(57)【要約】血液サンプル中の有核血球を計測するための血球溶解試薬組成物を説明する。前記血球溶解試薬組成物は、4級アンモニウム界面活性剤、エトキシル化フェノール、及びエトキシル化アルコールを含む。血液サンプルと混合したとき、前記血球溶解試薬組成物は、赤血球を溶解し、そしてDCインピーダンス測定による他の細胞型と有核赤血球と区別を可能にする。前記血球溶解試薬組成物は、血液サンプル中の総ヘモグロビン濃度を光度的に測定するための有機リガンドをさらに含むことができる。前記血球溶解試薬組成物と希釈液を含む血球溶解試薬システムを、さらに開示する。さらに、別個の希釈液なしに使用することができる、塩を含む単独の試薬組成物をも開示する。前記血球溶解試薬組成物は、有核赤血球、WBC及び血液サンプル中のヘモグロビンの同時測定のために使用されることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球を溶解し、かつ、有核血球を計測するための血球溶解試薬組成物であって、以下の：
(a)以下の分子構造：
【化１】
2004537725.tif 000004
{式中、
R1が、12〜16の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2、R3及びR4が、1〜4の炭素原子をもつアルキル基であり、そして
X-が、塩化物又は臭化物アニオンである。}によって表される、少なくとも1の4級アンモニウム塩；
(b)アルキル基が、6〜12の炭素原子をもち、かつ、エチレン・オキサイドの数が、約10〜約50の範囲内にある、エトキシル化アルキルフェノール；並びに
(c)以下の分子構造：
R1-R2-(CH2CH2O)n-H
{式中、
R1が、10〜22の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2が、-O-であり、そして
nが、20〜35である。}によって表されるエトキシル化アルコール；
の水性溶液を含み、そして
ここで、そのpHが、約2〜約11の範囲にある、前記血球溶解試薬組成物。
【請求項２】
前記4級アンモニウム塩が、約6 g/L〜約50 g/Lの濃度を有する、請求項1に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項３】
前記4級アンモニウム塩が、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムである、請求項1に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項４】
前記エトキシル化フェノールが、約2 g/L〜約40 g/Lの濃度を有する、請求項1に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項５】
前記エトキシル化アルコールが、約1 g/L〜約20 g/Lの濃度を有する、請求項1に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項６】
血液サンプル中のヘモグロビン濃度を計測するために、ヘモグロビンとクロモゲンを形成するのに十分な量の有機リガンドをさらに含む、請求項1に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項７】
前記有機リガンドが、(a)テトラゾール及びその誘導体、(b)イミダゾール及びその誘導体、(c)キナルジン酸、並びに(d)安息香酸及び安息香酸のアルカリ金属塩から成る群から選ばれる、請求項6に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項８】
前記有機リガンドが、約1 g/L〜約10 g/Lの濃度を有する、請求項7に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項９】
前記有機リガンドが、テトラゾール及びその誘導体である、請求項7に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項１０】
前記有核血球が、有核赤血球及び白血球を含む、請求項1に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項１１】
赤血球を溶解し、血液サンプル中の有核血球及びヘモグロビン濃度を計測するための血球溶解試薬組成物であって、以下の：
(a)以下の分子構造：
【化２】
2004537725.tif 000005
{式中、
R1が、14の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2、R3及びR4が、1〜4の炭素原子をもつアルキル基であり、そして
X-が、塩化物又は臭化物アニオンである。}によって表される、少なくとも1の4級アンモニウム塩；
(b)アルキル基が、6〜12の炭素原子をもち、かつ、エチレン・オキサイドの数が、約10〜約50の範囲内にある、エトキシル化アルキルフェノール；
(c)以下の分子構造：
R1-R2-(CH2CH2O)n-H
{式中、
R1が、10〜22の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2が、-O-であり、そして
nが、20〜35である。}によって表されるエトキシル化アルコール；並びに
(e)テトラゾール、
の水性溶液を含む前記血球溶解試薬組成物。
【請求項１２】
前記4級アンモニウム塩が、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムである、請求項11に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項１３】
赤血球を溶解し、かつ、有核血球を計測するための試薬システムであって、以下の：
(Ｉ)以下の水性溶液を含む血球溶解試薬組成物：
(a)以下の分子構造：
【化３】
2004537725.tif 000006
{式中、
R1が、12〜16の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2、R3及びR4が、1〜4の炭素原子をもつアルキル基であり、そして
X-が、塩化物又は臭化物アニオンである。}によって表される、少なくとも1の4級アンモニウム塩；
(b)アルキル基が、6〜12の炭素原子をもち、かつ、エチレン・オキサイドの数が、約10〜約50の範囲内にある、エトキシル化アルキルフェノール；そして
(c)以下の分子構造：
R1-R2-(CH2CH2O)n-H
{式中、
R1が、10〜22の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2が、-O-であり、そして
nが、20〜35である。}によって表されたエトキシル化アルコール；及び
(II)希釈液、
を含む前記試薬システム。
【請求項１４】
前記血球溶解試薬組成物が、血液サンプル中のヘモグロビン濃度を計測するために、ヘモグロビンとクロモゲンを形成するのに十分な量の有機リガンドをさらに含む、請求項13に記載の試薬システム。
【請求項１５】
前記有機リガンドが、(a)テトラゾール及びその誘導体、(b)イミダゾール及びその誘導体、(c)キナルジン酸、並びに(d)安息香酸及び安息香酸のアルカリ金属塩から成る群から選ばれる、請求項14に記載の試薬システム。
【請求項１６】
前記希釈液が、以下の：
(a)インピーダンス計測に十分な上記希釈液の伝導度を調整するための量の、少なくとも1の塩；及び
(b)抗菌剤、
を含む水性溶液である、請求項13に記載の試薬システム。
【請求項１７】
前記希釈液が、血液サンプル中のヘモグロビン濃度を計測するために、ヘモグロビンとクロモゲンを形成するのに十分な量の有機リガンドをさらに含む、請求項16に記載の試薬システム。
【請求項１８】
前記有機リガンドが、(a)テトラゾール及びその誘導体、(b)イミダゾール及びその誘導体、(c)キナルジン酸、並びに(d)安息香酸及び安息香酸のアルカリ金属塩から成る群から選ばれる、請求項17に記載の試薬システム。
【請求項１９】
前記希釈液が、当該希釈液のpHを中性に調整するための緩衝物質をさらに含む、請求項16に記載の試薬システム。
【請求項２０】
赤血球を溶解し、かつ、有核血球を計測するための血球溶解試薬組成物であって、以下の：
(a)以下の分子構造：
【化４】
2004537725.tif 000007
{式中、
R1が、12〜16の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2、R3及びR4が、1〜4の炭素原子をもつアルキル基であり、そして
X-が、塩化物又は臭化物アニオンである。}によって表される、少なくとも1の4級アンモニウム塩；
(b)アルキル基が、6〜12の炭素原子をもち、かつ、エチレン・オキサイドの数が、約10〜約50の範囲内にある、エトキシル化アルキルフェノール；
(c)以下の分子構造：
R1-R2-(CH2CH2O)n-H
{式中、
R1が、10〜22の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2が、-O-であり、そして
nが、20〜35である。}によって表されるエトキシル化アルコール；並びに
(d)インピーダンス計測に十分な、上記血球溶解試薬組成物の伝導度を調整するための量の、少なくとも1の塩、
の水性溶液を含む前記血球溶解試薬組成物。
【請求項２１】
前記塩が、硫酸、塩化物、リン酸又はクエン酸のアルカリ金属塩から成る群から選ばれる、請求項20に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項２２】
前記血球溶解試薬組成物が、血液サンプル中のヘモグロビン濃度を計測するために、ヘモグロビンと安定なクロモゲンを形成するのに十分な量の有機リガンドをさらに含む、請求項20に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項２３】
前記有機リガンドが、(a)テトラゾール及びその誘導体、(b)イミダゾール及びその誘導体、(c)キナルジン酸、並びに(d)安息香酸及び安息香酸のアルカリ金属塩から成る群から選ばれる、請求項22に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項２４】
前記4級アンモニウム塩が、臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムである、請求項20に記載の血球溶解試薬組成物。
【請求項２５】
前記有核血球が、有核赤血球及び白血球を含む、請求項20に記載の血球溶解試薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液サンプル中の有核血球の定量のための血球溶解試薬組成物に関する。より特に、前記血球溶解試薬組成物は、直流インピーダンス計測によって血液サンプル中の他の細胞型と、有核赤血球とを区別することができる。さらに、前記血球溶解試薬組成物は、さらに血液サンプル中の総ヘモグロビン濃度を計測するために使用されることができる。
【背景技術】
【０００２】
正常な末梢血は、核をもたない成熟した赤血球を含んでいる。有核赤血球(NRBCs)、あるいは赤芽球は、未熟な赤血球である。それらは、通常末梢血中ではなく骨髄中に生じる。しかし、貧血と白血病のような特定の病気において、NRBCsは末梢血中にも生じる。従って、NRBCsの計測は、臨床的に重要である。伝統的に、NRBCの区別とカウントは、手作業で行われる。前記方法は、顕微鏡スライド上に血液サンプルを塗りつけ、そして染色し、その後手作業により個々のスライドを視覚的に分析する。NRBC濃度は、白血球100個あたりのNRBCの数として報告される。通常、血液塗抹上の同じ部位に存在する200個の白血球及びNRBCの数が、カウントされ、そしてこの数を2で割ってNRBC数/100 WBCとしてNRBC濃度を表す。このアプローチは、非常に時間がかかり、そしてスライドを分析した個人の解釈に対して主観的である。
【０００３】
ここ数年、いくつかの蛍光フローサイトメトリー方法が、NRBCsを区別するために開発された。これらの方法は、電子又は光学的な性質に基づいてNRBCsを区別するのが困難であるので、NRBCsを他の細胞型と区別するために特定の核染色反応技術を利用する。
【０００４】
米国特許番号第5,298,426号(Inamiらに対する)は、NRBCsを区別するための蛍光法を開示する。この方法は、酸性の低張蛍光色素溶液である第1の流体と、第1の流体の重量オスモル濃度及びpHを変える第2の流体を使った、ツーステップ染色を利用する。Inamiらは、前記第1の流体が、有核赤血球内に拡散する赤芽球染色染料を含み、上記染料が、特異的に有核赤血球の核を染色し、そして2次元のプロットにより他の細胞群からNRBCsの群を区別し、それによりNRBCの区別の結果が算出されることを教示する。
【０００５】
米国特許番号第5,516,695号及び同第5,648,225号(Kimらに対する)は、有核血球の細分類のための多目的血球溶解試薬システム及び使用方法を開示する。前記血球溶解試薬は、非4級アンモニウム塩、脂肪族アルデヒド、脂肪族アルデヒドに対し不活性な非リン酸バッファー、及び核染料を含む。前記方法は、血球溶解試薬により血液サンプルを溶解し、高温にてサンプル混合物をインキュベートし、そして自動化された電子光学的な血液学器具使用を用いてNRBCsを含む有核血球を定量するステップを含む。
【０００６】
米国特許番号第5,559,037号(Kimらに対する)は、NRBCsと白血球のフローサイトメトリー分析法を開示する。この方法は、NRBC核を生体核染色に晒すために全血サンプル由来の赤血球及びNRBC細胞質を溶解し、上記生体核染色の白血球中への浸透を最小限にし、そして、蛍光と2アングルの光散乱を測定することによってサンプルを分析することを含む。白血球は有核細胞でもあるので、蛍光測定法に対する妨害を避けるために、これらの細胞の染色を防ぐ必要がある。白血球膜の維持と白血球中の核染色の浸透の最小限化は、赤血球の溶解中に脂肪族アルデヒドを用いて白血球を固定することによって同時に達成される。アルデヒド固定液は、危険な化学薬品として知られている。さらに、前記方法は、NRBCと白血球を区別するために、試薬を42℃に加熱する要求がある。
【０００７】
欧州特許第1 004 880 A2号は、有核赤血球を識別し、そしてカウントする試薬及び方法を開示する。この試薬は、赤血球を溶かし、そして染色に好適なようにサンプル中の白血球及びNRBCsを調整するための溶血剤；並びに白血球とNRBCsを別個に染色するように選ばれた少なくとも1つの蛍光色素を含む。この方法は、赤血球を溶解し、白血球及びNRBCsを染色し、少なくとも1つの光散乱パラメーター及び少なくとも1つの蛍光パラメーターを計測することによって、サンプルをアッセイするステップを含む。
【０００８】
米国特許番号第5,874,310号(Liらに対する)は、有核赤血球を区別するための試薬及び方法を開示する。この方法は、成熟赤血球を溶解するために血液サンプルを血球溶解試薬システムに晒し、そしてNRBCsを他の細胞型と区別するために2つの小角光散乱計測によって、フローセル内のサンプルを分析することを含む。この方法は、さらに電子及び光学的な分析を使った白血球の同時区別を含む。ここで、前記電子分析は、DCインピーダンス計測である。
【０００９】
米国特許番号第5,917,584号(Liらに対する)は、有核赤血球の区別の方法を開示する。この方法は、成熟赤血球を血液サンプル中で溶解し；NRBCsを他の細胞型と区別するために、2アングルの光散乱計測によってフローセル内のサンプルを分析することを含む。ここで、第2の光散乱シグナルは、中程度のアングルか、又は直角の光散乱シグナルである。
【００１０】
前記方法は、蛍光フローサイトメトリーと光散乱の計測により白血球とNRBCsの区別とカウントを可能にする。しかし、蛍光と光散乱の計測は、複雑で、かつ、高価な検出方法である。
【００１１】
多くの最新の非蛍光自動化血液学分析器、例えばAbbott Cell-Dyn(登録商標)3500、COULTER(登録商標)Gen・S(商標)、Bayer Advia*120(登録商標)及びSysmex(商標)NE-9000は、得られた細胞分布ヒストグラムの赤血球残屑エリア近くのシグナルの増加を器具が感知したときに、分析された血液サンプル中のNRBCsの存在の可能性に関するNRBC合図（NRBC flagging）を提供することしかできない。しかし、多くの他の血液異常、例えば血小板塊及び鎌状赤血球、並びに十分に溶解されていないな血液サンプル由来の赤血球残屑が同じエリアのシグナル増加を引き起こしうるので、そのような方法は、偽陽性の合図を生じやすい。これらの方法において、NRBCsは明確に確認されない。それどころか、前記の他の原因によって生じた類似パターンと混同する可能性がある、ヒストグラム又はドットプロットにおける共通のNRBCサンプル分布パターンだけが、機器によって見分けられる。偽陽性の合図を含む合図されたサンプルに関して、手作業による方法によるサンプルの再試験が臨床検査室で必要とされる。
【００１２】
さらに、サンプルを含むNRBCについての周知の問題は、これらのサンプルに対する血液学分析器によって報告される誤った白血球計数(WBC)である。NRBCsの核の量が白血球のそれに近いので、NRBCsは、血球サイズを計測する血液学分析器によって普通、白血球としてカウントされ、WBCの増加をもたらす。従って、血液学分析器から報告されたWBCに対するNRBCの寄与の補正が、NRBCを含むサンプルについて必要とされる。臨床検査室における現在の実務は、血液学分析器によって報告されたWBCから、手作業によるカウントによって得られたNRBCの数を差し引くことになっている。これは時間がかかり、そして間違いを生じやすい。
【００１３】
異なる側面において、白血球分析のための様々な血球溶解試薬組成物が当該技術分野で知られている。米国特許番号第5,618,733号(Tsujiらに対する)は、イオン性界面活性剤；疎水基と、及び白血球内の陽イオン成分と結合することによって白血球形態を保つための水溶液中、負電荷をもつ酸性基とを有する少なくとも1つの有機化合物；非イオン性界面活性剤；並びに緩衝物質を含む白血球を分析するための試薬を開示する。
【００１４】
米国特許番号第4,528,274号(Carterらに対する)は、血液中の少なくとも2つの白血球集団の定量のための血球溶解試薬を開示する。この血球溶解試薬は、少なくとも2つの4級アンモニウム塩、及び非イオン性ポリオキシエチル化アルキルフェノールを含む1つの非陽イオン性界面活性剤及び添加剤の水溶液を含む。先行技術は、4級アンモニウム塩と添加剤が、白血球集団の位置合わせに十分な量で、血液分析器の計測時間の範囲内で相互に関係することを教示している。
【００１５】
これらの血球溶解試薬は、白血球の形態を保つことによって、又は亜集団のサイズを制御することによって、白血球亜集団の区別を可能にする。しかし、これらの試薬は、有核赤血球を他の細胞型と区別することはない。
【００１６】
さらに、血液サンプル中のヘモグロビン(Hgb)濃度の測定は、病気の診断及び医療処置に対する応答を観察するために重要である血液分析に不可欠な部分である。同じ試薬及び同時検出を使った複数の診断上の分析、例えば血液サンプルの有核血球をカウントすること及びヘモグロビン濃度を測定することが達成できることが望ましい。
【００１７】
ヘモグロビン定量のための多くの周知の方法のなかで、シアンメトヘモグロビン法が、標準として国際標準法によって推薦されてきた。しかし、試薬廃棄物中のシアン化物の存在は、非常に大きな環境的な懸念を引き起こした。この10年で、多大な努力が、シアン化物を利用することのない自動化されたヘモグロビン分析法を開発させた。
【００１８】
米国特許番号第5,242,832号(Sakataに対する)は、血液サンプル中の白血球をカウントし、そしてヘモグロビン濃度を計測するための、シアン化物を含まない血球溶解試薬を開示する。この血球溶解試薬は、4級アンモニウム塩である少なくとも1つの第1の界面活性剤、陽イオン性及び両性界面活性剤を含む、少なくとも1つの第2の界面活性剤、そしてTiron、8-ヒドロキシキノリン、ビピリジン、1-10-フェナントロリン、フェノール化合物、ビスフェノール、ピラゾール及び誘導体、セカンド・フェニル-5-ピラゾロン及び誘導体、フェニル-3-ピラゾロン、並びにイミダゾール及びその誘導体から成る群から選ばれる少なくとも1つのヘモグロビン安定化剤を含む。
【００１９】
PCT/US95/02897(Kimに対する)は、全血サンプル中のヘモグロビンを測定するための、シアン化物を含まない方法及び試薬を開示する。この試薬は、イミダゾールと誘導体、N-ヒドロキシアセトアミド、H-ヒドロキシルアミン、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリミジン、プリン、キノリン、及びイソキノリンから成る群から選ばれるリガンド、並びにラウリル・ジメチルアミン酸化物、及びオクチルフェノキシ・ポリエトキシエタノールから成る群から選ばれる強い赤血球溶解能力(erythrolytic capability)をもつ界面活性剤を含む。前記分析法は、速く、10秒未満である。しかし、前記試薬は、極度のアルカリ性条件、11〜14のpH下で作用する。加えて、白血球をカウントする能力も、有核赤血球を他の細胞型と区別する能力もKimによって教示されていない。
【００２０】
米国特許番号第5,763,280号(Liらに対する)は、血液サンプル中のヘモグロビンを計測し、白血球をカウントし、そして白血球亜集団を区別するための、シアン化物を含まない試薬を開示する。この試薬は、4級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、有機リン酸エステル、及び有機スルホン酸エステルから成る群から選ばれる溶血界面活性剤、並びに赤血球を溶解し、ヘモグロビンを放出するための有機界面活性剤、そしてヘモグロビンをもつ安定したクロモゲンを形成するための、トリアゾールとその誘導体、テトラゾールとその誘導体、オキソン酸、メラミン、アニリン-2-スルホン酸、キナルジン酸、2-アミノ-1,3,4-チアジアゾール、トリアジンとその誘導体、ウラゾール、DL-ピペコリン酸、イソニコチンアミド、アンスラニロニトリル、6-アザ-2-チオチミン、アデニン、3-(2-チエニル)アクリル酸、安息香酸、及びアルカリ金属のアルカリ金属塩、並びに安息香酸のアンモニウム塩、そしてピラジンとその誘導体から成る群から選ばれる有機リガンドを含む。
【００２１】
同様に、米国特許番号第5,882,934号(Liらに対する)は、全血サンプル中のヘモグロビンを計測し、白血球をカウントし、そして白血球亜集団を区別するための、シアン化物を含まない試薬を開示する。この試薬は、溶血界面活性剤、及び有機リガンドに加えて、インピーダンス測定法のために試薬の伝導度を調節するための塩をさらに含む。しかし、前記の、シアン化物を含まない試薬及びヘモグロビン測定法のいずれも、他の細胞型から有核赤血球を区別し、そして血液サンプル中の有核赤血球のカウントを可能にすることはない。
【００２２】
前記に基づき、有核赤血球を区別し、そしてカウントするための、単純で、安価な分析方法を可能にする試薬の必要性が存在する。さらに、シアン化物の不存在下での、有核血球のカウント、他の細胞型と有核赤血球との区別、及びヘモグロビン濃度の測定を可能にする多機能試薬を有することが望ましい。
【発明の開示】
【００２３】
本発明の概要
本発明は、血液サンプル中の赤血球を溶解し、そして有核血球を計測するための、血球溶解試薬組成物に関する。この血球溶解試薬組成物は、少なくとも1つの4級アンモニウム界面活性剤、エトキシル化フェノール、及びエトキシル化アルコールを含み、そして約2〜約11のpHをもつ。希釈液で前もって希釈された血液サンプルと混ぜるとき、血球溶解試薬組成物は、赤血球を溶解し、そしてDCインピーダンス測定法によって他の細胞型から有核赤血球を区別することを可能にする。
【００２４】
前記血球溶解試薬組成物は、所定の波長の分光光度的吸光度を計測することによって血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を決定するためのヘモグロビンを伴うクロモゲンを形成するために十分な量の有機リガンドをさらに含むことができる。
【００２５】
本発明は、血球溶解試薬組成物と希釈液を含む、血液サンプル中の有核血球を計測するための血球溶解試薬システムにさらに関する。前記血球溶解試薬組成物は、少なくとも1つの4級アンモニウム界面活性剤、エトキシル化フェノール、及びエトキシル化アルコールを含み、約2〜約11のpHを有する。前記希釈液は、インピーダンス計測に十分な希釈液の伝導度を調節するための塩、及び抗菌剤を含む中性の水性溶液である。前記血球溶解試薬システムは、血液サンプル中のヘモグロビン濃度を計測するための、血球溶解試薬組成物中、又は希釈液中のいずれかに有機リガンドをさらに含むことができる。
【００２６】
さらなる態様において、同様に、本発明は、少なくとも1つの4級アンモニウム界面活性剤現在、エトキシル化フェノール、エトキシル化アルコール、及びインピーダンス測定法に十分な血球溶解試薬組成物の伝導度を調節するための塩を含む血球溶解試薬組成物に関する。前記血球溶解試薬組成物は、ヘモグロビン測定のための有機リガンドをさらに含むことができる。この血球溶解試薬組成物は、組み合わされた希釈と溶解、そして1ステップで有核血球を計測するための血液サンプルの調製に使用されることができる。
【００２７】
好ましい態様の詳細な説明
1の態様において、本発明は、有核血球の測定のための血球溶解試薬組成物に向けられる。より特に、前記血球溶解試薬組成物は、DCインピーダンス測定法によって、血液サンプル中の他の細胞型と有核赤血球との区別を可能にする。この文脈において、有核血球は、有核赤血球と白血球を含みうる。
【００２８】
血球溶解試薬組成物は、以下の：
(a)以下の分子構造：
【００２９】
【化１】
2004537725.tif 000002
【００３０】
{式中、
R1が、12〜16の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2、R3及びR4が、1〜4の炭素原子をもつアルキル基であり、そして
X-が、塩化物又は臭化物アニオンである。}によって表される4級アンモニウム塩；
(b)アルキル基が、6〜12の炭素原子をもち、かつ、エチレン・オキサイドの数が、約10〜約50におよぶ、エトキシル化アルキルフェノール；そして
(c)以下の分子構造：
R1-R2-(CH2CH2O)n-H
{式中、
R1が、10〜22の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2が、-O-であり、そして
nが、20〜35である。}によって表されるエトキシル化アルコール；
の水性溶液を含む。
血球溶解試薬組成物のpHは、約2〜約11の幅広い範囲にある。
【００３１】
4級アンモニウム塩が、赤血球、及び有核血球の細胞膜を溶解する働きをする。血球溶解試薬組成物中の4級アンモニウム塩の濃度は、有核血球の核の量を保存する一方で、赤血球を溶解するのに十分な量である必要がある。前記血球溶解試薬組成物により、サンプル中の赤血球は、血球溶解試薬組成物と混ぜることによって完全に溶解される。有核赤血球(NRBC)の細胞膜は溶解され、それらの核のサイズは小くなる。しかし、白血球膜は部分的にしか溶解されず、それらの残りのサイズは比較的に大きい。4級アンモニウム塩の濃度が高すぎた場合、白血球がさらに小さくなり、リンパ球のサイズがNRBCsのサイズに非常に近くなる。その結果、NRBCsと白血球は、それらのサイズによって計測されるとき区別できないであろう。4級アンモニウム塩の濃度が低すぎた場合、赤血球は、完全に溶解されず、有核血球の検出を妨げる可能性がある。しかも、溶解された細胞膜残屑が分解されていないか又は十分にサイズが減少していない場合、それらも検出を妨げる。血球溶解試薬組成物中の4級アンモニウム塩の濃度は、約6 g/L〜約50 g/L、好ましくは約10 g/L〜約40 g/Lの範囲にある。
【００３２】
一方で、4級アンモニウム塩の血球溶解効力は、R1基の長さにより高まることが知られている。16の炭素鎖をもつ4級アンモニウム塩は、12又は14の炭素鎖をもつものに比べ、有核血球を小さくしやすい。白血球とNRBCsとの最適な分離を達成するために、R1基の適切な炭素鎖の長さが決定された。好ましくは、テトラデシルトリメチル・アンモニウム塩、又はテトラデシルトリメチル・アンモニウム塩とヘキサデシルトリメチル・アンモニウム塩若しくはドデシルトリメチル・アンモニウム塩の混合物が使用される。
【００３３】
血球溶解試薬組成物中のエトキシル化フェノールは、リンパ球のサイズを保つことによってNRBCsと白血球の間の分離を向上させることが判明した。さらに、エトキシル化フェノールは、細胞膜残屑が可溶化するのを助けもし、妨害の可能性を減少させる。エトキシル化フェノール内のエチレン・オキサイドの数は、好ましくは約20〜約40の範囲である。血球溶解試薬組成物中のエトキシル化フェノールの濃度は、約2 g/L〜約40 g/Lの範囲である。
【００３４】
血球溶解試薬組成物中のエトキシル化アルコールは、リンパ球のサイズを保つことも判明した。エトキシル化アルコールとエトキシル化フェノールの組み合わせ物が、エトキシル化アルコール又はエトキシル化フェノールのいずれかを単独で使用したのと比べて、NRBCsとリンパ球の間のより良好な分離を提供することが分かった。従って、エトキシル化フェノールとエトキシル化アルコールの組み合わせ物が使用される。血球溶解試薬組成物中のエトキシル化アルコールの濃度は、約1 g/L〜約20 g/Lの範囲である。
【００３５】
エトキシル化アルコールの好適な例は、BASF Corp., New Jersey製のPlurofac A38小球状界面活性剤、及びHeterene Inc., New Jersey製のHetoxol STA-30である。エトキシル化フェノールの好適な例は、RhOne-Poulenc, New Jersey製のIgepal SS-837である。
【００３６】
場合により、血球溶解試薬組成物は、試薬の貯蔵寿命を延ばすのに十分な量の保存剤、例えば酸化防止剤をさらに含みうる。酸化防止剤の好適な例は、ブチルメチルフェノールである。保存剤は、血球溶解試薬組成物の主要な機能要素と適合する必要がある。
【００３７】
他の態様において、血球溶解試薬組成物は、ヘモグロビン測定のために有機リガンドをさらに含むことができる。前記のとおり、本発明溶解の血球溶解試薬組成物は、血液サンプルと混合することにより、当該サンプル混合物中にヘモグロビンを放出する赤血球を溶解する。有機リガンドの存在下で、放出されたヘモグロビンは、光度的に計測されうるクロモゲンを形成することができる。有機リガンドの好適な例は、テトラゾール及びその誘導体、例えば5-アミノ・テトラゾール；イミダゾール及びその誘導体、例えばメチルイミダゾール及びエチルイミダゾール；キナルジン酸；並びに安息香酸及び安息香酸のアルカリ金属塩を含む。
【００３８】
有機リガンドの存在下で、血球溶解試薬組成物は、有核血球の計測及びヘモグロビン測定の両方に使用されることができる。より少数の試薬及びサンプルの調製ステップしか必要としないので、そのような多機能の特徴は、自動化された血液学分析器におけるその適用にとって有利である。
【００３９】
血球溶解試薬組成物中の有機リガンドの濃度は、安定したヘモグロビンクロモゲンの形成を可能にするのに十分であることが必要である。濃度は、ヘモグロビンに対するリガンドの親和性に依存し、リガンドの種類によって変わる。一般的に、血球溶解試薬組成物中のリガンドの量が十分でなければ、形成されたヘモグロビンクロモゲンは不安定である。血球溶解試薬組成物中の有機リガンドの濃度は、約1 g/Lから約10 g/Lの範囲にある。
【００４０】
血球溶解試薬組成物中の化学成分の濃度は、有核血球のカウント及びヘモグロビンの測定が、既存の血液分析器を使う便宜のための好適な血液希釈液の使用によって達成される条件下の濃度である。しかし、化学成分の濃度は、血球溶解試薬組成物と希釈液の間の容量比に依存して、変更されることができる。
【００４１】
さらなる態様において、本発明は、有核血球の測定のために使用される試薬システムに向けられる。前記試薬システムは、以下の：
(Ｉ)以下の水性溶液を含む血球溶解試薬組成物：
(a)以下の分子構造：
【００４２】
【化２】
2004537725.tif 000003
【００４３】
{式中、
R1が、12〜16の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2、R3及びR4が、1〜4の炭素原子をもつアルキル基であり、そして
X-が、塩化物又は臭化物アニオンである。}によって表される4級アンモニウム塩；
(b)アルキル基が、6〜12の炭素原子をもち、かつエチレン・オキサイドの数が、約10〜約50におよぶ、エトキシル化アルキルフェノール；そして
(c)以下の分子構造：
R1-R2-(CH2CH20)n-H
{式中、
R1が、10〜22の炭素原子をもつアルキル、アルケニル又はアルキニル基であり、
R2が、-O-であり、そして
nが、20〜35である。}によって表されるエトキシル化アルコール；そして
(II)希釈液、
を含む。
【００４４】
試薬システムの血球溶解試薬組成物は、先に記載された。さらに、血球溶解試薬組成物は、先に記載のヘモグロビン測定のために有機リガンドをさらに含むことができる。
【００４５】
希釈液は、(a)インピーダンス計測に十分な希釈液の伝導度を調整するための塩、及び(b)抗菌剤を含む水製溶液である。塩の好適な例は、アルカリ金属塩である。好ましくは、ナトリウム又はカリウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩又はクエン酸塩が希釈液に使用される。
【００４６】
同様に、血液希釈液は、赤血球の計測のための血液サンプルの希釈のために血液学分析器において一般に使用される。後者の場合、等張希釈液が、赤血球容量を維持するために求められる。従って、赤血球と有核血球の計測のための併用のために、血液希釈液が等張となるように調整されるか、又は有核血球を計測するために等張度が要求されないことが好ましい。
【００４７】
希釈液は、緩衝物質をさらに含むことができる。様々な有機又は無機緩衝物質が希釈液として使用されうる。先に検討した伝導度と同様に、希釈液は中性のpHを必要とする赤血球計測のために一般的に使用されるので、希釈液は中性であることが好ましい。
【００４８】
抗菌剤は、希釈液を保存するために十分な量である必要があるが、しかし血球溶解試薬の機能を妨げない。
【００４９】
あるいは、ヘモグロビン測定のための有機リガンドは、血球溶解試薬組成物に含まれる代わりに希釈液中に加えられることができる。
【００５０】
本発明の血球溶解試薬組成物を有核血球の測定のため及びNRBCの他の細胞型との区別のために使用するために、血液サンプルは、好適な血液希釈液によって希釈され、次に十分な量の血球溶解試薬組成物が加えられて、そして希釈されたサンプルと、チャンバー内で機械的又はバブル・ミキシングによって混合され、サンプル混合物を形成する(総試薬容量、対、血液の希釈率は約250:1である)。血球溶解試薬組成物の添加の約7〜9秒後に、前記サンプル混合物は、真空によって非絞り込み開口部(non-focus aperture)を通して取り出され、DC検出器で計測される。DC検出器は、インピーダンス変化により、有核血球が開口部を通過したままであるときに生じる電気シグナルを検出する。細胞サイズ分布ヒストグラムは、測定から得られる。さらに、サンプル混合物中の総有核細胞のカウントは、DCインピーダンス測定によっても生み出されうる。
【００５１】
あるいは、絞り込みフローセルもDCインピーダンス測定に使用されうる。絞り込みフローセルが使用される場合、絞り込みに使用されるシース流体液(sheath fluid)が上記フローセルで計測される細胞数を減少させるので、サンプル希釈率はより低い。約30：1〜約35：1の希釈率が、この場合の本発明の血球溶解試薬組成物のために使用されることができることが分かった。
【００５２】
図1Aは、実施例1の血球溶解試薬組成物を使い、続いて実施例1に詳細に記載の方法を使って得られた、新鮮な正常全血サンプルのヒストグラムを示す。図のように、この場合の有核血球、総白血球は、双峰性分布をもつ。左側のピークの集団の大部分は、リンパ球である。しかし、同様に、他の白血球集団がこの領域内に収まりうることが観察された。このピークの左側面に、透明な区域があって、この領域に細胞は現われない。
【００５３】
図1B及び1Cは、同じ血球溶解試薬組成物を使って、続いて(手作業による標準法によって報告されている)有核赤血球を含む2点の臨床全血サンプルから同じ方法を使って得られたヒストグラムを示す。図のように、有核赤血球(NRBC)由来のさらなるピークが、白血球の左側に現われた。おそらく、記載した反応条件下で、有核赤血球の核が、白血球の核に比べてより小さなサイズをもつのであろう。本発明の血球溶解試薬組成物を利用することによって達成されたそのようなサイズによる分離は、DCインピーダンス測定から得られる1次元ヒストグラムを使った白血球と有核赤血球との区別を可能にする。
【００５４】
本発明の血球溶解試薬組成物を使用することで、NRBC集団が他の細胞型と区別されるので、サンプル中のNRBC集団の存在が、確認され、そして報告されうる。血液サンプル中の臨床的に異常な集団の存在を報告することは、多くの場合血液学分析器による合図と呼ばれ、それは臨床診断を補助するための重要な特徴である。
【００５５】
さらに、本発明の血球溶解試薬組成物を使って、NRBC集団はカウントされうる。図面に示されるようにDC検出器のしきい値がNRBCsサイズより低く設定されるとき、NRBC集団は、白血球と一緒にカウントされることができる。NRBC集団を、得られたDCヒストグラムの集団分布に基づいて他の細胞型と区別した後に、分析したサンプルのNRBC濃度が計算されうる。NRBC濃度は、手作業標準と同じ単位である、白血球100個あたりのNRBCの数(NRBC/100WBC)として報告されることができる。あるいは、NRBC数は、血液サンプルの1単位体積あたりの絶対数としても報告されることができる。この場合、白血球100個あたりのNRBCの数は、同じサンプルの白血球数が掛けられる。
【００５６】
しかも、先に記載のとおり、歴史的に、白血球がサイズで計測された場合、NRBCsがカウントされるか、又はそれらが他の有核血球と区別されないので白血球と一緒に一部カウントされる。NRBCsによって引き起こされる妨害は、高く、そして誤った白血球数をもたらす可能性がある。本発明の血球溶解試薬組成物を用いてNRBCsを区別することによって、白血球数に対してこの集団から付け加わった量が、有核血球の総計数から差し引かれることができ、正しい白血球数を提供する。
【００５７】
図2は、有機リガンドをさらに含む本発明の血球溶解試薬組成物を使用して得られ、そして実施例2に詳述された手作業による手順を用いて処理された、全血サンプルの一連のヘモグロビン光度吸収スペクトルを示す。合計12のスペクトルが10秒間隔で120秒間得られた。図のように、形成されたヘモグロビンクロモゲンは、約565 nmに肩のある約538 nmの最大吸収をもっていた。ヘモグロビンクロモゲンは、血球溶解試薬組成物と、前もって希釈したサンプルとを、混合した後に急速に形成した。連続的に得られたスペクトルの完璧な重複によって説明されるように、ヘモグロビンクロモゲンは、分析の120秒の間非常に安定しており、それは、血液学分析器に使用される典型的なデータ取得時間をはるかに越えた。
【００５８】
先に記載のとおり、ヘモグロビン測定のための有機リガンドが、血球溶解試薬組成物又は血球溶解試薬システムの希釈液のいずれかの中に加えられることができる。図3A及び3Bは、希釈液が有機リガンドを含む、後者の選択肢の結果を説明する。
【００５９】
図3Aは、本発明の血球溶解試薬組成物、及びヘモグロビンリガンドとしてイミダゾールを含んでいる実施例3に記載の希釈用組成物を使って処理された全血サンプルのスペクトルである。図3Bは、実施例3の血球溶解試薬及び希釈用組成物を使って得られた、NRBCを含む臨床血液サンプルのヒストグラムを示す。ヒストグラムは、白血球と、有核赤血球との区別を明確に示す。
【００６０】
本発明の血球溶解試薬組成物は、1つのサンプル調製により白血球のカウント、有核赤血球のカウント、及びヘモグロビン測定を可能にする。
【００６１】
実施例4は、臨床サンプルの分析における血球溶解試薬組成物の有用性を説明する。実施例2の血球溶解試薬組成物、及び希釈液としてIsoton(登録商標)III(Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida)を使った実施例1に詳述された器具構成を用いて、有核赤血球を含む、全95の正常、及び74の臨床全血サンプルが実験的血液学分析器により分析された。同じサンプルが、標準としてCOULTER(登録商標)GEN・S血液学分析器、及びCOULTER COUNTER(登録商標)、ZBIによっても分析された。100WBCあたりのNRBCの数は、NCCLS標準法に続く500細胞の手作業によるカウントから得られ、基準として使用された。
【００６２】
実験的な血液学分析器により得られたDCヒストグラムは、有核赤血球を白血球と区別し、かつ、100WBCあたりのNRBC数を報告するための実験的なアルゴリズムによって分析された。その後、NRBCsは、補正されたWBC計数を得るために計測された総有核血球から差し引かれた。
【００６３】
図4Aは、本発明の血球溶解試薬組成物と手作業による基準を使って得られた結果の良好な線形相関を説明するNRBCのカウントの結果を示す。
図4Bは、本発明の血球溶解試薬組成物を使用することによって得られたヘモグロビン濃度と、COULTER(登録商標)GEN・Sにより得られたヘモグロビン濃度の間の相関関係を示す。この結果は、ヘモグロビン測定についての優れた線形相関を説明する。
【００６４】
図4Cは、基準と本発明の血球溶解試薬組成物を使用することによって得られた結果の間の補正されたWBC計数の相関関係を示す。基準結果は、COULTER COUNTER(登録商標)ZBIにより得られたWBC計数から、手作業によるNRBCの結果を差し引くことによって得られた。図のように、本発明の血球溶解試薬組成物を使用することによって得られた結果は、基準と非常によく相関する。
【００６５】
さらなる態様において、本発明は、希釈液による予備希釈なしに血球サンプルの希釈と溶解を組み合わせるための単独の試薬組成物に関する。血液学分析器が希釈液による予備希釈なしに単独の試薬を利用する場合、当業者は、本発明の血球溶解試薬組成物の化学成分の濃度を下げて、そしてインピーダンス計測のためのその使用を可能にするために血球溶解試薬組成物の伝導度を調節することができる。伝導度は、十分な量の塩の添加によって調整されることができる。塩の好適な例は、アルカリ金属塩、例えば硫酸塩、塩化物、リン酸塩、及びクエン酸塩である。単独の試薬組成物において、血球溶解試薬組成物の化学成分の濃度は、別個の血球溶解試薬と希釈液が使用されるときの、最終的なサンプル混合物に含まれている濃度と同じであるべきである。同時にヘモグロビン計測が望まれれば、単独の試薬組成物は、前記の有機リガンドをさらに含むことができる。
【００６６】
図5A及び5Bは、有核血球とヘモグロビンを計測する血液サンプルの希釈と溶解を組み合わせるための単独の試薬組成物の有用性を説明する。図5Aは、血球溶解試薬と希釈液の両方として実施例5の単独の試薬組成物を使った実験的な血液学分析器により得られた、NRBCを含む臨床全血サンプルのDCヒストグラムを示す。このヒストグラムは、白血球と、NRBCとの区別を明確に示す。
【００６７】
図5Bは、単独の試薬組成物により処理された全血サンプルの光度吸収スペクトルを示す。このスペクトルは、別個の血球溶解試薬組成物と希釈液を使用することによって得られたヘモグロビンクロモゲンと同じ特徴を示す。
【００６８】
以下の実施例は、本発明の説明であり、請求項により規定される本発明の範囲を決して制限しない。先の開示に従って、様々な他の成分及び割合が利用されうることは理解されるであろう。
【実施例】
【００６９】
実施例1
以下の組成の試薬を準備した。
臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム         25.0 g
Igepal SS-837(RhOne-Poulenc製)                 15.0 g
Plurofac A38小球状界面活性剤(BASF Corp.製)     4.0 g
1 lに調整するための蒸留水
pH                                             5.0
【００７０】
28μlの全血サンプルを、実験的な血液学分析器によって吸引し、6 mlのIsoton(登録商標)III(Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida)で希釈し、次に1 mlの前述の血球溶解試薬組成物と混合して、赤血球を溶解させた。サンプル混合物を、(並行に配置された)3つ1組の非絞り込み開口部を通して取り出した。前記開口部は120 μmの長さと100 μmの幅をもつ。有核血球を、DCインピーダンス計測によってカウントし、そして同様に、パルス補正後に、(3つの開口部を平均した)血球のヒストグラムを作製した。
【００７１】
図1Aは、前述の手順に従って分析された新鮮な正常血液サンプルのヒストグラムを示し、それは白血球の双モジュール分布を示す。図1B及び1Cは、前述の手順に続いて分析された2点の臨床異常サンプルを示す。この臨床サンプルは、それぞれ230 NRBC/100 WBC、及び9 NRBC/100 WBCを含んでいる。見てとれるように、NRBCの明瞭な集団が、白血球の左側に現われる。NRBC集団は、白血球と区別され、そしてNRBCと白血球(×100)の間の比を、NRBCの数/100 WBCとして報告した。あるいは、NRBCを、白血球の総計数を取り入れることによって、血液サンプルの単位体積中の絶対計数として報告することもできる。
【００７２】
実施例2
以下の組成の試薬を準備した。
臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム         25.0 g
Igepal SS-837(RhOne-Poulenc製)                 15.0 g
Plurofac A38小球状界面活性剤(BASF Corp.製)     4.0 g
テトラゾール                                   2.0 g
BHT(エタノール中に前もって溶解)                0.04 g
1 lに調整するための蒸留水
pH                                             2.9
【００７３】
11.6 μlの全血サンプルを、2500 μlのIsoton(登録商標)IIIによって希釈し、次に403 μlの前述の血球溶解試薬組成物を、上記前もって希釈したサンプルと手作業で混ぜた。サンプルの光度吸収スペクトルを、Beckman DU(登録商標)7500分光光度計により直ちに計測した。図2は、前記の手順に従って処理された血液サンプルのスペクトルを示す。図2は、完全に12のスペクトルを覆う。最初のスペクトルを、血球溶解試薬組成物の添加後10秒で得、次に、1つのスペクトルを10秒ごとに自動的に得、そして最後のものを、血球溶解試薬組成物の添加後130秒で得た。
【００７４】
実施例3
以下の組成の試薬を準備した。
血球溶解試薬
臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム         25.0 g
Igepal SS-837(RhOne-Poulenc製)                 15.0 g
Plurofac A38小球状界面活性剤(BASF Corp.製)     4.0 g
1 lに調整するための蒸留水
pH                                             5.0
【００７５】
希釈液
Na2SO4                                         10.58 g
NaCl                                           3.0 g
Na2EDTA                                        1.5 g
イミダゾール                                   1.5 g
pHを中性に調整するための6 N HCl
1 lに調整するための蒸留水
pH                                             7.1
重量オスモル濃度                               308 mOsm
【００７６】
11.6 μlの新鮮な正常全血サンプルを、2500 μlの前記希釈液によって希釈し、次に403 μlの前述の血球溶解試薬組成物を、上記前もって希釈したサンプルと手作業で混ぜた。サンプルの光度吸収スペクトルを、Beckman DU(登録商標)7500分光光度計により直ちに計測した。図3Aは、前記の手順に従って処理された血液サンプルのスペクトルを示す。
【００７７】
19 NRBC/100 WBCを含む臨床全血サンプルを、120 μmの長さ100 μmの幅の非絞り込み流入部を使用し、そして実施例3の血球溶解試薬及び希釈液を使用することを除いて、同じ器具構成で、実施例1に記載の実験的な血液学分析器により分析した。図3Bは、得られたヒストグラムを示し、それは白血球と、有核赤血球との区別を明確に説明する。
【００７８】
実施例4
実施例2の血球溶解試薬組成物、及び希釈液としてIsoton(登録商標)IIIを使った実施例1に記載の実験的血液学分析器により、有核赤血球を含む、95の正常、及び74の臨床全血サンプルを分析した。同様に、サンプル混合物の吸収を、有核血球を計測した直後に分析器により525 nmにて計測した。サンプル中のヘモグロビン濃度を、分析器によって報告した。その後同じサンプルを、COULTER(登録商標)GEN・S血液学分析器、及びCOULTER COUNTER(登録商標)ZBIにより分析した。血球溶解試薬としてLyseS(登録商標)III diff(Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida）を、及び希釈液としてIsoton(登録商標)IIIを使用して、COULTER(登録商標)RGEN・Sを、製造業者マニュアルに従ってその標準構成下で作動させた。血液サンプル中の白血球を、WBCカウントのためのNCCLS基準手順に続いてCOULTER COUNTER(登録商標)ZBIによりカウントした。確実に有核赤血球がカウントされるように、COULTER COUNTER(登録商標)ZBIのしきい値を7.5に設定した。500個の細胞の手作業によるカウントを、有核赤血球の基準として全ての臨床サンプルについて、3人の臨床検査技師によって得、そして100 WBCにつき観察される有核赤血球の数(NRBC数/100 WBC)として報告した。
【００７９】
得られたDCヒストグラムを、NRBCsを白血球と区別し、そして100 WBCあたりのNRBC数を報告するための実験的アルゴリズムによって分析した。そしてNRBCsを、カウントされた総有核血球から差し引いて、補正されたWBC計数を得る。
【００８０】
図4Aは、前述の方法に従って得られたNRBC計数、対、手作業による基準の結果を示す。回帰直線の相関係数、傾き、切片は、NRBC対して良好な線形相関を示した。
【００８１】
図4Bは、実験的血液学分析器により前述の血球溶解試薬を使用することによって得られたヘモグロビン濃度と、COULTER(登録商標)GEN・Sで得られたヘモグロビン濃度の相関関係を示す。この結果は、ヘモグロビン濃度に関する優れた線形相関が証明される。
【００８２】
図4Cは、前述の手順及び実験的血液学分析器により前述の血球溶解試薬を使って得られる補正されたWBC計数と、COULTER COUNTER(登録商標)ZBIにより得られるWBC計数から手作業によるNRBCの結果を差し引くことにより得られる補正されたWBC計数の間の相関関係を示す。この結果は、本発明の方法と、基準の方法の優れた相関関係を説明する。
【００８３】
実施例5
以下の組成の試薬を準備した。
臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム         3.48 g
Igepal SS-837(RhOne-Poulenc製)                 2.09 g
Plurofac A38小球状界面活性剤(BASF Corp.製)     0.56 g
テトラゾール                                   0.28 g
Na2SO4                                         7.94 g
NaCl                                           3.46 g
Na2EDTA                                        0.09 g
ADA                                            1.21 g
抗菌剤                                         0.98 g
BHT(エタノール中に前もって溶解)                0.01 g
1 lに調整するための蒸留水
pH                                            5.8
重量オスモル濃度                              312 mOsm
【００８４】
31 NRBC/100 WBCを含む臨床全血サンプルを、試薬及び希釈液の両方として前述の単独の試薬組成物を使用することを除いて、同じ器具構成を用いて実施例1に記載の実験的血液学分析器により分析した。図5Aは、白血球と有核赤血球との区別を説明する、得られたヒストグラムを示す。
【００８５】
さらに、11.6 μlの同じサンプルを希釈し、そして2903 μlの前述の単独の試薬組成物と混合した。Beckman DU(登録商標)7500分光光度計により直後に前記サンプルの光度吸収スペクトルを計測した。図5Bは、得られたスペクトルを示し、それは、別個の血球溶解試薬組成物と希釈液を使用することによって得られたヘモグロビンクロモゲンと同じ特徴をもつ。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】A、B、及びCは、本発明の実施例1に記載の血球溶解試薬組成物を使って、実施例1に記載の手順に従って処理された全血サンプルのDCヒストグラムである。
【図２】実施例2に記載の血球溶解試薬組成物を使って、実施例2の手順に従って処理された血液サンプルの一連の吸収スペクトルを示す。12のスペクトルの合計を、10秒間隔で120秒得た。
【図３】Aは、実施例3に記載の血球溶解試薬及び希釈用組成物を使って、実施例3に記載の手順に従って処理された全血サンプルのスペクトルを示す。Bは、実施例3の血球溶解試薬及び希釈用組成物を使って、実施例1に記載の手順に従って得られた臨床全血サンプルのヒストグラムを示す。
【図４Ａ】実施例4に記載の本発明の血球溶解試薬組成物及び方法を使用して得られたNRBC濃度の、手作業による標準結果に対する相関関係を示す。
【図４Ｂ】実施例4に記載の本発明の血球溶解試薬組成物を使って得られたヘモグロビン濃度の、COULTER Gen・SのLyseS(登録商標)III diffを使って得られたヘモグロビン濃度に対する相関関係を示す。
【図４Ｃ】実施例4に記載の本発明の血球溶解試薬組成物及び方法を使って得られた修正WBC計数の、手作業によるNRBC計数によるCOULTER COUNTER(登録商標) ZBIを用いて得られた計数を修正することによって得られた修正WBC計数に対する相関関係を示す。
【図５】Aは、実施例5の単独の試薬組成物を使って、実施例5で述べられた手順に従って得られた全血サンプルのヒストグラムを示す。Bは実施例5の単独の試薬組成物で実施例5で述べられた手順に従って処理された同じサンプルのスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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