(57)【要約】本発明は、新規の経口組成物およびワクチンに関し、特に、カンジダ症の予防または治療のための経口ワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口投与に適した組成物であって、カンジダ　アルビカンスコロニー形成により引き起こされる口内、鼻咽頭または呼吸器管の状態を予防または治療するためのカンジダアルビカンスを含む組成物。
【請求項２】
カンジダアルビカンスコロニー形成により引き起こされる状態を予防または治療するための、カンジダアルビカンスの出芽球菌形態を含む組成物。
【請求項３】
ワクチン形態である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
カンジダアルビカンス全体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
不活化カンジダアルビカンスを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
カンジダアルビカンスの超音波処理物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
カンジダアルビカンスの１つ又はそれを超える断片または個々の抗原を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記カンジダアルビカンスは球状分芽形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
カンジダアルビカンスコロニー形成により引き起こされる状態は感染である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
製薬上許容できる溶剤、添加剤、または担体をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のに記載の組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントは、Ｔｈ１応答を誘導するように選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記アジュバントはプロバイオティックである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プロバイオティックはプロバイオティック細菌である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記プロバイオティック細菌はラクトバシラス　アシドフィルスである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
カンジダアルビカンスコロニー形成により引き起こされる状態の予防法または治療法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物を、そのような治療を必要とする対象者に投与することを含む、前記予防法または治療法。
【請求項１７】
カンジダアルビカンスコロニー形成により引き起こされる状態の予防法または治療法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物を、そのような治療を必要とする対象者に投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記状態は粘膜炎である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記状態は、再発性／持続性の口内炎、再発性の外陰部膣カンジダ症、食道炎、および、下部尿路または腸管コロニー形成からなる群より選択される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
アジュバントの投与をさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アジュバントは、Ｔｈ１応答を誘導するように選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アジュバントはプロバイオティックである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アジュバントはプロバイオティック細菌である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロバイオティック細菌はラクトバシラス　アシドフィルスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アジュバントおよび／または前記プロバイオティックは経口投与される、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記アジュバントおよび／または前記プロバイオティックが非経口投与される、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アジュバントおよび／または前記プロバイオティックが、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物での治療の停止前、その停止の際間、またはその停止後に投与される、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記アジュバントおよび／または前記プロバイオティックが、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物での治療前に投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
カンジダアルビカンスワクチン要求性またはカンジダアルビカンスワクチン有効性をモニタリングする方法であって、ＩＦＮ−γ、ＮＯ、および／またはＩＬ−４の測定を含む方法。
【請求項３０】
ワクチンまたはワクチン成分として効果的なカンジダ分離株および／またはカンジダ抗原を同定する方法であって、マウスモデルにおいてＩＦＮ−γ、ＮＯ、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−４を測定することを含む方法。。
【請求項３１】
前記測定が唾液試料へなされる、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記測定が血液試料へなされる、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記測定が組織試料へなされる、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記組織試料はリンパ組織から得られる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料はリンパ節から得られる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＩＦＮ−γ、ＮＯ、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−４の測定は、ＩＦＮ−γ、ＮＯ、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−４を発現する細胞の割合を測定することからなる、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規の経口ワクチンに関し、特にカンジダ症の予防または治療のための経口ワクチンに関する。
【０００２】
発明の背景
カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）は、酵母様の二形性真菌であり、正常な微生物相の一部として口、膣および消化管のヒト粘膜表面にコロニー形成（ｃｏｌｏｎｉｓｅ）する。またカンジダアルビカンスは日和見病原体であり、口内炎や膣炎のような局所的な粘膜炎を引き起こし、また、広がって全身感染を起こす可能性もある。
宿主−寄生体関係の異なるバランスにより様々な結果がもたらされることは明白である。防御メカニズムは完全には解明されていないが、微生物の局所的蔓延および全身性蔓延の双方において細胞性メカニズム（特にＴリンパ球−マクロファージ単位）が重要であると考えられる。
粘膜炎の臨床範囲として以下のものが挙げられる。
【０００３】
再発性／持続性の口内炎
再発性／持続性の口内炎は、年配者、特に歯科補綴物（義歯）を有する年配者に共通の問題である。後者において、その約３分の２は、補綴物上に蓄積したプラーク中のカンジダアルビカンスコロニー形成により粘膜炎を発症させる。興味深いことに、この状態は、抗原量が低いことを意味し、特定の宿主の応答を伴う可能性がある。同様の真菌性の問題が、通常補綴物を装着しているより若い対象者でもみられる。細胞性免疫不全性を有する対象者（特にＨＩＶ疾患の対象者）において、持続的なカンジダアルビカンス関連口内炎（または口腔カンジダ症）は、共通で深刻な合併症である。吸引によるステロイド（通常は喘息用）を使用する対象者は、ステロイドによる粘膜の防御の下方制御に起因して、口腔カンジダ症をよく発症させる。
【０００４】
再発性の外陰部膣カンジダ症
再発性の外陰部膣カンジダ症は女性の３〜５％に共通する問題であり、エストロゲンが停止する月経周期の時期（月経前）に、「粘膜ゲート（ｍｕｃｏｓａｌ ｇａｔｅ）」が閉鎖し、粘膜組織への特定のＴ細胞の移送が遮断されると発症する。この集団における「Ｔ細胞プール」は減少するので、この間に生殖管内のカンジダアルビカンス抑制への弱い支配力が攻撃され、その結果、臨床的粘膜炎になる。
【０００５】
食道炎
食道炎は、免疫障害を有し最も通常はガンのような全身性疾患に罹っている対象者の、または免疫抑制療法を受けている対象者において、共通する厄介な合併症である。口腔カンジダ症に続く食道炎はしばしば無症状であり、生命を脅かす全身への蔓延を引き起こす病巣になり得る。従って、粘膜のＴ細胞の機能の効率を最大化し、それにより局所／全身性疾患の危険を減少させることができる経口ワクチンは、上部消化管のカンジダアルビカンス感染の予防（「危険性を有する」集団における）または治療（臨床的粘膜炎の治療）にとって相当に価値あるものであり、特に免疫抑制された対象者においては、このワクチンについての一次的指標となり得る。
【０００６】
腸管コロニー形成
カンジダアルビカンスでの消化管のコロニー形成は、慢性疲労から「全身性アレルギー」に至る異常に広範囲の疾患や病状を発症させると考えられる。「カンジダをコントロールすること」を取り巻いて産業が出現している。消化管内のカンジダ量を数ログ減少させることができるワクチンを有することは好都合であるので、魅力的な治療案である。
【０００７】
他の粘膜部位および状況
特に抗生物質の繰り返し投与の後や、粘膜の損傷によりダメージを受けた場合、気管支にカンジダアルビカンスでのコロニー形成が起こり得る。場合によって、対象者は、下部尿路のコロニー形成を起こす。より一般的な問題は、抗生物質の繰り返し使用の後の、１ヶ所または数ヶ所の再発性または持続性の「鵞口瘡」である。このような状況が、ワクチンについて特に予防式の臨床的機会を提供し、すなわち、一定の抗生物質を長期間用いるところで、ワクチンを与えることによってカンジダアルビカンスの過剰増殖の危険を減少させ得る。
それゆえに、カンジダ症の予防および／または治療のための改善されたワクチンおよび方法が必要である。
本発明の目的は、従来技術の治療の少なくともいくつかの不利益を克服または改善すること、または、有用な新しい手段を提供することである。
【０００８】
発明の要旨
本発明は、カンジダアルビカンスの出芽球菌（ｂｌａｓｔｏｃｏｃｃｏｉｄ）形態での経口免疫により、生物の感染を防ぐか、または定着した感染を治療する、という予想外の発見に一部基づいている。従来技術の教示に基づけば、侵襲性の菌糸形態が最適の免疫原となり得ることが予想される。また本発明は、カンジダの出芽球菌形態がＴ細胞−マクロファージユニットを発動させて、ＩＦＮ−γのような特定のサイトカイン、そして酸化窒素（ＮＯ）をも唾液中に分泌する、という観察に基づく。それにより、それら真菌に有毒な環境を形成するだけでなく、それら真菌の菌糸（侵襲性）形態への転換を防ぐ。その効果は、全ての粘膜表面と分泌に関して同様であることが予想される。
【０００９】
第一の観点により、カンジダアルビカンスコロニー形成により起こる口内、鼻咽頭、または呼吸器管の状態の予防または治療のための、カンジダアルビカンスを含む、経口投与に適した組成物を提供する。
第二の観点により、カンジダアルビカンスコロニー形成により起こる状態の予防または治療のための、カンジダアルビカンスの出芽球菌形態を含む組成物を提供する。
【００１０】
当該組成物は、不活化されているか又は生きているが弱毒化されているかのいずれかであるその生物体全体、その生物体の超音波処理物、または、１又はそれを超える別個の抗原を含むそれらのあらゆる断片を含むワクチンであり得る。
カンジダアルビカンス全体の場合、生物の出芽球菌形態が好ましいが、菌糸形態も用いることができる。
【００１１】
第三の観点により、カンジダアルビカンスコロニー形成により起こる状態の予防的または治療的処置が提供され、その処置は、このような治療を必要とする対象者への前記いずれかの側面による化合物の投与を含む。
好ましくは、前記状態は粘膜炎である。
さらにより好ましい状態は、再発性／持続性の口内炎、再発性の外陰部膣カンジダ症、食道炎、および下部尿路または腸管コロニー形成からなる群より選択される。
【００１２】
本発明に係る治療法は、１以上のアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）の投与をさらに含んでもよい。
上記アジュバントは、好ましくは、典型的なＴｈ１応答（例えばＢＣＧ）を誘導するように選択され、または、必要に応じて、Ｔｈ２応答（例えば、コレラ毒素等のＢサブユニットなど）、または、ショートカットワクチン（ｓｈｏｒｔｃｕｔ ｖａｃｃｉｎｅ）（例えば、百日咳）を誘導するように選択される。
アジュバントは、微生物のようなプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）（例えば乳酸桿菌）の投与と代替させてもよいし、それで補助されてもよい。さらにより好ましいものは、乳酸桿菌種の微生物、特にラクトバシラスアシドフィルスである。しかしながら、他の微生物、例えば発酵乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）やマイコバクテリウムバッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅ）もまた用いることができる。さらに、Ｔｈ１応答を引き起こすことができる他のアジュバント、微生物、またはそれらの成分もまた適切であると理解されている。本明細書の関連において用いられる「プロバイオティック」という用語は、本明細書で説明されるように、必ずしも慣例的なプロバイオティックとして作用しないが、Ｔ細胞応答を誘導するかまたはサイトカインパターンを変化させることができる物質をその範囲内に含むことを意味する。
【００１３】
プロバイオティックおよび／またはアジュバントは、経口投与または非経口投与することができ、本発明の化合物での治療をやめる前、やめる際、またはやめた後に投与することができる。本発明の化合物での治療をやめる前、やめる際またはやめた後におけるプロバイオティックの投与は、サイトカインパターンを「歪める（ｓｋｅｗ）」ことで効果的な治療に最適なサイトカインバランスを達成するそれらの能力の故、特に好ましい。
【００１４】
第四の観点により、ワクチン要求性またはワクチン有効性のモニタリング方法を提供し、当該方法は、ＩＦＮ−γ、ＮＯ、および／またはＩＬ−４の測定を含む。
第五の観点により、ワクチンまたはワクチン成分として効果的なカンジダ分離株および／またはカンジダ抗原を同定する方法を提供し、当該方法は、マウスモデルにおいてＩＦＮ−γ、ＮＯ、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−４の測定を含む。
便宜上、それら測定は、唾液試料へなされるが、血液試料、同様に組織試料（例えばリンパ節及びそれに類したもの）も使用可能である。リンパ節または類似のリンパ組織（ｓｉｍｉｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）を用いる場合、関連するサイトカインを発現する細胞の割合への評価を行うことができる。
以下本発明を、非限定的な実施例について、参考文献を用いてより詳細に説明する。
【００１５】
【実施例】
実施例１：材料および一般的な方法
マウス
別途明言されない限り、６〜８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）およびＤＢＡ／２マウス（Ｈ−２ｄ）は、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｐｅｒｔｈ， Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。これらマウスを３〜５匹のグループに分けて住まわせ、えさと水を自由に与えた。全てのマウスは１週間順応させてた後に用いた。真菌の培養物であるカンジダアルビカンス分離株３６３０を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｒｏｙａｌ Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から得た。酵母細胞を、サブローデキストロースブロス（Ｏｘｏｉｄ， Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用い、振盪水槽中で２５℃で４８時間培養した。出芽胞子を新しい培地に移し、２５℃でさらに１８時間培養した。遠心分離によってその出芽胞子を回収し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、さらに、使用前に、１ｍＬにつき１０８個の出芽胞子になるようにＰＢＳで調節した。
【００１６】
カンジダ抗原
新しく培養したカンジダアルビカンス分離株３６３０を、１×１０１０／ｍｌになるようにＰＢＳに再懸濁し、次に、ＭＳＥ Ｓｏｎｉｐｒｅｐセットにおいて振幅１０で３０サイクルの断続的な冷却と超音波処理で超音波処理した。その超音波処理物を２０００ｇで１０分間遠心分離し、その後、上清を回収し、ＰＢＳで透析した。タンパク質定量した後、その溶液をろ過滅菌し、アリコートにして使用まで−２０℃で保存した。
【００１７】
口腔感染
７５ｍｌのケタミン：キシラジル（Ｘｙｌａｚｉｌ）（１００ｍｇ／ｍｌ：２０ｍｇ／ｍＬ）を腹膜内注射することによって、マウスを麻酔した。簡単に説明すると、ＰＢＳ中、出芽胞子１０８／ｍｌを１４，０００ｇで５分間遠心分離した。そのペレットを先端が微細な滅菌綿棒（Ｃｏｒｓｈａｍ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＵＫ）で回収し、次に、この綿棒を用いて口腔へ局所的に塗布し、口腔接種した。
【００１８】
口腔感染の定量
別途明言されない限り、マウスのグループ（１グループにつき３〜５匹）を様々な時点で殺し、口腔粘膜におけるカンジダアルビカンス数を測定した。口腔（すなわち、頬、舌および軟口蓋）を、先端が微細なコットン綿棒を用いて完全に拭き取った。綿棒で拭き取った後、そのコットンの先端を切り取り、次に、１ｍｌのＰＢＳを含むエッペンドルフチューブ中に置いた。ボルテックスミキサーで混合することによって酵母細胞を再懸濁し、１０倍の連続希釈液にした後、クロラムフェニコール（０．０５ｇ／Ｌ）を添加したサブローデキストロース寒天（Ｏｘｏｉｄ， ＵＫ）で３７℃で４８時間培養した。組織学的研究のために、口腔組織を１０％のホルマリンで固定し、パラフィン中に埋め込んだ。厚さ５ｍｍの組織切片を切断し、スライドガラス上にマウントし、次に、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）または菌類用のＰＡＳ染料で染色した。出芽胞子および菌糸形態の数を光学顕微鏡で計測した。４０倍の倍率で５領域を計数し、その平均値を結果をとして示した。
【００１９】
細胞分離およびフローサイトメトリー
３〜５匹のカンジダアルビカンス感染マウスから、頚部リンパ節（ＣＬＮ）を感染後の各時点で切除し、単一の細胞懸濁液を調製した（１７）。Ｌｙｓｉｓ２ソフトウェアとＦＡＳＣａｎサイトメトリー（Ｂｅｃｔｉｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ）とを用いた２カラーモードで、プールされたＣＬＮ集団を分析した。染色に用いられたモノクローナル抗体は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体（Ｈ１２９．１９抗ＣＤ４およびＨ５７−５９７抗ａ／ｂＴＣＲ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）結合体（Ｈ５３−６．７抗ＣＤ８ａ、ＩＤ３抗ＣＤ１９およびＧＬ３抗ａ／ｄＴＣＲ）であった。ＦＩＴＣ結合体またはＰＥ結合体アイソタイプに対応した抗体をネガティブコントロールとして用いた。全てのモノクローナル抗体をＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。分析用の各標品から、少なくとも１０，０００個の生育可能な細胞を用いた。
【００２０】
リンパ球増殖分析
１０％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中にプールされたＣＬＮ細胞を、９６−ウェルの丸底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェル中で３連で培養した（１ウェルにつき０．２×１０６個の細胞数）。カンジダアルビカンス抗原を、最終濃度が２．５ｍｇ／ｍＬになるように各ウェルに加えた。その培養物を、加湿したインキュベーター中で、５％のＣＯ２雰囲気下で７２時間インキュベートした。インキュベーション終了前の６時間、細胞を１μＣｉの３Ｈ−標識チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ， ＵＫ）でパルスすることによって、チミジンの取り込みを測定し、その後、回収し、計測した。その結果を平均ｃｐｍ±標準誤差として示す。
【００２１】
抗体分析
マイクロプレートＥＬＩＳＡ分析を用いて、唾液および血清中の特異的な抗体を定量した。イムノポリソルブ（Ｉｍｍｕｎｏｐｏｌｙｓｏｒｂ）マイクロタイター（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルを、０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝食塩水（ｐＨ８．４）中の５０μｇ／ｍＬのカンジダアルビカンス抗原でコーティングした。血清および唾液試料の適切な連続希釈液を各ウェルに加えた。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、続いてアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（ＡＮＩＲＡＤ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を加えることによって、結合抗体を検出した。基質溶液を添加した後、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＶＡ）を用いて、二連試料の光学密度を４５０ｎｍで読み取った。
【００２２】
ＲＴ−ＰＣＲ
リンパ細胞からのＲＮＡ抽出と合成ｃＤＮＡの増幅が、参考文献３１、４２に述べられている。リンパ細胞からのＲＮＡ抽出と合成ｃＤＮＡの増幅が、参考文献３１、４２に述べられている。簡単に説明すると、４×１０６／ｍＬのＣＬＮ細胞から抽出された１０ｍＬのトータルＲＮＡを、２０ｍＬのＲＴミックスに加えた［ここで上記ＲＴミックスは、６ｍＬの５×ＲＴ反応緩衝液（２５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、３７５ｍＭのＫＣｌおよび１５ｍＭのＭｇＣｌ２）、３ｍＬの１００ｍＭのジチオスレイトール、１．５ｍＬのデオキシリボヌクレオチド（１０ｍＭ）、１ｍＬのＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／ｍＬ）、０．５ｍＬのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００Ｕ／ｍＬ）、３ｍＬのオリゴ（ｄＴ）１５、３ｍＬのアセチル化ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）および２ｍＬのＤＥＰＣ処理水を含む］。そのｃＤＮＡ合成を４２℃で１時間行い、続いて７２℃で１０分間加熱した。５ｍＬのファーストストランドｃＤＮＡをＰＣＲミックスに加えて、ＰＣＲ増幅を行った［ここで上記ＰＣＲミックスは、１ｍＭの各プライマー（２０ｍＭ）、１ｍＬのｄＮＴＰミックス（４ｍＭ）、５ｍＬの１０×ＰＣＲ緩衝液、１．２ｍＬのＭｇＣｌ２（１．５ｍＭ）、０．２ｍＬのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）、および３１ｍＬのＤＥＰＣ処理水を含む］。この混合物の増幅は、サーマルサイクラー（Ｈｙｂａｉｄ， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， ＬＪＫ）セットを用いて、９４℃で１分間（ＩＬ−４およびＧ３ＤＰＨ）または３０秒（ＩＦＮ−ｇ）、６０℃で２分間（ＩＬ−４およびＧ３ＤＰＨ）または６２℃で１分間（ＩＦＮ−ｇ）、および、７２℃で３分間（ＩＬ−４およびＧ３ＤＰＨ）または９０秒（ＩＦＮ−γ）で、さらに最後の伸長工程が７２℃で１０分間で行われた。ＰＣＲ増幅を３５〜４０サイクル行った。ＰＣＲ断片を２％アガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで染料し、次に、ＵＶトランスイルミネーター下で可視化した。そのプライマー配列は、ＩＬ−４、センスＧＡＡ　ＴＧＴ　ＡＣＣ　ＡＧＧ　ＡＧＣ　ＣＡＴ　ＡＴＣ；アンチセンスＣＴＣ　ＡＧＴ　ＡＣＴ　ＡＣＧ　ＡＧＴ　ＡＴＴ　ＣＣＡ；ＩＦＮ−ｇ、センスＴＣＴ　ＣＴＣ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　Ｃ；アンチセンスＡＣＡ　ＣＡＧ　ＴＧＡ　ＴＣＣ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　Ａであった。ＩＬ−４およびＩＦＮ−γに関する増幅ＤＮＡ産物は、それぞれ３９９ｂｐおよび４６０ｂｐであった。
【００２３】
サイトカイン分析
１０％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中のＣＬＮ細胞を、２４ウェルプレートを用いて（１ウェルにつき４×１０６個の細胞）、２．５ｍｇ／ｍＬのカンジダアルビカンス抗原存在下で３日間培養した（上述した通り）。その培養上清を回収し、次に、対応抗体ペアと、標準として組換えサイトカイン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）とを用いたＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γに関して分析した。簡単に説明すると、イムノポリソルブマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｉｎａｒｋ）を、１μｇ／ｍＬの捕捉用（ｃａｐｔｕｒｅ）ラットモノクローナル抗ＩＬ−４（ＩｇＧ１）、ＩＬ−１２（ＩｇＧ２ａ）またはＩＦＮ−γ（ＩｇＧ１）抗体を含む炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）で４℃で一晩コーティングした。ウェルを洗浄し、次に、１％のＢＳＡでブロッキングし、その後、培養上清と適切な標準とを各ウェルに加えた。第二の抗体として、ビオチン化ラットモノクローナル抗ＩＬ−４、ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γ抗体を２ｍｇ／ｍＬ加えた。ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（ＡＭＲＡＤ， Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）およびＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。サイトカインＥＬＩＳＡの感度は、３１ｐｇ／ｍＬであった。計数からバックグラウンドを差し引き、正味のカンジダ誘導性を結果として示した。
【００２４】
感染および抗ＩＬ−４モノクローナル抗体を用いた治療
マウス口腔へ１０８個の酵母細胞（カンジダアルビカンス）を感染させ、その後の１日目、３日目および５日目に、マウス１匹につき３０μｇのラット抗ｒＩＬ−４（３１）（クローン１１Ｂ１１， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、または、マウス１匹につき２００ｍＬのＰＢＳ中の精製ラットＩｇＧ１に対応した同位体を腹腔内注射した。口腔内の酵母の数を上述したように測定した。
【００２５】
統計的分析
ノンパラメトリックのマン−ホイットニーのＵ試験を用いてデータを比較した。Ｐ値＜０．０５で有意差ありとした。全ての計算は統計ソフトウェアプログラム（ＳｔａｔＶｉｅｗ； Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ， ＣＡ）を用いて行われた。
【００２６】
実施例２：ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスにおけるカンジダアルビカンス口腔感染の動態
０日目に、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスの口腔粘膜に１０８個のカンジダアルビカンスの出芽胞子（出芽球菌形態）を感染させ、その後、コロニー形成の程度を２８日間試験した。図１（左のパネル）に示すように、感染後６時間のコロニー形成の程度は、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスの双方において類似していた。しかしながら、ＤＢＡ／２マウスにおいて酵母数が１ログ増加したのに比べて、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける感染への耐性は、接種後１日目のコロニー形成における最初の減少後から２日目において顕著であった（ｐ＜０．０５）。４日目にＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスにおけるコロニー形成は減少したが、６日目にＤＢＡ／２マウスにおける酵母数はＢＡＬＢ／ｃマウスと比べて２ログ増加した（ｐ＜０．００１）。８日目までに、ＢＡＬＢ／ｃマウス口腔内に酵母がなくなっていたのに対して、ＤＢＡ／２マウスにおける酵母数は３ログを超過し、１５日目までに次第にバックグラウンドレベルにまで減少した。カンジダアルビカンス接種後のマウスから得た糞粒の培養物は増殖せず、また糞粒あたり＜３ＣＦＵであることが示され、従って、ＤＢＡ／２マウスにおける感染の反復サイクルが糞食によるという可能性は除かれた。
【００２７】
カンジダアルビカンスの形態学的に異なる形態によって感染パターンが特徴付けられるかどうかを決定するために、口腔組織における出芽胞子のおよび菌糸形態の割合を算出した。図１（右のパネル）は、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスの口腔粘膜の組織切片における、カンジダの出芽胞子の菌糸形態に対する配分を示す。接種の後、ＤＢＡ／２およびＢＡＬＢ／ｃマウスの出芽胞子の菌糸形態に対する配分は、ほとんど類似していた。２日目までには、ＢＡＬＢ／ｃマウスよりもＤＢＡ／２において、出芽胞子より菌糸形態のほうが多くなっていた。４日目における両マウス系において検出された出芽胞子と菌糸形態との配分はほとんど同等であった。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、出芽胞子の菌糸に対する配分は時間経過につれ増え続け、その際、６日目の口腔粘膜に存在する酵母の１００％が出芽胞子であり、その後８日目に上記酵母はなくなった。著しく異なる点として、６日目にＤＢＡ／２マウスにおいては出芽胞子の菌糸に対する割合の低下が検出され、続いて１０日目まで増え、その後、酵母（優勢的に出芽胞子からなる）は１５日目になくなった。
【００２８】
実施例３：ＣＬＮにおける細胞性応答
ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ１２マウスをカンジダアルビカンスに感染させた後４日目のＣＬＮから回収された細胞の平均数は、それぞれ、マウス１匹あたり９．８×１０６〜２２×１０６個の細胞、および、９．５×１０６〜１８×１０６個の細胞に増加した（表１）。ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウス双方とも、６日目に細胞数が低下し、その後、カンジダアルビカンスはなくなったが、ＤＢＡ／２マウスにおいては、再感染後に細胞数が上昇し、その後１５日目で減少した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞と様々なＴ細胞との部分集合の相対的な割合は一定を保ったが、γ／δＴ細胞の割合は、感染している間、バックグラウンドレベルを超過する顕著な増加がみられた。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、γ／δＴ細胞の数は、６日目に５〜６倍に増加し、その後減少し、感染が解消された。これに比べて、ＤＢＡ／２マウスにおけるγ／δＴ細胞の数の増加は周期的であり、最大レベルは４日目と８日目に生じ、その後２８日目に、バックグラウンドレベルに低下し、感染が解消された。
【００２９】
ＣＬＮ細胞のインビトロ刺激
カンジダアルビカンス抗原で刺激したＣＬＮ細胞の培養物における、カンジダアルビカンスコロニー形成のＴ細胞増殖への効果を測定した。図２で示すように、刺激されていないコントロールと比べてＤＢＡ／２マウスでは、抗原で刺激されたＴ細胞の血管増殖応答が顕著に高く、そのピークは、４日目（ｐ＜０．０５）と１０日目（ｐ＜０．０５）であった。これに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては、血管増殖応答の低い（しかし顕著な）増加が４日目にみられ（ｐ＜０．０５）、６日目のピーク応答後（ｐ＜０．０１）、同じようなレベルをそれ以降保った。しかしながら、ＤＢＡ／２マウスにおける血管増殖応答は、２８日目までにコントロールレベルまで減少し続けた。
【００３０】
実施例４：血清のＩｇＧおよびＩｇＡ抗体応答、および、局所的なＩｇＧおよびＩｇＡ抗体応答
図３で示すように、感染後１０日後にＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウス双方において血清ＩｇＧ抗体レベルの増加が検出され、１５日目にその最大レベルが検出された。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩｇＧ抗体のレベルは、ＤＢＡ／２マウスに比べると、１０日目と１５日目（ｐ＜０．０５）および２８日目（ｐ＜０．０１）において顕著に高かった。同様に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの唾液中で、ＤＢＡ／２マウスに比べて顕著に高いレベルのＩｇＡ抗体が８日目以降全ての時点において検出され、最大レベルは１５日目であり（ｐ＜０．０５）、その後、２８日目で減少した（ｐ＜０．０５）。
【００３１】
実施例５：ＩＬ−４およびＩＦＮ−γのｍＲＮＡ遺伝子発現に関する感染の効果
ＣＬＮ細胞のＩＬ−４およびＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現へのコロニー形成の効果をＲＴ−ＰＣＲにより試験した。図４で示すように、２日目にＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＩＬ−４遺伝子発現が検出されたが、ＤＢＡ／２マウスにおいては６日目まで発現がみられなかった。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては１０日目でＩＬ−４遺伝子発現がみられなくなったが、ＤＢＡ／２マウスにおいては１５日目も発現し続けた。比較すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてはＩＦＮ−γのｍＲＮＡ遺伝子発現が感染後６時間で初めて検出され、続いて、次第に減少したが、ＤＢＡ／２マウスにおいては２８日を超過しても強く発現し続けた。カンジダアルビカンス抗原で刺激されたＣＬＮ細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γを生産した。感染後のサイトカイン生産のパターンと動態を決定するために、ＣＬＮ細胞をカンジダアルビカンス抗原で７２時間刺激し、その後、培養上清中のＩＬ−４とＩＦＮ−γとのレベルを測定した。
【００３２】
【表１】
2004502653.tif 000002
細胞数はマウス１匹あたりの計数として表され、γ／δＴ細胞の割合は、バックグラウンドを超えて有意差があった。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（バックグラウンドレベルと比較）。
図５で示すように、２日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＤＢＡ／２マウスより顕著に高いレベルのＩＬ−４が生産され、最大レベルは４日目と６日目であった（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）。比較すると、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスにおいて、ＩＦＮ−γレベルの増加が観察されたが、ＤＢＡ／２マウスにおいては、感染後６時間および２日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスより顕著に高いレベルの生産が観察された（それぞれ、ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては、４日目および６日目までにＩＦＮ−γ生産が最高になり、それに比べて、ＤＢＡ／２マウスにおいては、６日目までにＩＦＮ−γ生産がバックグラウンドレベルになっていた。ＩＦＮ−γの生産について、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては減少したが（ただし１５日目にわずかに増加したことを除く）、ＤＢＡ／２マウスにおいては、８日目（ｐ＜０．０５）と１０日目（ｐ＜０．０１）に著しい生産の増加が検出された。両マウス系において、２８日目までに、ＩＦＮ−γのレベルはバックグラウンドレベルに戻った。
【００３３】
ＩＬ−４生産量およびＩＦＮ−γ生産量が異なることと、ＩＬ−１２生産とが関連しているかどうかを決定するために、様々な時間で感染したＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスからＣＬＮ細胞を単離し、次に、カンジダアルビカンス抗原で３日間刺激し、その後、培養物上清中のＩＬ−１２を測定した。図５で示すように、ＤＢＡ／２マウスにおいて、感染後２日目もの早い時間で顕著に高いＩＬ−１２生産が検出された（ｐ＜０．０５）。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては、６日目および８日目にＩＬ−１２生産の増加が検出された（ｐ＜０．０５）。その後ＤＢＡ／２マウスにおいてはＩＬ−１２レベルがさらに増加したが、２８日目には、両マウス系におけるＩＬ−１２レベルは同様であった。
【００３４】
実施例６：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるカンジダ感染への感受性に対する、抗ＩＬ−４モノクローナル抗体の複数回の注射の効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＩＬ−４の高レベル生産と酵母の迅速な排除とが関連するかどうかを決定するために、抗ＩＬ−４投与の効果を評価した。図６によれば、ＢＡＬＢ／ｃマウスに酵母を口腔感染させ、感染後１、３および５日目に３０μｇの抗ＩＬ−４を投与した後、未処理コントロールに比べて高い保菌率（ｃａｒｒｉａｇｅ ｒａｔｅ）を有しており、酵母の排除遅延がみられた。しかしながら、ＣＬＮ細胞の培養上清中のＩＦＮ−γ量に関しては、抗ＩＬ−４モノクローナル抗体処理マウスとコントロールのカンジダアルビカンス感染マウスとの間で検出可能な差はみられなかった。
【００３５】
実施例７：カンジダ排除に対する、カンジダアルビカンスの出芽球菌および菌糸形態による免疫の効果
ＤＢＡ／２マウス（ｎ＝３〜５）に、０．２ｍＬのＰＢＳ中１×１０９個の加熱・不活化カンジダアルビカンス出芽胞子または菌糸形態を、１８日間中２日毎に胃内挿管することにより免疫した。最後の免疫から１日目に、マウス口腔粘膜に１０８個の酵母細胞を局所的に塗布することにより感染させた。全身性免疫と比較するため、マウスのグループに、ＰＢＳ中１×１０９個の酵母細胞を皮下感染させた。様々な時点で口腔全体を綿棒で拭き取ることによって、口腔粘膜の酵母排除率を測定した。その綿棒をＰＢＳに再懸濁し、次に、その細胞懸濁液の連続希釈液をサブローデキストロース寒天上にプローブレーティングした。その結果（平均±標準誤差）をマウス１匹あたりのｌｏｇ１０ＣＦＵとして示した。図７で示すように、出芽胞子または菌糸のいずれかで経口免疫したマウスは、非免疫コントロールマウスに比べて迅速に酵母を排除した。出芽胞子で免疫したマウスの様々な時点の排除率は、菌糸形態で免疫したマウスの排除率に比べてより迅速であった。比較すると、皮下で免疫したマウスにおいては、排除率は低かったものの１５日目までには酵母は排除され、一方で非免疫コントロールにおいては排除されなかったことから、迅速な酵母の排除が起こる経口免疫による細胞媒介性免疫に対して、耐性メカニズムは抗体生産と関連することがわかった。
【００３６】
実施例８：カンジダアルビカンスでの感染後、および、経口免疫後のＩＦＮ−γおよびＮＯ生産
防御の免疫パラメーターを決定するために、カンジダアルビカンス感染後の様々な時間でＩＦＮ−γレベルを測定した。図８に、経口免疫による唾液のＩＦＮ−γレベルへの効果を示す。感染前（０日目）は高レベルで存在し、口腔感染後２日目でコントロールマウスが同様のレベルに到達する。これは、口の免疫により唾液中に高レベルのＩＦＮ−γが誘導され、感染から防御することを示す。
酸化窒素（ＮＯ）生産は寄生虫感染における宿主の防御と関連するので、同じＨ２ｄのＭＨＣハプロタイプを共有する２種のマウス系に感染させた後にＮＯの定量を行った。この実験において、マウスをカンジダアルビカンスに感染させ、次に、ＮＯシンターゼ阻害剤としてＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニンモノアセタート（ＭＮＬＡ）を３日間毎日腹腔内注射し、その後、酵母排除率を測定した。図９で示すように、２種のマウス系において、ＭＮＬＡで処理したマウスは、未処理マウスに比べて、様々な時点で酵母排除が遅く、従って、ＮＯ生産の減少が耐性と関連することがわかる。
【００３７】
実施例９：口腔粘膜への生カンジダアルビカンス感染（ｌｉｖｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する、カンジダワクチンを経口投与した場合の効果
ＤＢＡ／２雄マウス（６〜８週齢）を、１×１０８個の加熱・不活化出芽胞子（Ｃａｎｄｉｖａｘ）で５回（１０日間中、２日毎）経口免疫するか、または、１×１０６個の出芽胞子を２日毎に４回皮下注射して免疫し、次に、１４日目に追加免疫し、その後、生カンジダアルビカンスに感染させた。経口免疫したマウスの防御は、皮下注射により免疫したマウスより優れていた（図１０）。このデータは、粘膜経路による免疫は、全身的な経路による免疫に比べて、粘膜部位での感染に対してより効果的であるという一般的な粘膜免疫系の概念に一致する。しかしながら、カンジダアルビカンスの超音波処理物で経口免疫したマウスの防御はより低かった（図１１）。
【００３８】
実施例１０：局所リンパ節におけるＴ細胞の血管増殖応答に対する、カンジダワクチンの効果
ＰＢＳ中の１×１０８個の出芽胞子を含むＣａｎｄｉｖａｘを用いて、ＤＢＡ／２マウスを継続的に１０回（２日毎に２０日間）経口免疫した。８週間後、マウスの１グループの口に追加免疫を１週間与え、その後、口腔をカンジダアルビカンスに感染させた。コントロールマウスにはＰＢＳが与えられた。感染後、２、６および８日目に、マウスのグループを殺した。カンジダ抗原で刺激した培養物中の頚部リンパ節の細胞におけるＴ細胞の血管増殖応答を測定した。３日後、培養物中のチミジン取り込みを測定（ｔｒｉｔｒｉａｔｅｄ）することによって血管増殖応答を測定した。図１２で示すように、コントロールマウスと比べて、Ｃａｎｄｉｖａｘで免疫したマウス、または、Ｃａｎｄｉｖａｘに加えて追加免疫したマウスにおいて、高いＴ細胞の増殖がみられた。さらに、Ｃａｎｄｉｖａｘを単独で与えたマウスは、ワクチンの付与に加えて口を追加免疫したマウスより優れた応答をみせた。しかしながら、双方の場合において、マウスは生細胞感染を防御した。
【００３９】
実施例１１：口腔カンジダ症および消化管カンジダ症に対するＣａｎｄｉｖａｘの治療効果
ＤＢＡ／２雄マウス（６〜８週齢）の２つのグループの口腔を、１×１０８個のカンジダアルビカンスに感染させた。２日目、１つのグループを、２００μｌのＰＢＳ中１×１０８個のオートクレーブで加熱・不活化したカンジダアルビカンス出芽胞子で、５日間連続して毎日免疫し、コントロールグループには２００μｌのＰＢＳのみを与えた。
口腔感染後、マウス（４つのグループ）を４、６、８、１２、１５日目に殺し、口腔および消化管のカンジダアルビカンス感染パターンを決定した。簡単に説明すると、マウスのグループを様々な時点で上述したように殺した。口腔内を完全に綿棒で塗布した。その酵母細胞をボルテックスミキサーで混合することによって再懸濁し、その後、サブローデキストロース寒天プレート上でその１０倍連続希釈液を培養した。
【００４０】
加えて、各マウスの腸の内容物全てを採取し、１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、４００ｇで遠心分離して管腔の内容物を分離した後、ｌ０μｌの１０倍連続希釈液をクロラムフェニコールを添加したサブローデキストロース寒天プレート上で培養した。３７℃で２４時間培養した後、コロニー数を計測し、口腔および腸のカンジダアルビカンス数を測定し、ＣＦＵ／ｍＬとして示した。
口腔から回収されたカンジダアルビカンス数を図１３に示し、腸におけるカンジダアルビカンス数を図１４に示す。
その結果によれば、カンジダアルビカンスで免疫したグループの口腔において、６および８日目で感染レベルが減少し（コントロールグループに比べて）、カンジダアルビカンスグループの腸において、８、１２および１５日目に感染レベルが減少した（コントロールグループに比べて）ことが示された。
このデータによれば、本発明のカンジダアルビカンスワクチンは慢性のカンジダアルビカンス感染に対して治療効果を有することを示す。また当該データによれば、本発明のワクチン組成物は、口腔だけでなく消化管においても、カンジダアルビカンスの感染に対して治療効果を有することを示す。
【００４１】
実施例１２：口腔カンジダ症におけるカンジダワクチンの効率に対する、ラクトバシラスアシドフィルス投与の効果
１×１０７個の加熱・不活化カンジダワクチンまたはＰＢＳを含む１×１０８個のラクトバシラスアシドフィルス（ＶＲＩ０１１）を、ＤＢＡ／２マウス（６〜８週齢）に２０日間１日おきに経口投与した。最終投与後の１日目に、上記マウス口腔にカンジダアルビカンスを感染させた。０、２、６および１０日目に、マウスのグループを殺し、口腔におけるコロニー形成のレベルを測定した。ラクトバシラスアシドフィルス（ＶＲＩ０１１）は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ、Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手できる。しかしながら、乳酸桿菌や他の生物に関する多くの一般的に用いられる他の源が当業者周知である。
図１５によれば、コントロールと比較して、ラクトバシラスアシドフィルスおよびカンジダワクチンを投与されたマウスにおいては、カンジダアルビカンスの口腔感染に対する防御がカンジダワクチン単独を投与されたマウスより顕著に優れていることが示される（ｐ＜０．０５）。
【００４２】
実施例１３：Ｃａｎｄｉｖａｘの組成物
組成物Ａ
組成物Ａは、１×１０８個の不活化カンジダアルビカンス出芽胞子からなる一価の口腔用不活化カンジダワクチンである。カンジダアルビカンス（分離株３６３０、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｒｏｙａｌ Ｎｏｒｔｈ Ｓｈｏｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｓｙｄｎｅｙ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、サブローデキストロースブロス（Ｏｘｏｉｄ， ＵＫ）を用いて、振盪水槽中で２５℃で４８時間培養した。次に、この生物体を新しい培地にトランスファーし、２５℃でさらに１８時間培養した。６００ｇで４０℃で１０分間遠心分離することによってその出芽胞子を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで再懸濁し、次に、１２１℃で３０分間オートクレーブすることによって不活化した。オートクレーブ後、その出芽胞子を滅菌ＰＢＳで遠心分離により３回洗浄し、１ｍｌにつき１×１０９個の細胞になるようにクレブスリンゲルリン酸デキストロース緩衝液（ＫＲＰＢ）で再懸濁し、次に、使用まで４℃で保存した。上記ワクチンは６ヶ月間安定である。
【００４３】
組成物Ｂ
組成物Ｂは、１×１０７個の熱で不活化カンジダアルビカンス出芽胞子および１×１０７個のラクトバシラスアシドフィルス（ＶＲＩ０１１）からなる混合口腔用不活化カンジダワクチンである。上記混合ワクチンでの経口免疫は、出芽胞子またはラクトバシラスアシドフィルスいずれか単独での免疫より効果的であった（図１５）。
【００４４】
上記研究の結果によれば、マウスモデルにおける口腔粘膜のカンジダアルビカンス感染に対する宿主の耐性は、特定のパターンのサイトカイン応答と局所リンパ節におけるγ／δＴ細胞の蓄積に関連することが示される。感染後の「感染耐性の」ＢＡＬＢ／ｃおよび「感染しやすい」ＤＢＡ／２マウスにおけるカンジダアルビカンスのコロニー形成パターンの差は、Ｔ細胞増殖と、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの分泌パターンの双方と相関していた。カンジダアルビカンスの出芽胞子および菌糸形態双方についてのコロニー形成パターンは、周期的であり、ＤＢＡ／２においては高いレベルのコロニー形成がみられた。より「感染耐性の」ＢＡＬＢ／ｃ系は、より低いレベルのコロニー形成での単一のピーク、およびより迅速な口腔からのカンジダアルビカンス排除を示した。局所リンパ節において、γ／δＴ細胞の選択的な広がりがみられ、これはやがては両マウス系における感染の排除と相関する。持続的で抗原特異的なＴ細胞増殖は、感染耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス系においてのみ起こった。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては、感染が解消された後、血清ＩｇＧおよび唾液ＩｇＡ抗体が高レベルになったが、ＤＢＡ／２マウスにおいては、より低いか又はその程度であった。ＤＢＡ／２マウスにおいて、大量の菌類での周期的なコロニー形成、および、感染排除の遅延は、感染後のＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の高い初期レベルと相関するが、鈍いＩＬ−４応答の遅延とは相関しない。これに対して、感染耐性のＢＡＬＢ／ｃ系は、単一のピークを示し、低いレベルのコロニー形成がみられ、その後、カンジダアルビカンスの迅速な排除が起こり、これはまた、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの初期生産にも相関する。抗ＩＬ−４モノクローナル抗体（１１Ｂ１１）を複数回注射することによるこれらマウスにおけるＩＬ−４の中和は、保菌率の増加と、その口腔からのカンジダアルビカンスの排除の遅延とを生じさせた。それら結果を総合すると、ＩＦＮ−γとＩＬ−４生産およびγ／δＴ細胞の増殖により特徴づけられるバランスの取れたＴｈ１およびＴｈ２ヘルパー細胞応答の誘導が、口腔カンジダ症においてカンジダアルビカンス感染に対する宿主の耐性と関連するファクターであることが示唆されるる。
【００４５】
カンジダアルビカンス感染に対する宿主保護のメカニズムが、カンジダ症のマウスモデルにおいて、様々な免疫性のエフェクターメカニズムを介したＴ細胞サイトカイン操作の影響に関して広範囲に研究されてきた（１０）。侵襲性カンジダ症においては、好中球とマクロファージが宿主の防御に関与する（２）。耐性と感受性との関連、および、Ｔ細胞サイトカインプロファイルは、死亡率または生存率に関するこれらモデルにおいて実証されている（２で述べられている）。例えば、耐性マウスおよび感受性マウスの双方において、ＩＦＮ−γが感染後迅速に生産され（２８，４４）、中和ＩＦＮ−γは耐性マウスの感染に対する感受性を増し（４０）、これは、ＩＬ−１２が仲介するＩＦＮ−γの過剰生産と同様である（２８）。ＩＦＮ−γ欠損マウスの研究において、ＩＦＮ−γにより誘導されたマクロファージの活性化は、生存に必須である（２４）。しかし、他の研究が示すところによれば、全身性カンジダ症に対する宿主の防御において、ＩＦＮ−γは必須ではない（３７）。このような研究において、粘膜のコロニー形成を制限するメカニズムと、全身への侵入を防ぐメカニズムや生存に必須なメカニズムとを区別することが重要である。宿主応答期間の単一の成分を操作することに関する重要な研究は、慎重に解釈しなければならない。現在の研究では、自己限定性の口腔カンジダ症の天然モデルを用いて、宿主耐性および感受性のメカニズムが試験されている。コロニー形成と、１ＵＮ−ｙおよびＩＬ−４生産との異なるパターンを、「感染耐性の」ＢＡＬＢ／ｃマウスと「感染しやすい」ＤＢＡ／２系とを用いて比較した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスの双方において、最初のカンジダアルビカンス感染の後、初期に（６時間で）ＩＦＮ−γ転写物が検出された一方で、ＤＢＡ／２マウスにおいては、ＩＦＮ−γの生産だけではより長引くコロニー形成を防げなかった。ＤＢＡ／２における補体第五成分の欠乏が、口腔カンジダ症における長引くコロニー形成に寄与するかどうかは不明である。コンジェニックマウス（異なる遺伝的バックグラウンドのＤＢＡ／２系から繁殖させたコンジェニックマウスを含む）を用いた数々の研究によれば、Ｃ５欠損ＤＢＡ／２マウスにおいて、感染の病巣における炎症性の病変の減少が認められていないため、Ｃ５欠損は、侵入性カンジダ症の病因論に寄与する必須のファクターではないことが報告されている（１、２）。
【００４６】
現在の研究が示すところによれば、ＤＢＡ／２マウスにおいて、高レベルのＩＬ−１２、ＩＦＮ−γおよびメッセージ発現の遅延と、低いレベルのＩＬ−４とは、カンジダアルビカンスのより高いレベルのコロニー形成と、排除遅延とに相関する。これは、感受性ＤＢＡ／２マウスにおける胃粘膜のカンジダアルビカンス感染は、パイアー斑におけるＩＬ−４の減少した発現に関係することを示す観察に一致する（１０）。比較すれば、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるより低いレベルのＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、および、初期のより高いＩＬ−４生産は、カンジダアルビカンスの低いコロニー形成および迅速な排除に関係し、これは、その程度、それら動態、およびサイトカインの混在が、感染後の防御を決定づけることにおいて決定的なファクターとなり得ることを示す。Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの双方とも、胃のカンジダ症においてみられたように、異なる動態での異なる産生量で、口腔カンジダ症から回復したＤＢＡ／２およびＢＡＬＢ／ｃマウスに存在した（１０）。従って、口腔粘膜におけるカンジダアルビカンスでの一次感染に対する耐性は、Ｔｈ１およびＴｈ２応答と関連する。その上、抗ＩＬ−４抗体で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスの保菌率の増加およびその口腔粘膜からのカンジダアルビカンス排除の遅延で示されるように、ＩＬ−４は、このプロセスにおいて重要な役割を果たすようである。
【００４７】
口腔粘膜におけるＩＬ−４で増強されたカンジダアルビカンス感染に対する耐性メカニズムは不明である。一次の全身性カンジダ症において、ＩＬ−４は、免疫のエフェクター媒介体を増進させること（エフェクターＴｈ１細胞の分化を含む）を介してカンジダアルビカンス感染を制限する可能性がある（３１）。特に、ＩＬ−４は、全身性カンジダ症および胃のカンジダ症において、防御的なＴｈ１応答の発達を促進する（１０）。他の研究によれば、ＩＬ−４欠損マウスは、正常コントロールより急性の全身性感染に対して高い感受性を有することが示されているが（３２）、感染後の口・胃（ｏｒｏｇａｓｔｒｉｃ）のカンジダ症に対する感受性においては差はみられなかった（４９）。これらの逆説的な発見は、異なるマウス系、異なる感染経路、および、全身性または粘膜性カンジダ症を誘導するようなカンジダアルビカンス用量を用いた異なる実験モデルによって説明することができる。例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける胃内のカンジダアルビカンスの感染は、ＤＢＡ／２マウスよりもひどい胃のカンジダ症を誘導したが、全身性カンジダ症に関してはその逆であった（１０）。現在のモデルにおいては、急性口腔カンジダ症は、カンジダアルビカンスの局所的塗布によって誘導され、これは、口・胃のカンジダ症を誘導するようなカンジダアルビカンスの塊（ｂｏｌｕｓ）での胃内の感染と対照的であった（３２）。その上、カンジダアルビカンスの口腔粘膜への局所的塗布は、その一般的粘膜免疫系の活性化を経る感染の経路を改変し得る消化管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）区域への抗原の供給を制限する（１４）。実際に我々は、ＤＢＡ／２マウスにおいて、死滅化カンジダアルビカンスで口を免疫することにより、酵母のより低いコロニー形成および口腔粘膜からの迅速な排除が起こることを示した。
【００４８】
本研究において、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスの双方は、抗体生産の開始前に感染を排除するので、血清ＩｇＧおよび分泌ＩｇＡ抗体の生産が粘膜における排除に重要な役割を果たさなかったことを示す。これは、排除時点でのＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン双方の生産を示したマウスの胃カンジダ症の研究に一致する（１０）。その上、分泌ＩｇＡ抗体の生産を強化しても、感染の解消は促進されなかった（１０）。
【００４９】
感染後、ＣＬＮにおいて細胞数が増加したにもかかわらず、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、α／βＴ細胞およびＢ細胞の割合は一定を維持したが、これは、抗原で誘導された細胞増殖というよりむしろ、細胞が補充されたことを示す。しかしながら、γ／δＴ細胞の選択的な増殖がみられ、これは、カンジダアルビカンス排除と相関した。その数は少ないが、末梢リンパ組織におけるγ／δＴ細胞の不足を考慮するとその増加は有意であった（２０）。微生物の感染、ウイルス性感染および寄生虫感染の後、γ／δＴ細胞数が増加することが報告されており、これは、宿主防御の第一線におけるγ／δＴ細胞に関する役割を示す。カンジダアルビカンスに感染したＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスにおいて、口腔粘膜におけるγ／δＴ細胞数の増加がコロニー形成のパターンに関係することは、以前に報告されている（１２）。しかしながら、γ／δＴ細胞がＩＬ−４の供給源であるかどうかは不明である。γ／δＴ細胞クローンおよびγ／δＴ細胞系がこのサイトカインを分泌できることが報告されているにも関わらず（４）、我々は、これらのマウスにおいて、γ／δＴ細胞中の有意な量のＩＬ−４を実証することができなかった（データは示さず）。腹腔内にカンジダアルビカンスを注射したマウスにおいて、γ／δＴ細胞は、マクロファージにより酸化窒素（ＮＯ）生産を増強し得ること（２３）、さらに、γ／δＴ細胞は耐性メカニズムに関連することが近年報告されている。その上、ＮＯはＴ細胞におけるＩＬ−４発現を増強することができ（１５）、さらに、サイトカイン分泌のバランスに影響を及ぼす。従って、粘膜におけるカンジダアルビカンスの保持は、ＮＯおよびＩＬ−４の放出を介したマクロファージとＴ細胞との間の相互作用に依存し得るものであり、それは、ＩＬ−４の表面受容体を有するマクロファージによる酵母細胞の死滅を促進すると報告されている（１９）。γ／δＴ細胞はＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を分泌し、これらはいずれもマクロファージを活性化し、カンジダアルビカンスに直接作用する（３８）。現在のモデルにおける唾液のＮＯレベルを試験した予備的な研究は、この仮説を支持している。
【００５０】
要約すると、局所リンパ節細胞集団の分析は、感染の実験モデルにおけるサイトカイン機能についての現在の構想に一致するデータを提供する。いかなる特定の作用メカニズムによっても縛られることを望まないが、この口腔カンジダ症モデルの研究における発見は、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの生産は、その無傷（ｉｎｔａｃｔ）動物における粘膜感染の解消に重要であろうことを示す。ＩＬ−４生産の初期的出現は、口腔粘膜におけるカンジダアルビカンス感染に対する免疫を増強することにおけるこのサイトカインの重要性を示す。高レベルのＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの同時的存在は、口腔粘膜の感染を一掃することにおいて効率的な宿主防御メカニズムであるものとして、バランスの取れたＴｈ１およびＴｈ２応答という概念を支持する。
特定の実施例および好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、本明細書で説明された本発明の広い構想および本質を逸脱しない改変も考慮されることは明白である。
【００５１】
参考文献
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４０． Ｒｏｍａｎｉ， Ｌ．， Ａ． Ｍｅｎｃａｃｃｉ， Ｌ． Ｔｏｎｎｅｔｔｉ， Ｒ． Ｓｐａｃｃａｐｅｌｏ， Ｅ． Ｃｅｎｃｉ， Ｐ． Ｐｕｃｃｅｔｔｉ， Ｓ． Ｆ． Ｗｏｌｆ， ａｎｄ Ｆ． Ｂｉｓｔｏｎｉ．１９９４． Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２ ｉｓ ｂｏｔｈ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｒ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｔｙｐｅ−１ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２： ５１６７−５１７５．
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスにおける、カンジダアルビカンスのコロニー形成パターンを示す。Ａ（左のパネル）において、綿棒でカンジダアルビカンス（１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）を口腔粘膜に塗布することによってマウスに感染させた。様々な指示時間に綿棒で口腔を拭き取ることによりコロニー形成レベルを評価した。示されたデータは、３〜５匹のマウスの平均±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＢＡＬＢ／ｃとＤＢＡ／２マウスとから得られた値の間の有意差を意味する。Ｂ（右のパネル）において、Ｈ＆ＥおよびＰＡＳ染料での染色後、光学顕微鏡（４０倍の倍率）で、口腔組織における出芽胞子および菌糸の数を計測した。示されたデータは、３〜５匹のマウスの平均±標準誤差を意味する。
【図２】
図２は、リンパ球の増殖を示す。頚部リンパ節（ＣＬＮ）細胞は、４日間、カンジダ抗原で刺激するか、または、カンジダ抗原で刺激せず、その後、チミジンを取り込み、の評価を示す。示された結果は、３匹のマウスの平均ｃｐｍ±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（刺激されなかった細胞から得られた値と比較）。
【図３】
図３は、カンジダアルビカンスに特異的な血清ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体を示す。感染マウスの血清および唾液中のカンジダアルビカンス特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。時間０は、非感染マウスを表す。示された結果は３匹のマウスの平均±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ＢＡＬＢ／ｃまたはＤＢＡ／２マウスから得られた値と比較）。
【図４】
図４は、ＣＬＮ細胞におけるＩＬ−４およびＩＦＮ−γのｍＲＮＡ遺伝子発現を示す。カンジダアルビカンスに感染したマウスのＣＬＮ細胞からトータルＲＮＡを抽出し、サイトカインに特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲで分析した。各試料の等量のローディング（Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｌｏａｄｉｎｇ）はＧ３ＤＰＨメッセージにより測定された。
【図５】
図５は、インビトロで刺激されたＣＬＮ細胞による、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生産を示す。感染マウスからのＣＬＮ細胞をカンジダアルビカンス抗原で３日間刺激し、その後、その培養上清をＥＬＩＳＡによりサイトカインに関して分析した。時間０は、非感染マウスを表す。示された結果は、３〜５匹のマウスの平均±標準誤差である。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（ＢＡＬＢ／ｃまたはＤＢＡ／２マウスから得られた値と比較）。
【図６】
図６は、急性カンジダアルビカンス感染に対する耐性に対する、抗ＩＬ−４抗体の治療効果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに酵母細胞を感染させた後、１、３および５日目に、３０μｇのラット抗ＩＬ−４、または、精製ラットＩｇＧ１に対応したアイソタイプを腹腔内注射した。様々な日に、口腔の酵母数を測定し、その結果を３〜５匹のマウスの平均コロニー形成単位（ＣＦＵ）±標準誤差として示した。＊ｐ＜０．０５。
【図７】
図７は、出芽胞子（Ｂ）または菌糸（Ｈ）のいずれかで経口免疫したマウスにおける、カンジダアルビカンス排除を示す。
【図８】
図８は、唾液のＩＦＮ−γレベルに対する経口免疫の効果を示す。
【図９】
図９は、マウスにおけるカンジダアルビカンスの排除に対する、Ｌ−ＭＬＮＡの治療効果を示す。
【図１０】
図１０は、カンジダワクチン（Ｃａｎｄｉｖａｘ）の経口投与または皮下投与の、免疫効率に関する比較を示す。
【図１１】
図１１は、カンジダ可溶性抗原での経口免疫を示す。
【図１２】
図１２は、カンジダ抗原での刺激に対する応答におけるＴ細胞増殖に対するＣａｎｄｉｖａｘの効果を示す。
【図１３】
図１３は、免疫の前後における、感染後のカンジダアルビカンスの口のコロニー形成を示す。
【図１４】
図１４は、免疫の前後における、口腔感染後のカンジダアルビカンスの消化管のコロニー形成を示す。
【図１５】
図１５は、口腔カンジダ症に対する防御に対する、ラクトバシラスおよびＣａｎｄｉｖａｘの共投与の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004502653.tif 000061
2004502653.tif 000062
2004502653.tif 000063