(57)【要約】本発明は、代謝生成物を分解及び／又は蓄積するための細胞の能力をモジュレートする試薬についてスクリーンするための、或いは細胞を選択的に殺すための、又は代謝生成物を蓄積及び／又は分解する能力の欠陥を有する細胞内で遺伝子若しくはｃＤＮＡを選択的に発現するために２−ハイブリッドシステムを利用する。１つの具体例では、ペプチド結合ドメイン及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸；代謝生成物又は代謝生成物に結合するリガンドに対して結合するるペプチド結合領域に結合する核酸結合領域を含む第一キメラタンパク質；並びに、第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質を含む哺乳動物細胞を提供する。細胞は１種又はそれ以上の試験試薬と接触し、そしてエフェクター遺伝子の発現の変化が（存在する場合）検出される、ここで、試験試薬に応答したエフェクター遺伝子の発現の変化は、試験試薬が前記細胞の能力をモジュレートし代謝生成物を蓄積又は分解することを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
代謝生成物を蓄積又は分解する細胞の能力をモジュレートする試薬についてスクリーニングする方法であって：
ｉ）　ペプチド結合サイト及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸；
前記代謝生成物又は前記代謝生成物に結合するリガンドに結合する前記ペプチド結合サイトを結合させる核酸結合ドメインを含む第一キメラタンパク質；
第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質；
を含む哺乳動物細胞を提供し、
ｉｉ）　試験試薬と前記細胞を接触させ；そして
ｉｉｉ）　前記エフェクター遺伝子の発現の変化を検出する、ここで前記試験細胞中の前記エフェクターの発現における差異は、低濃度の試験試薬と接触し若しくは試験試薬と接触しないコントロール細胞との比較で、前記試験細胞が前記代謝生成物を蓄積又は分解する細胞の能力をモジュレートすることを示す、
ことを含む該方法。
【請求項２】
前記発現コントロールタンパク質がトランスアクティベーターである請求項１の方法。
【請求項３】
前記トランスアクティベーターがＶＰ１６である請求項２の方法。
【請求項４】
前記発現コントロールタンパク質がリプレッサーである請求項１の方法。
【請求項５】
前記核酸結合タンパク質がＧＡＬ−４及びＧＡＬ−４−Ｙからなる群より選択される請求項１の方法。
【請求項６】
前記エフェクターがレポーター遺伝子、細胞毒及びアポトーシス遺伝子からなる群より選択される請求項１の方法。
【請求項７】
前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ（ｂ−ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、成長ホルモン（ＧＨ）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる群より選択される請求項１の方法。
【請求項８】
前記エフェクターが、チミジンキナーゼ、シュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒、リシン及びアブリンからなる群より選択される細胞毒を符号化する請求項１の方法。
【請求項９】
前記アポトーシス遺伝子が、Ｐ５３、Ｐ７３、Ｂａｘ、Ｂａｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）からなる群より選択される請求項１の方法。
【請求項１０】
前記リガンド及び代謝生成物が、ベータカテニン及びＴｃｆ、ＮＦ−κＢ及びＩ−κＢ、Ｐ５３及びＭＤＭ２、レセプター及びそのヘテロメリックレセプターパートナーからそれぞれ選択される請求項１の方法。
【請求項１１】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内の核酸から発現される請求項１の方法。
【請求項１２】
前記第二キメラタンパク質が前記細胞内の核酸から発現される請求項１の方法。
【請求項１３】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内に輸送されるタンパク質である請求項１の方法。
【請求項１４】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内に輸送されるタンパク質である請求項１の方法。
【請求項１５】
前記第一キメラタンパク質又は前記第二キメラタンパク質がＨＩＶ　ＴＡＴドメインを含む請求項１の方法。
【請求項１６】
前記細胞がＳＷ４８０、ＳＷ４８、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、２９３、Ｕ−２０Ｓ、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｈｅｐ　Ｇ２及びＪａｒｋａｔ細胞から選択される細胞である請求項１の方法。
【請求項１７】
前記核酸がＧＡＬ−４結合サイトを符号化し、そして前記エフェクター遺伝子がレポーター遺伝子であり；
前記第一キメラタンパク質がＧＡＬ−４核酸結合タンパク質及びベータカテニン又はＴｃｆを含み；
前記第二キメラタンパク質がＶＰ−１６及びベータカテニン又はＴｃｆを含む、
請求項１の方法。
【請求項１８】
前記ＴｃｆがＴｃｆ４である請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、組織特異的又は誘導可能なプロモーターのコントロール下で第一又は第二キメラタンパク質を符号化する核酸を含む請求項１の方法。
【請求項２０】
前記プロモーターがエクジソンプロモーターである請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、さらに誘導可能なプロモーターと操作可能に連結する前記リガンド又は代謝生成物を符号化する第二核酸を含む請求項１の方法。
【請求項２２】
代謝生成物を蓄積又は分解する細胞中でエフェクター遺伝子を選択的に発現させる方法であって：
ペプチド結合サイト及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸；
核酸結合タンパク質が前記代謝生成物又は前記代謝生成物に結合するリガンドに結合する前記ペプチド結合サイトを結合させる核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質；
第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質；
を含む細胞を提供し、それにより前記細胞が前記代謝生成物又は前記代謝生成物を結合させるリガンドを分解する能力の不存在下で、前記エフェクター遺伝子の発現を活性化又は抑制する該方法。
【請求項２３】
前記発現コントロールタンパク質がトランスアクティベーターである請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記トランスアクティベーターがＶＰ１６である請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記発現コントロールタンパク質がリプレッサーである請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記核酸結合タンパク質がＧＡＬ−４及びＧＡＬ−４−Ｙからなる群より選択される請求項２２の方法。
【請求項２７】
前記エフェクターがレポーター遺伝子、細胞毒及びアポトーシス誘導遺伝子からなる群より選択される請求項２２の方法。
【請求項２８】
前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ（ｂ−ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、成長ホルモン（ＧＨ）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる群より選択される請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記エフェクターが、チミジンキナーゼ、シュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒、リシン及びアブリンからなる群より選択される細胞毒を符号化する請求項２７の方法。
【請求項３０】
前記アポトーシス遺伝子が、Ｐ５３、Ｐ７３、Ｂａｘ、Ｂａｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼからなる群より選択される請求項２７の方法。
【請求項３１】
前記リガンド及び代謝生成物が、ベータカテニン及びＴｃｆ、ＮＦ−κＢ及びＩ−κＢ、Ｐ５３及びＭＤＭ２、レセプター及びそのヘテロメリックレセプターパートナーからそれぞれ選択される請求項２２の方法。
【請求項３２】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内の核酸から発現される請求項２２の方法。
【請求項３３】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内の核酸から発現される請求項２２の方法。
【請求項３４】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内に輸送されるタンパク質である請求項２２の方法。
【請求項３５】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内に輸送されるタンパク質である請求項２２の方法。
【請求項３６】
前記第一キメラタンパク質又は前記第二キメラタンパク質が、ＨＩＶ　ＴＡＴドメインを含む請求項２２の方法。
【請求項３７】
前記核酸がＧＡＬ−４結合サイトを符号化し、そして前記エフェクター遺伝子がレポーター遺伝子であり；
前記第一キメラタンパク質がＧＡＬ−４核酸結合タンパク質及びベータカテニン又はＴｃｆを含み；
前記第二キメラタンパク質がＶＰ−１６及びベータカテニン又はＴｃｆを含む、
請求項２２の方法。
【請求項３８】
前記ＴｃｆがＴｃｆ４である請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記試験試薬が小有機分子である請求項１の方法。
【請求項４０】
代謝生成物を蓄積する細胞を選択的に殺す方法であって：
ペプチド結合サイトを符号化する核酸及び細胞毒若しくはアポトーシス誘導遺伝子であるエフェクターを用いて前記細胞をトランスフェクトし；
核酸結合タンパク質が前記代謝生成物又は前記代謝生成物に結合するリガンドに結合する前記ペプチド結合サイトを結合させる核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質を細胞内に導入し；そして
第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合するトランスアクティベーターを含む第二キメラタンパク質を前記細胞中へ導入する、
ことを含む該方法。
【請求項４１】
前記トランスアクティベーターがＶＰ１６である請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記核酸結合タンパク質がＧＡＬ−４及びＧＡＬ−４−Ｙからなる群より選択される請求項４０の方法。
【請求項４３】
前記エフェクターが細胞毒である請求項４０の方法。
【請求項４４】
前記エフェクターが、チミジンキナーゼ、シュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒、リシン及びアブリンからなる群より選択される細胞毒である請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記エフェクターがアポトーシス誘導遺伝子である請求項４０の方法。
【請求項４６】
前記アポトーシス誘導遺伝子が、Ｐ５３、Ｐ７３、Ｂａｘ、Ｂａｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼからなる群より選択される請求項４５の方法。
【請求項４７】
前記リガンド及び代謝生成物が、ベータカテニン及びＴｃｆ、ＮＦ−κＢ及びＩ−κＢ、Ｐ５３及びＭＤＭ２、レセプター及びそのヘテロメリックレセプターパートナーからそれぞれ選択される請求項４０の方法。
【請求項４８】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内の核酸から発現される請求項４０の方法。
【請求項４９】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内の核酸から発現される請求項４０の方法。
【請求項５０】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内に輸送されるタンパク質である請求項４０の方法。
【請求項５１】
前記第一キメラタンパク質が前記細胞内に輸送されるタンパク質である請求項４０の方法。
【請求項５２】
前記第一キメラタンパク質又は前記第二キメラタンパク質がＨＩＶ　ＴＡＴドメインを含む請求項４０の方法。
【請求項５３】
前記細胞がＳＷ４８０、ＳＷ４８、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、２９３、Ｕ−２０Ｓ、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｈｅｐ　Ｇ２及びＪａｒｋａｔ細胞から選択される細胞である請求項４０の方法。
【請求項５４】
前記細胞が癌細胞である請求項４０の方法。
【請求項５５】
前記核酸がＧＡＬ−４結合サイトを符号化し；
前記第一キメラタンパク質がＧＡＬ−４核酸結合タンパク質及びベータカテニン又はＴｃｆを含み；
前記第二キメラタンパク質がＶＰ−１６及びベータカテニン又はＴｃｆを含む、
請求項４０の方法。
【請求項５６】
前記ＴｃｆがＴｃｆ４である請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記癌細胞が、結腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、咽喉癌、皮膚癌及び卵巣癌からなる群より選択される癌からの細胞である請求項５４の方法。
【請求項５８】
請求項４０〜５５のいずれか１項の方法を含む癌の治療方法。
【請求項５９】
前記癌が、結腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、咽喉癌、皮膚癌及び卵巣癌からなる群より選択される請求項６２の方法。
【請求項６０】
ペプチド結合サイト及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸；
核酸結合タンパク質が前記代謝生成物又は前記代謝生成物に結合するリガンドに結合する前記ペプチド結合サイトを結合させる核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質；及び
第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質；
を含む細胞。
【請求項６１】
前記発現コントロールタンパク質がトランスアクティベーターである請求項６０の細胞。
【請求項６２】
前記トランスアクティベーターがＶＰ１６である請求項６０の細胞。
【請求項６３】
前記発現コントロールタンパク質がリプレッサーである請求項６０の細胞。
【請求項６４】
前記核酸結合タンパク質がＧＡＬ−４及びＧＡＬ−４−Ｙからなる群より選択される請求項６０の細胞。
【請求項６５】
前記エフェクターがレポーター遺伝子、細胞毒及びアポトーシス誘導遺伝子からなる群より選択される請求項６０の細胞。
【請求項６６】
前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ（ｂ−ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、成長ホルモン（ＧＨ）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる群より選択される請求項６０の細胞。
【請求項６７】
前記エフェクターが、チミジンキナーゼ、シュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒、リシン及びアブリンからなる群より選択される細胞毒を符号化する請求項６０の細胞。
【請求項６８】
前記アポトーシス誘導遺伝子が、Ｐ５３、Ｐ７３、Ｂａｘ、Ｂａｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼからなる群より選択される請求項６０の細胞。
【請求項６９】
前記リガンド及び代謝生成物が、ベータカテニン及びＴｃｆ、ＮＦ−κＢ及びＩ−κＢ、Ｐ５３及びＭＤＭ２、レセプター及びそのヘテロメリックレセプターパートナーからそれぞれ選択される請求項６０の細胞。
【請求項７０】
前記細胞が前記第一キメラタンパク質を符号化する核酸を含む請求項６０の細胞。
【請求項７１】
前記細胞が前記第二キメラタンパク質を符号化する核酸を含む請求項６０の細胞。
【請求項７２】
前記細胞がＳＷ４８０、ＳＷ４８、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、２９３、Ｕ−２０Ｓ、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｈｅｐ　Ｇ２及びＪａｒｋａｔ細胞から選択される細胞である請求項６０の細胞。
【請求項７３】
前記核酸がＧＡＬ−４結合サイトを符号化し、そして前記エフェクター遺伝子がレポーター遺伝子であり；
前記第一キメラタンパク質がＧＡＬ−４核酸結合タンパク質及びベータカテニン又はＴｃｆを含み；
前記第二キメラタンパク質がＶＰ−１６及びベータカテニン又はＴｃｆを含む、
請求項６０の細胞。
【請求項７４】
前記ＴｃｆがＴｃｆ４である請求項７３の細胞。
【請求項７５】
前記細胞が、さらに誘導可能なプロモーターと操作可能に連結する前記リガンド又は代謝生成物を符号化する第二核酸を含む請求項６０の細胞。
【請求項７６】
Ｔｃｆ４又はベータカテニンに結合する核酸結合ドメインを含むキメラタンパク質を符号化する核酸、及びベータカテニン又はＴｃｆ４に対して結合するトランスアクティベーターを符号化する核酸、からなる群より選択される核酸を含む核酸。
【請求項７７】
前記核酸が、Ｔｃｆ４に対して結合する核酸結合ドメインを符号化する核酸を含む請求項７６の核酸。
【請求項７８】
前記核酸が、ベータカテニンに対して結合する核酸結合ドメインを符号化する核酸を含む請求項７６の核酸。
【請求項７９】
前記核酸がトランスアクティベーターに結合するＴｃｆ４を符号化する核酸を含む請求項７６の核酸。
【請求項８０】
前記核酸がトランスアクティベーターに結合するベータカテニンを符号化する核酸を含む請求項７６の核酸。
【請求項８１】
前記核酸がＤＮＡである請求項７６の核酸。
【請求項８２】
前記核酸がベクターである請求項７６の核酸。
【請求項８３】
ペプチド結合サイト及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸；
核酸結合タンパク質が、前記代謝生成物又は前記代謝生成物に結合するリガンドに結合する前記ペプチド結合サイトを結合させる核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質を符号化する核酸；及び
第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質を符号化する核酸；
を含むベクター。
【請求項８４】
前記第一キメラタンパク質を符号化する核酸が、さらに前記第一キメラタンパク質に結合するＨＩＶ　ＴＡＴドメインを符号化する請求項８３のベクター。
【請求項８５】
前記第二キメラタンパク質を符号化する核酸が、さらに前記第二キメラタンパク質に結合するＨＩＶ　ＴＡＴドメインを符号化する請求項８３のベクター。
【請求項８６】
前記代謝生成物又は代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質を符号化する核酸。
【請求項８７】
前記核酸が、さらに前記第一キメラタンパク質に結合するＨＩＶ　ＴＡＴドメインを符号化する請求項８６の核酸。
【請求項８８】
前記代謝生成物又は代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質を符号化する核酸。
【請求項８９】
前記核酸が、さらに前記第一キメラタンパク質に結合するＨＩＶ　ＴＡＴドメインを符号化する請求項８８の核酸。
【請求項９０】
代謝生成物を蓄積又は分解する細胞の能力をモジュレートする試薬についてスクリーニングするためのキットであって：
タンパク質結合サイト及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸；
前記代謝生成物及び代謝生成物に結合するリガンドに結合する前記タンパク質結合サイトを結合させる核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質；
前記第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に前記第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質；
を含む哺乳動物細胞
を含むコンテナを含む該キット。
【請求項９１】
代謝生成物を蓄積又は分解する細胞の能力をモジュレートする試薬についてスクリーニングするためのキットであって、請求項７６の核酸を含むコンテナを含む該キット。
【請求項９２】
細胞を選択的に殺すためのキットであって、
請求項７６の核酸、及び請求項７６の核酸により符号化されるタンパク質からなる群より選択される２−ハイブリッドシステム成分を含むコンテナを含む該キット。
【請求項９３】
代謝生成物を蓄積又は分解する細胞の能力をモジュレートする化合物であって、請求項１の方法により同定される該化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、全ての目的について本明細書中に完全に参照として援用される、２０００年１０月１３日出願のＵＳＳＮ　０９／６８７，５９３に対し優先権及び利益を主張する。
【０００２】
連邦政府主催研究の下でなされた本発明に対する権利の声明（適用なし）
【０００３】
発明の分野
本発明は分子生物学及び腫瘍学の分野に関する。特に本発明は、代謝生成物を分解する細胞（例えば所定の癌細胞）の能力をモジュレートする試薬についてスクリーンし又は代謝生成物を分解するその能力の欠陥を有する細胞を選択的に殺すための新規な２−ハイブリッドシステム（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ　ｓｙｓｔｅｍ）を提供する。
【０００４】
発明の背景
種々の疾患が、１種又はそれ以上の代謝生成物の異常な蓄積により特徴付けられる。しばしば“貯蔵疾患（ｓｔｏｒａｇｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）” と呼ばれるこのような疾患は、代謝生成物を分解する酵素の不活性化又は該生成物を生成する酵素の過度の活性化のために代謝生成物の増加する蓄積により典型的に引き起こされる。貯蔵疾患は、限定するものではないがグリコーゲン貯蔵疾患　Ｉ、ＧＭ１ガングリオシドーズ（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ）、ＭＰＳ　ＩＶ　Ｂ（Ｍｏｒｑｕｉｏ　Ｂ）、ＧＭ２ガングリオシドーズ（Ｏ，Ｂ．ＡＢ，Ｂ１変異体）、ニーマンピック病（Ａ、Ｂ及びＣ）、異染性脳白質変性症（アリールサルファターゼＡ及びＳＡＰ−１欠乏）、クラッベ病、ファブリ病、ゴーシェ病、ファーバー病、ウォルマン病（コレステロールエステル蓄積症）、ＭＰＳ　Ｉ（Ｈｕｒｌｅｒ及びＳｃｈｉｅｉ症候群）、ＭＰＳ　ＩＩ（ハンター症候群）、ＭＰＳ　ＩＩＩＡ、Ｃ及びＤ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ　Ａ，Ｃ及びＤ）、ＰＳ　ＩＩＩ　Ｂ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ　Ｂ）、ＭＰＳ　ＩＶ　Ａ（Ｍｏｒｑｕｉｏ　Ａ）、ＭＰＳ　ＶＩ（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−Ｌａｍｙ症候群）、ＭＰＳ　ＶＩＩ（ベータ−グルコロニダーゼ欠乏）、多発性スルファターゼ欠乏（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｕｌｆａｔａｓｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、ミュークリピドーシス（Ｍｕｃｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）Ｉ（Ｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ）、ミュークリピドーシス（Ｍｕｃｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）ＩＩ＆ＩＩＩ、アルファ−マンノーシドーシス、ベータ−マンノーシドーシス、フコーシドーシス、シアル酸貯蔵疾患、ガラクトシアリドーシス、及びアスパルチルグルコサミン尿症シスチノーシスを含む。
【０００５】
歴史的には、貯蔵疾患は“不足している” 酵素活性を補うことにより治療されてきた。それゆえ、例えばゴーシェ病は脾臓細胞にターゲットされたグルコセレブロシダーゼの使用により治療できる。同様に、ジスムターゼ超過酸化物は、抗酸化剤として肝臓などに対してターゲットされることができる。
【０００６】
このような試みは典型的には限られた成功を表す。しばしば、この“治療試薬” は特定の臓器又は組織に対して特定的にターゲットされなければならない。さらにターゲットされた治療試薬の生理学的関連濃度における一貫したデリバリーは困難であることが証明されている。さらに、生存能力のある治療試薬の特定は困難であることが証明されている。
【０００７】
発明の要約
本発明は、１種又はそれ以上の所望でない代謝物の蓄積により特徴付けられる病理学的な状態の治療（例えば１種又はそれ以上の症状の改善）に対する新規なアプローチを提供する。さらに本発明は、代謝生成物を蓄積及び／又は分解するための細胞の能力をモジュレートする試薬についてスクリーンする効果的なシステムを提供する。
【０００８】
好ましい具体例において、本発明は、代謝生成物を分解及び／又は蓄積するための細胞の能力をモジュレートする試薬についてスクリーンするための、或いは細胞を選択的に殺すための、又は代謝生成物を蓄積及び／又は分解する能力の欠陥を有する細胞内で遺伝子若しくはｃＤＮＡを選択的に発現するための２−ハイブリッドシステムを利用する。あるそのような具体例おいて、本発明は、代謝生成物を蓄積又は分解するための細胞の能力をモジュレートする試薬についてのスクリーニングの方法を提供する。本方法は、ペプチド結合ドメイン及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸；代謝生成物又は代謝生成物に結合するリガンドに対して結合するペプチド結合領域に結合する核酸結合領域を含む第一キメラタンパク質；並びに、第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質、を含む哺乳動物細胞を提供することを含む。細胞は１種又はそれ以上の試験試薬と接触させ、そしてエフェクター遺伝子の発現の変化が検出される、ここで低濃度の試験試薬と接触し又は試験試薬とは接触しないコントロール細胞と比較して、試験細胞中のエフェクター遺伝子の発現の差異は、試験試薬が前記細胞の能力をモジュレートし代謝生成物を蓄積又は分解することを示す。
【０００９】
特に好適な具体例において、発現コントロールタンパク質は、トランスアクティベーター（例えばＶＰ１６）又はリプレッサーである。特に好ましい核酸結合タンパク質は、限定するものではないがＧＡＬ−４及びＧＡＬ−４−Ｙを含む。所定の具体例において、好ましいエフェクターは、限定するものではないがレポーター遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ（ｂ−ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、成長ホルモン（ＧＨ）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等）、細胞毒（例えばチミジンキナーゼ、シュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒、リシン及びアブリン等）及び／又はアポトーシス誘導（例えばＰ５３、Ｐ７３、Ｂａｘ、Ｂａｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）遺伝子等）を含む。種々の具体例において、リガンド及び代謝生成物はそれぞれ、限定するものではないが、ベータカテニン及びＴｃｆ、ＮＦ−κＢ及びＩ−κＢ、Ｐ５３及びＭＤＭ２、レセプター及びそのヘテロメリックレセプターパートナーを含む。
【００１０】
第一及び／又は第二キメラタンパク質は、（例えば誘導可能な（例えばエクジソンプロモーター）、細胞特異的な又は構成性プロモーターのコントロール下で）細胞中の核酸から発現され、或いは第一及び／又は第二キメラタンパク質は、例えばＨＩＶ　ＴＡＴドメインを含むタンパク質を使用することにより、細胞内に輸送されるタンパク質である。
【００１１】
本発明の方法を行うために好適な細胞は、限定するものではないが、ＳＷ４８０、ＳＷ４８、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、２９３、Ｕ−２０Ｓ、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｈｅｐ　Ｇ２、及び／又はＪａｒｋａｔ細胞を含む。
【００１２】
特に好適な１つの具体例において、核酸はＧＡＬ−４結合サイトを符号化し、エフェクター遺伝子はレポーター遺伝子であり、第一キメラタンパク質はＧＡＬ−４核酸結合タンパク質及びベータカテニン又はＴｃｆを含む；そして第二キメラタンパク質は、ＶＰ−１６及びベータカテニン又はＴｃｆを含む。好適なＴｃｆの１つはＴｃｆ４である。
【００１３】
所定の具体例において、細胞はさらに誘導性プロモーター（例えばｅｃｄｙｓｏｎプロモーター）に操作可能にリンクするリガンド又は代謝生成物を符号化する第二の核酸を含む。
【００１４】
他の具体例において、本発明は代謝生成物を蓄積又は分解する細胞においてエフェクター遺伝子を選択的に発現する方法を提供する。本方法は、ペプチド結合サイト及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸、核酸結合タンパク質が代謝生成物に対して又は前記代謝生成物結合するリガンドに対して結合するペプチド結合ドメインを結合させる核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質、代謝生成物に対して又は代謝生成物に結合するリガンドに対して、前記第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に第二キメラタンパク質がリガンドを含み、第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質であって、代謝生成物を含む該第二キメラタンパク質、を含む細胞を提供することを含む、それにより、代謝生成物又は代謝生成物を結合させるリガンドを分解する能力の不存在下で、細胞は前記エフェクター遺伝子の発現を活性化又は抑制する。好ましい発現コントロールタンパク質は、トランスアクティベーター（例えばＶＰ１６）又はリプレッサーである。好ましい核酸結合タンパク質、エフェクター遺伝子、リガンド及び代謝生成物は、限定するものではないが上述のものである。
【００１５】
第一及び／又は第二キメラタンパク質は、細胞中の核酸から（例えば誘導性（例えばエクジソンプロモーター）、組織特異的、又は構成性プロモーターのコントロール下で）発現され、或いは第一及び／又は第二キメラタンパク質は、例えばＨＩＶ　ＴＡＴドメインを含むタンパク質を使用することにより細胞中に輸送される。
【００１６】
本発明の方法を行うための好ましい細胞は、限定するものではないが、ＳＷ４８０、ＳＷ４８、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、２９３、Ｕ−２０Ｓ、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｈｅｐ　Ｇ２、及び／又はＪａｒｋａｔ細胞を含む。
【００１７】
好適な具体例の１つにおいて、核酸はＧＡＬ−４結合サイトを符号化し、エフェクター遺伝子はレポーター遺伝子であり、第一キメラタンパク質はＧＡＬ−４核酸結合タンパク質及びベータカテニン又はＴｃｆを含む；そして第二キメラタンパク質はＶＰ−１６及びベータカテニン又はＴｃｆを含む。好適なＴｃｆの１つはＴｃｆ４である。
【００１８】
本発明は、代謝生成物を蓄積する細胞（例えば所定の癌細胞）を選択的に殺す方法も提供する。本方法は、ペプチド結合サイト及び細胞毒若しくはアポトーシス誘導遺伝子であるエフェクターを符号化する核酸を用いて細胞をトランスフェクトし；核酸結合タンパク質が前記代謝生成物及び前記代謝生成物に結合するリガンドに結合するペプチド結合ドメインを結合させる核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質を細胞内に誘導し；そして前記代謝生成物又は前記代謝生成物に結合するトランスアクティベーター（例えばＶＰ１６）を含む第二キメラタンパク質を、第一キメラタンパク質が前記代謝生成物を含む場合には前記第二キメラタンパク質が前記リガンドを含み、第一キメラタンパク質が前記リガンドを含む場合には前記第二キメラタンパク質が前記代謝生成物を含むように細胞内に導入することを含む。好ましい核酸結合タンパク質は、限定するものではないがＧＡＬ−４及びＧＡＬ−４−Ｙである。好適な具体例の１つにおいて、エフェクターは細胞毒（例えばチミジンキナーゼ、シュードモナスエキソトキシン、ジフテリア毒、リシン及びアブリン等）である。所定の好適な具体例において、エフェクターはアポトーシス誘導遺伝子（例えばＰ５３、Ｐ７３；Ｂａｘ、Ｂａｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）（例えばＣａｓｐ３、Ｃａｓｐ９、Ａｐａｆｌ等）等）である。種々の具体例において、リガンド及び代謝生成物は、限定するものではないが、それぞれベータカテニン及びＴｃｆ、ＮＦ−κＢ及びＩ−κＢ、Ｐ５３及びＭＤＭ２、レセプター及びそのヘテロメリックレセプターパートナーを含む。
【００１９】
第一及び第二キメラタンパク質は、（誘導性（例えばエクジソンプロモーター）、組織特異的、又は構成性プロモーターのコントロール下で）発現され、或いは第一及び／又は第二キメラタンパク質は、例えばＨＩＶ　ＴＡＴドメインを含むタンパク質を使用することにより細胞中に輸送される。好ましい細胞は、限定するものではないが、ＳＷ４８０、ＳＷ４８、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、２９３、Ｕ−２０Ｓ、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｈｅｐ　Ｇ２、Ｊａｒｋａｔ細胞等を含む。具体例の１つにおいて、核酸はＧＡＬ−４結合サイトを符号化し、第一キメラタンパク質はＧＡＬ−４核酸結合タンパク質及びベータカテニン又はＴｃｆを含み、そして第二キメラタンパク質ＶＰ−１６及びベータカテニン又はＴｃｆ（例えばＴｃｆ４）を含む。
【００２０】
さらに他の具体例において、本発明は本発明の１種又はそれ以上の構成を含む脊椎細胞、好ましくは哺乳動物細胞を提供する。１つの具体例において、該細胞は、ペプチド結合サイト及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸、核酸結合タンパク質が代謝生成物又は代謝生成物に結合するリガンドに結合されるペプチド結合ドメインに結合する核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質；第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に前記第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質を含む細胞である。発現コントロールタンパク質、第一及び第二核酸、エフェクター遺伝子、核酸結合ドメインは上述のものを含むが、限定するものではない。
【００２１】
さらに別の具体例において、本発明は；Ｔｃｆ又はベータカテニンに結合する核酸結合ドメインを含むキメラタンパク質を符号化する核酸、及びベータカテニン又はＴｃｆに対して結合されるトランスアクティベーターを符号化する核酸、からなる群から選択される核酸を提供する。特に好ましい核酸は、Ｔｃｆ４に結合する核酸結合タンパク質を符号化する核酸、ベータカテニンに結合する核酸結合タンパク質を符号化する核酸、及びトランスアクティベーター（例えばＶＰ１６）に結合するベータカテニンを符号化する核酸を含む。好ましい核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり、所定の具体例においてベクターを含む。
【００２２】
さらに別の具体例において、本発明は代謝生成物を蓄積又は分解する細胞の能力をモジュレートする試薬についてスクリーニングするためのキットを提供する。好ましいキットは、タンパク質結合サイト及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸；前記代謝生成物及び代謝生成物に結合するリガンドに結合する前記ペプチド結合ドメインを結合させる核酸結合タンパク質を含む第一キメラタンパク質；第一キメラタンパク質が代謝生成物を含む場合に前記第二キメラタンパク質がリガンドを含みかつ第一キメラタンパク質がリガンドを含む場合に第二キメラタンパク質が代謝生成物を含むように、代謝生成物に若しくは代謝生成物に結合するリガンドに対して結合する発現コントロールタンパク質を含む第二キメラタンパク質、を含む哺乳動物細胞を含むコンテナを含む。
【００２３】
他の具体例において、該キットは本明細書中に記載されるように核酸を含むコンテナである。
【００２４】
細胞を選択的に殺すキットも提供する。このようなキットは、本明細書中に示されるような１種又はそれ以上の核酸及び／又は本明細書中に示されるような１種又は２種のキメラタンパク質からなる群より選択される２−ハイブリッドシステム成分を含むコンテナを含む。
【００２５】
定義
“キメラ分子” とは、１種又はそれ以上の共有結合を通じて典型的に結合するネイティブ状態において別々に見出される２種又はそれ以上の分子を含む分子である。この分子は直接的に又はリンカーを通して結合できる。分子が両方ともポリペプチドである場合は、ペプチド結合又は融合タンパク質を形成するペプチドリンカーを通じて結合できる。
【００２６】
“融合タンパク質” とは、あるポリペプチドのアミノ末端と他のポリペプチドのカルボキシル末端との間で形成されるペプチド結合を通じて２種又はそれ以上のポリペプチドを結合させることにより形成されるポリペプチドを意味する。融合タンパク質は、構成ポリペプチドの化学的なカップリングにより形成されることができ、或いはそれは単一接触（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）融合タンパク質を符号化する核酸シーケンスからの単一のポリペプチドとして発現され得る。一本鎖融合タンパク質は、単一接触ポリペプチドバックボーンを有する融合タンパク質である。
本明細書中において融合タンパク質に対して使用される“スペーサー” 又は“リンカー” は、融合タンパク質を含むタンパク質を結合させるペプチドを意味する。一般的には、スペーサーは、タンパク質を結合させ或いは数種の最小距離又はそれらの間の空間的な関係を維持するため以外には特異的な生物学的活性を有さない。しかし、スペーサーの構成アミノ酸は、分子のホールディング、ネットチャージ又は疎水性のような分子の数種の特性に影響を与えるように選択される。
【００２７】
本明細書中で化学的にコンジュゲートしたキメラ分子に関して使用される“スペーサー” 又は“リンカー” は、化学的にコンジュゲートしたキメラ分子の構成分子をリンク／結合させる任意の分子を意味する。
【００２８】
“代謝生成物” とは、代謝経路の中間又は最終生成物として形成される分子を意味する。この用語は、細胞内の異なる経路のメンバーにより続けて修飾される生成物をも含むことができる。本発明におけるキメラ分子のドメインとして使用される場合、代謝生成物は完全長／完全サイズの代謝生成物又は他の分子により十分に特異的に結合されるそれらのフラグメントであることができる。
【００２９】
“細胞を殺し又は抑制する” というフレーズは、細胞の死又は細胞の成長及び／又は増幅における減少を意味する。
【００３０】
核酸結合タンパク質及び核酸結合サイト又は２タンパク質若しくは他の結合対の相互作用に関して、“特異的に結合” という用語は、分子（例えばタンパク質又は他の生物製剤）の不均一な個体群の存在下で１種又はそれ以外の構成要素の結合対の存在に限定的である結合反応を意味する。それゆえ、例えばレセプター／リガンド結合対の場合、リガンドは特異的に及び／又は優先的に分子の複合混合物からそのレセプターを選択する、又はその逆である。酵素はその基体等と特異的に結合する。結合は限定するものではないが、イオン相互作用、共有相互作用、疎水相互作用、ファンデルワールス相互作用等を含む種々の機構のうち１種又はそれ以上を含むことができる。
【００３１】
用語“結合パートナー” 又は“結合対” のメンバー或いは“同属リガンド” とは、他の分子と特異的に結合し、抗体／抗原、レクチン／炭水化物、核酸／核酸、レセプター／レセプターリガンド（例えばＩＬ−４レセプター及びＩＬ−４）、アビジン／ビオチン等である。
【００３２】
用語リガンドは、他の分子に特異的に結合する分子を意味することに使用される。一般的に、リガンドはレセプタ−に対して結合する溶性分子（例えばホルモン又はサイトカイン）である。どの結合対のメンバーがリガンドであり及びどれが“レセプター” であるかの規定はより広い意味でのレセプターが使用される場合（例えば信号の変換の意味がない場合）には、しばしば多少任意である。これらの場合において、典型的には、結合対の２種のメンバーの小さい方がリガンドと呼ばれる。それゆえ、レクチン−糖相互作用において、糖はリガンドである（非常に大きな分子に結合したとしても、認識はサッカライドのものである）。
【００３３】
用語“２−ハイブリッドシステム” は２種のキメラ分子を含むシステムを意味し、そのうちの一方は核酸結合領域を産し、他方は発現コントロールエレメント（例えばトランスアクティベーション又はリプレッサードメイン）を産する。さらに該分子は、一方のキメラ分子が他方のキメラ分子に特異的に結合できるような同属の結合対であり得る。２−ハイブリッドシステムは、キメラ分子上のタンパク質結合ドメインにより特異的に結合し、それによりキメラ分子を核酸に対して固定することにより、タンパク質結合サイトを符号化する核酸を含む。キメラ分子のドメインは、第二キメラ分子上の同属結合パートナーに対して認識及び結合し、それにより核酸に対して分子を補い、それにより発現コントロールエレメントは潜在する核酸を含む遺伝子又はｃＤＮＡの発現を変化させる（例えば、活性化させる）。
【００３４】
“本発明の２−ハイブリッドシステムの１種又はそれ以上の成分” というフレーズは、２−ハイブリッドシステムを含むキメラ分子及び／又はそれらを符号化する核酸及び／又はタンパク質認識サイト及びエフェクターを含む核酸のいずれか又はいずれをも意味する。
【００３５】
“トランスフェクション” とは、ターゲット細胞が核酸を発現できるようにするように、発現可能な核酸をターゲット細胞へデリバリーすることを意味するために使用される。用語“核酸” は分子量に関係無くＤＮＡ及びＲＮＡの両方を意味し、用語“発現” とは細胞内の核酸の機能的な存在の任意の表現を含み、制限無く一時的な発現及び安定した発現の両方を含むものと理解される。
【００３６】
“デリバリー” とは、所望の化合物が、最終的にはターゲット細胞内或いはターゲット細胞膜内若しくは膜上に位置するように、ターゲット細胞へ輸送されるプロセスを表すために使用される。本発明の化合物の多くの使用において、所望の化合物はターゲット細胞により直ちには吸収されず、脂質集合体を経由するデリバリーは細胞内に所望の化合物を得る方法である。所定の使用において、特にインビボ条件下において、特定のターゲット細胞型へのデリバリーが好ましく、そして本発明の化合物により容易化され得る。
【００３７】
本明細書中において、用語“ポリペプチド” 、“ペプチド” 及び“タンパク質” は、本明細書中において、アミノ酸残渣のポリマーを意味するために交換可能に使用される。この用語は１種又はそれ以上のアミノ酸残渣が天然発生アミノ酸ポリマー同様に天然発生のアミノ酸に相当する人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに適用する。この用語は、ポリペプチドを形成するアミノ酸を連結させた従来のポリペプチド結合における変異体を含む。
【００３８】
用語“核酸” 又は“オリゴヌクレオチド” は、互いに共有結合した少なくとも２種のヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、好ましくは一本鎖又は二本鎖であり、そして通常はホスホジエステル結合を含むが、ある場合においては、概略として核酸類似体は別のバックボーンを有するものことができるもの、例えばホスホラミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）（Ｂｅａｕｃａｇｅ等（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９（１０）：１９２５）及びその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌ等（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉ等（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；及びＰａｕｗｅｌｓ等（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ　Ｓｃｒｉｐｔａ　２６：１４１９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇ等（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：１４３７；及び米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕ等（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ参照）並びにペプチド核酸バックボーン及び結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１９８５；Ｍｅｉｅｒ等（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎ等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　３８０：２０７参照）を含む。他の類似核酸ポジティブなバックボーンを有するもの（Ｄｅｎｐｃｙ等（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６０９７）、非イオン性バックボーンを有するもの（米国特許第５，３８６，０２３号、第５，６３７，６８４号、第５，６０２，２４０号、第５，２１６，１４１号及び第４，４６９，８６３号；Ａｎｇｅｗ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ　３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　１３：１５９７；Ｃｈａｐｔｅｒ２及び３，ＡＳＣ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ” ，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ　ａｎｄ　Ｐ．Ｄａｎ　Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ等（１９９４），Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍ。Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓ等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ＮＭＲ　３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））並びに米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号、及びＣｈａｐｔｅｒ６及び７，ＡＳＣ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ　ａｎｄ　Ｐ．Ｄａｎ　Ｃｏｏｋに記載されるものを含む非リボーゼバックボーンを有するものを含む。１種又はそれ以上の炭環式糖を含む核酸も、核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓ等（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐ１６９−１７６参照）。種々の核酸同属体は、Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ　Ｎｅｗｓ　Ｊｕｎｅ　２，１９９７　３５頁に記載される。リボース−ホスフェートバックボーンのこれらの修飾は、ラベルのような追加的な部位を追加することを容易化し又は生理学的な環境におけるこのような分子の安定性及び半減期を増加させる。
【００３９】
“組換え発現カセット” 又は単純に“発現カセット” は、組換え的又は合成的に発生された核酸構造であり、そのようなシーケンスと融和するホスト内における遺伝子又はｃＤＮＡの発現をもたらし得る核酸エレメントを有する。発現カセットは少なくともプロモーターを含み、及び随意に転写末端信号を含む。典型的には、組換え発現カセットは転写されるための核酸（例えば所望のポリペプチドを符号化する核酸）及びプロモーターを含む。発現を行うことにおいて必要かつ有用なさらなるファクターも本明細書中で使用できる。
【００４０】
用語“遺伝子” 及び“ｃＤＮＡ” は、典型的には本明細書中で交換可能に使用される。それゆえ、例えばレポーター遺伝子はゲノム核酸（例えばイントロン及びエクソンを含む）又はｃＤＮＡを含むことができる。所定の例において、用語ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡは交換可能には使用できない。これは用法の状況より定義される。
【００４１】
“アポトーシス誘導遺伝子” とはアポトーシスにおいて影響を与える遺伝子又はｃＤＮＡを意味する。好適なアポトーシス誘導遺伝子は、それらが活性化された場合にアポトーシスを誘導又は増加させる。限定するものではないがＰ５３、Ｐ７３、Ｂａｘ、Ｂａｄ，ＦＡＤＤ、カスパーゼ等を含む。
【００４２】
“選択的に殺す” 方法とは、特定の細胞型の死をより頻繁に及び／又は“ターゲット化” 細胞とは別の細胞型（例えば特定の分類態様を欠く細胞）の死よりも早く死を誘導する方法を意味する。
【００４３】
用語“トランスアクティベーター” とは、遺伝子又はｃＤＮＡの転写を誘導し及び／又は転写をアップレギュレートする分子を意味する。トランスアクティベータ−は完全に“ネイティブな” 分子であることができ、又は遺伝子又はｃＤＮＡの転写を誘発し及び／又はアップレギュレートできる分子のドメインであることができる。
【００４４】
“発現コントロールドメイン” 又は“発現コントロールタンパク質” は、典型的には遺伝子又はｃＤＮＡ発現を変化させるポリペプチドである。典型的な発現コントロールタンパク質は、（遺伝子又はｃＤＮＡの発現をアップレギュレートする）トランスアクティベータ−又は（遺伝子又はｃＤＮＡの発現をダウンレギュレートする）リプレッサーである。
【００４５】
“細胞毒” とは細胞を殺す試薬（例えばタンパク質）を意味する。
【００４６】
“アポトーシス遺伝子” とは、それらの発現がアポトーシス過程に含まれる遺伝子を意味する。このようなアポトーシス遺伝子は、限定するものではないが、Ｐ５３、Ｐ７３、Ｂａｘ、Ｂａｄ，ＦＡＤＤ、カスパーゼ遺伝子等を含む。
【００４７】
用語“試験試薬” は、所望の活性についてスクリーンされる任意の遺伝子を意味する。“試験組成物” とは、場合によっては好適なキャリア内の任意の分子又は分子の混合物であることができる。
【００４８】
用語“小有機分子” とは、典型的には医薬において通常使用される有機分子に匹敵するサイズの分子を意味する。この用語は、生物学的マクロ分子（例えばタンパク質、核酸等）を除外する。好ましい小有機分子は約５０００Ｄａまでの、より好ましくは約２０００Ｄａ、まで及び最も好ましくは約１０００Ｄａまでの範囲のサイズである。
【００４９】
“エフェクター分子” は、それらの発現が本発明の２−ハイブリッドシステムによりコントロールされる任意の分子である。好適なエフェクター分子は、限定するものではないが細胞毒、レポーター遺伝子、酵素、アポトーシス遺伝子等を含む。
【００５０】
“レポーター遺伝子” は容易にアッセイ可能な（検出可能及び／又は定量可能な）生成物を発現する遺伝子又はｃＤＮＡである。アッセイ可能な生成物の検出は、レポーター遺伝子の発現及び／又は発現のレベルを表す。レポーター遺伝子は当業者に公知である。それらは、限定するものではないが、バクテリアクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び他の蛍光タンパク質、種々のバクテリアルシフェラーゼ遺伝子、例えばＶｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ，Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ，及びＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、蛍ルシフェラーゼ遺伝子ＦＦｌｕｘ等により符号化されるルシフェラーゼ遺伝子を含む。
【００５１】
用語“モジュレート” は、代謝生成物を蓄積又は分解する細胞の能力に言及して使用される。
【００５２】
用語“ペプチド結合サイト” 又は“タンパク質結合サイト” とは、核酸結合タンパク質（例えばＤＮＡ結合タンパク質）により認識及び／又は結合される核酸シーケンスを意味する。
【００５３】
“核酸結合ドメイン” とは、核酸を認識し及び／又は核酸に結合するタンパク質又はタンパク質の領域を意味する。核酸結合タンパク質（例えばＤＮＡ結合タンパク質）は完全長の核酸結合タンパク質であることができ、又は核酸に結合するそれらのフラグメントであることができる。
【００５４】
用語“キット” とは、材料の集合、より好ましくは特定の機能を行うための（例えばスクリーニングアッセイを行う、タンパク質を発現する、細胞を培養する等）材料（好ましくは関連材料）のパッケージされた集合を意味する。該キットは、随意にキット内に存在する材料の使用を記載する指示材料を含む。
【００５５】
図面の簡単な説明
図１は、β−カテニン／Ｔｃｆ４哺乳動物２−ハイブリッドシステムを用いた遺伝子治療の概念を表す。細胞がＧＡＬ−４／ＷＴ−β−カテニン、ＶＰ−１６／ＦＬ−Ｔｃｆ４及びＧＡＬ−４応答エレメント−ドライブ化（ｅｌｅｍｅｎｔ−ｄｒｉｖｅｎ）自殺遺伝子を符号化するプラスミドを用いてトランスフェクトされる場合には、自殺遺伝子発現はＡＰＣ変異細胞内でのみ発生する。
【００５６】
図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃは、本発明の２−ハイブリッドシステムを表す。図２Ａは２−ハイブリッド成分の構造を示す。ｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニンプラスミドは、酵母ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメイン及び野生型−β−カテニンで構成されるキメラタンパク質を生成するためにデザインされる。ｐＢＩＮＤ／ＭＴ−β−カテニンプラスミドは、ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメイン及びＧＳＫ−３βリン酸化サイト（ａａ２９−ａａ４８）−削除βカテニンからなるキメラタンパク質を生成するためにデザインされる。ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４プラスミドは、単純性ヘルペスウイルスＶＰ１６転写活性化ドメイン及び完全長Ｔｃｆ４からなるキメラタンパク質を生成するためにデザインされる。ｐＡＣＴ／ＤＮ−Ｔｃｆ４プラスミドは、ＶＰ１６転写活性化ドメイン及びβカテニン結合サイト（ａａ２−ａａ５３）−削除Ｔｃｆ４からなるキメラタンパク質を生成するためにデザインされる。図２ＢはＧＡＬ４／β−カテニン及びＳＷ４８０細胞内のＶＰ１６／Ｔｃｆ４の発現を表す。細胞はｐＢＩＮＤ／β−カテニン又はｐＡＣＴ／Ｔｃｆ４プラスミドを用いてトランスフェクトされ、そして２４時間培養された。それから融合タンパク質の発現レベルがウエスタンブロットにより検出された。図２Ｃは２−ハイブリッドシステムの特異性を表す。ＳＷ４８０細胞はＧＡＬ４融合タンパク質、ＶＰ１６融合タンパク質及びｐＧ５／ｌｕｃプラスミドの種々の組合せを用いてトランスフェクトされ、そして２４時間培養された。各試料のルシフェラーゼ活性をルミノメーターにより測定した。
【００５７】
図３Ａ及び図３ＢはＡＰＣ依存性の選択的な発現及びＳＷ４８細胞における２−ハイブリッド成分タンパク質の検出を表す。図３ＡはＳＷ４８０細胞における２−ハイブリッド産出遺伝子のＡＰＣ依存性の選択的な発現を表す。ＳＷ４８０細胞は、ｐＢＩＮＤ／ＷＴ若しくはＭＴ−β−カテニンプラスミド、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４プラスミド及びｐＧ５／ｌｕｃプラスミドの存在下で、種々の濃度のｐｃＤＮＡ／ＡＰＣプラスミドを使用してトランスフェクトされた。２４時間の培養の後、細胞は溶解され、そしてルシフェラーゼ活性が測定された。図３ＢはＳＷ４８細胞における２−ハイブリッド成分タンパク質の検出を表す。ＳＷ４８０細胞は、ｐＢＩＮＤ／ＷＴ若しくはＭＴ−β−カテニンプラスミド、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４プラスミド及びｐＧ５／ｌｕｃプラスミドの存在下で、種々の濃度のｐｃＤＮＡ／ＡＰＣプラスミドを使用してトランスフェクトされた。２４時間の培養の後、細胞は溶解され、そしてルシフェラーゼ活性がウエスタンブロッティングにより検出された。
【００５８】
図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、細胞質β−カテニンの発現、Ｇａｌ４融合タンパク質分解生成物の検出、及びターゲット細胞のＡＰＣプロファイルに依存する選択的な遺伝子発現を表す。図４Ａは、細胞質β−カテニン及びヒト細胞株内のＡＰＣの発現レベルを表す。ＳＷ４８０細胞、ＳＷ４８細胞、Ｕ−２ＯＳ細胞及び２９３細胞（１．０×１０６ 細胞）はプロテアーゼリプレッサーを含むＴＥバッファーを用いて溶解された（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｍｉｎｉ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ製）、そして溶解可能なフラクションは遠心分離により集められた。各試料は４−２０％勾配アクリルアミドゲルへ充填され、そしてニトロセルロース膜へ移された。分離したタンパク質は抗−β−カテニン抗体又は抗−ＡＰＣ抗体を用いて検出された。図４Ｂは、Ｇａｌ４融合タンパク質分解生成物の検出を表す。ＳＷ４８０細胞及びＳＷ４８細胞は、ｐＢＩＮＤ／ＷＴ若しくはＭＴ−β−カテニンプラスミドを使用してトランスフェクトされ、そして２４時間培養された。細胞はＳＤＳページ試料バッファーを用いて溶解され、そして４−２０％勾配ポリアクリルアミドゲルへ充填された。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜へ移され、ＧＡＬ４タンパク質は抗−ＧＡＬ４抗体を用いて検出された。図４Ｃは細胞株のＡＰＣプロファイルに依存する２−ハイブリッドシステムの選択的な産出遺伝子発現を表す。ヒト細胞株は、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４プラスミド及びｐＧ５／ｌｕｃプラスミドの存在下で、種々の濃度のｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニンプラスミドを使用してトランスフェクトされた。各点におけるルシフェラーゼ活性は２４時間の培養後に測定された。
【００５９】
図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃはｐ５３応答ルシフェラーゼ発現の活性化及びｐ５３−ＥＧＦＰの検出を表す。図５Ａは、ｐ５３−ＥＧＦＰによるｐ５３応答ルシフェラーゼ発現の活性化を表す。ｐｃＤＮＡ／ｐ５３−ＥＧＦＰは、ｐＲＬ／ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下で、ｐ５３−Ｌｕｃ、ｐＡＰ−１−Ｌｕｃ又はｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を用いて、ＳＷ４８０細胞へトランスフェクトされ、そして２４時間培養される。細胞は採取されそしてルシフェラーゼ活性が測定された。図５Ｂは、ＳＷ４８０細胞におけるｐ５３−ＥＧＦＰの検出を表す。ＳＷ４８０細胞は、ｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニン、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４及びｐＧ５／ｐ５３−ＥＧＦＰを用いてコ−トランスフェクトされ、そして２４時間培養された。生成したｐ５３−ＥＧＦＰは抗−ｐ５３抗体を使用してウエスタンブロットにより検出された。図５Ｃは２−ハイブリッドシステムを使用する細胞殺傷実験の結果を表す。ＳＷ４８０細胞は、ｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニン、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４及びｐＧ５／ｐ５３−ＥＧＦＰを用いてトランスフェクトされ、そして４８−７２時間培養された。細胞はトリプシナイズされそしてＰＢＳで洗浄された。それから細胞は、１０μＭのヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ中に懸濁された、ＥＧＦＰポジティブ細胞の細胞死プロファイルは、フローシトメーターを使用して、ヨウ化プロピジウムのアップテークを測定することにより分析された。
【００６０】
詳細な説明
本発明は、１種又はそれ以上の代謝生成物の望ましくない蓄積により特徴付けられる病理学的な状態の治療（例えば１種又はそれ以上の症状の改善）に対する新規なアプローチを提供する。さらに、本発明は、細胞の能力をモジュレートする試薬をスクリーンし、代謝生成物（例えばβ−カテニン）を分解又は蓄積する効果的なシステムを提供する。
【００６１】
一般的には、本発明の方法は２−ハイブリッドシステムを、より好ましくは哺乳動物２−ハイブリッドシステム（例えばＰｒｏｍｅｇａ　Ｃｈｅｃｋ　Ｍａｔｅ（登録商標））を利用する。細胞は、２−ハイブリッドシステムを形成する構造を含むものが提供される。第一構造は、蓄積する代謝生成物、代謝経路において代謝生成物を生成若しくは分解する酵素、又は酵素に対するものの代謝生成物に結合するリガンドのいずれかに結合する核酸結合ドメインを有するものを含む第一キメラタンパク質を含む。第二構造は、代謝生成物の同属結合パートナー、リガンド又は第一構造の酵素成分に結合するトランスアクティベーティングドメインを含むキメラタンパク質を提供される。それゆえ、例えば第一構造が核酸結合ドメインに結合する代謝生成物を含む場合、第二構造はトランスアクティベーティングドメインに結合する代謝生成物に結合するリガンドを含む。細胞内の第三構造は、第一構造及びエフェクターを符号化する遺伝子／ｃＤＮＡの核酸結合ドメインにより結合されることができる核酸シーケンスを含むことができる核酸である。エフェクターは、この２−ハイブリッドシステムにより転写及び／又は翻訳が制限される任意の核酸又はタンパク質である。それゆえ、例えば所定の好ましい具体例の場合、エフェクターはレポーター又は細胞毒である。
【００６２】
代謝生成物を分解する能力を減少して有する又は有さない細胞において、代謝生成物を産する構造は、その生成物の同属の結合パートナーを産する構造に特異的に結合する。２−タンパク質複合物は、核酸結合ドメインを産する成分により核酸に対して固定され、結合するトランスアクティベータードメインはエフェクター遺伝子の発現をアップレギュレートする（ある具体例においてはダウンレギュレートする）。細胞が代謝生成物を分解できる場合は、その生成物を産する構造は全て又は部分的に分解される。２種の構造物間で形成される複合物は無く、エフェクター遺伝子の転写及び／又は翻訳は影響をされない（例えば信号が存在しない）。
【００６３】
このシステムの１つの特徴的な具体例が図１に表されており、これは家族性腺腫ポリポシス患者にて本来発見される（及び結腸癌を含む種々の散発性癌においても発見される）家族性腺腫ポリポシス菌（ＡＰＣ）遺伝子生成物の機能的損失に適する。腫瘍抑制ＡＰＣ遺伝子生成物は、Ｗｎｔ信号経路のメンバーである。この経路は、胚形成中の細胞の運命を示すことにおいて、重要かつ進化的に保護される役割を果たすものと信じられる。
【００６４】
Ｗｎｔ信号は細胞内のタンパク質β−カテニンの存在又は不存在により制限される。ＡＰＣ又はＡｘｉｎファミリーのタンパク質を含む大きなマルチタンパク質機構は、ホスフェート基をβ−カテニンへグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ３β）により加えることを容易化する。リン酸化β−カテニンはβＴｒＣＰと呼ばれるタンパク質と結合し、そしてそれからユビキチンと呼ばれる小さなタンパク質の共有結合添加により修飾される。ユビキチンを付けたタンパク質は、通常、プロテオソームにより分解される。
【００６５】
変異したＡＰＣは、ＡＰＣ／Ａｘｉｎ複合物を形成できない。この場合、β−カテニンはリン酸化されず及び最終的に分解されない。それゆえ、β−カテニンは細胞内へ蓄積する。過剰なβ−カテニンが蓄積し、そしてパートナー、例えばＴＣＦ／ＬＥＦファミリーのＤＮＡ結合タンパク質を見つけた場合は核に入る。さらにそれらは、新しい遺伝子発現プログラム、例えばサイクリンＤ１のような発癌ターゲット遺伝子を発現させる。この条件は多数の癌細胞中（例えば全ての結腸癌の８０〜８５％において）で観察される。
【００６６】
ある具体例において、本発明の方法は、欠陥ＡＰＣを有する細胞を選択的に殺しかつβ−カテニン分解へ誘導するＷｎｔ経路のモジュレータ−についてスクリーンすることに使用される。特定の例を図１に示す、これは核酸結合ドメインを含む第一キメラ分子を表し、この場合Ｇａｌ４はβ−カテニンへ結合する。第二キメラ分子はトランスアクティベーター（ＶＰ１６）に結合するＴ−細胞因子（例えばＴｃｆ−４）を含む。第三構造はＧａｌ４結合ドメイン及びエフェクター（例えばチミジンキナーゼ）遺伝子を符号化する核酸である。
【００６７】
欠陥ＡＰＣを有する細胞はβ−カテニン、この場合はＧａｌ４−β−カテニン構造を蓄積する。Ｇａｌ４−β−カテニン構造は、核酸上のＧａｌ４結合サイトへ結合する。Ｔｃｆ４−ＶＰ１６キメラ分子はβ−カテニン／Ｔｃｆ４相互作用を介してβ−カテニンに結合し、それにより核酸に対してＶＰ１６トランスアクティベーターを並列させ、それからエフェクター遺伝子の転写を誘導する。エフェクター遺伝子が細胞毒である場合は、欠陥ＡＰＣを有する細胞は殺される。エフェクターがレポーターの場合は、生じた信号が欠陥ＡＰＣを含む細胞を同定する。細胞が試験試薬と接触し及びエフェクターがレポーターである場合は、信号における変化は、試験試薬が特にβ−カテニンの蓄積に関してＷｎｔ経路の活性をモジュレートすることを示す。
【００６８】
通常のＡＰＣを有する細胞はβ−カテニン（この場合はＧＡｌ４−β−カテニン）キメラ分子を分解する。Ｔｃｆ４−ＶＰ１６キメラ分子は、それから核酸に対しては向けられず、そしてエフェクター遺伝子の発現（又は非発現（ｎｏｎ− ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））における代替は無い。それゆえ、エフェクター遺伝子が細胞毒である場合、通常のＡＰＣを有し及びそれゆえβ−カテニンを分解できる細胞は、細胞毒を発現せずそして殺されない。細胞毒エフェクターを用いたこのシステムの使用は、それゆえ欠陥ＡＰＣを有する細胞を特異的に除去する。
【００６９】
Ｉ．本発明の方法の使用
上記システム又はそれらの変形は、代謝生成物を蓄積又は分解するための細胞の能力をモジュレートする（増加又は減少させる）試薬（例えば医薬又はリード化合物）についてスクリーンする広範囲の状況にて使用できる。他の具体例において、本明細書中に記載される方法は、代謝生成物を異常に蓄積又は分解する細胞を選択的に殺し又は抑制し、そしてそれにより代謝生成物の異常な蓄積又は分解により特徴付けられる病理学的な状態の症状を静める。
【００７０】
Ａ）　代謝生成物を蓄積又は分解するための細胞の能力のモジュレーターについてのスクリーニング
上述のように、本発明の方法は、代謝生成物を蓄積又は分解するための細胞の能力をモジュレートする試薬についてスクリーニングすることに、良好に適合する。好適な具体例において、このようなアッセイは、上述のように２種のキメラタンパク質（結合ドメイン／代謝物、リガンド−トランスアクティベーター）及びエフェクターを含む核酸を含有する細胞を提供することを含む。ある具体例において、エフェクターは、レポーター遺伝子又は検出可能であるが致死生成物を符号化する他の遺伝子を符号化することが好ましい。この例において、遺伝子発現が検出される。他の具体例において、遺伝子は致死遺伝子生成物（例えばＰ５３又は細胞毒）を符号化し、アッセイは生存遺伝子の数を測定することを含む。
【００７１】
それから細胞は関心ある試薬と接触され、そしてレポーター遺伝子の活性が検出される。レポーター遺伝子が、同じ構造を有する同じ型の細胞中に示されるレベルと異なる発現レベル及び／又は活性レベルを示すが、異なる濃度の試験試薬と接触する場合（又は試験試薬が無い場合）、試験試薬は代謝生成物の蓄積又は分解を導く変更された代謝経路を有するものと推定される。
【００７２】
試験試薬の効果は、例えば代謝生成物又は酵素或いは通常代謝生成物に結合する他のリガンドの結合又は分解により直接的であることができる、或いはその効果は、例えば関心ある代謝生成物を蓄積又は分解するための細胞の能力を最終的に変える経路の異なる成分を結合させ、分解し又は変化させることによって間接的であることができる。それゆえ、例えば上記ＡＰＣシステムの場合において、試験試薬は、ＡＰＣ、アキシン又はＴｃｆと結合させ又は接触させることにより、直接的にβ−カテニンの細胞蓄積を変化させ得る。そのかわりに、試験試薬は、例えば結合又はＧＳＫ３βの活性を変化させることによりβ− カテニンのリン酸化を変化させることによって、直接的に作用する。これは、もちろん可能な試験試薬又は存在もする他の多数の可能性による間接的な作用についての例証的な機構の１つである。この例において、試験試薬の作用の機構にかかわらず、β−カテニンのそれが蓄積又は分解を変化させる限りは、その活性はこの発明のアッセイにおいて検出される。
【００７３】
１）アッセイのスコアリング
本発明のアッセイは、当業者に公知の標準的な方法に従って評価される。典型的には、レポーター遺伝子の発現レベルは標準的な方法に従ってアッセイされる。レポーター遺伝子は、容易にアッセイ可能な（検出可能及び／又は定量可能な）生成物を発現する遺伝子又はｃＤＮＡである。アッセイ可能な生成物の検出は、レポーター遺伝子の発現及び／又は発現レベルを示す。レポーター遺伝子は当業者に公知である。それらは、限定するものではないが、バクテリアクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び他の蛍光タンパク質、種々のバクテリアルシフェラーゼ遺伝子、例えばＶｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ，Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ，及びＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、蛍ルシフェラーゼ遺伝子ＦＦｌｕｘ等を含む。レポーター遺伝子は、第二キメラ分子を含む転写因子（例えばＶＰ−１６）により活性化又は抑制されるプロモーターのコントロール下で単独の遺伝子であることができ、或いは対象プロモーター（例えばＰ５３−ｅＧＦＰ）のコントロール下でも１種又はそれ以上の他の遺伝子が存在し得る。
【００７４】
本発明のアッセイは、レポーター遺伝子の使用に限定されるものではない。一般的に、任意の遺伝子又はｃＤＮＡの転写、翻訳又は活性は、日常的に検出される。それゆえ、例えば転写されたｍＲＮＡは、限定するものではないが、ノーザンブロット、増幅技術（例えばＰＣＲ）等を含む。同様に、翻訳されたタンパク質生成物はタンパク質の特徴的な活性を検出することにより又はタンパク質生成物自体を（例えば、ウエスタンブロット、キャピラリ−電気泳動等を介して）検出することにより検出され得る。
【００７５】
上述のように、好ましい具体例においては“レポーター” 遺伝子又はｃＤＮＡの発現は、１種又はそれ以上のコントロールに関して評価される。典型的な具体例は、試験試薬を低濃度で含む又は試験試薬が存在しないネガティブコントロールを利用する。試験試薬が低い濃度で存在するか又は存在しない場合のレポーター遺伝子の発現と比較したターゲット試薬の存在下での“レポーター” 遺伝子の発現は、試験試薬がアッセイされる代謝経路における活性を有することを示す。
【００７６】
他の具体例は、特定の濃度の試験試薬又はより好ましくは参照試薬を投与された細胞を含むポジティブコントロールを利用できる。試験試薬の効果は、それから試験試薬又は参照試薬の特定濃度と比較して測定される。
【００７７】
さらに他のコントロールを利用し、試験試薬の活性の特性についてアッセイできる。それゆえ、例えば試験試薬は　関心ある代謝経路における特定の活性を通じてよりも、細胞の完全な一般化された活性を作用させることができる。好ましい具体例において、試験試薬の一般化された活性と関心ある代謝経路における特定の活性とを区別することが望ましい。所定の具体例において、これは誘導可能なプロモーターのコントロール下でキメラタンパク質の一方又は両方を発現することにより達成される。それゆえ、例えばＧａｌ４−β−カテニンキメラは誘導可能なプロモーター（例えばエクジソン誘導可能システム又はテトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）誘導可能システム）のコントロール下であることができる。試験試薬が誘導されたＧａｌ４−β−カテニンの不存在下においても効果を有する場合、或いはＧａｌ４−β−カテニンの誘導のレベルを変化させることが試験試薬の効果を変えない場合、試験試薬は非特異的機構を通じて作用するものと推測される。逆に、Ｇａｌ４−β−カテニンの発現レベルを変化させることが試験試薬の明確な活性を変化させる場合は、試験試薬は関心ある経路において特異的に作用するものと仮定される（この例においては、Ｗｎｔ信号経路）。
【００７８】
本発明のアッセイは、存在する試験試薬及び（通常はネガティブ）コントロールを用いて示される活性間に差異がある場合、好ましくはその差異が統計的に大きい場合（例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の信頼レベル）、典型的にはポジティブとしてスコアされる。最も好ましい“ポジティブ” アッセイは、ネガティブコントロールから少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、及び最も好ましくは少なくとも４倍又は又はまさに１０倍の差異を表す。
【００７９】
２）　スクリーニング用試薬：組合せライブラリー（例えば小有機分子）
実際に、任意の試薬が本発明の方法に従ってスクリーンされ得る。このような試薬は、限定するものではないが、核酸、タンパク質、糖、多糖類、糖タンパク、脂質及び小有機分子を含む。用語“小有機分子” は、典型的には医薬において通常使用される有機分子に匹敵するサイズの分子を意味する。この用語は、生物学的マクロ分子（例えばタンパク質、核酸等）を除外する。好ましい小有機分子は約５０００Ｄａまで、より好ましくは約２０００Ｄａ、及び最も好ましくは約１０００Ｄａまでのサイズの範囲である。
【００８０】
慣用的には、有用な特性を有する新規な化学物質は、数種の所望の特性又は活性を有する化学化合物（リード化合物と呼ばれる）を同定し、リード化合物の変異体を生成させ、そしてそれらの変異体化合物の特性及び活性を評価することにより発生される。しかし、最近の傾向は、医薬発見の全ての面についての時間スケールを短くすることである。早くかつ効率的にたくさんの数を試験する能力のために、高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）方法が慣用のリード化合物同定方法に取って代わっている。
【００８１】
ある好適な具体例において、高処理量スクリーニング方法は多数の潜在的な治療上の化合物（候補化合物）ライブラリーを提供することを含む。このような“組合せ化学物質ライブラリー” は、それから１種又はそれ以上のアッセイにおいてスクリーンされ、本明細書中に記載されるように、所望の特徴的な活性を示すこれらのライブラリーメンバーを同定する（特に化学種又はサブクラス）。そのようにして同定される該化合物は、慣用の“リード化合物” として働き、又は潜在的な若しくは現実の治療として、それ自体が使用される。
【００８２】
組合せの化学物質ライブラリーは、試薬のような化学的な“ビルディングブロック” を多数組み合わせることによる化学合成又は生物学的合成のいずれかにより発生する多様な化学化合物の集合である。例えば、ポリペプチド（例えばムテイン）ライブラリーのような線状組合せ化学物質ライブラリーは、アミノ酸と呼ばれる化学的なビルディングブロックのセットを、与えられた化合物の長さ（すなわちポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について全ての可能な方法において組み合わせることにより形成される。１００万種の化学化合物が、化学的なビルディングブロックのこのような組合せの混合を通じて合成され得る。例えば、あるコメンテーターは、合成の１００種の交換可能なビルディングブロックの組合せ混合は、１億種の四量体化合物又は１００億種の五量体化合物の理論合成物が生じる（Ｇａｌｌｏｐ等（１９９４）３７（９）：１２３３−１２５０）と述べた。
【００８３】
組合せ化学ライブラリーの調製は、当業者に公知である。このような組合せ化学ライブラリーは、限定するものではないがペプチドライブラリーを含む（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−４９３、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８参照）。ペプチド合成は本発明とともに使用することについてのみ想定及び意図するものではない。多様な化学ライブラリーを発生させる他の化学物質も使用できる。このような化学物質は、限定するものではないが：ペプチド（ＰＣＴ公報ＷＯ９１／１９７３５、１９９１年１２月２６日）、符号化ペプチド（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／２０２４２、１９９３年１０月１４日）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０００９１、１９９２年１月９日）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドのような変異体（Ｈｏｂｂｓ等（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６９０９−６９１３）、ビニル性（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ等（１９９２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８）、ベータ−Ｄ−グルコース骨格を有する非ペプチド擬似ペプチド（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ等（１９９２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８）、類似の小化合物ライブラリーの有機合成物（Ｃｈｅｎ等（１９９４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ等（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３０３）、及び／又はペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８）、を含む。（一般的には、Ｇｏｒｄｏｎ等（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５、核酸ライブラリー（例えばＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｃｏｒｐ．参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第５，５３９，０８３号参照）、抗体ライブラリー（例えばＶａｕｇｈｎ等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４参照）、及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、炭水化物ライブラリー（例えばＬｉａｎｇ等（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２及び米国特許第５．５９３．８５３参照）及び小有機分子ライブラリー（例えばベンゾジアゼピン，Ｂａｕｍ（１９９３）Ｃ＆ＥＮ，１月１８日３３頁、イソプレノイド，米国特許５，５６９，５８８号、チアゾリジノン及びメタチアザノン，米国特許５，５４９，９７４号、ピロリジン，米国特許５，５２５，７３５号及び５，５１９，１３４号、モルホリノ化合物，米国特許第５，５０６，３３７号、ベンゾジアゼピン５，２８８，５１４等参照）。
【００８４】
組合せライブラリーの製造装置は市販入手できる（例えば３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ　ＫＹ，Ｓｙｍｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ，４３３Ａ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，９０５０Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ参照）。
【００８５】
多数の公知のロボットシステムも解決段階化学について発達してきた。これらのシステムは、限定するものではないが、Ｔａｋｅｄａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＬＴＤ．（大阪，日本）により発達した自動化合成装置のような自動化ワークステーション及び化学者により行われる手動合成操作を真似たロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ　ＩＩ、Ｚｙｍａｒｋ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．；Ｏｒｃａ，Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）及びＶｅｎｔｕｒｅ（登録商標）プラットフォーム、開始から終了まで５７６〜９６００の同時反応を行うことができる超高処理量シンセサイザー（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｔｅｃｈ，　Ｉｎｃ．，　Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，　ＫＹ　参照）を含む。上記装置のうち任意のものが本発明に使用するに好適である。（もしあれば）本明細書中に議論されるように操作できるように、これらの装置に対する性質及び改変の実施は、当業者に明らかである。さらに、多くの組合せライブラリー自体が市販入手できる（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ， 　Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＣｈｅｍＳｔａｒ，　Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，ＲＵ，３Ｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，Ｍａｒｔｅｋ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ等参照）。
【００８６】
３）　高処理量スクリーニング
本明細書中に記載された代謝生成物の蓄積又は分解をモジュレートする化合物について任意のアッセイが、高処理量スクリーニングに従う。好ましいアッセイは、試験化合物の存在に応答して、レポーター遺伝子の転写及び／又は翻訳における増加又は減少を検出する。
【００８７】
本発明の方法に利用される細胞は、１度に単一の試験試薬と接触する必要はない。逆に、高処理量スクリーニングを容易化するために、１つの細胞は少なくとも２種、好ましくはおよそ５種まで、より好ましくはおよそ１０種まで、最も好ましくはおよそ２０種までの試験化合物と接触できる。細胞がポジティブである場合は、活性を有する試薬が同定されるまで試験試薬のサブセットを用いて続けて試験される。
【００８８】
種々のレポーター遺伝子生成物用の高処理量アッセイは、当業者に公知である。例えばマルチウェル蛍光光度計は（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒより）市販入手できる。
【００８９】
さらに、高処理量スクリーニングシステムは市販入手できる（例えばＺｙｍａｒｋ　Ｃｏｒｐ．，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；Ａｉｒ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ；Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ；Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ等参照）。これらのシステムは、全試料及び試薬のピペッティング、液体分配、定期的なインキュベーション、及びアッセイに適する検出器の最終読み取りを含む全ての手順を、典型的に自動化する。これらの適用可能なシステムは、高度の柔軟性及びカスタマイゼーションはもちろん、高処理量及び迅速なスタートアップを提供する。このようなシステムの製造は、詳細なプロトコルの種々の高処理量を提供する。それゆえ、例えばＺｙｍａｒｋ　Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合等のモジュレーションを検出するスクリーニングシステムを記載する技術報告を提供する。
【００９０】
Ｂ）　代謝経路において異常性を示す細胞の選択的な殺傷又は抑制
本発明の方法は代謝経路において異常性を示す細胞を殺傷又は抑制することにも使用できる。これはエフェクターとして細胞毒遺伝子又はｃＤＮＡを使用することにより簡単に達成される。問題の代謝生成物を分解できる細胞は（例えばβ−カテニン）、キメラ分子を生成する代謝生成物も分解し、そしてエフェクター遺伝子はトランスアクティベートされない。逆に、代謝生成物を分解できない細胞は、細胞毒エフェクターをトランスアクティベートし、それにより細胞を殺傷又は抑制する２−ハイブリッドシステムを機能させる。それゆえ本方法は、関心ある代謝経路における異常性を示す細胞について高度に選択的である。
【００９１】
このアプローチは従来の“蓄積の疾患” の治療において有用であるばかりでなく、代謝生成物の蓄積により特徴付けられる種々の癌の治療においても有用である。
【００９２】
本明細書中で使用されるように、細胞毒遺伝子又はｃＤＮＡとは、発現された場合に細胞死を生じ、又は細胞を他の試薬による殺傷に対して感受性にする遺伝子又はｃＤＮＡを意味する。それゆえ、例えばヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の発現は、細胞を、ｔｋを生成する任意の細胞の選択的な殺傷を引き起こす医薬ガンシクロビルに対し感受性にする。
【００９３】
好適な細胞毒遺伝子は、限定するものではないが、シュードモナスエクソトキシン、ジフテリア毒、リシン及びアブリン、チミジンキナーゼ、アポトーシス遺伝子、及びアポトーシス関連経路にて含まれる遺伝子（例えばＰ５３、Ｐ７３、Ｂａｘ、Ｂａｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ等）を含む。所定の具体例において、遺伝子はＢｃｌ２又はＭＤＭ２等のような抗アポトーシス遺伝子である。
【００９４】
本明細書中の例１において、本方法は、欠陥ＡＰＣを有する細胞の選択的な殺傷について例証される。Ｇａｌ４−β−カテニン及びＴｃｆ−ＶＰ１６キメラ分子を含む２−ハイブリッドシステムは、Ｐ５３又はｔｋ遺伝子を含むエフェクターをトランスアクティベートするために使用される。例中に表されるように、本方法は、ＡＰＣ−欠陥細胞の高度に特異的な殺傷を提供する。
【００９５】
本方法はインビトロでの使用に限定されない。逆に、欠陥細胞の高度に効果的な殺傷を提供する場合、キメラ分子又はキメラ分子を含む核酸はインビボで（例えば本明細書中に記載されるような遺伝子治療デリバリー方法を用いて）細胞へ運ばれる。それゆえ本方法は、多数の癌及び蓄積の他の疾患を治療する方法を提供する。
【００９６】
Ｃ）　代謝欠陥についての選択的な補充
対象細胞を殺す代わりに、本発明の方法は１種又はそれ以上の代謝欠陥について選択的に補うことにも使用できる。この場合において、エフェクターは、細胞が欠乏するタンパク質（例えば酵素）を符号化する遺伝子又はｃＤＮＡである。所望の活性について欠乏する細胞内に２−ハイブリッドシステムが導入される場合、２−ハイブリッドシステムはエフェクターを変換し、それにより所望の代謝活性を開始させる（例えば特定の代謝生成物を分解する）。
【００９７】
Ｄ）　本発明の方法を使用する介在に適する例証的な病状
本発明の方法は、代謝生成物の蓄積により特徴付けられる必須の任意の条件における活性を有する試薬についてのアッセイに使用できる。同様に、本方法は分解欠陥を示す細胞を選択的に殺すことに使用できる。それゆえ、本発明の方法は蓄積疾患の治療又は蓄積疾患の治療においても有用な試薬のスクリーニングにおいて有用である。
【００９８】
蓄積疾患（貯蔵疾患）は当業者に公知であり、そして限定するものではないが、グリコーゲン貯蔵疾患Ｉ、ＧＭ１ガングリオシドーズ、ＭＰＳ　ＩＶ　Ｂ（Ｍｏｒｑｕｉｏ　Ｂ）、ＧＭ２ガングリオシドーズ（Ｏ、Ｂ、ＡＢ、Ｂ１変異体）、ニーマンピック病（Ａ、Ｂ及びＣ）、異染性脳白質変性症（アリールサルファターゼ　Ａ及びＳＡＰ−１欠乏）、クラッベ（Ｋｒａｂｂｅ）病、ファブリィ（Ｆａｂｒｙ）病、ゴーシェ（Ｇａｕｃｈｅｒ）病、ファーバー（Ｆａｒｂｅｒ）病、ウォルマン（Ｗｏｌｍａｎ）病（コレステロールエステル蓄積症）、ＭＰＳ　Ｉ（Ｈｕｒｌｅｒ及びＳｃｈｅｉｅ症候群）、ＭＰＳ　ＩＩ（Ｈｕｒｌｅｒ症候群）、ＭＰＳ　ＩＩＩ　Ａ、Ｃ及びＤ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ　Ａ、Ｃ及びＤ）、ＰＳ　ＩＩＩ　Ｂ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ　Ｂ）、ＭＰＳ　ＩＶ　Ａ（Ｍｏｒｑｕｉｏ　Ａ）、ＭＰＳ　ＶＩ（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−Ｌａｍｙ症候群）、ＭＰＳ　ＶＩＩ（ベータ−グルクロニダーゼ欠乏）、多発性スルファターゼ欠乏（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｕｌｆａｔａｓｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、ミュークリピドーシス（Ｍｕｃｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）Ｉ（Ｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ）、ミュークリピドーシス（Ｍｕｃｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）ＩＩ＆ＩＩＩ、アルファ−マンノーシドーシス、ベータ−マンノーシドーシス、フコーシドーシス、シアル酸貯蔵疾患、ガラクトシアリドーシス、及びアスパルチルグルコサミン尿症シスチノーシスを含む。
【００９９】
このような蓄積疾患の原因は、比較的よく理解されている。それゆえ、疾患に関連する２−ハイブリッドシステムにおいて使用される代謝生成物及びリガンドの同定は、比較的簡単である。例えばグルコセレブロシダーゼについてのゴーシェ病欠陥遺伝子は、マクロファージ内にグルコシルセラミドの蓄積を生じる。グルコシルセラミド又は細胞毒であるエフェクターを用いた同経路の他の成分を用いる本発明の２−ハイブリッドシステムの使用は、ゴーシェ表現型を示す細胞を選択的に殺すが、グルコセレブロシダーゼであるエフェクターの使用は、このような活性の必要性においてこれらの細胞中の失われた活性に取って代わる。同様に、クラッベ病はガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）酵素活性の欠乏により生じる致死ｄｅｍｅｌｉｎａｔｉｎｇ条件である。これはセレブロシド（ｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄｅ）及びプシコシン（ｐｓｙｃｏｓｉｎｅ）の蓄積を導く。本発明の２−ハイブリッドシステム中の代謝生成物又はガラクトシルセラミダーゼのいずれかのエフェクターとしての使用は、そのような活性の必要性について細胞内の所望の代謝生成物を選択的に置きかえるシステムを提供する。
【０１００】
本発明の方法は、多くの癌の治療において又は多くの癌の治療において有用である治療試薬についてスクリーニングするためにも有用である。例えば、欠陥あるＡＰＣは多数の癌（全ての結腸癌の８０−８５％）において観察される。さらに、Ｗｎｔ−１のウイルス活性化は、乳腺腫瘍を引き起こし、多種の癌において見出される破壊に対してβ−カテニンを耐性にする（例えばＰｏｌａｋｉｓ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅ．Ｄｅｖ．，９：１５参照）。
【０１０１】
ＩＩ　本発明の方法の成分
Ａ）　第一及び第二キメラ分子
本発明の方法は、核酸結合ドメインを有する第一キメラ分子及び調整ドメイン（例えばトランスアクティベーター又はリプレッサー）を有する第二キメラ分子を含む哺乳動物２−ハイブリッドシステムを利用する。第一キメラ分子は、好ましくは関心ある代謝生成物（例えばβ−カテニン）であるドメインを含むが、第二キメラ分子は、第一キメラ分子を含む代謝生成物ドメインを結合させるリガンド、酵素等であるドメインを含む。リガンド及び代謝生成物は交換可能である。すなわち、第一キメラ分子がリガンドを有しかつ第二キメラ分子が代謝生成物を有してもよい。
【０１０２】
例１に表されるＡＰＣシステムにおいて、第一キメラ分子はＧａｌ４ドメイン及びβ−カテニンドメインを含み、第二キメラ分子はＴｃｆ４ドメイン及びＶＰ１６ドメインを含む。該成分は逆でもよく第一キメラ分子はＧａｌ４ドメイン及びＴｃｆ４を含み、第二キメラ分子がβ−カテニン及びＶＰ１６を含んでもよい。さらに、リガンドはＴｃｆ４である必要はない。必然的に、β−カテニンに結合するＷｎｔ経路における任意の分子が好適である。それゆえ、例えばＴｃｆはＴｃｆ１、Ｔｃｆ３、Ｌｅｆ１又はＴｃｆファミリーの他のメンバーに置き換えられることができる。Ｗｎｔ信号経路において含まれる他の分子は、限定するものではないがアキシン、乱雑な、ＧＳＫ３β、β−ＴｒＣＰ、カゼインキナーゼ１ε及びＩＩ、タンパク質ホスファターゼ２Ａ、並びにＦＲＡＴ（発展したＴ細胞ｌｙｐｈｏｍａｓ中で頻繁に再配列される）。
【０１０３】
それゆえ、本発明の２−ハイブリッドシステムは：１）代謝生成物（又はそれらのフラグメント）、２）代謝生成物又はそれらのフラグメントに結合するリガンド、３）調整（発現コントロール）ドメイン、４）核酸結合ドメイン、を含む。核酸結合ドメイン及び調整ドメインは異なるキメラ細胞上にある。
【０１０４】
１）　代謝生成物
本発明の方法の２−ハイブリッドシステムにおける使用のための代謝生成物（又はそれらのフラグメント）の選択は、関心ある特定の代謝経路又は病状の機能である。例１において表されるように、Ｗｎｔ信号経路について有用な代謝生成物は、β−カテニンである。
【０１０５】
マクロファージ内にグルコシルセラミダーゼの蓄積を生じるグルコセレブロシダーゼの不活性化により特徴付けられるゴーシェ病の場合、グルコシルセラミダーゼ又はグルコセレブロシダーゼは、本発明の方法の使用のための効果的なターゲット（代謝生成物又は酵素）を提供する。同様に、クラッベ病、致死ミエリン除去コンディションは、セレブロシド及びｐｓｙｃｈｏｓｉｎｅの蓄積を導くガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）酵素活性の欠乏により発生する。さらに、蓄積された代謝生成物及び／又は欠乏酵素及び／又は同代謝経路の他の分子は、本発明の方法の使用のために良好なターゲットを提供する。
【０１０６】
本明細書で使用される教示を使用すると、当業者は本発明の方法によるアッセイ及び治療のための２−ハイブリッドシステムにおける使用のために他の代謝生成物を直ちに決定することができる。
【０１０７】
２）　代謝生成物に結合するリガンド
代謝生成物に結合するリガンドは、代謝生成物を生成又は分解する代謝生成物経路中で見出される天然発生分子であることができる。その代わり、関心ある代謝生成物を結合させることに使用されるリガンドは、代謝生成物を正常に生成又は分解する経路において見出されるリガンドである必要はない。代謝生成物を結合させる任意のリガンド、より好ましくは代謝生成物を特異的に結合させるリガンドが適している。それゆえ、例えば例１に表されるシステムは、ＴＣＦ／ＬＥＦファミリーのメンバーを利用する。ＴＣＦファミリーメンバーはβ−カテニンに結合することが公知であるが、β−カテニンを生成又は分解する経路において、関連するものと信じられている。
【０１０８】
リガンドは、自然発生分子である必要はない。それゆえ、例えばリガンドが特定の分子（例えばゴーシェ病におけるグルコシルセラミド）用に必要とされる場合、多数の公知の技術（例えばファージディスプレイ又は示された進化の他の方法）のうちの任意のものを用いて直ちに発生させることができる。高度の親和性を有する特定の分子を特異的に結合させる一本鎖ポリペプチドを同定するためのファージディスプレイライブラリーの使用は当業者に公知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等（１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｍａｒｋｓ等（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓ等（１９９３）．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等（１９９３）ＥＭＢＯ　Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ．３５２：６２４−６２８）。
【０１０９】
３）　発現コントロールタンパク質／ドメイン
本発明の２−ハイブリッドシステムにて使用されるキメラ分子の一つは、発現コントロール（調整）ドメインを含む。発現コントロールドメインは、典型的には遺伝子又はｃＤＮＡの発現を変えるポリペプチドである。典型的な発現コントロールタンパク質は、（遺伝子又はｃＤＮＡの発現をアップレギュレートする）トランスアクティベーター又は（遺伝子又はｃＤＮＡの発現をダウンレギュレートする）リプレッサーである。
【０１１０】
ある特定の好適な具体例において、発現コントロールタンパク質はＶＰ１６であるが、好適な具体例において、公知のトランスアクティベーティングタンパク質のＴＡＴＡボックス結合ドメインは、ＶＰ１６に取って代わることができる。他の好適なトランスアクティベーターは、当業者に公知である。種々のトランスアクティベーターは、限定するものではないが、Ｅ２Ｆ−４（米国特許第６，０４５，９９９号）、ヒト転写因子（米国特許第４６，００１，９７１号参照）、転写因子Ｉｓｌｅｔ−Ｂｒａｉｎ　１（ＩＢ１）（米国特許第５，８８０，２６１号）、日和見感染からのＴＦＩＩＢ転写因子（米国特許第５，８６３，７６２号）、ＤＰ１（米国特許第５，８６３，７５７号）、ＤＰ−３（米国特許第５，８５９，１９９号）、肝臓富化転写因子（米国特許第５，８４９，４８５号）、ＲＮＡポリメラーゼ転写因子（米国特許第５，７９２，６３４号）、転写因子ＡＰＲＦ（急性段階応答因子）（米国特許第５，７１９，０４２号）、細胞型特異性転写因子（米国特許５，７１０，０２５号）、ｐ３００転写因子（米国特許第５，６５８，７８４号）、ヒト転写因子ＩＩＡ（米国特許第５，６５２，１１７号参照）、Ｓ−ＩＩ転写因子（米国特許５，１９６，３０３）等を含む。
【０１１１】
好適な具体例においては、本発明はトランスアクティベーターである発現コントロールドメインを利用するが、所定の具体例においては、コントロールエレメントは遺伝子又はｃＤＮＡ転写のリプレッサーであるものが使用される。種々の転写リプレッサーは当業者に公知である。これらは、限定するものではないが、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子（米国特許第６，０７７，９３３号）、テトラサイクリンリプレッサー（米国特許第５，９７２，６５０号及び５，９１７，１２２号）、ＥＴＳ２リプレッサー（米国特許第５，８５６，１２５号）、パピローマウイルスＥ２トランスアクティベーションリプレッサー（米国特許第５，５９５，８８４号）、ＣＩ４３４リプレッサー、プラスミド（米国特許第５，１４７，７８９号）等を含む。
【０１１２】
４）　核酸結合ドメイン
実際には、任意の核酸結合タンパク質又はそれらの中の結合ドメインが、本発明の２−ハイブリッドシステム中で使用できる。好ましくは、結合タンパク質は、結合されたトランスアクティベーターが適切に配置された遺伝子又はｃＤＮＡの発現をアップレギュレートすることができる十分な親和力を有する特定の核酸シーケンスへ結合する。他の多くの核酸結合分子は当業者に公知であるがＧａｌ４ドメインは良好に特徴化され及び特別に好ましい具体例を提供する。例えば、米国特許第６，０１０，８４９号及び５，５７８，４４４号は、（典型的には非タンパク質）核酸結合分子の迅速な同定のためのアッセイを提供し、そして多数の例証となる分子も提供する。
【０１１３】
他の核酸結合タンパク質は、種々のトランスアクティベーターを含み、そしてジンクフィンガー（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ）モチーフの存在によりしばしば特徴付けられる。好適な核酸結合タンパク質及びそれらの及び他の核酸結合タンパク質を同定するためのアッセイは、当業者に公知である。それゆえ、例えば米国特許第６，０６６，４５２号は多重ＤＮＡ結合タンパク質用の結合サイトシーケンス同時に選択する方法を教示する。米国特許第６，０７，９８８号は、特定のターゲットシーケンスに結合するためのジンクフィンガーポリペプチドをデザインする方法を開示し、そして多数の好適なジンクフィンガーポリペプチドを列挙する。米国特許５，７７３，５８３号は、特定のＤＮＡシーケンスに結合する多数の“Ｅｇｒ” タンパク質を開示する。
【０１１４】
本明細書中で提供される教示を使用すると、他の好適な核酸結合タンパク質／結合ドメインは、過度の経験を有さない当業者により直ちに決定されることができる。
【０１１５】
５）　キメラ分子の調製
本発明の２−ハイブリッドシステムを含むキメラ分子は、化学的にコンジュゲートされたドメインであることができる、或いは該ドメインがアミノ酸又はペプチドリンカーによりリンクされる場合は、組換え発現される融合タンパク質であることができる。キメラ分子が化学的にコンジュゲートされる場合、キメラ分子は細胞へ運ばれる。キメラ分子が融合タンパク質である場合、融合タンパク質自体が細胞へ運ばれるか、又は融合タンパク質を符号化する核酸が、所望の融合タンパク質を生成する細胞内へトランスフェクトされるかのいずれかである。
【０１１６】
化学的に分子をコンジュゲートすることの分子の意味は、当業者に公知である。ポリペプチドは典型的には種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）又は自由アミン（−ＮＨ２ ）基を含み、それはエフェクター分子における好適な官能基を用いた反応に利用でき、それらへエフェクターを結合させるのに利用できる。その代わりに、キメラ分子を含む成分（例えばＧａｌ４及びβ−カテニン）はデリベタイズされることができ、さらなる反応性の官能基を曝し及び結合できる。この発生は、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ　Ｉｌｌｉｎｏｉｓから市販入手できるもののような多数のリンカー分子のうち任意のものの結合を含む。
【０１１７】
本明細書中で使用される“リンカー” とは、キメラ分子の２種のドメインを繋ぐことに使用される分子である。好適な具体例において、リンカーは両方のドメインに対して共有結合を形成することができる。好適なリンカーは当業界で公知であり、限定するものではないが、直鎖又は分岐鎖炭素リンカー、ヘテロ環状炭素リンカー又はペプチドリンカーを含む。所定の具体例において、リンカーはそれらの側基を通して（例えばシステインに対するジサルファイド結合を通して）アミノ酸に連結できる。しかし、好適な具体例において、リンカーはアルファ炭素アミノ及び末端アミノ酸のカルボキシル基と連結する。リンカーは二官能性であることができ、第１ドメイン（例えばＧａｌ４）上での置換基と反応性の官能基と第二ドメイン（例えばβ−カテニン）の置換基と反応性の別の官能基を有する。その代わりに、２種のドメインがデリバタイズされ、“一官能性” リンカーと反応してもよい（例えば、ペプチドにおける反応性の基を発生させる手順について米国特許第４，６７１，９５８号及び４，６５９，８３９号を参照されたい）。
【０１１８】
特に好適な具体例において、本発明のキメラ分子は融合タンパク質である。融合タンパク質は標準的な化学ペプチド合成技術を用いて合成され、より好ましくは組換え発現される。両方の分子が比較的短い場合、キメラ分子は単一の接触ポリペプチドとして化学的に合成される。シーケンスのＣ−末端アミノ酸が不溶性支持体に結合し、シーケンス内の残渣アミノ酸が連続的に付加する固相合成は、本発明のポリペプチドの化学合成の好ましい方法である。固相合成についての技術は、Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４頁　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２：Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ　Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ等　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）、及びＳｔｅｗａｒｔ等．，Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２版　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１１．（１９８４）により記載される。
【０１１９】
最も好適な具体例において、本発明のキメラ分子は組換えＤＮＡ方法論を用いて合成される。一般的には、これは融合タンパク質を符号化するＤＮＡシーケンスを生成し、特定のプロモーターのコントロール下で発現カセット中にＤＮＡを配置させ、そしてキメラ（融合）タンパク質をホスト細胞内に発現させる。
【０１２０】
本発明中で使用される融合タンパク質を符号化するＤＮＡは、任意の好適な方法、例えばクローニング及び適当なシーケンスの制限、又はＮａｒａｎｇ等（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のホスホトリエステル方法；Ｂｒｏｗｎ等（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅ等（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホラミダイト方法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持方法を含む任意の好適な方法により調製できる。
【０１２１】
化学合成は一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的シーケンスを用いたハイブリダイゼーションにより、又は鋳型として一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼを用いた重合により、二本鎖ＤＮＡに変換される。当業者は、ＤＮＡの化学合成は約１００〜５００塩基のシーケンスに限定されるが、短いシーケンスのライゲーションにより長いシーケンスが得られることが理解できるであろう。
【０１２２】
その代わりに、シーケンスはクローン化されることができ、そして好適なシーケンスは好適な制限酵素を使用して開裂される。フラグメントはライゲートされ、所望のＤＮＡシーケンスを生成する。
【０１２３】
好適な具体例において、本発明のＤＮＡ符号化融合タンパク質はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅反応を使用する。それゆえ、例えば例１に表されるように、ヒトβ−カテニンｃＤＮＡはＢａｍＨＩリンカーを用いてＰＣＲ増幅され、ｐＢＩＮＤのＢａｍＨＩサイトへクローン化される。ＢａｍＨＩリンカーを用いてヒトＴｃｆ４ｃＤＮＡはＰＣＲ増幅され、そしてｐＡＣＴのＢａｍ　ＨＩサイトへクローン化される。
【０１２４】
リンカーは、核酸結合ドメインと代謝生成物間で或いはリガンド及びトランスアクティベーター間で、キメラ分子内に導入されることができる。リンカーは２つのドメインを、好適な具体例において、各ドメインが適切にその第二及び第三構造へ収まることを保証するに十分な距離により、分離することに使用される。好適なペプチドリンカーシーケンスは、フレキシブルに延びる形態を採用し、機能的なＧＭ−ＣＳＦ及びＧ２５０ドメインと相互作用できる整列第二構造を発展させるための傾向を示さない。フレキシブルなタンパク質領域における典型的なアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含む。実際には、上記基準を満足させるために、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含むアミノ酸シーケンスの任意の入れ替えが予測される。Ｔｈｒ及びＡｌａのような他の良く似た神経アミノ酸も、リンカーシーケンスにおいて使用できる。リンカーとして使用できるさらに他のアミノ酸は、Ｍａｒａｔｅａ等（１９８５），Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６；Ｍｕｒｐｈｙ等（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：８２５８−６２；米国特許第４，９３５，２３３号；及び米国特許第４，７５１，１８０号に記載される。
【０１２５】
ペプチドリンカーシーケンスの長さは、融合タンパク質の生物学的活性に大きく影響することなく変えることができる。長いリンカーシーケンスも使用できるが、本発明の好適な具体例において、約２のアミノ酸のペプチドリンカーシーケンス長は官能性タンパク質ドメインの好適な分離を提供するために使用できる。リンカーシーケンスは長さにおいて１〜５０アミノ酸であることができる。本発明の最も好適な態様において、リンカーシーケンスは長さにおいて１〜２０アミノ酸である。本明細書中に開示される特定の具体例において、リンカーシーケンスは約２〜１５アミノ酸で、そして有利には約２〜１０アミノ酸である。ペプチドリンカーシーケンスは本発明の融合タンパク質において必ずしも必要ではない。
【０１２６】
一般的には、リンカーは、タンパク質を連結し又はある最小距離若しくはそれらの間の他の空間的関係を保つ以外には特別な生物学的活性を有しない。しかし、スペーサーの構成アミノ酸は、保護、ネットチャージ又は疎水性のような分子のある特性に作用するように選択できる。
【０１２７】
本発明の２−ハイブリッドシステムを含む２つのキメラ分子のいずれかが組み合わせて発現されることが所望である場合、Ｇ２５０、ＧＭ−ＣＳＦ、又はＧ２５０−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質、所望のタンパク質を符号化する核酸シーケンスは、典型的には好適な転写若しくは翻訳調整エレメントと操作可能にリンクする。調整エレメントは、典型的には転写プロモーター、転写をコントロールするための随意のオペレーターシーケンス、好適なｍＲＮＡリボゾーム結合サイトを符号化するシーケンス、転写及び翻訳の終結をコントロールするシーケンスを含む。複製の起源により通常与えられるホスト中で複製する能力及び形質転換の認識を容易化するための選択遺伝子がさらに導入できる。
【０１２８】
融合タンパク質を符号化する核酸シーケンスは、Ｅ．ｃｏｌｉ及び他のバクテリアホスト、最も好ましくは限定するものではないが酵母、昆虫細胞及び哺乳動物細胞を含む真核生物ホスト細胞を含む種々のホスト細胞内で発現される。組換えタンパク質遺伝子は、各ホストについての適切な発現コントロールシーケンスに操作可能にリンクする。
【０１２９】
本発明のプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉについての塩化カルシウム形質転換及び哺乳動物細胞についてのリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレ−ションのような公知の方法により、選ばれたホスト細胞中に輸送されることができる。インビボトランスフェクションは、例えば本明細書中に記載される標準的な遺伝子治療方法を使用して達成される。
【０１３０】
これらの技術の例及び多くのクローニング実施を通じて当業者に指示するために十分な教示は、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５２　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（２版）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等）；Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等版，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ　ｊｏｉｎｔ　ｖｅｎｔｕｒｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９４　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎ等．，米国特許第５，０１７，４７８；及びＣａｒｒ，欧州特許第０，２４６，８６４号中に見出せる。
【０１３１】
インビボの増幅方法を通して当業者を指示するに十分な技術の例は、Ｍｕｌｌｉｓ等．，（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ等版）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ＆Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ　３６−４７；Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　ＮＩＨ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；（Ｋｗｏｈ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１１７３；Ｇａｕｔｅｌｌｉ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌ等（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等（１９８８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ　Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１−２９４；Ｗｕ及びＷａｌｌａｃａ，（１９８９）Ｇｅｎｅ，４：５６０；及びＢａｒｒｉｎｇｅｒ等（１９９０）Ｇｅｎｅ，８９：１１７同様に、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＡｕｓｂｅｌ中に見出せる。
【０１３２】
Ｃ　核酸
本発明の２−ハイブリッドシステムの核酸成分は標準的な方法に従って製造される。典型的には、核酸は核酸結合分子（例えばＧＡＬ４）により認識される結合ドメイン及び１種又はそれ以上の遺伝子若しくはｃＤＮＡを含む発現カセットを含む。２−ハイブリッド複合物が結合サイトに結合するようにタンパク質結合サイトに関して位置付けられた発現カセットは、発現カセットを含む遺伝子又はｃＤＮＡの転写を果たすことができる。
【０１３３】
そのような核酸を生成する方法は、当業者に公知でありかつ本明細書中の例１に表される。
【０１３４】
Ｄ　細胞
実際には、任意の細胞が本発明の２−ハイブリッドシステムを収容できる。しかし、好適な細胞は真核細胞であり、及びより好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。細胞は、長期培養（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍ　ｃｕｌｔｕｒｅ）細胞を含む（例えばＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＳＷ４８０細胞、ＳＷ４８細胞、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ２９、２９３細胞、Ｕ２０Ｓ、Ｔ−４７Ｄ、ＭＣＦ−７、Ａ５４９、Ｈｅｐ　Ｇ、Ｊａｒｋａｔ細胞等）。細胞は急性の（非通過）細胞及びインビボ細胞も含むことができる。
【０１３５】
細胞は、本発明の２−ハイブリッド成分を含むキメラ分子を符号化する核酸を用いてトランスフェクトされ、又はキメラ分子は細胞内に（例えばマイクロインジェクション、脂質エンカプスレイション、ＨＩＶ　ＴＡＴタンパク質媒介輸送等を介して）直接的に導入され得る。特に、非常に大きなタンパク質に対して融合する場合、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質（ＨＩＶ　ＴＡＴ）は血液脳関門でさえ通過する生物学的活性のタンパク質のデリバリーを生じる（例えばＳｃｈｗａｒｚｅ等（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２及びそこで引用された参考文献を参照されたい）。
【０１３６】
細胞も本発明の方法のタンパク質結合サイトを符号化する核酸及びエフェクター分子を含むことが好ましい。
【０１３７】
具体例に依存して、細胞は本発明の２−ハイブリッドシステムの１種又はそれ以上の成分を含む。それゆえ、細胞は、キメラ分子のいずれか又は両方及び／又はキメラ分子のいずれか又は両方を符号化する核酸及び／又は結合サイト及びエフェクター遺伝子を含む核酸を含むことができる。
【０１３８】
ＩＩＩ　細胞中への構造物の配置
キメラ細胞は細胞内に直接導入でき、キメラ分子が融合タンパク質の場合は、タンパク質を符号化する核酸は、当業者に公知の標準的な方法に従って細胞内に導入できる。
【０１３９】
細胞が急性又は培養中のものである場合、半ビボトランスフェクションの標準的な方法が利用できる。これらは、限定するものではないが、ミクロインジェクション、バイオリスティック輸送、脂質媒介輸送、デンドリマー媒介輸送、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム輸送等を含む。
【０１４０】
キメラ分子自体が細胞中に導入される場合は、医薬を細胞内に輸送する標準的な方法が使用できる。このような方法は、限定するものではないが、リポソームエンカプスレーション、ミクロインジェクション、輸送を容易化するＨＩＶ　ＴＡＴドメインの使用等を含む。
【０１４１】
Ａ）　２−ハイブリッドシステムの成分の発現のための構成
キメラ分子（例えばＧａｌ４−β−カテニン、Ｔｃｆ４−ＶＰ１６、Ｇａｌ４−Ｔｃｆ４、β−カテニン−ＶＰ１６等）を発現させるために、キメラ分子を発現する遺伝子／ｃＤＮＡは典型的には発現カセット内に配置される。発現カセットは、典型的には遺伝子及び／又はｃＤＮＡの直接的な発現に十分な調整機構（例えば真核生物プロモーター、出発サイト、停止サイト等）を含む。本明細書中で提供されるシーケンス情報を使用して、発現カセットは発現するために適している。
【０１４２】
遺伝子／ｃＤＮＡは、典型的には対象の核酸の転写を示すプロモーターのコントロール下（すなわち操作可能にリンクする）に配置される。プロモーターは構造性で誘導可能である。組織特異的な発現が所望である場合、プロモーターは組織特異的なプロモーターであることができる。
【０１４３】
本発明の状況において、広範囲の組織特異的なプロモーターが利用できる。このようなプロモーターの典型的な例としては、限定するものではないが、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ（“ＰＥＰＣＫ” ）（Ｈａｔｚｏｇｉｏｕ等（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２６３：１７７９８−８０８；Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１１１８−１１２２；Ｖａｕｌｏｎｔ等（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：４４０９−４４１５）；ＩｇＧプロモーターのようなＢ細胞特異的プロモーター；癌胚性抗原プロモーター（ＣＥＡ）のような乳癌又は肝細胞性癌特異性プロモーター（Ｓｃｈｒｅｗｅ等（１９９０）Ｍｏｌ．ａｎｄ　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２７３８）；エラスターゼプロモーターのような膵臓腺房特異的プロモーター（Ｓｗｉｆｔ等（１９８９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：６８７−９６）；カゼインプロモーターのような乳上皮特異的プロモーター（Ｄｏｐｐｌｅｒ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１０４−１０８）；ポルホビリノゲンデアミナーゼプロモーターのような赤芽球細胞内にて活性な赤芽球特異的転写プロモーター（Ｍｉｇｎｏｔｔｅ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６４５８−６４５２）；α−又はβ−グロビン特異性プロモーター（ｖａｎ　Ａｓｓｅｎｄｅｌｆｔ等（１９８９）Ｃｅｌｌ　５６：９６９−９７７；Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４３９−５４４３）；ｍｙｏ−Ｄ結合サイトのような骨格菌を調整するプロモーター（Ｂｕｒｄｅｎ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：７１６；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４３４−５４３８）；インスリンプロモーターのような膵臓のベータ細胞に特異的なプロモーター（Ｏｈｌｓｓｏｎ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：４２２８−４２３１；Ｋａｒｌｓｓｏｎ等（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：８２３−８２７）；成長ホルモン因子プロモーターのような下垂体について特異的なプロモーター（Ｉｎｇｒａｈａｍ等（１９８８）Ｃｅｌｌ５５：５１９−５２９；Ｂｏｄｎｅｒ等（１９８８）Ｃｅｌｌ５５：５０５−５１８）；チロシン水酸化酵素プロモーターのような黒色腫について特異的なプロモーター；アルブミンプロモーター及びアルファフェトタンパク質プロモーターのような肝臓特異性プロモーター（Ｆｅｕｅｒｍａｎ等（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：４２０４−４２１２；Ｃａｍｐｅｒ　及びＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：５３７−５４６）；ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターのような乳癌特異性プロモーター（Ｔａｌ等（１９８７）Ｍｏｌ．ａｎｄ　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２５９７）；アルコール脱水素酵素プロモーターのような肝臓特異性プロモーター（Ｆｅｌｄｅｒ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５９０３−５９０７）；Ｔ−細胞レセプタープロモーターのようなＴ−細胞特異性プロ���ーター（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：３５５１−３５５４；Ｗｉｎｔｏ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ　Ｊ．８：７２９−７３３）；オステオカルシンプロモーターのような骨特異性プロモーター（Ｍａｒｋｏｓｅ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１７０１−１７０５；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ等（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：３５１７−３５２３；Ｋｅｒｎｅｒ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：４４５５−４５５９）、ＩＬ−２プロモーター、ＩＬ−２レセプタープロモーター、乳漿（ワップ）プロモーター及びＭＨＣクラスＩＩプロモーター等、を含む
【０１４４】
該構造は、随意にホストゲノムＤＮＡの領域に対して相補的なフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）シーケンスを含み、（例えば下記のような類似の組換えを通じて）ホストゲノム内へのカセットの統合を容易化する。さらに又は代わりに、フランキングシーケンスは１種又はそれ以上の組み換え酵素認識サイト（例えばＬｏｘＰ又はＦＬＰ）を含むことができ、組み換え酵素（例えばＣｒｅ）の使用を通じて発現カセットの統合を容易化する。
【０１４５】
Ｂ）　インビボトランスフェクション
所定の好適な具体例において、本発明の２−ハイブリッドシステムはインビボで細胞内に導入され、代謝欠陥を表す細胞（例えば、所定の癌細胞）を選択的に殺し、又はそのような活性が消滅又は不足する細胞内の特定の酵素活性を誘導する。ある具体例において、ＨＩＶ　ＴＡＴ融合タンパク質を用いて、キメラ分子は細胞内に“直接的に” すなわち組替発現されないで）導入されるが（例えばＳｃｈｗａｒｚｅ等（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２及びそれらの中に引用される参考文献参照）、好適な具体例においては、キメラ分子は組換え発現された融合タンパク質である。両方のタンパク質が単一の核酸又は別々の核酸から発現されることができる。同様に、タンパク質結合サイト及びエフェクターｃＤＮＡを符号化する核酸は、キメラ分子を符号化する核酸の成分であることができる、又は別々の核酸であることができる。典型的には、キメラ分子を符号化する核酸及び／又は結合サイトを含む核酸並びにエフェクターは、“遺伝子治療” の標準的な方法を使用して細胞内に導入される。
【０１４６】
核酸をインビボ、半ビボ及びインビトロで細胞内に核酸を導入する数種のアプローチが使用されてきた。これらは脂質又はリポソームベースの遺伝子デリバリーを含む（ＷＯ９６／１８３７２；ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ及びＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６（７）：６８２−６９１；Ｒｏｓｅ米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ等（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１４）及びレトロウイルスゲノムの一部として治療のポリヌクレオチドシーケンス有する複製欠陥レトロウイルスベクター（例えばＭｉｌｌｅｒ等（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０）；Ｋｏｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ．ＮＩＨ　Ｒｅｓ．４：４３及びＣｏｒｎｅｔｔａ等（１９９１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．２：２１５）を含む。
【０１４７】
遺伝子治療手順のレビューについては、例えばＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３；Ｎａｂｅｌ及びＦｅｌｇｎｅｒ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ　１１：２１１−２１７；Ｍｉｔａｎｉ及びＣａｓｋｅｙ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ　１１：１６２−１６６，Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，９２６−９３２；Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ　１１：１６７−１７５，Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５７：４５５−４６０；Ｖａｎ　Ｂｒｕｎｔ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６（１０）：１１４９−１１５４；Ｖｉｇｎｅ（１９９５）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　８：３５−３６；Ｋｒｅｍｅｒ及びＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ（１９９５）Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　５１（１）３１−４４；Ｈａｄｄａｄａ等（１９９５）ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ及びＢｏｅｈｍ（ｅｄｓ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ　Ｇｅｒｍａｎｙ；及びＹｕ等（１９９４）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，１：１３−２６を参照されたい。
【０１４８】
広く使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、アルファウイルス及びそれらの組合せに基づくものを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｈｅｒ等（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎ等（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ等（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６　５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎ等（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒ等Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ等ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００、及びＲｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＦａｕｃｉ（１９９３）ｉｎ　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３版，Ｐａｕｌ（ｅｄ）Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ及びそれらの中の参考文献、並びにＹｕ等（１９９４）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，ｓｕｐｒａ；米国特許６，００８，５３５等参照）。
【０１４９】
ベクターは偽性分類（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）され、ベクターに対応するレトロウイルスにより感染していない細胞に対するベクターのホスト範囲を広げる。例えば、水疱性口内炎ウィルスエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、造血幹細胞を感染させるＶＳＶ−Ｇ−偽性分類ＨＩＶベクターを構成することに使用される（Ｎａｌｄｉｎｉ等（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：２６３，及びＡｋｋｉｎａ等（１９９６）Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　７０：２５８１）。
【０１５０】
例えば、核酸及びペプチドのインビトロ生成及びインビボ及び半ビボ遺伝子治療手順において、アデノアソシエイテトウイルス（ＡＡＶ）をベースとするベクターも使用でき、ターゲット核酸を用いて細胞を形質導入する。ＡＡＶベクターのあらましについては、Ｗｅｓｔ等（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６０：３８−４７；Ｃａｒｔｅｒ等（１９８９）米国特許第４，７９７，３６８号；Ｃａｒｔｅｒ等ＷＯ９３／２４６４１（１９９３）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：７９３−８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．９４：１３５１を参照されたい。組換えＡＡＶベクターの構成は、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（１１）：３２５１−３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｈｅｒｍｏｎａｔ及びＭｕｚｙｃｚｋａ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６−６４７０；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等（１９８８）及びＳａｍｕｌｓｋｉ等（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：０３８２２−３８２８、を含む多数の刊行物に記載される。ｒＡＶＶにより変換され得る細胞株は、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：３９８８−３９９６に記載されるものである。他の好適なウイルスベクターはヘルペスウイルス、レンチウイルス及びワクシニアウイルスを含む。
【０１５１】
１）　レトロウイルストランスフェクションシステム
ある特定の好適な具体例において、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）は、ターゲット細胞を種々の成分を符号化する核酸を用いて本発明の２−ハイブリッドシステムに対してトランスフェクトすることに使用される。レトロウイルス、特にレンチウイルス（例えばＨＩＶ、ＳＩＶ等）は、この適用について特に好適である、なぜならそれらは非分離（ｎｏｎ−ｄｉｖｉｄｉｎｇ）細胞を感染させることができるからである。核酸トランスフェクションのためにレトロウイルスを使用する方法は、当業界で公知である（例えば米国特許第６，０１３，５７６号参照）。
【０１５２】
レトロウイルスはＲＮＡウイルスであり、ウイルスゲノムはＲＮＡである。ホスト細胞がレトロウイルスに感染した場合、ゲノムＲＮＡは、感染細胞の染色体ＤＮＡ中に非常に効率的に統合されたＤＮＡ媒体へ逆転写される。統合されたＤＮＡ媒体は、プロウイルスと呼ばれる。プロウイルスの転写と感染ウイルスへの集合は、好適なヘルパーウイルスの存在下又は混入ヘルパーウイルスの同時生成なしにエンカプシデーション（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）を可能にする好適なシーケンスを含む細胞株にて起こる。好適な具体例において、エンカプスレーションのためのシーケンスは好適なベクターを用いたコ−トランスフェクションにより生成されることができるので、ヘルパーウイルスは組換えレトロウイルス生成のために利用される必要はない。
【０１５３】
レトロウイルスゲノム及びプロウイルスＤＮＡは３種の遺伝子を有する：ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、これらは２種の末端反復配列（ＬＴＲ）シーケンスによりフランクされる。ｇａｇ遺伝子は内部構造（マトリックス、キャプシド及びヌクレオキャプシド）タンパク質を符号化する；ｐｏｌ遺伝子はＲＮＡ指定ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を符号化し、そしてｅｎｖ遺伝子はウイルスエンベロープ糖タンパク質を符号化する。５’ 及び３’ ＬＴＲはビリオンＲＮＡの転写及びポリアデニル化を促進させる。ＬＴＲはウイルス複製に必要な全ての他のシス作用シーケンスを含む。レンチウイルスは（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及び／又はＳＩＶ中の）ｖｉｔ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ及びｖｐｘを含む他の遺伝子を有する。
【０１５４】
ゲノム（ｔＲＮＡ結合サイト）の逆転写及びウイルスＲＮＡの粒子（Ｐｓｉサイト）内への効率的なエンキャプシデーションのために必要なシーケンスは、５’ ＬＴＲに隣接する。エンキャプシデーション（又はレトロウイルスＲＮＡの感染ビリオンへのパッケージング）に必要なシーケンスがウイルスゲノムから無くなる場合、ゲノムＲＮＡのエンキャプシデーションを阻止するシス欠陥が生じる。しかし、生じた変異体は、さらに全てのビリオンタンパク質の合成を示すことができる。
【０１５５】
ある好ましい具体例において、本発明は、非分離細胞に感染可能な組換えレトロウイルスを提供する。上述のように、組換えレトロウイルスは、ウイルス性ＧＡＧ、ウイルス性ＰＯＬ、ウイルス性ＥＮＶ、調節核酸シーケンスと操作可能にリンクする異質構造の核酸シーケンス、及びパッケージング、逆転写及び統合に必要なシス作用核酸シーケンスを含む。本発明の組換えレトロウイルスは、非分離細胞はもちろん分離細胞に感染することができることを理解されたい。
【０１５６】
好ましい具体例において、組換えレトロウイルスは、それゆえ、ネイティブウイルス（例えばｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ）の構造性、感染遺伝子の数種が取り除かれそして核酸シーケンスに置き換えられターゲット非分離細胞へ運ばれるような方法により、遺伝子改変される（例えば、本発明の２−ハイブリッドシステムの種々の成分を符号化するシーケンス）。ウイルスによる細胞の感染後、ウイルスは核酸を細胞内へ注入し、そしてレトロウイルス遺伝物質は、時折、ホスト細胞ゲノム内へ統合される。統合され又はエピソームのいずれかであっても、移されたレトロウイルス遺伝物質は、ホスト細胞内で本発明の２−ハイブリッドシステムの種々の成分内に転写及び翻訳される。レンチウイルスベクターを作成及び使用する方法は、米国特許第６，０１３，５１６号、第５，９３２，４６７号等で詳しく議論される。
【０１５７】
２）　アデノウイルスベクターシステム
他の好適な具体例において、本発明の２−ハイブリッドシステムの１種又はそれ以上の成分は、遺伝子治療用に好適なアデノウイルスベクターにて発現される。アデノウイルスベクターの使用はＷＯ９６／２５５０７において詳細に記載される。特に好適なアデノウイルスベクターは、Ｗｉｌｌｓ等（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐ．５：１０７９−１０８８により記載される。典型的には、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス初期（ｅａｒｌｙ）領域３及び／又は初期領域４において欠失を含み、そしてこの欠失はタンパク質ＩＸ遺伝子の数種又は全部の欠失を含むことができる。ある具体例において、アデノウイルスベクターはＥ１ａ及び／又はＥ１ｂの欠失を含むことができる。
【０１５８】
多数の異なるアデノウイルスベクターは、遺伝子輸送のために最適化される。このようなアデノウイルスベクターの１つは、米国特許第６，０２０，１９１号に記載される。このようなベクターは、導入遺伝子が操作可能にリンクするＣＭＶプロモーターを含み、そしてＥ１欠失及びＥ３領域からの１．６ｋｂの部分欠失を含む。これは、導入遺伝子（例えばβサブユニット遺伝子）及びその発現コントロールシーケンスが挿入され得るＥ１領域、好ましくはこのベクター内に含まれるＣＭＶプロモーターを含む複製欠陥ベクターである。それはさらに野生型アデノウイルスＥ２及びＥ４領域を含む。ベクターはアデノウイルスヌクレオチド２９２９２〜３０８４０の１５４９ヌクレオチドを包含するＥ３領域内の欠失を含む（Ｒｏｂｅｒｔ等（１９８６）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ，ｉｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ，ｅｄ．，８：１−５１）。ベクター内のＥ３領域へのこれらの改変は以下のことを生じる：（ａ）全ての下流の接続アクセプターサイトが欠失し、そしてｍＲＮＡのみがＥ３プロモーターから合成される（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ等（１９９６）Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．７０：２２９６−２３０６，１９９６；Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ等（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２２０：１５２−１６２，）；（ｂ）Ｅ３ＡポリＡサイトが欠失する、しかしＥ３ＢポリＡサイトは残る；（ｃ）Ｅ３ｇｐ１９Ｋ（ＭＨＣ　Ｉ　結合タンパク質）遺伝子が残る；そして（ｄ）Ｅ３　１１．６Ｋ（Ａｄ死タンパク質）遺伝子が欠失する。
【０１５９】
このようなアデノウイルスベクターは、限定するものではないがアデノウイルス抗原型２，５及び好ましくは他の全ての非発癌性抗原型を含む任意のアデノウイルス抗原型からのアデノウイルス遺伝子シーケンスを利用できる。
【０１６０】
１種の好適な具体例において、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモーターは（Ｂｏｓｈａｒｔ等（１９８５）Ｃｅｌｌ４１：５２１−５３０）、本発明の２−ハイブリッドシステムを含むキメラ分子の発現をコントロールすることに使用される。ＣＭＶプロモーターは、転写ユニット内の導入遺伝子に対して５’ へ位置付けられる。完全長プロモーターの一部は、導入遺伝子の持続性の発現をさせる能力についてテストできる。
【０１６１】
導入遺伝子の３’ 末端に位置することができるポリアデニル化信号は、限定するものではないが、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）及びＳＶ４０から誘導されるものを含む。
【０１６２】
ある好適な具体例において、本明細書中に記載の２−ハイブリッドシステムの成分を符号化する転写ユニット（発現カセット）を含む本発明の組換えアデノウイルスベクターを生成するために、アデノウイルスゲノムフラグメントへ挿入される転写ユニットを含むプラスミドは、関心あるアデノウイルスベクターから受容細胞へ誘導される線状化ウイルスを用いて、それにより相同組換えがゲノムフラグメントとウイルスとの間で起こる条件下において、コ−トランスフェクトされる。好ましくは、転写ユニットはＥ１欠失のサイト内に処理される。結果として、所望の導入遺伝子を符号化する転写ユニットは、プラスミドへクローン化されるサイトにおいてアデノウイルスゲノム内へ挿入され、組替えアデノウイルスベクターを生成する。相同組換えに続いて、ベクターゲノムはウイルス血小板の形成により証明されるように、ビリオン内にエンキャプシデートされる。複製−欠失ベクターストックの製造は、相同性ウイルス遺伝子がベクターから欠失される細胞株、例えば欠失されたアデノウイルスＥ１ゲノムシーケンスを含む２９３若しくはＡ５４９細胞を使用して達成できる。好適な相同細胞株における血小板の増幅後、ウイルスは凍結−解凍により回復され及びその後の塩化セシウム遠心分離を使用して精製される。その代わりに、ウイルス精製は、（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２に示されているように）クロマトグラフィー技術を使用して行われることができる。
【０１６３】
複製−欠陥アデノウイルスベクターストックの滴定濃度は、相同する細胞株、例えば２９３細胞中の血小板形成により測定される。例えば、抗体を使用するヘクソン（ｈｅｘｏｎ）タンパク質に対する終点希釈は、定量的なウイルス生成に使用できる（Ａｒｍｅｔａｎｏ等（１９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．６：１３４３−１３５３）。
【０１６４】
３）　非ウイルストランスフェクション
単独で又はウイルスベクターとの組合せで、多数の非ウイルスベクターは、本明細書中に記載される核酸構造を使用して細胞をトランスフェクトするためにも有用であり得る。好適な非ウイルスベクターは、限定するものではないが、プラスミド、コスミド、ファージミド、リポソーム、水−油乳化物、ポリエチレンイミン、バイオリスティックペレット／ビーズ、及びデンドリマーを含む。
【０１６５】
リポソームは１９６５年に初めて細胞膜のモデルとして記載され、そして細胞に物質を運ぶことに迅速に適用された。リポソームは一種又はそれ以上の機構によりＤＮＡを捕らえ、それはカチオン性リポソーム又はｐＨ感受性リポソームとしてそれらの分類を生じる。カチオン性リポソームは正に帯電したリポソームであり、負に帯電したリポソームと相互作用し、安定な複合体を形成する。カチオン性リポソームは、典型的には正に帯電した脂質及び共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）からなる。一般的に使用される共脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む。ヘルパー脂質とも呼ばれる共脂質は、ほとんどの場合、リポソーム複合物の安定化のために必要とされる。種々の正に帯電した脂質配合物は市販入手でき、そして多くの他のものが改良中である。２種の最も頻繁に引用されるカチオン性脂質は、リポフェクタミン及びリポフェクチンである。リポフェクチンは、１９８７年にＰｈｉｌ　Ｆｅｌｇｎｅｒにより初めて報告された市販入手できるカチオン性脂質であり、培地中の細胞へ遺伝子を運ぶ。リポフェクチンはＮ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニアクロライド（ＤＯＴＭＡ）とＤＯＰＥとの混合物である。
【０１６６】
ＤＮＡとリポフェクチン又はリポフェクタミンは、自発的に相互作用し、１００％充填効率を有する複合物を形成する。言いかえると、十分な脂質が入手できる場合、必然的に全てのＤＮＡが脂質と複合される。ＤＮＡ分子の負の帯電はＤＯＴＭＡの正に帯電した群と相互作用するものと仮定される。脂質：ＤＮＡ比及びこれらの複合物を形成することにおいて使用される全体の脂質濃度は、効率的な遺伝子輸送に非常に重要であり、そして適用とともに変化する。リポフェクチンは線状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ及びＲＮＡを培地中の種々の細胞中に運ぶことに使用される。その導入の少し後に、リポフェクチンは遺伝子をインビボで運ぶことに使用できることが分かる。リポフェクチン−ＤＮＡ複合物の静脈投与に続いて、肺及び肝臓は、これらの複合物の摂取及び導入遺伝子発現について、顕著な親和力を示した。これらの複合物の他の組織への注入は、変化する結果を有し、そしてほとんどの部分において、肺又は肝臓のいずれかへのリポフェクチン媒介遺伝子輸送よりも効率が非常に低い。
【０１６７】
ＰＨ感受性又は負に帯電したリポソームは、ＤＮＡを、むしろそれを有する複合物よりも捕らえる。ＤＮＡ及び脂質は同様の帯電をするので、複合物形成よりも反発が起こる。しかし数種のＤＮＡは、これらのリポソームの水性の内部に捕らえられるように処理される。数種の場合、これらのリポソームは低いｐＨにより不安定化され、そしてｐＨ感受性と呼ばれる。現在まで、カチオン性リポソームは、ｐＨ感受性リポソームよりも、インビボ及びインビトロ両方の遺伝子輸送において非常に効率的であった。ｐＨ感受性リポソームは、インビボのＤＮＡ輸送において、それらのカチオン性の対象物よりも非常に効率的であるポテンシャルを有する、そして減少した毒性及び血清タンパク質からの阻害を伴って、それを行うことができなければならない。
【０１６８】
他のアプローチにおいて、ＤＮＡに複合するデンドリマーが、細胞をトランスフェクトすることに使用される。このようなデンドリマーは、限定するものではないが、“スターバースト” デンドリマー及び種々のデンドリマーポリカチオンを含む。
【０１６９】
デンドリマーポリカチオンは３次元で、典型的にはコア分子又は明確な開始剤上において、オリゴマー又はポリマーを加える反復反応シーケンスにより形成される高度に整列したオリゴマー又はポリマー化合物であり、そしてそれは正に帯電した外表面を提供する。これらのデンドリマーはＰＣＴ／ＵＳ８３／０２０５２、及び米国特許第４，５０７，４６６号；第４，５５８，１２０号；第４，５６８，７３７号；第４，５８７，３２９号；第４，６３１，３３７号；第４，６９４，０６４号；第４，７１３，９７５号；第４，７３７，５５０号；第４，８７１，７７９号；第４，８５７，５９９号に記載されるように製造できる。
【０１７０】
デンドリマーポリカチオンは、典型的にはポリマーが加えられるコア分子を含む。ポリマーは正電荷を獲得することができる末端機を有するオリゴマー又はポリマーであることができる。好適なコア分子は、コア分子のオリゴマー及び／又はポリマーへの結合に利用可能な少なくとも２種の反応性残基を含む。反応性残基の例は、特にヒドロキシル、エステル、アミノ、イミノ、イミド、ハライド、カルボキシル、カルボハライド、マレイミド、ジチオピリジル、スルフヒドリルである。好適なコア分子は、特にアンモニア、トリス−（２−アミノエチル）アミン、リシン、オルニチン、ペンタエリトルトール及びエチレンジアミンである。これらの残基の組合わせも、他の残基と同様に好適である
【０１７１】
本発明のデンドリマーポリカチオンの製造に好適なオリゴマー及びポリマーは、人体に良好に許容される医薬的に許容性オリゴマー及び／又はポリマーである。これらの例は、特にα，β−エチレン性不飽和カルボン酸又はα，β−エチレン性不飽和アミドのアルキルエステルとアルキレンポリアミン又はポリアルキレンポリアミンとの反応から誘導されるポリアミドアミンである。好適にはメチルアクリレートとエチレンジアミンである。ポリマーは、好ましくはコア分子と共有結合する。
【０１７２】
オリゴマー及び／又はポリマーに結合する末端基は正電荷を得ることができるものでなければならない。これらの例は、アゾール並びにＳ若しくはＯで置換されることができる第一、第二、第三、第四脂肪属及び芳香族アミン及びアゾール、グアニジニウム、又はそれらの組合せである。末端カチオン基は、好ましくはオリゴマー及び／又はポリマーに共有様式で結合する。好ましい末端カチオン基は、アミン及びグアニジニウムである。しかし、他のものも利用できる。末端カチオン基は、オリゴマー及び／又はポリマーの全末端基の約１０〜１００％、より好ましくは約５０〜１００％の割合で存在できる。
【０１７３】
デンドリマーポリカチオンも、カチオン基以外の末端反応性残基を０〜約９０％含むことができる。末端カチオン基以外の好適な応反応性残基は、特にヒドロキシル、シアノ、カルボキシル、スルフィドリル、アミド及びチオエーテル並びにそれらの組合せである。しかし、他のものも利用できる。
【０１７４】
デンドリマーポリカチオンは、一般的に及び好適にはポリヌクレオチドと非共有結合する。これは、一旦細胞内に運ばれた場合に、組成物の容易な分解及び解離を許容する。本明細書中で好適に使用される典型的なデンドリマーポリカチオンは、約２，０００〜１，０００，０００Ｄａ、より好ましくは約５，０００〜５００，０００Ｄａの範囲の分子量を有する。しかし他の分子量も使用できる。好適なデンドリマーポリカチオンは約１１〜６０Å、及びより好ましくは約１５〜５５Åの流体力学的半径を有する。しかし、他のサイズも好適である。デンドリマーの製造方法及び遺伝子治療における使用方法は当業者に公知であり、例えば米国特許第５，６６１，０２５号に詳細に記載される。
【０１７５】
適切な場合は、２種又はそれ以上の型のベクターを一緒に使用できる。例えば、プラスミドベクターはリポソームとともに使用できる。非ウイルスベクターの場合は、核酸は当業界で公知の任意の方法により非ウイルスベクター内へ導入できる。プラスミドについては、これは、典型的には該構造を好適な制限サイト内へライゲートすることを含む。リポソーム、水−油乳化物、ポリエチレンアミン及びデンドリマーのようなベクターについては、ベクター及び構造は当業界で公知な好適な条件下で混合することにより結合されることができる。
【０１７６】
Ｄ）　半ビボ遺伝子治療
本発明の方法は、インビボの細胞の治療に制限されるものではない。それゆえ、所定の具体例において、本発明は、特定の酵素活性を欠く場合に、それを補うためにデザインされた２−ハイブリッドシステムを用いた細胞の半ビボトランスフェクションを企図している
【０１７７】
診断、調査又は遺伝子治療のための（例えば形質転換された細胞のホスト生物体内への再注入を介する）半ビボ細胞形質転換は、当業者に公知である。好適な具体例において、細胞は対象生物体から単離され、本発明の構造を用いてトランスフェクトされ、そして場合によっては対象生物体（例えば患者）へ再注入される。
【０１７８】
ＶＩ．　キット
さらに他の具体例において、本発明は本明細書中に記載される方法の実施のためのキットを提供する。所定の具体例において、該キットは、本発明の２−ハイブリッドシステムにおいて使用されるキメラ分子の一方又は両方を符号化する核酸を含む。それゆえ、例えば例１に記載のＡＰＣ２−ハイブリッドシステムにおいて、該キットはＧａｌ４−β−カテニン、及び／又はＴｃｆ−ＶＰ１６、及び／又はＧａｌ４−Ｔｃｆ、及び／又はβカテニン−ＶＰ１６を符号化する核酸を含むことができる。所定のキットはキメラ分子自体（例えば融合タンパク質）を含むことができる。キットは代わりに又は追加でポリペプチド結合サイト及びエフェクター遺伝子を符号化する核酸を含むことができる。核酸は（例えば適切な制限サイト及び／又はＰＣＲプライマー結合サイトによりフランクされた）ベクターの成分として提供されることができる。キメラ分子を符号化する核酸構造は、構造性、誘導性又は組織特異的なプロモーターのコントロール下で“融合遺伝子” を含むことができる。このようなプロモーターは、当業者に公知である。
【０１７９】
所定の具体例において、キットは本明細書中に記載されるような２−ハイブリッドシステムの１種又はそれ以上の成分を含む細胞（例えば哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞）を含む。
【０１８０】
該キットは、本明細書中に記載される方法の実施を容易化するために任意の試薬及び／又は装置を随意に含むことができる。このような試薬は、限定するものではないが、緩衝液、器具（例えばバンドパスフィルター）、レポーター遺伝子からの信号を検出するための試薬、トランスフェクション試薬、細胞株、ベクター等を含む。
【０１８１】
さらに、該キットは本発明の方法の実施のための指示（すなわちプロトコル）を含む指示材料を含むことができる。好ましい指示材料は、代謝生成物を蓄積及び／又は分解する細胞能力のモジュレーターをスクリーニングするための、及び／又は異常な代謝経路を有する細胞を選択的に殺す方法のための、及び／又は本明細書中に記載されるように減少した若しくは不存在の前記細胞活性を有する細胞を補うための酵素活性を選択的に発現する方法のためのキット内容を利用するプロトコルを提供する。指示材料は記載又は印刷された材料を含むが、それらに限定されるものではない。それらの指示を保存しかつ末端ユーザーへ伝達できる任意の媒体が本発明により企図される。このような媒体は、限定されるものではないが、電気記録媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ　ＲＯＭ）等を含む。このような媒体は、このような指示材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含み得る。
【０１８２】
例
例証のために以下の例を表す、しかし特許請求の範囲の発明に限定されるものではない。
【０１８３】
例１：
ＡＰＣ−変異結腸癌治療用の哺乳動物２−ハイブリッドシステムの適用される使用
細胞質内のβ−カテニンの蓄積は、腺腫ポリポシス菌（ＡＰＣ）遺伝子変異結腸癌細胞中に見出される重要なイベントの一つである。変異ＡＰＣ遺伝子は、β−カテニンタンパク質に対する親和力を欠く途切れた形態のＡＰＣタンパク質を提供する。β−カテニンタンパク質の蓄積は、ユビキチン−プロテアソーム経路を経由する分解機構から避けるβ−カテニンにより引き起こされ、それはグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）によるβ−カテニン／ＡＰＣのリン酸化を必要とする。この例において、我々は、ＡＰＣ変異細胞を選択的に殺す新規な遺伝子治療システムを記載する。このシステムは、ＧＡＬ４／β−カテニン、ＶＰ１６／Ｔｃｆ４及び自殺遺伝子発生産出遺伝子ＤＮＡ構造からなる哺乳動物２−ハイブリッドシステムから作られる。このシステムは、ＧＡＬ４／β−カテニンの蓄積が発生する場合にのみ働くためにデザインされる。ＡＰＣ変異ヒト結腸癌細胞株ＳＷ４８０において、ＶＰ１６／ＴＣＦ４タンパク質の存在下におけるＧＡＬ４／β−カテニンの蓄積は、高い発現レベルの産出遺伝子を生じた。逆に、ＳＷ４８のようなＡＰＣ野生型を有する他のヒト細胞株において、ＧＡＬ４／β−カテニンの分解が観察され、そして産出遺伝子の発現レベルは低く維持された。ＳＷ４８０細胞内の２−ハイブリッド構造を用いた野生型ＡＰＣ発現プラスミドの添加は、ＧＡＬ４／及び完全なβ−カテニンレベルの減少ばかりでなく、産出遺伝子の発現レベルの減少を生じた。レポーター遺伝子からの産出遺伝子の自殺遺伝子への置き換えは、この２−ハイブリッドシステムをＳＷ４８０細胞を殺すことができるものにした。我々は、ｐＧ５プラスミドのホタルルシフェラーゼｃＤＮＡをｐ５３−ＥＧＦＰｃＤＮＡへ交換し、そして他の２−ハイブリッド成分の存在下で、ＳＷ４８０細胞へトランスフェクトした。ｐ５３−ＥＧＦＰトランスフェクトされた細胞中で約８０％のＥＧＦＰポジティブ細胞が死んだが、コントロールｐ５３−ＥＧＦＰトランスフェクトされた細胞中では、約２０％のみのＥＧＦＰポジティブ細胞が死んだ。我々は、このシステムがタンパク質分解疾患を含む疾患を標的にする遺伝子治療におけるより広い使用のために適用できるものと信じる。
【０１８４】
導入
家族性腺腫ポリポシス（ＦＡＰ）患者に見出される（Ｋｉｎｚｅｒ等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：６６１−６６５；Ｎｉｓｈｉｓｈｏ等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：６６５−６６９）腺腫ポリポシス菌（ＡＰＣ）腫瘍抑制遺伝子の変異は、散発性大腸癌患者においても頻繁に見出せる（Ｓｐａｒｋ等（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５８：１１３０−１１３４）。ＡＰＣの機能的な研究は、野生型ＡＰＣタンパク質がβ−カテニンをリン酸化するために、本来は細胞接着分子の成分として見出されているグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）について最適な環境を提供し、（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ等（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：１０２３−１０２６）、そしてユビキチン−プロテアソーム経路を経由して細胞質β−カテニンの分解を促進することを明らかにした（Ａｂｅｒｌｅ等（１９９７）ＥＭＢＯ　Ｊ．，１６：３７９７−３８０４；Ｗｉｎｓｔｏｎ等（１９９９）Ｇｅｎｅ　Ｄｅｖ．，１３：２７０−２８３）。それゆえ大腸癌における遺伝子変異によるＡＰＣの機能的損失は、β−カテニンの蓄積を生じる（Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ等（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：３０４６−３０５０）。およそ８０％の大腸癌細胞は機能不全ＡＰＣを有し（Ｓｐａｒｋ等（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５８：１１３０−１１３４）及び他のものはβ−カテニンのＧＳＫ−３βリン酸化サイトに数種の変異を有し、それは細胞中のβ−カテニンタンパク質を安定化もさせる（Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ等（１９９６）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：４０８８−４０９４）という事実は、細胞質内のβ−カテニンの蓄積が大腸癌形成のために重要なイベントであることを示すものである。その上、遺伝子操作されたマウスモデルにおいて、ＡＰＣ−変異マウス（Ｓｈｉｂａｔａ等（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８：１２０−１２３）及びβ−カテニン変異マウス（Ｈａｒａｄａ（１９９９）ＥＭＢＯ　Ｊ．，１８：５９３１−５９４２）の両方が、腸ポリープを形成した。これらの変異はラス（ｒａｓ）又はｐ５３変異の前でさえ、大腸癌進行の初期段階にて観察された（Ｌａｕｒｅｎｔ−Ｐｕｉｇ等（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒｅｖ．，８：Ｓｕｐｐｌ　１　Ｓ３９−４７）。最近の研究は、大腸癌中に蓄積されたβ−カテニンが転写因子Ｔ細胞因子４（Ｔｃｆ４）を用いて複合物を形成し（Ｋｏｒｉｎｅｋ等（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７８４−１７８７；Ｍｏｒｉｎ等（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７８７−１７９０）及びサイクリンＤ１（Ｔｅｔｓｕ及びＭｃＣｏｒｍｉｃｋ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ，３９８：４２２−４２６）、ｃ−ｍｙｃ（Ｈｅ等（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１５０９−１５１２）及びペルオキシソーム増殖薬活性化レセプターδ（Ｈｅ等（１９９９）Ｃｅｌｌ，９９：３３５−３４５）のようなＴｃｆ／ｌｅｆ−１−依存発癌性遺伝子発現を強めることを報告している。
【０１８５】
酵母２−ハイブリッドシステムは、タンパク質−タンパク質相互作用を研究するための又は所定のタンパク質用の相互作用パートナーを同定するための最も便利なツールの一つとして使用される（Ｄａｎｇ等（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：９５４−９６２）。このシステムは基本的には３種の成分からなる。第一の成分は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質である。第二の成分は、転写因子の転写活性ドメインを含む融合タンパク質である。第三の成分は、第一成分のための一致シーケンスを有し、続けてＴＡＴＡボックスのような第二成分のための転写活性サイトである産出遺伝子発現構造である。第一成分として、酵母ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインが広く使用される、そして第二成分としてヘルペス単純ウイルスＶＰ１６転写活性ドメインが広く使用される。数年後、酵母２−ハイブリッドシステムは改良され、融合タンパク質発現プラスミドのプロモーター領域を置きかえることにより、哺乳動物細胞用に改変された（Ｆｅａｒｏｎ等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：７９５８−７９６２）。この改変は、産出遺伝子発現を測定することにより、哺乳動物細胞における２種のタンパク質の機能的結合を研究することを可能にした。このペーパーにおいて、我々は哺乳動物２−ハイブリッドシステムのユニークな適用を導入した。我々はβ−カテニン及びＴｃｆ４を、細胞死誘発遺伝子産出の組合せを用いた２−ハイブリッドシステム用の結合分子として導入し、そしてＡＰＣ変異細胞を使用して選択的な細胞殺傷の研究を行った（図１）。
【０１８６】
材料及び方法
細胞
本明細書中で使用される全てのヒト癌細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ヒト結腸癌細胞株ＳＷ４８０及びＳＷ４８を、０．８％ＣＯ２ インキュベーター中、３７℃で１０％−熱不活性化ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を補充したＬｅｉｖｏｖｏｔｚ’ ｓ　Ｌ−１５媒体（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中に保持した。ヒト骨肉腫細胞株Ｕ２−ＯＳ及び胚性腎臓細胞株２９３を５％ＣＯ２ インキュベーター中、３７℃で１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を補充したＲＰＭＩ１６４０媒体中に保持した。
【０１８７】
プラスミド
ｐＢＩＮＤ、ｐＢＩＮＤ／Ｉｄ、ｐＡＣＴ及びｐＧ５ＬｕｃプラスミドをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。ｐｐ５３−ＥＧＦＰをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。ＧＡＬ４融合β−カテニン発現プラスミド、ｐＢＩＮＤ／β−カテニン及びＶＰ１６融合Ｔｃｆ４発現プラスミド、ｐＡＣＴ／Ｔｃｆ４を以下のように製造した。Ｂａｍ　ＨＩリンカーを有するヒトβ−カテニンｃＤＮＡをＰＣＲを使用して製造し、そしてｐＡＣＴのＢａｍ　ＨＩサイト内へクローン化した。Ｂａｍ　ＨＩリンカーを有するヒトＴｃｆ４ｃＤＮＡをＰＣＲを使用して製造し、そしてｐＡＣＴのＢａｍ　ＨＩサイト内へクローン化した。ｐｃＤＮＡ３／ｐ５３−ＥＧＦＰを、ｐｐ５３−ＥＧＦＰのＫｐｎＩ及びＸｂａＩをｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＫｐｎＩ／ＸｂａＩサイト内へ発生させることにより製造した。ｐＧ５／ｐ５３−ＥＧＦＰプラスミドは、ｐｐ５３−ＥＧＦＰのｐ５３−ＥＧＦＰｃＤＮＡフラグメントをｐＧ５ＬｕｃのＢｇｌ　ＩＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトへ導入することにより構成される。ｐＧ５／ＥＧＦＰプラスミドはｐＧ５／ｐ５３−ＥＧＦＰプラスミドからｐ５３ｃＤＮＡを消去することにより構成される。ｐ５３−Ｌｕｃ、ｐＡＰ−１−Ｌｕｃ、及びｐＣＲＥ−ＬｕｃプラスミドはＳｒｔａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）より購入した。
【０１８８】
免疫染色
５０−８０％融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）まで成長した細胞を、トリプシナイズしそしてホスフェートバッファー塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、そしてプロテアーゼ抑制剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｍｉｎｉ（登録商標），Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含むＴＥバッファー（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）内で溶解させた。細胞溶解物試料を４−２０％のアクリルアミド線状勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて分離し、ニトロセルロース膜上に移し、第一（ｐｒｉｍａｒｙ）抗体を用いてインキュベートし、第二抗体を用いて西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートし、そしてＥｎｈａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて検出した。抗β−カテニン（ｓｃ−７１９９）、ＧＡＬ４（ｓｃ−５７７）、ＶＰ１６（ｓｃ−７５４６）、ｐ５３（ｓｃ−１２６）抗体を、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。抗ＡＰＣ抗体（ＯＰ４４）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製であった。抗Ｔｃｆ４抗体はＵｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から入手した。西洋わさびコンジュゲートした抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ抗体は、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ製であった。
【０１８９】
２−ハイブリッドアッセイ
ｐＢＩＮＤ／β−カテニン、ｐＡＣＴ／Ｔｃｆ４及びｐＧ５／ｌｕｃプラスミドを、製造者の推奨するプロトコルに従って、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞に対してコ−トランスフェクトした。簡単には、細胞を２４−ウエルプレートへ５×１０４ 細胞／ウエルの密度で供給し、そして２４時間培養した。全１μｇ／ウエルのプラスミドをトランスフェクトし、そしてさらに２４時間培養した。最終的に、ルシフェラーゼ活性を市販入手できるキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。トランスフェクション効率を、ｐＢＩＮＤプラスミドから同時に発現されたｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性により標準化した。
【０１９０】
ＦＡＣＳ分析
ｐＧ５／ｐ５３−ＥＧＦＰ又はｐＧ５／ＥＧＦＰプラスミドを、ｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニン及びｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４プラスミドを用いて、ＳＷ４８０へコ−トランスフェクトした。４８−７２時間のインキュベーションの後、細胞をトリプシナイズしそしてＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１０μＭヨウ化プピジウムを含むＰＢＳ中で懸濁させ、シトメーターを流すことができるＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において分析した。ＥＧＦＰ−ポジティブ細胞の細胞生存力プロファイルを、ヨウ化プピジウムの取り込みにより分析した。
【０１９１】
結果
結腸癌細胞株における２−ハイブリッドタンパク質の機能的発現
我々は、ｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニン、ｐＢＩＮＤ／ＭＴ−β−カテニン、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４、ｐＡＣＴ／ＤＮ−Ｔｃｆ４の４種の融合タンパク質発現プラスミドを構成させ、それはそれぞれＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニン、ＧＡＬ４／ＭＴ−β−カテニン、ＶＰ１６／ＦＬ−Ｔｃｆ４、ＶＰ１６／ＤＮ−Ｔｃｆ４を発現する（図２Ａ）。ＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニンは、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン及び完全長ヒトβ−カテニンからなる融合タンパク質である。ＧＡＬ４／ＭＴ−β−カテニンは、β−カテニンの途切れた形態であり、それはＧＳＫ−３β認識サイトを欠く。ＶＰ１６／ＦＬ−Ｔｃｆ４は、ヘルペス単純ウイルスの転写活性ドメイン及び完全長ヒトＴｃｆ４からなる。ＶＰ１６／ＤＮ−Ｔｃｆ４はＴｃｆ４の途切れた形態であり、それはβカテニン結合サイトを欠く。我々はｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニン、ｐＢＩＮＤ／ＭＴ−β−カテニン、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４、ｐＡＣＴ／ＤＮ−Ｔｃｆ４をＳＷ４８０細胞に対してトランスフェクトし、免疫ブロッティングを使用してそれらの融合タンパク質発現レベルを検出した。発現されたＧＡＬ４／β−カテニン融合タンパク質は、抗ＶＰ１６及び抗Ｔｃｆ４抗体の両方により認識されるＶＰ１６／Ｔｃｆ４タンパク質と同様に、抗ＧＡＬ４及び抗β−カテニン抗体の両方により認識される（図２Ｂ）。ｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニン、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４及びｐＧ５／Ｌｕｃのコ−トランスフェクションは、産出遺伝子の発現、ホタルルシフェラーゼへと導く（図２Ｃ）。ｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニンプラスミドのｐＢＩＮＤ／Ｉｄへの置き換え又はｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４プラスミドのｐＡＣＴ／ＤＮ−Ｔｃｆ４への置き換えが、ホタルルシフェラーゼ活性を上げることができないとき、これらの産出遺伝子発現レベルは、ＧＡＬ４／β−カテニン及びＶＰ１６／ＦＬ−Ｔｃｆ４の組合せの発現により、厳格にコントロールされる。
【０１９２】
ＡＰＣによるβ−カテニン／Ｔｃｆ４　２−ハイブリッドシステムの調整
それらの融合タンパク質が産出遺伝子発現レベルを適切に操るとき、我々は、次にＡＰＣプロファイルに依存して、完全な野生型β−カテニンタンパク質と同様に、ＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニンが分解されるかどうかを試験した。初めに、野生型ＡＰＣ発現プラスミドのコトランスフェクションを、ＳＷ４８０内においてｐＢＩＮＤ／ＷＴ又はＭＴ−β−カテニン、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４及びｐＧ５／Ｌｕｃを使用して行った。ｐＢＩＮＤ／ＷＴ−β−カテニンシステム中でのＡＰＣの添加は、ホタルルシフェラーゼ活性の激烈な減少を生じるが、ｐＢＩＮＤ／ＭＴ−β−カテニンシステムはＡＰＣ発現により影響を受けない（図３Ａ）。次に、ＧＡＬ４／β−カテニン及びＶＰ１６／Ｔｃｆ４のタンパク質レベルは、レポーター遺伝子アッセイと同じ条件で検出される。ポジティブコントロール実験として、ｐｃＤＮＡ３／ｍｙｃ−β−カテニンを、ｐｃＤＮＡ／ＡＰＣプラスミドを用いてコ−トランスフェクトした。ＡＰＣタンパク質の存在下で、ＧＡＬ４／ＭＴ−β−カテニン及びｍｙｃ−タグ化ＭＴ−β−カテニンタンパク質レベルは変化しなかったにもかかわらず、ＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニン及びｍｙｃ−タグ化ＷＴ−β−カテニンタンパク質レベルは減少した（図３Ｂ）。ＶＰ１６／Ｔｃｆ４も完全なＴｃｆ４タンパク質レベルも、ＡＰＣ発現により影響されない。
【０１９３】
種々の細胞型におけるβ−カテニン／Ｔｃｆ４　２−ハイブリッドシステムの調節
これらの結果を確認するために、我々は、野生型ＡＰＣを発現することが想定されるヒト骨肉腫Ｕ−２ＯＳ及びヒト胚性腎臓２９３細胞を使用して２−ハイブリッドアッセイを行った。我々は細胞質β−カテニン及びＡＰＣ第一の発現レベルを試験した（図４Ａ）。Ｕ−２ＯＳ及び２９３の両方が、低いレベルの細胞質β−カテニンを示した。これらの２種の細胞株は、予測された分子サイズにおけるＡＰＣバンドも示した。これらの結果は、β−カテニンの分解機構がこれらの細胞株中において適切に作用したことを示した。ＡＰＣ変異細胞株として公知のＳＷ４８０は、予測されたサイズにおいてＡＰＣバンドを示さなかった。β−カテニン変異細胞株として公知のＳＷ４８は、野生型ＡＰＣを有するにもかかわらず高いレベルのβ−カテニンを示した。図４Ｂは、ＳＷ４８０及びＳＷ４８細胞中のＧＡＬ４／ＷＴ又はＭＴ−β−カテニンタンパク質の発現レベルを表す。ＳＷ４８細胞においてのみ、ＧＡＬ４／ＭＴ−β−カテニンでなくＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニンがＡＰＣ野生型細胞株中において分解されたことを意味するＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニンを表す特定の下側のバンドが観察された。野生型ＡＰＣを有する試験された全ての細胞株は、ＳＷ４８０細胞よりも低い産出遺伝子発現レベルを表した（図４Ｃ）。その上、ＳＷ４８は、ＧＡＬ４／ＭＴ−β−カテニンを使用する２−ハイブリッドシステムを用いてトランスフェクトされる場合は、ＳＷ４８０細胞に対して近い量の産出遺伝子発現を示した（データは示さない）。これらの結果は、細胞のＡＰＣプロファイルが産出遺伝子発現レベルをコントロールするために非常に重要な因子であることを示すものである。
【０１９４】
哺乳動物２−ハイブリッドシステムのインビボ遺伝子治療への適用
この２−ハイブリッドシステムが機能不全ＡＰＣ存在環境下で選択的に作用したことを我々が示したように、我々は産出遺伝子をルシフェラーゼからｐ５３−ＥＧＦＰへ置きかえることを決めた。第一に、我々はＳＷ４８０内でｐ５３−ＥＧＦＰをｐ５３応答性エレメント−ドライブ化（ｅｌｅｍｅｎｔ−ｄｒｉｖｅｎ）ルシフェラーゼプラスミドの存在下で発現させ、ｐ５３−ＥＧＦＰ融合タンパク質が野生型ｐ５３と機能的に同じであるか試験した。トランスフェクトされたｐ５３−ＥＧＦＰは、ｐ５３応答性エレメント−ドライブ化ルシフェラーゼを選択的に活性化したが、ネガティブコントロールｌａｃＺはｐ５３応答性エレメント−ドライブ化ルシフェラーゼを活性化しなかった（図５Ａ）。ｐ５３−ＥＧＦＰ発現は蛍光顕微鏡で緑光として観察され（データは示さない）、抗ｐ５３抗体により８０ｋＤａタンパク質として認識もされた（図５Ｂ）。それらのｐ５３−ＥＧＦＰ発現細胞の生存力を、ヨウ化プロピジウム導入法を使用するフローシトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ）により分析した。４８時間又は７２時間のインキュベーション後、２−ハイブリッドプラスミド−トランスフェクトされた細胞を採取した。約２０％のｐＧ５／ｐ５３−ＥＧＦＰプラスミド−トランスフェクトされた細胞が生存し、約８０％のｐＧ５／ＥＧＦＰプラスミド−トランスフェクトされた細胞が生存した（図５Ｃ）。この実験において、ｐＧ５／ＥＧＦＰトランスフェクトされた細胞は、ｐＧ５／ｐ５３−ＥＧＦＰトランスフェクトされた細胞よりもより強いＧＦＰ光を示した（データは示さない）。おそらく、ｐ５３−ＥＧＦＰ発現細胞は、ｐ５３−ＥＧＦＰの発現レベルがＥＧＦＰと同じ高さに到達する前に、死に始めた。
【０１９５】
ディスカッション
癌治療用アプローチとしての遺伝子治療は、比較的新しい。以前には、非効率的又は非特異的なデリバリー方法が、このようなアプローチには問題あることが証明した（Ｖｅｒｍａ及びＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ，３８９：２３９−２４２）。不十分なデリバリー効率を補うために、癌細胞に対してユニークな特異化された選択性が所望である。例えば、組織特異的なプロモーター−ドライブ化自殺遺伝子発現は、非癌細胞へのダメージを防ぐためのアイデアの一つである（Ｖａｎｄｉｅｒ等（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５８：４５７７−４５８０）
【０１９６】
本明細書において、我々は遺伝子治療の選択性を改良することができる２種の新規なコンセプトを提案する。１つは癌細胞特異的タンパク質分解疾患をターゲットとし、そして他は哺乳動物２−ハイブリッドシステムを使用して自殺遺伝子発現をコントロールすることである。細胞質内のβ−カテニンの蓄積は、ほとんどの大腸癌で起こり、それらの約８０％が機能不全ＡＰＣにより生じる（Ｋｉｎｚｅｒ及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９９６）Ｃｅｌｌ，８７：１５９−１７０）。我々のシステムは、β−カテニンがＡＰＣ変異細胞中で迅速に分解しないという利点がある。Ｇａｌ４融合タンパク質でさえ、ＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニンタンパク質は、ＡＰＣ依存分解経路を経由して除去された（図３Ｂ）。このイベントにおける重要な事実は、このシステムにおけるβ−カテニンが、それが産出遺伝子発現を活性化し及びＡＰＣ依存経路を経由して分解可能である限り、完全長の野生型タンパク質である必要が無いことである。この２−ハイブリッドシステム用のβ−カテニンタンパク質の最少成分は、ＧＳＫ−３β用のリン酸化サイト、ＡＰＣ及びＴｃｆ４のための結合ドメインである。β−カテニンの最終アルマジロドメイン後のＣ末端部分は、この部分が転写活性機能を有すると認められるときには必要ない。それは、ＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニンの親和力がＡＰＣに対して好適であり得、Ｅ−カドヘリンに対しては好適でない場合、アルマジロ構造の数種の部分を消去又は変異することによりシステムをより効率的にする。ＶＰ１６／Ｔｃｆ４に関しては、Ｎ末端β−カテニン結合ドメインは２−ハイブリッドシステム用のＴｃｆ４タンパク質からの唯一の必要なドメインである。このＤＮＡ結合ドメインのトランケーションは、不必要な遺伝子発現の可能性を、核中のＴｃｆ一致シーケンスを認識するＶＰ１６／Ｔｃｆ４により減じることができる。少なくとも、ｐＡＣＴ／ＦＬ−Ｔｃｆ４及びＴｏｐ　Ｆｌａｓｈ（Ｋｏｒｉｎｅｋ等（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７８４−１７８７）プラスミドのコトランスフェクションは、重要なＴｃｆコンセンサスシーケンスをベースとする遺伝子トランスアクティベーションを何も誘発しない（データは示さない）。他の起こり得るイベントは、ＤＮＡ上のＴｃｆ４はβ−カテニンなしでｇｒｏｕｃｈｏとの複合物を形成するのでＶＰ１６／Ｔｃｆ４の過剰発現が非所望の遺伝子活性化を生じず、そして遺伝子転写アクティベーターよりもターゲット遺伝子サプレッサーとして作用するということである。さらに、ＧＡＬ４融合タンパク質及びＶＰ１６融合タンパク質発現用の機能性Ｔｃｆ４応答性エレメントを有するプロモーターを使用することにより大腸癌細胞のためのこの治療方法の選択性を改良することは可能であり、そのためこれらのタンパク質の発現レベルは大腸癌細胞中で選択的に高い。サイクリンＤ１（Ｔｅｔｓｕ及びＭｃＣｏｒｍｉｃｋ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ，３９８：４２２−４２６）又はｃ−ｍｙｃ（Ｈｅ等（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：１５０９−１５１２）プロモーターは、この目的のために良い候補である。
【０１９７】
より安全なプロトコルとして、１度に全ての成分を導入する代わりに、ＶＰ１６／ＦＬ−Ｔｃｆ４及びｐＧ５／ｐ５３−ＥＧＦＰ構造は、青蛍光タンパク質（ＢＦＰ）のような数種のマーカー発現プラスミドを用いて、ＧｅｎｅＧｕｎを用いた感染性ＲＮＡのような方法（Ｍａｎｄｌ等（１９９８）Ｎａｔ　Ｍｅｄ．，４：１４３８−１４４０）又はＶＰ１６／ＦＬ−Ｔｃｆ４の十分な発現レベルを得るためのアデノウイルスデリバリーシステムを使用して、初めに導入されなければならない。遺伝子の第一セット発現レベルを確認後、ＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニンは、産出遺伝子の発現レベルをマニピュレートできる方法を使用することにより（すなわちＴｃｆ４応答性エレメント−ドライブ化プロモーターを用いて）、導入されなければならない。遺伝子デリバリーよりも早いＧＡＬ４−β−カテニンタンパク質の発現を行うために、ＴＡＴ−ｔａｇ融合タンパク質を使用することも魅力的な選択である（Ｎａｇａｈａｒａ等（１９９８）Ｎａｔ　Ｍｅｄ．，４：１４４９−１４５２）。ＧＡＬ４／ＷＴ−β−カテニンの量により産出遺伝子の発現レベル処理し、患者における副作用を防ぎ得ることは、遺伝子治療のための２−ハイブリッドシステムの非常に重要な利点である。産出遺伝子の発現レベルが厳重に調整される限りにおいては、産出遺伝子についての選択が広くなり得る、すなわちｐ５３、Ｂａｘ、ヘルペス、単純ウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、カスパーゼなどである。
【０１９８】
より広い視点から、このシステムは、タンパク質分解疾患を含みかつ異常に蓄積されたタンパク質が相互作用パートナーを有する疾患に関しては大腸癌以外の他の疾患にも適用できる。その上、２−ハイブリッド部分が特定の信号変換用のバイオセンサーとして働くことができ及びインビボでのイベント、すなわち血中グルコース濃度の増加を検出する場合、そのイベントをモジュレートする遺伝子は、産出遺伝子、すなわち糖尿病患者についてのインスリン又はインスリンレセプターとして選択されることができる。
【０１９９】
本明細書中に記載される例及び具体例は単に例証の目的であり、そしてそれらの権利の範囲内の種々の改変及び変化が当業者に提案でき、そしてそれは本出願の精神及び範囲及び添付される特許請求の範囲の領域に含まれる。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願は、その全体が全ての目的について参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、β−カテニン／Ｔｃｆ４哺乳動物２−ハイブリッドシステムを用いた遺伝子治療の概念を表す。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃは、本発明の２−ハイブリッドシステムを表す。
【図３】図３Ａ及び図３ＢはＡＰＣ依存性の選択的な発現及びＳＷ４８細胞における２−ハイブリッド成分タンパク質の検出を表す。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、細胞質β−カテニンの発現、Ｇａｌ４融合タンパク質分解生成物の検出、及びターゲット細胞のＡＰＣプロファイルに依存する選択的な遺伝子発現を表す。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃはｐ５３応答ルシフェラーゼ発現の活性化及びｐ５３−ＥＧＦＰの検出を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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