(57)【要約】本発明は、フィブリノーゲンから誘導化される抗−血管新生ペプチド；該ペプチドを含む医薬組成物；該ペプチドをコードする核酸および、血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう疾患に罹っている動物、好ましくはヒト、を処置する方法に関する。
2004512832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列：
【表１】
2004512832.tif 000007
〔配列中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。〕
を有するペプチド；
ｉｉ）アミノ酸残基Ｘが以下のグループ：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンから選択される、（ｉ）で表されるペプチド；および
ｉｉｉ）抗−血管新生活性を有する、（ｉ）もしくは（ｉｉ）で表されるペプチド：からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは下記のグループ：
【表２】
2004512832.tif 000008
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
Ｘがアラニンである、請求項１もしくは２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
該ポリペプチドが配列：
【表３】
2004512832.tif 000009
を含む、請求項１もしくは２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが長さで少なくとも２４個のアミノ酸残基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが２４個のアミノ酸ポリペプチドの活性フラグメントである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチドがアミノ酸配列ＡＤＳＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲＧＰＲＶＶＥＲＨからなる、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドがアセチル化されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
該アセチル化が該ポリペプチドのアミノ末端にされている、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
α１−２４ペプチドのアミノ末端アラニンアミノ酸がアセチル化されている、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
該ポリペプチドがアミド化されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
該アミド化が該ポリペプチドのカルボキシル末端にされている、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
α１−２４ペプチドのカルボキシル−末端ヒスチジンアミノ酸がアミド化されている、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
該ポリペプチドがアセチル化およびアミド化の両方により修飾されている、請求項８〜１３いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
該アセチル化がα１−２４ペプチドのアミノ末端アラニンアミノ酸にされそして該アミド化がα１−２４ペプチドのカルボキシル−末端ヒスチジンにされている、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
該ポリペプチドが環化により修飾されている、請求項１〜１５いずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
以下のグル−プ：
ｉ）図６で表されるようなＤＮＡ配列；
ｉｉ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドをコードする、少なくとも一つのコドン内で少なくとも一つのヌクレオチド塩基の挿入、欠失もしくは置換により修飾されている、図６で表されるようなＤＮＡ配列；
ｉｉｉ）抗−血管新生活性を有するペプチドをコードするところの図６に示される配列にハイブリダイズする、ＤＮＡ配列；および
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）で規定されるＤＮＡ配列への遺伝子コードの結果として縮重しているＤＮＡ配列、から選択されるＤＮＡ配列を含む核酸分子。
【請求項１８】
該核酸分子がストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下でアニールする、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件が：４〜６×ＳＳＰＥ；５〜１０×デンハート溶液；１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ／ニシンＤＮＡ；０．１〜１．０％ドデシル硫酸ナトリウム；４０〜６０％の脱イオンホルムアミド；および４２〜６５℃の間の温度、を含む請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
少なくとも一つのα１−２４ペプチド、もしくはその部分を含む医薬組成物。
【請求項２１】
図５Ｂで表されるアミノ酸配列により表されるような少なくとも一つのα１−２４ペプチドからなる、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
少なくとも一つのα１−２４ペプチドを含みそして少なくとも一つの化学療法剤をさらに含む医薬組成物。
【請求項２３】
該薬剤が、ネオカルジノスタチン；シスプラチン；カルボプラチン；シクロホスファミド；メルファラン；カルムスリン；メソトレキセート；５−フルオロウラシル；シタラビン；メルカプトプリン；ダウノルビシン；ドキソルビシン；エピルビシン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ダクチノマイシン；マイトマイシンＣ；タキソール；Ｌ−アスパラギナーゼ；Ｇ−ＣＳＦ；チャリチアミシンもしくはエスペラミシンのようなエンジイン；クロラムブシル；アラ−Ｃ；ビンデシン；ブレオマイシン；およびエトポシド：からなるグル−プから選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
がんの処置に使用するための医薬品の製造におけるα１−２４ペプチド、もしくはその部分、を含むポリペプチドの使用。
【請求項２５】
α１−２４ペプチド、もしくはその部分、を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む、ベクター。
【請求項２６】
該ベクターが原核の発現ベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】
該ベクターが真核の発現ベクターである、請求項２５に記載のベクター。
【請求項２８】
該ベクターが遺伝子治療ベクターである、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
該遺伝子治療ベクターが以下のウイルス：アデノウイルス；アデノ−関連ウイルス；ヘルペスウイルス；レンチウイルス；ワクチニアウイルス；バキュロウイルス、から選択されるウイルスベースのベクターである、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の核酸もしくは請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のベクターと形質転換またはトランスフェクトされる、細胞。
【請求項３１】
ｉ）請求項３０にしたがう細胞を提供すること；
ｉｉ）α１−２４を含むポリペプチドの製造に実施的な条件を提供すること；および
ｉｉｉ）該ポリペプチドを細胞から、もしくは細胞培養環境から精製すること：を含む、α１−２４を含むポリペプチドの製造のための方法。
【請求項３２】
該動物がα１−２４を含むポリペプチドをコードする核酸分子をそのゲノム内に組入れることを特徴とする非−ヒトの、形質転換動物。
【請求項３３】
トランス遺伝子はヒトの起源である、請求項３２に記載の非−ヒトの形質転換動物。
【請求項３４】
ｉ）処置すべき動物にα１−２４を含む薬剤の有効量を投与すること；および
ｉｉ）血管新生の阻害への該薬剤の効果をモニターすること：を含む血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう動物を処置する方法。
【請求項３５】
ｉ）処置すべき動物に請求項２０もしくは２１に記載の医薬組成物の有効量を投与すること；および
ｉｉ）血管新生の阻害への該組成物の効果をモニターすること：を含む血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう動物を処置する方法。
【請求項３６】
α１−２４ペプチドを含むポリペプチドが、化学療法剤に接合され、会合されもしくは架橋される、請求項３４もしくは３５に記載の方法。
【請求項３７】
ｉ）請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の核酸または請求項２８もしくは２９に記載のベクターの有効量を投与すること；および
ｉｉ）血管新生の阻害への（ｉ）における核酸のトランスフェクションの効果をモニターすること：を含む血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう動物を処置する方法。
【請求項３８】
該処置が腫瘍の発育の阻害である、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
該動物はヒトである、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
検出可能な標識と接合させるか、会合させるかもしくは架橋させたα１−２４ポリペプチドを含む、イメージング剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、フィブリノーゲンから誘導化されるペプチドの抗−血管新生効果に関する。
【０００２】
血管新生、現存する血管床から新しい血管の発育、は、細胞外マトリックスの成分の分解に引き続く、細管および結局は新しい血管を形成する内皮細胞の遊走、増殖および分化を伴うところの複雑な多段階プロセスである。血管新生は、胚移植；胚形成および発育；ならびに創傷治癒を、例示としてそして限定としてではなく、含む、正常な生理プロセスにおいて重要である。過剰な血管新生はまた、腫瘍細胞生育のような病態異常ならびに新生血管緑内障、慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病性網膜症のような非−がん性異常に関与する。
【０００３】
血管内皮は普通は静止性である。しかしながら、活性化すると内皮細胞は増殖しかつ遊走して、発育中の組織、勿論生長中の腫瘍、に血液を供給する毛細管床を究極的に形成するであろう微小管を形成する。内皮細胞を促進し／活性化して、血管新生を受ける、数多くの成長因子が同定されている。これらには、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；形質変換成長因子（ＴＧＦｂ）；酸性および塩基性の繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；および血小板誘導化成長因子（ＰＤＧＦ）が、例示としてそして限定としてではなく、挙げられる（１，２）。
【０００４】
ＶＥＧＦは、非常に特異的な活動部位、即ち、内皮細胞の増殖、遊走および分化の促進、を有するところの内皮細胞−特異的成長因子である。ＶＥＧＦは、二つの同一な２３ｋＤのポリペプチドを含む二量複合体である。ＶＥＧＦの単量形は、代わりにスプライスされたｍＲＮＡからそれぞれが誘導化される、異なる分子量を持つ四つの別なポリペプチドとして存在し得る。四つの単量体のうち、二つは膜結合ＶＥＧＦとして存在しそして二つは可溶性である。ＶＥＧＦは、胚性組織；増殖性角化細胞；マクロファージ；腫瘍細胞を含む多種の細胞／組織タイプによりにより発現される。研究（２）は、ＶＥＧＦが、神経膠腫およびＡＩＤＳ−関連カポジ肉腫を含む多くの腫瘍細胞株中で高度に発現されることを示している。ＶＥＧＦ活性は、内皮細胞および腫瘍細胞により発現される、ＶＥＧＦ特異的受容体により仲介される。事実、ＶＥＧＦ受容体は、腫瘍を浸潤する内皮細胞中で上方−調節されて、それにより腫瘍細胞の成長を促進する。
【０００５】
ｂＦＧＦは、繊維芽細胞および内皮細胞の増殖を刺激するように機能する、成長因子である。ｂＦＧＦは１６．５Ｋｄの分子量を持つ単一ポリペプチド鎖である。それらのアミノ酸末端領域で長さの異なる、ｂＦＧＦの幾つかの分子型が発見されている。しかしながら、種々の分子型の生物学的機能は同じように見える。ｂＦＧＦは脳下垂体により生成され、そしてヒトの染色体４上に位置する単一遺伝子によりコード化される。
【０００６】
血管新生の内因性阻害剤が数多く発見されているが、それらの例は、プラスミノーゲンおよびコラーゲンＸＶＩＩＩそれぞれのタンパク質分解切断により形成される、アンギオスタチンおよびエンドスタチンである。これらの因子の両方は、血管性のＶＥＧＦおよびｂＦＧＦのようなプロ−血管新生成長因子の活性を抑制すると示されている。両方共に、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦに対する内皮細胞の反応をインビトロで抑制し、そして動物モデル中の実験腫瘍の血管化および成長を減少させる。
【０００７】
フィブリノーゲン、フィブリンの可溶性の循環先駆体、は非−同一鎖（即ち、α−、β−およびγ−鎖）の対を含む二量体分子である。これらは、三つの別個のドメイン、二つの外側Ｄ−ドメインおよび中心Ｅ−ドメイン、として配列されている（４）。フィブリノーゲンはプラスミンもしくはトロンビンのどちらかにより消化され得る。
【０００８】
フィブリノーゲンのプラスミン切断における第一ステップはα鎖Ｃ−末端ドメインの切断である。それから、プラスミンは、一つのＥ−ドメイン（ジスルフィド結合により一緒に保たれたα−、β−およびγ−鎖のＮＨ２末端領域からなる）および小ペプチド、ベータ１−４２（β−鎖のアミノ末端）を含む数多くのさらに小さいフラグメントから二つのＤ−ドメインを切断する（５）。他方において、トロンビンは一つのフィブリン単量体およびフィブリノペプチドＡおよびＢの二つのコピーを生成する（４）。フィブリノーゲンは、固形腫瘍中で漏れやすい血管の周りで蓄積すると示されている（５）。フィブリノーゲンはまた、宿主腫瘍の界面で重合して、内皮細胞の接着、遊走、増殖および分化を支持することにより腫瘍の血管新生を促進する、フィブリンネットワークを形成すると示されている（７）。
【０００９】
フィブリンのタンパク質分解切断により生成される、フィブリンＥ−フラグメント（ＦｎＥ−フラグメント）は、しょう尿膜アッセイで血管新生を刺激する（８）。さらに、浸入性乳がん腫に存在するこのタンパク質の量は腫瘍血管化度と正に相関する（５）。
【００１０】
フィブリノーゲンの５０ｋＤａタンパク質分解フラグメントであるところの強力で、新しい血管新生阻害剤、フィブリノーゲンＥ、は、出典明示により本明細書の一部とする、我々の同時係属出願、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０２０７９、に開示されている。今や我々は、フィブリノーゲンＥフラグメント内に、このはるかに大きいフィブリノーゲンＥフラグメントと同じ抗−血管新生活性を有するドメインを同定している。このドメインはα鎖のアミノ末端に位置し、そしてα１−２４と呼ばれる。このドメインから誘導化されるペプチドは抗−血管新生活性を有する。我々はまた、非修飾α１−２４ペプチドの抗−血管新生活性を保持するところの修飾α１−２４ペプチドを同定している。
【００１１】
この発明の第一の態様にしたがい、以下のものからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する：
ｉ）配列：
【表４】
2004512832.tif 000003
〔配列中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。〕
を有するペプチド；
ｉｉ）配列中アミノ酸残基Ｘが以下のグループ：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、から選択される、（ｉ）で表されるペプチド；および
ｉｉｉ）抗−血管新生活性を有する、（ｉ）もしくは（ｉｉ）で表されるペプチド。
【００１２】
抗−血管新生活性への参照はここに開示するアッセイにより測定される。例えば、この発明のポリペプチドはインビトロアッセイにより試験されるが、これらとしては、内皮細胞仲介細管形成の阻害、内皮細胞遊走の阻害、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦ誘導の内皮細胞増殖の阻害ならびに内皮細胞細胞毒性のアッセイが挙げられる。ポリペプチドをまた、ここで開示されるように、マウスの腫瘍モデルを用いてインビボで試験することができる。
【００１３】
この発明の好ましい実施態様において、該ポリペプチドは以下のグループから選択されるアミノ酸配列を含む：
【表５】
2004512832.tif 000004
【００１４】
この発明のさらに好ましい実施態様において、該ペプチドは、配列中Ｘはアラニンであるアミノ酸配列を含む。
この発明のなおさらに好ましい実施態様において、該ポリペプチドはアミノ酸配列：
【表６】
2004512832.tif 000005
を含む。
【００１５】
α１−２４ペプチドへの参照は配列：
【表７】
2004512832.tif 000006
を有するペプチド、または、少なくとも一つのアミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換により修飾されているこの配列から誘導化される活性なペプチドへの参照である。
【００１６】
この発明の好ましい実施態様において、該ポリペプチドは長さで少なくとも２４個のアミノ酸残基である。好ましくは、該ペプチドはアミノ酸配列ＡＤＳＧＥＧＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲＧＰＲＶＶＥＲＨ、もしくはそのフラグメントからなる。
【００１７】
フラグメントへの参照は、抗−血管新生活性を保持するα１−２４ペプチドから誘導化されるペプチドへの参照である。そのようなフラグメントは長さで３個のアミノ酸であってもよい；好ましくは、該フラグメントは長さで、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２もしくは２３個のアミノ酸残基である。
【００１８】
α１−２４を含むポリペプチドのアミノ酸配列への修飾は、その標的配列に関してポリペプチドの結合および／もしくは安定性を増強できたことは当業者に明らかであるであろう。加えて、ポリペプチドの修飾はまた、ポリペプチドのインビボ安定性を増加し、それにより血管新生を阻害するために必要なポリペプチドの有効量を減少させる。これは、インビボで起り得る望ましくない副作用を有利に減少させるであろう。修飾にはアセチル化およびアミド化が、例示としてそして限定としてではなく、挙げられる。
【００１９】
この発明の好ましい実施態様において、α１−２４配列を含む該ポリペプチドがアセチル化される。好ましくは、該アセチル化は該ポリペプチドのアミノ末端にされる。さらに好ましくはなお、α１−２４ペプチドのアミノ末端のアラニンアミノ酸がアセチル化される。
【００２０】
この発明のさらに好ましい実施態様において、α１−２４配列を含む該ポリペプチドがアミド化される。好ましくは、該アミド化は該ポリペプチドのカルボキシル末端にされる。さらに好ましくはなお、カルボキシル末端のヒスチジンアミノ酸がアミド化される。
【００２１】
この発明のさらに好ましい実施態様において、α１−２４ペプチド、もしくはそのフラグメント、はアセチル化およびアミド化の両方により修飾される。好ましくは、該アセチル化はα１−２４ペプチドのアミノ−末端のアラニンアミノ酸にされ、そして、該アミド化はα１−２４ペプチドのカルボキシル−末端のヒスチジンにされる。
【００２２】
ここで開示されるようなα１−２４ペプチドのフラグメントがアセチル化および／もしくはアミド化のような修飾を受けやすいことは当業者に明らかであるであろう。
これに代えてもしくは好ましくは、該修飾は、α１−２４ペプチドを含むポリペプチドの組換えもしくは合成型の生成における修飾アミノ酸の使用を含む。
【００２３】
修飾アミノ酸としては、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、Ｎ６−アセチルリシン、Ｎ６−メチルリシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルリシン、Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−トリメチルリシン、シクロヘキシルアラニン、Ｄ−アミノ酸およびオルニチンが、例示としてそして限定としてではなく、挙げられることは当業者に明らかであるであろう。他の修飾としては、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、ヒドロキシもしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシから選択される、１、２もしくは３個の置換基により任意に置換されるＣ２、Ｃ３もしくはＣ４アルキルＲ基を持つアミノ酸が挙げられる。
【００２４】
この発明のさらに好ましい実施態様において、ポリペプチドが、配列中Ｘは該修飾アミノ酸の位置を意味する、少なくとも一つの修飾アミノ酸を含むところのこの発明にしたがうポリペプチドを提供する。
修飾アミノ酸の組入れは、α１−２４を含むポリペプチド上で有利な性質を授けるであろう。例えば、修飾アミノ酸の組入れは、ポリペプチドのその結合部位に対する親和性を増加させ得るか、もしくは修飾アミノ酸がポリペプチド上で増加したインビボの安定性を授け得て、かくして患者に投与する治療的ポリペプチドの有効量の減少を可能にする。
【００２５】
抗−血管新生活性を保持するα１−２４のフラグメントは、例えば、タンパク質分解酵素を用いる未変化のポリペプチドの分画により回収され得たことは当業者に明らかであるであろう。これに代えて、フラグメントを新規に合成し、そしてまた、例えば環化、により修飾することができた。環化は技術上公知である（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ （２００１）， ８： ８０１−８１５； Ｇｅｌｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ （２００１）， ５７： ２７７−２９１； Ｄｕｔｔａ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ （２０００）， ８： ３９８−４１２； Ｎｇｏｋａ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ Ｊ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ （１９９９）， １０： ３６０−３６３；を参照）。
【００２６】
この発明の好ましい実施態様において、この発明にしたがうポリペプチドは環化により修飾される。
この発明のさらなる態様にしたがい、以下のものから選択されるＤＮＡ配列を含む核酸分子を提供する：
ｉ）図５ａで表されるようなＤＮＡ配列；
ｉｉ）この発明にしたがう修飾ペプチドをコードする、少なくとも一つのコドン内で少なくとも一つのヌクレオチド塩基の挿入、欠失もしくは置換により修飾されている図５ａで表されるようなＤＮＡ配列；
ｉｉｉ）抗−血管新生活性を有するペプチドをコードするところの図６に示される配列にハイブリダイズする、ＤＮＡ配列；および
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）で規定されるＤＮＡ配列への遺伝子コードの結果として縮重しているＤＮＡ配列。
【００２７】
この発明の好ましい実施態様において、上の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）で説明された配列へストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件下でアニールするところの分離された核酸分子を提供する。
【００２８】
ストリンジェント・ハイブリダイゼーション／洗浄条件は技術上周知である。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６０℃で洗浄後安定である核酸ハイブリッドである。最適なハイブリダイゼーション条件は、核酸の配列が既知であれば、計算され得ることは技術上周知である。典型的に、ハイブリダイゼーション条件は、４〜６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥは、１リットルに溶かしそしてｐＨを７．４に調節した、ＮａＣｌ １７５．３ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ８８．２ｇおよびＥＤＴＡ ７．４ｇを含有する）；５〜１０×デンハート溶液（５０×デンハート溶液は５ｇのフィコール（４００タイプ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ポリビニルピロリドン５ｇおよびウシ血清アルブミン５ｇを含有する）；１００μｇ〜１．０ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ／ニシンＤＮＡ；０．１〜１．０％ドデシル硫酸ナトリウム；任意に４０〜６０％の脱イオンホルムアミドを使用する。ハイブリダイゼーション温度は核酸標的配列のＧＣ含量に依存して変わるであろうが、典型的には４２〜６５℃の間にあるであろう。
【００２９】
この発明のさらなる態様にしたがい、α１−２４ペプチド、もしくはその一部を含む医薬組成物を提供する。
投与されるときには、本発明の医薬組成物は薬学的に許容される製剤で投与される。そのような製剤は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性のキャリヤー、アジュバントおよびサイトカインのような補助的な免疫強化剤ならびに任意に化学療法剤のような治療剤を型通りに含有してもよい。
【００３０】
この発明の医薬組成物は、注射を含むいかなる従来の経路によるか、もしくは経時的に徐々の点滴により投与され得る。この投与は、例えば、経口的、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下もしくは経皮であってもよい。
【００３１】
この発明の組成物は有効量で投与される。“有効量”は、単独で、もしくはさらなる投薬と共に、望ましい応答を生じる組成物の量である。がんのような特定の疾患を処置する場合には、望ましい応答は疾患の進行を阻害することである。これは疾患の進行を一時的に遅くすることを伴ってもよいが、さらに好ましくは、それは疾患の進行を永久に停止させることを伴う。これは日常的な方法によりモニターされ得る。
【００３２】
そのような量は、勿論、処置される特定の異常、異常の重篤度、年齢、物理的状態、身長および体重を含む個々の患者のパラメータ、処置の継続時間、併行する治療（もしあれば）の性質、投与の特異的経路ならびに健康医師の知識および専門的技術内の類似した要因に依存するであろう。これらの要因は通常の当業者に周知であり、そして単なる日常的な実験で検討され得る。
【００３３】
前述の処置方法で使用される医薬組成物は、好ましくは、無菌でありそして、患者への投与に適する重量もしくは容量の一単位で望ましい応答を生じるための、α１−２４ペプチドまたはα１−２４ペプチドをコードする核酸を含有する。
【００３４】
被験者に投与されるα１−２４ペプチドまたはα１−２４ペプチドをコードする核酸の投与量は、異なるパラメターにしたがい、特に用いる投与様式および被験者の状態で選択され得る。他の要因としては処置の望ましい期間が挙げられる。被験者中での応答が与えた始めの投与量で不十分な場合には、さらに高い投与量（もしくは異なる、さらに局部的な送達経路による効果的にさらに高い投与量）を患者の許容度が許す程度に使用してもよい。
【００３５】
投与されるときには、本発明の治療製剤は治療的に許容される量でおよび薬学的に許容される組成物で与えられる。“薬学的に許容される”なる用語は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げない無毒性な材料を意味する。そのような製剤は、塩、緩衝剤、保存剤、適合性のキャリヤーおよび任意に他の治療剤を型通りに含有してもよい。薬に用いるときには、塩は薬学的に許容されるべきであるが、非−薬学的に許容される塩を便宜的に使用して、薬学的に許容されるそれらの塩を調製してもよく、そしてこの発明の範囲から除外するものではない。
【００３６】
α１−２４ペプチド組成物を、望ましくは、薬学的に許容されるキャリヤーと組合せてもよい。本明細書で使用される“薬学的に許容されるキャリヤー”なる語は、ヒトへの投与に適するところの、一つもしくはそれ以上の適合性の固体または液体の賦形剤、希釈剤もしくはカプセル化物質を意味する。用語“キャリヤー”は、活性成分がそれと組合わされて、施用を容易にするところの有機もしくは無機で天然もしくは合成の成分を意味する。
【００３７】
医薬組成物は、塩での酢酸；塩でのクエン酸；塩でのホウ酸；および塩でのリン酸を含む、適当な緩衝剤を含有してもよい。
医薬組成物はまた、塩化ベンザルコニウム；クロロブタノール；パラベンおよびチメロサールのような適当な保存剤を、任意に、含有してもよい。
【００３８】
医薬組成物は単位投与形で便宜的に提供されてもよく、そして製剤技術で周知の方法のいずれかにより調製されてもよい。全ての方法は、一つもしくはそれ以上の補助成分を構成するキャリヤーと活性剤を会合させるようにするステップを含む。一般的に、組成物は、活性剤を液体キャリヤー、細かく分割した固体キャリヤーもしくは両方と均一にかつ密接に会合させるようにし、それから、必要により生成物を成形することにより調製される。
【００３９】
経口投与に適する組成物を、それぞれが予め決めた量の活性化合物を含む、カプセル、錠剤、トローチのような別個の単位として提供してもよい。他の組成物としては、水性液体もしくは非−水性液体中の懸濁剤、例えばシロップ剤、エリキシル剤または乳化剤が挙げられる。
【００４０】
非経口投与に適する組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張であるところの、α１−２４ペプチドもしくは核酸の水溶性または非−水溶性の無菌製剤を便宜的に含む。この製剤を適当な分散もしくは湿潤剤および懸濁剤を用いる公知の方法にしたがって処方してもよい。無菌の注射製剤はまた、無毒で非経口的に許容される希釈剤もしくは溶剤中の無菌の注射液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール溶液としてあってもよい。使用してもよいところの許容されるビヒクルおよび溶剤は、水、リンゲル液および等張食塩水である。これに加えて、無菌で不揮発性の油が溶剤もしくは懸濁媒体として便宜的に使用される。この目的のためには、合成のモノ−もしくはジ−グリセリドを含む、いかなる口当たりのよい不揮発性の油を使用してもよい。これに加えて、オレイン酸のような脂肪酸を注射製剤に使用してもよい。
【００４１】
経口的、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適するキャリヤーの処方を、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ、中に見ることができる。
この発明の好ましい実施態様において、該医薬組成物は血管新生を調整する。好ましくは、該調整は血管新生の阻害である。好ましくは、該阻害は内皮細胞で刺激される血管新生に関する。
【００４２】
これに代えて、もしくは好ましくは、該阻害はマクロファージおよび／もしくは腫瘍細胞で刺激される血管新生の阻害である。
この発明のさらに好ましい実施態様において、該阻害はプロ−血管新生因子の阻害により仲介される。理想的には、これらは細胞内もしくは細胞表面の受容体のどちらかである。
さらに好ましくはなお、該阻害はプロ−血管新生成長因子の活性の阻害により仲介される。理想的には、該成長因子は、ＶＥＧＦ；ｂＦＧＦ；ａＦＧＦ；ＴＧＦβ；ＰＤＧＦから選択される。
【００４３】
この発明のなおさらなる態様にしたがい、がんの処置に用いる医薬品の製造におけるα１−２４ペプチド、もしくはその部分、を含むポリペプチドの使用を提供する。
α１−２４ペプチドを含むポリペプチドは、標準的なペプチド合成手法を用いるインビトロのペプチド合成により製造され得る。これに代えて、もしくは好ましくは、技術上周知である組換え手法により、ポリペプチドを製造することができる。
【００４４】
この発明のさらなる態様にしたがい、ベクターを提供するが、そこでは該ベクターは、α１−２４ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
これに代えて、α１−２４ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸を含むところの一個以上のベクターを組換え発現に適応させることができる。
【００４５】
この発明の好ましい実施態様において、該ベクターは原核もしくは真核細胞の発現に適応される発現ベクターである。好ましくは、該真核ベクターは遺伝子治療に適応される。
典型的に該適応は、細胞／組織特異的発現を仲介するところの転写制御配列（プロモーター配列）の規定を、例示としてそして限定としてではなく、含む。これらのプロモーター配列は細胞／組織特異的、誘導性もしくは構成的であってもよい。
【００４６】
プロモーターは技術上認識された用語でありそして、はっきりさせるために、例示としてそして限定としてではなく提供される以下の特徴を含む。エンハンサー・エレメントは、遺伝子の転写開始部位に対してしばしば５’に見出される（エンハンサーはまた、遺伝子に対して３’に見出されるかイントロン配列にさえ位置し得るので、位置依存性である）、シスに作用する核酸配列である。エンハンサーは、それにエンハンサーが連結される遺伝子の転写速度を増加させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサー・エレメントに特異的に結合すると示されているところのトランスに作用する転写因子（ポリペプチド）に応答的である。転写因子の結合／活性（Ｄａｖｉｄ Ｓ Ｌａｔｃｈｍａｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏによる「真核転写因子」を参照されたい）は、中間代謝物もしくは環境エフェクターを、例示としてそして限定としてではなく、含むところの数多くの環境合図に応答的である。
【００４７】
プロモーター・エレメントはまた、所謂ＴＡＴＡボックスおよび、転写開始部位を選択するように機能するＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含む。これらの配列はまた、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように、とりわけ、作用するポリペプチドに結合する。
【００４８】
適応はまた、真核細胞もしくは原核宿主のどちらかの中で該ベクターの維持を一緒に容易にするところの選択可能マーカーおよび自律性反復配列を含む。自律的に維持されるベクターはエピソームベクターと呼ばれる。
【００４９】
ベクターコード化遺伝子の発現を容易にする適応は転写終結／ポリアデニン化配列の規定を含む。これはまた、ビシストロニックもしくはマルチ−シストロニック発現カセット中に配置されたベクターコード化遺伝子の発現を最大にするように機能するところの内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）の規定を含む。
【００５０】
これらの適応は技術上周知である。発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技法一般に関する大量の出版文献がある。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ （１９８９）、「分子クローニング：実験室マニュアル」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， ＮＹ およびその中の参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ， Ｆ （１９８７）、「ＤＮＡクローンニング技法：実際的アプローチ」、Ｖｏｌ ＩＩＩ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ；「ＤＮＡクローンニング」、Ｆ Ｍ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ、「分子生物学における現行プロトコル」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４）を参照されたい。
【００５１】
この発明のなおさらに好ましい実施態様において、この発明にしたがう核酸を含む遺伝子治療ベクターを提供する。
【００５２】
遺伝子治療ベクターの内皮細胞もしくは腫瘍細胞のどちらかへの送達は腫瘍の周辺でのα１−２４ペプチドを含むポリペプチドの生成に目標を向け、それによりα１−２４を含むポリペプチドの抗−血管新生効果を増大することは当業者に明らかであるであろう。
【００５３】
この発明のなおさらなる態様にしたがい、この発明にしたがう核酸と形質転換／トランスフェクトされる細胞を提供する。理想的には、該核酸はこの発明にしたがうベクターである。
【００５４】
この発明のさらに好ましい態様にしたがい、α１−２４を含むポリペプチドの製造のための方法を提供するが、この方法は：
ｉ）この発明にしたがう細胞を提供すること；
ｉｉ）α１−２４を含むポリペプチドの製造に実施的な条件を提供すること；および
ｉｉｉ）該ポリペプチドを細胞から、もしくは細胞培養環境から精製すること、を含む。
【００５５】
この発明のなおいっそうさらなる態様にしたがい、該動物がα１−２４を含むポリペプチドをゲノム中にコードする核酸分子を組入れることを特徴とする非−ヒトの、形質転換動物を提供する。
【００５６】
α１−２４を含むポリペプチドをコードする一個以上のトランス遺伝子の規定により遺伝子的に修飾される非−ヒトの、形質転換動物の規定は活性ポリペプチドの代わりの供給源であることは当業者に明らかであるであろう。形質転換動物を使用して種々の治療ポリペプチドを作ることは技術上周知である。
【００５７】
この発明の好ましい実施態様において、該トランス遺伝子はヒト起源である。
【００５８】
この発明のさらなる態様において、血管新生の阻害の恩恵を受けるであろう動物を処置する方法を提供するが、この方法は：
ｉ）処置すべき動物に有効量のα１−２４を含む薬剤を投与すること；および
ｉｉ） 血管新生の阻害への該薬剤の効果をモニターすることを含む。
【００５９】
この発明の好ましい方法において、該処置は腫瘍の発育の阻害である。
【００６０】
代わりの処置方法において、α１−２４を含むポリペプチドは、ポリペプチドの抗−血管新生効果を増大させる薬剤に追加的に接合され、会合されもしくは架橋される。
【００６１】
典型的に、この薬剤は細胞毒剤、もう一つの抗−血管新生剤、前駆薬剤活性化酵素、化学療法剤、プロ−凝固剤もしくは免疫調整剤であり得るであろう。
【００６２】
これらの例は技術上周知であリ、例えば、そして限定としてではなく、リシンＡ−鎖もしくはジフテリア毒のような細胞毒である；腫瘍（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＮＦアルファ、ＰＤＧＦ）中において重要なプロ−血管新生因子のアンタゴニストとしては以下に挙げられる：これらの因子に対して中和する抗体もしくは受容体、またはそれらの受容体（例えば、ＶＥＧＦ受容体に対するＳＵ５４１６、Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）に対するチロシンキナーゼ阻害剤；全身投与時に前駆薬剤、ガンシクロビルを活性化する、ヒトのシンプレックスウイルス−チミジンキナーゼＨＳＶ−ＴＫ、のような前駆薬剤活性化酵素；ならびにネオカルジノスタチン；シスプラチン；カルボプラチン；シクロホスファミド；メルファラン；カルムスリン；メソトレキセート；５−フルオロウラシル；シタラビン；メルカプトプリン；ダウノルビシン；ドキソルビシン；エピルビシン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ダクチノマイシン；マイトマイシンＣ；タキソール；Ｌ−アスパラギナーゼ；Ｇ−ＣＳＦ；チャリチアミシン（ｃｈａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）もしくはエスペラミシンのようなエンジイン；クロラムブシル；ＡＲＡ−Ｃ；ビンデシン；ブレオマイシン；およびエトポシド、のような化学療法剤。
【００６３】
これに加えて、もしくはこれに代えて、ヒト組織因子 （トランケートされた形態の組織因子（ｔＴＦ）） の細胞表面ドメインはまたα１−２４と会合し得るであろう。トランケートされたＴＦは、血行中で遊離しているときにはある程度の抗−内皮活性を有するが、腫瘍内皮細胞の表面へ目標を向けるときには効果的でかつ選択的なトロンボゲン（即ち、血管中で広大な血栓症と凝固を引き起こす）になる。
【００６４】
免疫調整因子の例はヒトＩｇＧ１のＦｃエフェクタードメインである。これはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびまた、補体カスケードを開始するＣｌｑタンパク質と結合する。それから、ＮＫ細胞および補体は標的の内皮細胞に対して強力な細胞溶解反応を活性化する。
【００６５】
α１−２４および治療剤の上の組合せはまた、血管新生に依存する他の異常／疾患の処置に関して恩恵を持つであろうことは明らかであるであろう。例えば、新生血管緑内障、慢性関節リウマチ、乾癬および糖尿病性網膜症である。
【００６６】
なおさらなる代わりの処置方法において、該遺伝子治療ベクターは、α１−２４の抗−血管新生効果を増大する薬剤をコードする核酸を含み、そしてそれ故にα１−２４を含むポリペプチドをコードする該核酸はそれを支給される。
【００６７】
この発明のなおさらなる態様にしたがい、α１−２４を含むイメージング剤を提供する。
【００６８】
α１−２４を含むポリペプチドを用いて、イメージング剤を、例えば、腫瘍に目標を向けて、発育する腫瘍を確認するかもしくは腫瘍の成長を阻害する処置の効果をモニターすることは当業者に明らかであるであろう。α１−２４およびさらなる抗−血管新生剤の両方を含む組合せ治療組成物はイメージング剤とさらに会合して、組合せ治療組成物の分布をモニターし、そして／もしくは該組合せ組成物の有効性をモニターすることもまた明らかであるであろう。
【００６９】
イメージング剤を検出するために用いる方法は技術上周知でありそして、Ｆ１８およびＣ１１化合物の陽電子放射断層撮影法の検出を、例示としてそして限定としてではなく、含む。
【００７０】
ここで、この発明の実施態様を以下の図を参照して、単に例示として、説明する。
図１は、フィブリノーゲンＥのα−β−γ−ポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列を表す。
【００７１】
図２は、インビトロでＨｕＤＭＥＣによる細管形成へのフィブリノーゲンＥフラグメント（パネルＡ）おおびフィブリンＥフラグメント（パネルＢ）の効果の比較を表す。ＶＥＧＦもしくはｂＦＧＦの非存在下（空白バー）もしくは存在下（着色バー）における細管形成によりカバーされる平均（±ＳＥＭ）面積である。それぞれの試験条件を３個の反復ウェル中で行い、全面積をの三つの無作為に選択した視野で測定した（ｎ＝９）。関連する対照群に関する＊ｐ＜０．００５である；
【００７２】
図３は、抗−血管新生フィブリノーゲンＥフラグメント（Ａ）おおびプロ−血管新生フィブリンＥフラグメント（Ｂ）間で構造の相違を示す概略図を表す。唯一の相違は、１６個のアミノ酸のフィブリノペプチドＡの存在（フィブリノーゲンＥフラグメント）もしくは不存在（フィブリンＥフラグメント）である；
【００７３】
図４は、ＶＥＧＦもしくはｂＦＧＦの非存在下もしくは存在下における、インビトロでＳＶＥＣ４−１０による細管形成へのα１−２４（β−彎曲）の効果を表す。上部パネル（Ａ）：外因性因子（対照）（Ｉ）の非存在下または１００ｎＭ　α１−２４ （ＩＩ）、ＶＥＧＦ　１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＩＩ）もしくは１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ＋１００ｎＭ　α１−２４の存在下におけるＧＦ−低減マトリゲルアッセイ（×４０対物レンズ）での細管形成。下部パネル（Ｂ）：ＶＥＧＦもしくはｂＦＧＦの非存在下（空白バー）もしくは存在下（灰色バー）における細管形成の平均（±ＳＥＭ）面積。ｎ＝９、関連する対照群に関する＊ｐ＜０．０３である；
【００７４】
図５Ａはα１−２４ペプチドをコードする核酸配列である；図５Ｂはα１−２４ペプチドの直線アミノ酸配列および種々の修飾α１−２４ペプチドのアミノ酸配列を表す；
【００７５】
図６は、マウス中の腫瘍成長に対する非修飾α１−２４ペプチドのインビボの効果を図示する。Ｂａｌｂ／ｃマウス中のＣＴ２６腫瘍の成長に対するＰＢＳ中２５μｇ／ｋｇのα１−２４ペプチドもしくはＰＢＳ単独（対照）の毎日注射（腹腔内）の効果 （二つの別々の実験からのデータ） である；
【００７６】
図７は、アルギニン２３からアラニンへの置換（Ｒ２３Ａ）について抗−血管新生活性の比較を表す；α１−２４対照ペプチドおよびトランケートされたα１−２４（アミノ酸１７〜２４）である；
図８はアラニン置換α１−２４ペプチド（Ｇ４Ａ、Ｇ６Ａ、Ｇ１７Ａ）の抗−血管新生活性を表す；
【００７７】
図９はアラニン置換α１−２４ペプチド（Ｄ７ＡおよびＲ１９）ならびに（Ｒ１６Ａ）の抗−血管新生活性を表す；
【００７８】
図１０は、α１−２４ペプチドへの末端修飾（アセチル化およびアミド化）の抗−血管新生活性を表す。インビトロでＨｕＤＭＥＣ（１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦの有無で）による細管形成へのアルファ１−２４ペプチドの阻害効果に対する末端修飾（ＴＭａ）の効果である；ならびに
【００７９】
図１１は、インビトロでＨｕＤＭＥＣ（１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦの存在もしくは不存在下で）による細管形成に対する広い濃度範囲のアルファ１−２４ペプチドの効果を表す。
【００８０】
物質および方法
成人ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨｕＤＭＥＣ）を市販（ＴＣＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）で入手して、微小血管内皮細胞育成培地（ＥＧＭ）中で培養した。この培地は、ヘパリン（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン、ヒト内皮成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒト繊維芽細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）（このような内皮成長因子は、ＨｕＤＭＥＣの日常的継代培養に必要である）およびジブチリルサイクリックＡＭＰを含む。これに、５％熱不活化ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（ＴＣＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を補充した。マウス内皮細胞（ＳＶＥＣ４−１０）をＡＴＣＣから入手し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で培養した。細胞を、３７℃、１００％加湿インキュベーターにて５％炭酸ガス気相中で育成させて、そしてマイコプラズマのスクリーニングを型通りに行った。以下に示すアッセイでそれらを使用する前に、８０％密集度にまでＨｕＤＭＥＣを育成させ、ＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳ中で２時間インキュベートし、それから、０．０５％トリプシン溶液で収穫し、２回洗浄しそしてそれぞれのアッセイに必要な細胞密度に再懸濁した（以下参照）。
【００８１】
タンパク質およびペプチド
ヒトフィブリノーゲン（Ｆｇｎ）Ｅフラグメントを、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ， Ａｓｎｉｅｒｅｓ、フランスより購入した。これは、フィブリノーゲンをプラスミンで切断して生成させ、そして電気泳動、免疫−電気泳動、イオン交換およびゲルろ過で精製されたものである。ヒトフィブリン（Ｆｎ）Ｅフラグメントを産生するために、以前記載されているように（１０）、ＦｇｎＥフラグメントをヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ， Ｄｏｒｓｅｔ、英国）で消化した。我々のアッセイに及ぼすＦｎＥフラグメント試料中の微量トロンビンの可能な効果を制御するために、同量のトロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）を加え、ＦｎＥフラグメントを用いる実験で使用する培地を制御した。ＨＰＬＣで精製したＦｐＡを、Ｂａｃｈｅｍ Ｌｔｄ．， Ｓａｆｆｒｏｎ Ｗａｌｄｅｎ、英国から市販で入手した。このペプチドはＦｎＥフラグメントの生成でＦｇｎＥフラグメントから切断されており、アッセイで微量に存在するであろうから、このペプチドをこの研究に含めた。ＦＭＯＣアミノ酸と合成機を用いる標準的なペプチド合成法により、ベータ彎曲（α１−２４）を産生させた。質量分析でペプチドの純度を点検した。
【００８２】
細管形成アッセイ
３０μｌ／ウェルの成長因子低減（ＧＦ低減）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）で２４ウェルプレートを被覆した。このマトリックス上で平板培養された内皮細胞は遊走し、以前記載されているように（１４）、平板培養の６時間以内に細管に分化する。４×１０４細胞／ｍｌの密度でＨｕＤＭＥＣもしくはＳＶＥＣ４−１０細胞を接種し、ＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳ単独（コントロール）、またはこの培地±１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦもしくはｂＦＧＦのどちらかの、５００μｌ中で、フィブリノーゲンＥフラグメント、フィブリンＥフラグメント、ＦｐＡもしくはα１−２４の存在下もしくは非存在下で、６時間インキュベートした。細管形成の評価は、７０％エタノール中、４℃で１５分間の細胞試料の固定、ＰＢＳ中でのすすぎそしてヘマトキシリンおよびエオシンによる染色を伴った。それぞれの試験条件について３個の反復ウェルでの三つの無作為視野を低倍率（×４０倍率）下で視覚化し、そしてペンチナムＩＩＩコンピュータ（フレームグラバーボードを含む）に連結したフジデジタルカメラを用いてカラーイメージを捕獲した。Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅの提供する画像解析ソフトを用いて、細管分枝数およびそれぞれの視野の中で細管によりカバーされている全面積を計数して、細管形成を評価した。
【００８３】
遊走アッセイ
Ｂｏｙｄｅｎチェンバー手法を（１３）から適応しそして使用して、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）もしくはｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかの濃度勾配に向いて多孔質膜を横断するＨｕＤＭＥＣの遊走を評価した。Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ ４８ウェル ミクロ走化性チェンバー（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ， Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ， ＭＤ）を、１００μｇ／ｍｌコラーゲンＩＶ型で被覆した孔径８μｍのポリカーボネート膜（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ， Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ， ＭＤ）と共に用いた。１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦもしくはｂＦＧＦを単独で、または種々の濃度のフィブリノーゲンＥフラグメント、フィブンＥフラグメント、ＦｐＡもしくはα１−２４と一緒で、ＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳ中に溶解し、下部のウェルに入れた。それから、この上にコラーゲンで被覆した膜を置き、そして２５×１０４個のＨｕＤＭＥＣ／ｍｌ（１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で）の５０μｌを上部のチェンバーに加えた。それから、チェンバーを３７℃で４．５時間インキュベートした。それから、チェンバーを取り外し、膜を取り除いて未遊走の細胞を上部表面から擦り落とした。下部表面上の遊走した細胞をメタノールで固定し、Ｈｅｍａ Ｇｕｒｒ’迅速染色キット（Ｍｅｒｃｋ， Ｌｅｉｃｓ、英国）で染色し、そして光学顕微鏡（×１６０倍率）を用いてウェル当たり三つの無作為視野で計数した。３〜６個の反復ウェル中でそれぞれの試験条件を実施し、そしてそれぞれの実験を三回反復した。
【００８４】
増殖アッセイ
以前記載（１２）されているように、ＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）アッセイを用いて、フィブリノーゲンＥフラグメント、フィブリンＥフラグメント、ＦｐＡもしくはα１−２４の非存在下もしくは存在下で、ＶＥＧＦもしくはｂＦＧＦによって誘導されるＨｕＤＭＥＣの増殖を評価した。９６ウェルマイクロタイタープレート内に試験溶液中において、ＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳ±１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦもしくはｂＦＧＦ中で、３×１０４細胞／１００μｌのＨｕＤＭＥＣを、４．５および６時間で接種した。これらの時点で、ＭＴＴ溶液（２ｍｇＭＴＴ／ｍｌＰＢＳ）の四分の一容量をそれぞれのウェルに加え、それぞれのウェルを４時間、３７℃でインキュベートして不溶性の紫色ホルマザン生成物を得た。培地を吸引し、そして沈殿をｐＨ１０．５に緩衝化したＤＭＳＯ１００μｌに溶解した。それから、Ｄｙｎｅｘ ＥＬＩＳＡ プレートリーダーで５４０ｎｍにて吸光度を読み取った。
【００８５】
細胞毒性アッセイ
フィブリノーゲンＥフラグメント、フィブリンＥフラグメント、ＦｐＡもしくはα１−２４の非存在下もしくは存在下で、２４ウェル−プレート中にウェル当たり１〜２×１０５細胞の密度で、ＨｕＤＭＥＣを接種した。６時間後、生存（トリプシン化による除去の後）および死滅（浮遊）細胞を収穫し、４８８ｎｍにおいて１５ｍＷの青色レーザー励起を装備したＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、処置毎に三組の試料のそれぞれにおいて、５０００個の細胞の沃化プロピジウム染色を用いて、存在する全細胞の細胞生存率を評価した。データを収集し、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析した。
【００８６】
α１−２４ペプチドのインビボ効能
Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｆｉｅｌｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した体重１５ｇの６週令Ｂａｌｂ／Ｃマウスで、実験を実施した。すべての実験は、Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｃｅｎｃｅ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＰＬ５０／１４１４により承認された。
【００８７】
腫瘍細胞培養
１０％ウシ胎児血清、ならびに１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコの最少イ−グル培地中で、ＣＴ２６細胞株をインビトロ継代により維持し、３７℃にて空気中５％炭酸ガスの加湿雰囲気中で維持した。細胞株を型通りに点検し、マイコプラズマが無いことを確認した（マイコプラズマ迅速検出システム、Ｇｅｎａ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、米国）。
【００８８】
皮下腫瘍移植
ジアゼパム（０．５ｍｇ／ｍｌ，Ｄｕｍｅｘ Ｌｔｄ．）およびヒプノルム（０．０３１５ｍｇ／ｍｌクエン酸フェンタニルおよび１ｍｇ／ｍｌフルアニゾン，Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｌｔｄ．）を１：１の比率で、０．１ｍｌ／２００ｇ体重の容量にて、必要な場合は十分な麻酔を維持するために補充して、動物を麻酔した。未投薬Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、毛皮の除去後、皮下的に右側腹部で免疫した。無血清培地１００μｌに懸濁した動物当たり３×１０５個の生存可能ＣＴ２６細胞の濃度で、腫瘍細胞を注射した。それから、動物を回復させた。腫瘍の成長および動物重量を毎日モニターした。
【００８９】
ペプチドα１−２４の投与
腫瘍成長を毎日測定し、群中の大多数の動物が、１００ｍｍ３以上／３５０ｍｍ３以下の腫瘍体積を有したとき、動物を実験および対照群に分けた。これは、腫瘍細胞懸濁液を移植後１４日と１８日の間で起きた。それから、動物は、活性薬剤（１００ｍＭペプチドα１−２４；１００μｌ）もしくはビークル（リン酸緩衝生理食塩液、１００μｌ）のいずれかの腹腔内（ｉｐ）注射を受けた。対照動物における腫瘍成長がＨｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ法で許容される最大負荷に達するまで、毎日の注射を継続した。
【００９０】
腫瘍成長の評価
垂直直径のキャリパー測定により腫瘍体積を評価し、そして次式を用いて体積を推定した：
体積＝（ａ２×ｂ）／２
式中、ａは小直径でありそしてｂは大直径である。
毎日の基準で動物を重量計測し、一般的な良好な生活状態をモニターした。
【００９１】
統計的解析
すべての実験を少なくとも三回実施し、そして解析されているデータ中でＧａｕｓｓｉａｎ分布を仮定しない非パラメータ検定である、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いて、データを解析した。Ｐ≦０．０５を有意とした。
【００９２】
残存レベルの成長因子がこのマトリックス中に存在していることは注目すべきであるが、内皮細胞が伸長しそしてＧＦ−低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で外因性刺激の非存在下にて細管を形成し始めるように見えた。それ故に、このアッセイは、血管新生経路における主要なステップの一つ、分化のモデルとして使用される。分枝数は同様な図的様式を生み出すけれども（データ表示せず）、引き続く細管形成を、細管によりカバーされる面積として測定する。この分化過程は、このアッセイシステム内の培養培地にＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）もしくはｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかの添加で有意に（Ｐ＜０．００１）増強された。このシステムへのα１−２４（β彎曲）の添加は、図４に示すように成長因子の非存在下および存在下の両方で、細管形成を有意に（Ｐ＜０．０３）低減した。
【００９３】
図４に示した結果から、我々はペプチドα１−２４がフィブリノーゲンＥフラグメントの活性部位を含むと結論する。２４個のアミノ酸ペプチドは、恐らくさらに複雑なポリペプチド構造のフィブリノーゲンＥフラグメントよりもより大きな治療的有用性を有するであろうが、これは後者は血液から誘導化されるフィブリノーゲンの切断によって作られるべきであるからである。対照的に、α１−２４は合成的もしくは組換え手法によって作成できる、さらに小さいペプチドである。また、がんもしくは他の血管新生依存性疾患の処置のための遺伝子治療プロトコルの一部として、これを使用することも可能であり得る。そこで、我々はα１−２４ペプチドのインビボ有効性を測定した。
【００９４】
α１−２４ペプチドのインビボ有効性
実施例１
実験動物（ｎ＝６）を腹腔内によりα１−２４で、対照動物（ｎ＝７）を腹腔内によりビークルで毎日処置した。開始した腫瘍体積は両群の動物で同様であった（実験対対照、２３５±３０対１９８±２８ｍｍ３）。対照群の腫瘍は、１４日間にわたり着実な速度で成長し続け、最終腫瘍体積は２２４５±３７１ｍｍ３に達した。対照的に、実験群における腫瘍は、４日目までは同様な成長速度を有し、そこで成長が低減した。それから、７日目で腫瘍は対照と同様な速度で成長を続けたが、体積は低減していた。１０日目までに腫瘍成長は再び安定し１４日目に到り、最終腫瘍体積は１３４１±１４５ｍｍ３であった（Ｐ＜０．００１）。
【００９５】
実験動物（ｎ＝７）を腹腔内によりα１−２４で、対照動物（ｎ＝７）を腹腔内によりビークルで毎日処置した。開始した腫瘍体積は両群の動物で同様であった（実験対対照、３３８±３９対３００±６５ｍｍ３）。対照群の腫瘍は、１２日間にわたり着実な速度で成長し続け、最終腫瘍体積は３０７２±２５５ｍｍ３に達した。対照的に、実験群における腫瘍は７日目までは対照群と同様な成長速度を有し、そこで成長は、動物を１２日目で屠殺するまで安定し、最終腫瘍体積は２０２９±５０４ｍｍ３であった（Ｐ＜０．００１）。
【００９６】
それ故にこのデータ、図６参照、はインビボでの抗−血管新生剤としてのペプチドα１−２４の潜在力を実証している。さらに、α１−２４のペプチド変異体も、非修飾α１−２４と同様な阻害活性を示す、図７〜９参照。また、アセチル化およびアミド化によるα１−２４の修飾は、抗−血管新生効果に影響を与えない。
【００９７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、フィブリノーゲンＥのα−β−γ−ポリペプチドの核酸およびアミノ酸配列を表す。
【図２】図２は、インビトロでＨｕＤＭＥＣによる細管形成へのフィブリノーゲンＥフラグメント（パネルＡ）おおびフィブリンＥフラグメント（パネルＢ）の効果の比較を表す。
【図３】図３は、抗−血管新生フィブリノーゲンＥフラグメント（Ａ）おおびプロ−血管新生フィブリンＥフラグメント（Ｂ）間で構造の相違を示す概略図を表す。唯一の相違は、１６個のアミノ酸のフィブリノペプチドＡの存在（フィブリノーゲンＥフラグメント）もしくは不存在（フィブリンＥフラグメント）である。
【図４】図４は、ＶＥＧＦもしくはｂＦＧＦの非存在下もしくは存在下における、インビトロでＳＶＥＣ４−１０による細管形成へのα１−２４（β−彎曲）の効果を表す。
【図５Ａ】図５Ａはα１−２４ペプチドをコードする核酸配列である。
【図５Ｂ】図５Ｂはα１−２４ペプチドの直線アミノ酸配列および種々の修飾α１−２４ペプチドのアミノ酸配列を表す。
【図６】図６は、マウス中の腫瘍成長に対する非修飾α１−２４ペプチドのインビボの効果を表す。
【図７】図７は、アルギニン２３からアラニンへの置換（Ｒ２３Ａ）について抗−血管新生活性の比較を表す。
【図８】図８はアラニン置換α１−２４ペプチド（Ｇ４Ａ、Ｇ６Ａ、Ｇ１７Ａ）の抗−血管新生活性を表す。
【図９】図９はアラニン置換α１−２４ペプチド（Ｄ７ＡおよびＲ１９）ならびに（Ｒ１６Ａ）の抗−血管新生活性を表す。
【図１０】図１０は、α１−２４ペプチドへの末端修飾（アセチル化およびアミド化）の抗−血管新生活性を表す。
【図１１】図１１は、インビトロでＨｕＤＭＥＣ（１０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦの存在もしくは不存在下で）による細管形成に対する広い濃度範囲のアルファ１−２４ペプチドの効果を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004512832.tif 000068
2004512832.tif 000069
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