(57)【要約】本発明はアロステリック制御部位を有するアルファ／ベータ（α／β）分子の結合力を調節する物質および方法を提供する【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＦＡ−１またはそのＩドメイン−含有フラグメントでない最初の分子と結合対分子の間の結合相互作用を調節する方法であって、その最初の分子がα／βドメイン構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子を、最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
ＬＦＡ−１またはそのＩドメイン−含有フラグメントでない最初の分子と結合対分子の間の結合相互作用を調節する方法であって、その最初の分子がα／βドメイン構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子とアロステリックエフェクター分子を接触させるステップを含み、そのアロステリックエフェクター分子がジアリール化合物を含み、そのジアリール化合物がその最初の分子とその結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進する方法。
【請求項３】
ＬＦＡ−１またはそのＩドメイン−含有フラグメントでない最初の分子と結合対分子の間の結合相互作用を調節する方法であって、その最初の分子がα／βドメイン構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子とアロステリックエフェクター分子を接触させるステップを含み、そのアロステリックエフェクター分子がジアリールスルフィド化合物およびジアリールアミド化合物からなる群より選択され、そのアロステリックエフェクター分子がその最初の分子とその結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進する方法。
【請求項４】
最初の分子がロスマンフォールドを構成し、そのロスマンフォールドがアロステリック制御部位を有する請求項１、２または３の方法。
【請求項５】
最初の分子のロスマンフォールドが ３２１４５６位 または ２３１４５６位 にβシート・ストランドの配向性を有するβシートを含む請求項４の方法。
【請求項６】
最初の分子のロスマンフォールドが ３２１４５６７位 にβシート・ストランドの配向性を有するβシートを含む請求項４の方法。
【請求項７】
最初の分子のロスマンフォールドが ３２１４５位 にβシート・ストランドの配向性を有するβシートを含む請求項４の方法。
【請求項８】
最初の分子がＩドメイン構造を有する請求項１、２または３の方法。
【請求項９】
最初の分子がＡドメイン構造を有する請求項１、２または３の方法。
【請求項１０】
最初の分子と結合対分子間の結合相互作用を調節する方法であって、その最初の分子が図１に説明されるようにＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がα／β構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子を、最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と接触させる段階を含む方法。
【請求項１１】
最初の分子と結合対分子間の結合相互作用を調節する方法であって、その最初の分子が図１に説明されるようにＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がα／β構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子とアロステリックエフェクター分子の接触段階を含み、そのアロステリックエフェクター分子がジアリール化合物を含み、そのジアリール化合物が、その最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進する方法。
【請求項１２】
最初の分子と結合対分子間の結合相互作用を調節する方法であって、その最初の分子が図１に説明されるようにＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がα／β構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子とアロステリックエフェクター分子の接触段階を含み、そのアロステリックエフェクター分子がジアリールスルフィド化合物およびジアリールアミド化合物からなる群より選択され、そのアロステリック制御分子が、その最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進する方法。
【請求項１３】
最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に関して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する請求項１０、１１または１２の方法。
【請求項１４】
最初の分子がロスマンフォールドを有し、そのロスマンフォールドが構造がアロステリック制御部位を含む請求項１０、１１または１２の方法。
【請求項１５】
最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に関して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する請求項１４の方法。
【請求項１６】
最初の分子のロスマンフォールドが ３２１４５６ または ２３１４５６ 部位にβシート・ストランドを有するβシートを含む請求項１４の方法。
【請求項１７】
最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に関して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する請求項１６の方法。
【請求項１８】
最初の分子のロスマンフォールドが ３２１４５６７ 部位にβシート・ストランドを有するβシートを含む請求項１４の方法。
【請求項１９】
最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に関して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する請求項１８の方法。
【請求項２０】
最初の分子のロスマンフォールドが ３２１４５ 部位にβシート・ストランドを有するβシートを含む請求項１４の方法。
【請求項２１】
最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に関して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する請求項２０の方法。
【請求項２２】
最初の分子がＩドメイン構造を有する請求項１０、１１または１２の方法。
【請求項２３】
最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に関して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する請求項２２の方法。
【請求項２４】
最初の分子がＡドメイン構造を有する請求項１０、１１または１２の方法。
【請求項２５】
最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメイン・アミノ酸配列に関して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する請求項２４の方法。
【請求項２６】
最初の分子と結合対分子間の結合を増加させる最初の分子のリガンド結合ドメインにおいて、モジュレーターが立体配位を促進する請求項１から３、５から７、１０から１２、１５から２１、２３または２５のいずれか一つの方法。
【請求項２７】
最初の分子と２番目の分子間の結合の増加が、最初の分子の酵素活性の増加を生じる請求項２６の方法。
【請求項２８】
最初の分子と結合対分子間の結合を増加させる最初の分子のリガンド結合ドメインにおいて、モジュレーターが立体配位を促進させる請求項１から３、５から７、１０から１２、１５から２１、２３または２５のいずれか一つの方法。
【請求項２９】
最初の分子と２番目の分子間の結合の増加が、最初の分子の酵素活性の増加を生じる請求項２８の方法。
【請求項３０】
最初の分子が表１に掲げるタンパク質から選択される請求項１から３、５から７、１０から１２、１５から２１、２３または２５のいずれか一つの方法。
【請求項３１】
最初の分子が真核分子である請求項３０の方法。
【請求項３２】
最初の分子がヒト分子である請求項３０の方法。
【請求項３３】
最初の分子が原核分子である請求項３０の方法
【請求項３４】
最初の分子が細菌分子である請求項３０の方法
【請求項３５】
最初の分子がαＭβ２、補体タンパク質Ｃ２、補体タンパク質因子Ｂ、αＥβ７、α４β７、αＶβ３、α４β１、αｄβ２、フォンウィルブランド因子、Ｒａｃ−１、ＨＰＰＫ、ｆｔｓＺ、およびＥＮＲからなる群より選択される請求項３０の方法。
【請求項３６】
最初の分子がαＭβ２、結合対タンパク質がフィブロノーゲンである請求項３５の方法。
【請求項３７】
最初の分子がαＭβ２、結合対タンパク質がｉＣ３ｂである請求項３５の方法。
【請求項３８】
最初の分子がαＥβ７、結合対タンパク質がＥ−カドヘリンである請求項３５の方法。
【請求項３９】
最初の分子がα４β７、結合対タンパク質がＭａｄＣＡＭ−１である請求項３５の方法。
【請求項４０】
最初の分子がαＶβ３、結合対タンパク質がビトロネクチンである請求項３５方法。
【請求項４１】
最初の分子がα４β１、結合対タンパク質がＶＣＡＭである請求項３５の方法。
【請求項４２】
最初の分子がαｄβ２、結合対タンパク質がＶＣＡＭである請求項３５の方法。
【請求項４３】
最初の分子がフォンウィルブランド因子、結合対タンパク質がｇｐＩｂである請求項３５の方法。
【請求項４４】
最初の分子が補体タンパク質Ｃ２、結合対タンパク質が補体タンパク質Ｃ４ｂである請求項３５の方法。
【請求項４５】
最初の分子が補体タンパク質因子Ｂ、結合対タンパク質が補体タンパク質Ｃ３ｂである請求項３５の方法。
【請求項４６】
最初の分子がＲａｃ−１、結合対がＧＴＰである請求項３５の方法。
【請求項４７】
最初の分子がＨＰＰＫ、結合対がＡＴＰまたはＨＭＤＰである請求項３５の方法。
【請求項４８】
最初の分子がｆｔｓＺ、結合対がＧＴＰである請求項３５の方法。
【請求項４９】
最初の分子がＥＮＲ、結合対がＮＡＤＨである請求項３５の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアロステリック制御部位を有するアルファ／ベータ（α／β）分子の結合力を調節する物質および方法に関する。
【０００２】
【発明の技術的背景】
タンパク質のアルファ／ベータ（α／β）ドメイン・スーパーファミリーには、特異的な折りたたみ構造によって識別される約９７ファミリーが含まれる。スーパーファミリーのタンパク質は一般的にＴＩＭバレル、ホースヘッド型折りたたみ、もしくは中心のベータシートがアルファヘリックスで取り巻かれ、かつ平行、逆平行または混合配位に配置された多重ベータストランド・ドメインから形成されるベータ−アルファ−ベータ構造のような特有の折りたたみ構造を有する。
【０００３】
インテグリンＩドメイン、Ａドメイン構造を有するフォンウィルブランド因子、および各種の酵素からなるタンパク質を含むスーパーファミリー中の多くのファミリーは、タンパク質の３次元構造中に折りたたみを生じさせる開螺旋状ベータシートを有する。この折りたたみは一般にロスマンフォールド、ロスマン様フォールド、またはジヌクレオチド結合フォールドと呼ばれる。多くの機能的に異なるタンパク質はロスマンフォールドを有し、ＳＣＯＰ、ＳＭＡＲＴ、またはＣＡＴＨデータベースを用いることにより識別することができる。原型的なロスマンフォールドはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのＮＡＤＰ結合部位において見出される。
【０００４】
多くのロスマンフォールドは中心のベータシートの「上面」に機能的部位を有する。例えば、インテグリンＩドメイン、Ｒｈｏ／Ｒａｃ　ＧＴＰアーゼ、およびヘテロ三量体ＧＴＰアーゼ中のこの部位は、配位された金属イオンを結合することができる。少なくともいくつかのインテグリンＩドメインでは、結合イオンは結合リガンドと重要な直接接触を形成し、この金属結合部位は金属イオン従属結合部位（ＭＩＤＡＳ）を意味する。他のタンパク質の金属結合部位も、例えばＧＴＰアーゼへのＧＴＰ／ＧＤＰ結合、および細菌タンパク質ＥＮＲへの補因子（例えば、ＮＡＤおよびＦＡＤ）を含むリガンド結合の基部である。以前の研究で、ＧＴＰアーゼ、ＬＦＡ−１［Ｈｕｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ （ＵＳＡ）９７：５２３１−５２３６ （２０００）］、Ｍａｃ−１［Ｏｘｖｉｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｓ． Ｎａｔｌ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９６： ２２１５−２０ （１９９９）］およびアルファ２［Ｅｍｓｌｅｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １０１： ４７−５６ （２０００）］を含む、少なくとも数種のタンパク質について、ＭＩＤＡＳ領域におけるリガンド結合がタンパク質の活性および不活性部位間の配位変化を要求することが示された。
【０００５】
インテグリンＩドメイン構造は詳細に特色づけられる。Ｉドメイン構造が識別されるインテグリンの中で、主要なアミノ酸配列を比較すると異なるインテグリンファミリーメンバーにおいて総合的な相同性が非常に幅広く変化しうることが示される。こうした相同性における相違にもかかわらず、いくつかの残基は多くのインテグリンにおいて高度に保護される。さらに、アミノ酸配列の相同性において観察される相違が、個々のサブユニットまたはヘテロダイマー中の四次元構造内部におけるＩドメイン三次元構造の実際の相違を引き起こすか否かは不明である。
【０００６】
αＭ［Ｌｅｅ ａｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ８０： ６３１−６３８ （１９９５）］、αＬ［Ｑｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４： ９３１−９４２ （１９９６）］、α１［Ｒｉｃｈ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４： ２４９０６−２４９１３ （１９９９）］、およびα２［Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２： ２８５１２−２８５１７ （１９９７）］のＩドメインは結晶化されており、そのため従来予想されていた機能領域の詳細な分析が可能となった。αＭ結晶構造は、中心となる疎水性のベータシート頂上に沿って形成されるリガンド結合溝を有するロスマンフォールドであることが明確に確認されており、そこにおいてベータシートは多数の両親媒性αヘリックスで取り囲まれている［Ｄｉｃｋｅｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， ５４： ５５６−５６６ （１９９８）］。以前の観察と一致して、αＭおよびαＬの結晶Ｉドメインは両方ＭＩＤＡＳ領域を含むことが示されている。
【０００７】
結晶αＭＩドメインの一般的構造を観察するとαＬの結晶構造と相互に関係するようである。これら観察はリガンド結合が起こる前にαＬが不活性状態から活性状態への変換を受けることを明確に示している。この観察はＮＭＲ研究によって立証され、Ｉドメイン内であるがＭＩＤＡＳ領域の末端である第２領域だけでなくαＬ ＭＩＤＡＳ領域領域におけるアミノ酸残基の位置的不安定化を、αＬＩドメインへのＩＣＡＭ−１が要求することが示された［Ｈｕｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９７： ５２３１−５２３６ （２０００）］。
【０００８】
この第２領域の位置指定性突然変異誘発は、残基がＩＣＡＭ−１結合部位の一部ではない、すなわちこれらの残基が直接リガンドに作用するのではなく、少なくとも部分的には、ＩＣＡＭ−１結合を調節する役割を果たすことを示している。この領域を含むアミノ酸残基はＩドメインのアロステリック部位（ＩＤＡＳ）［Ｉｄ．］を意味し、この領域は小さな分子で調節される機能的に適切な配位へと誘導を受けおよび／または誘導することが要求される。もし総合的な三次元構造が他のタンパク質のＩまたはＡドメイン中で保護されれば、そのような部位はこれらタンパク質のリガンド結合を調節する魅力的な標的を提供する。
【０００９】
さらに、αＶβ３とインテグリンの全細胞外領域の結晶構造が、最近報告された［Ｃｏｕｓｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９３： １７４３−１７４６ （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ７， ２００１）］。結晶構造はすべてのインテグリンのベータ・サブユニットがＩドメインを有するという予想を確認する。なぜならこのＩドメインはインテグリン機能の調節に関係させられるからであり、これらタンパク質のリガンド結合を調節する付加的潜在的部位である。このような調節部位の同定は、リガンドに結合するモジュレーター、例えばアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる手段を提供する。このようなモジュレーターの同定により、α／βタンパク質の異常な活性と結びつけられる無数の病理上の状態を防御、軽減することができる化合物を提供する。
【００１０】
それ故、機能と一次構造の広い多様性を持つα／βタンパク質の、それらの生物学的活性に影響を与える調節方法に関する技術が求められている。
【００１１】
【発明の概要】
一面において、本発明はＬＦＡ−１またはそれ自身Ｉドメインを含む断片でない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がα／βドメイン構造を有し、そのα／β構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。ここでの使用に関し、分子についての「α／β構造」という用語は、例えばαおよびβサブユニットと呼ばれる多数のサブユニットを持つ分子を表すのに必要ではない特徴的構造を有する分子の一般的分類を意味する。しかし、この分子の一般的分類はαおよびβサブユニットと呼ばれる多数のサブユニットを持つ分子を含みうる。さらに本発明はＬＦＡ−１またはそれ自身Ｉドメインを含む断片でない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がα／βドメイン構造を有し、そのα／β構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子をアロステリックエフェクター分子と接触させるステップを含み、そのアロステリックエフェクター分子がジアリール化合物を含み、そのジアリール化合物が、最初の分子とその結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進する方法を提供する。別の一面において、本発明はＬＦＡ−１またはそれ自身Ｉドメインを含む断片でない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がα／βドメイン構造を有し、そのα／β構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子をアロステリックエフェクター分子と接触させるステップを含み、そのアロステリックエフェクター分子がジアリールスルフィド化合物およびジアリールアミド化合物からなる群より選択され、そのアロステリックエフェクター分子が最初の分子とその結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進する方法を提供する。
【００１２】
一つの具体例において、本発明の方法はロスマンフォールド構造を有する最初の分子を利用し、そのロスマンフォールド構造はアロステリック制御部位を有する。ここでの使用に関し、ロスマンフォールド構造という用語は、この技術分野で知られているように、ロスマン様フォールド構造およびジヌクレオチドフォールド構造を含む。その方法において、最初の分子のロスマンフォールド構造は ３２１４５６ または ２３１４５６位に配位するβシート・ストランドを有するβシートを含む。選択的には、最初の分子のロスマンフォールド構造は ３２１４５６７位に配位するβシート・ストランドを有するβシートを含む。別の一面において、最初の分子のロスマンフォールド構造は３２１４５位に配位するβシート・ストランドを有するβシートを含む。ここでの使用に関し、配位という用語は平行、逆平行、または混合配置におけるβシートの個々のストランドの位置を意味する。望ましくは、本方法はＩドメイン構造またはＡドメイン構造を有する最初の分子を用いる。
【００１３】
本発明はさらに最初の分子と結合対分子間の結合相互作用を調節する方法であって、その最初の分子が図１に示されたＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がα／β構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子を、最初の分子と結合対分子間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と接触させるステップを含む方法を提供する。本発明のアロステリック制御部位にはＩＤＡＳドメインのみならず「Ｉ様ドメイン」または「ＩＤＡＳ様ドメイン」も含まれる。ここでの使用に関し、Ｉ様ドメインおよびＩＤＡＳ様ドメインという用語は（ＭＩＤＡＳを含む分子中の）ＭＩＤＡＳ領域から単離される（すなわち、識別される）調節部位を意味し、それ自体は完全なＩドメインを含む必要はないが、最初の分子と結合対分子間の結合を増加または減少させる小さな分子によって調節される機能的に適切な配位変化を受けおよび／または誘導する、リガンド、基質または補因子結合部位から単離される（すなわち、識別される）。別の一面において、本発明は最初の分子と結合対分子間の結合相互作用を調節する方法であって、その最初の分子が図１に示されたＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がα／β構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子とアロステリックエフェクター分子を接触させるステップを含む方法であって、そのアロステリックエフェクター分子がジアリール化合物を含み、そのジアリール化合物が、最初の分子と結合対分子間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進する方法を提供する。さらに別の一面において、本発明は最初の分子と結合対分子間の結合相互作用を調節する方法であって、その最初の分子が図１に示されたＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がα／β構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子とアロステリックエフェクター分子を接触させるステップを含む方法であって、そのアロステリックエフェクター分子がジアリール化合物およびジアリールアミド化合物からなる群より選択され、そのアロステリックエフェクター分子が、最初の分子と結合対分子間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進する方法を提供する。好ましい具体例において、各方法は最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。別の一面において、最初の分子はロスマンフォールド構造を有し、そのロスマンフォールド構造がアロステリック制御部位を有し、かつ最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。別の一面において、本発明の方法はそのロスマンフォールド構造が３２１４５６または ２３１４５６位に配位するβシート・ストランドを有するβシートを含む最初の分子を利用し、かつ最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。別の一面において、本発明の方法はそのロスマンフォールド構造が ３２１４５６７位に配位するβシート・ストランドを有するβシートを含むタンパク質を利用し、かつ最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。別の一面において、本発明の方法はそのロスマンフォールド構造が ３２１４５位に配位するβシート・ストランドを有するβシートを含む最初の分子を利用し、かつ最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。好ましくは、最初の分子がＩドメイン構造を有し、かつ最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。もう一つの好ましい具体例において、最初の分子がＡドメイン構造を有し、かつ最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【００１４】
本発明の方法において、モジュレーターは最初の分子と結合対分子間の結合を増加させる最初の分子のリガンド結合ドメインにおいて立体配座を促進し、かつ一面において、最初の分子と２番目の分子の間の結合の増加は、最初の分子の酵素活性の減少を引き起こす。
【００１５】
本発明の方法は、ＩまたはＡドメイン、Ｇタンパク質、ヘテロトリメリックＧタンパク質、および管状ＧＴＰアーゼを含む他のタンパク質のみならず表１に示されるタンパク質を含む群から選択される最初の分子の利用を含む。好ましくは、本発明の方法は表１に示されるタンパク質を含む群から選択される最初の分子を利用する。一面において、最初の分子は真核分子である。別の一面において、最初の分子は原核分子である。一つの具体例として、最初の分子は細菌分子である。
【００１６】
より好ましくは、最初の分子はαＭβ２、補体タンパク質Ｃ２、補体タンパク質因子Ｂ、αＥβ７、α４β７、αＶβ３、α４β１、αｄβ２、フォンウィルブランド因子、Ｒａｃ−１、ＨＰＰＫ、ｆｔｓＺ、およびＥＮＲからなる群より選択される。
【００１７】
ここで、これらの方法においては、
最初の分子がαＭβ２であり結合対タンパク質がフィブリノーゲン；
最初の分子がαＭβ２であり結合対タンパク質がｉＣ３ｂ；
最初の分子がαＥβ７であり結合対タンパク質がＥ−カドヘリン；
最初の分子がα４β７であり結合対タンパク質がＭａｄＣＡＭ−１；
最初の分子がαＶβ３であり結合対タンパク質がビトロネクチン；
最初の分子がα４β１であり結合対タンパク質がＶＣＡＭ；
最初の分子がαｄβ２であり結合対タンパク質がＶＣＡＭ；
最初の分子がフォンウィルブランド因子であり結合対タンパク質がｇｐＩｂ；
最初の分子が補体タンパク質Ｃ２であり結合対タンパク質が補体タンパク質Ｃ４ｂ；
最初の分子が補体タンパク質因子Ｂであり結合対タンパク質が補体タンパク質Ｃ３ｂ；
最初の分子がＲａｃ−１であり結合対がＧＴＰ；
最初の分子がＨＰＰＫであり結合対がＡＴＰまたはＨＭＤＰ；
最初の分子がｆｔｓＺであり結合対がＧＴＰ；および
最初の分子がＥＮＲであり結合対がＮＡＤＨである。
【００１８】
［発明の詳細な説明］
一面において、本発明はＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメインを含む断片でない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がα／βドメイン構造を有し、そのα／β構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。ここでの使用に関し、「結合対分子」という用語はリガンド、基質、および補因子を含み、その結合は最初の分子の１つまたはそれ以上の生物学的活性に影響を与えることを要求される。ＬＦＡ−１のＩドメイン・フラグメントは（ｉ）ＬＦＡ−１のＩドメイン、または（ｉｉ）ＬＦＡ−１Ｉドメインの生物学的に活性な特徴を維持したＬＦＡ−１のＩドメインの一部を有する、ＬＦＡ−１のポリペプチド部分または断片（すなわち、図２に示されるＬＦＡ−１の全長以下であるポリペプチド）である。ＬＦＡ−１Ｉドメインの一つもしくはそれ以上の生物学的活性を複製し、またはそれに作用するペプチド類似物を含むＬＦＡ−１Ｉドメインの合成類似物は、この定義に含まれる。α／βスーパーファミリーは、中心のベータシート・ドメインが一つまたはそれ以上のアルファ・ヘリックス・ドメインによってシートの側面に位置するベータ−アルファ−ベータ構造を有するタンパク質を含む。
【００１９】
別の一面において、本発明はＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメインまたは類似物を含む断片でない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がロスマンフォールド構造を有し、そのロスマンフォールド構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するロスマンフォールド構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。タンパク質中のロスマンフォールド構造は、タンパク質の個々のベータシート・ドメインが平行、逆平行、または混合配位のいずれかに配位されるベータシート構造を含む。本発明の好ましい一面として、最初の分子のベータシートは個々のベータシート・ストランドに含まれる。個々のベータシートへの数に関する指示は、最初のタンパク質の一次アミノ酸配列におけるそれらの位置によって決定され、最初のベータシート・ストランドはタンパク質配列のアミノ端末に最も近い位置にある。ロスマンフォールド構造はさらにリガンド結合フォールド、空隙、またはベータシート構造の「頂上」に通常位置するベータシートの三次元構造における部位によって特徴づけられる。
【００２０】
別の一面において、本発明はＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメインまたは類似物を含む断片またはでない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がロスマンフォールド構造を有し、そのロスマンフォールド構造が ３２１４５６ または ２３１４５６位に配位するβストランドを有するβシートとアロステリック制御部位を含み、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するロスマンフォールド構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。別の一面において、本発明はＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメインまたは類似物を含む断片でない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がロスマンフォールド構造を有し、そのロスマンフォールド構造が ３２１４５６７位に配位するβストランドを有するβシートとアロステリック制御部位を含み、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するロスマンフォールド構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。本発明はまたＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメインまたは類似物を含む断片またはでない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がロスマンフォールド構造を有し、そのロスマンフォールド構造が ３２１４５位に配位するβストランドを有するβシートとアロステリック制御部位を含み、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するロスマンフォールド構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。最初の分子における個々のベータシートに対する数的指示は上記の通りである。
【００２１】
別の一面において、本発明はＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメインまたは類似物を含む断片またはでない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がＩドメイン構造を有し、そのＩドメイン構造がアロステリック制御部位を含み、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するＩドメイン構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。Ｉドメイン構造は当該技術分野において、多数のインテグリン中に確認されるドメインによって実証されるように、約２００のアミノ酸を含むことが知られている［Ｄｉｃｋｅｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ５４： ５５６−５６６ （１９９８）］。
【００２２】
本発明はさらにＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメインまたは類似物を含む断片またはでない最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がＡドメイン構造を有し、そのＡドメイン構造がアロステリック制御部位を含み、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するＡドメイン構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。Ａドメインのモチーフは当該技術分野においてＩドメインと相同性を共有することが知られており、フォンウィルブランド因子中に見出されるドメインによって実証されている。
【００２３】
本発明はさらに最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列［図１に表示］に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がα／βドメイン構造を有し、そのα／βドメイン構造がアロステリック制御部位を含み、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するα／βドメイン構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。ここでの使用に関し、同一性はデフォルト・パラメーターを用いるベイシックＢＬＡＳＴ解析を使用して計算される。
【００２４】
パーセント同一性の値は図１に示した全ＬＦＡ−１Ｉ配列に交差するアミノ酸残基と、最初の分子における同一または類似の長さのアミノ酸残基領域の１対１対応を反映する。本発明の方法のもう一つの具体例において、最初の分子はＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【００２５】
さらに別の一面において、本発明は最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列［図１に表示］に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がロスマンフォールド構造を有し、そのロスマンフォールドドメイン構造がアロステリック制御部位を含み、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するロスマンフォールドドメイン構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。本発明の方法のもう一方の具体例において、最初の分子はＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【００２６】
別の一面において、本発明は最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列［図１に表示］に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子が ３２１４５６ または ２３１４５６位に配位するβシート・ストランドを有するロスマンフォールド構造とアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するロスマンフォールドドメイン構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。本発明の方法のもう一方の具体例において、最初の分子はＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【００２７】
さらに別の一面において、本発明は最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列［図１に表示］に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がロスマンフォールド構造を有し、そのロスマンフォールド構造が３２１４５６７位に配位するβシート・ストランドを有するロスマンフォールド構造とアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するロスマンフォールドドメイン構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。本発明の方法のもう一方の具体例において、最初の分子はＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【００２８】
本発明はさらに最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列（図１に表示）に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がロスマンフォールド構造を有し、そのロスマンフォールド構造が ３２１４５位に配位するβシート・ストランドを有するロスマンフォールド構造とアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するロスマンフォールドドメイン構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。本発明の方法のもう一方の具体例において、最初の分子はＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【００２９】
本発明の方法はさらに最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列［図１に表示］に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がＩドメイン構造を有し、そのＩドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するＩドメイン構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。本発明の方法のもう一方の具体例において、最初の分子はＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【００３０】
別の一面において、本発明の方法は最初の分子とその結合対分子間の結合相互作用の調節方法であって、その最初の分子がＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列［図１に表示］に対して約９０％未満の同一性を示すアミノ酸配列を有し、その最初の分子がＡドメイン構造を有し、そのＡドメイン構造がアロステリック制御部位を有し、その方法が最初の分子と結合対分子との間の結合を調節するＡドメイン構造のリガンド結合ドメインにおいて、そのアロステリック制御部位に作用し、立体配座を促進するアロステリックエフェクター分子と、最初の分子を接触させるステップを含む方法を提供する。本発明の方法のもう一方の具体例において、最初の分子はＬＦＡ−１Ｉドメインのアミノ酸配列に対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。
【００３１】
本発明のそれぞれの方法において、最初の分子とその結合対分子間の結合を増加させる最初の分子のリガンド結合ドメインにおいて、モジュレーターは立体配座を促進する。選択的には、最初の分子とその結合対分子間の結合を減少させる最初の分子のリガンド結合ドメインにおいて、モジュレーターは立体配座を促進する。好ましくは、本発明の方法は表１に掲げられた分子、さもなくばここで表された分子からなる群より選択される最初の分子を含む。より好ましくは、本発明の方法はαＭβ２、補体タンパク質Ｃ２、補体タンパク質因子Ｂ、αＥβ７、α４β７、αＶβ３、α４β１、αｄβ２、フォンウィルブランド因子、Ｒａｃ−１、ＨＰＰＫ、ｆｔｓＺ、およびＥＮＲからなる群より選択される最初の分子を利用する。さらに好ましくは、本発明の方法と組成物はジアリール化合物をモジュレーターとして使用する。より好ましくは、本発明の方法と組成物はジアリールスルフィド化合物およびジアリールアミド化合物から選択されるモジュレーターを使用する。最も好ましくは、本発明の方法と組成物はジアリールスルフィド化合物をモジュレーターとして使用する。
【００３２】
最初の分子がαＭβ２である本発明の方法において、好ましい結合対タンパク質はフィブリノーゲンであり、好ましいモジュレーターは表２に掲げられる化合物Ｓ、化合物Ｒ、化合物Ｎ、化合物Ｏ、化合物Ｐ、化合物Ｑ、化合物Ｌ、化合物Ｖ、化合物Ｆ、化合物ＡＡ、および化合物ＡＣからなる群より選択される。最初の分子がαＭβ２である本発明の方法において、別の好ましい結合対タンパク質はｉＣ３ｂであり、好ましいモジュレーターは化合物Ｈ、化合物Ｉおよび化合物Ｃからなる群より選択される。最初の分子がαＥβ７である本発明の方法において、好ましい結合対タンパク質はＥ−カドヘリンであり、好ましいモジュレーターは表２に掲げられる化合物から選択される。最初の分子がα４β７である本発明の方法において、好ましい結合対タンパク質はＭａｄＣＡＭ−１である。最初の分子がαＶβ３である本発明の方法において、好ましい結合対タンパク質はビトロネクチンである。最初の分子がα４β１である本発明の方法において、好ましい結合対タンパク質はＶＣＡＭである。最初の分子がαｄβ２である本発明の方法において、好ましい結合対タンパク質はＶＣＡＭである。最初の分子がフォンウィルブランド因子である本発明の方法において、好ましい結合対タンパク質はｇｐＩｂである。最初の分子が補体タンパク質Ｃ２である本発明の方法において、好ましい結合対タンパク質は補体タンパク質Ｃ４ｂである。最初の分子が補体タンパク質因子Ｂである本発明の方法において、好ましい結合対タンパク質は補体タンパク質Ｃ３ｂである。最初の分子がα１β１、α２β１、α１１β１のいずれかである本発明の方法において、好ましい結合対はコラーゲンである。最初の分子がα２β１である本発明の方法において、好ましい結合対はコラーゲンであり、好ましいモジュレーターは表２に掲げられる化合物の群から選択される。最初の分子がＲａｃ−１である本発明の方法において、好ましい結合対はＧＤＰ／ＧＴＰであり、好ましいモジュレーターはＧＴＰである。最初の分子がＨＰＰＫである本発明の方法において、好ましい結合対はＡＴＰまたはＨＭＤＰである。最初の分子がｆｔｓＺである本発明の方法において、好ましい結合対はＮＡＤＨである。最初の分子がＥＮＲである本発明の方法において、好ましい結合対はＧＴＰである。
【００３３】
本発明の方法は、天然資源または異種タンパク質として分子を分泌するように改質された細胞から得られる、最初の分子、結合対分子もしくはその両方が単離されたタンパク質である、または結合断片自身を含む。本発明の方法はさらに異種タンパク質として分子を分泌する細胞表面、または異種タンパク質として分子を分泌するように改質された細胞表面において分泌される、最初の分子または結合断片自身、結合対分子または結合断片自身の利用を含む。ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ法が予想される。
【００３４】
ｉｎ ｖｉｖｏ法としては最初の分子と結合対分子間の異常な結合活性に起因する病理上の状態を軽減かつ／または予防することが期待される。例えば、（ｉ）全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー病、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板性紫斑、およびラスムッセン脳炎を含む抗原／補体沈殿物を伴う疾病；（ｉｉ）虚血性再灌流損傷を伴う疾病、卒中、心筋梗塞、心肺バイパス、急性低血液量性疾患、腎不全、および同種移植術；（ｉｉｉ）アルツハイマー病のような中枢神経系異常、多様な動脈硬化；（ｉｖ）トラウマ、化学的または熱的損傷、および異種移植術のような多種多様な適応を含む、不適切な補体活性化と関連づけられる疾病を、本発明の方法が軽減かつ／または予防することが期待される。
【００３５】
さらに、アルファ１、アルファ２、およびアルファ１１の阻害剤はガンの治療に有効であることも期待される。転移の間、腫瘍細胞は管内遊出および続く管外遊出に先立ち細胞外マトリックスを通過する必要がある。これら領域を通じた移動はインテグリン活性に依存する。加えて、モノクローナル抗体［Ｌｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ． １０： ２７１−２８２ （１９９９）］を用いたα１もしくはα２のブロッキング、またはノックアウトマウス［Ｐｏｚｚｉ， ａｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９７： ２２０２−２２０７ （２０００）］におけるα１活性の除去はマトリックス中のメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）レベルの変化を生じることが示されている。ＭＭＰは様々な種類のガンにおいて役割を果たすと考えられている細胞外のマトリックス−損傷酵素である［Ｎｅｌｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １８： １１３５−１１４９ （２０００）を参照］。ＭＭＰの阻害剤は最近、多くの種類のガンの治療において治療上の有効性が試験されている。今日までのところ、ＭＭＰの阻害剤はヒトへの試用においては動物モデルにおけるほど効果的ではない。インテグリン活性の阻害によるＭＭＰ発現の調節は、異なるＭＭＰレベルの特異的な調節およびα１、α２、またはα１１発現細胞に対するこのＭＭＰ調節の特異的標的化によって、より効果的であることを証明することができる。
【００３６】
特に、アルファ１１は慢性関節リウマチ患者からの滑膜中のマクロファージのサブセットにおいてのみならず、粥状硬化性プラーク中の泡のようなマクロファージとして現れることが明らかになっている。マクロファージに運ばれる非活性単球中には全く発現は認められない。アルファ１１／リガンド結合相互作用の阻害は、それ故様々な炎症過程と関連づけられる移動を抑制かつ／またはマクロファージの事象を伝えることについて役に立つ。従って、アルファ１１の阻害剤はアテローム性動脈硬化および慢性関節リウマチを含む炎症性疾患の治療に役立つことが示された。
【００３７】
同様に、アルファ１およびアルファ２インテグリンは励起を起こすある種の細胞（Ｔ細胞および単球を含む）において調節されていることが示された。モノクローナル抗体を用いたアルファ１またはアルファ２とそれらのリガンドとの間のブロッキング相互作用は、遅延型アレルギー、接触型アレルギーおよび関節炎のマウスモデルにおいて炎症反応を阻害することも示されている［ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０５： ７２１−７２９ （２０００）］。アルファ１およびアルファ２のアンタゴニストは、細胞移動、細胞増殖、およびマトリックス・メタロプロテイナーゼ３、腫瘍壊死因子アルファ並びにインターロイキン−１のような炎症性メディエーター産生の阻害を含む様々なメカニズムを通して炎症を阻害する。従って、アルファ１およびアルファ２の会合（リガンド結合）の低分子阻害剤またはアンタゴニスト、例えばアロステリックエフェクター分子は関節炎、線維性疾患およびガンのような炎症性疾患の治療に役立つ。
【００３８】
線維性疾患状態は不適切に活性化されたある種の細胞による線維性細胞外マトリックスの過剰な産生によって特徴づけられる。線維性細胞外マトリックスのメカニズムは、少なくとも部分的には、α／βタンパク質活性を含むと考えられている。従って、α／βタンパク質の阻害によって、本発明は浮腫性硬化（限局性強皮症、全般性強皮症、線形浮腫性硬化）、ケロイド、瘢痕ケロイド、偽肉腫症様筋膜炎、好酸球性筋膜炎、デュピュイトラン拘縮、腎線維症、肺線維症、化学療法／放射線誘導性肺線維症、動脈硬化性プラーク、炎症性腸疾患、クローン病、関節炎、浸潤性乳ガン、皮膚線維腫、内皮細胞圧出、血管脂肪腫、血管平滑筋腫、サルコイドーシス、硬変、突発性間質性肺疾患、突発性肺線維症（４つの病理上の種類）、肺症候群に結びつくコラーゲン血管病、クリプトジニック器質化性肺炎、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、好酸球性肉芽腫、医原性肺疾患、塵肺（石綿肺、珪肺）、過敏性肺炎（農夫肺、愛鳥家肺など）、間質性肺線維症、化学肺炎、過敏性肺炎、並びに同様の疾患を含む各種の線維性疾患の治療および予防のための方法および組成物を提供する。
【００３９】
細菌タンパク質に関しては、ＥＮＲがすでに抗結核薬および広スペクトラム性殺菌剤トリクロサンの標的となっている。低分子はそれ故抗結核薬において有用である。また、ＥＮＲおよびＤａｐＢ阻害剤の活性スペクトラムはグラム陰性阻害剤として有用である。さらに、細菌ではＥＲＡ−ＧＴＰアーゼが高度に保護されているため、阻害剤は浸透性に依存して広スペクトラムの細菌に対して有用である。加えて、様々な細菌タンパク質の阻害剤はグラム陰性細菌を含む細菌性疾患および未知の細菌病原菌による感染の治療に有用である。
【００４０】
スルホンアミドのような他の化学療法剤は、新生葉酸生合成経路を阻害することにより細菌の成長を阻害する［Ｍａｎｄｅｌｌ ａｎｄ Ｐｅｔｒｉ， Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ， Ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ−ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌ， Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ， ａｎｄ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｕｒｉｎａｒｙ Ｔｒａｃｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ， ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ （Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ ｅｄｓ．， １９９６）］。抗葉酸療法の第一の終点は、葉酸の細胞内プールを使い果たさせることにより、チミジン量が不十分になることによるＤＮＡ複製の阻害を引き起こすことである［Ｈｉｔｃｈｉｎｇｓ ａｎｄ Ｂａｃｃａｎａｒｉ， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｏｌａｔｅ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ａｓ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ， ｉｎ Ｆｏｌａｔｅ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ （１９８４）］。６−ハイドロキシメチル−７，８−ジヒドロプテリン・ピロホスホキナーゼ酵素（ＨＰＰＫ）は新生葉酸生合成経路において、ピロリン酸のＡＴＰから６−ハイドロキシメチル−７，８−ジヒドロプテリン（ＨＭＤＰ）への転移を触媒する［Ｒｉｃｈｅｙ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ．， ２４４： １５８２−１５９２ （１９６９）］。
ＨＰＰＫはグラム陽性およびグラム陰性細菌、真菌、および原生動物において認められるがより高度な真核生物においては認められず、抗葉酸活性を持つ抗生物質の発展に対して重要なターゲットとなっている。ＨＰＰＫの阻害により、本発明は様々な細菌並びに真菌感染を治療および予防する方法と組成物を提供する。
【００４１】
ｆｔｓＺは細胞分裂に関連する基礎的細菌遺伝子の産生物である。ｆｔｓＺはＧＴＰを結合および加水分解し、ＧＴＰと結びつくと長い直線性の高分子を形成する。ｆｔｓＺのＧＴＰ依存性重合は細菌の細胞分裂におけるその機能と関連づけられる。中隔形成の間、ｆｔｓＺは細胞分裂の程度を決める環を形成する。ｆｔｓＺを欠く細胞はセプテーションを行うことができず、分割せずに死滅する。ｆｔｓＺは細菌界では高度に保護されている（約６０％）。従って、ｆｔｓＺの阻害によって、本発明の組成物と方法は広スペクトラムな抗生物質を提供する。ｆｔｓＺの原子構造はそれがアルファ／ベータタンパク質であることを示している［Ｎｏｇａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５： ４５１−４５８］。
【００４２】
ｖＷＦ結合のモジュレーターは、心筋梗塞（ＭＩ）および血栓性卒中のような血栓性血管疾患の治療に有用である。ｖＷＦ Ａ１−ドメイン結合アンタゴニストの急速投与は、不安定急性扁桃炎、次のＰＴＣＡまたはステント・プレースメント（ｓｔｅｎｔ ｐｌａｃｅｍｅｎｔ）のような高リスク患者における冠状動脈閉塞のリスクを減少させることができる。いくつかのｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、最近このような状況下で臨床的使用が認可されている（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標）、イトラフィバン、シブラフィバン）。これら薬剤は効果的であるが、使用すると出血が伴うため、有効量が制限される。もしＡ−１ドメイン阻害剤の出血という副作用を抑制すれば、血管閉塞のリスクを持つ個人に長期に渡って用いることが可能となる。このような個人には急性扁桃炎、跛行、およびＭＩまたは卒中の経歴のある患者が含まれる。ｖＷＦ代謝の異常は血栓性血小板減少性紫斑病において閉塞性血栓の原因であり、この状況下でＡ１ドメイン阻害剤も有用であることが示される。
【００４３】
Ｒａｃ１、Ｒａｃ２およびＲａｃ３は低分子量（約２２から２５ｋＤａ）ＧＴＰアーゼのＲａｓスーパーファミリーのメンバーであり、それらの多くはα／βタンパク質である［Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｐｅｒｋｉｎｓ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３５８：２８３ （１９９５）； Ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：８８８ （１９８８）； Ｗｏｒｔｈｙｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０８：６８２ （２０００）］。一次アミノ酸配列を比較すると、Ｒａｃタンパク質の全体的同一性は約８８から約９２％の一致である。Ｒａｃ１とＲａｃ２タンパク質は細胞の存続、増殖、転移、および活性酸素（ＲＯＳ）産生において極めて重要な役割を果たすことが知られている［Ｓｙｍｏｎｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ６：６６８ （１９９５）； Ｓｃｉｔａ， ＥＭＢＯ Ｊ．，１９（１１）：２３９３（２０００）］。細胞増殖の調整、Ｒａｃグアニン・ヌクレオチド変換反応のアンタゴニスト、そして特に、Ｔｉａｍ１存在下にＲａｃ１のＧＴＰへのＧＤＰの変換に影響する低分子におけるＲａｃタンパク質の重要性のために、本発明の方法と組成物は興味深いと考えられる。
【００４４】
上記事項を考慮して、本発明はＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメインまたは類似物を含む断片ではない最初の分子とその結合対分子間の異常な結合に起因する状態を軽減しまたは予防する方法であって、その最初の分子が表１に掲げられるタンパク質群から選択されるα／βタンパク質であって、その方法が最初の分子と結合対分子間の結合のモジュレーターの有効用量を、必要とする個人に投与するステップを含む方法を提供する。ここでの使用に関し、有効用量という用語は意図する目的を達成するのに十分なモジュレーター量の投与を意味する。より明確には、「治療上の有効用量」は治療しようとする患者を治療もしくは病状の進行を予防し、または患者の既存の症状を軽減するのに十分な量を意味する。
有効用量の決定は、特にここにおける詳細な開示を考慮すると、十分に当該技術分野の能力の範囲内である。
【００４５】
一面において、本発明はα／βタンパク質がロスマンフォールドを有する場合の治療方法を提供する。別の一面において、ターゲットタンパク質中のロスマンフォールドが、中心となるβシート構造を形成する５、６または７つのβストランドを有する治療方法が提供される。ロスマンフォールドが５つのβストランドを含む場合、個々のストランドの位置は上記のように３２１４５位であることが好ましい。ロスマンフォールドが６つのβストランドを含む場合、個々のストランドの位置は上記のように３２１４５６位または２３１４５６位であることが好ましい。ロスマンフォールドが７つのβストランドを含む場合、個々のストランドの位置は上記のように３２１４５６７位であることが好ましい。
本発明の治療方法は最初の分子が図１に示されたＬＦＡ−１のＩドメイン・アミノ酸配列に対して約９０％未満の同一性を示す方法を含む。好ましくは、最初の分子がＬＦＡ−１のＩドメインに対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。本発明のこの一面における目的のための配列同一性は、例えば、デフォルト・パラメーターを使用するベイシック・ＢＬＡＳＴ調査解析を用いて計算される。
【００４６】
本発明の方法はまた、ＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメイン断片ではない最初の分子とその結合対分子間の結合のモジュレーターを識別する方法であって、最初の分子が表１に掲げられるタンパク質からなる群より選択され、その方法が試験化合物の存在下または非存在下における最初の分子と結合対分子間の結合、および試験物質の非存在下における結合と比較した、試験化合物の存在下における最初の分子と結合対分子間の結合中の変化が検出された時、結合モジュレータとしての試験化合物を測定するステップを含む方法を提供する。一面において、本発明の方法はα／βタンパク質がロスマンフォールドを有する方法を提供する。別の一面において、本発明の方法はターゲットタンパク質中のロスマンフォールドが、中心となるβシート構造を形成する５、６または７つのβストランドを有する方法を提供する。ロスマンフォールドが５つのβストランドを有する場合、個々のストランドの位置は上記のように３２１４５位であることが好ましい。ロスマンフォールドが６つのβストランドを有する場合、個々のストランドの位置は上記のように３２１４５６位または２３１４５６位であることが好ましい。ロスマンフォールドが７つのβストランドを有する場合、個々のストランドの位置は上記のように３２１４５６７位であることが好ましい。本発明の方法は、最初の分子が図１に示されたＬＦＡ−１のアミノ酸配列に対して約９０％未満の同一性を示す方法を含む。好ましくは、最初の分子がＬＦＡ−１のＩドメインに対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。本発明のこの一面における目的のための配列同一性は、例えば、例えば、デフォルト・パラメーターを使用するベイシック・ＢＬＡＳＴ調査解析を用いて計算される。
【００４７】
本発明はまたＬＦＡ−１またはそれ自身のＩドメインでない最初の分子と結合対分子間の結合のモジュレーターであって、最初の分子が表１に掲げられるタンパク質からなる群より選択されるα／βタンパク質であるものを提供する。別の一面において、モジュレーターはロスマンフォールドを有するα／βタンパク質の結合に影響を与える。別の一面において、ターゲットタンパク質におけるロスマンフォールドが中心となるβシート構造を形成する５、６または７つのβストランドを有する場合に、結合に影響を与えるモジュレーターが提供される。ロスマンフォールドが５つのβストランドを有する場合、個々のストランドの位置は上記のように３２１４５位であることが好ましい。ロスマンフォールドが６つのβストランドを有する場合、個々のストランドの位置は上記のように３２１４５６位または２３１４５６位であることが好ましい。
ロスマンフォールドが７つのβストランドを有する場合、個々のストランドの位置は上記のように３２１４５６７位であることが好ましい。最初の分子が図１に示されたＬＦＡ−１のアミノ酸配列に対して約９０％未満の同一性を示すためのモジュレーターも提供される。好ましくは、好ましくは、最初の分子がＬＦＡ−１のＩドメインに対して約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％未満のパーセント同一性を示すアミノ酸配列を有する。本発明のこの一面における目的のための配列同一性は、例えば、例えば、デフォルト・パラメーターを使用するベイシックＢＬＡＳＴ調査解析を用いて計算される。
【００４８】
本発明はまたモジュレーターを含む組成物を提供する。好ましい組成物は医薬組成物である。本発明の医薬組成物は本発明の１つまたはそれ以上の本発明のモジュレーターを含み、好ましくは薬学的に許容しうる担体または希釈剤をさらに含む。ここでの使用に関し「薬学的に許容しうる担体」という用語は、感受性のある動物、好ましくはほ乳類、より好ましくはヒトを取り扱うのに適切であり、合理的な有用性／リスク比に釣り合った毒性、炎症、またはアレルギー反応を有し、意図した目的に効果的な化合物を意味する。
【００４９】
本発明はまたプロドラッグとして存在するモジュレーターも提供する。ここでの使用に関し「プロドラッグ」という用語は、例えば加水分解によって、ｉｎ ｖｉｖｏで親化合物または活性モジュレーター化合物に急速に変化する化合物を意味する。徹底的な検討は、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｄ． Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、および Ｒｏｃｈｅ（ｅｄ）， Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８７ においてなされており、いずれもここでは参照として取り入れられている。プロドラッグ設計については一般的に Ｈａｒｄｍａ， ｅｔ ａｌ．，（Ｅｄｓ）， Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， 第９版， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９６）， ｐｐ．１１−１６ の中で論ぜられている。明らかに、薬物の投与についで身体からの排泄、または薬物の生物学的活性が減少もしくは除去されるある種の生物学的変換が起こる。選択的には、生物学的変換過程は当初投与された薬物と比較してより活性または同等に活性な代謝副産物へと薬物を導く。
これら生物学的変換過程さらなる理解により、つづく生物学的変換過程によって、変化した状態でより生理学的に活性となるいわゆる「プロドラッグ」の設計が可能となる。プロドラッグはそれ故生物学的に活性な代謝物に変換される薬理学的に不活性な化合物である。ある種の形式においてプロドラッグは、例えば、エステルまたはアミド結合の加水分解の加水分解、しばしばプロドラッグへの官能基の導入もしくは脱離を通して薬理学的に活性となる。このように調整された薬物は、例えば循環半減期が増加する結果、化合物の薬理学的性質をさらに増大させる水溶性包合物を形成するために内因性化合物とも反応する。
【００５０】
一方、プロドラッグはその官能基に、例えばグルクロン酸硫酸、グルタチオン、アミノ酸、または酢酸と共有修正を受けるように設計することができる。その結果生じた包合物は不活性であり尿中に排泄され、または親化合物よりも強力な化合物に誘導される。高分子量包合物は胆汁中に排泄され、酵素分解の対象となり、循環中に戻され、そのために元々投与された化合物の生物学的半減期を効果的に増加させる。
【００５１】
本発明の化合物は不斉またはキラル中心を有する立体異性体として存在する。立体異性体はキラル炭素原子の周りの置換基の配置によって”Ｓ”または”Ｒ”と呼ばれる。立体異性体の混合物は本発明によって意図される。立体異性体には鏡像異性体、ジアステレオマー、およびそれらの混合物が含まれる。本発明の化合物の個々の立体異性体は不斉もしくはキラル中心を有する商業的に利用可能な出発物質から合成的に、またはラセミ混合物を調製し、当該技術分野で周知の単離、分割技術を用いて調製することができる。分割技術には、（１）鏡像異性体混合物のキラル補助物への結合、その結果生じた混合物の再結晶化またはクロマトグラフィーによる単離、および光学的に純粋な産生物の補助物からの単離；（２）光学的に活性な再溶解剤を用いた塩形成；（３）キラルクロマトグラフィーカラム上の鏡像異性体混合物の直接単離、が含まれる。
【００５２】
本発明の薬学的組成物は適切な投与経路によってヒトおよび他の動物に投与することが可能である。例えば、組成物は経口的、直腸的、非経口的、脳糟内的、経膣的、腹腔内的、局所的（粉末、軟膏、またはドロップとして）、口腔的、または点鼻的に投与することができる。ここでの使用に関し、「非経口的」という用語は静脈内、動脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、包膜内、皮下並びに関節内注射および注入を含む投与モデルを含む。
【００５３】
非経口投与用の本発明の薬学的組成物は、使用直前に無菌で注射可能な溶液または分配剤へ再構成可能な無菌粉末のみならず、薬学的に許容しうる無菌の水溶性または非水溶性溶液、分配剤、懸濁剤もしくは乳化剤を含む。適切な水溶性および非水溶性の担体、希釈剤、溶剤、賦形剤の例には水、エタノール、（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび類似物のような）ポリオール、適切な混合物自身、（オリーブ油のような）植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが含まれる。例えばレシチンのようなコーティング剤の使用、分散剤の場合には要求される粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適度な流動性が保たれる。
【００５４】
これら組成物は防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤のような補助剤を含むことが可能である。微生物の働きの防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸のような様々な抗菌および抗真菌剤の配合によって達成される。注射可能な薬学的剤形の吸収の延長はステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅らせる薬剤の配合によって達成される。
【００５５】
注射可能なデポ剤はポリアクチド−ポリグリコシドのような生分解性ポリマーでマイクロカプセル・マトリックスを形成することにより調製される。薬物のポリマーに対する比率、および用いられる特定ポリマーの性質に依存して薬物の放出速度を制御することが可能である。他の生分解性ポリマーにはポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。注射可能なデポ剤処方は生体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによっても調製される。
【００５６】
注射剤の処方は、例えば細菌またはウイルス捕捉フィルターを通過させることによって、または使用直前に無菌水もしくは他の無菌注射用溶媒中に溶解もしくは分散させることが可能な無菌の固形組成物において殺菌剤を含むことによって滅菌される。
【００５７】
経口投与用の固体剤形としてカプセル、錠剤、丸剤、粉末、および顆粒が含まれる。これら固体剤形では、活性化合物は少なくとも１種の不活性で薬学的に許容しうる、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムのような賦形剤または担体、かつ／または（ａ）デンプン、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、およびケイ酸のような充填剤または増量剤、（ｂ）例えばカルボキシメチルセルロース、ゴム（例えばアルギン酸塩、アラビアゴム）、ゼラチン、ポリビニリピロリドンおよびセルロースのような結合剤、（ｃ）グリセロールのような湿潤剤、（ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ポテトまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤、（ｅ）パラフィンのような溶解遅延剤、（ｆ）第四級アンモニウム化合物のような吸収促進剤、（ｇ）例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤、（ｈ）カオリン、ベントナイト粘土のような吸収剤、（ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物のような滑沢剤と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤をも含む。
【００５８】
類似タイプの固体組成物は、高分子量ポリエチレングリコールおよび類似物のみならず乳糖のような賦形剤を用いることにより、ソフトまたはハード充填ゼラチンカプセルにおいて充填物として使用される。
【００５９】
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒といった固体剤形は薬学的製剤技術分野において周知である腸溶コーティングや他のコーティングのようなコーティングまたは殻を用いることにより調製することができる。それらは任意にオパシファイ剤（ｏｐａｃｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を含み、活性成分のみを、優先的には腸管の一部で、任意に、遅延方法により放出する組成物となりうる。
【００６０】
典型的な素材として、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）のように商業的に利用可能なｐＨ感受性溶解性を有するポリマーが含まれる。使用可能な埋め込み組成には高分子化合物やロウが含まれる。
【００６１】
活性化合物は任意に、上記賦形剤の１種またはそれ以上と共にマイクロカプセルとすることも可能である。
【００６２】
経口投与用の液体剤形には薬学的に許容しうる乳剤、溶液、懸濁剤、シロップおよびエリキシル剤が含まれる。液体剤形は活性成分に加えて、当該技術分野において通常用いられる、例えば水やその他の溶剤のような不活性な希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチルベンジルアルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルマミド、油（特に、綿実、グランドナッツ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、チェストナッツ、およびゴマの油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール並びにソルビタン脂肪酸エステルのような可溶化剤および乳化剤を含む。
【００６３】
不活性な希釈剤のほか、経口用組成は湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、芳香剤、および香料のような補剤を含むこともできる。
【００６４】
懸濁剤は活性成分に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶化セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガント、およびそれらの混合物を懸濁化剤として含む。
【００６５】
直腸または膣投与用の組成物は、好ましくは本発明の化合物と、室温では固体でるが体温で液体となるココアバター、ポリエチレングリコールまたは座薬用ロウのような非刺激性の賦形剤または担体を混合して調製される座剤である。従って、これらの担体は直腸または膣内で溶解し、活性成分が放出される。
【００６６】
本発明の化合物はまたリポソームの形態でも投与することができる。当該技術分野において知られているように、リポソームは一般的にはリン脂質またはその他の脂質成分から得られる。リポソームは水性溶液中で分散する液体結晶で水和された単層または多層によって形成される。無毒で、生理学的に許容でき、かつ代謝可能な脂質であればリポソームの形成に用いることが可能である。リポソーム形態の本組成物は、本発明の化合物に加えて安定化剤、防腐剤、賦形剤等を含むことが可能である。好ましい脂質はリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）であり、天然および合成のいずれであってもよい。リポソームの形成方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ， Ｅｄ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ＸＩＶ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９７６）， ｐ．３３ 以下を参照。
【００６７】
本発明の化合物は無機または有機酸から得られる薬学的に許容しうる塩の形態でも用いることができる。「薬学的に許容しうる塩」には適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等がなく、かつ合理的な利益／リスク比に相応であり、ヒトおよびより下等な動物の組織に用いることにてきした塩を含む。薬学的に許容しうる塩は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓ． Ｍ．Ｂｅｒｇｅ， ｅｔ ａｌ．， ｄｅｓｃｒｉｂｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ−ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔｓ ｉｎ ｄｅｔａｉｌ ｉｎ Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ６６：１ （１９７７） はそっくりそのまま引用することによってここに組み込まれる。その塩類は、ｉｎ ｓｉｔｕで本発明の化合物の最終的な単離および精製の間に、または遊離塩基性官能基の適切な酸との反応によって個々に調製される。代表的な酸付加塩には酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、カンフル塩、カンフル硫酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸、亜硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタン硫酸塩（イソチオ硫酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレン硫酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、過硫酸塩、ペクチン酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、トリメチル酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、炭酸水素塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。
薬学的に許容しうる酸付加塩を形成するのに用いられる酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸のような無機酸と、シュウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸のような有機酸が含まれる。
【００６８】
塩基性の窒素含有基は、例えばメチル、エチル、プルピル、およびブチル塩化物、臭化物並びにヨウ化物を含む低級アルキルハロゲン化合物；ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル硫酸塩のようなジアルキル硫酸塩；デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル塩化物、臭化物並びにヨウ化物のような長鎖ハロゲン化合物；ベンジルおよびフェネチル臭化物等のようなアリールアルキルハロゲン化合物、といった試薬によって四級化されうる。水もしくは油可溶性の、または可分散性の化合物はそのようにして得ることができる。
【００６９】
塩基付加塩はｉｎ ｓｉｔｕで本発明の化合物の最終的な単離および精製の間に、カルボン酸を含む部分と水酸化物、塩基薬学的に許容しうる金属カチオンの炭酸塩または炭酸水素塩、またはアンモニアもしくは有機第一級、第二級または第三級アミンのような適切な塩基の反応により得ることができる。薬学的に許容しうる塩基付加塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、並びにアルミニウム等のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属に基づくカチオン、およびアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン等を含む無毒性第四級アンモニウムおよびアミンカチオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。塩基付加塩の形成に役立つその他の代表的有機アミンにはエチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン等が含まれる。
【００７０】
本発明の化合物の局所投与用の剤形には粉末、スプレー、軟膏および吸入剤が含まれる。活性化合物は無菌状態下、薬学的に許容しうる担体、必要とされる保存剤、緩衝剤、または噴射剤と混合される。眼科の処方である眼軟膏、眼粉末および点眼液も本発明の範囲内のものとして予想される。
【００７１】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の用量は、個々の患者、状態、および投与方式にとって治療上の効果を達成するために十分な活性化合物量を得るために変化させることができる。選択された投与量は個々の化合物の活性、投与経路並びに処理される状態の過酷さ、および治療を受ける患者の状態および医学的前歴に依存する。しかし、所望の治療上の成果を達成するために要求されるよりも少ないレベルから化合物量を開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加することは、当該技術分野における技術範囲内である。
【００７２】
一般的な用量として約０．１から約１０００ｍｇ、約０．５から約５００ｍｇ、約１から約２５０ｍｇ、約１．５から約１００ｍｇ、好ましくは約５から約２０ｍｇ／体重ｋｇ／日の活性化合物が経口的にまたは静脈内に哺乳動物患者に投与される。必要とあれば、有効１日用量は投与の目的のために多数回、すなわち１日２回から４回の用量に分けることができる。
【００７３】
本発明の化合物の有効性が調査され、例えばＥＣ５０やＬＣ５０のようなパラメーターで表される。ここでの使用に関し、ＥＣ５０という用語は細胞アッセイにおいて５０％の活性を阻害するのに必要な有効濃度を意味する。ここでの使用に関し、ＩＣ５０という用語は生化学的アッセイにおいて５０％のタンパク質活性を阻害するのに要求される濃度を意味する。ここでの使用に関し、ＬＤ５０という用語は毒性アッセイにおいて一定期間内に５０％の細胞を殺すのに必要な化合物の濃度を意味する。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８４】
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【００８５】
2004511496.tif 000044
【００８６】
2004511496.tif 000045
【００８７】
2004511496.tif 000046
【００８８】
【表２Ａ】
2004511496.tif 000047
【００８９】
【表２Ｂ】
2004511496.tif 000048
【００９０】
【表２Ｃ】
2004511496.tif 000049
【００９１】
【表２Ｄ】
2004511496.tif 000050
【００９２】
【表２Ｅ】
2004511496.tif 000051
【００９３】
【表２Ｆ】
2004511496.tif 000052
【００９４】
【表２Ｇ】
2004511496.tif 000053
【００９５】
【表２Ｈ】
2004511496.tif 000054
【００９６】
【表２Ｉ】
2004511496.tif 000055
【００９７】
【表２Ｊ】
2004511496.tif 000056
【００９８】
【表２Ｋ】
2004511496.tif 000057
【００９９】
【表２Ｌ】
2004511496.tif 000058
【０１００】
【表２Ｍ】
2004511496.tif 000059
【０１０１】
【表２Ｎ】
2004511496.tif 000060
【０１０２】
本発明は以下の実施例により説明される。
【０１０３】
【実施例１】
アルファ／ベータタンパク質およびアロステリック制御部位の確認
本発明はＬＦＡ−１またはＩドメインを含むフラグメント自身ではない分子の確認方法であって、その分子がα／βドメイン構造を含み、そのα／β構造がアロステリック制御部位を有する方法も提供する。そのような分子がアロステリックエフェクター分子と接触すると、例えばＩドメインアロステリック制御部位のようなアロステリック制御部位は、最初の分子とその結合対分子間の結合を調節するα／β構造のリガンド結合部位において、立体配座を促進するためにアロステリックエフェクター分子と相互作用する。
【０１０４】
アロステリック制御部位は、例えば、被験タンパク質と公知のアロステリック制御部位を有するタンパク質を比較することによって確認することができる。例えば、アロステリック制御部位を有するα／βタンパク質は、前もって決められた三次元構造に類似するタンパク質を確認することができるＮＣＢＩベクター配列サーチツール（または”ＶＡＳＴ”サーチ）のようなサーチツールを用いることにより確認することができる ［Ｇｉｂｒａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃ． Ｂｉｏｌ． ６：３７７−３８５ （１９９６）、全部を引用されることによりここに組み込まれる；Ｍａｄｅｊ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２３：３５６−３６９ （１９９５）全部を引用することによりここに組み込まれる］。これらの方法に関して、ＬＦＡ−１はＩドメインアロステリック制御部位を有することが知られているために比較または照会タンパク質として使用される。
同様に、アロステリック制御部位を有することが知られている他のα／βタンパク質は、Ｉドメインアロステリック制御部位をもつ他のα／βタンパク質を確認するための参照として使用される。一つの具体例として、ＶＡＳＴ価が７もしくはそれ以上の、またはＰ値が０．００５もしくはそれ以下のタンパク質はさらなる調査を保証するための比較タンパク質と十分に関連すると定義される。
【０１０５】
アロステリック制御部位は構造上の二重性を予測するアルゴリズムを用いることによっても定義される［Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８： １７５２−１７６４ （１９９９）、全部を引用されることによりここに組み込まれる；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ ８（９）： １８０６−１８１５ （１９９９）、全部を引用されることによりここに組み込まれる］。二重性構造予測（ＡＳＰ）として言及されるこのアルゴリズムは、アミノ酸配列情報から三次元構造的再配列領域を予測する。このアルゴリズムは二次的構造予測アルゴリズム、プロファイル・ネットワーク・プレディクション・ハイデルベルグ（ＰＨＤ）からの判断確率を、構造的二重性配列要素を同定するために用いる［Ｒｏｓｔ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｉｌ． ２６６： ５２５−５３９ （１９９６）、全部を引用されることによりここに組み込まれる］。α／βドメイン中の平均残基二重性価の標準偏差−１．７５以下のＺ価をもつ残基は、本発明に従って有用な類型のアロステリック制御部位と一致すると理解される。
【０１０６】
例えば、表３はインテグリンα／βドメインおよびそれらに近い類似物は、２つの典型例ＬＦＡ−１およびＭａｃ−１に関して、約１０またはそれ以上の高ＶＡＳＴ価、および約０．０００９またはそれ以下のＰ値を有することを示す。さらに、表３は構造的に二重の配列要素（ＳＡＳＥ）が、これらドメインのための公知のまたは予想されるＣ末端固定体機構と一致することを示す。従って、これらのおよび他の緊密に関連したこの型のドメインは典型的ＩＤＡＳを有すると予想される。さらに、表３に掲げられた計算によって示されるように、ＲｈｏＡのようなＲａｓスーパーファミリーメンバーのいくつかおよびＥＮＲのような酵素も典型的ＩＤＡＳを有すると予想される。
【０１０７】
加えて、ＶＡＳＴ分析で示されるように、より距離が離れて関連するいくつかの非インテグリンα／βドメインは、典型的インテグリンＩＤＡＳから全く異なると思われる部位にＳＡＳＥを有する。これらα／βドメインはジアリール化合物のような小さな分子で調節することが可能なＩＤＡＳ様部位を有する。
【０１０８】
多くのα／βドメインは３５％未満のアミノ酸同一性を共有する。それ故、照会配列とドメイン配列のデータベースを比較するウェブ・ベースの簡易モジュラー構造調査ツールであるＳＭＡＲＴ［Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２８： ２３１−２３４ （２０００）、参照として全部を引用されることによりここに組み込まれる；Ｐｏｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７： ２２９−２３２ （１９９９）、全部を引用されることによりここに組み込まれる；Ｓｃｈｕｌｔｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５： ５８５７−５８６４ （１９９８）、全部を引用されることによりここに組み込まれる］は付加的相違ファミリーメンバーを同定するために使用される。ＳＭＡＲＴは代表的ファミリーメンバーの多数のシーケンス配列を利用する。これらの配列は手動で最適化され、シーケンスデータベースを調査するのに使用することのできる隠れたＭａｒｋｏｖモデルの世代が続く。明確に類似したシーケンスは配列に加えられ、次の調査に使用できるモデルを洗練する。従って、ＳＭＡＲＴデータベースは関心のある付加的α／βドメインの同定源として、アロステリック制御部位の存在を分析するために使用される。
【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
【実施例２】
ＣＤ１１ｂＩドメイン突然変異体
Ａ．ＣＤ１１ｂＩドメインにおける突然変異の発生
Ｉドメインにおける突然変異をもつＣＤ１１ａ変異体も用いた従来の結果［Ｈｕｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９７： ５２３１−５２３６ （２０００）］を考慮し、結合対であるＩＣＡＭ−１およびｉＣ３ｂに対して増加した親和性をもつＣＤ１１ｂ変異体を同定する試みにおいて、突然変異はＣＤ１１ｂ中に導入された。
【０１１１】
６つの突然変異をＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて発生させた。これらの変異体はＡｓｐ１５６（Ｄ１５６Ａ）、Ｖａｌ２５４（Ｖ２５４Ａ）、Ｇｌｕ３２７（Ｑ３２７Ａ）、Ｉｌｅ３３２（Ｉ３３２Ａ）、Ｐｈｅ３３３（Ｆ３３３Ａ）およびＧｌｕ３３６（Ｅ３３６Ａ） のＡｌａへの単独変化を含む。簡単に言えば、２つの突然変異性オリゴヌクレオチドを合成し、ＣＤ１１ｂの全長を鋳型としてＰＣＲ法で使用した。変異体Ｄ１５６Ａ、Ｖ２５４Ａ、Ｑ３２７Ａ、およびＩ３３２Ａに対するＰＣＲ条件は９５℃・３０秒の１サイクル、次いで９５℃・３０秒、５０℃・１分、および６０℃・１８分の１６サイクルが続く。変異体Ｆ３３３ＡおよびＥ３３６Ａ対するＰＣＲ条件は、最終延長ステップを１６サイクル中６８℃・２０分で実行することを除いて同じである。ＰＣＲ完了後、メチル化された非変異性鋳型ＤＮＡは３７℃で１時間ＤｐｎＩを作用させて消化し、変異したＣＤ１１ｂＤＮＡは製造者に示されたプロトコールに従ってスーパーコンポーネントＸＬ１ Ｂｌｕｅ Ｃｅｌｌｓ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を変化させるのに用いた。カルボマイシン抵抗性コロニーを採取し、液体培地で培養し、その後プラスミドＤＮＡを単離し、挿入をシーケンスした。全長変異体を有するクローンから、遺伝子の５’部分を含む１．３ｋｂ ＳａｃＩ／ＥｃｏＲＶ断片が親ベクターへサブクローンした。これらのサブクローンからの挿入は、接合部の無傷および突然変異の存在を証明するためにシーケンスした。
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Ｂ．ＣＯＳ−７トランスフェクション
ＣＯＳ細胞をＣＤ１８／ｐＤＣと野生型ＣＤ１１ｂまたは変異型ＣＤ１１ｂのいずれかと共トランスフェクションした。トランスフェクションは本質的には従来の方法で実施した［Ｈｕｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９７： ５２３１−５２３６ （２０００）］。
Ｃ．ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析は抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体ＴＭＧ６−５［Ｄｉａｍｏｎｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２０： １０３１−１０４３ （１９９３）］を、ＣＤ１１ｂ発現を確認するために用いた以外は従来の方法［Ｈｕｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９７： ５２３１−５２３６ （２０００）］で実施した。
Ｄ．ＣＯＳトランスフェクション細胞と固定化ＩＣＡＭ−１またはｉＣ３ｂを用いた接着分析　接着分析は修正法［Ｓａｄｈｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２： ４２９−４４０ （１９９４）］を用いて９６ウェルＥａｓｙ Ｗａｓｈプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）中で行った。各ウェルを５０ｍＭ炭酸水素緩衝液（ｐＨ ９．６）中濃度として、５０μＬのグリコフォリン（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（１０μｇ／ｍＬ）、ＩＣＡＭ−１／Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）、ｉＣ３ｂ（３μｇ／ｍＬ）、もしくは抗ＣＤ１８モノクローナル抗体（ＴＳ１／１８、５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（４４ＡＡＣＢ［ＡＴＣＣ］、５μｇ／ｍＬ）、または緩衝液のみにより４℃で一晩コートした。プレートを１ウェル当たり２００μＬのＤ−ＰＢＳで２回洗浄し、Ｄ−ＰＢＳ中濃度として１％ＨＳＡを用いて室温で１時間かけてブロックした。ウェルは１００μＬの接着緩衝液（ＲＰＭＩおよび５．０％非活性ＦＢＳを含む）で１回リンスし、１００μＬの接着緩衝液を各ウェルに加えた。コントロール抗体（ＩｇＧ（５ａ）７．２、６０μｇ／ｍＬ）、ブロッキング抗体（４４ＡＡＣＢ、６０μｇ／ｍＬ）または６０μｇ／ｍＬの活性化抗体２４０Ｑ［Ｈｕｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９７： ５２３１−５２３６ （２０００）］と共に、またはこれらなしでさらに１００μＬの接着緩衝液を各ウェルに加え、その後接着緩衝液中のＣＯＳ−７トランスフェラーゼ（０．７５×１０６細胞／ｍＬの１００μＬ）を各ウェルに加えた。ＩＣＡＭ−１結合のために３７℃で３０分またはｉＣ３ｂ結合のために１５分プレートをインキュベートした。接着細胞は１ウェル当たりＤ−ＰＢＳ中濃度として１４％グルタールアルデヒド５０μＬを加え、室温で１．５時間インキュベートした。プレートを蒸留水で洗浄し、１０％エタノール中濃度として０．５％クリスタルバイオレット１００μＬを用いて室温で５分間染色し、蒸留水で数回洗浄した。洗浄後、７０％エタノールを加え、接着細胞をＳＰＥＣＴＲｍａｘ ２５０ マイクロプレート吸光光度計システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を使用して５７０ｎｍおよび４１０ｎｍの吸光度を測定することによって定量した。細胞結合のパーセンテージは以下の式を用いて算出した。
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その結果、ＩＣＡＭ−１およびｉＣ３ｂに結合する野生型ＣＤ１１ｂは、それぞれ３．１％および２６．４％であった。変異体Ｖ２５４Ａ、Ｑ３２７Ａ、およびＩ３３２ＡはＩＣＡＭ−１（それぞれ１１４．７％、１０５．１％、および１２３．１％の野生型レベル）とｉＣ３ｂ（それぞれ１４７．１％、１４０．５％、および２０５．２％）に対して、それぞれ著しく高い結合を示したが、一方変異体Ｆ３３２ＡとＥ３３６ＡはＩＣＡＭ−１（それぞれ１．１％と０．７％）とｉＣ３ｂ（それぞれ４．９％と４．３％）に対して、それぞれ著しく低い結合を示した。ＩＣＡＭ−１と高度に結合する変異体は、それ故ＩＣＡＭ−１結合が増加する結果としてより高いシグナル−ノイズ比を与えることによって、ＩＣＡＭ−１へのＣＤ１８／ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）の結合を阻害する化合物を同定するのに有用である。
【０１１２】
【実施例３】
ＣＤ１１ｂアンタゴニストの同定
様々なジアリール化合物がＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１の結合を阻害することは以前の研究により明らかである。この観察と上記実施例１の結果を考慮し、おそらくＣＤ１１ｂのアロステリック制御領域との相互作用を通して、ジアリール化合物が天然結合対へのＣＤ１１ｂの結合に影響を与えるか否か決定することができるように実験をデザインした。
Ａ．固定化ＩＣＡＭ−１に対するＨＬ６０発現αＭの接着分析
ＣＤ１１ｂ（αＭ）結合を調節する試験化合物の能力を評価するため、ＨＬ６０細胞と固定化ＩＣＡＭ−１を用いて接着試験を行った。
【０１１３】
分析はブロッキング抗ＣＤ１８モノクローナル抗体（ＴＳ１／２２、１０μｇ／ｍＬ）と接着緩衝液中において１×１０６細胞／ｍＬであるＨＬ６０細胞１００μＬの存在下で実施し、各ウェルを（ｉ）５０μＬのＩＣＡＭ−１／Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）、（ｉｉ）５０ｍＭ炭酸水素緩衝液（ｐＨ ９．６）中濃度として抗ＣＤ１８モノクローナル抗体（２２Ｆ１２Ｃ、５μｇ／ｍＬ）および抗アルファ４モノクローナル抗体（Ａ４．１、５μｇ／ｍＬ）、または（ｉｉｉ）緩衝液単独を用いて４℃で一晩コートしたこと以外、上記方法を用いて９６ウェルＥａｓｙ Ｗａｓｈプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）中で実施した。細胞結合のパーセンテージは以下の式を用いて算出した。
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データはその後、次式を用いて標準化した。
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約３０種の化合物をさらなる研究のために確認した。ＩＣ５０値は上記ＨＬ６０分析または下記（実施例１５）フィブリノーゲンを用いる好中球結合分析において決定した。
Ｂ．固定化ｉＣ３ｂへのＪＹ／ＣＤ１１ｂ細胞の接着分析
簡単に言えば、９６ウェルプレートの各ウェルは炭酸水素緩衝液（ｐＨ ９．６）中濃度としてグリコフォリン（１０μｇ／ｍＬ）とｉＣ３ｂ（５μｇ／ｍＬ）、または抗ＣＤ１８モノクローナル抗体（２２Ｆ１２Ｃ、５μｇ／ｍＬ）と抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（４４ＡＡＣＢ、５μｇ／ｍＬ）の５０μＬを用いて４℃で一晩コートした。プレートはＤ−ＰＢＳに溶かしたヒト血清アルブミンによって室温で１時間かけてブロックした。接着緩衝液中のＣＤ１１ｂ（ＪＹ／ＣＤ１１ｂ細胞）でトランスフェクトされたＪＹ細胞を各ウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを固定化し、上記実施例１と同様に分析した。細胞結合のパーセンテージは以下の式を用いて決定した。
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データは次式を用いて標準化した。
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スクリーニングにおいて阻害が明らかとなった４５種の化合物についてＩＣ５０値が決定し、これら化合物のうち６種は１０μＭ以下のＩＣ５０値を示した。４５種の化合物のうち１２種を続いてフィブリノーゲンに対する好中球の接着を用いた結合分析（実施例１５に記載）に使用した。
【０１１４】
このスクリーニングによって１７種の化合物がｉＣ３ｂへの結合を促進する作用を有することが確認された。１７種の化合物の再タイトレーションによって化合物Ｈ、化合物Ｉ、および化合物Ｈが対照ＤＭＳＯ処理において観察される２倍のレベルでｉＣ３ｂへのＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８の結合を容量依存的に促進することが可能であることが明らかとなった。
【０１１５】
【実施例４】
補体タンパク質Ｃ２および因子Ｂの阻害剤のスクリーニング
補体タンパク質Ｃ２および因子Ｂは、タンパク質のセリンプロテアーゼ活性およびそれらの各変換酵素を調節すると考えられているＡドメイン領域を有することが示されている。これらタンパク質のＡドメインはリガンド結合部位として働き、１つまたはそれ以上の調節ドメインを含むとも考えられている。Ｃ２は典型的な一連の補体経路において、Ｃ３変換酵素とＣ５変換酵素の一部を形成するために補体タンパク質Ｃ４ｂと結合し、因子Ｂは選択的補体経路のＣ３変換酵素およびＣ５変換酵素の一部を形成するためにＣ３ｂと結合する。Ｃ２または因子Ｂ結合のモジュレーターの同定は、おそらくＣ３および／またはＣ５変換酵素活性を調節しうるメカニズムを提供する。
【０１１６】
典型的補体経路における補体タンパク質Ｃ２と選択的補体経路における補体タンパク質因子Ｂの阻害剤のスクリーニングは、以下［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ １３， Ｕｎｉｔ１３．１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，（２０００）を参照］に述べるマイクロタイター・プレート・フォーマットにおける標準溶血性ＣＨ５０およびＡＨ５０分析の修正法を用いる主要なスクリーニングを含む。ＴＨ５０分析は選択的補体経路と因子Ｂの活性に依存する。
【０１１７】
ＣＨ５０分析は、抗ヒツジ赤血球細胞血清によりオプソニン化され、かつＭｇ２＋とＣａ２＋の両方に依存するヒツジ赤血球細胞（ＲＢＣ）の補体依存性溶解分析からなる。ＣＨ５０とは３７℃・１時間以内にオプソニン化されたヒツジＲＢＣの５０％を溶解するのに必要なヒト血清濃度である。Ｃ２阻害剤の第１スクリーニングはＣＨ５０水準の一定血清濃度の使用を含み、分析は１０μＭ試験化合物の存在下、または非存在下で実施する。この第１分析を阻害する化合物をタイトレイトし、どの構成成分が阻害されるか確認するために試験化合物の存在下、または非存在下で個々の精製された補体タンパク質を続いて加える第２の溶血性試験において、特異性を再試験する。
【０１１８】
ＡＨ５０分析はウサギ赤血球細胞の直接補体依存性溶血分析からなり、Ｍｇ２＋に依存するがＣａ２＋には依存しないために、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−四酢酸）存在下で実施する。ＣＨ５０と同様、ＡＨ５０も３７℃・１時間以内にウサギＲＢＣの５０％を溶解するのに必要なヒト血清濃度である。因子Ｂ阻害剤の第１スクリーニングはＡＨ５０水準の血清濃度の使用を含み、分析は１０μＭ試験化合物の存在下、または非存在下で実施する。この第１分析を阻害する化合物をタイトレイトし、どの構成成分が阻害されるか確認するために試験化合物の存在下、または非存在下で個々の精製された補体タンパク質を続いて加える第２の溶血性試験において、特異性を再試験する。
【０１１９】
アルゼバー液中のヒツジ全血と抗ヒツジ溶血毒はＣｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏ．（Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）から得た。赤血球−抗体複合体（ＥＡ）を抗ヒツジ溶血毒の最適濃度を用いて生産し、８００倍希釈することでタイトレイトし、測定した。通常ヒト血清（ＮＨＳ）は無作為の健康な１０人のドナーからの新鮮血清を選択することによって産生し、プールし、プール血清を分別し、液体窒素中で急速冷凍し、−７０℃で保存した。新鮮な分別物は使用直前に解凍した。
【０１２０】
標準的分析はＣｏｓｔａｒ９６ウェル丸底またはＶ底マイクロプレート中で実施した。全てのサンプルは二重測定し、平均化した。最初に、ＥＡを溶血する線状活性（ＣＨ５０希釈）の中間点を求めるためにＮＨＳをタイトレートした。Ｍｇ２＋とＣａ２＋を含むゼラチン−ベローナル緩衝液（ＧＶＢ２＋、０．１４２Ｍ ＮａＣｌ、４．９ｍＭ ５，５’−ジメチルバルビツール酸、１．０ｇ／Ｌ ゼラチン、ＨＣｌでｐＨを７．３５に調整、最終濃度がそれぞれ６０μＭおよび４００μＭとなるようにＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を加えるる）、または蒸留水を二列のウェルに加え（８０μＬ／ウェル）、３７℃で５分間インキュベートした。ＧＶＢ２＋で２回洗浄し、２×１０８複合体／ｍＬに懸濁させたＥＡを加え（８０μＬ／ウェル）、プレートを３７℃で６０分間インキュベートした。０．１５Ｍ ＮａＣｌを８０μＬ／ウェル加えてプレートを２５００ｒｐｍで３分間遠心した。上清１００μＬ／ウェルをプレートからＩｍｍｕｌｏｎ４ ９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレートに移し、４２０ｎｍの吸光度を測定した。ＮＨＳを含まないウェルの吸光値のバックグランド値はＮＨＳを含む全てのウェルの吸光値から差し引かれ、得られた比吸光度は蒸留水を含むウェルから得られた吸光度とのパーセンテージとして表される（％全溶血）。
【０１２１】
３７℃・６０分で５０％全溶血を生じるのに必要なＮＨＳの希釈（ＣＨ５０）は１５０倍であると決定した。この希釈はＮＨＳ溶血活性の線状活性の直線範囲の中間点を構成し、補体経路の阻害剤としての試験化合物のライブラリーをスクリーンするために用いた。試験化合物は最初にＧＶＢ２＋／５％ＤＭＳＯ中で４０μＭに希釈し、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル丸底またはＶ底プレートに二重に４０μＬ／ウェルに分別した。
【０１２２】
ＧＶＢ２＋（バックグランド）、蒸留水（全溶血）、ＤＭＳＯ単独、抗Ｃ２ポリクローナル抗血清（４０μｇ／ｍＬ； Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、通常のヤギＩｇＧ（４０μｇ／ｍＬ； Ｓｉｇｍａ）、およびＥＧＴＡ（４ｍＭ）を含む対照ウェルもインキュベートした。プレートは３７℃で５分間インキュベートした。それぞれＧＶＢ２＋および蒸留水を加えるバックグランドおよび全溶血ウェルを除き、ＧＶＢ２＋で７５倍希釈した４０μＬ／ウェルのＮＨＳを加えた（これにより化合物は最終的に１５０倍希釈される）。プレートは３７℃で１０分間インキュベートした。ＥＡを２回洗浄し、ＧＶＢ２＋中で２×１０８／ｍＬに再懸濁させ、各プレートに８０μ／ウェル加えた。プレートは３７℃で６０から７０分間インキュベートし、その後０．１５Ｍ ＮａＣｌを８０μＬ／ウェル加え、プレートを２５００ｒｐｍで３分間遠心した。上清１００μＬを各アッセイプレートからＩｍｍｕｌｏｎ４ ９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレートの個々のウェルに移し、４２０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１２３】
ＮＨＳを含まないウェルのバックグランド吸光値は各ウェルの吸光値から差し引かれ、得られた比吸光度はＤＭＳＯのみを含むウェルから得られた吸光度とのパーセンテージとして表される（％ＤＭＳＯ溶血）。３５％以上ＤＭＳＯ溶血を阻害する全ての化合物は再試験し、同じ方法でタイトレートした。３９種の化合物が２０μＭ以下のＩＣ５０値をもつことを確認した。２つの最も強力な化合物は５μＭ未満のＩＣ５０値を有しており、２０μＭ以上の濃度での標準細胞接着分析において（ｉ）ＬＦＡ−１が介在するＩＣＡＭ−１への接着、（ｉｉ）Ｍａｃ−１が介在するＩＣＡＭ−１への接着、（ｉｉｉ）α２β１が介在するコラーゲンへの接着、（ｉｖ）α４β７が介在するＭＡｄＣＡＭ−１への接着、または（ｖ）ｖＷｆのｇｐ１ｂへの接着を顕著には阻害しないために、補体阻害に選択的であることが示された。
【０１２４】
古典的補体経路（ＣＣＰ）スクリーンにおける血清活性の約３０％はＣ３およびＣ５変換酵素を含む選択的補体経路（ＡＣＰ）因子Ｂによる増幅に起因する。それ故、この分析は古典的補体経路変換酵素、レクチン補体経路（ＬＣＰ）（ここではＣ３は中間組成）、選択的補体経路、いずれの阻害剤も単離する可能性を持っている。３つの経路全てにおいて変換酵素を阻害する、Ｃ２と因子Ｂの間に主要構造上の高度な同一性を与える化合物を単離することも可能と考えられる。
【０１２５】
独自のスクリーンの性質を与え、阻害は補体経路のいかなる段階でも起こりうる。補体活性化のどの段階で試験化合物が活性を阻害するか確認するために、精製された補体を得て（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）補体活性化を段階的方法で再構成した。各段階において鉛化合物またはＤＭＳＯのみを加え、最終的な溶血活性を上記方法で測定した。はじめに、補体活性化の４つの異なる段階：１）ＥＡ表面に結合した抗体へのＣ１結合；２）Ｃ１へのＣ４結合とＣ１による開裂；３）Ｃ４ｂへのＣ２の結合、Ｃ３のＣ１介在開裂およびＣ４ｂＣ２ａ介在開裂によるＣ２の活性化（例えば、Ｃ３変換酵素の形成と活性化）；４）Ｃ５変換酵素の形成と活性化および細胞溶解の結果膜攻撃複合体（ＭＡＣ）を形成する補体タンパク質Ｃ６からＣ９のそれに続く沈殿、における阻害の可能性のために鉛化合物を試験した。
【０１２６】
アッセイでは、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル丸底プレートの二重のウェルにおいて１×１０７ＥＡ／ウェルを分析した。試験段階１（上記の通り）では、細胞を７．５μｇ／ｍＬのＣ１タンパク質を含むＧＶＢ２＋中に再懸濁し、３０℃で１５分間インキュベートした。試験段階２では、細胞を７．５μｇ／ｍＬのＣ４タンパク質を含むＧＶＢ２＋中に再懸濁し、３０℃で１５分間インキュベートした。試験段階３では、細胞を０．４μｇ／ｍＬのＣ２タンパク質と２５μｇ／ｍＬのＣ３タンパク質を含むＧＶＢ２＋中に再懸濁し、３０℃で１５分間インキュベートした。試験段階４では、細胞を４ｍＭ ＥＧＴＡと５０倍希釈ＮＨＳを含むＧＶＢ２＋中に再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベートした。各段階において、ＤＭＳＯ、ヤギ抗Ｃ２ｐＩｇＧ、ヤギ通常ｐＩｇＧを用いる化合物の希釈を阻害のために試験し、鉛化合物のタイトレーションを実施した。ウェルの各一組には１つの段階でのみ阻害剤を加える。各段階のインキュベート時間の後、プレートを２４００ｒｐｍで３分間遠心し、阻害剤および非結合タンパク質を除去するために細胞ペレットを１００μＬ／ウェルのＧＶＢ２＋で２回洗浄した。ＥＧＴＡは段階４において血清からの新たなＣ１の添加を防止するために用いられ、上記Ｃ３ｂの沈殿に依存する最終段階を形作る。この組成分析において、通常のｐＩｇＧではない抗Ｃ２ｐＩｇＧは予想通り段階３において補体活性化を妨害した。
【０１２７】
段階４を濃度依存的に阻害した鉛化合物は段階１、２および３は阻害しなかった。これらの結果は化合物が　ＣＣＰ／ＬＣＰ Ｃ３変換酵素の形成または活性化を阻害したのではなく、Ｃ５変換酵素または続くＭＡＣ形成、補体系の最終構成を阻害したことを示している。
【０１２８】
鉛化合物がＣ５変換酵素の活性化または続くＭＡＣ形成を阻害するか否か確認するために、簡易な構成のアッセイを実施した。Ｃ２枯渇化ＮＨＳを入手した（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。ＥＡはＧＶＢ２＋で２回洗浄し、ＧＶＢ２＋中で２×１０９細胞／ｍＬに再懸濁させた。５０倍希釈のＣ２枯渇化ＮＨＳを含むＧＶＢ２＋の等量を加え、Ｃ１の沈殿化と活性化、および続くＣ４の開裂を生じさせるために３０℃で７．５分間インキュベートした。細胞懸濁液は反応を停止させるためにＧＶＢ２＋で２０倍希釈し、２４００ｒｐｍで３分間遠心した。細胞ペレットをＧＶＢ２＋で３回洗浄し、ＧＶＢ２＋中で２×１０８細胞／ｍＬに再懸濁させた。処理したＥＡ５０μＬ／ウェルをＣｏｓｔａｒ９６ウェル丸底プレートの二重のウェルに、抗Ｃ２通常ヤギＩｇＧ（８０μｇ／ｍＬ）を含むまたは含まない、１μｇ／ｍＬＣ２、５０μｇ／ｍＬＣ３、および１μｇ／ｍＬＣ５を含むＧＶＢ２＋５０μＬ／ウェルと共に加えた。鉛化合物（８０μＭ）またはＤＭＳＯを加え、プレートを３０℃で２０分間インキュベートした。ＧＶＢ２＋２００μＬ／ウェルを加え、プレートを２４００ｒｐｍで３分間遠心した。細胞ペレットを１００μＬ／ウェルＧＶＢとして再懸濁させ、４０ｍＭ ＥＤＴＡと５０倍希釈ＮＨＳを含む１００μＬ／ウェルＧＶＢを加え、その後プレートを３７℃で６０分間遠心した。プレートを再遠心し、１００μＬ／ウェルをＩｍｍｕｌｏｎ４ ９６ウェル平底プレートに移し、４２０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１２９】
抗Ｃ２ ｐＩｇＧおよび鉛化合物は溶血を顕著に阻害し、化合物がＣＣＰ／ＬＣＰ Ｃ５変換酵素活性を直接阻害することが示された。これらの結果は試験化合物がＣ２または因子Ｂに結合し、セリンプロテアーゼがＣ５基質への通路を獲得するのに必要な配位変化を阻害するという補体阻害の潜在的メカニズムと一致した。因子Ｂセリンプロテアーゼドメインの結晶構造データおよびＡドメインとの相互作用のモデリングはこの仮説と一致する［Ｈｕａ Ｊｉｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １９：１６４−１７３ （２０００）］。
【０１３０】
補体タンパク質Ｃ２および因子Ｂの上位５種の阻害剤は表４に示した。
【０１３１】
【表４Ａ】
2004511496.tif 000068
【０１３２】
【表４Ｂ】
2004511496.tif 000069
【０１３３】
【実施例５】
アルファＥ、Ｅ−カドヘリンおよびＭＡｄＣＡＭ−１に対するｃＤＮＡの単離
他のα／βタンパク質の結合活性を調節することができるか否か評価するために、アルファＥ、Ｅ−カドヘリンおよびＭＡｄＣＡＭ−１をコードするＤＮＡを以下のように調製した。
Ａ．アルファＥ
１．ヒトアルファ−Ｅ ｃＤＮＡの単離
ヒトアルファ−ＥをコードするＤＮＡは、アルファ−Ｅ ＩドメインｃＤＮＡをプローブとして用いる通常ヒト腸ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から単離した。アルファ−Ｅ Ｉドメインプローブはヒト結腸ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートおよびアルファ−Ｅ Ｉドメインの５’並びに３’末端を囲むプライマーとして用いるＰＣＲ増幅によって複製した。複製を促進するために、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限部位（配列中で下線を付した）を５’（配列番号７）および３’（配列番号８）プライマー中にデザインした。
2004511496.tif 000070
Ａ６０７ｂｐドメイン・フラグメントを増幅し、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩを用いて消化し、プラスミド ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）中へ挿入した。プラスミドを細菌中に形質転換し、プラスミドＤＮＡは公表された方法に従って調製し、そしたＢａｍＨＩ／ＸＨｏＩ挿入物を精製した。アルファ−Ｅ Ｉドメインをコードするフラグメントは、ハイブリダイゼーションプローブとしてランダムプライムＤＮＡラベリングキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，ＩＮ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰおよび３２Ｐ−ｄＣＴＰによって放射標識した。
【０１３４】
ＤＮＡがコードする全長アルファ−Ｅは下記のように確認した。ファージ・ラムダＧＴ１１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）におけるヒト腸ｃＤＮＡライブラリーはプレート化し、標準的手段を用いてＩドメインプローブとハイブリダイズした。二巡のスクリーニングにより、６種のファージクローンを単離した。ｃＤＮＡ挿入物はＥｃｏＲＩ消化によりファージから単離し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）中へサブクローンし、シーケンスした。完全な３．４ｋｂシーケンスは３つの異なるクローン：５’末端を包囲するクローンＡ（３）、ｃＤＮＡの中央からのシーケンスを含むクローンＢ（２２）、およびアルファ−Ｅ ｃＤＮＡの３’末端を囲むクローンＣ（２２）から再構成した。シーケンス分析はクローンＡ（３）が公表されたヌクレオチド配列と比較して、それぞれ３５７位と４６４位に２つのシチジンの挿入およびグアニンのもう一つの挿入を含むことを示した。これらの挿入は、以下に示す、従来報告された配列には見いだせない、２５個の付加的アミノ酸の付加に起因した開放読み込みフレームにおける７５塩基のフレームシフトを引き起こした。
2004511496.tif 000071
この２５個のアミノ酸挿入の配列下流は公表されたアルファＥシーケンスと分子の残りの部分で一致した。
【０１３５】
アルファＥ ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にサブクローンするために、以下に示した５’プライマーＥｏ２６−Ｈ３（配列番号１０）および３’プライマーＥｏ−２４（配列番号１１）を用いるＰＣＲ増幅によってＨｉｎｄＩＩＩ部位を５’末端で発生させた。
2004511496.tif 000072
ＰＣＲ生成物はＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｓｉＩを用いて消化し、ベクターの対応部位中に連結した。
【０１３６】
発現ベクターｐＭＨｎｅｏ［ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １２７： ２６７−２６８ （１９９３）］とｐｃＤＮＡ３（登録商標）／ａＥを通常の手段に従って細菌ストレインＮＥＢ３１６、ＸｂａＩ制限部位をメチル化しないダムストレイン、および単離されたプラスミドＤＮＡ中に形質転換させた。ｐＭＨｎｅｏおよびｐｃＤＮＡ３（登録商標）／ａＥをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて消化し、ｐｃＤＮＡ３（登録商標）／ａＥからの３．４ｋｂアルファＥ ｃＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて単離した。断片をゲルから切り出し、精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ消化済ベクターｐＭＨｎｅｏ中に連結した。連結混合物の分別を製造者のプロトコールに従ってＸＬ−１ブルーバクテリア（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を形質転換するのに用い、ｐＭＨｎｅｏを含む細菌コロニーはアンピシリン含有ＬＢＭ寒天プレート上の発育によって選別した。細菌コロニーは１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢＭ培地中で一晩発育させ、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡは診断に役立つ制限消化によって特徴づけられ、ｐＭＨｎｅｏ／ａＥと呼ばれるアルファＥ ｃＤＮＡを含むプラスミドは以下に述べるＪＹ細胞線の安定したトランスフェクトのために用いられた。
Ｂ．Ｅ−カドヘリン
１．Ｅ−カドヘリンｃＤＮＡの単離
ヒトＥ−カドヘリン用のｃＤＮＡは、以下に示されるＥ−ｃａｄ５’＃１（配列番号１２）およびＥ−ｃａｄ３’＃１（配列番号１３）プライマーを用いるＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）ヒト結腸ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ． Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＰＣＲ増幅によって単離した。
2004511496.tif 000073
ポリメラーゼ連鎖反応はライブラリーｃＤＮＡ ５μＬ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）−ＧＣ ｃＤＮＡ・ＰＣＲキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からの５Ｘ ＰＣＲ緩衝液 １０μＬ、５０Ｘ ｄＮＴＰ混合液 １μＬ、１０μＭ プライマーＥ−ｃａｄ５’＃１ １μＬ、１０μＭ プライマーＥ−ｃａｄ３’＃１ １μＬ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合液 １μＬ、および水３１μＬを含む反応溶液中でＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）サーマルサイクラーを用いて実施した。増幅条件は初期インキュベーションが９４℃・１分間、次に９４℃・３０秒間および７２℃・４分間が５サイクル；９４℃・３０秒間および７０℃・４分間が５サイクル；９４℃・３０秒間および６８℃・４分間が２５サイクル；および最後に７２℃・５分間インキュベートである。反応の分別物はＰＣＲ産物の適切な大きさを決定するためにアガロースゲル電気泳動を用いて単離され、２．７ｋｂ以下のシングルバンドが予想された通り検出された。２．７ｋｂ ＰＣＲ産物は製造者のプロトコールに従って ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてプラスミドｐＣＲ（登録商標）２．１中に連結させた。Ｅ．ｃｏｌｉストレインＩＮＶａＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者の推奨するように連結反応の分別物と共に形質転換し、単一の細菌コロニーを分離し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢＭ培地中で一晩発育させた。プラスミドＤＮＡは Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてこれら培地から分離した。
２．Ｅ−カドヘリンをコードするＤＮＡ／Ｉｇ融合タンパク質の生産
Ｅ−カドヘリンの細胞外領域はそれぞれが１１０アミノ酸である５回の縦の繰り返し（ドメイン）から形成される。Ｅ−カドヘリン−ヒト／ヒトＩｇＧ１融合細胞を表すために、Ｅ−カドヘリンの１から５までのドメインを含むＤＮＡ断片を、プライマーＥｃａｄ５’Ｋｏｚａｋ（配列番号１４）およびＥｃａｄ３’（ＥＸＯ）（配列番号１５）を用いたＥ−カドヘリンｃＤＮＡ（上記ｐＣＲ（登録商標）２．１／Ｅ−カドヘリン＃３）のＰＣＲ増幅によって生産した。５’プライマーＥｃａｄ５’Ｋｏｚａｋは発現ベクターｐＤＥＦ２（米国特許第５，８８８，８０９号参照）中へと５−ドメイン断片の引き続き起こるサブクローニングを促進するために５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を加え、当初のＥ−カドヘリンｃＤＮＡクローンには欠損している翻訳開始コドンのＫｏｚａｋシーケンス上流を再構成するために使用した。３’プライマーＥｃａｄ３’（ＥＸＯ）はＥ−カドヘリンの１から５のドメインを含む断片の新たな３’末端を生産し、ｐＤＥＦ２中への５−ドメイン断片の引き続き起こるサブクローニングを促進するために断片の３’末端にＸｈｏＩ制限部位を加えた。
2004511496.tif 000074
ｐＣＲ２．１／Ｅ−ｃａｄ＃３に含まれるＥ−カドヘリンｃＤＮＡ断片はｐＣＲ２．１／Ｅ−ｃａｄ＃３ ０．５μＬ、５Ｘ ＰＣＲ反応緩衝液 １０μＬ、１０μＭプライマーＥｃａｄ５’Ｋｏｚａｋ １μＬ、１０μＭプライマーＥｃａｄ３’（Ｘｈｏ） １μＬ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合液 １μＬ、および水３５．５μＬを含む反応液中でＰＣＲによって増幅した。増幅条件は初期インキュベーションが９４℃・１分間、９４℃・３０秒間および７２℃・４分間が５サイクル；９４℃・３０秒間および７０℃・４分間が５サイクル；９４℃・３０秒間および６８℃・４分間が２５サイクル；および最後に７２℃・５分間インキュベートである。ＰＣＲ反応の分別物はアガロースゲル電気泳動によって決定し、予想したように２．１ｋｂのシングルバンドが観察された。断片はＷｉｚａｒｄ ＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて精製し、標準的な条件でＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。その結果得られた断片を５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−Ｅ−カドヘリン−ＸｈｏＩ−３’と呼ぶ。
【０１３７】
プラスミドｐＤＣ１／ＩＣＡＭ３ ＩｇＧ１はＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、５’末端ＳａｌＩ部位および３’末端ＸｂａＩ部位を有する９０８ｂｐフラグメント（５’−ＳａｌＩ−ＩｇＧ１−ＸｂａＩ−３’と呼ばれる）を低温溶解性アガロースゲル（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）から精製した。この断片はヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３領域をコードする配列を含む。発現ベクターｐＤＥＦ２はＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩによって多重クローニング部位で直線化され、５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−Ｅ−カドヘリン−ＸｈｏＩ−３’フラグメント、直線化されたｐＤＥＦ２、および５’−ＳａｌＩ−ＩｇＧ１−ＸｂａＩ−３’断片を含む３通りの連結反応が実施された。この反応では、５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋｏｚａｋ−Ｅ−カドヘリン−ＸｈｏＩ−３’は５’−ＳａｌＩ−ＩｇＧ１−ＸｂａＩ−３’にインフレーム結合され；ＸｈｏＩとＳａｌＩは両方とも、一緒に連結させることができるがＸｈｏＩまたはＳａｌＩいずれによっても再消化させることができない共存性５’突出部を有する。連結反応の分別物は細菌性ストレインＸＬ−１ブルー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を形質転換するために用いた。個々の細菌コロニーは１００μｇ／１００ｍＬアンピシリンを含有するＬＢＭ培地中で一晩発育させ、プラスミドＤＮＡは Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて単離した。ｐＤＥＦ２／Ｅ−ｃａｄＩｇＧ１プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩを用いて消化し、消化生成物をアガロースゲル電気泳動により決定した。２．１ｋｂ断片を含むそれらクローンを、Ｅ−カドヘリン／ＩｇＧ１キメラがＥ−カドヘリン／ＩｇＧ１接合と交差する開放読みとりフレーム保持することを確認するためにシーケンスした。
【０１３８】
ｐＤＥＦ２／Ｅ−ｃａｄＩｇＧ１クローンがＥ−カドヘリン／ＩｇＧ１接合と交差する連続した開放読みとりフレームを含むことを見出し、以下に述べるＣＨＯ細胞発現の研究のために用いた。Ｅ−カドヘリン／ＩｇＧ１融合体の開放読みとりフレームは、このキメラに寄与するＤＮＡフラグメントが以前シーケンスされ、未だＰＣＲ増幅を受けたことがないために完全にはシーケンスを行わなかった。
Ｃ．ＭＡｄＣＡＭ−１−１
１．ヒトＭＡｄＣＡＭ−１−１用の部分的ｃＤＮＡの単離
ＭＡｄＣＡＭ−１用の部分的ｃＤＮＡを含む断片はＡｄｖａｎｔａｇｅ（商標）−ＧＣｃＤＮＡ ＰＣＲキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いてＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅によって単離した。ポリメラーゼ連鎖反応はＭａｒａｔｈｏｎ（商標）ヒト脾臓ｃＤＮＡ ５μＬ、１０μＭプライマーＭＡｄＣＡＭ−１ ５’＃１（配列番号１６） １μＬ、１０μＭプライマーＭＡｄＣＡＭ−１ ３’＃５（配列番号１７） １μＬ、５．０Ｍ ＧＣ−Ｍｅｌｔ（商標） １０μＬ、５０Ｘ ｄＮＴＰ混合液 １μＬ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合液 １μＬ、５Ｘ 反応緩衝液 １０μＬ、および水２１μＬを含む反応液中でＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）サーマルサイクラーを用いて実施した。
2004511496.tif 000075
増幅条件は初期インキュベーションが９４℃・１分間、９４℃・３０秒間および７２℃・３分間が５サイクル；９４℃・３０秒間および７０℃・３分間が５サイクル；９４℃・３０秒間および６８℃・３分間が２５サイクル；および最後に６８℃・５分間インキュベートである。反応の分別物はアガロースゲル電気泳動によって決定し、予想したように６４０ｂｐの単一断片が観察された。断片をｐＣＲ（登録商標）２．１中にサブクローンし、製造者のプロトコールに従ってＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて細菌中で増幅させた。単一の細菌コロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢＭ培地中で一晩発育させた。プラスミドＤＮＡは Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてこれら培地から単離し、サブクローン化ＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列をＤＮＡシーケンス分析によって決定した。ＭＡｄＣＡＭ−１用の部分的ｃＤＮＡは開始コドンから始まり、ドメイン２中６４０残基の３’末端で終了する。この部分的ＭＡｄＣＡＭ−１ｃＤＮＡの配列は従来の報告［Ｓｈｙｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６： ２８５１−２８５７（１９９６）］と同一である。
２．ＭＡｄＣＡＭ−１ドメイン１および２をコードするＤＮＡの付加的ＰＣＲ増幅
ＭＡｄＣＡＭ−１のドメイン１および２を選択された免疫グロブリン融合タンパク質として発現するために、（ｉ）十分なタンパク質翻訳を行うために開始コドンのＫｏｚａｋシーケンス上流を再貯蔵する；（ｉｉ）ｐＤＥＦ２への断片のサブクローニングを促進するために５’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を加える；（ｉｉｉ）２番目のドメイン全体をコードするために必要な付加的アミノ酸残基を囲む現存の部分的ＭＡｄＣＡＭ−１ ｃＤＮＡの開放読みとりフレームを拡張する；（ｉｖ）ｐＤＥＦ２へのサブクローニングを促進するために断片の３’末端にＳａｌＩ部位を導入することが不可欠であった。これらの修正は、以下に示すプライマーＭａｄ５’Ｋｏｚａｋ（配列番号１８）およびＭａｄ３’＃６Ｓａｌ（配列番号１９）を用いたＰＣＲ増幅によって上記ＭＡｄＣＡＭ−１断片に導入した。
2004511496.tif 000076
ＰＣＲ反応液はｐＣＲ（登録商標）２．１／ＭＡｄ＃４−１テンプレートＤＮＡ ０．５μＬ、５Ｘ ＰＣＲ緩衝液 １０μＬ、５．０Ｍ ＧＣ Ｍｅｌｔ（商標） １０μＬ、５０Ｘ ｄＮＴＰ混合液 １μＬ、１０μＭ プライマーＭａｄ５’Ｋｏｚａｋ（配列番号１８） １μＬ、１０μＭ プライマーＭａｄ３’＃６Ｓａｌ（配列番号１９）、５０Ｘ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（商標）ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼ混合液 １μＬ、および水２５．５μＬを含む。ＰＣＲ増幅条件は初期インキュベーションが９４℃・１分間、９４℃・３０秒間および７２℃・２分間が５サイクル；９４℃・３０秒間および７０℃・２分間が５サイクル；９４℃・３０秒間および６８℃・２分間が２０サイクル；および６８℃・５分間インキュベートである。反応の分別物はアガロースゲル電気泳動によって決定し、予想したように０．７ｋｂ以下の単一断片が観察された。ＰＣＲ生成物をウィザードＰＣＲ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて精製し、標準的条件下でＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩを用いて消化した。断片を標準的条件下でＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ消化済みｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫプラスミドＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に連結し、ｐＢＳ−ＳＫ／Ｍａｄ＃７中のＭＡｄＣＡＭ−１断片の配列を決定した。
３．ＭＡｄＣＡＭ−１／Ｉｇ融合タンパク質の生産
キメラドメイン１／ドメイン２ ＭＡｄＣＡＭ−１−ＩｇＧ１融合タンパク質をコードする発現ベクターを生産するために、ｐＢＳ／Ｍａｄ＃７からの７０２ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ、ｐＤＣ１／ＩＣＡＭ３ ＩｇＧからの９０８ｂｐ ＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片、およびＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩを用いた消化によって直線化されたｐＤＥＦ２を連結反応において結合させた。連結反応の分別物はＸＬ−１ブルー細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を形質転換するために用い、単一コロニーから単離されたプラスミドＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ、およびＳａｌＩを用いた制限消化によってスクリーンした。一つのクローン、ｐＤＥＦ２／ＭａｄＩｇ＃１は３つのフラグメント全てを含むことが明らかとなり、以下に述べるＣＨＯ細胞系統の安定したトランスフェクトのために用いられた。
【０１３９】
【実施例６】
ＭＡｄＣＡＭ−１／ＩｇおよびＥ−カドヘリン／Ｉｇの発現
Ａ．ＭＡｄＣＡＭ−１／ＩｇおよびＥ−カドヘリン／Ｉｇを発現する安定ＣＨＯ細胞系統の生産
ｐＤＥＦ２／ＭＡｄＩｇまたはｐＤＥＦ２／ＥｃａｄＩｇを用いたホストＣＨＯ ＤＧ４４細胞のトランスフェクションのために、５０から１００μｇのプラスミドを制限酵素ＰｖｕＩを用いた消化によって直線化した。ＤＧ４４細胞は、「ＨＴ」と呼ばれるヒポキサンチン（最終濃度０．０１ｍＭ）およびチミジン（最終濃度０．００１６ｍＭ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で培養した。ＤＧ４４細胞は１５０ｃｍ２組織培養用ポリスチレンフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で約５０％以下の集落になるまで培養組織を発育させることによってトランスフェクション用に調製した。細胞を選別し、ＨｅＢＳ緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４および ６ｍＭデキストロース）と所望のプラスミドＤＮＡを含む０．８ｍＬの溶液中に再懸濁させた。再懸濁細胞を２９０Ｖ・９６０μＦ（９から１１．５ｍｓｅｃパルス）のコンデンサー放電を用いて室温で電気穿孔した。細胞は５％透析処理ＦＢＳおよびＨＴを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２ １０ｍＬ中に加え、遠心によってペレット化し、５％透析処理ＦＢＳおよびＨＴを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（非選択的培地）２ｍＬ中に再懸濁させ、７５ｃｍ２ポリスチレン組織培養フラスコ中にシードした。２日後成長した細胞を選別し、希釈を変更した５％透析処理ＦＢＳおよびＨＴを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（選択的培地）にシードした。
【０１４０】
一度選別に成功し単一細胞クローンを同定したら、プールしたＣＨＯトランスフェクションはトリプシン処理によって調製した。個々のクローンを同定するため、ＣＨＯ／ＭＡｄＣＡＭ−１ＩｇとＣＨＯ／Ｅ−ｃａｄＩｇトランスフェクションは選択的条件下、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４ ９６ウェルプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）中で約１細胞／ウェルの濃度でプレート化した。一度単一コロニーが９６ウェルプレート中で検出すると、各ウェルからの上清をＭａｄＣＡＭ−１／ＩｇまたはＥ−カドヘリン／Ｉｇ融合タンパク質が存在するかスクリーンした。ヒトＩｇＧ１タンパク質成分を生産する単一細胞ＣＨＯクローンを増殖させ、最大量のＣＨＯ／Ｍａｄ１ＩｇまたはＣＨＯ／Ｅ−ｃａｄＩｇ融合タンパク質を生産するクローンを大規模なタンパク質生産のために選別した。
【０１４１】
ラージスケールのタンパク質生産においては、ＣＨＯ／ＭＡｄ１ＩｇおよびＣＨＯ／Ｅ−ｃａｄＩｇクローンを５％ＣＯ２空気中３７℃に維持しながらスピナーフラスコ中の無血清５．２（ＨＴ−）培地で増殖させた。細胞濃度が１０６細胞／ｍＬを超えたとき、培地を採取してスピナーフラスコに新鮮な５．２（ＨＴ−）培地を供給した。使用済みの培地をまず遠心して細胞の残骸を取り除き、０．２２μｍの１リットルフィルターユニット（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を通して濾過し、４℃で保存した。
Ｂ．ＭＡｄＣＡＭ−１／Ｉｇ精製
ＭＡｄＣＡＭ−１／ＩｇはＣＭＦ−ＰＢＳで平衡化したｐｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。細胞上清は４ｍＬ／分の流速でカラムを通じて循環させた。負荷をかけた後、流出液に検出可能なタンパク質が存在しなくなるまでＣＭＦ−ＰＢＳを用いて洗浄した。
ＭａｄＣＡＭ−１／Ｉｇは１Ｍトリス緩衝液ｐＨ ９．０の入ったチューブに０．１Ｍ酢酸（ｐＨ ３．０）を用いて流出させ、サンプルは４℃でＣＭＦ−ＰＢＳに対して透析した。
Ｃ．Ｅ−カドヘリン／Ｉｇの精製
Ｅ−カドヘリン／ＩｇはＤ−ＰＢＳで平衡化したｐｒｏｔｅｉｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４ ＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。上清は４ｍＬ／分の流速でカラムを通じて循環させた。負荷をかけた後、流出液に検出可能なタンパク質が存在しなくなるまで１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むトリス緩衝生理食塩水を用いて洗浄した。Ｅ−カドヘリン／Ｉｇは１Ｍトリス緩衝液ｐＨ ９．０の入ったチューブに、０．１Ｍ酢酸（ｐＨ ３．０）を用いて流出させた。カルシウム濃度は１ｍＭに調整し、サンプルは４℃で１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むトリス緩衝生理食塩水に対して透析した。
【０１４２】
【実施例７】
ＪＹ／アルファ−Ｅトランスフェクタントの生産
ヒトＢリンパ芽球細胞系統、ＪＹは上記の通りプラスミドｐＭＨｎｅｏ／ａＥを用いてトランスフェクションした。トランスフェクトされた集団は「選別培地」（５％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１．０ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８を含む）中で発育させ、１４日後、１０８個のＧ４１８抵抗性ＪＹ細胞を５μｇ／ｍＬの抗ａＥモノクローナル抗体Ｂｅｒ−ＡＣＴ８（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を含む選別培地５ｍＬ中に再懸濁させ、１時間氷上でインキュベートした。細胞を遠心分離により集め、培地を吸引した。ＪＹ／ａＥトランスフェクタントは２００倍希釈したヒツジ抗マウスＩｇ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む選別培地を用いて１時間氷上で染色した。非結合抗体は遠心により取り除き、上清を吸引した。アルファＥ−発現細胞はフローサイトメトリーによって分離し、続いて選別培地中でｉｎ ｖｉｔｒｏ培養によって増殖させた。
【０１４３】
Ｂｅｒ−ＡＣＴ８を用いたフローサイトメトリーによる選び出されたＪＹ／ａＥ＋集落の再分析は、アルファＥ−発現およびアルファＥ−非発現細胞の両方を有する細胞の二重形式集落を明らかにした。その二重形式集落をＢｅｒ−ＡＣＴ８を用いて上述の通り染色し、個々のＪＹ／ａＥ細胞は選別培地を含んだ９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ−４プレート中に分類した。アルファＥを高度に発現する単一細胞ＪＹ／ａＥ＋クローンをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、ＪＹ／ａＥクローン＃４７をさらなる特徴づけのために選択した。このクローンは、親細胞のＪＹ細胞と異なり、組換え体Ｅ−カドヘリン／Ｉｇに対して強い接着性を示し、細胞のホルボールエステル処理によって結合が誘導される。Ｅ−カドヘリン／ＩｇへのＪＹ／ａＥクローン＃４７の結合は、Ｅ−カドヘリンに対する抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｃｏｒｐ．，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）のみならず抗β７インテグリン抗体ＦＩＢ５０４（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＤ）によっても阻害される。
【０１４４】
【実施例８】
ＪＹ／アルファＤ＋クローンの単離
αｄβ２インテグリンを安定して発現するＪＹ細胞系統を得るため、ＪＹ細胞を上述したとおりｐＭＨｎｅｏ／ａＤと共に電気穿孔し、安定的なトランスフェクタントを選別培地中の発育によって選択した。細胞のＧ４１８抵抗性集落を選択し、ＪＹ／ａＤ＋細胞を抗αｄモノクローナル抗体２１２Ｄおよびヒツジ抗マウスＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて染色した。単一細胞ＪＹ／ａＤ＋クローンは、単一細胞ＪＹ／ａＥ＋クローンの単離について上述したように、フローサイトメーターを用いた細胞分類によって単離した。
【０１４５】
【実施例９】
ＪＹ／ａＥ＋接着分析
Ａ．化合物の希釈
接着培地（３５０μＬ）（ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０）を深底９６ウェルタイタープレートの列Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇの各ウェルと２．０ｍＬ容量（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ）のカラム１から１１に分別した。スクリーンした全ての化合物は最終濃度が１０ｍＭになるようＤＭＳＯ中に再溶解させた。化合物は−２０℃で保存し、使用当日に３７℃インキュベーター中で解凍した。各化合物（２．１μＬ）をカラム３から１１の１ウェル、深底タイタープレートの列Ａ、Ｃ、Ｅ、およびＧにピペッティングした。化合物（Ａ１とＡ２、Ｃ１とＣ２、Ｅ１とＥ２、Ｇ１とＧ２）を含まないようにＤＭＳＯ ２．１μＬをウェルに加えた。αＥβ７結合活性を阻害する抗β７モノクローナル抗体ＦＩＢ５０４（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＤ）をウェルＣ２とＧ２に７．５μｇ／ｍＬの濃度で加えた。各深底タイータープレートは乾燥を防止するためにカバーし、使用するまで３７℃のインキュベーター内に保存した。
Ｂ．接着分析
接着試験は９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ−４プレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）内で以下のように実施した。各ウェルは５０μＬのＥ−カドヘリン／Ｉｇ（Ｄ−ＰＢＳ中で３．０μｇ／ｍＬ）でコートした。対照ウェルは投入細胞の結合を１００％定量化するために捕獲抗体ＦＩＢ５０４で、またバックグランド結合を決定するためにコーティング緩衝液のみででコートした。次に４℃で一晩インキュベーションし、プレートを２００μＬ／ウェルＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、Ｄ−ＰＢＳ中濃度１％ＢＳＡで最低１時間ブロックした。ＢＳＡ溶液を除去し、１００μＬの接着培地（ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、０．１％ＢＳＡ、および６０ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡを含むＲＰＭＩ １６４０）を列ＢからＧ、カラム１から１１に加えた。
【０１４６】
この時点で、試験化合物を６０μＭの濃度で含む１００μＬの接着培地を深底９６タイターピペットからＥ−カドヘリン／Ｉｇコートした接着プレートに三重に移した。外側の列は３００μＬのＤ−ＰＢＳを満たした。これらプレートを５％ＣＯ２空気の加湿３７℃インキュベーターに移した。
【０１４７】
接着アッセイはＥ−カドヘリンコートしたプレートの各ウェルに１００μＬのＪＹ／ａＥ＋細胞件濁液を加えることにより開始した。各ウェルの最終容積は１０５細胞、ＰＭＡ（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）、および試験化合物（最終濃度２０μＭ）を含む３００μＬ接着培地である。プレートは３７℃で３０分間インキュベートした。各化合物は三重に試験した。
【０１４８】
接着細胞はＤ−ＰＢＳ中濃度１４％のグルタールアルデヒド溶液５０μＬを加えることにより固定した。プレートを水で洗浄し、１００μＬ／ウェル０．５％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液で５分間染色した。７０％エタノールを３００μＬ／ウェルになるように加え、接着細胞を５７０ｎｍの吸光度測定によって定量した。細胞結合のパーセンテージは各三重分析の平均値を次式に適用することにより算出した。
2004511496.tif 000077
Ｃ．ＩＣ５０測定
試験化合物の最初のスクリーニングの間、各化学物質を固定濃度２０μＭで細胞ベースの接着アッセイにおいて試験した。Ｅ−カドヘリン／ＩｇへのＪＹ／αＥβ７依存性接着を５０％以上阻害するそれら化合物を、次に細胞結合を５０％減少させる阻害濃度、すなわちＩＣ５０値を測定するために様々な濃度で再試験した。
【０１４９】
スクリーンした化合物の４０種、または全ライブラリーの１．４％はαＥβ７−Ｅ−カドヘリン接着を４０％以上阻害した。約１８種の化合物がジアリールアミドライブラリー中で確認され、２２種の化合物がジアリール硫化物ライブラリー中で確認された。ＩＣ５０測定におけるこれら最初の的中物の再分析で、４０種の化合物のうち４種が１０μＭ以下のＩＣ５０値でＥ−カドヘリンへのＪＹ／ａＥ＋結合を阻害することが示された。最初の的中物の多くはその最初の阻害活性に再現性がなかった；化合物が多インテグリン依存性接着を阻害することが示された；ＩＣ５０値が１０μＭを超えた；または細胞変性もしくは細胞毒性効果を示した場合にはさらなる特徴づけから排除した。表２に掲げる以下の化合物、化合物Ｋ、化合物Ｗ、化合物Ｚ、化合物Ｄは１０μＭ以下の濃度で再現性のある阻害活性を示した。最初のスクリーンでは顕著な阻害活性を示したが、再分析でＪＹ／ａＥ＋／Ｅ−カドヘリン結合を阻害できなかった化合物が数種類あった。ある種のジアリール化合物の活性が凍結融解を繰り返しにより失われたという可能性はある。各化合物の選択性を評価するために、付加的結合対化合物ＪＹ／αＶβ３とビトロネクチン、ＪＹ／α４β１とＶＣＡＭ／Ｉｇ、ＪＹ／αｄβ２とＶＣＡＭ、ＪＹ／αＬβ２とＩＣＡＭ−１、ＪＹ／αＭβ２とｉＣ３ｂ、ＪＹ／α４β７とＭＡｄＣＡＭ−１のＩＣ５０値を測定した。
【０１５０】
各ＩＣ５０アッセイでは５０ｍＭ炭酸水素緩衝液（ｐＨ ９．６）で希釈した５０μＬのリガンドをＩｍｍｕｌｏｎ−４プレートの各ウェルに文中した。２つの異なるリガンドをそれぞれ三重に試験するために１枚のプレートを使用した。様々なリガンドのコーティング濃度は以下の通りである：ＶＣＡＭ−１Ｉｇ ２．０μｇ／ｍＬ；ＩＣＡＭ−１／Ｉｇ ５．０μｇ／ｍＬ；ビトロネクチン ０．５μｇ／ｍＬ；ＭＡｄＣＡＭ−１／Ｉｇ ３．０μｇ／ｍＬ；ｉＣ３ｂ ５．０μｇ／ｍＬ。捕獲抗体、例えば抗ＣＤ１８モノクローナル抗体ＴＳ１／２２を５０μＬ／ウェルで１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。リガンドコートしたプレートはカバーし、４℃で一晩保存した。次の日、各ウェルの内容物を他に移し、各プレートを２００μＬ／ウェルのＤ−ＰＢＳを用いて３回洗浄した。その後プレートを３００μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳを加えることによりブロックした。各プレートは再度カバーして室温で最低１時間インキュベートした。
【０１５１】
各ＩＣ５０測定では、試験化合物を４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５．０μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６３μＭ、０．３２μＭ、および０．１６μＭの最終濃度での試験を可能とすべく順次ＤＭＳＯ中に希釈した。接着プレートに移す前に、予め３７℃に加温したＲＰＭＩ１６４０、０．１％ＢＳＡ、および３ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の０．７ｍＬを含んだ９６ウェル深底タイタープレートに希釈化合物４．２μＬを移すことで最初に希釈した。１％ＢＳＡ／Ｄ−ＰＢＳブロッキング溶液を９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ−４プレートから他に移し、０．２ｍＬの希釈化合物に置き換えた。スクリーンする各９６ウェルプレートに約８×１０６細胞を遠心により集め、１０６／ｍＬの最終濃度で接着培地（０．１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁させた。接着アッセイにおけるＰＭＡ依存性相同性凝縮を防止するため、抗ＣＤ１８抗体２２Ｆ１２Ｃ（Ｉｃｏｓ Ｃｏｒｐ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）を最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように細胞懸濁液に加え、細胞を３７℃で５分間インキュベートした。この抗体はαＬβ２、ＪＹ／αｄβ２またはＪＹ／αＭβ２とその対応リガンドＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、またはｉＣ３ｂを必要とするＣＤ１８依存性接着アッセイには加えなかった。
【０１５２】
接着アッセイはＩｍｍｕｌｏｎ−４プレートの各ウェルに１００μＬの細胞懸濁液を加えることにより開始した。プレートを３７℃で３０分インキュベートし、接着細胞はＤ−ＰＢＳ中濃度１４％のグルタールアルデヒド溶液５０μＬを加えることにより固定した。プレートを水で洗浄し、１００μＬ／ウェル０．５％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液で５分間染色した。プレートを過剰のクリスタルバイオレット色素を除去するために水で２回洗浄し、各ウェルに７０％エタノールを３００μＬ加えた。接着細胞はプレート吸光光度計で５７０ｎｍの吸光度を測定することにより算出した。細胞結合のパーセンテージは各三重分析の平均値を次式に適用することにより算出した。
2004511496.tif 000078
最初のスクリーンで確認された化合物Ｋ、化合物Ｗ、化合物Ｚおよび化合物Ｄの４種の化合物をさらなる特異性描写のために選択し、付加的インテグリン依存性接着においてそれらのＩＣ５０を測定した。全ての場合において、結合アッセイにおいて用いる指示細胞系統をアッセイ過程の間に、インテグリン依存性接着を促進するために２ｎｇ／ｍＬのＰＭＡを用いて処理した。これら４種化合物のＩＣ５０値は表５に示すように接着試験において測定した。
【０１５３】
【表５】
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【０１５４】
【実施例１０】
アルファ１、アルファ２およびアルファ１１
Ｉドメインのクローニング、発現および精製
コラーゲン結合インテグリン アルファ１、アルファ２およびアルファ１１は、ロイコインテグリン アルファＬ、アルファＭ、アルファＸおよびアルファｄに含まれるＩドメイン配列とＩドメイン相同性を有する。これら分子がアロステリック制御部位を通した調節の影響を受けやすいという可能性を調査するため、試験化合物のライブラリーをこれらインテグリンとリガンドコラーゲンおよびラミニンとの間の相互作用を阻害する能力を評価した。
【０１５５】
アルファ１並びにアルファ２Ｉドメイン配列およびアルファ１１を細菌性発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローンした。Ｅ．Ｃｏｌｉ中のこれら構成の発現はアミノ酸末端にヒスチジン標識を有するタンパク質およびニッケルカラムを用いて精製することができる「標識化」タンパク質を生じる。アルファ１１のクローニングは従来通り実施した［Ｖｅｌｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７４： ２５７３５−２５７４２ （１９９９）］。
【０１５６】
アルファ１とアルファ２双方のＩドメイン配列は、Ｉドメインがベクター中のヒスチジン標識と共にフレーム内にクローンされることを可能とする制限部位を加えるために、以下のＰＣＲ増幅によってｐＥＴ１５ｂ中にクローンした。アルファ１１ＩドメインＰＣＲ反応用の鋳型は、従来通りベクターｐｃＤＮＡ−１ Ａｍｐにおける脾臓ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼイションによってクローンされた全長アルファ１ｃＤＮＡである。このスクリーンに用いたハイブリダイゼーションプローブは、それぞれ以下のアルファ１．５（配列番号２０）およびアルファ１．３（配列番号２１）プライマーを用いたＰＣＲ反応の産物であった。
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サンプルは最初９４℃・３０秒間、次に９４℃・５秒間および７２℃・２分間が５サイクル；９４℃・５秒間および７０℃・２分間が５サイクル；９４℃・５秒間および６８℃・２分間が２５サイクル；および７２℃・７分間の最終インキュベートでインキュベートした。ＰＣＲ産物はＴＯＰＯ ＴＡベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローンし、シーケンスした。生じたクローンは上記と同じ条件でのＰＣＲにおいて鋳型として用い、増幅産物をゲル精製し、ランダムプライムＤＮＡラベリングキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，ＩＮ）を用いて３２Ｐにより標識し、ハイブリダイゼイションプローブとして用いた。ハイブリダイゼイションは全長アルファ１１ｃＤＮＡスクリーニングで用いたのと同じ条件でＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼイション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して実施した。
【０１５７】
アルファ１Ｉドメインはそれぞれ以下に示すＡ１．５Ｎｄｅ（配列番号２２）およびＡ１．３Ｂａｍ（配列番号２３）を用いるＰＣＲによって増幅した。
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アルファ２Ｉドメインは鋳型としてベクターｐｃＤＮＡ−１ ＡｍｐにおけるＨＵＶＥＣ ｃＤＮＡライブラリー、およびそれぞれ以下に示すＡ２．５Ｎｄｅ（配列番号２４）並びにＡ２．３Ｂａｍ（配列番号２５）プライマーを用いるＰＣＲによってクローンした。
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両方のＩドメイン増幅用のＰＣＲ条件は、初期インキュベーションが９４℃・２分間、次に９４℃・２０秒間が３０サイクル；５５℃・３０秒間および７２℃・４５秒間；および最終インキュベーションが７２℃・７分間である。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、再度ゲル精製し、同じ酵素を用いて前もって消化したｐＥＴ１５ｂ内にクローンした。生じたクローンであるアルファ１／ｐｅｔ／２およびアルファ２／ｐｅｔ／２７をシーケンスした。
【０１５８】
アルファ１、アルファ２およびアルファ１１ ｐＥＴ１５ｂクローンを増殖のため細菌性ストレインＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に形質転換させたヒスチジン標識タンパク質はＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（ＱＩＡＧＥＮ）とイミダゾール勾配による溶出を用いてＥ．ｃｏｌｉ ｌｙｓａｔｅの可溶性分画から単離した。溶出したタンパク質をＣＭＦ−ＰＢＳに対して透析し、製造者が示すプロトコールに従ってＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチン化した。９６ウェルプレート内でコラーゲンに結合するアルファ１またはアルファ２Ｉドメインを測定するアッセイは９６ウェルプレートのウェルに結合するコラーゲンを含み、ウェルにビオチン化したアルファ１またはアルファ２タンパク質を加え、エウロピウム結合ストレプトアビジンおよび経時的に変化する蛍光を用いてＩドメインに結合するコラーゲン量を測定した。Ｉｍｍｕｌｏｎ−４プレートをＣＭＦ−ＰＢＳ中濃度２０μＬ／ｍＬのラットＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）を用い、４℃で一晩コートした。ウェルを２５０μＬのＣＭＦ−ＰＢＳで２回洗浄し、ＣＭＦ−ＰＢＳ中濃度２．５％ＢＳＡを用いて３０℃で１時間ブロックした。ウェルを２００μＬのＣＭＦ−ＰＢＳで洗浄し、ビオチン化タンパク質をウェルに２ｍＭ ＭｇＣｌ２および１％ＢＳＡを含むＣＭＦ−ＰＢＳ中で、または２ｍＭ ＭｎＣｌ２および１％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で１μｇ／ｍＬの濃度で加え、３７℃で３時間インキュベートした。ウェルを２００μＬの同じインキュベーション緩衝液（Ｉドメインタンパク質なし）で２回洗浄し、コラーゲン結合ビオチン化タンパク質をＳＡ−Ｅｕ希釈緩衝液（Ｗａｌｌａｃ）中で１０００倍希釈したストレプトアビジンエウロピウム（ＳＡ−Ｅｕ；Ｗａｌｌａｃ）１００μＬを加えることにより測定した。インキュベーションは室温で１時間行った。ウェルをインキュベーション緩衝液で６回洗浄し、１００μＬの強化溶液（Ｗａｌｌａｃ；水で１：１に希釈）を室温で５分間加えた。蛍光値はＥｕｇｅｎプログラムを用いて測定した。
【０１５９】
【実施例１１】
コラーゲン結合のアルファ２アンタゴニストの同定
ＦＡＣＳ分析はＪｕｒｋａｔ細胞がアルファ１およびアルファ２インテグリンの両方を発現することを示した。これらインテグリンのそれぞれに対するモノクローナル抗体を用いる結合研究は、ラットＩ型コラーゲンに接着するＪｕｒｋａｔ細胞がアルファ２との相互作用を通して支配的に介在させられることを示した。例えば、アルファ２阻害モノクローナル抗体はＪｕｒｋａｔ細胞がＩ型コラーゲンに結合するのを完全に阻害することが示されている。この結果を考慮し、Ｊｕｒｋａｔ細胞は以下に述べるようにアルファ２結合の阻害剤を同定するために接着アッセイで用いた。従来手段［Ｓａｄｈｕ， ｅｔ ａｌ．， ”ＬＦＡ−１ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ｉｎ ＩＣＡＭ−３ Ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｍｏｔｉｆ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ”， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２： ４２９−４４０ （１９９４）］の修正法を用いて実行した。
【０１６０】
Ｉｍｍｕｌｏｎ−４プレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を（ｉ）５０μＬラットＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）（ＣＭＦ−ＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬ）、（ｉｉ）抗ベータ１モノクローナル抗体３Ｓ３（炭酸水素緩衝液、ｐＨ９．６中で５μｇ／ｍＬ）、（ｉｉｉ）炭酸水素緩衝液単独を用いて４℃で一晩コートした。プレートを２００μＬ／ウェルＤ−ＰＢＳで１回洗浄し、Ｄ−ＰＢＳ中濃度１％ＢＳＡ（１００μＬ／ウェル）を用い、室温で１時間ブロックした。ウェルをＲＰＭＩおよび１％不活性化ＦＢＳを含む接着緩衝液１００μＬで１回洗浄し、ＰＭＡを含む接着緩衝液（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えた。候補となる阻害剤（最終濃度２０μＭ）を含有するまたは含有しない接着緩衝液１００μＬを各ウェルに加え、次に接着緩衝液中濃度１×１０６細胞／ｍＬのＪｕｒｋａｔ細胞１００μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベーションした。接着細胞をＤ−ＰＢＳ中濃度１４％のグルタールアルデヒド５０μＬ／ウェルを加えることで固定し、室温で２時間インキュベーションした。プレートを蒸留水で数回洗浄し、その後７０％エタノールを加えた。接着細胞はＳＰＥＣＴＲｍａｘ２５０マイクロプレート吸光光度システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌ，ＣＡ）を用いて５７０ｎｍおよび４１０ｎｍの吸光度を測定することにより算出した。細胞結合のパーセンテージは以下の式を用いて算出した。
2004511496.tif 000083
データは以下の式により標準化した。
2004511496.tif 000084
１２１種の化合物がラットＩ型コラーゲンへのＪｕｒｋａｔ細胞の接着を対照よりも５０％またはそれ以上の水準で阻害した。これら阻害剤のＩＣ５０測定は、阻害剤が０．１５から０．４０μＭの濃度範囲を通して２倍希釈して試験することを除いて上述したようにＪｕｒｋａｔ接着アッセイにおいて評価した。１２１種の化合物中の１１３種のＩＣ５０値を測定し、１２１種中の２１種をアッセイにおける２から１７μＭのＩＣ５０範囲での効果、およびα４β７結合アッセイ（ここで述べる）並びにフォンウィルブランド因子結合アッセイ（ここで述べる）における低水準の阻害を示す特異性に基づき選択した。特異性測定において、化合物は固定化されたＶＣＡＭ−１／ＩｇへのＪｕｒｋａｔ細胞の結合を阻害するために０．１５から２０μＭの濃度範囲で効果を試験した。アッセイは細胞をコラーゲンの代わりにＶＣＡＭ−１／Ｉｇでコートしたことを除いて上記コラーゲン接着アッセイと同様の方法で実施した。ＶＣＡＭ−１への結合はα４β１の表面発現に依存したこれらの結果を表６に示す。
【０１６１】
２１種の化合物について、Ｊｕｒｋａｔ細胞の毒性は４または２４時間インキュベーションにより評価した。ＬＤ５０濃度は製造者の示したプロトコールに従いＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。各化合物の２倍希釈系列を０．１５μＭから４０μＭの濃度範囲で試験した。毒性アッセイの結果を表６に示す。
【０１６２】
【表６】
2004511496.tif 000085
【０１６３】
【実施例１２】
コラーゲン結合のアルファ１アンタゴニストの同定
チャイニーズハムスター卵（ＣＨＯ）細胞は内因性コラーゲンレセプターを発現しない。従って、ＣＨＯ細胞は全長アルファ１発現構成、アルファ１／ｐＤＣ−１／１を用いてトランスフェクトされる。全長アルファ１挿入をベクターｐＬＥＮ［Ｂｒｉｅｓｅｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， ＪＢＣ ２６８： ２９８９−２９９６ （１９９３）］においてクローンから除去し、クローンアルファ１／ｐＤＣ−１／１を生産するためにｐＤＣ−１内にサブクローンした。トランスフェクタントを選択的培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で発育させ、制限希釈によってクローンした。アルファ１発現クローンはブロッキングアルファ１モノクローナル抗体（抗体５Ｅ８Ｄ９；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた細胞染色およびＦＡＣＳ分析による発現レベルの測定によって同定した。これら細胞はこの接着を阻害することがわかっているブロッキングアルファ１モノクローナル抗体（抗体５Ｅ８Ｄ９；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ）を用いたアルファ１依存様式におけるＩＶ型コラーゲンに接着することが証明された。この結果を考慮し、アルファ１トランスフェクト化ＣＨＯ細胞をアルファ１結合の阻害剤を確認するために以下に述べる接着アッセイで使用した。このアッセイは上述したアルファ２アンタゴニストを確認するために用いた手段の変更である。
【０１６４】
Ｉｍｍｕｌｏｎ−４プレートを（ｉ）１ウェル当たり５０μＬのヒトＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）（ＣＭＦ−ＰＢＳ中濃度０．５μｇ／ｍＬ）、（ｉｉ）炭酸水素緩衝液ｐＨ９．６に溶かした抗アルファ１モノクローナル抗体５Ｅ８Ｄ９、（ｉｉｉ）炭酸水素緩衝液単独を用いて４℃で一晩コートした。プレートをＤ−ＰＢＳで２回洗浄し、Ｄ−ＰＢＳ中濃度１％ＢＳＡを用いて室温で１時間ブロックした。ウェルを１００μＬ／ウェル接着緩衝液（無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地）で１回すすいだ。候補阻害剤を含むまたは含まない接着緩衝液（２００μＬ）をウェルに加え、次に接着緩衝液中に１００μＬのアルファ１トランスフェクト化ＣＨＯ細胞を加えた。ＣＨＯ細胞はＥＤＴＡを用いて事前に再カバーし、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で３回すすいだ。細胞を０．７５×１０６細胞／ｍＬの濃度で接着緩衝液中に再懸濁させた。ＩＶ型コラーゲン上のアルファ１トランスフェクト化ＣＨＯ細胞は３７℃で３０分間インキュベーションした。接着細胞はＤ−ＰＢＳ中濃度１４％グルタールアルデヒドを５０μＬ／ウェル加えることにより固定し、室温で２時間インキュベーションした。プレートを蒸留水で数回洗浄し、その後７０％エタノールを加えた。接着細胞はＳＰＥＣＴＲｍａｘ２５０マイクロプレート吸光光度システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌ，ＣＡ）を用いて５７０ｎｍおよび４１０ｎｍの吸光度を測定することにより算出した。細胞結合のパーセンテージは以下の式を用いて算出した。
2004511496.tif 000086
データは以下の式により標準化した。
2004511496.tif 000087
６４種の化合物がＩＶ型コラーゲンへのアルファ１トランスフェクト化ＣＨＯ細胞の接着をＤＭＳＯ対照よりも５０％またはそれ以上の水準で阻害した。これら化合物のＥＣ５０測定は、阻害剤を０．１５μＭから２０μＭ（例えば０．１５μＭ、０．３１２５μＭ、０．６２５μＭ、１．２５μＭ、２．５０μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）の濃度範囲を通しての２倍希釈系列で試験したことを除き、上述したアルファ１トランスフェクト化ＣＨＯ細胞接着アッセイにおいて測定した。これら化合物のＥＣ５０値は０．５μＭから１８μＭの範囲であった。これら化合物はさらに選択性と毒性について分析した。
【０１６５】
最初の特異性試験では、Ｉ型コラーゲンへのアルファ２トランスフェクト化ＣＨＯ細胞の接着を阻害する効果について０．１５μＭから２０μＭの濃度範囲で試験した。このアッセイではＣＨＯ細胞はアルファ２発現構成であるアルファ２／ｐＤＣ−１／８を用いてトランスフェクトした。本来のアルファ２構成は発現ベクターｐｃＤＮＡ−３中にあり、インビトロゲンから得られるＧｅｎｅｓｔｏｒｍクローンである。アルファ２配列をｐＤＣ−１内にサブクローンし、クローンアルファ２／ｐｄｃ−１／８を生じた。アルファ２発現細胞をクローンし、アルファ２モノクローナル抗体Ａ２−ＩＩＥ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて分析した。アルファ２の適度の水準を発現するＣＨＯ細胞系統を確認し、アルファ１に用いた上記接着アッセイにおいて使用した。アルファ２アッセイにおける相違点は（ｉ）ＩＶ型コラーゲンの代わりに固定化ラットＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）を用いた、（ｉｉ）アルファ１モノクローナル抗体の代わりにアルファ２モノクローナル抗体Ａ２−ＩＩＥ１０を用いたことだけである。大部分の化合物はアルファ２と比較してアルファ１に対しては狭い範囲の特異性を持っていた。これらの化合物はアルファ２依存性接着の阻害よりもアルファ１依存性接着の阻害において１から３倍効果があった。
【０１６６】
化合物の毒性はアルファ１トランスフェクト化ＣＨＯ細胞を用いた４時間アッセイにおいて評価した。ここで用いるＬＤ５０濃度（または「致死量５０」）とは所定の時間間隔で５０％の細胞を死滅させるのに必要な化合物濃度である。ＬＤ５０濃度は製造者が示すプロトコールに従いＣｅｌｌｔｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。各化合物の２倍希釈系列は０．１５μＭから０．４０μＭの濃度範囲で試験した。これら化合物の毒性は２．５μＭから４０μＭの範囲であった。
【０１６７】
効果、選択性および毒性に基づいて選んだ３２種の化合物をさらに特異性について分析した。より離れた同類であるＩドメインを含むインテグリンであるアルファＬ（ＬＦＡ−１）およびアルファＭ（Ｍａｃ−１）の接着阻害について化合物を試験した。アルファＬについて、ＩＣＡＭ−１へのＪＹ８細胞の接着を阻害する化合物の試験を行った。
ＩＣＡＭ−１／ＪＹ８細胞接着アッセイ
本発明の化合物の生物学的に適切な活性は、以下のように固定化ＩＣＡＭ−１へのＪＹ−８細胞（表面にＬＦＡ−１を発現するヒトＥＢＶ−形質転換化Ｂ細胞系列）の接着を阻害する化合物の能力を測定する細胞ベース接着アッセイを用いて確認した。化合物をアルファ１アッセイを考慮して、いくつかの変更を加えて表現されるＬＦＡ−１依存性接着の阻害についてスクリーンした。プレートをＩＶ型コラーゲンの代わりにＩＣＡＭ−１Ｉｇタンパク質（炭酸水素ナトリウム緩衝液中５μｇ／ｍＬ）を用いてコートした。ＪＹ細胞はＫ５６２［α１］細胞の代わりに使用した。アルファ１モノクローナル抗体の代わりに使用した捕獲モノクローナル抗体は２２Ｆ１２Ｃ（炭酸水素ナトリウム緩衝液中５μｇ／ｍＬ）であった。アルファＭのために、ｉＣ３ｂへのＭａｃ−１トランスフェクト化ＪＹ細胞接着（実施例２で述べたアッセイ）の阻害について化合物を試験した。両方のアッセイで、化合物を０．１５μＭから２０μＭの濃度範囲の２倍希釈系列において試験した。大部分の化合物はＬＦＡ−１およびＭＡＣ−１依存性接着よりもアルファ１依存性接着の阻害において１から１０倍効果的であった。
【０１６８】
第２のアルファ１依存性細胞接着アッセイを確認したアルファ１アンタゴニストのさらなる評価に発展させた。骨髄性白血病細胞Ｋ５６２細胞を全長アルファ１発現構成アルファ１／ｐＭＨｎｅｏ／４０でトランスフェクトした。アルファ１／ｐＭＨｎｅｏ／４０構成は全長アルファ１配列を発現ベクターｐＭＨｎｅｏ内にサブクローンすることにより生産される［Ｈａｈｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ １２７： ２６７−２６８ （１９９３）］。トランスフェクタントは０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８を用いて選択した。アルファ１発現細胞をさらに選択するために、トランスフェクタントをＩＶ型コラーゲンへの接着のためにパンした（ｐａｎｎｅｄ）。パニングするため、組織培養プレートをＣＭＦ−ＰＢＳ中濃度２０ｍｇ／ｍＬのヒトＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で１時間コートした。プレートを結合緩衝液（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ）で洗浄し、アルファ１トランスフェクト化Ｋ５６２細胞を２０ｎｇ／ｍＬ ＰＭＡ含有結合緩衝液を加えた。３７℃・１時間のインキュベーションの後、非結合細胞を取り除くためにプレートを洗浄した。接着細胞をＥＤＴＡを用いて取り除き、結合緩衝液で希釈した。パニングした後、アルファ１を発現するＫ５２６細胞系列を得て、以下に述べるさらなるスクリーニングに使用した。
【０１６９】
ＣＨＯ細胞接着アッセイで確認された２１種のアルファ１アンタゴニストをアルファ１トランスフェクト化Ｋ５６２細胞接着アッセイでさらに分析した。細胞接着アッセイはＲＰＭＩを接着緩衝液として用いたことを除いて上述したＣＨＯ細胞アッセイと同様に実施した。アルファ１アンタゴニストの効果は、大部分の化合物のＥＣ５０値が２つのアッセイ間で１から３倍の範囲内に収まることからＫ５６２およびＣＨＯ細胞接着アッセイで類似していた。化合物は上述したＣｅｌｌｔｉｔｅｒ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いる４時間アッセイにおいてＫ５６２細胞への毒性についても分析した。大部分の化合物の毒性（ＬＤ５０）はＫ５６２およびＣＨＯアッセイにおいて類似していた。２つのアッセイのＬＤ５０値は化合物の大多数について２倍以下であった。５種のアルファ１アンタゴニストの構造を表７に示した。これら化合物のＥＣ５０値は０．５から１．５μＭの範囲内である。これら化合物はアルファ２よりもアルファ１に対して狭い特異性（１から４倍）を有し、ＬＦＡ−１およびＭＡＣ−１のようにより離れて関連するインテグリンに対してより大きな選択性（３から１０倍）を有する。効果（ＥＣ５０）と毒性（ＬＤ５０）の間の窓は６から２０倍の範囲である。
【０１７０】
【表７】
2004511496.tif 000088
【０１７１】
【実施例１３】
アルファ１ドメインの発現と精製
およびその生化学的アッセイにおける利用
アルファ１ドメイン構成はＥ．ｃｏｌｉにおいてヒスチジン標識化タンパク質としてアルファ１Ｉドメインを発現させることにより生産した。ヒスチジン標識化タンパク質は阻害剤と混合したアルファ１Ｉドメインの三次元構造を決定する共結晶化実験において使用した。ヒスチジン標識タンパク質はまた固定化コラーゲンへのアルファ１Ｉドメインの結合を測定することによる生化学的アッセイにおいてアルファ１アンタゴニストを評価するのに使用した。
【０１７２】
アルファ１Ｉドメインは以下のようにクローンされた。アルファ１Ｉドメインをコードするポリヌクレオチドは以下に示すＡ１．Ｉ．Ｂａｍ（配列番号２６）とＡ１．Ｉ．Ｐｓｔ（配列番号２７）プライマーを用いて、および鋳型としてベクターアルファ１／ｐＤＣ−１／１を用いてＰＣＲ増幅した。
2004511496.tif 000089
ＰＣＲ条件は、初期インキュベーションが９４℃・２分間、次に９４℃・２０秒間が３０サイクル；５５℃・３０秒間および７２℃・３０秒間；および最終インキュベーションが７２℃・７分間である。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを用いて消化し、再度ゲル精製し、前もってＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを用いて消化したｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）内にクローンした。生じたクローンであるアルファ１／ｐＱＥ３０／２をシーケンスするにより確認した。
【０１７３】
アルファ１／ｐＱＥ３０／２構成をタンパク質発現のためにＥ．ｃｏｌｉストレインＭ１５（ｐＲＥＰ４）（Ｑｉａｇｅｎ）内に形質転換させた。ヒスチジン標識化アルファ１ドメインを精製した含有体から６Ｍグアニジンを用いて可溶化し、グアニジンを含まない緩衝液で希釈することによって急に再折りたたみした。可溶化されたアルファ１ＩドメインはＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、イミダゾール勾配によって溶出した。
【０１７４】
精製したアルファ１Ｉドメインは以下のように固定化ＩＶ型コラーゲンとの直接結合アッセイにおいて使用した。Ｃｏｓｔａｒ Ｉｍｍｕｌｏｎ−４プレート（９６ウェル）を（ｉ）ＣＭＦ−ＰＢＳ中濃度４０μｇ／ｍＬのヒトコラーゲンＩＶタンパク質（Ｓｉｇｍａ）５０μＬ／ウェル、（ｉｉ）ＣＭＦ−ＰＢＳ中濃度１０μｇ／ｍＬの抗アルファ１Ｉドメインモノクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、（ｉｉｉ）ＣＭＦ−ＰＢＳ単独を用い一晩コートした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、培地を取り除いてプレートを乾燥させ、その後０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＣＭＦ−ＰＢＳ中濃度が２％ＢＳＡの１５０μＬ／ウェルをプレートをブロックするために加え、プレートをさらに３７℃で１時間インキュベートした。培地を再度取り除いて乾燥させ、その後０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有ＣＭＦ−ＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｔ／Ｍｇ） １５０μＬ／ウェルで２回洗浄した。２倍の化合物、ＤＭＳＯ、抗アルファ１Ｉドメインモノクローナル抗体、イソタイプ適合性対照モノクローナル抗体を含む、または阻害剤を含まないＰＢＳ／Ｔ／Ｍｇ 約５０μＬ／ウェルをプレートに加え、その後精製アルファ１Ｉドメイン２０μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ／Ｔ／Ｍｇ ５０μＬ／ウェルを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。培地を取り除いてプレートを乾燥させ、ＰＢＳ／Ｔ／Ｍｇ １００μＬ／ウェルで２回洗浄し、その後１μｇ／ｍＬ抗ペンタＨｉｓモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を含むＰＢＳ／Ｔ／Ｍｇ １００μＬ／ウェルを加えた。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、培地を取り除き、プレートを乾燥させた。その後プレートを１００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ｔ／Ｍｇで２回洗浄し、２００００倍希釈ＧＡＭ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ／Ｔ／Ｍｇ １００μＬ／ウェルを加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。培地を取り除き、プレートを乾燥させた。プレートを１００μＬ／ウェル ＰＢＳ／Ｔ／Ｍｇで２回洗浄し、１５０μＬのＨ２Ｏ２および１００倍希釈ＴＭＢ基質ストックを含む基質緩衝液１００μＬ／ウェルを各ウェルに加え、プレートを暗所に室温で３０分間展開させた。
１５％Ｈ２ＳＯ４ ５０μＬ／ウェルをその後反応を停止させるために加え、プレートを吸光光度計におけるＡ４５０−Ａ６７０によって分析した。特異的信号を「陰性対照」ウェルへのバックグランド結合を引くことにより決定した。付加的アッセイはユーロピウム標識アルファ１Ｉドメインを用いて展開し、結合したＩドメインは洗浄後経時的に変化する蛍光（ＴＲＦ）を用いて直接検出した。このアッセイでは、精製アルファ１Ｉドメインを製造者（Ｗａｌｌａｃ）の示すプロトコールに従いＤＥＬＦＩＡ ユーロピウム標識キットを使用してユーロピウムで標識した。Ｃｏｓｔａｒ Ｉｍｍｕｌｏｎ−４プレート（９６ウェル）をＣＭＦ−ＰＢＳ／１μＭ ＭｇＣｌ２中濃度２５μｇ／ｍＬのヒトコラーゲンＩＶタンパク質（Ｓｉｇｍａ） １００μＬを用いてコートし、４℃で一晩インキュベートした。その後プレートを１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むＴＢＳ／Ｔ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０）２００μＬ／ウェルで３回洗浄した。そしてプレートを１００μＬのＣＭＦ−ＰＢＳ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／２％ＢＳＡを用いて３７℃で１時間ブロックした。その後プレートを再度洗浄し、１００μＬ／ウェルのＥｎｈａｎｓｅ（Ｗａｌｌａｃ）を加えて展開し、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダーで経時的に変化する蛍光を測定して分析した。
【０１７５】
【実施例１４】
アルファ１ベータ１ロイシンジッパータンパク質の発現と精製
およびその生化学的アッセイにおける利用
より生理学的に正確な生化学的アッセイを発展させるため、アルファ１ベータ１ロイシンジッパータンパク質を生産した。発現構成は個々に調製され、膜透過および細胞質テールポリペプチドシーケンスなしで全長アルファ１とアルファ２の細胞外ドメインをコードする。膜透過領域の除去によりこれらタンパク質は容易な精製を提供するトランスフェクト化細胞から分泌されるようになる。膜透過シーケンスは酸性および塩基性ロイシンジッパーシーケンスに取って代わられる。Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１： １１４０８−１１４１２ （１９９４）を参照。
【０１７６】
ベータ１の細胞外ドメインは全長ベータクローンＨｅ６．１．２／ｐｃＤＮＡ−１Ａｍｐからサブクローンした。このクローンはハイブリダイゼイションによるＨｅｔａ ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得られた。ロイシンジッパーシーケンスはアルファ１アルファ２ヘテロダイマーの形成を促進する。これら構成は２００１年６月２６日に特許された米国特許第６，２５１，３９５号と同じロイシンジッパーシーケンスおよびベクターを用いて生産し、その実施例１４はロイシンジッパータンパク質を構成する方法の記述として参照することによりここに組み込まれる。アルファ１およびアルファ２ロイシンジッパー構成をＣＨＯ細胞内へ共トランスフェクトし、その後１０％透析済みＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持した。上清を集め分泌されたアルファ１ベータ１ヘテロダイマーをロイシンジッパーの両鎖を認識する抗ロイシンジッパーモノクローナル抗体を連結したＣＮＢｒ（臭化シアン）活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｓｉａ）を用いたクロマトグラフィーによって精製した。生化学的アッセイへの使用のために、精製アルファ１ベータ１ロイシンジッパータンパク質を製造者の示すプロトコールに従ってＤＥＬＦＩＡユーロピウム標識キットを用いてユーロピウム標識した。固定化コラーゲンへの標識アルファ１ベータ１ロイシンジッパータンパク質の結合は経時的に変化する蛍光によって測定した。ヘテロダイマーアッセイは、ＣＭＦ−ＰＢＳ／１ｍＭ ＭｇＣｌ２／２％ＢＳＡがユーロピウム標識したＩドメイン用のプローブの代わりをすることを除いて基本的にはユーロピウム標識したＩドメインアッセイと同様に実施した。
【０１７７】
【実施例１５】
フォンウィルブランド因子／ｇｐＩｂ−ＣＨＯ静止細胞接着アッセイ
フォンウィルブランド因子中のＡ１１ドメイン（ｖＷｆ）は他のタンパク質中に見られるＩドメインと相同である。これら分子が上述したのと類似の調節を受けやすいという可能性を調査するため、試験化合物のライブラリーをｇｐＩｂへのｖＷｆ結合を調節する効果についてを試験を行った。
【０１７８】
丸底（ＰＢ）ガラスプレートをＣＭＦ−ＰＢＳ中濃度１μｇ／ｍＬのウシｖＷｆ（ｂｖＷｆ）５０μＬを用いて４℃で一晩コートした。対照ウェルは５μｇ／ｍＬのｖＷｆ５０μＬ／ウェルでコートしたウェル、または１０μｇ／ｍＬのフィブリノーゲンでコートしたウェルを含む。翌朝、プレートを２００μＬのＣＭＦ−ＰＢＳで１回洗浄し、２．５％ゼラチン２００μＬを用いて３７℃で１時間ブロックし、２００μＬＣＭＦ−ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１７９】
糖タンパク質（ＧＰ）Ｉｂ−ＩＸ［Ｃｒａｎｍｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ６０９７−６１０６ （１９９９）］をコードするＤＮＡを有するＣＨＯ細胞を４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８および２００μｇ／ｍＬゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した１０％ＦＣＳ、抗体、ゼラチンおよび５−ヒドロキシトリプトファン含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で発育させた。集密細胞をＣＭＦ−ＰＢＳで１回洗浄し、温ＥＤＴＡを用いて５分間インキュベーター内でインキュベートした。細胞を集め、４ｍＭ ＥＤＴＡを含むタイロード液（Ｓｉｇｍａ）中に２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させた。
【０１８０】
試験化合物のライブラリーをタイロード／ＥＤＴＡ中に２０μＭに希釈し、希釈した化合物５０μＬを最終濃度１０μＭになるように各ウェルに加えた。対照として、最終濃度ＤＭＳＯ ０．３％となるよう細胞３００μＬに１００％ＤＭＳＯを１μＬ加えた。公知のｖＷｆ阻害剤を含む対照では、アウリン−トリカルボン酸（ＡＴＡ、Ｓｉｇｍａ）を１００％ＤＭＳＯに溶かして２０ｍＭとし、タイロード／ＥＤＴＡで２０μＭに希釈し、最終濃度１０μＭとなるよう各ウェルに５０μＬずつ加えた。
【０１８１】
細胞を各ウェルの濃度が５０μＬ中１０５細胞／ウェルとなるよう加え、プレートを室温で４０分間振盪した。非接着細胞を吸引によって取り除き、２００μＬのＣＭＦ−ＰＢＳを加え、プレートを撹拌ボルテックスし、緩衝液を取り除いた。カルセリンを加え（２μＭストックを各ウェル５０μＬ）、接着細胞を標識するため室温で１時間インキュベートした。接着細胞を定量化するためミリポアＣｙｔｏＦｌｕｏ２３５０蛍光光度計を用いて蛍光を測定した。２０μＭ以下のＩＣ５０値を有する化合物の相当数を確認した。
【０１８２】
【実施例１６】
ＣＤ１１ｂが介在するフィブリノーゲンへの好中球接着
ＣＤ１８／ＣＤ１１ｂ−（Ｍａｃ−１）が介在するＩＣＡＭ−１への接着に関する上述した接着アッセイは以下の変更法により実施した。各ウェルを５０ｍＭ炭酸水素緩衝液（ｐＨ ９．６）５０ｍＬ中のグリコフォリン（１０μｇ／ｍＬ）、フィブリノーゲン（５μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ１８モノクローナル抗体（２２Ｆ１２Ｃ、５μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体（４４ＡＡＣＢ、５μｇ／ｍＬ）５０μＬを用いて４℃で一晩コートした。プレートを１％ヒト血清アルブミンを用いてブロックし、非ブロック抗体を用いた。好中球は新鮮なヘパリン添加ヒト全血から密度勾配遠心によって分離し、接着緩衝液中の細胞（４×１０６細胞／ｍＬ）１００μＬを各ウェルに加えた。プレートを３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１８３】
１０００種を超える化合物をスクリーンし、いくつかの化合物は１μＭから４０μＭの範囲のＩＣ５０値を有していた。９種の化合物のＩＣ５０値は１０μＭ以下であった（表２に掲げる化合物Ｓ、化合物Ｒ、化合物Ｎ、化合物Ｏ、化合物Ｐ、化合物Ｑ、化合物Ｌ、化合物Ｖ、および化合物Ｆ）。化合物Ｓ（当初１μＭのＩＣ５０を示した）に基づくＳＡＲ作業の後、化合物の阻害効果は２００ｎＭ（化合物ＡＡおよび化合物ＡＣ）以下であることが証明され、いくつかの化合物（化合物Ｚから化合物ＡＭの範囲の化合物）は２０μＭで完全な阻害を示した。化合物Ｚの例外を除き、αＥβ７／Ｅ−カドヘリンを阻害する効果によって選択された全ての化合物は他のβ７インテグリンであるα４β７にも拮抗する。これら化合物はαＬβ２、αｄβ２、およびα４β１に対して最小限の抑制活性も示した。また、αＥβ７／Ｅ−カドヘリンに関連し、これら化合物はαＭβ２、αＶβ３に対して限定的選択性（２倍以下）を示した。
【０１８４】
【実施例１７】
Ｒａｃ１グアニンヌクレオチド交換反応阻害剤の開発
Ｒａｃタンパク質はＧＤＰと結合しているときには活性ではないが、ＧＤＰをＧＴＰに交換することによって活性化される。Ｒａｃタンパク質中でＧＴＰへのＧＤＰの交換はＶａｖ１およびＴｉａｍ１のようなグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦｓ）によって触媒される［Ａｇｈａｚｄｅｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １０２：６２５（２０００）； Ｗｏｒｔｈｙｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４０８：６８２（２０００）］。細胞増殖の調整におけるＲａｃタンパク質の重要性のため、Ｒａｃグアニンヌクレオチド交換反応および、特に、Ｔｉａｍ１存在下Ｒａｃ１ＧＤＰのＧＴＰへの変換を妨げる小分子は、本発明の方法並びに組成物にとって興味深いと考えられる。
Ａ．Ｒａｃ１およびＴｉａｍ１のクローニングと発現：
Ｔｉａｍ１のＲａｃ１およびＤＨ−ＰＨドメインを標準的組み換え体ＤＮＡ法［Ｄｉｓｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１６３７８ （１９８９）］を用いてクローンした。Ｒａｃ１は従来法［Ｓｅｌｆ ａｎｄ Ｈａｌｌ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２５６：３ （１９９５）］に従い、ベクターｐＧＥＸ２Ｔを用いてＧＳＴ融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中に発現した。精製したトロンビン開裂Ｒａｃ１タンパク質をアッセイに用いた。
【０１８５】
Ｔｉａｍ１ＤＨ−ＰＨドメインはＲｏｓｓｍａｎとＣａｍｐｂｅｌｌがＭｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２５：２５ （２０００）で述べたプラスミドｐＥＴ２８ａを用いるカルボキシ末端６ＸＨｉｓ標識を含む融合タンパク質であると表明された。
Ｂ．グアニンヌクレオチド交換アッセイ：
Ｔｉｍ１に触媒されるＲａｃ１のＧＤＰのＧＴＰへの交換は、基本的にはＣｒｏｍｐｔｏｎらの方法［Ｃｒｏｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（３３）：２５７５１ （２０００）］に従って実施した。ＧＤＰ結合Ｒａｃ１はＴｉａｍ１存在下、［α３２Ｐ］標識ＧＴＰと共にインキュベーションし、ヌクレオチド交換は以下のＲａｃ１に結合する放射能の増加によって観察した。遊離放射能は９６ウェルプレートのウェル内の反応液を移し、Ｒａｃ１に結合しない［α３２Ｐ］標識ＧＴＰ分画を濾過することにより取り除いた。ヌクレオチド交換アンタゴニストのスクリーンの間、化合物は１０μＭの濃度で使用した。スクリーニング法によって分析した化合物をさらに以下に示す。
Ｃ．細胞増殖アッセイ：
ラット胚線維芽細胞（ＲＥＦ）およびＪｕｒｋａｔ細胞を、細胞増殖におけるＲａｃ１グアニンヌクレオチド交換阻害剤の効果を試験するために、それぞれ線維芽およびＴ細胞の代表として選んだ。ＲＰＭＩ培地で培養されたＲＥＦ（「ＲＥＦ−Ｒ細胞培養」）をＮｏｂｅｓの方法［Ｎｏｂｅｓ， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２５：４４１ （２０００）］により得た。完全ＲＰＭＩおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中のＲＥＦ−ＲまたはＪｕｒｋａｔ細胞は９６ウェルプレート中に二重に、１０×１０３細胞／ウェルの濃度で移した。２１時間（Ｊｕｒｋａｔ細胞用）、および４５時間（ＲＥＦ−Ｒ用）後、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を加え、細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）に戻してさらに３時間インキュベートした。結果はＳｐｅｃｔｒａＭａｘＧＥＭＩＮＩ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて得た。
【０１８６】
対照の少なくとも５０％でＲａｃ１グアニンヌクレオチド交換反応を阻害する化合物が得られた。いくつかの化合物のＩＣ５０値をＴｉａｍ１存在下、Ｒａｃ１のグアニンヌクレオチド交換反応として測定した。表８に掲げる５種の構造は最も効果のある阻害剤を表し、これら化合物のグアニンヌクレオチド交換反応のＩＣ５０値もそこに含まれる。
【０１８７】
【表８Ａ】
2004511496.tif 000090
【０１８８】
【表８Ｂ】
2004511496.tif 000091
【０１８９】
【実施例１８】
細菌性タンパク質の阻害
ロスマンフォールド構造を有する３種の微生物酵素を、試験化合物のライブラリーと共にスクリーニングする候補として確認した。選択は（ｉ）ロスマン構造の存在；（ｉｉ）原核および真核細胞における発現様式；（ｉｉｉ）臨床上の重要性；および（ｉｖ）細菌の発育および生存にとっての機能的重要性に基づいて行った。選択した２種のタンパク質、ジヒドロジピコリン酸還元酵素（ＤＨＰＲまたはＤａｐＢ）およびエノイルａｃｐ還元酵素（ＥＮＲ）は、ＮＡＤＰＨから基質への電子伝達を触媒し、リジン生合成および脂肪酸生合成の生合成経路にそれぞれ不可欠である。３番目および４番目のタンパク質、Ｅ．ｃｏｌｉ ｒａｓ−ｌｉｋｅ ＧＴＰアーゼ（ＥＲＡ−ＧＴＡｓｅ）およびｙｉｈＡ（１種のＧＴＰアーゼ）は、翻訳および周期調節に関係する。
【０１９０】
ＤａｐＢ調節活性はアスパラギン酸セミアルデヒドからのジヒドロジピコリン酸合成に関連する光学アッセイを用いて評価した。アッセイは最初にジヒドロジピコリン酸を合成するためにジヒドロジピコリン酸シンテターゼ（ＤａｐＡ）を利用し、次にＮＡＤＨとＤａｐＢｎｏの添加が続く。ジヒドロジピコリン酸は不安定な化合物であるため連結反応が必要である。試験化合物の存在下および非存在下における、ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に変換することにより生じる吸光度の変化を３４０ｎｍで観察した。
【０１９１】
ＥＮＲのモジュレーターの同定は同様の方法で行ったが、単一段階反応で行った。簡単に言えば、ＮＡＤＨとＥＮＲをまずインキュベートし、次に基質（クロトニルＣｏＡまたはクロトニルＡＣＰ）を加える。再度、試験物質の存在下および非存在下における、ＮＡＤＨがＮＡＤ＋に変換することにより生じる吸光度の変化を３４０ｎｍで観察した。
【０１９２】
光学的アッセイは多量の基質、例えばクロトニルＣｏＡを必要とするという事実、およびいくつかの試験化合物は同じ波長でＮＡＤＨとして吸光するという事実を考慮し、ため、放射標識ＮＡＤＨを用いてＥＮＲモジュレーターを同定するために選択的薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびプレートベースアッセイを立案した。
【０１９３】
ＰＥＩ膜上で５から１０分の展開時間差で分離する２つの状態を生じる塩化リチウム存在下、３２Ｐ−ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への変換を測定した。放射標識スポットはＳｔｏｒｍ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒにより測定し、ＮＡＤ＋とＮＡＤＨの比を算出した。試験化合物存在下におけるＮＡＤＨとＮＡＤ＋の比の増加は変換の阻害を暗示する。対照反応は直線範囲で変換を測定できるように最適化する。このアッセイの実用的利用を商業上利用可能な酵素阻害剤を用いて示した。ＴＬＣ法は特に小規模のスクリーニングに便利である。
【０１９４】
大規模なスクリーニングには、同じ試薬を利用するようにプレートベースアッセイを立案した。このアッセイは分離するためにＮＡＤＨとＮＡＤ＋間の電荷の違いを利用する。正電荷ＤＥＡＥセルロース膜を、ＮＡＤ＋よりも大きな負の電荷をもつ３２Ｐ−ＮＡＤＨを選択的に捕捉するために用いた。捕捉された３２Ｐ−ＮＡＤＨをシンチレーション計測を用いて測定し、試験化合物存在下で増加する信号は酵素阻害を示す。
【０１９５】
ＥＲＡ−ＧＴＰアーゼ用には、モジュレーターを同定するために一段階アッセイを実施する。ＧＴＰのＧＤＰへの変換における標識化リン酸の移転は、試験化合物および当該技術分野において日常的に行われるアッセイを用いるシンチレーションカウンターで検出される標識の存在下および非存在下で測定した。ＥＲＡ−ＧＴＰアーゼアッセイはｙｉｈＡモジュレーターのスクリーニングにおいても利用することが可能である。
【０１９６】
【実施例１９】
ＨＰＰＫアンタゴニストの同定
酵素６−ヒドロキシメチル−７，８−ジヒドロプテリンピロホスフォキナーゼ（ＨＰＰＫ）は新規葉酸生合成カスケードの一部であり、ＡＴＰから６−ヒドロキシメチル−７，８−ジヒドロプテリン（ＨＭＤＰ）へのピロリン酸の移転を触媒する［Ｒｉｃｈｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２４４： １５８２−１５９２ （１９６９）］。ＨＰＰＫはグラム陽性並びにグラム陰性細菌、真菌、および原生動物において発現するが、高等真核生物においては発現しない。従って、ＨＰＰＫは抗葉酸活性を有する抗菌剤の開発に対して新規な標的となる。
１．Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＰＰＫ遺伝子の同定
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＰＰＫ遺伝子はＨＰＰＫ遺伝子の５’（配列番号２８）および３’（配列番号２９）末端に特異的な以下のオリゴヌクレオチドプライマーを有するＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって同定した。
2004511496.tif 000092
ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）ＤＮＡサーマルサイクラーで標準条件において実施した。一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．３， ｐ．１５．１．１−ｐ．１５．１．１５ （１９９９）を参照。その後増幅産物をＰＣＲ産物の適切な大きさを決定するために、アガロースゲル電気泳動によって分析し、予想通り約４８７ｂｐの単一ＤＮＡ断片を検出した。
【０１９７】
ＨＰＰＫ ＰＣＲ産物は製造者のプロトコールに従ってベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に連結させた。Ｅ．ｃｏｌｉストレインＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）は製造者が推薦するように正確な量の連結反応を用いて形質転換し、単一細菌コロニーを分離して１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むＬＢＭ培地中で一晩発育させた。
【０１９８】
プラスミドＤＮＡを Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて単一コロニーの培地２ｍＬから同定した。プラスミドｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ／ＥｃＨＰＰＫ中のＥ．ｃｏｌｉ ＨＰＰＫ ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列は正確に、配列番号３０に示すアミノ酸配列を有することを確認した。
２．Ｈｉｓ（６）−ＨＰＰＫ発現構成の生産
Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＰＰＫの精製と検出を促進するために、サブシーケンスＰＣＲ増幅の間に、シーケンスをコードするＥ． ｃｏｌｉ ＨＰＰＫに以下の変更を行った：１）ＨＰＰＫのアミノ末端を付加的６ヒスチジン残基を組み入れるように修正した、２）発現ベクターｐＢＡＲ５内へのＰＣＲ断片のサブクローニングを促進するためにコード領域の５’および３’末端に独自の制限部位を加えた。発現ベクター内への同様のＰＣＲ断片のサブクローニング法は、１９９８年１２月８日特許された米国特許第５，８４７，０８８号、実施例８にすでに記載されており、引用されることによりここに組み込まれる。
５’ＰＣＲプライマーは、以下に示す付加的アミノ酸残基 ”ＭＧＨＨＨＨＨＨＧＧ”（配列番号３１）をコードするシーケンスに従うＮｃｏＩ制限部位を含んでいた。
2004511496.tif 000093
３’ＰＣＲプライマーは以下に示すＸｈｏＩ制限部位を含んでいた。
2004511496.tif 000094
これらプライマーを用いて、４８７ｂｐ ＨＰＰＫ ＰＣＲ産物を標準的ＰＣＲ増幅反応において増幅し、反応の分別物はアガロースゲル電気泳動によって分析した。予想した大きさに一致する約５１９ｂｐのシングルバンドを検出した。ＰＣＲ増幅産物はＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて精製し、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。消化したＰＣＲ産物をＮｃｏＩ−およびＸｈｏＩ−消化したプラスミドｐＢＡＲ５内に連結し、連結反応の分別物は製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）のプロトコールに従ってＴＯＰＯ１０細菌を形質転換するのに用いた。単一コロニーをカルベニシリン含有ＬＢＭ寒天プレート上にプレーティングした後分離した。単一コロニーのいくつかはカルベニシリン含有ＬＢＭ培地２ｍＬ中で一晩発育させ、プラスミドＤＮＡを上述したようにＤＮＡシーケンシングで単離した。プラスミドｐＢＡＲ５／ＨｉｓＨＰＰＫは、次の配列番号３４に示すアミノ酸配列を有するＨｉｓ（６）−ＨＰＰＫ遺伝子をコードする開放読み込みフレームを含むことが示された。
３．ＨｉｓＨＰＰＫ発現
プラスミドｐＢＡＲ５／ＨｉｓＨＰＰＫを標準的方法でＥ．ｃｏｌｉストレイン ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を形質転換するために用いた。プラスミドｐＬｙｓＳおよびｐＢＡＲ５／ＨｉｓＨＰＰＫをそれぞれ選択するために、形質転換体はクロラムフェニコールおよびカルベニシリンの両方を含有するＬＢＭプレート上にプレーティングした後、選択した。プラスミドｐＬｙｓＳはＴ７ライソゾームをコードするプラスミドである。ライソゾームの存在は凍結−解凍サイクルの結果起こる細胞溶解を促進する。
【０１９９】
ＨｉｓＨＰＰＫの大規模発現を開始するため、ｐＢＡＲ５／ＨｉｓＨＰＰＫを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ培養組織５０ｍＬをカルベニシリンおよびクロラムフェニコールを含有するＬＢＭ中において３０℃で一晩振盪しながら発育させた。翌日、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールを補充したＬＢＭ ５００ｍＬを満たした２リットルフラスコに植え付けるために培養液１０ｍＬを使用した。フラスコは細菌培養液のＯＤ６００が約０．６に到達するまで振盪しながら３７℃にインキュベートした。
【０２００】
プラスミドｐＢＡＲ５／ＨｉｓＨＰＰＫは、ＨｉｓＨＰＰＫ遺伝子のアラビノース誘導性プロモーター上流を含む。培養液が適切な濃度に達すれば、アラビノースをＨｉｓＨＰＰＫ発現を誘導するために０．１％の最終濃度になるよう培養液に加え、フラスコをさらに２．５時間振盪しながら３７℃にインキュベートした。細胞を遠心によって収穫し、細胞培養液１リットルから得た細胞ペレットを３５ｍＬの最終容量になるように溶解緩衝液［５０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ ｐＨ８、５０ｍＭイミダゾール、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、および無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）］中に再懸濁させた。各３５ｍＬ細菌培養液を５０ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ドライアイス上で凍結させ、その後−２０℃で保存した。
４．ＨｉｓＨＰＰＫの精製
各３５ｍＬの分別物は氷上解凍し、フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ）内で溶解させた。溶解性タンパク質分画を表す透明な溶解液を得るために、溶解液を４℃で３０分間、２０，０００ ｘｇで遠心した。ＨｉｓＨＰＰＫは２段階法を用いて精製した。
【０２０１】
まず、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）に非特異的に結合した細菌性タンパク質を、透明化した溶解液と結合したＮｉ２＋を事前にＥＤＴＡで処理して取り除いたＮＴＡアガロースをインキュベートすることにより除去した。透明化した溶解液３５ｍＬを１ｍＬ ＮＴＡアガロースと共に４℃で約１時間、バッチ式でインキュベートし、その後ＮＴＡ樹脂を遠心により取り除いた。製造者（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）のプロトコールに従ってＨｉｓＨＰＰＫをＮｉ−ＮＴＡアガロース上で精製した。単離したＨｉｓＨＰＰＫタンパク質を１２％Ｎｏｖｅｘゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）上に再溶解させ、ゲルを固定化し、標準的条件においてクマシーブリリアントブルーを用いて染色し、ＨｉｓＨＰＰＫ調製において同定された唯一のタンパク質はＨｉｓＨＰＰＫの予想された大きさに一致する分子量約１９ｋＤの単一種であった。そのタンパク質を２０ｍＭトリス ｐＨ８に対して透析し、分別し、−７０℃で保存した。
５．ＨＰＰＫ活性のスクリーニングアッセイ
ＨＰＰＫの低分子阻害剤を同定するために、６−ヒドロキシメチル−７，８−ジヒドロプテリン（ＨＭＤＰ）のピロリン酸化反応の副産物としてＨＰＰＫ依存性のＡＴＰのＡＭＰへの変換を測定するＨＰＰＫアッセイを使用した［Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４４： １３６４−１３７１ （２００１）］。基質競合を識別する可能性を減少するため、アッセイにおいて両基質（ＨＭＤＰおよびＡＴＰ）の濃度を増加させた。この反応は９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート中で使用するように以下のように変更した。
【０２０２】
以下の組成物の主要混合物は、５０ｍＭヘペス ｐＨ８．５、１００μＭ ＨＭＤＰ（Ｓｃｈｉｒｃｋｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｊｏｎａ， スイス）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３５μＭアデノシン三リン酸、および１０ｎｇのγ−標識３２Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｓｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）を含むように調製した。主要混合物の分別物を９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに加えた。さらに２０μＭの最終スクリーニング濃度になるよう候補阻害化合物を５μＬ／ウェル加えた。各候補化合物はアッセイプレートへの添加に先立ちＤＭＳＯ中に希釈させ、最終アッセイ混合物中のＤＭＳＯ最終濃度を５％とした。１００ ｎｇの精製ＨｉｓＨＰＰＫの添加により反応を開始させ、３７℃で１５分間実施した。各ウェルに等量の１２０ｍＭ ＥＤＴＡを添加して反応を停止させた。ＡＭＰから生成する放射標識ＡＴＰを分析するために、２μＬの反応容積をＰＥＩセルロースプレート上にスポットし、プレートを０．３Ｍ ＫＨ２ＰＯ４を用いて展開した。プレートの放射能はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ ８６０ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｉｍａｇｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いて測定した。化合物存在下におけるＨＰＰＫ酵素活性は、ＤＭＳＯ単独対照反応と関連する二重試験のサンプルにおける放射標識ＡＴＰのＡＭＰへのパーセント変換から推論した。基質を含まないサンプルの非特異的バックグランドは１％以下であるので、校正は行わなかった。約２５２０種の化合物をスクリーンし、約５８種の化合物がＨＰＰＫ活性を５５％以上阻害し、ヒット率は２．３％であった。これら化合物ＩＣ５０測定によってｉｎ ｖｉｔｒｏの効果をランク付けした。
６．Ｅ．ｃｏｌｉ ＴｏｌＣの細菌発育に対するＨＰＰＫアンタゴニストの効果
Ｅ．ｃｏｌｉの発育を阻害するために要求される最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、ＨＰＰＫヒット化合物のｉｎ ｖｉｖｏ活性を確認するために、ＨＰＰＫマイクロタイターブイヨンアッセイを用いて測定した。ＭＩＣはＤＭＳＯ単独対照と比較して８０％発育を減少させるために最小濃度として定義される。より特異的には、これらの化合物の有効性をＴｏｌＣ遺伝子に突然変異を含むＥ．ｃｏｌｉストレインに対して測定した。ＴｏｌＣ遺伝子は細菌細胞質ゾルからのタンパク質毒素や抗生物質のような低分子の移出を促進する経ペリプラズム流出ポンプをコードする［Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３： ４１２−４１６ （２００１）］。この突然変異は細胞内への化合物の移入には全く影響しないが、ＴｏｌＣ突然変異体ではエフラックスポンプを経由して排出される傾向があるいくつかの化合物が、より高い細胞質内濃度に到達する。全てのマイクロタイターブイヨンアッセイは臨床研究標準国家委員会が確立したプロトコールに従った［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ Ｇｒｏｗ Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；承認標準第５版 Ｖｏｌ．２０， Ｎｏ．２ ＮＣＣＬＳガイドライン Ｗａｙｎｅ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（２０００）．］
マイクロタイターブイヨンアッセイはチミジン水準が低いミューラー−ヒントンブイヨン中で実施した。細菌用培地中のチミジンの存在は抗葉酸性のトリメトプリムおよびスルファメトキサゾール活性に拮抗し、ＨＰＰＫ阻害剤にも拮抗する。
【０２０３】
マイクロダイリューションプレートへの添加に先立ち、化合物を順次ＤＭＳＯで２倍希釈した。各プレートは２つの対照を含む：トリメトプリムの一連の希釈は各プレートの陽性対照となり、未接種ミューラー・ヒントンブイヨンを含む２番目の列は各ウェル間の交差汚染を観察するための無菌対照として利用できる。プレートはＯＤ６００を測定する前に１６時間インキュベートした。
【０２０４】
【表９Ａ】
2004511496.tif 000095
【０２０５】
【表９Ｂ】
2004511496.tif 000096
【０２０６】
ＭＩＣアッセイにおいて最も活性が高かった４種の化合物を表９に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ ＴｏｌＣにおけるこれら化合物の最小阻害濃度は０．１から１２．５μＭの範囲であった。しかしながら、ＭＩＣアッセイは制菌および殺菌作用機序間の区別はできず、これら化合物がｉｎ ｖｉｖｏでＨＰＰＫを選択的に阻害するか否か決定することもできない。これら化合物が抗葉酸活性を有し、かつｉｎ ｖｉｖｏでＨＰＰＫを阻害するか否かを決定するための実験を進行中である。トリメトプリムやスルファメトキサゾールのような典型的な抗葉酸剤の活性は細菌用培地中のチミジンの存在によって十分に立証されている［Ａｍｙｅｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７（２）： １４３−１５３ （１９７３）］。
ミューラー−ヒントン培地単独、またはチミジンを補充した培地における各化合物のＭＩＣを決定する実験を実施する予定である。ジアリール硫化物がｉｎ ｖｉｖｏでＨＰＰＫを阻害するならば、葉酸の最終産物であるチミジンの存在によってそれらの活性は減少するであろう。選択的には、これらの化合物をトリメトプリムと一組としたときに細菌の発育を共同的に阻害する効果について分析した。共同作用はジアリール化合物とトリメトプリムの両方が同じ生化学経路に作用する場合に起こる。トリメトプリムと試験化合物の組合わせ分析は、それら化合物を交差タイトレートし、従来知られたマイクロタイターブイヨンアッセイでの細菌発育に対する効果を分析する標準的「チェッカー盤」試験において実施した［Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｍｏｅｌｌｅｒｉｎｇ， Ｊｒ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ， ｐｐ． ３３０−３９３， ｉｎ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， 第４版（Ｖ． Ｌｏｒｉａｎ ｅｄ．， １９９６）］。
【０２０７】
【実施例２０】
ｆｔｓＺ阻害剤の同定アッセイ
ｆｔｓＺは細胞分割中に含まれる基礎的細菌遺伝子の産物である。ｆｔｓＺはＧＴＰと結合し加水分解する、そしてＧＴＰに結合したときには長い線状のポリマーを形成する。ｆｔｓＺのＧＴＰ依存性重合は細菌細胞分割における機能に関連する。セプテーション（ｓｅｐｔａｔｉｏｎ）の間、ｆｔｓＺは細胞分裂の程度を決める環を形成する。ｆｔｓＺを欠く細胞はセプテーションを行うことができず、分割せずに死滅する。ｆｔｓＺは細菌界では高度に保護されている（約６０％）。従って、ｆｔｓＺの阻害によって、本発明の組成物と方法は広スペクトラムな抗生物質を提供する。ｆｔｓＺの原子構造はそれがアルファ／ベータタンパク質であることを示している［Ｎｏｇａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５： ４５１−４５８］。ｆｔｓＺに関連する最も類似する構造は、ＧＴＰ結合性および加水分解性タンパク質であり、細胞分裂の間細胞小器官と染色体の分離において基礎的役割を果たす微小管を形成するために重合化する真核生物タンパク質チュブリンである。
【０２０８】
マイクロタイターウェル内で実施することができるｆｔｓＺ阻害剤同定のための重合アッセイを工夫した。重合アッセイはチュブリン重合アッセイ［Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５： ２３２５−２３３３ （１９９５）］の改良であり、ＧＴＰ依存型のｆｔｓＺの可逆的重合を含む。
【０２０９】
ＧＴＰおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、５ｎｍ ｆｔｓＺ線状ポリマーは０．２μｍフィルターに捕集されるのに十分な大きさのより高度のポリマーを組み立てる［Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ １６： ５４５５−５４６３ （１９９７）］。フィルター上に残ったタンパク質を染色し、比色アッセイにおいて検出した。１００μＭ ＧＴＰによって重合化されるｆｔｓＺ ３００μｇ／ｍＬからなる重合反応を１０μＭの候補ｆｔｓＺ阻害剤に対してスクリーンした。
【０２１０】
より高感度の選択的アッセイも工夫した。このアッセイでは、１００μｇ／ｍＬのｆｔｓＺを０．５μＭ ３２Ｐ−γ−ＧＴＰと共にインキュベートした。ｆｔｓＺのＧＴＰアーゼ活性は３２ＰＯ４を遊離する。１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４中濃度２５ｍｇ／ｍＬの活性炭を用いて反応を停止させ、産物を遠心することにより、残存する３２Ｐ−γ−ＧＴＰは活性炭に吸着される。従って、上清中に残存する３２ＰＯ４を測定し、ＧＴＰアーゼ阻害の測定がなされる。このスクリーニングアッセイは上述した重合スクリーンに比べてＧＤＰによる阻害に対して顕著に高感度であるため（ＩＣ５０ ８μＭ対２５０μＭ）、ｆｔｓＺ阻害剤をより良く同定する。
【０２１１】
【実施例２１】
ＥＮＲ阻害剤のスクリーニングアッセイ
非放射性高純度ＮＡＤＨを用いるＥＮＲ阻害剤をスクリーンするアッセイを開発した。ＥＮＲの単離はＢａｌｄｏｃｋら［Ｂａｌｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：２１０７ （１９９６］によって表されている。明らかに、ＥＮＲはＮＡＤＨおよびクロトニルＣｏＡのＮＡＤ＋および脂肪酸アシルＣｏＡへの変換を触媒し、アッセイはルシフェラーゼがＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する第２反応において生産されるＮＡＤ＋量を測定する。ルシフェラーゼ反応からの光放射は最初の反応におけるＮＡＤ＋生産量に比例する。候補阻害化合物をＥＮＲ反応に加え、もし候補化合物がＥＮＲ活性を阻害するならば、ルシフェラーゼ反応において検出される光の量は減少する。
【０２１２】
アッセイは以下のように実施した。６ｎｇ／μＬ ＥＮＲを含む２０ｍＭヘペス中濃度が３０μＭのＮＡＤＨ（Ｒｏｃｈｅ）２０μＬまたはウェル当たり全量１２０ｎｇのＮＡＤＨ、およびＤＭＳＯ中濃度１０μＭの候補阻害化合物２０μＬを９６ウェル平底光学プレートに加えた。反応を開始するために３００μＭクロトニルＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ， Ｃ６１４６）２０μＬを続いて加えた。トリクロサンは対照阻害剤として用い、阻害を証明するために各プレートに含まれるようにした。スクリーニングアッセイにおいて、トリクロサンは約１μＭのＩＣ５０で阻害する。
【０２１３】
反応が約３０％完了するのに相当する約１０分間反応を継続させた。従って、ＮＡＤ＋濃度は１０分後約３μＭになる。
【０２１４】
１６０ｍＭ ＨＣｌ ３０μＬを反応混合液のｐＨを２以下とし、残存するＮＡＤＨ基質を取り除くために反応系に加えた。残存ＮＡＤＨがＡＤＰ−リボースとニコチンアミドに分解するように反応混合液を酸添加に続いて１分間インキュベートした。ＮＡＤ＋は強酸の添加によって実質上影響を受けない。
【０２１５】
上述した１分間終了後直ちに、アルコール脱水素酵素、エタノール、ＦＭＮ、ＦＭＮ酸化還元酵素、デカナールおよび細菌性ルシフェラーゼを含むＮＡＤＨ再生／ルシフェラーゼ溶液１１０μＬを反応混合液に加えた。
【０２１６】
より特異的に、ＮＡＤＨ再生／ルシフェラーゼ溶液を３００ｍＭトリス（１Ｍ ｐＨ７．５のストックを使用）、０．２６重量％ビス（トリメチルシリル）アセタミド（”ＢＭＡ”）、０．６５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１８ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝溶液１１０μＬ中に調製した。約２００μＭのデカナール濃度である最終溶液を生じるようにデカナール（Ｓｉｇｍａ Ｄ７３８４， ９８％）０．６７μＬをこの溶液の全ての１０ｍＬに加えた。約２μＭのＦＭＮ濃度である最終溶液を生じるように十分なＦＭＮ（Ｓｉｇｍａ Ｆ８３９９）を加えた。同様に、約１００μＭのエタノール濃度である最終溶液を生じるように十分なエタノール（標準強度２００）を加えた。これら試薬全てを溶液に加えた後、強くボルテックスした。
【０２１７】
１．２５単位／Ｌの濃度である最終溶液を生じるようにＮＡＤＨ：ＦＭＮ酸化還元酵素（Ｒｏｃｈｅ，４７６４８０）１．０８μＬをこの溶液の全ての１０ｍＬに加えた。細菌性ルシフェラーゼ（Ｒｏｃｈｅ，４７６４９８）を約４．５μｇ／ｍＬの濃度の溶液を生じるように加えた。同様に、０．７単位／ｍＬの最終濃度である溶液を生じるようにアルコール脱水素酵素を加えた。これら試薬全てを加えた後、混合液を倒置により緩やかに混和した。
【０２１８】
ＥＮＲ活性を阻害する約１００種の化合物をこのアッセイにおいて同定した。これら化合物の約５０種は放射線類似ＥＮＲアッセイにおいて顕著な阻害活性を示した。このアッセイでは、２０ｍＭヘペス中濃度３０μＭの３２Ｐ−ＮＡＤＨ ２０μＬをウェル当たり１２０ｎｇのＥＮＲおよびＤＭＳＯ中濃度１０μＭの候補化合物２０μＬと共にインキュベートした。３００μＭクロトニルＣｏＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃ６１４６）２０μＬを反応を開始するために続いて加えた。反応産物は３２Ｐ−ＮＡＤを含む。反応物３２Ｐ−ＮＡＤＨと生産物３２Ｐ−ＮＡＤは１Ｍ ＬｉＣｌ中ＰＥＩ−セルロースを用いる薄層クロマトグラフィーによって互いに分離され、オートラジオグラフィーによって視覚化される。反応の程度はＮＡＤＰのＮＡＤへの変換により観察される。これら化合物をＥ．ｃｏｌｉ発育の阻害についてさらに試験した。
【０２１９】
浸透性細菌性ストレイン（ＡＢ７３４ ＴＮ１０：：ｔｏｌＣ）をグラム陰性細胞壁を交差する化合物の能力を最大にするためにスクリーニング方において用いた。アッセイは個々で参照するＮＣＣＬＳプロトコールに従って実施した。
【０２２０】
それら抗菌活性を有する化合物がＥＮＲ依存様式において作用するかについて確認したことはさらに興味深い。浸透性ｔｏｌＣストレインの２つのストレインを組み立てた。最初のストレインにおいて、ＥＮＲタンパク質は適切な複写番号プラスミドである自身のプロモーターの調節下におくことにより過度に発現した。ＥＮＲを標的とする候補化合物は標的が実質上過度に発現しているために、上述した最初のストレインに対してかなり効果が低い。例えば、最初のストレインに対して試験した場合、トリクロサンのＭＩＣは３１から１０００ｎｇ／ｍＬに変化した。同様に、化合物３２５０８４はＭＩＣが２５μＭから１００μＭ以上に変化し、この化合物は細菌発育の間、ＥＮＲ阻害作用によって抗菌活性を発揮することを示している。この結果は化合物３２５０８４およびトリクロサンが酵素の同じまたは異なる部位のＥＮＲに作用する可能性を識別しない。しかしながら、同様のＭＩＣ変化を示す化合物がないことから、これら他の化合物はおそらく異なる機構を通じて細菌の発育を阻害すると考えられる。それにもかかわらず、化合物３２５０８５および３２５０８６は化合物３２５０８４を類似の構造を持ち、ＥＮＲに対してある程度の活性も示す。
【０２２１】
化合物３２５０８４およびトリクロサンが同じまたは異なるＥＮＲ部位に作用するか確認するために、（ｉ）残基９３においてバリンをグリシンに置換、（ｉｉ）酵素活性を保持、および（ｉｉｉ）トリクロサンへの感受性が低い組み換えＥＮＲを生産する。ＥＮＲ阻害剤として確認された化合物を野生型および変異型ＥＮＲの両方を用いてアッセイし、変異型ＥＮＲに対してほとんどまたは全く阻害活性を示さない化合物はおそらくＥＮＲの活性部位に作用しており、放棄される。選択的には、変異型酵素および野生型酵素を阻害する化合物はアロステリック部位に作用しており、さらに研究する予定である。
【０２２２】
本発明を特異的な具体例に関して述べたが、当該技術分野の当業者によって変更および修正が見出されると理解する。例えば、ここで開示した化合物に関して、あるハロゲン置換体を別のハロゲンに置換した、異なるハロゲン置換体は本発明の範囲内である。従って、請求項に示されたような制限のみが本発明に課されるべきである。
【０２２３】
【塩基配列】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＦＡ−１　Ｉドメイン　アミノ酸配列
【図２】ＬＦＡ−１　アミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004511496.tif 000279
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