(57)【要約】本発明は２組のヌクレオチド配列（１及び２）を用いて相互に対して相同性を示す一以上の標的ヌクレオチド配列であってサンプル中に存在する可能性がある一以上の標的ヌクレオチド配列（３）を同定及び／又は定量し、相同である可能性がある配列から区別する方法であって、所望によりラベルされたヌクレオチド配列の第一の組（１）が第一工程において前記標的ヌクレオチド配列（３）に特異的に結合し、ヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされているヌクレオチド配列（１）に対して相補的な配列の少なくとも一部を有する捕獲ヌクレオチド配列の第二の組（２）とのハイブリダイゼーションを通して検出され及び／又は定量され、ただし、前記捕獲ヌクレオチド配列（２）は１ｃｍ２当たり少なくとも４個の別個の領域のアレイに従って固体支持体の表面（４）上に固定されており、前記別個の領域のそれぞれは一種類の捕獲ヌクレオチド配列（２）と結合されており、所望によりラベルされたヌクレオチド配列（１）とそれらの対応する捕獲ヌクレオチド配列（２）との間の結合の同定及び定量はサンプル中に存在する標的ヌクレオチド配列（３）の同定及び定量と相互に関連することを特徴とする方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２組のヌクレオチド配列（１及び２）を用いて相互に対して相同性を示す一以上の標的ヌクレオチド配列であってサンプル中に存在する可能性がある一以上の標的ヌクレオチド配列（３）を同定及び／又は定量し、相同である可能性がある配列から区別する方法であって、所望によりラベルされたヌクレオチド配列の第一の組（１）が第一工程において前記標的ヌクレオチド配列（３）に特異的に結合し、ヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされているヌクレオチド配列（１）に対して相補的な配列の少なくとも一部を有する捕獲ヌクレオチド配列の第二の組（２）とのハイブリダイゼーションを通して検出され及び／又は定量され、ただし、前記捕獲ヌクレオチド配列（２）は１ｃｍ２当たり少なくとも４個の別個の領域のアレイに従って固体支持体の表面（４）上に固定されており、前記別個の領域のそれぞれは一種類の捕獲ヌクレオチド配列（２）と結合されており、所望によりラベルされたヌクレオチド配列（１）とそれらの対応する捕獲ヌクレオチド配列（２）との間の結合の同定及び定量はサンプル中に存在する標的ヌクレオチド配列（３）の同定及び定量と相互に関連することを特徴とする方法。
【請求項２】
第一工程と第二工程の間に、ヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされた配列であって標的ヌクレオチド配列（３）に結合されていない配列が除去され、標的ヌクレオチド配列（３）に結合したヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされた配列（１）が第二工程におけるそれらの再使用の前に相互から脱ハイブリダイズされることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
標的ヌクレオチド配列（３）がヌクレオチド配列の第一の組の一つ以上の所望によりラベルされた配列（１）とハイブリダイゼーション結合する前に、標的ヌクレオチド配列（３）が好ましくは共有結合によって固体支持体（４）上にまず結合されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
標的ヌクレオチド配列（３）とヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされた配列（１）との間の結合が溶液中で生ずることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされた配列（１）がヌクレオチド配列の第二の組の捕獲ヌクレオチド配列（２）の長さと本質的に同一又は類似（好ましくは８０％より高く類似）である長さを有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
同定及び／又は定量されるべき標的ヌクレオチド配列（３）がサンプル中に存在する相同配列と３０％より高い、好ましくは６０％より高い、より好ましくは８０％より高い相同性を示すことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
同定及び／又は定量されるべき標的ヌクレオチド配列（３）が一塩基のみによって相同配列から異なることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
所望によりラベルされたヌクレオチド配列（１）が１０〜６０塩基のそれらの配列の部分の一部を含み、その配列が標的ヌクレオチド配列（３）に特異的であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ヌクレオチド配列の第二の組の捕獲ヌクレオチド配列が所望によりラベルされたヌクレオチド配列（１）に相補的な配列を示すことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列の第二の組の捕獲ヌクレオチド配列（２）がそれらの完全配列に加えてヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされたヌクレオチド配列（１）に対して相補的な配列を有するか又は１０〜２００塩基の長さを有するスペーサーを介して固体支持体に結合された配列を有することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
所望によりラベルされたヌクレオチド配列（１）が標的には特異的でないがそれらの捕獲プローブに特異的であるそれらの配列の一部を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
ラベルされたヌクレオチド配列（１）がＳＮＰに隣接する標的配列に結合する様々なヌクレオチドによって停止された二種以上のラベルされた配列の混合物を含み、末端ヌクレオチドの一方はＳＮＰに完全にマッチし、ラベルされたヌクレオチド配列（１）はＳＮＰ標的の他方の部位に結合する予定の他の付加されたプローブをも含み、完全にマッチするプローブは捕獲プローブアレイ上での検出前にリガーゼによってこのプローブに結合されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
ラベルされたヌクレオチド配列（１）がプローブの混合物を含み、前記プローブのそれぞれはＳＮＰ部位に位置する少なくとも一塩基が異なり、捕獲プローブアレイ上で検出される前に特定ヌクレアーゼで処理されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
検出及び／又は定量されるべき一種以上の標的ヌクレオチド配列（３）がｒＲＮＡ、好ましくは１６Ｓ，２３Ｓ，１８Ｓ及び２５Ｓ　ｒＲＮＡからなる群から選択されたｒＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
検出及び／又は定量されるべき一種以上の標的ヌクレオチド配列（３）がｍＲＮＡ、好ましくはコンセンサス配列によってｃＤＮＡへと反転写されたｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
固体支持体がガラス、電子装置、シリコン支持体、プラスチック支持体、コンパクトディスク、フィルター、金属支持体、ポリリジンコートされた表面又はこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法を行うための手段を含む、サンプル中に存在する可能性がある一以上の相同標的ヌクレオチド配列の診断及び／又は定量装置。
【請求項１８】
装置が二つの別個の室（５及び６）を含み、それぞれが請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法において行われる工程の一つに専ら用いられることを特徴とする請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
室が固体支持体を含み、その上に捕獲ヌクレオチド配列（２）が１ｃｍ２当たり少なくとも４個の別個の領域のアレイに従ってその表面上に固定されており、前記別個の領域のそれぞれが一種類のヌクレオチド配列と結合されていることを特徴とする請求項１７又は１８記載の装置。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項記載の装置上で請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法の様々な工程を行うための機械又は自動機械。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はサンプル中に存在する一以上の標的ヌクレオチド配列を同定及び／又は定量し、相同配列とのそれらの区別を可能にする方法を提供する。特に、本発明は同じ科に属する微生物の特定の種を同定及び定量する方法、又は特定生物に属する一般的配列の様々なアイソタイプ（一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）配列を含む）を検出及び／又は定量する方法を提供する。
【０００２】
発明の背景及び技術の現状
多くの特異的捕獲ヌクレオチド配列で作られたバイオチップはサンプル中の検出されるべき対応する様々な相同ヌクレオチド配列の間の区別を行うための良好に適合されたツールである。
【０００３】
しかし、微生物間又は一つの微生物においてＤＮＡ又はＲＮＡ配列の一塩基のみで異なる相違が存在する。これらの配列は極めて類似しているので、一つの所定の標的ヌクレオチド配列と異なる捕獲ヌクレオチド配列（その上でそれがハイブリダイズすることができる）との間で交差反応が生ずるかもしれない。
【０００４】
一以上の標的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション及び検出をミニチュア化によって可能とするバイオチップ技術は、バイオチップ上に多数の捕獲ヌクレオチド配列が結合されていると仮定して、一以上の標的ヌクレオチド配列の間の検出（区別）を行うための有用なツールである。それは組織の遺伝子発現パターンの決定も可能にし、それはｍＲＮＡをｃＤＮＡへとコピーしてこれらの配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含むバイオチップ上でそれらをハイブリダイゼーションさせることによって得られる。ｃＤＮＡ配列は相互に異なっているので交差反応のレベルは高く、捕獲ヌクレオチド配列（それらはかなり長い配列である）は組織からクローニングされたｃＤＮＡのバンクから構築され、ハイブリダイゼーションの速度及び収率は高い。
【０００５】
小さな捕獲ヌクレオチド配列が用いられた場合、標的配列が小片に切り分けられない限りハイブリダイゼーションのレベルはかなり低い。溶液中ではハイブリダイゼーション速度は鎖長の平方根に比例し、小さいものは制限的である（Ｗｅｔｍｕｒ， Ｊ．Ｇ．， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １０， ６０１ （１９７１）； Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ Ｙｏｕｎｇ ｉｎ“Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｈａｍｅｓ， Ｂ． ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｓ． Ｅｄｉｔｅｕｒｓ， ７３−１１１， Ｏｘｆｏｒｄ−Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ （１９８５））。反応が固体表面上で行われる場合、捕獲ヌクレオチド配列の長さの影響は溶液中よりもずっと大きい。従って小さな捕獲ヌクレオチド配列上での所定の標的ＤＮＡ配列の固定速度と長い捕獲ヌクレオチド配列上での所定の標的ＤＮＡ配列の固定速度との間の相違は極めて大きい。
【０００６】
ＤＮＡ標的ヌクレオチド配列自体の検出はずっと問題がある。何故ならＤＮＡはまず増幅されなければならないからである（通常ＰＣＲによって）。アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）は２本鎖ＤＮＡであり、固体表面上に結合されている捕獲ヌクレオチド配列上にハイブリダイズするよりも溶液中で再会合しやすい（ＷＯ　９８／１１２５３）。この効果は捕獲ヌクレオチド配列の長さに直接依存しており、小さな捕獲ヌクレオチド配列は感受性の欠如に導く。ＤＮＡを非特異的な方法で片に切り分けることも可能である（多数の配列がチップ中で分析されると仮定して）。できるかぎり多数の捕獲ヌクレオチド配列を固体支持体の表面上に結合させて反応収率に影響を与えることも可能であるが、結合されることができる濃度に制限がある。配列の選択は最終的に重要である。何故なら、同一長であってもある配列は他の配列よりも高いハイブリダイゼーション収率を与えるからである（第一工程に好ましいか又は第一工程を加速することができ二本鎖形成を導く二次構造の形成）。
【０００７】
それ故、良好なハイブリダイゼーション収率を与えつつも標的相同配列の検出を可能にする中程度の長さの捕獲ヌクレオチド配列が妥協として提案されている。
【０００８】
しかし、小さな捕獲ヌクレオチド配列は一塩基の小ささで異なる配列間の区別を可能にする。小さな捕獲ヌクレオチド配列を担持するこれらのアレイの一つの適用は一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）配列の同定である（ＷＯ　９８／５６９５４）。
【０００９】
発明の目的
本発明は異なる相同標的配列に特異的な捕獲ヌクレオチド配列を担持するアレイを用いて他の可能な相同標的配列の間から標的ヌクレオチド配列を同定及び／又は定量するための新規の改良された解決策であって従来技術の欠点を示さない解決策を提供することを目的とする。
【００１０】
発明の概要
本発明はアレイ上にハイブリダイズされるべき配列のハイブリダイゼーションプロセスの反転を行うことによって、サンプル中に同時に存在することがあり得る相同標的配列間の区別を可能にする。
【００１１】
本発明による方法は、第一工程において標的に結合するヌクレオチド配列がアレイ上で検出されるべき標的として第二工程において用いられるという二工程の結合プロセスに基づいた標的ヌクレオチド配列の同定（検出及び特性決定）及び／又は定量を可能にする。
【００１２】
本発明による方法においては、標的ＤＮＡ（又はＲＮＡ）配列は所望によりラベルされた様々なヌクレオチド配列とまず反応させられ、次に、洗浄後、前記所望によりラベルされたヌクレオチド配列は標的ヌクレオチド配列から分離され、所望によりラベルされたヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を担持するアレイ上のハイブリダイゼーションによって最終的に同定される。本発明によれば、アレイ上にハイブリダイズするのは所望によりラベルされたヌクレオチド配列であり標的ヌクレオチド配列ではない。
【００１３】
本発明による方法においては、捕獲ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列は同一であるそれらの配列の少なくとも一部又は部分を有し、一方、所望によりラベルされたヌクレオチド配列はそれらに相補的な配列である。特許請求の範囲に記載されるようなかかる反転方法は相同標的配列の間の有効な区別の問題を有利に解決する。
【００１４】
定義
「相同ヌクレオチド配列」は対応する位置に同一ヌクレオチドを有するＤＮＡ又はＲＮＡ配列を意味する。相同（又は配列同一性）の程度は、比較されるべき二つの配列のうちの一方におけるギャップの如き欠失又は挿入を考慮に入れて配列を最適に整列（全配列）させた後の所定の位置における同一ヌクレオチドの割合として計算される。これは異なる生物種の如き遺伝的に異なる源中に存在する所定の遺伝子の配列の場合に、又は（同一ファミリーからの又は共通の構造ドメインを有する）類似機能を有するタンパク質又は酵素の場合、事実である。相同性（又は配列同一性）の程度は一以上の特定位置のみで又はそれらの配列の全てに沿って相同である配列を用いた場合は大きく変化し得る。両方の配列において同一である配列の一部（又は部分）は「保存されている」と称される。それらの配列において高度の不変性を示す配列は「高度に保存されている」と称され、それらは高度の相同性を示す。一塩基のみで異なる配列は高度の相同配列とみなすことができる。これは一ヌクレオチド多型配列又はＳＮＰ配列の原因である配列の場合、事実である。
【００１５】
相同性（又は配列同一性）は配列の整列後に計算され、コンピュータ化されている地域的な相同性アルゴリズム（例えば Ｃｌｕｓｔａｌ， Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， 又は Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ における ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ 及び ＴＦＡＳＴＡ 又は Ｂｏｘｓｈａｄｅ を挙げることができるがこれらに限定されない）に基づいている。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は本発明による反転バイオチップの模式図である。これは二つの室５及び６から作られており、これらは同一固体支持体４上に存在し、自動化の目的のために連結されている。
【００１７】
本発明の詳細な記述
本発明は二つのバイオチップの使用を有利にも含む。そこではサンプルから同定され単離されるべき標的ヌクレオチド配列３を担持する第一の室５、及びバイオチップ７の固体支持体４に対する捕獲ヌクレオチド配列２のさまざまな結合を含む第二の室６が導入されている。前記捕獲ヌクレオチド配列は図１に示される通り、ラベルされたヌクレオチド配列１に特異的である。アッセイを行いやすくするため、標的ヌクレオチド配列３は固体支持体４上に固定されており、従って標的ヌクレオチド配列３は第一の室中の様々なラベルされたヌクレオチド配列１と反応することができる。しかし、この固定は本発明に必須ではない。何故なら第一ハイブリダイゼーションは溶液中で行うことができ、ラベルされたヌクレオチド配列１はその後、アレイ上で検出される（対応する捕獲ヌクレオチド配列２とのハイブリダイゼーション）前に標的ヌクレオチド配列３から分離されることができるからである。
【００１８】
本発明による方法の第一の利点は特異性を検出速度と関連させることである。特異性は、相互に異なる標的ヌクレオチド配列の一部において選択されることができるような小さなラベルされたヌクレオチド配列が用いられるという事実によって得られる。それが小さい配列を用いるという事実は一塩基のみ異なる配列（ＳＮＰ配列）を区別することも可能にする。好ましい実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列は対応する標的ヌクレオチド配列に特異的な８〜６０塩基、好ましくは１５〜３０塩基の配列を有する。
【００１９】
本発明による方法の第二の利点は、固定された標的ヌクレオチド配列３上でのラベルされたヌクレオチド配列１のハイブリダイゼーションは捕獲ヌクレオチド配列２が小さく、溶液中の標的ヌクレオチド配列３が長いフラグメント（これは通常二本鎖になっている）である状況と比較するとかなり迅速なプロセスであるということである。更に、速度は固体支持体への標的ヌクレオチド配列３の結合部位から離れて位置するラベルされたヌクレオチド配列１のハイブリダイゼーションのための配列を選択し、そしてラベルされたヌクレオチド配列１を過剰に加えることによって加速されることができる。好ましい実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列１は標的ヌクレオチド配列の量の１００倍以上の大過剰で加えられる。これは標的ヌクレオチド配列３上へのこれらのラベルされたヌクレオチド配列１の固定速度及び収率を増大させるためである。
【００２０】
ラベルされたヌクレオチド配列１は全て標的ヌクレオチド配列３上でのそれらのハイブリダイゼーションのために一緒に存在し、これは反応がそれら自体の間で競争的になることを可能にする。配列は同一又は類似濃度で存在するので、結合収率は標的ヌクレオチド配列の親和性に依存するであろう。たとえ一塩基の小ささによって異なっていても非相補的配列についての方よりも相補的配列についての方が好ましい結合が観察された。相同配列間の区別は極めて良好である。
【００２１】
第二の（アレイ）室６においてはハイブリダイゼーション収率は様々なラベルされたヌクレオチド配列１について同様である。何故ならそれらは同一（又は類似）サイズを有し、それらは類似サイズの捕獲ヌクレオチド配列２上でハイブリダイズするからである。スポットの強度は（サンプル中に存在する）第一標的ヌクレオチド配列から離脱したラベルされたヌクレオチド配列１であって第二（アレイ）室６中でのハイブリダイゼーションに利用可能なラベルされたヌクレオチド配列１のレベルを反映する。
【００２２】
アレイ中の捕獲ヌクレオチド配列２上での配列の第二ハイブリダイゼーションは迅速なプロセスである。何故なら、小さな配列は迅速な反応を可能とするように設計された捕獲ヌクレオチド配列２上で反応するからである。捕獲ヌクレオチド配列２はかかる反応が速い速度で進行されるように最適化されることができ、固体支持体４への結合点から離れて特定配列を伸長させ、ハイブリダイゼーション速度を増大させる。相補的配列は他の非相補的配列と比較して常に過剰に存在するので、対応するスポットは反応の開始から高いシグナルを与え、標的ヌクレオチド配列の同定を可能にする。もし定性的測定のみが要求されるならば、反応は完了前に停止されることができる。何故なら、スポット上のシグナルレベルは反応の開始から溶液中のそれらの割合を反映するであろうからである。
【００２３】
本発明による方法の一つの好ましい実施態様は二本鎖標的ＤＮＡの検出である。アレイ上での標的ＤＮＡ配列の古典的な検出においては、標的ＤＮＡ配列が溶液中で二本鎖を再形成できるという事実のためハイブリダイゼーション速度は低い。かかる状況に対抗する一つの方法は捕獲ヌクレオチド配列の長さを増大させることであるが、この場合、相同配列が同一捕獲ヌクレオチド配列上に交差ハイブリダイゼーションし、偽の検出を導くことがある。本発明においては標的はラベルされた捕獲ヌクレオチド配列と第二の標的鎖との間のハイブリダイゼーションに対する競争を減少又は除去するため固定前又は固定後に一本鎖にされる。ラベルされたヌクレオチド配列は溶液中でのそれらの再ハイブリダイゼーションを回避するために一本鎖ヌクレオチドであることが好ましい。
【００２４】
本発明は相同配列の同定及び／又は定量（サンプル中の微生物の特定株の同定、又は研究において正常又は病気の状況で異なる役割を有するタンパク質をコードする関連遺伝子の集団の間で遺伝子が特異的に同定されなければならない場合）に特に好適である。これはレセプター、キナーゼ、ホスファターゼ、サイクリンの如き調節遺伝子、転写因子又はオンコジーンについて特に真実である。それらの配列の一部が同一であるので、標的相同ヌクレオチド配列はコンセンサスプライマーを用いて増幅又は複製されることができる。多くの適用においては、検出の役割は類似生物の標的ヌクレオチド配列（相同ＤＮＡ又はＲＮＡ配列）の間の区別を行うことである。その場合、保存されている配列の一部又は部分はこれらの相同ヌクレオチド配列（サンプル中に存在するなら）すべてを認識するプライマーの結合のために用いられる。生物の一つの科又は属について一つのプライマー対のみの使用はそれぞれの種又は亜種について特異的なプライマーを使用することと比較して有利である。何故なら生物の科の中には３０以上の種を含むものもあるからである。１回の多重ＰＣＲでこれらの種すべてを増幅することを可能にする増幅条件を見出すことは（たとえ不可能ではないにしても）困難である。（五つの異なるヌクレオチド配列についての多重ＰＣＲですら再現性のある様式でサンプルを取扱うことがすでに困難である。）本発明によれば、各科について一つのプライマー対のみを用いて（細菌科の如き）生物の各科を増幅するためにアッセイを設計することができる。ｍＲＮＡの反転写の場合のように複製のみが行われるならば、単一のｐｏｌ−ｄＴが複製を行ってｃＤＮＡにする転写酵素として役立つことができる。
【００２５】
好ましくは、小さなラベルされたヌクレオチド配列１は第一及び第二ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションのために用いられる。小さなヌクレオチド配列１の使用は極めて相同な配列（３０〜９８％の相同性）の区別を可能とする。もしラベルされたヌクレオチド配列が好適に選択されるならば、それらは一塩基で異なる（ＳＮＰ）二つの配列の間で区別することができ、かくして多型の決定を可能にする。
【００２６】
好ましい実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列１はそれらの標的ヌクレオチド３に特異的なそれらの配列の一部及び標的ヌクレオチド配列３に非特異的でありかつ所定のラベルされたヌクレオチド配列に特異的な追加テールを含む。このテールはアレイ室６上に存在する捕獲ヌクレオチド配列２と相補的である。テールはそれぞれのラベルされたヌクレオチド配列１について異なるので、それらはアレイ上での完全なマッチを安定化させ、その結果、標的ヌクレオチド配列に特異的な配列の一部において例えば一塩基異なる密接に関連したラベルされたヌクレオチド配列はアレイ上でより良好に区別されるであろう。
【００２７】
本発明による方法はヌクレオチド配列の改変を用いたＳＮＰ配列の検出に適用されることができ、これらはまず標的ＤＮＡ配列上にハイブリダイズされ、次に第二工程において様々な捕獲ヌクレオチド配列２を担持するアレイ室６上で検出される。
【００２８】
一実施態様においては、本発明はＳＮＰ配列に隣接する標的ヌクレオチド配列に結合する、異なるヌクレオチドによって停止された二以上のラベルされたヌクレオチド配列の混合物を用いることによるＳＮＰ配列の決定に適用され、ヌクレオチド配列の末端ヌクレオチドの一方はＳＮＰ配列に完全にマッチされる。ラベルされたヌクレオチド配列以外に結合する他の追加ヌクレオチド配列の存在は、完全にマッチするヌクレオチド配列がリガーゼによりこのヌクレオチド配列に結合されることを可能とする。結合されたヌクレオチド配列は次に第二アレイ上で検出され、かくしてＳＮＰ配列が同定される。様々なラベルされたヌクレオチド配列は容易に同定されるようにＣｙ３，Ｃｙ５又はＣｙ７の如き異なるラベルを担持してもよい。もしラベルされていないのなら、第二の追加ヌクレオチド配列は生ずる結合生成物がラベルされるようにラベルされる必要がある。
【００２９】
本発明の他の実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列の混合物が用いられ、それぞれの配列は同一ＳＮＰ上の部位に位置する少なくとも一塩基において異なる。ハイブリダイゼーション後、ミスマッチヌクレオチド配列は一本鎖に特異的であるが二本鎖ＤＮＡには影響を与えないヌクレアーゼによって切断され、プロセスが繰返される。未切断の及び切断されたヌクレオチド配列は次にアレイ室６上でのハイブリダイゼーションのために処理される。好適なハイブリダイゼーション条件において及びアレイ室上の良く選択された捕獲ヌクレオチド配列を用いると、それらは長い未切断の又は小さな切断されたヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かくしてＳＮＰ配列の同定を可能にする。
【００３０】
本発明の他の実施態様においては、標的ヌクレオチド配列に沿って位置するＳＮＰ配列の如き標的ヌクレオチド配列の異なる部分を認識した複数のヌクレオチド配列の混合物が用いられ、方法の第二工程においてアレイ上で検出される。多数の捕獲ヌクレオチド配列２がアレイ上に固定されることができ、多数のラベルされたヌクレオチド配列１の間で区別することができる。このようにして、所定の標的ヌクレオチド配列の中に存在する可能性がある突然変異の如き多数の変異について一つのアッセイで調査することが可能である。これはこれらの変異がすべて標的中に潜在的に存在し、これらが病気の状況と関連している場合に特に有利である。これはオンコジーン（Ｐ５３の如き）に生ずる突然変異について事実である；それらの多くはがん進行に関連しており、ＨＩＶウィルス酵素において医薬治療に対する抵抗性に導く。ＳＮＰは医薬治療に対する又は病気に対する反応に影響を与える個人的変異にもたぶん関連している。
【００３１】
好ましい実施態様においては、所定の問題に対して幅広い応答を得るためにいくつかの標的ヌクレオチド配列が第一ハイブリダイゼーション工程で用いられ、アレイ上で可能な多数の検出という利益が得られる。
【００３２】
有利には標的ヌクレオチド配列は複製又は増幅工程によってラベルされることなしに検出されることができ、かくしてＤＮＡ又はＲＮＡ配列の直接検出を可能にする（多くの従来法においては、標的ヌクレオチド配列は増幅又は転写工程中にラベルされる）。これはバイオチップの最終用途における単純化を可能とする。何故なら、使用者は増幅をいかなる方法においても行うことができ、この工程中のラベルされた試薬の干渉に悩まされる必要がないからである。この特性はサンプルからの抽出後、直接配列を同定することを可能にし、複製又は増幅工程を除去し、それを行いやすくする。この直接検出は十分な材料が利用できるときのみ行うことができる。本発明による適用はリボゾーマルＲＮＡ：１６ｓ，２３ｓ，１８ｓ又は２５ｓの如きＲＮＡに適用するがｍＲＮＡにも適用する（しかしこれらに限定されない）。これらのＲＮＡは一本鎖ヌクレオチドであるので、支持体上へのそれらの固定後、二本鎖アンプリコンの場合ほど劇的な変性を用いる必要はなく、従って非共有結合をこの工程で用いることができる。ＲＮＡ（リボゾーマルＲＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡ）の検出は、直接であれそれらの相補的ＤＮＡ配列へのそれらの複製後であれ、本発明の好ましい実施態様である。何故なら、それらは通常多数のコピー数で細胞中に存在し、多くの適用においてはそれらの検出は増幅なしに行うことができるからである。この直接検出は定量をも容易にする。何故なら、増幅を回避することはこの工程による変異（これは克服することが困難である場合が極めて多い）を減少させるからである。直接検出は長いＤＮＡ配列に、それらを抽出及び変性した後、又はそれらを小さい片に切り分けた後に適合されることができる。
【００３３】
本発明の好ましい実施態様においては、標的ヌクレオチド配列３はコンセンサスプライマーによって増幅（ＰＣＲ）される（同一プライマーによって増幅される配列）。相同配列は例えば同一の科又は属の微生物中に存在する遺伝子の配列である。この増幅のためには、プライマーの一方はアミノ化され、従って増幅後アンプリコン鎖の一方はこのアミノ基を担持する。アンプリコンは次にアルデヒド基を担持する表面上でインキュベートされる。アミンとアルデヒトの間の反応は正常条件では自発的であり、他の試薬は不要である。反応後、還元剤（ＮａＢＨ４）が添加されて反応性二重結合を削除する。次に第二鎖はヌクレオチド配列用の変性条件を用いて除去される。ヌクレオチド配列が標的鎖から分離するように温度をヌクレオチド配列の溶融温度より上に増大させてもよいが、アルカリ溶液の使用の如き他の条件も用いることができる。（二つの鎖を分離するためには０．１又は０．０５ＮのＮａＯＨ溶液濃度で十分である。）
【００３４】
活性化された表面へのアンプリコンの結合は、増幅後に溶液中になおも存在しているプライマーの存在によって制限され得る。これらのプライマーは活性化された表面と反応することもでき、それ故標的アンプリコンの固定を低下させる。必要ならばアンプリコンを表面上に固定する前にアンプリコンをプライマーから分離させる。（スピンカラム上での分離がかかる分離には好適だが、Ｎｕｃｌｅｏ ｔｒａｐ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ） 又はゲルフィルター上での濾過 （Ｎｕｃｌｅｏ Ｓｐｉｎ Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ） の如きシリカ由来の吸着もかかる分離に好適である。）
【００３５】
サイズに応じたＤＮＡフラグメントの分離は電気泳動法を用いても良好に得ることができる。かかる技術のミニチュア化は、かかるルーチン適用における必要の如き現在の適用に今や好適であることを可能とする。
【００３６】
本発明によれば、アッセイは同一支持体４上で行われるタンデムチップである。第一室５上で標的ヌクレオチド配列は活性化された支持体４上に共有結合によって固定される。共有結合反応は化学において周知であり、それらの多くは例えばチップ表面上に存在するアルデヒド基とアミノ化された標的ヌクレオチド配列との反応によってチップ形成に既に用いられている。他の実施態様においては、標的配列は直接又は複製もしくは増幅工程中にビオチン化（好ましくは一方の鎖上で）されており、標的はストレプトアビジンでコートされた表面上に固定される。他の実施態様においては、ハプテン又はリガンドが標的配列上に固定され、従ってそれは表面上に固定された対応する抗体又は受容体によって固定される。
【００３７】
この工程を生じさせるために多くの支持体が適合されることができる。ガラスはアルデヒド基を担持するように活性化される。表面上にアルデヒドをグラフトするためには多くの異なる方法がある。ガラスはアミノシランと反応し、次にグルタルアルデヒドと反応する。カルボキシル基を固体支持体の表面上に結合させて次にそれらをアルデヒドへと還元してもよい。アルコール官能基はアルデヒドへと酸化されることもできる。しかし、ＳＭＣＣ又はＤＳＳの如き二官能性活性化剤の使用も有用である。何故なら、それらはアミノ基を活性化させそれらをそれぞれチオール又はアミノ基と結合させることができるからである。標的ヌクレオチド配列が二本鎖であり変性溶液中で処理されなければならない場合、かかる化学結合は支持体への標的ヌクレオチド配列の特に有用な共有結合固定を与える。しかし、ナイロン、セルロース誘導体の如き表面上への単純な吸着、又は正に帯電された表面（例えばポリリジン又はポリ（ｐｈｅ−ｌｙｓ） の如きコポリマーでカバーされた表面）上への単純な吸着も表面上にヌクレオチド配列を吸着させるための好適な方法である。この場合、条件は小さいプライマーよりもむしろ長い標的ＤＮＡフラグメントの吸着のために決定される。
【００３８】
もしガラスが不活性でありかつ低い自己蛍光性を有するというような多くの利点を有するなら、他の支持体、特にポリマーは有用であることができる。何故なら、それらはそれらの表面で様々な化学的に良く規定された基を用いて得ることができ、かくして標的ＤＮＡの固定を可能とするからである。ポリスチレンは表面上でカルボキシル又はアミノ基を得るために活性化され、アミノ−ＤＮＡの共有結合固定を可能とする（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３６， ８５ （１９９６））。大部分のポリマーはカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を得るために活性化することができる。ポリスチレンは平坦な支持体としてのみならずマイクロビーズとしても入手可能であり、これは固定された標的上でのラベルされたプローブの第一結合工程を行うために用いるのに有利である。
【００３９】
ＤＮＡを固定することができる全ての他の支持体（フィルター、シリコン支持体、金属支持体、コンパクトディスク、プラスチック又は電子装置の如き）も用いることができる。有利には前記固体支持体は単独のガラス又はプラスチックプレートであり、これは本発明による方法を改良するための追加の手段（バーコード、マーカー等）又は媒体（被覆等）を含んでいてもよい。プラスチック支持体中に挿入されたガラスの如き支持体の組合せは自動化のためにチップを取扱うのに有用である。
【００４０】
結合後及び／又は結合前に標的ヌクレオチド配列は変性され、一本鎖の固定された標的ヌクレオチド配列を生成する。様々なラベルされたヌクレオチド配列を含む溶液が次にこの第一モノチップに加えられ、それらはもしそれらの相補配列が標的ヌクレオチド配列上に存在するなら反応することができる。洗浄後、溶液は加熱され、結合されたヌクレオチド配列は標的ヌクレオチド配列から分離され溶液中に見出される。この溶液は次に特定のチャネル又は他の手段（マイクロポンプ又は弁を利用した洗浄工程）によってラベルされたヌクレオチド配列に特異的な捕獲ヌクレオチド配列を含む第二室６へと移される。第二ハイブリダイゼーションが次に行われ、ラベルされたヌクレオチド配列、従って標的ヌクレオチド配列の同定を可能にする。もし異なる工程が良好に行われるのなら、アッセイは定量的にすることができ、従って標的ヌクレオチド配列の同定のみならず定量をも可能にする。全ての工程は同一表面４上で行われるのでアッセイは使用者にとって行いやすく、自動化を可能とする。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様においては、コンセンサスプライマーはサンプル中に存在する可能性がある相同配列のＰＣＲ増幅において用いられる。ＮＨ２の如き官能基又はビオチンは上述の通りそれらを個体表面上に付着させるために組込まれる。ＬＣＲ，ＣＰＲ，ＮＡＳＢＡ，ＩＣＲ，ＴＭＡ又はなだれＤＮＡの如き他の増幅方法も可能である。ＲＮＡ増幅は反転写後、同様の方法で行うことができる。短い配列のＤＮＡも制限酵素を用いた特定開裂によって得ることができ、小さな配列のＲＮＡは熱による又は塩基の存在による非特定開裂によって得ることができる（ＷＯ　９７／１０３６５）。
【００４２】
ビオチン化されたラベルされたヌクレオチド配列（これはその後、蛍光分子又は酵素又はコロイド金粒子を有するストレプトアビジンコンジュゲートと結合する）を用いた間接ラベリングも用いることができる。これらの金粒子はそれ自体によって検出されるか又は銀の還元のための触媒として役立つことができる。沈殿は次に検出され、所望により定量される（ＥＰ−９９８７０１０６．４）。
【００４３】
ラベリングはハプテンと抗体の反応を用いても得ることができる。抗体はラベルであるか又はシグナルを与えることができる分子と結合する。
【００４４】
ＤＮＡチップに適合された蛍光、比色、磁気、電気、電気発光、生物発光又は放射能に基づくＤＮＡ検出法は全てアレイの検出に用いることができる。
【００４５】
ラベルされたヌクレオチド配列及びそれらの相補的捕獲ヌクレオチド配列の検出の選択は、相同配列が相互から特異的に区別されなければならない場合、全プロセス中で非常に重要な工程である。配列間の相同性が高いほどこれらの配列の選択は一層重要である。相同配列が最も（又は多く）異なる小さな配列領域（又は部分）を選択してこの領域（又は部分）に対する相補物としてラベルされたヌクレオチド配列を設計することが好ましい。配列の長さは相同性によっても変化し、配列が異なれば長く、極めて相同であれば短い。配列は１５〜３０塩基であることができるが、８塩基の小ささの配列又は６０塩基の長さの配列も用いることができる。アレイ上にスポットされた捕獲ヌクレオチド配列はラベルされたヌクレオチド配列に対して相補的である。一つの好ましい実施態様においては、これらの配列２は表面４に結合された非特異的配列を有することによって又は固定用のリンカーを用いることによって表面４から特定の距離に位置する。
【００４６】
二つのハイブリダイゼーション工程を行うために単一の表面を使用することはプロセスが自動化及び微小流体光学技術に適合されることを可能とする。表面は二つの室に分けられ、第一の室では標的ＤＮＡ又はＲＮＡが結合されてラベルされた配列が標的配列上にハイブリダイズし、第二の室はアレイであり、様々な捕獲配列を含む。溶液はチャネル及びポンプによって各室に注入され除去され、これによりインキュベーション及び洗浄を可能とする。室は要求された温度に加熱されることもできる。
【００４７】
二つの室は小さなパイプ又はチャネルによって連結されることもでき、従ってラベルされたヌクレオチド配列の標的からの分離後、溶液は第二の室へと移されアレイ上でのハイブリダイゼーションプロセスが行われる。検出をも含む全プロセスが自動化されることができ、この反転チップ検出を容易なプロセスとする。本発明は固定された標的上でのラベルされたヌクレオチド配列の結合及び分離工程を繰返し、かくして特定のヌクレオチド配列が捕獲ヌクレオチド配列上でのそれらの区別のためにアレイに蓄積される。自動機械又は機械によるプロセスの自動化はプロセスを繰返すのに特に好適である。
【００４８】
この技術は現存の自動機械に容易に適合されることができる。それらの一つはＥＬＩＳＡアッセイ用に開発されたＶＩＤＡＳ（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ， Ｌｙｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）である。それはチップ中での抗原／抗体反応を行うことに対する特異性を有しており、チップは次に洗浄及びインキュベーションのために様々な溶液を徐々に通過させられる。このチップ中で得られる最終シグナルが次に記録される。アレイは分配チップの如き装置中に挿入されることができ、かくして溶液は内側にくみ上げられ、反応させられ、洗浄し、アレイ上でインキュベートする。チップ中で反応を行うことは抗体−抗原反応について開発されておりＶＩＤＡＳ機械（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ， Ｌｙｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）によって行われるような自動化に良く適合されている。反応が完了した後、シグナルは後述のようにアレイ上で検出される。
【００４９】
二重アレイシステムは同様の方法で処理されることができ、各々はマイクロピペット装置中に挿入されてプロトコールによって要求される場合はヌクレオチド配列の溶液を通過させるために相互に連結されている。
【００５０】
微小流体工学技術は同一表面上で行われるべき過剰のプライマーからアンプリコンを増幅及び／又は分離する手順全てを可能とし、かくして「チップ上の研究室」をもたらす。最終表面は区画のいくつか又は全てを含むであろう：行われるべきＰＣＲ用の室、もし必要ならばアンプリコンを精製するための分離装置、アンプリコンの固定及び様々なラベルされたヌクレオチド配列との第一ハイブリダイゼーションのための室、及び最後にヌクレオチド配列の最終同定及び検出のためのアレイを有する室。全生成物は室間で行われるべき液体のための及び外部溶液を用いたインキュベーション及び洗浄のための必要な連結を担持するであろう。アッセイの十分に自動化された分析を得るために検出器を自動機械に加えることもできる。プライマーからのアンプリコンの分離は例えば ＡＣＬＡＲＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， （Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａ， ＵＳＡ）によって提案されているような濾過、吸着−脱吸着プロセス又は微小電気泳動を用いて行うことができる。
【００５１】
ハイブリダイゼーション結果の分析
アレイ上でのハイブリダイゼーション結果は、陽性ハイブリダイゼーションによって発されるシグナルに適合された検出システムを用いて機械によって検出及び／又は定量される必要がある。マイクロアレイにおいて用いられる最も一般的なＤＮＡラベリングは蛍光ヌクレオチド配列の使用に基づいている。この場合、蛍光スキャナーが検出器として作用する（即ち共焦点蛍光スキャナー（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ， ＵＳＡ））。
【００５２】
陽性スポット上での沈殿の形成、特にナノ金でラベルした後の銀沈殿は簡易な検出に特に好適である。何故なら比色スキャナー又は写真検出器という特に低コストの技術で反応レベルを検出及び／又は定量することができるからである（ＥＰ−９９８７０１０６．４）。
【００５３】
像認識用のソフトウェア分析はスポットに適合されてきており、その後、背景レベルが考慮に入れられて各スポット上に存在するシグナルが定量される。他のタイプの分析はスポットの相関分析に基づいており、それはスポットの各ピクセルの形状及びレベルを考慮に入れる。相関レベルに従ったスポットの分類は陽性又は陰性スポットへの分類を可能にし、原サンプル中に標的が存在するか否かについての容易な回答を使用者に与える。
【００５４】
ハイブリダイゼーションの定量は内部又は外部標準による従来のアプローチを用いて行われ、それは抽出に始まって、複製または増幅、第一ハイブリダイゼーション及びアレイ上での第二ハイブリダイゼーションへと続くプロセスの様々な工程において得られる異なる収率についての相関を可能にする。好ましい実施態様においては、既知の濃度の外部標準が全工程を適してサンプル及びプロセスに加えられ、全プロセスの効率を訂正する。本発明の方法は複製または増幅方法を通常含むので、競合的標準は本発明の好ましい実施態様である。それらのうちの一つは文献ＷＯ　９８／１１２５３において提案されている。
【００５５】
好ましくは、この特定配列を通した標準のハイブリダイゼーション収率は標的配列のハイブリダイゼーション収率と同一であるかまたはこれから２０％より多く異なることはなく、定量はＷＯ　９８／１１２５３に記載されたように得られる。
【００５６】
前記標準ヌクレオチド配列、外部及び／又は内部標準は本発明によるキット（装置）又は装置に含まれることが有利であり、所望により本発明による様々な工程を行うために必要な全ての媒体及び手段（ハイブリダイゼーション及び培養培地、ポリメラーゼ及び他の酵素、標準配列、ラベリング分子など）も含まれる。
【００５７】
実施例
特定 ｆｅｍＡ 遺伝子の検出による Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（スタフィロコッカス）種の同定
ＦｅｍＡ 遺伝子は極めて高度に保存されている遺伝子であり、それらは異なるスタフィロコッカス種の間で５０〜９０％の相同性を有する。サンプル中のスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の同定は以下の五つの最も一般的なスタフィロコッカスを増幅することができるコンセンサスプライマーによる予備増幅を用いて行われた：エス・アウレス（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）、エス・エピデルミディス、エス・へモリティカス（Ｓ． ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エス・ホミニス（Ｓ． ｈｏｍｉｎｉｓ）及びエス・サプロフィティカス（Ｓ． ｓａｐｒｏｐｈｉｔｉｃｕｓ）。プライマーの一方はアミノ化され、かくしてアンプリコンの一方の鎖はその５′端にアミノ基を担持していた。アンプリコンは次にアルデヒド基を担持するガラスに共有結合固定され、１００℃に加熱することによって変性された。五つのスタフィロコッカス種に特異的なラベルされたヌクレオチド配列は次にこれらの一本鎖化されたアンプリコンと共にインキュベートされた。反応及び洗浄後、ＮａＯＨ溶液中に回収された。この溶液は次に各ラベルされたヌクレオチド配列に特異的な捕獲ヌクレオチド配列のスポットにより形成されたアレイ上に添加された。反応及び洗浄後、ストレプトアビジン−Ｃｙ５コンジュゲートが添加され、続いて共焦点蛍光スキャナー（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて読み取られた。この方法の原理は図１及び図２に示されている。エス・エピデルミディスに特異的な捕獲ヌクレオチド配列を担持するスポットのみが陽性である。
【００５８】
コンセンサスプライマーを用いた ＦｅｍＡ 遺伝子の増幅
ＰＣＲ増幅に用いられたプライマーの配列は以下の通りである：
ＦＰ １ ： ５’ ＣＣＡ ＣＴＡ ＧＣＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＡＴ ＴＴＴ ＧＡ ３’
ＦＰ １ＨＳ ： ５’ ＣＣＣ ＡＣＴ ＣＧＣ ＴＴＡ ＴＡＴ ＡＧＡ ＡＴＴ ＴＧＡ ３’
ＦＰ ３ ：　５’ ＧＧＴ ＴＴＡ ＡＴＡ ＡＡＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＡＴ Ｔ　３’
ＦＰ３は５′端にＮＨ２基を有する。これらのプライマーは ｆｅｍＡ 遺伝子内の４８７ｂｐの配列を増幅する。
【００５９】
表面上でのアンプリコンＤＮＡの固定
アンプリコンは Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｍａｎｎａｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ） 上のクロマトグラフィーによって精製され、アミノ化プライマー及び遊離のヌクレオチドが除去された。表面上での固定のために、１５０ｎＭの精製されたアンプリコンを含む溶液ＳＳＣ３Ｘ　ｐＨ５の１００μｌがハイブリダイゼーション室によって枠にはめられたシリル化顕微鏡スライド（Ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＵＳＡ）上で２３℃で３０分インキュベートされた。インキュベーション後、スライドは０．１％ＳＤＳで１回、水で２回洗浄され、次にＮａＢＨ４（２．５ｍｇが７５０μｌのＰＢＳ及び２５０μｌの１００％エタノール中に溶解された）と共に５分間インキュベートされ、次に３分間沸騰水中でインキュベートされ、スライドは使用するまで４℃で貯蔵された。
【００６０】
標的からの特定ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション及び除去
五つのスタフィロコッカス種検出のための特異的なビオチン化ヌクレオチド配列は以下の通りである：
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ
ＡＳａｕｒ０１ ： ５’ ＣＴＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＧＴ ＧＡＴ ＡＴＴ ＴＴＡ ＡＡＴ ３’
Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
ＡＳｅｐｉ０１ ： ５’ ＣＴＡ ＡＡＴ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＡＡＴ ＧＴＧ ＣＴＴ ＡＡＴ ３’
Ｓ． ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ
ＡＳｈａｅ０１ ： ５’ ＴＴＡ ＣＡＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＣＧＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＴＴＡ ＡＡＴ ３’
Ｓ． ｈｏｍｉｎｉｓ
ＡＳｈｏｍ０１ ： ５’ ＣＴＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＣＧＴ ＣＡＧ ＡＣＡ ＴＴＡ ＡＡＴ ３’
Ｓ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
ＡＳｓａｐ０１ ： ５’ ＴＴＡ ＡＡＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＣＧＣ ＧＡＡ ＧＴＡ ＴＴＡ ＡＧＴ ３’
【００６１】
ビオチン化ヌクレオチド配列コントロールの配列は：
ＣＭＶ２３Ｂｉｏｔ ５’ ＧＧＴ ＴＡＴ ＣＡＧ ＡＧＧ ＣＣＧ ＣＴＴ ＧＧＣ ＣＡ ３’　である。
【００６２】
各プローブはその５′端にビオチンを担持する。
【００６３】
ハイブリダイゼーションのため、１００μｌのハイブリダイゼーション溶液が標的ＤＮＡを担持するガラス上に添加される。この混合物は０．５Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．４，７％　ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ，３０ｎＭのエス・エピデルミディスのビオチン化ヌクレオチド配列（１ヌクレオチド配列）又は３０ｎＭの各ヌクレオチド配列（５ヌクレオチド配列）を含有する。ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション室中で６０℃で２時間行われる。サンプルはマレイン酸緩衝液１０ｍＭ　ｐＨ７．５，ＮａＣｌ　１５ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ　０．０３％を用いて４回洗浄される。
【００６４】
ハイブリダイズされたプローブは疎水性のペンで範囲を定められたハイブリダイズした領域中で７０μｌのＮａＯＨ　０．０５Ｎを用いて２５℃で５分間インキュベートすることによって解放される。５０μｌの溶液が次にマイクロチューブに移され、０．７Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４，１０％　ＳＤＳ，２００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ，１０ｎＭのビオチン化されたＣＭＶヌクレオチド配列（ハイブリダイゼーションコントロール）を含む溶液５６μｌを用いて中和される。
【００６５】
アレイ上のラベルされたヌクレオチド配列の検出
五つのスタフィロコッカスについての捕獲ヌクレオチド配列の配列は以下の通りである：
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ
ＡＴａｕｒ０２ ： ５’ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＡＴ ＡＴＣ ＡＣＧ ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＴＴ ＴＡＧ ３’
Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
ＡＴｅｐｉ０２ ： ５’ ＡＴＴ ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＴＴ ＴＣＴ ＴＴＣ ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡＧ ３’
Ｓ． ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ
ＡＴｈａｅ０２ ： ５’ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＧＴ ＴＴＣ ＡＣＧ ＴＴＣ ＡＴＴ ＴＴＧ ＴＡＡ ３’
Ｓ． ｈｏｍｉｎｉｓ
ＡＴｈｏｍ０２ ： ５’ ＡＴＴ ＴＡＡ ＴＧＴ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ３’
Ｓ． ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ
ＡＴｓａｐ０２ ： ５’ ＡＣＴ ＴＡＡ ＴＡＣ ＴＴＣ ＧＣＧ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＴＴ ＴＡＡ ３’
【００６６】
捕獲ヌクレオチド配列コントロールの配列は：
ＣＭＶＮＨ２ ： ５’ ＴＧＧ ＣＣＡ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＴＣ ＴＧＡ ＴＡＡ ＣＣ ３’　である。
【００６７】
各捕獲ヌクレオチド配列はその５′端にＮＨ２基を担持する。
【００６８】
捕獲プローブの固定
アミノ化ＤＮＡのアルデヒドへのグラフトのための Ｓｃｈｅｎａ らによって記述されるプロトコール （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， １０６１４， １９９６） は若干変化させて用いられた。
【００６９】
アミノ化された捕獲ヌクレオチド配列は１．６μＭの濃度でスポットされた。捕獲ヌクレオチド配列はシリル化顕微鏡スライド上に自家製の配列器を用いてプリントされた。捕獲ヌクレオチド配列はラベルされたヌクレオチド配列と相補的であり、それらの５′端でアミノ基によって停止されている。Ｇｅｎｅｔｉｘ （ＵＫ） からの２５０μｍピン及び Ｃｅｌｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ （Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＵＳＡ） からのシリル化（アルデヒド）顕微鏡スライドが用いられた。スポットは直径が４００μｍであり、分配された体積は約１ナノリットルである。スライドは室温で乾燥され、使用されるまで４℃で貯蔵された。
【００７０】
ハイブリダイゼーション及び検出
１０６μｌの変性生成物はハイブリダイゼーション室中で３０分間５０℃でインキュベートされる。スライドは次にマレイン酸緩衝液１０ｍＭ　ｐＨ７．５，ＮａＣｌ　１５ｍＭ，Ｔｗｅｅｎ　０．０３％（洗浄緩衝液）で４回洗浄される。ガラスサンプルはマレイン酸緩衝液１００ｍＭ　ｐＨ７．５，ＮａＣｌ　１５０ｍＭ，Ｇｌｏｒｉａ　ミルク粉末０．１％中で５００倍に希釈された８００μｌのストレプトアビジンラベルされた ｃｙａｂｉｎ５ （Ｓｉｇｍａ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉ） と共に室温で４５分間インキュベートされる。スライドは洗浄緩衝液で５回洗浄され、水で１回リンスされて乾燥される。スライドは Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ （Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ， ＵＳＡ） からの共焦点スキャナーを用いて読み取られる。
【００７１】
表１は（Ａ）標的エス・エピデルミディスのアンプリコンが固定され五つのスタフィロコッカス種に特異的なラベルされたヌクレオチド配列１の混合物と共に第一室５中でインキュベートされる場合の、又は（Ｂ）標的エス・アウレウスのアンプリコンが固定され特定のラベルされたエス・エピデルミディスのヌクレオチド配列と共にインキュベートされる場合のスタフィロコッカス・エピデルミディスの特定配列の検出について本発明による反転バイオチップで得られた結果を示す。ハイブリダイゼーション後に標的ヌクレオチド配列から分離したヌクレオチド配列１は次に五つのスタフィロコッカス種に特異的な五つの可能なラベルされたプローブのための捕獲プローブ２を担持するアレイ（室６）上に移され、検出される。
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による反転バイオチップの模式図である。
【図１】
2004502468.tif 000004
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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