(57)【要約】本発明は、新規デリバリーシステム及びその作製方法に関する。かかるデリバリーシステムは荷電高分子を送達する二相性システムであり、負荷電疎水性有機相及び正荷電無機相を含むものである。かかる有機相及び無機相は添加した高分子を捕捉し、かかる高分子の捕捉は、有機相、無機相及び高分子の間の静電結合によって行われる。かかるデリバリーシステムの作製方法には、負荷電有機相、荷電高分子、及び正荷電無機相を接触させる工程及びそれらを混合する工程が含まれる。
2004512352.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
負荷電疎水性有機相及び正荷電無機相が、荷電分子と該有機相及び該無機相との静電結合によって荷電分子を捕捉できることを特徴とする負荷電疎水性有機相及び正荷電無機相を含む荷電分子用二相性デリバリーシステム。
【請求項２】
荷電分子が高分子であることを特徴とする請求項１記載のデリバリーシステム。
【請求項３】
有機相が、静電気的中性油と負荷電有機化合物を含む水中油型エマルジョンであることを特徴とする請求項１記載のデリバリーシステム。
【請求項４】
中性油が、スクワラン、ダイズ油、ゴマ油、及びピーナッツ油からなる群より選択されることを特徴とする請求項３記載のデリバリーシステム。
【請求項５】
負荷電有機化合物がリン酸ジセチルであることを特徴とする請求項３記載のデリバリーシステム。
【請求項６】
無機相がミョウバンを含むことを特徴とする請求項１記載のデリバリーシステム。
【請求項７】
デリバリーシステムの内部に荷電分子が捕捉される場合には最大５μｍの直径を有することを特徴とする請求項１記載のデリバリーシステム。
【請求項８】
さらに荷電分子を含むことを特徴とする請求項１記載のデリバリーシステム。
【請求項９】
荷電分子がＤＮＡであることを特徴とする請求項８記載のデリバリーシステム。
【請求項１０】
荷電分子を有する負荷電疎水性有機相と正荷電無機相を接触させ、さらに混合して、該有機相と該無機相との間に存在する該荷電分子を捕捉することを特徴とする請求項１で定義したデリバリーシステムの作製方法。
【請求項１１】
負荷電有機相及び荷電分子をまず混合し、次いで正荷電無機相をその中に添加して混合することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
有機相が、中性油と負荷電有機化合物を含む水中油型エマルジョンであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
中性油が、スクワラン、ダイズ油、ゴマ油、及びピーナッツ油からなる群より選択されることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
負荷電有機化合物がリン酸ジセチルであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
無機相がミョウバンを含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
デリバリーシステムの内部に該荷電分子が捕捉される場合には、該デリバリーシステムが最大５μｍの直径を有することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
荷電分子がＤＮＡであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
（ａ）発明の分野
本発明は、薬剤、ワクチン又はその他の荷電化合物を投与するための新規デリバリーシステムに関する。本発明はまた、荷電高分子の新規捕捉方法に関する。
【０００２】
（ｂ）先行技術の記載
ワクチン分野では、リポソーム及びナノ粒子のデリバリーシステムと類似してはいるがかなり大量の高分子タンパク質を捕捉できるコロイド系デリバリーシステムの開発に対する関心が高まっている。コロイド系デリバリーシステムは、製品の有効期間に関する薬学的要件も満たしている。
【０００３】
より安全な形の薬剤及びワクチンを開発するために、いくつかのコロイド系システムが調べられてきた。これらのシステムの第一目的は、一般に、生体のある部位への効率的な薬剤の送達（デリバリー）を可能にすることであった。これに関連して、コロイド系システムが送達する高分子タンパク質の標的であるという理由から、マクロファージの同定が行われてきた。しかし、コロイド系システムを使用して高分子タンパク質を生体のある部位に効率的に送達するには、使用したデリバリーシステム中での高分子タンパク質の安定的な捕捉が必要となることは、周知である。
【０００４】
デリバリーシステムにおける高分子タンパク質の捕捉を評価する研究によると、水溶性の高分子タンパク質を捕捉する能力が比較的低いことが大きな難点となって、製薬業界の多岐にわたる分野での使用を制限するとされている。水溶性の高分子タンパク質は、サイズが大きいため、コロイド系システムに捕捉されにくい。通常は、リポソーム中での大型水溶性高分子タンパク質の捕捉率は水相の性質によって左右され、５０％を超えることはめったにない。
【０００５】
コロイド系システムで水溶性タンパク質の捕捉に関与していると思われる機構がいくつかある。水溶性タンパク質の捕捉は、リポソームのように、コロイド系システムの水相中で自由に行われるということが、一般的に想定されている。さらに大型の水溶性高分子タンパク質については、その大きさのため、現実に捕捉するのが困難である。巨大リポソーム及び油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンの導入は、事態を部分的に改善するにすぎない。なぜなら、こうしたシステムを用いて得られたタンパク質捕捉効率は、こうしたシステムの水相の実際の能力を反映していないからである。
【０００６】
加えて、先行技術に使用されているデリバリーシステム調製方法は、一般的に時間がかかるものであり、現行の薬学的要件に一致しないものである。
上記のことからわかるように、広範囲にわたる大きさの水溶性タンパク質を大量に捕捉することが可能なデリバリーシステムに対するニーズは非常に大きい。
【０００７】
発明の開示
本発明の１つの目的は、多様な静電的相互作用を利用して、水溶性タンパク質を捕捉する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、多様な静電的相互作用を利用して、水溶性タンパク質を捕捉するデリバリーシステムを提供することである。
本発明の別の目的は、製薬業界ですでに許容されている方法で調製されたデリバリーシステムを提供することである。
【０００８】
本発明によると、負荷電疎水性有機相及び正荷電無機相を含む荷電分子用二相性デリバリーシステムが提供される。かかる有機相及び無機相は、有機相、無機相及び少なくとも１つの荷電分子との間の静電結合によって荷電分子を捕獲するように改造されている。
【０００９】
有機相は、中性油及び負荷電有機化合物を含む水中油型エマルジョンであるのが好ましい。そのような中性油としては、スクワラン、ダイズ油、ゴマ油、ピーナッツ油からなる群より選択されるものが例示されるが、これらに限定されるものではない。負荷電有機化合物としては、リン酸ジセチルが好ましい。
【００１０】
本発明のデリバリーシステムの無機相としては、ミョウバンを含むものが好ましい。
デリバリーシステムは、内部に荷電分子を捕捉した状態で最大５μｍの直径を有するものが好ましい。
さらに、本発明によると、上記デリバリーシステムで、さらに荷電分子を含むものが提供される。かかる荷電分子は、例えば、ＤＮＡであってもよい。
【００１１】
本発明によると、上記のとおり定義したデリバリーシステムの作製方法も提供される。かかる方法には、負荷電疎水性有機相、荷電分子、及び正荷電無機相を接触させる工程、及びそれらを混合して、有機相と無機相との間の荷電分子を捕捉する工程が含まれる。負荷電有機相と荷電分子をまず混合し、それから正荷電無機相をその中に添加して混合するのが好ましい。
【００１２】
本発明の方法は簡潔であり、産業上の利用可能性を容易にしかも再現可能な状態で増大させるものである。本方法により、デリバリーシステムの明確で特異的な粒度分布の調製が可能になる。よって、かかるシステムは本発明の別の態様であり、高分子用の担体、ワクチン用アジュバント、遅延性デリバリーシステム又は安定剤を含むことを意図するものといえる。
【００１３】
発明の詳細な説明
図９Ａ及び９Ｂに示した組織分布結果からはっきりわかるとおり、本発明のシステムには、動物に非経口投与した場合に、肺、腸及び腎臓に蓄積する傾向があるのに加え、細網内皮系（ＲＥＳ）のマクロファージ高含有組織に蓄積する傾向もある。
かかるシステムは、好ましくは筋肉内又は皮下経路での投与用に設計されたものである。本発明のデリバリーシステムを投与する際に、毒性に関する問題が注入部位で発生したことはなかった。
【００１４】
かかるデリバリーシステムは静電気的に調整可能であり、静電的相互作用のみに基づいて、有機相と無機相の間に存在するかなり大量のタンパク質を捕捉することができる。さらに、かかるシステムの調製及び殺菌については、製薬業界で広く許容されている産業的な手順を利用して行うことができる。例えば、当該分野では周知のように、かかるデリバリーシステムは濾過又はＵＶ照射によって、また、オートクレーブ工程（１２０℃で３０分間）によって殺菌することができる。このことは、その薬剤製品としての許容性を高める商業的に重要な特性と考えられている。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態によると、かかるデリバリーシステムは、先行技術中の他のデリバリーシステムよりも優れたタンパク質捕捉能力を有している。標的相は負荷電疎水性エマルジョン又は有機マトリックスで構成され、捕捉相は正荷電無機マトリックスで構成されている。正荷電無機マトリックスとしては、鉱物のミョウバンが好ましい。かかるエマルジョンマトリックスの形状、平均粒度、及び粒度分布は、かかるエマルジョンマトリックスの調製に油を使用したにもかかわらず、類似していた。しかし、保管中に生じる脂質の過酸化に対する耐性が高いことで知られているスクワランが、飽和脂肪酸を多く含有するため、最も好ましい。
【００１６】
本発明のシステムは実施するのが容易であるとともに、ＢＳＡ、ペルオキシダーゼ、及び不活化ウシウィルス性下痢症ウィルス（ＢＶＤＶ）タンパク質混合物の捕捉に関する捕捉率が安定している。本発明のシステムの標的相にユビキノンＴＭ５０を添加して標的相の疎水性を高める一方で、捕捉相が正の電荷を帯びているという事実を考え、標的相にリン酸ジセチルを添加して負の電荷を与えた（Ｍａｋａｂｉ−Ｐａｎｚｕ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， Ｖｏｌ． １６， Ｎｏ． １６， ｐｐ． １５０４−１５１０ （１９９８））。
【００１７】
リポソーム及びナノ粒子について見出されたように、負荷電疎水性コロイド相の使用には、循環型血清オプソニンの結合が可能になることで、システムのマクロファージ標的能力が増大するという付加的な利点が伴う。血清のオプソニン化によって、負荷電疎水性小胞のマクロファージの食作用が増大することが知られている。他のタイプの血清タンパク質についても、本発明のシステムにおいて実験を行っている。
【００１８】
従来のコロイド系デリバリーシステムとは異なり、本発明のデリバリーシステムは、反対の電荷を帯びた２つの相、すなわち、タンパク質が結合する標的相である負荷電有機相と、負荷電有機相が捕捉され可変的静電結合によって囲いこまれる正荷電無機相（捕捉相）を含む二相性のシステムを含有するものである。かかるタンパク質は、正荷電無機相とも静電気的に相互作用する。本発明のシステムによって、投与後、好ましくは筋肉内及び／又は皮下投与後の、タンパク質の細網内皮系への送達が可能となり、本発明のシステムによって、標的相及び／又は捕捉相に結合したタンパク質の送達が可能となる。
【００１９】
本発明のシステムの物理化学的特徴づけを行った結果、かかるシステムは、ＢＶＤＶワクチン及びインフルエンザワクチンなどのワクチンの免疫原性を高める能力を有しているのに加えて、４℃で１年間保管した後も高いタンパク質捕捉能力を示す非常に安定したシステムであることが実証された。よって、本発明のシステムはワクチンの免疫原性を高める能力を有していることから、追加免疫の必要性はなくなるか、又は少なくてすむことになる。効果を出すには二度の追加免疫が必要なワクチンを本発明にしたがって調製すると、必要な追加免疫が一度だけになるか、又はまったく必要なくなる。そのどちらになるかは、免疫を受けるタンパク質によって、及び本発明のデリバリーシステム中に捕捉されたタンパク質の全体的な免疫原性によって決まる。
【００２０】
ＢＶＤＶ及び細胞グリコプロテイン混合物の放射能標識
本発明のシステム中に捕捉される大型水溶性タンパク質の例として、ウシウィルス性下痢症ウィルス（ＢＶＤＶ）及び細胞表面グリコプロテインをここで使用している。遠心分離（２５０００ｇ、４℃で３時間）によって事前に安全性を確認したウィルス含有細胞培養上清液のペレットを用いた、ガラクトースオキシダーゼ−［３Ｈ］水素化ホウ素処置（Ｌｕｋｋｏｎｅｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ７６：５５ （１９７７））にしたがって、ＢＶＤＶ表面グリコプロテインの標識を行った。すなわち、ＰＢＳに懸濁する前に０．５％のトリトンＴＭＸ−１００溶液で１時間処理したウィルスペレット調製物を、まずガラクトースオキシダーゼとともに３７℃で６０分間インキュベーションして、その後、５００μＣｉの［３Ｈ］水素化ホウ素ナトリウムとともに室温で３０分間インキュベーションした。低速遠心分離（２００ｇ、４℃で１５分間）の後、セファデックス５０ＴＭカラムを用いて、標識したウィルスを分離した。最後に、標識したグリコプロテインをプールして、−７０℃で保管した。
【００２１】
デリバリーシステムの調製
本発明の好ましい実施形態にしたがい、１４０ｍｇの市販のペレット状ミョウバンを、２ｍｌ（３２．４ｇ）の中性油から作製した水中油型エマルジョンと下記のとおり接触させて、デリバリーシステムを調製した。ユビキノンＴＭ５０、４ｍｌの中性油（スクワラン、ダイズ油、ゴマ油、又はピーナッツ油）、１００ｍｇのリン酸ジセチル及び２ｍｌのツイーンＴＭ８０：スパン８５（１：１、ｖ／ｖ）を混合したＰＢＳ中でのマイクロ流動（室温で、１２，０００ｐｓｉで３サイクル又は２０，０００ｐｓｉで１サイクル）により、１００ｍｌのエマルジョンを調製した。この溶液にビタミンを添加してもよい。ミョウバンと反応させる前に、調製直後の大量のエマルジョンを、等量のタンパク質溶液を含むＰＢＳに添加する。添加したエマルジョン調製物の量の１００％に結合するのに必要な量として、システム調製に使用したミョウバンの量を測定した。ミョウバンの量を測定するため、２ｍｌ（３２．４ｍｇ）のトリチウム化油エマルジョンを異なる量のミョウバンと反応させる。低速遠心分離（２００ｇ、１５分間）を４℃で行った後、上清液中の残留放射能をモニターした。上清液中の放射能が最低となる量が、ミョウバンの量として好ましい。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態においては、高分子とシステムとの間の静電的相互作用を調節して、かかるシステムによる高分子の放出速度を変えるために、リン酸ジセチルの使用量を変えることができる。さらに多くのリン酸ジセチルを添加して強い静電的相互作用を生じさせることは、結果的に、かかるシステムの送達速度を徐放性デリバリーシステム程度にまで低下させる可能性がある。本発明のシステムの放出速度が可変的なのは、そのためである。
かかるデリバリーシステムは、抗原を用いても用いなくても調製可能であり、用いない場合は、抗原を後で添加する。
【００２３】
粒度分布及び形状分析
Ａｕｒｏｒａ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， Ｖｏｌ． ８２０， ｐｐ． ２５０−２５８ （１９８５）； Ｗｅｉ， Ｌ． ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ， Ｈ． ＬＨ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ２５， ｐｐ． ７４７７−７４８３ （１９８６））が概述したとおりに、１％の酢酸ウラニル水溶液を用いてサンプルのネガティブ染色を行った後で、粒子の粒度と形状を光子相関分光法及び透過形電子顕微鏡で測定した。粒度の測定結果は、平均粒度及び粒度分布として引用されている。適切な拡大率の電子顕微鏡写真により、システムの形状が目視できるようになった（図３Ａ、３Ｂ、５Ａ及び５Ｂ）。
【００２４】
高分子の捕捉
かかるデリバリーシステムにおけるＢＶＤＶの表面グリコプロテインの捕捉を測定した。測定が行われた時点は、粒度がはっきりしている等量のエマルジョン及び高分子溶液に対して、１２０００ｐｓｉで室温でのマイクロ流動を行った後で本発明のシステムを調製する前の時点、又は、類似した条件下で、すでに載せておいた等量のシステム懸濁液及びタンパク質溶液（５０ｍｌのタンパク質溶液及び載せておいた５０ｍｌのシステム懸濁液）と一緒にマイクロ流動を行った後の時点のいずれかであった。どちらの場合も、装置中の捕捉タンパク質の量は、Ｐｉｅｒｃｅ社が販売している市販のブシンコニン酸（ｂｕｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＢＣＡ）タンパク質アッセイを用いたモニタリングにより測定した。かかる上清液中のタンパク質の存在も、タンパク質の全添加量との比較で、メタノール：クロロホルム（１：２）による抽出後に測定した。
【００２５】
タンパク質の測定
市販のＢＣＡアッセイと標準物としてのＢＳＡを用いて、本システムのタンパク質濃度を測定した。
【００２６】
組織分布研究
Ｍａｋａｂｉ−Ｐａｎｚｕ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， Ｖｏｌ． １６， Ｎｏ． １６， ｐｐ． １５０４−１５１０ （１９９８）に報告されているとおり、体重が１７〜２０ｇの雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを使用して、インビボ実験を行った。マウスを６つのグループに分け、本発明のデリバリーシステムを筋肉内に投与した。投与量は、マウス１匹につき１，０００，０００ＤＰＭであった。大半の事例では、注入したシステムの特異活性は、中性油１ｍｇにつき１μＣｉであり、その際、デバイス（ｄｅｖｉｃｅ）標的相のマーカーとして、交換不可能で代謝不可能なトリチウム化ヘキサデシルエーテルコレステロールを使用した。標識した全デバイスをマウスに投与してから２４時間後に組織分布を測定した。下記の組織を採取した：肺、脾臓、肝臓、腸、腎臓、及び血漿。サンプルを計量し、最少量の０．２５％のトリトンＸ−１００ＴＭ溶液（１ｍｌにつき、組織２０ｍｇ）中で、組織ブレンダー（９８５−３７０モデル、Ｘｙｍｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて分解した。２００μｌ又は３００μｌのホモジェネートである部分標本を、Ｂｅｃｋｍａｎ組織可溶化装置４５０（オンタリオ州、ミシサーガ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．社製）を使用して、６０℃で３時間分解した。その後、消光を回避するため、シンチレーション計測の前に、適量の、３０％の過酸化水素を添加してサンプルを脱色した（１ｍｌあたり５０μｌの組織ホモジェネート、又は、脱色されなかった場合は、さらに５０μｌを添加する）。バイアルに入れしっかり栓をして、室温で１８時間が経過した時点で、化学発光を回避するために７０μｌの氷酢酸をサンプルに添加した。適量の、ＥｃｏｌｉｔｅＴＭ（Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｃａｎａｄａ社製）などのシンチレーションカクテル剤をサンプルに添加し、かかるサンプルを液体シンチレーションカウンター（液体シンチレーションカウンター、ラックベータ１２１７、ＬＫＢ Ｗａｌｌａｃ社製、フィンランド国、トゥルク）で計測した。マウスにおけるかかるシステムの分布を、全組織重量あたりの放射能（ＤＰＭ計測）から評価し、組織１ｇあたりの注入システム（ｍｇ）に変換した。
【００２７】
結果
デリバリーシステムの調製
負荷電エマルジョンに基づく有機相と正荷電ミョウバンに基づく無機相とを接触させることにより、デリバリーシステムを構築した。４つの好ましい中性油、すなわち、ダイズ油、ゴマ油、ピーナッツ油及びスクワランについての実験を行って、サブミクロンの水中油型エマルジョンの形でデリバリーシステムの有機相を形成した。全般的に、形状、平均粒度、及び粒度分布における差異は認められなかった（図１及び図３）。調製したすべてのエマルジョンは、主として直径４００ｎｍ未満で同様の分布状況を示す球状の小滴からなっている。飽和脂肪酸の含有量が多いことからスクワランを選択し、さらに研究を続けた。スクワランエマルジョンは、４℃で４２０日間保管した後も、非常に良好なコロイド質長期安定性を示した。一方、本発明のデリバリーシステムの無機相を調製する際に使用するミョウバンは、すぐに使用可能な市販の調製物であった（販売元：米国、ニューヨーク州、ウェストベリーのＡｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）。
【００２８】
図４において、全デリバリーシステムを載せるにはこのミョウバンを１４０ｍｇ使用するのが適切であることが判明している。このミョウバンの量は、有機相の全使用量（３２．４ｍｇ）と結合する量である。図４は、本発明のデリバリーシステムの有機相に結合するのに必要なミョウバンの量を示している。図４からわかるように、平衡状態に達するのは、ミョウバンを１４０ｍｇ以上使用したときである。ミョウバンの使用量は、脂質相の最大量を囲いこむ量のことであった。異なる量のミョウバンを２ｍｌのトリチウム化脂質相と室温で相互作用させて、この最大量を測定した。
【００２９】
デリバリーシステムのタンパク質捕捉効率
本発明のデリバリーシステムは、図５及び６からわかるように、非常に高いタンパク質捕捉能力を示した。本発明のシステムのタンパク質捕捉能力は、さまざまな量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をモデルとして用いて評価したところ、ユビキノン５０を製剤に使用しない場合には２５ｍｇを越えていた。同じ条件下でのＢＳＡの捕捉比率は、使用した個々の調製方法及び／又はエマルジョン相の脂質量の約９０〜１００％であった。エマルジョン相の脂質含有量と、システムのタンパク質捕捉効率との間には、強い相関関係が認められた（表１、図７）。他のタンパク質及び／又は手動混合による捕捉方法を使用したところ、かかるデリバリーシステムは、類似した捕捉挙動を示した（図８参照）。
【００３０】
【表１】
2004512352.tif 000003
【００３１】
体内デリバリーシステムのインビボでの性質
図９で報告したとおり、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに筋肉内投与した場合の本発明のデリバリーシステムの標的相は、投与２４時間後の時点で、ＲＥＳのマクロファージ高含有組織中に優先的に蓄積していた。かかるシステムの有意な蓄積は、腸、腎臓などの組織及び循環器でも観察された。
【００３２】
好ましくは筋肉内に又は皮下に荷電タンパク質を送達するビヒクル又は担体として、本発明のデリバリーシステムを使用できることがわかっている。高分子の捕捉は、その荷電及びデリバリーシステムとの静電的相互作用に基づいて行われる。システムの荷電を変化させて、デリバリーシステムと捕捉される高分子との間の相互作用を調節すること、及びそれによってかかるシステムの高分子放出応答を調節することができる。先行技術のシステムとは反対に、本デリバリーシステムは、マクロファージだけではなく、肺、脾臓、肝臓、腸、腎臓及び血漿などの組織をも標的とする。
【００３３】
【実施例】
下記の実施例を参照することで本発明への理解が深まるだろうが、下記の実施例は、発明の範囲を限定するためというより、発明を例示するためのものである。
実施例Ｉ
ガラクトースオキシダーゼトリチウム化水素化ホウ素処置による、ＢＶＤＶ感染ＭＤＢＫグリコプロテインの標識
２５，０００ｇでの遠心分離を４℃で３時間行って、ウィルス含有細胞培養上清液の安全性を事前に確認する。グリコプロテインを含むペレットをＰＢＳに再懸濁し、等量の０．５％のトリトンＸ−１００ＴＭ溶液を使用して４℃で１時間の処理を行う。その後、２５単位のガラクトースオキシダーゼを添加し、１時間インキュベーションする。次いで、トリチウム化水素化ホウ素ナトリウム（５００μＣｉ）を添加し、室温で３０分間インキュベーションする。２００ｇ、４℃で１５分間の低速遠心分離を行った後、セファデックスＴＭＧ５０カラムを用いて、遊離標識（ラジオアイソトープ）を除去する。このような標識を行ったグリコプロテインをプールして、使用時まで−７０℃で保管する。
【００３４】
実施例ＩＩ
本発明のデリバリーシステムの調製及び特徴づけ
調製
容積１００ｍｌ、１２０００ｐｓｉで、４ｍｌのスクワラン、１ｍｌのスパン８５、１ｍｌのツイーン８０、１００ｍｇのユビキノン５０（Ｕ５０）、１００ｍｇのリン酸ジセチル（ＤＣＰ）、２０ｍｇのビタミンＡ及び１００ｍｇのビタミンＥを用いて、下記のとおりマイクロ流動を行い、システムを調製した。すなわち、メタノール：クロロホルム（２：１）に、適量のＵ５０、ＤＣＰ、ビタミンＡ及びＥを溶解し、それを１００ｍｌボトルに入れた。適量のスクワラン、スパン８５及びツイーン８０を添加する前に、窒素ガス流を用いて有機溶媒を蒸発させた。その後、１００ｍｌのＰＢＳ中で、混合液のマイクロ流動を３回行った。得られたエマルジョンを１２０℃のオートクレーブに１５分間入れて、最終的に殺菌した。オートクレーブ工程の末期、手で取り扱える程度にボトルの温度が下がったときに、かかるボトルを振るだけで、分離したＵ５０相を再付着させた。通常は、１４ｍｌのエマルジョン相を９８０ｍｇのミョウバンと接触させて、室温でゲル状の混合物を形成する。等量の調製済アジュバントシステム（ここではデリバリーシステムとも称する）懸濁液と混合するだけで、高分子を捕捉した。この手順は、事前形成アジュバントシステムエマルジョン相又は事前に載せておいたデリバリーシステム懸濁液を用いる事前形成手順と称されている。マイクロ流動工程中の高分子捕捉からなる別の手順は、段階的手順と称されている。
【００３５】
粒度
粒度測定機（Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を使用して、デリバリーシステムエマルジョン相の粒度を分析した。かかる測定機は、１μｍ未満の粒子の測定に適した最高の分解能を有する機器であるが、確度が低下するとはいえ、大型粒子の定量も可能である。
【００３６】
高分子の捕捉
アジュバントシステムにおける遊離高分子又は結合高分子の分離の特徴づけを行うため、かかるシステムの高分子捕捉効率を評価した。低速遠心分離（１３０００ｒｐｍ、室温で１５分間）により、結合高分子から遊離高分子を分離し、タンパク質の場合にはＢＣＡタンパク質アッセイを利用して、ＤＮＡ測定の場合にはＵＶ波長（２６０ｎｍ）での評価を行うだけで、最初に添加した高分子の量との比較によって捕捉高分子の量を評価した。
【００３７】
アジュバントシステムからの結合高分子の放出
アジュバントシステムから放出される結合高分子を測定すると、主としてマクロファージなどのＡＰＣを標的とすることによって結合高分子を介した免疫応答を区別した上で調節する、かかるシステムの能力がよくわかる。結合高分子を含むアジュバントシステムの部分標本１ｍｌを、ＰＢＳ中で、４℃、２５℃、３７℃、及び６０℃でインキュベーションした。上清液中で高分子の放出を異なる時間帯でモニターした。等量のメタノール／クロロホルム（１／２）で抽出した後、タンパク質の場合にはＢＣＡタンパク質アッセイを利用して、ＤＮＡ測定の場合にはＵＶ波長（２６０ｎｍ）での測定を行うだけで、放出された高分子の量を上清液中で評価した。
【００３８】
安定性の評価
４℃で２年間保管した調製物のクリーム化工程、相分離、及び凝集を肉眼でモニターすることにより、かかるアジュバントシステムの安定性も評価した。
【００３９】
結果及び討論
表２は、本発明のデリバリーシステムのエマルジョン相の処方を示すものである。この表からわかるように、かかるエマルジョンは、リン酸ジセチルが存在するため、負荷電スクワランでできている。かかるスクワランは、ユビキノン５０、ビタミンＡ及びＥなど他の成分に対するマトリックスとして役に立つ。ユビキノン５０の１０％溶液１０ｍｌ、リン酸ジセチル、ビタミンＥ、及びビタミンＡの２％溶液１０ｍｌを使用して、かかるエマルジョン相を調製した。
【００４０】
【表２】
2004512352.tif 000004
【００４１】
スクワランマトリックスは、ＰＢＳ水溶液に懸濁した２００ｎｍの安定した小滴で構成されている。かかる小滴は、オートクレーブ工程（１２１℃、１５分間）中の高温の影響をあまり受けない大きさであるため、オートクレーブ工程に抵抗性があるといえる（表３を参照のこと）。表３では、Ｃｏｕｌｔｅｒ社製の粒度測定器を使用して、４℃で保管していたエマルジョンの小滴の大きさを調製後２年及び５年の時点で測定している。
【００４２】
【表３】
2004512352.tif 000005
【００４３】
表４では、使用した調製方法に応じた、小滴と相互作用するＢＳＡの存在下でのエマルジョン相の安定性をモニターした。段階的方法とはエマルジョン調製中のタンパク質捕捉であり、事前形成方法とは事前形成した小滴を使用したタンパク質捕捉である。
【００４４】
【表４】
2004512352.tif 000006
【００４５】
４０〜５０℃前後でボトルを振るだけで油性小滴に再付着させたユビキノン５０がオートクレーブ工程によって分離するとはいえ、ミョウバン相との反応により、４℃で２年間保管した後でも高いタンパク質捕捉能力をもつ、かなり安定したシステムが生じていた（表５及び６）。調製後２年保管したシステムの捕捉能力は、調製直後のシステムの能力に匹敵していた（表５）。
【００４６】
【表５】
2004512352.tif 000007
【００４７】
表５に示した比率は、当初の使用量に対する、捕捉されたままのタンパク質の量から計算している。
【００４８】
タンパク質結合能力は、最初に添加したタンパク質のうちでシステムに完全に取りこまれたタンパク質の量として明示されている。異なる量のタンパク質をシステムの部分標本と混合し、等量のメタノール／クロロホルムで抽出した後、ＢＣＡタンパク質アッセイを利用して上清液中のタンパク質の量と最初に添加したタンパク質の量とを比較することにより、捕捉されたタンパク質を評価した。
【００４９】
調製２年後のシステムは、ミョウバンよりも高い捕捉能力を示した（表６）。
【００５０】
【表６】
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【００５１】
表６に示した比率は、当初のタンパク質使用量に対する、捕捉されたタンパク質の量から計算している。
【００５２】
負荷電タンパク質を捕捉するのに加え、かかるシステムは正荷電タンパク質も大量に保有している（表７）。
【００５３】
【表７】
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【００５４】
表７に示した比率は、当初のタンパク質使用量に対する、システム中で捕捉されたタンパク質の量から計算している。
【００５５】
本発明のデリバリーシステムはきわめて多量のインフルエンザワクチンを高濃度で捕捉することができた（表８）。
【００５６】
【表８】
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【００５７】
ＢＣＡタンパク質アッセイを利用して評価した、１．２５ｍｇの全タンパク質を含むインフルエンザワクチン溶液についての実験をここで行った。表５に記載のとおり、捕捉タンパク質を測定した。
【００５８】
異なる温度（４℃、２５℃、３７℃及び６０℃）でのインキュベーションをＰＢＳ中で３週間行った後の、システムからのタンパク質放出結果により、ＢＳＡなどのタンパク質の捕捉に関するシステムの安定性を確認した（表９）。
【００５９】
【表９】
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【００６０】
表９では、１２．５ｍｇのタンパク質を捕捉したアジュバントシステムの部分標本を、表示の温度で３日間インキュベーションして、上清液中に放出されたタンパク質を上述のとおりＢＣＡタンパク質アッセイを利用して評価した。
【００６１】
安定性は、当初の結合タンパク質に対する残存する結合タンパク質の比率で表されている。
使用したすべてのインキュベーション温度について、３日後、１週間後、２週間後、及び３週間後に、安定的なタンパク質捕捉が認められた（表９〜１２）。アジュバントシステムの捕捉能力は、過剰量のタンパク質の存在下で、インキュベーション温度に応じて不可逆的に増大すると思われる（表１０〜１２）。なぜなら、４℃で長期間（３週間）保存した後のサンプルからは、タンパク質の放出が観察されなかったからである。かかるアジュバントシステムは、大量のタンパク質を捕捉するのに加え、ＤＮＡに対してはさらに高い捕捉能力を示していた。
【００６２】
【表１０】
2004512352.tif 000012
【００６３】
表１０に示したアッセイは、異なる量のＢＳＡを混合したアジュバントシステムの部分標本を用いたこと以外は、表９に示したアッセイと同様に行われた。
【００６４】
【表１１】
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【００６５】
【表１２】
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【００６６】
表１２に示したアッセイは、異なる量のＢＳＡを混合したアジュバントシステムの部分標本を用いたこと以外は、表９に示したアッセイと同様に行われた。
【００６７】
本発明のシステムに捕捉されたタンパク質は、図１１に示すように、２年間保管した後でさえ完全性を保っていた。
図１１は、システムを４℃で２年間保管した後の、捕捉されたＢＳＡの完全性を示している。最初に異なる濃度のＢＳＡと混合しておいた１０μｌのシステム懸濁液と、２５．００ｍｇ、１２．５ｍｇ、６．２５ｍｇ、３．１２ｍｇの標準レーン（Ｂｉｏｒａｄ社の高分子量標準物）を、クーマシーブルーでの染色後、かつ１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの分析前に、ＳＤＳサンプル緩衝液中で１／２に稀釈した（レーン６〜９）。対応する同量の遊離ＢＳＡ（レーン２〜５）をコントロールとして使用した。
【００６８】
低濃度では、タンパク質はシステム中に強力に捕捉されたが、高濃度では、タンパク質の一部分がシステム中にゆるやかに捕捉された。強力に捕捉されたタンパク質がゲル内に入り込むことはなかった。ゆるやかに捕捉されたタンパク質部分だけが、ゲル内に入り込んでいった。
【００６９】
４℃で２年間保管した場合と、調製直後の場合とで、本発明のシステムの物理化学的特性に関する結果を比較したところ、かかるシステムが非常に安定したデリバリーシステムであり、ＢＳＡをモデルタンパク質として使用して４℃で２年間保管した後も高いタンパク質捕捉能力を有していることが、はっきりと示された。かかるシステムは、相分離も、クリーム化も凝集も示さなかった。正荷電無機相と相互作用する負荷電有機エマルジョンを、その相互作用を介して安定させた。
【００７０】
ＢＳＡ、インフルエンザワクチン及びＤＮＡの結果に示されたように、かかるシステムは、等量の高分子溶液と荷電高分子とを混ぜ合わせるだけで、どの荷電高分子も容易に捕捉した。かかるシステムが２年以上安定しているという事実及び臨床的に認可されている材料から広く許容されている薬学的手順を利用して調製されたという事実は、ＦＤＡからの認可取得及び薬学的要件を満たすことに関してかなり有利であることを示すものである。
【００７１】
これらの結果を考慮すると、本発明のシステムは、荷電のみに基づいた高い捕捉能力を有する非常に安定したシステムであると結論づけられる。
ここまで本発明を特定の実施例と関連させて記載してきたが、さらなる改良が可能であること、並びにこうした応用が、一般的に本発明の原則にしたがっている本発明のあらゆるバリエーション、使用、又は改作物をもカバーすること、及び、本件の開示内容を逸脱するものであっても、本発明が属する分野において周知の方式又は習慣的な方式であって、これまで述べてきた基本的特徴及びクレームの範囲に応用されるようなものの場合は、それも含むことを意図するものであることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の好ましい実施形態にしたがい、デリバリーシステムの標的有機相を調製するために行った、各種静電気的中性油の実験結果を示すものである。
【図２】
図２は、４２０日間４℃で保管した、本発明の好ましい実施形態に基づくデリバリーシステムのスクワランエマルジョン標的相の小滴粒度分布を示すものである。
【図３】
図３Ａ及び３Ｂは、拡大率１０．５Ｋ（図３Ａ）及び５１Ｋ（図３Ｂ）で有機相の小滴形状及び粒度分布を示している電子顕微鏡写真を示すものである。
【図４】
図４は、本発明のデリバリーシステムの好ましい実施形態の捕捉相において使用したミョウバンの量を評価するのに使用されたグラフを示すものである。
【図５】
図５は、本発明の１つの実施形態に基づくデリバリーシステムの拡大率３．３Ｋ（図５Ａ）及び５１Ｋ（図５Ｂ）での電子顕微鏡写真を示すものである。
【図６】
図６は、好ましいデリバリーシステムのタンパク質捕捉効率を、タンパク質濃度の関数として、有機相（図６Ａ）又は無機相（図６Ｂ）と関連させて示すものである。
【図７】
図７は、本発明のデリバリーシステムの好ましい実施形態が有する捕捉能力の比率を、添加したタンパク質の濃度と関連させて示すものである。
【図８】
図８Ａ及び８Ｂは、各種タンパク質に対して本発明のデリバリーシステムの好ましい実施形態が有する捕捉能力（図８Ａ）、及びマイクロ流動と手動混合による捕捉方法との比較（図８Ｂ）を示すものである。
【図９】
図９Ａ及び９Ｂは、筋肉内注入から２４時間後のＢａｌｂ／Ｃマウスにおける、遊離抗原及び捕捉抗原の組織分布比較（図９Ａ）、並びに空の（ｂａｒｅ）デリバリーシステム（図９Ｂ）の組織分布を示したものである。
【図１０】
図１０Ａ及び１０Ｂは、５０％のウシ胎児血清を含む培地でインキュベーションした後の、３７℃での抗原（図１０Ａ）及びデバイス（ｄｅｖｉｃｅ）標的相（図１０Ｂ）の放出における時間経過を示したものである。
【図１１】
図１１は、システムを４℃で２年間保管した後の、捕捉されたＢＳＡの完全性を示しているＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを表すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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