(57)【要約】３−ヒドロキシ−７β−ヒドロキシステロイド及び３−オキシ−７β−ヒドロキシステロイド並びにそれらの医薬用許容可能なエステルは、ニューロン損傷に対する保護に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ヒドロキシ−７β−ヒドロキシステロイド又は３−オキソ−７β−ヒドロキシステロイド及びそれらの医薬用許容可能なエステルの、ニューロン損傷に対する保護用薬剤の製造のための使用。
【請求項２】
前記ステロイドが、式（Ｉ）の化合物、並びにそれらの医薬用許容可能な塩及びエステルである、請求項１に記載の使用：
【化１】
2004501195.tif 000014
式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに同一又は異なり、それぞれ、水素原子、１〜６の炭素原子を有するアルキル基、２〜６の炭素原子を有するアルケニル基、２〜６の炭素原子を有するアルキニル基、６〜１０の炭素原子を有するアリール基、ホルミル基、２〜７の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、３〜７の炭素原子を有するアルケニルカルボニル基、３〜７の炭素原子を有するアルキニルカルボニル基、７〜１１の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、９〜１５の炭素原子を有するアラルケニルカルボニル基、又は下記に定義されるような複素環式カルボニル基を表す；
Ｒａ及びＲｂの一方は、式−Ｒｃの基、好ましくはβ配置のものを表し、他方は水素原子を表し、又はＲａ及びＲｂは合わせてオキソ基を表す；
Ｒｃは、１〜６の炭素原子を有するアルカノイル基、アリールカルボニル基（ここで、アリール部分は、６〜１０環炭素原子を有する芳香族炭素環基である）、下記に定義されるような複素環式カルボニル基、又は式−ＯＲ４の基（式中Ｒ４は、上記Ｒ１及びＲ２で定義された基及び原子の何れか一つを表す）を表す；
環Ａ、
【化２】
2004501195.tif 000015
は、ベンゼン又はシクロヘキサン環である；
環Ａがシクロヘキサン環であるとき、環Ｂの点線は炭素−炭素単又は二重結合を表し、ｎは１である；又は環Ａがベンゼン環であるとき、環Ｂの点線は炭素−炭素単結合を表し、ｎは０である；
前記複素環式カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基であり、式中Ｒ３は３〜７環原子を有する複素環基を表し、それらの１〜３は、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、少なくとも１つある単数又は複数の残りの原子は炭素原子である；
前記アルキル、アルケニル及びアルキニル基；並びに前記アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル及びアルキニルカルボニル基のアルキル、アルケニル及びアルキニル部分は、非置換又は少なくとも１つの下記の置換基ψを有する：
置換基ψ：ヒドロキシ基、メルカプト基、ハロゲン原子、アミノ基、１〜６の炭素原子を有するアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基（ここで各アルキル基は１〜６の炭素原子を有する）、カルバモイル基、ニトロ基、１〜６の炭素原子を有するアルコキシ基、１〜６の炭素原子を有するアルキルチオ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、及び６〜１０の炭素原子を有する非置換アリール基；
前記アリール基、前記複素環基、並びに前記アリールカルボニル基及び前記アラルキルカルボニル基のアリール部分は、非置換又は少なくとも１つの下記の置換基ξを有する：
置換基ξ；何れかの置換基ψ、及び１〜６の炭素原子を有するアルキル基、１〜６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、並びに１〜６の炭素原子を有するハロアルキル基。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２は、互いに同一又は異なり、それぞれ、水素原子、１〜６の炭素原子を有するアルキル基、任意に置換されたフェニル基、ホルミル基、２〜５の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、７〜１１の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、又は下記に定義されるような複素環式カルボニル基；
Ｒａ及びＲｂの一方は、１〜６の炭素原子を有するアルカノイル基又は式−ＯＲ４の基（式中Ｒ４は、β配置での、上記Ｒ１及びＲ２で定義された基及び原子の何れか一つを表す）を表し、他方は水素原子を表し、又はＲａ及びＲｂは合わせてオキソ基を表す；
前記複素環式カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基であり、式中Ｒ３は３〜７環原子を有する複素環基を表し、それらの１〜３は、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、少なくとも１つある単数又は複数の残りの原子は炭素原子である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ステロイドが、式（ＩＩ）の化合物である、請求項１に記載の使用：
【化３】
2004501195.tif 000016
Ｒａ及びＲｂの一方は、式−Ｒｃの基、好ましくはβ配置のものを表し、他方は水素原子を表し、又はＲａ及びＲｂは合わせてオキソ基を表す；
Ｒｃは、１〜６の炭素原子を有するアルカノイル基、アリールカルボニル基（ここで、アリール部分は、６〜１０環炭素原子を有する芳香族炭素環基である）、下記に定義されるような複素環式カルボニル基、又は式−ＯＲ４の基（式中Ｒ４は、上記Ｒ１及びＲ２で定義された基及び原子の何れか一つを表す）を表す。
【請求項５】
前記ステロイドが、７β−ヒドロキシ−エピアンドロステロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記ステロイドが、７β−ヒドロキシ−デヒドロ−エピアンドロステロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記ステロイドが、７β−ヒドロキシ−１７β−エストラジオールである、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記ステロイドが、７β−ヒドロキシ−プレグネノロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記ステロイドが、７β−ヒドロキシ−エストロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記ステロイドが、７α−ヒドロキシ−エストロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
ニューロン損傷が、慢性疾患により生じる、請求項１〜１０のいずれかの記載の使用。
【請求項１２】
前記慢性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、又は痴呆ではない認知欠損である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ニューロン損傷が、急性疾患により生じる、請求項１〜１２のいずれかの記載の使用。
【請求項１４】
急性疾患が、発作、脳外傷、脊髄損傷、又は末梢神経損傷により生じる、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ニューロン損傷に対する哺乳類の保護方法であって、有効量の３−ヒドロキシ−７β−ヒドロキシステロイド又は３−オキシ−７β−ヒドロキシステロイド或いはそれらの医薬用許容可能なエステルを哺乳類に投与することによる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ニューロンの細胞死に対する保護用の一連の３−ヒドロキシ−７β−ヒドロキシステロイド化合物及び所定のそれらのケトン誘導体に関するものであり、従って、これは、アルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆ではない認知欠損（ＣＩＮＤ）、発作、脳外傷、脊髄損傷及び末梢神経損傷のような、そのような状態又はそのような状態の後遺症の治療及び予防に有用である。また、これらは、認知機能の増強のために有用である。
【０００２】
生体内でのデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）の７α−ヒドロキシル化代謝産物の生成は、尿中の７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの同定により、１９５９年から知られている［Ｊ Ｊ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ Ｌ Ｌｅｗｂａｒｔ， Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． １５ （１９５９） ２０１−２３０； Ｌ Ｓｔａｒｋａ ｅｔ ａｌ， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ． ７ （１９６１） ３０９−３１６］。その後、３β−ヒドロキシステロイド基質（ＤＨＥＡ及びエピアンドロステロン−ＥＰＩＡを含む）の大量の７α−ヒドロキシル化は、成人及び胎児の肝臓、精巣、精巣上体、皮膚、乳房組織、前立腺、脂肪間質細胞及び扁桃を含む多数のヒト器官からの組織調製物において報告されている。７位でのＤＨＥＡのヒドキシル化は、ラットの肝臓並びに多数のマウス組織及び器官においてもまた証明されている。しかしながら、７β−同等物には、ほとんど又はまったく注目を向けられていなかった。全てのこれらの研究において、７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡは、はるかに主要な生成代謝産物であった。実際に、Ｄｏｏｓｔｚａｄｅｈら［Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ６３ （１９９８） ６０８−６１４］は、マウス肝ミクロソームによる７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの生成速度が７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの生成速度の１５倍以上であることを報告した。
【０００３】
また、ＥＰＩＡ、ＤＨＥＡ及びプレグネノロンは、ラットの脳でそれらの相当する７α−ヒドロキシ代謝産物へ速やかに及び広範囲に変換することが示されている［Ｊ Ｍ Ｇｕｉｒａｕｄ ｅｔ ａｌ， Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ３４ （１９７９） ２４１−２４８； Ｍ Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２４ （１９８９） ２６９９−２７０６； Ｙ Ａｋｗａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２８８ （１９２２） ９５９−９６４］。
【０００４】
ＷＯ９７／３７６６４は、神経精神病、免疫性疾患又は内分泌性疾患を治療するために７α−ヒドロキシ置換ステロイドを含む種々の化合物の使用を開示している。これらの化合物が治療のために使用され得るとＷＯ９７／３７６６４にて提示された疾患の中では、アルツハイマー病が含まれる。しかしながら、この作用のために提示された機構は、疾患が脳での７α−ヒドロキシ置換ステロイドの欠乏によるものと仮定されている。従って、ＷＯ９７／３７６６４にて提案された治療は、失った化合物と置き換わるための７α−ヒドロキシ置換ステロイドの投与により、この欠乏を修正する。従って、ＷＯ９７／３７６６４に記載された手段は、更なるニューロン損傷を予防することにより状態を予防すること又は状態の悪化を予防することというよりはむしろ現存の状態を治療する。それゆえに、ＷＯ９７／３７６６４は、神経保護効果を記載していない。また、活性剤は７α化合物であり、７β化合物が仮に存在するときには不活性であるという確信を前提としている。
【０００５】
また、ＷＯ９４／２０１１１は、内皮細胞に対する好中球の付着により生じる組織生存能力の欠失の予防用又は減少用の多数のＤＨＥＡ誘導体の使用を開示する。しかしながら、これは、本発明により治療される疾患が引き起こされる機構ではない。
【０００６】
ＷＯ９７／３７６６４に開示された化合物の７β−ヒドロキシアナログは、生体内で作られることが知られているが、それらは、９５％以上の７α異性体に対して、５％下記の量で作られている。更に、それらの相当する７β−ヒドロキシ誘導体への３−ヒドロキシステロイドの変換に寄与する酵素系は特徴付けされていない。全てのこれらの理由のため、上記に要約された研究にかんがみて、一般的予想は７β−異性体が不活性であるという論文から明らかである。結果として、上記に要約された文献から明らかであるように、かなり多くの文献で、７β化合物の生物学的活性の可能性が実施されている研究はない。
【０００７】
この予想に反して、我々は、驚くことに、７β−ヒドロキシ−置換ステロイドが生物学的活性を有し、またこの活性が７α−ヒドロキシ−置換ステロイドについてのＷＯ９７／３７６６４に記載されるような活性ではないことを見出している。それどころか、それは、ＷＯ９９／３１０４９において別の化合物ではあるが、以前から証明されるような神経保護活性である。
【０００８】
長期化低酸素症及び虚血のような事態は、低血糖症に関連しているかもしれないし、しないかもしれないが、さまざまな程度のニューロン損傷に遭遇する。
【０００９】
虚血は典型的に心臓発作の間に生じるが、それらの時間で受ける損傷は心臓組織に実質的に限定され、所定の治療が展開される。本発明について、我々は、患者の発作により生じるような又は頭部損傷の結果によるような脳での短期間及びより長時間の双方の虚血の結果、また同様に観察された脳の退化的変化に虚血の慢性的な閾値下レベル及び／又はエネルギー供給の損傷が寄与するかもしれない老化におけるゆっくり進行する神経変性疾病にも関心がある。虚血の重篤さは、発作又は損傷の性質に依存するが、常に、脳損傷があり、これは本発明が対面する問題である。
【００１０】
種々の神経保護剤は、脳損傷の問題を軽減するために試みる当業界で知られているが、現今知られているそれらの全てが有害な副作用に関連する傾向にある。例えば、ＭＫ８０１（マレイン酸ジゾシルピン）は、全くの単分子であり、虚血患者へあるレベルの神経保護をもたらすことが知られている。しかしながら、ＭＫ８０１はまた、「警戒精神作用効果（ａｌａｒｍｉｎｇ ｐｓｙｃｈｏｔｒｏｐｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ）」（Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ）、並びに不都合な運動性効果にも関連している。神経保護効果は、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７５５（１９９７）３６−４６（Ｐｒｉｎｇｌｅ， Ａ．Ｋ． ｅｔ ａｌ）に詳述され、これは援用され本明細書に組み込まれる。同一著者はまた、早期の論文でコノトキシン（ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）の神経保護効果を記載しているが、この化合物の神経保護効果にもかかわらず、生体内にて有害な副作用が観察されている。
【００１１】
従って、本発明は、３−ヒドロキシ−７β−ヒドロキシステロイド又は３−オキシ−７β−ヒドロキシステロイドとそれらの医薬用許容可能なエステルとの、ニューロン損傷に対する保護用薬剤の製造のための使用にある。
【００１２】
本発明にとって特に重要な特定クラスの７β−ヒドロキシステロイドは、３β，７β−ジヒドロキシステロイド及びそれらの医薬用許容可能なエステルである。
好ましいエステルは、カルボン酸エステルである。
【００１３】
任意に置換された３β，７β−ジヒドロキシステロイド及びそれらの医薬用許容可能なエステル並びに本発明で使用されてもよいそれらの他の誘導体の例は、式（Ｉ）のこれらの化合物：
並びにそれらの医薬用許容可能な塩及びエステルである。
【００１４】
【化４】
2004501195.tif 000002
【００１５】
式中、Ｒ１及びＲ２は、互いに同一又は異なり、それぞれ、水素原子、１〜６の炭素原子を有するアルキル基、２〜６の炭素原子を有するアルケニル基、２〜６の炭素原子を有するアルキニル基、６〜１０の炭素原子を有するアリール基、ホルミル基、２〜７の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、３〜７の炭素原子を有するアルケニルカルボニル基、３〜７の炭素原子を有するアルキニルカルボニル基、７〜１１の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、９〜１５の炭素原子を有するアラルケニルカルボニル基、又は下記に定義されるような複素環式カルボニル基を表す；
【００１６】
Ｒａ及びＲｂの一方は、式−Ｒｃの基、好ましくはβ配置のものを表し、他方は水素原子を表し、又はＲａ及びＲｂは合わせてオキソ基を表す；
【００１７】
Ｒｃは、１〜６の炭素原子を有するアルカノイル基、アリールカルボニル基（ここで、アリール部分は、６〜１０環炭素原子を有する芳香族炭素環基である）、下記に定義されるような複素環式カルボニル基、又は式−ＯＲ４の基（式中Ｒ４は、上記Ｒ１及びＲ２で定義された基及び原子の何れか一つを表す）を表す；
環Ａ、
【００１８】
【化５】
2004501195.tif 000003
【００１９】
は、ベンゼン又はシクロヘキサン環である；
【００２０】
環Ａがシクロヘキサン環であるとき、環Ｂの点線は炭素−炭素単又は二重結合を表し、ｎは１である；又は環Ａがベンゼン環であるとき、環Ｂの点線は炭素−炭素単結合を表し、ｎは０である；
【００２１】
前記複素環式カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基であり、式中Ｒ３は３〜７環原子を有する複素環基を表し、それらの１〜３は、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、少なくとも１つある単数又は複数の残りの原子は炭素原子である；
【００２２】
前記アルキル、アルケニル及びアルキニル基；並びに前記アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル及びアルキニルカルボニル基のアルキル、アルケニル及びアルキニル部分は、非置換又は少なくとも１つの下記の置換基ψを有する：
【００２３】
置換基ψ：ヒドロキシ基、メルカプト基、ハロゲン原子、アミノ基、１〜６の炭素原子を有するアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基（ここで各アルキル基は１〜６の炭素原子を有する）、カルバモイル基、ニトロ基、１〜６の炭素原子を有するアルコキシ基、１〜６の炭素原子を有するアルキルチオ基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、及び６〜１０の炭素原子を有する非置換アリール基；
【００２４】
前記アリール基、前記複素環基、並びに前記アリールカルボニル基及び前記アラルキルカルボニル基のアリール部分は、非置換又は少なくとも１つの下記の置換基ξを有する：
【００２５】
置換基ξ；何れかの置換基ψ、及び１〜６の炭素原子を有するアルキル基、１〜６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、並びに１〜６の炭素原子を有するハロアルキル基。
【００２６】
より好ましくは、式（Ｉ）の化合物において：
Ｒ１及びＲ２は、互いに同一又は異なり、それぞれ、水素原子、１〜６の炭素原子を有するアルキル基、任意に置換されたフェニル基、ホルミル基、２〜５の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、７〜１１の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、又は下記に定義されるような複素環式カルボニル基；
【００２７】
Ｒａ及びＲｂの一方は、１〜６の炭素原子を有するアルカノイル基又は式−ＯＲ４の基（式中Ｒ４は、β配置での、上記Ｒ１及びＲ２で定義された基及び原子の何れか一つを表す）を表し、他方は水素原子を表し、又はＲａ及びＲｂは合わせてオキソ基を表す；
【００２８】
前記複素環式カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基であり、式中Ｒ３は３〜７環原子を有する複素環基を表し、それらの１〜３は、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、少なくとも１つある単数又は複数の残りの原子は炭素原子である。
【００２９】
本発明で使用されてもよい３−オキソ−７β−ヒドロキシステロイドの例は、式（ＩＩ）のそれらの化合物である：
【００３０】
【化６】
2004501195.tif 000004
【００３１】
式中Ｒａ、Ｒｂ及びＲ２は、上記の定義と同様であり、好ましくは合わせてオキソ基を表す。
【００３２】
本発明の化合物では、式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４又は置換基ξがアルキル基である場合に、これは１〜６の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基でよく、例示には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１−エチルプロピル、２−エチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、ｔ−ヘキシル及び１，１−ジメチルペンチル基が挙げられ、１〜４の炭素原子を有するそれらの基が好ましく、メチル及びエチル基が最も好ましい。
【００３３】
式中Ｒ１、Ｒ２又はＲ４がアルケニル基を表す場合に、これは２〜６の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルケニル基でよく、例示には、ビニル、１−プロペニル、アリル、イソプロペニル、メタリル、１−、２−、３−ブテニル、イソブテニル、１−、２−、３−、４−ペンテニル及び１−、２−、３−、４−、５−ヘキセニル基が挙げられ、２〜４の炭素原子を有するそれらのアルケニル基が好ましく、ビニル及びアリル基が最も好ましい。
【００３４】
式中Ｒ１、Ｒ２又はＲ４がアルキニル基を表す場合に、これは２〜６の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキニル基でよく、例示には、エチニル、１−、２−プロピニル、１−、２−、３−ブチニル、イソブチニル、１−、２−、３−、４−ペンチニル及び１−、２−、３−、４−、５−ヘキシニル基が挙げられ、２〜４の炭素原子を有するそれらのアルキニル基が好ましい。
【００３５】
式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４又は置換基ψがアリール基を表す場合に、これは６〜１０の炭素原子を有する芳香族炭素環基である。そのような基の例示には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル及びインデニル基が挙げられ、これらのフェニル基のものが好ましい。置換基αの場合以外は、これらの基は置換又は非置換されてよい。その基が置換される場合に、置換基の数は、置換可能な位置の数のみに制限されるが、或いは立体拘束による場合もあり得る。従って、フェニル基の場合には、置換基の最大数は５であり、ナフチル基の場合には、置換基の最大数は７などである。しかしながら、置換基の好ましい数は１〜３であり、置換基は後述のものと同様である。
【００３６】
式中Ｒ１、Ｒ２又はＲ４がアルキルカルボニル基を表す場合に、これはアルカノイル基であり、これは２〜７の炭素原子（すなわち、アルキル部分において１〜６の炭素原子）を有する直鎖又は分岐鎖基でよく、例示には、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル及びヘプタノイル基が挙げられ、２〜５の炭素原子を有するそれらの基が好ましく、アセチル及びプロピオニル基が最も好ましい。この基のアルキル部分は置換及び非置換されてよく、置換されるならば、置換基は置換基αから選択される。そのような置換基の例示には、アラニル、β−アラニル、フェニルアラニル、アスパラギニル、システイニル、グリコロイル、グリシル、メチオニル、オルニチル、グリセロイル、トロポイル、グルタミニル、グルタミル、ホモシステイニル、セリル、ホモセリル、トレオニル、ラクトイル、ロイシル、イソロイシル、ノルロイシル、リシル、バリル、ノルバリル及びサルコシル基が挙げられる。
【００３７】
式中Ｒ１、Ｒ２又はＲ４がアルケニルカルボニル基を表す場合に、これは３〜７の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルケニルカルボニル基でよく、例示には、アクリロイル、メタクリロイル、クロトノイル、イソクロトノイル、３−ブテノイル、ペンテノイル及びヘキセノイル基が挙げられ、３〜５の炭素原子を有するそれらのアルケニルカルボニル基が好ましく、アクリロイル及びメタクリロイル基が最も好ましい。
【００３８】
式中Ｒ１、Ｒ２又はＲ４がアルキニルカルボニル基を表す場合に、これは３〜７の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキニルカルボニル基でよく、例示には、プロピオロイル、３−ブチニルカルボニル、ペンチニルカルボニル及びヘキシニルカルボニル基が挙げられ、３〜５の炭素原子を有するそれらのアルキニルカルボニル基が好ましい。
【００３９】
式中Ｒｃ、Ｒ１、Ｒ２又はＲ４がアリールカルボニル基を表す場合に、これのアリール部分は上記で定義及び例示された何れかのアリール基でよい。好ましいアリールカルボニル基は、ベンゾイル、ｏ−、ｍ−又はｐ−トルオイル、ｏ−、ｍ−又はｐ−アニソイル、ｏ−、ｍ−又はｐ−ヒドロキシベンゾイル、ピクリル、ガロイル、プロトカテクオイル、バニロイル、ベラトロイル、アントラニロイル、１−ナフトイル及び２−ナフトイル基が挙げられる。
【００４０】
Ｒ１、Ｒ２又はＲ４がアラルキルカルボニル又はアラルケニルカルボニル基を表す場合に、アリール及び、アルキル又はアルケニル基であり得る場合には、上記に定義及び例示されたそれらの基の何れかでよい。そのような基の特定の例示には、フェニルアセチル、３−フェニルプロピオニル、ベンジロイル、チロシル、アトロポイル、ヒドラアトロポイル及びシンナモイル基が挙げられる。
【００４１】
Ｒｃ、Ｒ１、Ｒ２又はＲ４が複素環式カルボニル基を表す場合に、これは式Ｒ３−ＣＯ−の基であり、式中Ｒ３は３〜７の環原子を有する複素環基を表し、これらの１〜３は、窒素、酸素又は硫黄原子であり、残りは炭素原子である。少なくとも１つの環原子は炭素原子であるべきである。３つのヘテロ原子がある場合に、少なくとも１つは窒素原子であることが好ましい。そのような基の例示には、２−及び３−フロイル、２−及び３−テノイル、２−ピリジンカルボニル、ニコチノイル、イソニコチノイル、プロリル、ピペリジンカルボニル、ピペラジンカルボニル及びモルホリノカルボニル基が挙げられる。
【００４２】
Ｒｃがアルカノイル基を表す場合に、これは１〜６の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖基でよく、例示には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル及びヘプタノイル基が挙げられ、２〜５の炭素原子を有するそれらの基が好ましく、アセチル及びプロピオニル基がより好ましく、アセチル基が最も好ましい。
【００４３】
置換基ψ又は置換基ξが１〜６の炭素原子を有するアルキルアミノ基である場合に、アルキル部分は上記に定義及び例示されたアルキル基の何れかでよい。そのようなアルキルアミノ基の好ましい例示は、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、イソブチルアミノ、ｓｅｃ−ブチルアミノ、ｔ−ブチルアミノ、ペンチルアミノ、イソペンチルアミノ、ネオペンチルアミノ、ｔ−ペンチルアミノ、ヘキシルアミノ及びイソヘキシルアミノ基が挙げられ、１〜４の炭素原子を有するそれらの基が好ましく、メチルアミノ及びエチルアミノ基が最も好ましい。
【００４４】
置換基ψ又は置換基ψがジアルキルアミノ基である場合に、各アルキル部分は１〜６の炭素原子を有し、２つのアルキル基は互いに同一又は異なってもよい。アルキル基は上記に定義及び例示されたアルキル基の何れかでよい。そのようなジアルキルアミノ基の好ましい例示は、ジメチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルプロピルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、エチルブチルアミノ、ジブチルアミノ、ジ−ｔ−ブチルアミノ、メチルペンチルアミノ、ジペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、及びジヘキシルアミノ基が挙げられ、各アルキル基において１〜４の炭素原子を有するそれらの基が好ましく、ジメチルアミノ及びジエチルアミノ基が最も好ましい。
【００４５】
置換基ψ又は置換基ξがアルコキシ基である場合に、これは１〜６の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルコキシ基でよく、例示には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペンチロキシ、イソペンチロキシ、ネオペンチロキシ、ｔ−ペンチロキシ、ヘキシロキシ、及びイソヘキシロキシ基が挙げられ、１〜４の炭素原子を有するそれらの基が好ましく、メトキシ及びエトキシ基が最も好ましい。
【００４６】
置換基ψ又は置換基ζが１〜６の炭素原子を有するアルキルチオ基である場合に、アルキル部分は上記に定義及び例示されたアルキル基の何れかでよい。そのようなアルキルチオ基の好ましい例示は、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオ、ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ネオペンチルチオ、ｔ−ペンチルチオ、ヘキシルチオ及びイソヘキシルチオ基が挙げられ、１〜４の炭素原子を有するそれらの基が好ましく、メチルチオ及びエチルチオ基が最も好ましい。
【００４７】
置換基ψ又は置換基ξがアルコキシカルボニル基である場合に、これは２〜７の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルコキシカルボニル基でよく、例示には、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ペンチロキシカルボニル、イソペンチロキシカルボニル、ネオペンチロキシカルボニル、ｔ−ペンチロキシカルボニル、ヘキシロキシカルボニル、及びイソヘキシロキシカルボニル基が挙げられ、１〜４の炭素原子を有するそれらの基が好ましく、メトキシカルボニル及びエトキシカルボニル基が最も好ましい。
【００４８】
置換基ξが１〜６の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基である場合に、アルキル部分は上記に定義及び例示されたアルキル基の何れかでよい。そのようなヒドロキシアルキル基の好ましい例示は、ヒドロキシメチル、１−及び２−ヒドロキシメチル、１−、２−及び３−ヒドロキシプロピル、１，２−ジヒドロキシエチル、１，２，３−トリヒドロキシプロピル、４−ヒドロキシブチル、５−ヒドロキシペンチル及び６−ヒドロキシヘキシル基が挙げられる。
【００４９】
置換基ξが１〜６、好ましくは１〜４の炭素原子を有するハロアルキル基である場合に、アルキル部分は上記に定義及び例示されたのと同様でよく、ハロゲン原子は、好ましくは、塩素、フッ素、臭素又はヨウ素である。そのような基の例示は、フルオロメチル、クロロメチル、ブロモメチル、ヨードメチル、ジクロロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−クロロエチル、２−フルオロエチル、２−ブロモエチル、２−ヨードエチル、２，２−ジブロモエチル、２，２，２−トリブロモエチル、３−フルオロプロピル、３−クロロプロピル、４−ブロモブチル、４−フルオロブチル、５−フルオロペンチル及び６−フルオロヘキシル基が挙げられる。
【００５０】
式−ＯＲの基を含む化合物の場合に（式中Ｒは、Ｒ１などに関する上記に定義された何れかの基及び原子である）、活性種は遊離ヒドロキシ基を含む化合物が適当であることは認識されるであろう。従って、生体内でヒドロキシ基に変換され得る如何なる基もヒドロキシ基の代わりに使用されてもよい。
【００５１】
本発明の化合物の特定の例示には、下記が挙げられる：
【００５２】
【化７】
2004501195.tif 000005
【００５３】
【化８】
2004501195.tif 000006
【００５４】
【化９】
2004501195.tif 000007
【００５５】
更に、下記の７α−ヒドロキシ化合物は、同様機構の活性であると考えられる。
【００５６】
【化１０】
2004501195.tif 000008
【００５７】
我々は、これらの化合物が、発作、脳外傷及びクモ膜下出血により引き起され得るような脳虚血、又は心臓バイパス外科手術などの間に起こる事態により生じる急性及び慢性のニューロン損傷に対して保護するために使用できることを、驚いたことに発見した。
【００５８】
本発明の化合物は、もとのステロイドから開始する本来よく知られている種々の方法により製造してよい。例えば、上記に引用された文献に記載された方法により製造してもよく、これは７β及び対応する７α化合物の混合物を提供し、これらを次によく知られた技術により分離してもよい。
【００５９】
例示として、７β−ヒドロキシＥＰＩＡは、従来の方法を使用して、３β−ヒドロキシ基及び１７−ケトン基の保護後に、アリル酸化によりＤＨＥＡから得られてもよい。次に、生成物は可溶性金属化合物触媒（例えば水素化ナトリウム）で還元され、３β−ヒドロキシ及び１７−ケトン基は脱保護される。次に、７α−ヒドロキシ及び７β−ヒドロキシエピマーは、従来の手法、例えばカラムクロマトグラフィにより分離されてもよく、７β−ヒドロキシＥＰＩＡは純粋に結晶化させてもよい。
【００６０】
別の合成方法は下記の反応スキームにて示される：
【００６１】
【化１１】
2004501195.tif 000009
【００６２】
上記の式において、ＴＢＤＭＳＯはｔ−ブチルジメチルシリルオキシを表し、Ａｃはアセチルを表す。
【００６３】
上記の反応機構の第一ステップにおいて、式（ＩＩＩ）の化合物のエストロンは、従来の手法においてｔ−ブチルジメチルシリルオキシ基により保護されて、式（ＩＶ）の保護ずみ化合物を提供する。次に、これは酸触媒（例えばｐ−トルエンスルホン酸）の存在下でエチレングリコールと反応させて、１７位にてケト基を保護し、式（Ｖ）の化合物を提供する。次に、ヒドロキシ基は、この後の実施例３において説明されるように６位にて導入されて、式（ＶＩ）の化合物を提供してもよく、次に、これは脱水されて、式（ＶＩＩ）の化合物を提供する。これはエポキシ化されて、式（ＶＩＩＩ）の化合物を提供し、次に、これは還元されて、７α−ヒドロキシ基を有する式（ＩＸ）の化合物になる。ｔ−ブチルジメチルシリル保護基は除去されて、式（Ｘ）の化合物を提供し、これは触媒量の酸と共に加熱されて、７α−ヒドロキシ−エストロン（ＸＩ）を提供する。これは例えばクロム酸／硫酸を使用して酸化されて、７−ケト−エストロン（ＸＩＩ）を提供し、次に、これは無水酢酸と反応させて、式（ＸＩＩＩ）の化合物を提供する。この化合物は、例えばパラジウム触媒の存在下で水素を使用して水素化され、式（ＸＩＶ）の化合物を提供し、最終的にアセチル基は除去されて、本発明の化合物の７β−ヒドロキシ−エストロン（ＸＶ）を提供する。所望の場合には、これは還元されてもよく、本発明の化合物の７β−ヒドロキシ−エストラジオール（ＸＶＩ）もまた提供する。
【００６４】
本発明のその他の７β−ヒドロキシ化合物は同様の方法において製造されてもよく、例えば、下記の反応スキームにより説明されるように製造されてもよい：
【００６５】
【化１２】
2004501195.tif 000010
【００６６】
この反応スキームにおいて、ＤＨＥＡ（ＸＶＩＩ）はアセチル化されて、対応する式（ＸＶＩＩＩ）のアセテートを提供し、次に、これはエチレングルコールと反応させて、式（ＸＩＸ）のケタールを提供する。次に、ケタール（ＸＩＸ）は実施例１６に記載されたように酸化されて、対応する７−ケト化合物（ＸＸ）を提供し、次に、これは脱アセチル化させて、式（ＸＸＩ）の化合物を提供する。これは還元されて、式（ＸＸＩＩ）の７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡを提供し、次に、これは酸と反応させてケタール基を除去して、７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを提供し、最終的にこれはクロマトグラフィにより７β−及び７α−異性体に分離させて、７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＶ）及び７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＶ）を提供する。
【００６７】
本発明の化合物は、患者が虚血発症、特に発作又は頭部損傷の危険があると疑われた場合に、患者に適用してもよい。そのような予防薬の適用は極めて有用であり得る。しかしながら、それはまた、たとえ虚血発症後に適用されても、本発明の化合物が有用な活性を有することは実証されているが、ニューロンの変性をできる限り避けるために、できるだけ早く化合物を投与することが好ましいことは認識されるであろう。幾つかの状況では、特に患者が虚血発症の危険にまだある場合に、繰返し用量を投与することが望ましいかもしれない。
【００６８】
投与の適当な方法は、できる限り望ましい結果に到達するために、一般に注入による方法である。従って、静脈内注入が特に好ましいが、幾つかの状況では、好ましくは化合物を脳脊髄液に直接的に投与してもよい。
【００６９】
本発明の化合物の用量は、患者の年齢、体重及び全身状態、並びに投与の形式、頻度及び経路を含む多数の要因に依存して変わるであろう。しかしながら、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量が一般に好ましく、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましい。これは単用量又は分割量で投与してもよい。
【００７０】
本発明は、下記の非限定の実施例により更に説明され、これらの実施例１〜２０は本発明の化合物の製造を説明し、実施例２１及び２２はそれらの活性を説明する。実施例１〜２０において、ローマ数字は上記に示された反応スキームの式を引用する。
【００７１】
（実施例１）
３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＶ）
４．２５ｇのｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（２８．２ｍｍｏｌ、３当量）を、１００ｍｌ三首フラスコ中の２．５４ｇのエストロン（ＩＩＩ）（９．４１ｍｍｏｌ、１当量）及び３．８４ｇのイミダゾール（５６．５ｍｍｏｌ、６当量）を含む５０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に添加した。次に、混合物を窒素雰囲気下、室温で一晩放置した。１０％ｗ／ｖ炭酸カリウム水溶液を反応液に添加し、次に、これを酢酸エチルで抽出した。有機相を水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させて、乾燥状態まで蒸発させた。３．７６ｇの３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン２（９．４１ｍｍｏｌ、１００％）を得た。
【００７２】
（実施例２）
１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（Ｖ）
３ｇの３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＶ）（７．５０ｍｍｏｌ）、３ｍｌのエチレングルコール及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を含む６０ｍｌのトルエン溶液を加熱して、２４時間、ディーンスターク装置を使用したスチーム蒸留により還流した。次に、反応液を５０ｍｌの１０％ｗ／ｖ炭酸カリウム水溶液へ注ぎ入れた。有機相をデカントした。水相を酢酸エチルで抽出した。有機相をあわせて、乾燥状態まで蒸発させた。３．１６ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（Ｖ）（７．１２ｍｍｏｌ、９５％）を得た。
【００７３】
（実施例３）
６α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＶＩ）
１リットル三首フラスコに、１００ｍｌの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液を窒素フラッシングにより脱ガスして、−８０℃に冷却した。ジイソプロピルアミン（２０ｍｌ、１４３．３０ｍｍｏｌ）を反応液に添加した。シクロヘキサン中の１５％ｗ／ｖブチルリチウム溶液（８９．９ｍｌ、１４３．３０ｍｍｏｌ）を反応液に滴下させた。１０分後に、１７．５ｇのカリウムｔ−ブチラートを含む１００ｍｌの無水ＴＨＦ溶液（好ましくは脱ガスして）を反応液に滴下した。更に１５分後に、１２．２７ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（Ｖ）（２７．６３ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌの無水ＴＨＦ溶液（好ましくは脱ガスして）を反応液に滴下した。反応混合物を−８０℃で２時間放置した。この時間の最後に、４８ｍｌのトリメチルボレート（４２９．９０ｍｍｏｌ）を−８０℃で反応液に滴下し、これを０℃で１時間放置した。次に、１００ｍｌの３０％ｖ／ｖ過酸化水素水溶液を添加した。反応混合物を室温で１時間放置し、次に、５００ｍｌの水を添加した。反応液を酢酸エチルで抽出した。有機相を１０％ｗ／ｖチオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン１／９、次に２／８）により精製した。６．３５ｇの６α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン４（１３．８１ｍｍｏｌ、５０％）を得た。
【００７４】
（実施例４）
１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６−デヒドロエストロン（ＶＩＩ）
１．５４ｇの６α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＶＩ）（３．３５ｍｍｏｌ）、４ｍｌのエチレングリコール及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を含む４０ｍｌのトルエン溶液を加熱して、２４時間、ディーンスターク装置を使用したスチーム蒸留により還流した。次に、反応液を５０ｍｌの１０％ｗ／ｖ炭酸カリウム水溶液へ注ぎ入れた。有機相をデカントした。水相を酢酸エチルで抽出した。有機相をあわせて、乾燥状態まで蒸発させた。１．４８ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６−デヒドロエストロン（ＶＩＩ）（３．３５ｍｍｏｌ、１００％）を得た。
【００７５】
（実施例５）
１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６α，７α−エポキシエストロン（ＶＩＩＩ）
１．１６ｇのｍ−クロロ安息香酸（５５％、３．６９ｍｍｏｌ、１．１当量）を含む２０ｍｌのジクロロメタン溶液を、１．８５ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６−デヒドロエストロン（ＶＩＩ）（３．３６ｍｍｏｌ、１当量）を含む２０ｍｌのジクロロメタン溶液に０℃で滴下した。反応液を２時間後に、１０％ｗ／ｖ炭酸水素ナトリウム水溶液へ注ぎ入れた後、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン１／９）により精製した。７６９ｍｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６α，７α−エポキシエストロン６（１．６８ｍｍｏｌ、５０％）を得た。
【００７６】
（実施例６）
７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＸ）
２００ｍｇの水素化アルミニウムリチウム（５．４０ｍｍｏｌ、２当量）を、１．１３ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６α，７α−エポキシエストロン６（２．６０ｍｍｏｌ、１当量）を含む５０ｍｌの無水ＴＨＦ溶液に添加した。反応液を加熱し、２時間還流した後、冷却し、氷に注ぎ入れ、セリテ（Ｃｅｌｉｔｅ、登録商標）フィルターエイドを通して濾過し、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン１／９）により精製した。８３７ｍｇの７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＸ）（１．８２ｍｍｏｌ、７０％）を得た。
【００７７】
（実施例７）
７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−エストロン（Ｘ）
１．５ｇのテトラブチルアンモニウムクロライド（４．７８ｍｍｏｌ、１．１０当量）を含む２０ｍｌのＴＨＦ溶液を、２ｇの７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＸ）（４．３５ｍｍｏｌ、１当量）を含む５０ｍｌのＴＨＦ溶液に室温で添加した。反応液を７０ｍｌの１０％ｗ／ｖ炭酸ナトリウム水溶液に注ぎ入れた。反応液を酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。１．３９ｇの７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−エストロン（Ｘ）（４．２２ｍｍｏｌ、９７％）を得た。
【００７８】
（実施例８）
７α−ヒドロキシ−エストロン（ＸＩ）
１ｍｌの水、１．０ｇの７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−エストロン（Ｘ）（３．０３ｍｍｏｌ）及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を含む５０ｍｌのアセトン溶液を加熱して、２時間還流した。次に、反応液を７０ｍｌの１０％ｗ／ｖ炭酸ナトリウムへ水溶液に注ぎ入れた。反応液を酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。酢酸エチルから再結晶化した８１４ｍｇの７α−ヒドロキシ−エストロン（ＸＩ）（２．８５ｍｍｏｌ、９４％）を得た。
【００７９】
（実施例９）
７−ケトエストロン（ＸＩＩ）
硫酸中８Ｎクロム酸溶液を、３００ｍｇの７α−ヒドロキシ−エストロン（ＸＩ）（１．０５ｍｍｏｌ）を含む０℃に冷却された４０ｍｌのアセトン溶液に、黄色に残存するまで滴下した。反応液を５０ｍｌの水に注ぎ入れた後、酢酸エチルで抽出した。有機相を炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン３／７）により精製した。２００ｍｇの７−ケト−エストロン１０（０．７０ｍｍｏｌ、６７％）を得た。
【００８０】
（実施例１０）
７−ヒドロキシ−６−デヒドロエストロン３，７−ジアセテート（ＸＩＩＩ）
５ｇの無水酢酸ナトリウム及び１ｇの７−ケト−エストロン（ＸＩＩ）（３．５２ｍｍｏｌ）を含む１０ｍｌの無水酢酸溶液を、加熱して１時間還流した。次に、反応液を冷却した後、水に注ぎ入れ、ジエチルエーテルで抽出した。有機相を炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン１／９）により精製した。１．２５ｇの７−ヒドロキシ−６−デヒドロエストロン−３，７−ジアセテート（ＸＩＩＩ）（３．４１ｍｍｏｌ、９７％）を得た。
【００８１】
（実施例１１）
７−ヒドロキシエストロン３，７−ジアセテート（ＸＩＶ）
１．０ｇの７−ヒドロキシ−６−デヒドロエストロン３，７−ジアセテート（ＸＩＩＩ）（２．７２ｍｍｏｌ）を含む８０ｍｌの氷酢酸溶液を、１ｂａｒの水素圧下で木炭触媒上の２００ｍｇの１０％パラジウムで水素化した。反応液を２時間後に濾過して、乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン１／９）により精製した。８５５ｍｇの７−ヒドロキシエストロン３，７−ジアセテート（ＸＩＶ）（２．３１ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
【００８２】
（実施例１２）
７β−ヒドロキシエストロン（ＸＶ）
１％の水酸化カリウム及び１ｇの７−ヒドロキシエストロン３，７−ジアセテート１２（２．７０ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌのメタノール溶液を加熱して、２時間還流した。次に、反応液を冷却し、中和した後、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。メタノールから再結晶化した６９５ｍｇの７β−ヒドロキシエストロン（ＸＶ）（２．４３ｍｍｏｌ、９０％）を得た。
【００８３】
（実施例１３）
７β−ヒドロキシエストラジオール（ＸＶＩ）
２６４ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを、１．０ｇの７β−ヒドロキシエストロン１３（３．５０ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌのメタノール溶液に添加した。反応液を水に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。メタノールから再結晶化した９１７ｍｇの７β−ヒドロキシエストラジオール１４（３．１８ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
【００８４】
（実施例１４）
ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＶＩＩＩ）
１０ｇのＤＨＥＡ（ＸＶＩＩ）（３４．７２ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌのピリジン及び５０ｍｌの無水酢酸の溶液を加熱して、４時間還流した。反応液を冷却し、水に注ぎ入れ、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、乾燥状態まで蒸発させた。エタノールから再結晶化した１１．０ｇのＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＶＩＩＩ）（３３．３３ｍｍｏｌ、９６％）を得た。
【００８５】
（実施例１５）
１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＩＸ）
５ｇのＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＶＩＩＩ）（１５．１５ｍｍｏｌ）、５ｍｌのエチレングルコール及び触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を含む１００ｍｌのトルエン溶液を加熱して、２４時間、ディーンスターク装置を使用したスチーム蒸留により還流した。次に、反応液を１００ｍｌの１０％ｗ／ｖ炭酸カリウム水溶液へ注ぎ入れた。有機相をデカントした。水相を酢酸エチルで抽出した。有機相をあわせて、乾燥状態まで蒸発させた。エタノールから再結晶化した５．１０ｇの１７−ケタール−３−ＤＨＥＡ−アセテート（ＸＩＸ）（１３．６４ｍｍｏｌ、９０％）を得た。
【００８６】
（実施例１６）
７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＸ）
５ｇの１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＩＸ）（１３．３７ｍｍｏｌ）及び触媒量のベンガルローズ（Ｂｅｎｇａｌ Ｒｏｓｅ）を含む７０ｍｌのピリジン溶液を、酸素分散による中圧水銀蒸気灯を用いて照射した。触媒量の酢酸銅を２４時間後に反応液に添加した。反応液を、２４時間後に乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン３／７）により精製した。３．１１ｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＸ）（８．０２ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
【００８７】
（実施例１７）
７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ（ＸＸＩ）
１％の水酸化カリウム及び１ｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＸ）（２．５８ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌのメタノール溶液を、加熱して２時間還流した。次に、反応液を冷却し、中和した後、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。メタノールから再結晶化した８０２ｍｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ５（２．３２ｍｍｏｌ、９０％）を得た。
【００８８】
（実施例１８）
７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩ）
１０ｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ（ＸＸＩ）（２８．９０ｍｍｏｌ）を、−３３℃で、２．６５ｇのナトリウムを含む液体アンモニア溶液に添加した。４時間後、塩化アンモニウムを青色が消えるまで添加した。次に、２．６５ｇのナトリウムを添加した。４時間後、塩化アンモニウムを青色が消えるまで再度添加した。水を添加し、アンモニアを蒸発させた。反応液を酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。６．０７ｇの７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩ）（１７．３４ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
【００８９】
（実施例１９）
７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩＩ）
５ｍｌの水、１０ｇの７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩ）（２８．５７ｍｍｏｌ、５０％）及び触媒量のパラトルエンスルホン酸を含む１００ｍｌのアセトン溶液を加熱して、４時間還流した。反応液を冷却し、１００ｍｌの１０％ｗ／ｖ炭酸ナトリウム水溶液に注ぎ入れた後、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、乾燥状態まで蒸発させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル）により精製した。５．２４ｇの７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩＩ）（１７．１４ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
【００９０】
（実施例２０）
７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＶ）及び７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＶ）
比率６５／３５の７α及び７βエピマーを含む７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩＩ）（５ｇ）をフラッシュクロマトグラフィ（Ａｌ２Ｏ３／ＣＨＣｌ３）により精製した。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＶ）（２．５ｇ）を最初に得て、その後に７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＶ）（１．３４ｇ）を得た。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＶ）及び７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＶ）を酢酸エチルから再結晶化させた。
【００９１】
（実施例２１）
低酸素症のニューロン損傷の研究用プロトコル
器官系海馬薄片培養物を、下記のように改変されたＰｉｎｇｌｅらの基本方法（１９９６、１９９７）を用いて調製した。
【００９２】
ウィスター幼ラット（８−１１日齢）を断頭し、海馬を直ぐに４．５ｍｇ／ｍｌグルコース補充氷冷ゲイ平衡塩溶液の中で解剖した。薄片を分けて、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＣＭカルチャーインサート（４ウェル毎）上に置き、１４日間３７℃／５％ＣＯ２で維持した。維持培地は、２５％熱不活性化ウマ血清、２５％ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）並びに１ｍＭグルタミン及び４．５ｍｇ／ｍｌグルコース補充添加アール塩を含む５０％最小必須培地（ＭＥＭ）からなる。培地は３−４日毎に取り替えた。
【００９３】
実験的低酸素症の既述（Ｐｒｉｎｇｌｅら、１９９６；１９９７）のように行なった。簡単に言えば、培養物を、５μｇ／ｍｌの蛍光除外染料プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）を含む無血清培地（ＳＦＭ−７５％ＭＥＭ、１ｍＭグルタミン及び４．５ｍｇ／ｍｌグルコース補充２５％ＨＢＳＳ）へ移した。培養物を、画像化の前の６０分間、ＳＦＭ中で平衡化にさせた。ＰＩ蛍光を、ローダミンフィルターセットを備えたライカ倒立顕微鏡を用いて検出した。ＰＩ蛍光がこの段階で検出された培養物はいずれも更なる研究から外した。低酸素症を、９５％Ｎ２／５％ＣＯ２で飽和されていたＳＦＭ（＋ＰＩ）へ培養物を移すことにより誘導した。次に、密閉する前の１０分間、１０Ｌ／分にて気体を通して連続的に吹込むことにより、雰囲気が９５％Ｎ２／５％ＣＯ２で飽和された気密チャンバー中で培養プレート（ふた無し）を密閉し、１７０分間インキュベーターで培養した（低酸素症の合計時間は、これによって１８０分間であった）。低酸素症期の終わりにて、培養物を、ＰＩを含む酸素正常状態のＳＦＭへ戻し、２４時間インキュベーターで再び培養した。
【００９４】
ニューロン損傷を、アップル ＩＩｓｉ コンピュータで実行するＮＩＨイメージ１．６０又はマッキントッシュＧ４／４００で実行するＯｐｅｎＬａｂ ２．１ （改良版）のいずれかを用いて既述（Ｐｒｉｎｇｌｅら、１９９６；１９９７）のように調べた。画像をモノクロカメラを用いてとらえて、オフライン分析用の光ディスクに保存した。光透過画像（Ｌｉｇｈｔ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｍａｇｅ）を薬剤の添加前にとらえ、ＰＩ蛍光画像を２４時間の低酸素症後回復期の終わりにて録画した。ＣＡ１細胞層の領域を透過画像から決定した。ＣＡ１におけるＰＩ蛍光の領域をＮＩＨイメージ１．６０又はＯｐｅｎＬａｂ中の密度スライス機能を用いて測定し、ニューロン損傷をＰＩ蛍光が上記バックグラウンドとして検出されたＣＡ１のパーセントとして表した。
【００９５】
ステロイド化合物は、エタノール中で当初の１ｍｇ／ｍｌ溶液を作り、更にＳＦＭで希釈することにより調製された。化合物は、低酸素症の前４５分間、低酸素症の発生の間、及び低酸素症後回復期の間に、培養物に添加された。コントロール実験は、賦形剤のみで処理された培養物からなる。
【００９６】
結果
実験１：
初めの実験は、７αＯＨ−ＥＰＩＡ及び７βＯＨ−ＥＰＩＡが１００ｎＭの高濃度で神経保護性であるか否かを決定するために行なわれた。低酸素症は、ＣＡ１の２５．５±６．４％において損傷を生じた。この損傷は、低酸素症の前、その間及びその後に存在するときに、７αＯＨ−ＥＰＩＡ及び７βＯＨ−ＥＰＩＡの両方により顕著に減少した（表Ｉ参照のこと）。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
実験２：
７ＯＨ−ＥＰＩＡのα−及びβ異性体の両方が神経保護性であることと決定されたので、我々はこの効果の濃度依存性を調べた。コントロール低酸素症は、ＣＡ１の３１．９±４．７％にニューロン損傷を生じた。下記の表ＩＩに示されるように、７βＯＨ−ＥＰＩＡは、１０ｎＭ及び１００ｎＭで顕著に神経保護性であったが、濃度を１ｎＭに下げた場合には活性を失っていた。
【００９９】
【表２】
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【０１００】
実験３：
７βＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護活性が観察されて、我々は次に７βＯＨ−ＤＨＥＡが神経保護性であるか否かを調べた。低酸素症の前、その間及びその後に、培養物を１００ｎＭの７βＯＨ−ＤＨＥＡ又は賦形剤と共にインキュベートした。低酸素症はＣＡ１の２９．０±６．２％において損傷を生じた。下記の表ＩＩＩに示されるように、７βＯＨ−ＤＨＥＡで処理された培養物では、大きく、顕著なニューロン損傷の減少が観察された。
【０１０１】
【表３】
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【０１０２】
（実施例２２）
ラットにおける全体脳虚血（４血管閉塞）
脳虚血を、オスのウィスターラット（２５０〜２８０ｇ）の４つの血管閉塞（４ＶＯ）により誘導した。両方の椎骨動脈をペントバルビタール麻酔（６０ｍｇ／ｋｇ、腹膜内）中で電気焼灼により閉塞した。その動物を、水は自由に飲ませたが、食物は自由に食べさせずに、２４時間で回復させた。翌日、頸動脈を３０％酸素／７０％亜酸化窒素麻酔中の２％ハロタン下に曝し、微小血管クラップを用いて１０分間閉塞した。続いて、両方のクラップを取り外して、両方の動脈を即時の再灌流のために視察した。手術中及びその後の３時間の間、動物の正常体温（３７．５±０．５℃）を、直腸体温計につなげられたサーモスタット制御式加温ブランケットを使用することにより維持させた。コントロール用の擬似手術動物では、両方の椎骨動脈を、ペントバルビタール麻酔中で焼灼し、翌日、両共通の頸動脈を３０％酸素／７０％亜酸化窒素麻酔中の２％ハロタン下に曝したが、クラップでは締めなかった。負傷をリドカインゲルで治療した後、縫合した。動物が意識を取り戻すまで、３０℃の環境温度にて、加温ランプ下で保持させた。
【０１０３】
７つの群の動物を調べた：
１．（ｎ＝８）ステロイド化合物、７β−ＯＨ ＥＰＩＡ（０．１ｍｇ／ｋｇ、尾部静脈経由で静脈内、３回注入：虚血の誘導の１５分前、虚血の間及び再灌流後の５分間）；
２．（ｎ＝８）ステロイド化合物、７β−ＯＨ ＥＰＩＡ（０．３ｍｇ／ｋｇ、静脈内、上記１に記載のように３回注入）；
３．（ｎ＝８）ステロイド化合物、７β−ＯＨ ＥＰＩＡ（１ｍｇ／ｋｇ、静脈内、上記１に記載のように３回注入）；
４．基準物質として（ｎ＝８）ＮＢＱＸ（二ナトリウム塩、より水に溶けるため）及び陽性コントロール（ＴＯＣＲＩＳ、ドイツ国、３０ｍｇ／ｋｇ、腹膜内、上記１に記載のように３回注入）；
５．（ｎ＝８）容認された賦形剤（０．９％ＮａＣｌ、１００μｌエタノール含有）（上記１に記載のように３回注入）；
６．（ｎ＝８）虚血のみ；
７．（ｎ＝８）擬似手術コントロール。
【０１０４】
ＮＢＱＸは、２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ（Ｆ）キノキサリンであり、神経保護活性を有することが知られている［Ｇｉｌｌ， Ｒ， Ｎｏｒｄｈｏｌｍ， Ｌ．， Ｌｏｄｇｅ Ｄ．：ラット集合（ｆｏｃａｌ）虚血モデルにおける ２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ（Ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）の神経保護作用、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ５８０， ３５−４３， １９９２］。
７β−ＯＨ ＥＰＩＡは、本発明の化合物の、７β−ヒドロキシエピアンドロステロンである。
物質は、１００μｌエタノールに溶解して、最後に０．９％ＮａＣｌで希釈した。
【０１０５】
虚血後７日間の生存期間の後に、全ての動物を４％パラホルムアルデヒドで血管を通して灌流固定した。次に、脳を慎重に取り出し、２時間、同様の固定剤で後固定した。３０％スクロースで凍結保護した後、脳をイソペンタン中で急速に凍結し、−８０℃に保存した。海馬構造を含む２０μｍの低温切片を、トルイジンブルー又はニューロトレース（Ｎｅｕｒｏ Ｔｒａｃｅ）蛍光でニッスル染色した。
【０１０６】
データ分析：
虚血後の海馬ＣＡ１領域におけるニューロン損傷の重篤さを、ニッスル染色を使用して生存ニューロンの数によって評価した。４００μｍ長毎に形態的に無傷のニューロンの平均数を、各群についてＣＡ１領域において算定した。細胞集計を、２０×対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、１動物あたり３〜５連続切片で、且つ１切片あたり４００μｍＣＡ１領域６回で行なった。データは一組のステューデントのｔ−検定により統計的に分析した。データを平均±ＳＥＭとして示した。
【０１０７】
結果及び考察：
結果を添付した図面の図１〜３に示した。
形態的に無傷の海馬ＣＡ１ニューロンは、下記の基準でニッスル染色（トルイジンブルー又はニューロトレース、図２）により特徴付けられた：即ちニューロンの核周囲部の明確な形状、陽性標識された核小体をもつ大きな核、ニッスル染色陽性の核周辺の小さな細胞質ゾーン（これは、リボソームをもつ無傷の粗面小胞体、従って無傷のタンパク質合成機構を示す）。
【０１０８】
１０分間の全体虚血（軽い虚血）及び７日間の生存期間は、海馬ＣＡ１領域での選択的な錐体細胞の神経変性をもたらす（図１Ａ−１Ｃ）。擬似手術動物のＣＡ１での錐体細胞の平均数は、１２１．５±４．３であった（１００％とする）。従って、６０％のＣＡ１ニューロンは、全体虚血の１０分後に死んだ（図１Ｂ）。実験に記載されたように適用された虚血及び賦形剤（ＮａＣｌ＋１００μｌエタノール）の静脈内注入の動物群でのニューロンの数を、虚血群のみのニューロンの数と比較した（図１Ａ、１Ｂ）。ＮＢＱＸ（３０ｍｇ／ｋｇ、実験に記載されているように静脈内、３回注入）は、虚血群と比べてＣＡ１錐体細胞での顕著な（ｐ＝０．０３）神経保護を示した。虚血のみと比べてＮＢＱＸは４７．５％の神経保護をもたらしたが、擬似手術動物と比べて保護効果は６８．５％であった。ＮＢＱＸにより生じる神経保護は、我々が実験に使用した全体虚血モデルの有効性を証明するＧｉｌｌら、１９９２年及びＧｉｌｌ １９９４年と一致した。７β−ＯＨ ＥＰＩＡは、全体虚血の１０分間後及び７日間の生存期間後の海馬ＣＡ１錐体細胞の神経保護の濃度依存をもたらした（図１Ａ）。ｔ−検定分析は、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０１）及び０．３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０００８）の濃度での７β−ＯＨ ＥＰＩＡの顕著に高い神経保護効果を表した。擬似手術群と比べて７β−ＯＨ ＥＰＩＡは、ＣＡ１錐体細胞における７４．８％（０．１ｍｇ／ｋｇ）及び８３．９％（０．３ｍｇ／ｋｇ）それぞれの神経保護効果を示した（図１Ｃ）。１．０ｍｇ／ｋｇの濃度での７β−ＯＨ ＥＰＩＡは、神経保護の傾向のみを示したが、その効果は顕著なものではなかった。
【０１０９】
虚血の前、その間及びその後に、静脈内注入される７β−ＯＨ ＥＰＩＡを有する全ての実験において、我々は如何なる動物の行動異常性をも観察しなかった。
【０１１０】
図の説明文：
異なる化合物の影響下及びラットの全体脳虚血後７日間のラットでの形態的に無傷の海馬ＣＡ１錐体細胞の数。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】データは、ＣＡ１領域の４００μｍ長毎の無傷のニューロンの平均数±ＳＥＭを示した。
【図１Ｂ】データは、１００％とした擬似手術動物と比較したＣＡ１領域の４００μｍ長毎の無傷のニューロンのパーセントを示した。
【図１Ｃ】データは、虚血群の生存ニューロンの数を０とし、擬似手術群の生存ニューロンの数を１００％としたときの、神経保護の絶対パーセントを示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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