(57)【要約】細胞プロセスに関与する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法であって、以下：（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；及び（ｂ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、前記細胞プロセスに関係する生物学的分子を含む、遺伝子発現を比較する工程；及びその発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含み、前記関心のある第１及び／又は第２細胞内の遺伝子発現が、前記細胞プロセスに関連する少なくとも２種の異なる環境条件下で比較される方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞プロセスに関与する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法であって、以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；及び
（ｂ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、前記細胞プロセスに関係する生物学的分子を含む、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含み、前記関心のある第１及び／又は第２細胞内の遺伝子発現が、前記細胞プロセスに関連する少なくとも２種の異なる環境条件下で比較される方法。
【請求項２】
遺伝子発現が、前記関心のある第１及び第２の両細胞内で、前記細胞プロセスに関連する少なくとも２種の異なる環境条件下で比較される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）第１タイプの環境変化にさらされた前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）第２タイプの環境変化にさらされた前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現；及び
（ｄ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、該細胞が前記第１及び／又は第２タイプの環境変化にさらされた、又はさらされていない条件下で、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性がｂ）及びｃ）記載の環境変化の一方又は両方に応答性である生物学的分子を含む、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記異なる環境条件が、異なるレベルの生物学的シグナルである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、前記生物学的シグナルが第１レベルである、遺伝子発現；
（ｃ）細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、前記生物学的シグナルが第２レベルである、遺伝子発現；及び
（ｄ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性が前記生物学的シグナルに対して応答性である生物学的分子を含み、前記シグナルが第１レベル又は第２レベルで不在である、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）該細胞が、前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｃ）前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第１細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性が前記生物学的シグナルに応答性である生物学的分子を含み、この生物学的分子の変化したレベルが第１レベルであり、かつ前記生物学的シグナルが存在するか又は不在である、遺伝子発現；
（ｄ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現；
（ｅ）該細胞が、前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第２細胞内の遺伝子発現；
（ｆ）前記関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの生物学的分子を含み、この生物学的分子の変化したレベルが第２レベルであり、かつ前記生物学的シグナルが存在するか又は不在である、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）該細胞が、前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｃ）前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、第１ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第１細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性が前記生物学的シグナルに応答性である第１生物学的分子を含み、前記生物学的シグナルが存在するか又は不在である、遺伝子発現；
（ｄ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現；
（ｅ）該細胞が、前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第２細胞内の遺伝子発現；
（ｆ）前記関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、第２ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの第２生物学的分子を含み、前記生物学的シグナルが存在するか又は不在である、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
その発現がシグナルによって制御される遺伝子又は遺伝子産物を同定するための差次的発現スクリーニング法であって、前記シグナルの２つの異なるレベルで、以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、前記シグナルが第１レベルである遺伝子発現；及び
（ｂ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性が前記シグナルに対して応答性である生物学的分子を含み、前記シグナルが第２レベルである、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝子又は遺伝子産物を同定する工程を含む方法。
【請求項９】
前記第１及び第２細胞が異なる細胞型である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的分子のレベルが、生理的レベルに比べて増強されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的分子のレベルが、生理的レベルに比べて低減されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的分子と前記ポリペプチドが同一である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種核酸が、ウイルスベクターによって導入される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス（ウマ伝染性貧血ウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｎａｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（ＥＩＡＶ））又はヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のような）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はポックスウイルス（エントモポックスのような）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子発現がプロテオミックス技法で決定される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子発現がゲノム又はｃＤＮＡ技法で決定される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記関心のある第１細胞が、正常な生理的レベルの前記生物学的分子を有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが細胞プロセスに関与する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１細胞が正常患者由来であり、かつ前記第２細胞が病気患者由来である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１細胞が病気患者由来であり、かつ前記第２細胞が同一の病気患者由来である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝的要素が遺伝子、遺伝子産物又は制御要素である、請求項１〜７、及び９〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
病気プロセスに関与する遺伝子産物を同定するための差次的発現スクリーニング法であって、以下：
（ｉ）以下：
（ａ）関心のある第１細胞；及び
（ｂ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現を比較する工程；
（ｉｉ）以下：
（ａ）前記関心のある第１細胞；及び
（ｂ）関心のある第３細胞であって、該細胞が、候補遺伝子産物の発現を指揮する異種核酸の該第３細胞中への導入のため、生理的レベルと比べて変化したレベルの候補遺伝子産物を含む細胞内の遺伝子発現を比較する工程；及び
（ｉｉｉ）前記関心のある第１細胞に比べて、前記関心のある第３細胞内における第２遺伝子産物の発現レベルの変化を惹起する、当該候補遺伝子産物を選択する工程であって、該第２遺伝子産物も、前記関心のある第１細胞に比べて前記関心のある第２細胞内における発現のレベルを変化させている、工程を含む方法。
【請求項２３】
前記候補遺伝子産物がポリペプチドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子発現の比較が、核酸技法を用いて、そのレベルが前記関心のある第１細胞と前記関心のある第２細胞との間、及び前記関心のある第１細胞と前記関心のある第３細胞との間で変化している、当該ｍＲＮＡ転写物を同定することによって行われる、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子発現の比較が、タンパク質解析手順を用いて、そのレベルが前記関心のある第１細胞と前記関心のある第２細胞との間、及び前記関心のある第１細胞と前記関心のある第３細胞との間で変化している、当該ポリペプチドを同定することによって行われる、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子産物がシグナルによって制御され、かつ遺伝子発現が、該シグナルの２種の異なるレベルの前記細胞内で比較される、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
シグナルの２つの異なるレベルに応じて、関心のある第１及び第２細胞の遺伝子発現が比較される差次的発現スクリーニング法の感度を高める方法であって、前記第１細胞又は前記第２細胞中に異種核酸を導入して、前記シグナルに対する該細胞の応答を調節する生物学的分子のレベルを高める工程を含む方法。
【請求項２８】
前記異種核酸が、以下：ＨＩＦ１α、ＥＰＡＳ１、膜結合型のＩＬ５αレセプター、可溶性型のＩＬ５αレセプター、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ、ＦａｓＬ、ＮＧＦ、ＧＤＮＦ、熱ショックタンパク質（ＨＳＰｓ）、ＡＰＰ、プレセニリン１、プレセニリン２、α−シヌクレイン、タウ、パーキン（Ｐａｒｋｉｎ）及びユビキチンからなる群より選択される生物学的分子をコードする、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１ポリペプチドがＨＩＦ−１αであり、かつ前記第２ポリペプチドがＥＰＡＳ１である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、差次的発現による遺伝子のスクリーニングの方法に関するものである。
発明の背景
遺伝子の発見分野における中心的な目標の１つは、特定の病状と、この病状を定義し及び／又は原因となる遺伝子発現パターンとの間の関係を理解かつ解明することである。このような方法で、病気の診断又は治療にとって大いに医学的に重要な可能性のある遺伝子を同定することができる。このような遺伝子の産物は、直接治療学として有用であり、遺伝子自体は遺伝子治療に利用でき、又はこれら遺伝子の発現又は効力を調節して病気を治療するための小分子エフェクターを見出すことができる。研究は、病気組織と健康組織との間の発現パターンの相異に焦点を当て、病気の生理的メカニズムを解明してきた。発現パターンの同定された相異は、病気の表現型を逆転させるための治療的介入の推定点を提供する。これら相異は、診断に有用なマーカーをも提供し、かつ問題の病気に関係する薬剤としてさらなる研究用のタンパク質を同定する。
【０００２】
遺伝子発現の差次的スクリーニング法は、本技術で周知な一技法であり、差引きｃＤＮＡクローニング法を伴うことが多く、ある範囲の細胞プロセスに関与する遺伝子を同定するのにうまく使用されている。差次的スクリーニングは、一般的に、ｍＲＮＡ発現のレベルが決定される核酸に基づく方法か、又は細胞の全タンパク質含量が２Ｄゲル電気泳動のような技法によって解明されるプロテオミックスアプローチを用いて行われる。
ＤＮＡチップ技術に基づく方法でさえ、今日まで公知の差次的スクリーニング法の問題の１つは、関心のある遺伝子産物の絶対的レベル、及び／又は２つの特定状態（例えば、成長因子の存在下と不在下又は異なる細胞型内）間の当該遺伝子産物の発現の差がかなり低いことである。結果として、いくつかの非常に重要な遺伝子は、標準的な差次的発現スクリーニング法で今日までに同定されているが、細胞プロセスで重要な役割を演じる多くの遺伝子は、それらの発現レベルが低いため又は発現レベルの観察可能な変化が相対的に小さいので、同定するのが困難である。
差次的スクリーニングの従来法で煩わされているさらなる問題は、これら方法では、研究している遺伝的又は生化学的経路の精査をできないことである。同定される遺伝子発現のいずれの変化も、研究中の経路の特定局面に特異的というよりはむしろ全体的である。従って、本技術では、生物学的経路の分子精査を容易にする方法が要望されている。
【０００３】
発明の概要
従って、本発明の目的は、差次的発現に基づく改良されたスクリーニング法を提供することである。
本発明の第１局面では、細胞プロセスに関与する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法が提供され、この方法は、以下：
（ａ）関心のある第１細胞；及び
（ｂ）関心のある第２細胞であって、異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの生物学的分子を含む第２細胞内の遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む。
【０００４】
用語“遺伝的要素”は、遺伝子、遺伝子産物（ＲＮＡ分子、及びポリペプチドのような）、シス作用制御要素（プロモーター要素及びエンハンサー要素のような）を包含する意である。本方法は、評価すべきこれら分子型のいずれの発現パターンの相異をも許容し、かつ研究している細胞プロセスに照らして生物学的文脈に表す。本方法は、例えば特定の細胞プロセスに対する生物学的応答に影響する突然変異及び多形性を同定するために研究すべき構成遺伝的要素の相異をも許容する。
【０００５】
一実施形態では、関心のある第１細胞は、生理的レベルに比べて変化したレベルの生物学的分子をも含む。しかし、代替実施形態では、関心のある第１細胞は、正常の生理的レベルの生物学的分子を有する。生物学的分子は、機能的に特徴づけられ、又は完全には特徴づけされない。
典型的に、関心のある第２細胞内では、生物学的分子のレベルは、増強又は低減されている。好ましい実施形態では、生物学的分子及び異種核酸によってコードされるポリペプチドは同一分子である。ポリペプチドは、機能的に特徴づけされ、又は完全には特徴づけされない。
【０００６】
好ましくは、核酸はポリペプチドの発現を指揮する。好ましくは、異種核酸によってコードされるポリペプチドは、細胞プロセスに関与する。“細胞プロセスに関与する”とは、該遺伝子が細胞内の遺伝的又は代謝経路において明確な役割を有することが分かっていることを意味する。ポリペプチドは、特定の病気の表現型又は生理的条件への感受性、その発生、又は維持に関与しうる。熟練した読者にとっては明らかなように、如何なる経路の如何なる点も、細胞が正常な生理的応答から逸脱し、かつ病気の表現型を発生させる特異点でありうる。病気として明らかにされている効果は、突然変異事象の結果であることが多く、突然変異は、関連する生理学的経路内で機能するタンパク質をコードする遺伝子の配列内で生じる。
【０００７】
好ましくは、核酸はウイルスベクターによって細胞に送達される。この場合、異種核酸は、ウイルスベクターと共に線状に伸びるべきである。熟練した読者は理解するように、異なるウイルスベクターが種々の細胞型に適する。本発明に従って使用するのに好ましいウイルスベクターは、レトロウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｎａｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（ＥＩＡＶ））又はヒト免疫不全症ウイルス、１型（ＨＩＶ−１）のようなレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びエントモポックスのようなポックスウイルスから誘導される。
【０００８】
本発明の目的のためのウイルスベクターの好ましい特徴は、標的細胞を形質導入するのに有効な能力、及びウイルスベクター自体の使用に原因しうるが、関心のある異種核酸の導入に特に無関係に駆け抜ける遺伝子発現の如何なる混乱をも最小にする能力（“表現型の沈黙”）である。ウイルス媒介遺伝子伝達の技術の当業者にとっては明らかなように、この分野は急速に進歩しており、種々の細胞型に好ましいベクターは該分野の進歩につれて変化している。例えば、本明細書を書いている時点では、マクロファージの形質導入に好ましいベクターは、最高の可能レベルの形質導入ができるので、アデノウイルスベクターである。このベクターは、表現型のサイレントな形質導入はできないが、適切なコントロールによって細胞性遺伝子発現に及ぼすベクターの効果を排除することができる。他方、レンチウイルスＥＩＡＶ由来のベクターは、表現型のサイレントな形質導入が可能であり、海馬神経細胞で最高の有用な形質導入を与えるので、当該用途で選択されるベクターである。ベクターの表現型の沈黙は常に望まししいが、形質導入効率によって釣り合わせなければならない。本明細書に包含される実施例で述べられるベクター開発は、記載細胞型のこれら２つの特徴の最適化に向けられている。ベクター技術の分野の当業者にとっては明らかなように、本発明は、ベクター型には無関係であるが、その実行は、各細胞型にとって最適なベクターの選択によって向上させることができる。
【０００９】
一般的に、第１及び第２細胞内の遺伝子発現は、プロテオミック技法を用いて、又は核酸に基づいたゲノム若しくはｃＤＮＡ技法を用いて決定される。
本発明の第１局面の好ましい実施形態では、細胞プロセスに関与する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法が提供され、
この方法は、以下：
（ａ）関心のある第１細胞；及び
（ｂ）関心のある第２細胞であって、異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの生物学的分子を含む第２細胞内の遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む。
好ましくは、核酸はポリペプチド、例えば、上述したように、細胞プロセスに関与するポリペプチドの発現を指揮する。
【００１０】
第２局面では、本発明は、その発現がシグナルによって制御される遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法が提供され、
この方法は、前記シグナルの２つの異なるレベルで、以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、前記シグナルが第１レベルである遺伝子発現；及び
（ｂ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性が前記シグナルに対して応答性である生物学的分子を含み、前記シグナルが第２レベルである、遺伝子発現を比較する工程；及びその発現が異なる遺伝子又は遺伝子産物を同定する工程を含む。
【００１１】
本発明の第３局面では、細胞プロセスに関与することが分かっているか、又は疑われるポリペプチドを用いて、細胞内の当該ポリペプチドのレベルを変えることによって、同一プロセスの他成分を同定し、差次的発現法による同定をより容易にする、同定すべき当該他成分のレベルのノイズ比に対して改良されたシグナルを生成する。
従って、本発明は、その発現が細胞プロセス内で変化する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法をも提供し、
この方法は、以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；及び
（ｂ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が修飾されて、前記細胞プロセスに関係するポリペプチドの変化したレベルを含む、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む。
好ましくは、ポリペプチドの変化したレベルは、該細胞中への、細胞内におけるポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の導入のためである。さらに好ましくは、異種核酸はウイルスベクターと共に線状に伸びる。
【００１２】
本発明の第３局面の好ましい実施形態では、遺伝的要素の発現が生物学的シグナルによって制御され、かつ本方法は、該シグナルの２つの異なるレベルで、２つの細胞型内の遺伝子発現を比較する工程を含む。
従って、本発明のこの局面は、細胞プロセスに関与する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；及び
（ｂ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、前記細胞プロセスに関係する生物学的分子を含む、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む方法であって、前記関心のある第１及び／又は第２細胞内の遺伝子発現が、該細胞プロセスに関連する少なくとも２つの異なる環境条件下で比較される。好ましくは、遺伝子発現は、関心のある第１及び第２の両細胞内で、該細胞プロセスに関連する少なくとも２つの異なる環境条件下で比較される。
【００１３】
細胞がさらされうる環境条件は、一例では、異なるレベルの生物学的シグナルである。２つの細胞型内の遺伝子発現は、シグナルが不在、第１レベルで存在、及び／又は第２レベルで存在する（例えば、正酸素［２０％酸素］と低酸素［＜１％酸素］との間の異なるパーセンテージの雰囲気酸素含量）。少なくとも２レベルの生物学的シグナルの使用は、環境条件の変化、及び当該細胞型についての異種核酸の影響の比較、及びその発現が、生物学的シグナルと試験環境条件のレベル間で、同一の様式、又は異なる様式で振る舞う遺伝的要素の同定を可能にする。当然に、同一の様式で、異なるタイプの環境変化、細胞型及び異種核酸を有する２レベルより多くの生物学的シグナルを適用することができる。
【００１４】
従って、本発明のこの局面の一実施形態は、細胞プロセスに関与する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、前記生物学的シグナルが第１レベルである、遺伝子発現；
（ｃ）前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、前記生物学的シグナルが第２レベルである、遺伝子発現；及び
（ｄ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性が生物学的シグナルに対して応答性である生物学的分子を含み、前記シグナルが第１レベル又は第２レベルで不在である、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む。
【００１５】
本発明のこの局面のこれとは別の実施形態では、細胞がさらされる環境条件が、種々のタイプの環境変化である（例えば、細胞がさらされる異なる成長因子のレベルの変化）。２つの環境変化の使用は、各環境変化及び各細胞型についての異種核酸の影響の比較、及び試験される環境変化間で、同一の様式、又は異なる様式で、その発現が振る舞う遺伝的要素の同定を可能にする。２つより多くの環境変化を、各細胞型及び各異種核酸と共に同一の方法で適用できる。
【００１６】
従って、本発明のこの局面は、細胞プロセスに関与する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）第１タイプの環境変化にさらされた、前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）第２タイプの環境変化にさらされた、前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現；及び
（ｄ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、該細胞が前記第１及び／又は第２タイプの環境変化にさらされた、又はさらされていない条件下で、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性がｂ）及びｃ）記載の環境変化の一方又は両方に応答性である生物学的分子を含む、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む。
【００１７】
本発明の上記実施形態では、第１細胞は、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性が環境変化間の相異に応答性である生物学的分子をも含みうる。
第１細胞内の生物学的分子は、そのレベルが第２細胞内で変化している生物学的細胞と同一でよい。この実施形態では、第１及び第２細胞内における該生物学的分子のレベルは、異なっているべきである。
【００１８】
従って、本発明のこの局面は、細胞プロセスに関与する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）該細胞が、前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｃ）前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第１細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性が該生物学的シグナルに応答性である生物学的分子を含み、この生物学的分子の変化したレベルが第１レベルであり、かつ前記生物学的シグナルが存在するか又は不在である、遺伝子発現；
（ｄ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現；
（ｅ）該細胞が、前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第２細胞内の遺伝子発現；
（ｆ）前記関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの生物学的分子を含み、この生物学的分子の変化したレベルが第２レベルであり、かつ前記生物学的シグナルが存在するか又は不在である、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む。
【００１９】
異種核酸の２レベルの発現の使用は、各レベル及び各細胞型についての生物学的シグナルの効果の比較、及び試験すべきそれらレベル及び生物学的シグナル間で、その発現が同一様式、又は異なる様式で振る舞う遺伝的要素の同定を可能にする。異種核酸の発現の２つより多くのレベルは、各細胞型及び各生物学的シグナルと共に同一方法で適用できる。
これとは別に、第１細胞内の生物学的分子は、そのレベルが第２細胞内で変化している生物学的分子と異なる生物学的分子でよい。この実施形態では、第１及び第２細胞内の生物学的分子のレベルは、同一又は異なってよい。
【００２０】
従って、本発明のこの局面は、細胞プロセスに関与する遺伝的要素を同定するための差次的発現スクリーニング法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｂ）該細胞が、前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現；
（ｃ）前記関心のある第１細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、第１ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第１細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの、その活性が前記生物学的シグナルに応答性である第１生物学的分子を含み、前記生物学的シグナルが存在するか又は不在である、遺伝子発現；
（ｄ）関心のある第２細胞内の遺伝子発現；
（ｅ）該細胞が、前記細胞プロセスに関連する生物学的シグナルにさらされた、前記関心のある第２細胞内の遺伝子発現；
（ｆ）前記関心のある第２細胞内の遺伝子発現であって、該細胞が、第２ポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の該第２細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの第２生物学的分子を含み、前記生物学的シグナルが存在するか又は不在である、遺伝子発現を比較する工程；及び
その発現が異なる遺伝的要素を同定する工程を含む。
【００２１】
２タイプの異種核酸の使用は、タイプ及び各細胞型についての生物学的シグナルの効果の比較、及びそれらタイプ及び生物学的シグナル間で、その発現が同一様式、又は異なる様式で振る舞う遺伝的要素の同定を可能にする。２つより多くのタイプの異種核酸は、試験される各細胞型及び各生物学的シグナルと共に同一方法で適用できる。本発明のこの局面は、特定の環境変化の下で異なる生物学的分子によって差次的に制御される遺伝子の発見を可能にした。これは、細胞応答の組織及び細胞特異性治療的調節の可能性を高める。
【００２２】
すべての上記実施形態では、その遺伝子発現が比較される第１及び第２細胞は、異なる細胞型でよい（例えば、健康細胞と病気細胞）。２つ以上の細胞型の使用は、異なる生物学的シグナル及びそれら細胞型についての異種核酸の効果の比較、及び試験されるそれら細胞型及び生物学的シグナル間で、その発現が同一様式で、又は異なる様式で振る舞う遺伝的要素の同定を可能にする。
本発明の好ましい実施形態では、ポリペプチドは病気プロセスに関係している。従って、第１細胞が正常患者由来であり、第２細胞が病気患者由来又はその逆でよい。代わりに、第１細胞が病気患者由来であり、第２細胞が同一の病気患者由来か又は同一の病気の患者由来である。
【００２３】
従って、本発明のさらなる局面は、細胞プロセスに関与する遺伝子又は遺伝子産物を同定するための差次的発現スクリーニング法を提供し、この方法は、以下を含む：
（ｉ）以下：
（ａ）関心のある第１細胞；及び
（ｂ）関心のある第１細胞内の遺伝子発現を比較する工程；
（ｉｉ）以下：
（ａ）前記関心のある第１細胞；及び
（ｂ）関心のある第３細胞であって、該細胞が、候補遺伝子又は遺伝子産物の増幅又は発現を指揮する異種核酸の該第３細胞中への導入のため、生理的レベルと比べて変化したレベルの候補遺伝子又は遺伝子産物を含む細胞内の遺伝子発現を比較する工程；及び
（ｉｉｉ）前記関心のある第１細胞に比べて前記関心のある第３細胞内における第２遺伝子又は遺伝子産物のレベル、コピー数又は発現の変化を惹起する当該候補遺伝子又は遺伝子産物を選択する工程であって、第２遺伝子又は遺伝子産物も、前記関心のある第１細胞に比べて前記関心のある第２細胞内におけるレベル、コピー数又は発現を変化させている、工程を含む。
好ましくは、候補遺伝子産物はポリペプチド又はＲＮＡ分子である。
【００２４】
本発明の上記局面の好ましい実施形態では、病気プロセスに関与する遺伝子産物を同定するための差次的発現スクリーニング法が提供され、この方法は、以下を含む：
（ｉ）以下：
（ａ）正常患者由来の関心のある第１細胞；及び
（ｂ）病気患者由来の関心のある第２細胞内の遺伝子発現を比較する工程；
（ｉｉ）以下：
（ａ）前記関心のある第１細胞；及び
（ｂ）正常患者由来の関心のある第３細胞であって、該細胞が、候補遺伝子又は遺伝子産物の増幅又は発現を指揮する異種核酸の該第３細胞中への導入のため、生理的レベルに比べて変化したレベルの候補遺伝子又は遺伝子産物を含む細胞内の遺伝子発現を比較する工程；及び
（ｉｉｉ）前記関心のある第１細胞に比べて前記関心のある第３細胞内における第２遺伝子又は遺伝子産物のレベル、コピー数又は発現の変化を惹起する当該候補遺伝子又は遺伝子産物を選択する工程であって、第２遺伝子又は遺伝子産物も、前記関心のある第１細胞に比べて前記関心のある第２細胞内におけるレベル、コピー数又は発現を変化させている、工程を含む。
【００２５】
本発明のこの局面の特に好ましい実施形態では、遺伝子産物の発現は、好ましくはシグナル（病気プロセスに関与する生物学的又は他の環境シグナルのような）によって制御され、かつ本方法は、該シグナルの２つの異なるレベルにおける該細胞型内の遺伝子発現を比較する工程を包含する。
上述した本発明の実施形態では、遺伝子発現の比較は、核酸技法を用いて、そのレベルが関心のある異なる細胞型間で変化しているｍＲＮＡ転写物を同定することによって行われる。
本発明のさらに別の局面によって、シグナルの２つの異なるレベルに応答する関心のある第１及び第２細胞の遺伝子発現が比較される、差次的発現スクリーニング法の感度を高める方法であって、前記第１細胞又は前記第２細胞中に異種核酸を導入して、前記シグナルに対する該細胞の応答を調節する生物学的分子のレベルを高める工程を含む方法が提供される。
【００２６】
発明の詳細な説明
一般的に本明細書で述べる方法は技術的に周知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋら，分子クローニング，実験マニュアル（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら，分子生物学のショートプロトコル（１９９９）第４版，Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃを参照することができる。
特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術の当業者が普通に理解するのと同一の意味を有する。
【００２７】
Ａ．差次的発現スクリーニング法
遺伝子は、主にポリペプチドであるがＲＮＡｓでもある遺伝子産物をコードし、それら遺伝子産物は、莫大な多様性の細胞プロセスに関与している。差次的発現スクリーニングという技法は、２セットの条件下における発現を比較することによって、その２つの条件間でその発現が変化する遺伝子と、それら条件間の相異に応じて関連するそれら遺伝子の機能を同定しうるという考えに基づいている。例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のようなミトゲンに応答性の経路に関与する遺伝子は、ＰＤＧＦにさらされない細胞内の遺伝子発現に対するＰＤＧＦにさらされた細胞内の遺伝子発現を比較することによって同定することができる。
【００２８】
従って、本明細書で用いる場合、用語“差次的発現スクリーニング”は、異なる条件下の２つの細胞間、又は同一若しくは異なる条件下の２つの異なる細胞間の遺伝子発現を、その２つの細胞間の発現のレベルが異なる遺伝子又は遺伝子産物を同定する目的で比較することを意味する。
遺伝子発現の相異は、種々の方法を用いて測定しうる。第１の主要タイプの技法は、核酸の測定に基づき、本明細書では“ゲノム又はｃＤＮＡ技法”と呼ばれる。有用なレビューは、Ｋｏｚｉａｎ及びＫｉｒｓｃｈｂａｕｍ（１９９９）に提供されている。第２の主要タイプの技法は、細胞のタンパク質含量の測定に基づき、本明細書では“プロテオミック技法”と呼ばれる。
【００２９】
ゲノム又はｃＤＮＡ技法
本技術で周知の一方法は、差引きｃＤＮＡハイブリダイゼーションである。この方法は、ある細胞（例えば、対照細胞）由来のｍＲＮＡ集団を、別の細胞（例えば、ＰＤＧＦにさらされた細胞）のｍＲＮＡから生じたｃＤＮＡｓ集団とハイブリダイズする工程を含む。この工程は、ｃＤＮＡ標本から両細胞に共通する全配列を除去する。ＰＤＧＦにさらされた細胞内で、その発現が上方制御されるｍＲＮＡｓ由来のｃＤＮＡｓは、ハイブリダイズさせて単離できる対照由来の対応するｍＲＮＡを持たない。典型的には、ｃＤＮＡｓは、同一細胞由来のｍＲＮＡともハイブリダイズされ、それらがコード配列を示すことを確証する。この手順は、ＷＯ９０／１１３６１に詳述されており、薬品、Ｎ−（アミノカルボニル）−２−クロロベンゼンスルホンアミドで処理された植物の根からの細胞由来のｍＲＮＡが使用され、未処理の根細胞由来のｍＲＮＡとハイブリダイズされたｃＤＮＡライブラリーが生成される。本手順は、その発現が該薬品によって上方制御される遺伝子の数を同定した。
【００３０】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、多くの他の方法の発展を招来した。ＲＴ−ＰＣＲ差次的ディスプレイは、Ｌｉａｎｇ及びＰａｒｄｅｅ（１９９２）によって最初に記述された。この技法は、異なる細胞集団由来の逆転写ＲＮＡについてＰＣＲを行うためのオリゴ−ｄＴプライマー及びランダムなオリゴヌクレオチド１０−ｍｅｒｓの使用を含む。ＰＣＲは、放射能標識したヌクレオチドを用いて行うことが多いので、その産物はゲル電気泳動法及びオートラジオグラフィ後に可視化することができる。Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら（１９９５）は、ＰＣＲ差次的ディスプレイを用いて、成熟中のイチゴ果実内で上方制御される５つのｍＲＮＡｓを同定した。差次的ディスプレイＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡの差次的ディスプレイとしても知られる）のレビューは、Ｚｈａｎｇら（１９９８）に提供されており、Ｚｈａｎｇら（１９９９）には、‘長距離’ＰＣＲを用いた最近の改良について述べられている。
【００３１】
別の技法は、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングと呼ばれる。この技法のレビュー及び上記他の２つの差次的発現スクリーニング法は、Ｍａｓｅｒ及びＣａｌｖｅｔ（１９９５）に提供されている。
差次的ディスプレイ競合ＰＣＲは、かなり最近の革新であり、エストラジオールへのＭＣＦ１７細胞の露出のような、２〜３の遺伝子のみが発現レベルを変える状況、及びヒトＮＴＥＲＡ２細胞の神経細胞分化のような、より複雑な状況における全体的な遺伝子発現の変化を研究するために使用して成功した（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら，１９９９）。
【００３２】
特有の細胞型に転写物の解析に好適な他の技法としては、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ：Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２７０；４８４−４８７）、ビオチン−及び制限酵素−媒介富化による選択的増殖（ＳＡＢＲＥ）（Ｌａｖｅｒｙら，（１９９７），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：ｐ６８３１−６８３６）；差次的ディスプレイ（例えば、差次的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を指標する（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ；Ｍａｈａｄｅｖａら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４，１３９１−１３９８））；表現相異解析（ＲＤＡ）（Ｈｕｂａｎｋ（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３０３：３２５−３４９；レビューのためにＫｏｚｉａｎ及びＫｉｒｓｃｈｂａｕｍ（１９９９）及びその中の参考文献を参照せよ；ｃＤＮＡライブラリーの差次的スクリーニング（Ｓａｇｅｒｓｔｒｏｍら（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：７５１−７８３参照）；“Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｒ．Ｍ．Ｔｗｙｍａｎ（１９９８）Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ｍ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；ノーザンブロット法；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ；Ｓ１−ヌクレアーゼ保護アッセイ；ＲＴ−ＰＣＲ；リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑ−ｍａｎ）；ＥＳＴ配列決定；大量平行署名配列決定（ＭＰＳＳ）；及びハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）（Ｄｒｍａｎａｃ Ｒ．ら（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３０３：１６５−１７８）が挙げられる。これら技法の多くは、“比較遺伝子発現解析”Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．１９９９年２月；１７（２）：７３−８でレビューされている。
【００３３】
その発現が２つの細胞集団間で異なる遺伝子産物の実際の同定は、多くの方法で行うことができる。差引き法は、その発現が同一である遺伝子産物が試料から除去されるので、その発現が異なる遺伝子産物を固有に同定する。他の方法は、単に、ある細胞由来の発現産物を別の細胞由来の発現産物と比較し、かつ任意にコンピュータプログラムを用いて、何らかの相異を捜す工程（ＰＣＲベース技法で、各試料中の産物の数を妥当な大きさに制限できる）を含む。例えば、ＰＣＲベー技法を用いて、異なるレーンに存在するバンドの目視比較すると、あるレーンに特異的なバンドの同定ができる。これらバンドをゲルから切断し、引き続き解析することができる。
【００３４】
ＤＮＡチップ技術の出現は、マイクロアレイの使用によって好都合に比較を行うこを可能にする（レビューのた、Ｋｏｚｉａｎ及びＫｉｒｓｃｈｂａｕｍ，１９９９及びその中の参考文献を参照せよ）。典型的に、アレイはｃＤＮＡｓ（ＥＳＴｓを含む）、ＰＣＲ産物、クローン化ＤＮＡ及びナイロンフィルタ、ガラススライド又はシリコンチップのような基板に固定されている合成オリゴヌクレオチドを用いて生成される。遺伝子発現の相異を決定するため、標識化ｃＤＮＡｓ又はＰＣＲ産物をアレイにハイブリダイズし、かつハイブリダイゼーションパターンを比較する。蛍光標識化プローブの使用は、２つの異なる細胞集団由来のｍＲＮＡを、あるチップについて同時に解析し、その結果を異なる波長で測定することを可能にする。マイクロアレイベースの差次的発現スクリーニング技法は、ＵＳ−Ａ−５，８００，９９２に記載されている。
【００３５】
プロテオミック技法
プロテオミックスは、病気プロセス、細胞プロセス及びタンパク質レベルでのネットワークの全体的な統合された見解を得るための大規模なタンパク質の特性の研究である。プロテオミックスで用いられる技術のレビューは、Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ及びＷｅｉｒ（１９９９）に与えられており、その中の参考文献も参照せよ。本発明の方法は、主に発現プロテオミックス、すなわち電気泳動法及び画像解析を用いてタンパク質を解明することによる細胞内のタンパク質発現の全体的な変化の研究に関連する。核酸解析は遺伝情報を強調するが、プロテオミックスは産物とさらに係わる。プロテオミック技法が、ｍＲＮＡレベルよりもむしろタンパク質の安定性の変化に起因するポリペプチドレベルの変化を検出するのに有用なので、２つのアプローチは、時に補完的である。
【００３６】
プロテオミックスの分野で使用される周知かつ至るところに存在する方法は、２Ｄポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）を用いて細胞のポリペプチド含量を測定する工程と、これを別の細胞のポリペプチド含量と比較する工程を含む。電気泳動法の結果は、典型的には、銀染料又はクーマシーブルーのような染料で可視化されたゲル、又は該ゲルから生成されるオートラジオグラフであり、すべて個々のタンパク質に対応するスポットを有する。蛍光染料も利用できる。
【００３７】
従って、目的は、２つのゲル／オートラジオグラフ間で異なる、すなわち一方から無くなり、強度が減少又は増加するスポットを同定することである。従って、プロテオミックスの場合、遺伝子発現を比較する工程は、単にある細胞由来のタンパク質プロフィルを別の細胞由来のタンパク質プロフィルと比較する工程を含む。商業的なソフトウェアパッケージを自動スポット検出に利用できる。
関心のあるスポットをゲルから切除し、マトリックス補助レーザー脱着イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法及びエレクトロスプレー質量分析法（“遺伝子及びゲノム研究のためのプロテオミックス”Ａｋｈｉｌｅｓｈ Ｐａｎｄｅｙ及びＭａｔｔｈｉａｓ Ｍａｎｎ，（２０００），Ｎａｔｕｒｅ ４０５：８３７−８４６参照）のような方法を用いてタンパク質を同定することができる。
【００３８】
遠心分離又は無担体流動電気泳動法のような前分画のいくつかの測定を行い、低量タンパク質の同定を高めることが望ましい。基礎タンパク質、膜タンパク質及び他の不十分な溶解性のタンパク質のために特有の手順も開発されている（Ｒａｂｉｌｌｏｕｄら，１９９７）。
さらに、タンパク質及び抗体アレイの分野における最近の発展は、今や多数のタンパク質の同時検出を可能にしている。例えば、汎用タンパク質アレイシステム（Ｇｅ Ｈ，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２），ｅ３）のようなフィルタ膜上の低密度タンパク質アレイは、標準的なＥＬＩＳＡ法及び走査型電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器を用いて配列される抗原の画像処理を可能にする。免疫センサーアレイも開発され、臨床分析の同時検出を可能にする。今や、タンパク質アレイを用いて、健康又は病気被験者、及び薬物治療前後の患者の血清のような、体液内のタンパク質発現の分布を測定することができる。
【００３９】
抗体アレイも、病気又は特定の生理状態に関与すると仮定される莫大なタンパク質の広範な平行解析を容易にする。抗体アレイの調製のための多くの方法は、最近報告された（Ｃａｈｉｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００年７月：４７−５１参照）。
上述の議論は、一般的な意味の２つ以上の細胞集団の差次的発現スクリーニングを行うために当業者が入手可能な先行技術の方法の説明を提供している。一般的な遺伝子発現の変化を調査する目的のための異種遺伝子の導入も記載されている（Ｂｕｓｃｈ及びＢｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９ １６２：２５５５−２５６１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９７ ９４：７１７０−７１７５）。しかし、本発明は、これら先行技術の方法とは、さらなる工程が必要な点、すなわちある細胞内の特定の内因性生物学的分子のレベルが実験者によって変えられるので、シグナルを送る事象のような細胞の混乱に応答性であり、かつ生物学的分子によって影響される遺伝子産物のレベルがさらに容易に検出できるようになる点で区別される。他言すれば、目的は、そのレベルが細胞内で低く、及び／又はその発現が少量だけで普通に変化する遺伝子産物を検出するという可能性（有望さ、見込み）を高めるように普通に得られる差次的応答のノイズ比に対するシグナルを増幅及び／又は増やすことである。
【００４０】
例として、転写因子ＨＩＦ−１αは細胞内酸素レベルに応答性である。酸素レベルが減少すると、ＨＩＦ−１α活性が高まり、低酸素応答性要素（ｈｅｐｏｘｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＨＲＥ））によってコントロールされている遺伝子由来の転写の増加となる。細胞内のＨＩＦ−１αのレベルが、例えば、ＨＩＦ−１αの発現を指揮するウイルスベクターで細胞を感染させることによって人為的に高めると、ＨＩＦ−１αで媒介される転写応答の増加が予想される。結果として、その発現が低酸素に感受性であり、かつＨＩＦ−１α誘発で媒介される遺伝子発現の変化は、生理的レベルのＨＩＦ−１αを発現する正常細胞におけるより大きいだろう。
【００４１】
Ｂ．生物学的分子
生物学的分子は、細胞内における同化又は異化プロセスの結果として、又はどんな手段であろうと、細胞外環境からの摂取の結果として細胞内で見出されるいずれの化合物でもありうる。用語“生物学的分子”は、該分子が生物学的意味での活性を有することを意味する。好ましくは、生物学的分子は、細胞内で合成され、すなわち当該細胞に対して内因性であり、又は多細胞生物体の場合は、該生物体のどの細胞内でも合成される。
【００４２】
従って、生物学的分子の例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、共因子、擬態物、補欠分子族（ヘムのような）、無機分子、イオン（Ｃａ２＋のような）、イノシタイド（ｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ）、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、催炎物質、毒素、代謝物、薬剤、プラズマボルネ栄養素（グルコース、アミノ酸、共因子、無機塩、タンパク質及び脂質を含む）、外因性又は病理学的細胞外成分、細胞内及び細胞外病原体（細菌、ウイルス、真菌及びマイコプラズマを含む）が挙げられる。適切な場合、上述の前駆体、モノマー、オリゴマー及びポリマー形態、及び分解産物をも包含する。
【００４３】
ポリペプチド生物学的分子の例としては、酵素、転写因子、ホルモン、膜結合型レセプターも含む、細胞及びレセプターの構造成分が挙げられる。
好ましくは、生物学的分子は、関心のある細胞プロセスに関与することが分かっている。
本発明の一実施形態では、生物学的分子は、本明細書ではシグナルとも呼ばれる、細胞環境の条件の変化に応答性である。このような環境条件又はシグナルの例としては、細胞の微細環境の変化、ホルモンに対する露出、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、催炎物質、毒素、代謝物、ｐＨ、薬剤、低酸素、無酸素、虚血、いずれのプラズマボルネ栄養素［グルコース、アミノ酸、共因子、無機塩、タンパク質及び脂質を含む］の不均衡、浸透ストレス、温度［低−及び高体温］、機械的ストレス、照射［電離又は非電離］、細胞−細胞外マトリックス相互作用、細胞−細胞相互作用、外来性又は病原性細胞外成分の蓄積、細胞内及び細胞外病原体［細菌、ウイルス、真菌及びマイコプラズマを含む］及び遺伝子の混乱［後成的又は突然変異若しくは多形性によって媒介される両方］が挙げられる。上記リストから明かなように、シグナルは、環境シグナルのような外部的に加えられるシグナルでよく、例えばレドックスストレス、細胞外リガンドの細胞表面のレセプターへの結合が、シグナル形質導入シグナルによって媒介された細胞の応答性を惹起する。これとは別に、シグナルは、細胞代謝物のレベルの低下によるキナーゼ活性の増加のような内部的に与えられるシグナルでよい。
【００４４】
生物学的分子のレベルは、直接的又は間接的に変えられる。直接的変化は、例えば、生理的レベル、例えば分子の高い生理的レベルから変化している分子のレベルを含む媒体内で細胞をインキュベートすることによって、細胞に該分子を取り上げさせることによって達成できる。他の方法としては、ベシクル媒介送達及び微量注入法が挙げられる。核酸及びポリペプチドの場合、細胞内の生物学的分子のレベルは、該細胞中への、該核酸又はポリペプチドの発現を指揮する異種核酸の導入によって高められる。
【００４５】
本明細書の文脈での用語“異種核酸”は、該核酸がその天然の背景では存在しない、すなわちそうでなければそれが導入される形態で存在しないであろう核酸を含有するように、該細胞が修飾されていることを意味する。例えば、この核酸は、細菌性プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母菌エピソーム、挿入要素、酵母菌染色体要素、ウイルス（例えば、バキュロウィルス及びＳＶ４０（サルウイルス）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス、又はプラスミドと、コスミド及びファージミドを含むバクテリオファージ遺伝的要素から誘導されるもののようなそれらの組合せについてコードされるような染色体外でよい。核酸は、マウス又はネコの白血病ウイルス、又はレンチウイルスヒト免疫不全症ウイルス及びウマの貧血ウイルスを含むレトロウイルスベクターの使用によってのように、染色体内に取り込まれる。ヒト、細菌及び酵母菌の人工染色体（それぞれＨＡＣｓ、ＢＡＣｓ及びＹＡＣｓ）を利用しても、ＤＮＡの、他のベクター内に含まれかつ発現されるより大きい断片を送達することができる。核酸も、例えば、ウイルス形質導入によって、若しくは相同的組換えによって（例えば、国際特許出願ＷＯ９９／２９８３７参照）、又はトランスジェニック動物胎仔若しくは幹細胞の生成に用いられる微量注入法によって、ゲノム中に組み込むことができる。それにもかかわらず、遺伝子の追加コピーの導入は、当該遺伝子の発現レベルを高めるのに便利な手段なので、異種核酸の一部又は全部は、対応するゲノム配列と同一でよい。
【００４６】
生物学的分子のレベルを変える間接的な手段は多く、上述した方法を用いて抑制性又は刺激性分子のレベルを高める工程を含む。抑制性分子としては、アンチセンス核酸、リボザイム又は該生物学的分子をコードするｍＲＮＡに反して配向されるＥＧＳ（外部ガイド配列）、該生物学的分子に反して配向されるトランスドミナントなネガティブ突然変異体、転写因子、酵素インヒビター、及びｓｃＦｖｓのような細胞内抗体が挙げられる。刺激性分子の例としては、酵素活性化物質、及び転写活性化物質が挙げられる。このように、細胞は多くの方法で操作され、究極的にその生物学的分子のレベルが変えられる。発現の低減は、アンチセンスＲＮＡを発現させることによって達成できる。
【００４７】
本発明により、生物学的分子のレベルが生理的レベルに比べて変えられる。こうして、レベルが高められ、又は減少される。用語“生理的レベルに比べて”は、その細胞型に普通の生理的条件下で操作前に通常存在するその生物学的分子の濃度又は活性のレベルに比べてという意味である。従って、慎重な手段によって、生物学的分子の活性が、普通の生理的条件の範囲下で該細胞内で見られる活性を上下に変えることを意図している。“生理的条件”は、生体内で普通に見られる条件及び細胞を培養するために生体外で普通に用いられる条件を包含する。
例として、活性又は濃度は、例えば、異種核酸を導入する前にその細胞内で見られた普通の生理活性又は濃度に比し、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又は１００倍高め又は低減することができる。
【００４８】
本発明は、細胞プロセスに関与する遺伝的要素の同定を可能にする。上述したように、用語“遺伝的要素”は、遺伝子、遺伝子産物（ＲＮＡ分子、及びポリペプチドのような）、及びシス作用制御要素（プロモーター要素及びエンハンサー要素のような）を包含する意である。従来の差次的スクリーニング法に比べ、本発明は、ノイズに対するシグナルのレベル及び／又は比が、前述の方法によってかなり改善されるので、細胞プロセスに関与する遺伝子及び遺伝子産物の同定をかなり容易にする。
特に注目されるのは、本発明は、細胞プロセスに関与する遺伝子及び遺伝子産物を同定し、ひいてはこれら遺伝子及び遺伝子産物の役割をさらに調査することを与える能力である。例えば、特定のポリペプチドが細胞プロセスで役割を演じることが分かっている場合、本発明は、そのポリペプチドを修飾又は制御し、細胞プロセス自体に影響を与える物質の開発への道を開く。このような情報は、明らかに、病気の解析、診断及び治療、介入の候補点を特定すること、及び病気のような望ましくない効果につながる何らかの細胞プロセスにおける何らかの生理的不均衡を阻止又は改善できる薬剤の開発を可能にすることに大いに関連性を有する。
【００４９】
遺伝子及び遺伝子産物を同定することに加え、本発明は、特定の細胞プロセスに関係する遺伝子に付随する他の要素の同定を可能にする。このような要素の例としては、細胞プロセスで発現される遺伝子の転写を制御するプロモーター要素及びエンハンサー要素が挙げられる。このような要素の同定は、細胞プロセスの研究で大きな価値があり、かつ例えば特定細胞プロセスで生成される生物学的シグナルに応答性である合成制御要素の開発に道を開くだろう。
本発明のこの局面に含まれるのは、研究中の細胞プロセスに対する遺伝子の応答に影響する、遺伝子及びその制御要素の突然変異及び多形性の同定である。このタイプの情報は、異なる生物学的条件下で異なる個体間に見られる発現パターンの相異を評価及び精査するのに非常に価値があるだろう。
【００５０】
また、本発明の差次的発現スクリーニング法は、所望どおりに研究中の経路の特有な局面を変えることによって、生物学的経路の分子の精査を可能にする。このように、本発明の方法は、技術的に公知の従来の差次的発現スクリーニング法よりも有利である。これら従来技術の方法は、異なる生物学的条件下で細胞集団間の遺伝子発現プロフィルを比較し、異種核酸が特有の生物学的経路及び応答を参照せずに使用される場合でさえ、その２集団の遺伝子発現パターンについての全体的な展望を生成する。対照的に、研究中の経路に関係する特定の生物学的分子のレベルに影響を与えることによって、ある細胞集団中に異種核酸を導入することで、本発明の方法は、ある経路を、その正確な分子成分に解体することができる。
【００５１】
本発明のこの局面は、低酸素に対する生物学的応答という特定の例で説明しうるが、熟練した読者は類似の細胞プロセスがこの方法によって同様に適用できることを理解するだろう。低酸素に対する生物学的応答は、非常に多くの関与分子成分があるので複雑である。２つの重要な成分は、タンパク質ＨＩＦ１α及びＥＰＡＳ１である。ある細胞集団中に、ＨＩＦ１αをコードする異種核酸を導入することによって、本発明は、ＨＩＦ１α自体によって生成される遺伝子発現プロフィルの相異の評価を可能にする。ＥＰＡＳ１をコードする異種核酸を用いて行われる同様の実験は、低酸素に対する分子応答のこの特定の局面の精査を可能にする。ある経路（ＨＩＦ１α）によっては制御され、他方（ＥＰＡＳ１）によっては制御されない分子成分を同定することによって、例えば、ＨＩＦ１α経路の成分に特異的な物質を用いて、この細胞プロセスを選択的に制御することができる。本発明の低酸素応答への適用は、ＨＩＦ１α及びＥＰＡＳ１によって差次的に制御される新規な遺伝子の発見を可能にし、ひいては低酸素に対する組織及び細胞応答の細胞特異性の治療的調節の可能性を高めた。
【００５２】
ＨＩＦ１αアゴニスト又はアンタゴニストは、血管形成及び赤血球形成のような低酸素に対する応答を、それぞれ上方又は下方制御するために適用される。例えば、腎臓内のエリスロポイエチンの産生がＨＩＦ１αによって制御されることは公知であり（Ｂｕｎｎら（１９９８）エリスロポイエチン：酸素依存性制御を研究するためのモデルシステム，Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ ２０１：１１９７−１２０１）、従ってＨＩＦ１αアンタゴニストはエリスロポイエチンの下方制御によって貧血を生じさせうる。本発明をＨＩＦ１α及びＥＰＡＳ１によって差次的に制御される遺伝子の同定に適用し、かつこれら２つの密接に関連する転写因子の異なる効果を明確に認識すると、ＥＰＡＳ１アゴニスト若しくはアンタゴニスト、又は特異的差次的に制御される遺伝子のモジュレーターの開発を可能にし、ＨＩＦ１α調節の如何なる可能性のあるネガティブな臨床効果をも克服し、それによって低酸素に関連する病気の診断及び治療のための診断及び治療産物の同定及び開発を可能にする。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態では、生物学的分子のレベルは、異種核酸、典型的にはポリペプチドの発現を指揮する核酸の導入によって変えられるが故に、その異種核酸は、宿主細胞によってコード配列の発現を備えうる、すなわち該ベクターは発現ベクターである対照配列に実施可能に連結されるコード配列を含むべきである。用語“実施可能に連結される”とは、述べている成分が、その意図した様式でその成分を機能させる関係にあることを意味する。コード配列に“実施可能に連結された”制御配列は、対照配列と適合可能な条件下で、そのコード配列の発現が達成されるような様式で該コード配列に結合されうる。
対照配列は、例えば、さらなる転写制御要素の添加によって修飾し、転写モジュレーターに対してより応答性の対照配列により指揮される転写のレベルを生じさせることができる。
【００５４】
本発明のタンパク質をコードする配列に実施可能に連結するのに好適な対照配列としては、プロモーター／エンハンサー及び他の発現制御シグナルが挙げられる。これら対照配列は、発現ベクターが使用されるべきと指摘される宿主と適合するように選択することができる。用語“プロモーター”は技術的に周知であり、最小のプロモーターから、上流要素及びエンハンサーを含むプロモーターまでのサイズ及び複雑さの範囲の核酸領域を包含する。
【００５５】
プロモーターは、典型的には哺乳類細胞内で機能性であるプロモーターから選択されるが、妥当な場合は、原核生物細胞又は他の真核生物細胞内で機能性のプロモーターも使用できる。従って、プロモーターは、典型的にはウイルス又は真核生物遺伝子のプロモーター配列から誘導される。例えば、発現が起こるべき細胞のゲノム由来のプロモーターでよい。真核生物プロモーターは、ユービキタス様式（α−アクチン、β−アクチン、チュブリンのようなプロモーター）又は、代わりに、組織特異性様式（ピルビン酸キナーゼ用の遺伝子のプロモーターのような）で機能するプロモーターでよい。特定の細胞に特異的な組織特異性プロモーターが使用できる。それらは、特異的刺激に応答するプロモーター、例えばステロイドホルモンレセプターを結合するプロモーターでよい。ウイルス性プロモーターも使用でき、例えばモロニーマウス白血病ウイルス長末端繰返し配列（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ（ＭＭＬＶ ＬＴＲ））プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ））ＬＴＲプロモーター又はヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ））ＩＥプロモーターがある。
【００５６】
プロモーターが異種核酸由来の発現のレベルを細胞の寿命の間制御できるように誘導可能なことは有利である。誘導可能とは、該プロモーターを用いて得られた発現のレベルを制御できることを意味する。
さらに、これらプロモーターはいずれも、さらなる制御配列、例えばエンハンサー配列を加えて修飾することができる。上述の２種以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラプロモーターも使用できる。
【００５７】
好適なベクターの例としては、プラスミド、人工染色体及びウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが挙げられる。ベクター／ポリヌクレオチドは、形質移入、形質転換、エレクトロポレーション、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス及びアデノウイルスのような組換え体による感染、核酸の直接注入及び微粒子銃形質転換のような技術的に公知の種々の技法を用いて適切な宿主細胞内に導入することができる。組換え型ウイルスベクター媒介法を使用することが特に好ましい。
【００５８】
ウイルスベクター
本発明に従い、細胞中に異種核酸を導入するために用いられるウイルスベクターは、いずれの適切なウイルスからも誘導され、又は誘導可能である。大多数の種々のウイルスは同定されており、サブクラスが存在し、レトロウイルス、レトロウイルスをサブクラスであるレンチウイルス、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルスがある。レトロウイルスの例としては：マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス，１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全症ウイルス，２型（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全症ウイルス、ヒトＴ−細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）、ジェムブラナウイルス（Ｊｅｍｂｒａｎａ ｖｉｒｕｓ）、サル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤浪肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、アビアンミエロサイトマトシス（ｍｙｅｌｏｃｙｔｏｍａｔｏｓｉｓ）ウイルス−２９（ＭＣ２９）、及びアビアン赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）が挙げられる。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら，９９７，“レトロウイルス”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ出版：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ７５８−７６３に示されている。
【００５９】
多くのレトロウイルスのゲノム構造についての詳細は技術的に得られる。例として、ＨＩＶ、ＥＩＡＶ及びＭｏ−ＭＬＶについての詳細は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（それぞれ、ゲノム受入れ番号ＡＦ０３３８１９，Ｕ０１８６６及びＡＦ０３３８１１）から得ることができる。
レトロウイルスのレンチウイルス亜群は、“霊長類”と“非霊長類”ウイルスに分けられる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト免疫不全症ウイルス，１型（ＨＩＶ−１）、エイズ（ＡＩＤＳ）の原因物質、及びサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群としては、プロトタイプ“スローウイルス”ビスナ／マエディウイルス（ｖｉｓｎａ／ｍａｅｄｉ ｖｉｒｕｓ（ＶＭＶ））、及び関連するヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）及びさらに最近開示されたネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）及びジェムブラナウイルス（Ｊｅｍｂｒａｎａ ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。
【００６０】
レトロウイルスゲノムの基本構造は、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲであり、その間又はその中に、ゲノムを詰め込むことのできるパッケージングシグナル（ｐｓｉ）、プライマー結合部位、宿主中にゲノムを組み込むことができる組込み部位及びパッケージング成分をコードするｐａｇ，ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が配置されており−これらはウイルス粒子の構築に必要なポリペプチドである。さらに複雑なレトロウイルスは、ＨＩＶにおけるｒｅｖ及びＲＲＥ配列のような追加の特徴があり、感染標的細胞の核から細胞質まで、組み込まれるプロウイルスのＲＮＡ転写物の効率的な輸送を可能にする。ＨＩＶ−１ゲノム中に存在する追加の特徴は、該ウイルスの感染力に必須の、又は該ウイルスの感染力を調節する補助タンパク質をコードするｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、及びｎｅｆである。レンチウイルスのゲノム中に存在する追加の特徴は、中心ポリプリントラクト／中心終止配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）であり、非分裂細胞の感染を容易にする。
【００６１】
プロウイルス内では、これら遺伝子及び他の要素は、長末端繰返し配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ（ＬＴＲｓ））と呼ばれる領域によって両末端で隣接している。ＬＴＲｓは、プロウイルス組込み及び転写の原因である。このように、それらはエンハンサー−プロモーター配列を含み、ウイルス遺伝子の発現をコントロールできる。レトロウイルスＲＮＡｓの被包は、ウイルスゲノムの５’末端の近くに位置するｐｓｉ配列によって起こる。
ＬＴＲｓ自体は、Ｕ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる３つの要素に分割できる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に独特な配列由来である。Ｒは、ＲＮＡの両末端で繰り返される配列由来であり、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に独特な配列由来である。これら３要素の大きさは、種々のレトロウイルス間でかなり変化しうる。Ｒ領域は、ウイルス性ＲＮＡの両末端で繰り返される配列であるが、Ｕ５及びＵ３はＲＮＡゲノムのそれぞれ５’−及び３’−末端で独特の配列を表す。
【００６２】
本発明のスクリーニング法で使用する典型的なレトロウイルスベクターでは、ウイルスの複製に必須のｐａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質コード領域の１種以上の少なくとも一部を除去してよい。これが、該レトロウイルスベクターを複製欠損にする。Ｕ３領域からのプロモーター／エンハンサー要素の除去、又は補助タンパク質用遺伝子の欠失のような他の修飾も、ベクターを複製欠損にすることができる。
除去されたタンパク質は、上述したような生物学的分子をコードするヌクレオチドのような関心のあるヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＯＩ））で一様に置き換えて、宿主ゲノム中にそのゲノムを組み込むことができるが、その修飾されたウイルスゲノムは、構造タンパク質を欠いているのでそれ自体増殖できないベクターを生成することができる。
【００６３】
宿主ゲノムに組み込まれると、そのＮＯＩの発現は、ベクターのＬＴＲからの転写の結果として、又は適切な位置、例えばＬＴＲ’ｓ間に位置するプロモーター配列からの転写の結果として、かつＮＯＩに関して起こる。ＬＴＲ内に存在するウイルスプロモーターは、異なるプロモーターと置き換え可能であることに留意すべきである。プロモーター配列は、典型的には哺乳類細胞内で活性である。１つ以上の第１ヌクレオチド配列の発現を作動するプロモーター配列は、例えば恒常的又は制御されていてよい。プロモーターは、例えば、天然のウイルスプロモーター若しくはＣＭＶプロモーターのようなウイルスプロモーターでよく、又は哺乳類プロモーターでよい。特定の細胞型若しくは組織型で優先的に活性であるか、又は制御できるプロモーターの使用が特に好ましい。従って、一実施形態では、組織特異性制御配列が使用される。哺乳類細胞では、制御可能なプロモーター系の例は、テトラサイクリン誘発性プロモーター系である（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。
【００６４】
従って、ＮＯＩの関心のある部位への伝達は、典型的には以下：ＮＯＩを組換え型ウイルスベクター中に組み込む工程；その修飾されたウイルスベクターをビリオン粒子内に詰め込む工程；及び関心のある部位−標的細胞又は標的細胞集団のような−を形質導入させる工程；によって達成される。
従って、本発明で使用するためのレトロウイルスベクターの最小ゲノムは、（５’）Ｒ−Ｕ５−パッケージングシグナル（ｐｓｉ）及び１種以上の第１ヌクレオチド配列−Ｕ３−Ｒ（３’）を含む。しかし、宿主細胞／パッケージング細胞内でベクターゲノムを生成するのに使用されるプラスミドベクターも、該ベクターゲノムに実施可能に連結されて、宿主細胞／パッケージング細胞内のゲノムの転写を指揮する転写制御配列を含むだろう。これら制御配列は、その転写されたレトロウイルス配列に付随する天然の配列すなわち５’ Ｕ３領域でよく、又はそれらは、別のウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターのような異種プロモーターでよい。
【００６５】
レトロウイルスベクターの産生
複製欠損レトロウイルスベクターは、プロデューサー細胞系、パッケージング細胞系又は適切な細胞系の一過性形質移入を用いることによって産生されうる。
プロデューサー細胞系は、形質導入可能なベクター粒子の構築に必要なすべての成分を発現する細胞系である。すなわち、それらはｇａｇ／ｐｏｌを発現し、ベクター粒子の形成に必要かつベクター粒子中に詰め込まれるベクターゲノムの転写物を産生するタンパク質を封入する。慣習的に、プロデューサー細胞は、それらがベクターＲＮＡをも安定して発現するという事実によってのみパッケージング細胞と異なる。ベクターＲＮＡをパッケージング細胞中に導入し、該ベクターＲＮＡの発現を指揮可能なプラスミドの形質移入によって、又はベクターＲＮＡの合成を指揮可能なベクターゲノムの形質導入後、その宿主細胞の核ＤＮＡ中に組み込むことによってプロデューサー細胞を生じさせることができる。パッケージング細胞も、ベクターＲＮＡの転写を指揮するプラスミドの一過性形質移入による一時的基礎としてプロデューサー細胞に転換することができる。プロデューサー細胞は、形質導入適格性ベクター粒子の形成に必要な３成分のうちの２成分しか含まない細胞系からも産生されうる。例えば、ＭＬＶベクターの分野では、ＴｅｌＣＥＢ細胞系が安定してＭＬＶ ｇａｇ／ｐｏｌ及びＭＬＶベクターのゲノム、ＭＦＧｎｌｓＬａｃＺを発現する。それは、エンベロープ遺伝子の発現を指揮するプラスミドの導入によってプロデューサー細胞系に変換されうる。この点で、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子は同一ウイルスから誘導されるのに対し、ｅｎｖは同一ウイルス又は異なるウイルスから誘導されうることに留意すべきである。感染性粒子が、異なるウイルス由来のエンベロープ機能の使用の結果として形成される場合、そのベクター粒子は、プソイドタイプされた（ｐｓｅｕｄｅｔｙｐｅｄ）と言われる。例えば、レンチウイルスベクターの分野では、ラブドウイルス、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質でプソイドタイプされるベクターを作ることが一般的である。
【００６６】
ベクター粒子は、形質導入粒子形成に必要な成分を発現するプラスミドを有する適切な細胞系の形質移入によって、一過性にも産生されうる。例えば、ＭＬＶ、ＥＩＡＶ又はＨＩＶベクター粒子は、ｇａｇ／ｐｏｌ、ベクターゲノム及びエンベロープの発現を指揮するプラスミドを有するヒト細胞系、ＨＥＫ ２９３Ｔの形質移入によって産生されうる（Ｓｏｎｅｏｋａら，１９９５）。例えばタイターを高める目的で、さらにプラスミドを共形質移入してもよい。
一過性形質移入法は、ベクターが発生されているときにベクター産生のレベルを測定するために有利に使用される。この点で、一過性形質移入は、安定なベクター製造細胞系を生成するのに長時間を避け、ベクター又はレトロウイルスパッケージング成分が細胞にとって毒性である場合にも使用できる。レトロウイルスベクターの産生に通常用いられる成分としては、ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードするプラスミド、ｅｎｖタンパク質をコードするプラスミド及びＮＯＩを含有するプラスミドが挙げられる。ベクター産生は、これら成分の１種以上の、他の必要な成分を含有する細胞中への一過性形質移入を含む。ベクターが毒性遺伝子又は細胞サイクルのインヒビター若しくはアポトーシスを誘発する遺伝子のような宿主細胞の複製を妨げる遺伝子をコードする場合、安定なベクター産生細胞系を生成するのは困難だろうが、一過性形質移入を用いて細胞が死ぬ前にベクターを生成することができる。また、細胞系は、安定なベクター産生細胞系から得られたレベルに匹敵するベクターのタイターレベルを生じさせる一過性形質移入を用いて開発された。
【００６７】
現在、個々にコードされるべき粒子形成用の成分をコードする遺伝子をアレンジすることが、レトロウイルスベクターの分野では標準的なプラクティスになっている。例えば、ＦＬＹＡ１３ ＭＬＶパッケージング細胞系は、ＭＬＶ ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖの発現用の転写単位を分離した。この戦略は、野生型ウイルス産生のためには３つの組換え型事象が必要なので、複製適格性ウイルス産生の可能性を減少させる。組換えは相同性によって大いに促進されるので、ベクターのゲノム間の相同性を低減又は除去することによって、かつヘルパーを用いても複製適格性ヘルパーウイルス産生の問題を減らすことができる。
【００６８】
プロデューサー細胞／パッケージング細胞は、いずれの適切な細胞型でもよい。最も一般的には、哺乳類のプロデューサー細胞が使用されるが、昆虫細胞のような他の細胞も除外されない。明らかに、プロデューサー細胞系は、効率的にｅｎｖ及びｇａｇ、ｐｏｌ ｍＲＮＡを翻訳できる必要がある。多くの適切なプロデューサー／パッケージング細胞系は、技術的に周知である。当業者は、例えば、安定的に細胞系内にパッケージング成分をコードするヌクレオチド構成物を導入することによって、適切なパッケージング細胞系を製造することできる。
実験的又は実用的適用の両方で高タイターのウイルス調製品を使用することが非常に望ましい。ウイルス性を高める一方法は、ウイルス原料を濃縮することである。これは、遠心分離によって便利に達成されるが、カラムクロマトグラフィーのような他の方法も使用できる。
【００６９】
この発明で使用するには、レンチウイルスに基づくベクター系が特に好適である。これは、それらが分裂又は非分裂細胞の感染が可能だからである。遺伝子伝達が行われうる非分裂細胞の例としては、神経細胞及び造血幹細胞が挙げられる。さらに、レンチウイルスベクターは、それらが標的細胞内でＮＯＩのみを発現するように構成することができる。事実上、それらは表現型的にサイレントである。従って、導入遺伝子を導入するプロセスは、宿主細胞に最小の混乱を引き起こす。ＨＩＶ−１、ＥＩＡＶ及びＦＩＶに基づくベクター系が開発され、かつ最小と述べられる点に開発されてきた。ＨＩＶ−１及びＥＩＡＶの最小ベクター系は、ＷＯ ９８／１７８１５及びＷＯ ９９／３２６４６及びＫｉｍら，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７２，８１１−８１６、及びＭｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，６，１８０８−１８１８に記載されている。これら最小系では、ベクター成分は、標的細胞内ではＮＯＩのみを発現し、さらに産生に使用される細胞内でウイルスタンパク質の発現が低減されて最小になるように操作される。ＨＩＶ−１及びＥＩＡＶ系の両方にとって、感染粒子形成のために発現されなければならない唯一のレンチウイルス遺伝子は、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖである。Ｒｅｖ−応答性要素（ＲＲＥ）と共に働くＲｅｖは、高レベルの粒子形成に必要なＧａｇ／Ｐｏｌのレベルを達成する必要がある。レンチウイルスタンパク質のためにさらなる要求を減少する一方法は、コドンｇａｇ／ｐｏｌを最適化することである。これは、Ｒｅｖ／ＲＲＥ非依存性発現を与える。レンチウイルスｇａｇ／ｐｏｌのコドン最適化のプロセスは、ＷＯ ９９／４１３９７，Ｋｏｔｓｏｐｏｕｌｏｕら，（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，４８３９−４８５２で述べられている。ＥＩＡＶ ｇａｇ／ｐｏｌのコドン最適化プロセスは、英国特許出願０００９７６０．０で述べられている。
【００７０】
コドン最適化プロセスに関するさらなる情報は、説明として本明細書に与えられている。様々な種由来の細胞は、特定コドンの使用法が異なる。このコドン傾向は、その細胞型内における特定のｔＲＮＡｓの相対量の傾向に反映されている。コドンが対応するｔＲＮＡｓの相対量と調和するように配列内のコドンを変えることによって、発現を高めることができる。同一の証拠で、対応するｔＲＮＡｓが特定の細胞型内に滅多にないことが分かっているコドンを慎重に選択することによって発現を減少させることができる。従って、さらなる度合の翻訳対照が利用できる。
ＨＩＶ及び他のレンチウイルスを含む多くのウイルスは、大多数のレアコドンを使用し、これらを普通に用いられる哺乳類のコドンに対応させることによって、哺乳類プロデューサー細胞内のパッケージング成分の発現を高めることができる。コドンの用法一覧は哺乳類細胞について、及び種々の他の生体について技術的に公知である。
【００７１】
コドン最適化は、多くの他の利点を有する。その配列の変化によって、プロデューサー細胞／パッケージング細胞内でウイルス粒子の構築に必要なウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列は、それらから除去されたＲＮＡ不安定配列（ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＮＳ））を有する。同時に、パッケージング成分のコード配列は、該配列によってコードされるウイルス成分が同一のままであるか、又はパッケージング成分の機能が損なわれないことを少なくとも十分保証するように保持される。コドン最適化は、最適化されたＲｅｖ非依存性配列を与えるので、輸送のためのＲｅｖ／ＲＲＥ要求を克服もする。コドン最適化は、ベクター系内の異なる構成物間（例えばｐａｇ−ｐｏｌ内の重なりの領域とｅｎｖ読み枠との間）の相同性組換えをも減少させる。従って、コドン最適化の全体的な効果は、ウイルスタイターを顕著に高め、かつ安全性を向上させる。
【００７２】
１つのアプローチでは、ＩＮＳに関連するコドンだけがコドン最適化される。しかし、非常に好ましい実施形態では、配列はフレームシフト部位を包含する配列を除き、配列全体的にコドン最適化される。ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子はそれぞれｇａｇ及びｐｏｌタンパク質をコードする２つの重なっている読み枠を含む。このフレームシフトは、翻訳時のリボソームの“ずれ”の結果として起こる。このずれは、リボソームストーリング（ｓｔａｌｌｉｎｇ）ＲＮＡ二次構造によって少なくとも一部は起こると考えられる。このような二次構造は、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶでは、重なりの領域は、ｇａｇの最初のヌクレオチド１２２２下流（ここで、ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）からｇａｇの末端（ｎｔ １５０３）に伸長している。結果として、フレームシフト部位にまたがる２８１ ｂｐフラグメント及び２つの読み枠の重なり領域は、好ましくはコドン最適化されない。このフラグメントを保持すると、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質のさらに効率的な発現を可能にするだろう。ＥＩＡＶについては、重なりの開始はｎｔ １２６２（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）と考えられる。重なりの終わりは、ｎｔ １４６１である。フレームシフト部位とｇａｇ−ｐｏｌ重なりの保存を確実にするため、野生型配列をｎｔ １１５６〜１４６５まで保持した。
【００７３】
例えば、好都合な制限部位を蓄積するため、最適なコドンの用法から派生物を作り、かつ保存的アミノ酸変化をｇａｇ−ｐｏｌタンパク質中に導入することができる。
非常に好ましい実施形態では、コドン最適化は、高度に発現される哺乳類遺伝子に基づいた。第３及び時には第２と第３塩基が変えられる。
遺伝子コードの性質の変性のため、多くのｇａｇ／ｐｏｌ配列は当業者によって達成できることは明かである。また、コドン最適化ｇａｇ／ｐｏｌ配列の生成の開始点として利用できる記載された多くのレトロウイルス変異体がある。レンチウイルスゲノムは、非常に変わりやすい。例えば、まだ機能的であるＨＩＶ−１の多くの準種がある。このことは、ＥＩＡＶについてもそうである。これら変異体を用いて形質導入プロセスの特定部分を向上させることができる。ＨＩＶ−１変異体の例は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖで見つけられる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、ＮＣＢＩデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで見つけられる。
【００７４】
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列の戦略は、如何なるレトロウイルスに関しても使用できる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、Ｍａｅｄｉ／Ｖｉｓｎａ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２を含むすべてのレンチウイルスに当てはまるだろう。さらに、この方法を用いてＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ及びヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ及び他のレトロウイルス由来の遺伝子の発現を高めることができるだろう。
レンチウイルスベクターの性能は、いくつかの方法で向上させうる。最も顕著には、形質導入の効率及びＮＯＩの発現レベルを改良するベクターゲノムへの修飾がある。これらタイプの修飾は両方ともレンチウイルスベクターの本明細書で述べる用途での有用性を高める。形質導入の効率は、中心ポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）及び中心終止配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）と呼ばれる要素の取り込みによって高めることができる。約２００ｎｔのこの要素は、ウイルスゲノムの中心近くに天然に配置され、ＨＩＶ−１ベースベクターによって形質導入を改良することが示されている（Ｆｏｌｌｅｎｚｉら，（２０００）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０００年６月；２５（２）：２１７−２２：Ｓｉｒｖｅｎら，Ｂｌｏｏｄ．２０００年１２月 １５；９６（１３）：１０３−１０）。ＮＯＩの発現は、マーモット肝炎ウイルス転写後制御要素（ｗｏｏｄｃｈｕｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ（ＷＨＰＲＥ）を利用して向上させうる。強化されたポリアデニル化を含むメカニズムによってｍＲＮＡの半減期を増やすことでタンパク質の発現を高めるのは６００ｂｐ要素である。その有益な効果は、ＨＩＶ−１ベースベクターを含む多くのベクターで例証されている（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）４月；７３（４）：２８８６−９２；Ｒａｍｅｚａｎｉら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０００年１１月；２（５）：４５８−６９）。この要素の使用についてのこれ及び他の方法は、ＷＯ ９９／１４３１０で述べられている。
【００７５】
ワクシニア、アビアンポックスウイルス及びエントモポックスウイルス由来のベクターを含むポックスウイルス由来のベクターを使用しても、広範な標的細胞型内でのＮＯＩの発現を達成できる。それらの使用は、Ｂ Ｍｏｓｓ．１９９６（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｔｅ：ウイルス及びその複製 Ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｅｄ ＢＮ Ｆｉｅｌｄら Ｃｈａｐ ８３ ｐｐ２６３７−２６７１ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；ＰＡ ＵＳＡ）でレビューされている。アルファウイルスとポックスウイルス由来のベクターの使用については、ＭＷ Ｃａｒｒｏｌｌら，２００１（哺乳類発現系及びワクチン接種；Ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ，ｐｐ１０７−１５８ Ｅｄ．Ｃ Ｒｉｎｇ ＆ Ｅ Ｂｌａｉｒ ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｅｓ Ｌｔｄ Ｏｘｆｏｄ ＵＫ）。アデノ随伴ウイルスベクターも遺伝子伝達ベクターとして使用でき、それらの使用は以下の出版物でレビューされている：“遺伝子伝達及び遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター”（Ｂｕｅｌｅｒ，Ｈ ＡＵＴＨＯＲ ＡＦＦＩＬＩＡＴＩＯＮ：Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｕｒ Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ．ＳＯＵＲＣＥ：Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９９年６月；３８０（６）：６１３−２２）。
【００７６】
Ｃ．関心のある細胞
関心のある細胞はいずれの細胞でもよく、例えば原核生物細胞、真菌細胞（例えば、酵母菌）、植物細胞又は昆虫細胞若しくはヒト細胞を含む哺乳類細胞のような動物細胞である。多細胞生体由来の細胞の場合、細胞は主要細胞又は不死化細胞系でよく、それらは組織試料を含み、又はそれらは生体の一部でよい。細胞は、単一で言及されることもあるが、一般的に細胞は細胞集団の一部である。
【００７７】
本発明の方法では、少なくとも２つの別個の細胞における遺伝子発現間の比較が必要である。典型的には、２種以上の細胞の１番目が参照細胞と名付けられる。本発明の好ましい実施形態では、比較に用いられる細胞は、実質的にすべての点で同一である。例えば、それらは両方とも同一の細胞系の細胞又はある生体の同一組織から得られる細胞である。その細胞の一方又は両方が、セクションＢで述べたように、生理的レベルと比べて変化したレベルの生物学的分子を含むように操作される。一実施形態では、第１細胞は変えず、第２細胞を変える。これは、ノイズ比に対するシグナルが改善されることになるので特に好ましい。しかし、別の実施形態では、両細胞を変える。
【００７８】
それにもかかわらず、調査の開始点として使用する細胞は実質的に同一である必要はない。例えば、本発明の一局面では、病気プロセスに関与する遺伝子は、病気の哺乳類患者のような生体由来の細胞を用いて調査される。これらは正常な生体由来の細胞又は同一若しくは異なる病気の個体由来の細胞と比較される。正常生体と病気生体由来の細胞を使用する場合、一般的に正常細胞が関心のある第１細胞に相当し、病気細胞が関心のある第２細胞に相当する。結果として、少なくとも病気細胞がセクションＢで述べたように修飾され、これら細胞が変化したレベルの生物学的分子を含む。
本発明の別の実施形態では、一方の細胞が突然変異遺伝子を含む細胞であり、他方の細胞が同一遺伝子の野生型異形を含む。
本発明に包含される別の可能性は、細胞が異なる組織由来か、又は発達若しくは分化の異なる段階由来であるということである。
【００７９】
Ｄ．用途
本発明は、差次的発現スクリーニング法で遺伝子を同定するための多くの改良された方法を提供する。
第１局面では、細胞プロセスに関与する遺伝子を同定するための方法が提供される。基本的に１つの細胞型が、細胞プロセスに関与する生物学的分子の当該細胞内のレベルが変わるように操作される。典型的に、これは該細胞中へのポリペプチドの発現を指揮するための異種核酸の導入によって達成される。このポリペプチドは生物学的分子と同一であるか、又は上述したように生物学的分子のレベルを調節しうる。
一般的に、２つの同一細胞の１つの生物学的分子のレベルを単に調節し、遺伝子転写を測定することは、その生物学的分子のレベルの変化を用いて関心のある事象に対する応答を高めるか又は減じるのではなく、むしろ細胞内におけるその生物学的分子が遺伝子発現に及ぼす効果が測定されるので、本発明の方法の目的ではない。
【００８０】
しかし、生物学的分子が、細胞内で天然に産生されるポリペプチドのような遺伝子産物である場合、異種核酸の導入による遺伝子産物のレベルを変える工程を用いて、同時に細胞プロセスを混乱させ、かつこのような混乱に対する応答を高め、そして差次的発現スクリーニング法による当該細胞プロセスに関与する遺伝子産物の同定を容易にすることができる。例として、ＨＩＦ−１αの過剰発現は、そのＨＩＦ−１α媒介転写に及ぼす制御効果を高めるため、低酸素応答の下流要素を増幅する。
それにもかかわらず、本発明のより広い局面では、２つの主要な可能性が生じる。第１の可能性は、２つの細胞型が異なり、かつ本質的に異なる遺伝子発現パターンを有することである。この状況では、生物学的分子レベルの変化を用いてそれらの相異を高めることができる。２つの細胞は、例えば、異なる組織由来、又は発達若しくは分化の異なる段階由来でよい。２つの細胞は、一方の細胞が病気組織由来であり、かつ他方の細胞が正常組織由来であることによって異なってもよい。他の考えられる構成は上記セクションＣで述べられている。
【００８１】
第２の可能性は、２つの細胞型が同一であるが、一方の細胞が何らかの様式で刺激され、他方の細胞は刺激されない（又は一方が他方より大程度に刺激される）ことである。例えば、一方の細胞は成長因子の存在下でインキュベートされ、他方はインキュベートされない。従って、この例において、成長因子は生物学的分子ではないが、細胞の遺伝子発現を混乱させるように設計された刺激若しくはシグナルの代わりであり、その効果は生物学的分子によって増幅され、順次異種核酸から発現されるポリペプチドのレベルを変える。
従って、本発明のこの局面では、２つの別個の細胞集団を異なるレベルのシグナル又は環境条件にさらし、どちらか若しくは両方の細胞集団が、その活性がシグナル又は環境条件に応答性である生物学的分子のレベルを変えるように操作され、かつその発現が異なる遺伝子産物を同定することによって、その発現がシグナル又は環境変化によって制御される遺伝子が同定される方法が提供される。用語“その活性がシグナル又は環境条件に応答性である”は、シグナル又は環境条件に応じて細胞内におけるその濃度が変化するいずれの生物学的分子、及びその特性（酵素活性又は他の細胞成分に対する親和性のような）が、シグナル又は環境条件に応じて変化する生物学的分子を包含する。
【００８２】
従って、上記の成長因子の例に戻ると、成長因子にさらされる細胞は変化し、当該成長因子に関連するシグナル伝達カスケードに関与する転写因子のレベルの上昇を発現する。結果として、成長因子の効果は、転写因子の下流を増加し（ネガティブ又はポジティブのどちらかの意味で）、そしてその発現が転写因子によって、結局成長因子によって制御される差次的発現遺伝子の同定を容易にする。
上述したように、シグナル又は環境条件は、物理的シグナル（例えば、レドックス条件、ＣＯ２レベル、光、浸透ストレス、温度［低温及び高温］、機械的ストレス、照射［電離又は非電離］の変化、低酸素、無酸素、虚血への露出のような）、又は化学的シグナル（細胞の微細環境の変化、細胞表面上のレセプターに結合してシグナル伝達経路を誘発するリガンド（ホルモンを含む）、他の細胞に普通に結合されている細胞表面分子、該細胞中に拡散し又は輸送される酵素反応の基質、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、催炎物質、毒素、代謝物ｐＨ、薬剤への露出、プラズマボルネ栄養素の不均衡、細胞−細胞外マトリックス相互作用、細胞−細胞相互作用、外来性又は病原性細胞外成分、細胞内及び細胞外病原体［細菌、ウイルス、真菌及びマイコプラズマを含む］の蓄積のような及び遺伝子の混乱のような）のどちらでもよい。
【００８３】
第１細胞は、第１レベルでシグナルにさらされ、第２細胞は第２レベルでさらされる。一例では、第１細胞は単にシグナルの非存在下で、第２細胞はシグナルの存在下であるか、又はその逆でよい。シグナルのレベルは、遺伝子発現の相異を認識できるように調整される。別の実施形態では、第１及び第２の両細胞がシグナルの第１及び第２の両レベルで比較される。第２細胞内に異種核酸が存在すると、シグナルの変化によって生じる遺伝子発現の相異が増幅する。
好ましくは、両シグナルのレベルは生理学的に適切なレベルである。
【００８４】
本発明の一局面では、病気又は他の生物学的プロセスに関与する遺伝子に関する既知の知識を用いて、その発現が病気又は他の生物学的プロセスで変化する他の遺伝子についてのさらなる情報を生成することができる。これを行うため、病気又は他の生物学的プロセスに関与することが知られている遺伝子産物のレベルが、直接、例えば該遺伝子産物をコードする異種核酸の導入によって、又は上記セクションＢで述べたように間接的に変化するように、一方の細胞が修飾される。そして、両細胞内の遺伝子発現を測定し、結果を比較し、その発現が変化する遺伝子産物を同定する。
本発明のこの局面では、病気又は他の生物学的プロセスに関与することが知られている遺伝子産物のレベルの変化の点を除き、２つの細胞は同一でよい。従って、２つの細胞は、両方とも病気又は他のプロセスがそれ自体を明らかにする細胞型と同一の型の正常細胞でよく、又は両方とも病気の細胞でよい。代わりに、一方の細胞が正常で、他方が病気でよい。好ましくは、細胞の一方だけが修飾される場合は、病気細胞が修飾される。
【００８５】
本発明のさらなる局面では、差次的発現スクリーニング法を用いて、２段階の手順で病気又は他のプロセスに関与する遺伝子を同定する。まず第１に、関心のある第１細胞、例えば正常患者由来の細胞と、関心のある第２細胞、例えば病気患者由来の対応する細胞との間で遺伝子発現が比較される。上述したように、第１細胞と第２細胞はいくつかの面で異なるので、異なる発現パターンを示す。これは、細胞が異なる組織由来であるか、又は細胞が異なる個体由来であるためである（例えば、正常患者由来と病気患者由来）。細胞は、同一源でよいが、いくつかの点で差次的に処理されている。
【００８６】
そして、その発現が第１細胞及び第２細胞間で異なる遺伝子産物が同定される。第２に、このスクリーニング手順では、本質的に第１細胞と同一である関心のある第３細胞が使用され、候補遺伝子が第３細胞中に導入されて、遺伝子のレベルが変わる（通常上昇する）。この細胞内の遺伝子発現が第１細胞内の遺伝子発現と比較され、第１細胞と、候補遺伝子の変化レベルを含む第３細胞との間でその発現が異なる遺伝子産物が同定される。その発現が第２細胞内で変わる遺伝子産物が第３細胞内の遺伝子発現をも変えていた場合、候補遺伝子はさらなる研究のために選択される。
好ましくは２種以上、偽陽性を最小にするため、好ましくは少なくとも４又は５種の遺伝子産物についての関係があることが好ましい。
以下、例示のためであり、非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。以下の実施例では、上述した本発明の方法は“スマートミックス（Ｓｍａｒｔｍｉｃｓ）”と呼ばれる。
【００８７】
図面の簡単な説明
図１：形質導入されたマクロファージ内のアデノウイルス遺伝子伝達を用いて、ＨＩＦ−１α及びＥＰＡＳ１の過剰発現を確認するために行ったノーザンブロット。ＲＮＡ装填は以下の通りである：レーン１，２：アデノウイルスＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入しマクロファージ。レーン３，４：アデノウイルスＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入しマクロファージ。レーン４，５：アデノウイルスＡｄＡｐｔ ＥＰＡＳ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入したマクロファージ。レーン１，３，５では、マクロファージを正酸素（２０％ Ｏ２）で維持した。レーン２，４，６では、マクロファージを低酸素（０．１％ Ｏ２）で維持した。ＲＮＡサイズラダー由来のバンドの位置は、核ブロットの右にキロベース（ｋｂ）で示される。ハイブリダイゼーションプローブは、遺伝子ＨＩＦ−１α（Ａ）、ＥＰＡＳ１（Ｂ）及び２８ｓリボソームＲＮＡ（Ｃ）に相補性である。
【００８８】
図２：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓを用いた２つの代表的なＲＮＡ試料の散布図。正酸素（Ｙ軸）又は低酸素（Ｘ軸）中、非形質移入マクロファージ由来のＲＮＡを２つのＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓ ＧＦ２００アレイにハイブリダイズした。解析は、アレイ上の各遺伝子について正規化した強度としての出力であり、正酸素と低酸素由来のシグナルに対応する遺伝子について２つの値がある。これら値を散布グラフとしてプロットし、各点はアレイ上の遺伝子を示す。ＲＮＡ試料間で同レベルで発現した遺伝子は、ｘ＝ｙ線に位置する。この提示では、検出のダイナミックレンジの指標が明白である。
【００８９】
図３：スマートミックスによる乳酸デヒドロゲナーゼＡ発現の解析。セクションＡでは、乳酸デヒドロゲナーゼ−Ａ（ＬＤＨ−Ａ）遺伝子に対応するスポットの親指の爪ほどの画像が示される。対照レベルは、この遺伝子の最適な可視化を可能にするが、この図全体で一定に定まるレベルに設定した。６画像の各ストリップは、ＲＮＡ試料の範囲にわたって別個のアレイ位置又は実験に対応している。個々のスポット画像下の数字は、参照条件（ｇｆｐ；２０％ Ｏ２）と比較した当該スポットの正規化強度の比である。アレイ配置：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによる定義通りのスポットの強度。クローン：ＩＭＡＧＥ同定。ヒストグラム（セクションＢ）は、示される数字の平均を示し、エラーバーは標準偏差である。ｇｆｐ：ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｈｉｆ−１ａ：ＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｅｐａｓ１：ＡｄＡｐｔ Ｅｐａｓ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。
【００９０】
図４：スマートミックスによるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ発現の解析。セクションＡでは、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子に対応する親指の爪ほどの画像が示される。対照レベルは、この遺伝子の最適な可視化を可能にするが、この図全体で一定に定まるレベルに設定した。６画像の各ストリップは、ＲＮＡ試料の範囲にわたって、別個のアレイ位置又は実験に対応している。個々のスポット画像下の数字は、参照条件（ｇｆｐ；２０％ Ｏ２）と比較した当該スポットの正規化強度の比である。アレイ配置：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによる定義通りのスポットの強度。クローン：ＩＭＡＧＥ同定。ヒストグラム（セクションＢ）は、示される数字の平均を示し、エラーバーは標準偏差である。ｇｆｐ：ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｈｉｆ−１ａ：ＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｅｐａｓ１：ＡｄＡｐｔ Ｅｐａｓ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。
【００９１】
図５：スマートミックスによる成長因子β発現由来血小板の解析。セクションＡでは、成長因子β由来の血小板（ＰＤＦＧβ）遺伝子に対応する親指の爪ほどの画像が示される。対照レベルは、この遺伝子の最適な可視化を可能にするが、この図全体で一定に定まるレベルに設定した。６画像の各ストリップは、ＲＮＡ試料の範囲にわたって、別個のアレイ位置又は実験に対応している。個々のスポット画像下の数字は、参照条件（ｇｆｐ；２０％ Ｏ２）と比較した当該スポットの正規化強度の比である。アレイ配置：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによる定義通りのスポットの強度。クローン：ＩＭＡＧＥ同定。この遺伝子では、同一遺伝子に対応する異なるＩＭＡＧＥクローンが存在する。ヒストグラム（セクションＢ）は、示される数字の平均を示し、エラーバーは標準偏差である。ｇｆｐ：ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｈｉｆ−１ａ：ＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｅｐａｓ１：ＡｄＡｐｔ Ｅｐａｓ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。
【００９２】
図６：スマートミックスによる単球走化性タンパク質−１発現の解析。セクションＡでは、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）遺伝子に対応する親指の爪ほどの画像が示される。対照レベルは、この遺伝子の最適な可視化を可能にするが、この図全体で一定に定まるレベルに設定した。６画像の各ストリップは、ＲＮＡ試料の範囲にわたって、別個の実験に対応している。個々のスポット画像下の数字は、参照条件（ｇｆｐ；２０％ Ｏ２）と比較した当該スポットの正規化強度の比である。アレイ配置：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによる定義通りのスポットの強度。クローン：ＩＭＡＧＥ同定。ヒストグラム（セクションＢ）は、示される数字の平均を示し、エラーバーは標準偏差である。ｇｆｐ：ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｈｉｆ−１ａ：ＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｅｐａｓ１：ＡｄＡｐｔ Ｅｐａｓ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。
【００９３】
図７：スマートミックスによる新規な遺伝子（Ｈｓ．１６３３５）の発見。セクションＡでは、ＵｎｉＧｅｎｅクラスターＨｓ．１６３３５由来のＥＳＴに対応する親指の爪ほどの画像が示される。対照レベルは、この遺伝子の最適な可視化を可能にするが、この図全体で一定に定まるレベルに設定した。この遺伝子では、対照レベルは最大である。６画像の各ストリップは、ＲＮＡ試料の範囲にわたって、別個の実験に対応している。個々のスポット画像下の数字は、参照条件（ｇｆｐ；２０％ Ｏ２）と比較した当該スポットの正規化強度の比である。アレイ配置：Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによる定義通りのスポットの強度。クローン：ＩＭＡＧＥ同定。ヒストグラム（セクションＢ）は、示される数字の平均を示し、エラーバーは標準偏差である。ｇｆｐ：ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｈｉｆ−１ａ：ＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。Ｅｐａｓ１：ＡｄＡｐｔ Ｅｐａｓ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞。
【００９４】
図８：スマートミックスによるＨｓ．１６３３５の発見を確証するための実際上のノーザンブロットハイブリダイゼーション。Ａ）ハイブリダイゼーションプローブ＝Ｈｓ．１６３３５。Ｂ）ハイブリダイゼーションプローブ＝βアクチン。レーン１〜６は、図３〜７で用いた、アデノウイルスで形質導入したＲＮＡ試料である。レーン７〜１０は、形質導入しないか（レーン９，１０）又は前活性化なし（レーン７，８）のマクロファージ由来である。ヒストグラムは、上に位置するノーザンブロットに関するリン光画像解析機（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）による相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す。数字は、ｇｆｐ（２０％ Ｏ２）と比較した相対的な発現比である。
【００９５】
実施例
実施例１：マクロファージにおける遺伝子発見のためのスマートミックスの使用
マクロファージは、癌、アテローム性動脈硬化症、及び関節炎のような炎症性疾患を含む種々の病気状態に付随する。多くのこれら状態では、マクロファージは病気状態を激化する因子を分泌する。これら因子としては、血管形成因子、走化性物質及び炎症性サイトカインが挙げられる。これら因子のいくつかは公知であるが、現在未知であり、また治療に重要かもしれない他の因子があると考えられる。多くの病状では、マクロファージは低い酸素（低酸素（Ｈｙｐｏｘｉａ））の領域に存在し、多くの遺伝子を刺激するためのシグナルとして作用するのは、この生理的状態である。この背景を考慮すると、循環器病、癌及び炎症性疾患の分野における薬物開発で重要な標的が低酸素環境で誘発されうると示唆することは妥当である。
【００９６】
本技術の現状を示す簡単なアプローチは、単球／マクロファージの集団を取り、それらを２つに分け、１セットを正酸素濃度に置き、他セットを低酸素濃度に置くことである。そして、２セットのＲＮＡ又はタンパク質分子を適切な差次的解析で使用する。目標は、低酸素の条件下では存在するが、正常な酸素濃度に維持された細胞内には存在しないタンパク質又はｃＤＮＡ分子を同定することである。
本発明をマクロファージ内で低酸素誘発される遺伝子及びタンパク質の同定に適用する場合、ノイズ比に対するシグナルを高めるため、低酸素及び正酸素間の相異を増幅する努力をするだろう。これは、Ｈｉｆ１α遺伝子を、それが過剰発現される構成でマクロファージに送達することで、低酸素シグナルに対する応答を高めることによって達成できるだろう。Ｈｉｆ１αは、低酸素に応答する制御プロセスの一部である。低酸素誘発経路内のＨｉｆ１α及び他のタンパク質が、低酸素応答要素（ＨＲＥ）と呼ばれるエンハンサー要素と相互作用し、低酸素誘発型遺伝子の転写のスイッチを入れる。種々の姿のＨＲＥは、低酸素条件でスイッチが入ることが知られる多くの遺伝子由来の上流位置に存在する。Ｈｉｆ１αの過剰発現が、異なるスクリーンで、多くの低酸素誘発型遺伝子等の大量の過剰発現を惹起し、それは低酸素特異性ｃＤＮＡｓ又はタンパク質のレベルを増幅するだろう。これは、順次、薬物開発の標的となりうるそれら分子種を検出する可能性を高めるだろう。従って、この場合、本発明に従って使用されるアプローチは、正酸素条件ではＨｉｆ１αを過剰発現しないマクロファージを、低酸素条件でＨｉｆ１αを過剰発現するマクロファージと比較することである。
【００９７】
Ｈｉｆ１α送達及び発現は、多くの方法で達成できる。
ここで、我々は、恒常的に転写因子ＨＩＦ１αを発現するアデノウイルスベクターの構築について述べる。ＨＩＦ１α ｃＤＮＡは、Ｊｕｋａｔ ｍＲＮＡから、５’オーバーハング内にＮｈｅＩ及びＨｐａＩ制限部位を隠している以下のＰＣＲプライマーを用いて単離した。
順方向プライマー：５’−ＣＧＧＣＴＡＧＣ−ＧＡＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧ−３’
逆方向プライマー：５’−ＣＧＧＴＴＡＡＣ−ＧＣＴＣＡＧＴＴＡＡＣＴＴＧＡＴＣＣ−３’
【００９８】
ＮｈｅＩ及びＨｐａＩ制限酵素でＰＣＲ産物を消化し、ヒトＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ配列を含むＩｎｔｒｏｇｅｎｅ ＡｄＡｐｔＴＭ伝達ベクター中のＮｈｅＩ−ＨｐａＩ部位内に挿入した。このベクターは、アデノウイルス血清型５ゲノムの右腕と共にＥ１発現細胞系ＰｅｒＣ６中に共形質移入する前に、Ｐｍｌｌを用いて線状にすることができる（９１１又は２９３細胞も使用できる）。
ＰｅｒＣ６ ＲＣＡ−フリーシステムによるＡｄＣＭＶＨＩＦ１αアデノウイルスの生成は、ｗｗｗ．ｉｎｔｏｒｇｅｎｅ．ｃｏｍ（Ｉｎｔｒｏｇｅｎｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で述べられている。主要なヒトマクロファージの効率的なアデノウイルス形質導入の方法は、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，２０００で述べられている。
【００９９】
形質導入された及び形質導入されないマクロファージ集団内の遺伝子発現は、上述したような多くの可能な方法で比較され、ＨＩＦ１αのコントロール下発現される遺伝子の読み出しを生成する。さらに、０．５％未満の酸素濃度でインキュベートした形質導入細胞が非形質導入細胞と比較される。
差次的遺伝子発現の解析用に、全ＲＮＡ試料を調製する。これらを放射能又は蛍光標識し、かつ固体担体上のｃＤＮＡｓのアレイにハイブリダイズする。低酸素及び／又は個々のＨＩＦタンパク質産物の発現によって上方制御される遺伝子は、定量的に強いハイブリダイゼーションシグナルを生成する。アレイ戦略は、ナイロン又はガラス担体を含んでよく、Ｂｏｗｔｅｌｌ，１９９９でレビューされている。ガラス担体アプローチに関与する方法論の詳細は、Ｅｉｓｅｎ及びＢｒｏｗｎ，１９９９に詳述されている。ここでは、蛍光標識したプローブを用い、かつハイブリダイゼーションをレーザー共焦点スキャナーで検出する。ナイロン担体アプローチには、分子クローニング：実験室マニュアル Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓで詳述されているように、標準的な分子生物学法のドットブロット法及びハイブリダイゼーションが含まれる。ここでは、比較すべきＲＮＡ試料を放射能標識し、ハイブリダイゼーションをリン光画像処理機で検出する。
アレイは、Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから購入でき、又は差引きクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ所有のＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ法）で生成されたｃＤＮＡクローンを用いて社内で製作される。製作は、アレイ化ロボットの使用を含むだろう（ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ，ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ Ｌｔｄ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。
【０１００】
実施例２：マクロファージ内で低酸素制御された遺伝子の同定のためのスマートミックスの使用
マクロファージ内で低酸素誘発された遺伝子及びタンパク質の同定に本発明を適用した。
スマートミックスを利用して、主要なヒトマクロファージ内で低酸素に応じて活性化又は抑制される遺伝子の発見を向上させた。実施例１で説明したように、これは、実験的に低酸素応答のキー制御因子、すなわち低酸素誘発性因子１α（ＨＩＦ−１α）を導入することによって、低酸素に対する天然の応答を高める工程を含む。ＨＩＦ−１αの過剰発現は、独立して行うか、又は低酸素への細胞の露出と併せて行った。これにより、低酸素のみでは検出できないであろう、その結果の遺伝子発現の変化の検出が可能になった。
【０１０１】
ＨＩＦ−１αが低酸素に応じて媒介することは周知であるが、他の転写因子も知られ、又は関与すると思われる。これらには、内皮ＰＡＳドメインタンパク質１（ＥＰＡＳ１）又はＨＩＦ−１αと４８％の配列同一性を共有するＨＩＦ−２αが含まれる（“内皮ＰＡＳドメインタンパク質１（ＥＰＡＳ１）、内皮細胞内で選択的に発現される転写因子”Ｔｉａｎ Ｈ，ＭｃＫｎｉｇｈｔ ＳＬ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ．Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．１９９７年１月 １；１１（１）：７２−８２）。証拠は、特定の細胞型内で低酸素応答を媒介するのに、ＥＰＡＳ１が特に重要であることを示唆しており、かつそれはヒトマクロファージ内で明らかに検出可能であり、この細胞型の役割を示唆している（“マクロファージ−病理学的低酸素に遺伝子治療を供給するための新規な系”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００年２月；７（３）：２５５−６２。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ｌ，Ｂｉｎｌｅｙ Ｋ，Ｉｑｂａｌｌ Ｓ，Ｋａｎ Ｏ，Ｍａｘｗｅｌｌ Ｐ，Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ Ｐ，Ｌｅｗｉｓ Ｃ，Ｈａｒｒｉｓ Ａ，Ｋｉｎｇｓｍａｎ Ｓ，Ｎａｙｌｏｒ Ｓ．）。この観点から、本実施例も、低酸素応答性遺伝子の発見を改善するというＨＩＦ−１αの過剰発現と無関係の手段として、ＥＰＡＳ１の過剰発現を利用する。また、それは本発明の実施形態を説明し、それによってＨＩＦ−１α又はＥＰＡＳ１（又は低酸素応答の他の媒介物）に応じた相異が同定され、病気の特異的かつ効率的治療により好適な治療的な標的分子を同定することを目標とする。
【０１０２】
実施例１で述べたように、外来性遺伝子配列（すなわちＨＩＦ−１α又はＥＰＡＳ１）の主要マクロファージへの導入は、組換え型アデノウイルスによって達成できる。実施例１で述べたように、商業的に入手可能な系を使用して、アデノウイルス伝達ベクターＡｄＡｐｔ、アデノウイルスゲノムプラスミドＡｄＥａｓｙ及びパッケージング細胞系Ｐｅｒ−ｃ６（Ｉｎｔｒｏｇｅｎｅ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含むアデノウイルス粒子を生成した。標準的な製造業者の使用説明に従った。
ＡｄＡｐｔ伝達ベクターの３つの誘導体を調製し、ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰ、ＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ及びＡｄＡｐｔ ＥＰＡＳ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰと名付けた。これらベクターでは、便宜のため、強力なサイトメガロウイルス（ＣＭＤ）プロモーターから発現される挿入遺伝子（すなわち、ＨＩＦ−１α又はＥＰＡＳ１）が、内部リボソームエントリ部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ（ｉｒｅｓ））によって、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）マーカーに連結されるようにＡｄＡｐｔを修飾した。従って、緑色蛍光の存在が、形質導入される哺乳類細胞内でＨＩＦ−１α又はＥＰＡＳ１のウイルス発現の好都合な指標を与える。
【０１０３】
ＡｄＡｐｔの誘導体を作製するため、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、制限酵素消化によるプラスミド間のＤＮＡフラグメントの伝達、アガロースゲルＤＮＡフラグメント分離、平滑末端を生成するためのオーバーハング末端を有する二本鎖ＤＮＡフラグメントの “末端修復”、又はＤＮＡ連結反応を含む標準的な分子生物学法を用いた。サブクローニング工程は、ＤＮＡ配列決定法によって確認した。これらの方法は技術的に周知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋら，分子クローニング，実験室マニュアル（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９），４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照することができる。
【０１０４】
要するに、ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰは、ＡｄＡｐｔの末端修復されたＨｐａＩ制限酵素部位、ＣＭＶプロモーターと同一起源のかつその中の即下流中に、脳心筋炎ウイルスＥＭＣＶ ｉｒｅｓ、次いで緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）を挿入することによって作った。ＥＭＣＶ ｉｒｅｓ及びｇｆｐの両配列は広く用いられており、一般的に入手可能なプラスミドから得ることができる。配列番号：１は、ＡｄＡｐｔプラスミド中に挿入された連結ｉｒｅｓ−ＧＦＰの正確なヌクレオチド配列を示す。
プラスミドＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰは、ヒトＨＩＦ−１αのタンパク質コード配列を、ＣＭＶプロモーターとＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰのｉｒｅｓ−ＧＦＰ要素との間に挿入することによってＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰから誘導した。これを行うため、ヒトｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲでヒトＨＩＦ−１α ｃＤＮＡをクローン化し、その配列を公開されているＨＩＦ−１α ｃＤＮＡヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受入れ Ｕ２２４３１）と比較することで検証した。ＨＩＦ−１α配列を末端修復フラグメントとしてＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰの末端修復ＡｇｅＩ制限酵素部位［これは、ＣＭＶプロモーターの親ベクターＡｄＡｐｔ即下流のＡｇｅＩ制限酵素部位でもある］中に連結した。ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰ中に挿入されたＨＩＦ−１αをコードする正確なＤＮＡ配列は、配列番号：２に示される。
【０１０５】
プラスミドＡｄＡｐｔ ＥＰＡＳ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰは、ヒトＥＰＡＳ１のタンパク質コード配列をＣＭＤプロモーターと、ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰのｉｒｅｓ−ＧＦＰ要素との間に挿入することで誘導した。これを行うため、ヒトｍＲＮＡから逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）でヒトＥＰＡＳ１ ｃＤＮＡをクローン化し、その配列を公開されているＥＰＡＳ１ ｃＤＮＡヌクレオチド配列（Ｇｅｎｂａｎｋ 受入れ Ｕ８１９８４）と比較することで検証した。ＥＰＡＳ１配列を末端修復フラグメントとしてＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰの末端修復ＡｇｅＩ制限酵素部位［これは、ＣＭＶプロモーターの親ベクターＡｄＡｐｔ即下流のＡｇｅＩ制限酵素部位でもある］中に連結した。ＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰ中に挿入されたＥＰＡＳ１を含有する正確なＤＮＡ配列は、配列番号：３に示される。
【０１０６】
アデノウイルス伝達ベクターＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦ及びＡｄＡｐｔ ＥＰＡＳ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰは、哺乳類細胞中のＣＭＶプロモーター由来の機能的に活性なＨＩＦ−１α又はＥＰＡＳ１タンパク質の発現を作動する能力のため、アデノウイルス粒子の産生前に検証した。これは、記載されているような（Ｂｏａｓｔ Ｋ，Ｂｉｎｌｅｙ Ｋ，Ｉｑｂａｌｌ Ｓ，Ｐｒｉｃｅ Ｔ，Ｓｐｅａｒｍａｎ Ｈ，Ｋｉｎｇｓｍａｎ Ｓ，Ｋｉｎｇｓｍａｎ Ａ，Ｎａｙｌｏｒ Ｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９９年９月 １；１０（１３）：２１９７−２０８。“虚血性疾患治療のための生理学的に制御されたベクターの特徴づけ”）一過性感染ルシフェラーゼ−リポーターアッセイによって行った。
上述のＩｎｔｒｏｇｅｎｅアデノウイルス系を用いて、ベクターＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰ、ＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ及びＡｄＡｐｔ ＥＰＡＳ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰのそれぞれについて、セシウム縞状の純粋なアデノウイルス粒子を生成した。Ｉｎｔｒｏｇｅｎｅマニュアルに従い、アデノウイルス調製品をスペクトロメトリで定量化し、ミリリッター毎のウイルス粒子（ＶＰ）の値を得た。
【０１０７】
ヒトマクロファージを単離するため、健康なヒトドナーの末梢血液から単球を誘導した。Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）からのバフィーコートの１００ｍｌバッグを等量のＲＰＭＩ１６４０媒体（Ｓｉｇｍａ）と混合した。これを、５０ｍｌ遠心分離管内の１０ｍｌフィコール−ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に積み重ね、２５分間８００ｘｇで遠心分離した。間期層を除去し、ＭＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水 ｐＨ ７．２，０．５％ウシ血清アルブミン，２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で洗浄し、１０ｎ７細胞当たり８０ミリリッターで懸濁させた。これに、２０マイクロリッターのＣＤ１４ Ｍｉｃｒｏｂｅａｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を添加し、管を４度で１５分間インキュベートした。この後、ＭＡＣＳ緩衝液中、４００ｘｇで１回洗浄し、細胞を３ｍｌ ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ｍｉｄｉ−ＭＡＣＳマグネット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上に載置したＬＳ＋ ＭＡＣＳ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上で分離した。カラムを３×３ｍｌ ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄した。カラムをマグネットから除去し、注射器を用いて細胞を５ｍｌ ＭＡＣＳ緩衝液に溶出させた。２％ヒトＡＢアルブミン血清（Ｓｉｇｍａ）を補足した培養液（ＡＩＭ Ｖ（Ｓｉｇｍａ））中で細胞を洗浄し、同じ培養液内で１ｍｌ当たり２×１０ｎ５細胞で再懸濁させ、大きなテフロン（登録商標）コート培養バッグ（Ｓｕｄ−Ｌａｂｏｒｂｅｄａｒｆ ＧｍｂＨ，８２１３１ Ｇａｕｔｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に置き、７〜１０日間組織培養インキュベーターに移した（３７度。５％ ＣＯ２）。この期間中、単球は自発的にマクロファージを分化する。これは、位相差顕微鏡を用いて細胞形態を調べることで確認される。４度で３０分間置き、かつ内容物を空にすることでバッグから細胞を除去する。
【０１０８】
マクロファージを洗浄し、４％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）で補足したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）内に再懸濁させた。４×１０６細胞を別個の１０ｃｍ Ｐｒｉｍｅｒｉａ（Ｆａｌｃｏｎ）組織培養皿中に塗布し、プレート毎に全容量８ｍｌで１ｍｌ当たり６×１０９アデノウイルス粒子を有した。１６時間の培養、その間にマクロファージがプレートに付着し、アデノウイルス粒子で感染し、その後培地を除去して２％ヒトＡＢ血清で補足したＡＩＭ Ｖ培地と交換した。実験前にさらに２４時間培養し、形質導入されたアデノウイルスからの遺伝子発現を可能にした。
アデノウイルス粒子の上記用量は、遺伝子伝達のマーカーとして緑色蛍光を用いてマクロファージ集団の大多数（８０％超え）の形質導入を達成するのに必要な最少量に決定した。これは、ＬａｃＺリポーター遺伝子を含有する個々のアデノウイルス構成物を用いて確認した。ウイルスの最小用量を選択することによって、ウイルス伝達の可能な非特異的効果が最小化される。
【０１０９】
低酸素における実験のため、同一の培養皿を２つの別個のインキュベーター中に分けた：一方は３７度、５％ＣＯ２、９５％空気（＝正酸素）、他方は３７度、５％ＣＯ２、９４．９％窒素、０．１％酸素（＝低酸素）。この条件下で８時間培養後、皿をインキュベーターから取り出し、チルド台上に載置し、冷却ＰＢＳ内で洗浄し、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮａｚｏｌ Ｂ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｌｔｄによって配給される）を用いて全ＲＮＡを抽出した。
【０１１０】
この実験の設計は、以下に示されるように、アデノウイルス及び／又は低酸素による処理のみが異なる６つの細胞集団（単に“細胞型”と呼ばれる）を得ることだった。
2004537958.tif 000002
【０１１１】
遺伝子の発見は、これら“細胞型”間の遺伝子発現プロフィルを比較することで実行できる。文献で入手可能な従来の方法により、細胞型２と１との間の比較をできるだろう。本発明（スマートミックス（Ｓｍａｒｔｏｍｉｃｓ））を実施することで、いくつかの他の可能性が考えられる。第１に、細胞型３又は５と細胞型１との間の比較を行うことができる。ここで、低酸素応答に関与するキー分子を過剰発現させるという刺激は、細胞型２について考えられるようにな低酸素に対する天然の応答を超えうる。第２に、本発明の好ましい実施形態では、細胞型４又は６と細胞型１との間の比較を行うことができる。この状況では、低酸素に対する天然の応答は、低酸素応答に関与するキー分子を過剰発現させることによって、増大又は強められている。上述の実験設計は未処理細胞の代わりに対照アデノウイルスを使用することに留意すべきである。これを行うことによって、ウイルス系形質導入の如何なる非特異的効果も解析全体を通して等しく起こり、かつ消滅するだろう。
【０１１２】
形質導入されたマクロファージ内で緑色蛍光によって効率的なアデノウイルス遺伝子伝達が示されたが、ノーザンブロットを用いてＨＩＦ−１α及びＥＰＡＳ１の過剰発現を確認した。上述したように細胞型１〜６より抽出したＲＮＡ試料をノーザンブロットで解析した（図１）。ＲＮＡ試料（レーン毎に８ｕｇ全ＲＮＡ）をホルムアルデヒド変性１％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）に移し、次いで、ＨＩＦ−１α（図１ａ）、ＥＰＡＳ１（図１ｂ）又は２８ＳリボソームＲＮＡ（図１ｃ）にヌクレオチド配列が相同性の３３Ｐ標識ＤＮＡプローブでハイブリダイズした。ノーザンブロットストリンジェント条件下におけるプローブハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーション間のプローブの除去に用いる方法論は技術的に周知である。
【０１１３】
図１ａでは、すべてのレーンが内因性ＨＩＦ−１α ｍＲＮＡに相当する約４ｋｂの弱いバンドを含むことがわかる。ＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞由来のＲＮＡを含むレーン３、４では、同サイズのもっと強いバンドが観察され、ＨＩＦ−１αの過剰発現の成功を示している。
図１ｂでは、すべてのレーンが内因性ＥＰＡＳ１ ｍＲＮＡに相当する約５ｋｂの非常に弱いバンドを含むことがわかる。ＡｄＡｐｔ ＥＰＡＳ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入した細胞由来のＲＮＡを含むレーン５、６では、約４ｋｂのもっと強いバンドが観察され、ＥＰＡＳ１の過剰発現の成功を示している。内因性ＥＰＡＳ１と過剰発現されたＥＰＡＳ１のサイズの相異は内因性遺伝子の長い非形質導入領域のためであり、重要でない。
図１ｃでは、すべてのレーンで２８ＳリボソームＲＮＡが検出され、ゲル上のＲＮＡの等しい装填を示していることがわかる。
【０１１４】
図１ａ及び１ｂのリン光画像処理定量分析により、ＨＩＦ−１αとＥＰＡＳ１の両方の過剰発現レベルが内因性レベルの約８０倍であることは明白である。これら遺伝子のアデノウイルス指揮ｍＲＮＡ過剰発現は、低酸素によってはさらに増大されない。例えば、図１ａでは、レーン４のバンド強度はレーン３のバンド強度を超えていない。しかし、そのタンパク質及び機能性のレベルでは、低酸素は、これらｍＲＮＡｓによってコードされたタンパク質の作用を増強する（Ｓｅｍｅｎｚａ ＧＬ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．１９９９；１５：５５１−７８。“低酸素誘発性因子１による哺乳類のＯ２ホメオスタシスの制御”）。
【０１１５】
６つの“細胞型”から単離したＲＮＡ試料の全体的なｍＲＮＡ発現プロフィルは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒ Ｒｅｌｅａｓｅ１（ＧＦ２００）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて得た。この方法は、ＤＮＡ未知機能の注釈無しＥＳＴｓ又はｃＤＮＡ配列を調和させるだけの配列を含む、特徴づけのレベルの範囲をカバーする５，３００遺伝子に相同性のＤＮＡのプレメイドアレイを使用する。
アレイは、組成がナイロンであり、特異的ＩＭＡＧＥコンソーシアムｃＤＮＡクローン（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｉｍａｇｅ／）から誘導されるＤＮＡでスポットを付けられる。そのアレイを同位元素３３Ｐで放射能標識されているＲＮＡ試料にハイブリダイズし、ＲＮＡ試料内の個々の遺伝子の量を測定する。複数のＲＮＡ試料を平行して標識化かつハイブリダイズし、アレイのコピーを分離し、ＲＮＡ試料間でスポットハイブリダイゼーションシグナルを比較する。
【０１１６】
アレイに基づくｍＲＮＡ発現解析における主要な問題は、感度及び信頼性である。現在、２つの他の方法；ガラスマクロアレイ及びＤＮＡチップが利用可能であり、両者とも蛍光標識したＲＮＡを利用する（Ｂｏｗｔｅｌｌ ＤＤ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅ．１９９９年１月；２１（１ Ｓｕｐｐｌ）：２５−３２。“マイクロアレイによる発現データを得るために−開始から終了まで−利用可能なオプション”）。これら方法は、しばしばナイロンに基づく方法より高い感度を提供すると考えられるが、この意見は決定的な証拠を欠く。対照的に、３つのアプローチを注意深く比較すると、同量の未増幅ＲＮＡでは、ナイロンベースの放射能法が優れていることがわかる（Ｂｅｒｔｕｃｃｉ Ｆ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｋ，Ｌｏｒｉｏｄ Ｂ，Ｃｈａｎｇ ＹＣ，Ｇｒａｎｊｅａｕｄ Ｓ，Ｂｉｒｎｂａｕｍ Ｄ，Ｎｇｕｙｅｎ Ｃ，Ｐｅｃｋ Ｋ，Ｊｏｒｄａｎ ＢＲ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅ．１９９９年９月；８（９）：１７１５−２２。“ＤＮＡアレイに基づく発現測定における感度の問題及び小試料用ナイロンマイクロアレイの性能”）。マイクロアレイ及びＤＮＡチップ法は、主要細胞からは容易に得られないことが多い、もっと大量のＲＮＡか、又は誤差を持ち込みやすい複雑な増幅法を必要とする。
【０１１７】
スマートミックスの本例示で使用するアレイベースの遺伝子発現法を実証するため、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓを用いて我が研究所で解析した２つの代表的なＲＮＡ試料の散布図は、４−ｌｏｇｓに近づく範囲の検出を示している（図２）。比較により、論証できる最も精巧なアレイに基づく方法、ＤＮＡチップは、３−ｌｏｇｓの検出範囲を有するとして引用される（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。
従って、本例示によって示されるように、感度の問題に関してスマートミックスによって与えられる改良は、代替的なアレイベース法を利用することによって容易には得られなと想定することは妥当である。どの場合でも、いずれの潜在的に優れたアレイ方法論も本明細書で述べるスマートミックスを利用することで、さらに改良できるだろう。本発明の重要な有用性は、アレイハイブリダイゼーションのような高処理能力法を用いて、通常はＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロットのような非常に感受性の低処理能力法によってのみ検出可能な発現の変化を同定できることである。
【０１１８】
上述したように６つの“細胞型”から抽出されたＲＮＡを放射能標識かつハイブリダイズして、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｈｕｍａｎ ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒ ＧＦ２００（実験 ＃１）のコピーを分離した。製造業者によって提供される方法に従った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＧＦ２００＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｈｐ３）。ハイブリダイズしたアレイの画像は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ リン光画像処理機を用いて得た。そして、上述の手順に従ってＲＮＡをアレイから外した。
再現性を保証するため、この手順を同一のＤＮＡ試料で繰り返した（実験 ＃２）。全データセットをインポートし、Ｐａｔｈｗａｙｓ ３．０マニュアルの説明通りに、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｐａｔｈｗａｙｓ ３．０ ソフトウェアを用いて解析した。本解析のキーとなる局面は以下に要約される。
【０１１９】
プロジェクトトリーセットアップ
“条件ペア”態様を使用し、同時に複数の実験を解析した。“条件”は、同一の“細胞型”から誘導される同様のＲＮＡ試料にハイブリダイズされるいくつかのアレイを意味する。
2004537958.tif 000003
【０１２０】
正規化セットアップ
“全データ点”オプション及びデフォルト設定を有するＹ．Ｃｈｅｎアルゴリズムを、Ｐａｔｈｗａｙｓ ３．０マニュアルで説明されているように選択した。同一実験からの異なるアレイ由来のハイブリダイゼーションシグナル間の全体的な相異が補正されるように、２つの実験を別個の正規化群として処理した。
【０１２１】
比較解析
ペア法の比較は、条件２と条件１
条件３と条件１
条件４と条件１
条件５と条件１
条件６と条件１
との間で行った。
他言すると、ペア法比較は参照条件として条件１（すなわち細胞型１）を用いて行った。これは対照のアデノウイルスＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入され、かつ正常な酸素濃度（正酸素）下に置かれた細胞に相当する。このようにしてＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧＦ２００アレイ上に存在する全遺伝子について比較する。条件を比較することで、本解析は実験＃１及び＃２の両方からのデータを考慮する。
【０１２２】
フィルタセッティング
そして、フィルタリングを行い、上述した５つのペア法比較の少なくとも１つについて、２．０を超える発現比率を有する遺伝子を選択した。全６条件で低いシグナル強度の遺伝子は、最小０．２、最大１０００のＩｎｔｅｎｓｉｔｙ ＩＩ フィルタを用いて自動的に除去した。実験＃１と＃２で再現性のある仕方で応答しない遺伝子は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定フィルタ（９０％信頼レベル）を用いて自動的に除去した。
個々の遺伝子の発現プロフィルとして結果を出力し、正規化シグナル強度と発現比率を示す。Ｐａｔｈｗａｙｓ ３．０の解析の主要な利点は、個々スポットの高倍率の親指の爪ほどの画像が示されることである。これは、測定される領域がハイブリダイズされたアレイスポットを含有する領域を本当にカバーし、かつそのスポットが本物であり、背景の人工産物でない、視覚的検証を可能にする。
【０１２３】
試料化領域が明らかに真実のアレイスポットであるとはいえ、時には、定量データと対応する親指の爪ほどの画像との間に微小な相異がある。例えば、目では２つのスポット間の差は小さく見えるが、定量分析はより大きな差を示す。親指の爪ほどの画像は、全体的な相異を補償するようには正規化されず、また画像の品質には限界があることに留意すべきである。グレイスケールの画像は、強度の定量的な差を示すための能力に本質的に制限される。Ｓｔｏｒｍリン光画像処理機で生成されるデジタル画像は、単一ピクセルでは１００，０００のリニアダイナミックレンジをカバーするのに対し、印刷された画像はグレイの２５６シェードとして描かれるのみである。
【０１２４】
３つの代表的な既知の低酸素制御遺伝子の結果
低酸素露出を伴うＨＩＦ−１α及びＥＰＡＳ１の過剰発現は、真正な低酸素制御遺伝子の発見という点で、非形質導入低酸素細胞を使用することより優れることの証明として、低酸素で制御されることが技術的に既知の遺伝子についての結果が示される。
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧＦ２００アレイ上の二重スポットとして表される３つの遺伝子を選択した。従って、全体的な実験を繰り返したが、これら３つの遺伝子について合計４回の繰り返しの比較が可能である。
【０１２５】
乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨ−Ａ）遺伝子は、低酸素で活性化されることが技術的に知られている（Ｗｅｂｓｔｅｒ ＫＡ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７年９月；７７（１）：１９−２８。“糖分解酵素ＲＮＡ転写速度の骨格筋細胞における酸素アベイラビリティによる制御”）。図３では、低酸素のみ（ｇｆｐ ０．１％Ｏ２）に応じて、正酸素（ｇｆｐ ２０％Ｏ２）と比較して平均２．２４倍ｍＲＮＡ発現が増加することを確かめることができる。
ＨＩＦ−１αを過剰発現させることで、ＬＤＨ−Ａ発現が平均３．３９倍高まり、天然の応答を超える有意な向上を与えている（図３；ＨＩＦ−１α ２０％ Ｏ２）。スマートミクッス法の好ましい実施形態を利用し、低酸素下で同時にＨＩＦ−１αを過剰発現させることで、ＬＤＨ−Ａの平均応答が、さらに４．５倍に上昇する（図３；ＨＩＦ−１α ０．１％ Ｏ２）。
【０１２６】
先行技術では、ＨＩＦ−１αがＬＤＨ−Ａの低酸素誘発活性化を媒介する原因であることが確立されている（Ｉｙｅｒ ＮＶ，Ｋｏｔｃｈ ＬＥ，Ａｇａｎｉ Ｆ，Ｌｅｕｎｇ ＳＷ，Ｌａｕｇｈｎｅｒ Ｅ，Ｗｅｎｇｅｒ ＲＨ，Ｇａｓｓｍａｎｎ Ｍ，Ｇｅａｒｈａｒｔ ＪＤ，Ｌａｗｌｅｒ ＡＭ，Ｙｕ ＡＹ，Ｓｅｍｅｎｚａ ＧＬ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９８年１月 １５；１２（２）：１４９−６２“低酸素誘発性因子１αによるＯ２ホメオスタシスの細胞及び発生コントロール”）。しかし、同時に低酸素の有無の両者で、ウイルス遺伝子伝達法を用いて安定的な様式でのＨＩＦ−１αの過剰発現が、遺伝子発現における天然の低酸素応答より顕著に大きい二次変化をもたらすことは、予想又は実証されていない。ＬＤＨ−Ａの低酸素に対する応答は、ＥＰＡＳ１を過剰発現させることによっても高まるが（図３；ＥＰＡＳ１）、これはＨＩＦ−１αを過剰発現させることよりも劇的でない。
【０１２７】
ＬＤＨ−Ａ同様に、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子は、低酸素で活性化されることが技術的に知られている（Ｗｅｂｓｔｅｒ ＫＡ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７年９月；７７（１）：１９−２８。“糖分解酵素ＲＮＡ転写速度の骨格筋細胞における酸素アベイラビリティによる制御”）。図４では、低酸素のみ（ｇｆｐ ０．１％Ｏ２）に応じて、正酸素と比較して平均１．５２倍ｍＲＮＡ発現が増加することを確かめることができる。
ＨＩＦ−１αを過剰発現させることで、ＧＡＰＤＨ発現が平均３．３３倍高まり、天然の応答を超えた有意な向上を与えている（図４；ＨＩＦ−１α ２０％ Ｏ２）。スマートミクッス法の好ましい実施形態を利用し、低酸素下で同時にＨＩＦ−１αを過剰発現させることで、ＧＡＰＤの平均応答が、さらに４．５７倍に上昇する（図４；ＨＩＦ−１α ０．１％ Ｏ２）。
【０１２８】
公表されている文献では、ＨＩＦ−１αがＧＡＰＤＨの低酸素誘発活性化を媒介する原因であることが確立されている（Ｉｙｅｒ ＮＶ，Ｋｏｔｃｈ ＬＥ，Ａｇａｎｉ Ｆ，Ｌｅｕｎｇ ＳＷ，Ｌａｕｇｈｎｅｒ Ｅ，Ｗｅｎｇｅｒ ＲＨ，Ｇａｓｓｍａｎｎ Ｍ，Ｇｅａｒｈａｒｔ ＪＤ，Ｌａｗｌｅｒ ＡＭ，Ｙｕ ＡＹ，Ｓｅｍｅｎｚａ ＧＬ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９８年１月 １５；１２（２）：１４９−６２“低酸素誘発性因子１αによるＯ２ホメオスタシスの細胞及び発生コントロール”）。しかし、同時に低酸素の有無の両者で、ウイルス遺伝子伝達法を用いて安定的な様式でのＨＩＦ−１αの過剰発現が、遺伝子発現における天然の低酸素応答より顕著に大きい二次変化をもたらすことは、予想又は実証されていない。
ＧＡＰＤＨでは、ＥＰＡＳ１の過剰発現は、ＨＩＦ−１αの過剰発現より効果がかなり小さいことを確認できる（図４；ＥＰＡＳ１ ２０％ Ｏ２及び０．１％Ｏ２）。これは、スマートミックス法の別個の実施形態を示しており、それによってＥＰＡＳ１又はＨＩＦ−１αの過剰発現に対して選択的又は優先的に応答する遺伝子が同定される。
【０１２９】
血小板由来成長因子ベータ（ＰＤＧＦ β）も、低酸素で活性化されることが知られている（Ｋｏｕｒｅｍｂａｎａｓ Ｓ，Ｈａｎｎａｎ ＲＬ，Ｆａｌｌｅｒ ＤＶ．Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．１９９０年８月；８６（２）：６７０−４“酸素分圧がヒト内皮細胞血小板由来成長因子Ｂ鎖遺伝子の発現を制御する”）。図５では、低酸素のみ（ｇｆｐ ０．１％Ｏ２）に応じて、正酸素と比較して平均２．１４倍ｍＲＮＡ発現が増加することを確かめることができる。
ＥＰＡＳ１を過剰発現させることで、ＰＤＦＧ β発現が平均９．２８倍高まり、天然の応答を超えた有意な向上を与えている（図５；ＥＰＡＳ１ ２０％ Ｏ２）。この場合、低酸素とＥＰＡＳ１過剰発現の組合せは、ＥＰＡＳ１過剰発現のみの応答を超えず、用量応答の飽和を示している（図５；ＥＰＡＳ１ ０．１％ Ｏ２）。
【０１３０】
図５から、ＥＰＡＳ１を過剰発現させることで、ＧＡＰＤＨについて観察されたのと反対の様式で、ＰＤＧＦ βのＥＰＡＳ１及びＨＩＦ−１αに応じた著しい特異性があることが明らかである。ＨＩＦ−１αのみの過剰発現は、ＰＤＦＧ βについては有意な効果がないが、ＥＰＡＳ１の過剰発現は大きな効果を生じている。これは、スマートミックス法の別個の実施形態によって、同一経路で作用する異なる因子の過剰発現に対して選択的又は優先的に応答する遺伝子が同定されることを実証している。
単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）をコードする遺伝子は、ｍＲＮＡ発現を減らすことでネガティブな様式で低酸素に応答することが技術的に知られている（Ｎｅｇｕｓ ＲＰ，Ｔｕｒｎｅｒ Ｌ，Ｂｕｒｋｅ Ｆ，Ｂａｌｋｗｉｌｌ ＥＲ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．１９９８年６月；６３（６）：７５８−６５．“低酸素はＭＣＰ−１発現を下方制御する：腫瘍におけるマクロファージ分布の意味”）。図６では、低酸素のみ（ｇｆｐ ０．１％Ｏ２）に応じて、正酸素と比較して平均０．４０７倍ｍＲＮＡ発現が変化することを確かめることができる。
【０１３１】
ＨＩＦ−１αを過剰発現させることで、ＭＣＰ−１発現が平均０．２４３倍変化し、天然の応答を超えた有意な向上を与えている（図６；ＨＩＦ−１α ２０％ Ｏ２）。スマートミクッス法の好ましい実施形態を利用し、低酸素下で同時にＨＩＦ−１αを過剰発現させることで、ＭＣＰ−１の平均応答がさらに０．１１２倍変化する（すなわち、８．９３倍の減少）（図６；ＨＩＦ−１α ０．１％ Ｏ２）。ＥＰＡＳ１を過剰発現させることで、ＭＣＰ−１発現のさらに明白な低酸素誘発阻害が得られる。これは、スマートミックスの使用が病気シグナルによって阻害又は抑制される遺伝子の発見を向上させることを実証している。
ＭＣＰ−１で例証されるように、ＨＩＦ−１α又はＥＰＡＳ１を過剰発現させることが、低酸素誘発性遺伝子抑制を可能にするという発見は、この分野では全く先例がない。ＨＩＦ−１αとＥＰＡＳ１の両タンパク質の構造は、形質導入ドメインを含むが、転写抑制ドメインは知られていない（Ｐｕｇｈ ＣＷ，Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ ＪＦ，Ｎａｇａｏ Ｍ，Ｇｌｅａｄｌｅ ＪＭ，Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ ＰＪ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９７年４月 ２５；２７２（１７）：１１２０５−１４．“低酸素誘発性因子−１；αサブユニット内の制御ドメインの定義”）。
【０１３２】
上述した結果は、アレイ遺伝子発現解析に関連し、アレイ上の全セット約５３００遺伝子から、５０を超える遺伝子が低酸素で制御されるとして同定された。低酸素で制御されることが技術的に知られている遺伝子に焦点を当て、かつスマートミックスがいかに応答を有意に高めることができるかを示すことによって、スマートミックスが、新規な真実の低酸素制御遺伝子の同定のために改良された方法を提供するという議論が与えられる。現研究では、これは、前述したように、スマートミックス法を用いて発見された新規な遺伝子について直接的に示すことができる。従来の解析から生じる発現の変化も（すなわち、ウイルスの過剰発現無しの低酸素／正酸素比較）この解析でカバーされるので、スマートミックス発明の利点が明白に実証される。
【０１３３】
表１は、ウイルス指揮過剰発現に応じて活性化されるとして、この解析では同定されたが、先行技術で行われるような低酸素／正酸素比較からは同定されていない、注釈無し遺伝子又はＥＳＴｓをリストしている。表１の最後の５列は、正酸素でＡｄＡｐｔ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰによって形質導入した細胞と比べた発現比率を示す。これら５列の最初は、スマートミックス無しの応答であり、ここで示されるすべての場合に、レベルは有意水準未満である。他の４列は、本発明を用いて得られた結果を示しており、ここでは有意な応答が見られる。特に、この表の最終列では、ＥＰＡＳ１過剰発現に対する高い応答を示す新規な遺伝子が同定されている。
【０１３４】
表１：スマートミックスによって同定された新規な遺伝子
【表１】
2004537958.tif 000004
【０１３５】
列１は、２００１年２月１６日のＵｎｉＧｅｎｅデータベースで使用されている遺伝子名である。最後の５列は、正酸素でＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰで形質導入された細胞と比較した比率として、発現された発現レベルを示す。ｇｆｐ Ｈ：低酸素でＡｄＡｐｔ ｉｒｅｓ−ＧＦＰによって形質導入された細胞内の発現。Ｈｉｆ Ｎ：正酸素でＡｄＡｐｔ Ｈｉｆ−１α ｉｒｅｓ−ＧＦＰによって形質導入された細胞内の発現。Ｈｉｆ Ｈ：低酸素でＡｄＡｐｔ Ｈｉｆ−１α ｉｒｅｓ−ＧＦＰによって形質導入された細胞内の発現。ＥＰＡＳ Ｎ：正酸素でＡｐＡｄｐ Ｅｐａｓ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰによって形質導入された細胞内の発現。ＥＰＡＳ Ｈ：低酸素でＡｐＡｄｐ Ｅｐａｓ１−ｉｒｅｓ−ＧＦＰによって形質導入された細胞内の発現。
【０１３６】
図７は、ＥＳＴに相当するこれら遺伝子の１つの発現プロフィルを示す（ＧｅｎＢａｎｋ受入れＮ６４７３４；ＩＭＡＧＥ クローン ２９３３３６）。ＵｎｉＧｅｎｅ ＥＳＴデータベースでは（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）、このＥＳＴは、現在受入れＡＩ０５１６０７（ＩＭＡＧＥ １６７４２５４）及びＴ８７１６１（ＩＭＡＧＥ ２９３３３６）の２つの他のＥＳＴｓと一群にされている。ＵｎｉＧｅｎｅ群番号は、Ｈｓ．１６３３５であり、データベース中で全く注釈されていない。配列解析は、このレアな配列が不完全であり、かつタンパク質コード配列に関する情報を欠いていることを示す。ヒトゲノム計画遺伝子注釈のＥｎｓｅｍｂｌデータベースにおいて（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）、予想又は確認されたｃＤＮＡ配列のブラストサーチは、このＥＳＴを同定していない。従って、パプリックドメイン情報から、ＥＳＴ ＩＭＡＧＥ ２９３３３６に対応する遺伝子が、本当に新規かつ注釈されていない遺伝子であることが明白である。
【０１３７】
図７では、親指の爪ほどのアレイスポット画像が、背景シグナルが明らかになるように、最大のコントラストで示されている。低酸素（ｇｆｐ ０．１％ Ｏ２）のみに応じて正酸素と比較してｍＲＮＡ発現が平均１．４倍高まることが確認できる。しかし、個々の実験からの種々多様な比率から誘導されるので（２．４１及び０．４６）、このことは重要でない。ｆｇｐ ２０％ Ｏ２及びｆｇｐ ０．１％ Ｏ２についての親指の爪ほどの画像から、これら条件下における遺伝子の発現は、アレイに基づく方法の検出許容限界未満であることがわかる。しかし、スマートミックス発明を用い、かつウイルス遺伝子伝達法によってＥＰＡＳ１が過剰発現されると、８倍を超える誘発比率で明らかに検出可能な応答が見られる（図７：ＥＰＡＳ１ ２０％ Ｏ２又はＥＰＡＳ１ ０．１％ Ｏ２）。図７の発現プロフィルは、ＨＩＦ−１α又はＥＰＡＳ１に対して選択的に応答する遺伝子の同定のための個別の実施形態を示している。
【０１３８】
図７に示される結果を確認するため、さらに感度の高い方法、すなわちノーザンブロット法を用いて、ＩＭＡＧＥ クローン ２９３３３６に対応する遺伝子の発現を研究した。ウイルスノーザンブロット法及び同様の方法は、多数の遺伝子の同時スクリーニングができないので、ＩＭＡＧＥクローン２９３３３６が低酸素によって誘発されるという最初の発見には適さなかっただろうことに留意すべきである。この方法は、発現された遺伝子のｍＲＮＡ集団に対応する二本鎖ｃＤＮＡを電気泳動によって分離し、かつナイロン膜上にブロットすることを除き、従来のノーザンブロット法と同様である。それは、全長ｃＤＮＡ分子を生成する、商業的に入手可能なｃＤＮＡ合成の方法に依存する（ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【０１３９】
ウイルスノーザンブロッティングの方法は、ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ Ｃｄｎａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔの使用説明マニュアルに記載されている通りに従った。要するに、アレイハイブリダイゼーション用に使用する６００ｎｇのｃＤＮＡを６つのＲＮＡ試料から合成した。さらに４つのＲＮＡも処理し、１００ｎｇ／ｍｌリポポリサッカリド（Ｅ．Ｃｏｌｉ ０２６：Ｂ６ Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）及びヒトガンマインターフェロン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）で１６時間前処理した場合としない場合の両者について正酸素及び低酸素で（６時間 ０．１％ Ｏ２）培養した非形質導入マクロファージから誘導した。この因子の組合せは、マクロファージ活性化、マクロファージの生理学的及び病態生理学的作用にとってキーとなるプロセスをもたらす。全１０種のｃＤＮＡ試料をアガロースゲル上で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋使用説明書に従い、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｍａｃｉａ，ＵＫ）上へのアルカリ伝達を行った。技術的に周知の標準的なノーザンブロットハイブリダイゼーションと同様に、３３Ｐ標識クローン化ｃＤＮＡプローブによるストリンジェントなハイブリダイゼーションを行った。ｃＤＮＡプローブは、商業的に入手可能なキット（Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＫ）を用いて標識した。ウイルスノーザンブロットは、まず、ＵｎｉＧｅｎｅ群Ｈｓ．１６３３５由来のＩＭＡＧＥクローン１６７４１５４のｃＤＮＡ挿入断片でハイブリダイズした（図８ａ）。そして、ブロットを高温／低塩洗浄でストリップし、ヒトβ−アクチン遺伝子のタンパク質コード領域で再プローブ化した（図８ｂ）。
【０１４０】
図８ｃからは、Ｈｓ．１６３３５に対応するｍＲＮＡが約４．５ｋｂの二重バンドとして検出されることがわかる。この遺伝子は、ＥＰＡＳ１のアデノウイルス指揮過剰発現によって強く誘発され（レーン５，６）、図７のアレイデータと一致している。この非アレイ解析における高い誘発比率は、ウイルスノーザン法によって与えられる増強された感度のためである。アレイデータと異なり、Ｈｓ．１６３３５の発現は、すべてのＲＮＡ試料の検出範囲内である。重要なことに、低酸素のみが約６０倍の誘発比率をもたらすことがわかる（図８ａ；レーン２，６）。従って、本発明（スマートミックス）の非存在下のアレイスクリーンの検出レベルより下であるが、Ｈｓ．１６３３５が真実の低酸素制御遺伝子として同定される。
【０１４１】
図８ａの結果は、スマートミックス法の別個の実施形態をも示しており、それによって、ＥＰＡＳ１又はＨＩＦ−１αの過剰発現に対して選択的又は優先的に応答する遺伝子が同定される。ＨＩＦ−１αの過剰発現は、Ｈｓ．１６３３５に対応する遺伝子の発現において１８．９倍の上昇をもたらすが、ＥＰＡＳ１の過剰発現は、１４１倍というずっと大きい誘発比率をもたらす。
図８ａ及び８ｂでは、ＬＰＳ及びＴＮＦαによるマクロファージの活性化が、Ｈｓ．１６３３５に対応する遺伝子の発現を１０．８倍高めることが示されている。従って、この新規な遺伝子は、マクロファージの感染機能におそらく関連している。
図８ｂでは、ヒトβ−アクチン遺伝子の発現が、この実験を通して大まかに一定であることが分かり、遺伝子発現における特異的変化に起因する図８ａにおける差と一致している。
【０１４２】
急速なｃＤＮＡ末端の増幅（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ））を行って、ウイルスノーザンブロット上のｃＤＮＡのサイズに基づき、Ｈｓ．１６３３５に対応する遺伝子の全長異形をクローン化できる。この遺伝子の配列決定及び機能解析により、おそらく新しい治療的標的分子の同定を招来するだろう。このプロセスへの重大さが、スマートミックス発明の最初の使用だった。
【０１４３】
実施例３：ＥＩＡＶベクター構築
この実施例は、ＣＭＶプロモーターの４つの独特なクローニング下流部位を有するＥＩＡＶベクター（ｐＯＮＹ８．１ＳＭ）の生産について述べる。ｐＯＮＹ８．１ＳＭは、それが含む（〜１．１ｋｂ）ＥＩＡＶ配列及びそれが発現する（なし）ＥＩＡＶタンパク質の点で、今日まで最小のＥＩＡＶベクターである。このベクターは、我々の発明の差次的発現スクリーニング法で使用することのできる遺伝子伝達系の例である。しかし、他のいずれのレンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はいずれの適切な製剤形態のＤＮＡに基づく他の遺伝子伝達系も使用可能である。
【０１４４】
ＥＩＡＶベースベクターｐＯＮＹ８．１ＳＭの構築
開始点はｐＯＮＹ８．１ＳＭだった（ＧＢ９７２７１３５．７及びＭｉｔｏｐｈａｎｏｕｓら，１９９９）。ベクター内のｇａｇ配列を維持しながら、ＥＩＡＶｇａｇ領域内の最初の２つのＡＴＧトリプレットをＡＴＴＧで置き換え、ＥＩＡＶゲノム由来のｇａｇの発現を排除した。ｇａｇ配列は、高タイターベクター産生を維持するのに重要であることがわかった。
ＰＣＲでＡＴＧからＡＴＴＧへ変更した。ＡＴＴＧ１及びＰＳ２を用いてＥＩＡＶリーダー／ｇａｇ配列を増幅した。このための鋳型はプラスミドｐＯＮＹ３．１だった（ＧＢ９７２７１３．７及びＭｉｔｏｐｈａｎｏｕｓら，１９９９）。このＰＣＲフラグメントは、それぞれ５’末端及び３’末端に、ＮａｒＩ及びＸｂａＩ部位を含む。このフラグメントを、ＮａｒＩ及びＸｂａＩで切断されたｐＯＮＹ４Ｚ中に挿入して、ｐＯＮＹ８．０Ｚを生成した。
【０１４５】
ＡＴＴＧ１プライマー：ＡＧＴＴＧＧＣＧＣＣＧＡＡＣＡＧＧＧＡＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＡＣＣＴＧＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＴＴＡＣＡＧＡＡＧＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＡＧＡＴＴＧＧＧＡＧＣＣＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＧＣＴＣＡＡＧＡＡ
下線部＝ＮａｒＩ部位
ＰＳ２プライマー：ＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＧＡＴＡＴＴＣＴＴＣＡＧＡＧ
下線部＝ＸｂａＩ部位
ｐＯＮＹ８．１ＳＭは、関心のあるいずれの遺伝子も発現させられる内部ＣＭＶプロモーターを含有するＥＩＡＶベクターゲノムである。それは、ｐＯＮＹ８Ｚからｅｎｖ配列の一部を欠失させることで作った。ｐＯＮＹ８Ｚは、ＳｂｆＩ（位置５８８５）で切断した。これをＳａｐＩ（ｐＯＮＹ８Ｚには２つのＳａｐＩ部位がある、図９参照）で部分的に切断した。部位８０５６で切断した分子を精製し、平滑末端化かつ再連結してｐＯＮＹ８．１Ｚを得た。ｐＯＮＹ８．１ＳＭを生成するため、ｐＯＮＹ８．１ＺをＳａｃＩＩ及びＳｐｈＩで切断し、平滑末端化かつ再連結した。これは、ｌａｃＺ遺伝子を除去し、いずれかの遺伝子又は遺伝子ライブラリーの挿入用の４つの独特な部位、ＢｓｍＢＩ、ＳｂｆＩ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを創造する（図１０）。ＳｂｆＩは、未知遺伝子を挿入するのに有用な８塩基認識配列を有する。
【０１４６】
実施例４：ＨＩＦ１−αを発現するＥＩＡＶベクターの生産
この実施例は、内部ＣＭＶプロモーターからＨＩＦ−１αを発現させうるＥＩＡＶベクター（ｐＯＮＹ８．１ＳＭＨＩＦ１）の生産について述べる。ヒトＨＩＦ−１αの受入れ番号はＵ２２４３１である。ｐＯＮＹ８．１ＳＭＨＩＦ１を作るため、ジャーカット細胞から単離されたｍＲＮＡから産生されたｃＤＮＡからＨＩＦ−１αをＰＣＲ増幅した。このためのプライマーは、後述するＨＩＦＰＭ１及びＨＩＦＰＭ２だった。それらは、クローニング用のＳｂｆＩ部位を含有し、Ｋｏｚａｋ配列を用いて翻訳を強化した。この方法で生成したＰＣＲ産物は、ＨＩＦ−１α読み枠に隣接するＳｂｆＩクローニング部位を含む。これをＳｂｆＩで切断し、ＳｂｆＩで切断したｐＯＮＹ８．１ＳＭ中に挿入した。この方法で生成したプラスミドをｐＯＮＹ８．１ＳＭＨＩＦ１と呼ぶ。
2004537958.tif 000005
ＳｂｆＩ部位＝下線、Ｋｏｚａｋ配列＝太字かつイタリック、ＡＴＧ開始コドン＝下線かつイタリック
ＨＩＦＰＭ２プライマー：ＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴＴＡＡＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＣＴＧＡＧ
ＳｂｆＩ部位＝下線
【０１４７】
このプラスミドは、ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖ発現プラスミドと併用され、Ｍｉｔｏｐｈａｎｏｕｓら，１９９９で述べられているように、ＥＩＡＶベースベクター粒子を生成する。これら粒子を用いて、Ｈｉｆ１経路で直接又は間接的にコントロールされる遺伝子という文脈で関心のある種々の細胞型を形質導入する。
一例は、主要なヒト骨格筋細胞である。形質導入細胞と非形質導入細胞集団を比較する。さらに、低酸素濃度で形質導入した細胞を正酸素濃度で形質導入した細胞と比較する。
【０１４８】
差次的遺伝子発現の解析用にＲＮＡ試料を調製する。これらを放射能又は蛍光標識し、かつ固体担体上のｃＤＮＡｓのアレイにハイブリダイズする。低酸素及び／又は個々のタンパク質の発現によって上方制御される遺伝子は、定量的に強いハイブリダイゼーションシグナルを生成する。アレイ戦略は、ナイロン又はガラス担体を含んでよく、Ｂｏｗｔｅｌｌ，１９９９でレビューされている。ガラス担体アプローチに関与する方法論の詳細は、Ｅｉｓｅｎ及びＢｒｏｗｎ，１９９９に詳述されている。ここでは、蛍光標識したプローブを使用し、レーザー共焦点スキャナーを用いてハイブリダイゼーションを検出する。ナイロン担体アプローチについては、標準的な分子クローニング：実験室マニュアルＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに詳述されている。ここでは、比較するＲＮＡ試料を放射能標識し、リン光画像処理機を用いてハイブリダイゼーションを検出する。
アレイは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから購入でき、又は差引きクローニング法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ所有のＰＣＲ−選択法）で生成したｃＤＮＡクローンを用いて自社内で製造される。製造は、アレイ化ロボットの使用を含む（ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ，ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。
【０１４９】
実施例５：ＨＩＦ１−αを発現するコドン最適化ＥＩＡＶベクターの生産
この実施例は、ＥＩＡＶ誘導ベクターであるｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ＨＩＦベクター、その内部に位置するＣＭＶプロモーターからＨＩＦ−１αの発現を作動するベクターの生産について述べる（図１１）。同様のベクター骨格を用いて、この特許で述べるような差次的スクリーニングの目的のために他の遺伝子の発現を達成できるだろう。
【０１５０】
ｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ＨＩＦの構築の開始点は、ｐＯＮＹ４．０Ｚだった（ＷＯ９９／３２６４６及びＭｉｔｏｐｈａｎｏｕｓら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９年１１月；６（１１）：１８０８−１８）。第１工程で、１）ｔａｔのエキソン２における８３ｎｔ欠失を引き起こすことによるＴＡＴの発現を妨げる、２）５１ｎｔ欠失によってＳ２ ＯＲＦ発現を妨げる、３）ｒｅｖのエクソン１内の単一塩基の欠失によってＲＥＶ発現を妨げる、及び４）ｇａｇ領域の第１及び第２ＡＴＧコドン内のＴ残基の挿入によって、ＡＴＴＧからＡＴＧに配列を変えることによって、ｇａｇのＮ末端タンパク質の発現を妨げる突然変異を導入することによって、プラスミドｐＯＮＹ４．０ＺをｐＯＮＹ８．０Ｚに転換した（上記実施例３参照）。野生型ＥＩＡＶ配列（受入れ番号Ｕ０１８６６）については、これらは、１）ｎｔ５２３４・５３１６を含めてｎｔ５２３４〜５３１６、２）ｎｔ５３４６・５３９６を含めてｎｔ５３４６〜５３９６、及び３）ｎｔ５５３８に相当する。Ｔ残基（４）は、ｎｔ５２６及びｎｔ５４３の後だった。これら変更は、当業者には容易に利用可能な技法を用いて行った。生成したベクター、ｐＯＮＹ８．０Ｚは、ＥＩＡＶ付属タンパク質又はいずれのＥＩＡＶ ｇａｇタンパク質をも発現しない。
【０１５１】
次の工程で、ｐＯＮＹ８．０Ｚに存在するβ−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子を、強化緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｅＧＦＰ）リポーター遺伝子と交換してｐＯＮＹ８Ｇを創造した。これは、ＧＦＰ遺伝子に対応するＳａｃＩＩ−ＫｐｎＩフラグメント及びｐＯＮＹ２．１３ＧＦＰ（ＷＯ９９／３２６４６）由来のフランキング配列を、同一酵素で切断されたｐＯＮＹ８．０Ｚ中に伝達することによって行った。
中心ポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）及び中心終止配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）と呼ばれる配列の存在は、ＨＩＶ−１ベースベクターによる非分裂細胞への遺伝子送達の効率を高めると考えられている（Ｚｅｎｎｏｕら，Ｃｅｌｌ．２０００年４月 １４；１０１（２）：１７３−８５，Ｆｏｌｌｅｎｚｉら，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０００年６月；２５（２）：２１７−２２）。ＥＩＡＶの類似のシス作用要素は、ポリメラーゼコード領域内に位置し、かつＰＣＲ増幅を用いて、以下の通りのＥＩＡＶポリメラーゼコード領域（例えばｐＯＮＹ３．１，ＷＯ９９／３２６４６）を含有するいずれかのプラスミドから、機能性要素として得ることができる。ＰＣＲ産物は、中心ポリプリントラクト及び中心終止配列（ＣＴＳ）を含む。ＰＣＲ反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の通りだった。
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【０１５２】
ＸｂａＩの認識配列は太字で示され、ｐＯＮＹ８Ｇ骨格中への挿入を許容する。上述したように調製したｃＰＰＴ／ＣＴＳ ＰＣＲ産物の挿入前に、ｐＯＮＹ８Ｇを修飾して、ｐＯＮＹ８Ｇベクター内に既に存在している中心終止配列（ＣＴＳ）を除去した。これは、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶでの消化による連結用に調製されたｐＳＰ７２中に、ｐＯＮＹ８．０Ｚ由来のＣＴＳ及びＲＲＥを包含するＳａｌＩからＳａｃＩフラグメントをサブクローニングすることで達成した。ＣＴＳ領域をＫｐｎＩ及びＰｐｕＭＩによる消化によって切除し、そのオーバーハング末端を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理で“平滑末端化”し、末端を再連結した。この修飾ＥＩＡＶベクターフラグメントをＳａｌＩ及びＮｈｅＩで切除し、同一酵素による消化によって連結するために調製されたｐＯＮＹ８Ｇ中に連結した。この新規なＥＩＡＶベクターをｐＯＮＹ８Ｇ ｄｅｌ ＣＴＳと名付けた。ｐＯＮＹ８Ｇ ｄｅｌ ＣＴＳは、ＣＭＶ−ＧＦＰカセット及びｃＰＰＴ／ＣＴＳを提示するＰＣＲ産物に隣接する２つのＸｂａＩ部位を有しており、ＸｂａＩによる消化後、部分消化後のどちらかの部位中に連結することができる。これら部位への連結の結果、ポジティブ又はネガティブの意味でｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素を有するプラスミドとなる。ｃＰＰＴ／ＣＴＳが、５’又は３’−位でポジティブな意味（機能的に活性）であるクローンは、それぞれｐＯＮＹ８Ｇ ５’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳ及びｐＯＮＹ８Ｇ ３’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳと名付けた。ｐＯＮＹ８Ｇ ５’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳと名付けられるもう一方のベクターも、ｐＯＮＹ８Ｇ ５’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳの製造に使用したのと同様の戦略に従って製造できる。従って、ｐＯＮＹ８．０Ｚ中に存在するＣＴＳ配列は、ｐＯＮＹ８Ｇ ｄｅｌ ＣＴＳを製造するのと同一の方法で除去し、ｐＯＮＹ８Ｇ ｄｅｌ ＣＴＳ中のＣＭＶプロモーターのちょうど上流の唯一のＸｂａＩ部位中にｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を導入した。
【０１５３】
ｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ＨＩＦベクタープラスミドは、ｅＧＦＰのコード流域をＨＩＦ−１αのコード領域と置換することで、ｐＯＮＹ８Ｇ ５’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳから誘導した。これは、ｅＧＦＰ遺伝子に隣接するＳａｃＩＩ及びＮｏｔＩによる後者の消化、及びプラスミドＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰから得られるＳａｃＩＩ−ＮｏｔＩフラグメントへの連結によって達成した。プラスミドＡｄＡｐｔ ＨＩＦ−１α−ｉｒｅｓ−ＧＦＰの構成は、上記実施例に記載通りである。
さらにｐＯＮＹ８Ｇ ５’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳ誘導体を製造して、形質導入実験で‘負の対照’として役立つベクター調製品を製造することもできる。このベクターは、ｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ｅｍｐｔｙと名付けられ（図１２）、ｐＯＮＹ８Ｇ ５’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳのｅＧＦＰに隣接するＢｓｍＢＩ及びＮｏｔＩによる消化後再連結によって製造した。内部プロモーターによって作動される転写の配列解析に基づき、このベクターで形質導入された細胞内では、３アミノ酸ペプチドのみが産生されると予想される。
【０１５４】
上述のＥＩＡＶベクターは、２９３Ｔヒト胎性腎臓細胞の、ベクタープラスミド、ｐＯＮＹ３．１（ＥＩＡＶ ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質を発現する）及びエンベロープ発現プラスミド、ｐＲＶ６７（水疱性口内炎ウイルスタンパク質Ｇ，ＶＳＶ−Ｇをコードする）のどちらかとのリン酸カルシウム沈殿法を用いた一過性共形質移入によって製造した。
形質移入の２４時間前に、グルタミン、非必須アミノ酸及び１０％胎児ウシ血清で補足した１０ｍｌのＤＭＥＭ中１０ｃｍ皿当たり３．６×１０６個の細胞を接種した。遅い午後に形質移入を行い、細胞を一晩中インキュベート後、ナトリウムブチラート（５ｍＭ）で補足した６ｍｌの新鮮な培養液と交換した。７時間後、培養液を収集し、細胞にさらに６ｍｌの新鮮な無補足培養液を加えた。この収集した培養液を低速遠心分離で清澄化してから０．４ミクロンフィルタでろ過した。
【０１５５】
ベクター粒子を一晩中４℃で低速遠心分離（６，０００ｇ，ＪＬＡ１０．５００ローター）によって濃縮し、上清を注ぎ出し、管の底にペレットを残した。次の朝、残留している組織培養液を収穫、清澄化し、ろ過した。そして、それを前に集めたペレットの上に置き、一晩中遠心分離を繰り返した。この後、上清をデカントし、過剰の液体を排出した。そして、開始上清の体積の１／１０００まで配合緩衝液に再懸濁させた。
配合緩衝液（１００ｍｌ）
組織培養グレード水                ２８．６５ｍｌ
１９．７５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．０    １９．７５ｍｌの０．１Ｍ溶液
４０ｍｇ／ｍｌ ラクトース                ２６．６ｍｌの１５０ｍｇ／ｍｌ溶液
３７．５ｍＭ 塩化ナトリウム             ２４．４ｍｌの１５４ｍＭ溶液
１ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミンａ        ５００μｌの２０％溶液
５μｌ／ｍｌ硫酸プロタミンｂ           １００μｌの５ｍｇ／ｍｌ溶液
ａヒト血清アルブミン（２０％）（Ａｌｂｕｔｅｉｎ，Ａｌｐｈａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ＵＫ Ｌｔｄ，Ｔｈｅｔｆｏｒｄ，Ｎｏｒｆｏｌｋ）。
ｂ硫酸プロタミン５ｍｇ／ｍｌ（Ｐｒｏｓｕｌｆ，ＣＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｗｒｅｘｈａｍ，ＵＫ）。
ｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ＨＩＦの配列は、配列番号：４に示される。
ｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ｅｍｐｔｙの配列は、配列番号：５に示される。
【０１５６】
実施例６：海馬神経細胞内における遺伝子同定のためのスマートミックスの使用
実施例１及び２で述べたように、低酸素は、脳卒中（脳虚血）の重要な構成要素である。今や、本発明（スマートミックス）を利用して、初生ラット海馬神経細胞内で低酸素に応じて活性化又は抑制される遺伝子の発見を改良した。これは、実験的に低酸素応答のキー制御因子、すなわち低酸素誘発性因子１α（ＨＩＦ−１α）を導入することによって、低酸素に対する天然の応答を増強する工程を含む。低酸素に対する細胞の露出とＨＩＦ−１αの過剰発現の併用が、ＨＩＦ−１αの過剰発現のみ、又は低酸素のみに応じては検出できないであろう遺伝子発現の変化の検出を可能にした。
【０１５７】
初生ラット海馬神経細胞培養を、胎児ラットから標準的な手順に従って確立した（Ｄｕｎｎｅｔｔ ＳＢ，Ｂｊｏｒｋ Ａ（Ｅｄｓ．）１９９２。神経細胞移植術，実際上のアプローチ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）。要するに、妊娠期１８日に調節した妊娠ウィスターラットを０．７ｍｌイソフルランで麻酔し、頚部脱臼によって殺した。子宮から子を除去し、首を切った。海馬を解剖し、トリプシン（０．１％）プラスＤＮＡｓｅ（０．０５％）中での５分間のインキュベーション前は、ＤＮＡｓｅ（０．０５％）及びグルコース（２ｍＭ）を含有するＨａｎｋｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）中氷上貯蔵した。インキュベーション後、大豆トリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ，０．１％）を添加してトリプシンを不活性化し、溶液を穏やかにこねた。細胞を遠心分離でペレットにし（３０００ｒｐｍ，５分）、トリプシンを除去した。細胞をＳＢＴＩ及びＤＮＡｓｅ（０．０５％）を含有するＨＢＳＳ中２回洗浄し、再びペレット化し、最終的に胎児ウシ血清（１０％）、グルタミン（２ｍＭ）、及びゲンタマイシン（０．１ｍｇ．ｍｌ−１）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に懸濁させた。細胞（１皿につき３×１０６細胞）を、ポリ−Ｄ−リジン（５０μｇ．ｍｌ−１）及びフィブロネクチン付着促進ペプチド（１０μｇ．ｍｌ−１）でコーティングした６０ｍｍ皿上に塗布した。培養を５％ＣＯ２含有の加湿された３７℃のインキュベーター内に塗布後１２時間置き、プレーティング培養液の５０％を、Ｂ２７及びグルタミン（２ｍＭ）で補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ（Ｂｒｅｗｅｒ ＧＪ，（１９９５）“血清フリーＢ２７／神経細胞基底培地は、線条体、黒質、中隔、大脳皮質、小脳、及び歯状回由来の神経細胞の差次的成長を援助する”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２：６７４−８３）と交換した。培養に２日おきに補足神経細胞基底培地を供給し、３の日にインビトロ形質導入した。
【０１５８】
形質導入は、典型的な培地体積の０．５量のポリブレン（２μｇ．ｍｌ−１）を含有する補足神経細胞基底培地内で行った。形質導入の開始５時間後、培地の体積を２の因子で増やし、１２時間後に交換した。このウイルスｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ＨＩＦ（ＨＩＦ−１α遺伝子を保有する；実施例５参照）、ｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ｅｍｐｔｙ（対照として用いる空のゲノム；実施例５参照）及びｐＯＮＹ８Ｇ ５’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子含有）は、上述した方法に従って平行して製造した。ｐＯＮＹ８Ｇ ５’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳを用いて、Ｄ１７細胞中及び海馬神経細胞中におけるウイルスタイターを計算した。３つのウイルスプレップの定量的なＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）によるＲＮＡパッケージングシグナルの比較は、ｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ＨＩＦ及びｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ｅｍｐｔｙウイルスの生物学的タイターをｐＯＮＹ８Ｚ ５’ＰＯＳ ｄｅｌ ＣＴＳと比較して見積もることを可能にした。すべての形質導入は、両ウイルスにとってほぼ同等の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ（ＭＯＩｓ））を用いて行い、各実験で使用したＭＯＩは少なくとも１０だった。
【０１５９】
形質導入３６時間後、同一の培養皿を、一方は３７℃，５％ＣＯ２，９５％空気（＝正酸素）及び他方は３７℃，５％ＣＯ２，９４．９％窒素，０．１％酸素（＝低酸素）という２つの別個のインキュベーターに分けた。この条件下で６時間培養後、インキュベーターから皿を取りだし、チルド台に載置し、冷却ＰＢＳで洗浄し、製造業者の使用説明書に従ってＲＮａｚｏｌＢ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｌｔｄによって配給される）を用いて全ＲＮＡを抽出した。
実験は、以下に示すように、レンチウイルス及び／又は低酸素で処理されることのみが異なる４試料を与えた。
2004537958.tif 000007
【０１６０】
これら試料間の遺伝子発現プロフィルを比較することによって遺伝子の発見を実行できる。本技術で公表されている従来法に従い、細胞型１と２との間の比較が為されるだろう。本発明（スマートミックス）を実施することによって、いくつかの他の可能性が見られる。第１に、細胞型１と３との間の比較を行うことができる。ここで、細胞型２について見られるように、低酸素応答に関与するキー分子を過剰発現させるという刺激が、低酸素に対する天然の応答を超えうる。第２に、細胞型１と４との間の比較を行うことができる。この状況では、低酸素に対する天然の応答は、低酸素応答に関与するキー分子を過剰発現させることによって増強され又は増幅されている。
４試料から単離されたＲＮＡ由来の全体的なｍＲＮＡ発現プロフィルは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒａｔ ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒ ＧＦ３００（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて得た。この方法は、遺伝子の３’末端を含有するＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．／ＬＬＮＬ ｃＤＮＡクローンから誘導されるＤＮＡのプレメイドナイロンアレイを使用する（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｉｍａｇｅ／）。アレイは、未知機能の注釈されていないＥＳＴｓ又はｃＤＮＡの代表的な配列を含め、特徴づけのレベル範囲をカバーする５，０００を超える遺伝子を含む。
【０１６１】
上記４試料から抽出されたＲＮＡを放射能標識かつハイブリダイズして、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒａｔ ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒ ＧＦ３００のコピーに分けた。以下の改変を行って、製造業者によって提供された方法に従った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ＧＦ２００＿ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｈｐ３）；標識化反応にＲＮＡｓｉｎを加え、標識化後、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを４５ｍＭ ＥＤＴＡ／１８ｍＭ ＮａＯＨと共に６５℃で３０分間インキュベートして変性させた。
ハイブリダイズされたアレイの画像は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄａｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍリン光画像処理機を用いて得た。前述の手順に従ってＲＮＡをアレイからはがした。再現性を確実にするため、この手順を同一のＲＮＡ試料で繰り返した。両データセットをインポートし、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｐａｔｈｗａｙ ３．０ ソフトウェアを用い、Ｐａｔｈｗａｙ３．０マニュアルで説明されている通りに解析した。本解析のキーとなる局面は以下に要約される。
【０１６２】
プロジェクトトリーセットアップ
“条件ペア”態様を使用し、同時に複数の実験を解析した。この文脈では、条件は、ある試料に等価である（例えば、試料３、正酸素におけるＨＩＦ−１αの過剰発現）。
正規化セットアップ
Ｐａｔｈｗａｙ ３．０マニュアルで説明されている通りに、データ点正規化を選択した。この技法は、全試料強度をアレイ上の全クローンの平均試料強度（対照点を除く）で除すことによって正規化強度を生成する。２つの実験は、同一実験内の異なるアレイ間のハイブリダイゼーションシグナルの全体的な差が補正されるように、別個の正規化群として処理した。
【０１６３】
比較解析
条件１（すなわち試料１）は、対照のレンチウイルスで形質導入され、かつ正常な酸素濃度（正酸素）下に置かれた細胞に対応する。これは、ペア法で参照条件として、条件２，３及び４（すなわち、試料２，３及び４）との比較に使用される。このようにして、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧＦ３００アレイ上に存在するすべての遺伝子について比較を行った。条件を比較することで、本解析は両実験からのデータを考慮する。
【０１６４】
４つの代表的な既知のＨＩＦ−１α／低酸素制御遺伝子の結果
真正な低酸素制御遺伝子の発見という点で、低酸素中のＨＩＦ−１αの過剰発現が、非形質移入低酸素細胞又は正酸素細胞中のＨＩＦ−１αの過剰発現を用いることより優れることの証明として、低酸素及びＨＩＦ−１αによって制御されることが技術的に既知の遺伝子についての結果を以下に示す。比率は、正規化強度の平均比率として表される。
表２．既知ＨＩＦ−１α／低酸素制御遺伝子の応答
【表２】
2004537958.tif 000008
【０１６５】
表２にリストされるすべての４つの遺伝子は、低酸素によって制御されることが技術的に知られており、ノーザンブロット解析によって、ＨＩＦ−１αノックアウト内で下方制御されることがわかっている（Ｉｙｅｒら（１９９８）低酸素誘発性因子１αによるＯ２ホメオスタシスの細胞及び発生コントロール。Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ １２：１４９−１６２）。エノラーゼ１，アルファの場合、低酸素に対する応答又は正酸素下ＨＩＦ−１αの過剰発現に対する応答は、アレイハイブリダイゼーションによっては検出できない。正酸素と比較して発現レベルの上昇が検出されるのは、ＨＩＦ−１αが低酸素下で発現されるときだけである。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼＡの両者の場合、低酸素に対する応答は検出可能であるが、正酸素下でのＨＩＦ−１αの過剰発現によって増加し、低酸素下におけるＨＩＦ−１αの過剰発現によってさらにもっと高まる。
【０１６６】
フィルタセッティング
そして、フィルタリングを行い、データセットを減らして上述した３つのペア法比較の少なくとも１つについて、２．０を超える発現比率を有する遺伝子を選択した。全４条件で低いシグナル強度の遺伝子は、最小０．２のＩｎｔｅｎｓｉｔｙ ＩＩ フィルタを用いて自動的に除去した。両実験で再現性のある仕方で応答しない遺伝子は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−検定フィルタ（９０％信頼レベル）を用いて自動的に除去した。
個々の遺伝子の発現プロフィルとして結果を出力し、正規化シグナル強度と発現比率を示す。Ｐａｔｈｗａｙｓ ３．０の解析の主要な利点は、個々のスポットの高倍率の親指の爪ほどの画像が示されることである。これは、測定される領域が、ハイブリダイズされたアレイスポットを含有する領域を本当にカバーするという視覚的検証を可能にする。
【０１６７】
既知及び新規遺伝子の注釈
真正な低酸素制御遺伝子の発見という点で、低酸素細胞中のＨＩＦ−１αの過剰発現が、非形質移入低酸素細胞又は正酸素細胞中のＨＩＦ−１αの過剰発現を用いることより優れることの証明として、低酸素によって制御されるが、ＩＦ−１αによっては制御されないことが技術的に既知の遺伝子、及び注釈されていない遺伝子についての結果を以下に示す。比率は、正規化強度の平均比率として表される。
表３．新規なＨＩＦ−１α制御遺伝子の応答
【表３】
2004537958.tif 000009
ａ代表的なメタロチオネインＥＳＴがアレイ上に２回スポットされるので、データは２点の平均である。
【０１６８】
メタロチオネイン−Ｉは、文献で低酸素によって制御されることが知られているが（Ｍｕｒｐｈｙら（１９９９）低酸素によるメタロチオネイン遺伝子発現の活性化は、金属応答要素及び金属転写因子−１に関与する。Ｃａｎｓｅｒ Ｒｅｓ ５９（６）：１３１５−２２）、ＨＩＦ−１αで制御されることは知られていない。表３のデータは、低酸素中のＨＩＦ−１αの過剰発現に対する応答が、低酸素のみ又は正酸素中のＨＩＦ−１αの過剰発現の応答を大きく超えることを示している。ＥＳＴ（発現配列ｔａｇ）は、完全には注釈されていないＤＮＡ配列である。同様に、表３のデータは、低酸素中のＨＩＦ−１αの過剰発現に対する応答が、低酸素のみ又は正酸素中のＨＩＦ−１αの過剰発現の応答を大きく超えていることを示している。
このデータは、上述の方法が、既知遺伝子のさらに機能的な注釈及び未知の機能を有する完全には注釈されていない新規な遺伝子の機能的な注釈を可能にすることを実証している。
【０１６９】
実施例７：サイトカインによって制御される遺伝子同定のためのスマートミックスの使用
好酸球は、患部組織内の多数の好酸球を特徴とする喘息のようなアレルギー性疾患に付随する。ＩＬ−５は、好酸球分化及び生存に関与する主要なサイトカインである。ＩＬ−５は、骨髄からの好酸球ポイエシス（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｏｐｏｉｅｓｉｓ）及び出口を刺激し、また末梢血好酸球の生存を延ばす。このようなＩＬ−５として喘息の病原性で原因となる役割を演じうる。
ＩＬ−５刺激に応じて活性化される遺伝子は、喘息治療用に可能性のある標的として関心がある。
【０１７０】
最新技術を表す簡単なアプローチは、好酸球の集団を取り、それを２つに分け、１セットをＩＬ５の存在下に置き、他方をＩＬ５の非存在下に置く工程を含む。２セット由来のＲＮＡ又はタンパク質を適切な差次的解析に使用する。目標は、ＩＬ５が存在する条件下（ＩＬ５＋）では存在するが、ＩＬ５が無い培地（Ｉｌ５−）で維持される細胞中には存在しないタンパク質又はｃＤＮＡを同定することである。
好酸球中のＩＬ５誘発遺伝子及びタンパク質の同定に適用される本発明は、ノイズ比に対するシグナルを高めるためにＩＬ５＋及びＩＬ５−間の差の増幅を求める。これは、ＩＬ５レセプター用遺伝子を、それが過剰発現されるような構成で好酸球に送達することにより、ＩＬ５シグナルに対する応答を高めることによって達成される。
【０１７１】
ＩＬ５レセプターは、２つのイソ型、すなわちＩＬ５アゴニストとして作用する膜結合型及びＩＬ５アンタゴニストとして作用する可溶性型で存在する。細胞は正常に両型を発現するので、２つの型間のバランスを維持することによってそれらの応答を調節すると考えられる。一方又は他方の発現は、外因性ＩＬ５の濃度を簡単に変えることが実現しえないようなやり方で好酸球応答を強いるべきである。
膜結合型のＩＬ５αレセプターの過剰発現は、サイトカインに反応亢進性の細胞を与えると予想される。差次的スクリーニングでは、この型のレセプターの過剰発現が、ＩＬ５特異性ｃＤＮＡ又はタンパク質レベルの増幅の原因となるだろう。従って、薬物開発用の標的を検出する確率が高まるだろう。この場合に適用される本発明は、ＩＬ５リガンドの非存在下で膜結合型のＩＬ５αレセプターを過剰発現しない好酸球と、ＩＬ５にさらされ、かつ膜結合型のＩＬ５αレセプターを過剰発現する好酸球との比較を含む。
【０１７２】
同様に、ＩＬ−５アンタゴニストとして作用する可溶性型レセプターの過剰発現は、ＩＬ−５による刺激に対する好酸球の応答を減じることが予想される。可溶性型のＩＬ５αレセプターをＩＬ５リガンドの非存在下で過剰発現する好酸球の発現プロフィルを、ＩＬ５にさらされた（しかし可溶性ＩＬ５αレセプターを過剰発現しない）好酸球の発現プロフィルと比較する。これらアプローチのどちらを用いてもＩＬ５に応じて発現され、かつその産物が喘息のようなアレルギー性疾患の治療のために可能性のある標的である遺伝子を識別することができる。
ＩＬ５レセプターを発現するいずれの細胞、例えば、ＡＭＬ１４．３Ｄ１０、ＴＦ−１．８又はＨＬ−６０も使用できる。膜結合型及び可溶性型のＩＬ５αレセプターの送達及び発現は、種々の方法で達成しうる。例えば、好酸球は、上記実施例及び後述する実施例８で述べられるように、発現構成物で形質移入又は形質導入することができる。
【０１７３】
形質導入された及び形質導入されない好酸球集団における遺伝子発現を、後述する種々の方法で比較し、ＩＬ５に応じて発現される遺伝子の読み出しを生成する。ＩＬ５の非存在下で可溶性ＩＬ５αレセプターを発現する構成物で形質移入された細胞を、ＩＬ５の存在下で形質移入されない細胞と比較する。ＩＬ５の存在下で膜結合型ＩＬ５αレセプターを発現する構成物で形質移入された細胞を、ＩＬ５の非存在下で形質移入されない細胞と比較する。
差次的遺伝子発現の解析のために、全ＲＮＡ試料を調製する。これらを放射能又は蛍光標識し、固体担体上のｃＤＮＡｓのアレイにハイブリダイズする。ＩＬ５によって上方制御される遺伝子は、定量的に強いハイブリダイゼーションシグナルを生成する。アレイ戦略は、ナイロン又はガラス担体のどちらかを含んでよく、Ｂｏｗｔｅｌｌ，１９９９でレビューされている。ガラス担体アプローチに関与する方法論の詳細は、Ｅｉｓｅｎ及びＢｒｏｗｎ，１９９９に詳述されている。ここでは、蛍光標識したプローブを用い、かつハイブリダイゼーションをレーザー共焦点スキャナーで検出する。ナイロン担体アプローチには、分子クローニング：実験室マニュアル Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに詳述されているように、標準的な分子生物学法のドットブロット法及びハイブリダイゼーションが含まれる。ここでは、比較すべきＲＮＡ試料を放射能標識し、ハイブリダイゼーションをリン光画像処理機で検出する。
【０１７４】
アレイは、Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから購入することができ、又は差引きクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ所有のＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ法）で生成されたｃＤＮＡクローンを用いて社内で製造される。製造は、アレイ化ロボットの使用を含むだろう（ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ，ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ Ｌｔｄ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。
細胞から単離されたＲＮＡがｃＤＮＡに逆転写され、結果的にそのｃＤＮＡがスクリーニングされる。代わりに、上述したように、プロテオミックスアプローチを用いて、例えば２−Ｄゲル電気泳動法によって差次的発現産物を同定することができる。もしＩＬ５のβ鎖がα鎖と共発現されるならば、ＩＬ５に普通は応答しない他の細胞を使用してもよい。この点で、共通のβ鎖がＩＬ−５、ＩＬ−３及びＧＭ−ＣＳＦの間で共有されることに留意すべきである。
【０１７５】
実施例８：ヒトＩＬ５αＲイソ型の過剰発現
この実施例は、内部ＣＭＶプロモーターからインターロイキン５α膜レセプター（ｐＯＮＹ８．１ＳＭＩＬ５Ｒｍ）又はインターロイキン５α可溶性レセプター（ｐＯＮＹ８．１ＳＭＩＬ５Ｒｓ）を発現できる２つのＥＩＡＶベクター（ｐＯＮＹ８．１ＳＭＩＬ５Ｒｍ及びｐＯＮＹ８．１ＳＭＩＬ５Ｒｓ）の産生について述べる。ヒトＩＬ５αＲの受入れ番号はＡ２６２５１である。
［ヒトＩＬ５αレセプター遺伝子：Ａ２６２５１、ＡＵＴＨＯＲＳ：Ｄｅｖｏｓ，Ｒ．Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．，Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ，Ｇ．，Ｔａｖｅｒｍｉｅｒ，Ｊ．及びｖａｎ ｄｅｒ Ｈｅｙｄｅｎ，タイトル：ヒトインターロイキン−５レセプター，特許：ＥＰ０４９２２１４−Ａ １１ ０１−ＪＵＬ−１９９２；Ｆ．ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＧ］
ｐＯＮＹ８．１ＳＭＩＬ５Ｒｍを作るため、ヒト末梢血好酸球から単離されたｍＲＮＡから産生されたｃＤＮＡからＩＬ５αＲをＰＣＲ増幅した。このためのプライマーは、後述するＩＬ５αＲ１及びＩＬ５αＲ２だった。それらはクローニング用のＳｂｆＩ部位を含み、そのＫｏｚａｋ配列を用いて翻訳を増強した。この方法で産生されるＰＣＲ産物は、ＩＬ５αＲ読み枠に隣接するＳｂｆＩクローニング部位を含有する。これをＳｂｆＩで切断し、ＳｂｆＩで切断したｐＯＮＹ８．１ＳＭ中に挿入した。ＩＬ５αＲが正しい配向で挿入したことを点検することが重要である。このように生成したプラスミドをｐＯＮＹ８．１ＳＭＩＬ５Ｒｍと呼んだ。
【０１７６】
この構成物は野生型ＩＬ５αＲを発現するだろう。ＩＬ５αＲ読み枠を修飾し、可溶性型のＩＬ５αＲを発現するｐＯＮＹ８．１ＳＭＩＬ５Ｒｓを作った。
これをＰＣＲで行い、レセプター（エピトープ標識可溶性ヒトインターロイキン−５（ＩＬ−５）レセプター。親和性架橋標識、ＩＬ−５結合性、及び生物活性。Ｂｒｏｗｎ ＰＭ，Ｔａｇａｒｉ Ｐ，Ｒｏｗａｎ ＫＲ，Ｙｕ ＶＬ，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ＧＰ，Ｍｉｄｄａｕｇｈ ＣＲ，Ｓａｎｙａｌ Ｇ，Ｆｏｒｄ−Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ＡＷ，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＤＷ）のＣ末端を除去した。最初の３３２個のアミノ酸を保持しながら、膜貫通かつ細胞内領域を含む最後の８８個のアミノ酸を除去する。このためのプライマーは、後述するＩＬ５Ｒ１及びＩＬ５Ｒ３だった。それらは、クローニング用ＳｂｆＩ部位を含み、そのＫｏｚａｋ配列を用いて翻訳を増強した。このように産生されたＰＣＲ産物は、ＩＬ５αＲ読み枠に隣接するＳｂｆＩクローニング部位を含む。これをＳｂｆＩで切断し、ＳｂｆＩで切断したｐＯＮＹ８．１ＳＭ中に挿入した。ＩＬ５αＲが正しい配向で挿入したことを点検することが重要である。このように生成したプラスミドをｐＯＮＹ８．１ＳＭＩＬ５Ｒｓと呼んだ。
【０１７７】
ＩＬ５Ｒ１ プライマー
2004537958.tif 000010
ＳｂｆＩ部位＝下線
Ｋｏｚａｋ配列＝太字かつイタリック
ＡＴＧ開始コドン＝下線かつイタリック
ＩＬ５Ｒ２ プライマー
ＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＡＡＡＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧＧＴＣ
ＳｂｆＩ部位＝下線
ＩＬ５Ｒ３ プライマー
ＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＴＡＡＡＴＡＧＧＴＴＧＧＣＴＣ
ＳｂｆＩ部位＝下線
【０１７８】
他の実施例
・ドーパミン作動性細胞系において抗アポトーシス遺伝子（すなわちＢｃｌ−２，Ｂｃｌ−ｘ）を過剰発現させると、ＭＰＴＰのような神経毒から神経保護することになる。さらに代表的なドーパミン作動性神経細胞（初生細胞）は、培養中分裂終了するので、レンチウイルスを用いて、このような遺伝子をこれら神経細胞中に導入かつ過剰発現させてから、差次的に発現されるようになる細胞標的をスクリーニングすることができる。
・Ｆａｓのような神経細胞内で（アポトーシス）死亡レセプターを過剰発現させ、限定量のリガンド（ＦａｓＬ）を供給することによっても抗アポトーシス標的を同定することができる。これら細胞は、その神経保護遺伝子を誘発することで生存しようとするだろう。
・同様に、成長因子（ＮＧＦ、ＧＤＮＦ等）、及びそのレセプターを、該成長因子の生存効果に過感受性細胞を生成する細胞系内で過剰発現させることができる。
【０１７９】
ＨＳＰ７０のような熱ショックタンパク質（ＨＳＰｓ）は、神経系内のストレス性発作後に発現され、その過剰生成は、神経系損傷のいくつかの異なるモデルのタンパク質を引き起こす。ＨＳＰｓは、脳虚血、神経変性疾患、てんかん及び心的外傷に関係がある。ＨＳＰｓは、損傷後サイトゾル内で分離され、リン酸化かつ三量体形成されて核に入る熱ショック因子に普通に結合されるシャペロンであり、核内でその転写活性化の原因となる熱ショック遺伝子のプロモーター内の熱ショック要素（ＨＳＥｓ）に結合する。従って、神経、グリア又は内皮細胞内でのＨＳＰｓの過剰発現は、Ｈｉｆ１の差次的スクリーニングと同じ様式で差次的スクリーニングのために使用できる。
【０１８０】
・ＡＰＰ（アミロイド前駆タンパク質）：アルツハイマー病の神経炎性プラーク内で見られるＡβペプチドの前駆体であるトランス膜タンパク質。この病気のいくつかの家族性（早発性）の原因である突然変異が同定された。
・プレセニリン１及び２：ＡＰＰのプロセシングに中心的なトランス膜タンパク質及びいくつかの他の膜タンパク質。いくつかの突然変異が、この病気の家族性型のいくつかで単離された。
・α−シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）：神経シナプスに付随する細胞質タンパク質。パーキンソン家系で突然変異が見出された。レーヴィ体の一部（パーキンソン病の細胞内破壊の特徴であり、アルツハイマー病及びレーヴィ体痴呆でも見られる）。
【０１８１】
・タウ（Ｔａｕ）：微小管結合タンパク質。染色体１７連係パーキンソン症候群及びピック病を有する前側頭部痴呆で突然変異が見出された。
・パーキン（Ｐａｒｋｉｎ）：Ｎ末端のユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）及びＣ末端のＲＩＮＧ−フィンガーモチーフに何らかの相同性を有する未知機能のタンパク質。パーキンソン病の若年型で確認された欠失。
・ユビキチン（ＵＣＨ−Ｌ１）：レーヴィ体の一部を形成するチオールプロテアーゼ。ドイツパーキンソン病家系で突然変異が確認された。
【０１８２】
上記説明で言及したすべての出版物は、参照として本明細書に取り込まれる。本発明の記載した方法及び系の種々の変更及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本技術の当業者には明かだろう。特定の好ましい実施形態に関して本発明について述べたが、請求される発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるものでないことを理解すべきである。実際に、分子生物学及び関連分野の当業者に明かな本発明を実施するための記載した形態の種々の変更は、特許請求の範囲内であることを意図している。
【０１８３】
参照文献
Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ及びＷｅｉｒ（１９９９） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１２１−１２６。
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【図面の簡単な説明】
【図１】
形質導入されたマクロファージ内のアデノウイルス遺伝子伝達を用いてＨＩＦ−１α及びＥＰＡＳ１の過剰発現を確認するために行ったノーザンブロットである。
【図２】
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＧｅｎｅＦｉｌｔｅｒｓを用いた２つの代表的なＲＮＡ試料の散布図である。
【図３Ａ】
スマートミックスによる乳酸デヒドロゲナーゼＡ発現の解析であり、乳酸デヒドロゲナーゼ−Ａ（ＬＤＨ−Ａ）遺伝子に対応するスポットの親指の爪ほどの画像を示す。
【図３Ｂ】
図３Ａのヒストグラムである。
【図４Ａ】
スマートミックスによるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ発現の解析であり、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子に対応する親指の爪ほどの画像を示す。
【図４Ｂ】
図４Ａのヒストグラムである。
【図５Ａ】
スマートミックスによる成長因子β発現由来血小板の解析であり、成長因子β由来の血小板（ＰＤＦＧβ）遺伝子に対応する親指の爪ほどの画像を示す。
【図５Ｂ】
図５Ａのヒストグラムである。
【図６Ａ】
スマートミックスによる単球走化性タンパク質−１発現の解析であり、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）遺伝子に対応する親指の爪ほどの画像を示す。
【図６Ｂ】
図６Ａのヒストグラムである。
【図７Ａ】
スマートミックスによる新規な遺伝子（Ｈｓ．１６３３５）の発見を示し、ＵｎｉＧｅｎｅクラスターＨｓ．１６３３５由来のＥＳＴに対応する親指の爪ほどの画像を示す。
【図７Ｂ】
図７Ａのヒストグラムである。
【図８Ａ】
スマートミックスによるＨｓ．１６３３５の発見を確証するための実際上のノーザンブロットを示し、ハイブリダイゼーションプローブ＝Ｈｓ．１６３３５の場合である。
【図８Ｂ】
スマートミックスによるＨｓ．１６３３５の発見を確証するための実際上のノーザンブロットを示し、ハイブリダイゼーションプローブ＝βアクチンの場合である。
【図９】
ｐＯＮＹ８Ｚについてのプラスミドマップである。
【図１０】
ｐＯＮＹ８．１ＳＭについてのプラスミドマップである。
【図１１】
ｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ＨＩＦについてのプラスミドマップである。
【図１２】
ｐＳＭＡＲＴ ＣＭＶ−ｅｍｐｔｙについてのプラスミドマップである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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