(57)【要約】ＭＨＣに結合するテロメラーゼペプチドを開示する。本出願はまた、哺乳類癌細胞に対するＣＴＬ応答を増強するための、このペプチドを含むワクチンおよびこのペプチドの使用方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、いかなる起源の腫瘍も治療する万能ワクチン：
哺乳類の癌細胞に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を開始および増強するために有効量の、少なくとも一つのテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＲＴ）ペプチド；および
生理的に許容される担体。
【請求項２】
テロメラーゼペプチドが、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に対する結合を増強するように改変される、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
ＭＨＣ分子がクラスＩである、請求項２記載のワクチン。
【請求項４】
ＭＨＣ分子がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である、請求項３記載のワクチン。
【請求項５】
ＭＨＣ分子がＨＬＡ−２である、請求項４記載のワクチン。
【請求項６】
ｈＴＲＴペプチドがヒトテロメラーゼ逆転写酵素ペプチドである、請求項１記載のワクチン。
【請求項７】
ペプチドの長さがアミノ酸約７〜約１５残基である、請求項６記載のワクチン。
【請求項８】
ペプチドが単独で有効である、請求項１記載のワクチン。
【請求項９】
ペプチドが他のペプチドと併用して有効である、請求項１記載のワクチン。
【請求項１０】
ワクチンがアジュバントも含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項１１】
担体が哺乳類細胞である、請求項１記載のワクチン。
【請求項１２】
担体である哺乳類細胞がトランスフェクトされたまたはトランスジェニック細胞である、請求項１１記載のワクチン。
【請求項１３】
クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって拘束された合成ｈＴＲＴペプチド。
【請求項１４】
以下を含む、癌細胞に対するＣＴＬ応答を誘導および増強する方法：
哺乳類の血中白血球を採取する段階；
ｈＴＲＴの有効量をパルスする段階；および
パルスした白血球の有効量を癌細胞に接触させる段階。
【請求項１５】
接触がインビトロで行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
接触がインビボで行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
その量がＣＴＬを腫瘍細胞に誘引するために有効である、哺乳類レシピエントにテロメラーゼ転写酵素（ＴＲＴ）ペプチドの有効量を投与することによって、細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）を腫瘍細胞に標的する方法。
【請求項１８】
レシピエントが癌患者である、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の背景
本発明は、癌を治療するために有効なワクチンに関する。
【０００２】
本発明は特に、特異的腫瘍抗原としてテロメラーゼ逆転写酵素を含む万能癌治療ワクチン、細胞障害性Ｔリンパ球を腫瘍細胞に標的するための使用法、および腫瘍に対して癌患者の免疫応答を誘導および／または増強する方法に関する。
【０００３】
２．先行技術の説明
本出願において様々な出版物を参照する。これらの出版物における開示は、本発明が属する技術分野の現状がより十分に説明されるように、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００４】
現在まで選択されてきた主な癌治療は、手術、放射線治療、化学療法、またはその組み合わせである。非常に少数の癌を例外として、予後はあまり満足のゆくものではなく、患者は時に治療そのものに対してひどく苦しんだ後に死亡する。
【０００５】
世界中で多くの医学研究の研究所が、良性および悪性腫瘍の双方の増殖を停止させ破壊するために有効な、非侵襲的治療の開発に向けた研究を行っている。しかし、臨床試験または一般診療の双方において用いられる治療は、これまで適当なレベルの腫瘍細胞の壊死を示していない。
【０００６】
治療の非特異的方法
腫瘍を治療する一つの方法、近接照射療法は、腫瘍に直接タンパク質アルブミンの顕微鏡的塊を注入することを含む。次に、適した量の放射性リンを同じ針で加える。アルブミンは腫瘍内の毛細管に詰まり、それによって腫瘍外の組織への放射性リンの放出を防止する。リンは腫瘍細胞に取り込まれて直ちに使用され、体内の他の部分の正常細胞に損傷を与えることなく放射活性によってそれらを選択的に殺す。毛細管の詰まりが解消するまでに、ほとんどまたは全ての放射性リンが腫瘍を含む細胞によって吸収され、隣接組織にはほとんど漏出しない。しかし、この治療は実施することが難しく、体内の健康な部分に放射活性材料が漏出して重篤な障害を引き起こす危険を常に伴う。
【０００７】
ロバートＴ．ゴードン（Ｒｏｂｅｒｔ Ｔ． Ｇｏｒｄｏｎ）は、米国特許第４，６２２，９５２号において、腫瘍を治療する異なる方法を開示した。この方法は、腫瘍と正常細胞との間に認められる異なった熱感受性を利用しようと試みている。腫瘍細胞が正常細胞より低い温度で殺されることは周知である。このように、ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）は、正常細胞に重篤な影響を及ぼすことなく腫瘍細胞を殺すために、電磁エネルギーを用いて腫瘍細胞または組織の温度を上昇させる方法を提唱した。
【０００８】
免疫療法
１．抗体応答
腫瘍特異的抗原に対して誘発されたポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体イソ抗体、または自家抗体によって腫瘍細胞を殺す多くの試みがなされてきた。一般的に、この方法は、特に固形腫瘍を扱う場合には成功しない。
【０００９】
２．細胞障害性免疫
残念なことに、癌の予防および／または治療に関するこれらのアプローチは、治療すべき腫瘍が発現する腫瘍抗原がワクチンには存在しないこと、腫瘍ワクチンにおける抗原の特徴付けが乏しいこと、仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）または移植抗原のような免疫原性であるが望ましくない材料によってワクチンが汚染されること、そしてさらに癌細胞が抗原的に不均質性であることといった多くの問題によって成功していない、または完全に満足のゆくものではない。その上、そのような腫瘍ワクチンはしばしば、新鮮な腫瘍細胞から調製されたが、その供給が限られているために、ワクチンの特性は再現的でない。
【００１０】
３．現在の概念
ａ．抗原非特異的標的物質の選択
１９９７年にダンラビー（Ｄｕｎｌａｖｙ）に与えられた米国特許第５，６５８，２３４号は、正常細胞の原子、分子、または細胞共鳴振動数とは異なる原子または分子共鳴振動数または複数の振動数を有する少なくとも一つの成分を有する標的物質を選択する段階、腫瘍内での標的物質の位置を決定または配置する段階、および成分が電磁波からのエネルギーを吸収してその結果、正常な細胞の生存率に有害な影響を及ぼすことなく腫瘍を破壊する、腫瘍の増殖を終わらせるまたは遅らせるのに十分な熱を放出させるように、成分の原子または分子共鳴に対応する振動数または複数の振動数で電磁波エネルギーを標的物質に照射する段階を含む。
【００１１】
ａ．特異的黒色腫抗原
メラノソーム抗原は免疫系によって認識されうる。これは、転移性黒色腫患者の血清ＩｇＧ抗体による自家黒色腫細胞からのｇｐ７５抗原の免疫沈降によって証明された（Ｍａｔｔｅｓ， Ｊ．Ｍ．、Ｔ．Ｍ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｌ．Ｊ． Ｏｌｄ、およびＫ．Ｏ． Ｌｌｏｙｄ、（１９８３）「ヒト血清における沈殿抗体によって定義されたヒト黒色腫の色素沈着関連分化抗原（Ａ ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ， ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ）」、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ３２：７１７）。ｇｐ７５抗原は、色素沈着メラニン細胞および黒色腫によって合成される最も量の多い糖タンパク質であるメラノソームポリペプチドである（Ｔａｉ Ｔ．、Ｍ． Ｅｉｓｉｎｇｅｒ、Ｓ． Ｏｇａｔａ、およびＫ．Ｏ． Ｌｌｏｙｄ（１９８３）、「ヒト悪性黒色腫およびメラニン細胞における分化マーカーとしての糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４３：２７７３）。上皮メラニン細胞、良性色素沈着病変、ならびに原発性および転移性黒色腫はｇｐ７５を発現するが、他の細胞型は発現しないＴｈｏｍｐｓｏｎ Ｔ．Ｍ．、Ｆ．Ｘ． Ｒｅａｌ、Ｓ． Ｍｕｒａｋａｍｉ、Ｃ．Ｃａｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ、Ｌ．Ｊ．Ｏｌｄ、およびＡ．Ｎ． Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、（１９８８）「メラニン細胞と黒色腫の分化抗原：モノクローナル抗体によるヒト色素沈着細胞のメラノソームおよび細胞表面マーカーの分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．）」、Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ９０：４５９）。本発明において、ｇｐ７５ ｃＤＮＡはｂ（褐色）遺伝子座にマッピングされるマウス遺伝子の由来アミノ酸およびヌクレオチド配列と約９０％同一性を有することが証明されている。褐色遺伝子座は、外皮の色を左右し、合成されたメラニンの型に影響を及ぼす部位であり、このことはｇｐ７５が、合成されたメラニンの型を調節または影響を及ぼすことを示唆している。
【００１２】
転移性黒色腫を有する患者の血清中のＩｇＧ抗体がｇｐ７５を免疫沈降することが示されたという事実は、ｇｐ７５に対する免疫寛容を破壊できることを証明する。したがって、本発明は黒色腫に対するワクチンとして用いられるｇｐ７５ ｃＤＮＡを含む発現ベクターを提供し、それによってペプチドのアミノ酸配列がｇｐ７５ポリペプチドから決定された。これをマウスモノクローナル抗体ＴＡ９９によって単離および精製し、それによってペプチド配列に基づくオリゴヌクレオチドでのスクリーニングを行うことにより、ｃＤＮＡクローンが単離された。
【００１３】
ｂ．ヒト前立腺特異的レダクターゼ
ヒー（Ｈｅ）らに与えられた米国特許第６１０６，８２９号は、前立腺癌の診断マーカーとして、および前立腺癌が転移するか否かを決定するための物質としてヒト前立腺特異的レダクターゼポリペプチドを用いる。この特許はまた、前立腺癌細胞を標的とするために用いても、前立腺癌ワクチンの一部として用いてもよく、前立腺特異的レダクターゼポリペプチドに対して特異的な抗体を開示する。
【００１４】
ｃ．テロメラーゼ
現在医学研究者によって評価されている腫瘍を治療するもう一つの方法は、テロメラーゼと呼ばれる物質を利用することであり、これは腫瘍細胞が産生して生存を維持するために必要な酵素であるが、正常な体細胞（精子および造血系を除く）は産生せず、必要ともしない酵素である。テロメラーゼのこの独自の特性によって、新しい腫瘍細胞の増殖を阻害するか、または老齢な細胞の死を引き起こすために十分な酵素の作用を遮断する薬剤を開発する試みが促進された。テロメラーゼは、体の正常な健康な細胞と比較して異なるようにより大量に腫瘍細胞によって必要とされるおよび／または用いられるために、しばしば「腫瘍特異的」であると言われる分類の物質の例である。
【００１５】
真核生物の末端に物理的に存在するタンパク質−ＤＮＡ構造であるテロメラーゼは、染色体の安定性のために必要であり、核内の染色体構築に関係している（例えば、Ｚａｋｉａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１６０１［１９９５］；ＢｌａｃｋｂｕｒｎおよびＧａｌｌ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２０：３３［１９７８］；Ｏｋａら、Ｇｅｎｅ １０：３０１［１９８０］；およびＫｌｏｂｕｔｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８：３０１５［１９８１］を参照のこと）。テロメラーゼは、それらによって細胞は破壊された染色体と無傷の染色体とを区別することができ、染色体を分解から保護し、新規複製メカニズムのための基質として作用するために、酵母のような生物およびおそらくほとんどの他の真核生物において必須であると考えられる。テロメラーゼは、一般的に、テロメア特異的ＤＮＡポリメラーゼである「テロメラーゼ」によって、複合体として複製され、細胞周期および発達段階で調節される。しかし、テロメアを維持するためのテロメラーゼ非依存的手段が記述されている。近年、テロメアの喪失が癌および加齢において起こるような染色体の変化に関連していることから、テロメアに多くの関心が集まっている。
【００１６】
重要なことは、テロメアの複製は、発達および細胞周期因子の双方によって調節される点である。テロメアの複製の局面は細胞周期におけるシグナルとして作用する可能性があるという仮説が立てられている。例えば、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成体の特定のＤＮＡ構造は、染色体の複製が完了したことを示すチェックポイントとして作用する可能性がある（例えば、Ｗｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３：４０５７［１９９３］を参照のこと）。さらに、ヒトにおいて、テロメラーゼ活性は、多くの腫瘍において検出されるが、ほとんどの体細胞組織において検出されないことが認められている（Ｗｅｌｌｉｎｇｅｒ、上記）。このテロメアの長さは、有糸分裂の時計として作用する可能性があり、インビボおよび／またはインビトロで細胞の複製能を制限するのに役立つ。当技術分野で依然として必要であるのは、正常と共に異常な細胞（すなわち、癌様細胞）におけるテロメアの役割およびその複製を調べる方法である。テロメラーゼとその機能を理解することは、癌治療または抗加齢過程の標的としてテロメラーゼを用いる手段を開発するために必要である。
【００１７】
腫瘍および癌の新しい治療および治癒方法を研究、開発、および評価することに費やされる広範囲の費用のかかる努力にもかかわらず、真の有意な進歩または完全に満足のゆく治療はこれまでのところ得られていない。
【００１８】
発明の概要
したがって、本発明の目的は、良性および悪性腫瘍の双方に対する新規かつ有効な治療様相を提供することである。治療は、特に放射活性物質と化学療法の使用に関して、上記のこれまでの治療の短所と危険性を回避しなければならない。
【００１９】
本発明のもう一つの目的は、増殖しつつある腫瘍に対して万能的に有効であるワクチンの構築能を考慮する。
【００２０】
これらの目的を達成するために、本発明の最も好ましい態様は、少なくとも一つのテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＲＴ）ペプチドを、生理的に許容される担体中で哺乳類の癌細胞に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を開始および増強するために有効な量で有する、いかなる起源の腫瘍も治療するための万能ワクチンである。好ましくは、テロメラーゼペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に対する結合を増強するように改変される。
【００２１】
ＭＨＣ分子は、クラスＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡ−２であることが都合がよいであろう。好ましくは、ｈＴＲＴペプチドは合成ヒトテロメラーゼ逆転写酵素ペプチドであるが、同様に有効な合成相同体であってもよい。好ましくは、ペプチドは長さがアミノ酸約７〜約１５残基であり、最も好ましくは９量体である。これは、単独または他のペプチドと併用して有効である可能性がある。
【００２２】
上記のワクチン調製物はまた、アジュバントまたは促進物質を含んでいてもよい。非常に好ましい促進物質はインターロイキン分子である。
【００２３】
同様に、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって都合よく拘束される合成ｈＴＲＴペプチドも本発明に含まれる。
【００２４】
本発明のもう一つの目的は、癌細胞に対するＣＴＬ応答を誘導および増強する方法である。本方法は、哺乳類の血中白血球を採取する段階、白血球にｈＴＲＴの有効量をパルスする段階、パルスした白血球の有効量に癌細胞を接触させる段階を含む。この接触段階はインビトロまたはインビボで行ってもよい。方法は、その最も単純な形で、癌患者がその腫瘍に対する潜在的な免疫を有するか否か、そして治療の候補となる可能性があるか否かを決定するためにインビトロで用いることができる。
【００２５】
本発明のさらにもう一つの目的は、その量がＣＴＬを腫瘍細胞に誘引するために有効である、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＲＴ）ペプチドの有効量を哺乳類レシピエントに投与することによって、腫瘍細胞に細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）を標的する方法を含む。このレシピエントは好ましくは癌患者である。
【００２６】
本発明のこれらの目的およびその他の局面は、以下の図面および添付の明細書を参照することによって、さらに明らかになるものと思われる。
【００２７】
好ましい態様の説明
本明細書に用いられる、「テロメラーゼ」および「テロメラーゼ複合体」という用語は、機能的テロメラーゼ酵素を意味する。本用語には、テロメラーゼに見出されるタンパク質の複合体を含むことが意図される。例えば、本用語は、１２３ｋＤａおよび４３ｋＤａのテロメラーゼタンパク質サブユニットを含む。
【００２８】
テロメラーゼは、ヒト細胞における悪性の形質転換につながるリボヌクレオタンパク質酵素である。テロメラーゼ活性は、大多数のヒト腫瘍において増大し、その遺伝子産物は全てのヒト腫瘍に共通する第一の分子となる。クラスＩ腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣ）と結合し、内因的にプロセッシングされたテロメラーゼペプチドが産生することで、異なる起源の腫瘍に細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を標的することができる。このことにより、正常な成人および癌患者において、テロメアーゼペプチドを認識する前駆体ＣＴＬを免疫により増大することができれば、癌に対するワクチン治療が進展する可能性がある。出願人は、大部分の正常な個体、およびテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＲＴ）由来の２つのＨＬＡ−Ａ２．１拘束ペプチドに対してインビトロで免疫された前立腺癌の患者が、ｈＴＲＴ特異的ＣＴＬを発生することを本明細書に示す。これは、正常な個体のレパートリー、および癌患者におけるｈＴＲＴに対する前駆体ＣＴＬの存在を示唆する。最も重要なことには、癌患者のＣＴＬは様々なＨＬＡ−Ａ２＋癌細胞株を特異的に溶解し、内因的にプロセッシングされたｈＴＲＴペプチドが免疫的に認識されることを示す。さらに、ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスをインビボで免疫することにより、両ｈＴＲＴペプチドに対する特異的なＣＴＬ応答を産生した。インビトロおよびインビボでのＣＴＬ応答の誘導、および様々な起源の腫瘍細胞のｈＴＲＴ ＣＴＬによる溶解に対する感受性に基づいて、出願人は、ｈＴＲＴがヒトに対する万能癌ワクチンとして役立ちうることを示す。
【００２９】
序文
テロメラーゼは、複製の間に染色体を安定化する真核生物の染色体の末端であるテロメアＤＮＡ（１）のＲＮＡ依存的な合成を仲介する、固有のリボヌクレオタンパク質である（２、３）。活性化された場合は、テロメラーゼはテロメアＤＮＡを合成し、細胞分裂のたびにその喪失を補う（４）。テロメアは、続く細胞分裂で徐々に短くなるため、テロメアの長さは細胞系譜の複製履歴（５）および細胞集団動態（６、７）を反映するとみなされる。マウスでは、テロメラーゼは、生殖系および造血系のような長期間生存の高再生器官系において重要な役割を果たすように思われる（８）。
【００３０】
一定のテロメアの長さを保持することで、染色体の安定性を保証し、細胞が加齢するのを防ぎ、不死を与える（９〜１１）。テロメラーゼＲＮＡを欠如しているマウスは、テロメラーゼ活性化が悪性細胞形質転換において鍵となる事象であることを示す（８、１２、１３）。ヒトにおけるインビトロの研究は、正常な繊維芽細胞におけるテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＲＴ）の長期間の異所的な発現が、不死化にとっては十分であるが、悪性形質転換には十分でないことを示す（１４）。しかしながら、２つの発癌遺伝子（ＳＶ４０Ｔ抗原およびＲａｓ）と結びついたｈＴＲＴの発現は、正常なヒト上皮細胞株および繊維芽細胞株において、腫瘍形質転換を促進する（１５）。これらの形質転換された細胞は、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成する。このように、テロメラーゼは、それ自体が腫瘍原性ではないが、前癌性細胞を継続的に増殖させ不死化させることにより、発癌における直接の役割を果たす。ＰＣＲに基づいたＴＲＡＰアッセイ法（１６）では、高テロメラーゼ活性と、組織の起源および型の異なる腫瘍との間の注目すべき相関関係（＞８０％）が明らかにされる（１７、１８）。対照的に、正常な組織は、ほとんどかまたは全くテロメラーゼ活性を示さない（１８、１９）。従って、腫瘍におけるテロメラーゼ発現はＨＥＲ２／ｎｅｕおよび変異ｐ５３よりもさらに高く、それぞれ３０％〜５０％の範囲である（２０、２１）。前述より、癌細胞におけるｈＴＲＴの発現が、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と関連して、癌細胞に細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を標的しうるペプチドの供給源となりうることは、理にかなっている。ｈＴＲＴに類似の酵素であるＨＩＶ−１逆転写酵素には興味深い類似性が存在し、ウイルス感染細胞にＣＴＬ応答を標的するようペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体に原因を与える（２２）。このように、高テロメラーゼ活性はヒト腫瘍間で広範にわたっているため、ｈＴＲＴは免疫治療およびワクチンアプローチのための万能腫瘍抗原として役立ちうる。
【００３１】
ｈＴＲＴはゲノムにコードされ、すべての局面において自己抗原である。結果的には、ＭＨＣ／ｈＴＲＴペプチド複合体のための受容体を有するＣＤ８＋Ｔリンパ球は、胸腺のネガティブ選択の間に除去されることが予想され、潜在的な前駆体Ｔ細胞レパートリーを減らし、成人の生涯で癌細胞と遭遇した上でのその増大に制限をかける。加えて、第２シグナル非存在下での抗原による刺激は、クローナルアネルギーを誘導し（２３）、さらに潜在的なレパートリーを妨害する。これらの事象が正常な成人のレパートリーに与える影響の程度、および癌形成の間にｈＴＲＴに曝されることで癌患者の応答する能力に何らかの有害な影響があるか否かということは、公知ではない。これらの疑問への回答は、ｈＴＲＴを標的する免疫介入の今後の戦略と関連性があるため、ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子により拘束された２つのｈＴＲＴペプチドに対してインビトロのＣＴＬ応答をマウントする正常な個体および癌患者の能力が解析された。
【００３２】
材料および方法
実施例１
合成ペプチド
ｈＴＲＴ合成ペプチド
2004527449.tif 000002
をバイオポリマー合成センター（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｅｎｔｅｒ）（ＣａｌＴｅｃｈ、 Ｐａｓａｄｅｎａ、 ＣＡ）から購入した。Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢＶｃ）の合成ペプチド、
2004527449.tif 000003
、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の合成ペプチド、
2004527449.tif 000004
、黒色腫抗原ｇｐ１００の合成ペプチド、
2004527449.tif 000005
、ＨＩＶ−１逆転写酵素の合成ペプチド、
2004527449.tif 000006
をネオシステム（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ）社（Ｓｔｒａｓｂｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。
【００３３】
ヒト血液細胞
正常なドナーからのバフィーコートをサンディエゴ血液バンク（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）から購入した。モノクローナル抗体ＢＢ７．２を用いて、ＨＬＡ−Ａ２＋の個体をＦＡＣＳスクリーニングにより選択した。前立腺癌患者を泌尿器科（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を通じて募集した。これらの患者からの血液を静脈穿刺により得た。モノクローナル抗体ＢＢ７．２を用いてＨＬＡ−Ａ２＋の個体をＦＡＣＳスクリーニングにより選択した。承認されたＩＲＢに従って血液回収および実験を行った。
【００３４】
腫瘍癌細胞株
Ｔ２細胞は、ピータークレスウェル博士（Ｄｒ． Ｐｅｔｅｒ Ｃｒｅｓｗｅｌｌ）（エール大学）の恵贈物だった。黒色腫細胞株６２４および１３５１は、ジョンワンターリッヒ博士（Ｄｒ． Ｊｏｈｎ Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 ＭＤ）の恵贈物だった。前立腺癌細胞株ＬｎＣａｐおよびＰＣ−３は、アントネラビチエロ博士（Ｄｒ． Ａｎｔｏｎｅｌｌａ Ｖｉｔｉｅｌｌｏ）（ＰＲＩ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）からの恵贈物だった。胸、大腸および肺腫瘍細胞をロックビルメリーランド州のＡＴＣＣから得た。
【００３５】
実施例２
インビトロの免疫
ＰＢＭＣを、フィコール−ハイパック勾配で遠心により分離し、１０％ヒトＡＢ＋血清、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質（ＣＭ）が補給されたＲＰＭＩ−１６４０で５×１０５細胞／ｍｌ／穴で２４穴プレート中に蒔いた。自家のＰＢＭＣ（刺激細胞）を３７℃で３時間ｈＴＲＴ合成ペプチドｐ５４０またはｐ８６５（１０μｇ／ｍｌ）でパルスした。細胞を５０００ラドで放射線照射し、一度洗浄し、１：１〜１：４の範囲の応答細胞：刺激細胞の比率で応答細胞に加えた。翌日、１２ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）および３０ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を培地に加えた。以下のようにペプチドパルスした自家の接着性細胞でリンパ球を毎週再刺激した。第一に、３７℃で８時間、自家ＰＢＭＣをｈＴＲＴペプチド（１０μｇ／ｍｌ）でインキュベートした。非接着性細胞を穏やかな洗浄により取り除き、接着性細胞を３７℃でさらなる３時間ｈＴＲＴペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を含んでいる新鮮な培地でインキュベートした。第二に、前の刺激サイクル由来の応答細胞を回収して洗浄し、ペプチド非存在の培地中で５×１０５細胞／ｍｌ（２ｍｌ／穴）の濃度でペプチドパルスされた接着細胞に加えた。翌日、組換えＩＬ−２およびＩＬ−７を培地に加えた。
【００３６】
実施例３
インビボの免疫
不完全フロイントアジュバンド（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄｓ’ ａｄｊｕｖａｎｔ：ＩＦＡ）で乳化した１００μｇの個々のｈＴＲＴペプチドで、ＨＨＤマウスを尾の基部に皮下免疫した。ｈＴＲＴペプチド、およびＢ型肝炎コア抗原（ＨＢＶｃ）１２８〜１４０位の残基に対応する（２５）ヘルパーペプチド
2004527449.tif 000007
で半分のマウスを免疫した。
【００３７】
実施例４
ＨＬＡ−Ａ２．１結合／安定化アッセイ法
以前に記載したように相対的な親和力を測定した（２５）。簡潔には、様々な最終ペプチド濃度（０．１〜１００μＭ）の試験ペプチドまたはＨＩＶ−１逆転写酵素の参照ペプチド
2004527449.tif 000008
の非存在下（陰性対照）または存在下で、ヒトβ２−マイクログロブリン（１００ ｎｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が追加されたＲＰＭＩ中において、Ｔ２細胞を３７℃で一晩インキュベートした。細胞をブレフェルジンＡ（０．５μｇ／ｍｌ）で１時間インキュベートし、続いて４℃で３０分間飽和濃度のモノクローナル抗体ＢＢ７．２で染色し、洗浄し、ＦＩＴＣ （Ｃａｌｔａｇ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）に結合されたマウスＩｇ（Ｆａｂ’）２に対するヤギ抗体で第２のインキュベーションをした。細胞を洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣｓ Ｃａｌｉｂｕｒサイトフルオロメーター（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で解析した。各濃度の平均蛍光強度から、ペプチドなしの細胞の平均蛍光強度を引いたものをペプチド結合の推定値として用いた。結果は、ＲＡの値として表され、これは参照ペプチドによる最大結合の２０％に達するのに必要な試験ペプチドの濃度を参照ペプチドで割った比率であり、従って値が小さいほど結合が強い。ＨＬＡ−Ａ２．１からの試験ペプチドの解離は、長期にわたるペプチド／ＭＨＣ複合体の蛍光強度の半減期を反映する。複合体（ＤＣ５０）の半減期とは、Ｔ０平均蛍光強度の５０％減少に必要とされる時間（時間（ｈｏｕｒｓ））を意味する（２５）。癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の合成ペプチド
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、および黒色腫抗原ｇｐ１００の合成ペプチド
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を内部対照として用いて、試験間の変動性ならびに以前に報告されたＲＡおよびＤＣ５０測定との一貫性を説明する（２５）。
【００３８】
実施例５
細胞障害アッセイ法
（ａ）ヒトＰＢＭＣにおけるＣＴＬの誘導を、従来の５１Ｃｒ放出アッセイ法でモニターした。簡潔には、ペプチドでパルスされたＴＡＰ−／ＨＬＡ−Ａ２．１＋ヒトＴ２細胞を、５１Ｃｒで標識する間の９０分間、１０μｇのｈＴＲＴまたはＭＡＲＴ−１対照ペプチドとともにインキュベートした。洗浄後、９６穴マイクロプレート中で標的細胞を連続的に希釈したエフェクター細胞に加えた。３７℃で６時間インキュベーション後、上清を回収し、トリラックス（Ｔｒｉｌｕｘ）βプレートカウンター（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）でカウントした。結果は、特異的な溶解の割合（％）として表現され、次のように決定される：［（実験の溶解（ｃｐｍ）−自発的溶解（ｃｐｍ）／（最大溶解（ｃｐｍ）−自発的溶解（ｃｐｍ）］×１００、（ｂ）ＨＨＤマウスにおいてＣＴＬの誘導を次のように評価した。脾臓細胞を免疫化後７日目に回収し、かつ対応するｈＴＲＴペプチドおよびＬＰＳ（２５μｇ／ｍｌ）で刺激され、放射線照射（５０００ラド）された同系の脾臓細胞でインビトロにおいて再刺激した。６日間の培養後、細胞を回収し、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイ法でＨＨＤ形質移入／ＴＡＰ−ＲＭＡ−Ｓ細胞を溶解する能力を試験した（２５）。図１の説明文に示したように特異的な溶解を計算した。値は、エフェクター細胞に対する標的細胞の比率が６０：１で、個々の応答マウスに関して評価した最大の細胞障害性を意味する。
【００３９】
結果
実施例６
ＨＬＡ−Ａ２．１拘束ｈＴＲＴペプチドの同定および解析
ｈＴＲＴ（遺伝子座ＡＦＯ１５９５０）のアミノ酸配列（１９）を、白人人口の約５０％で発現するＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子の９５％を含むサブタイプである、ＨＬＡ−Ａ２．１分子（５２；３５；６０）に関して公知の結合モチーフを含む９量体のペプチド配列に関して解析した。ＨＬＡ−Ａ２．１に関する規範的なアンカー残基に基づく逆遺伝学手法およびＨＬＡクラスＩ分子からの予想される半減期の解離係数について９量体ペプチドを評価するｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能なｔｈｅ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＮＩＨ）のソフトウェアを用いて、ペプチドを同定した。最初のパネルの約３０個の候補ペプチドより、出願人は、ｐ５４０およびｐ８６５のような下記に示す
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の２つの配列を確保した。
【００４０】
ＭＨＣクラス１に拘束されたペプチドの免疫原性は、ある程度ＭＨＣクラスＩ分子に関する結合および安定化能力を反映するため（３１〜３３）、出願人は、抗原輸送を欠失している（ＴＡＰ−）ＨＬＡ−Ａ２．１＋ヒトＴ２細胞を用いる、従来の結合／安定化アッセイ法を用いて、２つのｈＴＲＴペプチドとＨＬＡ−Ａ２．１分子との間の相互作用の強さに関して直接の証拠を追求した。規範的な高バインダーペプチド（２５）である、ＨＩＶ−１逆転写酵素の
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に関して計算した相対的親和力（ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｖｉｄｉｔｙ（ＲＡ））は、ｐ５４０およびｐ８６５についてそれぞれ２．９および２．５だった（表１）。ＨＬＡ−Ａ２．１に結合する各ペプチドの安定性を、複合体（ＤＣ５０）の半減期として測定し、順にそれぞれｐ５４０が４〜６時間であり、ｐ８６５が２〜４時間であった。まとめると、これらの測定により、ｐ８６５はより迅速な解離率を有するが、両ｈＴＲＴペプチドは優れたバインダーであることが示される。
【００４１】
実施例７
正常なヒト個体におけるｈＴＲＴに対するＣＴＬ応答
インビトロの免疫アッセイ法で、１０匹のＨＬＡ−Ａ２＋正常な血液ドナーからの末梢血白血球（ＰＢＭＣ）を用いて、両ｈＴＲＴペプチドのための前駆体Ｔ細胞の存在、および抗原刺激時のそれらの増大を試験した。１０人中９人は、３回目のペプチド刺激から始まる、標的細胞としてペプチドパルスされたＴ２細胞を溶解するＴ細胞を産生する免疫化に応答した。９人の全ての応答者は、ｐ５４０に対する特異的なＣＴＬを産生し、７人はｐ８６５に対して応答した（図１、ＡおよびＢ）。最大の溶解の値は、個体間で異なっており、それぞれ２８〜６８％から２０〜６８％の範囲だった。２つの例（ドナー９７５および９８０）において、おそらく夾雑したＮＫ細胞のため、より低いが測定可能な非特異的な溶解があった。従って、正常なＨＬＡ−Ａ２＋個体の無作為試験により、両ｈＴＲＴペプチドが免疫原性であり、ｈＴＲＴのための前駆体ＣＴＬが末梢の成人レパートリーにおいて存在することを含意することが明白に証明された。
【００４２】
実施例８
癌患者におけるｈＴＲＴに対するＣＴＬ応答
ｈＴＲＴに対するＣＴＬが癌患者においても誘導されうるか否かを、前立腺癌の臨床的な診断および組織学的診断で、４人のＨＬＡ−Ａ２．１＋個体において研究した。４人の患者全てがホルモン治療に耐性であり、３人が転移を有し、かつ誰も前立腺摘出手術を受けていなかった。前立腺癌においては、男性における癌の最も共通した原因であるｈＴＲＴの高発現が事例の８４％で記録されている（３４）。ペプチドパルスされたＴ２細胞の著しい溶解が、３回のインビトロの刺激後、４人中３人において観察された（図２、ＡおよびＢ）。両ペプチドは、それぞれ、２７〜４９％から４８〜５２％の範囲で最大の溶解を有する全ての３個体において比較できるＣＴＬ応答を産生した。両ペプチドに対するＣＴＬは、ｐ５４０に関して２４〜３６％、かつｐ８６５に関して１２〜４０％の範囲で最大の溶解を有し、ＨＬＡ−Ａ２．１＋前立腺癌細胞株であるＬｎＣａｐを溶解した。ＨＬＡ−Ａ２．１−である前立腺癌細胞株ＰＣ−３を対照として用い、かつ溶解されなかった（図２Ｃ）。両前立腺癌細胞株はＴＲＡＰｅｚｅ（テロメラーゼ検出アッセイ法；ＩＮＴＥＲＧＥＮ）によってｈＴＲＴに陽性であると判定され（図示せず）、合成ペプチドに対して産生されたＣＴＬが、癌細胞の表面のｈＴＲＴペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体を認識することによって癌細胞を溶解しうることを示唆した。
【００４３】
ＬｎＣａｐ腫瘍細胞株の溶解が内因的にプロセッシングされたｈＴＲＴペプチドに特異的であるか否かを理解するために、非放射性（ｃｏｌｄ）標的細胞競合実験を行った。これらの実験において、前立腺癌患者由来のＣＴＬによるＬｎＣａｐ細胞の溶解を、ｐ５４０またはｐ８６５（１０μｇ／ｍｌ）を用いてインビトロでパルスされたＴ２細胞による溶解と競合させた。ペプチドが負荷されたＴ２細胞は、両ペプチドの併用でＬｎＣａｐ細胞の溶解の量依存的な阻害を引き起こした（図３Ａ）。出願人はさらに、無関係なＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドでパルスされたＴ２標的細胞について２つのｈＴＲＴペプチドを試験することにより、これらのうちのそれぞれ１つに対して産生されるＣＴＬの特異性を評価した。黒色腫抗原ＭＡＲＴ−１からのペプチド２７ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ３５でパルスされたＴ２細胞、または非相同的なｈＴＲＴペプチドでパルスされたＴ２細胞のいずれも、溶解しなかった。まとめると、これらの研究によって、１）患者のＣＴＬは、それらを誘導するために用いられるｈＴＲＴペプチドに特異的であり、および２）前立腺癌細胞の溶解はＨＬＡ−Ａ２．１分子と複合体をなす内因的にプロセッシングされたｈＴＲＴペプチドによって仲介され、かつこれに特異的であり、このことは腫瘍細胞上の自然にプロセッシングされたペプチドと、免疫化に用いられる同型のペプチドとの間の化学的同一性を示唆すると言うことが示される。正式な検証には、腫瘍細胞からのペプチドの溶出、およびタンデム質量分光測定による解析が必要になる（３５）。阻止抗体を用いて、ＭＨＣ拘束処理に関する研究を行った。前立腺癌患者から産生されたＣＴＬ系による、ペプチドパルスされたＴ２細胞の溶解は、両ペプチドの併用で抗ＭＨＣクラスＩモノクローナル抗体ＢＢ７．２により阻止された（図３）が、抗ＭＨＣクラスＩＩモノクローナル抗体Ｑ５／１３（３６）またはＮＫ細胞を阻止するトランスフェクトーマ抗体＿１ＲＧＤ３（３７）によっては阻止されなかった。２色ＦＡＣＳ解析により、ｈＴＲＴペプチドでの３回のインビトロの刺激後のＴ細胞増殖の表現型は、ＣＤ３＋（７８％）、ＣＤ８ ＋（３７％）、ＣＤ４＋（３６％）およびＣＤ１６／５６（６％）だった。まとめると、これらの実験は、インビトロの免疫化により産生された効果Ｔ細胞がＮＫ活性を有しないＭＨＣクラスＩ拘束の（ＣＤ８＋）Ｔ細胞であること確認する。
【００４４】
循環しているＢ細胞およびＴ細胞、胚中心Ｂ細胞、胸腺細胞ならびにＣＤ３４＋前駆造血細胞のような正常細胞において、ｈＴＲＴが発現される（６、７、３８）。これは、ｈＴＲＴペプチドに対して産生されるＣＴＬが、正常細胞において自己免疫攻撃を発生しうることを示す。このために、出願人は、癌患者のＣＴＬがＨＬＡ−Ａ２＋ＣＤ３４＋細胞を溶解するかどうか検証した。ｐ５４０に対するＣＴＬもｐ８６５に対するＣＴＬも、エフェクター細胞に対する標的細胞（Ｅ：Ｔ）比率の広範囲に渡り全く溶解を誘導しなかった（図示せず）。従って、少なくとも造血幹細胞に関して自己免疫攻撃は起こりそうにないようだ。このことは、活性化されたＴ細胞が、培地中のｈＴＲＴ ＣＴＬにより溶解されなかったという事実と一致する。
【００４５】
実施例１０
ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスにおけるｈＴＲＴに対するＣＴＬ応答
ペプチドがインビボの免疫原として働き、ＣＴＬ応答を誘発しうるかどうかは、免疫化の様式、抗原提示細胞の適切な活性化、前駆細胞の頻度、ならびにペプチドによるＭＨＣクラスＩ分子の結合および安定化のような様々な因子に依存する。本研究において出願人は、両ペプチドがＲＡ＜３でＨＬＡ−Ａ２．１と結合するが解離率は異なることを示した（表１）。いずれの場合でも、出願人は、正常な血液ドナーおよび前立腺癌患者のＰＢＭＣからのインビトロのＣＴＬ応答を産生することができた。従って、それらもまた、インビボの免疫原性でありうることは、理にかなった予想と考えられる。この可能性を試験するために、出願人は、Ｈ−２Ｄｂ−／−、β２ｍ−／−、ＨＬＡ−Ａ２．１＋単鎖トランスジェニックＨＨＤマウスを免疫した（３９）。これらのマウスにおける末梢のＣＤ８＋Ｔ細胞レパートリーは、本質的にトランスジェニックヒト分子上で培養される。従って、ＨＨＤマウスは、ＨＬＡ−Ａ２．１で拘束したインビボのＣＴＬ応答を誘導する各ペプチドの能力を、前臨床レベルで評価するための優れた手段である（２５）。
【００４６】
ｐ５４０およびｐ８６５は両方とも、相違点は注意されるが特異的なＣＴＬ応答を誘導することができる（表２）。実際にｐ５４０は、単独またはヘルパーペプチドとの併用でＣＴＬを誘導した（６６％応答細胞、対８０％応答細胞）。対照的に、ヘルパーペプチドとの関連によってその免疫原性を増大させた場合、ｐ８６５に対する高い（７０％）応答を得た。２つのｈＴＲＴペプチドの異なる免疫原性はまた、それぞれ、ヘルパーペプチドを伴ったｐ５４０およびｐ８６５に対する、個別の応答の度合い（５５．８〜９．４％溶解、対２０〜１１．５％溶解）によっても反映される。これは、２匹の正常な血液ドナーが、ｐ５４０に対する免疫化に応答するがｐ８６５に対する免疫化には応答しないという観察と一致する（図１）。従って、ＨＬＡ−Ａ２．１分子の結合／安定化の結果と、ヒトＰＢＭＣのインビトロの免疫原性の結果およびＨＨＤマウスにおけるインビボの応答との間に全般的な相関関係がある。最後に、ｈＴＲＴペプチドに対して免疫された有害な自己免疫ＨＨＤマウスの発生を除くために、循環するＢリンパ球数に関してモニターした。２つの系（Ｂ２２０および抗Ｉｇ）のＦＡＣＳ解析を用いたが、出願人は、正常なＨＨＤマウスと比較した場合に、免疫されたマウスにおける循環するＢ細胞の減少を見い出さなかった（図示せず）。さらに、免疫後、腸間膜リンパ節の拡張や肝臓への細胞の浸潤は観察されなかった（図示せず）。
【００４７】
実施例１１
癌患者のＣＴＬは様々な起源および型の癌細胞を殺す
ｐ５４０およびｐ８６５に対して産生されるＣＴＬはＬｎＣａｐ前立腺癌細胞上で自然にプロセッシングされたｈＴＲＴペプチドを認識し、かつｈＴＲＴ活性は大部分のヒトの癌で高レベルに発現しているため、ｈＴＲＴ由来のペプチドをＣＴＬによって認識することで、広く多様な癌の型の抹殺が仲介されうると考えられる。標的細胞として胸、大腸、肺、および黒色腫を起源とするＨＬＡ−Ａ２＋腫瘍細胞株の溶解を評価するための５１Ｃｒ放出アッセイ法では、前立腺癌患者由来のＣＴＬ系を用いた。ＴＲＡＰｅｚｅアッセイ法によると、全てのこれらの細胞株がｈＴＲＴ陽性だった。ペプチドパルスされたＴ２細胞およびＬｎＣａｐ前立腺癌細胞株は、陽性対照として役割を果たした（表３）。ＳＷ４８０大腸細胞株以外の全ての細胞株を、ｐ５４０に対して産生されたＣＴＬにより溶解した（溶解の範囲は３９％〜４８％）。一方、Ｈ６９肺細胞株以外の全ての細胞株を、ｐ８６５に対して産生したＣＴＬにより溶解した（溶解の範囲は３７％〜４１％）。ＨＬＡ型が異なり、腫瘍が一致する細胞株は溶解されなかったため、細胞障害活性はＨＬＡ−Ａ２分子の発現に依存していた。まとめると、これらのデータは、ｐ５４０およびｐ８６５のようなｈＴＲＴペプチドが、様々な腫瘍細胞型において自然にプロセッシングされることを示す。
【００４８】
Ｔ細胞の抗原認識活性は、ＭＨＣ（ヒトにおけるＨＬＡ）分子の認識と親密に結びつく。この複合体は、第６染色体に位置しており、かつ特にＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩをコードした２００個近くの遺伝子を含む。最初の発見は、白人人口の約５０％で発現するＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子に関係する（５６）。ＨＬＡ−Ａ２＋白人の約９５％は、ＨＬＡ−Ａ２．１サブタイプを発現する（５３）。
【００４９】
ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドの大部分は、アミノ酸が９±１個の制限された大きさを有しており、遊離Ｎ末端およびＣ末端を必要とする（５２、５９、６１）。特異的な大きさに加えて、異なるクラスＩ分子は、ペプチドリガンド内に通常２つの主要アンカー残基の特異的な組合せを必要とするように思われる（５２、５９）。ヒト対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ２．１の事例において、これらのアンカー残基は、２位におけるロイシン（Ｌ）、およびＣ末端におけるＬまたはバリン（Ｖ）として記載されている（５２）。さらに最近、ルペート（Ｒｕｐｐｅｒｔ）らは、「規範の」Ａ２．１モチーフが、２位におけるＬまたはＭ（メチオニン）、および９位におけるＬ、Ｖ、またはＩ（イソロイシン）として規定されうることを見いだした（６０）。
【００５０】
選択過程を精緻化するために付加的な基準を用いた。各非アンカー残基（１、３、４、５、６、７、８位）は、Ａ２．１結合に有意な作用を有する（６０）。より特異的には、１、３、６、７、および８位におけるいくつかのアミノ酸は、ペプチドのＡ２．１結合能力を消滅させる（６０）。従って、出願人は、特定の位置において以下のアミノ酸を有する全てのペプチドを除外した：１位におけるＤ（アスパラギン酸）およびＰ（プロリン）；３位におけるＫ（リジン）；６位におけるＲ（アルギニン）またはＧ（グリシン）；ならびに７位または８位におけるＥ（グルタミン酸）。この選択により出願人は１２個のペプチドを除外し、２７個のペプチドを維持した。多数の９量体ペプチドに関して、各非アンカー位における各アミノ酸の頻度を考慮することによって（６０）、出願人はさらに正確なＡ２．１バインダー、および２７個のペプチド中の１０個を規定した（表４）。
【００５１】
（５８）より推測されるＨＬＡクラスＩ分子からの予想解離半減期に基づいて潜在的な９量体ペプチドを評価するＮＩＨのバイオインフォマティクス及び分子解析部門（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＩＨ）（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）のウェブサイトにおいて利用可能なオンラインアプリケーションを用いて、ペプチド選択を確認した。本発明者らの試験的な研究において、「手作業の」アプローチによって同定したペプチドの一つであるＰ８６５は、ソフトウェアが導き出した解析により同定されたＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの上位５つの中に位置した。他のペプチドＰ５４０は、ソフトウェアが導き出した解析において最上位に位置した。
【００５２】
出願人は、ｐ５４０およびｐ８６５として示される、２つのペプチド
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を使用した。
両ペプチドは、正常な血液ドナーおよび前立腺癌の患者においてインビトロのＣＴＬ応答を誘導できる。出願人は、同じペプチドがまた、黒色腫患者においてインビトロのＣＴＬ応答を誘導できることを示している。これらの研究の概要を表５に示す。
【００５３】
まとめると、ｐ５４０は、４人のＨＬＡ−Ａ２＋患者中３人において、ＣＴＬ応答を誘導するように思われる。ｐ８６５は、２人の患者においてのみ応答を誘導した。患者００は、樹状細胞＋黒色腫ペプチド（ｈＴＲＴペプチド以外のペプチド）で同時に免疫されており、高いバックグラウンドを有するためにｈＴＲＴに対する特異的応答が誘導されているか否かを決定することが困難であることに留意すべきである。
【００５４】
【表５】黒色腫患者におけるインビトロでのＣＴＬの誘導
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【００５５】
付加的な新しい発見は、他のｈＴＲＴペプチドの免疫原性を探求することから生まれた。特に、３つのペプチドを試験し、その未処理のｈＴＲＴ分子における配列を下記の表６に示す。
【００５６】
ＨＬＡ−Ａ２（表７）との高い親和性結合（遅い解離半減期）を有することで特徴づけられるｐ５４０とは異なり、これらのペプチドは原型ｐ５４０よりも速い解離半減期スコアが推定される。プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて計算を行った。
【００５７】
【表６】野生型および改変されたｈＴＲＴペプチドの付加的な配列
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【００５８】
出願人は、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合親和性、およびまたその免疫原性の増大に裏付けられる１位における１残基（Ｙ）の修飾に及んだ（６０）。新しい改変配列を表６に示す。
【００５９】
正常なＨＬＡ−Ａ２＋個体からのＰＢＭＣをＹ改変したペプチドで免疫した。これらの結果を以下にまとめる（表７）。
【００６０】
【表７】「Ｙ」改変ｈＴＲＴペプチドの免疫原性能力
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【００６１】
ｐ５７２に対して産生されたＣＴＬはまた、ｈＴＲＴ＋／ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞株６２４を溶解することができた。黒色腫６２４の抹殺の投与量応答曲線を図６に示す。Ｔ細胞の抗原認識活性は、ＭＨＣ（ヒトにおけるＨＬＡ）分子の認識と親密に結びつけられる。
【００６２】
考察
出願人は、ｈＴＲＴペプチドが、正常な個体および前立腺癌患者における前駆体ＣＴＬを増大でき、双方において、ＭＨＣクラスＩで拘束された、ペプチド特異的ＣＴＬ応答を誘導しうることを示している。従って、これらの所見からの最初の主要な示唆は、ｈＴＲＴのために利用可能なＣＴＬレパートリーが最近報告されたように正常な個体において保存される（２４）だけでなく、より重要なことには癌の個体においても同様に保存されるということである。これは、癌に曝すことがｈＴＲＴ特異的なクローン型の欠失またはアネルギーを引き起こさないことを示す。免疫化に応答する３人の患者はホルモン治療に耐性であり、かつ転移を有していたため、一般的に免疫抑制を特徴とする疾患の進行期においてｈＴＲＴ ＣＴＬを誘導できたことは、驚くべきことだった。これらの事柄に基づき、ＰＢＭＣからの前駆体の頻度がインビトロでそれを増大させるのに十分高く、かつｈＴＲＴペプチドが十分な親和力でＭＨＣクラスＩに結合するため、本研究において同定された２つのペプチドはＨＬＡ−Ａ２＋癌患者のワクチン接種に使用されうる。
【００６３】
前立腺癌患者のＣＴＬが、前立腺、胸、大腸、肺および黒色腫のような様々なＨＬＡ−Ａ２＋癌細胞の効率的溶解を仲介するという所見は前例がない。特異的な溶解の値に基づき、これらの癌細胞は、同じ内因性のｈＴＲＴペプチドをプロセッシングし、かつ提示することにおいて、等しく効率的であるかのように思われる。従って、本発明者らの研究の第２の重要な示唆は、異なる組織学的器官および型の様々な癌細胞において、類似のｈＴＲＴペプチドが発現しＭＨＣクラスＩ分子との複合体となることである。これにより、ＣＴＬによって破壊されやすくなり、潜在的で優位なｈＴＲＴ免疫化が強調され、これは、ヒトにおける広く様々な癌の型における初期腫瘍および転移の制御下においてありうる。
【００６４】
今後のｈＴＲＴに基づくワクチン接種はまた、免疫化に付随しうる副作用の型にも依存すると思われる。ｈＴＲＴは幹細胞および成熟造血細胞において発現するため（６、７、３８）、ｈＴＲＴワクチンは、自己免疫、および正常細胞の破壊を結果として生じうる。本発明者らの手法において、ｐ５４０またはｐ８６５に特異的である患者のＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２＋ＣＤ３４＋細胞を溶解しなかった。同様に、正常個体で生じるｐ５４０に対するＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ２＋ＣＤ３４＋細胞を溶解しなかった（２４）。ｈＴＲＴペプチドでのワクチン接種に続き、ＨＨＤマウスでの造血細胞および肝臓における顕在的自己免疫疾患が無いことと併せて、出願人は、ｈＴＲＴに特異的なＣＴＬが正常細胞に対して自己免疫の引き金を引くことはあり得ないことを暫定的にで結論づける。おそらく、生理的系統／クローン型の活性化および分化の下で、産生されるｈＴＲＴペプチドの量は、ＣＴＬによる溶解を仲介するには不十分である。ＣＤ８ Ｔ細胞に仲介された自己免疫についてほとんど公知でない生殖器の生殖細胞に関して同じことが真に保っているか否かということだけは、推論されうる。さらなる実験が必要とされる一方、リンパ組織（５０）および生殖器（５１）を含んだ正常な組織で共有される腫瘍抗原に対する免疫化の後に自己免疫が発生しないという事実は（４８、４９）、癌患者におけるｈＴＲＴに基づくワクチン接種が可能でかつ安全でありうるという見解を支持する。
【００６５】
ｈＴＲＴに基づくワクチン接種を実行するための方法は、合成ペプチド、免疫学的なアジュバントにおける合成ペプチド、合成ペプチドでパルスされた樹状細胞、裸のＤＮＡおよびＲＮＡのような、様々な現在の使用上の方法を含むと思われる。さらに、出願人は、トランスジェニック細胞を用いて有効なワクチン接種が達成されうることを予想する。例えば、特異的なリンパ球プロモーター下の遺伝子は、所望のｈＴＲＴペプチドをコードするよう操作され、個体（例えば癌患者）からのリンパ球においてトランスフェクトされ、かつ発現され、リンパ球はペプチドをプロセッシングし、かつＴリンパ球に提示するので患者自身のリンパ球をワクチン接種のために用いることができ、従ってワクチン接種が効果が達成される。
【００６６】
結果として、２つのｈＴＲＴペプチドに関して特異的な前駆体ＣＴＬを癌患者において増大でき、それらのＣＴＬは、様々な器官および組織学的型の腫瘍細胞上で同じｈＴＲＴペプチドを認識し、およびＨＬＡ−Ａ２．１＋単鎖トランスジェニックマウスにおいて、両ｈＴＲＴペプチドに対する強いインビボのＣＴＬ応答を誘導した。出願人は、ｈＴＲＴが万能癌抗原、およびヒトにとって可能性のある万能癌ワクチンのための基質としてのペプチドとしてみなされうることを示す。
【００６７】
前述に従って、本発明のワクチンおよび方法論の変形物および改作物は、医学の分野における当業者にとってそれが自明であると思われる。本発明の趣旨において、本発明のこれらおよびその他の可能性のある変形物および改作物、ならびに本発明の目的は、以下の特許請求の範囲に従って決定されるべきであり、単に、開示されている発明の中の態様に従って決定されるべきではない。
【００６８】
参考文献
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2004527449.tif 000018
2004527449.tif 000019
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【図面の簡単な説明】
【図１】正常な血液ドナーからの末梢血白血球（ＰＢＭＣ）におけるｈＴＲＴに対するＣＴＬの誘導。ＨＬＡ−Ａ２＋個体からのＴ細胞を、材料および方法において詳説するようにｈＴＲＴ由来の合成ペプチドでパルスされた自家ＰＢＭＣによって刺激した。（Ａ）結果は、ｐ５４０に対してインビトロでの免疫された個々のドナーからのエフェクター細胞を意味する。○はＴ２細胞を定義し、●は標的細胞としてｐ５４０でパルスされたＴ２細胞を定義する。（Ｂ）結果は、ｐ８６５に対してインビトロで免疫された各ドナーからのエフェクター細胞を意味する。□はＴ２細胞を定義し、■は標的細胞としてｐ８６５でパルスされたＴ２細胞を定義する。標的細胞に対するエフェクター細胞の比率を、個々の基準で示す。細胞障害の割合は、材料および方法に明記したように計算した。
【図２】前立腺癌患者由来のＰＢＭＣにおけるｈＴＲＴに対するＣＴＬの誘導。（Ａ）結果は、ｐ５４０に対して免疫された個々の患者由来のエフェクター細胞を意味する。値は、３回のインビトロの刺激後に試験された細胞を意味する。○はＴ２細胞を定義し、●は標的細胞としてｐ５４０でパルスされたＴ２細胞を定義する。（Ｂ）結果は、ｐ８６５に対して免疫された個々の患者由来のエフェクター細胞を意味する。□はＴ２細胞を定義し、■は標的細胞としてｐ８６５でパルスされたＴ２細胞を定義する。（Ｃ）結果は、ｐ５４０（丸）またはｐ８６５（四角）に対してインビトロで免疫された個々の患者由来のエフェクター細胞を意味する。白抜きの記号は、標的細胞としてＨＬＡ−Ａ２−ＰＣ−３前立腺癌細胞株を定義する。黒く塗りつぶした記号は、標的細胞としてＨＬＡ−Ａ２＋前立腺癌細胞株ＬｎＣａｐを定義する。細胞障害の割合を、材料および方法の節に明記したように計算した。
【図３】ｈＴＲＴペプチドに対して産生されたＣＴＬによる標的認識の分子特異性。（Ａ）非放射性標的阻害。非放射性：放射性標的細胞の比率が５：１、２５：１および５０：１で５１Ｃｒ標識されたＬｎＣａｐ細胞（５×１０４個／ｍｌ）をＴ２細胞（白抜きの記号）またはｐ５４０（●）もしくはｐ８６５（■）（１μｇ／ｍｌ）でパルスされたＴ２細胞と混合した。ｐ５４０およびｐ８６５に対してそれぞれ産生された患者のＣＴＬ株３８０．５４０．１および３８０．８６５．１を５０：１のＥ：Ｔ比率で加えた。（Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２非関連結合ペプチドでパルスされたＴ２細胞の溶解。結果は、ｐ５４０（パネルａ）またはｐ８６５（パネルｂ）に対して産生された患者の（＃６５１）ＣＴＬ、およびｐ５４０（パネルｃ）またはｐ８６５（パネルｄ）に対して産生された患者の（＃３８０）ＣＴＬによる溶解を意味する。●記号は、ｐ５４０（丸）、ｐ８６５（四角）およびＭＡＲＴ−１ペプチド（三角）でパルスされたＴ２細胞を定義する。○は、パルスされなかったＴ２細胞を意味する。細胞障害の割合を、材料および方法で明記したように計算した。
【図４】前立腺癌患者のｈＴＲＴに対するＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩに拘束される。ｐ５４０（Ａ）またはｐ８６５（Ｂ）でパルスされたＴ２細胞を標的細胞として用いて、患者のＣＴＬ株３８０．５４０．１および３８０．８６５．１を５１Ｃｒ放出アッセイ法で試験した。以下の阻止抗体を用いた：ＭＨＣクラスＩに対するマウスモノクローナル抗体ＢＢ７．２（ＩｇＧ２ｂ）、ＨＬＡ−ＤＲに対するマウスモノクローナル抗体Ｑ５／１３（ＩｇＧ２ａ）、およびＮＫ細胞機能を阻止する操作された抗体＿１ＲＧＤ３。
【図５】ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＲＴ）配列［Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９７より］
【図６】ｈＴＲＴのｐ５７２（Ｙ）ペプチドに対してインビトロで免疫された正常な血液ドナーＰＢＭＣは、黒色腫細胞６２４を殺すＣＴＬを産生する。本結果は、溶解の割合として表示され、６２４黒色腫細胞の溶解、ならびにｐ５７２（Ｙ）およびｐ５７２野生型ペプチドでパルスされたＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ２標的細胞の溶解をそれぞれ比較して示す。Ｔ２細胞の特異的な溶解がないものは、対照として示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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