(57)【要約】本発明は、脂肪酸、スクアレン及びコレステロールを含む脂質の生合成に必須的なＮＡＤＰＨの生産を促進するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、及び肥満、高脂血症、脂肪肝を含む代謝性疾患の治療に使用する用途に関するものである。また、本発明は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、前記遺伝子を含む融合遺伝子コンストラクト、ゲノム内に前記遺伝子を含む形質転換細胞株及び生存する間持続的にイソクエン酸デヒドロゲナーゼを発現する、形質転換動物に関するものである。
2004511256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸、コレステロール生合成及び脂肪蓄積に利用されるＮＡＤＰＨを生産するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）。
【請求項２】
マウスから由来した配列番号４で記載される、請求項１記載のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ。
【請求項３】
配列番号３で記載される請求項１のイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子。
【請求項４】
請求項３の遺伝子を含み、正方向に発現するように遺伝子が挿入された融合遺伝子コンストラクト。
【請求項５】
請求項３の遺伝子を含み、逆方向に発現するように遺伝子が挿入された融合遺伝子コンストラクト。
【請求項６】
請求項４の融合遺伝子コンストラクトで形質転換された細胞株（寄託番号 ：ＫＣＴＣ ０８６１ＢＰ）。
【請求項７】
図４に記載された開列地図を持ち、ラットの細胞質形ＰＥＰＣＫ （ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子プロモーターの下流に請求項３の遺伝子が正方向に挿入された融合遺伝子コンストラクト。
【請求項８】
請求項７の融合遺伝子コンストラクトを含む受精卵（寄託番号 ： ＫＣＴＣ ０８７４ＢＰ）。
【請求項９】
請求項７の融合遺伝子コンストラクトをゲノム内に含む（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）形質転換動物。
【請求項１０】
動物が、マウスであることを特徴とする請求項９記載の形質転換動物。
【請求項１１】
請求項１のイソクエン酸デヒドロゲナーゼまたは請求項３の遺伝子を有効成分として含むＮＡＤＰＨの生合成増加剤。
【請求項１２】
請求項１のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、請求項３の遺伝子または前記酵素反応生成物であるＮＡＤＰＨを有効成分として含むＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ）の活性化剤。
【請求項１３】
請求項１のイソクエン酸デヒドロゲナーゼまたは請求項３の遺伝子を有効成分として含む脂質、スクアレンまたはコレステロールの生体内合成増加剤。
【請求項１４】
請求項３の遺伝子を利用した肥満、高脂血症または脂肪肝の予防及び治療剤。
【請求項１５】
生体内の中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、コレステロール及びスクアレンの生合成増加剤としてのＮＡＤＰＨ。
【請求項１６】
請求項１のイソクエン酸デヒドロゲナーゼ反応生成物であるＮＡＤＰＨを生体内に添加して中性脂肪、コレステロール及びスクアレン等の生合成増加に利用する方法。
【請求項１７】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼと反応すると前記酵素の活性を阻害し、窮極的に酵素反応産物であるＮＡＤＰＨの生成を減少させ脂肪の蓄積及び中性脂肪、コレステロールの生成を阻害する物質を選別する方法。
【請求項１８】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子と反応すると前記酵素の発現を阻害し、窮極的に酵素反応産物であるＮＡＤＰＨの生成を減少させ、脂肪の蓄積及び中性脂肪、コレステロールの生成を阻害する物質を選別する方法。
【請求項１９】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼとその基質のイソクエン酸及び助酵素であるＮＡＤＰ＋を含む反応液に未知の物質を添加することによって前記酵素の活性を調節する物質をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で選別する方法。
【請求項２０】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を含んだ動物細胞株、特に前記酵素の遺伝子が形質転換された動物細胞株を培養した培養液に未知の物質を添加することによって前記酵素の活性を調節する物質を選別する方法。
【請求項２１】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を含んだ動物、特に前記酵素の遺伝子が形質転換された動物に未知の物質を投与することによって前記酵素の活性を調節する物質を選別する方法。
【請求項２２】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼと反応して前記酵素の活性を阻害する物質を肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性疾患の治療剤に利用する方法。
【請求項２３】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子と反応して前記酵素の発現を阻害する物質を肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性疾患の治療剤に利用する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ＮＡＤＰＨ（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍ）を生産する細胞質内イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びその遺伝子、そして、この酵素の活性及びその遺伝子の発現を阻害する肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性疾患の治療剤を選別する方法に関するものである。より詳細には、細胞質内に存在するイソクエン酸デヒドロゲナーゼのＩＤＰｃ遺伝子を含む融合遺伝子コンストラクトで形質転換細胞株及び形質転換動物を製造し、前記形質転換細胞株及び形質転換動物を利用してＩＤＰｃ酵素の活性及び遺伝子発現程度が、脂肪酸、コレステロール生合成及び脂肪蓄積に絶対的に必要なＮＡＤＰＨを生成する核心因子であることを明らかにすることによってこの酵素の活性及びその遺伝子の発現を阻害する肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性疾患の治療剤を選別する方法を提供する。
【０００２】
従来の技術
イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、エネルギー代謝のためのＴＣＡ（ｔｒｉｃａｒｂｏｘｉｌｉｃ ａｃｉｄ）回路の主要酵素であり、クエン酸を酸化的に脱炭酸化させα−ケトグルタル酸（α−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ）とＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ等を生産するものと知られている。
【０００３】
高等動物のイソクエン酸デヒドロゲナーゼは、助酵素（ｃｏｆａｃｔｏｒ）の種類と細胞内の存在位置によって、ミトコンドリアＮＡＤ＋−特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＩＤＨ」と略称する）、細胞質ＮＡＤＰ＋−特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＩＤＰｃ」と略称する）及びミトコンドリアＮＡＤＰ＋−特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＩＤＰｍ」と略称する）の３種類のアイソザイム（ｉｓｏｚｙｍｅ）に分けられる。
【０００４】
イソクエン酸アイソザイムの中で、ＩＤＨはＮＡＤＨとα−ケトグルタル酸を生成することによってＴＣＡ回路内でイソクエン酸を脱炭酸化させるのに重要な役割をする。ＮＡＤＨは、電子伝達系を通したエネルギー代謝に使用され、α−ケトグルタル酸は、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン及びプロリン等のアミノ酸生合成または他の生体代謝物質を合成する中間代謝産物である。ＩＤＨの活性は、エネルギー代謝、蛋白質生合成及び窒素代謝によるＴＣＡ回路の重要な調節酵素として作用する。
【０００５】
ＩＤＨに対する研究は、酵母と豚からこれらの蛋白質を分離しながら進められてきた。酵母のＩＤＨは、二個の相同性が高いサブユニットで構成されていて、調節機能をするサブユニット（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｕｂｕｎｉｔ）ＩＤＨ１と酵素活性を持ったサブユニット（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ） ＩＤＨ２が各々４個ずつからなる８重合体（ｏｃｔａｍｅｒ）構造は、活性形態であると知られている（Ｋｅｙｓ， Ｄ． Ａ． ＆　ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅｎｎ， Ｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９９０年、第１７２巻、Ｐ．４２８０−４２８７）。豚のＩＤＨは３個の小単位体（α、β、γ小単位体）で構成され、２（α ２β γ）の８重合体をなし、活性を示す。
【０００６】
一方、動物細胞のミトコンドリア内に存在するＩＤＰｍ及び細胞質に存在するＩＤＰｃは、二重合体の構造を持つと報告されているが、その機能に対しては報告されていない。これら二酵素の分子量は、両方約４５ｋＤａで蛋白質相同性が非常に高いが、ＩＤＰｃとＩＤＰｍ各々の酵素蛋白質に対する多クローン性抗体を使用した相互免疫反応実験でお互いに異なる独立的な蛋白質であることが確認された（Ｐｌａｕｔ， Ｇ．Ｗ．Ｅ．等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．， １９８３年、第７６０巻、Ｐ．３００−３０８ ； Ｆａｎｔａｎｉａ， Ｈ． Ｒ．等， ＦＥＢＳ，１９９３年、第 ３２２巻、Ｐ．２４５−２４８）。これらＩＤＰｍ及びＩＤＰｃは、酵素活性面で高い組織特異性を示す。心臓組織では、ＮＡＤＰ＋−特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼの９０％ 以上がミトコンドリアに存在し、１０％程度が細胞質に存在する。これと反対に、肝組織では、全体ＮＡＤＰ＋−特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼの３％だけがミトコンドリアに存在し、残り９７％程度が細胞質に存在すると報告されている（Ｐｌａｕｔ， Ｇ．Ｗ．Ｅ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，１９８３年、第２巻、Ｐ．１−２７）。
【０００７】
上述したように、イソクエン酸デヒドロゲナーゼのアイソザイムは、その構造的な特徴だけが一部明らかにされているだけで、機能はほとんど究明されていない。特にＩＤＰｃとＩＤＰｍの正確な作用機序に対する研究は、全くなされていない。ただ、最近の研究によって、培養された動物細胞でＩＤＰｍが、ＴＣＡ回路の逆反応を触媒することによりα−ケトグルタル酸からイソクエン酸を経てクエン酸に転換され、トリカルボキシル酸運搬体を通して脂肪酸及びコレステロール生合成の前駆物質に使用されるアセチル−ＣｏＡを供給するもので、これと共にα−ケトグルタル酸からイソクエン酸及びクエン酸を経てオキサロアセタートの生合成を増加させ細胞質でホスホエノールピルビン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ）の生合成増進を通したグルコネオジェネシス（ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）を増加させると推定されている（Ｄｅｓ Ｒｏｓｉｅｒｓ， Ｃ．等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９９４年、第２６９巻、 Ｐ．２７１７９−２７１８２ ； Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｃ．Ａ．等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９９５年、第２７０巻、Ｐ．１００３７−１００４２）。
【０００８】
このようにＩＤＰｍは、ＴＣＡ回路の逆反応によるグルコネオジェネシスに対する重要性が提案されているのに比べて、ＩＤＰｃの代謝機能に対してはほとんど報告されていない。ただ、ＩＤＰｃは卵巣と乳腺で多く発現されると報告されている。ネズミの肝に存在するＮＡＤＰＨ生成酵素中でＩＤＰｃは、５炭糖リン酸経路（ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ）の重要な酵素であるグルコース−６−リン酸を６−ホスホグルコノ−δ−ラクトン（６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎｏ−δ−ｌａｃｔｏｎｅ）とＮＡＤＰＨに生成するグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコン酸（６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ）をリブロース−５−リン酸 （ｒｉｂｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とＮＡＤＰＨに生成する６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ （６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｙｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、そして細胞質内でリンゴ酸（ｍａｌａｔｅ）をピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）とＮＡＤＰＨに生成するリンゴ酸酵素（ｍａｌｉｃ ａｃｉｄ）等よりＮＡＤＰＨの生成率が各々１６倍、８倍及び１８倍高いと報告されている（Ｖｅｅｃｈ， Ｒ．Ｌ．等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１９６９年、第１１５巻、Ｐ．６０９−６１９）。
【０００９】
細胞質内では、脂肪酸及びコレステロール代謝とホルモン代謝に関与する色々な酵素が作用するために多量のＮＡＤＰＨを必要とする。したがって、細胞質内でＮＡＤＰを生産する酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとリンゴ酸酵素等は細胞質内にＮＡＤＰＨを供給する代表的な酵素である。ＩＤＰｃの作用がＮＡＤＰＨの供給に重要な役割をするものと予測され、窮極的には、ＩＤＰｃ酵素が脂肪酸及びコレステロールの生合成に重要な役割をするものと推測できる。言い換えれば、生体内で脂肪酸の生合成過程に関与する脂肪酸生合成酵素 （ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）中、β−ケトアシル−ＡＣＰ還元酵素（β−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＡＣＰ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）とエノイル−ＡＣＰ還元酵素（ｅｎｏｙｌ−ＡＣＰ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）等の反応にＮＡＤＰＨが必須的に要求され、また、コレステロール生合成過程中ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）とスクアレン合成酵素（Ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の反応、そしてラノステロール（ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ）からコレステロールを最終合成する１９段階の反応にＮＡＤＰＨ等が多量に要求される。したがって、細胞内で必要とされるＮＡＤＰＨを大部分供給するＩＤＰｃ酵素の活性調節は、脂肪酸及びその誘導体、脂肪、スクアレンそしてコレステロール及びその誘導体の生合成調節にとても重要であると言える。
【００１０】
一方、高等動物において、脂肪の蓄積は下記の過程によってなされる。即ち、 体内にエネルギーが過多なら、白色脂肪組織（ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）の数と大きさが増す脂肪細胞の分化が促進されて脂肪質の蓄積が増加される。これにより白色脂肪組織ではｏｂ遺伝子の発現が増加され、体内のレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）濃度の増加が起こる。その結果、脳のホルモン作用を変化させ食欲を低下させる。一方では過多に摂取されたカロリーをＵＣＰ（ｕｎｃｏｕｐｌｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）等によって体温に発散する機序を経るようになる。白色脂肪組織では、脂肪細胞分化の主要転写因子（ｍａｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であると報告されているＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ）、Ｃ／ＥＢＰα及びＡＤＤ１／ＳＲＥＢＰ１等の遺伝子発現が促進される。それで脂肪細胞分化及び脂肪蓄積が増加し、体内の過多なエネルギーが脂肪の形態で貯蔵されることによって体内のエネルギー均衡を調節する（Ｈｕ， Ｅ．等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９９５年、第９２巻、Ｐ．９８５６−９８６０ ； Ｋｅｌｌｅｒ， Ｈ．等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９９３年、第２０巻、Ｐ．９８５６−９８６０ ； Ｆｒｅｙｔａｇ． Ｓ．Ｏ．等， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１９９４年、第８巻、Ｐ．１６５４−１６６３ ； Ｔｏｎｔｏｎｏｚ， Ｐ．等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１９９３年、第１３巻、Ｐ．４７５３−４７５９ ； Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ， Ｂ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ，１９９６年、第８７巻、Ｐ．３７７−３８９）。脂肪細胞分化の主転写因子であるＰＰＡＲγの活性化に必要な生体内リガンド（ｌｉｇａｎｄ）として作用する物質としては脂肪酸の一種であるリノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ， ＤＨＡ）とアラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）等の多重不飽和脂肪酸等（Ｋｒｅｙ， Ｇ．等， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１９９７年、第１１巻、Ｐ．７７９−７９１ ； Ｙｕ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９９５年、第２７０巻、Ｐ．２３９７５−２３９８３）と共にプロスタグランジンＪ２ （ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｊ２）（Ｆｏｒｍａｎ Ｂ． Ｍ．等， Ｃｅｌｌ，１９９５年、第８３巻、Ｐ．８０３−８１２ ； Ｋｌｉｅｗｅｒ． Ｓ． Ａ．等， Ｃｅｌｌ，１９９５年、第８３巻、Ｐ．８１３−８１９）が報告されている。
【００１１】
このような観点から見る時、ＩＤＰｃはＮＡＤＰＨを生成することによって多様な脂肪酸及びコレステロール、そして各々の誘導体ホルモンの生合成調節に直接的に作用している可能性が高い。また、ＩＤＰｃはこのようなＰＰＡＲγの活性リガンド物質として作用する多重不飽和脂肪酸等とアラキドン酸等の生成を増加させ、結果的にはＰＰＡＲγの活性化にともなって連鎖的に脂肪細胞分化促進に関連した色々な遺伝子の発現量をすべて増加させ、肥満と脂肪肝を引き起こす重要な作用を遂行する可能性が高いことが推定される。これと共に、コレステロールの生合成は多量のＮＡＤＰＨを要求するため、ＩＤＰｃ酵素活性及びこの反応産物であるＮＡＤＰＨを人為的に増加させると、生体コレステロール生合成量の増加にも重要な作用を及ぼす可能性が高い。
【００１２】
これらの問題を鑑みて、本発明者らは、脂肪細胞の分化において今までその機能が明らかにされていないＩＤＰｃ酵素遺伝子の発現増加及び抑制、そしてこの酵素反応産物であるＮＡＤＰＨ生成量の変化が脂肪細胞の分化速度及びこれらの脂肪細胞内脂肪蓄積量を変化させることを明らかにし、前記酵素及びＮＡＤＰＨが脂質及びコレステロールの生合成に決定的な作用をしていることを、培養動物細胞及び形質転換マウスの製造とこれらに対する分子生物学的及び生化学的調査を通して確認することによって本発明を完成した。
【００１３】
発明の開示
本発明の目的は、ＮＡＤＰＨを生産するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びその遺伝子、そして前記遺伝子を永久的に発現できる形質転換細胞株及び形質転換動物を提供し、これらを利用してイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びその遺伝子が脂肪酸、コレステロール生合成及び脂肪蓄積に絶対的に必要なＮＡＤＰＨ生成因子であることを明らかにすることによって、この酵素の活性及びその遺伝子の発現を阻害する肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性治療剤を選別する方法を提供することである。
【００１４】
発明を実施する為の最良の形態
前記目的を達成するために、本発明は、脂肪酸、コレステロール生合成及び脂肪蓄積に利用されるＮＡＤＰＨを生産するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びその遺伝子を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記遺伝子を含む融合遺伝子コンストラクト、その形質転換細胞株及び形質転換動物を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの反応産物であるＮＡＤＰＨを人為的に細胞内に提供すると脂質生合成が増加されるという事実を明らかにすることによって、前記イソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びその遺伝子を利用した肥満、高脂血症、脂肪肝等の治療及び予防の為の物質開発または生体内必要脂質成分を生合成するための用途を提供する。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、脂肪酸、コレステロール生合成及び脂肪蓄積に利用されるＮＡＤＰＨを生産するイソクエン酸デヒドロゲナーゼ及びその遺伝子を提供する。
【００１８】
マウスから分離した本発明のＩＤＰｃ遺伝子は、配列番号３で記載される１，２４５ｂｐからなるＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を持っていて、ポリ（Ａ）＋シグナルと予想されるＡＡＴＡＡＡ塩基配列が３’−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）に存在する。また、前記のＩＤＰｃ遺伝子がコーディングしているＩＤＰｃ酵素蛋白質は、配列番号４で記載される４１４個のアミノ酸で構成され、４６，５７５Ｄａの分子量を持っている。本発明のマウスＩＤＰｃのアミノ酸配列を異なる種に由来したイソクエン酸デヒドロゲナーゼ蛋白質と比較すると、ラットのＩＤＰｃとは９７．８％の類似性を示し、牛のＩＤＰｍとは６８．５％、そして酵母のＩＤＰｃとは６４．４％の類似性が見られる。特に、マウスＩＤＰｃの蛋白質配列中４１２−４１４番目のアミノ酸配列は、脂肪酸及びコレステロール生合成及び分解に関与すると報告されているペルオキシソーム（ｐｅｒｏｘｙｓｏｍｅ）のターゲット配列と一致する。これはＩＤＰｃがペルオキシソームに移動して脂肪酸及びコレステロールの生合成に関与する可能性があることを示唆している。
【００１９】
本発明の脂肪酸、コレステロール生合成及び脂肪蓄積に利用されるＮＡＤＰＨを生産するイソクエン酸デヒドロゲナーゼは、前記のＩＤＰｃ以外に類似な塩基配列をしたＩＤＰｍも含む。
【００２０】
また、本発明は、前記遺伝子を含む融合遺伝子コンストラクト、その形質転換細胞株及び形質転換動物を提供する。
【００２１】
まず、ＩＤＰｃ遺伝子を哺乳類細胞株で発現が可能な発現ベクターに挿入することによって、前記遺伝子が正方向と逆方向に発現するように融合遺伝子コンストラクトを製造する。
【００２２】
本発明では、好ましい実施例として遺伝子運搬体にレトロウイルス（ｒｅｔｒｏ ｖｉｒｕｓ）発現ベクターを利用し、より好ましくは、ｐＬＮＣＸレトロウイルスベクターを始発ベクターに使用する。ｐＬＮＣＸは、ＭＭＬＶ（ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）に由来したベクターで、レトロウイルスベクターの基本要素のＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）塩基配列が存在し、外部遺伝子が哺乳類細胞内で発現するようにするためのＣＭＶプロモーター及び選別因子としてネオマイシン（ｎｅｏｍｙｃｉｎ）遺伝子を持っている。
【００２３】
このように製造された融合遺伝子コンストラクト中、サイトメガロウイルス （ＣＭＶ）プロモーターにより正方向に転写される組換えベクターは、ＩＤＰｃの発現増大の為に使用され、逆方向に転写される組換えベクターはＩＤＰｃの発現抑制のために使用できる。これから得た融合遺伝子コンストラクトを脂肪細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）のＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１ 細胞に導入させ、最終的にＩＤＰｃ遺伝子がゲノム内に含まれたことが確認された細胞株中、ＩＤＰｃ遺伝子が正方向に挿入された細胞株をＦＳ１と命名し、ＩＤＰｃ遺伝子が逆方向に挿入された細胞株はＦＡＳ１と命名した。前記ＩＤＰｃ遺伝子が正方向に挿入された細胞株 ＦＳ１を２０００年９月６日付けで生命工学研究所遺伝子銀行に寄託した（寄託番号 ： ＫＣＴＣ ０８６１ＢＰ）。
【００２４】
前記のＩＤＰｃ遺伝子が正方向に導入されたマウスＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１形質転換細胞（ＦＳ１）ではＩＤＰｃ酵素活性が、ｐＬＮＣＸベクターだけ導入された形質転換細胞（対照群）に比べて 約２倍増加し、反対にＩＤＰｃ遺伝子が逆方向に導入された形質転換細胞（ＦＡＳ１）ではＩＤＰｃ 酵素活性が０．４倍減少したことが確認できる。
【００２５】
ＩＤＰｃ酵素が脂肪酸合成に及ぼす影響は、前記の形質転換細胞株をインシュリン処理により脂肪細胞に分化させた後、脂肪を特異的に染色するオイル レッド オー（Ｏｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ）で処理することによって確認できる。その結果、ＩＤＰｃ遺伝子発現が増加されたＦＳ１形質転換細胞は対照群に比べて脂肪の生成が増加され、反対にＩＤＰｃ遺伝子発現が減少されたＦＡＳ１形質転換細胞では対照群に比べて脂肪蓄積が減少することを確認した（図２参照）。また、ｐＬＮＣＸベクターだけ導入された形質転換細胞（対照群）を脂肪細胞に分化させる間、ＩＤＰｃ酵素反応の産物であるＮＡＤＰＨを直接的に培地に添加した場合には、添加されたＮＡＤＰＨの濃度に比例して脂肪細胞の分化及び細胞内脂質蓄積が増加されることを確認した（図３参照）。前記結果は、ＩＤＰｃ遺伝子、酵素そして酵素反応の産物であるＮＡＤＰＨの増加または減少が細胞内脂肪蓄積量をそれぞれ増加または減少させるのに重要な作用をしていることを意味する。
【００２６】
また、本発明のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの生体内活性を確認するために 本発明者らは、前記融合遺伝子コンストラクトを導入してＩＤＰｃ遺伝子をゲノム内に含む形質転換動物を製造する。
【００２７】
１） 融合遺伝子コンストラクトの製造
ＩＤＰｃ遺伝子を永久的に発現させるためには、適当なプロモーターにＩＤＰｃ遺伝子を連結した融合遺伝子コンストラクトを適当な動物で形質転換させることによって前記融合遺伝子コンストラクトが動物のゲノム内に含まれるようにする。ここで「融合遺伝子コンストラクト」と言うのは、ある生物の形質転換の為に使用する遺伝子の機能的集合であり、基本的な構成成分に少なくても一つ以上の構造遺伝子（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｇｅｎｅ）及びその発現を調節する少なくても一つ以上のシス−作用性調節要素（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むものである。
【００２８】
また、前記シス−作用性調節要素は、一般的にプロモーター、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、イントロン、５’−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）、３’−ＵＴＲ等の形態を取ることができ、融合遺伝子コンストラクト上での位置は、構造遺伝子の５’−フランキング領域（５’−ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）、３’−フランキング領域、５’−末端または３’−末端で１０ｋｂ以内の任意の位置、構造遺伝子の内部（イントロンの場合）等の多様な所に位置できる。
【００２９】
一方、前記融合遺伝子コンストラクトは、構造遺伝子とシス−作用性調節要素 以外に多様な構成成分を追加に含むことができる。例えば、転写または翻訳効率向上の為のポリアデニル化信号（Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、リボソーム結合配列、イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）等を含むことができ、ゲノムとしての挿入効率を増加させるかまたは特定部位へ挿入させられる塩基配列、挿入可否を確認できる標識遺伝子等を含むことができる。
【００３０】
本発明の形質転換動物が含む形質転換用融合遺伝子コンストラクトに含まれたプロモーターとして使用できるものは、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ ｖｉｒｕｓ， ＣＭＶ）、リポ蛋白リパーゼ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ， ＬＰＬ）、アディプシン（ａｄｉｐｓｉｎ）、脂肪細胞蛋白質２（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２， ａＰ２）、及びＩＤＰｃを含んだ白色脂肪組織で発現する遺伝子等の発現調節部位等がある。本発明の好ましい実施例では、肝（ｌｉｖｅｒ）及び白色脂肪組織で発現するラット由来の細胞質形ＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子のプロモーターを使用した。
【００３１】
詳細には、本発明ではラットの細胞質ＰＥＰＣＫ（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子からプロモーターを含む２．２ｋｂの５’側上流配列（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を得た後、前記遺伝子の下流にマウスＩＤＰｃ ｃＤＮＡ遺伝子が正方向に挿入された融合遺伝子コンストラクトを製造し、これをｐＰＥＰＣＫＩＤＰｃと命名した。ＰＥＰＣＫ遺伝子は、細胞質形態及びミトコンドリア形態の酵素を作る二種類があり、本発明では、細胞質形ＰＥＰＣＫ酵素を作る遺伝子（以下「ＰＥＰＣＫ−Ｃ」と略称）の５’側上流配列を使用した。ＰＥＰＣＫ−Ｃ遺伝子は、肝、腸及び腎臓等で５’側上流配列に存在する調節部位を含むかどうかによってプロモーターが発現される組織が異なって現れる。本発明で使用した２．２ｋｂのＰＥＰＣＫ−Ｃ遺伝子の５’側上流配列は、白色脂肪細胞で円滑な発現に必要な調節部位として報告された９８７ｂｐ近くの遺伝子配列（Ｈａｎｓｏｎ， Ｒ． Ｗ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７年、第６６巻、Ｐ．８１−６１１）を含んだものである。
【００３２】
前記形質転換動物に使用できる好ましい生物種はマウスであるが、ＩＤＰｃがほとんどすべての高等動物で発現される酵素であることを考慮にいれると、形質転換が可能な動物は、どんなものでも使用できる。
【００３３】
２） 受精卵の製造
形質転換動物を製造するに際して最も重要な段階は、融合遺伝子コンストラクトを受精卵に導入することである。遺伝子の導入には、微細注入システムを利用した。前記融合遺伝子コンストラクトを受精卵に微細注入する段階において、自動微細注入装置（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して注入するＤＮＡ量を４ｐｌに自動調節することにより、手動によって調節する既存の微細注入装置より形質転換動物の生産率を向上させることができた。これから得たＩＤＰｃ融合遺伝子コンストラクトを含むマウス受精卵を２０００年１０月５日付けで生命工学研究所遺伝子銀行に寄託した（寄託番号 ： ＫＣＴＣ ０８７４ＢＰ）。
【００３４】
（３） 形質転換動物の製造
前記受精卵を代理母に移植して形質転換マウスを得た。受精卵を代理母に移植する段階では、２細胞期状態で卵管へ移植する方法を使用しないで、１細胞期受精卵にｈＧＭ−ＣＳＦ融合遺伝子コンストラクトを注入した後、ただちに代理母の輸卵管に移植することによって２ 細胞期まで培養するのに必要な色々な操作を単純化した。例えば、受精卵を２細胞期状態で代理母の卵管に移植するには一旦インキュベーターで一晩程度さらに培養しなければならず、受精卵を卵管漏斗部へ移植する場合にも卵管を通して受精卵を深く注入させるか、卵管に針で穴を開けた後、受精卵を注入しなければならない。１細胞期状態で受精卵を代理母に移植すれば、卵管漏斗部へ移植する場合にも一般マウスの受精卵と同様な条件を作れる。
【００３５】
本発明者らは、前記のように製造された形質転換動物を利用して生体内ＩＤＰｃの活性を幾つかの指標で測定した。
【００３６】
１） 腹部脂肪増加確認
Ｆ１形質転換マウスは、生後２３週後に対照群マウスに比べてその体が大きくなり、これを解剖した時、腹部脂肪（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）の量がとても増えていることが確認でき、重量は約１４倍以上増加した。また、外皮を除去した後、背中側には形質転換マウスの肥満細胞が対照群マウスに比べて多く増加していることを確認でき、腹部側の皮膚を完全に除去した状態でも腹部脂肪細胞の量が大きく増加したことを確認できた（図５参照）。
【００３７】
２） 肥満指標遺伝子の発現増加確認
形質転換動物のＩＤＰｃ発現により肥満指標遺伝子の発現が増加したことを確認できる
まず、ＩＤＰｃ形質転換マウスの腹部脂肪組織では元来持っていたＩＤＰｃ遺伝子と共に導入された組換えＩＤＰｃ遺伝子発現も検出され、総ＩＤＰｃ遺伝子発現が増加したことを確認した。また、肥満細胞分化が増加すると共通的に遺伝子発現が上昇すると良く知られている脂肪細胞蛋白質２（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ２， ａＰ２）、アディプシン（ａｄｉｐｓｉｎ）、リポ蛋白リパーゼ（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ， ＬＰＬ）、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α， ＴＮＦα）及びＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ）等のような肥満指標遺伝子（Ｈｗａｎｇ， Ｃ．−Ｓ．等， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．，１９９７年、第１３巻、Ｐ．２３１−２５９ ； Ｌｅｍｂｅｒｇｅｒ， Ｔ．等， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．，１９９６年、第１２、Ｐ．２２５−３６２ ； Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ， Ｂ．Ｍ．等， Ｃｅｌｌ，１９９６年、第８７巻、Ｐ．３７７−３８９）の発現もやはり全て増加した。
【００３８】
このような結果は、最近ＰＰＡＲγ遺伝子が肥満細胞の分化及び脂肪質生合成過程で主要転写因子（ｍａｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）として作用するという既知の事実（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ， Ｂ．Ｍ．等， Ｃｅｌｌ，１９９６年、第８７巻、Ｐ．３７７−３８９）に照らしてみる時、ＩＤＰｃ形質転換マウスでのａｐ２、アディプシン、ＬＰＬ、レプチンそしてＴＮＦα等の肥満指標遺伝子の発現が増加するＰＰＡＲγ遺伝子発現の増加により誘発されることが分かる。結局、前記結果はＩＤＰｃ遺伝子発現の増加によるＩＤＰｃ酵素活性増加及びその酵素反応産物であるＮＡＤＰＨの増加が脂肪細胞分化及び脂肪質生合成増加に必須的なＰＰＡＲγ遺伝子発現を急激に増加させる機能を持っていることを意味する（図６参照）。このような結果は、ＰＰＡＲγの活性に必要なリガンドの供給増加がＰＰＡＲγ自身の遺伝子発現を再び増加させるという報告（Ｋｉｍ， Ｊ． Ｂ．等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．，１９９８年、第９５巻、Ｐ．４３３３−４３３７）に照らしてみる時、ＩＤＰｃ酵素及びこの酵素反応産物であるＮＡＤＰＨの増加は、ＰＰＡＲγの活性化を誘導できるリガンドの不飽和脂肪酸の生成を一次的に増加させ、これにより二次的にＰＰＡＲγ自身の遺伝子発現を再び増加させることによって色々な脂肪細胞の分化に関連したａｐ２、アディプシン、ＬＰＬそしてレプチン等を含んだ肥満細胞分化指標遺伝子の発現を増加させ、肥満と脂肪肝を起すようになると見ることができる。
【００３９】
３） 体内脂質蓄積量の確認
形質転換マウスで、ＩＤＰｃ酵素活性は、肝（ｌｉｖｅｒ）と腹部脂肪組織（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）で対照群マウスに比べてそれぞれ２．７倍及び１．４倍増加した（図９参照）。これによって全体［ＮＡＤＰＨ ＋ ＮＡＤＰ＋］含量に占める［ＮＡＤＰＨ］の比率がＩＤＰｃ酵素活性増加により増加する（図１０参照）。形質転換マウスの体重は、正常マウスに比べて最高３５％以上増加し（図７参照）、腹部脂肪組織（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）の重さは対照群に比べて明白に増加するが（図１１参照） 肝の重さには変化が無いことを確認できる（図８参照）。
【００４０】
また、血液中の中性脂質（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）及び総コレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）の量もまた対照群に比べて１．８倍及び２．４倍以上増加し（図１２参照）、肝においても中性脂質及びコレステロールの量が血液におけるのと同様に増加する（図１３参照）。これと共に肥満細胞で主に生成される蛋白質のレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）の血中濃度もやはり対照群に比べて２倍多く生成される（図１４参照）。
【００４１】
その外にも、形質転換マウスの肝組織は、対照群マウスの肝組織に比べて脂肪が多く蓄積された脂肪肝を示し、腹部脂肪組織での脂肪細胞の大きさも対照群に比べて大きく増加する（図１５及び図１６参照）。
【００４２】
前記のように、ＩＤＰｃ遺伝子の発現が増加された形質転換マウスが対照群に比べて体重が増加したことは、体脂肪の増加に起因する。例えば、形質転換マウスの脂肪組織では脂質生合成に関与する酵素の遺伝子を一括的に増加させる遺伝子転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ）のＰＰＡＲγを始めとする色々な種類の代表的な肥満指標遺伝子の発現が対照群マウスに比べて顕著に増加した。したがって、ＩＤＰｃ遺伝子発現の増加は一次的に脂肪酸の生合成に必要なＮＡＤＰＨの生合成量増加を起し、これにより増加された脂質誘導体が二次的にＰＰＡＲγの活性化及び遺伝子発現増加を誘導してこれによる肥満指標遺伝子の発現を増加させることによってＩＤＰｃ遺伝子形質転換マウスで肥満が誘導されることを確認できる。
【００４３】
一方、ＩＤＰｃ遺伝子発現の増加及び酵素活性の増加そしてＮＡＤＰＨの増加は、コレステロールの生合成に関与する色々な酵素反応を促進して高め、これと共に脂質成分の増加による脂質蛋白質の合成も増加させ、脂質蛋白質と結合された形態で存在する生体コレステロール複合体の生成量も増加させると言える。
【００４４】
さらに、本発明は、前記イソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性及びその遺伝子の発現を阻害する肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性治療剤を選別する方法を提供する。
【００４５】
前記で明らかにした酵素的機能を根拠にして、本発明のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性及びその遺伝子の発現が増加されるとＮＡＤＰＨの生合成が増加されＰＰＡＲγの活性化及び脂肪酸、スクアレン、コレステロールの生体内合成が増加され、このような事実を利用すれば、肥満、高脂血症または脂肪肝等の脂肪合成の増加により現れる代謝性疾患を治療する物質を選別できる。
【００４６】
詳細には、１０倍に濃縮された反応緩衝剤と三次蒸溜水だけを入れた試料を用いて３４０ｎｍ波長で分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）の零点を調節する。１０倍に濃縮された反応緩衝剤、検査試料及び三次蒸溜水をクリスタルキュベット（ｃｒｙｓｔａｌ ｃｕｖｅｔ）に入れた後、よく混合する。分光光度計にクリスタルキュベット（ｃｒｙｓｔａｌ ｃｕｖｅｔ）を入れ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを添加した後、３４０ｎｍで時間による吸光度変化を測定する。
【００４７】
酵素阻害活性を示す試料の処理濃度が高ければ高いほど時間による吸光度変化量が減少するようになるため、これを根拠にしてイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を選別できる。
【００４８】
本発明で前記した方法を利用して、ニコチン酸、ニコチンアミド、ビュープロピオン、メチルイソクエン酸及びオキサロマレイン酸を利用してイソクエン酸デヒドロゲナーゼに対する阻害度を測定した結果、ニコチン酸、ニコチンアミドは、前記酵素に対する阻害能力が見られなかったが、ビュープロピオンは若干の阻害能力を示し、メチルイソクエン酸とオキサロマレイン酸は前記酵素に対する明白な阻害能力を示した。
【００４９】
また、本発明は、ＮＡＤＰＨを人為的に直接増加させると肥満、高脂血症、中性脂肪の生合成を大きく増加させられるという本発明で最初に確認した事実を根拠にＮＡＤＰＨを生体脂質、コレステロール、スクアレン生合成増加剤及びＰＰＡＲγの活性化剤に直接的に使用できる用途を提供する。
【００５０】
実施例
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示しただけのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００５１】
＜実施例１＞ＩＤＰｃ遺伝子の分離及び配列確認
＜１−１＞マウス由来のＩＤＰｃ ｃＤＮＡ遺伝子分離
マウスＩＤＰｃ ｃＤＮＡを認識するプローブ（ｐｒｏｂｅ）を製作する為に、最近発表されたラットのＩＤＰｃ遺伝子塩基配列（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１９９４年、第２６９巻、Ｐ．２１３２８−２３１３４）を利用した。配列番号１のセンスプライマ−（ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）は、ラットＩＤＰｃの５３２−５５０番目塩基配列を、配列番号２のアンチセンスプライマー（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）は１２６３−１２４５番目の塩基配列を根拠に製作した。ラットの肝から抽出したｍＲＮＡを逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）によってｃＤＮＡにすべて転換させて得られたｃＤＮＡ混合物１００ｎｇを鋳型にして、９４℃で５分間変性させた後、９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で２分、２５回の重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を遂行した後、最終的に７２℃で１０分間反応させた。その結果０．８ｋｂのＤＮＡが増幅され、前記のＰＣＲ生成物をｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターにクローニングしてＤＮＡ塩基配列分析を通してラットのＩＣＰｃ遺伝子であることを確認した。
【００５２】
マウスのＩＤＰｃ ｃＤＮＡの分離は、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識された前記のラットＩＤＰｃをプローブに使用して、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からプラークハイブリダイゼーションを遂行して分離した。ハイブリダイゼーションと洗浄はすべて６５℃で行なった。１次スクリーニングのために５×１０４ＰＦＵのｃＤＮＡライブラリーファージを３ ×１０８の宿主の大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅと混合して３７℃で１５分間吸着させた後、７ｍｌのソフトアガロース培地（０．７％アガロース、１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）と良く混ぜて１５０ｍｍ ＴＹＭ−Ａｐアガロース（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％アガー、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）プレートに注いで固め３７℃で１２時間培養した。ファージプラークの形成を確認した後、４℃で１時間保管した後、溶菌したファージをニトロセルロース膜に移した。前記膜は、蒸溜水と１Ｍ ＮａＣｌに順に濡らし３ＭＭろ過紙上で乾かし使用した。ファージが溶菌したソフトアガープレート （ｓｏｆｔ ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）上に順に覆って同じ膜を２枚作った。溶菌したファージとファージ ＤＮＡの変性の為に変性溶液（０．５Ｍ ＮａＯＨ， ０．５Ｍ ＮａＣｌ）に５分間放置し、中和溶液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ， ｐＨ ８．０， ０．５Ｍ ＮａＣｌ）に５分間放置して中和させ、最終的に３ＭＭろ過紙上で乾かした。
【００５３】
ファージＤＮＡを８０℃で２時間処理して膜に固定させた後、１％ＳＤＳが含まれた６ Ｘ ＳＳＣ（１Ｘ ＳＳＣ； ０．１５Ｍ ＮａＣｌ， ０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム， ｐＨ ７．０）溶液で洗浄した後、６５℃で２時間のプレ−ハイブリダイゼーション（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を実施した。ハイブリダイゼーションは、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識されたラットのＩＤＰｃをプローブに５Ｘデンハルト溶液（０．１％ｆｉｃｏｌｌ， ０．１％ポリビニルピロリドン， ０．１％ ＢＳＡ）と鮭精子ＤＮＡ（ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）が１００μｇ／ｍｌ、ＳＤＳが０．０１％の濃度で含まれた６Ｘ ＳＳＣ溶液を使用して行なった。 ハイブリダイゼーション後、Ｘ線フイルムに１２時間露出させた後、陽性反応を確認して単一プラークを分離した。
【００５４】
分離した６個のファージから抽出したＤＮＡを制限酵素のＥｃｏＲＩで切断した後、 ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識されたラットのＩＤＰｃをプローブにサザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行なった。前記の６個のファージクローンは、１．９ｋｂないし２．２ｋｂの断片を持っていることが確認された。これらの中で最も大きいｃＤＮＡ断片を持っているファージクローンからマウスのＩＤＰｃ ｃＤＮＡ断片を分離してｐＧＥＭ７（＋）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。
【００５５】
＜１−２＞マウス由来のＩＤＰｃ ｃＤＮＡ遺伝子の配列確認
前記実施例＜１−１＞で分離されたマウス由来ＩＤＰｃ ｃＤＮＡ遺伝子の塩基配列を分析キット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０キット、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を利用して分析した。得られた塩基配列からアミノ酸配列を決定し、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース探索を実施して、他の蛋白質とアミノ酸配列の類似性を比較した。
【００５６】
ＤＮＡ塩基配列分析結果、マウスのＩＤＰｃ ｃＤＮＡは、配列番号３で記載される １，２４５ｂｐからなるＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を持っていて、ポリ（Ａ）＋シグナルと予想されるＡＡＴＡＡＡ塩基配列が３’−ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）に存在していた。また、マウスＩＤＰｃの塩基配列からコーディングされた配列番号４で記載されるアミノ酸配列を分析した結果、ＩＤＰｃ蛋白質は４１４個のアミノ酸で構成されこれによる分子量は、４６，５７５Ｄａであると確認された。
【００５７】
本発明のマウスＩＤＰｃのアミノ酸配列を異なる種から由来したイソクエン酸デヒドロゲナーゼ蛋白質と比較した結果、ラットのＩＤＰｃとは９７．８％の類似性がみられ、牛のＩＤＰｍとは６８．５％、そして酵母のＩＤＰｃとは６４．４％の類似性があることを確認した。
【００５８】
また、マウスＩＤＰｃの蛋白質配列中４１２−４１４番目のアミノ酸配列は、脂肪酸及びコレステロール生合成及び分解に関与すると報告されているペルオキシソーム （ｐｅｒｏｘｙｓｏｍｅ）のターゲット配列と一致することが分かったが、これはＩＤＰｃが前記配列によってペルオキシソームへ移動して脂肪酸及びコレステロール代謝にも関与する可能性があることを示唆している。
【００５９】
＜実施例 ２＞ＩＤＰｃ遺伝子で形質転換された細胞株の製造
＜２−１＞ＩＤＰｃ遺伝子発現のための組換えレトロウイルスベクターの製造
細胞内でＩＤＰｃ遺伝子を発現させるために、前記実施例１で確保されたＩＤＰｃ ｃＤＮＡ遺伝子をレトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ（Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ． Ｄ． ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ， Ｇ． Ｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８９年、第７巻、Ｐ．９８０−９９０）に正方向と逆方向に発現するように挿入して組換えレトロウイルスベクターを製造した。
【００６０】
まず、ＩＤＰｃ遺伝子の両側末端部位をＣｌａＩで切断した後、切断したＤＮＡをｐＬＮＣＸに挿入して大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。制限酵素処理を通して方向性を確認した後、前記遺伝子が各々正方向及び逆方向に挿入された組換えベクターを得た。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより正方向に転写される組換えベクターは、ＩＤＰｃの発現増大のために使用され、逆方向に転写される組換えベクターはＩＤＰｃの発現抑制のために使用された。対照群には遺伝子が挿入されていないレトロウイルスベクター ｐＬＮＣＸを使用した（図１）。得られた組換えベクターは、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）のＮＩＨ３Ｔ３ 細胞に導入させた。この効率を検証するためにマーカー遺伝子にＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 社）を挿入したｐＬＮＣＸベクターを同時に細胞に導入させた。
【００６１】
＜２−２＞形質転換細胞株の製造
前記実施例＜２−１＞で製造した組換えベクターをＮＩＨ３Ｔ３ 脂肪細胞に導入させるためにＢＯＳＣ２３細胞を利用したレトロウイルスパッケージングシステムを使用した。このために２×１０６のＢＯＳＣ２３細胞をまず、１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ）培地に接種し、形質転換する前に２５μＭクロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎ）、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に接種した。形質転換はリン酸カルシウム方式（Ｐｅａｒ， Ｗ． Ｓ．等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．，１９９３年、第９０巻、Ｐ．８３９２−８３９６）にしたがい行なった。まず、１０μｇの組換えベクターＤＮＡと０．２５Ｍ ＣａＣｌ２を混合した溶液を２Ｘ ＨＢＳ（２０ｍＭ ＮａＣｌ， １．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４， ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ７．１）に混合した後、ＢＯＳＣ２３細胞が成長したプレートに均一に添加して１０時間ＣＯ２培養器で培養した。１０時間後、１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ培地に交換して２４時間培養した後、培養液だけを１，２００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を再び４５μｍフィルターを使用してろ過した。ろ過された溶液には、組換えレトロウイルスベクターだけが存在し、ここに４μｇ／ｍｌの濃度でポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ， Ｓｉｇｍａ）を添加した。
【００６２】
前記組換えレトロウイルスベクターをＮＩＨ３Ｔ３ 細胞に感染させるために、まず、５×１０５のＮＩＨ３Ｔ３ 細胞を接種して１０％ＦＢＳを含んだＤＭＥＭ培地で培養した。細胞が５０％成長した状態で培地を捨てて、ＢＯＳＣ２３細胞からパッケージングされたレトロウイルスベクターが含まれた溶液を均一に添加した後、５時間程度培養した後、新しい培地に交換して再び２日間培養した。
【００６３】
組換えされたレトロウイルスベクターに感染されたＮＩＨ３Ｔ３ 細胞数を測定し４００μｇ／ｍｌのＧ−４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含んだＤＭＥＭ培地が入っている９６ウェルプレートに ５０個の細胞が入るように接種した後、再び培養した。２日に一回ずつＧ−４１８培地を交換しながら各ウェルで成長する細胞群を再び分離し再培養して１次形質転換細胞株を選別した。１次形質転換細胞株のゲノムＤＮＡを抽出してＰＣＲを行うことによってゲノム内にＩＤＰｃ遺伝子Ｇが挿入されたかを確認して２次選別した。
【００６４】
最終的にＩＤＰｃ遺伝子がゲノム内に含まれたと確認された細胞株中ＩＤＰｃ遺伝子が正方向に挿入された細胞株は、ＦＳ１と命名し、ＩＤＰｃ遺伝子が逆方向に挿入された細胞株はＦＡＳ１と命名した。前記ＩＤＰｃ遺伝子が正方向に挿入された細胞株のＦＳ１を ２０００年９月６日付けで生命工学研究所遺伝子銀行に寄託した（寄託番号 ： ＫＣＴＣ ０８６１ＢＰ）。
【００６５】
＜実施例 ３＞形質転換細胞株でのＩＤＰｃ及びＩＤＰｍ酵素活性測定
形質転換ＮＩＨ３Ｔ３ 細胞株でのＩＤＰｃ酵素活性を測定するために、細胞から細胞質を分離した後、ブラッドフォード方法で蛋白質の濃度を測定した。まず、３×１０７ 個の細胞を１Ｘリン酸塩緩衝溶液で２回洗浄した後、スクロース緩衝溶液（０．３２Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ， ０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ， ｐＨ ７．４）を利用して破砕した。これを１，０００ ｘ ｇで遠心分離して細胞カスを除去し、再び１５，０００ ｘ ｇで遠心分離して上澄み液の細胞質と沈殿物のミトコンドリア部分を分離した。細胞質分画を含む上澄み液に溶液全体の１／１０容積で０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含んだリン酸塩緩衝溶液を添加してブラッドフォード方法 （Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）を用いて定量した。酵素活性測定は、２５℃の緩衝溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ， ｐＨ ７．２， ３５．５ ｍＭ トリエタノールアミン， ｐＨ ７．２， ２ ｍＭ ＮＡＤＰ＋， ２ ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５ ｍＭ イソクエン酸， １ μｇ／ｍｌ ロテノン）で反応させて行なった。 反応が終わった後、３４０ｎｍで２分間、スペクトルフォトメーター（吸光測定器）で吸光度の変化を測定し、１分間に１μＭのＮＡＤＰＨを生成する酵素の量を１ ユニットとして酵素の活性を表した。
【００６６】
その結果、ＩＤＰｃ遺伝子が正方向に導入されたマウスＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１形質転換脂肪細胞ＦＳ１では、ＩＤＰｃ酵素活性がＬＮＣＸ−ベクターだけ導入された形質転換細胞（対照群）に比べて約２倍増加し、反対にＩＤＰｃ遺伝子が逆方向に導入された形質転換細胞ＦＡＳ１ではＩＤＰｃ酵素活性が対照群と比べて０．４倍減少したことを確認した。
【００６７】
＜実施例 ４＞形質転換細胞株でＩＤＰｃ酵素活性変化による脂肪酸合成量確認
ＩＤＰｃ酵素が脂肪酸合成に及ぼす影響を確認するために、形質転換細胞株を１０％の牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍｅ， ＦＢＳ）が含まれたＤＭＥＭに５μｇ／ｍｌ濃度のインシュリン、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ， ＩＢＭＸ， Ｓｉｇｍａ）、１μＭデキサメサゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ， ＤＥＸ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を各々１リットル当り５０，０００ユニットずつ添加して、細胞の密度が約３×１０４細胞／ｃｍ２に到達するまで二日間培養して脂肪細胞の分化を促進させた。その後、再び前記の培地からＩＢＭＸとＤＥＸを除去させた培地を利用して二日毎に培地を替えて１２日間継続培養した。細胞培養は、ＣＯ２培養器内で５％ＣＯ２、３７℃の湿潤状態で実施した。培養が終わった後、脂肪細胞内に形成された脂肪を特異的に染色するオイル レッド オー（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）を処理して脂肪細胞内に蓄積された脂肪を観察した。
【００６８】
オイル レッド オー染色は、細胞が培養されているプレートから培地を捨てて、固定溶液（カコジル酸緩衝液， ９０ｍＭ カコジル酸， ｐＨ７．２， ２％ ホルムアルデヒド， ２．５％ グルタルアルデヒド， ０．０２５％ ＣａＣｌ２， ５％スクロース）を１０ｍｌ添加した後、４℃で１時間放置した後、溶液を除去して再び４０％イソプロパノールに溶解されているオイル レッド オー溶液を５ｍｌ添加して１時間ゆっくり混合した後、４０％イソプロパノールで洗浄することにより行なった。
【００６９】
その結果、図２に見られるように、ＩＤＰｃ遺伝子発現が増加されたＦＳ１形質転換細胞では対照群に比べて脂肪の生成が増加した反面、ＩＤＰｃ遺伝子発現が減少されたＦＡＳ１ 形質転換細胞では対照群に比べて脂肪蓄積が顕著に減少したことを確認できた（図２）。また、２００倍に拡大した写真を見れば細胞群間の脂肪細胞の大きさの差が大きいことが分かった。前記結果は、ＩＤＰｃ遺伝子、酵素及び前記酵素反応の産物であるＮＡＤＰＨの増加または減少が、細胞内脂肪の蓄積量をそれぞれ増加または減少させるのに重要な作用をしていることを意味する。
【００７０】
＜実施例 ５＞添加されたＮＡＤＰＨの濃度増加による細胞内脂肪細胞分化及び脂肪蓄積量の増加
ＩＤＰｃ酵素反応産物であるＮＡＤＰＨの増加が直接的に細胞内脂肪蓄積を増加させるかどうかを確認するために、脂肪特異的染色体のオイル レッド オーで細胞内脂肪を測定した。前記実施例４と同じ細胞培養条件で培地にＮＡＤＰＨを０μＭ、２５μＭそして５０μＭずつ添加してｐＬＮＣＸ−ベクターだけ導入されたＮＩＨ３Ｔ３ Ｌ１対照群脂肪細胞を脂肪細胞に分化させた。分化が終わった後、オイル レッド オー溶液を利用して細胞内脂肪粒の蓄積量を調査した結果、培地にＮＡＤＰＨを添加すると添加しない時よりさらに多くの脂肪が細胞内に蓄積され、ＮＡＤＰＨの濃度が２５μＭより ５０μＭで添加された場合にさらに多くの脂肪の蓄積がなされることを確認した（図３）。したがって、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ等のＩＤＰｃ及びＩＤＰｍだけではなく、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ （６−ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、そしてリンゴ酸酵素等からも得られる酵素反応産物であるＮＡＤＰＨの人為的添加だけによっても脂肪細胞の分化促進及びこれによる脂肪の蓄積増加に直接的な効果があることを確認した。
【００７１】
＜実施例 ６＞ＩＤＰｃ遺伝子をゲノム内に含む形質転換動物を利用した生体内ＩＤＰｃの活性確認
＜６−１＞形質転換動物の製造
＜６−１−１＞微細注入用融合遺伝子コンストラクトの製造
細胞質形イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ＮＡＤＰ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ， ＩＤＰｃ）を肝及び脂肪細胞に特異的に発現させるために、まず、約２．２ｋｂのラットＰＥＰＣＫ−Ｃ遺伝子のプロモーターが含まれた５’側上流配列部位を配列番号５及び配列番号６のプライマーにＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を利用して増幅した。得られた遺伝子切片をＢｇｌＩＩ、ＳｍａＩで切断し、これを再びＩ−Ｐｐｏ−Ｉ制限酵素で切断した後、ヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を処理し平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）にした後、他の一方をＢｇｌＩＩで切断してＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）プロモーターが含まれた動物細胞発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏに挿入した。ここに再びマウスＩＤＰｃ ｃＤＮＡをＸｈｏＩ及びＳａｌＩで切断して組換えすることにより、ＰＥＰＣＫ５’−上流配列によって調節を受けるマウスＩＤＰｃ融合遺伝子コンストラクトを製造し、これをｐＰＥＰＣＫＩＤＰｃと命名した（図４）。
【００７２】
＜６−１−２＞微細注入用融合遺伝子コンストラクトＤＮＡの準備
前記実施例＜６−１−１＞から得たマウスＩＤＰｃ融合遺伝子コンストラクトＤＮＡ （ＴＣＳ）約１０μｇを制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＮｓｉＩで同時に切断し、これを０．７％アガロースゲルで電気泳動して組換え遺伝子が含まれた４．９ｋｂのＤＮＡ切片が含まれたゲルを分離した。これをフェノールとＣＩＡＡ（クロロホルム ： イソアミルアルコール ＝ ２４ ： １）が同量含まれた溶液で抽出した後、上澄み液を１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離してＤＮＡが溶解している上澄み液を回収した。ここに同じ容積のエーテルを加え再び１０，０００ｒｐｍで５秒間遠心分離し、上層部のエーテルは捨てて下層部のＤＮＡ溶液だけを回収し、２倍容積の純粋エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。得られたＤＮＡ沈殿に再び２−１０μｇ ＤＮＡ当り２．４ｍｌの微細注入用溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ［ｐＨ ７．４］， ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えてよく溶かした後、４℃の微細注入用溶液で２４時間透析した。微細注入のために最終ＤＮＡ濃度が２−４ｎｇ／μｌになるようにして−２０℃で貯蔵しておき必要時に使用した。
【００７３】
＜６−１−３＞受精卵の製造
採卵数が多く微細注入時の受精卵の損傷が少ないＦＶＢ／Ｎマウス系にＰＭＳＧ （Ｐｒｅｇｎａｎｔ ｍａｌｅ’ｓ ｓｅｒｕｍ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）とｈＣＧ （ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）の性腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）を５ＩＵずつ腹腔内に投与して過排卵（ｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｉｏｎ）を誘導した。ＰＭＳＧとｈＣＧを投与して２０時間経過後のマウス卵管膨大部を破裂させ卵球細胞塊を回収し、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ， ３００μｇ／ｍｌ）を３分間処理して卵丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌｓ）を除去して二個の真核が見える１細胞期マウス受精卵だけを微細注入に使用した。
【００７４】
ノマルスキー（Ｎｏｒｍａｒｓｋｉ）ＤＩＣ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ）レンズを付着した倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用して、前記の方法で確保した受精卵の核膜を観察しながら細胞微量注入装置（ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ）を利用して融合遺伝子コンストラクトを微細注入した。微細注入後、生存した受精卵をＭ１６培養液に入れ３７℃、５％ＣＯ２培養器内で培養した。これから得たＩＤＰｃ融合遺伝子コンストラクトを含むマウス受精卵を２０００年 １０月５日付けで生命工学研究所遺伝子銀行に寄託した（寄託番号 ： ＫＣＴＣ ０８７４ＢＰ）。
【００７５】
＜６−１−４＞マウス受精卵の移植及び形質転換マウスの確認
代理母（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）に、子宮の容積が大きく繁殖及び哺乳能力が優れた特徴を持っているＦＶＢ／Ｎマウス系を使用した。発情期の雄マウスだけを選んで精管手術を実施した後、代理母と交配させ次の朝、膣栓（ｖａｇｉｎａｌ ｐｌｕｇ）がある個体を選び最終的な代理母に使用した。代理母正中線の皮下層を鋏で１ｃｍ程度切開した後、続いて筋肉層を切開して現れたマウスの両側卵管に受精卵を移植した。
【００７６】
代理母から受精卵移植により生れた生後２−３週になるマウスの尾を１−２ｃｍ程度切断して、これを７００μｌの溶解溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ， ｐＨ８．０， １００ｍＭ ＥＤＴＡ， １００ｍＭ ＮａＣｌ， １％ＳＤＳ）に入れ、ここに蛋白質分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を３５μｌ 添加した後、５５℃で１５−１８時間震盪して尾組織を溶解させた。その後、２０μｌのＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ）溶液（１３μｇ／ｍｌ）を添加してＲＮＡを分解させ、ここに同じ容積のフェノールを添加して遠心分離で上澄み液を抽出する過程を２−３回反復した。得られた上澄み液に２倍容積の純粋エタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。得られたマウスのゲノムＤＮＡ１μｇを配列番号７で記載されるＰＥＰＣＫ−Ｃプロモーターの３’−末端配列のＰ１及び配列番号８で記載されるＩＤＰＣ遺伝子の５’−末端近くの遺伝子配列を含むＰ２を利用して ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、生れたマウスの染色体遺伝子に微細注入されたマウスＩＤＰｃ融合遺伝子コンストラクトＤＮＡ（ｐＰＥＰＣＫＩＤＰｃ）遺伝子が、挿入されているかどうかを確認した。ＰＣＲの遂行は、９５℃で５分間変性させた後、９５℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分３０秒間３０回実施した。ＰＣＲ反応産物として１．５％アガロースゲルで約０．５ ｋｂのＤＮＡバンドが現れるマウス個体を最終形質転換マウスに選別した。これから選別された形質転換マウスの雄を野生型ＦＶＢ／Ｎ雌と交配した後、生れたマウスの尾を切断して前記と同じ方法でＰＣＲ反応を遂行することによって、組換え遺伝子を生殖細胞系（ｇｅｒｍ ｌｉｎｅ）で遺伝させられる形質転換マウスを確認した。この時、得られた形質転換マウスをＦ１ラインで継続維持した。また、Ｆ１異形接合（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）形質転換マウスを野生型 ＦＶＢ／Ｎマウスと継続交配して得られた子ネズミ中、組換え遺伝子を持っているマウスを前記と同じＰＣＲ方法で確認した後、これらを異形接合Ｆ２ラインで継続維持した。これらＦ２ラインも全てＦ１ラインと同様に肥満、高脂血症及び脂肪肝症状を示した。
【００７７】
形質転換マウスの個体管理は、生れて２週になる幼いマウスの尾を切断してこれからＤＮＡを分離精製した後、外来遺伝子の挿入可否を分析し、確認されたマウスの雌雄を区別して分離し、耳に標識（ｅａｒ ｍａｒｋ）して管理した。
【００７８】
＜６−２＞形質転換動物を利用した生体内脂肪組織重量及びＩＤＰｃの活性確認
＜６−２−１＞形質転換動物の腹部脂肪増加確認
まず、同じ父母から生れた２８週齢の形質転換マウスと正常マウスを脊椎脱臼の方法で安楽死させた後、ピンセットで外皮をつまんだ後、ハサミでそっと切開した。ハサミと手で外皮を除去した後、再び内皮を切開して現れた腹部脂肪組織（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）の大きさを対照群の野生型ＦＶＢ／Ｎマウスの腹部脂肪組織の大きさと比較した。その後、脂肪組織の総重量の差を比較するために形質転換マウス及び野生型マウスの脂肪組織全体を採取した。脂肪組織の重さを確認するために採取した全ての脂肪細胞の重さを測定した後、すばやくホルマリンに入れて脂肪組織を固定化させ、これを急速冷凍した。冷凍された脂肪組織を−２０℃の環境でミクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を利用して１０μｍの厚さに切って組織スライドを作った後、ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）とエオジン（Ｅｏｓｉｎ）で脂肪組織を染色して、顕微鏡上で形質転換マウスと正常マウスの脂肪組織の大きさを測定した。
【００７９】
その結果、図５に示したように、異形接合（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｉｃ）Ｆ１形質転換マウスは、生後２６週後に正常マウスに比べてその体が大きくなっていることがわかる（図５のＡ）、これを解剖して外皮を除去した後、背中側から見た姿でも形質転換マウスの肥満細胞が多く増加したことを見ることができ（図５のＢ）、この時、腹部脂肪組織（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ ｆａｔ ｐａｄ）の大きさがとても増加していることを確認した。継続的に内皮を切開して腹部を解剖した時、腹部脂肪組織の大きさが野生型に比べて大きく増加していた（図５のＣ）。また、全体脂肪組織を分離して比較した場合にも、白色脂肪組織の総量は正常マウスに比べて顕著に増加した（図５のＤ）。その反面、肝（ｌｉｖｅｒ）の大きさや色相は、形質転換マウスと正常マウスで肉眼上の差が見られなかった（図５のＤ）。
【００８０】
＜６−２−２＞形質転換動物のＩＤＰｃ発現による肥満指標遺伝子の発現増加確認
形質転換動物のＩＤＰｃ発現による肥満指標遺伝子の発現増加を確認するために 下記のような方法で各遺伝子の発現を測定した。
【００８１】
詳細には、形質転換マウス及び正常マウスから採取した腹部脂肪組織１ｇを９ｍｌの溶解溶液（４Ｍ チオシアン酸グアニジン， ２５ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ７．０， ０．５％ サルコシル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）， ０．７２％ β−メルカプトエタノール）に入れた後、粉砕機（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で組織を粉砕した。これを冷たい氷で２−３分間冷却した後、ここに１ｍｌの抽出溶液（２Ｍ ナトリウムアセタート， ｐＨ４．０）、１０ｍｌのフェノール（ＤＥＰＣ−水飽和フェノール）、２ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール［２４：１］を加えて氷に１５分間放置した。前記混合溶液を３，０００ ｘ ｇ、４℃で１５分間遠心分離を遂行し、上澄み液を取得した後、再びフェノール／クロロホルム混合溶液で抽出した。得られた抽出液に同量のイソプロパノールを入れた後、１５分間遠心分離を実施してＲＮＡ沈殿物を得た。これをホルムアルデヒドが３６％含まれた水に溶かした後、ホルムアルデヒドが６．７％含まれた１％アガロースゲルで電気泳動を実施した。電気泳動が終わった後、分離された ＲＮＡバンドを２０Ｘ ＳＳＣ溶液でナイロン膜に移動させ乾かした後、ＵＶ−結合リンカー（ＵＶ−ｃｒｏｓｓ ｌｉｎｋｅｒ）で固定させた。前記ナイロン膜を再び６Ｘ ＳＳＣで５分間洗浄した後、適当量のハイブリダイゼーション溶液（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（５０％ ホルムアミド， ６Ｘ ＳＳＣ， ５Ｘ デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）， １．２％ ＳＤＳ， １０μｇ／ｍｌ サケ精子 ＤＮＡ）に入れて４２℃で２時間プレ−ハイブリダイゼーションを実施した。ノーザンブロット（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）のためのプローブとして多様な肥満指標遺伝子のｃＤＮＡ（ａＰ２， アディプシン， ＬＰＬ ［Ｌｉｐｉｄ ｌｉｐａｓｅ］， レプチン， ＴＮＦα［ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α］及びＰＰＡＲγ）を［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを使用して標識した後、これをハイブリダイゼーション溶液に添加して１２時間以上ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーションが終わった後、前記ナイロン膜を０．１％ＳＤＳが含まれた６Ｘ ＳＳＣ溶液で３０分、０．１％ＳＤＳが含まれた２Ｘ ＳＳＣ 溶液で２０分ずつ、６５℃で２回以上洗浄し、再び最終的に０．２Ｘ ＳＳＣ溶液を用いて常温で２回洗浄し、これを−７０℃でＸ−ｒａｙフイルムに露出させ、腹部脂肪組織内に存在するｍＲＮＡ発現量を確認した。
【００８２】
その結果、図６に示したように、ＩＤＰｃ形質転換マウスの腹部脂肪組織では、元来持っていたＩＤＰｃ遺伝子と共に導入された組換えＩＤＰｃ遺伝子発現も検出され、総ＩＤＰｃ活性が増加されたことを確認できた。また、肥満細胞分化の増加時、共通的に遺伝子発現が増加される肥満指標遺伝子のａＰ２、アディプシン、ＬＰＬ、レプチン、ＴＮＦα及びＰＰＡＲγ遺伝子等もやはり全て発現が増加され、ＩＤＰｃ遺伝子発現増加によるＩＤＰｃ酵素活性の増加は、これら遺伝子の発現を全て増加させる効果があることを確認した。これは、図３で確認したように、ＩＤＰｃ酵素反応産物であるＮＡＤＰＨの増加がこれら肥満指標遺伝子の発現増大に関与していることを示すものである。
【００８３】
一方、最近の多重不飽和脂肪酸及び脂質誘導体がＰＰＡＲγを活性化させるリガンド物質に作用するという報告と共に、ＰＰＡＲγの活性化はＰＰＡＲγ自身の遺伝子発現をさらに増加させる陽性フィードバック（ｐｏｓｉｔｕｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ）機序を見せるという研究結果（Ｋｉｍ， Ｊ． Ｂ．等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１９９８年、第９５巻、Ｐ．４３３３−４３３７）に照らしてみる時、こうした結果は細胞質内にＩＤＰｃ酵素活性の増加によるＮＡＤＰＨの供給増加により、酵素反応にＮＡＤＰＨを必須的に要求する脂肪酸生合成酵素（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性が増加し、それによって脂肪酸生合成量が増加したためである。また、ＮＡＤＰＨの増加によりその生成量が増加された脂肪酸誘導体が再びＰＰＡＲγの活性化を増加させ、これを通して肥満細胞の分化促進に必要な脂肪酸生合成関連遺伝子だけではなく、コレステロール生合成に関与する遺伝子の発現も一括的に増加させる主要転写因子（ｍａｓｔｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）として作用するという既知の事実に照らしてみる時、ＩＤＰｃ形質転換マウスでの前記ａｐ２、アディプシン、ＬＰＬ、レプチン及びＴＮＦα等の肥満指標遺伝子の発現増加がＰＰＡＲγ遺伝子発現の増加に因ることが分かる。結局、前記結果は、ＩＤＰｃ遺伝子ＤＭＬ発現増加によるＩＤＰｃ酵素活性増加及びその酵素反応産物であるＮＡＤＰＨの増加は、脂肪及びコレステロール生合成増加に必須的なＰＰＡＲγ遺伝子ＤＭＬ発現を急激に増加させる機能があることを意味するものである。
【００８４】
＜６−２−３＞形質転換動物のＩＤＰｃ発現による体重、体内脂質、コレステロール増加及び生化学的な調査
肥満形質転換マウスＦ１の体内脂質蓄積量を確認するために、生後２６週後に正常マウスと相互差を分析した。
【００８５】
１）体重測定
形質転換マウスと正常マウスの体重を測定するために、水平に置かれている秤にマウスをのせられる適当な容器を置いて零点を調節した後、マウスを静かに載せた。マウスが動くと秤の数値が変化するため、マウスの動きが微微な時の数値を測定した。
【００８６】
２）ＩＤＰｃ酵素活性測定
形質転換マウスと正常マウスの肝と脂肪組織を粉砕緩衝溶液（０．３２Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ， ０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ ７．４）を添加して粉砕機（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で細かく砕いた後、３０００ ｘ ｇで１０分間遠心分離した。上澄み液だけを取りだし１０，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離して上澄み液を得ると、純粋な細胞質溶液だけ分離できる。ＩＤＰｃ酵素活性の分析は、適当量の細胞質溶液を反応溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ 緩衝液， ｐＨ７．２， ３５．５ｍＭ トリエタノールアミン， ２ｍＭ ＮＡＤＰ＋， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５ｍＭ イソクエン酸， １μｇ／ｍｌ ロテノン）に添加して２５℃で反応させた後、３４０ｎｍで２分間吸光度を測定することによってＮＡＤＰＨ生成量を測定した。酵素活性単位として１分間に１μモルのＮＡＤＰＨを生成するＩＤＰｃ酵素活性を１ユニットとした。蛋白質の定量はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）方法により実施した。
【００８７】
３）［ＮＡＤＰＨ］／［ＮＡＤＰＨ ＋ ＮＡＤＰ＋］ 測定
ＮＡＤＰＨの定量は、ＮＡＤＰＨがＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５ −ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）と反応して発色反応を起す原理を利用して測定した。１００μｇ蛋白質を含む細胞質抽出物を２個準備し、１個は３０分間６０℃で反応させた後０℃で冷却させる前処理をすることによりＮＡＤＰ＋を全て分解させ元来存在したＮＡＤＰＨ量［ＮＡＤＰＨ］を測定するために使用した（試料１）。もう１個の試料は、前処理をしない状態で０℃に保管した後に使用して、全体ＮＡＤＰ＋存在量の総量［ＮＡＤＰＨ ＋ ＮＡＤＰ＋］を測定するための試料に使用した（試料２）。二種類の試料全てを各々反応液（０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ 緩衝液， ｐＨ８．０， ５ｍＭ ＥＤＴＡ， ２ｍＭ 電子輸送試薬（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）， ０．５ｍＭ ＭＴＴ）に添加し、ここに１．３ユニットのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を各々入れた後、３７℃で５分間反応させることによって反応液に存在するＮＡＤＰ＋を全てＮＡＤＰＨに転換させた。この時、酵素の基質であるグルコース−６−リン酸 （ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を１ｍＭになるように試料（試料１及び２）にだけ添加し、これらに対する対照群には添加しなかった。反応が終わった後、５７０ｎｍでＭＴＴと反応して現れた吸光度変化を測定してＮＡＤＰＨ量を調査した。試料２で得られた吸光度の増加を全体［ＮＡＤＰＨ ＋ ＮＡＤＰ＋］とし、試料１で得られた吸光度の変化を［ＮＡＤＰＨ］として全体 ＮＡＤＰ＋とＮＡＤＰＨ量に対するＮＡＤＰＨの比率を測定した。
【００８８】
４）血中中性脂質（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）及び総コレステロール濃度測定
血中中性脂質及び総コレステロール濃度の測定は、アサン製薬株式会社の測定用キットを各々使用した。形質転換マウスと正常マウスから血液を採取して抗凝固剤を処理した後、遠心分離して血清（ｓｅｒｕｍ）を確保した。確保した血清１０μｌに１．５ｍｌの中性脂質測定キット液［リポ蛋白リパーゼ１０８００Ｕ、グリセロールキナーゼ５．４Ｕ、ペルオキシダーゼ１３５０００Ｕ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ１６０Ｕを７２ｍｌのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノメタンスルホン酸緩衝液に溶解した溶液］または１．５ｍｌのコレステロール酵素測定キット液［酵素液（コレステロールエステラーゼ２０．５ＫＵ／ｌ、コレステロールオキシダーゼ１０．７ＫＵ／ｌ、水酸化ナトリウム１．８１ｇ／ｌ）と緩衝液（リン酸１カリウム１３．６ｇ／ｌ、フェノール１．８８ｇ／ｌ）を１：１で混ぜた溶液］を混ぜた後、３７℃で５分間反応させてマイクロプレート分析器（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）でコレステロールは５００ｎｍ、トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）は５４０ｎｍで各々吸光度を測定して中性脂質及び総コレステロールの血中濃度を測定した。中性脂質及びコレステロールの定量換算は、これらの標準物質溶液に対して前記と同じ方法を適用した後、得られた標準濃度曲線を利用して実施した。
【００８９】
５） 血中中性脂質及び総コレステロール濃度測定
形質転換マウスと正常マウスの肝を一定量採取し、ＣＩＡＡを２：１で混ぜた溶液１ｍｌと混合した後、粉砕した。そのうち１００μｌを乾燥させ２００μｌの純粋エチルアルコールに溶かした後、０．５％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、３ｍＭコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｏｌａｔｅ）が含まれた５００μｌの前記と同じアサン製薬製品の中性脂質及びコレステロール測定キット溶液を混合した後、３７℃で１０分間反応させた。反応後８００μｌの水を混ぜた後、上の血中濃度測定法と同様にマイクロプレート分析器を使用して肝の中性脂質及び総コレステロールの濃度を測定した。中性脂質及びコレステロールの定量換算は、これらの標準物質溶液に対して前記と同じ方法を適用した後、得られた標準濃度曲線を利用して実施した。
【００９０】
６）血中レプチン濃度測定
形質転換マウスと正常マウスから血液を採取して２−８℃で一晩中凝固させた後、 ５３，０００ ｘ ｇで２０分間遠心分離して血清を分離した。レプチンを測定する前には、溶けないように−２０℃で保管し、濃度を測定するためにＥＬＩＳＡキット（ｍｏｕｓｅ ｌｅｐｔｉｎ ［ＯＢ］ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｋｉｔ， Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して製造会社の方法にしたがい分析した。まず、血清５０μｌに同じ容積の２．５Ｎ 酢酸／１０Ｍ ウレアを混ぜた後、常温で１０分間放置した。中性化させるために５０μｌの２．７Ｎ ＮａＯＨ／１Ｍ ＨＥＰＥＳを添加してよく混合した。濃度を測定する前に前記反応溶液を測定溶液（Ｃａｌｌｉｂｒａｔｏｒ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ５−３）で１／２０に稀釈させた。９６ウェルプレートの各ウェルに５０μｌの分析用稀釈溶液（Ａｓｓａｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ ＲＤ１Ｗ）を入れ、試料血清と標準物質溶液を各ウェルに５０μｌずつ入れた。１分間よく混ぜた後、 常温で２時間反応させ、各ウェルの溶液を全て除去した後、洗浄緩衝溶液を使用して４−５回洗浄した。ここに１００μｌのマウスレプチン接合体（ｍｏｕｓｅ Ｌｅｐｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を添加した後、常温で２時間反応させ、再び４−５回洗浄した。３０分以内に４５０ｎｍでマイクロプレート分析器（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を利用して各々の血中レプチン濃度を測定した。
【００９１】
その結果、２６週になった形質転換マウス（Ｔｇ）の体重は、正常マウス（Ｎｏｎ−Ｔｇ）に比べて２３−３５％増加し（図７）、ＩＤＰｃ酵素活性は肝と脂肪組織で正常マウスに比べてそれぞれ１．４倍及び２．７倍増加し（図９）、ＩＤＰｃ酵素反応産物である［ＮＡＤＰＨ］の全体［ＮＡＤＰＨ ＋ ＮＡＤＰ＋］に対する含量比率は、肝で１．２倍、脂肪組織で１．３倍増加した（図１０）。腹部脂肪組織の重さは対照群に比べて約１３．６倍増加したが（図１１）肝の重さには変化が無かった（図８）。一方、血液中の中性脂質及び総コレステロールの量は、形質転換マウスで正常マウスに比べてそれぞれ１．８倍及び２．４倍増加した（図１２）。肝でも中性脂質及びコレステロールの量は、それぞれ１．８倍及び２．４倍増加していることが確認できた（図１３）。これと共に肥満細胞で主に生成される蛋白質であるレプチンもやはりＩＤＰｃ形質転換マウスの脂肪組織で対照群に比べて約２倍多く生成されることが観察された（図１４）。
【００９２】
この他にも、肥満形質転換マウスＦ１の肝細胞組織と脂肪細胞組織の差を比較するために、各組織を切片して断面を比較して見た。形質転換マウスの肝組織は、正常マウスの肝組織に比べて脂肪が多く蓄積された脂肪肝を示している（図１５）、脂肪細胞の大きさも対照群に比べて５倍以上増加したことを確認できた（図１６）。
【００９３】
前記したように、ＩＤＰｃ遺伝子の発現が増加された形質転換マウスの体重増加は、体脂肪の増加に起因し、形質転換マウスの脂肪組織では脂質及びコレステロール代謝に関与する酵素遺伝子を一括的に増加させる遺伝子転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ）であるＰＰＡＲγをはじめとする色々な種類の代表的な肥満指標遺伝子の発現が、対照群マウスに比べて顕著に増加していた。したがって、ＩＤＰｃ遺伝子発現の増加は、一次的に脂肪酸の生合成に必要なＮＡＤＰＨの生合成量増加を引き起こし、これにより増加した脂質誘導体が二次的にＰＰＡＲγの活性化及び遺伝子の発現増加を誘導してこれによる肥満指標遺伝子の発現を増加させることによってＩＤＰｃ遺伝子形質転換マウスで肥満が誘導されたことを確認した。
【００９４】
＜実施例 ７＞イソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤選別方法
本発明者らは、下記の方法を利用してイソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を調節する物質を選別した。
【００９５】
反応緩衝剤［ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ， ５０ｍＭ ＭＯＰＳ （ｐＨ７．２）， ３５．５ｍＭ トリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ， ｐＨ７．２）、２ｍＭ ＮＡＤＰ＋、２ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、５ｍＭイソクエン酸（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ）、１ｍｇ／ｍｌロテノン（ｒｏｔｅｎｏｎｅ）］と検査試料は全て１０倍に濃縮された濃度にして使用した。酵素反応は、２５℃に設定されたクリスタルキュベット（ｃｒｙｓｔａｌ ｃｕｖｅｔ）最終容積１ｍｌで行なった。検査試料は、三次蒸溜水で稀釈して使用した。１０倍に濃縮された反応緩衝剤及び酵素阻害剤、イソクエン酸脱水素酵素は、氷に入れておき低温状態を維持させた。
【００９６】
まず、１０倍に濃縮した反応緩衝剤と三次蒸溜水だけを入れた試料を用いて、３４０ｎｍ波長で分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）の零点調節し、１０倍に濃縮された反応緩衝剤と検査試料を各１００ｍｌずつクリスタルキュベットに入れた後、三次蒸溜水を６００ｍｌ追加してよく混ぜる。分光光度計にクリスタルキュベットを入れた後、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを２００ｍｌ追加した後、ピペットで２〜３回程度混ぜて時間による吸光度変化を測定した。酵素阻害活性を示す試料は、処理した試料の濃度が高ければ高いほど時間による吸光度変化量が増加するため、これを根拠にしてイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を選別した。
【００９７】
その結果、検査した５種の試料中、ニコチン酸、ニコチンアミドは、前記酵素に対する阻害能力が見られなかったが、ビュープロピオンは若干の阻害能力を示し、オキサロマレイン酸（図１７）とメチルイソクエン酸（図１８）は明白な酵素阻害能力を示した。
【００９８】
＜実施例 ８＞イソクエン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤による肥満抑制程度調査
＜８−１＞イソクエン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤による３Ｔ３−Ｌ１細胞株の脂肪蓄積抑制程度調査
脂肪細胞に分化する細胞である３Ｔ３−Ｌ１細胞に、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるメチルイソクエン酸とオキサロマレイン酸を処理して脂肪細胞への分化抑制程度の差を分析した。イソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤が脂肪酸合成に及ぼす影響は、前記の細胞株をインシュリン処理により脂肪細胞に分化させた後、脂肪を特異的に染色するオイル レッド オー（Ｏｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ）で処理することにより確認できる。図１９は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼを処理していない細胞（左）、オキサロマレイン酸を処理した細胞（中間）、トレオイソクエン酸を処理した細胞（右）をオイル レッド オーで染色して後、１００倍拡大（上）及び２００倍拡大（下）した結果である。その結果、オキサロマレイン酸とメチルイソクエン酸を処理した細胞株が対照群に比べて脂肪の生成が減少したことを確認した（図１９）。前記結果は、ＩＤＰｃ抑制剤が細胞内脂肪蓄積量を減少させることを示すものでありＩＤＰｃが細胞内脂肪代謝に重要な作用をしていることを示す。
【００９９】
＜８−２＞イソクエン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤によるラットの肥満抑制程度調査
ラットの体内脂質蓄積量確認のために、生後２６週後にイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるメチルイソクエン酸を投与したラットと前記阻害剤を投与していないラットとの相互差を分析した。
【０１００】
１）体重測定
阻害剤を投与したラットと投与していないラットの体重を測定するために、水平に置かれた秤にラットを載せられる適当な容器を置き零点を調節した後、ラットを静かに載せた。ラットが動いた場合秤の数値が変化するため、ラットの動きが微微な時の数値を測定した。
【０１０１】
２）ＩＤＰｃ酵素活性測定
阻害剤を投与したラットと投与していないラットの肝と脂肪組織を粉砕緩衝溶液（０．３２Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ， ０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４）を添加して粉砕機（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で細かく砕いた後、３０００ ｘ ｇで１０分間遠心分離した。上澄み液だけ取りだした後、１０，０００ ｘ ｇで１５分間遠心分離して上澄み液を得ると純粋な細胞質溶液だけ分離できる。ＩＤＰｃ酵素活性の分析は、適当量の細胞質溶液を反応溶液（５０ｍＭ ＭＯＰＳ 緩衝液， ｐＨ７．２， ３５．５ｍＭ トリエタノールアミン， ２ｍＭ ＮＡＤＰ＋， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５ｍＭ イソクエン酸， １μｇ／ｍｌ ロテノン）に添加して２５℃で反応させた後、３４０ｎｍで２分間吸光度を測定することによってＮＡＤＰＨ生成量を測定した。酵素活性単位としては、１分に１μモルのＮＡＤＰＨを生成するＩＤＰｃ酵素活性を１ユニットとした。蛋白質の定量はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）方法によって実施した。
【０１０２】
３）血中中性脂質及び総コレステロール濃度測定
中性脂質及び総コレステロール濃度の測定は、アサン製薬株式会社の測定用 キットを各々使用した。阻害剤を投与したラットと阻害剤を投与していないラットから血液を採取して抗凝固剤を処理した後、遠心分離して血清（ｓｅｒｕｍ）を確保した。確保した血清１０μｌに１．５ｍｌの中性脂質測定キット液［リポ蛋白リパーゼ１０８００Ｕ、グリセロールキナーゼ５．４Ｕ、ペルオキシダーゼ１３５０００Ｕ、Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ１６０Ｕを７２ｍｌのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノメタンスルホン酸緩衝液に溶解した溶液］または１．５ｍｌのコレステロール酵素測定キット液［酵素液（コレステロールエステラーゼ２０．５ＫＵ／ｌ、コレステロールオキシダーゼ１０．７ＫＵ／ｌ、水酸化ナトリウム１．８１ｇ／ｌ）と緩衝液（リン酸１カリウム１３．６ｇ／ｌ、フェノール１．８８ｇ／ｌ）を１：１で混ぜた溶液］を混ぜた後、３７℃で５分間反応させてマイクロプレート分析器（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）でコレステロールは５００ｎｍ、トリグリセリド（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）は５４０ｎｍで各々吸光度を測定して中性脂質及び総コレステロールの血中濃度を測定した。中性脂質及びコレステロールの定量換算は、これらの標準物質溶液に対して前記と同じ方法を適用した後、得られた標準濃度曲線を利用して実施した。
【０１０３】
４）肝の中性脂質及び総コレステロール濃度測定
阻害剤を投与したラットと阻害剤を投与していないラットの肝を一定量採取し、ＣＩＡＡを２：１で混ぜた溶液１ｍｌと混合した後、粉砕した。そのうちの１００μｌを乾燥させ２００μｌの純粋エチルアルコールに溶かした後、０．５％トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、３ｍＭコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｏｌａｔｅ）が含まれた５００μｌの前記と同じアサン製薬製品の中性脂質及びコレステロール測定キット溶液を混合した後、３７℃で１０分間反応させた。反応後８００μｌの水を混ぜた後、上の血中濃度測定法と同様にマイクロプレート分析器を使用して肝の中性脂質及び総コレステロールの濃度を測定した。中性脂質及びコレステロールの定量換算は、これらの標準物質溶液に対して前記と同じ方法を適用した後、得られた標準濃度曲線を利用して実施した。
【０１０４】
その結果、１０週になったラットの体重は、阻害剤を投与したラットは、阻害剤を投与していないラットと比較してみる時、大差が無かったが、腹部脂肪組織の重さは対照群に比べて約１２％減少し、肝の重さには変化がなかった（図２０）。一方、血液中の中性脂質及び総コレステロールの量は、阻害剤を投与したラットでそれぞれ２０％及び１１％減少した（図２１）。動脈硬化指数もまた１０％程度減少した。反面、コレステロール逆輸送経路で組織中のコレステロールを肝に運搬してコレステロールの分解及び排泄作用を促進する高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）は、阻害剤を投与したラットが阻害剤を投与していないラットに比べて１１％程度増加した（図２２）。
【０１０５】
前記したように、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を投与したラットで腹部脂肪の増加が抑制され、血液中の中性脂質及び総コレステロール量も減少した。また、動脈硬化指数もやはり減少してイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤により肥満が抑制され、動脈硬化誘発の危険性も低くなるという事実を確認した。反面、コレステロールの分解及び排泄作用に関与する高密度リポ蛋白質が増加するという事実からイソクエン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤により高コレステロール血症の誘発が抑制され得るという事実を確認した。
【０１０６】
本発明では、ＩＤＰｃ遺伝子の発現が増加された形質転換マウスの体重増加は、体脂肪の増加に起因し、形質転換マウスの脂肪組織で脂質及びコレステロール代謝に関与する酵素遺伝子を一括的に増加させる遺伝子転写因子であるＰＰＡＲγをはじめとする色々な種類の代表的な肥満指標遺伝子の発現が、正常マウスに比べて顕著に増加されるという事実を確認した。したがって、ＩＤＰｃ遺伝子発現の増加は、一次的に脂肪酸の生合成に必要なＮＡＤＰＨの生合成量増加を起し、これによって増加された脂質誘導体が二次的にＰＰＡＲγの活性化及び遺伝子発現増加を誘導し、これによる肥満指標遺伝子の発現を増加させることによってＩＤＰｃ遺伝子形質転換マウスで肥満が誘導されることを確認した。
【０１０７】
このような事実を土台にイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤をラットに投与すると、肥満が抑制される事実を、腹部脂肪の減少と中性脂質、総コレステロール量の減少によって確認し、動脈硬化指数が減少する事実からも肥満による動脈硬化の誘発を抑制できる事実を確認した。また、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤により高密度リポ蛋白質の量が増加したことにより、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤による総コレステロール量の減少は、高密度リポ蛋白質の増加によることを明らかにした。
【０１０８】
産業上の利用可能性
以上、詳細に説明したように、本発明では今まで報告されていないマウスのＩＤＰｃ遺伝子発現及び酵素の増加、そしてこれによる酵素反応生成物であるＮＡＤＰＨの増加が脂肪の蓄積を増加させ、肥満と脂肪肝を誘発し、それと同時に血液中の中性脂質及びコレステロールの量も増加させることを確認した。反対に肥満細胞でＩＤＰｃ遺伝子発現、酵素及びその酵素反応生成物であるＮＡＤＰＨの減少は、細胞内脂肪の蓄積を抑制することも発見した。このような結果を通して、本発明のＩＤＰｃ遺伝子、酵素及びその酵素反応生成物であるＮＡＤＰＨは、生体内脂肪酸、スクアレン、ＤＨＡ等を含んだ脂質成分の生合成増加及びこれに伴ったＰＰＡＲγの活性化に利用できる。また、本発明のＩＤＰｃ遺伝子形質転換マウスは、明確に肥満、高脂血症及び脂肪肝症状を示すためＩＤＰｃ 等を含んだＮＡＤＰＨ生成イソクエン酸酵素及びその遺伝子は、肥満、脂肪肝の抑制物質開発に直接的に利用できるだけではなく、生体中性脂質及びコレステロール生合成を抑制する物質を選別する目的にも利用できる。さらに、本発明で確認したイソクエン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤の肥満抑制効果と生体中性脂質及びコレステロール生合成抑制効果を利用して肥満、高脂血症及び脂肪肝の抑制剤の開発に利用できる。
【０１０９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＬＮＣＸ−ベクター（上）、ＮＩＨ３Ｔ３ Ｆ４４２Ａ脂肪細胞でＩＤＰｃ 遺伝子の発現を増加させるためにＩＤＰｃ 遺伝子をセンス方向に挿入した組換えベクター（中）、ＮＩＨ３Ｔ３ Ｆ４４２Ａ脂肪細胞でＩＤＰｃ 遺伝子の発現を減少させるためにＩＤＰｃ 遺伝子をアンチセンス方向に挿入した組換えベクター（下）の構造を示した模式図である。
【図２】正常ＮＩＨ３Ｔ３ Ｆ４４２Ａ細胞（左）、ＩＤＰｃ遺伝子発現量が増加した形質転換ＦＳ１細胞（中間）、ＩＤＰｃ遺伝子発現量が減少した形質転換ＦＡＳ１細胞（右）から分化された脂肪細胞をオイル レッド オー（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）で染色したプレート写真（上パネル）及び２００倍に拡大した写真（下パネル）である。
【図３】ＮＡＤＰＨの用量に依存的に脂肪細胞で脂肪が蓄積されることを示した写真である。
【図４】形質転換動物製造に使用するために、ＩＤＰｃ ｃＤＮＡをラットから由来したＰＥＰＣＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）遺伝子プロモーターの下流に挿入した組換え発現ベクターを製造する過程を示した模式図である。
【図５】本発明の形質転換マウスから繁殖した第１代子孫（Ｆ１）の体の大きさ及びこれを解剖した時の腹部脂肪蓄積量を正常マウスと比較した写真である。
【図６】本発明の形質転換マウスの脂肪組織内肥満指標遺伝子の発現水準が、正常マウスと比べて増加したことを示した放射線写真である。
【図７】本発明の形質転換マウスＦ１の体重を正常マウスと比較したグラフである。
【図８】本発明の形質転換マウスＦ１の肝重量を正常マウスと比較したグラフである。
【図９】本発明の形質転換マウスＦ１のＩＤＰｃ 活性及び血中ＩＤＰｃ濃度を正常マウスと比較したグラフである。
【図１０】本発明の形質転換マウスＦ１の［ＮＡＤＰＨ］ ／ ［ＮＡＤＰＨ ＋ ＮＡＤＰ＋］の量を正常マウスと比較したグラフである。
【図１１】本発明の形質転換マウスＦ１の腹部脂肪重量を正常マウスと比較したグラフである。
【図１２】本発明の形質転換マウスＦ１の血中中性脂質及びコレステロールの量を正常マウスと比較したグラフである。
【図１３】本発明の形質転換マウスＦ１の肝の中性脂質及びコレステロールの量を正常マウスと比較したグラフである。
【図１４】本発明の形質転換マウスＦ１の血中レプチン濃度を正常マウスと比較したグラフである。
【図１５】本発明の形質転換マウスの脂肪肝が形成された肝組織を対照群と比較した写真である。
【図１６】本発明の形質転換マウスの脂肪細胞の大きさを対照群と比較した写真である。
【図１７】本発明のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤選別方法により選別された酵素活性阻害物質オキサロマレイン酸の酵素活性阻害度を示したグラフである。
【図１８】本発明のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤選別方法により選別された酵素活性阻害物質メチルイソクエン酸の酵素活性阻害度を示したグラフである。
【図１９】イソクエン酸デヒドロゲナーゼを処理していないＮＩＨ３Ｔ３ Ｆ４４２Ａ細胞（左）、オキサロマレイン酸を処理した細胞（中間）、メチルイソクエン酸を処理した細胞（右）から分化された脂肪細胞をオイル レッド オーで染色した後、１００倍（上）及び２００倍（下）に拡大した写真である。
【図２０】本発明のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を投与したラットと阻害剤を投与しないラットの肝の重さ及び腹部脂肪組織の重さを比較したグラフである。
【図２１】本発明のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を投与したラットと阻害剤を投与しないラットの血中の中性脂質及び総コレステロールの量を比較したグラフである。
【図２２】本発明のイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を投与したラットと阻害剤を投与しないラットの血中（ＨＤＬ）濃度を比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年5月7日(2002.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２】
削除
【請求項３】
削除
【請求項４】
サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、 ネオマイシン（ｍｅｏｍｙｃｉｎ）遺伝子、長い末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ） 及びマウス（ｍｏｕｓｅ）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコーディングする配列番号３で記載される遺伝子を含むレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）発現ベクター。
【請求項５】
削除
【請求項６】
請求項４の発現ベクターで形質転換された細胞株（寄託番号 ： ＫＣＴＣ ０８６１ＢＰ）。
【請求項７】
ラットサイトゾール　ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）のプロモーター、ネオマイシン遺伝子及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする配列番号３で記載される遺伝子を含み、前記配列番号３で記載される遺伝子が、ラットサイトゾール　ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ　プロモーターの下流に挿入された、融合遺伝子コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）。
【請求項８】
請求項７の融合遺伝子コンストラクトを含む受精卵（寄託番号 ： ＫＣＴＣ ０８７４ＢＰ）。
【請求項９】
請求項７の融合遺伝子コンストラクトをゲノム内に含む（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）形質転換動物。
【請求項１０】
動物が、マウスであることを特徴とする請求項９記載の形質転換動物。
【請求項１１】
配列番号４で記載されるイソクエン酸デヒドロゲナーゼまたはイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする配列番号３で記載される遺伝子を有効成分として含み、ＮＡＤＰＨの生合成を増加させる方法。
【請求項１２】
配列番号４で記載されるイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする配列番号３で記載される遺伝子またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼの産物であるＮＡＤＰを投与することによって、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ）（ＰＰＡＲγ）を活性化させる方法。
【請求項１３】
配列番号４で記載されるイソクエン酸デヒドロゲナーゼまたはイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする配列番号３で記載される遺伝子を投与することによって脂質、スクアレンまたはコレステロールの生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を増加させる方法。
【請求項１４】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする配列番号３で記載される遺伝子を投与することによって肥満、高脂血症または脂肪肝を予防及び治療する方法。
【請求項１５】
生体内の中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、コレステロール及びスクアレンの生合成増加剤としてのＮＡＤＰＨ。
【請求項１６】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼの反応生成物であるＮＡＤＰＨを生体内に添加することによって中性脂肪、コレステロール及びスクアレンの生合成を増加させる方法。
【請求項１７】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼを利用することによってイソクエン酸デヒドロゲナーゼと反応すると、前記酵素の活性を阻害し、窮極的にはＮＡＤＰＨの生成を減少させる、脂肪蓄積及び中性脂肪、コレステロール生成阻害物質を選別する方法。
【請求項１８】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子を利用することによって、イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子と反応すると、前記遺伝子の発現を阻害し、窮極的には細胞内のＮＡＤＰＨ生成を減少させる、脂肪蓄積及び中性脂肪、コレステロール生成阻害物質を選別する方法。
【請求項１９】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼとその基質のイソクエン酸及び助酵素であるＮＡＤＰ＋を含む反応液に未知の物質を添加する段階を含む、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性調節物質をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で選別する方法。
【請求項２０】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子で形質転換された動物細胞株を含んでいる培養液に未知の物質を添加する段階を含む、イソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性調節物質をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で選別する方法。
【請求項２１】
ゲノム内に（ｉｎ ｇｅｎｏｍｅ）イソクエン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を含む動物がＮＡＤＰＨを生成することを抑制するイソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性調節物質をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で選別する方法。
【請求項２２】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼと反応することによって前記酵素の活性を阻害するイソクエン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を投与して肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性疾患を治療する方法。
【請求項２３】
イソクエン酸デヒドロゲナーゼの発現を抑制するイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコーディングする遺伝子の阻害剤を投与して肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性疾患を治療する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
【配列表】
2004511256.tif 000133
2004511256.tif 000134
2004511256.tif 000135
2004511256.tif 000136
2004511256.tif 000137
2004511256.tif 000138
2004511256.tif 000139
2004511256.tif 000140
2004511256.tif 000141
2004511256.tif 000142
2004511256.tif 000143
【手続補正書】
【提出日】平成14年12月31日(2002.12.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
削除
【請求項２】
削除
【請求項３】
削除
【請求項４】
削除
【請求項５】
削除
【請求項６】
サイトメガロウイルスプロモーター、ネオマイシン遺伝子、長い末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ） 及びＩＤＰｃ（サイトゾールＮＡＤＰ＋−依存的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ）をコーディングする配列番号３で記載される遺伝子を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）発現ベクターで形質転換され脂質生合成能力が増加された細胞株（寄託番号 ： ＫＣＴＣ ０８６１ＢＰ）。
【請求項７】
削除
【請求項８】
ラットサイトゾール　ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｋｉｎａｓｅ）のプロモーター、ネオマイシン遺伝子及びＩＤＰｃをコーディングする配列番号３で記載される遺伝子を含む、融合遺伝子コンストラクトを含む受精卵（寄託番号 ： ＫＣＴＣ ０８７４ＢＰ）。
【請求項９】
ラットサイトゾール　ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼのプロモーター、ネオマイシン遺伝子及びＩＤＰｃをコーディングする配列番号３で記載される遺伝子を含む融合遺伝子コンストラクトをゲノム内に含み肥満、高脂血症または脂肪肝等の代謝性疾患が見られる形質転換動物。
【請求項１０】
削除
【請求項１１】
削除
【請求項１２】
ＩＤＰｃ遺伝子またはＩＤＰｃの酵素反応産物であるＮＡＤＰＨを投与することによって、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ）（ＰＰＡＲγ）を活性化させる方法。
【請求項１３】
ＩＤＰｃまたはＩＤＰｃ遺伝子を投与することによって中性脂肪、スクアレンまたはコレステロールの生合成（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を増加させる方法。
【請求項１４】
削除
【請求項１５】
削除
【請求項１６】
ＩＤＰｃの酵素反応生成物であるＮＡＤＰＨを生体内に添加することによって中性脂肪、コレステロールまたはスクアレンのような脂肪の生合成を増加させる方法。
【請求項１７】
ＩＤＰｃを利用することによってＩＤＰｃと反応すると、前記酵素の活性を阻害し、窮極的にはＩＤＰｃ酵素反応産物である細胞内ＮＡＤＰＨの生成を減少させる脂肪蓄積及び中性脂肪、コレステロール生成阻害物質を選別する方法。
【請求項１８】
ＩＤＰｃをコーディングする遺伝子を利用することによって、ＩＤＰｃをコーディングする遺伝子と反応すると、前記遺伝子の発現を阻害し、窮極的には細胞内のＮＡＤＰＨ生成を減少させる脂肪蓄積及び中性脂肪、コレステロール生成阻害物質を選別する方法。
【請求項１９】
削除
【請求項 ２０】ＩＤＰｃをコーディングする遺伝子で形質転換された請求項６の動物細胞株を含んでいる培養液に未知の物質を添加する段階を含む、ＩＤＰｃの活性を調節する物質をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で選別する方法。
【請求項２１】
削除
【請求項２２】
ＩＤＰｃと反応することによって前記酵素の活性を阻害するＩＤＰｃの阻害剤を投与して肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性疾患を治療する方法。
【請求項２３】
ＩＤＰｃの発現を抑制するＩＤＰｃ遺伝子の阻害剤を投与して肥満、高脂血症、脂肪肝等の代謝性疾患を治療する方法。
【国際調査報告】
2004511256.tif 000144
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