(57)【要約】菌類のＣＰＳ１遺伝子のオルソログと、菌類の鉄還元酵素及び透過酵素及び又はＭＦＳ輸送体遺伝子とを特定する方法、及びその使用方法を提示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、或いはその相補体を含むオープンリーディングフレームを備える核酸配列によりコードされるポリペプチドに十分に類似するポリペプチドをコードする菌類の核酸セグメントを含む分離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体を含むオープンリーディングフレームを備える核酸配列に十分に類似する菌類の核酸セグメントを含む分離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
厳密なハイブリダイゼーション条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体とハイブリッド形成する菌類の核酸セグメントを含む分離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、或いはその相補体のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５で構成される、請求項１、２、又は３の分離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
核酸セグメントが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ由来のものである、請求項１、２、又は３の分離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
核酸セグメントが、病原菌由来のものである、請求項１、２、又は３の分離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
核酸セグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６を含むポリペプチドに対する８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１の分離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
核酸セグメントが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６を含むポリペプチドに対する９０％の同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１の分離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１乃至８の任意の一つのポリヌクレオチドによってコードされる分離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１乃至８の任意の一つのポリヌクレオチドに機能的にリンクするプロモータを含む発現カセット。
【請求項１１】
請求項１乃至８の任意の一つのポリヌクレオチドを含み、安定した状態で宿主細胞へ形質転換することが可能である組み換えベクタ。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが、真核生物の宿主細胞内で機能可能なプロモータと機能的に結びつく、請求項１１のベクタ。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが、センス方向である、請求項１０の発現カセット又は請求項１１のベクタ。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、アンチセンス方向である、請求項１０の発現カセット又は請求項１１のベクタ。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドが、原核生物の宿主細胞内で機能可能なプロモータと機能的に結びつく、請求項１１のベクタ。
【請求項１６】
請求項１０の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１１のベクタを含む宿主細胞。
【請求項１８】
バクテリア、酵母、植物、及び哺乳類で構成されるグループから選択された、請求項１６又は１７の宿主細胞。
【請求項１９】
殺菌又は殺黴活性を有する作用因子を特定する方法であって、
ａ）菌類を請求項９のポリペプチドと結合する作用因子に接触させるステップと、
ｂ）殺菌又は殺黴活性を有する作用因子を特定するステップとを含む方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法によって特定された作用因子。
【請求項２１】
ポリペプチドの阻害物質を特定する方法であって、
ａ）請求項１乃至８の任意の一つのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する宿主細胞を作用因子に接触させるステップと、
ｂ）ポリペプチドの活性を阻害する作用因子を特定するステップとを含む方法。
【請求項２２】
請求項２０の方法によって特定された作用因子。
【請求項２３】
菌類の成長又は病原性を阻害する方法であって、前記菌類を、該菌類の成長又は病原性を阻害するのに十分な量である請求項２０又は２２の作用因子に接触させるステップを含む方法。
【請求項２４】
殺菌又は殺黴活性を有する作用因子を特定する方法であって、
ａ）菌類を請求項９のポリペプチドの活性を阻害する作用因子に接触させるステップと、
ｂ）殺菌又は殺黴活性を有する作用因子を特定するステップとを含む方法。
【請求項２５】
菌類の病原性に関連するポリペプチドを変調する作用因子を特定する方法であって、
ａ）菌類を請求項９のポリペプチドと結合する作用因子に接触させるステップと、
ｂ）菌類の病原性を変調する作用因子を特定するステップとを含む方法。
【請求項２６】
菌類の病原性を変調する作用因子を特定する方法であって、
ａ）菌類を請求項９のポリペプチドの活性を阻害する作用因子に接触させるステップと、
ｂ）菌類の病原性を変調する作用因子を特定するステップとを含む方法。
【請求項２７】
菌類病原体又はマイコゲンの表現型を改変する作用因子を特定する方法であって、
ａ）テストする作用因子を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６と十分に類似するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む菌類病原体又はマイコゲンに接触させるステップと、
ｂ）その作用因子が、ポリペプチドに関連する発現又は機能、或いは代謝経路を選択的に変調し、これにより、作用因子に接触させていない細胞と相対的に、細胞の表現型を改変するかどうかを検出又は判定するステップとを含む方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、毒性又は病原性と関連する、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記作用因子が、ポリペプチドの活性を改変する、請求項２７の方法。
【請求項３０】
殺菌、殺黴、又は抗病原活性を有する作用因子を特定するステップを更に含む、請求項２７の方法。
【請求項３１】
細胞の成長が、検出又は判定される、請求項２７の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドの活性が、検出又は判定される、請求項２７の方法。
【請求項３３】
毒性が、検出又は判定される、請求項２７の方法。
【請求項３４】
病原体が、前記ポリペプチドを発現する、請求項２７の方法。
【請求項３５】
病原体が、前記ポリペプチドを発現しない、請求項２７の方法。
【請求項３６】
菌類病原体又はマイコゲンの表現型を改変する作用因子を特定する方法であって、
ａ）テストする作用因子を、菌類病原体又はマイコゲンの一つ以上の細胞に接触させ、前記細胞が、請求項１乃至８の任意の一つによるポリヌクレオチドに対応する核酸配列に突然変異を有し、前記突然変異が、コードされたポリヌクレオチドの過剰発現又は過小発現を発生させるステップと、
ｂ）その作用因子が、ポリペプチドに関連する発現又は機能、或いは代謝経路を選択的に変調し、これにより、作用因子に接触させていない一つ以上の野生型細胞と相対的に、細胞の表現型を改変するかどうかを検出又は判定するステップとを含む方法。
【請求項３７】
前記経路が、毒素又はシデロフォアの生成に関連する、請求項２７又は３６の方法。
【請求項３８】
前記経路が、鉄の代謝、摂取、又は吸収に関連する、請求項２７又は３６の方法。
【請求項３９】
前記経路が、成長、毒性、又は病原性に関連する、請求項２７又は３６の方法。
【請求項４０】
請求項９のポリペプチドと特異的に結合する分離抗体。
【請求項４１】
モノクローナル抗体である、請求項４０の抗体。
【請求項４２】
ポリクローナル抗体である、請求項４０の抗体。
【請求項４３】
菌類が、組み換え菌類である、請求項１９、２３、２４、２５、２６、２７、又は３６の方法。
【請求項４４】
菌類が、前記ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子を含む、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記組み換えＤＮＡ分子が過剰発現する、請求項４３の方法。
【請求項４６】
菌類が、前記ポリペプチドに関するアンチセンス組み換えＤＮＡ分子を含む、請求項４４の方法。
【請求項４７】
菌類のゲノムが、前記ポリペプチドをコードする内因性遺伝子が発現しないように破壊される、請求項４４の方法。
【請求項４８】
菌類病原体による感染が疑われる動物に、効果的な量の請求項１９又は２２の作用因子を投与するステップを含む、治療方法。
【請求項４９】
動物又は植物に、菌類の成長又は繁殖を阻害又は防止するのに十分な時期及び条件下において、効果的な量の請求項１９又は２２の作用因子を投与するステップを含む、菌類病原体による動物又は植物の感染を防止又は阻害する方法。
【請求項５０】
前記動物が人間である、請求項５１又は５２の方法。
【請求項５１】
前記作用因子が局所的に投与される、請求項５１又は５２の方法。
【請求項５２】
請求項１乃至８の任意の一つのポリヌクレオチドの核酸配列。
【請求項５３】
コンピュータ可読媒体に格納された、請求項５２の核酸配列。
【請求項５４】
請求項９のポリペプチドのアミノ酸配列。
【請求項５５】
コンピュータ可読媒体に格納された、請求項５４のアミノ酸配列。
【請求項５６】
前記動物が免疫障害を有する、請求項４８又は４９の方法。
【請求項５７】
前記動物がコクシジオイデス症を有する、請求項４８又は４９の方法。
【請求項５８】
前記動物が免疫抑制療法を受けている、請求項４８又は４９の方法。
【請求項５９】
菌類の鉄代謝が阻害される、請求項４８又は４９の方法。
【請求項６０】
前記作用因子が植物に投与される、請求項４９の方法。
【請求項６１】
前記作用因子がスプレによって投与される、請求項６０の方法。
【請求項６２】
形質転換された植物で、そのゲノムが、菌類の鉄代謝又はシデロフォア生成を阻害することで、菌類病原体に対する耐性又は許容性を植物に与える遺伝子産物をコードするキメラＤＮＡ分子を発現する植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチドシンテターゼ遺伝子群、例えば、鉄還元酵素及び又は透過酵素又は主要ファシリテータ超科輸送体からの菌類、例えば、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓの遺伝子を含むＤＮＡ分子と、その使用法とに関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、２０００年１１月２２日出願の米国特許出願第６０／２５２，６４９号、および２０００年１１月２２日出願の米国特許出願第６０／２５２，７３２号の出願日の利益を請求し、これらの開示内容は参照により本明細書に援用する。
【０００３】
政府の権利に関する記述
本発明は、米国政府からの支援を受けて成されたものである（ＵＳＤＡ／ＮＲＩからの交付番号９６−３５３０３−３１９８）。米国政府は、本発明において特定の権利を有することができる。
【０００４】
【従来の技術】
Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属には約３０種が含まれ、その大半が、野草又は穀物の病原体である（ヨーダら，Ｔｈｅ Ｍｙｃｏｔａ Ｖｏｌ．５： Ｐｌａｎｔ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ， ＰａｒｔＡ， Ｂｅｒｌｉｎ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｃａｒｒｏｌｌ， ｅｄｓ．， ｐｐ． １４５−１６６ （１９９７）内）。Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓは、この属内で最も広く分布する種を意味し、世界の多くの熱帯及び亜熱帯地方で確認できる。トウモロコシの自然病原体として、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓは、古い文献においてトウモロコシの斑点病として頻繁に登場する病気を引き起こす（ドレクスラ，Ｊ． Ａｇｒ． Ｒｅｓ．， ３１：７０１ （１９２５）、ドレクスラ，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．， ２４：９５３ （１９３４）、ユー，”Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍａｙｄｉｓ，” ３６：３２７ （１９５２））。米国において、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓは、通常、温暖な南部州で見られるため、この病気は一般に、南部トウモロコシ葉枯病（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃｏｒｎ  Ｌｅａｆ  Ｂｌｉｇｈｔ）として知られている（フッカ，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．， １２：１６７（１９７４））。長年、南部トウモロコシ葉枯病は、風土病としてのみ知られ、米国において経済的な重大性を有するとはみなされなかった。しかし、１９７０年に、突如として深刻な流行病となり、米国のトウモロコシ収穫高の１５％を壊滅させ、推定１０億ドル超の損失を発生させた。この甚大な被害により、南部トウモロコシ葉枯病は、米国で最も広く知られる作物病の一つとなった。
【０００５】
この病気の発生以前には、この分野で知られていたＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのレースは一つのみ（Ｏレース）だった。１９６９年後半、この病気が流行した時、深刻な流行地域で収集された感染したトウモロコシの葉から新しい菌のレースが確認された。これは、Ｔ細胞質トウモロコシに関する高い毒性と、Ｔトウモロコシに特異的に影響するＴ毒素と呼ばれる植物毒素を生成する能力とから、まもなくＴレースとして指定された。対照的に、Ｏレースは、Ｔ毒素を生成せず、Ｔ細胞質及びＮ細胞質（標準細胞質）トウモロコシの両方に関して低い毒性を有する（フッカら，Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ． Ｒｅｐｔｒ．， ５４：１１０９ （１９７０）、シャイフェレ，”Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｌｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｌｌｅｎ Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｍａｉｚｅ，” ２５：１１０ （１９７０）、スミスら，Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ． Ｒｅｐ．， ５４：８１９ （１９７０）、ヨーダら，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ６５：２７３ （１９７５）、ヨーダら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｔｏｍｉｙａｍａ， ｅｄｓ．， ｐｐ． １６−２４ （１９７６）内、ヨーダ，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．， １８：１０３ （１９８０））。Ｔ細胞質は、テキサス雄性不稔細胞質を意味し、母性遺伝の雄性不稔の形質を備える独特な細胞質で、花粉を生成できないことにより特徴付けられる（レビングス，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５０：９４２ （１９９０））。Ｔ細胞質トウモロコシは、１９５０年代及び１９６０年代に、手作業又は機械での除雄をさけるために、雑種種子の生成及び育種に広く使用された。Ｔ細胞質トウモロコシが集中的に作付けされた面積の広さと、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＴレースの突然の出現とが共存することで、１９７０年の病気の流行が発生した。この発見により、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓによる病理発生を理解する扉が初めて開かれた。
【０００６】
初期の遺伝分析では、Ｔ毒素生成及びＴ細胞質トウモロコシに関する高い毒性の両方がＴｏｘ１として定められる単一の遺伝子座によって制御されることが示唆された（リーチら，Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．， ２１：３２７ （１９８２））。これは、親の表現型のみが１：１の比率（Ｔｏｘ＋：Ｔｏｘ−）で分離されたＴレースとＯレースとの間の交配によって実証され、Ｔ毒素を生成するすべての子孫はＴ細胞質トウモロコシに関して毒性が高くなり、Ｔ毒素を生成しないすべての子孫は毒性が弱くなる（ヨーダら，１９７５，前掲、リーチら，１９８２，前掲）。電気泳動的核型及び染色体特異的ＤＮＡハイブリダイゼーションの比較による更なる研究では、Ｔｏｘ１が相互転座中止点と密接に結びついており、Ｏレースにおいて欠失しているものと同じ量のＤＮＡのメガベース（大部分において反復性が高く、高Ａ＋Ｔ）に関連していることが指摘された（ブロンソン，Ｇｅｎｏｍｅ， ３０：１２ （１９８８）、ツェンら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １３０：８１ （１９９２）、チャンら，Ｇｅｎｏｍｅ， ３９：５４９ （１９９６））。驚くべきことに、Ｔｏｘ突然変異体の最近の分析では、Ｔｏｘ１が単一の座ではなく、二つの座であり、それぞれが異なる転座染色体に関することが明らかとなった（ヨーダら，Ｈｏｓｔ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｏｘｉｎ： Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｏｔｔｏｒｉ， Ｊａｐａｎ： Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｔｏｔｔｏｒｉ Ｕｎｉｖ．， Ｋｏｈｍｏｔｏ， ｅｄｓ．， ｐｐ． ２３−３２ （１９９４）内、タージオンら，Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｏｔ．， ７３：Ｓ１０７１ （１９９５））。これら二つのＴｏｘ１の座は、Ｔｏｘ１Ａ及びＴｏｘ１Ｂと指定された（ヨーダら，１９９７，前掲）。二つの遺伝子ＰＫＳ１及びＤＥＣ１は、この二つの座により、それぞれクローニングされ、これらは両方ともＴ毒素の生合成に必要であり、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＴレース分離物においてのみ見られる（ヤン，”Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｔ−Ｔｏｘｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ，” Ｐｈ． Ｄ． Ｔｈｅｓｉｓ， Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （１９９５）、ヤンら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８：２１３９ （１９９６）、ローズら，８ｔｈ Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ． Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔ．， Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ， ｐ． Ｊ−４９ （１９９６））。
【０００７】
遺伝分析では、更に、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓがＴ細胞質トウモロコシに関する高い毒性のためにＴ毒素を必要としていることが示唆された。この仮説は、様々な突然変異誘発手順を使用して誘発されたＴ毒素欠如突然変異体の生成によって最初にテストされた。密接なＴｏｘ−表現型を伴うすべての突然変異体は、Ｔ及びＮ細胞質トウモロコシの両方でテストした時、Ｏレースが引き起こすものと区別できない病徴を引き起こし、Ｔ毒素が実際に毒性因子であることを示唆した（ヤンら，１９９２、ルーら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１２６４９ （１９９４）、ローズら，（１９９６），前掲）。この結論は、野生型ＴレースゲノムにおけるＰＫＳ１又はＤＥＣ１の部位特異的分裂によって確実に裏付けられ、分裂体はＴ毒素を生成する能力を失い、Ｔトウモロコシ及びＮトウモロコシの両方でＯレース型の症状を引き起こす（ヤンら，１９９６，前掲、ローズら，１９９６，前掲）。こうした実験により、病理発生におけるＴ毒素の役割について、非常に明確な解答が得られた。これらは、更に、Ｔ毒素及びＴレース誘導Ｔｏｘ−突然変異体を生成しないＯレースがトウモロコシの有効な病原体であることから、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓによる病理発生が追加的な病原性因子を伴う必要があることを意味した。
【０００８】
いくつかの植物病原菌における全般的な病原性因子又は毒性因子として、多数の菌類分子が特定されている（ヨーダら，Ｊ． Ｇｅｎｅｔ．， ７５：４２５ （１９９６））。これらには、メラニン（ギエンら，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｎｅｗｓｌ．， ４１：４１ （１９９４））と、クチナーゼ（エーゼルら，Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔ．， ７：２８２ （１９９４））と、ポリガラクツロナーゼ及びキシラナーゼ（リングホルムら，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｎｅｗｓｌ．， ４２：４６ （１９９５））と等の潜在的な侵入因子、或いは、植物毒素の無毒化（シェファら，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：２４７ （１９８９））又は信号伝達経路の構成要素といったコロニ形成に関与することが可能なメカニズムが含まれる。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓは、オフィオボリン（又はコクリオボリン）と呼ばれる非宿主特異的毒素を生成することが知られており、これはＣ２５セスタテルペノイド化合物で、植物、バクテリア、菌類、及び線虫類を含む多くの有機体に対して毒性を有するが、オフィオボリンがＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓその他の植物病原菌による病理発生に関与している証拠は存在しない。いまのところＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓからその他の病原関連毒素は分離されていないが、密接に関連するＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種及びその他の病原菌類に関する研究では、この菌類群による病理発生には、ペプチド毒素も関与することが示唆されている。
【０００９】
四つのペプチド植物毒素（ビクトリン、ＨＣ毒素、ＡＭ毒素、及びエニアチン）は、病原性因子又は毒性因子として特徴付けられている。これらは、すべて小さな環状ペプチド（四乃至六残基）であり、異常なアミノ酸又はヒドロキシ酸を含み、植物毒性の観点において、宿主特異的又は非宿主特異的になる可能性がある。多数のペプチド植物毒素は、非リボソーム合成されると考えられる。１９６０年代の初めに、バクテリアペプチド抗生物質グラミシジン及びチロシジンを研究する数人の生化学者は、同じ抗生物質を生成することが知られているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓのＲＮＡアーゼ処理済み無粒子抽出物において、これらのポリペプチドを合成することが可能であり、この抽出物にタンパク質合成阻害物質を追加しても、このプロセスに影響がないことを発見した。これは、リボソーム及びｍＲＮＡを必要としないペプチド生合成系の存在を示している。更なる研究では、この系において、ペプチドがタンパク質鋳型で合成され、この鋳型自体が多機能酵素、或いは、集合的にペプチドシンテターゼと呼ばれる、こうしたいくつかの酵素の複合体であり、生合成プロセスを触媒することが明らかとなった（ラランドら，Ｅｓｓａｙｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７：３１ （１９７３）、リップマン，Ａｄｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２１：２７７ （１９８０））。
【００１０】
ペプチドシンテターゼは、様々なペプチドの生合成を触媒することが可能である。生物活性の観点において、これらは、抗生物質、酵素阻害物質、植物又は動物毒素、及び免疫抑制物質となる可能性がある（スタッケルハウスら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７０：６１６３ （１９９５））。化学構造の観点において、これらは、線状（つまり、ＡＣＶ、ペニシリン前駆体、及びグラミシジン）又は環状（大部分のもの）となる可能性がある。後者は、更に三種類の下位群に分類可能であり、１）「標準」環状ペプチド（つまり、グラミシジンＳ、チロシジン、ＨＣ毒素、サイクロスポリン）と、２）環状ラクトース（つまり、デストラキシン）と、３）環状デプシペプチド（つまり、ビューベリシン及びエニアチン）とになる。ペプチドシンテターゼにより活性化可能なカルボキシ化合物は、３００種類を上回る。
【００１１】
最初のペプチドシンテターゼ、グラミシジンＳシンテターゼは、１９６０年代の初めにペプチドの無細胞合成のために生成及び使用されたが（トミノら，Ｂｉｏｃｈｅｍ， ６：２５５２ （１９６７））、最初のバクテリアペプチドシンテターゼ遺伝子、ｔｙｃＡは、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓにおいてチロシジンシンテターゼ１をコードしており、ほぼ２０年後までクローニングされなかった（マラヒールら，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０１：１９８６ （１９８５））。これ以後、２０種類を超えるペプチドシンテターゼ遺伝子が、バクテリア及び糸状菌類の両方に関して報告されているが、完全なヌクレオチド配列が公開されているのは１４種類のみである。すべてが、３．３ｋｂよりも大きく、バクテリア遺伝子では３．３乃至１９．５ｋｂの範囲、菌類遺伝子では９．４乃至４５．８ｋｂの範囲である。興味深いことに、すべての菌類ペプチドシンテターゼ遺伝子では、イントロンの欠失が報告されており、これは４５．８ｋｂのオープンリーディングフレーム（これまでに記録されている最長のゲノムＯＲＦ）を有するサイクロスポリンＡシンテターゼ遺伝子ｓｉｍＡについても同様である。バクテリアペプチドの生合成は、関与する多機能酵素の数において、菌類のものとは異なるが、こうした酵素をコードする遺伝子は、機能及び構造の両方において、互いに類似している。
【００１２】
ヌクレオチド配列の比較により、各ペプチドシンテターゼ遺伝子の特定の位置において、一つ以上の保存性の高い領域が明らかになる。こうした領域は、以前は「アミノ酸活性化ドメイン」（スタッケルハウスら，１９９５，前掲）と呼ばれていたが、現在は「アミノ酸活性化モジュール」（マラヒール，Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ４：５６１ （１９９７））と呼ばれ、ドメイン（以前は「モジュール」と呼ばれた）のセットにより構成され、これは個別の構成アミノ酸又はヒドロキシ酸の認識、活性化、及びチオエステル化、及び場合によっては、ペプチド鎖への組み込み前の特定の残基の修飾に関するメチル化及びラセミ化といった特定の機能を有すると考えられる（スタッケルハウスら，１９９５，前掲）。この割り当てを裏付ける最も説得力のある証拠は、殆どのケースにおいて、各遺伝子又は遺伝子群において保存された機能単位の数がそれぞれのペプチドにおけるアミノ酸の数と等しいことである。こうした一対一の一致は、四種類の菌類ペプチドのうち三種類と、その生合成遺伝子との間で非常に明確である。四種類のバクテリア遺伝子群のうち三種類のモジュールの合計数も、それぞれのペプチドにおけるアミノ酸の数と一致する。
【００１３】
アミノ酸活性化モジュールの配列アラインメントにより、モジュール機能に関する活性残基を含む、厳密に保存された配列モチーフが明らかとなる。こうしたモチーフは、「コア配列」と呼ばれる（マラヒール，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ３０７：４０ （１９９２））。最小のアミノ酸活性化モジュールは、六つのコア配列を含む必要があり、その機能（コア１を除く）は、いくつかのペプチドシンテターゼの突然変異分析に基づいて提示されている。コア配列１乃至５は、アミノ酸アデニル化ドメインにグループ化され、コア６は、チオエステル形成ドメインとなる（図１Ａ）。すべてのバクテリアペプチドシンテターゼ遺伝子は、「タイプＩモジュール」を含み、これは以前「タイプＩドメイン」と呼ばれていた最小のアミノ酸活性化モジュールである（スタッケルハウスら，１９９５，前掲）。二種類の菌類遺伝子、ａｃｖＡ及びＨＴＳ１も、このモジュール構造を有する。タイプＩモジュールに加えて、二種類の菌類遺伝子、ｅｓｙｎ１及びｓｉｍＡは、タイプＩＩモジュールを含み、これにおいては、通常のタイプＩモジュールのコア５及び６の間に挿入（約４００アミノ酸）が見られる。この領域は、モチーフ（ＶＬＥ／ＤＸＧＸＧＸＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含み、これはＳ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ）依存性メチルトランスフェラーゼにおいて保存性が高いため、Ｎ−メチル化ドメインと呼ばれる（図１Ａ）。このモジュールのメチルトランスフェラーゼ活性の付加的な証拠は、ｅｓｙｎ１及びｓｉｍＡにおけるタイプＩＩモジュールの数及び位置が、エニアチン及びサイクロスポリン配列におけるＮ−メチル化アミノ酸のものと正確に一致することである（図１Ｂ）。
【００１４】
上で説明したモジュラ構造は殆どのペプチドシンテターゼ遺伝子で保存性が高いが、最も新しいクローン化ペプチドシンテターゼ遺伝子ｓａｆＢでは、いくつかの変種が見つかっており、これはサフラマイシンＭｘ１シンテターゼ遺伝子群における第一の遺伝子である（ポスピークら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４１：１７９３ （１９９５））。ｓａｆＢは、二種類のタイプＩアミノ酸活性化モジュールを含む。一方のモジュールは、六種類の高保存性コア配列をすべて有するが、他方は、アラニン（サフラマイシンＭｘ１の線状テトラペプチド前駆体における第一のアミノ酸）を活性化すると考えられ、コア５が欠失しており、弱保存性のコア１を有する（ポスピークら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４２：７４１ （１９９６））（図１Ａ）。これは、アミノ酸アデニル化ドメインの一部のモチーフが、不要であること、或いはドメインの機能にとって重要ではないことを示唆する。更に、未知のペプチドシンテターゼ遺伝子において、他の変種が発見される可能性を提起する。
【００１５】
Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓは１９７０年以降、典型的な真核植物病原体となっているが、この系において実施された殆どの分子遺伝子分析では、この菌類のＴレース分離物によるポリケチドＴ毒素の生成に焦点が当てられている。Ｔ毒素が南部トウモロコシ葉枯病において宿主特異的毒性因子であることは、現在では、確かな証拠により指摘されている（ヨーダら，Ｊ． Ｇｅｎｅｔ．， ７５：４２５ （１９９６）、ヨーダら，１９９７）。しかしながら、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓが追加因子を必要とすることは明らかであり、Ｔ毒素を生成しないＯレースが有効なトウモロコシ病原体となる可能性があるため、これはおそらく、トウモロコシ植物にとって病理発生の一般因子である。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓが病理発生のために必要とする追加的な一般因子を特定する試みは、成功していない。
【００１６】
そのため、必要な事柄は、病理発生に関連する新しい菌類分子の生合成を制御する追加的な菌類遺伝子、つまり、感染プロセスに干渉する可能性がある生成物の設計に関して潜在的な標的である遺伝子、及び菌類ペプチドシンテターゼ遺伝子の脊椎動物菌類オルソログの分離及び特徴付けである。
【００１７】
【発明が解決する課題】
本発明は、一般に、病理発生に関連する遺伝子産物をコードする核酸セグメントを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡ等の分離核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の一実施形態では、病理発生に関連する菌類遺伝子が特定される。本発明の利点は、殺菌剤又は殺黴剤として有効な遺伝子産物の新しい阻害物質の迅速な発見を可能にする新しい殺菌又は殺黴作用形態を特定する根拠を、本明細書で説明される遺伝子が提供することにある。加えて、本発明は、殺菌又は殺黴活性を有する阻害性化合物に関するアッセイ開発のために、菌類からの分離遺伝子又は遺伝子産物を提供し、これは、菌類においてこうした遺伝子産物の機能を阻害する作用因子、或いは活性を低減又は抑制する作用因子が、菌類にとって有害な影響を有する可能性が高く、優れた殺菌剤又は殺黴剤の候補となるためである。そのため、本発明は、更に、本発明の一つ以上の遺伝子によってコードされたポリペプチド、或いはこうしたポリペプチドを発現する細胞を使用して、ポリペプチドの阻害物質を特定する方法を提供し、この阻害物質は、次に、病原菌類の成長を抑制する殺菌剤として使用することが可能である。病原菌類とは、宿主をコロニ化し、病気を発生させる能力を有するものとして定義される。菌類病原体の例に含まれるのは、Ｓｅｐｔｏｒｉａ  ｔｒｉｃｉ、Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｓｔａｇｅｎｏｓｐｏｒａ  ｎｏｄｏｒｕｍ、Ｂｏｔｒｙｕｓ  ｃｉｎｅｒａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ、Ｃｏｌｌｅｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ、及びＥｒｉｓｙｐｈｅ  ｇｒａｍｉｎｉｓといった植物病原体、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ及びＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓといった植物病原卵菌、更にＢ．ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ等のＢｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ等のＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、又はＰ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等のＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ、Ｌｏｂｏａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｒｕｌａ、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｍａｎｓを含むＣｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓといった二形性菌類病原体、更にＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐｒａｐｓｏｌｏｓｉｓ、及びＣ．ｇｕｉｅｔｔｅｒｍｏｎｄｉｉ等のその他の病原性Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｕｓ  ｉｍｉｔｉｓ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｓｐｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ属、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ属、及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の病原性構成要素、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）  ｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｂａｎｔｉａｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｉｉ、Ｅｘｐｏｐｈｉａｌａ（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ）  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ  ｐｅｄｒｏｓｏｉ、及びＤａｃｔｙｌａｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａ���ａ（Ｏｃｈｒｏｃｏｎｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｕｍ）といったヒト病原体であり、マイコゲンが含まれる。本発明の方法によって特定される作用因子により使用するのに好適な菌類は、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａである。
【００１８】
【課題を解決する手段】
本発明の一実施形態において、本発明は、植物菌ＣＰＳ１、例えば、ＣｏＡリガーゼであるＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓからのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のオルソログをコードする核酸セグメントに関し、或いは、菌類の鉄の代謝、摂取、無機又は有機第二鉄塩の吸収を調節する遺伝子産物、例えば、菌類の鉄還元酵素、透過酵素、又はＭＦＳ輸送体、例えば、シデロフォア輸送体をコードする核酸セグメントで、遺伝子が遺伝子群においてＣＰＳ１に関連する可能性があるものを含む分離ポリヌクレオチドに関する。本明細書で説明するように、ＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓのＣＰＳ１遺伝子に関連するＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｕｓ  ｉｍｉｔｉｓ及びＣａｎｄｉｄａからの遺伝子が特定され、これは例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７又はその相補体をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６を含むオープンリーディングフレームを含む核酸配列である。ＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓのＣＰＳ１遺伝子は、密接に結びついたオープンリーディングフレームの群内に存在し、これは毒性及び又は病原性に関連する群であり、これにおいて、ＣＰＳ１は、非リボソーム性タンパク質シンテターゼ（ＮＲＰＳ）に関連するが別個である新しいクラスのアデニル化ドメイン含有酵素を表している。したがって、遺伝子群内の少なくとも一つの遺伝子は、菌類の毒性及び又は病原性に必要な、或いはこれに関連する、二次代謝生成物（小分子）の生合成を制御することができる。同様に、例えば、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｕｓ及びＣａｎｄｉｄａ内にあるもの等、説明するＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ遺伝子群のオルソログは、菌類の毒性に必要な、或いはこれに関連する、遺伝子産物をコードすることができる。更に本明細書において説明するように、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ鉄還元酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８によってコードされるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、及び透過酵素及び又はＭＦＳ輸送体タンパク質遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）は、ＣＳＰ１ペプチドシンテターゼ遺伝子、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ５３９９１）をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３２８７８）を含むＤＮＡ分子で、毒性及び又は病原性に関連する遺伝子群の一部であるものに、密接に結びつくことが確認された。
【００１９】
したがって、遺伝子群内の少なくとも一つの遺伝子は、菌類の成長、毒性及び又は病原性に必要な、或いはこれに関連する、少なくとも一つの二次代謝生成物又はその他の小分子の生合成を制御することができる。菌類が生成したシデロフォアは、菌類の成長を助けるために、環境又は宿主から鉄を封鎖することができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、毒性に関連する可能性が高い色素、例えば、ピオシアニンを生成する。ピオシアニンの誘導体、ピロシアニンは、鉄分の少ない条件下で、病原体の成長のために環境から鉄を封鎖する目的で生成されるシデロフォアである。鉄に関する競合は、宿主に対する悪影響を有する場合がある。同様に、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ鉄還元酵素又は透過酵素／輸送体、或いは鉄代謝に関連するその他の遺伝子産物は、Ｆｅに関して宿主と競合するため、菌類の病原性に寄与する。同様に、植物に感染する、或いは脊椎動物に感染する、その他の菌類のＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ遺伝子群内にある説明する遺伝子のオルソログは、鉄代謝遺伝子、例えば、毒素又はシデロフォアの分泌に関連する遺伝子を含め、菌類の毒性に必要な、或いはこれに関連する、遺伝子産物をコードする可能性がある。
【００２０】
好ましくは、この核酸セグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のいずれか一つを含む核酸配列によってコードされるポリペプチドと十分に類似しており、アミノ酸配列同一性が、好ましくは、少なくとも７０％、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％であり、及び更には９０％以上、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び少なくとも９９％までであるポリペプチドをコードする菌類遺伝子から、或いは、全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する部分長ポリペプチドをコードするその断片（一部）から、取得又は分離される。好ましくは、部分長ポリペプチドの活性は、全長ポリペプチドの活性の少なくとも５０％、一般的には少なくとも６０％、通常は少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％である。好適な部分長ポリペプチドは、対応する全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する。
【００２１】
更に提供されるのは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のいずれか一つを含むオープンリーディングフレームを含む核酸配列と十分に類似しており、ヌクレオチド配列同一性が、好ましくは、少なくとも７０％、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％であり、及び更には９０％以上、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び少なくとも９９％までである核酸セグメントを含む分離ポリヌクレオチドである。
【００２２】
本発明の別の態様は、下で説明するように、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の阻害物質を特定する方法に関連し、これは、ポリヌクレオチドを発現する遺伝子産物又は細胞を、潜在的な阻害物質化合物である作用因子に接触させることと、遺伝子産物の活性を減少させる化合物及び又は細胞の成長を阻害する化合物を選択することとを含む。別の実施形態において、本発明は、植物又はその他の有機体において本発明のＣＰＳ１オルソログを過剰発現させることで、植物又はその他の有機体に耐病性を与える方法に関連する。
【００２３】
本発明の核酸分子は、好ましくは、脊椎動物に感染する菌類の遺伝子から取得されるか、或いは分離可能であり、脊椎動物の一部には哺乳類が含まれ、これは例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及び七面鳥及び鶏等の鳥類といった家畜と、トリ、ネコ、及びイヌを含む家庭用ペットと、ヒトとであり、この遺伝子は病理発生に関連する。例えば、本発明の好適な核酸分子は、Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ（子嚢菌類）から取得されるか、或いは分離可能であり、本発明の作用因子は、本明細書で開示する様々な子嚢菌類のヒト（及び植物）病原体における、ＣＰＳ１、そのオルソログ、及び遺伝子群内の関連遺伝子の発見に基づいたＡｓｃｏｍｙｃｏｔａ感染による感染症を治療するのに有効である。病原性Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓのうち、該当するグループは以下の通りである：Ａｇｒｙｒｉａｌｅｓ、Ａｒｔｈｏｎｉａｌｅｓ、Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、Ｃａｌｉｃｉａｌｅｓ、Ｃａｌｏｓｐｈａｅｒｉａｌｅｓ、Ｃａｐｎｏｄｉａｌｅｓ、Ｃｈａｅｔｏｔｈｙｒｉａｌｅｓ（黒酵母）、Ｃｙｔｔａｒｉａｌｅｓ、Ｄｉａｐｏｒｔｈａｌｅｓ、Ｄｏｔｈｉｄｅａｌｅｓ、Ｅｌａｐｈｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｈａｌｅｓ（うどん粉病）、Ｅｕｒｏｔｉａｌｅｓ（緑及び青かび病）、Ｇｙａｌｅｃｔａｌｅｓ、Ｈａｌｏｓｐｈａｅｒｉａｌｅｓ、Ｈｅｌｏｔｉａｌｅｓ、Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ、Ｌａｂｏｕｌｂｅｎｉａｌｅｓ、Ｌｅｃａｎｏｒａｌｅｓ、Ｌｕｌｗｏｒｔｈｉａｌｅｓ、Ｍｅｌａｎｏｍｍａｔａｌｅｓ、Ｍｅｌｉｏｌａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏａｓｃａｌｅｓ、Ｍｙｒｉａｎｇｉａｌｅｓ、Ｎｅｏｌｅｃｔａｌｅｓ、Ｏｎｙｇｅｎａｌｅｓ、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａｔａｌｅｓ、Ｏｓｔｒｏｐａｌｅｓ、Ｐａｔｅｌｌａｒｉａｌｅｓ、Ｐｅｒｔｕｓａｒｉａｌｅｓ、Ｐｅｚｉｚａｌｅｓ、Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｌｅｓ、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｐｙｒｅｎｕｌａｌｅｓ、Ｒｈｙｔｉｓｍａｔａｌｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ、Ｔａｐｈｒｉｎａｌｅｓ、Ｔｅｌｏｓｃｈｉｓｔａｌｅｓ、Ｔｈｅｌｅｂｏｌａｃｅａｅ、Ｕｍｂｉｌｉｃａｒｉａｌｅｓ、Ｘｙｌａｒｉａｌｅｓ、アナモルフＡｓｃｏｍｙｃｏｔａ、未分類Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、及びＡｓｃｏｍｙｃｏｔａ  ｉｎｃｅｒｔａｅｓｅｄｉｓ。
【００２４】
Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ動物病原体に関して、好適なものは、病原性Ｏｎｙｇｅｎａｌｅｓで、詳しくはアナモルフＯｎｙｇｅｎａｌｅｓであり、これはｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓを含み、更にＯｎｙｇｅｎａｃｅａｅ及びそのＡｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓグループであり、これはＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ等のＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、及びＢｌａｓｔｏｍｙｃｏｉｄｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ等のＢｌａｓｔｏｍｙｃｏｉｄｅｓを含む。同じく好適なものは、病原性Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓで、更に好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓであり、更により好ましくはアナモルフＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｌｅｓであり、これはＣａｎｄｉｄａ種を含む。同じく好適なものは、Ｃｈａｅｔｏｔｈｙｒｉａｌｅｓで、更に好ましくはＨｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉｅｌｌａｃｅａｅであり、更により好ましくはアナモルフＨｅｒｐｏｔｒｉｃｈｉｅｌｌａｃｅａｅであり、更により好ましくはＥｘｏｐｈｉａｌａであり、これはヒト病原性有機体のＥｘｏｐｈｉａｌａ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ及びＥｘｏｐｈｉａｌａ  ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉを含む。同じく好適なものは、Ｏｎｙｇｅｎａｌｅｓであり、更に好ましくはＡｒｔｈｒｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅであり、更に好ましくはアナモルフＡｒｔｈｒｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅであり、更により好ましくはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎであり、これはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍを含む。別の好適なグループは、菌界ｉｎｃｅｒｔａｅ  ｓｅｄｉｓで、更に好ましくはＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｄａｃｅａｅであり、更により好ましくはＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓであり、これはヒト病原性Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉを含む。更に別の好適なグループは、Ｅｕｒｏｔｉａｌｅｓで、更に好ましくはＴｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅであり、更により好ましくはアナモルフＴｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅであり、更により好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種であり、これはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｖｅｎａｃｅｕｓ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓを含む。別の好適なグループは、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａｌｅｓの病原性菌類で、更に好ましくはＰｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅであり、更により好ましくはアナモルフＰｌｅｏｓｐｏｒａｃｅａｅであり、更により好ましくはＡｌｔｅｒｎａｒｉａ種であり、これはＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａを含む。同じく好適なものは、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ  ｉｎｃｅｒｔａｅ  ｓｅｄｉｓで、更に好ましくはＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅ、特にアナモルフＭｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｃｅａｅであり、更に好ましくはＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種であり、これは空気伝染性のヒト病原体を含む。同じく好適なものは、アナモルフＡｓｃｏｍｙｃｏｔａで、更に好ましくはＨｅｌｉｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ種である。Ｏｎｙｇｅｎａｌｅｓの中では、好ましくはアナモルフＯｎｙｇｅｎａｌｅｓであり、更に好ましくはＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種であり、これはＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓを含む。同じ好適なものは、Ｍｉｃｒｏａｓｃａｌｅｓで、更に好ましくはＭｉｃｒｏａｓｃ���ｃｅａｅであり、更により好ましくはＰｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ種であり、これはＰｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｂｏｙｄｉｉを含む。同じく好適なものは、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａｔａｌｅｓで、更に好ましくはＯｐｈｉｏｓｔｏｍａｔａｃｅａｅであり、更により好ましくはアナモルフＯｐｈｉｏｓｔｏｍａｔａｃｅａｅであり、更に好ましくはＳｐｏｒｏｔｈｒｉｘ種であり、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉを含む。
【００２５】
「十分に類似する」という用語は、ポリペプチドに関して本明細書で使用される時、あるポリペプチドが基準ポリペプチドに対応しており、このポリペプチドが基準ポリペプチドと実質的に同じ構造及び機能を有することを意味し、これは例えば、アミノ酸配列の変更点がポリペプチドの機能に影響を与えないもののみである場合等である。ポリペプチド又はアミノ酸配列について使用される時、十分に類似するものと基準ポリペプチド又はアミノ酸配列との間での同一性のパーセンテージは、少なくとも７０％、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％であり、及び更には９０％以上、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び少なくとも９９％までで、これにおいて、基準ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６を含む。二つのポリペプチドが互いに十分に類似することを示すものの一つは、ポリペプチドの一方と特異的に結合する抗体等の作用因子が他方と特異的に結合することである。
【００２６】
最も広い意味において、「十分に類似する」という用語は、ヌクレオチド配列又は核酸セグメントに関して本明細書で使用される時、あるヌクレオチド配列又はセグメントが基準ヌクレオチド配列又は核酸セグメントに対応しており、基準ヌクレオチド配列又は核酸セグメントによってコードされたポリペプチドと実質的に同じ構造及び機能を有するポリペプチドを、対応する配列がコードしていることを意味する。「十分に類似する」という用語では、具体的には、特定の細胞における発現を最適化するために配列が修飾されたヌクレオチド配列を含むことが意図されている。十分に類似するヌクレオチド配列と基準ヌクレオチド配列との間での同一性のパーセンテージは、少なくとも７０％、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％であり、及び更には９０％以上、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び少なくとも９９％までで、好ましくは、これにおいて、基準配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５又はその相補体を含む。配列比較は、スミス−ウォーターマン配列アラインメントアルゴリズムを使用して実行することができる（ウォーターマン，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｍａｐｓ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅｓ， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ （１９９５）又はｈｔｔｐ：／／ｈｔｏｕｓｃ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｅｑａｌｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ等を参照せよ）局所的Ｓプログラム、バージョン１．１６は、好ましくは、以下のパラメータで使用される：ｍａｔ：１、ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｐｅｎａｌｔｙ：０．３３、ｏｐｅｎ−ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ：２、ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ：２。更に、基準ヌクレオチド配列と「十分に類似する」ヌクレオチド配列は、中程度、厳密、又は非常に厳密なハイブリダイゼーション条件下で、基準ヌクレオチド配列とハイブリッド形成し、これは例えば、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃、及び２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄であり、更に望ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃、及び１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄であり、更に望ましくは同じく７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃、及び０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄であり、好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄であり、更に好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ内、５０℃、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄である。
【００２７】
したがって、本発明は、更に、未修飾配列に存在していないコドンを含めるために修飾された、或いはシャッフリングによって修飾された、組み換え核酸分子を含む。この本発明の組み換え核酸は、未修飾配列内に修飾コドンが存在するもの、及び異なるアミノ酸を指定するものを含み、つまり、これらは、未修飾配列によってコードされたポリヌクレオチドと相対的に一つ以上のアミノ酸置換を有する変種ポリヌクレオチドをコードする。
【００２８】
本発明は、更に、厳密な条件下で、本発明の核酸分子、同じく本発明の核酸分子によってコードされたＲＮＡ、同じく核酸分子によってコードされたＲＮＡとハイブリッド形成するもの（以下「テスト」配列）に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。厳密な条件下でハイブリダイゼーションが実行される時、本発明のテスト又は核酸分子は、好ましくは、例えばメンブレン又はＤＮＡチップで支持される。したがって、本発明の変性したテスト又は核酸分子は、好ましくは、最初に支持体に結合され、指定された期間に渡り、例えば５５乃至７０℃の温度で、０．１％ＳＤＳを含む二倍強度のクエン酸緩衝生理食塩水（ＳＣ）において、ハイブリダイゼーションが達成され、続いて、同じ温度で、ＳＣ濃度を低減した緩衝液により、支持体の洗浄が行われる。必要な厳密度に応じて、こうした濃度低減緩衝液は、通常、０．１％ＳＤＳを含む単一強度ＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む半強度ＳＣ、及び０．１％ＳＤＳを含む十分の一強度ＳＣとなる。
【００２９】
したがって、本発明の分離核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のオルソログを含み、これは、その中でコードされたポリペプチドのオルソログを含む。オルソログは、基準有機体からの遺伝子によってコードされた生成物と同じ機能を有する生成物をコードする異なる種からの遺伝子である。コードされたオルソログ生成物は、互いに少なくとも６８乃至７０％の（実質的な）配列同一性を有する可能性が高い。したがって、本発明の一実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５によってコードされたポリペプチドに対して少なくとも６８乃至７０％の同一性を有するポリヌクレオチドをコードする核酸セグメントを含んだ分離ポリヌクレオチドを含む。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでアクセス可能なＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースを利用して、こうした配列に関連する配列を特定することができる。代わりに、ハイブリダイゼーション又はＰＣＲ等の組み換えＤＮＡ手法を利用して、こうした配列に関連する配列を特定することができる。好適なオルソログは、Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ等のＢｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ等のＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、又はＰ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等のＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ、Ｌｏｂｏａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｒｕｌａ、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｍａｎｓを含むＣｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓといった二形性菌類病原体、更にＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｐｒａｐｓｏｌｏｓｉｓ、及びＣ．ｇｕｉｅｔｔｅｒｍｏｎｄｉｉ等のその他の病原性Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｕｓ  ｉｍｉｔｉｓ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｓｐｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ属、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ属、及びＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ属の病原性構成要素、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ（Ｘｙｌｏｈｙｐｈａ）  ｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｂａｎｔｉａｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｉｉ、Ｅｘｐｏｐｈｉａｌａ（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ）  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ  ｐｅｄｒｏｓｏｉ、及びＤａｃｔｙｌａｒｉａ  ｇａｌｌｏｐａｖａ（Ｏｃｈｒｏｃｏｎｉｓ  ｇａｌｌｏｐａｖｕｍ）といったヒト病原体、更に、その他のマイコゲンからのものを含む。
【００３０】
本発明は、更に、本明細書で説明する配列に対応するアンチセンス核酸分子を提供する。更に提供されるものは、発現カセット、例えば、組み換えベクタ及び宿主細胞であり、これは核酸セグメントがセンス方向又はアンチセンス方向である本発明の核酸分子を含む。更に提供されるものは、マイクロアレイであり、これは本発明の一つ以上の核酸分子又はその一部を含む。
【００３１】
生命にかかわる日和見真菌感染症の発生率が劇的に増加したため、真菌感染による病気が非常に重要であることが明らかとなった。患者の増加は、移植レシピエント及び免疫障害を有するその他の者、特にＡＩＤＳ患者において非常に顕著である。こうした脆弱なグループに関連する重篤な感染に加え、白癬及び鵞口瘡といった表在性感染も、以前より流行している。ヒト及び動物の病気の原因としての菌類の重要性が認識されているにもかかわらず、重篤な真菌感染症の多くは、依然として診断及び治療が困難である。したがって、免疫障害を有する脊椎動物を含め、脊椎動物の真菌感染症及びその合併症、例えば、肺炎と、インフルエンザ様疾患と、結節性紅斑と、有緑性紅斑と、関節炎と、多重薄壁慢性空洞と、栗粒性疾患と、骨関節感染症と、皮膚病と、軟組織腫瘍と、髄膜炎と、口腔咽頭炎と、食道炎と、膣炎と、爪真菌症と、眼内炎と、爪周囲炎と、尿管、腎臓、肝臓、脳、胃腸、及び肺の炎症とを治療する作用因子を特定する継続的な必要性が存在する。
【００３２】
したがって、本発明の別の態様は、菌類脊椎動物ＣＰＳ１オルソログ、又は本発明の菌類鉄還元酵素又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体の阻害物質を特定する方法に関連する。例えば、毒性に関連する生成物をコードする遺伝子、及びその遺伝子産物の活性と結びつく、或いは別の形で変更又は調節する作用因子、好ましくは、遺伝子産物の活性を不活性化又は減少させる（低減又は阻害する）作用因子を特定することができる。この方法は、（複数の）遺伝子産物又は（複数の）遺伝子産物を発現する細胞を作用因子に接触させることと、次に、作用因子が（複数の）遺伝子産物と結合したか、或いはその活性を低減したかどうかを判断又は検知することとを含む。こうした作用因子は、遺伝子産物又は細胞の表現型、例えば、遺伝子産物を発現する細胞の病原性等を調節又は変更する。調節又は変更は、活性の増加及び減少を含み、好ましくは、作用因子と接触した遺伝子産物又は遺伝子産物を有する細胞の活性における調節又は変更は、未処理の対照における活性に対して少なくとも１０％、又は少なくとも５０％である。特に、この方法は、ポリペプチドの活性を、例えば、未処理の対照における活性に対して少なくとも１０％、好ましくは５０％、阻害、低減、又は抑制する作用因子を特定するのに有効である。したがって、本発明は、更に、本発明の方法によって特定された作用因子を提供する。好適な作用因子は、例えば、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、又はＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓからのものといった二形性菌類病原体、及びＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．Ｐａｒａｐｓｏｌｏｓｉｓ、及びＣ．ｇｕｉｅｔｔｅｒｍｏｎｄｉｉ等の病原性Ｃａｎｄｉｄａによってコードされるもの等、本発明のポリペプチドの活性と結びつき、更に好ましくは阻害する。この方法では、野生型菌類及び又は組み換え菌類、例えば、アンチセンス配列又は遺伝子ノックアウトの発現の結果として、所定のポリペプチドを過剰発現する菌類、或いはこうしたポリペプチドを発現しない菌類等において、作用因子をスクリーニングすることを利用できる。作用因子がＤＮＡによってコードされるものである場合、植物等、病原体に影響されやすい有機体におけるそのＤＮＡの発現は、好ましくは病原体の感染を阻害又は防止することで、病原体に対する許容性又は耐性を有機体に提供する可能性がある。
【００３３】
本発明の方法は、有機体の細胞においてヌクレオチドの発現を促進することが可能なプロモータと機能的に結びつく許容性又は耐性を与える一つ以上の配列により、感受性有機体の細胞を安定した状態で転換することを含むことができる。
【００３４】
本発明の核酸分子又はポリペプチドのその他の使用法は、ポリペプチドを使用して、多クローン性抗体又は単クローン性抗体、例えばポリペプチドに特異的な抗体等を増加させ、脊椎動物の血清中の抗体、或いは、病原体の存在に関する診断アッセイ又は治療目的で利用可能な核酸分子に特異的なプライマ又はプローブ、及び、例えばアンチセンス方向の核酸分子を含む、或いは本発明の核酸分子に対応する少なくとも一つの遺伝子の少なくとも一部に欠失を有する宿主細胞を検出することである。更に、遺伝子がペプチドシンテターゼをコードする場合（ワタナベら，Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ３， ４６３ （１９９６））、遺伝子産物は、例えば、抗癌剤、抗体、又は免疫抑制剤等として、治療に有効なものとなる可能性がある。
【００３５】
本発明の方法によって特定された作用因子には、更なるアッセイを施し、治療を受ける植物又は脊椎生物に対して十分に無毒性であるかどうか、及び脊椎生物に投与する分量を判断することもできる。例えば、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓについては、マウスモデルを利用することができる（カークランドら，Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ４０：９１２ （１９８３）を参照）。このモデルは、本発明の作用因子のスクリーニングに使用することもできる。更に、治療される植物又は脊椎動物に対して無毒であるもの等、本発明の方法によって特定した作用因子は、表在感染症、皮下感染症、又は全身感染症を含む真菌感染症に伴う病気又は障害の予防又は治療に有効である。この方法は、免疫不全である脊椎動物等、こうした治療を必要とする脊椎動物又は植物に、菌類又はマイコゲンの感染又は成長を阻害又は予防するのに有効な量の本発明の作用因子を投与することを含む。例えば、ヒトと、家畜及び家庭用ペットを含むヒト以外の動物とは、本発明の作用因子により治療することが可能であり、これは例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及び七面鳥及び鶏等の鳥類といった家畜と、トリ、ネコ、及びイヌを含む家庭用ペットとである。好ましくは、この作用因子は、ヒト等の哺乳類に局所的に投与される。好適な植物には、穀物、例えばトウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、米、アブラナ属、カノーラ、大豆、大麦、大豆、甜菜、綿花、紅花、ピーナッツ、モロコシ、小麦雑穀、及びタバコが含まれる。
【００３６】
更に、本発明の作用因子は、アンフォテリシンＢ及びアゾールを含め、殺菌剤、殺黴剤、及びワクチン等、他の治療剤と併せて使用することができる。加えて、この作用因子は、土壌、或いは菌類が生残及び又は繁殖可能な表面エリア又は物質といった菌類汚染源を処理するために利用可能である。したがって、この作用因子は、土壌、或いは脊椎動物が接触することになるその他の表面に接触させることができる。こうした接触では菌類は排除されない可能性があるが、菌類又はその胞子が空気播種するリスクを減らすことができる。
【００３７】
更に提供されるものは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体のいずれか一つと十分に類似する核酸配列が格納されたコンピュータ可読媒体と、プロセッサ及びデータ記憶デバイスを備えるコンピュータシステムとであり、これにおいて、前記データ記憶デバイスはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体のいずれか一つと十分に類似する核酸配列を格納する。好ましくは、このコンピュータシステムは、前記配列の特徴を識別する識別子を備える。更に提供されるものは、コンピュータ可読形態で少なくとも一つのヌクレオチド配列を含むデータベースであり、これにおいて、前記ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体のいずれか一つと十分に類似する。このデータベースは、例えば、相同性を決定すること、配列をアラインメントすること、配列アラインメントを調整すること、重複配列を有する配列を組み立てること、遺伝子配列を予測すること、イントロン境界を予測すること、モチーフを特定すること、ドメインを特定すること、非翻訳調節配列を特定すること、及び推定される配列誤差を特定することを含む機能を実行し、機能ゲノム解析を実行し、或いは、ヌクレオチド配列のシャッフリングを実行する。
【００３８】
本発明は、更に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体と相同である少なくとも一つの領域を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成する方法を提供する。この方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体と一致する、或いは十分に一致する未修飾ヌクレオチド配列をシャッフリングすることを含む。結果として生じたシャッフル済みヌクレオチド配列を発現させ、これによりコードされた遺伝子産物を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５によってコードされたポリペプチドにおける活性と比較して変化した活性に関して選択する。更に提供されるものは、この方法によって取得可能である、或いは生成される、シャッフル済みヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子である。一実施形態において、シャッフル済みＤＮＡ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５によってコードされたポリペプチドの阻害物質に対する許容性が強化されたポリペプチドをコードする。シャッフル済みＤＮＡ分子は、植物細胞等の宿主細胞に導入されるキメラ分子を形成するプロモータと機能的に結びつくことができる。
【００３９】
発明の詳細な説明
定義
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びその一本鎖又は二本鎖形態のポリマを指し、糖、リン酸塩、及びプリン又はピリミジンである塩基を含むモノマ（ヌクレオチド）により構成される。明確に限定されない限り、この用語は、基準核酸に類似する結合特性を有し、自然発生したヌクレオチドに類似する形で代謝される、天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。別の表示がない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたその変異（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列と、明示的に示された配列とを黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、一つ以上の選択された（又はすべての）コドンの第三の位置が混合塩基及び又はデオキシイノシン残基により置換される配列を生成することで達成することができる（ベイツァーら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．， １９：５０８ （１９９１）、オーツカら，ＪＢＣ， ２６０：２６０５ （１９８５）、ロッソリーニら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ， ８：９１ （１９９４））。ヌクレオチドは、通常、ホスホジエステル結合により接合されるが、ペプチド結合により接合された重合ヌクレオチド（ペプチド核酸）も含まれる（ニールソン及びエグホルム，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ， Ｎｏｒｆｏｌｋ ＵＫ， １９９９）。「核酸断片」は、一定の核酸分子の破片である。大部分の有機体のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、遺伝物質であり、一方、リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡに含まれる情報のタンパク質への転換に関与する。「ヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖又は二本鎖であるＤＮＡ又はＲＮＡのポリマを指し、これはＤＮＡ又はＲＮＡポリマへ組み込むことが可能な合成、非天然、又は改変ヌクレオチド塩基を随意的に含む。「核酸」、「核酸分子」、「核酸断片」、又は「核酸配列又はセグメント」という用語は、遺伝子、遺伝子によってコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡ、及びＲＮＡと相互に交換して使用することができる。
【００４０】
本発明は、分離された、或いは十分に精製された、核酸又はタンパク質組成を包含する。本発明のコンテクストにおいて、「分離された」又は「精製された」ＤＮＡ分子、或いは「分離された」又は「精製された」ポリペプチドとは、人間の手を経て、天然の環境から離れて存在するＤＮＡ分子又はポリペプチドであり、したがって、これは天然物ではない。分離されたＤＮＡ分子又はポリペプチドは、精製された形態で存在する場合があり、或いは、非天然環境、例えばトランスジェニック宿主細胞に存在する場合がある。例えば、「分離された」又は「精製された」核酸分子又はタンパク質、又はその生物活性部分は、その他の細胞物質、又は組み換え手法で生成される時の培地を実質的に含んでおらず、或いは、科学的に合成される時の化学先駆物質又はその他の化学物質を実質的に含んでいない。一実施形態において、「分離された」核酸は、その核酸が誘導された有機体のゲノムＤＮＡにおいて自然状態で核酸の側面に位置する配列（つまり、核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を含んでいない。例えば、様々な実施形態において、分離された核酸分子は、その核酸が誘導された細胞のゲノムＤＮＡにおいて自然状態で核酸分子の側面に位置するヌクレオチド配列を約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満含むことができる。細胞物質を実質的に含んでいないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量）の汚染タンパク質を有するタンパク質又はポリヌクレオチドの調製物が含まれる。本発明のタンパク質、又はその生物活性部分が、組み換えにより生成される時、好ましくは、培地は、約３０％、２０％、１０％、又は５％（乾燥重量）の化学先駆物質、或いは当該タンパク質ではない化学物質を表す。開示するヌクレオチド配列及びタンパク質又はこれによってコードされる部分長タンパク質の断片及び変異体も、本発明に包含される。
【００４１】
「断片」又は「一部」とは、ポリペプチド又はタンパク質をコードする全長又は全長未満の核酸配列、或いはポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を意味する。代わりに、ハイブリダイゼーションプローブとして有効なヌクレオチド配列の断片又は部分は、一般に、生物活性を保持する断片タンパク質をコードしない。したがって、ヌクレオチド配列の断片又は部分は、少なくとも約６ヌクレオチドから、約９ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド以上の範囲にすることができる。「一部」又は「断片」は、本発明の核酸分子、配列、又はセグメントに関連する際には、発現のために他の配列と結びつく時、少なくとも８０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも４００ヌクレオチドを有する配列を意味する。発現に利用されない場合、「一部」又は「断片」は、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列に対応する、少なくとも６、約９、好ましくは１２、更に好ましくは１５、更により好ましくは２０の連続するヌクレオチド、例えばプローブ及びプライマ（オリゴヌクレオチド）等を意味する。
【００４２】
「耐性」とは、病原体による感染の結果として、実質的に表現型の変化を示さない植物又は動物等の有機体を意味する。「許容性」とは、病原体による感染の結果として、ある程度の表現型の変化を示す場合があるものの、繁殖能力が減少しない、或いは代謝の実質的な変化がない有機体を意味する。
【００４３】
「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連する核酸の任意のセグメントを指すために広義で使用される。したがって、遺伝子は、その発現に必要なコード配列及び又は調節配列を含む。例えば、遺伝子は、調節配列を含め、ｍＲＮＡ、機能ＲＮＡ、又は特異的タンパク質を発現する核酸断片を指す。遺伝子は、更に、例えば他のタンパク質の認識配列を形成する、非発現ＤＮＡセグメントを含む。遺伝子は、所定のソースからクローニングすること、或いは既知の配列情報又は予測される配列情報から合成することを含め、様々なソースから取得可能であり、望ましいパラメータを有するように設計された配列を含むことができる。
【００４４】
「自然発生」は、人間によって人工的に生成されるものを除外して、自然状態で発見することが可能な対象物を説明するために使用される。例えば、有機体内（ウイルスを含む）に存在するタンパク質又はヌクレオチド配列で、自然状態のソースから分離可能であり、実験室で人間によって意図的に修飾されていないものは、自然発生である。
【００４５】
「標識遺伝子」は、選択可能又はスクリーニング可能な形質をコードする。
【００４６】
「選択標識」は、細胞内での発現がその細胞に選択的な利点を与える遺伝子である。選択標識遺伝子により形質転換された細胞が保有する選択的利点は、非形質転換細胞の成長と比較して、抗生物質又は除草剤といった負の選択的作用因子が存在する状態で成長できる能力によるものである場合がある。形質転換された細胞が保有する選択的利点は、非形質転換細胞と比較して、付加された化合物を栄養素、成長因子、又はエネルギ源として利用できる強化された能力又は新しい能力によるものである場合もある。選択標識遺伝子は、更に、細胞内での発現がその細胞に負及び又は正の選択的利点の両方を与える遺伝子又は遺伝子の組み合わせを指す。
【００４７】
「キメラ」という用語は、（１）調節配列及びコード配列を含め、自然状態で共に発見されないＤＮＡ配列、或いは（２）自然状態で隣接しないタンパク質の部分をコードする配列、或いは（３）自然状態で隣接しないプロモータの部分、を含む任意の遺伝子又はＤＮＡを指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースから誘導された調節配列及びコード配列を含む場合があり、或いは、同じソースから誘導された調節配列及びコード配列を含むが、自然状態で確認されるものとは異なる形で配列される。
【００４８】
「導入遺伝子」は、形質転換によりゲノムに導入され、安定した状態で維持される遺伝子を指す。導入遺伝子は、例えば、形質転換される特定の植物のＤＮＡと非相同的又は相同的なＤＮＡを含む場合がある。加えて、導入遺伝子は、ネイティブではない有機体又はキメラ遺伝子に挿入されたネイティブの遺伝子を含むことができる。「内因性遺伝子」という用語は、有機体のゲノムにおいて自然な位置にあるネイティブの遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、通常は宿主有機体で見られないが、遺伝子導入によって導入された遺伝子を指す。
【００４９】
「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、相互に交換できるものとして使用される。
【００５０】
「変異体」とは、十分に類似する配列を意図するものである。ヌクレオチド配列に関して、変異体は、遺伝コードの縮重によって、ネイティブのタンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。このような自然発生の対立遺伝子変異体は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション手法のように、広く知られた分子生物学的手法を使用して特定できる。変異体ヌクレオチド配列は、例えば、ネイティブのタンパク質をコードする部位特異的突然変異誘発を使用して生成されるもの、及びアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするもののように、合成的に誘導されたヌクレオチド配列を更に含む。一般に、本発明のヌクレオチド配列変異体は、少なくとも４０、５０、６０、７０％まで、例えば、好ましくは７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％まで、一般には少なくとも８０％、例えば、８１％乃至８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％まで、ネイティブ（内因性）のヌクレオチド配列に一致する配列を有する。
【００５１】
「ＤＮＡシャッフリング」は、突然変異又は再配列を、好ましくはランダムに、ＤＮＡ分子に導入する方法であり、或いは、二つ以上のＤＮＡ分子間でＤＮＡ配列を、好ましくはランダムに、交換する方法である。ＤＮＡシャッフリングの結果として生じたＤＮＡ分子は、少なくとも一つの鋳型ＤＮＡ分子から誘導された非自然発生ＤＮＡ分子であるシャッフル済みＤＮＡ分子である。シャッフル済みＤＮＡは、好ましくは、鋳型ＤＮＡによってコードされたポリペプチドに関して修飾された変異体ポリペプチドをコードし、鋳型ＤＮＡによってコードされたポリペプチドに関して改変された生物活性を有する可能性がある。
【００５２】
本発明の核酸分子は、所定の有機体における発現の強化のために最適化することができる（ワダら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８：２３６７ （１９９０））。植物に関しては、例えば、ＥＰＡ０３５４７２、ＷＯ９１／１６４３２、パーラクら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：３３２４ （１９９１）、及びマーレら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｄｓ Ｒｅｓ． １７：４７７ （１９８９）を参照せよ。この方法において、遺伝子又は遺伝子断片は、植物に好適なコドンを利用して合成することができる。例えば、キャンベル及びゴウリ，１９９０の宿主に好適なコドンの使用法に関する議論を参照せよ。したがって、核酸配列は、任意の植物における発現のために最適化することができる。遺伝子配列のすべて又は任意の部分を最適化又は合成可能であることが認識されている。つまり、合成又は部分的に最適化された配列を使用することも可能である。変異体ヌクレオチド配列及びタンパク質は、ＤＮＡシャッフリング等の突然変異誘発及び組み換え誘発手順により誘導された配列及びタンパク質も包含する。こうした手順により、一つ以上の異なるコード配列を操作し、望ましい特性を有する新しいポリペプチドを作成することができる。この方法では、十分な配列同一性を有し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの相同組み換えが可能な配列領域を含んだ、関連する配列のポリヌクレオチド集団から、組み換えポリヌクレオチドのライブラリが生成される。こうしたＤＮＡシャッフリングの戦略は、この技術で知られている。例えば、ステマ，Ｎａｔｕｒｅ， ３７０：３８９ （１９９４）、クレイメリら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １５：４３６ （１９９７）、ムーアら，ＪＭＢ， ２７２：３３６ （１９９７）、チャンら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：４５０４ （１９９７）、クレイメリら，Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：２８８ （１９９８）、及び米国特許第５，６０５，７９３号及び第５，８３７，４５８号を参照せよ。
【００５３】
特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」は、同一又は基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指し、或いは、核酸配列がアミノ酸配列をコードしない場合、基本的に同一な配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、任意の一定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧは、すべてアミノ酸アルギニンをコードする。したがって、コドンがアルギニンを指定するあらゆる位置において、このコドンは、コードされたタンパク質を変更することなく、説明した対応コドンのいずれかに改変することができる。こうした核酸変異体は、「保存的に修飾された変異」の一種の「サイレント変異」である。本明細書で説明する、ポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、特別な注記がある場合を除き、考えられるすべてのサイレント変異を同様に表すものとする。同業者が認識するように、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに関する唯一のコドンであるＡＴＧを除く）は、標準的な手法によって、機能的に同一の分子が生じるように修飾することができる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各「サイレント変異」は、説明される各配列において暗黙のものとなる。
【００５４】
「組み換えＤＮＡ分子」は、例えば、サンブルックら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）において説明されるような、ＤＮＡ配列を共に接合するために使用される組み換えＤＮＡ手法及び手順を使用して、共に接合されたＤＮＡ配列の組み合わせである。
【００５５】
「非相同的ＤＮＡ配列」、「外因性ＤＮＡセグメント」、又は「非相同核酸」という用語は、それぞれ、特定の宿主細胞にとって外来のソースを起源とする配列を指し、或いは、同じソースである場合、オリジナルの形態から修飾された配列を指す。したがって、宿主細胞中の非相同遺伝子は、特定の宿主細胞にとって内因性だが、例えばＤＮＡシャッフリングの使用を通じて修飾されたものを含む。この用語には、自然発生ＤＮＡ配列の多数の非自然発生型コピーも含まれる。したがって、この用語は、細胞にとって外来又は非相同的であるＤＮＡセグメント、或いは、細胞にとって相同的だが、宿主細胞の核酸の中で、通常はその要素が見られない位置にあるＤＮＡセグメントを指す。外因性ＤＮＡセグメントを発現させることで、外因性ポリペプチドが生じる。
【００５６】
「マイクロアレイ」は、本明細書での使用において、固体支持体、及び支持体に付着する種類の異なる複数のオリゴヌクレオチドである。種類の異なるそれぞれのオリゴヌクレオチドは、固体支持体表面の様々な定義領域に付着し、決定可能な様々な配列を有し、少なくとも六ヌクレオチドの長さである。好ましくは、種類の異なるオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体から選択されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの領域から誘導される。
【００５７】
「相同」ＤＮＡ配列は、導入される宿主細胞と自然状態で関連するＤＮＡ配列である。
【００５８】
「野生型」は、通常の遺伝子を指し、例えば、任意の既知の突然変異が無い自然状態で見られる特定の集団又は有機体において、最も高い頻度で確認される遺伝子等を指す。
【００５９】
「ゲノム」は、有機体の完全な遺伝物質を指す。
【００６０】
「ベクタ」の定義は、特に、一本鎖又は二本鎖の線状又は環状形態である任意のプラスミド、コスミド、ファージ、又はバイナリベクタで、自己伝達性又は移動性である場合又はそうでない場合があり、細胞ゲノムへの組み込みによって、或いは染色体外に存在することによって（例えば、複製の起源を有する自律複製プラスミド）、原核生物又は真核生物の宿主を形質転換できるものを含む。
【００６１】
具体的には、シャトルベクタが含まれ、これは、放線菌類及び関連する種と、バクテリアと、真核生物（例えば、高等植物、哺乳類、酵母、又は菌類細胞）とから選択可能な二種類の宿主有機体において、自然に又は計画的に、複製する能力を有するＤＮＡ伝播体を意味する。
【００６２】
「クローニングベクタ」は、通常、ベクタの基本的な生物学的機能を損なうことなく、確定可能な方法で、外来ＤＮＡ配列を挿入できる一つ又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位と、クローニングベクタにより形質転換された細胞の特定及び選択に使用するのに適した標識遺伝子とを含む。標識遺伝子は、通常、テトラサイクリン耐性、ハイグロマイシン耐性、又はアンピシリン耐性を提供する遺伝子を含む。
【００６３】
「発現カセット」は、本明細書での使用において、適切な宿主細胞で特定のヌクレオチド配列の発現を方向付けることが可能なＤＮＡ配列を意味し、終止信号と機能的に結びついた所定のヌクレオチド配列と機能的に結びつくプロモータを含む。更に、通常、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含む。コード領域は、通常、所定のタンパク質をコードするが、所定の機能ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡを、アンチセンス方向の意味においてコードすることもできる。所定のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラにすることが可能であり、これは、その構成要素の少なくとも一つが他の少なくとも一つの構成要素に関して非相同的であることを意味する。発現カセットは、自然発生ではあるが、非相同的発現に有効な組み換え形態で取得されたものにすることもできる。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞が何らかの特定の外的刺激に晒された時のみ転写を開始する構成プロモータ又は誘導プロモータの制御下におくことができる。多細胞有機体の場合、このプロモータは、特定の組織又は器官、或いは発達段階に対して特異的にすることもできる。
【００６４】
こうした発現カセットは、所定のヌクレオチド配列に結びつく本発明の転写開始領域を含む。こうした発現カセットには、調節領域の転写調節下におかれる所定の遺伝子の挿入に関する複数の制限部位が提供される。この発現カセットは、選択可能な標識遺伝子を追加的に含むことができる。
【００６５】
転写カセットは、５’乃至３’の転写方向で、植物において機能する転写及び翻訳開始領域と、所定のＤＮＡ配列と、転写及び翻訳終止領域とを含む。終止領域は、転写開始領域に対してネイティブにすることが可能であり、所定のＤＮＡ配列に対してネイティブにすることが可能であり、或いは、別のソースから誘導することができる。植物での発現に関して、都合の良い終止領域は、オクトピンシンターゼ及びノパリンシンターゼ終止領域のように、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉ−プラスミドから入手可能である。ゲルノら，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２６２：１４１ （１９９１）、プラウドフット，Ｃｅｌｌ， ６４：６７１ （１９９１）、サンファコンら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ５：１４１ （１９９１）、モーゲンら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２：１２６１ （１９９０）、マンロら，Ｇｅｎｅ， ９１：１５１ （１９９０）、バラスら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７：７８９１ （１９８９）、ジョーシら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５：９８２７ （１９８７）を参照せよ。
【００６６】
本発明の核酸分子に対応するオリゴヌクレオチドは、長さ３０ヌクレオチド以下にすることができる（例えば９、１２、１５、１８、２０、２１、又は２４、或いは９乃至３０の任意の数）。一般に、特異的プライマは、長さ１４ヌクレオチドよりも長い。最適な特異性及び費用効率に関して、長さ１６乃至２４ヌクレオチドのプライマが好適である可能性がある。当業者は、ＰＣＲ等のプロセスで使用するプライマの設計に精通している。必要な場合は、本明細書で開示する遺伝子の制限断片全体によりプローブを行うことが可能であり、これは、長さ１００ヌクレオチド台、更には１０００ヌクレオチド台になる場合がある。
【００６７】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードし、そのコード配列に対する非コード配列５’及び３’を除外するＤＮＡ又はＲＮＡ配列を指す。これは、「無中断コード配列」、つまり、ｃＤＮＡの場合のようなイントロンの欠失を構成する場合があり、或いは、ゲノムＤＮＡにおいて見られるような、適切なスプライス部位によって区切られた一つ以上のイントロンを含む場合がある。「イントロン」は、一次転写産物に含まれるが、タンパク質に転換可能な成熟ｍＲＮＡを作成するために、細胞内でＲＮＡが開裂及び再ライゲーションすることにより除去されるＲＮＡの配列である。
【００６８】
「オープンリーディングフレーム」及び「ＯＲＦ」という用語は、コード配列の翻訳開始及び終止コドンの間でコードされるアミノ酸配列を指す。「開始コドン」及び「終止コドン」という用語は、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始及び鎖終止をそれぞれ指定する、コード配列内にある三個の隣接ヌクレオチドの単位（「コドン」）を指す。
【００６９】
「機能ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、又は翻訳されないその他のＲＮＡを指す。
【００７０】
「ＲＮＡ転写産物」という用語は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写の結果として生じる生成物を指す。ＲＮＡ転写産物は、ＤＮＡ配列の完全相補型コピーである場合、一次転写産物と呼ばれるが、或いは一次転写産物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡである可能性があり、これは成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、イントロンが無く、細胞がタンパク質に翻訳可能なＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに対して相補的で、これに由来する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを指す。
【００７１】
「調節配列」及び「適切な調節配列」のそれぞれは、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、又は下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性、或いは翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、エンハンサ、プロモータ、翻訳リーダ配列、イントロン、及びポリアデニル化信号配列を含む。これは、自然配列、及び合成配列と、合成及び自然配列の組み合わせにすることが可能な配列とを含む。上で述べたように、「適切な調節配列」という用語は、プロモータに限定されない。しかしながら、本発明において有効な一部の適切な調節配列は、その一部として、構成プロモータ、組織特異的プロモータ、発達特異的プロモータ、誘導プロモータ、及びウイルスプロモータを含む。
【００７２】
「５’非コード配列」は、コード配列に対して５’（上流）に位置するヌクレオチド配列である。開始コドンの上流にある完全に処理されたｍＲＮＡに存在し、一次転写産物のｍＲＮＡに至る処理、ｍＲＮＡの安定性、又は翻訳効率に影響を与えることができる（ターナら，Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ３：２２５ （１９９５））。
【００７３】
「３’非コード配列」は、コード配列に対して３’（下流）に位置するヌクレオチド配列であり、ポリアデニル化信号配列、及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を与えることが可能な調節信号をコードするその他の配列を含むヌクレオチド配列を指す。ポリアデニル化信号は、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端におけるポリアデニル酸領域の追加に影響を与えることを特徴とする。様々な３’非コード配列の使用法は、インゲルブレクトら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １， ６７１， １９８９ において例証されている。
【００７４】
「プロモータ」は、コード配列に対して通常は上流（５’）にあり、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に必要なその他の因子の認識を提供することで、コード配列の発現を制御するヌクレオチド配列を指す。「プロモータ」は、ＴＡＴＡボックス及びその他の配列を含む短いＤＮＡ配列である最小プロモータを含み、こうした配列は、発現の制御のために調節要素が追加される転写開始部位を指定する役割を果たす。「プロモータ」は、更に、コード配列又は機能ＲＮＡの発現を制御できる調節要素が追加された最小プロモータを含むヌクレオチド配列を指す。このタイプのプロモータ配列は、近位及び更に遠位の上流要素で構成され、後者の要素はエンハンサと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサ」は、プロモータ活性を刺激可能なＤＮＡ配列であり、プロモータの生得的要素にすることが可能であり、或いは、プロモータのレベル又は組織特異性を強化するために挿入された非相同的要素にすることができる。これは、両方の方向性（正常又は反転）で機能することが可能であり、プロモータから上流又は下流へ移動した場合でも機能できる。エンハンサ及びその他の上流のプロモータ要素は、両方とも、影響を媒介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質と結合する。プロモータは、その全体がネイティブの遺伝子に由来する場合があり、或いは、自然状態で見られる様々なプロモータに由来する様々な要素を含む場合があり、或いは、合成ＤＮＡセグメントを含む場合もある。プロモータは、生理学的条件又は発達条件に応じて転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含むこともできる。
【００７５】
「開始部位」は、転写された配列の一部である第一のヌクレオチドを囲む位置であり、これは位置＋１としても定義される。この部位に関して、遺伝子の他のすべての配列及びその制御領域には、番号が与えられる。下流配列（つまり、３’方向での更なるタンパク質コード配列）には正の番号が与えられ、上流配列（主に５’方向の制御領域）には負の番号が与えられる。
【００７６】
上流の活性化が存在しない場合に不活性である、或いはプロモータ活性が大幅に減少するプロモータ要素、特にＴＡＴＡ要素は、「最小又はコアプロモータ」と呼ばれる。最適な転写因子が存在する場合、最小プロモータは機能し、転写を可能にする。したがって、「最小又はコアプロモータ」は、ＴＡＴＡボックス及び又はイニシエータ等、転写開始に必要なすべての基礎的要素のみで構成される。
【００７７】
「構成発現」は、構成又は調節性プロモータを使用する発現を指す。「条件」及び「調節発現」は、調節性プロモータによって制御される発現を指す。
【００７８】
「機能的な結びつき」は、一方の機能が他方に影響を受けるような、単一の核酸断片での核酸配列の関連性を指す。例えば、ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に調節ＤＮＡ配列が「機能的に結びつく」又は「関連する」と言えるのは、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を与えるように、二つの配列が位置している（つまり、コード配列又は機能ＲＮＡがプロモータの転写制御下にある）場合である。コード配列は、センス又はアンチセンス方向において、調節配列と機能的に結びつく可能性がある。
【００７９】
「発現」は、植物における内因性遺伝子又は導入遺伝子の転写及び又は翻訳を指す。例えば、アンチセンス構造体の場合、発現は、アンチセンスＤＮＡのみの転写を指す場合がある。加えて、発現は、センス（ｍＲＮＡ）又は機能ＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す場合がある。発現は、更に、タンパク質の生成を指す場合がある。
【００８０】
「改変レベル」は、通常又は未形質転換細胞又は有機体のレベルとは異なる、トランスジェニック細胞又は有機体における発現のレベルを指す。
【００８１】
「過剰発現」は、通常又は未形質転換細胞又は有機体のレベルを上回る、トランスジェニック細胞又は有機体における発現のレベルを指す。
【００８２】
「アンチセンス阻害」は、内因性遺伝子又は導入遺伝子からのタンパク質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写産物の生成を指す。
【００８３】
「共同抑制」及び「トランスイッチ」のそれぞれは、同一の、或いは十分に類似する導入遺伝子又は内因性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写産物の生成を指す（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００８４】
「遺伝子サイレンシング」は、ウイルス遺伝子、導入遺伝子、又は内因性核遺伝子の相同性依存型抑制を指す。遺伝子サイレンシングは、影響された遺伝子の転写の減少による抑制である時、転写時型にすることが可能であり、或いは、影響された遺伝子と相同のＲＮＡ種のターンオーバ（分解）の増加による抑制である時、転写後型にすることができる（イングリッシュら，Ｐｌａｎｔ． Ｃｅｌｌ． ８：１７９ （１９９６））。遺伝子サイレンシングは、ウイルス誘導遺伝子サイレンシングを含む（ルイスら，Ｐｌａｎｔ． Ｃｅｌｌ．， １０：９３７ （１９９８））。
【００８５】
「染色体への組み込み」は、外来遺伝子又はＤＮＡ構造体の共有結合による宿主ＤＮＡへの組み込みを指す。遺伝子の「染色体への組み込み」が成されない場合、これは「一過性発現」となる可能性がある。遺伝子の一過性発現は、宿主染色体に組み込まれていないが、例えば、自律複製プラスミド又は発現カセットの一部として、或いはウイルス等の別の生物系の一部として、単独で機能する遺伝子の発現を指す。
【００８６】
以下の用語は、二つ以上の核酸又はポリヌクレオチド間での配列の関係を説明するのに使用される：（ａ）「基準配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、及び（ｅ）「十分な同一性」。
【００８７】
（ａ）本明細書での使用において、「基準配列」とは、配列比較の根拠として使用される定義済み配列である。基準配列は、特定の配列のサブセット又は全体にすることが可能であり、例えば、全長ｃＤＮＡ又は遺伝子配列のセグメント、或いは完全なｃＤＮＡ又は遺伝子配列にすることができる。
【００８８】
（ｂ）本明細書での使用において、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の隣接する指定セグメントを参照し、これにおいて、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列は、二配列の最適なアラインメントが得られる基準配列（追加又は欠失を含まない）と比較して、追加又は欠失（つまり、ギャップ）を含む可能性がある。一般に、比較ウィンドウの長さは、少なくとも２０隣接ヌクレオチドであり、随意的に、３０、４０、５０、１００以上にすることができる。当業者が理解するように、ポリヌクレオチド配列のギャップを含めることによる高い類似性を回避するために、通常は、ギャップペナルティが導入され、一致数から差し引かれる。
【００８９】
比較のために配列をアラインメントする方法は、この技術で広く知られている。したがって、任意の二配列間の同一性パーセントの判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。こうした数学的アルゴリズムの非制限的で好適な例は、マイヤース及びミラー，ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１ （１９８８）のアルゴリズム、スミスら，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．， ２：４８２ （１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、ニードルマン及びブンシュ，ＪＭＢ， ４８：４４３ （１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ピアソン及びリップマン，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：２４４４ （１９８８）の類似性検索法、カーリン及びオルトシュル，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：２２６４ （１９９０）のアルゴリズム、及びカーリン及びオルトシュル，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：５８７３ （１９９３）の修正である。
【００９０】
こうした数学的アルゴリズムのコンピュータによる実施は、配列同一性を決定する配列の比較に利用することができる。こうした実施の一部に含まれるものは、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ（カリフォルニア州マウンテンビューのＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓより入手可能）、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）及び、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン８のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（米国ウィスコンシン州マディソン、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＤｒｉｖｅのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）より入手可能）である。こうしたプログラムを使用したアラインメントは、デフォルトのパラメータを使用して実行できる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、ヒギンスら，Ｇｅｎｅ， ７３：２３７ （１９８８）、ヒギンスら，ＣＡＢＩＯＳ， ５：１５１ （１９８９）、コルペら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６：１０８８１ （１９８８）、ファンら，ＣＡＢＩＯＳ， ８：１５５ （１９９２）、及びピアソンら，Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ／ Ｂｉｏｌ．， ２４：３０７ （１９９４）において詳しく説明されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、マイヤース及びミラー，前掲のアルゴリズムに基づいている。オルトシュルら，ＪＭＢ， ２１５：４０３ （１９９０）、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３３８９ （１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムは、カーリン及びオルトシュル，前掲のアルゴリズムに基づいている。
【００９１】
ＢＬＡＳＴ解析を実行するソフトウェアは、全米バイオテクノロジ情報センタ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて一般に入手できる。このアルゴリズムは、問い合わせ配列にある長さＷの短いワードで、データベース配列内の同じ長さのワードにアライメントした時、何らかの正の値の閾値スコアＴに一致するもの又はこれを満たすものを特定することで、ハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（オルトシュルら，１９９０，前掲）。こうした最初の近傍ワードヒットは、これを含む長いＨＳＰを見つける検索を実行するための種の役割を果たす。ワードヒットは、その後、累積アラインメントスコアを増加させることが可能な限り、各配列に沿って両方向で延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一致する残基のペアに関する報酬スコア、常に０より大きい）及びＮ（一致しない残基に関するペナルティスコア、常に０より小さい）を使用して計算される。アミノ酸配列に関しては、スコアマトリックスを使用して追跡スコアを計算する。各方向でのワードヒットの延長が中止されるのは、累積アラインメントスコアが最高達成値から数量Ｘだけ下落した時、一つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積により累積スコアがゼロ以下になった時、或いは、一方の配列の終わりに達した時である。
【００９２】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、二配列間の類似性の統計解析も実行する（例えば、カーリン及びオルトシュル（１９９３），前掲を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の尺度の一つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））で、これは二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間で偶然に一致が発生する確率を示すものである。例えば、テスト核酸配列を基準核酸配列と比較した際の最小合計確率が約０．１未満、更に好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、テスト核酸配列は、基準配列に類似するとみなされる。
【００９３】
比較の目的でギャップ付きのアラインメントを得るためには、オルトシュルら，１９９７において説明されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０内）を利用することができる。或いは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０内）を使用して、分子間の希薄な関係を検出する反復検索を実行できる。オルトシュルら，前掲を参照せよ。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する時には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用することができる（ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質用のＢＬＡＳＴＸ等）。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを使用する（ヘニコフ及びヘニコフ，１９８９を参照）。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照せよ。アラインメントは、目視検査により手作業で実行することもできる。
【００９４】
本発明の目的から、本明細書で開示する配列との配列同一性パーセントを決定するためのヌクレオチド配列の比較は、好ましくは、ＢｌａｓｔＮプログラム（バージョン１．４．７以降）及びデフォルトパラメータ、又は任意の同等のプログラムを使用して行われる。「同等のプログラム」とは、問題となる任意の二配列に関して、好適なプログラムが生成した対応するアラインメントと比較した時に、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致、及び同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを意図している。
【００９５】
（ｃ）本明細書での使用において、二つの核酸又はポリペプチド配列のコンテクストにおける「配列同一性」又は「同一性」では、配列比較アルゴリズム又は目視検査による測定において、特定の比較ウィンドウで最大の対応性が得られるようにアライメントされた時に、同じである二配列の残基の特定のパーセンテージを参照する。タンパク質の参照において、配列同一性のパーセンテージが使用される時には、同一ではない残基位置が保存的アミノ酸置換によって相違する場合が多いことが認識されており、これにおいて、アミノ酸残基は類似する化学特性（電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されるため、分子の機能特性は変化しない。保存的置換によって配列が相違する時、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するために上方調整することができる。こうした保存的置換によって相違する配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言える。こうした調整を行う意味は、当業者に広く知られている。通常、これには、保存的な置換を完全ではない部分的な不一致としてスコアリングすることが伴い、これにより配列同一性パーセンテージを増加させる。したがって、例えば、同一アミノ酸にスコア１を与え、非保存的置換にゼロのスコアを与える時、保存的置換にはゼロと１の間のスコアを与える。保存的置換のスコアは、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（カリフォルニア州マウンテンビューのＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）において実施されているような形で計算される。
【００９６】
（ｄ）本明細書での使用において、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにおいて最適にアライメントされた二配列を比較した時に決定される値を意味し、これにおいて、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、二配列の最適なアラインメントが得られる基準配列（追加又は欠失を含まない）と比較して、追加又は欠失（つまり、ギャップ）を含む可能性がある。このパーセンテージは、一致位置数を得るために、両配列で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する位置数を決定し、一致位置数を比較ウィンドウ内の位置の合計数で割り、配列同一性パーセンテージを得るために、この結果に１００を掛けることで計算される。
【００９７】
（ｅ）（ｉ）ポリヌクレオチド配列の「十分な同一性」は、ポリヌクレオチドが、標準パラメータを使用する説明したアライメントプログラムの一つを使用して基準配列と比較した時、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、又は７９％、好ましくは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、更に好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、及び最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者が認識するように、こうした値は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置、及びその他を考慮に入れることで、二つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切な形で調整することができる。こうした目的におけるアミノ酸配列の十分な同一性は、少なくとも７０％、更に好ましくは、少なくとも８０％及び９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００９８】
ヌクレオチド配列が十分に同一であることを別の形で示すのは、二分子が厳密な条件下（下を参照）で互いにハイブリッド形成する場合である。一般に、厳密な条件は、定められたイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列に関する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。しかしながら、厳密な条件は、本明細書で特別に認めるように、望ましい厳密度の度合いに応じて約１℃乃至約２０℃の範囲内の温度を包含する。厳密な条件下で互いにハイブリッド形成しない核酸も、コードするポリペプチドが十分に同一である場合は十分に同一である。これは、例えば、遺伝コードによって認められる最大限のコドン縮重を使用して核酸のコピーが生成される時等に発生する可能性がある。二つの核酸配列が十分に同一であることを示すものの一つは、第一の核酸によってコードされるポリペプチドが第二の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的な交差反応性を有する時である。
【００９９】
（ｅ）（ｉｉ）ペプチドのコンテクストにおける「十分な同一性」という用語は、ペプチドが、指定された比較ウィンドウにおいて、基準配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、又は７９％、好ましくは、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、更に好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、或いは更により好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。好ましくは、ニードルマン及びブンシュ，１９７０，前掲の相同性アラインメントアルゴリズムを使用して、最適なアラインメントが実行される。二つのペプチド配列が十分に同一であることを示すものは、一方のペプチドが第二のペプチドに対して生じた抗体に免疫学的に反応性を有することである。したがって、例えば、二つのペプチドの相違が保存性置換によるもののみである場合、ペプチドは第二のペプチドと十分に同一である。
【０１００】
配列比較に関して、通常、一方の配列は、テスト配列の比較対象となる基準配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する時、テスト配列及び基準配列は、コンピュータに入力され、必要な場合は部分列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。配列比較アルゴリズムは、その後、指定されたプログラムパラメータが指定される。配列比較アルゴリズムは、その後、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する配列同一性パーセントを（複数の）テスト配列に関して計算する。
【０１０１】
上で述べたように、二つの核酸配列が十分に同一であることを別の形で示すものは、二分子が厳密な条件下で互いにハイブリッド形成することである。「特異的にハイブリッド形成する」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡ又はＲＮＡに存在する時に、厳密な条件下で、その配列のみと結合、二重化、又はハイブリッド形成することを指す。「十分に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との間での相補的なハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の望ましい検出を達成するためにハイブリダイゼーション媒体の厳密度を低減することで対応可能な小さな不一致を包含する。
【０１０２】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験のコンテクストにおける「厳密なハイブリダイゼーション条件」及び「厳密なハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列に依存し、様々な環境パラメータによって異なる。長い配列は、高温で特異的にハイブリッド形成する。Ｔｍは、（定められたイオン強度及びｐＨにおいて）５０％の標的配列が完全に一意するプローブとハイブリッド形成する温度である。特異性は、通常、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度が決定的な要素となる。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関して、Ｔｍは、マインコス及びウォール，１９８４の式：Ｔｍ  ８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％−ｆｏｒｍ）−５００／Ｌから概算可能であり、これにおいて、Ｍは一価カチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージ、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージ、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。Ｔｍは、１％の不一致につき約１℃低下するため、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション、及び又は洗浄条件は、望ましい同一性の配列とのハイブリッド形成を行うために調整することができる。例えば、９０％を上回る同一性を有する配列を求める場合、Ｔｍは、１０℃低下させることができる。一般に、厳密な条件は、定められたイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列及びその相補体に関する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。しかしながら、極めて厳密な条件では熱融点（Ｔｍ）より１、２、３、又は４℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び又は洗浄を利用することが可能であり、中程度に厳密な条件では熱融点（Ｔｍ）より６、７、８、９、又は１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び又は洗浄を利用することが可能であり、厳密度の低い条件では熱融点（Ｔｍ）より１１、１２、１３、１４、１５、又は２０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び又は洗浄を利用することができる。この式と、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件と、望ましいＴとを使用することで、当業者が理解するように、ハイブリダイゼーション及び又は洗浄溶液の厳密度における変化は、本質的に説明される。望ましい度合いの不一致により、４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）より低いＴが生じる場合は、これより高い温度が使用できるようにＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範にわたる指針は、ティッセン，１９９３において確認できる。一般に、厳密度の高いハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、定められたイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列に関する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。
【０１０３】
非常に厳密な条件は、特定のプローブに関するＴｍと等しくなるように選択される。サザン又はノーザンブロットにおいて、フィルタ上で１００を超える相補残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーションに関する厳密な条件の例は、５０％ホルムアミドであり、例えば、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、６０乃至６５℃での洗浄である。厳密度の低い条件の例は、３０乃至３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液による３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×乃至２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）による５０乃至５５℃での洗浄を含む。中程度に厳密な条件の例は、４０乃至４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５×乃至１×ＳＳＣ、５５乃至６０℃での洗浄を含む。
【０１０４】
以下は、本発明の基準ヌクレオチド配列に対して十分に同一なオルソログヌクレオチド配列をクローニングするのに使用できるハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である。好ましくは、基準ヌクレオチド配列の基準ヌクレオチド配列とのハイブリッド形成を、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃で行い、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄し、更に望ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃で行い、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄し、更により望ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃で行い、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄し、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃で行い、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で洗浄し、更に好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃で行い、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄する。
【０１０５】
「変異体」ポリペプチドとは、ネイティブなタンパク質のＮ末端及び又はＣ末端での一つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆるトランケーション）又は追加、ネイティブなタンパク質の一つ以上の部位での一つ以上のアミノ酸の欠失又は追加、或いはネイティブなタンパク質の一つ以上の部位での一つ以上のアミノ酸の置換によって、ネイティブなタンパク質から誘導されるポリペプチドを意図している。こうした変異体は、例えば、遺伝子の多形性又は人為的操作によって生じる可能性がある。こうした操作の方法は、この技術で一般に知られている。
【０１０６】
したがって、本発明のポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、トランケーション、及び挿入を含め、様々な方法で改変することができる。こうした操作の方法は、この技術で一般に知られている。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列の変異体は、ＤＮＡにおける突然変異によって作成することができる。突然変異誘発及びヌクレオチド配列改変の方法は、この技術で広く知られている。例えば、キュンケル，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：４８８ （１９８５）、キュンケルら，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５４：３６７ （１９８７）、米国特許第４，８７３，１９２号、ウォーカ及びガーストラ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． １９８３）、及びこれらの中で引用されている文献を参照せよ。所定のタンパク質の生物活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関する指針は、デイホフら，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ． １９７８）のモデルに見ることができる。保存的置換、例えば、あるアミノ酸を類似する特性を有する他のアミノ酸と交換すること等が好適である。
【０１０７】
したがって、本発明の遺伝子及びヌクレオチド配列は、自然発生配列と、突然変異形態との両方を含む。同様に、本発明のポリペプチドは、自然発生のタンパク質と、その変異体及び改変形態との両方を包含する。こうした変異体は、引き続き望ましい活性を有する。本明細書に包含されるポリペプチド配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特徴において急進的な変化を生成しないと予測される。しかしながら、実行する前に置換、欠失、又は挿入の正確な影響を予測するのが困難な時、当業者が理解するように、その影響は、通常のスクリーニングアッセイにより評価される。
【０１０８】
コードされた配列において単一のアミノ酸又は低いパーセンテージのアミノ酸（一般的には５％未満、更に一般的には１％未満）を改変、追加、又は削除する個別の置換、欠失、又は追加は、「保存的修飾変化」であり、この改変により、化学的に類似するアミノ酸とのアミノ酸置換が生じる。機能的に類似するアミノ案を提供する保存的置換表は、この技術で広く知られている。以下の五種類のグループは、互いにとって保存的置換となるアミノ酸をそれぞれ含んでいる。脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、含硫：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。クレイトン，１９８４を更に参照せよ。加えて、コードされた配列において単一のアミノ酸又は低いパーセンテージのアミノ酸を改変、追加、又は削除する個別の置換、欠失、又は追加も、「保存的修飾変化」である。
【０１０９】
「生殖系列細胞」は、配偶子となることが決定づけられ、その遺伝物質が継承される細胞を指す。
【０１１０】
「植物」という言葉は、任意の植物、特に種子植物を指し、「植物細胞」は、植物の構造的及び生理学的単位であり、細胞壁を含むが、プロトプラストを指す場合もある。植物細胞は、分離された単一細胞又は培養細胞の形態である場合、或いは、例えば植物組織又は植物器官といった高度な組織的単位の一部としての形態である場合がある。
【０１１１】
「植物組織」は、差別化又は非差別化された組織又は植物を含み、その一部として、根と、茎と、苗条と、葉と、花粉と、種子と、腫瘍組織と、単細胞、プロトプラスト、胚、及びカルス組織等の様々な形態の細胞及び培養物とが含まれる。植物組織は、植物内に存在する場合があり、或いは、器官、組織、又は細胞培養物に存在する場合がある。
【０１１２】
「改変された植物形質」は、野生型又は非トランスジェニック植物宿主と相対的なトランスジェニック植物における任意の表現型又は遺伝子型を意味する。
【０１１３】
「形質転換」という用語は、遺伝的に安定した遺伝を発生させる、宿主細胞のゲノムへの核酸断片の転移を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主細胞は、「トランスジェニック」細胞と呼ばれ、トランスジェニック細胞を含む有機体は、「トランスジェニック有機体」と呼ばれる。植物及び植物細胞の形質転換の方法の例は、アグロバクテリウム媒介形質転換（デブラエルら，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １４３：２７７ （１９８７））及び粒子衝撃技術（クライン，Ｎａｔｕｒｅ．， ３２７：７０ （１９８７）、米国特許第４，９４５，０５０号）を含む。当業者に広く知られた方法により、トランスジェニック細胞から植物全体を再生することができる（例えば、フロムら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ８：８３３ （１９９０））。
【０１１４】
「形質転換された」、「トランスジェニック」、及び「組み換え」は、非相同的核酸分子が導入された宿主細胞、或いはバクテリア又は植物等の有機体を指す。この核酸分子は、この技術で一般的に知られ、サンブルックら，１９８９，前掲において開示されるゲノムに安定した状態で組み込むことが可能である。イニスら，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）、及びゲルファント，ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）、及びイニス及びゲルファント，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９９）を更に参照せよ。ＰＣＲの既知の方法には、その一部として、プライマ対と、ネスト化プライマと、単一特異的プライマと、縮重プライマと、遺伝子特異的プライマと、ベクタ特異的プライマと、部分不一致プライマと、その他とを使用した方法が含まれる。例えば、「形質転換された」、「形質転換体」、及び「トランスジェニック」植物又はカルスは、形質転換プロセスを施され、染色体に組み込まれた外来遺伝子を含む。「非形質転換」は、形質転換プロセスを施されていない通常の植物を指す。
【０１１５】
「トランスジェニック」有機体は、発現ベクタを含む一つ以上の細胞を有する有機体である。
【０１１６】
「一過性形質転換」は、導入遺伝子及び外来ＤＮＡが導入されているが、安定した維持に関して選択されていない細胞を指す。
【０１１７】
「安定形質転換」は、形質転換に続いて、選択培地上で選択及び再生された細胞を指す。
【０１１８】
「遺伝的に安定」及び「遺伝可能」は、植物において安定して維持され、続く世代に渡って子孫によって安定して継承される、染色体に組み込まれた遺伝因子を指す。
【０１１９】
「酵素活性」は、本明細書において、基質の生成物への変換を触媒する酵素の能力を意味する。酵素の基質は、その酵素の天然基質を含むだけでなく、その酵素によって生成物又は生成物の類似体に変換可能な天然基質の類似体も含む。酵素の活性は、例えば、特定の期間の後で反応における生成物の量を決定すること、或いは、特定の期間の後で反応における生成物の量を決定すること、或いは、特定の期間の後で反応混合物に残っている基質の量を決定することで測定される。酵素の活性は、更に、特定の期間の後で反応混合物に残っている未使用の共同因子の量を決定することで、或いは、特定の期間の後で反応混合物に残っている使用済みの共同因子の量を決定することで測定される。酵素の活性は、更に、特定の期間の後で反応混合物に残っている自由エネルギ又は高エネルギ分子のドナー（例えば、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸塩、アセチルリン酸、又はホスホクレアチン）の量を決定すること、或いは、特定の期間の後で反応混合物に残っている自由エネルギ又は高エネルギ分子の使用済みドナー（例えば、ＡＤＰ、ピルビン酸塩、又はクレアチン）の量を決定することで測定される。
【０１２０】
「殺菌剤」は、菌類細胞を殺すため、或いはその成長を抑制するために使用される化学物質である。
【０１２１】
「阻害物質」は、例えば、菌類の成長又は生残に不可欠である、或いは、毒性又は病原性を改変する、生合成酵素、レセプタ、信号伝達タンパク質、構造遺伝子産物、又は輸送タンパク質といったタンパク質の酵素活性を不活性化することで、成長異常を引き起こす化学物質である。本発明のコンテクストにおいて、阻害物質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、又はそのオルソログの任意の一つによってコードされる活性を改変する化学物質である。
【０１２２】
「同質遺伝子」菌類は、非相同的ＤＮＡ配列の存在又は欠如によって相違する可能性があることを除き、遺伝子的に同一である。
【０１２３】
「基質」は、酵素が自然状態で機能を実行する生化学経路において、酵素が自然状態で認識し生成物へ変換する分子であり、或いは、自然発生の反応に類似する酵素反応において、同じく酵素によって認識され、酵素によって変換される分子である。
【０１２４】
「許容性」は、本明細書での使用において、ネイティブの未修飾菌類の正常な成長又は機能を抑制するのに十分な量の阻害物質又は殺菌剤に晒された時に、基本的に正常な成長又は機能を継続する、菌類等の有機体の能力である。
【０１２５】
本発明の核酸分子及びその使用法
植物での菌類による病理発生におけるペプチドシンテターゼ遺伝子の関与が遺伝的にテストされたのは、過去の二種類の研究においてのみである。Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍでは、ＨＣ毒素シンテターゼをコードするＨＴＳ１遺伝子の両方のコピーの破壊がＨＣ毒素を生成する能力の損失を引き起こしており、この菌類はＨＣ毒素感受性トウモロコシ植物において非病原性となり（パナシオンら，ＰＮＡＳ， ８９， ６５９０， １９９２）、これはＨＣ毒素シンテターゼ遺伝子が病原性決定因子であることを示している。Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｖｅｎａｃｅｕｍでは、エニアチン非生成形質転換体が、エニアチンシンテターゼコード遺伝子（ｅｓｙｎ１）の破壊により得られ、こうした形質転換体は、ジャガイモ塊茎の組織アッセイにおいて、毒性の大幅な減少を示しており（ハーマンら，１９９６）、これは、この菌類による病理発生において、エニアチンシンテターゼ遺伝子が毒性因子であることを示している。こうした二種類の病理系では、一種類の菌類二次代謝物（ペプチド毒素）しか研究されていない。対照的に、ポリケチドＴ毒素は、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｓにおいて十分に研究され、宿主特異的毒性因子となることが確認されており（ヨーダ及びタージオン，１９９６、ヨーダら，１９９７、前掲）、この研究により、第二の二次代謝物である仮定上のＣＰＳ１毒素が、この菌類による病理発生に更に関与することが実証された。Ｔレースのみで発見されるＰＫＳ１及びＤＥＣ１といったＴ毒素生合成遺伝子とは異なり（ヤンら，１９９６，前掲、ローズら，１９９６，前掲）、ＣＰＳ１は、Ｏレース及びＴレースの両方で発見される。いずれかのレースにおけるＣＰＳ１の破壊により、Ｎ細胞質トウモロコシでのテストでは、菌類毒性が大幅に減少する。この結果は、ＣＰＳ１毒素が以前に提示された「Ｏレース」毒素と同じである可能性を示している（ヨーダ，１９８１）。しかしながら、本明細書で開示するように、ＣＰＳ１はＣｏＡリガーゼである。
【０１２６】
興味深いことに、Ｔｏｘ＋、ｃｐｓ１−突然変異体は、Ｔ細胞質トウモロコシでも低減された毒性を示すが、野生型Ｔレースと同じ量のＴ毒素を生成する。Ｔ毒素とＴトウモロコシ固有のＵＲＦ１３タンパク質との間の相互作用は非常に特異的であり、同じ量のＴ毒素を生成する二つの菌株が同じ宿主、つまりＴトウモロコシを攻撃した場合には、同じ結果が予測されるはずであるため、これは異常である。この結果の説明として最も可能性の高いものは、ｉｎ  ｐｌａｎｔａの菌類の成長が宿主植物によって阻害され、こうした貧弱な成長の結果として、この菌類を培養で成長させた時には正常であるＴ毒素生成の減少が生じるというものである。Ｔ細胞質トウモロコシでの毒性の低減は、漏出Ｔｏｘ−突然変異体で見られるようなＴ毒素生成の減少によるものである。こうした成長の阻害は、この菌類による宿主防御メカニズムの抑制の失敗による可能性があり、これはＣＰＳ１制御ペプチド毒素によって媒介される。この「サプレッサ」を生成できないｃｐｓ１−突然変異体は、野生型のように活発に植物組織をコロニ化することができず、結果として、病変の少ない表現型が示すように、病気を引き起こす能力の減少が生じる。これが事実である場合、ＣＰＳ１は、エニアチンに関して提案されているように、一般毒性因子であると考えられる。
【０１２７】
ｃｐｓ１−突然変異体であっても、特定の量のＣＰＳ１毒素を生成することは可能である。可能性の一つは、挿入突然変異又は標的破壊によって遺伝子が完全に不活性化されていないことである。オリジナルのＲＥＭＩ挿入は、ＣＰＳ１Ａのコア配列１で発生しており、これは重要な領域ではない可能性がある（コア１の機能は不明である）。第二の標的部位は、ＣＰＳ１Ｂのコア１及び２の間に位置しており、第三のものは、同じモジュールのコア２及び３の間に位置している。三つの挿入は、いずれも重要なモチーフを破壊しない。一方、ＣＰＳ１は、多数のインフレーム開始コドンを含み、その一部は挿入部位のすぐ下流に位置する。可能性として、こうした断絶のそれぞれが、実際には二つの下位転写を発生させ、一方は通常通りＣＰＳ１の開始コドンから転写され、挿入部位で停止し、第二のものは挿入部位の下流にあるインフレームＡＴＧの一つの近くで転写され、ＣＰＳ１の末端で停止することが考えられる。これらの転写は、両方とも、依然として酵素活性を有するトランケート型タンパク質をもたらすことができる。しかし、こうした別個の酵素は、基質との親和性がホロ酵素よりも低い可能性がある。ＣＰＳ１毒素の生成量の減少は、ベクタ挿入によって二つの部分に分割されたＣＰＳ１ホロ酵素と、結果として生じたトランケート型タンパク質がオリジナルのポリペプチドに比べて活性が大幅に少ないこととによるものである可能性がある。この仮説は、ＣＰＳ１コード配列全体が削除されたＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ菌株の構築によってテストすることができる。
【０１２８】
第二の可能性として、ゲノム内でのＣＰＳ１の多数のコピーの存在が考えられる。以前の研究では、ＨＣ毒素シンテターゼをコードする遺伝子（ＨＴＳ１）がゲノム内で複製され、Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍのほとんどのＴｏｘ２＋分離物において、両方のコピー（ＨＴＳ１−１及びＨＴＳ１−２）が２７０ｋｂ離れていることが実証された（アーン及びウォルトン，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８， ８８７， １９９６）。一方のコピーの破壊により、ＨＴＳ１活性は減少するが、これはＨＣ毒素の生成には影響せず、両方のコピーが破壊されると、ＨＣ毒素の生成が停止する（パナキオンら，１９９２，前掲）。しかし、ＨＴＳ１のケースとは対照的に、ゲルブロット解析ではＣＰＳ１の第二のコピーの存在が示されず、ＣＰＳ１の破壊は推定される毒素の生成に影響しない。類似する編成を有する二つの遺伝子がゲノムに存在するとは考えにくい。代替の仮定として、ＣＰＳ１と同じ酵素活性を有するタンパク質をコードするが、ＣＰＳ１との有意の配列相同性を有していない第二の遺伝子が存在することが考えられる。この仮定は、この遺伝子がＣＰＳ１と共に群化し、染色体歩行により回収できない限り、テストするのが困難である。
【０１２９】
トウモロコシでのＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓによる病理発生には、少なくとも二つの二次代謝物が関与し、これらは、特定の宿主、つまりＴトウモロコシでの高い毒性を決定する宿主特異的因子であるＴ毒素と、一般的な宿主植物での菌類による病気の定着の基盤となる基本メカニズムに寄与する一般因子（毒性又は病原性因子）である仮定上のＣＰＳ１毒素とである。
【０１３０】
ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションにより、五種類の属に属する新たな１６の菌種でＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  ＣＰＳ１ホモログが発見された。一部のもののハイブリダイゼーションシグナルは、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ遺伝子と同じように強く、こうした菌類の中でＣＰＳ１の保存性が高いことを示している。この保存性は、こうした種間の分類学上の関係と一致すると思われる。Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ（アナモルフＢｉｐｏｌａｒｉｓ）及びＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ（アナモルフＥｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）は、密接に関連する属である。
【０１３１】
二つの種、Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅ及びＣ．ｃａｒｂｏｎｕｍは、互いに交配が可能であるため、異なる種ではない可能性があり（シェファら，１９６７、ヨーダら，１９８９）、ＣＰＳ１と同じハイブリダイゼーションパターンを示した。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓに最も近い無性の類縁であるＢ．ｓａｃｃｈａｒｉは、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ自体でのみ見られた二種類のＨｉｎｄＩＩＩ断片とハイブリッド形成したが、他のすべての種は、明確な多形性のバンドを一つしか提供しなかった。内部転写スペーサ（ＩＴＳ）配列と、ＧＰＤ（バンウェルト及びヨーダ，１９９２）及びＭＡＴ遺伝子（タージオンら，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２３８， ２７０， １９９３）とを使用した系統解析では、更にＣ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅ／Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍ及びＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ／Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｉが互いにも最も近いとされた（タージオン及びバーベク，１９９７）。こうした結果は、ＣＰＳ１がこうした遺伝子と共進化したことを意味する可能性がある。
【０１３２】
Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ及びＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属は、主に耕作穀物及び野草での斑点病又は葉枯病と広く関連する多くの植物病原種を含む（シバネサン，１９８７、アルコン，１９８８）。この植物病原菌のグループは、宿主特異的毒素を生成することが多い軽度の病原体及び重度の病原体の両方を含む（ヨーダ，１９８０，前掲）。基本的な問題の一つは、こうした菌類によって発生する多様な宿主植物での様々な病気が共通因子を伴っているか、それとも宿主特異的毒素等の個別の特異的因子のみに依存するかである。
【０１３３】
以前の研究では、宿主特異的毒素は、毒性又は宿主範囲を定める上で決定的な因子となり得るが、これらはその種における特定の分離体によってのみ生成され、こうした毒素生成分離体においてのみ、対応する生合成遺伝子が確認されるため、一般的な病原性の原因にはならないことが明らかとなっている（ヨーダら，１９９７，前掲）。対照的に、ＣＰＳ１ホモログは、これまでにテストされたすべてのＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ及びＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ種において確認されており、これがこのグループで共有される共通因子であることを示している。オート麦の病原体Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅにおけるＣＰＳ１ホモログの破壊は、ビクトリン感受性オート麦に対する毒性の劇的な減少を引き起こしたが、この形質転換体は野生型レベルのビクトリンを生成した。この結果は、ｃｓｐ１−を破壊しても野生型レベルのＴ毒素が生成されるが、Ｔ細胞質トウモロコシに関する毒性が減少する、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  Ｔレースでのものと類似している。こうした結果は、菌類／植物相互作用の最終的な結果を決定する上で宿主特異的毒素のみでは十分でないことを強く主張するものであり、こうした菌類による病気の定着には、一般的な病原性の経路を制御する可能性があるＣＰＳ１を更に必要とすることを示している。
【０１３４】
１９９０年代の初め、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉに関する研究が、「病原性島」と呼ばれる病原性遺伝子群の特定につながった（ハッカら，１９９０、ブラムら，１９９４）。その後、同様の遺伝子群が、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを含む、その他の動物又はヒトバクテリア病原体において特定された。こうした島は、毒素を生成するための遺伝子、或いは、宿主の防御因子と相互作用できるタンパク質、又は宿主細胞に毒性タンパク質を伝達するタイプＩＩＩ分泌系に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む場合が多い。通常、これらは病原菌株（又は種）のみで見られるが、まれなケースでは、同じ種又は関連種の非病原菌株に発生する（ハッカら，Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２３， １０８９， １９９７）。
【０１３５】
植物病原性バクテリアにおいて、ｈｒｐ遺伝子群は、動物病原性バクテリアの「病原性島」に共通するいくつかの特徴を有するため、すなわち、（植物病原性に必要な）病原種のみで発見され、タイプＩＩＩタンパク質分泌系を定める保存性の高い遺伝子（ｈｒｃ遺伝子）を含むため、「病原性島」と呼ばれてきた（アルファノ及びコルマ，１９９６、バリナガ，１９９６）。
【０１３６】
植物病原菌において、「病原性島」の特徴を備えた遺伝子又は遺伝子群は、特定の種、つまりＮｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａにおいて確認されており、エンドウのフィトアレキシン及びその他のエンドウ病原性遺伝子（ＰＥＰ）を解毒するＰＤＡ遺伝子は、重要ではない染色体に位置し、この染色体はエンドウに対して病原性のあるすべての分離体で発見されるが、通常、非病原性分離体においては欠如している（バンエッテンら，Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ， ６５， ２６３， １９９４、リューら，１９９７，前掲）。Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属において、ＨＣ毒素の生合成を制御するＴｏｘ２遺伝子群は、Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍ  １レース（ｈｍ１ｈｍ１トウモロコシに対して病原性）でのみ発見され、Ｔ毒素の生成を制御するＴｏｘ１遺伝子群は、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  Ｔレース（Ｔ細胞トウモロコシに対して強い毒性）のみで発見されており、これまでテストされた同じ種及び他の全菌種の他の全レースでは、こうしたＴｏｘ遺伝子が欠如している（アーン及びウォルトン，１９９６，前掲、ヤンら、１９９６，前掲、ヨーダら，１９９７，前掲）。
【０１３７】
ＣＰＳ１は、こうした菌類の「病原性島」と比較して、二つの重要な形で相違している。第一に、いくつかの植物病原性Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種及び縁類の中での保存性が高い。第二に、特定のバクテリアの「病原性島」と同様に、ＣＰＳ１も、「非病原性」種においてホモログを有する。Ｃ．ｈｏｍｏｍｏｒｐｈｕｓ及びＣ．ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｉは、どちらも植物で病気を引き起こさず、ＣＰＳ１と強くハイブリッド形成する。これは、病原性の喪失を生じる「病原性島」における遺伝的変化を反映する可能性がある。保存性の高い「病原性島」を内包するいくつかのヒト又は動物病原種を含む、バクテリアのＬｉｓｔｅｒｉａ属において、非病原種（Ｌ．ｓｅａｌｉｇｅｒｉ）における「病原性島」ホモログは、群内の重要な調節遺伝子のプロモータ領域で発生する突然変異により「サイレント」となることが発見されている（ハッカら，１９９７，前掲）。こうした特徴は、ＣＰＳ１遺伝子群及びホモログが菌類の「病原性島」の新しいグループを定義できることを示している。
【０１３８】
病原性の進化には、二種類の主要なプロセスが関与することが知られている。病原性微生物は、宿主での寄生的成長に適応した遺伝子の遅い修飾（点突然変異及び遺伝子組み換え等）により、或いは、レシピエントによる特定の宿主への攻撃を可能にするゲノムへの「異質な」ＤＮＡの大きな断片の組み込み（遺伝子水平転移）により、非病原性の祖先が起源となる可能性がある。後者は、進化的に近い過去又は遠い過去に発生した可能性がある。その後の系統内での垂直伝播により（転移遺伝子がレシピエントゲノムにおいて安定している場合）、（複数の）遺伝子の取得後に分岐したすべての種において、その遺伝子が維持されることになる（シェファ，１９９１、アーバ，Ｇｅｎｅ， １３５， ４９， １９９３、クリシナピレイ，１９９６、バードン及びシルク，１９９７）。
【０１３９】
過去数年には、遺伝子水平転移の仮説を支持する十分な証拠が入手可能となった。動物の病原性バクテリアのすべての「病原性島」は、通常、レシピエントゲノムからのＧ＋Ｃ含有量において相違しており、遺伝子群の境界に置き換え可能な要素を有するため、（最近又は過去の）水平転移事象によって取得されたと考えられている（ハッカら，１９９７，前掲）。ｈｒｐ「病原性島」は、Ｇ＋Ｃ含有量の大きな相違、或いは置き換え可能な要素との関連性を示していないが、こうした「病原性島」のｈｒｃ遺伝子が上で述べたように動物病原性バクテリアに見られるタイプＩＩＩタンパク質分泌系を定める遺伝子との高い類似性を示すことから、同じように発生したと考えられている（アルファノ及びコルマ，１９６６、及びバリナガ，１９９６）。
【０１４０】
ＣＰＳ１自体はいくつかの代表的な菌類イントロンと、殆どの既知の菌類遺伝子と同様のＧ＋Ｃ含有量（５１．５％）を有するが、この遺伝子の側面に位置するゲノム領域（約１．５ｋｂ）は、高いＧ＋Ｃ含有量を有する（６０％超）。この遺伝子群では、いくつかの短い高Ｇ＋Ｃ領域も発見されており、オープンリーディングフレームの一つ（ＯＲＦ１０）は、６３．６％のＧ＋Ｃ含有量を有する。Ｎ．ｃｒａｓｓａ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｕ．ｍａｙｄｉｓ（すべてが５１乃至５４％のＧ＋Ｃ含有量を有する、カーリン及びムラーゼク，ＰＮＡＳ， ９４ １０２２７， １９９７を参照）を含む、これまでに特徴付けられている糸状菌ゲノムと比較して、ＣＰＳ１の周囲のゲノム領域は異常である。これは、ＣＰＳ１を内包する遺伝子群がバクテリアソースに由来するものの（殆どのバクテリア遺伝子が高いＧ＋Ｃ含有量を有することが知られているため）、菌類のバージョンへと進化したことを示す可能性がある。
【０１４１】
こうしたデータに基づくと、ＣＰＳ１ホモログは、水平転移を介してバクテリア種から取得され、その後、密接に関連する系統における水平転移を介して、菌類ゲノムによって維持された、共通の祖先遺伝子を有する可能性がある。
【０１４２】
進化のプロセスにおいて、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属は、更に、祖先が「異質な」ＣＰＳ１を取り込むのに用いた、外来ＤＮＡを取り込む能力を制御する第二の遺伝子（Ｘ）を継承した可能性がある。結果として、この菌類のグループは、追加的な「水平転移」によって、他の有機体からの遺伝子を捕獲し続けることが可能となり、独自の病原因子を生成する能力によって特徴付けられる新しいレース、更には新しい種を発生させる。この仮説を直接的に支持するものは、Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍのＴｏｘ２座及びＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＴｏｘ１座の両方が「異質な」ＤＮＡ（高Ａ＋Ｔ及び高反復）の大きな断片に関連しており、Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅによるビクトリンの生成を制御するＴｏｘ３についても同じことが言える点であるが、直接の実験的証拠は、まだ存在しない（アーン及びウォルトン，１９９６，前掲、ヤンら，１９９６，前掲、ヨーダら，１９９７，前掲）。ＣＰＳ１とは対照的に、こうした遺伝子転移は、Ｔｏｘ１及びＴｏｘ２座の両方がこの種における特定の分離物においてのみ発見されているため、進化的に近い過去に発生したことになり、例えば、Ｔｏｘ１遺伝子の取得は、おそらく、この分野でＴレースが初めて特定された１９６０年代頃に発生したことになる（ヨーダら，１９９７，前掲）。
【０１４３】
ＣＰＳ１の進化には別の可能性も存在する。第一に、上で述べた各遺伝子は、系統の分岐後、個別にＣＰＳ１を取得した可能性がある。しかし、これは同時に起こる必要があり、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ及びＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａにおいて検出されたホモログが同様のハイブリダイゼーションシグナル強度を提供する事実を考慮した場合、同じドナー有機体が関与する必要があるため、可能性は低く思える。第二に、ＣＰＳ１の水平転移は、プレオスポラル目の分岐前、更には子嚢菌類の分岐前といった、早い時期に発生した可能性がある。こうした仮定をテストするには、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ、及びその他の属におけるＣＰＳ１ホモログの検出を、ゲノムＤＮＡハイブリダイゼーション又はＰＣＲによって行う必要がある。ここで説明した事実に基づくと、他の菌種において新たなＣＰＳ１ホモログが発見されるのを予測することは不合理ではない。更なる調査により、植物における菌類の病原の進化を理解する直接的な入口点がもたらされる可能性がある。
【０１４４】
Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  ＣＰＳ１遺伝子は、ＲＥＭＩ挿入突然変異誘発を使用して生成された突然変異体の標識部位から回収したゲノムＤＮＡ断片の特定によってクローニングした。この研究における二種類の重複コスミドクローンの特徴付けにより、遺伝子標識付けの事象に欠失又は染色体再配列が伴わないことが証明され、これは両方のコスミドがＲＥＭＩ挿入部位の範囲に渡る同じ断片を運び、この領域のヌクレオチド配列が標識部位から回収されたゲノムＤＮＡのものと同じであるためである。これにより、主要な生合成遺伝子であるＣＰＳ１の同一性は確実に明らかとなる。以前にクローニングされた断片から配列を２７．４ｋｂ延長した二つのコスミドのマッピング及び配列決定は、３８．７ｋｂの隣接ゲノムＤＮＡの特徴付けにつながり、これはＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓにおいてこれまでに解析された最長のゲノム領域である。ＣＰＳ１及びＴＥＳ１に加え、この領域の配列解析では、少なくとも１１種類のオープンリーディングフレームが明らかとなり、そのうち３種類は、それぞれＤＢＺ１、ＣＡＴ１、及びＤＥＣ２と指定され、明らかに機能タンパク質をコードしている。こうした遺伝子の密接な結びつきは、これらが同じ経路で進化した可能性があることを示している。
【０１４５】
糸状菌では、場合によっては、例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのセファロスポリンＣ経路遺伝子（マティソンら，Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．， ２３， ３３， １９３３）、及びＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍのメラニン経路遺伝子（クボら，Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６２， ４３４０， １９９６）等、二次代謝物の生合成に関する経路内の遺伝子は、様々な染色体に分散している。別のケースでは、密接に結びついた遺伝子は、通常、機能的に共通の経路に関連している。この群化の編成は、６０ｋｂのゲノム領域で２５の同等に調節された転写が発見されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのステリグマトシスティン経路遺伝子（ブラウンら，１９９６）、及び２５ｋｂの領域で九遺伝子が群化し、そのうち八遺伝子が経路機能に必要であることが分かったＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓのトリコテセン経路遺伝子（ホーンら，Ｍｏｌ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２４８， ９５， １９９５）によって例証されている。特定の菌類ペプチドの生合成に関連する遺伝子も、群として見つかっている。ＣＰＳ１と、こうした追加的な遺伝子との密接な結びつきは、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓにおける新たな二次代謝物経路の存在を明らかにする可能性がある。この経路において、ＣＰＳ１は、二次代謝物、おそらくはペプチド植物毒素の合成に必要なあらゆる触媒作用を備えた大きな多機能酵素をコードするため、主要な構造遺伝子であり、他の遺伝子は、下で説明するように、調節、翻訳後修飾、又は基質処理といった経路の調整動作に必要な様々な機能を実行することができる。
【０１４６】
機能解析及び構造解析の両方において、ＣＰＳ１遺伝子群が新しい生合成経路を制御しているという仮説は強く支持される。経路遺伝子は、主に産業目的で、僅かな糸状菌類のみにおいて研究されてきた（ケラーら，Ｊ． Ｉｎｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９， ３０５， １９９７）。植物病原菌類に関して、菌類による病理発生のための経路遺伝子については殆ど分かっていない。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓにおいて、二種類のＴｏｘ１遺伝子、ＰＫＳ１（ヤンら，１９９６，前掲）及びＤＥＣ１（ローズら，１９９６，前掲）の最近のクローニングは、菌類／トウモロコシの相互作用における毒性決定因子であるＴ毒素の生合成に関する分子メカニズムを理解する上での突破口をもたらした。しかし、関連する経路遺伝子の更なる特定は失敗に終わっており、これは、これら二種類の遺伝子が異なる染色体に位置しており、それぞれが高Ａ＋Ｔ  ＤＮＡに埋め込まれているためである（ヨーダら，１９９７，前掲）。対照的に、ＣＰＳ１群は、病理発生経路を探求する優れた機会を提供する。
【０１４７】
第一に、これは、「正常な」配列領域に存在している。クローン配列の殆どにおいて、５０乃至５５％のＧ＋Ｃ含有量が確認されており、高Ａ＋Ｔ  ＤＮＡはクローン領域のいずれの末端にも伴わない。これは、更なる染色体歩行、コスミドライブラリのスクリーニング、或いは標的組み込み及びプラスミドレスキュにより、追加的な経路遺伝子をクローニングするのを容易にする。第二に、これは、おそらくは単一の伝達経路に結びつく調節遺伝子（ＤＢＺ１）を含む。ＤＢＺ１と相互作用する遺伝子の分離は、菌類病原体と宿主植物との間での分子の伝達を媒介する新しい因子を明らかにする可能性がある。ＤＢＺ１の更なる特徴付けも（位置特異的破壊又は欠失と共に）、遺伝子群の限界を判断する上で有効であり、これは、共通の経路に関与する密接に結びついた遺伝子が同じ調節因子によって同等に調節されるケースが多く存在するためである（ケラーら，１９９７，前掲）。最後に、ＣＰＳ１遺伝子は、ＴレースとＯレースの両方で確認されており、そのホモログも別のＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種で確認されている。高いＧ＋Ｃ含有量の存在は、こうした遺伝子がバクテリアの祖先から進化したことを意味する可能性があり、こうした菌類での保存性は、ＣＰＳ１群によってコードされた遺伝子産物の植物病原性機能と相関する可能性がある。この群の更なる調査は、この菌類のグループにおける一般病原因子の進化に対する洞察をもたらすはずである。
【０１４８】
第二鉄還元酵素は、バクテリア、菌類、植物、及び動物で見られる酵素のグループで、第二鉄を還元し、有機体が使用する吸収形態である第一鉄にする役割を果たす。これは、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＨ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍその他において、十分に研究されている。ＦＥＲ１酵母は、タバコでの発現が行われている（オキら，１９９９）。
【０１４９】
これまでの研究では、ＦＥＲ遺伝子が重要な病原性決定因子となり得ることが明らかになっている。ティンマーマン及びウッズは、Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍにおいて、ＦＥＲが三種類の方法で鉄を取得する上で重要な役割を果たす可能性があることを提示しており、その方法は、無機物又は有機物の第二鉄塩からと、宿主のＦｅ（ＩＩＩ）結合タンパク質（トランスフェリンその他）からと、菌類自体が生成するシデロフォア（シデロフォア分子によりキレート化された鉄を還元及び放出する）からとである。
【０１５０】
一方、微生物感染に応答した鉄の封鎖は、宿主防御メカニズムとなることが実証されている。病原体にある感染に関連する鉄取得システムは、宿主の防御に対抗し、宿主細胞において病原体によるコロニ化を成功させるために、重要なメカニズムであると考えることができる。これは、すべての病原菌類にとって一般的なメカニズムである可能性がある。
【０１５１】
ＣＰＳ１は、異常なアミノ酸、ヒドロキシル酸、及び構造を含む新しいシデロフォアを生合成する役割を果たすペプチドシンテターゼをコードし、これはＣＰＳ１が一般的なＮＲＰＳとの類似性を示さない理由である。ＣＰＳ１シデロフォアは、宿主の封鎖により鉄が限定される宿主細胞に菌類が入った時、鉄の取得に関して宿主と競合できる。特に、Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅのような根の病原体では、封鎖は、根の表面で強くなる場合がある。これにより、ｃｐｓ１突然変異体が大幅な毒性の低減を示した理由を説明することができる。ＦＥＲ１は、ＣＰＳ１シデロフォアから鉄を放出するために必要である可能性があり、これは、ＣＰＳ１遺伝子の近くに位置することの説明となる。更に、鉄が限定される条件の中で菌株を培養できるのは、鉄が乏しい条件の間のみ、ＣＰＳ１、及びおそらくは群内の他の遺伝子が活発になるためである可能性がある。
【０１５２】
好適な実施形態において、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６に十分に類似する活性を有するものを含め、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体において表されるヌクレオチド配列と望ましくは同一である、又は十分に類似する、菌類、好ましくは病原菌類に由来するヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１５３】
別の好適な実施形態において、本発明は、菌類においてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６の任意の一つ以上の活性を阻害又は低減する能力を有する作用因子を特定する方法を説明する。好ましくは、トランスジェニック「ノックアウト」菌及び又は菌細胞を取得し、これは好ましくは安定した形質転換済みのものであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のいずれかの欠失を含む。したがって、一実施形態において、ヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子産物は、発現せず、或いは、低減された発現又は異常な発現を有する。別の実施形態において、トランスジェニック菌又は細胞は、過剰発現となる遺伝子産物を発生させるプロモータと結びついた、対応する非欠失配列を含む。その後、このトランスジェニック菌及び又は細胞に作用因子を接触させ、このトランスジェニック菌及び又は細胞の成長、発達、毒性、又は病原性を、作用因子を適用していない対応するトランスジェニック菌及び又は細胞の成長、発達、毒性、又は病原性と相対的に、或いは非トランスジェニック菌及び又は細胞と相対的に、判断する。
【０１５４】
本発明は、一般に、ＣＰＳ１ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体をコードする、菌類病原体からの分離核酸分子に関する。好適な実施形態において、ＤＮＡ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に対応する配列を有するＤＮＡ分子とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を有する。本発明の他のＤＮＡ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５のヌクレオチド配列と６５％より多くが同一である配列を有するＤＮＡ分子を含む。ヌクレオチド配列の類似性は、デフォルトパラメータのＢＬＡＳＴプログラムにより決定される（オルトシュルら，”Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ”， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３ （１９９０））。好適な配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体の配列を有する核酸分子とハイブリッド形成するＤＮＡ分子を含む。好ましくは、このＤＮＡ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、又はその相補体と、低い又は中程度の厳密度、或いは厳密な条件下で、ハイブリッド形成する。
【０１５５】
本発明のその他のタンパク質又はポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６のアミノ酸配列と少なくとも７５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明の好適な実施形態において、このタンパク質又はポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６と少なくとも９０％の類似性を有する。
【０１５６】
加えて、本発明の核酸分子は、適切な宿主細胞に転移させた時、修飾された配列がコードするポリペプチドによってもたらされる改変表現型を、修飾ポリヌクレオチドが与えるような形で、修飾、適合化、及び最適化が可能である。この方法の利点の一つは、任意のタンパク質を、その構造に関する知識が無くとも、迅速に進化させるために使用できることである。ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリヌクレオチドは、ＷＯ  ００／２８００８及びその中の参考文献により説明されるような配列シャッフリング方法を使用して改変できる。本発明のペプチドシンテターゼは、他のペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体により組み換えを行い、望ましい及び又は新しい特異性及び又は活性のペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体を生成することが可能であり、したがって、望ましい及び又は新しい非コードペプチド生成物を生成することができる。こうした新しいペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体は、少なくとも一つの活性ドメイン又はその他の望ましい特性付与ドメイン（結合、酵素活性、特異性決定等）を有する。
【０１５７】
簡単に言えば、配列又は配列の断片を様々な組み換え方法によってシャッフリングし、シャッフリングしたポリヌクレオチドを発現に適した宿主に導入し、結果として生じた表現型を測定し、修飾表現型を非修飾配列によって生成される表現型と比較する。ここで「表現型」とは、所定の形質を指し、配列シャッフリングが実行されている場合、単一のタンパク質を修飾するために、コードされたポリペプチドの量、配座、組成、又は酵素活性を測定することを含む場合がある。表現型は、他の遺伝子の発現と、呼吸又は解糖といった細胞プロセスと、細胞形状及びサイズといった組織レベルのプロセスと、病原性及び又は毒性といった有機体形質とに対する、修飾ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリヌクレオチドの発現の影響を測定することで評価される場合もある。望ましい表現型を生成する配列シャッフリングされたペプチドシンテターゼポリヌクレオチドは、その後、選択され、更に修飾され、結果として生じた表現型が測定される。シャッフリング及び選択のプロセスは、望ましい表現型を生成する少なくとも一つのポリペプチドをコードする配列シャッフリング済みポリヌクレオチドが取得されるまで、或いは所定の形質の最適化が安定し、その後のシャッフリング及び選択のラウンドにおいて更なる改善が見られなくなるまで、反復して実行される。或いは、結果として生じる核酸集団の多様性を選択前に増加させる目的で、任意の選択ステップの前に、ペプチドシンテターゼ配列の組み換えを多数のラウンドで実行することができる。
【０１５８】
ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリヌクレオチドには、少なくとも五種類の一般的なクラスの組み換え方法を適用することができる。第一に、ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリヌクレオチドの核酸は、ポリヌクレオチドのＤＮアーゼ消化と、これに続くポリヌクレオチドのライゲーション及び又はＰＣＲ再構成とを含む様々な手法のいずれかによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み換えることができる。第二に、ポリヌクレオチドは、例えば、導入したペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリヌクレオチドと、細胞内の相同的配列との間で組み換えが発生するのを可能にすることで、再帰的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み換えることができる。第三に、細胞のゲノム全体を組み換え、ゲノム（核酸及び又はプラスミド）組み換え混合物を所定のペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体配列によりスパイクすることを随意的に含む、全細胞ゲノム組み換え法を使用することができる。第四に、ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体配列の様々なホモログに対応するオリゴヌクレオチドを、二つ以上の対立遺伝子変異体に対応するオリゴヌクレオチドを更に含むＰＣＲ又はライゲーション反応において合成及び再構成し、これにより新しい組み換えポリヌクレオチドを生成する、合成組み換え法を使用することができる。第五に、遺伝子アルゴリズムをコンピュータで使用し、所定のペプチドシンテターゼ配列のホモログに対応する配列ストリングを組み換える、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ手法の組み換えを実行することができる。結果として生じた組み換え配列ストリングは、組み換え配列に対応する核酸の合成により、随意的に核酸へ変換される。こうした合成は、オリゴヌクレオチド合成及び遺伝子再構成手法によって進めることができる。上の任意の一般的な組み換え形式は、更に多様な組み換え核酸のセットを生成するために反復して実施することができる。
【０１５９】
遺伝子配列、構造、及び機能に関してだけでなく、ゲノムスケールでの遺伝子発現パターン及びタンパク質相互作用に関しても蓄積されるデータの量及び質は増加の一途をたどっており、それぞれの項目に基づいて遺伝データに取り組むことはもはや実行不可能となっているため、代わりに、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏデータマイニングによって生物学的情報を発見する新しい方法を作り出す必要がある。「データマイニング」は、本明細書での使用において、意味のあるパターンやルールを発見するために、自動的及び半自動的手段により、大量のデータを調査及び解析することを指す。データマイニングは、分子配列及び構造データ、遺伝子発現及びその他のハイスループットデータ、及び科学文献の既存の知識に適用され、様々な形態の知識及びデータ間で意味のあるつながりを作り出すことを含む。
【０１６０】
本発明のペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体配列を使用して、様々なデータマイニングツールを適用することが可能である。ロングパターンデータセットとして知られる長いデータを含む配列データベースにおいて使用するのに適した方法は、米国特許第６，１３８，１１７号において開示されるものであり、これは、初期設定段階に限定されずに長いパターンを迅速に特定するルックアヘッドスキームと、検索の的を正確に絞る発見的項目順序付けポリシと、他のアルゴリズムにも応用可能なサポートローワバウンディングスキームを使用する。リカーシブパーティショニングは、構造−活性の関係を解明し、ペプチド合成ポリペプチドへの影響に関する化合物のハイスループットスクリーニングにおける意志決定を導くために有効であり、例えば、Ｇタンパク質結合受容体の連続スクリーニングに関して、ヘルツォホらによって説明されている（Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４２：２０７ （１９９９））。本発明のペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体配列は、発現差を解析し、様々な生理条件に関する電子発現プロフィールを作成するために、デジタル微分ディスプレイ（ＤＤＤ）に適用することができる。ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体配列データは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して解析し、タンパク質ドメインを予測することができる。ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体タンパク質の高位の相関は、ペプチドシンテターゼタンパク質配列データを使用して、重要な構造的又は機能的特徴を表す可能性がある、高い相互情報量を示す遠配列部位のセットと比較することで予測可能であり、この方法は単一の残基の特徴又はペアでの相互作用のみを調査する以前の方法の限界を克服するものである（スティーグら，Ｐａｃ． Ｓｙｍｐ． Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．， １９９８：５７３ （１９９８））。
【０１６１】
コンピュータ可読形態で表現された構造を有するペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリペプチド配列は、公報ＷＯ００／１１２０６において説明されるように、特定の生物学的機能を有する生体分子の機能部位に関する機能部位記述子（ＦＳＤ）を使用して、機能を評価することができる。ＦＳＤは、一つ以上のペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリペプチドの新しい機能を特定又はスクリーニングするために使用し、これまでに特定又は推測されたタンパク質の機能を確認すること、タンパク質の機能に関してシャッフリングした配列の影響を評価すること、或いは、ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリペプチドにおける特定の機能部位に関する更なる情報を提供することが可能である。
【０１６２】
ＦＳＤは、タンパク質の機能部位の幾何学的表現であり、通常、タンパク質の機能部位の三次元（３Ｄ）表現を提供することで、機能部位の空間配位を定義する。ＦＳＤによって表現される好適な機能部位には、リガンド結合ドメイン、鉄又は共同因子結合部位、タンパク質−タンパク質相互作用の部位又はドメイン、又は酵素活性部位が含まれる。ＦＳＤは、通常、タンパク質の機能部位を含む二つ以上のアミノ酸残基のそれぞれにおいて、一つ以上の原子に関する幾何学的制約のセットを含む。ＦＳＤの幾何学的制約は、３Ｄ座標のセットによって指定される原子位置、原子間距離、原子間結合角度、或いは、部位の残基によって、又はジンクフィンガ、ロイシンジッパ、ヘリックス、又はα鎖といった二次構造によって課せられる配座制約が含まれる場合があり、こうした制約は固定座標又は範囲として表現することができる。ＦＳＤのライブラリは、ライブラリで表現される少なくとも一つの生物学的機能に関する少なくとも二つのＦＳＤを含むことができる。
【０１６３】
ＦＳＤは、タンパク質構造をプローブし、対応するＦＳＤによって説明される機能部位を、こうした構造が含むかどうかを判断するために使用される。スクリーニングするペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６から選択された非修飾配列、或いは以前に説明したランダム又は定方向配列シャッフリングに由来する修飾形態を含むことができる。通常、機能スクリーニング方法は、ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリペプチドの構造にＦＳＤを適用することを含み、この構造は、Ｘ線結晶法、核磁気共鳴、或いは、コンピュータ「ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ」フォールディングプログラム、相同性プログラム、又は「スレッディング」プログラムによって決定することが可能であり、コンピュータ可読形態で表現できる。
【０１６４】
コンピュータ可読形態で構造を表現されたペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリペプチドの機能は、ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリペプチドの構造にＦＳＤを適用し、ペプチドシンテターゼ、鉄還元酵素、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体ポリペプチド構造がＦＳＤの制約と一致するか、或いはこれを満足させるかを判断することでスクリーニングできる。ＦＳＤのライブラリは、一つ以上のタンパク質構造においてＦＳＤに関連する活性又は機能をプローブするため、或いは評価するために使用することができる。
【０１６５】
本発明のＣＰＳ１、鉄還元酵素ポリペプチド、及び又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体をコードするＤＮＡ分子は、従来の組み換えＤＮＡ技術を使用して、細胞に組み込むことができる。一般に、これには、ＤＮＡ分子を、そのＤＮＡ分子が非相同的である（つまり、通常は存在しない）発現系に挿入することを伴う。非相同的ＤＮＡ分子は、適切なセンス方向及び正しいリーディングフレームにおいて、発現系又はベクタに挿入される。このベクタは、挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含む。米国特許第４，２３７，２２４号では、制限酵素による開裂及びＤＮＡリガーゼによるライゲーションを使用した、組み換えプラスミドの形態での発現系の生成について説明している。こうした組み換えプラスミドは、その後、培養によって成長させた原核有機体及び真核細胞を含む単細胞培養物において、形質転換を用いて導入及び複製する。組み換え遺伝子は、ワクチンウイルス等のウイルスに導入することもできる。組み換えウイルスは、ウイルスに感染した細胞へのプラスミドのトランスフェクションによって生成することができる。
【０１６６】
適切なベクタには、その一部として、ラムダベクタ系ｇｔ１１、ｇｔＷＥＳＴ．Ｂ、Ｃｈａｒｏｎ４といったウイルスベクタと、ｐＢＲ２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫＣ３７、ｐＫＣ１０１、ＳＶ４０、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋／−又はＫＳ＋／−（カリフォルニア州ラホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅの「Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」カタログ（１９９３）を参照）、ｐＱＥ、ｐＩＨ８２１、ｐＧＥＸ、ｐＥＴシリーズ（スタディアら，”Ｕｓｅ ｏｆ Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ”， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １８５ （１９９０）を参照）といったプラスミドベクタと、その任意の誘導体とが含まれる。適切なベクタは、継続的に開発及び特定されている。組み換え分子は、形質転換、形質導入、接合、可動化、又はエレクトロポレーションにより、細胞に導入することができる。ＤＮＡ配列は、マニアティスら又はサンブルックら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（それぞれ１９８２又は１９８９）で説明されているように、この技術において標準的なクローニング手順を使用して、ベクタにクローニングされる。
【０１６７】
様々な宿主−ベクタ系を利用して、（複数の）タンパク質コード配列を発現させることができる。第一に、ベクタ系は、使用される宿主細胞に適合する必要がある。宿主−ベクタ系には、その一部として、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡにより形質転換したバクテリアと、酵母ベクタを含む酵母等の微生物と、ウイルス（ワクチンウイルス、アデノウイルス、その他）に感染させた哺乳類細胞系と、ウイルス（バキュロウイルス等）に感染させた昆虫細胞系と、バクテリアに感染させた、或いは粒子衝撃（つまり、バイオリスティクス）により形質転換した植物細胞とが含まれる。こうしたベクタの発現要素は、その強度及び特異性が異なる。利用する宿主−ベクタ系に応じて、多数の適切な転写及び翻訳要素のうち任意の一つを使用することができる。様々な遺伝信号及びプロセシング事象により、多くのレベルの遺伝発現が制御される（例えば、ＤＮＡ転写及びメッセンジャＤＮＡ、「ｍＲＮＡ」翻訳）。ＤＮＡの翻訳は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を方向付け、これによりｍＲＮＡの合成を促進するＤＮＡ配列であるプロモータの存在に依存する。真核生物のプロモータのＤＮＡ配列は、原核生物のプロモータとは異なる。更に、真核生物のプロモータ及び付随する遺伝信号は、原核系において認識されない場合、或いは機能しない場合があり、更に、原核生物のプロモータは、真核細胞において認識されず、機能しない。同様に、原核生物におけるＤＮＡの翻訳は、真核生物のものとは異なる正しい原核生物の信号の存在に依存する。原核生物におけるＤＮＡの効率的な翻訳には、ｍＲＮＡ上のシャイン−ダルガーノ（「ＳＤ」）配列と呼ばれるリボソーム結合部位が必要である。この配列は、ｍＲＮＡの短いヌクレオチド配列であり、開始コドン、通常はＡＵＧの前に位置し、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする。ＳＤ配列は、１６５  ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）の３’末端と相補的であり、おそらくは、ｒＲＮＡと二重化し、リボソームの正しい配置を可能にすることで、ｍＲＮＡのリボソームとの結合を促進する。遺伝子発現の最大化に関するレビューについては、コバーツ及びラウア，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ６８：４７３ （１９７９）を参照せよ。
【０１６８】
プロモータは、その「強度」（つまり、転写を促進する能力）が異なる。クローン遺伝子を発現させる目的では、高レベルの転写により、高レベルの遺伝子発現を得るために、強力なプロモータが望ましい。利用する宿主細胞系に応じて、多数の適切なプロモータのうち任意の一つを使用することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでのクローニングでは、ｌａｃＵＶ５、ｏｍｐＦ、ｂｌａ、ｌｐｐ、及びその他を一部として含め、ファージプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、リボソームＲＮＡプロモータ、大腸菌ファージラムダのＰＲ及びＰＬプロモータ、及びその他といったバクテリオファージ又はプラスミドプロモータを、隣接するＤＮＡセグメントの高レベルの転写を方向付けるために使用することができる。加えて、組み換えＤＮＡ又はその他の合成ＤＮＡ手法によって生成されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（ｔａｃ）プロモータ又はその他のＥ．ｃｏｌｉプロモータを使用して、挿入遺伝子の転写を提供することができる。バクテリア宿主細胞株及び発現ベクタは、特異的に誘導されない限り、プロモータの作用を阻害するものを選択することができる。特定のオペロンにおいては、挿入ＤＮＡの効率的な転写のために、特異的誘導因子の追加が必要となる。例えば、ｌａｃオペロンは、ラクトース又はＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）の追加により誘導される。ｔｒｐ、ｐｒｏ、その他といった、他の様々なオペロンは、異なる制御を受けることになる。原核細胞における効率的な遺伝子の転写及び翻訳には、特異的な開始信号も必要となる。こうした転写及び翻訳開始信号は、遺伝子特異的メッセンジャＲＮＡ及び合成されたタンパク質の量によってそれぞれ測定した「強度」において異なる場合がある。プロモータを含むＤＮＡ発現ベクタも、様々な「強度」の転写及び又は翻訳開始信号の任意の組み合わせを含む場合がある。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける効率的な転写には、開始コドン（「ＡＴＧ」）に対して約７乃至９塩基５’側にあり、リボソーム結合部位を提供するシャイン−ダルガーノ（「ＳＤ」）配列が必要となる。したがって、宿主細胞のリボソームが利用可能な任意のＳＤ−ＡＴＧの組み合わせを使用することができる。こうした組み合わせには、その一部として、大腸菌ファージラムダのｃｒｏ遺伝子又はＮ遺伝子から、或いは、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、Ｂ、又はＡ遺伝子からのＳＤ−ＡＴＧの組み合わせが含まれる。加えて、組み換えＤＮＡ、或いは合成ヌクレオチドの組み込みを伴うその他の手法によって生成される、任意のＳＤ−ＡＴＧの組み合わせを使用することができる。本発明は、更に、宿主細胞による更なる細胞の成長及び分裂を不可能にするのに役立つ複製タンパク質等、必須細胞タンパク質に関するアンチセンス核酸に関する。アンチセンス調節については、ローゼンバーグら，Ｎａｔｕｒｅ， ３１３：７０３ （１９８５）、プライスら，Ｎａｔｕｒｅ， ３１３：２７ （１９８５）、メルトン，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：１４４ （１９８５）、イザウトら，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：３４２ （１９８５）、キムら，Ｃｅｌｌ， ４２：１２９ （１��８５）、ベスカら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：７５２５ （１９８４）、コールマンら，Ｃｅｌｌ， ３７：４２９ （１９８４）、及びマッカニら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８３：３９９ （１９８６）によって説明されており、これらは参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１６９】
ＣＰＳ１ポリペプチド又は鉄還元酵素をコードする分離ＤＮＡ分子を発現系にクローニングすると、これらを宿主細胞に組み込む準備が整う。こうした組み込みは、ベクタの宿主細胞系に応じて、上で述べた様々な形態の形質転換によって実行することができる。適切な宿主細胞には、その一部として、バクテリア、ウイルス、酵母、哺乳類細胞、昆虫、植物、及びその他が含まれる。本発明において、宿主細胞は、トウモロコシ、オート麦、草、雑草、竹、及びサトウキビといった植物からのものである。本発明のこの態様において、米国特許第５，７６７，９４６号において説明されるハイスループットスクリーニングアッセイにより、ＣＰＳ１タンパク質、鉄還元酵素、又は透過酵素／ＭＦＳ輸送体の阻害物質としての活性に関して、多数の化合物をスクリーニングすることができる。一般には、化合物のライブラリは、酵素触媒反応の阻害に関してアッセイされ、懸濁可能な固体支持体に結合する蛍光量を測定し、阻害の度合いが判断される。例えば、阻害性化合物が存在する状態でマイクロビーズに結合する蛍光量は、非阻害性化合物の場合に比べ大きくなる。個別のビーズに結合する蛍光量は、共焦点顕微鏡法により決定される。このタイプのアッセイを使用することで、例えば、ＣＰＳ１等のペプチドシンテターゼについて、阻害性を判断することができる。ＣＰＳ１に関して、基質は、一方の末端でマイクロビーズと結びつき、他方の末端で蛍光標識と結びつく、アミノ酸（又はヒドロキシ酸）にすることができる。酵素阻害物質を利用して、様々な脊椎生物に菌類への耐性を与えることが可能である。
【０１７０】
本発明の別の態様には、有機体を形質転換し、その有機体に菌類への耐性を与えるために、ＣＰＳ１ポリペプチドをコードする上の一つ以上のＤＮＡ分子、或いはＣＰＳ１生成物を分解する酵素をコードする遺伝子を使用することが関与する。米国特許第５，８４０，４８１号による、こうした病原体誘導耐性の概念では、遺伝子、遺伝子断片、又は修飾遺伝子、或いは病原体の遺伝子断片を宿主に導入することで、特定の寄生体に対する宿主の耐性を効果的に操作することができる。このアプローチは、任意の寄生体−宿主相互作用では、寄生体にとって必須だが、宿主にとってはそうでない特定の寄生体コード化細胞機能（活性）が存在しており、生残又は繁殖といった寄生体の必須機能の一つを混乱させると、その寄生体のプロセスが停止するという事実に基づいている。「混乱」とは、寄生体の生残、繁殖、又は無効性を減じる任意の変化を指す。こうした必須機能は、寄生体の遺伝子の制御下にあり、宿主において、（１）機能不全である、（２）過剰である、或いは（３）寄生体のライフサイクルで誤ったコンテクスト又は誤った発達段階に現れる、対応する遺伝子産物の存在によって混乱させることができる。こうした不良信号は、寄生体の細胞機能に特異的に設計された場合、宿主への影響は殆どない。そのため、有機体を、例えば、一つ以上の菌類による感染に対する抵抗力を与える手順には、菌類のＣＰＳ１等の遺伝子をコードするＤＮＡを分離することと、発現ベクタ内でＤＮＡを機能的に結び付けることと、その発現ベクタにより細胞又は組織を形質転換することとが関与する。形質転換された細胞又は組織では、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ等の菌類が存在すると、ＣＰＳ１  ＤＮＡが遺伝子産物として発現し、このＣＰＳタンパク質が菌類の必須活動を混乱させる。
【０１７１】
本発明の作用因子の用量、製剤、及び投与経路
本発明の方法によって特定される治療剤は、体重に対して、少なくとも約０．０１乃至約１００ｍｇ／ｋｇ、更に好ましくは約０．１乃至約５０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは約０．１乃至約３０ｍｇ／ｋｇの用量を投与することが可能だが、他の用量が有益な結果をもたらす場合もある。投与する量は、様々な要素に応じて変化し、その一部には、選択する薬剤、病気、達成すべきものが予防か治療か、及びその薬剤がバイオアベイラビリティ及びｉｎ  ｖｉｖｏ安定性に関して修飾されているかどうかが含まれる。
【０１７２】
治療剤をコードするセンス又はアンチセンス核酸分子の投与は、核酸分子を含む発現カセットにより形質転換した細胞の導入（例えば、ＷＯ９３／０２５５６を参照）、或いは核酸分子の投与（例えば、フェルグナら，米国特許第５，５８０，８５９号、パードルら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３；１６５ （１９９５）、スティーブンソンら，Ｉｍｍｕｎｏｌ， Ｒｅｖ．， １４５：２１１ （１９９５）、モーリング，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．， ７５：２４２ （１９９７）、ドンリら，Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７７２：４０ （１９９５）、ヤンら，Ｍｏｌ． ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ， ２：４７６ （１９９６）、アブダラら，Ｂｉｏｌ， Ｃｅｌｌ， ８５：１ （１９９５）を参照）により達成することができる。核酸の薬品製剤、用量、及び投与経路は、例えば、フェルグナら，前掲において、全般的に開示されている。
【０１７３】
本発明の治療剤は、好ましくは全身投与による、予防を目的とする常習的な使用になじみやすい。
【０１７４】
本発明による治療剤の投与は、例えば、受容者の生理的状態、投与の目的が治療か予防か、及び当業者に知られているその他の要素に応じて、連続的又は断続的に行うことができる。本発明の薬剤の投与は、事前に選択した期間に渡って基本的に連続して行うことが可能であり、或いは、一連の間隔を空けた投与を行うことができる。局所的投与及び全身投与が考えられる。
【０１７５】
本発明の治療剤を含む一つ以上の適切な単位投与形態は、下で説明するように、除放性となるように随意的に調製される場合があり、様々な経路で投与することが可能で、これには、経口経路、或いは、直腸、口腔粘膜、経膣及び舌下、経皮、皮下、静脈、筋肉内、腹腔内、胸腔内、肺内、及び鼻孔内経路を含む非経口経路が含まれる。製剤は、適当である場合、個別の単位投与形態として都合良く提供することが可能であり、調剤学で広く知られている任意の方法によって作成できる。こうした方法は、治療剤を、液体担体、固体担体、半固体担体、細粒固体担体、又はその組み合わせと結び付け、その後、必要な場合は、生成物を望ましい伝達システムへと導入又は成形するステップを含む。
【０１７６】
本発明の治療剤を経口投与用に作成する時、好ましくは、これを薬品において許容される担体、稀釈剤、又は賦形剤と組み合わせ、薬品製剤又は単位投与形態を形成する。こうした製剤の有効成分の合計は、製剤の重量の０．１乃至９９．９％となる。「薬品において許容される」とは、担体、稀釈剤、賦形剤、及び又は塩類が、製剤の他の成分に適合する必要があり、その受容者に対して有害でないことを意味する。経口投与での有効成分は、粉末又は顆粒として、溶液、懸濁液、又は乳液として、或いは、チューインガムから有効成分を摂取するための合成樹脂等の達成可能な基剤中に、提供できる。有効成分は、ボーラス、舐剤、又はペーストとして提供することもできる。
【０１７７】
経膣投与に適した製剤は、この技術で知られる適切な担体を、有効成分と共に含む、ペッサリ、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、灌水、滑剤、フォーム、又はスプレとして提供することができる。直腸投与に適した製剤は、座剤として提供することができる。
【０１７８】
本発明の治療剤を含む薬品製剤は、広く知られた容易に入手可能な材料を使用して、この技術で知られている手順により作成できる。例えば、この薬剤は、一般的な賦形剤、稀釈剤、又は担体により調製し、タブレット、カプセル、懸濁液、粉末、及びその他を形成することができる。こうした製剤に適した賦形剤、稀釈剤、担体の例には、澱粉、砂糖、マンニトール、シリカ誘導体のような溶加剤及び増量剤と、カルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣその他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニール−ピロリドンのような結合剤と、グリセロールのような加湿剤と、炭酸カルシウム及び重炭素ナトリウムのような崩壊剤と、パラフィンのような分解遅延剤と、第四アンモニウム化合物のような再吸収促進剤と、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレートのような界面活性剤と、カオリン及びベントナイト吸収担体と、タルク、ステアリン酸カルシウム及びマグネシウム、及び固形ポリエチレングリコールのような滑剤が含まれる。
【０１７９】
例えば、本発明の薬剤を含むタブレット又はカプレットは、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、及び炭酸マグネシウムのような緩衝剤を含むことができる。カプレット及びタブレットは、セルロース、アルファ化澱粉、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、澱粉、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、鉱油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウム、及びステアリン酸亜鉛、その他の非活性成分を含むことができる。本発明の薬剤を含むハード又はソフトゼラチンカプセルは、ゼラチン、微結晶性セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、澱粉、タルク、及び二酸化チタン、その他の非活性成分と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び植物油等の液体媒介物を含むことができる。更に、本発明の薬剤の腸溶性カプレット又はタブレットは、胃での分解に抵抗し、十二指腸の中性乃至アルカリ性の環境で分解するように設計される。
【０１８０】
本発明の治療剤は、経口投与に都合の良いエリキシル剤又は溶液として、或いは、例えば、筋肉内、皮下、又は静脈経路による非経口投与用の溶液として調製することも可能である。
【０１８１】
本発明の治療剤の薬品製剤は、水性又は無水性の溶液又は分散物の形態にすることも可能であり、或いは代わりに乳液又は懸濁液の形態にすることもできる。
【０１８２】
したがって、この治療剤は、（例えば、ボーラス注射又は持続注入等の注入による）非経口投与用に調製可能であり、アンプル、充填済み注射器、小容量注入容器、又は保存剤を付加した多投与容器の単位投与形態で提供することができる。有効成分は、油性又は水性媒体物において懸濁、溶体、又は乳濁等の形態をとることが可能であり、懸濁化剤、安定化剤、及び又は分散剤といった調製剤を含むことができる。代わりに、有効成分は、滅菌固体の無菌分離又は溶液の凍結乾燥によって得られる粉末形態とし、使用前に発熱物質のない滅菌水等の適切な媒体物を伴う構成にすることができる。
【０１８３】
こうした製剤は、従来技術で広く知られる、薬品において許容される媒体物及びアジュバントを含むことができる。例えば、水に加え、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、「Ｄｏｗａｎｏｌ」の名称で販売される製品等のグリコールエーテル、ポリグリコール又はポリエチレングリコール、短鎖酸のＣ１乃至Ｃ４アルキルエステル、好ましくは、乳酸エチル又はイソプロピル、「Ｍｉｇｌｙｏｌ」の名称で販売されている製品等の脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物油、鉱油、植物油、及びポリシロキサン等の溶媒から選択された、生理学的な観点から許容できる一つ以上の有機溶媒を使用する溶液を作成することが可能である。
【０１８４】
本発明による組成は、セルロース及び又はセルロース誘導体等の増粘剤を含むことができる。更に、キサンタン、グアール、又は炭水化物ガム、或いはアラビアゴム、或いは代替として、ポリエチレングリコール、ベントン、及びモンモリロナイト、その他のようなガムを含むことができる。
【０１８５】
必要な場合は、酸化防止剤、界面活性剤、その他の保存剤、被膜形成剤、角質溶解剤、面皰溶解剤、香料、及び着色剤から選択されたアジュバントを追加することができる。更に、説明する条件、或いは他の何らかの条件のために、他の有効成分を追加することができる。
【０１８６】
例えば、酸化防止剤については、ｔ−ブチルヒドロキノンと、ブチル化ヒドロキシアニソールと、ブチル化ヒドロキシトルエンと、ａ−トコフェロール及びその誘導体とを挙げることができる。ガレヌス製剤の形態は、クリーム、ミルク、ゲル、分散物又はマイクロエマルジョン、高濃縮又は低濃縮ローション、含浸パッド、軟膏又はスティックの形態、或いは代替として、スプレ又はフォーム形態のエアゾール製剤の形態、或いは固形石鹸の形態をとった、局所適用のために準備される。
【０１８７】
加えて、この薬剤は、除放性投与形態等にも最適である。この製剤は、腸管又は気道の特定の部分においてのみ、或いは、好ましくは、こうした部分において、おそらくは一定の期間に渡って、有効成分を放出するように構成することができる。コーティング、エンベロープ、保護基質は、例えば、ポリ乳酸−グリコール酸塩、リポソーム、マイクロエマルジョン、マイクロ粒子、ナノ粒子、又はワックスといった高分子物質から形成することが可能である。こうしたコーティング、エンベロープ、保護基質は、ステント、カテーテル、腹膜透析管、及びその他のような留置デバイスをコーティングするのに有効である。
【０１８８】
本発明の治療剤は、経皮投与用のパッチを介して伝達することができる。この治療剤の経皮伝達に適したパッチの例については、米国特許第５，５６０，９２２号を参照せよ。経皮伝達用のパッチは、バッキング層と、治療剤を一つ以上の皮膚浸透促進剤と共に内部に分散又は溶解させたポリマ基質とを含む。バッキング層は、治療剤に対して不浸透性である任意の適切な素材で作成できる。バッキング層は、基質層の保護カバーの役割を果たし、更に支持機能を提供する。このバッキングは、ポリマ基質と基本的に同じサイズの層になるように形成可能であり、或いは、ポリマ基質の側部を超えて延びることができるように、若しくはポリマ基質の側部又は複数の側部を覆い、その後、バッキング層の延長部の表面が接着手段の基部となるような形で外側へ延びることができるように、大きな寸法にすることができる。代わりに、ポリマ基質は、ポリアクリレート又はアクリレート／ビニルアセテート共重合体等の接着性ポリマを含むか、これにより調製することが可能である。長期的な投与では、皮膚の水和又は浸軟を最小化できるように、微小孔性及び又は通気性のバッキングラミネートが望ましい場合がある。
【０１８９】
バッキング層を作成するのに適した材料の例は、高密度及び低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリビニルクロライド、ポリ（エチレンフタレート）等のポリエステル、金属箔、適切なポリマフィルムの金属箔ラミネート、及びその他のフィルムである。好ましくは、バッキング層に使用する材料は、アルミ箔等の金属箔が付いたこうしたポリマフィルムのラミネートである。こうしたラミネートにおいて、ラミネートのポリマフィルムは、通常、接着性ポリマ基質と接触した状態にある。
【０１９０】
バッキング層は、望ましい保護及び支持機能を提供する任意の適切な厚さにすることができる。適切な厚さは、約１０乃至２００ミクロンである。
【０１９１】
一般に、生物学的に許容される接着ポリマ層を形成するのに使用されるポリマは、治療剤が制御された速度で通過可能な成形体、薄壁、又はコーティングを形成できるものである。適切なポリマは、生物学的適合性及び薬品における適合性を有し、非アレルギ性であり、デバイスが接触する体液又は組織に対する不溶解性及び適合性を有する。皮膚の水分による基質の溶解及び浸食が治療剤の放出速度と、除去の利便性のために投与単位が定位置に留まる能力とに影響することになるため、溶解性ポリマの使用は、避けるべきである。
【０１９２】
接着性ポリマ層を作成する材料の例には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン／プロピレン共重合体、エチレン／エチルアクリレート共重合体、エチレン／ビニルアセテート共重合体、シリコンエラストマ、特に、医療グレードのポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、ポリビニルクロライド、ビニルクロライド−ビニルアセテート共重合体、架橋ポリメタクリレート重合体（ヒドロゲル）、ポリビニリデンクロライド、ポリ（エチレンテレフタレート）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコール共重合体、エチレン−ビニルオキシエタノール共重合体と、シリコン共重合体、例えば、ポリシロキサン−ポリカーボネート共重合体、ポリシロキサン−ポリエチレンオキシド共重合体、ポリシロキサン−ポリメタクリレート共重合体、ポリシロキサン−アルキレン共重合体（ポリシロキサン−エチレン共重合体等）、ポリシロキサン−アルキレンシラン共重合体（ポリシロキサン−エチレンシラン共重合体等）、及びその他と、セルロース重合体、例えば、メチル又はエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びセルロースエステルと、ポリカーボネートと、ポリテトラフルオロエチレンと、その他とが含まれる。
【０１９３】
好ましくは、生物学的に許容されるポリマ基質は、室温より低いガラス転移温度を有するポリマから選択するべきである。このポリマは、必ずしも必要ではないが、室温でのある程度の結晶化度を有することができる。こうしたポリマには、架橋単量体単位又は部位を組み込むことができる。例えば、ポリアクリレート重合体に架橋単量体を組み込むことが可能であり、これは、ポリマ内に治療剤を分散させた後、基質と架橋する部位を提供する。ポリアクリレート重合体のための既知の架橋単量体には、ブチレンジアクリレート及びジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、及びその他のようなポリオールのポリメタクリル酸エステルが含まれる。こうした部位を提供するその他の単量体には、アクリル酸アリル、メタクリル酸アリル、マレイン酸ジアリル、及びその他が含まれる。
【０１９４】
好ましくは、可塑剤及び又は湿潤剤を、接着性ポリマ基質内で分散させる。一般には、水溶性ポリオールが、この目的に適している。製剤に湿潤剤を組み込むことで、投与単位は、皮膚表面の水分を吸収できるようになり、これは皮膚刺激を減らし、接着性ポリマ層の伝達システムが機能しなくなるのを防ぐのに役立つ。
【０１９５】
経皮伝達システムから放出される治療剤は、皮膚の各層に侵入する能力を有する必要がある。治療剤の浸透速度を高めるために、経皮薬物伝達システムは、特に、分子の侵入に対して最も耐性が強い皮膚の最外層である角質層の透過性を高めることができなくてはいけない。治療剤を経皮伝達するパッチの製造については、この技術において広く知られている。
【０１９６】
吸入による上気道（鼻）又は下気道への投与に関して、本発明の治療剤は、吸入器、噴霧器、又は加圧式パック、或いはエアゾールスプレを伝達するその他の利便性に優れた手段により、都合良く伝達することができる。加圧式パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又はその他の適切なガス等、適切な噴射剤を含むことができる。加圧式エアゾールの場合、投与単位は、定量を伝達するバルブを設けることで決定することができる。
【０１９７】
代わりに、吸入又は通気による投与に関して、組成物は、乾燥粉末、例えば、治療剤とラクトース及び澱粉のような適切な粉末基剤との粉末混合物の形態をとることができる。この粉末組成物は、例えば、カプセル又はカートリッジ、或いは、吸入器、通気器、定量吸入器を用いて粉末を投与することが可能なゼラチン又はブリスタパック等、単位投与形態で提供することができる。
【０１９８】
鼻腔内投与に関して、治療剤は、点鼻剤、つまり液体スプレによって、プラスチックボトルの噴霧器又は定量吸入器等を介して、投与することができる。代表的な噴霧器は、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）及びＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。
【０１９９】
本発明の治療剤の局所伝達も、薬剤を病気の部位又はその近くに投与する様々な手法によって行うことができる。部位特異的又は標的局所伝達手法の例については、限定的ではなく例示的な意図で手法を挙げることができる。例には、注入又は留置カテーテルのような局所伝達カテーテル、例えば、針注入カテーテルと、シャント及びステントその他の移植可能デバイスと、部位特異的担体と、直接注射と、直接適用とが含まれる。
【０２００】
局所投与に関してこの治療剤は、この技術で知られているように、目標エリアに直接適用するものとして調製できる。この目的での従来型の形態には、創傷被覆材、コート済み包帯その他のポリマ被覆、軟膏、ローション、ペースト、ゼリー、スプレ、及びエアゾールと、練り歯磨き及び洗口液、或いは、コート済みコンドーム等、その他の最適な形態によるものとが含まれる。軟膏及びクリームは、例えば、適切な増粘剤及び又はゲル化剤を追加した水性又は油性基剤により調製することができる。ローションは、水性又は油性基剤により調整可能であり、一般に、一つ以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、又は着色剤を含む。有効成分は、例えば、米国特許第４，１４０，１２２号、第４，３８３，５２９号、又は第４，０５１，８４２号において開示されるように、イオントフォレーゼによって伝達することもできる。局所的製剤に存在する本発明の治療剤の重量パーセントは、様々な要素に応じて変化するが、一般に、製剤の総重量の０．０１％乃至９５％であり、通常は０．１乃至２５％の重量である。
【０２０１】
望ましい場合、上で説明した製剤は、例えば、天然ゲル、合成ポリマ、又はその混合物を含む親水性ポリマ基質等により、有効成分の除放性を与えるために適合化できる。
【０２０２】
点眼剤又は点鼻剤等の滴剤は、一つ以上の分散剤、安定化剤、又は懸濁剤を更に含む水性又は無水性の基剤により調製することができる。液体スプレは、加圧式パックから、高い利便性で伝達される。滴剤は、単純なキャップ付き点眼剤ボトルにより、或いは、特殊な形状のクロージャを介して、液体内容物を滴状で伝達するように適合化されたプラスチックボトルにより伝達することができる。
【０２０３】
この治療剤は、更に、口腔又は咽喉での局所的投与用に調製することができる。例えば、有効成分は、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカントである風味付きの基剤を更に含むトローチ剤、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア等の不活性基剤内に組成物を含む香錠、適切な液体担体中に本発明の組成物を含む洗口液、及び、本発明の組成物を含む練り歯磨き及びゲル等のペースト及びゲルとして調製できる。
【０２０４】
本明細書で説明する製剤及び組成物は、抗菌剤又は保存剤といった他の成分を含むことができる。更に、この有効成分は、他の治療剤、例えば、経口避妊薬、気管支拡張剤、抗ウイルス剤、ステロイド剤、及びその他と組み合わせて使用することができる。
【０２０５】
本発明については、以下の非制限的な例によって更に説明する。
【０２０６】
例Ｉ
突然変異体の作成及び特徴付け
材料及び方法
菌株、培地、交配、及び形質転換。Ｃ４（Ｔｏｘ１＋、ＭＡＴ−２）及びＣ５（Ｔｏｘ１−、ＭＡＴ−１）は、準同質遺伝子Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ菌株の構成要素である（リーチら，１９８２，前掲）。Ｒ．Ｃ４．２６９６（Ｔｏｘ＋、ＭＡＴ−２、ｈｙｇＢＲ）は、ＲＥＭＩ突然変異誘発手順を使用して生成したＣ４誘導突然変異体である（ルーら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１２６４９ （１９９４））。菌株１３０１Ｒ３３（Ｔｏｘ−、ＭＡＴ−２、ｈｙｇＢＲ）、１３０１Ｒ４５（Ｔｏｘ−、ＭＡＴ−１、ｈｙｇＢＲ）、１３０１Ｒ２６（Ｔｏｘ＋、ＭＡＴ−２、ｈｙｇＢＲ）は、交配Ｃ５×Ｒ．Ｃ４．２６９６の子孫である。培地は、ＣＭ（完全培地）、ＣＭＸ（グルコースの代わりにキシロースを含む完全培地）、ＣＭＮＳ（塩類を除外したＣＭ）、及びＭＭ（最小培地）を含め、説明されており、交配手順についても同様である（リーチら，１９８２，前掲、タージオンら，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０１：４５０ （１９８５））。すべての菌株は、白熱灯又はブラックライト（Ｆ４０／３５０ＢＬ）下において２４℃で成長させた。子嚢胞子の発芽は、３２℃で暗所において三日間行った。ＲＥＭＩ形質転換体は、形質転換体をオリジナルのＲＥＭＩプレートから、ハイグロマイシンＢ（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＲ）を８０  ｉ  ｇ／ｍｌで含む新鮮なＣＭＮＳ培地へと転移させることで精製した。分生子形成に関しては、培地の塩類の阻害により減少した薬物活性を補うために、同じ薬品を高い濃度（１２０  ｉ  ｇ／ｍｌ）で含むＣＭＸに、安定した形質転換体を転移させた。単一の分生子を、解剖顕微鏡下で取り出し、ＣＭＮＳハイグロマイシンＢプレートで成長させ、安定したコロニを個別のＣＭＸ／ハイグロマイシンプレートに転移させた。精製したすべての形質転換体は、９６穴マイクロタイタプレートで、２５％のグリセロールを含むＣＭ液体培地において、−７０℃で保管した。
【０２０７】
バイオアッセイ。菌株は、分生子形成を最大にするために、ＣＭＸプレート（１００×１５ｍｍ）上で、７乃至１０日間、明所において２４℃で成長させた。Ｔレース分離体による正常なＴ毒素生成を確認するために、１．０ｍｌのＴ毒素感受性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨＳａ）細胞を、アンピシリン（１００  ｉ  ｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地に均等に塗り広げ、プレートを層流フード内で３０分間、空気乾燥させた。菌類の菌糸が生じた寒天プラグを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を塗布したものに（上下逆に）接種し、このプレートを３２℃で培養した。野生型Ｔレース及びＯレースを、各アッセイプレートの対照として使用した。この菌類のＴ毒素生成菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の成長を阻害し、ハロを形成する。Ｔｏｘ−突然変異体は、ハロ（緊密）を形成しないこと、或いは野生型（過剰生成）よりも小さな（漏れやすい）ハロ又は大きなハロの形成により、野生型と区別できる。すべてのＴｏｘ−突然変異体を、毒素生成に最適化したフリース培地（プリングルら，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ４７：３６９ （１９５７））に転移させ、再テストを行った。
【０２０８】
Ｔ細胞質トウモロコシ植物（近交系Ｗ６４Ａ）を使用して、下で説明する手順により、Ｅ．ｃｏｉから特定したＴｏｘ−突然変異体を検証する。Ｔ毒素生成において欠陥のある突然変異体は、Ｔトウモロコシにおいて通常のＴレースの症状を作り出すことができない。Ｔｏｘ＋菌株のＮ細胞質トウモロコシでの病原性表現型及びＴ細胞質トウモロコシに対する毒性は、植物のアッセイによって決定され、ここでは、ＲＥＭＩ突然変異誘発手順を使用して生成した約３，０００の形質転換体（ルーら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１２６４９ （１９９４））を、トウモロコシ植物で病気を引き起こす能力に欠陥のある突然変異体に関してスクリーニングした。温室（４”×６”ポット一つに５乃至６苗）で二週間成長させたＮ細胞質トウモロコシ植物（近交系Ｗ６４Ａ）に、加圧したＰｒｅｖａｌ  Ｓｐｒａｙ  Ｇｕｎ  Ｐｏｗｅｒ  Ｕｎｉｔ薄層クロマトグラフィ噴霧器（イリノイ州ディアフィールドＡｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して、５ｍｌ分生子懸濁物（１０５分生子／ｍｌ）を接種し、ミスト室で２４時間（２３℃）培養し、その後、成長室に移した（２３℃、湿度８０％、照明時間１４時間）。突然変異体の表現型は、病徴の進行における明白な変化の発生、主に病変サイズの比較により判断した。野生型よりも小さな病変を生み出す突然変異体を再テストし、各突然変異体での代表的な病変の長さを接種七日後に野生型と比較し、測定結果を統計的に評価した。
【０２０９】
ＤＮＡ操作及び配列決定。ゲノム及びプラスミドＤＮＡの作成、制限酵素による消化、ゲル電気泳動、及びゲルブロット解析は、標準的なプロトコルを使用して行った（サンブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））。ＤＮＡは、ＤｙｅＤｅｏｘｙターミネータ（カリフォルニア州フォスタシティのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ＴａｑＣｙｃｌｅ自動配列決定を使用するＣｏｒｎｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで配列決定した。サブクローニングにはｐＵＣＡＴＰＨを使用した（表１）。配列決定に使用したプライマ（表２）は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、ＬａｓｅｒＧｅｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して設計し、Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより合成した。各プラスミドクローンの配列決定は、ベクタ特異的プライマ、或いは以前に決定された配列に対して設計されたプライマにより開始した。取得した配列は、同じシステムを使用して解析し、ヌクレオチド又はタンパク質データベース検索は、ＢＬＡＳＴプログラム（オルトシュルら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３ （１９９０））により実行した。
【０２１０】
【表１】
2004537967.tif 000002
ａ  下線のｋｂ数は、プラスミドがゲノムＤＮＡ配列を有することを示す。
【０２１１】
【表２】
2004537967.tif 000003
2004537967.tif 000004
ａ  「ＲＰ」は復帰プライマ、「ＦＰ」は前進プライマを示す。ゲノムＤＮＡ配列に対して設計されたプライマには、順に番号が付いている。プライマ１乃至１７には先行番号「２１４」が付いており、１８乃至２０には「１１８」、２１乃至２９には「９Ｐ２」、３０乃至３１には「９Ｐ５」が付いている。Ｍ１３ＲＭＴ（Ｍ１３Ｒの突然変異バージョンで、ｐＵＣ１８のポリリンカに突然変異が存在する）及びＭ１３Ｆ４０は、Ｃｏｒｎｅｌｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにより提供された。ＴｒｐＣプライマ部位は、ＳａｌＩ部位から３８ｂｐのｐＵＣＡＴＰＨ  ＴｒｐＣプロモータ領域に存在し、ｓａｌＩからｋｐｎＩの配列方向性を有する。
ｂ  各プライマの第一に塩基の位置は、組み立てた配列に対応する（ＣＰＳ１＋ＴＥＳ１、合計１１．３ｋｂ）。
ｃ  各プライマの配列は、５’から３’の方向で提示されている。
ｄ  各配列決定反応に関して鋳型として使用したプラスミド。Ａ＝ｐ２１４Ｂ７、Ｂ＝Ｐ２１４Ｍ１、Ｃ＝ｐ２１４Ｓ１、Ｄ＝ｐ１１８Ｂ１４、Ｅ＝ｐ１１８ＢＣ４、Ｆ＝ｐ９Ｐ２、Ｇ＝ｐ９Ｐ５（＝９Ｐ２）。
ｅ  プライマの設計に使用されたオリジナル配列。
【０２１２】
結果
ＲＥＭＩ挿入部位からの標識ＤＮＡの回収及び標的遺伝子破壊。突然変異体Ｒ．Ｃ４．２６９６のゲノムＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ、ＭｓｃＩ（ｐＵＣＡＴＰＨの部位がない）、又はＳａｃＩ（ベクタを一度切断する）により消化し、フェノール抽出及びエタノール沈殿により精製した後、ＴＥ（ｐＨ８．０）に溶解させた。ライゲーションは、１０ｍＭ  ＡＴＰ、６０単位Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（マサチューセッツ州ビバリのＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、及び３μｇのＢｇｌＩＩ消化ゲノムＤＮＡを伴う１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液を含んだ５０μｌ反応混合物において、１４℃で一晩行った。１０ｍｌのライゲーション混合物を使用し、塩化カルシウム処理（サンブルックら，１９８９，前掲）を使用して作成した２００μｌのコンピテントＤＨ５α細胞を形質転換し、アンピシリン耐性とした。アンピシリン耐性クローンを、いくつかの診断用制限酵素によるプラスミドＤＮＡの消化により解析し、ＲＥＭＩベクタ及びフランキングゲノムＤＮＡを含むクローンは、ベクタ特異的プライマ（Ｍ１３Ｒ又はＴｒｐＣ）を使用して配列決定した。三種類のプラスミド、つまりｐ２１４Ｂ７、ｐ２１４Ｍ１、及びｐ２１４Ｓ１を回収し、配列決定に使用した。ｐ２１４Ｂ７は、４．２ｋｂのフランキングＤＮＡ（左３．４、右０．７）を含み、ｐ２１４Ｍ１は、ｐ２１４Ｂ７と重複する左０．１ｋｂのフランキングと、ｐ２１４Ｓ１と重複する右１．１ｋｂのフランキングとを含み、ｐ２１４Ｓ１は、左だけに３．２ｋｂのフランキングＤＮＡを含む。
【０２１３】
野生型での標的遺伝子破壊に関しては、ｐ２１４Ｂ７を増幅し、プラスミドＤＮＡをＣｓＣｌ臭化エチジウム勾配における平衡遠心分離により精製した（サンブルックら，１９８９，前掲）。３０μｇのプラスミドＤＮＡ（ダブルクロスオーバ組み込みのためにＢｇｌＩＩにより線状化）を使用して野生型を形質転換し、この形質転換体を単一の分生子の分離によって精製し、病原性に関してアッセイし、ゲルブロット解析により特徴付けた。
【０２１４】
標的組み込み及びプラスミドレスキュによる配列の延長。二つの重複するコスミドクローンを、コスミドベクタ上に構築されたＣ４のゲノムＤＮＡライブラリをプローブすることで分離し、両方をｐ２１４Ｂ７の左側領域のみで延長した。右側へ延長するために、染色体歩行戦略を利用した。三種類の標的遺伝子破壊実験（その後、それぞれプラスミドレスキュを実行）を連続して行った。最初の実験では、ベクタを次のように構築した：ｐ２１４Ｓ１をＮａｒＩにより消化し、再ライゲーションによりｐ２１４Ｓ１Ｎを作成し、その後、これをＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ｐＵＣＡＴＰＨのＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションして、Ｏレース（Ｃ５）の形質転換のためのｐ２１４ＳＮＰを作成した。相同的組み込み（ゲルブロット解析により確認）により生じた一形質転換体（Ｔｘｌ１８）を、上で説明したように、プラスミドレスキュに使用した。二種類の新しいプラスミドｐ１１８Ｂ１４及びｐ１１８ＢＣ４が回収され、この両方は３’末端に配列を有し、それぞれ１７２及び６８０ｂｐのみｐ２１４Ｓ１より大きかった。歩行を続けるために、ｐ１１８Ｂ１４をＳａｃＩにより消化し、ｐＵＣＡＴＰＨのＳａｃＩ部位にライゲーションし、ｐ１１８ＢＳＰを作成した。このベクタを、ＢｇｌＩＩにより線状化し、野生型に形質転換し、一つのプラスミド、ｐ９Ｐ２を（形質転換体Ｔｘ９から）回収し、これはｐ１１８ＢＣ４の３’領域に４．４ｋｂ延び、ＣＰＳ１の３’末端を含んだ。回収したプラスミドｐ９Ｐ２は、ｐ１１８ＢＳＰ上のｐＵＣ１８配列全体と、停止コドン（ＴＡＧ）及び停止コドンの３．０ｋｂのゲノム領域３’を含めたＯＲＦ１（ＣＰＳ１）のすべてを包含した４．６ｋｂのゲノムＤＮＡとを含んでいる。第三の実験では、その標識遺伝子の３’末端にある１５ｋｂ  ＸｈｏＩ断片を回収することを試みた。０．８ｋｂＳｓｐＩ断片をｐＵＣＡＴＰＨの同じ部位にサブクローニングすることで、ｐ１１８ＢＣＳを構築した。形質転換体（Ｔｘ１２）のＸｈｏＩ消化ゲノムＤＮＡを使用したプラスミドレスキュでは、１５ｋｂ  ＸｈｏＩ断片を回収できなかったが、同じ形質転換体のＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡを使用してｐ１２Ｈ６が回収され、このゲノムＤＮＡはｐ９Ｐ２で既にクローニングされたものと一致した。
【０２１５】
ＲＥＭＩ突然変異体の特徴付け。使用したすべての培養条件において、突然変異体Ｒ．Ｃ４．２６９６は、野生型と全く同じように成長し、成長速度、色、及び形態学的特徴に変化は無かった。これは、人工表面上で誘導した時に野生型のように発芽して感染構造を形成する正常な付着器形成を行う分生子を生成し、野生型のテスタと交配させた時に正常な交配能力を示す。突然変異に伴う多面表現型は、これまでに検出されていない。この突然変異体は、トウモロコシ植物で病気を引き起こす能力において、野生型と相違する。
【０２１６】
野生型Ｏレースと、Ｒ．Ｃ４．２６９６突然変異を受け継ぐ突然変異体子孫Ｒ４５（Ｔｏｘ−、ｈｙｇＢＲ）とを接種したトウモロコシの葉からの１００の代表的な病変の長さを、接種から７日後に測定し、値をプロットした。Ｔ細胞質トウモロコシでテストした時、突然変異体は、Ｔタイプの症状を発生させたが、病気の進行速度は野生型よりも遅く、ただし、微生物アッセイにおいて検出されるように、野生型の水準のＴ毒素を生成しているため、これは、毒性の減少がＴ毒素を生成する能力の欠陥に関連しないことを示している。これはＮ細胞質トウモロコシでは更に明らかであり、突然変異体で発生した病変は、野生型で発生するものより大幅に小さい。この突然変異体を野生型Ｏレースと交配した時、小さな病変の表現型とＴ毒素を生成する能力とは独立して分離し、これは、突然変異体の表現型がＴｏｘ１座と密接に結びつく適応性形質の減少と関連しないことを示している（クリティッチら，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ７６：１２９４ （１９８６））。野生型Ｏレースの遺伝的背景における病変サイズの統計的評価は、突然変異により、トウモロコシ植物に対する菌類の毒性において６０％の減少が発生することを示している。表３は、突然変異体の病変の８６％が長さ４ｍｍ未満（平均３．５ｍｍ）であり、野生型のもの（８．５ｍｍ）に比べ６０％減少したという統計分析を示している。
【表３】
2004537967.tif 000005
＊Ｐ＜０．０１での有意差
【０２１７】
この突然変異体の表現型は、標識された単一部位の突然変異によって生じたものである。突然変異体と野生型テスタとの交配において、子孫は、親型のみについて１：１に分離し、すべてのハイグロマイシンＢ耐性子孫は突然変異体の親と類似する病変を発生させ、すべてのハイグロマイシンＢ感受性子孫は野生型の病変を発生させており、これは、標識した突然変異が突然変異体の病原性減少の原因であることを示している。表４は、子孫の分離データを示している。
【表４】
2004537967.tif 000006
＊１３０１−Ｒ３３（病原性、ｈｙｇＢＲ、Ｔｏｘ−、ＭＡＴ−２）は、第一の交配からの子孫で、Ｒ．Ｃ４．２６９６突然変異体を受け継ぐ。
【０２１８】
例２
ＲＥＭＩベクタ挿入部位の側面に位置するＤＮＡのクローニング、配列決定、及び特徴付け
挿入部位を囲む合計１１．３ｋｂのゲノムＤＮＡをクローニングし、完全に配列決定した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、図２）。この配列は、七個のプラスミドクローンに由来する。最初の三個（ｐ２１４Ｂ７、ｐ２１４Ｍ１、及びｐ２１４Ｓ１）は、突然変異体Ｒ．Ｃ４．２６９６の標識部位から回収され、全領域の約６０％をカバーした。残り（ｐ１１８Ｂ１４、ｐ１１８ＢＣ４、ｐ９Ｐ２、及びｐ１２Ｈ６）は、染色体歩行戦略を使用して生成した形質転換体から回収した。挿入部位の左のＤＮＡ（３．４ｋｂ）は、ｐ２１４Ｂ７にクローニングされ、右のＤＮＡ（７．９ｋｂ）は、異なる重複プラスミドにクローニングされた。ｐ９Ｐ２は、ｐ１２Ｈ６のゲノムＤＮＡを含む最大の量（４．６ｋｂ）を有する。
【０２１９】
結合した配列の解析により、二つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかとなった。ＯＲＦ１（５．４ｋｂ）は、ＲＥＭＩベクタ挿入部位の５７６ｂｐ上流で開始され、右側面の配列領域の終わりから３０２９ｂｐのインフレーム停止コドン（ＴＡＧ）により終了する。「ＴＡＴＡ」ボックス状の要素は、予測される位置で見られないが、五個の推定「ＣＡＡＴ」ボックスが開始コドン（ＡＴＧ）の上流に位置し、そのうち三個は殆どの糸状菌プロモータにおいて見られた範囲に存在する（６０乃至２００ｂｐ）（ガーら，１９８７，前掲）。ＯＲＦ１のＡＴＧの周囲の配列（ＣＡＣＣＡＴＧＣＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）は、菌類のコンセンサス（ＣＡＣＣＡＴＧＧＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）と類似している。上流ではいくつかのＡＴＧが見られるが、周囲の配列にコンセンサスとの類似性がないため、開始コドンとして使用される可能性は低い。三つの推定イントロンは、保存された５’及び３’境界配列と潜在的な分岐部位とによって特定される（図５）。こうしたイントロンのスプライシングにより、５．４ｋｂのオープンリーディングフレームを断絶するはずの停止コドンが排除された。三つのイントロンは、同様のサイズ（それぞれ４５乃至５３ｂｐ）で、殆どの菌類遺伝子から決定されるイントロンの範囲内である。推定ポリアデニル化信号（ＡＴＡＡ）は、翻訳開始部位の２２３ｂｐ下流で見られる。
【０２２０】
ＯＲＦ１のＧ＋Ｃ含有量は５１．５％で、殆どのＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ遺伝子と同様である（タージオンら，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅ．， ２３８：２７０ （１９９３）、バンワートら，Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．， ２２：２９ （１９９２）、ヤンら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８：２１３９ （１９９６）、ローズら，１９９６，前掲）。興味深いことにＯＲＦ１の側面には、高Ｇ＋ＣＤＮＡの二つの領域が位置している。第一のもの（１．４ｋｂ、６０．３％Ｇ＋Ｃ）は、ＯＲＦ１とＯＲＦ２との間で見られ、第二のもの（１．２ｋｂ、６０．３％Ｇ＋Ｃ）は、ＯＲＦ１の停止コドンの１．８ｋｂ下流で見られる。ＯＲＦ１の翻訳済みタンパク質配列を使用したデータベース検索では、バクテリアＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓによって生成される環状ペプチド抗生物質サフラマイシンＭｘ１の生合成を触媒する多機能酵素の一つであるＳａｆＢとの高い類似性が明らかとなった（ポスピークら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４２：７４１ （１９９６））。ＯＲＦ１（ＣＰＳ１）のヌクレオチド配列全体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に指定される（１１．３ｋｂ配列領域からの６，５５０塩基対、図２）。ＣＰＳ１タンパク質の推論されるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に指定される。ＣｈＣＰＳ１の修飾は、三塩基対における変更（ＧｅｎＢａｎｋエントリ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３２８７８）の位置５３４９及び５３５０の間での「ＡＴＧ」の追加）及び３１のアミノ酸の追加（最初の３０のアミノ酸（「ＭＭＧＮＹＡＦＮＰＤＮＱＱＳＹＤＧＱＦＧＳＰＧＥＡＳＲＲＳＴ」）は、新しい開始コドン及び追加的なメチオニンの選択に基づいてＮ末端に追加された（位置１４８９の「Ｍ」は、ＧｅｎＢａｎｋエントリにおいて欠失していた））を含め、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に指定される（６５５３塩基対）。修飾済みＣｈＣＰＳ１タンパク質の推論されるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５に指定される（１７７４アミノ酸、オリジナルのＣＰＳ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ５３９９１）の改訂版）。オープンリーディングフレームは、５，４７４塩基対（７３６乃至６２０９）で、５３８１ｂｐであるデポジットされた配列と比較して９３塩基対増加している。新しい開始コドン（位置７３６、オリジナルのものは位置８２６）は、この領域で保存された残基を示す様々な菌類からのいくつかのＣＰＳ１オルソログのアミノ酸アラインメントに基づいて提案された。停止コドン（６，２０９）は、オリジナルのＧｅｎＢａｎｋ配列と同じである。
【表５】
2004537967.tif 000007
【０２２１】
ＯＲＦ２は、ＣＰＳ１の開始コドンの約１．６ｋｂ上流で開始され、反対方向で転写される（図２）。「ＴＡＴＡ」ボックス状の要素及びＣＡＡＴボックスは見られず、代わりに、高ＡＴ配列「ＡＡＡＡＣＴＡＴ」が開始コドンＡＴＧの１１ｂｐ上流に位置し、ＣＴモチーフが−３０領域に見られ、これはプロモータ領域にＣＡＡＴボックスが欠如している多数の菌類遺伝子の特徴である（ガーら，Ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｍｉｃｔｒｏｂｅｓ， Ｖｏｌ．２２， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ： ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｋｉｎｇｈｏｒｎ， ｅｄ．， ｐｐ ９３−１４０ （１９８７）内）。ＡＴＧの周囲の配列は、菌類遺伝子のコンセンサスと完全に一致する。推定イントロン（５０ｂｐ）は、保護された５’及び３’境界配列及び潜在的な分岐部位と共に、ＯＲＦ２の中央に見られる（表５）。推定ポリアデニル化信号（ＡＡＡＴＡ）は、翻訳停止コドンＴＧＡの１８９ｂｐ下流に見られる。ＯＲＦ２のＧ＋Ｃ含有量は５５．５％で、ＯＲＦ２の５’末端がＯＲＦ１の上流の高Ｇ＋Ｃ領域に位置しているため、通常の範囲よりも僅かに高い。データベース検索では、ＯＲＦ２がＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓチオエステラーゼＩＩ（ｈＴＥ、ルーら，Ｊ． ｂｏｉｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：１３７７９ （１９９７））及びｔａｓＢ遺伝子によってコードされるＥ．ｃｏｌｉチオエステラーゼＩＩ（ナガートら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１１０４４ （１９９１））との高い類似性を有するタンパク質をコードすることが明らかとなった。ＯＲＦ２のヌクレオチド配列（ＴＥＳ１）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７に指定される。ＴＥＳ１タンパク質の推論されるアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８に指定される。
【０２２２】
ＣＰＳ１のモジュラ構造。予測されるＣＰＳ１タンパク質（１７４３アミノ酸、Ｍｒ１９３２３５）は、構造的に類似する二つのモジュールを含み、その両方がサフラマイシンシンテターゼＢの第一のモジュール、ＳａｆＢ１に類似しており（全体として２５％の同一性、５０％の類似性）、明確なアミノ酸活性化及びチオール化ドメインを有するが、メチルトランスフェラーゼ活性が欠如しているため、通常のタイプＩモジュールであると思われる（図３）。各モジュールのアミノ酸の数は異なっており、第一のモジュール（ＣＰＳ１Ａ）は５７４のアミノ酸で構成され（コア１の第一の残基乃至コア６の最後の残基）、これは殆どのタイプＩモジュールより大きく、第二のモジュール（ＣＰＳ１Ｂ）は５３０のアミノ酸を有し、これは平均的である。二モジュール間の距離は、１９３アミノ酸で、ほとんどのペプチドシンテターゼ（５００乃至６００アミノ酸）より遙かに短いが、この距離の保存性は高くなく、すなわち、ＨＣ毒素シンテターゼ及びサイクロスポリンシンテターゼでは反対の変化が見られ、これら両方は第一及び第二アミノ酸活性化モジュール間に約１，０００のアミノ酸を有する（表６Ｆ参照）。
【０２２３】
表６Ａ乃至Ｆは、ＣＰＳ１Ａ及びＣＰＳ１Ｂのコアアミノ酸配列を他のペプチドシンテターゼのものと比較したアラインメントを示している。表６Ａ乃至Ｆのそれぞれにおいて、第一のカラムは、ペプチドシンテターゼの名称を示し、第二のものは、各タンパク質のオリジナルのアミノ酸配列においてアライメントされた第一の残基の位置を示し、右側の最後のカラムは、二つのコア間のアミノ酸の数（６Ａ乃至Ｅ、丸括弧内）、或いは隣接する二つのアミノ酸活性化モジュール間の距離（表６Ｆ、丸括弧内）を示す。６Ｆにおいて追加されたカラムは、アライメントされたコア配列が位置する各アミノ酸活性化モジュールの残基の合計数（下線）を示す。各コア配列のコンセンサスは最上部に表示されており、これはすべてのペプチドシンテターゼにおいて見られた、或いは僅かな例外が存在する、同一又は同様の残基を含む（活性部位もアスタリスクにより示される）。ｓａｆＢ１：Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓのサフラマイシンＭｘ１シンテターゼＢにおける第一のモジュール（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２４６５７）、ＧｒｓＡ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓのグラミシジンＳシンテターゼＡ（ＳＷＩＳＳ  ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ１４６８７）、ＨＴＳ１Ａ及びＨＴＳ１Ｂ：Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ＣａｒｂｏｎｕｍのＨＣ毒素シンテターゼにおける第一の二つのモジュール（Ｑ０１８８６）、ＥｓｙｎＡ及びＥｓｙｎＢ：Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｃｉｒｐｉのエニアチンシンテターゼにおける二つのモジュール（ＥＭＢＬアクセッション番号Ｚ１８７５５）、ＡＣＶＡ及びＡＣＶＢ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのＡＣＶシンテターゼにおける第一の二つのモジュール（ＳＷＩＳＳ  ＰＲＯＴ  Ｐ１９７８７）、ＣｙｓｎＡ及びＣｙｓｎＢ：Ｔｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｎｉｖｅｎｍのサイクロスポリンシンテターゼにおける第一の二つのモジュール（ＥＭＢＬアクセッション番号Ｚ２８３８３）。
【表６Ａ】
2004537967.tif 000008
【表６Ｂ】
2004537967.tif 000009
＊  挿入（Ｒ及びＡの間の二残基）は未表示。
【表６Ｃ】
2004537967.tif 000010
【表６Ｄ】
2004537967.tif 000011
【表６Ｅ】
2004537967.tif 000012
＊  ＣＰＳ１ＡのＥ及びＮの間の挿入（二つのアミノ酸）は未表示。
ＣＰＳ１Ｂ及びＳａｆＢ１の保存性の低いコア５は矢印で示す。
【表６Ｆ】
2004537967.tif 000013
＊  ４’−ホスホパンテテイン結合に関する活性部位。
＊＊  コア５及び６の間のメチルトランスフェラーゼドメインを含むタイプＩＩモジュール（約４００アミノ酸）。その他はすべて、この挿入のないタイプＩモジュール
【０２２４】
ＳａｆＢ１に対するＣＰＳ１の二つのモジュールのアミノ酸アライメントは、スタッケルハウス及びマラヒールが定義したように、全体的なアミノ酸組成及び保存されたモチーフの両方において、これらのモジュールが互いに高い類似性を有することを示している（スタッケルハウスら，１９９５，前掲、マラヒール，１９９７，前掲）。他のバクテリア及び菌類のペプチドシンテターゼとアラインメントした時、ＣＰＳ１は、サイクロスポリンシンテターゼ（ウェーバら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２６（２）：１２０ （１９９４））及びチロシジンシンテターゼＡ（ムーツら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７９（２１）：６８４３ （１９９７））に対して局所的な類似性のみを示したが、モチーフ領域のアミノ酸をアラインメントした時には、全体的な保存が観察された。ＣＰＳ１Ａ及びＣＰＳ１Ｂは、両方とも、アミノ酸活性領域に五種類すべてのコア配列を有する（表６Ａ乃至Ｅ）。コア３及び４は、ＣＰＳ１Ａにおいてコア４のアスパラギン酸残基がロイシンに置き換わっていることを除き、十分に保存されている。コア１、２、及び５は、弱い保存性を示しているが、類似する変化はＳａｆＢ１にも見られる。チオール化ドメインは、両方のモジュールで見られ、これは保存性の高いモチーフを含む（コア６、表６Ｆ）。このモチーフのセリン残基は、４’−ホスホパンテテインが付着する活性部位となることが明らかになっている（シュラムボーンら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：２３１３５ （１９９１）、シュタインら，ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．， ３４０：３９ （１９９４））。
【０２２５】
二つのモジュールにおける六種類のコア配列間の距離も、大部分が保存される。第一のモジュールにおいて二つの例外が見られ、コア２及び３の間の３１２アミノ酸は、通常（１５０乃至２００）より大きく、コア５及び６の間の６１は、殆どのペプチドシンテターゼの半分しかない。ＳａｆＢ１も、これらの二つの区間領域で距離の変化を示している（表６Ｂ及びＥ）。アミノ酸活性化及びチオール化ドメインに加え、ＣＰＳ１は、更に、ＣＰＳ１Ｂのカルボキシ末端の終わりに組み込みチオエステラーゼドメイン（ＴＥ）を有する（図１２）。動物の脂肪酸チオエステラーゼＩＩ型酵素及びいくつかのペプチドシンテターゼにおいて保存性が高いシグネチャ配列ＧＸＳＸＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）が、このドメインに見られる（表７）。
【表７】
2004537967.tif 000014
【０２２６】
ＡＣＶ：ＡＣＶシンテターゼ（ＳＷＩＳＳ  ＰＲＯＴアクセッション番号Ｐ１９７８７）、ＧｒｓＢ：グラミシジンＳシンテターゼＢ（Ｐ１４６８８）、ＧｒｓＴ：グラミシジンＳシンテターゼ遺伝子群においてｇｒｓＴ（Ｐ１４６８６）によってコードされるチオエステラーゼ、ＳｒｆＡ：サーファクチンシンテターゼＡ−３（Ｑ０８７８７）、ＴｙｃＣ：チロシジンシンテターゼＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ００４８３５）、ＴｙｃＦ：チロシジンシンテターゼ遺伝子群においてｔｙｃＦ（ＡＦ００４８３５）によってコードされるチオエステラーゼ。保存性の高い残基（ＧＸＳＸＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）は、アスタリスクによって示される。各アミノ酸配列の左側の数字は、第一の残基のオリジナルの位置を示し、右側の数字（丸括弧内）は、表示した最後の残基と各タンパク質の末端との間の距離を示す。
【０２２７】
ＴＥＳ１タンパク質の配列相同性解析。予測されるＴＥＳ１タンパク質は、３６７のアミノ酸（Ｍｒ４１０１３）で構成され、ｈＴＥ、ＴＥＳＢ、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＴＥＳＢホモログ（フィリップら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：３１３２ （１９９６））とのＴＥＳ１のアミノ酸アラインメントは、こうしたタンパク質が全体として４０％の同一性及び６０％の類似性を有することを示した。保存性の高いＶＨＳモチーフ（推定活性部位）は、ＴＥＳ１のＣ末端領域で保存位置において見られる（図１３）。こうしたすべてのチオエステラーゼは、脂肪酸合成の鎖終止に関与することが知られている以前に特定された動物のタイプＩ又はタイプＩＩチオエステラーゼとの配列類似性を有していない（ナガートら，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１１０４４ （１９９１））。興味深いことに、ＴＥＳ１は、二種類のバクテリア遺伝子よりも、ｈＴＥとの相同性が強く、これは、両方のタンパク質が真核生物のチオエステラーゼの新しい系統群に属することを示している。
【０２２８】
ＣＰＳ１の標的破壊。ＣＰＳ１Ａ又はＣＰＳ１Ｂの破壊により、オリジナルの突然変異体表現型が回復した。突然変異体におけるＲＥＭＩ挿入部位から回収したプラスミド（ｐ２１４Ｂ７）と、染色体歩行のための三種類のベクタ（ｐ２１４ＳＮＰ、ｐ１１８ＢＳＰ、及びｐ１１８ＢＣＳ）とを含め、異なる構造体を使用した四種類の個別の破壊実験のそれぞれから十種類の形質転換体を精製し、Ｎ細胞質トウモロコシでアッセイした。すべての形質転換体は、オリジナルのＲＥＭＩ突然変異体と同じ小さな病変の表現型を示した。サザンブロット解析により、野生型ＣＰＳ１を破壊する形質転換ベクタの相同的組み込みによって、すべての形質転換体が生じたことが確認された。野生型の表現型を示す形質転換体は得られず、これはおそらく、効率の高い相同性組み換えによって生じたゲノムＤＮＡ断片が大きく（すべての破壊実験において８００ｂｐ超）、異所性の組み込みを伴う形質転換体を回収する可能性が低いためである。
【０２２９】
例３
Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅにおけるＣＰＳ１の標的破壊
方法及び材料
菌株、成長条件、及び形質転換。ゲノムＤＮＡハイブリダイゼーションに使用されたＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種及び縁類の菌株は、表８に列挙されている。Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅのビクトリン生成分離体である菌株ＨｙＷは、貯蔵状態から戻し、分生子形成用のＣＭＸ培地（タージオンら，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．， ２０１：４５０ （１９８５））及びビクトリン検出用のオートミール寒天培地（チャーチルら，Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ． Ｎｅｗｓｌ．， ４２Ａ：４１ （１９９５））において、白熱灯（マサチューセッツ州ダンバーズのＳｙｌｖａｎｉａ  Ｉｎｃ．）の下、２４℃で成長させた。形質転換は、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓの手順を使用して行った（タージオンら，ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅ．， ２３８：２７０ （１９９３））。
【表８】
2004537967.tif 000015
ａ  Ｃ．＝Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓ．＝Ｓｅｒｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｂ．＝Ｂｉｏｐｌａｒｉｓ。各種の分離体（又は実験用菌株）の名称は括弧内に示し、宿主特異的毒素を生成することが知られているものは下線で示している。＊ツキボシ・タカオ（日本）が提供したもので、この分離体はＢＺ１２０９又はＢＺ１７０３の場合がある。
ｂ  宿主特異的毒素生成分離体に対する感受性のある遺伝子型は括弧内に示している。こうした種の未記載の宿主に関する参考文献は、次の通りである。１：ウェルツら，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ８３：５９３ （１９９３）、レオナルドら，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ８０：１１５４ （１９９０）（２及び３レースのみに関する）。２：ドムシュら，”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｏｉｌ Ｆｕｎｇｉ， Ｖｏｌ． １”， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ２１６−２２２ （１９８０）。３：デイビッドら，”Ｆｕｎｇｉ ｏｎ Ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”， Ｓｔ． Ｐａｕｌ， Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ： ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， ｐ．６３５ （１９８９）、タークルら，Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓ．， ７３：１５１ （１９８９）。４：ラオら，Ｉｎｄｉａｎ Ｂｏｔ． Ｒｅｐ．， ６：３８ （１９８７）、バートら，Ｃｕｒｒ． ＳＣＩ． （ＢＡＮＧＡＬＯＲＥ）， ５８：１１４８ （１９８９）。５：ヨーダ，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．， １８：１０３ （１９８０）。
ｃ  ゲノムＤＮＡ（以前に作成したゲルブロットフィルタより、ローズら，１９９６，前掲）を、ｐ２１４Ｂ７でクローニングした３．４ｋｂのＣＰＳ１断片によりプローブした。「＋」は、強いハイブリダイゼーション信号を示す。すべての種が、大きな断片（約２３ｋｂ）とハイブリッド形成した。
ｄ  コレクションから選択されたゲノムＤＮＡを、ｐ２１４Ｓ１でクローニングしたＣＰＳ１の３．２ｋｂの断片によりプローブした。このプローブとハイブリッド形成した断片のサイズをｋｂで表している。ハイブリダイゼーション信号の強度は、互いに類似していた。Ｎ＝達成されず。
ｅ  ゲノムＤＮＡを、ｃと同じＣＰＳ１断片によりプローブした。
【０２３０】
Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅのＣＰＳ１ホモログのＤＮＡ操作及び標的破壊。プローブするゲノムＤＮＡは、ヨーダ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｆｕｎｇｉ， Ｖｏｌ． ６， Ｓａｎ ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｉｄｈｕ， ｅｄ．， ｐｐ． ９３−１１２ （１９８８）に従って作成、或いは実験用ＤＮＡコレクションから選択した（４℃で保存）。既知のゲノムＤＮＡが生じているゲルブロットフィルタのプローブも行った。プラスミドＤＮＡの作成、制限酵素による消化、ゲル電気泳動、及びゲルブロット解析は、標準的なプロトコルを使用して行った（サンブルックら，１９８９，前掲）。プロービングに関しては、ｐ２１４Ｂ７（３．４ｋｂ左側面）及び２１４Ｓ１（３．２ｋｂ右側面）でクローニングしたＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＣＰＳ１断片を、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化、及びその後のＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州チャッツワースのＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を使用した精製により作成した。ｈｙｇＢカセットによって中断させたＣＰＳ１の２．３ｋｂ  ＢｇｌＩＩ断片を運ぶプラスミドｐ１８Ｂ１４を、ＢｇｌＩＩにより線状化し、ＨｖＷゲノムに導入した。形質転換体を単一の分生子の分離により精製し、ゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩにより消化し、ＣＰＳ１の３．２ｋｂ断片によりプローブした。
【０２３１】
バイオアッセイ。病原性は、オート麦植物アッセイにより判定した。菌株は、ハイグロマイシンＢ（６０μｇ／ｍｌ）を含む個別のオートミール寒天培地プレート（６０×１５ｍｍ）で、明所において１０日間２４℃で成長させた。分生子をプレートからこすり取り、６ｍｌ滅菌蒸留水に懸濁させた。各菌株の分生子懸濁１ｍｌを、感受性又は耐性オート麦の種子６０個と混合した。接種した種子を４”×６”のポットに植え、苗を二週間成長させた。種子の発芽率と症状の進行を様々な段階で記録した（接種後４、６、８、及び２４日後）。ＨＰＬＣ解析を使用したビクトリン生成の検出は、ボイストンプソン植物研究所のウラジミール・マッコ博士の実験室においてアリス・チャーチルにより行われた。
【０２３２】
結果
ＣＰＳ１ホモログの検出。九種類の菌種の１２の分離体（又は実験用菌株）のゲノムＤＮＡが、ＣＰＳ１とハイブリッド形成した（表８）。六種類すべてのＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種は、四種類の既知の植物病原体（Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍ、Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅ、Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ、及びＣ．ｓｐｅｃｉｆｅｒ）及び宿主が不明である二種類（Ｃ．ｈｏｍｏｍｏｒｐｈｕｓ及びＣ．ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｉ）を含め、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＣＰＳ１断片のものと同じ強度のハイブリダイゼーション信号を示した。二種類の植物病原性Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ種、及びサトウキビの病原体であるＢｉｏｐｌａｒｉｓ  ｓａｃｃｈａｒｉは、同様のハイブリダイゼーション強度を示した。
【０２３３】
ＣＰＳ１ホモログは、様々な種において多形性を示すと思われ、つまり、ＢｇｌＩＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡをプローブした時、すべての種は一つ又は二つの固有のバンドを提供した（Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍと同じハイブリダイゼーションパターンを示したＣ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅを除く）（表８）。興味深いことに、同じ種のＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡは、多形性を示しておらず、すべての種が大きな断片（約２３ｋｂ、表８）とハイブリッド形成しており、これは、すべてのＣＰＳ１ホモログにおける、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ遺伝子と同様のＥｃｏＲＩ部位の欠如を示している。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓにおいて、ＣＰＳ１（５．４ｋｂ）、ＴＥＳ１（１．１ｋｂ）、及びＣＰＳ１の３’末端の下流にある配列を含む１２ｋｂ超のゲノム領域は、ＥｃｏＲＩ部位を有していない。種依存多形性とは対照的に、ＣＰＳ１ホモログは、同じ種の様々な分離体の間での保存性が高いと思われる。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＴレース及びＯレースは、両方とも同じ４．２ｋｂのＢｇｌＩＩ断片（又は５．２及び３．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片）とハイブリッド形成し、Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍの三種類のレースは、すべて同じ５．０ｋｂのＢｇｌＩＩ断片（又は６．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片）とハイブリッド形成し（表８）、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｉ分離体７６４−１及び１２４９−１０は、同じＨｉｎｄＩＩＩ断片（５．４及び２．５ｋｂ）とハイブリッド形成する（表８）。
【０２３４】
２０種類の形質転換体を、ＢｇｌＩＩ線状化プラスミドｐ１１８Ｂ１４によるビクトリン生成分離体ＨｖＷの形質転換によって取得した。六種類の形質転換体を、ビクトリン生成及び感受性オート麦植物に対する病原性の両方に関してアッセイした。すべての形質転換体は、ＨＰＬＣ解析で判定されるように、野生型レベルのビクトリンを生成したが、そのうち四種類（Ｔｘ７、Ｔｘ２、Ｔｘ５、及びＴｘ８）は、植物アッセイにおいて劇的に減少した毒性を示した。接種後八日目の発芽率は、野生型及び二種類の形質転換体（Ｔｘ９及びＴｘ４）では僅か１３乃至２５％だが、他の四種類の形質転換体では４５乃至６３％である。接種後２４日目、野生型、Ｔｘ９、又はＴｘ４を接種した種子から現れたすべての植物は死滅したが、Ｔｘ２、Ｔｘ７、Ｔｘ５、又はＴｘ８を接種した種子からの大部分（２９乃至６３％）は、依然として生存していた（表９）。サザンブロット分析により、減少した毒性表現型を示した形質転換体がＣ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅの野生型ＣＰＳ１ホモログを破壊した形質転換ベクタの相同的組み込みによって発生しており、野生型表現型を示した形質転換体がネイティブの遺伝子を完全な形で残す異所性の組み込み事象によって生じたことが確認された。すべての形質転換体は、耐性オート麦に対して非病原性である状態を維持しており、これはＣＰＳ１ホモログの破壊が菌類の宿主特異性に影響しないことを示している。
【表９】
2004537967.tif 000016
ａ  対照１＝未接種の感受性オート麦種子。対照２及び対照３＝それぞれ、野生型Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅ（分離体ＨｖＷ）を接種した耐性及び感受性オート麦種子。六種類の形質転換体を耐性及び感受性種子の両方についてテストしたが、後者のデータのみを表示している（すべての形質転換体は、耐性種子でテストした時、対照２と同じ結果を示した）。反復実験では同様の結果が得られた（データ未表示）。
ｂ  各菌株について６０個のオート麦種子を使用した。発芽したオート麦植物を接種後四、六、及び八日目に計数した。
ｃ  八日目に収集したデータに基づく計算。
ｄ  接種後２４日目に記録。生存のパーセンテージは、八日目及び２４日目に記録された植物の数に基づいている。
【０２３５】
考察
ＣＰＳ１は、アデニル化領域を有する酵素をコードする。ＣＰＳ１に指定された遺伝子は、ＲＥＭＩ突然変異誘発手順を使用してトウモロコシ病原体Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓからクローニングした。構造及び機能解析は、例えば、ＣｏＡリガーゼ等、一つ以上のアデニル化領域を有する酵素をＣＰＳ１がコードすることを強く示した。ＣＰＳ１は、モジュラ編成を備えた二つの反復機能ユニットを含み、チオエステルモチーフ（ＧＸＳＸＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）を有する。このモチーフは、脂肪酸シンターゼにおいて中鎖長（Ｃ８−１２）脂肪酸の放出を触媒すること、おそらくはペプチド鎖の終止、又は反復するアシル転移反応に関して、活性部位となることが実証されており、これは同じモチーフが脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）及びポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）のアシルトランスフェラーゼ又はアシル転移ドメイン（ＡＴ）の特徴でもあるためである（クラッツマら，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７１， ５４２２， （１９８９））。
【０２３６】
同様のＴＥドメインは特定の菌類のＰＫＳ、つまりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｐｋｓＬ１遺伝子（フェン及びレオナルド，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １７７， ６２４６， （１９９５））及びｐｋｓＳＴ遺伝子（ユー及びレオナルド，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １１７， ４７９２， （１９９５））においても見られるが、ＣＰＳ１は、ポリケチドシンターゼである可能性は低く、その理由は（１）既知のＰＫＳとの有意の類似性を示さないこと、及び（２）すべての菌類ＰＫＳの末端領域において見られるケトアシルシンターゼドメイン（ＫＳ）及びアシルトランスフェラーゼドメイン（ＡＴ）等、こうしたタンパク質に見られる固有の機能ドメインが欠如していることである（ヤンら，１９９６，前掲）。これは、ＣＰＳ１及びＰＫＳについて考えられる共通の進化起源を排除するものではない（スタッケルハウス及びマラヒール，１９９５，前掲）。
【０２３７】
ＣＰＳ１は、未確認のペプチド植物毒素の生合成を引き起こす可能性がある。いくつかのＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種及び関連する糸状菌がペプチド毒素を生成することは広く知られている。これには、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓと最も密接に関連する二種であるＣ．ｃａｒｂｏｎｕｍとＣ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅとが含まれる。前者は、上で述べたようにＨＣ毒素を生成し、後者は、塩素化した環化毒素であるビクトリンを生成する。Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓと密接に関連する属の植物病原性種であるＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａも、Ａ．ａｌｔｅｒｎａｔａリンゴ病原型によって生成される環状テトラデプシペプチドであるＡＭ毒素、及びＡ．ａｌｔｅｒｎａｔａ  ｐｖ．ｔｅｎｕｉｓによって生成される環状テトラペプチドであるテントキシンといった、いくつかのペプチド毒素を生成することが知られている（ニシムラ及びコウモト，１９８３）。こうした発見は、Ｔ毒素に加え、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓが仮定上の「Ｏレース」毒素等の類似する二次代謝物を生成する可能性があるという仮定につながった（ヨーダ，１９８１）。
【０２３８】
興味深いことに、Ｔｏｘ＋、ｃｐｓ１−突然変異体は、Ｔ細胞質トウモロコシで低減された毒性を示すが、野生型Ｔレースと同じ量のＴ毒素を生成する。Ｔ毒素とＴトウモロコシ固有のＵＲＦ１３タンパク質との間の相互作用は非常に特異的であり、同じ量のＴ毒素を生成する二つの菌株が同じ宿主、つまりＴトウモロコシを攻撃した場合には、同じ結果が予測されるはずであるため、これは異常である。この結果の説明として最も可能性の高いものは、ｉｎ  ｐｌａｎｔａの菌類の成長が宿主植物によって阻害され、こうした貧弱な成長の結果として、この菌類を培養で成長させた時には正常であるＴ毒素生成の減少が生じるというものである。Ｔ細胞質トウモロコシでの毒性の低減は、漏出Ｔｏｘ−突然変異体で見られるようなＴ毒素生成の減少によるものである。こうした成長の阻害は、この菌類による宿主防御メカニズムの抑制の失敗による可能性があり、これはＣＰＳ１制御ペプチド毒素によって媒介される。この「サプレッサ」を生成できないｃｐｓ１−突然変異体は、野生型のように活発に植物組織をコロニ化することができず、結果として、病変の少ない表現型が示すように、病気を引き起こす能力の減少が生じる。これが事実である場合、ＣＰＳ１は、エニアチンに関して提案されているように、一般毒性因子であると考えられる。
【０２３９】
ｃｐｓ１−突然変異体であっても、特定の量のＣＰＳ１毒素を生成することは可能である。可能性の一つは、挿入突然変異又は標的破壊によって遺伝子が完全に不活性化されていないことである。オリジナルのＲＥＭＩ挿入は、ＣＰＳ１Ａのコア配列１で発生しており、これは重要な領域ではない可能性がある（コア１の機能は不明である）。第二の標的部位は、ＣＰＳ１Ｂのコア１及び２の間に位置しており、第三のものは、同じモジュールのコア２及び３の間に位置している。三つの挿入は、いずれも重要なモチーフを破壊しない。一方、ＣＰＳ１は、多数のインフレーム開始コドンを含み、その一部は挿入部位のすぐ下流に位置する。可能性として、こうした断絶のそれぞれが、実際には二つの下位転写を発生させ、一方は通常通りＣＰＳ１の開始コドンから転写され、挿入部位で停止し、第二のものは挿入部位の下流にあるインフレームＡＴＧの一つの近くで転写され、ＣＰＳ１の末端で停止することが考えられる。これらの転写は、両方とも、依然として酵素活性を有するトランケート型タンパク質をもたらすことができる。しかし、こうした別個の酵素は、基質との親和性がホロ酵素よりも低い可能性がある。ＣＰＳ１毒素の生成量の減少は、ベクタ挿入によって二つの部分に分割されたＣＰＳ１ホロ酵素と、結果として生じたトランケート型タンパク質がオリジナルのポリペプチドに比べて活性が大幅に少ないこととによるものである可能性がある。この仮説は、ＣＰＳ１コード配列全体が削除されたＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ菌株の構築によってテストすることができる。
【０２４０】
第二の可能性として、ゲノム内でのＣＰＳ１の多数のコピーの存在が考えられる。以前の研究では、ＨＣ毒素シンテターゼをコードする遺伝子（ＨＴＳ１）がゲノム内で複製され、Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍのほとんどのＴｏｘ２＋分離物において、両方のコピー（ＨＴＳ１−１及びＨＴＳ１−２）が２７０ｋｂ離れていることが実証された（アーン及びウォルトン，１９９６，前掲）。一方のコピーの破壊により、ＨＴＳ１活性は減少するが、これはＨＣ毒素の生成には影響せず、両方のコピーが破壊されると、ＨＣ毒素の生成が停止する（パナキオンら，１９９２，前掲）。しかし、ＨＴＳ１のケースとは対照的に、ゲルブロット解析ではＣＰＳ１の第二のコピーの存在が示されず、ＣＰＳ１の破壊は推定される毒素の生成に影響しない。類似する編成を有する二つの遺伝子がゲノムに存在するとは考えにくい。代替の仮定として、ＣＰＳ１と同じ酵素活性を有するタンパク質をコードするが、ＣＰＳ１との有意の配列相同性を有していない第二の遺伝子が存在することが考えられる。この仮定は、この遺伝子がＣＰＳ１と共に群化し、染色体歩行により回収できない限り、テストするのが困難である。
【０２４１】
結論として、トウモロコシでのＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓによる病理発生には、少なくとも二つの二次代謝物が関与し、これらは、特定の宿主、つまりＴトウモロコシでの高い毒性を決定する宿主特異的因子であるＴ毒素と、一般的な宿主植物での菌類による病気の定着の基盤となる基本メカニズムに寄与する一般因子（毒性又は病原性因子）である仮定上のＣＰＳ１毒素とである。
【０２４２】
例４
ＣＰＳ１オルソログ
上で説明したように、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｒｕｓ  Ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓの遺伝子ＣＰＳ１は、宿主に対する菌類の毒性にとって一般因子になると思われる推定のペプチドシンテターゼをコードする。ＣＰＳ１は、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｒｕｓ属及び密接に関連するＢｉｏｐｌａｒｉｓ及びＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属を含む三属に属する少なくとも九菌種において高い保存性を示すことが分かっており、三種類の植物病原体、つまりトウモロコシに対するＣ．ＨｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＯレース、Ｔレース、及びオート麦に対するＣ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅによる病理発生に必要であることが実証されている（ルー，１９９８， Ｐｈ． Ｄ． Ｔｈｅｓｉｓ， Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。
【０２４３】
菌類による病理発生におけるＣＰＳ１の役割と、他の菌類における保存とを更に探求するために、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｒｕｓ及び他の密接な関係又は遠縁の関係にある属のその他の種のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによるＣｈＣＰＳ１でプローブした（ルー，Ｓ．−Ｗ．、Ｂ．Ｇ．タージオン、及びＯ．Ｃ．ヨーダ、１９９９年菌類遺伝学コンファレンス、１９９９年３月、カリフォルニア州パシフィックグローブ）。ＣｈＣＰＳ１によるプローブでは、１６種類の属の３４菌種を表す４０種類の現場での分離体（又は実験用菌株）のゲノムＤＮＡがハイブリッド形成した（図４）。既知の植物病原体であるＣ．ｃａｒｂｏｎｕｍ、Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅ、Ｃ．ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ、Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ、及びＣ．ｓｐｅｃｉｆｅｒを含む１６種類すべてのＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種と、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓに密接に関連する五種類の属、つまり、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ、及びＡｌｔｅｒｎａｒｉａ属は、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ自体のものに匹敵するハイブリダイゼーション強度を示した（図４）。経済的な重要性（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）又は医学的な重要性（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ等）を有する数種を含む、遠縁の関係である九種類の属からの種のＤＮＡは、ＣＰＳ１と弱くハイブリッド形成し（図４Ｂ及び４Ｃ）、担子菌Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓのＤＮＡでは信号が検出されなかった。
【０２４４】
ＣＰＳ１のホモログは、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＣＰＳ１（ＣｈＣＰＳ１）の保存領域向けに設計した縮重プライマを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって更に特定した。四種類のＣＰＳ１ホモログをクローニングし、特徴付けした。そのうち三種類は、コムギ頭部痂皮菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ  Ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ（ＦｇＣＰＳ１、６００３ｂｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）と、ジャガイモ夏疫病菌Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ（ＡｓＣＰＳ１、６００３ｂｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）と、オオムギ網斑病菌Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｅｒｅｓ（ＰｔＣＰＳ１、２３２０ｂｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）とを含む植物病原性菌類からクローニングした。第四のものは、ヒト病原菌Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ（ＣｉＣＰＳ１、２４３５ｂｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）からクローニングした。完全なＦｇＣＰＳ１遺伝子は、ゲノム内のこの遺伝子の標的遺伝子破壊に続いて、ＰＣＲ増幅及びプラスミドレスキュ手順の両方を使用してクローニングした。残りの三種類のＣＰＳ１ホモログは、直接ＰＣＲ増幅により部分的にクローニングした。
【０２４５】
ＦｇＣＰＳ１のオープンリーディングフレーム（５１２５ｂｐ）は、約４．４ｋｂｐの重複において、ＣｈＣＰＳ１との５０％ヌクレオチド同一性を有する。「ＴＡＴＡ」ボックス状の要素は５’非翻訳領域に見られなかったが、二個の推定「ＣＡＡＴ」ボックス及び「ＣＴ」モチーフを含む他のプロモータ配列が、開始コドン（ＡＴＧ）の上流に位置していた。推定イントロンは、ＣｈＣＰＳ１では三つであるのと対照的に、停止コドン（ＴＧＡ）の１５０８ｂｐ上流に一つだけ見られた。
【０２４６】
推定ポリアデニル化信号「ＡＡＴＡＡ」は、停止コドンの６２ｂｐ下流に位置している。予測されるＦｇＣＰＳ１タンパク質（１６９２アミノ酸、Ｍｒ１８７９８３Ｄａ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）は、ＣｈＣＰＳ１のものとの類似性が高い二つの構造的に類似するモジュールを含む約１，５００のアミノ酸の重複において、ＣｈＣＰＳ１との６８％の同一性及び７３％の一致性を有する（図７Ｂ）。ＦｇＣＰＳ１は、Ｃ末端でのＣｈＣＰＳ１との有意の類似性を有しておらず、これは短く、ＣｈＣＰＳ１において見られるチオエステラーゼドメインが欠如している。
【０２４７】
ＡｓＣＰＳ１（２３６９ｂｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）は、保存された二つのイントロンを含むクローン領域全体において、ＣｈＣＰＳ１との７６％ヌクレオチド同一性を有する。翻訳されたＡｓＣＰＳ１タンパク質（一部）は、ＣｈＣＰＳ１のアミノ酸５１１乃至１２６９に対応する７５８のアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）を含み、ＣｈＣＰＳ１との９３％の同一性及び９５％の類似性を有する（図７Ｂ）。
【０２４８】
ＰｔＣＰＳ１（２３２０ｂｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）は、一つのみのイントロンを含むクローン領域全体において、ＣｈＣＰＳ１との７８％ヌクレオチド同一性を有する。翻訳されたＰｔＣＰＳ１タンパク質（一部）は、ＣｈＣＰＳ１のアミノ酸５１１乃至１２６９に対応する７５８のアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）を含み、ＣｈＣＰＳ１との９３％の同一性及び９６％の類似性を有する。
【０２４９】
ＣｉＣＰＳ１（２４３５ｂｐ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）は、イントロンを有していないクローン領域全体において、ＣｈＣＰＳ１との６５％ヌクレオチド同一性を有する。翻訳されたＣｉＣＰＳ１タンパク質（一部）は、ＣｈＣＰＳ１のアミノ酸５１１乃至１０４０に対応する８１２のアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）を含み、ＣｈＣＰＳ１との６７％の同一性及び８０％の類似性を有する（図７Ｂ）。Ｃａｎｄｉｄａにおける別のオルソログは、サザンブロットによって特定された（図４参照）。
【０２５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１（図６）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７（図７Ａ）を使用したＢＬＡＳＴ検索により、こうした菌類ＣＰＳ１のオルソログが特定された。
【０２５１】
コムギ頭部痂皮菌Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ（＝Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）におけるＦｓＣＰＳ１の破壊は、コムギに対する毒性の大幅な減少を引き起こす。Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍのすべてのｃｐｓ１−の破壊は、宿主で通常の「頭部白化」症状を引き起こす能力において、少なくとも５０％（１０５／ｍｌ分生子の接種時）又は更には８０乃至９０％（１０４／ｍｌ分生子の接種時）の減少を示し、一方、同じ条件において、異所性の形質転換は、野生型と識別不可能な症状を引き起こす。これらの結果は、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓとの遠縁の関係を有する菌類による病理発生にも、ＣＰＳ１が必要であることを示し、こうしたペプチドシンテターゼ遺伝子のホモログが、一般的な菌類毒性因子の生合成を制御する可能性があることを主張している。
【０２５２】
考察
ＣＰＳ１の保存及び分類。ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションにより、五種類の属に属する新たな１６の菌種でＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  ＣＰＳ１ホモログが発見された。一部のもののハイブリダイゼーションシグナルは、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ遺伝子と同じように強く、こうした菌類の中でＣＰＳ１の保存性が高いことを示している。この保存性は、こうした種間の分類学上の関係と一致すると思われる。Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ（アナモルフＢｉｐｏｌａｒｉｓ）及びＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ（アナモルフＥｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ）は、密接に関連する属である。
【０２５３】
ＣＰＳ１ホモログ及び病理発生。二つの種、Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅ及びＣ．ｃａｒｂｏｎｕｍは、互いに交配が可能であるため、異なる種ではない可能性があり（シェファら，１９６７、ヨーダら，１９８９）、ＣＰＳ１と同じハイブリダイゼーションパターンを示した。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓに最も近い無性の類縁であるＢ．ｓａｃｃｈａｒｉは、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ自体でのみ見られた二種類のＨｉｎｄＩＩＩ断片とハイブリッド形成したが、他のすべての種は、明確な多形性のバンドを一つしか提供しなかった。内部転写スペーサ（ＩＴＳ）配列と、ＧＰＤ（バンウェルト及びヨーダ，１９９２）及びＭＡＴ遺伝子（タージオンら，１９９３，前掲）とを使用した系統解析では、更にＣ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅ／Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍ及びＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ／Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｉが互いにも最も近いとされた（タージオン及びバーベク，１９９７）。こうした結果は、ＣＰＳ１がこうした遺伝子と共進化したことを意味する可能性がある。
【０２５４】
ＣＰＳ１ホモログ及び病理発生。Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ及びＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ属は、主に耕作穀物及び野草での斑点病又は葉枯病と広く関連する多くの植物病原種を含む（シバネサン，１９８７、アルコン，１９８８）。この植物病原菌のグループは、宿主特異的毒素を生成することが多い軽度の病原体及び重度の病原体の両方を含む（ヨーダ，１９８０，前掲）。基本的な問題の一つは、こうした菌類によって発生する多様な宿主植物での様々な病気が共通因子を伴っているか、それとも宿主特異的毒素等の個別の特異的因子のみに依存するかである。
【０２５５】
以前の研究では、宿主特異的毒素は、毒性又は宿主範囲を定める上で決定的な因子となり得るが、これらはその種における特定の分離体によってのみ生成され、こうした毒素生成分離体においてのみ、対応する生合成遺伝子が確認されるため、一般的な病原性の原因にはならないことが明らかとなっている（ヨーダら，１９９７，前掲）。対照的に、ＣＰＳ１ホモログは、これまでにテストされたすべてのＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ及びＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ種において確認されており、これがこのグループで共有される共通因子であることを示している。オート麦の病原体Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅにおけるＣＰＳ１ホモログの破壊は、ビクトリン感受性オート麦に対する毒性の劇的な減少を引き起こしたが、この形質転換体は野生型レベルのビクトリンを生成した。この結果は、ｃｓｐ１−を破壊しても野生型レベルのＴ毒素が生成されるが、Ｔ細胞質トウモロコシに関する毒性が減少する、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  Ｔレースでのものと類似している。こうした結果は、菌類／植物相互作用の最終的な結果を決定する上で宿主特異的毒素のみでは十分でないことを強く主張するものであり、こうした菌類による病気の定着には、一般的な病原性の経路を制御する可能性があるＣＰＳ１を更に必要とすることを示している。
【０２５６】
ＣＰＳ１遺伝子群及びホモログは菌類の「病原性島」である可能性がある。１９９０年代の初め、尿路病原性Ｅ．ｃｏｌｉに関する研究が、「病原性島」と呼ばれる病原性遺伝子群の特定につながった（ハッカら，１９９０、ブラムら，１９９４）。その後、同様の遺伝子群が、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを含む、その他の動物又はヒトバクテリア病原体において特定された。こうした島は、毒素を生成するための遺伝子、或いは、宿主の防御因子と相互作用できるタンパク質、又は宿主細胞に毒性タンパク質を伝達するタイプＩＩＩ分泌系に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む場合が多い。通常、これらは病原菌株（又は種）のみで見られるが、まれなケースでは、同じ種又は関連種の非病原菌株に発生する（ハッカら，１９９７，前掲）。
【０２５７】
植物病原性バクテリアにおいて、ｈｒｐ遺伝子群は、動物病原性バクテリアの「病原性島」に共通するいくつかの特徴を有するため、すなわち、（植物病原性に必要な）病原種のみで発見され、タイプＩＩＩタンパク質分泌系を定める保存性の高い遺伝子（ｈｒｃ遺伝子）を含むため、「病原性島」と呼ばれてきた（アルファノ及びコルマ，１９９６、バリナガ，１９９６）。
【０２５８】
植物病原菌において、「病原性島」の特徴を備えた遺伝子又は遺伝子群は、特定の種、つまりＮｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａにおいて確認されており、エンドウのフィトアレキシン及びその他のエンドウ病原性遺伝子（ＰＥＰ）を解毒するＰＤＡ遺伝子は、重要ではない染色体に位置し、この染色体はエンドウに対して病原性のあるすべての分離体で発見されるが、通常、非病原性分離体においては欠如している（バンエッテンら，１９９４、リューら，１９９７，前掲）。Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属において、ＨＣ毒素の生合成を制御するＴｏｘ２遺伝子群は、Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍ  １レース（ｈｍ１ｈｍ１トウモロコシに対して病原性）でのみ発見され、Ｔ毒素の生成を制御するＴｏｘ１遺伝子群は、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  Ｔレース（Ｔ細胞トウモロコシに対して強い毒性）のみで発見されており、これまでテストされた同じ種及び他の全菌種の他の全レースでは、こうしたＴｏｘ遺伝子が欠如している（アーン及びウォルトン，１９９６，前掲、ヤンら、１９９６，前掲、ヨーダら，１９９７，前掲）。
【０２５９】
ＣＰＳ１は、こうした菌類の「病原性島」と比較して、二つの重要な形で相違している。第一に、いくつかの植物病原性Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種及び縁類の中での保存性が高い。第二に、特定のバクテリアの「病原性島」と同様に、ＣＰＳ１も、「非病原性」種においてホモログを有する。Ｃ．ｈｏｍｏｍｏｒｐｈｕｓ及びＣ．ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｉは、どちらも植物で病気を引き起こさず、ＣＰＳ１と強くハイブリッド形成する。これは、病原性の喪失を生じる「病原性島」における遺伝的変化を反映する可能性がある。保存性の高い「病原性島」を内包するいくつかのヒト又は動物病原種を含む、バクテリアのＬｉｓｔｅｒｉａ属において、非病原種（Ｌ．ｓｅａｌｉｇｅｒｉ）における「病原性島」ホモログは、群内の重要な調節遺伝子のプロモータ領域で発生する突然変異により「サイレント」となることが発見されている（ハッカら，１９９７，前掲）。こうした特徴は、ＣＰＳ１遺伝子群及びホモログが菌類の「病原性島」の新しいグループを定義できることを示している。
【０２６０】
ＣＰＳ１の起源。病原性の進化には、二種類の主要なプロセスが関与することが知られている。病原性微生物は、宿主での寄生的成長に適応した遺伝子の遅い修飾（点突然変異及び遺伝子組み換え等）により、或いは、レシピエントによる特定の宿主への攻撃を可能にするゲノムへの「異質な」ＤＮＡの大きな断片の組み込み（遺伝子水平転移）により、非病原性の祖先が起源となる可能性がある。後者は、進化的に近い過去又は遠い過去に発生した可能性がある。その後の系統内での垂直伝播により（転移遺伝子がレシピエントゲノムにおいて安定している場合）、（複数の）遺伝子の取得後に分岐したすべての種において、その遺伝子が維持されることになる（シェファ，１９９１、アーバ，１９９３、クリシナピレイ，１９９６、バードン及びシルク，１９９７）。
【０２６１】
過去数年には、遺伝子水平転移の仮説を支持する十分な証拠が入手可能となった。動物の病原性バクテリアのすべての「病原性島」は、通常、レシピエントゲノムからのＧ＋Ｃ含有量において相違しており、遺伝子群の境界に置き換え可能な要素を有するため、（最近又は過去の）水平転移事象によって取得されたと考えられている（ハッカら，１９９７，前掲）。ｈｒｐ「病原性島」は、Ｇ＋Ｃ含有量の大きな相違、或いは置き換え可能な要素との関連性を示していないが、こうした「病原性島」のｈｒｃ遺伝子が上で述べたように動物病原性バクテリアに見られるタイプＩＩＩタンパク質分泌系を定める遺伝子との高い類似性を示すことから、同じように発生したと考えられている（アルファノ及びコルマ，１９６６、及びバリナガ，１９９６）。
【０２６２】
ＣＰＳ１自体はいくつかの代表的な菌類イントロンと、殆どの既知の菌類遺伝子と同様のＧ＋Ｃ含有量（５１．５％）を有するが、この遺伝子の側面に位置するゲノム領域（約１．５ｋｂ）は、高いＧ＋Ｃ含有量を有する（６０％超）。この遺伝子群では、いくつかの短い高Ｇ＋Ｃ領域も発見されており、オープンリーディングフレームの一つ（ＯＲＦ１０）は、６３．６％のＧ＋Ｃ含有量を有する。Ｎ．ｃｒａｓｓａ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｕ．ｍａｙｄｉｓ（すべてが５１乃至５４％のＧ＋Ｃ含有量を有する、カーリン及びムラーゼク，１９９７，前掲）を含む、これまでに特徴付けられている糸状菌ゲノムと比較して、ＣＰＳ１の周囲のゲノム領域は異常である。これは、ＣＰＳ１を内包する遺伝子群がバクテリアソースに由来するものの（殆どのバクテリア遺伝子が高いＧ＋Ｃ含有量を有することが知られているため）、菌類のバージョンへと進化したことを示す可能性がある。
【０２６３】
こうしたデータに基づくと、ＣＰＳ１ホモログは、水平転移を介してバクテリア種から取得され、その後、密接に関連する系統における水平転移を介して、菌類ゲノムによって維持された、共通の祖先遺伝子を有する可能性がある。
【０２６４】
進化のプロセスにおいて、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属は、更に、祖先が「異質な」ＣＰＳ１を取り込むのに用いた、外来ＤＮＡを取り込む能力を制御する第二の遺伝子（Ｘ）を継承した可能性がある。結果として、この菌類のグループは、追加的な「水平転移」によって、他の有機体からの遺伝子を捕獲し続けることが可能となり、独自の病原因子を生成する能力によって特徴付けられる新しいレース、更には新しい種を発生させる。この仮説を直接的に支持するものは、Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍのＴｏｘ２座及びＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのＴｏｘ１座の両方が「異質な」ＤＮＡ（高Ａ＋Ｔ及び高反復）の大きな断片に関連しており、Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅによるビクトリンの生成を制御するＴｏｘ３についても同じことが言える点であるが、直接の実験的証拠は、まだ存在しない（アーン及びウォルトン，１９９６，前掲、ヤンら，１９９６，前掲、ヨーダら，１９９７，前掲）。ＣＰＳ１とは対照的に、こうした遺伝子転移は、Ｔｏｘ１及びＴｏｘ２座の両方がこの種における特定の分離物においてのみ発見されているため、進化的に近い過去に発生したことになり、例えば、Ｔｏｘ１遺伝子の取得は、おそらく、この分野でＴレースが初めて特定された１９６０年代頃に発生したことになる（ヨーダら，１９９７，前掲）。
【０２６５】
ＣＰＳ１の進化には別の可能性も存在する。第一に、上で述べた各遺伝子は、系統の分岐後、個別にＣＰＳ１を取得した可能性がある。しかし、これは同時に起こる必要があり、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ及びＳｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａにおいて検出されたホモログが同様のハイブリダイゼーションシグナル強度を提供する事実を考慮した場合、同じドナー有機体が関与する必要があるため、可能性は低く思える。第二に、ＣＰＳ１の水平転移は、プレオスポラル目の分岐前、更には子嚢菌類の分岐前といった、早い時期に発生した可能性がある。こうした仮定をテストするには、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ、Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ、及びその他の属におけるＣＰＳ１ホモログの検出を、ゲノムＤＮＡハイブリダイゼーション又はＰＣＲによって行う必要がある。ここで説明した事実に基づくと、他の菌種において新たなＣＰＳ１ホモログが発見されるのを予測することは不合理ではない。更なる調査により、植物における菌類の病原の進化を理解する直接的な入口点がもたらされる可能性がある。
【０２６６】
例５
Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ＣＰＳ１に近い他の遺伝子
材料及び方法
Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓのゲノムライブラリの構築。コスミドベクタｃｏｓＨｙｇ１（タージオンら、１９９３，前掲）の修飾体であるコスミドＳｕｐｅｒＣｏｓＰ１−１１（米国農務省農業研究所マイコトキシン研究部門のトーマス・ホーン博士が好意により提供）を、ライブラリの修飾に使用した。菌株Ｃ４（Ｔｏｘ＋、ＭＡＴ−２）のゲノムＤＮＡを、以前に説明したように作成し（ヨーダ，１９８８、前掲）、ＣｓＣｌ臭化エチジウム勾配における平衡遠心分離により精製した（サンブルックら，１９８９，前掲）。３ｉｇのゲノムＤＮＡをＭｂｏＩにより、酵素稀釈剤のテストシリーズ（１．５×１０−４−１．２５ユニット、マサチューセッツ州ビバリのＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、３７℃で０．５時間、部分的に消化した。消化により平均サイズが３０ｋｂの断片となったＤＮＡをプールし、その後、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＡＰ、メリーランド州ゲーサーズバーグのＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）により脱ホスホリル化した。２ｉｇのＣＩＡＰ処理済みＤＮＡを、ＸｂａＩにより消化したコスミドベクタのＢａｍＨＩ部位にライゲーションし、ＣＩＡＰにより処理した。ライゲーションした分子のアリコートを、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（カリフォルニア州ラホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、メーカの推奨にしたがってパッケージした。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＮＭ５５４を、パッケージした粒子によりトランスフェクションし、アンピシリン耐性に関して選択した。二つの実験から、約１．６×１０５の独立したアンピシリン耐性コロニを取得した。コスミドＤＮＡを１６のコロニから作成し、ランダムな挿入を確実に行うためにＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩのそれぞれにより消化した。オリジナルのアンピシリン追加ＬＢプレートのそれぞれからコロニをこすり取り、２５％グリセロール中において−７０℃で保存した（１チューブ当たり１プレートのコロニ）。
【０２６７】
コスミドライブラリのスクリーニング。２３本の保存チューブからのコスミドクローンの混合物を、１０−４に稀釈し、１０枚のアンピシリン追加ＬＢプレート（１５０×１５ｍｍ）に塗布し、３７℃で一晩培養した。コロニ（合計約１．２×１０４）は、Ｃｏｌｏｎｙ／Ｐｌａｑｕｅ  ＳｃｒｅｅｎＴＭ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（１３７ｍｍディスク、マサチューセッツ州ボストンのＮＥＮＴＭ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に転移させ、３７℃で８時間培養した。各プレートから三枚の複製を作成した（一枚はマスタフィルタ、二枚はプローブ用）。ハイブリダイゼーションのために、コロニの付いたフィルタを０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌにおいて五分間溶解し、１ＭトリスｐＨ７．４、１．５Ｍ  ＮａＣｌによる五分間及びその後の２×ＳＳＣによる二分間により二度中和した。フィルタは、３０分間空気乾燥させ、その後、８０℃の真空オーブンで一時間焼いた。複製フィルタは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カリフォルニア州チャッツワースのＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）を使用した制限酵素消化及び精製により作成した３２Ｐ標識付きのＣＰＳ１遺伝子の３．４及び３．２ｋｂ断片によりプローブした。ハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、１×ＢＬＯＴＴＯ（サンブルックら、１９８９）において６５℃で一晩行った。その後、フィルタを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて、６５℃で１５分間、二度洗浄した。陽性エリアに対応するコスミドクローンは、マスタフィルタから９６穴マイクロタイタプレート（マサチューセッツ州ケンブリッジのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｓｔａｒ）へ転移させ、３７℃で一晩成長させた。細胞は、その後、フロッガを使用してメンブレンへ転移させ、上と同じように培養及び処理した。陽性のクローンを精製し、上で述べたものと同じプローブによるハイブリダイゼーションによって再テストした。分離したコスミドクローンは、いくつかの酵素により消化されたコスミドＤＮＡを標識付きの３．４及び３．２ｋｂ  ＣＰＳ１断片により別々にプローブすることでマッピングした。
【０２６８】
ＤＮＡの操作及び配列決定。コスミドＤＮＡは、標準的なプロトコルを使用して作成した（サンブルックら，１９８９，前掲）。制限酵素による消化、ゲル電気泳動、ゲルブロット解析、プライマ設計、ＤＮＡ配列決定、及び配列解析は、上で説明したように行った。配列決定を促進するために、コスミドベクタを切断しない制限酵素によるオリジナルのコスミドクローンの消化（表１０）、及びその後の再ライゲーション（表１０）により、三つの欠失構造体を作成した。各コスミドクローンの配列決定は、ベクタ特異的及びＣＰＳ１（又はＴＥＳ１）特異的プライマにより開始した。その後、以前に配列決定した領域に対する新しいプライマを設計することで、配列を延長した（表１１）。
【０２６９】
結果
二つの重複するコスミドクローンの特徴付け。二つのコスミドクローン、Ｃ４Ｌ６５８２及びＣ４Ｌ７２９６は、ライブラリをスクリーニングすることで分離した（表１０）。ゲルブロット解析は、両方のコスミドクローンがＲＥＭＩ突然変異体のベクタ挿入部位の範囲に渡っており、上で説明したクローンＣＰＳ１及びＴＥＳ１配列を含むことを示した。挿入部位の間近で側面に位置する領域に対するプライマを使用して取得した配列は、ＲＥＭＩ突然変異体から回収した標識ＤＮＡのものと同じであり、標識部位で欠失又は染色体の再配列が発生していないことを裏付けている。二つのコスミドは、２７．９ｋｂの領域において互いに重複している。Ｃ４Ｌ７２９６（３７．２ｋｂ）は、３．４ｋｂ及び３．２ｋｂ  ＣＰＳ１断片の両方とハイブリッド形成する３０．９ｋｂのゲノム挿入を有している。制限マッピング及び配列決定により、この挿入がＴＥＳ１配列全体と、ＣＰＳ１配列の大部分（５．４ｋｂのうち４．４ｋｂ）を含むことが確認された。Ｃ４Ｌ６５８２（３７．７ｋｂ）は、同じくＴＥＳ１配列全体を含むが、ＣＰＳ１の配列をコードするＮ端末を１．１ｋｂしか含まない３１．４ｋｂの挿入を有する。どちらの挿入でも、ＣＰＳ１のＣ末端領域が欠如しており、その３’末端は、ＳｕｐｅｒＣｏｓＰ１−１１のクローン部位のＴ３末端にライゲーションされる。Ｔ７プライマを使用した配列決定の試みは成功しておらず、これはおそらく、ＳｕｐｅｒＣｏｓＰ１−１１のｃｏｓ部位の一つに近接するＴ７末端がパッケージングプロセス中に破壊されたためである。
【表１０】
2004537967.tif 000017
＊  ２８．２ｋｂのゲノム領域の欠失（＝ｐ７２９６ｄＸからの欠失、３．６ｋｂのＣＰＳ１  Ｎ末端コード配列を含む）のために設計されたが、野生型の形質転換は成功しなかった。
【０２７０】
【表１１】
2004537967.tif 000018
2004537967.tif 000019
ａ  「ＲＰ」は復帰プライマ、「ＦＰ」は前進プライマを示す。コスミドクローンのゲノムＤＮＡ配列に対して設計されたプライマには、順に番号が付いている。プライマ１乃至１０には先行番号「７２９６」が付いており、１１乃至２４には「７２９６ｄ」、２５乃至２９には「７２９６ｐＵ」、３０乃至３１には「６５８２ｄ」が付いている。
ｂ  各断片のゲノム配列における位置に対応するプライマ位置。
ｃ  各プライマの配列は、５’から３’の方向で提示されている。
ｄ  配列決定反応に関して使用したコスミド又はプラスミド。Ａ＝Ｃ４Ｌ７２９６、Ｂ＝６５８２ｄＳ、Ｃ＝ｐＤＸＰＳ、Ｄ＝ｐＤＸＰＳＨ、Ｅ＝６５８２ｄＨ、Ｆ＝Ｃ４Ｌ６５８２。
【０２７１】
Ｃ４Ｌ７２９６の配列決定。ＴＥＳ１の５’の合計２７．４ｋｂの追加ゲノム配列をクローニングした。合計１６．９ｋｂ（６０％）の四断片を配列決定し、そのうち三つはＣ４Ｌ７２９６を鋳型として使用して配列決定した。断片Ｉ（Ｆ−Ｉ、５．３ｋｂ）の配列決定は、プライマ２１４Ｂ７ＲＰ７（ＴＥＳ１の５’末端と一致）により開始し、続いて、以前に決定された配列に対して設計されたプライマによる配列決定を行った。断片ＩＩ（Ｆ−ＩＩ、６．９ｋｂ）は、欠失構造体６５８２ｄＳ（表１０参照）の配列決定により以前に決定されたＳａｃＩ部位の側面に位置する配列に対するプライマを使用して開始し、その後、両方向で延長した。断片ＩＩＩ（Ｆ−ＩＩＩ、３．２ｋｂ）の配列は、形質転換のための欠失構造体を作成する試みの一部として、複雑な形で取得した。配列の第一の部分を、ＴｒｐＣプライマを使用して欠失構造体７２９６ｄＸ（表１０）から誘導したクローンｐＤＸＰＳから取得し、Ｃ４Ｌ７２９６を鋳型として使用して、この配列を３’へ延長した。Ｆ−ＩＩＩの５’末端の２００ｂｐ領域は、ＣＰＳ１特異的プライマ２１４Ｓ１ＦＰ６を使用して、ｐＤＸＰＳ誘導クローン、ｐＤＸＰＳＨ（表１０）から取得した。
【０２７２】
Ｃ４Ｌ６５８２の配列決定。このクローンは、Ｃ４Ｌ７２９６の左端の領域へ延びる２．８ｋｂの追加ゲノムＤＮＡを含む。欠失クローン６５８２ｄＨ（表１０）は、ＴＥＳ１特異的プライマ２１４Ｂ７ＲＰ５と、その後のＣ４Ｌ６５８２における３’及び５’両方向でのワンステップの配列延長とによる断片ＩＶ（Ｆ−ＩＶ、１．５ｋｂ）の配列決定を開始するために使用した。
【０２７３】
配列領域におけるオープンリーディングフレームの特定。四種類の配列断片において１１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を特定した（表１２）これらのＯＲＦは、すべて比較的小さい（０．３乃至２．３ｋｂ）。五つのＯＲＦは、通常の菌類の特徴を備えた推定イントロンを含む（表１３）。ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１０、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ５、及びＯＲＦ８は、一方向で転写され、その他は反対方向で転写される。ＯＲＦ６及びＯＲＦ７（Ｆ−ＩＩ）は、重複し、同じ方向で転写される。ＯＲＦ１４及びＯＲＦ９（Ｆ−ＩＩＩ）、ＯＲＦ３及びＯＲＦ８（Ｆ−Ｉ）も重複するが、反対方向で転写される。大部分のＯＲＦは、殆どの菌類遺伝子に関して正常な範囲内の５０乃至５５％のＧ＋Ｃ含有量を有しており、二つの例外として、Ｆ−ＩＩＩの５’末端のＯＲＦ（０．３ｋｂ）は６３．６％のＧ＋Ｃ含有量を有し、ＯＲＦ１４（０．７ｋｂ、ＯＲＦ１０の１．０ｋｂ下流に位置する）は５６．９％のＧ＋Ｃ含有量を有する。このＯＲＦは、両方ともＦ−ＩＩＩの高Ｇ＋Ｃ（約５８．０％）領域に位置している（それぞれ、位置３００乃至８００、及び１２４０乃至２０４０）。
【０２７４】
データベース検索では、三つのＯＲＦ（ＯＲＦ３、ＯＲＦ７、及びＯＲＦ１１）とＣＰＳ１及びＴＥＳ１とが、既知のタンパク質のホモログ（下を参照）をコードし、その他のものは、あるとすれば、未知の機能を備えたタンパク質をコードすることを示した（表１２）。ＯＲＦ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）は、鉄還元酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）をコードし、ＯＲＦ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）は、透過酵素／ＭＦＳ輸送体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）をコードする。図９Ａは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９によるＢＬＡＳＴ検索の結果を示し、図１０は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５によりコードされたポリペプチドによるＢＬＡＳＴ検索の結果を示している。
【表１２】
2004537967.tif 000020
ａ  ＦＩ’＝ゲノムＤＮＡ。
ｂ  配列断片におけるＯＲＦ３乃至ＯＲＦ１４及び１７の位置を表示。既知のタンパク質に対応するＯＲＦは下線で表示。
ｃ  推定イントロンの特徴は表１３に記載。
ｄ  ＣＰＳ１及びＴＥＳ１として特徴付けられる。
【０２７５】
【表１３】
2004537967.tif 000021
ａ  配列全体に関して、イントロンの第一及び最後のヌクレオチドの位置が後に続く断片の番号。
ｂ  Ｙ＝ピリミジン（Ｔ又はＣ）、Ｒ＝プリン、Ｎ＝プリン又はピリミジン。
【０２７６】
考察
二つのコスミドが、大きな遺伝子群を定める。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  ＣＰＳ１遺伝子は、ＲＥＭＩ挿入突然変異誘発を使用して生成された突然変異体の標識部位から回収したゲノムＤＮＡ断片の特定によってクローニングした。この研究における二種類の重複コスミドクローンの特徴付けにより、遺伝子標識付けの事象に欠失又は染色体再配列が伴わないことが証明され、これは両方のコスミドがＲＥＭＩ挿入部位の範囲に渡る同じ断片を運び、この領域のヌクレオチド配列が標識部位から回収されたゲノムＤＮＡのものと同じであるためである。これにより、主要な生合成遺伝子であるＣＰＳ１の同一性は確実に明らかとなる。以前にクローニングされた断片から配列を２７．４ｋｂ延長した二つのコスミドのマッピング及び配列決定は、３８．７ｋｂの隣接ゲノムＤＮＡの特徴付けにつながり、これはＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓにおいてこれまでに解析された最長のゲノム領域である。ＣＰＳ１及びＴＥＳ１に加え、この領域の配列解析では、少なくとも１１種類のオープンリーディングフレームが明らかとなり、そのうち３種類は、それぞれＤＢＺ１、ＣＡＴ１、及びＤＥＣ２と指定され、明らかに機能タンパク質をコードしている（表１３）。こうした遺伝子の密接な結びつきは、これらが同じ経路で進化した可能性があることを示している。
【０２７７】
糸状菌では、場合によっては、例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのセファロスポリンＣ経路遺伝子（マティソンら，１９９３，前掲）、及びＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌａｇｅｎａｒｉｕｍのメラニン経路遺伝子（クボら，１９９６，前掲）等、二次代謝物の生合成に関する経路内の遺伝子は、様々な染色体に分散している。別のケースでは、密接に結びついた遺伝子は、通常、機能的に共通の経路に関連している。この群化の編成は、６０ｋｂのゲノム領域で２５の同等に調節された転写が発見されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのステリグマトシスティン経路遺伝子（ブラウンら，１９９６）、及び２５ｋｂの領域で九遺伝子が群化し、そのうち八遺伝子が経路機能に必要であることが分かったＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓのトリコテセン経路遺伝子（ホーンら，１９９５）によって例証されている。特定の菌類ペプチドの生合成に関連する遺伝子も、群として見つかっている。ＣＰＳ１と、こうした追加的な遺伝子との密接な結びつきは、Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓにおける新たな二次代謝物経路の存在を明らかにする可能性がある。この経路において、ＣＰＳ１は、二次代謝物、おそらくはペプチド植物毒素の合成に必要なあらゆる触媒作用を備えた大きな多機能酵素をコードするため、主要な構造遺伝子であり、他の遺伝子は、下で説明するように、調節、翻訳後修飾、又は基質処理といった経路の調整動作に必要な様々な機能を実行することができる。
【０２７８】
ＣＰＳ１遺伝子群の意義。機能解析及び構造解析の両方において、ＣＰＳ１遺伝子群が新しい生合成経路を制御しているという仮説は強く支持される。経路遺伝子は、主に産業目的で、僅かな糸状菌類のみにおいて研究されてきた（ケラーら，１９９７，前掲）。植物病原菌類に関して、菌類による病理発生のための経路遺伝子については殆ど分かっていない。Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓにおいて、二種類のＴｏｘ１遺伝子、ＰＫＳ１（ヤンら，１９９６，前掲）及びＤＥＣ１（ローズら，１９９６，前掲）の最近のクローニングは、菌類／トウモロコシの相互作用における毒性決定因子であるＴ毒素の生合成に関する分子メカニズムを理解する上での突破口をもたらした。しかし、関連する経路遺伝子の更なる特定は失敗に終わっており、これは、これら二種類の遺伝子が異なる染色体に位置しており、それぞれが高Ａ＋Ｔ  ＤＮＡに埋め込まれているためである（ヨーダら，１９９７，前掲）。対照的に、ＣＰＳ１群は、病理発生経路を探求する優れた機会を提供する。
【０２７９】
第一に、これは、「正常な」配列領域に存在している。クローン配列の殆どにおいて、５０乃至５５％のＧ＋Ｃ含有量が確認されており、高Ａ＋Ｔ  ＤＮＡはクローン領域のいずれの末端にも伴わない。これは、更なる染色体歩行、コスミドライブラリのスクリーニング、或いは標的組み込み及びプラスミドレスキュにより、追加的な経路遺伝子をクローニングするのを容易にする。第二に、これは、おそらくは単一の伝達経路に結びつく調節遺伝子（ＤＢＺ１）を含む。ＤＢＺ１と相互作用する遺伝子の分離は、菌類病原体と宿主植物との間での分子の伝達を媒介する新しい因子を明らかにする可能性がある。ＤＢＺ１の更なる特徴付けも（位置特異的破壊又は欠失と共に）、遺伝子群の限界を判断する上で有効であり、これは、共通の経路に関与する密接に結びついた遺伝子が同じ調節因子によって同等に調節されるケースが多く存在するためである（ケラーら，１９９７，前掲）。最後に、ＣＰＳ１遺伝子は、ＴレースとＯレースの両方で確認されており、そのホモログも別のＣｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種で確認されている。高いＧ＋Ｃ含有量の存在は、こうした遺伝子がバクテリアの祖先から進化したことを意味する可能性があり、こうした菌類での保存性は、ＣＰＳ１群によってコードされた遺伝子産物の植物病原性機能と相関する可能性がある。この群の更なる調査は、この菌類のグループにおける一般病原因子の進化に対する洞察をもたらすはずである。
【０２８０】
ＯＲＦ１７は、鉄還元酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）であり、ＯＲＦ１５は、透過酵素／ＭＦＳ輸送体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）である。第二鉄還元酵素は、バクテリア、菌類、植物、及び動物で見られる酵素のグループで、第二鉄を還元し、有機体が使用する吸収形態である第一鉄にする役割を果たす。これは、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、及びＨ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍその他において、十分に研究されている。ＦＥＲ１酵母は、タバコでの発現が行われている（オキら，１９９９）。
【０２８１】
これまでの研究では、ＦＥＲ遺伝子が重要な病原性決定因子となり得ることが明らかになっている。ティンマーマン及びウッズは、Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍにおいて、ＦＥＲが三種類の方法で鉄を取得する上で重要な役割を果たす可能性があることを提示しており、その方法は、無機物又は有機物の第二鉄塩からと、宿主のＦｅ（ＩＩＩ）結合タンパク質（トランスフェリンその他）からと、菌類自体が生成するシデロフォア（シデロフォア分子によりキレート化された鉄を還元及び放出する）からとである。
【０２８２】
一方、微生物感染に応答した鉄の封鎖は、宿主防御メカニズムとなることが実証されている。病原体にある感染に関連する鉄取得システムは、宿主の防御に対抗し、宿主細胞において病原体によるコロニ化を成功させるために、重要なメカニズムであると考えることができる。これは、すべての病原菌類にとって一般的なメカニズムである可能性がある。
【０２８３】
ＣＰＳ１は、異常なアミノ酸、ヒドロキシル酸、及び構造を含む新しいシデロフォアを生合成する役割を果たす酵素をコードする可能性がある。ＣＰＳ１シデロフォアは、宿主の封鎖により鉄が限定される宿主細胞に菌類が入った時、鉄の取得に関して宿主と競合できる。特に、Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅのような根の病原体では、封鎖は、根の表面で強くなる場合がある。これにより、ｃｐｓ１突然変異体が大幅な毒性の低減を示した理由を説明することができる。ＦＥＲ１は、ＣＰＳ１シデロフォアから鉄を放出するために必要である可能性があり、これは、ＣＰＳ１遺伝子の近くに位置することの説明となる。更に、鉄が限定される条件の中で菌株を培養できるのは、鉄が乏しい条件の間のみ、ＣＰＳ１、及びおそらくは群内の他の遺伝子が活発になるためである可能性がある。
【０２８４】
すべての刊行物、特許、及び特許出願は、参照により本明細書に援用する。以上、本明細書では、本発明について、特定の好適な実施形態に関連させて説明し且つ例示の目的で多数の詳細を述べてきたが、本発明では追加的な実施形態が可能であり且つ本発明の基本原理から逸脱することなく本明細書の特定の詳細を大幅に変化させ得ることは当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ペプチドシンテターゼ遺伝子において特定されたアミノ酸活性化モジュールの構造を示す図である（スタッケルハウス及びマラヒール，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ６１６３， １９９５、スタッケルハウス及びマラヒール，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １２５， ３， １９９５、ポスピーク，１９９５，前掲、マラヒール，１９９７，前掲を利用）。図１Ａは、二タイプのモジュールにおけるドメイン配列を示している。遺伝子ｓａｆＢの第一のモジュール（ｓａｆＢ１）における構造的な変化は、タイプＩの下にも表示されている。図１Ｂは、二種類の菌類ペプチドにおけるモジュールタイプと残基の性質との相関を示している。空白ボックスはタイプＩモジュール、色付きボックスはタイプＩＩモジュールである。各ペプチド配列は、下に提示されている。
【図２】
標識部位を囲むクローン配列の制限地図を示す図である。１１．３ｋｂゲノム領域（太線）がクローニングされ、完全に配列された。突然変異体Ｒ．Ｃ４．２６９６におけるオリジナルのＲＥＭＩ挿入点は、縦の矢印で示している。アスタリスクは、野生型ゲノムにおける二つの標的組み込み部位を示している。二つのオープンリーディングフレーム（対向方向）、ＯＲＦ１（ＣＰＳ１、５．４ｋｂ）及びＯＲＦ２（ＴＥＳ１、１．１ｋｂ）は、地図の下の空白ボックスによって示している（推定イントロンの位置は、縦のバーにより示している）。配列決定に使用される七つの重複プラスミドクローンの位置は、地図の最上部の細線により示している（色付き三角形は、各クローンのベクタ配列を表す）。
【図３Ａ乃至図３Ｃ】
ＣＰＳ１のモジュラ構造の特徴を示す説明図である。ペプチドシンテターゼ及びチオエステラーゼは、空白ボックスによって示しており、内部の影付きボックスは機能領域及びモジュールを示し、影付きボックス内の縦のバーは保存性の高いコア配列を示す。図３Ａは、バクテリア及び菌類ペプチドシンテターゼの全般的な構造を例示している（マラヒール，１９９７，前掲を利用）。ペプチドシンテターゼ遺伝子群は、最上部に表示されている。各タンパク質には一つ以上のアミノ酸活性化モジュールが存在する可能性があり（サイクロスポリンシンテターゼには１１）、一部のペプチドシンテターゼはチオエステラーゼドメイン（ＴＥ）を有し、これはモジュールに組み込むことが可能であり、或いは別個の遺伝子によりコードすることが可能である。各シンテターゼは、タイプＩ、タイプＩＩ、又は両方のモジュールを有することができる。タイプＩ（最小）モジュールは、コア配列及びドメインの編成を示すために拡大されている。一部のペプチドシンテターゼは、更に、縮合又はエピマ化ドメインを有する。図３Ｂは、四つのアミノ酸活性化モジュールを含むサフラマイシンＭｘｌシンテターゼの編成を例示している（ポスピークら，１９９６，前掲）。第一のモジュールからのｓａｆＢ１は、拡大されている。ｓａｆＢ１のコア配列１乃至５は、保存性が弱い（破線の縦のバーで示す）。残りのドメインは、図３Ａに示すタイプＩを表すものである。ｓａｆＣは、推定上のＯ−メチルトランスフェラーゼである。図３Ｃは、ＣＰＳ１の編成を例示している。配列解析では、二種類のアミノ酸活性化モジュール（ＣＰＳ１Ａ及びＣＰＳ１Ｂ）が明らかとなり、コア２の保存性が弱いことを除き、両方ともｓａｆＢ１との高い類似性を有する。チオエステラーゼドメインは、ＣＰＳ１ＢのＣ末端領域で確認される。三本の縦の矢印は、突然変異表現型を産出した野生型ゲノムにおける標的遺伝子破壊の位置を示す。ＴＥＳ１は、別個の遺伝子（ＴＥＳ１）によってコードされたチオエステラーゼである。
【図４Ａ乃至図４Ｃ】
ＣｈＣＰＳ１の他の菌属及び菌種とのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを示すＤＮＡゲルブロットを示す図である。（Ａ）Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ種（１乃至１７）：Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  Ｔレース，Ｏレース、Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍ  １レース，２レース、Ｃ．ｖｉｃｔｏｒｉａｅ分離物ＦＩ３，ＨｖＷ、Ｃ．ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｃ．ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｉ、Ｃ．ｃｈｌｏｒｉｄｉｓ、Ｃ．ｈｏｍｏｍｏｒｐｈｕｓ、Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｃ．ｍｅｌｉｎｉｄｉｓ、Ｃ．ｍｅｌｉｎｉｄｉｓ、Ｃ．ｐｅｒｅｇｉａｎｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｐｅｒｏｔｉｄｉｓ、及びＣ．ｒａｖｅｎｅｌｉｉ。（Ｂ）他のＡｓｃｏｍｙｃｅｔｅ属（１乃至１４）：Ｃ．ｃａｒｂｏｎｕｍ  １レース（対照）、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｒｏｓｔｒａｔａ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ種、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｓａｃｃｈａｒｉ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ種、Ａ．ｓｏｌａｎｉ、Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ種、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｉｓｅａ、Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ（反復）、及びＡ．ｓｏｌａｎｉ（反復）。（Ｃ）Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ及び密接に関連する種と比較したＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（１乃至７）：Ｃ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  Ｔレース、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ  ｓａｃｃｈａｒｉ、Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｒｏｓｔｒａｔａ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ種、Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｒｉｔｉｃｉ−ｒｅｐｅｎｔｉｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ種、及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（矢印）。ゲノムＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ａ，レーン１乃至１７、Ｂ，レーン１乃至１１、Ｃ，レーン１乃至７）、ＸｈｏＩ（Ｂ，レーン１２及び１４）、又はＢｇｌＩＩＩ（Ｂ，レーン１３）により消化し、高い厳密度でＣＰＳ１の３．２ｋｂ断片によりプローブした。レーン３及び１７（パネルＡ）の弱い信号は、不十分なＤＮＡローディングによるものである（反復実験により確認）。
【図５Ａ乃至図５Ｂ】
クローンＣＰＳ１ホモログのＣ．ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ  ＣＰＳ１との類似性を示す図である。（Ａ）四種類のＣＰＳ１ホモログとＣｈＣＰＳ１との構造比較（Ａｓ＝Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｐｔ＝Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｅｒｅｓ、Ｆｇ＝Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｉｕｍ、Ｃｉ＝Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｉｔｕｓ）。ＯＲＦは、空白ボックスで示しており、内部の影付きボックスは機能ドメインを示し、縦のバーはスタッケルハウス及びマラヒールが定義した非リボソーム性ペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）において確認された保存モチーフ配列を示している（スタッケルハウス及びマラヒール，１９９５，前掲、マラヒール，１９９７，前掲）（破線のバーは、弱い保存を示す）。黒い球は、推定イントロンの位置を示す。コア１乃至５：アデニル化、コア６：チオール化、ＴＥ：チオエステラーゼ。コア配列間の距離は、正確な縮尺で描かれていない。タンパク質の名前はＯＲＦボックスの左にあり、アミノ酸の番号は右にある。ＡｓＣＰＳ１、ＰｔＣＰＳ１、及びＣｉＣＰＳ１の未確認領域は、破線のボックスで示している。ＣｈＣＰＳ１との（重複領域のみにおける）類似性は、タンパク質名の下の丸括弧に、ヌクレオチド同一性／アミノ酸同一性／アミノ酸類似性の順序で提示されている。ＣｈＣＰＳ１アミノ酸の位置２２０及び１０４０（ＣｉＣＰＳ１の最初と最後のアミノ酸に対応）は、細い矢印で示しており、位置５１１及び１２６９（ＡｓＣＰＳ１及びＰｔＣＰＳ１の最初と最後のアミノ酸に対応）は、色付きの三角形で示している。（Ｂ）四種類のＣＰＳ１ホモログのＣｈＣＰＳ１に対するアミノ酸アラインメント。ＣｈＣＰＳ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６）のアミノ酸５１１乃至１０４０に対してアラインメントされた５３０のアミノ酸を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１乃至５４）。同一残基は大文字であり、類似残基は小文字である。代表的なＮＲＰＳシグネチャモチーフに類似する配列のコンセンサスには、下線が引かれている。推定環化ドメインモチーフ「ＤＸＸＸＸＤ／ＥＸＸＳ／Ａ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）には、下線が引かれている。
【図６】
ＦｇＣＰＳ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）を問い合わせ配列として使用したＢＬＡＳＴ検索の結果を示す図である。
【図７Ａ】
ＣｉＣＰＳ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）を問い合わせ配列として使用したＢＬＡＳＴ検索の結果を示す図である。
【図７Ｂ】
ＦｇＣＰＳ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、ＡｓＣＰＳ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、ＰｔＣＰＳ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、ＣｉＣＰＳ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、及びＣｈＣＰＳ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図８Ａ乃至図８Ｃ】
ＣｈＣＰＳ１遺伝子群に関する配列決定戦略（Ａ）、制限地図（Ｂ）、及びゲノム編成（Ｃ）を示す図である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９は、ＣｈＣＰＳ１に近い群化した遺伝子の配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７及び１８８は、それぞれ、ＯＲＦ１６に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９及び１９０は、それぞれ、ＯＲＦ１０に対応するＤＮＡ、及びこれに対応するアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１及び１９２は、それぞれ、ＯＲＦ１１に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３及び１９４は、それぞれ、ＯＲＦ１２に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５及び１９６は、それぞれ、ＯＲＦ１３に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９７及び１９８は、それぞれ、ＯＲＦ１４に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９９及び２００は、それぞれ、ＯＲＦ３に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０１及び２０２は、それぞれ、ＯＲＦ５に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０３及び２０４は、それぞれ、ＯＲＦ６に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０５及び２０６は、それぞれ、ＯＲＦ７に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７及び２０８は、それぞれ、ＯＲＦ８に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９及び２１０は、それぞれ、ＯＲＦ９に対応するＤＮＡ、及びこれによってコードされたアミノ酸配列を表す。
【図９Ａ】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８によってコードされた鉄還元酵素）を問い合わせ配列として使用したＢＬＡＳＴ検索の結果を示す図である。
【図９Ｂ】
Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ鉄還元酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ還元酵素（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図９Ｃ】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８を含むＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１）を例示する図である。
【図９Ｄ】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１によってコードされるアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１）を例示する図である。
【図１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ透過酵素及び又はＭＦＳ輸送体）によってコードされたポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）を問い合わせ配列として使用したＢＬＡＳＴ検索の結果を示す図である。
【図１Ａ】
2004537967.tif 000022
【図１Ｂ】
2004537967.tif 000023
【図２】
2004537967.tif 000024
【図３Ａ】
2004537967.tif 000025
【図３Ｂ】
2004537967.tif 000026
【図３Ｃ】
2004537967.tif 000027
【図６−１】
2004537967.tif 000028
【図６−２】
2004537967.tif 000029
【図６−３】
2004537967.tif 000030
【図６−４】
2004537967.tif 000031
【図７Ａ−１】
2004537967.tif 000032
【図７Ａ−２】
2004537967.tif 000033
【図７Ａ−３】
2004537967.tif 000034
【図７Ａ−４】
2004537967.tif 000035
【図７Ｂ−９】
2004537967.tif 000036
【図８Ａ】
2004537967.tif 000037
【図８Ｂ】
2004537967.tif 000038
【図８Ｃ】
2004537967.tif 000039
【図９Ａ−１】
2004537967.tif 000040
【図９Ａ−２】
2004537967.tif 000041
【図９Ａ−３】
2004537967.tif 000042
【図９Ａ−４】
2004537967.tif 000043
【図９Ｂ−４】
2004537967.tif 000044
【図１０−１】
2004537967.tif 000045
【図１０−２】
2004537967.tif 000046
【図１０−３】
2004537967.tif 000047
【国際公開パンフレット】
2004537967.tif 000048
2004537967.tif 000049
2004537967.tif 000050
2004537967.tif 000051
2004537967.tif 000052
2004537967.tif 000053
2004537967.tif 000054
2004537967.tif 000055
2004537967.tif 000056
2004537967.tif 000057
2004537967.tif 000058
2004537967.tif 000059
2004537967.tif 000060
2004537967.tif 000061
2004537967.tif 000062
2004537967.tif 000063
2004537967.tif 000064
2004537967.tif 000065
2004537967.tif 000066
2004537967.tif 000067
2004537967.tif 000068
2004537967.tif 000069
2004537967.tif 000070
2004537967.tif 000071
2004537967.tif 000072
2004537967.tif 000073
2004537967.tif 000074
2004537967.tif 000075
2004537967.tif 000076
2004537967.tif 000077
2004537967.tif 000078
2004537967.tif 000079
2004537967.tif 000080
2004537967.tif 000081
2004537967.tif 000082
2004537967.tif 000083
2004537967.tif 000084
2004537967.tif 000085
2004537967.tif 000086
2004537967.tif 000087
2004537967.tif 000088
2004537967.tif 000089
2004537967.tif 000090
2004537967.tif 000091
2004537967.tif 000092
2004537967.tif 000093
2004537967.tif 000094
2004537967.tif 000095
2004537967.tif 000096
2004537967.tif 000097
2004537967.tif 000098
2004537967.tif 000099
2004537967.tif 000100
2004537967.tif 000101
2004537967.tif 000102
2004537967.tif 000103
2004537967.tif 000104
2004537967.tif 000105
2004537967.tif 000106
2004537967.tif 000107
2004537967.tif 000108
2004537967.tif 000109
2004537967.tif 000110
2004537967.tif 000111
2004537967.tif 000112
2004537967.tif 000113
2004537967.tif 000114
2004537967.tif 000115
2004537967.tif 000116
2004537967.tif 000117
2004537967.tif 000118
2004537967.tif 000119
2004537967.tif 000120
2004537967.tif 000121
2004537967.tif 000122
2004537967.tif 000123
2004537967.tif 000124
2004537967.tif 000125
2004537967.tif 000126
2004537967.tif 000127
2004537967.tif 000128
2004537967.tif 000129
2004537967.tif 000130
2004537967.tif 000131
2004537967.tif 000132
2004537967.tif 000133
2004537967.tif 000134
2004537967.tif 000135
2004537967.tif 000136
2004537967.tif 000137
2004537967.tif 000138
2004537967.tif 000139
2004537967.tif 000140
2004537967.tif 000141
2004537967.tif 000142
2004537967.tif 000143
2004537967.tif 000144
2004537967.tif 000145
2004537967.tif 000146
2004537967.tif 000147
2004537967.tif 000148
2004537967.tif 000149
2004537967.tif 000150
2004537967.tif 000151
2004537967.tif 000152
2004537967.tif 000153
2004537967.tif 000154
2004537967.tif 000155
2004537967.tif 000156
2004537967.tif 000157
2004537967.tif 000158
2004537967.tif 000159
2004537967.tif 000160
2004537967.tif 000161
2004537967.tif 000162
2004537967.tif 000163
2004537967.tif 000164
2004537967.tif 000165
2004537967.tif 000166
2004537967.tif 000167
2004537967.tif 000168
2004537967.tif 000169
2004537967.tif 000170
2004537967.tif 000171
2004537967.tif 000172
2004537967.tif 000173
2004537967.tif 000174
2004537967.tif 000175
2004537967.tif 000176
2004537967.tif 000177
2004537967.tif 000178
2004537967.tif 000179
2004537967.tif 000180
2004537967.tif 000181
2004537967.tif 000182
2004537967.tif 000183
2004537967.tif 000184
2004537967.tif 000185
2004537967.tif 000186
2004537967.tif 000187
2004537967.tif 000188
2004537967.tif 000189
2004537967.tif 000190
2004537967.tif 000191
2004537967.tif 000192
2004537967.tif 000193
2004537967.tif 000194
2004537967.tif 000195
2004537967.tif 000196
2004537967.tif 000197
2004537967.tif 000198
2004537967.tif 000199
2004537967.tif 000200
2004537967.tif 000201
2004537967.tif 000202
2004537967.tif 000203
2004537967.tif 000204
2004537967.tif 000205
2004537967.tif 000206
2004537967.tif 000207
2004537967.tif 000208
2004537967.tif 000209
2004537967.tif 000210
2004537967.tif 000211
2004537967.tif 000212
2004537967.tif 000213
2004537967.tif 000214
2004537967.tif 000215
2004537967.tif 000216
2004537967.tif 000217
2004537967.tif 000218
2004537967.tif 000219
2004537967.tif 000220
2004537967.tif 000221
2004537967.tif 000222
2004537967.tif 000223
2004537967.tif 000224
2004537967.tif 000225
2004537967.tif 000226
2004537967.tif 000227
2004537967.tif 000228
2004537967.tif 000229
2004537967.tif 000230
2004537967.tif 000231
2004537967.tif 000232
2004537967.tif 000233
2004537967.tif 000234
2004537967.tif 000235
2004537967.tif 000236
2004537967.tif 000237
2004537967.tif 000238
2004537967.tif 000239
2004537967.tif 000240
2004537967.tif 000241
2004537967.tif 000242
2004537967.tif 000243
2004537967.tif 000244
2004537967.tif 000245
2004537967.tif 000246
2004537967.tif 000247
2004537967.tif 000248
2004537967.tif 000249
2004537967.tif 000250
2004537967.tif 000251
2004537967.tif 000252
2004537967.tif 000253
2004537967.tif 000254
2004537967.tif 000255
2004537967.tif 000256
2004537967.tif 000257
2004537967.tif 000258
2004537967.tif 000259
2004537967.tif 000260
2004537967.tif 000261
2004537967.tif 000262
2004537967.tif 000263
2004537967.tif 000264
2004537967.tif 000265
2004537967.tif 000266
2004537967.tif 000267
2004537967.tif 000268
2004537967.tif 000269
2004537967.tif 000270
2004537967.tif 000271
2004537967.tif 000272
2004537967.tif 000273
2004537967.tif 000274
2004537967.tif 000275
2004537967.tif 000276
2004537967.tif 000277
2004537967.tif 000278
2004537967.tif 000279
2004537967.tif 000280
2004537967.tif 000281
2004537967.tif 000282
2004537967.tif 000283
2004537967.tif 000284
2004537967.tif 000285
2004537967.tif 000286
2004537967.tif 000287
2004537967.tif 000288
2004537967.tif 000289
2004537967.tif 000290
2004537967.tif 000291
2004537967.tif 000292
2004537967.tif 000293
2004537967.tif 000294
2004537967.tif 000295
2004537967.tif 000296
2004537967.tif 000297
2004537967.tif 000298
2004537967.tif 000299
2004537967.tif 000300
2004537967.tif 000301
2004537967.tif 000302
2004537967.tif 000303
2004537967.tif 000304
2004537967.tif 000305
2004537967.tif 000306
2004537967.tif 000307
2004537967.tif 000308
2004537967.tif 000309
2004537967.tif 000310
2004537967.tif 000311
2004537967.tif 000312
2004537967.tif 000313
2004537967.tif 000314
2004537967.tif 000315
2004537967.tif 000316
2004537967.tif 000317
2004537967.tif 000318
2004537967.tif 000319
2004537967.tif 000320
2004537967.tif 000321
2004537967.tif 000322
2004537967.tif 000323
2004537967.tif 000324
2004537967.tif 000325
2004537967.tif 000326
2004537967.tif 000327
2004537967.tif 000328
2004537967.tif 000329
2004537967.tif 000330
2004537967.tif 000331
2004537967.tif 000332
2004537967.tif 000333
2004537967.tif 000334
2004537967.tif 000335
2004537967.tif 000336
2004537967.tif 000337
2004537967.tif 000338
2004537967.tif 000339
2004537967.tif 000340
2004537967.tif 000341
2004537967.tif 000342
2004537967.tif 000343
2004537967.tif 000344
2004537967.tif 000345
2004537967.tif 000346
2004537967.tif 000347
2004537967.tif 000348
2004537967.tif 000349
2004537967.tif 000350
2004537967.tif 000351
2004537967.tif 000352
2004537967.tif 000353
2004537967.tif 000354
2004537967.tif 000355
2004537967.tif 000356
2004537967.tif 000357
2004537967.tif 000358
2004537967.tif 000359
2004537967.tif 000360
2004537967.tif 000361
2004537967.tif 000362
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537967.tif 000363
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537967.tif 000364
【国際調査報告】
2004537967.tif 000365
2004537967.tif 000366
2004537967.tif 000367
2004537967.tif 000368
2004537967.tif 000369
2004537967.tif 000370
2004537967.tif 000371