(57)【要約】被験体における、一本鎖標的ＲＮＡが関与する塩基特異的細胞内結合現象の発生を検出する方法が開示されている。この方法は、（ｉ）標的ｍＲＮＡの領域に相補的な標的化塩基配列を含む、８〜４０の塩基、（ｉｉ）相補的なＲＮＡ配列への結合に関して、約５０℃よりも高いＴｍ、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞を活発に利用する能力、ならびに（ｉｖ）この薬剤とハイブリダイズする相補的ＲＮＡの、ＲｎａｓｅＨに対する付与された耐性、を有するオリゴマーアンチセンス化合物を被験体に投与する工程を包含する。化合物が非複合形態で投与される場合、好ましくは、実質的に骨格を有する。試薬を投与した後の選択された時間において、体液サンプルが被験体から獲得され、そしてアンチセンスオリゴマーおよび標的ＲＮＡの相補的部分から構成されるヘテロ二重鎖が検出される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における、一本鎖標的ＲＮＡが関与する塩基特異的細胞内結合現象の発生を検出する方法であって：
（ａ）該被験体に、（ｉ）該標的ＲＮＡの一部に相補的な標的化塩基配列を含む、８〜４０の塩基、（ｉｉ）相補的なＲＮＡ配列への結合に関して、約５０℃よりも高いＴｍ、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞により活発に取り込まれる能力、ならびに（ｉｖ）薬剤とハイブリダイズした相補的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨに対する付与された耐性、を有するオリゴマーアンチセンス化合物を投与する工程；
（ｂ）該投与後の選択された時点にて、該被験体から体液のサンプルを獲得する工程、ならびに
（ｃ）該サンプルにおいて、アンチセンスオリゴマーと該標的ＲＮＡの相補的部分で構成されるヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記アンチセンス化合物が、実質的に非電荷骨格を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンチセンス化合物が、非電荷、リン含有内部サブユニット結合を有するモルホリノアンチセンス化合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出工程が、前記ヘテロ二重鎖に結合し得るが、遊離のアンチセンス薬剤には結合し得ない支持体結合捕捉剤に結合することにより、固体支持体に該ヘテロ二重鎖を捕捉する工程、およびこのように捕捉されたヘテロ二重鎖を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉剤が、（ａ）配列非依存的な様式で前記ヘテロ二重鎖に結合し得る抗体、（ｂ）配列依存的な様式で該ヘテロ二重鎖に結合し得る抗体、（ｃ）前記アンチセンス化合物に取り付けられた抗原に結合し得る抗体、（ｄ）該アンチセンス化合物に取り付けられたリガンド部分に結合し得る、非抗体抗リガンド分子、および（ｅ）塩基特異的な二本鎖結合オリゴマーからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記検出工程が、前記固体支持体および結合したヘテロ二重鎖を、（ａ）ヘテロ二重鎖に結合し得る標識抗体、（ｂ）前記アンチセンス化合物に取り付けられた抗原に結合し得る標識抗体、（ｃ）該アンチセンス化合物に取り付けられたリガンド部分に結合し得る非抗体抗リガンド分子、（ｄ）標識二本鎖結合オリゴマー、および（ｅ）標識カチオンポリマーからなる群より選択される検出試薬と接触させる工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記検出工程が、前記支持体に結合したヘテロ二重鎖を溶出する工程、および溶出したヘテロ二重鎖を検出する工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体に投与された治療剤に応答した標的遺伝子の発現における変化を検出するのに使用するための、請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標的ＲＮＡが該標的遺伝子の発現によって生成され、工程（ａ）〜（ｃ）は、該治療剤の投与前の選択された時点で実施され、そして前記検出工程は、このような投与の前後で検出されるヘテロ二重鎖のレベルを比較擦る工程を包含する、方法。
【請求項９】
所定の生化学的または病理的状態または素因の診断としてｍＲＮＡの存在またはレベルを検出するのに使用するための、請求項１に記載の方法であって、該状態または素因は、（ｉ）妊娠、（ｉｉ）心臓病、（ｉｉｉ）アルコール中毒、および（ｉｖ）癌からなる群より選択され、ここで、前記標的ｍＲＮＡは、（ｉ）ｈＣＧ、（ｉｉ）心臓病マーカー、（ｉｉｉ）アルコール中毒マーカー、および（ｉｖ）癌マーカーからなる群より選択されるタンパク質をコードする、方法。
【請求項１０】
所定の遺伝的疾患の診断として変異した遺伝子の存在を検出するのに使用するための、請求項１に記載の方法であって、前記標的ＲＮＡは該遺伝子により転写されたｍＲＮＡであり、種々の遺伝子的疾患についての既知の変異タンパク質およびアンチセンス化合物標的からなる群より選択される変異したタンパク質をコードする、方法。
【請求項１１】
前記アンチセンス化合物が、５０℃以上で、前記ｍＲＮＡの変異形態とのみ安定なヘテロ二重鎖を形成するように設計され、そして前記検出工程が、必要に応じて、前記サンプル中にて５０℃以上で加熱し、１つ以上の内部塩基ミスマッチを有するヘテロ二重鎖を変性させる工程を包含し得る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験体における感染性ウイルスまたは細菌薬剤の存在を検出するのに使用するための、請求項１に記載の方法であって、ここで、前記標的ＲＮＡは、ウイルス特異的または細菌特異的な配列を有する、それぞれ、一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡである、方法。
【請求項１３】
前記投与工程が、前記被験体の皮膚領域に前記アンチセンス薬剤を適用する工程を包含し、前記獲得工程が、該皮膚領域に接着テープを適用する工程を包含し、そして前記検出工程が、該接着テープ上のヘテロ二重鎖の存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
被験体における、複数の標的ＲＮＡが関与する塩基特異的細胞内結合現象の発生を検出する方法であって：
（ａ）該被験体に、（ｉ）該標的ＲＮＡの一部に相補的な標的化塩基配列を含む、８〜４０の塩基、（ｉｉ）相補的なＲＮＡ配列への結合に関して、約５０℃よりも高いＴｍ、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞により活発に取り込まれる能力、ならびに（ｉｖ）薬剤とハイブリダイズした相補的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨに対する付与された耐性、を各々有する複数の異なる配列のオリゴマーアンチセンス化合物を投与する工程；
（ｂ）該投与後の選択された時点にて、該被験体から体液のサンプルを獲得する工程、ならびに
（ｃ）該サンプルにおいて、ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在を検出する工程であって、各々が、アンチセンスオリゴマーと対応する標的ＲＮＡの相補的部分で構成される、工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記アンチセンス化合物が、実質的に非電荷骨格を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アンチセンス化合物が、非電荷、リン含有内部サブユニット結合を有するモルホリノアンチセンス化合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出工程が、前記ヘテロ二重鎖に結合し得るが、遊離のアンチセンス薬剤には結合し得ない支持体結合捕捉剤に結合することにより、固体支持体に該ヘテロ二重鎖を捕捉する工程、およびこのように捕捉されたヘテロ二重鎖を検出する工程を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記捕捉剤が、（ａ）配列非依存的な様式で前記ヘテロ二重鎖に結合し得る抗体、（ｂ）配列依存的な様式で該ヘテロ二重鎖に結合し得る抗体、（ｃ）前記アンチセンス化合物に取り付けられた抗原に結合し得る抗体、（ｄ）該アンチセンス化合物に取り付けられたリガンド部分に結合し得る、非抗体抗リガンド分子、および（ｅ）塩基特異的な二本鎖結合オリゴマーからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが複数の異なる配列のヘテロ二重鎖を含み、各々が異なる分子量および／または電荷を有し、そして該検出工程は、質量スペクトルまたは電気泳動によりヘテロ二重鎖の相違を同定する工程を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出工程が、異なる配列のヘテロ二重鎖の固体支持体への親和性結合によって前記サンプルからヘテロ二重鎖を部分的に精製する工程、および該固体支持体から該結合したヘテロ二重鎖を溶出する工程を包含し、該固体支持体は、ヘテロ二重鎖を結合するのに効果的であるが、アンチセンス化合物単独では結合しない支持体結合薬剤を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１つ以上の既知の疾患状態に関係する複数の異なる既知の変異遺伝子配列のうちの１つを検出するのに使用するための、請求項１４に記載の方法であって、前記標的ＲＮＡは該遺伝子により転写されたｍＲＮＡであり、種々の遺伝子的疾患についての既知の変異タンパク質およびアンチセンス化合物標的からなる群より選択される変異したタンパク質をコードする、方法。
【請求項２２】
複数の異なるウイルスまたは細菌の１つ以上の存在を検出するのに使用するための、請求項１４に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）〜（ｃ）は、（ｉ）比較的広いクラスおよび比較的狭いクラスのウイルスまたは細菌を表す、ウイルスまたは細菌に結合するのに効果的なアンチセンス薬剤の第１および第２のセットを用いて連続的に実施され、そして該第２セットのアンチセンス薬剤は該第１セットの薬剤を用いてヘテロ二重鎖を形成および検出するのに基づき選択される、方法。
【請求項２３】
前記投与工程が、前記被験体の皮膚領域に前記アンチセンス薬剤を適用する工程であって、接着パッドが該被験体の皮膚に接着により取り付けられるよう適合された下部接着層を含む工程、および皮膚領域のアレイを曝すよう適合された穴のアレイを規定する工程、ならびに該接着パッドが該被験体の皮膚に適用される場合、該被験体に対して経皮的に、除去可能なアンチセンス送達層が該下部層穴に対応する位置に異なる配列のアンチセンス薬剤を含み、そして該検出工程が、該送達層を除去する工程、該送達層を接着サンプル収集層と置き換える工程であって、それによって該穴に対応するアレイ領域での接着層においてサンプルを回収する、工程、および該サンプル回収層におけるこのようなアレイ領域にてヘテロ二重鎖の存在を検出する工程を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
被験体における、複数の標的ＲＮＡが関与する塩基特異的細胞内結合現象の発生を検出するのに使用するための診断アレイデバイスであって、該デバイスは以下：
複数の領域に分割された基板、および
（ｄ）各々のアレイ領域にて保有さる、特異的配列のＲＮＡオリゴマーおよび以下によって特徴付けられる相補的配列アンチセンスオリゴマーで構成される配列特異的なヘテロ二重鎖に結合し得る、配列特異的な結合薬剤：（ｉ）相補的なＲＮＡ配列への結合に関して、約５０℃よりも高いＴｍ、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞により活発に取り込まれる能力、ならびに（ｉｖ）薬剤とハイブリダイズした相補的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨに対する付与された耐性、を備え、ここで、各々の該結合薬剤は、（ａ）配列依存的な様式で該ヘテロ二重鎖に結合し得る抗体、（ｂ）前記アンチセンス化合物に取り付けられた抗原に結合し得る抗体、および（ｄ）塩基特異的な二本鎖結合オリゴマーからなる群より選択される、デバイス。
【請求項２５】
前記配列特異的な結合剤が、アンチセンス薬剤が実質的に非電荷の骨格を有するこのようなヘテロ二重鎖に配列特異的に結合し得る、請求項２４のアレイ。
【請求項２６】
被験体において、複数の標的ＲＮＡが関与する塩基特異的細胞内結合現象の発生を検出するのに使用するためのキットであって、該キットは、
請求項２４に記載のアレイデバイス、および
該アレイの１つ以上の領域に結合したこのようなヘテロ二重鎖種に結合し得る検出試薬、
を備える、キット。
【請求項２７】
前記検出試薬が、（ａ）ヘテロ二重鎖に結合し得る標識抗体、（ｂ）前記アンチセンス化合物に取り付けられた抗原に結合し得る標識抗体、（ｃ）該アンチセンス化合物に取り付けられたリガンド部分に結合し得る非抗体抗リガンド分子、（ｄ）標識二本鎖結合オリゴマー、および（ｅ）標識カチオンポリマーからなる群より選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記アレイデバイス中の前記配列特異的な結合剤が、アンチセンス薬剤が実質的に非電荷の骨格を有するこのようなヘテロ二重鎖に配列特異的に結合し得る、請求項２６に記載のキット。
【請求項２９】
ＲＮＡオリゴマーおよび以下によって特徴付けられる相補的配列アンチセンスオリゴマーで構成される配列特異的なヘテロ二重鎖に対する特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体：（ｉ）実質的に非電荷の骨格（ｉｉ）相補的なＲＮＡ配列への結合に関して、約５０℃よりも高いＴｍ、および（ｉｉｉ）哺乳動物細胞により活発に取り込まれる能力、ならびに（ｉｖ）薬剤とハイブリダイズした相補的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨに対する付与された耐性。
【請求項３０】
前記ヘテロ二重鎖についての結合親和性が、実質的にヘテロ二重鎖配列に非依存的である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
前記ヘテロ二重鎖についての結合親和性が、実質的にヘテロ二重鎖配列に依存的である、請求項２９に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、インビボでの標的ＲＮＡの存在を検出するための非侵襲的法、およびこの方法の実施において有用であるアレイ、キットおよび抗体に関する。
【０００２】
（参考文献）
Ｂｌｏｏｍｅｒｓ，Ｍ．、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２２（２０）：４１８７（１９９４）
Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：７７７（１９９４）。
【０００３】
Ｃｒｏｓｓ，Ｖ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３６：４０９６（１９９７）
Ｃｒｕｓｅ，Ｗ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９２：８９１（１９８６）。
【０００４】
Ｄａｇｌｅ，ら、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２８（１０）：２１５３（２０００）。
【０００５】
Ｄｉｎｇ，Ｄ．ら、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２４（２）：３５４（１９９６）。
【０００６】
Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．；Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｓ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｒ．Ｔ．（１９７４）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ、１６８４−１６８６。
【０００７】
Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．ら、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１９：４２７（１９９１）
Ｈｕｉｅ，Ｅ．Ｍ．；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｒ．；およびＴｒａｉｎｏｓ，Ｇ．Ｌ．（１９９２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：４５６９。
【０００８】
Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｓ．；ＭａｃＣｒｏｓｓ，Ｍ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｒ．Ｔ．（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３６５：３６５−３７７。
【０００９】
Ｋａｎｇ，Ｈ．；Ｃｈｏｕ，Ｐ．Ｊ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．；Ｗｅｌｌｅｒ，Ｄ．；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｂ；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３２：１３５１−６３。
【００１０】
Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２７０：３６３（２０００）。
【００１１】
Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：２３８５−２３８８
ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｅ．Ｂ．；Ｂａｎｄａｒｎ，Ｒ．；Ｈｕａｎｄ，Ｊ．；およびＷｉｄｌａｎｓｋｉ，Ｔ．Ｓ．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０７１。
【００１２】
Ｍｅｒｔｅｓ，Ｍ．Ｐ．およびＣｏａｔｅｓ，Ｅ．Ａ．（１９６９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：１５４−１５７。
【００１３】
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．，Ｔｓ’Ｏ，Ｐ．Ｏ．Ｐ．；Ｈｏｇｒｅｆｅ，Ｒ．Ｉ．；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｍ．Ａ．；およびＡｒｎｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．（１９９３）：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．（編）：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１８９。
【００１４】
Ｍｏｈａｎ，  Ｖ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５１：８６５５（１９９５）。
【００１５】
Ｎｅｉｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｅｎｇｈｏｌｍ，Ｍ．；Ｂｅｒｇ，Ｒ．Ｈ．；およびＢｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００
Ｏｌｇｉｖｅ，Ｋ．Ｋ．およびＣｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２６：４１５９−４１６２。
【００１６】
Ｐｉｏｔｔｏ，Ｍ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４７：２４４９（１９９１）
Ｒａｙ，Ａ．ら、ＦＡＳＥＢ  １４：１０４１（２０００）
Ｒｏｕｇｈｔｏｎ；Ａ．Ｌ．，Ｐｏｒｔｍａｎ，Ｓ．；Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．；およびＥｇｌｉ，Ｍ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：７２４９。
【００１７】
Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｈ．Ｗ．、「Ｐａｒｔ  ＩＶ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、第２３章、Ｃｅｃｉｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｊ．Ｃｌａｕｄｅ  ＢｅｎｅｔｔおよびＦ．Ｂｌｕｍ編）  第２０版。
【００１８】
Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６、ｐｐ．１３４−１６５
Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８５：２３１（２０００）。
【００１９】
Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．ら、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、１７（１５）：６１２９（１９８９）。
【００２０】
Ｖａｓｓｅｕｒ，Ｊ．Ｊ．；Ｄｅｂａｒｔ，Ｆ．；Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．；およびＣｏｏｋ，Ｐ．Ｄ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６。
【００２１】
（発明の背景）
種々の疾患状態の診断およびモニターは、この状態に関連するペプチド、タンパク質、抗体および／または核酸の分析により行われる。
【００２２】
近年、遺伝子および他のゲノム配列の分析は、遺伝病またはこのような疾患の素質を同定するための、あるいは特定の病理状態または細胞型に特徴的であるか、もしくは機能的遺伝子発現の調節を目的とした薬物へ応答した、遺伝子の発現レベルをモニターするための重要なツールになってきている。現在、この型の遺伝分析は、エキソビボで行われ、特定の配列変異の存在または非存在について、または遺伝子発現レベルの向上または抑制について、あるいはウイルス特異的配列かもしくは細菌特異的配列であるかについて、代表的には、個体から連続して血液サンプルを獲得し、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを分析することによって行われる。
【００２３】
診断デバイス（例えば変異または発現レベルの変化を検出するための遺伝子チップ）は、今日利用可能であり、新たな可能性を秘めている。個体における遺伝子発現に対する治療用化合物の効果をモニターするために、類似の方法が、使用され得る。すなわち、化合物の投与に続き、１つ以上の標的遺伝子の発現に対する化合物の効果を決定するために処置された患者から、組織生検または血液サンプルが、入手され得る。
【００２４】
これらのインビトロの方法による変異および遺伝子発現レベルの分析は、個体の遺伝子構造またはおよび薬剤応答についての重要な情報をもたらす可能性を有しているが、しばしばこの方法は実用的でなく、高価であり、そして／または所望の情報を提供できない。例えば、組織サンプルを提供する患者に対する困難性および危険性、ならびに分析のための組織サンプルの作製が高価であることの両方の理由によって、組織における遺伝子発現をモニターするための個体組織の生検は、通常実用的ではない。
【００２５】
従って、個体から組織もしくは細胞サンプルの入手もこのような細胞または組織から得られる核酸サンプルの単離および測定も、要求しない方法により、遺伝子変異を検出し、かつ遺伝子発現レベルまたは治療薬剤に応答する遺伝子の発現をモニターし得ることは、非常に望ましい。
【００２６】
提唱されてきた細胞におけるｍＲＮＡレベルを調節するための治療的アプローチの１つは、アンチセンス治療である。代表的には、このアプローチは、標的ｍＲＮＡの既知の配列領域（例えば、ｍＲＮＡ開始コドンまたはスプライス接合部位にわたる領域）に対しワトソン−クリック塩基対によって結合し得る核酸または核酸アナログを使用する。アンチセンス化合物が標的組織細胞を見つけて入り、そしてｍＲＮＡプロセシングまたは転写を不活性化し得る場合、アンチセンス化合物はｍＲＮＡの機能的発現産物の減少において有効であり、従って所望の治療上の効果を引き起こすはずである。
【００２７】
アンチセンス治療において、投与されるアンチセンス化合物が、細胞に取り込まれ、そして標的ｍＲＮＡ分子に結合する（従って不活性化すると推測される）ことを確認することは、さらに望ましい。
【００２８】
別の遺伝子配列分析の診断適用は、感染した被験者におけるウイルス性因子または細菌性因子を同定することである。分析は、最も有効な処置過程を決定する目的のために、抗生物質耐性遺伝子の発現レベルの状態の同定にすら及び得る。しかしながら、このような遺伝子配列分析は、代表的には困難な培養および／またはＰＣＲ技術のいずれかを必要とする。従って、簡便な、比較的迅速なアッセイ法によるウイルス性または細菌性（または真菌性）の感染薬剤の分析法の提供が、望まれる。
【００２９】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、被験体において一本鎖標的ＲＮＡが関与する塩基特異的細胞内結合事象の発生の検出法を含む。この方法を実施するにあたり、被験体に投与される、オリゴマーのアンチセンス化合物は（ｉ）標的ＲＮＡ部分に対し相補的な標的塩基配列を含む８〜４０塩基、（ｉｉ）相補的ＲＮＡ配列への結合に関し、約５０℃より大きいＴｍ、そして（ｉｉｉ）哺乳動物細胞によって積極的に取り込まれる能力、そして（ｉｖ）二本鎖形態のＲＮＡを切断できるＲＮａｓｅ（例えばＲｎａｓｅＨ）に対する因子とハイブダイズした相補的ｍＲＮＡ抵抗性の付与を備える。好ましくは、因子は、実質的に無電荷の骨格を有するか、細胞内への積極的な取り込み（例えば、エンドサイトーシスによって）のために適する複合体をつくる化合物（例えば、ポリカチオン）との複合体化である。化合物が投与された後の選択した時期において、その患者からの体液サンプルを得て、このサンプルをアンチセンスオリゴマーおよびＲＮＡ転写物の相補的部分で構成されるヌクレアーゼ抵抗性ヘテロ二重鎖の存在を検出するために分析する。
【００３０】
種々の好ましい実施形態において、アンチセンス化合物は、無電荷の、リン含有サブユニット間連結型（例えば、図５において示される化合物（Ａ）〜（Ｄ）によって例示される）のモルホリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）アンチセンス化合物である。
【００３１】
検出工程は、二重鎖と、支持体結合型捕捉薬剤（捕捉薬剤はヘテロ二重鎖と結合できるが遊離アンチセンス薬剤とは結合できない）との接触により固体の支持体上にヘテロ二重鎖を捕捉する工程、およびこのように捕獲したヘテロ二重鎖を検出する工程を包含する。好ましくは、捕捉薬剤は：（ａ）ヘテロ二重鎖に、配列非依存的な様式で結合可能な抗体、（ｂ）配列依存的な様式でヘテロ二重鎖に対し配列依存的な様式で結合可能な抗体、（ｃ）アンチセンス化合物に結合した抗体に結合可能な抗体、（ｄ）アンチセンス化合物に結合したリガンド部分に結合可能な非抗体性抗リガンド分子、および（ｅ）塩基特異的二重鎖結合オリゴマー、である。
【００３２】
１つの一般的な実施形態において、固体の支持体上のヘテロ二重鎖の存在は、標識された抗体のような標識された（検出可能な）ヘテロ二重鎖結合薬剤と接触させた状態で、支持体と結合したヘテロ二重鎖体を配置することにより検出される。別の一般的な実施形態において、支持体結合型ヘテロ二重鎖は、支持体から溶出され、そして遊離された形態において検出される（例えば、電気泳動または質量分析によって）。
【００３３】
被験体の治療薬に対する応答した標的遺伝子の発現の変化を検出の際の使用に関して、標的ＲＮＡは、標的遺伝子の発現により生成されるｍＲＮＡであり、本発明の工程は、治療薬の投与前の選択された時期に行われ、そして、このような投与の前後のヘテロ二重鎖のレベルが、比較される。
【００３４】
所定の生化学状態または病理状態例えば（ｉ）妊娠、（ｉｉ）心臓病、（ｉｉｉ）アルコール中毒、および（ｉｖ）癌、あるいはこのような状態の素因の診断に役立つ、ｍＲＮＡの存在の検出またはレベルの検出の使用に関して、標的ＲＮＡは、選択された状態の診断用のタンパク質をコードするｍＲＮＡである。
【００３５】
変異した、所定の遺伝病の診断に役立つ遺伝子の存在を検出する際の使用に関して、標的ＲＮＡは、遺伝子に基づいて転写されたｍＲＮＡであり、遺伝病の特徴の変異タンパク質をコードする。アンチセンス化合物は、５０℃を超えてもｍＲＮＡの変異された形態とのみ、安定なヘテロ二重鎖を形成するように設計され得、そして１つ以上の内在塩基の不適正塩基対を有するヘテロ二重鎖を変性するために、検出過程は、選ばれた温度（例えば、５０℃）より高くサンプル中のヘテロ二重鎖を加熱する工程を必要に応じて包含し得る。
【００３６】
被験体における感染性ウイルス因子または細菌性因子の存在を検出する際の使用に関して、標的ＲＮＡは、ウイルス特異的または細菌特異的配列をそれぞれ有する一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡである。
【００３７】
ひとつの実施形態において、アンチセンス薬剤は、被験体の皮膚の領域へこの薬剤を適用することによって投与され得、身体へのサンプルは、皮膚領域への接着テープの貼付によって獲得され、そしてサンプルにおけるヘテロ二重鎖の存在は、結合したヘテロ二重鎖の存在についてテープをアッセイすることにより検出される。
【００３８】
別の局面において、本発明は被験体における、標的ＲＮＡの多数が関与する塩基特異的細胞内結合事象の発生の検出方法を包含する。この方法は、配列の異なる多数のオリゴマーのアンチセンス化合物が、患者に投与され、そして検出工程が、形成され得る複数のヘテロ二重鎖種に対して適用される点において上記の方法と異なる。
【００３９】
ヘテロ二重鎖種が、固体の支持体上において検出される場合、支持体は、一連の領域のアレイを有し得、ここで各領域は、選択された配列のヘテロ二重鎖種に特異的に結合可能な配列特異的支持体結合型捕獲薬剤を含む。アレイにおける捕獲薬剤は、例えば、（ａ）ヘテロ二重鎖に対して配列依存性様式によって結合可能な抗体、（ｂ）アンチセンス化合物に結合した配列特異的な抗原に対し結合可能な抗体、または（ｃ）配列特異的二重鎖結合型オリゴマーであり得る。
【００４０】
ヘテロ二重鎖が、溶質または懸濁液形態として検出される場合、ヘテロ二重鎖種は、好ましくは、固定の支持体への結合によってはじめに単離され、そして支持体からの遊離させた後、異なる配列種を識別可能な方法（例えば、電気泳動または質量分析）によって検出し、ここで異なる配列のヘテロ二重鎖は、異なる分子量または電荷を有する。
【００４１】
１つ以上の既知の疾患状態に関連する多数の異なる既知の変異体遺伝子配列のうちの１つを検出する際の使用に関して、標的ＲＮＡは、遺伝子配列に基づくｍＲＮＡの転写物であり、そして選択された遺伝病に関連する変異タンパク質をコードする。
【００４２】
多数の異なるのウイルスまたは細菌のうちの１つ以上の存在を検出する際の使用に関して、本方法の中の工程は、ウイルスまたは細菌の比較的広範なクラスおよび比較的狭いクラスをそれぞれ代表する、ウイルスまたは細菌の配列に対する結合に有効であるアンチセンス薬剤の第１および第２のセットを引き続いて使用し、実行され得る。アンチセンス薬剤の第２のセットは、第１の薬剤のセットを使用して形成され、そして検出されるヘテロ二重鎖に基づいて選択される。
【００４３】
別の実施形態において、本発明に基づく皮膚のアッセイシステムを使用するアンチセンス薬剤は、接着性パッドを、被験体の皮膚へ貼付することによって投与され、この接着性パッドは被験体の皮膚に接着して貼付されるように適合された下部接着層を備え一連の皮膚領域の曝露に適する一連の孔を規定し、そして下部層の孔に相当する部位に一連の異なる配列のアンチセンス薬剤を含有する取り外し可能なアンチセンス送達層を規定する。検出工程は、送達層を剥がす工程、および送達層とサンプル収集層とを交換して、接着層上の、孔に対応するアレイ領域におけるサンプルを収集する工程を包含する。次いで、サンプルのアレイは、各アレイ領域のヘテロ二重鎖の存在についてアッセイされる。
【００４４】
被験体における、標的ＲＮＡの多数が関与する塩基特異的細胞内結合事象の発生の検出のための診断用アレイデバイスも、本発明の一部を形成する。アレイデバイスは、多数の領域に分かれる基材を含む。上記に記載された型の特異的配列ＲＮＡ／アンチセンスヘテロ二重鎖に結合可能な配列特異的結合剤が各アレイ領域に保持される。さらに、アレイデバイスおよびアレイの１つ以上の領域に結合したこのようなヘテロ二重鎖種に結合可能な検出試薬を含有するキットが、開示される。
【００４５】
さらに別の局面において、本発明は、上記に記載された型のオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖に対する特異的な結合親和性を有するモノクローナル抗体を含む。ヘテロ二重鎖に対する抗体の結合親和性は、実質的にヘテロ二重鎖配列から独立であってもよいし、ヘテロ二重鎖領域に特定の配列を必要としてもよい。
【００４６】
本発明のこれらのおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明が、添付図面と合わせて読まれた場合、より十分に理解される。
【００４７】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用される場合、他に指示がなければ、下記の用語は、以下の意味を有する：
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「アンチセンス薬剤」、「アンチセンス化合物」、および「アンチセンスオリゴマー」と交換可能的に使用され、そして、ヌクレオチド塩基配列およびサブユニット間の骨格の架橋を有するヌクレオチドアナログオリゴマーのことをいい、この骨格は、アンチセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対によってＲＮＡ中の標的配列にハイブリダイズして標的配列の範囲内でオリゴマー：ＲＮＡへテロ二重鎖を形成することを可能にする。これらのオリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補的またはほぼ正確な相補性を有し得る。これらのアンチセンスオリゴマーは、標的配列を含有するｍＲＮＡの翻訳を遮断もしくは阻害し得、またはｍＲＮＡプロセシング（例えば、スライス接合部（ｓｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）プロセシング）を遮断し得るか、または遺伝子の転写を遮断し得、ここでオリゴヌクレオチドは、二本鎖結合薬剤である。用語「化合物」、「薬剤（因子）」、「オリゴマー」および「オリゴヌクレオチド」は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して交換可能的に使用される。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「アンチセンスオリゴマー組成物」は、本発明のＲＮＡ検出法における使用のための１つ以上のアンチセンスオリゴマーを含有する組成物のことをいう。いくつかの場合において、このような「アンチセンスオリゴマー組成物」は、多数のアンチセンスオリゴマーを含有する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、「モルホリノリゴマー」とは、典型的なポリヌクレオチドに対し水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するアンチセンスオリゴマーのことをいい、ここで、ポリマー骨格部分は、ペントース糖類ではなくてモルホリノ基である。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「ＰＭＯ」は、以下でさらに記載されるように、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーのことをいい、ここで、このオリゴマーは、約８〜４０塩基長のポリヌクレオチドであり、好ましくは１２〜２５塩基長である。この本発明の好ましい局面は、図５中に図示され、ここでホスホロジアミデート架橋によって連結された２つのこのようなサブユニットを示す。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー分子（オリゴマー）とは、その骨格が、ホスホジエステル結合のヌクレアーゼ切断に対し感受性でないオリゴマーである。例示的なヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴマーは、メチルホスホネート、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチドのような、その全てが無電荷の骨格を有する、オリゴヌクレオチドアナログである。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、そのオリゴマーが、生理学的条件下で、３７℃よりも実質的に高い、好ましくは少なくとも５０℃、そして代表的には６０℃〜８０℃以上のＴｍで、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするならば、この標的に「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約１０℃、そして好ましくは約５℃低いように選択される、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に相当する。所定のイオン強度およびｐＨでは、このＴｍは、標的配列の５０％が、相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。
【００５３】
ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが、２本の一本鎖ポリヌクレオチドの間で逆平行配置に生じる場合、互いに「相補的」として記載される。二本鎖ポリヌクレオチドは、第一のポリヌクレオチドの一方の鎖と第二のポリヌクレオチドの一方の鎖との間でハイブリダイゼーションが生じ得る場合、別のポリヌクレオチドに対して「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが、別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般的に受け入れられた塩基対合規則に従って互いに水素結合を形成すると予測される、向かい合う鎖中の塩基の比率に関して定量され得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、第一配列は、その配列が第一配列であるポリヌクレオチドが、その配列が第二配列であるポリヌクレオチドに特異的に結合するならば、第二配列に関して「アンチセンス配列」である。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「標的ＲＮＡに関与する塩基特異的細胞内結合事象」とは、細胞内での相補的標的ＲＮＡ配列とのアンチセンスオリゴマーの特異的結合をいう。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖」とは、アンチセンスおよびＲＮＡの相補的領域の両方が、細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼによるインビボでの分解に耐性である、相補的標的へのアンチセンスオリゴマーの結合によって形成されるヘテロ二重鎖をいう。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「標的」とは、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ種（例えば、ウイルスゲノムＲＮＡ）に関して、１以上の種類の哺乳動物細胞において、発現されるかまたは一本鎖で存在する、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡをいう。優勢に発現される、とは、標的ｍＲＮＡが、ある細胞型において別の細胞型よりも高い程度で発現される遺伝子に由来することを意味する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、アンチセンスオリゴマーに関連して「有効量」とは、単回用量または一連の用量の一部のいずれかとして哺乳動物被験体に投与されるアンチセンスオリゴマー量であって、選択された標的配列の全てまたは一部に特異的にハイブリダイズして、その被験体の体液においてその後検出され得る、標的ＲＮＡとアンチセンスオリゴマーとの間でのヘテロ二重鎖を形成するに有効である量をいう。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「体液」は、被験体から得られた種々のサンプル型（尿、唾液、血漿、血液、脊髄液またはおよび生物学的起源の他のサンプル（例えば、皮膚細胞または皮膚屑）を含む）を包含し、そしてその中に懸濁された細胞もしくは細胞フラグメントまたは液体培地およびその溶質を含むことを指し得る。
【００６０】
用語「相対量」は、試験測定値とコントロール測定値との間で比較が行われる場合に用いられる。反応において複合体を形成する試薬の相対量は、コントロール標本と反応する量と比較した、試験標本と反応する量である。コントロール標本は、同じアッセイにおいて別々に実施され得るか、または同じサンプルの一部であり得る（例えば、組織切片における悪性領域の周囲の正常組織）。
【００６１】
「哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる能力」を有するアンチセンス因子は、細胞膜を横切って、受動拡散以外の機構によって細胞に侵入し得る因子である。この因子は、例えば、「能動輸送」（ＡＴＰ依存性輸送機構によって哺乳動物細胞膜を横切って因子を輸送することをいう）によって、または「促進輸送」（輸送タンパク質へのこの因子の結合を必要とし、次いでこの膜を横切っての、結合した因子の通過を促進する輸送機構による、細胞膜を横切ったアンチセンス因子の輸送をいう）によって、輸送され得る。能動輸送および促進輸送の両方に関して、このアンチセンス因子は、以下に定義されるように、実質的に荷電していない骨格を有する。あるいは、このアンチセンス化合物は、エンドサイトーシス機構によって細胞中に取り込まれ得る、複合体化形態（例えば、アニオン性骨格がカチオン性脂質またはリポソームと複合体化した因子）で処方され得る。
【００６２】
（ＩＩ．本発明の方法）
本発明は、特定のアンチセンス化合物が、哺乳動物被験体に投与された場合に、その後、尿（または他の体液）中にこのアンチセンスと標的ＲＮＡの相補的部分との二重鎖の形態で出現するという知見に基づく。この知見の基礎となる観察を、実施例１および２に説明する。
【００６３】
実施例１における研究は、アンチセンス因子（この場合、ＰＭＯ）が、相補的ＲＮＡ標的とハイブリダイズして、ゲル電気泳動において、おそらく二重鎖のより大きな質量／電荷比に起因して、会合した一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）よりもゆっくりと移動するヌクレアーゼ耐性二重鎖を形成することを示す。
【００６４】
また、実施例１において、アンチセンスオリゴマー因子（ＰＭＯ）を、哺乳動物にＩＰ注射し、そして２４時間後、尿サンプルを採取した。ＲＮアーゼ（例えば、３’−エキソヌクレアーゼおよび５−エキソヌクレアーゼ）でのサンプルの処理後、サンプル中の核酸を、ゲル電気泳動によって分析した。この結果は、オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖（実施例１において研究したとおり）の移動速度で移動するバンドの存在を示す。二重鎖のバンドの出現は、用量依存性である。
【００６５】
実施例２は、哺乳動物被験体（この場合、ラット）へのアンチセンス投与後のアンチセンス／ＲＮＡ二重鎖の出現の時間経過を調べる。血液サンプルを、ラットＰ４５０に対するアンチセンスの注射後０時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間および２４時間の時点で採取した。血液サンプル中の蛍光標識種の電気泳動移動時間および質量スペクトル分析は両方とも、オリゴマー：ＲＮＡ二重鎖と一貫している。
【００６６】
血液サンプル中の標識されたアンチセンス（白四角）およびオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖（黒丸）の測定レベルを、図２に示す。標識されたアンチセンスのレベルは、注射２時間以内に血流中で迅速に低下する。二重鎖は、注射後４〜８時間の間に血液中に出現し、そしてときどき８時間と２４時間との間でピークに達する。
【００６７】
（ＩＩＡ．二重鎖形成のモデル）
まとめると、図１に例示されるアンチセンス取り込みおよびプロセシングのモデルをこれらのデータは示し、そしてこれらのデータは、このモデルと一貫している。最初に、アンチセンス因子１２は、被験体１４に、例えば、経口投与、ＩＶ投与、ＩＭ投与、皮下投与または経皮投与によって投与される。この化合物によって、１６に示される血流への道が開かれ、そして血流から、細胞（例えば、細胞２０）が浸かっている細胞外腔１８へと分散する。この化合物は、好ましくは能動輸送または促進輸送によって、細胞へと取り込まれ、細胞では、この化合物は、標的ＲＮＡ２４の相補的領域とハイブリダイズして、オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖２６を形成する。二重鎖のうちの一本鎖（ハイブリダイズしていない）ＲＮＡ領域は、ＲＮａｓｅ分解感受性であり、そして細胞内でか、または細胞からの排出後に、酵素的に部分的または完全に切断されて、一本鎖突出部がほとんどないかまたは全くない、オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖２８を形成し得る。次いで、この二重鎖（「外来」種と認識される）は、細胞から周囲の細胞外腔へと排出され、そして細胞外腔から、血流に戻り、血流においてこの二重鎖は、例えば、尿中にクリアランスされ得る。
【００６８】
上記のデータは、この二重鎖の取り込みおよびこの二重鎖のその二重鎖形態へのプロセシングに必要な期間は、注射後８〜２４時間の期間で生じることを示す。
【００６９】
（ＩＩＢ．アンチセンス因子の選択）
上記のモデルは、以下の５つの小節において考慮される、本発明において用いられるアンチセンス化合物に４つの基本的必要条件を課す。
【００７０】
（Ｂ１．選択された標的配列）  アンチセンス化合物は、塩基配列において、選択されたＲＮＡ標的配列に対して標的化されなければならない。標的ＲＮＡ配列との相補性領域を有するアンチセンス化合物は、１０〜１２塩基程度に短くてもよいが、好ましくは１３〜２０塩基である。１５〜２０塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、哺乳動物ゲノムにおいて１つの相補的配列を有するに充分に長い。さらに、相補的塩基の最短の長さは、以下で考察されるように、必要な結合Ｔｍを達成するために必要とされ得る。４０塩基程度の長さのオリゴマーが適切であり得、ここで、少なくとも最少数の塩基（例えば、１０〜１５塩基）は、標的ＲＮＡ配列に対して相補的であるが、一般に、細胞における促進取り込みまたは能動取り込みは、約２０塩基未満のオリゴマー長で最適化される。
【００７１】
標的ＲＮＡ配列は一般に、以下の５つの異なるクラスの目的のＲＮＡのうちの１つの範囲に入る：（ｉ）治療アンチセンス（例えば、ｃ−ｍｙｃアンチセンスまたはｐ５３アンチセンス）によってその発現が阻害されるべきである、遺伝子；（ｉｉ）所定の生化学的状態（例えば、妊娠）、肝臓ＡＬＴまたは心臓関連病状についてのマーカーをその発現が示す、遺伝子；（ｉｉｉ）遺伝子疾患または遺伝子疾患に対する素因の特徴である、遺伝子変異；（ｉｖ）ヒトおよび他の哺乳動物（例えば、獣医学的動物）に感染し得るウイルスに対応する、ウイルスゲノム配列；ならびに（ｖ）ヒトまたは他の哺乳動物に感染し得る細菌（または真菌）に対応する、細菌（または真菌）ゲノム配列。これらの５つのクラスの各々についての標的ＲＮＡ配列は、以下の第Ｄ節において詳細に考慮される。
【００７２】
（Ｂ２．高Ｔｍ）  オリゴマー化合物は、標的配列と安定なハイブリッド二重鎖を形成しなければならない。アンチセンス化合物は、相補的配列ＲＮＡに関して、体温よりも高い（好ましくは５０℃よりも高い）結合Ｔｍを有する。６０〜８０℃以上の範囲のＴｍが好ましい。相補的配列ＲＮＡに関するアンチセンス化合物のＴｍは、従来法（例えば、Ｈａｍｅｓら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５，１０７−１０８頁によって記載される方法）によって測定され得る。周知の原理によれば、相補的塩基ＲＮＡハイブリッドに関するオリゴマー化合物のＴｍは、二重鎖中のＣ：Ｇ対合塩基の比が上昇すること、および／またはヘテロ二重鎖の（塩基対の）長さが長くなることによって上昇し得る。同時に、細胞輸送を最適にする目的のために、オリゴマーの大きさを制限することが有利であり得る。この理由に関して、１５〜２０塩基以下の間でハウ（ｈｏｗ）（５０℃以上）Ｔｍを示す化合物が、高いＴｍ値のために、２０個より多い塩基を必要とする化合物よりも好ましい。
【００７３】
（Ｂ３．細胞による能動取り込み）  適切な細胞内レベルを達成するために、アンチセンスオリゴマーは、細胞によって能動取り込みされて取り込まれなければならない。このことは、この化合物が、遊離（非複合体化）形態で投与される場合、促進輸送もしくは能動輸送によって取り込まれるか、または複合体化形態で投与される場合、エンドサイトーシス機構によって取り込まれることを意味する。
【００７４】
この因子が遊離形態で投与される場合、この因子は、実質的に非荷電であるべきである。このことは、そのサブユニット間結合の大部分が、生理学的ｐＨで非荷電であることを意味する。あるいは、オリゴマーは、２つの反対の電荷が、実質的に相殺される限り、負に荷電した骨格結合および正に荷電した骨格結合の両方を有し得、そして好ましくは、３〜５個よりも多くの一続きのサブユニットを含まず、いずれの電荷も含まない。例えば、オリゴマーは、所定の数のアニオン性結合（例えば、Ｎ３−Ｐ５ホスホロアミデート結合）および匹敵する数のカチオン性結合（例えば、Ｎ，Ｎ，ジエチレン−ジアミンホスホロアミデート）を有し得る（Ｄａｇｌｅ）。
【００７５】
好ましくは、電荷（または正味の電荷）の数は、５つのアブユニットあたり１個以下の電荷基である。本発明を支持して実施される実験は、少数（例えば、１〜２個）の電荷が、非荷電の骨格を有する特定のオリゴマーの細胞取り込みを実際に増強し得ることを示す。この電荷は、オリゴマー自体に（例えば、骨格に）保有され得るか、または末端の荷電基付属物に存在し得る。
【００７６】
非荷電であることに加えて、アンチセンス因子は、細胞膜を横切ったオリゴマーの輸送を促進し得るかまたは細胞膜を横切ってオリゴマーを能動輸送し得る、膜輸送体系（膜タンパク質）についての基質であるべきである。この字句（ｌｅｔｔｅｒ）の特徴は、オリゴマー相互作用または細胞取り込みについての多数の試験のうちの１つによって決定され得る。
【００７７】
第一の試験は、オリゴマー化合物が、細胞表面で、選択されたオリゴマー（例えば、ホスホロチオエートオリゴマー）を置換するかまたは選択されたオリゴマー（例えば、ホスホロチオエートオリゴマー）によって置換される能力を調べる。この試験のために、培養中の哺乳動物細胞または細菌細胞のいずれかが、細胞基質として用いられ得る。細胞は、約１０〜３００ｎＭの間の最終オリゴマー濃度で、所定量の試験因子（例えば、蛍光標識された試験因子）と共に最初にインキュベートされる。そのすぐ（例えば、１０〜３０分間）後（試験化合物の顕著なインターナリゼーションが生じ得る前）に、細胞レセプターに特異的に結合することが既知の第二のオリゴマー化合物（例えば、同じ配列のホスホロチオエートオリゴマー）（置換化合物）が、多数の漸増濃度の各々で添加される。試験化合物がこの細胞レセプターに特異的に結合する場合、その試験化合物は、置換化合物によって濃度依存性様式で置換される。置換化合物が、試験化合物濃度の１０倍以下（代表的には０．５倍〜２倍）の濃度で５０％置換を生じ得る場合、その置換化合物は、その細胞輸送系に関して同じ認識部位に適切な結合を有すると考えられる。
【００７８】
細胞輸送に関する第二の試験は、試験化合物が、標識されたレポーター（例えば、蛍光レポーター）を細胞内に輸送する能力を直接調べる。さらに、細胞基質は、細菌細胞基質または培養哺乳動物細胞基質であり得る。細胞は、好ましくは約１０〜３００ｎＭの間の最終濃度で添加された、標識された試験化合物の存在下でインキュベートされる。３０〜１２０分間のインキュベーション後、細胞は、例えば、顕微鏡法によって、細胞内レベルに関して調べられる。顕著な細胞内レベルの存在は、試験化合物が促進輸送または能動輸送によって輸送されることの証拠である。
【００７９】
第三の試験は、細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡに対する標的が観察される場合、特定のアンチセンス化合物が、細菌の増殖を有効に阻害する能力に頼る。本発明を支持して実施される研究は、この阻害が、細胞（この場合、細菌細胞）膜を横切る能動輸送または促進輸送を必要とすることを示す。その試験化合物は、標的１６Ｓ配列（例えば、細菌の増殖を阻害する際に有効であることが実証されている、Ｅ．ｃｏｌｉ  １６Ｓ  ｒＲＮＡに対する代表的配列である、配列番号１〜３）を用いて調製される。この化合物は、増殖中の細菌培養物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物）に漸増濃度で（代表的には１０ｎＭと１ｍＭとの間で）添加される。細菌の増殖を阻害する能力は、この試験化合物の添加後２４〜７２時間後に、細胞コロニー数（細胞数）から測定される。約１００〜５００ｎＭ以下の間の濃度で５０％阻害を生じ得る化合物は、哺乳動物細胞における能動輸送に関する良好な候補であると考えられる。
【００８０】
アンチセンス化合物が複合体形態で投与される、二番目の場合、この因子は、荷電した（例えば、アニオン性の）骨格を有し得、ここで、複合体化因子は代表的には、反対の電荷を有するポリマー（例えば、カチオン性脂質、ポリペプチドまたは非生物学的カチオン性ポリマー）である。アニオン性オリゴヌクレオチドとカチオン性脂質または他のポリマー成分との間で複合体（二重層複合体を含む）を形成する方法は周知であり、そして本発明に適用可能である（例えば、ＤＮＡ／カチオン性脂質、ポリマーに関する参考文献）。投与後、複合体は、エンドサイトーシス機構（代表的には、エンドソーム体中での粒子のカプセル化を含む）によって細胞によって取り込まれる。アンチセンス因子が細胞性ヌクレアーゼに耐える能力は、この因子の残存および細胞の細胞質への最終的な送達を促進する。
【００８１】
最後に、化合物が細胞によって取り込まれて、標的ＲＮＡと安定なヘテロ二重鎖を形成する能力は、インビボで直接試験され得る。ここで、既知の哺乳動物ｍＲＮＡ（例えば、Ｐ４５０コード配列）に対して標的化された、標識された試験オリゴマー化合物（例えば、蛍光標識化合物）が、動物（例えば、ラットまたはマウス）に注射される。化合物投与の８〜２４時間後、尿が、実施例１および２に示される手順に従って、二重鎖の存在に関してアッセイされる。ヘテロ二重鎖が検出された場合、この化合物は、この方法における使用に適切である。
【００８２】
（Ｂ４．ＲＮａｓｅに耐性のｍＲＮＡ）  アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の阻害を説明するために、２つの一般的機構が提唱されている（例えば、Ａｇｒａｗａｌら，１９９０；Ｂｏｎｈａｍら，１９９５；およびＢｏｕｄｖｉｌｌａｉｎら，１９９７を参照のこと）。第一に、オリゴヌクレオチドとｍＲＮＡとの間で形成されたヘテロ二重鎖は、ＲＮａｓｅ  Ｈについての基質であり、そのｍＲＮＡの切断をもたらす。このクラスに属する（または属すると提唱されている）オリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル（未改変の「天然の」オリゴヌクレオチド）が挙げられる。しかし、このような化合物は、オリゴマー：ＲＮＡ二重鎖構造中のｍＲＮＡをＲＮａｓｅ  Ｈによる加水分解に曝露し、それゆえ、二重鎖を喪失するので、これらは、本発明における使用のためには最適状態には及ばない。
【００８３】
第二のクラスのオリゴヌクレオチドアナログ（「立体ブロッカー」、あるいは「ＲＮａｓｅ  Ｈ不活性」または「ＲＮａｓｅ  Ｈ耐性」と称される）は、ＲＮａｓｅ  Ｈについての基質として作用することは観察されておらず、そして標的ＲＮＡの核細胞質輸送、スプライシングまたは翻訳を立体的にブロックすることによって作用する考えられる。このクラスは、メチルホスホネート（Ｔｏｕｌｍｅら，１９９６）、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’−Ｏ−アリル改変オリゴヌクレオチドまたは２’−Ｏ−アルキル改変オリゴヌクレオチド（Ｂｏｎｈａｍ，１９９５）、およびＮ３’Ｐ５’ホスホロアミデート（Ｇｅｅ，１９９８，Ｄｉｎｇ）を包含する。
【００８４】
試験オリゴマーは、Ｓｔｅｉｎらに記載されるように、試験化合物と一緒にオリゴマー：ＲＮＡ二重鎖を最初に形成させ、次いで、その二重鎖を標準的なアッセイ条件下でＲＮａｓｅ  Ｈと一緒にインキュベートすることによって、ＲＮａｓｅ  ＨからｍＲＮＡを保護する能力についてアッセイされ得る。ＲＮａｓｅ  Ｈへの曝露後、インタクトな二重鎖の存在または非存在は、実施例１および２に記載のように、ゲル電気泳動または質量スペクトル分析によってモニタリングされ得る。
【００８５】
（ＩＩＣ．非荷電のオリゴマー化合物）
オリゴヌクレオチドアナログにおける非イオン性結合の例を図３Ａ〜図３Ｈに示す。そしてこの例としては以下が挙げられる：カルボネート結合（３Ａ、Ｒ＝Ｏ）およびカルバメート結合（３Ａ、Ｒ＝ＮＨ２）（Ｍｅｒｔｅｓ，Ｇａｉｔ）；アルキルホスホネート結合（３Ｂ、Ｒ＝アルキルまたは−Ｏ−アルキル）（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊａｗｏｒｓｋａ）；アミド結合（３Ｃ）（Ｂｌｏｏｍｅｒｓ）；スルホン結合およびスルホンアミド結合（３Ｄ）（Ｒｏｕｇｈｔｅｎ，ＭｃＥｌｒｏｙ，Ｅｇｌｉ）；ならびにチオホルムアセチル結合（３Ｅ）（Ｃｒｏｓｓ）。後者は、ホスホロチオエートアンチセンス化合物に関して増強された二重鎖安定性および三重鎖安定性を有することが報告されている（Ｃｒｏｓｓ）。構造３Ｆの３’−メチレン−Ｎ−メチルヒドロキシアミノ化合物もまた報告されている（Ｍｏｈａｎ）。
【００８６】
Ｐａｎ（図３Ｇ）は、骨格が、デオキシリボース骨格と構造的にホモモルファスであるＤＮＡアナログであって、このＤＮＡアナログは、ピリジン塩基またはプリン塩基が結合しているＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる。天然のピリミジン塩基およびプリン塩基を含むＰＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合規則に従って相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、そして塩基対合認識に関してＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって形成される。これにより、これらの骨格は、アンチセンス適用に関して充分適切になる。この骨格は非荷電であり、通常よりも大きな熱安定性を示す、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖をもたらす。ＰＮＡは、ヌクレアーゼによってもプロテアーゼによっても認識されない。しかし、ＰＮＡアンチセンス因子は、細胞内への乏しい取り込み（輸送）におそらく起因して、細胞培養物においてゆっくりとした膜透過を提示することが観察されている（例えば、Ａｒｄｈａｍｍａｒ  Ｍら，１９９９を参照のこと）。
【００８７】
以下で詳述する、１つの好ましいオリゴマー構造は、（例えば、３Ｈにおけるホスホロジアミデート化合物によって例示される）非荷電のモルホリノオリゴマーである。モルホリノオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、共有に係る米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号および同第５，５０６，３３７号（これらの全ては、本明細書中に参考として明示的に援用される）に詳述される。
【００８８】
本発明における適切さに関してオリゴマーを試験する際に、上記で詳述した特性の各々が満たされるべきである（「実質的に非荷電」の特徴が、本質的に満たされることが認識され、ここで、結合は非荷電であり、そして標的配列の相補性は、塩基配列の設計によって達成される）。従って、化合物は、以下に関して試験されるべきである：（ｉ）二重鎖長（好ましくは１２〜２０塩基対の間）での標的ＲＮＡに関するＴｍ、（ｉｉ）能動輸送または促進輸送によって、細胞膜を横切って輸送される能力、および（ｉｉｉ）二重鎖形態での、ＲＮａｓｅ  ＨによるＲＮＡのタンパク質分解を防止する能力。
【００８９】
（Ｃ１．例示的なモルホリノ化合物）  本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドについての例示的な骨格構造は、各々非電荷のリンを含有するサブユニット結合によって結合される、図４Ａ〜４Ｅに示されるβ−モルホリノサブユニット型を含む。図４中のサブユニットＡは、図５中にＡで示される５原子の反復単位骨格を形成するリン含有結合を有し、ここで、モルホリノ環は、１原子のホスホアミド結合によって結合される。
【００９０】
図４中のサブユニットＢは、図５にＢで示されるように、６原子の反復単位骨格のために設計される。構造Ｂにおいて、５’モルホリノ炭素をリン基に結合する原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素または、好ましくは、酸素であり得る。リンからぶら下がるＸ部分は、環構造を含む、以下：フッ素；アルキルもしくは置換アルキル；アルコキシもしくは置換アルコキシ；チオアルコキシもしくは置換チオアルコキシ；または無置換窒素、一置換窒素、もしくは二置換窒素のいずれかであり得る。
【００９１】
図４中のサブユニットＣ〜Ｅは、図５中のＣ〜Ｄ／Ｅについて示されるように、７原子の単位長の骨格のために設計される。構造Ｃにおいて、Ｘ部分は、構造Ｂ中と同様であり、そして部分Ｙは、メチレン、硫黄、または好ましくは、酸素であり得る。構造Ｄにおいて、Ｘ部分およびＹ部分は、構造Ｂ中と同様である。構造Ｅにおいて、Ｘは構造Ｂ中と同様であり、そしてＹはＯ、Ｓ、またはＮＲである。図３Ａ〜Ｅに示される全てのサブユニットにおいて、ＺはＯまたはＳであり、そしてＰｉまたはＰｊは、アデニン、シトシン、グアニンまたはウラシルである。
【００９２】
１つの好ましい「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは、図５Ｂに示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成され、ここで、（ｉ）この構造は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に連結する、１〜３原子長の結合を含むホスホロジアミデートによって一緒に結合され、（ｉｉ）ＰｉおよびＰｊは、塩基特異的な水素結合によってポリヌクレオチド中の塩基に結合するに効果的なプリンまたはピリミジンの塩基対部分であり、そしてＸ＝ＮＨ２、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏである。
【００９３】
モルホリノベースのサブユニットの重要な化学的特性は、安定で非電荷の骨格結合によってポリマーの形態で結合される能力、相補的塩基の標的核酸（高いＴｍを有する標的ＲＮＡを含む）と（１０〜１４塩基ほどに短いオリゴマーとでさえ）ハイブリダイズするように形成されるポリマーの能力、哺乳動物細胞中に能動的に輸送されるオリゴマーの能力、ＲＮＡｓｅ分解に耐えるオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の能力である。
【００９４】
（Ｃ２．オリゴマーの合成および改変）  本発明のアンチセンス化合物は、上記で引用される参考文献中に詳述される方法を使用して、段階的な固相合成によって合成され得る。サブユニット付加物の配列は、以下の選択された塩基配列（Ｄ節（ｓｅｃｔｉｏｎ）を参照のこと）によって決定される。
【００９５】
いくつかの場合において、化合物の薬物動態を増大させるため、または化合物を含むヘテロ二重鎖の捕捉もしくは検出を容易にするために、さらなる化学的部分をオリゴマー化合物に加えることが所望され得る。この部分は、典型的に、標準的な合成方法に従って、オリゴマーの５’末端または３’末端に共有結合される。
【００９６】
例えば、ポリエチレングリコール部分または他の親水性ポリマー（例えば、１０〜１００個のポリマーサブユニットを有する親水性ポリマー）の付加は、オリゴマー化合物の可溶性を増強させる際に有用であり得る。
【００９７】
１つ以上の荷電した基（例えば、有機酸のようにアニオン性に荷電した基）は、細胞の取り込みを増大させ得る。
【００９８】
レポーター部分（例えば、フルオレセインまたは放射標識された基）は、体サンプルにおけるヘテロ二重鎖の存在を検出するために結合され得る。あるいは、オリゴマーに結合されるレポーター標識は、標識化した抗体またはストレプトアビジンに結合し得るリガンド（例えば、抗原またはビオチン）であり得る。
【００９９】
最終的に、オリゴマーは、抗原に特異的な抗体と特異的に捕捉され得る配列を含むヘテロ二重鎖を介して、配列に関連した抗原（例えば、２−４ジニトロフェノールおよび関連抗原）とともに提供され得る。
【０１００】
オリゴマーアンチセンスの結合または改変のための部分を選択する際に、生体適合性であり、そして好ましくない副作用もなく被験体によって許容にされるような化合物の群を選択することが一般的に当然所望される。
【０１０１】
（ＩＩＤ．アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する標的）
この節は、先に言及した５つのクラスの標的ＲＮＡを考察し、そして標的配列が選択され得る例示的な配列を提供する。原則として、以下に詳細に言及される配列のような、目的の遺伝子または微生物についての配列は、公共の遺伝子データベース（例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＧｅｎＢａｎｋ））に見出され得る。
【０１０２】
標的配列が、所定のＲＮＡ（例えば、プロセスされたｍＲＮＡまたはウイルスのゲノム）のうちの任意の配列であり得る場合、標的配列の選択は、一般的に、（配列の独自性を最適化するために）少なくとも１２〜１５塩基長であり、そのサイズの範囲内で、より高いＴｍ値のためにＣ：Ｇ塩基対に富む配列を選択することによって作製される。ＡＵＧ開始部位もしくはスプライシング連結部位のように、ｍＲＮＡのプロセシングまたは翻訳に重要である標的配列を選択することは、一般的に、重要でないかまたは所望もされない。なぜなら、次いで、投与されるアンチセンスは、細胞の代謝の潜在的に破壊的な効果を有するからである。しかし、治療的なアンチセンス処置法の一部として、この方法が実施され得、ここで、投与されるアンチセンス因子は、ＲＮＡのプロセシングまたは翻訳を妨害するように設計され、そして同一の因子が、標的ＲＮＡへのアンチセンス送達をモニターまたは確認するために、本発明に従って使用され得る。
【０１０３】
ここで、アンチセンス因子が一塩基対変異を有するＲＮＡに結合するように設計される場合、野生型配列から変異配列を区別するための３つのストラテジーのうちの１つが続き得る。１番目は、ヘテロ二重鎖中の一塩基ミスマッチでヘテロ二重鎖ＲＮＡを切断するような細胞内ＲＮＡｓｅの可能性に基づく。例えば、アンチセンス化合物が１２〜１４塩基長であり、そして変異された塩基に対して相補的な塩基を中央部にて含む場合、（野生型配列で生じるが、変異配列では生じない）ヘテロ二重鎖のＲＮＡｓｅ切断は、ヘテロ二重鎖を変性させるために効果的である。従って、ヘテロ二重鎖は、変異を含有する標的配列が存在する場合にのみ検出される。
【０１０４】
第２のストラテジーにおいて、アンチセンス化合物は、変異部位の塩基に対する塩基の相補性に加えて、変異部位の近傍（例えば、変異塩基の部位から２〜５塩基）に誤対合の塩基を含む。例えば、１４マーの因子において、塩基部位の変異は、位置６であり得、そして誤対合は、位置１１であり得る。この化合物は、生理学的な温度で単一塩基の誤対合を可能にするヘテロ二重鎖を形成するが（変異した標的配列）、２つの誤対合を含む配列とともに安定なヘテロ二重鎖を形成し得ない（野生型標的配列）ように設計される。たとえヘテロ二重鎖中の誤対合した塩基がＲＮＡｓｅ切断の部位になるとしても、このヘテロ二重鎖は、ヘテロ二重鎖内の８つ以上の連続する塩基対形成の観点から、なお安定である。
【０１０５】
第３のストラテジーは、２つのアンチセンス因子（変異した標的に相補的であり、そして１つのレポーター（例えば、第１の蛍光レポーター）を保有する配列を有する因子、および類似の野生型標的配列に相補的であり、そして識別可能な第２のレポーター（例えば、第２の蛍光レポーター）を保有する配列を有する第２の因子）の間の標的結合に対する競合に基づく。変異した配列を発現する細胞において、第２の因子で形成されたヘテロ二重鎖に対する第１の因子で形成されたヘテロ二重鎖の比率は高く、そして対応して、野生型配列のみが発現される場合は低い。
【０１０６】
（Ｄ１．発現が治療的アンチセンスによって阻害されるべきである遺伝子）  多くの遺伝子が、アンチセンス治療のための潜在的な治療的標的である。一般に、アンチセンス治療の原理は、遺伝子転写物（ｍＲＮＡ）のプロセシングまたは翻訳を破壊させることであり、従って、標的遺伝子の発現を阻害することである。アンチセンス治療のための標的として提案されている多くの遺伝子は、以下である（対応するＧｅｎＢａｎｋ配列番号にと共に）：メチオニンアミノペプチダーゼ２（ＮＭ＿００６８３８）；インターロイキン−５（Ｊ０３４７８）；Ｃ−ｍｙｃ（Ｘ００３６４）；Ｃ−ｍｙｂ（Ｍ１５０２４）；ＰＩ３キナーゼｐ１１０（Ｓ６７３３４）；細胞斑接着キナーゼ（Ｌ１３６１６）；テロメア反復結合因子１（ＮＭ＿０１７４８９）；ＰＤＫ−１（Ｌ４２４５０）；細胞間接着分子−１（Ｘ８４７３７）；Ｇ−α−Ｓ１（Ｘ０４４０９）；ＳＲＡ（ＡＦ０９２０３８）；Ｇ−α−１６（Ｍ６３９０４）；ＰＩ３キナーゼｐ８５（ＡＣ００７１９２）；ＭＥＫ１（Ｌ１１２８４）；ＲＡＦ（Ｘ０３４８４）；チミジル酸シンターゼ（Ｄ００５９６）；アポトーシスの１７．Ｘ−結合インヒビター（Ｕ４５８８０）；ＴＮＦ−α（Ｍ１６４４１）；ＭＥＫＫ５（ＡＬ０２４５０８）；サルビビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（Ｕ７５２８５）；ＭＤＭＸ（ＡＦ００７１１１）；肝臓グリコゲンホスホリラーゼ（ＡＦ０４６７８７）；ＳＭＡＤ５（ＡＦ０１０６０２）；ＳＭＡＤ２（ＡＦ０２７９６４）；ＰＥＰＣＫ−ミトコンドリアル（ＮＭ＿００４５６３）；ＲｈｏＣ（Ｌ２５０８１）；ＰＴＥＮ（ＡＨ００７８０３）；ＲＩＰ−１（Ｕ５５７６６）；ＦＡＤＤ（ＮＭ＿００３８２４）；ＳＭＡＤ３（ＳＥＧ＿ＡＢ００４９２２Ｓ）；ＥＧＲ−１（ＡＪ２４３４２５）；ＴＮＦＲ１（ＡＨ００３０１６）；ｍｃｌ−１（ＡＦ１１８１２４）；微小管結合タンパク質４（ＮＭ＿００２３７５）；セントリン（ｓｅｎｔｒｉｎ）（Ｕ８３１１７）；インターロイキン−１５（Ｕ１４４０７）；Ｂ−ＲＡＦ（Ｍ９５７１２）；インテグリンα４（Ｌ１２００２）；ｈｅｒ−２（ＡＦ１７７７６１）；ＲｈｏＧ（ＮＭ＿００１６６５５）；ＲｈｏＢ（Ｘ０６８２０）；ＭＥＫ２（Ｌ１１２８５）；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ（Ｘ９７８６７）；ＥＬＫ−１（Ｙ１１４３２）；ＲｈｏＡ（Ｌ２５０８０）；ｂｃｌ−ｘｌ（Ｚ２３１１５）；Ａｔｍ（ＳＥＧ＿Ｄ８３２４４Ｓ）；ＤＩＲ１（ＡＦ１３９３７４）；Ｂｃｌ−２（Ｕ１６８１２）；ｍｄｒ１（ＡＦ０１６５３５）；ｐｏｌｏ様キナーゼ１（Ｘ７３４５８）；プロテインキナーゼＣ−α（ＮＭ＿００２７３７）；ＴＧＦ−α（Ｍ３１１７２）；テロメアーゼ（ＡＦ０４７３８６）；アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）（Ｍ３０７０４）；ＴＮＦ−α（Ｘ０２９１０、Ｘ０２１５９）；ＩＧＦ−１（Ａ２９１１７）；ＴＧＦ−β（Ｍ６０３１６）；ＴＲ３オーファンレセプター（Ｌ１３７４０）；トポイソメラーゼＩＩ（Ｊ０４０８８）；ｂｃｒ／ａｂｌ（ＡＪ１３１４６７  部分）；ウロキナーゼ（Ｅ００１７８）；コネキシン４３（Ｕ６４５７３）；ｐ５３（ＡＨ００２９１８）；塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｊ０４５１３）；ｃ−ｋｉｔ癌原遺伝子���Ｌ０４１４３）；ＥＴＳ−２（Ｊ０４１０２）；ＮＦ−κ−Ｂ  ｐ６５（Ｌ１９０６７）。
【０１０７】
（Ｄ２．発現が所定の生化学的状態を示す遺伝子）  特定の条件、または特定の条件に対する素因は、正常細胞内で発現されないＲＮＡまたはＲＮＡの翻訳産物（すなわち、ペプチドもしくはタンパク質）の変更された発現によって特徴付けられる。典型的に、遺伝子産物（すなわち、タンパク質）は、患者の血液中で検出され、そして特定の条件または特定の条件に対する傾向を診断するために使用される。特に、（ｉ）種々の癌に対する素因、（ｉｉ）癌患者における予後または処置の応答、（ｉｉｉ）アルコール依存症に対する素因、（ｉｖ）心臓疾患に対する素因、（ｖ）肝臓の病理学、および（ｖｉ）神経学的な病理学（例えば、アルツハイマー病）の診断指標である、遺伝子タンパク質が同定されている。以下は、対応するＧｅｎＢａｎｋ配列番号と共に、これらの６つのクラスの各々において同定された遺伝子の部分的な一覧である。
【０１０８】
（Ｄ２（ｉ）．種々の癌に対する素因）  ５．ｆｅｓ（ＮＭ＿００２００５）；ｆｏｓ（Ｋ００６５０）；ｍｙｃ；ｍｙｂ；ｆｍｓ（Ｕ６３９６３）；複数の薬剤耐性に関連するタンパク質（ＭＲＰ）（Ｌ０５６２８）；肺耐性タンパク質（ＬＲＰ）；ｐ５３遺伝子（ＡＨ００７６６７）；網膜芽細胞腫遺伝子（Ｌ１１９１０）；ウィルムス腫瘍遺伝子（Ｍ６４２４１）；およびヒトミスマッチ修復遺伝子ｈＭＳＨ２（ＡＨ００３２３５）。
【０１０９】
（Ｄ２（ｉｉ）癌患者における予後または処置の応答）  プロガストリン放出ペプチド（ＡＨ００２７１３）；ＳＣＣ抗原（ＳＣＣ−Ａｇ）（Ｓ６６８９６）；ＵＰＡ（Ｘ０２４１９）；ＰＡＩ−１（ＡＨ００２９２２）；ＨＥＲ−２（ＡＦ１７７７６１）；脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｍ３２９７７）；インシュリン様増殖因子Ｉ（Ｍ３７４８４、Ｍ２９６４４）；ＩＦＧ結合タンパク質３（Ｍ３５８７８）；ｂｃｌ−２（Ｕ１６８１２）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子（ＡＨ００２８２３）；サイトケラチン２０（Ｘ７３５０１）；性ホルモン結合グロブリン（Ｍ３１６５１）；ＩＬ−２レセプター（Ｅ００７２７）；α−フェトプロテイン（ＮＭ＿００１１３４）；インターフェロン誘導性ＭｘＡタンパク質（ＮＭ＿００２４６２）；ＴＮＦ−ｂ（Ｄ１２６１４）；脂肪酸シンターゼ（ＯＡ−５１９）（ＮＭ＿００４１０４）；テトラネクチン（ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ）（Ｘ９８１２１）；Ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＡＨ００１４５５）；Ｐ−糖タンパク質（Ｍ１４７５８）；癌胎児抗原（Ｍ１７３０３）；クロモグラニンＡ（ＡＨ００５１９６）；ハプトグロビン関連タンパク質（Ｈｐｒ）（ＮＭ＿０２０９９５）；妊娠関連血漿タンパク質Ａ（ＮＭ＿００２５８１）；アルカリホスファターゼ（Ｊ０４９４８）。
【０１１０】
（Ｄ２（ｉｉｉ）アルコール依存症に対する素因）  γ−グルタミルトランスフェラーゼ（Ｊ０４１３１）；γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（Ｊ０４１３１）；Ｄ２ドパミンレセプター（Ｍ２９０６６）；ＣＹＰ１Ａ１（ＮＭ＿０００４９９）；α−１−抗トリプシンＰＩ（Ｋ０１３９６、Ｍ１１４６５）；ハプトグロビンＨＰ（Ｍ６９１９７）；アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（Ｘ７６３４２）；アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）（ＡＨ００２５９８）；
（Ｄ２（ｉｖ）心臓疾患に対する素因）  リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（Ｕ２４５７７）；アドレノメデュリン（ＮＭ＿００１１２４）；Ｃ−反応性タンパク質（Ｍ１１８８０）。
【０１１１】
（Ｄ２（ｖ）肝臓の病理学）  α−Ｌ−フコシダーゼ（ＡＨ００２７０２）；ガストリン（ＡＨ００５３０１）。
【０１１２】
（Ｄ２（ｖｉ）神経学的な病理学（例えば、アルツハイマー病））  プレセニリン２（Ｄ８４１４９  部分）；アセチルコリンエステラーゼ（Ｍ５５０４０）；β２−ミクログロブリン（ＡＦ０７２０９７）；アポリポタンパク質Ｅ（Ｋ００３９６）。
【０１１３】
（Ｄ３．遺伝的変異）  遺伝的疾患に関連した多くの遺伝的変異、または遺伝的疾患に対する素因が、同定された。例えば、本明細書中に参考として援用される、先に引用されるＳｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｈ．Ｗ．を参照のこと。例えば、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒの参考文献の表２３−３は、常染色体優性、常染色体劣性、およびＸ−結合によって分類される最も一般的な遺伝的障害を列挙し；表２４−３は、形質膜タンパク質における変異によって引き起こされる疾患を列挙し；表２４−４は、ヒトグルコーストランスポーター中の種々の同定された変異によって引き起こされる障害を列挙し；そして表２４−５は、ヒトインスリンレセプター遺伝子における多くの変異を列挙する。当業者は、広範に入手可能なこれらおよび他の参考文献から、ＧｅｎＢａｎｋの配列供給源を含む、多くの遺伝的障害に関連する特定の変異を容易に決定し得、そして野生型配列と単一変異配列との間を区別するための上記で概説した原理に従って、変異した配列を標的化するためのオリゴマーを容易に設計し得る。
【０１１４】
（Ｄ４．ウイルスの遺伝的配列）
本発明の方法は、多くの微生物のいずれかによる被験体の感染、およびこのような感染に関する治療的介入の効果のモニタリングにおけるさらなる有用性を見出す。さらに詳細には、特定のウイルス、細菌または菌類での感染が、診断され得、そして本発明の方法を使用して、このような感染に関連するＲＮＡまたはＤＮＡの発現を評価することによって、治療が、モニタリングされ得る。多くの感染性微生物に関連する特徴的な核酸配列は、公共のデータベースにおいて入手可能であり、そして本発明の方法における使用についての特定のアンチセンスオリゴマーの設計のための基礎として働き得る。
【０１１５】
例えば、典型的なウイルス感染（例えば、ＣＭＶのような潜伏性ウイルスの発現によって引き起こされるウイルス感染）は、免疫蛍光アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および／または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する、感染した組織または血液の分析によってモニタリングされる。広範なクラスのウイルス（例えば、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、およびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）におけるウイルスの存在が、決定され得る。これらのクラスのうちの特定のウイルスの存在（例えば、Ｔ細胞白血病関連ウイルス（ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）２、肉腫ウイルスおよび白血病ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、単純疱疹１型および単純疱疹２型、エプスタイン−バーウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ならびに麻疹ウイルス）が、さらに決定され得る。標的ウイルスの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋから入手され得る。
【０１１６】
より詳細には、感染された被験体においてのウイルス感染性因子の同定における使用のための一般的な実施形態は、第１のオリゴマー組成物および第２のオリゴマー組成物を含む。第１の組成物は、ウイルスの広範な科および／または属（例えば、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、およびＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）を標的化するオリゴマーを含む。この組成物におけるオリゴマーは、標準的なＧｅｎＢａｎｋウイルス配列から決定され得、ここで、所望される配列は、（ｉ）広範なウイルスの科／属に特異的であり、そして（ｉｉ）ヒトにおいて見出されない、ウイルス配列である。第２の組成物は、特定の属および／または種および／または広範な科／属の中の系統に対して相補的なオリゴマーを含む。第１の組成物で試験された広範なウイルスの科／属の各々について、いくつかの異なる第２のオリゴマー組成物が、要求される。第２の組成物について、配列は、（ｉ）試験された個々の科／種／系統に特異的であり、そして（ｉｉ）ヒトにおいて見出されない、配列である。
【０１１７】
（Ｄ５．細菌および菌類の配列）
本発明の方法は、さらに、細菌または菌類の感染性因子を検出すること、および処置において有用な情報（例えば、感染性細菌が薬物耐性であるか否か、そしてもし薬物耐性であれば、薬物耐性遺伝子の型）を入手するために適用可能である。
【０１１８】
好ましい実施形態において、この方法は、感染性のウイルス因子を検出するために使用されるオリゴマー組成物に類似した、２つのオリゴマーの組成物を利用する。第１の組成物は、広範な科および／または属の細菌または菌類の生物（例えば、以下に示される細菌の科）に標的化される複数のオリゴマー配列を含む。標的化される各々の広範な細菌の科／属について、オリゴマー組成物は、（ｉ）広範な細菌の科／属に特異的であり、そして（ｉｉ）ヒトにおいて見出されない、細菌の配列に対して標的化されるオリゴマーを含む。広範な科−特異的配列または属−特異的配列は公知であり、例えば、有用な標的を代表する細菌性１６Ｓ  ｒＲＮＡおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡについて、例えば、２０００年１１月２９日に出願された「Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」についての共同所有される米国特許出願（これは、本明細書中に参考として援用される）において詳述される。
【０１１９】
第１の組成物における各オリゴマーについて、第２のオリゴマーは、広範な科／属の群における特定の属／種／または系統に対して指向される複数のオリゴマーを提供する。いくつかの共通な病原性細菌種およびそれらに関連するＧｅｎＢａｎｋ配列は、以下の通りである：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｘ８０７２５）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｕ８８５４５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＦ１７０３５８）；Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ（ＡＦ１１８０２１）；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ（Ｘ０７７１４）；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｙ１５８５６）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｘ５２９１７）；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（Ｍ８８１５７）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＦ００３９３０）；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌａｄｉｕｍ（ＡＪ０１０９５１）；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（Ｄ８５７２２）；Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ（Ｘ８９２０８）；Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ｍ３５０１９）；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒａｅ（Ｘ９６９６６）。
【０１２０】
別の有用な標的は、細菌性の薬物耐性遺伝子に対して指向される配列であり、処置する臨床医が、感染する生物を同定すること、および感染する生物の薬物耐性のプロフィールに基づいて、処置に対して最も好ましい抗生物質を選択することを可能にする。
【０１２１】
（ＩＩＩ．発明を実施する形態）
本発明の方法を実施する際に、アンチセンスの化合物もしくは代替物、または複数の異なる配列のアンチセンス化合物を含有する組成物は、被験体（例えば、ヒト被験者）に投与される。方法の目的が１つ以上の遺伝的変異の存在を検出することである場合、化合物または組成物は、任意の都合のよい時間に１度のみ投与され得る。
【０１２２】
方法の目的が、所定の条件または治療的処置に応答して選択された遺伝子の上方制御または下方制御を検出することである場合、化合物または組成物は、条件または処置の前および／または後の選択された時間で与えられる。例えば、所定の遺伝子を上方制御するための薬物の効果をモニタリングするために、遺伝子のｍＲＮＡに標的化される化合物は、ｍＲＮＡの「制御」レベルを確立するための薬物の投与の前、次いで、薬物投与後に選択された間隔（例えば、４〜２４時間）で再度投与され、薬物に応答するｍＲＮＡレベルを決定する。
【０１２３】
被験体に対するアンチセンス化合物または組成物（複数のアンチセンス化合物）の投与に続いて、化合物は、図１に示されるモデルにおいて概略されるように被験体内での体内の分布を可能にされる。投与に続く１つ以上の選択された時間間隔で、体液サンプルが採取され、そしてサンプル中の１つ以上のヘテロ二重鎖種の存在および／または量は、決定／測定される。サンプリング時間は、典型的に、投与後、４〜２４時間、好ましくは、８〜１６時間の範囲内であるが、一連のサンプル（例えば、投与後２４時間までの間の４〜８時間毎）が、適切であり得る。
【０１２４】
次いで、体サンプルは、サンプル中のヘテロ二重鎖もしくは異なるヘテロ二重鎖の存在および／または量を決定するためにアッセイされる。引き続く小節（ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ）は、この方法を実施するための詳細な方法およびデバイスを考察する。
【０１２５】
（ＩＩＩＡ．アンチセンスオリゴマーの投与）
オリゴマー化合物の効率的な送達は、当業者に公知の多数の方法のうちの任意の方法により達成され得る。このような方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：経口送達、種々の全身経路（非経口経路、例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射および動脈内注射）ならびに吸入および経皮送達。ある場合において、特定の組織または部位への直接投与による標的化された送達が好ましい。標的部位に薬物を送達するか、または薬物を血流に導入するに有効な任意の方法もまた意図されることは、理解される。
【０１２６】
アンチセンスオリゴマーを標的化することはまた、特定の組織または位置への直接注入（すなわち、腫瘍への直接注入）により達成され得、これにより、腫瘍と関連する特定のＲＮＡ配列（すなわち、腫瘍抑制遺伝子または発癌遺伝子）の発現評価を容易にする。あるいは、このアンチセンスオリゴマーは、このオリゴマーを特定の組織型または細胞型に標的化するように働く分子と結合体化され得る（例えば、抗体／オリゴマー結合体）。
【０１２７】
アンチセンスオリゴマーの経皮送達は、例えば、局所的投与のために適合された薬学的に受容可能なキャリアの使用により達成され得る。以下にさらに詳細に議論されるように、１つの送達ビヒクルとしては、水性媒体中に５０〜９０％のエチレングリコールの溶液、および１ｃｍ２の面積に０．０５〜０．３ｍｇの間の量のアンチセンス化合物を含む。
【０１２８】
経口投与の好ましい用量は、（約７０ｋｇの体重に基づいて）約１ｍｇオリゴマー／患者〜約２５ｍｇオリゴマー／患者までである。いくつかの場合において、２５ｍｇオリゴマー／患者を上回る用量が必要であり得る。ＩＶ投与については、好ましい用量は、（７０ｋｇの成人体重に基づいて）約０．５ｍｇオリゴマー／患者〜約１０ｍｇのオリゴマー／患者２５ｍｇオリゴマー／患者までの範囲である。
【０１２９】
アンチセンス化合物は、概して、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーのピーク血液濃度を生じるに有効な量および様式で投与される。体液（例えば、尿）中のヘテロ二重鎖の存在が、代表的には、投与の３〜２４時間後にモニターされ、好ましくは、投与の約６〜２４時間後にモニターされる。
【０１３０】
（ＩＩＩＢ．サンプル収集および処理）
アンチセンス投与後の選択された時間にて、サンプル中のヘテロ二重鎖種の存在を検出するか、そして／またはこの標本のレベルを測定するために体液を収集する。上記のように、体液サンプルは、尿、唾液、血漿、血液、髄液、または生物起源の他の液体サンプルであり得、この体液サンプル中に懸濁されている細胞、細胞断片、または液体媒体およびその溶質を含み得る。収集されたサンプルの量は、代表的には、０．１〜１０ｍｌ範囲にある。好ましくは、約１ｍｌ以下である。サンプルが皮膚領域（以下を参照のこと）から得られる場合、サンプル「容積」は、代表的には、約１〜２５ｍｍ２の間の面積を有する皮膚領域から、接着剤により剥がされる皮膚の量である。
【０１３１】
サンプルは、サンプル中の所望でない成分を除去するために処理され得るか、そして／またはヘテロ二重鎖種を処理するために処理されて、所望でないｓｓＲＮＡオーバーハング領域を除去し得る。実施例１は、ヘテロ二重鎖における任意の１本鎖ＲＮＡオーバーハングを除去するためにＲＮａｓｅを用いたサンプル処理を記載する。当然、これは、オーバーハングを除去するために特に重要であり、ここで、ヘテロ二重鎖検出は、サイズ分離（例えば、電気泳動または質量分析）に依存する。
【０１３２】
種々の方法が、所望でない成分を除去するために利用可能である。例えば、ヘテロ二重鎖は、正味の負の電荷を有するので、電気泳動技術またはイオン交換技術を用いて、中性または正に荷電した材料からヘテロ二重鎖を分離し得る。より特定の技術（これは、図８に関して以下にさらに記載される）は、サンプルと、ヘテロ二重鎖に特異的に結合し得る、表面に結合した抗体または他の薬剤を有する固体支持体とを接触させることである。この支持体を洗浄して結合していない物質を除去した後、ヘテロ二重鎖は、以下に記載のように、さらなる分析（例えば、電気泳動または質量分析）のために実質的に生成された形態で遊離される。
【０１３３】
あるいは、検出工程／測定工程は、ヘテロ二重鎖またはそのアンチセンス成分と特異的に反応し得る、表面に結合した抗体または他の薬剤を有する固体支持体上で行われ得る（図６および７を参照して、以下に説明される）。この実施形態において、サンプルは、ヘテロ二重鎖結合条件下で、固体支持体と接触した状態にされる。支持体を洗浄して、結合していない物質を除去した後、この支持体は、固体支持体に結合したヘテロ二重鎖に結合するように設計されたレセプター試薬とさらに反応される。このアプローチは、図９および１０を参照して以下に詳述されるように、多くの異なる配列のヘテロ二重鎖種を検出するためのアレイ形式において特に有利である。
【０１３４】
（ＩＩＩＣ．ヘテロ二重鎖の検出）
存在するヘテロ二重鎖は、身体サンプル（例えば、尿、唾液、血液、毛髪、または皮膚細胞のサンプル）であり、固相または流体相のアッセイ法によりアッセイされ得る。一般に、固相反応は、まずヘテロ二重鎖分析物を固相支持体（例えば、粒子またはポリマーまたは試験ストリップ基材）に結合させる工程、およびこの支持体に結合したヘテロ二重鎖の存在／量を検出する工程を包含する。流体相アッセイにおいては、この分析物サンプルは、代表的には、妨害するサンプル成分を除去するために予め処理され、次いで、溶液または気体懸濁形態（例えば、質量分析）において分析される。
【０１３５】
（Ｃ１．固相形式）
図６Ａ〜６Ｅは、固相形式について本発明において有用な種々のヘテロ二重鎖結合剤を例示する。図６Ａは、基剤または支持体３４および表面に結合したヘテロ二重鎖結合剤３６を有するデバイス３２を示す。この実施形態において、結合剤は、抗体であり、この抗体の結合親和性は、標的ＲＮＡおよび既知のオリゴマーから形成されたヘテロ二重鎖に特異的であるが、ヘテロ二重鎖塩基配列に関して非特異的である。
【０１３６】
抗体（本発明の１つの局面を形成する）は、標準的な方法（例えば、実施例３に概説される）により形成される。簡潔には、選択したオリゴマー薬剤（例えば、３’トリエチレングリコールテイルを有するＰＭＯ）が、適切なキャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に、標準的なリンカー化学物質によりこの薬剤の一端または両端にカップリングされる。オリゴマー−キャリアＫＬＨ結合体は、相補的ＲＮＡにハイブリダイズし、次いで、マウスに注射され、続いて追加免疫され、マウスから採血され、ＰＭＯに対する強い抗体力価が存在するか否かが決定される。ハイブリドーマ細胞株は、標準的なハイブリドーマ技術に従って、免疫した動物由来の脾細胞を不死化することにより生成される。
【０１３７】
次いで、種々のハイブリドーマ細胞株由来のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、抗原に対する特異性について試験される。実施例３において同定された抗体の中には、（ｉ）ヘテロ二量体に対して特異的であるが、ヘテロ二重鎖塩基配列に関して非特異的であるもの、（ｉｉ）ヘテロ二重鎖およびヘテロ二重鎖配列両方に対して特異的であるもの、および（ｉｉｉ）ヘテロ二量体のトリエチレングリコールテイルに対して特異的であるもの、が存在した。実施例３に提供される方法が、任意の選択されたオリゴマー化合物と形成されたヘテロ二量体にどのように適用され得るかは、理解される。
【０１３８】
上記のように形成された抗体は、周知のタンパク質結合方法（例えば、二価カップリング剤を使用して、エステル結合、アミド結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合または他の結合を介した基材反応基への共有結合カップリング）により基材表面に結合される。米国特許第５，５１６，６３５号および同第５，８３７，５５１号は、固体支持体への抗体カップリングを開示する代表的な技術である。
【０１３９】
図６Ｂは、基材４２および選択されたヘテロ二量体に配列特異的に結合し得る表面に結合した結合剤４４を有する固相デバイス４０の同様の型を示す。すなわち、この抗体は、特定の二重鎖塩基配列を有する、特定のオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二量体構造に対してのみ高い親和性結合を示す。このような抗体を生成する方法（この抗体は、本発明の局面を形成する）は、上記および実施例３で議論される。
【０１４０】
図６Ｃ、デバイス４８は、基材５０および表面に結合した抗体（例えば、抗体５２）を有し、この抗体は、オリゴマー化合物にカップリングした抗原５４に対する高親和性結合を示す。この抗原は、例えば、アミノ酸またはオリゴペプチド、または低分子量抗原（例えば、ジニトロフェノールまたはオリゴエチレングリコール（ｏｌｉｏｇｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ））であり得る。抗原は、従来のカップリング方法を用いて、ヘテロ二重鎖のオリゴマー部分の一端（たとえば、３’末端）に結合される。抗原に対する抗体は、抗原単独に対して（例えば、ＫＬＨにカップリグさせて）形成されてもよいし、オリゴマー化合物と組み合わせた抗原に対して形成されてもよい。以下の実施例３は、誘導体化ＰＭＯ薬剤のトリエチレングリコール部分に対するＭａｂの生成を開示する。この抗体は、上記の従来の方法により基材表面にカップリングされる。
【０１４１】
図６Ｄにおけるデバイス５８は、ヘテロ二量体６６のオリゴマー薬剤に結合したリガンドが、ビオチン基６４であり、基材６０に結合した抗リガンド結合剤６２が、アビジンであることを除いて、同様である。この実施形態において、オリゴマー化合物は、公知の方法に従って、１以上のビオチン化塩基を用いて合成され、アビジンは、これも周知の方法により基材表面に結合される。
【０１４２】
図６Ｅのデバイス６８は、ヘテロ二重鎖と塩基特異的三重らせんを形成することにより、ＲＮＡオリゴマーヘテロ二重鎖と配列特異的様式で結合するように設計された、表面に結合したヘテロマー結合剤７２を有する基材７０を有する。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの二重鎖と三重鎖らせん構造を形成し得るオリゴマーは、例えば、米国特許第５，８４４，１１０号に詳述され、これは、二本鎖のワトソン−クリックＤＮＡ構造において鎖間のプリン−ピリミジン塩基対と特異的に水素結合し得る、キノリンベースの構造またはキノゾリンベースの構造を有するヌクレオチドアナログオリゴマーを開示する。この特許に開示されたオリゴマー構造は、ホスホジエステル結合したリボースまたはデオキシリボースの骨格構造を有するが、荷電したリボースベースの骨格の絶対的な必要性はない。なぜなら、このポリマー骨格は、二重鎖中の主溝部位に結合し得る位置に改変塩基を配置するように機能するに過ぎないからである。従って、二重鎖構造の塩基から塩基までの間隔に対応する所望の間隔で改変塩基を有し得る任意の通常のポリマー骨格が適切であるはずである。
【０１４３】
二重鎖核酸と安定な塩基特異的三重鎖構造を形成し得る別の二重鎖結合剤は、共有に係る米国特許第５，４０５，９３８号および同第５，１６６，３１５号において開示され、これらの米国特許はともに、非荷電５員環骨格または非荷電６員環骨格（例えば、非荷電リボースまたはモルホリノ）を有するポリマー組成物および標的二重鎖構造において異なって配向した塩基対と特異的に水素結合で結合するように設計された改変塩基を開示する。
【０１４４】
二重鎖結合オリゴマーは、従来の表面結合化学物質（例えば、上記のもの）により固体支持体に結合される。表面結合オリゴマーが固相においてサブユニット付加によって調製される場合、粒子が調製される固相は、デバイス基材または支持体自体であり得る。
【０１４５】
検出アッセイを実施するにおいて、溶液中のサンプルを、支持体表面に接触した状態で配置し、分析物を結合剤分子に結合させる条件下で反応させる。代表的には、結合反応は、特定のリガンド−抗リガンド結合反応に依存して、生理学的ｐＨ、２４〜３７℃の間の温度、５〜３０分の反応時間にて行われる。反応期間の最後に、基材は、緩衝液および／または温和な界面活性剤を用いて１回以上洗浄されて、非特異的に結合したサンプル物質が除去され得る。
【０１４６】
図７Ａ〜７Ｃは、ヘテロ二重鎖が固相形式で検出され得る種々の方法を例示する。ここに示される代表的なデバイスは、図６Ｂにおけるデバイス４０であり、結合剤４２として、ヘテロ二重鎖配列とは独立したヘテロ二重鎖に特異的に結合する抗体を有する。図７Ａに示される実施形態において、検出薬剤は、レポーター基８２（例えば、蛍光部分、金粒子、発色団、または他の検出可能なレポーター基）を有する、上記のヘテロ二重鎖に対して特異的な抗体８０である。抗体／レポーター結合体を形成する方法は、周知である。
【０１４７】
図７Ｂは、類似の抗体検出薬剤８４を例示するが、ここで、この抗体は、図６Ｃに関して上記で議論したように、ヘテロ二重鎖におけるオリゴマー化合物上に保持される抗原８６に対して免疫特異的である。
【０１４８】
図７Ｃに例示される検出形式において、ヘテロ二重鎖におけるオリゴマーは、図６Ｄに関して上記で記載されるように、１以上のビオチン化塩基（８８で示される）を含み、検出薬剤９０は、レポーター基９２に結合体化されたアビジンを含む。
【０１４９】
他の検出薬剤が支持体に結合したヘテロ二重鎖を検出する際の使用に適切であることが、理解される。例えば、図６Ｃおよび６Ｄに示される実施形態において、ヘテロ二重鎖は、３’末端リガンドまたは５’末端リガンドを介して固体支持体に結合され、結合剤は、上記の型のレポーター標識三重鎖オリゴマー、またはヘテロ二重鎖の荷電したＲＮＡ骨格との電荷相互作用によってそのヘテロ二重鎖に結合し得るレポーター標識カチオンポリマー（例えば、ポリエチルアミン）であり得る。
【０１５０】
上記の検出薬剤は、直接結合アッセイのために設計され、ここでヘテロ二重鎖は、任意の競合ヘテロ二重鎖種の非存在下で固体支持体に最初に反応される。本発明はまた、競合アッセイを意図し、このアッセイにおいて、既知の量／濃度のレポーター標識ヘテロ二重鎖の存在下で固体支持体とサンプルを反応させ、ここで固体支持体に結合する標識二重鎖の量は、このアッセイサンプル中に含まれるヘテロ二重鎖の量に反比例し得る。標識ヘテロ二重鎖は、ヘテロ二重鎖のオリゴマーまたはＲＮＡ鎖のいずれかを標識することにより調製され得る。
【０１５１】
競合アッセイ形式は、試験ストリップとして、競合する標識ヘテロ二重鎖をサンプルの流路中に含むように従来どおりに設計され得、その結果、試験ストリップを介するサンプル流は、サンプルおよび標識ヘテロ二重鎖を、ストリップ上のヘテロ二重鎖結合領域に同時に結合させるに有効である。本発明の方法は、リガンド／抗リガンド相互作用に関する種々の他の公知の固相２工程アッセイまたは均質アッセイに適合され得ることが理解される。
【０１５２】
結合したレポーターの存在および／または量は、従来の方法により測定／決定され得、この方法は、目視検査または機械リーダー（例えば、標準的な比色または蛍光のカードリーダー、スライドリーダーまたはアレイリーダー）による定量的検出を含み得る。
【０１５３】
選択されたオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を検出する際に使用するためのデバイスおよび検出試薬は、本発明の別の局面に従って、キットを形成し、このキットはまた、適切な送達形態にあるオリゴマー化合物を含み得る。例えば、自宅妊娠検査キットは、本発明のこの局面に従って、経口送達のための錠剤形態で、ｈＣＧ特異的配列（例えば、上記の配列）を有するＰＭＯオリゴマーおよびそのストリップ中に含まれる遊離（移動可能）標識抗ヘテロ二重鎖抗体を有する固相試験ストリップ、従来のサンドイッチアッセイのためのストリップ上に結合剤検出領域を含み得る。
【０１５４】
妊娠を自己検査するにおいて、ユーザーは、オリゴマー含有錠剤（ｔａｂｌｅ）を摂取し、選択された時間後（例えば、投与の１２〜２４時間後）に、尿サンプルを収集する。ｈＣＧ配列へテロ二重鎖の予告の存在を検出するために、試験ストリップを、尿サンプル中に浸し、尿サンプルをストリップの長さに沿って移動させ、ヘテロ二重鎖分析物が（ｉ）遊離標識抗ヘテロ二重鎖抗体に首尾よく結合して、検出可能レポーターでヘテロ二重鎖を標識する、および（ｉｉ）固定化された抗ヘテロ二重鎖抗体に首尾よく結合して、サンプル検出領域で標識分析物を結合する。このアッセイ読み出し（標的ｈＣＧの存在を示す）は、単純に、ストリップ上の検出部位の検出可能レポーターの存在である。
【０１５５】
種々の他の試験キット（上記に示されるものに対応するオリゴマー配列を組み込み、種々の公知のアッセイ形式のいずれかを有する）もまた、例えば、点変異または病理学的状態（これは、所定の遺伝子産物の存在もしくは非存在もしくはレベルにより特徴付けられる）により特徴付けられる１以上の遺伝的変異の存在を検出するために、または所定のウイルス感染因子、細菌感染因子、もしくは真菌感染因子を検出および同定するために、本明細書中で意図される。
【０１５６】
（Ｃ２．流体相検出）
流体相形式は、広義には、液体媒体、均質アッセイのための単純な溶液中、分離媒体中（例えば、ゲル電気泳動もしくは液体クロマトグラフィー分離媒体、または質量分析における気体キャリア相）のヘテロ二重鎖の検出を包含する。概して、アッセイされるサンプルは、妨害物質を除去するために予め処理されている。
【０１５７】
サンプルを予め処理するための１つの一般的方法は、図８Ａに例示され、この図は、表面に結合剤９６（例えば、ヘテロ二重鎖特異的抗体）が結合した固体支持体９４を示す。最初に、ヘテロ二重鎖分析物を含む液体サンプルを、分析物結合条件下で固体支持体と反応させ、次いで、洗浄して、非特異的に結合したサンプル物質を除去する。この後に、例えば、従来の方法によりヘテロ二重鎖を固体支持体から遊離させ、例えば、電気泳動もしくは質量分析によるヘテロ二重鎖分析のための溶液キャリアまたは気体キャリアへと溶出させる。以下に認められるように、これらの方法は、複数の異なる配列ヘテロ二重鎖分析物を含むサンプル混合物中でのヘテロ二重鎖分析物の同定に特によく適合している。
【０１５８】
（ＩＶ．多重分析物サンプル法）
多くの場合、複数の異なるＲＮＡ標的をアッセイすることは望ましいことであるか、または必要なことである。例えば、遺伝的疾患について個体を試験する際に、異なる遺伝的疾患のための一連の試験が、特に胎児遺伝子スクリーニングにおいてしばしば行われる。同様に、遺伝子分析により感染因子について試験する際に、一般に、多数の候補生物についての配列プローブを含めることが必要である。
【０１５９】
１つの一般的実施形態において、遺伝子スクリーニングにおける使用のために、本発明は、複数のオリゴマー化合物を含む組成物を包含し、このオリゴマー化合物の配列は、複数の既知の遺伝子変異（例えば、上記で同定された遺伝子変異）の各々に標的化される。この組成物が妊婦に投与され、胎児変異の遺伝子スクリーニングのために使用される場合、この化合物の配列は、胎児遺伝子スクリーニングにより通常試験される遺伝子異常（例えば、ダウン症候群）に対して標的化される。
【０１６０】
第２の実施形態において、本発明の組成物は、複数のオリゴマー化合物を含み、このオリゴマー化合物の配列は、発癌遺伝子または抑制遺伝子における変異（例えば、上記第ＩＩ節に列挙される変異）に対して標的化され、この変異は、癌または癌に対する素因と関連する。
【０１６１】
別の実施形態において、この組成物は、複数のオリゴマーを含み、このオリゴマーの配列は、種々の遺伝子に対して標的化され、これらの遺伝子は、上記の２以上の病理状態（例えば、糖尿病、肝臓疾患、心臓疾患、および神経学的障害）またはこの病理状態に対する素因を示す。
【０１６２】
なお別の実施形態において、所定の感染したウイルス因子、細菌因子または真菌因子を検出および同定する際に使用するために、この組成物は、オリゴマーを含み、このオリゴマーの配列は、微生物の群またはクラスに対して標的化される。例えば、未知のウイルス生物による感染を検出するために、患者は、広いファミリーのウイルス病原体に対する配列を含む最初の組成物を与えられ得る。ウイルスファミリーの最初の検出および同定の後に、第１の同定されたファミリー内の特定のウイルス種またはウイルス系統の同定のための、より特定の群の第２のオリゴマーが患者に投与される。同様に、細菌病原体の検出のために、第１の組成物が、細菌の科または属を同定するために設計され得、第２のさらなる組成物が、第１の科内の特定の種または系統を検出するために設計され得る。
【０１６３】
関連実施形態において、細菌感染を有する患者のための最適な処置方法を同定するために、この組成物はオリゴマーを含み、このオリゴマーの配列は、特定の型の薬物耐性と関連する既知の変異に対して標的化されて、細菌病原体だけでなく、感染を処置するに最も有効であると思われる抗生物質の型もまた同定される。
【０１６４】
本発明の重要な局面に従って、標的ＲＮＡ配列の非侵襲的検出について上記に記載されたアッセイ方法およびキットは、複数の異なる標的配列が検出および／または定量されるアッセイ形式に容易に適合可能である。多重分析物の分析のための方法およびキットは、概して、以下の差異を除いて、上記に従う。
【０１６５】
１．被験体に投与されるオリゴマー物質は、上記のように、複数の（すなわち、２以上の）異なるオリゴマー化合物（複数の異なる配列に対して標的化される）を含む。これらの異なる配列は、組成物、例えば、経口錠剤または注射可能な溶液（複数のオリゴマー化合物を含む）として、またはアレイとして、以下の第ＩＶＣ節において詳述されるように、経皮送達のために投与され得る。
【０１６６】
２．ヘテロ二重鎖検出は、サンプル中に形成され、そして存在する個々の異なる配列ヘテロ二重鎖を同定するためのツールまたは方法が必要である。以下の第ＩＶＡ節において詳述される一般的流体相アッセイ形式において、異なる配列へテロ二重鎖は、異なる物理的分離特性に基づいて検出され、ヘテロ二重鎖が、例えば電気泳動易動度、質量分析特性、またはクロマトグラフィー特性に基づいて区別され得る。実施例ＩＶＢにおいて詳述される一般的固相アッセイ形式において、サンプル材料は、配列特異的二重鎖結合剤のアレイと反応され、その結果、各異なる配列分析物が、アレイの既知の配列領域に結合する。皮膚アッセイにおいて使用するための改変された固相アレイ形式は、節ＩＶＣに詳述される。
【０１６７】
（ＩＶＡ．流体相複数分析物様式）
この一般的なアプローチにおいて、図８Ａに関する前の記載のように、一つ以上の異なる配列のヘテロ二重鎖を含むサンプルを、まず前処理し、干渉するサンプル成分を除去する。ヘテロ二重鎖の識別が大きさに基づく場合、前に議論されたように、サンプルを処理してｓｓＲＮＡの突出を除去することもまた、重要である。
【０１６８】
図８Ａに示した分析物は、図においてＨ１、Ｈ２、およびＨｎと示される複数の異なる配列のヘテロ二重鎖を含む。最初の固相捕捉の目的によって非結合物質の除去が可能になるので、固相支持体上に使用される結合因子は、ヘテロ二重鎖に特異的でなければならず、ヘテロ二重鎖配列に特異的であってはならない。好ましくは、結合因子もまた、遊離オリゴマー化合物とほとんど結合を示さないか、または全く結合を示さないかのいずれかである。
【０１６９】
固相支持体を洗浄し、非特異的に結合する物質を除去した後、インタクトなヘテロ二重鎖または変性した一本鎖オリゴマーのいずれかとして（後者のアプローチは、変性剤の添加または加熱によって達成される）、ヘテロ二重鎖を溶出する。次いで、溶出されたヘテロ二重鎖（または、対応するオリゴマー化合物）は、図８Ｂに示すように、収集され、溶出した分析物の分離によって、ヘテロ二重鎖の同定のために調製される。
【０１７０】
１つの方法において、図８Ｂに例示するように、溶出された分析物を、例えば、米国特許第５，７７０，８５９号、第５，９９４，６９６号、第５，７７０，８５８号、および第５，８２７，６５９号に記載された方法および装置に従って、質量スペクトルフラグメント分析を基にした配列解析のために調製する。図８Ｃは、異なる配列のオリゴマーの仮想質量スペクトル解析を示し、ここで異なるピークは、異なる配列のオリゴマーまたはオリゴマーフラグメントに対応し、サンプル中の特定のオリゴマー化合物配列の同定に使用され得る。
【０１７１】
もう一つの一般的な実施形態において、異なる配列のヘテロ二重鎖またはオリゴマー化合物は、図８Ｄに例示されるように、ゲル電気泳動によって解析される。図８Ｄは、５個の異なる配列のヘテロ二重鎖（例えば、１０２、１０４に示されるヘテロ二重鎖）を含むサンプルを用いて得られた仮想的な電気泳動パターン１００を示す。電気泳動の分離の基礎は、大きさおよび／または電荷の配列特異的な違いであり得る。例えば、異なる塩基数、または異なる荷電結合の数、または荷電ポリマーの「テイル」もしくは非荷電のポリマーの「テイル」の異なった大きさ、またはポリマーのテイル中の異なる電荷数を有するオリゴマー化合物（各々の化合物は、所定のオリゴマー塩基配列と関連する）は、被験体に投与する組成物中で使用され得る。
【０１７２】
分離したバンドの検出および／または同定は、数多くの標準的な方法の一つによってなされ得る。この標準的な方法は、着色または蛍光核酸インターカレート剤を用いた視覚化、溶出および微小配列決定、または溶出および質量スペクトル分析を含む。
【０１７３】
（ＩＶＢ．固相複数分析物の検出）
図９は、本発明に従った、異なる配列のヘテロ二重鎖、またはオリゴマー化合物を検出および同定するために使用されるアレイデバイス１１０の一部を示す。このデバイスは、領域１１２、１１４のようなアレイ領域またはアッセイ領域を含む。各々の領域は、その領域で基盤表面に結合した配列特異的結合因子（ＢＡＸＹ）を有する。サンプルへテロ二重鎖への特異的な結合に対して、結合因子は、図６Ｂ、６Ｃ，および６Ｅに関連して前に記載された、それぞれ、配列特異的な抗ヘテロ二重鎖抗体、抗原特異的抗体、または配列特異的二重鎖結合因子であり得る。
【０１７４】
固相アレイ法の利点は、サンプルのクリーンアップおよび前処理を避け得ることである。それは、アレイの領域に結合する分析物が、ヘテロ二重鎖およびヘテロ二重鎖配列両方に特異的であるからである。結合条件で、アレイをサンプルに曝した後、アレイ表面を洗浄し、非特異的結合物質を除去し、次いで、結合したヘテロ二重鎖の存在について、例えば、図７Ａ〜図７Ｃに関連して記載された方法によって、アッセイする。
【０１７５】
従って、一つの局面において、本発明は、多数の領域（または粒子）を有するアレイデバイスを含む。各々の領域は、異なる配列のオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を結合可能な異なる結合因子を有する。アレイデバイスを含むキットおよびデバイスに結合したヘテロ二重鎖の存在を検出するための検出因子もまた、本発明に含まれる。このキットは、必要に応じて、被験体に投与するための、上記形態のオリゴマー組成物を含む。
【０１７６】
図１０は、本発明のキットおよび方法を使用した、アレイデバイス１１０における仮想的なアッセイ結果を示す。アレイ領域のいくつかは、コントロールおよび／または複製に割り振られるが、８×８アレイ形式は、最大６４の異なった配列を受け入れる。本発明の形式において、アレイ結果は、４つのアレイ領域（例えば、領域１１２、１１６）での検出可能なヘテロ二重鎖の結合を示す。各々のアレイ領域に保持された配列に対する鍵を使用する場合、ユーザーは、標的ＲＮＡが４つの既知の配列に対して存在したことを知り、これは、上で議論した種々の状態の診断となる。
（ＩＶＣ．固相皮膚アッセイ）
別の実施例において、単一解析試験および複数解析試験について意図された、オリゴマーまたは複数のオリゴマーは、経皮的に投与される。オリゴマーの経皮的通過、オリゴマーの皮膚表面下の細胞（例えば、樹状細胞および皮膚下皮膚細胞）への侵入ならびに皮膚表面近傍でのヘテロ二重鎖の形成および細胞外への排除を可能にする適切な時期の後は、皮膚表面はヘテロ二重鎖の存在に対するサンプルである。これは、オリゴマーが適用された領域へ、皮膚の領域にわたって粘着テープを置くことによってなされる。その後、粘着体に収集された物質は、前記任意の方法によって検出するための適切な水性溶媒へ遊離される。本方法は、皮膚下細胞によって粘着される投与されたオリゴマーの能力、および皮膚投与の領域中の放出されたヘテロ二量体の分布に依存する。
【０１７７】
図１１は、患者の皮膚領域へ複数のオリゴマーを投与する際に使用する塗布具１２０を示す。この塗布具は、患者の皮膚領域へ適用される吸着パッチ１２２を含む。この塗布具パッチは、開口部１２４、１２６のような、開口部のアレイを有し、それらを通して、オリゴマーが選択された皮膚領域に送達され、ヘテロ二重鎖が収集される。塗布具パッチ上の対応する開口部を有する記録部中の領域１３０のような、アレイ領域を有するオリゴマーアレイ層１２８は塗布具パッチの上に保持されている。各々の領域は、適切な経皮的送達溶媒中の選択されたオリゴマーを保持する。この経皮的送達溶媒は、例えばオリゴマー、５０％〜９０％プロピレングリコール、５％〜１０％リノール酸または他の長鎖脂肪酸、および残りの水を含む流体組成物である。皮膚に塗布する前、その領域を湿潤条件に保持するために、パッチの下側表面を、塗布剤使用直前に取り除かれるフィルムで覆う。
【０１７８】
塗布剤を患者の皮膚表面に置く場合、塗布剤の各々のアレイ領域由来のオリゴマーを、図１２に示されるように、皮膚表面と接触させ、アレイ領域のオリゴマーが患者に経皮的に投与されるのを可能にする。投薬の期間（すなわち層１２８を皮膚と接触させて保持する間）は、代表的には１〜４時間であり、その後、患者皮膚表面に保持されていた層がパッチから除去される。
【０１７９】
サンプルを収集するために、粘着性の裏材１３４を有する収集層１３２を、図１３に示されるように、粘着側を下にして、パッチ１２２の上に置き、粘着物をパッチ開口部の領域で皮膚と接触させる。この粘着物は、代表的に、タッキーポリマー型粘着剤であり、皮膚の表面上層に効率よく結合する。従って、パッチからの収集層の除去が、細胞、皮膚の屑、および皮膚上層に含まれる任意のヘテロ二重鎖の収集に効率的である。収集層は、ここで、粘着領域のアレイを形成し、パッチ開口部の１つを通して回収された皮膚物質を各々有する。この方法で形成されたヘテロ二重鎖が、投与部位で相対的に局在化されたままであるので、収集層に含まれるヘテロ二重鎖は、同じ皮膚領域で投与された特定のオリゴマーに対応する。
【０１８０】
収集層で収集されたヘテロ二重鎖を検出するために、層を、図１４に見られるプレート１３６のように、収集層上の収集領域を用いた記録に配分されたウェル１３８、１４０のようなウェルを有するマルチウェルプレート上に置く。この層をプレート１３６の上側表面に置く場合、プレートと層との間の、接着シールを形成し、収集領域が、プレート上の開口ウェルに曝される。これらのウェルは、適切な抽出媒体（例えば、粘着物質を溶解または部分的に溶解し、粘着物質中に捕捉された物質の溶媒へ放出するように設計された水性界面活性溶媒）で満たされる。移行は、対応するウェルを含む粘着領域を下に押して抽出溶媒と接触させることによって、もしくは、プレート１３６を攪拌することによって、または収集プレートが下になるように、プレートをひっくり返すことによって、達成され得る。適切な抽出期間（例えば、室温で３０〜６０分）の後、収集層をプレートから除去し、ウェルおよびその中の溶液を曝す。
【０１８１】
任意のアレイ中のヘテロ二重鎖は、例えば、ヘテロ二重鎖結合因子を通したウェルの表面上でのヘテロ二重鎖の捕捉のような、上記任意の方法、そしてその後のレポーター標識化へテロ二重鎖結合因子を用いた結合ヘテロ二重鎖の検出によって、検出される。
【０１８２】
以下の実施例は、本発明を例示するが、いかなる方法でも本発明の制限を意図されない。
【０１８３】
（実施例１）
（インビトロまたはインビボでの、ヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の形成）
（インビトロでの研究）
二重鎖形成を、種々のｍＲＮＡをアンチセンスオリゴマーと混合し、それらをハイブリダイズさせ、続いて、３６Ｖで４．７５時間の１２％非変性アクリルアミドゲル泳動での二重鎖形成の視覚化をし、臭化エチジウムで染色し、二重鎖形成およびＲＮＡｓｅ耐性を検出することによって評価した。ゲル中でのオリゴヌクレオチドの移動は、電荷対質量に基づいており、二重鎖の場合、質量はＲＮＡ単体の質量のほぼ２倍であるが、ＰＭＯが中性の場合、電荷が加算されない。二重鎖の移動は、アクリルアミドゲルの濃度によって変わる。
【０１８４】
αグロビン合成ｍＲＮＡ２５マー（配列番号１）およびｃ−ｍｙｃにアンチセンスな非相補的ＰＭＯオリゴマー（配列番号２）、または相補的αグロビンアンチセンスＰＭＯ２５マー（配列番号３）を、ＲＮＡｓｅの存在下または非存在下において混合した。
【０１８５】
αグロビン合成２５マーを、ｃ−ｍｙｃにアンチセンスな配列を有する非相補的ＰＭＯ２５マー（ＰＭＯ１２２−１２６、配列番号２）と混合した場合、１つのみのバンドを、ゲル電気泳動後に観察し、バンドの分子質量は合成ｍＲＮＡ２５マーと一致した。しかし、αグロビン合成２５マーを相補的αグロビンアンチセンスＰＭＯ２５マー（配列番号３）と混合した場合、ゲル電気泳動後に、２つのバンドを観察し、低い方のバンドはｍＲＮＡ２５マーに対して予想された速度で移動し、そして第二のバンドは約２００塩基対のオリゴマーに対して予測された速度で移動した。高い方のバンドは、充填前に、ＲＮＡｓｅＢＭまたはＲＮＡｓｅＴ１での処理に耐性であったが、低い方のバンドはそうではなかった。
【０１８６】
この結果は、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖に対して予想されるゲル移動点でうすいバンドによって示され、ＲＮＡ単独に対するバンドがないことによって示されるように、ＲＮＡｓｅ耐性二重鎖が、ＲＮＡｓｅＢＭの存在下で、αグロビン合成ｍＲＮＡ２５マー（配列番号１）および相補的アンチセンスＰＭＯ（配列番号３）との間で形成されたことを示した。
【０１８７】
この結果はさらに、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖に対して予想されるゲル移動点でバンドによって示され、ＲＮＡ単独に対するバンドがないことによって示されるように、ＲＮＡｓｅ耐性二重鎖が、ＲＮＡｓｅＴ１の存在下で、αグロビン合成ｍＲＮＡ２５マー（配列番号１）および相補的アンチセンスＰＭＯ（配列番号３）との間で形成されたことを示した。このことは、ＲＮＡが二重鎖の一部でない場合は、分解され得ることを示す。
【０１８８】
相補的なｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴマー対混合物対非相補的なｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴマー対混合物を用いた電気泳動結果の比較によって、ｍＲＮＡとその相補的アンチセンスＰＭＯオリゴマーとの間に二重鎖が形成されたことが確認され、この二重鎖がＲＮＡｓｅによる分解に耐性であることが確認された。ＲＮＡｓｅ存在下および非存在下における相補的なｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴマー対混合物の相対的ゲル電気泳動移動速度は、αグロビン合成ｍＲＮＡ２５マー（配列番号１）と相補的アンチセンスＰＭＯ（配列番号３）との間で二重鎖を形成することを示し、過剰のαグロビン合成ｍＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ非存在下で存在することを示す。
【０１８９】
（インビボでの研究）
アンチセンスオリゴマーは、ラットに腹腔内注入され、続いて、ラットの尿中でその後検出され得る安定なオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖がインビボで形成される。
【０１９０】
各々の試験動物について、投与２４時間後に収集された１ｍｌの尿を、６０００〜８０００ｍｗカットオフの透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）中で、標準アッセイ緩衝液に対して透析し、塩を除去した。透析されたサンプルを、１０分間ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅと共にインキュベートし、Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で乾燥した。乾燥されたサンプルを５０μｌの水に溶解し、１レーンあたり２５μｌを、１２％非変性アクリルアミドゲルに充填した。
【０１９１】
ラットに、部分肝切除時に生理食塩水または３ｎｍｏｌｅ、７５ｎｍｏｌｅもしくは３７５ｎｍｏｌｅのｃ−ｍｙｃにアンチセンスなＰＭＯ  １２２−１２６  ２５マー（配列番号２）を投与した。ゲル電気泳動の結果は、２００ｂｐのＤＮＡラダーバンドの近傍に移動するＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅ耐性バンドの存在を示し、このバンドはＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖のバンドと一致する。このバンドの出現は、投与されたＰＭＯの量に依存し、ラットに生理食塩水を投与した場合は、存在しない。部分肝切除時に、ｃ−ｍｙｃにアンチセンスなＰＭＯ  １２２−１２６  ２５マー（配列番号２）を３７５ｎｍｏｌｅ与えられたラットにおいて、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖の移動パターンと一致するバンドが観察され、このことはインビボでのＰＭＯへの露出後のＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖の検出を支持する。
【０１９２】
これらの観察は、ＰＭＯの動物への投与による特定の検出可能なアンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖のインビボでの形成を支持する。この二重鎖は細胞内で形成される。そして、ヌクレアーゼに耐性であり、細胞膜を通した腎臓血供給への輸送、腎臓を通した尿へのクリアランスを通して、浸透圧の変化に安定なままである。
【０１９３】
（実施例２）
（アンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を用いたインビボでの研究）
フルオレセイン共役オリゴマーを検出可能な器具（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ６７２  ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒ）を使用して実行する較正の研究を使用して、種々の長さ（１５マー、２０マー、２４マーおよび３８マーのリボザイム）のフルオレセイン共役オリゴマーの移動速度を決定した。移動速度をＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒ  ｇｅｌで評価し、較正研究によって、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖の検出に対するＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒアプローチの妥当性を確認した。較正研究によって、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ６７２  ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒは、長さおよび濃度両方に基づいてフルオレセイン共役オリゴマーを区別し得ることを示す。
【０１９４】
（インビボでの研究）
ラットに、ラットチトクロームＰ−４５０３Ａ２（配列番号６）とアンチセンスな、カルボキシフルオレセイン共役ＰＭＯ（配列番号５）を注射した。
【０１９５】
注射１時間後のラットから抜き取った血液から調製された血漿サンプルのＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒクロマトグラムは、２７０分および３４０分で移動する蛍光成分を含んだ（異なって移動する２つの可能なフルオレセイン結合による２つのピーク）。注射２４時間後のラットから調製された血漿サンプルは、約７５分および８０分で移動する蛍光成分を含んだ。質量スペクトルデータ（示さず）より短い移動時間がＰＭＯの分解によらないことを確認し、ＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖がその時間にわたって形成されていたことを示す。
【０１９６】
図２は、Ｐ４５０アンチセンスＰＭＯの投与後、種々の時間に採取されたサンプルの解析の結果を示し、ＰＭＯモノマーの消失およびそのような投与に続いたラットの結晶中のＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の対応する出現を示す。有意な量の血漿中の二重鎖の出現は、二重鎖化していないＰＭＯの大多数によって、血漿が一般的に「分布期」といわれる時期になるまで、起こらない。ＰＭＯヘテロ二重鎖は、ＰＭＯモノマーが、相補体ｍＲＮＡ転写体を局在する被験体組織へ分布した後まで、血漿中に蓄積しない。荷電したＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖は、おそらくこれらの組織中で形成され、細胞外に流出し、血漿内に流入する。この全体の過程は、数時間を要する。
【０１９７】
ｐ４５０アンチセンスＰＭＯ（配列番号５）の投与後、フルオレセインは腎臓および肝臓の両方で検出された。
【０１９８】
腎臓組織サンプルのクロマトグラムは、二重鎖化していないＰＭＯと一致する３５０分にバンドを示し、ＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖と一致する８０分に追加のバンドを示す。これらは、間隙空間または腎臓の細胞内に存在し得る二重鎖ＰＭＯおよび親ＰＭＯの両方を示す。肝臓組織サンプルは、本質的に二重鎖化していないＰＭＯを示さず、より多くの有意なＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖を示した。これらの結果は、Ｐ４５０  ｍＲＮＡ転写体のレベルが肝臓よりも腎臓でより低いという観察と一致する。
【０１９９】
非二重鎖化アンチセンスＰＭＯオリゴマーおよびアンチセンスＰＭＯオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の尿中クリアランスの時間経過に関係する研究は、組織から血漿へのＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の形成および流出に対して、数時間が要求され、続いて尿中へ根本的に出現することを示す。
【０２００】
（実施例３）
（ホスホローダミンモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を認識する多重モノクローナル抗体の開発）
以下に、本発明のホスホローダミンモルホリノオリゴマーを認識する多重モノクローナル抗体の調製を詳述する。免疫原を形成するために、ＰＭＯの５’末端を、標準的なリンカー化学によってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と連結した。このＰＭＯ−ＫＬＨ複合体を相補的ＲＮＡとハイブリダイズし、次いで、マウスに注射し、続いて増幅し、そしてマウスから採血し、ＰＭＯに対する強い抗体力価が存在するかどうかを決定した。
【０２０１】
強い抗体応答が観測されたマウスにおいて、周知の方法に従って、脾臓を除去し、単離された脾臓細胞を不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマを調製した。スクリーニングされた細胞株の中で、ＰＭＯを認識する抗体を分泌する１０クローンを観察した。これらの１０クローンから、３クローンの一般的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）認識型を単離した；（ａ）１０クローンのうち３クローンは、ＰＭＯの５’末端へ結合するトリエチレングリコール部位を認識するＭａｂを分泌する、および（ｂ）１０クローンのうち７クローンは、ＰＭＯヘテロ二重鎖構造を認識するＭａｂを有する。これら７クローンのうち、６クローンはＰＭＯの単一配列を認識しないように見えるＭａｂを産出するが、ＲＮＡまたはＤＮＡを認識しない。ＰＭＯを認識した７クローンのＭａｂのうち１つはまた、他のＰＭＬＯ配列よりも、免疫に使用された特定のＰＭＯの配列に対して、実質的により敏感である。
【０２０２】
ポリクローナル血清もまた、血管壁送達に対して適合した侵入カテーテルによって本発明のＰＭＯを注入したブタ由来の血管壁中のＰＭＯを検出するために評価した。冠状動脈管の組織溶解産物を、アクリルアミドゲルに充填し、電場を印加し、そして、ゲル内容物をウエスタンブロット法に従って、Ｎｙｔｒａｎ膜へ転写した。この膜は、ＰＭＯ抗血清で探査され、バンドは、ゲル中で移動しなかった遊離ＰＭＯについて可視で、ＲＮＡに付随した負電荷によるゲル中で移動するＲＮＡ：ＰＭＯ二重鎖であるもう一つのバンドは、可視であった。
【０２０３】
本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載されてきたが、種々の改変および変化は、本発明からそれることなくなされ得ることは、理解される。
【０２０４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、人体から分泌されたヘテロ二重鎖を形成する際のアンチセンス分子の相互作用を示し、これは、本発明の方法に基づき得られたインビボのデータと一致する。
【図２】
図２は、ラットに投与されてからの時間の経過（分）に伴う血漿中のＰ４５０アンチセンスホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）モルホリノリゴマー（ＰＭＯ）の消失およびＰＭＯ：ｍＲＮＡヘテロ二重鎖の出現のプロットであり、ここで、白抜きの四角はＰＭＯに対応し、黒塗りの丸はＰＭＯ”ＲＮＡ二重鎖に対応する。
【図３】
図３は、無電荷骨格を有する種々のアンチセンス分子を示し、これらの無電荷骨格は、本発明における使用のための候補分子である。
【図４】
図４は、本発明における使用のために適切なアンチセンス化合物を形成するために適切な種々の架橋基を有する好ましいアンチセンスサブユニットのクラスの１つを示す。
【図５】
図５Ａ〜Ｄは、例示的なモルホリノリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを示し、ＡからＤ／Ｅまでの表記は、それぞれ図４のサブユニットＡ〜Ｅを使用して構築される。
【図６】
図６Ａ〜６Ｅは、本発明に基づくヘテロ二重鎖種の検出に使用される種々の型の固体支持体／へテロ二重鎖相互作用を図示する。
【図７】
図７Ａ〜７Ｃは、本発明の１つの実施形態に基づく固体支持体上のヘテロ二重鎖の検出に使用される検出試薬の種々の型を示す。
【図８】
図８Ａ〜８Ｄは、本発明の別の実施形態に基づく、精製された溶液形態の中のヘテロ二重鎖の検出の工程を図示し、ここで精製されたかまたは部分的に精製されたヘテロ二重鎖は、質量分析（８Ｃ）またはゲル電気泳動（８Ｄ）によってアッセイされる。
【図９】
図９は、本発明の局面に基づいて形成されたアレイデバイスの一部を示す。
【図１０】
図１０は、被験体における多数のｍＲＮＡ種の個々の存在を決定するための仮想試験の結果を図示する。
【図１１】
図１１は、本発明の経皮的な実施形態に使用される経皮的なアレイ塗布器の平面図である。
【図１２】
図１２は、線１２−１２に沿った、図１１の塗布器のデバイスの断面拡大図である。
【図１３】
図１３は、本発明の経皮的な実施形態に使用される経皮的なアレイ捕集器（ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）の断面図である。
【図１４】
図１４は、経皮的な実施形態において使用されるマルチウェル検出デバイスの平面図である。
【図２】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004537030.tif 000072
2004537030.tif 000073
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