(57)【要約】ポリ［（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−グルタミン］（ＰＨＥＧ）のようなポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸誘導体）又はポリ（アミノ酸類似化合物）の脂質結合体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの疎水性無極部位と親水性極性ヘッド基からなる両親媒性脂質と、Ｎ−及びＣ−末端基を有するポリマー又はそのモノマー前駆体とから得ることができる脂質−ポリマー結合体であって、該ポリマーがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸誘導体）又はポリ（アミノ酸類似化合物）であり、該脂質が該ポリマーのＮ又はＣ末端基に結合しており、該ポリマーが以下の式：
-［ＮＨＣＨＲ（ＣＨ2）mＣＯ］n‐
（式中、
‐Ｒは、-H, -CH3, -CHCH3OR1, -(CH2)xOR1, -(CH2)x-CO-NHR1, -(CH2)x-NH-CO-R1, -(CH2)x-SOyCH3又は-(CH2)xCOOHと定義され
‐Ｒ1は水素又は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル基で、１個以上の水酸基又は１個のジ（Ｃ1−Ｃ4）アルキルアミン基で置換されており、
ｘは、０〜４、
ｍ＝１又は０、
ｙ＝１又は２）
で表される脂質−ポリマー結合体。
【請求項２】
該両親媒性脂質が、リン脂質、糖脂質、セラミド、コレステロール及びその誘導体、飽和又は不飽和の分岐又は直鎖の炭素数８〜１００のモノ又はジアルキルアミン、アリールアルキルアミン、シクロアルキルアルキルアミン、アルカノール、アルデヒド、カルボハライド又はアルカノイック酸、及びこれらの無水物からなる群から選択され、炭素原子の総数が２５以上である請求項１記載の結合体。
【請求項３】
該両親媒性脂質が少なくとも２つの疎水性無極部位を有する請求項２記載の結合体。
【請求項４】
該両親媒性脂質が、１−ヘプタデシルオクタデシルアミン、Ｎ−スクシニルジオクタデシルアミン及びジステアリルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される請求項３記載の結合体。
【請求項５】
該ポリマーの水におけるχ−パラメーターが、０．６５以下、好ましくは０．５以下である請求項１〜４のいずれか１項記載の結合体。
【請求項６】
該ポリマーが、α−アミノ酸及びその誘導体又は類似化合物からなる請求項１〜５のいずれか１項記載の結合体。
【請求項７】
該ポリマーが、生理的ｐＨ範囲４〜８において実質的な量の荷電基を含まない請求項１〜６のいずれか１項記載の結合体。
【請求項８】
該ポリマーが、生理的ｐＨ値４〜８において中性であるか又は中和されているアミノ酸モノマー、アミノ酸類似化合物モノマー又はアミノ酸誘導体モノマーからなる請求項７記載の結合体。
【請求項９】
該ポリマーの分子量が500〜75,000、好ましくは2,000〜15,000である請求項１〜８のいずれか１項記載の結合体。
【請求項１０】
該ポリマーが生分解性である請求項１〜９のいずれか１項記載の結合体。
【請求項１１】
該ポリマーが、ポリ［（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）］−Ｌ−グルタミンである請求項１記載の結合体。
【請求項１２】
該ポリマーが、ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−アスパラギンである請求項１記載の結合体。
【請求項１３】
該ポリマーがポリ（Ｄ，Ｌ−メチオニンスルホキシド）である請求項１記載の結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質−ポリマー結合体及びその調製と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質−ポリマー−結合体はよく知られており、様々な異なる用途に使用されている。その中の一つが、リポソーム、ニオソームやリバース小胞（reversed vesicles）のような二分子膜小胞系、ミセル系、ナノカプセル、ナノスフェア等のコロイド状担体組成物への包含である。このようなコロイド状担体組成物のなかでよく知られた代表的なものは、リポソームで形成されている。以後、特にリポソームについて言及するが、本明細書における説明、開示及び教示は、他のコロイド状担体組成物にも同様に関わるということを念頭においておかなければならない。
リポソームはコロイド状担体粒子のグループに属し、水性相を封入した一つ以上の同心円状の脂質二分子膜からなる微細な小胞である。その大きさ、表面電荷、脂質組成物、二分子膜流動性という点における構造上の汎用性、また、ほとんどすべての薬物を封入することができるという点から、薬物送達系としてのリポソームの重要性は容易に理解されていた。しかしながら、リポソームが静脈内に注入されると、リポソームは単核食細胞系（ＭＰＳ）によって異物粒子として認識され、肝臓、脾臓及び骨髄のような食細胞の多い器官へと循環系から容易に消失する。この作用を抑制するいくつかの可能性が明確にされてきた。例えばリポソームの粒子径を小さくしたり、リポソームの表面電荷を変更することである。また、もう一つは、リポソームの表面に特定の親水性ポリマー成分を導入してリポソームを表面修飾することに関する開発で、この親水性の基が粒子表面でのタンパク質の吸着をおさえるのである。その結果、こうしてできたリポソームはＭＰＳの細胞による認識を免れ、総循環における滞留時間が長くなる。リポソームの表面修飾のよく知られた例として、脂質誘導体のリポソーム組成物を調製する際に親水性ポリマーのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させる例が挙げられる。通常、このポリマーは、疎水性部位で末端が改質されており、この疎水性部位はホスファチジルエタノールアミン誘導体又は長鎖脂肪酸の残基である。ポリエチレングリコール自体がかなり安定したポリマーであり、タンパク質粘着を阻止し、生理学的条件下では酵素による劣化又は加水分解による劣化をうけないポリマーである。血漿半減期を伸ばし食細胞が多い器官への集積を減らすという点に関して良好な結果が得られ、ＰＥＧで表面修飾されたリポソームの静脈内投与は様々な種類の動物、そして人間にも行われた（非特許文献１）（非特許文献２）（非特許文献３）。ドキソルビシンを含有した上記のようなリポソーム製剤に対して市場の認可もでている。
【０００３】
一方で、長期循環性(long circulating)リポソームにポリエチレングリコールポリマーを使用することによる短所にもいくつか直面することになった。ＰＥＧをグラフトしたリポソームは非生分解性であるため、大食細胞や皮膚に集積することが懸念される。ＰＥＧリポソームを二度目に注入すると、長期循環性が失われていること（迅速なクリアランス）がわかった（非特許文献４）。ＰＥＧ−リポソームを患者に使用した最近の研究によると、ＰＥＧ−リポソームが急性の副作用（顔面紅潮、胸部圧迫、息切れ、血圧の変化）を誘発する可能性があり、ＰＥＧ−リポソーム処方の投与（注入）が終了するとすぐにそれらの副作用は消えることがわかった。最近のデータでは、副作用の誘発は補体活性のしわざであると指摘されている（非特許文献５）。今のところ、ＰＥＧ−リポソームを基本とした市販の製剤は水性懸濁液製剤である。一般的なリポソーム水性懸濁液製剤やＰＥＧ−リポソームの貯蔵寿命はかなり限界があることはよく知られている。こうした製剤のビヒクル又は分散媒の取り除き方についての技術もいくつか知られており、例えば、噴霧乾燥、ダイアフィルトレーション、回転蒸発等、さらに好ましくは凍結乾燥が挙げられる。近年、テクネチウムキレート化剤ヒドラジノニコチンアミドを含ませＰＥＧ−リポソームの貯蔵寿命を改善して長くする凍結乾燥法が提案された（非特許文献６）。しかし、結果とこの技術のリポソーム製剤への適用性についてはさらに調査研究する必要がある。
【０００４】
ポリエチレングリコールの使用には欠点があることから、それに代わるポリマーを探すことに研究者たちは駆りたてられた。リポソームに結合するために小胞形成脂質で誘導体化するのに適した候補として多くのポリマーが提案された（特許文献１参照）。親水性を有する水溶性ポリマーのポリビニルピロリドン、ポリアクリロイルモルフォリン、ポリ２−メチル−２−オキサゾリン、ポリ２−エチル−２−オキサゾリン、ポリアクリルアミド及びポリグリセロールは、静脈内投与後のリポソームの循環時間をある程度長くすることがわかった。しかしながら、そのような脂質ポリマー結合体は、既知の脂質−ＰＥＧ−結合体にまさる利点がなかったということが主な理由で、今に至るまで市販の薬物製剤の分野に適用されなかった。そのため、脂質で誘導体化してリポソームのようなコロイド状担体組成物中に結合できるポリマーであって、長期循環性を有しさらにＰＥＧよりも優位な点、たとえば生分解性を有するポリマーを見つける必要が依然としてある。
【０００５】
【特許文献１】
EP-0688207
【非特許文献１】
Storm G., Belliot S.O., Daernen T., Lasic D.D.: Surface modification of nanoparticles to oppose uptake by the mononuclear phagocyte system in Adv. Drug delivery Rev. 17, 31-48, (1995)
【非特許文献２】
Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J.C.: Long-circulating andtarget-specific nanoparticles; theory to practice in Pharmacol. Rev. 53, 283-318, (2001)
【非特許文献３】
Boerman O.C., Dams E.T., Oyen W.J.G., Corstens F.H.M., Storm G.: Radiopharmaceuticals for scintigraphic imaging of infection and inflammation in Inflamm. Res. 50, 55-64, (2001)
【非特許文献４】
Dams E.T., Laverman P., Oijen W.J., Storm G., Scherphof G.L., Van der Meer J.W., Corstens F.H., Boennan O.C.: Accelerated blood clearance and altered biodistribution of repeated injections of sterically stabilized liposomes in J. Pharmacol. Exp. Ther. 292, 1071-1079, (2000)
【非特許文献５】
Szebeni J., Baranyi L., Savay S., Lutz H., Jelezarova E., Bunger R., Alving C.R.: The role of complement activation in hypersensitivity to Pegylated liposomal doxorubicin (Doxil) in J. Liposome Res. 10, 467-481, (2000)
【非特許文献６】
Laverman P., van Bloois L., Boerman O.C., Oyen W.J.G., Corstens F.H.M., Storm G.: Lyophilisation of Tc-99m-HYNIC labelled PEG-liposomes in J. Liposome Res. 10(2&3), page 117-129 (2000)
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
脂質−ポリマー結合体が提供されるが、脂質−ポリマー結合体は、少なくとも１つの疎水性無極部位と親水性を有する極性ヘッド基からなる両親媒性脂質と、Ｎ−及びＣ−末端基を有するポリマー又はそのモノマー前駆体とから得ることができ、前記のポリマーはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸誘導体）又はポリ（アミノ酸類似化合物）であり、前記の脂質はポリマーのＮ又はＣ末端基と共有結合しており、ポリマーは以下の式：
‐［ＮＨＣＨＲ（ＣＨ2）mＣＯ］n‐で表され、式中、‐Ｒは-H, -CH3, -CHCH3OR1, -(CH2)xOR1, -(CH2)x-CO-NHR1, -(CH2)x-NH-CO-R1, -(CH2)x-SOyCH3又は-(CH2)xCOOHと定義され、
‐Ｒ1は水素又は（Ｃ1−Ｃ4）アルキル基で１個以上の水酸基又は１個のジ（Ｃ1−Ｃ4）アルキルアミン基で置換されており、ｘは０〜４、ｍ＝１又は０、ｙ＝１又は２である。また、このような結合体の調製方法及び結合体の使用についても提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の組成物中の両親媒性脂質−ポリマー−結合体は、両親媒性脂質とポリマー又はそのモノマー前駆体から得られる。
本発明の脂質−ポリマー結合体に使用される両親媒性脂質は、少なくとも１つの疎水性を有する無極のテールと親水性を有する極性ヘッド基からなる様々な合成又は天然の脂質から選択すればよく、小胞形成脂質や膜脂質がある。
脂質−ポリマー結合体に使用される両親媒性脂質の重要な特色の一つは、脂質中、ポリマー鎖との共有結合に適した極性ヘッド基に官能基を含むということである。極性ヘッド基としては、例えば、第一又は第二アミン基、水酸基、アルデヒド基、ハロゲン化物又はカルボン酸基が挙げられる。脂質の疎水性部位によって、リポソームのような二分子膜構造中に脂質−ポリマー結合体が包含されることが可能となり、疎水性部位はアンカーとして作用する。
両親媒性脂質の例として、リン脂質、糖脂質、セラミド、コレステロール及びその誘導体、飽和又は部分不飽和の分岐又は直鎖の炭素数８〜５０のモノ又はジアルキルアミン、アリールアルキルアミン、シクロアルキルアミン、アルカノール、アルデヒド、カルボハライド（carbohalide）又はアルカノイック酸、及びこれらの無水物が挙げられるが、このなかで炭素原子の総数は２５以上が好ましい。
より具体的には、適切な両親媒性脂質の例として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ステアリルアミン、ミリスチルアルコール、コレステロール及びパルミチン酸が挙げられる。
脂質−ポリマー−結合体において推奨される両親媒性脂質とは、多くの場合はアルカリ鎖である２つの疎水性鎖と、前記に記載のとおり官能基を含む極性ヘッド基とを有する脂質である。ホスファチジルエタノールアミン誘導体、なかでもジステアリルホスファチジルエタノールアミンは、反応性アミノ基を有することから上記記載の推奨されるリン脂質である。
さらに推奨される両親媒性脂質としては、第一又は第二アミンを親水性極性ヘッド基として有し、さらに飽和又は不飽和の炭素数８〜５０の分岐又は直鎖の疎水性を有する２つの無極部位を有する。この例としては、１−ヘプタデシルオクタデシルアミン並びにジステアリルアミンやＮ−スクシニルジオクタデシルアミン（ＤＯＤＡＳｕｃ）のようなジステアリルアミン含有化合物が挙げられる。
【０００８】
本発明の脂質−ポリマー−結合体のポリマー部分は、ポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸誘導体）又はポリ（アミノ酸類似化合物）で形成されている。ポリ（アミノ酸誘導体）は、アミノ酸モノマーからなるポリマーで、１個以上の置換基が結合している。この例としては、ポリ（２‐ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンが挙げられる。本願明細書に開示されているポリ（アミノ酸類似化合物）とは、アミノ酸モノマーの炭素原子鎖長が短かったり長いポリマーを指す。その例として、ポリ（ホモセリン）やポリ（ペンタホモセリン）が挙げられる。
ポリマーは、ポリマー鎖全体を通して同じモノマーからなるホモポリマーである。また、ポリマー部分はポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸誘導体）及びポリ（アミノ酸類似化合物）からなる群から選択されるブロック共重合体で構成することも可能であるし、或いは１種以上のアミノ酸、アミノ酸誘導体及びアミノ酸類似化合物からなる群から選択される適切なモノマーを交互に並べたもの又は順番を制御して並べたもの、又はランダム重合したものでポリマー部分を形成することも可能である。ポリマーは直鎖でも分岐していてもよく、グラフトポリマーも含まれるが、直鎖が好ましい。
有用なアミノ酸としては、天然のα−アミノ酸が挙げられる。しかし、非タンパク性又は天然でないアミノ酸と同様にβ−アミノ酸にも関心がもたれてきたようである。Ｌ体とＤ体両方のアミノ酸及びその誘導体を使用することができる。脂質−ポリマー−結合体におけるポリマーのアミノ酸配列がＬ体アミノ酸の残基によって形成されると、できたポリマーは酵素劣化をうけやすい。一方、本発明の脂質−ポリマー−結合体におけるポリマーのアミノ酸配列がＤ体アミノ酸によって形成される場合は、できたポリマーはペプチド劣化酵素に対して安定した傾向がある。また、Ｌ体アミノ酸とＤ体アミノ酸の混合物も使用できる。コロイド状担体粒子の表面修飾に本発明の脂質−ポリマー−結合体が取り込まれるので、ポリマーの異なる特性を考慮すると、結合体調製用の出発物質にＬ体及び／又はＤ体を選択的に使用して表面修飾を調整することができる。
【０００９】
ポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸誘導体）及びポリ（アミノ酸類似化合物）は、本発明の脂質−ポリマー−結合体にとりこむのに適しているが、これらの重要な特性の一つは水に溶ける（１００部の水に対して少なくとも１部、好ましくは３０部の水に対して１部、最も好ましくは１０部以下の水に対して１部）ということである。また、このポリマーは、水中におけるポリマーのχ−パラメーターによっても特徴づけることができる。このポリマーと溶媒の相互作用パラメーターは、例えば膜浸透圧法で求めることができる。本発明の脂質−ポリマー−結合体中において優位に使用することができるポリマーは、χ−パラメーターが水中で０．６５以下、好ましくは０．５以下である。
ポリマーのもう一つの重要な特徴は、ｐＨ値４〜８の範囲（生理的範囲）内では荷電した基が実質的な量含まれないということである。中性アミノ酸モノマー又はアミノ酸類似モノマーをポリマー又はアミノ酸誘導体モノマーの調製に使用することが好ましく、これらは中性であるか中和しておいたものである。本発明のコロイド状担体組成物の長期循環性を阻害しないような低い割合であれば荷電した基を含ませることはできるようである。２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミンと荷電したモノマーの共重合体について実証されているように、正帯電している基は負帯電している基よりもより高い割合で含有させることができる。
ポリマー作成に適したモノマーとしては、他にはアラニン、トレオニン、バリン、サルコシン、α−アミノアジピン酸、α、γ−ジアミノ酪酸誘導体、オルニチン、グルタミンとグルタミン酸を含むグルタミン誘導体、アスパラギンとアスパラギン酸を含むアスパラギン誘導体、リジン誘導体、メチオニンとメチオニン誘導体、セリン及びその誘導体、さらにホモセリンやペンタホモセリンのようなＣＨ2基を付加した類似化合物がある。側基として適しているのは、炭素数１〜４のアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、酸アミド、アリール基、又はこれらを組み合わせたものであるが、ポリマーの水溶性を保つことが前提である。これらの基の例としては、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、４−ヒドロキシブチル及び２，３−ジヒドロキシプロピルが挙げられる。使用できるポリマーには、例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−セリン）（ＰＤＬＳ）、ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｄ，Ｌ−グルタミン（ＰＤＬＨＥＧ）、ポリ（２−ヒドロキシブチル）−Ｌ−グルタミン（ＰＨＢＧ）、及び１％のグルタミン酸を含むポリ（ＨＥＧ−ｃｏ−グルタミン酸）共重合体（ＰＨＥＧ１％ＧＡ）が挙げられる。好ましいポリマーとしては、ポリ（Ｄ，Ｌ−グルタミン）（ＰＤＬＧ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−アスパラギン）（ＰＤＬＡ）、ポリ（ヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン（ＰＨＰＧ）、ポリ（２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン（Ｐ２ＨＰＧ）、並びにベータアラニンと２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミンの共重合体（ＰｂＡＨＥＧ）及び５％と１％のジメチルアミノエチル側基を含むポリ（ＨＥＧ−ｃｏ−ジメチルアミノエチル−グルタミン）共重合体（ＰＨＥＧ５％ＤＧ及びＰＨＥＧ１％ＤＧ）が挙げられる。より好ましいポリマーは、ポリ−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン］（ＰＨＥＧ）、ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−アスパラギン（ＰＨＥＡ）、及びポリ（Ｄ，Ｌ−メチオニンスルホキシド）（ＰＤＬＭＳ）といったホモポリマーである。
ポリマー鎖には、モノマーサブユニットが５〜５００、好ましくは２０〜１００個含まれている。ポリマーの平均分子量は５００〜７５０００、好ましくは２０００〜１５０００である。平均分子量はこの分野で既知の様々な方法で評価することができる。本出願における実施例では、分子量の評価はＮＭＲデータをもとに行った。
【００１０】
本発明の組成物に取り込まれる脂質−ポリマー−結合体を作成するには、重合や脂質との結合に先立って、アミノ酸モノマーの側鎖に含まれる反応性基を保護する製造方法が好ましくは採用されてきた。
脂質−ポリマー−結合体はこの分野で既知の方法に従って調製することができる。アミノ酸のポリマーを調製する方法として、任意に１種以上の保護基を有していてもよい対応のアミノ酸Ｎ−カルボキシ−無水物（ＮＣＡ）を、炭素数１〜４のアルキル第一アミンのような求核剤で開環重合を開始させる方法がよく知られている。脂質−ポリマー−結合体を得るためのもう一つの方法としては、開環ＮＣＡ重合における開始剤として、例えばＮ−Ｂｏｃ−１，４−ジアミノブタンのような保護官能基を有するアミンを使用する方法がある。このプロセスでは二つのステップ、即ち、官能基の脱保護のステップとその後の反応性基で脂質に結合させるステップが余計に必要ではあるが、この方法で調製した脂質−ポリマー−結合体も本発明のコロイド状担体組成物に組み込むのに適している。
両親媒性脂質が、炭素数８〜５０の分岐又は直鎖のモノ又はジアルキル、ジヒドロキシアルキル若しくはジアルキレンアミン、アルカノール又はセラミドであるならば、それを開環重合のプロセスで開始剤として有利に使用することができる。これは、一つのステップで重合の最中に両親媒性脂質がポリマーに結合することを意味している。ポリアミノ酸の分子量は、溶媒又は溶媒の組み合わせ、使用する化学物質の純度、及び重合開始剤に対するモノマーの割合に著しく左右される。一般に、重合開始剤に対するモノマーの割合が高ければ高いほど、ポリマーの分子量は大きくなる。
所定の組成のポリマーを調製すべき時は、固相法によるペプチドの合成方法を用いることが好ましい。
【００１１】
ポリマーの繰り返し単位に存在する保護基は、２−アミノエタノール、３−アミノプロパノール又は２，３−ジヒドロキシプロピルアミンのようなアミノアルコールを使ってアミノ分解して取り除くことができる。
本発明の脂質−ポリマー−結合体は、リポソーム、ニオソームやリバース小胞のような二分子膜小胞系、ミセル系、ナノカプセル、ナノスフェア等の本発明のコロイド状担体組成物中に有利に包含することができる。推奨されるコロイド状担体系は、二分子膜小胞系である。
リポソームの調製にあたっては、リポソーム調製に通常使用される成分、例えば、小胞形成脂質、安定剤等と本発明の脂質−ポリマー−結合体を混合する。ポリマー−脂質結合体を含有しない対応のリポソームに比べて、リポソームの血中循環時間を数倍延長するのに十分なモル濃度で結合体を含有させる。ポリマー結合体は、通常１〜１５モルパーセント、好ましくは３〜１０モルパーセント、最も好ましくは５〜７．５モルパーセントの割合で含有する。
【００１２】
リポソームの平均粒径は、動的光散乱（ＤＬＳ）法で求める場合、２００ｎｍより小さく、好ましくは１５０ｎｍより小さく、１００ｎｍ未満が最も好ましい。
このタイプのコロイド状担体粒子の平均粒径の下限は２０ｎｍである。
ポリマー−脂質−結合体は、帯電したリポソームに取り込まれるとゼータ電位を下げる性質を示したが、このようにしてポリマーのグラフト化によって表面電荷が遮蔽された。
本組成物にはいくつかの投与方法があるが、非経口的投与が好ましい。有効成分に応じて、また医学的適応又は治療すべき疾患に応じて、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔内注入、関節内注入等で投与することができる。
本発明のリポソーム製剤をラットに静脈内投与した結果、リポソームの血中循環時間を所望の目的に応じて変えることができることがわかってきた。血中循環時間は使用した脂質−ポリマー−結合体に左右されるが、特に脂質とポリマーの組み合わせの選択、ポリマーの分子量及びグラフト密度に左右される。例えば、脂質−ＰＨＥＧ−結合体、脂質−ＰＨＥＡ−結合体及び脂質−ＰＤＬＭＳ−結合体は、両親媒性脂質が２つの疎水性テールを有する（ＰＨＥＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ、ＰＨＥＡ‐ＤＯＤＡＳｕｃ及びＰＤＬＭＳ−ＤＯＤＡＳｕｃ）が、これらについては、対応のＰＥＧ−グラフトリポソームで得た結果と同様の結果が見られた。
本発明による脂質−ポリマー−結合体で調製したリポソーム製剤の安定性は、従来のリポソーム製剤の安定性に比べておおむね向上する。それにくわえて、脂質−ポリマー−結合体を適切に選ぶことによってリポソーム製剤の安定性はさらに向上する。この選択は有効な配合剤の選択にも依存することがわかるであろう。例えば、コルチコステロイド自体ではなくコルチコステロイドの水溶性誘導体をリポソーム製剤に封入すれば、リポソーム製剤の安定性が向上するという結果となる。リン酸プレドニゾロンをポリヒドロキシエチルアスパラギン−ＤＯＤＡＳｕｃ−結合体含有リポソームに封入した場合、ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ−結合体含有リポソームに封入した場合に比べてわずかながら良い結果がでた。噴霧乾燥、凍結乾燥、回転蒸発等のこの分野で既知の方法によって、リポソーム組成物から水性ビヒクルを取り除き、安定性をさらに向上させることができる。
【００１３】
脂質−ポリマー−結合体が本発明のコロイド状担体組成物に組み込まれると、この組成物に長期循環性が付与される。このコロイド状担体組成物が、脂質−ポリマー−結合体を含有しないような組成物に比べて血中循環時間が増加しているのは、長期循環性によると理解すべきである。長期循環性については、この分野で既知の方法によって求めることができる（Torchilin VP, Shtilman MI, Trubetskoy VS, Whiteman K, Milstein AM.: Amphiphilic vinyl polymers effectively prolong liposome circulation time in vivo. Biochimica et Biophysica Acta (1994) 1195: 181-184; Torchilin VP, Trubetskoy VS, Whiteman KR, Caliceti P, Ferruti P, Verones FM.: New synthetic amphiphilic polymers for steric protection of liposomes in vivo. Journal of pharmaceutical sciences (1995) 84 (9): 1049-1053）。リポソームに関しては、ある方法を実施例に記載した。このように、上記の組成物、とりわけ小胞系組成物は様々な用途に利用することができる。循環薬物レザバー（reservoir）として以外に、上記の組成物は受動的に標的疾患部位（腫瘍、感染、炎症）に送達するためにも、また、例えばモノクローン抗体のようなホーミングデバイス（homing devices）に結合させて能動的に血流中の細胞や内皮（例えば脈管形成にかかわるレセプター）という標的に送達するためにも使うことができる。人工的酸素供給システム、血液プール像、カテーテルや血管系プロテーシスのような生体材料用の防汚塗料も、さらなる用途となろう。
さらに、脂質−ポリマー−結合物は生分解性を有し、とりわけ人間の細胞にも動物体内の細胞にも集積する危険がないという事実があることから多くの利点がある。
また、脂質−ポリマー−結合体は、ＰＥＧ−リポソームと比べて脂質の分量への依存性が低くなっていることがわかった。
さらに付け加えると、これが非常に重要な利点なのであるが、本発明の組成物を二度目に注入した後のクリアランスの増大は必ずしも見られるわけではなく、血中循環時間の短縮はほどほどである。これは、ＰＥＧで被覆したコロイド状担体組成物に比べると重大な利点を意味するといえよう。
【００１４】
本発明のコロイド状担体組成物は、治療、診断、予防等において様々な可能性を提供するものである。脂質−ポリマー−結合体には多様性があるので、その成分は目的に応じて選択することができ、また、選択範囲となる種々のコロイド状担体システムには多様性があるので、一般に、すべての有効な配合剤は適切なコロイド状担体組成物を構成することが可能となろうことは容易に明らかであろう。本発明の組成物を静脈内投与した後の最初の事例において、血中循環時間には何ら影響がないか若しくはほんのわずかな影響しか見られないのであれば、基準となるセットに応じて循環時間を延ばすために、脂質−ポリマー−結合体の多数の様々なパラメーター（例えば、分子量、ドラフト密度、ポリマー、脂質等）やコロイド状担体組成物の多数の様々なパラメーターを変えることは、この分野の当業者であれば可能である。本発明の組成物が、水溶性コルチコステロイドを有効な配合剤として含む際に、非常に興味深い結果が見られる。この組成物を生体内実験の関節炎モデルにおいて一回のみ静脈内注入したところ、封入していないコルチコステロイド化合物を繰り返し注入した場合、又は従来のリポソームに封入したときと同じくらい効果があることがわかった。興味深い水溶性コルチコステロイドとは、リン酸ブデゾニド並びにフルニソリド及びプロピオン酸フルチカゾンの水溶性誘導体である。関節炎による症状の全面的な小康状態が長く続くという好ましい効果があり、一方、コルチコステロイドを主とした治療による副作用は抑えられる。これは、投与すべきコルチコステロイドの量を抑えられることと、またコルチコステロイドは通常血液からの迅速なクリアランスを示すものであるが、今回はそれを使用することができたという理由からである。また、他の疾病においてコルチコステロイドが薬剤として選択される場合又は共同の治療薬として使用される場合、本発明の組成物の有益な効果が容易に認識できるであろう。他の有効な配合剤も、本発明の組成物において興味深い効果を示している。
【００１５】
前述の発明を明確化し理解できるようにするために図示と実施例によって詳細に記載したが、この分野の当業者であれば本発明の教示することを鑑み、添付のクレームから逸脱することなく変更したり修正することができるであろうことは容易に明らかとなろう。
以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。
【００１６】
（実施例１）
ヘプタデシルオクタデシルアミン末端基を有するポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート）（ＰＢＬＧ−ヘプタデシルオクタデシルアミン）
０．９４ｇ（３．６mmol）のγ−ベンジル−Ｌ−グルタメート  Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を、窒素雰囲気下５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解させた。２５ｍｇ（０．０５mmol）の１−ヘプタデシルオクタデシルアミン（Sigma Aldrich社）を１ｍｌの乾燥クロロホルムに溶解させた溶液を直ちに添加した。ほぼ即座に、気泡（二酸化炭素）が形成された。溶液を室温で１日攪拌し、１０〜２０倍の過剰の水に析出させた。白色の析出物を回収し真空内で乾燥させた。収量：０．７５ｇ
特性：
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3） （溶媒のピークを基準としたｐｐｍのδ）：
グルタミン酸ベンジル：7.2 （Ｃ6Ｈ5）, 5.0 (ベンジルＣＨ2), 3.9 (α−ＣＨ)、2.8及び2.2 (β及びγＣＨ2)
アルキル鎖：1.2（ＣＨ2アルキル鎖), 0.85 (ＣＨ3)
【００１７】
（実施例２）
ヘプタデシルオクタデシルアミン末端基を有するポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン］（ＰＨＥＧ−ヘプタデシルオクタデシルアミン）
５ｍｌの乾燥ＤＭＦに０．６０ｇのＰＢＬＧ−ヘプタデシルオクタデシルアミン（上記参照）を溶解した溶液に、０．１５ｇの２−ヒドロキシピリジンと０．８ｍｌのエタノールアミンを加えた。この溶液を窒素雰囲気下室温で３日間攪拌し、１０〜２０倍の過剰のジエチルエーテルに析出させた。生成物を回収し真空内で乾燥させた。水溶性のポリマー生成物をセルロースエステル透析チューブ（ＭＷＣＯ５００）の中で水に対して透析を２日間行った。凍結乾燥後、ヘプタデシルオクタデシル末端基を有する精製ＰＨＥＧを得た。収量：０．３０ｇ
特性：
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたｐｐｍのδ）：
ヒドロキシエチルグルタミン：4.1 (α−ＣＨ), 2.2及び1.8-1.9 (β及びγＣＨ2), 3.4 (ＣＨ2−ＯＨ), 3.1 (ＣＨ2−ＮＨ2)
アルキル鎖：1.2 （ＣＨ2アルキル鎖), 0.8 (ＣＨ3)
ステアリルのシグナルとα−ＣＨシグナルの積分値の比からＰＨＥＧの分子量は12,000と算定された。
【００１８】
（実施例３）
開始剤としてのＮ−Ｂｏｃ−１，４−ジアミノブタンを介して導入されたジステアリルアミン末端基を有するポリ−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン］（ＰＨＥＧ−ジアミノブタン−ＤＯＤＡＳｕｃ）
２．５ｇ（９．５mmol）のγ−ベンジル−Ｌ−グルタメート  Ｎ−カルボキシ無水物を２．５ｍｌの乾燥エチルアセテートと１２．５ｍｌの乾燥ジクロロメタンの混合物に溶解させた。Ｎ−Ｂｏｃ−１，４−ジアミノブタン１モル濃度のジクロロメタン溶液０．９５ｍｌ（０．９５mmol）を開始剤として添加した。混合物を窒素雰囲気下室温で３日間攪拌し、その後メタノールに析出させた。収量：１．４８ｇ、ＰＢＬＧ−Ｎ−Ｂｏｃ−ジアミノブタン
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）スペクトルによると、Ｎ−Ｂｏｃ−１，４−ジアミノブタンシグナルがδ1.4-1.3にあることがわかった。
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦ  ｍｓ：
ベンジルグルタミン酸繰り返し単位の質量：ｎｘ２１９
ｍ／ｚ 1471 (n=5), 1636 (n=6), 1855 (n=7), 2074 (n=8)、Ｎ−Ｂｏｃ−１，４−ジアミノブタン（１８７Ｄａ）基と環状ペプチド末端基（１１２Ｄａ）を有するナトリウム付加物の質量に相当。
ｍ／ｚ 1433(n=5), 1652 (n=6), 1872 (n=7)、Ｎ−Ｂｏｃ−１，４−ジアミノブタン（１８７Ｄａ）基と環状ペプチド末端基（１１２Ｄａ）を有するカリウム付加物の質量に相当。
【００１９】
ＰＢＬＧ−Ｎ−Ｂｏｃ−ジアミノブタンの脱保護：
７３８ｍｇのＰＢＬＧ−Ｎ−Ｂｏｃ−ジアミノブタンを５ｍｌの４Ｎ塩酸のジオキサン溶液中で３．５時間攪拌した。その後、反応混合物をロータリーエバポレーター（Rotavap）で溶媒を蒸発させた。残渣を５ｍｌのテトラヒドロフランに溶解し、８０ｍｌのＮａＨＣＯ3溶液（６．５ｇを水に溶かす）に滴下した。生成物を濾取して水で洗浄した後、真空中で乾燥させた。収量：６７７ｍｇ、ＰＢＬＧ−ジアミノブタン
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）により、保護基が首尾よく除去されたことがわかった。
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦの質量分析により、所望のモル質量（molmasses）であることがわかった。
ベンジルグルタミン酸繰り返し単位の質量：ｎｘ２１９
ｍ／ｚ 1318 (n=5), 1537 (n=6), 1756 (n=7), 1976 (n=8)、 １，４−ジアミノブタン（８７Ｄａ）基と環状ペプチド末端基（１１２Ｄａ）を有するナトリウム付加物の質量に相当。
【００２０】
ＤＯＤＡＳｕｃとの結合：
６２ｍｇ（０．１mmol）のＮ−スクシニル−ジオクタデシルアミン（ＤＯＤＡＳｕｃ、Schmitt et al, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 19, 8485-8491）と、１３．７ｍｇ（０．１２mmol）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと、０．６６ｍｇのジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）とを２ｍｌのジクロロメタンに溶解させた。０℃まで冷却した後、２４．６ｍｇ（０．１２mmol）のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加えた。溶液を０℃で１時間、さらに室温で一晩攪拌した。その後、不溶分のジシクロヘキシル尿素を濾過により除去し、２００ｍｇのＰＢＬＧ−ジアミノブタンを含む３ｍｌのジクロロメタン溶液と１４μｌのトリエチルアミンに、濾液を添加した。室温で一晩攪拌した後、溶液をメタノールに滴下し、濾別して乾燥させた。収量：１３５ｍｇ。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）のスペクトルによると、ジステアリルが存在した。ＣＨ2シグナル：δ1.4-1.2、ＣＨ3シグナル：δ0.9-0.8
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦ質量分析で、ＤＯＤＡＳｕｃがＰＢＬＧ−ジアミノブタンに結合していることを示す所望のモル質量が明らかになった。
ｍ／ｚ 1922 (n=5), 2141 (n=6), 2360 (n=7), 2580 (n=8), 2799 (n=9), 3018 (n=10)、環状ペプチド末端基（１１２Ｄａ）を有するＰＢＬＧ−ジアミノブタン−ＤＯＤＡＳｕｃのナトリウム付加物の質量に相当。
構造：
【００２１】
【化１】
2004527585.tif 000002
【００２２】
アミノ分解：
１２０ｍｇのＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃと１０．８ｍｇの２−ＨＰを１．３ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解して、０．６８ｍｌの２−アミノエタノールを添加した。窒素雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した後、溶液をクロロホルムに滴下した。生成物を濾取し真空中で乾燥させた。収量：８３ｍｇ、ＰＨＥＧ−ジアミノブタン−ＤＯＤＡＳｕｃ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）によると、ジステアリルのシグナルがδ1.2-1.4（ＣＨ2）とδ0.8-0.9（ＣＨ3）に見られた。
ステアリルのシグナルとα−ＣＨシグナルの積分値の比からＰＨＥＧの分子量は４０００と算定された。
構造：
【００２３】
【化２】
2004527585.tif 000003
【００２４】
（実施例４）
開始剤としてのジステアリルアミンを介して導入されたアミン末端基を有するポリ−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン］（ＰＨＥＧ−ジステアリルアミン）
１．０ｇ（３．８mmol）のγ−ベンジル−Ｌ−グルタメート  Ｎ−カルボキシ無水物を１ｍｌの乾燥エチルアセテートと５ｍｌの乾燥クロロホルムの混合物に溶解させた。その後、１６３ｍｇのジステアリルアミンを３．２６ｍｌのクロロホルムに溶解した溶液２ｍｌ（０．１９mmol）を添加した。フラスコに塩化カルシウム管を取り付け、混合物を窒素雰囲気下室温で４日間攪拌した。混合物をメタノールに滴下し、ポリマーを濾過して単離し、真空中で乾燥させた。収量：７５７ｍｇ、ＰＢＬＧ−ジステアリルアミン
反応：
【００２５】
【化３】
2004527585.tif 000004
【００２６】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）の分析によると、生成物中にジステアリルのシグナルが示された。ＣＨ3シグナル：δ0.9(t), ＣＨ2シグナル：δ1.3-1.2
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦ  ｍｓ：
ベンジルグルタミン酸繰り返し単位の質量：ｎｘ２１９
ｍ／ｚ 1971 (n=6), 2190 (n=7), 2410 (n=8), 2629 (n=9), 2848 (n=10)、ジステアリルアミン（５２１Ｄａ）基と環状ペプチド末端基（１１２Ｄａ）を有するナトリウム付加物の質量に相当。
ｍ／ｚ 2206 (n=7), 2427 (n=8)、ジステアリルアミン（５２１Ｄａ）基と環状ペプチド末端基（１１２Ｄａ）を有するカリウム付加物の質量に相当。
【００２７】
アミノ分解：
アミノエーテルと２−ヒドロキシピリジンを触媒として用いて、上記で調製したＰＢＬＧ−ジステアリルアミン（６００ｍｇ）のアミノ分解をジメチルホルムアミド中で行ったところ、４３０ｍｇのＰＨＥＧ−ジステアリルアミンを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）でジステアリルアミンのシグナルが検出された。
構造：
【００２８】
【化４】
2004527585.tif 000005
【００２９】
（実施例５）
ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ末端基を有するポリ−［Ｎ−（ヒドロキシアルキル）−Ｌ−グルタミン］
ＰＢＬＧ−ジアミノブタンＢＯＣ：
３ｇのベンジル−Ｌ−γ−グルタメート  Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を８ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解した溶液に、０．１ｇのＮ−ＢＯＣ−１，４−ジアミノブタンを１ｍｌのクロロホルムに溶解した溶液を加えた。最初の数時間、気体（二酸化炭素）の発生が認められた。この溶液を窒素雰囲気下室温で１日攪拌した。およそ１００ｍｌのメタノールに析出させた後、ポリマーを濾取して乾燥させたところ、ＢＯＣ−保護アミノ基を含むＰＢＬＧを２ｇ得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ＢＯＣ：1.4（ＣＨ3）
ＰＢＬＧ：2.2及び2.6（β及びγ−ＣＨ2）, 4.0（α−ＣＨ）, 5.0（ベンジルＣＨ2）, 7.3（フェニル）
【００３０】
ＰＢＬＧ−ジアミノブタン  （保護ＢＯＣ基の除去）:
５ｍｌの４Ｎ塩酸／ジオキサンに１．１ｇのＰＢＬＧ−ジアミノブタンＢＯＣを溶解した溶液を３〜４時間攪拌し、その後およそ８０ｍｌのＮａＨＣＯ3溶液（水に６．５ｇ溶解）に滴下した。生成物を濾取し、水で洗浄し真空中で乾燥させた。収量：１ｇ、ＰＢＬＧ−ジアミノブタン
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ＰＢＬＧ：2.2及び2.6（β及びγ−ＣＨ2）, 4.0（α−ＣＨ）, 5.0（ベンジルＣＨ2）, 7.3（フェニル）
ＢＯＣシグナル：なし
【００３１】
ＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ（ＤＣＣ結合）：
１７０ｍｇのＮ−スクシニル−ジオクタデシルアミン（ＤＯＤＡＳｕｃ）と、９０ｍｇのＤＣＣと、１０ｍｇの４−（ジメチルアミノ）ピリジニウム４−トルエンスルホナート（ＤＰＴＳ）とを４ｍｌのジクロロメタンに溶解した。溶液を室温で１時間攪拌した。０．７３ｇのＰＢＬＧ−ジアミノブタンと４０μｌのトリエチルアミンを３ｍｌのクロロホルムに溶解した溶液を添加した。室温で一晩攪拌した後、溶液（ジシクロヘキシル尿素析出分を含む）を過剰なメタノール（およそ１００ｍｌ）に滴下した。ポリマー生成物を濾取し乾燥させた。収量：０．５ｇ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリルシグナル：0.8-0.9（ＣＨ3）, 1.2-1.4（メチレンプロトン）
ＰＢＬＧ：2.2及び2.6（β及びγ−ＣＨ2）, 4.0（α−ＣＨ）, 5.0（ベンジルＣＨ2）, 7.3（フェニル）
【００３２】
５．１  ＰＨＥＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ
以下のようにして、ＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃをエタノールアミンでアミノ分解することによってＰＨＥＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを得た。
０．５ｇのＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃと１５ｍｇの２−ヒドロキシピリジンを４ｍｌのＤＭＦに溶解した。さらに２ｍｌのエタノールアミンを加えた。窒素雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した後、溶液をおよそ１００ｍｌのジエチルエーテルに析出させた。ＰＨＥＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを水に溶解し、透析を行って（ＭＷＣＯ５００）凍結乾燥させたところ、精製されたＰＨＥＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ結合体を０．３５ｇ得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリルのシグナル：0.8-0.85（ＣＨ3）, 1.2-1.5（メチレンプロトン）
ＰＨＥＧ：1.7-2.2（β及びγ−ＣＨ2）, 3.1及び3.3（ヒドロキシエチル）, 4.2（α−ＣＨ）, 4.7（ＯＨ）, 7.8及び8.2（ＮＨ）
ジステアリルのシグナルとα−ＣＨシグナルの積分値の比からＰＨＥＧの分子量はおよそ４０００と算出された。
Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦにより、ＰＨＥＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ結合体の分子構造が確認されている。
Ｎａ+付加物：ｍ／ｚ 3064.5 (n=13), 3236.1 (n=14), 3408.7 (n=15), 3580.6 (n=16), 3752.9 (n=17), 3924.7 (n=18), 4096.7 (n=19), 4268.4 (n=20), 4441.1 (n=21), 4613.3 (n=22), 4785.1 (n=23)等
【００３３】
５．２  ポリ−［（２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ
以下のようにして、ＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを２−プロパノールアミン（イソプロパノールアミン）でアミノ分解することによってポリ−［（２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを得た。
０．１５ｇのＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃと０．０５ｇの２−ヒドロキシピリジンを４ｍｌのＤＭＦに溶解した。さらに１ｍｌの２−プロパノールアミンを添加した。窒素雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した後、溶液をおよそ１００ｍｌのジエチルエーテルに析出させた。乾燥後、０．１ｇのＰＨｉｓｏＰＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを得た。ポリマーを水に溶解し、透析を行って（ＭＷＣＯ５００）、凍結乾燥させたところ、精製されたポリ−［（２−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリルのシグナル：0.8-0.85（ＣＨ3）, 1.2-1.5（メチレンプロトン）
ＰＨＰＧ：1.7-2.2（β及びγ−ＣＨ2）, 1.0（ＣＨ3）, 3.0, 3.3及び3.7（ヒドロキシプロピル）, 4.2（α−ＣＨ）, 4.7（ＯＨ）, 7.8及び8.2（ＮＨ）
測定分子量：約４０００
【００３４】
５．３  ポリ−［（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ
ＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを３−プロパノールアミンでアミノ分解することによってポリ−［（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを得た。
０．３ｇのＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃと０．１ｇの２−ヒドロキシピリジンを４ｍｌのＤＭＦに溶解した。さらに２ｍｌの３−プロパノールアミンを加えた。窒素雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した後、溶液をおよそ１００ｍｌのジエチルエーテルに析出させた。乾燥後、０．２５ｇのＰＨＰＧ５０００−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを得た。ポリマーを水に溶解し、透析を行って（ＭＷＣＯ５００）、凍結乾燥させたところ、精製されたポリ−［（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリルのシグナル：0.8-0.85（ＣＨ3）, 1.2-1.5（メチレンプロトン）
ＰＨＰＧ：1.7-2.2（β及びγ−ＣＨ2）, 1.5, 3.1及び3.3（ヒドロキシプロピル）, 4.2（α−ＣＨ）, 4.6（ＯＨ）, 7.8及び8.2（ＮＨ）
分子量：約５０００
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦ：
Ｎａ+付加物：ｍ／ｚ 3623 (n=15), 3810 (n=16), 3996 (n=17), 4182 (n=18), 4368 (n=19), 4555 (n=20)等
【００３５】
５．４  ポリ−［（４−ヒドロキシブチル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ
ＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを４−ブタノールアミンでアミノ分解することによってポリ−［（４−ヒドロキシブチル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを得た。
０．３ｇのＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃと０．１ｇの２−ヒドロキシピリジンを４ｍｌのＤＭＦに溶解した。さらに２ｍｌの４−ブタノールアミンを加えた。窒素雰囲気下４０℃で４８時間攪拌した後、溶液をおよそ１００ｍｌのジエチルエーテルに析出させた。ポリマーを水に溶解し、透析を行って（ＭＷＣＯ５００）、凍結乾燥させたところ、精製されたポリ−［（４−ヒドロキシブチル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを０．２ｇ得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリルのシグナル：0.8-0.85（ＣＨ3）, 1.2-1.5（メチレンプロトン）
ＰＨＢＧ：1.7-2.2（β及びγ−ＣＨ2）, 1.4, 3.1及び3.3（ヒドロキシブチル）, 4.2（α−ＣＨ）, 4.5（ＯＨ）, 7.8及び8.2（ＮＨ）
分子量：約４０００
【００３６】
５．５  ポリ−［（２，３−ジヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ
ＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを２，３−ジヒドロキシプロピルアミンでアミノ分解することによってポリ−［（２，３−ジヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを得た。
０．１５ｇのＰＢＬＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃと０．０６ｇの２−ヒドロキシピリジンを３ｍｌのＤＭＦに溶解した。さらに１ｍｌの２，３−ジヒドロキシプロピルアミンを加えた。窒素雰囲気下４０℃で１日攪拌した後、溶液をおよそ１００ｍｌのジエチルエーテルに析出させた。ポリマーを水に溶解し、透析を行って（ＭＷＣＯ５００）、凍結乾燥させたところ、精製されたポリ−［（２，３−ジヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを０．１ｇ得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリルのシグナル：0.8-0.85（ＣＨ3）, 1.2-1.5（メチレンプロトン）
ポリ（ジヒドロキシプロピル）Ｇ：1.7-2.2（β及びγ−ＣＨ2）, 3.1及び3.3-3.6（ジヒドロキシプロピル）, 4.2（α−ＣＨ）, 4.6及び4.8（ＯＨ）, 7.8及び8.2（ＮＨ）
分子量：約４０００
【００３７】
（実施例６）
コレステリル−ＰＨＥＧ
２ｍｌのクロロホルムに０．２ｇのＰＢＬＧ−ＮＨ2と２０μｌのトリエチルアミンを溶解した溶液に、１ｍｌのクロロホルムに０．０７ｇのコレステリルクロロホルメートを溶解した溶液を加えた。溶液を室温で約１時間攪拌し、ジエチルエーテルの中に析出させた。回収し、乾燥させて０．１３ｇのポリマー生成物を得た。
エタノールアミンでアミノ分解（２−ヒドロキシピリジンは触媒の役目）を４０℃で１日行うと、コレステリル−ＰＨＥＧが得られた。ポリマー生成物を透析（ＭＷＣＯ５００）によって精製した。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ＰＨＥＧ：1.7-2.2（β及びγ−ＣＨ2）, 3.1及び3.3（ヒドロキシエチル）, 4.2（α−ＣＨ）, 4.7（ＯＨ）, 7.8及び8.2（ＮＨ）
コレステリル：0.6-1.6
分子量：約４０００
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦにより、コレステリル−ＰＨＥＧ結合体の分子構造が確認されている。
Ｎａ+付加物：ｍ／ｚ 3046 (n=14), 3218 (n=15), 3390 (n=16), 3562 (n=17), 3735 (n=18), 3907 (n=19), 4080 (n=20)等
【００３８】
（実施例７）
ポリ（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−グルタミンジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ
合成は、ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ（実施例８）の合成と同様であるが、いくつか細かい点が異なる。
γ−ベンジル−ＤＬ−グルタミンＮＣＡを、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメートとγ−ベンジル−Ｄ−グルタメートの１：１の混合物から合成し、エチルアセテート／ヘキサン（約１：５）から結晶化させた（実施例１参照）。
ポリ（ベンジル−ＤＬ−グルタミン）ジアミノブタンＢＯＣを、メタノールの代わりに水を使って析出させた。
ポリ（ベンジル−ＤＬ−グルタミン）ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃをメタノールの中で析出させた。
ＮＭＲスペクトルは、ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ（実施例８．１）と実質的に同じである。
分子量：約３０００
【００３９】
（実施例８）
ＰＨＥＧ共重合体：ポリ（ＨＥＧ−ｃｏ−グルタミン酸）ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ；グルタミン酸５％含有
１．５ｍｌのＤＭＦに０．１４ｇのＰＢＬＧジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃと、０．０５ｇの２−ヒドロキシピリジンと、約１ｍｌのエタノールアミンとを溶解させた溶液を窒素雰囲気下室温で１日攪拌した。その後、この溶液をジエチルエーテル中に析出させた。生成物は、部分的にエタノールアミンでアミノ分解されたＰＢＬＧジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ（５％のベンジルエステル側基を有するＰＨＥＧ）であったが、回収して乾燥させた。ＤＭＳＯ中で記録されたＮＭＲによると、未反応ベンジル基が５％存在することが明らかになった。
前記のポリマーを８．５ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムに溶解し４時間攪拌した。溶液を１Ｎ塩酸で中和させ、数日間透析を行った（ＭＷＣＯ５００）。透析した溶液を凍結乾燥させた結果、負帯電（生理的ｐＨ値において）した共重合体−脂質−結合体（０．１ｇ）を得た。
ＤＭＳＯ中のＮＭＲによると、ベンジル基が完全に変換されていることがわかった。
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦを使って、グルタミン酸とヒドロキシエチルグルタミン繰り返し単位の両方が存在することを確認した。
分子量：約３５００
【００４０】
（実施例９）
ＰＨＥＧ共重合体：ポリ（ＨＥＧ−ｃｏ−ジメチルアミノエチルグルタミン）ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ；ジメチルアミノエチル側基５％含有
２．５ｍｌのＤＭＦに０．２５ｇのＰＢＬＧジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃと、０．０８ｇの２−ヒドロキシピリジンと、１ｍｌのエタノールアミンとを溶解させた溶液を窒素雰囲気下室温で２日間攪拌した。できた溶液をジエチルエーテル中に析出させた。部分的にエタノールアミンでアミノ分解されたＰＢＬＧジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ（５％のベンジルエステル側基を有するＰＨＥＧ）を回収して乾燥させた。ＣＤＣｌ3中で記録されたＮＭＲによると、未反応ベンジル基が５％存在することが明らかになった。
２．５ｍｌのＤＭＦに、０．１６ｇの上記の部分エタノールアミン−アミノ分解化ＰＢＬＧジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃと、０．０６ｇの２−ヒドロキシピリジンと、１ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミンとを溶解させた溶液を、窒素雰囲気下４０℃で１日攪拌した。ジエチルエーテルに析出させると粉末が得られ、この粉末を回収し真空中で乾燥させた。ＤＭＳＯのＮＭＲによると、残っていたベンジル基が完全に変換されていることがわかった。生成物を水に溶解させ、数日間透析（ＭＷＣＯ５００）をした後、凍結乾燥させた。収量：０．１ｇの正帯電したＰＨＥＧ共重合体−脂質−結合体。
分子量：約４０００
【００４１】
（実施例１０）
ステアリルアミンとヘプタデシルオクタデシルアミン末端基をそれぞれ有するポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−アスパラギン（ＰＨＥＡ）
β−ベンジル−Ｌ−アスパラテート  Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）：
５０ｍｌの蒸留したＴＨＦに５ｇのβ−ベンジルＬ−アスパラテートを懸濁させた懸濁液におよそ１６ｍｌのホスゲン２０％のトルエン溶液を含ませ、この懸濁液を６０〜６５℃で加熱した（溶液上は窒素ガス気流）。約１０分後、透明な液を得た。およそ１．５時間後、溶液を約１４０ｍｌのｎ−ヘキサンにゆっくり注いだ。ほとんど即座に結晶が形成された。さらに−２０℃で一晩結晶化させた後、ＮＣＡ結晶性生成物を単離した。さらに、ＴＨＦ／ヘキサンと加熱したクロロホルムで結晶化させ、４．３ｇの微細な針状結晶を得た。（Biopolymers 1976, 15(9) 1869-71）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ベンジル基：7.3（フェニル）, 5.1（ＣＨ2）
アスパラテート  ＮＣＡ：2.8及び3.0（β−ＣＨ2）, 4.5（α−ＣＨ）, 6.4（ＮＨ）
【００４２】
ステアリル−ＰＢＬＡ：
０．９５ｇのβ−ベンジルＬ−アスパラテートＮＣＡのＤＭＦ溶液２ｍｌに、０．５ｍｌのクロロホルムに０．０４ｇのステアリルアミンを溶解させた溶液を加えた。６０℃で数時間攪拌した後、濁った液をメタノール中に析出させた。乾燥後、０．５６ｇのポリ（ベンジルＬ−アスパラテート）ステアリルアミンを得た。
【００４３】
ヘプタデシルオクタデシル−ＰＢＬＡ：
０．５ｇのβ−ベンジルＬ−アスパラテートＮＣＡのＤＭＦ溶液２ｍｌに、約１ｍｌのクロロホルムに０．１ｇの１−ヘプタデシルオクタデシルアミンを溶解させた溶液を加えた。室温で３日間攪拌した後、濁った液をメタノール中に析出させた。収量：０．２ｇ、ポリマー生成物ＰＢＬＡ−ヘプタデシルオクタデシルアミン
【００４４】
ステアリル−／ヘプタデシルオクタデシル−ＰＨＥＡ：
エタノールアミンと触媒の２−ヒドロキシピリジンを使い、上記のＰＢＬＡ−結合体を４０℃で１日間アミノ分解した後、ジエチルエーテルに析出させたところ、ステアリル又はヘプタデシルオクタデシルのテールをそれぞれ含む水溶性のポリ（ヒドロキシエチル）Ｌ−アスパラギン（ＰＨＥＡ）を得た。脂質−ポリマー−結合体を透析（ＭＷＣＯ５００）で精製した。
ステアリル−ＰＨＥＡ：
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦ: Ｎａ+付加物 ｍ／ｚ 2823 (n=16), 2981 (n=17), 3139 (n=18), 3297 (n=19), 3455 (n=20), 3613 (n=21)等
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦにより、各ＰＨＥＡ鎖は遊離のアミノ末端基を含むという結論がでた。
ヘプタデシルオクタデシル−ＰＨＥＡ：
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ヘプタデシルオクタデシル：0.8及び1.2
ＰＨＥＡ：2.2-2.6（β−ＣＨ2）, 3.1及び3.4（ヒドロキシエチル）, 4.5（ＯＨ＋α−ＣＨ）, 7.8及び8.3（ＮＨ）
分子量：約６０００
【００４５】
（実施例１１）
ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−アスパラギンＤＯＤＡＳｕｃ
ＰＢＬＡ  ＤＯＤＡＳｕｃ：
５ｍｌのＤＭＦに１．７ｇのβ−ベンジルＬ−アスパラテートＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を溶解させた溶液に、２ＭメチルアミンのＴＨＦ溶液０．２ｍｌを加えた。この透明な溶液を１日攪拌した後、メタノール（約１００ｍｌ）と水（２５０ｍｌ）の混合物中に析出させた。収量：１．３ｇ、メチルアミドとアミノ末端基を有するＰＢＬＡ
０．４ｇのＰＢＬＡと、３０ｍｇのＤＣＣと、１０ｍｇのＤＰＴＳと、１００ｍｇのＮ−スクシニル−ジステアリルアミンとを５ｍｌのＤＭＳＯと１ｍｌのクロロホルムに溶解した溶液を１日攪拌してから、水の中で析出させた。ポリマー生成物を攪拌し、ジエチルエーテルで洗浄後、乾燥させた。
【００４６】
ＰＨＥＡ  ＤＯＤＡＳｕｃ：
ＤＭＦ溶液中、エタノールアミンでＰＢＬＡＤＯＤＡＳｕｃを４０℃で１日間アミノ分解（触媒として２−ヒドロキシピリジン使用）したところ、ＰＨＥＡＤＯＤＡＳｕｃを得た（透析と凍結乾燥を経て０．２ｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリル：0.8（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）, 1.4（ＣＨ2−Ｎ）
ＰＨＥＡ：2.4-2.8（β−ＣＨ2）, 3.2及び3.4（ヒドロキシエチル）, 4.6（α−ＣＨ＋ＯＨ）, 7.8-8.5（ＮＨ）
測定分子量：約３０００
Ｍａｌｄｉ  ＴＯＦにより、ＰＨＥＡ  ＤＯＤＡＳｕｃ結合体の分子構造が確認されている。
Ｎａ+付加物： ｍ／ｚ 2084 (n=9), 2243 (n=10), 2401 (n=11), 2559 (n=12), 2718 (n=13)、2876 (n=14)等
【００４７】
【化５】
2004527585.tif 000006
【００４８】
（実施例１２）
ポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−アスパラギンＤＳＰＥＳｕｃ結合体
ベンジル−Ｌ−アスパラテートＮＣＡをメチルアミンで開始した重合によって得たＰＢＬＡ（ポリベンジル−Ｌ−アスパラテート）をアミノ分解して、アミノ末端基を有するＰＨＥＡを作製した。スクシニル化ＤＳＰＥ（合成はJACS, 116, 8485 (1994)のＤＰＰＥで記載の方法と同様）は、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）を使って現場でまずＮＨＳエステルに変換された。
７０ｍｇのスクシニル化ＤＳＰＥと、２０ｍｇのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）と、５ｍｇのＤＭＡＰと、３０ｍｇのＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）とを２ｍｌのジクロロメタンに溶解させた溶液を、約３〜４時間攪拌した。この混合物に、０．１３ｇのアミノ末端基を有するＰＨＥＡ（分子量約４０００）を含む２ｍｌのＤＭＳＯ溶液を加えた。一晩攪拌した後、混合物をエーテル中に析出させた。析出物を回収し、水に溶かし数日間透析した（ＭＷＣＯ５００）。凍結乾燥させたところ、約８０ｍｇのＰＨＥＡ−ＤＳＰＥを得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ＤＳＰＥ：0.8（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）, 1.4（ＣＨ2−Ｎ）
ＰＨＥＡ：2.4-2.8（β−ＣＨ2）, 3.2及び3.4（ヒドロキシエチル）, 4.6（α−ＣＨ＋ＯＨ）, 7.8-8.4（ＮＨ）
測定分子量：約４０００
【００４９】
（実施例１３）
ポリ（ＤＬ−セリン）ＤＯＤＡＳｕｃ
Ｏ−ベンジル−ＤＬ−セリンＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）:
３０ｍｌの蒸留した（乾燥）ＴＨＦに２．５ｇのＯ−ベンジル−ＤＬ−セリンを懸濁させた懸濁液に約１０ｍｌのホスゲンの２０％トルエン溶液を含ませ、６０〜６５℃で加熱した（溶液上は窒素ガス気流）。約５分後、透明な液を得た。約１．５時間後、溶液をおよそ１００ｍｌのｎ−ヘキサンにゆっくり注いだ。生成物は油として分離した。溶媒はデカンテーションによって除去し、油の方は約２５ｍｌのエチルアセテートに溶解させ、そこに１００ｍｌのヘキサンをゆっくりと加えた。激しくフラスコを振って−２０℃で冷却したところ、Ｏ−ベンジル−ＤＬ−セリンＮＣＡは結晶化し始めた。エチルアセテート／ヘキサン及び／又はクロロホルム／ヘキサンから同様に再結晶化させて、２ｇの結晶性物質を得た。（Biopolymers 1976, 15(9), 1869-71）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ベンジル基：4.5（ＣＨ2）, 7.2（フェニル）
セリンＮＣＡ：3.7（β−ＣＨ2）, 4.4（α−ＣＨ）, 5.8（ＮＨ）
【００５０】
ポリ（Ｏ−ベンジル−ＤＬ−セリン）：
０．９ｇのＯ−ベンジル−ＤＬ−セリンＮＣＡのＤＭＦ溶液２．５ｍｌに、０．０８ｍｌの２ＭメチルアミンのＴＨＦ溶液を加えた。室温で数時間攪拌すると、溶液が濁り粘性を帯びてきた。１日後、この粘性を帯びた「結晶化した」溶液をメタノール／水と混合して、ポリマー生成物を完全に析出させた。収量：０．６ｇ、ポリマー生成物ポリ（Ｏ−ベンジル−ＤＬ−セリン）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ベンジル基：4.4（ＣＨ2）, 7.2（フェニル）
ポリセリン：3.5（β−ＣＨ2）, 4.7（α−ＣＨ）, 8.2（ＮＨ）
【００５１】
ポリ（Ｏ−ベンジル−ＤＬ−セリン）ＤＯＤＡＳｕｃ：
１５０ｍｇのＮ−スクシニル−ジオクタデシルアミン（ＤＯＤＡＳｕｃ）と、８０ｍｇのＤＣＣと、５ｍｇのＤＰＴＳとを４ｍｌのクロロホルムに溶解した。この溶液を室温で１時間攪拌した。０．６ｇのポリ（Ｏ−ベンジル−ＤＬ−セリン）と約５０μｌのトリエチルアミンとを約５ｍｌのクロロホルムに溶解した溶液を添加した。室温で一晩攪拌した後、溶液（ジシクロヘキシル尿素析出物を含む）を過剰なメタノール（約１００ｍｌ）に滴下した。ポリマー生成物を濾取して乾燥させた。収量：０．４ｇ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリル：0.8（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）, 1.6（ＣＨ2−Ｎ）
ベンジル基：4.4（ＣＨ2）, 7.2（フェニル）
ポリセリン：3.5（β−ＣＨ2）, 4.7（α−ＣＨ）, 8.2（ＮＨ）
【００５２】
ポリ（ＤＬ−セリン）ＤＯＤＡＳｕｃ：
０．１ｇのポリ（Ｏ−ベンジル−ＤＬ−セリン）ＤＯＤＡＳｕｃを約４ｍｌの３３％ＨＢｒ／ＡｃＯＨ溶液に溶解し、１時間攪拌した。この溶液を水中で析出させた。ポリマー析出物を濾取し、水で洗浄し回収した後、４ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウムに溶解させた（１〜２時間）。できた溶液を１Ｎ塩酸溶液で中和して、数日間透析をおこなった（ＭＷＣＯ５００）。この透析をおこなった溶液を凍結乾燥させた。収量：２０ｍｇ、ポリ（ＤＬ−セリン）ＤＯＤＡＳｕｃ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリル：0.8（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）, 1.6（ＣＨ2−Ｎ）
ポリセリン：3.6（β−ＣＨ2）, 4.3（ＯＨ）, 5.0（α−ＣＨ）, 8.0（ＮＨ）
ジステアリルのシグナルとα−ＣＨシグナルの積分値の比からポリセリンの分子量は約１５００と算出された。
【００５３】
【化６】
2004527585.tif 000007
【００５４】
（実施例１４）
ポリ−Ｌ−スレオニンＤＯＤＡＳｕｃ
合成は、ポリ（Ｄ，Ｌ−セリン）ＤＯＤＡＳｕｃの合成と同様で、Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニン、ＨＣＬ及びホスゲンを出発物質としてＯ−ベンジル−Ｌ−スレオニンＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）を介して合成した。
ポリ−Ｌ−スレオニンＤＯＤＡＳｕｃ（Ｍ＝約２０００）：
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリル：0.8（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）, 1.6（ＣＨ2−Ｎ）
ポリスレオニン：1.0（ＣＨ3）, 4.0（β−ＣＨ）, 4.3（α−ＣＨ）, 5.0（ＯＨ）, 7.8（ＮＨ）
【００５５】
（実施例１５）
ポリ（Ｄ，Ｌ−メチオニンスルホキシド）ＤＯＤＡＳｕｃ
ＤＬ−メチオニンＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）：
４０ｍｌの蒸留した（乾燥）ＴＨＦに２．５ｇのＤＬ−メチオニンを懸濁させた懸濁液に約１５ｍｌのホスゲンの２０％トルエン溶液を含ませ、６０〜６５℃で加熱した（溶液上は窒素ガス気流）。ほぼ即座に透明な液が形成された。約１時間後、溶液をおよそ１４０ｍｌのｎ−ヘキサンにゆっくり注いだ。ＤＬ−メチオニンＮＣＡを−２０℃で結晶化させた（数日かかる）。エチルアセテート／ヘキサンから再結晶させて、約０．７ｇの結晶性物質を得た。（Biopolymers 1976, 15(9), 1869-71）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）（溶媒のピークを基準としたδ）:
メチオニンＮＣＡ：2.0-2.4（β−ＣＨ2＋ＣＨ3）, 4.5（α−ＣＨ）, 6.8（ＮＨ）
【００５６】
ポリ（ＤＬ−メチオニン）：
０．７ｇのＤＬ−メチオニンＮＣＡのＤＭＦ溶液２．５ｍｌに、０．１ｍｌの２ＭメチルアミンのＴＨＦ溶液を加えた。１日後、濁った液を約１００ｍｌのメタノールに析出させて、その後乾燥させた。収量：０．３３ｇ、ポリマー生成物：ポリ（ＤＬ−メチオニン）
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3／ＴＦ−ｄ）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ポリメチオニン：2.0-2.3（ＣＨ2及びＣＨ3）, 2.6（ＣＨ2）, 4.7（α−ＣＨ）
【００５７】
ポリ（ＤＬ−メチオニン）ＤＯＤＡＳｕｃ：
８０ｍｇのＮ−スクシニル−ジオクタデシルアミン（ＤＯＤＡＳｕｃ）と、４５ｍｇのＤＣＣと、５ｍｇのＤＰＴＳとを２ｍｌのクロロホルムに溶解した。この溶液を室温で１時間攪拌した。０．３３ｇのポリ（ＤＬ−メチオニン）と約２０μｌのトリエチルアミンとを約２．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解した溶液を添加した。室温で一晩攪拌した後、溶液（ジシクロヘキシル尿素析出物を含む）を過剰なメタノール（約１００ｍｌ）に滴下した。ポリマー生成物を濾取して乾燥させた。収量：０．２２ｇ
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリル：0.8（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）, 1.4（ＣＨ2−Ｎ）
ポリメチオニン：1.8（β−ＣＨ2）, 2.0（ＣＨ3）, 2.4（γ−ＣＨ2）, 4.4（α−ＣＨ）, 8.1（ＮＨ）
【００５８】
ポリ（ＤＬ−メチオニンスルホキシド）ＤＯＤＡＳｕｃ：
ポリ（ＤＬ−メチオニン）ＤＯＤＡＳｕｃの一酸素添加：
０．３ｇのヨウ素酸ナトリウムの水溶液２ｍｌを、約６ｍｌの酢酸に０．２２ｇのポリ（ＤＬ−メチオニン）ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃを懸濁させた懸濁液にゆっくり添加した。得られたオレンジ／赤色の溶液（数時間後に形成）を一晩攪拌した。その後、約１５ｍｌの水を加え、できたオレンジ／赤色の溶液を数日間透析した（ＭＷＣＯ５００）。凍結乾燥させた後、０．２５ｇの生成物を得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリル：0.7（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）（広いピーク）
ポリメチオニンスルホキシド：2.0（β−ＣＨ2）, 2.5（ＣＨ3）, 2.8（γ−ＣＨ2）, 4.3（α−ＣＨ）, 8.5（ＮＨ）
計測した分子量：約４０００
【００５９】
【化７】
2004527585.tif 000008
【００６０】
（実施例１６）
ポリ（ＤＬ−グルタミン）ＤＯＤＡＳｕｃ
ペプチド固相合成方法によって、ポリ（ＤＬ−グルタミン）ＤＯＤＡＳｕｃ結合体をAnsynth Service B.V.社が合成した（約５０ｍｇのスケール）。Ｆｍｏｃ保護基付きアミノ酸を使って、樹脂に結合したポリ（ＤＬ−グルタミン）（ｎ＝２０）を順次作り上げた。Ｎ末端にＮ−スクシニル−ジステアリルアミンを結合した。Ｃ末端はアミドに変えた。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって構造が確認された。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリル：0.8（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）, 1.4（ＣＨ2−Ｎ）
ポリグルタミン：1.7-2.2（β−及びγ−ＣＨ2）, 4.2（ＣＨ）, 6.8及び7.3（ＮＨ2）, 8.2（ＮＨ）
【００６１】
【化８】
2004527585.tif 000009
【００６２】
（実施例１７）
ポリ（ＤＬ−アスパラギン）ＤＯＤＡＳｕｃ
ペプチド固相合成方法を用いて、Ｆｍｏｃ保護基付きアミノ酸から出発してポリ（ＤＬ−アスパラギン）ＤＯＤＡＳｕｃ結合体をAnsynth Service B.V.社が合成した（約５０ｍのｇスケール）。樹脂に結合したポリ（ＤＬ−アスパラギン）（ｎ＝２０）を順次作り上げた。Ｎ末端にＮ−スクシニル−ジステアリルアミンを結合した。Ｃ末端はアミドに変えた。ＤＭＳＯ中で記録された1Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって構造が確認された。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）（溶媒のピークを基準としたδ）：
ジステアリル：0.8（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）, 1.4（ＣＨ2−Ｎ）
ポリアスパラギン：2.5（ＣＨ2）, 4.5（ＣＨ）, 7.0及び7.4（ＮＨ2）, 8.1（ＮＨ）
【００６３】
【化９】
2004527585.tif 000010
【００６４】
（実施例１８）
ポリ（Ｄ，Ｌ−アラニン）ＤＯＤＡＳｕｃ
９５ｍｇのポリ−ＤＬ−アラニン（シグマ社；ＭＷ：約２０００）を４ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた。４０μｌのトリエチルアミンをこの溶液に添加した。さらに、この溶液を０．１ｇのＤＯＤＡＳｕｃと７０ｍｇのＤＣＣと５ｍｇのＤＰＴＳとを２ｍｌのクロロホルムに溶解して１時間攪拌しておいた溶液に加えた。１日攪拌した後、混合物をメタノール／ジエチルエーテル混合物の中で析出させた。析出物を濾取し乾燥させた。
ＤＭＳＯにおける1Ｈ−ＮＭＲ：
ジステアリル：0.8（ＣＨ3）, 1.2（ＣＨ2）, 1.4（ＣＨ2Ｎ）
ポリアラニン：1.2（ＣＨ3）, 4.2（ＣＨ）, 8.0（ＮＨ）
【００６５】
（実施例１９）
β−アラニンとヒドロキシエチルＬ−グルタミンのペプチド共重合体
DODASuc-(β-Ala)3-Glu(OBzl)-(β-Ala)4-Glu(OBzl)-(β-Ala)3-Glu(OBzl)-(β-Ala)2-NH2：
Ｆｍｏｃで保護されたモノマーから出発して固相合成方法を用いて、β−アラニンとＬ−グルタミン酸ベンジルのペプチド共重合体をAnsynth Service B.V.社が合成した。
Ｃ末端：アミド；  Ｎ末端：ＤＯＤＡＳｕｃ
DODASuc-(β-Ala)3-HEG-(β-Ala)4-HEG-(β-Ala)3-HEG-(β-Ala)2-NH2：
その後、ＤＭＦ中で行われたアミノ分解（エタノールアミン）反応によって、グルタミン酸ベンジルの単位をヒドロキシエチルグルタミン（ＨＥＧ）単位に変えた。
ＤＭＳＯ中で記録された1Ｈ−ＮＭＲにより、ベンジル基がなくなり変換されていることが明らかになった。
【００６６】
（実施例２０）
ＰＨＥＧ−ステアリルアミン含有リポソームの調製
３３．８ｍｇの卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）（Lipoid社 (Ludwigshafen)製）と、９．６７ｍｇのコレステロール（Sigma Aldrich社製）と、３０．０ｍｇのポリ−［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン］−ステアリルアミン（ＰＨＥＧ−ステアリルアミン）（合成済み）とを秤量し、５０ｍｌの丸底フラスコに移した。５００ｋＢｑのトリチウム標識コレステリルオレイルエーテルを脂質マーカーとして添加した。脂質とラベルを約１０ｍｌのエタノールに溶解させた。その後、Rotavaporを使って真空下４０℃で１時間乾涸させ、続いて窒素ガスを１時間流した。
ＰＢＳを乾燥した脂質フィルムに添加し、脂質フィルムを完全に水和させるためにガラスビーズの存在下１時間振動を与えた。
リポソーム懸濁液を押出し成形機（Avestin社製、最大容量１５ｍｌ）に移し、窒素ガスを使って加圧し、孔径がそれぞれ２００ｎｍと１００ｎｍの二枚の上下に配置されたポリカーボネートフィルターから６回、孔径がそれぞれ１００ｎｍと５０ｎｍのフィルターから１８回押し出した。その後、リポソーム懸濁液を透析部（Slide-A-Lizer, 10,000MWCO）で１リットルの滅菌したＰＢＳに対して２４時間にわたり２回透析をおこなった。
リポソームの平均粒子径は光散乱法（Malvern Zeta-sizer）によって求めたところ、93.6±0.9ｎｍであることがわかった。分散指数は0.099±0.02であった。リポソーム調製中の脂質損失は、製剤の最終放射能と押出し工程前の放射能とを比較して求めたところ２５％であった。リポソーム懸濁液を窒素雰囲気下４℃で保存した。
【００６７】
（実施例２１）
脂質−ポリマー−結合体を含むリポソームの調製
実施例２０記載のように、膜法（film method）を用いてリポソームを調製した。卵黄ホスファチジルコリンの代わりにジパルミトイルホスファチジルコリンを使用した。５ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを乾燥した脂質フィルムに添加し、脂質フィルムを完全に水和させるためにガラスビーズの存在下５分間振動を与えた。孔径が１００ｎｍと２００ｎｍの２枚の上下に配置されたＰＣ膜からリポソームを１２回押し出して分級した。得られたリポソーム分散液を透析し（ＭＷＣＯ10,000）、平均粒子径を動的光散乱法で求めた。リポソーム製剤の特性については表１を参照。
【００６８】
（実施例２２）
リポソームに組み込まれた3Ｈ標識を用いたポリマー−脂質−結合体をラットに静脈内注入（１回）を行った後の比較動態
雄ラット（Wistar, Crl: (WI) BR（非近交系、SPF）（チャールスリバー社、ドイツSulzfeld）が、標準的なペレット状の実験動物用の餌（altromin社、コードＶＲＦ１、ドイツLage）と水道水を自由に利用できるようにした。リポソーム製剤はそれぞれ放射能４０〜５０ｋＢｑの3Ｈ標識を用いたコレステリルオレイルエーテル（Amersham社）を含有するが（脂質５０μモルあたりのリポソームの組成については表１に示す）、各リポソーム製剤をラットの尻尾の静脈に単回投与した。特に示していない限り、投与した総脂質は５μモルであった。
投与後の以下の時点、５分後、４時間後、２４時間後及び４８時間後に、各ラットの尻尾の静脈から血液サンプルを採取した。回収したサンプルの量は、採取ごとに約３００μｌであった。
回収したサンプルをヘパリン化生理食塩水で処理した（heparinised）チューブに移し−２０℃で保管した。
１００μｌのアリコートを以下の方法に従って可溶化した。
【００６９】
−１００μｌをシンチレーションバイアル（２０ｍｌ）に移した。
−１００μｌの「Ｓｏｌｖａｂｌｅ」を添加した。これを少なくとも１時間培養した。
−１００μｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡと２００μｌのＨ2Ｏ2（３０％）を添加した。この混合物を室温で２４時間、その後５０℃で一晩培養した。
−シンチレーション液（scintillation fluid）として「Ultima Gold」（１０ｍｌ）を添加した。
−放射能をＬＳＣで測定した。
すべての放射能測定は、パッカード社のシンチレーション計数管（１９００ＴＲ）を用いて行った。計測時間は、統計的精度が±０．２％になるか、最高５分経つまでかのいずれかが先に達成されるまでとした。パッカード社の１９００ＴＲは、自動的にバックグラウンド計数を差し引いて、１分間あたりのカウント数（ＣＰＭ）を１分間あたりの壊変数（ＤＰＭ）に変換するようにプログラムされていた。
記載の製剤のうちのいくつかについては、注入から４８時間後にラットの肝臓と脾臓を解剖してリポソームの位置を以下の方法に従って査定した。
器官を均質化し、得られたホモジェネートを２５ｍｌ（肝臓）又は５ｍｌ（脾臓）に希釈した。１ｍｌのホモジェネートをシンチレーションバイアルに移し、引き続きそこに以下のものを添加した。
【００７０】
−２００ｍｌの「Ｓｏｌｖａｂｌｅ」（混合しサンプルを５０℃で一晩培養）
−２００ｍｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液
−２５０ｍｌのＨ2Ｏ2（３０％）溶液（５０℃で一晩培養）
−１０ｍｌのシンチレーション液「Ultima Gold」（Vortexミキサーにかけて、サンプルを２４時間培養）
その後、ベータシンチレーション計数管で１０分間サンプルをカウントした。リポソーム製剤の結果について図６に示す。
実施例２１で調製したリポソーム製剤の組成と該実施例の生体内テストで得た結果を、表１に示す。血中循環時間の増加を評価したが、評価中、
−「良好」とは、循環時間への効果がＰＥＧ−ＤＳＰＥ含有リポソームによって示される効果に匹敵することを意味する。
−「中くらい」とは、循環時間への効果が、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ含有リポソームによる効果とポリマーコーティングのない非表面修飾のリポソームによる効果との中間であることを意味する。
−「わずか」とは、現在の条件下における循環時間への効果が表面修飾のないリポソームの場合とほぼ同様であることを意味する。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
＊：投与した総脂質は０．５μモル（図１、図２参照）
＊＊：投与した総脂質は０．０５μモル（図１、図２参照）
＊＊＊：投与した総脂質は０．００５μモル（図１、図２参照）
（＃）：２度目の注入（ＴＬ：１μモル）を１週間後に行ったところ、実施例５．１の脂質−ポリマー−結合体を含むリポソームに関して循環時間に減少が見られた。実施例１１の結合体を含むリポソームもまた同様な減少を示したが、２匹に関してはこの結果がそれほど著しくなかった。
【００７５】
（実施例２３）
脂質−ポリマー−結合体とリン酸プレドニゾロンを含むリポソームの調製
７５０ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）（Lipoid社  Ludwigshafen）と、２２０．０ｍｇのコレステロール（Sigma Aldrich社）と、２７０．０ｍｇの実施例１１の脂質−ポリマー−結合体、並びに７５０ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリンと、２５０．８ｍｇのコレステロールと、２６７．６ｍｇのＰＥＧ−ジステアロイルホスファチジルエタノール−アミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（Avanti Polar Lipids社）とをそれぞれ秤量し、１００ｍｌの丸底フラスコで混合した。実施例１４の脂質−ポリマー−結合体の方は、脂質類をメタノールとクロロホルムの１：１の混合物約３０ｍｌに溶解し、ＰＥＧ−ＤＳＰＥの方は脂質類をエタノールに溶解させた。この後、真空下４０℃で１時間かけてRotavaporで乾固させ、続いて窒素ガスを１時間流した。
１２００ｍｇのリン酸プレドニゾロン二ナトリウム（ＰＬＰ）（ＯＰＧ  Nieuwegein）を秤量し、１２ｍｌの滅菌したＰＢＳに溶解させた。この溶液を乾燥した脂質フィルムに添加し、脂質フィルムを完全に水和させるためにガラスビーズの存在下、１時間振動を与えた。
リポソーム懸濁液を押出し成形機（Avestin社製、最大容量１５ｍｌ）に移し、窒素ガスによる加圧のもと、上下に配置された２枚のポアフィルターで孔径がそれぞれ２００ｎｍと１００ｎｍ、１００ｎｍと５０ｎｍ、及び５０ｎｍと５０ｎｍから６回押し出した。その後、リポソーム懸濁液を透析部（Slide-A-Lizer, 10,000ＭＷＣＯ）で１リットルの滅菌したＰＢＳに対して２４時間にわたり２回透析をおこなった。
リポソームの平均粒子径を光散乱法（Malvern Zeta-sizer）で求めたところ、それぞれ８５ｎｍと９０ｎｍであることがわかった。分散指数は０．１より小さかった。リン酸プレドニゾロンの封入効率をＨＰＬＣ方法で求めたところ、２．６％であることがわかった。リポソーム懸濁液を窒素雰囲気下４℃で保存したところ、少なくとも５週間は安定していることがわかった。この間、実施例１４の脂質−ポリマー−結合体を含むリポソーム製剤は、参照用の脂質−ポリマー−結合体ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含むリポソーム製剤に比べわずかに良い性能をしめした。（図３参照）
【００７６】
（実施例２４）
アジュバント関節炎モデルのラットにおけるリン酸プレドニゾロン含有リポソーム調合物の循環時間と治療効果の評価
フロイント不完全アシュバントに熱不活性化させた結核菌を加えたものを、ルイスラットの尻尾の根元に皮下注射（免疫）した。免疫から９〜１２日で足に炎症がではじめ、およそ２０日後にもっともひどくなり、その後次第に炎症が消散した。
免疫を与えて１０日から３５日までの足の炎症の重篤度を目視により点数化して疾病の評価を行った。足の炎症スコアが最高スコアの中間点に達したところで（１４〜１５日目）、すべてのラットをグループ分けし、平均スコアが同じ５匹のグループに分けて以下の静脈注射を１回行った。
１．１０ｍｇ／ｋｇのＰＨＥＡ−ＤＰＤＡＳｕｃリポソームに含有されたＰＬＰで、実施例２３のようにして調製されたもの、又は
２．１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ＤＳＰＥリポソームに含有されたＰＬＰで、実施例２３（参照用）のようにして調製されたもの、又は
３．ＰＢＳ（対照）
ｔ＝０、２４及び４８時間において、血液サンプルを回収しリポソームＰＬＰの血漿濃度を分析した。
血液中のＰＨＥＡ−リポソーム及びＰＥＧ−リポソーム両方の循環挙動をＰＬＰの血漿濃度特性として図４に図示したが、両タイプのリポソームは循環半減期に関しては同様に良好な性能を示している。
対照としての生理食塩水で処方したラットに対する、アジュバント関節炎のラットにおける１０ｍｇ／ｋｇのＰＬＰ−ＰＨＥＡ−リポソームと１０ｍｇ／ｋｇのＰＬＰ−ＰＥＧ−リポソームの治療薬効を図５に示す。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】総脂質の含有量が異なるＰＥＧ−ＤＳＰＥ含有リポソーム製剤において、注入投与量に対する血液サンプル中の実測した割合（％）の平均値と時間との関係をグラフに表したものである。（実施例２２）
【図２】総脂質の含有量が異なるＰＨＥＡ−ＤＯＤＡＳｕｃ含有リポソーム製剤において、注入投与量に対する血液サンプル中の割合（％）の平均値と時間との関係をグラフに表したものである。（実施例２２）
【図３】ＰＥＧ−ＤＳＰＥ含有リポソーム製剤とＰＨＥＡ−ＤＯＤＡＳｕｃ含有リポソーム製剤のそれぞれに封入されたリン酸プレドニゾロンの割合（％）を時間との関係で表したものである。（実施例２３）
【図４】ＰＥＧ−ＤＳＰＥ含有リポソームとＰＨＥＡ−ＤＯＤＡＳｕｃ含有リポソームに封入されたリン酸プレドニゾロンの血液中濃度と時間との関係をグラフに表したものである。（実施例２４）
【図５】生理食塩水とリン酸プレドニゾロン含有リポソーム（各リポソームはＰＥＧ−ＤＳＰＥ又はＰＨＥＡ−ＤＯＤＡＳｕｃでコーティング）を一回のみ静脈内注入した場合、注入前後の足の炎症スコアと時間との関係をグラフに表したものである。（実施例２４）
【図６】脂質−ポリマー−結合体として、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＰＨＥＧ−ジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ、ＰＨＰＧジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ、ＰＨＢＧジアミノブタンＤＯＤＡＳｕｃ及びＰＨＥＡ−ＤＯＤＡＳｕｃをそれぞれ含むリポソーム、並びに従来のリポソーム（表面修飾なし）を静脈内投与した後、リポソーム投与注入量に対する肝臓、脾臓、及び（肝臓＋脾臓）で検出された割合（％）をグラフに表したものである。（実施例２１）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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