(57)【要約】【課題】            低電位閾値作動型であるＴ型カルシウムイオンチャネルを修飾する化合物を探索するための蛍光アッセイ法で、且つ、ハイスループットスクリーニングに対応可能な蛍光アッセイ法を提供すること。【解決手段】        高電位閾値作動型カルシウムイオンチャネルを発現している細胞内に取り込ませたフルオロフォアの存在下で高濃度カリウムイオン刺激によって活性化した際の細胞内カルシウムイオン濃度の変化に基づく蛍光強度変化の検出により該高閾値チャネルの活性化を測定した従来の蛍光アッセイ法を、Ｔ型カルシウムイオンチャネルを発現している細胞の膜電位を人為的に低下させることにより、高濃度カリウムイオン刺激による該Ｔ型チャネルの活性化が可能なように改良し、Ｔ型カルシウムイオンチャネルに対するハイスループットな蛍光アッセイを可能とした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ型カルシウムイオンチャネルの活性化を検出する方法であって、
該方法は少なくともＴ型カルシウムイオンチャネルのα１サブユニットを発現している細胞を前記Ｔ型チャネルの活性化に十分なカリウムイオンにより処理すること、及び、その細胞によって励起された蛍光を測定することを含み、
ここで、該細胞は、カルシウムイオンの存在下で変化するフルオロフォアを含むように修飾されており、及び
該細胞はカリウムイオンで処理する前に、浸透圧平衡溶液の存在下で一価陽イオン選択的な孔を形成する薬物で処理されており、
励起された蛍光強度の変化は該Ｔ型カルシウムイオンチャネルの活性化を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フルオロフォアの励起がカルシウムイオンの存在下で増加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一価陽イオン選択的な孔を形成する薬物が、グラミシジン、人工ペプチド、又は、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfrigens)β‐トキシンから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記浸透圧平衡溶液が、１又はそれ以上のＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）、コリン、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン（ＴＲＩＳ）及びテトラ-エチル-アンモニウム（ＴＥＡ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ型イオンチャネルの活性化を検出する方法であって、
該方法は少なくともＴ型カルシウムイオンチャネルのα１サブユニットを発現している細胞を前記Ｔ型チャネルの活性化に十分なカリウムイオンにより処理すること、及び、その細胞によって励起された蛍光を測定することを含み、
ここで、該細胞は、カルシウムイオンの存在下で変化するフルオロフォアを含むように修飾されており、及び
該細胞はＴ型カルシウムチャネルと共にカリウムチャネルを共発現し、
励起された蛍光強度の変化は該Ｔ型カルシウムイオンチャネルの活性化を示すことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記細胞がＩＲＫ‐１、ＴＡＳＫ‐１、ＴＡＳＫ‐３、ＴＲＥＫ‐１、ＴＲＥＫ‐２、及びＴＲＡＡＫから選択されるカルシウムチャネルを共発現していることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ型カルシウムイオンチャネルを修飾する化合物を同定する方法であって、該方法は、被検化合物の存在下及び非存在下において請求項１の方法を実行すること、並びに、励起される蛍光のレベルを変化させる被検化合物の能力を決定することを含み、但し、該化合物の存在下において励起される蛍光強度の該化合物非存在下における蛍光強度との差により該Ｔ型カルシウムイオンチャネルの修飾物質として該化合物を同定することを特徴とする方法。
【請求項８】
前記フルオロフォアの蛍光励起がカルシウムイオンの存在下で増加し、且つ、被検化合物が存在する場合の蛍光強度の増加によって、該被検化合物をカルシウムイオンチャネルの刺激薬として同定することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記フルオロフォアの蛍光励起がカルシウムイオンの存在下で増加し、且つ、被検化合物が存在する場合の非存在の場合に対する蛍光強度の減少によって、該チャネルの阻害剤として被検化合物を同定することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
カルシウムイオンが存在する場合の非存在の場合に対する励起の変化を示すフルオロフォア；
少なくともＴ型カルシウムイオンチャネルα１サブユニットを発現するシステムで安定的に形質転換した細胞;
ＮＭＤＧを含むバッファー；及び、
細胞膜中に一価陽イオン特異的な孔を形成出来る成分、
を含むことを特徴とするＴ型カルシウムイオンチャネルの活性化を評価するキット。
【請求項１１】
前記成分がグラミシジンである、請求項６に記載のキット。
【請求項１２】
細胞膜中に一価陽イオン特異的な孔を形成できる成分で細胞を処理することを含み、該細胞は、ナトリウムイオンが実質的に欠如している等張性培養液に懸濁されていることを特徴とする細胞の膜電位を下げる方法。
【請求項１３】
前記成分がグラミシジンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養液がＮＭＤＧを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願の請求の範囲は、２００３年１月７日に出願された米国仮特許出願 第６０／４３８，６１６号及び２００３年３月２４日に出願された米国仮特許出願 第６０／４５７，４０５号に基づき、米国特許法第１１９条（ｅ）項の利益を主張する。上記出願の内容は引用をもって本書に組み込む。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、カルシウムチャネル遮断薬に対するハイスループットアッセイに関する。更に、とりわけ、ハイスループットな自動化スクリーニング方法により、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネル活性を調節する化合物を同定する目的で設計された蛍光アッセイ（fluorescence-based assay）に関係している。
【背景技術】
【０００３】
静止条件下では、細胞内カルシウム濃度は非常に低い。細胞内へのカルシウムの急速な流入は、電位作動型カルシウムチャネル（細胞膜上の一過的かつ可逆的なカルシウム選択的な開孔によって膜の速い脱分極に反応する統合的な膜タンパク質）によって仲介される。この孔は、細胞外液から細胞内への濃度勾配に従った急速なカルシウムイオンの拡散（カルシウム電流）を可能とする。より高濃度の細胞内カルシウムイオンは、広範な種類の細胞生理学的な反応（興奮収縮連関、ホルモン分泌及び遺伝子発現を含む）を誘発する。
【０００４】
正常な生理的機能はカルシウムチャネルによって仲介されているため、このチャネルの機能不全は多くの疾患をもたらす。例えば、ヒト及びマウスのカルシウムチャネル遺伝子で同定された変異が、家族性半身偏頭痛（familial hemiplegic migraine）、偶発性失調症２型（episodic ataxia type 2）、小脳失調症、欠神てんかん、及びてんかん発作の原因であることが判明した。Ophoff, et al., "Familial hemiplegic migraine and episodic ataxia type-2 are caused by mutations in the Ca2+gene CACNL1A4." Cell (1996) 87, 543-552； Fletcher, et al., "Absence epilepsy in tottering mutant mice is associated with calcium channel defects." Cell (1996) 87, 607-617；及び、Zhuchenko, et al., "Autosomal dominant cerebellar ataxia (SCA6) associated with small polyglutamine expansions in the α1A-voltage-dependent calcium channel." Nature Genetics (1997) 15, 62-69。
【０００５】
実際、幾つかの疾患の臨床的な治療は、治療用カルシウムチャネル遮断薬の開発によって助けられてきた。例えば、Janis, et al., Calcium Channels: Their Properties, Functions, Regulation and Clinical Relevance (1991). CRC Press, Londonを参照。
【０００６】
カルシウムチャネルは、電気生理学的及び薬理学的特性によって、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｐ及びＱ型に分類されている(以下のレビューを参照；McCleskey, et al., Curr. Topics Membr. (1991) 39:295-326、Dunlap, et al., Trends Neurosci. (1995) 18:89-98)。Ｔ型（又は低電位作動型）チャネルは、相対的に負の膜電位で活性化し静止電位の変化に高い感受性がある。Ｌ、Ｎ及びＰ／Ｑ型チャネルは、より正の電位で活性化し多様なカイネティクスと電位依存性を示す。それらの高電位作動型チャネルの生物物理的特性には幾らか重複があるため、それらを区別するためには薬理学的なプロファイリングが有用である。Ｌ型チャネルはジヒドロピリジン（ＤＨＰ）作動薬及び遮断薬に感受性があり、Ｎ型チャネルはConus geographusのペプチド毒ω−コノトキシンＧＶＩＡによって遮断され、Ｐ型チャネルはfunnel web spider（Agelenopsis aperta）の毒由来のペプチド性ω-アガトキシン ＵＶＡによって遮断される。Ｑ及びＰ型チャネルは非常に似ており、それらは単一遺伝子の選択的スプライシングによるものと示唆されている（Bourinet, et al., "Phenotype variants of P- and Q-type calcium channels are generated by alternative splicing of the α1A subunit gene." Nature Neuroscience (1999) 2:407-415）。
【０００７】
高電位閾値カルシウムチャネル（Ｌ、Ｎ及びＰ／Ｑ）は３つの別個のサブユニットから成る複合体である(α１、α２δ及びβ)（De Waardらによるレビュー、Ion Channels, Volume 4, (1997) edited by Narahashi, T. Plenum Press, New York参照）。α１サブユニットは孔形成に必須の主要なサブユニットで、電位センサーとカルシウムチャネル修飾物質の結合部位を含む。α２サブユニットは主に細胞外にあり、膜貫通性のδサブユニットとジスルフィド結合しているが、これら両者は同一の遺伝子由来でin vivoでタンパク質分解性に切断される。βサブユニットは糖修飾されず、α１サブユニットの細胞内領域と高い親和性で結合する親水性タンパク質である。四つ目のサブユニットγは、骨格筋のＴ管に発現しているＬ型Ｃａチャネルに特異的である。
【０００８】
分子クローニングにより、高電位閾値チャネルである６つの異なる型のαチャネル（α１Ａ、α１Ｂ、α１Ｃ、α１Ｄ、α１Ｅ及びα１Ｓ）及び４つの型のβサブユニット（β１、β２、β３及びβ４）の、ｃＤＮＡと相当するアミノ酸配列が明らかになった（Stea, A., Soong, T. W. and Snutch, T. P.によるレビュー、"Voltage-gated calcium channels." in Handbook of Receptors and Channels (1994), edited by R. A. North, CRC Press参照)。
【０００９】
さらに最近、低電位作動型Ｔ型カルシウムイオンチャネルに対応する幾つかのα１サブユニットがクローニングされた。これらクローニングされたα１サブユニットに関する記述は、例えば、米国特許 第６，３０９，８５８号及び第６，３５８，７０６号並びにＰＣＴ国際公開公報 第ＷＯ ９８／３８３０１号及び第ＷＯ ０１／０２５６１号においても見出せるが、これら全ては参照により本出願に組み込む。
【００１０】
α１サブユニットは、一般的には、ほぼ２０００アミノ酸の長さであり、４つの内在性相同的リピート（internal homologous repeats）（ドメインＩ‐ＩＶ）を含み、その各々は６つの推定αへリックス膜貫通領域（alpha helical membrane spanning segments）（Ｓ１‐Ｓ６）を持ち、このうちの一つ（Ｓ４）は正に荷電した残基を３又は４アミノ酸残基毎に有する。スプライシングバリアントには一つの例外がある。ドメインIIとIIIの間には、細胞内領域があるが、この領域はα１Sにおける興奮‐収縮連関を仲介していると考えられ、サブタイプにより１００-４００アミノ酸残基の範囲にある。ドメインＩ―ＩＶで分子の凡そ２／３を形成し、ドメインＩＶのＳ６領域に隣接するカルボキシ末端はカルシウムチャネルの細胞内側に存在すると考えられている。高電位作動型チャネルをコードするα１サブユニットにおいて、ドメインＩのＳ６膜貫通セグメント（βサブユニットの結合部位である）の下流にコンセンサスモチーフ（ＱＱ‐Ｅ‐Ｌ‐ＧＹ‐ＷＩ‐Ｅ）が存在する。しかしながら、α１Ｇ、α１Ｈ及びα１Ｉ（低電位作動型チャネルをコードするクローニングされたサブユニットは今のところこれだけである）は、結合部位を欠如している。
【００１１】
ある発現系においては、高閾値α１サブユニット単独で機能的なカルシウムチャネルを形成することが可能であったものの、その電気生理学的及び薬理学的特性は４つのβサブユニットのいずれかを共発現させると各々異なった様式で調節され、またα２の存在によってそれらの効率が高められた。一方、低電位作動型Ｔ型チャネルは一般的に、α１サブユニット単独で存在している場合にも、完全に問題なく機能する。Perez-Reyes, et al., "Molecular characterization of a neuronal low-voltage-activated T-type calcium channel." Nature (1998) 391: 896-900； Cribbs, et al., "Cloning and characterization of α1H from human heart, a member of the T-type Ca2+channel gene family." Circ. Res. (1998) 83: 103-109；及び、McRory, et al., "Molecular and functional characterization of a family of rat brain T-type calcium channels." J. Biol. Chem. (2001) 276: 3999-4011。
【００１２】
Ｔ型α１サブユニットにおいて、４構造ドメインの各々の孔の領域（Ｐ領域）は、チャネル透過性に関係する診断上（diagnostic）のアミノ酸配列―例えば、グルタミン酸／グルタミン酸／アスパラギン酸／アスパラギン酸（ＥＥＤＤ）―を含む。このＴ型チャネルにおける配列は、４ドメインのチャネルのＰ領域がアスパラギン酸／グルタミン酸／リジン／アラニン（ＤＥＫＡ）であるナトリウム（Ｎａ）チャネルと区別するものであり、グルタミン酸／グルタミン酸／グルタミン酸／グルタミン酸（ＥＥＥＥ）である高閾値カルシウムチャネルと区別するものである。
【００１３】
また、全ての高閾値カルシウムチャネルが、ある種のカルシウム結合タンパク質で見られるＥＦ-handドメインに密接に関連したコンセンサス配列を含有しているのに対して、Ｔ型チャネルでは、カルボキシル領域からドメインＩＶのＳ６の中にＥＦ-handカルシウム結合モチーフを有していない点でも区別される。
【００１４】
チャネル活性を修飾する化合物（例えば、カルシウム流束を遮断、及び／又は、カルシウムチャネルの活性化を阻害することによる）を同定することは、重要な課題である。そのための一つの標準的な方法は、パッチクランプ実験を利用することである。これらの実験では、高度な技術を有する実験者が膜電位の変化及び／又は被検化合物の処理に対応した細胞膜のカルシウム電流を測定することによって、細胞を個別的連続的に評価しなければならない。これらの実験は、効果的で有益である一方、多大な時間を消費し、またカルシウムイオンチャネル活性を修飾する化合物をハイスループットにアッセイするには不適である。
【００１５】
高電位作動型カルシウムチャネル遮断薬のハイスループットアッセイに関しては、商業的に利用可能なフルオロフォア（カルシウムイオンの存在により蛍光発光が変化する）の利点を取り入れた効率的なアッセイが現在使用されている。こうしたフロオロフォアと共に高電位作動型カルシウムイオンチャネルを発現させた細胞を乗せた（loading）後、細胞を高濃度の細胞外カリウムイオンに暴露することにより一人の実験者が同時に数百ウェルのカルシウムチャネル活性を測定することが出来る。この単純な技術は、細胞の静止電位がほぼカリウムイオン濃度の細胞外と細胞内の比で決定されるという知見に基づいている。通常、カリウムは細胞内より細胞外で低く、細胞内で負である静止電位を形成する。細胞外のカリウムレベルが増加して現時点の細胞内濃度に近くなると、膜が脱分極し（内部の負電荷が消失する）、カルシウムチャネルが活性化する。細胞に遮断薬を処理することにより、カルシウムチャネルの活性化の減少が観察される。
【００１６】
カルシウムチャネル（及び、電位作動型イオンチャネル一般）は、３つの状態で存在する；不活性化状態（開孔できない）、静止状態（開孔できる）、活性化状態（開孔する）。このパターンに基づいて、カルシウムイオンチャネルがカリウムパルスに反応できるように、チャネルの相当数は、不活性化状態とは対照的な静止状態になければならない。典型的には、-３０ｍＶの自発的静止膜電位では、４０―７０％のＮ型カルシウムチャネルが静止状態にあり、開孔できる状態にある。これらの各状態間への移行は、膜の電圧によって調節されている。さらに、不活性化状態から静止状態への移行は緩徐であるが、静止状態から活性化状態（活性化したチャネルはカルシウムイオン流束を許容する）は非常に速い。チャネルが活性化状態から不活性化状態へ戻るのも、また比較的緩徐である。
【００１７】
化合物がカルシウムチャネル活性化を遮断できる場合には、カルシウム流束は生じないか程度が減少し、また、測定される蛍光は存在しないか低下したものとなり、そして、この現象を化合物の同定に利用する事が可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
このタイプのアッセイで、低電位作動型カルシウムチャネル（Ｔ型）を用いた場合、-３０ｍＶの自発的静止電位でチャネルが不活性化状態にある事から、アッセイが成功していなかった。この電位においては、本質的に全てのＴ型チャネルが不活性化されており、そのため高カリウムパルス又はその他の生理学的刺激によっても活性化することが出来ない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
しかし、本発明者らは、カリウムイオンで活性化させる前に膜電位を約−７０ｍＶまで減少させることによって十分な数のＴ型チャネルを静止状態に転換でき、上述の蛍光アッセイをＴ型チャネルでの要求を満たすよう改良できる事を見出した。
【００２０】
ハイスループット蛍光アッセイを、低閾値電位作動型Ｔ型カルシウムチャネルの活性を修飾する化合物のスクリーニング及び同定に役立つように改良した。本アッセイは、低電位作動型Ｔ型チャネルを不活性で有効でない状態から静止状態に転換するために、カリウムイオンによる活性化を改良して、膜電位を調節することによって、機能する。そして、続く細胞外液の高カリウム処理によりチャネルが活性化され得る。Ｔ型チャネルを発現する細胞をグラミシジン又は同様の機能の化合物（細胞膜に挿入され一価陽イオン選択的な孔として機能する）で処理することにより、膜電位は低下する。カリウムイオン（細胞内で高濃度）とナトリウムイオン（細胞外で高濃度）の両方はグラミシジン孔を介してそれぞれ反対方向に流れるため、グラミシジン単独で細胞を処理しても膜電位を変えることは出来ない。しかしながら、細胞外液中のナトリウムイオンをＮ‐メチル‐Ｄ‐グルカミン（ＮＭＤＧ）のような正に荷電した高分子（該高分子はグラミシジンで誘発された孔を通過できない）で置換することにより、ナトリウムイオン流による補正を妨げ、カリウムイオンによる外向き流束によって、不活性状態から静止状態にＴ型チャネルが転換するのに十分な膜電位の低下が得られる。そして、これらのチャネルは、高カリウム濃度による活性化に感受性があるため、Ｔ型カルシウムチャネルの活性化（被検化合物の非存在下）を介した内部のカルシウムイオン濃度増加に依存した蛍光シグナルの生成のメカニズムを提供する。それゆえ、一つの態様においては、本発明は、Ｔ型カルシウムチャネルの活性化を検出するための方法を指向している。本方法は、少なくともＴ型カルシウムチャネルのα１サブユニットを発現している細胞をＴ型チャネルの活性化に十分なカリウムイオンで処理し当該細胞で励起された蛍光を測定することを含む、ここで、該細胞はカルシウムイオンの存在下で蛍光発色するフロオロフォアを含有するよう修飾されており、及び、該細胞はカリウムイオンパルスの前にＮＭＤＧ等張液の存在下グラミシジンで処理されている。
【００２１】
もう一つの態様において、本発明は、Ｔ型カルシウムイオンチャネルの活性化を阻害又はカルシウムイオン流を遮断する化合物を同定する方法を指向するものであり、被検化合物の存在下及び非存在下で上記方法を遂行し、励起する蛍光レベルを減少させる被検化合物の能力を決定し、それによって、当該化合物がＴ型カルシウムイオンチャネルの活性化又はカルシウムイオン流を阻害する能力を同定することを含む方法である。もちろん、チャネルを介するカルシウムイオン流を活性化及び増加させる任意の化合物については、蛍光は増加する。それゆえ、本方法は細胞内へのカルシウム流束を増大させる効果を有する化合物を同定することも可能である。このような結果は、ある場合には望ましいかもしれない。
【００２２】
他の態様においては、本発明は、アッセイの遂行に役立つキット、及び、有効性について結果を評価する方法を指向する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、被検化合物の存在下及び非存在下でカルシウムイオン濃度に反応するフロオロフォアを含有する細胞の蛍光を比較することにより、Ｔ型カルシウムイオンチャネル活性化又は該チャネルを通過するカルシウムイオン流を遮断する化合物を同定する機会を提供する。蛍光度を減少させる被検化合物の能力は、Ｔ型カルシウムチャネルを抑制する能力を示している。逆に、蛍光度を増加させる化合物はこれらのチャネルの活性化剤であることを示している。
【００２４】
この一般的なタイプのアッセイは、Ｎ型チャネルに代表される高電位作動型カルシウムイオンチャネルへの適用で成功している。等張液に懸濁したＨＥＫ ２９３細胞のような典型的な培養細胞の細胞膜における膜電位は凡そ-２０ｍＶであるので、この適用が可能である。この膜電位において、高閾値カルシウムイオンチャネルのほとんどが静止状態（この静止状態は、懸濁液中に加えた高濃度のカリウムイオンへの応答における早い反応における活性化に感受性がある）にある。そのため、フルオロフォアを処理され、それを内部に取り込んだ高閾値チャネル発現細胞は、十分なカリウムイオン濃度で処理され膜電位が凡そ０ｍＶに変わり該チャネルが活性化され該細胞内にカルシウム流が生じた場合、蛍光を発することになる。カルシウムイオンとフルオロフォアとの相互作用により蛍光の読み取りが起こるが、これは、カルシウムイオンチャネルの活性化を示している。このプロセスが被検化合物の存在下及び非存在下で行われた場合に、蛍光出力の差異がカルシウムチャネルの活性化における該化合物の効果を示している。
【００２５】
等張液に懸濁された細胞を取り巻く膜電位は凡そ−２０ｍＶである。高電位閾値カルシウムチャネルとは対照的に、この膜電位では、低電位閾値Ｔ型カルシウムチャネルは非活性化状態にあり急速な活性化は無理である。従って、遮断薬化合物の非存在下でも、何ら実質的な蛍光は生じない。
【００２６】
出願人らは、膜電位を人工的に凡そ-７０ｍＶまで下げることによって、Ｔ型チャネルを不活性化状態から静止状態に転換することが出来、それにより、膜電位を急激に０ｍＶ付近にまで増加させる十分なカリウムイオンの素早い添加によって、該チャネルが活性化可能となることを見出した。必要とされるカリウムイオン濃度は１−１００ｍＭの間、好ましくは５−７０ｍＭの間、より好ましくは２０−３０ｍＭの間である。これによりＴ型チャネルを介するカルシウムイオン流が生じ蛍光シグナルが提供されるが、この蛍光シグナルは被検化合物（該化合物のＴ型チャネルと相互作用する能力が試験される）の存在によって調節され得る。
【００２７】
膜電位の引き下げは、膜の中に人工的な外因性の孔（この孔は一価の陽イオンの内向き及び外向き流束を許容する）を挿入する事によって実現する。このチャネルが開孔している間、カリウムイオンが流出し、また通常はナトリウムイオンが細胞内に流入してくる；よって実質的には膜電位には無影響である。しかしながら、同時に等張液の中のナトリウムイオンを孔を通過できない代償成分で置換することにより、カリウムイオンの正味の流出が獲得され、不活性化Ｔ型チャネルを静止状態に転換するのに十分な高い負の膜電位が得られる。
【００２８】
そのため、二つの追加的な構成要素がアッセイのために必要となる；一価の陽イオンのためのチャネルを開ける物質、及び、細胞内環境の浸透圧濃度のバランスを取るがチャネルを通過しない成分。
【００２９】
望ましい性質（一価陽イオン選択的）の孔を膜内に挿入する好適な化合物は、グラミシジン(Wallace, Common structural features in gramicidin and other ion channels. Bioessays, 22:227-234, 2000を参照)、非天然アミノ酸を含むある種の環状ペプチドのような人工イオンチャネル(Ishida, et al., Molecular design and synthesis of artificial ion channels based on cyclic peptides containing unnatural amino acids. J. Org. Chem., 66:2978-2989, 2001を参照)、及び、ある種の細菌毒素(Shatursky, et al., Clostridium perfrigens beta-toxin forms potential-dependent, cation-selective channels in lipid bilayers. Infection and Immunity, 68:5546-5551, 2000を参照)を含むがこれに限定されない。細胞の膜電位の引き下げは、カリウムチャネル、例えばＩＲＫ‐１、ＴＡＳＫ‐１、ＴＡＳＫ‐３、ＴＲＥＫ‐１、ＴＲＥＫ‐２及びＴＲＡＡＫの安定的な共発現によっても実現できる。細胞にＩＲＫ‐１チャネルをトランスフェクションし、次にＩＲＫ‐１チャネルを発現している細胞（−７０ｍＶ以下の膜電位を有する）を選別する。次にＩＲＫ‐１チャネルを安定的に発現している細胞にＴ型チャネルをトランスフェクションし、そして、−７０ｍＶの静止電位で、そのためにＴ型チャネルの不活性化状態から静止状態への移行を可能とするＩＲＫ‐１チャネルとＴ型チャネルの両方を共発現している細胞を選別する。細胞外のカリウムイオン濃度の上昇によって、Ｔ型チャネルは活性化され、それにより、フルオロフォアとの結合によって蛍光励起をもたらすカルシウム流入が起こる。
【００３０】
浸透圧のバランスを取るがグラミシジン又は他の人工孔を通過しない典型的な化合物は、例えば、N-メチル-D-グルカミン（ＮＭＤＧ）、コリン、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン（ＴＲＩＳ）、及び、テトラ-エチル-アンモニウム（ＴＥＡ）を含む。
【００３１】
あるいは、細胞の膜電位の引き下げは、カリウムチャネル、例えば、これに限定するものではないが、ヒトＩＲＫ‐１、ＴＡＳＫ‐１、ＴＡＳＫ‐３、ＴＲＥＫ‐１、ＴＲＥＫ‐２及びＴＲＡＡＫの安定的共発現によって達成してもよい。例えば、細胞をｈＩＲＫ−１チャネル発現システムによりトランスフェクションし、膜電位が−７０ｍＶ以下のｈＩＲＫ−１チャネルを安定的に発現している細胞株を選別する。そして、これらの細胞をＴ型チャネルの発現システムによりトランスフェクションし、そして、−７０ｍＶの静止電位で、そのためにＴ型チャネルの不活性化状態から静止状態への移行を可能とするＩＲＫ‐１チャネルとＴ型チャネルの両方を共発現している細胞を選別する。細胞外のカリウムイオン濃度の上昇によって、Ｔ型チャネルは活性化され、それにより、フルオロフォアとの結合によって蛍光励起をもたらすカルシウム流入が起こる。
【００３２】
また、本アッセイを行うのに必須の要素は、好適なフルオロフォアである。フルオロフォアは、カルシウムイオンの存在によって活性化（又は、不活性化）されなければならない。また、フルオロフォアは、フルオロフォアを処理された細胞が化合物を吸収できるように、膜透過性でなければならない。好適なフルオロフォアとしては、ＦＬＵＯ‐３、ＦＵＲＡ、オレゴングリーン、及びカルシウムグリーンの他、ＦＬＵＯ‐４も含む。
【００３３】
クローン化した高閾値カルシウムチャネルを発現する哺乳動物細胞を用いた典型的なアッセイ（当業者に既知のもので図１に示す）においては、細胞はまずＦＬＵＯ‐４のようなフルオロフォアにより十分な時間（フルオロフォアが膜を通過して入り込むのに十分な時間で、例えば４５分）処理し、それから洗浄し、フルオロフォア色素の細胞内分布が平衡になるよう凡そ２０分間静置する。遮断又は活性化を調べるための化合物を添加するのであれば、その後に、化合物を加え、凡そ１０分間平衡化するように放置する。そして、細胞内へのカルシウム流を引き起こすのに必要な、凡そ−２０ｍＶから０ｍＶへと膜電位の増加をもたらす濃度のカリウムイオンで、細胞を活性化させる。そして標準的な手法により蛍光を決定する。
【００３４】
しかしながら、図２に示すように、ヒト及びラットＴ型α１サブユニットはより低い電位で活性化される。図２では、電圧の関数としての活性化と不活性化を示している。−１１０ｍＶの保持電位から１５秒毎のスクエア試験パルス（５０ｍｓ間隔）の適用により、Ｔ型電流が惹起された。不活性化カーブ（三角）において、試験パルスは−４０ｍＶに固定し、プレパルス（１秒）のサイズを図示した値に変えた。活性化カーブにおいて、試験パルスのサイズを図示した値に変えた。外液は１ｍＭカルシウムイオンを含んでいる。図２のグラフで、Ｘ軸はチャネルサブユニットを発現している細胞の膜電圧をプロットしており、Ｙ軸は静止状態にあって活性化可能な該チャネルの割合をプロットしている。図に示されたように、不活性化から活性化状態への移行は−６０ｍＶから−５０ｍＶの範囲で起こる。
【００３５】
図３は、外液のナトリウムをＮＭＤＧで置換することにより細胞内の等張性が得られるような懸濁バッファーで維持した場合に、グラミシジンの存在下で細胞の膜電位を変えられることを示している。外液にナトリウムが無い状態で５μｇ／ｍｌのグラミシジンを添加した場合、膜電位が凡そ−７０ｍＶまで低下することが示されている。
【００３６】
図４に示したものは、図３の現象を利用して、図１のアッセイを改良した方法である。最初のステップは図１の最初のステップに似ているが、アッセイはナトリウムイオンがＮＭＤＧに置換された等張液の中で行われ、また被検化合物の添加後約１０分間インキューベートしてからグラミシジンを添加し約２分間平衡化させている。グラミシジン処理後、膜電位が凡そ-７０ｍＶまで低下するが、素早いカリウムイオンパルスにより膜電位が０ｍＶに変わりＴ型チャネルの活性化が誘導され、細胞内カルシウムの増加が蛍光の変化となり検出される。
【００３７】
本発明のアッセイに従ってＴ型チャネル活性の修飾に成功した化合物は、Ｔ型チャネルの不適切な活性によって仲介されることが知られている種々の状態の治療における医薬の有用な候補である。カルシウムイオン情報伝達は様々な代謝系で非常に重要であるため、影響を受ける状態（condition）は多数にのぼる。用語「治療」とは、状態の負の影響を寛解するか、又は、少なくともその可能性を有している、任意の薬理学的な処置を意味する。完全な「治癒」又は完全な「予防」は、必要でもなく現実的でもない。
【００３８】
ヒトＴ型チャネルの活性に影響される状態（condition）には、てんかん、うつ病、統合失調症、及び心臓のリズムのような神経系の興奮/弛緩リズムによって制御されている筋関連疾患などの神経系と関連した状態、並びに、その他の心臓血管系の疾患がある。血管拡張若しくは血管弛緩及び血圧のような細胞の増殖と関連した状態（condition）も、また影響を受ける。また、カルシウムイオンＴ型チャネルの活性は、腎機能の他、性機能及び生殖機能の障害を含む、生殖／泌尿器系の状態（condition）にも影響を与える。その他の適応症としては、麻酔への反応性及びパーキンソン病を含む。これらの状態（condition）（また、その他）がＴ型チャネル活性と関連していることが当業者によく知られている。
【００３９】
以下の実施例は説明のためのものであり、本発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【００４０】
（調製Ａ）
（哺乳類Ｔ型カルシウムチャネルα１サブユニットを安定的に発現する細胞株の構築）
Ｔ型カルシウムチャネルのα１サブユニットを安定して発現する哺乳類細胞は、ＨＥＫ ２９３細胞にα１カルシウムチャネルサブユニットＤＮＡをトランスフェクトし、抗生物質抵抗性により選別することにより構築した。簡潔に述べると、完全長のＴ型カルシウムチャネルのα１サブユニットを選択マーカーと共に発現ベクターｐｃＤＮＡ３ (InvitroGen, San Diego, Calif.)にサブコローニングした。そのベクターをリポフェクションによりＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、細胞を１６‐２０時間インキュベーションした。その細胞を非選択培養液で培養し、さらに２４時間インキュベーションし、それから、トリプシン処理し、６００から８００μｇ／ｍｌの範囲のジェネティシン（Ｇ４１８）を添加した選択培養液中に低密度でプレーティングした。非選択培養液中で１２から１６日後に、Ｇ４１８に抵抗性を持つ細胞が目に見えるようになり、ピペットチップテクニックを用いて単離コロニーを拾いだした。各単離コロニーが細胞株を確立するほどに集密して生育した後に、Ｔ型カルシウムチャネルの発現をノーザン及びサザンブロットにより判別した。
【００４１】
安定して形質転換された細胞におけるＴ型カルシウムチャネルの機能的な確認は、電気生理学的に、ホールパッチクランプ法、又は単一チャネル解析、又はその両方によって調べた。
【００４２】
（実施例１）
（Ｔ型チャネルの修飾物質に関するアッセイ）
調製Ａにおいて調製した形質転換されたＨＥＫ２９３細胞をポリ-Ｄ−リジンでコートされた３８４ウェルのマイクロウエルプレートに約１．１×１０５細胞／ウェルの密度で播き、３７℃で約２４時間その後２９℃で約１８時間インキュベーションした。
【００４３】
その後、細胞は、培養液を除くため、Bio-tek ELX405 Select plate washerを用いてＭＫＨバッファーで洗浄した；バッファーの残余体積が１５μｌ／ウェルとなる。
【００４４】
各ウェルを、５０μｇのＦＬＵＯ‐４ ＡＭ (Molecular Probes, F-14201); ４５．５μｌのＤＭＳＯ; ４５．５μｌの２０％ Pluronic Ｆ‐１２７（Molecular Probes, P-6867）及び４ｍｌのＭＫＨバッファーの混合液を含む蛍光色素溶液で処理した。２９℃で４５分間インキュベーションした後、溶液を完全に置換するため細胞を上述のようにＥＢバッファーで洗浄し、そして細胞を２０℃で１０分間インキュベーションした。
【００４５】
ネガティブコントロールとして被検化合物の場合と同濃度のＤＭＳＯ、ポジティブコントロールとして既知の遮断薬ペンフルオリドールを２．５μＭ、及び被検化合物（ＤＭＳＯで希釈）を、各々ＥＢバッファーに含む形で、各ウェルに添加した。そして細胞を室温でさらに１０分間インキュベーションし、Fluoroskan Ascent microplate readerに置いた。バックグラウンドの蛍光を全てのウェルで測定した。
【００４６】
そして、ＥＢバッファー中に１５μｇ/ｍｌのグラミシジン溶液を、各ウェルに１５μｌ/ウェルの量を添加し、約２分間以上してから２０μｌのＭＫＨバッファー中に６０ｍＭのＫＣｌを、各ウェルに、一度に１ウェルづつ、添加した。２秒後に励起された蛍光を測定した。コントロールに関する結果を図５に示した。図示したように、様々な濃度のペンフルオリドールにより、カルシウムイオン輸送の遮断が成功した。
【００４７】
（バッファー組成）
ＭＫＨバッファー:１１８ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、０．５ ｍＭ ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１１．７ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１８．４ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２(含ＮａＯＨ)。
【００４８】
ＥＢバッファー:１４０ｍＭ ＮＭＤＧ（ｐＨ９．０ 含ＨＣｌ）、２ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭグルコース、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１６ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４（含ＨＣｌ）。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】細胞内蛍光を用いた標準的なＮ型カルシウムチャネルアッセイにおける電圧パターンを示した図である。
【図２】２種の哺乳動物のＴ型α１サブユニットに対する活性化及び不活性化のカーブを示した図である。
【図３】ＮＭＤＧ存在下でのグラミシジンの、細胞膜における膜電位を劇的に低下させる作用を示した図である。
【図４】蛍光を用いたＴ型カルシウムチャネルアッセイにおける膜電位の変化を示した図である。
【図５】既知のＴ型カルシウムチャネル遮断薬の存在下及び非存在下における、図４のアッセイの結果を示した図である。
【図１】
2006526389.tif 000002
【図２】
2006526389.tif 000003
【図３】
2006526389.tif 000004
【図４】
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【図５】
2006526389.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月14日(2005.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ型カルシウムイオンチャネルの活性化を検出する方法であって、
該方法は少なくともＴ型カルシウムイオンチャネルのα１サブユニットを発現している細胞を前記Ｔ型チャネルの活性化に十分なカリウムイオンにより処理すること、及び、その細胞によって励起された蛍光を測定することを含み、
ここで、該細胞は、カルシウムイオンの存在下で変化するフルオロフォアを含むように修飾されており、及び
該細胞はカリウムイオンで処理する前に、浸透圧平衡溶液の存在下で一価陽イオン選択的な孔を形成する薬物で処理されており、
励起された蛍光強度の変化は該Ｔ型カルシウムイオンチャネルの活性化を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フルオロフォアの励起がカルシウムイオンの存在下で増加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一価陽イオン選択的な孔を形成する薬物が、グラミシジン、人工ペプチド、又は、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfrigens)β‐トキシンから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記浸透圧平衡溶液が、１又はそれ以上のＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）、コリン、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン（ＴＲＩＳ）及びテトラ-エチル-アンモニウム（ＴＥＡ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ型イオンチャネルの活性化を検出する方法であって、
該方法は少なくともＴ型カルシウムイオンチャネルのα１サブユニットを発現している細胞を前記Ｔ型チャネルの活性化に十分なカリウムイオンにより処理すること、及び、その細胞によって励起された蛍光を測定することを含み、
ここで、該細胞は、カルシウムイオンの存在下で変化するフルオロフォアを含むように修飾されており、
該細胞は安定的にカリウムチャネルを発現するようにトランスフェクションされ、及び
励起された蛍光強度の変化は該Ｔ型カルシウムイオンチャネルの活性化を示すことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記トランスフェクションされた細胞のカリウムチャネルがＩＲＫ‐１、ＴＡＳＫ‐１、ＴＡＳＫ‐３、ＴＲＥＫ‐１、ＴＲＥＫ‐２、又はＴＲＡＡＫカリウムチャネルであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ型カルシウムイオンチャネルを修飾する化合物を同定する方法であって、該方法は、被検化合物の存在下及び非存在下において請求項１の方法を実行すること、並びに、励起される蛍光のレベルを変化させる被検化合物の能力を決定することを含み、但し、該化合物の存在下において励起される蛍光強度の該化合物非存在下における蛍光強度との差により該Ｔ型カルシウムイオンチャネルの修飾物質として該化合物を同定することを特徴とする方法。
【請求項８】
前記フルオロフォアの蛍光励起がカルシウムイオンの存在下で増加し、且つ、被検化合物が存在する場合の蛍光強度の増加によって、該被検化合物をカルシウムイオンチャネルの刺激薬として同定することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記フルオロフォアの蛍光励起がカルシウムイオンの存在下で増加し、且つ、被検化合物が存在する場合の非存在の場合に対する蛍光強度の減少によって、該チャネルの阻害剤として被検化合物を同定することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
カルシウムイオンが存在する場合の非存在の場合に対する励起の変化を示すフルオロフォア；
少なくともＴ型カルシウムイオンチャネルα１サブユニットを発現するシステムで安定的に形質転換した細胞;
ＮＭＤＧを含むバッファー；及び、
細胞膜中に一価陽イオン特異的な孔を形成出来る成分、
を含むことを特徴とするＴ型カルシウムイオンチャネルの活性化を評価するキット。
【請求項１１】
前記成分がグラミシジンである、請求項６に記載のキット。
【請求項１２】
細胞膜中に一価陽イオン特異的な孔を形成できる成分で細胞を処理することを含み、該細胞は、ナトリウムイオンが実質的に欠如している等張性培養液に懸濁されていることを特徴とする細胞の膜電位を下げる方法。
【請求項１３】
前記成分がグラミシジンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養液がＮＭＤＧを含む、請求項９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
α１サブユニットは、一般的には、ほぼ２０００アミノ酸の長さであり、４つの内在性相同的リピート（internal homologous repeats）（ドメインＩ‐ＩＶ）を含み、その各々は６つの推定αへリックス膜貫通領域（alpha helical membrane spanning segments）（Ｓ１‐Ｓ６）を持ち、このうちの一つ（Ｓ４）は正に荷電した残基を３又は４アミノ酸残基毎に有する。スプライシングバリアントには一つの例外がある。ドメインIIとIIIの間には、細胞内領域があるが、この領域はα１Sにおける興奮‐収縮連関を仲介していると考えられ、サブタイプにより１００-４００アミノ酸残基の範囲にある。ドメインＩ―ＩＶで分子の凡そ２／３を形成し、ドメインＩＶのＳ６領域に隣接するカルボキシ末端はカルシウムチャネルの細胞内側に存在すると考えられている。高電位作動型チャネルをコードするα１サブユニットにおいて、ドメインＩのＳ６膜貫通セグメント（βサブユニットの結合部位である）の下流にコンセンサスモチーフ（ＱＱ‐Ｅ‐Ｌ‐ＧＹ‐ＷＩ‐Ｅ）（配列番号１）が存在する。しかしながら、α１Ｇ、α１Ｈ及びα１Ｉ（低電位作動型チャネルをコードするクローニングされたサブユニットは今のところこれだけである）は、結合部位を欠如している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
Ｔ型α１サブユニットにおいて、４構造ドメインの各々の孔の領域（Ｐ領域）は、チャネル透過性に関係する診断上（diagnostic）のアミノ酸配列―例えば、グルタミン酸／グルタミン酸／アスパラギン酸／アスパラギン酸（ＥＥＤＤ）（配列番号２）―を含む。このＴ型チャネルにおける配列は、４ドメインのチャネルのＰ領域がアスパラギン酸／グルタミン酸／リジン／アラニン（ＤＥＫＡ）（配列番号３）であるナトリウム（Ｎａ）チャネルと区別するものであり、グルタミン酸／グルタミン酸／グルタミン酸／グルタミン酸（ＥＥＥＥ）（配列番号４）である高閾値カルシウムチャネルと区別するものである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006526389000001.app
【国際調査報告】
2006526389.tif 000007
2006526389.tif 000008
2006526389.tif 000009
2006526389.tif 000010
2006526389.tif 000011