(57)【要約】血管以外の組織又は器官をガラス化する方法であって、−１５℃より高い温度で凍結保護物質の濃度をガラス化に十分な凍結保護物質の濃度にまで増加させる溶液中に、組織又は器官を浸す工程；組織又は器官を毎分２．５〜１００℃の平均速度で−８０℃とガラス転移温度との間の温度まで冷却する工程；及び毎分３０℃未満の平均速度でガラス転移温度未満の温度まで更に組織又は器官を冷却して、組織又は器官をガラス化する工程を含む。ガラス化した組織又は器官を貯蔵した後、毎分２０〜４０℃の平均速度で−８０℃とガラス転移温度との間の温度まで組織又は器官を温める工程；更に毎分２００〜３００℃の速度で−７５℃より高い温度まで組織又は器官を温める工程；及び凍結保護物質の濃度を減少させる工程によって、組織又は器官をガラス化から解くことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管以外の天然の又は人工の組織又は器官をガラス化するにあたり、
（ｉ）凍結保護物質の濃度を増加させる一連の溶液中に、血管以外の組織又は器官を浸して、ガラス化に十分な凍結保護物質の濃度を達成する工程であって、前記一連の溶液の各溶液が−１５℃より高い温度を有しており；
（ｉｉ）ガラス化に十分な前記凍結保護物質の濃度を有する溶液中、毎分２．５から１００℃までの平均速度で、−１５℃より高い温度から−８０℃とガラス転移温度との間の温度に、組織又は器官を冷却する工程；及び
（ｉｉｉ）組織又は器官がガラス化されるように、毎分３０℃未満の平均速度で、−８０℃とガラス転移温度との間の温度からガラス転移温度未満の温度に、更に組織又は器官を冷却する工程
を含むことを特徴とする血管以外の組織又は器官のガラス化方法。
【請求項２】
凍結保護物質を含有する溶液中で、血管以外の組織又は器官をガラス化から解除するにあたり、
（ａ）凍結保護物質を含有する前記溶液中、毎分２０から４０℃までの平均速度で、−８０℃とガラス転移温度との間の温度に、ガラス化した血管以外の組織又は器官を温める工程；
（ｂ）前記溶液中、毎分２００から３００℃までの平均速度で、−７５℃より高い温度に、組織又は器官を更に温める工程であって、この場合、前記温度で、溶液が組織又は器官をガラス化から解除することができる十分な流体であり；及び
（ｃ）凍結保護物質を含まない溶液中の組織又は器官が得られるように、凍結保護物質の濃度を減少させる一連の溶液中に組織又は器官を浸す工程
を含むことを特徴とする血管以外の組織又は器官をガラス化から解除する方法。
【請求項３】
血管以外の組織又は器官のガラス化及びそれに続くガラス化からの解除にあたり、
（ｉ）凍結保護物質の濃度を増加させる一連の溶液中で、血管以外の組織又は器官を浸し、ガラス化に十分な凍結保護物質の濃度を達成する工程であって、前記一連の溶液の各溶液が−１５℃より高い温度を有しており；
（ｉｉ）前記ガラス化に十分な前記凍結保護物質の濃度を有する溶液中、毎分２．５から１００℃までの平均速度で、−１５℃より高い温度から−８０℃とガラス転移温度との間の温度に、組織又は器官を冷却する工程；
（ｉｉｉ）組織又は器官がガラス化されるように、毎分３０℃未満の平均速度で、−８０℃とガラス転移温度との間の温度からガラス転移温度未満の温度に、組織又は器官を更に冷却する工程；
（ａ）毎分２０から４０℃までの平均速度で、−８０℃とガラス転移温度との間の温度に、ガラス化された組織又は器官を温める工程；
（ｂ）毎分２００から３００℃までの平均速度で、−７５℃より高い温度に、組織又は器官を更に温める工程；及び
（ｃ）凍結保護物質を含まない溶液中の組織又は器官が得られるように、凍結保護物質の濃度を減少させる一連の溶液中に、組織又は器官を浸す工程
を含むことを特徴とする血管以外の組織又は器官のガラス化及びそれに続くガラス化からの解除方法。
【請求項４】
組織又は器官を−１５℃より高い温度から−８０℃とガラス転移温度との間の温度に冷却する工程を、少なくとも毎分１０℃の平均速度で行う請求項１又は３記載の方法。
【請求項５】
組織又は器官を−１５℃より高い温度から−８０℃とガラス転移温度との間の温度に冷却する工程を、少なくとも毎分１５℃の平均速度で行う請求項１又は３記載の方法。
【請求項６】
組織又は器官を−１５℃より高い温度から−８０℃とガラス転移温度との間の温度に冷却する工程を、少なくとも毎分２０℃の平均速度で行う請求項１又は３記載の方法。
【請求項７】
組織又は器官を−１５℃より高い温度から−８０℃とガラス転移温度との間の温度に冷却する工程を、毎分１０から８０℃までの平均速度で行う請求項１又は３記載の方法。
【請求項８】
組織又は器官を−１５℃より高い温度から−８０℃とガラス転移温度との間の温度に冷却する工程を、毎分３０から６０℃までの平均速度で行う請求項１又は３記載の方法。
【請求項９】
組織又は器官を−８０℃とガラス転移温度との間の温度からガラス転移温度未満の温度に冷却する工程を、毎分１０℃未満の平均速度で行う請求項１又は３記載の方法。
【請求項１０】
組織又は器官を−８０℃とガラス転移温度との間の温度からガラス転移温度未満の温度に冷却する工程を、組織又は器官を−１５℃より高い温度から−８０℃とガラス転移温度との間の温度に冷却する工程のための速度よりも緩徐に行う請求項１又は３記載の方法。
【請求項１１】
組織又は器官を−８０℃とガラス転移温度との間の温度からガラス転移温度未満の温度に冷却する工程を、組織又は器官を−１５℃より高い温度から−８０℃とガラス転移温度との間の温度に冷却する工程のための速度と同じ速度で行う請求項１又は３記載の方法。
【請求項１２】
浸せき工程（ｉ）が：
凍結保護物質を含まない溶液中で、組織又は器官を浸す工程；
ガラス化に十分な前記濃度未満の濃度で、凍結保護物質を含有する少なくとも１種の溶液中で、組織又は器官を浸す工程；及び
ガラス化に十分な前記濃度で、凍結保護物質を含有する溶液中で、組織又は器官を浸す工程
を含む請求項１又は３記載の方法。
【請求項１３】
浸せき工程（ｉ）の各工程において、おおよその浸透圧平衡に達するのに十分な時間、組織又は器官を溶液中に浸す請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
浸せき工程（ｉ）の各工程において、少なくとも１０分間、組織又は器官を溶液中に浸す請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
浸せき工程（ｉ）の第２工程が、凍結保護物質の濃度を増加させる一連の４種の溶液中に、組織又は器官を浸す工程を含んでおり、各溶液がガラス化に十分な前記濃度未満の凍結保護物質の濃度を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記一連の４種の溶液の各溶液中に、おおよその浸透圧平衡に達するのに十分な時間、組織又は器官を浸す請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記一連の４種の溶液の各溶液中に、少なくとも１０分間、組織又は器官を浸す請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記４種の溶液の増加させる濃度が、ガラス化に十分な５〜２０％の前記凍結保護物質の濃度；ガラス化に十分な１５〜３５％の前記凍結保護物質の濃度；ガラス化に十分な４０〜６０％の前記凍結保護物質の濃度；及びガラス化に十分な６５〜８５％の前記凍結保護物質の濃度である請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
ガラス化に十分な前記凍結保護物質の濃度が６Ｍと９．５Ｍとの間である請求項１又は３記載の方法。
【請求項２０】
組織又は器官を毎分２００から３００℃までの平均速度で−３５℃より高い温度に温める請求項２又は３記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）において前記一連の溶液の各溶液が−１５℃より高い温度を有する請求項２又は３記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）の各浸せき工程において、前記溶液を用いて、前記組織又は器官をかん流もする請求項２又は３記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）において前記一連の溶液の各溶液中に、おおよその浸透圧平衡を達成するのに十分な時間、組織又は器官を浸す請求項２又は３記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）において前記凍結保護物質の濃度を減少させる一連の６種の溶液中に、組織又は器官を浸し、この場合、第６の溶液が凍結保護物質を含んでいない請求項２又は３記載の方法。
【請求項２５】
前記一連の６種の溶液の各溶液中に、おおよその浸透圧平衡を達成するのに十分な時間、組織又は器官を浸す請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記一連の溶液の各溶液中に、少なくとも１０分間、組織又は器官を浸す請求項２又は２４記載の方法。
【請求項２７】
前記６種の溶液の凍結保護物質の濃度が：ガラス化に十分な４０〜６０％の前記濃度；ガラス化に十分な３０〜４５％の前記濃度；ガラス化に十分な１５〜３５％の前記濃度；ガラス化に十分な５〜２０％の前記濃度；ガラス化に十分な２．５〜１０％の前記濃度；及びガラス化に十分な０％の前記濃度である請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記６種の溶液のそれぞれが浸透圧を緩衝する薬剤を含有する請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記浸透圧を緩衝する薬剤が低分子量の浸透圧緩衝剤である請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記浸透圧緩衝剤がマンニトールである請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
さらに、凍結保護物質を含まない第２の媒体溶液中に、前記組織又は器官を浸す工程を含み、この溶液が浸透圧を緩衝する薬剤を含まず、凍結保護物質を含まない前記溶液中での前記浸せき後、この溶液が前記浸透圧を緩衝する薬剤を含有する請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
新鮮な組織又は器官に比べて、組織又は器官の測定される機能の少なくとも５０％が維持される請求項２又は３記載の方法。
【請求項３３】
前記凍結保護物質の溶液が少なくとも１種の天然の又は合成の氷ブロッカー分子を含有する請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項３４】
前記凍結保護物質の溶液が、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、アラニン、アルブミン、酢酸アンモニウム、不凍化タンパク質、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸、クロロホルム、コリン、シクロヘキサンジオール、デキストラン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エリスリトール、エタノール、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、ホルムアミド、グルコース、グリセロール、グリセロリン酸、グリセリルモノアセテート、グリシン、糖タンパク質、ヒドロキシエチルでんぷん、イノシトール、乳糖、塩化マグネシウム、マグネシウム、硫酸塩、麦芽糖、マンニトール、マンノース、メタノール、メトキシプロパンジオール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチル尿素、メチルグルコース、メチルグリセロール、フェノール、プルロニックポリオール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、１，２−プロパンジオール、ピリジンＮ−オキシド、ラフィノース、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、ショ糖、トレハロース、トリエチレングリコール、酢酸トリメチルアミン、尿素、バリン及びキシロースからなる群より選ばれる少なくとも１種のメンバを含有する請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項３５】
前記凍結保護物質の溶液が、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、及び１，２−プロパンジオールを含有する請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項３６】
前記凍結保護物質の溶液が、媒体溶液中、２０〜３０ｗ／ｖ％のジメチルスルホキシド、１０〜２０ｗ／ｖ％のホルムアミド、及び１０〜２０ｗ／ｖ％の１，２−プロパンジオールを含有する請求項１３記載の方法。
【請求項３７】
前記組織又は器官が、筋骨格の組織、軟骨、半月、筋肉、靭帯、腱、皮膚、心臓血管性の組織、心臓弁、心筋、歯周の組織、腺性の組織、ランゲルハンス島、角膜、尿管、尿道、膵臓、膀胱、腎臓、胸、肝臓、腸、及び心臓からなる群より選ばれる、天然の又は人工の、血管新生化したか又は無血管性の少なくとも１種の組織又は器官である請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項３８】
前記組織又は器官が心臓弁組織である請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項３９】
前記組織又は器官が軟骨である請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項４０】
前記方法を前記組織又は器官をかん流することなく行う請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項４１】
さらに、冷却後でかつ加温に先立って、ガラス化した組織又は器官を貯蔵する工程を含む請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
米国政府は、本発明における支払済み実施許諾及びＮＩＳＴにより授与された共同協定第７０ＮＡＮＢ７Ｈ３０７１号の条件によって提供されるような適切な条件で特許権者が他に実施許諾するように要求する制限された状況での権利を有する。
【０００２】
【従来の技術】
自己の植込み及び異種の移植（以下、一緒に移植と称する。）のための生存可能な組織及び細胞の供給及び研究は、組織又は器官を生存可能な状態で維持することができる時間によってある程度制限される。組織又は器官が生存可能なままである時間の長さを増加させることは、特定の組織又は器官がレシピエント又は研究者に生存可能な状態で到達する可能性を劇的に増加させる。
【０００３】
筋骨格の組織、例えば、軟骨、半月、筋肉、靭帯及び腱、皮膚、心臓血管性の組織、例えば、心臓弁及び心筋、神経細胞の組織、歯周の組織、腺性の組織、器官の組織、ランゲルハンス島、角膜、尿管、尿道、胸の組織、及び器官、その無処理のもの又は切片、例えば、膵臓、膀胱、腎臓、肝臓、腸、及び心臓を含み、これらに制限されないが、血管新生化した組織及び無血管性の組織を含み、天然の又は人工のものの組織の移植は、かかる組織及び器官が生存可能なままである時間の長さを増加させることにより、すべて利益を得ることができる。
【０００４】
血管新生化した組織及び器官は、ヒト及び動物の双方で、移植のためのガラス化によってうまく貯蔵することができる。重大な免疫学的問題を解決できるという場合には、動物から誘導した移植片を、いつか、移植に先立ってガラス化した状態で貯蔵することができる血管新生化した組織及び器官の制限のない供給を提供することができる。
【０００５】
無血管性の組織もまた、移植のために用いることができる。例えば、概して、膝手術を専門とする整形外科医は、毎年１０〜２０名の間の患者を処置し、これらの患者は、外傷性の、全層の関節軟骨の障害が認められる。これらの患者は、すべて軟骨植込みのための候補であるかもしれない。すべての前十字靭帯（ＡＣＬ）の約３０％の裂傷が、手術後にも検出できないことが多い関連する全層の軟骨の欠陥を有する。例えば、１９９６年に軟骨修復を受けている３９２，５６８名の患者の２０．４％が軟骨埋め込みのための候補であると評価された。
【０００６】
そのうち、ほとんどの全層の欠陥は悪化し、及び重大な関節障害を起こす。軟骨が無血管性であるので、部分的な厚さの欠陥の治癒を助ける細胞の補充は困難である。対照的に、全層の欠陥は、擦過傷の関節形成術のような技術を用いる場合、部分的な治癒のための潜在能力を有する。しかしながら、不幸にも、これらの方法は一般に機械的に劣る繊維性瘢痕を生じさせる。
【０００７】
新鮮な骨軟骨性の同種移植片は移植にとって有効であり、及び役立つことが証明されている。しかし、新鮮な自己移植片組織のこの有限の利用能は、長期の貯蔵のために保存される骨軟骨性の同種移植片の使用を必要とする。凝固を含む凍結保存が、必要な時まで組織を貯蔵するために好ましい方法であるが、８０〜１００％の軟骨細胞の死をもたらし、及び氷の形成のために細胞外基質を損失させる。これらの有害な影響は成功した臨床結果を妨げる主要な障壁である。動物の関節の軟骨モデル及びヒトの軟骨の生検を用いる種々の研究は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はグリセロールのいずれかを凍結保護物質として用いる通常の凍結保存の方法の後の２０％以下の軟骨細胞の生存度を明らかにしている。かかる結果は、収集した軟骨の移植又は移植術にとってその可能性を著しく制限する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
生物学的組織及び器官の低温保存、すなわち凍結保存は、研究の努力が大いに必要な問題であった。凍結保存は、凍結によって又はガラス化によって取り組むことができる。器官又は組織が凍結した場合、氷晶が器官又は組織内に形成され、その氷晶は、機械的にその構造を壊し、それがレシピエントに移植される際にそれが正しく機能する能力を損傷することがある。組織化された組織及び器官は特に凍結中に形成される氷晶から機械的な損傷を受け易い。
【０００９】
すべての凍結保存の変数を制御する場合でも、制限があり、それは大部分が組織の容積及び幾何学（任意の関連流体及び詰め込みを含む）の関数であり、それを超える伝統的な凍結保存方法は一貫して研究されていない。例えば、凍結保存された同種移植片の心臓弁において、小葉状（ｌｅａｆｌｅｔ）の繊維芽細胞はよく生存（７０〜９０％）するが、弁の生存に関連する大動脈の組織の内皮細胞又は平滑筋細胞ではいずれも生存しない。また、凍結保存は、ランゲルハンス島の単離のために有効であることがあるが、生物学的に設計されたカプセル中での島の保存は技術的に困難であることがある。皮膚は、その組織の薄い、平坦な構造のために比較的容易に保存することができる。しかし、皮膚様製品の解凍は、加温の間の誤差が非常に限られ、その外側では、組織の損傷を起こす氷の成長が発生するために、技術的に困難な場合がある。これらの例のすべてでは、問題は、細胞、細胞外基質、カプセル内、又は心臓弁の内皮の場合のようないずれかで、氷の形成、関連する動脈の管腔における圧迫が原因となる。
【００１０】
それに比べて、ガラス化は、氷晶の形成を伴わない、ガラスにおけるような凝固を意味する。ガラス化の原理はよく知られている。概して、溶液が凍結することなく過冷却される最も低い温度は、均質な核形成温度Ｔｈであり、その温度で、氷晶は核をなして、成長し、結晶性固体が溶液から形成される。ガラス化溶液はガラス転移温度Ｔｇを有し、その温度で、溶質が、ガラス化するか、又は非結晶性固体になる。核形成及び結晶成長の動力学によって、水分子がＴｇより著しく低い温度で結晶形成のために並ぶことを効率的に不可能にする。さらに、最も希薄な水溶液をガラス転移温度に冷却する際、Ｔｇの前にＴｈにでくわして、氷の核形成が起こり、それは溶液のガラス化を不可能にする。したがって、かかる溶液をガラス化による生物学的材料の保存に有用なものとするために、溶液の特性を変化させて、氷晶の核形成及び成長の代わりにガラス化が発生するようにする必要がある。また、すべての生存度及び組織機能を完全なガラス化処理によって維持するのが重要である。
【００１１】
一般に、高い静水圧がＴｇを高め、Ｔｈを低下させることが知られているが、最も希薄な溶液の圧力の適用によるガラス化は、不可能であるか、又は非現実的であることが多い。特に、圧力の適用によってガラス化可能な多くの溶液にとって、求められる圧力は、未保護の生物材料に対して、そのガラス化中に受け入れ難い重篤な障害を生じさせる。また、多くの溶質、例えば通常用いられるＤＭＳＯのような凍結保護物質がＴｇを上げ、Ｔｈを低下させることが知られているが、ガラス化を可能にするのに十分高いＤＭＳＯ又は同様の溶質の溶液濃度は、代表的に共晶の濃度に近づき、一般に生物学的材料に対して有毒である。
【００１２】
凍結保護物質によって生じる損傷の１つは浸透圧性の損傷である。低温生物学者は、１９５０年代に凍結保護物質の浸透圧効果を知り、分離した細胞及び組織に対する凍結保護物質の添加及び除去中の損傷を防ぐように、これらの効果を制御する必要性を知った。同様の教訓は、低温生物学者が凍結保護物質を用いて全体の器官をかん流する研究に移る場合に知られた。浸透作用の原理への対応は、器官への凍結保護物質の添加に対する耐性を誘導するために本質的であった。
【００１３】
凍結保護物質の有害な浸透圧効果を制御する努力にもかかわらず、耐凍結保護物質性の限界がなお観察されている。凍結保護物質の固有の毒作用がこれらの化学薬品の一時的な浸透圧効果と関係のないことは真実であるらしい。
【００１４】
本発明者及び他のものによる研究は、凍結保護物質の薬剤の非浸透圧性の、固有の毒性を制御する方法を試験した。これらの結果は、いくつかの技術が単独で及び組み合わせて効果的であり得ることを示す。これらには、（ａ）凍結保護物質の特定の組合せであり、この効果は他の毒性を互いに相殺する；（ｂ）特定の凍結保護物質にとって最適化された媒体溶液中での凍結保護物質についての暴露；（ｃ）必要以外の１部の穿通性薬剤に適切であり得る非穿通性薬剤の使用であり、従って細胞の内部を追加の細胞内の薬剤についての暴露から免れさせる；及び（ｄ）迅速な時間依存的な毒性の濃度範囲内で時間消費を最小にすることが含まれる。
【００１５】
これらの技術のいくつかは、浸透圧の力を制御する必要性と潜在的に矛盾している。例えば、温度低下はまた、凍結保護物質の流入及び流出速度を低下させるが、それによって、それらの浸透圧効果を延長し、強化する。同様に、凍結保護物質への暴露時間を最小にすることは、それらの潜在的な浸透圧効果を最大にする。したがって、浸透圧性の損傷の制御と毒性の制御との間が均衡に達する必要がある。この均衡を得るための手段は、ファイ（Ｆａｈｙ）等への米国特許第５，７２３，２８２号明細書に記載されている。しかし、この特許は、軟骨又は他の組織のために使用され、ガラス化によって優れた凍結保存のための潜在的な技術が提供される特定の方法は記載していない。さらに、この特許は、器官又は組織を冷却するか、又は温めるためのプロトコルを何ら議論していない。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、血管以外の、血管新生化した組織及び無血管性の組織、又は器官を含む組織のガラス化のための方法に関する。この方法は、−５℃より高い温度で、ガラス化に十分な凍結保護物質の濃度に凍結保護物質の濃度を増加させる溶液中に、組織又は器官を浸す工程；−８０℃とガラス転移温度（Ｔｇ）との間の温度に、組織又は器官を迅速に冷却する工程；及び組織又は器官がガラス化するように、ガラス転移温度よりも高い温度からガラス転移温度未満の温度に、組織又は器官を更に冷却する工程を含む。
【００１７】
また、本発明は、凍結保護物質の溶液中で、血管以外の組織又は器官をガラス化から解除する方法に関する。この方法は、凍結保護物質の溶液中で、−８０℃とガラス転移温度との間の温度に、ガラス化した組織又は器官を緩徐に温める工程；凍結保護物質の溶液中で、−７５℃より高い温度に、組織又は器官を迅速に温める工程；及び組織又は器官を浸して凍結保護物質の濃度を減少させることによって、凍結保護物質の濃度を減少させる工程を含む。
【００１８】
また、本発明は血管以外の組織又は器官の処理方法に関し、この方法は生存度を高レベルに保持させる。例えば、本発明は細胞及び組織の機能を維持させる。特に、本発明は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、及び更に好ましくは８０％より高い細胞及び組織の機能を、新鮮な未処理のコントロールに比べて維持させる方法に関する。
【００１９】
図１は本発明で用いられる一例のかん流系を示す図である。図２は組織又は器官を迅速に冷却するのに用いられる装置を示す図である。図３は、予め冷却した２−メチルブタン中、３０ｍｍの深さでガラスシンチレーションバイアルを配置し、次いで、図２の装置を用いる冷気中に配置することによって生じた典型的な冷却プロファイルを示す図である。図４は、冷気中、次いで室温で３０％のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏの混合物中に、ガラスシンチレーションバイアルを配置することによって生じた典型的な加温プロファイルを示す図である。
【００２０】
【発明の実施の形態】
好適例の詳細な記載
本発明は、凍結保護物質の溶液中での組織又は器官のガラス化、及びそれに続く組織又は器官のガラス化からの解除のための方法に関する。本明細書で用いる“組織又は器官”は、筋骨格の組織、例えば、軟骨、半月、筋肉、靭帯及び腱、皮膚、心臓血管性の組織、例えば、心臓弁及び心筋、神経細胞の組織、歯周の組織、腺性の組織、器官の組織、ランゲルハンス島、角膜、尿管、尿道、胸の組織、及び器官、例えば、膵臓、膀胱、腎臓、肝臓、腸、心臓及びその切片又は小片を含み、これらに制限されないが、血管新生化した組織及び無血管性の組織を含む任意の天然の又は人工の生物学的組織又は器官をいう。
【００２１】
本明細書で用いるように、用語“移植”は、自己か、同族か、又は異種かのいずれも、及びその組織又は器官を直接か、又はその後に更に処理して行うかのいずれもの移植又は植込みの任意の種類をいう。
【００２２】
本明細書で用いるように、用語“ガラス化”は、氷晶の形成を伴わない凝固をいう。本明細書で用いるように、組織がガラス転移温度（Ｔｇ）に達する場合、組織はガラス化する。ガラス化の処理には、氷の核形成及び成長が抑制されるよう温度を低くするように、凍結保護物質の溶液の粘度の顕著な増加が含まれる。実際には、ガラス化又はガラス質の凍結保存は、少量の、又は限られた量の、その組織に損傷を起こす量未満の氷の存在においてさえ達成することができる。
【００２３】
本明細書で用いるように、“ガラス転移温度”は、処理を行う条件下の溶液のガラス転移温度をいう。概して、本発明の処理は生理学的な圧力で行う。しかし、より一層高い圧力を、組織又は器官がそれによって有意に損傷しない限り用いることができる。
【００２４】
本明細書で用いるように、“生理学的な圧力”は、組織又は器官が正常に機能する間に受ける圧力をいう。したがって、この用語“生理学的な圧力”は、正常な大気条件、並びに種々の組織、例えば、血管新生化した組織が弛緩性及び収縮期性条件下に受ける、より一層高い圧力を含む。
【００２５】
本明細書で用いるように、用語“かん流”は、組織又は器官を通して流体を流すことを意味する。器官及び組織をかん流するための技術は、例えば、ファイ等への米国特許第５，７２３，２８２号明細書で議論されており、その総てを本明細書に加入する。
【００２６】
本明細書で用いるように、用語“凍結保護物質”は、組織又は器官を氷点下の温度に冷却した場合、組織又は器官中での氷晶の形成を最小にし、結果として、加温後の生存度を、凍結保護物質を用いない冷却の効果と比較して増加させる化学的物質を意味する。
【００２７】
本明細書で用いるように、“おおよその浸透圧平衡”は、細胞内と細胞外の溶質の濃度の間に１０％を超える違いのないことを意味する。１０％以下の違いは、例えば、細胞外の濃度が４Ｍである場合、細胞内の溶質の濃度が３．６Ｍと４．４Ｍとの間にあることを意味する。細胞内と細胞外との間の濃度が５％以下の違いしかないのが好ましい。
【００２８】
ガラス化は、多種多様の凍結保護物質の混合物及び冷却／加温条件を用いて達成することができる。基本変数を各特定の細胞又は組織の種類及び試料寸法について最適化するべきである。凍結保護物質の混合物の選定、及び凍結保護物質の添加及び過度の浸透圧衝撃を伴わない除去のために必要な平衡工程を、組織試料中の凍結保護物質の浸透の測定された動態学に基づいて最適化すべきである。低温置換（ｃｒｙｏｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）もまた、氷結しない保存が所定のプロトコルにとって達成されるのを確認するために用いることができる。
【００２９】
本発明の方法では、凍結保護物質の濃度を増加させる溶液に、−５℃より高い温度で、組織又は器官を浸す。血管を含む器官及び組織は、浸せきの代わりに、又はそれと併せてかん流させることができる。温度は、好ましくは０℃と１５℃との間であり、より一層好ましくは、０℃と１０℃との間である。また、凍結保護物質の濃度を増加させながら、組織又は器官をかん流もするのが好ましい。
【００３０】
濃度の増加は、段階的方法で行うのが好ましい。すなわち、凍結保護物質を細胞外溶液に添加して凍結保護物質の特定の濃度を達成する。この濃度レベルが得られた後、次いで、溶液の濃度を、ある期間、実質的に維持する。特に、この濃度レベルを、概して、その溶液中でその組織又は器官のおおよその浸透圧平衡が得られるのに十分な時間維持する。おおよその浸透圧平衡を得るために、概して、その濃度レベルを少なくとも１０分間維持する。好適例では、その濃度レベルを少なくとも１５分間維持する。この処理は必要なだけたくさんの回数、最終的な濃度が生理学的な圧力、特に正常な大気条件下で、ガラス化に十分となるように、繰り返す。さらに、概して、１時間以下、好ましくは３０分以下の間、組織又は器官を各濃度レベルに維持する。
【００３１】
概して、組織又は器官を最初に、凍結保護物質を含まない溶液に浸す。また、凍結保護物質を含まない溶液を用いて、組織又は器官をかん流もすることができる。この凍結保護物質を含まない溶液は、任意の種類の溶液でよく、正常な温度での合成の理学的緩衝剤、及び低体温での器官保存溶液に代表されるように、インビトロの条件下、細胞の完全性を維持する。最も代表的には、凍結保護物質を含まない最初の溶液は、組織又は器官において凍結保護物質を添加し、及び除去するのに用いる媒体溶液と同じである。例えば、凍結保護物質を含まない溶液は、ユーロ−コリンズ（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ）溶液でよく、以下の表１に記載の水溶液である。
【表１】
2004511497.tif 000002
他の適切な水溶液の例を以下の表２及び３に示す。
【表２】
2004511497.tif 000003
【表３】
2004511497.tif 000004
【００３２】
凍結保護物質を含まない溶液中に浸した後、凍結保護物質を含有する溶液中に、かん流をしてか、又はしないで、組織又は器官を浸す。（本発明の利点はかん流を必ずしも必要としないことである）。ガラス化に十分な凍結保護物質の濃度は、概して、６．０〜９．５Ｍの凍結保護物質、好ましくは７〜９Ｍの凍結保護物質、より一層好ましくは８〜９Ｍの凍結保護物質を包含する。凍結保護物質の溶液は、ガラス化に十分な凍結保護物質の任意の組合せを含むことができる。凍結保護物質には、次のものに限定されないが、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、１，２−プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコール、ｎ−ジメチルホルムアミド及び１，３−プロパンジオールが含まれる。
【００３３】
ポリビニルピロリドン又はヒドロキシエチルスターチのような不浸透性の凍結保護物質の薬剤は、高速で冷却した生物学的系の保護において、より一層効果的な場合がある。かかる薬剤は大きなマクロ分子であることが多く、その薬剤は、溶液の特性をそれらの浸透圧から予測される範囲よりも大きい範囲にもたらす。これらの不浸透性の凍結保護物質の薬剤のいくつかは、細胞膜上の直接的な保護効果を有する。しかし、作用の本質的機構は、細胞外のガラス形成の誘導であると思われる。かかる凍結保護物質を極端に高い濃度で用いる場合、低温貯蔵の温度への冷却及び低温貯蔵の温度からの加温の間に氷形成が完全に排除されることがある。例示された凍結保護活性を有する不浸透性の化学物質には、アガロース、デキストラン、グルコース、ヒドロキシエチルでんぷん、イノシトール、乳糖、メチルグルコース、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、ショ糖及び尿素が包含される。
【００３４】
本発明の特定の例では、凍結保護物質の溶液は、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、及び１，２−プロパンジオールを含有する。例えば、凍結保護物質の溶液は、ＶＳ５５と称される溶液でよい。ＶＳ５５は、２４．２ｗ／ｖ％（３．１Ｍ）のジメチルスルホキシド、１６．８ｗ／ｖ％（２．２Ｍ）の１，２−プロパンジオール、及び１４．０ｗ／ｖ％（３．１Ｍ）のホルムアミドを媒体溶液中に含有する、ユーロ−コリンズ溶液のような溶液である。したがって、この溶液は約５５ｗ／ｖ％の凍結保護物質、すなわち８．４Ｍの凍結保護物質を含有する。ジメチルスルホキシドの量を２０から３０ｗ／ｖ％までに変化させることができる。同様に、１，２−プロパンジオール及びホルムアミドの量を、それぞれ約１０から２０ｗ／ｖ％までに変化させることができる。しかし、十分な強度の溶液中の凍結保護物質の総量は、４５ｗ／ｖ％と６０ｗ／ｖ％との間、好ましくは約５０ｗ／ｖから５５ｗ／ｖ％までにすべきである。
【００３５】
ＶＳ５５はまた、通常の凍結保護物質及び／又は天然のか又は合成の氷−ブロッキング分子、例えば、アセトアミド、アガロース、アルギン酸塩、アラニン、アルブミン、酢酸アンモニウム、不凍化（ａｎｔｉ−ｆｒｅｅｚｅ）タンパク質、ブタンジオール、コンドロイチン硫酸、クロロホルム、コリン、シクロヘキサンジオール、シクロヘキサンジオン、シクロヘキサントリオール、デキストラン、ジエチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、エリスリトール、エタノール、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、グルコース、グリセロール、グリセロリン酸、グリセリルモノアセテート、グリシン、糖タンパク質、ヒドロキシエチルでんぷん、イノシトール、乳糖、塩化マグネシウム、マグネシウム、硫酸塩、麦芽糖、マンニトール、マンノース、メタノール、メトキシプロパンジオール、メチルアセトアミド、メチルホルムアミド、メチル尿素、メチルグルコース、メチルグリセロール、フェノール、プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、プロリン、ピリジンＮ−オキシド、ラフィノース、リボース、セリン、臭化ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、ソルビトール、ショ糖、トレハロース、トリエチレングリコール、酢酸トリメチルアミン、尿素、バリン及び／又はキシロースを用いて改変することができる。
【００３６】
また、本発明の更に好ましい例では、１，２−プロパンジオールを同様の濃度の２，３−ブタンジオールにより置換することができる。同様に、ジメチルスルホキシドを、同様の濃度のグリセロール又はエチレングリコール又はそれらの組合せによって置換することができる。
【００３７】
凍結保護物質溶液のための媒体は、インビトロ条件下に細胞の完全性を維持する任意の種類の溶液でよい。特に、媒体は、概して、緩徐に透過する溶質を含有する。ＶＳ５５では、媒体溶液は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するユーロ−コリンズ溶液である。ＨＥＰＥＳは、緩衝剤として含有され、任意の有効な量で含有される。さらに、他の緩衝剤、並びに緩衝剤でないものを用いることができる。あるいはまた、媒体は、次のものに限定されないが、上記の表２及び３に示した溶液を包含する。
【００３８】
かん流溶液の最終的な濃度は、組織又は器官をガラス化するのに十分なものである。しかし、上述したように、溶液の濃度は、このレベルを達成するために、徐々に、好ましくは段階的方法で増加させる。特に、凍結保護物質を、特定のプラトーを達成するために添加するが、このプラトーを、おおよその浸透圧平衡を達成するのに十分な時間、特に、少なくとも１０分間、好ましくは約１５分間維持する。次いで、更なる凍結保護物質を、凍結保護物質の濃度を増加させるために添加するが、この濃度はガラス化に十分なレベルであっても、そうでなくてもよい。そうでない場合、おおよその浸透圧平衡を達成するのに十分な時間濃度を維持した後、更なる凍結保護物質を１種以上の工程で添加して、ガラス化に十分な濃度を達成する。
【００３９】
本発明の好適例においては、ガラス化に十分な濃度に達する前の４種の凍結保護物質の濃度のプラトーがある。したがって、この好適例においては、６種の工程があり、凍結保護物質を含まない溶液を用いる第１工程、それに次いで、凍結保護物質の濃度を増加させる４種のプラトー、次いで、ガラス化に十分な凍結保護物質の濃度である。特定の好ましい６種の工程の例では、工程１において、凍結保護物質を用いないで；工程２において、５〜２０％、好ましくは１０〜１５％の最終的な凍結保護物質の濃度を用い；工程３において、１５〜３５％、好ましくは２０〜３０％の最終的な凍結保護物質の濃度を用い；工程４において、４０〜６０％、好ましくは４５〜５５％の最終的な凍結保護物質の濃度を用い；工程５において、６５〜８５％、好ましくは７０〜８０％の最終的な凍結保護物質の濃度を用い；工程６において、ガラス化に十分な最終的な凍結保護物質の濃度を用いる。各凍結保護物質の濃度の工程を、おおよその浸透圧平衡を達成するのに十分な時間維持する。更に好ましい例では、各工程で溶液を用いて組織又は器官をかん流する。
【００４０】
ガラス化に十分な濃度の凍結保護物質を含有する溶液中に、組織又は器官を浸した後、ガラス化に十分な濃度の凍結保護物質を含有する溶液中で維持された組織又は器官を、−８０℃とガラス点温度との間の温度に迅速に冷却する。迅速な冷却速度は、毎分２．５から１００℃まででよい。迅速な冷却速度は、概して、少なくとも毎分１５、２０、２５又は３０℃である。この工程中の平均冷却速度は、好ましくは１０から８０℃まで、より一層好ましくは毎分３０〜６０℃、なお一層好ましくは毎分３５〜５０℃から、更になお一層好ましくは毎分４０〜４５℃である。この迅速な冷却処理の間に、組織又は器官が冷却される温度は、好ましくは−９０と−１１０℃の間、より一層好ましくは−９５と−１０５℃との間である。
【００４１】
組織又は器官がこの迅速な冷却処理を受けた後、次いで、組織又は器官に緩徐な冷却処理を受けさせ、この緩徐な冷却処理では、毎分３０℃未満の平均速度で、好ましくは毎分１０℃未満の平均速度で、ガラス転移温度より高い温度からガラス転移温度未満の温度に、組織又は器官を冷却して、組織又は器官をガラス化する。この冷却処理は、毎分５℃未満の平均速度で行うのが好ましい。好ましくは、この全体の工程中の冷却速度は、毎分３０℃を超えて増加しないで、より一層好ましくは、この冷却速度は毎分１０℃を超えて増加させず、なお一層好ましくは、この冷却速度は毎分５℃を超えて増加させない。ガラス転移温度は、概して、正常な大気条件下では、約−１２０℃〜−１３５℃である。次いで、組織又は器官を、ガラス転移温度未満の温度で長期間貯蔵することができる。
【００４２】
最初の冷却速度は、概して、第２の冷却速度より速く；しかし、具体例では、これら２つの冷却速度を同じにすることができる。
【００４３】
本発明の１例では、溶液を含有する容器を配置する環境を変化させることによって、緩徐な冷却速度を達成する。特定の例において、−１００℃未満の温度、好ましくは冷却すべき溶液のガラス転移温度付近又はそれ未満に予め冷却された２−メチルブタンのような液体中に容器を配置することによって、迅速な冷却速度を達成する。次いで、緩徐な冷却速度を達成するために、容器を液体から取り出し、ガラス転移温度未満の温度で、ガス環境中で冷却する。
【００４４】
本発明はまた、凍結保護物質の溶液中でかん流をしてか、又はしないで、組織又は器官をガラス化から解除する方法に関する。この方法は、凍結保護物質の溶液中で、−８０℃とガラス転移温度との間の温度に、ガラス化した組織又は器官を緩徐に温める工程を含む。この緩徐な加温速度は、概して、毎分５０℃未満である。さらに、この段階の間の平均加温速度は、概して、毎分２０〜４０℃、好ましくは毎分２５〜３５℃である。また、ガラス化した組織又は器官が緩徐に温められる温度は、好ましくは−９０と−１１０℃との間、より一層好ましくは−９５と−１０５℃との間の温度である。
【００４５】
組織又は器官がこの緩徐な加温処理を受けた後、次いで、組織又は器官を−７５℃より高い温度に迅速に加温する。その温度は、その溶液が、組織又は器官をそこから取り出すことができる十分な流体であるのに十分に高くなければならない。迅速な加温処理は、概して、毎分８０℃より高い、好ましくは毎分１００℃より高い速度で行う。この工程の間の平均加温速度は、好ましくは毎分２００〜３００℃、より一層好ましくは毎分２１５〜２５０℃である。この処理において、組織又は器官を、−３５℃より高いような、−７５℃より高い温度に温めるのが好ましい。しかし、本発明の更なる例において、この工程で、組織又は器官を、−５℃より高い、好ましくは−５℃と＋５℃との間の温度に温める。
【００４６】
本発明の例では、迅速な加温速度を、溶液を含む容器を配置する環境を変化させることによって達成することができる。特定の例では、組織又は器官を貯蔵する温度より高い温度で、その容器をガス環境中に配置することによって、この緩徐な加温速度を達成する。次いで、迅速な加温速度を達成するために、−７５℃より高い、好ましくは０℃より高い、更により一層好ましくは正常な大気温度の温度で、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の水溶液のような液体中に、容器を配置する。
【００４７】
組織又は器官を−６５℃より高い温度に温めた後、溶液中の凍結保護物質の濃度を徐々に減少させる。凍結保護物質の濃度は、段階的方法において減少させるのが好ましい。本発明の１例では、凍結保護物質が組織又は器官から溶出されるのを促進する一連の減少する凍結保護物質の濃度の溶液中に、組織又は器官を浸すことによって、減少する凍結保護物質の溶液を達成する。組織又は器官はまた、これらの溶液を用いてかん流もすることができる。これらの溶液は、概して、−１５℃より高い、好ましくは−１５と＋１５℃との間、より一層好ましくは０℃と１０℃との間の温度である。
【００４８】
凍結保護物質の濃度を減少させ、特定のプラトーを達成するのが好ましく、このプラトーを、おおよその浸透圧平衡が達成されるのに十分な時間、特に少なくとも１０分間、好ましくは約１５分間維持する。次いで、凍結保護物質の濃度を更に減少させるが、このことは凍結保護物質を含まない溶液を提供してもよく、そうでなくてもよい。そうでない場合、その濃度を、おおよその浸透圧平衡が達成されるのに十分な時間維持した後、凍結保護物質の濃度を、再び、１以上の工程において更に減少させ、最終的には、凍結保護物質を含まない溶液を提供する。さらに、組織又は器官を、概して、１時間以下、好ましくは３０分以下の間、各溶液中に浸す。
【００４９】
凍結保護物質の濃度を減少させるために、凍結保護物質の溶液を、組織又は器官に凍結保護物質を添加する際に用いる凍結保護物質を含まない溶液と類似の種類の溶液と混合することができる。溶液は、好ましくは、少なくとも１種の浸透圧を緩衝する薬剤を含有する。
【００５０】
本発明のガラス化の方法は、代表的に、凝固を含む通常の凍結保存技術に比べ組織又は器官試料中の生存可能な細胞のより一層高い数又は割合をもたらす。本発明の方法は、概して、少なくとも５０％の生存可能な細胞を有する組織又は器官の試料をもたらす。例において、本発明の方法は、例えば、少なくとも９０％の生存度のような、少なくとも８０％の生存度の、少なくとも６０％の生存可能な細胞を有する組織又は器官の試料をもたらす。本発明はまた、新鮮な未処理のコントロールに対し、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の維持された細胞機能及び移植片機能をもたらすことができる。
【００５１】
本明細書で用いるように、“浸透圧を緩衝する薬剤”は、低分子量又は高分子量の非穿通性の細胞外の溶質を意味し、これは凍結保護物質の流出プロセスの間に、凍結保護物質の細胞外濃度よりは大きい細胞内濃度の浸透圧効果を弱める。
【００５２】
本明細書で用いるように、“非穿通性の”は、化学物質の分子の大部分が組織又は器官の細胞内に浸透しないで、その代わりに、組織の細胞内の流体中に残ることを意味する。
【００５３】
本明細書で用いるように、“低分量の浸透圧を緩衝する薬剤”は、１，０００ダルトン以下の相対分子量を有する。低分子量の浸透圧を緩衝する薬剤には、次のものに限定されないが、マルトース、フルクトース１，６−二リン酸カリウム及びナトリウム、ラクトビオチン酸カリウム及びナトリウム、グリセロリン酸カリウム及びナトリウム、マルトペントース、スタキロース、マンニトール、ショ糖、グルコース、マルトトリオース、グルコン酸ナトリウム及びカリウム、グルコース６−リン酸ナトリウム及びカリウム、及びラフィノースが包含される。好適例では、低分子量の浸透圧を緩衝する薬剤は、少なくとも、マンニトール、スクロース及びラフィノースの１種である。
【００５４】
本明細書で用いるように、“高分子量の浸透圧を緩衝する薬剤”は、概して、１，００〜５００，０００ダルトンより高い相対分子量を有する。高分子量の浸透圧を緩衝する薬剤には、次のものに限定されないが、ヒドロキシエチルでんぷん（ＨＥＳ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ラフィノースウンデカ酢酸カリウム（＞１，０００ダルトン）及びフィコール（１，０００〜１００，０００ダルトンより高い）が包含される。好適例では、高分子量の浸透圧を緩衝する薬剤は、ＨＥＳであり、より一層好ましくは、約４５０，０００の分子量を有する。
【００５５】
凍結保護物質を含まない溶液は、好ましくは約５００ｍＭ未満の浸透圧を緩衝する薬剤、より一層好ましくは約２００から４００ｍＭまでの浸透圧を緩衝する薬剤を含有する。浸透圧を緩衝する薬剤としては、低分子量の浸透圧を緩衝する薬剤を用いるのが好ましい。最も好ましくは、低分子量の浸透圧を緩衝する薬剤はマンニトールである。
【００５６】
特に好ましい例では、凍結保護物質を７種の工程において除去する。好適例では、工程１において、凍結保護物質の濃度は、ガラス化のために用いる４０〜６０％、好ましくは４５〜５５％の凍結保護物質濃度であり；工程２において、凍結保護物質の濃度は、ガラス化のために用いる３０〜４５％、好ましくは３５〜４０％の凍結保護物質濃度であり；工程３において、凍結保護物質の濃度は、ガラス化のために用いる１５〜３５％、好ましくは２０〜３０％の凍結保護物質濃度であり；工程４において、凍結保護物質の濃度は、ガラス化のために用いる５〜２０％、好ましくは１０〜１５％の凍結保護物質濃度であり；及び工程５において、凍結保護物質の濃度は、ガラス化のために用いる２．５〜１０％、好ましくは５〜７．５％の凍結保護物質濃度である。これらの工程では、溶液の残余は凍結保護物質を含まない、浸透圧を緩衝する薬剤を含有する溶液である。工程６においては、本質的に、すべての凍結保護物質を除去する。しかし、浸透圧を緩衝する薬剤を残す。工程７においては、浸透圧を緩衝する薬剤を除去する。あるいはまた、工程６及び７は単一の工程に組み合わせることができる。すなわち、浸透圧を緩衝する薬剤を凍結保護物質の残余と同時に除去することができる。さらに、浸透圧を緩衝する薬剤を用いていない場合や、それを除去しない場合には、工程７を除くことができる。これらの濃度の各工程をおおよその浸透圧平衡が達成されるのに十分な時間維持する。
【００５７】
一連の溶液の温度は、概して、−１５℃より高い、好ましくは−１５と＋１５℃との間、更により好ましくは０℃と＋１０℃との間である。工程１を始める場合、組織又は器官は−７５℃より高い、好ましくは−６５℃より高い温度である。したがって、組織又は器官の温度が、組織又は器官を工程１において浸す際に溶液の温度未満である場合、凍結保護物質除去の工程１の間に、組織又は器官を更に温める。
【００５８】
さらに、組織又は器官をガラス化及び／又は失透の前又は後に処理することができる。例えば、組織又は器官を、米国特許出願第０９／６４５，５２５号、その総ての内容を参考のため本明細書に加入するもののような、かん流処理によって、ガラス化及び失透の前及び／又は後に再生することができる。組織又は器官は、ガラス化の前に、遺伝的に操作することができ、及び／又は、例えば、以下のＢｉｎｅｔｔｅ（ビネット）Ｆ、ＭｃＱｕａｉｄ（マッククウェイド）ＤＰ、Ｈａｕｄｅｎｓｃｈｉｌｄ（ハウデンシルド）ＤＲ、Ｙａｅｇｅｒ（ヤエガー）ＰＣ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（マクファーソン）ＪＭ、Ｔｕｂｏ（ツボ）Ｒの“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｔａｂｌｅ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ ｂｙ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（インビトロにおける成人ヒト関節軟骨細胞による肥大の証拠のない安定な関節軟骨の表現型の発現）”、 Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，（ジャーナルオブオルトペディックリサーチ） Ｖｏｌ． １６， Ｎｏ． ２， １９９８及びＳｔｏｎｅ（ストーン）ＢＢ、ＤｅＦｒａｎｚｏ（デフランツォ）ＢＥ、ＤｉＣｅｓａｒｅ（ディチェザレ）Ｃ、Ｒａｐｋｏ（ラプコ）ＳＭ、Ｂｒｏｃｋｂａｎｋ（ブロックバンク）ＫＧＭ、Ｗｏｌｆｒｕｍ（ウォルウルム）ＪＭ、Ｗｒｅｎｎ（レン）ＣＡ、Ｇｒｏｓｍａｎ（グロスマン）ＪＤの第３５回低温生物学学会（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ）の年会、１９９８年７月で示された“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｆｏｒ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（自家の軟骨細胞植込みのためのヒト関節軟骨の凍結保存）”、これらの総ての内容を参考として本明細書に加入する、に記載の、軟骨温浸（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）及び細胞増殖の処理によって、失透後の再操作することができる。あるいはまた、組織又は器官を、収集後実質的に直接にガラス化し及び／又は失透後実質的に直接移植することができる。
【００５９】
【実施例】
例１：血管新生化した組織
組織をかん流するために、図１に示すかん流系を用いることができる。かん流系は、３元活栓を有するカニューレ２に連通するかん流溶液５を含むリザーバ１（６０ｃｃシリンジ）を備える。リザーバ１を生理学的圧力に調整する。かん流溶液５を含むペトリ皿４（直径×高さ、５０×１５ｍｍ）中に、組織３を配置する。リザーバ１及びペトリ皿の双方においてかん流溶液５は、同じであり、予冷（０℃〜４℃）され、ペトリ皿４をかん流処理の間、氷（０℃〜４℃）中に配置する。
【００６０】
用いるガラス化溶液はＶＳ５５である。十分な強度のＶＳ５５溶液を６種の連続的な工程において導入する。第１工程において、組織を、ＶＳ５５のキャリアであるユーロ−コリンズ溶液でかん流する。工程２〜５において、その溶液中の十分な強度のＶＳ５５の量は、それぞれ、次のようである：１／８　ＶＳ５５、２／８　ＶＳ５５；４／８　ＶＳ５５；及び６／８　ＶＳ５５。各場合において、溶液の残余はユーロ−コリンズ溶液である。第６工程において、かん流溶液は十分な強度のＶＳ５５である。各工程での暴露は１５分間である。
【００６１】
ガラス化溶液を添加した後、図２に示す装置を用いて組織を迅速に冷却する。組織３を、シリコンチューブと共に、１ｍｌの予冷した十分な強度のＶＳ５５溶液７を含むガラスシンチレーションバイアル６（直径×高さ、２５×６０ｍｍ）中に配置し、試料８を形成する。ガラス化溶液７の上部を、０℃〜４℃で、０．７ｍｌの２−メチルブタン９（イソペンタン、凝固点：−１６０℃、密度：０．６２）で覆い、空気に直接接触するのを防ぐ。熱電対１０を、ガラス化溶液７のダミー試料１１中に挿入し、デジタル温度計１２上でその出力を監視する。温度を冷却処理中記録する。
【００６２】
冷却装置を−１３５℃の冷凍機内に設置する。冷却速度を、予冷した２−メチルブタン１４を含む容器１３中に試料を配置することによって調整する。冷却速度は、２−メチルブタン中にバイアルを配置する深さ（３０ｍｍは４３℃／分の冷却速度を生じさせ；６０ｍｍは７１℃／分の冷却速度を生じさせる）に依存して変化させることができる。この技術によって、試料を迅速（平均速度＝４３±２℃／分）に−１００℃に冷却する。次いで、試料を２−メチルブタン１４の容器１３の外に出し、−１３５℃の冷凍機中の空気で冷却処理を完了させることによって、試料を緩徐（平均速度＝３±０．２℃／分）に冷却する。図３は、予冷（−１３５℃）した２−メチルブタン中に３０ｍｍの深さでガラスシンチレーションバイアルを配置する技術を用いる一例の冷却プロファイルを示す。試料を次いで−１３５℃の冷凍機中に少なくとも２４時間貯蔵する。
【００６３】
２４時間貯蔵した後、２種の段階、−１００℃への緩徐な加温（平均速度＝３０±２℃／分）及び−６５℃への迅速な加温（平均速度＝２２５±１５℃／分）において、組織を再び加温する。緩徐な加温速度は、試料を−１３５℃の冷凍機の上部に置くことによって生成させ、迅速な加温速度は、ガラスバイアルを室温で３０％ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏの混合物中に配置することによって生成させる。図４はこの技術を用いる一例の加温プロファイルを示す。
【００６４】
次いで、ＶＳ５５のガラス化溶液を、７種の工程において、図１のかん流系を用い除去する。リザーバ１及びペトリ皿４におけるかん流溶液５は同じであり、予冷（０℃〜４℃）し、かん流処理の間、ペトリ皿４を氷（０℃〜４℃）中に配置する。したがって、第１工程の間、組織を０℃と４℃との間の温度に更に加温する。
【００６５】
最後の工程を除くすべての工程において、溶液は、凍結保護物質の溶液に加えて、４００〜２００ｍＭのマンニトールを含有する。工程１〜５において、溶液中の十分な強度のＶＳ５５の量は、次の：４／８　ＶＳ５５；３／８　ＶＳ５５；２／８　ＶＳ５５；１／８　ＶＳ５５；及び０．５／８　ＶＳ５５であり、溶液の残余は、マンニトール含有ユーロ−コリンズ溶液である。（４／８の強度のＶＳ５５溶液は、４００ｍＭのマンニトールと、混合されて２００ｍＭマンニトールを含有する低い凍結保護物質の濃度の溶液を形成する凍結保護物質フリーのユーロ−コリンズ用液とを含有する。したがって、ＶＳ５５の量が減少するので、マンニトールの量は４００と２００ｍＭとの間で減少する。）工程６において、２００ｍＭのマンニトールを含有するユーロ−コリンズ溶液を用いる。工程７において、マンニトールを含有しないユーロ−コリンズ用液を用いる。各工程での暴露は１５分間である。
【００６６】
例２：軟骨
ブタの軟骨をこの研究に用いた。試料の寸法は１００〜３００ｍｇから、及び＞３００ｍｇに変動した。これらの実験には、新鮮なコントロール及びガラス化群が含まれる。組織の生存度は、アマーラブルー（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）アッセイを用いて試験した。
【００６７】
非近交系ブタ６匹のそれぞれ、秤量３０〜６０ｋｇをこの試験的な研究において選定した。この動物を秤量し、次いで３３ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１．１ｍｇ／ｋｇのアセプロマジンを用いて感覚消失を誘導し、及びイソフルランをフェイスマスクによって酸素中に届けた。挿管後、酸素中に届けられるイソフルランを用いて感覚消失を維持した。ブタの膝の軟骨を後の研究のために収集した。
【００６８】
氷点下への冷却に先立って、軟骨組織試料を、６つの工程においてガラス化溶液ＶＳ５５を添加することによって、凍結保護物質の混合物に、氷上（４℃）で、それぞれ１５分間曝した。これを、ユーロ−コリンズ溶液を含有するガラスシンチレーションバイアル（直径×高さ、２５ｍｍ×６０ｍｍ）中で、軟骨試料が４℃の十分な強さのＶＳ５５中に浸せきされるまで、溶液中の凍結保護物質の濃度を増加させる連続の工程を用いて、行った。ガラス化溶液の表面を、４℃で、０．７ｍｌの２−メチルブタンで覆い、空気に直接接触するのを防いだ。試料を迅速に（３１℃／分で）−１００℃にまで冷却し、次いで緩徐に（２℃／分）−１３５℃にまで冷却し、及び最後に−１３５℃で冷凍機中に少なくとも２４時間貯蔵した。各ガラス化した軟骨試料を２つの段階中、−１００℃までの緩徐な加温（２７℃／分）及び約−３５℃までの迅速な加温（１６９℃／分）で再び加温した。試料の再加温の後、ＶＳ５５を段階的方法（７つの工程、各１５分、氷上、十分な強さのＶＳ５５を用いて開始し、及び連続する工程において溶液中の凍結保護物質の濃度を減少させる）において除去し細胞に対する浸透圧の衝撃を最小にした。
【００６９】
アマーラブルーアッセイを、非細胞特異的生存度アッセイとして用いた。このアッセイは獲得（新鮮）及びガラス化処理後の細胞の生存を決定するために用いた。これには、細胞の代謝によって生じる増殖培地の化学的な還元に応じて蛍光を発すると共に及び色を変化させる、代謝活性、特異的な、酸化還元（ＲＥＤＯＸ）指示剤に基づく水溶性の蛍光定量的な生存度指示剤が組み入れられる。ＲＥＤＯＸ指示剤は、細胞に対し最小限の毒性という追加の利点を有し、及びこのことによって同じ組織検体上で行うべき複数の試験が許容される。マイクロタイタープレートのウェル中に配置されるに先立って、３〜６時間アマーラブルーの作業溶液と温置した組織試料からの培地のアリコートを、マイクロタイタープレートの蛍光光度計上５９０ｎｍで読み取った。データを組織試料の重量に対して標準化し、及び１１又はそれ以上の未処理のコントロールの繰り返し試料についてアマーラブルー蛍光強度の平均±１標準誤差（ｓｅ） として割合で示した。
【００７０】
この試験的研究の結果を以下の表４にまとめる。生存度は、軟骨の湿重量に対して相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）（平均±ＳＥＭ）で示した。蛍光を、Ｆｍａｘマイクロプレート読み取り機を用い５４４ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの発光波長で読み取った。ｎ＝１５、新鮮コントロール；ｎ＝１１、ガラス化。ガラス化した軟骨組織の平均の細胞の生存は、新鮮コントロール（２９．６５±３．０４）と比較して約９１．５％（２７．１３±６．６４）であることが分かる。ガラス化した軟骨における改善された細胞の回復が例証されたこの研究は、凍結保存に対するこのアプローチによって軟骨組織の長期の貯蔵のために奨励される溶液が提供されることを示す。
【表４】
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【００７１】
この例は、新規なガラス化のアプローチを用い、劇的に改善された細胞の生存が軟骨のガラス質の凍結保存を用いることによって達成されることを示した。著しく対照的に、他の研究者は、軟骨の通常の凍結保存が、コラゲナーゼ／トリプシン消化によって組織から解放された生存可能な細胞の数を、新鮮なコントロール組織の２０％（範囲０〜２０％）未満に減少させると報告している。これらの結果は、明らかに、ガラス化した軟骨が通常の凍結保存した軟骨に対して著しく優れることを示す。この例は、無処理の関節軟骨中のより一層高い細胞の回復が氷の形成の回避の直接の結果であることを示唆し、及び多細胞性の組織における低温傷害の既知の機構を実証する。
【００７２】
例３：さらなる組織
組織の長期間貯蔵のためのガラス化の実現可能性を試験するため、種々の組織の原料のための動物モデルとしてブタを選定した。試料の寸法は＜１００ｍｇから及び１００−３００ｍｇで変動した。これらの試験的な実験には、新鮮なコントロール及びガラス化群が含まれる。組織の生存度は、アマーラブルーアッセイを用いて試験した。
【００７３】
非近交系ブタ６匹のそれぞれ、秤量３０〜６０ｋｇをこの実験において選定した。この動物を秤量し、次いで３３ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１．１ｍｇ／ｋｇのアセプロマジンを用いて感覚消失を誘導し、及びイソフルランをフェイスマスクによって酸素中に届けた。挿管後、酸素中に届けられるイソフルランを用いて感覚消失を維持した。ブタの心臓弁、心筋、皮膚及び角膜を、後の研究のために収集した。
【００７４】
氷点下への冷却に先立って、組織試料を、６つの工程においてガラス化溶液ＶＳ５５を添加することによって、凍結保護物質の混合物に、氷上（４℃）で、それぞれ１５分間曝した。これを、ユーロ−コリンズ溶液を含有するガラスシンチレーションバイアル（直径×高さ、２５ｍｍ×６０ｍｍ）中で、試料が４℃の十分な強さのＶＳ５５中に浸せきされるまで、溶液中の凍結保護物質の濃度を増加させる連続の工程を用いて、行った。ガラス化溶液の表面を、４℃で、０．７ｍｌの２−メチルブタンで覆い、空気に直接接触するのを防いだ。試料を迅速に（２０℃／分で）−１００℃にまで冷却し、次いで緩徐に（２℃／分）−１３５℃にまで冷却し、及び最後に−１３５℃で冷凍機中に少なくとも２４時間貯蔵した。各ガラス化した試料を２つの段階中、−１００℃までの緩徐な加温（２６℃／分）及び約−３５℃までの迅速な加温（２１６℃／分）で再び加温した。試料の再加温の後、ＶＳ５５を段階的方法（７つの工程、各１５分、氷上、十分な強さのＶＳ５５を用いて開始し、及び連続する工程において溶液中の凍結保護物質の濃度を減少させる）において除去し細胞に対する浸透圧衝撃を最小にした。
【００７５】
アマーラブルーアッセイを、非細胞特異的生存度アッセイとして用いた。このアッセイは獲得（新鮮）及びガラス化処理後の細胞の生存を決定するために用いた。マイクロタイタープレートのウェル中に配置されるに先立って、２〜２４時間アマーラブルーの作業溶液と温置した組織試料からの培地のアリコートを、マイクロタイタープレートの蛍光光度計上５９０ｎｍで読み取った。データを組織試料の重量に対して標準化し、及び６又はそれ以上の未処理のコントロールの繰り返し試料についてアマーラブルー蛍光強度の平均±１標準誤差として割合で示した。
【００７６】
この研究の結果を以下の表５にまとめる。生存度は、組織の湿重量に対して相対的な蛍光単位（ＲＦＵ）（平均±ＳＥＭ）で示す。蛍光は、Ｆｍａｘマイクロプレート読み取り機を用い５４４ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの発光波長で読み取った。ガラス化した組織の平均の生存度は、新鮮コントロールと比較して約７３％（６１％から８８％までの範囲）であることが分かる。ガラス化した組織における改善された細胞の回復が例証されるこれらの例は、この凍結保存に対するアプローチによって組織の長期の貯蔵のために奨励される溶液が提供されることを示す。
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いられる一例のかん流系を示す図である。
【図２】組織又は器官を迅速に冷却するのに用いられる装置を示す図である。
【図３】予め冷却した２−メチルブタン中、３０ｍｍの深さでガラスシンチレーションバイアルを配置し、次いで、図２の装置を用いる冷気中に配置することによって生じた典型的な冷却プロファイルを示す図である。
【図４】冷気中、次いで室温で３０％のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏの混合物中に、ガラスシンチレーションバイアルを配置することによって生じた典型的な加温プロファイルを示す図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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