(57)【要約】本発明は、ワクチンおよびそれらの調製に関する。リポソームに封入された抗原、適切なアジュバント、および疎水性物質の連続相を含む担体を含むワクチンを用いて、有効かつ長期にわたる免疫応答を、特に哺乳動物において生成できる。ワクチンは、天然型タンパク質のエピトープを認識する抗体の産生を引き出すのに特に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）疎水性物質の連続相を含む担体；
（ｂ）リポソーム；
（ｃ）抗原；および
（ｄ）適切なアジュバント
を含有する、ワクチンとして使用するための組成物。
【請求項２】
前記疎水性物質が液体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記担体が、油、または油中水型エマルジョンである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記油が、鉱油、植物油または木の実の（ｎｕｔ）油である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記アジュバントが、ミョウバン（ａｌｕｍ）、別のアルミニウム化合物、またはＴｉｔｅｒＭａｘである、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記アジュバントがミョウバンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原が、適切な天然型、非天然型、組換え型もしくは変性型のタンパク質またはペプチド、またはそれらの断片である、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原が、ウイルス、細菌、原生動物または哺乳動物抗原である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗原が、天然型エピトープを認識する抗体を引き出すことが可能である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記天然型エピトープが哺乳動物中にあるものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記哺乳動物が、ウマ、ウサギ、シカまたはネコである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原が、透明帯、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｂ型肝炎、またはストレプトキナーゼである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リポソームが、非エステル化コレステロール、およびホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリンおよびホスホイノシトールからなる群より選択される少なくとも１つの頭部基を有するリン脂質を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リポソームが、ホスホリポン９０Ｇ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ９０Ｇ）の脂質を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項１５】
リピドＡが実質的に入っていない、請求項３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗原が透明帯であり、アジュバントがミョウバンであり、ワクチンが哺乳動物において有効な長期免疫避妊をもたらす、請求項４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記油が鉱油であり、前記組成物が本質的にリピドＡを含まない、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
（ａ）疎水性物質の連続相を含む担体；
（ｂ）リポソーム；
（ｃ）抗原；および
（ｄ）適切なアジュバント
を含有する有効量のワクチン組成物を動物に投与することを含む、動物における免疫応答を増強する方法。
【請求項１９】
前記疎水性物質が液体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記担体が、油、または油中水型エマルジョンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記油が、鉱油、植物油、または木の実の油である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アジュバントがミョウバンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原が、透明帯、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｂ型肝炎、またはストレプトキナーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原が、天然型エピトープを認識する抗体を引き出すことが可能である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記天然型エピトープが哺乳動物中にあるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物が、ウマ、ウサギ、シカ、またはネコである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が実質的にリピドＡを含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）抗原または抗原／アジュバント複合体をリポソームに封入して、リポソーム封入抗原を形成するステップ；
（ｂ）該リポソーム封入抗原を、疎水性物質の連続相を含む担体と混合するステップ；および
（ｃ）（ａ）において抗原／アジュバント複合体を使用しない場合には適切なアジュバントを添加するステップ
を含む、ワクチン組成物の調製方法。
【請求項２９】
前記リポソーム封入抗原を凍結乾燥する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アジュバントを添加する前に抗原をアジュバント無しでリポソームに封入し、該アジュバントを添加した後に該リポソーム封入抗原を凍結乾燥させて、アジュバントを外側に有する凍結乾燥リポソーム封入抗原を形成する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アジュバントを、リポソーム封入抗原に添加する前に、発熱物質を含まない水に添加する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アジュバントを外側に有する凍結乾燥リポソーム封入抗原を担体と混合し、水性媒体を該担体と混合して、疎水性物質中水型エマルジョンを形成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
次いで、前記アジュバントを外側に有する凍結乾燥リポソーム封入抗原を、担体と混合する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記リポソーム封入抗原が抗原／アジュバント複合体を含むものであり、前記凍結乾燥リポソーム封入抗原を担体と混合し、水性媒体を担体と混合して疎水性物質中水型エマルジョンを形成する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
（ｉ）前記リポソーム封入抗原を、前記担体と混合する前に水性媒体と混合し；
（ｉｉ）該担体を該リポソーム封入抗原と混合する前に、前記アジュバントを該担体に添加し；および
（ｉｉｉ）該担体を該リポソーム封入抗原と混合して、疎水性物質中水型エマルジョンを形成する、
請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
（ｉ）前記リポソーム封入抗原が抗原／アジュバント複合体を含むものであり；
（ｉｉ）該リポソーム封入抗原を、前記担体と混合する前に、水性媒体と混合し；および
（ｉｉｉ）該リポソーム封入抗原を該担体と混合して、疎水性物質中水型エマルジョンを形成する、
請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記疎水性物質が液体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記液体が油である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記油が鉱油である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記アジュバントがミョウバンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗原が、透明帯、アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｂ型肝炎、またはストレプトキナーゼである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記アジュバントがミョウバンであり、前記担体が油または油中水型エマルジョンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記油が鉱油である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年１１月７日に出願された米国特許仮出願ＵＳＳＮ６０／２４６，０７５号、および２００１年７月２４日に出願された同ＵＳＳＮ６０／３０７，１５９号（これらの開示は全体的に参照により本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、免疫学の分野、特にワクチンおよびその調製に関する。
【０００３】
発明の背景
一般的に、ワクチンは少ない用量の特異的抗原を使用して、それよりも多い用量の抗原または同様の抗原化合物の効果を意図して、宿主において耐性を構築する。ワクチンに使用される抗原は、通常、抗体産生を誘導する、生物全体の一部または変性毒素（トキソイド）である。残念ながら、産生される抗体の一部しか、標的生物または毒素に結合しない。なぜなら、ほとんどの場合、ワクチンで使用される抗原は、標的と構造的に異なるからである。有用な抗原の利用可能性が限られていることから、過去のワクチン開発には限界があった。遺伝子操作の進歩により、組換え手段による抗原産生が可能になった。しかし、組換え手段により産生される抗原を使用しても、上記理由のために標的天然型抗原に対する親和性が乏しい抗体が低い量でしか産生されないことが多い。免疫化の効果は、標的に対して高い親和性を有する抗体がより多く産生された場合に、増強できる。当該技術では、ワクチン中で使用する抗原の量を増やすことなく、増強された免疫応答を生成するワクチンを開発する必要がある。特に、二次免疫化の必要を無くすかまたは軽減する単回投与ワクチンが必要とされている。
【０００４】
多くの免疫化戦略が、このような開発により恩恵を受けると思われる。哺乳動物、ウイルス、細菌、菌類または酵母由来源から誘導される抗原を使用するワクチンは、多くの用途を有する。例えば、ウイルス、細菌、菌類または酵母由来源由来の抗原は、疾患の予防のために有用である。哺乳動物由来の抗原は、癌治療または免疫避妊（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ）において使用され得る。免疫避妊ワクチンは、卵母細胞表面に対して親和性を有する抗原の産生を援助することで、宿主（特に哺乳動物宿主）の一過的な不妊症または不稔症をもたらす哺乳動物誘導型抗原を使用する。免疫避妊ワクチンは、野生動物の頭数（ネコなどの野生化した家畜の頭数を含む）を制御するために有用である。
【０００５】
特に、野生化ネコの頭数は、制御することが難しく、多くの鳥や小動物が脅かされてきた。野生化した野良ネコはまた、ヒトおよび動物疾患のベクターとしても作用する。狩猟、捕獲および毒殺等の様々な方法が、野良ネコの頭数を制御するために使用されてきたが、これらの方法は、大した成果も無く、社会の反対を受けている。過去２０年間で、野生化ネコの頭数を減らすために、野生化したネコの避妊手術が人道的な手段としてますます採用されている。この処置は広く容認されている；しかし、不利な点としては、費用、習性（ｂｅｈａｖｉｏｒ）の変化、ならびに感染および死亡の危険性が挙げられる。大規模な避妊手術が成功したにも関わらず、このようなプログラムは、多くの場所において経済的または論理的に実行可能ではない。なぜなら、動物の捕獲は時間がかかり、難しく、動物にとってもストレスになるからである。免疫避妊は、より費用が低く施行が簡単な代替的な処置を提供する。しかし、長期免疫避妊は、一般的に、二次ワクチン接種を必要とし、野生化し、自由に徘徊する種を制御するには実用的ではない。
【０００６】
ワクチンは、通常、宿主において免疫応答を引き出す抗原、ならびに抗原を宿主に投与するのに有用な担体、賦形剤およびアジュバントを含む。
【０００７】
抗原を封入するリポソームが徐々にワクチン送達に使用されてきている。変性抗原のリポソーム送達が、天然型エピトープを認識する抗体の産生を援助することが示されている（Ｍｕｔｔｉｌａｉｎｅｎ， Ｓ．， Ｉ． Ｉｄａｎｐａａｎ−Ｈｅｉｋｋｉｌａ， Ｅ． Ｗａｈｌｓｔｒｏｍ， Ｍ． Ｎｕｒｍｉｎｅｎ， Ｐ．Ｈ． ＭａｋｅｌａおよびＭ． Ｓａｒｖａｓ． １９９５． ”Ｔｈｅ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ１ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｉｎｔｏ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｎａｔｉｖｅ Ｐ１ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．” Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎ． １８：４２３−４３６）。リポソームは有用なワクチン送達ビヒクルであるが、単独での使用により（特に免疫避妊ワクチンに関して）有効な単回用量ワクチンは提供されていない。
【０００８】
ほとんどの免疫避妊ワクチンは、多数回注射において、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、次いでフロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）を使用して、十分な抗体が免疫避妊効果を有するように産生されるのを助ける（Ｉｖａｎｏｖａら， １９９５． ”Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ ｉｎ ｃａｔｓ．” Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ． ４３：９６９−９８１およびＳａｃｃｏら， １９８９． ”Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖａｒｙｉｎｇ ｄｏｓａｇｅ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｓｑｕｉｒｒｅｌ ｍｏｎｋｅｙｓ （Ｓａｉｍｉｒｉ ｓｃｉｕｒｅｕｓ） ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ Ｍｒ ＝ ５５，０００ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ （ＺＰ３）．” Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：１−８を参照）。Ｒｉｂｉ（商標）およびＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）等の他のアジュバントは、一部の研究者らに使用されてきた。ミョウバン（ａｌｕｍ）（リン酸アルミニウムおよび／または水酸化アルミニウム）は、アジュバントとして長い間使用されてきた。ミョウバンは、食品医薬品局により安全であると認められた唯一のアジュバントである。ミョウバンを使用する多くの免疫避妊ワクチンは、免疫避妊効果のために十分な抗体を産生するために一次注射および数回の二次注射を必要とする（Ｂａｇａｖａｎｔら， １９９４． ”Ａｎｔｉｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ−３ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｐｅｒｍｉｓｓｉｂｌｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ ｆｅｍａｌｅ ｂｏｎｎｅｔ ｍｏｎｋｅｙｓ （Ｍａｃａｃａ ｒａｄｉａｔａ）： ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ， ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．” Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． １０２：１７−２５を参照）。一部の研究は、ミョウバンが、透明帯免疫避妊ワクチンに適したアジュバントではないことを示している（Ｓａｃｃｏら， １９８９． Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：１−８、およびＢａｇａｖａｎｔら， １９９４． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． １０２：１７−２５を参照）。
【０００９】
従来技術は、全般的に、担体として、水性媒体、または水中油型エマルジョンの使用に依存してきた。例えば、Ｍｕｔｔｉｌａｉｎｅｎら（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎ． １８：４２３−４３６（１９９５））は、水性媒体をリポソーム送達と組み合わせて使用して、免疫応答を引き出す。Ｐｏｐｅｓｃｕ（１９９９年４月２７日に発行された米国特許第５，８９７，８７３号および２０００年７月１８日に発行された同第６，０９０，４０６号）、Ａｌｖｉｎｇ（２０００年７月２５日に発行された米国特許第６，０９３，４０６号および２０００年８月２９日に発行された同第６，１１０，４９２号）、ならびにＭｕｄｅｒｈｗａら（”Ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”， （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ， １９９９） Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ． ８８ （１２）：１３３２−９）も、ワクチン中で、リポソーム系を、送達系としての水中油型担体と共に使用する。Ｐｏｐｅｓｃｕは、コハク酸塩または他の有機酸でエステル化されたコレステロールからなるリポソームと共に、ミョウバンを使用する。米国特許第６，０９３，４０６号は、ミョウバン、および水中油型エマルジョンに入ったリピドＡまたは非発熱リピドＡを含むリポソームを使用して、マラリア抗原に基づくワクチンを送達することを教示している。米国特許第６，１１０，４９２号およびＭｕｄｅｒｈｗａは、水中油型エマルジョンに入ったリピドＡまたは非発熱リピドＡを含むリポソームを使用して、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）特異的抗原を送達することを教示する。
【００１０】
１９９８年４月７日に発行された共同所有の米国特許第５，７３６，１４１号は、透明帯抗原から誘導される、アザラシ用の単回用量免疫避妊ワクチンを教示する。このワクチンから得られる結果は良好であるが、食品医薬局が承認したアジュバントを用いた、様々な種において有効な、単回用量の長時間効果のある免疫避妊ワクチンが今も必要とされている。
【００１１】
また、食品医薬局が承認したアジュバントを用いて、様々な抗原を様々な種において使用することで、有効な、長期間効果のある免疫ワクチンの必要も概してある。
【００１２】
発明の要旨
本発明によれば、
（ａ）疎水性物質の連続相を含む担体；
（ｂ）リポソーム；
（ｃ）抗原；および
（ｄ）適切なアジュバント
を含有する、ワクチンとして使用するための組成物が提供される。
【００１３】
さらに、（ａ）疎水性物質の連続相を含む担体；
（ｂ）リポソーム；
（ｃ）抗原；および
（ｄ）適切なアジュバント
を含有する有効量のワクチン組成物を動物に投与することを含む、動物における免疫応答を増強する方法が提供される。
【００１４】
さらに、
（ａ）抗原または抗原／アジュバント複合体をリポソームに封入して、リポソーム封入抗原を形成するステップ；
（ｂ）該リポソーム封入抗原を、疎水性物質の連続相を含む担体と混合するステップ；および
（ｃ）（ａ）において抗原／アジュバント複合体を使用しない場合には適切なアジュバントを添加するステップ
を含む、ワクチン組成物の調製方法が提供される。
【００１５】
予想外に、またこれまでになく、疎水性物質の連続相を、本発明のワクチン組成物の担体として用いることで、免疫応答が増強されることが分かった。増強された応答は、単回ワクチン投与後に永続する高い抗体力価の特徴を有し、免疫応答の持続期間を向上させる。これは、リポソーム封入抗原およびアジュバント（または抗原／アジュバントの混合物）も含有するワクチンに関して特に当てはまる。本発明のワクチン組成物は、様々な種において長期免疫応答を提供する単回用量（典型的に二次免疫を必要としない）として全般的に有効である。
【００１６】
発明の詳細な説明
特定の作用理論にとらわれるわけではないが、本発明のワクチン組成物が使用される場合、ＩｇＧ抗体産生が２期で生じ、各期で産生される抗体は、それらのエピトープ認識が異なる。ＩｇＧ産生の第２期で産生された抗体は、天然型タンパク質抗原に対してより親和性を有し、つまりワクチンをより有効にする。一次および二次注射による従来のワクチンを使用する場合、本発明のワクチン組成物を使用する場合と異なる結合特異性を抗原に対して有する抗体が産生される。
【００１７】
担体は、疎水性物質（好ましくは液体疎水性物質）の連続相を有する。連続相は、本質的に純粋な疎水性物質、疎水性物質の混合液、疎水性物質中水型エマルジョン、または疎水性物質混合液中水型エマルジョンであり得る。
【００１８】
本発明において有用な疎水性物質は、製薬的および／または免疫学的に許容可能なものである。理想的には、疎水性物質は、米国食品医薬局などの保健規制機関により使用が認可されたものである。担体は、液体であることが好ましいが、大気温度において液体でない特定の疎水性物質を（例えば加温により）液化してもよく、これも本発明において有用である。
【００１９】
油または油中水型エマルジョンは、本発明における使用に特に適した担体である。油は、製薬的および／または免疫学的に許容可能でなければならない。油の好ましい例は、鉱油（特に、軽いまたは低い粘性の鉱油）、植物油（例えば、トウモロコシまたはカノーラ油）、木の実の油（例えば、ピーナッツ油）およびスクアレンである。低粘性鉱油が最も好ましい。動物脂肪および人工疎水性高分子物質（特に、大気温度にて液体であるか、または比較的簡単に液化できるもの）も使用できる。
【００２０】
使用する疎水性物質の量は、重要ではないが、典型的に、動物の大きさおよび使用する抗原の量に応じて、１用量につき約０．ｌ ｍｌ〜約１．５ ｍｌである。小動物については、疎水性物質の量は、１用量につき約０．２０ ｍｌ〜約１．０ ｍｌであることが好ましく、大動物については、量は、１用量につき約０．４５ ｍｌ〜約１．５ ｍｌであることが好ましい。典型的に、小動物には１用量につき０．２５ ｍｌが使用され、大動物には１用量につき０．５ ｍｌが使用される。
【００２１】
適切な抗原は、宿主生物において免疫応答を生成可能な任意の化学物質である。抗原は、宿主生物において所望の免疫応答を生成可能な、適切な天然型、非天然型、組換えもしくは変性タンパク質もしくはペプチド、またはそれらの断片であることが好ましい。宿主生物は、好ましくは動物（哺乳動物を含む）であり、より好ましくはネコ、ウサギ、ウマおよび／またはシカである。抗原は、ウイルス、細菌、原生動物または哺乳動物由来源のものであり得る。抗原は、宿主生物において免疫応答を引き出すことが可能な任意の化学物質（典型的にタンパク質または他のペプチド）であることが一般的に知られている。より具体的には、抗原が宿主生物に導入された場合、Ｂ細胞上の抗体に結合し、宿主により多くの抗体を産生させる。抗原および免疫応答の一般的な議論については、Ｋｕｂｙ， Ｊ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３ｒｄ Ｅｄ． Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃ． ＮＹ （１９９７）を参照のこと（その開示は全体的に参照により本明細書に援用される）。
【００２２】
癌、避妊および他の生物学的症状に関連する免疫応答を引き出す抗原を、免疫ワクチンの調製に使用し得る。使用できる抗原の一部の典型的な限定しない例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ストレプトキナーゼ、Ｂ型肝炎表面抗原、および透明帯（ＺＰ）糖タンパク質が挙げられる。
【００２３】
所望の免疫応答が、哺乳動物における避妊である場合、標的エピトープは、哺乳動物卵母細胞上で見とめられる。この場合には、透明帯（ＺＰ）糖タンパク質もしくは組換えタンパク質、またはそれから誘導されるペプチド断片を使用してもよい。特に、熱抽出可溶化単離透明帯糖タンパク質（ＳＩＺＰ）を、免疫避妊ワクチン中の抗原として使用してもよい。より具体的には、可溶性無傷ブタ透明帯を使用してもよい。
【００２４】
１用量のワクチン組成物において使用される抗原の量は、抗原の種類および宿主の大きさに応じて変化し得る。当業者は、過度な実験を必要とせずに、特定の用途に使用するための抗原の有効量を決定できるであろう。
【００２５】
ＳＩＺＰの場合、典型的に使用される量は、１用量につき約１５μｇ〜約２ ｍｇの範囲にある。好ましくは１用量につき約２０μｇ〜約２ ｍｇの範囲、より好ましくは約２０μｇ〜約２００μｇ、およびさらにより好ましくは約４０μｇ〜約１２０μｇである。典型的に、小動物用の量は、１用量につき約５０μｇであり、大動物については１用量につき約１００μｇである。
【００２６】
本発明の組成物では、抗原は、標的タンパク質の天然型エピトープに結合する宿主抗体のレベルを増強する。これは、抗原が非天然型、組換えもしくは変性タンパク質もしくはペプチド、またはそれらの断片である場合でも同じである。任意の特定の理論にとらわれることを望まないが、これは、リポソーム中の天然型様三次元コンホメーションにおいて抗原が保持されるためかもしれない。
【００２７】
リポソームは、トラップされた水性容量を含む完全に閉じられた脂質二層膜である。リポソームは、（単一の二層膜を有する）単膜小胞、または多重膜小胞（水性層により隣と隔たれている多膜二重層を特徴とするタマネギ様構造）であり得る。リポソームの一般的な議論は、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ． （１９９０） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １１：８９−９７およびＦｒｅｚａｒｄ， Ｆ． （１９９９） Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ｆｒｏｍ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｂｒａｚ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏ． Ｒｅｓ ３２：１８１−１８９（この開示は参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００２８】
古細菌脂質からなるリポソームを含む任意のリポソームが本発明において使用され得るが、特に有用なリポソームは、リポソーム製剤にリン脂質および非エステル化コレステロールを入れて使用する。コレステロールはリポソームを安定化させるために使用され、リポソームを安定化させる任意の他の化合物をコレステロールと置き換えてもよい。他のリポソーム安定化化合物は当業者に公知である。特に好適なリポソームを使用することで、抗原とリポソームとの静電的会合を限定し得る。その結果、ほとんどの抗原がリポソームの内部に隔絶され得る。
【００２９】
リポソームの調製に使用されることが好ましいリン脂質は、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリンおよびホスホイノシトールからなる群より選択される少なくとも１つの頭部基を有するものである。より好ましいのは、ホスホリポン（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ）９０Ｇ中の脂質を含むリポソームである。
【００３０】
リポソームを形成するために使用する脂質の量は、使用する抗原に依存するが、典型的に、１ワクチン用量につき約０．０５グラム〜０．５グラムの範囲にある。１用量につき約０．１グラムの量であることが好ましい。非エステル化コレステロールもリポソーム製剤に使用する場合、コレステロールは脂質の量の約１０％と等しい量で使用される。コレステロールの好ましい量は、１ワクチン用量につき約０．０１グラムである。コレステロール以外の化合物を使用して、リポソームを安定化させる場合、当業者は、製剤中で必要な量を容易に決定できる。
【００３１】
より好適な態様では、本発明のワクチン組成物は、リピドＡ（非発熱リピドＡを含む）を本質的に含まない。本明細書の目的において、リピドＡという用語が使用された場合、非発熱リピドＡも含まれることが理解される。リピドＡは、従来技術のリポソーム製剤において見とめられることが多い。リピドＡは、多くの望ましくない副作用を有し、これは、非発熱リピドＡを使用して克服され得るが、それでも、リピドＡは、発熱性のもの以外でも多くの製薬反応を有し、多くの不都合な反応を生じ得る。従って、本発明の組成物からリピドＡを除くことが望ましい。
【００３２】
適切なアジュバントは、ミョウバン、他のアルミニウム化合物、カルメット‐ゲラン杆菌（ＢＣＧ）、ＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）、Ｒｉｂｉ（商標）、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、およびヨーネ（Ｊｏｈｎｅ）抗原に基づく、米国農務省（ＵＳＤＡ）の野生動物研究センターがそのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｈｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｗｓ／ｎｗｒｃ／ｐｚｐ．ｈｔｍ．）で開示する新しいアジュバントである。ミョウバン、他のアルミニウム化合物、ＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）および新しいＵＳＤＡアジュバントが好ましい。増強した免疫応答は、アジュバントがミョウバンの場合でも見とめられ、これは従来技術を考慮すると驚くべきことである（Ｓａｃｃｏら １９８９． Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２１：１−８）。ミョウバンは、特にアジュバントとして好ましい。
【００３３】
一般的に、ミョウバンは、任意のアルミニウム塩、特に、無機酸の塩であると考えられる。水酸化塩およびリン酸塩は、アジュバントとして特に有用である。適切なミョウバンアジュバントは、水酸化アルミニウム（４５ ｍｇ／ｍｌ）および水酸化マグネシウム（４０ ｍｇ／ｍｌ）の水溶液、ならびに不活性安定剤からなるＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）の商標名で売られている。ミョウバンは、規制承認を受けており、当該分野で広く認められていることから、特に都合の良いアジュバントである。
【００３４】
使用するアジュバントの量は、抗原の量およびアジュバントの種類による。当業者は、特定の用途において必要なアジュバントの量を容易に決定できる。免疫避妊の場合、ウサギのために適したＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）の量は０．１ ｍｌ／ワクチン用量であり、ウマのために適したＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）の量は０．５ ｍｌ／用量である。
【００３５】
ワクチン組成物は、一般的に、抗原または抗原／アジュバント複合体をリポソームに封入して、リポソーム封入抗原を形成し、該リポソーム封入抗原を、疎水性物質の連続相を含む担体と混合することにより製剤化される。抗原／アジュバント複合体を第１のステップで使用しない場合、適切なアジュバントを、リポソーム封入抗原に、リポソーム封入抗原および担体の混合物に、または担体をリポソーム封入抗原と混合する前に担体に、加えてもよい。プロセスの順番は、使用するアジュバントの種類による。典型的に、ミョウバンのようなアジュバントを使用する場合、アジュバントおよび抗原を混合してまず抗原／アジュバント複合体を形成し、その後、抗原／アジュバント複合体をリポソームで封入する。次いで、得られたリポソーム封入抗原を、担体と混合する。（「リポソーム封入抗原」という用語は、内容に応じて、単独の抗原の封入または抗原／アジュバント複合体の封入を指し得ることを付記しておく）。これにより、アジュバントと抗原との密接な接触を促し、ミョウバンがアジュバントとして使用される場合には、少なくとも部分的に、驚くほど良好な免疫応答を引き起こす。別のものが使用される場合、抗原は、リポソームに入れられてまず封入され、得られたリポソーム封入抗原を、疎水性物質においてアジュバントと混合する。
【００３６】
水を実質的に含まないワクチン組成物を製剤化するために、抗原または抗原／アジュバント複合体を、リポソームで封入し、疎水性物質と混合する。ワクチンを、疎水性物質中水型エマルジョンに製剤化する場合、抗原または抗原／アジュバント複合体を、水性媒体中でリポソームで封入し、その後水性媒体と疎水性物質とを混合する。エマルジョンの場合、疎水性物質を連続相として維持するために、リポソームを含む水性媒体を、アリコートとして添加し、疎水性物質と混合する。
【００３７】
全ての製剤化方法において、リポソーム封入抗原は、疎水性物質または水性媒体と混合する前に、場合によっては凍結乾燥されてもよい。場合によっては、抗原／アジュバント複合体は、リポソームで封入され、その後凍結乾燥されてもよい。別の場合では、抗原はリポソームで封入され、その後アジュバントを添加され、そして凍結乾燥されて、外側にアジュバントがある凍結乾燥リポソーム封入抗原を形成してもよい。さらに別の例では、抗原はリポソームで封入され、その後アジュバントを添加する前に凍結乾燥されてもよい。凍結乾燥は、アジュバントと抗原との良好な相互作用を促し、より効果的なワクチンをもたらし得る。
【００３８】
リポソーム封入抗原を疎水性物質に入れて製剤化する場合も、乳化剤を使用して、疎水性物質でのリポソームのより均一な分布を促すことを伴う。典型的な乳化剤は、当該分野で周知であり、オレイン酸マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ ｏｌｅａｔｅ）（Ａｒｌａｃｅｌ（商標）Ａ）、レシチン、Ｔｗｅｅｎ（商標） ８０、Ｓｐａｎｓ（商標） ２０、８０、８３および８５が挙げられる。オレイン酸マンニドは、好ましい乳化剤である。乳化剤は、リポソームの均一な分布を促するのに有効な量で使用される。典型的に、疎水性物質対乳化剤の容量比（ｖ／ｖ）は、約５：１〜約１５：１の範囲にあり、約１０：１の比が好ましい。
【００３９】
ワクチン組成物の投与は、任意の都合の良い方法により実施でき、使用する抗原による。ワクチン組成物は、非経口（筋内、皮下投与を含む）、または直腸投与され得る。非経口投与が好ましい。
【００４０】
非経口用途のために、特に都合の良い単位投薬量形態は、アンプルである。注射および遠隔送達（ダーツ、注射付き棒（ｊａｂ ｓｔｉｃｋｓ）を有するバネ充填シリンジ、空気／二酸化炭素推進ライフル、ウェスタ銃（Ｗｅｓｔｅｒ ｇｕｎ）および／またはＢａｌｌｉｓｔｉｖｅｔ（商標）生物弾を使用）によりワクチンを送達し、かつ生物学的活性を保持する技術が特に好ましい。
【００４１】
宿主に投与されるワクチン組成物の量は、用量中で使用される抗原の量、および特定の用途のために必要とされる抗原の有効量に応じる。ＳＩＺＰの場合、動物に投与される各用量の大きさは、動物の大きさに応じて、典型的に約０．２５ ｍｌ〜約２．０ ｍｌである。より小さい動物（例えば、ネコ、ウサギ等）のためには、用量の大きさは典型的に約０．５ ｍｌであり、より大きい動物（例えば、ウマ、ファロージカ、オジロジカ等）のためには、用量の大きさは典型的に約１．０ ｍｌである。典型的に、ＳＩＺＰの量が多様であっても、用量の大きさは適正に一定にされている。
【００４２】
以下、本発明を、限定しない実施例により、添付の図面を参照しながら説明する。
【００４３】
実施例
実施例１：ワクチン組成物の調製
ワクチン組成物は、水を含まないか、または様々な量の水を含むように（水性媒体、例えば、食塩水、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）もしくは非発熱物質含有水を用いて）、かつ連続油相を保ちながら製剤化できる。以下に記載する処置１は、ワクチン組成物の水を含まない製剤化に当てはまる。以下に記載する処置２は、ワクチン組成物の水含有製剤化（すなわち、油中水型エマルジョン）に当てはまる。２つの処置は、使用するアジュバントに応じて変化し得る。例として、方法Ａは、ミョウバンを含むワクチン組成物の製剤化に当てはまり、方法Ｂは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を含む製剤に当てはまる。方法Ａまたは方法Ｂのいずれかを採りいれることにより、他のアジュバントを適応してもよい。以下に記載する処置は、ブタ可溶性無傷透明帯（ＳＩＺＰ）を抗原として取り入れるが、製剤化において他の抗原にＳＩＺＰを置き換えてもよい。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、ストレプトキナーゼまたはＢ型肝炎表面抗原も抗原として使用できる。
【００４４】
処置１：水を含まない製剤
方法Ａ．ミョウバンアジュバント
ＳＩＺＰを先に記載されているように調製する（Ｂｒｏｗｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｗ．Ｄ． Ｂｏｗｅｎ， Ｊ．Ｄ． Ｅｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｗ．Ｃ．Ｋｉｍｍｉｎｓ， Ｍ． Ｍｅｚｅｉ， Ｊ．Ｌ． Ｐａｒｓｏｎｓ， Ｂ． Ｐｏｈａｊｄａｋ． （１９９７） Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｔｒｅａｎｄｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｐｔｉｖｅ ｇｒｅｙ ｓｅａｌｓ， ｈａｒｐ ａｎｄ ｈｏｏｄｅｄ ｓｅａｌｓ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５：５３−６４）。調製するワクチンの用量数に必要なＳＩＺＰの量を量る（免疫化のために使用するＳＩＺＰの通常の量は、小動物については５０μｇ、そして大動物については１００μｇである）。ＳＩＺＰを、非発熱物質含有蒸留水に溶解し、２ ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。等容量のＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， カタログ番号７７１６１のミョウバン製品）を添加し、懸濁液を混合し、凍結乾燥させる。
【００４５】
リポソームを形成するために、ホスホリポン９０Ｇ（または、トラップされた抗原を含む閉じた脂質二層を形成する、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリン、ホスホイノシトール、古細菌脂質（これらに限定されない）から選択される他の脂質）を量る（０．１ ｇ／ワクチン組成物用量）。ホスホリポン９０Ｇをコレステロール（０．０１ ｇ／ワクチン組成物用量）と混合し、混合物をクロロホルム：メタノール（１／１；ｖ／ｖ；１．５／ワクチン組成物用量）に溶解させる。コレステロールは、当業者に決定される濃度にてリポソームを安定化させる他の化合物と置き換えられる。洗浄したガラスビーズ（直径約３ ｍｍ；１０ワクチン用量について１５ ｍｌ）を添加し、ロータリー・エバポレーターを用いて、減圧下で、クロロホルム：メタノールが無くなるまで混合液を蒸発させる。全てのクロロホルム：メタノールの除去を確実にするために、混合液を、減圧下で一晩室温にてデシケーターに入れる。
【００４６】
凍結乾燥させたＳＩＺＰ／ミョウバン複合体を、非発熱物質含有蒸留水（５ ｍｌ／ｍｇ ＳＩＺＰ）に懸濁させ、該懸濁液を、フラスコを被覆するホスホリポン９０Ｇ／コレステロールおよびガラスビーズの混合物を含むフラスコに添加する。フラスコの内容物を攪拌すること無く３０分間静置させる。３０分後、フラスコを、３５〜４０℃の水浴に入れ、スパチュラで緩やかにかき混ぜて、リポソームを形成する。顕微鏡を使用して、リポソーム形成を評価し、振とうを大きくして、混合物が、多層リポソームを主に含むと当業者が見とめるまでかき混ぜ続けた。リポソームを凍結乾燥させ、得られた凍結乾燥リポソームを、オレイン酸マンニドを乳化剤として含む低粘性鉱油（１０：１：油：乳化剤：ｖ／ｖ）に懸濁させた（小動物には０．２５ ｍｌ油／用量、大動物には０．５ ｍｌ油／用量）。リポソームは溶液ではなく油に懸濁させるので、使用する処置が、各用量においてＳＩＺＰの均一な分布を生じるか否かを決定する必要がある。ＳＩＺＰを含む凍結乾燥リポソームが油中で均等に分布されているか否かを決定するために、還元的メチル化によりＳＩＺＰを１４Ｃで標識化し（Ｊｅｎｔｏｆｔ， Ｎ．およびＤ．Ｇ．Ｄｅａｒｂｏｒｎ． １９７９． Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５４：４３５９−４３６５、この開示は参照により全体的に本明細書に援用される）、放射能ＳＩＺＰを使用して、２つのワクチン調製物を調製した。ワクチンの個別の用量を調製し、各用量中の放射能を決定して、各ワクチン用量中のＳＩＺＰの内容量を決定した（表１）。各用量中のＳＩＺＰの分布は、高度に再現可能である（標準偏差（ＳＤ）は＋／− １０％未満であった）。
【００４７】
【表１】
2004512384.tif 000002
方法Ｂ．ＦＣＡアジュバント
ミョウバンの代わりにＦＣＡをアジュバントとして含むようにワクチン組成物を調製することは、ＳＩＺＰ／ミョウバン複合体としてではなく、ＳＩＺＰ自体が上述したようにリポソームに封入されること以外は、方法Ａと同様である。ＳＩＺＰを含むリポソームを凍結乾燥させ、凍結乾燥させたリポソームをアリコートとしてＦＣＡに添加し、混合して、油中でのリポソームの均等な分布を促す。その結果得られた、ＦＣＡにＳＩＺＰを含む凍結乾燥リポソームの懸濁液を、ワクチン化される動物に投与する。
【００４８】
処置２．水含有製剤
方法Ａ．ミョウバンアジュバント
ＳＩＺＰを先に記載されているように調製する（Ｂｒｏｗｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｗ．Ｄ． Ｂｏｗｅｎ， Ｊ．Ｄ． Ｅｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｗ．Ｃ．Ｋｉｍｍｉｎｓ， Ｍ． Ｍｅｚｅｉ， Ｊ．Ｌ． Ｐａｒｓｏｎｓ， Ｂ． Ｐｏｈａｊｄａｋ． （１９９７） Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｐｔｉｖｅ ｇｒｅｙ ｓｅａｌｓ， ｈａｒｐ ａｎｄ ｈｏｏｄｅｄ ｓｅａｌｓ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５：５３−６４、この開示は参照により本明細書に援用する）。調製するワクチンの用量数に必要なＳＩＺＰの量を量る（免疫化のために使用するＳＩＺＰの通常の量は、小動物については５０μｇ、そして大動物については１００μｇである）。ＳＩＺＰを、非発熱物質含有蒸留水に溶解し、２ ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。等容量のＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， カタログ番号７７１６１のミョウバン製品）を添加し、懸濁液を混合し、そして凍結乾燥させる。
【００４９】
リポソームを形成するために、ホスホリポン９０Ｇ（または、トラップされた水性容量を含む閉じた脂質二層を形成する、ホスホグリセロール、ホスホエタノールアミン、ホスホセリン、ホスホコリン、ホスホイノシトール等から選択される他の脂質）を量る（０．１ ｇ／ワクチン組成物用量）。ホスホリポン９０Ｇをコレステロール（０．０１ ｇ／ワクチン組成物用量）と混合し、混合物をクロロホルム：メタノール（１／１；ｖ／ｖ；１．５／ワクチン組成物用量）に溶解させる。コレステロールは、当業者が決定した濃度にてリポソームを安定化させる他の化合物と置き換えられる。洗浄したガラスビーズ（直径約３ ｍｍ；１０ワクチン用量のために１５ ｍｌ）を添加し、ロータリー・エバポレーターを用いて、減圧下で、クロロホルム：メタノールが無くなるまで混合液を蒸発させる。全てのクロロホルム：メタノールの除去を確実にするために、混合液を、減圧下で一晩室温にてデシケーターに入れる。
【００５０】
凍結乾燥させたＳＩＺＰ／ミョウバン複合体を、食塩水（５ ｍｌ／ｍｇ ＳＩＺＰ）に懸濁させ、該懸濁液を、フラスコを被覆するホスホリポン９０Ｇ／コレステロールおよびガラスビーズの混合物を含むフラスコに添加する。フラスコの内容物を攪拌すること無く３０分間静置させる。３０分後、フラスコを、３５〜４０℃の水浴に入れ、スパチュラで緩やかにかき混ぜて、リポソームを形成する。顕微鏡を使用して、リポソーム形成を評価し、振とうを大きくして、多層リポソームを主に含む混合物を当業者が見とめるまでかき混ぜ続けた。リポソームの水性懸濁液（小動物には０．２５ ｍｌ油／用量、大動物には０．５ ｍｌ油／用量）を、オレイン酸マンニドを乳化剤として含む低粘性鉱油（１０：１：油：乳化剤：ｖ／ｖ）に添加した（小動物には０．２５ ｍｌ油／用量、大動物には０．５ ｍｌ油／用量）。リポソームの水性懸濁液を、アリコートとして低鉱油相に添加して、アリコート間で混合して、連続油相を維持する。
【００５１】
方法Ｂ．ＦＣＡアジュバント
ミョウバンの代わりにＦＣＡをアジュバントとして含むようにワクチン組成物を調製することは、ＳＩＺＰ／ミョウバン複合体としてではなく、ＳＩＺＰ自体が上述したようにリポソームに封入されること以外は、方法Ａと同様である。リポソームの水性懸濁液をアリコートとしてＦＣＡに添加し、アリコート間で混合して、連続油相を維持する。その結果得られた、ＦＣＡにＳＩＺＰを含むリポソームの水性懸濁液を、ワクチン化される動物に投与する。
【００５２】
付記：一部の治験において、ＳＩＺＰの量を変えて、異なる量の抗原に対する免疫化動物の応答を調査した。このような実験では、小動物（ネコ、ウサギ等）に投与したワクチンの容量は０．５ ｍｌで、大動物（ウマ、ファロージカ、オジロジカ等）に投与した容量は１．０ ｍｌであった。このような場合、各ワクチン用量中のリポソームの量は一定に維持され、リポソーム中に封入される抗原の量を変える。
【００５３】
実施例２：天然型および変性型酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）に対するウサギの免疫化
ワクチン組成物は、単回投与後長時間持続する高い力価の抗ＳＩＺＰ抗体を産生する点で他とは異なる。ワクチン組成物が、他の抗原（特に細胞膜に結合していないタンパク質）で高い抗体力価を産生するか否かを決定するために、ウサギを酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）で免疫化する。２つの形態のＡＤＨ（すなわち、天然型ＡＤＨ、およびタンパク質を変性するように処理されたＡＤＨ）を抗原として使用する。ＡＤＨを変性するために、ＡＤＨをメルカプトエタノール（Ｔｒｉｓ緩衝液中１０％ ｖ／ｖ、０．１ Ｍ（ｐＨ ７．５）、３０分、１００℃）で処置する。溶液を蒸留水に透析し、凍結乾燥させた。４匹のウサギ（各処置に２匹）を、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）での一次注射、その１ヵ月後のフロイント不完全アジュバントでの二次注射により、野生型または変性型ＡＤＨ（４０μｇ）で免疫化する。免疫化後期間は、二次免疫注射後から開始すると考える。二次免疫注射を投与するのと同時に４匹のウサギ（各処置につき２匹）を、ワクチン組成物を用いた天然型または変性型ＡＤＨ（４０μｇ）のいずれかでの単回の投与により免疫化する（つまり、ＡＤＨは、食塩水（０．５ ｍｌ）に懸濁され、ＦＣＡ（０．５ ｍｌ）に乳化されたリポソームに封入される）。抗ＡＤＨ力価を、天然型および変性型ＡＤＨの両方を用いてＥＬＩＳＡで測定する（表２）。
【００５４】
ウサギを天然型ＡＤＨで免疫化した場合、得られた血清は、ワクチン組成物と共に天然型ＡＤＨを送達した場合、または一次注射を一次免疫化に使用した場合と同量の抗ＡＤＨ抗体を含んでいた。対照的に、ワクチン組成物で送達された変性型ＡＤＨで免疫化されたウサギ由来の血清は、一次注射および１回の二次免疫により変性型ＡＤＨで免疫化されたウサギ由来の血清よりも、天然型ＡＤＨに結合する２．７倍の抗体を含む（Ｐ＜０．０１；Ｔ＝４．１４；ｄｆ＝６）。いずれの場合も、力価は、変性型ＡＤＨで免疫化されたウサギよりも、天然型ＡＤＨで免疫化されたウサギにおいて高い。これは、天然型ＡＤＨが、変性型ＡＤＨよりも良い抗原であることを示す。多くのタンパク質抗原は、抽出および単離の間、または組換え手段により産生される場合にある程度変性されているため、天然型タンパク質により良く結合する抗体がより多く産生されることで、本発明のワクチン組成物を使用したＳＩＺＰでの多様な哺乳動物の免疫避妊により実証されるワクチン化の結果が有意に改善される。
【００５５】
さらに、ウサギ２３７および２３８由来の抗ＡＤＨ血清は、ウサギ２３５および２３６由来の抗ＡＤＨ血清の強度の約４〜５倍でウェスタンブロットにおいて変性型ＡＤＨを認識する。これは、力価測定の結果を裏付け、ワクチン組成物によるウサギの免疫化が、天然型ＡＤＨにより良く結合する抗ＡＤＨ抗体の産生を支持することを示す。なぜなら、多くのタンパク質は、ウェスタンプロトコールの間に再折り畳みしてより天然型の状態になることが知られているからである。この結論は、髄膜炎菌外膜タンパク質Ｐ１の研究においてＭｕｔｔｉｌａｉｎｅｎら（１９９５）により支持されており、彼らは、天然Ｐ１に対する抗体が、リン脂質小胞（リポソーム）に入れられて構成された変性Ｐ１でワクチン化されたマウスにおいて引き出されたことを発見した。しかし、Ｍｕｔｔｉｌａｉｎｅｎら（１９９５）は、ワクチン製剤中で油を使用しなかった。従って、彼らの免疫化プロトコールは本発明と異なる。
【００５６】
【表２】
2004512384.tif 000003
実施例３：ウサギの免疫避妊
抗原（ブタＳＩＺＰ）以外のワクチン組成物の全成分を含むプラシーボワクチンで免疫化されたウサギ由来の血清は、抗ブタＳＩＺＰ抗体を含まない（表３Ａを参照）。ＦＣＡアジュバント（０．５ ｍｌ）に乳化された、ホスホリポン９０Ｇ（０．１ ｇ）、食塩水（０．５ ｍｌ）中コレステロール（０．０１ ｇ）を含むリポソームに封入されたブタＳＩＺＰ（４０μｇ）でのウサギの免疫化は、ワクチンの単回投与後の免疫化後１２ヶ月モニター期間の間に高い力価の抗ＳＩＺＰ抗体を産生する。ＭＦ ５９アジュバント（０．５ ｍｌ）と共にリポソームで封入されたブタＳＩＺＰ（４０μｇ）でのウサギの免疫化は、低い抗ＳＩＺＰ力価を産生する。対照的に、ミョウバンアジュバント（１００μｌ， Ｐｉｅｒｃｅ ＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標））とリポソームに封入されたブタＳＩＺＰウサギの免疫化は、免疫化後初期にＦＣＡを用いて産生される力価未満の抗ブタＳＩＺＰ力価を産生するが、力価は免疫化後１２ヶ月目にはミョウバンとＦＣＡ作用（ｒｕｎ）とは大差がない。ウサギの育種により、ＦＣＡまたはミョウバンを使用した単回のワクチン投与が、ウサギの受精率をそれぞれ７９および７４％低下させることを明らかにした（表３Ｂ）。ゲルブ（Ｇｅｒｂｕ）アジュバントと共にリポソームに封入されていないＳＩＺＰ（４０μｇ）の単回注射によるウサギの免疫化は、低い抗ブタＳＩＺＰ力価を生じる（表３Ａ）。抗ＳＩＺＰ力価に基づき予想されるように、ゲルブアジュバントと共にリポソームに封入されていないＳＩＺＰで免疫化されたウサギは、プラシーボワクチンを受けたウサギと同じ受精率を有する（表３Ｂ）。これらの結果は、リポソーム封入抗原を含むワクチンが良好な結果を生じ、ＦＣＡおよびミョウバン（特にミョウバン）が良いアジュバントであることを示す。
【００５７】
【表３】
2004512384.tif 000004
使用する参照血清は、フロイント完全アジュバントでの一次注射、およびフロイント不完全アジュバントでの２回の二次免疫注射を用いて、ブタ透明帯で免疫化されたウサギから得た。
【００５８】
【表４】
2004512384.tif 000005
実施例４：ネコにおける免疫避妊
２９匹の特定の無病原菌短毛家畜ネコを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａの特定の無病原菌施設で、Ｊｕｌｉｅ Ｌｅｖｙ博士およびＳｈａｗｎ Ｇｏｒｍａｎ氏の監視の下で収容する。毎日の観察および膣細胞診（ｖａｇｉｎａｌ ｃｙｔｏｌｏｇｙ）から発情周期をモニターする。本発明のワクチン組成物、プラシーボワクチン、および血清サンプルを、二重盲検調査の一環として符号化する。ネコをランダムに９〜１０匹ずつの３つのグループに分ける。１つのグループは、抗原（ブタＳＩＺＰ）以外のワクチン組成物の全成分を含むプラシーボワクチンを筋内注射により受ける。このグループのネコはそれぞれ、抗原を含まない食塩水（０．２５ ｍｌ）がＦＣＡ（０．２５ ｍｌ）に懸濁されたリポソームを受ける。第２グループの９匹のネコはそれぞれ、食塩水（０．２５ ｍｌ）中リポソームに封入され、ＦＣＡ（０．２５ ｍｌ）に懸濁されたＳＩＺＰ（１３５μｇ）を含むワクチン組成物で筋内注射により免疫化される。第３グループの９匹のネコはそれぞれ、食塩水（０．１２ ｍｌ）中のリポソームに封入され、適切な製薬担体に懸濁された、ミョウバン（０．１２ ｍｌ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， カタログ番号７７１６１）と共にブタＳＩＺＰ（２００μｇ）を含むワクチン組成物で筋内注射により免疫化される。ネコにおける抗ＳＩＺＰ抗体の産生は、プロテインＡ／アルカリホスファターゼを用いてＥＬＩＳＡにより測定される（Ｂｒｏｗｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｗ．Ｄ．Ｂｏｗｅｎ， Ｊ．Ｄ．Ｅｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｗ．Ｃ．Ｋｉｍｍｉｎｓ， Ｍ．Ｍｅｚｅｉ， Ｊ．Ｌ．Ｐａｒｓｏｎｓ， Ｂ．Ｐｏｈａｊｄａｋ． （１９９７） Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｐｔｉｖｅ ｇｒｅｙ ｓｅａｌｓ， ｈａｒｐ ａｎｄ ｈｏｏｄｅｄ ｓｅａｌｓ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５：５３−６４）。
【００５９】
ＦＣＡを用いたワクチン組成物の単回投与により、２ヶ月以内に最大力価に到達する抗ＳＩＺＰ抗体力価が生じる（表４）。免疫化後２ヶ月の平均力価は、参照血清の５８±２％で、これは、検査済みの（ｐｒｏｖｅｎ）オスネコをコロニーに導入した場合に、免疫化後４ヶ月で参照血清の４１±４％に低下した。ミョウバンをアジュバントとして用いたワクチン組成物の単回投与を受けるネコは、免疫後２ヶ月目に参照血清の平均力価６７±２％の抗ＳＩＺＰ抗体を産生する。
【００６０】
抗原以外のワクチン組成物の全ワクチン成分を含むプラシーボワクチンにより免疫化したネコから得る毎月の血清サンプルは、免疫化後モニター期間の間に参照血清の０．６±０．２％の平均抗ＳＩＺＰ力価を有する。従って、プラシーボワクチンを受けたネコが、免疫後期間に仔ネコを産むことは明らかである。
【００６１】
【表５】
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実施例５：シカの免疫避妊
Ｊａｍｅｓ Ｉｓｌａｎｄ（南ブリティッシュコロンビア州の沖にある３６０ヘクタールの島）にいる４１匹のファロージカ（Ｄａｍａ ｄａｍａ）のメスを、ＦＣＡをアジュバントとして用いたワクチン組成物で免疫化した。別の４０匹のファロージカのメスのグループを、ミョウバンをアジュバントとして用いたワクチン組成物で免疫化した。捕獲のために、小さい建物に続く一連のフェンスで囲まれた囲いおよび走路に連結した大きい（２００×２００メートル）檻にシカをおびき寄せる。免疫化の前に、各シカを物理的に拘束し、番号のついた耳標、色付きプラスチックカラー、または死亡センサー付きの無線カラー、および独自のコードの付いたＰＩＴ（永久識別応答機）タグを付けた。従って、処置するシカが全ての外部マークを失った場合でも、耳標を無くした際の傷から処置動物であること、またＰＩＴタグから特定のシカであることが認められる。各捕獲メスは、ＦＣＡまたはミョウバンアジュバントと共にリポソーム中に封入されたＳＩＺＰ（１００μｇ）を尻に筋内注射される。未処置のメスは対照としての役割を果たす。
【００６２】
プロテインＡ／アルカリホスファターゼをプロテインＧ／アルカリホスファターゼに置き換えたこと（ファロージカの免疫グロブリンに対してはプロテインＧの方がプロテインＡよりも高い親和性を有するため）以外は、先に記載されているように、抗ＳＩＺＰ力価を測定する（Ｂｒｏｗｎ， Ｒ．Ｇ．， Ｗ．Ｄ． Ｂｏｗｅｎ， Ｊ．Ｄ． Ｅｄｄｉｎｇｔｏｎ， Ｗ．Ｃ． Ｋｉｍｍｉｎｓ， Ｍ． Ｍｅｚｅｉ， Ｊ．Ｌ．Ｐａｒｓｏｎｓ， Ｂ． Ｐｏｈｊａｊｄａｋ． （１９９７） Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｐｔｉｖｅ ｇｒｅｙ ｓｅａｌｓ， ｈａｒｐ ａｎｄ ｈｏｏｄｅｄ ｓｅａｌｓ ｔｏ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５：５３−６４）。ウサギ免疫グロブリン（参照血清）に対するプロテインＡおよびプロテインＧの親和性に関して、ファロージカ免疫グロブリンに対するプロテインＡおよびプロテインＧの親和性はそれぞれ８および８９％である。ファロージカ抗ＳＩＺＰ力価は、プロテインＧの相対親和性について修正していない（表５Ａ）。発情の２ヶ月以上、およびをＦＣＡを含むワクチンで免疫化した８〜９ヶ月後に検査したメスはいずれも妊娠しておらず、９６％（１９２／２００）の未処置のメスは妊娠していた。妊娠は、妊娠の徴候について生殖器官を検査することにより、または生存捕獲メスから得た血液を妊娠特異的プロテインＢ（ＰＳＰＢ）についてＢｉｏＴｒａｃｋｉｎｇ， Ｉｎｃ． ｏｆ Ｍｏｓｃｏｗ， Ｉｄａｈｏ （Ｗｉｌｌａｒｄら、 ”Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｇｅ， ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ， ａｎｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｗｅａｎｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｆａｒｍｅｄ ｆａｌｌｏｗ ｄｅｅｒ （Ｄａｍａ ｄａｍａ）． Ｊ． Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ． ７７：３２−３８ （１９９９）”（この開示は参照により本明細書に援用する））により分析することで判断した。免疫化および非免疫化メスの妊娠率の対比は、ＦＣＡを含むワクチン組成物が明らかに受精を抑制するのに有効であることを示す。これは、数年にわたる調査のため、可能な限り多くのメスが生きたまま捕獲される。
【００６３】
【表６】
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他の実験を、オジロジカに対して行った。ＦＣＡを含むワクチン組成物で免疫化したオジロジカのいずれも、免疫化１年後に妊娠しなかった。ミョウバンを含むワクチン組成物で免疫化した１匹のオジロジカだけ、免疫化１年後に妊娠しなかった。抗ＳＩＺＰ力価レベルの結果を表５Ｂに示す。
【００６４】
【表７】
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実施例６：抗ＳＩＺＰ抗体の産生における油含量の影響
ワクチン組成物は、抗原の単回投与後に良好な抗体力価を産出し、従って、特に明記しない限り、以下の実施例で報告する全ての力価は、ワクチン製剤および他の免疫化プロトコール中の抗原の単回投与から生じるものである。
【００６５】
良い免疫応答を得るために、水相がワクチン組成物に必要な成分であるか否かを決定するために、３グループのウサギ（２または３匹のウサギ／グループ）を、食塩水（０．５ ｍｌ）に懸濁され、フロイント完全アジュバント（０．５ ｍｌ）に乳化されたリポソーム中に封入されたＳＩＺＰ（５０μｇ ＳＩＺＰ／ウサギ）を含むワクチンの３つの異なる調製物で免疫化した。これらの調製物における油相および水相の割合は等しい（表６Ａ）。
【００６６】
【表８】
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水を含まないように製剤化されたワクチンを使用して、４つのグループのウサギ（２または３匹のウサギ／グループ）を、フロイント完全アジュバント（０．２ ｍｌまたは０．５ ｍｌ）に懸濁した凍結乾燥リポソームに封入されたＳＩＺＰ（５０μｇ ＳＩＺＰ／ウサギ）を含む４つの異なるワクチン調製物で免疫化した。フロイント完全アジュバントは、水を含まないため、これらの調製物は、水を含まず、油相のみを含んだ。免疫化４ヵ月後の平均抗ＳＩＺＰ力価は、５０％の油を含む組成物で免疫化されたウサギについては５５±４４％（変動係数、ｃｖ ８０％）、１００％油を含むワクチンで免疫化されたウサギについては５９±４１％（ｃｖ ６９％）である。１００％油のワクチンを受けたメスウサギと、５０％油を含むワクチンで免疫化されたメスウサギの応答には差はない（Ｐ ＝ ０．８７；Ｆ （１，４５） ＝ ０．０３；平均力価は、５０％油については７１±７％、１００％油については７２±１２％であった）。これらの結果は、水相の存在が、ワクチンに対する良好な免疫応答のために必要でないことを示す。
【００６７】
５０％および１００％油を有するワクチン組成物で免疫化されたウサギにおいて抗ＳＩＺＰ力価の持続期間に違いがあるか否かを判断するために、抗ＳＩＺＰ力価を１２ヶ月測定した（表６Ｂ）。免疫化後１２ヶ月期間の間の抗ＳＩＺＰ力価は、５０％油製剤で免疫化されたウサギと、１００％油製剤で免疫化されたウサギとで同様である。ＳＩＺＰでの免疫化の生物学的効果を検証するために、両方のワクチン製剤で免疫化された検査済みのメスウサギを、検査済みのオスと、免疫化後１２ヶ月期間の間に３回交配させた。５０％油を含むワクチンで免疫化されたウサギについて受精率の低下は８０％であり、１００％油を含むワクチンで免疫化されたメスウサギは子供を産まず、受精率の低下の生物学的効果が両方のワクチン製剤で類似することを示す。
【００６８】
【表９】
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リポソームは、親油性の物質からなるため、油中でリポソームを保存すると、リポソームの構成物質が油に溶けて、リポソームが崩壊するかもしれない。この問題を調査するために、ウサギ（各グループに２匹のウサギ）を、５℃および−２０℃にて５ヶ月間保存したワクチン（１００％油製剤）で免疫化する。ワクチンを５℃にて５ヶ月間保存した場合には、ウサギの抗ＳＩＺＰ力価は２８％しか低下しなかった（表６Ｃ；Ｐ＝０．００２；Ｆ（５，３３）＝４．９）。ワクチンを−２０℃にて５ヶ月間保存した場合には、ウサギの抗ＳＩＺＰ力価は１４％しか低下しなかった（表６Ｄ；Ｐ＝＜０．００１；Ｆ（５，３５）＝２３．７）。これらの結果は、ほとんどのリポソームが、油中で無傷のままでいることを示す。なぜなら、リポソーム封入無しに、フロイント完全アジュバント中に懸濁されたＳＩＺＰの単回注射によるウサギの免疫化では、力価が低いからである（表６Ｅ）。
【００６９】
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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水相を含まないように製剤化されたワクチンが、別の哺乳動物種において良好な応答を生じるか否かを判断するために、ハイイロアザラシ（Ｈａｌｉｃｈｏｅｒｕｓ ｇｒｙｐｕｓ）を、等量の油相および水相、水相のみ、または油相のみを含むワクチンで免疫化した（表６Ｆ）。等量の油相および水相、または油のみを含むワクチンの抗ＳＩＺＰ力価に差はなかったが、油以外の全成分を含むワクチンを投与した場合には力価が有意に低かった。
【００７０】
【表１３】
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実施例７：リポソーム中での古細菌脂質の使用
リポソームは、様々な脂質物質からなり得る完全に閉じた脂質膜である。本実施例では、古細菌脂質を用いてなるリポソームを、ダイズレシチンを用いて作られたリポソームと、ウサギによる抗体産生を刺激する能力について比較する（表７）。ダイズレシチンで作られたリポソームは、古細菌脂質で作られたリポソームよりも、抗ＳＩＺＰ抗体をより良く産生する。
【００７１】
【表１４】
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実施例８：ストレプトキナーゼに対する免疫化
ワクチン組成物は、単回投与後に長時間持続する抗ＳＩＺＰ抗体の高い力価を産生するかは独特（ｕｎｉｑｕｅ）である。ワクチン組成物が、他の抗原で高い抗体力価を産生するか否かを決定するために、ウサギをストレプトキナーゼで免疫化する。
【００７２】
ストレプトキナーゼは、連鎖球菌科の細菌の病原菌株から産生されるエキソタンパク質（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。血管繊溶（ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）のアクチベーターとして、その治療的有用性が長い間心筋梗塞の治療において評価されてきた。ストレプトキナーゼは、非協同的に解ける。従って、タンパク質は、天然型であると思われるいくつかの領域を含むいくつかの部分的に折り畳まれた状態、およびその他は解かれた状態をとりえる。タンパク質の他の領域から独立した、異なる安定性の３つのドメインが存在する（Ｔｅｕｔｅｎら， １９９３， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２９０：３１３−３１９）。天然型ストレプトキナーゼは、Ｃ末端領域に免疫優性エピトープを含む（Ｔｏｒｒｅｎｓら， １９９９， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ７０：２１３−２１８）。Ｃ末端領域は、比較的構成的でないため（Ｐａｒｒａｄｏら， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ５：６９３−７０４）、熱処理により構成を変えることはできない。なぜなら、熱処理前から構成的でないからである。ドメインＣの熱安定性は、残りの鎖から単離されることにより、有意に高くなる（Ｃｏｎｎｅｊｅｒｏ−Ｌａｒａら， １９９６， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ５：２５８３−２５９１）。Ｃ末端領域の欠如により、免疫原性タンパク質が減るが、天然型分子に隠れた免疫原生エピトープを曝露する。本発明者らの調査では、Ｃ末端領域は、天然型および熱処理ストレプトキナーゼに存在し、従って、タンパク質の免疫優性領域として、ウサギの応答を決定するであろう。Ｃ末端領域が、天然型状態で見とめられるのと同じエピトープを熱処理後にも保持する場合には、抗ストレプトキナーゼ抗体が、天然型および熱処理ストレプトキナーゼに結合する際の違いは期待できないであろう。これらは、まさに見とめられた観察である（表８）。本発明者らは、本発明のワクチン組成物を用いた変性タンパク質の送達により、天然型エピトープを指向する抗体の産生に有利に働くことを提案した。これは、実施例２のアルコールデヒドロゲナーゼ調査により裏付けられる。ストレプトキナーゼでの結果は、この提案と一致する。なぜなら、熱処理は、免疫優性領域の構成を変化せず、採用する送達系とは無関係に、天然型および熱処理ストレプトキナーゼで免疫化されたウサギの免疫応答において違いがないと予想されるからである。これらは、本発明者らの間違いのない観察である（表８）。
【００７３】
【表１５】
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この結果から、本発明のワクチンを用いたストレプトキナーゼの単回注射が、従来の一次および二次免疫注射プロトコールにより得た力価と同様の抗ストレプトキナーゼ力価を産生したということは明らかである。また、使用する免疫化プロトコール（つまり、本発明または従来のプロトコール）に関わらず、産生した抗体は、天然型および熱処理ストレプトキナーゼに同等に結合した。
【００７４】
実施例９：食用植物油の使用
本発明に従って、鉱油の代わりにカノーラ油を使用してワクチン組成物を製剤化した。結果を表９に示す。結果は、カノーラ油で製剤化したワクチンが、ウサギにおいて抗ＳＩＺＰ抗体を産生し、従って、カノーラ油が有用であることを示す。しかし、力価レベルは、鉱油ほど高くはない。
【００７５】
【表１６】
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実施例１０：Ｂ型肝炎に対する免疫化
本発明に従い、食塩水（０．２５ ｍｌ）に懸濁され、次いで低粘性鉱油（０．２２５ ｍｌ）およびオレイン酸マンニド（０．０２５ ｍｌ）中で乳化されたダイズレシチン（０．０５ ｇ）およびコレステロール（０．００５ ｇ）を含むリポソームに封入されたミョウバンアジュバントを含む５μｇＢ型肝炎表面抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ（商標）、組換えＢ型肝炎抗原）を用いて、Ｂ型肝炎ワクチンを製剤化した。製造元が推奨するように０．５ ｍｌ容量の水性媒体にミョウバンアジュバントを含む５μｇのＢ型肝炎表面抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ（商標））を用いた従来のＢ型肝炎ワクチンも投与した。８匹のウサギを本発明により調製したワクチンで免疫化し、８匹のウサギを従来のワクチンで免疫化した。結果を表１０に示す。
【００７６】
表１０から、本発明により調製されたワクチンが、従来のＢ型肝炎表面抗原の送達よりも、免疫化後１ヵ月後に約６倍多い抗体を生じることが明らかである。
【００７７】
【表１７】
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実施例１１：ミョウバンアジュバントをリポソームの内側および外側に用いてワクチンを製剤化する影響
以下のようにワクチンを調製した：
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グループ１〜４は、０．１ ｇダイズレシチンおよび０．０１ ｇコレステロールで形成されたリポソームに封入された１００μｇＳＩＺＰで調製した。グループ１〜３のリポソームは、１００μｌＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）も含んでいた。グループ２および４では、１００μｌ ＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）をリポソームの外側に用いた。グループ１および２では、リポソームを、０．２５ ｍｌ食塩水に懸濁し、この懸濁液を０．２２５ ｍｌ低粘性鉱油および０．０２５ ｍｌオレイン酸マンニド中で乳化した。グループ３および４では、リポソームを凍結乾燥し、次いで０．２２５ ｍｌ低粘性鉱油および０．０２５ ｍｌオレイン酸マンニドに懸濁し、この懸濁液を０．２５ ｍｌ食塩水中で乳化した。グループ５では、１００μｇ ＳＩＺＰおよび１００μｌ ＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）を凍結乾燥させ、次いで、０．２２５ ｍｌ低粘性鉱油および０．０２５ ｍｌオレイン酸マンニドに懸濁し、０．２５ ｍｌ食塩水中で乳化した。グループ６では、１００μｇ ＳＩＺＰおよび１００μｌ ＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）を凍結乾燥させ、次いで０．２５ ｍｌ食塩水に懸濁し、０．２２５ ｍｌ低粘性鉱油および０．０２５ ｍｌオレイン酸マンニド中で乳化した。この６つのワクチンでウサギを免疫化し、結果を表１１に示す。
【００７８】
【表１８】
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実施例１２：熱殺結核菌アジュバントをリポソームの内側および外側に用いてワクチンを製剤化する影響
以下のようにワクチンを調製した：
2004512384.tif 000021
グループ１〜４は、０．１ ｇダイズレシチンおよび０．０１ ｇコレステロールで形成されたリポソームに封入された１００μｇＳＩＺＰで調製した。グループ１〜３のリポソームは、２００μｌの熱殺結核菌も含んでいた。グループ２および４では、２００μｇの熱殺結核菌をリポソームの外側に用いた。グループ１および２では、リポソームを、０．２ ｍｌ食塩水に懸濁し、この懸濁液を０．１８ ｍｌ低粘性鉱油および０．０２ ｍｌオレイン酸マンニド中で乳化した。グループ３および４では、リポソームを凍結乾燥し、次いで０．１８ ｍｌ低粘性鉱油および０．０２ ｍｌオレイン酸マンニドに懸濁し、この懸濁液を０．２ ｍｌ食塩水中で乳化した。この４つのグループのワクチンでウサギを免疫化し、結果を表１２に示す。
【００７９】
【表１９】
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実施例１３：ミョウバンアジュバントと共に天然型および変性型酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）でのウサギの免疫化
１００μｇ天然型または変性型ＡＤＨを、１００μｌＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）と共に、０．１ｇダイズレシチンおよび０．０１ ｇコレステロールで形成されたリポソームに封入して、本発明のワクチンを製剤化した。リポソームを０．２５ ｍｌ食塩水に懸濁し、懸濁液を０．２２５ ｍｌ低粘性鉱油および０．０２５ ｍｌオレイン酸マンニド中に乳化した。
【００８０】
従来のワクチンは、１００μｇの天然型または変性型ＡＤＨを、１００μｌ ＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（商標）と共に含んで製剤化され、０．５ ｍｌ食塩水に懸濁されていた。
【００８１】
ＡＤＨを１００℃まで３０分間加熱して変性型ＡＤＨを調製し、１０％メルカプトエタノールで３０分間室温にて処理することによりジスルフィド結合を切断した。メルカプトエタノールを、１２時間の透析により除去し、変性型ＡＤＨを凍結乾燥により回収した。
【００８２】
本発明のワクチンと従来ワクチンを比較した結果を表１３に示す。
【００８３】
【表２０】
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この結果は、本発明の製剤を用いた天然型または変性型ＡＤＨの送達が、従来方法を用いて天然型または変性型ＡＤＨに対して免疫化されたウサギによる抗ＡＤＨ抗体の産生と比べて、抗ＡＤＨ抗体の産生が高いことを示す。さらに、変性型ＡＤＨで免疫化されたウサギは、二次免疫注射をしない従来手段により変性型ＡＤＨが送達される場合よりも、本発明の製剤を使用した場合の方が、天然型ＡＤＨに特異的な抗体をより多く産生した。
【００８４】
実施例１４：エピトープマッピング
エピトープマッピングを、一次および二次ブースター注射による従来の免疫化プロトコールにより達成される場合よりも、本発明のワクチンが、抗原に対して異なる結合特異性を有する抗体を産生することを実証するために試みる。具体的にはＺＰ抗原の断片を使用したが、他の抗原も似たような作用をすると予想される。
【００８５】
一次注射および２回のブースター注射でのハイイロアザラシおよびタテゴトアザラシの従来の免疫化では、抗ＳＩＺＰ抗体力価が低く、ハイイロアザラシおよびタテゴトアザラシの両方において免疫化後２ヶ月にピークに達する。対照的に、本発明により製剤化したワクチンでの免疫化は、１例を除いて、ハイイロアザラシにおいて少なくとも２４ヶ月間、そしてタテゴトアザラシにおいて５〜６ヶ月間持続する抗ＳＩＺＰ抗体力価を産生する。タテゴトアザラシにおける力価は、免疫化後６〜１０ヶ月間持続する水平期に達する。従って、本発明により製剤化したワクチンは、一次および二次免疫注射を使用する従来の免疫化プロトコールと比べて、高い抗ＳＩＺＰ力価を長い持続期間の間生じさせる。
【００８６】
従来の免疫化プロトコール後に産生される抗ＳＩＺＰ抗体が、本発明のワクチンでの免疫化後に産生される抗ＳＩＺＰ抗体と異なる結合特異性を有することを実証するためのエピトープマッピングで使用したＺＰＢおよびＺＰＣのポリペプチド断片を図１に示す。断片ＺＰＢ１、ＺＰＢ２、ＺＰＣ１およびＺＰＣ２は、短いポリペプチドで、完全長ＺＰＢおよびＺＰＣの三次元構造をもたない。図１において、完全長未プロセシングポリペプチドを、２つのＺＰＢおよびＺＰＣ断片の上に示す。天然型タンパク質において切断される分泌シグナルペプチドは黒塗りしている。
【００８７】
従来免疫化（ＦＣＡアジュバントを使用した一次および２回の二次免疫注射）後に産生される抗ＳＩＺＰハイイロアザラシ抗体は、ＺＰＢ１、ＺＰＢ２、ＺＰＣ１およびＺＰＣ２断片に対して高い親和性を有する（表１４Ａ、アザラシＩＤ１）。対照的に、本発明により製剤化したワクチンで免疫化したハイイロアザラシは（表１４Ａ、アザラシＩＤ ７６および９６）、免疫化後１年で断片ＺＰＢ２、ＺＰＣ１およびＺＰＣ２に対して低い親和性を有し、免疫化後３年で４つ全ての断片に対して低い親和性を有する抗体を産生する。４つの断片は合わせるとＳＩＺＰに基づくタンパク質の８０％を占める。
【００８８】
【表２１】
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本発明により製剤化されたワクチンで免疫化されたハイイロアザラシで産生された抗体の結合特異性の時間的調査によれば、抗体が、ＺＰＢ１断片上で主に見とめられるエピトープに対して免疫化後初期（７ヶ月未満）に結合したことを示した。免疫化後後期（７ヶ月を上回る）に産生された抗体は、ＺＰＢ１および他の３つの断片に対して低い親和性を有する。ＺＰＢ１、ＺＰＢ２、ＺＰＣ１およびＺＰＣ２は、低分子量で、グリコシル化されていない。これらの断片は、分子量が低いため、完全長ＺＰＢおよびＺＰＣよりも小さい三次元構造を有する。従って、ＳＩＺＰに結合するが、ＺＰＢ１、ＺＰＢ２、ＺＰＣ１またはＺＰＣ２には結合しない抗体は、完全長ＺＰＢおよびＺＰＣ上のみで見とめられる三次元構造、またはこれらのタンパク質に共有結合した糖質（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）のいずれかを認識するはずである。免疫化後初期に断片に結合した抗体の合計量は、ＺＰＢおよびＺＰＣに結合した抗体の量を超えるか等しいため、糖質認識抗体は、比較的重要でない役割を有するのであろう。これは、三次元構造が、ＳＩＺＰと対照的な、断片への結合の違いを決定することを意味する。本発明のワクチン中のＳＩＺＰで免疫化された９匹の他のハイイロアザラシの調査から、免疫化後５ヶ月以上で産生される抗体の同様の減少が示された。
【００８９】
別の実験では、本発明のワクチンで免疫化された４匹のウサギのうち３匹が、他の３つの断片においてよりも、ＺＰＢ１中のエピトープに対して高い親和性を有する抗体を産生した。４匹全てのウサギにより産生された抗体の２０〜４０％のみが、４つのＺＰ断片において見とめられるエピトープに結合した。従って、本発明のワクチンで免疫化されたウサギにより産生される抗ＳＩＺＰ抗体の６０〜８０％は、完全長ＺＰＢおよびＺＰＣにおいて見とめられるエピトープにのみ結合する。従って、本発明のワクチンで免疫化されたウサギにおいて産生された抗体の６０〜８０％は、天然型三次元構造に関連したエピトープを認識する。
【００９０】
さらに別の実験では、ＦＣＡアジュバントを用いた一次注射、その後のＦＩＡアジュバントを用いた二次免疫注射での従来プロトコールによるタテゴトアザラシ（１５６および１６２）の免疫化により、ＺＰＢ１、ＺＰＢ２およびＺＰＣ２（タテゴトアザラシ１５６）、または４つ全ての断片（タテゴトアザラシ１６２）で見とめられるエピトープ、ならびにＳＩＺＰに結合する免疫化後初期に抗体が産生された（表１４Ｂ）。対照的に、本発明により製剤化したワクチンでのタテゴトアザラシ１５１の免疫化は、免疫化後初期（５ヶ月未満）に、４つ全てのＺＰ断片に見とめられるエピトープに結合する抗体を産生したが、免疫化後後期（７ヶ月を上回る）に産生された抗体は、完全長ＺＰＢおよびＺＰＣのみに見とめられるエピトープに結合した（表１４Ｂ）。本発明のワクチンによるタテゴトアザラシ１５３の免疫化により産生される抗体の３０〜４０％のみが、４つのＺＰ断片上のエピトープに良く結合し、免疫化後７ヶ月期間の間にタテゴトアザラシ１５３により産生される抗体の６０〜７０％が、完全長ＺＰＢおよびＺＰＣにおいて見とめられるエピトープにのみ結合することを意味する。これらのエピトープは、三次元構造を意味する完全長ＺＰＢおよびＺＰＣにおいてのみ見とめられる構造に関係しているに違いない。本発明のワクチンでのズキンアザラシ１の免疫化では、タテゴトアザラシ１５１と同様の特異性の時系列を有する抗体を産生した。
【００９１】
【表２２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐＲＳＥＴベクターで産生されたブタ透明帯のＺＰＢおよびＺＰＣタンパク質の組換えＺＰＢ１およびＺＰＢ２；ＺＰＣ１およびＺＰＣ２の位置を示す図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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