(57)【要約】一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の場合などにおいて、適合および不適合一ヌクレオチド部位を識別するために、プライマー伸長法およびエキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼの利用と組み合わせた、ローリング  サークル増幅（ＲＣＡ）の使用を含む対立遺伝子識別のための方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、
（ａ）一つあるいはそれ以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド  プライマー（Ｐ１）と一つあるいはそれ以上の標的ポリヌクレオチド（ＴＰ）との接触であって、ここで前記標的ポリヌクレオチドは、その一末端部あるいは隣接部に、前記Ｐ１上に位置する第２部位と相補的な第１部位を含有するが、しかしここで前記Ｐ１の前記末端における、末端ヌクレオチドおよび末端ヌクレオチドから３つめのヌクレオチドは、前記標的ポリヌクレオチドの対応ヌクレオチドに相補的でないこともあり、そしてここで前記接触は、第１および第２部位のハイブリッド形成を促進する条件下で起こり、それによるＰ１−ＴＰ複合体の形成；
（ｂ）鋳型としてのＴＰを伴うＰ１の伸長を促進する条件下での、（ａ）のＰ１−ＴＰ複合体とエキソヌクレアーゼ欠失デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）ポリメラーゼ酵素との接触、それによるＰ１の伸長分節（ＥＳ）の形成；および、
（ｃ）伸長Ｐ１の検出、
より成ることを特徴とするプロセス。
【請求項２】
請求項１記載の伸長Ｐ１を検出するための一つのプロセスであって、ここで前記プロセスが、
（ｄ）（ｂ）段階において形成された複合体からの標的ポリヌクレオチド（ＴＰ）の除去；
（ｅ）プライマー  オリゴヌクレオチド（Ｐ２）と伸長Ｐ１との接触であって、ここでプライマー  オリゴヌクレオチドは、（ｂ）段階において形成された伸長分節（ＥＳ）の最低一つの部位と相補的な第１分節および前記プライマー  オリゴヌクレオチド（Ｐ２）の３′末端を含む第２分節より成り、ＥＰ１−Ｐ２複合体を形成するために、Ｐ２と伸長Ｐ１（ＥＰ１）のハイブリッド形成を促進する条件下で行われる接触；
（ｆ）ＥＰ１−Ｐ２−ＡＴＣ複合体を形成するために、増幅標的サークルと前記ＥＰ１−Ｐ２複合体のＰ２部位との間のハイブリッド形成を促進する条件下での増幅標的サークル（ＡＴＣ）とＥＰ１−Ｐ２複合体との接触；および
（ｇ）増幅標的サークルの複製を促進する条件下での、ＤＮＡポリメラーゼとＥＰ１−Ｐ２−ＡＴＣ複合体との接触、
より成り、ここで前記ＡＴＣの複製の結果、縦列配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）が形成され、それによりＰ１の伸長を示唆することを特徴とするプロセス。
【請求項３】
請求項２記載のプロセスであって、ここで標的ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから得られることを特徴とするプロセス。
【請求項４】
請求項２記載のプロセスであって、ここでＤＮＡがゲノムＤＮＡであることを特徴とするプロセス。
【請求項５】
請求項４記載のプロセスであって、ここでゲノムＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡであることを特徴とするプロセス。
【請求項６】
請求項４記載のプロセスであって、ここでゲノムＤＮＡが非ヒトゲノムＤＮＡであることを特徴とするプロセス。
【請求項７】
請求項２記載のプロセスであって、ここで標的ＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡおよび非ヒトゲノムＤＮＡの混合であることを特徴とするプロセス。
【請求項８】
請求項２記載のプロセスであって、ここで（ｇ）段階のＤＮＡポリメラーゼが、バクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ、ファージφ−ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ  フラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、ＴｔｓポリメラーゼおよびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼより成るグループから選択された酵素であることを特徴とするプロセス。
【請求項９】
請求項１記載のプロセスであって、ここでエキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼがＴ７シークエナーゼあるいはＴｔｈポリメラーゼであることを特徴とするプロセス。
【請求項１０】
請求項２記載のプロセスであって、ここで（ｇ）段階のＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ欠失であることを特徴とするプロセス。
【請求項１１】
請求項１０記載のプロセスであって、ここでＤＮＡポリメラーゼがクレノウ  ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ  ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）、Ｐｆｕ  ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）、Ｔａｑ  ポリメラーゼ、Ｔａｑ  ポリメラーゼのＳｔｏｅｆｆｅｌ断片、Ｂｓｔポリメラーゼ、ＴｔｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｏシークエナーゼより成るグループから選択された酵素であることを特徴とするプロセス。
【請求項１２】
請求項１記載のプロセスであって、ここで対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド  プライマー（Ｐ１）の最低一末端が固体支持材に付着していることを特徴とするプロセス。
【請求項１３】
請求項１２記載のプロセスであって、ここで固体支持材が最低、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン  ビニル  アセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリル樹脂、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（Ｒ）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸より成るグループから選択された一つより成ることを特徴とするプロセス。
【請求項１４】
請求項１２記載のプロセスであって、ここで前記固体支持材がガラスあるいはプラスチックより成ることを特徴とするプロセス。
【請求項１５】
請求項１記載のプロセスであって、ここで対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド  プライマー（Ｐ１）が、配列番号：１、２、３、４、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２６の配列より成るグループから選択されることを特徴とするプロセス。
【請求項１６】
請求項２記載のプロセスであって、ここで前記プライマー（Ｐ２）が、配列番号２７，２８，３４および３５より成るグループから選択された配列を持つオリゴヌクレオチドより成り、ここで前記配列のそれぞれが双極性形態に変換されていることを特徴とするプロセス。
【請求項１７】
請求項２記載のプロセスであって、ここで前記ＡＴＣが、配列番号２９および３０より成るグループから選択された配列を持つポリヌクレオチドより成ることを特徴とするプロセス。
【請求項１８】
遺伝子突然変異により特徴付けられる疾病を診断するための一つの方法であって、ここで前記方法が、
（ａ）前記疾病に苦しむ生物からの突然変異遺伝子配列のサンプルの獲得；および、
（ｂ）前記突然変異遺伝子配列の最低一部が、標的ポリヌクレオチドあるいは対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとして用いられる、請求項１記載のプロセスの実施
より成ることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８記載のプロセスであって、ここで突然変異遺伝子配列が標的ポリヌクレオチドとして用いられることを特徴とするプロセス。
【請求項２０】
請求項１８記載のプロセスであって、ここで前記生物がヒトであることを特徴とするプロセス。
【請求項２１】
請求項１８記載のプロセスであって、ここで前記疾病が、最低一つの遺伝子における突然変異により引き起こされ、誘導され、あるいは関連する疾病であることを特徴とするプロセス。
【請求項２２】
請求項２１記載のプロセスであって、ここで前記疾病が、パーキンソン病、ヂュシェーヌ筋ジストロフィー、ニーマン・ピック病、ポリープ病、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、テイ・サックス病、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調、ハンチントン病、リー・フラウメニー癌症候群、ベータ・サラセミア、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ病、血友病、急性間欠性ポルフィリン病、嚢胞性線維症、糖尿病、肥満症およびガンより成るグループから選択された一つであることを特徴とするプロセス。
【請求項２３】
請求項２２記載のプロセスであって、ここで前記ガンが、白血病、リンパ腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、頭頸部ガン、皮膚ガン、脳腫瘍、食道ガン、胃ガン、肺ガン、乳ガン、大腸ガン、卵巣ガン、睾丸ガンおよび前立腺ガンより成るグループから選択された一つであることを特徴とするプロセス。
【請求項２４】
請求項１記載のプロセスであって、ここで前記Ｐ１の末端から３つめのヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの対応ヌクレオチドに相補的であることを特徴とするプロセス。
【請求項２５】
請求項２記載のプロセスであって、ここで前記Ｐ１の末端から３つめのヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの対応ヌクレオチドに相補的であることを特徴とするプロセス。
【請求項２６】
請求項１記載のプロセスであって、ここで前記Ｐ１の末端から３つめのヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの対応ヌクレオチドに相補的ではないことを特徴とするプロセス。
【請求項２７】
請求項２記載のプロセスであって、ここで前記Ｐ１の末端から３つめのヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドの対応ヌクレオチドに相補的ではないことを特徴とするプロセス。
【請求項２８】
請求項１記載のプロセスであって、ここで前記Ｐ１の末端ヌクレオチドおよび末端から３つめのヌクレオチドのそれぞれが、標的ポリヌクレオチドの対応ヌクレオチドに相補的ではないことを特徴とするプロセス。
【請求項２９】
請求項２記載のプロセスであって、ここで前記Ｐ１の末端ヌクレオチドおよび末端から３つめのヌクレオチドのそれぞれが、標的ポリヌクレオチドの対応ヌクレオチドに相補的ではないことを特徴とするプロセス。
【請求項３０】
一つのキットであって、ここで前記キットが
（ａ）それぞれがオリゴヌクレオチド  プローブの末端残基について不適合を有するあるいは有しない一つあるいはそれ以上の標的ポリヌクレオチドと、ハイブリッド形成することが可能である、多数のオリゴヌクレオチド  プローブ；
（ｂ）エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼのサンプル；
（ｃ）それぞれがローリング  サークル増幅法において用いるための増幅標的サークル（ＡＴＣ）上の配列に対して相補的なプライマー配列より成り、前記オリゴヌクレオチド  プローブの伸長した分節とハイブリッド形成することが可能である、多数の増幅プライマー；
（ｄ）本質的に単鎖ＤＮＡサークルであり、１０から２０、さらには３０ヌクレオチド長の配列より成り、前記配列は項目（ｃ）の増幅プライマーの配列に相補的な配列であり、ローリング  サークル増幅法（ＲＣＡ）の鋳型として働く、一つあるいはそれ以上の増幅標的サークル（ＡＴＣ）のサンプル；
（ｅ）複数回のローリング  サークル増幅法を実施することが可能なＤＮＡポリメラーゼのサンプル；
（ｆ）種々の標識試薬およびアドレス  プローブを含むが、これに限定されないローリング  サークル増幅の産物を検出するための手段；および
（ｇ）請求項１および請求項２の段階を実施するための説明書のセット
より成ることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は２０００年４月５日に出願された合衆国暫定特許出願番号６０／１９４８４３号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、ハイブリッド形成したプライマーおよび標的オリゴヌクレオチドの不適合３′末端から適合３′末端を区別するためにエキソヌクレアーゼ欠失ポリメラ−ゼを用いるプライマー伸長法を用いた対立遺伝子識別のためのプロセスに関する。
【０００３】
【発明の背景】
多くの疾病がその病因に遺伝的根拠を持つことが知られており、前記疾病は、前記疾病に苦しむ種々の生物、特に、ヒトを含む動物のゲノム中に存在する遺伝子配列における突然変異の発生により生じる。その結果、健康なヒトのゲノムと遺伝子欠陥に苦しむヒトのゲノムとの間の、（一ヌクレオチド多型すなわちＳＮＰｓといわれる）一ヌクレオチドほどの大きさのわずかな遺伝的差異を検出するための方法は、前記状態の性質および原因を明らかにすることにおいて、非常に有益に検査することができる。より重要なことに、前記状態についての有益な情報を得ることは、高感度プロセスをゲノム中の特定の部位における一ヌクレオチドの差異などの小遺伝子欠陥を確認するために利用できる場合には、大いに価値が高まる。
【０００４】
ゲノムは、それ自体が一つあるいはそれ以上の遺伝子から構成される種々の遺伝子座から構成され、前記遺伝子は、各システムに対して、変異、すなわち対立遺伝子を含み得る。例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーは、ｉｎｔｅｒ  ａｌｉａ、Ｔ細胞レセプター、免疫グロブリンおよびＨＬＡ（すなわちヒト白血球抗原）システムを含み、多数の配列変異（すなわち多型）の存在により特徴付けられる。免疫応答における欠陥は、前記システムの一つあるいはそれ以上の遺伝子配列における種々の変異が原因であり、結果的に疾病を生じ得る。逆に、嚢胞性線維症のような疾病は、ＤＮＡ配列中に変異および複合遺伝子変異を示す。したがって、遺伝子変異は、疾病およびその症状に関連し得る。関連する対立遺伝子、特にそれらの対立遺伝子における差異の同定は、遺伝子マーカーに関連する疾病の危険性の確認において、あるいは結果的にその他の疾病を生じる遺伝子における差異を検出することにおいて重要であり得る。さらには、わずかな遺伝子差異の描写は、特定の疾病の診断（さらには処置）と同様、特定の疾病に対する最大の危険を持つヒトを同定することによる予防に対するさらなる試みに容易に用いることができる。後者は、早期の処置が可能となり疾病の発生を阻止できるようにするためには、重大な要素である。
【０００５】
核酸における特異的なヌクレオチド変異および遺伝子多型を検出するための方法のいくつかは、知られている。例えば、いくつかの方法は、ヌクレオチド変異、突然変異および多型を持つ核酸配列の増幅、それに続く対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド配列を用いた前記増幅配列の検出およびドットプロットより成る。この方法は、検出されるヌクレオチド変異に対して非常に特異的でなければならない対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド配列を利用し、試験されるＤＮＡ配列に依存した、そこで用いるための多数のプライマー配列を提供する（例えば、ＥＰ−Ａ−２３７３６２参照）。
【０００６】
Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６，６２３０−６２３４（１９８９）と同様にＷＯ８９／１１５４７の両方は、固定化配列特異的オリゴヌクレオチドの使用を開示する。ＷＯ８９／１１５４７は、ＨＬＡ−ＤＰ遺伝子座中に異なる対立遺伝子を持つ遺伝子型を決定するための方法を開示する。後者の方法は、核酸サンプルと種々の分節に特異的な一連のプローブをハイブリッド形成することより作用する。
【０００７】
合衆国特許番号５９１２１４８は、単一反応容器における複合遺伝子システムの分析のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法と同様にオリゴヌクレオチドリガーゼ検定（ＯＬＡ）法を開示する（そこに引用されたその他の方法も参照）。この方法は、種々のＯＬＡおよびＰＣＲプローブを用いたＯＬＡ反応産物を決定することを試みるものである。
【０００８】
合衆国特許番号５７５９７７１は、特定の遺伝子座の多型分節の側面に位置する遺伝子システムの構成要素のヌクレオチド配列を比較することにより、遺伝子型を決定するための方法を開示する。ここで、比較した配列は、異なる源由来の高度に保存された分節を増幅するために用いられた保存された配列を含む。これらは、その後遺伝子型を確立する方法として比較される。
【０００９】
合衆国特許番号５７１００２８は、重要な核酸中の特異的な部位におけるヌクレオチド塩基の同一性の同時決定の方法を開示するが、この方法は、標的配列（鋳型として働く）中の特定の部位に存在する特定のヌクレオチドがある場合に伸長を止めるために、通常ジデオキシヌクレオシド三リン酸などの伸長遮断薬の使用に頼るものである。同様の方法は、合衆国特許番号６０１３４３１において用いられている。
【００１０】
核酸配列分析は、多くの調査、医療および産業分野で重要なものとなり、その方法の多くは、文献に開示されてきた。これまで、これらの方法の多くは、例えば、合衆国特許番号５１３７８０６のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）、その他同種のものと同様に、ローリング  サークル増幅法（ＲＣＡ）（例えば合衆国特許番号５８５４０３３；Ｌｉｚａｒｄｉ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９，２２５−２３２（１９９８）参照）などの標的核酸を増幅するための種々の方法の開発によって誘導されてきた。前記増幅技術は、高感度で特異的な診断検定の開発のための基礎として、明らかに有益であるが、場合によっては、特に、分析の対象となるシステムが、例えばより高度に変異した嚢胞性線維症遺伝子座といった複合遺伝子システムなどの複雑なものである場合には、これらの方法はかなり複雑になり得る。前記システムにおける増幅産物を同定することは困難であるため、特にＲＣＡ以外の場合には、増幅後の処置が必要であろう。これらの問題を回避するために用いられる一つの方法は、オリゴヌクレオチド  ライゲーション検定（ＯＬＡ）である（合衆国特許番号４８８３７５０）。ここで、オリゴヌクレオチドは、標的配列の隣接した領域に相補的となるように調製され、標的に対してハイブリッド形成できるため、これらは端から端までに位置し、隣接末端部あるいはその近くに不適合がない場合にはライゲーション可能である。不適合が存在する場合には、ライゲーションは妨げられる。この結果物は、特定の遺伝子座における重要な全ての対立遺伝子変異の完全な相補鎖である一組のオリゴヌクレオチド対である。慎重に標識方法を選択することにより、広範囲の対立遺伝子を一検定において特異的に同定することができる。しかし、前記検定は複雑に成り得る（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：８９２３−８９２７（１９９０））。
【００１１】
対立遺伝子識別のためのその他の方法は、２つの隣接短オリゴヌクレオチドの鋳型依存ライゲーションに依存する。第一の前記オリゴヌクレオチドは、ＲＣＡに対するプライマーおよび対立遺伝子特異的３′末端残基で終結する標的特異的短配列を含む、逆極性オリゴヌクレオチドから成る。第二のオリゴヌクレオチドは、ガラススライド上に固定され、標的特異的オリゴヌクレオチド配列に隣接してアニールする。鋳型依存および対立遺伝子特異的ライゲーションは、ＲＣＡ台座をスライドに固定する。ＲＣＡに続いて、産物は標準蛍光および免疫化学技術により検出される。異なるサークルにアニールする対立遺伝子特異的プライマーの使用は、種々の対立遺伝子の同時検定を可能にする（すなわちマルチプレキシング）。前記方法は、対立遺伝子識別としてライゲーション段階に依存する（Ｌｉｚａｒｄｉ他，ｓｕｐｒａ参照）。
【００１２】
別の方法の一つは、細胞学サンプル中の突然変異を検出するためのパドロック  プローブを使用するＲＣＡを用いる。しかし、パドロック  プローブは、ＤＮＡ標的に対する立体障害および形態抑制に起因して、常に有益というわけではない。前記方法もまたライゲーション段階に依存する（参照：Ｎｉｌｓｓｏｎ他，Ｐａｄｌｏｃｋ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，２０８５−２０８８（１９９４））。
【００１３】
これらの方法を簡易化するための方法の一つは、いくつかの段階を削除することであり、それにより方法全体を簡易化し迅速化する。例えば、前記方法は、対立遺伝子識別段階としてＤＮＡライゲーションに依存するという不利益を有する。
【００１４】
本発明にしたがった方法は、単一突然変異（すなわちＳＮＰｓ）に高感度であると共に単一複製遺伝子に対してより効果的であり高感度であるという全体的な利点を持つことにより、これらの問題を克服する。より特異的には、前記利点は、新しい突然変異が直接的に検出でき、その後機能性について（突然変異を起こしたポリペプチドおよびポリヌクレオチドの単なる血清学試験に対して）より詳細に調査することができるという事実を含む。加えて、本方法は簡易であり、したがって広く利用に供することができ、大規模な検査について容易に自動化することができ、あるいはマニュアルおよびスポット測定のためのキットとして容易に提供することができる。あるいは本分野での使用に対して、縣濁液中で、あるいは産物の迅速な単離のために固体支持材を用いて行うことができ、多くの異なる検出法を施すことが容易であり、異なる対立遺伝子あるいは一連の対立遺伝子を容易に、そして同時に検出可能なマルチプレキシングに容易に適応する。加えて、本発明の方法は、対立遺伝子識別、ＳＮＰｓの検出、遺伝子型決定、分子ハプロタイプ決定および突然変異検出、その他ここに記載しない方法において有益である。
【００１５】
【発明の簡単な要約】
本発明は、エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼ活性によるプライマー伸長法を用いて、遺伝子配列中の特異的部位にける一つあるいはそれ以上のヌクレオチドを検出する方法に関する。
【００１６】
したがって本発明の目的の一つは、標的ポリヌクレオチド配列における不適合を検出するためのプローブの能力を用いた遺伝子型決定の簡易で迅速な方法を提供することであり、そのため、特定不適合（すなわち突然変異残基）が存在しないと、容易に検出可能な前決定遺伝子配列の増幅に至り、ここで前記配列増幅が無いことは、一ヌクレオチド不適合の存在の確実な指標である。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、その他の突然変異と同様一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）の検出において一般的に使用し、および分子ハプロタイプ決定において使用する簡易、特異的そして分かりやすい対立遺伝子識別の方法として、特異的ヌクレオチド部位における不適合を検出する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、標的ポリヌクレオチド中の突然変異を検出する方法として特異的遺伝子配列を増幅するための方法を提供することである。ここで前記標的ポリヌクレオチドは、動物のゲノムから得られ、前記動物は、特にヒトであるが、しかしまたヒト以外の動物でもある。
【００１９】
本発明のまた他の目的は、特異的プローブおよび標識試薬、特に蛍光標識の使用を含む全ての形式の検出を容易に施すことができる、ローリング  サークル増幅および縦列ＤＮＡ配列形成による対立遺伝子識別の方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらにまた他の目的は、懸濁液、溶液中での使用に容易に適用することができる配列増幅、あるいは前記増幅の産物の迅速な単離のための固体支持材の使用による、遺伝子型決定のための方法を提供することである。
【００２１】
本発明のまたさらに他の目的は、既知のマルチプレキシング技術を受けることが容易であり、それによりサンプル中の異なる対立遺伝子の同時検出を容易にし、検出のために利用できる蛍光検出剤および装置の数によってのみ制限される方法による、複対立遺伝子識別における有益な方法を提供することである。
【００２２】
別の実施例において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットに向けられるものである。好ましくは、前記キットは、（ａ）それぞれがオリゴヌクレオチド  プローブの末端残基について不適合を有するあるいは有しない一つあるいはそれ以上の標的ポリヌクレオチドに、ハイブリッド形成することが可能である、多数のオリゴヌクレオチド  プローブ；（ｂ）エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼのサンプル；（ｃ）それぞれがローリング  サークル増幅法において用いるための増幅標的サークル（ＡＴＣ）上の配列に対して相補的なプライマー配列より成り、前記オリゴヌクレオチド  プローブの伸長した分節にハイブリッド形成することが可能である、多数の増幅プライマー；（ｄ）本質的に単鎖ＤＮＡサークルであり、１０から２０、さらには３０ヌクレオチド長の配列より成り、前記配列は項目（ｃ）の増幅プライマーの配列に相補的な配列であり、ローリング  サークル増幅法（ＲＣＡ）の鋳型として働く、増幅標的サークル（ＡＴＣ）のサンプル；（ｅ）Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼなどの、複数回のローリング  サークル増幅法を実施することが可能なＤＮＡポリメラーゼのサンプル；および（ｆ）種々の標識試薬およびアドレス  プローブおよびタグを含むが、これに限定されないローリング  サークル増幅の産物を検出するための手段、を含む。
【００２３】
【発明の説明】
通常、本発明は、参照配列とは異なる対立遺伝子を含む標的核酸配列の、簡易で、定量的で、一定し、そしてより信頼性の高い増幅および検出のための方法に関する。本発明の方法の適用により、標的配列が、標的配列に適合あるいは不適合な小プライマープローブにより増幅され、その後プライマープローブは伸長され、標的は除去され、プライマープローブは、任意のプライマーが結合する配列を含む二次プローブと適合される。これは、非常に異なる標的配列を持つプローブ間であっても、プライミングおよび複製反応における一貫性を可能にする。加えて、増幅は、サイクル中には起こらず、連続的な等温ローリング  サークル増幅において起こり、それにより、続く検出および同定に対して、より信頼性の高い、簡易なそしてより一定した出力を提供する。本発明の方法は、選択された標的配列において、異なる対立遺伝子あるいは突然変異を示す不適合配列の検出を容易にする。
【００２４】
ここでの開示にしたがって、本発明は一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するためのプロセスに関し、
（ａ）一つあるいはそれ以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド  プライマー（Ｐ１）と一つあるいはそれ以上の標的ポリヌクレオチド（ＴＰ）との接触であって、ここで前記標的ポリヌクレオチドは、その一末端部あるいは隣接部に、前記Ｐ１上に位置する第２部位と相補的な第１部位を含有するが、しかしここで前記Ｐ１の前記末端における、末端ヌクレオチドおよび末端ヌクレオチドから３つめのヌクレオチドは、前記標的ポリヌクレオチドの対応ヌクレオチドに相補的でないこともあり、そしてここで前記接触は、第１および第２部位のハイブリッド形成を促進する条件下で起こり、それによるＰ１−ＴＰ複合体の形成；
（ｂ）鋳型としてのＴＰを伴うＰ１の伸長を促進する条件下での、（ａ）のＰ１−ＴＰ複合体とエキソヌクレアーゼ欠失デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）ポリメラーゼ酵素との接触、それによるＰ１の伸長分節（ＥＳ）の形成；および、
（ｃ）伸長Ｐ１の検出、
より成る。
【００２５】
本発明はまた、前記段階を含む伸長Ｐ１を増幅し、およびまたは検出するためのプロセスに関する。ここで前記プロセスはさらに、追加段階：
（ｄ）前記複合体からの標的ポリヌクレオチド（ＴＰ）の除去；
（ｅ）プライマー  オリゴヌクレオチド（Ｐ２）と伸長Ｐ１との接触であって、ここでプライマー  オリゴヌクレオチドは、（ｂ）段階において形成された伸長分節（ＥＳ）の最低一つの部位と相補的な第１分節および前記プライマー  オリゴヌクレオチド（Ｐ２）の３′末端を含む第２分節より成り、ＥＰ１−Ｐ２複合体を形成するために、Ｐ２と伸長Ｐ１（ＥＰ１）のハイブリッド形成を促進する条件下で行われる接触；
（ｆ）ＥＰ１−Ｐ２−ＡＴＣ複合体を形成するために、増幅標的サークルと前記ＥＰ１−Ｐ２複合体のＰ２部位との間のハイブリッド形成を促進する条件下での増幅標的サークル（ＡＴＣ）とＥＰ１−Ｐ２複合体との接触；および
（ｇ）増幅標的サークルの複製を促進する条件下での、ＤＮＡポリメラーゼとＥＰ１−Ｐ２−ＡＴＣ複合体との接触、
より成り、ここで前記ＡＴＣの複製の結果、縦列配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）が形成され、それにより伸長Ｐ１（および、本発明の一つの実施例において、野生型標的あるいはＰ１ポリヌクレオチド）の存在を示す。
【００２６】
図１は本発明の実施例を示し、ここで固定オリゴヌクレオチド（Ｐ１）へのローリング  サークル増幅（ＲＣＡ）台座の固定は、標的および対立遺伝子特異的態様において達成される。ここで示されたように、Ｐ１オリゴヌクレオチド（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドあるいはＡＳＯあるいはＰ１プローブ）は、対立遺伝子特異的３′末端で終結する標的特異的短配列を含有する。標的ＤＮＡ（左側のパネルに示される野生型ゲノムＤＮＡあるいは右側のパネルに示される突然変異ゲノムＤＮＡ）は、Ｐ１の３′末端部位あるいはその隣接部においてこのオリゴヌクレオチド（Ｐ１）とアニールする。本発明の方法にしたがって、Ｐ１の３′末端ヌクレオチドは、標的ＤＮＡの対応ヌクレオチドと適合するかあるいは適合しない。したがって、本発明の一つの実施例において、図１のパネルＡに示されるように、野生型ゲノムＤＮＡの場合には、適合する。この場合Ｐ１の３′末端ヌクレオチド残基は、標準ワトソン−クリック対合機構において、（標的ＤＮＡに示される）グアニン（Ｇ）残基と通常の組合せであるシトシン（Ｃ）残基である。逆に、突然変異ＤＮＡ（図１のパネルＡ′）の場合には、対応標的ヌクレオチドはチミン（Ｔ）残基であり、適合しない。結果的に、ＡＳＯ（Ｐ１）の３′末端残基は標的突然変異ゲノムＤＮＡの相補的ヌクレオチドと対合せず、それにより不適合を生じる。前記アニールに続いて、図１のパネルＢにおける前記オリゴヌクレオチド（Ｐ１）の３′末端は、その後、鋳型としての標的ＤＮＡおよびプライマーとしてのＰ１の３′末端を伴うエキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼを用いた限定合成により伸長し、全ては不適合３′末端と適合３′末端を識別する条件下で行われる。おそらく４０から５０残基、しかし最低でも約４０残基の前記限定ＤＮＡ合成に続いて、標的ＤＮＡは、除去を促進する条件に変えることにより除去される。Ｐ１の伸長部分は、ライゲーション段階を必要とすることなく、Ｐ１の３′末端であった部分と共有結合するために残存する。本発明のさらなる実施例において、故意に配列される不適合がまた、ＡＳＯあるいはＰ１の−３残基（すなわち３′末端から３番目の残基）に生じ得るが、前記不適合は、用いられるエキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼに依存した対立遺伝子識別の感度を増加し得る。
【００２７】
ここに開示された発明にしたがって、Ｐ１プライマーは、本発明の方法に有益な適切な対立遺伝子特異的配列を含むならば、任意の型のオリゴヌクレオチドであり得る。ここで３′末端ヌクレオチドは、適合する場合には続いて起こる伸長のための望ましい適合あるいは不適合を規定する。好ましい実施例にいて、前記プローブ  オリゴヌクレオチドは、３′末端ホスホロチオエート構造を含み、前記構造は、エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性を持つ。加えて、前記誘導体の水素結合は弱く、したがって適合対および不適合対間の化学的差異が大きくなる。他の実施例において、最後の２つ、好ましくは３つのリン酸ジエステル結合は、ホスホロチオエート誘導体によって置換される。注意すべきことは、前記Ｐ１プローブあるいはＰ１プライマーの伸長は、プローブと標的が適合する場合のみ起こり、前記適合は、標的ＤＮＡ中に存在する野生型あるいは突然変異対立遺伝子を示し得るあるいは示さないということである。したがって、使用者の意向に依存して、ここに開示された方法は、ＡＳＯ（あるいはＰ１）に用いられた配列に依存して、前記適合が野生型対立遺伝子あるいは突然変異対立遺伝子を示すことを可能にする。
【００２８】
図１のパネルＣに示されたように、ＲＣＡ台座あるいは増幅プライマー配列を含む二次プライマー（Ｐ２）、すなわち増幅プライマーは、新しく伸長し、固定されたＤＮＡにアニール（すなわちハイブリッド形成）する（前記方法は溶液あるいは懸濁液中で行うことができる）。増幅プライマーＰ２は、一続きのチミジンにより分けられる２つの機能性を有するため、二官能性あるいは双極性である（例えば配列番号：２７参照）。加えて、Ｐ２は、Ｐ１の伸長部位の、配列全体でないとしても、分節に相補的な第１分節、部位、断片あるいは配列を有する（そしてそれにより、伸長部位の合成のために鋳型として用いた標的ＤＮＡ配列に、同一でないにしても、相同性の高い配列を持つ）。加えて、増幅プライマーＰ２は、第２分節、部位、断片あるいは配列、すなわち前記第１相補的配列と反対側の３′末端に位置する増幅プライマー配列より成り、前記増幅プライマー配列は、単鎖ＤＮＡサークル、すなわち増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）上に存在する配列に相補的である。そのため、後者が混合物中に加えられた場合には、前記ＡＴＣｓは、増幅プライマー配列にハイブリッド形成し、その後、後者は、鋳型として増幅標的サークルＤＮＡを用いるローリング  サークル増幅（ＲＣＡ）のためのプライマーとしての役割を果たす。
【００２９】
反応混合物へのＡＴＣｓの添加および、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼなどのローリング  サークル増幅を実施することができるＤＮＡポリメラーゼの添加に続いて、条件は、ＡＴＣｓの配列に相補的な配列の繰り返し分節を有する直鎖状ＤＮＡを産生するために、前記ローリング  サークル増幅を促進するように変えられる。前記ＲＣＡ産物は、縦列配列ＤＮＡ（あるいはＴＳ−ＤＮＡ）と示される。ＲＣＡ産物、あるいはＴＳ−ＤＮＡｓは、標準方法、例えばプローブなどの標識修飾オリゴヌクレオチドの使用、あるいは標識ｄＮＴＰｓの直接結合により検出される。図１のパネルＣおよびＣ′に示されるように、（プライマーの合成の基となる標的ＤＮＡ鋳型に相補的であり、また増幅プライマーＰ２の前記第１分節に相補的である）伸長したプライマーのみがＲＣＡシグナルを与える（すなわち、ＴＳ−ＤＮＡ産物が生じる）。Ｐ１の３′末端残基に不適合を引き起こす突然変異ＤＮＡは、伸長Ｐ１に用いられる不適合感受性ポリメラーゼ酵素により、Ｐ１の伸長のための鋳型を提供することができず、したがって続いて添加される増幅プライマーＰ２にアニールする伸長Ｐ１部位は無い。限定しない例として、エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼ、すなわちＴ７シークエナーゼは、適合３′末端から不適合３′末端を、４００倍程度まで識別することができる。代わりに、別のエキソヌクレアーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼは、前記不適合を約３００倍程度まで区別できる。不適合対合から適合対合を識別することが可能であり、本発明の方法の実施において有益なその他のＤＮＡポリメラーゼは、クレノウ  ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）、Ｖｅｎｔ  ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）、Ｐｆｕ  ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）、Ｔａｑ  ポリメラーゼ、Ｔａｑ  ポリメラーゼのＳｔｏｅｆｆｅｌ断片、Ｂｓｔポリメラーゼ、ＴｔｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｏシークエナーゼ、限定あるいは網羅することを意図しない列挙を含む。
【００３０】
図２は、本発明の他の実施例を示し、ここで第２識別段階は、特異性を増加し、複数の異なる対立遺伝子の存在と同様に、野生型および突然変異対立遺伝子の同時検出を可能にすることを含む。ここで、任意の固定オリゴヌクレオチド  プライマー（Ｐ１）あるいはＡＳＯは、５′末端部で固体支持材に付着し、突然変異について（すなわち、一ヌクレオチド多型あるいはＳＮＰについて）試験されるゲノムＤＮＡの残基（野生型あるいはいくつかの突然変異対立遺伝子の任意の１つ）に位置する、４つの可能性のあるヌクレオチド残基（Ａ、Ｔ、ＧあるいはＣ、しかしＣＧおよびＡＴ対合のみがそれぞれ図中の左および右に示される）の１つと相補的な３′末端ヌクレオチドを含む。標的ＤＮＡ（野生型あるいは突然変異）の添加およびアニールに続いて、後者は再びＰ１オリゴヌクレオチド  プローブのプライマー伸長のための鋳型として働く。しかし、この場合、標的ＤＮＡの結合に利用できるＰ１オリゴヌクレオチド（あるいはＡＳＯｓ）は、（４つの異なる種類のＰ１を伴う、すなわち、それぞれが３′末端に４つの可能性のあるヌクレオチド塩基の異なる１つ（および−３残基部位の任意の追加の不適合）を伴うために）３′末端残基が異なり、そして標的ＤＮＡは、Ｐ１オリゴヌクレオチド  プローブに結合する。しかし、エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼによるＰ１プローブのプライマー伸長は、標的ＤＮＡの試験残基とＰ１プローブの３′末端残基の間に不適合が無い場合にのみ起こる。適合末端部でのみＰ１伸長を開始するエキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー伸長の後、標的ＤＮＡは除去され、双極性増幅プライマー（Ｐ２）が添加される。後者はさらに、伸長部位Ｐ１′（Ｐ１の伸長形態）に相補的な第１配列を有する。本発明のプロセスのこの時点において、条件は、プライマー伸長の第２巡目を促進するように変えられ、この時の、鋳型としてのＰ１に沿った増幅プライマーＰ２の伸長は、Ｐ１の基の３′末端残基とＰ２の３′末端残基の適合に感度の高いエキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼを再び用いて、野生型および突然変異対立遺伝子のそれぞれについて図２のパネルＣおよびＣ′に示される伸長産物を形成するためのものである。増幅プライマーＰ２はまた、Ｐ１プローブの基の３′末端残基との適合あるいは不適合のどちらかを含み、それにより、この点に不適合が無い場合のみ伸長する。適合Ｐ２オリゴヌクレオチドの伸長に続いて、条件が調整され、非伸長Ｐ２オリゴヌクレオチドは除去され（より弱い全体の結合につながる低いハイブリッド形成により容易となる）、伸長Ｐ２オリゴヌクレオチドのみがＰ１に結合する十分なハイブリッド形成を持ち、そのために付着したままとなる。その後、ＡＴＣｓが添加され、ＲＣＡは、異なるＰ２オリゴヌクレオチドが存在し、それによって増幅されるために、異なる配列を持つＡＴＣｓが用いられ得ることを除いて、図１について前に開示されたように実施される。この場合に、続くＲＣＡにより産生される産物は、異なるＴＳ−ＤＮＡｓである（すなわち、相補的ＡＴＣｓの異なる配列に影響し、それがまた増幅プライマー（Ｐ２）の異なる増幅プライマー配列に影響する異なる配列を持つＴＳ−ＤＮＡｓであり、その相対濃度は、基のＰ１オリゴヌクレオチド  プローブおよびＰ２オリゴヌクレオチド  プローブのそれぞれのプライマー伸長の程度に影響を与える）。
【００３１】
この後者の実施例において、増幅プライマーＰ２は、炭素リンカーにより分けられる２つの３′末端を有する双極性プライマーである（例えば、配列番号：３４および３５参照）。したがって、本発明のプロセスを行うにおいて、２つの異なるＰ２プライマーは利用可能であり、２つの別個の実施例のそれぞれに対しての１つ、しかしながらその他の可能性もまた考えられる。ここに開示された図および実施例により例示された両タイプのＰ２プライマーは、一端がＲＣＡ台座より成り、他端が標的認識を容易にするという点で二官能性である。例えば、図１において示されたＰ２プライマーは、配列番号：２７および２８の配列により例示されるような、一連のチミジン（すなわちＴ′ｓ）により分割される分節を伴って、通常の極性（すなわち、５′から３′）を持つ。図２において示されるプロセスで図解されたような、本発明において有益なＰ２の第２の型は、逆極性３′−５′−３′をもち、分節は、化学および合成工程がこの分野における通常の知識を有する者に十分知られている、例えばメチレングループなどの約６から約１８炭素鎖長であり得る炭素リンカーにより分割される。加えて、前記構成物は、多数の市販源から容易に得られる。（図２に示されたような）Ｇ５４２Ｘ遺伝子座に関連する突然変異の検出に用いるためのみの実施例として、前記Ｐ２プライマーは：
【００３２】
2004516806.tif 000002
【００３３】
の構造を持つ双極性プライマー中に形質転換された
【００３４】
2004516806.tif 000003
【００３５】
および
【００３６】
2004516806.tif 000004
【００３７】
の構造を持つ双極性プライマー中に形質転換された
【００３８】
2004516806.tif 000005
【００３９】
の配列を持ち得る。
【００４０】
前記方法において用いられるように、対立遺伝子特異的３′末端およびＲＣＡ台座で終結する標的特異的短配列（約１５−１７ヌクレオチド長、低Ｔｍ（融解温度））を含む双極性逆プライマー（ここでＰ２は、ここに開示されたように３′−５′−３′あるいは異なる二官能性プライマーである）は、新しく合成され（すなわち伸長し）、固定されたＤＮＡにアニールする。Ｐ２プライマーを固定ＤＮＡに固定するために、プライマー伸長は、適合３′末端から不適合３′末端を識別する条件下で、再び行われる。ＲＣＡが行われる前に、非伸長Ｐ２プライマーは、低Ｔｍを利用した、厳密性の高い洗浄により除去される。これは、対立遺伝子特異的ＲＣＡ産物のみが検出されることを確実にする。マルチプレキシングは、対立遺伝子特異的サークルを用いることにより成し遂げられる。Ｔ７シークエナーゼあるいはＴｔｈポリメラーゼのいずれかを用いた第２識別段階の使用は、対立遺伝子特異性を１００００倍以上に増加させる。
【００４１】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、直単鎖ＤＮＡ分子であり、通常５０から１０００ヌクレオチドから成り、好ましくは約６０から１５０ヌクレオチドから、最も好ましくは約７０から１００ヌクレオチドから成る。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（プローブＰ１）は、５′アミノ基および３′ヒドロキシル基を持つ。これは、５′末端を選択的に、図１および２の実施例において示されるガラススライドなどの固体支持材に貼り付けることを可能にする。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（プローブＰ１）の構造部位は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（プローブＰ１）を、最終的なローリング  サークル増幅（ＲＣＡ）を容易にするための、標的ＤＮＡあるいは増幅プローブ（Ｐ２）へのアニールに対して有益なものとする、特異的官能部位を持つ。これらの部位は、（３′末端に位置する）標的プローブ部位として示され、標的ＤＮＡに相補的であり、（遺伝子の異なる対立遺伝子あるいは試験される遺伝子に対して）野生型あるいは突然変異のどちらかの、Ｐ１の３′末端残基の例外の可能性を伴う。同様に、５′末端に位置する付着部位は、プローブを固体支持材に付着するように働く。標的プローブ部位は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、Ｐ１）の必要な要素である。通常、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（図１および２のＰ１）は、５′末端から３′末端方向に、５′アミノ基、標的プローブ部位（あるいは分節、あるいは断片、あるいは配列）、Ｐ１の標的プローブ部位が標的ＤＮＡとハイブリッド形成する場合に、標的ＤＮＡ上の対応残基と適合するかあるいは適合しないヌクレオチド残基における終結、および−３部位（３′−ＯＨの３残基上流）における選択的な不適合残基を伴う（例えば配列番号１−４の比較）３′ヒドロキシル基より成る単鎖直ＤＮＡ分子である。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのその他の部位は、配列について任意に選択することができ、特にここで、前記の選択された配列は固体支持材あるいは基質への結合を容易にする。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（プローブＰ１）は自己相補的な配列を持たず、この条件は、不適合のない６ヌクレオチド長以上の大きさの相補的領域が無い場合に適する。
【００４２】
ＡＳＯ（Ｐ１）にアニールする１つの分節と増幅標的サークル（ＡＴＣ）にアニールする別の分節を持つ増幅プローブ（Ｐ２）は、後者が前記Ｐ２増幅プローブにアニールした後、ＡＴＣの複製のためのプライマーとして働く。図２の実施例において、前記増幅プローブ、例えば配列番号：１３は、Ｐ１から形成される鋳型上で伸長し、ＡＴＣのアニールおよび、不適合検出および伸長のために用いられるＤＮＡポリメラーゼであり得るかあるいはそうではない適切なＤＮＡポリメラーゼの添加後、開環プローブに相補的な配列の多数の繰り返しを含有する長ＤＮＡ分子（すなわち、ＴＳ−ＤＮＡあるいは縦列配列ＤＮＡ）を生じる。
【００４３】
すでに開示されたように、ＴＳ−ＤＮＡは、増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）に相補的な配列を含み、前記増幅標的サークル（ＡＴＣｓ）は、増幅プライマー  オリゴヌクレオチドＰ２の増幅プライマー分節に相補的な配列を含み、後者の配列はまたＡＴＣｓの増幅のためのプライマーとして働く。ＴＳ−ＤＮＡ中のこれらの配列は、プライマー配列（ローリング  サークル複製プライマーあるいは増幅プライマーＰ２の配列に適合する）、および（Ｐ２の増幅プライマー配列に相補的でないＡＴＣ分節を相補的に結合させ、前記配列は任意に選択することが可能な）選択可能な相補的配列として示される。この後者の選択可能な配列は、縦列配列ＤＮＡの検出に有益な種々の配列より成り、検出タグ、二次標的配列、アドレスタグおよびプロモーター配列などの配列を含み得る。
【００４４】
特定の好ましい実施例は、３′末端部あるいはその隣接部において、約１０から２０ヌクレオチドの標的配列プローブを含む７０から１００ヌクレオチドの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドである。
【００４５】
本発明にしたがって、検出される可能性のある対立遺伝子変異体を含む配列は、標的オリゴヌクレオチド、あるいは標的配列、または標的ＤＮＡを形成し、図の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（Ｐ１）の部位に相補的な配列を含む。ここで用いられるように、“標的ポリヌクレオチド”あるいは“標的ＤＮＡ”または“標的配列”という用語は、プローブ  オリゴヌクレオチド（Ｐ１）全体に渡って一つあるいはそれ以上の対立遺伝子差異を含有する多数の独立したポリヌクレオチド鎖を含み、独立して増幅され、そしてまたは検出される。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、あるいは、できればＲＮＡを含むウイルスゲノムなどの、二本鎖ポリヌクレオチドあるいは単鎖ポリヌクレオチドの単一分子、または、ゲノムＤＮＡ断片あるいは感染サンプルから得たウイルスポリヌクレオチド断片および体性ポリヌクレオチド断片の混合体などの、ポリヌクレオチド断片の混合体であり得る。典型的に、標的ポリヌクレオチドあるいは標的ＤＮＡは、最初は二本鎖ＤＮＡであり、ここでの図においてＰ１で表されるプライマーおよびまたはオリゴヌクレオチド  プローブとハイブリッド形成することができる単鎖標的分子を形成するために、例えば加熱により変性される。
【００４６】
通常、ここで用いられる“オリゴヌクレオチド”という用語は、ワトソン−クリック型相補的塩基対合などのモノマー間相互作用の規則的パターンとして、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能で、また、鋳型主導の反応において、別のオリゴヌクレオチドにライゲーションすることが可能な含有デオキシリボヌクレオチドより成る、自然の直鎖オリゴマーあるいは修飾モノマーまたは連鎖を含む。通常、モノマーは、例えば３−４の少数の単量体ユニット、から数百の単量体ユニットの大きさにわたるオリゴヌクレオチドを形成するために、リン酸ジエステル結合あるいはその類似結合により結合する。オリゴヌクレオチドが、“ＧＡＴＴＡＣＡ”などのように、アルファベットの配列により表される場合には、別に指示がない限りは、ヌクレオチドは、左から右に、５′から３′方向であり、“Ａ”はデオキシアデノシンを表し、“Ｃ”はデオキシシチジンを表し、“Ｇ”はデオキシグアノシンを表し、そして“Ｔ”はチミジンを表す。ここで用いられる“ポリヌクレオチド”という用語は、通常、数十ユニット長からおそらく百あるいはそれ以上のユニット長、好ましくはより長い、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドあるいはその類似体を含む、ヌクレオチドあるいはその類似体の直鎖オリゴマーを意味する。
【００４７】
プライマーを含む、Ｐ１あるいはＰ２などの、本発明のオリゴヌクレオチド  プローブについて言及する際に用いられる場合に、“複数”という用語は、通常標的ポリヌクレオチドの非変異領域に特異的な単“共通”オリゴヌクレオチド  プローブおよび、通常配列中に対立遺伝子変異体あるいは突然変異変異体を含有する標的ポリヌクレオチドの一領域に特異的な一つあるいはそれ以上の“野生型”およびまたは“突然変異”オリゴヌクレオチド  プローブなどであり得る、２つあるいはそれ以上のオリゴヌクレオチド  プローブの組み合わせを包含するほどに十分広く構成される。通常、前記プローブは、一ヌクレオチド部位のみでの変異ヌクレオチドであるが、ここに開示された方法においては、一つ以上の差異も可能性がある。
【００４８】
ここで用いられる“増幅プライマー”という用語は、プライマー伸長産物の合成を誘導する条件、すなわちヌクレオチド三リン酸および、エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼなどの重合誘導剤の存在下に置かれた場合に、相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始するように働くオリゴヌクレオチドを示す。前記条件は、適切な温度、ｐＨ、金属濃度および塩濃度を含む。本開示の目的に対して、Ｐ２は、増幅プライマーである。
【００４９】
本発明の方法の重要な見地は、基の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（Ｐ１）により形成されたプライマー鎖の伸長のための、ＤＮＡポリメラーゼなどのエキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼの使用、および対立遺伝子特異的プライマー（Ｐ１）の終末３′末端に不適合がある場合には伸長が起こらない方法において、この対立遺伝子特異的プライマーを伸長するための鋳型としての標的ＤＮＡの使用である。前記酵素の使用は、ライゲーション段階を実施する必要性を不要にすると同時に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド  プローブ（Ｐ１）に対する標的ＤＮＡの配列中の不適合の存在を検出するために働く。前記酵素は、本発明の方法で使用するために、容易に利用することができる。したがって、Ｔ７シークエナーゼおよびＴｔｈポリメラーゼなどの前記酵素は、ここに開示された方法において有益である。加えて、前記酵素のその他のものは、必要な目的を持つように構成されている。例えば、Ｆｏｘａｌｌ他（合衆国特許番号５９８５５６９）は、微生物ＤＮＡ配列の選択分節を増幅するためのエキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼおよびプライマー融解温度に関連する不適合の使用を開示する。Ｍａｍｏｎｅ（合衆国特許番号５８２７７１６）は、エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼである修飾ｐｏｌＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼを構成するための方法を開示する。本発明の方法において有益であるためには、前記酵素は、適合３′残基から不適合３′残基を、最低２桁、あるいは約１００倍、好ましくは最低約２００倍、最も好ましくは最低約４００倍程度で検出できなくてはならない。加えて、ここで提供される検定は、プライマー伸長およびＲＣＡの両方を促進するポリメラーゼにより、非常に容易になる。すでに示されたエキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼとしてのＴ７シークエナーゼは、適合３′末端から不適合３′末端を４００倍程度で識別することができる。代わって、別のエキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼであるＴｔｈポリメラーゼは、前記不適合を約３００倍程度で識別することができる。
【００５０】
本発明の方法はさらに、プライマー伸長および続く対立遺伝子識別に対する最適な条件を提供する。しかし、前記条件は、おおよそ約１００ヌクレオチド長の標準ＡＴＣ  ＤＮＡ配列の使用および、ゲノムＤＮＡとクローンＤＮＡの比較による最適条件の決定により容易に決定される。
【００５１】
プライマー伸長の完了後、混合物中の条件は、今までハイブリッド形成していた標的ＤＮＡを除去するために調整され、その後前記標的を洗浄し、除去する。生じた伸長単鎖ポリヌクレオチドは、その後、伸長プライマーに相補的な第１配列および増幅標的サークル（ＡＴＣ）の選択配列に相補的な第２配列を含有する二次オリゴヌクレオチド（Ｐ２）と混合される。前記標的サークルの添加およびＡＴＣのプライマー（Ｐ２）へのハイブリッド形成後、後者は、続いて起こるＡＴＣを鋳型として用いる繰り返しのＤＮＡ複製のためのプライマーとして働く。ＡＴＣの前記複製により産生された単鎖ＤＮＡは、“縦列配列ＤＮＡ”あるいはＴＳ−ＤＮＡと示される。（ＡＴＣの配列に相補的な）同一配列が繰り返し複製されるため、その配列同一性はＡＴＣの配列により決定される。
【００５２】
したがって、本発明にしたがって、増幅標的サークル（ＡＴＣ）は、通常４０から１０００ヌクレオチド、好ましくは約５０から１５０ヌクレオチド、最も好ましくは５０から１００ヌクレオチドを含有する、環状単鎖ＤＮＡ分子である。ＡＴＣｓの構成部分は、ＡＴＣをローリング  サークル複製（ＲＣＡ）に対して有益なものとする特異的官能部位を持つ。これらの部位は、プライマー相補的部位、検出タグ部位、二次標的配列部位、アドレスタグ部位およびプロモーター部位のように示される。プライマー相補的部位は、増幅標的サークルの必須要素である。検出タグ部位、二次標的配列部位、アドレスタグ部位およびプロモーター部位は付随のものである。通常、増幅標的サークルは、プライマー相補的部位から成る単鎖環状ＤＮＡ分子である。ＡＴＣの特異的部位に対応しないＡＴＣの分節は、任意に選択された配列であり得る。ＡＴＣｓは、自己相補的な配列を持たないことが好ましい。この条件は、不適合あるいは間隙のない６ヌクレオチド長以上の大きさの相補的領域が無い場合に適することは考慮される。プロモーター部位を含有するＡＴＣｓは、８あるいはそれ以上の一連のチミジンヌクレオチドなどの転写ターミネーターと類似する配列を持たないこともまた好ましい。ライゲーションした開環プローブは、ＡＴＣの様式であり、ここで用いられるように、増幅標的サークルという用語は、ライゲーションした開環プローブを含む。
【００５３】
開示されたように、増幅標的サークルは、複製された場合に、増幅標的サークルに相補的な配列の複数繰り返しを含有する長ＤＮＡ分子を生じる。このＴＳ−ＤＮＡは、プライマー相補的部位に相補的な配列を含有し、また増幅標的サークル上に存在する場合には検出タグ部位、二次標的配列部位、アドレスタグ部位およびプロモーター部位に相補的な配列を含有する。ＴＳ−ＤＮＡ中のこれらの配列は、（ＡＴＣに相補的なローリング  サークル複製プライマーの配列と適合する）プライマー配列、検出配列、二次標的配列、アドレスタグおよびプロモーター配列と示される。増幅標的サークルは、特異的結合分子のためのタグとして有益である。
【００５４】
ここに開示されたように、ローリング  サークル複製を容易にする増幅プライマーとして働く第２オリゴヌクレオチド  プローブ（Ｐ２）が提供される。増幅プライマー、あるいはローリング  サークル複製プライマーは、図１および２のパネルＣにおいて単鎖ＤＮＡサークルとして示される、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（プローブＰ１）の伸長部位および、増幅標的サークル（ＡＴＣ）の配列に相補的な増幅プライマー部位のほとんどあるいは全てに相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドである。（Ｐ２などの）増幅プライマーの増幅プライマー部位およびＡＴＣの相補的部位は、お互いに相補的である限りは、任意の望ましい配列を持つことができる。通常、増幅プライマー（Ｐ２）の配列は、（ここではＰ１′と示され、鋳型としての標的ＤＮＡを用いたＰ１の伸長により形成された）伸長プローブを形成するためのエキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼにより伸長する、Ｐ１の部位以外の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（プローブＰ１）の部位に著しく相補的でないように選択され、同様に、結合するＡＴＣの部位にのみ相補的である。増幅プライマーの相補的部位は、プライマーとプライマー相補的部位との特異的かつ安定したハイブリッド形成を補佐する任意の長さであり得る。通常、これは１０から３５ヌクレオチド長であるが、好ましくは１６から２０ヌクレオチド長である。
【００５５】
図の固体支持材から離れた方向の３′末端部に追加の配列を含み、前記追加配列は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（プローブＰ１）の任意の部分に相補的でなく、またＡＴＣにも相補的でないこともまた好ましい。この分節は非相補的分節あるいはスペーサーと示され、通常Ｐ１に相補的な分節とＡＴＣに相補的な分節の間に位置する。増幅プライマーの非相補的分節あるいはスペーサーは、通常ＲＣＡにおける鎖置換を容易にするように働く。増幅プライマー（Ｐ２）の非相補的部位は、任意の長さであり得るが、通常１から１００ヌクレオチド長、好ましくは最低５から１０ヌクレオチド長である。増幅プライマーあるいはローリング  サークル複製プライマーはまた、エキソヌクレアーゼ消化に耐性を示すようにする修飾ヌクレオチドを含み得る。ここでエキソヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼはＲＣＡに用いられる。例えば、プライマーは、プライマー配列の５′末端および３′末端のヌクレオチド間に３あるいは４つのホスホロチオエート連鎖を持ち得る。
【００５６】
ここに開示された方法は、溶液中あるいは懸濁液中で行なう一方で、それらは固体支持材上で行なうように、容易に、また有益に適応される。特異的な実施例において、本発明の方法は、対立遺伝子特異的プローブが、最も好ましくは潜在的な不適合ヌクレオチドを含有する末端とは反対側の末端において、固体支持材上に付着する場合に容易に行なわれる。ここに開示された方法において用いられる前記の固体状態基質は、オリゴヌクレオチドが結合できる任意の固体資材を含む。これは、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン  ビニル  アセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリル樹脂、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（Ｒ）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸などの資材を含む。固体状態基質は、薄層あるいは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、織られた繊維、成形ポリマー、微粒子および極微粒子を含む任意の有用な形態をとることができる。固体状態基質として好ましい形態は、ガラススライドである。ガラススライドの最も好ましい形態は、Ｐ１プライマー  オリゴヌクレオチドのマイクロアレーである。
【００５７】
したがって、ここに開示された本発明にしたがって、すでに利用できる二部分からなるオリゴヌクレオチド  ライゲーション法の有益な代替法として、突然変異（すなわち対立遺伝子差異）を検出するためにＲＣＡと組み合わせたｉｎ  ｓｉｔｕプライマー伸長法あるいは  “ＰＲＩＮＳ”などの、プライマー伸長を用いる方法が提供される。これを行なうにあたり、対立遺伝子特異的様式のＲＣＡプライマーを含有する二官能性オリゴヌクレオチドは、含有される位置情報が保存されるために、ゲノムから得られたような標的遺伝子あるいはその他のＤＮＡ配列に固定される。
【００５８】
多数の遺伝子の多くの対立遺伝子は、研究目的のために配列決定されており、これらの配列は、ＥＭＢＬデータバンク（ヨーロッパ）およびＧｅｎｂａｎｋ（ＵＳＡ）に保存され、その両方が契約者にとって容易に入手できる。これらの配列に基づいて、多くの配列は、潜在的な一ヌクレオチド多型について試験することができ、それにより、ここに開示された方法を用いた試験に対して感度の高い異なる対立遺伝子を同定するために用いることができる。ほとんどの遺伝子および遺伝子のシステムは、配列変異性（すなわち突然変異）の異なる程度に従う配列の領域を含有する。遺伝子システムに依存して、前記変異性は、広く研究されており、ここに開示された方法によるさらなる分析に利用できる。したがって、本発明にしたがった方法に利用できる配列の存在は、自己決定配列により補足される、ＧｅｎｂａｎｋおよびＥＭＢＬの提出情報のより詳細な分析により検出することができる。
【００５９】
（Ｐ２などの）増幅プライマーおよび（Ｐ１などの）オリゴヌクレオチド  プローブは、標準技術、例えば合衆国特許番号４４５８０６６と４４１５７３２およびその他の参照に開示されたホスホロアミダイト化学による固相合成法により容易に合成される。それに対する文献は広範囲にわたり、最も常套的な調査にまで向けられる。その上、本発明の方法に有用な増幅プライマーおよびオリゴヌクレオチド  プローブは、反応グループを伴って、例えば結合標識に対して、あるいは一般化学を用いて、適切に誘導され得る（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｒｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１）参照）。
【００６０】
本発明の方法において有益な増幅標的サークルは、プライマーとしてＰ２を用いるローリング  サークル増幅により産生される縦列配列産物を検出するための迅速な方法を提供する、非相補的配列の一部である、特異的選択配列中に効率的に組み込まれる。したがって、縦列配列産物は、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫科学的あるいは放射化学的方法により検出可能な別個の標識の使用を含む、考えられる限りのほとんどの方法により、検出することができる。検出はまた、例えばＵｒｄｅａ他，合衆国特許番号５１２４２４６に開示された核酸ハイブリダイゼーション検定、あるいはＲＣＡの縦列配列産物内で繰り返されるヌクレオチド配列の高感度プローブとして用いることができる類似技術の使用により達成され得る。
【００６１】
好ましい実施例において、縦列配列産物中で繰り返される相補的配列の存在を測定するために用いられるオリゴヌクレオチド  プローブは、増幅プライマー（Ｐ２）の伸長物である産物がＰ１に結合し、それにより固体支持材に付着するために容易に検出される蛍光標識を含む。したがって、縦列配列ＤＮＡ産物は、反応混合体から容易に分離することができ、縦列繰り返し中の一つあるいはそれ以上の配列の存在は、前記標識に結合する高感度プローブを用いて容易に測定される。より一般的には、使用することができる前記蛍光標識は、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２′，７′−ジメトキシ−４′，５′−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシ  ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４，７，２′，４′，５′，７′−ヘキサクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＨＥＸ−１）、４，７，２′，４′，５′，７′−ヘキサクロロ−５−カルボキシ−フルオレセイン（ＨＥＸ−２）、２′，４′，５′，７′−テトラクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（ＺＯＥ）、４，７，２′，７′−テトラクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（ＴＥＴ−１）、１′，２′，７′，８′−ジベンゾ−４，７−ジクロロ−５−カルボキシフルオレセイン（ＮＡＮ−２）および１′，２′，７′，８′−ジベンゾ−４，７−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、テキサス−レッド、Ｃｙ３色素およびＣｙ５色素を含む。
【００６２】
好ましくは、オリゴヌクレオチド  プローブは、ハイブリッド結合に不利益に影響しないように、縦列配列産物中の測定される配列に相補的な部位から十分離れたプローブの末端部位に蛍光分子を結合することにより、蛍光に標識され、前記標識は、厳密な条件下ですでに行われ得る。マルチプレックス検定（以下参照）における検出を容易にするために、異なるレポータープローブの複製は、異なる蛍光標識で標識される。適切な蛍光標識を選択するための指導は、Ｓｍｉｔｈ他（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：２６０−３０１、Ｋａｒｇｅｒ他（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４９５５−４９６２、Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９８９）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）に見ることができる。好ましい蛍光標識は、Ｋｈａｎｎａ他の合衆国特許番号４３１８８４６およびＬｅｅ他（１９８９）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １０：１５１−１６４、そして上記の６−ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ−１、ＨＥＸ−２、ＺＯＥ、ＴＥＴ−１あるいはＮＡＮ−２および類似体などの、フルオレセインおよびその誘導体を含む。最も好ましくは、多数の蛍光色素が用いられる場合に、それらはスペクトルにより解像でき、すなわちそれらは定量収量、放射バンド幅および標識されたポリヌクレオチドの電気泳動による分離を可能にする最大放射をもたらし、それにより、分離されたポリヌクレオチドの濃縮バンドの相当の重複にもかかわらず、容易に検出される。
【００６３】
配列特異的態様において、増幅プローブ（Ｐ２）中の配列に結合することが可能なオリゴヌクレオチドにより容易に検出することができる増幅プローブ（Ｐ２）中の配列の結合などの、ＲＣＡ産物への適切な配列の結合により、上記の蛍光試薬などの多数の種々の試薬は、ＴＳ−ＤＮＡ中の特異的な配列に、これらの配列が存在する場合には、結合するように誘導することができる。例えば、ＴＳ−ＤＮＡ中に特異的な配列が存在するか否か（すなわち、標的ＤＮＡあるいは対立遺伝子特異的プローブの持つ適合に対する反応において、特定プローブが伸長するか否か）を決定したい場合には、この配列は、蛍光標識あるいは、タンパク質の存在の検出およびそれによる標的配列の存在の検出に有益な抗体と反応するタンパク質などのその他の構造体に付着するプローブにハイブリッド結合できる。前記試薬は、この分野においてレポーター結合試薬と示される。
【００６４】
ここで用いられたように、そして通常この分野において、レポーター結合試薬は、オリゴヌクレオチドに結合する特異的結合分子あるいはその他の分子構造体である。特異的結合分子は通常、レポーター結合試薬の親和性部位と示され、オリゴヌクレオチドは、前記レポーター結合試薬のオリゴヌクレオチド部位である。前記特異的結合分子は、特定分子あるいは機能基と特異的態様で相互作用する分子である。例えば、特異的親和性を持つ抗体およびその他の分子は、前記特異的結合分子の例であり、レポーター結合分子の親和性部位を形成するためにオリゴヌクレオチドに容易に結合することができる。前記特異的結合分子への増幅標的サークルの結合あるいは標的配列の結合により、前記特異的結合分子のその特異的標的への結合は、ローリング  サークル増幅を用いたＡＴＣあるいは標的配列の増幅により検出することができる。この追加の増幅は、結合した特異的結合分子の数が非常に少ない場合であっても、感度の高い検出を可能にする。
【００６５】
一つの実施例において、オリゴヌクレオチドは、ＴＳ−ＤＮＡ上に存在する選択配列に対するプローブとして働くことができる配列、すなわちプローブ配列より成るレポーター結合試薬の一部として存在する。このプローブ配列は、任意に選択することができる。多数のレポーター結合試薬を用いるマルチプレックス検定において、それぞれのレポーター結合試薬に対するプローブ配列は、非特異的標的検出の可能性を限定するために、大きく異なることが好ましい。代わって、用いられるシステム、試験あるいはプロセスの目的および用いられるヌクレオチド配列の型に依存して、特にここで特定のマルチプレキシング検定は実施され、プローブ配列は関連配列を持つ。
【００６６】
オリゴヌクレオチド部位は、本分野においてよく知られた、オリゴヌクレオチドをその他の型の分子に結合するための多数の方法により、親和性部位に結合できる（例えば、オリゴヌクレオチドを抗体に結合するための適切な方法を開示する、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（３）：５２２−５２９（１９９５）参照）。
【００６７】
他の実施例において、レポーター結合試薬のオリゴヌクレオチド部位は、ＲＣＡの鋳型として働くＡＴＣを含有することができる。したがって、多数のレポーター結合試薬を用いるマルチプレックス検定において、アドレスタグおよび別個のレポーター結合試薬を用いて独立して同定できる配列を組み込むＡＴＣｓを用いることは望ましくまた有益であり得る。これらの後者は通常、本発明の方法において有益なレポーター結合試薬の典型であるオリゴヌクレオチド部位より成るが、前記レポーター結合試薬の前記オリゴヌクレオチド部位は、各レポーター結合試薬の独自の検出を容易にするために、有益に大きく異なるべきである。もちろん、同一プライマー相補的部位は通常、前記マルチプレックス検定において用いられる全てのＡＴＣｓに用いられる。ＡＴＣは、ＡＴＣを拘束ループに沿って巻きつけ、それによりＡＴＣが、例えばレポーター結合試薬の抗体部位などの親和性部位に結合したままで、ローリング  サークル複製の間自由に回転することを可能にするなどのこの分野において知られた方法により、共有結合あるいはそうでなければ前記特異的結合分子に付着する、最も有益なものの一つである。前記拘束資材は、ポリマーあるいは、分子の拘束を達成するために分子生物学的技術において用いられるその他の一般基質を含み得る。ポリマーは、拘束ループの好ましい資材であり、前記ポリマーは、オリゴペプチドと同様にオリゴヌクレオチドを含み得る。したがって、オリゴヌクレオチドは、既知の技術を用いて、特異的結合分子に結合することができる。例えば、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ他（１９９５）は、オリゴヌクレオチドを抗体に結合するための適切な方法を開示し（しかし前記方法は通常、オリゴヌクレオチドを全ての種類のタンパク質に結合するために有益である）、Ｌｉｚａｒｄｉ（合衆国特許番号５８５４０３３）は、前記技術の一般論を収容している。前記拘束ループの末端はまた、適切な活性化グループと共に容易に誘導することができる官能基グループを用いて、任意の特異的結合分子に有益に結合することができる。タンパク質および類似の分子を用いる方法に対して、有益な方法が、タンパク質固定：ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ．  Ｔａｙｌｏｒ，ｅｄ（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）に開示される。親和性部位としての抗体の使用に対して、前記抗体は、この分野においてよく知られた方法により調製され、この分野においてよく知られた組換え抗体および合成抗体と同様に、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含み得る。
【００６８】
前記により明らかなように、種々の検出方法および検出のレベルは、ここに開示された標識方法によりもたらされる。したがって、前記標識方法は、ＲＣＡにおけるローリング  サークル複製の間に、ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン含有ヌクレオチドあるいはブロモデオキシウリジンを含む蛍光などの標識官能基を組み込むことにより行うことができる。例えば、一つは、シアニン色素ＵＴＰ類似体（Ｙｕ他（１９９４））を１００ヌクレオチド毎に約４類似体の頻度で組み込み得る。ｉｎ  ｓｉｔｕで増幅した核酸を検出するための好ましい方法の一つは、増幅時にＢｒｄＵｒｄでＤＮＡを標識し、続いて組み込まれたＢＵＲＤをビオチン化抗ＢＵＲＤ抗体と結合させ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ）、続いてビオチン機能基をストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）と結合させ（例えば、以下の実施例を参照）、そして蛍光をフルオレセイン−チラミド（ＤｕＰｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ＆  Ｃｏ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｅｐｔ．）で発生させることである。
【００６９】
追加の標識方法は用いることができ、ここで適切な分子プローブは、増幅されたＤＮＡを検出するために用いられる。例えば、ＡＴＣは、検出タグと示される既知の任意の配列の複数繰り返しを含有するように設計され得る。ここですでに開示した、第２ハイブリッド形成段階は、前記検出プローブを前記検出タグに結合するために用いることができる。検出プローブは、前記のように、酵素、蛍光機能基、放射性同位体および類似体で標識され得る。蛍光機能基と検出タグを結合することにより、理論上、ＴＳ−ＤＮＡ中の開環プローブ繰り返し毎に、数千でないにしても数百の蛍光シグナルを得ることができる。
【００７０】
ローリング  サークル増幅は、中でも、異なる開環プローブの使用を通してマルチプレキシングを容易に与えるために、非常に有益な増幅の方法である。前記プローブの各セットは、独自の相補的標識に結合するように設計された異なるプローブ配列を持つ。プライマー相補的部位は一定であるため、ローリング  サークル複製の同一プライマーは、標的の同一性とは無関係に用いることができる。しかし、前記増幅プライマーは、伸長したＡＳＯ（あるいはＰ１′）に相補的な部位が異なり、したがって、これらのプライマーのいくつかのみが、ＡＴＣｓおよびＤＮＡポリメラーゼの添加後、最終的に複製され得る。残基の適合対合を伴うＡＳＯｓのみが伸長し、プライマーに結合し、ＴＳ−ＤＮＡを生じるために、産生された特定ＴＳ−ＤＮＡおよび前記ＴＳ−ＤＮＡｓの相対量は、適合および不適合標的／プローブ対合の相対量に依存する。代わりに、増幅プライマー（Ｐ２）のＡＴＣ相補的部位は、異なるＡＴＣｓとハイブリッド形成するために異なり、それにより、検出の別の方法として働き、したがって、検出結果を拡大する。前記産物の相対量はその後、前記のレポーター結合試薬を伴う、ここに開示された任意の方法を用いて定量される。
【００７１】
本発明はまた、遺伝子突然変異により特徴付けられる疾病を診断するための方法に向けられ、
（ａ）前記疾病に苦しむ生物からの突然変異遺伝子配列のサンプルの獲得、および、
（ｂ）前記突然変異遺伝子配列の最低一部が、標的ポリヌクレオチドあるいは対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとして用いられる、請求項１のプロセスの実施
より成る。
【００７２】
本発明の方法の実施において、サンプルは提供され、サンプルは、起源が生物から得られたかあるいは完全に合成された、標的ヌクレオチド配列（すなわち突然変異遺伝子配列は、標的ポリヌクレオチドとして用いられる。）を含有するＤＮＡを含む。もちろん前記生物は、典型的にヒトを含む動物であり得る。したがって、ここに開示されたプロセスにおいて、特に標的ＤＮＡとして有益なＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡから得られたＤＮＡ、あるいは完全合成ＤＮＡであり得る。ここで前記ＤＮＡは、ヒトあるいはその他の動物、特に哺乳動物などの非ヒト生物、あるいは、さらには植物もしくはその他の植物性構造体における突然変異などの非ヒト源から得られる。前記ＤＮＡサンプルはまた、ここに列挙された任意のＤＮＡｓの混合体を含み得る。ここで前記混合体は、最低２つの異なる源から得られたサンプルより成るか、あるいは、ヒトなどの同一生物の２つの異なる細胞あるいは組織から得られたＤＮＡなどの、同一源から得られた異なるＤＮＡ分節をより成る。
【００７３】
例として、試験あるいはスクリーンされる個体の染色体ＤＮＡは、個体由来の細胞サンプルから得られる（最も通常、源はヒトであるが、そうである必要はなく、任意の動物が本発明の方法を用いて試験される）。細胞サンプルは、個体の年齢および状態に依存して、多様な組織から得ることができる。例として、細胞サンプルは、よく知られた技術を用いて、末梢血から得られ得る。胎児試験において、サンプルは、羊水穿刺あるいは絨毛膜絨毛サンプリングにより、好ましく得られる。その他のＤＮＡの源は、精液、頬側細胞および排出物中に見られる細胞を含む。好ましくは、ＤＮＡは、例えば、上記の、Ｍａｎｉａｔｉｓ他により開示されたフェノール：クロロホルム抽出およびＨｉｇｕｃｈｉ（Ｍａｙ  １９８９）ＰＣＲアプリケーション、刊行２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ  Ｕｓｅｒｓ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）などの標準方法を用いて、サンプルから得られる。胎児試験のための細胞サンプルはまた、例えばＩｖｅｒｓｏｎ他，（１９８１）Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，９：３１−４８に開示された蛍光活性化細胞選別を用いて、母親の末梢血から得ることができる。
【００７４】
前記の観点において、本発明は、発現が突然変異により影響を受ける遺伝子に対して、シスあるいはトランスに位置するプロモーター領域あるいはエンハンサー領域の型などの、最低一つの遺伝子あるいはその他のＤＮＡの配列における突然変異により引き起こされ、誘導され、あるいは関連する疾病の診断に関することは明らかである。
【００７５】
本発明の方法により容易に診断される疾病は、パーキンソン病、ヂュシェーヌ筋ジストロフィー、ニーマン・ピック病、ポリープ病、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、テイ・サックス病、色素性乾皮症、毛細管拡張性運動失調、ハンチントン病、リー・フラウメニー癌症候群、ベータ・サラセミア、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ病、血友病、急性間欠性ポルフィリン病、嚢胞性線維症、糖尿病、肥満症およびガンと同様に、遺伝的突然変異が含まれるその他の型のガンより成るグループから選択される疾病を含むが、決してこれに限定されない。前記ガンは、白血病、リンパ腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、頭頸部ガン、皮膚ガン、脳腫瘍、食道ガン、胃ガン、肺ガン、乳ガン、大腸ガン、卵巣ガン、睾丸ガンおよび前立腺ガンより成るグループから選択されるガンを含むが、決してこれに限定されない。
【００７６】
本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットに関する。好ましくは、前記キットは、（ａ）それぞれが、オリゴヌクレオチド  プローブの末端残基に関して不適合を所有するかあるいは所有しない一つあるいはそれ以上の標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成することが可能な、多数のオリゴヌクレオチド  プローブ；（ｂ）エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼのサンプル；（ｃ）それぞれが前記オリゴヌクレオチド  プローブの伸長分節とハイブリッド形成することが可能であるとともに、ローリング  サークル増幅において用いられる増幅標的サークル（ＡＴＣ）上の配列に相補的なプライマー配列より成る、多数の増幅プライマー；（ｄ）１０から２０、さらには３０ヌクレオチド長の配列より成り、その配列が（ｃ）の増幅プライマーの配列に相補的であり、またローリング  サークル増幅（ＲＣＡ）のための鋳型として働く、本質的に単鎖ＤＮＡサークルである、増幅標的サークル（ＡＴＣ）のサンプル；（ｅ）連続したローリング  サークル増幅の実施が可能なＤＮＡポリメラーゼのサンプル；および（ｆ）種々の標識試薬およびアドレス  プローブを含むがこれに限定されない、ローリング  サークル増幅の産物を検出するための方法を含む。
【００７７】
本発明にしたがって開示された増幅プライマーのローリング  サークル複製の実施において、非常に多様なＤＮＡポリメラーゼは、特定の基準を満たしさえすれば、利用することができる。異なる対立遺伝子の存在を検出するためのローリング  サークル複製段階において有益なＤＮＡポリメラーゼは、用意された単鎖サークルのローリング  サークル複製を行う能力を持つ必要がある。前記ポリメラーゼは、ＲＣＡポリメラーゼと示される。ローリング  サークル複製に対して、ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型鎖（ＡＴＣ）に相補的な鎖を置換することができ、これは鎖置換と称され、５′から３′へのエキソヌクレアーゼ活性を欠失していることが望ましい。鎖置換は、増幅標的サークルすなわちＡＴＣの多数の縦列コピーの合成を起こすために必要である。５′から３′でのエキソヌクレアーゼ活性が存在する場合には、合成された鎖の破壊が起こり得る。ここに開示された方法に使用するためのＤＮＡポリメラーゼは、非常に処理加工可能であり、本発明の方法において使用するＤＮＡポリメラーゼの適性は、ＲＣＡを実施する能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験されることが好ましい。好ましいローリング  サークルＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ（合衆国特許番号５１９８５４３および５００１０５０）、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ他、Ｇｅｎｅ  ８４：２４７（１９８９））、ファージφ−ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８２８７（１９８７））、ＶＥＮＴ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６８：１９６５−１９７５（１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ  フラグメント（Ｊａｃｏｂｓｅｎ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４５：６２３−６２７（１９７４））、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ他、Ｇｅｎｅ  ９７：１３−１９（１９９１））、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｉｔｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９（２）：２６７−２７６（１９９４））、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（Ｋａｂｏｏｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．  ５：１４９−１５７（１９９５））およびＴ７  ＤＮＡポリメラーゼであり、φ２９およびＴ７ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。鎖置換は、ヘリカーゼ酵素などの鎖置換因子の使用を通して容易にすることができる。多くは、鎖置換因子の存在下でローリング  サークル複製を行うことができるＤＮＡポリメラーゼは、開示された方法においての使用に適するように考慮すべきである（前記ＤＮＡポリメラーゼはＲＣＡのための前記因子を必要とし得る）。ＲＣＡに有益な鎖置換因子は、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼ補助サブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（１２）：７６４８−７６５３（１９９３））、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８（２）：１１５８−１１６４（１９９４））、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（Ｂｏｅｈｍｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（２）：７１１−７１５（１９９３）；Ｓｋａｌｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２２）：１０６６５−１０６６９（１９９４））、大腸菌単鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；Ｒｉｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−８９１９（１９９５））および子牛胸腺へリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３６２９−１３６３５（１９９２））を含む。ローリング  サークル複製を実施するためのポリメラーゼの能力は、Ｆｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４６４１−４６４５（１９９５）およびＬｉｚａｅｄｉ，合衆国特許番号５８５４０３３において提供される例、特にその実施例１において示されるものなどの、ローリング  サークル複製検定におけるポリメラーゼの使用により測定することができる。
【００７８】
本発明の他の実施例において、多数の一ヌクレオチド多型（すなわち複対立遺伝子）は、マルチプレキシング  プロセスを通して同時に検出することが可能である。したがって、最低４つの異なる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（Ｐ１）は、標的ＤＮＡ上の特定部位における４つの起こりうる点突然変異の任意の一つを検出するために用いることができる。前記対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのそれぞれは、異なる３′末端ヌクレオチド残基を所有する。例として、図２の方法に用いられる。
【００７９】
本発明の方法の実施において、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件およびその他同種のものとの関係は限定されるように意図するものではないことは、もちろん考慮されるべきであり、本分野における通常の技術の一つが、論文が提供される特定の関係において、重要あるいは価値があると認める全ての関連素材を含むように判断するべきである。例えば、一つの緩衝液システムあるいは培養培地を別のものと置き換え、同一でないとしても同様の結果を得ることが可能である。この分野における通常の技術を有する者は、過度の実験例がなくとも、前記置換がここに開示された方法の使用において、最適にその効果を働かせるようにすることを可能にするための前記システムおよび方法論の十分な知識を持つ。
【００８０】
本発明はここで、以下の限定しない例としてさらに示される。これらの例の開示の適用において、本発明にしたがって開示された方法のその他のまた異なる実施例は、恐らく関連分野における通常の知識を有する者に提案されるであろうことは、はっきりと意図されるべきである。
【００８１】
【発明の実施の形態】
（実施例１）
この実行のために、標的配列は、嚢胞性線維症における突然変異の特徴を有する、ＣＦＴＲ  Ｇ５４２Ｘ遺伝子座である。この遺伝子座に対して、ローリング  サークル増幅は、二分割オリゴヌクレオチド  ライゲーション法を用いて行われることはすでに示されており（Ｌｉｚａｒｄｉ他，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９，２２５−２３２（１９９８）参照）、このプロセスは突然変異対立遺伝子を識別することが可能であった。標的配列は、４６ヌクレオチド長である。この実施例に対して、野生型および突然変異対立遺伝子標的の両方が、プライマー伸長のための鋳型として利用され、各鋳型は９６ヌクレオチド長である。
【００８２】
ここで、嚢胞性線維症Ｇ５４２Ｘ遺伝子座の標的配列に相補的な、２３ヌクレオチド長の標的特異的オリゴヌクレオチド（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドすなわちＡＳＯｓ、図１のＰ１）は、エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼとしてのＴ７シークエナーゼと共に利用される。
【００８３】
この実施例において有益なＰ１プライマーは：
野生型：３′末端はＣであり、偶数番号プライマーは−３部位にＡを含有する：
【００８４】
2004516806.tif 000006
【００８５】
突然変異：３′末端はＡであり、偶数番号プライマーは−３部位にＡを含有する：
【００８６】
2004516806.tif 000007
【００８７】
伸長のために用いられるプライマー（Ｐ１）は、識別を増強する手段として、−３部位に追加の突然変異を任意に持ちうる。プライマー伸長に続いて、標識プライマーの使用およびポリアクリルアミド  ゲル電気泳動の変性が容易に続けられる。
【００８８】
識別の成功は、野生型対立遺伝子に対する突然変異の最低１００倍の識別を得られるプライマー伸長プロセスの能力に基づいて定義された。
【００８９】
ここで、標的配列は、４６ヌクレオチドの野生型あるいは突然変異ヒトＣＦＴＲ  Ｇ５４２Ｘ遺伝子座配列より成る、９６ヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドより成る。
野生型：
【００９０】
2004516806.tif 000008
【００９１】
突然変異：
【００９２】
2004516806.tif 000009
【００９３】
通常、合成標的のそれぞれは９６ヌクレオチド長であり、プライマーは、融解温度（Ｔｍ）以下の温度でアニールすることができる。加えて、鋳型は、オーバーローディングを避け、非特異的プライミングを減少させるために、プライマーを超過している。しかし、最適条件は、配列、プライマーおよび標的の同一性に依存し、したがって常に経験的に識別しなくてはならない。プライマー伸長は、エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼ、全４つのデオキシヌクレオシド三リン酸およびＭｇ＋＋の添加により開始される。反応は、用いられる特定酵素の使用が可能である最高温度で最も有益に実施される。
【００９４】
単鎖結合タンパク質はまた、反応混合物中に任意に添加され、不適合塩基を認識し、それに結合することにより、不適合塩基のプライマー伸長の防止を容易にすることができる。前記結合に有益なタンパク質は、大腸菌単鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質およびＴ４遺伝子３２タンパク質である。これらは、ＤＮＡポリメラーゼの添加に先立って、反応混合物中に有益に滴定される。
【００９５】
０．１μＭの放射性同位元素標識オリゴヌクレオチドＰ１（プライマー１、ここで、配列番号：１）は、０．２μＭの野生型（配列番号：５）あるいは突然変異（配列番号：６）オリゴヌクレオチド標的、ヒト熱変性ＤＮＡの増加量、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、５μＭのｄＡＴＰ、５μＭのｄＴＴＰ、５μＭのｄＣＴＰ、５μＭのｄＧＴＰと混合され、５５℃で５分間アニールした。適合プライマーの３′末端はその後、０．００３３ユニットのＴ７シークエナーゼの添加および３７℃、５分間のインキュベートにより、伸長した。反応は、尿素ローディング色素の添加および９４℃、５分間の加熱により停止した。５９ヌクレオチド長伸長産物は、１５％ポリアクリルアミド尿素ゲル上で分析した。ゲルは乾燥し、バンドはホスホロイメージャーを用いて定量された。定量データは、Ｔ７シークエナーゼが、非常に複雑なＤＮＡ混合物の存在下でさえも、野生型および突然変異鋳型間において４００：１以上で識別することを示す。
【００９６】
（実施例２）
この試験に対して、標的配列は、嚢胞性線維症における自然発生突然変異の特徴を有するＣＦＴＲ  Ｇ５４２Ｘ遺伝子座およびＭ１１０１Ｋ遺伝子座である。Ｇ５４２Ｘ遺伝子座に対して、プライマー伸長は、実施例１において、突然変異から野生型を識別することはすでに示された。この実施例に対して、野生型および突然変異対立遺伝子オリゴヌクレオチド標的の両方が鋳型として利用され、各鋳型は８０（Ｇ５４２Ｘ）あるいは６８（Ｍ１１０１Ｋ）ヌクレオチド長である。
【００９７】
2004516806.tif 000010
【００９８】
嚢胞性線維症遺伝子座の標的配列に相補的な３′配列を含有する、可変長の標的特異的オリゴヌクレオチド（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドすなわちＡＳＯｓ、図１のＰ１）は、エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼとしてのＴ７シークエナーゼと共に利用される。
【００９９】
この実施例において有益なＰ１プライマーは：
野生型Ｇ４５４２Ｘ：３′末端はＣ
【０１００】
2004516806.tif 000011
【０１０１】
突然変異Ｇ５４２Ｘ：３′末端はＡ
【０１０２】
2004516806.tif 000012
【０１０３】
野生型Ｍ１１０１Ｋ：３′末端はＡ
【０１０４】
2004516806.tif 000013
【０１０５】
突然変異Ｍ１１０１Ｋ：３′末端はＴ
【０１０６】
2004516806.tif 000014
【０１０７】
伸長のために用いられるＰ１プライマーは、識別を増強する手段として、−３部位に追加の不適合を任意に持ち得る。プライマー伸長に続いて、双極性プライマー（図１のＰ２）の使用およびＲＣＡが容易に続けられる。ＲＣＡ産物は、マイクロアレー  スライド  スキャナーを用いて、蛍光により検出される。この実施例において、双極性Ｐ２プライマーは：
Ｇ５４２Ｘ遺伝子座
【０１０８】
2004516806.tif 000015
【０１０９】
Ｍ１１０１Ｋ遺伝子座
【０１１０】
2004516806.tif 000016
【０１１１】
の配列を持つ。
【０１１２】
この実施例におけるローリング  サークル増幅鋳型は：
Ｇ５４２Ｘ遺伝子座：ＲＣＡは配列番号２７により行われる
サークル１
【０１１３】
2004516806.tif 000017
【０１１４】
Ｍ１１０１Ｋ遺伝子座：ＲＣＡは配列番号２８により行われる
サークル４．２
【０１１５】
2004516806.tif 000018
【０１１６】
の配列を持つ。
【０１１７】
蛍光修飾物質は：
Ｇ５４２Ｘ遺伝子座：
【０１１８】
2004516806.tif 000019
【０１１９】
Ｍ１１０１Ｋ遺伝子座：
【０１２０】
2004516806.tif 000020
【０１２１】
の配列を持つ。
【０１２２】
対立遺伝子識別の成功は、野生型対立遺伝子に対する突然変異の最低１０倍の識別を得られるプライマー伸長／ＲＣＡプロセスの能力に基づいて定義された。
【０１２３】
ＡＳＯ  Ｐ１プライマーの二重の連続希釈の固定されたマイクロアレーを含有するガラススライドは、１０μｌの６×ＳＳＣ緩衝液（１×ＳＳＣ緩衝液は、０．１５Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム）、１％グリセロールおよび１００μｇ／ｍｌ単鎖サーモン精子ＤＮＡ中で、６．２５ｎＭの標的と共に、４５℃で１時間インキュベートされた。スライドはその後、１００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５および０．５ｍＭのＭｇＣｌ２中で、室温で５分間、一回洗浄された。ＡＳＯ  Ｐ１プライマーはその後、０．０９ユニットのＴ７シークエナーゼ、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２０μＭのｄＮＴＰｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴおよび０．５ｍＭのＭｇＣｌ２を共なう３７℃で１５分間のインキュベートにより、伸長した。標的はその後、スライドを９４℃で０．１×ＳＳＣ中で２回、続いて室温で５０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２で５分間洗浄することにより除去された。
【０１２４】
ＲＣＡサークル（１μＭ）は、２×ＳＳＣ中で、４２℃で１時間、Ｐ２プライマー（０．５μＭ）と前アニールした。その後、サークル／プライマー混合物は、５倍に希釈され、マイクロアレーに添加された。伸長したＡＳＯ  Ｐ１プライマーへのアニールは、ＲＣＡ緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）中で、４２℃で１時間行われた。スライドは、ＲＣＡ緩衝液中で室温で５分間、一回洗浄された。その後、ローリング  サークル増幅は、１０μｌのＲＣＡ緩衝液、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．２ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび５μＭのＳＳＢ中への６．５ユニットのＴ７シークエナーゼの添加により開始された。スライドは３７℃で１時間インキュベートされた。ＲＣＡは、スライドを２×ＳＳＣ中で、３７℃で５分間洗浄することにより終了した。ＲＣＡ産物は、マイクロアレーを２×ＳＳＣ、０．０５μＭのＣｙ３標識オリゴヌクレオチド修飾物質（配列番号：３１−３３）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および１００μｇ／ｍｌサーモン精子ＤＮＡと共に、３７℃で３０分間インキュベートすることにより検出された。その後スライドは、３７℃で５分間、２×ＳＳＣで一回、室温で１０秒間、０．５×ＳＳＣで一回洗浄された。スライドは、卓上臨床遠心機による１０００ｒｐｍで５分間の回転により乾燥された。蛍光は、マイクロアレー  スキャナー（ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ５０００，ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて測定され、点強度は、ＱｕａｎｔＡｒｒａｙソフトウェア（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて定量された。
【０１２５】
ＲＣＡの産物は、この分野においてよく知られた方法により、容易に検出される。ここで、前記ＲＣＡ産物は、鋳型サークル中の配列とハイブリッド形成するＣｙ３標識オリゴヌクレオチドを用いて、蛍光光度計により有益に測定される。代わりに、ＲＣＡ産物は、例えば、産物が抗ＢｒＵｄＲ免疫グロブリン（すなわち抗ＢｒＵｄＲ  Ｉｇ）を用いて検出されるブロモデオキシウリジン−ｄＵＴＰ（ｄＢｒＵＴＰ）あるいは産物がアビジン−アルカリ  フォスファターゼ結合体を用いて検出されるビオチンｄＵＴＰなどの多くのｄＮＴＰタグの任意の一つなど、この分野においてよく知られたタグを用いて、標識することができる。
【０１２６】
ここに開示された発明にしたがって、標的ＤＮＡは、細胞源（例えば、ヒト細胞系列、血液、組織サンプルあるいは非ヒト細胞由来のものを含むその他のＤＮＡ源）からゲノムＤＮＡとして単離される。本実施例の目的に対して、この源は、Ｇ５４２遺伝子座およびＭ１１０１Ｋ遺伝子座について、既知の遺伝子型のヒト細胞である。
【０１２７】
上記のように設計されたオリゴヌクレオチド  プライマーはその後、ＤＮＡ鎖にアニールし、続いてプライマー伸長する。スライドはその後、未反応のオリゴヌクレオチドを除去するために、適切な緩衝液で十分に洗浄される。ＲＣＡは、すでに開示された構造の前形成サークル（ＡＴＣｓ）の添加により開始され、続いてアニールし、望ましいＤＮＡポリメラーゼが添加される。増幅ＤＮＡはその後、ＲＣＡ産物とハイブリッド形成する（開示されたような）オリゴヌクレオチド  サークル特異的タグの一つを用いて検出される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一つの実施例を示す図。ここで野生型および標的ゲノムＤＮＡｓは、プライマー（ここではＰ１と示される）の伸長を支持する相対的な能力により識別される。野生型あるいは突然変異標的ＤＮＡは、まず最初に対立遺伝子特異的Ｐ１プライマーにアニールし、前記プライマーの３′末端はその後、Ｐ１オリゴヌクレオチドの３′末端の適合および不適合残基を識別し、適合ヌクレオチドからのみ伸長し、標的ＤＮＡを前記伸長のための鋳型として用いる（パネルＡ−野生型ＤＮＡおよびパネルＡ′−突然変異標的ＤＮＡ）ことが可能な、エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼにより伸長する。プローブＰ１は、Ｂ（ここでは野生型対立遺伝子）においてポリメラーゼ酵素により伸長するが、Ｂ′（ここでは突然変異対立遺伝子）においては伸長しない。標的ＤＮＡが除去された後、対立遺伝子特異的双極性あるいは二官能性短プライマー（ここではＰ２と示される）は、伸長した新規合成ＤＮＡにアニール（パネルＣ）し、前記Ｐ２プライマーは、対立遺伝子特異的方法において、スライドにローリング  サークル増殖（ＲＣＡ）台座を固定するために働く。この実施例において、Ｐ１はガラススライド上に固定されるが、その他の基質も請求された発明において利用可能である。
【図２】追加の実施例を示す図。ここで野生型および突然変異標的ＤＮＡは、対立遺伝子特異的Ｐ１プライマーにアニールする。Ｐ１の３′末端は、図１に示されたように、その後伸長し（野生型および突然変異対立遺伝子それぞれに対してパネルＡおよびＡ′参照）、標的ＤＮＡは続いて除去される。対立遺伝子特異的二官能性あるいは双極性短プライマー（Ｐ２）はその後、新規合成伸長ＤＮＡにアニールし（パネルＢおよびＢ′）、不適合３′末端から適合３′末端を識別する条件下で再び伸長する（パネルＣおよびＣ′）。プライマー伸長の間に伸長しなかったＰ２プライマーは、対立遺伝子特異的サークル（ＡＴＣ）がＰ２にアニールする前に、洗浄して除去される。対立遺伝子特異的ＲＣＡ産物はその後、標識ヌクレオチド検出剤を用いて検出される。Ｐ１はガラススライド上に固定されるが、請求された発明において、その他の基質も利用可能である。
【図３】ゲノムＤＮＡの存在下でのＴ７シークエナーゼを用いた、また適合プライマーおよび不適合プライマーを用いたプライマー伸長法実験を示す図。
【図４】マイクロアレーの走査画像を示す図。Ｐｒ１、Ｐｒ２およびＰｒ４はＲＣＡ反応に対するコントロールである。マーカーは、定位のためにアレー上にスポットしたＣｙ３標識オリゴヌクレオチドである。ＷＴ＝野生型、Ｍｕｔ＝突然変異。
【図１】
2004516806.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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