(57)【要約】本発明は、４−ガラクトシル−キシロースのヒトにおける使用方法であって、尿中のキシロースを測定するための代替技術を含む該使用方法に関する。この方法は、４−ガラクトシル−キシロースを患者に経口投与した後で、血中のキシロースの濃度を測定することを含み、該方法は新生児に対しても適当である。本発明は、腸ラクターゼの欠乏症を診断するための非侵襲試験によって該酵素の活性を生体内で評価するために使用される技術にも関する。該技術は個々の患者における該酵素の全活性を直接的に評価することを含むが、該欠乏症の結果を評価することは含まない。この方法は専門的な装置を必要とせず、また、ラクターゼ欠乏症患者に明確な不快感をもたらさないだけでなく、信頼性が極めて高いために、従来から使用されている診断法の不都合な点を除去する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿中のキシロースの存在を評価するための４−ガラクトシル−キシロースの使用であって、腸内ラクターゼの欠乏症の診断試験としての該酵素の生体内評価のために有用であり、次の過程（ｉ）および（ii）を含む該使用：
（ｉ）少なくとも８時間絶食した被験体に４−ガラクトシル−キシロースの水溶液を経口投与し、次いで
（ii）尿中に存在するキシロースの量を評価する。
【請求項２】
尿中のキシロースの存在量を次の測定値（ａ）と（ｂ）の差から計算する請求項１に記載の使用：
（ａ）４−ガラクトシル−キシロースの投与後に採取される尿の全量から得られるアリコート中での該化合物の測定値および
（ｂ）該化合物を投与する直前に採取される基礎尿の量から得られるアリコート中での該化合物の測定値。
【請求項３】
被験体がヒトである請求項１記載の使用。
【請求項４】
血中のキシロースの存在を評価するための４−ガラクトシル−キシロースの使用であって、腸内ラクターゼの欠乏症の診断試験としての該酵素の生体内評価のために有用であり、次の過程（ｉ）および（ii）を含む該使用：
（ｉ）少なくとも８時間絶食した被験体に４−ガラクトシル−キシロースの水溶液を経口投与し、次いで
（ii）血中に存在するキシロースの量を評価する。
【請求項５】
４−ガラクトシル−キシロースの投与後の血中に存在するキシロースの量を血漿中または血清中において評価する請求項４記載の使用。
【請求項６】
血中のキシロースの存在量を次の測定値（ａ）と（ｂ）の差から計算する請求項４に記載の使用：
（ａ）４−ガラクトシル−キシロースの投与後に被験体から採取される血液試料から得られる液状アリコート中での該化合物の測定値および
（ｂ）該化合物を投与する直前に採取される基礎血液試料から得られるアリコート中での該化合物の測定値。
【請求項７】
被験体がヒトである請求項４基細胞の使用。
【請求項８】
請求項１または４記載の使用であって、ヒトにおける被験者に適用することによって、腸内ラクターゼの欠乏症の被験者および乳中の一部の成分に対してアレルギー性であるが該酵素の欠乏症でない被験者を区別することを可能にする該使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬剤の部門に属し、ヒトにおける腸内ラクターゼの欠乏症の非侵襲性診断試験として該酵素の活性を生体内で評価する医療部門および該酵素の濃度を生体内で評価する必要のあるその他の正常な状況もしくは病理学的な状況に適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
腸内ラクターゼは小腸の粘膜中に存在し、その活性中心は、小腸の内腔に向かって露出しており、該酵素は乳中に存在する糖であるラクトースの加水分解酵素である。この糖はそのままでは小腸内で吸収されないが、加水分解によってガラクトースとグルコースに分解されて最終的には吸収されるので重要である。腸内ラクターゼの欠乏症はラクトースの吸収不良と不耐性をもたらす。該酵素の欠乏症に起因して、小腸内で加水分解されないラクトースは、胃を空にする速度の遅延、小腸内の移動時間の増加、浸透圧の増加および小腸の内腔中の流体の停留がもたらされるために、結腸内におけるラクトースのバクテリア発酵が増加すると共に、ガス類（例えば、水素、メタンおよび二酸化炭素等）の発生量と短鎖脂肪酸の生成量が増加する。この結果、消化過程が遅延し、単糖類の吸収量が低下する。このような現象は苦痛、胃痙攣、腹部膨満、可聴腸内騒音および下痢をもたらす。成人においては、このような臨床的な特徴は低ラクターゼ症（hypolactasia）またはラクトース不耐症として知られており、このような症状は、人類の約半数が冒されている最も頻繁にみられる遺伝的疾患である。
【０００３】
新生児の場合、該酵素の先天的欠乏症はラクトースの正常な利用を妨げるために重大な疾患（例えば、エネルギー供給量の減少と加水分解されない二糖の腸内での蓄積に起因する強い下痢と脱水症等）をもたらす。このため、このような症状の早期発見とラクトースを含まないミルクへの食事変更が必要となる。
【０００４】
さらに、ラクターゼ欠乏症は、腸内の粘膜を種々の程度に劣化させることを含むかなりの数の腸病理において二次的な病状をもたらす。このような病理としては小児脂肪便症、慢性腸炎症性疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、痙攣性結腸症候群、腸切除、のう胞性線維症、早発新生児、化学療法薬の投与および、特に老人における適心症候群等が例示される。従って、ラクターゼ活性の評価は胃腸病学、小児科学、および一般的な病理学的過程（即ち、腸内粘膜の機能的統合性の評価または該酵素欠乏症の特異的診断法の確立が必要な病理学的過程において特に重要である。
【０００５】
現在までのところ、腸内ラクターゼ欠乏症の診断法は次の方法に基づいている：
（ｉ）内視鏡下生検によって得られる患者の小腸の粘膜試料中のラクターゼ酵素を直接的に評価する方法（文献１参照）。
（ii）ラクトースを過剰に投与する試験（体重１ｋｇあたり１〜２ｇ）後に該欠乏症に起因する代謝の結果、例えば、被験者の欠乏症状の出現（例えば、腹腔痛、鼓腸、下痢等）等を評価し、また、血漿中のグルコース（文献２参照）、血漿中のガラクトース（文献２参照）、尿中のガラクトース（文献３参照）または便中の炭水化物（文献４参照）を評価する方法。ラクトースの過量投与後に吐き出されるガスまたは代謝されないラクトースの結腸内での発酵に起因するガスを評価する方法、例えば、１４Ｃ−ラクトースもしくは１３Ｃ−ラクトースを含有するラクトースの過量投与後に吐き出される呼気中の水素（文献５参照）または１４ＣＯ２（文献６参照）もしくは１３ＣＯ２（文献７参照）あるいは１３ＣＯ２／Ｈ２比（文献８参照）を評価する方法。１３Ｃ−ラクトースと２Ｈ−グルコースを含有するラクトースの過量投与後に血清中の１３Ｃ−グルコース／２Ｈ−グルコース比を評価する方法（文献９参照）。
【０００６】
腸内ラクターゼを評価する別の方法は、ラクトースと構造的に類似するためにこの酵素の基質として作用する特定の二糖類を使用することに基づくものである。これらの二糖類は体内に取込まれた後、腸内ラクターゼの作用によって特定の単糖類へ変換され、該単糖類は腸の粘膜によって吸収され、これらの単糖類のうちの１種もしくは複数種は尿中へ排出されるためにこれらの一部のものを評価することができる。例えば、スペイン国特許ＥＳ−Ｐ−４７８５９０号およびＥＳ−Ｐ−４８２０７３号各明細書に記載されている方法は、３−Ｏ−メチルラクトースを経口投与した後、尿中の３−Ｏ−メチル−Ｄグリコースを評価する生体内評価に基づくものである。
【０００７】
一方、スペイン国特許ＥＳ−Ｐ−９００１６８０号明細書には、腸内ラクターゼ活性を生体内評価するための４−Ｏ−β−ガラクトペラノシル−Ｄ−キシロースの製造法が記載されている。この化合物は次式で表される二糖である：
【化１】
2006503281.tif 000002
該二糖は経口投与されると腸内ラクターゼ基質として作用するので腸管内でキシロースとガラクトースに加水分解され、これらの分解生成物はいずれも吸収され、キシロースは尿中へ排出される。尿中において簡単な比色法によって直接的に滴定分析することができる。尿中へ排出されるキシロースの量は腸内ラクターゼの濃度と関連づけられる。
【０００８】
スペイン国特許ＥＳ−Ｐ−９００１６８０号明細書には、４−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロースの製造法であって、選択的な保護反応、グリコシル化反応および脱保護反応を含むベンジルβ−Ｄ−キシロピラノシドからの合成工程を含む該製造法も記載されている。
【０００９】
スペイン国特許ＥＳ−Ｐ−９５０２１８５号明細書には、４−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロース並びにその位置異性体である２−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロースおよび３−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロースを含有するガラクトピラノシル−キシロース二糖類の混合物を製造するための酵素反応が記載されている。この特許明細書には、これらの３種の位置異性体の混合物を非離乳ラットにおける腸内ラクターゼ活性の生体内評価に使用することも記載されており、これによれば、該動物の成長中に該混合物を経口投与した後に尿中へ排出されるキシロースは該動物の死後の腸粘膜中で評価される腸内ラクターゼ活性に比例することが示されている。
【００１０】
スペイン国特許ＥＳ−Ｐ−２００１０４１９号明細書には、Ｄ−キシロースとβ−Ｄ−キシロピラノシド基質との酵素反応工程とその後の４−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロースの分離精製工程を含む４−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロースの酵素的製造法が記載されている。
【００１１】
先に言及した引用文献用文献を以下にまとめて示す。
１．Ａ．ダールクヴィスト（１９６４年）、Anal. Biochem.、第７巻、第１８頁〜第２５頁
２．Ａ．Ｄ．ニューコマー、Ｄ．Ｂ．マックギル、Ｐ．Ｊ．トーマスおよびＡ．Ｆ．ホフマン（１９７５年）、N. Engl. J. Med.、第２９３巻、第１２３２頁〜第１２３６頁
３．Ｔ．ゴーダ、Ｓ．ブスタマンテ、Ｗ．トンブルクおよびＯ．コルドフスキー（１９８４年）、Biochem. J. 第２２１巻、第２６１頁〜第２６３頁
４．Ｋ．Ｒ．ケリーおよびＣ．Ｍ．アンダーソン（１９６４年）、Lancet、第１巻、第９８１頁〜第９８４頁
５．Ｇ．メッツ、Ｄ．Ｊ．ジェンキンス、Ｔ．Ｊ．ペータース、Ａ．ニューマンおよびＬ．Ｍ．ブレンディス（１９７５年）、Lancet、第１巻、第１１５５頁〜第１１５７頁
６．Ｙ．ササキ、Ｍ．リオ、Ｈ．カメダ、Ｈ．ウエダおよびＴ．アオヤギ、J. Lah. Clin. Med.、第７６巻、第８２４頁〜第８３５頁
７．Ｈ．Ａ．ケッツェ、Ｆ．ステラード、Ｃ．Ｍ．ビールベルト、Ｈ．エルチンガ、Ｒ．ボヴァーホフ、Ｒ．ファン・デァ・メール、Ｒ．Ｊ．ボンクおよびＰ．Ｊ．ザウアー（１９９９年）、Scand. J. Gastroenterol. 第３４巻、第３５頁〜第４０頁
８．Ｈ．Ａ．ケッシェ、Ｒ．Ｊ．ボンク、Ｓ．パスターカンプ、Ｊ．パル、Ｓ．ドヴルインおよびＦ．ステラード（２０００年）、Scand. J. Gastroenterol.、第３５巻、第６０７頁〜第６１１頁
９．Ｒ．Ｊ．ボンク、Ｆ．ステラード、Ｍ．Ｇ．プリーベ、Ｈ．Ａ．ケッツェ、Ｒ．Ｅ．ハーゲドーム、Ｓ．ドヴルイン、Ｈ．エルジンガ、Ｉ．ルノワール−ヴィンコープおよびＪ．Ｍ．アントワン（２００１年）、Eur. J. Clin. Invest.、第３１巻、第２２６頁〜第２３３頁
【００１２】
本発明の目的は、スペイン国特許ＥＳ−Ｐ−２００１０４１９号明細書に記載されている方法によって調製される４−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロースを、ヒトにおける腸内ラクターゼ欠乏症の非侵襲的診断試験として該酵素の活性を生体内評価するために使用することである。本発明においては、血中のキシロースを評価することに基づく従前の特許明細書に記載されている方法とは異なる方法であって、診断試験への適用に対して種々の実質的に有利な点を含む方法を利用する。
【００１３】
腸内ラクターゼの欠乏症を診断するために今日使用されている前記の方法には、以下に説明するような特別な装置を必要とするだけでなく、一般に不十分な信頼性や患者の著しい不快感を含む一連の問題点が付随する。内視鏡を用いる生検によって得られる患者の小腸の粘膜試料中のラクターゼ活性の直接的評価は、Ｘ線による調節を必要とする流血性の侵襲性試験を伴うだけでなく、小腸内の１つの特定の部位もしくは領域内の酵素活性のみを示すにすぎない。さらに、この直接的評価は、内視鏡によって接近することが困難なために、この酵素が最も多く存在する領域（中間の空腸）の場合とは一般に一致せず、しかも、他の領域からの試料によって変化する。従って、被験者における全酵素活性に関する情報は得られない。
【００１４】
その他の評価法は、ラクトースの経口過量投与（２５〜５０ｇ）とその後のラクターゼ欠乏に起因する代謝結果物の評価（例えば、大腸内に生息するバクテリアによる非加水分解ラクトースの代謝によって発生する呼気中のガス類の測定）を含む非侵襲性試験である。これらの試験は、該酵素活性の直接的生体内測定を可能にしないだけでなく、被験者の内因性ガス（例えば、Ｈ２およびＣＯ２等）の発生能によって左右されることを考慮するならば、間接的評価法である。さらに、このガス発生能は、被験者の種々の要因（例えば、喫煙の習慣、ダイエット、緩下薬の服用および抗生物質の経口療法等）によって影響を受けるので、著しい比率の偽陽性結果と偽陰性結果がもたらされ、評価の信頼性は不十分なものとなる。
【００１５】
一方、ラクトースの過量投与を伴う試験は、生理学的にバランスのとれた食物中に含まれる量の糖に比べて非常に多量の糖を投与しなければならないために、欠乏症被験者に種々の胃腸障害（例えば、腹腔内の痛み、鼓腸および下痢等）をもたらす。欠乏症が推測される乳離れしていない赤ん坊の場合、ラクトースの過量投与は著しい下痢と潜在的な脱水症の原因をもたらすので危険である。従って、この場合には別のタイプの試験法が必要となる。異なるタイプのラクトースを過量投与する試験を利用する場合、呼気中に含まれるガス類を測定するためには特殊な装置、例えば、ガスクロマトグラフや電気化学的検出機等が必要となる。この種の特殊な装置は病院等のおいては通常は設置されているが、一般的な保健センターには設置されていない。
【００１６】
過量投与法において１−１４Ｃ−グルコースまたは１３Ｃ−ラクトース／２Ｈ−グルコースを使用する場合、１４ＣＯ２、１３ＣＯ２および１３Ｃ／２Ｈ−グルコースを評価するためには、スパークリングカウンター（sparkling counter）またはより特殊な限定的装置、例えばガスクロマトグラフィーまたはマススペクトロメトリー等が必要となる。
【００１７】
３−Ｏ−メチルラクトースを経口投与した後、尿中へ排出される３−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコースを評価する方法は現在までのところ臨床的実施において利用されていないが、この方法においては非生理学的化合物、例えば、３−Ｏ−メチル−Ｄ−グルコース等を血中へ吸収させることを含んでおり、該化合物の評価にはガスクロマトグラフィー系または高圧液体クロマトグラフィー系が必要となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の課題は、現在利用されている診断試験の前記の諸問題を、全体としての被験者における腸内ラクターゼの全活性の直接的評価に基づく該酵素の非侵襲性試験としての該酵素の活性の生体内評価用技術を提供して解決することである。この技術は該酵素の欠乏の結果を評価するものではない。この技術においては、特殊な装置は不要であり、また、ラクターゼ欠乏症の患者に明白な不快感をもたらすことなく、さらに、該技術は高い信頼性をはじめとして、以下に説明する種々の利点を有する。
【００１９】
４−ガラクトシル−キシロースのヒトにおける使用に基づく方法を利用すると共に該方法において尿中のキシロースを評価することを補完する別の方法は、４−ガラクトシル−キシロースを患者へ投与した後、血中のキシロース濃度を評価することを含む。１つの試料あたり、最小容量の血液（２〜３滴）を採取するだけで十分であるために、この方法を子供や新生児に適用する場合には、これらの被験者にもたらされる不快感がより少なく、しかも信頼性が高くなるので、非常に便利である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の方法的特徴は、４−ガラクトシル−キシロース（４−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−Ｄ−キシロース）の使用に基づく。この化合物は、ラクターゼの生理学的基質であるラクトースの構造的類似体として、経口投与後に腸粘膜中の酵素によって加水分解されるように作用する。この反応の生成物は血液中へ流入し、このうちの１種であるキシロースは尿中へ排出されるので、簡単な比色法による滴定によって評価してもよい。
【００２１】
また、本発明は血中のキシロースの評価にも関し、この評価においては数滴の血液で十分であり、高感度のキシロース評価法が提供される。この評価法は特に乳離れしていない赤ん坊や子供一般に適用する場合に実質的な利点をもたらす。このことは、数時間の間に尿試料を採取することが敬遠されることおよびこの別の方法によればこれらの被験者にもたらされる不快感が少なくなると共により高い信頼性のある評価が得られることを考慮すれば明らかである。
【００２２】
本発明によれば次のことが示される。即ち、ラクトース耐性を有するヒトに４−ガラクトシル−キシロースを投与した後で尿中と血中にキシロースが存在するようになり、該キシロースの存在は被験者における腸内ラクターゼの活性の尺度となる。また、本発明によれば、腸内ラクターゼ欠乏症（ラクトース不耐性）のヒトに４−ガラクトシル−キシロースを投与した後において、尿中へのキシロースの排出量と血中のキシロースの濃度が低減することが示される。さらにまた、本発明によれば、４−ガラクトシル−キシロースの使用と尿中のキシロースの評価によって、ラクターゼ欠乏症の被験者と乳中の一部の成分に対してアレルギーを示す被験者を高い信頼性で簡単に区別することが可能であることが初めて実証された。
【００２３】
腸内ラクターゼ欠乏症を診断するために現在使用されている方法に比べて、本発明による方法は以下のような利点を有する。
（ｉ）信頼性が高い。本発明方法は尿中または血漿中のキシロースの評価による酵素活性の直接的評価に基づくものであって、該酵素の欠乏に起因する代謝の結果（例えば、結腸内での非加水分解化二糖の発酵に基づくＨ２またはＣＯ２の生成）の評価に基づくものではないからである。ガス類の内因性生成に影響を及ぼすためにラクトースの過量投与後の呼気中のガス類を測定する試験の信頼性を著しく低下させて偽陽性の結果と偽陰性の結果をもたらす前記の全ての要因は、本発明方法によって得られる結果には影響を及ぼさない。
（ii）得られる情報は、被験者における生体内ラクターゼの全活性の直接的な指標となる。
【００２４】
（iii）感度が高い。フルオログルシノールの反応に基づく比色分析法によって滴定するときのキシロールの検出限界は０．１〜０．０５μｇである。
（iv）評価には簡単な装置が必要なだけである。通常は、臨床的な生化学的実験室の最低限の設備を有する保健センターにおいて利用できるような装置が必要なだけである。この理由は、該酵素の生体内評価が、比色試験によっておこなうことができるキシロースの滴定のみに基づくからである。
（ｖ）試験の実施に際しては、ラクターゼ欠乏症の患者の胃腸に対して不都合な不快感や障害がもたらされることはない。この理由は、投与される４−ガラクトシル−キシロース（二糖）の経口投与量が非常に少ないからである（成人の場合、尿中のキシロースを評価するときには０．２５ｇであり、血中のキシロースを評価するときには３．０ｇである）。子供の場合には投与量をさらに少なくすることが可能である。二糖の投与量の低減化は、キシロース評価の高感度の結果に起因する。また、腸内ラクターゼによる４−ガラクトシル−キシロースの加水分解によって２種の生理学的生成物（ガラクトースおよびキシロース）の生成量が増加するが、これらの生成物は最終的には腸粘膜によって吸収されることにも注目するべきである。
（vi）被験者の側には能動的な関与は不要であり、このことは乳離れしていない赤ん坊の場合に特に重要である。
（vii）放射性同位体で標識化した化合物の投与は不要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
図１は、乳離れしていない成長期のラットに４−ガラクトシル−キシロース（４ｍｇ）を経口投与した後の尿中へのキシロースの排出量（「●」）と腸内ラクターゼ活性（「○」）を示すグラフである。
図２は、乳離れしていない成長期のラットに４−ガラクトシル−キシロース（８ｍｇ）を経口投与した後の血漿中のキシロースの濃度（「●」）と腸内ラクターゼ活性（「○」）を示すグラフである。
図３は、乳摂取に対して耐性のある成人ボランティア（被験者１：男性）に４−ガラクトシル−キシロース（１ｇ）を経口投与した後の尿中へのキシロースの排出量を示すグラフである。
図４は、乳摂取に対して耐性のある２人の成人ボランティア（被験者１：男性、被験者２：女性）に種々の量の４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の尿中へのキシロースの経時的排出量を示すグラフである。
【００２６】
図５は、乳摂取に対して耐性のある３人の男性ボランティア［被験者１（「●」および「○」）、被験者７（「▲」および「△」）および被験者１１（「■」および「□」）］並びに５人の女性ボランティア［被験者２（「●」および「○」）、被験者３（「■」および「□」）被験者６（「◆」および「◇」）、被験者８（「▼」および「▽」）および被験者９（「▲」および「△」）］に２５０ｍｇの４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の尿中へのキシロースの経時的排出量を示すグラフである。
図６は、乳摂取に対して不耐性の３人のボランティア［被験者１２（男性）、被験者５（女性）および被験者１０（女性）］に０．２５ｇの４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の尿中へのキシロースの経時的排出量を示すグラフである。
図７は、乳摂取に対して耐性の被験者１および乳摂取に対して不耐性の被験者１２に０．２８ｇの４−ガラクトシル−キシロースを投与した後の尿中のキシロースのガスクロマトグラフィーによる評価を示す。
図８は、乳摂取に対して正常な耐性の成人ボランティア［被験者１（「○」および被験者２（「●」）］並びに低ラクターゼ症の成人ボランティア［被験者１２（「■」）］に３ｇの４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の血漿中のキシロースの濃度を示すグラフである。
【００２７】
本発明方法は、４−ガラクトシル−キシロースの水溶液を、少なくとも８時間の絶食後のヒトに経口投与することを含む。排泄される尿中のキシロースの存在量はその後で一定の時間の経過後に評価する。この方法は、該二糖を投与した後で一定の時間の経過後に採取される血液試料から調製される血清または血漿に含まれるキシロースを評価する血中キシロースの評価によっても実施することができる。キシロースの滴定は、フルオログリシノールとの反応に基づく比色分析法を利用しておこなうことができる。この場合、ターゲット（target）としては、適用法に応じて基礎尿、基礎血漿または基礎血清を使用する。４−ガラクトシル−キシロースは摂取されると、腸内ラクターゼによって加水分解され、この酵素反応による生成物（ガラクトースおよびキシロース）は腸の粘膜を通して血中へ放出され、その後、キシロースは尿中へ排出される。従って、該二糖が摂取された後に血中または尿中に出現するキシロースの量は、該酵素の生体内活性の直接的な表示尺度となる。
【００２８】
本発明を実施するために使用する４−ガラクトシル−キシロースはスペイン国特許ＥＳ−Ｐ−２００１０４１９号明細書に記載されている方法に従って調製することができる。
【００２９】
４−ガラクトシル−キシロースの経口投与後の尿中へのキシロースの排出および血中のキシロースの存在は、腸内ラクターゼの活性と密接に関連づけられる。このことは、図１および図２並びに実施例１および実施例２に記載されているように、乳離れしていないラットを用いる実験によって実証されている。
【００３０】
乳またはいずれかの乳製品を摂取した後に胃腸の不都合な不快感を訴えないことから判断されるラクトースの正常な消化能を有するか、またはラクトースに対して耐性を示す成人ボランティア（即ち、正常なレベルの腸内ラクターゼ活性を有する成人ボランティア）によって４−ガラクトシル−キシロースが摂取されると、腸内ラクターゼによる該二糖の加水分解の結果として、該化合物の投与から８時間にわたって尿中へキシロースが漸進的に排出される。このことは、図３〜図５および実施例３〜１１に示すように、４−ガラクトシル−キシロースが、ヒトの腸内ラクターゼの生体内基質であることを示す。
【００３１】
ラクトース耐性を示す成人ボランティアにおける尿中へのキシロースの排出量は、４−ガラクトシル−キシロースを０．２５ｇ、０．５ｇ、１ｇおよび３ｇ投与した場合、該化合物の摂取量に伴って増加した。４−ガラクトシル−キシロースの摂取によって、被験者に胃腸の不快感や障害はもたらされなかった。このことは、被験者におけるキシロースの排出量が投与される４−ガラクトシル−キシロースの量に依存することを示す。図４並びに実施例４および実施例５に示すように、該化合物の投与後に尿中へ排出されるキシロースを高い信頼度で検出するためには、該化合物の投与量は０．２５ｇで十分である。
【００３２】
ラクトースに対して耐性を有する成人ボランティアにおいて尿中へ排出されたキシロースの比率は、同性の被験者に同量の４−ガラクトシル−キシロースを投与した場合の範囲内にあった。このことは、図５および実施例４〜１１に示すように、この方法によって得られた結果が、複数の正常な被験者において信頼性を伴って再現されたことを示す。
【００３３】
ラクトースに対して不耐性であって腸内ラクターゼ欠乏症の成人ボランティアに４−ガラクトシル−キシロースを０．２５ｇ投与した場合、尿中へ排出されるキシロースの量は、酵素欠乏度の観点からはラクトースに対して耐性のあるボランティアにおいて観測された平均値に比べて著しく低下した。このことはラクトースに対して不耐性の２人の被験者において観測された。このうちの一人は試験前に強度の低ラクターゼ症であると診断された被験者であり、残りの一人は出生以来ラクトースに対して不耐性であると告白した被験者であり、これらの事実はそれぞれ図６Ａおよび図６Ｂ並びに実施例１２および実施例１３において反映されている。ラクトースに対して不耐性のこれらの二人の被験者によって４−ガラクトシル−キシロースが摂取された場合、胃腸の不快感や障害はもたらされなかった。本発明方法が、腸内ラクターゼ活性の生体内評価を可能とすること示すと共に、該方法が、ヒトにおける該酵素の欠乏症の非侵襲性診断のための有効な試験法であることを示す。さらに、本発明方法は、この欠乏症で患う被験者に明白な不快感をもたらすことはなく、また、該酵素の強度の欠乏を高い信頼度で検出するために投与される４−ガラクトシル−キシロースの量はわずかに０．２５ｇで十分である。
【００３４】
４−ガラクトシル−キシロースの経口投与およびその結果として生成する尿中のキシロースの評価によって、ラクトース不耐性の腸内ラクトース欠乏症の患者および乳成分に対してアレルギー症状を示すために乳摂取に対して不耐性であるが該酵素の欠乏症で患わない患者を区別することを可能にする（後者においては、尿中へのキシロースの排出量は正常な限界値の範囲内にある）。このことは図６Ｃおよび実施例１４において示されている。図６Ｃにおいては、子供の時から乳または乳製品の摂取後に発現するアレルギー性皮膚反応で患っていると告白したラクトース不耐性の成人ボランティアに４−ガラクトシル−キシロースを０．２５ｇ投与した後の尿中へのキシロースの排出量が、ラクトース耐性の女性ボランティアの場合の平均値に比べて著しく相違しないことが示されている。このアレルギー性のラクトース不耐性成人ボランティア（女性）による４−ガラクトシル−キシロースの摂取によって、アレルギー反応や胃腸障害がもたらされることはなかった。
【００３５】
ラクトース耐性の被験者に０．２５ｇの４−ガラクトシル−キシロースを投与した後での尿中へのキシロースの排出量およびラクトース不耐性の低ラクターゼ症被験者における該排出量の減少は、フルオログルシノールとの比色反応とは異なるキシロース評価技術（例えば、ガスクロマトグラフィー等）によっても示される。この方法に関しては、図７および実施例１５において説明する。この場合においても、尿中へのキシロースの排出量に関しては、４−ガラクトシル−キシロースをラクトース不耐性の低ラクターゼ症被験者へ投与する場合は、該化合物をラクトース耐性の被験者へ投与する場合に比べて著しく低減する。
【００３６】
ラクトース耐性の成人ボランティアへ３ｇの４−ガラクトシル−キシロースを経口投与することによって、フルオログルシノールを用いる比色滴定法による血漿中のキシロースの測定濃度は漸増し、該二糖の投与から約２時間後に最大値に達する。同量の４−ガラクトシル−キシロースを、低ラクターゼ症と診断されたラクトース不耐性の成人ボランティアへ経口投与する場合には、該二糖の投与から２時間に評価された血漿中のキシロースの量は著しく低減した。ラクトース不耐性のこの被験者においては、この試験によって胃腸の不快感や障害がもたらされることはなかった。このことは、図８と実施例１６に示されており、また、このことは、４−ガラクトシル−キシロースの経口投与後の血中のキシロースを評価することによって腸内ラクターゼ活性の生体内評価が可能となることを示すものである。従って、この試験は、ヒトにおける該酵素の欠乏症を非侵襲的に診断するための有効な試験である。
【００３７】
ラクトース耐性またはラクトース不耐性の成人ボランティアへ４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の血中や尿中のキシロースの存在量を経時的に追跡する様式および使用されるフルオログルシノールによるキシロースの比色滴定法の高い感度を考慮するならば、成人被験者にこの方法を適用するときに使用されるべき体液試料は、４−ガラクトシル−キシロースの投与前の基礎尿および該化合物の投与から３時間または４時間経過後の全尿であってもよく、あるいは４−ガラクトシル−キシロースの投与前の基礎血液および該化合物の投与から２時間後に採取される血液試料であってもよい。各々の試料血液の量は０．２ｍｌ（２〜３滴）で十分である。
【００３８】
この試験は、尿中および血液中のキシロースを評価することによって子供や乳離れしていない赤ん坊に対しても同様に適用される。経口投与されるべき４−ガラクトシル−キシロースの投与量は成人の場合よりも半減させることができ、また、血液試料の使用量は第一次近似としては０．２ｍｌ（２〜３滴）で十分である。
【００３９】
血中のキシロースの評価は、５０μｌの血清もしくは血漿を用いて高い信頼度で実施することができるので、実質的な利点をもたらす（各々の試料としては２〜３滴の血液で十分である）。このことは乳離れしていない赤ん坊や子供一般の場合に特に重要である。このような被験者の場合には、数時間に排泄される全尿を捕集することを必要とする試験において正確な量の尿を捕集することや会陰腺領域において可能な皮膚反応の発現が困難であるからである。この評価法による不快感はより低減され、またより高い信頼性のあるデータが該方法によって得られる。
【実施例】
【００４０】
実施例１
腸内ラクターゼ活性および４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の尿中へのキシロースの排出量と血中のキシロース含有量との相関関係を検討した。この関係は、乳離れしていないラットの成長期において、４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の尿中へのキシロースの排出量を死後に評価した腸粘膜中のラクターゼ活性（該活性は成長期においては生理学的に低下することが知られている）と比較することによって示された。この目的のためには、２群の同腹子に属する生後１２日目の乳離れしていない２０匹のラットから成る群の実験動物を、母親から隔離することによって６時間絶食させた。この時間の経過後、各々のラットから膀胱への経腹印加によって基礎尿を採取し、次いで４−ガラクトシル−キシロース４ｍｇを蒸留水０．３ｍｌに溶解させた溶液を食道内プローブで投与した。この後、６時間にわたって尿を捕集し、尿中へ排出されたキシロースを、フルオログルシノールとの反応に基づく比色分析によって滴定した。この場合、ターゲットとしては基礎尿を使用した。
【００４１】
採尿直後、４匹のラットを死亡させ、腸粘膜中のラクターゼ活性を直接的に評価した。このためには、小腸片を切除し、該小腸片を洗浄後、粘膜をガラスでこすり取り、これを均質化した。調製された均質化物のラクターゼ活性を分光光度法によって測定した。残りのラットは母親の元に戻し、次いで、上記のラットを死亡させておこなった実験と同じ条件下において、生後１５日目、１８日目、２１日目、２６日目および３５日目のラットについて実験を繰り返した。この実験結果を図１に示す。図１から明らかなように、（ｉ）投与された４−ガラクトシル−キシロースの加水分解に起因して尿中へ排出されるキシロースの存在は腸内ラクターゼの作用によって検出され、また、（ii）実験動物の成長中に経口投与される４−ガラクトシル−キシロースによってもたらされる尿中へのキシロースの排出速度は、成長中に低減する腸内ラクターゼ活性の既知の生理学的調節と対応関係にある。
【００４２】
図１の挿入図によって示されるように、尿中へのキシロースの排出量と腸内ラクターゼ活性との間には一次相関係数（ｒ＝０．９６）が得られ、このことは、両方のパラメーターの間に密接な関連があることを示す。この実験の前において、次のことが判明していた。即ち、４−ガラクトシル−キシロースを０．３ｍｌの水に２ｍｇ〜３２ｍｇ溶解させた溶液を実験動物へ経口投与したところ、該動物の年令にかかわらず、該二糖の投与量の増加に伴って尿中へのキシロースの排出量は増加した。この実験は、本発明方法が腸内ラクターゼ活性の生体内評価にとって有用であることを示すものである。この方法は、診断目的の流血を伴わないで、該活性を非侵襲的に評価するために利用することができる。
【００４３】
実施例２
腸内ラクターゼ活性および４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の尿中へのキシロースの排出量と血中のキシロース含有量との相関関係を検討した。この関係は、乳離れしていないラットの成長期において、４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後に分析された血漿中のキシロース含有量を死後に評価した腸粘膜中の特異的なラクターゼ活性と比較することによって示された。この目的のためには、２群の同腹子に属する生後１２日目の乳離れしていない６０匹のラットから成る群の実験動物を、母親から隔離することによって６時間絶食させた。この時間の経過後、各々のラットから心臓穿刺によって基礎血液を採取し、次いで０．３ｍｌの蒸留水で希釈した４−ガラクトシル−キシロース（８ｍｇ）を食道内プローブで投与した。該二糖を投与してから３時間経過後、別の血液試料を採取した。この血液試料を遠心分離処理に付すことによって血漿または上澄み成分を採取し、キシロースの含有量をフルオログルシノールを用いる比色分析法による滴定によって測定した。この場合、基礎血液の血漿をターゲットして使用した。
【００４４】
採血の直後、４匹の実験動物を死亡させ、腸粘膜中のラクターゼ活性を、実施例１に記載の場合と同様にして、直接的に評価した。残りの実験動物は母親の元に戻し、次いで、上記のラットを死亡させておこなった実験と同じ条件下において、生後１５日目、１８日目、２１日目、２６日目および３５日目のラットについて実験を繰り返した。この実験結果を図２に示す。図２から明らかなように、（ｉ）投与された４−ガラクトシル−キシロースの加水分解に起因する血漿中のキシロースの存在は腸内ラクターゼの作用によって検出され、また、（ii）実験動物の成長中に経口投与される４−ガラクトシル−キシロースによってもたらされる血漿中へのキシロースの出現速度は、成長中の腸内ラクターゼ活性の生理学的低減と対応関係がある。この場合、血漿中のキシロースの含有量は、図２の挿入図によって示されるように、腸内ラクターゼ活性と密接な関連がある（両方のパラメーター間の一次相関係数（ｒ）は０．９８である）。
【００４５】
この実験の前において、次のことが判明していた。即ち、（ｉ）血漿中のキシロースの含有量は、４−ガラクトシル−キシロースの経口投与から３時間後に最高値に達し、また、（ii）血漿中のキシロースの含有量は、４〜１６ｍｇの該二糖を０．３ｍｌの水で希釈して投与したときの実験動物の年令にかかわりなく、経口投与された４−ガラクトシル−キシロースの量の増加に伴って増加し、さらに、（iii）血液試料を室温で２０分間静置させた後、遠心分離処理に付して得られた血清中のキシロースの含有量は血漿中での評価値と同様であった。この実験は、４−ガラクトシル−キシロースの経口投与後の血漿中または血清中に含まれるキシロースの量を評価することも腸内ラクターゼ活性の生体内評価にとって有用であることを示す。この方法は、診断目的に該活性を非侵襲的に評価するたために利用してもよい。
【００４６】
本発明の一連の実施態様は複数の成人ボランティアの協力に基づいて実施した。全てのボランティアは実施される臨床実験の内容について十分な説明を受けた後、該臨床実験に自主的に参加することを証明する同意書を提出した。これらの一連の実施態様を以下に説明する。
【００４７】
実施例３
４−ガラクトシル−キシロースはヒトの腸内ラクターゼの生体内基質である。このことは、先ず第一に、４−ガラクトシル−キシロース１ｇを水５０ｍｌに溶解させた溶液を、８時間絶食した成人男性ボランティアであって乳または乳製品に対して正常な耐性（即ち、ラクトース耐性）を有するボランティア（被験者１）に経口投与することによって示された。４−ガラクトシル−キシロースを投与する直前に、基礎尿試料をこの被験者から採取し、該化合物の投与後は、８時間にわたって１時間毎に採尿した。各々の尿試料は各時間中に排出された全尿を示す。全ての尿試料中のキシロースは、フルオログルシノールとの反応に基づく比色分析法によって滴定した（この場合、基礎尿をターゲットとして使用した）。４−ガラクトシル−キシロースの摂取によって、この被験者に胃腸の不快感又は障害はもたらされなかった。
【００４８】
この実験の結果を図３に示す。図３において、各試料中で評価されたキシロースの量は「○」で表示し、また、全実験時間にわたって蓄積されたキシロースの量は「●」で示す。後者は、各試料中で評価されたキシロースの量に全ての先行試料中で評価された量を加えることによって計算した。図３から明らかなように、（ｉ）４−ガラクトシル−キシロースの経口投与後のこの被験者の尿中にはキシロースが排出され、また、（ii）尿中へのキシロースの排出量は該化合物の投与から２時間後に最大値に達し、その後はキシロースは尿中へ漸進的に蓄積した。この実験は、４−ガラクトシル−キシロースがヒトの腸内ラクターゼ活性の生体内基質であること、および４−ガラクトシル−キシロースの経口投与による尿中のキシロースの評価はヒトの腸内ラクターゼ活性の生体内評価のために有用であることを示す。この方法は、診断用に該活性を非侵襲的に評価するために有用である。
【００４９】
実施例４および５
ラクトース耐性を有する成人ボランティアにおける尿中へのキシロースの排出量は４−ガラクトシル−キシロースの摂取量によって変化する。このことは、０．２５ｇ、０．５ｇおよび３ｇの４−ガラクトシル−キシロースをラクトース耐性を有する成人男性ボランティア（被験者１；実施例４）およびラクトース耐性を有する成人女性ボランティア（被験者２；実施例５）に実施例１に記載の場合と同じ条件下で投与し、該二糖を投与後の両方のボランティアの尿中へ排出されるキシロースをフルオログルシノールを用いる比色分析法によって滴定することによって示された。同じ被験者による４−ガラクトシル−キシロースの投与間隔として約１週間の空白時間を設定した。４−ガラクトシル−キシロースの上記投与量によって、両方の被験者に胃腸の不快感または障害はもたらされなかった。
【００５０】
これらの実験の結果を図４に示す。図４Ａおよび図４Ｂはそれぞれは被験者１（実施例４）および被験者２（実施例５）に関するデータを示す。この場合、各投与量に対する４−ガラクトシル−キシロース摂取後の尿中に蓄積されるキシロースの量を示す。図４Ａは、該二糖１ｇを同一の被験者に投与したときの図３に示したデータも含んでいるので、その他の投与量の場合と比較することができる。これらの図４Ａおよび４Ｂから明らかなように、（ｉ）４−ガラクトシル−キシロースの摂取後に経時的に尿中へ排出されるキシロースの量は、被験者１（図４Ａ）および被験者２（図４Ｂ）に対する該二糖の投与量の増加に伴って増加し、また、（ii）両方の被験者のいずれの場合にも、４−ガラクトシル−キシロースを０．２５ｇ投与することによって尿中のキシロースの存在を容易に検出することが可能である。これらの実験は、（ｉ）４−ガラクトシル−キシロースを０．２５ｇ、０．５ｇ、１ｇおよび３ｇ経口投与した場合、ラクトース耐性を有する成人ボランティアの尿中へのキシロースの排出量は該投与量の増加に伴って増加すること（この場合、この実験の実施に伴って被験者に胃腸の不快感や障害がもたらされることはなかった）、および（ii）該二糖の投与後、非常に高い信頼度で尿中のキシロースを評価するためには該二糖を０．２５ｇ投与するだけで十分であることを示す。
【００５１】
実施例６〜１１
ラクトース耐性を有する成人ボランティアの尿中へのキシロースの排出量は、同性被験者へ同量の４−ガラクトシル−キシロースを投与した場合と同じ範囲内にある。このことは、４−ガラクトシル−キシロース０．２５ｇをラクトース耐性を有する８人の成人ボランティアに実施例１に記載の場合と同じ条件下において投与し、次いで、該二糖を摂取後の被験者の尿中へ排出されるキシロースをフルオログルシノールを用いる比色分析法によって滴定することによって示された。８人のボランティアの内訳は、３人の男性［即ち、被験者１（実施例４）、被験者７（実施例６）および被験者１１（実施例７）］および５人の女性［即ち、被験者２（実施例５）、被験者３（実施例８）、被験者６（実施例９）、被験者８（実施例１０）および被験者９（実施例１１）］である。上記投与量の４−ガラクトシル−キシロースの摂取によっては、いずれの被験者にも胃腸の不快感や障害はみられなかった。
【００５２】
これらの実験の結果を、分図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを含む図５に示す。図５において、各試料中で評価されたキシロースの量は白色の符号で示し、尿中に経時的に蓄積されたキシロースの量は黒色の符号で示す。後者は、各試料中で評価されたキシロースの量に全ての先行試料で評価された量を加えて計算した値を示す。分図Ａは、男性被験者１、３および６の各人において得られた各々の値を示す。分図Ｂは女性被験者２、３、６、８および９の各人において得られた各々の値を示す。分図ＣおよびＤは、実験をおこなった男性被験者および女性被験者に対して計算した平均値±標準誤差をそれぞれ示す。
【００５３】
図５Ａは、被験者１に４−ガラクトシル−キシロース０．２５ｇを投与した後で得られた図４Ａに示したデータを含む。図５Ｂは、被験者２に４−ガラクトシル−キシロース０．２５ｇを投与した後で得られた図４Ｂに示したデータを含む。従って、これらの図においては、同一条件下で実験をおこなった他の被験者との比較が可能である。図５から明らかなように、（ｉ）尿中へ排出されるキシロースの蓄積量は、標準誤差（男性被験者の平均値に関しては３７％であり、女性被験者の場合は８％）を越えない同一の範囲にあり、また、（ii）キシロースの最大排出量は、該二糖を投与してから２〜３時間後にみられた。これらの実験は、本発明方法を用いて得られる結果がいずれの実験群においても高い信頼性を伴って再現されることを示す。
【００５４】
実施例１２および１３
ラクトース不耐性のボランティアに４−ガラクトシル−キシロースを投与した後、尿中へ排出されるキシロースを評価することによって腸内ラクターゼ欠乏症を検知することが可能である。このことは、ラクトース不耐性の症状を示す２人のボランティアに４−ガラクトシル−キシロースを０．２５ｇ投与した後、両方のボランティアの尿中へ経時的に排出されるキシロースをフルオログルシノールを用いる比色分析法により滴定することによって示された。これらのボランティアの一方は、８才のときから乳摂取に対して強い不耐性を示す６４才の男性であり、腸生検とラクトース過投与試験によって低ラクターゼ症と診断された被験者である。従って、この被験者は強度の腸内ラクターゼ欠乏症の患者である［被験者１２（実施例１２）］。他方の被験者は、出生以来ラクトース不耐性の症状で患っていると告白した３０才の女性であり、彼女は一定の時期までは母親からの授乳を停止して、ラクトース不含乳を摂取しなければならなかった。彼女は先天性の腸内ラクターゼ欠乏症であったと考えられる。いずれの被験者においても、実験に使用した量の４−ガラクトシル−キシロースの投与によって胃腸の不快感や障害がもたらされることはなかった。
【００５５】
これらの実験において得られた結果を、分図Ａ［被験者１２（実施例１２）］および分図Ｂ［被験者５（実施例１３）］を含む図６に示す。図６においては、両方の被験者の尿中へ経時的に蓄積されたキシロースの量を黒色の符号で示す。いずれの場合にも、比較を容易にするために、ラクトース耐性のある対応する性のボランティアの平均値を示す図５Ｃと図５Ｄの曲線を含む。図６から明らかなように、（ｉ）被験者１２の尿中へのキシロースの排出量（該二糖の投与から８時間後の尿中へのキシロースの全排出量：１．３３ｍｇ）は、ラクトース耐性を有する被験者の尿中への平均排出量（同じ時間の経過後の男性被験者の平均値：３５．７±２．０ｍｇ）に比べて非常に少なく（低減率：９６％）［このことは、被験者１２が強い腸内ラクターゼ欠乏症である診断された結果と一致する。］、また、（ii）被験者５の尿中へのキシロースの排出量は、ラクトース耐性の被験者におけるキシロースの排出量の平均値よりも非常に低い。
【００５６】
この被験者は、該二糖の摂取から８時間後の尿中へ全体で４．０８ｍｇのキシロースを排出した。これに対して、ラクトース耐性の女性被験者における同じ時間の経過後の平均値は２３．５±２．０ｍｇであった。低減率は８３％であり、この結果は、出生からラクトース不耐性であるこの被験者が先天的な腸内ラクターゼ欠乏症で患っていることを示すものである。これらの実験は、本発明方法によれば、ヒトにおける当該酵素の欠乏症の非侵襲的診断が可能であることを示す。該欠乏症で患う被験者において明白な不快感はもたらされず、また、成人の被験者における当該酵素の強い欠乏症を高い信頼度で検知するためには０．２５ｇの４−ガラクトシル−キシロースを投与するだけで十分である。
【００５７】
実施例１４
ラクトース不耐性の被験者に４−ガラクトシル−キシロースを投与した後、尿中のキシロースを評価することによって、腸内ラクターゼ欠乏症で患うラクトース不耐性の患者および乳成分に対してアレルギー症状のあるために乳摂取に対して不耐性であるが該酵素の欠乏症で患っていない患者を区別することが可能となる。このことは、１２才の頃からラクトース不耐性の症状のある２５才の女性被験者（被験者１３）であって、乳摂取後の急性皮膚アレルギーで患う被験者に４−ガラクトシル−キシロースを０．２５ｇ投与した後、尿中へ経時的に排出されるキシロースをフルオログルシノールを用いる比色分析法で滴定することによって示された。この被験者においては、上記の投与量の４−ガラクトシル−キシロースの摂取によって胃腸の不快感や障害はみられなかった。
【００５８】
これらの実験の結果を図６の分図Ｃに示す。この図においては、この被験者の尿中へ経時的に蓄積されるキシロースの量は黒色の符号で示す。比較を容易にするために、ラクトース耐性のある対応する性の被験者における平均値を示す図５Ｄの各曲線も図６に示す。図６Ｃから明らかなように、この被験者は実質上は正常なキシロースの排出パターンを示し、該二糖の投与から８時間後のキシロースの尿中への全排出量は、ラクトース耐性のある女性被験者における平均値と同じ値であった。従って、このことは当該酵素の欠乏症の問題ではなく、被験者自身が述べている臨床的説明の見地からは、一部の乳成分に対するアレルギーの問題である。この実験は、本発明方法によれば、腸内ラクターゼ欠乏症で患うラクトース不耐性の患者および乳成分に対してアレルギー症状を示すために乳摂取に対して不耐性であるが当該酵素の実質的な欠乏症では患っていない患者の区別が可能となるということを示す。
【００５９】
実施例１５および１６
ラクトース耐性のある被験者に４−ガラクトシル−キシロースを０．２５ｇ投与した後の尿中へのキシロースの排出およびラクトース不耐性の低ラクターゼ症被験者における該キシロースの排出量の低減は、フルオログルシノールを用いる比色反応とは異なるキシロース評価法によっても観察された。このことは、ラクトース耐性の被験者［実施例３においても登場した被験者１（実施例１５）］および強度のラクターゼ欠乏症で患うラクトース不耐性の被験者［実施例１２においても登場した被験者１２（実施例１６）］に４−ガラクトシル−キシロースを０．２５ｇ投与し、次いで該二糖の投与から３時間採取した全尿中のキシロースをガスクロマトグラフィーによって評価することによって示された。クロマトグラムとしては、フレームイオン化検出器とガラス製スピラルカラム（長さ１２ｍ、内径０．２ｍｍ、厚さ０．３μｍ）を具備したものを使用した。
【００６０】
尿中のキシロースの検出は、該化合物のトリメチルシリル誘導体の形態でおこなった。この目的のためには、尿試料を凍結乾燥させた後、内部基準としてベンジル−β−Ｄ−キシロピラノシド（１ｍＭ）を含有するピリジン（２０μｌ）に溶解させた。この溶液に、Ｎ−トリメチルシリルイミダゾール（２０μｌ）をシリル化剤として添加し、得られた混合物を超音波で１分間処理し、次いで６０℃で３０分間加熱した。得られた試料１〜２μｌをガスクロマトグラフ中へ注入した。注入器と検出器の温度は２５０℃とし、カラム内の温度勾配は次の通りである：１８０℃で２分間維持した後、５℃／分の昇温速度で２５０℃まで加熱し、この温度を１５分間維持した。各々の試料中のキシロースの濃度は、そのクロマトグラムに対応するピークの面積から計算した。
【００６１】
これらの実験の結果を図７に示す。図７においては、基礎尿試料並びにラクトース耐性の被験者およびラクトース不耐性の被験者から３時間で採取した尿試料に対応するクロマトグラムを示す。各場合におけるキシロースと内部基準に帰属されるピークの保持時間は分単位で示す。図７は、低ラクターゼ症の被験者１２において、４−ガラクトシル−キシロースの投与から３時間の間に尿中へ排出されたキシロースの量が、クロマトグラム中のキシロースに対応するピークの面積から判断されるように、ラクトース耐性の被験者１のの場合の値よりも著しく少ないことを示す。この方法によれば、ラクトース不耐性の低ラクターゼ症被験者１２において３時間後に排出された尿中のキシロースの全量（２．１ｍｇ）を決定することができ、この値は、被験者１において３時間後に排出された尿中のキシロースの全量（２５．２ｍｇ）に比べて９２％低減しており、このことは、低ラクターゼ症の被験者が強い腸内ラクターゼ欠乏症で患っているということに一致する。また、この実験結果は、図６Ａから明らかなように、同一の被験者において同一の時間の経過後の試料について比色法による滴定によって得られたキシロースの低減率と類似する。この実験は、本発明方法によれば、排出されるキシロースの評価方法にかかわりなく、ヒトの腸内ラクターゼ欠乏症の非侵襲的診断が可能になるということを示す。
【００６２】
実施例１７〜１９
４−ガラクトシル−キシロースの経口投与後の血中に存在するキシロースの評価によれば、腸内ラクターゼ欠乏症の非侵襲的診断が可能となる。このことは、ラクトース耐性の２人の被験者［即ち、被験者１（実施例１７）および被験者２（実施例１８）；これらの被験者は実施例３〜６においても登場した。］およびラクターゼ不耐性の低ラクターゼ症の被験者１２（実施例１９）［この被験者は実施例１２および１５においても登場した。］に４−ガラクトシル−キシロースを３ｇ投与することによって示された。これらの被験者において、４−ガラクトシル−キシロースの投与前に採取した血液試料の血漿中のキシロースおよび該二糖の投与から約１時間の間隔で６時間にわたって採取した血液試料の血漿中のキシロースは、フルオログルシノールを用いる比色分析法によって滴定した。低ラクターゼ症の被験者の場合には、基礎血液試料および４−ガラクトシル−キシロースの投与から２時間後に別の血液試料を採取した。ラクトース不耐性のこの被験者１２およびラクトース耐性の２人の被験者においては、４−ガラクトシル−キシロースを３ｇ投与することによって胃腸の不快感や障害はみられなかった。
【００６３】
これらの実験の結果を図８に示す。図８から次のことが明らかである：
（ｉ）４−ガラクトシル−キシロースをラクトース耐性の被験者１および２に経口投与した後では、腸内ラクターゼによってこの二糖が加水分解される結果として、血漿中にキシロースが存在する。
（ii）これらの２人の被験者の血漿中のキシロースの含有量は、４−ガラクトシル−キシロースの投与から約２時間後に最大値に達し、その後は、キシロースが尿中へ排出される結果として、６時間後に検出されなくなるまで減少した。
（iii）ラクトース耐性の被験者１２においては、４−ガラクトシル−キシロースの投与から２時間後に採取した血液試料からの血漿中で検出されたキシロースの量は血漿１００μｌあたり０．４８μｇであった。このことは、同じ時間の経過後に被験者１および２から採取したそれぞれの血液試料からの血漿中で検出されたキシロースの量［即ち、血漿１００ｍｌあたり１．７２μｇおよび１．９５μｇ］は、ラクトース不耐性の低ラクターゼ症被験者の場合に比べてそれぞれ７２％および７５％低減していることを示す。
【００６４】
ラクトース不耐性の被験者への４−ガラクトシル−キシロースの投与から２時間後に検出されたキシロースの量（即ち、血漿１００μｌあたり０．４８μｇ）および滴定感度（フルオログルシノールを用いるキシロースの最小検出限界は０．１〜０．０５μである）を考慮するならば、高い信頼度で測定をおこなうために必要な血清または血漿の最小体積は５０μｌであり、この量は血液０．２ｍｌ（２〜３滴）に相当する。これらの実験は、４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後で血液中のキシロースを評価することによって、腸内ラクターゼ活性の生体内評価が可能となること、およびこの方法が被験者における該酵素の欠乏症を非侵襲的に診断するための有効な試験法であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】乳離れしていない生長期のラットに４−ガラクトシル−キシロース（４ｍｇ）を経口投与した後の尿中へのキシロースの排出量と腸内ラクターゼ活性を示すグラフである。
【図２】乳離れしていない生長期のラットに４−ガラクトシル−キシロース（８ｍｇ）を経口投与した後の血漿中のキシロースの濃度と腸内ラクターゼ活性を示すグラフである。
【図３】乳摂取に対して耐性のある成人ボランティアに４−ガラクトシル−キシロース（１ｇ）を経口投与した後の尿中へのキシロースの排出量を示すグラフである。
【図４】乳摂取に対して耐性のある２人の成人ボランティアに種々の量の４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の尿中へのキシロースの経時的排出量を示すグラフである。
【図５】乳摂取に対して耐性のある３人の男性ボランティアおよび５人の女性ボランティアに２５０ｍｇの４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の尿中へのキシロースの経時的排出量を示すグラフである。
【図６】乳摂取に対して不耐性の３人のボランティアに０．２５ｇの４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の尿中へのキシロースの経時的排出量を示すグラフである。
【図７】乳摂取に対して耐性の被験者１および乳摂取に対して不耐性の被験者１２に０．２８ｇの４−ガラクトシル−キシロースを投与した後の尿中へのキシロースのガスクロマトグラフィーによる評価を示す。
【図８】乳摂取に対して正常な耐性の成人ボランティアおよび低ラクターゼ症の成人ボランティアに３ｇの４−ガラクトシル−キシロースを経口投与した後の血漿中のキシロースの濃度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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