(57)【要約】荷電状態が相異なるイオンの分離を提供するイオン分析方法。初めに、好ましくはイオントラップ内で、実質的に同じエネルギーをもつようにイオンが熱平衡化される。次いで、荷電が小さいイオンの抜け出しは可能にするが、荷電状態がより高いイオンは保持するように、障壁高さが設定される。イオンの分離が実施されれば、一方または両方のイオン群を様々な通常の質量分析またはその他の処理ステップにかけることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオンを分析する方法において、
（１）イオン流を提供する工程、及び
（２）少なくとも第１の荷電を有する第１のイオン群の運動エネルギーと第２の、より高い、荷電を有する第２のイオン群の運動エネルギーの間の大きさを有するエネルギー障壁をイオン処理区画に提供し、よって少なくとも第１のイオン群が前記イオン区画から外に出され、前記第２のイオン群が後続の処理のために前記イオン区画内に保持される工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程（１）と（２）の間に、
（３）前記イオン間のエネルギー差が、前記第１のイオン群の排出及び前記第２のイオン群の保持の期間中の前記第１のイオン群と前記第２のイオン群の間の十分な分離を提供するに十分に小さいことを保証する工程、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（１）と（２）の間に、中性ガスとの衝突により前記イオンを熱平衡化する工程を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程(３)の後に、前記第２のイオン群を質量分析にかける工程を含むことを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン処理区画をイオントラップとして動作させる工程を含む、請求項４に記載の方法において、
前記工程（１）において、注入期間に、イオン流を前記処理区画に注入する工程、及び
前記工程（２）において、前記処理区画へのイオンの供給を終結させる工程及び前記イオン処理区画においてイオンを熱平衡化する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記イオン処理区画に四重極子ロッドセットを備える工程及び前記四重極子ロッドセット内で前記質量分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
軸方向射出により前記四重極子ロッドセットから前記第２のイオン群をスキャンアウトすることによって前記イオン処理区画において質量分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
質量分析を実施するための前記四重極子ロッドセットから前記第２のイオン群をスキャンアウトする前記工程の後に、前記イオントラップを空にするために、前記イオントラップに電圧を印加する工程を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ(３)において前記処理区画から外に出された前記少なくとも第１のイオン群に対して質量分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項１０】
多重極子ロッドセットを用いて前記質量分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
四重極子ロッドセットを用いて前記質量分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
飛行時間型質量分析計において前記質量分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
フーリエ変換質量分析計を用いて前記質量分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
３次元イオントラップ質量分析計を用いて前記質量分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記イオン処理区画をイオントラップとして動作させる工程を含む、請求項９に記載の方法において、
前記工程（１）において、注入期間に、イオン流を前記処理区画に注入する工程、及び
前記工程（２）において、前記処理区画へのイオンの供給を終結させる工程及び前記イオン処理区画においてイオンを熱平衡化する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項９に記載の方法において、
（ａ）注入期間に、前記処理区画にイオン流を注入する工程；質量分析のために、第１の荷電を有する第１のイオン群を前記処理区画から外に出させるため、エネルギー障壁を設ける工程、
（ｂ）個別の質量分析のために、より高い荷電を有する後続のイオン群を前記処理区画から外に出させるため、前記エネルギー障壁をより低いレベルに再設定する工程、及び
(ｃ)  相異なる荷電を有する複数のイオン群のそれぞれの質量分析を可能にするために前記工程(ａ)及び(ｂ)を繰り返す工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、
（ａ）前記処理区画への前記イオン流の注入を、前記工程（１）において、提供する工程、及び前記処理区画内の前記イオンが前記十分に小さいエネルギー差を有することを保証する工程、及び
（ｂ）質量分析のために所望のイオン群の全てが前記処理区画から外に出された後に、分析のための別のイオンを提供するため、前記処理区画にイオンを注入する前記工程を繰り返す工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記イオン流を前記処理区画に供給する前記工程に先だち、検体のイオン流を生成する工程と、第１の質量分析段階において所望のｍ/ｚをもつ検体イオンを質量選択する工程と、分析のために前記所望のイオンを前記処理区画に注入する工程とを含み、前記第２のイオン群の前記質量分析が第２の質量分析段階を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の質量分析段階において前記所望のイオンとして前駆体イオンを質量選択する工程、フラグメントイオンを生成するために前記前駆体イオンを衝突プロセスにかける工程、及び前記フラグメントイオン及びいかなる残余前駆体イオンも前記処理区画に送り込む工程を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２のイオン群を質量分析するため、前記第２の質量分析段階を前記処理区画内で実施する工程を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の荷電を有する前記少なくとも第１のイオン群を前記処理区画の外で質量分析する工程を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の質量分析段階を、多重極子質量分析計、四重極子質量分析計、飛行時間型質量分析計及びフーリエ変換質量分析計の内の１つで実施する工程を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の方法において：
（ａ）注入期間に、前記処理区画にイオン流を注入し、質量分析のために、第１の荷電を有する第１のイオン群を前記処理区画から外に出させるためにエネルギー障壁を設ける工程、
（ｂ）質量分析のために、より高い荷電を有する後続のイオン群を前記処理区画から外に出させるために前記エネルギー障壁をより低いレベルに再設定する工程、及び
（ｃ）相異なる荷電を有する複数のイオン群のそれぞれの質量分析を可能にするために前記工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返す工程、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析法及び質量分析装置に関する。さらに詳しくは、本発明は、荷電の異なるイオンの分離を可能にするかあるいは少なくとも促進する、質量分析手法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析法は、今では、相異なる質量対電荷比によるイオン分離により物質を分析するための十分に確立された手法である。多様な質量分析計及びイオン化法が知られている。本発明は、排他的にではないが、特にエレクトロスプレーによって生成されたイオン、さらに詳しくは、大きな有機分子に対するエレクトロスプレーイオン化法の使用に関するものである。
【０００３】
エレクトロスプレープロダクトイオンの質量分析は、低濃度の微量化合物の同定及び定量のための極めて感受性の高い手法である。特に、エレクトロスプレーイオン化法では多価イオンが生成され、限定された質量範囲でしか質量分析計による分析ができないことが、今では知られている。多くの有機化合物が、多重電荷をもつようにイオン化され得る。例えば、酵素トリプシンによるタンパク消化から形成されたペプチドの多価イオンは、特許文献１でコベイ（Covey）等により説明されているように、プロダクトイオンのＭＳ/ＭＳスキャンによる配列の判断に有用であることが示されている。プロダクトイオンスキャンは、質量分析において今では良く知られた分析法である。このプロダクトイオンスキャンでは、前駆体イオンが選択され、（通常は衝突セルへの加速により）フラグメントにされ、その後、フラグメントがスキャンされ、前駆体の構造に関する情報を与えることができる、選択された前駆体から生成されたフラグメントまたは生成物が決定される。しかし、１つの難点は、単ＭＳ探査スキャンでは、そのようなスキャンにしばしば存在する一価の化学雑音の存在により、低濃度多価ペプチドイオンの同定が困難な課題となり得ることである。前駆体イオンスキャン及びニュートラルロススキャンのようなＭＳ/ＭＳ手法(前駆体イオンスキャンは、選択されたプロダクトイオンまたはフラグメントイオンの質量対電荷比を一定に保ち、そのような選択されたプロダクトイオンまたはフラグメントイオンを生成する前駆体イオンを同定するためにスキャンし、また、ニュートラルロススキャンは、選択された前駆体イオンと選択されたプロダクト／フラグメントイオンの間に一定の質量差を維持する)は、探査スキャンにある程度の特異性をさらに導入することにより、化学雑音の問題をある程度軽減できる。しかし、このスキャンが有用であるためには試料に関してある程度の予備知識が必要であるが、この条件が必ず満たされるとは限らない。例えば、有意な前駆体スキャンを実施するには、生成され得るであろうフラグメントイオンの知識をある程度有することが必要である。したがって、多価フラグメントイオンを生成する検体の分析には特有の問題がいくつか生じる可能性がある。
【０００４】
総電荷密度が高い条件の下で高ｍ/ｚイオンを弁別するためのリニアイオントラップが報告されている。これは、与えられたＲＦ電圧すなわちトラッピングｑ値において、高ｍ/ｚイオンに対するポテンシャル井戸が低ｍ/ｚイオンに対するポテンシャル井戸より浅いという事実による［非特許文献１］。これは、２次元ラジオ周波数トラッピング電場をもつリニアイオントラップ及び３次元トラッピング電場をもつ通常のイオントラップのいずれについても当てはまる。しかし、イオントラップでは、ｍ/ｚが同じ、（所望の検体イオンであることが多い）多価イオンと（不要な化学雑音であることが多い）一価イオンとを弁別するという課題は解決されない。本発明の発明者は、与えられたｍ/ｚをもつ多価イオンの総数を同じｍ/ｚにある一価イオンの数に対して高め得ることを見いだした。したがって、これにより、通常はかなり高い濃度で存在するであろう一価の化学雑音内で低濃度多価イオンを同定することが可能になる。
【特許文献１】
米国特許第５９５２６５３号明細書
【特許文献２】
米国特許第６１７７６６８号明細書
【特許文献３】
米国特許第５８４７３８６号明細書
【非特許文献１】
トルマチェフ（Tolmachev）等，Rapid Commun. Mass Spectrom.，２０００年，第１４巻，ｐ.１９０７−１９１３
【非特許文献２】
D. Gerlich，Advances in Chemical Physics，１９９２年，第８２巻，ｐ.１−１７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ｍ/ｚが同じ多価イオンと一価イオンの分離を弁別する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、最初に、好ましくは衝突冷却により、実質的に同じエネルギーを確実にイオンに持たせ、次いでエネルギー障壁により相異なるイオンを弁別することで、単ＭＳ探査スキャンにおける多価イオンの出現を高める方法を提供する。上記工程は、イオントラップにおいて実施されることが好ましく、リニアイオントラップを利用するとさらに好ましい。本手法は、初めに、一価及び多価イオンが同じ運動エネルギーを有するレベルまでトラップされたイオンをバックグラウンドガスとの衝突により冷却させる工程を含む。続いて、リニアイオントラップの一端の、以前にはトラップを維持するために用いられた常反発ＤＣ障壁電圧が、一価イオンは抜け出すことができるが多価イオンはトラップされたままとなるレベルまで低められる。以下に詳述される実験結果は、多価イオン集団がほとんど減損せずに、トラップされた一価イオンの数が劇的に減少することを示す。本方法により、少なくともペプチド及びタンパクについて、配列情報を得ることを可能にするための、プロダクトイオン、前駆体またはニュートラルロススキャンなどの、ＭＳ/ＭＳスキャンをさらに続けて受けることができる、多価イオンフラグメントまたは生成物の迅速な同定が可能になる。
【０００７】
本発明の第１の態様にしたがえば、イオンを分析する方法であって、
（１）イオン流を提供する工程、及び
（２）少なくとも第１の荷電を有する第１のイオン群の運動エネルギーと第２の、より大きな、荷電を有する第２のイオン群の運動エネルギーの間の大きさを有するエネルギー障壁をイオン処理区画に提供し、よって、少なくとも第１のイオン群がイオン処理区画から外に出され、第２のイオン群は以降の処理のためにイオン処理区画に保持される工程、
を含む方法が提供される。
【０００８】
最も一般的な場合において、第１及び第２のイオン群のいずれか一方を、または両方を、質量分析ステップまたはその他の処理、すなわち質量分析が後に続くフラグメンテーションにかけることができる。第１のイオン群はイオントラップから外に出される必要があるから、以降の処理または質量分析はいずれもトラップの外で実施されなければならない。第２のイオン群は、トラップ内でさらに（すなわち、質量分析を実施するために、軸方向射出によってスキャンアウトすることにより）処理することもできるし、あるいは以降の処理のために別のデバイスに移すこともできる。
【０００９】
非常に多くの様々な多価イオン種が存在する場合には、エネルギー障壁を任意の数の様々なレベルに初期設定できることも理解されるであろう。例えば、一価イオンだけを排出する代わりに、一価及び二価イオンを排出し、三価及びこれより多価のイオンだけを保持することが望ましいことがあり得る。このような状況における別の選択肢は、荷電が相異なるイオン群のそれぞれを、それぞれのイオン群が個別に二次処理をうけることができるように、例えば初めに一価イオン、次いで二価イオンを射出し、以下同様に、漸次射出する、すなわち外に出すことである。
【００１０】
リニアイオントラップの外で、四重極子又はその他の多重極子ベース質量分析器、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、通常の３次元イオントラップ質量分析計、またはその他いずれかの適当な質量分析計を用いて、質量分析を実施することができる。
【００１１】
第１及び第２のイオン群の高レベル分離を達成するためには、エネルギー障壁が第２のイオン群を保持するであろうが、第１のイオン群は外に出される、すなわち第１のイオン群を抜け出させるように、イオン間のエネルギー差が十分に小さいことが保証されなければならない。したがって、本方法は、高レベル分離を提供するため十分に小さいエネルギー差を保証する工程を、工程(１)と(２)の間に含むことが好ましい。これは、中性ガスとの衝突によりイオンを熱平衡化することで達成されることがさらに好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明に対する理解を深め、本発明がどのように実施され得るかをさらに明確に示すため、ここで、例として添付図面を参照する。
【００１３】
初めに図１を参照すると、全体として参照数字１０で指定される、通常の３連四重極子質量分析計装置が示されている。イオン源１２，例えばエレクトロスプレーイオン源がカーテンプレート１４に向けられるイオンを生成する。カーテンプレート１４の背後には、公知の方法でオリフィスを画定するオリフィスプレート１６がある。
【００１４】
カーテンプレート１４とオリフィスプレート１６の間にカーテンチャンバ１８が形成され、カーテンガス流が質量分析計の分析区画への不要な中性種の流入を減じる。
【００１５】
オリフィスプレート１６の次に、スキマープレート２０がある。オリフィスプレート１６とスキマープレート２０の間に中間圧チャンバ２２が画定され、このチャンバの圧力は一般に２Ｔｏｒｒ(約２.７×１０２Ｐａ)程度である。
【００１６】
イオンはスキマープレート２０を通過して、参照数字２４で示される第１の質量分析計チャンバに入る。このチャンバ２４には、イオンを収集し集束させるための四重極子ロッドセットＱ０が設けられている。チャンバ２４はイオン流からさらに残存溶媒を抜き取るのに貢献し、一般に７ｍＴｏｒｒ(約０.９Ｐａ)の圧力下で動作する。チャンバ２４は質量分析計の分析区画へのインターフェースを提供する。
【００１７】
第１の四重極子間障壁すなわちレンズＩＱ１が主質量分析計チャンバ２６からチャンバ２４を分離し、イオンのためのアパーチャを有する。四重極子間障壁ＩＱ１に隣接して、短い“スタブ”ロッドセット、すなわちブルベーカーレンズ２８がある。
【００１８】
前駆体イオンの質量選択のため、第１の質量分解四重極子ロッドセットＱ１がチャンバ２６に設けられている。ロッドセットＱ１に続いて、第２の四重極子ロッドセットＱ２を収める衝突セル３０があり、衝突セル３０に続いて、第２の質量分析ステップを実施するための第３の四重極子ロッドセットＱ３がある。
【００１９】
最終すなわち第３の四重極子ロッドセットＱ３は主四重極子チャンバ２６にあり、チャンバ２６内の圧力は一般に１×１０−５Ｔｏｒｒ(約１.３×１０−３Ｐａ)である。図示されるように、第２の四重極子ロッドセットＱ２は、第２の四重極子ロッドセットＱ２をより高い圧力に維持できるように、衝突セル３０を形成する外囲器内に収められる。既知の態様では、この圧力は検体に依存し、５ｍＴｏｒｒ(約０.７Ｐａ)とすることができる。四重極子間障壁すなわちレンズＩＱ２及びＩＱ３が衝突セル３０の両端に設けられている。
【００２０】
Ｑ３をでたイオンは出射レンズ３２を通過して検出器３４に向かう。図１の描写が簡略化されており、装置を完成するために様々な付加要素が備えられるであろうことが、当業者には理解されるであろう。例えば、装置の様々な要素にＡＣ及びＤＣ電圧を供給するために様々な電源が必要である。さらに、上述した所望のレベルに圧力を維持するために、ポンプ排気装置または機構が必要である。
【００２１】
図示されるように、ＲＦ及びＤＣ分解電圧を第１の四重極子ロッドセットＱ１に供給するために電源３６が設けられている。同様に、第３の四重極子ロッドセットＱ３から軸方向にイオンをスキャンアウトさせるための駆動ＲＦ及び補助ＡＣ電圧を第３のロッドセットＱ３に供給するために、第２の電源３８が設けられている。衝突セル３０内を所望の圧力に維持するため、衝突ガスが、参照数字４０で示されるように、衝突セル３０に供給される。
【００２２】
図１の装置は、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）／ＭＤＳＳＣＩＥＸ ＡＰＩ ２０００型３連四重極子質量分析計に基づくものである。本発明にしたがい、第３の四重極子ロッドセットＱ３は、特許文献２に開示されているような、軸方向スキャン及び射出を実施できる能力をもつリニアイオントラップ質量分析計としてはたらくように改修される。
【００２３】
特許文献２に詳述される標準スキャン機能には、リニアイオントラップとしてのＱ３の動作が含まれる。検体イオンがＱ３に通され、トラップされて、冷却される。次いで、イオンは出射レンズ３２を通して検出器３４に向けて質量選択的にスキャンアウトされる。イオンの径方向永年周波数がロッドセットＱ３に印加される双極性補助ＡＣの周波数と一致するときに、リニアイオントラップ出射口のフリンジ電場における径方向イオン運動と軸方向イオン運動の結合によって、イオンが射出される。
【００２４】
上記のスキャン機能に対する通常のタイミング図が、図２に示される。初めの注入段階においては、ＩＱ２及びＩＱ３のＤＣ電圧が、参照数字５０及び５２で示されるように、低電圧に維持され、同時に出射レンズ３２が高ＤＣ電圧５４に維持される。これにより、イオンがロッドセットＱ１及びＱ２を通過してＱ３に入ることができ、Ｑ３は、イオンをＱ３から出させないイオントラップとして機能する。この時点において、Ｑ３に印加される駆動ＲＦ及び補助ＡＣ電圧は、図２の参照数字５６及び５８に示される低電圧に維持されている。注入期間は一般に５〜２５ミリ秒(ｍｓ)間持続する。
【００２５】
注入期間に続いて冷却期間があり、冷却期間の間は、イオンをそれ以上通過させないため、ＩＱ２及びＩＱ３の電圧は参照数字６０及び６２に示されるレベルまで高められる。出射レンズ３２の電圧は電圧５４に維持される。したがって、イオンは完全にＱ３内にトラップされ、Ｑ３からのいずれの方向への出射も妨げられており、四重極子電場によって径方向にも閉じ込められている。四重極子ロッドセットＱ３に印加される駆動ＲＦ及び補助ＡＣ電圧はレベル５６及び５８に維持される。この冷却期間は１０〜５０ミリ秒間持続する。
【００２６】
イオンが実質的に同じエネルギーまで冷却されると、イオンは質量スキャン期間においてスキャンアウトされ、質量スキャン期間の間、レンズＩＱ２及びＩＱ３にかかる電圧は、高遮断電圧レベル６０及び６２に維持され、出射レンズ３２は電圧レベル５４に維持される。これらの電圧は、通常、イオンをトラップしておくに十分である。
【００２７】
しかし、特許文献２によれば、上記の質量スキャン期間の間、四重極子ロッドセットＱ３に印加される駆動ＲＦ及び補助ＡＣ電圧は、参照数字６４及び６６に示されるようにスキャンされる。これにより、イオンは、イオンレンズ３２を通して検出器３４に向けて質量選択式にスキャンアウトされる。
【００２８】
質量スキャン期間終了時に、駆動ＲＦ及び補助ＡＣ電圧は、参照数字６８及び７０で示されるようにゼロに戻される。同時に、参照数字７２及び７４で示されるように、レンズＩＱ２及びＩＱ３に印加されるＤＣ電位すなわち障壁がゼロまで下げられる。これを受けて、参照数字７６で示されるように、出射レンズ３２にかかる電圧がゼロまで下げられる。これは、Ｑ３で形成されるイオントラップから全てのイオンを外に出すはたらきをする。
【００２９】
冷却期間において、径方向に印加されるＲＦ電圧とデバイスの両端、すなわちレンズすなわち障壁ＩＱ３及び出射レンズ３２に印加されるＤＣ障壁により、イオンは、Ｑ３で形成されるリニアイオントラップ内にトラップされる。イオンがリニアイオントラップにトラップされると、イオンは多数回の衝突をうけ、トラップされたイオンの運動エネルギーが、ＲＦ電場からのエネルギーならびに周囲の中性ガスの温度によって決まるレベルまで、エネルギーを散逸する。この熱平衡化過程に必要な時間は、バックグラウンドガス密度及びバックグラウンドガスとのイオンの衝突断面積によって決まる。非常に低いバックグラウンドガス圧においてさえ、十分な時間が与えられれば、トラップされたイオン集団は熱平衡に達する。
【００３０】
トラップされた一価及び多価イオンを含むイオン集団が熱平衡に達すると、リニアイオントラップの両端における実効ＤＣ障壁高さはイオンの荷電状態に依存する。イオンの運動エネルギーが、イオンの荷電状態に印加反発電圧を乗じた値より大きければ、すなわち：
【数１】
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【００３１】
であれば、イオンは抜け出すであろう。ここで、ｍはイオンの質量、ｖはイオンの速度、ｑはイオンの荷電状態、Ｖは印加反発ＤＣ電圧である。
【００３２】
例えば、１０ボルトのＤＣ障壁高さは、一価イオンには１０ボルトの反発障壁として、二価イオンには２０ボルトの反発障壁として、また三価イオンには３０ボルトの障壁として見える。リニアイオントラップの一端又は両端に印加されるＤＣ電圧が、熱平衡化されたトラップイオン集団の運動エネルギーと同等になるレベルまで下げられれば、荷電状態に依存する態様で抜け出すイオンがあるであろう。例えば、リニアイオントラップＱ３のＩＱ３及び出射レンズ３２の内の１つに印加されるＤＣトラップ電圧が、１.５電子ボルトの運動エネルギーまで熱平衡化された、様々な荷電状態にあるイオンの集団に対して１ボルトまで下げられれば、荷電状態が高いイオンほど、印加された１ボルトの反発ＤＣ電圧による、比例して高くなる実効障壁を見るから、一価イオンが優先的にリニアイオントラップから抜け出し、荷電状態がより高いイオンの相対濃度を高めるであろう。反発障壁高さの最適化により、一価イオンが支配的トラップ種であった元のイオン集団から、一価イオンのほとんどが除去されるという結果を得ることができる。
【００３３】
トラップされたイオンの集団の特徴は、個々のイオンのエネルギーではなく、エネルギー分布により定められることがわかる。完全に熱平衡化されていれば、このエネルギー分布は、ＲＦ電場からのエネルギーに加えて、リニアイオントラップ内の中性ガスの温度で特徴づけられる、マクスウエル−ボルツマン分布にほぼ一致する。これに含まれる意味は、トラップされたイオンのそれぞれが互いに若干異なる運動エネルギーをもつであろうということである。したがって、電荷状態がより低いイオンのリニアイオントラップからの完全な除去が室温で達成され得ることはないであろう。しかし、一価イオンに相対的な、電荷状態がより高いイオンの増大はおこるであろう。ある程度の荷電状態分離を実施するためには、リニアイオントラップ内にトラップされたイオンの集団が完全に熱平衡化される必要はない。しかし、多価イオンは一価イオンより一般にエネルギーが高いであろうから、多価イオン数の一価イオンに対する相対的増大はそれほど大きくはならないであろう。次に図３を参照すれば、図３は、１０ｆｍ/マイクロリットル(μＬ)の、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)トリプシン消化物の単ＭＳ探査スキャンを示している。このスペクトルは、イオン源からのイオンのほとんどをＱ３イオントラップに通過させるために、Ｑ１四重極子ロッドセットをＲＦ限定モードで動作させて得られたものである。Ｑ２衝突セルは、Ｑ３のトラップ効率を高めるため、窒素でほぼ５ｍＴｏｒｒに維持し、質量分析計に沿う電位は、有意ないかなるフラグメンテーションもおこらない、所望のイオン運動を与えるように選んだ。したがって、Ｑ１とＱ２の間のＤＣ電圧オフセットは、Ｑ３のトラップ効率を最大化するために、１０Ｖより低い値に維持した。図３の質量スペクトルは、多くの一価イオン種の存在を示し、容易には多価ペプチド質量ピークを認識できない。
【００３４】
ここで、図２と同様であるが、本発明にしたがって修正されたタイミング図を示す図４を参照する。簡単及び簡潔のため、図４の同様の要素には図２と同じ参照数字が与えられ、それぞれの期間の説明は繰り返されない。
【００３５】
図４のタイミング方式は図２と同じ４つの期間を有する。すなわち、図４のタイミング方式には、その間にイオンがＱ１及びＱ２を通過してＱ３に入る初期注入期間、その間にイオンがＱ３にトラップされて、ほぼ一様なレベルまで冷却される冷却期間があり、タイミング図の後半には、質量スキャン期間及び排出期間がある。付け加えられているのは、参照数字８０で示される、分離すなわち部分的排出期間である。この期間の間は、ＩＱ３レンズに印加されるＤＣ電圧すなわち障壁が、トラップされている一価イオンは抜け出すことができるが、多価イオンはＱ３のリニアイオントラップ内に保持するレベルまで低められる。上で説明したように、イオンの様々な荷電のため、またイオンはほぼ同じエネルギーまで冷却されているから、これによって、不要な一価イオンをイオントラップから排出する一方で、所望の多価イオンを保持することが可能になる。
【００３６】
ＩＱ３又は出射レンズ３２のいずれかにかかる電圧を下げることにより、Ｑ３にあるイオントラップからイオンを排出することが可能であることに注意されたい。イオン検出器の寿命を縮める、イオンによるイオン検出器打撃が防止されるから、ＩＱ３にあるポテンシャル障壁を低めることが望ましい。
【００３７】
本発明にしたがう相対多価イオン数増大スキャンは、この場合もＱ３イオントラップをエレクトロスプレーイオン源からのイオンでＱ３イオントラップを満たし、Ｑ３イオントラップ内にトラップされたイオンの集団を熱平衡化させて、次いでＩＱ３障壁が図４の参照数字８０で示されるように低められる“分離”すなわち“一部排除”ステップを提供することにより、実施した。ここでも、入ってくるイオンのエネルギーに対して出射レンズ３２を適当な反発電圧に維持しながら、１００〜１０００ｍｓの間、ＩＱ３レンズに印加されるＤＣ電圧を下げることにより、イオンをＱ３リニアイオントラップに通した。イオンをＱ３イオントラップ内にトラップし、先と同様に、１０〜１５ミリ秒の範囲の時間をかけて、Ｑ３リニアイオントラップ内で、残留バックグラウンドガスとの衝突により、イオンを冷却した。図４の８０における分離ステップは、ＩＱ３に印加される反発ＤＣ電圧を、一価イオンは抜け出すことができるが荷電状態がより高いイオンはトラップされたままとなるレベルまで、１〜５０ミリ秒間、下げることにより、達成した。トラップ内イオンの質量分析を１００〜１０００ミリ秒かけて実施した。この場合も、最終ステップでは、持続時間が５ｍｓの排出ステップにおいて、いかなる残留トラップイオンも放出すなわち排出した。
【００３８】
相対多価イオン数増大スキャンの実施により、図３と同じ１０ｆｍ/マイクロリットルのＢＳＡ消化物溶液に対して、図５に示される探査質量スペクトルが得られる。図５では、スペクトルの主要な質量ピークの全てが、非常に低いレベルの一価雑音イオンから容易に弁別される、二価のＢＳＡペプチドイオンによる。すなわち、相対多価イオン数増大スキャンモードから得られるデータは、図３の通常の単ＭＳ探査スキャンよりかなり高い信号対雑音比を示し、多価ペプチドイオンの非常に容易な同定を可能にする。
【００３９】
注目するイオンが同定されれば、図６に示されるように、選択されたペプチドイオンについて、通常のプロダクトイオンＭＳ/ＭＳスキャンを行うことができる。図６は、ｍ/ｚ＝４６４に位置する二価のＢＳＡトリプシン消化ペプチドイオンを選択し、Ｑ１とＱ２の間の加速によりｍ/ｚ＝４６４の前駆体イオンをフラグメント化し、フラグメント及び残留前駆体イオンをＱ３イオントラップにトラップし、最後に、トラップされたイオンを質量選択スキャンして検出器に送ることにより得られる、プロダクトイオン質量スペクトルである。
【００４０】
相対多価イオン数増大スキャンモードすなわち本発明の方法は、質量選択可能なリニアイオントラップを用いる装置に限定されない。直線または湾曲多重極子イオントラップにイオンをトラップすることができる能力を有するいかなる質量分析計システムも用いることができる。本発明の別の実施のわかりやすい例は、図７に簡略に示されるような、Ｑ-ｑ-飛行時間(ＴＯＦ)型縦連質量分析計のＱ２衝突セルの使用である(Ｑは質量分析区画を表し、ｑは衝突セルを表す)。指定されたフィル時間の間、ＩＱ２に印加される電圧を下げる一方でＩＱ３を十分に高い反発ＤＣ電圧に維持することにより、Ｑ２リニアイオントラップ内にイオンをトラップすることができる。次いで、イオン集団をＱ２内にトラップするために、ＩＱ２に印加される電圧が高められる。通常のＱ２衝突セル内のｍＴｏｒｒ台(数１００Ｐａ)の圧力により、Ｑ２リニアイオントラップ内のイオンは迅速に熱平衡化される。次に、ＩＱ２，ＩＱ３または両レンズに印加される反発ＤＣ障壁が、荷電状態がより低いイオンが抜け出せるレベルまで低められる。次いで、通常の質量分析のために、Ｑ２リニアイオントラップ内の残余トラップイオン集団がパルス化されてＴＯＦ型質量分析計に向けて送り出され、荷電状態がより高いイオンの出現が強められた質量スペクトルが得られる。
【００４１】
Ｑ-ｑ-ＴＯＦ型分析計は非常に迅速な全質量スペクトルを提供するから、ＩＱ３に印加される反発ＤＣ障壁を段階的に低めることにより、先にＱ２リニアイオントラップ内にトラップされていたイオンの全てを同定することができる。最初に抜け出るイオンは一価イオンであり、続いて二価イオン、さらに多価のイオンが続くことになろう。ＩＱ３に印加される反発ＤＣ電圧の減少レートがＴＯＦスキャン時間より緩やかであれば、ＩＱ３障壁高さのそれぞれの値において質量スペクトルを得ることができる。したがって、Ｑ２イオントラップ内にトラップされていたイオンで無駄になるイオンはないであろうし、荷電状態分離が達成されたことになるであろう。
【００４２】
Ｑ-ｑ-ＴＯＦ型分析計を用いる荷電状態分離のための方法の例が図８に示される。ここでは、ウシ血清アルブミントリプシン消化物からエレクトロスプレーで生成されたイオンをＱ２にトラップし、次いでＩＱ３に印加される電圧の段階的低下により抜け出させた。８.５ボルトのＤＣオフセットをＱ２に印加して、ＩＱ３を９.７ボルトから８.５ボルトまで下げた。すなわち、本実験にかかった時間内にＤＣ障壁高さは１.２ボルトから０ボルトまで一定レートで低められた。トラップされたイオンの集団をＩＱ３方向に集結させるため、軸方向電場を印加した。図８は総イオン信号をＩＱ３電圧が低められていった時間の関数として示す。
【００４３】
図示されるように、ＩＱ３の電圧が漸次低下するとともに、イオンが増率しながら抜け出し初め、ほぼ０.２７秒でピークに達し、以後は減少してほぼ０.５秒で最小値に達する。これは、基本的に、抜け出してきている一価イオンである。０.５０秒の後、障壁をさらに低めていくと、丸で囲まれた領域で示されるように、別の小さなピークが現れる。これは、基本的に、トラップから抜け出してきている二価イオンである。
【００４４】
図９は、図８の全イオン集団に対する和分ＴＯＦ質量スペクトルを示す。この質量スペクトルは一価及び多価イオンからなる。図９にある挿入図は、ｍ/ｚ＝５３５〜５９５の領域の拡大図であって、この質量スペクトルの輻輳した性質を示している。
【００４５】
図１０は、図８の全イオン信号の丸で囲まれた部分から得られた質量スペクトルを示す。このスペクトルはほとんど多価イオンからなり、一価イオンからの寄与は極めてわずかである。図１０にある挿入図は、図９で強調された領域と同じｍ/ｚ＝５３５〜５９５の質量範囲におけるスペクトルの単純化を示す。図１０の挿入図で顕著なイオンは、多価イオンだけである。図９の質量スペクトルではこれらの多価イオンを同定するのは困難であったであろう。
【００４６】
荷電状態がより低いイオンを抜け出させるＤＣ障壁は、単純なアパーチャレンズとは別のイオン光学素子で形成することができる。ＤＣ障壁は、四重極子またはブルベーカーレンズのような別の多重極子デバイスに適当なＤＣ障壁を与えることにより形成することができる。ＤＣ障壁は、ガーリッチ（Gerlich）によって実際に示された非特許文献２のように、リニア多重極子イオントラップの周りに配置された円筒リング電極によっても形成される。これらのイオン光学素子は、単純なアパーチャレンズの代わりに、あるいは単純なアパーチャレンズに付加して用いることができる。
【００４７】
ＤＣ障壁は、リニアイオントラップを定めるために用いられる、適切な形状につくられたロッド自体を用いて、あるいは特許文献３でトムソン(Thomson)及びジョリッフェ(Jolliffe)により説明されるようにリニアイオントラップロッド間に挿入される補助電極により、形成することもできる。これらの手法は、リニアイオントラップ自体内に連続ＤＣ障壁すなわち電場を形成する機会を提供し、より効率的な荷電状態弁別を与えることができる。
【００４８】
いくつかの用途に対しては、イオントラッピングが必要にならない場合もあり得る。イオントラッピングは、先の説明では、全てのイオンを実質的に同じエネルギーレベルまで熱平衡化すなわち冷却するに十分な時間を確保するために提供される。ある種の質量分析計システムでは、これを連続流過デバイスで達成することが可能であり得る。これには、例えば、冷却区画通過時間及び衝突回数が、エネルギー障壁が与えられる冷却区画の終端において全イオンが実質的に熱平衡化されていることを保証するに十分であることが必要であろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明とともに用いるための３連四重極子の質量分析計の略図である
【図２】図１の質量分析計内の様々な位置における、通常動作時の電圧変化を示すタイミング図である
【図３】図１の質量分析計を利用する、単ＭＳモードにおける、単ＭＳ探査スキャンを示す
【図４】本発明にしたがう、図１の装置の電圧に対するタイミング図を示す
【図５】図３と同様であるが、多価イオンを一価イオンから分離する、図４にしたがって動作する質量分析計による単ＭＳ探査スキャンを示す
【図６】本発明にしたがう例示的なＭＳ/ＭＳスキャンを示す
【図７】本発明とともに用いるためのＱ-ｑ-ＴＯ型Ｆ質量分析計を簡略に示す
【図８】ＩＱ３レンズ電圧を９.７ボルトから８.５ボルトに低めながら得られた、Ｑ-ｑ-ＴＯＦ型分析器の総イオン信号を示す
【図９】図８の総イオン信号を含む和分質量スペクトルを、ｍ/ｚ＝５３５から５９５までの拡大図である挿入図とともに示す
【図１０】図８の丸で囲んだ領域の和分質量スペクトルを、ｍ/ｚ＝５３５から５９５までの拡大図であり、一価イオンが弁別されて多価イオンだけが残されていることを示している挿入図とともに示す
【符号の説明】
【００５０】
１０    ３連四重極子質量分析計
１２    イオン源
１４    カーテンプレート
１６    オリフィスプレート
１８    カーテンチャンバ
２０    スキマープレート
２４，２６    質量分析計チャンバ
２８    ブルベーカーレンズ
３０    衝突セル
３２    出射レンズ
３４    検出器
３６    ＲＦ及びＤＣ分解電圧電源
３８    駆動ＲＦ及び補助ＡＣ電圧電源
４０    衝突ガス
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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