(57)【要約】中枢神経系の機能の改善をもたらす方法が提供される。本方法は、血液、例えば臍帯血由来の幹細胞の一定分量を患者に投与することを含む。場合によっては、成長因子が細胞とともに投与される。
2004529858.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血由来の細胞の一定分量を、中枢神経系の機能が傷害された患者に投与することから成る、該患者の中枢神経系の機能の改善をもたらす方法。
【請求項２】
幹細胞を含む、血液由来の細胞の一定分量を患者に投与することから成る、該患者の中枢神経系の機能の改善をもたらす方法。
【請求項３】
血液由来の細胞の一定分量と成長因子とを患者に投与することから成る、該患者の中枢神経系の機能の改善をもたらす方法。
【請求項４】
細胞が臍帯血に由来する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
細胞が末梢血に由来する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
臍帯血から所望の細胞集団を分離することによって細胞の一定分量を得ることからさらに成る、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項７】
成長因子が、オンコスタチンＭと次のファミリー：ＦＧＦ、ニューロトロフィン、ＩＧＦ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＬＩＦ、インターロイキン、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ：由来の成長因子とからなるグループから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
細胞の試料を得ることと、一定分量を得るためにその試料を精製することとからさらに成る、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項９】
細胞の試料を得ることと、一定分量を得るために試料中の少なくとも選択された細胞集団を生体外で増殖させることとからさらに成る、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１０】
細胞の一定分量が同種細胞を含む、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の一定分量は自家細胞を含む、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１２】
改善が中枢神経系の外傷性傷害からの回復をもたらす、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１３】
改善が中枢神経系の損傷の修復をもたらす、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１４】
改善が中枢神経系の疾患の修復をもたらす、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１５】
改善が中枢神経系の組織再生をもたらす、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１６】
改善が測定可能な脳卒中からの回復を含む、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１７】
改善が脳卒中の修復の結果である、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項１８】
改善が脳卒中後の組織再生の結果生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
改善が投与細胞に含まれる遺伝因子から生じる、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝因子が投与細胞に内在性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝因子が投与細胞に外から加えられたものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
改善が頭部外傷性傷害の回復を含む、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項２３】
改善が頭部外傷性傷害の修復を含む、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項２４】
改善が頭部外傷性傷害後の組織再生の結果生じる、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が脳内、大槽内、脳室内、または実質内に投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
細胞がＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞または前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が、ＣＤ２−，ＣＤ３−，ＣＤ１４−，ＣＤ１６−，ＣＤ１９−，ＣＤ２４−，ＣＤ５６−，ＣＤ６６ｂ−，グリコホリンＡ−，ｆｌｋ−１＋，ＣＤ４５＋，ＣＸＣＲ４＋，ＭＤＲ＋として特徴付けられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
改善が、次の疾患：パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、ＭＳ、テイ−サックス病、および脳性まひ：のうちの１つの治療の結果生じる、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項２９】
細胞分化因子を患者に投与することからさらに成る、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項３０】
神経ガイダンス分子を患者に投与することからさらに成る、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項３１】
成長因子が脳内、大槽内、脳室内、または実質内に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項３２】
成長因子が細胞の一定分量と一緒に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項３３】
成長因子が細胞の一定分量と別々に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項３４】
細胞の一定分量が脳の負傷部位に直接投与される、請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項３５】
損傷が脳の酸素欠乏による、請求項１３に記載の方法。
【請求項３６】
損傷が脳卒中または窒息による、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
患者の中枢神経系の機能の改善をもたらす方法であって、
所定の標的細胞集団を含んだ一定分量を、
（ａ）成長培地内に細胞の開始試料を導入すること；
（ｂ）所定の標的細胞集団を分裂させること；
（ｃ）ステップ（ｂ）と同時に、ステップ（ｂ）の間断続的に、またはステップ（ｂ）の後に、成長培地中の他の細胞から標的集団の細胞を選択するために、成長培地中の細胞を選択因子に接触させること；
によって取得すること；および
該患者にその一定分量を投与することから成る方法。
【請求項３８】
選択因子が、標的細胞または非標的細胞の初期集団のいずれかに親和性を有する複数の選択的結合分子を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
開始試料が臍帯血であるかまたは臍帯血由来である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
細胞の一定分量がＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
増殖がクローン原性である、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）の機能を改善する方法に関する。
（背景）
中枢神経系は、運動、方向決定（ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ）、認知、発語、視覚、情動を含む多種多様な機能を可能にするべく協調して相互作用する、細胞、体液および化学物質を含む組織の複雑なシステムである。残念なことに、中枢神経系を衰弱させる種々の中枢神経系機能不全が生じ、これらの機能の一部または全部を崩壊させることがある。これらの機能不全は範囲が広く、例えば；遺伝因子の欠落（例えばテイ−サックス病のような遺伝性疾患）；細胞の作用の機能不全（例えばパーキンソン病）；外傷性傷害（例えば頭部の負傷）；変性疾患（例えばアルツハイマー病）；例えば脳卒中や窒息によって引き起こされる、酸素欠乏による損傷；を含む。
【０００２】
通常、上記の機能不全による損傷後の中枢神経系の機能を回復させる治療は、薬物と、適応療法または行動療法とに限られている。これらの方法は一般に、損傷を逆転し（または変性を止め）、正常な機能を回復させる能力については限界がある。
【０００３】
最近の研究により、中枢神経系に、機能を回復させるために細胞を用いることの可能性が検討されている。動物モデルを用いたデータにより、細胞の移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎまたはｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）が損傷後の中枢神経系の機能を回復させる有効な手段でありうることが示唆されている。この研究で使用された細胞には、例えば、ブタおよびヒトの原料由来の胎児性もしくは胚性神経細胞（例えばＮａｉｒｎｅ， Ｓ．Ｐ．， Ａｎｉｍａｌ−ｔｏ−Ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ； ｔｈｅ ｅｔｈｉｃｓ ｏｆ Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｌｏｎｄｏｎ： Ｎｕｆｆｉｅｌｄ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｂｉｏｅｔｈｉｃｓ， １９９６ を参照のこと）；不死化された胎児性神経細胞（Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏ−Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂＦＧＦ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｆｏｃａｌ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔ， Ｓｏｃ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ａｂｓｔｒ．， ２６：２２９１， ２０００ ）；多分化能成人幹細胞（例えばＫｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ Ａｄｕｌｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｒａｔ ＣＮＳ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ＆ Ｒｅｐａｉｒ， Ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ７：２０００， ６−３を参照のこと）を含む、間充織の骨髄幹細胞と前駆細胞（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ＭＣＡＯ ｉｎ Ｒａｔｓ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ＆ Ｒｅｐａｉｒ， Ｐｒｏｇｒａｍ ａｎｄ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ７：２０００， Ａ−３ ）；不死化されたマウス神経上皮幹細胞（Ｍｏｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＭＣＡＯ Ｒａｔｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｔｅｓｔｓ，  上記文献，８−２ ）を含む、マウス神経幹細胞（Ｍａｒｃｉｎｉａｋ， Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， Ｉｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏ−Ｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ） Ｍａｙ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔｒｏｋｅ， 上記文献，Ａ−１ ）；成体マウスおよびヒトの神経幹細胞と子孫細胞（例えばＳｔｅｉｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ．， 上記文献，８−３ を参照のこと）；胎児性中脳細胞（Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｉｎｔｒａｐｕｔａｍｉｎａｌ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒａｎｉｇｒａｌ Ｆｅｔａｌ Ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ Ｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ： Ｆｉｒ��ｔ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ，  上記文献，５−３ ）；精巣由来セルトリ細胞（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＮＡＣｓ ｂｙ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｇｒａｖｉｔｙ Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｓｅｒｔｏｌｉ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＮＴ２ Ｃｅｌｌｓ，  上記文献，Ｃ−）；および骨髄粗抽出物（Ｍａｈｍｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｃｅｌｌｓ ｏｎ Ｗｉｓｔｅｒ Ｒａｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｔｒａｕｍａｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ，  上記文献，Ａ−４ ）が含まれる。これらのタイプの細胞の多くの入手可能性がないことを打開するため、研究者は、がん性細胞の使用の内在的危険にもかかわらず、奇形がん細胞のようながん細胞を投与する可能性を研究するという手段に訴えることさえしている（Ｋｏｎｄｚｉｏｌｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｏｋｅ， Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０００， ５５： ５６５−５６９ ）。細胞療法についての一部の研究は臨床段階に至っている。一般に、上述の研究に使用された細胞は患者に対する潜在的な危険要因をもたらすか、入手困難であるかの少なくともいずれかである。
【０００４】
（要約）
本発明は、血液由来の細胞（例えば臍帯血由来の細胞）を投与することにより中枢神経系の機能の回復を強化する方法を特徴とする。「臍帯血」という用語は、ヒトの赤ん坊の誕生時前後の胎盤または臍帯に由来する血液を意味する。好都合なことに、胎児性もしくは胚性の原料に頼ったり、または患者自身の脳細胞を採取するという手段をとったりしなくても、すでに利用可能なそのような細胞の供給がある。例えば、臍帯血の細胞は、今日では他の用途での自家または同種間の投与のためにバンク化されている。その結果、これらの細胞は不死化される必要がなく、従って、不死化細胞の使用の結果生じるかもしれない、がん化するという結果または他の有害な合併症のリスクが減少する。これらの細胞は初代細胞なので、該細胞が発がん性であったり他の関連する問題の原因となったりする可能性も低い。同様に、自家臍帯血細胞または免疫学的に適合した臍帯血細胞の使用により、拒絶反応のリスクが低減される。
【０００５】
さらに、場合によっては（例えば臍帯血の大量供給がすぐには入手できない場合）、臍帯血、または、例えば全開示内容が引用により本願に組み込まれる米国特許第５，６７４，７５０号および第５，９２５，５６７号に記載されているような比較的未分化な前駆細胞の他の原料の、比較的少ない試料を用いて、適当な細胞集団を得ることが可能である。
【０００６】
臍帯血由来の細胞の一定分量（ａｌｉｑｕｏｔ）を患者に投与することから成る、該患者の中枢神経系の機能の改善をもたらす方法である。
１つの態様では、本発明は、幹細胞を含む、血液由来の細胞の一定分量を患者に投与することから成る、該患者の中枢神経系の機能の改善をもたらす方法を特徴とする。
【０００７】
別の態様では、本発明は、血液由来の細胞の一定分量と成長因子とを患者に投与することから成る、該患者の中枢神経系の機能の改善をもたらす方法を特徴とする。
【０００８】
本発明の実施には、１つまたはそれ以上の以下の特徴が含まれうる。
細胞は臍帯血に由来する。細胞は末梢血に由来する。方法は、臍帯血から所望の細胞集団を分離することによって細胞の一定分量を得ることをさらに含む。成長因子は、オンコスタチンＭと次のファミリー由来の成長因子とからなるグループから選択される：ＦＧＦ、ニューロトロフィン、ＩＧＦ、ＣＮＴＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＬＩＦ、インターロイキン、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ。方法は、細胞の試料を得ることと、一定分量を得るためにその試料を精製することとをさらに含む。方法は、細胞の試料を得ることと、一定分量を得るために試料中の少なくとも選択された細胞集団を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で増殖させることとをさらに含む。細胞の一定分量は同種細胞を含む。その代わりに、またはそれに加えて、細胞の一定分量は自家細胞を含む。改善により、中枢神経系の外傷性傷害からの回復、中枢神経系の損傷もしくは疾患の修復、および中枢神経系の組織再生のうち、少なくともいずれかがもたらされる。改善は、測定可能な脳卒中からの回復を含む。改善は、脳卒中の修復の結果である。改善は、脳卒中後の組織再生の結果生じる。改善は、投与細胞に含まれる遺伝因子から生じる。遺伝因子は、投与細胞に内在性である。遺伝因子は、投与細胞に外から加えられる。改善は、頭部外傷性傷害の回復および修復の少なくともいずれかを含む。改善は、頭部外傷性傷害後の組織再生の結果生じる。細胞は脳内に投与される。細胞は、ＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞または前駆細胞である。細胞は、ＣＤ２−，ＣＤ３−，ＣＤ１４−，ＣＤ１６−，ＣＤ１９−，ＣＤ２４−，ＣＤ５６−，ＣＤ６６ｂ−，グリコホリンＡ−，ｆｌｋ−１＋，ＣＤ４５＋，ＣＸＣＲ４＋，ＭＤＲ＋として特徴付けられる。改善は、次の疾患のうちの１つの治療の結果生じる：パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、ＭＳ、テイ−サックス病、および脳性まひ。方法は、細胞分化因子または神経ガイダンス分子を患者に投与することをさらに含む。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）所定の標的細胞集団を含んだ一定分量を、（ａ）成長培地内に細胞の開始試料を導入すること；（ｂ）所定の標的集団の細胞を分裂させること；（ｃ）ステップ（ｂ）と同時に、ステップ（ｂ）の間断続的に、またはステップ（ｂ）の後に、成長培地中の他の細胞から標的集団の細胞を選択するために、成長培地中の細胞を選択因子に接触させること；によって取得すること；および（ｉｉ）該患者にその一定分量を投与すること；を含む、患者の中枢神経系の機能の改善をもたらす方法を特徴とする。
【００１０】
選択因子には、標的細胞または非標的細胞の初期集団のいずれかに親和性を有する複数の選択的結合分子が含まれうる。開始試料は臍帯血または臍帯血由来でよい。細胞の一定分量は、ＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞を含みうる。増殖はクローン原性でありうる。
【００１１】
「血液」という用語は、本明細書では、末梢血、胎児血液および臍帯血を言い、骨髄を含むことを意味しない。
「血液由来の細胞」という語句は、比較的未分化な細胞を言い、Ｔ細胞やＢ細胞のような分化したリンパ球を含むことを意味しない。
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明と図面から、ならびに請求項から明らかになるであろう。
【００１２】
（詳細な説明）
ＣＮＳの障害や損傷を被っているヒト患者を治療する好ましい方法を、図１に図式的に示す。この方法に従って、患者は治療用量の血液由来の細胞の投与を受ける。細胞は、例えば臍帯血細胞のバンクから入手してもよい。代替案として、臍帯血細胞は、例えば下記および米国特許第５，９２５，５６７号に記載のような、ＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞を選択するための選択手順を経ることも可能であり、これらの細胞の比較的濃縮された試料が投与されてもよい。望ましければ、ＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞の集団を、米国特許第５，９２５，５６７号に記載のように、患者への投与に先立って増殖させてもよい。望ましければ、例えば成長因子または遺伝因子のような補助剤を、臍帯血細胞もしくはＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞に加えるか、またはそれらとともに同時投与することも可能である。
【００１３】
例えば下記の方法を用いて細胞が患者に投与された後、生じた機能回復の程度を判断するため、患者のＣＮＳ機能をある期間（例えば９０日）の後にテストする。回復が不十分と判断された場合、さらなる量の細胞を投与し評価プロセスを繰り返すことになる。望ましければ、治療の効果とＣＮＳ機能の改善の程度をモニタするために、ＣＮＳ機能をより頻繁に、例えば３０日後および治療を反復する場合はそのさらなる治療の間定期的に、テストすることも可能である。
【００１４】
細胞は、任意の適当な技術を用いて患者に投与することが可能である。１つの適当な技術は、脳内へ直接（実質内）あるいは脊髄液へ（脳室内または大槽内）のいずれかの、脳内注射である。細胞は一般に医薬として許容可能な液体培地をその担体とする。投与を反復することも、または連続的に（例えば脊髄液への連続注入によって）実施することも可能である。複数回投与には一般に少なくとも２〜７日間の間隔を置く。
【００１５】
細胞を脳内に注射する場合、患者の頭部を標準的な定位固定枠に固定し、例えば標準的なＣＴスキャンまたはＭＲＩスキャンによって、細胞の投与部位を定める。頭蓋骨にドリルで小さな径の穴を開け、細胞を注射器を用いて所望の位置に注射する。
【００１６】
適当な細胞の用量は、患者が受けているＣＮＳの損傷または劣化の量、患者の体重、および他の要因によって変化する。概して、用量は１回投与あたり細胞約１００，０００〜１，０００，０００，０００個、一般に細胞約１，０００，０００〜１０，０００，０００個の範囲でよい。
【００１７】
投与される細胞は、非胎児性、非胚性でかつ血液由来であることが好ましい。適当な原料には、新鮮な臍帯血、臍帯血から分離されたＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞、および臍帯血から選択された細胞を増殖させることにより得られたＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞が含まれる。
【００１８】
選択された集団および増殖した集団の少なくともいずれかの場合は、細胞はＣＤ２−，ＣＤ３−，ＣＤ１４−，ＣＤ１６−，ＣＤ１９−，ＣＤ２４−，ＣＤ５６−，ＣＤ６６ｂ−，グリコホリンＡ−，ｆｌｋ−１＋，ＣＤ４５＋，ＣＸＣＲ４＋，ＭＤＲ＋として特徴付けられる、ＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞または前駆細胞であることが好ましい。
【００１９】
臍帯血からＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞を分離し、その分離した集団を増殖させるための適当な手順は、米国特許第５，９２５，５６７号に記載され、以下に簡単に説明される。
【００２０】
（分離／増殖手順）
図２および図２Ａは適当な選択手順を示す。これらの手順に従って、細胞が増殖しうる栄養培地を含むシステムを提供することと、増殖と同時に、増殖の間断続的に、または増殖後に、システム中の非標的細胞から標的集団の細胞を選択することとによって、所望の標的集団の細胞を実質的に連続的に増殖させうる。細胞増殖および細胞の選択は、様々な技術と道具立てとのほぼ無限の組合せを用いて実施することが可能であり、そのうちのごく一部を例として以下に説明する。多くの他の技術は、当業者には容易に理解されるであろう。
【００２１】
しかしながら、すべての好ましい技術は、ポジティブ選択（標的細胞に対する（標的細胞を「選択する」ための）親和性を有する選択因子を提供すること）およびネガティブ選択（非標的細胞に対する（非標的細胞を「選択する」ための）親和性を有する選択因子を提供すること）の概念に基づく。単独あるいは組み合わせて使用されるこれら２つの技術は、所望の際にいつでも、不要の細胞をシステムから除去し標的の細胞を収穫することを可能にする。
【００２２】
ポジティブ選択技術の実施例を図２に図式的に示す。簡単にいえば、標的細胞に特異的な１つまたはそれ以上のビオチン化抗体とアビジンとを、順次システムに導入する。規定のインキュベーション時間の後、標的細胞との複合体を形成しなかったすべてのビオチン化抗体とアビジンとを、洗い流す。次いでビオチン化したデキストラン鉄を細胞懸濁物に加える。ビオチン化デキストラン鉄は、ビオチン化デキストラン鉄を含んだより大きな複合体を形成すべく、アビジン／ビオチン化抗体／抗原複合体と反応する。次にこの懸濁物を、磁場に通過させる。ポジティブ選択された細胞は磁場に残り、鉄の結合した複合体を持たない細胞は除去される。捕捉と洗浄の後、磁場を除去し、ポジティブ選択された所定の標的集団を栄養培地に戻す。
【００２３】
ネガティブ選択技術の実施例を、図２Ａに図式的に示す。簡単にいえば、所定の標的集団ではない所定の集団に特異的な、１つまたはそれ以上の抗デキストラン抗体結合抗体を、培養物に導入する。規定のインキュベーション時間の後、細胞懸濁物を、デキストランでコーティングしたガラスビーズの入ったカラムに通過させる。抗原／抗体／抗デキストラン抗体／デキストラン／ビーズ複合体が、栄養培地から所定の標的集団でない細胞を除去しつつ形成される。所定の標的集団を下流で集め、栄養培地に戻す。
【００２４】
明らかなことであるが、所望の親和性が選択因子によって提供されるかぎりは、多くの他の技術がポジティブ選択およびネガティブ選択のいずれにも利用可能である。
【００２５】
選択因子は単に選択分子自身でもよいし、または、例えば選択分子が結合された固相支持体のような他の構成要素を備えることも可能である。固相支持体は、選択の実施の際に、または選択分子を所望の位置に維持しもしくは選択分子をシステムから引き出し除去する際に助けとなる材料で形成されうる。例えば、図２について上述したように、選択分子は、選択された細胞を磁場の適用によってシステムから簡単に除去してから磁場の除去によって収集することを可能にするために、鉄または他の磁性粒子に結合されうる。代替案として、選択分子は、栄養培地の入った容器の内壁または本方法の間その中を栄養培地が流れるチャンバの内壁に結合されうる。ガラスまたは他の不活性で不浸透性のビーズも、以下に詳細に論じるように、固相支持体として使用可能である。ビーズまたは他の粒子を使用するときは、それらは栄養培地が通過可能な充填形状で提供されてもよいし、または容器に入っていない形態で、懸濁状態で、もしくは任意の所望のタイプの配置でシステムに導入されてもよい。容易に理解されるように、非常に様々な他の固相支持体が使用可能である。
【００２６】
（補助剤）
種々の補助剤を、ＣＮＳ機能の回復をさらに強化するために患者に投与することが可能である。細胞の一定分量に種々の補助剤が含まれてもよいし、補助剤は細胞と一緒に同時投与されてもよい。適当な補助剤には、成長因子や神経伝達物質のような神経刺激剤が含まれる。遺伝因子も、以下に論じるように、補助剤として使用可能である。
【００２７】
適当な成長因子は、２０００年８月１８日に出願され、その開示内容が引用により本願に組み込まれる、同時係属の米国出願第６０／１４９，５６１号において論じられている。適当な成長因子には、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバー、例えば塩基性ＦＧＦ、酸性ＦＧＦ、ｈｓｔ／Ｋｆｇｆ遺伝子産物、ＦＧＦ−５またはｉｎｔ−２；ニューロトロフィンファミリー、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、またはニューロトロフィン４／５（ＮＴ４／５）；ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を含むインスリン様成長因子ファミリー；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）ファミリー；ＥＧＦ，ＴＧＦ−αおよびＨＢ−ＥＧＦを含むＥＧＦファミリー；ＴＧＦ−βおよびＢＭＰサブファミリーのメンバーを含むＴＧＦ−βファミリー；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；オンコスタチンＭ；ＩＬ−１１を始めとするインターロイキン類；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバー；およびＶＥＧＦファミリー；が含まれる。上記の成長因子の生物活性のある（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ）断片、類縁体および活性のある（ａｃｔｉｖｅ）断片を用いてもよい。
【００２８】
１つまたは複数の成長因子の好適な用量は、所望の結果および投与経路によって変わるであろう。１つまたは複数の成長因子を、細胞と一緒に、または脳の中への直接投与（脳内投与）、全身的投与（たとえば静脈内投与）、脊髄液内投与（大槽内または脳室内投与）を含む異なる経路によって投与してもよい。脳内または脊髄液内に直接投与するときは、１回投与あたりの成長因子の好適な量は、一般に約０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。投与が全身性の場合、用量は一般に患者の体重を基準とし、通常用量は約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００２９】
適当な神経伝達物質には、プロザックのような神経伝達物質アゴニストもしくはアンタゴニスト、アンフェタミン、リタリン、およびエラビルのような三環系抗うつ薬が含まれる。これらの化合物は神経の刺激剤として作用し、脳への安定した効果を有する。
【００３０】
遺伝因子の投与は、テイ−サックス病のような遺伝性疾患の患者の回復を強化し得る。例えば、患者が、遺伝子変異または遺伝的欠陥の結果、本来生じるタンパク質の機能の欠如または機能不全を原因とする疾患に罹っているとき、外来遺伝子をその患者に投与する細胞に導入してもよい。このことは、一般に投与される細胞が自家細胞であるときに必要である。同種細胞、例えば免疫学的に適合した細胞が患者に投与されるときは、必要な遺伝子が通常内在的に存在し、適切に機能するであろうから、一般に外来遺伝子を導入する必要はない。しかしながら、場合によっては、同様にこの場合についても外来遺伝子を導入することが望ましいことがある。
【００３１】
同時係属の米国出願第６０／１４９，５６１号において論じられているように、他の補助剤、例えばレチノイン酸のような細胞分化因子、セマフォリン、ネトリン、ニューロピリン、エフリンのような神経ガイダンス分子を投与したり、経頭蓋磁気刺激のような物理的処置を施したりしてもよい。
【００３２】
（ＣＮＳ機能の評価）
有利なことに、本発明の方法は一般にＣＮＳ機能における測定可能な改善、例えば測定可能な脳卒中の回復をもたらす。ヒトの脳卒中の回復を評価するために用いられうるテストには、世界的な機能および神経の予後スコア（修正Ｒａｎｋｉｎスケール、ＮＩＨ脳卒中スケール、およびバーセルインデックス）；神経学的機能の専門的なテスト（運動機能のＦｕｇｌ−Ｍｅｙｅｒスケール；神経心理学的テストバッテリー）および、例えばその開示内容が引用により本願に組み込まれる米国特許第５，８８５，２３１号に記載のテストのような、他のテストが含まれる。ＣＮＳ機能を評価するために用いられうる他のテストは、神経学の分野ではよく知られている。
【００３３】
（実施例）
幹細胞（ＣＤ３４＋／−，Ｌｉｎ−細胞）を、新鮮な臍帯血細胞の試料から、上記の引用により組み込まれる米国特許第５，９２５，５６７号の実施例５に記載の手順を用いて選択した。
【００３４】
各々体重３００−３５０グラムの２０匹のスプレーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットを、亜酸化窒素／酸素混合物（２：１）とともに２％ハロタンを用いて麻酔し、修正タムラモデル（図３および３Ａを参照のこと）を用いたＭＣＡ閉塞に供した。この脳卒中モデルは文献に記載されている（例えばＫａｗａｍａｔａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ （ｂＦＧＦ） Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｆｏｃａｌ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９７． ９４： ｐ．８１７９−８１８４．を参照のこと）。
【００３５】
手術の１日前と手術後すぐに、ラットにセファゾリンナトリウムを腹腔内投与（４０ｍｇ／ｋｇ）した。閉塞２４時間後、すべてのラットに、卒中部分を囲む脳組織の中に直接注射した（図４）。１０匹のラットには各１，０００，０００個の幹細胞を注射し、他の１０匹のラットには生理学的緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶媒を注射した。注射後、ラットに毎日シクロスポリンを腹腔内投与（１０ｍｇ／ｋｇ）した。
【００３６】
ラットを、その中枢神経系の機能を測定するべく、閉塞手術３日後と、次いでその後２１日間、４日ごとにテストした。閉塞手術の１日前（ｄａｙ−１）にも、同じテストを用いてラットをテストした。以下に記載のように、いくつかの行動テストを用いてラットをテストした。これらのテストのために、ラットを脳卒中手術前に７日間、毎日１０分間ハンドリングした。
【００３７】
以下に簡単に記載される、前肢および後肢プレーシングテスト（ｆｏｒｅｌｉｍｂ  ａｎｄ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｐｌａｃｉｎｇ  ｔｅｓｔ）は、上記のカワマタ（Ｋａｗａｍａｔａ）らの文献に、より詳細に記載されている。前肢プレーシングテストについては、実験者は、ラットをテーブル面の近くに保定し、ヒゲへの刺激、視覚的刺激、触覚刺激、または自己受容（ｐｒｏｐｒｉｏｃｅｐｔｉｖｅ）刺激に反応してテーブル面に前肢を置くラットの能力をスコア化する。同様に後肢プレーシングテストについては、実験者は、触覚刺激および自己受容刺激に反応してテーブル面に後肢を置くラットの能力を評価する。個々のサブスコアを感覚入力の方式ごとに得て、加算して総スコアを得る（前肢プレーシングテスト：０＝正常、１２＝最も強い障害度；後肢プレーシングテスト：０＝正常、６＝最も強い障害度）。
【００３８】
身体揺れテスト（ｂｏｄｙ  ｓｗｉｎｇ  ｔｅｓｔ）（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ （ＮＴ２Ｎ Ｃｅｌｌｓ） Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｒａｔｓ， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．， １９９８． １４９： ｐ．３１０−３２１ に詳細に記載されている）が、脳卒中後の側方優先傾向（ｓｉｄｅ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）を調べるために使用された。動物を尾の付け根から約２．５４ｃｍ（１インチ）の所で保定する。次いで動物をテーブル表面の上方２．５４ｃｍ（１インチ）まで持ち上げる。動物を、左側と右側のいずれにもわずか１０度までに規定された垂直軸上に保持する。動物が垂直軸を外れてどちらかの側へ頭を動かしたら揺れを記録する。別の揺れが起きる前に、次の揺れを数えるために、動物を垂直な位置に戻さなければならない。全３０回の揺れを数える。正常な動物は、通常各側に均等な回数の揺れを有する。限局性の脳卒中の後では、動物は対側（反対）の側に揺れる傾向がある。脳卒中後１ヶ月の間に身体の揺れの緩やかな自然回復がある。
【００３９】
他の２つのテスト、シリンダーテスト（ｃｙｌｉｎｄｅｒ  ｔｅｓｔ）および足伸ばしテスト（ｐａｗ  ｒｅａｃｈｉｎｇ  ｔｅｓｔ）を実施した。（Ｊｏ ｎｅｓ， Ｔ．Ａ． ＆ Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ， Ｔ．， Ｕｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｐｙｒａｍｉｄａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ Ａｆｔｅｒ Ｎｅｏｃｏｒｔｉｃａｌ Ｄａｍａｇｅ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １９９４． １４： ｐ．２１４０−２１５２に詳細に記載されている）シリンダーテストまたは「自然肢（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｌｉｍｂ）」テストは、動物が狭いガラスシリンダー内で立ち上がるときの、動物の前肢の側方優先傾向を調べる。脳卒中手術の前日およびその後１週間ごとに、動物を狭いプレキシグラス（Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ）のシリンダー（１８×３０ｃｍ）の中に入れ、５分間（または最小回数の動作の間）ビデオテープに撮影する。次いでビデオテープを、立ち上がりを開始し、着地またはシリンダーの内壁に沿って横へ動き、または立ち上がった後に床に着地するための、各前肢による自然な動作の回数についてスコア化する。次に各前肢の自然な動作の平均回数を、非対称スコア（（対側前肢の使用総数−同側前肢の使用総数）／前肢の使用総数）として表現する。脳卒中前は、動物は両方の前肢を均等に使う傾向がある。脳卒中後は、障害のない（同側の）前肢を優先する傾向がある。このような非対称性は、脳卒中後１ヶ月の間に部分的に自然回復する。
【００４０】
足伸ばしテスト（Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ａｔｒｏｐｈｙ ａｎｄ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｆｔｅｒ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ｉｎｊｕｒｙ， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １９９７． ７６： ｐ．１１３９−１１５１に詳細に記載されている）は、えさのペレット（小さな粒）をつかんで食べるためにケージの棒材の間を通って伸ばすときの、前足の器用さを測定する。動物を、訓練およびテストの日の前にえさ欠乏状態（１日に通常のえさ１５ｇを許容）にする。動物を、縁と縁が９ｍｍ間隔の２ｍｍの棒材で構成された上下床面と壁を有するテストケージ（２３×３０×１３ｃｍ）に入れる。チョコレート味のペレット（各４５ｍｇ）の入った幅８ｃｍ深さ６ｃｍのトレーを、ケージの１つの壁面に取り付ける。ラットは、棒材のすき間を通って前肢を伸ばし、えさを握って引きこむ必要がある。トレーを、ラットがケージ内にえさをこするようにして入れないように、ケージから０．５ｃｍ離す。ラットを、脳卒中手術の前に両前足を用いて１０日間訓練する。脳卒中手術後、ラットを、障害を受けた（対側の）足だけを用いて５日間、再度訓練する。これは、ケージの棒材の間を通って足を伸ばさせないように、損傷のない足にブレスレットを付けることによって実施する。次に、動物をブレスレットを付けた状態で５分間、ブレスレットを外した状態で５分間、ビデオテープに撮影する。「到達」および「成功」（えさのペレットをうまくつかんで食べること）の総数を、各区間ごとに記録する。
【００４１】
これらの行動テストの結果を図５−５Ｄに示す。図５Ａおよび５Ｂの星印は、幹細胞群のデータが、二元分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）（処理×時間）によりｐ＜０．０５で溶媒群と差があることを示す。図５Ｂ，５Ｃおよび５Ｄに星印がないことは、有意な差がなかったことを示す。
【００４２】
前肢および後肢プレーシングテストにおいて、統計的に有意な差が幹細胞を投与されたラットと溶媒を投与されたラットとの間に認められ、幹細胞を投与されたラットが有意に高い機能回復を示した。前肢プレーシングテストでは、１匹を除く全ての幹細胞処理動物（９／１０）が、実験終了時までに溶媒処理動物の平均よりも良い結果を出した。後肢プレーシングテストでは、全ての幹細胞処理動物（１０／１０）が、実験終了時までに溶媒処理動物の平均よりも良い結果を出した。
【００４３】
揺れテスト、シリンダーテスト、または足伸ばしテストでは、有意な差は認められなかった。
データはまちまちの結果を示すが、前肢および後肢プレーシングテストにおいては、発明者らが本発明が実行可能であると考えるのに十分な改善が認められた。実施された複数のテストは感覚運動の回復の異なる側面を測定するが、前肢および後肢プレーシングテストは治療効果に対して最も感度が高いと思われる。発明者らは、他のテストの結果が、より高用量の細胞を投与することにより、または反復投与により、おそらく改善されるであろうと考える（これらのテストは今のところ実施されていない）。
【００４４】
他の実施形態が特許請求の範囲内にある。例えば細胞が、他の血液を基にした、非胎児性、非胚性の原料に由来してもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１つの態様に従って、ＣＮＳ不全の患者を治療する方法を示す略図。
【図２】選択により本発明で使用するために適した細胞を得る方法を示す図（標的細胞のポジティブ選択の方法を示す、非常に拡大された略図）。
【図２Ａ】選択により本発明で使用するために適した細胞を得る方法を示す図（非標的細胞のネガティブ選択の方法を示す、非常に拡大された略図）。
【図３】脳卒中モデルのために用意されたラットを示す略斜視図。
【図３Ａ】ラットの近位ＭＣＡの閉塞の略図。
【図４】幹細胞の実質内投与を受けているラットを示す略図。
【図５】脳卒中モデルのラットについて実施された行動テストの結果を示すグラフ。
【図５Ａ】脳卒中モデルのラットについて実施された行動テストの結果を示すグラフ。
【図５Ｂ】脳卒中モデルのラットについて実施された行動テストの結果を示すグラフ。
【図５Ｃ】脳卒中モデルのラットについて実施された行動テストの結果を示すグラフ。
【図５Ｄ】脳卒中モデルのラットについて実施された行動テストの結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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