(57)【要約】本発明は、二本鎖ＲＮＡの形で核酸標的を増殖させるための方法およびキットに関する。特に本発明は、ｄｓＲＮＡを大量産生するための方法に関する。この方法は、生細胞中でＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製可能な形の核酸標的を与える工程と、前記複製可能な形の核酸標的と前記ポリメラーゼを、反応産物の１つが必ず二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡである鋳型指示ＲＮＡ合成に十分な条件下において接触させる工程と、十分純粋な形で前記ｄｓＲＮＡ産物を回収する工程とを含む。ｄｓＲＮＡ産物はさまざまな適用例において、例えば遺伝子サイレンシングにおいて使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生細胞中でＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製可能な形の核酸標的を与える工程と、
ｂ）前記複製可能な形の核酸標的と前記ポリメラーゼを、反応産物の１つが必ず二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡである鋳型指示ＲＮＡ合成に十分な条件下において接触させる工程と、
ｃ）十分純粋な形で前記ｄｓＲＮＡ産物を回収する工程とを含む、ｄｓＲＮＡを大量産生するための方法。
【請求項２】
前記核酸標的がポリペプチドをコードしているか、あるいは所望の生物のゲノム中の非コード領域に等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリメラーゼによる検出可能な複製に必要不可欠な決定因子と前記核酸標的が動作可能に連結した、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリメラーゼが遺伝学的修飾によるまたは野生型ポリメラーゼである、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンが遺伝学的修飾によるまたは野生型である、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸標的がＲＮＡウイルス様粒子、ウイロイドまたはＲＮＡ系自己遺伝因子などのＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンのゲノム中に取り込まれる、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンがポリメラーゼをコードしている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ポリメラーゼをコードしている前記核酸と前記核酸標的が別個の核酸である、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリメラーゼがＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンに由来する、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼがＲＮＡバクテリオファージに由来する、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼがシストウイルス科のメンバー、好ましくはφ６、φ７、φ８、φ９、φ１０、φ１１、φ１２、φ１３およびφ１４を含む群から選択されるバクテリオファージ、最も好ましくはバクテリオファージφ６に由来する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複製可能な形の核酸標的を原核細胞中、好ましくはグラム陰性菌細胞中、より好ましくはシュードモナス属、大腸菌属、およびサルモネラ属を含む群から選択される細菌細胞中、最も好ましくはシュードモナス・シリンゲの細胞中でポリメラーゼと接触させる、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複製可能な形の核酸標的を哺乳動物、昆虫、植物または酵母細胞などの真核細胞中でポリメラーゼと接触させる、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸標的を自殺ベクター、好ましくはＤＮＡベクター、最も好ましくはＤＮＡプラスミドを使用して生細胞中に送達する、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス複製機構による検出可能な複製に十分な配列と動作可能に連結した標的核酸を含む自殺ベクターを使用して、前記核酸標的を前記ＲＮＡウイルスのゲノム中に取り込む、前項までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンのＲＮＡ合成装置による複製に必要不可欠な決定因子と動作可能に連結した標的核酸配列と、
ＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンの複製を支援することができる生細胞と、
十分純粋な形でｄｓＲＮＡ産物を回収するための回収手順を含む、ｄｓＲＮＡを大量産生するための生細胞系。
【請求項１７】
前記生細胞がキャリア状態の細胞であるか、あるいはキャリア状態に形質転換することができる、請求項１６に記載の生細胞系。
【請求項１８】
前記核酸標的を自殺ベクター中に与える、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＲＮＡ合成装置中のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがｄｓＲＮＡウイルスまたはｄｓＲＮＡレプリコンに由来する、請求項１６乃至１８のいずれか１項に記載の生細胞系。
【請求項２０】
ＲＮＡ合成装置中のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがシストウイルス科、好ましくはφ６、φ７、φ８、φ９、φ１０、φ１１、φ１２、φ１３、φ１４を含む群から選択されるバクテリオファージ、最も好ましくはバクテリオファージφ６に由来する、請求項１６乃至１９のいずれか１項に記載の生細胞系。
【請求項２１】
前記生細胞が原核細胞、好ましくはグラム陰性菌細胞であり、より好ましくは前記細菌細胞がシュードモナス属、大腸菌属、およびサルモネラ属を含む群から選択され、最も好ましくは前記細菌がシュードモナス・シリンゲである、請求項１６乃至２０のいずれか１項に記載の生細胞系。
【請求項２２】
ａ）キャリア状態であるかあるいはキャリア状態に形質転換することができる予め選択した細胞中での、標的核酸の一過性の発現用のベクターおよび／または
ｂ）前記標的核酸を導入することができる遺伝子操作ウイルスおよび／または
ｃ）キャリア状態であるかあるいはキャリア状態に形質転換することができる細胞を含む、ｄｓＲＮＡを大量産生するためのキット。
【請求項２３】
ａ）生細胞中でＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製可能な形の核酸標的を与える工程と、
ｂ）前記複製可能な形の核酸標的と前記ポリメラーゼを、反応産物の１つが必ず二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡである鋳型指示ＲＮＡ合成に十分な条件下において接触させる工程と、
ｃ）十分純粋な形で前記ｄｓＲＮＡ産物を回収し、任意選択で性能を最適にするため前記産物を操作する工程と、
ｄ）前記純粋な、任意選択で操作されたｄｓＲＮＡ産物を使用して、生物、細胞または無細胞抽出物などの真核生物系中で配列特異的な遺伝子サイレンシング効果を誘導する工程とを含む、真核生物系中で配列特異的な遺伝子サイレンシング効果を誘導するための方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがｄｓＲＮＡウイルスまたはｄｓＲＮＡレプリコンに由来する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがシストウイルス科、好ましくはφ６、φ７、φ８、φ９、φ１０、φ１１、φ１２、φ１３、φ１４を含む群から選択されるバクテリオファージ、最も好ましくはバクテリオファージφ６に由来する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生細胞が原核細胞、好ましくはグラム陰性菌細胞であり、より好ましくは前記細菌細胞がシュードモナス属、大腸菌属、およびサルモネラ属を含む群から選択され、最も好ましくは前記細菌がシュードモナス・シリンゲである、請求項２３乃至２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
性能を最適にするための前記任意選択の操作工程が、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼ、好ましくはＲＮａｓｅＩＩＩ、Ｄｉｃｅｒ、またはこれらの誘導体を用いてｄｓＲＮＡを断片化する工程である、請求項２３乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸標的を自殺ベクター中に与える、請求項２０または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｄｓＲＮＡ産物を使用して、好ましくは昆虫または線虫起源、最も好ましくはキイロショウジョウバエまたは線虫起源の無脊椎動物系中で配列特異的な遺伝子サイレンシング効果を誘導する、請求項２０乃至２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｄｓＲＮＡ産物を使用して、好ましくは哺乳動物起源、最も好ましくはヒトまたはマウス起源の脊椎動物系中で配列特異的な遺伝子サイレンシング効果を誘導する、請求項２０乃至２９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｄｓＲＮＡの大量産生の分野に関する。本発明はさらに、ｄｓＲＮＡを大量産生するための生細胞系およびキットに関する。より詳細には、本発明は、ｄｓＲＮＡの形で標的核酸配列を与えるための、ＲＮＡウイルスおよび他のＲＮＡレプリコンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多量のＤＮＡを生成するための方法は、よく開発され広く使用されている。分子生物学および細胞生物学における近年の開発では、一般にＲＮＡ分子および特にｄｓＲＮＡ分子が、以前に知られていたより、幾つかの細胞プロセスにおいてより一層中心的な役割を果たしていることが明らかとなっている。このようなプロセスの１つは、転写後の遺伝子サイレンシングである。この進展は明らかに、配列特異的ｄｓＲＮＡ生成用の大規模な生成法の必要性につながる。現在使用されている好ましい方法は、プラスミド由来のｓｓＲＮＡを合成し、次に２つの相補的ＲＮＡ分子をアニーリングしてｄｓＲＮＡを得ることである。このような技術は成功しているが、長いＲＮＡ分子を生成することは難しく、この方法は産業規模の量のｄｓＲＮＡを生成するのに非実用的でありコスト効率が悪い。ｄｓＲＮＡの治療上および診断上の使用が必要とされるときは、数ｋｂｐ長のｄｓＲＮＡ分子を生成する能力を有する、信頼できる、低コストの、多量の（グラム単位の）方法が求められる。
【特許文献１】ＰＣＴ／ＦＩ００／０１１３５
【特許文献２】ＷＯ０１／４６３９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明では、予想外に高い収率で生細胞中において、特にＲＮＡウイルスまたはレプリコン由来の、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用することによってｄｓＲＮＡを生成することができることを見出した。文献（Ｏｎｏｄｅｒａ他、１９９２）中では、マーカー抗生物質耐性遺伝子をｄｓＲＮＡバクテリオファージにｄｓＲＮＡ形で挿入することができ、このような細胞内ウイルス要素はコードされている抗生物質に耐性がある細胞をもたらすことが示されている。しかしながら、当該の核酸標的を増幅させるために、ｄｓＲＮＡバクテリオファージまたは他のＲＮＡレプリコンを使用することは示唆されておらず、標的ｄｓＲＮＡを大量産生するためのｄｓＲＮＡバクテリオファージまたは他のＲＮＡレプリコンの使用は、誰も示唆していない。
【０００４】
前に論じたように、ｄｓＲＮＡを生成するための既存のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、限られた量の産物のみを与えることができる。したがって、生細胞などの再生可能な源からｄｓＲＮＡを生成し、簡単な手順を使用して精製することができる方法を開発できれば有利である。この目的のために本発明は、ＲＮＡレプリコン（ＲＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス様粒子、ＲＮＡプラスミド、またはこれらの誘導体など）を使用して、ｄｓＲＮＡの形で標的核酸配列を増幅させる、簡潔で好都合な戦略を与える。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様において本発明は、ｄｓＲＮＡを大量産生するための新規の方法を提供する。この方法は、ｄｓＲＮＡゲノムを有するウイルスまたは他の型のレプリコン由来の、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用することに基づくものであり、この方法によって、十分な純度および十分な量のｄｓＲＮＡの生成が容易になされる。より詳細にはこの方法は、請求項１の特徴付け部分の記述によって主に特徴付けられる。
【０００６】
第２の態様において本発明は、ｄｓＲＮＡを大量産生するための生細胞系を提供する。この生細胞系は、請求項１６の特徴付け部分の記述によって主に特徴付けられる。
【０００７】
第３の態様において本発明は、ｄｓＲＮＡを大量産生するためのキットを提供する。このキットは、請求項２２の特徴付け部分の記述によって主に特徴付けられる。
【０００８】
第４の態様において本発明は、ＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンに基づいて、真核生物中で配列特異的な遺伝子サイレンシング効果を誘導するための方法を提供する。この方法では、ｄｓＲＮＡの形で標的核酸配列を増殖させるための媒体としてＲＮＡレプリコンを使用し、ｄｓＲＮＡを精製し、これを使用してサイレンシング効果を誘導する。より詳細にはこの方法は、請求項２３の特徴付け部分の記述によって主に特徴付けられる。
【０００９】
好ましい実施形態によれば本発明は、キャリア状態の微生物細胞中のウイルス複製複合体が、（発酵槽規模で）無制限な量のｄｓＲＮＡを実際に生成する方法を提供する。望ましい核酸配列をベクター中にいれて、一過性の転写により、望ましいｓｓＲＮＡ分子を生成するキャリア状態の細胞に形質転換することができる。これらは、相補鎖が合成される細胞内ウイルス複製複合体へのパッケージングを対象とする。このような細胞の増殖後、当該のｄｓＲＮＡを単離および精製することができる。
【００１０】
ＲＮＡゲノムを有する幾つかの生物体は、この方法で使用するのに適している。例えば、少なくとも幾つかのｓｓＲＮＡウイルスは、ｄｓＲＮＡ中間体を介してそれらのゲノムを複製することが知られている（Ｂｕｃｋ、１９９６）。しかしながら、十分な純度および十分な量のｄｓＲＮＡを得るのを容易にするために、ｄｓＲＮＡゲノムを有するウイルスまたは他の型のレプリコンを使用することが有利である。
【００１１】
ＲＮＡウイルス様粒子、ＲＮＡプラスミド、ウイロイド、または他のＲＮＡ系自己遺伝因子を含めた、ほとんどＲＮＡ系生物または系を任意に使用することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡ系の系はＲＮＡバクテリオファージであり、これはシストウイルス科、好ましくはφ６、φ７、φ８、φ９、φ１０、φ１１、φ１２、φ１３およびφ１４の群から選択されるバクテリオファージ、最も好ましくはバクテリオファージφ６に属する。複製可能な形の核酸標的は原核細胞中、好ましくはグラム陰性菌細胞中、より好ましくはシュードモナス属、大腸菌属、およびサルモネラ属を含む群から選択される細菌細胞中、最も好ましくはシュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｄｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）の細胞中でポリメラーゼと接触させる。現在好ましい実施形態は、遺伝的に操作されたバクテリオファージφ６、シュードモナス菌、特にシュードモナス・シリンゲに感染するシストウイルス科由来のｄｓＲＮＡウイルスに頼るものである（Ｍｉｎｄｉｃｈ、１９８８；Ｍｉｎｄｉｃｈ、１９９９ａ）。
【００１２】
本発明は、組換えｄｓＲＮＡバクテリオファージを構築するための新規な方法も提供する。この方法は、当該の核酸断片がウイルス複製機構による検出可能な複製に十分な配列と動作可能に連結した、自殺ベクターを利用する。この新しい方法は、プロキャプシド粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージング（Ｐｏｒａｎｅｎ他、２００１）、または標的遺伝子を発現するプラスミドを用いて安定的に形質転換した宿主細胞中での遺伝的に操作されたバクテリオファージの増殖（Ｍｉｎｄｉｃｈ、１９９９ｂ）およびその中の参照文献に関する、組換えｄｓＲＮＡバクテリオファージを構築するための以前に記載された方法より迅速かつ容易である。
【００１３】
現在好ましい実施形態では、前記自殺ベクターは、機能的なウイルス複製機構を含む細胞中に送達されるＤＮＡプラスミドである。このプラスミドを前記細胞内で安定的に増殖させることはできないが（自殺ベクターの定義）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより一過的に転写して、ウイルス・ポリメラーゼによって複製可能なＲＮＡを生成することはできる。
【００１４】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｄｓＲＮＡウイルス・ポリメラーゼによって複製可能なＲＮＡはｄｓＲＮＡ（ゲノム）形に変換されるので、自殺ベクター戦略を使用することは、本発明のさまざまな適用例に非常に有利である。
【００１５】
本発明は非常に利点がある。何故なら本発明は、ＲＮＡ分野の絶えず増殖する調査用のツールを提供するからである。考えられる適用分野の中では、遺伝子サイレンシングにおけるｄｓＲＮＡの使用が現時点では最も有望である。
【００１６】
本発明の他の特徴、態様および利点は、特定の実施形態および実施例の記載からさらに良く理解されるだろう。しかしながら、これらの記載および実施例は例示によってのみ与えられ、制限によって与えられるものではないことを理解されたい。本発明の精神および範囲内のさまざまな変化および変更形態は、以下の文章から当業者には明らかとなるであろう。さらに、本特許全体の文章中の参照文献の引用は、これらが本発明に先行する技術であることを承認するものとして解釈すべきではない。
【００１７】
前の文章、ならびに以下の記載および添付の特許請求の範囲は、以下の添付の図面と共に読むとさらに良く理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
定義
他に明確に述べない限り、本発明中で使用する特定の用語は以下の意味を有する：
「バクテリオファージ」という用語は、真性細菌または他の原核生物、例えば古細菌などに感染するウイルスを指す。
【００１９】
本明細書で使用する「生物活性」という用語は、タンパク質または核酸のさまざまな機能および性質を広く指す。生物活性の例には、触媒、結合、および制御機能があるが、これらだけには限られない。
【００２０】
本明細書で使用する「生物体」という用語は、鋳型指示機構によって増殖することができる核酸を含むあらゆる系を指す。
【００２１】
本明細書で使用する「キャリア状態細胞」という用語は、多ラウンドのウイルス・ゲノムの複製を支援し、典型的なウイルスのライフ・サイクルの期間よりも相当長い期間生存状態で存在し続けることができる、ウイルスによって感染される細胞株または複数の細胞を指す。
【００２２】
「核酸配列」、または時には「ヌクレオチド配列」という用語は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドの整列を指す。
【００２３】
「ポリメラーゼ」、または時には「核酸ポリメラーゼ」という用語は、リボ−またはデオキシリボ−ヌクレオシド３リン酸のポリヌクレオチド鎖への重合を触媒することができる、タンパク質またはタンパク質複合体を指す。
【００２４】
「タンパク質配列」、または時には「アミノ酸配列」という用語は、ペプチドまたはタンパク質鎖中のアミノ酸残基の整列を指す。
【００２５】
本明細書で使用する「リボウイルス」という用語は、そのライフ・サイクルが完全にＲＮＡのレベルで進行し、ＤＮＡ期を通常含まないＲＮＡウイルスを指す。リボウイルスは、ポジティブ−およびネガティブ−センス一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡゲノムを有するウイルス、および二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡウイルスを含む。本発明の好ましい実施形態は、「シストウイルス」とも呼ばれるシストウイルス科由来のｄｓＲＮＡウイルスに関するものである。「ＲＮＡウイルス」も参照。ｄｓＲＮＡウイルスは好ましくはφ６、φ７、φ８、φ９、φ１０、φ１１、φ１２、φ１３およびφ１４を含む群から選択されるバクテリオファージであり、最も好ましくは、それはバクテリオファージφ６である。
【００２６】
本明細書で使用する「逆転写ウイルス」という用語は、そのライフ・サイクルがＲＮＡ期とＤＮＡ期の両方を必ず含むウイルスを広く指す。このグループの名称は、ＲＮＡ分子を鋳型として使用してＤＮＡのコピーを生成する、これらのウイルスによって使用される「逆転写」のプロセスに由来する。２つの型の逆転写ウイルス、「レトロウイルス」および「パラレトロウイルス」が知られている。レトロウイルスはＲＮＡの形でそれらのゲノムをキャプシドで包んでいるが、感染細胞中で増殖するときはＤＮＡ中間体を使用する。パラレトロウイルスはＤＮＡゲノムをキャプシドで包んでいるが、感染細胞中で増殖するときはＲＮＡ中間体を使用する。
【００２７】
「リボザイム」という用語は、検出可能な触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。多様な触媒活性を有するさまざまな天然および人工リボザイムが、従来技術において記載されている（Ｂｉｔｔｋｅｒ他、２００２ｂ；ＤｏｕｄｎａおよびＣｅｃｈ、２００２；Ｊａｓｃｈｋｅ、２００１）。
【００２８】
「ＲＮＡウイルス」という用語は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスを指す。
【００２９】
本明細書で使用する「ＲＮＡ系自己遺伝因子」という用語は、ＲＮＡウイルスとは異なるＲＮＡゲノムを含む生物体を一般に指す。ＲＮＡ系自己遺伝因子には、ＲＮＡウイルス様粒子、ウイロイド、およびＲＮＡプラスミドがあるが、これらだけには限られない。ＲＮＡ系自己遺伝因子を指すために本文献中で時々使用する他の用語は、「ＲＮＡサブウイルス因子」である。「生物体」の定義も参照のこと。
【００３０】
本明細書で使用する「ＲＮＡ系生物」という用語は、前に定義したＲＮＡウイルスおよびＲＮＡ系自己遺伝因子を一般に指す。全てのＲＮＡ生物は適切な条件下でそれらのゲノムを複製することができるので、「ＲＮＡレプリコン」という用語を本明細書で使用して、ＲＮＡ生物およびそれらの誘導体を指し、この能力を強調する。
【００３１】
「ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ」という用語は、ＲＮＡ鋳型をコピーすることができる核酸ポリメラーゼを指す。ＲＮＡ鋳型のＲＮＡまたはＤＮＡコピーを生成する、２つの型のＲＮＡ依存性ポリメラーゼが知られている。これらはそれぞれ「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」（「ＲｄＲＰ」）、および「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」（「ＲｄＤＰ」、逆転写酵素としてより良く知られている）と呼ばれている。「ポリメラーゼ」も参照のこと。
【００３２】
本明細書で使用する「標的」または「標的分子」という用語は、本発明の方法を施す核酸を指す。１つまたは多数の異なる変異体を含む複数の標的分子を、「標的群」と呼ぶこともある。標的核酸の長さは約２０塩基から、好ましくは約５０塩基から１５０００塩基であってよく、より好ましくは、それは３００塩基から３０００塩基である。
【００３３】
「異種標的配列」は、標的配列の複製において使用されるＲＮＡ系の生物体（例えばＲＮＡウイルス）以外の、任意の考えられる源由来の標的配列をここでは指す。「相同標的配列」は、標的配列の複製において使用されるＲＮＡ系の生物体（例えばＲＮＡウイルス）由来の標的配列をここでは指す。
【００３４】
標的核酸配列は相同または異種であってよく、特にそれはＲＮＡウイルスまたはレプリコンと異種であってよい。
【００３５】
「生細胞」は、ＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンなどの、ＲＮＡ系の生物体の複製を支援する細胞をここでは指す。生細胞は原核生物に属してよい。それらは細菌、好ましくはグラム陰性菌、より好ましくはシュードモナス属、大腸菌属、およびサルモネラ属を含む群から選択される細菌、最も好ましくはシュードモナス・シリンゲであってよい。生細胞は哺乳動物、昆虫、植物または酵母細胞などの真核細胞であってもよい。
【００３６】
「検出可能な複製」は、任意の一般的に利用可能な分子生物学の方法によって検出可能な核酸標的の複製をここでは指す。
【００３７】
本明細書で使用する「自殺ベクター」という用語、またはより具体的な「自殺プラスミド」という用語は、所与の細胞系内で安定して維持されることはできないが一過性の遺伝子発現を指示することができる、ベクター／プラスミドをそれぞれ指す。
他の用語は本文中で説明するか、あるいは当分野の一般的慣習に従い使用する。
【００３８】
ウイルスＲＮＡベクター
選択した形式で標的をＲＮＡレプリコン中に組み込み、これによって適切なＲＮＡ依存性ポリメラーゼによるその標的の複製を可能にする。ＲＮＡレプリコンとしてＲＮＡウイルスを選択することが、多くの適用例に有利である可能性がある。この場合、組み込まれた標的がウイルス・コード・ポリメラーゼ、好ましくはＲＮＡ依存性ポリメラーゼによってウイルス・ゲノムの一部として複製される。以前の実験では、異種配列挿入体用のベクターとしてＲＮＡウイルスが使用されている。例えば、アルファウイルス、レトロウイルスおよび幾つかの（−）ＲＮＡウイルスが、遺伝子療法および遺伝子発現の適用例用のベクターとして使用される（Ｐａｌｅｓｅ、１９９８；Ｒｏｂｂｉｎｓ他、１９９８）。同様に、植物に感染する幾つかのＲＮＡウイルスを、ベクターとして使用することもできる（Ｌｉｎｄｂｏ他、２００１）。
【００３９】
幾つかの方法の実施形態は一本鎖ＲＮＡウイルスに頼ることができるが、二本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスを選択することが、多くの適用例に有利であろう。ｄｓＲＮＡはｓｓＲＮＡよりもヌクレアーゼ分解に耐性があり、これによってｓｓＲＮＡの量よりも十分な量の完全なｄｓＲＮＡを精製することが容易になる。ｄｓＲＮＡウイルスの例には、シストウイルス、レオウイルス、トティウイルス、パルティティウイルス、ビルナウイルスおよびハイポウイルス科のメンバーがある。経済的および利便性の理由のために、原核生物および下級の真核生物、細菌、酵母菌および他の真菌などに感染する、シスト−（Ｃｙｓｔｏ−）、トティ−（Ｔｏｔｉ−）およびパルティティウイルス科由来のウイルスを使用することが有利であろう。グラム陰性菌に感染するバクテリオファージφ６およびその同系（φ７〜φ１４）、および「ウイルス様粒子」の名称でも知られている酵母ウィルス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｖｉｒｕｓ） Ｌ−ＡおよびＬ−ＢＣは、中でも最も明白な選択である。
【００４０】
現在好ましい実施形態では、標的遺伝子をシストウイルス科（シストウイルス）由来のｄｓＲＮＡバクテリオファージのゲノムＲＮＡ中に組み込む。動物または植物ＲＮＡウイルスに関するＲＮＡバクテリオファージの重要な利点は、低コストで比較的容易な増幅である。さらに、バクテリオファージは一般に短いライフ・サイクルを有しており、このことで生成に必要とされる時間が短縮される。
【００４１】
ｄｓＲＮＡバクテリオファージ形式の具体例として、標的遺伝子をシストウイルスφ６のＭセグメント中に組み込み、φ６コードＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製することができる。他の実施形態では、φ７〜φ１４由来のシストウイルス科の他のメンバー（Ｍｉｎｄｉｃｈ他、１９９９）を標的配列用のベクターとして、さらにポリメラーゼ源として使用することができる。さらに、シストウイルスに典型的な３個のゲノムのセグメントＬ、ＭおよびＳのいずれかを、標的配列を組み込むために使用することができる。
【００４２】
さらに、少なくとも幾つかのシストウイルスは実質的なゲノム再編成を許容することができ、これは短いゲノムのセグメントまたは長いゲノムのセグメントの形、またはセグメント数の変化で示される可能性があることが知られている。例えば、１、２または４個のゲノムのセグメントを含むφ６の変異体が記載されてきている（Ｏｎｏｄｅｒａ他、１９９５；Ｏｎｏｄｅｒａ他、１９９８）。これらの操作型シストウイルスも本発明の範囲内である。何故ならそれらは、野生型シストウイルスより有利なＲＮＡベクターである可能性があるからである。
【００４３】
シストウイルスＲＮＡの合成は、タンパク質Ｐ１、Ｐ２（触媒サブユニット）、Ｐ４、およびＰ７を含むいわゆるポリメラーゼ複合体によって触媒されることが示されてきている（Ｍｉｎｄｉｃｈ、１９９９ａ；Ｍｉｎｄｉｃｈ、１９９９ｂ）。ポリメラーゼ複合体は、ゲノムＲＮＡ用の入れ物としても働く。全てのポリメラーゼ複合体のタンパク質は、セグメントＬにコードされている。初期の研究は、ＬセグメントのｃＤＮＡを発現する細菌細胞は、機能的ポリメラーゼ複合体粒子を蓄積させることも実証している（Ｍｉｎｄｉｃｈ、１９９９ｂ）。したがって幾つかの実施形態は、そのＬセグメントがポリメラーゼ複合体をコードしており、一方他のセグメントが核酸標的を取り込むために使用される、シストウイルス誘導体の使用を含むことができる。他の実施形態では、ポリメラーゼ複合体のタンパク質はｃＤＮＡから生成することができ、それは例えばＤＮＡプラスミドの形で細菌細胞中に導入することができる。この場合、ポリメラーゼ複合体（〜１５ｋｂ）のすべての遺伝的能力を、特異的配列を有するｄｓＲＮＡの生成用に使用することができる。
【００４４】
使用するＲＮＡウイルス・ベクターがキャリア状態細胞の形で増幅することは、現在好ましい特徴である。この型のウイルス感染は大部分の感染細胞を破壊するわけではなく、したがって標的遺伝子の発現の時間を効果的に増殖させる。ウイルスが感染細胞に致命的ではない全ての形式が、ｄｓＲＮＡ生成に特に有用であろうことは明らかである。
【００４５】
現在好ましい実施形態では、組換えバクテリオファージφ６をキャリア状態の細菌シュードモナス・シリンゲ中で増殖させる。少なくとも幾つかの関連シストウイルスは、大腸菌およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に感染することが示されてきているので（Ｈｏｏｇｓｔｒａｔｅｎ他、２０００；Ｍｉｎｄｉｃｈ他、１９９９；Ｑｉａｏ他、２０００）、本発明の他の実施形態は、φ６、φ７、φ８、φ９、φ１０、φ１１、φ１２、φ１３およびφ１４の群から選択される組換えシストウイルスを含むキャリア状態のグラム陰性菌の使用に基づくものであろう。
【００４６】
他の特定の実施形態では、特別な細胞系、弱体化（弱毒化）ウイルス菌株、あるいはこの両方を使用することによって非致命的感染を実施することができる。第１の戦略の１例として、野生型φ６ウイルスに感染した後にキャリア状態細胞を形成する、シュードモナス・シリンゲ細胞の突然変異体が知られている。弱毒化ウイルスは天然に存在する突然変異体として選択することができ、あるいは人工的に工学処理することができる。場合によっては、ウイルス遺伝子の一部分を標的配列で置換して弱毒化ウイルスを得ることで十分事足りるであろう。興味深いことに、非致命的感染は、幾つかのウイルスの正常なライフ・サイクルに典型的である。その例には前述の酵母菌全ウイルスＬ−ＡおよびＬ−ＢＣがある。
【００４７】
非ウイルスＲＮＡベクター
ウイルス系ベクターの使用は多くの適用例に有利であるが、幾つかの実施形態は非ウイルス・ベクターを使用することができる。この戦略の１例としては、多様な欠陥干渉（ＤＩ）要素およびサテライトＲＮＡなどの、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって自然に複製される特異的要素を使用することが挙げられる。具体例には、大腸菌ファージＱβのＲｄＲＰによって増殖する小さなＲＮＡ、および酵母菌Ｌ−Ａウイルスの毒素をコードするサテライト（ＭＩ、Ｍ２、およびその他）がある（ＢｒｏｗｎおよびＧｏｌｄ、１９９５；Ｗｉｃｋｎｅｒ、１９９６）。
【００４８】
非ウイルス・ベクターの他の例は、例えば真菌および植物中で見られる自己遺伝因子の使用であろう。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株は、２０ＳＲＮＡおよび２３ＳＲＮＡと呼ばれる一本鎖レプリコンを含むことが多い。これらのうち２０ＳＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼをコードする（Ｗと呼ばれるｄｓＲＮＡ形を有する）外見上裸のＲＮＡレプリコンである。２３ＳＲＮＡもＲＮＡポリメラーゼをコードしており、Ｔと呼ばれるｄｓＲＮＡ形を有する（Ｗｉｃｋｎｅｒ、１９９６）。さらに、米などの幾つかの植物には、異なる筆者（Ｇｉｂｂｓ他、２０００）から「ＲＮＡプラスミド」または「エンドルナウイルス」などと呼ばれる広範囲のｄｓＲＮＡ要素が感染する。これらの要素はその独自のＲｄＲＰをコードしており、コート・タンパク質を欠いていると推測される。非ウイルス起源の多くのＲＮＡレプリコンは通常感染細胞は破壊しない。これは前に論じた有利な特徴である可能性がある。
【００４９】
ポリメラーゼの源
前述の実施形態では、ウイルスまたは非ウイルスＲＮＡベクター中に組み込まれる標的核酸を、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼによって複製する。様々な方法で前記ポリメラーゼを与えることができることは、当業者には明らかであろう。幾つかの実施形態では、ポリメラーゼは核酸を含むＲＮＡレプリコンによってコードされており、一方他の実施形態では、ポリメラーゼは宿主細胞と同時感染する他のＲＮＡレプリコンによってコードされるであろう。
【００５０】
さらに他の実施形態では、ポリメラーゼはＤＮＡによってコードされていてよく、それは染色体、プラスミド、ウイルス、トランスポゾンまたは他の起源であってよい。この形式の１例は、シストウイルス系ベクターに関して前に論じた。他の特定の実施形態では、標的配列をウイロイドＲＮＡ中に取り込むことができ、遺伝的に操作されたウイロイドＲＮＡの複製は、おそらく細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩによって行われ、この場合ＲＮＡ依存式に操作される（Ｌａｉ、１９９５）。他の実施形態では、ウイルス・ポリメラーゼ遺伝子を宿主細胞中にＤＮＡの形で導入することができ、細胞の転写および翻訳機構を使用して発現させることができる。
【００５１】
送達方法
ｄｓＲＮＡを大量産生するための方法の他の重要な態様は、核酸標的とポリメラーゼを接触させるために使用する手順である。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、複製可能な形の核酸標的と前記ポリメラーゼを生細胞中で接触させることによって、この作業を実施することができる。この目的のために、標的とポリメラーゼの両方を宿主細胞中に送達しなければならない。
【００５３】
ウイルス感染による送達、形質転換（細菌中）、トランスフェクション（真核細胞系中）、エレクトロポレーション、リポフェクション、衝撃法、アグロインフィルトレーション、マイクロインジェクションなどの範囲の異なる実施形態において、異なる送達方法を使用することができる。これらの方法および他の送達方法の記載は、他の場所で見ることができる。
【００５４】
実施例１に例示する現在好ましい実施形態では、バクテリオファージφ６ＲｄＲＰを、ウイルス感染を使用して宿主シュードモナス・シリンゲ細胞に送達する。異種配列はウイルス感染によって（φ６−ｎｐｔの場合と同様に）、あるいはエレクトロポレーションを使用して自殺ＤＮＡプラスミドの形で（φ６−ｂｌａの場合と同様に）送達する。
【００５５】
多くの実施形態において、マーカー遺伝子を含むＲＮＡレプリコンを送達することは有利である可能性がある。このようなマーカー遺伝子は、ＲＮＡレプリコンを含む細胞と残りの細胞を区別するために非常に有用であろう。実際、現在利用可能な送達方法は、通常は一部の処理済細胞のみが核酸標的をコードするＲＮＡレプリコンを得る点で、１００％有効というわけではないであろう。マーカー遺伝子の例は、抗生物質または毒素耐性遺伝子、アミノ酸またはヌクレオチド代謝の酵素をコードする遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。
【００５６】
ｄｓＲＮＡを大量産生するための方法
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｄｓＲＮＡの形の異種または相同配列を大量産生するために、ＲＮＡレプリコンを媒体として使用する方法を提供する。
【００５７】
この方法は、
ａ）生細胞中でＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製可能な形の核酸標的を与える工程と、
ｂ）前記複製可能な形の核酸標的と前記ポリメラーゼを、反応産物の１つが必ず二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡである鋳型指示ＲＮＡ合成に十分な条件下において接触させる工程と、
ｃ）十分純粋な形で前記ｄｓＲＮＡ産物を回収し、任意選択で性能を最適にするため前記産物を操作する工程とを含む。
【００５８】
２つの主な要件が、好ましい実施形態の選択に影響を与える。
（１）実質的な犠牲なしで多量の十分純粋なｄｓＲＮＡ分子を生成することは有利である。
（２）可能な限り最短の時間内で全ての方法の工程を行うことも有利である。
【００５９】
したがって、現在好ましい方法の実施形態は、シストウイルス、トティウイルスおよびパルティティウイルスなどの、原核生物および下級の真核生物に感染する組換えｄｓＲＮＡウイルスを使用する。これらのウイルスの宿主、通常は細菌および真菌は、容易かつ安価で増殖させることができ、したがって対応する組換えウイルスからｄｓＲＮＡを大量産生することができる。最も好ましい実施形態では、シストウイルス科由来のｄｓＲＮＡウイルスを、ｄｓＲＮＡの形で異種配列を増幅させるためのベクターとして使用する。他の実施形態は、ｄｓＲＮＡおよびｓｓＲＮＡ性の他のウイルスを確実に使用することができる。ｓｓＲＮＡウイルスの使用は理論上正当化される。何故ならこれらのウイルスの多くは、ｄｓＲＮＡ複製中間体を形成するからである。
【００６０】
ｄｓＲＮＡの形に転換しさらに増幅させる標的配列は、適切なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの制御下において、ＤＮＡベクターの形で宿主細胞に送達することがさらに好ましい。前記ＤＮＡベクター由来の転写産物は、核酸標的およびＲＮＡ複製に十分な配列を含むはずである。宿主細胞は、標的ＲＮＡ分子を複製することができる、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むはずである。
【００６１】
現在好ましい実施形態では、シュードモナス中では安定して増殖することはできないが細胞のＲＮＡポリメラーゼによって一過的に転写することができる自殺ＤＮＡプラスミドの形で、φ６ウイルスを有するシュードモナス・シリンゲのキャリア状態細胞中に、標的配列を送達する。標的はアンピシリンまたはセホタキシム耐性遺伝子などのマーカー遺伝子と物理的に連結し、したがって任意の検出可能な活性をコードする必要はない。標的配列のタンパク質への翻訳も任意選択である。φ６ポリメラーゼ複合体によって複製可能な形で標的分子を得た細胞は、マーカー遺伝子を発現し残りの細胞と区別されるであろう（例えばアンピシリン／セフィタキシミン耐性であろう）。
【００６２】
本発明の他の特定の実施形態は、キャリア状態のシュードモナス属、または他のグラム陰性菌、大腸菌またはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの中で増殖する、他の組換えシストウイルス（φ７〜φ１４）の使用に基づく。
ｄｓＲＮＡの形で増殖するとき、標的配列が実質的に変わらないことは有利であるので、好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコン増幅の時間を最小限に制限する。最も好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンを適切な細胞系内で１２〜９６時間、好ましくは２４〜４８時間増幅させる。
【００６３】
現在選択している実施形態では、実施例３に記載した特異的なフェノール／クロロホルム抽出および沈殿手順を使用して、キャリア状態細胞からｄｓＲＮＡを回収する。しかしながら、ｄｓＲＮＡ回収用の他の良く知られている方法、および市販のキットが利用可能である。このようにして得るｄｓＲＮＡ調製物は、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、微量の細菌染色体およびタンパク質を含む可能性がある。したがって、ｄｓＲＮＡ性質感度の適用例に関してはｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡおよびタンパク質不純物を除去する工程で、この精製手順を修正することが賢明である可能性がある。これらの工程は、アニオン交換クロマトグラフィー、セルロースまたはシリカ樹脂上での吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過、およびＤＮＡｓｅ、プロテアーゼまたはｓｓＲＮＡ特異的ＲＮａｓｅ処理を使用する精製だけには限られないが、これらを含むことができる。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡを単離したウイルス粒子から精製し、これによって不純物の量を減らすこともできる。
【００６４】
標的核酸の最大の大きさは、方法中で使用するＲＮＡゲノムに依存する。φ６に関しては、理論上の最大の大きさは１５ｋｂである。標的核酸の長さは約２０塩基から、好ましくは約５０塩基から１５０００塩基であってよく、より好ましくは、それは５０塩基から５０００塩基、さらにより好ましくは３００塩基から３０００塩基である。生成されるｄｓＲＮＡの量は培養培地１リットル当たり１〜５ｍｇであるが、最適化によって増殖させることができる。
【００６５】
ｄｓＲＮＡを大量産生するための生細胞系
本発明の１つの他の目的は、ｄｓＲＮＡを大量産生するための生細胞系である。この系は：
ＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンのＲＮＡ合成装置による複製に必要不可欠な決定因子と動作可能に連結した標的核酸配列と、
ＲＮＡウイルスまたは他のＲＮＡレプリコンの複製を支援することができる生細胞と、
十分純粋な形でｄｓＲＮＡ産物を回収するための回収手順とを含む。
【００６６】
細胞はキャリア状態であるか、あるいはキャリア状態に形質転換することができることが好ましい。ベクターは自殺ベクターであることが好ましい。
【００６７】
「十分純粋である」とは、ｄｓＲＮＡ産物がある適用例に関して求められるほど純粋であることをここでは意味する。純度は抽出工程後のある適用例に関して十分なものであってよく、その純度は８０または９０％である。ある適用例では、ｄｓＲＮＡが実際に均質になるまでに、幾つかの精製工程が必要とされる可能性がある。
【００６８】
ｄｓＲＮＡを大量産生するためのキット
本発明の１つのさらに他の目的は、ｄｓＲＮＡを大量産生するためのキットである。このキットは以下の要素の１つまたは複数を含み、以下の要素の少なくとも２つを含むことが好ましい：
ａ）キャリア状態であるかあるいはキャリア状態に形質転換することができる予め選択した細胞中での、標的核酸の一過性の発現用のベクターおよび／または
ｂ）標的核酸を導入することができる遺伝子操作ウイルスおよび／または
ｃ）キャリア状態であるかあるいはキャリア状態に形質転換することができる細胞。
ベクターは自殺ベクターであることが好ましい。
【００６９】
本発明のｄｓＲＮＡ産物の適用例
本発明の適用例の１例として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｄｓＲＮＡの形の異種配列を大量産生するための媒体としてＲＮＡレプリコンを使用する、ＲＮＡｉなどの配列特異的な遺伝子のサイレンシング効果を誘導するための方法を提供する。
【００７０】
この方法は：
ａ）生細胞中でＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製可能な形の核酸標的を与える工程と、
ｂ）前記複製可能な形の核酸標的と前記ポリメラーゼを、反応産物の１つが必ず二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡである鋳型指示ＲＮＡ合成に十分な条件下において接触させる工程と、
ｃ）十分純粋な形で前記ｄｓＲＮＡ産物を回収し、任意選択で性能を最適にするため前記産物を操作する工程と、
ｄ）前記純粋な、任意選択で操作されたｄｓＲＮＡ産物を使用して、生物、細胞または無細胞抽出物などの真核生物系中で配列特異的な遺伝子サイレンシング効果を誘導する工程とを含む。
【００７１】
本発明は、真核生物中で配列特異的な遺伝子サイレンシング効果を誘導するのに適した二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ誘導物質を生成するための、新規の戦略を提供する。ＲＮＡ抑制とも呼ばれる配列特異的な遺伝子サイレンシングの包括的記載は、他で見ることができる（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、２００２；Ｃｏｇｏｎｉ、２００１；Ｈａｎｎｏｎ、２００２；ＶａｎｃｅおよびＶａｕｃｈｅｒｅｔ、２００１）。簡潔にはＲＮＡ抑制は、ｄｓＲＮＡ誘導物質が真核生物中での標的遺伝子の発現の配列特異的な下方制御を誘導する一群の現象である。ｄｓＲＮＡ誘導物質が人工的に細胞中に導入されるＲＮＡ抑制の形式は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる。ＲＮＡｉの幾つかの重要な適用例は、機能的ゲノムから疾患治療の範囲で報告されてきている（Ｂａｒｓｔｅａｄ、２００１；Ｊａｃｑｕｅ他、２００２；Ｋａｍａｔｈ他、２００３；Ｌｕｍ他、２００３；ＭｃＣａｆｆｒｅｙ他、２００３；Ｎｏｖｉｎａ他、２００２；Ｐｅｋａｒｉｋ他、２００３）。
【００７２】
幾つかの適用例では、単離形で与えられるｄｓＲＮＡ誘導物質を生細胞または無細胞抽出物に投与して、遺伝子サイレンシング効果を誘導する。したがって、所望の配列のｄｓＲＮＡを生成するための幾つかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、従来技術において報告されている。大部分のこのような方法は、２つの自己相補的一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡを与える工程、およびこれらのｓｓＲＮＡを二重らせんにアニーリングする工程を含む。あるいは、単離ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｓｓＲＮＡの鋳型からｄｓＲＮＡを生成した（ＰＣＴ／ＦＩ００／０１１３５；ＷＯ０１／４６３９６）。
【００７３】
無脊椎動物、真菌、原生動物および植物において配列特異的な遺伝子サイレンシングを誘導することを目的とする特定の実施形態では、前に記載したのと同様に精製した広範囲のｄｓＲＮＡ誘導物質を同様に使用することができる。しかしながら脊椎動物では、長いｄｓＲＮＡが幾つかの非特異的効果を誘導することができ、一方１９〜２２ｎｔ長のｄｓＲＮＡ断片は、配列特異的な抑制のみを誘導する（ＭｃＭａｎｕｓおよびＳｈａｒｐ、２００２）。したがってそれは、脊椎動物または脊椎動物細胞系中でＲＮＡｉを誘導して長いｄｓＲＮＡを１９〜２２ｎｔ片に断片化することを含む、幾つかの実施形態に有利である可能性がある。リボヌクレアーゼＤＩＣＥＲおよびＲＮａｓｅＩＩＩによる加水分解を含めた幾つかの断片化法が、他の場所で記載されてきている（Ｍｙｅｒｓ他、２００３；Ｙａｎｇ他、２００２）。
【００７４】
以下の実施例は、本発明のさまざまな態様および実施形態の他の例示を提供する。本発明の範囲から逸脱せずに特定の詳細を変更することができることを、当業者は理解するであろう。
【実施例１】
【００７５】
ｄｓＲＮＡウイルスφ６のゲノム中への異種配列の導入、およびキャリア状態の宿主細菌の作製
１．１．細菌菌株およびプラスミド
大腸菌ＤＨ５αを、プラスミド増殖および遺伝子工学処理用の宿主として使用した。プラスミドｐＥＭ３５は、ｐＬＭ６５６のＰｓｔＩ部位にｐＵＣ４Ｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来のネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ）カセットを挿入することによって生成した（Ｏｌｋｋｏｎｅｎ他、１９９０）。φ６Ｍセグメントおよび挿入ｎｐｔ遺伝子をセンス方向にコードする正確なプラスミドを、制限分析を使用して選択した。ｐＥＭ３７を構築するために、φ６Ｍセグメントを含むＴｆｉＩ−Ｘｂａｌ断片をｐＬＭ６５６から切除し、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を使用してその両端を充填し、平滑断片はｐＳＵ１８ベクター（クロラムフェニコール耐性マーカー；（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ他、１９９１））中のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位に挿入した。ｐＥＭ３８を生成するために、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）遺伝子を、プライマー５’−ＴＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＴＡＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴ−３’（配列番号１）および５’−ＣＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡ−３’（配列番号２）およびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してｐＵＣ１８から増幅させた。生成したＰＣＲ断片は、ｐＥＭ３７のＰｓｔＩ部位にセンス方向に挿入した。
【００７６】
１．２．φ６−ｎｐｔキャリア状態細胞の構築
シュードモナス・シリンゲＨＢ１０Ｙに野生型φ６を感染させると、細胞溶解およびウイルス子孫の放出が最高潮に達する（Ｍｉｎｄｉｃｈ、１９８８）。しかしながら、カナマイシン耐性マーカーｎｐｔをφ６Ｍセグメント中に挿入すると、Ｋｍ含有培地上でキャリア状態の細菌を選択することができた（Ｏｎｏｄｅｒａ他、１９９２）。
【００７７】
我々はこの実験を繰り返して、Ｋｍ耐性菌株ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｎｐｔ）を得た。簡潔には、精製した組換えφ６プロキャプシド（ＰＣ）を、ｎｐｔ遺伝子（ＸｂａＩおよび緑豆ヌクレアーゼで処理したｐＥＭ３５由来のＴ７転写産物）を含む組換えｍ＋（φ６Ｍセグメントの一本鎖のセンス・コピー）、および野生型１＋およびｓ＋（ＬおよびＳの一本鎖のセンス・コピー）とｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージ化した。パッケージ化したｓｓＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＣ複製を使用してｄｓＲＮＡに転換し、粒子はφ６Ｐ８タンパク質でコーティングして、感染性ヌクレオキャプシドを生成した（Ｂａｍｆｏｒｄ他、１９９５）。これらを使用して、シュードモナス・シリンゲＨＢ１０Ｙの菌叢上で組換えウイルス・プラークを生成した。プラークの１つ由来の物質（クローン＃２６）を、３０μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋｍ）を含むＬＢ寒天プレート上に画線培養して、組換えウイルスを有するキャリア状態の細菌ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｎｐｔ）を選択した。ウイルスｄｓＲＮＡのアガロース・ゲル電気泳動、ならびにｎｐｔ特異的プライマー５’−ＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＡ−３’（配列番号３）および５’−ＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴ−３’（配列番号４）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって判断されるように、ｎｐｔ遺伝子を失わずにＫｍ含有ＬＢ寒天上またはＬＢ培地中において、これらを安定して増殖させることができると思われる。
【００７８】
予想したように、φ６−ｎｐｔウイルスのｄｓＲＮＡセグメントＭ（Ｍ−ｎｐｔ）は野生型Ｍより長く、一方φ６−ｎｐｔのＬおよびＳセグメントは通常の長さを有していた（図２Ａ、レーンφ６およびＫ）。
【００７９】
１．３．φ６−ｂｌａキャリア状態細胞の構築
精製ＲＮＡおよびウイルス・プロキャプシド（ＰＣ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いる操作、次にスフェロプラスト感染を含むφ６−ｎｐｔの構築（Ｂａｍｆｏｒｄ他、１９９５）。φ６−ｂｌａウイルス調製時のこれらの技術上の難点を回避するために、我々はＭｉｎｄｉｃｈおよび同僚（Ｍｉｎｄｉｃｈ、１９９９ｂ）によって最初に開発されたプラスミド系戦略を使用した（図１）。アンピシリン耐性マーカーｂｌａを含むφ６ＭセグメントをコードするプラスミドｐＥＭ３８を用いて、ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｎｐｔ）細胞を形質転換した。
【００８０】
形質転換用に、エレクトロポレーション用コンピテントＨＢ１０Ｙ（φ６−ｎｐｔ）細胞を、記載されたのと同様に調製した（Ｌｙｒａ他、１９９１）。これら（４０μｌ）は０．１ｍｇ／ｍｌのｐＥＭ３８でエレクトロポレーションに施した。細胞懸濁液は１ｍＭのＭｇＳＯ４を含む１ｍｌのＬＢで希釈し、２８℃で２時間インキュベートし、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天上に平板培養した。
【００８１】
ｐＥＭ３８はシュードモナス・シリンゲ中で複製することはできないが、他の大腸菌プラスミドに関して以前に示されたのと同様に（Ｍｉｎｄｉｃｈ、１９９９ｂ）、それは組換えＭセグメントの一過性の発現を指示することができる。ＲＮＡ転写物の幾つかは、ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｎｐｔ）細胞質中に存在するＰＣによってパッケージ化することができ、φ６−ｂｌａウイルスを生成することができる。実際、Ａｍｐ耐性コロニー（１０１〜１０２μｇ−１のＤＮＡ）が、ｐＥＭ３８の２８℃でのインキュベーションの４８〜７２時間後に出現したが、擬似形質転換プレート上では出現しなかった。Ａｍｐの存在下で安定して増殖することができると思われるＡｍｐ耐性クローンの１つを、後の実験用に使用した。φ６−ｂｌａのｄｓＲＮＡゲノム・セグメントの電気泳動分析によって、２つのＭセグメント種、Ｍ−ｎｐｔおよび１つの新しいセグメント、Ｍ−ｂｌａの存在、Ｍ−ｎｐｔとｗｔＭの間の移動が明らかになった（図２Ａ、レーンＡ０）。
【００８２】
１．４．キャリア状態の細菌はＲＮＡコード型抗生物質耐性遺伝子を含む
我々はＲＴ−ＰＣＲ分析を行って、ｂｌａ遺伝子は宿主ＤＮＡによってではなく、φ６−ｂｌａによって実際にコードされていることを確かめた。ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｂｌａ）から抽出した核酸を逆転写し、ｂｌａ特異的プライマーを使用して増幅させると、ｂｌａのＰＣＲ産物は容易に検出可能であった（図２Ｂ、レーン６）。しかしながら逆転写酵素なしでＲＴ工程を行うと、対照中に産物は出現しなかった（レーン５）。これはｂｌａ遺伝子のＲＮＡ性を強く示唆する。ｎｐｔ特異的プライマーを使用して、ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｂｌａ）細菌は検出可能な量のｎｐｔ遺伝子を有しており（レーン４）、ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｂｌａ）ＲＮＡの電気泳動分析と一致することも我々は確認した。予想したように、ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｎｐｔ）細胞は、ＲＮＡコード型ｎｐｔ遺伝子のみを含んでいた（レーン１〜３）。
【実施例２】
【００８３】
ｄｓＲＮＡの大量産生
２．１．キャリア状態の細菌からの全ＲＮＡの調製
２０〜４０個のキャリア状態のコロニーから集めたか、あるいは１．５ｍｌの液体培地からペレット状にした細菌細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＥＤＴＡ、８％（ｖ／ｗ）のスクロース３００μｌ中に再懸濁させた。リゾチームを１ｍｇ／ｍｌまで加え、混合物は５分間室温でインキュベートした。細胞は１％のＳＤＳによって３〜５分間で溶解させた。ＳＤＳおよび大部分の染色体ＤＮＡを、１．５Ｍの酢酸カリウム、ｐＨ７．５によって氷上に沈殿させた。０．７体積のイソプロパノールを加えることによって上清分画からＲＮＡを沈殿させた。ＲＮＡペレットを４００μｌのＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１ｍＭのＥＤＴＡ）中で溶解させ、等体積のフェノール−クロロホルムおよびクロロホルムを用いて連続的に抽出し、エタノールを用いて再沈殿させた。ペレットは７０％エタノールで洗浄し、１００μｌの滅菌水に溶かした。
【００８４】
２．２．ｂｌａ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲおよびクローニング
ウイルス・コードｂｌａ遺伝子のｃＤＮＡコピーを得るために、キャリア状態の細菌由来の全ＲＮＡ（１〜５μｇ）を、１０ｐｍｏｌの逆転写プライマー（５’−ＣＴＡＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＴ−３’）（配列番号５）と混合させ、１分間煮沸することによって変性させ氷上で冷やした。推奨されたのと同様に１時間４５℃において、ＡＭＶ−ＲＴ（Ｓｉｇｍａ）を使用して逆転写を行った。ＰｆｕとＴａｑＤＮＡポリメラーゼの混合物、ならびにプライマー５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＧＧＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡ−３’（配列番号６）および５’−ＣＡＡＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＴＡＣＡＡＣＧＡＣＴ−３’（配列番号７）を使用して、ｂｌａのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅させた。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ切断ＰＣＲ産物を同様に処理したｐＳＵ１８ベクターと連結させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。市販の自動塩基配列決定装置（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、クローン化したｂｌａ配列を決定した。
【００８５】
２．３．Ｃｔｘ適合型キャリア状態シュードモナス・シリンゲ細胞由来の遺伝子ｂｌａは、大腸菌内においてＣｔｘ耐性を与える
【００８６】
β−ラクタマーゼ遺伝子に対するセホタキシム選択の考えられる影響を特徴付けるために、Ａ０、Ｃ１〜Ｃ４、Ｃ７およびＣ１０継代由来のｂｌａのｃＤＮＡを、ｌａｃプロモーターの制御下でｐＳＵ１８（クロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性マーカーを含む大腸菌プラスミド）にクローン化した。大腸菌ＤＨ５αは生成したプラスミド・ライブラリーで形質転換し、Ｃｍ培地上に平板培養した。既存のセホタキシム特異的β−ラクタマーゼはアンピシリンにも耐性があるので（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、２００１）、我々は低いＡｍｐ濃度（５０μｇ／ｍｌ）を有するプレートを使用して、ｂｌａ挿入体を含むクローンに関してライブラリーをスクリーニングした。十分な量のβ−ラクタマーゼを、誘導なしでｌａｃプロモーターから生成した。Ａｍｐ耐性クローン由来の（マスターＣｍプレートから単離した）プラスミドは、ｂｌａ挿入体を常に含んでいた。逆に、Ｃｍに耐性があったがＡｍｐには耐性がなかった、幾つかのランダムに選択したクローンは、ｐＳＵ１８ベクターと同じ大きさであった。
【００８７】
我々は次に、ｐＳＵ１８およびφ６−ｂｌａ由来のｂｌａ挿入体を含む大腸菌は、Ｃｔｘにも耐性があるかどうかを調べた。この目的のために、１０６個までの細胞を、Ｃｍ上で増殖させたコロニーから５または１０μｇ／ｍｌのＣｔｘを含むプレートに移した。それぞれのライブラリーに関して分析した５０〜１００個のコロニーのうち、２２％のＣ１由来ｂｌａクローンが５μｇ／ｍｌのＣｔｘに実際に耐性があった。Ｃ２−、Ｃ３−、Ｃ４−、Ｃ７−およびＣ１０由来のライブラリーの場合、Ｃｔｘ耐性ｂｌａクローンの割合は、それぞれ７２、８１、９３、１００および１００％であり、５および１０μｇ／ｍｌのＣｔｘの存在下で大部分のクローンは増殖した。Ａ０由来のライブラリー中で、Ｃｔｘ耐性コロニーは検出されなかった。
【００８８】
キャリア状態の細菌細胞において得られた構築体は、富裕状態のＬＢ増殖培地中、あるいはバッチ培養、連続培養または大規模な発酵槽中で、適切な選択によって増殖させる。バッチ遠心分離または連続遠心分離を使用する遠心分離によって、細胞を採取する。前に記載したのと同様に、ＲＮＡを抽出し細胞ＲＮＡからｄｓＲＮＡを分離する。
【００８９】
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】自殺プラスミド戦略を使用して組換えＲＮＡレプリコンがどのようにして生成するかを、概略的に示す図である。この例は、β−ラクタマーゼ遺伝子を発現する組換えφ６ウイルスを含むキャリア状態シュードモナス・シリンゲ細胞（φ６−ｂｌａ）の構築を示す。
【図２】（Ａ）以下の菌株：Ｋ、Ｋｍ耐性ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｎｐｔ）；Ａ０、Ａｍｐ耐性ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｂｌａ）；ＨＢ、非感染ＨＢ１０Ｙ由来の、全ＲＮＡのアガロース・ゲル電気泳動の図である。レーンφ６、野生型φ６から抽出したｄｓＲＮＡセグメントＬ、ＭおよびＳ（シュードモナス・シリンゲの２３Ｓおよび１６ＳｒＲＮＡの位置と共に左側に示す位置）。Ｍｋ、ｄｓＤＮＡマーカー。ｋｂｐ長のマーカーを右側に示す。白色の矢じりは、Ａｍｐ耐性細胞中に出現する新しいセグメントＭ−ｂｌａを示す。（Ｂ）ｎｐｔ−およびｂｌａ−特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析を、Ｋ、ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｎｐｔ）およびＡ０、ＨＢ１０Ｙ（φ６−ｂｌａ）由来のＲＮＡを使用して行ったことを示す図である。反応２および５において逆転写（ＲＴ）工程を省略した。異なるＰＣＲプライマーを、図の下に示したように使用した。ｎｐｔおよびｂｌａ特異的ＰＣＲ断片の位置は右側に示す。ｄｓＤＮＡマーカー（Ｍｋ）の長さは左側に示す。
【図３】φ６−ｂｌａキャリア細胞がセホタキシムに迅速に適合することを示す図である。（Ａ）０．２〜１×１０７個のＨＢ１０Ｙ（φ６−ｂｌａ）キャリア状態細胞を、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐ１５０）または５０μｇ／ｍｌのセホタキシム（Ｃｔｘ５０）を含むＬＢ寒天上に平板培養した。Ｃｔｘ耐性コロニーが、２８℃でのインキュベーションの３日後に出現した。ｂｌａ遺伝子をコードするプラスミドを含む１×１０７個のＨＢ１０Ｙ（ｐＬＭ２５４）細胞を接種した部分上では、この時点ではコロニーは検出されなかった。（Ｂ）Ｃｔｘ適合実験の概略図である。以下のペトリ皿に示すように、高いＣｔｘ濃度（μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上で細胞を培養した。毎回の継代後に２０〜４０の最大コロニーを集め、後の選択ラウンド用に使用した。（Ｃ）上図は、継代Ａ０、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ７およびＣ１０でキャリア状態細胞から抽出したＲＮＡのアガロース・ゲル分析図である。ＨＢ、非感染ＨＢ１０Ｙ細胞由来のＲＮＡ。下図は、ｂｌａ−特異的プライマーを使用して生成したＲＴ−ＰＣＲ産物の図である。他の名称は、図２の記載中で定義したのと同様である。（Ｄ）異なる継代（Ａ０、Ｃ１、Ｃ４、Ｃ７およびＣ１０）または精製φ６ウイルス（φ６）由来のキャリア状態細胞の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ＯｌｋｋｏｎｅｎおよびＢａｍｆｏｒｄ、１９８９）の図である。ＨＢ、非感染ＨＢ１０Ｙ細胞。図中のＧ２５０、クーマシーＧ２５０染色ゲル断片はタンパク質Ｐ１．α−Ｐ１、α−Ｐ２、α−Ｐ４、およびα−Ｐ８のバンドを示し、イムノブロットは対応するφ６ヌクレオキャプシド（ＮＣ）タンパク質に特異的な抗体を使用して生成し、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって推奨されたのと同様にＥＣＬ検出を行った。（Ｅ）記載されたのと（ＢａｍｆｏｒｄおよびＭｉｎｄｉｃｈ、１９８０）同様に採取したＡ０およびＣ１０継代培養物由来の四酸化オスミウムおよび酢酸ウラニル染色細胞の薄い切片の、透過型電子顕微鏡写真の図である。黒色の矢じりはエンベロープで覆われたビリオンであり；白色の矢じりはＮＣおよびＰＣ粒子である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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