(57)【要約】【課題】【解決手段】アレー中の大環状（ＬＣ）センス分子が記載される。ＬＣセンス分子アレーは異なった細胞間の発現プロフィールにおける差異を検出するために、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションと組み合わされる。ＬＣセンス分子は組換えファージミドとともに非縮退クローンから精製され、シラン化スライドガラス上に整列させた。Ｃｙ３またはＣｙ５標識ｃＤＮＡ調製物とＬＣセンスアレーを６０℃でハイブリダイズすることにより、癌性肝臓組織中の上流制御された２９個の遺伝子および下流制御された６個の遺伝子が検出された。
2006503558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々のＬＣセンス分子を含むライブラリー。
【請求項２】
前記ＬＣセンス分子はベクター配列およびプローブ配列を含み、プローブ配列はセンス方向である、請求項１記載のライブラリー。
【請求項３】
前記ベクターは単鎖生成ファージミドである、請求項２記載のライブラリー。
【請求項４】
前記ＬＣセンス分子は長さ約１，０００〜約２０，０００のヌクレオチドである、請求項１記載のライブラリー。
【請求項５】
個々のＬＣセンス分子は互いに分離されている、請求項４記載のライブラリー。
【請求項６】
前記ベクターはｐＳＰＯＲＴ１、ｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔIIＳＫ（＋／−）またはＫＳ（＋／−）、ｐＧＥＭ−ｆ、Ｍ１３ｍｐ、ｐＣＲ２．１、ｐＧＬ２またはｐβｇａｌである、請求項２記載のライブラリー。
【請求項７】
前記ベクターはＭ１３バクテリオファージ、ｆ１バクテリオファージ、またはｆｄバクテリオファージである、請求項２記載のライブラリー。
【請求項８】
支持体の表面に安定して結合された個々のＬＣセンス分子を複数含むアレー。
【請求項９】
前記支持体はアミノシラン、ポリ−Ｌ−リジンまたはアルデヒドの被覆層を含む、請求項８記載のアレー。
【請求項１０】
前記支持体はスライドガラス、セラミック、無機−有機複合体、柔軟なプラスチックフィルム、シリコーン、金属または膜である、請求項８記載のアレー。
【請求項１１】
（ｉ）単鎖形状のベクターを生成するベクター中に核酸断片を挿入し；
（ii）細菌性形質転換体を作るコンピテント細菌細胞中に挿入物を含むベクターを導入して、細菌性形質転換体を調製し；
（iii）ＬＣセンス分子を産生するヘルパーファージに形質転換体を感染させ；
（iv）形質転換体の培養上清からＬＣセンス分子を単離し；そして
（v）支持体表面上にＬＣセンス分子を整列する、
ことを含む請求項８記載のアレーを作成する方法。
【請求項１２】
核酸断片はベクター中に一方向に挿入される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）試料中のＤＮＡを標識し；
（ii）標識ＤＮＡを含む試料を請求項８記載のアレーと接触させ；
（iii）試料中の標識ＤＮＡをアレー中のＬＣセンス分子とハイブリダイズさせ；そして
（iv）ＬＣセンス分子へのＤＮＡの結合性を測定し、ここでアレー上のシグナルの存在は整列されたＬＣセンス分子に対するＤＮＡの存在を示す、
ことを含むアレー中の個々のＬＣセンス分子の集団に関する試料中のＤＮＡの存在を検出する方法。
【請求項１４】
標識はストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ共役体、化学蛍光性または化学発光性である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
標識はＣｙ３またはＣｙ５である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）第１試料から得たＤＮＡの第１集団を標識し；
（ii）第２試料から得たＤＮＡの第２集団を異なった標識で標識し；
（iii）標識ＤＮＡの第１集団を含む試料を請求項８記載のアレーと接触させ；
（iv）試料中の標識ＤＮＡの第１集団をアレー中のＬＣセンス分子とハイブリダイズさせ；
（v）標識ＤＮＡの第２集団を含む試料を請求項８記載のアレーと接触させ；
（vi）試料中の標識ＤＮＡの第２集団をアレー中のＬＣセンス分子とハイブリダイズさせ；そして
（vii）ＬＣセンス分子への標識ＤＮＡの結合性を測定し、ここでアレー上のシグナルの存在はＤＮＡの存在を示す、
ことを含む２つまたはそれ以上の核酸分子中のＤＮＡの存在を検出する方法。
【請求項１７】
請求項８記載のアレーおよび試料中のＤＮＡを検出するためのアレーを使用する指示書を含む遺伝子発現分析キット。
【請求項１８】
（ｉ）試験核酸を生成するためのプライマーを含む容器；
（ii）ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰを含む容器；
（iii）蛍光染料の化学的活性な誘導体などのポストＤＮＡ合成標識試薬を含む容器；
（iv）ＤＮＡ合成酵素を含む容器；
（v）緩衝媒体を含む容器；
（vi）シグナル生成試薬および検出試薬を含む容器；
（vii）ＤＮＡを検出するために使用する指示書
を含む、請求項１７記載の遺伝子発現分析キット。
【請求項１９】
チトクロームＰ４５０、サブファミリーIIＥ（エタノール誘導性）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０２８４３）；
転写伸長因子Ａ（ＳII）１；
ＫＩＡＡ０２０６に弱く類似するＥＳＴ[H. sapiens]（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ１９３０７５）；
トロポミオシンに対するヒト骨格筋の１．３ｋｂｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ７９７０３７）；
ＫＩＡＡ０７０１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ７９７０３７）；
転写伸長因子Ｓ−II、ｈＳ−II−Ｔ１のｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３１９５）；
難聴性常染色体優性５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０７３３０８）；
ＫＩＡＡ１０３７タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ３８３６２８）；
ＫＩＡＡ０３７５遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ００２３７３）；
プレフォルジン５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ２８７３９７）；
ＫＩＡＡ０７１０遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１４６１０）；
対様ホメオドメイン転写因子１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０３７０）；
網膜外節膜タンパク質１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０７８９４）；
ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ３９４１９）；
ＭＹＣ関連亜鉛フィンガータンパク質（プリン結合性転写因子）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ９４０４６）；
ユビキノン共役酵素Ｅ２Ｌ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０００５１９）；
染色体１の新規ヒトゲノムマッピング（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０４０４３８）；
ホモサピエンスクローン２４４２１ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０７０６４１）；
ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６６Ｊ２１４６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５００８１）；
染色体凝縮１類似体（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１２６８）；
ＫＩＡＡ０９０２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２０７０９）；
チロシンキナーゼ関連タンパク質９類似体（Ａ６関連タンパク質）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ１８８６６０）；
ＯＲＦ  ＹＯＲ１５０ｗに弱く類似するＥＳＴ（S. serevisie）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ１２９４３３）；
転写伸長因子Ｂ（ＳIII）、ポリペプチド２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷ３２７２８５）および
Ｓｐ１転写活性において必要な補助因子、サブユニット９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ６６５９９８）、
からなる群から選択される遺伝子の正常肝臓細胞と比較して、上流制御を検出することを含む癌性肝臓細胞を測定する方法。
【請求項２０】
膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５３２９）；
カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼに類似する、ＰＡＣ２７２Ｌ１６、染色体１から単離されたヒト遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０２３７５４）；
デスドメインとともにアダプターを含むＣＡＳＰ２およびＲＩＰＫ１ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ８１１１３０）；
アリアドネホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０４０７０８）；および
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）フラボプロテイン１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷ２５０７３４）、
からなる群から選択された遺伝子の正常肝臓細胞と比較した下流制御を検出することを含む癌性肝臓細胞を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の属する技術分野：
【０００２】
本発明は一般にアレーシステムのプローブとして大環状（ＬＣ）センス分子を使用することに関する。また、本発明はアレーシステムのプローブとしてＬＣセンス分子ライブラリーを使用することに関する。特に、本発明は単鎖ＬＣセンス分子を結合したアレーを使用するＤＮＡチップ技術に関する。また、本発明はこのようなアレーを製造する方法、このようなアレーを使用する分析、このようなアレーを含むキット、およびこれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．一般的な背景と先行技術：
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレー技術における近年の開発は、多数の細胞転写物を平行して(parallel fashion)モニターすることを可能とする（シェーナ(Schena)ら、Science, 270, 467-470  (1995)、デリシ（DeRisi）ら、Science, 278, 680-686 (1997)、アイヤル(Iyer)ら、Science, 283、83-87(1999)）。細胞の機能における生理学的および病理学的変化の両者は遺伝子発現パターンの変化に関連する。例えば、悪性腫瘍の発生は通常、癌遺伝子の過剰発現および腫瘍抑制遺伝子の発現低下に関連する。差別的発現遺伝子の同定は疾患プロセスに関与する遺伝子を認識する手段として利用されている。
【０００５】
差別的発現遺伝子を検出する方法としては、ノザンブロット分析（アルワイン(Alwine)ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5350-5354 (1977)、Ｓ１ヌクレーアゼ保護（バーク(Berk)ら、Cell, 12, 721-732 (1977)）、ディファレンシャルディスプレー（リャング(Liang)ら、Science, 257, 967-971 (1992)）、ｃＤＮＡライブラリーの配列決定（アダムス（Adams)ら、Science, 252, 1651-1656(1991)、オクボ(Okubo)ら、Nature Genet, 2, 173-179 (1992)）、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）（ベルキュレスキュ(Velculescu)ら、Science, 270, 484-487 (1995)）、サブトラクティブハイブリダイゼーション（ヘドリック(Hedrick)ら、Nature, 308, 149-153 (1984)）および表現差異分析（ＲＤＡ）（フバンク(Hubank)ら、Nucleic Acids Res., 22, 5640-5648 (1994)、リシツイン(Lisitsyn)ら、Science, 259, 946-951 (1993)）など種々の方法が利用可能である。しかしながら、これらの技術は１つの実験から得られたデータの量により制限され、達成するには時間がかかる。ｃＤＮＡアレーハイブリダイゼーションを使用すると数千または数万の遺伝子の発現が同時に研究され得る。これはこれまでナイロン膜上にＤＮＡをドットし、放射性標識ｃＤＮＡとハイブリダイズして行われている（オージェンリヒト(Augenlicht)ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 3286-3289（1991））。近年、ガラススライド上でｃＤＮＡマイクロアレー、またはいわゆる遺伝子チップ上でオリゴヌクレオチドを蛍光標識プローブとともに使用するプロトコールが導入されている（シェーナ(Schena)ら、Science, 270, 467-470 (1995)、ロックハート(Lockhart)ら、Nature, Biotechnol, 14, 1675-1680 (1996)）。
【０００６】
種々のアレー技術が開発されているにもかかわらず、特別な用途の要求を満足する新規なアレー装置を確認することが引き続き必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記課題を克服する。本発明はＬＣセンス分子の調製方法、ＬＣセンス分子のライブラリーおよびＬＣセンスアレーの製造方法を提供する。これらはｃＤＮＡハイブリダイゼーションと組み合わせて、異なった細胞間の発現プロフィールにおける差異の検出において、その有用性を評価する。出願人はプローブ試薬としてＬＣセンス分子を使用するアレーを提供する。Ｍ１３バクテリオファージなどのある種のバクテリオファージは、１本鎖環状ゲノムを有し、従来からＤＮＡ配列決定分析ならびに突然変異研究において使用されている。例えば、組換えバクテリオファージの構築に使用されるプラスミドであるＭ１３ファージミドは、標的特異的センス配列挿入物を含む多量の環状１本鎖ゲノムＤＮＡを産生するために操作され得る。センスＤＮＡ挿入物を含むＬＣセンス分子を産生するこの方法は、その共有結合による閉鎖構造に関連する酵素的分解に対するより大きな抵抗性、相補的核酸とのより高い結合親和性、高い配列フィデリティ、骨の折れる標的部位検索の除去、変性不要および低価格での簡単な大量生産など多くの利点をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は個々のＬＣセンス分子を含むライブラリーに関する。ＬＣセンス分子はベクター配列およびプローブ配列を含んでいてもよい。ここで、プローブ配列はセンス方向に存在する。ベクターは１本鎖生成ファージミドであってもよい。さらに、ＬＣセンス分子は長さ約１，０００〜約２０，０００ヌクレオチドを有していてもよい。個々のＬＣセンス分子は互いに分離されてもまたは区画されていてもよい。特に、ベクターはｐＳＰＯＲＴ１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋／−）またはＫＳ（＋／−）、ｐＧＥＭ−ｆ、Ｍ１３ｍｐ、ｐＣＲ２．１、ｐＧＬ２またはｐβｇａｌであってもよい。また、特にベクターはＭ１３バクテリオファージ、ｆ１バクテリオファージ、またはｆｄバクテリオファージであってもよい。
【０００９】
他の態様では、本発明はまた、支持体の表面に安定に結合された複数の個々のＬＣセンス分子を含むアレーに関する。支持体はアミノシラン、ポリ−Ｌ−リジンまたはアルデヒドの被覆層を含んでもよい。さらに、支持体はスライドガラス、セラミック、無機−有機複合体、柔軟なプラスチックフィルム、シリコーン、金属または膜であってもよい。
【００１０】
本発明のなおも他の態様では、本発明は下記工程を含む上記アレーを作成する方法に関する。
（i）１本鎖形態のベクターを生成するベクター中に核酸断片を挿入し；
（ii）細菌性形質転換体を作るコンピテント細菌細胞中に挿入物を含むベクターを導入して、細菌性形質転換体を調製し；
(iii)ＬＣセンス分子を製造するヘルパーファージに形質転換体を感染させ；
(iv)形質転換体の培養上清からＬＣセンス分子を単離し；そして
（v）支持体の表面上にＬＣセンス分子を整列させる。
【００１１】
上記した方法では、核酸断片はアレーまたはライブラリーの全員において、ベクター中に一方向に挿入してもよい。
【００１２】
他の実施態様では、本発明は下記工程を含むアレー中の個々のＬＣセンス分子集団において試料中のＤＮＡの存在を検出する方法に関する。
（i）試料中のＤＮＡを標識し；
（ii）上記したアレーに標識ＤＮＡを含む試料を接触させ；
（iii）試料中の標識ＤＮＡをアレー中のＬＣセンス分子とハイブリダイズさせ；そして
（iv）ＬＣセンス分子へのＤＮＡの結合を測定する；
ここで、アレー上のシグナルの存在は整列したＬＣセンス分子に対するＤＮＡの存在を示す。
【００１３】
上記方法では、標識はストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ共役体、化学蛍光性または化学発光性標識であってもよい。特に標識はＣｙ３またはＣｙ５であってもよい。
【００１４】
なおも別な実施態様では、本発明は以下の工程を含む２つまたはそれ以上の核酸分子試料中のＤＮＡの存在を検出する方法に関する。
第１試料から得たＤＮＡの第１集団を標識し；
第２試料から得たＤＮＡの第２集団を異なった標識で標識し；
標識ＤＮＡの第１集団を含む試料を上記したアレーと接触させ；
試料中の標識ＤＮＡの第１集団をアレー中のＬＣセンス分子とハイブリダイズさせ；
標識ＤＮＡの第２集団を含む試料を上記アレーと接触させ；
試料中の標識ＤＮＡの第２集団をアレー中のＬＣセンス分子とハイブリダイズさせ；そして、
ＬＣセンス分子への標識ＤＮＡの結合性を測定し、ここで、アレー上のシグナルの存在がＤＮＡの存在を示す。
【００１５】
標識ＤＮＡの少なくとも２つの集団のアレーへの接触は、同じアレーへ同時に行ってよく、または集団は同じアレーへ連続して接触させてもよく、あるいは接触は異なったアレー上で行ってもよく、そしてその結果を比較する。
【００１６】
なおも別な本発明の実施態様では、本発明は上記アレーおよび試料中のＤＮＡを検出するためにアレーを使用する際の指示書を含む遺伝子発現分析キットに関する。
【００１７】
上記遺伝子発現分析キットは、さらに
（i）試験核酸を生成するためのプライマーを含む容器；
（ii）ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰを含む容器；
（iii）蛍光染料の化学的活性な誘導体などのポストＤＮＡ合成標識試薬を含む容器；
（iv）ＤＮＡ合成酵素を含む容器；
（v）緩衝媒体を含む容器；
（vi）シグナル発生および検出試薬を含む容器；および
（vii）ＤＮＡ検出に使用する指示書
を含んでいてもよい。
【００１８】
本発明はさらに、
チトクロームＰ４５０、サブファミリーIIＥ（エタノール誘導性）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０２８４３）；
転写伸長因子Ａ（ＳII）１；
ＫＩＡＡ０２０６と弱く類似するＥＳＴ(H. sapiens)（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ１９３０７５）；
トロポミオシンに対するヒト骨格筋の１．３ｋｂ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ７９７０３７）；
ＫＩＡＡ０７０１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ７９７０３７）；
転写伸長因子Ｓ−II、ｈＳ−II−Ｔ１に対するｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３１９５）；
難聴性常染色体優性５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０７３３０８）；
ＫＩＡＡ１０３７タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ３８３６２８）；
ＫＩＡＡ０３７５遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ００２３７３）；
プレフォルジン５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ２８７３９７）；
ＫＩＡＡ０７１０遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１４６１０）；
対様ホメオドメイン転写因子１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０３７０）；
網膜外節膜タンパク質１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０７８９４）；
ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ３９４１９）；
ＭＹＣ関連亜鉛フィンガータンパク質（プリン結合性転写因子）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ９４０４６）；
ユビキノン共役酵素Ｅ２Ｌ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０００５１９）；
染色体１の新規ヒトゲノムマッピング（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０４０４３８）；
ホモサピエンスクローン２４４２１ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０７０６４１）；
ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６６Ｊ２１４６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５００８１）；
染色体凝縮１類似体（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１２６８）；
ＫＩＡＡ０９０２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２０７０９）；
チロシンキナーゼ関連タンパク質９類似体（Ａ６関連タンパク質）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ１８８６６０）；
ＯＲＦ  ＹＯＲ１５０ｗに弱く類似するＥＳＴ（S. cerevisiae）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ１２９４３３）；
転写伸長因子Ｂ（ＳIII）、ポリペプチド２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷ３２７２８５）および
Ｓｐ１転写活性において必要な補助因子、サブユニット９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ６６５９９８）、
からなる群から選択される遺伝子の正常肝臓細胞と比較して、上流制御を検出することを含む癌性肝臓細胞を測定する方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、
膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５３２９）；
カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼに類似する、ＰＡＣ２７２Ｌ１６、染色体１から単離されたヒト遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０２３７５４）；
デスドメインとともにアダプターを含むＣＡＳＰ２およびＲＩＰＫ１ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ８１１１３０）；
アリアドネホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０４０７０８）；および
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）フラボプロテイン１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷ２５０７３４）、
からなる群から選択された遺伝子の正常肝臓細胞と比較して、下流制御を検出することを含む癌性肝臓細胞を測定する方法に関する。
【００２０】
本発明のこれらおよび他の目的は、本発明の下記説明やここに添付される参照図面および特許請求の範囲からより十分に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は以下に記載される詳細な説明、および単に説明の目的にて示される添付図面からより十分に理解されるであろう。なお、これらは本発明を限定するものではない。
【００２２】
本明細書中、「ａ」および「ａｎ」は単一および複数の主題の双方を呼ぶために使用される。
【００２３】
本発明は標的特異的センス領域を含む大環状ファージゲノム分子が相補的標的ｃＤＮＡのための効果的なプローブとして、特にアレー配列で有用であるとの発見に基づく。好ましくは、アレーはマイクロアレーシステムである。好ましくは、マイクロアレーシステムはＬＣセンス分子が基板に高密度にスポットされる。本発明のシステムは種々の細胞生理学的プロセスに関与する遺伝子を測定するために、大量アレープロトコールで高処理能力にて使用され得る。
【００２４】
ここで使用されるように、「アレー」または「固体支持体上のアレー領域」とは好ましくは個々の領域の一次元または二次元アレーをいい、それぞれは固体支持体の表面上に形成された限定領域を有する。
【００２５】
ここで使用されるように、「アレー化ライブラリー」とは、マイクロタイター（多穴）皿またはプレートの二次元アレーに載置された個々の単鎖ＬＣセンス一次組換えクローン（ファージ、ファージミド、または他のベクターの単鎖ゲノム中に集結された）をいう。各一次クローンはプレートの同一性およびそのプレート上のクローンの位置（列および行）によって同定され得る。クローンのアレー化ライブラリーは特定遺伝子または関心あるゲノム領域のスクリーニングならびに物理的マッピングを含む多くの用途に使用され得る。
【００２６】
ここで使用されるように、「高いストリンジェンシー条件下にハイブリダイズ可能である」との用語は、高いストリンジェンシー条件下に関心あるＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖をアニールさせることを意味する。同様に、「低いストリンジェンシー条件下にハイブリダイズ可能である」とは、低ストリンジェンシー条件下に関心あるＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖をアニールさせることをいう。アニーリング過程における「高いストリンジェンシー条件」は、例えばミスマッチされた塩基対間の水素結合接触を嫌う高温および／または低塩含量に関する。「低ストリンジェンシー条件」は高ストリンジェンシー条件よりもより低い温度および／またはより高い塩濃度に関する。同じタンパク質をコードするが遺伝子コードの縮退により配列が異なるＤＮＡ鎖間の場合のように、もしも２本鎖の間に実質的であってほとんど完全でない相補性が存在するなら、このような条件は２つのＤＮＡ鎖をアニールさせる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件、例えば約４５℃で６×ＳＳＣ、続いて５０℃で２×ＳＳＣの洗浄は当業者には公知であり、Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.31-6.3.6のCurrent Protocolsに見られ得る。例えば、洗浄工程の塩濃度は５０℃で約２×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから約５０℃で０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンンシーから選択され得る。さらに、洗浄工程の温度は室温、約２２℃での低ストリンジェンシーから約７５℃での高ストリンジェンシー条件へ増加され得る。他のストリンジェンシーパラメーターは、マニアティス(Maniatis) T.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring N.Y., (1982),387-389に記載されている。サンブルック(Sambrook) J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volume 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, N.Y.,8.46-8.47(1989)も参照。
【００２７】
ここで使用されるように、基材に繋がれたセンスプローブライブラリーについて使用される「ｃＤＮＡライブラリー」とは、標的メッセンジャーＲＮＡに特異的なＬＣセンス分子から構成されたライブラリーを言う。
【００２８】
ここで使用されるように、標的ライブラリーについて使用される「標的ｃＤＮＡライブラリー」とは、細胞または生物体に存在し、逆転写酵素でｃＤＮＡ分子へ変換されるｍＲＮＡ分子の全ての集合体を言い、その結果、次いでこのライブラリーは関心ある特異的ｃＤＮＡ（およびすなわちｍＲＮＡ）に対してプローブ化され得る。
【００２９】
ここで使用されるように、「区画」とはＬＣセンス分子ライブラリーの各メンバークローンの物理的描写をいう。物理的描写は多穴プレートなどのウェル形態であってもよい。一般的には９６穴プレートまたは９６深穴プレートが使用される。他の物理的バリアーとしては平坦なシート、ガラスまたは膜上に個々にスポットすることによる空気であってもよい。この点では、マクロアレー法またはマイクロアレー法のいずれかが使用される。区画によってクローンメンバーが互いに分離されることを意味すると理解される。他のバリアーは膜状物質による個々のクローンの被包（カプセル化）などによってもよい。
【００３０】
ここで使用されるように、マイクロアレーを形成するＬＣセンス分子に適用される「個々のＬＣセンス分子」とは、異なったＬＣセンスＤＮＡ配列、および／または同一若しくは個々のＬＣセンス分子の異なった濃度、および／または個々のまたは異なった濃度のＬＣセンス分子の異なった混合物に基づく他のアレーメンバーと区別されるアレーメンバーを意味する。すなわち、「個々のＬＣセンス分子」のアレーとは、そのメンバーとして、（ｉ）各メンバー中に特定量を有していてもよい個々のＬＣセンス分子、（ii）異なった段階的濃度の所与配列を有するＬＣセンス分子、および／または（iii）２つまたはそれ以上の個々のＬＣセンス分子の異なった組成の混合物を含むアレーを意味する。
【００３１】
ここで使用されるように、「繊維状ファージ」は本発明のＬＣセンス分子を産生する媒体である。ファージまたはファージミドを使用してもよい。この実例では、所望配列は媒体中に挿入またはクローン化されて、単鎖がファージまたはファージミドによって生成された場合、ＬＣセンス分子が生成される。ＤＮＡまたはＲＮＡバクテリオファージをこの目的に使用してもよい。特に繊維状バクテリオファージを使用してもよい。Ｍ１３、ｆｄおよびｆ１などの繊維状ファージは、環状ｓｓＤＮＡ分子をもつ繊維状キャプシドを有する。これらのライフサイクルは被包に先たち、ｓｓＤＮＡ分子に変換される細胞内のｄｓＤＮＡ中間複製体に関与する。この変換はｓｓＤＮＡを調製する手段を提供する。バクテリオファージＭ１３がクローニングベクターとしての使用に適している。
【００３２】
ファージミドベクターもまた、繊維状ファージｆ１ Ｏｒｉ領域を有する。その例として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene, USA）、ｐＧＥＭ−ｆ(Promega, USA) 、Ｍ１３ｍｐ、ｐＣＲ２．１、ｐＧＬ２、ｐβｇａｌおよびｐＳＰＯＲＴベクターおよびこれらの誘導体がある。特に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋／−）などのＭ１３バクテリオファージのファージミドベクターを使用してもよい。Ｍ１３バクテリオファージに基づく組換えウイルスベクターを使用する１つの利点は、ベクターが種々の大きさの挿入物を収容することができることにある。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋／−）ファージミドベクターはｆ１（＋／−）オリジンを有するので、標的特異的ＤＮＡ断片を所望方向に挿入することができ、挿入ＤＮＡ断片のセンス方向が生じる。
【００３３】
単鎖環状ゲノムを有し、かつ正二十面体形を有する他の有用なバクテリオファージはＦＸ１７４である。しかしながら、このクローニングベクターは挿入物の大きさにおいて制限を有する。
【００３４】
ここで使用されるように、「大環状センス分子（ＬＣセンス分子またはＬＣセンスＤＮＡ）もまた、単鎖環状ＤＮＡ分子である「ファージゲノムセンス分子」を言い、これは標的ｃＤＮＡの起源にかかわらず、標的ｃＤＮＡ配列に実質的に相補的であり、かつ結合する少なくとも１つのセンス領域を含む。
【００３５】
ＬＣセンス分子は種々の方法で合成してもよい。しかしながら、通常、これはＭ１３およびファージミドを含む繊維状ファージシステムから産生される。大環状核酸分子がファージから生成される場合、これは「ファージゲノムセンス化合物」ともいう。
【００３６】
本発明の１つの態様では、ＬＣセンス分子は約１５〜１００ヌクレオチドの通常のオリゴヌクレオチド配列よりも長い。ＬＣセンス分子はＤＮＡ分子がほとんど外来ベクター配列からなる少なくとも約３，０００ヌクレオチド長である。通常、この範囲は挿入体の大きさおよび外来ベクター配列の大きさによって、約１，０００〜約８，０００ヌクレオチド長であってもよい。長さ約３，０００〜約７，０００のヌクレオチドは本発明において有用であるけれども、好ましい長さは約３，３００〜約６，０００塩基の範囲であってもよい。ＬＣセンス分子の大きさは、ＬＣセンス分子がその相補的ｃＤＮＡに選択的および特異的に結合するかぎり、不当な実験を要することなく、変更および最適化してもよいことが理解される。
【００３７】
また、大環状核酸分子の長さに対する絶対的な上限または下限が存在しないことが理解される。これは特に、ベクターが大環状核酸分子を生成するために使用される場合にそうである。この場合、ベクター配列の大きさと標的遺伝子の少なくとも一部をコードする挿入配列の大きさの組合せは、生成する単鎖核酸の長さを制御するであろう。すなわち、１つの実施態様では核酸分子はベクターが収容する長さと同じであろう。
【００３８】
大環状核酸分子は標的特異的センス配列ならびにファージ配列などの外来性配列の双方を含んでいてもよい。外来性配列は種々の他の遺伝子のセンスまたはアンチセンス体を含んでいてもよい。もし、ベクターが核酸分子を生成するために使用されるなら、外来性配列はベクター配列であってもよい。大環状核酸分子の標的特異的センス領域長は、約１００ヌクレオチド〜約５，０００塩基以上の範囲外であってもよい。通常、その範囲は約２００〜約３，０００であってもよい。特に、その範囲は約４００〜約２，０００であってもよい。１つの実施態様では、標的特異的センス領域は全遺伝子をコードしていてもよい。
【００３９】
他の実施態様では、ＬＣセンス分子はその天然ライフサイクルの一部として、ファージまたはファージミドのゲノムから生成してもよい。
【００４０】
ここで使用されるように、「ライブラリー」とは特別な生物体から得たクローン化ＤＮＡの無秩序な集合体をいう。互いの関係は物理的マッピングで確立され得る。このようなライブラリーは１セットのライブラリー中、個々のクローンを約１０個以上含み、好ましくは５０個以上、好ましくは１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、７０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、３００００、３５０００、４００００、または５０００個以上の個々のＬＣセンス分子を含む。
【００４１】
ここで使用されるように、「マイクロアレー」とは、個々の領域の密度が少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２である領域を有するアレーをいう。マイクロアレーの領域は通常の大きさ、例えば直径約１０〜２５０μｍの範囲を有し、アレー中で他の領域とほぼ同じ距離でもって分離されていてもよい。マイクロアレーはＬＣセンス分子の選択された１セットを含んでいてもよい。それは転写発現または１セットの細胞中の発現遺伝子のプロフィールを試験するために使用され得る。
【００４２】
ここで使用されるように、アレーシステムの文脈中に使用される「プローブ」とは公知配列を有する繋がれた核酸である。特に、プローブはガラススライドなどの基材に繋がれている。
【００４３】
ここで使用されるように、「特異的に結合する」との用語は、２つの分子間、例えばＬＣセンス分子とその相補配列との間の非ランダム結合反応をいう。
【００４４】
ここで使用されるように、「実質的に相補的」とは他の核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の類似性を有する核酸配列を意味する。一般的には、絶対的な相補性は特異的結合が２つの核酸分子間で生じるためには必要ないであろう。安定な二重鎖形成はハイブリダイズするＬＣセンス分子の配列及び長さ並びにＬＣセンス分子と標的配列の間の相補性の程度に依存するから、標的ｃＤＮＡと安定な二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するＬＣセンス分子は、２つの核酸分子間の結合において好適な特異性を有すると考えられる。
【００４５】
ここで使用するように、アレーシステムの文脈中の「標的」または「標的とする」とは、その同一性または量がＬＣセンスプローブを使用して検出されることが求められる遊離核酸転写物またはｃＤＮＡを言い、かつ、特にＬＣセンス分子が作られる個人の遺伝子をいう。ある文脈では、「標的とする」とは外来性発現転写物またはそのｃＤＮＡにＬＣセンス分子を結合すること、または結合させることを意味する。標的核酸配列はいかなる遺伝子からも制限されることなく選択してもよく、特に癌に関連する遺伝子を含む種々の悪性腫瘍に関連する遺伝子、および免疫疾患、感染症疾患、代謝系疾患および遺伝的疾患あるいは異常な遺伝子発現によって生じる他の疾患などの種々の疾患の発症および進行に関連する遺伝子から選択してもよい。
【００４６】
ここで使用されるように、「一方向性」または「ランダム遺伝子一方向性」センスライブラリーは、ライブラリー中の各メンバークローンの挿入遺伝子の配向が一方向であることを示す。「ランダム」との用語は、未証明配列の遺伝子を含むライブラリーを言うことを意味する。
【００４７】
ここで使用されるように、「一方向性サブトラクテッドライブラリー」とはコントロール組織またはセルラインと比べて、関心ある特定組織またはセルライン中で発現または過剰発現された遺伝子が選択的に濃縮されたライブラリーをいう。
【００４８】
ここで使用されるように、「単遺伝子」センスライブラリーとは、センス核酸生成ベクター中に所望により挿入された配列検証核酸断片の集合体をいう。
【００４９】
大環状（ＬＣ）センス分子
【００５０】
本発明はヌクレアーゼに対する大きな安定性および特異的活性を有するＬＣセンス化合物、および単鎖環状ゲノムとともに組換えバクテリオファージを使用することによるＬＣセンス化合物を産生する方法を提供する。本発明はまた、アレーを作成するためのプローブＤＮＡとしてＬＣセンスＤＮＡライブラリーを提供する。多数の遺伝子に特異的であるＬＣセンス分子は組換えバクテリオファージを含む細菌培養物から同時に少量または多量にて産生してもよい。本発明の一例である実施態様では、異なったＬＣセンス試料１，１５２個が培養上清３ｍｌから少量で得られ、シラン化されたガラススライドの表面上にスポットされた。一般的には培養上清１ｍｌから、ＬＣセンスＤＮＡ１〜３μｇが得られた。
【００５１】
本発明の他の例である実施態様では、出願人はＬＣセンスＤＮＡライブラリーを大量で産生するための精製カラム、ディスペンサーおよび真空マニフォールドを主に備えた半自動装置を設計した。この装置および培養上清１００ｍｌを集めるその能力を使用して、〜２００μｇのＬＣセンス分子が得られた。生産スケールは培養のためのジャー発酵槽システムを使用することによってリッター単位まで拡大されるであろう。
【００５２】
さらに、本発明の一実施態様では本発明のファージゲノムセンス方法を使用することによって、遺伝子発現の高処理能力検出のためのアレーシステムの効率はオリゴヌクレオチドプローブまたはＰＣＲ増幅されたより大きな核酸プローブを使用する従来の方法よりも優れている。すなわち、ＬＣセンス分子はその相補ＤＮＡへのハイブリダイゼーションが望まれる設定や装置でプローブとして使用してもよい。
【００５３】
ＤＮＡプローブのアレーを作成するために、現在、種々の方法が入手可能である。ＬＣセンス分子は核酸分子アレー中などで膜に結合されたプローブとして、このようなシステムに使用してもよい。多孔性膜上にＤＮＡが並んだアレーを作成する１つの方法は、「ドットブロット」法である。この方法では、真空マニフォールドが複数、例えば９６個のＤＮＡ水性試料を直径３ｍｍ穴から多孔性膜へ移送する。この手法の一般的な変法は、穴が大きく伸長した卵形を有する「スロットブロット」法である。膜を焼成するか、あるいはＵＶ照射に露呈することによって多孔性膜上にＤＮＡを固定化する。これは１つのアレーを一度に作成するのに役立つ手作業であり、通常、アレー１つに付き９６試料に限られる。
【００５４】
ゲノム断片の並んだアレーを作成するために使用されるより効率的な技術では、多孔性膜などの基材に試料のアレーを移送するために、マイクロタイタープレートの穴、例えば９６穴中に浸漬したピンのアレーを使用する。１つのアレーは面積２２×２２ｃｍ２に９２１６個のスポットのアレーを作るためにジグザグ状に膜にスポットするように設計されたピンを含む。
【００５５】
近年、アレーシステムが（ｉ）５０〜２００ミクロン以下の距離で分離された多数のミクロサイズの分析領域および（ii）アレーの各領域に結合した十分に規定された量、通常、ピコモル範囲のＬＣセンス分子を特徴とするマイクロアレーの大量生産のために考案されている（米国特許第５，８０７，５２２号、これは特にマイクロアレーシステムに関するので、その全体を本明細書中に参考として導入する）。
【００５６】
本発明の１つの態様によれば、本発明のＬＣセンス化合物は、１）標的ヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ断片を調製し；２）ＬＣセンス化合物を産生することができるファージベクター中にｃＤＮＡ断片をクローン化することによって組換えファージを調製し；そして３）大量に標的センス配列を含む単鎖環状ファージゲノムを生成することによって作成してもよい。このようなＬＣセンス分子のライブラリーを作成してもよい。
【００５７】
すなわち、本発明の他の態様では、ＬＣセンス化合物は標的配列の断片または全遺伝子配列のいずれかを含んでいてもよいことが理解される。また、複数の異なった遺伝子のための数種の標的特異的センス配列は、１つの単鎖ファージゲノム中に挿入してもよい。その結果として、ＬＣセンス分子は標的特異的センス配列の１つ以上の領域を含んでいてもよい。
【００５８】
ＬＣセンス化合物は、この化合物が細菌細胞中でＤＮＡポリメラーゼによって複製されるから、強い複製フィデリティを有する。ＤＮＡポリメラーゼは校正能力を有するから、ＬＣセンス化合物のフィデリティは化学的に合成されたオリゴヌクレオチドよりも大きい。さらに、本発明のＬＣセンス化合物は化学的に合成されたオリゴヌクレオチドまたは増幅されたＤＮＡ断片よりも安価に作成される。
【００５９】
本発明の他の態様では、アレー中の各区画はＬＣセンス分子のみを含むことが理解される。他の態様では、区画は２本鎖ファージミドがＬＣセンス分子鎖とその相補的単鎖対応物を生成するために変性される場合など、ＬＣセンス分子とその相補的対応物の双方を含んでいてもよい。好ましくは、アレーの領域にはＬＣセンス分子は存在する相補的単鎖対応ＤＮＡと対比して、１対１の割合よりも多く存在していてもよい。より好ましくは、アレーの領域中の組成物は少なくとも９５％ＬＣセンス分子を含む。さらにより好ましくは、この組成物は単鎖ＬＣセンス分子のみがアレーの領域に存在する場合、挿入物を含むファージのライフサイクル中に単鎖ＤＮＡとして生成するＬＣセンス分子を含む。
【００６０】
高処理能力のマイクロアレーシステム
【００６１】
アレーによる大量発現プロファイリングは、細胞生理学の体系的分析における主たる技術として出現してきた（ヤング(Young)ら、Cell, 102, 9-15 (2000)）。これらのアレーは今や遺伝子発見（カチ(Kati)ら、J.Pathol.,193, 73-79 (2001)）、疾患診断（アリザデー（Alizadeh）ら、Nature, 403, 503-511 (2000)）、薬剤発見（レミング(Leming)ら、J. Chem. Inf. Comput. Sci., 40, 367-379 (2000)）、毒物学研究（ヌワイジル（Nuwaysir）ら、Molecular Carcinogenesis, 24, 153-159 (1999)）などを含む種々の用途に使用されている。マイクロアレーを製造する技術は、プローブオリゴヌクレオチド（通常、１５〜１００ヌクレオチド）をガラス表面上に直接に形成する技術（リップシュッツ（Lipshutz）ら、Biotechniques.,、19,442-447(1995)、リップシュッツ（Lipshutz）ら、Nat. Genet., 21, 20-24(1999)、シン−ガッソン（Singh-Gasson）ら、Nat. Biotechnol., 17, 974-978 (1999)）、またはｃＤＮＡクローンセットまたはｃＤＮＡライブラリーから増幅されたＰＣＲ産生物でもって基材をプロットする（デュガン(Duggan)ら、Nat. Genet., 21, 10-14(1999)）などの技術を利用する。しかしながら、オリゴヌクレオチドまたはＰＣＲ産生物によるアレーの産生はいくつかの不利な点を有する。例えば、数万の変性オリゴヌクレオチドの調製は、配列情報、高い生産費用および各遺伝子の骨のおれる標的配列探索、合成、脱塩、カラム精製、濃度、変性など、時間がかかる複数の工程を必要とする。一方、ＰＣＲ産生物を使用するアレーの製造は、プラスミド精製、ＴａｑポリメラーゼによるｃＤＮＡ増幅、および費用が大きくかかるＤＮＡ精製工程を必要とする。ここで、我々はＬＣセンス分子を使用するアレーを考案した。遺伝子の発現プロフィールを研究するための結合試薬プローブとしてその用途が実証された。
【００６２】
組換えバクテリオファージの構築のためのプラスミド、Ｍ１３ファージミドはそのｆ１オリジンゆえにセンス配列を含む大量の単鎖ゲノムＤＮＡを産生するために組み込まれている。ＬＣセンス分子はヘルパーバクテリオファージによる共感染によって組換えＭ１３ファージミドとともにコンピテント細胞の細菌培養物から大量に生産され得る。
【００６３】
この点では、アレーで使用するための大量のＬＣセンス分子を産生する能力は、アレーの価格を低下させる利点をもたらす。一方、従来は大量のオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産生大ｃＤＮＡ産物を容易に産生する能力がないことは、安価のアレーチップを得るには障害であった。
【００６４】
本発明はまた、上記したＬＣセンス分子ライブラリーを使用する機能的ゲノムのための高処理能力システムを提供する。本発明の機能的ゲノムシステムは遺伝子機能を迅速かつ大量に研究するために使用してもよい。すなわち、ＬＣセンスライブラリーは異なった遺伝子産物間の相互関係を決定するために使用してもよい。
【００６５】
ＬＣセンス分子を含む種々の特異的アレー型は本発明によってもたらされ、種々の動物、植物および微生物の細胞または組織中に差動的に発現した遺伝子を同定する。これらのアレー型としては、次のもの；発生的(developmental)アレー；癌アレー；アポトーシスアレー；癌遺伝子および腫瘍抑制因子アレー；細胞周期遺伝子アレー；サイトカインおよびサイトカインレセプターアレー；成長因子および成長因子受容体アレー；神経アレーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明のアレーはとりわけ差動的遺伝子発現分析に使用され得る。例えば、アレーは（ａ）疾患状態、例えば新生または正常；（ｂ）異なった組織型；（ｃ）発達段階；（ｄ）外部刺激または内部刺激に対する応答；（ｅ）治療に対する応答などの差動的発現分析に使用してもよい。このアレーは薬剤発見および研究のための広範な規模の発現スクリーニングにも有用である。さらに、遺伝子発現における特別な細胞型での活性化剤の効果を研究することによって、薬剤毒性、発癌性、環境モニタリングなどの情報が得られ解析され得る。
【００６７】
１つの態様では、本発明は約１ｃｍ２以下の表面積に少なくとも１０３個の個々のＬＣセンス分子のマイクロアレーを有する表面の基材を含む。個々のＬＣセンス分子はそれぞれ、（ｉ）アレー中の離れた所定位置に配置され、（ii）少なくとも約３，０００塩基の長さを有し、かつ、（iii）約０．１フェムトモルから１００ナノモルの所定量にて存在する。
【００６８】
１つの実施態様では、特定の基材あるいは特定のアレーシステムに限られることなく、表面はポリリジンなどのポリカチオン系ポリマーで被覆されたガラススライド表面であってもよく、また、被覆層に非共役結合であって静電気的に結合された個々のＬＣセンス分子のアレーを含んでいてもよい。ここで、個々のＬＣセンス分子は表面アレーの離れた所定位置に配置される。
【００６９】
また、第１細胞型中の複数の遺伝子の各差動的発現を第２細胞型の同じ遺伝子の発現に関連して検出する方法もまた本発明の一部分を形成する。この方法を実施するには、まず、２つの細胞型から単離したｍＲＮＡから蛍光標識ｃＤＮＡが産生される。ここで第１および第２細胞型から得たｃＤＮＡは第１および第２の異なった蛍光レポーターで標識されている。
【００７０】
２つの細胞型から得た標識ｃＤＮＡ混合物は、アレー中の相補的配列のＬＣセンス分子にｃＤＮＡをハイブリダイズさせる条件下に、２つの細胞型から誘導された複数の公知遺伝子を表現するＬＣセンス分子のアレーに加えられる。このアレーは次いで蛍光励起条件下に蛍光によって試験される。ここで（ｉ）第１または第２細胞型のうちの１つから誘導されたｃＤＮＡへ優先的にハイブリダイズするアレー中のＬＣセンス分子が、個々の第１または第２蛍光発光色をそれぞれ呈示し、かつ（ii）第１および第２細胞から誘導された実質的に等しい数のｃＤＮＡとハイブリダイズするアレー中のポリヌクレオチドは、個々の組み合わされた蛍光発光色をそれぞれ呈示する。次いで、２つの細胞型の公知遺伝子の相対的発現は各スポットの観察された蛍光発光色により測定され得る。
【００７１】
代表的な大量機能的ゲノミックスプロトコールは、以下のようなものであり、特定の実施態様および実施例がいかなる方法においても本発明を限定するものではないと理解される。
【００７２】
（１）単鎖ゲノムを有する組換えバクテリオファージベクターを使用してｃＤＮＡライブラリーを構築し；
【００７３】
（２）挿入サイズでもってｃＤＮＡクローンを同定および選択し；
（挿入サイズは少なくとも１００、２００、３００、４００塩基、好ましくは少なくとも５００塩基から少なくとも約２，０００、３，０００、４，０００または５，０００塩基以上であってもよい。ｃＤＮＡクローンは多重小規模プラスミドを使用して単離してもよい。）
【００７４】
（３）選択クローンを増幅し、そしてＬＣセンスライブラリーを構築し；
（選択ファージミド形質転換体はヘルパーバクテリオファージに感染させる。単鎖ファージゲノムセンス化合物は続いて培養上清から収集される。）
【００７５】
（４）アレー中のガラス、膜またはフィルターなどの基材上に個々のＬＣセンス分子を分配する。（分配またはスポット工程は手動で、あるいはスポット機を使用して自動的に行ってもよい。）
【００７６】
標的ｃＤＮＡが得られる細胞は、正常細胞などの関心ある細胞、あるいは肝臓癌、肺癌、胃癌、乳癌、膀胱癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、および皮膚癌などの種々の型の癌ならびに肥満細胞、毛包、自己免疫疾患、および代謝異常の細胞から選択してもよい。
【００７７】
ＬＣセンス分子のライブラリーは、関心あるクローンの特殊な非縮退ライブラリーを調製するように、ショットガン変法でｃＤＮＡ挿入物の集団をランダムにかつ一方向に挿入することによって、あるいは挿入物の配列を個々に同定し、かつ、ファージベクター中の挿入物をクローン化して作ってもよい。試験されるランダム遺伝子一方向性ＬＣセンスライブラリーまたは単一遺伝子一方向性ＬＣセンスライブラリーまたは宿主細胞の起源はヒトである必要はないことが理解される。本発明の原理によるとヒト、植物および真菌などのいかなる起源の生物体も使用されるが、これらに限定されない。宿主細胞はまた、ＬＣセンス化合物が細胞膜または細胞壁を貫通することができる限り、いかなる生物体であってもよい。
【００７８】
アレー用結合剤としてＬＣセンス分子の機能を評価するために、我々はまず、ヘルパーバクテリオファージＭ１３Ｋ０７を用いて大腸菌コンピテント細胞中に１，１５２個の非縮退クローンの組換えｐＳＰＯＲＴファージミドを形質転換した。次いで、各クローンのＬＣセンス分子は培養上清から精製し、０．２〜０．５ｍｇ／ｍｌまで大量に濃縮した。この方法で、我々は１，１５２個の試料を得た。結合剤のアレー基質としては、ポリ−Ｌ−リジンまたはアミノシランをガラス表面に被覆して、核酸の固定化を増強した（シェーナ(Schena)ら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93, 10614-19(1996)）。アガロースゲル電気泳動によってＬＣセンス分子の性質および量を確認した後、ＬＣセンスアレーは、マイクロアレヤーを使用してシラン化スライドガラス上にこれらの分子をスポットして調製した。正常および癌性肝臓組織から精製されたポリ（Ａ＋）ＲＮＡの性質を確認した後、標識ｃＤＮＡプローブを混合し、１，１５２個の非縮退試料を含むＬＣセンスアレーとハイブリダイズさせた。
【００７９】
正常肝臓細胞および癌性肝臓組織から得たＲＮＡを放射標識タグまたは蛍光タグで標識されたヌクレオチドの存在下でｃＤＮＡに逆転写した。Ｃｙ３−ｄＮＴＰおよびＣｙ５−ｄＮＴＰ染料は標識剤として最も一般的に使用される蛍光体である。オリゴヌクレオチドまたは増幅ｃＤＮＡ産物を含む従来のマイクロアレーと標的をインキュベートすることは、通常、水性ハイブリダイゼーション緩衝液において４５℃または６５℃でそれぞれ実施されていた。しかしながら、我々は単鎖ＬＣ分子の融点の測定に基づき、ハイブリダイゼーション温度を６０℃に最適化した。ハイブリダイゼーションの最適温度におけるこれらの違いは、ＬＣセンス分子プローブと従来から使用されているオリゴヌクレオチドまたはＰＣＲ産物との構造的差異を反映している。ハイブリダイゼーションに続いて、ＬＣセンスアレーを繰り返し洗浄して、非結合および非特異的シグナルを除去した。ソフトウェアによる走査分析は、正常組織に比べて癌性肝臓組織では１，１５２個の遺伝子のうち、２９個が上流制御され、６個の遺伝子は下流制御されていることを示した。これらの結果から、我々はＬＣセンス分子がスライドガラスアレー上でプローブとして十分に作用することを確認した。
【００８０】
ＬＣセンスアレーは遺伝子の発現プロフィールを研究するために使用されるアレーシステムの使用において、いくつかの利点をもたらす。まず、ＬＣセンス分子を大腸菌などの細菌性形質転換体から速度、正確性および価格における有効性をもって大量に産生することができる。第２に、ファージミドベクターは種々の大きさのセンス挿入物を収容することができる。その長い配列ゆえに、結合特異性を著しく増大することができる。第３に、ＬＣセンス分子を有するアレーを作成するには、標的結合配列の調査に費やす時間を必要としない。第４に、ＬＣセンス分子は細菌細胞中でＤＮＡポリメラーゼによって分子が複製されるから、強い複製フィデリティを有する。ＤＮＡポリメラーゼは校正能力を有するから、ＬＣセンス分子のフィデリティは化学的に合成されたオリゴヌクレオチドまたは試験管内で増幅されたｃＤＮＡよりも大きい。第５に、ＬＣセンス分子は化学的に合成されたオリゴヌクレオチドまたは増幅ＰＣＲ産物よりも安く作成することができる。最後に、ベクターに基づく技術を使用して、多数の個々のクローンを有するＬＣセンス分子ライブラリーの構築は、容易にかつ迅速に達成してもよい。特定疾患に特異的なライブラリーは疾患細胞または異常細胞または組織から容易に構築され得る。これらのライブラリーから、我々は大量でＬＣセンス分子を産生し、未知の機能を有する遺伝子を含む疾患関連遺伝子のパネルを発見することができる。そうでなくても、ヒト遺伝子または他の生物体の遺伝子の全パネルの構成員中に縮退が少ないかまたは全くなくて構築されたライブラリーから種々の疾患の多様な発現プロフィールがここに記載されるように達成され得る。さらなる工程で、抗癌剤をより効率的に発見するために、抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）とｃＤＮＡアレーハイブリダイゼーション法を組み合わせて使用してもよい（カチ(Kati)ら、J. Pathol., 193, 73-79 (2001)。サブトラクテッドｃＤＮＡライブラリーの構築においてｆ１オリジンを有するファージミドベクターを使用して、特定細胞または組織中で過剰発現されたランダム遺伝子の一方向性ライブラリーを作成する方法がより簡単に行われる。ＬＣセンスアレーから得た遺伝子発現プロフィールは、実時間(real time)ＰＣＲおよびノザンブロッティングを含む別な方法で確認されている。
【００８１】
１つの一般的な実施態様では、表面は比較的親水性であり、すなわち未変性、結合性または共有結合的に付着した電荷基を有する表面などの湿潤性表面である。以下に記載するこのような表面の１つは、ポリ−Ｌ−リジンなどのポリカチオン性ポリマーの吸収性層を有するガラス表面である。
【００８２】
他の実施態様では、表面は比較的疎水性特性、すなわち表面上に付着された水性媒体をビーズとする特性を有するか、あるいは有するように形成される。ガラスおよび支持体表面に適用される種々の潤滑剤または他の疎水性フィルムと同じように、ポリスチレン、ポリプロピレン、またはポリエチレンなどの種々の公知疎水性ポリマーが望ましい疎水性特性を有する。
【００８３】
スライドはスライド表面上にポリカチオン性ポリマー、例えばポリ−Ｌ−リジンの均一厚のフィルムを載置し、フィルムを乾燥して乾燥被膜を形成することによって被覆されてもよい。添加されたポリカチオン性ポリマーの量はガラス表面上に少なくともポリマーの単層を形成するのに十分であればよい。ポリマーフィルムは表面上の陰性シリル−ＯＨ基とポリマー中の電荷アミノ基の間の静電的結合により表面に結合してもよい。ポリ−Ｌ−リジン被覆ガラススライドは、例えば、Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo) から購入してもよい。
【００８４】
マイクロアレーを形成するために、規定量の個々のＬＣセンス分子をポリマー被覆スライド上に付着する。基材の重要な態様によれば、試料中のレポーター標識ｃＤＮＡを基材アレー中のＬＣセンスＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションさせる条件下に水性ＤＮＡ試料を基材に適用するとき、付着したＬＣセンス分子が被覆スライド表面に非共有結合により結合された状態となる。
【００８５】
好ましい実施態様では、各マイクロアレーは約１ｃｍ２以下の表面積当たり、少なくとも１０３個の個々のＬＣセンス分子を含む。マイクロアレーは約１６ｍｍ２の面積に少なくとも約４００の領域、または２．５×１０３領域／ｃｍ２を含んでいてもよい。また、好ましい実施態様ではポリヌクレオチドの場合、各マイクロアレー領域中のＬＣセンス分子は約０．１フェムトモルから１００ノナモル間の規定量で存在していてもよい。
【００８６】
また、好ましい実施態様ではポリヌクレオチドは少なくとも約３０００ｂｐの長さを有し、すなわち、種々のインサイチュ(in situ)合成図式によって高密度アレーに形成され得るオリゴヌクレオチドよりも実質的に長い。
【００８７】
標識
【００８８】
好適な酵素としては、例えば基質と反応することによる過酸化水素の生成を触媒するオキシダーゼ群からなるものが挙げられる。グルコースオキシダーゼは、良好な安定性を有し、その基質（グルコース）が容易に入手可能であるから特に好ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体／基質反応によって生じた過酸化水素の濃度を測定して分析してもよい。酵素のほかに、他の好適な標識としてはヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）などの放射性同位元素、およびフルオレセインおよびローダミンなどの蛍光性標識、およびビオチンが挙げられる。
【００８９】
好適な放射性同位元素標識の例としては、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、１５２Ｅｕ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄなどが挙げられる。好適な非放射性同位元素標識の例としては、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｔｒおよび５６Ｆｅが挙げられる。
【００９０】
好適な蛍光標識の例としては、１５２Ｅｕ標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、ｏ−ファルアルデヒド標識、フルオレスカミン標識、シアニン（Ｃｙ３ＴＭ）およびインドカーボシアニン（Ｃｙ５ＴＭ）が挙げられる。
【００９１】
化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、蓚酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識およびアクオリン標識が挙げられる。
【００９２】
核磁気共鳴造影剤の例としては、Ｇｄ、Ｍｎおよび鉄などの重金属核が挙げられる。ジウテリウムもまた使用してもよい。他の造影剤もまたＥＰＲ、ＰＥＴまたは他の画像メカニズムにおいて存在している。これらは当業者には公知である。
【００９３】
キット
【００９４】
本発明はまた、試料中のｃＤＮＡの存在について試料を分析するキットも含む。一般的な実施態様では、キットは１つまたはそれ以上の容器中に、ＬＣセンス分子のアレーが上に存在する基材を含む。具体的な実施態様では、本発明のキットは試薬、ＮＴＰ、酵素、カラムおよびアレーと特異的に反応する試験核酸を含んでいてもよい。好ましくは、本発明のキットはさらにマイクロアレーと反応するかあるいは反応しない核酸を含んでいてもよい。キットはさらにその使用時の指示書と標識を含む。
【００９５】
本発明はここに記載される具体的な実施態様によって範囲を限定されるものではない。事実、ここに記載されるものに対する本発明の種々の変更は、前記した説明および添付される図面から当業者には明白になるであろう。このような変更は添付される請求項の範囲内に入ることが意図される。下記実施例は本発明の説明のために提供され、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００９６】
ＬＣセンスアレー
【００９７】
組換えｐＳＰＯＲＴファージミドは、ヘルパーバクテリオファージＭ１３Ｋ０７（NEB Nucleic Acids, USA）を感染させ、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上で３７℃、一夜インキュベートして細菌性コンピテント細胞（ＸＬ−１０ Ｇｏｌｄ、Stratagene, USA）中に形質転換した。十分に単離された形質転換体を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン１６ｇ、酵母抽出液１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１０００ｍｌ）を含む９６深穴プレートの各穴に播種し、３７℃で１４時間、激しく攪拌しながら培養した。このインキュベーションを各クローンについて３回実施して、１回の精製でＬＣセンス分子の収量を最大とした。少量のＬＣセンス分子の産生には、１／５容量の２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）および２．５Ｍ  ＮａＣｌとともに培養上清３ｍｌを添加し、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｍ１３キット（Qiagen, German）上に移送した。精製工程はＱＩＡＶＡＣ真空マニフォールド（Qiagen, German）を使用し、製造者の指示書に従って実施した。調製されたＬＣセンス分子を１％アガロースゲル上に置いて、その量と質を試験した。次いで、溶出液を乾燥し、３×ＳＳＣ１０μｌ中に再溶解し、ＬＣセンス分子の濃度を調整し、ＯｍｎｉＧｒｉｄマイクロアレー（GeneMachines, Inc., USA）を使用して、シラン化ガラススライド(CMT-GAPS, Corning, USA)の表面上へ整列させた。各スライドに短波ＵＶ（Stratalinker, Stratagene, USA）を３００ｍＪ照射して架橋し、使用時まで乾燥機中に保存した。
【実施例２】
【００９８】
ラットＴＮＦ−αのＬＣセンス分子の産生
【００９９】
ＲａｔＴＮＦ−αｃＤＮＡをファージミドベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）−ＫＳ（＋）の多重クローニングサイト中にクローン化した。組換えＭ１３ファージの産生は、ｐＢＳ ＫＳ（＋）ファージミドで既に形質転換された細菌細胞中にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させて実施した。標的遺伝子のためのＬＣセンス分子を生成するために、ファージミドのｆ１複製オリジンを使用した。ヘルパーファージを感染させた細胞の一夜培養物の上清に２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を添加した。バクテリオファージ沈殿物をＴＥ（ｐＨ８．０）中に再懸濁し、ファージゲノムＤＮＡをフェール抽出およびエタノール沈殿によって単離した。ヘルパーバクテリオファージと宿主細菌細胞の残渣ゲノムＤＮＡから得たＬＣセンス分子の精製は、小規模精製では０．８％低融点（ＬＭＰ）アガロースゲルを使用するか、あるいは大量精製ではゲル濾過カラムクロマトグラフィ（１．０×５０ｃｍ）を使用して実施した。ゲル濾過用カラム樹脂は非常に細かいＳｅｐｈａｃｒｙｌＴＭＳ−１０００（分子量カットオフ：２０，０００ｂｐ）（Amersham Pharmacia Biotech AB, Sweden）であり、充填して０．２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化した。ＬＣ分子の初期量を５％ゲル穴容量に調整し、ＤＮＡ溶出を樹脂平衡化（流速：０．３ｍｌ／分）において使用した同じ緩衝液で実施した。二重ＵＶ検出システムを使用して２６０／２８０ｎｍで試料をＵＶ走査し、そして溶出中、５分毎に試料を収集した。試料画分を洗浄し、７０％冷エタノールで沈殿させ、次の実験のために希釈した超純水およびＰＢＳ（燐酸塩緩衝化生理食塩水）中に再懸濁した。精製ＬＣ分子を１％アガロースゲル上でその量と純度について試験した。
【実施例３】
【０１００】
Ｔｍ分析
【０１０１】
ラットＴＮＦ−αの単鎖ＬＣ分子およびＴＮＦ−α挿入物を含む２本鎖プラスミドＤＮＡ（ｐＢＳ）−ＫＳ（＋）ファージミドの熱的変性は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ナトリウムＰＩＰＥＳ（Sigma, USA）の溶液中で実施した。１０μｇ／ｍｌ（１０ｎＭ）のＤＮＡを９５℃に加熱し、変性実験の前に室温までゆっくりと冷却した。温度は０．５℃／３分で上昇させた。溶融試験はペルチエ温度制御器を備えたダイオードアレー分光光度計(Hewlette Packard, USA)で実施した。
【実施例４】
【０１０２】
ＲＮＡ調製
【０１０３】
正常および癌性肝臓組織の全ＲＮＡ調製は、製造者の推奨するプロトコールに従って、Ｔｒｉ試薬（MRC, USA）を使用して実施した。組織をリン酸塩緩衝化生理食塩水で洗浄し、小片に薄く切った。次いで、薄く切った組織を最適容量のＴｒｉ試薬中で１０分間、ホモジナイズした。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの精製は製造者の指示書に従って、ポリ（Ａ）クイックｍＲＮＡ単離キット(Stratagene, USA)を使用して行った。精製ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを標的ＤＮＡ調製のための鋳型として使用した。
【実施例５】
【０１０４】
標的ｃＤＮＡの調製およびハイブリダイゼーション
【０１０５】
ハイブリダイゼーションの全般的手順は、パトリック・オー・ブラウン（Patrick O. Brown）博士の研究室プロトコール(http://cmgm.stanford.edu/pbrown)に従って実施した。簡単には、肝臓の正常および腫瘍組織から得た各ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ２μｇをＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰそれぞれの存在下にオリゴ−ｄＴプライマーを使用して逆転写した。次いで、標識ｃＤＮＡはミクロコン(microcon)−３０により精製した。精製された標的ｃＤＮＡをハイブリダイゼーション溶液（３×ＳＳＣおよび０．３％ＳＤＳ）８０μｌ中に再懸濁し、１００℃で２分間、変性し、ＬＣセンス分子のアレーへ適用した。ハイブリダイゼーションを湿潤室中で６０℃にて１６時間、実施した。最後に、ハイブリダイズしたスライドをそれぞれ１度、２×ＳＳＣで２分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５分間、および０．１×ＳＳＣで５分間、洗浄し、次いで室温で走査に先たってスピン乾燥した。
【実施例６】
【０１０６】
データ取得および分析
【０１０７】
ｃＤＮＡマイクロアレーにハイブリダイズした蛍光標的ｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ走査装置(Axon instruments, USA)を使用してスライドを走査することにより検出した。Ｃｙ３またはＣｙ５のＰＭＴ（光電子増倍管）値は、それぞれ４５０および５００であった。次いで、走査画像はＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ３．０ソフトウェアパッケージを使用して解析した。シグナル強度値は各スポットの強度中央値から背景中央値を差し引いて測定した。発現値は単一積和正規化因子で正規化し、中央正規化Ｃｙ５／Ｃｙ３比が１．０になるように、全Ｃｙ５／Ｃｙ３比に適用した。
【実施例７】
【０１０８】
ＬＣセンス分子の大量調製
【０１０９】
組換えファージミドはヘルパーバクテオリオファージ、Ｍ１３Ｋ０７に感染させたコンピテント大腸菌中に形質転換した。形質転換された細胞を３７℃で一夜、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天プレート上でインキュベートした。１つのコロニーを注意深く単離し、ＬＢ液体培地（バクトトリプトン１０ｇ、酵母抽出液５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ／１０００ｍｌ、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび７０μｇ／ｍｌカナマイシン）中に播種した。次いで、細胞を一定の攪拌下に３７℃で１４時間、培養した。室温で１０分間、６，０００ｒｐｍで細菌細胞を遠心分離した後、培養上清１００ｍｌをソリューションＩ（２０％ＰＥＧ８０００＋２．５Ｍ  ＮａＣｌ）と混合し、室温で１０分間、インキュベートした。次いで、１０分間、真空を付してホウ珪酸塩フィルターを含むカラム穴中に試料を載置した。Ｍ１３溶解および結合のために、ソリューションII（４Ｍ  ＮａＣｌＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）５０ｍｌをカラムに入れ、バクテリオファージの完全な溶解のために１０分間、室温でインキュベートした。フィルターにＬＣセンス分子の吸収させるために、１０分間、真空とした。次いで、ソリューションIII（８０％ＥｔＯＨ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌをカラムに添加し、１０分間、真空とした。ソリューションIIIによる洗浄工程を再び、繰り返し、さらに１５分間、真空として緩衝溶液を除去した。無菌水１０ｍｌを使用してＬＣセンス分子を溶出した。ＬＣセンス分子を１％アガロースゲル上に乗せ、その性質化および数量化のためにＵＶ光下に撮影した。
【実施例８】
【０１１０】
結果
【０１１１】
１−ＬＣセンスアレーの調製
【０１１２】
我々は差異的遺伝子発現の量的プロフィール化におけるその有用性を試験するためにＬＣセンス分子（図１）を有するマイクロアレーを調製した。ヘルパーバクテリオファージＭ１３Ｋ０７を含むコンピテント大腸菌細胞を１，１５２個の非縮退クローンの組換えｐＳＰＯＲＴ１ファージミドで形質転換して、ＬＣセンス分子を産生した。ＬＣセンス分子の高処理能力生産は、９６穴フォーマットで達成した。精製ＬＣセンス分子を１％アガロースゲル上で電気泳動し、ＵＶ光で撮影した（図２）。マイクロアレイアーを使用して、ＬＣセンス分子の単鎖ＤＮＡ試料をシラン化スライドガラス上に整列させた。
【０１１３】
２−ＬＣセンス分子の融点
【０１１４】
単鎖ＬＣセンス分子とＴＮＦ−α挿入物を含有する二重鎖ファージミドＤＮＡ間の構造的差異は、融点（Ｔｍ１／２）を測定して試験した。温度を徐々に上昇させながら、２６０ｎｍの吸収を二重鎖ファージミドＤＮＡでモニターしたとき、約８７℃で典型的な色変化を検出した（図３Ａ）。しかしながら、単鎖ＬＣセンス分子をその融点について試験したとき、約５４℃でなだらかな傾斜の色変化を検出し、内分子短二重鎖の変性を示した（図３Ｂ）。これらの結果からＬＣセンス分子が単鎖分子であることを確認した。さらに、最適ハイブリダイゼーション温度はこれらの結果に基づいて決定した。
【０１１５】
３−ＲＮＡ品質の確認
【０１１６】
ＲＮＡの品質はしばしばマイクロアレー実験の結果を決定する。正常および癌性肝臓組織から調製したポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ標識ｃＤＮＡをそれぞれ合成するために使用した。標識ｃＤＮＡを混合して、ＤＮＡチップ上に播種したｃＤＮＡをプローブするために６５℃でハイブリダイズさせた。ＬＣセンスマイクロアレーを洗浄し、走査装置で走査し（図４Ａ）、ソフトウェアで解析した。次いで、データをｌｏｇ２変換した後に走査プロットした（図４Ｂ）。走査画像は、ＲＮＡの品質が標識化およびＬＣセンスアレーへのハイブリダイゼーションのために使用するには十分に純粋であることを証明した。
【０１１７】
４−癌性肝臓組織中の差異的発現遺伝子の同定
【０１１８】
実施例８．３において調製され、かつその強度を確認したポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを使用して、標識化標的ｃＤＮＡをＬＣマイクロアレー上に載置し、ハイブリダイゼーションを６０℃で実施することを除いて、上記したような同じ手順を使用して癌性肝臓組織中の遺伝子の発現プロフィールを検出した。次いで、ＬＣセンスマイクロアレーを走査し、発現プロフィールについて解析した（図５）。次いで、データをｌｏｇ２変換した後に走査プロットした（図６）。中央値の合計２００以下の遺伝子をさらなるデータ処理から除外した。実験から、我々は１，１５２個のうち、２９個（〜２．５％）の遺伝子が肝臓癌組織中で上流制御したことを発見した（表１）。２９個の遺伝子の中で、特にＣＤ４４抗原（エンド(Endo) Kら、J. Hepatology, 32(1): 78-84, 2000）、イノシンモノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ジャックソン(Jackson) R.C.ら、Nature 256(5515):331-333, 1975）、多発性内分泌異常増殖１（ナカジマ（Nakajima）Kら、Intern. Med. 30(1):20-24, 2000）およびカルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼ２（アリゾノ (Arizono) Kら、Life Sci, 53(12):1031-1037, 1993）が、既に肝臓癌進行に関与するものとして報告されている。他方、１，１５２個の遺伝子のうち、６個は肝臓癌組織中で下流制御されていた（表２）。６個（〜０．５％）の遺伝子中で、特にフィブリノーゲン様１（コーノ(Kohno) Tら、Jpn. J. Cancer Res. 91(11):1103-1110, 2000）は、その発現が成人Ｔ細胞白血病で下流制御されることが既に報告されている。これらの結果は、ＬＣセンス分子が差異的発現を示す遺伝子を検出するマイクロアレーの結合剤として使用され得ることを示す。
【０１１９】
５−ＬＣセンスＤＮＡの大量調製
【０１２０】
ＬＣセンス分子の大量生産は、一貫して信頼できる品質を有する多数のＤＮＡマイクロアレーを作成することを要するであろう。ＬＣセンス分子の大量生産は半自動「プロトタイプ」の装置でもって達成されていた。この装置は内径３７ｍｍの９６精製カラム、それぞれ３０または１００ｍｌポンピング能力を有する８穴分配器２つおよび真空多岐管（６０Ｗ×４２Ｌ×６０Ｈ）を備えている。ヘルパーバクテリオファージＭ１３Ｋ０７を含有するコンピテント大腸菌細胞中に組換えファージミドを形質転換した。１つのコロニーを選び、ＬＢ液体培地１００ｍｌ中に播種し、そして一定の攪拌下に３７℃で１４時間、培養した。半自動精製装置を使用して培養上清１００ｍｌからＬＣセンス分子を精製した。大量で調製したＬＣセンス分子を１％アガロースゲル上に載置し、その性質と量を試験した（図７）。上記装置を使用して培養上清１００ｍｌから約２００μｇのＬＣセンス分子を得た。
【０１２１】
ここに引用された参考文献の全ては、その全体を参考として導入する。
当業者は通常の実験の域を出ないで、ここに具体的に記載される発明の特定の実施態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確信できるであろう。このような均等物は、請求項の範囲内に包含されることが意図される。
【０１２２】
癌性肝臓組織中の上流制御遺伝子（＞２Ｘ）リスト
【表１】
2006503558.tif 000003
【０１２３】
癌性肝臓組織中の下流制御遺伝子（＞２Ｘ）リスト
【表２】
2006503558.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】：１本鎖ＬＣセンス分子の産生のための図式を示す。標的遺伝子のｃＤＮＡはＭ１３ファージミドベクターの複数クローニング部位中へクローン化される。この構築物はヘルパーファージ、Ｍ１３ＫＯ７に感染したとき、標的遺伝子の１本鎖ＬＣセンス分子のレスキューを可能とする。
【図２】：ＬＣセンス分子の大量産生を少量にて示す。組換えｐＳＰＯＲＴ１ファージミドによる１，１５２個の形質転換体をインキュベートし、ＬＣセンス分子の高処理能力大量生産のための９６穴フォーマット中でＭ１３ヘルパーバクテリオファージに感染させた。精製後、その量および性質を試験するために、ＬＣセンス分子を１％アガロースゲル上にかけた。Ｃ；挿入配列を有しないコントロールＬＣセンス分子。
【図３】：図３Ａ〜３Ｂは２本鎖プラスミド分子およびＬＣセンス分子の融点プロフィールを示す。温度を３０℃から９５℃まで上昇させる間、３分間隔で０．５℃増加毎に吸収をモニターした。Ａ：ＴＮＦ−α挿入物を含む２本鎖ファージミドのＴｍ１／２プロフィール。Ｂ：ＴＮＦ−αセンス挿入配列を含むＬＣセンス分子のＴｍ１／２プロフィール。
【図４】：図４Ａ〜４ＢはＲＮＡ特性の確証を示す。正常および癌性肝臓組織から調製されたポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの完全性を試験した。Ｃｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ標識化標的ｃＤＮＡは互いに混合され、ｃＤＮＡチップ上でＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ｃＤＮＡチップを洗浄し、スキャナーで走査し、ソフトウェアで解析した。次いでデータを散乱プロットした。Ａ：ｃＤＮＡチップの走査画像、Ｂ：発現プロフィールの散乱スポット。
【図５】：癌性肝臓組織から得たＬＣセンスアレーの走査画像を示す。Ｃｙ３とＣｙ５のＰＭＴ値は、それぞれ４５０および５００であった。正常組織に比べて上流制御された遺伝子は赤色で示され、下流制御された遺伝子は緑色で示され、そして黄色は発現において変化を示さない遺伝子を表す。
【図６】：正常および癌性肝臓組織間の発現プロフィールを比較する走査プロットを示す。発現プロフィールは試験したＬＣセンスアレーから得た二変数走査プロットとして示される。各スポットはその強度に従い、ｌｏｇ２形質転換後に走査プロットされた。
【図７】：ＬＣセンス分子の大量産生の一例を示す。組換えファージミドによる形質転換体を２×ＬＢ液体培地１００ｍｌに播種し、次いで一定の攪拌下に３７℃で１４時間、培養した。特別に設計された半自動精製装置を使用して組換えバクテリオファージを含む培養上清１００ｍｌからＬＣセンス分子を得た。調製後、ＬＣセンス分子を１％アガロースゲル上にかけてその数量化および定量化のためにＵＶ光下で撮影した。レーン１、大量（４０ｎｇ）に産生したＬＣセンス分子、レーン２、大量（３０ｎｇ）に産生したＬＣセンス分子、およびレーン３、少量（３２ｎｇ）に産生したＬＣセンス分子。
【図１】
2006503558.tif 000005
【図２】
2006503558.tif 000006
【図３】
2006503558.tif 000007
【図４】
2006503558.tif 000008
【図５】
2006503558.tif 000009
【図６】
2006503558.tif 000010
【図７】
2006503558.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月28日(2005.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々のＬＣセンス分子を含むライブラリー。
【請求項２】
前記ＬＣセンス分子はベクター配列およびプローブ配列を含み、プローブ配列はセンス方向である、請求項１記載のライブラリー。
【請求項３】
前記ベクターは単鎖生成ファージミドである、請求項２記載のライブラリー。
【請求項４】
前記ＬＣセンス分子は長さ約１，０００〜約２０，０００のヌクレオチドである、請求項１記載のライブラリー。
【請求項５】
個々のＬＣセンス分子は互いに分離されている、請求項４記載のライブラリー。
【請求項６】
前記ベクターはｐＳＰＯＲＴ１、ｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔIIＳＫ（＋／−）またはＫＳ（＋／−）、ｐＧＥＭ−ｆ、Ｍ１３ｍｐ、ｐＣＲ２．１、ｐＧＬ２またはｐβｇａｌである、請求項２記載のライブラリー。
【請求項７】
前記ベクターはＭ１３バクテリオファージ、ｆ１バクテリオファージ、またはｆｄバクテリオファージである、請求項２記載のライブラリー。
【請求項８】
支持体の表面に安定して結合された個々のＬＣセンス分子を複数含むアレー。
【請求項９】
前記支持体はアミノシラン、ポリ−Ｌ−リジンまたはアルデヒドの被覆層を含む、請求項８記載のアレー。
【請求項１０】
前記支持体はスライドガラス、セラミック、無機−有機複合体、柔軟なプラスチックフィルム、シリコーン、金属または膜である、請求項８記載のアレー。
【請求項１１】
（ｉ）単鎖形状のベクターを生成するベクター中に核酸断片を挿入し；
（ii）細菌性形質転換体を作るコンピテント細菌細胞中に挿入物を含むベクターを導入して、細菌性形質転換体を調製し；
（iii）ＬＣセンス分子を産生するヘルパーファージに形質転換体を感染させ；
（iv）形質転換体の培養上清からＬＣセンス分子を単離し；そして
（v）支持体表面上にＬＣセンス分子を整列する、
ことを含む請求項８記載のアレーを作成する方法。
【請求項１２】
核酸断片はベクター中に一方向に挿入される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）試料中のＤＮＡを標識し；
（ii）標識ＤＮＡを含む試料を請求項８記載のアレーと接触させ；
（iii）試料中の標識ＤＮＡをアレー中のＬＣセンス分子とハイブリダイズさせ；そして
（iv）ＬＣセンス分子へのＤＮＡの結合性を測定し、ここでアレー上のシグナルの存在は整列されたＬＣセンス分子に対するＤＮＡの存在を示す、
ことを含むアレー中の個々のＬＣセンス分子の集団に関する試料中のＤＮＡの存在を検出する方法。
【請求項１４】
標識はストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ共役体、化学蛍光性または化学発光性である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）第１試料から得たＤＮＡの第１集団を標識し；
（ii）第２試料から得たＤＮＡの第２集団を異なった標識で標識し；
（iii）標識ＤＮＡの第１集団を含む試料を請求項８記載のアレーと接触させ；
（iv）試料中の標識ＤＮＡの第１集団をアレー中のＬＣセンス分子とハイブリダイズさせ；
（v）標識ＤＮＡの第２集団を含む試料を請求項８記載のアレーと接触させ；
（vi）試料中の標識ＤＮＡの第２集団をアレー中のＬＣセンス分子とハイブリダイズさせ；そして
（vii）ＬＣセンス分子への標識ＤＮＡの結合性を測定し、ここでアレー上のシグナルの存在はＤＮＡの存在を示す、
ことを含む２つまたはそれ以上の核酸分子中のＤＮＡの存在を検出する方法。
【請求項１６】
請求項８記載のアレーおよび試料中のＤＮＡを検出するためのアレーを使用する指示書を含む遺伝子発現分析キット。
【請求項１７】
（ｉ）試験核酸を生成するためのプライマーを含む容器；
（ii）ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰを含む容器；
（iii）蛍光染料の化学的活性な誘導体などのポストＤＮＡ合成標識試薬を含む容器；
（iv）ＤＮＡ合成酵素を含む容器；
（v）緩衝媒体を含む容器；
（vi）シグナル生成試薬および検出試薬を含む容器；
（vii）ＤＮＡを検出するために使用する指示書
を含む、請求項１６記載の遺伝子発現分析キット。
【請求項１８】
チトクロームＰ４５０、サブファミリーIIＥ（エタノール誘導性）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０２８４３）；
転写伸長因子Ａ（ＳII）１；
ＫＩＡＡ０２０６に弱く類似するＥＳＴ[H. sapiens]（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ１９３０７５）；
トロポミオシンに対するヒト骨格筋の１．３ｋｂｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ７９７０３７）；
ＫＩＡＡ０７０１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ７９７０３７）；
転写伸長因子Ｓ−II、ｈＳ−II−Ｔ１のｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３１９５）；
難聴性常染色体優性５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０７３３０８）；
ＫＩＡＡ１０３７タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ３８３６２８）；
ＫＩＡＡ０３７５遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ００２３７３）；
プレフォルジン５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ２８７３９７）；
ＫＩＡＡ０７１０遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０１４６１０）；
対様ホメオドメイン転写因子１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０３７０）；
網膜外節膜タンパク質１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０７８９４）；
ＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ３９４１９）；
ＭＹＣ関連亜鉛フィンガータンパク質（プリン結合性転写因子）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ９４０４６）；
ユビキノン共役酵素Ｅ２Ｌ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０００５１９）；
染色体１の新規ヒトゲノムマッピング（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０４０４３８）；
ホモサピエンスクローン２４４２１ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０７０６４１）；
ホモサピエンスｍＲＮＡ；ｃＤＮＡ  ＤＫＦＺｐ５６６Ｊ２１４６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０５００８１）；
染色体凝縮１類似体（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１２６８）；
ＫＩＡＡ０９０２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０２０７０９）；
チロシンキナーゼ関連タンパク質９類似体（Ａ６関連タンパク質）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ１８８６６０）；
ＯＲＦ  ＹＯＲ１５０ｗに弱く類似するＥＳＴ（S. cerevisie）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＩ１２９４３３）；
転写伸長因子Ｂ（ＳIII）、ポリペプチド２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷ３２７２８５）および
Ｓｐ１転写活性において必要な補助因子、サブユニット９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ６６５９９８）、
からなる群から選択される遺伝子の正常肝臓細胞と比較して、上流制御を検出することを含む癌性肝臓細胞を測定する方法。
【請求項１９】
膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５３２９）；
カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼに類似する、ＰＡＣ２７２Ｌ１６、染色体１から単離されたヒト遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０２３７５４）；
デスドメインとともにアダプターを含むＣＡＳＰ２およびＲＩＰＫ１ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡ８１１１３０）；
アリアドネホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ０４０７０８）；および
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（ユビキノン）フラボプロテイン１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷ２５０７３４）、
からなる群から選択された遺伝子の正常肝臓細胞と比較した下流制御を検出することを含む癌性肝臓細胞を測定する方法。
【国際調査報告】
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