(57)【要約】本発明は、新形成細胞の異常増殖を正常の経路に復帰させるところの、上皮由来の哺乳動物新形成細胞を正常の分化に復帰させるための薬剤の製造のためのＮ−アセチル−Ｌ−システイン及びその２量体の有効用量の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の上皮由来の新形成細胞を正常の分化に復帰させるための薬剤の製造のための有効用量のＮ−アセチル−Ｌ−システイン、又はその２量体の使用であって、それによって上記新形成細胞の異常増殖が正常の経路に復帰させられる、前記使用。
【請求項２】
上記新形成細胞が退形成細胞であることに特徴を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記退形成細胞が良性の腫瘍細胞であることに特徴を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
上記良性の腫瘍細胞が表皮腫瘍細胞であることに特徴を有する、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
上記表皮腫瘍細胞が乾癬細胞であることに特徴を有する、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
上記良性の腫瘍細胞がリウマチ様の細胞であることに特徴を有する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
上記退形成細胞が悪性の腫瘍細胞であることに特徴を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項８】
上記悪性の腫瘍細胞が肺癌、乳癌、前立腺癌、又はヒト大腸癌腫であることに特徴を有する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
上記新形成細胞が異形成細胞であることに特徴を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
上記異形成細胞が角化症細胞であることに特徴を有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
上記角化症細胞が乾癬細胞であることに特徴を有する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
上記異形成細胞が糖尿病性の病変を呈する細胞であることに特徴を有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
上記新形成細胞が前進形成細胞であることに特徴を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記新形成細胞が退行変性細胞であることに特徴を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、又はその２量体の上記有効用量が、局所的に０．１〜５０ｍＭであることに特徴を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、又はその２量体の上記有効用量が、局所的に０．２５〜４０ｍＭであることに特徴を有する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
治療的に有効な量のＮ−アセチル−Ｌ−システイン、又はその２量体、及び医薬品として許容できる担体に特徴を有する、哺乳動物の上皮由来の新形成細胞を正常の分化に復帰させるための化合物であって、それによって上記新形成細胞の異常増殖が正常の経路に復帰させられる、前記化合物。
【請求項１８】
組織ターゲティング分子がＮ−アセチル−Ｌ−システイン又はその２量体に結合されていることに特徴を有する、請求項１７に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の上皮由来の新形成細胞の臨床的な治療のためのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、又はその２量体の使用に関する。
【０００２】
腫瘍、又は新生物は組織の新たな成長を含み、ここで細胞の増殖は非管理であり、進行性である。異常な成長のすべてのタイプが悪性ではなく；悪性でないものは良性の腫瘍と呼ばれる。悪性の腫瘍とは対照的に、良性の腫瘍は、しばしばその正常の同等物と同様又は非常によく似た規則正しい細胞の成長から成る。
【０００３】
しかしながら、癌は冒された細胞の非管理の増殖及び無秩序の成長に特徴を有する。その制御されていない成長の能力に付随して、癌細胞及びそれらが構成する組織は、顕微鏡を通して見られる通り正常の外観を失ない、異常な機能を帯びる。それらは攻撃的で周囲の組織に侵潤し、離れた部位へ広がり、ついには宿主を殺す。１９９４年には、癌は米国のすべての死のほぼ１／４の原因であった。
【０００４】
悪性又は良性のいずれかの腫瘍はその構成細胞の構造的及び機能的特性及びそれらの生物学的挙動に基づく。悪性の腫瘍の細胞及び組織はそれらが発生した組織とは異なる。それらはより速い成長及び変化した構造及び機能を示す。悪性の腫瘍細胞の特性は、それらの増殖及び体中の組織及び器官への拡張を促進し、維持するのに貢献する。対照的に、良性の腫瘍の細胞及び組織はよりゆっくりと成長する傾向にあり、一般的には、それらの由来する正常な組織によく似ている。良性の腫瘍細胞の構造及び機能が、形態学的に及び機能的に正常な細胞のそれらと区別がつかない場合、腫瘍のかたまりとしてのそれらの成長はそれらの新形成性の性質を示す唯一の特徴である。
【０００５】
連続的な増殖を行なう細胞の成長及び複製のサイクルは最初の成長相（Ｇ１）を通過する新しい小さな細胞から出発する、と記述することができるという一般的な合意が本分野にある。上記Ｇ１相の後には、各染色体の複製が得られるＤＮＡ合成の相（Ｓ相）が続く。その後第２成長相が続き、これによりすべてのタンパク、膜、オルガネラなどが合成され、これらは母細胞から２の細胞を得るのに必要とされる（Ｇ２相）。このＧ２相の間に細胞の大きさが増加する。分裂期（Ｍ相）が実際の細胞の分裂を完結し、結果が２の新しい細胞であって、上記サイクルが再び始まる。
【０００６】
化学療法は一定の形態の癌を治療することができ、そして化学療法剤が使用されてきた、これは有糸分裂の間、すなわちＧ２相の後、上記細胞のサイクルを妨害する。そのような外因性の物質は、細胞骨格タンパク、すなわちチューブリン線維、の構築／分解の動力学を妨害する。そのような物質の例は例えばビンカアルカロイド（例えばタキソール）である。
【０００７】
しかしながら、ほとんどの抗癌剤はその有用性に限界がある。１つの問題はいずれの時においてもある一定部分の細胞しか分裂せず、ほとんどの抗癌剤は、分裂を行なう細胞の母集団のその一部分しか破壊しないということである。別の問題は、抗癌剤は、癌細胞に損傷を与えることとは別に正常の細胞及び組織にも損傷を与えるということである。これらの困難性を克服するために、化学療法剤の組み合わせであって、異なる方法で細胞に作用するものが同時に又は連続して多様な治療プログラムにおいて使用されてきた。
【０００８】
細胞の全体の酸化還元状態が増殖の調節に関連していると考えられてきた。いくつかの知見が、酸化にシフトした場合、細胞は増殖するように誘導され、還元剤を補った場合、上記細胞は分化する傾向にあることを報告する。多様な由来の酸化的ストレス、すなわちＵＶ放射線、電離放射線、及び化学物質、にさらされた細胞はしばしば増殖性の応答を示す。フリーラジカル及び過酸化水素残基は酸化的ストレスをひき起こし、ほとんどの場合において抗酸化剤及びフリーラジカルスカベンジャーによる前処理が、増殖性の応答を減少させ又は完全に消滅させる。
【０００９】
Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）は、酸化を防止又は減少させるチオールを含む化合物である。したがって、それはいくつかの薬理学的及び実験的用途を有する。最終的に証明されていないにもかかわらず、その性質はスルフヒドリル残基（−ＳＨ）と合理的に関係がある。その抗酸化的性質により、ＮＡＣはまた炎症の副産物であるフリーラジカルの作用を相殺することにより、抗炎症剤として作用することが報告されている。
【００１０】
ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９７／２９７５９号において、ＮＡＣは癌の腫瘍の形成を阻害するためのドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）の医薬組成物中に用いられてきた。この場合、ＮＡＣの抗酸化活性はドキソルビシンの心毒性を相殺する。
【００１１】
Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ （１９９８）， ３１ （５１６）， ２１７−２２９において、抗酸化的性質を示すチオール含有化合物が細胞保護及び化学防御における使用について評価された。Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｌ−ＮＡＣ）及びその非代謝性に活性の立体異性体Ｎ−アセチル−Ｄ−システイン（Ｄ−ＮＡＣ）がその細胞サイクルの進行に対する効果を評価するために、カプトプリル及びジチオエリスリトール（ＤＴＴ）と共に研究された。トポイソメラーゼ−ＩＩａ活性の低下は、Ｇ２相において蓄積した相対的な細胞数の６倍の増加と関連していた。
【００１２】
ＮＡＣの他の薬理学的及び臨床的使用は、よく知られた粘液溶解作用及びプラセタモール及び関連化合物による治療後の劇症肝炎の治療を含む。臨床的に用いられた場合、１０ｇ／日のような高用量の後でさえ、ＮＡＣによる重大な副作用はなかった。これは、メルカプトエタノール及びジチオスレイトールのような他の有害なチオール含有化合物とは反対であった。さらには、ＮＡＣの消失は比較的迅速であった。
【００１３】
日本国特許第０８０４０８８８号においては、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでミエローマタイプ腫瘍の治療のための抗ガン剤として用いられており、その理由は、それがｉｎ  ｖｉｔｒｏでミエローマタイプ腫瘍細胞に対して抗癌活性を有し、腫瘍増殖阻害活性が得られているからである。
【００１４】
ミエローマタイプの腫瘍とは対照的に、ほとんどの上皮由来の固形組織における細胞成長及び細胞新生は、１の幹細胞の１の末期の細胞及び持続した成長能を有する１の細胞への複製として描写されることができる。末期の細胞はその後分化の経路に入り、ここで、多様な組織機能を遂行し、有限の寿命を有することとなる。
【００１５】
分化の経路に入る細胞は、細胞どうしの接触の注目すべき増加を示し、上記過程はまた、一般的に接触阻害として表される。細胞が分化の終点に入るためのシグナルは、細胞どうしの接触の構成成分自体に由来していることをいくつかの証拠が示している。細胞間のシグナルの拡散も細胞どうしの接着が原因となっている。
【００１６】
癌細胞は、この接触阻害を失ない、持続的に増殖する分化した細胞とみなすことができる。したがって、癌細胞は、分化のシグナルに対して応答する能力を失なっている。この点で、分化した細胞の有限の寿命を有するかわりに、癌細胞は不死である。
【００１７】
本発明の目的は、上皮組織における分化機能障害に関連した疾患のための治療薬として作用する薬剤を生産することにある。
【００１８】
この目的を達成するために、本発明による方法は、請求項１に記載の特徴を有する。
【００１９】
驚くべきことに、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）及びそのジスルフィド２量体、Ｎ，Ｎ′−ジアセチル−Ｌ−システイン（ｄｉ−ＮＡＣ）は、上皮由来の新形成細胞の異常増殖を有毒な効果を伴わずに増殖のブロック、分化及び有限の細胞の寿命を含む正常の経路へ復帰させる復帰物質であることが発見された。同様の構造を有するＮ−アセチル−Ｌ−システインの他の２量体、例えば４，４′−（イソプロピリデン−ジチオ）ビス〔２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール〕、もまたこれらの効果を示す。
【００２０】
この関係において、新形成細胞は新生物、すなわち、正常細胞の増殖の中止を誘発又はひき起こすことのない状態での細胞の進行性の増殖、を形成する。そのような細胞の良性又は悪性の過増殖は、異形成、すなわち組織にとって正常でない、組織中の細胞のタイプの変化；退形成、すなわち細胞の分化及び相互の配向性の喪失；前進形成、すなわち組織の異常な分化；及び退行変成、すなわちさらに原始的なタイプへの組織又は細胞の退化を含む。
【００２１】
ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの復帰作用は、一般的に認められている形態学的不均一性における分化が細胞のサイクルのＧ２相でなく、Ｇ１−Ｇ０相の後におこる、細胞の通常の分化を含む。
【００２２】
本発明により、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン又はその２量体を用いることによって、細胞が分化する場合−さらに分裂する代わりに−上記細胞は、その最終的な正常の形態を示す。上皮由来の細胞及び組織における増殖性の腫瘤の挙動の復帰は、新しいＤＮＡ合成の前、すなわちＳ相の前、に開始する。そして、上記細胞はＧ１相からＧ０相（成長ゼロ）へ入り、そこから分化相（Ｄ相）が始まる。この相は、適切な形態に終わり、それは、組織中の最終的に分化し、機能的に活性のある細胞をすべて特徴づけるすべての必要な構成成分を合成し、構築することによる。
【００２３】
本発明によってＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣで処理した新形成細胞の正常な分化は、細胞間接着構造の増加、機能同様にいくつかの他の構造の獲得、これは−以下の実施例中で説明されるように−うまく分化した細胞に典型的かつ各細胞のタイプで異なるものである、及び増殖の静止によって証明されることができる。他の生物化学的な分化のマーカーは初期の転写因子である。
【００２４】
例えば腫瘍が高濃度のＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣで治療された場合、得られた細胞間接着は、隣接する細胞間及び細胞と基底の細胞外マトリックス間のいくつかの接着性の構造を含む。これらは顕微鏡下で、デスモソーム及びギャップ結合同様、密接した接着性の接合部として観察され、それぞれがタンパクの複雑な構造により構成され、しばしば反復的なサブユニットから構築される。これらの接触は、細胞膜を架橋し、細胞外の、膜貫通の及び細胞質内の部位を有する。これらの多タンパク構造の細胞外の部位が、隣接する細胞又は基底の細胞外マトリックスに連結する一方、細胞質内の部位は、今度は細胞骨格タンパクのネットワークに連結している。
【００２５】
例えば、２の細胞タイプ、１次の正常ヒト内皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）及びヒト大腸癌腫ライン（ＣａＣｏ２）、の両方が、ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣで処理した場合、３日で分化する。これらの細胞の増殖の最大の阻害−成長のない状態として示される−は１ｍＭの局所的な濃度で得られる。より低い用量もまた抗増殖効果を有するが、それほど大規模なものではない。ＮＡＣ及びｄｉ−ＮＡＣの抗酸化的性質によって、非常に低い用量がわずかな増殖効果を有する。したがって、上皮由来の哺乳動物新形成細胞を正常の分化に復帰させ、それによってそのような細胞の異常な増殖が正常の経路に復帰させられる、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、又はその２量体の有効用量は本発明によれば最大の増殖阻害に必要とされる濃度よりも高い濃度において得られる。したがって、増殖の阻害は新形成細胞の復帰自体ではなく、それが分化を伴う場合のみを意味する。
【００２６】
これらのＮＡＣ及びｄｉ−ＮＡＣのより高い用量においては、ほとんどの細胞骨格タンパクの分解がおこる。ＮＡＣ及びｄｉ−ＮＡＣは、分裂した細胞骨格の自然の復旧をも妨げる。細胞骨格が断片化された場合、細胞間接合部が増加するのと同様に細胞間のより強い接触が得られる、すなわち細胞接合部間の相互作用の強度の増加及びそのような接合部の数の増加である。これは、細胞が増殖するのに正確な距離に接合部を保持する細胞骨格ネットワークに結合された細胞間接合部に依存することができる。いったんこのネットが十分な濃度のＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣによって破壊されると、上記接合部は崩壊し、より密接な細胞間接触が得られるであろう。このいわゆる接触阻害は、増殖の終止、そして驚くべきことに、分化の開始、腫瘍細胞の場合には腫瘍の復帰、に帰する。したがって、上皮由来の機能不全の哺乳動物細胞の正常の分化への復帰は、細胞間接触の増加を通して誘導され、これらの細胞の成長の制御が得られる。
【００２７】
したがって、本発明は、個々に高濃度又は低濃度のＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣで対応する疾患を阻止又は安定化させることによる上皮由来の新形成細胞の臨床的治療のために、ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの使用を提案する。新形成細胞のタイプは、本願発明に係る使用について拘束的なものではなく、退形成細胞、異形成細胞、前進形成細胞又は退行変性細胞であることができる。
【００２８】
好ましくは、発明に係る使用は抗癌療法を含み、ここにおいては上皮由来の腫瘍における腫瘍の良性及び悪性の過増殖を含む増殖が分化の経路へ復帰させられる。ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣによって正常の分化へ戻される良性の腫瘍細胞の例は、表皮腫瘍細胞及びリウマチ様細胞である。悪性の腫瘍は肺癌、乳癌、前立腺がん又はヒト大腸癌腫であることができる。本発明によって正常の経路に復帰させられることのできる悪性の細胞又は腫瘍のよりわかり易いしかし制限のないリストは、ＣＮＥ２ヒト上皮腫瘍細胞株、Ａ４３１細胞株、６６−ｋＤａ  Ｓｈｃ、食道癌細胞株、ＨｅｐＧ２ヒト腫瘍細胞株、ヒトパピローマウイルスタイプ１６を含む癌細胞株、メルケル細胞癌細胞株、頭部及び頸部癌細胞株、食道癌細胞株、同様にグリア芽細胞腫細胞、網膜芽細胞腫、ヒト網膜芽細胞腫Ｙ７９細胞、肝細胞癌細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、エールリッヒ腹水腫瘍細胞、肝臓上皮腫瘍細胞、胸腺様の分化を伴う紡錘体上皮腫瘍（ＳＥＴＴＬＥ）、脱落性の上皮性中皮腫、上皮性卵巣癌、外陰部上皮内腫瘍症、ヒト腸間膜動脈腫瘍症、中皮腫瘍症、上皮内腫瘍症非小細胞型肺癌、管状嚢胞性明細胞腺癌、大腸腺癌細胞、色素性肝細胞腺腫、非大腸炎性散発性腺腫、バレット食道腺癌及び付随する腺癌、直腸膣中隔の腺腫、前立腺腺癌、膵臓腺癌、下垂体好酸性幹細胞腺腫、唾液腺腫嚢胞癌腫、胆嚢の内分泌腺細胞癌、膵臓の大嚢胞性漿液性嚢腺腫、腺扁平上皮細胞又は円柱細胞腫瘍症、扁平上皮癌、頚部扁平上皮癌、神経芽細胞腫、汗孔角化症病変及び足底播種病変から生じる扁平上皮癌腫、頚部の扁平上皮癌膵臓の固形偽性乳腺癌、棒状体又はそうでない腎臓細胞の癌、肝細胞癌、大細胞型神経内分泌癌、小細胞型の癌、小細胞型肺癌、小細胞型乳癌、乳癌、乳房の腺管癌、印環細胞小葉癌コロイド腺癌、基底細胞癌の細胞、甲状腺退形成癌、ワルダイアー環部位の癌、肝細胞性−胆管癌、神経膠腫、Ｃ６神経膠腫細胞、乏突起細胞腫及び星細胞腫、神経膠肉腫、粘液乳頭脳室上皮腫、膵臓癌細胞、ヒト前立腺癌細胞、結腸直腸癌、卵巣癌細胞、腎臓癌細胞、非メラノーマ皮膚癌、上皮小体ホルモンに関連したタンパク及び皮膚癌、ヒト咽頭乳頭腫細胞、口腔の腺房細胞癌、甲状腺のヒュルトレ細胞腫、卵巣癌、膀胱の細胞癌、結腸直腸癌、エンテロクロマフィン様の細胞、ヒト星細胞、腎臓のヒト明細胞癌、転移性の腎細胞癌、舌癌、頭部及び頸部アデノパシー、膵臓の大腺房細胞癌、門部胆管癌、乳頭甲状腺癌、デント（ｄｅｎｔ）、ヒト前立腺癌細胞、明細胞“糖”腫瘍（ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ“ｓｕｇａｒ”ｔｕｍｏｒｓ）、鎌状間膜／円索（血管周囲の類上皮明細胞群の１員）のミオメラノサイト性の腫瘍、及び尿管中の移行細胞癌を含む。
【００２９】
さらには、乾癬及び海線状皮膚炎のような角化性の皮膚は、ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣによって効果的に治療されることができる。同様に、ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣによって正しい上皮の向性が得られ、血管の損傷に関係して形成された糖尿病性の病変の内皮細胞が再び確立される。
【００３０】
ｄｉ−ＮＡＣがＷＨＨＬウサギにおいて動脈硬化を抑制することが示された。同様に、腎臓の上皮腫瘍が、最小の腎臓の細動脈硬化又はそれがない場合（８％）にくらべて中程度及び顕著な腎臓の細動脈硬化（４０％）の場合において、より頻繁に見い出された（Ｂｕｄｉｎ ＲＥ， ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ ＰＪ． Ａｒｃｈ Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ １９８４ Ｆｅｂ； １０８（２） ： １３８−４０）。この関係は６０才よりもより老年の及びより若い患者の両方において発見された。腎臓の上皮腫瘍の成長は腎臓の瘢痕と相関しており；それらは独立した年令に関連する現象ではない。
【００３１】
５０％の動脈硬化性の細胞の正常の経路への復帰は、サイトケラチンの発現と関係していると思われる。サイトケラチン（ＣＫ）の発現は、上皮の分化の状態の特徴であると考えられる。ＣＫはまた、一定の血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）中にも発生し、より未分化の発現型との関係が推論される。ＣＫの翻訳後修飾は、ストレスのかかった、有糸分裂中の、又はアポトーシスにある上皮細胞においておこることが示された。最近、ＣＫのリン酸化の様式がヒトＶＳＭＣにおいて研究された（Ｂａｒ Ｈ， Ｂｅａ Ｆ， Ｂｌｅｓｓｉｎｇ Ｅ， Ｗａｔｓｏｎ Ｌ， Ｗｅｎｄｅ Ｐ， Ｋｒｅｕｚｕｒ Ｊ， Ｋｕｂｌｅｒ Ｗ， Ｊａｈｎ Ｌ．， Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００１ Ｆｅｂ； ９６（１） ： ５０−８）。
【００３２】
正常の末梢動脈及び冠状動脈、動脈硬化病変並びに臍帯静脈の組織サンプルが、特異的なサイトケラチンのリン酸化部位であるサイトケラチン８及び１８に特異的な抗体、増殖マーカーとしてのＫｉ−６７−抗原及びアポトーシスを検出するためのニック末端ラベリング（ＴＵＮＥＬ）を加えて免疫蛍光顕微鏡を用いて調べられた。すべてのサンプルが、サイトケラチン陽性のＶＳＭＣを含んでいたが、リン酸化様式は多様ではなかった。サイトケラチン８のＣ末端のセリン４３１（ＣＫ８Ｓｅｒ−４３１）は、冠動脈病変のＣＫ−発現ＶＳＭＣの大多数においてリン酸化された。これらの細胞の小部分のみがＣＫ１８Ｓｅｒ−３３のリン酸化を示し、さらにＣＫ８Ｓｅｒ−７３については低度であった。
【００３３】
ＤＮＡ断片化は、圧倒的にリン酸化したＣＫ８Ｓｅｒ−４３１ドメインを含む細胞において起こった。対照的に、末梢の閉鎖した病変部はわずかなリン酸化を示したか又はリン酸化しなかった。臍帯血管中の新生児のＶＳＭＣは、豊富なリン酸化ＣＫドメインを含み、これもまた圧倒的にＣＫ８Ｓｅｒ−４３１ドメインであるが、ＣＫ１８Ｓｅｒ−３３ドメインもリン酸化されている。また再び、ごく少数の細胞のみが増殖し又はＤＮＡの断片化を含むことが観察された。したがって、動脈硬化病変部のＶＳＭＣ中の豊富なＣＫリン酸化は、細胞ストレスに対する特異的な機能的応答及びアポトーシスに対する関係の可能性を示唆するものである。
【００３４】
当然、すべての化学療法剤は、抗増殖性でなければならない。したがって、ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの復帰効果を得るためには、本発明にしたがって要求される用量は、増殖を抑制することのみのために要求される用量よりも高い。報告された他のすべての化学療法的物質、これらは広範な副作用による強い毒性を有するものである、とは対照的に、ＮＡＣは、処理される細胞タイプによって、対応する疾患の重篤度によって、そして上記疾患のステージによって、局所濃度０．１〜５０ｍＭで新形成細胞の処理に使用されることができる。
【００３５】
好ましい濃度である０．２５及び４０ｍＭの間のＮＡＣでは、毒性効果は得られない。例えば、パラセタモール中毒後の自殺を救うためには、ＮＡＣが１５分間の間に１０ｇの用量で、その後、続く３０分の間に半分の用量が静脈内に注射されたが、全く副作用の報告はなかった。
【００３６】
当然、増殖を完全にブロックするために要求される絶対的なＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの最大用量及び最小用量は、処理される細胞のタイプに依存する。例えば、正常のケラチノサイトの分化を促進するために要求される最小用量は０．５ｍＭであり、１ｍＭではケラチノサイトは完全に分化する。しかしながら、大腸癌細胞の復帰はＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの１ｍＭの濃度で誘導され、大腸癌は５ｍＭで完全に分化する。
【００３７】
さらに、正常のケラチノサイトと同様に大腸癌細胞において得られた分化の効果は直接的に、すなわちＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの一回のみの補充後に、表される。
【００３８】
有効な量のＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣ及び好適な担体を含む医薬組成物及び獣医学的組成物が調製されることができる。そのような担体は当業者に周知である。ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣは、直接的に又はヒト又は動物の被験者に対する組成物の形態で投与されることができる。
【００３９】
本発明による復帰物質は、例えば反応部位の近傍のエピトープに対して作成された抗体である、ターゲティング分子に対してカップリングすることにより特異的な作用部位に意図的に運ばれることができる。さらには、ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣは、特異的な上皮組織に対して作成された抗体に、復帰活性が上皮由来の新形成細胞を標的とし、そして同細胞と融合するような方法で結合することができる。
【００４０】
ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣは全身的と同様に局所的に補充され、治療される疾患のタイプ及びそのステージに依存して経口で、静脈内に、動脈内等に投与されることができる。例えば、表皮の腫瘍には局所投与で十分である。一方では、リウマチ様関節炎には、動脈内注射が必要とされる。投与の適切な経路は治療される疾患のタイプにも依存する。例えば、ＮＡＣは、乾癬性関節炎及びリウマチ様関節炎の全身的及び局所的な治療と同様に乾癬の局所的な治療のために有効に使用された。
【００４１】
ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣによる治療は、間隔をおいて数回くり返されることができ、その上、上記物質は持続的に補充可能である。腫瘍細胞がこの治療によって殺されないことから、上記疾患の明らかな復帰のための時間間隔は、治療される細胞タイプの特異的な寿命に依存する。例として約３０日の表皮細胞の寿命を有する表皮腫瘍では、腫瘍質量の明らかな減少がその後現れる。本発明によって乾癬が治療された場合、２，３日から３〜４週間の範囲の治療の後、症状が消失し、治療は、数ヵ月の後にくり返される必要があるかも知れない。
【００４２】
本願発明に係る使用においてＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣは、回復した細胞間接触を通して誘導された機能障害の細胞の成長の制御により、分化を開始する、すなわち腫瘍細胞の場合には腫瘍を復帰させる。これらの濃度においては、ＮＡＣ及びｄｉ−ＮＡＣはまた、低濃度で接触阻害を示し、これは、細胞の増殖中止をひき起こす。さらには、発明に係る使用において、ＮＡＣ及びｄｉ−ＮＡＣもまた抗酸化効果を示す。
【００４３】
実施例
本発明は以下の実施例を参照することにより、さらに描写され、例解されるであろう。しかしながら、これらの実施例は、いかなる方法によっても本発明を制限するものと解釈されるべきではない。
【００４４】
実施例１．ヒト大腸癌細胞に対するＮＡＣ及びｄｉ−ＮＡＣの効果
確立されたヒト大腸癌細胞の細胞株を使用した（ＣａＣｏ２）。ＣａＣｏ２は、微絨毛構造に乏しく、細胞間隙の広い多細胞層を形成する不規則な形態を示す増殖性のヒト大腸癌細胞株である。
約１４日間の長期培養の後、上記細胞は、分化した細胞の典型的な形態を進行性に獲得し、それは以下の：
ｉ）増加した基底面の極性、
ｉｉ）細胞の上皮表面における突出した絨毛構造の出現、（刷子縁）
ｉｉｉ）細胞の上部におけるアクチン細胞骨格線維の局在化及び細胞の基底部におけるサイトケラチン細胞骨格線維の局在化であって、これらは、隣接する細胞との新たに確立されたタイトジャンクションに結合されている、
ｉｖ）基底膜の近傍への核の再配置、
を伴う。
【００４５】
ＣａＣｏ２細胞を２〜１０ｍＭの範囲の多様なミリモル濃度のＮＡＣで処理した。ＮＡＣを上記細胞の接種の２４時間後に培養液に加えた。ＮＡＣ存在下で３日間培養後、上記細胞を以下のマーカーパラメーター：
−細胞骨格の構築：ストレスファイバーの出現とともにアクチン線維の組織崩壊が観察された。アクチン線維の細胞上部における再局在化、刷子縁微絨毛の維持、及びサイトケラチン線維の細胞基底部における再局在化。サイトケラチン線維もまた低密度に断片化されて出現した。
−表面の形態：細胞表面に相応する数の微絨毛構造が観察され、最終段階の分化した細胞の形態を有していた。
−細胞間接着：すべての種類の細胞接着構造の増加が観察された。細胞間隙もまた劇的に減少した。
−チューブリンの発現及び重合：チューブリンの発現は強力にＮＡＣ処理により減少させられた。紡錘体は有糸分裂中期にはしばしば細胞中に存在しなかった。
−増殖：２ｍＭ  ＮＡＣで最大効果を示し、細胞増殖は用量依存的に低下した。
−毒性：加えられたすべての用量で細胞生存度はＮＡＣ処理による影響を受けなかった。アポトーシスもネクローシスも観察されなかった。
について分析した。
【００４６】
同様に、ｄｉ−ＮＡＣによるＣａＣｏ２細胞の処理は細胞中に形態学的及び生化学的変化を誘導した。例として、細胞の厚さの増加、頂端−基底面の極性、Ｅ−カドヘリン発現の増加、刷子縁及びタイトジャンクションの形成を増殖の低下と同様に得た。いくつかの場合には、ｄｉ−ＮＡＣによる処理は、ＮＡＣによる処理よりもより有効であった。
【００４７】
要約すると、ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣで処理された場合、ＣａＣｏ２細胞は、検出可能な有毒な副作用を伴わずに分化の経路への復帰へ誘導される。それらの分化の結果として、ＣａＣｏ２細胞の増殖もまた低下した。
【００４８】
実施例２．ヒト表皮ケラチノサイトに対するＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの効果
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）より得た１次の正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）を供給者から提供された培養液中で培養した。これらの細胞は培養中で約１５日という限られた寿命を有し、最終的な脱核及び剥脱を伴う、表皮ケラチノサイトの正常な分化の過程を経る。接種後、上記細胞は細胞間接着において多角形の形態となる。細胞骨格の形態は主に細胞の縁で、ほとんど器質化している。
【００４９】
ＮＨＥＫ細胞は、１〜１０ｍＭの範囲の多様なミリモル濃度のＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣで処理した。上記物質を接種の２４時間後、培養液に加えた。２ｍＭのＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの存在下、３日培養した後上記細胞を以下のマーカーパラメーター：
−細胞骨格の構築：アクチン線維の組織破壊が観察され、それは細胞質中の全体に分散して現れ、いくつかのストレスファイバーが出現した。サイトケラチン線維が劇的に断片化した。細胞骨格の断片化は、電気泳動によってもモニターした。未処理の細胞では広いバンドが唯一見られた一方、処理後にはいくつかのバンドを得た。
−表面の形態：増殖性のケラチノサイトに典型的な微細な微絨毛構造が失なわれ、平滑な細胞表面が現れた。角化したエンベロープの最初のステージの出現に付随して顕著な数の脱核した細胞が観察された。
−細胞間ジャンクション：ジャンクションの数の増加が観察され、細胞間隙が劇的に減少した。Ｅ−カドヘリン濃度もまた増加した。
−チューブリンの発現及び重合：チューブリンの発現は上記処理により減少させられた。有糸分裂中期の細胞中では紡錘体の形成のパーセントのわずかな低下が観察された。
−分化：ケラチノサイトの増殖ステージのマーカーの消失をウエスタンブロッティングにより判定した。
−増殖：細胞増殖は用量依存的に減少し、２ｍＭ  ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣで完全に細胞増殖が抑制された。
−毒性：細胞生存度はＮＡＣ処理のすべての用量、すなわち１０ｍＭまで、で影響を受けなかった。アポトーシスもネクローシスも観察されなかった。
について分析した。
単離されたケラチノサイトは、白血球の完全な非存在下でＮＡＣ処理されたことを指摘するべきである。
要約すると、ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣによるＮＨＥＫ細胞の処理は、復帰及び、毒性のある副作用を伴わずに３〜４倍速い分化を誘導した。誘導された分化はまた、ＮＨＥＫ増殖が消滅するという結果となった。
【００５０】
実施例３．乾癬に対するＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの効果
乾癬は、良性の細胞の過増殖、サイトカイン産生、免疫細胞の蓄積、異常な角質化、及び血管新生の増加が顕著な慢性の皮膚障害である。
局在化した乾癬のプラークを示す、説明を受けた５人のボランティアを１０〜２０重量％のＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣを含むベースクリームで局所的に治療した。上記クリームを多様な期間−数週間から２〜３ヵ月−にわたって閉塞性の絆創膏と共に又はそうでなく毎晩適用した。上記患者の皮膚を各日周の治療の間に普通に洗浄した。同時に使用した他の薬はなかった。
既に１〜２回の治療の後、皮膚の平滑化と同様に、規模の減少という迅速な改善が見られた。治療の延長は、すべての症状の完全な寛解に帰着した。完全な寛解に必要とされる治療の長さは、個人の応答及び疾患の重さにより異なる。最も共通して報告された副作用は、閉塞性の絆創膏を取り除いた時に消失した、局所的な引きつれに関する。１のケースにおいては、腫脹もまた報告された。
上記治療の中止後、１の患者のみが４ヵ月後に新しい小さな乾癬のプラークを示し、それは２，３日のさらなる治療の後、消失した。
したがって、乾癬性のケラチノサイトの分化の欠如と同様に異常な増殖も消滅した。
実施例４．大腸腫瘍に対するＮＡＣの効果
腸の腫瘍であって１，２−ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）でオスＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔｓ）を処理することにより誘導されたものに対する日周のＮＡＣ治療又は断続的なＮＡＣ治療の効果を研究した。
上記大腸腫瘍の負担はＮＡＣで断続的に治療されたラットにおいて、対応するコントロール群よりも有意に低かった（それぞれ１１及び１腫瘍／治療群、ｐ＝０．００１）。大腸腫瘍重量の指標は同様にＮＡＣで治療された群においてコントロール群よりも有意に低かった（それぞれ１．９３及び０．０４、ｐ＜０．００１）。日周でＮＡＣで治療されたラットでは、大腸に腺癌が存在しなかった。
ＮＡＣが、オスＳＤラットにおけるＤＭＨ−誘導された大腸腫瘍を縮小させ、ラット大腸中の腫瘍の顕著な抑制により見られるように保護的効果を有する、と結論する。
実施例５．大腸腺癌に対するＮＡＣの効果
この実験的モデルにおいてＢＤ−ＩＸラットを以下の４の群：“癌の群”と命名されたＧ１及びＧ２群は、大腸がんの進行に対するＮＡＣの効果を研究するために用いた、そして“毒性群”と命名されたＧ３及びＧ４群は代謝過程及び実質組織に対する効果を研究するために用いた、に分割した。ＤＨＤ／Ｋ１２−ＰＲＯｂ細胞をＧ１及びＧ２群の動物の胸部に皮下注射した。接種後１〜１３週でＧ２及びＧ４群の動物がＮＡＣの一週一度の注射を受けた。Ｇ１及びＧ３群の動物は治療を受けなかった。
加えて、動物及びヒトの大腸腺癌細胞株（ＤＨＤ／Ｋ１２−ＰＲＯｂ及びＨＴ−２９）をＮＡＣの細胞毒性を調べるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイを実施するのに使用した。
ラットにおけるこの実験的研究中の大腸腺癌のＮＡＣによる長期治療が寿命を延長する結果となったことがわかった。さらには、ＮＡＣで治療されたラットは、オスラットと同様メスにおいても腫瘍の成長が顕著に遅くなった。
【００５１】
実施例６．大腸癌に対するＮＡＣの効果、化学防御のメカニズム
大腸癌に対するＮＡＣの有効性が顕著であるため、アゾキシメタン（ＡＯＭ）−誘導されたラット大腸癌モデルにおいて、８−イソプロスタンレベルと同様に、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、チロシンプロテインキナーゼ（ＴＰＫ）、及びジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）活性を大腸粘膜及び腫瘍組織中において調査することにより、上記大腸発癌抑制メカニズムを探索した。
７週齢において、ラットの対応する群にアゾキシメタン（ＡＯＭ；１５ｍｇ／ｋｇ体重、週ごとに１回で２週間）を皮下に注射し、別々の実験を２回目のＡＯＭ治療の３８週後まで断続した。その後、ラットを犠牲にし、腫瘍サンプルと同じく大腸粘膜サンプルをＰＫＣ、ＴＰＫ、ＤＧＫ及び８−イソプロスタンレベルについて評価した。
ＮＡＣ投与は大腸粘膜及び腫瘍中のＣａ２＋依存性及び非依存性のＰＫＣ活性を有意に阻害した（ｐ＜０．０１）。ＮＡＣ投与はまた、大腸粘膜及び腫瘍両方のＴＰＫ活性を有意に抑制した（ｐ＜０．０１）。対照的に、ＮＡＣを受容したラットは有意なＤＧＫ活性の増加を示した（ｐ＜０．０１）。加えて、ＮＡＣで治療されたラットは、コントロールよりも大腸腫瘍中において８−イソプロスタンレベルが低下した。
これらの知見は、大腸癌の化学防御におけるＮＡＣのメカニズムは、ＰＫＣ及びＴＰＫ活性の下方制御及びＤＧＫ活性の上方制御の誘導によるプロテインキナーゼＣ、チロシンプロテインキナーゼ及びジアシルグリセロールキナーゼ活性の調節を含むことを示唆する。したがって、これらの事象は部分的に大腸発癌に対する化学防御活性の原因であることができる。さらには、これらの結果は、ＮＡＣが大腸中のＰＫＣ、ＴＰＫ及びＤＧＫ活性の制御を増強するであろうということを含む。
実施例７．口腔のケラチノサイトの腫瘍及びそれらの転移性の播種
４ＮＱＯ−誘導されたラットの悪性口腔ケラチノサイトのクローン母集団の転移能に対するＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣの効果を胸腺欠損マウスへの同所移植後に調査した。すべての動物の接種部位（口底）において、多角形の細胞及び紡錘細胞がそれぞれよく分化した扁平上皮細胞癌腫（ケラチン陽性及びビメンチン陰性）及び未分化の紡錘細胞腫瘍（ケラチン陰性及びビメンチン陽性）を形成した。
高細胞密度での各細胞タイプの５×１０６ 細胞数の移植は、上記動物の約５０％が肺への転移を形成する結果となった。
未分化の紡錘細胞株は、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ−β１）を発現し及び、続く同所性の移植及び本発明による治療では、ほとんどすべての移植された動物において１次的な腫瘍が形成されたにもかかわらず、より少ない動物が肺への転移を形成した。
上記の結果は、ＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣにより誘導されたＴＧＦ−β１がこの細胞タイプにおいて腫瘍抑制剤として作用することができることを示唆する。多角形の細胞のクローンは外因性のＮＡＣによって顕著に阻害され、紡錘体細胞も同様に阻害された。上記結果はまた、分化したラットの悪性口腔ケラチノサイトはＮＡＣ又はｄｉ−ＮＡＣで処理した場合、攻撃性がより低く、そしてそれらは未処理の対応物よりも転移能力が減少していた。同様の知見が未分化の紡錘体細胞の対応物においても見られた。ＴＧＦ−β及びそのレセプターのプロフィールは、部分的にＮＡＣ又はその２量体が悪性の口腔のケラチノサイト腫瘍を減少させ、そしてそれらの転移性の播種を減少させるという知見を説明することに貢献することができる。
実施例８．組織ターゲティング
インフルエンザビロゾーム（再構築されたインフルエンザウイルスエンベロープ）は、融合能を保存しつつ卵巣癌腫細胞（ＯＶＣＡＲ−３）を標的とすることができる。これは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）−誘導体化された脂質をビロゾーム膜にとり込むことにより達成される（Ｍａｓｔｒｏ−ｂａｔｔｉｓｔａ Ｅ， Ｓｃｈｏｅｎ Ｐ， Ｗｉｌｓｃｈｕｔ Ｊ， Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ ＤＪ， Ｓｔｏｒｍ Ｇ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００１ Ｎｏｖ ３０； ５０９（１） ： ７１〜７６）。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）３２３／Ａ３（抗−表在性糖タンパク抗体−２）Ｆａｂ′−フラグメントをＰＥＧ脂質の遠位の末端と結合させる。このＰＥＧ層は、ウイルスの赤血球凝集素と遍在性のシアル酸残基との相互作用を防ぐ遮蔽物として、及び抗体結合のための空間的な固定具として役立つ。結果として、ビロゾームとＯＶＣＡＲ−３細胞の特異的な結合が得られた。抗体に再指令されたビロゾームがＯＶＣＡＲ−３細胞の膜とｐＨ−依存的な方法で融合する。
そのような手順（Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ Ｅ， Ｓｃｈｏｅｎ Ｐ， Ｗｉｌｓｃｈｕｔ Ｊ， Ｃｒｏｍｍｅｌｉｎ ＤＪ， Ｓｔｏｒｍ Ｇ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００１ Ｎｏｖ ３０； ５０９（１） ： ７１〜７６）により、ＮＡＣ及びｄｉ−ＮＡＣがｍＡｂ３２３／Ａ３のＦａｂ′フラグメントに結合させられることができ、ビロゾームに結合することができる。
これらの実験はＮＡＣ及びｄｉ−ＮＡＣを組織ターゲティングに関連して使用することができることを示す。
実施例９．ＮＡＣ処理によるＰＰＡＲ合成の阻害
ペルオキシソーム増殖剤により活性化されるレセプター（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ （ＰＰＡＲｓ））は、核レセプターファミリーに属するリガンドにより活性化される転写因子である（Ｃｈｉｎｅｔｔｉ Ｇ．， Ｆｒｕｃｈａｒｔ Ｊ．−Ｃ．， Ｓｔａｅｌｓ Ｂ．， Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｖｏｌｕｍｅ ４９ Ｉｓｓｕｅ １０ （２０００）， ｐｐ ４９７〜５０５ ）。これらのレセプターは脂質及びリポタンパク代謝並びにグルコースホメオスタシスの制御因子として機能し、そして細胞の増殖、分化及びアポトーシスに影響を及ぼす。ＰＰＡＲ−αは、肝臓、筋肉、腎臓及び心臓のような組織中で高発現し、そこで脂肪酸のβ−酸化的分解を刺激する。ＰＰＡＲ−δは腸及び脂肪組織中で優勢に発現する。ＰＰＡＲ−γは脂肪細胞の分化のひき金となり、脂肪貯蔵を促進する。脂質低下性のフィブレート及び抗糖尿病性のグリタゾンは、それぞれＰＰＡＲ−α及びＰＰＡＲ−γのための合成リガンドである。さらには、脂肪酸及びエイコサノイドは天然のＰＰＡＲリガンドである：プロスタグランジンＪ２がＰＰＡＲ−γリガンドである一方、ＰＰＡＲ−αはロイコトリエンＢ４により活性化される。
【００５２】
さらには、ＰＰＡＲ−α欠乏性のマウスは免疫的刺激に対して延長した応答を示した。ＰＰＡＲ活性化剤は、ＮＦ−κ、ＳＴＡＴ及びＡＰ−１情報伝達経路に負の干渉をすることにより、免疫応答遺伝子（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α及びメタロプロテアーゼのような）の活性化を阻害することが示されている。ＰＰＡＲ活性化剤は、ＰＰＡＲの発現している、単球／マクロファージ、内皮細胞、表皮細胞及び平滑筋細胞のような異なる免疫細胞及び血管壁の細胞のタイプにおいてこれらの抗免疫的活性を発揮する。
したがって、ＮＡＣの有効濃度（上を参照のこと）は、ＰＰＡＲを阻害することにより、代謝だけでなく炎症のコントロールも示す。
潜在的な治療的適用は、アテローム性動脈硬化及び炎症性の腸疾患のような炎症に関連した疾患である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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