(57)【要約】本発明は、神経糸タンパク質および関連分子を用いて、良性および悪性腫瘍等の患者の有害または望ましくない細胞の除去または破壊を必要とする症状を治療する方法に関する。
2004529908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする哺乳動物に治療的に有効量の神経糸タンパク質(NTP)を投与することを含む、細胞の除去または破壊を必要とする個体における症状を治療する方法。
【請求項２】
前記NTPが、経口、皮下、皮内、静脈内、筋内、髄腔内、腹腔内、大脳内(実質内)、脳室内、眼内、動脈内、鼻腔内、腫瘍内、病変内、局所、および経皮からなる群より選択される方法により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療は、外科的切除、移植(transplantation)、移植片移植(grafting)、化学療法、免疫療法、ワクチン化、熱、マイクロ波または電気切除、寒冷療法、レーザ療法、光線療法、遺伝子療法、および放射能からなる治療群より選択された患者の治療の前、途中または後に、患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記症状が、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺(parathyroid)、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の良性または悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記症状が、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の過形成、肥大または過剰増殖からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記症状が、扁桃肥大である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記症状が、前立腺肥大である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記症状が、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の、ウイルスによる改変、細菌による改変または寄生生物による改変からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記症状が、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の奇形からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記症状が、組織に対する美容的改変である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織が、皮膚、眼、耳、鼻、喉、口、筋肉、結合組織、脂肪組織、毛および胸からなる群より選択される組織である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記症状が、血管疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記症状が、痔である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記症状が、拡張蛇行静脈である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記血管疾患が、アテローム硬化症または動脈硬化症である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記症状が、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、遺伝性/遺伝子疾患、外傷性疾患または身体的傷害、栄養欠乏疾患、感染性疾患、アミロイド疾患、線維症疾患、蓄積症、先天性奇形、酵素欠損疾患、被毒、中毒、環境性疾患、放射線疾患、内分泌性疾患、変性疾患および機械的疾患(mechanical disease)からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記NTPが、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様結合分子からなる群より選択される分子とコンジュゲート、連結または結合し、該分子は他の細胞への結合よりも、腫瘍または他の標的への結合について高い親和性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記NTPは、タンパク質または他の分子にコンジュゲート、連結または結合しており、該組成物は、腫瘍特異的もしくは部位特異的酵素もしくはプロテアーゼ、または腫瘍もしくは所望でない細胞を標的化する抗体コンジュゲートにより、腫瘍または他の所望でない細胞の部位またはその付近において切断されてNTPを放出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記NTPは、タンパク質または他の分子にコンジュゲート、連結または結合しており、該組成物は、前記処置する組織を、光(レーザ療法または他の光力的もしくは光活性化療法を含む)、電磁放射の他の形態(赤外線放射、紫外線放射、Ｘ線もしくはγ線放射、局所化熱、αもしくはβ放射、超音波放射を含む)、または他の局所化エネルギー源に曝露した際に、NTPを放出する、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記NTPが、治療される症状に適した、サイトカイン、増殖因子、抗生物質、アポトーシス誘発剤、抗炎症剤、および/または化学療法剤等の他の医薬組成物と共に組み合わせられて採用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記NTPが、デンドリマー、フラーレンおよび他の合成分子、高分子および巨大分子と組み合わせられて採用され、該NTPは、単独で、または他の細胞への結合よりも腫瘍もしくは他の標的への結合について親和性が高い分子と共に、該分子、高分子または巨大分子とコンジュゲート、付着またはそれらの中に閉じ込められる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記NTPは、NTPと、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様結合分子からなる群より選択される分子とから構成される単一の新規クローン化組換え分子の一部であり、該分子は他の細胞への結合よりも腫瘍または他の標的への結合についての親和性が高い、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記NTPは、AD7c-NTP(配列番号１)、配列番号２〜９により同定されるタンパク質、神経膵臓糸タンパク質、膵臓糸タンパク質、ならびにそれらの任意の断片、相同体、変異体、誘導体、ペプチド模倣体、逆転Dペプチドおよび鏡像異性体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記NTPは、経口、皮下、皮内、静脈内、筋内、髄腔内、腹腔内、大脳内(実質内)、脳室内、眼内、動脈内、鼻腔内、腫瘍内、病変内、局所、および経皮からなる群より選択される方法により投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療は、外科的切除、移植、移植片移植、化学療法、免疫療法、ワクチン化、熱または電気切除、寒冷療法、レーザ療法、光線療法、遺伝子療法、および放射能からなる治療群より選択された患者の治療の前、途中または後に、患者に投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記症状が、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の良性または悪性腫瘍からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記症状が、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の過形成、肥大または過剰増殖からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記症状が、扁桃肥大である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記症状が、前立腺肥大または痔である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記症状が、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の、ウイルスによる改変、細菌による改変または寄生生物による改変からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記症状が、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の奇形からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記症状が、組織に対する美容的改変である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記組織が、皮膚、眼、耳、鼻、喉、口、筋肉、結合組織、脂肪組織、毛および胸からなる群より選択される組織である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記症状が、血管疾患である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記症状が、痔である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記症状が、拡張蛇行静脈である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記血管疾患が、アテローム硬化症または動脈硬化症である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記症状が、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、遺伝性/遺伝子疾患、外傷性疾患または身体的傷害、栄養欠乏疾患、感染性疾患、アミロイド疾患、線維症疾患、蓄積症、先天性奇形、酵素欠損疾患、被毒、中毒、環境性疾患、放射線疾患、内分泌性疾患、変性疾患および機械的疾患からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記NTPが、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様結合分子からなる群より選択される分子とコンジュゲート、連結または結合し、該分子は他の細胞への結合よりも、腫瘍または他の標的への結合について高い親和性を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記NTPは、NTPと、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様結合分子からなる群より選択される分子とから構成される単一の新規クローン化組換え分子の一部であり、該分子は他の細胞への結合よりも、腫瘍または他の標的への結合についての親和性が高い、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記NTPは、タンパク質または他の分子にコンジュゲート、連結または結合しており、該組成物は、腫瘍特異的もしくは部位特異的酵素もしくはプロテアーゼ、または腫瘍もしくは所望でない細胞を標的化する抗体コンジュゲートにより、腫瘍または他の所望でない細胞の部位またはその付近において切断されてNTPを放出する、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
前記NTPは、タンパク質または他の分子にコンジュゲート、連結または結合しており、該組成物は、前記処置する組織が、光(レーザ療法または他の光力的もしくは光活性化療法を含む)、電磁放射の他の形態(赤外線放射、紫外線放射、Ｘ線もしくはγ線放射、局所化熱、αもしくはβ放射、超音波放射を含む)、または他の局所化エネルギー源に曝露した際に、NTPを放出する、請求項２３の方法。
【請求項４３】
前記NTPが、治療される症状に適した、サイトカイン、増殖因子、抗生物質、アポトーシス誘発剤、抗炎症剤、および/または化学療法剤等の他の医薬組成物と共に組み合わせられて採用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項４４】
前記NTPが、デンドリマー、フラーレンおよび他の合成分子、高分子および巨大分子と組み合わせられて採用され、該NTPは、単独で、または他の細胞への結合よりも腫瘍もしくは他の標的への結合についての親和性が高い分子と共に、該分子、高分子または巨大分子とコンジュゲート、付着またはそれらの中に閉じ込められる、請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
前記NTPは、NTPと、抗体、抗体フラグメントおよび抗体様結合分子からなる群より選択される分子とから構成される単一の新規クローン化組換え分子の一部であり、該分子は他の細胞への結合よりも腫瘍または他の標的への結合についての親和性が高い、請求項２３に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍または他の標的細胞に、治療的有効量のNTP遺伝子を投与し、該NTP遺伝子の発現を誘導して、NTPタンパク質の発現を生じさせることを含む、細胞の除去または破壊を必要とする個体における症状を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、神経糸タンパク質(NTP)および関連分子を使用する、細胞エレメント(ヒトにおける良性または悪性腫瘍等)の除去または破壊を必要とする症状の治療方法に関する。本方法としては、化合物を単独でまたはキャリアとコンジュゲートさせて、筋内、経口、静脈内、髄腔内、腫瘍内、鼻腔内、局所、経皮等に投与することが挙げられるがこれらに限定されない。
【発明の背景】
【０００２】
多くの医療的治療および処置の本質は、有害または望ましくない組織の除去または破壊に関わる。このような重要な治療の例としては、手術による癌性増殖の除去、化学療法による転移性腫瘍の破壊、および腺(例えば、前立腺)肥大の低減が挙げられる。他の例としては、所望でない顔の毛、いぼの除去、および所望でない脂肪組織の除去が挙げられる。
【０００３】
有害または所望でない細胞および組織を破壊し、それによって除去するかまたはそれ以上の増殖を阻害し易くするが、主に局所的な影響を有し、全身的毒性が最小限であるか、または皆無である有効な薬剤が明らかに必要とされている。
【０００４】
神経糸タンパク質およびそれらの関連分子はこのような薬剤である。
【０００５】
癌および良性過剰増殖
癌は、細胞の内部調節メカニズムにおける異常であり、細胞の非制御な増殖および再生を生じる。正常細胞は、組織を構成し、これらの細胞が特定および制御された、協調的な単位として振舞う能力を失った場合(脱分化)、この不具合は細胞集合における無秩序状態を生じる。これが生じると腫瘍が形成される。
【０００６】
組織の良性過剰増殖は、生物から細胞を除去することが望ましい異常である。良性腫瘍は、身体に転移しないが、疾患症状は生じる細胞増殖である。このような腫瘍は、脳等の手をつけることのできない器官領域に位置する場合には致命的となりうる。良性腫瘍の器官としては、肺、脳、皮膚、下垂体、甲状腺、副腎皮質および髄質、卵巣、子宮、精巣、結合組織、筋肉、腸、耳、鼻、喉、扁桃、口、肝臓、胆嚢、膵臓、前立腺、心臓、および他の器官が挙げられる。
【０００７】
癌治療
手術は、癌治療の最初の段階である場合が多い。手術の目的は様々である。明らかな腫瘍を可能な限り除去するか、少なくとも「減量」する(腫瘍の大部分を除去して、他の手段により治療する必要を少なくする)ために、採用される場合がある。癌の種類および位置によっては、手術はまた、患者に対していくらかの症状的な緩和を与え得る。例えば、外科医が、拡大する脳腫瘍の大部分を除去できれば、頭蓋内の圧力は低下し、患者の症状が改善される。
【０００８】
全ての腫瘍が手術を施すことが可能ではない。場合によっては完全に除去するのが不可能な身体の部分に位置しているかもしれない。これらの例としては、脳幹(呼吸を制御する脳部分)中の腫瘍または主要な血管中またはその周囲で増殖した腫瘍が挙げられる。これらの場合、腫瘍除去に伴う高い危険性のために、手術の役割は限定される。
【０００９】
場合によっては、腫瘍を減量する際に手術が採用されない。なぜなら、単にその必要が無いからである。例えば、化学療法および放射能療法の組合わせに非常によく反応するリンパ節の癌であるホジキンリンパ腫が挙げられる。ホジキンリンパ腫では、手術は、治癒のために必要なことは稀であるが、診断を確立するためにはほぼ常に採用される。
【００１０】
化学療法は、別のよくある癌治療の形態である。これは、本質的に、身体中の(腫瘍において見られるような)高速分裂細胞を特異的に攻撃する投薬の使用(通常、口または注射により与える)を伴う。このため、化学療法は、既に転移した癌、ならびに血液およびリンパ系を介して広がっている可能性が高いが原発性腫瘍以外は明らかではない腫瘍を治療するために有用である。化学療法はまた、手術および放射能療法に対する局所的腫瘍の応答を向上させるためにも使用され得る。これは、例えば、頭部および頸部(head and neck)の一部の癌の場合を指す。
【００１１】
残念ながら、同じく通常高速分裂するヒトの身体中の他の細胞(例えば、胃の管壁(lining)および毛髪等)も化学療法により影響を受ける。このために、一部(全てではない)化学療法薬剤は、吐気または脱毛を誘発する。これらの副作用は一時的であり、医師は、多くのこれらの副作用を緩和するのを助けることができる薬剤を知っている。従って、一般的に、化学療法治療は、患者により良く寛容されている。我々の知識が深まるにつれて、研究者らは、癌細胞をより上手く殺すだけではなく、患者に対する副作用も少ない、より新しい化学療法剤を考案してきた。
【００１２】
化学療法は、様々な方法により患者に投与される。一部は毎日または週に一回またはその他のスケジュールで飲む丸剤、そして一部は静脈内注射により投与される。注射可能な化学療法については、患者は、医院または病院に通い治療を受ける。他の化学治療剤は、血流への連続的な輸液を一日24時間必要とする。このような種の化学療法のためには、小規模な手術的処置を行い、患者が装着する小さいポンプを移植する。このポンプは薬剤をゆっくりと投与する。多くの場合、繰返し針を刺す必要性を無くすために、常備着用型の引き込み口を患者の静脈に配置する。
【００１３】
放射能療法は、癌と闘うためによく使われる別の対抗手段である。放射能は、腫瘍細胞中のDNAを破損することで癌を殺す。放射能は２つの可能な手段により「適用」される。第１、そして最も一般的なものは、放射能のビームを精度高い方法で腫瘍を焦点に、患者に当てるものである。これを行うためには、患者は台の上に横たわり、ビームが患者の周りを移動する。これは数分しかかからないが、(腫瘍の種類によって)３〜６週間かけて、週に５日間行い、特定の処方した合計「線量」を得る。
【００１４】
近接照射療法と呼ばれる時々採用される別の放射能法は、放射性ペレット(「シード(seed)」)またはワイヤーを用いて、身体の腫瘍領域にそれらを移植することを伴う。インプラントは、一時的でも永久的でもよい。永久的インプラントの場合、シード中の放射能は、数日または数週間の期間をかけて「減衰」するかまたは次第に無くなり、患者を放射性にしないようにする。一時的インプラントの場合、放射能の全線量が、通常約２日間で送達され、その間、患者は入院していなければならない。両方のタイプの近接照射療法とも、放射能は、一般的に、(化学療法が全身治療するのに対して)まさに標的とする領域に送達され、癌についての局所制御を得る。
【００１５】
一部の高度に選択された患者は、骨髄移植に委ねられ得る。この処置は、通常、患者が特に急速に進行する癌を患っているか、または従来の治療法で治療後再発した癌を患っているかのいずれかのために行われる。骨髄移植は複雑な処置である。多くの種類があり、副作用および治癒を生じる可能性も異なる。ほとんどの移植は、特別なセンターで行われ、多くの場合、それらの採用は試験的なものであると考えられる。
【００１６】
その他の治療も多数あるが、それらのほとんどはいまだに臨床治験において調査されており、標準的な医療とはなっていない。例としては、免疫療法、モノクローナル抗体、抗血管新生因子、および遺伝子療法の使用が挙げられる。
【００１７】
免疫療法：放射能または化学療法とは完全に異なり、患者自身の免疫系が癌と闘うのを助けるように設計された技術が様々ある。目的を果たすために、研究者は患者に特異的に誘導したワクチンを注射することがよくある。この領域のほとんどの研究は、黒色腫に対して行われてきたが、現在は他の癌も標的としている。
【００１８】
モノクローナル抗体：これらは、細胞膜における癌性および非癌性細胞の違いを利用して、癌性細胞に付着する(正常細胞には付着しない)ように特別に設計された小さいタンパク質である。抗体を患者に投与する前に、様々な細胞傷害性化合物を「タグ付け」(付着)するか、放射性にすることが多く、このようにして、抗体が癌細胞を優先的に標的とし、毒剤を所望の細胞に送達させる。
【００１９】
抗血管新生因子：癌細胞が高速分裂し、腫瘍が増殖するにつれて、しばらくすると血液供給が足りなくなり得る。これを補うために一部の腫瘍は、付近の血管成長を誘導するのを助けることが示された化合物を分泌し、癌細胞に対する持続的な栄養供給を確実にする。最近、研究者らは、このプロセスを打ち切る(血管成長を止める)手段を研究している。
【００２０】
遺伝子療法：癌は、一連の突然変異の生産物であり、最終的には癌細胞の産生およびその過剰な増殖を生じる。癌の増殖を抑制もしくは停止させるか、細胞のプログラム化された細胞メカニズムを作動させて細胞を破壊するか、細胞の免疫認識を増強するか、または腫瘍増殖を阻害する毒性代謝産物もしくはサイトカインに変換するプロドラッグを発現させる遺伝子を、癌細胞に導入することにより癌を治療できる。
【００２１】
良性腫瘍および奇形の治療
良性腫瘍および奇形も、手術、放射線療法、薬剤療法、熱または電気切除、寒冷療法およびその他の様々な方法により治療できる。良性腫瘍は転移しないが、大きく増殖し、再発し得る。良性腫瘍の手術摘出は、一般的な手術の全ての困難性および副作用を有し、下垂体腺腫、脳の髄膜腫、前立腺肥大およびその他の一部の良性腫瘍については繰返し行われなければならないことがよくある。
【００２２】
選択的な細胞除去が望ましい、所望でない細胞エレメントが関与する他の症状はまだある。例えば、心臓疾患および発作は、アテローム硬化症により生じることが多い。これは、血管壁を変形させ、管腔を狭め、血流を収縮し、限局性血餅を生じ易くし、最終的に閉塞および梗塞形成を生じる、繊維脂肪の増殖性病巣および変化した平滑筋エレメントである。アテローム硬化症のためには、バイパス移植；人工移植；再疎通、掻爬、放射線、レーザもしくは他の除去による血管形成；薬物療法による脂質減量を介したアテローム硬化症の阻害；抗凝固療法；ならびに食事、運動およびライフスタイルの一般的な対策等の様々な治療がある。手術的処置の危険性および副作用の無い、アテローム硬化症病巣を除去するための方法が必要である。
【００２３】
選択的な細胞除去が望ましい所望でない細胞エレメントのその他の例としては、いぼ等のウイルス誘導型増殖が挙げられる。別の例は、炎症性症状において見とめられる肥大性炎症性塊、および肥大性瘢痕またはケロイドである。さらに別の例は、所望でない毛(例えば、顔の毛)の除去等の美容目的、または美容目的のための所望でない組織領域の収縮(例えば、顔面皮膚および結合組織、または四肢の皮膚および結合組織)において見とめられる。
【００２４】
さらに他の例は、当業者に明らかであろう。これらの全てまたは殆どの例において、従来の療法の危険性および副作用が無く所望でない細胞エレメントを除去または破壊できる治療、または所望でない細胞エレメントをより精度高く除去できる療法が必要とされている。
【００２５】
神経糸タンパク質
神経糸タンパク質(NTP)は、最近特徴決定された脳タンパク質の新しいファミリーである。このファミリーのメンバーの１つであるAD7C-NTPは、神経炎萌芽(neuritic sprouting)および細胞死に関連した機能を有する約41 kDの膜結合リン酸化タンパク質である(de la Monteら, J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)；de la Monteら, Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)；de la Monte SMおよびWands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353 (2001))。AD7C-NTPの遺伝子および予測タンパク質配列は同定および記載されている(de la Monteら, J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997))。約41 kDの分子種に加えて、他の種の神経糸タンパク質(約26 kD、約21 kD、約17 kD、および約15 kD)が同定され、神経外胚葉腫瘍、星状細胞腫、および神経膠芽細胞種、ならびに低酸素、スキーマ(schema)または大脳梗塞形成による傷害と関連付けられている(Xuら, Cancer Research, 53:3823-2829；de la Monteら, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996)、de la Monteら, J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35(1996)；de la Monteら, J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996)；de la Monteら, J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)；およびde la Monteら, Alz., Rep., 2:327-332 (1999))。
【００２６】
神経糸タンパク質は、米国特許第5,948,634号；同第5,948,888号；同第5,830,670号(全て"Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease")、ならびに米国特許第6,071,705号("Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction")に記載および請求されている。これらの特許の方法および明細書は、参照により本明細書に特に援用する。
【００２７】
AD7C-NTPをアルツハイマー病(AD)と関連付ける説得力のある証拠がある。AD7C-NTP mRNAは、対照と比べてAD脳において上向き調節される；脳およびCSFにおけるAD7C-NTPタンパク質レベルは、対照よりもADにおいて高い；そして、AD7C-NTP免疫反応性は、ADおよびダウン症候群脳における老人斑、神経原線維変化(NFT)、変性ニューロン、神経網糸、およびジストロフィー神経性萌芽(neurotic sprouts)において見られる(Ozturkら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:419-423 (1989)；de la Monteら, J. Clin. Invest., 86(3):1004-13(1990)；de la Monteら, J. Neurol. Sci., 113(2): 152-64 (1992)；de la Monteら, Ann. Neurol., 32(6):733-42(1992)；de la Monteら, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996)、de la Monteら, J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996)；de la Monteら, J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996)；de la Monteら, J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)；およびde la Monteら, Alz.. Rep., 2:327-332 (1999))。AD7C-NTPは、ダウン症候群脳組織においても同定されている(Wandsら, 国際特許公報第WO 90/06993号；de la Monteら, Alz.. Rep., 2:327-332 (1999))。AD7C-NTPは、アルツハイマー病における細胞死のプロセスにも関連付けられている(de la MonteおよびWands, J. Neuropatho. and Exp. Neuro., 60:195-207 (2001))。
【００２８】
新しい、所望でない細胞エレメントを治療するための、毒性の低い治療が、当該分野において依然として必要とされている。本発明は、これらの要望を満たす。
【発明の要旨】
【００２９】
本発明は、良性および悪性腫瘍、腺(例えば、前立腺)肥大、所望でない顔の毛、いぼ、および所望でない脂肪組織等、所望でない細胞増殖を治療する新規方法に関する。このような方法は、必要とする哺乳動物に、有効量の神経糸タンパク質(NTP)を投与することを含む。
【００３０】
NTPは、単独で、またはキャリアもしくは抗体とコンジュゲートされて投与され得る。さらに、NTPは、良性および悪性腫瘍ならびに他の所望でないまたは有害な細胞増殖を治療するための他の療法と共に使用され得る。
【００３１】
前記全般的な記載および以下の詳細な説明は両方とも例示および説明であり、請求する本発明のさらなる説明を提供することを意図するものである。他の目的、利点および新規特徴は、以下の本発明の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【００３２】
好適な実施形態の詳細な説明
定義
本明細書で使用する用語および言いまわしは、特に明記しない限り以下に定義される通りである。
【００３３】
「AD7c-NTP」という用語は、de la Monteら, J. Clin. Invest., 100:3093-104 (1997)、米国特許第5,948,634号、同第5,948,888号、および同第5,830,670号の配列120および121、ならびにGenBank#AF010144に記載の約41 kDタンパク質、ならびにそれをコードする遺伝子および核酸配列を指す。この核酸およびアミノ酸配列は図１に示している。「AD7c-NTP」という用語はまた、AD7c-NTPの生物学的に活性な断片、変異体および誘導体、相同体、ペプチド模倣体、逆転(reverse)Dペプチド、ならびに鏡像異性体も含む。
【００３４】
「NTP」または「神経糸タンパク質」という用語は、神経糸タンパク質および関連タンパク質(膵臓糸タンパク質を含む)、ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸配列を指し、以下のタンパク質およびこれらのタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸が含まれる(ただしこれらに限定されない)：
(a)AD7c-NTP；
(b) 米国特許第5,948,634号、同第5,948,888号、同第5,830,670号および同第6,071,705号、ならびにde la Monteら, J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50(1996)、de la Monteら, J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996)；de la Monteら, J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996)、de la Monteら, J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)およびde la Monteら, Alz.. Rep., 2:327-332 (1999)に記載されている約42、約26、約21、約17、約14および約8 kD種の神経糸タンパク質；
(c)American Type Culture Collection, Manassas, Va.に受託番号HB-12546として寄託されたモノクローナル抗体#2、またはAmerican Type Culture Collection, Manassas, Va.に受託番号HB-12545として寄託されたモノクローナル抗体#5により特異的に認識されるタンパク質；
(d)AD7c-NTP遺伝子によりコードされるタンパク質；
(e)米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列40に記載され、NCBI Entrez-Protein受託番号AAE25447, PID g10048540に記載されている122アミノ酸神経糸タンパク質(このアミノ酸配列は図２に示す)；
(f)NCBI Entrez-Protein受託番号XP_032307、PID g14725132に記載されている122アミノ酸神経糸タンパク質(このアミノ酸配列は図３に示す)；
(g)NCBI Entrez-Protein受託番号AAH14951 PID g15928971に記載されている106アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質(このアミノ酸配列は図４に示す)；
(h)NCBI Entrez-Protein受託番号XP_039102、PID g18599339に記載されている106アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質(このアミノ酸配列は図５に示す)；
(i)米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列30に記載され、NCBI Entrez-Protein受託番号AAE25445、PID g10048538に記載されている98アミノ酸神経糸タンパク質(このアミノ酸配列は図６に示す)；
(j)米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列48に記載され、NCBI Entrez-Protein受託番号AAE25448、PID g10048541に記載されている75アミノ酸神経糸タンパク質(このアミノ酸配列は図７に示す)；
(k)米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列36に記載され、NCBI Entrez-Protein受託番号AAE25446、PID g10048539に記載されている68アミノ酸神経糸タンパク質(このアミノ酸配列は図８に示す)；
(l)NCBI Entrez-Protein受託番号AAH02534、PID g12803421に記載されている61アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質(このアミノ酸配列は図９に示す)；
(m)膵臓糸タンパク質；
(n)米国特許第6,071,705号に記載の神経膵臓糸タンパク質(nPTP)；ならびに
(o)American Type Culture Collectionに寄託されたHB 9934、HB 9935およびHB 9936からなる群のうちのいずれかのハイブリドーマにより産生される抗体により特異的に認識されるタンパク質。
【００３５】
「NTP」という用語は、NTPの生物学的に活性な断片、変異体および誘導体、相同体、ペプチド模倣体、逆転Dペプチド、ならびに鏡像異性体も含む。
【００３６】
「生物学的に活性」という用語は、有害または所望でない細胞および組織を破壊し、したがって、それらを除去するかそれ以上増殖するのを阻害し易くするが、主に局所的な影響を有し、全身的な毒性は最小限であるかまたは無いという能力を有し、かつ本明細書の実施例１の細胞培養物細胞傷害性アッセイにおいて細胞を殺すか生存を低下させる能力、本明細書の実施例２のin vivo組織アッセイにおいて細胞損失および/もしくは組織壊死を生じさせる能力、または本明細書の実施例３の腫瘍アッセイにおいて細胞損失、組織壊死もしくは腫瘍収縮を生じる能力を有する(ただしこれらに限定されない)、タンパク質、ポリペプチド断片、変異体、誘導体、相同体、逆転Dペプチド、ペプチド模倣体、または鏡像異性体を指す。
【００３７】
「断片」という用語は、NTPタンパク質またはその変異体、誘導体、相同体、逆転Dペプチドもしくは鏡像異性体のアミノ酸配列の連続的なサブ配列からなる生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドを指し、天然型in vivoプロテアーゼ活性から生じるスプライス変異体および断片等の天然型断片を含む。このような断片は、アミノ末端、カルボキシ末端、および/または(天然型スプライシング等により)内部において平滑末端化され、NTPタンパク質の変異体または誘導体であり得る。このような断片は、アミノ末端メチオニンがあっても無くても調製され得る。「断片」という用語は、同一であっても異なっても、同じNTPタンパク質に由来するか、または共通するかしない連続的なアミノ酸配列が直接的またはリンカーを介して連結された断片を含む。
【００３８】
「変異体」という用語は、NTPタンパク質のアミノ酸配列と比べた場合に、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入が存在し、NTPタンパク質の天然型対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体を含む、生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドを指す。「変異体」という用語は、ペプチド配列における１つ以上のアミノ酸と、類似するかまたは相同なアミノ酸または異なるアミノ酸との置換を含む。アミノ酸が類似するかまたは相同であることをランク付けする尺度は多数ある。(Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p. 123-39 (Academic Press, New York, NY 1987))。好ましい変異体は、１つ以上のアミノ酸位置においてアラニン置換を含む。他の好適な置換としては、タンパク質の全体的な正味電荷、極性または疎水性にほとんどまたは全く影響のない保存的置換が含まれる。保存的置換は以下の表Ｉに示す。
【表１】
2004529908.tif 000003
表IIは別のスキームのアミノ酸置換を示す。
【表２】
2004529908.tif 000004
その他の変異体は、(a)置換領域におけるポリペプチド骨格の構造(例えば、シート状またはらせん状コンホメーション)、(b)標的部位における分子の電荷または疎水性、または(c)側鎖のかさばり(bulk)、を維持する効果がより有意に異なる残基を選択する等、より保存的でないアミノ酸置換から構成され得る。一般的に機能に対してより有意な影響を有することが予想される置換は、(a)グリシンおよび/もしくはプロリンが別のアミノ酸と置換されるか、または欠失もしくは挿入される；(b)親水性残基(例えば、セリンもしくはトレオニンが、疎水性残基(例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニン)と置き換わる(もしくはそれにより置き換えられる)；(c)システイン残基が、任意の他の残基と置き換わる(もしくはそれにより置き換えられる)；(d)プラスに荷電した側鎖を有する残基(例えば、リシン、アルギニンもしくはヒスチジン)が、マイナスに荷電した残基(例えば、グルタミンもしくはアスパラギン)と置き換わる(もしくはそれにより置き換えられる)；または(e)かさばる側鎖を有する残基(例えば、フェニルアラニン)が、このような側鎖を持たない残基(例えばグリシン)と置き換わる(もしくはそれにより置き換えられる)、ような置換である。その他の変異体は、新規グリコシル化および/もしくはリン酸化部位のいずれかを生成するように設計されたもの、または既存するグリコシル化および/もしくはリン酸化部位を欠失するように設計されたものを含む。変異体は、グリコシル化部位、タンパク質分解部位および/またはシステイン残基において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。変異体は、リンカーペプチド上に追加のアミノ酸残基をNTPアミノ酸配列の前後に有する、NTPタンパク質、断片、誘導体、相同体、逆転Dペプチドおよび相称部分(antimer)も含む。例えば、NTP断片のアミノおよびカルボキシ末端の両方にシステイン残基が付加されて、ジスルフィド結合の形成によりNTP断片の環化を可能にし得る。「変異体」という用語は、NTPまたはAD7c-NTPの断片、誘導体、相同体、逆転Dペプチドおよび鏡像異性体の変異体も含む。
【００３９】
「誘導体」という用語は、天然型プロセス(プロセシングおよび他の翻訳後修飾等)もしくは化学修飾技術(例えば、１つ以上のポリエチレングリコール分子、糖、リン酸塩および/もしくは他のそのような分子の付加によるもの(ここで、１つ以上の分子は野生型NTPタンパク質に自然に付着しない))のいずれかにより化学的に修飾された、生物学的に活性な化学的修飾型タンパク質、またはポリペプチドを指す。誘導体は、塩を含む。このような化学的修飾は、基本的なテキストおよびより詳細な研究論文によく記載されており、さらに豊富な調査文献に記載されており、これらは当業者に周知である。所与のタンパク質またはポリペプチドにおけるいくつかの部位において同じまたは異なる程度に同じ種類の修飾が存在し得ることが理解されよう。また、所与のタンパク質またはポリペプチドは、多くの種類の修飾を含み得る。修飾は、タンパク質またはポリペプチドのどこにおいても生じ得る(ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端が挙げられる)。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的付着、ヘム部分の共有結合的付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的付着、脂質または脂質誘導体の共有結合的付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合的付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル反応、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化反応、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、水酸化およびADP-リボシル化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、アミノ酸のタンパク質への転移RNA仲介型付加(アルギニル化(arginylation)等)、ならびにユビキチン化が挙げられる。例えば、Proteins-Structure And Molecular Properties, 第２版, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993)、およびPosttranslational Covalent Modification Of Proteins, B.C. Johnson編, Academic Press, New York (1983)に掲載のWold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects," 1-12頁；Seifterら, Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990)、ならびにRattanら, "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging," Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62(1992)を参照のこと。「誘導体」という用語は、分枝の有無に関わらずタンパク質またはポリペプチドを分枝状または環状にする化学的修飾を含む。環状、分枝および分枝環状タンパク質またはポリペプチドは、翻訳後の自然なプロセスにより生じ得るし、また完全に合成的な方法によっても作られ得る。「誘導体」という用語はまた、断片、変異体、相同体、逆転Dペプチド、ペプチド模倣体および鏡像異性体の誘導体も含む。
【００４０】
「相同体」という用語は、場合次第で、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するのによく使用される標準的方法により判断された際に、NTPタンパク質またはAD7c-NTPとアミノ酸配列が少なくとも75％同一の生物学的に活性なタンパク質を指す。２つのタンパク質の類似性または同一性の程度は、公知の方法により簡単に計算でき、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.,編, Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.,およびGriffin, H.G.,編, Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.およびDevereux, J.,編, M Stockton Press, New York, 1991；ならびにCarillo H.およびLipman, D., SIAM, J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されるものが挙げられるがこれらに限定されない。同一性を判断するのに好適な方法は、テストする配列間の最大限の一致を得るように設計される。同一性および類似性を判断する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムで体系化されている。２つの配列の同一性および類似性を判断するのに好ましいコンピュータプログラム法としては、GCGプログラムパッケージ(Devereux, J.,ら, Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984))、BLASTP、BLASTNおよびFASTA、Atschul, S.F.ら, J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)が挙げられるがこれに限定されない。BLAST Xプログラムは、NCBIおよび他のソース(BLAST Manual, Altschul, S.,ら, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894；Altschul, S,ら, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))から公的に利用可能である。例として、GAP(Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)等のコンピュータアルゴリズムを使用する場合、配列同一性％を判断する２つのタンパク質またはポリペプチドを、それぞれのアミノ酸が最適に合致するように並列させる(アルゴリズムにより決定される「合致スパン」)。ギャップオープニングペナルティー(gap opening penalty)(これは平均対角線(diagonal)の３倍として計算される；「平均対角線」は使用する比較マトリックスの対角線の平均である；「対角線」は特定の比較マトリックスにより各完全アミノ酸に割り当てられるスコアまたは数字である)、およびギャップ伸長ペナルティー(gap extension penalty)(これは通常ギャップオープンペナルティーの1/10である)、ならびにPAM 250またはBLOSUM 62等の比較マトリックスをアルゴリズムと共に使用する。標準的比較マトリックス(PAM250比較マトリックスについては、Atlas of Protein Sequnece and Structure, vol. 5, supp.3[1978]に掲載のDayhoffらを参照；BLOSUM 62比較マトリックスについてはHenikoffら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919[1992]を参照)も、アルゴリズムにより採用される。その後、同一性％をアルゴリズムにより計算する。相同体は、典型的に、NTPまたはAD7c-NTPと比べて、１つ以上のアミノ酸置換、欠失および/または挿入を有する。
【００４１】
「ペプチド模倣体」という用語は、ペプチドまたはタンパク質の生物活性を模倣するが、化学的性質はペプチド性ではない、つまりペプチド結合(すなわち、アミノ酸間のアミド結合)を全く含まない、生物学的に活性な化合物を指す。ここでは、ペプチド模倣体という用語は、性質が完全にはペプチド性ではない分子(擬似ペプチド、セミペプチドおよびペプトイド等)を含む広い意味で使用する。このような(ペプチドの一部分がペプチド結合を欠く構造に置き換えられている)広い意味でのペプチド模倣体の例は、以下に記載している。非ペプチドが完全であっても部分的であっても、本発明のペプチド模倣体は、ペプチド模倣体が基づくNTPタンパク質における活性グループの三次元配置に酷似している反応性化学部分の空間的配置を提供する。この類似する活性部位幾何学の結果、ペプチド模倣体は、ペプチドの生物学的活性に類似する生物学的系に対する影響を有する。本発明のペプチド模倣体は、三次元形状および生物学的活性の両方において上記NTPペプチドに実質的に類似することが好ましい。当該分野で公知のペプチドを構造的に改変して、ペプチド模倣体を作製する方法の例としては、骨格キラル中心の反転により、特にＮ末端において、活性に有害な影響を与えることなくタンパク質分解に対して増強された安定性をもたらすかもしれないＤアミノ酸残基構造を生じることが挙げられる。一例が、"Tritriated D-ala.sup.1-Peptide T Binding", Smith C.S.ら, Drug Development Res., 15, pp. 371-379 (1988)という論文に記載されている。第２の方法は、例えば、ＮからＣ鎖内(interchain)イミドおよびラクタムへ等、安定性のために環状構造を変えることである(SmithおよびRivier(編)"Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp. 268-270に掲載のEdeら)。この例としては、米国特許第4,457,489号(1985)、Goldstein, Gら(この開示は参照により、本明細書に全体的に援用する)に開示されるもの等、コンホメーション的に制限されたチモペンチン(thymopentin)様化合物がある。第３の方法は、
NTPペプチド中のペプチド結合を、タンパク質分解に対する耐性を付与する擬似ペプチド結合と置換することである。多数の擬似ペプチド結合が、一般的にペプチド構造および生物学的活性に影響を与えないことが記載されている。このアプローチの一例は、反転(retro-inverso)擬似ペプチド結合を置換することである(Rivier, J. E.およびMarshall, G.R.(編)"Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp. 722-773に掲載の"Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto Aら、およびDalpozzoら(1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566(参照により本明細書に援用する))。この改変によれば、１つ以上のペプチド結合が反転擬似ペプチド結合により置換されること以外は、ペプチドのアミノ酸配列は上記NTPペプチドの配列と同一であり得る。最もＮ末端のペプチド結合が置換されることが好ましい。なぜなら、このような置換は、Ｎ末端に作用するエクソペプチダーゼによりタンパク質分解に対する耐性を付与するからである。アミノ酸の化学基を似た構造の他の化学基と置換することにより、さらなる改変も行える。生物学的活性を全くまたはほとんど失うことなく、酵素切断に対して安定性を向上させることが知られている別の適切な擬似ペプチド結合は、還元イソステア(reduced isostere)擬似ペプチド結合である(Couderら(1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184、参照により本明細書に全体的に援用する)。従って、１つ以上のペプチド結合がイソステア擬似ペプチド結合と置き換えられたこと以外は、これらのペプチドのアミノ酸配列は、NTPタンパク質の配列と同一であり得る。最もＮ末端のペプチド結合が置換されることが好ましい。なぜなら、このような置換は、Ｎ末端に作用するエクソペプチダーゼによりタンパク質分解に対する耐性を付与するからである。１つ以上の還元イソステア擬似ペプチド結合を有するペプチドの合成は当該分野で公知である(Couderら (1993), 上記引用)。他の例としては、ケトメチレンまたは硫化メチル結合を導入して、ペプチド結合を置き換えることが挙げられる。
【００４２】
NTPペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性のための重要な構造決定基を保持するが、ペプチド結合を失い、タンパク質分解に対する耐性を付与された、ペプチド模倣体の別のクラスを代表する(Simonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371、参照により本明細書に全体的に援用する)。ペプトイドは、Ｎ置換型グリシンのオリゴマーである。多数のＮ-アルキル基が記載されており、それぞれが天然型アミノ酸の側鎖に対応している(Simonら (1992)、上記引用、参照により本明細書に全体的に援用する)。NTPの一部または全てのアミノ酸は、置換されるアミノ酸に対応するＮ置換型グリシンで置き換えられる。
【００４３】
「逆転Dペプチド」という用語は、NTPタンパク質、断片、変異体または相同体のLアミノ酸配列と比べて逆順に配置されたDアミノ酸からなる生物学的に活性なタンパク質またはペプチドを指す。従って、L-アミノ酸NTPタンパク質、断片、変異体または相同体のカルボキシ末端残基は、Dアミノ酸ペプチドのアミノ酸末端になり、以下同様となる。例えば、AD7c-NTP断片、HVGQAG、は、GdAdQdGdVdHdとなり、Ad、Gd、Hd、QdおよびVdは、Lアミノ酸であるA、G、H、QおよびVにそれぞれ対応するDアミノ酸である。
【００４４】
「鏡像異性体」という用語は、NTPタンパク質、断片、変異体または相同体のアミノ酸配列中の１つ以上のLアミノ酸残基が、対応するDアミノ酸残基と置換されている、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドを指す。
【００４５】
本明細書に記載するアミノ酸およびアミノ酸残基は、以下の表に示す一般に認められた１文字または３文字の符号で言及し得る。特に明記しない限り、これらのアミノ酸または残基は、天然型L立体異性体形態のものである。
【表３】
2004529908.tif 000005
NTPタンパク質および断片の調製
本発明の包含するNTPタンパク質(AD7c-NTP、断片、変異体、誘導体、および相同体を含む)は、組換えDNA技術、タンパク質合成、ならびに天然型NTPおよびAD7c-NTP、それらの断片および変異体の単離等の当業者に公知の方法を用いて調製できる。
【００４６】
NTPタンパク質は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.[1989])および/またはAusubelら編, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc.and Wiley and Sons, N.Y.[1994]に記載される方法等の周知の組換えDNA技術法を使用して調製できる。
【００４７】
NTPタンパク質をコードする遺伝子またはcDNAは、例えば、ゲノムもしくはcDNAライブラリーをスクリーニングすること、またはPCR増幅により得ることができる。ライブラリーをスクリーニングするために有用なプローブまたはプライマーは、同じまたは関連する遺伝子ファミリーに由来する他の公知の遺伝子または遺伝子断片についての配列情報に基づき生成できる(例えば、他のNTPタンパク質において見とめられる保存的モチーフ等)。さらに、NTPタンパク質をコードする遺伝子が１種から同定された場合、該遺伝子の全体または一部をプローブとして使用して、他の種由来の相同遺伝子を同定してもよい。プローブまたはプライマーを使用して、cDNAライブラリーを、NTP遺伝子を発現すると思われる様々な組織由来源からスクリーニングしてもよい。典型的には、高いストリンジェンシー条件を採用して、スクリーニングにより得られる偽陽性の数を最小限にする。
【００４８】
NTPタンパク質をコードする遺伝子を調製するための別の手段は、Engelsら(Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734[1989])等に記載されているような当業者に周知の方法を用いる化学合成である。これらの方法は、特に、核酸合成のための、リン酸トリエステル、ホスホルアミダイト、およびH-ホスホン酸塩法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を用いた高分子支持型合成である。典型的に、NTPタンパク質をコードするDNAは、数百ヌクレオチドの長さである。約100ヌクレオチドよりも大きい核酸は、これらの方法を用いていくつかの断片として合成できる。次いで、断片を共にライゲートして、完全長NTPタンパク質を形成できる。通常、タンパク質のアミノ末端をコードするDNA断片は、メチオニン残基をコードするATGを有する。このメチオニンは、宿主細胞中で生成されるタンパク質が細胞から分泌されるように設計されているか否かに応じて、NTPタンパク質の成熟形態上に存在してもしなくてもよい。
【００４９】
NTPタンパク質をコードする遺伝子、cDNA、またはそれらの断片は、標準的なライゲーション技術を用いて、適切な発現または増幅ベクターに挿入され得る。ベクターは、典型的に、具体的に採用される宿主細胞中で機能的である(すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および/または遺伝子の発現が生じ得るように宿主細胞機構と適合性を有する)ように選択される。NTPタンパク質をコードする遺伝子、cDNAまたはそれらの断片は、原核生物、酵母、昆虫(バキュロウイルス系)、および/または真核生物宿主細胞において増幅/発現され得る。宿主細胞の選択は、NTPタンパク質がグリコシル化および/またはリン酸化されるか否かに一部依存する。この場合、酵母、昆虫、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。
【００５０】
典型的に、どの宿主細胞において使用されるベクターも、5'側隣接配列(「プロモーター」とも呼ばれる)、および他の調節エレメント(エンハンサー、複製起点エレメント，転写終結エレメント、供与および受容スプライス部位を含む完全イントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、発現するポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカーエレメント等)も含む。これらのエレメントはそれぞれ以下で議論する。任意に、ベクターは「タグ」配列(すなわち、NTPタンパク質コード配列の5'または3'端部に位置するオリゴヌクレオチド分子；オリゴヌクレオチド分子は、ポリHis(ヘキサHis等)、または市販の抗体が存在するFLAG、HA(赤血球凝集素インフルエンザウイルス)またはmyc等の他の「タグ」)を含み得る。このタグは、典型的に、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からNTPタンパク質をアフィニティー精製するための手段としての役割を果たす。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスであるタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィーにより行い得る。任意に、タグは、その後、特定のペプチダーゼを用いる等の様々な手段により、精製されたNTPタンパク質から除去できる。
【００５１】
ヒト免疫グロブリンヒンジおよびFc領域は、当業者により、NTPタンパク質のN末端またはC末端のいずれかに融合され得る。その後のFc融合タンパク質は、プロテインＡアフィニティーカラムの使用により精製できる。Fcは、in vivoで長い薬物動態半減期を示すことが知られており、Fcに融合したタンパク質は、融合していない同等物よりも実質的に長いin vivo半減期を示す。また、Fc領域への融合は、一部の分子の生物活性について有用となり得る分子の二量化/多量化を可能にする。
【００５２】
5'側隣接配列は同種(すなわち、宿主細胞と同じ種および/もしくは株に由来する)、異種(すなわち、宿主細胞種もしくは株以外の種に由来する)、ハイブリッド(すなわち、２つ以上の由来源に由来する5'側隣接配列の組み合わせ)、合成、または天然型NTPタンパク質遺伝子5'側隣接配列であり得る。従って、5'側隣接配列の由来源は、5'側隣接配列が宿主機構において機能的でかつ宿主機構により活性化されるのであれば、任意の単細胞原核生物または真核生物、任意の脊椎動物または無脊椎動物、または任意の植物であり得る。
【００５３】
本発明のベクターにおいて有用な5'側隣接配列は、当該分野で周知の任意のいくつかの方法により得ることができる。典型的に、NTP遺伝子隣接配列以外で、本明細書において有用な5'側隣接配列は、マッピングおよび/または制限エンドヌクレアーゼ消化により既に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織由来源から単離できる。場合によって、5'側隣接配列の完全ヌクレオチド配列が分かるかもしれない。ここで、5'側隣接配列は、核酸合成またはクローニングについて上記記載した方法を用いて合成され得る。
【００５４】
5'側隣接配列の全体または一部のみが知られている場合、適切なオリゴヌクレオチドおよび/または同じもしくは別の種に由来する5'側隣接配列で、PCRを使用することおよび/またはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。
【００５５】
5'側隣接配列が知られていない場合、5'側隣接配列を含むDNAの断片を、例えばコード配列またはさらに別の１つ以上の遺伝子を含み得るより大きいDNA断片から単離し得る。１つ以上の注意深く選択された酵素を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化により単離を行い、適切なDNA断片を単離する。消化後、所望の断片はアガロースゲル精製、Qiagen.RTMカラムまたは当業者に公知の他の方法により単離され得る。この目的を果たすために適切な酵素の選択は、当業者には容易に分かるであろう。
【００５６】
複製起点エレメントは、典型的に、市販されている原核生物発現ベクターの一部であり、宿主細胞中でのベクターの増幅を助ける。特定のコピー数へのベクターの増幅は、場合により、NTPタンパク質の最適な発現のために重要となり得る。選択したベクターが複製起点部位を含まない場合、公知の配列に基づき化学的に合成され、ベクターにライゲートされ得る。転写終結エレメントは、典型的に、NTPタンパク質コード配列の端部の3'側に位置し、NTPタンパク質の転写を終結する役割を果たす。通常、原核生物細胞中の転写終結エレメントは、GCリッチ断片にポリＴ配列が後続している。エレメントは、ライブラリーから簡単にクローニングでき、さらにはベクターの一部として購入できるが、上記記載した核酸合成のための方法を用いて簡単に合成もできる。
【００５７】
選択可能マーカー遺伝子エレメントは、選択培地中で培養される宿主細胞の生存および成長のために必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、(a)原核生物宿主細胞に、抗生物質または他の毒素(例えば、アンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシン)に対する耐性を付与するタンパク質、(b)細胞の栄養要求性欠損を補うタンパク質；または(c)複合培地から得られない重要な栄養を供給するタンパク質、をコードする。好ましい選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。
【００５８】
シャイン-ダルガーノ配列(原核生物)またはコザック配列(真核生物)と一般的に呼ばれるリボソーム結合エレメントは、mRNAの翻訳開始のために通常必要である。このエレメントは、典型的に、プロモーターの3'側に位置し、合成するNTPタンパク質のコード配列の5'側に位置する。シャイン-ダルガーノ配列は変化に富むが、典型的にポリプリン(すなわち、高いA-G含量を有する)である。多くのシャイン-ダルガーノ配列が同定されており、それぞれ上記方法を用いて簡単に合成でき、原核生物ベクターにおいて使用できる。
【００５９】
NTPタンパク質を宿主細胞から分泌させることが望ましい場合、シグナル配列を使用して、NTPタンパク質を、合成される宿主細胞から外に出し、タンパク質のカルボキシ末端部分を欠失させて、膜固定(anchoring)を防いでもよい。典型的に、シグナル配列は、NTP遺伝子もしくはcDNAのコード領域中、またはNTP遺伝子コード領域の5'端部に直接配置される。多くのシグナル配列が同定されており、選択した宿主細胞において機能的なものはどれでも、NTP遺伝子またはcDNAと共に使用され得る。従って、シグナル配列は、NTP遺伝子またはcDNAに対して同種でも異種でもよい。さらに、シグナル配列は、上記方法を用いて化学的に合成され得る。ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在を介した宿主細胞からのポリペプチドの分泌は、ポリペプチドからアミノ末端メチオニンを除去する。
【００６０】
多くの場合、NTP遺伝子またはcDNAは、ベクター中の１つ以上のイントロンの存在により増加する；これは、NTPタンパク質が真核生物細胞(特に哺乳動物宿主細胞)において産生される場合に特に言える。使用するイントロンは、具体的に使用する遺伝子が完全長ゲノム配列またはその断片である場合に、NTP遺伝子中で自然に生じるものであってもよい。イントロンが遺伝子内で自然に生じたものでない場合(ほとんどのcDNAの場合のように)、イントロンを別の由来源から得てもよい。隣接配列およびNTP遺伝子に対するイントロンの位置は、概して重要である。なぜなら、イントロンは有効に転写されなければならないからである。従って、発現ベクターに挿入されるNTP遺伝子がcDNA分子の場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の3'側であり、ポリＡ転写終結配列の5'側である。NTP cDNAについては、１つ以上のイントロンは、cDNAの一方の側または他方の側(すなわち、5'側または3'側)に位置して、このコード配列を妨害しないようにする。任意のウイルス、原核生物および真核生物(植物または動物)を含む任意の由来源由来の任意のイントロンを使用して本発明は実施され得る(挿入される宿主細胞と生適合性を有するという条件下で)。本明細書には合成イントロンも含まれる。任意に、２つ以上のイントロンをベクター中で使用してもよい。
【００６１】
上記１つ以上のエレメントが使用するベクターに予め存在しない場合、個々に得てベクターにライゲートさせてもよい。各エレメントを得る方法は、当業者に周知であり、上記方法(すなわち、DNAの合成、ライブラリースクリーニング等)に匹敵する。
【００６２】
本発明を実施するために使用する最終的なベクターは、典型的に、市販のベクター等の出発ベクターから構築される。このようなベクターは、完成したベクターに含まれるエレメントをいくつか含んでいてもよいし含んでいなくてもよい。出発ベクターに所望のエレメントが全く存在しない場合、ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、ライゲートするエレメントの端部とベクターの端部をライゲーションのために適合させることにより、各エレメントを個々にベクターにライゲートし得る。場合により、申し分ないライゲーションを得るために、ライゲートし合う端部を「平滑末端化」する必要があり得る。平滑末端化は、まず、４つのヌクレオチド全ての存在下にて、クレノウDNAポリメラーゼまたはT4DNAポリメラーゼを使用して「付着端部」を埋めることにより行う。この手順は、当該分野で周知であり、例えば、Sambrookら、前掲に記載されている。あるいはまた、ベクターに挿入する２つ以上のエレメントを(互いと隣接して配置させる場合)まず共にライゲートしてから、ベクターにライゲートさせてもよい。
【００６３】
ベクターを構築する他の方法としては、様々なエレメントの全てのライゲーションを同時に１つの反応混合液で行うことである。ここでは、多くのナンセンスまたは非機能的ベクターが、エレメントの不適切なライゲーションまたは挿入により生成されるが、機能的ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化により同定および選択され得る。
【００６４】
本発明の実施するために好ましいベクターは、細菌、昆虫および哺乳動物宿主細胞と適合するものである。このようなベクターとしては、とりわけ、pCRII、pCR3およびpcDNA3.1(Invitrogen Company, San Diego, Calif.)、pBSII(Stratagene Company, La Jolla, Calif.)、pET15b(Novagen, Madison, Wis.)、PGEX(Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.)、pEGFP-N2(Clontech, Palo Alto, Calif.)、pETL(BlueBacII;Invitrogen)、およびpFastBacDual(Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.)が挙げられる。
【００６５】
ベクターを構築し、完全長または平滑末端化NTPタンパク質をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、増幅および/またはポリペプチド発現のために、完成したベクターを適切な宿主細胞に挿入し得る。宿主細胞は、原核生物宿主細胞(大腸菌等)または真核生物宿主細胞(酵母細胞、昆虫細胞もしくは脊椎動物細胞等)であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、NTPタンパク質を合成でき、これはその後、(宿主細胞がNTPタンパク質を培地中に分泌する場合)培養培地から、または(NTPタンパク質が分泌されない場合)それを産生する宿主細胞から直接回収することができる。
【００６６】
回収後、分子ふるいクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いてNTPタンパク質を精製できる。NTPタンパク質産生のための宿主細胞の選択は、NTPタンパク質をグリコシル化するかリン酸化するか(この場合真核生物宿主細胞が好ましい)、および宿主細胞がタンパク質を天然型の三次構造に「折り畳み」(例えば、適切なジスルフィド架橋の配向等)可能で、生物活性を有するNTPタンパク質により生物学的活性なタンパク質を調製できる手法(NTPタンパク質は以下に議論する適切な化学条件を使用した合成後に「折り畳まれ」てもよい)に一部依存する。適切な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、ヒト胚腎臓(HEK)293もしくは293T細胞、または3T3細胞等の哺乳動物細胞であり得る。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物産生および精製の方法は当該分野で公知である。他の適切な哺乳動物細胞系は、サルCOS-1およびCOS-7細胞系、ならびにCV-1細胞系である。さらなる例示の哺乳動物宿主細胞としては、霊長類細胞系およびげっ歯類細胞系(形質転換細胞系も含む)が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代培養組織(primary tissue)ならびに初代外植片(primary explant)のin vitro培養により得られた細胞株も適している。候補細胞は、選択遺伝子が遺伝子型に由来する欠損を有しているか、または優性に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞系としては、マウス神経芽細胞腫N2A細胞、HeLa、マウスL-929細胞、Swiss、Balb-cもしくはNIHマウスから誘導された3T3系、BHK、またはHaKハムスター細胞系が挙げられる。
【００６７】
本発明に適した宿主細胞として同様に有用なのは細菌細胞である。例えば、大腸菌の様々な株(例えば、HB101、DH5.alpha.、DH10およびMC1061)は、バイオ技術の分野において宿主細胞として周知である。枯草菌、シュードモナス属、他のバチルス属、ストレプトミセス属等の様々な株も本方法において採用され得る。当業者に公知の酵母細胞の多くの株も、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。
【００６８】
さらに、所望である場合、昆虫細胞系を、本発明の方法において利用してもよい。このような系は、例えば、Kittsら(Biotechniques, 14:810-817[1993])、Lucklow(Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572[1993])、およびLucklowら(J. Virol., 67:4566-4579[1993])に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Sf-9およびHi5(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)である。
【００６９】
選択した宿主細胞へのベクターの挿入(「形質転換」または「トランスフェクション」とも呼ばれる)は、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、またはDEAE-デキストラン方法等の方法を用いて行われ得る。選択される方法は、使用する宿主細胞の種類によっても異なる。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrookら、前掲に記載されている。
【００７０】
ベクターを含む宿主細胞(すなわち、形質転換またはトランスフェクトされたもの)は、当業者に周知の標準的な培地を用いて培養し得る。培地は、通常、細胞の成長および生存に必要な全ての栄養を含む。大腸菌細胞を培養するために適した培地は、例えば、ルリアブロス(LB)および/またはテリフィックブロス(TB)である。真核生物細胞を培養するのに適した培地は、RPMI 1640、MEM、DMEMであり、これらは全て、培養する具体的な細胞株によって、必要に応じて、血清および/または増殖因子を補う場合がある。昆虫培養に適した培地は、必要に応じて、イーストレート(yeastolate)、ラクトアルブミン加水分解物、および/またはウシ胎仔血清を添加したグレース培地である。典型的に、形質転換細胞の選択的培養に有用な抗生物質または他の化合物のみが、捕捉物として培地に添加される。使用する化合物は、宿主細胞を形質転換したプラスミド上に存在する選択可能マーカーエレメントにより決定される。例えば、選択可能マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に添加する化合物はカナマイシンである。
【００７１】
宿主細胞中で産生されるNTPタンパク質の量は、当該分野で公知の標準的な方法を用いて評価できる。このような方法としては、ウェスタンブロット分析、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、HPLC分離、免疫沈降、および/またはDNA結合ゲルシフトアッセイ等の活性アッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
NTPタンパク質が、宿主細胞から分泌されるように設計されている場合、NTPタンパク質の大部分は細胞培養培地中で認められる。このようにして調製したタンパク質は、典型的にアミノ末端メチオニンを所有しない。なぜなら、細胞からの分泌の間に除去されてしまうからである。しかし、NTPタンパク質が宿主細胞から分泌されない場合、細胞質および/または核(真核生物宿主細胞の場合)もしくはサイトゾル(グラム陰性細菌宿主細胞の場合)に存在し、アミノ末端メチオニンを有し得る。
【００７３】
宿主細胞細胞質および/または核に位置するNTPタンパク質については、典型的に、宿主細胞をまず機械的にまたは界面活性剤で破壊し、細胞内含有物を緩衝化溶液に放出させる。次いで、NTPタンパク質をこの溶液から単離できる。
【００７４】
溶液からのNTPタンパク質の精製は、様々な技術を用いて行うことができる。タンパク質が、ヘキサヒスチジン(NTPタンパク質/ヘキサHis)等のタグ、またはFLAG(Sigma-Aldritch, St. Louis, MI)もしくはカルモジュリン結合ペプチド(Stratagene, La Jolla, CA)等の他の小ペプチドを、カルボキシルまたはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、溶液をアフィニティーカラム(カラムマトリックスは、タグまたはタンパク質に直接的かつ高い親和性を有する(すなわち、NTPタンパク質を特異的に認識するモノクローナル抗体など))に通す１段階ステップで本質的に精製し得る。例えば、ポリヒスチジンは、高い親和性および特異性で、ニッケル、亜鉛およびコバルトと結合し、従って、ニッケル利用型親和性樹脂(QiagenのOIAexpress系もしくはInvitrogenのXpress系で使用されるようなもの)またはコバルト利用型親和性樹脂(BD Biosciences-CLONTECHのTalon系に使用されるようなもの)を採用する固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを、NTPタンパク質/ポリHisの精製のために使用できる。(例えば、Ausubelら編, Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley and Sons, New York [1993]を参照)
NTPタンパク質がタグを付着されずに調製され、利用できる抗体がない場合、他の周知の精製手順が使用できる。このような手順としては、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、HPLC、ゲル溶出と組み合わせた天然型ゲル電気泳動、および調製的(preparative)等電点電気泳動法(「Isoprime」装置/技術、Hoefer Scientific)が挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、これらの技術の２つ以上を組み合わせて、純度を高めることができる。
【００７５】
NTPタンパク質が主に細胞内に存在することが予想される場合、細胞内物質(グラム陰性細菌の封入体も含む)は当業者に公知の任意の標準的技術を用いて宿主細胞から抽出できる。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および/または音波処理と、その後の遠心分離により、ペリプラズム/細胞質の内容物を放出するように溶解できる。NTPタンパク質が、サイトゾル中に封入体を形成している場合、封入体は、内部および/または外部細胞膜に結合し得ることがよくあるので、遠心分離の後ではペレット材料中に主に存在する。その後、ペレット材料は、アルカリpHのジチオトレイトールまたは酸性pHのトリスカルボキシエチルホスフィン(carboxyethyl phosphine)等の還元剤の存在下で、pHの両極端、または界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素もしくは尿素誘導体等のカオトロピック剤で処置されて、封入体を放出、破壊分離および可溶性にし得る。ここで可溶性形態になったNTPタンパク質を、ゲル電気泳動、免疫沈降等を用いて分析できる。NTPタンパク質を単離することが望ましい場合、以下およびMarstonら(Meth. Enz., 182:264-275[1990])に記載の方法等の標準的な方法を用いて達成し得る。場合によっては、NTPタンパク質は、単離の際に生物学的に活性ではないかもしれない。ポリペプチドをその三次構造を「リフォールディング」または変化させるか、ジスルフィド結合を生成する様々な方法を使用して、生物学的活性を回復させることができる。このような方法としては、特定の濃度のカオトロープの存在下で、可溶化ポリペプチドを通常７を上回るpHに曝すことが挙げられる。カオトロープの選択は、封入体可溶化で使用する選択に非常に似ているが、通常より低い濃度で、可溶化で使用したものと同じカオトロープである必要はない。ほとんどの場合、リフォールディング/酸化溶液は、還元剤、または還元剤および特定比のその酸化形態も含み、特定の酸化還元電位を生成して、タンパク質のシステイン架橋の形成においてジスルフィドシャッフリング(disulfide shuffling)を生じさせる。よく使用される酸化還元対の一部としては、システイン/シスタミン、グルタチオン(GSH)/ジチオビスGSH、塩化第二銅、ジチオトレイトール(DTT)/ジチアンDTT、2-メルカプトエタノール(bME)/ジチオ-b(ME)が挙げられる。多くの場合、リフォールディングの効率を上げるために溶媒混合系(cosolvent)が必要であり、この目的のためにより多く使用されている試薬としては、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが挙げられる。
【００７６】
NTPタンパク質封入体が、宿主細胞において有意な程度まで形成されない場合、NTPタンパク質は、細胞ホモジネートの遠心分離後の上清に主に認められ、NTPタンパク質は以下に記載するような方法を用いて上清から単離できる。
【００７７】
NTPタンパク質を部分的または完全に単離することが好ましい状況では、当業者に周知の標準的な方法を用いて精製を行うことができる。このような方法としては、電気泳動による分離およびその後の電気溶出(electroelution)、様々な種類のクロマトグラフィー(イムノアフィニティー、分子ふるい、および/もしくはイオン交換)、ならびに/または高圧液体クロマトグラフィーが挙げられるがこれらに限定されない。場合によっては、完全な精製のために、これらの方法を２つ以上使用することが好ましいかもしれない。
【００７８】
組換えDNA技術を用いてNTPタンパク質を調製および精製するのに加えて、NTPタンパク質およびそれらの誘導体は、Merrifieldら(J. Am. Chem. Soc., 85:2149[1963])、Houghtenら(Proc Natl Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985])、ならびにStewartおよびYoung(Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984])に記載されるような当該分野で公知の技術を使用して、化学合成法(固相ペプチド合成法等)によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端上にメチオニンを有していてもいなくても合成され得る。化学的に合成されたNTPタンパク質を、これらの参考文献に記載される方法を使用して酸化させ、ジスルフィド架橋を形成してもよい。NTPタンパク質は、遺伝子組換えにより産生されたかまたは天然型由来源から精製されたNTPタンパク質に匹敵する生物学的活性を有することが予想されており、従って、組換え型または天然型NTPタンパク質と互換的に使用し得る。
【００７９】
NTPタンパク質が高分子と連結された化学的に修飾されたNTPタンパク質組成物は、本発明の範囲内に含まれる。選択する高分子は、付着先のタンパク質が水溶性環境(生理学的環境)で沈降しないよう、典型的には水溶性である。選択する高分子は、アシル化用の活性エステル、またはアルキル化用のアルデヒド等、通常単一の反応基を有するように修飾され、本方法において規定するように重合化の程度を制御し得るようにする。高分子はあらゆる分子量のものであってよく、分枝型または非分枝型であり得る。NTPタンパク質高分子の範囲には、高分子の混合物も含まれる。
【００８０】
場合により、天然型NTPタンパク質の核酸および/またはアミノ酸変異体を調製することが望ましい場合がある。核酸変異体は、プライマーが所望の点突然変異を有する、部位特異的突然変異誘発、PCR増幅、または他の適切な方法を用いて生成し得る(突然変異誘発技術については、Sambrookら、前掲、およびAusubelら、前掲を参照)。Engelsら（前掲）に記載された方法を用いた化学合成も、このような変異体を調製するために使用してもよい。当業者に公知の他の方法も同様に使用し得る。
【００８１】
好ましい核酸変異体は、NTPタンパク質を生成するのに使用される宿主細胞における優先コドンとなるヌクレオチド置換を含むものである。このような「コドン最適化」は、University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis.から提供されるような、高度に発現される細菌遺伝子のコドン優先についての"Ecohigh.Cod"等のコドン頻度表を採用したコンピューターアルゴリズム(algorither)を介して決定できる。他の有用なコドン頻度表としては、"Celegans_high.cod"、"Celegans_low.cod"、"Drosophila_high.cod"、"Human_high.cod"、"Maize_high.cod"、および"Yeast_high.cod"が挙げられる。他の好ましい変異体は、上述したような、野生型と比べて保存的アミノ酸変化をコードする(例えば、天然型アミノ酸側鎖の電荷または極性が異なるアミノ酸での置換により実質的に変化しない)もの、および/または新規グリコシル化および/もしくはリン酸化部位のいずれかを生成するように設計されたもの、または既存のグリコシル化および/もしくはリン酸化部位を欠失するように設計されたものである。
【００８２】
NTP断片、相同体、変異体、誘導体、およびそれらの塩は、当業者に公知の従来のペプチド合成技術を用いて作製できる。これらの技術としては、化学共役法(Wunsch, E: "Methoden der organischen Chemie", Volume 15, Band 1+2, Synthese von Peptiden, thime Verlag, Stuttgart (1974)、およびBarrany, G.; Marrifield, R.B.:"The Peptides", E. Gross, J. Meienhofer編, Volume 2, Chapter 1, pp. 1-284, Academic Press (1980)を参照)、酵素共役法(Widmer, F. Johansen, J.T., Carlsberg Res. Commun., Vol. 44, pp. 37-46 (1979)、およびKullmann, W.:"Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987)、および"Synthetic Peptides in Biology and Medicines:, Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A.編, pp.79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)"に掲載のWidmer, F., Johansen, J.T.を参照)、またはプロセス設計および節約のために有利となるのであれば化学的および酵素的方法の組み合わせが挙げられる。当業者は、NTPタンパク質のペプチド配列を変えて、元のまたは天然型のNTPタンパク質と同じまたは類似する生物学的活性(生物活性)を有する相同体を作製することが可能である。
【００８３】
タンパク質自体ではなく、所与のNTPタンパク質の模倣体を使用する明白な利点がある。これは、タンパク質は、２つの望ましくない性質：すなわち、(1)生物学的利用能の乏しさ；および(2)短い作用期間、を示すことがよくあるからである。ペプチド模倣体は、これらの２つの主要な障害を回避できる。なぜなら、関連する分子は、より広い利用可能性および長い作用期間の両方を得るのに十分に小さいからである。さらに、ペプチド模倣体は、タンパク質およびペプチドを産生するよりもはるかに安い。最後に、タンパク質およびペプチドの安定性、保存性、および免疫反応性に関連する問題があるが、ペプチド模倣体はかかる問題には直面しない。
【００８４】
従って、上述したNTPペプチドは、類似する生物学的活性を有し、類似する治療的利用性を有するこのような小さい化学化合物の開発において利用性を有する。NTPペプチドのペプチド模倣体は、コンビナトリアル化学技術および当該分野で公知の他の技術を使用して開発できる(例えば、Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, G.Jung, E. Bayer編, pp. 289-336、および該文献中の参考文献を参照)。
【００８５】
当該分野で公知のペプチドを構造的に改変して、ペプチド模倣体を作製する方法の例としては、骨格キラル中心の反転によりDアミノ酸残基構造を生じさせ、これにより(特にN末端において)活性に悪影響を与えることなくタンパク質分解に対する安定性を増強させ得ることが含まれる。一例が、論文"Tritriated D-ala.sup.1-Peptide T Binding", Smith C.S.ら, Drug Development Res. 15, pp. 371-379 (1988)に記載されている。
【００８６】
第２の方法は、NからC鎖内イミドおよびラクタムに変える等、安定性のために環状構造を変えることである(SmithおよびRivier(編)"Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp. 268-270に掲載のEdeら)。この一例としては、米国特許第4,457,489号(1985)、Goldstein, G.ら(これらの開示は、参照により本明細書に全体的に援用する)に開示されているような、立体構造により制限されているチモペンチン様化合物が挙げられる。
【００８７】
第３の方法は、NTPペプチド中のペプチド結合を、タンパク質分解に対する耐性を付与する擬似ペプチド結合と置き換えることである。ペプチド構造および生物学的活性に概して影響を及ぼさない多数の擬似ペプチド結合が記載されている。このアプローチの一例は、反転擬似ペプチド結合を置き換えることである(Rivier, J.E.およびMarshall, G.R.(編)"Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp. 722-773に掲載の"Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A.ら、ならびにDalpozzoら(1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566(参照により本明細書に援用する))。この改変によれば、ペプチドのアミノ酸配列は、１つ以上のペプチド結合が反転擬似ペプチド結合で置き換えられていること以外は、上記NTPペプチドの配列と同一であり得る。最もN末端のペプチド結合が置換されることが好ましい。なぜなら、このような置換により、N末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性が付与されるからである。
【００８８】
１つ以上の還元された反転擬似ペプチド結合を有するペプチドの合成は、当該分野で公知である(上記引用した、Sisto(1990)およびDalpozzoら(1993))。従って、ペプチド結合は、ペプチド模倣体が、元のペプチドと類似する構造となるよう、すなわち、類似する生物学的活性を有するように、非ペプチド結合により置換され得る。アミノ酸の化学基を、類似する構造の他の化学基と置き換えることにより、さらなる改変を行い得る。全くまたはほとんど生物学的活性を損失せずに酵素切断に対する安定性を増強することが知られている別の適切な擬似ペプチド結合は、還元イソステア擬似ペプチド結合である(Couderら(1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184、参照により本明細書に全体的に援用する)。従って、これらのペプチドのアミノ酸配列は、１つ以上のペプチド結合がイソステア擬似ペプチド結合と置き換えられていること以外は、NTPペプチドの配列と同一であり得る。最もN末端のペプチド結合は置換されることが好ましい。なぜなら、このような置換により、N末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性が付与されるからである。１つ以上の還元イソステア擬似ペプチド結合を有するペプチドの合成は当該分野で公知である(Couderら (1993)、上記引用)。他の例としては、ケトメチレンまたはメチルスルフィド結合を導入してペプチド結合を置き換えることが挙げられる。
【００８９】
NTPペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性についての重要な構造決定基を保持し、しかもペプチド結合を無くして、タンパク質分解に対する耐性を付与するペプチド模倣体の別のクラスを表す(Simonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371、参照により本明細書に全体的に援用する)。ペプトイドは、N-置換型グリシンのオリゴマーである。多数のN-アルキル基が記載されており、それぞれ天然型アミノ酸の側鎖に対応する(Simonら (1992)、上記引用、参照により本明細書に全体的に援用する)。NTPのアミノ酸の一部または全体は、置換されるアミノ酸に対応するN-置換型グリシンで置き換えられる。
【００９０】
ペプチド模倣体の開発は、NMR分光法、結晶学および/またはコンピュータ支援型分子モデリングにより元のNTPペプチドの三次構造を決定することにより支援される。これらの技術は、元のペプチドよりも高い潜在力および/または高い生物学的利用能および/または高い安定性を有する新規組成物の開発を支援する(Dean (1994), BioEssays, 16: 683-687；CohenおよびShatzmiller (1993), J. Mol. Graph., 11:166-173；WileyおよびRich(1993), Med. Res. Rev., 13:327-384；Moore (1994), Trends Pharmacol. Sci., 15:124-129；Hruby (1993), Biopolymers, 33: 1073-1082；Buggら (1993), Sci. Am., 269:92-98、全て参照により本明細書に全体的に援用する)。
【００９１】
可能性のあるペプチド模倣体化合物が同定されれば、以下の実施例に概要されている方法を用いてそれを合成およびアッセイし、その活性を評価し得る。NTPペプチドの生物学的活性および類似する三次元構造を有する、上記方法により得られるペプチド模倣体化合物は、本発明により包含される。ペプチド模倣体が、上述した１つ以上の改変を担持する任意のNTPペプチドから生成され得ることが、当業者には容易に理解されるであろう。さらに、本発明のペプチド模倣体が、それらの治療的化合物としての利用性に加えて、よりいっそう潜在力のある非ペプチド化合物の開発のためにさらに使用できることが理解されるであろう。
【００９２】
NTPタンパク質についてのアッセイ
本発明は、NTPタンパク質およびそれらの対応する核酸分子をアッセイのために使用して、哺乳動物組織または体液サンプル中のNTPタンパク質、NTP DNAまたは対応するRNAの存在について定性的にまたは定量的にテストすることも包含する。NTPタンパク質およびそれらの対応する核酸分子は、このようなアッセイにおける調製物(preparation)において(NTPタンパク質または該核酸分子によりコードされるNTPタンパク質が生物学的活性を示そうが示さなかろうが)有用であり得る。NTP核酸配列は、哺乳動物組織または体液サンプル中のNTP DNAまたは対応するRNAの存在について、定性的または定量的にテストするためのハイブリダイゼーションプローブの有用な由来源であり得る。それ自体では生物学的に活性でないNTPタンパク質は、NTPタンパク質を認識および/または結合する抗体を調製するのに有用であり得る。このような抗体は、標準的な方法を使用して調製され得る。従って、NTPタンパク質と反応する抗体、ならびに短い鎖抗体フラグメントおよびこのような抗体の他の反応性断片も、本発明の範囲内にあることを意図する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、キメラ、一本鎖および/または二重特異性のものであり得る。典型的に、抗体およびその断片は、ヒト由来源のものか、または「ヒト化」された(すなわち、患者に投与された場合に抗体に対する免疫反応を防ぐかまたは最小限にするように調製される)ものである。好ましい抗体は、ヒト抗体である(ポリクローナルでもモノクローナルでもよい)。抗体フラグメントは、Fab、Fab'等の本発明のNTPタンパク質と反応する任意のフラグメントであり得る。NTPタンパク質を抗原として、選択した哺乳動物に提示し、哺乳動物の細胞(例えば、脾臓細胞)を特定の癌細胞と融合させて、公知の技術により不死化細胞系を作製することにより生成されたハイブリドーマも、本発明により提供される。NTPタンパク質の全体または一部に対して方向付けられたこのような細胞系および抗体を産生するために採用される方法も、本発明により包含される。
【００９３】
抗体は、体液または細胞サンプル中のNTPタンパク質の存在を検出するための標識化形態などで、in vivoおよびin vitro診断または調査目的のためにさらに使用され得る。
【００９４】
治療される症状
本発明は、良性および悪性腫瘍、腺(例えば、前立腺)肥大、所望でない顔の毛、いぼ、ならびに所望でない脂肪組織等の細胞の除去を必要とする症状を治療するための新規方法に関する。このような方法は、必要とする哺乳動物に、治療に有効な量のNTPを投与することを含む。
【００９５】
症状は、例えば、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺(parathyroid)、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系、ならびに他の器官の腫瘍であり得る。
【００９６】
本明細書で使用する「悪性腫瘍」という用語は、分化が乏しい、分化が中度、またはよく分化した形態にある、ヒト癌腫、肉腫および黒色腫の全形態を包含することを意図する。
【００９７】
本発明は、手術の危険性がより低く、所望でない副作用がより少ない、腫瘍を除去できるという治療に対する当該分野の要望を満たす。身体の深い位置等(例えば、脳、心臓、肺等)の外科的に危険な領域における良性腫瘍を除去する方法が、特に必要とされている。
【００９８】
細胞を除去しなければならない症状を治療する方法は、術的切除、化学療法および放射能等のこのような症状を治療する従来方法と共に使用できる。NTPは、このような従来の治療の前、途中または後に投与できる。
【００９９】
治療する症状は、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の過形成、肥大または過剰増殖であってもよい。
【０１００】
本発明の方法を用いて治療できるさらに別の症状は、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される、ウイルス、細菌または寄生生物により改変された組織である。
【０１０１】
治療される症状は、肺、胸、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳およびその被層、脊椎およびその被層、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、下垂体、生殖器、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、喉、扁桃、口、リンパ節およびリンパ球系からなる群より選択される組織の奇形であってもよい。
【０１０２】
特に、治療する症状は、扁桃肥大、前立腺肥大または痔であり得る。治療する症状は、アテローム硬化症もしくは動脈硬化症などの等の血管疾患、または拡張蛇行静脈等の血管疾患であり得る。治療する症状は、皮膚、眼、耳、鼻、喉、口、筋肉、結合組織、毛髪、または胸組織等の組織に対する美容的改変であってもよい。
【０１０３】
NTP組成物
NTPタンパク質の治療的組成物は、本発明の範囲内にある。このような組成物は、製薬上許容可能なキャリアと混合された治療的有効量のNTPタンパク質を含み得る。キャリア物質は、好ましくは哺乳動物への投与用の溶液によく入っている他の物質を補充された注射用の水であり得る。典型的に、治療用途のためのNTPタンパク質は、１つ以上の生理的に許容されるキャリア、賦形剤または希釈剤と共に、精製されたNTPタンパク質を含む組成物の形態で投与される。中性緩衝化食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水は、適切なキャリアの例である。製品は、適切な賦形剤(例えば、スクロース)を用いた凍結乾燥形剤(lyophilizate)として剤形化されることが好ましい。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤も、所望によって含まれていてもよい。他の組成物の例としては、約pH7.0〜8.5のTris緩衝液、または約pH4.0〜5.5のアセテート緩衝液が挙げられ、これらは、ソルビトールまたはそれに適した代替物質をさらに含み得る。
【０１０４】
所望でない細胞エレメントを標的化するための、抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または特異的腫瘍マーカー(細胞受容体、シグナルペプチドもしくは過剰発現酵素等)に高い親和性を有する分子にコンジュゲートまたは連結または結合したNTPタンパク質の使用も、本発明の範囲に包含される。抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または特異的な腫瘍マーカーに高い親和性を有する分子は、特定の細胞または組織標的にコンジュゲートしたNTPタンパク質を標的化するために使用する。例えば、異なる表面抗原または発現抗原を有する腫瘍が、抗体、抗体フラグメント、または抗体様結合分子により標的化され、腫瘍細胞がNTPタンパク質により殺され得る。抗体標的化を使用したこのようなアプローチは、投薬量の低下、標的細胞への結合および標的細胞による摂取の可能性を高める、ならびに転移性腫瘍および微小サイズの腫瘍を標的化するための有用性を高めるという利点を有することが予想されている。
【０１０５】
本発明はまた、タンパク質または他の分子にコンジュゲートまたは連結または結合したNTPタンパク質を使用して、腫瘍もしくは部位特異的酵素もしくはプロテアーゼによる、または腫瘍もしくは所望でない細胞を標的化する抗体コンジュゲートによる腫瘍または他の所望でない細胞の部位またはその付近における切断の際に、腫瘍もしくは他の所望でない細胞の部位または付近にNTPタンパク質を放出する組成物を形成することも包含する。
【０１０６】
本発明はまた、タンパク質または他の分子とコンジュゲートまたは連結または結合したNTPタンパク質を使用して、処置する組織を、光(レーザ療法または他の光力的もしくは光活性化療法等)、電磁放射の他の形態(赤外線放射、紫外線放射、Ｘ線もしくはγ線放射、局所化熱、αもしくはβ放射、超音波放射等)、または他の局所化エネルギー源に曝露した際に、NTPタンパク質またはいくらか生物学的に活性なNTPタンパク質断片を放出する組成物を形成することも包含する。
【０１０７】
NTPタンパク質は、治療する症状に応じて、単独でも使用でき、または他の製薬的組成物(サイトカイン、増殖因子、抗生物質、アポトーシス誘発剤、抗炎症剤、および/または化学療法剤)と組み合わせて一緒にも採用できる。
【０１０８】
本発明は、NTPタンパク質および/またはその対応するDNA分子が、単独で、または他の種の分子(腫瘍特異的マーカー等)と共に、分子、高分子または巨大分子にコンジュゲート、付着または封入されている、デンドリマー、フラーレンおよび他の合成分子、高分子および巨大分子を採用するNTPの治療的組成物も包含する。例えば、米国特許第5,714,166号、Bioactive and/or Targeted Dendimer Conjugatesは、とりわけ、標的指示体(target director)を有する少なくとも１つのデンドリマーおよびそれにコンジュゲートした少なくとも１つの生物活性剤からなる樹状高分子コンジュゲートを調製および使用する方法を提供する。
【０１０９】
本発明はまた、NTPタンパク質および/または遺伝子ならびに薬剤送達ビヒクル(脂質エマルジョン、ミセル高分子、高分子微小球、電気活性高分子、ヒドロゲルおよびリポソーム等)の治療的組成物も包含する。
【０１１０】
所望でない細胞に伝達されるNTPまたは関連遺伝子もしくは遺伝子等価物の使用も、本発明の範囲に包含されている。腫瘍内でのNTPの過剰発現を使用して、腫瘍中の細胞を死ぬように誘導することで、腫瘍細胞集合を減少させることができる。NTPの遺伝子または遺伝子等価物伝達により、所望でない細胞エレメントを治療することは、必要な投薬量がより少なく、標的化細胞エレメントの細胞子孫に伝達されるために、治療の頻度がより少なく、総合的な治療がより少なくできるという利点を有すると予想されている。本発明はまた、NTPを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を、所望でない細胞または隣接細胞に伝達し、遺伝子の発現、そして融合タンパク質の産生および/または分泌後、融合タンパク質が、天然型酵素もしくはプロテアーゼ、またはプロドラッグのいずれかにより切断されて、所望でない細胞またはその付近でNTPタンパク質を放出させることも包含する。
【０１１１】
クローン化組換えNTP抗体コンジュゲート；クローン化組換えNTP抗体フラグメントコンジュゲート；およびクローン化組換えNTP抗体様タンパク質コンジュゲートの使用も本発明の範囲に包含される。標的化コンジュゲート(抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、または癌特異的受容体もしくは他の腫瘍マーカーに高い親和性を有する分子等)と組み合わせられたクローン化NTPの利点は、このような分子が、クローン化コンジュゲート分子の製造および標準化製造についての利点に加えて、上記した標的化の利点も組み合わせる点である。
【０１１２】
投薬形態
経口投与用の固形投薬形態は、カプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒が挙げられるがこれらに限定されない。このような固形投薬形態では、活性化合物は、以下の少なくとも１つと混合される：すなわち、(a)クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウム等の１つ以上の不活性賦形剤(またはキャリア)；(b)デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸等の充填剤または増量剤；(c)カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシア等の結合剤；(d)グリセロール等の保湿剤；(e)寒天(agar-agar)、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩(complex silicate)、および炭酸ナトリウム等の崩壊剤；(f)パラフィン等の溶液凝結遅延剤(retarder)；(g)第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤；(h)アセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート等の湿潤剤；(i)カオリンおよびベントナイト等の吸着剤；ならびに(j)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、固体ラウリル硫酸、またはそれらの混合物等の潤滑油。カプセル、錠剤および丸剤のために、投薬形態は緩衝化剤も含み得る。
【０１１３】
経口投与用の液体投薬形態としては、製薬上許容可能なエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが挙げられる。活性化合物に加えて、液体投与形態は、当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤(水または他の溶剤、可溶化剤および乳化剤等)を含み得る。乳化剤の例は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物等である。
【０１１４】
このような不活性希釈剤とは別に、組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味料、香味料、および芳香剤等のアジュバントも含み得る。
【０１１５】
本発明の組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、具体的な組成物および投与方法について所望の治療的応答を得るのに有効なNTPの量を得るために異なり得る。従って、選択される投薬レベルは、所望の治療的効果、投与経路、望ましい治療の持続期間、および他の要因に依存する。
【０１１６】
哺乳動物(ヒトを含む)の場合、有効量は、体表面積に基づいて投与され得る。様々な大きさの動物、種およびヒトについての投薬量の相互関係(体表面積のmg/M2に基づく)は、E.J.Freireichら, Cancer Chemother. Rep., 50(4):219 (1966)に記載されている。体表面積は、個体の背丈および体重から適切に決定され得る(例えば、Scientific Tables, Geigy 'Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. pp. 537-538 (1970)を参照)。
【０１１７】
宿主に投与されるNTPの合計一日用量は一回で投与してもも用量を分けて投与してもよい。投薬単位組成物は、一日の用量を構成するように使用され得るような分量を含み得る。しかし、任意の具体的な患者についての具体的な用量レベルは、体重、全体的な健康、性別、食事、投与の時間および経路、投与される薬剤の潜在力、吸収および排出率、他の薬剤との組み合わせ、ならびに治療する具体的な疾患の重傷度を含む様々な要因に依存することが理解されるであろう。
【０１１８】
投与方法
本発明によるNTP組成物を投与する方法としては、化合物を、筋内、経口、静脈内、腹腔内、小脳内(実質内)、脳質内、腫瘍内、病変内、皮内、髄腔内、鼻腔内、眼内、動脈内、局所、経皮的、エーロゾル、輸液、ボーラス注射、移植装置、持続的放出系等を介して投与することが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１９】
本発明のNTPを投与する別の方法は、経皮的(transdermal or transcutaneous)経路によるものである。このような実施形態の一例はパッチの使用である。特に、パッチは、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはDMSOと綿実油の混合液に入ったNTPの純度の高い懸濁液と共に作製され、腫瘍を持つ哺乳動物の皮膚と、皮膚パウチ内部の腫瘍部位から離して接触させる。他の溶剤および固体支持体を用いた他の溶媒またはその混合物も同等に作用する。パッチは、溶液または懸濁液の形態でNTP化合物を含み得る。次いで、パッチは、例えば、皮膚を折り畳み、皮膚を縫い合わせるか、クリップもしくは他の固定装置により皮膚を固定し合わせて形成された患者の皮膚パウチに挿入することにより、患者の皮膚に適用できる。このパウチは、哺乳動物に妨害されずに皮膚との持続的な接触が確実となるように採用される。皮膚パウチを使用するのとは別に、パッチを皮膚と確実に堅固に接触させる任意の装置を使用してもよい。例えば、接着帯具を使用して、パッチを皮膚に配置および固定させてもよい。
【０１２０】
NTPは、持続性放出剤形または調製物として投与され得る。持続性放出調製物の適切な例としては、成形品形態の半浸透性高分子マトリックス(例えば、フィルムまたは微小カプセル)が挙げられる。持続性放出マトリックスとしては、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP 58,481)、L-グルタミン酸およびγエチル-L-グルタミン酸塩の共重合体(Sidmanら, Biopolymers, 22: 547-556 [1983])、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)(Langerら, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981])およびLanger, Chem. Tech., 12:98-105 [1982]）、エチレン酢酸ビニル(Langerら、前掲)、またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシブチル酸(EP 133,988)が挙げられる。持続性放出組成物はまた、当該分野で公知のいくつかの方法の任意のものにより調製され得るリポソームも含み得る(例えば、Eppsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985]；EP 36,676；EP 88,046；およびEP 143,949)。
【０１２１】
本発明のNTPを投与する別の方法は、治療する腫瘍または他の組織にNTPを直接または間接的に注入することである。このような実施形態の一例は、治療する腫瘍または他の組織にNTPを直接注射することである。治療は、単一注射、１回の機会での複数注射、または治療する腫瘍または他の組織の退化または破壊を、生検、画像化または他の組織成長モニター方法によりモニターしながら、数時間、数日間もしくは数ヶ月間の期間にわたる一連の注射から構成され得る。治療する腫瘍または他の組織への注射は、鼻、口、耳、膣、直腸または尿道等の開口部に挿入される装置により行われてもよいし、またはin vivoで腫瘍または組織に到達するために切開されて行われてもよく、注射の適切な部位を識別するために超音波またはファイバ光学スコープ等の画像化または光学システムと共に行われ得る。このような実施形態の別の例は、時間経過と共に組織に一定のNTPの注入を提供できる装置を使用することである。
【０１２２】
本発明のNTPを投与する別の方法は、除去するか破壊することが必要なまたは望ましい腫瘍または他の組織もしくは細胞エレメントを、身体的に切除、剥離、さもなければ殺すか破壊するために採用する手術または同様の処置と共に行うことである。ここで、本発明のNTPは、腫瘍または他の組織が除去された領域のすぐ周囲の領域に投与されて、上記処置により除去または破壊されなかったあらゆる腫瘍細胞または他の細胞エレメントの成長を破壊または妨げる。
【０１２３】
本発明のNTPを投与する別の方法は、治療する腫瘍または他の組織内に装置を移植することによるものである。このような実施形態の一例は、治療する腫瘍または他の組織に、NTPを含有するウエハを移植することである。ウエハは、時間経過と共に組織に治療的用量のNTPを放出する。代替的または追加的に、組成物は、本発明のNTPが吸収された膜、スポンジまたは他の適切な材料を、患部へ移植することにより、局所的に投与され得る。移植装置を使用する場合、装置は任意の適切な組織または器官に移植され、本発明のNTPの送達は、ボーラスを介した装置を直接介して、または持続的投与を介して、または持続的輸液を採用したカテーテルを介して行われ得る。
【０１２４】
代替的な投与方法は、NTP遺伝子の１つ以上のコピーを、標的化細胞に導入し、必要であれば、遺伝子のコピーにNTPを細胞内で産生させ始めるように誘導させる。遺伝子療法が適用できる１つの手法は、構成的または誘導可能なプロモーターに作用可能に連結し得るNTP遺伝子(本発明のNTP、またはその断片、変異体もしくは誘導体をコードするゲノムDNA、cDNA、および/または合成DNA)を使用して、「遺伝子療法DNA構築物」を構築することである。プロモーターは、構築物が挿入される細胞または組織の種類において活性であれば、内因性NTP遺伝子に対して同種でも異種でもよい。遺伝子療法DNA構築物の他の成分としては、任意に、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されたDNA分子(例えば、相同組換えに有用な内因性隣接配列)、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞に対して選択的な利点を提供可能なDNA分子、形質転換細胞を同定するための標識として有用なDNA分子、負の選択系、細胞特異的結合剤(例えば、細胞標的化のため等)、細胞特異的内在化因子、ベクターによる発現を増強する転写因子、ならびにベクター製造を可能にする因子を含んでもよい。
【０１２５】
in vivoまたはex vivoでの細胞または組織への遺伝子送達手段としては、DNAそのままの直接注射、衝撃法、リポソーム仲介型伝達、受容体仲介型伝達(リガンド-DNA複合体)、エレクトロポレーション、およびリン酸カルシウム沈降が挙げられる(ただしこれらに限定されない)。米国特許第4,970,154号、WO 96/40958、米国特許第5,679,559号、米国特許第5,676,954号および米国特許第5,593,875号を参照のこと。これらはまた、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、パピローマウイルスまたは単純ヘルペスウイルス等のウイルスベクターの使用、DNA-タンパク質コンジュゲートの使用、ならびにリポソームの使用も含む。遺伝子療法ベクターの使用は、例えば、米国特許第5,672,344号、米国特許第5,399,346号、米国特許第5,631,236号および米国特許第5,635,399号に記載されている。
【０１２６】
NTP遺伝子は、本明細書に記載するような方法を用いて、本発明のNTP、またはその断片、変異体もしくは誘導体を発現および分泌するようにex vivoで遺伝子操作された特定の細胞を患者に移植することにより送達され得る。このような細胞は、動物またはヒト細胞であり、患者自身の組織または別の(ヒトまたは非ヒト)由来源から誘導され得る。任意に、細胞は不死化または幹細胞であってもよい。しかし、免疫学的応答の機会を少なくするため、細胞をカプセル化して、周囲組織の浸透を避けることが好ましい。カプセル化材料は、典型的に、タンパク質生成物は放出させるが、患者の免疫系または周囲組織の他の有害な要因による細胞の破壊は妨げる、生体適合性の半浸透高分子包囲体または膜である。細胞の膜カプセル化のために使用する方法は、当業者に公知であり、カプセル化細胞の調製、および患者におけるそれらの移植は、過度の実験無しに行い得る。例えば、米国特許第4,892,538号；同第5,011,472号；および同第5,106,627号を参照のこと。生存細胞をカプセル化するシステムは、PCT WO 91/10425に記載されている。様々な他の持続性または制御的な送達手段(リポソームキャリア、生体侵食粒子またはビーズ等)を剤形化する技術も、当業者に公知であり、例えば、米国特許第5,653,975号に記載されている。カプセル化されたまたはされていない細胞も、患者の適切な身体組織または器官に移植され得る。
【０１２７】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供する。しかし、本発明は、これらの実施例に記載する具体的な条件または詳細に限定されないことが理解されよう。明細書全体を通して、米国特許を含む公的な文献のいかなる全ての引用も、参照により特に援用するものである。
【０１２８】
実施例１
本実施例の目的は、神経膠腫および神経芽腫細胞に対するNTPの細胞傷害的影響をテストすることであった。
【０１２９】
神経芽腫は、主に子供がかかる癌である。頸部、胸部、腹部または骨盤中の神経組織から始まる。通常、腹部の副腎組織において発生する。診断時には、癌は、ほとんどの場合、リンパ節、肝臓、肺、骨および/または骨髄に広がっていることが多い。
【０１３０】
神経膠腫は脳腫瘍である。神経膠腫の腫瘍は、脳内で急速に発生し広がり易いために、特に損害が大きい。毎年、約20,000のアメリカ人が神経膠腫を患っていることを知る。半分以上が18ヶ月以内に死亡する。
【０１３１】
細胞培養：
低温保存された神経膠腫および神経芽腫細胞を、American Type Culture Collection (ATCC), Virginiaから得た。細胞を解凍し、懸濁培地に希釈し、700 rpmで７分間４℃にて遠心分離にかけた。次いで、細胞ペレットをCACO-2培地に再懸濁させ、標準的な75または175 cm2フラスコ中で、おおまかに集密するまで、37℃、5％CO2で培養した。次いで、細胞をトリプシン化し、CACO-2培地中に再懸濁させ、1.5×105細胞/mlの最終的な細胞密度を得た。その後、１サンプルにつき50μlアリコートを、96ウェルプレートの各ウェルに添加した。
【０１３２】
投薬：
実験Ｉについては、50μlのPBS(リン酸緩衝化溶液)(陰性対照)、100μMタモキシフェン含有リン酸緩衝化生理食塩水PBS(陽性対照)、またはテスト品のいずれかを、各サンプル培養液に添加した。
【０１３３】
実験IIについては、1 mMタモキシフェン含有DMSO(ジメチルスルホキシド)を、CACO-2培地中で100μM濃度に希釈し、１ウェルにつき100μlを陽性対照ウェルに添加した。1％DMSO含有CACO-2培地からなるビヒクル対照も、この実験に加えた。他の陰性対照は、ヒトおよびウシ血清アルブミン、ならびに他の非毒性ポリペプチドから構成した。
【０１３４】
MTTアッセイ：
MTTアッセイは、テトラゾリウム塩3,[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-臭化ジフェニルテトラゾリウム(MTT)の還元に基づく、細胞増殖を測定するための感受性アッセイである。
【０１３５】
対照またはテスト物質とのインキュベーションの後、培地を吸引し、100μl MTTを各ウェルに添加した。次いで、プレートを３時間、37℃、5％CO2でインキュベートした。次に、MTTを酸性化イソプロパノール(0.4 N HCl)と置き換え、プレートをカバーしたまま一晩４℃にて保存した。次いで、プレートを緩やかに１分間ロータリーシェーカー上で攪拌し、570 nmの発光吸光度と、650 nmのバックグラウンド吸光度との差を、自動化プレートリーダー上で分光光度学的に測定した。
【０１３６】
結果：
実験Ｉ：
神経芽腫および神経膠腫細胞を、テスト物質または対照溶液で処置した後に、24時間インキュベートした。この時点で、MTTを全ての培養液に添加した。結果は、平均吸光度の差として表し、陰性対照のパーセントとして表し、表４(神経膠腫細胞中の細胞傷害性)および表５(神経芽腫細胞中の細胞傷害性)に示す。
【表４】
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【表５】
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実験２：
神経膠腫細胞および神経芽腫細胞をこの実験に使用した。MTTを、対照またはテスト溶液との24時間のインキュベーションの後にプレートに添加した。他のプレートは、新しい培地、対照またはテスト溶液で24時間目に補充し、三日後に読み取った。結果は、平均吸光度の差として、および陰性対照のパーセントとして表し、表６(神経膠腫細胞)および表７(神経芽腫細胞)に示す。
【表６】
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【表７】
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結論：
神経膠腫および神経芽腫細胞に対する有意な細胞傷害性影響は、AD7C-NTPで、24時間および96時間において明らかであった。
【０１３７】
実施例２
本実施例の目的は、注射部位における組織に対するNTPの影響を判断することであった。
【０１３８】
８匹の正常ラットの皮膚に皮下的に、それぞれ３つの異なる焦点(foci)に、0.1〜10μg/mLの濃度の精製組換えAD7C-NTP含有生理食塩水を、プラスチックシリンジからステンレス26ゲージ針を介して送達して注射した。
【０１３９】
動物を24時間観察し、24時間目に無痛屠殺した。24の個々の湿潤焦点を切除し、10％ホルマリン中で固定し、パラフィンに埋め込み、標準的組織病理学的方法により染色および検査した。
【０１４０】
同様の対照ラットグループには、(1)ウシ血清アルブミン0.1％含有食塩水、(2)正常ヒト血清、(3)生理食塩水、(4)AD7C-NTPを含まないベクター由来の大腸菌タンパク質(AD7C-NTP精製と同様の処置により精製)；(5)大腸菌で発現させ精製した非NTP組換えタンパク質を注射し、その後、上述のように検査および屠殺し、切除した注射焦点を上述のように処置した。
【０１４１】
結果
全実施例におけるAD7C-NTPの注射により、注射部位において組織の十分な急性壊死が得られた(図１〜５)。壊死は、AD7C-NTPを注射した部位における、筋肉組織、皮下結合組織、および真皮において顕著であった。24時間目に、細胞は色を失い、収縮し、壊死した。炎症性細胞で浸潤が見られた。壊死は、注射領域と相関し、注射部位を超えて広がっているようには見えない。
【０１４２】
軽度の炎症領域以外は、対照は、壊死または細胞損失の徴候は示さなかった。筋肉繊維層の全体が壊死したAD7C-NTP注射と対照的に、対照は、筋肉の変化が最小限または無かった。対照注射は、注射部位において軽度から最小限の急性炎症、および針による焦点微出血を有するのみであった。
【０１４３】
実施例３
本実施例の目的は、異なるヒトおよび非ヒト由来源腫瘍に対するNTPの影響を判断することであった。
【０１４４】
げっ歯類モデルにおける乳癌、皮膚癌および乳頭腫、結腸癌、脳の神経膠腫等を含む様々なヒトおよび非ヒト由来源腫瘍に対して、AD7C-NTP湿潤をテストした。腫瘍は、実施例２に記載のようにAD7C-NTPで直接浸潤させた、実験動物を観察し、24時間から２週間の間隔をあけた後に無痛屠殺した。屠殺後、腫瘍の組織病理学的検査を上述したように行った。
【０１４５】
対照腫瘍は、(1)未処置、(2)正常ヒト血清での浸潤、(3)ウシ血清アルブミンでの湿潤、および(4)食塩水での湿潤で、テストした。
【０１４６】
結果
テストした全てのケースにおいて、AD7C-NTP浸潤後に腫瘍細胞の有意な壊死が見とめられた(図６〜１０)。24時間の間をあけた２本の注射の実施例では、一回の注射後よりも腫瘍が破壊された。一部の実験では、腫瘍はほぼ完全に退行していた。１回の注射後の別の例では、AD7C-NTPをさらに注射しなかった場合に１〜２週間後に腫瘍が大きくなった。AD7C-NTPで１回注射され、２週間後に組織学的に検査された一部の腫瘍では、元々腫瘍があったところに周囲を腫瘍の周縁に囲まれた大きな空洞があり、壊死後の浸潤した腫瘍が空洞化し、消えたことを示した。１回の注射で処置し、２週間後に組織学的に検査した他の腫瘍では、対照では見とめられなかった腫瘍内での広範囲な繊維質があり、腫瘍破壊およびその後の繊維形成の結果であると考えられる。対照のケースは、焦点的な微出血および炎症、ならびに時に変形を示したのみで、壊死はわずかで、AD7C-NTP注入で見とめられた大規模な壊死の痕跡はなかった。
【０１４７】
本発明の思想または範囲から逸脱することなく、本発明の方法および組成物において様々な改変および変更が行われ得ることが当業者には理解されよう。従って、本発明は、添付の請求の範囲内およびそれらの等価物である場合には、本発明の改変および変更を網羅することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１Ａ】AD7c-NTP遺伝子および該遺伝子のAD7c-NTPタンパク質生成物の完全アミノ酸配列および核酸配列を示す(米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列120および121；de la Monteら, J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)；NCBI Entrez-Protein受託番号AAC08737；PID g3002527)[配列番号１]。
【図１Ｂ】図１Ａの続き。AD7c-NTP遺伝子および該遺伝子のAD7c-NTPタンパク質生成物の完全アミノ酸配列および核酸配列を示す(米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列120および121；de la Monteら, J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)；NCBI Entrez-Protein受託番号AAC08737；PID g3002527)[配列番号１]。
【図１Ｃ】図１Ｂの続き。AD7c-NTP遺伝子および該遺伝子のAD7c-NTPタンパク質生成物の完全アミノ酸配列および核酸配列を示す(米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列120および121；de la Monteら, J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)；NCBI Entrez-Protein受託番号AAC08737；PID g3002527)[配列番号１]。
【図２】122アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す(米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列40；NCBI Entrez-Protein受託番号AAE25447 PID g10048540)[配列番号２]。
【図３】112アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す(NCBI Entrez-Protein受託番号XP 032307 PID g15928971)[配列番号３]。
【図４】106アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質の完全アミノ酸配列を示す(NCBI Entrez-Protein受託番号AAH14951 PID g15928971)[配列番号４]。
【図５】106アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質の完全アミノ酸配列を示す(NCBI Entrez-Protein受託番号XP_039102 PID g18599339)[配列番号５]。
【図６】98アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す(米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列30；NCBI Entrez-Protein受託番号AAE25445、PID g10048538)[配列番号６]。
【図７】75アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す(米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列48；NCBI Entrez-Protein受託番号AAE25448、PID g10048541)[配列番号７]。
【図８】68アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す(米国特許第5,830,670号、同第5,948,634号および同第5,948,888号の配列36；NCBI Entrez-Protein受託番号AAE25446、PID g10048539)[配列番号８]。
【図９】61アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質の完全アミノ酸配列を示す(NCBI Entrez-Protein受託番号AAH02534、PID g12803421)[配列番号９]。
【図１０】注射24時間後の、AD7C-NTP注射部位における皮下組織および筋肉壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、×400；
【図１１】注射24時間後の、AD7C-NTP注射部位における皮下組織および筋肉壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、×400；
【図１２】注射24時間後の、AD7C-NTP注射部位における皮下組織および筋肉壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、×400；
【図１３】注射24時間後の、AD7C-NTP注射部位における皮下組織および筋肉壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、×1000；
【図１４】注射24時間後の、AD7C-NTP注射部位における皮下組織および筋肉壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、×1000；
【図１５】AD7C-NTP注射24時間後の腫瘍壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色  ×200；
【図１６】AD7C-NTP注射24時間後の腫瘍壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色  ×400；
【図１７】AD7C-NTP注射24時間後の腫瘍壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色  ×1000；
【図１８】AD7C-NTP注射２週間後の腫瘍壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色  ×40；ならびに
【図１９】AD7C-NTP注射２週間後の腫瘍壊死を示す。光学顕微鏡検査、ヘマトキシリンおよびエオシン染色  ×200。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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2004529908.tif 000099
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004529908.tif 000102
【国際調査報告】
2004529908.tif 000103
2004529908.tif 000104
2004529908.tif 000105