(57)【要約】本発明は、眼表面異常の治療のための医薬組成物に関する。本発明によると、ＳＯＤ、ＳＯＤ模倣体及び誘導体、ラセミ体のα−リポ酸とそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマー、及び、これら化合物の混合物からなる群より選択される抗酸化剤は、眼表面異常の治療及び／又は予防薬の製造に使用される。本発明は、人間医学及び獣医学に適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体、スーパーオキシドジスムターゼ誘導体、ラセミ体のα−リポ酸、α−リポ酸のＲ＋エナンチオマー、α−リポ酸のＲ−エナンチオマー、及び、これら化合物の混合物からなる群より選択される抗酸化剤の、人間又は動物の眼表面異常の治療及び／又は予防薬の製造における使用。
【請求項２】
前記抗酸化剤はＳＯＤ、ＳＯＤ誘導体又は模倣体である
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＳＯＤは小麦ＳＯＤである
ことを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＳＯＤ、ＳＯＤ誘導体及び／又はＳＯＤ模倣体は薬剤中に１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの濃度で含有される
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記抗酸化剤はラセミ体のα−リポ酸及び／又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーである
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記抗酸化剤はラセミ体のα−リポ酸である
ことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記ラセミ体のα−リポ酸及び／又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーは、薬剤中に０．０５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの濃度で含有される
ことを特徴とする請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
前記抗酸化剤はラセミ体のα−リポ酸及び／又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーの混合物、及び、ＳＯＤ又はＳＯＤ誘導体又は模倣体である
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記α−リポ酸又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーは、薬剤中に０．０５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌの濃度で含有され、前記ＳＯＤ及び／又はＳＯＤ誘導体又は模倣体は、薬剤中に１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌの濃度で含有される
ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記眼表面異常は眼の乾燥を引き起こす
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記眼表面異常は角膜細胞の劣化である
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記眼異常は、オゾン、酸化窒素、二酸化硫黄、揮発性有機化合物、及び、ディーゼルエンジンから放出される粒子等の環境物質にさらされることに起因する
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記眼表面異常は、コンピューター画面、テレビ画面又はビデオモニターに眼を長時間さらされることに起因する
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記眼表面異常は、コンタクトレンズの装用に起因する
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記眼異常は、塩水及び／又は塩素消毒した水にさらされることに起因する
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記眼異常は、紫外線Ａ及び／若しくはＢ及び／若しくはＣ、又は、Ｘ線、又は、γ線、又は、放射線にさらされることに起因する
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記眼異常は、微生物、ウィルス及び／又は菌類にさらされることに起因する
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記眼表面異常は、シェーグレン病、眼瞼炎又は眼性酒さである
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記眼表面異常は、アレルゲンにさらされることに起因し、炎症反応や眼表面の劣化からなる
ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記眼異常は、眼に局所的に投与する組成物中に含有される１種以上の防腐剤にさらされることに起因する
ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記防腐剤が塩化ベンザルコニウムである
ことを特徴とする請求項２１に記載の使用。
【請求項２２】
前記薬剤は、目薬、ゲル又は軟膏の形状であり、薬学的に許容される賦形剤も含有する
ことを特徴とする請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体、スーパーオキシドジスムターゼ誘導体、ラセミ体のα−リポ酸、α−リポ酸のエナンチオマー、及び、これら抗酸化剤の混合物からなる群より選択される抗酸化剤の、人間又は動物の眼表面異常の治療及び／又は予防薬の製造における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
眼の表面は、眼の奥の媒質と外部環境を隔てている移動性の粘膜である。像を網膜に送るための、外側に開いた眼の透明な窓である角膜は、その透明性がなくなるということは盲目に等しく、人によっては永久に盲目となる場合もあるため、整合性が保たれる必要がある。
【０００３】
眼の表面は、眼を外部刺激から守るための解剖学的及び機能的なバリヤーとして見なされるべきであり、３つの部分、すなわち角膜、涙膜（ｌａｃｒｉｍａｌ  ｆｉｌｍ）及び結膜からなっている（Ｈｏａｎｇ−Ｘｕａｎ  Ｔ．１９９８年、Ｐｏｕｌｉｑｕｅｎ  Ｙ．１９９１年、Ｒｉｇａｌ  Ｄ．１９９３年、Ｂａｕｄｏｕｉｎ  Ｃｈ．１９９８年）。
【０００４】
その解剖学的構造及び涙膜との界面であるという特性により、角膜上皮は、その下の角膜成分及び眼内の媒質を保護するために必要なバリヤー機能を果たしている。
【０００５】
涙膜は次の３層、厚さ０．１μｍの脂質層、７μｍの水性中間層、及び、粘液の多い奥の層からなっている。この粘液は、結膜上皮の内側にある杯細胞より分泌されるもので、眼の表面を覆っており、表面細胞の一番外側の細胞質膜とグリコカリックスを介して接触している。
【０００６】
涙膜はその物理化学的及び免疫学的性質によって作用する。瞬きすることで微生物、異物、及び、角膜表面に存在する落屑した上皮細胞を、下結膜嚢の粘膜で覆うことにより継続的に流し出し、除去する。このような役に立つ流涙によって、あらゆる微生物の付着を予防し、角膜−結膜表面を洗い流して完全に洗浄することができる。
【０００７】
流涙の力学的な役割は、涙のｐＨとその変動、温度及びオスモル濃度と関係がある。ラクトフェリン、リゾチーム及び免疫グロブリンを含有しているため、涙は角膜の非特異的防御手段として作用する。涙による上記非特異的な手段は、結膜組織の特定成分と深い関わりがある。
【０００８】
上皮血漿膜の涙粘液、糖脂質及び糖タンパク質からなる複合体が、角膜表面の性質を決定する。涙膜が存在しない場合には、上皮表面が疎水性になり、涙の水相は表面に広がらず、水滴として沈着する。ムチンは、表面張力を下げることによって涙の水性成分を拡散させて上皮表面に吸収されるようにし、それによって瞬きを続ける間安定な涙膜を保つことができる。
【０００９】
粘膜層に異常が起きると、涙膜の安定性が損なわれ、亀裂が生じ、乾燥点が形成される。これらは瞬きによって表面が新しくなった直後に生じる。涙膜の付着性を高めることによって、表面細胞の微絨毛や微襞壁等の一番外側の部分が拡大し、涙膜の安定性が良好になる。
【００１０】
角膜−結膜表面が劣化すると、上皮表面への微生物の付着が促進される。
【００１１】
角膜自身を保護するため、角膜にも結膜がある。この結膜は、血管新生化した粘膜であり、眼表面及び上下眼瞼の裏表面を覆っていて、涙膜の安定性及び角膜の透明性を保つために不可欠な粘液を分泌している。
【００１２】
結膜は重要な防御の役割を果たしており、十分に血管新生化されている。そして、炎症反応を引き起こし、この反応に加わって免疫グロブリンを合成することのできる免疫担当細胞を豊富に含んでいる。さらに、微絨毛等の形態的特徴や上皮細胞の酵素活性等の生化学的特徴を有しているため、ウィルス等の外来粒子を包み込んで食作用により破壊することができる（Ｈｏａｎｇ−Ｘｕａｎ  Ｔ．ら、１９９８年）。
【００１３】
従って、生理学的に非常に貴重な角膜／結膜／涙膜の３部分からなる組織は、以下の要因：
−環境物質による眼表面への攻撃、
−涙膜の質、量の低下（ドライアイ症候群）、
−アレルギー、又は、
−眼表面の慢性的な感染症
といった要因によって炎症を起こす可能性がある。
【００１４】
この炎症は、非常に反応性の高い化学種であるフリーラジカルの放出を引き起こす（Ｌｅｍｐ  Ｍ．Ａ．１９９９年、Ｓａｖｏｕｒｅ  Ｎ．１９９３年）。フリーラジカルは、涙膜と角膜に直接影響して、眼の乾燥を引き起こす。
【００１５】
眼表面の病理学においては、ポリ不飽和脂肪酸を多く含んでいるために粘膜に対する毒性の高い種である酸素のフリーラジカルのために、酸化ストレスが大きな位置を占める。
【００１６】
フリーラジカルは最外殻に不対電子１つを有する化学種であるが、この電子が、最外殻に電子が２つ存在している場合と比較して、フリーラジカルの不安定性を高くしている（Ｐｒｙｏｒ  Ｗ．Ａ．１９８６年、Ｓａｖｏｕｒｅ  Ｎ．１９９３年）。
【００１７】
一次ラジカルは、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２・−）であり、分子酸素からのフリーラジカル鎖の起点となる。電子を得て分子酸素（Ｏ２）が還元され、その結果、酸素の活動的な形態であるスーパーオキシドアニオン（Ｏ２・−）が放出される。不均化反応を経て、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２・−）は過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を媒質中に放出する。Ｈ２Ｏ２はその後、非常に反応性の高い種であるヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）に変換される。この反応には、二価鉄の状態の鉄や銅等の遷移金属の存在が必要である。フリーラジカルの酸化において、ヘモグロビンから三価鉄を大量に得ることができる。
【００１８】
一酸化窒素（ＮＯ・）は単一分子であり、窒素原子を中心とするフリーラジカルである。これは構成型ＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）によって生体内で形成されるが、特定の病状においては、他のＮＯＳ、誘発性ＮＯＳが発現する可能性がある。
【００１９】
分子酸素（Ｏ２）の存在下では、一酸化窒素（ＮＯ・）が二酸化窒素（ＮＯ２）を形成し、それがＮＯ・の１分子と反応して三酸化二窒素（Ｎ２Ｏ３）を生成する。ＮＯ２とＮ２Ｏ３は、窒素ストレスを引き起こす反応性窒素種として説明される。
【００２０】
さらに、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２・−）は、一酸化窒素（ＮＯ・）と反応して過酸化亜硝酸アニオン（ＯＮＯＯ−）を形成することができる（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ．Ｓ．、Ｋｏｐｐｅｎｏｌ  Ｗ．Ｈ．１９９６年、Ｓｑｕａｄｒｉｔｏ  Ｇ．Ｌ．、Ｐｒｙｏｒ  Ｗ．Ａ．１９９８年）。この過酸化亜硝酸アニオンは、多数の標的細胞を酸化する酸化ストレスを誘導できる強力な酸化剤である。
【００２１】
二次ラジカルは、最も不安定な標的であるポリ不飽和脂肪酸（例えばアラキドン酸）の脂質膜の過酸化に由来する。この脂質の過酸化は、ヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）とポリ不飽和脂肪酸（Ｌ）の炭化水素鎖が反応してアルキルラジカル（Ｌ・）を形成することから始まる連鎖反応である。分子酸素（Ｏ２）の存在下、アルキルラジカル（Ｌ・）は、成長反応の過程でペルオキシラジカル（ＲＯＯ・）及びアルコキシラジカル（ＲＯ・）の放出を引き起こす。鉄や銅等の遷移金属の存在により、上記成長反応の継続が可能となる。これらの過酸化物は、膜構造の深刻な崩壊を引き起こし、分子間の相互作用という深刻な結果をもたらす（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ  Ｉ．１９９７年）。
【００２２】
タンパク質の酸化は、主としてヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）によって開始するが、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２・−）の存在にも依存している。酸化攻撃は、アミノ酸の側鎖又は不斉炭素に向けられる。
【００２３】
アミノ酸の直接酸化によるカルボニル基の形成は、タンパク質の主要な酸化的改変の１つと考えられる。このカルボニル基は、タンパク質酸化の標識として用いられる（Ｄｅａｎ  Ｒ．Ｔ．ら、１９９７年）。
【００２４】
ＤＮＡ塩基は、生物学的酸化剤の作用に非常に不安定である。スーパーオキシドアニオン（Ｏ２・−）は、鉄の存在下でヒドロキシルラジカル（ＯＨ・）を形成することによってＤＮＡを酸化できる（Ｈｅｎｌｅ  Ｅ．Ｓ．、Ｌｉｎｎ  Ｓ．１９９７年）。
【００２５】
その結果、フリーラジカルの放出が増加して、粘液中のアルブミン、リゾチーム、ラクトフェリン、免疫グロブリン及び糖タンパク質等の血清タンパク質が分解されるので、涙の質に悪影響が及ぶ。このようにフリーラジカルは、糜爛の発症から深刻で障害を引き起こす潰瘍形成まで、角膜及び結膜の細胞に対して様々な有害な作用を有する。
【００２６】
環境要因は、眼表面を襲う恒久的原因である。
【００２７】
ここで、微生物、ウィルス、異物、過度のコンピューター作業によって起こる涙の実質的な蒸発、及び、光化学スモッグによる大気中の汚染物はフリーラジカルが生じる大きな要因である。
【００２８】
毎年、何万という患者がこれらの要因が眼表面に及ぼす有害な作用について訴えている。例えばアメリカでは１０００万人、６５歳の人の１５％が眼表面を患っている。
【００２９】
臨床学的な見地によると、眼の乾燥によって眼の疲れ、瞬きの単純な不足、痛み及び異物感が起こり、これらが何度となく軽視された結果、より深刻な焼けるような感覚、痛みとなり、痛みを伴う表層角膜炎、誘発された上皮症からくる視覚障害、角膜の不透明化につながる。
【００３０】
眼の乾燥の重症度は、臨床学的に以下のように区別することができる。
−環境要因によって引き起こされ、更年期障害等の潜在条件によって促進され、刺激の多い環境によって悪化する単純な乾燥症候群（Ａｚｚｕｒｏｌｏ  Ａ．ら、１９９５年）
−眼表面の慢性的な病気、すなわち、慢性的な細胞疲労が、本質的であって解決できないことが多い悪循環の症状に至るような乾性角結膜炎
【００３１】
眼表面異常において、生理病理学的に主に２つの展開があり、その２つとは、眼への攻撃における免疫炎症性の要素と、炎症によって及び特定の目薬によって誘導されるアポトーシス現象である（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｄ．Ａ．ら、１９９９年）。
【００３２】
激しい総体症状が頻繁に起こり、涙膜が不安定であり、また場合によっては角膜炎である場合でも、ドライアイは白いままで、慢性結膜炎に見られる真っ赤な目とは全く異なる。しかし、慢性的な炎症は、シェーグレン症候群、乾性角膜炎の次に起こる炎症、眼性アレルギー、ウィルス性感染症、眼瞼炎若しくは酒さと関連のある炎症、又は、医原性炎症における場合のように、初期の炎症であるドライアイに常に偏って存在している。
【００３３】
シェーグレン症候群は、炎症性の乾燥の最も特徴的な形態の１つである。主要な涙腺に作用して線維症を起こすだけでなく、炎症性媒介物が多く存在する媒質中に浸っている結膜表面全体に影響を及ぼす。免疫系が局部的に活性化されることにより、結膜に炎症細胞が侵入し、上皮細胞の代謝構造が変わってしまう。その後これらは免疫標識を発現し、サイトカインとフリーラジカルを分泌する。シェーグレン症候群は、この炎症が全身に広がって深刻なものとなる（Ｊｏｎｅｓ  Ｄ．Ｔ．ら、１９９８年）。
【００３４】
ウィルス性角結膜炎によって、又は、急性若しくは亜急性結膜炎の結果として乾燥症候群が誘導されることはよくあることである。これらの異常により、結膜表面の粘膜細胞が永久に失われることもある。目薬で治療した後も、患者は病気の初期に感じた感覚と同様の症状が残っていると訴える。彼らは病気が治療されていないと考えているが、実際は集中的な治療を続けることによってさらに悪化することが多い二次的な乾燥を患っているのであって、患者は悪循環に陥っている。
【００３５】
同様に、慢性感染症は重度の眼の乾燥の原因となる場合が多いが、感染の兆候がはっきりしなかったり、表に現れなかったり、認識されなかったりするので、この乾燥の治療は一層困難である（Ｈｏａｎｇ−Ｘｕａｎｔ  Ｔ．ら、１９９８年）。
【００３６】
眼瞼炎及び眼性酒さもまた、感染性及び炎症性の要素を伴って性質上の眼の乾燥の原因となることが多い。これらの異常はマイボーム腺の機能不全を引き起こし、その結果、涙膜の脂質層の組成を乱し、涙の蒸発速度を速める。この現象はＢＵＴ（涙伸長耐性）の縮小という形で臨床的に現れ、上皮の高浸透圧を引き起こす。このマイボーム腺の機能不全は、細胞疲労、細胞内結合の破壊、杯細胞の損失、そしておそらく結膜細胞からの粘液の分泌不足に至る（Ｔｏｄａ  Ｉ．ら、１９９５年）。
【００３７】
目薬で治療しても患者の苦痛を和らげることのできないような涙腺の変性萎縮症において、一般的に乾燥が見られる。刺激性の目薬が蓄積される場所、特に眼瞼の下側や鼻の粘膜の亀裂において毒性作用が見られる可能性があり、塩化ベンザルコニウム、すなわち４級アンモニウム化合物等の防腐剤が目薬中に使用されている場合に、開放隅角緑内障、続発緑内障を呈する。これらの防腐剤はフリーラジカルを生成することにより毒性が著しく高い。これによって、上皮細胞に対して直接害となる涙伸長耐性の縮小が生じ、上皮の糜爛及び炎症反応を呈する。ベンザルコニウム化合物の半減期は２０時間であり、１滴滴下するだけでもその後１６８時間にわたって相当量の防腐剤が残留していることに留意すべきである（Ｄｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｊｅａｎら、１９９９年）。
【００３８】
従って、初期のものであっても、二次的なものであっても、炎症反応はドライアイ症候群の最も重要な要素である。このため、ドライアイ症候群、もっと広くは眼表面異常に適した治療法を開発する必要がある。
【００３９】
現在、提案されているあらゆる治療法の目的は、眼表面異常、すなわち眼の乾燥等の症状を緩和するためのものであり、この眼の乾燥を引き起こす異常の原因を治療するためのものとは実際のところ異なる。
【００４０】
このため、治療を中断するとすぐに症状が再発する。
【００４１】
さらに、眼表面が炎症剤、例えば様々な病状を治療するために眼に滴下する組成物中の防腐剤にさらされることは知られているが、眼表面の炎症の発症を防ぐ予防法は提案されていない。
【００４２】
実際、防腐剤（消毒薬）を含有している局所用薬剤は、眼表面に投与すると表面の均衡を乱し、結膜と角膜に深刻な異常を引き起こす可能性がある。その症状は、目立たずに進行し、かなり後になってから、時には全く予期しない時に現れる可能性がある。
【００４３】
４級アンモニウム化合物の毒性作用が最もよく研究されている。
【００４４】
塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）は、抗緑内障目薬等の複数回投与する目薬のほとんど全てに含有されている。そして、わずかな投与量でも酸素のフリーラジカルの放出を伴う細胞のアポトーシスを誘導し、角膜上皮を実質的に劣化させ、炎症細胞の結膜への侵入を刺激する。
【００４５】
また、ラセミ体のα−リポ酸又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーは、特にＵＶ、末梢神経障害及び特定の脂肪異栄養症から保護するため、またＨＩＶの増殖を遅らせるために用いている抗酸化剤である。
【００４６】
そして、その網膜保護作用により、経口用組成物として多くの他の活性成分と組み合わせた形で、老年性劣化、緑内障及び眼圧増加、すなわち眼表面ではなく眼後部の異常に対しても用いられてきた。
【００４７】
スーパーオキシドジスムターゼ（以下ＳＯＤと称する）は、細胞外及び細胞内レベルで生体内に存在する酵素である。
【００４８】
銅／亜鉛ＳＯＤは化粧品、及び、これを静脈内に投与する癌の治療に用いられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４９】
本発明の目的は、眼の乾燥を引き起こす可能性のある眼表面異常の基本的な治療だけでなく、これらの異常の予防をも提供するものである。
【００５０】
「基本的な治療」とは、本質的な治癒を意味するものであり、眼の乾燥等の眼異常に起因する症状を単に治療するだけのものではない。
【課題を解決するための手段】
【００５１】
この目的のため、本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体、スーパーオキシドジスムターゼ誘導体、ラセミ体のα−リポ酸、α−リポ酸のＲ＋エナンチオマー、α−リポ酸のＲ−エナンチオマー、及び、これら化合物の混合物からなる群より選択される抗酸化剤の、人間又は動物の眼表面異常の治療及び／又は予防薬の製造における使用を提案する。
【００５２】
第一の実施形態においては、上記抗酸化剤はＳＯＤ、ＳＯＤ誘導体及び／又は模倣体である。
【００５３】
この第一の実施形態において、上記ＳＯＤは小麦ＳＯＤが好ましい。
【００５４】
しかし、ＳＯＤ、ＳＯＤ模倣体、ＳＯＤ誘導体のいずれを用いる場合でも、ＳＯＤは薬剤中に１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの濃度で含有されることが好ましく、２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌがより好ましい。
【００５５】
第二の特に好ましい実施形態においては、上記抗酸化剤はラセミ体のα−リポ酸及び／又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーである。
【００５６】
しかし、この実施形態においてはラセミ体のα−リポ酸を用いることが好ましい。
【００５７】
全ての場合において、ラセミ体のα−リポ酸又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーは、薬剤中に０．０５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含有されることが好ましく、０．５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌがより好ましい。
【００５８】
第三の特に好ましい実施形態においては、上記抗酸化剤はラセミ体のα−リポ酸及び／又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーの混合物、及び、１種以上のＳＯＤ及び／又はＳＯＤ誘導体及び／又は模倣体である。
【００５９】
この実施形態においては、α−リポ酸及び／又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーは、薬剤中に０．０５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含有されることが好ましく、０．５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌがより好ましく、ＳＯＤ及び／又はＳＯＤ誘導体及び／又は模倣体は、薬剤中に１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの濃度で含有されることが好ましく、２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌがより好ましい。
【００６０】
本発明の全ての実施形態において、治療する眼表面異常は眼の乾燥を引き起こす異常である。
【００６１】
より具体的には、治療する眼表面異常は角膜細胞の劣化であることができる。
【００６２】
また、治療する眼表面異常は、オゾン、酸化窒素、二酸化硫黄、揮発性有機化合物、及び、ディーゼルエンジンから放出される粒子等の環境物質にさらされることに起因するものであることもできる。
【００６３】
さらに、治療する眼表面異常は、コンピューター画面、テレビ画面又はビデオモニターに眼を長時間さらされることに起因してもよい。
【００６４】
さらに、治療する眼表面異常は、コンタクトレンズの装用に起因する。
【００６５】
さらなる可能性として、治療する眼表面異常は、塩水及び／又は塩素消毒した水にさらされることに起因する。
【００６６】
上記眼異常は、紫外線Ａ及び／若しくはＢ及び／若しくはＣ、又は、Ｘ線にさらされることに起因することもできる。
【００６７】
また、治療する眼表面異常は、微生物、ウィルス及び／又は菌類にさらされることに起因することもできる。
【００６８】
シェーグレン病、眼瞼炎及び眼性酒さもまた治療することができる。
【００６９】
炎症反応及び眼表面の劣化に関連する、アレルゲンにさらされることに起因する眼表面異常も治療することができる。
【００７０】
特に、眼に局所的に投与する組成物中に含有される１種以上の防腐剤にさらされることに起因する眼異常は、特に防腐剤が塩化ベンザルコニウムである場合、本発明によって、治療するだけでなく予防することもできる。
【００７１】
本発明によって製造される薬剤は、目薬、軟膏又はゲルの形状をとることができ、また薬学的に許容される賦形剤も含有することができる。
【００７２】
本発明をより明確に理解し、本発明の他の目的、利点及び特徴をよりはっきりとさせるための図面の説明を以下に記載する。
−図１は、フラックス（ｆｌｕｘ）細胞蛍光測定分析により得られた、結膜細胞の存在を示す特有で代表的なものであり、結膜細胞のＤＮＡより放射された蛍光ピークを示すものであり、
−図２は、本発明の化合物を用いて行った試験の分析結果を、柱状グラフの形で示すものである。
【００７３】
本発明に関する眼表面異常は、以下の原因によって起こる。
−都市における光化学スモッグ等の環境物質（オゾン、酸化窒素、二酸化硫黄、揮発性有機化合物、ディーゼル粒子）への曝露
−コンピューター画面、テレビ画面又はビデオモニター画面への長時間の曝露
−コンタクトレンズの装用
−塩水又は塩素消毒した水への曝露
−紫外線（ＵＶＡ、ＵＶＢ、ＵＶＣ）、Ｘ線、γ線又は放射線への曝露
−微生物、ウィルス又は菌類等の環境物質への曝露
−シェーグレン病、眼瞼炎又は眼性酒さによる眼表面の劣化
−炎症反応及び眼表面の劣化に関連する、アレルゲンへの曝露
−眼に滴下する組成物中の防腐剤への曝露
【００７４】
これらの様々な異常の治療はこれまで、種々の目薬、ゲル又は軟膏を局所的に投与し、眼の乾燥や、これらの異常に起因する他の不快な症状を一時的に軽減して患者である人間又は動物を楽にする対症治療に限られていた。
【００７５】
しかしながら、基本的な治療法、すなわち眼表面を実際に治癒させて回復させることができる治療法はこれまで提案されていなかった。同様に、予防法についても提案されていなかった。
【００７６】
しかし今回、抗酸化剤が、眼表面異常の基本的な治療のための活性成分であることを発見した。
【００７７】
上記より、これらの抗酸化剤を用いて得られる医薬組成物は、眼に局所的に投与するものとして許容される薬学的賦形剤と共に１種以上の抗酸化剤を活性成分として含有するものである。
【００７８】
特に適切な抗酸化剤は、スーパーオキシドジスムターゼ、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体、スーパーオキシドジスムターゼ誘導体、ラセミ体のα−リポ酸又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマー、及び、これらの化合物の混合物である。
【００７９】
ＳＯＤとも称されるスーパーオキシドジスムターゼは、カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼと並んで、生体内の抗酸化酵素の３つの主なクラスのうちの１つである（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ  １９８６年）。
【００８０】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、ＭｃＣｏｒｄとＦｒｉｄｏｖｉｃｈが１９６９年に発見した抗酸化金属酵素である。この酵素は、鉄の存在を必要とする以下の反応により、水性媒体中でスーパーオキシドアニオン（Ｏ２・−）から過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と酸素が生成する不均化反応を触媒することができる。
（１）２Ｏ２・−＋２Ｈ＋→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２
（２）Ｆｅ２＋＋Ｈ２Ｏ２→Ｆｅ３＋＋ＯＨ・（Ｆｅｎｔｏｎ反応）
【００８１】
スーパーオキシドジスムターゼは細胞外及び細胞内レベルで生体内に存在する。
【００８２】
この酵素は３つのグループに分けられる。
−銅／亜鉛ＳＯＤ
−マンガンＳＯＤ
−鉄ＳＯＤ
【００８３】
これらはヒト由来のものでもよいが、この場合は相同性のあるＳＯＤである。また、動物、植物又は微生物由来のものでもよいが、この場合は非相同性のＳＯＤである。
【００８４】
これらは抽出することもできるし、組み換え体や合成品を用いることもできる。
【００８５】
これらの効果は、スーパーオキシドジスムターゼ模倣体と呼ばれる様々な複合体によって模倣することができる。
【００８６】
内在性ＳＯＤの役割は、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２・−）による攻撃から細胞と細胞外間隙を確実に保護することである。標準的な条件において、ＳＯＤのレベル及びこの酵素の特異的活性は、同一の健康な個体内の同一の組織において比較的一定である（Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ  Ａ．Ｍ．１９８７年）。
【００８７】
フリーラジカルの高産生とその結果起こる脂質の過酸化によって酸化ストレスが発生すると、ＳＯＤのレベルが変化する。急性又は慢性の炎症及び自己免疫疾患等の病状は、ＳＯＤの適応特性の消失を示すものである。この病状においてはＳＯＤのレベルが非常に低いことが報告されている。
【００８８】
内在性ＳＯＤの３つの型、すなわち、通常真核生物のサイトゾル中、哺乳類の細胞外液中及び特定の微生物に存在する銅／亜鉛ＳＯＤ、原核生物内又はミトコンドリア中のマンガンＳＯＤ、並びに、嫌気性菌及び原核生物内に存在する鉄を含有する鉄ＳＯＤがこれまでに説明されている。
【００８９】
銅／亜鉛ＳＯＤはさらに、銅／亜鉛ＳＯＤＩと銅／亜鉛ＳＯＤＩＩに分けられる。
【００９０】
現在、組み換えヒト銅／亜鉛ＳＯＤ、及び、小麦、メロン、トマト、花粉、ホウレンソウ若しくはコメからの抽出型又は組み換え型の植物銅／亜鉛ＳＯＤがある。
【００９１】
また、出芽酵母由来等の抽出型微生物銅／亜鉛ＳＯＤ、ウシから抽出した動物銅／亜鉛ＳＯＤ及び組み換え銅／亜鉛ＳＯＤもある。
【００９２】
マンガンＳＯＤはさらに、抽出型又は組み換え型のマンガンＳＯＤＩとマンガンＳＯＤＩＩに分けられる。
【００９３】
同様に、鉄ＳＯＤも抽出型又は組み換え型で存在する。
【００９４】
上記ＳＯＤのうち、銅／亜鉛ＳＯＤが本発明の使用において特に好ましい。
【００９５】
ＳＯＤは分子量３２ｋｄの酵素であり、それぞれ非共有的に結合している銅原子と亜鉛原子を含有する２つのサブユニットから構成されている（Ｋｅｌｌｅｒ  Ｇ．Ａ．ら、１９９１年）。
【００９６】
内在性ＳＯＤは、ヒト抽出物中に（相同タンパク質）又は動物若しくは植物抽出物中に（非相同タンパク質）未変性の形で、又は、組み換え体の形で存在している。その半減期を延ばして細胞レベルでの分布を改善するため、これらをその薬理学的特性に影響を与えずにベクター化することが興味の対象となることがある。
【００９７】
細胞外又は細胞内レベルで様々なＳＯＤの効果を模倣する複合体、すなわちＳＯＤ模倣体もまた、浸透性及び安定性が良好であるため、本発明において最も好ましい化合物である。
【００９８】
天然由来のＳＯＤと同様、これらはスーパーオキシドアニオンを触媒するが、キサンチンオキシダーゼの阻害もする。
【００９９】
上記模倣体のうち、トランス−ビス（ナプロキセナート（ｎａｐｒｏｘｅｎａｔｏ））ビス（３−ピリジルメタノール）銅（ＩＩ）単量体、ルチンのような鉄と銅を含有するビオフラボノイド由来の錯体、１，４，７，１０，１３−ペンタアザシクロ（ｐｅｎｔｏａｚａｃｙｃｌｏ）−ペンタデカン由来の錯体及びＳＯＤａｓｅが好ましい。
【０１００】
生体内外で行った様々な試験より、非相同ＳＯＤは相同ＳＯＤに比べて抗炎症活性が顕著に高いということが分かった。
【０１０１】
免疫学的性質の発生の低い上記非相同ＳＯＤは、炎症誘発性の反応を誘導せず、酸素のフリーラジカルの形成を阻害することにより劣化から細胞を保護する。
【０１０２】
以上より、ＳＯＤが有利な効果を持つことから、本発明はこれを単独で又は薬学的媒体の存在下で眼表面異常の治療において使用することを提案する。
【０１０３】
しかしながら、ＳＯＤは涙によって角膜から迅速に排出される分子なので、眼に滴下された時にその作用を完全に発揮することはできない。
【０１０４】
また、ＳＯＤは細胞組織中に十分に拡散することができない巨大な分子である。
【０１０５】
以上より、第二の実施形態において、本発明はα−リポ酸及び／又はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーの抗酸化剤としての使用を提案する。
【０１０６】
１９３７年に発見され、１９５１年にＬｅｓｔｅｒ  Ｒｅｅｄによって化学的に特徴付けされたα−リポ酸（ＬＡ）は、２−ジチオラン−３−ペンタン酸、１，２−ジチオラン−３−吉草酸及びチオクト酸等の様々な名称で知られており、人間の体内で合成されるが、ジャガイモ、ホウレンソウ及び赤身の肉にも微量存在する抗酸化剤である。
【０１０７】
ＬＡの産生は、他の抗酸化剤の場合と同様、人間の年齢と共に減少する。
【０１０８】
α−リポ酸は、炭素原子８個の鎖、及び、水素原子を１個又は２個非常に容易に供与できる隣り合った２個の硫黄原子を持つ複素環を有する。
【０１０９】
このα−リポ酸は、ラセミ体（ＲＡＣ−α−リポ酸、ＤＬ−α−リポ酸）であるが、そのＲ＋又はＲ−エナンチオマーの形においても活性を持っている。
【０１１０】
最も活性の高い形態は、Ｒ＋−α−リポ酸、Ｒ−チオクト酸、Ｒ−α−リポ酸又はデックスリポタム（ｄｅｘｌｉｐｏｔａｍ）１２００  ２２  ２である。
【０１１１】
このように、α−リポ酸とその誘導体は、多様な化学的複合体の形態をとることができる。
【０１１２】
α−リポ酸は細胞に迅速に吸収され、極めて強力な還元剤であるジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）に変換される。また、硫黄含有基を２つ有しており、これによって水素原子を１個又は２個非常に容易に供与できる。
【０１１３】
ＬＡ／ＤＨＬＡは、以下のこと：
−フリーラジカル（ヒドロキシラジカルＯＨ・、次亜塩素酸ＨＣｌＯ、単重項酸素‘Ｏ２）の捕捉
−金属（Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋及びＺｎ２＋との安定な複合体）のキレート
−酸化型ビタミンＥ及びＣ、グルタチオン並びにチオレドキシンの再生（グルタチオンが存在している場合において、その細胞内での増加が観察される）
−遺伝子（炎症応答の間のＮＦ−ＫＢ因子）の発現阻害
をする能力がある。
【０１１４】
ＤＨＬＡはまた、スーパーオキシドアニオンを放出する酵素であるキサンチンオキシダーゼの活性を阻害することにより、虚血−再灌流の悪影響から保護することもできる（Ｐｒｅｎｎ  Ｊ．Ｈ．ら、１９９０年及び１９９２年、Ｓｃｈｅｅｒ  Ｂ．、Ｚｉｍｍｅｒ  Ｇ．１９９３年、Ｓｅｒｂｉｎｏｖａ  Ｅ．ら、１９９２年）。
【０１１５】
上記の理由から、ラセミ体のα−リポ酸とそのエナンチオマーは人間又は動物の眼表面異常の治療及び／又は予防において特に有利な活性成分である。
【０１１６】
そして、活性成分として、ゲル、目薬又は軟膏等の形態をとっていて薬学的に許容される賦形剤も任意に含有する、上記眼表面異常の治療のための組成物の一部を構成しているであろう。
【０１１７】
一方では、α−リポ酸とそのエナンチオマーが単独で又は組み合わせた形で、また他方では、スーパーオキシドジスムターゼが単独で又は組み合わせた形で、人間又は動物の眼表面異常の治療において優秀な活性源であることが証明されているが、α−リポ酸を１種以上の上記スーパーオキシドジスムターゼと組み合わせて使用することが有利である。
【０１１８】
実際、生体外における研究より、ＳＯＤ及びα−リポ酸は、異なる濃度で医薬組成物に導入すると、眼表面異常の治療又は予防において特に効果的な活性成分であることが分かった。
【０１１９】
また、臨床調査を厳密に補足するため、上記とは異なる濃度のα−リポ酸及び異なるスーパーオキシドジスムターゼを別の眼表面調査法で試験することにより、上記とは異なる生体外研究を行った。
【０１２０】
以下の試験を下記のように行った。
【０１２１】
第一段階において、異なる濃度の本発明の活性化合物（銅／亜鉛ＳＯＤ、α−リポ酸）を、臨床調査を厳密に補足するため、上記とは別の眼表面調査法で試験する。
【０１２２】
＜酸素のフリーラジカルの評価＞
試験は細胞蛍光微量滴定測定法によって冷光において行う。照射系統（赤外効果及びジュール効果）を取り去って温度エネルギーのみにすることにより、この新規の方法は、バックグラウンドのノイズを非常に小さくしてシグナルとノイズの割合を良好にし、感度を良好にすることができる。また、マイクロプレート法の再現性と細胞数測定方法の感度とを兼ね備えており、かつ  検出スペクトルが非常に広い（２８０〜８７０ｎｍ）。マイクロプレートは規定の波長の光線束を０．３秒未満の間各ウェルに照射して調査し、これによりあらゆるプローブの吸光現象を制限する。
【０１２３】
＜ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）試験＞
ヒト由来の角膜及び／又は結膜の培養細胞を、フリーラジカルの放出を誘導するために様々な環境物質にさらす。本発明の活性化合物（銅／亜鉛ＳＯＤ又はα−リポ酸）をこのモデルにおいて異なる濃度で試験する。培養液中のフリーラジカルの存在を、ＤＣＦＨ−ＤＡ試験（モレキュラープローブ社、ユージーン、オレゴン、アメリカ）により蛍光定量法（λｅｘｃ．＝４９０ｎｍ−λｅｍ．＝５３５ｎｍ、Ｉ＝４Ｖ）を用いて評価する。蛍光発生プローブは、過酸化水素と結合すると蛍光になる。用いるＤＣＦＨ−ＤＡ溶液は、ダルベッコ変法最小必須培地（ＤＭＥＭ）に２０μＭで溶解した溶液である。そして、培養物はプローブを含有したＤＭＥＭ中に２０分間静置し、この後過酸化水素の産生を測定するために抽出する。測定は９６ウェルプレート中の細胞に対して直接行う（Ｄｅｂｂａｓｃｈ  Ｃ．ら、２０００年）。
【０１２４】
この結果、試験した活性化合物（銅／亜鉛ＳＯＤ又はα−リポ酸）は膜の損傷とアポトーシス現象から角膜及び／又は結膜の細胞を保護し、フリーラジカルが細胞に及ぼす悪影響を投与量に依存して顕著に減少させるということが分かる。アポトーシスとは、細胞のプログラム死である。
【０１２５】
＜ヒドロエチジン（Ｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｎｅ）試験＞
フリーラジカルの放出を誘導するために様々な攻撃物質にさらしたヒト由来の角膜及び／又は結膜の培養細胞を、異なる濃度の本発明の活性化合物（銅／亜鉛ＳＯＤ又はα−リポ酸）で処理するか、又は、未処理のままとする。
【０１２６】
ヒドロエチジン（モレキュラープローブ社）は、スーパーオキシドアニオンの存在下で酸化されてエチジウムカチオンになる蛍光発生プローブである。このプローブは、スーパーオキシドアニオンと結合すると蛍光になる（λｅｘｃ．＝４９０ｎｍ−λｅｍ．＝６００ｎｍ、Ｉ＝６Ｖ）。用いるヒドロエチジン溶液は５μＭ溶液である。細胞培養物はプローブを含有したＤＭＥＭ中に１０分間静置し、この後スーパーオキシドアニオンの産生を測定するために細胞を抽出する。測定は９６ウェルプレートにおいて行う。
【０１２７】
上記のようにしてウェル当たり５０００個の細胞について測定し、各測定は６回ずつ繰り返す。結果は蛍光単位で表す。蛍光の平均値を各グループについて計算し、マン・ホイットニーのノンパラメトリックＵ検定によって比較する。
【０１２８】
その結果はＤＣＦＨ−ＤＡ試験の結果を追認するものである。活性化合物（銅／亜鉛ＳＯＤ又はα−リポ酸）の存在下、スーパーオキシドアニオンの産生、及び、膜の脂質過酸化に関連する細胞の変性が投与量に依存して顕著に減少している。
【０１２９】
＜塩化ベンザルコニウムに対する効果＞
ヒト由来結膜培養細胞について、本発明の産物（銅／亜鉛ＳＯＤ又はα−リポ酸）の、フリーラジカル産生の原因である４級アンモニウム化合物（塩化ベンザルコニウム）等の防腐剤によって誘導される壊死に対する保護効果を実験で証明する。
【０１３０】
性質上の眼の乾燥を誘導するとされる４級アンモニウム化合物は実際、涙膜の脂質相を変性させて蒸発を加速する洗浄剤としての特性を持つ。上記化合物は、上皮微絨毛を劣化させて粘液の付着を妨害し、涙膜をさらに不安定にしている。上記化合物は低濃度（０．００４％）で破壊時間を縮め、上皮の糜爛を経て表面細胞に対してアポトーシス劣化から本当の壊死まで濃度依存的に幅広い直接毒性を引き起こす（Ｂａｕｄｏｕｉｎら、１９９１年、Ｄｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｊｅａｎ  Ｍ．ら、１９９９年）。
【０１３１】
本発明の活性化合物は、結膜培養細胞に対する塩化ベンザルコニウムの毒性を投与量に依存して顕著に低下させる。この薬剤によるフリーラジカル種の産生を阻害することにより、本発明の活性化合物は上皮の糜爛を減少させる。
【０１３２】
４級アンモニウム化合物、特に塩化ベンザルコニウムは、防腐剤として多くの目薬、目用ゲル及び目用軟膏中に含有されている。
【０１３３】
上記より、上記防腐剤の有害な副作用を防ぐことのできる本発明の化合物は、既に確立された眼表面異常を治療するための活性源としてだけでなく、投与された医薬組成物中の防腐剤の副作用を予防するための別の活性源への添加剤としても使用されてよい。この防腐剤は、４級アンモニウム型のものも、また、酸素のフリーラジカルの形成を引き起こすことができてアポトーシス現象を引き起こすことのできる他の防腐剤も指す。
【０１３４】
特に、これらの化合物を添加剤として緑内障治療目薬に配合することは特に好ましい。
【０１３５】
上記より、ＳＯＤ、α−リポ酸及びこれらの混合物は、眼表面異常の治療にも予防にも有用である。
【０１３６】
本発明の化合物の有利な効果は、以下の試験の結果により明らかに証明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３７】
塩化ベンザルコニウムによって誘導されるアポトーシスを、本発明によって治療及び／又は予防される眼表面異常のモデルとして選択した。
【０１３８】
−ＳＩＬＡＢ研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  ＳＩＬＡＢ）から市販されているＨＰ小麦ＳＯＤ、
−ＬＡＬＩＬＡＢ研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  ＬＡＬＩＬＡＢ）より供給されたラセミ体のα−リポ酸、及び、
−上記ＳＯＤとα−リポ酸の混合物
の効果をフラックス（ｆｌｕｘ）細胞蛍光測定によって、連続培養系の結膜細胞（Ｗｏｎｇ−Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  Ｃｈａｎｇ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ，ｃｌｏｎｅ  １−５Ｃ−４，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２０．２）に対して調べた。ここではｓｕｂＧ１期の細胞のＤＮＡの百分率を用いているが、これは塩化ベンザルコニウムによって誘導されたアポトーシスの程度を表し、従って細胞の攻撃の程度を表している。
【０１３９】
このアポトーシスの研究は、本発明の化合物で処理する前後のｓｕｂＧ１期のＤＮＡの百分率を比較するためのフラックス（ｆｌｕｘ）細胞蛍光測定によって行う。
【０１４０】
実際、アポトーシスは、ＤＮＡが全く同一の２００塩基対の断片に分割されることによって特徴付けられる。これより、上記過程に関与する細胞のＤＮＡ含量は低い。
【０１４１】
上記ＤＮＡの断片化は、生体内でフラックス（ｆｌｕｘ）細胞蛍光測定によりＤＮＡ染色ヨウ化プロピジウムを用いて測定できる。ＤＮＡの減少は、標準細胞に比べて蛍光が弱いことから分かる。細胞蛍光測定により図１に示すようなピークが得られる。図１に示すように、このピークはＭ１ピーク、Ｇ１ピーク、並びに、Ｓ期及びＧ２Ｍ期として示した３つの領域に分けられる。標準細胞の数はＧ１ピーク領域として示す。また、蛍光の弱い細胞、すなわちＤＮＡが断片化されている細胞は、このＧ１ピークより下、すなわち図１でＭ１として示す領域に位置するｓｕｂＧ１ピークと称される位置で示す。
【０１４２】
上記試験の操作条件を以下に示す。
【０１４３】
＜材料と方法＞
・ＳＩＬＡＢ研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  ＳＩＬＡＢ）より入手の高度精製小麦ＳＯＤ、分子量＝３５００ｇ、これを初期値とする。
・ＬＡＬＩＬＡＢ研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  ＬＡＬＩＬＡＢ）より入手のラセミ体のα−リポ酸、分子量＝２０５．３ｇ、０．５μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌで用いる。
【０１４４】
結膜細胞を培養している６ウェルプレート中のＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ製２１８８５参照：試料の全体積に対して１０容量％のウシ胎児血清を含有し、ストレプトマイシン５０ｍｇ／ｍｌ及びペニシリン５０ＩＵ／ｍｌを添加したもの）に塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）を試料の全体積に対して０．００１容量％添加することによってアポトーシスを誘導した。
【０１４５】
実際には結膜細胞を上記培地中で培養し、８０％コンフルエンスにおいてＳＯＤ、α−リポ酸及びこれらの混合物を添加し、３７℃で４５分間インキュベートした。そして各ウェルに塩化ベンザルコニウムを添加した。１５分間インキュベートした後、各ウェルの上清を１５ｍｌチューブに集めた。細胞をトリプシン０．２５％で３７℃において５分間処理して分離し、それぞれの上清に加えた。チューブを遠心分離した後、細胞をリン酸バッファー中で２回洗浄した。残った細胞をリン酸バッファーに細胞１００万個／１ｍｌの濃度で再度懸濁した。
【０１４６】
まずこの１０６個／ｍｌの細胞懸濁液１００μｌを固定し、無水エタノール１ｍｌ中に−２０℃で１時間透過させた。そしてリン酸バッファー中で洗浄し、ＤＮＡをヨウ化プロピジウム（０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ）を用いて４℃で１時間染色した後、細胞蛍光測定（Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ−ＭＣＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ）によって測定した。
【０１４７】
ｓｕｂＧ１期ピークの百分率、すなわち断片化したＤＮＡの百分率と、アポトーシスによって劣化した結膜細胞の数とを測定した。測定は以下について行った。
−コントロールとして、ＤＭＥＭのみで培養した結膜細胞
−コントロールとして、ＤＭＥＭ中で培養し、小麦ＳＯＤ２５μｇ／ｍｌで処理した結膜細胞
−コントロールとして、ＤＭＥＭ中で培養し、小麦ＳＯＤ５０μｇ／ｍｌで処理した結膜細胞
−コントロールとして、ＤＭＥＭ中で培養し、α−リポ酸０．５μｇ／ｍｌで処理した結膜細胞
−コントロールとして、ＤＭＥＭ中で培養し、ラセミ体のα−リポ酸５μｇ／ｍｌで処理した結膜細胞
−対照として、ＤＭＥＭ中で培養し、塩化ベンザルコニウムで処理した結膜細胞：これは、結膜細胞において塩化ベンザルコニウムにより誘導されたアポトーシスを測定することになる；この最大値を参照することにより、本発明の方法によってアポトーシスが減少したことが測定されるであろう
−ＤＭＥＭ中で培養した後（塩化ベンザルコニウムによってアポトーシスが既に誘導されている）、小麦ＳＯＤ２５μｇ／ｍｌで処理した結膜細胞
−ＤＭＥＭ中で培養した後（塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）の添加によってアポトーシスが既に誘導されている）、小麦ＳＯＤ５０μｇ／ｍｌで処理した結膜細胞
−ＤＭＥＭ中で培養した後（塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）の添加によってアポトーシスが既に誘導されている）、ラセミ体のα−リポ酸５μｇ／ｍｌで処理した結膜細胞
−ＭＥＭ中で培養した後（塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）の添加によってアポトーシスが既に誘導されている）、小麦ＳＯＤ５０μｇ／ｍｌとラセミ体のα−リポ酸０．５μｇ／ｍｌの混合物で処理した結膜細胞、及び、
−ＭＥＭ中で培養した後（塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）の添加によってアポトーシスが既に誘導されている）、小麦ＳＯＤ５０μｇ／ｍｌとラセミ体のα−リポ酸５μｇ／ｍｌの混合物で処理した結膜細胞
【０１４８】
上記試験の結果を数値で下記の表１に示す。
【０１４９】
【表１】
2004537522.tif 000002
【０１５０】
上記結果を柱状グラフの形で図２に示す。
【０１５１】
図２において、左側はコントロールに相当する柱状グラフを示し、右側は塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）の添加によってアポトーシスが誘導されている細胞に相当する柱状グラフを示す。
【０１５２】
表１と図２より、外的誘発因子が何もなくてもアポトーシスが既に発生していることが分かる。
【０１５３】
図２の右側の柱状グラフより、本発明の化合物が結膜細胞のアポトーシスに対して好ましい作用を持っていることが分かる。
【０１５４】
ＳＯＤに比べてα−リポ酸の治療効果と予防効果が、ＳＯＤよりずっと低濃度において勝っていることに着目することが重要である。
【０１５５】
また、ＳＯＤの好ましい効果が濃度と共に強くなっているのに対して、α−リポ酸の場合は逆であることに着目することも重要である。表１と図２より、試験した最低濃度のＳＯＤ及び最高濃度のα−リポ酸を含有する混合物を用いた場合に特に、ＳＯＤとα−リポ酸との間に相乗効果があることも分かる。このことは、α−リポ酸単独では低濃度で最も好ましく作用することが分かっているため、予想しなかったことである。
【０１５６】
ＳＯＤは巨大な分子であり、α−リポ酸はそれより小さい分子であるため、ＳＯＤ分子同士の間の空間にはまり込んで、ＳＯＤと特に効果的な関係を作っているのだろうと説明できる。
【０１５７】
上記より、眼表面異常の治療及び／又は予防のために本発明の化合物が有利な効果を持つためには、ＳＯＤを１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは２５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ含有している眼に滴下して投与する医薬組成物が、非常に有効である。しかし、ラセミ体のα−リポ酸又はそのエナンチオマーの１種を含有する組成物は、眼に滴下する医薬組成物中０．０５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの濃度で有利に用いられるであろう。上記組成物は、ラセミ体のα−リポ酸及び／又はそのエナンチオマーの１種を０．０５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ含有することが好ましい。
【０１５８】
また、眼表面異常の治療及び／又は予防のための組成物は、ＳＯＤ、ＳＯＤ誘導体又は模倣体の混合物を、ＳＯＤ単独では上記の濃度で、ラセミ体のα−リポ酸及び／又はα−リポ酸はそのＲ＋若しくはＲ−エナンチオマーの形で、α−リポ酸を含有する組成物単独では上記の濃度で含有することがさらに好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】フラックス（ｆｌｕｘ）細胞蛍光測定分析により得られた、結膜細胞の存在を示す特有で代表的なものであり、結膜細胞のＤＮＡより放射された蛍光ピークを示す。
【図２】本発明の化合物を用いて行った試験の分析結果を、柱状グラフの形で示す。
【図１】
2004537522.tif 000003
【図２】
2004537522.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2004537522.tif 000005
2004537522.tif 000006
2004537522.tif 000007
2004537522.tif 000008
2004537522.tif 000009
2004537522.tif 000010
2004537522.tif 000011
2004537522.tif 000012
2004537522.tif 000013
2004537522.tif 000014
2004537522.tif 000015
2004537522.tif 000016
2004537522.tif 000017
2004537522.tif 000018
2004537522.tif 000019
2004537522.tif 000020
2004537522.tif 000021
2004537522.tif 000022
2004537522.tif 000023
2004537522.tif 000024
2004537522.tif 000025
2004537522.tif 000026
2004537522.tif 000027
2004537522.tif 000028
2004537522.tif 000029
2004537522.tif 000030
2004537522.tif 000031
2004537522.tif 000032
2004537522.tif 000033
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537522.tif 000034
【国際調査報告】
2004537522.tif 000035
2004537522.tif 000036
2004537522.tif 000037
2004537522.tif 000038
2004537522.tif 000039
2004537522.tif 000040