(57)【要約】本発明は、患者から採取した尿試料によってフリーラジカルに変換されうるスピントラッピング剤の量を測定するために電子常磁性共鳴分光法を用いて患者における活動性腎炎を診断する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照値と比較して尿試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量が増加すれば、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断される、以下の段階を含む、患者における活動性腎炎の病態を診断する方法：
（ａ）患者から尿試料を得る段階；
（ｂ）スピントラッピング剤を試料またはその一部と混合する段階；および
（ｃ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階。
【請求項２】
患者から得られた尿試料が、既知容積の２４時間尿試料であり；
段階（ｂ）において、スピントラッピング剤を試料の一部と混合し；および
方法の段階（ｃ）が
（ｉ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料の一部におけるスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階と
（ｉｉ）２４時間尿試料全量に存在するフリーラジカル産物の量を計算する段階とによって行われる、請求項１記載の方法であって、対照値と比較して患者の２４時間尿試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量が増加すれば、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断される方法。
【請求項３】
対照値と比較してフリーラジカル産物：マーカー物質比が増加すれば、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断される、以下のさらなる段階を含む、請求項１または請求項２に記載の方法：
（ｄ）試料中のマーカー物質の量を測定する段階；および
（ｅ）マーカー物質に対するフリーラジカル産物の比を計算する段階。
【請求項４】
同じ被験者からの一つまたはそれ以上の前回の試料と比較して患者からの尿試料中のフリーラジカル産物の量が増加すれば、患者が切迫腎不全の病態を有することが予測される、以下の段階を含む、活動性腎炎患者において腎不全のリスクを予測するおよび／または治療に対する反応を評価する方法：
（ａ）患者から尿試料を得る段階；
（ｂ）スピントラッピング剤を試料またはその一部と混合する段階；
（ｃ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階；および
（ｅ）（ａ）から（ｃ）の段階を一定間隔で繰り返す段階。
【請求項５】
患者から得られた尿試料が、既知容積の２４時間尿試料であり；
段階（ｂ）において、スピントラッピング剤を試料の一部と混合し；および
方法の段階（ｃ）が
（ｉ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料の一部におけるスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階と
（ｉｉ）２４時間尿試料全量に存在するフリーラジカル産物の量を計算する段階とによって行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
同じ被験者からの一つまたはそれ以上の前回の試料と比較してフリーラジカル産物：マーカー物質比が増加すれば、患者が切迫腎不全の病態を有することが予測される、以下のさらなる段階を含む、請求項４または請求項５に記載の方法：
（ｃ）（ｉｉｉ）試料中のマーカー物質の量を測定する段階；および
（ｉｖ）マーカー物質に対するフリーラジカル産物の比を計算する段階。
【請求項７】
マーカー物質がクレアチニンである、請求項３または６に記載の方法。
【請求項８】
スピントラッピング剤が、
３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルホネート（ＤＢＮＢＳ）；
例、３，５−ジクロロ−４−ニトロソベンゼンスルホネート（ＤＣＮＢＳ）
５−（ジエトキシホスホリル）−５−メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＥＰＭＰＯ）；
５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）；
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−α−フェニルニトロン（ＰＢＮ）；
ニトロメタン；
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンジチオカルバメート（ＭＧＤ）の鉄（ＩＩ）複合体
ジエチルジチオカルバメート（ＤＥＴＣ）の鉄（ＩＩ）複合体；または
上記のいずれかの誘導体もしくは類似体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
スピントラッピング剤がＤＢＮＢＳ、重水素標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２）、１５Ｎ−標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−１５Ｎ）、または重水素および１５Ｎ二重標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２−１５Ｎ）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
腎機能を評価するためにクレアチニンクリアランスを測定する段階をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
急性期反応の指標、例えば血清中のＣ反応性タンパク質濃度、または赤血球沈降速度を測定する段階をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
スピントラッピング剤を含む、患者における活動性腎炎の病態を診断するためのキット。
【請求項１３】
患者における活動性腎炎の病態を有するか否かを診断するためのスピントラッピング剤の使用。
【請求項１４】
スピントラッピング剤が、
３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルホネート（ＤＢＮＢＳ）；
例、３，５−ジクロロ−４−ニトロソベンゼンスルホネート（ＤＣＮＢＳ）
５−（ジエトキシホスホリル）−５−メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＥＰＭＰＯ）；
５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）；
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−α−フェニルニトロン（ＰＢＮ）；
ニトロメタン；
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンジチオカルバメート（ＭＧＤ）の鉄（ＩＩ）複合体
ジエチルジチオカルバメート（ＤＥＴＣ）の鉄（ＩＩ）複合体；または
上記のいずれかの誘導体もしくは類似体である、請求項１２記載のキットまたは請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
スピントラッピング剤がＤＢＮＢＳ、重水素標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２）、１５Ｎ−標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−１５Ｎ）、または重水素および１５Ｎ二重標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２−１５Ｎ）である、請求項１４記載のキットまたは使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、患者における活動性腎炎を診断する方法に関する。
【０００２】
腎臓は、老廃物の排泄、体の内部環境の定常性の維持、ホルモンの生合成に関係する。これらの機能の重要性は、腎疾患において容易に認識され、有効な人工透析治療を提供することは難しい（カニンガム（Ｊ． Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）、「医学テキスト（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、第二版、７８５〜８４１頁、ソウハミ（Ｓｏｕｈａｍｉ）およびモクサム（Ｍｏｘｈａｍ）、チャーチル・リビングストン（１９９４））。
【０００３】
腎炎は、腎臓の糸球体および尿細管領域に影響を及ぼす多くの炎症疾患に関する広い診断である。これは、蛋白尿、血尿、顆粒円柱と断片化赤血球が存在する腎炎沈降物、および腎不全では大きく減少している異常な糸球体濾過速度（ＧＦＲ）を呈する可能性がある。腎炎または「腎臓の炎症」は、最終的に、多くの重篤な疾患の転帰である腎不全に至る可能性がある。腎不全は、腎臓における構造異常と機能的組織喪失に関連し、これは尿毒症に至る。簡単に説明すると、尿毒症は腎不全による体内の毒性老廃物の蓄積として特徴付けることができる。腎臓の必須化合物の枯渇および生合成機能の不全も同様に、この状態の一因となる。
【０００４】
患者における腎炎は、活動性または非活動性であると記述してもよい。腎炎の病態は、時間と共に重症度および臨床症状がより大きくなったり、またはより小さくなって変化しうる。患者は、過去に腎炎の発症例を有することがわかっていても、特定の時期に明白な炎症反応の臨床兆候を示さなければ、非活動性腎炎であると記述される。例えば、最初に医師の診察を受けたときに、患者が血尿（尿中の血液）を示せばそれは活動性腎炎に関連するが、２回目の診察を受けた際に、血尿を示さなければ、すなわち彼らは非活動性腎炎である。
【０００５】
現在、臨床の場において、活動性腎炎は、尿中のヘモグロビンまたはタンパク質の存在によって検出され、より信頼できるのは、顆粒円柱と断片化赤血球とが存在する腎炎沈殿物の存在によって検出される。しかし、これらの方法は全て、月経期間等の干渉を受け、腎炎沈殿物の発見は観察者に依存する。これらの診断指標は、腎炎の予防を試みて臨床介入ができるほどの初期には出現しない可能性がある。現在、活動性腎炎を検出する唯一の正確で信頼のおける方法は、腎生検である。これは、重度に出血する危険性を伴った侵襲性の技法であり、頻繁に行うことはできない。したがって、慢性または急性腎不全の発病前に患者における活動性腎炎を調べるために、単純で有効な診断アッセイ法を提供する必要がある。そのような試験によって、より早期の介入が可能となり、費用のかかる透析を回避して重度の腎障害が予防される可能性があると思われる。
【０００６】
現在では、結合組織疾患のような特定の疾患を有する患者の２４時間尿における特定の化合物の総排泄を測定することによって、活動性腎炎の有無を診断できることが発見されている。
【０００７】
さらに、活動性腎炎患者におけるこれらの化合物の総尿排泄レベルをモニターすることによって、腎不全を発症するリスクおよび治療に対する反応を評価してもよい。
【０００８】
そのような患者の尿におけるこれらの種の存在は、患者がその後腎不全を発症する可能性に関する予後的指標となりうる。
【０００９】
本発明の第一の局面に従って、
（ａ）患者から尿試料を得る段階；
（ｂ）スピントラッピング剤を試料またはその一部と混合する段階；および
（ｃ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階
を含む、患者における活動性腎炎の病態を診断する方法が提供され、
対照値と比較して尿試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量が増加すれば、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断される。
【００１０】
アテローム性動脈硬化症の酸化的原因の研究では、腎不全患者における尿毒症血漿および透析液が調べられている（ロゼラー（Ｒｏｓｅｌａａｒ）ら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４８ １９９〜２０６（１９９５））。そのような患者は、尿検査による腎機能の分析を行うことができるほど十分な尿を産生しない。そのような患者の血漿中に酸化剤が存在することが、ＥＰＲ分光法を用いて検出された。酸化活性は、スピントラップである３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルホネート（ＤＢＮＢＳ）の推定のラジカル陽イオンＤＢＮＢＳ・＋への一電子酸化をモニターすることによって検出した。尿毒症は、正常で健康な人と比較して腎不全患者の血漿では酸化剤の蓄積に関連することが認められ、このことは尿毒症患者においてアテローム性動脈硬化症または他の血管疾患が発症することを意味している。しかし、活動性腎炎患者では、血漿試料のいずれも、腎不全を有する尿毒症患者の血漿とは対照的に酸化剤種の存在を示さない。
【００１１】
本発明の方法を行うことができる様々な方法がある。例えば、好ましい態様において、患者から得た尿試料は、既知容積の２４時間尿試料である。この場合、段階（ｂ）において、スピントラッピング剤を試料の一部と混合して、方法の段階（ｃ）は
（ｉ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料の一部におけるスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階と
（ｉｉ）２４時間全尿試料に存在するであろうフリーラジカル産物の量を計算する段階とによって行われる。
この場合、対照値と比較して患者からの２４時間試料におけるスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量が増加すれば、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断される。
【００１２】
しかし、または、試料中のフリーラジカル産物の量は、尿中に一定速度で排泄されるマーカー物質の量と比較してもよい。この場合、方法はさらに
（ｄ）試料中のマーカー物質の量を測定する段階と
（ｅ）マーカー物質に対するフリーラジカル産物の比を計算する段階とを含んでいてもよく、
ここで、対照値と比較してフリーラジカル産物：マーカー物質の比が増加すれば、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断される。
【００１３】
本発明の意味において、「マーカー物質に対するフリーラジカル産物の比」という用語は、
2004511777.tif 000002
の双方を組み入れ、一方、「フリーラジカル産物：マーカー物質比」は、
2004511777.tif 000003
を意味する。したがって、明らかに、上記の方法において、マーカー物質：フリーラジカル産物比が減少しても同様に、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断されると思われる。
【００１４】
この方法は、既知容積の２４時間尿試料について用いてもよいが、無作為な尿試料を用いる場合に特に有用である。これは、尿の容積が患者の液体摂取量に応じて変化するためである。したがって、フリーラジカル産物の量を、一定速度で排泄されるマーカー物質の量と比較すると、尿試料中のフリーラジカル産物の量または濃度を単に測定することより意味のある値が得られる。
【００１５】
この比較のために用いる適したマーカー物質は、クレアチニンである。下記により詳細に考察するように、活動性腎炎患者におけるクレアチニンクリアランスレベルは、正常範囲内である（実施例１を参照のこと）。
【００１６】
本明細書の意味において、「対照値」という用語は、単一の値または値の範囲のいずれかを意味する。用いる対照値は、方法のどの特定の態様を用いるかに依存して、本発明の方法において測定された値と同等であるが、少なくとも１人の健常ボランティアから得られた測定値であろう。より通常、健常被験者の正常範囲である対照範囲を得るためには、多数の健常ボランティア、例えば少なくとも５０人からの測定値を用いる。
【００１７】
例えば、患者からの試料が既知容積の２４時間尿試料である場合、対照値は健常ボランティアの２４時間尿試料中のフリーラジカル産物の全量を測定することによって得られる正常範囲であってもよい。
【００１８】
一方、マーカー物質に対するフリーラジカル産物の比を計算する場合、対照値は、多数の健康ボランティアにおける測定値から計算した比の範囲であってもよい。
【００１９】
本明細書の意味において、２４時間尿試料は、２４時間のあいだに患者によって排泄された尿の全量である。
【００２０】
本明細書の意味において、スピントラッピング剤は、活動性腎炎患者の尿中に存在する物質と反応して、常磁性であって、ＥＰＲ分光法によって検出するために十分に安定である荷電または非荷電フリーラジカル産物を産生することができる物質である。ラジカル産物の不対電子は、ＥＰＲ分光法によって検出することができ、これも同様に、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法として知られている。
【００２１】
フリーラジカル産物は、スピントラッピング剤と尿試料に存在する物質との直接反応産物であってもよい。しかし、これは必ずしも当てはまらず、スピントラッピング剤によってはフリーラジカル産物は間接的に誘導される。
【００２２】
適したスピントラッピング剤には、ＤＢＮＢＳが含まれ、これはラジカル陽イオンＤＢＮＢＳ・＋に変換されると考えられる。ＤＢＮＢＳの類似体も同様に用いてもよく、これらには、重水素標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２）、１５Ｎ−標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−１５Ｎ）、ならびに重水素および１５Ｎ二重標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２−Ｎ１５）のような同位元素標識型が含まれる。ＤＢＮＢＳの他の誘導体、例えば、３，５−ジクロロ−４−ニトロソベンゼンスルホネート（ＤＣＮＢＳ）も同様に用いてもよく、これは２０００年１２月１３日にランドックス研究所（株）の名称で提出された英国特許出願番号第００３０２７８．６号に開示されている。ＤＣＮＢＳは、ＤＢＮＢＳと類似の感度を提供するが、よりよい溶解度を有する。
【００２３】
本発明の方法において有用なもう一つのスピントラッピング剤には、５−（ジエトキシホスホリル）−５−メチル−１−ピロリンＮ−オキシド（ＤＥＰＭＰＯ）、５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−α−フェニルニトロン（ＰＢＮ）、ニトロメタン、またはＮ−メチル−Ｄ−グルカミンジチオカルバメート（ＭＧＤ）もしくはジエチルジチオカルバメート（ＤＥＴＣ）の鉄（ＩＩ）複合体、またはこれらの一つの誘導体もしくは類似体（標識類似体を含む）が含まれる。その他のスピントラッピング剤を同様に用いてもよく、適した物質は、当業者によって容易に同定されうるであろう。
【００２４】
本発明の方法においてスピントラッピング剤がフリーラジカルに変換されることについて最も可能性が高い説明は、尿試料が一つまたはそれ以上の酸化種を含むことである。これが実際に本当であるならば、スピントラッピング物質のフリーラジカル産物への変換の測定は、実質的に、２４時間尿試料に存在する酸化活性を測定することである。このことを考慮すると、フリーラジカル産物の濃度は場合によっては下記のように試料中の酸化活性レベルとして記述される。
【００２５】
しかし、試料中に酸化物質が存在するために、スピントラッピング剤のフリーラジカル産物への変換が起こらなくとも、本発明の方法が有効に作用することに変わりはないことを強調すべきである。
【００２６】
本発明に従う方法は、腎障害を有するが、腎不全をまだ発症していない患者、特に、例えば、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）、およびウェグナー肉芽腫（ＷＧ）のような結合組織疾患を有する患者における活動性腎炎を診断するために特に有用である可能性がある。
【００２７】
本発明の方法は、腎障害に関連した他の疾患を診断するために、特に炎症性の腎疾患を非炎症性の腎疾患と区別するために大いに役立つ。例えば、方法は、妊娠中に腎障害を発症したＳＬＥ患者において用いることができるであろう。このような状況では、本方法は、ループス腎炎または子癇前期毒血症のいずれかとなりうる腎障害の基礎となる原因を区別するために用いることができる。さらに、糖尿病、高血圧症、または腎血管疾患のような腎障害の他の非炎症性原因を、尿路感染症に関連した腎盂腎炎のような腎障害の炎症性原因と区別することが可能となるであろう。
【００２８】
そのような患者の尿によってフリーラジカルに変換させることができるスピントラッピング剤の量が急激に増加すれば、切迫腎不全を示しており、活動性腎炎の治療を受ける患者において、尿酸化剤排泄を繰り返し測定することは、治療に対する反応をモニターするために有用となりうるであろう。
【００２９】
したがって、本発明のさらなる局面において、
（ａ）患者から尿試料を得る段階；
（ｂ）試料またはその一部をスピントラッピング剤と混合する段階；および
（ｃ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階；
（ｄ）一定間隔で段階（ａ）〜（ｃ）を繰り返す段階、
を含む、活動性腎炎患者における腎不全のリスクを予測するおよび／または治療に対する反応を評価する方法が提供される。
この場合、患者の尿試料中のフリーラジカル産物の量が、同じ被験者からの一つまたはそれ以上の前回の試料と比較して増加すれば、患者が切迫腎不全の病態を有することが予測される。
【００３０】
本発明のこの局面に従って、酸化剤排泄の繰り返し測定を行う。測定間隔は、患者の病態および初回測定時に存在した酸化剤のレベルに応じて、２日から２ヶ月であってもよい。
【００３１】
本発明の第一の局面の方法に関して、患者から得る試料は、既知容積の２４時間尿試料であり、スピントラッピング剤をこの試料の一部と混合することが非常に好ましい。この段階において、方法の段階（ｃ）は、
（ｉ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料の一部におけるスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階と
（ｉｉ）２４時間全尿試料に存在するフリーラジカル産物の量を計算する段階とによって行われる。
【００３２】
または、再度本発明の第一の局面に関して、試料中のフリーラジカル産物の量を、尿中に一定速度で排泄されるマーカー物質の量と比較することも同様に可能である。したがって、この場合、方法は
試料中のマーカー物質の量を測定する段階と
マーカー物質に対するフリーラジカル産物の比を計算する段階とのさらなる段階を含んでいてもよい。
この場合、同じ被験者の一つまたはそれ以上の前回の試料と比較してフリーラジカル産物：マーカー物質の比が増加すれば、患者が切迫腎不全病態を有することが予測される。
【００３３】
本発明の第一の局面の場合のように、マーカー物質に対するフリーラジカルの比を測定することは、既知容積の２４時間尿試料について用いてもよいが、無作為な尿試料を用いる場合に特に有用である。
【００３４】
上記のように、クレアチニンは、この方法において用いるのに適したマーカー物質である。
【００３５】
分析するための尿試料は患者から通常の方法で採取してもよい。フリーラジカルに変換されるスピントラッピング剤のレベルは、ロゼラー（Ｒｏｓｅｌａａｒ）ら、（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４８、１９９〜２０６（１９９５））に記載された方法に従ってアッセイしてもよい。例えば、ＤＢＮＢＳの一定量とリン酸緩衝生理食塩液（例えば、ｐＨ ７．４）とを試料採取装置において試料と混合してもよい。尿試料を試料採取装置において他の成分と混合した後、試料をＥＰＲ分析装置、例えば、ＪＯＥＬ ＲＥ１Ｘ分光計に移すことができる。
【００３６】
同様に、患者における腎機能のレベルをアッセイすることも都合がよい可能性がある。したがって、本発明のこの局面に従う方法には、クレアチニンクリアランスのアッセイ法が含まれうる。血漿クレアチニンは、腎機能の確立されたマーカーである。血漿クレアチニンおよび尿中クレアチニンは、分光光度法、例えば、シグマディアグノスティック社のキット「クレアチニン５５５」（シグマ−アルドリッチ社、プール、イギリス）を用いて測定することができる。血漿は、通常の方法で患者から得ることができる。腎臓が血液からクレアチニンを「消失」させることができる指標としてのクレアチニンクリアランスは、以下の等式によって計算することができる。
2004511777.tif 000004
【００３７】
本発明の方法と共に評価される可能性がある炎症の指標には、血清中のＣ反応性タンパク質レベルおよび赤血球沈降速度が含まれる。
【００３８】
本発明のさらなる局面に従って、キットがＤＢＮＢＳまたは上記のその誘導体もしくは類似体の一つのようなスピントラッピング剤を含む、患者における活動性腎炎の病態を診断するためのキットが提供される。
【００３９】
例えば、キットは、ＤＢＮＢＳの一定量、リン酸緩衝生理食塩液（例えば、ｐＨ ７．４）、および試料採取装置を含んでいてもよい。尿試料を試料採取装置において他の成分と混合した後、試料をＥＰＲ分析装置、例えばＪＥＯＬ ＲＥ１Ｘ分光光度計に移すことができる。キットはさらに、標準物質および／または対照試料を含んでもよい。
【００４０】
本発明のさらなる局面に従って、ＤＢＮＢＳのようなスピントラッピング剤または上記の他のスピントラッピング剤を、患者における活動性腎炎の病態を診断するために用いることが提供される。
【００４１】
本発明の第二およびその後の局面に関する好ましい特徴は、第一の局面に必要な変更を加えたものである。
【００４２】
本発明は、実施例および図面を参照することによって詳しく説明するが、これらの実施例および図面は、説明する目的で提供されるのであって、本発明を制限すると解釈されない。
【００４３】
実施例１：活動性または非活動性腎炎を有する結合組織疾患患者の尿および血漿におけるスピントラッピング剤のラジカルへの変換とクレアチニンレベルとの相関
腎不全を発症していないが、活動性または非活動性腎炎であると臨床診断されている結合組織疾患患者の尿においてスピントラッピング剤をフリーラジカルに変換することができる（本明細書において酸化活性として記述する）物質の全量を調べた。
【００４４】
血清および２４時間尿は、デビッド・クルツ博士（Ｄａｖｉｄ Ｄ’Ｃｒｕｚ、王立ロンドン病院、ホワイトチャペル）がＳＬＥ患者５人（試料は異なる４時点で患者の１人から採取した）、チャーグ・ストラウス症候群患者２人（ＣＳＳ、彼らの１人は腎炎を有しなかった）、およびウェグナー肉芽腫症（ＷＧ）患者１人から採取した。患者は全員、腎機能が正常であった。健康なボランティア７人も同様に対照として含めた。これらの健康なボランティアの４人については、血清と２４時間尿とを採取し、３人については２４時間尿のみを採取した。
【００４５】
酸化活性の量は、尿または血清６０ μｌを、ｐＨ ７．４のリン酸緩衝生理食塩液２０ μｌおよび１０ ｍＭ ＤＢＮＢＳ ２０ μｌと混合することによって決定した。室温で２５分間インキュベートした後、既に記述されているように（ロゼラー（Ｒｏｓｅｌａａｒ）ら、１９９５）、ＥＰＲ分光法（Ｊｏｅｌ ＲＥ１Ｘ分光光度計）によって酸化活性を決定した。血漿中クレアチニン（腎機能の確立されたマーカー）および尿中クレアチニンは、手動の分光光度法（シグマ・ディアグノスティックキット「クレアチニン５５５」）によって測定した。クレアチニンクリアランス（腎臓が血液からクレアチニンを「排泄」する能力の指標）は、以下の等式によって計算した：
2004511777.tif 000005
【００４６】
結果は、全ての患者における血清クレアチニン濃度が正常範囲内であったこと（図１）、そして患者全員のクレアチニンクリアランスが正常範囲内であったこと（図２）を示した。しかし、非活動性対活動性腎炎の群の２４時間尿における総酸化活性は異なった（図３）。統計分析（スチューデントのｔ検定）によって、２群の差が非常に有意であったこと（ｐ＜０．０００１；活動性腎炎：ｎ＝４、非活動性腎炎：ｎ＝４）が示された。健常被験者と活動性腎炎患者のあいだの総酸化活性の差も同様に有意であった（ｐ＜０．０１）。正常被験者と非活動性腎炎患者のあいだには有意差を認めなかった（ｐ＞０．３）。血清と２４時間尿とを異なる４時点で採取した患者に関して、４つの試料から得た値の平均値に最も近い一つの特定の試料の値は、統計の計算において考慮した。
【００４７】
尿中総クレアチニン排泄と尿中総酸化活性とのあいだに明白な相関がないこと（図４）から、クレアチニンレベルとは無関係に、酸化活性が、活動性腎炎の全ての患者においてより高く、非活動性腎炎の全ての患者においてより低いことが示された。このことは、尿中総酸化活性が、結合組織疾患における活動性腎炎の指標となりうることを示した。
【００４８】
実施例２：腎臓が関係する様々な疾患患者の尿および血漿における酸化剤
異なる疾患を有するが、腎不全を有しない、または透析治療を受けていない、程度の異なる腎不全を有する患者からの血漿および尿中の酸化活性を以下のように調べた。
【００４９】
患者２０人からの試料は、マグディ・ヤクーブ（Ｍａｇｄｉ Ｙａｑｏｏｂ）およびマーチン・ラフタリー（Ｍａｒｔｉｎ Ｒａｆｔｅｒｙ）両博士の協力を得てホワイトチャペルの王立ロンドン病院の腎臓クリニックで得た。同じ時間に無作為な尿および血漿を採取した。患者には糖尿病患者５人（Ｄｉａ；血漿中クレアチニン１０９〜５８９ μｍｏｌ／Ｌ）、高血圧症患者３人（ＨＴ；血漿中クレアチニン９８〜２８９ μｍｏｌ／Ｌ）、ＳＬＥ患者３人（血漿中クレアチニン４０〜５２２ μｍｏｌ／Ｌ）、糸球体腎炎患者６人（ＧＮ；血漿中クレアチニン７１〜６８２ μｍｏｌ／Ｌ）、原因不明の慢性腎不全患者１人（ＣＲＦ；血漿中クレアチニン５５９ μｍｏｌ／Ｌ）、多嚢胞腎患者１人（ＰＫ；血漿中クレアチニン１４８ μｍｏｌ／Ｌ）、および腎血管疾患患者（ＲＶＤ；血漿中クレアチニン３９４ μｍｏｌ／Ｌ）が含まれた。血漿中クレアチニンの正常範囲は７０〜１２３ μｍｏｌ／Ｌである。酸化活性およびクレアチニンの測定は上記と同じであった。
【００５０】
結果を図５および６に示す。尿中の酸化活性（任意の単位／ｍｌ）と尿中クレアチニン濃度（相関係数＝０．１６）とのあいだには相関を認めず、この場合も、結合組織疾患患者からの上記の研究において得られた知見を確認した。患者２０人中５人のみが検出可能な血漿中酸化剤を有した（図６）。これらの患者５人全員が３９４ μｍｏｌ／Ｌに等しいかそれ以上の血漿クレアチニン濃度を示し（３９４、５５２、５５９、５７３、および６８２）、その内訳は糸球体腎炎患者２人、糖尿病患者１人、腎血管疾患患者１人、および慢性腎不全（ｒｅｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）患者１人であった。尿中の酸化活性の濃度もこれらの患者では同様に高かった。しかし、血漿中クレアチニンレベルが高い（それぞれ、５８９および５２２ μｍｏｌ／Ｌ）糖尿病とＳＬＥの他の患者２人は、検出可能な血漿中酸化剤を有しなかった。このことは、２つのアッセイ法が異なる臨床情報を提供する可能性があることを示唆するが、多数の患者による試験が必要である。
【００５１】
実施例３：腎不全患者の血漿において認められた酸化剤の測定に及ぼすＤＢＮＢＳ亜硫酸塩ラジカル（ＤＢＮＢＳ−ＳＯ３・−）の影響
腎不全患者の血漿に存在する酸化剤は、スピントラップＤＢＮＢＳと反応して、ＤＢＮＢＳラジカル陽イオンを形成することができる（ロゼラー（Ｒｏｓｅｌａａｒ）ら、１９９５）。このラジカル陽イオンは、ａＮ＝１．３２ ｍＴの非常に細かい分割を有する典型的な３本線のＥＰＲスペクトルを生じる（図７）。しかし、イチモリ（Ｉｃｈｉｍｏｒｉ）とその共同研究者（１９９３）は、この場合に検出されたＥＰＲシグナルがＤＢＮＢＳ−ＳＯ３・−であって、ＤＢＮＢＳラジカル陽イオンではないことを示唆した。
【００５２】
われわれは、ＤＢＮＢＳ亜硫酸塩ラジカルをＤＢＮＢＳラジカル陽イオンと区別する方法を決定して、ＤＢＮＢＳを合成する際に亜硫酸塩が混入し、それが酸化活性の決定にとって問題となりうるか否かを評価した。
【００５３】
ＤＢＮＢＳ−ＳＯ３・−の特徴的なスペクトルは、ａＮ＝１．３２ ｍＴおよびａＨ＝０．０６ ｍＴの９本線のシグナルであった（図８）。これは、ＤＢＮＢＳを過酸化水素およびホースラディッシュペルオキシダーゼと反応させることによって得られた。反応混合物に１０ ｍＭ亜硫酸塩を加えると、シグナル強度は１００倍以上増加した。シグナルはまた、ＤＢＮＢＳを亜硫酸塩単独と反応させることによっても得ることができる。しかし、ＤＢＮＢＳを腎不全患者の血漿および健常被験者の尿と反応させても、ａＮ＝１．３２ ｍＴの３本線が認められたに過ぎなかった（それぞれ、図７および９）。ＤＢＮＢＳ−ＳＯ３・−のスペクトルにおいて認められた水素の微細な分割は存在しなかった。反応混合物に１ｍＭおよび１０ ｍＭ亜硫酸塩を加えると、シグナルがＤＢＮＢＳ−ＳＯ３・−から生じたのであれば増加すると予想されるが、シグナルの高さは減少した（図９および１０を比較）。したがって、われわれは、腎患者の血漿または正常な尿によって生成されたＤＢＮＢＳ−ＳＯ３・−およびＤＢＮＢＳラジカル陽イオンは、全く異なるラジカルであることを確認した。
【００５４】
ＤＢＮＢＳおよび血漿または尿の混合物に亜硫酸塩を加えると、ＤＢＮＢＳラジカル陽イオンのシグナルの高さが減少した。これは、ＤＢＮＢＳ調製物に亜硫酸塩が混入するか、または内因性の亜硫酸塩が生物学的試料そのものに存在すれば、生体試料における酸化剤の決定に影響を及ぼしうる。したがって、反応混合物に亜硫酸塩を加えた場合の用量反応作用を調べた。結果は、反応混合物に最終濃度２ｍＭの亜硫酸塩が存在すればＤＢＮＢＳラジカル陽イオンの３本線シグナルを完全に消失させることを示した（図１１）。しかし、最終濃度０．４ ｍＭの亜硫酸塩は、シグナルの高さの６．１％減少を引き起こしたに過ぎず、０．０８ ｍＭの亜硫酸塩は１．４％の減少を引き起こしたに過ぎなかった。したがって、ＤＢＮＢＳラジカル陽イオンの測定に及ぼす亜硫酸塩の作用は、ＤＢＮＢＳ調製物または患者の試料に存在する亜硫酸塩の濃度では無視できる程度であり、これについて可能性がある問題は、度外視することができる。
【００５５】
実施例４：酸化剤とＤＢＮＢＳおよび様々な類似体との反応
本実施例において、用いたスピントラッピング剤はＤＢＮＢＳおよびその類似体、ＤＣＮＢＳ、ＤＢＮＢＳ−ｄ２、１５Ｎ−ＤＢＮＢＳおよびＤＢＮＢＳ−ｄ２−１５Ｎであった。実験の目的は、異なる多様なスピントラップを用いて酸化剤を検出することが可能であることを証明することであった。この実験では尿よりむしろ透析液を用いて、したがって、ＤＢＮＢＳを対照スピントラップとして用いて、透析液が尿中に認められるものと同じ酸化剤を含むことを証明した。
【００５６】
スピントラップ（５、８、１２、２５、および３０ μｌ、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中での最終濃度０．５、０．８、１．２、２．５、および３ｍＭ）を透析液６０ μｌに加えた。容積の差はＰＢＳで補った。最終容積は１００ μｌであった。反応混合物を十分に混合して、室温で２５分インキュベートした後ＥＰＲ分光法によって分析した。用いたＥＰＲ条件は：マイクロウェーブのパワー４ｍＷ、ＣＦ ３３６．７ ｍＴ、ＳＷ±５ｍＴ、ＳＴ １５０ ｓ、ＴＣ ０．３ ｓ、ＭＷ ０．２ ｍＴであった。結果を表１および図１２に示す。図１２のグラフは、２つの実験の平均値を表す。２つの実験間の変動は平均値を比較すると１８％未満であった。図１３〜１７は、透析液と反応したＤＢＮＢＳおよび様々な類似体のＥＰＲスペクトルである。これらの図において、２つの大きい外側の線はマンガンマーカー（ｍａｎｇａｎａｓｅ ｍａｒｋｅｒ）である。
【００５７】
【表１】腎疾患患者からの透析液における酸化剤を検出するためのＤＢＮＢＳとその類似体との感度の比較
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【００５８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
本明細書においては以下の図の番号が参照される。
【図１】健常者ならびに非活動性および活動性腎炎患者の血清中のクレアチニン濃度を示す。白抜きの印は異なる時点での同じ患者からのものである。
【図２】健常者ならびに非活動性および活動性腎炎患者のクレアチニンクリアランスを示す。白抜きの印は異なる時点での同じ患者からのものである。
【図３】健常者ならびに非活動性および活動性腎炎患者における２４時間の尿中総酸化剤排泄を示す。
【図４】健常者ならびに非活動性および活動性腎炎患者の２４時間尿において総酸化剤とクレアチニンとのあいだに関連がないことを示す。白抜きの印は異なる時点での同じ患者からのものである。
【図５】様々な疾患患者からの無作為な尿試料における酸化剤とクレアチニンの濃度を示すプロットである。Ｄｉａ＝糖尿病；ＨＴ＝高血圧症；ＣＲＦ＝慢性腎不全；ＧＮ＝糸球体腎炎；ＰＫ＝多嚢胞腎；ＳＬＥ＝全身性紅斑性狼瘡；ＲＶＤ＝腎血管疾患。
【図６】様々な疾患患者における血漿中の酸化剤およびクレアチニンのレベルを示すプロットである。用いた省略語は図５と同じである。
【図７】ＤＢＮＢＳと腎不全患者の血漿との反応混合物から得られたＤＢＮＢＳラジカル陽イオンのＥＰＲスペクトルを示す。
【図８】ＤＢＮＢＳと過酸化水素およびホースラディッシュペルオキシダーゼとの反応混合物から得られたＤＢＮＢＳ−ＳＯ３・−産物のＥＰＲスペクトルを示す。
【図９】ＤＢＮＢＳと健常者の尿との反応混合物から得られたＤＢＮＢＳラジカル陽イオンのＥＰＲスペクトルを示す。
【図１０】図９に示した同じ混合物に、１０ ｍＭ亜硫酸二カリウムを加えたＥＰＲスペクトルを示す。図９のシグナルの高さと直接比較できるように、総反応容積をＰＢＳによって補正した。
【図１１】ＤＢＮＢＳを正常ヒト尿と反応させた場合に得られるＥＰＲシグナルに及ぼす亜流酸塩濃度の影響を示す。
【図１２】酸化剤系におけるＤＢＮＢＳ類似体の感度を示す。
【図１３】透析物と反応するＤＢＮＢＳ（１．２ ｍＭ）のＥＰＲスペクトルである。
【図１４】透析物と反応するＤＣＮＢＳ（２．５ ｍＭ）のＥＰＲスペクトルである。
【図１５】透析物と反応するＤＢＮＢＳ−ｄ２（２．５ ｍＭ）のＥＰＲスペクトルである。
【図１６】透析物と反応するＤＢＮＢＳ−１５Ｎ（２．５ ｍＭ）のＥＰＲスペクトルである。
【図１７】透析物と反応するＤＢＮＢＳ−ｄ２−１５Ｎ（２．５ ｍＭ）のＥＰＲスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年10月8日(2002.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照値と比較して尿試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量が増加すれば、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断される、以下の段階を含む、患者における活動性腎炎の病態を診断する方法：
（ａ）患者から尿試料を得る段階；
（ｂ）スピントラッピング剤を試料またはその一部と混合する段階；および
（ｃ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階。
【請求項２】
患者から得られた尿試料が、既知容積の２４時間尿試料であり；
段階（ｂ）において、スピントラッピング剤を試料の一部と混合し；および
方法の段階（ｃ）が
（ｉ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料の一部におけるスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階と
（ｉｉ）２４時間尿試料全量に存在するフリーラジカル産物の量を計算する段階とによって行われる、請求項１記載の方法であって、対照値と比較して患者の２４時間尿試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量が増加すれば、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断される方法。
【請求項３】
対照値と比較してフリーラジカル産物：マーカー物質比が増加すれば、患者が活動性腎炎の病態を有することが診断される、以下のさらなる段階を含む、請求項１または請求項２に記載の方法：
（ｄ）試料中のマーカー物質の量を測定する段階；および
（ｅ）マーカー物質に対するフリーラジカル産物の比を計算する段階。
【請求項４】
同じ被験者からの一つまたはそれ以上の前回の試料と比較して患者からの尿試料中のフリーラジカル産物の量が増加すれば、患者が切迫腎不全の病態を有することが予測される、以下の段階を含む、活動性腎炎患者において腎不全のリスクを予測するおよび／または治療に対する反応を評価する方法：
（ａ）患者から尿試料を得る段階；
（ｂ）スピントラッピング剤を試料またはその一部と混合する段階；
（ｃ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料中のスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階；および
（ｄ）（ａ）から（ｃ）の段階を一定間隔で繰り返す段階。
【請求項５】
患者から得られた尿試料が、既知容積の２４時間尿試料であり；
段階（ｂ）において、スピントラッピング剤を試料の一部と混合し；および
方法の段階（ｃ）が
（ｉ）電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分析を用いて、試料の一部におけるスピントラッピング剤に由来するフリーラジカル産物の量を決定する段階と
（ｉｉ）２４時間尿試料全量に存在するフリーラジカル産物の量を計算する段階とによって行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
同じ被験者からの一つまたはそれ以上の前回の試料と比較してフリーラジカル産物：マーカー物質比が増加すれば、患者が切迫腎不全の病態を有することが予測される、以下のさらなる段階を含む、請求項４または請求項５に記載の方法：
（ｃ）（ｉｉｉ）試料中のマーカー物質の量を測定する段階；および
（ｉｖ）マーカー物質に対するフリーラジカル産物の比を計算する段階。
【請求項７】
マーカー物質がクレアチニンである、請求項３または６に記載の方法。
【請求項８】
スピントラッピング剤が、
３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルホネート（ＤＢＮＢＳ）；
例、３，５−ジクロロ−４−ニトロソベンゼンスルホネート（ＤＣＮＢＳ）
５−（ジエトキシホスホリル）−５−メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＥＰＭＰＯ）；
５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）；
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−α−フェニルニトロン（ＰＢＮ）；
ニトロメタン；
Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンジチオカルバメート（ＭＧＤ）の鉄（ＩＩ）複合体
ジエチルジチオカルバメート（ＤＥＴＣ）の鉄（ＩＩ）複合体；または
上記のいずれかの誘導体もしくは類似体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
スピントラッピング剤がＤＢＮＢＳ、重水素標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２）、１５Ｎ−標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−１５Ｎ）、または重水素および１５Ｎ二重標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２−１５Ｎ）である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
腎機能を評価するためにクレアチニンクリアランスを測定する段階をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
急性期反応の指標、例えば血清中のＣ反応性タンパク質濃度、または赤血球沈降速度を測定する段階をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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