(57)【要約】新規ｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチド、タンパク質および核酸分子を開示する。単離された全長ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質以外に、本発明は、単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質、抗原性ペプチドおよび抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体を提供する。本発明はまた、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクター、該発現ベクターが導入された宿主細胞、およびｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子が導入または崩壊した非ヒトトランスジェニック動物を提供する。本発明の組成物を用いた、診断的、スクリーニングおよび治療的方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、Ｎ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインおよびＣ末端固有ドメインを含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項２】
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、ポリペプチドがＮ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインおよびＣ末端固有ドメインを含む、核酸分子。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、ポリペプチドが膜貫通ドメインを欠く、核酸分子。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、パーセント同一性が世界的な整合アルゴリズムを用いて決定される、核酸分子。
【請求項７】
パーセント同一性が、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いたＡＬＩＧＮアルゴリズムに従って決定される、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
コードされたアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
コードされたアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
ストリンジェントな条件で配列番号３を含む核酸分子の相補体にハイブリダイズする単離された核酸分子であって、Ｎ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインおよびＣ末端固有ドメインを含むポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１１】
ストリンジェントな条件で配列番号１を含む核酸分子の相補体にハイブリダイズする単離された核酸分子であって、膜貫通ドメインを欠くポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１２】
受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物を含む、単離された核酸分子。
【請求項１３】
配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、単離された核酸分子。
【請求項１４】
配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１５】
ベクター核酸配列をさらに含む、請求項１、４〜６、および１０〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
非相同ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１、４〜６、および１０〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１、４〜６、および１０〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１８】
哺乳動物宿主細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１、４〜６、および１０〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、非ヒト哺乳動物宿主細胞。
【請求項２０】
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、Ｎ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインおよびＣ末端固有ドメインを含む、ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、Ｎ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインおよびＣ末端固有ドメインを含む、ポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、膜貫通ドメインを欠く、ポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、パーセント同一性が世界的な整合アルゴリズムを用いて決定される、ポリペプチド。
【請求項２６】
パーセント同一性が、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティー１２、ギャップペナルティー４を用いたＡＬＩＧＮアルゴリズムに従って決定される、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
ストリンジェントな条件で配列番号１を含む核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、Ｎ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインおよびＣ末端固有ドメインを含む、ポリペプチド。
【請求項３０】
ストリンジェントな条件で配列番号１を含む核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、核酸分子が膜貫通ドメインを欠くポリペプチドをコードする、ポリペプチド。
【請求項３１】
受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３４】
非相同アミノ酸配列をさらに含む、請求項２０、２３〜２５、および２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
請求項２０、２３〜２５、および２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
【請求項３６】
請求項１、４〜６、および１０〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドを製造方法であって、核酸分子が発現する条件下で、核酸分子を含有する宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項３７】
試料中で、請求項２０、２３〜２５、および２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドの存在の検出方法であって、
ａ）ポリペプチドに選択的に結合する化合物と試料を接触させることと、
ｂ）試料中で化合物がポリペプチドに結合するかどうかを測定することにより試料中でのポリペプチドの存在を検出することとを含む、方法。
【請求項３８】
ポリペプチドに結合する化合物が抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
請求項２０、２３〜２５、および２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物および使用説明書を含む、キット。
【請求項４０】
試料中で、請求項１、４〜６、および１０〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子の存在の検出方法であって、
ａ）核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマーと試料を接触させることと、
ｂ）試料中で核酸プローブまたはプライマーが核酸分子に結合するかどうかを測定することにより、試料中での核酸分子の存在を検出することとを含む、方法。
【請求項４１】
試料がｍＲＮＡ分子を含み、かつ核酸プローブと接触される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１、４〜６、および１０〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子に選択的にハイブリダイズする化合物および使用説明書を含む、キット。
【請求項４３】
細胞中でｍＧｌｕＲ活性を調節する化合物の同定方法であって、
ａ）ｍＧｌｕＲを発現する細胞を、請求項２０、２３〜２５、および２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび試験化合物に接触させることと、
ｂ）試験化合物が、適当な対照と比較して、ｍＧｌｕＲ活性を調節するポリペプチドの能力を調節するかどうかを測定することとを含む、方法。
【請求項４４】
ｍＧｌｕＲを発現する細胞を、ｍＧｌｕＲの活性を調節するのに十分な濃度で、請求項２０、２３〜２５、および２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドのモジュレーターと接触させることを含む、ｍＧｌｕＲの活性の調節方法。
【請求項４５】
神経細胞の少なくとも一項の情報伝達経路を調節するのに十分な濃度で、請求項２０、２３〜２５、および２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドのモジュレーターと神経細胞を接触させることを含む、神経細胞情報伝達の調節方法。
【請求項４６】
神経細胞がｍＧｌｕＲレセプターを発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ｍＧｌｕＲ５レセプターが、ｍＧｌｕＲ５ａまたはｍＧｌｕＲ５ｂである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
神経疾患を患う対象の治療方法であって、請求項２０、２３〜２５、および２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドのモジュレーターを有効量前記対象に投与して、神経疾患を治療する、方法。
【請求項４９】
精神病理学的疾患を患う対象の治療方法であって、請求項２０、２３〜２５、および２９〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドのモジュレーターを有効量前記対象に投与して、精神病理的疾患を治療する、方法。
【請求項５０】
精神病理学的疾患が統合失調症である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
精神病理学的疾患が統合失調性感情障害である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
精神病理学的疾患が双極性気分障害である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
精神病理学的疾患が単極性気分障害である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
精神病理学的疾患が思春期行動障害である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
モジュレーターが、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子、ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体または活性抗体断片、リボザイム、アンチセンス核酸分子、小分子モジュレーター、ペプチドおよびペプチドミミックからなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
モジュレーターが、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子、ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体または活性抗体断片、リボザイム、アンチセンス核酸分子、小分子モジュレーター、ペプチドおよびペプチドミミックからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
モジュレーターが、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子、ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体または活性抗体断片、リボザイム、アンチセンス核酸分子、小分子モジュレーター、ペプチドおよびペプチドミミックからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
モジュレーターが、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子、ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体または活性抗体断片、リボザイム、アンチセンス核酸分子、小分子モジュレーター、ペプチドおよびペプチドミミックからなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０００年１２月２２日に提出された、米国仮出願番号第６０／２５７，２８９号の優先権を主張し、その内容すべては本参考文献にて組み込まれる。
【発明の背景】
【０００２】
グルタミン酸は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）における興奮性シナプスの大部分の伝達物質であり、広い範囲のＣＮＳ機能において重要な役割を果たしている（概説として、Ｈｏｌｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ  （１９９４）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  １７：３１−１０８参照）。グルタミン酸作動性シナプスの理解は、主として、グルタミン酸レセプターおよびトランスポーターの研究に対して分子生物学的技術が適用され、過去１０年で非常に進んできた。イオン性グルタミン酸レセプター（ｉＧｌｕＲｓ）と呼ばれる３つのグルタミン酸ゲート陽イオンチャネルのファミリー、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプター、アルファ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾ−ルプロピオン酸（ＡＭＰＡ）レセプターおよびカイニン酸レセプターが存在する。また、膜イオンチャネル上で作用するＧタンパク質サブユニットおよびジアシルグリセロールおよびｃＡＭＰ等の第２メッセンジャーを介して、神経およびグルア興奮性を調節する、代謝調節型、Ｇ−タンパク質共役グルタミン酸レセプター（ｍＧｌｕＲｓ）の（そのアミノ酸の同一性に基づく）３つの群が存在する。さらに、少なくとも２つのグリアグルタミン酸トランスポーターおよび３つの神経トランスポーターが脳内に存在する。
【０００３】
グルタミン酸レセプターは、神経可塑性、神経発達および神経変性を限定はしないが含む、種々の神経活性を調節するのに重要であることが知られている。ＮＭＤＡレセプターおよびＡＭＰＡ／カイニン酸レセプターは、グルタミン酸ゲート陽イオンチャネルとして作用し、一方で代謝調節型レセプター（ｍＧｌｕＲｓ）は、Ｇタンパク質を介した第２メッセンジャーの製造を調節する。分子研究によって、ＮＭＤＡレセプターが多重サブユニット（ＮＭＤＡＲＩおよびＮＭＤＡＲ２Ａ−２Ｄ）として存在すること、ｍＧｌｕＲｓは多重サブタイプ（ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ８）として存在することが示唆された。さらに、スプライシングバリアントが、少なくとも３つのｍＧｌｕＲｓ、すなわちｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５に関して発見された。
【０００４】
サブタイプｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５は、ホスファチジルイノシトール−カルシウム第２メッセンジャー系の刺激と連結し、一方で、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ８は、アデニル酸シクラーゼ活性を阻害するＧタンパク質に共役する。代謝調節型グルタミン酸レセプター（ｍＧｌｕＲｓ）、たとえばｍＧｌｕＲ１およびｍＧｌｕＲ５は、ニューロン内で、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３−およびリアノジン−感受性Ｃａ２＋保存を介して、細胞内Ｃａ２＋濃度を増加させることができる。両方の型の保存は、機能的に、血漿膜中で見られるＣａ２＋浸透性チャネルに共役する。細胞内Ｃａ２＋濃度のｍＧｌｕＲの仲介による増加は、Ｃａ２＋感受性Ｋ＋チャネルおよびＣａ２＋依存非選択性陽イオンチャネルを活性化させることができる。これらのｍＧｌｕＲの仲介効果は、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ３感受性よりもリアノジン感受性のＣａ２＋保存からのＣａ２＋の代謝の結果であることが多く、このことは、ｍＧｌｕＲｓ、細胞内Ｃａ２＋保存および膜におけるＣａ２＋感受性イオンチャネル間での、非常に緊密な機能的相互作用を示唆する。
【０００５】
代謝調節型グルタミン酸レセプターサブタイプ５（ｍＧｌｕＲ５）に関して、２つのアイソフォームがラットおよびヒトの脳で同定されている。ｍＧｌｕ５ａと比較して、ｍＧｌｕ５ｂは、第７膜貫通ドメインの後に３２アミノ酸、５０残基の挿入を含む。ヒトレセプターの一次配列は、ラット相同物と比較して、約９３〜９６％同一性を有する。大きな細胞外ドメインの予想されるアミノ酸配列は、ラットおよびヒトｍＧｌｕＲ５において非常によく保存されており（９８．６％）、このことはｍＧｌｕＲ５のアミノ末端領域が機能的に重要であることを示唆する。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中でのいずれかのヒトアイソフォームの発現はグルタミン酸応答を誘発し、このことはヒト脳からの２つのレセプターが、ホスホリパーゼＣを活性化し、Ｃａ（２＋）活性化Ｃｌ−電流を生成することを示唆する。
【０００６】
グルタミン酸作動性シナプルの偏在分布のために、ｍＧｌｕＲｓは、ＣＮＳにおける広範囲の機能に関与する潜在性がある。さらに、ｍＧｌｕＲサブタイプが広い多様性を有し、不均一な分布であるので、１つのみまたは限定された数のＣＮＳ機能に関与する、ｍＧｌｕＲｓに選択的に相互作用する、薬理学的物質を開発する機会が提供される。したがって、特に、種々の精神病理学的および神経疾患に対する新規戦略の発展に使用するために、ＣＮＳ機能におけるｍＧｌｕＲｓの特定の役割の詳細な理解を得ること、および特定のｍＧｌｕＲｓのモジュレーターを同定することに対する必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、少なくとも部分的には、代謝調節型グルタミン酸レセプターサブタイプ５サブファミリー、特に、本明細書においては代謝調節型グルタミン酸レセプターサブタイプ５調節タンパク質（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ５ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）という（同様に本明細書においては「ｍＧｌｕＲ５Ｍ」タンパク質または「ｍＧｌｕＲ５Ｍ」ファミリーともいう）、代謝調節型グルタミンレセプターｍＧｌｕＲ５ａおよびｍＧｌｕＲ５ｂのＮ末端部分に対して相同性を有する、分泌タンパク質の新規ファミリーをコードする核酸分子の発見に基づくものである。本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ分子、ならびにｍＧｌｕＲ５Ｍミミックおよび／またはｍＧｌｕＲ５Ｍモジュレーターは、多数の細胞工程を調整するのに有用である。したがって、１つの観点において、本発明は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子を提供し、ならびに、ｍＧｌｕＲ５Ｍコード核酸の検出のために、プライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして好適である核酸断片を提供する。
【０００８】
１つの実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、配列番号１にて示された核酸配列、受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドＤＮＡ挿入物の核酸配列、またはその相補体と６０％同一である。好ましい実施形態において、単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、配列番号３で示されたヌクレオチド配列、またはその相補体を有する。他の好ましい実施形態においては、単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、配列番号１で示されたヌクレオチド配列、またはその相補体を有する。また他の好ましい実施形態においては、単離された核酸分子は、受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列、またはその相補体を有する。
【０００９】
他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列またはアミノ酸、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物によってコードされたアミノ酸配列と、十分に相同的または同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。他の好ましい実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、配列番号２のアミノ酸配列またはアミノ酸、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物によってコードされたアミノ酸配列と、少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
他の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、Ｎ末端ｍＧｌｕＲ−様ドメインおよび／またはＣ末端固有ドメインを含むＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする。他の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、Ｇタンパク質共役レセプターファミリー３コンセンサス配列を含むタンパク質をコードする。また他の実施形態では、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、膜貫通ドメインを欠くＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする。また他の実施形態においては、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードし、かつ天然に存在するヌクレオチド配列である。また他の実施形態においては、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、膜貫通ドメインを欠くｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする。
【００１１】
本発明の他の実施形態は、非ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする核酸分子と比較して、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子を特定的に検出するｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子を特徴とする。たとえば、１つの実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、少なくとも長さにして３０ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件で、配列番号１で示されたヌクレオチド配列または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補体とハイブリダイズする。また他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、ストリンジェントな条件で、配列番号１の約ヌクレオチド８８０〜１８２３からなる核酸分子の相補体とハイブリダイズする。本発明の他の実施形態により、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸のコード鎖に対するアンチセンスである、単離された核酸分子が提供される。
【００１２】
本発明の他の観点により、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子を含むベクターが提供される。ある実施形態において、ベクターは組換え発現ベクターである。他の実施形態において、本発明により、本発明のベクターを含有する宿主細胞が提供される。本発明はまた、好適な培地中で、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を製造するよう、組換え発現ベクターを含む本発明の宿主細胞を培養することによって、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を製造する方法が提供される。
【００１３】
本発明の他の観点は、単離されたまたは組換体ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質およびポリペプチドを特徴とする。１つの実施形態において、単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質はＮ末端ｍＧｌｕＲ−様ドメインを含む。他の実施形態において、単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質はＣ末端固有ドメインを含む。他の実施形態において、単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は膜貫通ドメインを欠く。他の実施形態において、単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と十分に相同または同一であるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
本発明の他の実施形態は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相補配列と、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を特徴とする。本発明の他の実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を特徴とする。本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を特徴とする。
【００１５】
本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、非ｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチドに動作可能に連結して、ｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質を形成することができる。本発明はさらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗体等のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に特定的に結合する抗体を特徴とする。さらに、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性な部分は、薬理学的に許容可能な担体を任意に含む薬理学的組成物に組み込むことが可能である。
【００１６】
他の観点において、本発明により、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子、タンパク質またはポリペプチドの存在が生物学的試料中で検出されるよう、生物学的試料を、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子、タンパク質またはポリペプチドを検出可能な試薬と接触させることによって、生物学的試料中でｍＧｌｕＲ５Ｍ発現を検出する方法が提供される。
【００１７】
他の観点において、本発明により、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性の存在が生物学的試料中で検出されるよう、生物学的試料を、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性のインディケーターを検出可能な試薬と接触させることによって、生物学的試料中でｍＧｌｕＲ５Ｍ活性の存在を検出する方法が提供される。
【００１８】
他の観点において、本発明により、細胞中のｍＧｌｕＲ５Ｍ活性が調節されるよう、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ペプチド、核酸分子、ペプチドミミックまたは他の小分子と細胞を接触させることを含む、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性の調節方法が提供される。１つの実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ペプチド、抗体、核酸分子、ペプチドミミックまたは他の小分子は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を阻害する。他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ペプチド、抗体、核酸分子、ペプチドミミックまたは他の小分子は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を刺激する。好ましい実施形態において、試薬は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に特定的に結合する抗体である。他の実施形態において、試薬はｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子である。また他の実施形態において、試薬はｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ペプチドミミックのペプチドである。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明の方法は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ペプチド、抗体、核酸分子、ペプチドミミックまたは他の小分子を対象に投与することによって、異常なｍＧｌｕＲ５Ｍ発現または活性によって特徴付けられる疾患を患う対象を治療するために使用される。好ましい実施形態において、異常なｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸発現によって特徴付けられる疾患は、中枢神経系疾患である。
【００２０】
本発明はまた、（ｉ）ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異、（ｉｉ）前記遺伝子の異常調整、および（ｉｉｉ）ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の異常な翻訳後修飾の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的変性の有無を同定するための診断アッセイを提供し、ここで、前記遺伝子の野生型がｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を有するタンパク質をコードする。
【００２１】
他の観点において、本発明により、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に結合するか、またはその活性を調節する化合物を同定する方法が提供される。１つの実施形態において、本発明は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を（任意によりｍＧｌｕＲ５Ｍリガンドに加えて）試験化合物と接触させることと、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質が試験化合物に結合するかどうかを判定することとを含む、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に結合する化合物を同定する方法を提供する。他の実施形態において、本発明により、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を発現する細胞を、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質および試験化合物と接触させることと、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の結合または活性における試験化合物の効果を判定することにより、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の活性を調節する化合物を同定することを含む、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に結合するか、またはその活性を調節する化合物を同定する方法が提供される。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項より明らかとなる。
【００２３】
本発明は、ある保存構造および機能的特徴を有する化合物のファミリーを含む、本明細書では代謝調節型グルタミン酸レセプターサブタイプ５調節タンパク質（ｍｅｔａｂｏｔｒｏｐｉｃ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ５ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）と呼ばれる、新規の分子の発見に基づくものである。本発明のタンパク質および核酸分子に関して使用する場合の、用語「ファミリー（ｆａｍｉｌｙ）」は、共通の構造ドメインを有し、本明細書で定義したような十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性または同一性を有する、１または複数のタンパク質または核酸分子を意味することを意図する。そのようなファミリーのメンバーは、天然に存在し、同一のまたは異なる種のいずれかからであってもよい。たとえば、ファミリーは、ヒト、ならびに他の種由来の第１タンパク質、ヒト由来の異なるタンパク質を含み、または非ヒト由来の相同物を含むことができる。ファミリーのメンバーはまた、共通の機能特性も有することができる。
【００２４】
たとえば、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、代謝調節型グルタミン酸レセプター、ｍＧｌｕ５ａおよびｍＧｌｕＲ５ｂのＮ末端細胞外ドメインと著しい相同性を有する。代謝調節型グルタミン酸レセプターは、特定の保存アミノ酸残基を共有することが知られており、そのいくつかは、リガンド結合および／またはレセプター機能において重要であることがわかっている。たとえば、代謝調節型グルタミン酸レセプターは、レセプターの三次元構造および／または細胞内形質導入において重要であると提案されている、Ｎ末端細胞外ドメインおよび細胞外ループ内に、少なくとも１９の保存システイン残基を共有することが知られている。これらの保存システイン残基の少なくとも３つが、配列番号２に記載したヒトｍＧｌｕＲ５Ｍアミノ酸配列中に存在する。さらに、公知の細菌ペリプラズマ結合タンパク質（ＰＢＬｓ）に対する、代謝活性型グルタミン酸レセプターのＮ末端細胞外ドメインの相同性に基づき、（配列番号４に記載のヒトｍＧｌｕＲ５配列中のアミノ酸１５２に位置する）セリン残基、および（配列番号４に記載のヒトｍＧｌｕＲ５配列中のアミノ酸１７５に位置する）スレオニン残基が、グルタミン酸結合に重要であると予想されており、両方とも、配列番号２に記載のヒトｍＧｌｕＲ５Ｍアミノ酸残基内に存在する（すなわち配列番号２のＳｅｒ１５２およびＴｈｒ１７５）。これらの重要な保存残基は、図２でのアスタリスクで示す。
【００２５】
１つの観点において、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、長さにして、約３３０〜４１０、好ましくは約３４０〜４００、さらに好ましくは約３５０〜３９０、さらに好ましくは約３６０〜３８０、または約３６９〜３７０アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、本明細書で説明するように、ｍＧｌｕＲ５Ｍファミリーのファミリーとして特徴的な、少なくとも１つのドメインまたはコンセンサス配列を含む。他の実施形態においては、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質はシグナル配列を含む。本明細書で使用するところの、「シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、分泌および統合膜タンパク質のＮ末端に存在し、少なくとも３０％の疎水性アミノ酸残基を含む、長さにして約２０アミノ酸残基のペプチドを含む。好ましい実施形態において、シグナル配列は、少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０またはそれ以上のアミノ酸残基を有し、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％またはそれ以上の疎水性アミノ酸残基（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、またはプロリン）を有する。また「シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」としても当技術分野で言及される、そのような「シグナル配列」は、そのような配列を含むタンパク質を脂質二十層に指向させるために役に立つ。たとえば、シグナル配列は、配列番号２のおよそアミノ酸１〜２０で見ることができる（配列番号２に記載のｍＧｌｕＲ５Ｍアミノ酸配列のＭｅｔ１〜Ａｌａ２０）。また他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、成熟ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質である。本明細書で使用するところの、用語「成熟ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質（ｍａｔｕｒｅ  ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、シグナルペプチドが開裂したｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を指す。例示的実施形態において、成熟ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列番号２のアミノ酸残基２１〜３６９を含有する。
【００２６】
他の実施形態において、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、Ｎ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインを含む。本明細書で使用するところの、用語「Ｎ末端ｍＧｌｕＲ様ドメイン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍＧｌｕＲ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ）」は、ｍＧｌｕＲアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を共有する、約２５０〜３５０アミノ酸のアミノ酸配列を有するタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、「Ｎ末端ｍＧｌｕＲ様ドメイン」には、約２６０〜３４０、２７０〜３３０、２８０〜３２０、２９０〜３１０、または約３００アミノ酸残基（たとえば約３０２アミノ酸残基）のアミノ酸配列を有するタンパク質ドメインが含まれ、ｍＧｌｕＲアミノ酸配列と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有する。例示的実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列番号２の約アミノ酸残基１〜３０３を含むＮ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインを含有する。
【００２７】
また他の実施形態において、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、Ｃ末端固有ドメインを含む。本明細書で使用するところの、用語「Ｃ末端固有ドメイン（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｕｎｉｑｕｅ  ｄｏｍａｉｎ）」は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のアミノ酸配列中、アミノ酸残基Ｃ末端からＮ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインを含む、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質ファミリーメンバーのタンパク質ドメインを指す。本明細書で使用するところの用語「Ｃ末端固有ドメイン」は、長さにして約５０〜７５アミノ酸残基、好ましくは長さにして少なくとも約５５〜７０残基、より好ましくは長さにして少なくとも約６０〜６５アミノ酸残基（たとえば長さにして約６３アミノ酸残基）であり、他のｍＧｌｕＲ５ＭファミリーメンバーのＣ末端アミノ酸配列と、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するタンパク質ドメインを指す。しかしながら、本明細書にてさらに詳細に説明するように、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質ファミリーのメンバーのＣ末端固有ドメインは、ｍＧｌｕＲのアミノ酸配列と十分に相同的ではない。たとえば、ヒトｍＧｌｕＲ５ＭのＣ末端固有ドメインは、配列番号２の約アミノ酸残基３０４〜３６９までのヒトｍＧｌｕＲ５ＭのＣ末端固有ドメインに対して、少なくとも約８０％の相同性を有するが、ヒトｍＧｌｕＲ５のアミノ酸配列とは相同性がない。
【００２８】
ｍＧｌｕＲ５Ｍファミリーメンバー（またはＮ末端ｍＧｌｕＲ様ドメイン）はさらに、少なくとも１つのＧタンパク質共役レセプターファミリー３シグニチャーコンセンサス配列の存在に基づいて同定可能である。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列［ＬＶ］−Ｘ−Ｎ−［ＬＩＶＭ］（２）−Ｘ−Ｌ−Ｆ−Ｘ−Ｉ−［ＰＡ］−Ｑ−［ＬＩＶＭ］−［ＳＴＡ］−Ｘ−［ＳＴＡ］（３）−［ＳＴＡＮ］（配列番号６）を有するＧ−タンパク質共役レセプターファミリー３＿１コンセンサスを含むことができる。本明細書で説明するコンセンサス配列は、標準プロサイトシグニチャー（Ｐｒｏｓｉｔｅ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）記号表記に従って説明される（たとえばすべてのアミノ酸は、その汎用単一文字表記に従って示され、Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｘ（ｎ）は任意のｎアミノ酸を示し、たとえばＸ（２）は任意の２アミノ酸を示し、また［ＬＩＶＭ］は括弧内で示されるアミノ酸の内の任意の１つを示唆し、たとえば、Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭの任意の１つ、また、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＭｅｔの任意の１つを示唆する）。
【００２９】
また他の実施形態において、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は膜貫通ドメインを欠く。本明細書で使用するところの「膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）」は、少なくとも約１０アミノ酸残基を有するタンパク質ドメインを含み、そのうち約６０％のアミノ酸残基は、非極性側鎖を含み、たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンである。好ましい実施形態において、「膜貫通ドメイン」には、少なくとも約１３、好ましくは約１６、より好ましくは約１９、さらにより好ましくは、約２１、２３、２５、３０、３５または４０アミノ酸残基を有するタンパク質ドメインが含まれ、そのうち約７０％、好ましくは約８０％、およびより好ましくは約９０％のアミノ酸残基が、非極性側鎖を含み、たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンである。膜貫通ドメインは性質として親脂質であり、細胞の膜に広がる（たとえば真核細胞中の細胞膜またはオルガネラ膜に広がる）。膜貫通ドメイン（または膜貫通ドメイン群）を有するタンパク質またはポリペプチドは共通して、「膜結合（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ）」タンパク質またはポリペプチドといわれる。「膜貫通ドメインを欠く（ｌａｃｋｓ  ａ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）」タンパク質またはポリペプチドは、膜結合せず、たとえば細胞質ゾルで、分泌するか、またはオルガネラ−ミリア内に存在するかいずれかである。
【００３０】
本発明の好ましいｍＧｌｕＲ５Ｍ分子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と十分に相同または同一なアミノ酸配列を有する。本明細書で使用するところの用語「十分に相同（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」または「十分に同一（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」は、第１および第２アミノ酸またはヌクレオチド配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を共有するように、第二アミノ酸またはヌクレオチド配列に対して、十分、または最小限の数の同一性または等価性を含む第１アミノ酸またはヌクレオチド配列（たとえば同一の側鎖を有するアミノ酸残基）を意味する。たとえば、ドメインのアミノ酸配列を通して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有し、少なくとも１つ、好ましくは２つの構造ドメインを含む共有の構造ドメインを共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列が、本明細書で、十分相同または同一であると定義される。さらに、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を共有し、共通機能活性を共有するアミノ酸またはヌクレオチド配列が、本明細書では十分相同または同一であると定義される。
【００３１】
本明細書において同じ意味で使用されるところの、「ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性（ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、「ｍＧｌｕＲ５Ｍの生物学的活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍＧｌｕＲ５Ｍ）」、または「ｍＧｌｕＲ５Ｍの機能活性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍＧｌｕＲ５Ｍ）」は、標準の技術に従って、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるような、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ポリペプチドまたは核酸分子によって行使される活性、たとえばｍＧｌｕＲ発現細胞上で行使される活性を意味する。
【００３２】
本発明における好ましい観点において、「ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性」、「ｍＧｌｕＲ５Ｍの生物学的活性」、または「ｍＧｌｕＲ５Ｍの機能活性」は、グルタミン酸レセプター機能および／または活性、特に代謝調節型グルタミン酸レセプター機能および／または活性（たとえばｍＧｌｕＲ５機能および／または）の調節（たとえば増強または阻害）を含む。１つの実施形態において、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、グルタミン酸レセプター機能および／または活性を直接、たとえばリガンド依存または非依存様式で、レセプターに結合するか、レセプター活性を増強するか、または阻害することによって、調節する。他の実施形態において、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、グルタミン酸レセプターリガンド効力に影響を与えることによって、グルタミン酸レセプター機能および／または活性を調節する。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、グルタミン酸への直接の結合によって、神経伝達、神経毒性、興奮毒性および／または代謝機能を調整可能である。
【００３３】
好ましい実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性は、少なくとも１つの以下の活性である。（１）Ｇタンパク質結合第２メッセンジャー情報伝達経路、たとえば神経細胞シグナリングおよび神経系機能に関与する情報伝達経路の調節（たとえばジアシルグリセロールおよび／またはイノシトール三リン酸仲介情報伝達経路の調節）、（２）グルタミン酸作動性伝達の調節、（３）神経興奮性の調節、（４）シナプス性伝達の調整、（５）神経伝達物質放出（たとえばグルタミン酸放出）の調節、（６）電圧依存および／または電圧非依存および／またはリガンドゲートイオンチャネル（たとえばＫ＋チャネルまたはＣａ２＋チャネル）の調整、（７）神経発達の調整（たとえば、発達中の脳における神経分化、移動および／または生存の調整）、（８）神経系機能の調節、および（９）神経変性工程の調節（たとえば、急性または慢性神経変性工程）。また他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ二量体化（たとえばｍＧｌｕＲ５ａおよび／またはｍＧｌｕＲ５ｂ二量体化）および／または他のｍＧｌｕＲファミリーメンバーの二量体化（たとえばｍＧｌｕＲ１二量体化）の調節である。
【００３４】
したがって、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質（ならびにペプチド、核酸分子、抗体、ペプチドミミックおよび小分子）は、たとえば神経変性疾患および／または疾病（たとえば、運動性ニューロン疾患（ＭＮＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病およびアルツハイマー病）、脳卒中、癲癇、脳虚血または外傷性脳障害の状態の後に急激に起こる脳損傷および／または運動障害を治療するのに有用である。本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質（ならびにぺプチド、核酸分子、抗体、ペプチドミミックおよび小分子）はまた、認識増強剤、抗癲癇剤として有用であり、および／または痛みおよび／または高血圧の治療で有用である。本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質での治療に応答することができる他の臨床状態には、癲癇、記憶喪失、不安、痛覚過敏および／または精神病理学的疾患（たとえば統合失調症および／または他の精神病）が含まれる。好ましくは、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質（ならびにぺプチド、核酸分子、抗体、ペプチドミミックおよび小分子）は、統合失調症および／または、統合失調性感情障害、双極性気分障害、単極性気分障害および思春期行動障害を限定はしないが含む他の精神病理学的疾患の治療に有用である。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書で説明したようなｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を有する単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質およびポリペプチドを特徴とする。好ましいｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、少なくともＮ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインおよび／またはＣ末端固有ドメインおよびｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を有する。好ましい実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、Ｇタンパク質共役レセプターファミリー３＿１コンセンサス配列およびｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を有する。他の好ましい実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、少なくともＮ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインおよび／またはＣ末端固有ドメイン、およびＧタンパク質共役レセプターファミリー３＿１コンセンサス配列、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性、および配列番号２のアミノ酸配列に対して十分相同であるか、または同一であるアミノ酸配列を有する。
【００３６】
ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡは、長さにしておよそ１８２３ヌクレオチドのヒト成人脳ＲＮＡから由来するライブラリーより同定され、長さにしておよそ３６９アミノ酸残基であるタンパク質をコードする。ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列番号２のおよそアミノ酸１〜３０３でＮ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインを含み、配列番号２のおよそアミノ酸３０４〜３６９でＣ末端固有ドメインを含む。ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質はさらに、配列番号２のおよそアミノ酸１５８〜１７６で、Ｇタンパク質共役レセプターファミリー３＿１コンセンサス配列をさらに含む。
【００３７】
ヒトｍＧｌｕＲＭをコードするヌクレオチドを含むプラスミド（本明細書において同義でＹＩ１７６ともいう）は、２０００年１２月１２日に、Ａｍｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０〜２２０９に寄託され、受託番号ＰＴＡ−２７７５を割り当てられた。この寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際承認（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）におけるブタベスト条約の条文下で維持される。この寄託は、単に当業者に対して好都合であるようにしただけであり、寄託が米国特許法第１１２条で必要とされるという許可ではない。
【００３８】
本発明の種々の観点を、以下の小節でさらに詳細に説明する。
１．単離された核酸分子
【００３９】
本発明の１つの観点は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子、ならびに、ｍＧｌｕＲ５Ｍコード核酸（たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡ）を同定するために、ハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸断片および、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子の増幅または変異挿入のためにＰＣＲプライマーとして使用するための断片と関連する。本明細書で使用するところの用語「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、ＤＮＡ分子（たとえばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（たとえばｍＲＮＡ）およびヌクレオチド類似体を用いて合成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むと意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４０】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸分子は、核酸の天然源中で存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が由来する有機体のゲノムＤＮＡ中で、核酸に通常隣接する配列（すなわち核酸の５’および３’末端に位置する配列）をもたない。たとえば、種々の実施形態において、単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で核酸分子と通常隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。さらに、ｃＤＮＡ分子等の「単離された」核酸分子は、組換え技術によって産出された場合には、本質的に他の細胞物質、または培養培地を含まず、または化学的に合成される場合、化学的前駆体または他の化学物質を本質的に含まない。
【００４１】
本発明の核酸分子、たとえば配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列、またはその一部分は、標準の分子生物学的技術および本明細書で提供される配列情報を用いて単離可能である。配列番号１の核酸配列のすべてまたは一部分、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することで、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子を、（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ，ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９で説明されているような）通常のハイブリダイゼーションおよびクローニング技術を用いて単離可能である。
【００４２】
さらに、配列番号１のすべてまたは一部分を含む核酸分子、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチドの核酸配列は、配列番号１の配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離可能である。
【００４３】
本発明の核酸は、標準のＰＣＲ増幅技術に従って、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを、そして好ましいオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅可能である。そのようにして増幅した核酸は、好ましいベクター内にクローン化し、ＤＮＡ配列解析で特性化可能である。さらに、ｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドは、標準の合成技術、たとえば自動化ＤＮＡ合成機を用いて調製可能である。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１で示されたヌクレオチド配列を含む。配列番号１の配列は、ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡに相当する。このｃＤＮＡは、ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする配列（すなわち「コード領域」、ヌクレオチド１１１０〜１１１３からの終止コドンを含むヌクレオチド４〜１１１３）、ならびに５’非翻訳配列（ヌクレオチド１〜３）、および３’非翻訳配列（ヌクレオチド１１１０または１１１３〜１８２３）を含む。あるいは、核酸分子は、配列番号１のコード領域のみを含むことができる（たとえば配列番号３に相当する、ヌクレオチド４〜１１１０または１１１３）。
【００４５】
他の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１で示したヌクレオチド配列、受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の部分の相補体である核酸分子を含む。配列番号１で示した核酸配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、配列番号１で示したヌクレオチド配列または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列と十分に相補的であり、これによって安定な二本鎖を形成するものである。
【００４６】
また他の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１で示したヌクレオチド配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の一部分と、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１の核酸配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列の一部分のみ、たとえばプローブまたはプライマーとして使用可能な断片、またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする断片である。ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子のクローニングより決定されたヌクレオチド配列は、他のｍＧｌｕＲ５Ｍファミリーメンバーを、同様に他の種からｍＧｌｕＲ５Ｍ相同物を、同定および／またはクローニングする際に使用するために設計されたプローブおよびプライマーの製造が可能になる。プローブ／プライマーは典型的に、本質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。プローブ／プライマー（たとえばオリゴヌクレオチド）は典型的には、ストリンジェントな条件で、配列番号１のセンス配列または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列と、また配列番号１のアンチセンス配列または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列と、または配列番号１の天然に存在する変異体とハイブリダイズする、およそ５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含む。あるいは、プローブ／プライマー（たとえばオリゴヌクレオチド）は、配列番号１のセンス配列または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列と、また配列番号１のアンチセンス配列または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列と、または配列番号１の天然に存在する変異体のおよそ５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含む。ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列の決定のために例示的なプローブ／プライマーは、約ヌクレオチド８８０〜１８２３の配列番号１のセンスまたはアンチセンス配列のヌクレオチドを含む。
【００４８】
ｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列に基づくプローブは、同一または相同タンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用可能である。好ましい実施形態において、プローブはさらに、それに結合した標識基を含み、たとえば標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補助因子であってもよい。そのようなプローブは、対象からの細胞試料中で、ｍＧｌｕＲ５Ｍコード核酸のレベルを測定すること、たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子が変異挿入するかまたは欠失されたかどうかを決定することなどによって、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を発現していない細胞または組織を同定するための、診断試験キットの一部として使用可能である。
【００４９】
ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の生物学的に活性な部分（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」をコードする核酸断片は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ生物学的活性（ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の生物学的活性は先述している）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１のヌクレオチド配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列の一部分を単離すること、（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換え発現によって）ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のコードされた部分を発現すること、およびｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のコードされた部分の活性を査定することによって調製可能である。例示的実施形態において、本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする核酸分子は、長さにして１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００またはそれ以上のヌクレオチドより大きいヌクレオチド配列を含み、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、配列番号１の核酸分子の相補体、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
【００５０】
本発明はさらに、遺伝子暗号の縮退のために、配列番号１で示したヌクレオチド配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列とは異なり、したがって配列番号１で示したヌクレオチド配列によってコードされたのと同一のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする核酸分子を含有する。他の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２で示したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００５１】
配列番号１で示されたｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に加えて、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のアミノ酸配列中での変化を導く、ＤＮＡ配列多型が、集団（たとえばヒト集団）内に存在してもよいことが当業者によって理解される。ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子中のそのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションのために、集団内で個々に存在してもよい。本明細書で使用するところの語句「遺伝子（ｇｅｎｅ）」および「組換え体遺伝子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ）」は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、好ましくは哺乳動物ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味する。そのような、天然の対立遺伝子バリエーションは、典型的には結果として、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列中１〜５％変化となる。天然の対立遺伝子変化の結果であり、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の機能的活性を変化させない、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子中での任意のそしてすべてのそのようなヌクレオチドバリエーションおよび結果として得られるアミノ酸多型は、本発明の意図の範囲内であると意図されている。
【００５２】
さらに、他のｍＧｌｕＲ５Ｍファミリーメンバーをコードする核酸分子で、かくして配列番号１のｍＧｌｕＲ５Ｍ配列からは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子が、本発明の意図の範囲内であると意図される。たとえば、霊長類ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡを、ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍのヌクレオチド配列に基づいて同定可能である。異なる種からの、したがって配列番号１のｍＧｌｕＲ５Ｍ配列とは異なるヌクレオチド配列を有する、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする核酸分子は、本発明の意図の範囲内であると意図される。
【００５３】
本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同物に相当する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、標準のハイブリダイゼーション技術に従って、本明細書にて開示されたｃＤＮＡまたはその一部分をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本明細書で開示されたｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸とのその相同性に基づいて単離可能である。
【００５４】
したがって、他の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、長さにして少なくとも１５ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補体とハイブリダイズする。他の実施形態において、核酸は、長さにして少なくとも３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を含む核酸分子の相補体とハイブリダイズする。
【００５５】
本明細書で使用するところの、語句「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」は、互いに明らかに同一であるか、または相同であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズされたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明することを意図する。好ましくは、前記条件は互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％または９０％同一である配列が互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。そのようなストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）、２、４および６章で得ることができる。さらなるストリンジェントな条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、７、９および１１章で得られる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい、非限定例には、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約６５〜７０℃でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃で、４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、続いて１または複数回の、約６５〜７０℃で、１×ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定例には、１×ＳＳＣ中、約６５〜７０℃でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃で、１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、続いて１または複数回の、約６５〜７０℃で、０．３×ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。緊縮したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定例には、４×ＳＳＣ中、約５０〜６０℃でのハイブリダイゼーション（または約４０〜４５℃で、６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、続いて１または複数回の、約５０〜６０℃で、２×ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。以上で引用した値に対する中間範囲、たとえば６５〜７０℃、または４２〜５０℃もまた本発明によって含まれることが意図される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）をハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中でＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）に代えてもよく、洗浄をハイブリダイゼーションが完了した後毎回、１５分間実施する。長さにして５０塩基対以下であると予想されるハイブリッドに対するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くあるべきであり、ここでＴｍは以下の式に従って計算される。長さ１８塩基対以下のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。１８〜４９塩基対のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウム塩の濃度である（１×ＳＳＣに対する［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。たとえばニトロセルロースまたはナイロン膜への核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、ブロッキング試薬（たとえばＢＳＡまたはサケまたはニシン血清含有ＤＮＡ）、界面活性剤（たとえばＳＤＳ）、キレート剤（たとえばＥＤＴＡ）、フィコール、ＰＶＰなどを限定はしないが含む、追加的な試薬を、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液中に加えてもよいことが当業者により認識される。ナイロン膜を使用する場合、とりわけ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の追加的な非限定例は、０．２５〜０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％ＳＤＳ中、約６５℃でのハイブリダイゼーション、続く６５℃、０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳでの、１または複数回の洗浄であり、たとえばＣｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１〜１９９５を参照のこと（または０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ）。
【００５６】
好ましくは、ストリンジェントな条件で配列番号１または３の配列の成分にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に相当する。本明細書で使用するところの語句「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（たとえば天然のポリペプチドをコードする）ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。
【００５７】
集団内に存在することができるｍＧｌｕＲ５Ｍ配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者はさらに、配列番号１のヌクレオチド配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列内への変位導入によって変化を導入可能であり、これによって、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の機能的能力を変化させることなしに、コードされたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のアミノ酸配列に変化を導くことが可能であることが当業者によって理解される。たとえば、「非必須（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を、配列番号１のヌクレオチド配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５としてＡＴＣＣに寄託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列で実施可能である。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変えることなく、ｍＧｌｕＲ５Ｍの野生型配列（配列番号２の配列）から改変可能であり、一方、「必須（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。たとえば、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質とｍＧｌｕＲ５タンパク質の間で保存され、図２中でアスタリスク表示したアミノ酸残基は、とりわけ改変不可能であると予想される。さらに、Ｇタンパク質共役レセプターファミリー３＿１コンセンサス配列によって定義されるアミノ酸残基はとりわけ改変不可能である。さらに、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質とＧタンパク質共役レセプターファミリーの他のメンバー（たとえば図２に示すｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質）の間で保存されているさらなるアミノ酸も改変可能であることはありえない。
【００５８】
したがって、本発明の他の観点は、活性に必須ではないアミノ酸残基で変化を含むｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列番号２からのアミノ酸配列とは異なるが、しかしながら生物学的活性は有する。１つの実施形態において、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、そこでタンパク質は配列番号２と、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５９】
配列番号２のタンパク質と相同なｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする単離された核酸分子は、１または複数のアミノ酸置換、添加または欠失をコードされるタンパク質に導入するように、配列番号１のヌクレオチド配列内に１または複数のヌクレオチド置換、添加および欠失を組み込むことで作製可能である。変異は、部位特異的変導入およびＰＣＲ−仲介変異導入のような、標準の技術によって配列番号１内に組み込むことができる。好ましくは、保存アミノ酸置換を、１または複数の予想される非必須アミノ酸残基で行うことが出来る。「保存アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、アミノ酸残基を、同一の側鎖を有するアミノ酸残基で置換したものである。同一の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本技術分野で定義されてきている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖を有するアミノ酸（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（たとえばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質中の予想される非必須アミノ酸残基は、同様の側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で好ましく置換される。あるいは、他の実施形態において、変異は、飽和変異導入によってなどで、ｍＧｌｕＲ５Ｍコード配列のすべてまたは一部に沿って無作為に挿入可能であり、得られた変異体は、活性を保っている変異体を同定するために、ｍＧｌｕＲ５Ｍ生物学的活性に関してスクリーニング可能である。配列番号１またはコードされるタンパク質の続く変異導入は、組換え体的に発現可能であり、タンパク質の活性を決定可能である。
【００６０】
好ましい実施形態において、変異体ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、（１）Ｇタンパク質連結第２メッセンジャー情報伝達経路を調節する（たとえば、ジアシルグリセロールおよび／またはイノシトール三リン酸仲介情報伝達経路を調節する）、（２）グルタミン酸作動性伝達を調節する、（３）神経興奮性を調節する、（４）シナプス性伝達を調整する、（５）神経伝達物質放出（たとえばグルタミン酸放出）を調節する、（６）電圧依存および／または電圧非依存および／またはリガンドゲートイオンチャネル（たとえばＫ＋チャネルまたはＣａ２＋チャネル）を調整する、（７）神経発達を調整する（たとえば、発達中の脳における神経分化、移動および／または生存を調整する）、（８）神経変性工程（たとえば急性または慢性神経変性工程）を調節する、および／または（９）ｍＧｌｕＲ５Ｍ二量体化（たとえばｍＧｌｕＲ５ａおよび／またはｍＧｌｕＲ５ｂ二量体化）を調節するための能力に関してアッセイ可能である。
【００６１】
以上で説明されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする核酸分子に加えて、本発明の他の観点は、そのアンチセンスである単離された核酸分子に関する。「アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）」核酸は、タンパク質をコードする「センス（ｓｅｎｓｅ）」核酸と相補的であり、たとえば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的、またはｍＲＮＡ配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合可能である。アンチセンス核酸は、全ｍＧｌｕＲ５Ｍコード鎖に相補的であり得、またはその一部分にのみ相補的であってもよい。１つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ｍＧｌｕＲ５Ｍをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域（ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味する（たとえば、ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍのコード領域は、配列番号３に相当する）。他の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ｍＧｌｕＲ５Ｍをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５’および３’配列を意味する（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）。
【００６２】
本明細書で開示されたｍＧｌｕＲ５をコードするコード鎖配列（たとえば配列番号３）を考えると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリックの塩基対のルールに従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡの全コード領域に相補的でありえるが、より好ましくはｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部分のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域に相補的である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば長さにして約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであってもよい。本発明のアンチセンス核酸は、本技術分野で公知の手順を用いた化学合成および酵素的ライゲーション反応を用いて構築可能である。たとえばアンチセンス核酸（たとえばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増強するため、またはアンチセンスとセンス核酸間で形成される二本鎖の力学的安定性を増強するために設計された種々に改変したヌクレオチドを用いて化学的に合成可能であり、たとえばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用可能である。アンチセンス核酸を合成するために使用可能な改変ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシルメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキソシン、パセドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが含まれる。あるいは、アンチセンス核酸は、その中で核酸がアンチセンス方向にサブクローン化される発現ベクターを用いて生物学的に産出可能である（すなわち挿入された核酸から転写されたＲＮＡが、目的の標的核酸のアンチセンス方向であり、詳細はさらに以下の項で示す）。
【００６３】
本発明のアンチセンス核酸分子は、一般的には、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または結合し、それによってタンパク質の発現を阻害するように、たとえば転写および／または翻訳を阻害することによって、対象に投与するか、またはｉｎ  ｓｉｔｕで産出する。ハイブリダイゼーションは、安定二本鎖を形成するために、またはたとえばＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二本鎖ヘリックスの主要溝中での特定の相互作用を介して、従来のヌクレオチド相補性によって行われる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位での直接注射が含まれる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、改変し、選択した細胞を標的化し、次いで全身的に投与可能である。たとえば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、たとえばアンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって、選択した細胞表面上に発現するレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変可能である。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に説明されたベクターを用いて細胞に伝達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【００６４】
また他の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常のβ−ユニットと反対に、鎖が互いに平行に走る、相補的なＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．  １５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８）、またはキメラＲＮＡ―ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２１５：３２７〜３３０）をも含むことができる。
【００６５】
また他の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それに対する相補領域を含む、ｍＲＮＡ等の一本鎖核酸を開裂可能であるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがってリボザイム（たとえば（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５〜５９１で説明された）ハンマーヘッド型リボザイム）は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂し、それによってｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍコード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書で開示されたｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち配列番号１）に従って設計することができる。たとえば、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を、活性部位のヌクレオチド配列が、ｍＧｌｕＲ５ＭコードｍＲＮＡ中で開裂されるヌクレオチド配列に相同的であるように構築することができる。たとえばＣｅｃｈらによる米国特許第４，９８７，０７１号、およびＣｅｃｈらによる米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから、特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために使用することができる。たとえばＢａｒｔｅｌ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【００６６】
あるいは、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子発現は、ｍＧｌｕＲ５Ｍの調節領域（たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞内でｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の転写を阻止する三ヘリックス構造を形成することで阻害可能である。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）：５６９〜８４、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６、およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７〜１５を参照のこと。
【００６７】
また他の実施形態において、本発明のＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子は、塩基部位、糖部位またはリン酸骨格の部分で改変し、たとえば分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解性を改善することが可能である。たとえば、核酸分子のリン酸デオキシリボース骨格を改変し、ペプチド核酸を合成することが可能である（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５〜２３を参照のこと）。本明細書で使用するところの用語「ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」または［ＰＮＡ］は、リン酸デオキシリボース骨格が、擬似ペプチド骨格によって置換され、４つの天然のヌクレオ塩基のみが保持される核酸ミミック、たとえばＤＮＡミミックを指す。ＰＮＡの中性骨格が、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることが許容すると示されてきた。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら（１９９６）上記、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ‘ＫｅｅｆｅらＰＮＡＳ  ９３：１４６７０〜６７５で説明されたように、標準の固相ペプチド合成プロトコルを用いて実施可能である。
【００６８】
ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子のＰＮＡは、治療および診断適用で使用可能である。たとえばＰＮＡは、たとえば、転写または翻訳停止を誘導するか、または複製を阻害することで、遺伝子発現の配列特異的変調のために、アンチセンスまたはアンチ遺伝子試薬として使用可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子のＰＮＡはまた、遺伝子中の単一塩基対変異の解析で使用でき（たとえばＰＮＡ−指向ＰＣＲクランピングによって）、他の酵素の組合せで使用した場合に「人工制限酵素」として使用でき（たとえばＳ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）上記）、またはＤＮＡシークエンシングまたはハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして使用できる（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ら（１９９６）上記、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  上記）。
【００６９】
他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５ＭのＰＮＡは、ＰＮＡに脂肪親和性または他の補助基を付着することによって、またはＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポゾームまたは本技術分野で公知の薬物伝達の他の技術によって、（その安定性または細胞取り込みを増強するために）改変可能である。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、ＰＮＡおよびＤＮＡの利点を組み合わせて合成可能である。そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素がＤＮＡ部位と相互作用することを可能にし（たとえばＲＮＡｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）、一方でＰＮＡ部位は、高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、ヌクレオ塩基間の結合数、および方向に関して選択した、適切な長さのリンカーを用いて連結可能である（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）上記およびＦｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７〜６３にて説明されたように実施可能である。たとえば、ＤＮＡ鎖を標準のホスホラミジン酸共役化学反応を用いて固体支持体上で合成可能であり、改変レオシド類似体、たとえば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジン  ホスホラミジン塩を、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端のとして使用可能である（Ｍａｇ，Ｍ．ら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：５９７３〜８８）。ＰＮＡモノマーは次いで、段階的に結合し、５’ＰＮＡ部分と３’ＤＮＡ部分を有するキメラ物質が産出される（Ｆｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）上記）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡ部分と３’ＰＮＡ部分とを有して合成される（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４）。
【００７０】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドには、（たとえばｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞レセプターを標的とするための）ペプチド、または細胞膜（たとえばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳ．８６：６５５３−６５５６、Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２、１９８８年１２月１５日に発行されたＰＣＴ第ＷＯ８８／０９８１０号を参照のこと）、または血液脳関門（たとえば１９８８年４月２５日に発行されたＰＣＴ第ＷＯ８９／１０１３４号を参照のこと）を介した輸送を促進する試薬等の他の添加群を含むことができる。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘因開裂剤（たとえばＫｒｏｌら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６）、または挿入試薬で改変可能である（たとえばＺｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．  ５：５３９−５４９）。このために、オリゴヌクレオチドは、他の分子と共役させてもよい（たとえば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘因架橋剤、輸送試薬、またはハイブリダイゼーション誘因開裂剤）。
２．単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質および抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体
【００７１】
本発明の他の観点は、単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体を作製するために免疫源として使用するのに公的なポリペプチド断片に関連する。１つの実施形態において、ネイティブｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、標準のタンパク質精製技術を用いて、好ましい精製スキームによって細胞または組織供給源より単離可能である。他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、組換え体ＤＮＡ技術によって産出される。組換え体発現のほかに、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはポリペプチドは、標準のペプチド合成技術を用いて化学的に合成可能である。
【００７２】
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」または「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、本質的には、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質が由来する細胞または組織供給源からの細胞物質または他の夾雑タンパク質を含まず、または化学合成した場合は、化学前駆体または他の化学物質を含まない。語句「実質的に細胞物質を含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」には、単離または組換え的に産出される細胞の細胞成分よりタンパク質が分離される、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の調製が含まれる。１つの実施形態において、語句「実質的に細胞物質を含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）」には、約３０（乾燥重量）％以下の非ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質（本明細書ではまた「夾雑タンパク質（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」とも呼ぶ）、より好ましくは約２０％以下の非ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、さらにより好ましくは約１０％以下の非ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、最も好ましくは約５％以下の非ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を含むｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の調製が含まれる。ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性な部分が、組換え的に産出される場合、本質的に培養培地を含まないことが好ましく、すなわち培養培地が、タンパク質調製容量の、約２０％以下、より好ましくは約１０％以下、最も好ましくは約５％以下である。
【００７３】
語句「実質的に化学前駆体または他の化学物質を含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｏｒ  ｏｔｈｅｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）」には、タンパク質の合成にかかわる化学前駆体または他の化学物質からタンパク質が分離されるｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の調製が含まれる。１つの実施形態において、語句「実質的に化学前駆体または他の化学物質を含まない」には、約３０（乾燥重量）％以下の化学前駆体または非ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、より好ましくは約２０％以下の化学前駆体または非ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、さらにより好ましくは約１０％以下の化学前駆体または非ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、最も好ましくは約５％以下の化学前駆体または非ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を含む、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の調製が含まれる。
【００７４】
ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の生物学的に活性な部分には、全長ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質よりも短いアミノ酸が含まれる、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のアミノ酸配列に十分相同なアミノ酸配列またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列、たとえば配列番号２にて示されたアミノ酸配列を含むペプチドが含まれ、ｍＧｕｌＲ５Ｍタンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的に、生物学的に活性な部分には、少なくとも１つのｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の活性を有するドメインまたはモチーフが含まれる。ｍＧｌｕＲ５Ｍの生物学的に活性な部分は、ポリペプチドであり、たとえば１０、２５、５０、１００またはそれ以上の長さのアミノ酸である。
【００７５】
１つの実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の生物学的に活性な部分には、少なくともＮ末端ｍＧｌｕＲ様ドメインおよび／またはＣ末端固有ドメインが含まれる。他の実施形態においては、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の生物学的に活性な部分には、少なくとも１つのＧタンパク質共役レセプターファミリー３＿１コンセンサス配列が含まれる。
【００７６】
本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の好ましい生物学的に活性な部分に、以上で同定した構造ドメインおよび／またはプロファイルの少なくとも１つが含まれてもよいことが理解されるべきである。ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のより好ましい生物学的に活性な部分には、少なくとも２つの以上で同定した構造ドメインおよび／またはプロファイルが含まれてよい。さらに、タンパク質の他の領域が欠失される、他の生物学的活性部分が、組換え技術によって調製可能であり、１または複数のネイティブｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の機能活性に関して評価可能である。
【００７７】
好ましい実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列番号２で示したアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、配列番号２と本質的に相同であるかまたは同一であり、配列番号２のタンパク質の機能活性を保っているが、以上の項目１にて詳細に説明したように、天然の対立遺伝子バリエーションまたは変異導入のためにアミノ酸配列が異なっている。したがって、他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質はそれぞれ、配列番号２のアミノ酸配列と少なくともおよそ６０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の機能活性を維持する。好ましくは、前記タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であり、配列番号２のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の機能活性を維持する。
【００７８】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を最適比較の目的のために並べる（たとえば、最適整列のためにギャップを第１および第２アミノ酸または核酸配列の１つまたは両方に導入することが可能であり、また比較目的のために非同一配列を無視することができる）。好ましい実施形態において、比較の目的で並べた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である（たとえば、３６９アミノ酸残基を有する配列番号２のｍＧｌｕＲ５Ｍアミノ酸配列に対して第２配列を並べるときに、少なくとも１１１、好ましくは少なくとも１４８、より好ましくは少なくとも１８５、さらにより好ましくは少なくとも２２１、さらにより好ましくは少なくとも２５８、２９５または３３２アミノ酸残基を並べる）。次いで相当するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１配列での位置が、第２配列中の相当する位置で、同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されている場合、ここで前記分子がその位置で同一である（本明細書で使用されるように、アミノ酸または核酸「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、アミノ酸または核酸「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」と等しい）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適配列化のために組み入れる必要がある、ギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた配列によって共有された同一位置の数の関数である。
【００７９】
２つの配列間の配列の比較、およびパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて実施可能である。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重量、および１、２、３、４、５または６の長さ重量を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を用いて決定する。また他の好ましい実施形態においては、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０または８０のギャップ重量、および１、２、３、４、５または６の長さ重量を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を用いて決定する。ＧＡＰプログラムと関連して使用するパラメータの好ましい、非限定例には、ギャップペナルティー１２、ギャップ伸長ペナルティー４およびフレームシフトギャップ５での、Ｂｌｏｓｕｍ６２スコアリングマトリックスが含まれる。
【００８０】
他の実施形態において、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０またはバージョン２．０Ｕ）内に組み込まれている、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して決定する。
【００８１】
本発明の核酸およびポリペプチド配列は、さらに、たとえば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するための、公的データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として使用可能である。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施可能である。ＢＬＡＳＴヌクレオチド調査は、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語句長＝１２で実施可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質調査は、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチド分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語句長＝３およびＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスで実施可能である。比較の目的のためにギャップアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２で説明されたように使用可能である。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用可能である。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００８２】
本発明のタンパク質およびタンパク質断片には、開示されたタンパク質の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％）のアミノ酸配列長を有し、開示されたタンパク質と、少なくとも６０〜７０％配列同一性（より好ましくは、少なくとも７０〜７５％同一性、さらにより好ましくは少なくとも７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％またはそれ以上の同一性）を有するタンパク質が含まれる。ここで配列同一性は本明細書で説明されたように決定される。
【００８３】
本発明はまた、ｍＧｌｕＲ５Ｍキメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書で使用するところの、ｍＧｌｕＲ５Ｍ「キメラタンパク質（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、非ｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチドに動作可能に連結したｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチドを含む。「ｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチド（ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ｍＧｌｕＲ５Ｍに相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、一方で「非ｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチド（ｎｏｎ−ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、本質的にｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と相同ではないタンパク質、たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と異なるタンパク質、および同一または異なる有機体由来のタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質内で、ｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチドは、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のすべてまたは一部分に相当する。好ましい実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質は、少なくとも１つの、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の生物学的に活性な部分を含む。他の好ましい実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質は、少なくとも２つのｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内で、語句「動作可能に連結する（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、ｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチドおよび非ｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチドが互いにインフレームで融合することを示唆する意図がある。非ｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチドは、ｍＧｌｕＲ５ＭポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合可能である。
【００８４】
たとえば、１つの実施形態において、前記融合タンパク質は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合した、ＧＳＴ−ｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組換え体ｍＧｌｕＲ５Ｍの精製を促進可能である。他の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質である。特定の宿主細胞（たとえば哺乳動物宿主細胞）において、ｍＧｌｕＲ５Ｍの発現および／または分泌は、異種シグナル配列を使用することを介して増加させることができる。
【００８５】
本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質は、薬理学的組成物内に組み込み、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与することが可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ基質のバイオアベイラビリティーに影響を与えるために使用可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質は、中枢神経系疾患の処置のために治療的に有用である。さらに、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ−融合タンパク質は、対象における抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体を産出するため、ｍＧｌｕＲ５Ｍリガンドを精製するため、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ｍＧｌｕＲ５ＭリガンドまたはｍＧｌｕＲとのｍＧｌｕＲ５Ｍの相互作用を阻害する分子を同定するために、免疫源として使用可能である。
【００８６】
好ましくは、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍキラルまたは融合タンパク質を標準の組換えＤＮＡ技術によって産出する。たとえば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、従来の技術に従って、たとえばライゲーションのために平滑末端またはスタッガー末端を用いること、好ましい末端を提供する制限酵素消化、好ましいように粘着末端を埋めること、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処置、および酵素的ライゲーションによって、互いにインフレームでライゲーションする。他の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成可能である。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、産出後にアニールし、増幅して、キラル遺伝子配列を合成可能な２つの連続遺伝子断片間の相補突出部を与えるアンカープライマーを用いて実施可能である（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．ＡｕｓｕｂｅｌらＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。さらに、多くの発現ベクターが、すでに融合部位（たとえばＧＳＴポリペプチド）をコードしており、市販されている。ｍＧｌｕＲ５Ｍ−コード核酸を、融合部位がｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質にインフレームで連結するように、そのような発現ベクター内にクローン化することができる。
【００８７】
本発明はまた、ｍＧｌｕＲ５Ｍアゴニスト（ミミック）として、またはｍＧｌｕＲ５Ｍアンタゴニストとしてのいずれかで機能するｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の変異体にもに関する。種々のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質変異体は、変異導入、たとえば分離点変異またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の切断によって合成可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のアゴニストは、本質的には、同一または一部のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の天然に存在する型の生物学活性を維持可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のアンタゴニストは、たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のプロテアーゼ活性を競合的に阻害することによって、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の天然に存在する型の、１または複数の活性を阻害可能である。したがって、特異的な生物学的効果は、限定された機能の変異体で処置することによって顕在化される。１つの実施形態において、前記タンパク質の天然に存在する型の生物学的活性のサブセットを有する変異体での対象の処置では、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の天然に存在する型での処置に比べて、対象における副作用が少ない。
【００８８】
１つの実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍアゴニスト（ミミック）として、またはｍＧｌｕＲ５Ｍアンタゴニストとしてのいずれかで機能するｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の変異体は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の変異体、たとえば切断変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定可能である。１つの実施形態において、種々のｍＧｌｕＲ５Ｍ変異体のライブラリーは、核酸レベルでコンビナトリアル変異導入によって合成され、種々の遺伝子ライブラリーによってコードされる。ｍＧｌｕＲ５Ｍの種々のライブラリーは、たとえば、潜在的なｍＧｌｕＲ５Ｍ配列の縮退組を個々のポリペプチドまたはあるいはｍＧｌｕＲ５Ｍ配列の組を含むより大きな融合タンパク質（たとえばファージディスプレイ用）として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドを、遺伝子配列中に酵素的にライゲーションすることで産出可能である。縮退オリゴヌクレオチドから、可能性あるｍＧｌｕＲ５Ｍ変異体のライブラリーを産出するために使用可能である種々の方法が存在する。縮退遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ合成機で実施可能であり、ついで合成遺伝子は、好ましい発現ベクター内にライゲーションされる。遺伝子の縮退組を使用することで、１つの混合液中で、可能性あるｍＧｌｕＲ５Ｍ配列の望む組をコードするすべての配列の供給が可能になる。縮退オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、本技術分野で公知である（たとえば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６、Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【００８９】
さらに、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質コード配列の断片ライブラリーは、スクリーニング、および続くｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の変異体の選別のための、ｍＧｌｕＲ５Ｍ断片の種々の集団を合成するために使用可能である。１つの実施形態において、コード配列断片のライブラリーは、ニッキングが分子あたりおよそ１回起こる条件下で、ｍＧｌｕＲ５Ｍコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再変性させて、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含む二本鎖ＤＮＡを形成させること、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理によって、再形成された二本鎖より、一本鎖部分を除去すること、および得られた断片ライブラリーを発現ベクター内にライゲーションすることによって合成可能である。本方法によって、発現ライブラリーは、種々の大きさのｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のＮ末端、Ｃ末端および内部断片をコードして誘導可能である。
【００９０】
点変異または切断によって産出されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択した特性を有する遺伝子産物に対してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が本技術分野で公知である。そのような技術は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のコンビナトリアル変異導入によって産出される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット解析可能な、最も広く使用されている技術は、一般的には、遺伝子ライブラリーを複製可能発現ベクター内にクローン化すること、得られたベクターのライブラリーを好ましい細胞に形質導入すること、および望んだ活性の欠失が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリー内での機能的変異体の頻度を増強する新規の技術である、ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ集合変異導入（ＲＥＭ）を、ｍＧｌｕＲ５Ｍ変異体を同定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて使用可能である（Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：７８１１−７８１５、Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３３１）。
【００９１】
１つの実施形態において、細胞に基づくアッセイを、変化に富むｍＧｌｕＲ５Ｍライブラリーを解析するために活用可能である。たとえば、発現ベクターのライブラリーを、ｍＧｌｕＲ５Ｍを通常合成する細胞株内にトランスフェクト可能である。次いで、トランスフェクトした細胞を、特定の変異体ｍＧｌｕＲ５Ｍが発現し、細胞内でのｍＧｌｕＲ５Ｍ活性における変異体の発現の効果が、たとえばネイティブｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に対する多くの活性アッセイのいくつかによって検出可能であるように培養される。次いでプラスミドＤＮＡを、調節されたｍＧｌｕＲ５Ｍ活性に関してスコア化する細胞より回収し、個々のクローンをさらに特性化する。
【００９２】
単離されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその一部または断片を、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製に関する標準技術を用いてｍＧｌｕＲ５Ｍに結合する抗体を合成するために、免疫原として使用可能である。全長ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を使用可能であり、または本発明は、免疫原として使用するためのｍＧｌｕＲ５Ｍの抗原性ペプチド断片を提供する。ｍＧｌｕＲ５Ｍの抗原性ペプチドは、配列番号２で示されているアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、ペプチドに対して産出された抗体が、ｍＧｌｕＲ５Ｍと特異的免疫複合体を形成するように、ｍＧｌｕＲ５Ｍのエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチド残基は、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含む。
【００９３】
抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に対して固有であるｍＧｌｕＲ５Ｍの領域である（たとえば、配列番号２の約アミノ酸３０４〜３６９のＣ末端固有ドメイン）。
【００９４】
ｍＧｌｕＲ５Ｍ免疫原を、典型的には、好適な対象（たとえばウサギ、ヤギ、マウスまたは他の動物）を免疫原で免疫することによって抗体を調製するために使用する。好ましい免疫原性調製物には、たとえば組換え発現ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または化学的に合成したｍＧｌｕＲ５Ｍポリペプチドが含まれる。調製にはさらに、フロイトの完全または不完全アジュバント等のアジュバントまたは同様の免疫刺激試薬が含まれる。好適な対象の免疫原性ｍＧｌｕＲ５Ｍ調製物での免疫により、ポリクローナル抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体応答が誘導される。
【００９５】
したがって、本発明の他の観点は抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体に関連する。本明細書で使用するところの用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちｍＧｌｕＲ５Ｍ等の抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗体結合部位を含む分子を指す。免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分の例には、抗体をペプシンのような酵素で処理することによって合成可能であるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。本発明は、ｍＧｌｕＲ５Ｍに結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用するところの用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「モノクローナル抗体組成物（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、ｍＧｌｕＲ５Ｍの特定のエピトープと免疫応答可能である抗原部位をただ１種のみ含む抗体分子の集団を指す。したがって、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、免疫応答する特定のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に対して単一の結合親和力を示す。
【００９６】
ポリクローナル抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ免疫原で好適な対象を免疫することによって、上記のように調製可能である。免疫した対象中での抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体タイターを、固定したｍＧｌｕＲ５Ｍを用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の標準の技術によって、時間を追ってモニタ可能である。所望により、ｍＧｌｕＲ５Ｍに対する抗体分子は、哺乳動物より（たとえば血液より）単離し、さらにタンパク質Ａクロマトグラフィーのようなよく公知の技術によって精製し、ＩｇＧ画分を得ることが可能である。免疫後の適切な時間、たとえば抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体タイターが最も高い時点で、抗体産出細胞を対象より得て、最初にＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７によって説明されたハイブリドーマ技術（また、Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６、Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３、Ｙｅｈら（１９７６）ＰＮＡＳ  ７６：２９２７−３１、およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５も参照のこと）、またはより最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７〜９６ページ）、またはトリオーマ技術のような、標準の技術によってモノクローナル抗体を産出するために使用可能である。モノクローナル抗原ハイブリドーマを産出するための技術はよく公知である（一般的に、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）、Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２、Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６を参照のこと）。簡単には、不死化細胞株（一般的にはミエローマ）を、上述のようにｍＧｌｕＲ５Ｍ免疫原で免疫した哺乳動物からのリンパ球（一般的に脾臓細胞）と融合させ、得られたハイブリドーマの培養上清をスクリーニングして、ｍＧｌｕＲ５Ｍに結合するモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマを同定する。
【００９７】
リンパ球および不死化細胞株を融合するために使用する任意の多くのよく知られたプロトコールを、抗ｍＧｌｕＲ５Ｍモノクローナル抗体を産出する目的のために適用可能である（たとえば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２、以上で引用したＧｅｆｔｅｒらによるＳｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、以上で引用したＬｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、以上で引用したＫｅｎｎｅｔｈ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを参照のこと）。さらに、当業者は、また有用である他種類のそのような方法が存在することを理解する。典型的には、不死化細胞株（たとえばミエローマ細胞株）は、リンパ球と同様の哺乳動物種から由来する。たとえば齧歯類ハイブリドーマは、本発明の免疫原性モジュレーターで免役したマウスからのリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合することで作製可能である。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノペテリンおよびチミジン含有培養培地（「ＨＡＴ培地（ＨＡＴ  ｍｅｄｉｕｍ）」）に感受性であるマウスミエローマ細胞株である。任意の多くのミエローマ細胞株、たとえばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｒｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ細胞株が、標準の技術に従って融合パートナーとして使用可能である。これらのミエローマ株はＡＴＣＣより入手可能である。一般的にＨＡＴ−感受性マウスミエローマ細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾臓細胞に融合させる。融合より得られたハイブリドーマ細胞を次いで、ＨＡＴ培地で選別し、そこで融合していないミエローマ細胞および非生産的に融合したミエローマ細胞が殺される（非融合脾臓細胞は形質転換されていないので、数日後に死亡する）。本発明のモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞は、たとえば標準のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ｍＧｌｕＲ５Ｍに結合する抗体に対して、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることで検出する。
【００９８】
モノクローナル抗体の調製−ハイブリドーマの他のスクリーニング方法としては、モノクローナル抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体を、ｍＧｌｕＲ５Ｍで組換え体コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（たとえば抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定し、単離可能であり、それによってｍＧｌｕＲ５Ｍに結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離可能である。ファージディスプレイライブラリーを産出し、スクリーニングするためのキットが商業的に入手可能である（たとえば、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、およびストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＳｕｒｆＺＡＰ（登録商標）Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを産出し、スクリーニングするために使用するのに特に適用可能な方法および試薬の例は、たとえばＬａｄｎｅｒらによる米国特許第５，２２３，４０９号、ＫａｎｇらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ９２／１８６１９号、ＤｏｗｅｒらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ９１／１７２７１号、ＷｉｎｔｅｒらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ９２／２０７９１号、ＭａｒｋｌａｎｄらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ９２／１５６７９号、ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ９３／０１２８８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ９２／０１０４７号、ＧａｒｒａｒｄらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ９０／０９６９０号、ＬａｎｄｅｒらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ９０／０２８０９号、Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｒｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２、Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６、Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８、Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０、Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７、Ｂａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２、およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらＮａｔｕｒｅ  （１９９０）３４８：５５２−５５４で見ることができる。
【００９９】
さらに、標準の組換えＤＮＡ技術を用いて作製可能な、ヒトおよび非ヒト部分両方を含むキラルおよびヒト化モノクローナル抗体のような、組換え体抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体も本発明の意図の範囲内である。そのようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、たとえばＲｏｂｉｎｓｏｎらによる国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、Ａｋｉｒａらによる欧州特許第１８４，１８７号、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許第１７１，４９６号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによる欧州特許第１７３，４９４号、ＮｅｕｂｅｒｇｅｒらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ８６／０１５３３号、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号、Ｃａｂｉｌｌｙらによる欧州特許第１２５，０２３号、Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３、Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３、Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６、Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：２１４−２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５、Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９、およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７、Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許第５，２２５，５３９号、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０で説明された方法を用いて、本技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって産出可能である。
【０１００】
抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体（たとえばモノクローナル抗体）を、アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降等の標準の技術によってｍＧｌｕＲ５Ｍを単離するのに使用可能である。抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体は、細胞からの天然ｍＧｌｕＲ５Ｍ、および宿主細胞で発現した組換え産出したｍＧｌｕＲ５Ｍの精製を促進することができる。さらに、抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の発現の量およびパターンを評価するために、（たとえば細胞溶解物または細胞上清内で）、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を検出するために使用可能である。抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体は、たとえば適用した治療計画の効果を決定するために、臨床試験手順の一部分として、組織内でのタンパク質のレベルをモニタするために診断的に使用可能である。検出は、検出可能基質に対する抗体の結合（すなわち物理的連結）によって促進可能である。検出可能な基質の例には、種々の酵素、補足群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質が含まれる。好適な酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補足群の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、蛍光物質の例には、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれ、好適な放射活性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
３．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
【０１０１】
本発明の他の観点は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質（またはその一部分）をコードする核酸を含んでいるベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用するところの語句「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、連結した他の核酸を運搬可能な核酸分子を指す。ベクターの１つの型は、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」であり、これは追加的ＤＮＡ部分をライゲーション可能な環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの他の型は、ウイルスベクターであり、ここで追加的なＤＮＡ部分をウイルスゲノム内にライゲーション可能である。特定のベクターは、挿入された宿主細胞内で自立的に複製可能である（たとえば細菌複製開始を含む細菌ベクターおよびエピゾーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば非エピゾーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内への導入に際し、宿主細胞のゲノムに連結され、それによって、宿主細胞ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、動作可能に連結する遺伝子の発現を指向可能である。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」と呼ぶ。一般的に、組換えＤＮＡ技術で使用される発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書では、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」および「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの型であることから、同義で使用される。しかしながら、本発明は、等しい機能を有する、ウイルスベクター（たとえば複製不全レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）のような他の型の発現ベクターを含むことも意図する。
【０１０２】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現のために好適な形で、本発明の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞の基準に基づいて選択された、発現されるべき核酸配列に動作可能に連結した、１または複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「動作可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、または宿主細胞にベクターが挿入される場合、宿主細胞で）、対象となるヌクレオチド配列が調節配列（群）に連結することを意味する。語句「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（たとえばポリアデニル化シグナル）を含むと意図される。そのような調節配列は、たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）で説明されている。調節配列には、多くの型の宿主細胞内でヌクレオチド配列の常時発現を指向するもの、および特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの（たとえば組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計が、形質導入される宿主細胞の選択、望むタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存することが当業者によって理解される。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書で説明したような核酸によってコードされた、融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド（たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の変異体形態、融合タンパク質など）を産出可能である。
【０１０３】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞中でのｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の発現のために設計可能である。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌細胞、（バキュロウイルス発現ベクターを用いた）昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現することができる。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）でさらに議論されている。あるいは、組換え発現ベクターは、たとえばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳可能である。
【０１０４】
原核細胞中でのタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質いずれかの発現を指向する、常時または誘導可能プロモーターを含むベクターで、大腸菌内で最もしばしば使用される。融合ベクターは、多くのアミノ酸を、そこでコードされたタンパク質に、通常組換えタンパク質のアミノ末端へ加える。そのような融合ベクターは典型的には、３つの目的、１）組換えタンパク質の発現を増加させるため、２）組換えタンパク質の安定性を増加させるため、３）アフィニティ精製にてリガンドとして働くことによって組換えタンパク質の精製で補助するため、に役に立つ。しばしば、融合発現ベクターにおいて、原核細胞開裂部位が、融合部位からの組換えタンパク質の分離、続いて融合タンパク質の精製を可能にするために、融合部位と組換えタンパク質の結合部で導入される。そのような酵素、およびその同帰属認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。一般的な融合発現ベクターには、標的組換え体タンパク質に、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａが融合するｐＧＥＸ（ファルマシア  バイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。
【０１０５】
精製された融合タンパク質をｍＧｌｕＲ５Ｍ活性アッセイで使用可能であり（たとえば、以下で詳細に説明される直接アッセイまたは競合アッセイ）、または、たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に特異的な抗体を産出するために利用可能である。好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルス発現ベクターで発現したｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質を、放射線照射レシピエント内に続いて埋め込まれる骨髄に感染するために使用可能である。次いで対象レシピエントの病状を十分な時間（たとえば６週間）が経過した後に調べる。
【０１０６】
好適な誘導可能非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｘｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写物に依存する。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）によって仲介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写物に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７ｇｎ１遺伝子を有する在外プロファージから、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【０１０７】
大腸菌での組換え体タンパク質発現を最大化するための１つの戦略は、組換え体タンパク質を、タンパク質分解開裂する能力が異常である宿主細菌中でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。他の戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個々のコドンが、好ましく大腸菌内で使用されるように、発現ベクター内に挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａら，（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。そのような本発明の核酸配列の変更は、標準のＤＮＡ合成技術によって実行可能である。
【０１０８】
他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅでの発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）Ｅｍｂｏ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびｐｉｃＺ（インビトロジェン社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれる。
【０１０９】
あるいは、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞内に発現させることができる。培養昆虫細胞（たとえばＳｆ９細胞）中でのタンパク質の発現のために入手可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）および、ｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が含まれる。
【０１１０】
また他の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞内で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞内で使用する場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節要素によって提供される。たとえば、一般的に使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０より由来する。原核細胞および真核細胞両方に対する他の好適な発現系に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の１６および１７章を参照のこと。
【０１１１】
他の実施形態において、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において特異的に核酸の発現を指向することが可能である（たとえば組織特異的調節要素が、核酸を発現するために使用される）。組織特異的調節因子が本技術分野で公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ球特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、とりわけＴ細胞レセプター（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊｌ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０、Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（たとえば神経フィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（たとえば牛乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許第２６４，１６６号）が挙げられる。発達調節プロモーター、たとえば齧歯類ｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も挙げられる。
【０１１２】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクター内に組み込まれた本発明のＤＮＡ分子を含む、組換え体発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にする様式で、調節配列に動作可能に連結する。アンチセンス方向でクローン化された核酸に動作可能に連結した調節配列は、種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ、たとえばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー分子の連続発現を指向するように選択され、または調節配列が、アンチセンスＲＮＡの連続的な、組織特異的、または細胞型特異的発現を指向するように選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が、高効率調節領域の制御下で産出される、組換え体プラスミド、ファージミドまたは無毒化ウイルスの形態であり得、その活性は、ベクターが導入された細胞型によって決定される。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の制御の議論に関しては、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．らによる遺伝的解析のための分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ），Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
【０１１３】
本発明の他の観点は、その中に本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」および「組換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」は本明細書では同義で使用する。そのような用語が、特定の対象細胞のみではなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をも指すと理解される。変異導入または環境的な影響のために、続く世代で特定の改変が起こり得、そのような子孫は、事実、親細胞とは異なる可能性があるが、しかし本明細書で使用するところの用語の範囲内に含まれる。
【０１１４】
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞であってもよい。たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞のような）酵母または哺乳動物細胞で発現させることができる。他の好適な宿主細胞が当業者に公知である。
【０１１５】
ベクターＤＮＡは、従来の形質導入またはトランスフェクション技術を介して、真核または原核細胞内に導入してもよい。本明細書で使用するところの用語「形質導入（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」および「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、宿主細胞内へ、外来核酸（たとえばＤＮＡ）を導入するための種々の本技術分野で公知の技術を指す。宿主細胞への形質導入またはトランスフェクトのための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および他の研究所マニュアルで見ることができる。
【０１１６】
哺乳動物細胞の安定トランスフェクションに関して、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小さな画分のみが、そのゲノムの中に外来ＤＮＡを統合することが可能であることが知られている。これらの統合したものを同定し、選択するために、選択可能マーカー（たとえば抗生物質に対する抵抗性）をコードする遺伝が、対象の遺伝子と共に宿主細胞内に一般的に導入される。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートのような試薬に対する抵抗性を与えるものが含まれる。選択可能マーカーをコードする核酸は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードするのと同じベクター上で、宿主細胞内に導入可能であり、または分離したベクター上で導入可能である。導入した核酸を安定にトランスフェクトした細胞は、薬物選別によって同定可能である（たとえば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、他の細胞は死亡する）。
【０１１７】
培養中の原核または真核宿主細胞等の本発明の宿主細胞を、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を産出（すなわち発現）するために使用可能である。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いて、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を産出するための方法を提供する。１つの実施形態において、方法には、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質が産出されるように、好適な培地中で、（ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞を培養することが含まれる。他の実施形態において、方法にはさらに、培地または宿主細胞からｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を単離することが含まれる。
【０１１８】
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を産出するために使用可能である。たとえば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ｍＧｌｕＲ５Ｍコード配列が組み込まれた受精卵または胚幹細胞である。そのような宿主細胞はついで、外来ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列がそのゲノム内に組み込まれた、非ヒトトランスジェニック動物、または内因性ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列が改変された、相同組換え動物を作製するために使用可能である。そのような動物は、ｍＧｌｕＲ５Ｍの機能および／または活性を研究するため、およびｍＧｌｕＲ５Ｍ活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書で使用するところの用語「トランスジェニック動物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ）」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類であり、前記動物の１または複数の細胞にトランスジーンが含まれる。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが含まれる。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発育する細胞のゲノムに組み入れられ、成熟動物のゲノム内に残る外来ＤＮＡであり、これによってトランスジェニック動物の１または複数の細胞型または組織中でのコードされた遺伝子産物の発現が指向される。本明細書で使用するところの用語「相同組換え動物（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｉｍａｌ）」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、そこでは内因性ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子が、動物の発育の前に、前記動物の細胞、たとえば動物の胚細胞に導入された外来ＤＮＡ分子と内因性遺伝子の間の相同組換えによって改変されている。
【０１１９】
本発明のトランスジェニック動物は、たとえばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵のオス前核内へｍＧｌｕＲ５Ｍコード核酸を導入すること、および擬似妊娠メス里親動物にて前記受精卵を発育させることによって産出することができる。ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡ配列、たとえば配列番号１のもの、または受託番号ＰＴＡ−２７７５でＡＴＣＣに受託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列のものを、非ヒト動物のゲノム内に、トランスジーンとして導入可能である。あるいは、マウスまたはラットｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子のような、ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の非ヒトｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅをトランスジーンとして使用可能である。あるいは、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子相同物を、（上記項目１でさらに説明した）配列番号１の配列、または受託番号ＰＴＡ−２７７５でＡＴＣＣに受託されたプラスミドのＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションに基づき単離し、トランスジーンとして使用可能である。序配列およびポリアデニル化シグナルもまた、トランスジーンの発現の効率を増加させるために、トランスジーン内に組み込むことが可能である。組織特異的調節配列（群）を、特定の細胞に対してｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の発現を指向するために、ｍＧｌｕＲ５Ｍトランスジーンに動作可能に連結可能である。胚操作およびマイクロインジェクションを介しての、トランスジェニック動物、とりわけマウスのような動物を産出するために方法は、本技術分野で慣習的になっており、たとえば、両方ともＬｅｄｅｒらによる米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、Ｗａｇｎｅｒらによる米国特許第４，８７３，１９１号、およびＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍｏｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）にて説明されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の産出のために使用される。トランスジェニック初代動物を、そのゲノム内でのｍＧｌｕＲ５Ｍトランスジーンの存在、および／または前記動物の組織または細胞におけるｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定可能である。トランスジェニック初代動物はついで、トランスジーンを含む更なる動物を繁殖させるために使用可能である。さらに、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードするトランスジーンを有するトランスジェニック動物はさらに、他のトランスジーンを有している他のトランスジェニック動物と繁殖可能である。
【０１２０】
相同組換え動物を産出するために、欠失、添加または置換が導入され、それによって、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子が改変、たとえば機能的に崩壊される、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の少なくとも一部分を含むようにベクターが調製される。ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子はヒト遺伝子（たとえば配列番号１のｃＤＮＡ）であってもよいが、しかしより好ましくはヒトｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の非ヒト相同物（たとえば配列番号１のヌクレオチド配列とストリンジェントにハイブリダイズすることで単離されたｃＤＮＡ）である。たとえば、マウスｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子を、マウスゲノム中の内因性ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子を改変するのに好適な相同組換えベクターを構築するために使用可能である。好ましい実施形態において、ベクターは、相同組換えにおいて、内因性ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子が機能的に崩壊するように設計される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない。または「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ）」ベクターともよばれる）。あるいは、相同組換えにおいて、内因性ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子に変異導入するか、または改変し、ただしまだ機能的タンパク質をコードするようにベクターを設計できる（たとえば、上流調節領域を改変し、それによって内因性ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の発現を変える）。相同組換えベクターにおいて、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の改変部分は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の追加的核酸配列によってその５’および３’末端に隣接し、相同組換えに関して、胚幹細胞中でのベクターによって運ばれる外来ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子および内因性ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子間で起こることが可能になる。一般的に、（５’および３’末端両方での）隣接ＤＮＡの数キロ塩基がベクター内に含まれる（たとえば、相同組換えベクターの説明に関して、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと）。ベクターは、（たとえばエレクトロポレーションによって）胚幹細胞株内に導入され、内因性ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子と相同的に組換えられたｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子が導入された細胞が選別される（たとえば、Ｌｉ，Ｅ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。選別された細胞はついで、動物（たとえばマウス）の胚盤胞内に注入され、凝集キメラが形成される（たとえば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと）。キメラ胚はついで好適な擬似妊娠メス里親動物内に植えられ、胎児が出産となる。その生殖細胞に相同的組換えＤＮＡを有する妊娠マウスを、トランスジーンの生殖細胞系列伝達によって、すべての動物細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を繁殖させるのに使用可能である。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、さらに、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９およびＬｅ  ＭｏｕｅｌｌｅｃらによるＰＣＴ国際特許第ＷＯ９０／１１３５４号、Ｓｍｉｔｈｉｅｓらによ��第ＷＯ９１／０１１４０号、Ｚｉｊｌｓｔｒａらによる第ＷＯ９２／０９６８号、およびＢｅｒｎｓらによる第ＷＯ９３／０４１６９号に説明されている。
【０１２１】
他の実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジーンの調節発現が可能な、選択系を含むように産出可能である。そのような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰルコンビナーゼ系の説明に関しては、たとえば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の他の例は、サッカロマイシス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系をトランスジーンの発現を調製するために使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質両方をコードするトランスジーンを含む動物が必要である。そのような動物は、たとえば二匹のトランスジェニック動物をつがいにさせることによって、「二重」トランスジェニック動物の構築を介して産出可能であり、１つは、選択したタンパク質をコードするトランスジーンを含み、他はリコンビナーゼをコードするトランスジーンを含む。
【０１２２】
本明細書で説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３で説明された方法に従って産出可能である。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞、たとえば体細胞を単離し、増殖周期を出、Ｇ０期に入るように誘導することが可能である。静止細胞をついで、たとえば電気パルスを用いることで、静止細胞を単離したのと同一の種の動物からの除核した受精卵に融合することが可能である。ついで再構成受精卵を、桑実胚または未分化胚芽細胞に発達するように培養し、ついで擬似妊娠メス里親動物に移す。このメス里親動物から生まれた子孫は、細胞、たとえば体細胞を単離した動物のクローンである可能性がある。
４．薬理学的組成物
【０１２３】
本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体、ｍＧｌｕＲ５Ｍリガンド、ペプチド、ペプチドミミックおよび／またはｍＧｌｕＲ５Ｍモジュレーター（また本明細書で「活性化合物（ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」とも呼ぶ）は、投与に好適な薬理学的組成物内に組み込むことができる。そのような組成物は一般的に、核酸分子、タンパク質、抗体、または調節化合物および薬理学的に許容可能な担体を一般的に含む。本明細書で使用するところの語句「薬理学的に許容可能な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）」は、薬理学的投与に適合可能な、任意およびすべての溶媒、分散溶媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。薬理学的に活性な基質のためのそのような培地および試薬の使用が本技術分野でよく公知である。任意の従来の培地または試薬が活性化合物に適合不能である範囲を除いて、組成物中でのその使用が考慮される。補助活性化合物もまた、組成物内に組み込むことができる。
【０１２４】
本発明の薬理学的組成物は、その意図する投与経路と適合するように処方される。投与経路の例には、たとえば静脈内のような非経口、皮内、皮下、経口（たとえば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および膣投与が含まれる。非経口、経皮または皮下適用には、以下の成分、注射のための水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような無菌希釈液、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような好酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート剤、酢酸、クエン酸またはリン酸のような緩衝液および、塩化ナトリウムまたはデキストロースのような弾力性を添加するための試薬を含めることが可能である。ｐＨは、塩化水素酸または水酸化物ナトリウムのような酸または塩基で調節可能である。非経口調製は、ガラスまたはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジまたは多重投与バイアルに入れることが可能である。
【０１２５】
投与可能な、使用に好適な薬理学的組成物には、（水溶性の場合）無菌水溶液、または分散液、および無菌注射可能溶液または分散を即時調整するための無菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、好適な担体には、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合で、組成物は無菌でなければならず、簡単にシリンジ注入可能である程度まで流体であるべきである。製造および保存の条件下で安定であり、細菌及び真菌のような微生物の夾雑活性に対して保護されなければならない。担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコールおよび脂肪ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散溶液であってもよい。好ましい流体性は、たとえばレシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合、必要な粒子の大きさの保持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の活性の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメローザルなどによって達成することが可能である。多くの場合、たとえば組成物中の糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムのような等張試薬が含まれることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長は、たとえば一ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような、吸収を遅らせる試薬を、組成物中に含めることにより達成可能である。
【０１２６】
無菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物（たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体）を、以上で列挙した成分１つまたは組み合わせとともに、好ましい溶媒中に組み込むこと、および必要であれば続いてフィルター滅菌によって調製することができる。一般的に、分散は、活性化合物を、基礎的分散培地と、以上に示したようなものからの、必要な他の成分を含む無菌賦形剤内に組み込むことで調製することができる。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分＋先に無菌滅菌したその溶液からの追加的な望む成分の粉末を産出する、吸引乾燥および凍結乾燥である。
【０１２７】
経口組成物には一般的に、不活性希釈液または食用担体が含まれる。これらは、ゼラチンカプセル内に入れられるか、錠剤内に埋め込まれる。経口治療投与のために、活性化合物を、賦形剤とともに組み込むことが可能であり、錠剤、トローチまたはカプセルの形で使用可能である。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための流体担体を使用して調製可能であり、そこでは流体担体中の化合物を経口で適用し、水を切る、喀出するまたは飲み込む。薬理学的に適用可能な結合剤、および／またはアジュバント物質を、組成物の一部分として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分または同様の性質の化合物の任意のものを含むことができる。微晶質性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチンのような結合剤、でんぷんまたはラクトースのような賦形剤、アラギニン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはトウモロコシデンプンのような崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓのような潤滑剤、コロイド二酸化シリコーンのようなｇｌｉｄａｎｔ、スクロースまたはサッカリンのような甘味料、またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーのような香料添加剤。
【０１２８】
吸入による投与のためには、化合物は、好適な推進剤、たとえば二酸化炭素のような気体、または噴霧器を含む加圧容器またはディスペンサーからのエアゾルスプレーの形態で伝達される。
【０１２９】
全身投与はまた、経粘膜または経皮方法によって行うこともできる。経粘膜または経皮投与に関しては、浸透すべきバリアに対しての適切な浸透剤が処方で使用される。そのような浸透剤は本技術分野で一般的に公知であり、たとえば、経粘膜投与に関して、界面活性剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは座薬の使用で実施することができる。経皮投与に関しては、活性化合物が、本技術分野で一般的に公知のような軟膏、ゲルまたはクリームで処方される。
【０１３０】
化合物はまた、座薬（たとえば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の座薬基体とともに）または腸伝達のための保持浣腸剤の形態で調製することができる。
【０１３１】
１つの実施形態において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル伝送系を含む、制御放出処方のような、体からの急速な除去に対して化合物を保護する担体で調整する。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸のような生物分解性、生物適合性ポリマーが使用可能である。そのような処方の調製のための方法が当業者に対して明らかである。物質はまた、アルザ  コーポレーション（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバ  ファーマシューティカル社（Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）より市販されている。（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞を標的としたリポソームを含む）リポゾーマル懸濁液もまた、薬理学的に許容可能な担体として使用可能である。これらは、たとえば米国特許第４，５２２，８１１号で説明されたような、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１３２】
投与の簡便さ、および投与量の一定化のために、投与ユニット形態中で経口または非経口組成物を処方することはとりわけ利点がある。本明細書で使用するところの投与ユニット形態は、処置すべき対象に対する単一投与量として好適である、生理学的に分離されたユニットを指し、それぞれのユニットは、必要な薬理学的担体と関連した望む治療的効果を産出するために計算した、活性化合物の先に決定した量を含む。本発明の投与ユニットに関する明細は、活性化合物の固有の特性および達成すべき特定の治療効果に、個々の治療のためのそのような化合物を配合する技術分野で固有の制限によって説明され、またこれらに直接依存する。
【０１３３】
そのような化合物の毒性および治療効果は、たとえばＬＤ５０（集団の５０％までの致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的効果量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準の薬理学的手順によって決定可能である。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することができる一方で、感染していない細胞に対する可能性あるダメージを最小化し、それによって副作用を減らすために、そのような化合物を、影響を受ける組織の部位にむける伝達系を設計する考慮をすべきである。
【０１３４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトでの使用のための用量範囲で処方することに使用可能である。そのような化合物の用量は、好ましくは、ほとんどまたはまったく毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。用量は使用する投与形態および使用した投与経路に依存して、この範囲内で変化する。本発明の方法で使用する任意の化合物に関して、治療的効果用量は、細胞培養アッセイからまず予想することができる。用量を動物モデルで処方し、細胞内で決定したようなＩＣ５０（すなわち症状の半最大阻害を達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成可能である。そのような情報は、人での有用な用量をより実際的に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、たとえば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定可能である。
【０１３５】
本発明の核酸分子をベクター内に組み込み、遺伝子治療ベクターとして使用可能である。遺伝子治療ベクターは、たとえば静脈内注射、局所投与（たとえば米国特許第５，３２８，４７０号）によって、または定位注射（たとえばＣｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって対象に伝送可能である。遺伝子治療ベクターの薬理学的調製物には、許容可能希釈液中の遺伝子治療ベクターが含まれ、または遺伝子伝送賦形剤が埋め込まれた低放出マトリックスを含むことができる。あるいは、完全遺伝子伝送ベクターが、組換え細胞、たとえばレトロウイルスから無傷で製造される場合に、薬理学的組成物は遺伝子伝送系を製造する１または複数の細胞を含むことができる。
【０１３６】
薬理学的組成物は、投与の説明書とともに、容器、パックまたはディスペンサー内に含めることができる。
５．発明の使用および方法
【０１３７】
核酸分子、タンパク質、タンパク質相同物、ペプチド、抗体および本明細書で説明した類似のものを、１または複数の以下の方法で使用可能である。ａ）スクリーニングアッセイ、ｂ）予測治療（たとえば診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験モニタリングおよびファーマコジェネティックス）、ｃ）治療の方法（たとえば、治療的および予防的方法）。本明細書にて説明したように、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は１または複数の以下の活性を有する。（１）Ｇタンパク質連結第２メッセンジャー情報伝達経路（たとえば、ジアクリルグリセロールおよび／またはイノシトール三リン酸仲介情報伝達経路）の調節、（２）グルタミン酸性伝達の調節、（３）神経興奮性の調節、（４）シナプス性伝達の調整、（５）神経伝達物質放出（たとえばグルタミン酸放出）の調節、（６）電圧依存および／または電圧非依存および／またはリガンドゲートイオンチャネル（たとえばＫ＋チャネルまたはＣａ２＋チャネル）の調整、（７）神経発達の調整（たとえば、発達中の脳における神経分化、移動および／または生存の調整）、（８）神経変性工程の調節（たとえば、急性または慢性神経変性工程）、および（９）ｍＧｌｕＲ５Ｍ二量体化（たとえば、ｍＧｌｕＲ５ａおよび／またはｍＧｌｕＲ５Ｍｂ二量体化）の調節および／または他のｍＧｌｕＲファミリーメンバーの二量体化（たとえばｍＧｌｕＲ１二量体化）の調節。したがって、本発明の単離核酸配列を、たとえば、以下でさらに説明したように、（遺伝子治療適用において、宿主細胞中での組換え発現ベクターを介して）ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を発現させるため、（たとえば生物学的試料中で）ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子中の遺伝的変化を検出するため、およびｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を調節するために使用可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質および／またはｍＧｌｕＲ５Ｍリガンドの不完全な、または過剰な産出によって特徴づけられる疾患を処置するために使用可能である。さらに、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため、ならびに、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の不十分または過剰な産出または、ｍＧｌｕＲ５Ｍ野生型タンパク質と比較して、少ないかまたは異常な活性を有するｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質型の産出によって特徴づけられる疾患を処置するために使用可能である。さらに、本発明の抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体を、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を検出および単離する、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のバイオアベイラビリティーを調節する、およびｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を調節するために使用可能である。
Ａ．スクリーニングアッセイ
【０１３８】
本発明は、モジュレーター、すなわち、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に結合するか、またはたとえばｍＧｌｕＲ５Ｍ発現またはｍＧｌｕＲ５Ｍ活性における刺激または抑制活性を有する候補または試験化合物または試薬（たとえばペプチド、ペプチドミミック、小分子または他の薬剤）を同定するための方法（本明細書ではまた「スクリーニングアッセイ（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）」とも呼ぶ）を提供する。
【０１３９】
１つの実施形態において、本発明は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  タンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはその活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー、位置帰属可能パラレル固相または液体相ライブラリー、デコンヴォリューションを必要とする合成ライブラリー方法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法、およびアフィニティクロマトグラフィー選別を用いた合成ライブラリー方法を含む、本技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多くのアプローチのうち任意のものを用いて入手可能である。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、一方で他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１４０】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、たとえば、ＤｅＷｉｔｔｅら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９、Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８、Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３、Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９、Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１、およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３にて、本技術分野でみることができる。
【０１４１】
化合物のライブラリーは、溶液中（たとえばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ  （１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒ  米国特許第’４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）またはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  （１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）、（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）、（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）、（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）、（Ｌａｄｎｅｒ上記）で存在してよい。
【０１４２】
１つの実施形態において、アッセイは、ｍＧｕｌＲタンパク質を細胞表面上に発現する細胞を、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質および試験化合物と接触させ、試験化合物の、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質がｍＧｌｕＲへ結合することを調節する能力を測定する、細胞に基づくアッセイである。たとえば、細胞は、哺乳動物由来または酵母細胞であってもよい。試験化合物の、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のｍＧｌｕＲへの結合を調節する能力の測定は、たとえば、試験化合物またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を、試験化合物またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のｍＧｌｕＲタンパク質への結合を、複合体中の標識化化合物を検出することによって測定可能であるように、放射性同位体または酵素標識と共役させることによって実施可能である。たとえば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで、直接的または間接的に標識化でき、前記放射性同位体は、放射線放射の直接計数、またはシンチレーション計数によって検出される。あるいは、化合物またはタンパク質を、たとえば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識化し、前記酵素標識は、好ましい基質の産物への変換を測定することで検出する。
【０１４３】
任意の相互作用物質の標識化を行わずに、試験化合物の、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の相互作用を調節する能力を測定することもまた本発明の意図の範囲内である。たとえば、マイクロフィジオメーターを、試験化合物またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質いずれかの標識化をすることなく、試験化合物とｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質との相互作用を検出するために使用可能である。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２。本明細書で使用するところの「マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）」（たとえばＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒＴＭ）は、光指定可能電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸性にする速度を測定する解析器具である。この酸化速度は、リガンドとレセプター間の相互作用の指標として使用することができる。
【０１４４】
好ましい実施形態において、アッセイには、その細胞表面にｍＧｌｕＲ５タンパク質を発現する細胞を、ｍＧｌｕ５Ｍリガンドと接触させて、アッセイ混合液を形成させること、前記アッセイ溶液を、任意に試験化合物に加えてｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または変異体と接触させること、および試験化合物またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または変異体の、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と相互作用する能力を測定することが含まれる。１つの実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または変異体または試験化合物の、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と相互作用する能力の測定には、ｍＧｌｕＲ５ＭのｍＧｌｕＲ５タンパク質へ結合する能力と比較して、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または変異体または試験化合物の、優先的にｍＧｌｕＲ５タンパク質に結合する能力を測定することが含まれる。
【０１４５】
ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または試験化合物の、ｍＧｌｕＲ５タンパク質に結合するか、または相互作用する能力を測定することは、直接結合を測定する上述の方法の１つで実施可能である。好ましい実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または試験化合物の、ｍＧｌｕＲ５タンパク質に結合するか、または相互作用する能力を測定することは、ｍＧｌｕＲ５タンパク質またはｍＧｌｕＲ５標的分子の下流の活性を測定することで実施可能である。たとえば、標的分子は、細胞内第二メッセンジャーでありえ、その標的分子の活性は、標的（すなわち細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、標的の、好ましい基質における触媒／酵素活性を検出すること、（検出可能マーカー、たとえばルシフェラーゼをコードする核酸に動作可能に連結するｍＧｌｕＲ５−応答性調節要素を含む）レポーター遺伝子の誘導を検出すること、または細胞応答、たとえば増殖応答または神経応答を検出することで測定可能である。
【０１４６】
また他の実施形態において、本発明のアッセイは、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させ、試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性な部分へ結合する能力を測定する、細胞を用いないアッセイである。試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質への結合は、上記したように、直接または間接的いずれかで測定可能である。試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質への結合はまた、リアルタイム  バイオモレキュラー  インターラクション  アナライシス（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ））のような技術を用いて実施可能である。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５．６９９−７０５。本明細書で使用するところの、「ＢＩＡ」は、任意の相互作用物質を標識することなく、リアルタイムで生物特異的相互作用を研究する技術である（たとえばＢＩＡｃｏｒｅＴＭ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を、生物学的物質間のリアルタイム反応の指標として使用可能である。
【０１４７】
好ましい実施形態において、アッセイには、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ｍＧｌｕＲ５Ｍに結合する公知のリガンドと接触させ、アッセイ混合物を形成させること、前記アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と相互作用する能力を測定することが含まれ、ここで、試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と相互作用する能力を測定することには、公知のリガンドと比較して、試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍまたはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する能力を測定することが含まれる。
【０１４８】
他の実施形態において、アッセイは、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性化部分を、試験化合物と接触させ、試験化合物の、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（たとえば刺激するまたは阻害する）能力を測定する、細胞を用いないアッセイである。試験化合物の、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、たとえば、細胞に基づいたアッセイに関して上述した方法の１つにより、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の、下流ｍＧｌｕＲ５Ｍ標的分子の活性を調節する能力を測定することによって実施することができる。たとえば、標的分子の、適切な基質における触媒／酵素活性を、先に説明したように測定可能である。あるいは、ｍＧｌｕＲ５Ｍの、ｍＧｌｕＲに結合するか、または相互作用する能力は、先に説明したように決定可能である。
【０１４９】
また他の実施形態において、細胞を用いないアッセイには、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質および任意にｍＧｌｕＲタンパク質に結合する公知のリガンドと接触させ、アッセイ混合物を形成させること、前記アッセイ混合物を試験化合物に接触させること、および試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と相互作用する能力を測定することが含まれ、ここで、試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と相互作用する能力を測定することには、公知のリガンドと比較して、試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍまたはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する能力を測定することが含まれる。
【０１５０】
本発明の細胞を用いないアッセイは、単離タンパク質（たとえばｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ５タンパク質）の、可溶性および／または膜結合形態の使用が可能である。膜結合形態の単離タンパク質（たとえばｍＧｌｕＲ５タンパク質）を使用する、細胞を用いないアッセイの場合、単離タンパク質の膜結合形態を溶液中で保持するような、可溶化剤の利用が望ましい可能性がある。そのような可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポロ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−クルアミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパン  サルフェート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアミニノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン  サルフェート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンサルフェートのような非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１５１】
本発明の上記のアッセイ方法の１つ以上の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍまたはその標的分子いずれかを固定し、１つまたは両方のタンパク質の非複合化形態から複合化形態の分離を促進し、ならびにアッセイの自動化に順応することが望ましい可能性がある。候補化合物の存在下、または非存在下での、試験化合物のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質への結合、またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の標的物質との相互作用は、反応物を含むために公的な任意の容器内で実施可能である。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験チューブおよび微小遠心チューブが含まれる。１つの実施形態において、融合タンパク質は、１つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合可能にするドメインを加えることで実施可能である。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ｍＧｌｕＲ５Ｍ融合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／試験融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（シグマ  ケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸収させることが可能であり、ついで試験化合物、または試験化合物と、非吸着標的タンパク質またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質いずれかと結合させ、前記混合物を複合体の形成を助ける条件下（たとえば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）インキュベートする。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレート壁を洗浄して、非結合成分を除去し、ビーズの場合マトリックスを固定化し、たとえば上述したように、複合体を直接または間接いずれかで測定する。あるいは、複合体をマトリックスより解離させ、ｍＧｌｕＲ５Ｍ結合または活性のレベルを、標準の技術を用いて測定する。
【０１５２】
タンパク質をマトリックス上に固定するための他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイで使用可能である。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはｍＧｌｕＲ５Ｍ標的分子を、ビオチンおよびストレプトアビジンの共役を用いて固定化できる。ビオチン化ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または標的分子を、本技術分野でよく知られている技術（たとえば、ビオチン化キット、ピアス  ケミカルズ（Ｐｉｅｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンコート９６ウェルプレート（ピアス  ケミカルズ）の壁に固定化することができる。あるいは、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または標的分子に反応するが、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質のその標的分子への結合は干渉しない抗体をプレートの壁に誘導し、非結合標的またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質が抗体共役により壁にトラップされる。ＧＳＴ−固定化複合体に関して上述したものに加えて、そのような複合体を検出する方法には、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いた、複合体の免疫検出、ならびにｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または標的分子と関連する酵素活性を検出することに依存する酵素を使用したアッセイが含まれる。
【０１５３】
他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ発現のモジュレーターが、細胞を候補化合物と接触させ、細胞内でのｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡ  またはタンパク質の発現を測定する方法で同定される。候補化合物の存在下でのｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物がない状態でのｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。ついで候補化合物が、この比較に基づいて、ｍＧｌｕＲ５Ｍ発現のモジュレーターとして同定される。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、存在しないときよりも大きい（統計学的に有意に大きい）場合、その候補化合物は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物として同定される。反対に、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、存在しないときよりも少ない（統計学的に有意に小さい）場合、この候補化合物は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の阻害剤として同定される。細胞におけるｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出することに関して本明細書で説明した方法によって測定可能である。
【０１５４】
本発明のまた他の観点において、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を、ツー−ハイブリッドアッセイまたはスリー−ハイブリッドアッセイで、ｍＧｌｕＲ５Ｍに結合するか、または相互作用する他のタンパク質（「ｍＧｌｕＲ５Ｍ結合タンパク質（ｍＧｌｕＲ５Ｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」または「ｍＧｌｕＲ５Ｍ−ｂｐ」）で、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性に関わるタンパク質を同定するために、「おとりタンパク質（ｂａｉｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」として使用可能である（たとえば、米国特許第５，２８３，３１７号、Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２、Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４、Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６、およびＢｒｅｎｔ  国際特許第ＷＯ９４／１０３００号を参照のこと）。そのようなｍＧｌｕＲ５Ｍ結合タンパク質はまた、たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍ仲介情報伝達経路の下流要素として、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質によるシグナルの伝播に関わる可能性がある。あるいは、そのようなｍＧｌｕＲ５Ｍ結合タンパク質は、非ＧｌｕＲ５Ｍ発現細胞と関連する細胞表面分子であり得、そこでそのようなｍＧｌｕＲ５Ｍ結合タンパク質は化学誘引に関連する。
【０１５５】
ツー−ハイブリッド系は、ほとんどの転写因子の調節特性に基づいており、分離可能ＤＮＡ結合および活性化ドメインからなる。簡単に記すと、アッセイは２つの異なるＤＮＡ構造を使用する。１つの構造においては、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする遺伝子が、公知の転写因子（たとえばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構造では、ＤＮＡ配列ライブラリーからｍｐ、同定されていないタンパク質（「餌（ｐｒｅｙ）」または「資料（ｓａｍｐｌｅ）」）をコードするＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。「おとり」および「餌」タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用可能であり、ｍＧｌｕＲ５Ｍ依存複合体を形成し、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインが最も近くにくる。この近接性により、転写因子に応答性の転写調節部位に動作可能に連結する、レポーター遺伝子（たとえばＬａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現は検出可能であり、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用可能である。
【０１５６】
本発明はさらに、上述したスクリーニングアッセイによって同定された、新規試薬に関する。したがって、適切な動物モデルで、本明細書で説明したように同定した試薬をさらに使用することも、意図の範囲内である。たとえば、本明細書で説明したように同定された試薬（たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍ調節試薬、アンチセンスｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子、ｍＧｌｕＲ５Ｍ特異的抗体、またはｍＧｌｕＲ５Ｍ結合パートナー）を、そのような試薬での処置の効果、毒性または副作用を決定するために、動物モデルで使用可能である。あるいは、本明細書で同定されたような試薬は、そのような試薬の活性機構を決定するために動物モデルで使用可能である。さらに、本発明は、本明細書で説明したような処置のために上述したスクリーニングアッセイによって同定された新規試薬の使用に関する。
Ｂ．検出アッセイ
【０１５７】
本明細書で同定したｃＤＮＡ配列（および相当する完全遺伝子配列）の部分または断片を、ポリヌクレオチド試薬として、多くの方法で使用可能である。たとえば、これらの配列は、（ｉ）クロモソーム上のそのそれぞれの遺伝子をマップすること、したがって、遺伝子病に関連した遺伝子領域を局在すること、（ｉｉ）微小な生物学的試料から個を同定（組織タイピング）すること、および（ｉｉｉ）生物学的試料の法医学的同定を助けることのために使用可能である。これらの適用を以下の項で説明する。
１．クロモソームマッピング
【０１５８】
いったん遺伝子の配列（または配列の部分）が単離されたならば、この配列を、クロモソーム上の遺伝子の局在をマップするのに使用可能である。この工程は、クロモソームマッピングと呼ばれる。したがって、本明細書で説明された、ｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列の部分または断片を、クロモソーム上のｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の局在をマップするのに使用可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列のクロモソームへのマッピングは、これらの配列を、疾患に関連した遺伝子と関連づける重要な第一段階である。
【０１５９】
簡単に記すと、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子を、ｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列からＰＣＲプライマー（好ましくは長さにして１５〜２５ｂｐ）を調製することで、クロモソームにマップ可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列のコンピュータ解析を使用し、ゲノムＤＮＡ中の１つ以上のエキソンに広がらない、したがって、増幅工程を複雑にすることのないプライマーを予想することができる。たとえば、本明細書の実施例３を参照のこと。ついでこれらのプライマーを、個々のヒトクロモソームを含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列に相当するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅断片を産出する。
【０１６０】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物（たとえばヒトおよびマウス細胞）からの体細胞を融合することによって調製される。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドは増殖し、分化するので、これらは徐々にランダムな順番でヒトクロモソームを失うが、しかしマウスクロモソームは維持する。ヒト細胞は増殖できるが、マウス細胞は、特定の酵素を持たないので、増殖できない培地を用いることで、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒトクロモソームが保持される。種々の培地を用いることによって、ハイブリッド細胞株のパネルを確立可能である。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒトクロモソームまたは少数のヒトクロモソームいずれか、および完全な一組のマウスクロモソームを含み、このことにより、個々の遺伝子の、特定のヒトクロモソームへのマッピングが簡単に可能になる（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４）。ヒトクロモソームの断片のみを含む体細胞ハイブリッドもまた、転座および欠損を有するヒトクロモソームを用いることで産出可能である。
【０１６１】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定のクロモソームに対して割り当てるための迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日あたり３つまたはそれ以上の配列を割り当て可能である。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、ｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列を用いて、補局在化を、特定のクロモソームからの断片のパネルで実施可能である。そのクロモソームに対して９ｏ、１ｐまたは１ｖ配列をマップするのに、同様に使用可能な他のマッピング戦略には、（Ｆａｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＰＮＡＳ、８７：６２２３−２７で説明された）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、標識化フロー分類クロモソームでのプレスクリーニング、およびクロモソーム特異的ｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ選別が含まれる。
【０１６２】
有糸分裂中期クロモソームスプレッドに対する、ＤＮＡ配列の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに、一段階での正確なクロモソーム局在化を実施するのに使用可能である。クロモソームスプレッドは、その分裂が、有糸分裂紡錘体を崩壊させるコルセミドのような化学物質によって、中期で阻害された細胞を用いて作成可能である。クロモソームは、トリプシンで簡単に処理可能であり、ついでギームザ染色可能である。明線および暗線のパターンがそれぞれのクロモソームで発色し、クロモソームが個々に同定可能となる。ＦＩＳＨ技術は、約５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列で使用可能である。しかしながら、１，０００塩基より長いクローンが、簡単な検出に十分なシグナル強度を有する、固有のクロモソーム局所により結合しやすい。好ましくは１，０００塩基、より好ましくは２，０００塩基が、妥当な時間量でよい結果を得るために十分である。本技術の概説として、Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８８）を参照のこと。
【０１６３】
クロモソームマッピングのための試薬を、単一のクロモソームまたはそのクロモソーム上の単一の部位を記録するために、個々に使用可能であり、あるいは試薬のパネルを、多数の部位および／または多数のクロモソームを記録するために使用可能である。遺伝子の非コード領域に相当する試薬が実際には、マッピング目的のために好適である。コード配列は、遺伝子ファミリー内で保存される傾向にあり、したがって、クロモソームマッピングの間に交差ハイブリダイズする機会が増加する。
【０１６４】
いったん配列が正確なクロモソーム局所にマップされたならば、配列のクロモソーム上での物理的位置を、遺伝子マップデータと比較可能である（そのようなデータは、たとえば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎでみられ、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを介してオンラインで入手可能である）。ついで、同一のクロモソーム領域にマップされた、遺伝子と疾患の関係を、たとえばＥｇｅｌａｎｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７で説明された、連結解析（物理的近接遺伝子の共遺伝）を介して同定可能である。
【０１６５】
さらに、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子と関連した疾患を患っている個人および患っていない個人の間のＤＮＡ配列の差を決定することができる。変異が、患っている個人の何人か、またはすべてでみられ、患っていない個人でみられない場合、この変異が、特定の疾患の原因物である可能がある。患っている個人および患っていない個人の比較には、一般的に、クロモソームスプレッドからみることができるか、またはＤＮＡ  配列に基づいたＰＣＲを用いて検出することができる欠損または転座のような、クロモソーム中での構造的変化をまず探すことが含まれる。結局のところ、いくつかの個人からの遺伝子の完全な配列決定を、変異の存在を確認するため、および多型から変異を見分けるために実施可能である。
２．組織タイピング
【０１６６】
本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ配列はまた、微小生物学的試料から個体を同定するために使用可能である。たとえば、米国軍は、その軍人を同定するために、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の使用を考慮する。本技術においては、個人のゲノムＤＮＡを１または複数の制限酵素で消化し、サザンブロット上でプローブ化し、同定のために固有のバンドを産出する。本方法は、確実な同定を難しくする欠損、転換、または盗用可能な「Ｄｏｇ  Ｔａｇｓの」現在の制限を受けることない。本発明の配列は、（米国特許第５，２７２，０５７号で説明された）ＲＦＬＰに対する追加ＤＮＡマーカーとして有用である。
【０１６７】
さらに、本発明の配列は、個人のゲノムの選択した部分の実際の塩基ずつのＤＮＡ配列を決定する他の技術を提供するために使用可能である。したがって、本明細書で説明したｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列は、配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製するために使用可能である。ついで、これらのプライマーを、個人のＤＮＡを増幅し、続いてそれを配列決定するために使用可能である。
【０１６８】
本様式で調製した、個人からの相当するＤＮＡ配列のパネルにより、それぞれの個人が、対立遺伝子の違いから、そのようなＤＮＡの固有の組を有することから、固有の個人同定が行われる。本発明の配列は、個人から、および組織からそのような同定配列を得るために使用可能である。本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列は、固有にヒトゲノムの部分を表す。対立遺伝子のバリエーションが、これらの配列のコード領域である程度起き、また非コード領域でそれ以上の程度で起きる。個人ヒトの間での対立遺伝子バリエーションは、５００塩基あたり約１回の頻度で起こる。本明細書で説明したそれぞれの配列は、ある程度まで、個人からのＤＮＡを同定の目的で比較可能な標準として使用可能である。より多くの数の多型が非コード領域で起こるので、個人を分別するためには、より少ない配列が必要となる。配列番号１の非コード配列は、それぞれが１００塩基の非コード増幅配列を産出する、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルで、確実な個人同定を楽に提供する。配列番号３でのもののような予想コード配列を使用する場合、確実な個人同定のための、プライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０１６９】
本明細書で説明するｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列からの試薬のパネルを、固体に対する固有同定データベースを構築するために使用する場合、これらの同様の試薬を、その個人からの組織を同定するために、後に使用可能である。固有の同定データベースを使用することで、個人の確実な同定、生きているか、死んでいるかを、非常に小さな組織試料から得ることが可能である。
３．法医学生物学での部分的ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列の使用
【０１７０】
ＤＮＡに基づく同定技術はまた、法医学生物学で使用可能である。法医学生物学は、たとえば犯罪の加害者を確実に同定するための方法として、犯罪の場面で発見された生物学的証拠の遺伝的タイピングを用いる科学的領域である。そのような同定を行うために、ＰＣＲ技術を使用して、犯罪の場面で発見される組織、たとえば髪または皮膚、または体液、たとえば血液、唾液または精液のような非常に小さな生物学的試料からえられたＤＮＡ配列を増幅可能である。ついで増幅された配列を標準と比較し、これによって、生物学的試料の起源を同定可能となる。
【０１７１】
本発明の配列は、ヒトゲノム中の特定の座を標的とする、ポリヌクレオチド試薬、たとえばＰＣＲプライマーを提供するために使用可能であり、たとえば、他の「同定マーカー（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ」）（すなわち、特定の個人に固有である他のＤＮＡ配列）を提供することによって、ＤＮＡに基づく法医学的同定の信頼性を増強可能ある。以上で言及したように、実際の塩基配列情報は、制限酵素で産出された断片によって形成されるパターンに正確に変わるものとして、同定のために使用可能である。より多くの数の多型が非コード領域で起こるので、配列番号１の非コード領域を標的とする配列がとりわけこの使用のために適切であり、本技術を用いて、個人を識別するのを簡単にする。ポリヌクレオチド試薬の例には、ｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列またはその部分、たとえば少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基の長さを有する、配列番号１の非コード領域から由来する断片が含まれる。
【０１７２】
本明細書で説明したｍＧｌｕＲ５Ｍヌクレオチド配列はさらに、ポリヌクレオチド試薬、たとえばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド技術などで使用することができる、標識化または標識可能プローブを提供するため、たとえば脳組織のような特定の組織を同定するために使用可能である。これは、法医学病理学者が未知の起源の組織を扱うような場合に、非常に有用である。そのようなｍＧｌｕＲ５Ｍプローブのパネルを、種および／または器官の型によって、組織を同定するために使用可能である。
【０１７３】
同様の様式で、これらの試薬、たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍプライマーまたはプローブを、夾雑に対して組織培養をスクリーンする（すなわち培養中に異なる型の細胞の混合物が存在することに対するスクリーンをする）ために使用可能である。
Ｃ．予測医療
【０１７４】
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイおよび臨床試験モニタリングを、予後（予測）目的で使用し、それによって個人を予防的に処置する、予測医療の領域に関する。したがって、本発明の１つの観点は、生物学的試料（たとえば血液、血清、細胞、組織）との関連で、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質および／または核酸発現、ならびにｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を測定し、それによって、異常なｍＧｌｕＲ５Ｍ発現または活性に関連して、個人が疾患または疾病に苦しんでいるかどうか、または疾患の発展のリスクであるかどうかを決定するための診断アッセイに関連する。本発明はまた、個人が、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、核酸発現または活性に関連した疾患が発展するリスクであるかどうかを決定する予後（または予測）アッセイに関して提供される。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子内での変異が、生物学的試料中でアッセイ可能である。そのようなアッセイは、診断または予測目的で使用可能であり、それによって、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、核酸発現または活性によって特徴付けられるか、または関連する疾患の発症の前に、個人を予防的に治療することが可能である。
【０１７５】
本発明の他の観点は、臨床試験中に、ｍＧｌｕＲ５Ｍの発現または活性における試薬（たとえば薬物、化合物）の影響をモニタすることに関する。
【０１７６】
これら、そして他の試薬は、以下の項目で、さらに詳細に説明する。
１．診断アッセイ
【０１７７】
生物学的試料中のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸の存在または不在を検出するための例示的方法には、試験対象から生物学的試料を入手すること、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸の存在が生物学的試料中で検出されるように、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、またはｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする核酸（たとえばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出可能な化合物または試薬と、前記生物学的試料を接触させることが含まれる。ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するために好ましい試薬は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズ可能な標識化核酸プローブである。核酸プローブは、たとえば配列番号１の核酸のような全長ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸または、長さにして少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドで、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドのようなｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸の断片または一部であってもよい。本発明の診断アッセイでの使用のために好適な他のプローブを本明細書で説明する。
【０１７８】
ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質を検出するための好ましい試薬は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質に結合可能な抗体、好ましくは検出可能な標識を伴う抗体である。抗体はポリクローナル、より好ましくはモノクローナル抗体である。抗体そのもの、またはその断片（たとえばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用可能である。プローブまたは抗体に関する語句「標識化（ｌａｂｅｌｅｄ）」は、プローブまたは抗体に検出可能な基質を共役（すなわち物理的に連結）することによって、プローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識化した他の試薬との反応によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを含む意図がある。間接標識の例には、蛍光標識化第二抗体を使用する第一抗体の検出、および蛍光標識化ストレプトアビジンで検出可能であるような、ビオチンでのＤＮＡの末端標識化が含まれる。語句「生物学的試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ）」は、対象から単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含むことが意図されている。すなわち、本発明の検出方法は、生物学的試料中のｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏで検出するために使用可能である。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡの検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術には、ノザンハイブリダイゼーションおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が含まれる。ｍＧｌｕＲ５ＭゲノムＤＮＡの検出のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の検出のためのｉｎ  ｖｉｖｏ技術には、対象内への標識化抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体の導入が含まれる。たとえば、抗体は、対象におけるその存在および局在を標準のイメージング技術によって検出可能である、放射活性マーカーで標識化可能である。
【０１７９】
１つの実施形態において、生物学的試料には、試験対象からのタンパク質分子が含まれる。あるいは、生物学的試料には、試験対象からのｍＲＮＡ分子または試験対象からのゲノムＤＮＡ分子が含まれる。好ましい生物学的試料は、対象より従来の方法によって単離された血清試料である。
【０１８０】
他の実施形態において、方法にはさらに、対照の対象から、対照生物学的試料を得ること、前記対照試料を、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡが生物学的試料中で検出されるように、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出可能な化合物または試薬と接触させること、および、対照試料中のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験試料中のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較すること、が含まれる。
【０１８１】
本発明はまた、生物学的試料中のｍＧｌｕＲ５Ｍの存在を検出するためのキットを含む。たとえば、前記キットは、生物学的試料中でｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質またはｍＲＮＡを検出可能な標識化化合物または試薬、試料中でのｍＧｌｕＲ５Ｍの量を測定する方法、および試料中のｍＧｌｕＲ５Ｍの量を標準と比較するための方法を含むことができる。化合物または試薬は、好適な容器内にパッケージ可能である。キットはさらに、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸を検出するためのキットの使用に関する説明書を含む。
２．予後アッセイ
【０１８２】
本明細書で説明する診断方法はさらに、異常なｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ発現または活性に関連した疾患または疾病を患っている、または発達のリスクである患者を同定するために使用可能である。たとえば、前記診断アッセイまたは以下のアッセイのような本明細書で説明したアッセイを、ＣＮＳまたは精神科疾患のようなｍＧｌｕＲＭタンパク質、核酸の発現または活性に関連した疾患を有する、またはその発達のリスクである患者を同定するために使用可能である。あるいは、診断アッセイは、ＣＮＳまたは精神科疾患を有する患者または発達のリスクを同定するために使用可能である。したがって、本発明は、試験試料を対象より得、ｍＧｌｕＲ５Ｒタンパク質または核酸（たとえばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する、異常なｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ発現または活性に関連した疾患または疾病を同定するための方法を提供し、そこでｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸の存在が、異常なｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ発現または活性に関連した疾患または疾病を有する、またはその発達のリスクである対象に関して診断的である。本明細書で使用するところの「試験試料（ｔｅｓｔ  ｓａｍｐｌｅ）」は、目的の対象から得た生物学的試料を指す。たとえば、試験試料は、生物学的液体（たとえば血清）、細胞試料または組織、とりわけ神経細胞試料または組織である。
【０１８３】
さらに、本明細書で説明する予後アッセイは、異常なｍＧｌｕＲ５Ｍ発現または活性に関連した疾患または疾病を治療するために、対象に試薬（たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミミック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または他の薬物候補）を投与可能であるかどうかを決定するために使用可能である。たとえば、そのような方法は、対象が、ＣＮＳまたは精神科疾患のような疾患に対する試薬で効果的に治療可能かどうかを決定するために使用可能である。あるいは、そのような方法は、対象が、炎症疾患に対する試薬で効果的に治療可能かどうかを決定するために使用可能である。したがって、本発明は、試験試料を得、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸の発現または活性を検出する、対象が、異常なｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸の発現または活性に関連した疾患に対する試薬で効果的に治療できるかどうかを決定するための方法を提供する（たとえば、そこで、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸の発現または活性が、異常なｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲの発現または活性に関連した疾患を処置するために、試薬を投与可能な対象に対して診断的である）。
【０１８４】
本発明の方法はまた、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子中の遺伝的改変を検出し、それによって改変した遺伝子が、異常な炎症応答によって特徴づけられる疾患に対するリスクであるかどうかを決定するのに使用可能である。好ましい実施形態において、本方法には、対象からの細胞の試料中で、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える少なくとも１つの改変、またはｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の誤発現によって特徴づけられる遺伝的改変があるかないかを検出することが含まれる。たとえば、そのような遺伝的改変は、少なくとも１つの、１）ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子からの１または複数のヌクレオチドの欠失、２）ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子への１または複数のヌクレオチドの追加、３）ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の１または複数のヌクレオチドの置換、４）ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子のクロモソーム転位、５）ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの変化、６）ゲノムのメチル化パターンのような、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の異常な改変、７）ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、８）ＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の非野生型レベル、９）ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の対立遺伝子欠損、および１０）ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の好ましくない翻訳後修飾の存在を確かめることによって検出可能である。本明細書で説明したように、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子内の改変を検出するために使用可能である多くのアッセイ技術が、本技術分野で公知である。好ましい生物学的試料は、従来の方法で対象より単離した組織または血清試料である。
【０１８５】
ある実施形態において、改変の検出には、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（たとえば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）中、またはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（たとえばＬａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０、およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）中のプローブ／プライマーの使用が含まれ、後者がとりわけ、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子中の点変異を検出するために有用である（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。本方法には、患者から細胞試料を回収すること、前記細胞試料より核酸（たとえば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離すること、核酸試料を、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる（存在する場合）ような条件下で、１または複数の、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子に特異的にハイブリダイズするプライマーと接触させること、および増幅産物が存在するか、しないかを検出すること、または増幅産物の大きさを検出し、対照試料に対して長さを比較すること、の段階が含まれる。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲが、本明細書で説明した変異を検出するために使用する任意の技術と組み合わせて、予備増幅段階として利用されることが望ましい。
【０１８６】
他の増幅方法には、自己保持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、または任意の他の核酸増幅方法、続いて当業者によく知られている技術を用いた増幅分子の検出が含まれる。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に小数で存在する場合に、それらの核酸分子を検出するためにとりわけ有用である。
【０１８７】
他の実施形態において、試料細胞からのｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子中の変異は、制限酵素開裂パターンの変化によって同定可能である。たとえば、試料および対照ＤＮＡを単離し、（任意に）増幅し、１または複数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片の長さをゲル電気泳動で測定し、比較する。試料と対照ＤＮＡ間の断片長さサイズの差が、試料ＤＮＡ中の変異を示唆する。さらに、配列特異的リボザイムの使用（たとえば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照のこと）を、リボザイム開裂部位の発展または欠失によって特定の変異の存在をスコア化するために使用可能である。
【０１８８】
他の実施形態において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ中の遺伝的変異は、試料および対照核酸、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定可能である（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５、Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｇ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３−７５９）。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍ中の遺伝的変異は、上記Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．で説明されたような光合成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイ中で同定可能である。簡単に記すと、プローブの第一ハイブリッドアレイを使用して、試料中および対照中のＤＮＡの長さ伸長を介してスキャンし、配列的に重なっているプローブの直線アレイを作成することで、配列間の塩基変化を同定することが可能である。この段階により、点変異の同定が可能になる。本段階に続き、第二ハイブリダイゼーションを行い、これにより、検出されたすべての変異体および変異に相当する、より小さな、特異的なプローブアレイを用いることで特定の変異の特性化が可能になる。それぞれの変異アレイは、平行プローブ組を含み、１つは野生型遺伝子と相補的であり、他は変異遺伝子と相補的である。
【０１８９】
また他の実施形態において、本技術分野で公知の任意の多数のシークエンシング反応を、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子を直接配列決定し、試料ｍＧｌｕＲ５Ｍの配列を、相当する野生型（対照）配列と比較することによって、変異を検出するために使用可能である。シークエンシング反応の例には、Ｍａｘｉｍ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ（（１９７７）ＰＮＡＳ  ７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（（１９７７）ＰＮＡＳ  ７４：５４６３）によって発展された自動化シークエンシング技術に基づくものが含まれる。また、質量分析機によるシークエンシングを含む、任意の多数の自動化シークエンシング手順を、診断アッセイを実施するときに（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８）、使用可能である（たとえば、ＰＣＴ国際特許第ＷＯ９４／１６１０１号、Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２、およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）。
【０１９０】
ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子中の変異を検出するための他の方法には、開裂剤からの保護を、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ異種二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出するために使用する方法が含まれる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般的に、「ミスマッチ開裂（ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｃｌｅａｖａｇｅ）」の技術は、野生型ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列を含む（標識化）ＲＮＡまたはＤＮＡを、試験試薬から得た、可能性のある変異ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることにより形成された異種二本鎖を産出することにより開始される。二本鎖デュプレックスを、対照および試料鎖間の塩基対ミスマッチのために存在する可能性のあるような、デュプレックスの一本鎖領域を開裂する薬剤で処理する。たとえば、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスを、ＲＮａｓｅで処理可能であり、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理し、酵素的にミスマッチ領域を消化する。他の実施形態においては、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスいずれかを、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで、およびピペリジンで処理可能である。ミスマッチ領域の消化の後、ついで、得られた物質を、変性ポリアクリルアミドゲル上で大きさによって分離し、変異の部分を決定する。たとえば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７、Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。好ましい実施形態において、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検出のために標識化可能である。
【０１９１】
また他の実施形態において、ミスマッチ開裂反応は、試料細胞から得たｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡ中の点変異を検出し、マッピングするために定義された系にて、二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１または複数のタンパク質（「ＤＮＡミスマッチ修復（ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ）」酵素」と呼ぶ）を使用する。たとえば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチにおけるＡを開裂し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチのＴを開裂させる（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ。（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７−１６６２）。例示的な実施形態に従って、ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列、たとえば野生型ｍＧｌｕＲ５Ｍ配列に基づいたプローブは、試験細胞（群）からのｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズする。デュプレックスを、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、もしあれば、開裂産物を電気泳動プロトコールなどから検出可能である。たとえば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０１９２】
他の実施形態において、電気泳動移動度の変化を使用して、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子の変異を同定する。たとえば、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）を、変異体と野生型核酸間の電気泳動移動度における差を検出するために使用してよい（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６，また、Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ２８５：１２５−１４４およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ  ９：７３−７９を参照のこと）。試料および対照ｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、復元を許容する。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動移動度における得られた変化が、単一塩基対の変化さえも検出可能にする。ＤＮＡ断片を標識するか、または標識化プローブで検出してよい。アッセイの感度は、（ＤＮＡではなく）ＲＮＡを使用することによって増強し得、そこで二次構造は、配列の変化により感受性である。好ましい実施形態において、対象となる方法は、異種二本鎖解析を用いるために、電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖異種デュプレックス分子を分離する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  ｇｅｎｅｔ  ７：５）。
【０１９３】
また他の実施形態において、界面活性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異体または野生型断片の移動を、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いてアッセイする（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）。ＤＧＧＥを解析の方法として使用する場合、ＤＮＡを改変し、たとえばおよそ４０ｂｐの高融解ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲによって加えることによって完全に変性させないようにする。さらなる実施形態において、温度勾配を、変性勾配の代わりに用い、対照および試料ＤＮＡの移動度の差を同定する（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ  ａｎｄ  Ｒｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１２７５３）。
【０１９４】
点変異を検出するための他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が限定はしないが含まれる。たとえば、オリゴヌクレオチドプライマーを、公知の変異が中心に位置し、完全なマッチが見つかる場合にのみハイブリッドを許容するような条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズするように調製することができる（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３、Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０）。そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ増幅標的ＤＮＡ、またはオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション膜に結合し、標識化標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合には、多数の異なる変異にハイブリダイズする。
【０１９５】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を、本発明とともに使用してよい。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように）分子の中心で（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、または、好ましい条件下で、ミスマッチが保存され、またはポリメラーゼ伸長が減少する１つのプライマーの最終３’末端にて（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８）対象の変異を有してもよい。さらに、変異の領域における新規制限部位を、変異の領域に導入し、開裂に基づく検出を行う（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。特定の実施形態において、増幅をまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて実施可能である（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９）。そのような場合、ライゲーションは、５’配列の３’末端で完全なマッチがある場合にのみおこり、このことで、増幅が存在するか、しないかを探すことによって、特定の部位での公知の変異の存在を検出可能となる。
【０１９６】
本明細書で説明した方法は、たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子に関与する疾患または病気の症状またはファミリー歴を示す患者を診断する臨床設定において、従来使用することができるような、本明細書で説明した少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパッケージ化診断キットを用いることで実施してよい。
【０１９７】
さらに、ｍＧｌｕＲ５Ｍが発現する細胞型または組織を、本明細書で説明した診断アッセイで使用してもよい。
３．臨床試験中の効果のモニタリング
【０１９８】
試薬（たとえば薬物、化合物）の、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質の発現および活性における影響（たとえばＣＮＳまたは精神的応答の調節）のモニタリングが、基本的な薬物スクリーニングにおいてのみでなく、臨床試験においても適用可能である。たとえば、本明細書で説明したようなスクリーニングアッセイによって、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加させる、またはｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ活性をアップレギュレートすると測定された試薬の効果を、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子発現、タンパク質レベルが減少し、またはｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ活性がダウンレギュレートされていることを示す対象の臨床試験でモニタ可能である。あるいは、スクリーニングアッセイで、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少させる、またはｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ活性をダウンレギュレートすると測定された試薬の効果を、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子発現、タンパク質レベルが増加し、またはｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ活性がアップレギュレートされていることを示す対象の臨床試験でモニタ可能である。そのような臨床試験において、ｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子、および好ましくは、たとえば炎症疾患に関与する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の表現系の「リードアウト（ｒｅａｄ  ｏｕｔ）」または表現系のマーカーとして使用可能である。
【０１９９】
たとえば、限定するつもりはないが、（たとえば本明細書で説明したようなスクリーニングアッセイで同定された）ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を調節する試薬（たとえば化合物、薬剤または小分子）での処理によって細胞内で調節されるｍＧｌｕＲ５Ｍを含む遺伝子が同定可能である。したがって、たとえば臨床試験において、ＣＮＳまたは精神科疾患における試薬の効果を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＣＮＳまたは精神科疾患に関与するｍＧｌｕＲ５Ｍおよび他の遺伝子の発現のレベルに関してそれぞれ解析することが可能である。遺伝子発現のレベル（すなわち遺伝子発現パターン）は、本明細書で説明したように、ノザンブロット解析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは、本明細書で説明したような方法の１つによって、産出されたタンパク質の量を測定すること、またはｍＧｌｕＲ５Ｍまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量可能である。この方法にて、遺伝子発現パターンは試薬に対する細胞の生理学的応答のマーカー、指標として利用可能である。したがって、本応答状態は、試薬による個々の処置の前、またはその間の種々の点で測定してよい。
【０２００】
好ましい実施形態において、本発明は、（ｉ）試薬の投与の前に、対象より投与前試料を得ること、（ｉｉ）投与前試料中で、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出すること、（ｉｉｉ）対象より、１または複数の投与後試料を得ること、（ｉｖ）  投与後試料中で、ｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出すること、（ｖ）投与前試料中のｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、投与後試料または試料（群）中の、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現または活性と比較すること、および（ｖｉ）以上の結果より、対象に対する試薬の投与を変更すること、の段階を含む、試薬（たとえばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミミック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子または本明細書で説明したスクリーニングアッセイによって同定された他の薬物候補）での対象の処置の効果をモニタするための方法を提供する。たとえば、ｍＧｌｕＲ５Ｍの発現または活性の、検出されたものよりもより高いレベルまで増加させるため、すなわち、試薬の効果を増加させるために、試薬の投与の増加が望ましい可能性がある。あるいは、ｍＧｌｕＲ５Ｍの発現または活性の、検出されたものよりもより低いレベルまで減少させるため、すなわち、試薬の効果を減少させるために、試薬の投与の減少が望ましい可能性がある。そのような実施形態に従って、ｍＧｌｕＲ５Ｍ発現または活性を、観察可能な表現系応答のない場合でさえも、試薬の効果の指標として使用してよい。
Ｄ．治療の方法
【０２０１】
本発明は、疾患のリスクを有する（または疾患になりやすい）対象、または異常なｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ発現または活性と関連する疾患を患っている対象を治療する予防的および治療的両方の方法を提供する。予防的および治療的両方の治療法に関して、そのような治療は、ファーマコジェノミックスの領域より得られた知識に基づいて、特異的に仕立てられるか、または改変可能である。本明細書で使用するところの語句「ファーマコジェノミックス（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）」は、遺伝子シークエンシング、統計的遺伝学、および臨床開発におけるおよび市場における薬物に対する遺伝子発現解析のような、ジェノミックス技術の適用を指す。よりとりわけ、本語は、患者の遺伝子が、薬物に対する応答をどのように決定するか（たとえば患者の「薬物応答表現系（ｄｒｕｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）」または「薬物応答遺伝子系（ｄｒｕｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ）」）の研究を指す。したがって、本発明の他の観点により、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ分子または個々の薬物応答遺伝子型にしたがったｍＧｌｕＲ５Ｍモジュレーターいずれかでの個々の予防的または治療的処置を仕立てるための方法が提供される。ファーマコジェノミックスにより、臨床医学者または医師が、予防的または治療的処置を、治療により最も利益を得る患者に標的化する、および毒性薬剤関連副作用を経験する患者の処置を避けることが可能になる。
１．予防的方法
【０２０２】
１つの観点において、本発明は、対象にｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ５Ｍ発現、または少なくとも１つのｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ活性を調節する試薬、投与することによって、異常なｍＧｌｕＲ５ＭまたはｍＧｌｕＲ発現に関連する疾患または状態、患者において予防するための方法が提供される。異常なｍＧｌｕＲ５Ｍ発現または活性により引き起こされるか、または寄与される疾患に対するリスク状態である対象を、たとえば、本明細書にて説明したような診断または予防的アッセイの任意または組合せによって同定可能である。予防的試薬の投与は、疾患または疾病を予防する、またはその進行を遅らせるように、ｍＧｌｕＲ５Ｍ異常の症状特性の発現の前に実施可能である。ｍＧｌｕＲ５Ｍ異常の型に依存して、たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍ、ｍＧｌｕＲ５Ｍアゴニスト、またはｍＧｌｕＲ５Ｍアンタゴニスト試薬を、対象を処置するために使用可能である。適切な薬剤は、本明細書に説明したスクリーニングアッセイに基づいて決定可能である。本発明の予防的方法を、さらに以下の項で議論する。
２．治療的方法
【０２０３】
本発明の他の観点は、治療目的で、ｍＧｌｕＲ５Ｍ発現または活性を調節する方法に関する。したがって、例示的実施形態において、本発明の調節方法には、ｍＧｌｕＲ５Ｍの活性が調節されるように、細胞を本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ分子と接触させることが含まれる。あるいは、本発明の調節方法には、細胞と関連したｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質活性の１または複数の活性を調節する試薬と細胞を接触させることが含まれる。ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質活性を調節する試薬は、核酸またはタンパク質、ｍＧｌｕＲ５Ｍの天然に存在する標的分子、ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体、ｍＧｌｕＲ５Ｍアゴニストまたはアンタゴニスト、ｍＧｌｕＲ５Ｍアゴニストまたはアンタゴニストのペプチドミミック、または他の小分子のような、本明細書で説明したような試薬であってもよい。１つの実施形態において、試薬が１または複数のｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を刺激する。そのような刺激試薬の例には、細胞内に導入された活性ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質およびｍＧｌｕＲ５Ｍをコードする核酸分子が含まれる。他の実施形態において、試薬は１または複数のｍＧｌｕＲ５Ｍ活性を阻害する。そのような阻害試薬の例には、アンチセンスｍＧｌｕＲ５Ｍ核酸分子および抗ｍＧｌｕＲ５Ｍ抗体が含まれる。これらの調節方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（たとえば細胞を薬剤と共に培養することによって）、またはｉｎ  ｖｉｖｏで（試薬を対象に投与することによって）実施可能である。そのように、本発明は、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性によって特徴づけられる疾患または疾病を患っている個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、本方法には、試薬（たとえば本明細書で説明したスクリーニングアッセイによって同定した試薬）、またはｍＧｌｕＲ５Ｍ発現または活性を調節する（たとえば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）試薬の組合せを投与することが含まれる。他の実施形態において、本方法には、減少したまたは異常なｍＧｌｕＲ５Ｍ発現または活性を補うために、治療として、ｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質または核酸分子を投与することが含まれる。
【０２０４】
ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性の刺激は、ｍＧｌｕＲ５Ｍが異常にダウンレギュレートされている状態、および／またはｍＧｌｕＲ５Ｍ活性の増加が有益な効果を有する可能性があるような状態（たとえば、ｍＧｌｕＲ活性が異常にアップレギュレートまたは増加する状態、たとえばＣＮＳまたは精神科疾患）で望ましい。同様に、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性の阻害が、ｍＧｌｕＲ５Ｍが異常にアップレギュレートする状態、および／またはｍＧｌｕＲ５Ｍ活性の減少が有益な効果を有する可能性がある状態で望ましい。
３．ファーマコジェノミックス
【０２０５】
本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ、ならびに本明細書で説明されたスクリーニングアッセイによって同定されたような、ｍＧｌｕＲ５Ｍ活性（たとえばｍＧｌｕＲ５Ｍ遺伝子発現）において刺激または阻害効果を有する試薬、またはモジュレーターを、異常なｍＧｌｕＲ５Ｍ活性に関連した疾患（たとえばＣＮＳまたは精神科疾患において）を（予防的または治療的に）処置するために個体に投与可能である。そのような処置とともに、ファーマコジェノミックス（すなわち、個々の遺伝子型と、外来化合物または薬剤に対する個々の応答間の関係の研究）を考慮してよい。治療物の代謝における差違によって、薬理学的に活性な薬剤の用量と血中濃度間の関係を変化させることによって、重度の毒性または治療の失敗が導かれる。したがって、臨床医学者または医師は、ｍＧｌｕＲ５Ｍ分子またはｍＧｌｕＲ５Ｍモジュレーターを投与するかどうかを決定する、ならびにｍＧｌｕＲ５Ｍ分子またはｍＧｌｕＲ５Ｍモジュレーターでの治療の用量および／または治療投与計画をあつらえる場合に、関連したファーマコジェノミックス研究で得た知識を適用することを考慮する可能性がある。
【０２０６】
ファーマコジェノミックスは、影響を受けた個人における薬物の性質の変化および異常な働きによる、薬物への応答における臨床的に有意な遺伝的バリエーションを扱う。たとえば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９６，２３（１０−１１）：９８３−９８５およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，  １９９７，４３（２）：２５４−２６６を参照のこと。一般的に、２つの型のファーマコジェノミックス条件を区別することができる。遺伝的条件は、体における薬物の作用方式を変化させる（薬物作用改変）単一因子として送信されるか、または遺伝的条件は、薬物における体の作用方式を変化させる（薬物作用改変）単一因子として送信される。これらのファーマコジェノミックス条件は、まれな遺伝的欠損として、または天然に存在する多型としてのいずれかで起こる。たとえば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損（Ｇ６ＰＤ）は、主要な臨床的にやっかいな問題が、酸化薬剤（抗マラリア類、スルホンアミド類、鎮痛剤類、ニトロフラン類）の摂取およびソラマメ消費後の赤血球溶血である、一般的な遺伝的酵素病である。
【０２０７】
「ゲノム−ワイド関連性（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」として知られる、薬物応答を予測する遺伝子を同定知ることのための１つのファーマコジェノミックスアプローチは、主として、すでに公知の遺伝子関連マーカーからなるヒトゲノムの高分解能マップによる（たとえば、ヒトゲノム上６０，０００〜１００，０００多型または可変部位からなる、「二重対立遺伝子（ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）」遺伝子マーカーマップで、それぞれが２つの変異体を有する）。そのような高分解能遺伝子マップを、特定の観察された薬物応答または副作用と関連したマーカーを同定するために、第ＩＩ／ＩＩＩ相薬物試験に参加する統計学的に有意な数の患者のそれぞれのゲノムのマップと比較可能である。あるいは、そのような高分解能マップを、数千万の公知のヒトゲノム中の一塩基変異多型（ＳＮＰｓ）の組み合わせより合成可能である。本明細書で使用するところの、「ＳＮＰ」は、ＤＮＡのストレッチ中の単一ヌクレオチド塩基にて起こる共通の変化である。たとえば、ＳＮＰは、ＤＮＡ１０００塩基あたり１回起こる。ＳＮＰは、疾病工程に関連する可能性があるが、しかしながら、大部分は疾病と関連してはいない。そのようなＳＮＰｓの発生に基づいて、遺伝的マップを考えると、個体を、その個々のゲノム内のＳＮＰｓの特定のパターンに依存して遺伝的カテゴリーにグループ化できる。そのような様式において、治療投与計画を、そのような遺伝的に類似の個体間で共通である可能性のある特徴を考慮して、遺伝的に類似の個体のグループに対して実施可能である。
【０２０８】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｇｅｎｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」と呼ばれる方法を、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために使用可能である。本方法に従って、薬物標的をコードする遺伝子が公知の場合（たとえば、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質）、その遺伝子のすべての共通な変異体が集団内でわずかに簡単に同定可能であり、他に対して１つの遺伝子の型を有することが、特定の薬物応答に関連するかどうか決定することができる。
【０２０９】
例示的実施形態として、薬物代謝酵素の活性が、薬物作用の強度および期間両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（たとえばＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見により、なぜ数人の患者が、予想される薬物効果を持たず、標準の安全な薬物用量を服用した後に、過大な薬物応答および重度の毒性を示すのかということに対する説明が提供された。これらの多型は、集団内で、２つの表現系、過剰代謝者（ＥＭ）および不全代謝者（ＰＭ）で表現される。ＰＭの患者数は異なる集団間で異なる。たとえば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、高い多型性であり、いくつかの変異がＰＭで同定されており、すべてが機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不全を導く。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の不全代謝者は、標準の用量を受けると、非常に頻繁に、過大な薬物応答および副作用を経験する。そのＣＹＰ２Ｃ６形成代謝物モルフィンによって仲介されるコデインの鎮痛効果に関して示されたように、代謝物が活性治療部位である場合、ＰＭは何の治療応答も示さない。他の過剰者は、標準の用量で反応しない、超急速代謝者と呼ばれる人たちである。最近、超急速代謝の分子的な基礎が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものであると同定された。
【０２１０】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）」と呼ばれる方法を、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために使用できる。たとえば、薬物（たとえば、本発明のｍＧｌｕＲ５Ｍ分子またはｍＧｌｕＲ５Ｍモジュレーター）を投与された動物の遺伝子発現が、毒性に関連した遺伝子経路が動作するかどうかの示唆を与える。
【０２１１】
１つ以上の上記ファーマコジェノミックスアプローチから産出された情報を使用して、個々の予防的または治療的処置に対する適切な用量および治療投与計画を決定可能である。用量または薬物選択に適用する場合、この知識は副作用または治療の失敗を避け、したがって、ｍＧｌｕＲ５Ｍ分子または、本明細書で説明した例示的スクリーニングアッセイの１つによって同定されたモジュレーターのような、ｍＧｌｕＲ５Ｍモジュレーターで対象を処置したときに、治療的または予防的効果を増強をすることが可能である。
【０２１２】
本発明はさらに、制限として構築されるべきではない、以下の実施例によって例示される。本明細書を通して引用された、すべての参考文献、特許および発行された特許明細書は、参考文献として本明細書に組み込まれている。本明細書を通しての、ワールドワイドウェブ（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ）の部分として維持されているウェブサイトへの参照は、接頭文字ｈｔｔｐ：／／によって本明細書で参照される。そのようなウェブサイトに含まれる情報は、公的に入手可能であり、引用されたアドレスにコンタクトすることによってコンピュータ上でアクセス可能である。
【実施例】
【０２１３】
実施例１：ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡの同定と特性化
【０２１４】
本実施例において、ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍ（ここでは同義で「ＹＩ１７６」ともいう）をコードする遺伝子の同定および特性化を説明する。
ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡｓの単離
【０２１５】
ＹＩ１７６を示す全長クローンを、成人ヒト脳ｍＲＮＡ（クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）（登録商標））から由来したｃＤＮＡライブラリー内で同定した。（部分的ＹＩ１７６もまた、クローンテック（登録商標）海馬ｃＤＮＡライブラリーより単離した。）ヒトクローンは、ｍＧｌｕＲ５Ｍのおよそ３６９アミノ酸をコード可能な、およそ１１１０ヌクレオチドのタンパク質コード配列（すなわちオープンリーディングフレーム）を含有するおよそ１８２３ｂｐの挿入物を含有した。
【０２１６】
ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列を図１および配列番号１で示す。この核酸によってコードされた全長タンパク質は、約３６９アミノ酸を含み、図１および配列番号２で示したアミノ酸配列を有する。配列番号１のコード部分（オープンリーディングフレーム）を配列番号３として記載する。
ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍの解析
【０２１７】
ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍのアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）により、ｍＧｌｕＲ５Ｍが、ヒト代謝調節型グルタミン酸レセプター５（ｍＧｌｕＲ５）のＮ末端とかなり類似していることが明らかになった。特に、同定されたｍＧｌｕＲ５Ｍタンパク質は、ｍＧｌｕＲ５タンパク質のＮ末端細胞外結合ドメインとほぼ同一であるＮ末端を有する（たとえばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（登録商標）受託番号Ｐ４１５９４）。ｍＧｌｕＲ５Ｍのアミノ酸１〜３０３は、ｍＧｌｕＲ５ａおよび／またはｍＧｌｕＲ５ｂのＮ末端細胞外ドメインと９７％まで同一である。一方、アミノ酸３０４〜３６９は、ＢＬＡＳＴ解析によって決定されたように固有である。
【０２１８】
最近のＢＬＡＳＴ検索により、ＲＮＦ１８（遺伝子銀行受託番号ＡＢ０３７６８２（Ｙｏｓｈｉｋａｗａら（２０００）ＢＢＡ  １４９３：３４９−３５５）を有する睾丸特異的環状フィンガータンパク質）と呼ばれるｃＤＮＡが、３’末端でＹＩ１７６と同一性を共有するとして同定された。さらに、ＥＳＴが、ＹＩ１７６／ｍＧｌｕＲ５領域に広がる配列を含有するとして報告され（ＧＢＥＳＴＨＵＭ３＿ＲＥＬ：ＢＥ６７４４２２およびＧＢＥＳＴＨＵＭ３＿ＲＥＬ：ＢＥ４６７４７７）、このことは、（たとえばｍＧｌｕＲ５人工物のようなライブラリー人工物と比較して）ＹＩ１７６が、真のｍＲＮＡを表している証拠である。
【０２１９】
部位検索の結果、配列番号２の約アミノ酸１５８〜１７６にて、Ｇタンパク質レセプターファミリー３＿１コンセンサス配列が同定された。ｍＧｌｕＲ５Ｍはまた、配列番号２の約アミノ酸８８〜９１および２１０〜２１３で、Ａｓｎ糖鎖付加部位を含有することが予想される。
ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡの組織分布
【０２２０】
本実施例は、ノザンブロット解析によって判定されたような、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡの組織分布を説明する。
【０２２１】
種々のＲＮＡ試料でのノーザンブロットハイブリダイゼーションを以下のように実施した。クロンテックヒト多重組織ノーザン（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎｓ）（登録商標）およびヒト多重組織アレイ（Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｒｒａｙ）（登録商標）膜を、取り扱いプロトコルおよび３２Ｐ−標識化ＤＮＡプローブを用いてプローブ化した。ＹＩ１７６−特異的配列（配列番号１のヌクレオチド９５９−１１０３およびヌクレオチド１４８１−１８４６）を含有するプローブを以下のように生成した。単離されたＹＩ１７６コロニーからのプラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）Ｋｉｔおよび取扱いプロトコルを用いて調製した。続いて、取扱説明書に従って、ＤＮＡをＰｓｔＩおよびＮｏｔＩ、またはＢｇｌＩＩおよびＡｐａＩで制限消化した。制限断片を、１．５％アガロース、０．１μｇ／ｍｌ臭化エチジウム、１×ゲル上のゲル電気泳動によってサイズ画分化した（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２）。適切なサイズの臭化エチジウム染色ＤＮＡバンド（ＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ〜３６５ｂｐ、ＢｇｉＩＩ／ＡｐａＩ  〜１４４ｂｐ）をアガロースゲルより切り取った。次に、ＤＮＡをクローンテックＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）核酸精製キットおよび取り扱いプロトコルを用いて抽出した。抽出したＤＮＡを、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ  ＩＩ（登録商標）ランダムプライマー標識化キットおよびプロトコルを用いて、Ｒｅｄｉｖｕｅ（登録商標）（α３２Ｐ）ｄＣＴＰで標識化した。組み込まれなかった（α３２Ｐ）ｄＣＴＰを、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のＮＩＣＫＴＭカラムおよびプロトコルで除去した。膜を、非特異的結合相互作用を阻止するためにプレハイブリダイズし、ついで、標準の条件で、３２Ｐ標識化ＹＩ１７６プローブの適切な一部分でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、膜を風乾させ、Ｘ−線フィルムに曝露し、続いて感光させて解析した。
【０２２２】
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎｓ（登録商標）の解析では、バンドは検出されなかった。しかしながら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｒｒａｙ（登録商標）膜では、ＹＩ１７６が、心臓や他の非神経組織ではなく、神経で発現されていることを示した。さらなるノーザン解析より得られたものに加えて、これらのデータは、ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｍＲＮＡが、全脳、大脳、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、側頭葉、大脳の中心回、橋、小脳、脳梁、扁桃、尾状核、海馬、延髄、被殻、黒質、中隔核、視床、および胎児脳で検出可能であることを示唆する。あきらかに、ｍＧｌｕＲ５Ｍの発現は、中枢神経系の細胞および／または組織で優位である。
実施例２：ｍＧｌｕＲ５Ｍ  ｃＤＮＡの同定および特性化
【０２２３】
本実施例は、ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍ（ここで同義として「ＹＩ１７６」ともいう）をコードする遺伝子のクロモソームマッピングを説明する。
【０２２４】
ＹＩ１７６およびｍＧｌｕＲ５のクロモソーム局在を、適切な関連クエリー配列を用いてＨＴＧＳデータベースのＢＬＡＳＴ（登録商標）検索によって決定した。これらの解析により、ｍＧｌｕＲ５Ｍが、クロモソーム１１に割り当てられたＢＡＣにマップされること、およびＹＩ１７６がクロモソーム１１およびクロモソーム３に割り当てられたＢＡＣにマップされることが示された。特に興味深いことは、ＹＩ１７６コードＢＡＣの少なくともいくつかが、最近、統合失調症および関する精神科疾患に関連するバランス転座事象で影響する１つの領域として同定された（Ｍｉｌｌａｒら（２０００）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：１４１５−１４２３）、クロモソーム１１の領域にマップされるという事実である。とりわけ、Ｍｉｌｌａｒとその共同研究者らは、研究された大きなスコットランド人ファミリーにおける、統合失調症および関連精神科疾患で分離するバランス（１：１１）（ｑ４２．１；ｑ１４．３）転座を説明した。Ｍｉｌｌａｒおよびその共同研究者らは、クロモソーム１上の影響を受ける領域を解析し、とりわけ、２つの新規遺伝子、統合失調症内崩壊１および２（Ｄｉｓｔｒｕｐｔｅｄ−Ｉｎ−Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ１および２（ＤＩＳＣ１およびＤＩＳＣ２））を説明し、神経系機能において役割を演じ、精神科疾病に影響を受けると信じている。Ｍｉｌｌａｒとその共同研究者らは、影響を受けたクロモソーム１１領域を、ブレークポイント領域中の遺伝子の死亡によって特徴付けられるとして説明し、このクロモソーム上での任意の遺伝子の発現が、転座によって影響を受ける可能性があると結論づけた。上述したクロモソームマップングデータ（たとえば放射ハイブリッドマッピング）、ＹＩ１７６  ｍＲＮＡの特異的発現パターン、ならびにゲノム予測により、この遺伝子が、統合失調症および／または他の精神科疾患に対する候補として示唆された。
実施例３：ＹＩ１７６の放射ハイブリッドマッピング
【０２２５】
放射ハイブリッドマッピングを、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ  ４  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐａｎｅｌ（カタログ番号第ＲＨ０２．０２、リサーチジェネティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．））および取り扱いプロトコルを用いて実施した。簡単に記すと、プライマー５’ＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＣＣおよび５’ＴＴＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＧＴＣＣでのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、それぞれの体性ハイブリッドクローンからの鋳型ＤＮＡを用いて実施した。反応混合物を、以下の最終濃度、成分で産出した。５０ｎｇのＤＮＡ、各８ｐｍｏｌの各０．２ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ（アマシャム  ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、１ユニットＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）ポリメラーゼ、１×反応緩衝液（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２。本混合液を９５℃で１０分間、続いて９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で２３秒間の３０サイクルでインキュベートした（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ  ＰＴＣ−２２５）。ＰＣＲ増幅産物を３％アガロース、１×ＴＡＥゲル上でサイズ画分した（Ｍａｎｉａｔｉｓら）。それぞれの体性ハイブリッドクローンを、ＰＣＲ産物の存在または不在に関してスコア化した。結果は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｃｏｎｔｉｇ／ｒｈｍａｐｐｅｒ．ｐｌまたはＲＨマップングに関して、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＲＨｓｅｒｖｅｒ／ＲＨｓｅｒｖｅｒ．ｓｈｔｍｌに投稿した。ＭＩＴマップングサーバーが、Ｄ１１Ｓ１３５０からのクロモソーム１１、３３．３３ｃＲに対して本遺伝子を割り当てた。Ｓａｎｇｅｒマッピングサーバーは、本遺伝子を、マーカーＡＦＭａ１３１ｘｄ５とＡＦＭ３４４ｚｇ１の間のクロモソーム１１に割り当てた。
実施例４：ＨＥＫ２９３細胞内での組換え体ＹＩ１７６タンパク質の発現
【０２２６】
ＹＩ１７６  ｃＤＮＡを、取扱説明書に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）ＦＬＰ−ＩＮ系を用いてＨＥＫ２９３細胞に安定にトランスフェクトした。ＹＩ１７６タンパク質（検出のためにタグ化したエピトープ）は、配列解析より予想されたように、タンパク質が分泌されることを確かめるために培地中で検出可能である。
実施例５：ｍＧｌｕＲ５との、組換え体ＹＩ１７６タンパク質の異種二量体形成
【０２２７】
ＨＥＫ２９３内での一過性コトランスフェクションを、取扱説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（登録商標）系（インビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。試料１：ｒｔＶ５として本明細書で言及される（細胞外イドメインを含むが、膜貫通ドメインを欠く、ｍＧｌｕＲ５残基１〜５７６を含む）ｍＧｌｕＲ５のＶ５−タグ化分泌形態をコードするｃＤＮＡ、および全長（ＦＬ）ｍＧｌｕＲ５をコトランスフェクトした細胞。試料２：ｒｔＶ５のみをトランスフェクトした細胞。試料３：ＹＩ１７６−Ｖ５（タグ化ＹＩ１７６）のみをトランスフェクトした細胞。試料４：ＹＩ１７６−Ｖ５およびＦＬ  ｍＧｌｕＲ５をコトランスフェクトした細胞。試料５：ＦＬ  ｍＧｌｕＲ５のみをトランスフェクトした細胞。試料６：モックトランスフェクト細胞。
【０２２８】
細胞膜画分を、十分に確立されたプロトコル、すなわち細胞溶解、続いて洗浄および遠心段階により細胞質、核および膜画分を分離する方法に従って、トランスフェクトした細胞より調製した。タンパク質を、抗ｍＧｌｕＲ５抗体で細胞膜画分より免疫沈降し、次いで、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ウエスタンブロット解析を、抗Ｖ５タグ特異的抗体を用いて実施した。結果は表１に列記する。
【表１】
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【０２２９】
Ｖ５−タグ化（分泌）ｍＧｌｕＲ５：ＦＬ  ｍＧｌｕＲ５複合体が試料１で検出され、このことは、タグ化（分泌）ｍＧｌｕＲ５の、細胞膜にて発現された、ＦＬ  ｍＧｌｕＲ５レセプターとの二量体化を示唆する。なお、ＹＩ１７６：ＦＬ  ｍＧｌｕＲ５複合体が試料４で同様に検出され、これは、ＹＩ１７６が、細胞膜に発現されたＦＬ  ｍＧｌｕＲ５と二量体化可能であることを示唆する。
均等論
【０２３０】
当業者は、本明細書で説明した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、単に通常の実験を用いて確かめることが可能である。そのような均等物は以下の請求項に組み込まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】ヒトｍＧｌｕＲ５ＭのｃＤＮＡ配列および予想されるアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド配列（パネルＡ）は配列番号１の核酸１〜１８２３に相当する。コード領域は下線を引いている。アミノ酸配列（パネルＢ）は、配列番号２のアミノ酸１〜３６９に相当する。
【図２】ヒトｍＧｌｕＲ５Ｍのアミノ酸配列（配列番号２）、ヒトｍＧｌｕＲ５の第１の３７０アミノ酸残基（配列番号４のアミノ酸残基１〜３７０）、およびラットｍＧｌｕＲ５の第１の３６９アミノ酸残基（配列番号５のアミノ酸残基１〜３６９）の多重配列アライメント（ＭＳＡ）を示す。アライメントは、ＤＮＡＳＴＡＲ配列解析ソフトウェアの一部であるＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（たとえばバージョン３．１．７）の一部であるＣｌｕｓｔａｌアルゴリズムを用いて実施した。対になっているアライメントパラメータは以下の通りである。Ｋ−ｔｕｐｌｅ＝１、ＧａｐＰｅｎａｌｔｙ＝３、Ｗｉｎｄｏｗ＝５、Ｄｉａｇｏｎａｌｓ  ｓａｖｅｄ＝５。多重アライメントパラメータは以下の通りである。Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０およびＧａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０。アスタリスクは、配列したタンパク質中の重要な保存残基を示す。
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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