(57)【要約】３要素を包含する抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドが開示される。第一の要素は、哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）の４〜１６残基より本質的になるＮ末端要素および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変である。第二の要素は上述されたＮ末端要素を下述されるＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに共有結合する化学構造である。該化学構造は、直鎖状の様式で配置される場合に同様に直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸の長さまで伸長するフレキシブルな鎖を形成する共有結合された原子群であり、該化学構造は：ｉ）免疫学的に中性の化学構造、ｉｉ）ＭＨＣクラスＩエピトープ若しくはその一部分、および／またはｉｉｉ）抗体に認識される決定子若しくはその一部分より成る群から選択される。最後に、高める抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態の抗原性エピトープを含んでなるＣ末端要素を包含する。ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有する目的のタンパク質若しくは目的のポリペプチドをコードする第一の発現可能な配列を含んでなる核酸分子もまた開示される。加えて、該核酸分子は抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドをコードする第二の発現可能な核酸配列を含んでなる。抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドは以下の要素、すなわちｉ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）の４〜１６残基から本質的になるＮ末端要素および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変；ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素（該ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープは段階ａ）の目的のタンパク質中に含有される）；ならびにｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端要素を結合する介在ペプチジル構造（該ペプチジル構造は約２０アミノ酸若しくはそれ未満の長さを有する）を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の要素：
ａ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
ｂ）直鎖状の様式で配置された場合に同じように直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸の長さまで伸長されるフレキシブルな鎖を形成する共有結合された原子群であり、
ｉ）ＭＨＣクラスＩエピトープ若しくはその一部分；および／または
ｉｉ）抗体に認識される決定子若しくはその一部分
よりなる群から選択される、要素ｃ）のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに段階ａ）のＮ末端要素を共有結合する化学構造；ならびに
ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態の抗原性エピトープを含んでなるＣ末端要素
を含んでなる、抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項２】
要素ａ）の改変が：
ａ）Ｃ末端からのアミノ酸の欠失；
ｂ）Ｎ末端の保護；
ｃ）Ｎ末端伸長；および
ｄ）アミノ酸置換
よりなる群から選択される、請求項１に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸置換が１アミノ酸残基のペプチド模倣構造の置換を包含する、請求項２に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項４】
要素ａ）に対するアミノ酸置換が、野性型の哺乳動物Ｉｉ−Ｋｅｙ配列（配列番号１）中に見出される１アミノ酸からアミノ酸残基アスパラギン酸若しくはグルタミン酸への置換を除外する、請求項２に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項５】
要素ａ）中のアミノ酸置換が、野性型アミノ酸残基の代わりにＤ−異性体アミノ酸の導入することを包含する、請求項２に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項６】
要素ａ）中のアミノ酸置換が、野性型アミノ酸残基の代わりにＮ−メチルアミノ酸の導入することを包含する、請求項２に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項７】
要素ａ）中のアミノ酸置換が、Ｌ−異性体アミノ酸若しくは修飾Ｌ−異性体アミノ酸の導入を包含する、請求項２に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項８】
要素ａ）中の修飾Ｌ−異性体アミノ酸が：Ｎ−メチルロイシン；Ｌ−シトルリン；Ｌ−ホモアルギニン；Ｌ−オルニチン；Ｌ−ヒドロキシプロリン、ｐ−クロロフェニルアラニン；ｐ−フルオロフェニルアラニン；ｐ−ニトロフェニルアラニン；α−アミノ−４−フェニル酪酸；β−チエニルアラニン；ｄ−ブロモチロシン；ジヨードチロシン；β−１−ナフチルアラニン；β−２−ナフチルアラニン；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸；および１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−７−ヒドロキシ−３−カルボン酸よりなる群から選択される、請求項７に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項９】
要素ｂ）の介在化学構造が、ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分を含んでなる、請求項１に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項１０】
Ｃ末端要素が：
ｉ）ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分、および／または
ｉｉ）抗体に認識される決定子若しくはその一部分
よりなる群から選択されるペプチジル要素をさらに含んでなる、請求項１に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項１１】
Ｃ末端要素が、ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分（該ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその部分を構成するアミノ酸残基はＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である）をさらに含んでなる、請求項１に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項１２】
Ｃ末端要素が、抗体に認識される決定子若しくはその一部分（該抗体に認識される決定子若しくはその一部分を構成するアミノ酸残基はＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である）をさらに含んでなる、請求項１に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項１３】
１種若しくはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ、１種若しくはそれ以上のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ、および１種若しくはそれ以上の抗体に認識される決定子を含有する、請求項１に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項１４】
以下の要素：
ａ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
ｂ）直鎖状の様式で配置された場合に同じように直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸の長さまで伸長されるフレキシブルな鎖を形成する共有結合された原子群であり、
ｉ）免疫学的に中性の化学構造；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩエピトープ若しくはその一部分；および／または
ｉｉｉ）抗体に認識される決定子若しくはその一部分
よりなる群から選択される、要素ｃ）のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに段階ａ）のＮ末端要素を共有結合する化学構造；ならびに
ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態の抗原性エピトープ
を含んでなる、抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項１５】
Ｃ末端要素が：
ｉ）ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分、および／または
ｉｉ）抗体に認識される決定子若しくはその一部分
よりなる群から選択されるペプチジル要素をさらに含んでなる、請求項１４に記載の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項１６】
要素ａ）の改変が：
ａ）Ｃ末端からのアミノ酸の欠失；
ｂ）Ｎ末端伸長；および
ｃ）アミノ酸置換
よりなる群から選択される、請求項１４に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
要素ａ）に対するアミノ酸置換が、野性型の哺乳動物Ｉｉ−Ｋｅｙ配列（配列番号１）中に見出される１アミノ酸からのアミノ酸残基アスパラギン酸若しくはグルタミン酸への置換を除外する、請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
Ｃ末端要素が、ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分（該ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその部分を構成するアミノ酸残基はＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である）をさらに含んでなる、請求項１４に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
Ｃ末端要素が、抗体に認識される決定子若しくはその一部分（該抗体に認識される決定子若しくはその一部分を構成するアミノ酸残基はＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である）をさらに含んでなる、請求項１４に記載の単離された核酸。
【請求項２０】
ａ）ｉ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素；ならびに
ｉｉｉ）直鎖状の様式で配置された場合に同じように直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸の長さまで伸長されるフレキシブルな鎖を形成する共有結合された原子群であり、
１）免疫学的に中性の化学構造；
２）ＭＨＣクラスＩエピトープ若しくはその一部分；および／または
３）抗体に認識される決定子若しくはその一部分
よりなる群から選択される、ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端要素を共有結合する介在化学構造
を含んでなる抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドを提供すること；ならびに
ｂ）段階ａ）の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドを生理学的条件下で以下の成分：
ｉ）段階ａ）ｉｉ）の抗原性エピトープをＴリンパ球に提示することが可能であるＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞；および
ｉｉ）段階ｂ）ｉ）の抗原提示細胞により発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される場合に要素ａ）ｉｉ）のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに対し応答性であるＴリンパ球
と接触させてそれによりＴリンパ球へのＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性ペプチドの提示を高めること
を含んでなる、Ｔリンパ球へのＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性ペプチドの提示を高める方法。
【請求項２１】
段階ｂ）の細胞がドナー個体により提供され、かつ、段階ｂ）の操作の後に該細胞がｅｘ  ｖｉｖｏ治療プロトコルでドナー個体に再注入される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ末端要素が、ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分をさらに含んでなり、かつ、段階ｂ）のインキュベーション混合物が、ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープに対し応答性のＴリンパ球をさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその部分を含んでなるアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｃ末端要素が、抗体に認識される決定子若しくはその一部分をさらに含んでなり、かつ、段階ｂ）のインキュベーション混合物が、抗体に認識される決定子を認識する免疫グロブリン受容体を発現するＢリンパ球をさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
抗体に認識される決定子若しくはその一部分を含んでなるアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
段階ｃ）のＴリンパ球が、Ｔリンパ球の調節セットに帰されるサイトカイン放出パターンを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
Ｔリンパ球の調節セットがＴＨ１セットである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
Ｔリンパ球の調節セットがＴＨ２セットである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）ｉ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素；ならびに
ｉｉｉ）直鎖状の様式で配置された場合に同じように直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸の長さまで伸長されるフレキシブルな鎖を形成する共有結合された原子群であり、
１）免疫学的に中性の化学構造；
２）ＭＨＣクラスＩエピトープ若しくはその一部分；および／または
３）抗体に認識される決定子若しくはその一部分
よりなる群から選択される、ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端要素を共有結合する介在化学構造
を含んでなる抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドを提供すること；ならびに
ｂ）段階ａ）の抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドを、免疫応答を刺激するのに有効な量で患者に投与すること
を含んでなる、哺乳動物を免疫してそれによる病理学的状態と関連する１種若しくはそれ以上のエピトープ／決定子に対する免疫学的感受性の増大方法。
【請求項３０】
抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドのＣ末端要素がＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分をさらに含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその部分を構成するアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドのＣ末端要素が、抗体に認識される決定子若しくはその一部分をさらに含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
抗体に認識される決定子若しくはその一部分を構成するアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）ｉ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素；ならびに
ｉｉｉ）２０アミノ酸までの長さを有する、ハイブリッドのＮ末端とＣ末端要素を結合する介在ペプチジルセグメント（該介在化学構造は
１）免疫学的に中性の化学構造；
２）ＭＨＣクラスＩエピトープ若しくはその一部分；および／または
３）抗体に認識される決定子若しくはその一部分
よりなる群から選択される
を含んでなる、抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドをコードする発現可能な核酸配列を提供すること；ならびに
ｂ）段階ａ）の発現可能な核酸配列を、免疫応答を刺激するのに有効な量で患者に投与すること
を含んでなる、哺乳動物を免疫して、それにより病理学的状態と関連する１種若しくはそれ以上のエピトープ／決定子に対する免疫学的感受性を増大させる方法。
【請求項３５】
抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドのＣ末端要素がＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分をさらに含んでなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその部分を構成するアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドのＣ末端要素が、抗体に認識される決定子若しくはその一部分をさらに含んでなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
抗体に認識される決定子若しくはその一部分を構成するアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
以下の要素：
ａ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
ｂ）直鎖状の様式で配置された場合に同じように直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸の長さまで伸長されるフレキシブルな鎖を形成する共有結合された原子群であり、
ｉ）免疫学的に中性の化学構造；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩエピトープ若しくはその一部分；および／または
ｉｉｉ）抗体に認識される決定子若しくはその一部分
よりなる群から選択される、要素ｃ）のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに段階ａ）のＮ末端要素を共有結合する化学構造；ならびに
ｃ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態の抗原性エピトープを含んでなり、
ｉ）ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分、および／または
ｉｉ）抗体に認識される決定子若しくはその一部分
よりなる群から選択されるペプチジル要素をさらに含んでなるＣ末端要素
を含んでなる、抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド。
【請求項４０】
ａ）ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素；
ｂ）Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフを含んでなるＮ末端要素；および
ｃ）約４ないし約１１アミノ酸残基からの配列を含んでなる介在要素
を含んでなり；
組換えＤＮＡ技術による改変が要素ｂ）およびｃ）内で生じている、組換えＤＮＡ技術により改変された天然に存在しないタンパク質若しくはポリペプチド。
【請求項４１】
Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフが、ＬＩＶＦＭ（配列番号７９０）よりなる群から選択される最低２アミノ酸、およびＨＫＲよりなる群から選択される最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸残基のセグメントを含んでなる、請求項４０に記載のタンパク質若しくはポリペプチド。
【請求項４２】
ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープが治療上重要なタンパク質中の分子的特徴である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ａ）ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素；
ｂ）ＬＩＶＦＭ（配列番号７９０）よりなる群から選択される最低２アミノ酸およびＨＫＲよりなる群から選択される最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸残基のセグメントを含んでなるＩｉ−Ｋｅｙモチーフを含んでなるＮ末端要素；ならびに
ｃ）約４ないし約１１アミノ酸残基からの配列を含んでなる介在要素
を含んでなる、天然に存在しないタンパク質若しくはポリペプチドをコードする発現可能な核酸配列。
【請求項４４】
ａ）目的のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端残基から４〜１１アミノ酸上流に位置するＩｉ−Ｋｅｙモチーフをコードする、目的のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープをコードする核酸配列を提供すること；ならびに
ｂ）ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニンおよびメチオニンよりなる群から選択される最低２アミノ酸、ならびにヒスチジン、リシンおよびアルギニンよりなる群から選択される最低１アミノ酸を含んでなる５個の連続するアミノ酸のセグメントを含んでなる原型のＩｉ−Ｋｅｙ調節モチーフとのＩｉ−Ｋｅｙモチーフの一致性を低下させるようにＩｉ−Ｋｅｙモチーフを改変すること
を含んでなる、目的のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに向けられる免疫応答の抑制方法。
【請求項４５】
ａ）目的のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端残基から４〜１１アミノ酸上流に位置するＩｉ−Ｋｅｙモチーフを欠く、目的のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープをコードする核酸配列を提供すること；および
ｂ）ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープから適切に間隔を空けてＩｉ−Ｋｅｙモチーフを導入するように核酸配列を改変すること
を含んでなる、目的のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに向けられる免疫応答を高める方法。
【請求項４６】
ａ）ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有する目的のタンパク質若しくは目的のポリペプチドをコードする第一の発現可能な配列；ならびに
ｂ）ｉ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
ｉｉ）段階ａ）の目的のタンパク質中に含有される、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素；ならびに
ｉｉｉ）約２０アミノ酸若しくはそれ未満の長さを有する、ハイブリッドのＮ末端とＣ末端要素を結合する介在ペプチジル構造
を含んでなる、抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドをコードする第二の発現可能な核酸配列
を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項４７】
要素ａ）の改変が：
ａ）Ｃ末端からのアミノ酸の欠失；
ｂ）Ｎ末端伸長；および
ｃ）アミノ酸置換
よりなる群から選択される、請求項４６に記載の単離された核酸。
【請求項４８】
要素ａ）に対するアミノ酸置換が、野性型の哺乳動物Ｉｉ−Ｋｅｙ配列（配列番号１）中に見出される１アミノ酸からのアミノ酸残基アスパラギン酸若しくはグルタミン酸へ置換を除外する、請求項４６に記載の単離された核酸。
【請求項４９】
Ｃ末端要素がＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分をさらに含んでなり、該ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその部分を構成するアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である、請求項４６に記載の単離された核酸。
【請求項５０】
Ｃ末端要素が抗体に認識される決定子若しくはその一部分をさらに含んでなり、該抗体に認識される決定子若しくはその一部分を構成するアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である、請求項４６に記載の単離された核酸。
【請求項５１】
目的のタンパク質若しくはポリペプチドが感染性病原体によりコードされるタンパク質若しくはポリペプチドに対応する、請求項４６に記載の単離された核酸配列。
【請求項５２】
感染性病原体が、炭疽菌、エボラ、ＨＩＶおよびインフルエンザよりなる群から選択される、請求項５１に記載の単離された核酸配列。
【請求項５３】
感染性病原体がワクシニアウイルスである、請求項４６に記載の単離された核酸配列。
【請求項５４】
目的のタンパク質がｇｐ４２である、請求項４６に記載の単離された核酸配列。
【請求項５５】
ａ）ｉ）感染性病原体によりコードされるタンパク質に対応する目的のタンパク質をコードする第一の発現可能な配列；
ｉｉ）１）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
２）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素（該ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープは段階ａ）の目的のタンパク質に含有される）；ならびに
３）約２０アミノ酸若しくはそれ未満の長さを有する、ハイブリッドのＮ末端およびＣ末端要素を結合する介在ペプチジル構造
を含んでなる抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドをコードする第二の発現可能な核酸配列
を含んでなる核酸分子を提供すること；ならびに
ｂ）段階ａ）の核酸分子を、免疫応答を刺激するのに十分な量で患者に投与すること
を含んでなる、哺乳動物を免疫してそれにより予め決められたエピトープ若しくは決定子に対する免疫学的感受性を変える方法。
【請求項５６】
ａ）感染性病原体によりコードされるタンパク質に対応する目的のタンパク質をコードする第一の発現可能な配列を含んでなる第一の核酸配列を提供すること；
ｂ）ｉ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素（該ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープは段階ａ）の目的のタンパク質に含有される）；ならびに
ｉｉｉ）約２０アミノ酸若しくはそれ未満の長さを有する、ハイブリッドのＮ末端とＣ末端要素を結合する介在ペプチジル構造
を含んでなる抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドをコードする第二の発現可能な配列を含んでなる第二の核酸配列を提供すること；ならびに
ｃ）段階ｂ）の核酸配列を、免疫応答を刺激するのに十分な量で患者に投与すること；ならびに
ｄ）段階ｃ）の投与に応答してのＴ細胞拡張後に、段階ａ）の第一の核酸配列を、免疫応答を刺激するのに十分な量で患者に投与すること
を含んでなる、哺乳動物を免疫してそれにより予め決められたエピトープ若しくは決定子に対する免疫学的感受性を変える方法。
【請求項５７】
ａ）目的のワクチン病原体のゲノムを準備すること；
ｂ）ｉ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；
ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素（該ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープは段階ａ）のゲノムによりコードされる）；ならびに
ｉｉｉ）約２０アミノ酸若しくはそれ未満の長さを有する、ハイブリッドのＮ末端とＣ末端要素を結合する介在ペプチジル構造
を含んでなる、抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドをコードする発現可能な核酸配列を段階ａ）のゲノムに組込むこと；
ｃ）段階ｂ）の核酸配列を、免疫応答を刺激するのに十分な量で患者に投与すること；ならびに
ｄ）段階ｃ）の投与に応答してのＴ細胞拡張後に、段階ａ）の第一の核酸配列を、免疫応答を刺激するのに十分な量で患者に投与すること
を含んでなる、哺乳動物を免疫してそれにより予め決められたエピトープ若しくは決定子に対する免疫学的感受性を変える方法。
【請求項５８】
ａ）ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞を提供すること；ならびに
ｂ）ｉ）目的のウイルス特異的抗原性エピトープをコードする発現可能な核酸配列；および
ｉｉ）ｍＲＮＡ分子とハイブリダイズしてそれにより該ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害する能力を有する、ヒトＩｉタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子に対し相補的であるＲＮＡ分子をコードする発現可能なリバース遺伝子構築物
を含んでなる組換えウイルスを段階ａ）の細胞に導入すること
を含んでなる、Ｉｉタンパク質発現が抑制されているＭＨＣクラスＩＩ分子陽性細胞の表面上での目的のウイルス特異的な抗原性エピトープの表示方法。
【請求項５９】
組換えウイルスがワクシニアウイルスである、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
免疫系は、「外来」若しくは「異常な」構造の抗原としての認識により外来病原体、腫瘍細胞、自己免疫疾患誘発過程、アレルゲン、移植片に応答する。それらの抗原の大部分は、宿主の細胞若しくは病原体のいずれかにより合成されるタンパク質である。こうした抗原はペプチドフラグメントにプロセシング（タンパク質分解性に消化）され、抗原提示細胞の表面上のペプチド提示構造中で免疫系の応答するリンパ球に提示されるようになる。それらのペプチド提示構造は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれる。それらは、それらがマウスの近交系の間での移植片拒絶を制御するＭＨＣ遺伝子座の多形の対立遺伝子の産物として最初に認識されたためその名称を得た。
【０００２】
特定の１抗原に対する免疫応答は、ＭＨＣ分子中のそれらの抗原のペプチドフラグメントを認識するＴリンパ球により媒介される。抗原提示細胞（ＡＰＣ）内で、タンパク質分解性にプロセシングされた抗原のペプチドフラグメントは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子の抗原性ペプチド結合部位に結合されるようになる。その後、これらのペプチド−ＭＨＣ複合体は、応答するＴリンパ球上のＴ細胞受容体により（該外来ペプチドおよび提示するＭＨＣ分子の隣接表面の双方の）認識のため細胞表面に輸送される。それらのＴリンパ球は（免疫応答を支援若しくは抑制するための）免疫調節機能または（例えば細胞傷害性免疫応答により病原体若しくは腫瘍を取り除くための）エフェクター機能のいずれかを有し得る。抗原特異的認識事象は、保護的免疫応答若しくは自己免疫過程の場合は有害な免疫応答に至る免疫応答カスケードを開始する。
【０００３】
２種類のＭＨＣ分子がＴ細胞への抗原性ペプチドの免疫系の提示体（ｐｒｅｓｅｎｔｅｒ）として機能する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩ分子の合成の時期ごろに、感染ウイルスのような小胞体で内因的に合成されたタンパク質からのペプチドを受領する。ＭＨＣクラスＩに結合された抗原性ペプチドは細胞表面でＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球に提示され、それはその後活性化され、ウイルスを発現している細胞を直接殺し得る。対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子は小胞体で合成され、それらの抗原性ペプチド結合部位はインバリアント鎖タンパク質（Ｉｉ）により阻害される。ＭＨＣクラスＩＩ分子およびＩｉタンパク質のこれらの複合体は、小胞体からゴルジ後（ｐｏｓｔ−Ｇｏｌｇｉ）区画に輸送され、そこでタンパク質分解によりＩｉが遊離され、かつ、特異的抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されるようになる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；および非特許文献７）。
【０００４】
特許文献１および特許文献２は、Ｉｉタンパク質が切断されて、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位内の抗原性ペプチドの結合および固定化を調節するフラグメントを切断の間に遊離する機構を示した（非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０）。Ｉｉタンパク質の１セグメント、Ｉｉ（７７−９２）が、抗原性ペプチドのＮ末端を保持する抗原性ペプチド結合部位の端部近くのその部位の外側のアロステリック部位で作用することが見出された。引用される特許はさらに、３種類の機構により免疫応答のこの初期の調節性の抗原性ペプチド認識事象を制御するための新規治療的化合物および方法を開示した。第一の機構において、抗原性ペプチドが該発明の化合物の作用により細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子から落とされる。
【０００５】
第二のものにおいて、それらの分子上の抗原性ペプチド結合部位の装填（ｃｈａｒｇｉｎｇ）が、他の合成ペプチドの結合のための該発明の化合物で促進される。こうした挿入されたペプチド配列は抗原性エピトープ、若しくは非抗原性であるにもかかわらず抗原性ペプチド結合部位を強固に結合して封鎖する非抗原性ペプチド配列のいずれかであり得る。第三の機構は、それらの複合体からの抗原性ペプチドの会合／解離の速度、ならびに三分子のＭＨＣ分子／抗原性ペプチド／Ｔ細胞受容体複合体の成分の相互作用の性質、ならびにさらに応答するＴリンパ球の分化および機能を調節する様式での補助的な細胞と細胞の相互作用分子とのその三分子複合体の相互作用を変えることを必要とする。
【０００６】
上に言及される機構の同定は治療的介入の新たな途を開く。これらの発見に基づく新たな方法および組成物はエピトープ特異的な治療の見込みを提供する。
【特許文献１】Ｒ．Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ（１９９６）米国特許第５，５５９，０２８号明細書
【特許文献２】Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら（１９９９）米国特許第５，９１９，６３９号明細書
【非特許文献１】Ｂｌｕｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３９７５（１９８８）
【非特許文献２】Ｒｉｂｅｒｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：４７４（１９９２）
【非特許文献３】Ｄａｉｂａｔａら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：２５５（１９９４）
【非特許文献４】Ｘｕら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：７２３（１９９４）
【非特許文献５】Ｘｕら、Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク  ｐ２７７（１９９４）
【非特許文献６】Ｋｒｏｐｓｈｏｆｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１３５７（１９９５）
【非特許文献７】Ｕｒｂａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：７５１（１９９４）
【非特許文献８】Ａｄａｍｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１６９３（１９９５）
【非特許文献９】Ａｄａｍｓら、Ａｒｚｎｅｉｍ．Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：１０６９（１９９７）
【非特許文献１０】Ｘｕら、Ａｒｚｎｅｉｍ．Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  印刷中（１９９９）
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
本発明は、一局面において、３要素を包含する抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドに関する。第一の要素は、哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基、および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素である。第二の要素は、上述されたＮ末端要素を下述されるＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに共有結合する化学構造である。該化学構造は、直鎖状の様式で配置された場合に同じように直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸の長さまで伸長されるフレキシブルな鎖を形成する共有結合された原子群であり、該化学構造は：ｉ）免疫学的に中性の化学構造、ｉｉ）ＭＨＣクラスＩエピトープ若しくはその一部分、および／またはｉｉｉ）抗体に認識される決定子若しくはその一部分よりなる群から選択される。最後に、高める抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態の抗原性エピトープを含んでなるＣ末端要素を包含する。
【０００８】
別の局面において、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有する目的のタンパク質若しくは目的のポリペプチドをコードする第一の発現可能な配列を含んでなる核酸分子に関する。加えて、該核酸分子は抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドをコードする第二の発現可能な核酸配列を含んでなる。該抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチドは、以下の要素：ｉ）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；ｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素（該ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープは段階ａ）の目的のタンパク質に含有される）；ならびにｉｉｉ）ハイブリッドのＮ末端とＣ末端要素を結合する介在ペプチジル構造（該ペプチジル構造は約２０アミノ酸若しくはそれ未満の長さを有する）を包含する。
【０００９】
好ましい態様において、Ｉ−Ｋｅｙペプチドの改変は、Ｃ末端からのアミノ酸の欠失；Ｎ末端伸長；およびアミノ酸置換を包含する。他の態様において、Ｃ末端要素はＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその一部分をさらに含んでなり、該ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ若しくはその部分を構成するアミノ酸残基はＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である。
【００１０】
開示される態様はまた、Ｃ末端要素が抗体に認識される決定子若しくはその一部分をさらに含んでなる態様も包含する。抗体に認識される決定子若しくはその一部分を構成するアミノ酸残基は、好ましくはＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの構成残基である。感染性病原体が炭疽菌、エボラ、ＨＩＶおよびインフルエンザよりなる群から選択される態様が開示される。開示される組成物に加え、使用方法もまた記述される。
［発明の詳細な記述］
本開示の発明の背景の節で論考されるとおり、米国特許出願第０９／３９６，８１３号明細書（現米国特許第６，４３２，４０９号明細書）は免疫系の調節に関して有用なハイブリッドペプチド（本明細書で「’８１３増強ハイブリッドペプチド」と称される）を開示する。該開示は、適切な介在化学構造により哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドに共有結合されてハイブリッドポリペプチドを形成するＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原性エピトープが、前駆体の抗原性エピトープがそうであるよりも有意により高い効力を伴い抗原提示細胞によりＴリンパ球に提示されるという発見に基づいていた。米国特許第６，４３２，４０９号明細書の開示は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００１１】
開示されたハイブリッドポリペプチドは、「ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示を高めるハイブリッドポリペプチド」若しくはより単純に「増強ハイブリッド」と称された。本開示において、こうしたペプチドは「Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド」若しくは「ハイブリッドペプチド」ともまた称される。あるいは、機能的要素に基づく短い呼称をとりわけ例示の節で使用するかもしれない。例えば、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープハイブリッド、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープ／ＭＨＣクラスＩに提示される抗原性エピトープハイブリッド、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープ／抗体に認識される決定子（ＡＲＤ）ハイブリッド。代替の専門用語の先行する列挙は包括的でないかもしれないが、しかし、こうした増強ハイブリッドへの言及は文脈において明らかであろう。
【００１２】
’８１３増強ハイブリッドは、哺乳動物のＩｉ−Ｋｅｙペプチド若しくは抗原提示を高める活性を保持するその改変より構成されるＮ末端を有する。提示されるべき特異的ＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープがＩｉ−Ｋｅｙペプチドに共有（しかし間接的に）結合される。Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドと抗原性エピトープとの間は、他の２成分を共有結合する介在化学構造である。本介在化学構造は単純に「スペーサー」と称された。スペーサーの必要なパラメータは詳細に記述された。
【００１３】
本開示は、とりわけ、’８１３増強ハイブリッドに関して開示されたＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープに加えて抗原性エピトープ／決定子を含有する増強ハイブリッドペプチドを企図している。例えば本発明の増強ハイブリッドは複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有しうる。複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープの包含はヒト集団のより大きな割合が免疫されることを可能にする。複数のエピトープは異なるアレルにより頻繁に提示されるからである。複数のＭＨＣクラスＩＩエピトープに加え、本発明はまた、１種若しくはそれ以上のＭＨＣクラスＩエピトープおよび／または１種若しくはそれ以上のＡＲＤ（抗体に認識される決定子）の包含も企図している。「エピトープ」および「決定子」という表現は当業者により同義語とみなされる。本明細書で使用されるところの「エピトープ／決定子」という表現の使用は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩエピトープおよびＡＲＤを包含することを意図している。
【００１４】
後に続く例示の節は、増強ハイブリッドペプチド中に組込み得る、実験で決定された若しくは予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩエピトープおよびＡＲＤの多数の特定の例を提供する。実験で決定されたエピトープは、ヒト疾患の動物モデルにおける前臨床試験にとって、アルゴリズムで予測されたエピトープより好ましい。部分的に、アルゴリズムで予測されたエピトープのかなりの割合が生物学的に機能的であることが見出されないからである。にもかかわらず、該「かなりの割合」は、こうしたエピトープが増強ハイブリッドの開発のための配列の供給源となるように十分に小さい。特定の疾患若しくは状態への集中の情況において、後に続く対応する例示の節で記述される化合物および使用方法に言及がなされる。
【００１５】
下で論考されるであろうとおり、ＭＨＣクラスＩＩ媒介性の免疫応答を高める若しくは増強するための’８１３増強ハイブリッドペプチドの使用は未利用の免疫貯蔵所（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を創製した。下でより詳細に論考されるであろうとおり、免疫系の細胞との’８１３増強ペプチドの相互作用は多数の応答性細胞型を大きく増幅した。増強ハイブリッドのＭＨＣクラスＩＩエピトープ成分の形態のこれらの応答性細胞型の１サブセットに対する分子入力が提供された。しかしながら、多数のプライミングされかつ応答性の免疫細胞型が’８１３ペプチドにより刺激されたが、しかし、適切な分子の入力の供給（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）は提供されなかった。ＭＨＣクラスＩエピトープおよびＡＲＤの形態のこうした付加的な分子入力が本明細書に提供される。
【００１６】
より具体的には、’８１３ペプチドのクラスＩＩエピトープにより媒介されるＴヘルパー細胞刺激の増強は、Ｉｉ−Ｋｅｙ部分の影響により実質的に増強される（すなわち約２５０倍）。活性化されたＴ細胞のような免疫調節性の細胞型のクローン拡張は、免疫系による増幅効果を有する。上で論考されたとおり、これは従来技術で扱われていなかった余剰の免疫能力を創製し得る。
【００１７】
究極的には、ハイブリッドペプチド（本発明の増強ハイブリッドペプチド若しくは’８１３増強ハイブリッドペプチドのいずれか）の一要素であるＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原は、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子による提示によりその影響を発揮する。２種のとりわけ重要な分類の抗原提示細胞は樹状細胞およびマクロファージである。これらの抗原提示細胞は、それらのそれぞれの表面上に、抗原提示において機能する２つの型の特別な分子を有する。これら２つの型の分子がＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子である。抗原性ペプチド（例えばＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩエピトープ）は、Ｔ細胞上の抗原特異的受容体へのその後の提示のためにＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩ分子に非共有結合される。
【００１８】
理論により束縛されることを願わない一方、ＭＨＣクラスＩおよび／若しくはＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するペプチドは、最低２種の機構によりコグネイトの表示分子（すなわちＭＨＣクラスＩ分子若しくはＭＨＣクラスＩＩ分子）とともに抗原提示細胞の表面上で表示されうると考えられる。例えば、抗原提示細胞との接触後に、こうしたペプチドは抗原提示細胞によりインターナリゼーションされかつ古典的チャンネルによりプロセシングされうる。あるいは、こうしたペプチドのＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原部分は、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩ分子に直接結合するかもしれない。従って、双方の場合において、該ペプチドのＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープは、そのコグネイトのＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩ分子とともに抗原提示細胞の表面上に表示される。
【００１９】
こうしたＭＨＣクラスＩＩに関連した表示が、Ｔ細胞の誘導およびこの誘導された集団のその後の拡張を包含する免疫媒介性の影響のカスケードを誘発する。この様式で刺激されたＴヘルパー細胞は多様な方法で応答する。例えば、刺激されたＴヘルパー細胞は、多様な活性化シグナルをＢ細胞に提供するサイトカインを遊離することにより機能する。Ｂ細胞は、例えば細胞表面と接触するタンパク質若しくはペプチド上に存在するＡＲＤ要素を認識かつ特異的に結合し得る表面免疫グロブリンを産生する。該タンパク質若しくはペプチドがその後インターナリゼーションされ、そしてその後、存在するいかなるプロセシングされたＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープもそれぞれＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩ分子とともにＢ細胞表面上に表示される。
【００２０】
先行する段落に提供されたＡＲＤを含有する分子の例はタンパク質若しくはペプチドであった。本発明に関して、ＡＲＤは増強ハイブリッドペプチドの一要素として提供される。前の例で真実であったとおり、増強ハイブリッドペプチドはＢ細胞によりインターナリゼーションされ、そして、増強ハイブリッドの一要素として存在するいかなるＭＨＣクラスＩＩエピトープも、ＭＨＣクラスＩＩ分子とともにのＢ細胞の表面上での表示のためプロセシングされる。こうした提示はヘルパーＴ細胞集団をさらに刺激して、Ｂリンパ球の増殖およびＡＲＤに特異的な抗体を産生するプラズマ細胞への成熟をもたらす。
【００２１】
本発明の増強ハイブリッドポリペプチドは’８１３増強ハイブリッドがそうであったように３要素から構成される。該３要素は：１）哺乳動物のＩｉ−ＫｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）のうちの４〜１６残基および抗原提示を高める活性を保持するそのＮ末端以外の欠失改変体より本質的になるＮ末端要素；２）ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位に結合するポリペプチド若しくはペプチド模倣構造の形態のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素；ならびに３）ハイブリッドのＮ末端とＣ末端要素を共有結合する介在化学構造（該化学構造は、直鎖状の様式で配置された場合に同様に直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸の長さまで伸長するフレキシブルな鎖を形成する共有結合された原子群である）である。
【００２２】
本発明の増強ハイブリッドを’８１３増強ハイブリッドと識別する、包含される付加的なエピトープ（１個若しくは複数）または決定子（１個若しくは複数）は、好ましくはＣ末端要素若しくはリンカー要素内に位置する。加えて、エピトープ若しくは決定子はＣ末端要素およびリンカー要素にオーバーラップしてもよい。いくつかの状況においては、付加的なエピトープ若しくは決定子がリンカー要素とＮ末端のＩｉ−Ｋｅｙ部分との間にオーバーラップすることが可能であるかもしれない。
【００２３】
一般的に言って、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩエピトープは約８ないし約１２アミノ酸残基から構成される。ＡＲＤ要素は、典型的に、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩエピトープよりいくぶんより広い大きさ範囲を有する。ＡＲＤの一般に引用される大きさ範囲は約６から約１６アミノ酸残基までである。ＡＲＤはそれらの三次元構造に基づいて認識される一方、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩエピトープはそれらの直鎖状の一次アミノ酸構造に基づいて認識される。
【００２４】
先行する段落にて概説された選択肢に対する特異性を提供するためには、本発明の増強ペプチドの構造をより詳細に論考することが必要である。リンカー配列はハイブリッドのＮ末端とＣ末端要素を共有結合する介在化学構造として記述されており、該化学構造は、直鎖状の様式で配置された場合に同様に直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸の長さまで伸長するフレキシブルな鎖を形成する共有結合された原子群である。従って、該リンカー配列がアミノ酸から構成されるかぎり（これは要件でない）、本発明の開示は、空間占有体（ｏｃｃｕｐｉｅｒ）としてのそれらの必要とされる役割に加え、リンカーのアミノ酸残基に付加的な機能性を提供する。
【００２５】
明記されるリンカーの長さ（直鎖状の様式で配置される２０アミノ酸まで）は、第二の完全なＭＨＣクラスＩＩエピトープ、第一の完全なＭＨＣクラスＩエピトープ、またはこうした付加的なエピトープの第一の完全なＡＲＤ若しくはセグメントを含有するのに十分に長い。加えて、こうした配列長さは、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープおよびＡＲＤよりなる群から選択される複数のオーバーラップしないエピトープを収容し得る。
【００２６】
機能的なＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープおよびＡＲＤが、全部の表されたエピトープの完全な機能性を保持しつつオーバーラップする様式で配置されていてもよいことが当該技術分野で既知である。ハイブリッド内の各エピトープのそれぞれの機能はペプチドごとで一時点で共発現されない。こうしたペプチドはＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩ分子中に結合されかつ折り畳み構造で抗体により認識されなければならないからである。にもかかわらず、それぞれのプロセシングおよび／若しくは細胞表面のＭＨＣ分子への結合を伴う注入されたペプチドの集団を考えれば、いずれか１種のＩｉ−Ｋｅｙ増強ハイブリッド内のエピトープの全３分類が、免疫した動物内で有効な免疫原となり得る。
【００２７】
最小配列がいくつかの理由から好ましい。これらは、単純性および合成の費用、タンパク質分解のより少ない機会、消失若しくは吸着につながる代謝的変化のより少ない機会を包含する。従って、リンカー要素は、相互にオーバーラップする（すなわち、個々のアミノ酸残基が１種以上のエピトープの成分でありうる）複数のエピトープを含有してよい。同様に、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを包含するＣ末端要素は、オーバーラップする若しくはオーバーラップしない配置の付加的なエピトープ（ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ若しくはＡＲＤ）もまた含有してよい。
【００２８】
本発明の増強ハイブリッドペプチドの多様な要素間の境界は、ある述べられた限界内でいくぶん自由裁量であることが示されている。多様な要素間の結合に広がるエピトープが本発明の範囲内に包含される。従って、例えば、エピトープの一部分が増強ハイブリッドペプチド要素若しくはドメイン（例えばリンカー領域）の１つ内に含有されることを１請求項が明記する場合は、これは、残存する部分が隣接する部分若しくはドメインの連続する部分で見出されることを必然的に意味する。部分的（すなわち非機能的エピトープは本発明に関連して有用でない）。
【００２９】
この領域の初期の研究は、哺乳動物のＩｉ  ｋｅｙペプチドＬＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号１）、および改変された哺乳動物のＩｉ−ｋｅｙペプチドＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ（配列番号２）が、それらのそれぞれの抗原性ペプチドを認識するＴリンパ球ハイブリドーマへのある種のＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原性ペプチドの提示を変える能力を有することを示した（米国特許第５，５５９，０２８号明細書；米国特許第５，９１９，６３９号明細書（それらの開示は引用することにより本明細書に組み込まれる））。改変バージョンのＩｉ−ｋｅｙペプチドを用いた以前の実験は、活性の損失を伴わずに多様な改変をこのポリペプチドに対しなし得ることを示した。事実、改変はしばしば該ポリペプチドの抗原提示活性を高めた。
【００３０】
米国特許出願第０９／３９６，８１３号明細書（現米国特許第６，４３２，４０９号明細書）の実験の節に詳述された結果は、抗原提示を高める活性を保持する全部の改変されたＩｉ  ｋｅｙペプチドが、適切に組込まれる場合に本発明の増強ハイブリッド中で機能することができることを示す。Ｉｉ  ｋｅｙペプチドの改変は、Ｃ末端からの１個若しくはそれ以上のアミノ酸の欠失、Ｎ末端の保護、アミノ酸置換および環状ペプチドの導入を包含する。元の配列の最低４連続アミノ酸を保持するＩｉ  ｋｅｙペプチドの欠失若しくはその置換されたバージョンは機能的活性を表す。多様な天然の若しくは非天然のアミノ酸をそれぞれの残基位置で置換してよい。置換されうる分子のいくつかの例は、ペプチド模倣構造、Ｄ−異性体アミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、Ｌ−異性体アミノ酸、修飾Ｌ−異性体アミノ酸および環化誘導体である。加えて、医薬品化学の手順が、ハイブリッドのＮ末端セグメントの付加的な改変を得るための慣例の実験方法を使用して当業者により応用されてよい。こうした手順の例は、合理的ドラッグデザインの方法、Ｘ線回折データからの構造情報に基づく分子モデル化、核磁気共鳴データ、および他のコンピュータの使用方法、ならびにコンビナトリアル化学合成の生成物のスクリーニング、ならびに天然の産物の単離である。高活性を保持することが既知である改変バージョンのＩｉ  ｋｅｙペプチドの例は、ＬＲＭＫ（配列番号３）、ＬＲＭＫＬＰＫ（配列番号４）、ＬＲＭＫＬＰＫＳ（配列番号５）、ＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰ（配列番号６）およびＬＲＭＫＬＰＫＳＡＫＰＶＳＫ（配列番号７）である。Ｉｉ−ｋｅｙペプチドの他の改変および改変されたバージョンは、米国特許第５，９１９，６３９号明細書および米国特許第５，５５９，０２８号明細書に記述されている。活性を保持することが既知である改変バージョンのＩｉ−ｋｅｙペプチド（ＹＲＭＫＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲ、配列番号２）は本明細書で「Ｉｉ−ｋｅｙ相同体」と称される。本明細書で使用されるところのＩｉ  ｋｅｙ相同体という用語はＩｉ  ｋｅｙペプチドそれ自身を包括する。
【００３１】
こうしたＩｉ−Ｋｅｙペプチドは、いくつかの実験方法により、抗原性ペプチドのＮ末端を保持するＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位の端のアロステリック部位に結合することが示された。アロステリック部位への結合のその過程は、内因性に結合された抗原性ペプチドの遊離および細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子との交換を助長した。
【００３２】
Ｉｉ−Ｋｅｙペプチドのペプチド相同体はマウス若しくはヒトＭＨＣクラスＩＩ分子に作用して、結合された抗原性ペプチドの遊離および合成ペプチドとのそれらの置換を促進する（Ａｄａｍｓ  Ｓ．Ａｒｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．１９９７  ４７：１０６９−１０７７；Ｘｕ  Ｍ．Ａｒｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．１９９９  ４９：７９１−９）。単純なポリメチレンリンカー若しくはＩｉタンパク質の伸長された天然の配列のいずれかにより抗原性エピトープペプチドに結合されたＩｉ−Ｋｅｙペプチドのハイブリッド構築物は、抗原性ペプチドに対し５００ないし２０００倍の提示効力を有する（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＲＥ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０００  １８：２６９３−２６９７）。この特性は、本明細書で提示されるところの多様な疾患および状態の診断、処置のモニタリングおよび治療において大きな臨床的有用性を有する。Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド内のＩｉ−Ｋｅｙ部分のこの活性はｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれでも見出される。この活性は細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用に帰すことができる。Ｉｉ−Ｋｅｙ化合物は生存若しくはパラホルムアルデヒド固定した抗原提示細胞のいずれともｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性であった（Ａｄａｍｓ  Ｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ２５：１６９３−１７０２）からである。しかしながら、該化合物はｉｎ  ｖｉｖｏで強力であるため、それらはまた、外因性抗原をプロセシングする経路により取り込まれかつゴルジ後の抗原装填区画でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するかもしれない。
【００３３】
本発明の増強ハイブリッドのＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープおよびＡＲＤを上で論考した。本発明の増強ハイブリッドの生成での使用に選択されるこうしたエピトープ／決定子を使用のためさらに改変してもよい。すなわち、天然の若しくは改変された配列のポリペプチド、ペプチド模倣構造、およびまた天然でないすなわち修飾されたアミノ酸である化学構造も、本明細書に開示される増強ハイブリッドのエピトープ／決定子要素中に包含してよい。加えて、増強ハイブリッドの抗原性エピトープ／決定子要素に対して多様な化学修飾を行ってよい。例えば、改変が抗原性エピトープ／決定子の結合特異性を保存する、非天然のアミノ酸または他のバックボーン若しくは側鎖部分の全体としての若しくは部分的な付加。こうした化学構造は、天然のタンパク質配列由来であるいかなる抗原性ペプチドに対しても見かけの構造類似性を中程度有するか、ほとんど若しくはまったく有しないかもしれない。こうした改変はＴ細胞受容体による認識に関係しても若しくはしなくてもよい。改変は抗原性エピトープの認識を増大させる（例えば、Ｔ細胞受容体の以前は認識しないサブセットによる認識に至る）ことができる。
【００３４】
介在化学構造すなわちスペーサーを上で論考した。介在化学構造が１個若しくはそれ以上のエピトープ／決定子を含んでなる場合、定義された限界内の全体長さは、大きな程度まで、該エピトープ／決定子の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）により指図される。介在化学構造が抗原的に中性である場合には、米国特許出願第０９／３９６，８１３号明細書（現米国特許第６，４３２，４０９号明細書）の教示が当てはまる。示されるとおり、該スペーサーは、好ましくは、直鎖状に配置された９アミノ酸のペプチジルバックボーンの長さ未満である。至適には、スペーサー長さは直鎖状に配置された４と６アミノ酸との間のペプチジルバックボーンの長さである。好ましくは、スペーサーは、増強ハイブリッドペプチドの他の別個の要素にいかなる空間的に別個の様式でも水素結合することが不可能である。
【００３５】
再度、抗原的に中性のスペーサー要素に関して、多様な化学基をアミノ酸の代わりにスペーサーセグメントに組込んでよい。例は米国特許第５，９１０，３００号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。好ましい一態様において、スペーサーは、ヘテロ原子により至適に中断されている脂肪族鎖、例えばＣ２−Ｃ６アルキレン若しくは＝Ｎ−（ＣＨ２）２−６−Ｎ＝より構成される。あるいは、スペーサーは交替する単位、例えば、Ｏ、Ｎ若しくはＳのようなヘテロ原子により場合によっては中断されている疎水性、親油性、脂肪族およびアリール脂肪族配列から構成されてもよい。スペーサーのこうした成分は、好ましくは以下の分類の化合物、すなわちステロール、アルキルアルコール、変動するアルキル官能基をもつポリグリセリド、アルキルフェノール、アルキルアミン、アミド、疎水酸性（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｂｉｃ）ポリオキシアルキレンなどから選ばれる。他の例は、疎水性ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ酸、ポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸ポリヒドロキシ酪酸である。スペーサーはまた、酸素原子により分離されるポリプロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンタメチレンなどのような反復する短い脂肪族鎖を含有してもよい。
【００３６】
スペーサー中で使用し得る付加的なペプチジル配列は、米国特許第５，８５６，４５６号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。一態様において、スペーサーは切断にさらされるそれ内に組込まれた化学基を有する。制限なしに、こうした化学基は、プロテアーゼ；化学基若しくは触媒的モノクローナル抗体により触媒される切断のため設計しうる。プロテアーゼ感受性の化学基の場合、トリプシンの標的（陽イオン性側鎖をもつ２アミノ酸）、キモトリプシンの標的（疎水性側鎖をもつ）およびカテプシン感受性（Ｂ、Ｄ若しくはＳ）が好ましい。「トリプシンの標的」という用語は、トリプシンおよびトリプシン様酵素により認識されるアミノ酸の配列を記述するために本明細書で使用する。「キモトリプシンの標的」という用語は、キモトリプシンおよびキモトリプシン様酵素により認識されるアミノ酸の配列を記述するために本明細書で使用する。加えて、触媒的モノクローナル抗体の化学的標的および他の化学的に切断される基は、ペプチド合成、酵素触媒作用および一般に有機化学の当業者に公知であり、そして慣例の実験方法を使用してハイブリッド構造に設計かつ合成し得る。
【００３７】
本発明の全部の態様が介在化学構造すなわちスペーサーの免疫原性の中性を包含するわけではない。すなわち、本発明は、介在化学構造すなわちスペーサーが：１）ＭＨＣクラスＩエピトープ若しくはその一部分；および２）抗体に認識される決定子若しくはその一部分よりなる群から選択される態様を包含する。とりわけ、本態様は、米国特許法の一部継続出願の規定が適用できない対応する国際特許出願の予期される出願に関して重要である。
【００３８】
本発明のハイブリッドは、特徴が完全にペプチドから特徴が実質的にペプチド以外まで変動する。いくつかの相同体は特徴が実質的に縮小されたペプチドもしくはペプチド以外であるという事実を考えれば、それらは好都合な特性、例えば細胞膜を通る浸透、溶解性、タンパク質分解に対する抵抗性、抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）による不活性化に対する抵抗性、経口の生物学的利用性およびｉｎ  ｖｉｖｏのより長い半減期を有することがよりありそうであることができる。
【００３９】
酸性若しくは塩基性基が構造中に存在する場合のハイブリッド分子の製薬学的に許容できる塩もまた本発明の範囲内に包含される。「製薬学的に許容できる塩」という用語は、酢酸塩、アンモニウム塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシル酸塩、炭酸塩、塩化物／二塩酸塩、クエン酸塩、クラブラン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩（ｅｄｉｓｙｌａｔｅ）、エストレート、エシレート、フマル酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、ヒドロキシナフトン酸塩、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオネート、ラウリン酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩（ｍｕｃａｔｅ）、ナプシル酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミド、オレアステ、シュウ酸塩、パモ酸塩、パルミチン酸塩、パノ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サブアセテート、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリエチオダイド、吉草酸塩などのような全部の許容できる塩を包含することを意図している。製薬学的に許容できる塩は、溶解性若しくは加水分解の特徴を改変するための投薬形態物として使用し得るか、または、徐放性若しくはプロドラッグ製剤で使用し得る。本発明の化合物の特定の官能性に依存して、本発明の化合物の製薬学的に許容できる塩は、ナトリウム、カリウム、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛のような陽イオンから、およびアンモニア、アルギニン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、リシン、Ｎ−メチルグルタミン、オルニチン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ピペラジン、プロカイン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、およびテトラメチレンジアミン水酸化物などのような塩基から形成しうる。これらの塩は標準的手順により、例えば遊離酸を適する有機若しくは無機塩基と反応させることにより製造しうる。アミノのような塩基性基が存在する場合、および酸性の塩、例えば酢酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、パモ酸塩などを投薬形態物として使用し得る。
【００４０】
また、酸（−ＣＯＯＨ）若しくはアルコール基が存在する場合は、徐放性若しくはプロドラッグ製剤としての使用のため溶解性若しくは加水分解の特徴を改変するために、製薬学的に許容できるエステル、例えば酢酸エステル、リンゴ酸エステル、ピバロイルオキシメチルなど、および当該技術分野で既知のエステルを使用し得る。
【００４１】
本発明のハイブリッド分子若しくはそれらの成分はキラル中心を有するかもしれず、そして、それのためにラセミ化合物、ラセミ混合物および個々の鏡像異性体若しくはジアステレオマーとして存在することができ、全部のこうした異性体ならびにそれらの混合物が本発明に包含される。さらに、本発明のハイブリッド化合物の結晶形のいくつかは多形として存在するかもしれず、そしてそれ自体本発明に包含されることを意図している。加えて、本発明の化合物のいくつかは水若しくは一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成しうる。こうした溶媒和物もまた本発明の範囲内に包含される。
【００４２】
本発明の増強ハイブリッドは、抗原性ペプチドの合成および選択のため開発された方法により合成かつ選択しうるペプチド若しくはペプチド模倣物または付加的な化学物質群から構成しうる。それらの方法および化合物は、以下の特許すなわち米国特許第４，７０８，８７１号明細書；米国特許第５，１９４，３９２号明細書；米国特許第５，２７０，１７０号明細書；米国特許第５，３８２，５１３号明細書；米国特許第５，５３９，０８４号明細書；米国特許第５，５５６，７６２号明細書；（１９９７）米国特許第５，５９５，９１５号明細書；米国特許第５，７４７，３３４号明細書；および米国特許第５，８７４，２１４号明細書（それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に提示されている。
【００４３】
上に提示される開示は主として抗原提示を高めるハイブリッドペプチドに関する。別の局面において、本発明はこうした増強ペプチドをコードする核酸配列に関する。増強ハイブリッドペプチドの開示の範囲は、コードする核酸配列から組換えＤＮＡ技術を使用して製造される増強ハイブリッドペプチドが２０種の天然に存在するアミノ酸の１種から製造されなければならないという事実に照らして対応する核酸配列の開示よりいくぶんより広いことが示される。はるかにより広範囲の置換は増強ハイブリッドペプチドが化学合成技術により製造される場合に利用可能である。
【００４４】
多様な送達系がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの本発明の増強ハイブリッドの標的細胞への送達における使用に利用可能である。こうした送達系は例えばウイルスおよび非ウイルス系を包含する。適するウイルス系の例は、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスベクター、ワクシニア、単純疱疹ウイルス、ＨＩＶ、マウスの微小ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスを包含する。例えば複合体形成されないＤＮＡ、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体およびＤＮＡ被覆した金粒子、サルモネラのような細菌ベクター、ならびに、ＶＰ２２輸送タンパク質、Ｃｏ−Ｘ−遺伝子およびレプリコンベクターを必要とするもののような他の技術を使用する非ウイルス送達系もまた使用してよい。
【００４５】
動物細胞中で目的の核酸配列を発現するための一選択肢はアデノウイルス系である。アデノウイルスは二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、そして宿主細胞の分裂と独立に複製する。アデノウイルスベクターは、発現可能な構築物の細胞中への代替の導入方法に関して多様な利点を提供する。例えば、アデノウイルスベクターは広範囲のヒト組織に形質導入することが可能であり、そして高レベルの遺伝子発現を分裂および非分裂細胞で得ることができる。アデノウイルスベクターは、標的細胞分裂の間の免疫系の消失および希釈喪失による比較的短いトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）発現持続期間を特徴とする。静脈内、胆管内、腹腔内、小嚢内、頭蓋内および鞘内注入、ならびに標的器官若しくは組織の直接注入を包含するいくつかの投与経路を使用し得る。従って、解剖学的境界に基づくターゲッティングが達成可能であることが当該技術分野で認識される。
【００４６】
アデノウイルスゲノムは約１５種のタンパク質をコードし、また、感染は細胞表面の受容体に結合する線維タンパク質を必要とする。この受容体相互作用は該ウイルスのインターナリゼーションをもたらす。感染した細胞の核にウイルスＤＮＡが進入し、そして転写が細胞分裂の非存在下で開始される。発現および複製はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子の制御下にある（Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２．ｓｕｐ．ｎｄ編、１９９０、ｐｐ．１７２３−１７４０中を参照されたい）。Ｅ１遺伝子の除去は該ウイルスを複製無能にする。
【００４７】
アデノウイルスの血清型２および５はベクター構築に広範囲に使用されている。Ｂｅｔｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９４、９１：８８０２−８８０６）はＥ１およびＥ３アデノウイルス遺伝子の欠失を伴うアデノウイルスタイプ５ベクター系を使用した。２９３ヒト胚腎細胞株がＥ１タンパク質を発現するよう工作され、そして従ってＥ１欠損ウイルスゲノムをトランス補完（ｔｒａｎｓｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）し得る。該ウイルスを２９３細胞培地から単離しかつ限界希釈プラークアッセイにより精製し得る（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．とＰｒｅｖｅｋ，Ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１、ｐｐ．１０９−１２８中）。組換えウイルスを２９３細胞株培養物中で増殖させかつ感染した細胞を溶解することおよび塩化セシウム密度遠心分離による精製により単離し得る。組換えアデノウイルスの製造のための２９３細胞と関連する問題は、Ｅ１遺伝子の付加的な隣接領域によりそれらがウイルス粒子産生の間に複製能力のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）を生じさせるかもしれないことである。この材料は野性型アデノウイルスのみでありかつ複製能力のある組換えウイルスでないとは言え、それは所望のアデノウイルス材料の最後の収量に対する大きな影響を有しかつ増大された製造費用、製造運転についての品質管理の問題および臨床使用のためのバッチの許容性につながり得る。２９３細胞よりもより定義されたＥ１遺伝子の組込みを有する（すなわち隣接するウイルス配列を含有しない）ＰＥＲ．Ｃ６のような代替細胞株が開発されており、それらはＲＣＡを生じさせる組換え事象を可能にせずかつ従って上のウイルス産生の問題を克服する可能性を有する。
【００４８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３−８０１）は非常に広範な宿主範囲の非分裂細胞のゲノム中に組込むことが可能な一本鎖ＤＮＡの非自律性パルボウイルスである。ＡＡＶはヒト疾患と関連することが示されておらず、そして免疫応答を導き出さない。ＡＡＶは２種の別個の生活環相を有する。野性型ウイルスは宿主細胞を感染させ、組込みかつ潜在性のまま留まることができる。アデノウイルスの存在下で該ウイルスの溶解期が誘導され（初期アデノウイルス遺伝子の発現に依存する）かつ活発なウイルス複製につながる。ＡＡＶゲノムは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列により隣接される２個のオープンリーディングフレーム（ｒｅｐおよびｃａｐと呼ばれる）から構成される。ｒｅｐ領域はＡＡＶの複製、ウイルスＤＮＡ転写、および宿主ゲノム組込みで使用されるエンドヌクレアーゼ機能を媒介する４種のタンパク質をコードする。ｒｅｐ遺伝子はウイルス複製に必要とされる唯一のＡＡＶ配列である。ｃａｐ配列はウイルスキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする。ＩＴＲはウイルスの複製起点を含有し、被包化シグナルを提供しかつウイルスＤＮＡ組込みに参画する。遺伝子治療のため開発された組換えの複製欠損ウイルスはｒｅｐおよびｃａｐ配列を欠く。複製欠損ＡＡＶは、ＡＡＶ複製に必要な分離された要素を許容的な２９３細胞株中にコトランスフェクトすることにより生じさせ得る。米国特許第４，７９７，３６８号明細書は関連する開示を含有しかつこうした開示は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００４９】
レトロウイルスベクターは分裂細胞を感染させるために有用であり、そして宿主細胞膜およびウイルスタンパク質由来のエンベロープ中にパッケージングされている１個のＲＮＡゲノムから構成される。レトロウイルス遺伝子発現は、その＋鎖ＲＮＡゲノムが二本鎖ＤＮＡ（その後宿主細胞のＤＮＡに組込まれる）の合成を指図するための鋳型として使用される逆転写段階を必要とする。組込まれたプロウイルスは遺伝子発現のため宿主細胞の機械装置を使用することが可能である。
【００５０】
マウス白血病ウイルスは一般に使用されるレトロウイルス種である（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９９３、２１７：５８１−５９９）。レトロウイルスベクターは、典型的にはｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の欠失により構築する。これらの配列の欠失は目的の核酸配列の挿入のための能力を提供しかつ該ウイルスの複製機能を排除する。抗生物質耐性をコードする遺伝子がしばしば選択の手段として包含される。例えばｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の組織特異的発現を提供するためのプロモーターおよびエンハンサー機能もまた包含してよい。末端反復配列に含有されるプロモーターおよびエンハンサー機能を使用してもまたよい。
【００５１】
こうしたウイルス、および目的の外因性核酸配列を運搬するこうしたウイルスの改変はウイルスパッケージング細胞株中でのみ生じさせ得る。パッケージング細胞株は、欠失されたウイルス遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）が組換えを予防するように異なる染色体上に存するような細胞中にそれらを安定に挿入することにより構築しうる。該パッケージング細胞株を使用して、組換えプロウイルスＤＮＡを挿入することにより目的の核酸配列を含有する複製欠損レトロウイルスを生成することができる産生体（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）細胞株を構築する。被包化配列および目的の遺伝子を含有するｇａｇ遺伝子の小さな一部分に隣接する末端反復配列を含有するプラスミドＤＮＡを、標準的ＤＮＡ移入および取り込み技術（電気穿孔法、カルシウム沈降法など）を使用してパッケージング細胞株にトランスフェクトする。このアプローチの変形が、複製能力のあるウイルスの産生の見込みを低下させるのに使用されている（Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、１、５１−６４）。ウイルスの宿主細胞範囲はエンベロープ遺伝子（ｅｎｖ）により決定され、そして、異なる細胞特異性をもつｅｎｖ遺伝子の置換を使用し得る。エンベロープタンパク質中への適切なリガンドの組込みもまたターゲッティングのために使用してよい。
【００５２】
組換えレトロウイルスベクターの投与はいかなる適する技術により達成してもよい。こうした技術は、例えば、患者の細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ形質導入、組織中へのウイルスの直接注入、およびレトロウイルス産生体細胞の投与によりを包含する。ｅｘ  ｖｉｖｏのアプローチは患者の細胞の単離および組織培養物中での維持を必要とする。この情況において、標的細胞に対するウイルス粒子の高い比を達成し得、そして従って形質導入効率を向上させ得る（例えば米国特許第５，３９９，３４６号明細書（その開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。米国特許第４，６５０，７６４号明細書はレトロウイルス発現系の使用に関する開示を含有し、そしてこの引用される特許の開示は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００５３】
いくつかの場合にはｉｎ  ｖｉｖｏのウイルスの直接導入が必要であるか若しくは好ましい。レトロウイルスは、分裂細胞（腫瘍細胞）のみを感染させるレトロウイルスの能力がとりわけ有利でありうる脳腫瘍を治療するのに使用されている。患者の脳腫瘍中へ直接のレトロウイルス産生体細胞株の投与もまた提案されている（例えばＯｌｄｆｉｅｌｄら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９３、４：３９−６９を参照されたい）。こうした産生体細胞は数日の期間脳腫瘍内で生存することができ、そして周囲の脳腫瘍を形質導入することが可能なレトロウイルスを分泌することができる。
【００５４】
発現のためのポックスウイルスに基づく系が記述されている（Ｍｏｓｓ，Ｂ．とＦｌｅｘｎｅｒ，Ｃ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８７、５：３０５−３２４；Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９０、ｐｐ．２０７９−２１１１中）。例えばワクシニアは感染した細胞の細胞質中で複製する大型のエンベロープＤＮＡウイルスである。多くの異なる組織からの非分裂および分裂細胞を感染させ、また、組込まれないゲノムからの遺伝子発現が観察されている。組換えウイルスは、ワクシニア由来プラスミドにトランスジーンを挿入すること、および相同的組換えがウイルス産生に至るワクシニアに感染した細胞中にこのＤＮＡをトランスフェクトすることにより製造し得る。大きな一欠点は、それが１５０ないし２００種のウイルスにコードされるタンパク質に対する宿主免疫応答を導き出して反復投与を問題の多いものにすることである。
【００５５】
単純疱疹ウイルスは感染した細胞の核で複製する大型の二本鎖ＤＮＡウイルスである。このウイルスは外因性核酸配列とともにの使用に適応可能である（Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｐ．Ｇ．Ｅ．とＳｔｅｉｎｅｒ，Ｉ．、Ｑ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９３、８６：６９７−７０２を参照されたい）。利点は、広範な宿主細胞範囲、分裂および非分裂細胞の感染を包含し、そして、外来ＤＮＡの大型配列を相同的組換えによりウイルスゲノムに挿入し得る。欠点は、ウイルス調製物を複製能力のあるウイルスを含まなくすることにおける困難および強力な免疫応答である。ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子の欠失は、低レベルのチミジンキナーゼを含む細胞中で該ウイルスを複製欠損にする。活発な細胞分裂を受けている細胞（例えば腫瘍細胞）は、複製を可能にするための十分なチミジンキナーゼ活性を有する。
【００５６】
ＨＩＶ、マウスの微小ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびインフルエンザウイルスを包含する多様な他のウイルスが遺伝子移入のためのベクターとして開示されている（Ｊｏｌｌｙ，Ｄ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、１：５１−６４を参照されたい）。非ウイルスＤＮＡ送達戦略もまた応用可能である。これらのＤＮＡ送達戦略は、複合体形成されないプラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ−脂質複合体、ＤＮＡ−リポソーム複合体、ＤＮＡ−タンパク質複合体、ＤＮＡ被覆した金粒子およびＤＮＡ被覆したポリラクチドコグリコリド粒子に関する。精製された核酸を組織中に直接注入し得、そして、例えば再生する筋中でとりわけ有効な筋組織中での一過性遺伝子発現をもたらす（Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０、２４７；１４６５−１４６８）。Ｄａｖｉｓら（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９３、４：７３３−７４０）は成熟筋（骨格筋が一般に好ましい）中へのＤＮＡの直接注入について公表した。
【００５７】
金粒子上のプラスミドＤＮＡは遺伝子銃を使用して細胞（例えば表皮若しくはメラノーマ）中に「発射」し得る。ＤＮＡを金粒子上に共沈殿させ、そしてその後噴射剤として電気スパーク若しくは加圧ガスを使用して発射する（Ｆｙｎａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９３、９０：１１４７８−１１４８２）。電気穿孔法もまた、マルチニードルアレイ（ｍｕｌｔｉ−ｎｅｅｄｌｅ  ａｒｒａｙ）およびパルス回転電場を使用する電気穿孔プローブを使用する充実性腫瘍中へのＤＮＡの移入を可能にするのに使用されている（Ｎｉｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９６、５６：１０５０−１０５５中）。腫瘍内注入処置を上回る有意の細胞トランスフェクション増強およびより良好な分布の特徴を伴う皮下腫瘍への高効率の遺伝子移入が特許請求されている。
【００５８】
脂質媒介性トランスフェクションがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ双方のトランスフェクションに好ましい（Ｈｏｒｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６２：６３７８、１９９９）。脂質−ＤＮＡ複合体は、ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬のような商業的に入手可能な脂質を使用して注入の１ないし５分前にＤＮＡおよび脂質を混合することにより形成される。
【００５９】
リポソームは、細胞進入を助長するために疎水性分子で親水性分子を取り囲むことにより作用する。リポソームは脂質から作成される単層若しくは多層球体である。脂質組成および製造方法がリポソームの構造に影響を及ぼす。他の分子を脂質膜中に取り込み得る。リポソームは陰イオン性若しくは陽イオン性であり得る。Ｎｉｃｏｌａｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、１９８３、８０：１０６８−１０７２）は、ラットに注入された陰イオン性リポソームからのインスリン発現に関する業績を公表した。陰イオン性リポソームは、別の方法で標的を定められない限り、主として肝の網内細胞を標的とする。分子がリポソームの表面に取り込まれてそれらの挙動を変え得る（例えば細胞選択的送達）（Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．とＷｕ，Ｃ．Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、２６２：４４２９−４４３２）。
【００６０】
Ｆｌｅｇｎｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、１９８７、８４：７４１３−７４１７）は、陽イオン性リポソームに関する業績を公表し、静電的相互作用による核酸のそれらの結合を立証しかつ細胞進入を示した。陽イオン性リポソームの静脈内注入は、器官への輸入血液供給中への注入に際して大部分の器官でのトランスジーン発現につながる。陽イオン性リポソームは肺上皮を標的とするエアゾルにより投与し得る（Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、１９８９、２９８：２７８−２８１）。陽イオン性リポソームトランスジーン送達を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ研究が公表されている（例えば、Ｎａｂｅｌ，Ｇ．、Ｒｅｖ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９−９２；Ｈｙｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９３、３６２：２５０−２５５および；Ｃｏｎａｒｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９４、９３：１８３４−１８４０を参照されたい）。
【００６１】
微粒子が貪食細胞へのＤＮＡの送達のための系として研究されており、こうしたアプローチはＰａｎｇａｅａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより報告されている。こうしたＤＮＡ微小被包化送達系は、ミクロスフェアを取り込むマクロファージのような貪食細胞のより効率的な形質導入を遂げるために使用されている。ミクロスフェアは、同一のエピトープを含有するこうしたペプチドおよびタンパク質配列に対する免疫応答を刺激し得る、発現される場合に細胞表面上のＭＨＣ分子を介するペプチド表示につながる潜在的に免疫原性のペプチドをコードするプラスミドＤＮＡを被包化する。このアプローチは現在、抗腫瘍および病原体ワクチンの開発における潜在的役割に向けられているが、しかし他の可能な遺伝子治療の応用を有するかもしれない。
【００６２】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）中への均一な自己集成が可能である天然のウイルスコートタンパク質もまた、送達のためにＤＮＡをパッケージングするのに使用されている。ヒトポリオーマウイルスの主要な構造コートタンパク質（ＶＰ１）を組換えタンパク質として発現させ得、そして、ＶＬＰ中への自己集成の間にプラスミドＤＮＡをパッケージングすることが可能である。生じる粒子をその後使用して多様な細胞株に形質導入し得る。
【００６３】
ＤＮＡベクターの改良もまたなされており、そして非ウイルス送達系の多くに応用可能なことがありそうである。これらは、スーパーコイルのミニサークル（細菌の複製起点も抗生物質耐性遺伝子も有さず、そして従ってそれらが高レベルの生物学的封じ込めを表す際に潜在的により安全である）、エピソーム発現ベクター（プラスミドが核内でしかし染色体の外側で増幅し、そして従ってゲノム組込み事象を回避する複製するエピソーム発現系）、およびＴ７系（ベクターそれ自身がファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現し、そして治療的遺伝子が第一のプロモーターにより生成されるポリメラーゼを使用して第二のＴ７プロモーターから駆動される、厳密に細胞質の発現ベクター）の使用を包含する。ＤＮＡベクター技術に対する他のより一般的な改良は、高レベル発現を遂げるためのｃｉｓに作用する要素、細胞周期あたり１回の複製を供給するためのアルフォイド反復ＤＮＡ由来の配列、および核ターゲッティング配列の使用を包含する。
【００６４】
他の局面において、本発明は、Ｔリンパ球へのＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性ペプチドの提示を高める方法に関する。米国特許第６，４３２，４０９号明細書にて論考されるとおり、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原性エピトープは、上述された本発明の増強ハイブリッドのＣ末端に適切に組込まれる。産生された増強ハイブリッドをその後、生理学的条件下で、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子による抗原性エピトープの提示に応答性であるＴ細胞と接触されている若しくはその後接触されるＭＨＣクラスＩＩを発現する抗原提示細胞に接触させる。この方法は、抗原性エピトープの上に列挙された記述に従う全部の抗原性エピトープを伴う使用に適する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこうした増強のアッセイ方法の例は、下の例示の節および本開示に列挙される米国特許に詳述されている。
【００６５】
一局面において、主題の発明は、治療若しくは診断の目的上、目的の抗原のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有するペプチドワクチンのＣＤ４＋免疫調節性Ｔ細胞を活性化する効力の向上方法に関する。ヒトにおける広範な疾患および状態が、ＣＤ４＋免疫調節性Ｔ細胞を活性化するための本発明の化合物および方法の応用から利益を得ることができる。こうしたＣＤ４＋免疫調節性Ｔ細胞は、癌、感染性疾患、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶および他の臨床過程における臨床目的の抗原に対する免疫応答を増強若しくは抑制のいずれかをし得る。
【００６６】
本明細書に提示されるところの多様な疾患および状態の処置若しくは改変における臨床目的の抗原は、抗原提示細胞の表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子により提示される小ペプチドフラグメントとして免疫系のＴ細胞により認識される。ＭＨＣクラスＩ分子はこうした抗原性ペプチドをＣＤ８＋細胞傷害性若しくはキラーＴ細胞に提示する。身体の大部分の細胞は、細胞性タンパク質のレパートリーから引き出されかつ小胞体でのそれらの合成の時点でそれらの細胞のＭＨＣクラスＩ分子中に結合されている（「自己の免疫学的調査」）、細胞表面のＭＨＣクラスＩに提示されるペプチドを発現する。ウイルス感染若しくは悪性形質転換後に、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩ分子中の新規すなわち「外来の」内因性に生じられたペプチドを認識しかつ該提示細胞を殺す。
【００６７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、免疫応答の多様なエフェクター機構を増強若しくは抑制することによりその応答を調節するＣＤ４＋  Ｔ免疫調節細胞に抗原性ペプチドを提示する。こうしたエフェクター機構は、例えば、標的細胞の細胞傷害性Ｔ細胞殺傷、Ｂ細胞およびプラズマ細胞による抗体産生、ならびに樹状細胞活性化を包含する。それらは免疫応答におけるほとんど全部の機構を直接若しくは間接的に調節するため、ＣＤ４＋  Ｔ免疫調節細胞は免疫応答オーケストラの指揮者と呼ばれている。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、環境の抗原をインターナリゼーションしかつプロセシングするための特化された機構を有するマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞のような身体の細胞の１サブセットのみ上で発現される。小胞体での合成の時点で、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位はＩｉタンパク質により満たされる。その複合体のゴルジ後の抗原装填区画への輸送後に、Ｉｉタンパク質は、抗原をプロセシングする細胞によりインターナリゼーションかつプロセシングされた外来タンパク質からの抗原性ペプチドの共同の挿入を伴いプロテアーゼにより除去される（Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ  Ｐ．Ｃｅｌｌ．１９９６  ８４：５０５−７；Ｈｕｄｓｏｎ  ＡＷ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２００２  ２７２：１−７；Ｂｒｙａｎｔ  ＰＷ．Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  ８０：７１−１１４）。Ｉｉタンパク質のＩｉ−ＫｅｙセグメントがＭＨＣクラスＩＩ分子上のアロステリック部位と相互作用して、Ｉｉタンパク質の遊離の間の抗原性ペプチド結合部位の不安定性および選択された抗原性ペプチドの結合を誘導する。Ｉｉ−Ｋｅｙセグメントの解離／破壊後に、抗原性ペプチドは、それらの分子の抗原性ペプチド結合部位の延長された発現のためにＭＨＣクラスＩＩ分子中に強固に結合される。細胞表面への輸送後に、こうしたＭＨＣクラスＩＩ−抗原ペプチド複合体はＣＤ４＋  Ｔ免疫調節細胞上の特化された受容体により認識される。それらの細胞の活性化は多様な方法で免疫応答を調節する。これらは後に個々の治療目的に関して考慮する。簡潔には、ＣＤ４＋細胞のサブセットが、サイトカインおよび他の遺伝子の差次的誘導を特徴とするＴｈ１、Ｔｈ２、若しくはＴｈ２経路に沿って活性化されうる。それらの調節性細胞は、抗原特異的様式で免疫応答を誘導若しくは抑制のいずれかをする。さらに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞はメモリーＴ細胞の持続する集団となるよう誘導され得る。
【００６８】
Ｉｉタンパク質のＩｉ−Ｋｅｙセグメントが相互作用するアロステリック部位は、細胞表面で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子中の環境に接近可能である。この事実は、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドペプチドを液相で単純な様式で、例えば皮下に、静脈内に、鞘内に、腹腔内に、経粘膜でおよび気道へのエアゾルとして投与し得かつ膜を横切るまたはいずれかの特別の細胞内若しくは代謝的プロセシング若しくは修飾を受けることなく標的のＭＨＣクラスＩＩ分子と接触し得るために、臨床上かなり価値がある。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子のアロステリック部位は生存している若しくはパラホルムアルデヒド固定された抗原呈示細胞さえの表面上で発現されるという事実は、本明細書および以前に米国特許第５，５５９，０２８号明細書（１９９６）および米国特許第５，９１９，６３９号明細書（１９９９）の双方で提示されるとおり、Ｉｉ−ＫｅｙペプチドおよびＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドペプチドの作用機序のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を助長した。
【００６９】
単純な液相投与後のＭＨＣクラスＩＩ分子と細胞表面で発現されたを接触させることの好ましい特性に加え、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドペプチドはまた、マクロファージ若しくは樹状細胞のような抗原をプロセシングしかつ提示する細胞中にも取り込まれ得、そしてゴルジ後の抗原装填区画のそれらの横断の経過中にＭＨＣクラスＩＩ分子に接触させ得る。抗原にＭＨＣクラスＩＩ分子を接触させるこれら２種の非常に異なる経路のいずれかの選択的使用は、本明細書に記述されるところの多様な疾患および状態の処置の間に有用である。例えば、長期間にわたる低濃度での静脈内投与は免疫抑制を生じさせる様式でのエピトープ提示に好ましいことができ、例えば多発性硬化症若しくは慢性関節リウマチに関する抗原からのペプチドエピトープの場合に好ましい。または、他方、癌若しくは感染性疾患のいずれかの治療に関連する抗原に対するその後投与されるＤＮＡワクチンに対する免疫応答を増強する場合には、補助的なサイトカイン若しくは他の刺激物質とともにＤＮＡワクチンによりコードされるエピトープを組込むＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープの投与がＴｈ１媒介性の応答の発生を促進する。
【００７０】
Ｔリンパ球へのＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原性エピトープの提示を高める方法は疾患の診断および治療における広範な応用を見出す。診断的抗原性エピトープに対するＴ細胞応答は、とりわけ病因の感染性病原体に関する疾患の診断でしばしば測定される。こうした診断的抗原性エピトープを組込ませた本発明の増強ハイブリッドの使用はこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイの感度を実質的に増大させることができる。感染性疾患および癌の場合、病原体若しくは癌特異的と同定される抗原性エピトープを本発明の増強ハイブリッドに中に組込み得、そしてその後、該ハイブリッドを使用して病原体若しくは癌特異的なＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープに対するＴｈ応答を開始させ得る。この応答はＴヘルパー細胞の活性化および拡張につながり、それは順に、侵襲する生物体に対する有効なＭＨＣクラスＩ拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球応答をプライミングするよう樹状細胞を活性化すなわち「許可」する。自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶の場合、病原性の免疫応答を誘発する特異的抗原エピトープを同定し、そしてその後本発明の増強ハイブリッドに組込む。該ハイブリッドをその後、Ｔ細胞応答をダウンレギュレートすることができるＴｈ２応答に至る様式でＴ細胞を刺激するのに使用する。この場合、サプレッサー細胞応答の刺激を使用して病原性の免疫応答をダウンレギュレートする。Ｔリンパ球の予め決められたサブセットを特異的に刺激する増強ハイブリッドの同定方法を下述する。疾患の治療におけるこうしたハイブリッドの付加的な方法および有用性を下で考慮する。
【００７１】
別の局面において、Ｉｉ−Ｋｅｙ抗原性エピトープハイブリッドは、いずれかの所定のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープで免疫し得るワクチン接種された集団の個体のＭＨＣクラスＩＩアレルのレパートリーおよび従って反応を増大させる。Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド内に提示される抗原性エピトープの効力は、ペプチドとして提示される同一のエピトープのものよりはるかにより大きいため、その所定のエピトープに対する低応答体のＭＨＣクラスＩＩアレルをもつ哺乳動物を高応答体のＭＨＣクラスＩＩアレルをもつ哺乳動物に同等なレベルまで刺激してもよい。そのエピトープを認識する免疫調節性Ｔ細胞クローンの発生は、目的の、例えば悪性の若しくはウイルスに感染した細胞の抗原からの同一のエピトープの高められたその後の提示につながることができる。いずれか１エピトープに対する治療応答を促進するＭＨＣクラスＩＩアレルのレパートリーのこの拡張は、いずれかの所定のエピトープで免疫することにより保護されている集団のより大きな部分につながる。従って、「ペプチドのかご（ｂａｓｋｅｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」ワクチン、すなわち多様なエピトープをもつペプチドを含有するものは必要とされない。すなわち、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの使用を伴わずに、はるかにより多数の個々の抗原性エピトープペプチドがＴヘルパーペプチドワクチンで使用されるに違いない。
【００７２】
別の局面において、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドはＤＮＡワクチンに対する応答を高める。病原体または腫瘍特異的若しくは腫瘍関連抗原のいずれかからの１種若しくはそれ以上の抗原のｃＤＮＡ配列を含有するワクチンが臨床で試験されている。しかしながら、多くの例において、高レベルの保護抗体、若しくは長期間の免疫学的記憶、若しくは最大の細胞傷害性Ｔ細胞応答は見出されない。効力のこの欠如はこうした免疫感作に対する弱いヘルパーＴ細胞応答に帰されている。Ｔヘルパー細胞を、従って、ｃＤＮＡワクチンでの免疫感作を最大にするように、適する時間的スケジュールでｃＤＮＡワクチン中のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに対するＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドでプライミングし得る。
【００７３】
別の局面において、目的の抗原の配列全体にオーバーラップするペプチドのライブラリーの１メンバーのそれぞれへのＩｉ−Ｋｅｙリンカーの付加は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを拾い上げる感受性を増大させる。こうしたハイブリッド中のエピトープの提示の増大された効力を考えれば、弱く抗原性のエピトープ、および生物学的応答、例えばＩｇＥにより媒介されるものの特定の経路の誘導において他の限界を伴うエピトープがより良好に認識されるかもしれない。さらに、所定の実験的抗原性エピトープに対する相同性、若しくは例えばＨＬＰＣ分離およびタンデム質量分光写真術により部分的にのみ同定された配列を伴い合成したペプチドのコンビナトリアルライブラリーの場合には、こうしたペプチドのＮ末端でＩｉ−Ｋｅｙモチーフおよびリンカーを合成することによりこうしたライブラリー中のペプチドの効力を高め得る。こうしたペプチドの合成がＣからＮ末端に進行するという事実は、連続的にａｖａ、その後Ｋ、その後Ｍ、その後Ｒ、その後Ｌ（逆でＬＲＭＫ（配列番号８））を付加し得るか、若しくはＡｃ−ＬＲＭＫ−ａｖａ（配列番号９）を１単位として末端に付加し得るかのいずれかであるため、好都合である。
【００７４】
別の局面において、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープ技術を潜在的抗原性エピトープの発見、検証および使用で応用し得る。潜在的抗原性エピトープは、抗原性タンパク質からのペプチドでの哺乳動物の免疫感作に際して（しかし無傷の抗原タンパク質での遺伝的に同一の哺乳動物の免疫感作に際してでなく）認識されるエピトープであると経験的に定義されている。Ｓｅｒｃａｒｚらによる徹底的な実験的研究において、所定の系統のマウスに関して所定の抗原性タンパク質中の大部分の潜在的エピトープを発見するための手順が確立された。例えば６アミノ酸のオーバーラップする末端セグメントをもつそれぞれ長さ１５アミノ酸のペプチドのライブラリーを目的の抗原性タンパク質、例えばニワトリ卵リゾチームの一次アミノ酸配列により創製した。所定の系統の１匹のマウスをリゾチームで免疫し、そしてリゾチームライブラリー中のペプチドのそれぞれに対する脾Ｔ細胞の増殖応答を試験した。増殖応答を刺激するペプチド中のエピトープを優性エピトープと命名した。その系統の追加のマウスをリゾチームペプチドのライブラリーのそれぞれのペプチドのそれぞれで免疫した場合に、優性エピトープの全部が単離されたペプチド中で免疫原性であることが見出されたが、しかし付加的なエピトープもまた発見された。これらの追加実験を潜在的エピトープと命名した。Ｓｅｒｃａｒｚらは、無傷のタンパク質内で提示される場合に潜在的エピトープが免疫原性でない一連の機構を示した。潜在的エピトープの臨床的価値は、部分的に、所定の個体がこうしたエピトープを免疫学上以前に認識していたことは非常にありそうになく、そして従ってそのエピトープに対し寛容化されていないという事実に存する。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッド内でのこうした潜在的エピトープの提示に際して、従って、用量、経路、スケジュールおよびアジュバントがその目的に対して設計されている場合には活発な免疫応答が発生し得る。癌の場合、および数種の感染性病原体の場合であっても、１種若しくはそれ以上のエピトープに対し寛容が発生し得、最終結果は宿主の有効な免疫応答が阻害されることである。潜在的エピトープはこうした治療目的上抗原性エピトープの新規レパートリーを提供する。同様に、アレルゲンからのこうしたエピトープは、ＩｇＥを促進するＴｈ２応答がアレルゲンの優性エピトープに対し発生された間に治療的Ｔｈ１応答を発生させるための標的を提供する。こうした場合は、優性エピトープを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは、病理学的アレルギー応答を悪化させるかもしれない。
【００７５】
別の局面において、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは、目的の抗原中のエピトープに対する応答に対する患者の臨床診断的若しくは治療的免疫感作において好ましい。すなわち、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドで免疫することは、エピトープペプチドと対照的に、臨床上重要な結果を得るのに必要とされる用量が大きく低減されるため、好ましい。同時に、アレルゲン若しくはそれ以外のいずれかの場合の抗原に対する致死的なアナフィラキシー応答の見込みも低減される。
【００７６】
付加的なアッセイ系を使用して、単一のＭＨＣクラスＩＩエピトープ以外の抗原性エピトープを本発明の増強ハイブリッド中に組込むことの影響を測定し得る。代替の読み上げ（ｒｅａｄｏｕｔ）を伴うアッセイは、制限なしに、Ｂ細胞のからの免疫グロブリン産生の効率を測定すること、細胞傷害性Ｔ細胞生成の効率を測定すること、およびＴ細胞受容体若しくは別の生物学的に関連する分子について非近交系、近交系、コンジェニック、トランスジェニックである動物からの天然のＴ細胞の使用を包含する。
【００７７】
個体の免疫応答の調節方法は疾患若しくは状態を伴う個体の治療的処置での応用を見出す。高められた免疫応答が患者の処置において有益であると考えられる抗原性エピトープを最初に選択する。一態様において、抗原性エピトープが由来する分子は発病においてある役割を演じている。あるいは、抗原性エピトープは、病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）のような有害な病原体（ａｇｅｎｔ）若しくは病原体に感染した細胞上で見出されるエピトープであるかもしれない。本明細書で使用されるところの「治療的処置」という用語は、疾患の兆候若しくは症状を軽減すること、または疾患に罹っていることが同定された若しくはそう考えられる個体での疾患の進行を停止させることを包含することを意図している。本明細書で使用されるところの「予防」という用語は、疾患の認識可能な兆候若しくは症状を経験することを開始していなくてもよい個体における疾患に対する根底にある原因若しくはそれに対する素因を作る関連する因子を軽減することを包含することを意図している。
【００７８】
疾患は、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、リケッチア、若しくは他の感染性病原体またはこうした病原体の組合せにより引き起こされるか若しくはそれらによる感染と関連する感染性疾患であってよい。治療は疾患の毒素若しくは疾患の毒素の受容体に対し向けてよい。エピトープ誘導のための好ましい毒素は、制限なしに、ブドウ球菌のエンテロトキシン、毒性ショック症候群トキシン、レトロウイルス抗原（例えばヒト免疫不全ウイルス由来の抗原）、連鎖球菌抗原、マイコプラスマ、ミコバクテリウムおよびヘルペスウイルスを包含する。高度に好ましい毒素は炭疽毒素（致死因子、浮腫因子および保護因子）、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥ１−３、ＳＥＤおよびＳＥＥである。
【００７９】
疾患若しくは状態は、自己免疫過程、例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、糖尿病、重症筋無力症、自己免疫甲状腺炎、強皮症、皮膚筋炎、天疱瘡および他の類似の過程であると考えてよい。本発明の化合物および方法の効果を評価するのに使用し得る自己免疫疾患のこうしたモデル系の例は、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病および実験的アレルギー性脳脊髄炎である。これらの実験の実施手順は、Ｃｌａｒｋら、（１９９４）米国特許第５，２８４，９３５号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に提示されている。
【００８０】
疾患若しくは状態は、アレルギー過程、例えば喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、局所皮膚炎、大腸炎、および特定のアレルゲンで若しくは定義されたアレルゲンを伴わず開始される若しくはそれらと関連する他のこうした過程であると考えてよい。こうしたアレルゲンの例は、植物、動物、細菌、寄生虫のアレルゲン、および接触感受性を引き起こす金属に基づくアレルゲンである。本発明での使用のための好ましいアレルゲンは、雑草、牧草、ラッカセイ、ダニ、ノミおよびネコ抗原である。
【００８１】
あるいは、疾患若しくは状態は、増殖性若しくは悪性過程、例えば癌、良性前立腺肥大、乾癬、腺腫、あるいは固有の起源の、あるいはウイルスまたは他の感染、刺激若しくは環境過程に応答しての他の細胞増殖であってよい。
【００８２】
本明細書で使用されるところの「哺乳動物」という用語は、ヒト種ならびに全部の他の哺乳動物種を包含することを意味している。本発明の化合物および方法は、全部の哺乳動物種の個体で発生する疾患および状態の処置に応用してよい。本明細書で使用されるところの「個体」という用語は、ヒト種を包含するいずれかの哺乳動物種の１種を指す。ヒト種の個体で発生しかつ例として本明細書で挙げられる疾患および状態は、同一の生物体若しくは病原性の過程によって引き起こされようと、関連する生物体若しくは病原性の過程によって引き起こされようと、未知の若しくは他の既知の生物体および／若しくは病原性の過程によって引き起こされようと、別の種で発生する匹敵する疾患若しくは状態を包含する。本明細書で使用されるところの「医師」という用語は、獣医師、または哺乳動物種の個体の診断および／若しくは処置に参画するいかなる個体もまた包含する。
【００８３】
本発明はまた、適する製薬学的製剤中の薬物、化合物のプロドラッグ、若しくは化合物の薬物代謝物としての化合物の投与も提供する。化合物「の投与」若しくは「を投与すること」という用語は、本発明の化合物を薬物、化合物のプロドラッグ、若しくは化合物の薬物代謝物として疾患の処置若しくは予防の必要な個体に提供することを意味することが理解される。上で示された疾患および状態の１種若しくはそれ以上の処置若しくは予防での使用のための主薬若しくは構成要素の（ｍｅｍｂｅｒ）有効成分として本発明のハイブリッドポリペプチドの１種若しくはそれ以上を含有するこうした薬物は、局所、経口、全身および非経口投与のための慣習的ベヒクル中の多様な治療的投薬形態物で投与し得る。投与経路およびレジメンは治療されるべき疾患若しくは状態に依存して変動することができ、そして当業者により決定されるべきである。例えば、化合物は例えば錠剤、カプセル剤（それぞれ調時放出および徐放性製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁剤、シロップならびに乳剤のような経口の投薬形態物で、若しくは注入により投与し得る。同様に、それらはまた静脈内（ボーラス若しくは注入法のいずれかにより）、腹腔内、皮下、閉塞を伴う若しくは伴わない局所、または筋肉内の剤形で投与してもよい。これらの形態の全部は製薬学的技術の当業者に公知である。
【００８４】
生成物の１日用量は成体あたり１日あたり０．００１から１，０００ｍｇまでの範囲にわたって変動してよい。経口投与については、組成物は、好ましくは、処置の経過における患者の兆候および症状に従った投薬量の症候的調節のために０．００１から１，０００ｍｇまで、好ましくは０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、１０．０、２０．０、５０．０、１００．０ミリグラムの有効成分を含有する錠剤の形態で提供される。薬物の有効量は、通常、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬量レベルで供給される。該範囲は、より具体的には、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから７ｍｇ／ｋｇ体重までである。
【００８５】
有利には、本発明の適する製剤は単一の１日用量で投与してよいか、または、総１日投薬量を例えば１日２、３若しくは４回の分割用量で投与してよい。本発明の増強ハイブリッドポリペプチドを使用して、上に列挙された疾患若しくは状態の処置に有用な薬品若しくは薬剤を製造してよい。さらに、本発明の化合物は、適する鼻内ベヒクルの局所使用を介する経皮剤形で、若しくは当業者に公知の経皮皮膚貼付剤の形態を使用して経皮経路を介して投与し得る。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬量の投与はもちろん、投薬レジメンを通じて間歇的よりはむしろ継続的であることができる。
【００８６】
疾患の処置および予防のため、本発明のハイブリッドポリペプチドは、局所投与のため採用された製薬学的に許容できる担体とともに有効成分を含んでなる製薬学的組成物で投与してよい。局所の製薬学的組成物は、例えば、皮膚への塗布に適合された溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、シャンプー若しくはエアゾル製剤の形態にあってよい。本発明の化合物を含有するこれらの局所製薬学的組成物は、通常、製薬学的に許容できるベヒクルとの混合状態の約０．００５％ないし５重量％の有効成分を包含する。
【００８７】
例えば上に列挙された疾患および状態の処置および予防のため、本発明のハイブリッドポリペプチドをこうした疾患および状態の治療において有用であることが既知の他の剤と一緒に使用してよい。有効成分を同時に投与し得る１種以上の有効成分を用いる組合せ処置のためには、有効成分を同時に投与し得るか、若しくはそれらをずらされた時間で別個に投与し得る。
【００８８】
本発明の組成物を利用する投薬量レジメンは、例えば患者の型、種、齢、重量、性および医学的状態、治療されるべき状態の重症度、ならびに使用されるその特定の化合物を包含する多様な因子に従って選択する。通常の技能の医師は、疾患若しくは状態を予防する、それに対抗する若しくはその進行を停止させるのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方し得る。毒性を伴わないか若しくは許容できる毒性を伴うかのいずれかで有効性を生じる範囲を伴う薬物の濃度の達成における至適の精度は、標的部位への薬物の利用可能性のキネティクスに基づくレジメンを必要とする。この過程は、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を必要とし、そして熟練した実務者の能力内にある。
【００８９】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述される化合物が有効成分となり得、そして、典型的には、意図された投与剤形、すなわち経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関して適して選択されかつ慣習的な製薬学的実務と矛盾しない適する製薬学的希釈剤、賦形剤若しくはカーダー（ｃａｒｄｅｒ）（集合的に「カーダー物質」と本明細書で称される）との混合状態で投与される。例えば、錠剤若しくはカプセル剤の形態での経口投与のためには、有効薬物成分をエタノール、グリセロール、水などのような経口の非毒性の製薬学的に許容できる不活性担体と組合せ得る。さらに、所望の若しくは必要な場合は適する結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた該混合物中に組込み得る。適する結合剤は、制限なしにデンプン、ゼラチン、ブドウ糖若しくはβ−乳糖のような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アラビアゴム、トラガカント若しくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成のガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋などを包含する。これらの投薬形態物で使用される滑沢剤は、制限なしにオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを包含する。崩壊剤は、制限なしにデンプン、メチルセルロース、アガー、ベントナイト、キサンタンガムなどを包含する。
【００９０】
液体剤形は、合成および天然のガム例えばトラガカント、アラビアゴム、メチルセルロースなどのような適して香味を付けられた懸濁化剤若しくは分散助剤であってよい。使用してよい他の分散助剤はグリセリンなどである。非経口投与のためには、滅菌の懸濁剤および溶液が望ましい。静脈内投与が望ましい場合は、一般に適する保存剤を含有する等張の捕食（ｐｒｅｄａｔｉｏｎ）を使用する。
【００９１】
有効薬物成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ若しくはＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどのような当該技術分野で公知の多様な担体物質と混合して例えばアルコール溶液、局所洗浄剤、クレンジングクリーム、皮膚ゲル、皮膚ローションおよびクリーム若しくはゲル製剤のシャンプーを形成し得る。
【００９２】
本発明のハイブリッドポリペプチドはまた、小型単層小胞、大型単層小胞および多層小胞のようなリポソーム送達系の形態でも投与し得る。リポソームは、例えばコレステロール、ステアリルアミンおよび多様なホスファチジルコリンを包含する多様な化合物から形成し得る。
【００９３】
本発明のハイブリッドポリペプチド若しくはその製剤は、薬物の制御放出の達成において有用な一分類の生物分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋若しくは両親媒性ブロックコポリマーに結合してよい。
【００９４】
本発明のハイブリッドポリペプチドおよびそれらの製剤は容易に入手可能な出発原料、試薬および慣習的合成手順を使用して製造し得る。これらの反応において、それら自身が当業者に既知であるがしかし本明細書でより詳細に挙げられない変異体を利用することもまた可能である。
【００９５】
個体のＴリンパ球への抗原性エピトープのＭＨＣクラスＩＩ提示を高めるため個体に本発明の増強ハイブリッドを直接投与することに対する一代替として、抗原提示細胞の一集団を個体から得そして本発明の増強ハイブリッドでｅｘ  ｖｉｖｏで処理してよい。これらの細胞を、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子への増強ハイブリッドの結合に適切な条件下で該ハイブリッドで処理する。一旦処理すれば、抗原提示細胞を個体のＴリンパ球との処理された細胞の物理的接触を促進する条件下で該個体に投与する。上述されたとおり、免疫応答に対する影響（増強若しくは抑制）は、Ｔ細胞のどのサブセットが増強ハイブリッドにより優先的に刺激されるかに依存することができる。免疫応答の増強は、例えば癌細胞若しくは感染性生物体のいずれかに対する細胞傷害性応答に対する好都合な影響を有するかもしれない。あるいは、Ｔサプレッサー細胞応答の増強は、特定の分子に対する免疫応答を抑制する効果を有するかもしれない。こうした抑制は、自己免疫疾患、例えば慢性関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症若しくは紅斑性狼瘡の病因の抗原からの抗原性エピトープを利用する場合に治療効果を有するかもしれない。本発明の化合物および方法を用いる患者からの細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処理のための方法および手順は、以下の特許（それらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）、すなわちＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９８）米国特許第５，１２６，１３２号明細書；Ｃｈａｄａら、（１９９７）米国特許第５，６９３，５２２号明細書；Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、（１９９８）米国特許第５，８４９，５８６号明細書；Ｇｒｕｂｅｒら、（１９９９）米国特許第５，８５６，１８５号明細書；およびＫｒｉｅｇｌｅｒら、（１９９９）米国特許第５，８７４，０７７号明細書から適応させてよい。
【００９６】
別の点に関して、本発明の化合物および方法をｅｘ  ｖｉｖｏ条件下で使用して、Ｃｅｌｉｓら、（１９９８）米国特許第５，８４６，８２７号明細書（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される化合物および方法を使用して細胞傷害性Ｔリンパ球の生成を促進させ得る。
【００９７】
上で論考されたところの本発明の増強ハイブリッド中の要素として有用なエピトープ／決定子の特定の例の非包括的論考を例示の節に提供する。また、こうした要素を含有する増強ハイブリッドの使用方法の論考も対応する例示の節に見出される。当業者は、わずかに慣例の実験の適用により、広範な疾患若しくは状態への応用のために実験で決定若しくは予測されたエピトープ／決定子を増強ハイブリッド中に組込み得る。
【００９８】
別の局面において、本発明は、合成Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドが関するように、古典的な外因性経路でのこうしたペプチドのプロセシングおよびＭＨＣクラスＩＩ分子への結合の間に機能する一次配列モチーフを配列中に有する天然に存在するＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープの同定かつ活用方法に関する。
【００９９】
構成するこうしたＩｉ−Ｋｅｙモチーフの存在若しくは非存在の同定を考えれば、それが存在しなかった場合にこうしたモチーフを導入する、若しくはそれが存在した場合にこうしたモチーフを欠失させる様式でタンパク質のアミノ酸配列を改変し得る。こうした改変は、例えばＩｉ−Ｋｅｙモチーフ中の機能上許容できるアミノ酸を置換する様式での抗原性タンパク質をコードする遺伝子の操作により得られる。いくつかの例において、アミノ酸の欠失若しくは挿入は、例えば抗原性エピトープがタンパク質のＮ末端若しくはその近くに存在する場合に同一端を得ることができる。タンパク質の免疫原性を変えるためのこうした改変は好都合な臨床特性を有する。例えばワクチンのプロモーターは増大された効力を振る舞う（ｂｅｈａｖｅ）ことができる。ある種の治療的タンパク質は低下された免疫原性を有し得る。
【０１００】
別の局面において、本発明は、生物学的に活性のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの選択方法、および抗原性タンパク質若しくはポリペプチド中のこうしたエピトープに対する免疫応答を変える方法に関する。具体的には、本開示は、実験で決定若しくはアルゴリズムで予測されるＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープに先行する５アミノ酸のＩｉ−Ｋｅｙ免疫調節モチーフの存在若しくは非存在のタンパク質のアミノ酸配列中での同定方法を提供する。この免疫調節性Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位中へのそれの後に続く抗原性エピトープの装填を高める。タンパク質内の抗原性エピトープの予測を考えれば、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフにより先行されるそれらのエピトープのサブセットを同定することはワクチンペプチドの選択の効率を大きく向上させる。また、例えば選択されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの前のＩｉ−Ｋｅｙモチーフを導入若しくは排除のいずれかをするようにタンパク質若しくはポリペプチドの配列を改変することにより、そのタンパク質に対する免疫学的応答を変え得る。
【０１０１】
治療的タンパク質に対する有害な免疫学的応答がこうしたタンパク質の使用を制限する可能性がある。こうした有害な免疫学的応答は、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかの免疫原性を低下させること若しくは免疫抑制を誘導することのいずれかにより小さくし得る。いずれの場合についても、ＭＨＣクラスＩＩエピトープの前に適切に間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙモチーフの位置での挿入若しくは変化（１個若しくは複数）が、ＭＨＣクラスＩＩエピトープそれ自身の変化を伴わずにその終点を達成し得る。治療的タンパク質の生物学的機能の喪失を伴わずにＭＨＣクラスＩＩエピトープ内の残基を変えることは可能でないかもしれない。目的の治療的タンパク質の免疫原性および／若しくはそのタンパク質に対する免疫応答を変えるようにその中の配列の改変を設計することにおいて以下の手順に従う。
【０１０２】
タンパク質若しくはそのフラグメントの配列はいくつかの方法の１つにより確立される。タンパク質若しくはそのフラグメントは実験でシークエンシングし得るか、または、配列は、該タンパク質をコードする遺伝子若しくは該タンパク質をコードするＲＮＡから創製したｃＤＮＡいずれかの配列から推定し得る。その一次アミノ酸配列を考えれば、実験で決定若しくはアルゴリズムで予測されるＭＨＣクラスＩＩエピトープが特定される。実験で決定されたエピトープは以前の研究から既知である。アルゴリズムで予測されるエピトープは、ＰｒｏＰｒｅｄ  ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド予測サーバー（Ｒａｇｈａｖａ  ＧＰ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９  １７：５５５−６１）；Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００１  １７：１２３６−７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを介してアクセス））のようないくつかの方法により見出される。代替の一プログラムはＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムである（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  Ｈ−Ｇ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９９  ５０：２１３−２１９（ｈｔｔｐ：／／１３４．２．９６．２２１／ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／Ｅｐ．ｈｔｍｌを介してアクセス））。これらのエピトープはまた、ヒト若しくはマウスのような実験動物の免疫系にＭＨＣクラスＩＩアレルを提示することが既知であるか若しくは予測されるかのいずれかであるＭＨＣクラスＩＩアレルに関しても特徴づけられている。従って、適切な提示するＭＨＣクラスＩＩアレルに従って異なるセットの予測されたエピトープが得られる。いくつかのエピトープは複数のＭＨＣクラスＩＩアレルにより提示され、そして従って好ましい。
【０１０３】
本開示はＩｉ−Ｋｅｙ免疫調節モチーフの同定方法を提示する。とりわけ、タンパク質の配列中で、免疫調節性のＩｉ−Ｋｅｙモチーフは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｈｅおよびＭｅｔを含んでなる群の最低２アミノ酸ならびにＨｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んでなる群の最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸の１セグメントであり、ここでその連続５アミノ酸のセグメントがＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端残基から５ないし１１アミノ酸だけ分離されている。
【０１０４】
適切に間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙモチーフの存在を伴うこうした抗原性エピトープのサブセットは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞免疫応答の効力を高めるためのワクチンペプチドにつながる。こうしたエピトープは優性すなわち生物学的に活性であることがよりありそうであると考えられる。こうしたエピトープをもつペプチドは、感染性疾患および癌に対するワクチン保護として、ならびにアレルギーに対する免疫抑制性ワクチンにとって好ましい。本発明の組成物および方法は：１）ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＣ末端要素；２）Ｉｉ−ｋｅｙモチーフを含んでなるＮ末端要素；および３）約４から約１１アミノ酸残基までの配列を含んでなる介在要素を含有する天然に存在しないタンパク質若しくはポリペプチドに関する。天然に存在しないという用語の使用は、タンパク質若しくはポリペプチドが改変されることを必要とすることを意図している。一般に改変は組換えＤＮＡ技術により、そして、改変（１個若しくは複数）は上で定義されたところの要素２）若しくは３）内で起こる。「ＮおよびＣ末端」という呼称は、具体的に列挙される３部分のセグメント中のこれらの要素の関係のみを指すことを意味している。当業者は、こうした３部分のセグメントがタンパク質内に位置する場合に、付加的な残基はＣ末端要素からＣ末端方向で、およびＮ末端要素からＮ末端方向で伸長することができることがありそうであることを認識するであろう。上述されたところのタンパク質若しくはポリペプチドに加え、本出願はまた、こうしたタンパク質若しくはポリペプチドをコードする発現可能な核酸配列にも向けられる。
【０１０５】
好ましい態様において、天然に存在しないタンパク質若しくはポリペプチドは、改変された形態の天然に存在するタンパク質若しくはポリペプチドである。治療的タンパク質はとりわけ重要な一分類を代表する。こうした改変されたタンパク質若しくはポリペプチドは、それらの改変されない天然に存在する対蹠物により誘導されるものと異なる免疫応答を刺激する。こうした生成物は、ホルモン、サイトカインのような治療的タンパク質、若しくは細胞表面受容体と相互作用する他の分子を包含する。Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフの改変はその機能を排除するように行い得るか、若しくは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフを導入するように推定の抗原性エピトープに対しＮ末端の部位を改変し得る。こうした改変は治療的タンパク質に対する有害な免疫応答を抑制する。こうした産物は治療的タンパク質およびそのフラグメント、ならびにそれらの発現につながる遺伝子構築物を包含する。
【０１０６】
免疫原性を変えるように工作されるべき治療的タンパク質の生物学的機能を混乱させることが最もありそうにない改変は以下を包含する。配列、ならびにタンパク質の結晶学的構造から該タンパク質上に表層的に露出されることが既知かつ従って機能の喪失を伴わずに突然変異を許容することがよりありそうである個々のアミノ酸残基からさえ存在がスコア化される。三次元構造が決定されていない治療的タンパク質の場合には、抗原性エピトープから適切に間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙボックスを工作するような突然変異の容認を予測することに多様な方法が適用される。タンパク質のＮ末端およびＣ末端からの距離を測定する。控えめに変性させる条件下で、Ｎ末端およびＣ末端抗原性エピトープをＭＨＣクラスＩＩ分子により提示させ得る。タンパク質のＮ末端のエピトープは、部分的に、設計されるべきＩｉ−Ｋｅｙボックスがより遠いためにＣ末端のエピトープより好ましい。また、好ましくは比較的自由な配置でタンパク質の表面上にあることが予測される配列の変化がある配列中で許容されることがよりありそうである。こうしたセグメントは天然に存在する突然変異の比較的より高い頻度で相同なタンパク質中で同定し得る。部位特異的突然変異研究においてアミノ酸置換を許容することが示された残基を含有するセグメントを同定する。先行するおよび付加的な方法により、当業者は、機能の喪失を伴わずに抗原性エピトープのＮ末端からの適切なＮ末端の置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）でのＩｉ−Ｋｅｙボックスモチーフの創製をもたらす残基位置でのアミノ酸置換を許容することがよりありそうであるタンパク質のセグメントを予測することができる。以下のペプチド配列、すなわち等級の順序でＭＨＣクラスＩＩに提示されることが既知のエピトープ、ヒトの間で若しくは実験目的の動物系統でのいずれかで最高頻度で存在するＭＨＣクラスＩＩアレルによりＭＨＣクラスＩＩ提示されることが予測されるエピトープ、が、Ｉｉ−Ｋｅｙボックスの操作の標的とされる。これらの方法のいくつかは米国特許第５，６７９，５２７号明細書（１９９７）（その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる）に提示されている。
【０１０７】
上の部位特異的に工作された置換に加え、当業者は、付加的なコンビナトリアル分子生物学的方法を使用して残基位置のセット内に突然変異を生成させて、選択された既知の若しくは推定のいずれかの抗原性エピトープに対しＮ末端に４ないし８アミノ酸間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙボックスモチーフを創製することができる。こうした方法は、生物学的活性の保持を伴う若しくは伴わない変えられた免疫原性についてスクリーニングされる複数の生成物の製造を包含してもよい。
【０１０８】
目的のタンパク質中のそれぞれ実験で決定若しくはアルゴリズムで予測されたエピトープを、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｈｅおよびＭｅｔを含んでなる群の最低２アミノ酸ならびにＨｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んでなる群の最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸の１セグメントのその一次配列中での存在について検査し、ここでその連続する５アミノ酸のセグメントはＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端残基から４ないし１２アミノ酸だけ分離されている。これらの基準と一致する、全部の実験で若しくはアルゴリズムで予測されたエピトープのサブセットは、例えばペプチドワクチンの合成、好都合な治療効果のためのそれらのワクチンの化学修飾、動物での実験的研究および臨床試験を包含する開発研究に好ましい。本開示において、タンパク質若しくはペプチドの配列内のアミノ酸を同定するために国際純正応用化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ）の標準的な一文字命名法を使用する。
【０１０９】
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｈｅおよびＭｅｔを含んでなる群の最低２アミノ酸ならびにＨｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んでなる群の最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸のセグメントの、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端残基からの４ないし８アミノ酸の分離を伴う、実験で若しくはアルゴリズムで予測されたエピトープのセットがより好ましい。このセットは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｈｅおよびＭｅｔを含んでなる群の最低２アミノ酸ならびにＨｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んでなる群の最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸のセグメントの、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端残基からの０ないし１２アミノ酸の分離を伴う、実験で若しくはアルゴリズムで予測されたエピトープのセットの一サブセットを構成する。本方法における重要な一利用性は治療的若しくは診断的開発目標に向かって研究するための候補のエピトープ対象の数の低減である。実験で決定されたか若しくはアルゴリズムで予測されたかのいずれかのエピトープを提示する本開示の例示の表のそれぞれにおいて、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端から４〜１０アミノ酸だけ分離されているＩｉ−Ｋｅｙボックスの存在を、介在する残基位置の数とともに示す。これらの間で、分離する間隔の長さに従って好みが順位付けされ、４個若しくはそれ以上のアミノ酸のスペーサーの間でより短いものがより良好である。
【０１１０】
合成のため選ばれるペプチドは、該タンパク質の天然の一次配列内で、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ、ならびにＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｈｅおよびＭｅｔを含んでなる群の最低２アミノ酸ならびにＨｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んでなる群の最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸のセグメント、０ないし１２アミノ酸の介在セグメント、ならびに１２ないし３４アミノ酸の全長さを含んでなる抗原性エピトープを有する。Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｈｅおよびＭｅｔを含んでなる群の最低２アミノ酸ならびにＨｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んでなる群の最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸のセグメント、４ないし１１アミノ酸の介在セグメント、ならびに１５ないし２５アミノ酸の全長さを含んでなる抗原性エピトープを包含する、該タンパク質の一次配列に従って合成された合成ペプチドがより好ましい。合成ペプチドの配列は通常哺乳動物タンパク質の天然の配列であることができるが、しかしまた、タンパク質は、有用な機能についての選択を伴いコンビナトリアルライブラリーを使用する方法により生成されるもののような非天然の配列であってもよい。さらに、タンパク質の配列は、非天然のアミノ酸の使用を包含する例えば１個若しくはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入若しくは欠失を包含する天然のタンパク質の配列の改変を包含してよい。
【０１１１】
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｈｅおよびＭｅｔを含んでなる群の最低２アミノ酸ならびにＨｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んでなる群の最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸のセグメント、４ないし８アミノ酸の介在セグメント、ならびに１２ないし３４アミノ酸の全長さを含んでなる抗原性エピトープを包含する選択されたペプチドを改変して、好都合な生物学的および薬物動態特性を得ることができる。これらの薬品は：ａ）Ｎ末端のアセチル化、ｂ）Ｃ末端のアミデート化；ｃ）１アミノ酸の別の天然若しくは合成のアミノ酸での置換、ｄ）Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での置換、ｅ）アミノ酸配列の反転および各残基位置でのＤ−アミノ酸の使用、ｆ）タンパク質分解若しくは消失（不活性化）を制限するための改変、ならびにｇ）溶解性、輸送および半減期を改良するための改変よりなる群から選択される。好都合な治療特性のための治療的ペプチドの化学修飾方法は、例えば米国特許第５，６７９，５２７号明細書（その開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に提示されている。
【０１１２】
こうした改変の設計方法は、抗原性エピトープのＮ末端から適切に間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙボックスモチーフを創製するアミノ酸置換を機能の喪失を伴わずに許容することがよりありそうである治療的タンパク質のセグメントを同定するためにいくつかの特徴のそれぞれに従って順位付けされた、同定されたエピトープの一覧を用いて開始する。エピトープが順位付けされる特徴は制限なしに以下を包含する。配列、ならびにタンパク質の結晶学的構造から該タンパク質上に表層的に露出されることが既知かつ従って機能の喪失を伴わずに突然変異を許容することがよりありそうである個々のアミノ酸残基からさえ存在がスコア化される。三次元構造が決定されていない治療的タンパク質の場合には、抗原性エピトープから適切に間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙボックスを工作するための突然変異の許容を予測することに多様な方法が適用される。タンパク質のＮ末端およびＣ末端からの距離を測定する。控えめに変性させる条件下で、Ｎ末端およびＣ末端抗原性エピトープがＭＨＣクラスＩＩ分子により提示され得る。タンパク質のＮ末端のエピトープは、部分的に、設計されるべきＩｉ−Ｋｅｙボックスがより遠いためにＣ末端のエピトープより好ましい。好ましくは比較的自由な配置でタンパク質の表面上にあることが予測される配列モチーフ中の存在。相同なタンパク質中で、天然に存在する突然変異の比較的より高い頻度を有するセグメントを同定し得る。部位特異的突然変異研究においてアミノ酸置換を許容することが示された残基を含有するセグメントを同定する。先行するおよび付加的な方法により、当業者は、以下の等級付けスキーム、すなわち、ＭＨＣクラスＩＩに提示されることが既知のエピトープ、ヒトの間で若しくは実験目的の動物系統のいずれかで最高頻度で存在するＭＨＣクラスＩＩアレルによりＭＨＣクラスＩＩ提示されることが予測されるエピトープ、に従って高度に等級付けされる、機能の喪失を伴わずに抗原性エピトープのＮ末端からの適切なＮ末端の置換でＩｉ−Ｋｅｙボックスモチーフを創製する残基位置でのアミノ酸置換を許容することがよりありそうであるタンパク質のセグメントを予測することができる。これらの方法のいくつかは、米国特許第５，６７９，５２７号明細書（１９９７）（その開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に提示されている。
【０１１３】
Ｉｉ−Ｋｅｙボックス／スペーサーを同定するアルゴリズムを、該タンパク質のアミノ酸配列内で適用して、３つの範疇、すなわちａ）抗原性エピトープに対しＮ末端の４ないし８アミノ酸だけ間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙボックスモチーフの存在、ｂ）１個若しくはそれ以上のアミノ酸が一次配列において群Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔの１メンバーと交換されかつ／または１個若しくはそれ以上のアミノ酸が群Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇの１メンバーと交換された場合は抗原性エピトープに対しＮ末端の４ないし８アミノ酸だけ間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙボックスモチーフの存在、を同定する様式で、上の実験で決定若しくは予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのそれぞれに対しＮ末端の領域を検査する。
【０１１４】
上の部位特異的に工作された置換に加え、当業者は、付加的なコンビナトリアル分子生物学的方法を使用して残基位置のセット内に突然変異を生成させて、選択された既知の若しくは推定のいずれかの抗原性エピトープに対しＮ末端に４ないし８アミノ酸間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙボックスモチーフを創製することができる。こうした方法は、生物学的活性の保持を伴う若しくは伴わない変えられた免疫原性についてスクリーニングされる複数の生成物の製造を包含してもよい。
【０１１５】
Ｉｉ−Ｋｅｙ抗原性エピトープハイブリッドの多くの用途を個々の抗原性タンパク質に関して記述し得る。こうした用途は変動する詳細の程度で実施例に提示されている。１実施例の情況で提示される概念は、にもかかわらず、適切な場合は、それらが各個々の実施例の情況で反復されない場合であっても全部の実施例の場合に当てはまる。一方、こうした特定の実施例は、こうしたＩｉ−Ｋｅｙ抗原性エピトープハイブリッドを目的の他のタンパク質に関して創製かつ使用し得る特定のタンパク質のＩｉ−Ｋｅｙ抗原性エピトープハイブリッドの設計および合成方法を十分に提示する。必要性が時に応じて生じるかもしれないからである。
【０１１６】
別の局面において、本発明は、その後投与されるＤＮＡワクチンに対する保護免疫応答を高めるための、若しくは弱毒化感染性病原体ワクチンに対するＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの使用に関する。こうしたアジュバントワクチン製剤はプレワクチン［ＰｒｅＶａｃｃｉｎｅ］ＴＭと称され得る。一例は、天然痘に対し保護するためのワクチン接種プロトコルでのＩｉ−Ｋｅｙ抗原性エピトープハイブリッドの使用である。天然痘ウイルスに対する保護での使用を、後に続く例示の節の対応する節で相対的により詳細に考慮する。本明細書に詳述される考慮はまた他の病原体に向けられる応用をモデル化するのにも役立つ。天然痘ワクチン接種の場合、Ｉｉ−Ｋｅｙ抗原性エピトープハイブリッドを使用して、ワクシニアのＢ５Ｒウイルス遺伝子によりコードされるｇｐ４２細胞外エンベロープタンパク質の１種若しくはそれ以上のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに対するＴｈ１応答を導き出す。そのようにワクチン接種された個体は、Ｂ５Ｒ遺伝子に対するｃＤＮＡワクチン、ワクシニア若しくは天然痘による攻撃に対する抗体力価ならびにアイソタイプおよび親和性の成熟、ＣＴＬおよび記憶応答に関してより迅速かつより高い効力のものである既往反応を有することができる。関連する一応用において、こうしたプレワクチン［ＰｒｅＶａｃｃｉｎｅ］ＴＭは、Ｉｉ−ＲＧＣ遺伝子若しくはＣＩＴＴＡおよびＩｉ−ＲＧＣ遺伝子のいずれかを含有する組換えワクシニアウイルスでのワクチン接種前に使用し得る。Ｉｉ−ＲＧＣ遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルスは、樹状細胞のような専門的抗原提示細胞内の感染に際して、記述されたところのそれらの細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ拘束性のＴヘルパー細胞応答につながることができる。Ｉｉ−ＲＧＣ遺伝子およびＣＩＩＴＡ遺伝子の双方を含有する組換えワクシニアウイルスの場合には、こうしたウイルスは、樹状細胞のようなＭＨＣクラスＩＩ分子を通常発現しない細胞を感染させることに際して、Ｉｉタンパク質を伴わないＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することができる。ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの広範なレパートリーが従って表され、そしてそれらのエピトープに対する応答はプレワクチン［ＰｒｅＶａｃｃｉｎｅ］ＴＭ中のＭＨＣクラスＩＩエピトープに対する応答の以前の拡張によりさらに高められる。こうした使用は、適切な用量、ベヒクル、経路およびスケジュールでのＩｉ−Ｋｅｙ抗原性エピトープハイブリッドでの哺乳動物の以前の免疫感作によりさらに増強され得る。Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは、従って、独立の保護ワクチンとして、若しくは他のウイルスおよび感染性病原体、例えば制限なしにＨＩＶ、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、エボラウイルスおよびマーブルグウイルスのためのワクチンとともに使用されるプレワクチン［ＰｒｅＶａｃｃｉｎｅ］ＴＭとしてのいずれかで使用し得る。
【０１１７】
例示
【実施例１】
【０１１８】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  １抗原性エピトープハイブリッド。
【０１１９】
一局面において、本発明はラッカセイおよび他の可食性ナッツ類に対する若干のヒトの病理学的アレルギー応答の治療的調節に関する。こうした応答は潜在的に致死的な喘息若しくはアナフィラキシー反応を包含する。これらの病理学的応答を媒介するラッカセイおよび他のナッツ類中の主要なタンパクアレルゲンの同定およびシークエンシングにおいて十分な進歩がなされた。交差放射免疫電気泳動が生のラッカセイ中の１６種のアレルゲン画分を同定し、また、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は３２本のタンパク質バンドを示した（Ｂａｒｎｅｔｔ  Ｄ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８３  ７２：６１−６８）。３種の主要なアレルゲンが同定された。６４．５ｋＤａのＡｒａ  ｈ  １は種子貯蔵タンパク質のビシリンファミリーの１メンバーである（Ｂｕｒｋｓ  ＡＷ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１  ８８：１７２−９）。１７．５ｋＤａのＡｒａ  ｈ  ２は種子貯蔵タンパク質のコングルチンファミリーの１メンバーである（Ｂｕｒｋｓ  ＡＷ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２  ９０：９６２−９）。６０ｋＤａのＡｒａ  ｈ  ３すなわちプレプログロブリンはグリシニン様の種子貯蔵タンパク質の１メンバーである（Ｒａｂｊｏｈｎ  Ｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９  １０３：５３５−４２）。Ａｒａ  ｈ  １について、２３種のＩｇＥに認識されるエピトープがマッピングされ、４種が優性である。Ａｒａ  ｈ  ２については１０種のＩｇＥに認識されるエピトープがマッピングされ、３種が優性である。Ａｒａ  ｈ  ３については４種のＩｇＥに認識されるエピトープがマッピングされ、１種が優性である。これら３種のアレルゲンのそれぞれについて、それぞれのｃＤＮＡが単離かつ発現された。推定されるタンパク質配列を下に提示する（表１．１、２．１および３．１）。
【０１２０】
アレルギーを誘発するＩｇＥ抗体の発生はＣＤ４＋  Ｔ細胞の１サブセットにより調節され、それらの受容体はＭＨＣクラスＩＩ分子により提示される抗原性ペプチドを認識する。ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるこうしたエピトープの認識は、応答するＴ細胞がＩＦＮ−γのような主にある種のサイトカインの合成を特徴とするＴｈ１応答、若しくは応答するＴ細胞がＩＬ−４およびＩＬ−１０のような主に他のサイトカインの合成を特徴とするＴｈ２応答のいずれかにつながる可能性がある。アレルゲン誘発性の喘息を伴う患者において、Ｔｈ２応答パターンは、攻撃アレルゲン（１種若しくは複数）の多くの異なる表面エピトープを認識するＩｇＥ分子の合成を高める。こうしたアレルゲンへのＩｇＥの結合が、喘息の症状をもたらす生物学的メディエーターのカスケードを活性化する。本発明の化合物および方法は、臨床上望ましい影響を得るためのＴｈ１若しくはＴｈ２経路特異的様式での応答の改変に適用し得る。こうした改変を喘息の制御について具体的に説明し得る。
【０１２１】
タンパク質抗原に対する喘息のアレルギー応答の動物研究において、ＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープ内の１個若しくはそれ以上のアミノ酸の置換が、変えられたＴ細胞免疫応答を誘導する潜在的治療薬につながることが発見された。具体的には、こうした変えられた抗原性ペプチドは、喘息応答を促進する主としてＴｈ２応答を主としてＴｈ１応答に変えた（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４：１５８０−８；Ｊａｎｓｓｅｎ  ＥＭ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６５：７２０７−１４）。Ｔｈ２からＴｈ１パターンへのこうした免疫偏向（ｉｍｍｕｎｏｄｅｖｉａｔｉｏｎ）は喘息応答を機能的に抑制する。しかしながら、攻撃アレルゲンのＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ中の個々のアミノ酸の置換は、抗原性ペプチド結合部位中の抗原性ペプチドの結合の効力、ならびに該抗原性ペプチドに応答するＴ細胞受容体のレパートリーを変えることが期待される。患者のＭＨＣクラスＩＩアレルに対する抗原性エピトープペプチドの親和性を、こうした構造の操作により低下させ得る。本発明の方法の重要な一利点は、抗原性エピトープの配列を変えることなくＴｈサブセットの活性化のパターンをＴｈ２経路からＴｈ１経路に免疫偏向させる能力である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は数種の抗原性ペプチドに対するアレル特異的な好みを示しかつ他の抗原性ペプチド（にもかかわらず他のＭＨＣクラスＩＩアレルにより十分に提示されうる）に対し示さないため、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの潜在的に低下される効力の問題は存在しない。事実、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド内のエピトープの提示の効力の増大を考えれば、より広範なＭＨＣクラスＩＩアレルによる提示を期待し得る。配列を改変された抗原性エピトープペプチドを上回るＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの別の臨床上好ましい特徴は、免疫偏向を達成するのに必要とされる用量がはるかにより少なく（１０ないし１００の係数だけ）そして従って潜在的に致死的なアナフィラキシーは起こることがはるかにより少なくありそうであることである。
【０１２２】
別の局面において、本発明はＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  １抗原性エピトープハイブリッドの設計に関する。こうしたＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  １抗原性エピトープハイブリッドは、ラッカセイおよび数種の付加的な可食性ナッツ類で見出されるナンキンマメ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）１（Ａｒａ  ｈ  １）主要アレルゲンタンパク質のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに単純なフレキシブルリンカーにより結合されたＩｉ−ＫｅｙモチーフＬＲＭＫ（配列番号３）および許容できる改変を含んでなる。このアレルゲン（６２６アミノ酸）のアミノ酸配列を表１．１に提示する。Ａｒａ  ｈ  １の配列はＧｅｎＢａｎｋエントリーｇｉ／１１６８３ｇｉ／アレルゲンＡｒａ  ｈ  １から採用した。このタンパク質配列内のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープは、ＳｉｎｇｈのＰｒｏＰｒｅｄ  ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド予測サーバー（Ｒａｇｈａｖａ  ＧＰ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９  １７：５５５−６１）；Ｓｉｎｇｈ，Ｈ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００１  １７：１２３６−７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを介してアクセス））を用いて同定した。ＰｒｏＰｒｅｄプログラムは多くの一般的なＭＨＣクラスＩＩアレルによる提示について配列を評価する。代替の一プログラムはＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムである（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  Ｈ−Ｇ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９９  ５０：２１３−２１９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉ−ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／ｕｎｉ／ｋｘｉ／を介してアクセス））。最高のスコアをもつエピトープを、ＭＨＣクラスＩＩアレルの９０％以上を包括する５１種のＨＬＡ−ＤＲアレルによるそれらの提示について同定した。ＰｒｏＰｒｅｄプログラムを用いて予測された最高のスコアを出すエピトープは実験で抗原性であることがありそうである。表１．２に列挙されるペプチドはＡｒａ  ｈ  １についてのＰｒｏＰｒｅｄプログラム解析において最高のスコアを出すエピトープを有する。表１．２の予測されるＭＨＣクラスＩＩに提示されるＡｒａ  ｈ  １エピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  １ハイブリッドを表１．３に列挙する。予測されるＭＨＣクラスＩＩに提示されるＡｒａ  ｈ  １エピトープとオーバーラップする、実験で定義されたＩｇＥを結合するＡｒａ  ｈ  １エピトープを表１．４に列挙する。予測されたＭＨＣクラスＩＩ  Ａｒａ  ｈ  １エピトープおよび実験で決定されたＩｇＥを結合するＡｒａ  ｈ  １  エピトープを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  １ハイブリッドを表１．５に列挙する。
【０１２３】
【表１】
2006515744.tif 000002
【０１２４】
【表２】
2006515744.tif 000003
【０１２５】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されるＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１２６】
表１．２において、ペプチド：１．２．１、１．２．３、１．２．６、１．２．５および１．２．１８は表１．４の実験で定義されたＩｇＥ結合エピトープとなんらかの程度オーバーラップする。ペプチド１．２．９、１．２．１０、１．２．１１、１．２．１２は組換えの変異Ａｒａ  ｈ  １中の変えられたアミノ酸配列をもつペプチドである（Ｂｕｒｋｓ  ＡＷ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ２４５：３３４−９）。ＩｇＥエピトープはＳｈｉｎら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８  ２７３：１３７５３−９）の研究でさらに定義された。
【０１２７】
【表３】
2006515744.tif 000004
【０１２８】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１２９】
付加的なＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ抗原性エピトープハイブリッドの活性を、スペーサーとしてa−アミノ吉草酸の１残基を用いて試験する。スペーサー構造の系統的変異を伴う一連のハイブリッドの以前の研究において、１個のａｖａ残基をもつハイブリッドはより複雑なスペーサー配列をもついかなるハイブリッドとも同程度活性であったからである。Ａｒａ  ｈハイブリッドにおいて、Ｉｉ−Ｋｅｙ−スペーサー（ＬＲＭＫ−ａｖａ）（配列番号９）配列をＰｒｏＰｒｅｄで同定されたペプチドの第一のアミノ酸（このアミノ酸はＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位のポケット１に嵌ると考えられる）に結合した。
【０１３０】
表１．３のペプチドは後に続くとおり特徴付けられる。ペプチド１．３．１はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド１．２．２．を含有する。ペプチド１．３．２は２アミノ酸だけオーバーラップする、最初の２個のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ（ペプチド１．２．９；１．２．１１）の混成物である。ペプチド１．３．３は最初の４個のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ（ペプチド１．２．１１、１．２．９、１．２．１０、１．２．１２）の混成物である。ペプチド１．３．２および１．３．３は組換えの変異Ａｒａ  ｈ  １（Ｂｕｒｋｓ  ＡＷ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ２４５：３３４−９）中の変えられたアミノ酸配列をもつペプチドである。ペプチド１．３．４はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド１．２．８を含有する。ペプチド１．３．５は６アミノ酸だけオーバーラップする、２個のＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープ（ペプチド１．２．７およびペプチド１．２．８）の混成物である。ペプチド１．３．６はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド１．２．１３を含有する。ペプチド１．３．７はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド１．２．１４を含有する。ペプチド１．３．８はそれぞれ３および４アミノ酸だけオーバーラップする、３個のＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープ（ペプチド１．２．１４、ペプチド１．２．１５およびペプチド１．２．１６）の混成物である。
【０１３１】
【表４】
2006515744.tif 000005
【０１３２】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１３３】
【表５】
2006515744.tif 000006
【０１３４】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は、表１．２の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープおよび表１．４のＩｇＥ結合エピトープを含有する提案されたハイブリッドのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１３５】
表１．５のペプチドは後に続くとおり特徴付けられる。ペプチド１．５．１、１．５．６および１．５．１０は実験で定義されたＩｇＥ結合エピトープの残基を包含する。ペプチド１．５．１、１．５．２、１．５．４、１．５．６、１．５．９および１．５．１０はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの残基を有する。ペプチド１．５．２、１．５．３、１．５．４、１．５．５、１．５．６、１．５．７、１．５．８および１．５．１０は、オーバーラップするＩｇＥ結合エピトープとＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープとの間でアミノ酸を共有する。ペプチド１．５．４、１．５．５、１．５．６、１．５．８、１．５．９および１．５．１０は、オーバーラップするＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ間でアミノ酸を共有する。
【０１３６】
表１．５のペプチドは後に続くとおり特徴付けられる。ペプチド１．５．１は、２アミノ酸だけオーバーラップする、最高のＰｒｏＰｒｅｄ予測結合スコアをもつＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ（ペプチド１．２．１）およびＩｇＥ結合エピトープ（ペプチド１．４．１）の混成物である。ペプチド１．５．２は、８アミノ酸だけオーバーラップする、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ、配列番号４４およびＩｇＥ結合エピトープペプチド１．４．２の混成物である。ペプチド１．５．３は、８アミノ酸だけオーバーラップする、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド１．２．６およびＩｇＥ結合エピトープペプチド１．４．３の混成物である。ペプチド１．５．４は、１アミノ酸だけオーバーラップする、ＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープペプチド１．２．４およびＩｇＥ結合エピトープペプチド１．４．５を含有する。ペプチド１．５．５は、５アミノ酸だけオーバーラップする、ＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープペプチド１．５およびＩｇＥ結合エピトープペプチド１．４．５を含有する。ペプチド１．５．６は、５アミノ酸だけオーバーラップする、２個のＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープペプチド１．２．４およびペプチド１．２．５の混成物である。加えて、ＩｇＥ結合エピトープ（ペプチド１．４．５）との５アミノ酸のオーバーラップが存在する。ペプチド１．５．７は、９アミノ酸だけオーバーラップする、ＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープペプチド１．２．１７およびＩｇＥ結合エピトープペプチド１．４．４．を含有する。ペプチド１．５．８は、６アミノ酸だけオーバーラップする、ＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープペプチド１．１８およびＩｇＥ結合エピトープ１．４．４を含有する。ペプチド１．５．９はＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープペプチド１．２．１９を含有する。ペプチド１．５．１０は、３個のＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープペプチド１．２．１７、１．２．１８および１．２．１９ならびにＩｇＥ結合エピトープペプチド３．１．５の混成物である。ペプチド１．５．５はそれぞれ５および３アミノ酸だけオーバーラップする、３個のＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープ（ペプチド１．２．１７、１．２．１８および１．２．１９）の混成物である。加えて、ＩｇＥ結合エピトープ（ペプチド１．４．４）との９アミノ酸のオーバーラップが存在する。
【実施例２】
【０１３７】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  ２ラッカセイ抗原性エピトープハイブリッド。
【０１３８】
別の局面において、本発明はＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  ２抗原性エピトープハイブリッドの設計に関する。Ｓａｍｐｓｏｎ、第ＷＯ  ００５２１５４号明細書、ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ａｒａ  ｈ  ２  ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ（一連のＡｒａ  ｈ  ２  ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ）、Ｂｕｒｋｓ  ＡＷ．（Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２  ９０：９６２−７）により実験で同定された。Ａｒａ  ｈ  ２特異的Ｔ細胞株は、１２名のアトピーおよび４名の非アトピーの個体の末梢血から樹立した。Ｔ細胞株の全部は優勢にＣＤ４＋  Ｔ細胞であった。これらのＴ細胞株のそれぞれの反応性を、オーバーラップするＡｒａ  ｈ  ２ペプチドのライブラリーからの個々のペプチドに対して試験した。４種の免疫優性Ｔ細胞エピトープ、すなわちエピトープ１（アミノ酸１８−２８）、エピトープ２（アミノ酸４５−５５）、エピトープ３（アミノ酸９５−１０８）およびエピトープ４（アミノ酸１３４−１４４）がＡｒａ  ｈ  ２について同定された。エピトープ１、２および４はＩｇＥ抗体に認識されるエピトープとのオーバーラップ配列を有する一方、エピトープ３はＩｇＥ結合エピトープとオーバーラップしない。Ｂａｎｎｏｎらは、こうした配列が非アナフィラキシー性のＴ細胞に向けられた免疫治療薬の開発のための可能性を提供することを示唆した（Ｂａｎｎｏｎ  ＧＡ．Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １２４：７０−７２）。表２．１中のＡｒａ  ｈ  ２の配列はＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ／１５４１８７０５／アレルゲンＩＩ［ナンキンマメ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）］から採用した。実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるＡｒａ  ｈ  ２エピトープを表２．２に列挙する。表２．２の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるＡｒａ  ｈ  ２エピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  ２ハイブリッドを表２．３に列挙する。Ａｒａ  ｈ  ２の予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープを表２．４に列挙する。表２．４の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるＡｒａ  ｈ  ２エピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  ２ハイブリッドを表２．５に列挙する。表２．４からの予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるＡｒａ  ｈ  ２エピトープとオーバーラップする実験で定義されたＩｇＥ結合Ａｒａ  ｈ  ２エピトープを表２．６に列挙する。予測されたＭＨＣクラスＩＩ  Ａｒａ  ｈ  ２エピトープおよびオーバーラップする実験で決定されたＩｇＥ結合Ａｒａ  ｈ  ２エピトープを含有するハイブリッドを表２．７に列挙する。
【０１３９】
【表６】
2006515744.tif 000007
【０１４０】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で決定されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１４１】
表２．２のペプチドは後に続くとおり特徴付けられる。ペプチド２．２．１、２．２．２、２．２．４および２．２．５はＰｒｏＰｒｅｄで予測されるＭＨＣクラスＩＩに提示される配列である。ペプチド２．２．１はＩｇＥ結合エピトープを含有する。ペプチド２．２．１および２．２．２はＩｇＥ結合エピトープおよびＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのオーバーラップするアミノ酸を有する。Ｐｏｓ．はエピトープの第一のアミノ酸の一次アミノ酸配列中の残基番号である。実験で予測されたエピトープの多くはＰｒｏＰｒｅｄアルゴリズムを用いてもまた、完全に若しくは部分的にのいずれかで予測される。
【０１４２】
【表７】
2006515744.tif 000008
【０１４３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表２．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１４４】
表２．３のペプチドは後に続くとおり特徴付けられる。ペプチド２．３．１は実験で定義されたＩｇＥ結合エピトープを含有する。ペプチド２．３．１および２．３．２は、オーバーラップするＩｇＥ結合エピトープとＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープとの間でアミノ酸を共有する。ペプチド２．３．２および２．３．３は、Ｂｕｒｋｓら（Ｂｕｒｋｓ  ＡＷ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ２４５：３３４−９）の改変Ａｒａ  ｈ  １中に変えられたアミノ酸配列をもつペプチドである。Ｐｏｓ．はエピトープの第一のアミノ酸の一次アミノ酸配列中の残基番号である。
【０１４５】
【表８】
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【０１４６】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１４７】
表２．４のペプチドは後に続くとおり特徴付けられる。ペプチド２．４．１、２．４．５、２．４．６、２．４．８および２．４．１１はアレルギー性のＩｇＥ結合を低下させるように改変されたＡｒａ  ｈ  ２中で保存されないペプチドである。ペプチド２．４．４中で、Ｒ５４がＡにより置換される。ペプチド２．４．７中ではＰ４３およびＱ４６がそれぞれＡにより置換される。ペプチド２．４．２、２．４．４、２．４．９、２．４．１０および２．４．１３は実験で定義されたＴ細胞エピトープである。ペプチド２．４．２、２．４．４、２．４．７、２．４．１０および２．４．１１はＩｇＥ結合エピトープのアミノ酸を有する。
【０１４８】
【表９】
2006515744.tif 000010
【０１４９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表２．４のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１５０】
表２．５のペプチドは後に続くとおり特徴付けられる。ペプチド２．５．１、２．５．２、２．５．３、２．５．４は改変Ａｒａ  ｈ  ２中で保存されないペプチドである。ペプチド２．５．５および２．５．７は実験で定義されたＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープである。
【０１５１】
別の局面において、本発明はＩｇＥパターンからＩｇＧ若しくはＩｇＧサブタイプパターンへのアレルギー患者の抗体応答の免疫偏向を提供する。アレルゲンに対するＩｇＥ抗体の合成の減少および／若しくはＩｇＧ抗体（ＩｇＥ抗体の結合を阻害する）の合成は所望の治療効果を有する。この目的のため、アレルゲンのＭＨＣクラスＩＩエピトープをＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＩｇＥエピトープハイブリッドペプチド中のＩｇＥ結合ペプチド配列と結合する。そのように組合せた配列はアレルゲンの一次アミノ酸配列の異なるセグメントから採用してもよい。例えば、高ＰｒｏＰｒｅｄスコアをもつＭＨＣクラスＩＩエピトープをアレルゲン上のＩｇＥに認識される部位からのペプチドと結合し得る。好ましくは、しかしながら、それら２種のそれぞれのＭＨＣクラスＩＩに提示される部位およびＩｇＥに認識される部位がアレルゲンの一次配列中でオーバーラップする。表２．４からのＭＨＣクラスＩＩに提示されるＡｒａ  ｈ２の２個のエピトープおよび表２．６の実験で決定されたＩｇＥ結合エピトープを結合するこうしたハイブリッドを表２．７に提示する。
【０１５２】
【表１０】
2006515744.tif 000011
【０１５３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で決定されたＩｇＥ結合エピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１５４】
【表１１】
2006515744.tif 000012
【０１５５】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表２．４のＭＨＣクラスＩＩエピトープおよび表２．６のＩｇＥ結合エピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１５６】
表２．７のペプチドは後に続くとおり特徴付けられる。ペプチド２．７．１は予測されかつ実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド７．２を含有し、これはＩｇＥ結合エピトープペプチド２．６．２および２．６．３と一致する。ペプチド２．７．２は予測されかつ実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド７．４を含有し、これはＩｇＥ結合エピトープペプチド２．６．４および２．６．５と一致する。ペプチド２．７．３は予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド７．７を含有し、これはＩｇＥ結合エピトープペプチド２．６．４と一致する。ペプチド２．７．４はＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド７．４および７．７、ならびにＩｇＥ結合エピトープペプチド２．６．４および２．６．５を含有する。ペプチド２．７．５はＩｇＥ結合エピトープペプチド２．６．４とオーバーラップするＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド７．１０を含有する。ペプチド２．７．６は、ＩｇＥ結合エピトープペプチド２．６．１とオーバーラップするＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド７．１１を含有する。
【実施例３】
【０１５７】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  ３ラッカセイ抗原性エピトープハイブリッド。
【０１５８】
別の局面において、本発明はＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  ３抗原性エピトープハイブリッドの設計に関する。ＲａｂｊｏｈｎらはラッカセイアレルゲンＡｒａ  ｈ３の分子クローニングおよびＴ細胞エピトープ解析を報告した（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９  １０３：５３５−４２）。表３．１中のＡｒａ  ｈ  ３の配列はＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ／３７０３１０７／グリシンから採用した。Ａｒａ  ｈ  ３の予測されるＭＨＣクラスＩＩエピトープを表３．２に列挙する。表３．２のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／Ａｒａ  ｈ  ３ハイブリッドを表３．３に列挙する。予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるＡｒａ  ｈ  ３エピトープとオーバーラップする、実験で定義されたＩｇＥ結合Ａｒａ  ｈ  ３エピトープを表３．４に列挙する。実験で定義されたＩｇＥ結合エピトープとオーバーラップする予測されたＭＨＣクラスＩＩ  Ａｒａ  ｈ  ３エピトープを含有するハイブリッド表３．５。
【０１５９】
【表１２】
2006515744.tif 000013
【０１６０】
【表１３】
2006515744.tif 000014
【０１６１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１６２】
【表１４】
2006515744.tif 000015
【０１６３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表３．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０１６４】
ペプチド３．３．１はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．２を含有する。ペプチド３．３．２はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．１を含有する。ペプチド３．３．３は、７アミノ酸だけオーバーラップする、２個のＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ（ペプチド３．２．１および３．２．２）の混成物である。ペプチド３．３．４はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．３を含有する。ペプチド３．３．５はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．３．６を含有する。ペプチド３．２．６はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．８を含有する。ペプチド３．３．７は、７アミノ酸だけオーバーラップする、２個のＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ（ペプチド３．２．９および３．２．８）の混成物である。ペプチド３．３．８はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．７を含有する。ペプチド３．３．９はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．１０を含有する。ペプチド３．３．１０はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．１１を含有する。ペプチド３．３．１１はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．１１を含有する。ペプチド３．３．１２はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．１３を含有する。ペプチド３．３．１３は、７アミノ酸だけオーバーラップする、２個のＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ（ペプチド３．２．１２および３．２．１３）を含有する。ペプチド３．３．１４はＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープペプチド３．２．１４を含有する。
【０１６５】
【表１５】
2006515744.tif 000016
【０１６６】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１６７】
【表１６】
2006515744.tif 000017
【０１６８】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は、表３．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープおよび表３．４のＩｇＥ結合エピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０１６９】
表３．５のペプチドは後に続くとおり特徴付けられる。ペプチド３．５．１〜３．５．４はＩｇＥ結合エピトープとＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープとの間のアミノ酸を共有する。ペプチド３．５．１は、実験で定義されたＩｇＥ結合エピトープペプチド１３．１と一致する、予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド３．２．５を含有する。ペプチド３．５．２は、実験で定義されたＩｇＥ結合エピトープペプチド３．４．１と一致する、予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド３．５．４を含有する。ペプチド３．４．３は、実験で定義されたＩｇＥ結合エピトープペプチド３．４．１と一致する、予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープペプチド３．２．６を含有する。ペプチド３．４．４は、ＩｇＥ結合エピトープペプチド３．４．１と一致する、３個のＰｒｏＰｒｅｄで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ（ペプチド３．２．４、３．２．５および３．２．６）の混成物である。
【実施例４】
【０１７０】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １ネコ鱗屑抗原性エピトープハイブリッド。
【０１７１】
別の局面において、本発明はＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １抗原性エピトープハイブリッドの設計に関する。こうしたＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １抗原性エピトープハイブリッドは、機能上許容できるリンカーによってネコ鱗屑のＦｌ  ｄ  １主要アレルゲンタンパク質のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに結合されたＩｉ−ＫｅｙモチーフＬＲＭＫ（配列番号３）および改変を含んでなる。表４．１中のＦｅｌ  ｄ  １の鎖１および２のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ／１０８２９４５／鎖１およびｇｉ／１０８２９４６／鎖２（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ＪＰ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  ８８：９６４０−４）から採用した。表４．２に列挙されるＦｅｌ  ｄ  １（鎖１）のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープは、ＰｒｏＰｒｅｄプログラム解析で最高スコアをもつものを包含する。表４．３は表２の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖１）ハイブリッドを提示する。表４．４はネコ鱗屑アトピーのヒトでアレルギー応答を導き出すＦｅｌ  ｄ  １（鎖１）のＭＨＣクラスＩＩに提示されるペプチドを提示する（Ｈａｓｅｌｄｅｎ  ＢＭ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９９  １８９：１８８５−９４）。表４．５は表４．４の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖１）ハイブリッドを提示する。表４．６はＦｅｌ  ｄ  １（鎖２）の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを提示する。表４．７は表４．６のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖２）ハイブリッドを提示する。表４．８はネコ鱗屑アトピーのヒトでアレルギー応答を導き出すＦｅｌ  ｄ  １（鎖２）のＭＨＣクラスＩＩに提示されるペプチドを提示する（Ｈａｓｅｌｄｅｎ  ＢＭ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９９  １８９：１８８５−９４）。表４．９は表４．８のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖２）ハイブリッドを提示する。エピトープペプチドのいくつかは単独で診察室でのネコ鱗屑アレルゲン攻撃に対し低応答性を誘導し得る（Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＷＬ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６７：１７３４−９；Ｍａｚｚａｒｅｌｌａ  Ｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２０００  ６１：６−９）ため、対応するハイブリッドは臨床検査若しくは治療の間にアナフィラキシーを誘発するのにより強力かつより少なく感受性であることができる。こうした分析および治療方法はＬａｒｃｈｅ  Ｍ．第ＷＯ９９／３４８２６号明細書および米国特許第６，１２０，７６９号明細書（２０００）（引用することにより本明細書に組み込まれる）に提示されている。
【０１７２】
喘息は、変動可能な気流閉塞、気管支過剰応答性および気道の炎症を特徴とする肺の複雑な炎症性疾患である。喘息における炎症は肥満細胞、リンパ球および好酸球による気道浸潤よりなる。Ｔｈ２サイトカインパターンをもつＣＤ４＋細胞が喘息の病因において中枢的役割を演じているという蓄積している証拠が存在する。これらの細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３のようなサイトカインの遊離により、アレルギー応答の主要なエフェクター細胞（肥満細胞および好酸球）の動員および活性化を調整する。アレルギー性の炎症もまた気道上皮の変化に関わっているが、とは言え炎症細胞およびとりわけＴ細胞が上皮と相互作用する機構は完全には解明されていない。
【０１７３】
卵アルブミン誘発性喘息応答におけるマウスのスーパーアゴニストの（ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔｉｃ）Ｔｈ１−ｓｋｅｗｉｎｇペプチド３３６Ｅ−Ａ（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＡＡＧＲ）（配列番号１３０）での処理は、Ｔｈ１様サイトカインプロファイル、ならびに気道の好酸球増加ならびにＯＶＡ特異的ＩＬ−４およびＩＬ−５産生の有意の減少をもたらした（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４：１５８０−８；Ｊａｎｓｓｅｎ  ＥＭ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６５：７２０７−１４）。これらの研究において、野性型配列（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ）（配列番号１３１）を、相同体中でそれぞれ全部のアラニン以外の残基位置での単一アラニン置換により改変した。
【０１７４】
この研究の原理を拡大して、Ｐｅｎｅらは、Ｆｅｌ  ｄ  １特異的な血清ＩｇＥおよびＩｇＧレベルならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏのＩＬ−４およびＩＦＮ−a産生に対する標準化Ｆｅｌ  ｄ  １ネコ抽出物を用いる気管支刺激試験に対する応答に対するＦｅｌ  ｄ  １ペプチドでの免疫治療の効果を検査した（Ｐｅｎｅ  Ｊ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１０２：５７１−８）。ネコに対しアレルギー性の患者が低用量、中用量若しくは高用量のＦｅｌ  ｄ  １ペプチド若しくはプラセボの６回の週１回注入を受領した。免疫治療が終了して６週後に、処置後ＰＤ２０努力呼気量／１ｓｅｃは処置群とプラセボ群との間で有意に異ならなかった。しかしながら、中および高用量群では、ベースラインと処置後の日との間に有意の改善が存在した。ＩＬ−４遊離は高用量処置群で有意に低下された一方、それは低若しくは中用量およびプラセボ処置群で変化しなかった。全群で、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥおよびＩｇＧレベルは未変化のままであった。該研究者は、ＰＤ２０ＦＥＶ１の改善とＩＬ−４産生の減少との間に相関が存在しなかったと結論した。彼らは、ペプチド免疫治療がｉｎ  ｖｉｔｒｏの末梢血単核細胞のＦｅｌ  ｄ  １誘発性の応答をＴｈ２様からＴｈ０様の表現型に移動させることにより作用しうることを示唆した。下に提示されるＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは、これらの研究者の実験で試験されたＭＨＣクラスＩＩエピトープのいくつかを包含し、そして、以前に提示された理由から、診断および治療の応用においてより大きな効力のものでありかつより広範囲の安全性を有することを予測し得る。
【０１７５】
先行する研究の後にＡＬＬＥＲＶＡＸ  ＣＡＴの調製物が続き、ネコ（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）ネコアレルゲンＦｅｌ  ｄ１鎖Ｉからの複数のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの領域を含有する２７アミノ酸の２種のペプチドを含有するペプチドワクチンが、ＦＣ１Ｐ１、ＬＦＬＴＧＴＰＤＥＹＶＥＱＶＡＱＹ（配列番号１３２）；ＦＣ１Ｐ２、ＥＱＶＡＱＹＫＡＬＰＶＶＬＥＮＡ（配列番号１３３）；およびＦＣ１Ｐ３、ＫＡＬＰＶＶＬＥＮＡＲＩＬＫＮＣＶ（配列番号１３４）を生じた。
【０１７６】
Ｆｅｌ  ｄ  １の鎖１および鎖２の推定されるアミノ酸配列を表４．１に提示する（＞ｇｉ｜１０８２９４５｜ｐｉｒ｜｜Ｂ５６４１３主要アレルゲンＦｅｌ  ｄＩ鎖１、短い形態−ネコ；＞ｇｉ｜１０８２９４６｜ｐｉｒ｜｜Ｃ５６４１３主要アレルゲンＦｅｌ  ｄＩ鎖２前駆体−ネコ）。Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖１）の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表４．３に列挙する。表４．２の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖１）ハイブリッドを表４．３に列挙する。実験で定義されたＦｅｌ  ｄ  １鎖１のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表４．４に列挙する。表４．４のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖１）ハイブリッドを表４．５に列挙する。Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖２）の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表４．６に列挙する。表４．６のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ（鎖２）ハイブリッドを表４．７に列挙する。実験で決定された／Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖２）のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表４．８に列挙する。表４．８のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／Ｆｅｌ  ｄ  １（鎖２）ハイブリッドを表４．９に列挙する。
【０１７７】
【表１７】
2006515744.tif 000018
【０１７８】
【表１８】
2006515744.tif 000019
【０１７９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１８０】
【表１９】
2006515744.tif 000020
【０１８１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１８２】
【表２０】
2006515744.tif 000021
【０１８３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は、ネコ鱗屑に対するアレルギーをもつ患者において応答を導き出すことが見出されたある種のペプチドのアミノ酸配列である（Ｈａｓｅｌｄｅｎ  ＢＭ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９９  １８９：１８８５−９４）。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ペプチド４．４．２はＦＣ１Ｐ１からであり；ペプチド４．４．３はＦＣ１Ｐ２からであり；ペプチド４．４．４はＦＣ１Ｐ３からである（Ｈａｓｅｌｄｅｎ  ＢＭ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９９  １８９：１８８５−９４）。
【０１８４】
【表２１】
2006515744.tif 000022
【０１８５】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１８６】
【表２２】
2006515744.tif 000023
【０１８７】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１８８】
【表２３】
2006515744.tif 000024
【０１８９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。
【０１９０】
【表２４】
2006515744.tif 000025
【０１９１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で決定されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０１９２】
【表２５】
2006515744.tif 000026
【０１９３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。
【実施例５】
【０１９４】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｐｈｌ  ｐ  １花粉抗原性エピトープハイブリッド。
【０１９５】
別の局面において、本発明はＩｉ−Ｋｅｙ／Ｐｈｌ  ｐ  １花粉抗原性エピトープハイブリッドの設計および使用に関する。Ｌａｆｆｅｒらは主要アレルゲンＰｈｌ  ｐ  ＩのｃＤＮＡをチモシー牧草（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）から得、そして、組換えタンパク質Ｐｈｌ  ｐ  Ｉが８種の異なる牧草種から調製した群ＩアレルゲンへのＩｇＥ結合を阻害することを見出した（Ｌａｆｆｅｒ  Ｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４  ９４：６８９−９８）。Ｐｈｌ  ｐ  １（チモシー牧草（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）の主要花粉アレルゲン）のＴ細胞エピトープの研究において、Ｓｃｈｅｎｋ  Ｓ．らは、牧草の群Ｉアレルゲン内の交差反応性および非交差反応性Ｔ細胞エピトープの証拠を見出した（Ｓｃｈｅｎｋ  Ｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ９６：９８６−９６）。多様な精製された組換えチモシー牧草花粉（チモシー（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ））アレルゲン（Ｐｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ  ５）の免疫学的特徴がこうした交差反応に関して特徴付けられた（Ｖｒｔａｌａ  Ｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  ９７：７８１−７）。多様な非アナフィラキシー性の合成ペプチドを、アレルギーワクチン接種のため主要牧草花粉アレルゲンＰｈｌ  ｐ  １の抗体に認識されるエピトープから得た（Ｆｏｃｋｅ  Ｍ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００１  １５：２０４２−４）。これらのエピトープのいくつかが表５．７のＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＩｇＧエピトープハイブリッドに取り込まれている。関連する研究において、ＢｌａｈｅｒらはＬｏｌ  ｐ  ９（ライグラス（ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ））花粉の主要アレルゲン）のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを同定した（Ｂｌａｈｅｒ  Ｂ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６  ９８：１２４−３２）。
【０１９６】
表５．１中のＰｈｌ  ｐ  Ｉアレルゲン［チモシー（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）］の配列はＧｅｎＢａｎｋ  ４７３３６０、Ｐｈｌ  ｐ  Ｉアレルゲンから採用した。Ｐｈｌ  ｐ  １の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表５．２に列挙する。表５．２のＭＨＣクラスＩＩに提示されるＰｈｌ  ｐ  １エピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／Ｐｈｌ  ｐ  １ハイブリッドを表５．３に列挙する。Ｐｈｌ  ｐ  １の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表５．４に列挙する。表５．４の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／Ｐｈｌ  ｐ  １ハイブリッドを表５．５に列挙する。ＭＨＣクラスＩＩに提示されるＰｈｌ  ｐ  １エピトープとオーバーラップする、Ｐｈｌ  ｐ  １の実験で定義されたＩｇＥ結合エピトープを表５．６に列挙する。実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩおよびＩｇＥ結合Ｐｈｐ  １エピトープを包含するハイブリッドペプチドを表５．７に列挙する。
【０１９７】
【表２６】
2006515744.tif 000027
【０１９８】
【表２７】
2006515744.tif 000028
【０１９９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０２００】
【表２８】
2006515744.tif 000029
【０２０１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。
【０２０２】
【表２９】
2006515744.tif 000030
【０２０３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０２０４】
Ｐｈｌ  ｐ  １の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩエピトープは、牧草の群Ｉアレルゲン、すなわちＬｏｌ  ｐ  １（ライグラス、ホソムギ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ））、Ｓｅｃ  ｃ  １（ライムギ、ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）内で交差反応する（Ｓｃｈｅｎｋ  Ｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ９６：９８６−９６）。とりわけ、ペプチド５．４．１のエピトープはＬｏｌ  ｐ  １（Ａ９７がＳ９７により置換されている）と交差反応し、また、Ｓｅｃ  ｃ  １（Ｉ８９がＬ８９により置換されている）と交差反応する。ペプチド５．４．２のエピトープはＬｏｌ  ｐ  １およびｓｅｃ  ｃ  １（Ａ１２４がＤ１２４により置換されている）と交差反応する。
【０２０５】
【表３０】
2006515744.tif 000031
【０２０６】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０２０７】
【表３１】
2006515744.tif 000032
【０２０８】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ＩｇＥ結合エピトープを含有するペプチドはＦｏｃｋｅらにより定義された（Ｆｏｃｋｅ  Ｍ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００１  １５：２０４２−４）。ペプチド５．６．３は、ＩｇＥエピトープを含有するペプチド（Ｆｏｃｋｅ  Ｍ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００１  １５：２０４２−４）とオーバーラップする、Ｐｈｌ  ｐ  １の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩエピトープ（Ｓｃｈｅｎｋ  Ｓ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ９６：９８６−９６）を包含する。
【０２０９】
【表３２】
2006515744.tif 000033
【０２１０】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ペプチド５．７．１は、Ｐｈｌ  ｐ  １の実験で定義されたＩｇＥエピトープ（Ｆｏｃｋｅ  Ｍ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００１  １５：２０４２−４）およびＰｈｌ  ｐ  １の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩエピトープ（Ｓｃｈｅｎｋ  Ｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ９６：９８６−９６）を包含する。
【実施例６】
【０２１１】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｐｈｌ  ｐ  ５ａカバノキ花粉抗原性エピトープハイブリッド。
【０２１２】
別の局面において、本発明はＩｉ−Ｋｅｙ／Ｐｈｌ  ｐ  ５ａカバノキ花粉抗原性エピトープハイブリッドの設計および使用に関する。主要カバノキ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ  Ｉ上の複数のＴ細胞エピトープは特異的Ｔ細胞クローンおよびオーバーラップペプチドを使用して決定された（Ｅｂｎｅｒ  Ｃ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３  １５０：１０４７−５４）。Ｖｒｔａｌａらは、主要カバノキ花粉アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １が２フラグメントに分割され得、そのそれぞれが非アナフィラキシー性Ｔ細胞エピトープを含有しかつ抑制的免疫治療の候補であることを見出した（Ｖｒｔａｌａ  Ｓ．  Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  １１３：２４６−８；Ｖｒｔａｌａ  Ｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７  ９９：１６７３−８１）。Ｆｒｉｅｄｌ−Ｈａｊｅｋ  Ｒ．らは、２例のカバノキ花粉アレルギーの個体由来かつＢｅｔ  ｖ  １に特異的な、カバノキ主要アレルゲンＢｅｔ  ｖ  １Ｆｉｖｅ  Ｂｅｔ  ｖ  
１特異的Ｔ細胞クローン中の高度に有望なＨＬＡアレル特異的Ｔ細胞エピトープを特徴付けした（Ｆｒｉｅｄｌ−Ｈａｊｅｋ  Ｒ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．１９９９  ２９：４７８−８７）。これらのＴ細胞クローンの１種がアミノ酸残基２１−３３を含有するＢｅｔ  ｖ  １ペプチド（ＢＰ２１）と反応し、他の２種のＴ細胞クローンは残基３７−４５を含有する最小ペプチド（ＢＰ３７）と反応した。ＢＰ３７特異的Ｔ細胞クローンはＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３０１／ＤＱＢ１＊０６０３ヘテロ二量体により拘束された一方、ＢＰ２１は高度に有望な様式で認識された。この配列を認識するＴ細胞クローンは、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０２０１／ＤＱＢ１＊０２０１ヘテロ二量体、若しくはＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０１０１により拘束された。
【０２１３】
表６．１中のＰｈｌ  ｐ  ５ａカバノキ花粉タンパク質の配列はＧｅｎＢａｎｋ  ２８５１４５６（Ｂｕｆｅ  Ａ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．１９９４  ９４：１７３−８１）から採用した。Ｐｈｌ  ｐ  ５ａの予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表６．２に列挙する。Ｐｈｌ  ｐ  ５ａおよびＰｈｌ  ｐ  ５ｂの実験で定義された交差反応するＭＨＣクラスＩＩイソエピトープ（ｉｓｏｅｐｉｔｏｐｅ）を表６．３に列挙する（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．１９９８  ２８：１５３８−４８）。Ｐｈｌ  ｐ  ５のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを表６．４に列挙する。
【０２１４】
【表３３】
2006515744.tif 000034
【０２１５】
【表３４】
2006515744.tif 000035
【０２１６】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されるＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０２１７】
【表３５】
2006515744.tif 000036
【０２１８】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で決定されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ペプチド６．３．１はペプチドＰｈｌ  ｐ  ５ｂ（１８４−１９５；ＹＫＣＩＰＳＬＥＡＡＶＫ）（配列番号２３４）に対応し、また、ペプチド６．３．２はペプチドＰｈｌ  ｐ  ５ｂ（１３６−１４７；ＬＱＩＩＤＫＩＤＡＡＦＫ（配列番号２３５）に対応する（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．１９９８  ２８：１５３８−４８）。
【０２１９】
【表３６】
2006515744.tif 000037
【０２２０】
【表３７】
2006515744.tif 000038
【０２２１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【実施例７】
【０２２２】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ホスホリパーゼＡ−２ハチ毒抗原性エピトープハイブリッド。
【０２２３】
別の局面において、本発明はＩｉ−Ｋｅｙ／ホスホリパーゼＡ−２ハチ毒抗原性エピトープハイブリッドの設計および使用に関する。Ｍｕｌｌｅｒらは、ハチ毒ホスホリパーゼＡ２のＴ細胞に認識されるペプチドでの免疫治療を用いて、ハチ毒に対しアレルギー性の患者において特異的Ｔ細胞アネルギーを成功裏に誘導した（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｕ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  １０１：７４７−５４）。ハチ刺創に対するＩｇＥ媒介性の全身アレルギー反応を伴う５例の患者をＰＬＡの３種のＴ細胞エピトープペプチドの混合物で処置した。全ＢＶ免疫治療を受領するＢＶに対しアレルギー性の１０例の患者が対照被験体としてはたらいた。１００マイクログラムの維持用量までの増大する用量のペプチド混合物を２ヶ月以内に皮下に投与した。患者をその後ＰＬＡでおよび１週間後にハチ刺創で攻撃した。細胞性および体液性免疫応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定した。ペプチド免疫治療によりアレルギー性の副作用は引き起こされず、また、全患者が全身性のアレルギー症状を伴わずにＰＬＡでの攻撃を耐えた。２例の患者がハチ刺創攻撃後に軽度の全身性のアレルギー反応を発生した。ペプチド免疫治療後、末梢血単核細胞でのＰＬＡおよびペプチドに対する特異的増殖応答は、成功裏に治療された患者で減少した。ＴＨ２およびＴＨ１サイトカインの産生が阻害され、また、Ｂ細胞は特異的ＩｇＥおよびＩｇＧ４抗体を産生するそれらの能力に影響を及ぼされなかった。それらのレベルはアレルゲン攻撃後にＩｇＧ４に好都合に増大した。該研究者は、ＰＬＡの短いＴ細胞ペプチドを用いるＢＶアレルギーの免疫治療が、末梢Ｔ細胞においてエピトープ特異的なアネルギーを誘導し、また、成功裏に治療された患者において慣習的免疫治療のものに類似の様式で特異的アイソタイプ比を変化させると結論した。付加的なＭＨＣクラスＩＩに提示される候補エピトープが同定されている（Ｔｅｘｉｅｒ  Ｃ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  １６４：３１７７−８４）。
【０２２４】
表７．１中のハチ毒ホスホリパーゼＡ−２の配列はＧｅｎＢａｎｋ  １２９５０１アレルゲンＡｐｉ  ｍ１から採用した（Ｋｕｃｈｌｅｒ  Ｋ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９  １８４：２４９−５４）。主要ハチ毒アレルゲン、ホスホリパーゼＡ−２の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表７．２に列挙する。表７．３。主要ハチ毒アレルゲン、ホスホリパーゼＡ−２の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表７．３に列挙する。表１および２のＭＨＣクラスＩＩに提示されるＰＨＬ  Ａ２エピトープ（オーバーラップしないおよびオーバーラップするエピトープ）のいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／ＰＨＬ  Ａ２ハイブリッドを表７．４に列挙する。
【０２２５】
【表３８】
2006515744.tif 000039
【０２２６】
【表３９】
2006515744.tif 000040
【０２２７】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
表７．３。主要ハチ毒アレルゲンホスホリパーゼＡ−２の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ。
【０２２８】
【表４０】
2006515744.tif 000041
【０２２９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で決定されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。上のエピトープはＴｅｘｉｅｒらおよびＣａｒｂａｌｌｉｄｏら（Ｔｅｘｉｅｒ  Ｃ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４：３１７７−８４；Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ  Ｊ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３  １５０：３５８２−９１）により定義された。
【０２３０】
【表４１】
2006515744.tif 000042
【０２３１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【実施例８】
【０２３２】
Ｂｌａ  ｇ  ５グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ゴキブリ抗原性エピトープハイブリッド。
【０２３３】
別の局面において、本発明はＩｉ−Ｋｅｙ／Ｂｌａ  ｇ  ５グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ゴキブリ抗原性エピトープハイブリッドの設計および使用に関する。ゴキブリアレルゲンへの感作は喘息の発症と関連する。この抗原性タンパク質は、ゴキブリに対しアレルギー性である患者の７０％において陽性の皮膚試験反応を誘発することが見出された。２３ｋＤａのアレルゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．５．１．１８；ＧＳＴ）をグルタチオンアフィニティークロマトグラフィーによりチャバネゴキブリ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）から精製した（Ａｒｒｕｄａ  ＬＫ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７  ２７２：２０９０７−１２）。精製されたタンパク質および組換えタンパク質は高レベルのＩｇＥ抗体結合活性を有した。このＧＳＴは、約３ｐｇの組換えタンパク質を使用してゴキブリアレルギーの患者において陽性の即時皮膚試験を引き起こした。Ｂｌａ  ｇ  １およびは複数のタンデムのアミノ酸リピートより構成される分子構造を有する。２個の連続するリピートは同一でないが、しかしＢｌａ  ｇ  １の塩基性分子ユニットを構成する二重鎖を形成する（Ｐｏｍｅｓ  Ａ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、２００２  １６５：３９１−７）。２個のリピートの存在はＩｇＥ抗体結合に対する要件でなかった（Ｐｏｍｅｓ  Ａ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２  ２６９：３０８６−３０９２）。その事実は、抗原中の１個のリピートの単一の直鎖がＩｇＥ結合エピトープを発現することが見出され得るという見解を支持する。Ｂｌａ  ｇ  ２は最も強力なゴキブリアレルゲンの１種であり（６０ないし８０％のＩｇＥ応答の頻度）、そして酵素のアスパラギン酸プロテイナーゼファミリーに対する相同性を示す。酵素活性の変異的破壊はアレルゲン性を変えなかった（Ｐｏｍｅｓ  Ａ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、２００２  １６５：３９１−７）。ゴキブリアレルゲンＢｌａ  ｇ  ２、Ｂｌａ  ｇ  ４およびＢｌａ  ｇ  ５、ならびにダニ群５アレルゲンの組換えタンパク質が細菌発現ベクター中で産生され、そして、ゴキブリアレルギーの患者における強い即時皮膚および血清ＩｇＥ抗体応答を示した（Ｃｈａｐｍａｎ  ＭＤ．Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  １１３：１０２−４）。組換えアレルゲンのそれぞれは生物学的活性を保持し、そして、該研究者は、２ないし４種の組換えアレルゲンのカクテルを診断若しくは治療目的上使用し得ることを示唆した。優性の直鎖状ＩｇＥ結合エピトープは報告されていないが、しかしそれらが決定されたようになる場合、Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｂｌａ  ｇ  ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＢＬＡ  ｇ  ＩｇＥに認識されるハイブリッドペプチドを設計かつ試験し得る。
【０２３４】
表８．１中のゴキブリアレルゲンＢＬＡ  ｇ  ５の配列はＧｅｎＢａｎｋ  ６２２５４９１（Ａｒｒｕｄａ  ＬＫ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７  ２７２：２０９０７−１２）から採用した。ゴキブリアレルゲンＢｌａ  ｇ  ５の予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープを表８．２に提示する。Ｂｌａ  ｇ  ５の実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩエピトープ（Ｐａｐｏｕｃｈａｄｏ  ＢＧ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０００  ５５：３０３−１１）を表８．３に提示する。
【０２３５】
【表４２】
2006515744.tif 000043
【０２３６】
【表４３】
2006515744.tif 000044
【０２３７】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０２３８】
【表４４】
2006515744.tif 000045
【０２３９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で決定されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【実施例９】
【０２４０】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＣＥＡ抗原性エピトープハイブリッド。
【０２４１】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、結腸、乳房および膵を包含する腫瘍中で発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。タンパク質およびｃＤＮＡが治療的腫瘍ワクチンに使用されている。組換えワクシニア−ＣＥＡワクチンがヒト癌胎児性抗原エピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を生成させるのに使用されている（Ｔｓａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドを、いずれかの形態のＤＮＡワクチンの前にこの腫瘍関連抗原に対するＴヘルパー細胞応答を発生させるのに使用し得る。従って、こうした組換えワクシニア−ＣＥＡ構築物の臨床的価値は、本開示に記述されるところの本発明の生成物および方法を用いて実質的に高め得る。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＣＥＡ抗原性エピトープハイブリッドを適用し得る付加的なＣＥＡワクチン接種手順を下に提示する。
【０２４２】
Ｒｅｉｓｆｅｌｄらは、ヒトＣＥＡに対する経口ＤＮＡワクチンがＣＥＡトランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌の増殖および播種を予防したことを示した（Ｎｉｅｔｈａｍｍｅｒ  ＡＧ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１  ２０：４２１−９）。ヒトＣＥＡをコードするＤＮＡワクチンは、ＣＥＡについてトランスジェニックのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、ＣＥＡで安定に形質導入したルイス肺癌により発現されるこの抗原に対する末梢Ｔ細胞寛容を破壊した。該ワクチンをネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＳＬ７２０７）の弱毒化株とともに経口胃管栄養により送達し、そして抗体−ＩＬ２融合タンパク質で追加免疫した。ＣＴＬおよび抗原提示樹状細胞の双方がそれらのそれぞれの活性化マーカー、ＣＤ２、ＣＤ２５、ＣＤ２８ならびにＣＤ４８およびＣＤ８０の決定的な増大により示されるとおり活性化された。
【０２４３】
Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎらは、目的の腫瘍抗原（ここではＣＥＡ）と一緒の破傷風トキソイドのＭＨＣクラスＩＩエピトープを包含するＤＮＡ融合ワクチンが、規定されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導したことを示した。ＣＥＡ配列への破傷風トキシンのフラグメントＣの融合は、試験されたＢ細胞腫瘍に対する抗体およびＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を促進した。「普遍的」ヘルパーエピトープを含有する破傷風トキソイドの第一ドメインのみ、次いでＣＥＡの２種の既知のＣＴＬに認識されるエピトープを使用して、彼らは、工作された構築物により誘発されるべき各ＣＴＬに認識されるペプチドに対する強いＣＴＬ応答を見出した。
【０２４４】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを用いる診断アッセイを使用して、以下の研究から示されるとおり、ＣＥＡ陽性腫瘍を伴う患者において治療をモニターしかつ転帰を予測し得る。２件のＣＥＡに基づくワクチンの臨床試験からのＰＭＢＣをそのＣＥＡペプチドおよびインフルエンザ（Ｆｌｕ）対照ペプチドに対するＴ細胞応答について分析した（Ａｒｌｅｎ  Ｐ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０００  ４９：５１７−２９）。第一の試験はアジュバント中のＣＥＡペプチド（ＰＰＰと呼称される）の３回の月１回のワクチン接種よりなった。第二の試験は、アビポックス−ＣＥＡ組換え体（ＡＡＡと呼称される）の３回の月１回のワクチン接種を受領するコホート、若しくは、組換えワクシニア−ＣＥＡを用いる一次ワクチン接種、次いでアビポックス−ＣＥＡを用いる２回の月１回のワクチン接種（ＶＡＡと呼称される）を受領するコホートよりなった。ＰＰＰワクチン接種を受領する患者ではＣＥＡ特異的Ｔ細胞応答があったとしてもほとんど見られなかった一方、ポックスウイルスＣＥＡ組み換え体を受領する患者の大多数はＣＥＡ特異的Ｔ細胞応答の増大を示しかつＦｌｕ特異的応答の増大を示さなかった。ＣＥＡ特異的ＩｇＧ応答が組換えＣＥＡポックスウイルスワクチン接種後の患者で発生した。ＣＥＡペプチドに対するＴ細胞応答は、組換えポックスウイルスワクチンでの免疫感作後にペプチドワクチンと比較して有意に増大した（ｐ＝０．０２８）。明らかに、ポックスウイルス組換え体に基づくワクチンは、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答の開始において、ペプチドワクチンがそうであるよりもより強力である。それらの活性はＩｉ−Ｋｅｙ／ＣＥＡ抗原性エピトープハイブリッドでの前ワクチン接種によりさらに高めることができる。
【０２４５】
ＣＥＡのような腫瘍抗原の場合、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープハイブリッドは、例えば樹状細胞の許可（ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ）により、ＣＥＡのＭＨＣクラスＩエピトープに対する免疫応答の発生を強めるＴヘルパー細胞応答を創製する。ＭＨＣクラスＩエピトープによるこうしたＣＴＬ活性化は、Ｉｉ−Ｋｅｙ  ＭＨＣクラスＩＩに提示されるハイブリッドにこうしたＭＨＣクラスＩエピトープを組込むことによってもまた生成させ得る。ＣＥＡの数種のＭＨＣクラスＩエピトープが実験で決定された（Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｉ．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  ５９：１−１４；Ｎｕｋａｙａ  Ｉ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９９  ８０：９２−７；表５）。こうしたペプチドは多様な技術により発見された。目的の抗原のｃＤＮＡのネステッド欠失はタンパク質産物につながり、該抗原を認識するＣＤ８＋細胞株の刺激についてそれらをアッセイし得る。個々のエピトープを認識する多様な細胞株を考えれば、Ｔ細胞エピトープの局在化は、ネステッド欠失ｃＤＮＡ構築物に対する各Ｔ細胞クローンの反応を分析することにより一次配列内で近似し得る。その後、生物学的に活性の標的領域全体のオーバーラップするペプチドのライブラリーをアッセイして、個々の決定子を正確に定義し得る。免疫精製されたＭＨＣクラスＩ分子へのこうしたペプチドの結合は、例えばＭＨＣ分子への放射標識標準ペプチドの結合の阻害によってもまたアッセイし得る（Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｉ．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  ５９：１−１４）。ＭＨＣクラスＩ分子を免疫精製しかつマイクロタイタープレートに結合し得、それにアッセイの多様な成分を、適切な洗浄を伴い連続的に添加する。あるいは、ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば培養されたリンパ芽球状細胞株のミクロソーム膜調製物から精製なしに洗剤で可溶化し得、そして複合体をゲル濾過カラムで分離し得、結合された放射活性ペプチドを未結合の遊離ペプチドからタンパク質複合体中で分離する。Ｋａｗａｓｈｉｍａの研究において、当初の研究はＨＬＡ−Ａ２．１分子で実施された。活発な抗腫瘍ＣＴＬ応答を誘導した高度に反応性のペプチド９．５．２もまたＡ２スーパータイプ（Ａ２．２、Ａ２．３、Ａ２．６およびＡ６８０２）の他の一般的なＨＬＡアレルに強固に結合し、従って広範なかつ人種的にバイアスのかかっていない集団の適用範囲の提供での潜在能力を示した。ＣＴＬ株を使用して、ＨＬＡ−Ａ２４およびＣＥＡを発現する腫瘍細胞を溶解したＣＴＬ株を導き出したペプチド９．５．４および９．５．６を同定した。該ＣＴＬ株による腫瘍細胞に対する細胞傷害性は、それがペプチドでパルスしたコールドの標的細胞ならびにＭＨＣクラスＩおよびＣＤ３分子に対するモノクローナル抗体により阻害されたため、抗原特異的であった。類似の方法を使用して、本開示のＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＭＨＣクラスＩエピトープハイブリッドにより誘導される生物学的応答を特徴付け得る。
【０２４６】
あるいは、こうしたペプチドはＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩのＴ細胞に認識されるエピトープの予測についてのアルゴリズムを用いて同定される（Ｌｕ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  ６０：５２２３−７）。インターネット上で入手可能であるこれらのコンピュータに基づく予測アルゴリズム（Ｐａｒｋｅｒ  ＫＣ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２  １４９：３５８０−７；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９５  ４１：１７８−２２８）を使用して、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するＨＬＡ−Ｂ７拘束性ＣＴＬエピトープを同定した。３種の候補ペプチドのうち、ＣＥＡ９（６３２）（ＩＰＱＱＨＴＱＶＬ）（配列番号２８１）が、抗原提示細胞として樹状細胞を使用した場合にＨＬＡ−Ｂ７＋の正常血液ドナーからのリンパ球で一次ＣＴＬ応答を誘発した。これらのＣＴＬは、ＨＬＡ−Ｂ７を発現しかつＣＥＡを産生した腫瘍細胞の殺傷において効率的であった。
【０２４７】
上皮細胞接着分子のＭＨＣクラスＩエピトープＨｅｒ−２／ｎｅｕおよび結腸直腸癌を伴う患者における癌胎児性抗原に対する天然のＴ細胞応答を反映する細胞株を使用してそれぞれの抗原エピトープが同定された（Ｎａｇｏｒｓｅｎ  Ｄ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  ６０：４８５０−４）。上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）の抗原ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＣＥＡは抗原特異的ワクチン接種に基づく癌治療での潜在的標的であった。該研究者は、これらの抗原に対する天然の特異的Ｔ細胞応答が結腸直腸癌を伴う患者で既に存在するかどうかを試験した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、未刺激の末梢血単核細胞中の循環するＴＡＡ反応性Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで直接検出した。彼らは、２２例の患者のうち７例が抗原ペプチドに応答してＩＦＮ−γを特異的に分泌するＴ細胞を有したがしかし８例の健康な被験体のいずれも有しなかったことを決定した（ｎ＝４、Ｅｐ−ＣＡＭ；ｎ＝５、ｈｅｒ−２／ｎｅｕ；ｎ＝６、ＣＥＡ）。Ｔ細胞応答は転移性疾患（ＤｕｋｅｓのステージＣおよびＤ）を伴う患者でのみ発生した。この研究の結果は、腫瘍抗原に対する天然のＴ細胞応答は、リンパ節若しくは遠隔転移の関与を伴う結腸直腸癌患者のおよそ半分で発生するがしかし腸管に限定された疾患を伴う結腸直腸癌患者で発生しないことを示す。ＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを使用して、局在化されたおよび転移性の疾患を伴う患者に彼らの腫瘍に対してワクチン接種し得る。
【０２４８】
ＣＥＡのアミノ酸配列は、１１３８６１７１癌胎児性抗原関連細胞接着分子５；癌胎児性抗原［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］としてＧｅｎＢａｎｋから得た（表１）。ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の一次配列をｃＤＮＡ配列から推定した（Ｏｉｋａｗａ  Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８７  １４２：５１１−８）。癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は複数の免疫グロブリン様ドメインを含有する（Ｏｉｋａｗａ  Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８７  １４４：６３４−４２）。ＣＥＡの予測されるＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表９．２に列挙する。表９．２中のＣＥＡのＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／ＣＥＡハイブリッドを表９．３に列挙する。予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるＣＥＡエピトープを表９．４に列挙する。ＣＥＡの実験で定義されたＭＨＣクラスＩエピトープを表９．５に列挙する。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩ／ＭＨＣクラスＩ  ＣＥＡハイブリッドを表９．６に列挙する。
【０２４９】
【表４５】
2006515744.tif 000046
【０２５０】
【表４６】
2006515744.tif 000047
【０２５１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０２５２】
【表４７】
2006515744.tif 000048
【０２５３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表９．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。ＣＥＡは７個の細胞外ドメインを含有し、それらは相互に著しく相同である。この事実は、この表中の位置１７８、３５６および５３４で開始する反復される同一のエピトープを説明する（Ｏｉｋａｗａ  Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１８７  １４４：６３４−４２）。
【０２５４】
【表４８】
2006515744.tif 000049
【０２５５】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアはこの下位配列を含有するペプチドの解離のＴ１／２である（Ｔｓａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。ペプチド９．３．１はＨＬＡ−Ａ３により提示される。ペプチド９．３．２および９．３．２はＨＬＡ−Ａ２４により提示される。ペプチド９．３．４および９．３．５はＨＬＡ−Ａ２．１により提示される。この表のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープは（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）のオンラインプログラムの使用を用いて予測した。
【０２５６】
【表４９】
2006515744.tif 000050
【０２５７】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で定義されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。ペプチド９．５．１、９．５．２、９．５．３はＨＬＡ−Ａ２．１により提示され、また、９．５．６はＨＬＡ−Ａ３により提示される（Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｉ．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  ５９：１−１４）。ペプチド９．５．４および９．５．５はＨＬＡ−Ａ２４により提示される（Ｎｕｋａｙａ  Ｉ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９９  ８０：９２−７）。ペプチド９．５．２はＨＬＡ−Ａ２．１により提示され、そして、それおよびＬＬＴＦＷＮＰＰＶ（配列番号３０８）は野性型配列ＬＬＴＦＷＮＰＰＴ（配列番号３０９）に関して工作されたＣＥＡエピトープである。
【０２５８】
【表５０】
2006515744.tif 000051
【０２５９】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩ／ＭＨＣクラスＩ  ＣＥＡハイブリッド。ＭＨＣクラスＩＩエピトープの配列位置が示される：ＩＩ：第一のエピトープアミノ酸のおよびＭＨＣクラスＩの残基位置が示される：Ｉ：第一のエピトープアミノ酸の残基位置。
【実施例１０】
【０２６０】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｃａ−１２５癌抗原性エピトープハイブリッド。
【０２６１】
卵巣癌抗原ＣＡ−１２５は免疫治療ワクチン接種で使用される。一例において、乳癌抗原ＣＡ１５．３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）および卵巣癌抗原ＣＡ１２５を包含する自原性および同種異系乳癌細胞および腫瘍関連抗原の混合ワクチンでのワクチン接種は乳癌患者において免疫および臨床応答をもたらした（Ｊｉａｎｇ  ＸＰ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０００  １５：４９５−５０５）。該ワクチンは、ワクチン接種前に比較してＡＵＴＯＣ、ＣＡ１５．３、ＣＥＡおよびＣＡ１２５に対するワクチン接種後のリンパ球増殖応答の有意の増大を誘導したが、しかしＡＬＬＯＣはしなかった（それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１およびｐ＞０．０５、対応のあるｔ検定）。
【０２６２】
ＧｅｎＢａｎｋに列挙されるところのＣＡ１２５卵巣癌抗原ムチン１６［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａ．．．）［ｇｉ：１４９７１１１０］のアミノ酸配列を表１０．１に提示する。ＣＡ１２５、卵巣癌抗原の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１０．２に列挙する。表１０．２のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／ＣＡ  １２５ハイブリッドを表１０．３に列挙する。ＣＡ  １２５の予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１０．４に列挙する。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣ  ＩＩエピトープ／ＭＨＣ  Ｉエピトープハイブリッドを表１０．５に列挙する。
【０２６３】
【表５１】
2006515744.tif 000052
【０２６４】
【表５２】
2006515744.tif 000053
【０２６５】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ＣＡ  １２５／ＭＵＣ  １６はＮ末端領域の９個の部分的に保存されたタンデムリピート（それぞれ１５６アミノ酸）を特徴とするため、類似の予測されたエピトープは異なる開始位置（例えば開始位置１０１７、１１７３、８６０若しくは８９７、１２０８、若しくは１１８４、８７２、１０２８）を有する。
【０２６６】
【表５３】
2006515744.tif 000054
【０２６７】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１０．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０２６８】
【表５４】
2006515744.tif 000055
【０２６９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＨＬＡ−Ａ２．１に提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアはこの下位配列を含有するペプチドの解離のＴ１／２である（Ｔｓｕａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。この表のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープは（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）のオンラインプログラムの使用を用いて予測した。
【０２７０】
【表５５】
2006515744.tif 000056
【０２７１】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩ／ＭＨＣクラスＩ  ＣＥＡハイブリッド。ＭＨＣクラスＩＩエピトープの配列位置が示される：ＩＩ：第一のエピトープのアミノ酸およびＭＨＣクラスＩエピトープの残基位置が示される：Ｉ：第一のエピトープのアミノ酸の残基位置。ペプチド１０．５．１では、ＭＨＣクラスＩＩの予測されるおよびＭＨＣクラスＩの予測されるエピトープが正確にオーバーラップする。ペプチド１０．５．２では、残基位置３９２で開始するＭＨＣクラスの予測されるエピトープが、残基位置３９４、２３８、８２、５５０で開始する（かつ反復される）ＭＨＣクラスＩの予測されるエピトープの配列とオーバーラップする。
【実施例１１】
【０２７２】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＰＳＡ抗原性エピトープハイブリッド。
【０２７３】
ＰＳＡのコーディング配列内のＴ細胞特異的エピトープの同定は、確立した前立腺癌を治療するための試みにおいてＰＳＡを標的とする多様なワクチン戦略の開発に至った（Ｋａｕｆｍａｎ  ＨＬ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００２  ２：３９５−４０８）。これらの戦略は、ＨＬＡ拘束性ＰＳＡペプチド、ＰＳＡでパルスした樹状細胞、ＰＳＡを発現する組換えウイルス、ならびに多様なサイトカインおよび細胞相互作用分子との組合せを包含した。これらの方法の多くは本開示の生成物および方法の使用により高められる。
【０２７４】
ＰＳＡ−組換えポックスワクチン構築物は免疫原性であり、そして、ＰＳＡ免疫感作による免疫系の刺激後に広がるエピトープ若しくは決定子による前立腺腫瘍細胞株上の表面抗原の刺激に対する抗体応答を誘導する（Ｃａｖａｃｉｎｉ  ＬＡ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２  ８：３６８−７３）。前立腺細胞表面抗原に対する抗体応答において広がる決定子が、組換えポックスベクターによりコードされる前立腺特異的抗原で免疫したヒトで観察された。ＬＮＣＡＰ（ＰＳＡ陽性）およびＰＣ−３（ＰＳＡ陰性）前立腺癌細胞株上で発現される細胞表面抗原に対する血清ＩｇＧ応答を、ワクシニア若しくは鶏痘ポックスで発現されるＰＳＡ（それぞれｖ−ＰＳＡ若しくはｆ−ＰＳＡ）を受領する進行した疾患を伴う個体で分析した。３回目の免疫感作前に収集したｖ−ＰＳＡのフェーズＩ試験における全７例の患者からの血清は双方の前立腺腫瘍細胞株と反応した。ｖ−ＰＳＡおよびｆ−ＰＳＡのフェーズＩＩ試験での個体（ｎ＝１２）の大多数が前立腺腫瘍細胞株上の細胞表面抗原に対する持続性の抗体応答を発生した。これらの応答の大きさおよびキネティクスは免疫感作スケジュールに依存した。
【０２７５】
Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅらは、前立腺癌を伴う患者におけるＰＳＡに基づくワクチン後のζ鎖発現の回復および自発的ＩＬ−１０産生の変化を示した（Ｍｅｉｄｅｎｂａｕｅｒ  Ｎ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００２  ８６：１６８−７８）。前立腺癌を伴う患者の循環するＴリンパ球が低い若しくは非存在のζ鎖発現を包含する機能的欠陥を有することが報告されている機構を決定するために、組換えヒト前立腺特異的抗原およびＧＭ−ＣＳＦで処置した１０例の患者ならびにＰＳＡおよび油乳剤を受領する８例の他者を評価した。治療前に、患者は、正常ドナーよりも、循環するＣＤ３＋細胞での有意により低いζ鎖発現ならびにζ鎖陰性のＣＤ３＋およびＣＤ４＋細胞のより高い比率を有した。患者の末梢血単核細胞は正常対照のものよりも多くのＩＬ−１０をｅｘ  ｖｉｖｏで自発的に産生した。ワクチン接種後、ζ鎖発現の回復が双方の臨床試験の患者の５０％で観察された。また、末梢血単核細胞による自発的ＩＬ−１０分泌は、ＰＳＡおよびＧＭ−ＣＳＦで処置した患者で免疫治療後に減少した。こうした治療は本開示の生成物および方法により大きく強めることができる。
【０２７６】
Ｍａｎｎらは、ＰＳＡ単独、マンノース受容体を標的としたＰＳＡ（マンノシル化ＰＳＡ（ＰＳＡ−ｍ））若しくはＰＳＡを抗ＰＳＡ抗体（ＡＲ４７．４７）と組み合わせることによりＦｃ受容体を標的としたＰＳＡへの曝露後の高められたＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を示した（Ｂｅｒｌｙｎ  ＫＡ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １０１：２７６−８３）。ＰＳＡおよびＰＳＡ−ｍはＭＨＣクラスＩＩ提示に好都合である経路により主としてプロセシングされる一方、ＰＳＡ／抗ＰＳＡ免疫複合体は単球由来樹状細胞中のクラスＩおよびクラスＩＩ双方の経路によりプロセシングされる。
【０２７７】
Ｇｉｌｂｏａらは、ＰＳＡのＲＮＡでトランスフェクトした自己の樹状細胞が転移性前立腺腫瘍に対するＣＴＬ応答を刺激することを示した（Ｈｅｉｓｅｒ  Ａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００２  １０９：４０９−１７）。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした自己の樹状細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで強力なＴ細胞媒介性の抗腫瘍免疫応答を刺激する。フェーズＩ試験は、転移性前立腺癌を伴う患者においてＰＳＡに対するＴ細胞応答を誘導することの安全性、実行可能性および有効性についてこの戦略を評価した。１３例の被験体において、増加する用量のＰＳＡ  ｍＲＮＡでトランスフェクトした樹状細胞を、自己免疫を包含する用量を制限する毒性若しくは悪影響の証拠を伴わずに投与した。ＰＳＡ特異的Ｔ細胞応答の誘導が一貫して全患者で検出され、該ワクチンのｉｎ  ｖｉｖｏでの生物活性を示唆した。ワクチン接種はさらに、７例の被験体のうち６例での血清ＰＳＡレベルの対数傾斜の有意の減少を伴った。
【０２７８】
Ｓｃｈｌｏｍらは、ＨＬＡ−Ａ２アレルへの高められた結合およびペプチド−ＭＨＣ複合体の高められた安定性を示したＰＳＡ−３  ＣＴＬエピトープのＰＳＡ−３Ａ（「Ａ」はアゴニスト）と呼称されるアゴニストエピトープを特徴付けした（Ｔｅｒａｓａｗａ  Ｈ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２  ８：４１−５３）。ＰＳＡ−３若しくはＰＳＡ−３Ａいずれかのペプチドで生成されるＴ細胞株は、ＰＳＡ−３ペプチドでパルスした標的よりもＰＳＡ−３Ａペプチドでパルスしたそれらの標的のより高レベルの溶解を示した。ＰＳＡ−３Ａペプチドでパルスした樹状細胞で刺激したＴ細胞（樹状細胞）は、ＰＳＡ−３ペプチドでパルスした樹状細胞が産生したよりもより高レベルのＩＦＮ−γを産生した。全ＰＳＡ遺伝子内のアゴニストアミノ酸変化を含有する組換えワクシニアウイルスに感染した樹状細胞（ｒＶ−ＰＳＡ−３Ａと呼称される）は、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の増強においてｒＶ−ＰＳＡベクターに感染した樹状細胞よりもより有効であった。最後に、ＰＳＡ−３Ａアゴニストは、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋ（ｂ）トランスジェニックマウスを使用するｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいてＰＳＡ−３ペプチドと比較してより高レベルのＴ細胞の活性化を誘導することが示された。これらの研究は、従って、前立腺癌のためのペプチドおよびベクターに媒介される免疫治療プロトコル双方におけるＰＳＡ−３Ａアゴニストエピトープの潜在的使用を示した。こうした結果を、本開示の生成物および方法を用いて改善し得る。
【０２７９】
６×Ｈｉｓ（配列番号３５７）残基を組込む組換えＰＳＡタンパク質を、抗原の単離ならびにプロセシングおよび提示のためのＡＰＣへの送達を可能にする磁性ビーズ結合のため合成した（Ｔｕｒｎｅｒ  ＭＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．１９９８  ２５６：１０７−１９）。一定の５’プライマーならびに７３６ｂｐ、６１０ｂｐ、５０５ｂｐおよび３９４ｂｐで開始する５種の個別の３’プライマーを使用してＰＳＡの３’欠損を増幅することにより、ＰＳＡ欠失構築物を生成させた。組換えＰＳＡタンパク質は２６１、２３１、１８９、１５４および１１７アミノ酸をコードした。系統（Ｌｉｎｅ）１／ＰＳＡ／ＩＬ−２腫瘍で攻撃したＢＡＬＢ／ｃマウスから単離したＴｈｙ−１＋腫瘍浸潤型リンパ球（ＴＬＬ）をＴ細胞融合パートナーＢＷＺ．３６に融合することにより、ＰＳＡ特異的なクラスＩおよびＩＩ拘束性Ｔ細胞ハイブリドーマを生成した。ＭＨＣクラスＩ（ＰＳＡ  １８８−１９７）およびクラスＩＩ（ＰＳＡ  ２３８−２５３）Ｔ細胞エピトープが同定された。
【０２８０】
ＧｅｎＢａｎｋ  ４５０２１７３１カリクレイン３から得られるところの前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のアミノ酸配列を表１１．１に提示する。この抗原に対するｃＤＮＡワクチンが入手可能である（Ｋｉｍ  ＪＪ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９８  １７：３１２５−３５）。ＰＳＡの予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１１．２に列挙する。ＰＳＡの実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１１．３に列挙する。表１１．２および表１１．３のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／ＰＳＡハイブリッドを表１１．４に列挙する。ＰＳＡの予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１１．５に列挙する。ＰＳＡの実験で定義されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１１．６に列挙する。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＰＳＡのＭＨＣ  ＩＩに提示されるエピトープ／ＰＳＡのＭＨＣ  Ｉに提示されるエピトープのハイブリッドを表１１．７に列挙する。
【０２８１】
【表５６】
2006515744.tif 000057
【０２８２】
【表５７】
2006515744.tif 000058
【０２８３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０２８４】
【表５８】
2006515744.tif 000059
【０２８５】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ペプチド１１．３．１は実験で定義した（Ｔｕｒｎｅｒ  ＭＪ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２００１  ２５６：１０７−１９）。
【０２８６】
【表５９】
2006515744.tif 000060
【０２８７】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１１．２および１１．３のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。ペプチド１１．４．８は、それぞれ残基位置５９、６７、７２および７４で開始するいくつかのＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有する。
【０２８８】
【表６０】
2006515744.tif 000061
【０２８９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープは、（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）のオンラインプログラムの使用を用いて予測した。スコアはこの下位配列を含有するペプチドの解離のＴ１／２である（Ｔｓａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。ペプチド１１．５．１、１１．５．２、１１．５．３および１．５．６はＨＬＡ−Ｂ＊２７０５により至適に提示される。ペプチド１１．５．４はＨＬＡ−Ｂ＊５１０２により最良に提示され、また、ペプチド１１．５．５はＨＬＡ−Ａ＊０２０１により最良に提示される。
【０２９０】
【表６１】
2006515744.tif 000062
【０２９１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で定義されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。
【０２９２】
【表６２】
2006515744.tif 000063
【０２９３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は、表１１．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープおよび表１１．５のＭＨＣクラスＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。実施例のそれぞれにおいて、予測されたＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩペプチドの配列は正確にオーバーラップする。予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープ中の第一のアミノ酸の残基位置が報告されている。
【実施例１２】
【０２９４】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／メラノサイトタンパク質Ｐｍｅｌ  １７抗原性ペプチドハイブリッド。
【０２９５】
メラノーマは治療的ペプチドおよびＤＮＡワクチンの開発における先導的な標的である。数種の特異的腫瘍関連抗原が同定されており、メラノーマの治療におけるペプチド若しくはＤＮＡワクチンでマウスをワクチン接種することの有効性が証明され、そして診察室での匹敵するワクチンの使用がときに有望な結果を有しているからである。メラノーマワクチン接種におけるＩｉ−Ｋｅｙ／メラノーマ抗原性エピトープのハイブリッドの使用をメラノサイトタンパク質Ｐｍｅｌ１７、ｇｐ１００、チロシナーゼおよびチロシナーゼ−ｓ関連タンパク質に関するそれぞれの実施例で考慮する。
【０２９６】
Ｓｔｏｒｋｕｓらは、ｇｐ  １００／ｐｍｅｌ１７およびチロシナーゼのメラノサイト関連抗原の数種のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを同定しかつこれらのペプチドに対する多様なメラノーマ患者からの腫瘍反応性ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞の応答を試験した（Ｋｉｅｒｓｔｅａｄ  ＬＳ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ８５：１７３８−４５）。２種の既知のおよび３種の新規のＣＤ４＋  Ｔ細胞エピトープがＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して見出された。しばしば、現在は疾患を伴わないＨＬＡ−ＤＲ４＋メラノーマ患者からの新たに単離されたＰＢＭＣは、これらのペプチドを認識する上昇されたＴｈ１型ＣＤ４＋  Ｔ細胞を示す。これらのエピトープを組込むＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープのハイブリッドを本開示に提示する。
【０２９７】
腫瘍の免疫治療における一問題は、宿主が腫瘍の自己タンパク質に対し寛容化され得るという事実である。ヒトＰｍｅｌ１７／ｇｐ１００のＤＮＡワクチンでのＣ５７ＢＬ／６マウスの皮内免疫感作はｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞媒介性のＢ１６メラノーマ保護を誘導するが、しかしマウスＤＮＡはしない（Ｗａｇｎｅｒ  ＳＮ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０００  １１５：１０８２−７）。自己抗原Ｐｍｅｌ１７／ｇｐ１００に対する非応答性のこの状態は、自己の形態の該分子をコードするプラスミドＤＮＡ構築物での免疫感作により破壊された。Ｐｍｅｌ１７／ｇｐ１００のＤＮＡの受領するマウスはＭ３メラノーマに対する抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球応答を装備した。さらに、免疫したマウス中で増殖するＭ３腫瘍はこのメラノーマ関連抗原の発現を喪失した一方、対照ベクターで処理した動物で出現するＭ３メラノーマはなおＰｍｅｌ１７／ｇｐ１００陽性であった。適切な免疫感作スキームおよびアジュバントを伴うＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは、Ｔｈ１若しくはＴｈ２の応答パターンを優先的に誘導してそれにより寛容を破壊し得る。
【０２９８】
メラノサイトタンパク質Ｐｍｅｌ  １７のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ、＞ｇｉ｜１１２５０６３｜ｇｂ｜ＡＡＢ００３８６．１｜メラノサイトタンパク質Ｐｍｅｌ  １７［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］＝＞ｇｉ｜６３９５９０｜ｇｂ｜ＡＡＣ６０６３４．１｜ｇｐ１００［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］で得た。
【０２９９】
【表６３】
2006515744.tif 000064
【０３００】
【表６４】
2006515744.tif 000065
【０３０１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０３０２】
【表６５】
2006515744.tif 000066
【０３０３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ＤＲ＊０４０１はペプチド１２．３．１（Ｓｔｏｒｋｕｓ  Ｗ．Ｆｏｒｕｍ（Ｇｅｎｏｖａ）．２０００  １０：２５６−７０）およびペプチド１２．３．２（Ｋｉｅｒｓｔｅａｄ  Ｌ．Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ８５：１７３８−４５）を最良に提示した。この表の残りのペプチドはＫｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１  ６１：７５７７−８４）により同定された。
【０３０４】
【表６６】
2006515744.tif 000067
【０３０５】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０３０６】
【表６７】
2006515744.tif 000068
【０３０７】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープは、（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）のオンラインプログラムの使用を用いて予測した。スコアはこの下位配列を含有するペプチドの解離のＴ１／２である（Ｔｓｕａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。ペプチド１２．５．１、１２．５．３および１２．５．５はＨＬＡ−Ａ＊０２０１により提示される。ペプチド１２．５．２はＨＬＡ−Ｂ＊５１０１により提示される。ペプチド１２．５．４はＨＬＡ−Ａ＊２４により提示される。ペプチド１２．５．６および１２．５．７はＨＬＡ−Ａ３により提示される。
【０３０８】
【表６８】
2006515744.tif 000069
【０３０９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。ペプチド１２．６．１はＨＬＡ−Ａ２により提示される（Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ  Ｃ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１  ７：３０１２−２４）。ペプチド１２．６．２はＨＬＡ−Ａ３により提示される（Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ  Ｇ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ９２：７０３−１１）。ペプチド１２．６．３、１２．６．５、１２．６．６および１２．６．７はＨＬＡ−Ａ＊０２０１２により提示される（Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８）。ペプチド１２．６．８および１２．６．９はＨＬＡ−Ａ＊０２０１により提示される（Ｔｓａｉ  Ｖ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  １５８：１７９６−８０２）。ペプチド１２．６．１０はＨＬＡ−Ｃｗ８により提示される（Ｃａｓｔｅｌｌｉ  Ｃ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  １６２：１７３９−４８）。ペプチド１２．６．１１はＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ａ１１により提示される。
【０３１０】
【表６９】
2006515744.tif 000070
【０３１１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置であり、ＭＨＣクラスＩＩはＩ：として示され、また、ＭＨＣクラスＩＩはＩＩ：として示される。配列は表１．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。ペプチド１２．７．３、１２．７．４および１２．７．５は既に提案されている（Ｋａｂａｙａｓｈｉ  Ｈ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１  ６１：７５７７−８４）。ペプチド１２．７．６−ＭＨＣクラスＩおよびＩＩに提示されるｇｐ  １００エピトープの双方のアミノ酸配列は実験で定義されかつ一致する。
【実施例１３】
【０３１２】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／チロシナーゼ関連タンパク質２抗原性エピトープハイブリッド。
【０３１３】
ＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ｜７３１０２６｜ｓｐ｜Ｐ４０１２６｜ＴＹＲ２＿ＨＵＭＡＮ（ヒト）ドーパクロームトートメラーゼ前駆体（ＤＴ）（ＤＣＴ）（ドーパクロームδ−イソメラーゼ）（チロシナーゼ関連タンパク質２）（ＴＲＰ−２）（ＴＲＰ２）に示されるところのチロシナーゼ関連タンパク質２のアミノ酸配列を表１３．１に提示する。ＴＲＰ−２の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１３．２に列挙する。表１３．２のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／ＴＲＰ−２抗原性エピトープハイブリッドを表１３．３に列挙する。ＴＲＰ−２の予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１３．４に列挙する。実験で定義されたＭＨＣクラスＩに提示されるＴＲＰ−２エピトープを表１３．５に列挙する。表１３．２、１３．３、１３．４および１３．５のＭＨＣクラスＩおよびＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／ＴＲＰ−２ハイブリッドを表１３．６に列挙する。
【０３１４】
【表７０】
2006515744.tif 000071
【０３１５】
【表７１】
2006515744.tif 000072
【０３１６】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０３１７】
【表７２】
2006515744.tif 000073
【０３１８】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１３．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０３１９】
【表７３】
2006515744.tif 000074
【０３２０】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。表９．４のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープは、（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）のオンラインプログラムの使用を用いて予測した。スコアはこの下位配列を含有するペプチドの解離のＴ１／２である（Ｔｓａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。ペプチド１３．４．１、１３．４．２、１３．４．３、１３．４．４および１３．４．５はＨＬＡ−Ｂ＊２７０５により提示される。ペプチド１３．４．６、１３．４．７、１３．４．９および１３．４．１０はＨＬＡ−Ａ＊０２０１により提示される。ペプチド１３．４．８はＨＬＡ−Ｂ＊５１０２により提示される。ペプチド１３．４．１１はＨＬＡ−Ａ＊０２０５により提示される。ペプチド１３．４．１２はＨＬＡ−Ｂ５１０１およびＨＬＡ−Ｂ＊５１０２により提示される。ペプチド１３．４．１３はＨＬＡ−Ｂ７により提示される。ペプチド１３．４．１４はＣｗ＊０４０１により提示される。ペプチド１３．４．１５はＨＬＡ−Ｂ＊２７０２により提示される。ペプチド１３．４．１６はＨＬＡ−Ａ２４により提示される。ペプチド１３．４．１７はＨＬＡ−Ｂ６２により提示される。
【０３２１】
【表７４】
2006515744.tif 000075
【０３２２】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で定義されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。ペプチド１３．５．１はＨＬＡ−Ａ２により提示される（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ＭＲ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９８  ５８：４８９５−９０１）。ペプチド１３．５．２および１３．５．３はＨＬＡ−Ａ２．１により提示される（Ｎｏｐｐｅｎ  Ｃ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０００  ８７：２４１−６）。ペプチド１３．５．４はＨＬＡ−Ａ２．１により提示される（Ｈａｒａｄａ  Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１  ６１：１０８９−９４）。
【０３２３】
【表７５】
2006515744.tif 000076
【０３２４】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１３．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープおよび表１３．４のＭＨＣクラスＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【実施例１４】
【０３２５】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／メラノーマチロシナーゼ抗原性エピトープハイブリッド。
【０３２６】
チロシナーゼはメラノーマを伴う患者の免疫治療の標的抗原として多くの利点を有する。それが高程度の細胞の均一性を伴いほぼ全部のメラノーマ試料で発現され、また、正常組織中でのその分布がメラノサイトに限定されるからである。数種のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープが同定かつ臨床で使用され、また、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープが発見された。ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチンおよびペプチド調製物（腫瘍細胞ライセート）を装填する樹状細胞の同定および使用における現在の従来技術の以下の要約は、これらの手順の改良に対する本開示の生成物および方法の価値を具体的に説明するために部分的に提示する。
【０３２７】
ＲｏｓｅｎｂｅｒｇらはＨＬＡ−Ａ２．１に提示される拘束性メラノーマチロシナーゼエピトープ（チロシナーゼ８−１７；ＣＬＬＷＳＦＱＴＳＡ）（配列番号４８０）を同定した（Ｒｉｌｅｙ  ＪＰ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００１  ２４：２１２−２０）。この研究では、中間の結合親和性をもつ標準ペプチドのものに対するアルゴリズムで予測された一連のペプチドのＨＬＡ−Ａ２．１への比較結合を測定した。標準ペプチドのものの８０％以内の結合親和性をもつ１２種のペプチドが、転移性メラノーマを伴う３例のＨＬＡ−Ａ２．１＋患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。２３例のＨＬＡ−Ａ２．１＋患者からのＰＢＭＣをチロシナーゼ：８−１７でｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した。１１種のバルクＴ細胞培養物は特異的ペプチド認識を示し、そしてこれらのうち６種はＨＬＡ−Ａ２．１＋チロシナーゼ＋のメラノーマ細胞もまた認識した。このエピトープをＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ／ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのハイブリッドに組込み得る。
【０３２８】
Ｗｅｂｅｒらは、切除されたメラノーマを伴う患者が、フロイントの不完全アジュバントともに乳化したｇｐ１００（２０９−２１７）（２１０Ｍ）（ＩＭＤＱＶＰＳＦＶ）（配列番号４８１）およびチロシナーゼ（３６８−３７６）（３７０Ｄ）（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）（配列番号４８２）に対する免疫応答を装備したことを見出した（Ｌｅｅ  Ｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００１  １９：３８３６−４７）。患者は毒性および免疫応答を評価するためにＩＬ−１２（３０ｎｇ／ｋｇ）を伴う若しくは伴わないペプチド／ＩＦＡを受領した。免疫感作を２週ごとに８週間、その後４週ごとに１２週間、およびその後８週間後に１回投与した。４０例の患者のうち３４例がｇｐ１００ペプチドに対する陽性の皮膚試験応答を発生したが、しかしチロシナーゼペプチドに応答した者はなかった。ペプチドでパルスした抗原提示細胞の存在下でのエフェクター細胞による酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）におけるγ−インターフェロンの遊離、若しくは抗原特異的四量体フローサイトメトリーアッセイにより、免疫応答を測定した。３８例の患者のうち３３例が、四量体アッセイにより４２例の患者のうち３７例が示したように、ワクチン接種後のＥＬＩＳＡにより免疫応答を示した。４８例の患者のうち２４例が２０か月の経過観察の中央値を伴い再発し、また、この高リスク群の１０例の患者が死亡した。
【０３２９】
Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆらは、メラノーマ患者の排出リンパ節および末梢血中の多様なＨＬＡ−Ａアレルに拘束される数種のペプチドのペプチドワクチンの免疫原性を評価した。ワクチン試験が主としてＨＬＡ−Ａ２を伴う者に制限されかつ免疫応答が一致せずに検出されたからである（Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ  ＧＶ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ９２：７０３−１１）。彼らは、ステージＩＶのメラノーマ患者にＧＭ−ＣＳＦおよびモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ−５１アジュバントを含む乳剤中でｇｐ１００ならびにＨＬＡ−Ａ１（ＤＡＥＫＳＤＩＣＴＤＥＹ）（配列番号４８３）、ＨＬＡ−Ａ２（ＹＬＥＰＧＰＶＴＡ（配列番号４８４）およびＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号４８５））ならびにＨＬＡ−Ａ３（ＡＬＬＡＶＧＡＴＫ）（配列番号４８６）により拘束されるチロシナーゼペプチドの混合物をワクチン接種した。ワクチン接種ペプチドに対するＣＴＬ応答は５／５例の患者（１００％）のワクチン部位から排出するリンパ節（センチネル免疫節、ＳＩＮ）で２／５例の患者（４０％）のＰＢＬで見出された。ＨＬＡ−Ａ１および−Ａ３ならびにＨＬＡ−Ａ２拘束性ペプチドにより拘束されるペプチドＹＭＤＧＴＭＳＱＶ（配列番号４８５）が免疫原性であった。
【０３３０】
メラノーマ関連抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球を、複数の免疫優性エピトープおよび補助刺激分子を発現する組換えワクシニアウイルスベクターによりｉｎ  ｖｉｖｏで誘導した（Ｏｅｒｔｌｉ  Ｄ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２  １３：５６９−７５）。患者は、全身性顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）処置の情況で、３種の免疫優性ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性エピトープＭｅｌａｎ−Ａ（２７−３５）、ｇｐ１００（２８０−２８８）およびチロシナーゼ（１−９）をコードするソラレン−ＵＶ処理されかつ複製能力を欠く組換えワクシニアウイルスを２種の補助刺激分子Ｂ７．１およびＢ７．２と一緒に受領した。その後の追加免疫は対応する合成ノナペプチドおよびＧＭ−ＣＳＦを使用した。組換えベクターの注入１２日以内に、工作されたエピトープに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答が３例の患者のうち３例で検出された。ワクチン接種処置の間、１０，０００倍の末梢ＣＤ８＋  Ｔ細胞を超える抗原特異的ＣＴＬの頻度を観察し得た。
【０３３１】
２例のステージＩＶメラノーマ患者をＨＬＡ−Ａ２若しくはＨＬＡ−Ａ２４拘束性チロシナーゼペプチドでワクチン接種し、そしてＧＭ−ＣＳＦは長期の再発の非存在を有した（Ｓｃｈｅｉｂｅｎｂｏｇｅｎ  Ｃ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００２  ９９：４０３−８）。患者はワクチン接種前３年間にそれぞれ９および１２例の再発（大部分が皮下）を経験した一方、彼らはワクチン接種後２年以上の間再発の非存在を経験した。該ワクチンペプチドに対するＴ細胞応答は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して双方の患者の末梢血中で見出された。
【０３３２】
Ｍｕｌｅらは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）の追加が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢ１６メラノーマのＤ５亜系統の確立した転移の免疫プライミングおよび拒絶のための腫瘍ライセートでパルスした樹状細胞およびペプチドでパルスした樹状細胞の双方の免疫感作の有効性を強めたことを見出した（Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｋ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１  ６１：２６１８−２４）。インターロイキン２は、自己免疫色素脱失の非存在下で、治癒率および全体生存により測定されるとおり、ＫＬＨにより提供される増強をさらに強めた。樹状細胞免疫感作に追加されたＫＬＨは腫瘍特異的Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生を顕著に高める。類似のレベルのＩＦＮ−γに曝露されたＤ５メラノーマはＭＨＣクラスＩ分子の実質的発現をもたらす。ＫＬＨおよびマウスチロシナーゼ関連タンパク質−２ペプチドでパルスした樹状細胞での免疫感作はＢ１６メラノーマ転移の高められた退縮をもたらし；該効果は、チロシナーゼ関連タンパク質−２ペプチドでパルスした樹状細胞単独が完全に無効である設定で最も著しい。
【０３３３】
Ｂ１６メラノーマに対する腫瘍細胞に基づくワクチンの治療的有効性は、自己反応性Ｔ細胞応答を制御する２種の免疫調節機構、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）−４経路若しくはＣＤ２５＋調節性Ｔ細胞のいずれかの破壊を必要とする。ＣＴＬＡ−４封鎖およびＣＤ２５＋  Ｔ細胞の枯渇の組合せが最大の腫瘍拒絶をもたらす（Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ  ＲＰ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００１  １９４：８２３−３２）。抗腫瘍治療の有効性は、自己免疫皮膚色素脱失の程度、ならびに末梢で検出されるチロシナーゼ関連タンパク質２（１８０−１８８）特異的ＣＴＬの頻度と相関する。さらに、腫瘍拒絶はＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットに依存する。メラノーマ抗原に対するＣＴＬ応答は治療的抗腫瘍応答の重要な一成分であり、また、これらのＣＴＬの反応性は免疫調節機構の妨害により増強し得る。ＣＴＬＡ−４封鎖およびＣＤ２５＋  Ｔ細胞の枯渇の効果における相乗作用は、ＣＤ２５＋  Ｔ細胞およびＣＴＬＡ−４シグナル伝達が自己反応性Ｔ細胞免疫の抑制のための２つの代替経路を表すことを示す。双方の調節機構を用いての同時の介入は、従って治療的抗腫瘍免疫の誘導の有望な概念である。
【０３３４】
ＧｅｎＢａｎｋ  ４５０７７５３｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０００３６３．１｜チロシナーゼ（眼皮膚白皮症ＩＡ）；チロシナーゼ［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］に示されるところのチロシナーゼのアミノ酸配列を表１４．１に列挙する。チロシナーゼの予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１４．２に列挙する。チロシナーゼの実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１４．３に列挙する。表１４．２および１４．３のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／チロシナーゼハイブリッドを表１４．４に列挙する。チロシナーゼの予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１４．５に列挙する。チロシナーゼのＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ（位置２４０、３６８、１４６）の実験的同定をｇｐ１００の例で記述する。チロシナーゼの実験で定義されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１４．６に列挙する。表１４．２、１４．３、１４．４および１４．５のＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／チロシナーゼハイブリッドを表１４．７に列挙する。
【０３３５】
【表７６】
2006515744.tif 000077
【０３３６】
【表７７】
2006515744.tif 000078
【０３３７】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０３３８】
【表７８】
2006515744.tif 000079
【０３３９】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ペプチド１４．３．１はＨＬＡ−ＤＲ＊０４０１により提示される（Ｓｔｏｒｋｕｓ  Ｗ．Ｆｏｒｕｍ（Ｇｅｎｏｖａ）．２０００  １０：２５６−２７０）。ペプチド１４．３．２および１４．３．３はＨＬＡ−ＤＲ＊０４０１により提示される（Ｋｉｅｒｓｔｅａｄ  Ｌ．Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ８５：１７３８−４５）。ペプチド１４．３．２はＮ−グリコシル化部位を含有する。
【０３４０】
【表７９】
2006515744.tif 000080
【０３４１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０３４２】
【表８０】
2006515744.tif 000081
【０３４３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。表９．４のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープは、（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）のオンラインプログラムの使用を用いて予測した。スコアはこの下位配列を含有するペプチドの解離のＴ１／２である（Ｔｓａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。ペプチド１４．４．１はＨＬＡ−Ａ１により提示される。ペプチド１４．５．２、１４．５．３および１４．５．４はＨＬＡ＊Ａ０２０１により提示される。
【０３４４】
【表８１】
2006515744.tif 000082
【０３４５】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。ペプチド１４．６．１はＨＬＡ−Ａ１により提示される（Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ  Ｇ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ９２：７０３−１１）。ペプチド１４．６．２はＨＬＡ−Ａ２により提示される（Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖ  Ｇ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ９２：７０３−１１）。ペプチド１４．６．３はＨＬＡ−Ａ１により提示される（Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  １６１：６９８５−９２）。
【０３４６】
【表８２】
2006515744.tif 000083
【０３４７】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１４．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。ペプチド１４．７．５はチロシナーゼのＭＨＣクラスＩおよびＩＩに提示されるエピトープの双方のアミノ酸配列を包含し、それらは実験で定義されかつ一致する。
【実施例１５】
【０３４８】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／メラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１抗原性エピトープハイブリッド。
【０３４９】
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらは、メラノーマ関連抗原ＭＡＲＴ−１およびｇｐ１００由来のエピトープを提示する自己の樹状細胞で転移性メラノーマ患者を免疫した（Ｐａｎｅｌｌｉ  ＭＣ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０００  ２３：４８７−９８）。ＤＣは、白血球搬出法により得た末梢血単球のインターロイキン−４（１，０００Ｕ／ｍＬ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（１，０００Ｕ／ｍＬ）中での５ないし７日インキュベーションにより生成させた。投与前に、ＤＣをＨＬＡ−Ａ＊０２０１関連メラノーマエピトープＭＡＲＴ−１（２７−３５）およびｇｐ−１００−２０９−２Ｍで別個にパルスした。ＤＣを３週間隔で４回投与した。第一の患者コホート（ｎ＝３）を６×１０７ＤＣで、また、第二のコホート（ｎ＝５）は２×１０８ＤＣで処置した（いずれの場合も、ＤＣの半分はＭＡＲＴ−１（２７−３５）でパルスしそして他の半分をｇｐ−１００−２０９−２Ｍでパルスした）。自然増加（ａｃｃｒｕａｌ）下の最後のコホート（ｎ＝２）では２×１０８ＤＣをインターロイキン−２（８時間ごとに７２０，０００ＩＵ／ｋｇ）とともに投与した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養後のＤＣの回収は元の末梢血単球の３％から３５％まで（平均１５％）の範囲にわたった。ＤＣの投与は用量のいずれでも症状を引き起こさず、また、インターロイキン−２の同時投与はインターロイキン−２単独について期待されたもの以外の毒性を引き起こさなかった。処置の前および後の患者の細胞傷害性Ｔリンパ球の反応性のモニタリングは、試験した５例の患者のうち１例のみで細胞傷害性Ｔリンパ球の反応性の増強を示した。応答について評価した７例の患者のうち、１例が肺および皮膚転移の退縮を伴う一過性の部分奏功を有した。
【０３５０】
Ｉｏａｎｎｉｄｅｓらは、自己ＭＡＲＴ−１特異的ＣＴＬによる転移性メラノーマ細胞の低下された認識がＴＡＰ欠損と相関したことを示した（Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０００  ２３：２８−３５）。Ｔ細胞受容体発現と関係したクラスＩ発現は、ペプチド提示およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘導に決定的に重要である。ＭＨＣクラスＩに結合したペプチドの提示は輸送体関連タンパク質（ＴＡＰ）発現および機能に依存する。メラノーマを伴う患者からの腫瘍浸潤リンパ球を単離し、インターロイキン−２の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡張し、そしてＨＬＡ−Ａ２陽性、ＭＡＲＴ−１陽性自己腫瘍細胞、ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＭＡＲＴ−１陽性メラノーマ細胞株（Ｍｅｌ−５０１）およびＨＬＡ−Ａ２陰性メラノーマ細胞に対する細胞傷害性について試験した。有意の殺傷が双方のＡ２陽性細胞株（それぞれ６３％および６５％）に対して発生したが、しかしＡ２陰性株（１８％）若しくはＡ２陽性自己腫瘍（１．５％）に対して発生しなかった。これらのＣＴＬは、ＭＡＲＴ−１ペプチドＦ１１９、２７−３５、およびｇｐ１００ペプチドＦ１２５、２８０−２８８を優先的に認識して、自己腫瘍若しくは主要組織適合複合体クラスＩが「空の」Ｔ２細胞をいずれかのペプチドでパルスした場合に溶解の３０％ないし６０％の増強をもたらした。自己腫瘍認識の欠損をＡｇ提示の欠損と関係づけうるかどうかを取り扱うために、ポリメラーゼ連鎖反応、サザンブロッティング、ならびに配列特異的プライマーおよびプローブを使用する走査デンシトメトリーによるＴＡＰ１およびＴＡＰ２転写物の存在についてのスクリーニング。自己腫瘍中でのＴＡＰ１およびＴＡＰ２双方の発現レベルは最小限であったがそれでもなおインターフェロン−γによりそれぞれ７ないし１８倍アップレギュレートされた。この増大にもかかわらず細胞傷害性の同様の増大は起こらなかった。要約すれば、ＴＡＰ提示の欠損は免疫学的監視からの腫瘍の回避にとって、およびワクチン試験の妨害に関して機能的意義を有しうる。
【０３５１】
Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆらは、末端の改変が免疫原性ＭＡＲＴ−１（２７−３５）ペプチドのタンパク質分解性の分解を阻害することを示した（Ｂｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ  ＬＨ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９９  Ｏｃｔ  ２９；８３（３）：３２６−３４）。新鮮正常ヒト血漿（ＮＨＰ）中での免疫原性ペプチドＭＡＲＴ−１（２７−３５）の安定性を試験して、免疫原性の喪失を伴わずに酵素的破壊に対し保護する改変を同定した。ＭＡＲＴ−１（２７−３５）ペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列番号５３０）および改変体を血漿中で変動される時間間隔の間インキュベートし、そしてＭＡＲＴ−１（２７−３５）反応性のＣＴＬに対しエピトープを再構成するそれらの能力について評価した。ＣＴＬの反応性の喪失は免疫反応性ペプチドの喪失を知らせた。標的細胞にパルスする前に１マイクロＭのＭＡＲＴ−１（２７−３５）ペプチドを血漿中でインキュベートした場合、ＣＴＬの反応性は３時間以内に喪失され、そしてこのペプチドの計算された半減期は２２秒であった。この分解はペプチダーゼにより媒介された。ＭＡＲＴ−１（２７−３５）の安定性は、Ｃ末端アミド化および／若しくはＮ末端アセチル化（ペプチドキャッピング）、またはＣ末端のポリエチレングリコール修飾（ペギル化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ））により顕著に延長された。これらの改変ペプチドはＣＴＬにより認識された。
【０３５２】
Ｒｏｍｅｒｏらは、ＣｐＧが腫瘍抗原由来ペプチドに対する特異的ＣＴＬ誘導のための効率的なアジュバントであることを示した（Ｍｉｃｏｎｎｅｔ  Ｉ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  １６８：１２１２−８）。キメラＭＨＣクラスＩ分子についてトランスジェニックのマウスを、単独の若しくはＩＦＡに乳化したＣｐＧオリゴヌクレオチドの存在下でＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ（２６−３５）のペプチド類似物で免疫した。ＣＴＬ応答をリンパ球の四量体染色によりｅｘ  ｖｉｖｏでモニターした。血液、脾およびリンパ節において、ＣｐＧ  ＯＤＮ単独と混合したペプチドはＩＦＡに乳化したペプチドに比較してより強い全身性ＣＴＬ応答を導き出すことが可能であった。さらに、ＩＦＡと組合せのＣｐＧ  ＯＤＮは、ｅｘ  ｖｉｖｏで四量体＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度に関してＣＴＬ応答をさらに高めた。ＣｐＧ  ＯＤＮの存在下でペプチド類似物に対しｉｎ  ｖｉｖｏで誘導されたＣＴＬは機能性である。それらはメラノーマ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで認識かつ殺すことが可能であったためである。
【０３５３】
Ｍｉｔｃｈｅｌｌらは、シグナル配列の合成挿入がメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１からのペプチドのＭＨＣクラスＩ提示を高めることを示した（Ｍｉｎｅｖ  ＢＲ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  ３０：２１１５−２４）。ヒトメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１からのエピトープのＮ末端（しかしＣ末端でない）での合成シグナル配列の付加は、ＴＡＰ欠損およびＴＡＰ発現双方の細胞でのその提示を高めた。天然のシグナル配列の疎水性部分を置換するエピトープから構成されるペプチド構築物もまた非常に有効であった。興味深いことに、同一のエピトープを含有する人工的シグナル配列が、その提示を高めるための最も効率的な構築物であった。これらのペプチド構築物は、ＴＡＰ欠損Ｔ２細胞、ＴＡＰを発現するメラノーマ細胞およびヒト樹状細胞の細胞質中に負荷された場合にエピトープ提示を助長した。
【０３５４】
Ｚａｊａｃらは、ＨＬＡ−Ａ２０１にターゲッティングされたすなわち完全なＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ抗原を発現する複製しない組換えワクシニアの免疫原性を示した（Ｓｃｈｕｔｚ  Ａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  ８：６５５−６１）。第一の組換えウイルスは、小胞体（ＥＲ）ターゲッティングシグナルとＨＬＡ−Ａ２０１に結合するＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ  ２７−３５ペプチドとの間の融合生成物をコードするミニジーン（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）を発現した。第二のウイルス構築物は完全なＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａタンパク質をコードした。いずれかのウイルス構築物に感染させたＨＬＡ−Ａ２０１細胞のＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ  ２７−３５特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成および刺激する能力を比較的に特徴付けした。得られた結果は、ワクシニアウイルスにコードされるＥＲミニジーンの非常に強い抗原性シグナルを生成させる能力を確認した。細胞傷害性アッセイにおいて、活性化された特異的ＣＴＬクローンを用いての大量の双方の組換えウイルスに感染させた標的細胞の認識は類似の溶解活性をもたらした。カルシウム移動、ＴＣＲのダウンレギュレーション、ＩＦＮ−γ遊離およびＴ細胞増殖アッセイに関して、ターゲッティングされたエピトープは１０ないし１０００倍より強い応答を導き出した。注目すべきことに、四量体検出により測定されるところのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのナイーブなＨＬＡ−Ａ２末梢血単核細胞からＣＴＬを生成させるそれらのそれぞれの能力における２処方間の免疫原性の差異はより小さかった（２ないし３倍）。完全な抗原を発現する組換えベクターは特異的応答を生成させるそれらの能力を示し、そしてこうしたワクチンは提示のより広範な潜在能力を利用するとみられる。しかしながら、ＨＬＡ−Ａ２０１拘束性のＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ免疫優性エピトープについて示されたとおり、ＥＲにターゲッティングされたミニジーンを発現する複製しないワクシニアウイルスは、有意により免疫原性のエピトープワクチン製剤を代表するようである。Ｉｉ−ＲＧＣでさらに高められる。
【０３５５】
Ｆａｌｏらはヒト皮膚樹状細胞の直接トランスフェクションおよび活性化を示した（Ｌａｒｒｅｇｉｎａ  ＡＴ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  ８：６０８−１７）。遺伝子銃を使用して、内在する皮膚樹状細胞中でトランスジェニック抗原を発現するという特定の目的を伴いヒト皮膚器官培養物をトランスフェクトした。ヒト皮膚に送達される金粒子は、高ヘリウム送達圧を使用する場合でさえ主として表皮中で観察される。基底表皮中に内在するランゲルハンス細胞をトランスフェクトし得、そして、遺伝子銃送達は皮膚樹状細胞の活性化および移動を刺激するのに十分である。トランスフェクトされた皮膚から移動した樹状細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析はトランスジェニックｍＲＮＡを示し、皮膚樹状細胞の直接トランスフェクションを示す。トランスフェクトした表皮ランゲルハンス細胞は、トランスジェニックメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１由来のペプチドをＭＡＲＴ−１特異的ＣＴＬに効率的に提示し得る。
【０３５６】
Ｍｕｌｅらは、腫瘍ライセートでパルスしたＤＣの投与が非毒性かつ腫瘍抗原に対する免疫学的応答を誘発することが可能であることを示した（Ｃｈａｎｇ  ＡＥ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２  ８：１０２１−３２）。ステージＩＶの充実性悪性病変を伴う１４例の患者を３種のワクチンについて２週ごとに１０６、１０７および１０８樹状細胞をｉ．ｄ．で受領したコホートで処置した。各ワクチンは、自己腫瘍ライセートでパルスした半分のＤＣおよびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む他の半分の混合物から構成された。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の局所蓄積がワクチン接種部位で見出された。ワクチンにより誘発されたＫＬＨに対するＰＢＭＣの有意の増殖応答が存在した。６例の患者のうち５例で、該ワクチンはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＫＬＨに対するＰＢＭＣによる増大されたＩＦＮ−γ産生をもたらした。同一のアッセイを使用して、７例の患者のＰＢＭＣのうち３例が、自己腫瘍ライセートに応答した増大したＩＦＮ−γ産生を表した。メラノーマを伴う１例の患者は、ワクチン接種後にＭＡＲＴ−１およびｇｐ１００反応性のＣＤ８（＋）Ｔ細胞の増大された頻度を有することもまた観察された。遅延型過敏性試験により、９例のうち８例および１０例の患者のうち４例がそれぞれＫＬＨおよび自己腫瘍に対する反応性を示した。Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは、この免疫プライミング（ｉｍｍｕｎｏｐｒｉｍｉｎｇ）技術の効率を向上させることができる。
【０３５７】
Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙらは、アポトーシス性の組換えカナリヤポックスウイルスに感染させた樹状細胞中で発現される腫瘍抗原の樹状細胞による交差提示を示した（Ｍｏｔｔａ  Ｉ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６７：１７９５−８０２）。メラノーマ関連Ａｇ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（ＭＡＲＴ−１）をコードする組換えカナリヤポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ）を、樹状細胞（ＤＣ）に基づくアプローチを使用して癌免疫治療で試験した。ＡＬＶＡＣ  ＭＡＲＴ−１に感染したＤＣは、該ウイルスベクターによりコードされる抗原を発現、プロセシングかつ提示する。ＡＬＶＡＣによる感染の一貫した一特徴はアポトーシスの誘導、およびＡＬＶＡＣ  ＭＡＲＴ−１に感染したＤＣとともに未感染のＤＣを共培養した場合のＡｇの交差提示であった。未感染のＤＣによるアポトーシス性ウイルスに感染したＤＣの取り込み、および未感染のＤＣにおける腫瘍抗原のその後の発現は、フローサイトメトリー分析、画像サイトメトリーおよび共焦点顕微鏡検査により確認された。機能的活性をＭＡＲＴ−１特異的な細胞傷害性Ｔ細胞クローンの刺激によりｉｎ  ｖｉｔｒｏでモニターした。ＡＬＶＡＣに感染したＤＣ単独と比較して、Ａｇ提示の高められた効率が、Ｔ細胞クローンによるＩＦＮ−γ産生の２ないし３倍の増大により示された。ＡＬＶＡＣ  ＭＡＲＴ−１に感染したおよび未感染のＤＣの共培養は、ＨＬＡクラスＩ／エピトープ四量体結合、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび細胞傷害性試験により評価されるとおり、ＭＡＲＴ−１特異的なＴ細胞免疫応答を誘導することが可能である。
【０３５８】
１０８２５８９｜ｐｉｒ｜｜Ａ５５２５３メラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１−ヒトとしてＧｅｎＢａｎｋに示されるところのメラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１のアミノ酸配列を表１５．１に提示する。ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａの予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１５．２に列挙する。ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａの実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１５．３に列挙する。表１５．２および１５．３のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−１ハイブリッドを表１５．４に列挙する。ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａの予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１５．５に列挙する。ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａの実験で定義されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１５．６に列挙する。表１５．２、１５．３、１５．５および１５．６のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有する設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＡＲＴ−１ハイブリッドを表１５．７に列挙する。
【０３５９】
【表８３】
2006515744.tif 000084
【０３６０】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは多くの一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０３６１】
【表８４】
2006515744.tif 000085
【０３６２】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ペプチド１５．３．１はＨＬＡ−ＤＲ４により提示される（Ｚａｒｏｕｒ  Ｈ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０００  ９７：４００−５）。
【０３６３】
【表８５】
2006515744.tif 000086
【０３６４】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１５．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０３６５】
【表８６】
2006515744.tif 000087
【０３６６】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。表９．４のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープは、（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）のオンラインプログラムの使用を用いて予測した。スコアはこの下位配列を含有するペプチドの解離のＴ１／２である（Ｔｓａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。ペプチド１５．５．１はＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ａ３１により提示される。ペプチド１５．５．２はＨＬＡ−Ａ＊０２０１により提示される。ペプチド１５．５．３および１５．５．４はＨＬＡ−Ｂ４０により提示される。
【０３６７】
【表８７】
2006515744.tif 000088
【０３６８】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。ペプチド１５．６．１はＨＬＡ−Ａ＊０２０１により提示される（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９４  １８０：３４７−５２）。ペプチド１５．６．２はＨＬＡ−Ａ＊０２０１により提示される（Ｃａｓｔｅｌｌｉ  Ｃ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９５  １８１：６３−８）。ペプチド１５．６．３はＨＬＡ−Ｂ＊４５０１により提示される（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｊ．Ｉｎｔｌ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９８  ７５：４５１−８）。
【０３６９】
【表８８】
2006515744.tif 000089
【０３７０】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１５．２のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープおよび表１５．６のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【実施例１６】
【０３７１】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｈｅｒ−２  ｎｅｕ抗原性エピトープハイブリッド。
【０３７２】
数種の癌細胞上で過剰発現される表皮増殖因子受容体に対し向けられる免疫治療はそれらの腫瘍の増殖を制御し得る。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは浸潤性乳癌を伴う患者の３０％までで腫瘍上で過剰発現され、そしてその過剰発現は不良な臨床転帰を伴う。Ｃａｒｒらは、１９９５年から１９９９年までのレトロスペクティブな連続的シリーズ（ｓｅｒｉｅｓ）において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子が９０例の患者のうち４０例（４３％）の浸潤性乳癌で増幅されたことを示した（Ｃａｒｒ  ＪＡ．Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ．２０００  １３５：１４６９−７４２０）。初期治療後、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ増幅を伴う患者は、その遺伝子を増幅しない乳癌を伴う患者が有した（４０か月）よりも短い疾患を伴わない間隔の中央値（２２か月；ｐ＝．００３）を有した。疾患は７２例（７２％）の患者で再発し、１８例（２５％）は局所で再発した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子増幅は、腫瘍グレード、エストロゲン／プロゲステロン受容体の状態およびリンパ節の状態に関係なく早期の再発についての高リスクにさらされている乳癌患者の１サブセットの独立した予後の指標である。早期ステージのリンパ節陰性および節陽性双方の疾患、ならびに転移性疾患を伴う女性において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現はより悪い生存を伴う。ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する腫瘍を伴う女性は、ホルモン療法若しくは化学療法のいずれかでの補助療法にもかかわらずより少なく好都合の転帰を有する。Ｎａｐｌｅｓ  ＧＵＮ試験におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ陰性の早期ステージ患者の間でタモキシフェンは全体生存に有益であった。しかしながら、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子増幅を伴う患者の間では、タモキシフェンは生存を改善しなかった（Ｄｅ  Ｐｌａｃｉｄｏ  Ｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９０  ６２：６４３−６）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現はタモキシフェン不成功の独立した予測因子である。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現は腫瘍細胞に対し選択的でありそして悪性形質転換の経過の初期に観察される。より重要なことに、原発性および転移性病変におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現（３２％）の細胞学的特徴はほぼ同一である（Ｍａｓｏｏｄ  Ｓ．Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ．２０００  ３０：２５９−６５）。微小転移巣は一次治療後の再発の主要な供給源でありかつＨＥＲ−２／ｎｅｕが転移巣で過剰発現されるため、ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、抗腫瘍応答の局所での強化および微小転移巣の根絶の双方のための、早期疾患を伴う患者の免疫治療の優れた標的である。同様に、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを初期治療後に再発した患者において他の主要な処置レジメンとともに標的とすべきである。
【０３７３】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕを標的することへの多くのアプローチのうち、臨床上最も進んだアプローチはトラスツズマブ（ハーセプチン［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ］（Ｒ））（上皮増殖因子（ＥＧＦ）のＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体の細胞外ドメインに結合する、ＦＤＡに承認されたヒト化モノクローナル抗体）を用いる受動免疫治療である。このモノクローナル抗体は単一薬剤としておよび古典的化学療法と組合せでの双方で指示される。Ｓｌａｍｏｎらは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現した転移性乳癌を伴う４９６例の女性においてドキソルビシンおよびシクロホスファミド（ＡＣ）若しくはパクリタキセルと併用したハーセプチン［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ］（Ｒ）を評価した（Ｖｏｇｅｌ  ＣＬ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００２  ２０：７１９−２６；Ｓｌａｍｏｎ  ＤＪ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００１  ３４４：７８３−９２）。ハーセプチン［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ］（Ｒ）を受領する患者は、化学療法単独（パクリタキセル若しくはＡＣのいずれか）に無作為化された患者に比較して、疾患の進行までの有意により長い時間（７．４か月対４．６か月；ｐ＜０．０００１）、より高い客観的奏功（５０％対３２％；ｐ＜０．００１）、より長い奏功期間（中央値９．１対６．１；ｐ＜０．００１）、より高い１年生存率（７８％対６７％；ｐ＝０．００８）、より長い生存（生存の中央値２５．１か月対２０．３か月；ｐ＝０．０４６）および死亡のリスクの２０％低下を有した。
【０３７４】
臨床試験は代替のトラスツズマブ投与レジメンおよび併用療法に進行するかもしれない一方、トラスツズマブの作用機序が有意に増大された有効性につながらないことができることを示唆し得る。とりわけ、トラスツズマブはＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ＥＧＦ受容体を遮断しかつ抗体依存性の細胞の細胞傷害性を誘導する（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９  ４  Ｓｕｐｐｌ  １２：６０−７０）。ＡＤＣＣはＴ若しくはＢリンパ球の抗原特異的記憶につながらず、また、それは抗原特異的な細胞障害性Ｔリンパ球の増殖も誘導しない。
【０３７５】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕはまた、能動的な特異的免疫応答を誘導するためのいくつかのワクチン試験の標的でもある。ＮＣＩ  ＰＤＱにおいて、３件の現在の臨床試験が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質、抗原でパルスした樹状細胞、リポソーム被包化ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ＭＨＣペプチドエピトープおよびＤＮＡワクチンを使用している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｃａｎｃｅｒ＿ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｄｏｃ．ａｓｐｘ？ｖｉｅｗｉｄ＝Ｆ２ＡＦＡＥＡ４−６４ＢＤ−４Ｅ４４−Ｂ４２１−５６０２６Ｅ２５２３８９）。理論的根拠はもちろん：（１）抗原特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋リンパ球；（２）メモリーＢ細胞を伴うＨＥＲ−２／ｎｅｕに対する自己抗体；および（３）メモリーヘルパーＴ細胞を誘導することにより治療の有効性および投与の臨床的容易さを高めることである。
【０３７６】
細胞に基づくワクチン、ＤＮＡワクチンおよび遺伝子治療のアプローチに比較して、ペプチドワクチン接種はいくつかの理由から好ましい。とりわけ、ペプチドワクチンは：（１）容易に構築かつ製造される；（２）化学的に安定である；（３）偶発的病原体（ａｇｅｎｔ）および他の病原体（ｐａｔｈｏｇｅｎ）を含まない；ならびに（４）発癌の潜在性を欠く。最近まで、大部分のグループは、低強度のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発したＭＨＣクラスＩペプチドワクチンの使用に焦点をあてていた。Ｓｈｉｋｕらは、マウスＨ−２Ｋｄ拘束性の腫瘍抗原に相同である新規ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕ２由来ペプチドが卵巣癌患者および健康な個体においてＨＬＡ−Ａ２４拘束性の細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導することを同定した（Ｏｋｕｇａｗａ  Ｔ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  ３０：３３３８−４６；Ｉｋｕｔａ  Ｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０００  ８７：５５３−８；Ｎａｇａｔａ  Ｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  １５９：１３３６−４３）。加えて、彼らは、疎水性化した多糖を短縮したＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質複合体を組込む単球由来樹状細胞によるＭＨＣクラスＩ結合ペプチドの提示を示した（Ｉｋｕｔａ  Ｙ．Ｂｌｏｏｄ．２００２  ９９：３７１７−２４；Ａｒａｋｉ  Ｈ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００１  １１４：６８１−９）。
【０３７７】
ペプチドワクチンはＭＨＣクラスＩに提示されるペプチドを認識するＣＴＬ細胞による応答を高めるが、しかし、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるペプチドでＴヘルパー細胞を免疫することによってもまた増強し得る。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ由来のＭＨＣクラスＩＩに提示されるペプチドはヒト乳房、結腸直腸および膵の腺癌により発現され、また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導された特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞クローンにより認識される（Ｐｅｒｅｚ  Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００２  ５０：６１５−２４；Ｓｏｔｉｒｉａｄｏｕ  Ｒ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ８５：１５２７−３４）。Ｍｕｒｒａｙらは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（７７７−７８９）ペプチドが、ＩＦＮ−γを分泌するように転移性乳癌を伴う患者からの末梢血単核細胞を誘導したことを示した（Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０００  ２７  Ｓｕｐｐｌ：７１−５）。このグループはまた、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）が、健康なドナーからの末梢血単核細胞での強いＣＴＬ応答（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＢＷ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  ６：４１９２−２００；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＢＷ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０００  ４９：４５９−６８）、ならびに乳癌患者および健康なドナーからの末梢血単核細胞からのＣＸＣケモカインＩＰ−１０の分泌（Ｌｅｅ  ＴＶ．Ｊ  Ｉｍｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０００  ２０：３９１−４０１）を誘導したことも示した。しかしながら、そのＭＨＣクラスＩペプチドを用いた臨床試験において、３／９例の患者のみがワクチン接種後に基礎より上であったリンパ球増殖応答を有した（Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０００  ２７  Ｓｕｐｐｌ：７１−５）。増大されたＣＴＬ増殖およびＩＦＮ−aレベルはただ１例のワクチン接種患者の末梢血単核細胞の刺激した培養物でみられた。５例の患者のうち３例で、ＩＦＮ−aおよびＣＴＬ活性がＩＬ−１２添加により有意に増大し、弱い抗原提示が弱いＣＴＬ誘導につながり、それは炎症前サイトカインでｉｎ  ｖｉｔｒｏで部分的に復帰されることを示した。しかしながら、ＭＨＣクラスＩペプチド免疫感作はヘルパーＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を誘導しない。この理由から、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を刺激するエピトープのみ、若しくはＭＨＣクラスＩＩに提示されるＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞を刺激するエピトープがＭＨＣクラスＩに提示されるＣＤ８＋  Ｔ細胞傷害性細胞を刺激するエピトープを覆っているペプチドのいずれかを含むペプチドワクチンが探究されている。
【０３７８】
健康なドナーおよび卵巣癌患者からの末梢血単核細胞はＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドに応答する（Ｆｉｓｋ  Ｂ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７  １７：４５−５３）。主要ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子のアンカーを含有するＨｅｒ−２／ｎｅｕからのペプチド配列は卵巣癌患者でよりも健康なドナーにおいてより高頻度で増殖およびサイトカイン応答を誘導した。配列：３９６−４０６、４７４−４８７、７７７−７８９および８８４−８９９の４種のＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドは、３種の他の別個のＨＥＲ−２ペプチド４４９−４６４、９７５−９８７および１０８６−１０９８より多数の健康なドナーの増殖を刺激した。２５例の卵巣癌患者の応答のパターンは健康なドナーのものと異なった。６か月にわたって全４種のＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドに対する安定な応答を示した１例の卵巣癌患者の末梢血単核細胞のペプチドでの刺激によりＴ細胞株を発生させた。各Ｔ細胞株はＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の分泌が異なった。これらの結果は、（ａ）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕペプチドが健康なドナーおよび卵巣癌患者の双方においてＴ細胞の拡張を刺激し得ること、ならびに（ｂ）異なるペプチドは異なるサイトカイン分泌パターンを誘導することを示す。（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２００２  Ｍａｙ；２２（５）：５８３−９２）。
【０３７９】
Ｉｏａｎｎｉｄｅｓらは、乳癌を伴う患者からの腋窩リンパ節がＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドに応答することを示した（Ｋｕｅｒｅｒ  ＨＭ．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２００２  ２２：５８３−９２）。浸潤性乳癌のための外科手術を受ける７例の女性のリンパ節からの新たに単離したリンパ球を５０μｇｍ／ｍｌのＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドおよび対照抗原で刺激した。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のレベルをＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドでのプライミングおよび再刺激時に測定した。患者の腋窩リンパ節から単離したリンパ球はＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドに応答した（増殖および特異的サイトカイン産生）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドに対する増殖応答は原発性腫瘍におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕの過剰発現を伴うおよび伴わない患者のリンパ節でみられた。若干の患者においては、転移巣を伴うリンパ節からのリンパ球におけるＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドに対する増殖応答が、同一患者からの転移巣を伴わないリンパ節からのリンパ球における応答に比較して非存在であったか若しくは低下された（ｐ＜０．０５）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドは乳癌患者から単離した節リンパ球におけるサイトカイン応答の主としてＴヘルパータイプ１（Ｔｈ１）パターンを誘導した。Ｔｈ１特異的サイトカイン産生パターンは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドでのプライミングおよび再刺激で維持されかつＩＬ−１２補助刺激で増幅された。これらの結果は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドが、浸潤性乳癌を伴う女性からの排出リンパ節中のＴ細胞を活性化し得ることを示す。
【０３８０】
ＨＬＡ−Ａ２に提示されるＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドで免疫した患者は、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープでの同時ワクチン接種の非存在下で低レベルかつ短命のＣＴＬ応答のみを発生した（Ｗａｒｄ  ＲＬ．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  ６０：５１０−５）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現する癌を伴う６例のＨＬＡ−Ａ２患者が、１００μｇのＧＭ−ＣＳＦと混合した５００μｇのＨｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）ペプチドよりなるワクチン製剤での６回の月１回のワクチン接種を受領した。患者はステージＩＩＩ若しくはＩＶいずれかの乳房若しくは卵巣癌を有した。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）ペプチドに対する免疫応答をＩＦＮ−γの酵素結合免疫吸着スポットアッセイを使用して検査した。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ＭＨＣクラスＩエピトープはＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチド特異的なＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘導したとは言え、応答の大きさは小さくならびに短命であり、このエピトープに対する確実かつ持続する免疫にＣＤ４＋  Ｔ細胞ヘルプが必要とされることを示した。
【０３８１】
Ｄｉｓｉｓらは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＣＤ８  Ｔ細胞免疫を生成させるＨＥＲ−２／ｎｅｕヘルパーペプチドワクチンで乳癌患者を免疫した（Ｋｎｕｔｓｏｎ  ＫＬ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００１  １０７：４７７−８４）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する癌を伴う１９例のＨＬＡ−Ａ２患者がＨｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３８４）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（６８８−７０３）およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ（９７１−９８４）よりなるワクチン製剤を受領した。これらの配列内にはＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（６８９−６９７）およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ（９７１−９７９）を含有する。ワクチン接種後、ＨＬＡ−Ａ２ペプチドに対する平均のペプチド特異的Ｔ細胞前駆体頻度が患者の大多数で増大した。加えて、ペプチド特異的Ｔ細胞は腫瘍を溶解することが可能であった。該応答は長命でありかつ若干の患者においては最終の免疫感作後１年以上検出された。これらの結果は、覆っているＭＨＣクラスＩエピトープを含有するＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ＭＨＣクラスＩＩエピトープが持続するＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的なＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘導することを示す。
【０３８２】
Ｄｉｓｉｓらは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子と混合したＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質の潜在的Ｔヘルパーエピトープ由来のペプチドから構成されかつ皮内に投与されるワクチンで、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する乳房、卵巣若しくは非小細胞肺癌を伴う６４例の患者を免疫した（Ｄｉｓｉｓ  ＭＬ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００２  ２０：２６２４−３２）。９種の異なるエピトープを使用した。すなわち、ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞内ドメイン由来の３種（ｐ７７６−７９０、ｐ９２７−９４１およびｐ１１６６−１１８０）、ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外ドメイン由来の３種（ｐ４２−５６、ｐ９８−１１４およびｐ３２８−３４５）、ならびにそれらの天然の配列中にＨＬＡ−Ａ２結合モチーフを包含するヘルパーエピトープを伴う３種（ｐ３６９−３８４、ｐ６８８−７０３およびｐ９７１−９８４）。患者の９２パーセントがＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドに対する、および６８％がＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質ドメインに対するＴ細胞免疫を発生させた。エピトープの広がり（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）は患者の８４％で観察され、そしてＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質特異的Ｔ細胞免疫の生成と相関した（Ｐ＝．０３）。１年経過観察時に、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質に対する免疫が患者の３８％で持続していた。とりわけ、肝、消化管および皮膚を包含する基礎レベルのｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質を発現することが既知の器官において、いずれかの検出された自己免疫毒性を発生した患者はいなかった。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッド分子中の本研究で使用したＭＨＣクラスＩＩエピトープの組込みは、より低いかつ少ない投与、より大きなエピトープの広がり、腫瘍に対するより高親和性Ｔ細胞の誘導、エピトープおよびｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対するより持続性の免疫応答、ならびにより大きな臨床的有効性を伴うより迅速な抗ｈｅｒ−２／ｎｅｕ免疫応答につながるかもしれない。
【０３８３】
癌患者の腫瘍浸潤物および末梢血中で腫瘍反応性のＣＴＬを見出すことは、いかなる抗腫瘍免疫応答も疾患の広がりを制御しないという疑問を提起する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＢＷ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  ６：４１９２−２００）。その場合、ペプチドワクチンによるこの応答の増幅が疾患の進行の間に有用であるかどうかを尋ねるかもしれない。危険にさらされている健康なドナーならびに疾患を伴わない患者における腫瘍反応性ＣＴＬの誘導が、腫瘍を早期に認識するＣＴＬは疾患が進行する場合にのみ拡張するＣＴＬよりもそれらの進行の阻止においてより有効であるという仮説に基づいて提案された。１０名の健康なドナーにおける細胞溶解性のＴ細胞活性のプライミングを、免疫原としてＨｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）ペプチドおよび抗原提示細胞として自己末梢血単核細胞由来の樹状細胞を用いて試験した。彼らのうち２名が、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）ペプチド特異的ＣＴＬ活性の誘導により自己の樹状細胞上に提示されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）ペプチドとプライミング時に応答した。３名の他の応答体が２回の付加的な再刺激後に同定された。プライミング時の細胞溶解活性の誘導は、腫瘍壊死因子−αおよびＩＬ−１２により応答体において高められたが、しかし非応答体においては高められなかった。
【０３８４】
決定子の広がりおよびＴｈ１応答がＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激により誘導された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＢＷ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０００  ４９：４５９−６８）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（７７６−７８９）に対する応答の誘導は他のＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドに対する反応性を誘導した。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（７７６−７８９）は、進行性疾患を伴う卵巣癌患者およびＨＬＡ−ＤＲ１１を共有した健康なドナーの双方においてＨｅｒ−２／ｎｅｕ（８８４−８９９）に対する応答を拡大した。この応答は主として増大されたＩＦＮ−γ分泌および増殖を特徴とするが、しかし、該患者とＨＬＡ−ＤＲ１４およびＨＬＡ−ＤＱ５のみを共有した別のドナーで起こらなかった。エピトープの広がりは、Ｉｉのリバース遺伝子構築物を用いるＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド免疫感作、すなわちＨｅｒ−２／ｎｅｕ遺伝子免疫感作の協調した使用によってもまた高めることができる。
【０３８５】
Ｈｅｓｓらは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕからのＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドおよびＣＬＩＰのＮ末端隣接領域のキメラ構築物がラットモデル系においてＨｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍に対する強力な抗腫瘍活性を導き出したことを見出した（Ｈｅｓｓ  ＡＤ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１  １０１：６７−７６）。有効な抗腫瘍免疫の誘導は、照射された腫瘍細胞上での、若しくはＨｅｒ−２／ｎｅｕからのＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドと協力してのキメラペプチドの提示を必要とした。養子移入研究は保護的抗腫瘍免疫のためのＣＤ４  Ｔヘルパー細胞に対する必要性を示した。エピトープのみのペプチドでの免疫感作は、ＲＴ−ＰＣＲ（定性的および定量的）ならびに限界希釈アッセイにより分析されるタイプ１（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ）およびタイプ２（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）双方のサイトカイン産生細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの未改変ペプチドに対する弱い免疫応答を引き起こした。比較上、キメラ構築物での免疫感作は主としてタイプ１のサイトカイン産生細胞で親エピトープに対する強力な免疫応答を導き出した。
【０３８６】
促進されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ分解はＣＴＬによる卵巣腫瘍認識を高めた（Ｃａｓｔｉｌｌｅｊａ  Ａ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１  ２１７：２１−３３）。それらの研究において、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ分解は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを構成的に過剰発現した卵巣腫瘍株ＳＫＯＶ３．Ａ２において、細胞表面からのＨｅｒ−２／ｎｅｕをダウンモジュレート（ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅ）しかつそのポリユビキチニル化および分解を促進したゲルダナマイシンの添加により高められた。ＳＫＯＶ．Ａ２からの免疫優性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープＨｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）の提示はＬＬｎＬのようなプロテオソーム阻害剤により阻害された。追加実験は、ＧＡの存在下で新たに合成されたＨｅｒ−２／ｎｅｕがＣＴＬにより認識されるエピトープの主供給源であったことを示した。２０時間ＧＡ処理したＳＫＯＶ３．Ａ２細胞は、対照の未処理のＳＫＯＶ３．Ａ２細胞に比較して末梢血単核細胞中の多数のＨｅｒ−２／ｎｅｕ  ＣＴＬエピトープに向けられたＣＴＬ活性のより良好な誘導体であり、それにより免疫原性を促進した。同様に、ゲルダナマイシンおよび類似の機構により作用する他の化合物は、Ｉｉタンパク質の非存在下でのＥＲにおけるＭＨＣクラスＩＩエピトープの結合を高めることが期待される。
【０３８７】
Ｗａｒｄらは、ファージに表示されるＥｒｂＢ−２遺伝子フラグメントライブラリーおよび合成ペプチドを使用して抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕモノクローナル抗体の一団をエピトープマッピングした（Ｙｉｐ  ＹＬ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００２  ５０：５６９−８７；Ｙｉｐ  ＹＬ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６６：５２７１−８）。３種のモノクローナル抗体、Ｎ１２、Ｎ２８およびＬ８７のエピトープをそれぞれＨｅｒ−２／ｎｅｕのＨｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｃ５３１−Ａ５８６）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｔ２１６−Ｃ２３５）およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｃ２２０−Ｃ２３５）に成功裏に配置した。Ｎ１２は腫瘍細胞増殖を阻害した一方、Ｎ２８はＨｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現する乳癌細胞株の１サブセットの増殖を刺激したことが見出された。Ｎ１２により認識されるペプチド領域Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｃ５３１−Ａ５８６）を、マウスで阻害性免疫応答を選択的に誘導するための免疫原として使用した。ＧＳＴ融合ペプチドＧＳＴ−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｃ５３１−Ａ５８６）で免疫したマウスは、天然のＨｅｒ−２／ｎｅｕ、ペプチドＨｅｒ−２／ｎｅｕ（５３１−５８６）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（５３３−５４８）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（５４５−５５６０）およびＨｅｒ−２／ｎｅｕ（５７１−５８６）の３種の１５アミノ酸のペプチドを認識した。より重要なことに、マウス血清から精製した免疫グロブリンは腫瘍細胞増殖の８５％までを阻害することが可能であった。この研究は、Ｉｉ−Ｋｅｙ／Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＮＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープ／抗体に認識される決定子のハイブリッドの構築における潜在的な抗体に認識される決定子のいくつかの使用を支持する。抗体に認識される決定子を表１６．８に提示しかつそれらのエピトープを含有するハイブリッドを表１６．９に提示する。抗体に認識される決定子を含有するこうしたハイブリッドが好ましいことができＨｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現する腫瘍の受動および能動双方の免疫治療の開発に使用し得る。
【０３８８】
実験で同定されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ（上）を考えれば、こうしたエピトープを診断的若しくは治療的免疫応答の刺激のためのＩｉ−Ｋｅｙ／Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗原性エピトープハイブリッド内で合成し得る。
【０３８９】
ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質［ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］のアミノ酸配列（ｇｉ｜１９５７５７６８｜）はＧｅｎＢａｎｋから得た（表１６．１）。癌免疫治療のためのペプチドの選択における重要な一考慮は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕと増殖因子受容体（ＥＧＦ−ｒ）のサブクラスＩファミリーの別のメンバーとの間の高程度の配列の相同性である（Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ  Ｊ．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ５２：１０９−１８）。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕと異なり、ＥＧＦ−ｒは身体中で広範に発現される。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕとマウス若しくはヒトＥＧＦ−ｒとの間で同一のペプチド配列は２つの理由から選択しなかった。第一に、こうした配列に対するＴ細胞寛容は、こうしたエピトープに対する特異性をもつレパートリー高親和性Ｔ細胞から排除されていたかもしれないことがありそうである。第二に、ＥＧＦ−ｒペプチドを発現する正常細胞にＣＴＬの標的を定めることは望ましくないことができる。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１６．２に提示する。ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の実験で決定されたＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープを表１６．３に列挙する。表２および３のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを使用して設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／Ｈｅｒ−２／ｎｅｕハイブリッドを表１６．４に列挙する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１６．５に列挙する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の実験で決定されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１６．６に列挙する。設計されるＩｉ−ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＭＨＣクラスＩエピトープハイブリッドを表１６．７に列挙する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ上の抗体に認識される決定子を表１６．８に列挙する。表１６．８の抗体に認識される決定子ならびに表２および３のＭＨＣＨクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを使用して設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／Ｈｅｒ−２／ｎｅｕハイブリッドを表１６．９に提示する。
【０３９０】
【表８９】
2006515744.tif 000090
【０３９１】
【表９０】
2006515744.tif 000091
【０３９２】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアは複数の一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルでの高得点を得る選択についてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０３９３】
【表９１】
2006515744.tif 000092
【０３９４】
Ｐｏｓ．は該ペプチド中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で決定されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。ペプチド１６．３．１はＰｅｒｅｚ  Ｓ．ら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００２  ５０：６１５−２４）により報告された。ペプチド１６．３．２はＳｏｔｉｒｉａｄｏｕ  Ｒ．ら（Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ８５：１５２７−３４）により報告された。ペプチド１６．３．３はＦｉｓｋ  Ｂ．ら（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７  １７：４５−５３）により報告された。ペプチド１６．３．８〜１６．３．１６はＤｉｓｉｓら（Ｄｉｓｉｓ  ＭＬ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００２  ２０：２６２４−３２）によるフェーズＩ臨床試験で報告されたものである。ペプチド１６．３．９は予測されたＨＬＡ−ＤＲＢ１−０１０１に提示されるモチーフＬＲＩＶＲＴＧＴＱＬ（配列番号５８５）を含有し、また、ペプチド１６．３．１６はＤＲＢ１−０１０１に提示されるモチーフＬＶＳＥＦＳＲＭＡ（配列番号５８６）を含有し；双方は免疫した患者からのリンパ球を刺激した。Ｄｉｓｉｓらにより研究されたシリーズ（ｓｅｒｉｅｓ）の付加的なペプチドは、付加的なＨＬＡ−ＤＢアレルについて試験される場合にＭＨＣクラスＩＩに提示されるモチーフを含有しかつスコア化のための指標を低下させることが見出されるかもしれない。こうしたエピトープはＩｉ−Ｋｅｙ／Ｈｅｒ−２抗原性エピトープハイブリッドに組込まれることにかけられる。
【０３９５】
【表９２】
2006515744.tif 000093
【０３９６】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は表１６．２および１６．３のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０３９７】
【表９３】
2006515744.tif 000094
【０３９８】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。クラスＩに提示されるエピトープは、（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）のオンラインプログラムの使用を用いて予測した。スコアはこの下位配列を含有するペプチドの解離のＴ１／２である（Ｔｓａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。
【０３９９】
【表９４】
2006515744.tif 000095
【０４００】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は実験で定義されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。ペプチド１６．６．１はＨＬＡ−Ａ２．１により提示される（Ｋｏｎｏ  Ｋ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９８  ７８：２０２−８）。ペプチド１６．６．２は、Ｒｏｎｇｃｕｎ  Ｙ．ら（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  １６３：１０３７−４４）により確認されたとおり、ＨＬＡ−Ａ２．１により提示される（Ｋｏｎｏ  Ｋ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９８  ７８：２０２−８）。それはＨＬＡ−Ａ２．１およびヒトＣＤ８を発現する二重トランスジェニックマウスにおいて免疫原性であることもまた示された（Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ  Ｊ．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ５２：１０９−１８）。ペプチド１６．６．３はＨＬＡ−Ａ２．１により提示される（Ｋｏｎｏ，Ｋ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９８  ７８：２０２−８；Ｒｏｎｇｃｕｎ  Ｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  １６３：１０３７−４４）。それはＬｕｓｔｇａｒｔｅｎ  Ｊ．らの研究（Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ５２：１０９−１８）で非免疫原性であった。ペプチド１６．６．４、１６．６．５および１６．６．６はＨＬＡ−Ａ２．１により提示される（Ｒｏｎｇｃｕｎ  Ｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  １６３：１０３７−４４）。ペプチド１６．６．７はＨＬＡ−Ａ２により提示され（Ｐｅｏｐｌｅｓ  Ｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９５  ９２：４３２−６）、そしてＬｕｓｔｇａｒｔｅｎ，Ｊ．らの研究（Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ５２：１０９−１８）で非免疫原性である。ペプチド１６．６．８はＨＬＡ−Ａ２により提示される（Ｔａｎａｋａ  Ｙ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１  ９４：５４０−４）。ペプチド１６．６．９はＨＬＡ−Ａ２．１により提示される（Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ  Ｊ．Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７  ５２：１０９−１８）。ペプチド１６．６．１０はＨＬＡ−Ａ３により提示される（Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｉ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９９  ５９：４３１−５）。
【０４０１】
【表９５】
2006515744.tif 000096
【０４０２】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置であり、ＭＨＣクラスＩＩはＩ：として示され、そしてＭＨＣクラスＩＩはＩＩ：として示される。配列は表１．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０４０３】
【表９６】
2006515744.tif 000097
【０４０４】
これらのペプチドは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｃ２２０−２３５）配列を含有するＧＳＴ融合タンパク質で免疫したマウスの血清と反応することが報告されている（Ｙｉｐ  ＹＬ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００２  ５０：５６９−８７；Ｙｉｐ  ＹＬ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６６：５２７１−８）。
【０４０５】
【表９７】
2006515744.tif 000098
【０４０６】
Ｐｏｓ．はＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置であり、また、セミコロンの後は抗体に認識されるエピトープを含有することが報告されたペプチド中の第一の残基である。配列はハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【実施例１７】
【０４０７】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／炭疽菌ＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープハイブリッド。
【０４０８】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは炭疽菌および他の生物テロ病原体に対するワクチンとして応用し得る。炭疽菌に対する独立したワクチン若しくはマルチワクチン（ｍｕｌｔｉｖａｃｃｉｎｅ）プロトコルの成分としてのＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの応用を十分に理解するために、炭疽菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の生物学および病因論の復習が有用である。同様に、炭疽菌に対する現在利用可能なワクチンを本開示の生成物および方法により提供される改良に照らして考慮する。とりわけ、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド技術は、既存のワクチンを可能にしかつ炭疽菌感染に対するかなりの程度の保護を独立に提供する、高められた抗原特異的Ｔヘルパー細胞応答を提供する。Ｉｉ−Ｋｅｙ／炭疽菌エピトープペプチドワクチンは、軍隊および文民双方の集団による使用のための安全性および有効性を提供する。
【０４０９】
炭疽は、大型のグラム陽性の非運動型細菌杆状体の細菌、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の胞子により引き起こされる感染性疾患である。ヒトの炭疽疾患は３種の主要な形態、すなわち皮膚、吸入および胃腸を有する。治療されない場合、全部の形態の炭疽は敗血症および死につながり得る。皮膚炭疽の早期の処置は通常治癒的である。胃腸炭疽を伴う患者は２５％ないし７５％の報告された症例死亡を有する。吸入炭疽の症例死亡率は９０％ないし１００％である。細菌が一旦、炭疽毒素を分泌するのに十分に密に増殖すれば、抗生物質は無効であるため、抗生物質での全部の形態の炭疽の早期の処置が不可欠である（Ｌｅｐｐｌａ  ＳＨ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００１  ７：６５９−６６０）。吸入炭疽は二相を有する。曝露後１ないし５日以内に発生する第一相の間、患者は流感様の症状（咳、倦怠感、疲労および軽度の発熱）を有する。後に続く相は、重症の呼吸困難、胸部痛および発熱の突然の発生を包含する。１日以内に敗血症ショックおよび死亡が起こることがありそうであることができる。吸入炭疽の場合、抗生物質治療は、曝露直後に投与される場合を除き制限された利益のものである。
【０４１０】
炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）により産生される主要な毒性因子、炭疽毒素は３種のタンパク質よりなる。ＰＡはヒト細胞に結合し、そしてＬＦ（優勢な毒性因子）が細胞質に進入するチャンネルを形成する（Ｌｅｐｐｌａ  ＳＨ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００１  ７：６５９−６６０）。ＬＦはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）を切断するメタロプロテイナーゼであり、細胞死および敗血症ショックに似た臨床像をもたらす。ＬＦ−ＰＡ６３結合、オリゴマー化、七量体形成およびＬＮの細胞質輸送を誘発するのは、ＰＡ６３（細胞の結合およびＰＡのフリン触媒作用後に利用可能にされるＰＡ上の一領域）へのＬＦの結合である（Ｌｅｐｐｌａ  ＳＨ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｘｉｎｓ（Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈ  Ｆ．ら編）１１１−１１２  Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ、ニューヨーク、１９８８）。
【０４１１】
炭疽の致死的毒素は２種のタンパク質すなわち保護因子（ＰＡ；ＭＷ  ８３ｋＤａ）および致死因子（ＬＦ；ＭＷ  ８７ｋＤａ）を含んでなる。ＰＡの結晶構造が単量体および七量体で決定された（Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ  Ｒ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９  ８７：２８２−２９０）。それは既知の三次元構造の他の細菌毒素への類似性をもたず、そして他のグラム陽性細菌からの相同な毒素を包含する新たな一構造分類を定義する。膜挿入は、実質的なｐＨに誘導されるコンホメーション変化を受けてそれにより１４本鎖のβ−バレルを創製する水溶解性の七量体を必要とする。Ｃｏｌｌｉｅｒのグループによる最近の研究は膜挿入のこのモデルに裏付けを与える（Ｂｅｎｓｏｎ  ＥＬ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９８  ３７：３９４１−８）。致死因子は炭疽の致死的毒素の触媒成分である。それは細胞に結合したＰＡ七量体の表面に結合しそしてエンドサイトーシスおよびエンドソームの酸性化後に細胞質に転位する。
【０４１２】
Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎらは炭疽の致死因子の結晶構造を決定した（Ｐａｎｎｉｆｅｒ  ＡＤ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  ４１４：２２９−３３）。致死因子（ＬＦ）は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）ファミリーのメンバーをアミノ末端近くで切断して１種若しくはそれ以上のシグナル伝達経路の阻害に至る、高度に特異的なプロテアーゼである。ＬＦおよびＭＡＰＫＫ−２のＮ末端とのその複合体の結晶構造が決定された。ＬＦは４ドメインを含んでなる。すなわち、ドメインＩは炭疽毒素の膜転位成分すなわち保護因子（ＰＡ）を結合し；ドメインＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶは一緒になって、切断前にＭＡＰＫＫ−２の１６残基のＮ末端の尾を保持する長く深い溝を創製する。ドメインＩＩはバチルス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からのＡＤＰリボシル化毒素に似ているが、しかし活性部位が変異されておりかつ基質認識を増強するのに動員される。ドメインＩＩはドメインＩＩ中に挿入されそしてドメインＩＩの構造的要素の反復する複製から生じるようである。ドメインＩＶは亜鉛メタロプロテイナーゼファミリーにわずかに関連しており、そして触媒中心を含有し；それはまたドメインＩにも似ている。該構造は、従って、遺伝子の複製、突然変異および融合の過程により高くかつ異常な特異性をもつ酵素に進化したタンパク質を示す。
【０４１３】
炭疽の致死的毒素がマクロファージを殺すのにプロテアソーム活性が必要とされる（Ｔａｎｇ  Ｇ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９９  ６７：３０５５−６０）。保護因子（ＰＡ）および致死因子（ＬＦ）よりなる炭疽の致死的毒素（ＬｅＴｘ）は初代マウスマクロファージおよびマクロファージ様細胞株を迅速に殺す。ＬＦはＰＡにより標的細胞の細胞質中に転位され、そこでそれはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ１（ＭＥＫ１）およびおそらく他のタンパク質を切断する。アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルロイシナールすなわちＭＧ１３２およびラクタシスチンのようなプロテアソーム阻害剤はＬｅＴｘの細胞傷害性を効率的に阻害する一方、他のプロテアーゼ阻害剤は阻害しない。多様なデータは、プロテアソームが細胞の細胞質中でＬＦにより開始される毒性の過程を媒介することを示す。この過程はおそらく、マクロファージの恒常性に不可欠である同定されていない分子の分解を必要とする。さらに、このプロテアソーム依存性の過程はＬｅＴｘ中毒の初期段階であるが、しかしそれはＭＥＫ１若しくは他の推定の基質のＬＦによる切断の下流にある。
【０４１４】
Ｌｅｐｐｌａらは哺乳動物細胞中へのエンドサイトーシス性の取り込みの間の炭疽毒素の保護因子のオリゴマー化および致死因子の結合を見出した（Ｓｉｎｇｈ  Ｙ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９９  ６７：１８５３−９）。炭疽毒素の保護因子（ＰＡ）タンパク質は細胞の受容体に結合し、そして細胞表面のフリンにより切断されて６３ｋＤａのフラグメント（ＰＡ６３）を生じさせる。受容体に結合したＰＡ６３は七量体にオリゴマー化し、そして毒素の触媒的部分すなわち致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）をエンドソームから細胞質に転位させるよう作用する。ＬＦ転位におけるＰＡオリゴマー化の不可欠の役割が、残基３１３−３１４で切断されるＰＡタンパク質で示された。毒素タンパク質の構造、ならびにタンパク質分解の活性化、ＬＦ結合およびインターナリゼーションのキネティクスは、各ＰＡ６３サブユニットにＬＦ分子をインターナリゼーションさせる様式で均衡を保たれている。
【０４１５】
Ｌｅｐｐｌａらは該毒素を阻害することにより可能な治療に向ける３つの利点を同定した（Ｃｈａｕｄｒｙ  ＧＪ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２  １０：５８−６２）。細胞表面の毒素受容体の同定は結合の競合体および受容体のおとりの設計につながる可能性がある。致死因子プロテアーゼの結晶構造の決定は、治療薬としてプロテアーゼ阻害剤を開発するための進行中の試みを助長することができる。最後に、炭疽の致死的毒素に対するある種の近交系マウスの感受性がキネシン様タンパク質Ｋｉｆ１Ｃ中の突然変異と関連した。これは炭疽毒素がどのように動物を殺すかを説明するのに役立つ可能性のある発見であった。
【０４１６】
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）により遊離されるＰＡおよびＬＦの病理学的影響に対しヒトを保護するための多様なワクチン戦略が開発された。それらのワクチンの増強におけるＩｉ−Ｋｅｙ（ＭＨＣクラスＩＩおよびＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＡＲＤハイブリッドの有用性を認識するために、炭疽菌感染に対するワクチン接種およびその処置の現在の状態を概観することが有用である。
【０４１７】
選ばれた公務員およびメディアの地方放送局の従業員への手紙に含有された炭疽菌胞子に何千もの人々が潜在的に曝露された２００１年後半の生物テロ攻撃の間、３０，０００以上の個人が予防的抗生物質治療（原則的にシプロフロキサシンおよびドキシサイクリン）を６０日間受領した。炭疽菌胞子は動物の肺中に６０日以上の間持続し得るため、これらの潜在的に曝露された個体はその後、別の４０日の１クールの抗生物質、および最初の抗生物質レジメンの完了に際して吸収型炭疽ワクチン（Ａｎｔｈｒａｘ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ）を用いる治療的ワクチン接種を提供された。しかしながら、炭疽菌胞子への曝露後の有効な抗生物質治療には狭い時間窓のみが存在するため、大スケールで抗生物質を使用することは現実的な選択肢でない。炭疽菌および炭疽毒素に対する予防的および治療的ワクチン接種は、従って炭疽菌生物テロ事象の場合の最も有望な形態の集団介入である。
【０４１８】
潜在的に好ましい生物テロ兵器としてのその出現前は、炭疽菌感染は、動物、および動物若しくは動物製品の直接かつ広範囲の取扱いを伴う職業をもつヒトに制限されていた。現在の炭疽菌ワクチン、吸収型炭疽ワクチン（Ａｎｔｈｒａｘ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ）の承認は、動物皮革を処理した米国の工場労働者を伴う１９５０年代のＰｈｉｌｉｐ  Ｓ．Ｂｒａｃｈｍａｎにより実施された臨床試験に基づいた。このワクチンの利用可能性の前、ヒト炭疽症例の年平均数はこれらの工場の従業員１００人あたり１．２であった。Ｂｒａｃｈｍａｎの研究は炭疽菌ワクチン接種の有効性に関する証拠を提供した。すなわち、（ａ）２６例の患者が試験の間に炭疽を発症した（５例の吸入および２１例の皮膚）；（ｂ）５例の吸入炭疽症例のうち、２例の患者がプラセボを受領し、また、３例は観察群にあった；（ｃ）吸入炭疽を伴う５例の患者のうち４例が死亡した；（ｄ）皮膚炭疽の２１症例のうち、１５例の個体がプラセボを受領し、３例が観察群にあり、そして２例の個体は部分的に免疫され、そして１例の個体は完全に免疫された；（ｅ）著者は、完全にワクチン接種した個体について９２．５％というワクチンの有効性レベルを計算した（Ｂｒａｃｈｍａｎ  ＰＳ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ．１９６２  ５２：４３２−４４０）。
【０４１９】
１９６６年、ＣＤＣは、Ｂｒａｃｈｍａｎの試験で使用されたワクチンの改変であったワクチンの臨床試験を開始した。双方のワクチンは保護因子（ＰＡ）により誘導される免疫に基づいたとは言え、それらの製造方法が異なった。ＩＮＤ試験はミシガン州公衆衛生局（ｔｈｅ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＭＤＰＨ）により製造された３ロットの材料を使用した。生物製剤基準部門（ｔｈｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）に提出されたデータは、７，０００名の試験参加者に投与された１６，０００用量の炭疽ワクチンを用いたＣＤＣの経験を記述した。軽度の局所反応は３ないし３６％の間、中程度の反応は１ないし３％の間、そして重症の局所反応は１％未満の範囲にわたった。全身反応は５年の期間にわたって４症例で報告され；これらの反応は一過性の発熱、寒気、悪心および全身の身体の痛みを包含した。該ワクチンは、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）胞子で汚染されているかもしれない動物製品と接触するかもしれない個体、高い危険にさらされている個体（獣医師を包含する）、および彼らを胞子と接触させるかもしれない診断もしくは研究活動に従事する者向けに１９７０年に承認された。
【０４２０】
１９８５年、公衆衛生総局法（ｔｈｅ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ａｃｔ）のもとでの諮問委員会の再評価（Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ  Ｒｅｖｉｅｗ）は、ＭＤＰＨにより製造された炭疽菌ワクチンを、安全、有効かつ不当表示がされていないカテゴリーＩ製品と呼称した（連邦官報  １９８５年  ５０：５１００２）。Ｂｒａｃｈｍａｎの試験からの有効性データおよびＣＤＣの試験からの安全性のデータがこれらの知見の基礎であった。１９８８年５月、国防総省（ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｎｓｅ）（ＤＯＤ）は米軍軍人の予防ワクチン接種を承認した。２００１年１２月には、以前に炭疽菌胞子に曝露された（フロリダ州、ニューヨーク州およびワシントンＤＣでの生物テロ行為の結果として）個人、ならびに予防的抗生物質治療を受けていた者でもまた治療的ワクチン接種が開始された。
【０４２１】
ＢｉｏＰｏｒｔ（炭疽菌ワクチン製造におけるＭＤＰＨの継承者）により製造される現在のＡＶＡワクチンは、炭疽疾患を引き起こさない炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の株由来である。それは全細菌を含有しない、細胞を含まない濾液である。ワクチン接種プロトコルは、０．５ｍｌ  ｓ．ｃ．の初回投与、次いで２および４週、ならびに６、１２および１８か月での０．５ｍｌ  ｓ．ｃ．の追加免疫投与を包含し、その後年１回の追加免疫を伴う。製造方法は困難であり、高価であり、時間がかかり、スケールが制限され、そして多くの生物製剤の法的規制を負わされている。非毒素産生性かつ被包化されていない組換え炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）胞子ワクチンおよび致死因子ＤＮＡワクチンの開発が最近開始された（Ｃｏｈｅｎ  Ｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２０００  ６８：４５４９−５８；Ｐｒｉｃｅ  ＢＭ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００２  ６９：４５０９−１５）。また、ＰＡタンパク質に基づく３種の新しい炭疽ワクチンも研究されている（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ＡＭ．ＪＡＭＡ  １９９９  ２８２：２１０４−６；Ｔｈｏｍａｓ  ＬＪ．４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｈｒａｘ．Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ．２００１年６月１０〜１３日、米国メリーランド州アナポリス；Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  ＰＣＢ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００１  １３：１１）。生物学的製造の製品であれば、工程および管理は単純なペプチドについてよりはるかにより複雑でありかつ規制の問題を伴い進められる。
【０４２２】
炭疽ワクチン専門家委員会（ｔｈｅ  Ａｎｔｈｒａｘ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＡＶＥＣ）は、ワクチン有害事象報告システム（ｔｈｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＶＡＥＲＳ）に報告された有害事象を精査した（Ｓｅｖｅｒ  ＪＬ．Ｐｈａｒｍａｃｏｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ．２００２  １１：１８９−２０２；Ｇｅｉｅｒ  ＤＡ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００２  ２０：２１７−２０）。ほぼ半数の報告が局所の注入部位の副作用を示し、これらの１／３以上は中程度ないし大きな程度の炎症を伴った。６事象が重大な副作用としての資格を有し、そして全部がワクチン接種のある種の結果であると判断された。報告の３／４は全身性の副作用（最も一般的：流感様症状、倦怠感、発疹、関節痛、頭痛）に言及したが、しかし６件の個別の医学上重要な事象のみがひょっとすると若しくは十中八九ワクチンによると判断された（脊椎関節症の悪化（２）、アナフィラキシー様反応、関節炎（２）、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎）。彼らは、局所炎症の若干の症例が遠位感覚異常を伴ったため、ＡＶＥＣは、尺骨神経に対する圧迫性傷害を回避するために三頭筋の代わりに下部三角筋上へのＡＶＡの皮下注入を与えることを推奨すると結論した。
【０４２３】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣクラスＩＩエピトープ）ハイブリッドは強いＴｈ１免疫応答を誘導することができ、それは順にＣＴＬ活性、マクロファージ媒介性の細菌溶解、およびＢ細胞媒介性の抗体産生を増強することができる。生じる免疫応答は、高められたマクロファージ活性化を介して細菌の破壊を媒介することができる。加えて、該ハイブリッドは増強されたＢ細胞活性化を提供することができ、それは、ＬＦへの同時の若しくはその後の曝露の設定においてＬＦのＰＡへの結合を阻害する抗体の産生を急がせかつ高めてそれにより炭疽毒素のインターナリゼーションを予防することができる。
【０４２４】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ）ハイブリッドペプチドワクチンを用いる予防的ワクチン接種はメモリーＴヘルパー細胞を誘導することができ、メモリーＴヘルパー細胞は、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）へのその後の曝露に際してマクロファージをより強力かつより迅速に活性化してそれにより細菌の効率的な溶解および消失をもたらすことができる。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ）ハイブリッドペプチドワクチンでのプライミングは特異的Ｔヘルパー細胞の拡張された集団につながることができ、その集団は、ＬＦワクチンを用いるワクチン接種若しくは炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）への曝露に際して抗体産生のためＢ細胞をより迅速かつ効率的に活性化することができる。以前にワクチン接種された若しくは該疾患に以前に曝露された患者におけるＩｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣクラスＩＩエピトープ）ハイブリッドペプチドワクチンでの追加免疫は、マクロファージおよびＢ細胞の効率的な活性化を伴う確実かつ迅速な既往反応を創製することができる。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ）ハイブリッドでの以前のワクチン接種は、古典的な炭疽ワクチンへの曝露若しくは感染それ自身に際しての炭疽毒素の中和において決定的に重要である、Ｔヘルパー細胞のより迅速な刺激および増強されたかつより迅速な抗体産生を提供するＢ細胞の活性化をもたらすことができる。
【０４２５】
別の局面において、Ｉｉ−Ｋｅｙ／炭疽菌ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／炭疽菌ＡＲＤハイブリッドを使用して、有効な阻害抗体を導き出すワクチンを創製し得る。ＬＦ上のＰＡ結合部位からのＡＲＤよりなる複合ペプチド構築物はＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドへの共有結合を伴い設計する。いくつかの例において、ＭＨＣクラスＩＩエピトープおよびＡＲＤの配列がオーバーラップする。これらの二重ハイブリッド構築物［Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ）／ＬＦ１−２５５（ＡＲＤ）］はＴヘルパー細胞およびＢ細胞の同時の抗原特異的活性化を介してＬＦ１−２５５に対する抗体の確実な産生を誘発する。該二重ハイブリッド構築物は、最も重要な領域すなわちＬＦのＰＡ６３結合部位での免疫応答に集中しかつそれを拡大する。ワクチン接種後に産生される抗体はＰＡ６３へのＬＦの結合および炭疽毒素のインターナリゼーションを破壊してそれにより該疾患の毒性を回避する。炭疽菌および炭疽毒素に対する保護のためのこれらのＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを用いる免疫感作手順の開発の過程の方法は以下を包含する。１．最も有効な二重ハイブリッド（１種若しくは複数）（最も強力なＣＤ４＋  Ｔ細胞免疫を誘導しかつＰＡ６３へのＬＤ１−２５５の結合および細胞中へのＬＦ１−２５５の進入を封鎖することに関して）を、細菌の増殖および致死的毒素の毒性の阻害を評価するための動物感染モデルでｉｎ  ｖｉｖｏで試験する。２．免疫感作製剤（アジュバントを伴う若しくは伴わない多様な用量）、免疫感作の経路（ｓ．ｃ．若しくはｉ．ｖ．）、および免疫感作スケジュール（追加免疫を伴う若しくは伴わない）を動物モデルで評価する。ヒト試験での応用に向けて、用量、投薬量スケジュール、製剤、サイトカインアジュバント、ならびに基礎的な局所および全身毒性をマウス保護モデルで評価する。３．Ｔｈメモリー細胞の活性化を、ペプチド、組換えタンパク質若しくはｃＤＮＡのＬＦワクチンでの二次攻撃に対するＣＤ４＋細胞応答の効力について、免疫したマウス群で３、６、９および１２か月に試験する。４．最も強力なヒトＨＬＡ−ＤＲ拘束性ＬＦエピトープをヒト臨床応用のため決定する。ある種のＨＬＡ−ＤＲアレルの最も強力なエピトープを、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅプログラムを使用して予測する。ＬＦ  ＭＨＣクラスＩＩエピトープ  ａａ５７６−５９１がＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４双方により提示されるとみられる限りは、他の汎ＤＲアレル結合エピトープを同定するための試みがなされる。予測されたＩｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＨＬＡ−ＤＲエピトープ）構築物をｅｘ  ｖｉｖｏでヒトＰＢＭＣ刺激および再刺激試験で活性について試験する。Ｔｈ１およびＴｈ２応答（ＣＤ４およびＩＦＮ−γ若しくはＣＤ４およびＩＬ−４についての二重染色）を評価する。５．構造Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＨＬＡ−ＤＲ）／ＬＦ１−２５５（ＡＲＤ）の二重ハイブリッドを、最も活性のＩｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＨＬＡ−ＤＲエピトープ）および最も活性の抗体決定子（ＡＲＤ）を使用して合成する。これらを動物毒物学および薬物動態試験で試験する。６．二重ハイブリッドを用いて、志願者での臨床ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫感作およびｅｘ  ｖｉｖｏＰＢＭＣ再刺激試験を実施してＴｈ１およびＴｈ２応答を評価する。数種の最も有望な二重ハイブリッドを、ＣＤ４＋  Ｔ細胞活性化（ＣＤ４およびＩＦＮ−γ若しくはＩＬ−４についてのＰＢＭＣの二重染色）ならびに阻害抗体の誘導を評価するその後の臨床試験で評価する。誘導される抗体のｅｘ  ｖｉｖｏ試験を実施して、ＰＡ６３へのＬＦ１−２５５の結合および細胞中へのＬＦ１−２５５の進入の阻害を評価する。至適のハイブリッド（１種若しくは複数）を、より多数の個体を伴う臨床試験で炭疽ワクチンとしてさらに開発する。適切な有効性のエンドポイントおよび免疫学的代理物を、適切な規制当局との徹底的な討論に基づき選択する。
【０４２６】
Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッド炭疽ワクチンは大きな利点を有する。（１）安全性。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドワクチンは完全長のＬＦ若しくはＰＡタンパク質と対照的に小型のペプチドであるため、正常の宿主分子と交差反応性でありうるタンパク質（１種若しくは複数）の無関係の領域に対する望ましくない免疫応答を誘導してそれにより自己免疫媒介性の毒性をもたらすより小さな危険が存在する。ペプチドワクチンは逆の効果を有さず、そして従って大きな軍隊および文民集団に安全に使用し得る；（２）有効性。今日まで、ＭＨＣクラスＩＩエピトープに基づくワクチンは主として低い結合効率により確実な抗原特異的免疫応答を誘導していない。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッド技術は、同時のＩＬ−１２投与の情況でのみ通常みられる強い抗原特異的免疫応答が観察されるようなＭＨＣクラスＩＩエピトープの装填効率を高める。（３）正確な標的設定。とは言え現在のワクチンは高力価のポリクローナル抗体を誘導しうる。しかしながらこれらの抗体は決定的に重要な標的すなわちＰＡのＬＦ結合部位に常に対するわけではない。Ｉｉ−Ｋｅｙ二重ハイブリッドＩｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ／ＬＦ１−２５５（ＡＲＤ）は、ＰＡのＬＦ結合部位に特異的かつ正確に標的を定めた抗体の産生をもたらしてそれにより免疫系によりもつことがもたらされる資源を効率的に利用することができる。（４）二重作用−Ｉｉ−Ｋｅｙ二重ハイブリッドは、マクロファージを活性化させて細胞媒介性の細菌溶解および消失を遂げることができるＴヘルパーメモリー細胞、ならびに炭疽毒素の毒性を回避することができるＰＡ６３結合部位に対する強い抗体を誘導することができる。密な細菌増殖の設定においてさえ、ＬＦ上のＰＡ結合部位に対する抗体は炭疽毒素の毒性効果から保護することができる。（５）プラットフォーム技術−炭疽菌の系で有効であることが一旦示されれば、このアプローチは他のカテゴリーＡ（すなわちボツリヌス、ペストおよび天然痘）、カテゴリーＢならびにカテゴリーＣの生物テロの脅威での使用に容易に適合可能である。
【０４２７】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ）ハイブリッドは、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の増殖を阻害するための主要防御線を形成するＬＦ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞活性化を誘導するために設計される。その場合、最も強力なＩｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ）ハイブリッドをＬＦ上のＰＡ６３結合部位の推定のＡＲＤに結合して、構造Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ）ＬＦ１−２５５（ＡＲＤ）の二重ハイブリッドを形成する。ＡＲＤは、突然変異／結合アッセイによりＰＡへの結合のためのＬＦ上の部位の公表されたマッピングから選ぶ（Ｌａｃｙ  ＤＢ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２００２  ２７７：３００５−１０）。ＡＲＤへのＩｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣクラスＩＩエピトープ）ハイブリッドの結合は、共有結合されたＡＲＤに対する抗体の誘導のための強いＣＤ４＋  Ｔ細胞ヘルプを提供することができる（Ｇｏｌｖａｎｏ  Ｊ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０  ２０：２３６３−６。これらの抗体はＬＦ上のＰＡ結合部位の表面に結合しかつＰＡ６３へのＬＦの結合を阻害することができる。正確に標的を定めた結合部位に対する高力価抗体の誘導は炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のＬＦの毒性を阻止する別の防御線を創製するが、とは言え細菌の感染は進行し得る。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムで予測されるＭＨＣクラスＩＩに提示されるＬＦエピトープは、Ｈ−２Ｅｋモチーフのコンセンサス配列に完全に一致する３種のエピトープ、すなわちＬＦ（９１−１０６；ＨＩＳＬＥＡＬＳＤＫＫＫＩＫ）（配列番号６３４）ＬＦ（２４９−２６４；ＥＱＥＩＮＬＳＬＥＥＬＫＤＱＲ）（配列番号６３５）；ＬＦ（３０５−３２０；ＤＤＩＩＨＳＬＳＱＥＥＫＥＬＬ）（配列番号６３６）を同定する。Ｔ細胞活性化研究での全部のハイブリッドの活性をＩｉ−Ｋｅｙに結合されていないエピトープと比較することができる。Ｔ細胞活性化は二色染色（Ｔｈ１について抗ＣＤ４および抗ＩＦＮ−・、ならびにＴｈ２について抗ＣＤ４および抗ＩＬ−４）により測定する。ＡＫＲ若しくはＣＨ３マウス（Ｈ−２Ｋｋ）を変動する用量（０．８、４および２０ｎｍｏｌ）のＩｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ）ハイブリッドで免疫する（１群あたり３匹のマウス）。Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９１  ８８：８７６−８４）により使用された２０ｎｍｏｌという濃度は至適のＴ細胞増殖を誘導した。はるかにより低濃度のハイブリッドが同一若しくはより高レベルのＴ細胞応答を誘導することができる。第一の実験において、アジュバント乳液は等容量の１ｍｇ／ｍｌのヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有するＣＦＡおよびＰＢＳに溶解したハイブリッドペプチドよりなる。マウスを尾の基部の左側でｓ．ｃ．免疫する。フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）中の同一量のハイブリッドペプチドを９日後に尾の基部の右側に注入する。ハイブリッドは、ハイブリッドの有効性におけるＣＦＡに対する要件を試験するために同一のスケジュールに従って生理的食塩水中で静脈内に注入する。Ｉｉ−ＫｅｙハイブリッドはＡＰＣの細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子と直接相互作用してそれにより古典的なＭＨＣクラスＩＩエピトープのプロセシングを迂回しかつアジュバントを不必要にすることができることに注目すべきである。第二の注入の４日後に、免疫したマウスの脾、膝窩、鼠頚部および傍大動脈節からのリンパ球の活性化をＣＤ４およびＩＦＮ−γ若しくはＩＬ−４のいずれかについての確立した二色染色により測定する（Ｖａｒｇａ  ＳＭ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６６：１５５４−６１）。
【０４２８】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ（ＭＨＣ  ＩＩエピトープ）／ＬＦ１−２５５（ＡＲＤ）二重ハイブリッドはＰＡへのＬＦの結合を阻害する抗体を産生することができる。ＰＡへのＬＦの結合および細胞中へのＬＦのその後の進入は炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）感染の主要な毒性に不可欠である。ＰＡへのＬＦの結合を阻害することは、従って炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の毒性を制御するための有効な一方法である。Ｌａｃｙらは突然変異／結合アッセイによりＬＦ  １−２５５の表面上のＰＡ結合部位を同定した。これらの部位からの９個のオーバーラップするＡＲＤをＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープ／ＡＲＤハイブリッド中に合成する。担体若しくはＭＨＣクラスＩＩエピトープのいずれかへの結合がこれらの短いペプチドに対する抗体を誘導するために必要とされる（Ｇｏｌｖａｎｏ  Ｊ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０  ２０：２３６３−６）。ＬＦは結晶化され、そしてその機能的ドメインが定義されている（Ｐａｎｎｉｆｅｒ  ＡＤ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  ４１４：２２９−３３；Ｌａｃｙ  ＤＢ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  ２７７：３００５−１０）。ＬＦ突然変異およびＰＡ／ＬＦ結合実験により、ＬａｃｙらはＬＦ上のＰＡ６３結合部位をマッピングした。２位置すなわちａａ１８２−１８８およびａａ２２３−２３６に群生した突然変異はＰＡ６３へのＬＦの結合を大きく消失させる。これら２集団はその露出された結合部位でＬＦの表面上に位置するため（Ｌａｃｙ  ＤＢ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  ２７７：３００５−１０）、それらは論理上、ＰＡ６３へのＬＦの結合を阻害するための抗体を開発するための良好な標的である。
【０４２９】
別の局面において、本開示はＰＡ若しくはＬＦのＤＮＡワクチンに対する免疫応答を強めることに関する。本開示のＩｉ−Ｋｅｙ／炭疽菌抗原性エピトープハイブリッドは、炭疽菌にコードされるタンパク質のＤＮＡワクチンの前もって投与される前ワクチンとして応用し得る。こうしたワクチンのいくつかの例が後に続く。
【０４３０】
ＧａｌｌｏｗａｙらはＬＦ（１０−２５４）若しくはＰＡ（１７５−７６４）または双方をコードするプラスミドでの免疫感作による炭疽菌の致死的毒素攻撃に対する保護を開発した（Ｐｒｉｃｅ  ＢＭ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  ６９：４５０９−１５）。いずれかの若しくは双方のプラスミドで被覆した金粒子を２週間間隔で３回マウスに遺伝子銃注入した。ＰＡおよびＬＦ双方の抗体力価はいずれかの遺伝子単独で免疫したマウスからの力価より５倍より高かった。いずれかの若しくは双方のプラスミドで免疫した全マウスは致死的用量のＰＡ＋ＬＦでのｉ．ｖ．攻撃を生き延びた。
【０４３１】
Ｇｕらもまた匹敵するＰＡのＤＮＡワクチンを研究した（ＧＵ  ＭＬ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９９  １７：３４０−４）。ＰＡのＤＮＡで免疫したマウスからの血清の１００倍希釈は細胞傷害性濃度のＰＡに対しｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を保護した。ＰＡのＤＮＡワクチンで３回免疫した８匹のマウスのうち７匹が、炭疽菌の保護因子および致死因子の組合せでの致死的攻撃に対し保護された。ＰＡのＤＮＡワクチンでのこうした免疫感作の増強は組換え保護因子での後の追加免疫によりさらに強められるかもしれない。こうしたタンパク質抗原はＰＡに対する抗体産生をさらに高めることができる。Ｉｉ−ＫｅｙハイブリッドがＤＮＡワクチンから発現される抗原に対するＭＨＣクラスＩＩ拘束性の応答を強めるとは言え、ＭＨＣクラスＩＩエピトープのインターナリゼーションおよびプロセシングのためにＢ細胞に結合してそれらのＢ細胞をプラズマ細胞および可溶性免疫グロブリン産生に進むよう活性化するのに細胞外で利用可能な十分なＰＡタンパク質がおそらく存在しないからである。
【０４３２】
ＤＮＡおよびタンパク質ワクチンの増強におけるＩｉ−Ｋｅｙ／炭疽菌抗原性エピトープハイブリッドの有効性は、多様な地理的起源の炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）単離物による胞子攻撃に対してモルモット、ウサギおよびアカゲザルで試験し得る（Ｆｅｌｌｏｗｓ  ＰＦ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１  １９：３２４１−７）。
【０４３３】
別の局面において、Ｉｉ−Ｋｅｙ／炭疽菌ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／炭疽菌ＡＲＤハイブリッドを使用して、細胞中へのＬＦのインターナリゼーションに必要とされるＰＡとのＬＦの相互作用を阻害する抗体を導き出し得る。こうした保護的阻害効果をもつ抗体の創製および使用の例が後に続く。
【０４３４】
Ｇｅｏｒｇｉｏｕらは、組換え抗体フラグメントによる炭疽毒素に対する保護が抗原の親和性と相関することを見出した（Ｍａｙｎａｒｄ  ＪＡ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  ２０：５９７−６０１）。炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）により産生される三部からなる毒素は炭疽の病因における重要な決定子である。彼らは、６３ｎＭと０．２５ｎＭとの間の平衡解離定数（Ｋ（ｄ））で毒素の保護因子サブユニットに結合する、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）およびヒト定常κドメインに融合させたｓｃＦｖ（ｓｃＡｂ）を包含する毒素中和抗体の一団を工作した。該抗体の一団全体は高い血清、熱的および変性剤に対する安定性を示した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ホロトキシンの作用からのマクロファージの攻撃後の保護がｓｃＦｖバリアントのＫｄと相関した。抗体構築物の親和性、血清半減期および保護の間の強い相関もまた毒素攻撃のラットモデルで観察された。高親和性の毒素中和抗体は、感染した個体において炭疽毒素の症状を緩和するため、および感染に対する中期予防のため治療上価値があり得る。
【０４３５】
別の局面において、本開示は細胞中へのインターナリゼーションのためＬＦを結合するＰＡのセグメントに対する保護抗体を生成させるためのＩｉ−Ｋｅｙ／炭疽菌ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＡＲＤハイブリッドに関する。Ｖａｒｕｇｈｅｓｅらは、突然変異誘発およびＬＦの存在下での毒性についての精製されたタンパク質の試験により、ＰＡのドメイン４の溶媒に露出されたループ中の２個のこうした潜在的部位（ａａ  ６７９ないし６９３および７０４ないし７２３）を同定した（Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ  Ｍ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９９  ６７：１８６０−５）。突然変異をこれらのループ中で設計し、そしてＰＣＲの間に発生する誤りにより導入した。大きなループ（ａａ  ７０４ないし７２３）内の置換はＰＡの活性に対する影響を有しなかった。２８種の変異体タンパク質の間の比較は、大きなループ（ａａ  ７０４ないし７２２）が受容体結合に関与しない一方、小さなループ（ａａ  ６７９ないし６９３）中およびその近くの残基が受容体相互作用に関係することを示した。ペプチドは、その小さなループにより、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＬＦ  ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＬＦ  ＡＲＤハイブリッド中の組込みの良好な候補である。
【０４３６】
細胞中に他のタンパク質を引き込むか若しくはＭＡＰキナーゼキナーゼを不活性化するその毒性の活性のいずれかのために炭疽菌の致死因子を使用し得る（Ｄｕｅｓｂｅｒｙ  ＮＳ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８  ２８０：７３４−７；Ｌｉｕ  Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００  ６０：６０６１−７；Ｌｉｕ  Ｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１  ２７６：１７９７６−８４）。
【０４３７】
本開示のハイブリッドはミョウバンに吸着された、後で投与される炭疽菌トキソイドワクチンに対する応用を高めることができる（Ｐｉｔｔｍａｎ  ＰＲ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００２  ２０：１４１２−２０）。これを投与するＩＭ経路は安全であり、また、２用量を４週間隔で投与する場合に、２週間隔で投与される３用量の認可された初期投与スケジュールに比較して、匹敵するピーク抗ＰＡ  ＩｇＧ抗体レベルを有する。
【０４３８】
本開示のＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは吸入炭疽のウサギモデルでアッセイし得る（Ｐｉｔｔ  ＭＬ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１  １９：４７６８−７３）。ワクチンに誘導される免疫の血清学的相関が吸入炭疽のウサギモデルで同定された。動物に、ヒト用量からリン酸緩衝生理的食塩水中２５６倍希釈までの範囲にわたる変動する用量の吸着型炭疽菌ワクチン（Ａｎｔｈｒａｘ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ）を第０および４週に筋肉内に接種する。第６および１０週に、定量的抗ＰＡ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡおよび毒素中和抗体アッセイの双方を使用してＰＡに対する抗体レベルを測定した。ウサギを第１０週に致死用量の炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）胞子でエアゾル攻撃した。未希釈および４倍希釈のワクチンを受領した全部のウサギは生き残った一方、より高い希釈のワクチン（１６倍、６４倍および２５６倍）を受領するものはそれらの群で死亡を有した。結果は、第６および１０週双方でのＰＡに対する抗体レベルが生存の有意の（Ｐ＜０．０００１）予測因子であったことを示した。加えて、非侵襲的鼻免疫感作を使用して炭疽菌に対してワクチン接種し得る（Ｇａｕｒ  Ｒ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００２  ２０：２８３６−９）。マウスに、精製したＰＡを第０、１５および２８日に鼻内で、皮下に若しくは皮膚を通して接種した。ＰＡでの鼻内および皮下免疫感作は高いＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ力価をもたらした。ＩｇＡの高力価は鼻内で免疫したマウスでのみ観察された。細胞傷害性アッセイにおいて、これらの血清はＪ７７４Ａ．１細胞を致死的毒素攻撃から保護した。
【０４３９】
表１７．１は炭疽毒素の致死因子の推定されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ｜１６９７４８２４；Ｐａｎｎｉｆｅｒ  ＡＤ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００１  ４１４：２２９−２３３．（２００１））を提示する。表１７．２は炭疽毒素の致死因子の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを提示する。表１７．３は炭疽毒素の致死因子の予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを提示する。炭疽菌の致死因子について設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩエピトープハイブリッドを表１７．４に提示する。表１７．５は炭疽菌の致死因子について設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＡＲＤハイブリッドを提示する。表１７．６は炭疽菌の保護因子の推定されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ：９２８０５３３；Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２０００  ６８：４５４９−４５５８）を提示する。表１７．７は炭疽菌の保護因子の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを提示する。表１７．８は炭疽菌の保護因子の予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを提示する。炭疽菌の保護因子について設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩエピトープハイブリッドを表１７．９に提示する。表１７．１０は設計されたＩｉ−Ｋｅｙ／炭疽菌の保護因子のＭＨＣクラスＩＩエピトープ／炭疽菌の保護因子のＡＲＤのハイブリッドを提示する。
【０４４０】
【表９８】
2006515744.tif 000099
【０４４１】
【表９９】
2006515744.tif 000100
【０４４２】
Ｐｏｓ．は明記された配列の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの第一のアミノ酸である。スコアは検査した所定のＨＬＡ−ＤＲＢ＊＿＿０１アレルの第一のものについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより計算されるスコアである。第二の列挙されるアレルは、正確に同一のエピトープについて、若しくはオーバーラップするエピトープについて（第一のアミノ酸位置がカッコ内に示される）である。
【０４４３】
【表１００】
2006515744.tif 000101
【０４４４】
Ｐｏｓ．は列挙される配列のエピトープの第一のアミノ酸である。スコアはＨＬＡ−Ａ２についてＳＰＥＹＥＴＨＥＩプログラムで計算される。
【０４４５】
【表１０１】
2006515744.tif 000102
【０４４６】
これらのハイブリッドは表１７．３の予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープについてのいくつかを組込む。
【０４４７】
【表１０２】
2006515744.tif 000103
【０４４８】
Ｐｏｓ．はハイブリッド中に組込まれるＬＦ配列の最初のおよび最後のアミノ酸である。予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープの第一のアミノ酸はＩＩ：の後に列挙する。個々のエピトープを提示することが高スコアを伴い予測されたＭＨＣクラスＩＩアレルは以下のとおりである：１７０：ＨＬＡ−ＤＲＢ＊１３０１。１９１：ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１。２０３：ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１。２１５：ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０１０１。２３０：ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０１０１。２３９：ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０８０１。＿＿０１アレルのみをＰｒｏｐｒｅｄ予測プログラムで評価した。これらのペプチドは、Ｄ１８２、Ｄ１８７、Ｙ２２３、Ｈ２２９、Ｌ２３５およびＹ２３６でのアラニン置換に際しての活性の喪失により示されるところのＰＡへの結合のための相互作用部位を含有するＬＦ（１８２−２３６）のセグメントから選んだ（Ｌａｃｙ  ＤＢ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  ２７７：３００５−１０）。これらのハイブリッド中で、介在配列は、ＡＲＤ構造に潜在的に寄与するＬＦの天然の配列により供給される。これらのハイブリッドのいずれかを用いる生物学的活性の同定に際して、エピトープを含有するペプチド配列の系統的欠失／伸長を用いて付加的なハイブリッドを試験することができる。
【０４４９】
【表１０３】
2006515744.tif 000104
【０４５０】
【表１０４】
2006515744.tif 000105
【０４５１】
Ｐｏｓ．は予測されたエピトープの第一のアミノ酸である。アレルはエピトープの提示についての高スコアを伴うＨＬＡ−ＤＲＢ＊＿＿０１アレルである。第二のアレルが列挙される場合、それは正確に同一の配列、若しくは覆う（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ）配列（第一のアミノ酸残基位置がカッコ内に示される）のいずれかを予測する。スコアは所定のエピトープおよびアレルについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムでの予測スコアである。
【０４５２】
【表１０５】
2006515744.tif 000106
【０４５３】
Ｐｏｓ．は列挙される配列のエピトープの第一のアミノ酸である。スコアはＨＬＡ−Ａ２についてＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムで計算される。
【０４５４】
【表１０６】
2006515744.tif 000107
【０４５５】
【表１０７】
2006515744.tif 000108
【０４５６】
Ｐｏｓ．はハイブリッドに組込まれるＰＡ配列の最初のおよび最後のアミノ酸である。予測されたＭＨＣクラスＩＩエピトープの最初のアミノ酸はＩＩ：の後に列挙する。個々のエピトープを提示することが高スコアを伴い予測されたＭＨＣクラスＩＩアレルは以下である：１７３：ＨＬＡ−ＤＲＢ０４０１、０７０１、１５０１。２２１  ＨＬＡ−ＤＲＢ０３０１。２２３：ＨＬＡ−ＤＲＢ１１０１。２２５：ＨＬＡ−ＤＲＢ０３０１、８０１、１１０１、１３０１。６６４：ＨＬＡ−ＤＲＢ０１０１、０３０１。６９０：ＨＬＡ−ＤＲＢ０４０１、１１０１。６９６：ＨＬＡ−ＤＲＢ０３０１。＊＊０１アレルのみをＰｒｏＰｒｅｄ予測プログラムでスコア化した。ハイブリッド１７．１０．２、．３および．５において、介在配列はＡＲＤ構造に潜在的に寄与するＰＡの天然の配列により供給される。これらのハイブリッドのいずれかを用いての生物学的活性の同定に際して、エピトープを含有するペプチド配列の系統的欠失／伸長を用いて付加的なハイブリッドを試験することができる。ペプチド１７．１０．１および１７．１０．２は、Ｋ１９７、Ｒ２００、Ｐ２０５、Ｉ２０７、Ｉ２１０およびＫ２１４でのアラニン置換でＬＦ結合に対し感受性であることがＣｏｌｌｉｅｒらにより示された領域ＰＡ（１９７−２２２）から選んだ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｋ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００２  ９９：７０４９−５３）。ペプチド１７．１０．４および１７．１０．５はＰＡへの結合のための相互作用部位を含有することがＬｅｐｐｌａらにより示されたＰＡ（６７９−６９３）のより小さなループから選んだ（Ｖａｒｕｇｈｅｓｅ  Ｍ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９９  ６７：１８６０−５）。これらのハイブリッドのいずれかでの生物学的活性の同定に際して、エピトープを含有するペプチド配列の系統的欠失／伸長を用いて付加的なハイブリッドを試験することができる。付加的なＩｉ−Ｋｅｙ／ＰＡ  ＭＨＣクラスＩＩエピトープ／ＡＲＤハイブリッドは、ＰＡ中和抗体と結合するファージディスプレイ分析により生じられるペプチドを用いて構築し得る。これらのペプチドにおいて、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、最良の実験で決定されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープから選ぶことができる。例を、単一のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのみを使用するこうした構築物について表１７．１１に提示する。
【０４５７】
【表１０８】
2006515744.tif 000109
【０４５８】
Ｐｏｓは、一例のみが示されるＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの第一のアミノ酸である。実験で決定された最良のエピトープが好ましい。そのエピトープの後に続く配列は、ＰＡ結合抗体と相互作用するファージの選択およびシークエンシングによりＣｏｌｌｉｅｒらにより発見されたＡＲＤ配列である。それらの抗体のいくつかはＬＦのインターナリゼーションを阻害する。
【実施例１８】
【０４５９】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘Ｂ５Ｒタンパク質抗原性エピトープハイブリッド。
【０４６０】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープワクチンは、単独で若しくは他のワクチン接種方法と組合せのいずれかで使用される場合に天然痘に対し確実なかつ比較的安全な保護を提供する。ワクシニアウイルスのようなある種の他のワクチンの効力および安全性は、Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープワクチンを用いる１回若しくはそれ以上の免疫感作により先行される場合に実質的に高められる。大集団の保護は、単独でＩｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープハイブリッドワクチンの使用で、または、好ましくはＭＨＣクラスＩＩエピトープがＭＨＣクラスＩに提示される（細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する）エピトープおよび／若しくは抗体に認識される（ウイルスを中和する）エピトープと結合されるかもしくはそれらと配列がオーバーラップするこうしたワクチンで達成し得る。Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープワクチンでの免疫感作は事前のワクシニア免疫感作を伴わない天然痘ウイルスに感染した個体についての臨床での見込みもまた改善する。Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドワクチンは、ワクシニアウイルスまたは天然痘若しくはワクシニアウイルスタンパク質のＤＮＡのいずれかを含む予防的ワクチンを受領する人の保護的応答を高めることができる。天然痘への曝露もしくは潜在的曝露に際して即座に個体に投与されるワクシニアウイルスワクチン（「輪状接種方式」）の有効性は、保護的応答の速度および効力に関して促進することができる。天然痘感染の生物学および臨床経過を、本開示の生成物および方法により天然痘の予防にもたらされる実質的利益を理解するために概説する。
【０４６１】
大痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ）すなわち天然痘ウイルスは、ワクシニア（天然痘ワクチン）、サルポックスウイルス、および血清学的に交差反応する数種の他の動物ポックスウイルスを包含するポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｄｉｄａｅ）、チョルドポックスウイルス亜科（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ）およびオルトポックスウイルス属に属する（Ｂｒｅｍａｎ  ＪＧ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００２  ３４６：１３００−８；Ｍｏｓｓ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ．Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９６：２６３７−７１中；Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ．Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９６：２６７３−８３中）。ポックスウイルスは、既知の、１３０ないし３７５ｋｂの１本の直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子を含有しかつ細胞質中で複製する最大のウイルスのひとつである。
【０４６２】
５パターンの天然痘感染が存在する。大痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ  ｍａｊｏｒ）（通常の天然痘）は根絶以前の時代の症例の９０％の原因であり、そしてワクチン接種されていない患者で３０％（１５％ないし４５％）の全体症例死亡率を伴う。扁平型すなわち悪性の天然痘および出血性天然痘は、典型的には欠陥のある免疫系を伴う患者で発生し、そして症例死亡率はそれぞれ９７％および９６％である。小児における天然痘は、乳児での症例死亡率が４０％を超えることを除き成人における天然痘に全般として同様である。小痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ  ｍｉｎｏｒ）は米国および英国における大発生で優勢であった最も軽度の形態であり、１％未満の症例死亡率を伴う（Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ．Ｂｕｌｌ  ＷＨＯ．１９８８  １−６８、１２１−２０８；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＡ．ＪＡＭＡ．１９９９  ２８１：２１２７−３９）。
【０４６３】
天然痘ウイルスは気道を通って進入し、リンパ節に迅速に進んで１４日にわたって網内系で増殖する。口腔咽頭部の粘膜ならびに真皮の毛細血管上皮（皮膚損傷に至る）が感染したようになる。口腔咽頭部および皮膚の病変は豊富なウイルス粒子を含有し；ウイルスは尿および結膜分泌物中にもまた存在する。細胞傷害性Ｔ細胞およびＢ細胞が生じて感染を制限し；中和抗体が感染の第一週に出現するが、しかし感染が重症の場合は遅れる（Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ．Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９６：２６７３−８３１９９６中；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＪＡ．Ｂｒ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ．１９６２  ４３：４５１−６１；Ｂｅｄｓｏｎ  ＨＳ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９６３  ８５：１−２０；Ｂｕｌｌｅｒ  ＲＭ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９１  ５５：８０−１２２；Ｚａｕｃｈａ  ＧＭ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００１  ８１：１５８１−６００；Ｓａｒｋａｒ  ＪＫ．Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．１９７３  ４８：５１７−２２）。潜伏期間は７ないし１７日（平均１０ないし１２）である。２ないし３日間持続する前駆期は、重症の頭痛、背部痛および発熱を特徴とし、全部突然開始する（Ｄｉｘｏｎ  ＣＷ．Ｓｍａｌｌｐｏｘ．ロンドン、１９６２）。舌、口および口腔咽頭部の粘膜疹が１日だけ発疹に先行する。発疹は小型の帯赤色の斑として開始し、それは２ないし３ｍｍの直径をもつ丘疹となる。丘疹は２ないし５ｍｍの直径をもつ小胞となる。４ないし６ｍｍ直径の膿疱が発疹の４ないし７日後に発生する。末梢分布を伴う天然痘の病変は一般には（水痘の病変と対照的に）全部そろって同一の発症段階にある。掌および足底上の病変が最長に持続する。天然痘による死亡は、免疫複合体を伴う毒血症ならびに体液およびタンパク質喪失に二次的な低血圧に帰される。
【０４６４】
天然痘は、最も一般的には密接な顔と顔の接触を伴う者の間での液滴の吸入により主として人から人に伝播される（Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ．Ｂｕｌｌ  ＷＨＯ．１９８８  １−６８、１２１−２０８）。風媒および媒介物（洗濯物、寝わら）伝播が起こる（Ｄｉｘｏｎ  ＣＷ．Ｓｍａｌｌｐｏｘ．ロンドン、１９６２）。患者は発疹発生の直前の発熱の時から感染性である。二次的攻撃率は３７％から７０％超までの範囲にわたり（Ｒａｏ  ＡＲ．Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．１９６８  ５６：１８２６−５４；Ａｒｎｔ  Ｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９７２  ９４：３６３−７０；Ｈｅｉｎｅｒ  ＧＧ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１９７１  ９４：３１６−２６）、１原発症例が３．６ないし６人の他者を感染させる（Ｇａｎｉ  Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２００１  ４１４：７４８−５１）。ユーゴスラビアおよびドイツにおける１９７０年代の大発生においては指標症例あたり１１ないし３８の感染性接触が存在した（Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ．Ｂｕｌｌ  ＷＨＯ．１９８８  １−６８、１２１−２０８）。従って、低集団免疫を伴う集団において、伝播は防禦手段が確立する前に大発生症例を迅速に創製する。感染性は全部の病変が痂皮を形成しかつ痂皮が剥がれ落ちるまで持続する。
【０４６５】
天然痘を伴う患者は支持的に（すなわち十分な水分摂取（口腔咽頭部の粘膜疹のため困難である）、疼痛および発熱の軽減、皮膚病変を清浄に保ち細菌の重複感染を予防すること）治療する。抗ウイルス薬は天然痘向けに米国ＦＤＡにより承認されていないとは言え、多くの化合物が治療活性についてスクリーニングされている。シドフィビル（ビスタイド［Ｖｉｓｔｉｄｅ］（Ｒ）、ＣＭＶ網膜炎向けに承認されている）は天然痘を包含するオルトポックスウイルスに対する活性を示す（ＣＩＤＲＡＰ／ＩＤＳＡ．２００２）。
【０４６６】
天然痘ワクチン接種は「種痘」すなわち感染した患者からの感染性物質の未感染の個体への投与でＡＤ１０００年に中国で開始した。Ｅｄｗａｒｄ  Ｊｅｎｎｅｒは牛痘が天然痘に対し保護したことを１７００年代後期に発見した。遺伝子的に牛痘と別個のワクシニアウイルスがワクチンとして牛痘に取って代わった（ＣＩＤＲＡＰ／ＩＤＳＡ．２００２）。保護は一次ワクチン接種後５〜１０年間もたらされ；中和抗体は２投与のワクチンを受領する個体の７５％で１０年まで、そして３投与をワクチン接種された者で３０年まで検出される（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＡ．ＪＡＭＡ．１９９９：２８１：２１２７−３９）。１９６７年に本格的に開始された集中的な世界的キャンペーン後に、天然痘根絶が１９８０年に宣言された。天然の貯蔵所を伴わず、天然痘はそれ以来実験室でのみ存在している。ＷＨＯは２か所の寄託所、すなわち疾病対策予防センター（Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（ジョージア州アトランタ）およびロシア・ノボシビルスクの国家ウイルス学生命工学研究センター（ｔｈｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ベクター研究所（Ｖｅｋｔｏｒ  Ｉｎｓｉｔｕｔｅ））を認可した。不適切に入手可能な天然痘ウイルスはテロリストの武器となり得る。１９７０年代早期（慣例のワクチン接種が米国で中断された）より前にワクチン接種された１億５，７００万の個体の２０％未満が今日保護されておりかつ１億１，９００万人のアメリカ人はワクチン接種を受けたことがないため、天然痘に対するワクチン接種の必要性および問題は最も慎重に考慮されている。
【０４６７】
生物兵器民間防禦に関する作業部会（ｔｈｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｃｉｖｉｌｉａｎ  Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ）は、都市若しくは地域を活動不能にするのに十分な数の疾患および死亡を引き起こし得る多数の公知の生物体を同定した。生物学的兵器として使用される天然痘はおそらくその伝播の容易さ、ワクチン接種を受けていない人の間での３０％若しくはそれ以上の症例死亡率、および特異的治療の非存在により、市民集団に対する最も重大な脅威である。天然痘は全部の感染性疾患のうち最も恐ろしいものとして長い間恐れられてきたとは言え、荒廃に対するその可能性は今日いかなる以前の時点よりもはるかにより大きい。全米中での慣例のワクチン接種は２５年前に終了した。現在高度に感受性の移動できる集団において、天然痘はこの国および世界中で広範かつ迅速に広まるとみられる（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＡ  ＪＡＭＡ．１９９９  ２８１：２１２７−３９；Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ．Ｂｕｌｌ  ＷＨＯ．１９８８  １−６８、１２１−２０８）。
【０４６８】
１９７０年代以来の米国のワクシニアワクチン、ドライバックス（Ｄｒｙｖａｘ）はＷｙｅｔｈにより製造されている凍結乾燥した生存ワクシニアウイルス製剤である。該ワクチンは再構成された製品の液滴を含有する分岐した針で投与され；上腕の皮膚をおよそ１５回突いて血液の滴を生じる創傷を創製する。保護的応答を導き出すためには「ジェンナー膿疱」が誘発されなければならない。生物テロの脅威に照らして現在の供給を拡大するための試みにおいて、最近の臨床試験は、１、５、１０および１００倍の希釈でのドライバックス（Ｄｒｙｖａｘ）の保護効果を試験した（Ｆｒｅｙ  ＳＥ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００２  ３４６：１２６５−７５；Ｆｒｅｙ  ＳＥ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００２  ３４６：１２７５−８０）。大きな（ｍａｊｏｒ）応答は、未希釈の生成物で９５％で、１０倍希釈したワクチンで７０％で、および１００倍希釈したワクチンで１５％で観察された。ワクチン接種の１か月後に、ジェンナー膿疱を発生しなかった２４例の患者のうち１例に比較して、大きな反応を伴った３６例の被験体のうち３４例が抗体応答を発生した（Ｆｒｅｙ  ＳＥ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００２  ３４６：１２７５−８０）。活発な細胞傷害性Ｔ細胞およびＩＦＮ−a応答は、大きな反応を伴った被験体の９４％およびジェンナー膿疱を発生しなかった２４例の患者のうちわずか１例で発生した。
【０４６９】
慣例のワクチン接種は、ワクチンからの合併症の危険が流行性の天然痘の脅威より重要であったために１９７９年に中断された（Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ．Ｂｕｌｌ  ＷＨＯ．１９８８  １−６８、１２１−２０８）。１０州の研究は、１００万の一次ワクチン接種あたり脳炎、進行性痘疹、痘疹性湿疹（ｅｃｚｅｍａ  ｖａｃｃｉｎａｔｕｍ）、汎発性痘疹および多形性紅斑を包含する１２５４件の合併症が存在したことを示した（Ｌａｎｅ  ＪＭ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９７０  １２２：３０３−９）。全国調査は、症例死亡率が１００万の一次ワクチン接種あたり１であったことを示した（Ｌａｎｅ  ＪＭ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９６９  ２８１：１２０１−８）。個体のある種の群、すなわち免疫不全を引き起こす状態（すなわちＨＩＶ感染、白血病、リンパ腫、汎発性悪性病変、無ガンマグロブリン血症、臓器移植レシピエント、またはアルキル化剤、代謝拮抗薬、放射線照射若しくは大用量のコルチコステロイドを用いる治療）を伴う者、湿疹を伴う人、免疫不全であるか若しくは湿疹の病歴を有する家庭接触を伴う人、および妊婦はワクチン接種されることが禁忌とされる。
【０４７０】
１９６７年から１９７９年までの米国でのワクシニアワクチン接種に関連した観察された罹病率および死亡率に基づき、１ないし６５歳の米国一般大衆における集団天然痘予防ワクチン接種キャンペーンは、約４，６００例の重大な有害事象および２８５例の死亡をもたらした可能性があった（高リスクの人および彼らの直接接触を除外する）（Ｋｅｍｐｅｒ  ＡＲ．Ｅｆｆ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ．２００２  ５：８４−６）。事実、皆がドライバックス（Ｄｒｙｖａｘ）ワクチンを受領することを命令することは、約４００人の人々に死をおよび多くの他者に重大に衰弱させる副作用を宣告したとみられる（Ｇｒａｎｄ  Ｒａｐｉｄｓ  Ｐｒｅｓｓ  Ａｐｒｉｌ  １０、２００２）。従って、ＣＤＣは「輪状接種方式」すなわち封じ込め戦略を推奨した。このアプローチにおいて、以下の個体、すなわち、放出に直接曝露された人；感染した患者との顔と顔若しくは家庭接触を伴うまたは密接な近位（２ｍ以内）にある人；感染した患者の評価、治療若しくは輸送に直接関与した人員；試料の処理に関与した実験室の人員；および感染性物質との接触を有することがありそうな他者が、天然痘ウイルスの実際の若しくは潜在的放出後にワクチンを受領する（ＣＤＣ  Ｉｎｔｅｒｉｍ  Ｓｍａｌｌｐｏｘ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｐｌａｎ  ＣＤＣ  Ｎｏｖ  ２００１；Ｖａｃｃｉｎｉａ  ＡＣＩＰ  Ｍｏｒｂ  Ｍｏｒｔａｌ  Ｗｋｌｙ  Ｒｅｐ．２００１  ５０：１−２５）。
【０４７１】
特定地域別接種方式に比較して、輪状接種方式は明らかに以下の理由から至適でない。（１）予防的志願者ワクチン接種は兵器としての天然痘の価値を排除し、有効な抑止力としてはたらく。（２）輪状接種方式は、広まった免疫を伴う集団における小さな限局的大発生の根絶にのみ有効である。ほとんど非免疫の移動可能な集団において、複数の同時曝露後の疫病防禦は大いに異なる攻撃である。（３）輪状接種方式は、ワクチン接種が有効でありうる３日の曝露後期間内の感染した個体の迅速な同定およびワクチン接種を必要とする。人は、天然痘が臨床上明らかになる前数日間に感染性であるかもしれず、従って、例えば４日の期間以内の感染したテロリストへの曝露の症例の同定は物流上不可能である。（４）ＣＤＣは各感染した人が２ないし３名の他者のみを感染させるであろうと想定しているが、しかしながら、約３８名の二次感染が観察されている。（５）緊急事態において数百万のワクチン用量を投与することの物流上の複雑さは気力を失わせるものであり、かつ、２００１年６月にジョンズ・ホプキンス大学（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により実施された暗黒の冬（Ｄａｒｋ  Ｗｉｎｔｅｒ）シミュレーション演習で観察されたところの医療および公衆衛生業務のパニックおよび崩壊を誘発することがありそうである（Ｂｉｃｋｎｅｌｌ  ＷＪ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００２  ３４６：１３２３−２５；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＡ．ＪＡＭＡ．１９９９  ２８１：２１２７−３９；Ｍｉｌｌａｒ  ＪＤ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｏｌｉｃｙ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｂｏａｒｄ．２０００；Ｆｅｎｎｅｒ  Ｆ．Ｂｕｌｌ  ＷＨＯ．１９８８：１−６８、１２１−２０８；Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  Ｔ．Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｉｖｉｌｉａｎ  Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．２００１）。対照的に、曝露前のワクチン接種は大発生の間のワクチン接種の物流上の困難を課さずかつより少なく高価である。加えて、曝露前のワクチン接種は免疫無防備状態の人の間での感染の危険を低下させる（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ＳＲ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００１  ７：９２０−６）。
【０４７２】
全部の人において天然痘に対する長期間持続する免疫を安全かつ迅速に導き出すことが可能な改良されたワクチンが明らかに必要とされる。特定地域別接種方式戦略で使用されようと輪状接種方式戦略で使用されようと、ドライバックス（Ｄｒｙｖａｘ）に関してより大きな安全性および有効性が必要とされる。単独で若しくはＤＮＡワクチンと組合せで使用されるＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは、ドライバックス（Ｄｒｙｖａｘ）に関して以下の好ましい特徴、すなわち（１）有意に低下された、死亡および衰弱させる副作用を包含する合併症率、（２）保護抗体およびウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞のより迅速な誘導（３）より単純なワクチン接種方法、（４）一次ワクチン接種後のより長い保護期間、ならびに（５）免疫無防備状態の個体におけるおよび妊娠中の使用を包含するより広範な標的集団、を有することができる。
【０４７３】
大集団の保護への好ましい一アプローチは、曝露された若しくは潜在的に曝露された個体の集団サブセットにおけるワクシニア若しくは類似のウイルスワクチンによる輪状接種方式の概念に従って従われる、本開示のＩｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープハイブリッドでの１回若しくはそれ以上の免疫感作の投与である。しかしながら、加えて、免疫された輪（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｒｉｎｇ）の中にいなかった個体が天然痘に罹る場合、ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞クローン、ＣＤ８＋  細胞傷害性Ｔリンパ球クローン、および場合によってはＢ細胞免疫グロブリン産生クローンの以前の拡張および記憶により大きな保護が与えられる。こうした応答は、該ハイブリッドで免疫されない個体で真実であろうよりも、天然痘ウイルスによる同一のおよび他のエピトープの提示に対する臨床上保護的な応答枠の発生のためのより迅速な時間枠を創製する。免疫するＩｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープハイブリッドにおける応答以外のウイルスエピトープに対する応答の誘導過程は、エピトープ拡大と称される。
【０４７４】
ワクチン接種は一般に、天然痘ウイルスに対する最良の防禦であるとみなされているとは言え、承認されたワクチンおよび開発中のいくつかは至適に安全でも強力でもない。Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘ＭＨＣクラスＩＩエピトープハイブリッドワクチンは、単独で、若しくは全ウイルス調製物、ＤＮＡおよびＲＮＡワクチン、不活性化全ウイルスならびにウイルス様粒子を包含する他のアプローチと一緒にのいずれでも使用し得る。本開示で示されるＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドワクチンは、希釈調製物で典型的に観察される主要反応率を向上させかつ低下された合併症率を見込むために希釈全ウイルス調製物例えばドライバックス（Ｄｒｙｖａｘ）とともに使用し得る（Ｆｒｅｙ  ＳＥ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００２  ３４６：１２６５−７５；Ｆｒｅｙ  ＳＥ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００２  ３４６：１２７５−８０）。加えて、Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘ＭＨＣクラスＩＩエピトープハイブリッドワクチンは、開発された弱毒化ウイルス株（Ａｎｋａｒａ  ＭＶＡおよびＪａｐａｎｅｓｅ株ＬＣ１６ｍ８）の有効性を強めるためにそれらともに使用し得る（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ＳＲ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２００１  ７：９２０−６；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ＤＡ  ＪＡＭＡ．１９９９：２８１：２１２７−３９）。Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘ＭＨＣクラスＩＩエピトープハイブリッドワクチンは、ウイルスの病原性若しくは感染性に決定的に重要である遺伝子産物、例えばＢ５Ｒおよび他者を標的とするＤＮＡおよびＲＮＡワクチンとともに使用し得る（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓ  ＲＪ．Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ  ２０００  ４４：１５１−６；Ｍａｔｈｅｗ  ＥＣ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００１  ８２：１１９９−２１３）。
【０４７５】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープハイブリッドは天然痘に対する強力かつ安全なワクチンを提供する。好ましい一例は、Ｉｉ−Ｋｅｙ  ＬＲＭＫ（配列番号３）モチーフおよび天然痘Ｂ５Ｒ遺伝子産物ｇｐ４２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを使用する。こうした構築物は、結合された若しくはオーバーラップするＭＨＣクラスＩエピトープ（１個若しくは複数）および／または抗体に決定されるエピトープ（１個若しくは複数）でさらに高めることができる。Ｔｈ応答をＭＨＣクラスＩＩエピトープに対し２００倍超高めることにより、Ｔｈ１細胞が動員されて免疫学的記憶を伴う強力なＣＴＬおよび体液性応答を導き出す。ハイブリッドへのＭＨＣクラスＩエピトープの付加は細胞傷害性Ｔリンパ球応答の抗原性エピトープ特異的な増強を与える。抗体に認識されるエピトープのハイブリッドへの付加は、抗体に決定される応答の抗原性エピトープ特異的な増強を与える。
【０４７６】
天然痘のｇｐ４２はいくつかの理由から選択される。（１）遺伝子Ｂ５Ｒは、感染の経過を通じて発現されかつ細胞外ウイルスのエンベロープの一部を形成する４２ｋＤの糖タンパク質をコードする。（２）ｇｐ４２は、細胞外ウイルスの粒子形成（ｅｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）および脱出（ｅｇｒｅｓｓ）ならびにウイルスの毒性に必要とされる。（３）ｇｐ４２特異的ＩｇＧ中和抗体はヒトにおけるオルソポックス感染に対する保護と相関する（Ｐｈｉｌｌｐｏｔｔｓ  ＲＪ．Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ  ２０００  ４４：１５１−６；Ｅｎｇｌｅｓｔａｄ  Ｍ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９４：６２７−３７；Ｍａｔｈｅｗ  ＥＣ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００１  ８２：１１９９−２１３）。天然痘ウイルスによりコード若しくは誘導される付加的なタンパク質の生物学的機能およびワクチン潜在性を同定するための慣例の実験の経過において、Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープハイブリッドの設計、合成および使用のための付加的な候補を標的とすることができる。本開示の方法は、不必要な実験を伴わずに付加的なＩｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープハイブリッドワクチンの開発に応用し得る。Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６ＲおよびＡ５６Ｒのような他の細胞外エンベロープタンパク質を使用してＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを製造し得る。
【０４７７】
上のワクチンの方法に加え、Ｉｉ−Ｋｅｙ／天然痘抗原性エピトープハイブリッドを使用してＢ５Ｒ  ｇｐ４２をコードするＤＮＡワクチンに対する応答を高め得る。こうしたＤＮＡワクチンはまた、同一のプラスミド若しくは送達構築物中にＩｉリバース遺伝子構築物を組込むことによってもさらに高め得る。Ｉｉタンパク質発現の抑制は内因性ｇｐ４２エピトープの提示を見込む。Ｂ５ＲのＤＮＡワクチン接種の情況において、標的を定められたＩｉが抑制された抗原提示細胞は、新規のおそらく潜在的Ｂ５Ｒエピトープの増大されたレパートリーを提示することができる。
【０４７８】
本発明はＩｉ−Ｋｅｙ／天然痘Ｂ５Ｒタンパク質抗原性エピトープハイブリッドの設計に部分的に関する。天然痘ウイルスの遺伝子は主としてロシアの研究者により同定かつシークエンシングされた（Ｓｈｃｈｅｌｋｕｎｏｖ  ＳＮ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９３  ３１９：８０−８３；Ｓｈｃｈｅｌｋｕｎｏｖ  ＳＮ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１９９４  ３４：２０７−２３６；Ｓｈｃｈｅｌｋｕｎｏｖ  ＳＮ．Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  １９９５：９：２３１−２４５；Ｓｈｃｈｅｌｋｕｎｏｖ  ＳＮ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１９９６  ４０：１６９−１８３）。天然痘ウイルスＢ５Ｒタンパク質の配列（ｇ５１０２２８）を表１８．１に提示する。Ｂ５Ｒタンパク質の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表１８．２に提示する。表１８．３は表１８．２のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのいくつかを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／天然痘Ｂ５Ｒタンパク質エピトープハイブリッドを列挙する。天然痘Ｂ５Ｒタンパク質の予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表１８．４に提示する。表１８．５はＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩに提示される／ＭＨＣクラスＩに提示されるＢ５Ｒハイブリッドを列挙する。
【０４７９】
【表１０９】
2006515744.tif 000110
【０４８０】
【表１１０】
2006515744.tif 000111
【０４８１】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。所定の配列が複数のＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示されることが予測される場合、各配列の第一の残基位置を示す。スコアは、列挙される第一のＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示される相対的見込みについてのＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより報告されるスコアである。それぞれのアレルは各場合でＨＬＡ−ＤＲＢ＊＿  ＿０１アレルである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフと抗原性エピトープの第一の残基との間に介在する残基位置の数である。
【０４８２】
【表１１１】
2006515744.tif 000112
【０４８３】
Ｐｏｓ．は抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。緊密にオーバーラップする予測の場合、第一の残基位置が各予測されたエピトープについて示される。配列は、表１８．２のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【０４８４】
【表１１２】
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【０４８５】
Ｐｏｓ．はＨＬＡ−Ａ２０１について予測された抗原性エピトープ中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である（Ｐａｒｋｅｒ  Ｋ  Ｃ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−１７５）。配列は予測されたＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープのアミノ酸配列である。スコアはこの下位配列を含有するペプチドの解離のＴ１／２である（Ｔｓａｎｇ  ＫＹ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１９９５  ８７：９８２−９０）。この表のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープは、（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／）のオンラインプログラムの使用を用いて予測した。
【０４８６】
【表１１３】
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【０４８７】
Ｐｏｓ．はＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープ（ＩＩ：）若しくはＭＨＣクラスＩに提示される抗原性エピトープ（Ｉ：）のいずれか中の第一のアミノ酸の一次配列中の残基位置である。配列は、表１８．２のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープおよび表１８．５のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを含有するハイブリッドペプチドのアミノ酸配列である。
【実施例１９】
【０４８８】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／エボラウイルス抗原性エピトープハイブリッド。
【０４８９】
既知の最も毒性の感染性病原体のひとつである、マーブルグおよびエボラウイルスを包含するフィロウイルスは、ある種の株の極端な病原性および保護的ワクチン若しくは有効な抗ウイルス薬の非存在により生物学的安全性レベル４に分類される（Ｗｉｌｌｓｏｎ  ＪＡ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００１  ５８：１８２６−４１）。エボラウイルスは出血性の発熱を引き起こし、１９７６年以来散発性の集団で認識されているヒトおよびヒト以外の霊長類における重篤なほとんど致死的な疾患である。エボラウイルスの天然の貯蔵所はアフリカに土着の動物である（Ｐｅｔｅｒｓ  ＣＪ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９９９  １７９（Ｓｕｐｐｌ  １）：ｉｘ−ｘｖｉ）。エボラ−Ｒｅｓｔｏｎ株は米国で輸入されたカニクイザルから単離された。アフリカ以外の諸国でのエボラウイルスに対する大衆の懸念は、国際的商取引、ジェット機による旅行および生物テロによる該ウイルスの蔓延の潜在性から生じる。
【０４９０】
ヒトにおけるエボラウイルス感染の集団は感染した動物に接触する最初の患者に依存するようである。指標症例患者が感染した後、（１）感染した人の血液および／若しくは分泌物、ならびに（２）感染した分泌物で汚染されている針およびシリンジのような物体との直接感染により、伝播がヒトの間で起こる。全部のエボラウイルスは、研究条件下では煙霧中で伝播され得る。
【０４９１】
エボラウイルスに感染したようになって数日以内に、大部分の患者は高熱、頭痛、筋肉痛、腹痛、疲労感および下痢を有する。若干の患者は咽頭痛、しゃっくり、発疹、眼の充血、ならびに吐血および下痢を有する。エボラウイルスに感染したようになって１週間以内に、大部分の患者は胸部痛、ショックおよび死亡を有する一方、若干は失明および出血を経験する（Ｇｅａｒ  ＨＳ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．１９８９  １１（ｓｕｐｐｌ  ４）：５７７７−５７８２）。なぜ若干の患者がエボラ出血熱から回復するかは理解されていないが、とは言え回復する者は該ウイルスに対する有意の免疫応答を発生する。
【０４９２】
エボラ出血熱を伴う患者の処置は支持的であり、主として患者の体液および電解質の均衡を取ること、酸素飽和および血圧を維持すること、ならびに付随する感染症を治療することに存する（ＣＤＣ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｒｅｐｏｒｔ．１９８８  ３７（ｓｕｐｐｌ  ３）：１−１６）。
【０４９３】
エボラウイルスは一連の破壊的な出血性発熱の大発生を引き起こし、最初のものは１９７６年にザイールのヤンブクで報告され、そこでは３１８人がエボラ出血熱に罹り、８８％が死亡した。疾患は病院および診察室における密接な人的接触ならびに汚染された針およびシリンジにより広まった。また１９７６年に、スーダン（ンザラおよびマリディ）において２８４人がエボラ出血熱に罹り、５３％が死亡し、そして該疾患は主として病院における密接な人的接触により広まった（Ｂｏｗｅｎ  ＥＴＷ．Ｌａｎｃｅｔ  １９７７  １：５７１−３）。１９７９年に、スーダンで３４例の患者および６５％の死亡を伴う再発性の大発生が存在した（Ｂａｒｏｎ  ＲＣ．Ｂｕｌｌ  ＷＨＯ  １９８３  ６２：９９７−１００３）。１９９４年にはガボンの４４人（ミンケベ、マココウ、および熱帯雨林内深部の金採掘の一時的集落）がエボラ出血熱を発症し、６３％が死亡した。この大発生は当初黄熱病であると考えられたが、しかしながら１９９５年にそれはエボラ出血熱であると同定された（Ｇｅｏｒｇｅｓ  ＡＪ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９９９  １７９  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ６５−７５）。１９９５年に、コンゴ民主共和国（以前はザイール）のキクウィトで３１５人がエボラ出血熱に罹り、８１％が死亡した（Ｌｅ  Ｇｅｕｅｎｎｏ  Ｂ．  Ｌａｎｃｅｔ．１９９５  ３４５：１２７１−４）。この大発生は、都市に隣接する森林で働いていた指標症例患者まで遡って調べられ；該大発生は家族および病院により広まった。１９９６年にガボンのマイボウトで３７人がエボラ出血熱を発症し、５７％が死亡した。森林で１９人により食された死亡した感染したチンパンジーがこの大発生を開始した。同一年に、ガボンのブーで６０例の患者がエボラ−Ｚａｉｒｅに感染し、７５％が死亡した。指標症例患者は森林の一時的集落に居住していた猟師であり；死亡した感染したチンパンジーが近くで見出された。最後に、２０００年および２００１年にウガンダ（グル、マシンディおよびムバララ）で４２５人がエボラ出血熱に罹り、５３％が死亡した。感染に関連する３つの最も重要な危険因子は：エボラ出血熱症例患者の葬儀に参列すること、家族中の症例患者と接触すること、ならびに、十分な個人的保護手段および実施を使用することなくエボラ症例患者に医療を提供することであった（ＣＤＣ：ＳＰＢ：Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔｓ：Ｅｂｏｌａ：Ｃａｓｅ  Ｔａｂｌｅ  ２００１）。
【０４９４】
エボラウイルスの天然の貯蔵所は決定されておらず、また、ヒトからヒトへの蔓延が報告されているため、ワクチンは感染の拡大の最良の制限方法であるとみられる（Ｎａｂｅｌ  ＧＬ．Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ｃｌｉｎ  Ｃｌｉｍａｔｏｌ  Ａｓｓｏｃ．２００１  １１２：７９−８４）。コンゴ民主共和国のキクウィトでの１９９５年のエボラ感染から回復した患者の血清から組換えファージディスプレイ吸着技術を使用して単離された抗体はエボラの感染性を中和した（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｔ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９９  ７３：６０２４−３０）。死につつある患者は免疫学的に強力な応答を装備しないという事実と結びつけられたこの知見は、予防的ワクチンが有効であろうという希望を提供する。こうしたワクチンは利用可能でない一方、エボラウイルスタンパク質ＮＰ（多いほうのヌクレオキャプシドタンパク質）、ＶＰ３５（リンタンパク質）、ＶＰ４０（膜会合型マトリックスタンパク質）、ＧＰ（膜貫通糖タンパク質）、ｓＧＰ（分泌型糖タンパク質）、ＶＰ３０（リボヌクレオタンパク質会合型−少ないほう）およびＶＰ２４（膜会合型タンパク質−少ないほう）をコードするＤＮＡおよびＲＮＡレプリコンワクチンを包含する数種のワクチンのアプローチが開発中である（第ＷＯ  ９９／３２１４７号明細書；第ＷＯ  ００／００６１７号明細書；Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＡ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００１  ２８６：３８４−９０；Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０００  １９：１４２−５３；およびＶａｎｄｅｒｚａｎｄｅｎ  Ｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９８  ２４６：１３４−４４）。
【０４９５】
ＮＩＡＩＤは、エボラの糖タンパク質および核タンパク質の遺伝子をコードするアデノウイルスワクチンを用いる臨床試験を２年以内に開始することを計画している。このワクチンはヒト以外の霊長類の研究で保護的免疫を誘導する（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＮＪ、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００  ４０８：６０５−９；Ｃｈｅａｒｙ  Ｍ、Ｄｕｔｃｈ  Ｆｉｒｍ  ｔｏ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｅｂｏｌａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ＵＳ、ロイター電  ２００２年５月１６日）。エボラの遺伝物質の非存在により複製しないがしかし内および外膜上に含有されるタンパク質を有しているエボラ様粒子を用いて別のワクチンが開発されている（ＵＡＳＡＭＲＩＩＤ、Ｂａｖａｒｉ  Ｓ、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００２  １９５：１−１１）。エボラの糖タンパク質および核タンパク質を発現するＶＥＥの弱毒株由来のＲＮＡレプリコン粒子、エボラの糖タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス、リピドＡおよび不活性化エボラウイルスを含有するリポソーム、ならびに濃縮された不活性化全エボラビリオン調製物を包含する、エボラウイルスでの致死的攻撃からマウスおよびモルモットを保護した多様なワクチン戦略が、ヒト以外の霊長類で試験された（Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ＴＷ．Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００２  ８：５０３−７；Ｐｕｓｈｋｏ  Ｐ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００１  ７５：１１６７７−８５；およびＰｕｓｈｋｏ  Ｐ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０００  １９：１４２−５３）。不幸なことに、これらのアプローチのいずれも、致死的なエボラウイルスの攻撃からのヒト以外の霊長類の保護において不成功であった。
【０４９６】
エボラウイルスの核タンパク質をコードするベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスレプリコンをマウスにワクチン接種することは、１１アミノ酸のエボラウイルスのＮＰ（４３−５３）に対する抗体およびＭＨＣクラスＩ拘束性の細胞傷害性Ｔ細胞双方を誘導した。ポリクローナル抗体の受動的移入はマウスをエボラウイルスでの致死的攻撃から保護しなかったが；しかしながら、エボラウイルスのＮＰ特異的ＣＴＬの養子移入はエボラウイルスの致死的攻撃からマウスを保護した（Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＡ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００１  ７５：２６６０−４）。エボラの糖タンパク質の５種の独特のエピトープに対し保護的組換え抗体が同定されており、該エピトープのうち１種がヒトにとって病原性であることが既知の全部の株の間で保存されている（Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０００  ２８７：１６６４−６）。それらのモノクローナル抗体のいくつかはまた、エボラウイルスでの致死的攻撃２日後のマウスへの投与に際して治療上有効であった。これらのデータは、抗体および細胞媒介性の応答の双方がエボラウイルスに対する保護に重要であり、そして従って抗体およびＣＴＬ応答双方を促進するよう設計されたワクチン戦略が好ましいという見解を支持する。
【０４９７】
ワクチンはエボラウイルスに対する最良の防禦であると一般に考えられるとはいえ、開発中のワクチンは至適に保護的であることが示されていない。ＤＮＡワクチンの場合、プラスミド中に存在しようと、ウイルス粒子中に存在しようと、別の製剤中に存在しようと、これらの開発の問題のいくつかは：１）製剤の送達ベクター（裸のＤＮＡとしてのｃＤＮＡ、またはプラスミド若しくは細菌ベクター中、または脂質若しくは他のトランスフェクトする担体とともに、または金粒子上若しくはＰＬＧ粒子中）、２）投与経路（皮膚、粘膜（ＧＩ若しくは気道）、または筋）３）１種若しくは複数のエボラ遺伝子およびそれらの遺伝子のプロモーターの選択、４）本開示のサイトカイン若しくは生成物のための遺伝子若しくはタンパク質アジュバント、５）用量、投薬量スケジュール、ならびに他の薬物動態および薬動力学的考慮を包含する。
【０４９８】
本実施例はエボラウイルスのＶＰ２４に対する強力かつ比較的安全なワクチンの設計を提示する。エボラのＶＰ２４の推定されるアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ  ｇ１６７５１３２６からである（Ｌｅｒｏｙ  ＥＭ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００２  ８３：６７−７３）。このタンパク質の系統は、ガボンでの１９９６年の大発生の間に死亡した、生き延びたおよび無症候性に感染した個体に存在するものであった。ＧＰ、ＮＰ、ＶＰ２４およびＶＰ４０遺伝子の配列は比較試験および系統発生的特徴付けで得られた。
【０４９９】
実験で決定されるＭＨＣクラスＩＩエピトープはＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの構築へのより消耗する経路であるとは言え、そうしたものはアルゴリズムで予測されるエピトープを用いて作成し得る。複数のＨＬＡ−ＤＲアレルにより提示されることが予測されるこうしたエピトープを表２に提示する。Ｉｉ−Ｋｅｙ  ＬＲＭＫ（配列番号３）モチーフおよびＶＰ２４の単一の若しくは有意にオーバーラップするＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有するＩｉ−Ｋｅｙ／エボラＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープハイブリッドを表３に提示する。こうしたハイブリッドはＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープの融合を用いて構築し得る。再度、実験で決定されるＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープの非存在下で、アルゴリズムで予測されるエピトープが同定された（表４）。こうしたエピトープは、好ましくは最高の程度のＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩ配列のオーバーラップが得られる場合に、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープハイブリッドに融合し得る。こうした生成物の例を表５に提示する。実験で決定される抗体に認識される決定子が実験で若しくは予測により同定されている場合、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープおよびこうした抗体に認識されるエピトープから構成される付加的なハイブリッドを、過度の実験を伴わずに本明細書に提示される方法により設計し得る。さらに、ＶＰ２４からのエピトープから構成されるＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの設計および試験に適用される方法は、ＧＰ、ＮＰ、ｓＧＰ、ＶＰ２４、ＶＰ３０、ＶＰ３５およびＶＰ４０のような他のエボラウイルスタンパク質からのエピトープをもつ類似のワクチンハイブリッドにもまた適用し得る。これらのハイブリッドの実験的検証は慣例の方法によるマウスのワクチン接種試験で達成し得る（Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＡ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２００１  ２８６：３８４−９０）。こうしたマウスの試験における付加的な目的のひとつは、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド中のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの提示が低応答体アレルによる提示につながることができ、本発明の背景で論考されたとおり該提示を有望なエピトープに機能的に転化するという概念の試験である。Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＡらの研究において、ＶＰ２４での免疫感作はＢＡＬＢ／ｃモデルにおいて強力な免疫応答を刺激することが可能であったとは言え、ＶＰ２４はＣ５７ＢＬ／６系統において保護的効果を誘導しなかった（Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＡ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００１  ７５：２６６０−４）。従って、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるＶＰ２４エピトープでのマウスのＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６双方の系統の免疫感作は、ＥＬＩＳＡにおける該エピトープに対する抗体力価、二色ＦＡＣＳ分析におけるＣＤ４＋／ＩＦＮγ＋細胞の誘導、およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＣＤ４＋／ＩＦＮγ＋細胞の誘導により測定されるところの比較可能な免疫応答を生じることができる。さらに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＶＥＥに対する致死的な攻撃に対し保護されることがができる。
【０５００】
エボラウイルスの膜会合型タンパク質ＶＰ２４の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ｇ１６７５１３２６；Ｌｅｒｏｙ  ＥＭ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００２  ８３：６７−７３）を表１に提示する。予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを表２に提示する。Ｉｉ−Ｋｅｙ／エボラウイルスＶＰ２４のＭＨＣクラスＩＩエピトープハイブリッドを表３に提示する。予測されたエボラウイルスＶＰ２４のＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープを表４に提示する。Ｉｉ−Ｋｅｙ／エボラＶＰ  ２４のＭＨＣクラスＩＩに予測されるエピトープ／エボラＶＰ  ２４  ＭＨＣクラスＩに予測されるエピトープハイブリッドを表５に提示する。
【０５０１】
【表１１４】
2006515744.tif 000115
【０５０２】
【表１１５】
2006515744.tif 000116
【０５０３】
本表のエピトープは以下の手順により選んだ。エボラＶＰ２４の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｇ１６７５１３２６）を、ＰｒｏＰｒｅｄプログラムを用いるＨＬＡ−ＤＲエピトープスクリーニングにかけた。各アレルの４個の最高の得点を出すエピトープを同定した。そのセットの間で、最初の１４種の独特のエピトープをそれらの最初の発生のＨＬＡ−ＤＲアレルとともにここに報告した。ここで報告される多くのエピトープは、事実、数種のアレルの配列アルゴリズムによりスコア化した。Ｐｏｓ．は該エピトープの第一のアミノ酸のアミノ酸残基位置である。スコアはＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより計算されたスコアである。Ｉｉ−Ｋｅｙは、該エピトープの第一のアミノ酸と、Ｎ末端で群ＬＩＶＦＭ（配列番号７９０）の最低２個のアミノ酸および群ＨＫＲの最低１個のアミノ酸を含有する５アミノ酸のモチーフとの間に介在するアミノ酸残基の数である。
【０５０４】
【表１１６】
2006515744.tif 000117
【０５０５】
【表１１７】
2006515744.tif 000118
【０５０６】
これらのＨＬＡ＊Ａ２０１エピトープはコンピュータ支援アルゴリズムでスコア化した（Ｐａｒｋｅｒ  Ｋ  Ｃ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−１７５）。
【０５０７】
【表１１８】
2006515744.tif 000119
【実施例２０】
【０５０８】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ミエリン塩基性タンパク質ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープハイブリッド。
【０５０９】
別の局面において、多発性硬化症におけるミエリン塩基性タンパク質および関節炎におけるコラーゲンのような自己抗原に特異的なサプレッサーＴ免疫調節細胞の誘導が、これらのヒトの自己免疫疾患の制御のための十分に検討されたかつ有望な戦略である。経口若しくは呼吸器経路によりミエリン塩基性タンパク質若しくはコラーゲンからのペプチドを投与することは、これらのタンパク質に対する抗体を減少させ、細胞性免疫応答を抑制し、そして動物モデルでの実験的アレルギー性脳炎若しくはコラーゲン関節炎の発症を遅らせるか若しくは阻害する。加えて、抗ＭＢＰ抗体に結合しかつ中和するある種のｈＭＢＰペプチドが診察室で試験されている。鞘内に投与されたＭＢＰ７５−８５ペプチドは抗ミエリン塩基性タンパク質抗体を中和し；このペプチドの静脈内投与は、能動的な免疫寛容誘導機構により遊離および結合型の抗ミエリン塩基性タンパク質レベルの低下された力価をもたらした。６１ないし１０６のＭＢＰ配列内の１０アミノ酸から２５アミノ酸までの範囲にわたる多様なペプチドがこの活性を示した。こうしたペプチド、およびＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを用いる新規治療に適応させ得るそれらの使用方法は、米国特許第５，８５８，３６４号明細書：ＨＬ  ＷｅｉｎｅｒとＤＡ  Ｈａｆｌｅｒ、１９９９年１月１２日−Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（多発性硬化症の処置のための製薬学的投薬形態物）；および米国特許第５，５７１，４９９号明細書：ＤＡ  ＨａｆｌｅｒとＨＬ  Ｗｅｉｎｅｒ、１９９６年１１月５日−Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ａｅｒｏｓｏｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ（自己抗原のエアゾル投与による自己免疫疾患の処置）、および米国特許第６，２５８，７８１号明細書：ＫＧ  ＷａｒｒｅｎとＩ  Ｃａｔｚ、２００１年７月１０日−Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ（抗ミエリン塩基性タンパク質のペプチド特異性および多発性硬化症患者へのミエリン塩基性タンパク質ペプチドの投与）（それらの開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。これらの結果は、こうした治療効果の効力、安全性、記憶およびＴｈサブセットの好みを増大させるためのＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド中へのこうしたエピトープの組込みに関して下に詳細に考慮している。
【０５１０】
炎症および神経膠症を伴う中枢神経系の脱髄性の見かけ上自己免疫性疾患、多発性硬化症（ＭＳ）はミエリンタンパク質に向けられたＴリンパ球および自己抗体を示す。多発性硬化症の免疫抑制療法は数種のミエリンタンパク質からのペプチドエピトープを用いて開発し得る。Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドに組込まれたこうしたエピトープを、実験的アレルギー性脳炎（多発性硬化症の動物モデル）で試験し得る。これらのタンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）およびミエリン関連乏突起膠細胞塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）を包含する（Ｚａｍｖｉｌｌ  ＳＳ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８６  ３２４：２５８−６０；Ｋｏｎｏ  ＤＨ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９８８  １６８：２１３−２７；Ｍａｄｓｅｎ  ＬＳ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９９  ２３：３４３−７；Ｔｕｏｈｙ  ＶＫ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９  １４２：１５２３−７；Ｇｒｅｅｒ  ＪＭ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２  １４９：７８３−８；Ｍｅｎｄｅｌ  Ｉ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ２５：１９５１−９）。特定の治療的目的のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープをここで要約し、そしてその後、前臨床動物モデルおよび開発の双方におけるそれらの使用方法ならびにこうした研究に基づく臨床治療の使用方法を部分的に考慮するためにＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドでのそれらの使用を支持する実験データを詳細に吟味する。ＭＢＰ８５−９９はヒトにおいて免疫優性であり、また、この領域中のいくつかのエピトープはマウスでＥＡＥを誘発する（ＭＢＰ８７−９８、ＭＢＰ９１−１０４およびＭＢＰ８４−１０２）。ＰＬＰ１３９−１５１およびＰＬＰ１７８−１９１はマウスの脳炎誘発性エピトープであり；全タンパク質を使用してマウスを免疫する場合、リンパ節細胞はこれらのエピトープの双方に応答し、それらが等位優性であることを示す。ＭＯＧからのいくつかの予測されたＴ細胞エピトープ（１−２１、３５−５５、６７−８７、１０４−１１７および２０２−２１８）の脳炎誘発性の潜在性をマウスで試験し；ＭＯＧ３５−５５のみが特異的Ｔ細胞応答およびＥＡＥを誘発した。このエピトープはＭＯＧ４０−５５に対する特異的Ｔ細胞応答を刺激し、そしてＭＯＧ４０−５５に対し反応性のＴ細胞株は同系マウスへの移入に際して脳炎誘発性であった。ＭＯＢＰ３７−６０はマウスで脳炎誘発性である。ＭＳを伴う患者からの抹消血リンパ球はＭＯＢＰ、とりわけＭＯＢＰ２１−３９に対する増殖応答を装備する。ＭＢＰ（７−５０、８３−１０６および１４２−１６８）、ＭＯＧ（１−２５、３２−５８および６３−９７）ならびにＰＬＰ（３０−６０、８４−１１６および１３９−１５５）由来の複数の脳炎誘発性エピトープをコードするＤＮＡプラスミドの使用は、ＰＬＰ１３９−１５１により誘発されるＥＡＥを発症することからマウスを保護することが示された。
【０５１１】
上述されたところのＭＢＰ、ＰＬＰ、ＭＯＧおよびＭＯＢＰからの自己抗原ペプチド由来のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含んでなるＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは免疫薬理学的治療薬として多くの好ましい特徴を有することができる。ＭＳの処置におけるこうしたＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの有用な効果は、ペプチドとして使用されようと、ＤＮＡワクチンとして使用されようと、以下、すなわち（１）より迅速かつ強力な免疫抑制応答、（２）免疫抑制応答および後の攻撃のための記憶のより長い持続期間、（３）自己免疫の分子内若しくは分子間の拡大の結果としての新反応性（ｎｅｏ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の低下された発生率、（４）そうでなければ低応答性アレル上のエピトープのより強力な提示の結果としての応答のより大きな幅、ならびに（５）疾患の発症に対するより大きな保護、または臨床症状発現の遅延若しくは逆転を包含する。
【０５１２】
Ｗａｒｒｅｎ、Ｃａｔｚらは、ヒトミエリン塩基性タンパク質（ｈＭＢＰ）ペプチドに基づく寛容の誘導がＭＳの有効な抗原特異的免疫治療であるかもしれないことを示した（Ｗａｒｒｅｎ  ＫＧ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．１９９５  １３３：８５−９４；Ｗａｒｒｅｎ  ＫＧ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．１９９７  １４８：６７−７８；Ｗａｒｒｅｎ  ＫＧ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．１９９７  １５２：３１−８）。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）に対する寛容は、ＭＢＰ特異的Ｔ細胞およびＢ細胞に対し免疫優性であるｈＭＢＰペプチドＰ８５ＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰ９６（配列番号８２２）を使用する慢性進行性疾患を伴うＭＳ患者におけるフェーズＩ臨床試験で検査した。寛容の誘導はＣＳＦ中のＭＢＰ特異的自己抗体の力価によりモニターした。静脈内注入はＭＢＰに対する寛容を誘導したが、しかし鞘内若しくは皮下注入はしなかった。応答の４種のキネティックパターンが４１例の患者で観察された（Ｗａｒｒｅｎ  ＫＧ．Ｍｕｌｔ  Ｓｃｌｅｒ．２０００  ６：３００−１１）。すなわち、群Ａ（１５例の患者）は正常範囲への持続性の抗ＭＢＰ抑制を具体的に説明し；群Ｂ（１０例の患者）はより短い期間の正常範囲への有意の抗ＭＢＰ抑制を具体的に説明し；群Ｃ（８例の患者）は初回注入後に有意のＣＳＦの抗ＭＢＰ抑制を示したがしかしその後の注入後の自己抗体力価を抑制する能力を喪失し；そして群Ｄ（８例の患者）は有意のＣＳＦの抗ＭＢＰ抑制を示すことに失敗した。対照群において、抗ＭＢＰ抗体は２年の期間にわたって持続的に上昇されたまま留まった。寛容の持続期間は患者のＭＨＣクラスＩＩハプロタイプに依存し；寛容は疾患に関連したＨＬＡ−ＤＲ２を伴う全患者で長期間持続した。神経学的若しくは全身の副作用は、ペプチド投与経路に関係なく観察されなかった。
【０５１３】
ＬｅｓｓらはＳＪＬマウスで活性のミエリンプロテオリピドタンパク質の数種の脳炎誘発性の決定子を同定した（Ｔｕｏｈｙ  ＶＫ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９  １４２：１５２３−７；Ｇｒｅｅｒ  ＪＭ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２  １４９：７８３−８）。中枢神経系のミエリンの主要タンパク質構成要素、ＰＬＰでの免疫感作はＳＪＬ／Ｊ（Ｈ−２ｓ）マウスで急性の形態のＥＡＥを誘導する。ＰＬＰ１３９−１５４（ＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦＶＧＩ）（配列番号８２３）での免疫感作は２０匹のマウスのうち３匹で重症の臨床的および組織学的ＥＡＥを誘発した。加えて、ＰＬＰ（１７８−１９１）もまたこれらのマウスでＥＡＥを誘発した。ＰＬＰ  １７８−１９１若しくは１３９−１５１のいずれかでのリンパ節細胞の刺激により選択される２種のＣＤ４＋のペプチド特異的なＩ−Ａ（ｓ）拘束性Ｔ細胞株はそれぞれナイーブな同系マウスで脳炎誘発性であった。
【０５１４】
Ｂｅｎ−ＮｕｎらはｐＭＯＧからの数種のペプチドを試験し、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質ペプチドがＨ−２ｂマウスで典型的な慢性の実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発することを見出した（Ｍｅｎｄｅｌ  Ｉ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ２５：１９５１−９；Ｋａｙｅ  ＪＦ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １０２：１８９−９８）。このグループはまた、複数の潜在的に病原性の抗ミエリンＴ細胞の反応性が人工的な「多抗原（ｍｕｌｔｉａｎｔｉｇｅｎ）／多エピトープ」タンパク質の寛容原性投与により阻害され得るという仮説も試験した（Ｚｈｏｎｇ  ＭＣ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００２  １１０：８１−９０）。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）およびミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）の選択された疾患関連エピトープをコードするように合成遺伝子を構築した。ｈｍＴＡＰの全身投与はＰＬＰエピトープに対する自己反応性により開始される実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を抑制かつ治療したのみならず、しかしまたＭＢＰ、ＰＬＰおよびＭＯＧの脳炎誘発性エピトープに対し反応性の多特異性株のＴ細胞により移入される複合性ＥＡＥも阻止した。加えて、Ｏｌｄｓｔｏｎｅらは、重篤な臨床経過を伴うマウスで実験的アレルギー性脳脊髄炎を誘発したＭＯＢＰ３７−６０エピトープを同定した（Ｈｏｌｚ  Ａ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４：１１０３−９）。また、再発／軽減する多発性硬化症を伴う患者からのＰＢＬはヒトＭＯＢＰ（とりわけアミノ酸２１−３９で）に対する増殖応答を装備する。
【０５１５】
抗ミエリン抗体はＭＳを伴わない若干の患者で見出し得る（Ｗａｒｒｅｎ  ＫＧ．Ｅｕｒ  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９９  ４２：９５−１０４）。Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇ、Ｃａｔｚ、Ｗａｒｒｅｎらは、１１例の死後症例の中枢神経系の病変からＭＢＰ自己抗体をアフィニティー精製した（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇ  ＫＷ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７  １００：１１１４−２２）。ＭＢＰ（８３−９７）ペプチドは全症例で免疫優性であった。それがＭＢＰへの自己抗体結合を９５％超阻害したからである。自己抗体結合に寄与する残基は、Ｔ細胞エピトープのＭＨＣ／Ｔ細胞受容体接触残基もまた含有した１０アミノ酸のセグメント（Ｖ８６−Ｔ９５）に位置した。エピトープ中心において、同一残基が抗体結合およびＴ細胞認識に重要であった。
【０５１６】
ＭＢＰ８２−９８エピトープを含んでなるＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドは、抗ＭＢＰ抑制応答の持続期間を増大させ、持続性の抗ＭＢＰ抑制応答を発生させる患者の比率を増大させ、抗ＭＢＰ抑制応答の大きさを増大させ、そして臨床上有効な抗ＭＢＰ抑制応答を誘導するのに必要とされる投与の回数および頻度を減少させることができる。Ｉｉ−Ｋｅｙハイブリッドでのエピトープ装填はエピトープ単独よりはるかにより大きいため、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＢＰ（８５−９６）ハイブリッドはＨＬＡ  ＤＲアレルのより大きなレパートリーへの結合を助長してそれにより処置に応答する患者の比率を増大させることができる。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＢＰ（ＭＢＰ８５−９６）ハイブリッドはまた、ＭＢＰ８５−９６エピトープに対する細胞媒介性の抑制性の免疫応答もまた誘発することができる。単独でまたはＭＨＣクラスＩ若しくはＢ細胞抗体に認識される決定子（ＭＨＣクラスＩＩエピトープにタンデムで直線状に配置された若しくはそれ内に埋め込まれた）と組合せのいずれかのこのおよび／若しくは他のＭＨＣクラスＩＩエピトープを含んでなるＩｉ−Ｋｅｙハイブリッドはまた、多発性硬化症を伴う患者のための臨床上重要な治療薬を提供するＭＢＰに対する高められた免疫抑制応答も誘導することができる。
【０５１７】
選択された前臨床試験は、ＭＳの処置における至適のエピトープ構造およびＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの使用方法の決定において有用である機構および特定の構造（化学的）データを示す。Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ  Ｍ、Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇ  ＫＷ、Ｆｕｇｇｅｒ  Ｌらは、ファージディスプレイ技術を使用して、ＭＢＰ  ８５−９９と複合体形成したＨＬＡ−ＤＲ２分子で免疫したＨＬＡ−ＤＲ２トランスジェニックマウスからのＨＬＡ−ＤＲ２ペプチド特異的抗体を選択した（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ  Ｍ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０００  １９１：１３９５−４１２）。ＭＫ１６で選択された抗体はＤＲ２およびＭＢＰの複合体のみを認識し、また、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が組換えＭＢＰで刺激されていた場合は細胞内および細胞外ＨＬＡ−ＤＲ２−ＭＢＰペプチド複合体を認識した。ＭＫ１６抗体は、ヒトＭＢＰ特異的Ｔ細胞受容体を発現した２種のトランスフェクタントによるインターロイキン２分泌を阻害した。ＭＫ１６結合に対する構造的要件の分析は、ＭＢＰ  ８５−９６の２種の主要なＨＬＡ−ＤＲ２アンカー残基ならびに該ペプチドのＣＯＯＨ末端部分、とりわけ残基Ｖａｌ−９６、Ｐｒｏ−９８およびＡｒｇ−９９が結合に重要であったことを示した。これらの結果に基づき、該抗体を使用して、ＨＬＡ−ＤＲ２−ＭＢＰペプチド複合体がＭＳ病変中で提示されたかどうかを決定した。抗体は、ＭＳ病変、とりわけ小膠細胞／マクロファージ、しかしまたいくつかの症例では肥大性星状細胞中のＡＰＣを染色した。ＡＰＣの染色はＨＬＡ−ＤＲ２ハプロタイプを伴うＭＳ症例中でのみ観察され、しかし、他のハプロタイプを伴う症例で観察されなかった。これらの結果は、ＭＳ病変中のＨＬＡ−ＤＲ２分子がミエリン由来の自己ペプチドを提示することを示し、また、星状細胞よりはむしろ小膠細胞／マクロファージがこれらの病変で優勢なＡＰＣであることを示す。
【０５１８】
Ｆｕｇｇｅｒらは、トランスジェニックマウス中で、ＨＬＡ−ＤＲ２分子により提示されるＭＳ関連自己抗原のＴ細胞認識に関与する３種のヒト成分、すなわちＤＲＡ＊０１０１／ＤＲＢ１＊１５０１（ＨＬＡ−ＤＲ２）すなわち欧州人の子孫の個体で見出されるＭＨＣクラスＩＩの候補のＭＳ感受性遺伝子；ＨＬＡ−ＤＲ２に結合された免疫優性のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の４１０２ペプチドに特異的なＭＳ患者由来のＴ細胞クローンからのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；およびヒトＣＤ４補助受容体を発現した（Ｍａｄｓｅｎ  ＬＳ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１９９９  ２３：２５８−９）。ＭＢＰ  ８４−１０２ペプチドのアミノ酸配列はヒトおよびマウス双方のＭＢＰで同一である。アジュバントおよび百日咳毒素と一緒のＭＢＰペプチドの投与後に、トランスジェニックマウスは、ＭＳでみられるものに似た臨床症状発現および疾患経過に至った、限局性のＣＮＳ炎症および脱髄を発症した。自発性疾患はマウスの４％で観察された。ＤＲ２およびＴＣＲの二重トランスジェニックマウスをＲａｇ２（組換え活性化遺伝子２について）欠損マウスに２回戻し交雑した場合、自発性疾患の発生率は増大し、ＨＬＡ−ＤＲ２に結合されたＭＢＰペプチドに特異的なＴ細胞が疾患の発症に十分かつ必要であることを示した。この研究は、ＨＬＡ−ＤＲ２が、Ｔ細胞にＭＢＰ自己ペプチドを提示することによりＭＳに似た誘発性および自発性双方の疾患を媒介し得るという証拠を提供する。
【０５１９】
多発性硬化症に対する感受性はヒト組織適合白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ２（ＤＲＢ１＊１５０１）ハプロタイプと関連する。Ｗｉｌｅｙらは、ＨＬＡ−ＤＲ２の構造がヒトＭＢＰ特異的Ｔ細胞に対し免疫優性であったヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）からの結合型ペプチドを用いて決定されたことを決定した（Ｓｍｉｔｈ  ＫＪ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９８  １８８：１５１１−２０；Ｇａｕｔｈｉｅｒ  Ｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９８  ９５：１１８２８−３３）。Ｔ細胞受容体認識に重要であるＭＢＰペプチドの残基は、結晶構造中の突出した、溶媒に露出された残基である。ＨＬＡ−ＤＲ２ペプチド結合部位の特徴的な特徴はＭＢＰペプチドのフェニルアラニンを収容する大きなおおむね疎水性のＰ４ポケットである。この芳香族側鎖に必要な空間は多形のＤＲβの７１位置のアラニンにより創製される。これらの特徴は、他の自己免疫疾患と関連するＤＲ分子と別個のＨＬＡ−ＤＲ２のＰ４ポケットを作成する。
【０５２０】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの結合部位の向きは、ｈＭＢＰ／ＤＲ２複合体とのＴＣＲの結合の分析から提案し得る。ＴＣＲおよびＭＨＣ／ペプチド複合体による三元の複合体の形成の特異性の構造的基礎を、異なるＤＲ２サブタイプにより拘束されるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）特異的Ｔ細胞クローンについて検査した（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇ  ＫＷ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９５  ９２：８８９６−９００）。この系の保存された特徴は、発生されるべきＤＲ２／ペプチド複合体上のＴＣＲの位置決めのためのモデルを可能にした。すなわち（ｉ）免疫優性のＭＢＰペプチドを提示したＤＲ２サブタイプはＤＲβ鎖のいくつかの多形の位置でのみ異なった。（ｉｉ）ＤＲβ鎖のらせん部分上の多形の残基（位置ＤＲβ６７）のＴＣＲ認識はＭＨＣ拘束の決定において重要であった。（ｉｉｉ）ＴＣＲの可変領域（Ｖ）α３．１遺伝子セグメントがＴ細胞クローンの全部により使用された。ＴＣＲＶβの使用はより多様であったがしかしＭＨＣ拘束すなわち多形のＤＲβ鎖と相関した。（ｉｖ）保存されたＴＣＲα鎖しかし異なるＴＣＲβ鎖を伴う２種のクローンは異なるＭＨＣ拘束しかし類似のペプチド特異性を有した。これらのＴ細胞クローン間のＭＨＣ拘束の差異は、多形のＤＲβ鎖残基（ＤＲβ６７−７１）の１クラスターの認識によるようであった。ＭＢＰ（８５−９９）特異的なＴＣＲは、従ってＴＣＲβ鎖が多形のＤＲβ鎖らせんを接触した一方で保存されたＴＣＲα鎖が多形でないＤＲα鎖を接触したようなＤＲ２／ペプチド複合体上に位置しているようであった。
【０５２１】
表２０．１はヒトミエリン塩基性タンパク質の推定されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ：１７３７８８０５）を提示する。表２０．２はＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムを用いて予測されたヒトミエリン塩基性タンパク質のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを提示する。表２０．３はｈＭＢＰのＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有することが実験で同定された配列を提示する（Ｐｅｔｔｅ  Ｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９８  ８７：７９６８）。表２０．４は表２０．２のエピトープを組込むハイブリッドを提示する。表２０．５は表２０．３のペプチドからのエピトープを組込むＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを提示する。表２０．６はヒトプロテオリピドタンパク質１の推定されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ  １９９２３１０４）を提示する。表２０．７はＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムを用いて予測されたプロテオリピドタンパク質１のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを提示する。表２０．８はプロテオリピドタンパク質１のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有することが実験で同定された配列を提示する。表２０．９は表２０．７のエピトープを組込むハイブリッドを提示する。表２０．１０は表２０．８のペプチド内のエピトープを組込むＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを提示する。表２０．１１はヒトミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質前駆体の推定されるアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ｇｉ：２４９７３１２）を提示する。表２０．１２はＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムを用いて予測された乏突起膠細胞糖タンパク質前駆体のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを提示する。表２０．１３は乏突起膠細胞糖タンパク質前駆体のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有することが実験で同定された配列を提示する。表２０．１４は表２０．１２のエピトープを組込むハイブリッドを提示する。表２０．１５は表２０．１３のペプチド内のエピトープを組込むＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドを提示する。
【０５２２】
【表１１９】
2006515744.tif 000120
【０５２３】
【表１２０】
2006515744.tif 000121
【０５２４】
Ｐｏｓ．は明記される配列の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの第一のアミノ酸である。スコアは検査した所定のＨＬＡ−ＤＲＢ＊＿＿０１アレルの第一のものについてのＳＹＦＰＥＩＴＨＩプログラムにより計算されたスコアである。第二の列挙されるアレルは、正確に同一のエピトープ若しくは第一のアミノ酸位置がカッコ内に示されるオーバーラップするエピトープについてである。
【０５２５】
【表１２１】
2006515744.tif 000122
【０５２６】
Ｐｏｓ．はＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有することが報告されたｈＭＢＰのセグメントの最初のおよび最後のアミノ酸である。配列はｈＭＢＰのＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有することがＰｅｔｔｅらにより同定されたペプチドである（Ｐｅｔｔｅ  Ｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９８  ８７：７９６８）。ペプチドＭＢＰ８５−９９、ＭＢＰ８５−９６およびＭＢＰ８３−９７もまた他者により特徴付けられている（Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ  Ｍ，Ｊ  Ｅｘｐｅｒｉ  Ｍｅｄ．２０００  １９１：１３９５−４１２；Ｇａｕｔｈｉｅｒ  Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９８  ９５：１１８２８−３３）。提示するアレルはそれぞれのセグメント中のエピトープを提示することが報告されているＭＨＣクラスＩＩアレルを包含する。配列は該セグメントの配列である。予測されたエピトープは、ＰｒｏＰｒｅｄアルゴリズムを使用してそれぞれのＭＨＣクラスＩＩアレルにより提示されることが予測されたエピトープの第一のアミノ酸である。ＨＭＢＰ（９１−９８；ＦＩＲＬＦＳＲＤＡ）（配列番号８４２）はＨＬＡ−ＤＲＢ＊０１０１、１１０１および１３０１により提示される。ｈＭＢＰ（９２−９９；ＩＲＬＦＳＲＤＡＰ）（配列番号８４３）はＨＬＡ−ＤＲＢ＊１３０１および１５０１により提示される。ｈＭＢＰ（１２０−１２８；ＩＱＷＤＳＡＡＴＡ）（配列番号８４４）はＨＬＡ−ＤＲＢ＊０３により提示される。ｈＭＢＰ（１３３−１４１；ＶＭＡＳＱＫＲＰＳ）（配列番号８４５）はＨＬＡ−ＤＲＢ＊０１０１および１３０１により提示される。ｈＭＢＰ（１４８−１５７；ＬＡＴＡＳＴＭＤＨ）（配列番号８４６）はＨＬＡ−ＤＲＢ＊０４０１および１１０１により提示される。ｈＭＢＰ（１６２−１７０）はＨＬＡ−ＤＲＢ＊０８０１により提示される。
【０５２７】
【表１２２】
2006515744.tif 000123
【０５２８】
【表１２３】
2006515744.tif 000124
【０５２９】
ＣＮＳミエリンの別の主要成分、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）はＳＪＬ／Ｊマウスにおいて急性の形態のＥＡＥを誘発する（Ｔｕｏｈｙ  ＶＫ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９  １４２：１５２３−７；Ｇｒｅｅｒ  ＪＭ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２  １４９：７８３−８）。主たるＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープは１３９−１５４  ＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦＶＧＩ（配列番号８５６）およびある種のセリン置換相同体で見出された。相同なヒト配列の配列を表２０．２に提示する。ＰＬＰの第二のペプチド、マウス１７８−１９１（ヒト相同体配列：ＦＮＴ  １８１  ＷＴＴＣＤＳＩＡＦＰ  Ｓ）（配列番号８５７）もまたＳＪＬ／Ｊ（ｈ−２ｓ）マウスにおいて脳炎誘発性であることが同定された（Ｇｒｅｅｒ  ＪＭ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９２  １４９：７８３−８）。
【０５３０】
【表１２４】
2006515744.tif 000125
【０５３１】
【表１２５】
2006515744.tif 000126
【０５３２】
Ｐｏｓ．は明記された配列の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの第一のアミノ酸である。スコアは検査した所定のＨＬＡ−ＤＲＢ＊＿＿０１アレルの第一のものについてＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより計算されたスコアである。第二の列挙されるアレルは、正確に同一のエピトープ若しくは第一のアミノ酸位置がカッコ内で示されるオーバーラップするエピトープについてである）。
【０５３３】
【表１２６】
2006515744.tif 000127
【０５３４】
位置１５２からの１連の４個若しくはそれ以上のオーバーラップする配列（ＦＶＧＩＴＹＡＬＴＶＶＷＬＬＶＦＡＣ）（配列番号８７０）がアレルＨＬＡ−ＤＲＢ  ０１、０３、０４、０７、０８、１１、１３、１５により提示される。Ｉｉ−ＫｅｙモチーフＬＧＫＷＬ（配列番号８７１）はＦ１５２からの５アミノ酸により分離されている。
【０５３５】
【表１２７】
2006515744.tif 000128
【０５３６】
【表１２８】
2006515744.tif 000129
【０５３７】
ミエリンの第三のタンパク質、ヒトミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）もまたマウスにおいて脳炎誘発性であることが示された（Ｍｅｎｄｅｌ  Ｉ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ２５：１９５１−９；Ｋａｙｅ  ＪＦ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １０２：１８９−９８）。
【０５３８】
【表１２９】
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【０５３９】
【表１３０】
2006515744.tif 000131
【０５４０】
Ｐｏｓ．は明記された配列の予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの第一のアミノ酸である。スコアは検査した所定のＨＬＡ−ＤＲＢ＊＿＿０１アレルの第一のものについてＰｒｏＰｒｅｄプログラムにより計算されたスコアである。第二の列挙されるアレルは、正確に同一のエピトープ若しくは第一のアミノ酸位置がカッコ内に示されるオーバーラップするエピトープについてである）。
【０５４１】
【表１３１】
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【０５４２】
【表１３２】
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【０５４３】
【表１３３】
2006515744.tif 000134
【０５４４】
ペプチド２０．１４．１はアレルＨＬＡ−ＤＲＢ  ０１、０３、０４、０７、１１、１３および１５により提示される３種のオーバーラップするＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有する。ペプチド２０．１４．２はアレルＨＬＡ＿ＤＲＢ０１、０８および１１により提示される２種のオーバーラップするＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープを含有する。
【実施例２１】
【０５４５】
ＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープのＮ末端から適切に配置されたＩｉ−Ｋｅｙモチーフを含有するペプチド配列の同定および使用。
【０５４６】
別の局面において、本発明は、抗原性タンパク質中の好ましい一組の生物学的に活性のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの選択方法に関する。具体的には、本開示は、実験で決定された若しくはアルゴリズムで予測されたＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープに先行する５アミノ酸のＩｉ−Ｋｅｙ免疫調節モチーフの存在若しくは非存在下のタンパク質のアミノ酸配列中での同定方法を提供する。この免疫調節性Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原性ペプチド結合部位中への結合された抗原性エピトープの装填を高める。あるタンパク質内の抗原性エピトープの予測を考えれば、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフにより先行されるそれらのエピトープのサブセットを同定することはワクチンペプチド選択の効率を大きく改善する。また、選択されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの前のＩｉ−Ｋｅｙモチーフを導入若しくは排除のいずれかをするようにタンパク質の配列を改変することにより、そのタンパク質に対する免疫学的応答を変えることができる。
【０５４７】
本開示はＩｉ−Ｋｅｙ免疫調節モチーフの同定方法を提示する。具体的には、あるタンパク質の配列中で、免疫調節性のＩｉ−ＫｅｙモチーフはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｈｅおよびＭｅｔを含んでなる群の最低２アミノ酸ならびにＨｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇを含んでなる群の最低１個を含有する５個の連続するアミノ酸の１セグメントであり、ここでその連続する５アミノ酸のセグメントはＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端残基からの５ないし１１アミノ酸により分離される。適切に間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙモチーフの存在を伴うこうした抗原性エピトープのサブセットは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞免疫応答の効力を高めることにおいてこうしたＩｉ−Ｋｅｙモチーフにより先行されないエピトープよりもより強力である。こうしたエピトープはまた優性若しくは生物学的に活性であることもよりありそうである。こうしたエピトープをもつペプチドは、感染性疾患および癌に対し保護するためのワクチンとして、ならびにアレルギー、自己免疫疾患および移植片拒絶に対する免疫抑制ワクチンとして好ましい。
【０５４８】
別の局面において、本発明は、治療的タンパク質に対する免疫応答を変える様式で改変されている配列をもつ治療的タンパク質に関する。こうしたタンパク質は、ホルモン、サイトカイン若しくは細胞表面受容体と相互作用する他の分子および酵素のような治療的タンパク質を包含する。Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフの改変はその機能を排除するように行い得るか、若しくはこうしたＩｉ−Ｋｅｙモチーフはこうしたモチーフが欠けている場合に推定の抗原性エピトープの前に導入し得る。こうした改変は該治療的タンパク質に対する不利な免疫応答を抑制し得る。こうした生成物は治療的タンパク質およびそのフラグメント、ならびにそれらの発現に至る遺伝子構築物を包含する。
【０５４９】
本発明は、潜在的抗原性エピトープの前に適切に間隔を空けられた天然に存在するＩｉ−ＫｅｙモチーフがＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの１サブセットにおける生物学的活性を選択するという発見に基づく。ＭＨＣクラスＩＩ分子への放射標識した光架橋する抗原性ペプチドの結合は、カテプシンＢ（しかしカテプシンＤでない）の存在下でのＭＨＣクラスＩＩ  αおよびβ鎖からのＩｉタンパク質の切断および遊離の間により効率的である（Ｄａｉｂａｔａ  Ｍ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４  ３１：２５５−２６０）。Ｉｉタンパク質中の推定の切断部位の変異体は、ＭＨＣクラスＩＩ  αおよびβ鎖でなお免疫沈殿されるアビジン標識Ｉｉフラグメントの最終的な切断および遊離におけるＲ７８−Ｋ８６領域中の残基の役割を確認した（Ｘｕ  Ｍ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４  ３１：７２３−７３１）。この「最終的な切断」領域の生化学的機構を、陽イオン性側鎖を伴い、陰イオン性側鎖を伴わずかつ４個の間隔を空けられたプロリンを伴う６残基を含有する合成のＩｉ−Ｌ８７−Ｋを用いて試験した。このＩｉ−Ｋｅｙペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原性ペプチドの結合若しくは遊離を促進した（Ａｄａｍｓ  Ｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５  ２５：１６９３−１７０２）。マウスＴハイブリドーマへの抗原性ペプチド提示において１６０種の相同体（Ａｄａｍｓ  Ｓ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．１９９７  ４７：１０６９−１０７７）およびペプチド結合／遊離アッセイにおいて精製したＨＬＡ−ＤＲ１（Ｘｕ  Ｍ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．１９９９  ４９：７９１−９）を用いて、構造活性関係を特徴付けした。Ｉｉタンパク質のＩｉ−ＫｅｙセグメントｈＩｉ（７７−９２）は、抗原性ペプチドを結合する谷（ｔｒｏｕｇｈ）の一端に隣接するアロステリック部位で作用することにより、ＭＨＣクラスＩＩ分子への合成ペプチドの結合を促進する。さらに、このＩｉ−Ｋｅｙセグメントを単純なポリメチレンリンカーにより抗原性ペプチドに結合することにより、Ｔハイブリドーマへのエピトープの提示の効力が抗原性エピトープのみに関して５００倍高められた（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＲＥ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０００  １８：２６９３−７）。従って、匹敵する天然に存在する適切に間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙモチーフは、その前にそれらが適切に間隔を空けられた間隔で存在する抗原性エピトープのサブセットの選択を促進することを期待し得る。ＬＲＭＫモチーフから伸長するＩｉタンパク質の天然の配列若しくは５−アミノペンタン酸のいずれかのリンカーを含有する合成ハイブリッドは比較的活性であったため、特定の側鎖相互作用がリンカーと抗原結合部位のαへリックスとの間に必要とされなかった。従って、スペーサー領域を形成する特定のアミノ酸が関連があるようには思われない。天然に存在するＩｉ−Ｋｅｙ−スペーサーモチーフがｉｎ  ｖｉｖｏで潜在的ＭＨＣクラスＩＩエピトープの選択を調節しているという仮説を、定義されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端（活性仮説）若しくはＣ末端（重要でない仮説）の双方からの包括的Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフの存在および間隔について試験した。
【０５５０】
抗原性タンパク質中のＩｉ−ＫｅｙモチーフはＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合部位中への緊密に続くＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープの挿入を触媒するように作用する。そのエピトープを免疫原性にするのは潜在的ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの前の適切に間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙモチーフである。この発見から、抗原提示におけるそれらの優勢な役割についてコンセンサスモチーフにより同定されるエピトープのサブセットの新規選択方法が生じる。こうしたエピトープは予防的および治療的ワクチンで活用し得る。治療的タンパク質はまた、免疫原性を高めるか若しくは抑制するかのいずれのためにも改変し得る。
【０５５１】
抗原性タンパク質のアミノ酸配列内のＩｉ−Ｋｅｙモチーフの以下の同定方法をデータセットの検査の前に設計しかつ変更なしに試験した。Ｉｉ−Ｋｅｙボックスは、群Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＦおよびＭの最低２残基ならびに群Ｈ、ＫおよびＲの最低１残基を含有する５個の連続する残基位置であると定義した。これは２つの概念に基づく最も単純なモデルであった。
【０５５２】
本発明の方法の設計における第一の決定的に重要な概念はＩｉ−Ｋｅｙの「コアセグメント」を定義するモチーフの発見であった。ヒトＩｉタンパク質の天然の配列中で、コアモチーフは、系統的な一連のハイブリッド中の最良のＩｉ−Ｋｅｙペプチドの少なくとも最大の半分の活性のこのペプチドによる保持を示す以前の実験的研究に基づきＬ７７ＲＭＫ（配列番号３）であると定義した（Ａｄａｍｓ  Ｓ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．１９９７  ４７：１０６９−７７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＲＥ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０００  １８：２６９３−７）。４アミノ酸のコアモチーフは、各残基位置での１２種のアミノ酸置換をもつ８４種の相同体の分析により研究された７アミノ酸（ＬＲＭＫＬＰＫ）（配列番号４）の以前に定義されたセグメント内に含有される（Ａｄａｍｓ  Ｓ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．１９９７  ４７：１０６９−７７；Ｘｕ  Ｍ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．１９９９  ４９：７９１−９）。それらの研究において、生物学的活性は正確に交替する疎水性／陽イオン性側鎖を必要としないことが発見されたが、但し、最低２個の疎水性および１個の陽イオン性残基が４若しくは５残基のセグメント内に存在した。この理由から、本発明におけるＩｉ−Ｋｅｙモチーフの構造の定義において、５アミノ酸の伸長内のいかなる配列中でもの２個の疎水性側鎖および最低１個の陽イオン性側鎖の存在が、ＭＨＣクラスＩＩ分子中への抗原性エピトープの装填におけるＩｉ−Ｋｅｙの機能に十分であると考えられた。
【０５５３】
本発明の方法の設計における第二の決定的に重要な概念は、タンパク質の局所的に折り畳まれるセグメントの構造の支配における１セット中でのＬ、Ｉ、Ｖ、ＦおよびＭならびに別のそれぞれのセット中でのＨ、ＫおよびＲの機能的同等性の発見であった。この同等性は、タンパク質全体（Ｖａｚｑｕｅｚ  Ｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３  ９０：９１００−４）若しくはαへリックスの周囲の幾何学的に定義された位置（Ｔｏｒｇｅｒｓｏｎ  Ｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９１  ２６６：５５２１−２４；Ｖａｚｑｕｅｚ  Ｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２  ２６７：７４０６−１０；Ｒｅｎｎｅｌｌ  Ｄ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２  ２６７：１７７４８−５２）のいずれかのあるパターン中のアミノ酸の群の系統的調査で発見された。
【０５５４】
ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端から適切に間隔を空けられた天然に存在するＩｉ−Ｋｅｙモチーフの上の同定方法は、以下の分析により検証した。Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９５  ４１：１７８−２２８）によりＭＨＣクラスＩＩに提示されるペプチドを予測するモチーフの彼らの分析において報告された抗原性エピトープの全３６種を、相同なエピトープ（例えば異なるＭＨＣクラスＩＩアレルについて）を除外して分析した。抗原性エピトープに関して上流および下流のこれらの報告されたタンパク質のそれぞれの配列はＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｐｒｏｔｅｉｎ）から得た。群Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＦおよびＭの最低２残基ならびに群Ｈ、ＫおよびＲの最低１残基を含有する５個の連続する残基位置を含有するＩｉ−Ｋｅｙボックスの定義を考え、その場合、抗原性タンパク質内の既知のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端若しくはＣ末端からのこうしたボックスの距離を決定した。こうしたエピトープのＮ末端（しかしＣ末端でない）からのこうしたＩｉ−Ｋｅｙボックスの有意の最小の間隔が予期された。生物学的影響はＮ末端にあると予期されかつＣ末端でされなかったからである。Ｃ末端でのこうしたボックスの生物学的影響の予測された欠如（および従ってＣ末端からの間隔）は統計学的解析のための有用なヌル仮説であった。Ｒａｍｍｅｎｓｅｅが報告した抗原性エピトープからＮ末端の方向に漸進的に伸長する５個の連続する残基のセグメントをＩｉ−Ｋｅｙボックスの存在について試験した。Ｉｉ−ＫｅｙボックスとＲａｍｍｅｎｓｅｅが報告した抗原性エピトープとの間の介在する残基位置の最小の数を伴うボックスを、介在する残基位置の数に関してスコア化した（表１）。鏡像様式の類似の分析を、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅが報告した抗原性エピトープのＣ末端から遠位にスコア化した。第一のＩｉ−Ｋｅｙボックスまでの最小の介在する残基位置を抗原性エピトープのＣ末端からスコア化した（表２１．１）。
【０５５５】
ＭＨＣクラスＩＩ拘束性の抗原性エピトープに対するＴ細胞の応答は、そのエピトープが、Ｉｉ−Ｋｅｙ配列（アセチル−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（配列番号３）［Ａｃ−ＬＲＭＫ−］のような）（配列番号３）をスペーサー、５−アミノペンタン酸によりＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープのＮ末端に結合する合成ハイブリッドペプチド中でＴ細胞に提示される場合に大きく高められる。相同な天然に存在するＩｉ−Ｋｅｙ／スペーサー／エピトープモチーフが抗原性タンパク質のプロセシングの間に抗原性エピトープを選択するかどうかを試験するために、１つの原型のパターンの頻度をそれらの実験で決定されたＭＨＣクラスＩＩエピトープについての配置に関して一連のタンパク質で試験した。非経験的なＮ末端分布（ｐ＜０．０２５）が、原型のＩｉ−Ｋｅｙ／スペーサーパターン（群Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｈｅおよびＭｅｔ［ＬＩＶＦＭ］（配列番号７９０）の最低２残基ならびに群Ａｒｇ、ＨｉｓおよびＬｙｓ［ＲＨＫ］の最低１個を含有する５アミノ酸セグメント）、ならびに４ないし８残基のスペーサー長さについて見出された。この配置はＣ末端からのモチーフ（重要でない仮説）の経験的配置に比較して有意であった。この観察結果は、抗原性タンパク質中の予測された「ＭＨＣクラスＩＩコンセンサスモチーフ」の組の間でのいくつかのエピトープのみの生物学的活性を説明するのに役立つ。それはまた、ある種の抗原に対する免疫応答の調節方法にもつながる。
【０５５６】
【表１３４】
2006515744.tif 000135
【０５５７】
検査により、Ｉｉ−Ｋｅｙボックスの存在およびエピトープのＮ末端からの配置についてのパターンはＣ末端側でのものと非常に異なり、そして、Ｃ末端側のパターンはモンテカルロモデル（データセット中の存在の頻度での残基型の無作為割当て）により生成されることが期待されたものと異ならない。これらの観察結果を定量的統計学的分析にかけた。観察された差異がスペーサー長さの多様なグループ分けについて無作為事象として起こっていたとみられる確率を表２１．２に示す。
【０５５８】
【表１３５】
2006515744.tif 000136
【０５５９】
陽性のＩｉ−Ｋｅｙボックスの定義ならびにスペーサーの長さおよび特徴の変動を提案し得る。しかしながら、第一種の統計学的過誤を回避するためにこうした代替の検定を新たなデータセットで実施しなければならない。こうした過誤はわれわれの本研究で起こらなかった。スコア化したモチーフを、現在のデータセットの検査の前に正確かつ完全に定義したためである。われわれは、このデータセットにより良好に一致するとみられる代替のＩｉ−Ｋｅｙボックスおよびスペーサーのパターンの示唆を控える。
【０５６０】
Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフが抗原性に活性のＭＨＣクラスＩＩエピトープのＮ末端側に適切に間隔を空けられて見出されるという事実は、こうしたＩｉ−Ｋｅｙモチーフが抗原提示細胞のゴルジ後抗原装填区画中でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されたようになるペプチドの選択において活性であるという見解を支持する。同様に、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩ抗原性エピトープハイブリッドペプチドがフロイントの不完全アジュバント中での免疫感作後に良好に提示されるという事実は、こうしたペプチドのＩｉ−Ｋｅｙモチーフがゴルジ後抗原性ペプチド装填区画中に装填するためのそれらのペプチドのエピトープの選択において活性であることを示す。
【０５６１】
好都合な特徴を高めるために治療的タンパク質中に変化を導入し得る。インスリン、エリスロポエチンおよびβ−インターフェロンで観察されたとおり、抗体を中和することにより明示されるところの免疫応答が該タンパク質に対し発生したため、多くの治療的タンパク質の使用が制限される。若干の患者における免疫学的応答が治療的使用を制限する治療的タンパク質を考えれば、免疫応答を発生した患者でのこうした応答を予防する若しくは該応答を和らげるのに本発明を使用してよい。該方法は以下の段階を包含する。一次アミノ酸配列を検査する。一次アミノ酸配列内でＭＨＣクラスＩＩ拘束性エピトープのモチーフを定義する。抗原性モチーフの第一の残基に対しＮ末端にＩｉ−Ｋｅｙボックス−スペーサーモチーフを創製する様式で数個のアミノ酸で変えるのに適するエピトープを選ぶ。組換え分子遺伝学的方法若しくはペプチド合成法によりタンパク質を合成する。例えば親治療的タンパク質での攻撃に際しての抗体の低下により該タンパク質に対する抑制する免疫応答の誘導について合成バリアントを試験する。
【０５６２】
臨床上適切な抗原中の選択されたＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに対し上流のＩｉ−Ｋｅｙモチーフは新規治療的ワクチンにつながるかもしれない。おそらく、Ｉｉ−Ｋｅｙスペーサーモチーフを工作することはあるタンパク質内の抗原性エピトープの免疫原性を変え得る。とりわけ大部分のＮ末端抗原性エピトープについて、１個若しくは数個の変えられた残基の導入が耐えられるとみられる（Ｒｅｎｎｅｌｌ  Ｄ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２  ２６７：１７７４８−５２）。こうした操作は寛容の誘導の影響を受けやすい治療的タンパク質の形態を生成させ得る。
【０５６３】
この分析方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫抑制応答が宿主に対し有害である目的の付加的な抗原性若しくは治療的タンパク質に拡大し得る。例えば、ＨＩＶ逆転写酵素中の抗原性エピトープの検査は、抗原性エピトープがそこで、おそらく寛容の確立における優位を確立する生物学的効力を支配するこうした上流のＩｉ−Ｋｅｙ様セグメントを有するかもしれないことを示す。ＨＩＶ逆転写酵素中の保存された普遍的ＴｈエピトープはＩｉ−Ｋｅｙ−スペーサーモチーフにより先行される。多様なＨＩＶ−１単離物の間で高度に保存されかつ少なくとも４種のＨＬＡ−ＤＲ分子により提示されたＨＩＶ−１逆転写酵素エピトープが、その酵素の配列全体の２０アミノ酸ペプチドの系統的調査においてＶａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇらにより発見された（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  １６２：１５２−１６０）。このペプチドおよび上流の１５アミノ酸は以下：
【０５６４】
【表１３６】
2006515744.tif 000137
【０５６５】
である。
【０５６６】
可能なＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープに一本下線を付け、また、推定のＩｉ−Ｋｅｙモチーフに二重下線を付ける。本実施例は、ＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープの前に適切に間隔を空けられたＩｉ−Ｋｅｙモチーフの存在がそのエピトープの提示をどのように高め得るかを具体的に説明する。さらに、Ｉｉ−Ｋｅｙモチーフの存在は、高度に効率的な免疫抑制応答の発生の原因であるかもしれない。
【実施例２２】
【０５６７】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩエピトープハイブリッドでの免疫感作によるＭＨＣクラスＩエピトープに対する抗体、Ｔヘルパー細胞およびＣＴＬ応答の増強。
【０５６８】
実質的により大きな免疫応答が、抗原性エピトープペプチド単独中よりもＩｉ−Ｋｅｙ抗原性エピトープハイブリッド中に提示されるエピトープで免疫したマウスで見出された。該免疫応答は、個々の抗原性エピトープに対する抗体の力価、エピトープ特異的ＣＤ４＋／ＩＦＮ−γ＋細胞およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるエピトープ特異的ＩＦＮ−γ遊離により測定した。
【０５６９】
ハトチトクロームＣおよびＨＩＶ  ｇｐ１６０からの２種の異なる抗原性エピトープをこれらの比較研究で使用した。ＰＧＣＣ（９５−１０４）エピトープは、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドペプチド（Ａｃ−ＬＲＭＫ−ａｖａ−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ２；「Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＰＧＣＣ」；配列番号９００）若しくは抗原性エピトープペプチド（Ａｃ−ＩＡＹＬＫＱＡＴＡＫ−ＮＨ２；（「ＰＧＣＣ」）；配列番号９０１）中で提示させた。ＨＩＶ  ｇｐ１６０（８４３−８５５）エピトープは：１）２個のａｖａ残基を伴うＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドペプチド（Ａｃ−ＬＲＭＫ−ａｖａ−ａｖａ−ＡＹＲＡＩＲＨＩＰＲ−ＮＨ２；「Ｉｉ−Ｋｅｙ／２ａｖａ／ｇｐ１６０（８４３−８５５）」；配列番号９０２）；２）１個のａｖａ残基を伴うＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドペプチド（Ａｃ−ＬＲＭＫ−ａｖａ−ＡＹＲＡＩＲＨＩＰＲ−ＮＨ２；「Ｉｉ−Ｋｅｙ／１ａｖａ／ｇｐ１６０（８４３−８５５）」；配列番号９０３）；３）１個のａｖａ残基を伴うＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドペプチド（Ａｃ−ＬＲＭＫ−ａｖａ−ＹＲＡＩＲＨＩＰＲ−ＮＨ２；アラニン−８４３がエピトープとＩｉ−Ｋｅｙとの間の間隔のより正確な測定のため欠失されている；「Ｉｉ−Ｋｅｙ／１ａｖａ／ｇｐ１６０（８４４−８５５）」；配列番号９０４）；４）「ａｖａ」を伴わないＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープペプチド（Ａｃ−ＬＲＭＫ−ＡＹＲＡＩＲＨＩＰＲ−ＮＨ２；「ｇｐ１６０（８４３−８５５）」）；配列番号９０５）中に提示させた。「ａｖａ」はδ−アミノ吉草酸であり、５−アミノペンタン酸である。その最大の直鎖状長さはペプチジル配列中の２．５アミノ酸のバックボーン原子の長さに近い。従って、２個のａｖａリンカーは約５アミノ酸により抗原性エピトープからＩｉ−Ｋｅｙモチーフを架橋する。５アミノ酸は、Ｐ１部位中に横たわる残基から抗原性ペプチドを結合する谷中に横たわるペプチドのＮ末端で露出された端までのその谷を占有する伸長された抗原性ペプチドのアミノ酸の数である。
【０５７０】
上で示された実験ペプチドでの免疫感作後の抗体応答についてのＥＬＩＳＡアッセイを後に続くとおり実施した。０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５中の２μｇ／ウェルの被覆ペプチドの溶液５０マイクロリットル（μｌ）を４℃での一夜インキュベーションのため９６ウェルＮｕｎｃイムノプレート（＃４４２４０４）の各ウェルに添加した。吸引後、３％ウシ胎児血清を含有するリン酸緩衝生理的食塩水溶液（アッセイ希釈剤）２５０μｌを各ウェルにＲＴで２時間添加した。アッセイ希釈剤で３回洗浄した後、アッセイ希釈剤中３倍の連続希釈で２０倍希釈したマウス血清５０μｌを各ウェルにＲＴで２時間添加した。アッセイ希釈剤で３回洗浄した後、５０μｌの１μｇ／ｍｌのビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ１若しくはＩｇＧ２ａを各ウェルに添加しかつＲＴで１時間インキュベートした。アッセイ希釈剤で３回洗浄した後、５０μｌのストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ複合物（１０００倍）を各ウェルに添加しかつＲＴで３０分間インキュベートした。アッセイ希釈剤で３回洗浄した後、１００μｌのテトラメチルベンジジン／Ｈ２Ｏ２溶液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ２６４ＫＫ）を各ウェルに室温で暗所中１５分間添加した。反応を各ウェル中で１００μｌの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止し、そして吸光度を４５０ｎｍで直ちに読み取った。
【０５７１】
ＰＧＣＣエピトープに対する有意により大きい抗体力価が、ＣＦＡ（表２２．１）若しくはＩＦＡ（表２２．２）のいずれか中のＰＧＣＣ（９５−１０４）ペプチド単独でよりもＩｉ−Ｋｅｙ／ＰＧＣＣ（９５−１０４）で免疫することにより誘導された。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Ｈ−２ｋ）を、等容量のフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）で乳化した１０ｎモルのペプチド（５０μｌ）で尾の基部で皮下に免疫した。第１４日に、マウスを、等容量のフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）で乳化した１０ｎモルのペプチド（５０μｌ）で尾の基部で皮下に追加免疫した。第２８日に、マウスをハンクス液（ＨＢＳＳ）に溶解した４０ｎモルのペプチドで静脈内に追加免疫した。第３３日にマウスを殺し、そして血清サンプルをＰＧＣＣ（９５−１０４）エピトープペプチドに対する抗体力価についてアッセイした。
【０５７２】
【表１３７】
2006515744.tif 000138
【０５７３】
ＩＦＡを伴いワクチン接種するために、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（Ｈ−２ｋ）を等量のＩＦＡで乳化した１０ｎモルのペプチド（５０μｌ）で尾の基部で皮下に免疫した。第１４日に、マウスを等容量のＩＦＡで乳化した１０ｎモルのペプチド（５０μｌ）で再度尾の基部で皮下に追加免疫した。第２８日に、マウスをハンクス液（ＨＢＳＳ）に溶解した４０ｎモルのペプチドで静脈内に追加免疫した。第３３日にマウスを殺し、そして血清サンプルをＰＧＣＣ（９５−１０４）エピトープペプチドに対する抗体力価についてアッセイした。
【０５７４】
【表１３８】
2006515744.tif 000139
【０５７５】
ＨＩＶ  ｇｐ１６０（８４３−８５５）エピトープに対する有意により大きい抗体力価が、ＨＩＶ  ｇｐ１６０（８４３−８５５）ペプチドでよりもＩｉ−Ｋｅｙ／ＨＩＶ  ｇｐ１６０（８４３−８５５）ハイブリッド（双方は生理的食塩水溶液中で投与した）での免疫感作から生じた（表３）。Ｂ１０．Ａ（５Ｒ）マウス（Ｈ−２ｋ／ｂ）を５０μｌのリン酸緩衝生理的食塩水溶液中の２０ｎモルのペプチドで第１および２日にそれぞれ右および左後肢に筋肉内に免疫した。第１４日に、マウスを２００μｌのハンクス液中の４０ｎモルのペプチドで後肢に筋肉内に筋肉内に追加免疫した。第３０日に、マウスをハンクス液（ＨＢＳＳ）に溶解した４０ｎモルのペプチドで静脈内に追加免疫した。第３５日にマウスを殺し、そして血清サンプルをＨＩＶ  ｇｐ１６０（８４３−８５５）ペプチドに対する抗体力価についてアッセイした。
【０５７６】
【表１３９】
2006515744.tif 000140
【０５７７】
上の結果は、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド中での抗原性エピトープの提示が、ＣＦＡが最初の免疫感作のベヒクルであるかＩＦＡがベヒクルであるかに関係なく抗体応答の誘導を大きく高めることを示す。ＩＦＡはｂａｙｏｌ油から構成され、またＣＦＡは熱殺菌したヒト結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を添加したＩＦＡから構成される。表１および２の実験において、ＩＦＡが第二の免疫感作すなわち皮下追加免疫注入のためのベヒクルであり、また、ＨＢＳＳが第三の免疫感作すなわち静脈内追加免疫注入のためのベヒクルであった。ＣＦＡおよびＩＦＡは専門的な抗原提示細胞によるペプチドの食作用を媒介するため、それらの使用はゴルジ後の抗原装填区画中のエピトープペプチドの装填につながる。従って、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子への装填のための２つの機構（すなわち、例えばパラホルムアルデヒドで固定した細胞上の細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子で（Ａｄａｍｓ  Ｓ．Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５  ２５：１６９３−１７０２）、およびインターナリゼーション後のゴルジ後抗原装填区画中で）からの利益を有する。
【０５７８】
ＣＤ４＋／ＩＦＮ−γ＋  Ｔｈ−１ヘルパーＴ細胞の頻度は、ｇｐ１６０（８４３−８５５）ペプチドでの免疫感作に比較してＩｉ−Ｋｅｙ／ｇｐ１６０（８４３−８５５）ハイブリッドでの免疫感作後に大きく増大した（表４）。Ｉｉ−Ｋｅｙ／エピトープハイブリッドエピトープペプチドのはるかにより大きな免疫原性のための機構を試験するため、Ｂ１０（Ａ）  ５Ｒマウスを、ＣＦＡ中の１０ｎモルのｇｐ１６０（８４３−８５５）ペプチド若しくはＩｉ−Ｋｅｙ／ｇｐ１６０（８４３−８５５）のいずれかで尾の基部の右側で皮下で免疫した。第１０日に、マウスを生理的食塩水中の４０ｎモルのハイブリッドペプチド若しくはエピトープペプチドで静脈内注入により追加免疫した。第２６日にマウスを殺し、そして脾細胞を得た。１×１０６脾単核細胞を１０単位の組換えＩＬ−２および示されたペプチド（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で一夜刺激した。インキュベーションの最後の３時間の間に２μＭのモネンシン（Ｇｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を培養物に添加し、そしてその後細胞を細胞表面マーカーおよび細胞内ＩＦＮ−γ双方について染色した。抗原特異的Ｔｈ１ヘルパー細胞応答を定量するためのＦＡＣＳアッセイを後に続くとおり実施した。細胞は１００μｌの染色緩衝液（マグネシウム若しくはカルシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理的食塩水溶液）中１０６細胞あたり１μｇのフルオレセインブロッキング試薬（ＦＣ／ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともにインキュベートした。それらの細胞を１００μｌあたり１０６細胞でラット抗マウスＣＤ３若しくはＣＤ４いずれかのモノクローナル抗体で４℃で３０分間染色した。洗浄した後、細胞を再懸濁し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして０．５％サポニンで４℃で２０分間浸透化した。０．５％サポニンを含む染色緩衝液に細胞を懸濁し、そして適切な抗サイトカイン若しくはアイソタイプ対照抗体（ＩＦＮ−γ、ＸＭＧ１．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、若しくはＩＦＮ−γアイソタイプ対照、Ｒ３−３４、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。細胞を暗所中４℃で３０分間インキュベートし、洗浄しかつフローサイトメトリー分析のため染色緩衝液中０．５％サポニン中０．３％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。フローサイトメトリー分析は後に続くとおり実施した。最初に、ＣＤ３＋細胞を、Ｔゲート集団としてのＣＤ３  ＦＩＴＣに対する側方散乱の二色ドットプロットを使用してゲートした。ＣＤ３＋細胞をその後ＣＤ４発現について分析してＣＤ３＋／ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞集団の標的を定めた。この特定の細胞集団内で、二色ドットプロットを使用して、フルオレセイン標識抗体で染色されたＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞に対するフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗体により染色された細胞内インターフェロン−γサイトカインを分析した。
【０５７９】
ＣＤ４＋／ＩＦＮ−γ＋細胞の増大は抗原特異的Ｔｈ−１ヘルパーＴ細胞の刺激および拡張と矛盾しない。Ｔｈ−１ヘルパーＴ細胞の亜集団はＩＦＮ−γの優勢な産生を特徴とする一方、ヘルパーＴ細胞のＴｈ−２亜集団はＩＬ−４およびＩＬ−１０の優先的な産生を特徴とする。Ｔ細胞受容体と反応する抗ＣＤ３抗体は休止期ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋亜集団双方の全Ｔ細胞を測定する。（ナイーブなマウスに比較して）ＣＤ４＋／ＩＦＮγ＋抗原特異的亜集団の約１．０％から約２．０％までの増大は多様な抗原でのマウスの免疫感作に関する他者の研究と矛盾しない（Ｃａｒａｈｅｒ  ＥＭ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０００  ２４４：２９；Ｏ’Ｈａｇａｎ  Ｄ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００１  ７５：９０３７；Ｋａｒｕｌｉｎ  ＡＹ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２  １６８：５４５−５３；Ｔａｒｇｏｎｉ  ＯＳ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６６：４７５７−６４；Ｈｅｓｓｅ  ＭＤ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  １６７：１３５３−６１；Ｈｅｅｇｅｒ  ＰＳ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６５：１２７８−８４；Ｈｅｌｍｓ  Ｔ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  １６４：３７２３−３２；Ｙｉｐ  ＨＣ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  １６２：３９４２−９）。
【０５８０】
【表１４０】
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【０５８１】
ＩＦＮ−γサイトカイン応答についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、Ｉｉ−Ｋｅｙ−ａｖａ−ｇｐ１６０（８４３−８５５）若しくはｇｐ１６０（８４３−８５５）での免疫感作に対する脾Ｔリンパ球サブセット応答をより正確に滴定するために実施した。アッセイは後に続くとおり実施した。サイトカイン特異的捕捉抗体の溶液（リン酸緩衝生理的食塩水溶液、ｐＨ７．２中６μｇ／ｍｌで１００μｌ）を４℃での一夜インキュベーションのため９６ウェルＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔプレート（Ｍ２００）の各ウェルに添加した。吸引後、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを含有するリン酸緩衝生理的食塩水溶液２００μｌ（マウス培地）を各ウェルにＲＴで２時間添加した。リン酸緩衝生理的食塩水溶液中１％Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄緩衝液Ｉ）で４回洗浄した後、１０６細胞／ウェルの免疫したマウスの脾からの単一細胞懸濁液１００μｌをマウス培地中５μｇ／ウェルのペプチドエピトープ１００μｌで再刺激し、そして３７℃、５％ＣＯ２で２０〜４０時間インキュベートした。リン酸緩衝生理的食塩水溶液（洗浄緩衝液ＩＩ）で２回および洗浄緩衝液Ｉで４回洗浄した後、１０％ウシ胎児血清を含む１×リン酸緩衝生理的食塩水（希釈緩衝液）中の２μｇ／ｍｌのビオチニル化抗マウスＩＦＮ−γ  １００μｌを各ウェルにＲＴで２時間添加した。洗浄緩衝液Ｉで５回洗浄した後、希釈緩衝液中のストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ複合物（５００倍）１００iｌを各ウェルにＲＴで１時間添加した。洗浄緩衝液Ｉで４回および洗浄緩衝液ＩＩで２回洗浄した後に１００μｌの３−アミノ−９−エチルカルバゾール／Ｈ２Ｏ２基質（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ５５１９５１）を添加し、そして暗所中ＲＴで３０〜６０分間インキュベートしたした。２００μｌの脱イオン水で３回洗浄することにより反応を停止した。ＥＬＩＳＰＯＴデータ解析はＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  １．７ｅソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用することにより実施した。四重のウェルのディジタル化画像を、対照細胞（ナイーブな脾細胞）および実験細胞（免疫したマウスの脾細胞）の細胞の比較に基づき色密度がバックグラウンドを超えるスポットの存在について分析した。スポットの大きさおよび円形性についての付加的な計数パラメータを適用して、非特異的抗体結合により引き起こされるスペックルをゲートした（ｇａｔｅ  ｏｕｔ）。各スポットはＩＦＮ−γを分泌する単一の細胞を表す。
【０５８２】
ＩＦＮ−γ／Ｔｈ−１応答は、Ｉｉ−ｋｅｙ／ＨＩＶ  ｇｐ１６０（８４３−８５５）ハイブリッドおよびＨＩＶ  ｇｐ１６０（８４３−８５５）ペプチド（双方とも生理的食塩水溶液中で投与された）での免疫感作からＨＩＶ  ｇｐ１６０（８４３−８５５）エピトープに対し導き出された（表５）。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ−２ｋ）マウスを、等容量のフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）で乳化した４０ｎモルのペプチド（５０μｌ）で尾の基部で皮下で免疫した。第１３日に、マウスを等量のフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）で乳化した４０ｎモルのペプチド（５０μｌ）で尾の基部で皮下で追加免疫した。第３１日に、マウスを１００μｌのハンクス液（ＨＢＳＳ）に溶解した４０ｎモルのペプチドで静脈内に追加免疫した。第３５日にマウスを殺し、そして脾からの単一細胞懸濁液をＨＩＶ  ｇｐ１６０（８４３−８５５）ペプチドに対するＩＦＮ−γ応答についてアッセイした。
【０５８３】
【表１４１】
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【０５８４】
数は三重のウェル中のスポットの平均の数（および標準偏差）であり、また、大きさはｍｍ２での平均のスポット大きさ（および標準偏差）である。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ｇｐ１６０（８４４−８５５）は１個のａｖａスペーサーを有する（Ｉｉ−ｋｅｙ−ａｖａ−ｇｐ１６０（８４４−８５５））。
【０５８５】
表２２．４および２２．５のデータは、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドは匹敵する抗原性ペプチドよりも有意により強力な免疫原であるという表１−３のデータから生じられる見解を支持する。さらに、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッド中の抗原性エピトープは、アジュバントを含まないＰＢＳ中での皮下免疫感作後に良好に提示される。この事実は、多様な他のアジュバント、例えばＣＦＡ若しくはＩＦＡでさえも禁忌とされるか若しくは好ましくないかのいずれかであるヒトにおけるワクチンとしてのこれらのペプチドの有効な使用に向かせる。
【０５８６】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドペプチドのｃＤＮＡ配列をミニジーン（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）ＤＮＡワクチンとしての送達のため構築し得る。こうした構築物は、それぞれＩｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープをコードする１個若しくは数個の反復遺伝子構築物から構成されるミニジーン、またはそれ自体ミニジーン構築物の抗原性エピトープが由来したタンパク質の発現をコードするＤＮＡワクチン中への１個若しくはそれ以上の挿入物のいずれかである。標準的分子生物学技術を使用してこうしたミニジーン構築物を生成する（Ｌｅｉｆｅｒｔ  ＪＡ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  １２：１８８１−９２；Ｌｉｕ  ＷＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００  ２７３：３７４−８２）。
【０５８７】
こうしたミニジーンをコードするＤＮＡ構築物は、１）ＬＲＭＫのような生物学的に活性のＩｉ−Ｋｅｙペプチド、若しくは米国特許第５，９１９，６３９号明細書で教示されるところのＩｉ−Ｋｅｙペプチドの生物学的に活性の相同体、２）ａｌａ−ａｌａ−ａｌａ、またはａｖａ若しくはａｌａ−ａｌａ−ａｌａの他の生物学的に許容できる機能的同等物から構成されるスペーサー、および３）抗原性エピトープのコドンを含有する。
【０５８８】
本開示は、５−アミノペンタン酸である１個のδ−アミノ吉草酸から構成されるスペーサーが２種のこうした残基から構成されるスペーサー若しくは全くないスペーサーに好ましいことを示す。Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープペプチド中の１個のδ−アミノ吉草酸残基の直線状の長さが約２．５アミノ酸のバックボーンに沿った直線状の長さに近いため、ミニジーンのＤＮＡ構築物中のスペーサー同等物の長さは好ましくは２、３若しくは４アミノ酸であるが、しかしそのスペーサーの長さは１から１１アミノ酸まで伸長し得る。ミニジーンのスペーサー同等物セグメント中のコドンは機能上許容できるアミノ酸をコードし得るが、しかし、好ましいものはアラニン、グリシンおよびセリンのような小さな側鎖のアミノ酸を包含する群から選ばれる。
【０５８９】
本開示に提示される他の実施例でのとおり、Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドの抗原性エピトープセグメントのアミノ酸は、１種のＭＨＣクラスＩＩに提示される抗原性エピトープのみ、または以下ａ）第二のＭＨＣクラスＩＩに提示されるエピトープ、ｂ）ＭＨＣクラスＩに提示されるエピトープ、およびｃ）抗体に認識されるエピトープの１種若しくはそれ以上をコードする結合された若しくはオーバーラップする配列（１種若しくは複数）を含むこうしたエピトープをコードするアミノ酸配列から構成されてよい。
【０５９０】
Ｉｉ−Ｋｅｙ／クラスＩＩエピトープハイブリッドでの免疫感作は抗原特異的Ｔヘルパー細胞応答を増強することによりＭＨＣクラスＩエピトープ活性に対するＣＴＬ応答を高める。ＭＨＣクラスＩＩエピトープ提示の向上された効力はＭＨＣクラスＩエピトープの活性に対する応答を増強する。マウスをＣＴＬエピトープとのＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩハイブリッドの混合物、若しくはＭＨＣクラスＩＩエピトープ＋ＣＴＬエピトープ、若しくはＣＴＬエピトープ単独で免疫した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＣＴＬエピトープを伴うＩｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩハイブリッドでマウスを免疫することが高められたＣＴＬ活性を生じさせたことを示した（表２２．６）。Ｃ３Ｄ２Ｆ１／Ｊマウスを：１）ＩＦＡ中の４０ｎモルのＩｉ−ｋｅｙ／ＨＩＶヘルパーＴエピトープＧＰ１２０（９１−１００）］および２０ｎモルのＨＩＶ  ＣＴＬエピトープ（ｐ１８）、２）ＩＦＡ中の４０ｎモルのＨＩＶヘルパーＴエピトープＧＰ１２０（９１−１００）および２０ｎモルのＨＩＶ  ＣＴＬエピトープ（ｐ１８）、３）ＩＦＡ中の２０ｎモルのＨＩＶ  ＣＴＬエピトープ（ｐ１８）の混合物、若しくは４）免疫原なしのいずれかで尾の基部で皮下に免疫した。第１４日に、マウスに尾の基部で上述されたと同一の免疫原で追加免疫した。第３２日にマウスをもう１回皮下で追加免疫した。個々のマウスの脾からの単一細胞懸濁液を、ＣＴＬエピトープｐ１８（５iｇ／ウェル）、非特異的エピトープ（５iｇ／ウェル）および培地単独を含有する培養物（１０６細胞／ウェル）中での最後の追加免疫５日後にｅｘ  ｖｉｖｏで攻撃した。表２２．６は６ないし９個のウェルの１群あたり３匹のマウスから平均したデータから計算した平均のスポット値およびＳＤを表す。
【０５９１】
【表１４２】
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【０５９２】
従って、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩヘルパーエピトープ＋ＣＴＬエピトープで免疫したマウスは、ＣＴＬエピトープ単独若しくはＭＨＣクラスＩＩエピトープ＋ＣＴＬエピトープで免疫したマウスよりもはるかにより大きい抗原特異的ＣＴＬ応答を表した。Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩハイブリッドおよびＣＴＬエピトープ、若しくはＣＴＬエピトープが内在するＭＨＣクラスＩＩ配列の共有結合もまた高められたＣＴＬ応答を提供することができる。加えて、Ｉｉ−Ｋｅｙ／ＭＨＣクラスＩＩハイブリッドのＣＴＬ配列から構成されるミニジーンおよびＤＮＡワクチンもまた高められたＣＴＬ反応を誘導することができる。
【国際調査報告】
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