(57)【要約】本発明は、以下に示す式（Ｉ）で表わされるペプチドに関するものである。（Ａ）ｎ−Ａ１−Ａ１−Ａ２−Ａ１−Ａ３−Ａ４−Ａ１−（Ａ）ｍ式中、・Ａは、任意のアミノ酸であり、・ｎとｍは、それぞれ０〜２０の範囲内にある数字であり、且つｎ＋ｍの合計が０〜２０の範囲にあり、その範囲は０〜１５であることが好ましく、更に０〜１０であることが特に好ましく、・Ａ１は、塩基性アミノ酸であり、特にリジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）であり、・Ａ２は、塩基性アミノ酸、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）からなる群から選択されるアミノ酸であり、・Ａ３は、塩基性アミノ酸、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）からなる群から選択されるアミノ酸であり、・Ａ４は、塩基性アミノ酸、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）及びバリン（Ｖａｌ） からなる群から選択されるアミノ酸である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）に該当するペプチド：
（Ａ）ｎ−Ａ１−Ａ１−Ａ２−Ａ１−Ａ３−Ａ４−Ａ１−（Ａ）ｍ
式中：
・Ａは、任意のアミノ酸であり、
・ｎとｍは、それぞれ０〜２０の範囲内にある数字であり、且つｎ＋ｍの合計が０〜２０の範囲にあり、その範囲は０〜１５であることが好ましく、更に０〜１０であることが特に好ましく、
・Ａ１は、塩基性アミノ酸であり、特にリジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）であり、
・Ａ２は、塩基性アミノ酸、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）からなる群から選択されるアミノ酸であり、
・Ａ３は、塩基性アミノ酸、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）からなる群から選択されるアミノ酸であり、
・Ａ４は、塩基性アミノ酸、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）及びバリン（Ｖａｌ） からなる群から選択されるアミノ酸である。
【請求項２】
以下に示される式のうち何れか１つに該当する請求項１に記載のペプチド。
（ＩＩ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−（Ａ）ｍ
（ＩＩＩ）　（Ａ）ｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（Ａ）ｍ
（ＩＶ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（Ａ）ｍ
（Ｖ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（Ａ）ｍ
（ＶＩ）　（Ａ）ｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−（Ａ）ｍ
（ＶＩＩ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（Ａ）ｍ
（ＶＩＩＩ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ａ）ｍ
上記式において、Ａ、ｎおよびｍは、式（Ｉ）におけるものと同じ意味である。
【請求項３】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有する医薬組成物
【請求項４】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、筋肉の増殖等、細胞の再生と増殖を促進するために役立つ請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有し、場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬組成物。
【請求項５】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、瘢痕治療に役立つ請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有し、場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬組成物。
【請求項６】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、血管の虚血の予防または治療に役立つ請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有し、場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬組成物。
【請求項７】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、血液単核細胞の増殖、特にＴリンパ球の増殖を刺激することに役立つ請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有し、場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬組成物。
【請求項８】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、炎症性サイトカインの産生を刺激するために役立つ請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有し、場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬組成物。
【請求項９】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、免疫抑制に関連した疾患の予防または治療に役立つ請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有し、場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＩＶウイルスの複製と遊離の促進に役立ち、結果的にこれらウイルスの抗ウイルス剤への接近を容易にする請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有し、場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬組成物。
【請求項１１】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、培養細胞、特に内皮細胞またはＴリンパ球などのリンパ系細胞の増殖と分化を促進するために役立つ請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有し、場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬組成物。
【請求項１２】
医薬上許容される賦形剤を含有してもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＩＶウイルスの複製を増幅することに役立ち、結果的にＨＩＶウイルスの検出とタイプの識別を容易にする請求項１または２に記載のペプチドを単数または複数含有し、場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は、新規な一連のペプチド化合物に関するものであり、特に炎症性サイトカインの分泌を刺激する能力と組織の再生を促進する能力を有する。更に本発明は、当該ペプチドを少なくとも一つ含有する医薬組成物に関するものである。
【０００１】
（背景技術）
ＨＡＲＰ、ＭＫ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＨＩＶ１−ｔａｔ、ＨＩＶ２−ｔａｔ、ＨＦＧ、ＨＢ−ＥＧＦ、或いはアンギオゲニン等、血管形成に関する数多くの増殖因子が、従来技術として知られている。これら物質の中でも、ＰＴＮ（プレイオトロフィン）或いはＨＢ−ＧＡＭ（ヘパリン結合性増殖関連因子）と称されているＨＡＲＰ（ヘパリン結合性調節ペプチド）は、ＭＫ（ミッドカイン）と共に、増殖と分化に関する構造的に類似した因子により構成されており、これらの因子はヘパリンと結合し、アミノ酸の相同性は５０％に達している（参考文献１、２）。
【０００２】
増殖関連因子であるＨＡＲＰは、１６８個のアミノ酸より成るペプチドであり、シグナルペプチドに相当する３２個の疎水性アミノ酸を、Ｎ−末端側に構成単位として有している。成熟した状態のＨＡＲＰは、短い形態においては１３６個のアミノ酸から成り、長い形態においては１３９個のアミノ酸から成る分泌タンパク質であり、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により決定された還元状態における見かけの分子量は１８ｋＤａである。
【０００３】
当初ＨＡＲＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ニューライトの増殖を誘発する分子としてラットの新生仔から分離され（参考文献３）、このポリペプチドはニューロン細胞の成熟に関連を有していることが示唆されていた（参考文献４）。後にこのポリペプチドは、ニューロン以外の組織中にも、ラットの心臓（参考文献５）、子宮（参考文献６）、軟骨組織（参考文献７）、骨の抽出物（参考文献８）に存在していることが研究により明らかにされ、ＨＡＲＰの機能はそれまでに報告されていたように（参考文献３）、その活性が、ニューライトの増殖促進に限定されるものではないことが証明された。
【０００４】
ＨＡＲＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞の増殖を刺激する能力を有している（参考文献６、９）。後に、この分裂促進活性は、真核細胞の発現系から産生された組み換えタンパク質を用いることにより確認されている（参考文献９、１２）。ＨＡＲＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、偽毛細血管（ｐｓｅｕｄｏ−ｃａｐｉｌｌａｉｒｅｓ）の形成をも誘発する（参考文献１２）。様々な組織のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、ＨＡＲＰの局在は、特に毛細血管の内皮細胞と関連を有している（参考文献１６）。現時点でのＨＡＲＰに関する知見では、このポリペプチドが、血管形成ならびに腫瘍性新血管形成と関連する複雑なメカニズムにおいて、役割を果していることが示唆されている。腫瘍、とりわけ乳房や前立腺などのホルモン依存性腫瘍の進行におけるＨＡＲＰの関連を明らかにするために、この分野に関する数多くの研究がこれまでに行われている。
【０００５】
ＨＡＲＰの生物学的性質に関する研究が数多くの研究施設において行われており（参考文献２）、それらの研究結果には異論が多いものの、ＭＫとまったく同様に、ＨＡＲＰは細胞増殖の制御に関連を有していることが認められているものと思われる（参考文献２、９〜１１）。そのうえ、精製されたヒトＨＡＲＰの組み替えタンパク質は、内皮細胞に対する分裂促進性を有しており（参考文献９、１２）、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて血管形成の作用を発揮することが証明されている（参考文献１２）。数多くの研究により、ＨＡＲＰならびにＭＫが、発育のプロセスに関連を有していることが認められている（参考文献１０、１３、１４）。胎児および出生後の発育の間におけるＨＡＲＰのｍＲＮＡ分布に関する研究により、細胞の増殖と分化における重要な機能が示唆されている（参考文献１５）。しかしながら、これら分子のｉｎ ｖｉｖｏにおける生理学的な機能は、きわめて僅かにしか知られていない。髄膜、虹彩、精巣、子宮を含む成人の組織において、ＨＡＲＰに関係する転写物が存在していることは、成人期の間における生理学的な役割をも意味している。
【０００６】
本発明の範囲内において行われた研究は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ、ＨＩＶ１−ｔａｔ、ＨＩＶ２−ｔａｔ、ＨＢ−ＥＧＦ、アンギオゲニン、ＨＡＲＰ、ＭＫ等、数多くの血管形成に関する増殖因子を対象としたものであり、これらの研究により、本発明者らは、これらの様々な増殖因子において共通して見出されるペプチド配列を突き止めることができた。これらのペプチド配列に基づいて、本発明者らは、リジン（Ｋ）ならびにアルギニン（Ｒ）の塩基性アミノ酸が豊富なペプチド化合物を創出した。
【０００７】
（発明の開示）
様々な増殖因子が、塩基性アミノ酸の豊富な配列部分を有していることが報告されている。表Ｉに示す通り、当該部分において、塩基性アミノ酸が一列に並んでいることは明らかである。
【０００８】
【表１】
2004502636.tif 000002
【０００９】
本発明は、斯かる事実に基づいて為されたものであり、以下の式（Ｉ）に該当するペプチドを対象とする：
（Ａ）ｎ−Ａ１−Ａ１−Ａ２−Ａ１−Ａ３−Ａ４−Ａ１−（Ａ）ｍ
式中：
・Ａは、任意のアミノ酸であり、
・ｎとｍは、それぞれ０〜２０の範囲内にある数字であり、且つｎ＋ｍの合計が０〜２０の範囲にあり、その範囲は０〜１５であることが好ましく、更に０〜１０であることが特に好ましく、
・Ａ１は、塩基性アミノ酸であり、特にリジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）であり、
・Ａ２は、塩基性アミノ酸、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ）からなる群から選択されるアミノ酸であり、
・Ａ３は、塩基性アミノ酸、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）及びグルタミン（Ｇｌｎ）からなる群から選択されるアミノ酸であり、
・Ａ４は、塩基性アミノ酸、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）及びバリン（Ｖａｌ） からなる群から選択されるアミノ酸である。
【００１０】
本発明に係る式（Ｉ）のペプチドは、“ＨＡＲＰと表わされる血管形成ペプチド”の代わりに“ｐＡＨＡ”と示されることがある。
【００１１】
本発明は、好ましくは以下の式で示されるペプチドを対象とするものである。
（ＩＩ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−（Ａ）ｍ
（ＩＩＩ）　（Ａ）ｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（Ａ）ｍ
（ＩＶ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（Ａ）ｍ
（Ｖ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−（Ａ）ｍ
（ＶＩ）　（Ａ）ｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−（Ａ）ｍ
（ＶＩＩ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（Ａ）ｍ
（ＶＩＩＩ）　（Ａ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（Ａ）ｍ
上記式において、Ａ、ｎおよびｍは、式（Ｉ）におけるものと同じ意味である。
【００１２】
式（ＩＩ）のペプチドは、特にＨＡＲＰ（１〜１４）の配列に基づいて決定されたものである。
【００１３】
式（ＩＩＩ）のペプチドは、特にＨＩＶ−ｔａｔ（７０〜９２）の配列に基づいて決定された。
【００１４】
式（ＩＶ）のペプチドは、特にＨＢ−ＥＧＦ（８５〜１１４）の配列に基づいて決定された。
【００１５】
式（Ｖ）のペプチドは、特にＨＡＲＰ（１０８〜１３２）の配列に基づいて決定された。
【００１６】
式（ＶＩ）のペプチドは、特にＶＥＧＦ（１４５〜１７０）の配列に基づいて決定された。
【００１７】
式（ＶＩＩ）のペプチドは、特にＨＩＶ−ｔａｔ（４１〜６５）の配列に基づいて決定された。
【００１８】
式（ＶＩＩＩ）のペプチドは、特にＭＫ（１〜１１）の配列に基づいて決定された。
【００１９】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明のペプチドは、化学的な合成により、当業者に知られている手法により、或いは相当するポリヌクレオチドの配列に基づいた遺伝子発現の手法により調製することができる。
【００２０】
本発明者らにより、ｐＡＨＡペプチドが、ＨＡＲＰと同様に、かつ似通った用量において（ＥＤ５０＃ ５〜５０ ｎｇ／ｍｌ）、血管形成と瘢痕に効果を示すことが明らかにされた。すなわち本発明者らにより、これらのペプチドが、血管の虚血（血管形成）、筋肉の再生、瘢痕に対して顕著な活性を有していることが認められた。また、本発明者らにより、本発明によるペプチドが炎症性サイトカインの分泌を刺激する能力を有しており、このため免疫抑制に関連した疾患、特にエイズの予防または治療に役立つことも示された。
【００２１】
また、本発明は、医薬上許容される賦形剤を単数または複数含有してもよく、前記ペプチドを単数または複数含有する医薬組成物に関するものでもある。
【００２２】
組織の再生に対する前記ペプチドの特性を考慮に入れた場合、本発明は、筋肉の増殖等、細胞の再生と増殖を促進するために役立ち、結果的に瘢痕治療に役立つ。本発明は、特にｐＡＨＡペプチドを単数または複数含有し、ならびに場合によっては更に１つの別成分を含有する医薬品組成物に関するものである。
【００２３】
血管形成に対して前記ペプチドが作用を及ぼすことから、本発明は、血管の虚血の予防または治療に役立ち、特にｐＡＨＡのペプチドを単数または複数含有し、ならびに場合によっては更に１つの別成分を含有する組成物に関するものである。
【００２４】
前述のように、本発明の範囲内において行われた研究により、血行中の細胞増殖、特に末梢血の単核細胞の増殖に対して、ｐＡＨＡが予想外の効果を有していることを明らかにすることができた。この性質に関する詳細な研究により、ある種のサイトカインに対して、特に炎症性サイトカインに対して、ｐＡＨＡが刺激をもたらす特性を有していることを認めることができた。
【００２５】
すなわち、内皮細胞および平滑筋の細胞と同様に、血管の細胞においても、またヒトの乳腺においても、ＨＡＲＰタンパク質のｍＲＮＡの存在が認められている（参考文献１６）。しかも、ＨＡＲＰが血管形成に関する増殖因子であり（参考文献１２）、血管の内皮細胞の中で合成され、この細胞に局在していることが報告されている（参考文献１６）。
【００２６】
このため、本発明者らにより、増殖因子ＨＡＲＰおよびｐＡＨＡペプチドと共にインキュベートすることによって、分離されたばかりのＰＢＭＣ（ヒト末梢血の単核細胞）に対するこの増殖因子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける活性の評価が行われた。得られた結果は、ＨＡＲＰならびにｐＡＨＡが、ＰＢＭＣの核へのトリチウムチミジンの取り込みを刺激する能力を有していることを示していた。したがって、これらの結果は、ＨＡＲＰ分子とｐＡＨＡペプチドのいずれもが、ヒト末梢血の単核細胞の増殖を強く刺激することを証明するものであり、特に１週間後に、Ｔリンパ球の数が増加していることが認められた。
【００２７】
本発明者らにより行われた様々な試験により、ＨＡＲＰは、１０ｐＭオーダーという極めて低濃度において、リンパ球の増殖に対して活性を有していることが認められた。この驚くべき結果が得られたことから、本発明者らは、増殖因子ＨＡＲＰが、強い親和性をもってＰＢＭＣにおける受容体に結合するはずであると考えた。
【００２８】
ＰＢＭＣをＨＡＲＰと共にインキュベートした後では、ＩＬ−２のいかなる増加も認められなかった。このため、本発明者らは、ＨＡＲＰがインターロイキンＩＬ−２の産生に対して作用を及ぼすのではなく、ＨＡＲＰならびにｐＡＨＡが、リンパ球に存在している特異的受容体と強い親和性により結合し、インターロイキン部位、特にＩＬ−２部位の活性化を誘発するものと結論づけた。
【００２９】
現在、ＨＡＲＰ受容体のことは非常に僅かにしか分かっていないが、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の中に、ＨＡＲＰとの強い親和性を有する結合部位（Ｋｄ＝６００ ｐＭ）が存在していることがすでに報告されている（参考文献２０）。これらのＨＡＲＰの結合部位は、ラットの腎臓の細胞、ヒト乳腺の癌細胞、ヒト表皮の癌細胞、ヒト悪性肝癌の細胞、マウスの神経芽細胞、ならびに褐色細胞腫の細胞を含む、様々なタイプの細胞に中にも存在することが認められている。
【００３０】
これらタイプの細胞においては、ＨＡＲＰにより伝達されるいかなる生物学的な反応も見出されていない。したがって、これらの結合部位は、機能を有する受容体とみなすことはできないということが広く認められている。同種の研究において、ＨＡＲＰとシンデカン１およびシンデカン３などのヘパラン硫酸プロテオグリカンとの間の相互作用が説明されている。シンデカン３の見かけの分子量はＫｄ＝８００ｐＭであり、ＨＡＲＰと相互作用を有していることが認められている。このヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ニューライトの病的な増殖に対するＨＡＲＰの活性と関連を有している。というのは、抗シンデカン３抗体は、この活性を妨げることができるからである（参考文献２１）。
【００３１】
より最近になって、前田らの報告において、ＨＡＲＰが、受容体様のタンパク質チロシンホスファターゼβの細胞外における変異体であり、ＲＰＴＰβと称されるホスパカン（ｐｈｏｓｐａｃａｎ）における弱い親和性（Ｋｄ＝３ｎＭ）ならびに強い親和性（Ｋｄ＝２５０ｐＭ）の結合部位と結合することが説明されている（参考文献２２）。
【００３２】
興味深いことに、ＭＫ（ミッドカイン）とＨＡＲＰは同じ系統の分子に属しており、これらの二つの物質はニューライトの増殖を誘発するにもかかわらず（参考文献１７、２３）、ＭＫを用いた場合はＰＢＭＣ中へのトリチウムチミジンの取り込みの誘発は何ら検出されない。このことは、ＭＫとＨＡＲＰが異なる表面受容体に結合することを示唆しており、しかも最近、この異なる表面受容体への結合が証明されている（参考文献２４、２５）。そのうえ、これら二つの分子は、同じ発現の組み換えの系ならびに同じ精製の手法を含む類似の実験方法を用いることにより、発現され、精製される。トリチウムチミジンの取り込みが、ＨＡＲＰを用いた場合にのみ観察され、ＭＫを用いた場合には観察されないという事実は、ＰＢＭＣに対して分裂促進の作用を及ぼす細菌の夾雑物が存在している可能性を除外するものである。
【００３３】
ドナーによって、ＰＢＭＣの刺激指数が異なることが認められている。ＩＬ−２により誘発される分裂促進の作用に関して推奨されているＰＨＡと同様に、レクチンによってＰＢＭＣを活性化しなくても、ＨＡＲＰにより休止状態の細胞の分裂促進の作用は、最も顕著に誘発されることが認められている。この結果から、ＨＡＲＰが、ＩＬ−２の産生の刺激を誘発することはないことが明瞭に確認される。
【００３４】
つまり得られた結果は、ｐＡＨＡのペプチドが、免疫細胞の増殖に対して、特にＴリンパ球に対して作用を及ぼすことを示している。したがって本発明は、血液単核細胞の増殖、特にＴリンパ球の増殖を刺激することに役立ち、とりわけｐＡＨＡペプチドを単数または複数含有し、場合によってはもう１つの別の成分を含有する医薬組成物に関するものである。Ｔリンパ球の増殖を刺激することは、特に免疫抑制の疾患の治療に有益である。
【００３５】
エイズを発症している患者の血液に由来する細胞において、別の観察が行われている。後述の実施例４において、本発明者らにより、本発明のペプチドによって患者の血液細胞を刺激することで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＨＩＶウイルスの複製を増幅することが可能であり、その結果ＨＩＶウイルスを検出し、そのことによりタイプの識別を容易にすることが可能となることが示されている。このため、本発明のペプチドを含有している組成物は、ＨＩＶウイルスによる感染の診断にも役立つ。
【００３６】
ＨＩＶウイルスによる感染の治療分野においては、抗ウイルス剤の効果は、事前にあるいは同時に、本発明のペプチドを単数または複数投与することにより、増強されるであろう。すなわち、本発明のペプチドにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＩＶウイルスの複製と遊離が、とりわけ抗ウイルス剤による治療後にも依然として人体内に存在している残存ＨＩＶウイルスの複製と遊離が促進されることになるだろう。本発明に基づくペプチドを投与してこれらのウイルスを活性化することによって、結果的にこれらのウイルスの抗ウイルス剤への接近が容易になり、より容易に破壊されるであろう。
【００３７】
一方、ＩＬ−２に加えてサイトカインも、細胞の増殖において、とりわけ血球の増殖において、役割を果していることが一般的に知られている。このため本発明者らにより、サイトカインの発現に対するＨＡＲＰとｐＡＨＡの役割を明らかにする研究が行われた。その結果、炎症性サイトカインの産生を誘発する性質を有していることが明らかにされた。ここで言う炎症性サイトカインとは、特にＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ならびにＩＮＦ−γを指すものと理解されなければならない。
【００３８】
このため、本発明者らは、ＨＡＲＰにより処理されたＰＢＭＣ細胞による３種類の炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６）の発現の誘発に関して、ならびに後述の実施例５に報告する配列を有する本発明に基づいた２種類のｐＡＨＡペプチドによるＩＬ−６の発現の誘発に関して、試験を行った。ＨＡＲＰを用いて得られた結果は、ＨＡＲＰが用量に比例してＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６のサイトカインの発現を誘発する能力を有していることを示している。
【００３９】
２種類のｐＡＨＡペプチドを用いて得られた結果は、これらペプチドがＩＬ−６の発現を刺激する能力を有していることを示している。これらサイトカインの発現増大は、アンギオゲニンならびにｔａｔタンパク質に由来する本発明に係る別のペプチド（表Ｉを参照）を、細胞に添加した後にも検出されている。ＨＡＲＰが変性させられている場合は、これらの炎症性サイトカインの発現はまったく検出されない。
【００４０】
これらの結果は、ＨＡＲＰならびにｐＡＨＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの双方において、炎症性サイトカインの産生を１００倍以上に刺激する能力を有していることを示している。従って、本発明は、特に炎症性サイトカインの産生を刺激するために役立ち、ｐＡＨＡのペプチドを単数または複数含有し、場合によってはもう１つの別の成分を含有する医薬組成物に関するものである。このため、本発明に基づくこのような組成物は、免疫抑制に関連した疾患の予防と治療に適応される。
【００４１】
これらの研究結果は、ＨＡＲＰまたはｐＡＨＡにより処理された組織がきわめて多数の単核細胞をもたらし、その結果筋肉の再生がもたらされることを示している。細胞および組織の再生に対するｐＡＨＡペプチドの作用に関する前述の結果と組み合わせて考えた場合、これらの結果は、組織の再生、とりわけ筋組織の再生に対してＨＡＲＰならびにｐＡＨＡが効果を有していることを証明するものである。
【００４２】
そのうえ、これらの結果から、培養細胞、特に内皮細胞やＴリンパ球などのリンパ系細胞の増殖と分化を促進するために、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドを含有している組成物を用いることが可能となる。斯かる結果より、これらの細胞の培養は、しばしば診断のためのテストの枠内で行われている。
【００４３】
前述のように、本発明のペプチドは、このペプチドをコードしているポリヌクレオチドの配列を遺伝的に発現させることにより作りだすことができる。したがって本発明は、先に定義されているあるペプチドに関してコードしている少なくとも一つのポリヌクレオチドの配列から構成されているか、この配列を含んでいる核酸の分子をも対象とするものである。このような核酸分子は、特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、宿主細胞の形質転換を行うために用いることが可能なプラスミドなどのベクターをいう。ここで言う宿主細胞とは、たとえば本発明のペプチドを産生することが可能なバクテリアを意味している。また、哺乳類の細胞であっても良いが、当該細胞は、特に、本発明のペプチドが役立つところの前述した疾患の細胞レベルでの治療または遺伝子治療方法のために有益な、ヒトの細胞であるものとされる。このため、本発明は、主成分として少なくとも１種類の核酸または先に定義されている細胞を含有している組成物をも対象としたものである。
【００４４】
本発明のその他の利点ならびに特徴は、添付図面に関連する実施例についての後述の説明において示されている。これらの図の内容は以下の通りである。
【００４５】
図１には、ＨＡＲＰにより刺激された場合または刺激されていない場合の、トリチウムチミジンのＰＢＭＣ内への取り込みが示されている。白抜きの棒は刺激されていない細胞を示し、斜線が引かれた棒は１００ｎｇ／ｍｌのＨＡＲＰにより刺激された細胞を示す。
【００４６】
図２には、ＰＢＭＣに対する試験に供されたＨＡＲＰの用量反応関係が示されている。Ａ）細胞は０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度のＨＡＲＰ（●−●）あるいはミッドカイン（○−○）が存在している状態または存在していない状態で培養されている。各値は得られたｃｐｍの平均値±標準偏差を意味している。Ｂ）細胞は１８００ＩＵ／ｍｌの破傷風毒素（ＴＴ）、２．５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、５０μＩＵ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と共にインキュベートされているか、あるいは対照として、処理を施されていない（ＮＴ）。
【００４７】
図３には、抗ＣＤ３抗体により処理されたＰＢＭＣに対するＨＡＲＰの用量反応関係が示されている。細胞は前述のように培養されている。注目すべきことに、細胞をＣＤ３の存在下に１００ｎｇ／ｍｌのＨＡＲＰにより処理した場合は、細胞が死に至る率が高いことが認められた。黒色の棒はＨＡＲＰのみを示し、白抜きの棒はＨＡＲＰ＋抗ＣＤ３抗体を示す。
【００４８】
図４には、破傷風毒素により処理されたＰＢＭＣに対するＨＡＲＰの用量反応関係が示されている。細胞は前述のように培養されている。注目すべきことに、破傷風毒素の存在下に（８００ＩＵ／ｍｌ）、１００ｎｇ／ｍｌのＨＡＲＰにより処理した場合は細胞死に至る率が高いことが認められた。黒色の棒グラフはＨＡＲＰのみを示し、白抜きの棒グラフはＨＡＲＰ＋破傷風毒素を示す。
【００４９】
図５には、ｐ２４の免疫反応性を測定することによるＨＩＶウイルスの複製に対するＨＡＲＰタンパク質の作用が示されている。ＨＩＶに感染している患者に由来したＰＢＭＣが、§１に説明されている手順に従って様々な濃度（０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）のＨＡＲＰと共に３日間インキュベートされた。ウイルスの複製は培地中に存在しているｐ２４のタンパク質に関連した免疫反応性を測定することにより評価されている。（＊）は細胞が死ぬ率が低いことを示し、（＊＊）は細胞が死ぬ率が高いことを示す。ウイルスの産生は、サンドイッチタイプの固相における酵素標識抗体法による定量である“Ａｂｏｔｔ ＨＩＶ Ａｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ”テストにより評価されている。試験に供されたサンプル中に存在しているウイルスはＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００により溶解され、次いで溶解物は抗ｐ２４モノクロナール抗体で覆われているポリスチレン微粒子と共にインキュベートされた。インキュベートされた後、微粒子は洗浄され、特異性を有する免疫グロブリンの存在は、ペルオキシダーゼと結合している二番目のマウスの抗Ｉｇ抗体と共にインキュベートすることにより明らかにされた。発色はペルオキシダーゼの基質を添加して、オルソフェニレンジアミンにより行なった。
【００５０】
図６には、ＨＡＲＰペプチドによる末梢血の単核細胞の活性化が示されている。ＰＢＭＣは、１ｎｇ／ｍｌのＨＡＲＰタンパク質あるいは１μｇ／ｍｌのペプチドの１または２が存在している状態あるいは存在していない状態において、牛の胎児の血清１０％を含有しているＲＰＭＩ培地中で７日間培養された。トリチウムチミジンの取り込みは前述にように測定された。
【００５１】
図７には、３日間（白抜きの棒）または７日間（黒色の棒）培養された後のＩＬ−１の発現に対するＨＡＲＰの作用に関する試験が示されている。これらサイトカインの定量は、Ｒ＆Ｄ社により市販されているＥＬＩＳＡ試験のキットを用いて行われた。
【００５２】
図８には、３日間（白抜きの棒）または７日間（黒色の棒）培養された後のＴＮＦ−αの発現に対するＨＡＲＰの作用に関する試験が示されている。これらサイトカインの定量はＲ＆Ｄ社により市販されているＥＬＩＳＡ試験のキットを用いて行われた。
【００５３】
図９には、３日間（白抜きの棒）または７日間（黒色の棒）培養された後のＩＬ−６の発現に対するＨＡＲＰの作用に関する試験が示されている。これらサイトカインの定量はＲ＆Ｄ社により市販されているＥＬＩＳＡ試験を用いて行われた。
【００５４】
図１０には、ＨＡＲＰのポリペプチドのＮＨ２部分とＣＯＯＨ部分に相当しているペプチド１と２によるＩＬ−６の発現が示されている。これらサイトカインの定量は、７日間のインキュベートの後に市販されているＥＬＩＳＡ試験のキットを用いて行われた。
【００５５】
図１１には、筋肉の再生に対するＨＡＲＰペプチドの作用が示されている。成ラットのヒラメ筋が粉砕され、これらのペプチドによる処理を施されるか、施されなかった。次いで４日間の再生の後にサンプリングされた。
【００５６】
１：ＰＢＳ　により処理されている（５０μｌ）
２：ペプチド１により処理されている（５０μｌ、１μｇ）
３：ペプチド２により処理されている（５０μｌ、１μｇ）
図１２には、ＣＡＭ（漿尿膜）中で試験されたペプチド１の血管形成の作用が図示されている。
【００５７】
Ａ：ペプチド１による処理
Ｂ：ＰＢＳにより処理された対照
図１３には、ＨＡＲＰのＮ末端の部分（１〜１４の残基）に相当しているペプチドの産生のために用いられたプラスミドが図示されている。
【００５８】
（実施例）
実施例１：末梢血に由来するヒト単核細胞の増殖に対するＨＡＲＰタンパク質の作用
健康なドナーに由来する様々なヒト単核細胞は、メーカーにより説明されているように、フィコール・ハイパック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を比重液として遠心分離を行った後に、末梢血から分離された。これらの細胞は洗浄され、次いで熱（５６℃、３０分）により不活化されたウシ胎児の血清１０％、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補われているＰＲＭＩ１６４０培地中で培養された。９６個の丸底ウエルを有している培養容器（Ｃｏｓｔａｒ製）に１０６個／１ｍｌの濃度で植え付けられた細胞を、大腸菌により産生されたヒトの組み換えＨＡＲＰタンパク質が１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在している状態または存在していない状態において、７日間培養した。培養の最後の１８時間以内に、１μＣｉのトリチウムチミジンが各ウエルに添加された。次いで、細胞の核に取り込まれた放射能が、シンチレーションカウンターを用いて測定された。得られた結果は図１に示されている。これらの結果の分析により、ＨＡＲＰポリペプチドが、ＰＢＭＣの核へのトリチウムチミジンの取り込みを刺激する能力を有していることが認められた。データに基づけば、ＨＡＲＰにより処理された細胞中に取り込まれた放射能と、ＨＡＲＰによる処理を施されていない対照の細胞中に取り込まれた放射能の比として定義される刺激指数は、２．３倍〜５１．７倍の範囲で変化していた（Ｎｏ．４とＮｏ．７の試験の結果を参照）。このように反応が多様であることは、ＨＡＲＰに対する細胞の反応と、試験対照とされた個人の免疫系の活性化状態との間に、ある関係が存在していることを示唆している可能性がある。図１内に挿入され示されているヒストグラムは、１００ｎｇ／ｍｌのＨＡＲＰで処理することにより、処理されていない対照に比べて２．９倍の数の細胞増殖が誘発されることを示している。このことは、観察されたチミジンの取り込みが、細胞の数に正確に比例していることを証明するものである。この細胞の計数は、トリチウムチミジンの取り込みのために使用された試験Ｎｏ．７の細胞を用いて行われた。
【００５９】
試験されたＨＡＲＰタンパク質（０．１〜５００ｎｇ／ｍｌ）のＰＢＭＣに対する用量反応曲線が、図２Ａに示されている。
【００６０】
この曲線の分析により、最大の作用は、培地におけるＨＡＲＰの濃度が１ｎｇ／ｍｌである場合に得られていることが認められ、この濃度では、ＨＡＲＰを添加せずに行われた対照の培養物と比べてＤＮＡの取り込みの刺激が４．５〜７．５倍誘発されている。注目すべきことに、ＨＡＲＰの用量が１〜５００ｎｇ／ｍｌより高い範囲のものである場合は、取り込まれる放射能が減少することを認めることができる。０．１〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲における一連の濃度における試験では、アミノ酸の５０％がＨＡＲＰと相同性を有しているタンパク質であるミッドカイン（ＭＫ）タンパク質を用いた場合、いかなる刺激も認められなかった。刺激に関するポジティブコントロールの試験は、２．５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と１８００ＩＵ／ｍｌの破傷風毒素（ＴＴ）を用いて行われた（図２Ｂ）。ＩＬ−２を添加した後には、いかなる刺激も認められず、このことは、これら試験のために用いられた細胞の活性化は、観察されなかったことを示している。
【００６１】
実施例２：特異的免疫反応の共同刺激因子としてのＨＡＲＰタンパク質の役割　Ｔリンパ球の活性化は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）と関連を有しているＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）のアクチベーターを介して得ることができる。この活性化は、さらにＴＣＲ−ＭＨＣ／抗原の特異的な識別、すなわち反応の共同的な活性化と増幅の役割を担っている接着分子の作用を必要とする。これらの知見に基づいて、本発明者らは、抗ＣＤ３抗体を用いてＴリンパ球における受容体を刺激することにより、あるいは記憶抗原、すなわち破傷風毒素により、ＨＡＲＰが細胞の増殖を増幅することができるか否ということに関する試験を行った。
【００６２】
ａ）Ｔリンパ球の受容体により誘発される刺激に対するＨＡＲＰタンパク質の作用
Ｔリンパ球の受容体の活性化は、抗ＣＤ３モノクロナール抗体（１／１００、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ製）によってリンパ球を処理することにより得られる。ＰＢＭＣ細胞の増殖に対するＨＡＲＰの作用は、抗ＣＤ３抗体の存在下で、または存在していない状態で、最適濃度のＨＡＲＰ（１ｎｇ／ｍｌ、実施例１を参照）を添加して試験された。培養ならびに取り込まれたトリチウムチミジンの定量は、実施例１で説明されている方法に従って行われた。得られた結果が図３に示されている。
【００６３】
ＨＡＲＰが存在していない場合、抗ＣＤ３抗体（１／１００）は、細胞と共に７日間インキュベートされた後、トリチウムチミジンの取り込みを２５倍刺激していた（対照：６００±６０ｃｐｍ、抗ＣＤ３抗体：１５０００±２００ｃｐｍ）。１ｎｇ／ｍｌの用量のＨＡＲＰにおいて、且つ抗ＣＤ３抗体が存在していない状態においては、このドナーに関して、対照に比べて５．８倍の増幅が認められた（対照：６００±６０ｃｐｍ、抗ＣＤ３抗体：３５００±２００ｃｐｍ）。これと同じ用量のＨＡＲＰにおいて、ＨＡＲＰ／抗ＣＤ３抗体で細胞を共同的に刺激した場合、反応において３３倍の増幅が認められた（対照：６００±６０ｃｐｍ、ＨＡＲＰ／抗ＣＤ３抗体：２００００±２００ｃｐｍ）。この結果は、ＨＡＲＰタンパク質はＴＣＲが活性化されているリンパ球に対して、相加的な共同刺激作用を及ぼすことを示すものである。ＨＡＲＰの濃度がより高く（１０および１００ｎｇ／ｍｌ）、且つ抗ＣＤ３抗体が存在している場合は、チミジンの取り込みはより少なく、非常に少ないことが認められた。
【００６４】
これらの培養において細胞の死亡率が高いことが認められたが、同じ用量においてＨＡＲＰのみが用いられた場合には、このようなことは認められなかった。これらの結果は、ＨＡＲＰがＴリンパ球に関連した免疫応答に対して用量依存的な共同刺激因子作用を有していることを示すものである。
【００６５】
ｂ）記憶抗原により誘発された刺激に対するＨＡＲＰタンパク質の作用
実施例１において説明されている条件で培養されたＰＢＭＣ細胞が、破傷風毒素のみにより（１８００ＩＵ／ｍｌ、Ｍｅｒｉｅｕｘ製）、あるいは０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で用いられたＨＡＲＰタンパク質と併用することにより刺激された。破傷風毒素は、記憶Ｔリンパ球のサブセットを特異的に増幅しようとする。
【００６６】
ＰＢＭＣに破傷風毒素を添加することにより、７日間のインキュベーションの後、トリチウムチミジンの取り込みは７１倍刺激されていたが（対照：６００±６０ｃｐｍ、破傷風毒素：４３０００±５００ｃｐｍ）、これらの細胞が１ｎｇ／ｍｌのＨＡＲＰと共にインキュベートされた場合は、刺激されていない対照に比べて５．８倍の刺激が認められた（対照：６００±６０ｃｐｍ、破傷風毒素：３５００±２００ｃｐｍ）。これらの細胞に１ｎｇ／ｍｌの用量のＨＡＲＰと破傷風毒素により共同的な刺激を与えた場合は、トリチウムチミジンの取り込みに対する刺激が対照に比べて１０８倍に達していることが認められた（対照：６００±６０ｃｐｍ、ＨＡＲＰ／破傷風毒素：６５０００±７００ｃｐｍ）。図２に示されている結果は、記憶抗原とＨＡＲＰの間にＰＢＭＣを刺激することに関する相乗作用が存在することを示している。
【００６７】
実施例３：ＰＢＭＣの培養物において、ＨＡＲＰで処理された後に増幅された細胞の個体数の測定
細胞は、ＥＤＴＡが含まれている真空採血管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）にサンプリングされた血液の提供者である正常な被験者の末梢血から分離された。単核細胞はフィコールの密度勾配により分離され、計数され、１ｍｌあたり１０６個に調節された。これらの細胞は、説明されている各例において言及されている濃度のＨＡＲＰまたは他のペプチドの存在下に、炭酸ガスが５％含まれている湿潤な雰囲気下において、３７℃で５日インキュベートされた。
【００６８】
表ＩＩに、リンパ系細胞の増殖に対する、１μｇ／ｍｌの濃度で試験されたＨＡＲＰ分子の作用が示されている。
【００６９】
【表２】
2004502636.tif 000003
【００７０】
この試験において示された結果の分析から、ＰＢＭＣの培養物をＨＡＲＰで処理した後、ＣＤ４＋リンパ球の個体が非常に豊富になっており、４５％増えていることが認められた。ＣＤ４５ＲＯの非常な増加も認められ（１１３％）、これはＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋の記憶細胞におけるＣＤ４の増加に匹敵している（＋１３３％）。これらの結果は、記憶Ｔリンパ球に特徴的なＣＤ４５ＲＯを発現するＣＤ４＋のリンパ球の増幅が認められることを示している。この例は、特にリンパ球のサブセットＣＤ４５ＲＯを増幅し、共同的に活性化することによる免疫反応におけるＨＡＲＰのアジュバントとしての役割を例証するものである。
【００７１】
実施例４：ＨＩＶに感染したヒトから得た末梢血に由来する単核細胞に対するＨＡＲＰ分子の作用
サイトカインによってＴリンパ球と単核細胞を活性化することにより、ウイルスの転写を再活性化する能力を有している宿主細胞内の核因子の産生と活性化の両方が、またはこのいずれかが誘発される。ＩＬ−２ならびにＴＮＦ−αによるこのウイルスの再活性化は、ＮＦ−κｂ因子の活性化に部分的に依存している。ＨＩＶによる感染中、Ｔリンパ球／単核細胞においてＨＩＶの複製を誘発するか増大させる能力を有しているＩＬ−１、ＩＬ−６のサイトカイン、特にＴＮＦ−αの血行中の単核細胞による分泌は、これらのサイトカインが、この疾患の進行を増大させる可能性を有していることを示唆している。図５の結果は、エイズにかかっている患者（ＣＤ４＜２００／ｍｍ３）に由来するＰＢＭＣで、ＨＡＲＰタンパク質のみにより活性化されたものが、ウイルス抗原ｐ２４を産生することにより測定されるＨＩＶウイルスを生じさせる能力を有していることを示している。このＨＩＶウイルスの産生は、ＨＡＲＰの濃度が１ｎｇ／ｍｌである場合に最大である。濃度が１００ｎｇ／ｍｌである場合は、非常な数の細胞が死んでいることが認められた。したがって、この実施例により、一方において、ＨＡＲＰがｐ２４のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける発現を増幅させて、ＨＩＶウイルスの菌株のタイプを識別することに利用され得るものであり、他方ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、１）ウイルス複製の誘導物質として、したがって休止状態の感染リンパ球に対する抗ウイルス剤の作用を促進する物質として利用され得るものであると考えることができ、あるいは２）１００ｎｇ／ｍｌの濃度でｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて認められた作用に匹敵する高い濃度において、慢性的に活性化されているＴ細胞の死を生じさせることができると考えることができる（図３と図４に図示されている前記の例を参照）。
【００７２】
実施例５：ＨＡＲＰペプチドによるリンパ球の活性化
実施例１に説明されている手順に従って、本発明者らは、配列がＨＡＲＰのＮＨ２末端とＣＯＯＨ末端に一致している２種類のペプチドが、ＰＢＭＣの増殖を誘発する能力に関して試験を行った。これらのペプチドの配列は以下の通りである。
【００７３】
ペプチド１：ＮＨ２−ＡＥＡＧＫＫＥＫＰＥＫＫＶＫＫＳＤＣＧＥＷ−ＣＯＯＨ：２１個のアミノ酸
ペプチド２：ＮＨ２−ＡＥＳＫＫＫＫＫＥＧＫＫＱＥＫＭＬＤ−ＣＯＯＨ ：１８個のアミノ酸
結果は図６に示されており、ＨＡＲＰタンパク質と比較して、ペプチド２は、ＰＢＭＣの活性化の反応を誘発する能力がＨＡＲＰよりも優れており、２倍近くに達していることが認められる。同様の濃度において、ペプチド１の作用はより弱いものであり、ＨＡＲＰのおよそ半分であるけれども、明らかに対照よりは強いものである（２倍以上）。
【００７４】
実施例６：ＨＡＲＰにより処理されたＰＢＭＣ細胞によるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１の産生の誘発
細胞は、ＥＤＴＡが含まれている真空採血管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）にサンプリングされた正常な被験者の末梢血から分離された。単核細胞はフィコールの密度勾配により分離され、計数され、１ｍｌあたり１０６個に調節された。細胞は１〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の様々な濃度のＨＡＲＰの存在下で、あるいは図の凡例において言及されている様々なペプチドの存在下で、炭酸ガス５％の湿潤な雰囲気下で、３７℃において３日間あるいは７日間インキュベートされた。
【００７５】
結果は図７、８、９に示されている。これらの分析の結果は、ＨＡＲＰ分子はＩＬ−１β（図７）、ＴＮＦ−α（図８）、ＩＬ−６（図９）のサイトカインの発現を誘発する能力を有しており、その作用は用量依存性のものであることを示している。
【００７６】
この実施例は、実施例５に示されている構造のペプチド１と２が、ＩＬ−６の発現を刺激する能力を有していることを示している。これらのサイトカインの発現が増大することは、ｔａｔペプチドあるいは相同タンパク質の領域を有している他の分子を細胞に添加した後にも検出されている（アンギオゲニン、ｔａｔタンパク質：結果は示されていない）。ＨＡＲＰ分子が変性させられている場合あるいは細胞がＬＰＳ（リポ多糖）で処理された場合は、この系において炎症性サイトカインの発現はまったく検出されていない。
【００７７】
実施例７：筋肉の再生におけるＨＡＲＰペプチドの作用
構造が実施例５において定義されているペプチド１と２の筋肉の再生に対する作用が、以下に述べられている手順とＢａｓｓａｇｌｉａ らの刊行物（Ｂａｓｓａｇｌｉａ， Ｙ．，とＧａｕｔｒｏｎ，Ｊ．（１９９５）：Ｆａｓｔａｎｄ ｓｌｏｗ ｒａｔ ｍｕｓｃｌｅ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ａｆｔｅｒ ｗｈｏｌｅ ｃｒｕｓｈ ｉｎｊｕｒｙ；Ｊ． Ｍｕｓｃｌｅ Ｒｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ． １６， ４２０−４２９）において説明されている手法に従って試験された。ラットに麻酔を施し（生後２〜３ヵ月のＷｉｓｔａｒラット）、脱神経後、ヒラメ筋を先端の平らなピンセットを用いて粉砕した。この粉砕に際して、試験に供されるサンプルを５０μｌのＰＢＳの存在下に注入した。４日間処理した後、ラットを屠殺し、筋肉のサンプリングを行い、次いで液体窒素で凍結させた。クリオスタットにおいて８μｍの切片を作成し、次いでマッソン三色染料を用いて染色した。
【００７８】
結果が図１１に示されている。これらの切片の分析により、１μｇのペプチド１により処理れた筋肉は、ペプチド２により処理された筋肉よりも（図１１．３）、あるいは５０μｌのＰＢＳのみを注入された筋肉よりも（図１１．１）、極めて数多くの単核細胞を有していることが認められた（図１１．２）。この観察結果は、粉砕された筋肉へのペプチド１の注入は、４日間の処理後に、鞘状の筋内膜の中に存在している組織の再生を促す単核細胞の数の増大を誘発することを示している。
【００７９】
実施例８：アンギオゲニンに対するＨＡＲＰペプチドの作用
アンギオゲニンの誘発に対するＨＡＲＰペプチド１と２の作用をｉｎ ｖｉｖｏにおいて評価するために、この試験において「ニワトリの尿膜テスト」（ＣＡＭテスト）が用いられた。これらのペプチドの構造は実施例５に示されている。試験手順は以下の通りである。
【００８０】
若鶏の受精卵を３７℃で３日間インキュベートする。このインキュベート期間を得た後、卵の殻に２個の穴を開け、３〜４ｍｌのアルブミンを注射器に吸引する。試験に供されるサンプルを直径３ｍｍのメチルセルロース円板の上に置く。乾燥後、各円板を４日目に上記のようにして開けられた穴の中に置く。９〜１３日の期間を経た後に、観察を行う。各時点の定量を１０回行い、各定量は３回繰り返し行う。全体的結果は以下の表ＩＩＩに示されている。
【００８１】
【表３】
2004502636.tif 000004
【００８２】
ＣＡＭ中のアンギオゲニンの誘発に対するペプチド１の作用は、後述の実施例において説明されている（図１２）。
【００８３】
実施例９：ＨＡＲＰ分子のＮ末端の部分と一致しているペプチドの分裂促進に対する作用の発現とその定量
ヒトＨＡＲＰのＮ末端のペプチド（１〜１４のアミノ酸）は、真核生物の発現の系における組み換えにより得た。
【００８４】
このペプチドは、１５番のアミノ酸の部位における停止コドンの創出により、真核生物の発現ベクターＰｃＤＮＡ−３（ＩｎＶｉｔｒｏＧｅｎ）におけるクローン化されたＥｃｏＲＩの下で、ヒトＨＡＲＰのｃＤＮＡから作られた（定方向突然変異キット、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＳ） 。使用されたプラスミドの図式は添付の図１３に示されている。
【００８５】
シークエンサーにより生じた突然変異の確認が行われた後、この構造を用いて真核細胞（ＮＩＨ ３Ｔ３）へのトランスフェクションが行われた（Ｆｕｎｇｅｎｅ 、Ｒｏｃｈｅ ，米国ニュージャージー州）。発現は、ＨＡＲＰの抗Ｎ末端抗体（１〜１５の残基、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製、米国カリフォルニア州）を用いてトランスフェクションが行われた細胞によるならし培地に基づいて、ウエスタンブロッティング法により追跡された。細胞を酪酸塩の存在下で７２時間培養し、次いでならし培地を回収した。ペプチドを精製した後、逆相陽イオンクロマトグラフィーが行われた（Ｗａｔｅｒｓ、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）、Ｃ１８、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）。カラムからの溶離はアセトニトリルの直線勾配により行われた。溶離したフラクション中のペプチドの存在は２２０ｎｍにおいて吸光度を測定することにより追跡された。上記のようにして精製されたペプチドにより誘発された分裂促進の活性の定量は以下の手順に基づいて行われた。
【００８６】
用いられた細胞は、１〜５の継代の間に用いられるＨＵＶＥＣ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）である。４８個のウエルを備えている培養容器（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウエルを、ＨＡＲＰ溶液（１００ｎｇ／ｍｌ）、精製されたＨＡＲＰペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）、あるいはネガティブコントロールである緩衝液のみを用いて４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳ溶液でウエルを洗浄した後、細胞をウシの胎児の血清２％を含んでいるＤＭＥＭ培地中に１ｃｍ２に２×１０４個の割合で植えつける。各定量は三重に行う。
【００８７】
細胞の増殖の誘発は、７２時間の培養後に細胞を計数することにより評価された。
【００８８】
結果が以下の表ＩＶに示されており、これらの結果は、ＨＡＲＰのＮ末端部分と一致している遺伝子工学により作りだされたＨＡＲＰペプチドが、内皮細胞の増殖を誘発することを示している。
【００８９】
【表４】
2004502636.tif 000005
【００９０】
（参考文献）
１．Ｂｏｈｅｎ Ｐ， Ｋｏｖｅｓｄｉ Ｉ．１９９１ ：胚形成および悩の機能において役割を果たす可能性を有しているヘパリン結合性タンパク質の新たな遺伝子族に属するＨＢＮＦとＭＫ。Ｐｒｏｇ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ． ３：１４３
２．Ｌａａｒｏｕｂｉ Ｋ， Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ， Ｄｅｌｂｅ Ｊ， Ｃａｒｕｅｌｌｅ Ｄ， Ｂａｒｒｉｔａｕｌｔ Ｄ， Ｃｏｕｒｔｙ Ｊ． １９５５：ヘパリン結合性増殖関連因子ＨＡＲＰの生物学的性質と分裂促進に関する性質。Ｐｒｏｇ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ． ６：２５
３．Ｒａｕｖａｌａ Ｈ． １９８９ ：繊維芽細胞増殖因子とは異なる、発達途上の悩の１８−ｋｄ のヘパリン結合性タンパク質。ＥＭＢＯ Ｊ． ８：２９３３
４．Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ Ｊ， Ｒａｕｖａｌａ Ｈ． １９９０：発達途上の悩の増殖に関連を有する１８−ｋｄ のタンパク質の分子クローニング。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１６７２１
５．Ｈａｍｐｔｏｎ Ｂ Ｓ， Ｍａｒｓｈａｋ Ｄ Ｒ， Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｗ Ｈ． １９９２ ：完全な長さを有しているヘパリン結合性増殖関連因子の構造と特性の分析。Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ． ３：８５
６．Ｍｉｌｎｅｒ Ｐ Ｇ， Ｌｉ Ｙ Ｓ， Ｈｏｆｍａｎ Ｒ Ｍ， Ｋｏｄｎｅｒ Ｃ Ｍ， Ｓｉｅｇｅｌ Ｎ Ｒ， Ｄｅｕｅｌ Ｔ Ｆ． １９８９．ウシの子宮における１７ｋＤの新たなヘパリン結合性増殖関連因子（ＨＢＧＦ−８）の精製とＮ末端のアミノ酸配列。Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １６５：１０９６
７．Ｎｅａｍ Ｐ Ｊ， Ｙｏｕｎｇ Ｃ Ｎ， Ｂｒｏｃｋ Ｃ Ｗ， Ｔｒｅｅｐ Ｊ Ｔ， Ｇａｎｅｙ Ｔ Ｍ， Ｓａｓｓｅ Ｊ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｌ Ｃ． １９９３ ：プレイオトロフィンは、ウシ胎児の骨端軟骨と新生仔の鼻軟骨の解離抽出物に豊富に存在するタンパク質である。Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐ． Ｒｅｓ． １１：４７９
８．Ｇｉｅｆｆｅｒｓ Ｃ， Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｗ， Ｂｒｅｎｚｅｌ Ｇ， Ｍａｔｓｕｉｓｈｉ Ｔ， Ｆｒｅｙ Ｊ． １９９３：ヒト骨肉腫細胞へ骨芽細胞特異性因子Ｉ（ＯＳＦ−Ｉ／ＨＢ−ＧＡＭ）を結合させる受容体は、細胞接着を促進する。Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ． ６２：３５２
９．Ｆａｎｇ Ｗ， Ｈａｒｔｍａｎ Ｎ， Ｃｈｏｗ Ｄ Ｔ， Ｒｉｅｇｅｌ Ａ． Ｔ， Ｗｅｌｌｓｔｅｉｎ Ａ． １９９２ ：プレイオトロフィンは、繊維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞を刺激し、ヒトの癌において発現される。 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２５８８９
１０．Ｓｚａｂａｔ Ｅ， Ｒａｕｖａｌａ Ｈ． １９９６ ：発育途上にあるラットの四肢の細胞増殖の停止におけるＨＢ−ＧＡＭ（ヘパリン結合性増殖関連因子）の役割と、その神経筋系の分化における発現。Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １７８：７７
１１．Ｗｅｌｌｓｔｅｉｎ Ａ ｅｔ ａｌ． １９９２ ：発達面に関して制御されているサイトカインと類似しており、乳癌細胞から分泌されるヘパリン結合性増殖関連因子。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２５８２
１２． Ｌａａｒｏｕｂｉ Ｋ， Ｄｅｌｂｅ Ｊ， Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ， Ｄｅｓｇｒａｎｇｅｓ Ｐ， Ｔａｒｄｉｅｕ Ｍ． Ｊａｙｅ Ｍ， Ｂａｒｒｉｔａｕｌｔ Ｄ， Ｃｏｕｒｔｙ Ｊ． １９９４：ヒトの組み換えヘパリン結合性調節ペプチドの分裂促進活性と、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血管形成活性。Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １０：８９
１３． Ｐｅｎｇ Ｈ Ｂ， Ａｌｉ Ａ Ａ， Ｄａｉ Ｚ， Ｄａｇｇｅｔｔ Ｄ Ｆ， Ｒａｕｌｏ Ｅ， Ｒａｕｖａｌａ Ｈ． １９９５ ：培養された筋肉細胞中の後シナプスの誘起におけるヘパリン結合性増殖関連因子（ＨＢ−ＧＡＭ）の役割。Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５：３０２７
１４． Ｍｉｔｓｉａｄｉｓ Ｔ Ａ， Ｓａｌｍｉｖｉｒｔａ Ｍ， Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ， Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ， Ｒａｕｖａｌａ Ｈ， Ｌｅｈｔｏｎｅｎ Ｅ， Ｊａｌｋａｎｅｎ Ｍ， Ｔｈｅｓｌｅｆｔ Ｉ． １９９５：ヘパリン結合性サイトカインであるミッドカイン（ＭＫ）とＨＢ−ＧＡＭ（プレイオトロフィン）の発現は、胎児の成長ならびに器官形成の間における上皮−間葉の相互作用に関連を有している。Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１：３７
１５． Ｖａｎｄｅｒｖｉｎｄｅｎ Ｊ Ｍ， Ｍａｉｌｌｅｕｘ Ｐ， Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ Ｓ Ｎ， Ｖｅｎｄｅｒｈａｅｇｅｎ Ｊ Ｊ． １９９２：発達途上の細胞の分布における新たな増殖関連因子プレイオトロフィン（ＨＢ−ＧＡＭ）のｍＲＮＡと成ラットの組織。Ａｎａｔ． Ｅｒｎｂｒｙｏｌ． １８６：３８７
１６． Ｌｅｄｏｕｘ Ｄ， Ｃａｒｕｅｌｌｅ Ｄ， Ｓａｂｏｕｒｉｎ Ｃ， Ｌｉｕ Ｊ， Ｃｒｅｐｉｎ Ｍ， Ｂａｒｒｉｔａｕｌｔ Ｄ， Ｃｏｕｒｔｙ Ｊ．１９９７：ヒト乳腺における血管形成誘導因子であるヘパリン結合性調節ペプチド（ＨＡＲＰ）のｍＲＮＡと、このタンパク質の細胞内分布。Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ４５：１
１７． Ｓｅｄｄｏｎ ＡＰ， Ｈｕｌｎｅｓ ＪＤ， Ｄｅｃｋｅｒ ＭＭ， Ｋｏｖｅｓｄｉ Ｉ， Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ ＪＬ， Ｂａｃｋｅｒ Ｊ． Ｄｏｕｇｈｅｎ−Ｖｅｒｍａｚｅｎ Ｍ， Ｂｏｈｌｅｎ Ｐ． １９９４：ヒトの組み換えヘパリン結合性神経突起伸展因子の復元と特徴の分析。Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ５：１４
１８．Ｓｍｉｔｈ Ｐ ｅｔ ａｌ． １９８５ ：ｂｉｃｉｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ を用いたタンパク質の測定。Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ １５０：５４３
１９．Ｎｖｏｔｎｕ ＷＦ， Ｍａｆｆｉ Ｔ， Ｍｅｈｔａ ＲＬ， Ｍｉｌｎｅｒ ＰＧ． １９９３ ：ヒトのヘパリン処理後の血漿において、ヘパリンを放出することができる新たなタンパク質、サイトカイン、ミッドカイン、プレイオトロフィンの識別。Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． １３：１７９８
２０． Ｋｕｏ ＭＤ， Ｈｕａｎｇ ＳＳ， Ｈｕａｎｇ ＪＳ． １９９２：ＮＩＨ ３Ｔ３ 細胞におけるヘパリン結合性増殖関連因子受容体の特性の分析。Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８２：１８８
２１．Ｒａｕｌｏ Ｅ， Ｃｈｅｒｎｏｕｓｏｖ ＭＡ， Ｃａｒｅｙ ＤＪ， Ｎｏｌｏ Ｒ， Ｒａｕｖａｌａ Ｈ． １９９４ ：ニューロン細胞表面受容体ｐｆのヘパリン結合性増殖関連因子（ＨＢ−ＧＡＭ）の単離、Ｎ−シンデカン（シンデカン−３） としての確認。Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２６９：１２９９９
２２．Ｍａｅｄａ Ｎ， Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ Ｔ， Ｓｈｉｎｔａｎｉ Ｔ， Ｈａｍａｎａｋａ Ｈ， Ｎｏｄａ Ｍ． １９９６：受容体様のタンパク質チロシンホスファターゼｚｅｔａ／ＲＰＴＢβの細胞外の変異体である６Ｂ４プロテオグリカン／ホスファカンは、プレイオトロフィン／ヘパリン結合性増殖関連因子（ＨＢ−ＧＡＭ）を結合する。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２１４４６
２３．Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ ＰＪ， Ｆａｉｒｈｕｒｓｔ ＪＬ， Ｄｅｃｋｅｒ ＭＭ， Ｃｈａｎ ＣＰ， Ｇｌｕｚｍａｎ Ｙ， Ｂｏｈｌｅｎ Ｐ， Ｋｏｖｅｓｄｉ Ｉ． １９９１ ：神経突起伸展を促進するタンパク質の新たなヒト遺伝子族に属する二つの遺伝子のクローニング、特性分析、ならびに成長の調節。Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ５：９９２４． Ｒａｔｏｖｉｔｓｋｉ Ｅ， Ｂｕｒｒｏｗ ＣＲ． １９９７ ：ミッドカインは、シグナル受容体を介してウィルムス腫瘍細胞の増殖を刺激する。Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４３：４２５
２５．Ｒａｔｏｖｉｔｓｋｉ Ｅ， Ｋｏｔｚａｂａｕｅｒ Ｔ， Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ Ｊ， Ｌｏｗｅｓｔｅｉｎ ＣＪ， Ｂｕｒｒｏｗ ＣＲ． １９９８：ミッドカインは、腫瘍細胞の増殖を誘発し、ＪＡＫチロシンキナーゼと関連を有している強い親和性のシグナル受容体と結合する。 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：３６５４
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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