(57)【要約】０．０００１％から約５０％のレチノイドブースターの組合わせと併用して、約０．００１％から約１０％のレチノイドを含むスキンケア製品。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．レチノイド０．００１％から１０％；
ｂ．Ｂ１からＢ５類に属する少なくとも２種のレチノイドブースターの、０．０００１％から５０％の量での組合わせであって、２つのブースターの互いに対する比が１：１０００から１０００：１である組合わせ；
ｃ．化粧品として許容しうるビヒクル、
を含むスキンケア組成物。
【請求項２】
ブースターの組合わせが、Ｂ１からＢ５類に属する少なくとも３種のブースターの、０．０００１％から５０％の量で含む、請求項１に記載のスキンケア組成物。
【請求項３】
第二の組成物が、Ｂ１からＢ５類に属する少なくとも４種のブースターの組合わせを、０．０００１％から５０％の量で有する、請求項１または２に記載のスキンケア組成物。
【請求項４】
第二の組成物が、Ｂ１からＢ５類に属する全５種のブースターの組合わせを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のスキンケア組成物。
【請求項５】
皮膚コンディショニングの美粧的方法であって、請求項１から５のうちのいずれか１つの製品を局所的に皮膚に適用する方法。
【請求項６】
レチノイン酸の皮膚への効果を模倣する美粧的方法であって、請求項１から５のうちのいずれか１つの製品を皮膚に適用することを含む方法。
【請求項７】
ａ．　Ｂ１からＢ５類に属する少なくとも２種のレチノイドブースターの、０．０００１％から５０％の量での組合わせであって、２つのブースターの互いに対する比が、１：１０００から１０００：１の範囲にある組合わせ；
ｂ．化粧品として許容しうるビヒクル、
を含むスキンケア組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、レチノイン酸の皮膚への効果を再現するあるいくつかの化合物を含む、美粧用のスキンコンディショニング組成物に関する。
【０００２】
レチノール（ビタミンＡ）は、人体の中に自然発生する内因性化合物であり、正常な上皮細胞分化に不可欠である。天然および合成ビタミンＡ誘導体は、多様な皮膚障害の治療において広範囲に用いられ、皮膚修復剤または再生剤として用いられてきた。レチノイン酸は、多様な皮膚の状態、例えばにきび、しわ、乾癬、加齢斑、および変色を治療するために用いられてきた。例えばＶａｈｌｑｕｉｓｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．９４、Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｄ．Ｂ．、およびＣｕｎｌｉｆｆｅ，Ｗ．Ｊ．（１９９０）、ｐｐ．４９６−４９８；Ｅｌｌｉｓ，Ｃ．Ｎ．ら、「皮膚におけるレチノールの薬理学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｔｉｎｏｌｓ　ｉｎ　Ｓｋｉｎ）」、Ｖａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，Ｖｏｌ．３、（１９８９）、ｐｐ．２４９−２５２；Ｌｏｗｅ，Ｎ．Ｊ．ら、「皮膚におけるレチノールの薬理学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｔｉｎｏｌｓ　ｉｎ　Ｓｋｉｎ）」、Ｖｏｌ．３、（１９８９）、ｐｐ．２４０−２４８；ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９３／１９７４３号参照。
【０００３】
レチノールエステルおよびレチノールは、下記のメカニズムにしたがって、皮膚の中で酵素的にレチノイン酸に転換されると考えられる：
【０００４】
【表１】
2004501952.tif 000002
【０００５】
本発明は、あるいくつかの化合物が、レチニルエステルおよびレチノールの、レチノイン酸への変換を高めるという発見に基づいている。これらの化合物は、集合的に「ブースター」と呼ばれ、特定の化合物の増強（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）メカニズムにしたがって、Ｂ１からＢ５群に体系化されている。これらのブースター群のメカニズムは次のとおりである：ＡＲＡＴ／ＬＲＡＴ（アシルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）：レチノールアシルトランスフェラーゼ／レシチン：レチノールアシルトランスフェラーゼ）活性を阻害する（Ｂ１）、レチノールデヒドロゲナーゼ活性を高める（Ｂ２）、レチナールレダクターゼ活性を阻害する（Ｂ３）、レチノイン酸のＣＲＡＢＰ−ＩＩ（細胞レチノイン酸結合タンパク質ＩＩ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＩ）結合を拮抗させる（Ｂ４）、およびシトクロムＰ４５０依存性レチノイン酸酸化を阻害する（Ｂ５）。
【０００６】
これらのブースターは単独または互いに共同して、レチノイドのレチノイン酸への転換を増加させ、レチノイン酸の分解を防ぐことによって、レチノイドの作用を増強する。これらのブースターは、レチノイド（例えばレチノール、レチニルエステル、レチナール、レチノイン酸）と共に作用する。レチノイドは、皮膚の中に内在的に存在する。しかしながら好ましい組成物は、性能を最適化するために、ブースターまたはブースターの組合わせと並存して、この組成物中にレチノイドを含む。
【０００７】
Ｇｒａｎｇｅｒらによるいくつかの特許は、レチノールおよびレチニルエステルの有効性を改良するための化粧品組成物におけるレチノイドブースターの使用について記載している（米国特許番号：第５，７５９，５５６号、第５，７５６，１０９号、第５，７４７，０５１号、第５，７１６，６２７号、第５，８１１，１１０号、第５，５３６，７４０号、第５，７４７，０５１号、第５，５９９，５４８号、第５，９５５，０９２号、第５，８８５，５９５号、第５，７５９，５５６号、第５，６９３，３３０号）。これらの特許に記載されているブースターは、Ｂ１とＢ５類とに限定されている。さらにはジョンソン・アンド・ジョンソン社（Ｊｏｈｎｓｏｎ　＆　Ｊｏｈｎｓｏｎ）は、５類ブースター分子に分類される分子の使用について記載している（米国特許第５，０２８，６２８号；米国特許第５，０３７，８２９号；米国特許第５，１５１，４２１号；米国特許第４７６８５２号；米国特許第５，５００，４３５号；米国特許第５，５８３，１３６号；米国特許第５，６１２，３５４号）。
【０００８】
レチノイドブースターとして作用する分子は、化粧品における一般的な成分である。化粧品組成物におけるこれらの使用について記載している少なからぬ先行技術がある。この同じ組成物におけるこれらの分子の２つ以上の使用について記載した先行技術はかなり存在する。先行技術の例のいくつかは、例えば次の特許に記載されている。すなわち、米国特許第５，６６５，３６７号、米国特許第５，７４７，０４９号、米国特許第５，８５３，７０５号、米国特許第５，７６６，５７５号、および米国特許第５，８４９，３１０号である。
【０００９】
しかしながら先行技術は、ブースター分子の組合わせから生じる相乗効果について記載していない。ブースター分子の組合わせからレチノイド活性の相乗的増強が見られたことは、意外な発見であった。先行技術は、ブースター分子の最適濃度または比、またはブースター分子対レチノイド分子の比について記載していない。したがって本発明は、化粧品的レチノイドとブースター分子とを最も適切な濃度または比において組合わせることによって、レチノイドの有効性における実質的な改良が得られるということにおいて新規である。
【００１０】
本発明に用いるのに適したブースターの種類には、表Ｂ１からＢ５に挙げたブースターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００１１】
ブースターの最良グループ
【００１２】
【表２】
2004501952.tif 000003
【００１３】
【表３】
2004501952.tif 000004
【００１４】
【表４】
2004501952.tif 000005
【００１５】
【表５】
2004501952.tif 000006
【００１６】
【表６】
2004501952.tif 000007
【００１７】
本発明は一部、組成物の約０．０００１重量％から約５０重量％、好ましくは０．００１重量％から１０重量％、最も好ましくは０．００１重量％から５重量％の一種類のブースターまたは複数のブースターの組合わせ、及び化粧品として許容しうるビヒクルを含むスキンコンディショニング組成物を包含する。
【００１８】
本発明の組成物中に含まれているブースターまたはこれらの組合わせは、下記のものから成る群より選ばれる：
（ａ）Ｂ２；Ｂ３；Ｂ４から成る群より選ばれるブースター；
（ｂ）次のものから成る群より選ばれるブースターの二元的組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２；Ｂ１／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３；Ｂ２／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４；Ｂ３／Ｂ５；Ｂ４／Ｂ５；
（ｃ）次のものから成る群より選ばれるブースターの三元的組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；
（ｄ）次のものから成る群より選ばれるブースターの四元的組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；
および
（ｅ）ブースターの５つの群の組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５。
【００１９】
これらの好ましい組成物は、レチノイドを組成物の約０．００１重量％から約１０重量％を含む。
【００２０】
ブースターとして本発明に含まれる化合物は、このような化合物が、セクション２．１から２．７として後に記載されている特異的酵素についてのインビトロアッセイに、表Ａに挙げられているある濃度において合格する能力に基づいて選ばれる。このようなブースターは、本明細書において明白に言及されていなくても、本発明の中に含まれる。換言すれば、ある化合物が、下記アッセイにおいて酵素を十分に阻害するかまたは活性を促進するならば、その化合物はレチノイドと共同して作用し、レチノイン酸のケラチノサイト（皮膚細胞）に対する効果を模倣し、したがってこれは本発明の範囲内に含まれる。
【００２１】
本明細書において用いられている「コンディショニング」という用語は、乾燥肌、にきび、光損傷肌、しわの外見、加齢斑、老化肌の予防および治療、角質層の柔軟性の増加、皮膚の色を明るくすること、皮脂分泌の制御、皮膚の質の一般的向上を意味する。この組成物は、皮膚の落屑および表皮分化を改良するために用いることができる。
【００２２】
本発明の製品における選択された化合物の存在は、レチノイドの性能を実質的に改善する。
【００２３】
本発明の組成物は、好ましい成分としてレチノイドを含む。これは、レチニルエステル、レチノール、レチナール、およびレチノイン酸から選ばれ、好ましくはレチノールまたはレチニルエステルである。「レチノール」という用語には、レチノールの下記異性体が含まれる。すなわち、全トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、１１−シス−レチノール、９−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１１−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−９−シス−レチノールである。好ましい異性体は、全トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、９−シス−レチノールである。最も好ましくは、商品としての広く入手可能であるため、全トランス−レチノールである。
【００２４】
レチニルエステルは、レチノールのエステルである。「レチノール」という用語は、上に規定されている。本発明に用いるのに適したレチニルエステルは、レチノールのＣ１〜Ｃ３０エステル、好ましくはＣ２〜Ｃ２０エステル、最も好ましくは、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ１６エステルであるが、その理由は、これらがより一般に入手しうるからである。レチニルエステルの例には次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、パルミチン酸レチニル、ギ酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル、酢酸レチニル、吉草酸レチニル、イソ吉草酸レチニル、ヘキサン酸レチニル、ヘプタン酸レチニル、オクタン酸レチニル、ノナン酸レチニル、デカン酸レチニル、ウンデカン酸レチニル、ラウリン酸レチニル、トリデカン酸レチニル、ミリスチン酸レチニル、ペンタデカン酸レチニル、ヘプタデカン酸レチニル、ステアリン酸レチニル、イソステアリン酸レチニル、ノナデカン酸レチニル、アラキドン酸レチニル、ベヘン酸レチニル、リノール酸レチニル、およびオレイン酸レチニルである。
【００２５】
本発明に用いるのに好ましいエステルは、パルミチン酸レチニル、酢酸レチニル、およびプロピオン酸レチニルから選ばれるが、その理由は、これらが商品として最も入手可能であり、したがって最も安いからである。リノール酸レチニルおよびオレイン酸レチニルも、その有効性のために好ましい。
【００２６】
レチノールまたはレチニルエステルは、本発明の組成物において、約０．００１％から約１０％の量、好ましくは約０．０１％から約１％の量、最も好ましくは約０．０１％から約０．５％の量で用いられる。
【００２７】
本発明の組成物の必須成分は、セクション２．１から２．７において後に記載されているインビトロアッセイに合格する化合物である。本発明に用いるのに適した化合物は、表Ａに挙げられている濃度において、表Ａに挙げられている少なくとも広い範囲の％まで、酵素を阻害または増強する。
【００２８】
セクションＡ：ブースターの同定
【００２９】
【表７】
2004501952.tif 000008
【００３０】
本発明の組成物の中にこの化合物を含めることの適切性を決定するために用いられるインビトロミクロソームアッセイは、次のとおりである：
１．材料
全トランス−レチノール、全トランス−レチノイン酸、パルミトイル−ＣｏＡ、ジラウロイルホスファチジルコリン、ＮＡＤ、およびＮＡＤＰＨは、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。ミクロソームアッセイのためのレチノイドの保存溶液を、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル中で調製した。ＨＰＬＣ分析のためのレチノイド標準保存溶液はすべて、エタノール中で調製し、Ｎ２雰囲気下、−７０℃で保存し、保存場所から取り出された時、暗室灯下、氷上に維持した。その他の化学薬品および阻害剤は、化粧品用材料供給業者または化学会社、例えばアルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）またはインターナショナル・フレイバーズ・アンド・フレグランス社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｌａｖｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ）から商品として入手することができた。
【００３１】
２．方法
２．１　ＲＰＥミクロソームの単離（（１）から変性されたもの）
網膜および房水が除去されている５０個のウシの凍結２等分（ｈｅｍｉｓｅｃｔｅｄ）アイカップ（ｅｙｅｃｕｐ）を、米国ネブラスカ州リンカーンのＷ．Ｌ．ローソン社（Ｗ．Ｌ．Ｌａｗｓｏｎ　Ｃｏ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）から入手した。これらの目を一晩解凍し、着色虹彩膜を、ピンセットで剥がして除去した。絵筆またはゴム冠ヘラを用いて、暗色着色された細胞をこすって、それぞれのアイカップを、２×０．５ｍＬ冷緩衝液（０．１Ｍ　Ｐ０４／１ｍＭ　ＤＴＴ／０．２５Ｍスクロース、ｐＨ７）で洗浄した。この細胞懸濁液を虹彩膜に添加し、この懸濁液をテフロン攪拌棒でビーカー中で数分間攪拌した。この懸濁液を、粗いフィルター（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ　９２５μ細孔サイズポリエチレンメッシュ）を通して濾過して大きい粒子を除去し、その結果生じた暗色の懸濁液を、モーター駆動テフロンホモジナイザーでＧｌａｓ−Ｃｏｌを用いてホモジナイズした。
【００３２】
細胞ホモジネートを、２０，０００ｇで３０分間遠心分離した（１４，０００ＲＰＭで２．５×１０ｃｍ管中ＳＳ３４ローターを有するソーバール（Ｓｏｒｖａａｌ）モデルＲＣ−５Ｂ遠心機）。その結果生じた上澄み液を、１５０，０００ｇで６０分間さらに遠心し、分離した（４０，０００ＲＰＭで１３×５１ｍｍ管中ＳＷ５０．１ローターを有するベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）モデルＬ８０超遠心機）。その結果生じたペレットを、ヒート・システムズ・ウルトラソニクス社（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）のモデルＷ１８５Ｄソニファイアー・セル・ディスラプター（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）を用いて、約５ｍＬ　０．１Ｍ　ＰＯ４／５ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ７緩衝液中に分散し、その結果生じたミクロソーム分散液を、小管にアリコートし、−７０℃で保存した。ＢＳＡを標準として用い、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）色素結合アッセイを用いて、ミクロソームのタンパク質濃度を測定した。
【００３３】
２．２　ラットの肝臓ミクロソームの単離（４）
約６グラムの凍結ラット肝臓（アキュレット・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐ．）のＨａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラットから入手したもの）を、ブリンクマンポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を用いて、３容積の０．１Ｍトリス／０．１Ｍ　ＫＣｌ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ／０．２５Ｍスクロース、ｐＨ７．４緩衝液中でホモジナイズした。その結果生じた組織懸濁液を、前記のモーター駆動テフロンホモジナイザーにおいてさらにホモジナイズした。その結果生じたホモジネートを、１０，０００ｇで３０分間、２０，０００ｇで３０分間、および３０，０００ｇで１５分間連続的に遠心分離し、その結果生じた上澄み液を、１０５，０００ｇで８０分間超遠心分離した。このペレットを、前記のように約５ｍＬの０．１Ｍ　ＰＯ４／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ／５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４緩衝液中で音波処理し、アリコートとして−７０℃で保存した。タンパク質濃度は、前記のように測定した。
【００３４】
２．３　ＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性についてのアッセイ（Ｂ１を同定するため）
下記手順は、文献（２）に記載された方法の修正方法である。次の緩衝液を調製し、４℃で保存した：０．１Ｍ　ＰＯ４／５ｍＭジチオトレイトール、ｐＨ７．０（ＰＯ４／ＤＴＴ）。このアッセイ当日、緩衝液１ｍＬあたり２ｍｇのＢＳＡを添加して、ＰＯ４／ＤＴＴ／ＢＳＡ作業緩衝液を生じた。１ｍＭのレチノール基質をアセトニトリル中に調製し、窒素ガス下、−２０℃でアンバーバイアルに保存した。作業緩衝液中４ｍＭのパルミトイル−ＣｏＡの溶液（アリコートとして保存されているもの）およびエタノール中の４ｍＭジラウロイルホスファチジルコリンを調製し、−２０℃で保存した。阻害剤を、Ｈ２Ｏ、エタノール、アセトニトリル、またはＤＭＳＯ中の１０ｍＭ保存溶液として調製した。５０μｇ／ｍＬブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含む純粋エタノールを用いて急冷溶液を調製し、５０μｇ／ｍＬ　ＢＨＴを含むヘキサン溶液を、これらの抽出のために用いた。
【００３５】
２ドラムガラスバイアルに、下記のものを順序正しく添加した：総容積５００μＬを生じるためのＰＯ４／ＤＴＴ／ＢＳＡ緩衝液、５μＬアシルドナー（４ｍＭパルミトイル−ＣｏＡおよび／またはジラウロイルホスファチジルコリン）、５μＬ阻害剤または溶媒ブランク（１０ｍＭ保存溶液（ｓｔｏｃｋ）またはさらなる希釈液）、ついで約１５μｇのＲＰＥミクロソームタンパク質（約１５μＬの約１ｍＭ／ｍＬミクロソームタンパク質アリコート）。この混合物を３７℃で５分間インキュベーションして反応温度を平衡させ、ついで５μＬ　１ｍＭレチノールを添加した。これらのガラスバイアルにフタをし、５秒間渦巻き攪拌し、３７℃で３０から９０分間インキュベーションした。０．５ｍＬエタノール／ＢＨＴを添加すして、反応液を急冷した。３ｍＬヘキサン／ＢＨＴを添加し、これらの管を数秒間数回渦巻き攪拌し、これらの管を低速で５分間遠心分離してこれらの層を急速に分離することによって、これらのレチノイドを抽出した。上部ヘキサン層を取り出して、きれいなガラスバイアルの中に入れ、水性層を、前記のようにもう１つの３ｍＬヘキサン／ＢＨＴで再抽出した。これらのヘキサン層を組合わせ、３７℃で窒素ガス流下、加熱アルミニウムブロック上で乾燥してヘキサンを蒸発させた。この乾燥残渣を、ＨＰＬＣ分析まで、−２０℃で保存した。パルミチン酸レチニルおよびラウリン酸レチニルの量を、下記のようなＨＰＬＣシグナルの統合によって、それぞれＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性について定量した。
【００３６】
このインキュベーション溶液は、４０μＭアシルドナー、１００μＭまたはそれ以下の阻害剤、１０μＭレチノール、約３０μｇ／ｍＬミクロソームタンパク質、および約０．１Ｍ　ＰＯ４／ｐＨ７／５ｍＭ　ＤＴＴ／２ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡを含んでいることに注目のこと。レチノールの添加に続くすべての工程は、暗闇で、または暗室灯下で実施された。
【００３７】
２．４　レチノールデヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイ（Ｂ２を同定するため）
次の保存溶液を調製した：
５０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４緩衝液、滅菌濾過されたもの。
ＤＭＳＯ中１０ｍＭ全トランス−レチノール（シグマＲ７６３２）。
滅菌水中の２００ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、ナトリウム塩（ＮＡＤＰ）（シグマＮ０５０５）。
適切な溶媒（水、緩衝液、エタノール、クロロホルム、またはＤＭＳＯ）中４０ｍＭテスト化合物。
５０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４緩衝液（４μｇ／μｌ）中ラット肝臓ミクロソームの１：１０希釈液。
【００３８】
スクリューキャップを有する２ドラムガラスバイアルに、次のものを順序正しく添加した：最終容積４００μＬを生じるための緩衝液、
２５μｌの希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照のために沸騰ミクロソームを用い、テストサンプルのために通常のミクロソームを用いた。
【００３９】
４μｌの２００ｍＭ　ＮＡＤＰ（最終＝２ｍＭ）
１μｌの４０ｍＭテスト化合物（最終＝１００μＭ）
８μｌの１０ｍＭレチノール（最終＝２００μＭ）。
【００４０】
これらのガラスバイアルを、３７℃の振とう水浴中で４５分間インキュベーションした。５００μｌ氷冷エタノールを各ガラスバイアルに添加して、反応液を急冷した。レチノイドを氷冷ヘキサンで２回抽出した（１抽出あたり２．７ｍｌ）。酢酸レチニル（９００μＭ保存溶液５μｌ）を、各サンプルにおける抽出効率を監視する手段として、第一抽出の間に各ガラスバイアルに添加した。サンプルを１０秒間渦巻き攪拌した後、ベックマンＧＳ−６Ｒ遠心機において１０００ｒｐｍ、５℃で５分間静かに遠心分離した。これらのレチノイドを含む上部ヘキサン層を、各々の抽出後に水性層から取り出し、きれいな２ドラムガラスバイアルに入れた。ヘキサンを、静かな窒素ガス流下に蒸発除去した。ついで乾燥残渣を、ＨＰＬＣ分析まで、−２０℃で保存した。
【００４１】
２．５　レチナールレダクターゼ活性についてのアッセイ（Ｂ３を同定するため）
下記の置き換えを行なって、すべての保存溶液を上記のように調製した：
レチノールの代りに、ＤＭＳＯ中１０ｍＭ全トランスレチナルデヒド（シグマＲ２５００）。
【００４２】
ＮＡＤＰの代りに、滅菌水中のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート還元形態四ナトリウム塩（ＮＡＤＰＨ）（シグマＮ７５０５）２００ｍＭ。
【００４３】
スクリューキャップを有する２ドラムガラスバイアルに、次のものを順序正しく添加する：最終容積４００μＬを生じるための緩衝液、
２５μｌの希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照のために沸騰ミクロソームを用い、テストサンプルのために通常のミクロソームを用いる。
【００４４】
４μｌの２００ｍＭ　ＮＡＤＰＨ（最終＝２ｍＭ）
１μｌの４０ｍＭテスト化合物（最終＝１００μＭ）
３μｌの１０ｍＭレチナルデヒド（最終＝７５μＭ）。
【００４５】
上に詳細に記載されているように、同じインキュベーションおよび抽出手順にしたがう。
【００４６】
２．６　ＣＲＡＢＰＩＩアンタゴニストについてのアッセイ（Ｂ４を同定するため）
２．６．１．ＣＲＡＢＰＩＩの調製
ａ．発現系
遺伝子ＣＲＡＢＰＩＩを、ｐＥＴ２９ａ−ｃ（＋）プラスミド（ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））中にクローンした。このクローン遺伝子は、強いバクテリオファージＴ７転写および翻訳シグナルの制御下にあった。Ｔ７ポリメラーゼ源は、ホスト細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバゲン社）によって供給された。このホスト細胞は、ＩＰＴＧの存在によって誘発される、ｌａｃＵＶ５制御下のＴ７ポリメラーゼの染色体コピーを有す。
【００４７】
このプラスミドを、製造業者のプロトコル（ノバゲン社）にしたがい、形質転換によって、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞中に導入させた。
【００４８】
ｂ．誘発
これらの形質転換細胞の一晩培養物を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンと２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールとを含む２×ＹＴ中に１：１００希釈した。これらの細胞を、６００ｎｍにおけるＯＤが０．６から０．８に達するまで、３７℃で振とうしながら成長させた。ついでＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度まで添加し、この培養物をさらに２時間インキュベーションした。これらの細胞を、室温で５，０００ｇで１０分間遠心分離によって採集した。このペレットを−２０℃で保存した。
【００４９】
２．６．２．精製
Ｎｏｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｌｉ，１９９７に記載されている方法にしたがって精製を実施した。
【００５０】
ａ．溶解
凍結ペレットを室温で解凍し、１から２ペレット容積の、新たに調製された溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジド、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、２．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフッ化物、２．５ｍＭベンズアミジン、６μｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ）中に再懸濁した。この溶解物を、室温で３０分間インキュベーションした。それ以上の溶解は、音波処理によって実施した（１０，０００ｐｓｉでの６回の３０秒バーストと、氷上の５回の３０秒間遅延（ｄｅｌａｙ）とを交互に行なった）。この溶解物の不溶性フラクションを、４℃で１時間１５，０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去し、上澄み液を−２０℃で保存した。
【００５１】
ｂ．セファクリルＳ３００上でのゲル濾過
工程ａからの上澄み液を、室温でセファクリルＳ−３００（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の２．５×１００ｃｍカラム上にローディングした。この溶離緩衝液は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、０．０５％ナトリウムアジド（緩衝液Ａ）であった。流量は２ｍＬ／分であった。収集された２ｍＬフラクションを、２８０ｎｍにおいて紫外線吸光度についてチェックした。ピークを表わすフラクションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＣＲＡＢＰＩＩの存在について調べた。
【００５２】
ｃ．アニオン交換クロマトグラフィー
ＣＲＡＢＰＩＩを含む２ｍＬのゲル濾過フラクションを、第四アミンアニオン交換カラムＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）型モノＱ（ファルマシア社）上にローディングした。室温で２０分間にわたって、１００％緩衝液Ａから３０％緩衝液Ｂまで（１００％緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ＋２５０ｍＭ　ＮａＣｌ）の勾配緩衝液を用いて、ＣＲＡＢＰＩＩを溶離した。１ｍＬ−フラクションを１分ごとに収集した。もう一度、ＳＤＳＰＡＧＥによって、ＣＲＡＢＰＩＩの存在をチェックした。ＣＲＡＢＰＩＩを４℃で保存した後、ガラスバイアルプラットフォーム付属部品を有するマイクロモデュリョ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄｕｌｙｏ）１．５Ｋを用いて凍結乾燥した（エドワーズ・ハイ・バキュアム・インターナショナル社（Ｅｄｗａｒｄｓ　Ｈｉｇｈ　Ｖａｃｕｕｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））。この乾燥サンプルは、結合測定法にこれらを用いるまで、室温で保存した。
【００５３】
ｄ．ＣＲＡＢＰＩＩの存在の検出
７から１５％ポリアクリルアミドゲル（バイオラッド社）上の変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を用いて、ＣＲＡＢＰＩＩの発現および精製を検証した。１０μＬサンプルを、１０μＬの２×ローディング緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、０．２％ＢＰＢ、２０％グリセロール、１ｍＭ　ＤＴＴ）と混合し、加熱（８０℃で２分）によって変性した。これらのサンプルを、１×トリス−グリシン緩衝液（バイオラッド社）中に浸漬されたゲル上にローディングし、室温で１時間、定電流（２５ｍＡ）で泳動した。クーマシーブルー染色後、ベンチマークの予め染色されたタンパク質ラダー（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ））を用いて測定された分子量にしたがって、タンパク質を同定した。
【００５４】
ＣＲＡＢＰＩＩの存在を確認するために、ウエスタンブロットを用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離されたタンパク質を、バイオラッドカセットを用いて、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐ転移膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））上に転移させた。この転移は、１×トリス−グリシン緩衝液（バイオラッド社）＋１０％メタノール中で行なわれた。電流（６０ｍＡ）を３時間流し、タンパク質をこの膜上にトランスファーした。その後この膜を、室温で１時間１×ＴＢＳ中５％ドライミルクでブロッキングし、４℃で一晩、同じ緩衝液中のＣＲＡＢＰＩＩへの一次抗体（マウスの抗クローン５−ＣＲＡ−Ｂ３の１／１０００希釈液）でプローブした。翌日、この膜をＰＢＳで洗浄し（３×５分）、ついで室温で１時間、二次抗体のペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ＥＣＬＴＭ、アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の１：２０００希釈液でインキュベーションした。この膜を１×ＰＢＳで洗浄し（３×５分）、製造業者の指示（アマーシャム社）にしたがってＥＣＬ検出キットを用いて、タンパク質を検出した。
【００５５】
精製ＣＲＡＢＰＩＩの濃度を、ＢＳＡキット（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて測定した。
【００５６】
２．６．３．放射性結合測定法
２２０ｐモルのＣＲＡＢＰＩＩを、総容積７０μＬ中放射性全トランス−レチノイン酸（ＮＥＮ）１５ｐモルとともに、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４中でインキュベーションした。競合アッセイのために、過剰のもう１つのリガンド（６６７０：１、６７０：１、または７０：１）を、この混合物に添加した。反応は、暗闇の中で室温で１時間発生した。この非結合全トランス−レチノイン酸を結合全トランス−レチノイン酸から分離するために、６ｋＤカットオフミニクロマトグラフィーカラム（バイオラッド社）を用いた。この保存緩衝液は、製造業者の指示（ファルマシア社）にしたがってマイクロプレックス（Ｍｉｃｒｏｐｌｅｘ）マニフォールドを用いて廃棄した。これらのサンプルをこのカラム上にローディングし、分離は、３０分間にわたって重力によって濾過した。ＣＲＡＢＰＩＩに結合したレチノイン酸（「ＲＡ」）が濾過物中に現われたが、一方、遊離ＲＡがこのカラム中に残留した。濾過物の放射性を、シンチレーションカウンターによって測定した。
【００５７】
２．７　ＮＡＤＰＨ依存性レチノイン酸酸化についてのアッセイ（Ｂ５を同定するため）
下記の手順は、文献（４）に記載されている方法の修正方法である。下記のアッセイ緩衝液を調製し、４℃で保存した：０．１Ｍ　ＰＯ４／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ／５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４。アッセイ当日に、緩衝液中の６０ｍＭ　ＮＡＤＰＨ溶液を調製した。阻害剤保存溶液、酸性化エタノール／ＢＨＴ急冷溶液、およびヘキサン／ＢＨＴを、前記のように調製した。１ｍＭレチノイン酸作業溶液を、エタノールでの１５ｍＭ保存溶液（ＤＭＳＯ）中への希釈によって調製した。
【００５８】
２ドラムガラスバイアルに、次のものを順序正しく添加した。すなわち、最終容積５００μｌを生じるためのアッセイ緩衝液、２０μＬ　６０ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、５μＬ阻害剤または溶媒ブランク、ついで約２ｍｇのラット肝臓ミクロソームタンパク質である。
【００５９】
この混合物を３７℃で５分間インキュベーションし、ついで５μＬの１ｍＭレチノイン酸作業溶液を添加した。インキュベーションを３７℃で６０分間続行した。これらのガラスバイアルにはフタをしなかったが、それは、酸化プロセスが、ＮＡＤＰＨに加えてＯ２分子を必要としたからである。急冷を、酸性化エタノール／ＢＨＴを用いて実施し、抽出は、前記のようにヘキサン／ＢＨＴを用いて実施した。急速に溶離する極性レチノイン酸代謝産物（４−オキソレチノイン酸であると推定される）の定量は、下記のようにＨＰＬＣシグナルの統合によって実施した。
【００６０】
レチノイン酸の添加に続く工程はすべて、暗所で、または暗室灯下で実施した。最終インキュベーション溶液は、２．４ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１００μＭまたはそれ以下の阻害剤、１０μＭレチノイン酸、約４ｍｇ／ｍＬラット肝臓ミクロソームタンパク質、および約０．１Ｍ　ＰＯ４／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ／５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含んでいた。
【００６１】
個々のレチノイドのＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣによるレチノイド定量用サンプルは、各ガラスバイアル中で残渣を１００μＬのメタノールで溶解して調製した。この溶液を、１ｍＬシェルガラスバイアル中の１５０μＬガラス円錐管へ移し替え、しっかりとフタをし、ウオーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）７１５オートサンプラーの中に入れた。６０μＬのアリコートを直ちに注入し、レチノイド含量について分析した。
【００６２】
このクロマトグラフィー機器は、ウオーターズ６００勾配制御器／ポンプ、ウオーターズ９９６光ダイオードアレー検出器、およびウオーターズ４７４走査蛍光検出器から構成されていた。レチノイド分析のために２つのＨＰＬＣプロトコルを用いた。ＡＲＡＴおよびＬＲＡＴアッセイのために、レチノールとレチノールエステルとの分離を、１０分間、ウオーターズ３．９×３００ｍｍ　Ｃ１８ノバパック（Ｎｏｖａｐａｋ）逆相分析カラム、および流量１ｍＬ／分に調節された８０：２０（ｖ／ｖ）メタノール／ＴＨＦ定組成移動相を有するウオーターズ・セントリー・ノバパック（Ｗａｔｅｒｓ　Ｓｅｎｔｒｙ　ＮｏｖａＰａｋ）Ｃ１８ガードカラムを用いて実施した。この溶離物は、３２５ｎｍにおける吸光度、および３２５ｅｘ／４８０ｅｍにおける蛍光度について監視した。
【００６３】
より短いウオーターズ３．９×１５０ｍｍ　Ｃ１８ノバパック逆相分析カラムおよびウオーターズ・セントリー・ノバパックＣ１８ガードカラムを用いて、Ｂａｒｕａ（５）によって記載された勾配系（５）の修正方法を用いて、レチノールおよびレチノイン酸酸化によるレチノイド酸とアルコールとを分離した。この系は、１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む６８：３２（ｖ／ｖ）メタノール／水から４：１（ｖ／ｖ）メタノール：ジクロロメタンまでの２０分直線勾配、ついで１ｍＬ／分の流量における５分間の維持から成っていた。このカラム溶離物を、３００ｎｍから４００ｎｍで監視した。
【００６４】
これらのプロトコルは、各々のアッセイに直接関係のあるレチノイド酸、アルコール、アルデヒド、および／またはエステルに対する高い分析能、および分離の相対的迅速性に基づいて選ばれた。ＨＰＬＣによる個々のレチノイドの同定は、未知のピークの保持時間と利用可能な基準レチノイド標準の保持時間との正確なマッチ、および利用可能な基準レチノイドに対する未知のピークのＵＶスペクトル分析（３００ｎｍから４００ｎｍ）に基づいていた。
【００６５】
【表８】
2004501952.tif 000009
【００６６】
本発明に用いるのに適したブースターには、下記表Ｂ１からＢ５に挙げられているブースターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。下記表は、ブースターの種類（Ｂ１からＢ５）、化合物の化学名、およびこのブースターを同定するために用いられた適切なアッセイ（すなわち、Ｂ１についてはＡＲＡＴ／ＬＲＡＴ、Ｂ２についてはレチノールデヒドロゲナーゼ、Ｂ３についてはレチナルデヒド阻害、Ｂ４についてはＣＲＡＢＰＩＩ結合、およびＢ５についてはレチノイン酸酸化阻害）からの結果を示す。
【００６７】
【表９】
2004501952.tif 000010
2004501952.tif 000011
2004501952.tif 000012
【００６８】
【表１０】
2004501952.tif 000013
【００６９】
【表１１】
2004501952.tif 000014
【００７０】
【表１２】
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【００７１】
【表１３】
2004501952.tif 000016
【００７２】
セクションＢ．ブースターの組合わせの効果
ブースター分子の組合わせの効果を評価するために、これら５つのブースターの種類の各々の作用を包含するアッセイが必要とされる。単一酵素アッセイは、ブースター分子の１つの種類のみに特異的であろうから、この目的には適していない。単一ブースター分子の作用とブースター分子の組合わせとを関連付けるために、ケラチノサイトにおけるレチノイド濃度を反映するアッセイが必要である。この理由から、トランスグルタミナーゼ（Ｔｇａｓｅ）アッセイが用いられた。Ｔｇａｓｅは、タンパク質における共有架橋の形成を触媒するカルシウム依存性酵素である。いくつかのＴｇａｓｅ酵素は、ケラチノサイトにおいて膜結合されており、このことは表皮細胞成熟に重要である。この酵素は、レチノイン酸によって阻害される。レチノイン酸の濃度が高くなればなるほど、Ｔｇａｓｅ発現の阻害は大きくなる。したがってＴｇａｓｅは、ケラチノサイト分化とケラチノサイトに対するレチノイド効果との両方の良好なマーカーである。
【００７３】
皮膚の分化のマーカーとしてのトランスグルタミナーゼ
表皮における末端分化プロセスの間、角質化エンベロープ（ＣＥ）として知られている１５ｎｍ厚さのタンパク質層が、細胞周辺部の内側表面上に形成される。ＣＥは多くの異なるタンパク質から成っており、これらのタンパク質は、表皮中に発現された少なくとも２つの異なるトランスグルタミナーゼ（Ｔｇａｓｅ）の作用によって触媒された、ＮΣ−（γ−グルタミル）リシンイソジペプチド結合の形成によって共に架橋されている。ＴｇａｓｅＩは、表皮の分化層、特に粒状層に多量に発現されるが、未分化基底表皮には不存在である。したがってＴｇａｓｅＩは、より分化された状態を示す、高いＴｇａｓｅＩレベルを有する表皮ケラチノサイトの分化の有用なマーカーである。ＴｇａｓｅＩ抗体を用いるＥＬＩＳＡベースのＴｇａｓｅＩアッセイを利用して、下記実施例における培養ケラチノサイトの分化の状態を評価した。
【００７４】
ケラチノサイト（前記のように培養されたもの）を、２００μｌ培地中１ウエルあたり４，０００から５，０００細胞の密度で、９６ウエルプレートにおいて培養した。２から３日間のインキュベーション後、または細胞が約５０％密集成長するまで、この培地を、テスト化合物を含む培地に変えた（１テストあたり５つの複製）。これらの細胞を、さらに９６時間培養し、その後この培地を吸引し、これらのプレートを−７０℃で保存した。プレートをフリーザーから除去し、これらの細胞を２００μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。これらの細胞を、ＴＢＳ／５％ＢＳＡ（洗浄緩衝液、ウシ血清アルブミン）で、室温（Ｒ／Ｔ）において１時間インキュベーションした。次にＴｇａｓｅ一次抗体を添加した：洗浄緩衝液中に１：２０００希釈された５０μｌのモノクローナル抗−ＴｇａｓｅＩ　Ａｂ　Ｂ．Ｃ．。この一次抗体を、３７℃で２時間インキュベーションし、ついで洗浄緩衝液で６×濯ぎ洗いした。ついで細胞を、３７℃で２時間、洗浄緩衝液中に１：４０００希釈された５０μｌの二次抗体（Ｆａｂ断片、アマーシャム社から得られるペルオキシダーゼ結合抗−マウスＩｇＧ）でインキュベーションし、ついで洗浄緩衝液で３回濯ぎ洗いした。洗浄緩衝液での濯ぎ洗いに続いて、これらの細胞を、ＰＢＳで３×濯ぎ洗いした。比色顕色（ｃｏｌｏｕｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）のために、これらの細胞を、正確に５分間、Ｒ／Ｔ、暗闇の中で（アルミニウムホイル下）、１００μｌ基質溶液（１０ｍｌ　０．１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ５．０中の４ｍｇ　ｏ−フェニレンジアミンおよび３．３μｌ　３０％Ｈ２Ｏ２）でインキュベーションした。５０μｌの４Ｎ　Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。サンプルの吸光度を、９６ウエルプレートＵＶ分光光度計において４９２ｎｍで読取った。５つの複製のうち４つを、両方の抗体で処理し、この５つ目のものを、Ｔｇａｓｅバックグラウンド対照として用いた。Ｔｇａｓｅレベルを測定し、パーセンテージ対照として表示した。
【００７５】
Ｔｇａｓｅアッセイの詳細
実験を開始する前、ブースター分子の組合わせの効果を測定するために、標準Ｔｇａｓｅアッセイ条件を調査した。完全に検証されたＴｇａｓｅアッセイを、下記のように確立した。
【００７６】
【表１４】
2004501952.tif 000017
【００７７】
Ｅ．細胞培養手順
９６ウエルプレートへのケラチノサイトの接種
１．ケラチノサイトの懸濁液を、ＫＧＭ培地中３０００細胞／２００μｌ／ウエルの濃度で調製した（各ミクロ滴定プレートにおいて３×１０５細胞／１２ｍｌ培地を用いた）。
【００７８】
２．２００μｌのケラチノサイトの懸濁液を、内部６０ウエルの各々にのみ移し替えた。
【００７９】
３．２００μｌのＫＧＭ培地を、外部ウエルの中にピペットで入れた（熱平衡を維持するため）。
【００８０】
４．各々のプレートを、３７℃、５％ＣＯ２で３日間、または細胞が約５０％密集成長するまでインキュベーションした。
【００８１】
サンプルでのケラチノサイトの処理
５．これらのサンプルの保存溶液を、ＤＭＳＯ中で調製した。
【００８２】
６．これらのサンプルを、所望の濃度まで希釈した。ＤＭＳＯの最終アッセイ濃度は０．１％である。
【００８３】
７．２０μｌのサンプルをウエルに移し替え、１８０μｌのＫＧＭ培地を添加して、最終アッセイ容積を２００μｌとした。
【００８４】
８．プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベーションした。
【００８５】
９．培地を各ウエルから完全に除去した。
【００８６】
１０．ウエルを２００μｌの１×ＰＢＳで２回濯ぎ洗いした。
【００８７】
１１．最後にこれらを、−７０℃で少なくとも１．５時間凍結した。
【００８８】
Ｆ．トランスグルタミナーゼアッセイ
１．ブロッキング：
２００μｌ／ウエルの遮断緩衝液で１時間、室温でプレートをインキュベーションする。
【００８９】
２．一次抗体：
ブロッキング緩衝液を吸引する。３７℃で少なくとも２時間、１００μｌ／ウエルのＴＧｍ−特異的モノクローナル抗体Ｂ．Ｃｌ（洗浄緩衝液中１：２０００希釈されたもの）でインキュベーションした。一次抗体は、バックグラウンド対照ウエルに添加されなかった。
【００９０】
３．洗浄緩衝液でウエルを６回濯ぎ洗いした。
【００９１】
４．二次抗体：
３７℃で２時間、１００μｌ／ウエルのペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＦ（ａｂ）２　断片（洗浄緩衝液中１：４０００希釈されたもの）でインキュベーションした。
【００９２】
５．洗浄緩衝液でウエルを３回濯ぎ洗いし（２００μｌを添加し）、各々の濯ぎ洗い後に吸引した。
【００９３】
６．ＰＢＳｗ／ｏトゥイーンで、ウエルを３回濯ぎ洗いした。
【００９４】
７．室温において正確に５分間、１００μｌ／ウエル基質溶液でインキュベーションした。
【００９５】
８．５０μｌ／ウエル４Ｎ　Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。
【００９６】
９．バイオテックプレート読取り機で４９２ｎｍにおいて吸光度を読取った。
【００９７】
Ｉ．最適化研究
ａ．トランスグルタミナーゼ生産の時間的経過
９６ウエルプレートで成長させたケラチノサイト（４０００細胞／ウエル）におけるトランスグルタミナーゼ生産に最適なインキュベーション時間を決定するために、時間的経過実験を実施した。この時間的経過研究は、レチノイン酸およびレチノールの用量反応分析、並びに１．２ｍＭ　ＣａＣｌ２の存在下におけるインキュベーションを含む多変数を用いて実施した。対照細胞（０．１％ＤＭＳＯ）中のトランスグルタミナーゼ産生は変化しなかったが、レチノイン酸とレチノールとのどちらも、５日間のインキュベーション期間にトランスグルタミナーゼ生産の用量依存的阻害を示した。最も顕著なレチノイド効果は、２日目および３日目に観察された。最大阻害は２日目に観察され、トランスグルタミナーゼ生産は、それぞれレチノイン酸とレチノールの最高濃度（１μＭ）の存在下、８５％および５５％だけ阻害された。同様に同じ実験を、細胞密度を変えて（３０００細胞／ウエルおよび５０００細胞／ウエル）実施し、匹敵しうる結果が観察された。
【００９８】
Ｂ：ＤＭＳＯ感受性
ケラチノサイトにおけるトランスグルタミナーゼ生産に対する効果について、０から２％の様々なＤＭＳＯ濃度をテストした。このアッセイは、ＤＭＳＯ濃度に対して感受性が高く、０．５％以上のＤＭＳＯで、有意な活性阻害を有する。したがって、その後のサンプル濃度研究のために、０．１％の最終アッセイ濃度が選ばれた。
【００９９】
Ｃ：用量反応曲線：レチノイン酸およびレチノール
このデータに基づき、最適時間として３日目が選ばれ、さらなるテストに用いられる濃度として０．１％ＤＭＳＯが選ばれた。０．１％ＤＭＳＯの存在下、レチノイン酸およびレチノールを用いて、追加の用量反応実験が実施され、トランスグルタミナーゼ生産は、３日目に検定された。レチノイン酸およびレチノールによって、Ｔｇａｓｅ阻害について良好な用量反応が観察された。１０から７Ｍレチノールは、直線濃度範囲においてＴｇａｓｅ阻害を生じた。したがって、ブースターの組合わせを評価するために、レチノールのこの濃度が選ばれた。
【０１００】
Ｄ：ブースターまたはブースターの組合わせをテストするために用いられる最終条件
レチノールおよびブースターでのケラチノサイトの　−　３日
インキュベーション日数
最終ＤＭＳＯ濃度　　　　　　　　　　　　　　　　−　０．１％未満
レチノール濃度　　　　　　　　　　　　　−　１０から７Ｍ（０．１μＭ）
ブースター濃度　　　　　　　　　　　　　−　１０ｍＭから０．１ｎＭ
前記条件を用いて、これらの様々なブースターのすべて（Ｂ１からＢ５）についての用量反応をテストし、組合わせてテストするのに最良のブースター濃度を同定した。
【０１０１】
トランスグルタミナーゼレベルを測定し、表Ｂ１からＢ５において下記のどちらかのものとして表示した。
【０１０２】
（ｉ）％（ブースター＋レチノール阻害／対照阻害）−％（ＲＯＨ阻害／対照阻害）、これは、レチノール単独に勝る、ブースター＋レチノール誘発Ｔｇａｓｅ阻害の追加の効果を測定する。あるいは
（ｉｉ）多ブースター濃度の阻害効果が調べられた時のＩＣ５０値として。これは、１０−７Ｍの一定のレチノール濃度と組合わせた場合、Ｔｇａｓｅを５０％だけ阻害するブースター濃度を示す。
【０１０３】
ブースターの組合わせおよびブースター比
驚くべきことに、あるいくつかの化合物が、様々なメカニズムによって、レチノールまたはレチニルエステルからのレチノイン酸形成の内生レベルを高めることが発見された。これらの化合物は、本明細書において集合的に「レチノイドブースター」と呼ばれる。これらには、ＡＲＡＴ／ＬＲＡＴの阻害剤（Ｂ１ブースター）、レチナルデヒドレダクターゼの阻害剤（Ｂ３ブースター）、ＣＲＡＢＰ−２に結合するレチノイン酸の阻害剤（Ｂ４ブースター）、およびシトクロムＰ４５０酵素によって触媒されたレチノイン酸酸化の阻害剤（Ｂ５ブースター）、またはレチノールデヒドロゲナーゼを高めるかまたは活性化するあるいくつかのその他の化合物（Ｂ２ブースター）が含まれる。これらのブースターは、本明細書の上記チャート１に見られるように、Ｂ１からＢ５群に体系化されている。
【０１０４】
単独または互いに組合わされたブースターは、レチノイン酸への転換に利用しうるレチノールの量を増すことによって、およびレチノイン酸の分解を阻害することによって、レチノイドの作用を増強する。これらのブースターは、レチノイド（例えばレチノール、レチニルエステル、レチナール、レチノイン酸）と共同して作用する。レチノイドは、皮膚の中に内在的に存在する。しかしながらこれらの好ましい組成物は、性能を最適化するために、ブースターと並存してこの組成物中にレチノイドを含む。
【０１０５】
本発明は一部、少なくとも１つのブースター化合物、あるいは二元、三元、四元、または５つのブースターの組合わせの組成物約０．０００１重量％から約５０重量％、好ましくは０．００１重量％から１０重量％、最も好ましくは０．００１重量％から５重量％を含んでいる第二の組成物を含む。下に示されている特定比における０．００１％から約５％のブースターの組合わせと、化粧品として許容しうるビヒクルの組合わされた濃度は、インビトロトランスグルタミナーゼアッセイにおいてトランスグルタミナーゼを５０％以上まで阻害する。
【０１０６】
本発明の組成物中に含まれるブースターは、下記のものから成る群より選ばれる：
ａ．どちらもＢ２、Ｂ３、およびＢ４から成る群より選ばれる２つのブースター；
ｂ．次のものから成る群より選ばれるブースターの二元的組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２；Ｂ１／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３；Ｂ２／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４；Ｂ３／Ｂ５；Ｂ４／Ｂ５；
ｃ．次のものから成る群より選ばれるブースターの三元的組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；
ｄ．次のものから成る群より選ばれるブースターの四元的組合わせ：
Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；および
ｅ．ブースターの５つのグループ：Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５の組合わせ。
【０１０７】
ブースター対ブースター比
上に示されている組合わせにおける様々な種類（Ｂ１からＢ５）のブースターは、少なくとも５０％以下までのＴｇａｓｅ活性の阻害について下に示されているように、特定比における化粧品中の０．００１％から５％の最適濃度を有する：
【０１０８】
【表１５】
2004501952.tif 000018
【０１０９】
レチノイド対ブースター比：
この好ましい組成物は、性能を最適化するために、ブースターまたはブースターの組合わせと並存して、この組成物中にレチノイド（例えばレチノール、レチニルエステル、およびレチナルデヒド）を含んでいる。
【０１１０】
最適な性能のために、レチノイド対ブースターの濃度は、下記の比においてこの組成物中に存在する方がよい。
【０１１１】
【表１６】
2004501952.tif 000019
【０１１２】
これらの実施例に用いられる個々のブースターの濃度
この目的は、活性化合物とレチノールとの組合わせによってトランスグルタミナーゼの発現の相乗的阻害を確立することであるので、レチノールの存在下に個別にテストした時、これらの活性化合物の用量反応プロフィール（ＩＣ２０およびＩＣ５０値）を決定することが肝要であった。Ｂ２からＢ４に属するブースターの詳細な用量反応は、下記のＩＣ５０およびＩＣ２０の表に続く表に示されている。このデータは、各活性化合物の適切な最大に近い（ｓｕｂ−ｍａｘｉｍａｌ）阻害濃度を同定するため、場合によってはレチノールの存在下にこれらの活性化合物の混合物の推定相乗効果を同定することを可能にするために用いられた。下記表のデータは、ＩＣ５０およびＩＣ２０（対照の８０％）値、およびブースターの組合わせとの相乗効果をテストする時に用いられた濃度を表わしている。
【０１１３】
２つの化合物の相乗効果を証明するために、最大のＩＣ２０にあるテストのための濃度、換言すればＴｇａｓｅ発現のレチノール阻害を２０％だけ個々に高める化合物濃度を選ぶことが肝要である。２つのこのような化合物は、４０％の追加阻害を有する方がよい。濃度を決定するためのこの戦略の使用によって、試験されているこれら２つの化合物の相乗効果を検出するためには、さらなる阻害に４０から１００％の窓（ｗｉｎｄｏｗ）が残される。
【０１１４】
より難しい濃度基準として、単独では阻害効果を示さないが、組合わせた場合に阻害を示す化合物の濃度を選ぶことであろう。しかしながらこの研究において、本発明者らは、さらに難しい基準を選んだ。本発明者らは、最小限に効果的なＴｇａｓｅ阻害濃度よりも１０から１０００倍低い化合物の濃度を選んだ。このように非常に低い濃度を用いた相乗的組合わせの確認は、最も効果的な相乗的組合わせが確認されたことを意味するであろう。
【０１１５】
【表１７】
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【０１１６】
Ｂ２からＢ４類ブースターについての用量反応
下記の表は、Ｂ２からＢ４類に属するブースターの用量反応に関するデータを含んでいる。ブースターの濃度はモルで示されている。４つの複製の平均Ｔｇａｓｅレベルおよび標準偏差は、対照の％として表示されている（０．１％ＤＭＳＯおよび１０−７Ｍレチノール）。高い方の数字（１００に近いかまたは１００以上）は、Ｔｇａｓｅの阻害がないことを示している。この数字が低くなればなるほど、その濃度においてこの阻害剤はそれだけ一層強力である。ＩＣ５０およびＩＣ２０値は、この用量反応表から計算され、前記表に表示された。
【０１１７】
【表１８】
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【０１１８】
【表１９】
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【０１１９】
【表２０】
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【０１２０】
ブースターの二元的組合わせを用いたＴｇａｓｅ阻害の相乗効果
２つの異なる種類のブースターとレチノールとの組合わせによるＴｇａｓｅ発現の相乗的阻害を調べるために、化合物の選ばれた組合わせを、前記表に示されている濃度においてテストした。テストされた濃度は、Ｔｇａｓｅ活性の最小阻害（すなわちＩＣ２０）に必要とされる濃度よりも小さい１対数桁（ｏｎｅ　ｌｏｇ　ｏｒｄｅｒ　ｏｆ　ｍａｇｎｉｔｕｄｅ）であった。これらの化合物は単独でおよび組合わせてテストされ、Ｔｇａｓｅの％阻害が、各化合物およびこの組合わせについて示されている。
【０１２１】
下記実施例は、すべての可能な二元的組合わせ（Ｂ１／Ｂ２；Ｂ１／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３；Ｂ２／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４；Ｂ３／Ｂ５；Ｂ４／Ｂ５）における相乗的組合わせを示す。この組合わせの％阻害が、共に添加された各化合物の阻害よりも大きい時、これは相乗効果を示す（すなわち組合わせによる阻害が、化合物１＋化合物２による阻害よりも大きい）。下記表に示されている二元的組合わせ例はすべて、Ｔｇａｓｅを相乗的に阻害した。
【０１２２】
【表２１】
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【０１２３】
ブースターの三元的組合わせを用いたＴｇａｓｅ阻害の相乗効果
３つの異なる種類のブースターとレチノールとの組合わせによるＴｇａｓｅ発現の相乗的阻害を調べるために、化合物の選ばれた組合わせをテストした。テストされた濃度は、Ｔｇａｓｅ活性の最小阻害（すなわちＩＣ２０）に必要とされる濃度よりも小さい１対数桁であった。これらの化合物は単独でおよび組合わせてテストされ、Ｔｇａｓｅの％阻害は、各化合物およびこの組合わせについて示されている。下記実施例は、すべての可能な三元的組合わせ（Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５）における相乗的組合わせを示す。この組合わせの％阻害が、共に添加された各化合物の阻害よりも大きい時、これは相乗効果を示す（すなわち組合わせによる阻害は、化合物１＋化合物２＋化合物３による阻害よりも大きい）。下記表に示されている三元的組合わせ例はすべて、１０−７Ｍレチノールの存在下にＴｇａｓｅを相乗的に阻害した。
【０１２４】
【表２２】
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【０１２５】
ブースターの四元的組合わせを用いたＴｇａｓｅ阻害の相乗効果
４つの異なる種類のブースターとレチノールとの組合わせによるＴｇａｓｅ発現の相乗的阻害を調べるために、化合物の選ばれた組合わせをテストした。テストされた濃度は、Ｔｇａｓｅ活性の最小阻害（すなわちＩＣ２０）に必要とされる濃度よりも小さい１対数桁であった。
これらの化合物は単独でおよび組合わせてテストされ、Ｔｇａｓｅの％阻害は、各化合物およびこの組合わせについて示されている。下記実施例は、すべての可能な四元的組合わせ（Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５）における相乗的組合わせを示す。（４つのブースターの）この組合わせの％阻害の差が、３つのブースターの組合わせによる阻害のものよりも３０％以上大きいならば、相乗効果が確認された（すなわち４つのブースターの組合わせの％阻害が、３つのブースターの組合わせの％阻害＋３０％と等しいか、またはこれよりも大きい）。下記表に示されているブースターの四元的組合わせはすべて、相乗効果を示した。
【０１２６】
【表２３】
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【０１２７】
化粧品として許容しうるビヒクル
本発明による組成物はまた、この組成物が皮膚につけられた時に活性成分の分散を促進するように、この組成物中の活性成分のための希釈剤、分散剤、またはキャリヤーとして作用するための、化粧品として許容しうるビヒクルも含む。
【０１２８】
水以外または水に加えてのビヒクルは、液体または固体エモリエント、溶媒、湿潤剤、増粘剤、および粉末を含んでいてもよい。特に好ましい非水性キャリヤーは、ポリジメチルシロキサンおよび／またはポリジメチルフェニルシロキサンである。この発明のシリコーンは、２５℃において約１０から１０，０００，０００センチストークスの範囲の粘度を有するものであってもよい。特に望ましくは、低粘度と高粘度のシリコーンの混合物である。これらのシリコーンは、ジェネラル・エレクトリック社（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から、ビカシル（Ｖｉｃａｓｉｌ）ＳＥおよびＳＦという商標として、およびダウ・コーニング社（Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から、２００および５５０シリーズとして入手しうる。この発明の組成物において用いることができるシリコーンの量は、この組成物の５から９５重量％、好ましくは２５から９０重量％の範囲にある。
【０１２９】
任意の皮膚効果物質および化粧品添加剤
主として、用いられる乳化剤の平均親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）に応じて、油中水エマルジョンまたは水中油エマルジョンのいずれかを供給するために、乳化剤と共に油または油性物質が存在してもよい。
【０１３０】
様々な種類の活性成分が、本発明の化粧品組成物中に存在してもよい。活性成分は、エモリエント以外、およびこの組成物の物理的特徴を単に改良するだけの成分以外の、皮膚または毛髪効果剤として規定される。このカテゴリーに限定されないが、一般的な例には、日焼け止め剤、皮膚を明るくする薬剤、および日焼け剤が含まれる。
【０１３１】
日焼け止め剤は、紫外線を遮断するために通常用いられている物質を含んでいる。化合物の例は、ＰＡＢＡの誘導体、シンナメート、およびサリチレートである。例えばオクチルメトキシシンナメート、および２−ヒドロキシ−４−メトキシ−ベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られている）を用いることができる。オクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシ−ベンゾフェノンは、それぞれ商標パーソル（Ｐａｒｓｏｌ）ＭＣＸおよびベンゾフェノン−３という商品として入手しうる。
【０１３２】
これらのエマルジョンに用いられる日焼け止め剤の正確な量は、太陽のＵＶ照射から望まれる保護の程度に応じて様々であってもよい。
【０１３３】
もう１つの好ましい任意成分は、必須脂肪酸（ＥＦＡ）、すなわち、すべての細胞の原形質膜形成に必須な脂肪酸から選ばれる。ケラチノサイトにおいて、ＥＦＡ欠乏は、細胞を超増殖性にする。ＥＦＡの補足がこれを補正する。ＥＦＡはまた、表皮の脂質生合成を高め、、表皮のバリヤー形成のための脂質を供給する。これらの必須脂肪酸は好ましくは、リノール酸、γ−リノレン酸、ホモ−γ−リノレン酸、コランビン（ｃｏｌｕｍｂｉｎｉｃ）酸、エイコサ−（ｎ−６，９，１３）−トリエン酸、アラキドン酸、γ−リノレン酸、ティムノドン酸、ヘキサエン酸、およびこれらの混合物から選ばれる。
【０１３４】
多くの場合エモリエントが、本発明の化粧品組成物中に組込まれる。このようなエモリエントのレベルは、総組成物の約０．５重量％から約５０重量％、好ましくは約５重量％から約３０重量％であってもよい。エモリエントは、例えばエステル、脂肪酸、およびアルコール、ポリオール、および炭化水素のような一般的な化学的カテゴリーに分類することができる。
【０１３５】
エステルは、モノ−またはジ−エステルであってもよい。脂肪ジエステルの許容しうる例には、アジピン酸ジブチル、セバシン酸ジエチル、ジメリン酸ジイソプロピル（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　ｄｉｍｅｒａｔｅ）、およびコハク酸ジオクチルが含まれる。許容しうる枝分かれ鎖脂肪エステルには、ミリスチン酸２−エチル−ヘキシル、ステアリン酸イソプロピル、およびパルミチン酸イソステアリルが含まれる。許容しうる三塩基性酸エステルには、トリリノール酸トリイソプロピル、およびクエン酸トリラウリルが含まれる。許容しうる直鎖脂肪エステルには、パルミチン酸ラウリル、乳酸ミリスチル、オレイルユールケート（ｏｌｅｙｌ　ｅｕｒｃａｔｅ）、およびオレイン酸ステアリルが含まれる。好ましいエステルには、ココカプリル酸エステル／カプリン酸エステル（ココカプリル酸エステルとココカプリン酸エステルとのブレンド）、プロピレングリコールミリスチルエーテルアセテート、アジピン酸ジイソプロピル、およびオクタノン酸セチルが含まれる。
【０１３６】
適切な脂肪アルコールおよび脂肪酸の例には、１０から２０個の炭素原子を有する化合物が含まれる。特に好ましくは、例えばセチル、ミリスチル、パルミチンおよびステアリルアルコールおよび酸などの化合物である。
【０１３７】
エモリエントとして用いることができるポリオールの中には、線状および枝分かれ鎖アルキルポリヒドロキシル化合物がある。例えばプロピレングリコール、ソルビトール、およびグリセリンが好ましい。同様に、ポリマーポリオール、例えばポリプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールも有用であろう。ブチレンおよびプロピレングリコールも、透過増強剤として特に好ましい。
【０１３８】
エモリエントとして用いることができる炭化水素の例は、１２から３０個の炭素原子の炭化水素鎖を有するものである。特定例には、鉱油、石油ゼリー、スクアレン、およびイソパラフィンが含まれる。
【０１３９】
本発明の化粧品組成物の中の機能成分のもう１つのカテゴリーは、増粘剤である。増粘剤は通常、この組成物の０．１から２０重量％、好ましくは約０．５から１０重量％の範囲の量で存在する。増粘剤の例は、Ｂ．Ｆ．グッドリッチ社（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から商標カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）として入手しうる架橋ポリアクリレート物質である。ガム、例えばキサンタン、カラゲーナン、ゼラチン、カラヤ、ペクチン、およびイナゴマメガムを用いることができる。ある状況において、増粘機能は、シリコーンまたはエモリエントとして用いられる物質によって得ることができる。例えば１０センチストークス以上のシリコーンガムおよびエステル、例えばグリセロールステアレートは、二重の機能性を有する。
【０１４０】
粉末が本発明の化粧品組成物の中に組込まれてもよい。これらの粉末には、チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、スメクタイト粘土、化学的に変性されたマグネシウムアルミニウムシリケート、有機的に変性されたモンモリロナイト粘土、水和アルミニウムシリケート、ヒュームドシリカ、アルミニウムデンプンオクテニルスクシネート、およびこれらの混合物が含まれる。
【０１４１】
その他の添加微量成分が、これらの化粧品組成物中に組込まれてもよい。これらの成分には、着色剤、乳白剤、および香料が含まれる。これらの物質の量は、この組成物の０．００１重量％から２０重量％の範囲であってもよい。
【０１４２】
この組成物の使用
本発明による組成物は主として、ヒトの皮膚への局所適用のための製品、特に皮膚のコンディショニングおよび平滑化、およびしわの寄った、または老化した皮膚の外見を防ぐかまたは軽減するための作用物質として意図されている。
【０１４３】
使用の時、この組成物の少量、例えば１から５ｍｌを、適切な容器またはアプリケーターから、皮膚の暴露区域につけ、ついで必要であれば、手または指、または適切な器具を用いて、これを皮膚の上に伸ばすかおよび／または中にすり込む。
【０１４４】
製品形態および包装
本発明の局所皮膚処理組成物は、ローション、流体クリーム、クリーム、またはジェルとして配合されてもよい。この組成物は、その粘度および消費者によって意図された用途に合わせるのに適した容器に包装されてもよい。例えばローションまたは流体クリームは、バイアルまたはロールボールアプリケーター、またはカプセル、または推進薬駆動エーロゾル器具、または指の操作に適したポンプが取り付けられた容器に包装されてもよい。この組成物がクリームである時、これは単に、変形不可能なバイアルまたは絞り容器、例えばチューブまたはフタ付きバイアルに保存されてもよい。
【０１４５】
したがって本発明はまた、本明細書に規定されている化粧品として許容しうる組成物が入っている閉鎖容器も提供する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501952.tif 000114
【国際調査報告】
2004501952.tif 000115
2004501952.tif 000116
2004501952.tif 000117
2004501952.tif 000118
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