(57)【要約】血管新生は２種の非増殖性のアデノウイルスベクターを内皮細胞または生体の内皮細胞の近接部へ導入することによって刺激される。第１のベクターはＶＥＧＦ−Ｂ１６７またはそのフラグメントもしくは保守的置換物をコードし、第２のベクターはＶＥＧＦ−ＡもしくはＶＥＧＦ−Ｃ、またはそのフラグメントもしくは保守的置換物をコードする。
2004527462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生を刺激するための、下記を備える方法：
ＶＥＧＦ−Ｂ１６７または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える、第１の非増殖性アデノウイルスベクターを生体に導入するステップ；および
ＶＥＧＦ−Ａ、または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第２の非増殖性アデノウイルスベクターを前記生体に導入するステップ、
このとき前記第１の非増殖性アデノウイルスベクターおよび前記第２の非増殖性アデノウイルスベクターは前記生体の内皮細胞および内皮細胞に近接する細胞からなる群から選択される少なくとも１個の生細胞へ送達される。
【請求項２】
前記少なくとも１個の生細胞が血管細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記内皮細胞が微小血管内皮細胞である請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記内皮細胞が大動脈内皮細胞である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記生体が哺乳動物である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記生体がマウスである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記生体がヒトである請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
各アデノウイルスベクターの１０７〜１０１３個のベクター粒子が導入される請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド配列の発現がベクター内に含まれているＣＭＶプロモーターによって推進される請求項１〜４記載の方法。
【請求項１０】
血管新生を刺激するための、下記を備える方法：
ＶＥＧＦ−Ｂ１６７または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第１の非増殖性アデノウイルスベクターを生体内に導入するステップ；および
ＶＥＧＦ−Ｃ、または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第２の非増殖性アデノウイルスベクターを前記生体内に導入するステップ、
このとき前記第１の非増殖性アデノウイルスベクターおよび前記第２の非増殖性アデノウイルスベクターは前記生体の内皮細胞および内皮細胞に近接する細胞からなる群から選択される少なくとも１個の生細胞へ送達される。
【請求項１１】
前記少なくとも１個の生細胞が血管細胞である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記内皮細胞が微小血管内皮細胞である請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記内皮細胞が大動脈内皮細胞である請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記生体が哺乳動物である請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記生体がマウスである請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記生体がヒトである請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
各アデノウイルスベクターの１０７〜１０１３個のベクター粒子が導入される請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド配列の発現がベクター内に含まれているＣＭＶプロモーターによって推進される請求項１０〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
血管新生を刺激するための、下記を備える方法：
ＶＥＧＦ−Ｂ１６７または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第１の非増殖性アデノウイルスベクターを生体に導入するステップ；および
ＶＥＧＦ−Ｄ、または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第２の非増殖性アデノウイルスベクターを前記生体に導入するステップ、
このとき前記第１の非増殖性アデノウイルスベクターおよび前記第２の非増殖性アデノウイルスベクターは前記生体の内皮細胞および内皮細胞に近接する細胞からなる群から選択される少なくとも１個の生細胞へ送達される。
【請求項２０】
前記少なくとも１個の生細胞が血管細胞である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記内皮細胞が微小血管内皮細胞である請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記内皮細胞が大動脈内皮細胞である請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
前記生体が哺乳動物である請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記生体がマウスである請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記生体がヒトである請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
各アデノウイルスベクターの１０７〜１０１３個のベクター粒子が導入される請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチド配列の発現がベクター内に含まれているＣＭＶプロモーターによって推進される請求項１９〜２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本特許出願は、その開示がこれにより参照してここに組み込まれる２０００年１１月１日に提出された米国特許仮出願第６０／２４４，５９８号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、概して遺伝子療法、より詳細にはウイルス媒介性およびその他の形態の遺伝子療法に関する。より具体的には、本発明は血管新生を促進する際に有用なアデノウイルス媒介性遺伝子送達に関する。
【０００３】
血管新生とは既存血管からの発芽プロセスによる新規毛細血管の形成であり、発達中並びに数多くの生理的および病理的プロセスにおいて発生する。血管新生は、内皮細胞の増殖、細胞外マトリックスの分解、血管の分岐、および、それに続く、細胞接着事象を含む生理学的に複雑なプロセスである。成体では、血管新生は厳密に制御されており、正常な状況下では女性生殖器系に限定されている。しかし、血管新生は、組織損傷に応答してスイッチが入れられる可能性がある。固型腫瘍もまた周囲組織において血管新生を誘発し得、これによって、腫瘍増殖を維持し、転移の形成を容易にする（フォークマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ．），Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  １：２７−３１（１９９５））。複雑な血管新生プロセスの基礎にある分子機序は理解されていると言うには程遠い。リンパ系においても類似のプロセスが発生するがこのプロセスについての研究ははるかに進んでおらず、これはしばしば、リンパ管新生と称されている。
【０００４】
血管新生は親血管の基底膜の局所的破壊から始まり、これに続いて内皮細胞の周囲細胞外マトリックスへの遊走および増殖が起こり、その結果として毛細管新芽が形成される。引き続いて管腔が形成され、機能的新芽形成における必須要素を構成する。新芽成熟は、基底膜の再構成後に完了する。
【０００５】
少なくとも３種の内皮細胞機能における変化は、次の一連の事象中に発生する：１）細胞−マトリックスの接触における変化およびマトリックスを分解させるタンパク分解性酵素（プラスミノーゲンアクチベーター類（ＰＡｓ）およびマトリックスメタロプロテアーゼ類）の産生を必要とする細胞外マトリックスとの相互作用の調節；２）細胞が血管新生刺激に向かって移行し、それらの目的部位に到達したら停止するのを許容する、移動運動（遊走）の初期増加およびその後の減衰；３）血管を成長かつ伸長させるために新たな細胞を提供する増殖の増加、および血管が形成された後の静止状態への復帰。
【０００６】
同時に、これらの細胞機能は毛細管形態発生のプロセスに、即ち三次元開存性もしくは開口様構造の形成に寄与する。多数の新たに形成された毛細管は、その後、血管壁成熟（即ち、平滑筋細胞豊富な内膜および外膜の形成）を遂げるが、残りの毛細管は退行する（即ち、血流が欠如する場合）［ペッパー（Ｐｅｐｐｅｒ）ら，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  ４９：１３８−１６２（１９９６）；リソー（Ｒｉｓａｕ），Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：６７１−６７４（１９９７）］。
【０００７】
組織損傷に応答して、または女性生殖器内で発生する血管新生を除いて、健常成体内で内皮細胞の代謝回転が発生する可能性は極めて少ない。内皮静止期が維持されるのは外因性の負の調節因子が存在するためであると考えられるが、それは明らかに血管新生が発生しない成体組織内では正の調節因子が頻回に検出されるためである。その逆もまた真である、つまり内皮細胞の代謝回転が増加している組織内では正および負の調節因子がしばしば共存している。これは、内皮細胞活性化状態が正および負の調節因子間のバランスによって決定される「血管新生スイッチ」の概念をもたらしてきた。
【０００８】
活性化された（血管新生性）内皮では正の調節因子が優勢であるが、他方、内皮の静止期は負の調節因子の優勢によって達成かつ維持される［ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）ら，Ｃｅｌｌ，  ８６：３５３−３６４（１９９６）］。「スイッチ」の概念は、最初は腫瘍進行の状況において早期血管相から血管相への移行を説明するために使用されたが、発達的、生理的並びに病理的血管新生の状況においても適用できる。依然としてｉｎ  ｖｉｖｏでは明確には証明できてはいないが、「スイッチ」には正の調節因子の誘導および／または負の調節因子の消失が含まれているというのが最新の研究仮説である。
【０００９】
血管新生は極めて多数の生理的および病理的プロセスにおいて決定的に重要な役割を有しているので、血管新生の制御に関与する因子が鋭意研究されてきた。血管新生の調節には多数の増殖因子が関与していることが証明されている；これらには繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる。概観については例えば、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）を参照。
【００１０】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびそれらの対応するレセプター類を含む内皮細胞特異的増殖因子の特定ファミリーが主として内皮細胞増殖および分化の刺激、および分化細胞の一定の機能に対する原因となっていることが示されている。これらの因子はＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーであり、主として内皮レセプターチロシンキナーゼ類（ＲＴＫ）を介して機能すると思われる。ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子はシスチンノット・スーパーファミリーの増殖因子に属しており、これらにはニューロトロフィン類およびトランスフォーミング増殖因子βも含まれている。
【００１１】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーでは８種のタンパク質、つまり２種のＰＤＧＦ（ＡおよびＢ）、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ａに密接に関連する５種のメンバーが同定されている。ＶＥＧＦ−Ａに密接に関連する５種のメンバーは次の通りである：ルードヴィッヒ  インスティーテュート  フォー  キャンサー  リサーチ（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）およびヘルシンキ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ）による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ９６／２６７３６）号および米国特許第５，８４０，６９３号および第５，６０７，９１８号中に記載されているＶＥＧＦ−Ｂ：ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．  １５：２９０−２９８（１９９６），リー（Ｌｅｅ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１９８８−１９９２（１９９６）、およびヒューマンゲノムサイエンス社（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）による米国特許第５，９３２，５４０号および第５，９３５，５４０号に記載されているＶＥＧＦ−ＣもしくはＶＥＧＦ２：国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）号およびアチェン（Ａｃｈｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５４８−５５３（１９９８）に記載されているＶＥＧＦ−Ｄ；マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９２６７−９２７１（１９９１）に記載されている胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；およびヒューマンゲノムサイエンス社（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）号に記載されているＶＥＧＦ３。
【００１２】
各ＶＥＧＦファミリーメンバーは、それらのＶＥＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ）においてＶＥＧＦ−Ａと３０％〜４５％アミノ酸配列同一性を有している。このＶＨＤは、シスチンノットモチーフを形成する８個の保存システイン残基を含んでいる。それらの活性な生理的状態では、タンパク質はダイマーである。ＶＥＧＦファミリーの機能的特徴には、内皮細胞および関連細胞タイプについての様々な度合いのマイトジェン活性、血管透過性の誘導および血管新生およびリンパ管形成特性が含まれる。
【００１３】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ）は数種の起源から単離されたホモダイマー糖タンパク質である。ＶＥＧＦ−Ａは内皮細胞に対して高度に特異的なマイトジェン活性を示す。ＶＥＧＦ−Ａは、胎生期の血管新生における新たな血管の形成および成体期における血管新生において重要な調節機能を有している（カーメリエット（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３５−４３９（１９９６）；ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２（１９９６）；ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）およびデイヴィス‐スミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，１８；４−２５（１９９７）の中で論評されている）。ＶＥＧＦ−Ａが果たす役割の有意性は、一のＶＥＧＦ−Ａ対立遺伝子の不活化が血管構造の発達不全を原因とする胎児致死性を生じさせることを証明した試験において実証されている（カーメリエット（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３５−４３９（１９９６）；ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２（１９９６）。ＶＥＧＦ−Ａの単離および特性について概観されている；ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）ら，Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２１１−２１８（１９９１）およびコノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ），Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２１９−２２３（１９９１）を参照。
【００１４】
さらにＶＥＧＦ−Ａは単球に対する強力な化学誘引活性を有しており、内皮細胞中でプラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターを誘導することができ、さらに微小血管透過性も誘導することができる。後者の活性があるために、時として、血管透過性因子（ＶＰＦ）と称されている。ＶＥＧＦ−Ａはさらにある種の造血細胞に対して化学誘引性である。最近の文献は、ＶＥＧＦ−Ａが樹状細胞の成熟を遮断し、それにより腫瘍に対する免疫応答の有効性を減少させることを指摘している（多くの腫瘍がＶＥＧＦ−Ａを分泌する）（ガブリロヴィッチ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ）ら，Ｂｌｏｏｄ  ９２：４１５０−４１６６（１９９８）；ガブリロヴィッチ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ）ら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５：２９６３−２９７０（１９９９））。
【００１５】
血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）はＶＥＧＦ−Ａと類似の血管新生およびその他の特性を有しているが、ＶＥＧＦ−Ａとは相違する組織中で分布かつ発現する。特に、ＶＥＧＦ−Ｂは心臓では極めて強度に発現するが肺ではほんの軽度にしか発現せず、他方、ＶＥＧＦ−Ａではその逆が当てはまる（オロフソン，ビー（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  Ｂ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２５７６−２５８１（１９９６））。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、メラノーマ、正常皮膚および筋肉中でのＶＥＧＦ−ＢおよびｍＲＮＡの存在を証明している。これは、それらが多数の組織中で同時発現するという事実にもかかわらず、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｂが機能上の相違を有する可能性があることを示唆している。
【００１６】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子の比較は、ＶＥＧＦ−Ｂの１６７アミノ酸アイソフォームがグリコシル化が完全に欠けている唯一のファミリーメンバーであることを証明している。遺伝子ターゲティング研究は、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損が軽度の心臓表現型および冠動脈構造の損傷を生じさせることを証明している（ベッロモ（Ｂｅｌｌｏｍｏ）ら，  Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８６：Ｅ２９−３５（２０００））。ＶＥＧＦ−Ｂノックアウトマウスは、冠血管構造の損傷、他より小さい心臓および心臓虚血後の回復障害を有することが証明された（ベッロモ，ディ（Ｂｅｌｌｏｍｏ  Ｄ．）ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｏｎｌｉｎｅ），８６：Ｅ２９−３５（２０００））。
【００１７】
ヒトＶＥＧＦ−Ｂは、細胞レチノイン酸結合タンパク質Ｉ型（ＣＲＡＢＰ−Ｉ）と相互作用する可能性がある細胞タンパク質のスクリーニングによる、酵母コ−ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング技術（ｙｅａｓｔ  ｃｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｒａｐ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用して単離した。ヒトおよびマウスＶＥＧＦ−Ｂの両方についてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含む単離および特徴は、ルードヴィッヒ  インスティーテュート  フォー  キャンサー  リサーチおよびヘルシンキ大学による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７号、米国特許第５，８４０，６９３号および第５，６０７，９１８号、およびオロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２５７６−２５８１（１９９６）に詳細に記載されている。ヒトＶＥＧＦ−Ｂのヌクレオチド配列もまたＧｅｎＢａｎｋ登録番号第Ｕ４８８０１号で所見される。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）号、米国特許第５，８４０，６９３号および第５，６０７，９１８号の全開示は参照してここに組み込まれる。
【００１８】
ＶＥＧＦ−Ｂのマウスおよびヒト遺伝子はほぼ同一であり、どちらも約４ｋｂ範囲のＤＮＡに及ぶ。これらの遺伝子は７個のエクソンから構成されており、それらのエクソン−イントロン構成はＶＥＧＦおよびＰｌＧＦ遺伝子のエクソン−イントロン構成と似ている（グリモンド（Ｇｒｉｍｍｏｎｄ）ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：１２４−１３１（１９９６）；オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９３１０−１９３１７（１９９６）；タウンソン（Ｔｏｗｎｓｏｎ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２０：９２２−９２８（１９９６））。
【００１９】
ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３を発現するようにトランスフェクトされた細胞を使用して、内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）のチロシンリン酸化を誘導する培地の能力をスクリーニングすることによってＰＣ−３前立腺腺癌細胞系（ＣＲＬ１４３５）の馴化培地から単離した。ＶＥＧＦ−Ｃは組換えＶＥＧＦＲ−３とのアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製し、ＰＣ−３  ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。その単離および特徴はヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１５：２９０−２９８（１９９６）の中に詳細に記載されている。
【００２０】
ＶＥＧＦ−Ｄは、ハイブリダイゼーションプローブとして「Ｓｏａｒｅｓ  Ｂｒｅａｓｔ  ３ＮｂＨＢｓｔ」と命名されたヒトｃＤＮＡライブラリーから得られた発現配列タグを用いてスクリーニングすることにより、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社から市販で入手可能なヒト乳房ｃＤＮＡライブラリーから単離した（アチェン（Ａｃｈｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：５４８−５５３（１９９８））。その単離および特徴については、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）号に詳細に記載されている。第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６号には、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性フラグメントの単離についても記載されている。このフラグメントはＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸残基９３〜２０１から構成されている。
【００２１】
ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子はヒト成体において広範囲に発現するが、もちろん、至るところに発現する訳ではない。ＶＥＧＦ−Ｄは心臓、肺および骨格筋で強度に発現する。中間レベルのＶＥＧＦ−Ｄは脾臓、卵巣、小腸および結腸で発現し、より低レベルの発現は腎臓、膵臓、胸腺、前立腺および精巣で発生する。脳、胎盤、肝臓もしくは末梢血白血球からのＲＮＡ中ではＶＥＧＦ−Ｄ  ｍＲＮＡは全く検出されなかった。
【００２２】
ＰｌＧＦは（妊娠）満期の胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離した。その単離および特徴についてはマグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９２６７−９２７１（１９９１）に詳細に記載されている。現時点では、その生物学的機能は明確には判明していない。
【００２３】
ＶＥＧＦ３は結腸組織に由来するｃＤＮＡライブラリーから単離した。ＶＥＧＦ３は、ＶＥＧＦと約３６％同一性および６６％類似性を有すると言われている。ＶＥＧＦ３をコードする遺伝子の単離方法は不明であり、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）号において生物学的活性の特徴付けは開示されていない。
【００２４】
２種のタンパク質間の類似性は、それらの一方のタンパク質のアミノ酸配列および保守的アミノ酸置換とを第２タンパク質の配列と比較することによって決定され、他方同一性は保存アミノ酸置換基を含めずに決定される。
【００２５】
上記のように、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーメンバーは主としてレセプターチロシンキナーゼへの結合によって機能する。一般に、レセプターチロシンキナーゼ類は、特定の増殖因子に結合可能な細胞外ドメインと、通例はタンパク質のαへリックス部分である膜貫通ドメイン、レセプターを例えばタンパク質リン酸化によって制御することのできる膜近傍（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）ドメイン、レセプターの酵素成分であるチロシンキナーゼドメインおよび多くのレセプターにおいてチロシンキナーゼのその基質の認識および結合に関係しているカルボキシ末端テールから構成される糖タンパク質である。
【００２６】
今までに次の２種のサブクラスに属する５種の内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼが同定されている：３種の血管内皮細胞増殖因子レセプターであるＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）、およびＴｉｅファミリーであるＴｉｅおよびＴｉｅ−２（Ｔｅｋ）の２種のレセプター。これらのレセプターは特異性および親和性が相違する。これらはすべて、シグナル伝達のために必要な内因性チロシンキナーゼ活性を有している。
【００２７】
ＶＥＧＦに結合することが知られているレセプターチロシンキナーゼ類はＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３だけである。ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２はＶＥＧＦへ高親和性で結合し、さらにＶＥＧＦＲ−１はＰｌＧＦにも結合する。ＶＥＧＦ−ＢはＶＥＧＦＲ−１に高親和性で結合するが、ＶＥＧＦＲ−２または−３には結合しない（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１１７０９−１１７１４（１９９８））。ＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦＲ−３に対するリガンドであることが証明されており、これはさらにＶＥＧＦＲ−２を活性化させる（ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：２９０−２９８（１９９６））。ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３の両方に結合する（アチェン（Ａｃｈｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：５４８−５５３（１９９８））。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２に対するリガンドについてはリジェネロン・ファーマスーティカル社（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）による国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５号（ＷＯ９６／１１２６９）に記載されている。Ｔｉｅに対するリガンドはまだ同定されていない。
【００２８】
１３０−１３５ｋＤａの新規ＶＥＧＦアイソフォーム特異的レセプターは精製かつクローニングされている（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）ら，Ｃｅｌｌ  ９２：７３５−７４５（１９９８））。ＶＥＧＦレセプターは、ヘパリンに対する軽度の親和性を示す、エクソン７をコードする配列を通してＶＥＧＦ１６５アイソフォームに特異的に結合することが発見された（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）ら，Ｃｅｌｌ  ９２：７３５−７４５（１９９８））。驚くべきことに、このレセプターは初期段階の神経形態発生に関係するレセプターである、ヒトニューロピリン−１（ＮＰ−１）と同一であることが証明された。ＶＥＧＦ１６７も、またＮＰ−１に結合する（マキネン  ティ（Ｍａｋｉｎｅｎ  Ｔ）ら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７４：２１２１７−２１２２２（１９９９））。さらに、ＰｌＧＦ−２もまたＮＰ−１と相互作用すると思われる（ミグダル（Ｍｉｇｄａｌ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２２７２−２２２７８（１９９８））。
【００２９】
ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３は内皮細胞によって異なった発現をする。概して、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２は血管内皮細胞中で発現し（エルリッヒス（Ｏｅｌｒｉｃｈｓ）ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１１−１８（１９９２）；カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２０７７−２０８８（１９９３）；デュモン（Ｄｕｍｏｎｔ）ら，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０３：８０−９２（１９９５）；フォン（Ｆｏｎｇ）ら，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０７：１−１０（１９９６））、およびＶＥＧＦＲ−３は大部分は成人組織のリンパ管内皮で発現する（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）ら，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９：３５６６−３５７０（１９９５））。ＶＥＧＦＲ−３はさらに腫瘍周囲の血管系で発現する。
【００３０】
ＶＥＧＦＲは、明白な構成型の血管新生が欠如しているにもかかわらず多くの成体組織中で発現する。しかし、ＶＥＧＦＲは明白に発達中の内皮細胞内および腫瘍増殖を含む一定の血管新生関連性／依存性病理学的状態においてアップレギュレーションされる［ドゥヴォラック（Ｄｖｏｒａｋ）ら，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４６：１０２９−１０３９（１９９５）；ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，１８：４−２５（１９９７）］。ＶＥＧＦＲ−１欠損マウスおよびＶＥＧＦＲ−２欠損マウスの表現型は発達中の血管形成におけるこれらのレセプターの必須の役割を明らかにしている。
【００３１】
ＶＥＧＦＲ−１欠損マウスは、結果として異常な血管路（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｎｅｌ）の形成を生じさせる血管内への内皮細胞の非効率的な構築を原因として妊娠中期に子宮内で死亡する［フォン（Ｆｏｎｇ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：６６−７０（１９９５）］。ＶＥＧＦＲ−２欠損マウスは性交８．５および９．５日後に子宮内で死亡し、ＶＥＧＦＲ−１とは対照的に、これは内皮細胞前駆物質の発達不全が原因であると思われる［シャラビー（Ｓｈａｌａｂｙ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：６２−６６（１９９５）］。腫瘍血管新生におけるＶＥＧＦＲ−２の重要性は優性阻害アプローチ（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用することによっても明白に証明されている［ミラウアー（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６７：５７６−５７９（１９９４）；ミラウアー（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：１６１５−１６２０（１９９６）］。ＶＥＧＦＲ−３欠損マウスの表現型についてはデュモン（Ｄｕｍｏｎｔ）ら，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ＶＥＧＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−３（ＶＥＧＦレセプター３欠損マウス胎児における心血管不全），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：９４６−９４９（１９９８）の中で報告されている。ＶＥＧＦＲ−３欠損マウスは欠陥のある血管発達を原因として妊娠１２〜１４日に子宮内で死亡する。
【００３２】
先行技術における集中的な活動にも関わらず、依然としてｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を刺激する方法の要請がある。
【００３３】
発明の概要
本発明は、血管新生の刺激において有用な遺伝子療法アプローチに向けられている。本発明の１つの目的は、少なくとも、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７に対するポリヌクレオチド配列を有する第１ベクターコンストラクトおよび別のＶＥＧＦに対するポリヌクレオチド配列を含有する第２ベクターコンストラクト、好ましくは非増殖性アデノウイルスコンストラクトを用いる、他のＶＥＧＦタンパク質およびペプチドに加えてＶＥＧＦ−Ｂ１６７タンパク質またはペプチドが血管新生を刺激するために持続的な期間に渡って治療的に有意な程度まで産生させられる、血管新生を刺激するための方法を提供することである。
【００３４】
本発明の１つの実施形態に従うと、血管新生を刺激する方法は、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７またはそのフラグメントもしくは保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第１の非増殖性アデノウイルスベクターを生体に導入するステップ、および、ＶＥＧＦ−Ａ、または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第２の非増殖性アデノウイルスベクターを生体に導入するステップを備えている。この実施形態では、非増殖性アデノウイルスベクターは生体の少なくとも１個の細胞に送達されるが、標的細胞は内皮細胞またはその内皮細胞に近接する細胞のいずれかである。
【００３５】
また別の実施形態に従うと、標的細胞は血管細胞である。また別の実施形態に従うと、標的細胞は微小血管内皮細胞または大動脈内皮細胞である。
【００３６】
また別の実施形態に従うと、生体は哺乳動物、マウス、もしくはヒトであってよい。
【００３７】
また別の実施形態に従うと、各アデノウイルスベクターの１０７〜１０１３個のベクター粒子が生体内へ導入される。
【００３８】
また別の実施形態に従うと、ポリヌクレオチド配列の発現は、ベクター内に含まれているＣＭＶプロモーターによって推進される
【００３９】
本発明のまた別の実施形態に従うと、血管新生を刺激する方法はＶＥＧＦ−Ｂ１６７または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第１の非増殖性アデノウイルスベクターを生体内に導入するステップ、および、ＶＥＧＦ−Ｃ、または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換をコードするポリヌクレオチド配列を備える第２の非増殖性アデノウイルスベクターを生体内に導入するステップを備えている。この実施形態では、非増殖性アデノウイルスベクターは生体の少なくとも１個の細胞に送達されるが、標的細胞は内皮細胞またはその内皮細胞に近接する細胞である。
【００４０】
本発明のまた別の実施形態に従うと、血管新生を刺激する方法はＶＥＧＦ−Ｂ１６７または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第１の非増殖性アデノウイルスベクターを生体内に導入するステップ、および、ＶＥＧＦ−Ｄ、または、そのフラグメント、もしくは、保守的置換物をコードするポリヌクレオチド配列を備える第２の非増殖性アデノウイルスベクターを生体内に導入するステップを備えている。この実施形態では、非増殖性アデノウイルスベクターは生体の少なくとも１個の細胞に送達されるが、標的細胞は内皮細胞またはその内皮細胞に近接する細胞である。
【００４１】
非増殖性アデノウイルスコンストラクトを使用する理由は、それが導入遺伝子の有効なｉｎ  ｖｉｖｏ発現を許容することにある。このウイルスは高力価へ産生されるので、多数の細胞型をアデノウイルスで感染させることができる。これはさらにまた組換えアデノウイルスとの同時感染により２種以上の導入遺伝子の同時発現も許容する（例、ＶＥＧＦ−Ｂ  ＋  ＶＥＧＦ−Ａ）。発現はさらにまた極めて迅速で、たいていは２４〜４８時間以内である。
【００４２】
この方法は、そのような刺激を必要とする生体の標的細胞へＶＥＧＦ−Ｂ１６７および別のＶＥＧＦを送達することによる血管新生を刺激するステップを含んでいる。標的細胞には、内皮細胞もしくは内皮細胞に近接する細胞、血管内皮細胞、微小血管内皮細胞および大動脈内皮細胞が含まれるが、それらに限定されない。これらの細胞は例えばマウスもしくはヒト細胞のような哺乳動物体からのものであってよい。好ましくは、ポリヌクレオチド配列の発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって推進される。好ましくは、各アデノウイルスベクターの約１０７〜約１０１３のベクター粒子がｉｎ  ｖｉｖｏ送達される。
【００４３】
ヌードマウスは血管新生のための適切な動物モデルであることは証明されているので、ヒトにおける同様の作用を予想することができる。
【００４４】
これらの組換えアデノウイルスは、当分野においてよく知られている標準的な生理的および／または医薬的に許容し得る担体と一緒に医薬組成物として投与することができる。用語「医薬的に許容し得る」とは有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性物質であることを意味する。用語「生理的に許容し得る」とは、例えば細胞、細胞培養物、組織もしくは生体のような生物学的系と適合する非毒性物質であることを意味する。担体の特徴は投与経路に左右されるであろう。生理的および医薬的に許容し得る担体には、希釈剤、賦形剤、塩類、緩衝剤、安定剤、溶解補助剤、およびその他の当分野においてよく知られている物質が含まれる。
【００４５】
所望の配列の機能的フラグメントを使用することは本発明の範囲内である。適正な機能のために必要な配列の領域を保存し、他方では結果として生じた生成物が全長配列の機能を維持するように配列の残りの部分に対する適切な置換および／または欠失を実行するためには当分野においてよく知られている技術を使用することができる。
【００４６】
ここでの使用において、用語「保守的置換」とは、１個のアミノ酸残基の別の生物学的に類似の残基による置換を意味する。保守的置換基の例には、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシンもしくはメチオニンのような１個の疎水性残基と他の残基との置換、または例えばアルギニンとリシン、グルタミン酸とアスパラギン酸、もしくはグルタミンとアスパラギンと等のような１個の極性残基と他の残基との置換を意味する。相互に置換できる中性親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニンが含まれる。用語の「保守的置換」にはさらにまた未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用も含まれる。
【００４７】
従って、本発明の文脈においては保守的置換は当該技術において１個のアミノ酸と類似特性を有する別のアミノ酸との置換であると認識されていると理解されなければならない。代表的な保守的置換の例は国際特許出願第ＷＯ９７／０９４３３号からの下記の表１に記載されている。
【００４８】
【表１】
2004527462.tif 000003
【００４９】
あるいはまた、保守的アミノ酸はＬｅｈｎｉｎｇｅｒ［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（生化学、第二版）；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ７１−７７］によって説明されているように、下記の表２に記載したように分類することができる。
【００５０】
【表２】
2004527462.tif 000004
【００５１】
具体的な保守的置換の例は下記の表３に記載されている。
【００５２】
【表３】
2004527462.tif 000005
【００５３】
所望であれば、本発明のペプチドは例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化、もしくはリン酸化によって、または酸付加塩類、アミド類、エステル類、特に、本発明のペプチドのＣ−末端エステル類およびＮ−アシル誘導体類の作製によって改変することができる。ペプチドはさらにまた、他の成分との共有もしくは非共有複合体を形成させることによってペプチド誘導体を作製することによって改変することもできる。共有結合複合体は、ペプチドを備えるアミノ酸の側鎖上の官能基へ、またはＮ−もしくはＣ−末端で化学成分を連結させることによって調製できる。
【００５４】
上記のペプチド類を放射ラベル、蛍光ラベル、酵素（例、比色反応または蛍光反応を触媒する）、基質、固体マトリックス、または担体（例、ビオチンもしくはアビジン）を含むがそれらに限定されないレポーター基へ共役結合させることができることは予想されている。
【００５５】
図面の簡単な説明
下記において、本発明を添付の図面を参照しながらより詳細に説明する。
図１は、ＶＥＧＦ−Ｂに対するポリクローナル抗体を使用してＡｄＶＥＧＦ−Ｂ１６７により感染させた２９３ＥＢＮＡ細胞の免疫沈降のブロット図である。
図２Ａ−２Ｆは、  組換えアデノウイルスを皮下注射されたマウス耳の皮膚の切片染色の結果を示した図であり、
図２Ｂおよび２Ｅは、ＡｄＶＥＧＦを、
図２Ａおよび２Ｄは、ＡｄＬａｃＺを、
図２Ｃおよび２Ｆは、ＡｄＶＥＧＦ−Ａ＋ＡｄＶＥＧＦ−Ｂを示した図である。
図３は、血管形成の定量的結果を示した図である。
【００５６】
好ましい実施形態の詳細な説明
実施例１  ＶＥＧＦ−Ｂ１６７もしくはＶＥＧＦ−Ａを有する組換えアデノウイルスの産生
ＡｄＶＥＧＦ−Ｂ１６７ベクターを作製するために、ＰＣＲ（フォワードプライマー：５’  ＣＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＡＣＡ  ＣＴＴ  ３’（配列番号１）；リバースプライマー：５’  ＣＴＡ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  Ｔ  ３’（配列番号２）、ＢａｍＨＩ部位を含有する）によってプラスミドから全長ＶＥＧＦ−Ｂ１６７  ｃＤＮＡを増幅させ、その後ＴＡ−プラスミドｐＣＲ２．１ベクター内へクローニングした（インビトロジェン［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］社製）。
【００５７】
Ｅ．ｃｏｌｉ内での増幅およびプラスミド精製に引き続いて、ＢａｍＨＩを用いてインサートを切り出し、プラスミドｐＱＢＩ−ＡｄＣＭＶ５−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（クワンタム・バイオテクノロジーズ［Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］，  ケベック、カナダ；トランスファープラスミド）のＢａｍＨＩ部位内へクローニングした。このプラスミド内では、ｃＤＮＡ発現はＣＭＶプロモーターによって推進される。このプラスミドはさらにグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の同時発現を許容するＩＲＥＳ−エレメントも含有している。ＶＥＧＦ−Ｂの発現は、プラスミドをＣＯＳ−１細胞内へトランスフェクトすることにより検証した。
【００５８】
ＦｓｅＩを用いて上記のトランスファープラスミドを直線化させ、その後に環状アデノウイルスプラスミドであるｐＪＭ１７（マイクロビックス・バイオシステムズ社［Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．］、オンタリオ州、カナダ）を用いて２９３細胞内へコトランスフェクトした。トランスフェクションはリポフェクタミン・プラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  Ｐｌｕｓ）を用いて実施した。１４日後、細胞を採取し、冷凍−解凍によって破壊し、低速遠心分離から採取した上清を使用して新しい２９３細胞を感染させた。増幅ステップを１回繰返した。インサートの発現は、インジケーターとしてＧＦＰを使用して検証した。この後、標準プロトコールを使用して組み換えウイルスを２９３細胞中でプラーク精製した。ＧＦＰ陽性プラークを増幅し、引き続いてこれを使用してＣｓＣｌ遠心分離により精製されるストックを調製した。
【００５９】
ＡｄＶＥＧＦ−Ａベクターを作製するために、全長ＶＥＧＦ−Ａをヒルトゥネン（Ｈｉｌｔｕｎｅｎ）ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０２：２２６２−２２６８（２０００）に記載されている第１世代アデノウイルスベクター内へクローニングした。この参考文献は明示的に参照してここに組み込まれる。あるいはまた、ＶＥＧＦ−Ａの活性フラグメントまたは保守的置換を含有する全長配列もしくはフラグメント配列を使用できよう。当分野において知られている他のベクター類の調製および様々なベクター調製法の使用は本発明の範囲内である。さらに、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７もしくはＶＥＧＦ−Ａアデノウイルスベクターを作製するために使用した方法は、ＶＥＧＦ−ＣもしくはＶＥＧＦ−Ｄアデノウイルスベクターを作製するためにも使用できよう。
【００６０】
２９３ＥＢＮＡ細胞は、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の２ｘ１０７ｐｆｕを含有する無血清培地中で１時間インキュベートした。さらに、リン酸カルシウム法を使用してＶＥＧＦ−ＢをコードするｐＲＥＰ７（インビトロジェン［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］社製）プラスミド発現ベクターもしくはｐＲＥＰ７ベクターコントロールを用いて細胞をトランスフェクトした。細胞は、翌日にＳ３５メチオニンおよびシステイン（プロミックス［Ｐｒｏｍｉｘ］、アマシャム社製）を用いて６時間かけて代謝的に標識した。培地を収集し、ＶＥＧＦ−Ｂに対して産生したポリクローナル抗体を使用して標識ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質を沈降させた［オロフソン，ビー（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  Ｂ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：２５７６−２５８１（１９９６）参照］。プロテインＡセファロースに結合した沈降タンパク質をリン酸緩衝生理食塩液中で３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中に溶解させ、１２．５％もしくは１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。その後ゲルを乾燥させ、ホスホイメージャーおよびオートラジオグラフィーによって分析した。図１に示した通り、ＡｄＶＥＧＦ−Ｂ１６７を用いて感染させた、またはＶＥＧＦ−Ｂ１６７をコードするｐＲＥＣ７プラスミドを用いてトランスフェクトした細胞は約２１ｋＤの主要ポリペプチドを産生した。
【００６１】
実施例２  組換えアデノウイルスに対する血管新生応答の評価
約２ｘ１０８ｐｆｕ（プラーク形成単位）のＶＥＧＦ−Ｂ１６７およびＶＥＧＦ−Ａ組換えアデノウイルス各々を３匹のＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウス（ハーラン［Ｈａｒｌａｎ］社、オランダ）の耳５個に皮下注射した。注射後の様々な時点でマウスを屠殺し、注射部位からの皮膚を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン内に包埋した。７μｍ切片をＶＥＧＦＲ−２に対するモノクローナル抗体（カタオカ，エイチ（Ｋａｔａｏｋａ  Ｈ．）ら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，３９：７２９−７４０（１９９７））または血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１）（ＢＤファーミンジェン［Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ］社製、サンディエゴ、ＣＡ、米国、製品番号０１９５１Ｄ）に対するモノクローナル抗体を用いて染色した。
【００６２】
ＰＥＣＡＭ−１は、ＰＥＣＡＭ−１分子が１０６まで濃縮されている内皮細胞細胞間接合部の主要構成分である免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの１３０ｋＤメンバーである。ＰＥＣＡＭ−１はさらに循環血小板単球、好中球および選択したＴ細胞サブセットの表面上でも発現する。チラミドシグナル増幅法（ＴＳＡ）キット（ＮＥＮライフサイエンス［Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ］社製、ボストン、ＭＡ、米国）を使用して染色を増強した。陰性対照は一次抗体を除外することによって産生させた。結果は、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＡＸ８０顕微鏡を用いて視認し、写真を撮影した。
【００６３】
図２Ａ〜２Ｆに示されているＰＥＣＡＭ−１染色から見て取ることができるように、ＡｄＶＥＧＦ−Ｂ１６７およびＡｄＶＥＧＦ−Ａの複合トランスファーはＡｄＶＥＧＦ−Ａ単独（図２Ｂおよび２Ｅ）より強力なＰＥＣＡＭ−１陽性血管（図２Ｃおよび２Ｆ）の形成を誘導したが、他方、ＡｄＬａｃＺ（図２Ａおよび２Ｄ）は血管構造に何の作用ももたらさなかった。バーの目盛は１００μｍを表している。
【００６４】
定量のために、正方形グリッド（面積＝０．１６ｍｍ２、倍率２０倍）を使用して、ＰＥＣＡＭ−１陽性血管を倍率２００倍で計数した。平均値およびｐ値は対応のスチューデントｔ検定を使用して計算した。Ｌａｃウイルス感染対照サンプル中の血管数の標準偏差の２倍を超える平均値だけを考慮に入れた。
【００６５】
図３から読み取ることができるように、ＡｄＶＥＧＦ−Ｂ１６７およびＡｄＶＥＧＦ−Ａの複合遺伝子トランスファーは血管密度のほぼ３倍の増加を誘発し、ＶＥＧＦ−ＡはＡｄＶＥＧＦ−Ｂ１６７もしくはＡｄＬａｃＺ単独を注射した耳と比較してｐ＜０．００１で血管密度の２倍の増加を誘発した。このように、ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦ−Ａの血管新生効果を増強する。ＶＥＧＦ−Ａに対して、ＶＥＧＦ−ＣもしくはＶＥＧＦ−Ｄの全長、活性フラグメント、もしくは保守的に置換した配列を置換し、上記と同様の結果を達成することは本発明の範囲内である。
【００６６】
実施例３  本発明に従ったアデノウイルスの投与
ＶＥＧＦ−Ｂ１６７配列の全長もしくは活性フラグメントを備える第１組換えアデノウイルスを上記の通りに、または当分野において許容し得る他の方法に従って調製する。この配列に保守的置換を行うことができる。ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−ＣもしくはＶＥＧＦ−Ｄ配列の全長もしくは活性フラグメントを備える第２組換えアデノウイルスを上記の通りに、または、当分野において許容し得る他の方法に従って調製する。この配列に保守的置換を行うことができる。
【００６７】
２種の組換えアデノウイルスベクターを投与するために標的細胞を同定する。例えば、微小血管内皮細胞を標的とすることができる。２種のベクターを用いて標的細胞をトランスフェクトすることのできる方法によって２種のベクター類を標的細胞へ投与することができる。例えば、微小血管構造内へのベクターの注入のような。所望であれば、血管新生の刺激の程度を測定するために標的細胞を備える生体を監視もしくは評価することができる。
【００６８】
組換えアデノウイルスベクターを内皮細胞に近接する細胞へ導入することが望ましい場合がある。トランスフェクションに感受性であるあらゆる細胞型およびあらゆるトランスフェクション法を使用できる。これらのベクターでコードされたＶＥＧＦはトランスフェクトされた細胞から分泌され、近位内皮細胞内での所望の血管新生刺激を惹起するであろう。例えば、虚血性脚モデル、骨格筋細胞が本発明に従ったアデノウイルスベクター投与の標的とできよう。トランスフェクションに引き続いて、標的とされる骨格筋細胞はトランスフェクトされたＧＥＧＦを分泌し、近位内皮細胞中での細胞増殖および血管形成を誘発するであろう。
【００６９】
上記の説明および実施例は、単に本発明を例示するために記載されており、本発明を限定することは意図されていない。当業者であれば本発明の精神および対照を組み込んでいる開示された実施形態の修飾を思いつくことができるであろうから、本発明は添付のクレームの範囲内に含まれるすべての変形およびその等価物を含むと広範に解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＶＥＧＦ−Ｂに対するポリクローナル抗体を使用してＡｄＶＥＧＦ−Ｂ１６７により感染させた２９３ＥＢＮＡ細胞の免疫沈降のブロット図
【図２Ａ】
組換えアデノウイルスを皮下注射されたマウス耳の皮膚の切片染色の結果を示した図であり、ＡｄＬａｃＺを示す図
【図２Ｂ】
組換えアデノウイルスを皮下注射されたマウス耳の皮膚の切片染色の結果を示した図であり、ＡｄＶＥＧＦを示す図
【図２Ｃ】
組換えアデノウイルスを皮下注射されたマウス耳の皮膚の切片染色の結果を示した図であり、ＡｄＶＥＧＦ−Ａ＋ＡｄＶＥＧＦ−Ｂを示す図
【図２Ｄ】
組換えアデノウイルスを皮下注射されたマウス耳の皮膚の切片染色の結果を示した図であり、ＡｄＬａｃＺを示す図
【図２Ｅ】
組換えアデノウイルスを皮下注射されたマウス耳の皮膚の切片染色の結果を示した図であり、ＡｄＶＥＧＦを示す図
【図２Ｆ】
組換えアデノウイルスを皮下注射されたマウス耳の皮膚の切片染色の結果を示した図であり、ＡｄＶＥＧＦ−Ａ＋ＡｄＶＥＧＦ−Ｂを示す図
【図３】
血管形成の定量的結果を示した図
【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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