(57)【要約】本発明は、少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、対象物にＭＨＣクラスＩＩ又はＣＤ４０の発現を調節するために有効な量にて投与することを含む、適切でない免疫反応に関わる症状に罹るか、罹り易い対象物に、ＭＨＣクラスＩＩ又はＣＤ４０が仲介する免疫調節、免疫阻害、及び抗炎症作用を起こさせる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、哺乳動物におけるＭＨＣクラスＩＩの発現を調節する有効な量にて、前記哺乳動物に投与することを含む、こうした治療を必要とする前記哺乳動物にＭＨＣクラスＩＩで仲介される免疫調節を実現する方法。
【請求項２】
少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、哺乳動物におけるＭＨＣクラスＩＩの発現を阻害する有効な量にて、前記哺乳動物に投与することを含む、こうした治療を必要とする前記哺乳動物にＭＨＣクラスＩＩで仲介される免疫阻害を実現する方法。
【請求項３】
少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、哺乳動物におけるＭＨＣクラスＩＩの発現を阻害する有効な量にて、前記哺乳動物に投与することを含む、こうした治療を必要とする哺乳動物におけるＭＨＣクラスＩＩで仲介される抗炎症効果を実現する方法。
【請求項４】
少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、ＣＤ４０の発現を調節する有効な量にて、前記哺乳動物に投与することを含む、こうした治療を必要とする哺乳動物におけるＣＤ４０で仲介される抗免疫炎症効果を実現する方法。
【請求項５】
前記哺乳動物がヒトである請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物が、高コレステロール血症に罹っていない請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記量が、ＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現を特に調節するために有効である請求項１、２又は３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記量が、誘発可能なＣＤ４０の発現を特に調節するために有効である請求項４記載の方法。
【請求項９】
前記誘発可能なＣＤ４０の発現が、ＩＦＮ−γにより誘発される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物が、ＩＮＦ−γにて誘発可能なＣＩＩＴＡの発現を含む症状に罹っている請求項１、２又は３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物が、自己免疫疾患である症状に罹っている請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記自己免疫疾患が、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、クローン病（Ｃｒｏｈｎｅ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）又は紅斑性狼瘡である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物が、器官又は組織の移植準備中又は移植後の治療下である請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物が、器官又は組織移植の準備中の治療下である請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が、乾癬又は炎症の症状に罹っている請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記スタチンが、局所的適用として用いられる請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記局所的な適用として、皮膚又は眼において行う請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記スタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン又はシンバスタチンである請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記スタチンが、アトロバスタチンである請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記スタチン、あるいは前記機能的又は構造的に等価な分子が、脂質低下効果を有しない請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
前記スタチン、あるいは前記機能的又は構造的に等価な分子が、他の免疫阻害剤のいずれにも存在しない状態で投与される請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記用量が、１日当り１０から８０ｍｇの間にあることを含む請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記用量が、１日当り２０から４０ｍｇの間にあることを含む請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記投与が、病巣内、腹腔内、筋肉内、又は静脈注射、輸液、あるいは鼻腔、経口、眼又は耳からの局所的な導入を含む請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記投与が毎日行われる請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫阻害又は抗炎症効果は、Ｔリンパ球の活性化を阻害する結果である請求項２から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
ＩＦＮ−γにより誘発されるＣＩＩＴＡの発現を阻害する分子であって、その阻害がＬ−メバロン酸の添加により少なくとも部分的に逆転可能である分子を同定する方法において、
ＩＦＮ−γに応答し易い細胞と候補阻害分子及びＩＦＮ−γとを接触させる工程；
候補分子の存在下、ＣＩＩＴＡの発現又はＭＨＣクラスＩＩの発現の阻害又は発現の不存在を検出する工程；
さらに前記細胞とＬ−メバロン酸とを接触させる工程；及び
前記抑止効果の全面的又は部分的な逆転を検出する工程；
を含む前記方法。
【請求項２８】
ＩＦＮ−γにより誘発されるＣＩＩＴＡの発現を阻害する分子を同定する方法において、
ＩＦＮ−γに応答し易い細胞と、スタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子、及びＩＦＮ−γとを接触させる工程；
スタチンあるいはそれと機能的又は構造的に等価な分子の存在下、ＣＩＩＴＡの発現又はＭＨＣクラスＩＩの発現の阻害又は発現の不存在を検出する工程；
を含む前記方法。
【請求項２９】
誘発されるＣＤ４０の発現を阻害し、前記阻害がＬ−メバロン酸の添加によって少なくとも部分的に逆転可能である分子を同定する方法において、
細胞と候補阻害分子及びＣＤ４０の発現を誘発する分子とを接触させる工程；
候補分子の存在下、ＣＤ４０の発現を阻害することを検出する工程；
さらに、上記細胞とＬ−メバロン酸とを接触させる工程；及び
前記阻害効果の全面的又は部分的逆転を検出する工程、
を含む前記方法。
【請求項３０】
ＣＤ４０の発現を含んでいる前記分子が、ＩＦＮ−γである請求項２９記載による方法。
【請求項３１】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼを阻害する化合物を、前記疾患を治療するための有効量にて、前記患者に投与することを含む、自己免疫疾患に罹り苦痛を受けている患者を治療する方法。
【請求項３２】
前記化合物が、治療として有意性のない脂質低下効果を有し、そしてＭＨＣクラスＩＩの発現を阻害する請求項３２記載の方法。
【請求項３３】
自己免疫疾患又は症状に罹っている患者を治療するための方法において、前記患者における測定可能なＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの阻害、及びＭＨＣクラスＩＩの発現の阻害を行うことのできる少なくとも１つの化合物を、こうした自己免疫疾患又は症状を治療するために有効な用量にて、前記患者に投与することを含む前記方法。
【請求項３４】
器官組織の移植の準備、又は移植後における患者を治療する方法において、前記患者における測定可能なＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの阻害及びＭＨＣクラスＩＩの発現の阻害を行うことのできる少なくとも１つの化合物を、組織拒絶反応を防止するために有効な用量にて、前記患者に投与することを含む前記方法。
【請求項３５】
患者における組織又は器官の拒絶反応を防止又は治療する方法において、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａリダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ）を阻害する化合物を、組織又は器官の拒絶反応を防止又は治療するために有効な用量にて、前記患者に投与することを含む前記方法。
【請求項３６】
少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、前記疾患の兆候を少なくとも部分的に緩和されるように、対象物におけるＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を調節するための有効な用量を、前記対象物に投与することを含む、自己免疫疾患又は自己炎症疾患を治療する方法。
【請求項３７】
疾患が慢性関節リウマチである請求項３６記載による方法。
【請求項３８】
前記対象物が、過コレステロール血症に罹っていない請求項３６記載による方法。
【請求項３９】
前記スタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチン、ならびにその組み合わせから成る群から選択される請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
前記スタチンが、他の慢性関節リウマチの治療と結びつけて投与される請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
前記他の慢性関節リウマチの治療が、ステロイド、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）、疾患を修飾する抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤｓ）、及びその組み合わせから成る群から選択される請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記非ステロイド抗炎症剤が、サリチル酸、フェノプロフェン、ナプロイセン、ピロキシカン、トルメチン、インドメタシン、スリンダク、メクロフェナメイト、及びその組み合わせから成る群から選択される請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患を修飾する抗リウマチ薬剤が、Ｄ−ペニシルアミン、金塩（非経口、経口形状の両方）、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスホアミド、及びその組み合わせから成る群から選択される請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
前記スタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子が、経口的に投与される請求項３６記載の方法。
【請求項４５】
前記用量が、１日当り少なくとも約１０から８０ｍｇである請求項３６記載の方法。
【請求項４６】
前記用量が、１日当り少なくとも約２０から４０ｍｇである請求項３６記載の方法。
【請求項４７】
自己免疫疾患又は免疫炎症疾患を治療する薬剤を調製するためのスタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子の使用において、こうしたスタチンが、ＩＦＮ−γにより誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を調節する有効量を提示し、それにより前記疾患の症状を少なくとも部分的に緩和させる、前記使用。
【請求項４８】
前記疾患が、慢性関節リウマチである請求項４７記載による使用。
【請求項４９】
少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、拒絶反応を少なくとも部分的に防止又は治療するように、ＩＦＮ−γにより誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を阻害する有効な量にて、対象物に投与することを含む、前記対象物における組織拒絶反応を防止又は治療するための方法。
【請求項５０】
スタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、炎症もしくは組織拒絶反応、又はその両方を、減少するように、ＩＦＮ−γにより誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を阻害する有効な量にて、患者に投与することを含む、移植前、移植中、移植後の組織移植片を治療する方法。
【請求項５１】
前記組織移植片が、皮膚、骨、腹壁、心膜、骨膜、軟骨膜、推間板、関節軟骨、真皮、表皮炎、靭帯、腸及び腱から成る群から選択される請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記組織移植片が、生の及び合成した移植片材料からなる群から選択される請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
前記スタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチン、ならびにその組み合わせから成る群から選択される請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
前記組織移植片が、皮膚の移植片である請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
皮膚の移植片が、潰瘍状皮膚を治療するために用いられる請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
皮膚の移植片が、皮膚の同種異系移植片である請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記スタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子が、経口、又は局所的に投与される請求項５０記載の方法。
【請求項５８】
前記用量が、１日当り少なくとも約１０から８０ｍｇである請求項５０記載の方法。
【請求項５９】
前記用量が、１日当り少なくとも約２０から４０ｍｇである請求項５０記載の方法。
【請求項６０】
炎症もしくは組織拒絶反応、あるいはその両方を減少させるための医薬剤の調製にスタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子の使用において、
こうしたスタチンが、炎症もしくは組織拒絶反応、あるいはその両方を減少させるように、ＩＦＮ−γにより誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を阻害する有効な量にて提示され、組織片の移植前、移植中、移植後対象物に投与される、前記使用。
【請求項６１】
前記組織移植片が皮膚移植片である請求項６０記載の使用。
【請求項６２】
前記スタチンの前記投与が、他の免疫阻害剤の投与を含んでいない請求項６０記載の使用。
【請求項６３】
前記スタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチン、ならびにその組み合わせから成る群から選択される請求項６０記載の方法。
【請求項６４】
同一か、別々かのどちらかにて包（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）んだ、組織移植片の材料、及びスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を含むキット。
【請求項６５】
前記組織移植片の材料が、天然又は加工された材料である請求項６４記載のキット。
【請求項６６】
前記組織移植片の材料が、皮膚、骨、腹壁、心膜、骨膜、軟骨膜、推間板、関節軟骨、真皮、表皮、靭帯、腸及び腱から成る群から選択される請求項６５記載のキット。
【請求項６７】
前記スタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチン、ならびにその組み合わせから成る群から選択される請求項６４記載のキット。
【請求項６８】
少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子が、拒絶反応を少なくとも部分的に防止又は治療するように、ＩＦＮ−γにより誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を阻害するに有効な量にて、移植前又は移植中対象物に投与されることを含む、前記対象物における器官の拒絶反応を防止又は治療する方法。
【請求項６９】
前記器官が、心臓、腎臓及び肝臓から成る群から選択される請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記スタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチン、ならびにその組み合わせから成る群から選択される請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
前記器官が心臓で、そしてスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子が、移植する前に対象物に投与される請求項６８記載の方法。
【請求項７２】
前記器官が腎臓で、そしてスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子が、移植する前に対象物に投与される請求項６８記載の方法。
【請求項７３】
スタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子が、経口、病巣内、腹腔内、筋肉内への導入、又は静脈注射により投与される請求項６８記載の方法。
【請求項７４】
前記用量が、１日当り少なくとも約１０から８０ｍｇである請求項６８記載の方法。
【請求項７５】
前記用量が、１日当り少なくとも約２０から４０ｍｇである請求項６８記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子が、炎症を減少させるようＩＦＮ−γにより誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現、及び／又はＣＤ４０の発現を阻害する有効な量にて、対象物に投与されることを含む炎症疾患を治療する方法。
【請求項７７】
前記炎症疾患が、皮膚の炎症疾患、眼の炎症疾患、及び紅斑性狼瘡から成る群から選択される請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
炎症疾患が、皮膚の炎症疾患である請求項７６記載の方法。
【請求項７９】
前記スタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチン、ならびにその組み合わせから成る群から選択される請求項７６記載の方法。
【請求項８０】
前記スタチンが、経口又は局所的に投与される請求項７６記載の方法。
【請求項８１】
前記スタチンが、ゲル、クリーム、噴霧、又は粉末状にて局所的に投与される請求項７６記載の方法。
【請求項８２】
前記皮膚炎症疾患が、乾癬及び湿疹から成る群から選択される請求項７６記載の方法。
【請求項８３】
前記用量が、１日当り少なくとも約１０から８０ｍｇである請求項７６記載の方法。
【請求項８４】
前記用量が、１日当り少なくとも約２０から４０ｍｇである請求項７６記載の方法。
【請求項８５】
前記スタチンが、炎症を減少させるための有効量にて提示され、皮膚炎症疾患における炎症を減少させるための薬剤の調製における前記スタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子の使用。
【請求項８６】
前記炎症疾患が、眼の炎症疾患である請求項７６記載の方法。
【請求項８７】
前記スタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、及びシンバスタチン、ならびにその組み合わせから成る群から選択される請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
前記スタチンが、経口又は局所的に投与される請求項８６記載の方法。
【請求項８９】
前記スタチンが、ゲル、クリーム、噴霧、又は粉末状にて局所的に投与される請求項８６記載の方法。
【請求項９０】
前記眼の疾患が、ブドウ膜炎である請求項８６記載の方法。
【請求項９１】
前記用量が、１日当り少なくとも約１０から８０ｍｇである請求項８６記載の方法。
【請求項９２】
前記用量が、１日当り少なくとも約２０から４０ｍｇである請求項８６記載の方法。
【請求項９３】
スタチンが、前記炎症を減少させるための有効量にて提示され、眼の炎症疾患において炎症を減少させるための薬剤の調製におけるスタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫学的、疾患の治療の分野に、より具体的には自己免疫疾患を治療するために免疫調節剤を使用することに関する。
【０００２】
発明の背景
スタチンは、肝酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼを競争的に阻害する能力を共有する新しい分子ファミリーである。この酵素は、コレステロールを合成するためのＬ−メバロン酸経路におけ律速段階を触媒する。従って、スタチンが、コレステロールの合成をブロックする。これらは、医薬的な実施１−３、特に高脂質血症の治療に広く使用されている。この種の薬剤が、高コレステロール血症の患者における心臓発作を防止するために有効であることが解ってきている。さらに、近年に公開された幾つかの大きな臨床試験の報告では、スタチンによる治療が、冠動脈疾患に罹っている、及び罹っていない患者の心臓血管に関係した罹病率及び死亡率を減少させることを明示している。
【０００３】
免疫系は、非常に複雑であるが、この系の他の部分において欠陥を補償することができる多くの代換経路によって密接に調節されている。しかしながら、免疫応答は、それが活性化されると病気又は他の望ましくない症状の原因となることがよくある。こうした病気又は他の望ましくない症状は、たとえば自己免疫疾患（Ｉ型糖尿病、多発性硬化症及び慢性関節リウマチを含む）、移植後の移植片の拒絶反応、又は無害な抗原に対するアレルギー、乾癬、アテローマ性動脈硬化症などの慢性炎症疾患、及び１般的な炎症疾患である。これらの症例と他に関与する不適切な又は望ましくない免疫応答において、臨床的に免疫を阻害させる必要性がある。これらの望ましくない免疫応答に導く経路が極めて多く、多くの症例において、十分には明らかにされていない。しかしながらこれらは、リンパ球の活性化という共通過程を含むことがよくある。
【０００４】
ヒトのＨＬＡ遺伝子クラスターによりコードされる主要組織適合複合体分子が、異なるリンパ様細胞間、及びリンパ球と抗原提示細胞との間の相互作用を含む、免疫学的認識の多くの観点に関与している。主要組織適合複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ又はＭＨＣ−ＩＩ）分子が、Ｔリンパ球の活性化、及び免疫応答の制御に直接関わっている。全ての細胞が、クラスＩＭＨＣ分子を発現するが、クラスＩＩの発現が抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）に限定される。これらの細胞は、リンパ球Ｔヘルパーに抗原を提示することが可能であり、そのリンパ球Ｔヘルパー細胞が免疫応答の発生を制御する。従って、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、抗原提示に極めて重要（ｋｅｙ）である。限定された数の特別の細胞型だけが、ＭＨＣクラスＩＩを構成的に発現するが、他の多くの細胞が、その刺激により陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のＭＨＣクラスＩＩとなる。通常その刺激が、サイトカイン、特にインターフェロン・ガンマー（ＩＦＮ−γ）５により誘発される。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現の調節は、非常に複雑であるが、この緊密な制御によりＴリンパ球の活性化に直接影響を与え、さらには免疫応答の制御に影響を与える。この複雑な調節が今まで詳細に分析されたことは、ベア・リンパ球症候群（（Ｂａｒｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）又はＭＨＣクラスＩＩ疾患）５と称するＭＨＣクラスＩＩの調節の希少なヒト疾患に範囲を大きく広げたおかげである。重篤な１次免疫不全という全く同じ臨床的な症状を有する全員の４群の患者が、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写に必須である４種の相違するトランスアクテング調節因子の１つにおいて、遺伝的に影響されることが示され、この場合ＲＦＸ５、ＲＦＸ−ＡＰ又はＲＦＸ−ＡＮＫが、偏在的に発現される因子であり、ＭＨＣクラスＩＩプロモータ５，１０のＸボックス（Ｘ ｂｏｘ）に結合するタンパク質複合体を形成し、ＣＩＩＴＡ（Ｃｌａｓｓ ＩＩ ＴｒａｎｓＡｃｔｉｖａｔｏｒ）が、ＭＨＣクラスＩＩ発現の１般的なコントローラであり、それ自体の発現が密接に調節されている６，７。
【０００６】
興味深いことに、ＣＩＩＴＡの発現が、明らかに相違する生理的状態により作用し１１、幾つか別のそれぞれのプロモータにより制御される。ＣＩＩＴＡプロモータＩが、樹状細胞の構成的発現を制御し、プロモータＩＩＩが、Ｂ及びＴリンパ球の構成的発現を制御するが、ＣＩＩＴＡプロモータＩＶが、ＩＦＮ−γにより誘発可能なＣＩＩＴＡの発現、さらにＭＨＣクラスＩＩ１１の発現に特異的に応答することができる。ＣＩＩＴＡプロモータＩＶの誘発性の分子的基礎が、詳細１２に明らかにされてきた。
【０００７】
ＭＨＣ−ＩＩの発現が、移植後における器官の拒絶反応の段階におけるＴ−リンパ球の同種異系反応に対する中核的な標的でもある。
【０００８】
リンパ球の活性化を誘発する別の分子は、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌである。ＣＤ４０Ｌ（ｇｐ３９、最近ＣＤ１５４と改名）及びＣＤ４０は、腫瘍懐死因子（ＴＮＦ）、及びＴＮＦ−受容体ファミリーのそれぞれのメンバーである。Ｔ細胞依存液性免疫におけるＣＤ４０Ｌの元来の機能は、Ｂリンパ球の活性化及び分化、免疫グロブリン・クラスのスイッチング、及び胚中心末端メモリー細胞の形成を含んでいる。最近ＣＤ４０のシグナリングに対しアテローマ（ａｔｈｅｒｏｍａ）関連細胞 （マクロファージ［Ｍφ］内皮細胞［ＥＣｓ］、平滑筋細胞［ＳＭＣｓ］） の活性化が、接着分子の発現（例えば、Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ，ＶＣＡＭ−１）［Ｋａｒｍａｎｎ，１９９５，４４］ ［Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ，１９９５，４５］ ［Ｙｅｌｌｉｎ， １９９５，４６］、前炎症性サイトカインの分泌 （例えば ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１２，ＴＮＦ）［Ｍａｃｈ，１９９７，１５］、マトリックスメタロプロテナーゼ（ＭＭＰｓ）（ＭＭＰ−ｌ，ＭＭＰ−９，ＭＭＰ−１３）［Ｍａｃｈ，１９９７，４７］［Ｍａｃｈ，１９９９，４８］ ［Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，１９９７，４９］、組織因子［Ｍａｃｈ，１９９７，４７］ ［Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，２０００，５０］及びケモカイン［Ｍａｃｈ，１９９９，５１］ ［Ｓｕｇｉｕｒａ，２０００，５２］により炎症反応を誘発させることを示している。
【０００９】
現在アテローマ性動脈硬化症が、免疫炎症疾患［Ｌｉｂｂｙ，２０００，２４］［Ｌｕｓｉｓ，２０００，２６］ ［Ｇｌａｓｓ，２００１，２７］と考えられている。この観点により、新たな証明が増えることが、この疾患の過程に［Ｍａｃｈ，１９９８， ２８］，［Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，２００１， ２９］おけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌのシグナリング経路で中核的役割があることを示唆している。実際最近の知見において、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの相互作用を実質的にブロックすることが、アテローマ性動脈硬化症班の発症を防止し、そしてすでに前に形成された障害を減少させる［Ｍａｃｈ，１９９８，３０］ ［Ｌｕｔｇｅｎｓ，１９９９，３７］ ［Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，２０００，３８］ことを示している。ＣＤ４０のシグナリングが、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、及び器官移植後の同種異系移植片による拒絶反応など幾つかの慢性疾患と密接に関連していた［Ｄｕｒｉｅ，１９９３，３９］ ［Ｇｅｒｒｉｔｓｅ，１９９６，４０］［Ｊｅｎｓｅｎ， ２００１，４１］ ［Ｓｈｉｍｉｚｕ，２０００，４２］ ［Ｌａｒｓｅｎ，１９９６，４３］。
【００１０】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）が、人口の約１％に罹っている極めて１般的な炎症性のリウマチ疾患である。ＲＡは、重度の能力不全及び死亡率の増大に関係している。組織学的にこの疾患は、滑液を過剰形成し、そして炎症細胞が新たに増大し、後期の段階で軟骨や骨の破壊に至ることを特徴とする。関節の滑液膜中に活性化された多数のＴ細胞が存在することは、ＲＡが免疫を仲介とする疾患であることを強く実証している。関節炎及び後の結合部の損傷におけるＩＬ−１及びＴＮＦ−αなどのサイトカインの役割が、動物のモデル２１で実証されてきた。ＲＡに罹っている患者にサイトカイン阻害剤を使用することによって、疾患の活性、及び放射線から見られる関節性糜爛（２２，２３）とする臨床的要因（ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）が改良される。これらの新しい方法が、ＲＡの管理における突破口と考えるべきであるが、患者の３０％が抗サイトカイン治療に抵抗性がある。そのためにＲＡの治療のために新たな標的を見出すことが必要である。
【００１１】
発明の要約
本発明は、クラスＩＩ又はＣＤ４０の発現により仲介されるＴリンパ球の活性化を減少又は阻害させ、そして後に免疫調節剤、及び抗炎症剤として作用できる新しい種類の薬剤を提供する。
【００１２】
本発明者により発見された免疫系に及ぼす薬剤の作用形態が、以下の様に記載され、さらに免疫関連のスタチンの異なる適用、およびこれらの薬剤の治療としての使用を記載する。
【００１３】
この内容において発明者が、ＩＦＮ−γによりＭＨＣクラスＩＩの発現の誘発を阻害し、ＭＨＣクラスＩＩで仲介されるＴ細胞の活性化を阻害する以下のスタチンの特性を実証した。
【００１４】
第１には、スタチンが、ＩＦＮ−γによるＭＨＣ−ＩＩの誘発を有効に阻害し、そして用量依存方法でそれを行う。
【００１５】
第２には、Ｌ−メバロン酸の存在下（酵素ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの生成物で、その基質がＨＭＧ−ＣｏＡである）では 、ＭＨＣクラスＩＩの発現に及ぼすスタチンの効果が無くなり、ＭＨＣクラスＩＩの阻害を仲介するＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤としてスタチンの効果があることが、正しいことを示している。
【００１６】
第３には、スタチンによるＭＨＣクラスＩＩ発現を阻害することが、ＭＨＣ−ＩＩの発現の誘発可能な形状に高い特異性があるが、樹状細胞、及びＢ細胞など、極めて特異的なＡＰＣｓ中のＭＨＣ−ＩＩの構成的発現に関係していない。
【００１７】
第４には、スタチンのこの効果は、ＭＨＣクラスＩＩの発現に特異的であるが、ＭＨＣクラスＩの発現に関係していない。
【００１８】
第５には、スタチンにより内皮細胞を前処理すると、ＭＨＣクラスＩＩの誘発を阻害し、以後のＴリンパ球の活性化及び増殖を減少させる。
【００１９】
第６には、ＣＩＩＴＡの発現に関しスタチンにより行われる阻害化が、ＣＩＩＴＡの誘発可能なプロモータＩＶの特異的な阻害化である。
【００２０】
第７には、スタチンが、血管細胞にＩＦＮ−γにより誘発されるＣＤ４０の発現を減少させ、用量依存方法によりそれを行う。この効果は、Ｌ−メバロン酸の添加により著しく逆転する方向に作用する。
【００２１】
ＭＨＣクラスＩＩ阻害剤としてスタチンの新規な効果が、ヒト内皮細胞（ＥＣｓ）の１次培養、ヒト平滑筋細胞、繊維芽細胞及び単球マクロファージ（Ｍφ）の一次培養を含む多くの細胞型、及びＴｈＰ１、メラノーマ及びＨｅｌａ細胞などの確立された細胞株において観察され、確認されてきた。ＭＨＣクラスＩＩの誘発に及ぼすスタチンのこうした効果が、臨床医薬において継続的に用いられるスタチンの違った形状で観察される。しかしながら興味深いことに、スタチンの違いが、ＭＨＣクラスＩＩ「阻害剤」としてまったく異なる性能を呈した。アトロバスタチン、ロバスタチン及びプラバスタチンのうち、最も強力なＭＨＣクラスＩＩ阻害剤は、アトロバスタチンである。スタチンファミリーにおける他のメンバー、及び機能的又は構造的に関連する分子により、ＭＨＣクラスＩＩ阻害化に同じく新しく記載された効果が得られるようにすべきである。
【００２２】
ＭＨＣクラスＩＩ誘発化のスタチンの阻害化機構に関するこれらの結果が、ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベータＣＩＩＴＡのプロモータＩＶ発現の誘発に及ぼすスタチンの選択的効果により決定できる。１般的にＩＦＮ−γの影響下、通常ＭＨＣクラスＩＩが陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）となる極めて多様な細胞にＭＨＣクラスＩＩ分子の誘発可能な発現ができないことが、多様な機能的結果を有すると期待される。これらは、内皮細胞ＣＤ４ Ｔリンパ球の活性化ばかりか、器官を移植した後の同種異系状態におけるＣＤ４ Ｔ細胞によるＭＨＣクラスＩＩ分子の認識にも関する。
【００２３】
本発明の他の観点は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼを阻害する化合物を、前記疾患を治療するために有効な量にて前記患者に投与することを含む、インターフェロン・ガンマーで仲介（ｍｅｄｉａｔｅｄ）される主要組織適合クラスＩＩ遺伝子発現の刺激を特徴とする疾患に苦しむ患者を治療する方法を対象とする。
【００２４】
本発明の他の観点は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼを阻害する化合物を、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現を減少させる有効な量にて前記患者に投与することを含む、インターフェロン・ガンマーで仲介（ｍｅｄｉａｔｅｄ）される主要組織適合（ＭＨＣ）クラスＩＩ遺伝子発現の刺激を特徴とする疾患に苦しむ患者を治療する方法を対象とする。
【００２５】
本発明の他の観点は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼを阻害する化合物を、前記疾患を治療するために有効な量にて前記患者に投与することを含む、インターフェロン・ガンマーで仲介（ｍｅｄｉａｔｅｄ）されるクラスＩＩトランスアクチベータ（ＣＩＩＴＡ）遺伝子発現の刺激を特徴とする疾患に苦しむ患者を治療する方法を対象とする。
【００２６】
本発明の他の観点は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼを阻害する化合物を、ＣＩＩＴＡ遺伝子発現を減少させる有効な量にて前記患者に投与することを含む、インターフェロン・ガンマーで仲介（ｍｅｄｉａｔｅｄ）されるクラスＩＩトランスアクチベータ（ＣＩＩＴＡ）遺伝子発現の刺激を特徴とする疾患に苦しむ患者を治療する方法を対象とする。
【００２７】
本発明の他の観点は、こうした自己免疫疾患又は症状を治療するに有効な量にて測定可能なＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの阻害、ＩＦＮ−γ応答性細胞中のＩＦＮ−γにより誘発されるＣＩＩＴＡの発現を阻害することができる少なくとも１つの化合物を前記患者に投与することを含む、自己免疫疾患又は症状に罹っている患者を治療する方法を対象とする。
【００２８】
本発明の他の観点は、組織拒絶反応を防止に有効である量にて測定可能なＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの阻害化、及びＩＦＮ−γ応答性細胞中のＩＦＮ−γにより誘発されるＣＩＩＴＡの発現を阻害することができる少なくとも１つの化合物を、前記患者に投与することを含む、器官又は組織の移植中、移植後の準備における患者に治療する方法を対象とする。
【００２９】
１つの実施例において、前記化合物が、拒絶反応の開始を防止又は阻害する予防薬として投与される。
【００３０】
発明の実施例の詳細な説明
本発明の内容において、以下の用語は、以下の方法において画定される。
【００３１】
スタチンとは、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの阻害剤として作用できる分子である。
【００３２】
スタチンファミリーのメンバーは、天然に生成する分子と合成分子との両方において、たとえば、コンパクチン、アトロバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、シンバスタチン、ロスバスタチンを含んでいる。この１欄に表されたものには制限されず、この大きなファミリーに属する新しい分子が普通に発見される。スタチンは、プラバスタチンなどの親水性、又はアトロバアスタチンなどの親油性でも良い。親油性スタチンが、組織を良く通すと考えられる。
【００３３】
本発明のフレームワークに発見されたように、さらにこれらの分子が、第２の機能を有し、それが適切な細胞におけるＩＦＮ−γにより誘発されるＣＩＩＴＡの発現を阻害する能力がある。所定の分子がスタチンであるかどうかを決定する従来の試験は、ステロール合成の阻害化、特に分析される組織及び細胞１９，２０による阻害化である。
【００３４】
スタチンに「化学的な関連、又は構造的に等価」な分子とは、それらの構造が、化学結合の２以下の置換又は修飾により、スタチンファミリーのどのメンバーの構造とも異なる分子を指している。幾つかのスタチン構造の例を、図５に示している。発明者によるスタチンに化学的に関連し、構造的に等価である分子が、上記少なくとも第２の機能を有し、それは、適切な細胞におけるＩＦＮ−γに誘発されるＣＩＩＴＡの発現を阻害する能力がある。この能力を、実例における下記の機能的アッセイを用いて試験する。
【００３５】
スタチンに「機能的に等価」である分子とは、測定可能なＨＭＧ−ＣｏＡリダクダーゼの阻害化を可能にする分子を指している。したがって少なくとも酵素ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼを競合的に阻害できるあらゆる分子、そしてスタチンと称する分子が、必要とされる性質を有している。加えて発明者による機能的に等価な分子も、適切な細胞におけるＩＦＮ−γにて誘発されるＣＩＩＴＡの発現を阻害する能力を有している。再度この能力を、実例における下記の機能的アッセイを用いて試験する。
【００３６】
スタチンに「機能的に等価」である分子は、臨床的に有意性のない脂質低下効果を有するが、１方では臨床的に有意な免疫阻害効果を有することができる。スタチンの脂質低下効果は、従来のアッセイ１９，２０を用いて測定可能である。本明細書に用いられている「化合物」という用語は、スタチンならびにそれに構造的及び機能的に等価なものを含んでいる。
【００３７】
ＩＦＮ−γ応答性細胞とは、その膜にＩＦＮ−γへのリセプターを有し、そしてＩＦＮ−γを結合した後にシクナルを伝達できる細胞である。幾つかの細胞種がＩＦＮ−γによって誘発され、ＭＨＣクラスＩＩを発現させることができる。ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現は、長い遅れ時間が必要（幾つかの例において最適な応答が２４時間）なことから、ＩＦＮ−γに対して２次的応答と考えられ、そしてシクロヘキシイミド及び／又はプロマイシン、タンパク質合成を阻害する薬剤が、ＩＦＮ−γにて誘発されるＭＨＣクラスＩＩの発現を終わらせることから、続けてタンパク質を合成する必要がある。
【００３８】
ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＣＤ４＋Ｔ細胞に抗原を提示し、Ｔ細胞の活性化を誘導する異種２量体の糖タンパク質である。「ＭＨＣクラスＩＩに陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」に指定された細胞が、たとえばＩＦＮ−γによってＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的か、あるいは刺激に応答するにより発現し、しかもこれらの分子膜に挿入されるＭＨＣクラスＩＩ分子を有する。
【００３９】
本発明の治療方法の内容において、次の用語が以下の方法で画定される。
【００４０】
免疫応答が天然か、人工的な引き金で生じたとしても、あるいはこの応答が、生来の免疫系の部分的か、適応可能な免疫系か、又はその両方として行われたとしても、免疫調節剤とは、上記免疫応答に関わる少なくとも１つの経路の活性を、同時又は遅れて増強又は減少に誘導する上記免疫系を作用する薬剤である。ＭＨＣクラスＩＩ仲介免疫調節剤は、免疫系に及ぼす中核的作用がＭＨＣクラスＩＩ分子を含む免疫調節剤である。
【００４１】
スタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子に暴露させた後、同じスタチン、又は同じ等価な分子に暴露させない同じ個体におけるＴ−細胞の増殖レベルと比較し、同種異系のＴ−リンパ球の所定集団に対しＴ−細胞の増殖が、少なくとも１０％だけ増減されると、免疫調節は、有意差があると考えられる。免疫調節が有意的であるかどうかは、下記の機能アッセイを用いて試験することができる。
【００４２】
免疫応答が、天然又は人工を引き金として生じたとしても、あるいはこの応答が、生来の免疫系又は適応可能な部分的な免疫系、あるいはその両方として行われたとしても、免疫阻害剤が、上記免疫系の作用により上記免疫応答に関わる少なくとも１つの経路の活性を、同時又は遅れて減少に誘導する薬剤である。ＭＨＣクラスＩＩ仲介免疫阻害剤は、免疫系に及ぼす中核的作用がＭＨＣクラスＩＩ分子を含む免疫阻害剤である。
【００４３】
スタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子に暴露させた後、同じスタチン、又は同じ等価な分子に暴露させない同じ個体におけるＴ−細胞の増殖レベルと比較して、所定の集団に対しＴ−細胞の増殖が、少なくとも３０％だけ、そして好ましくは少なくとも５０％だけ減少される場合、免疫阻害は、臨床的に有意差があると考えられる。免疫阻害が臨床的に有意的であるかどうかは、下記の機能アッセイを用いて試験することができる。
【００４４】
ｉ）　単球・マクロファージ又は内皮細胞等ＩＦＮ−γ応答性細胞の試料を、最初に個体から回収し、バッチ１及びバッチ２の２つのバッチに分ける。
【００４５】
ｉｉ）　ＩＦＮ−γ応答性細胞のバッチ１を、ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）のみにより約４８時間前処理する。ＩＦＮ−γ応答性細胞のバッチ２を、ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）及びスタチン又は誘導体（１０μＭ）により、約４８時間前処理する。
【００４６】
ｉｉｉ）　同種異系Ｔ−リンパ球（たとえば、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を、異なるドナーから回収し、そして以下に示される適切な時間、ＩＦＮ−γ応答性細胞の前処理されたバッチ１及びバッチ２（同時インキュベーション（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）に暴露する。
【００４７】
ｉｖ）　［３Ｈ］チミジンの組み込み量を、Ｔ細胞の増殖の読み出しとして（例えば図３を参照）、５日間の同時インキュベート（ｃｏ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）のうち最後の２４時間の期間に測定する。
【００４８】
ｖ）　又はインターロイキン−２（ＩＬ−２）の放出を、Ｔ−細胞増殖の読み出しとして（例えば図３を参照）、２日間の同時インキュベーション期間の後に測定する。
【００４９】
ｖｉ）　バッチ２に対する読み出し値が、バッチ１の読み出しパーセントとして表される。この値が７０％以下あるか、好ましくは５０％以下であれば、スタチン又は誘導体が、臨床的に有意差のある免疫阻害効果を有すると考えられる。
【００５０】
免疫阻害効果は、臨床的に有意差があるかどうか試験するさらなる手段が、フローサイトメトリー（たとえば、図１を参照）を用いて、上記アセスメントにて行う。
【００５１】
抗炎症剤は、炎症、又はその発症の１つたとえば走下性による白血球の移動を、部分的又は全体的に、直ちにまたは遅延後に減少または阻害できる薬剤である。
【００５２】
ＭＨＣクラスＩＩ仲介の抗炎症剤は、免疫系の中核的な作用に、ＭＨＣクラスＩＩの分子を含む抗炎症剤である。
【００５３】
抗免疫炎症剤は、炎症又はその発症の１つ、及び他の免疫応答を、部分的又は全体的に、同時に又は遅延した後に、減少又は阻害できる薬剤である。
【００５４】
有害な免疫応答は、長期又は短期間にわたり患者の健康に苦痛，又は傷害を与える免疫応答である。自己の分子又は組織に、又は異種の移植片が移植された組織又は器官に対する免疫反応は、有害な免疫応答の例である。
【００５５】
免疫系が患者の健康に有害に作用するか、又はそうなる恐れのある場合、免疫阻害（又は免疫調節）が臨床的に望ましく、免疫応答を遮断するか、下限調節することが、患者の健康に対し医者として有益なものと考えられる。こうした症状を、器官を移植した後、移植片の寛容性を高めるために遭遇させることができる。他の例は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、及び慢性関節リウマチを含む自己免疫疾患である。免疫阻害が臨床的に必要とされる症例では、これらの記載に限定されないが、さらに乾癬、及び他の病状を含んでいる。さらに免疫阻害には、たとえば移植前における好ましくない免疫反応の防止も含んでいる。
【００５６】
移植は、心臓、腎臓又は皮膚などの器官又は組織に関する。
【００５７】
本発明の第１の観点は、ＩＦＮ−γを仲介する細胞応答において、スタチン、及びこれらに構造的及び機能的に等価な分子と密接に関係する分子を利用することを含んでいる。
【００５８】
第１の観点における１つの実施例では、たとえばスタチンは、ＩＦＮ−γ応答性細胞におけるＩＦＮ−γにより誘発されるＣＩＩＴＡの発現を調節する過程において使用できる。この方法は、少なくとも１種のスタチンとＩＦＮ−γ応答性細胞とを接触させることにより行われる。この調節の結果は、ＣＩＩＴＡに依存する細胞内及び細胞間に起こる事象を調節できることである。
【００５９】
細胞に必須であり、特にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するために、この重要なトランスアクチベターに作用するＣＩＩＴＡの役割が、ＭＨＣクラスＩＩの転写、発現、しかもＴ−リンパ球への提示に干渉する唯一の方法である。
【００６０】
同様に、ＣＩＩＴＡの発現を阻害すると、Ｔ−リンパ球の活性化、及び増殖を阻害する。このことが、免疫応答の複合カスケードを特徴とする細胞間の事象によるあらゆる阻害に対し、少なくとも部分的に順次導びく。
【００６１】
上記方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏかｉｎ　ｖｉｔｒｏのいずれかにて行うことができる。
【００６２】
ＩＦＮ−γにより誘発されるＣＩＩＴＡの発現を調節する本方法に対し、スタチン以外の分子が、少なくとも１種のスタチン及び／又はそれに機能的に等価な化学的に関連性のある分子の場合、使用することができる。好ましい例においてスタチンが使用され、そしてその使用されたスタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタイン又はシンバスタチンである。特に好ましい例において、特に器官又は組織を移植中又は移植した後、患者に準備して治療する場合に使用されるスタチンが、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、又はシンバスタチンである。
【００６３】
ＩＦＮ−γ応答性細胞におけるＩＦＮ−γによる誘発下ＡＰＣ（抗原提示細胞）となる細胞がある。「機能的（ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ）なＡＰＣｓ」と称する特定細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）となることができ、すなわち適切に刺激されると表面にあるＭＨＣクラスＩＩ分子を表示することができる。こうした細胞は、初期ヒト内皮細胞、初期ヒト平滑筋細胞、繊維芽細胞、単球−マクロファージ、中枢神経系の細胞、ＴｈＰ１，メラノーマ又はヘラ細胞にて可能である。
【００６４】
刺激されたＣＩＩＴＡの発現によるスタチンの活性作用は、用量に依存するか、スタチンの種類に依存するかの両方であり、スタチンファミリーの特定メンバーを細胞に特定用量にて接触させる本方法は、ＣＩＩＴＡの発現を定量的に制御し、そしてそれを所与レベルに設定するための有益な機会を提供する。ＣＩＩＴＡの発現とＭＨＣクラスＩＩｍＲＮＡとの間の関係が直線性であり、このＣＩＩＴＡの発現による定量的制御が、ＭＨＣクラスＩＩの転写及び翻訳、即ちＭＨＣクラスＩＩの発現に変換することができる。
【００６５】
上記のようにＩＦＮ−γにより誘発されたＣＩＩＴＡの発現を調節する過程において、ＩＦＮ−γにより誘発されたＣＩＩＴＡの発現を調節することは、この発現を阻害又は減少させるために好ましい。
【００６６】
スタチン、あるいは機能的又は構造的な誘導物質を活性化にするための好ましい形態において、ＩＦＮ−γにより誘発されたＣＩＩＴＡの発現を調節することが、ＣＩＩＴＡの誘発可能なプロモータＩＶを阻害することのみにより実現できる。「のみによる実現」とは、スタチンが、ＣＩＩＴＡの構成的発現、つまりプロモータＩ及びＩＩＩ１１により調節された発現に効果を有しないか、あるいは実質的に効果がないことを意味する。
【００６７】
上記のように、ＣＩＩＴＡの阻害によるＭＨＣクラスＩＩの阻害を仲介するＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤としてスタチンの効果が驚くべきものである。実際にＨＭＧ−ＣｏＡの産生物であるＬ−メバロン酸を前記細胞に与えると、スタチンによる阻害化を取り止める。従って本発明の方法は、この調節が、Ｌ−メバロン酸の添加により少なくとも部分的に、好ましくは全面的な逆転可能であるという特性を有する。
【００６８】
この第１の観点のさらなる例により、本発明は、スクリーニング方法、より具体的にはＩＦＮ−γにより誘発されたＣＩＩＴＡの発現を阻害できる分子を同定する方法にて、この阻害がＬ−メバロン酸の添加により少なくとも部分的に逆転可能である前記方法に関する。この方法は、ＩＦＮ−γに応答性のある細胞と、阻害剤候補分子及びＩＦＮ−γとを接触させることにより行われる。この方法の第２の工程において、候補分子の存在下、ＭＨＣクラスＩＩの発現の阻害又はその発現のないことが検出される。次の工程は、前記細胞にＬ−メバロン酸を接触させること、及び阻害効果の全面的又は部分的逆転を検出することである。
【００６９】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼに作用することによって、ＩＦＮ−γにより誘発されたＣＩＩＴＡの発現を少なくとも部分的に阻害することは、臨床として潜在的に有意性のある予期しない効果であり、すなわちこれを行うことのできる分子を、記載のスクリーニングにより同定できることである。
【００７０】
これを上記試験による特性では、Ｌ−メバロン酸の添加によって少なくとも部分的に逆転可能な方法にて、ＩＦＮ−γにより誘発されたＣＩＩＴＡの発現を阻害することができる。
【００７１】
この検出は、ＭＨＣクラスＩＩの発現に基づいて、又はＣＩＩＴＡの直接的な発現により行うことができる。ＭＨＣクラスＩＩの発現を検出するために使用される細胞は、ＩＦＮ−γによる刺激に応答性でなければならず、このため好ましい細胞は内皮細胞である。ＩＦＮ−γ及び阻害剤として可能性のである分子を、上記細胞と接触させ、次にＭＨＣクラスＩＩの発現の検出を行う。特にこの工程は、たとえば蛍光剤に結合する特定抗体を伴い上記細胞をインキュベートすることにより行われ、しかもフロー・サイトメトリーにより試験される。当業者が、ＭＨＣクラスＩＩの発現を検出するために、他の古典的方法をたとえば混合したリンパ球反応（ＩＦＮ−γ、及び候補分子により前処理されたヒト内皮細胞を伴いインキュベートされた同種異系Ｔリンパ球）を行い、そしてＴ細胞増殖アッセイを行うことにより知ることになろう。
【００７２】
第２の可能性は、ＣＩＩＴＡのプロモータＩＶ（例えば文献９を参照）の制御下、レポータ遺伝子を含むトランスフェト剤を用いることにより、ＣＩＩＴＡプロモータＩＶの活性を阻害するため、直接 （ｄｉｒｅｃｔ）スクリーンを使用することである。
【００７３】
候補分子が、有効な阻害剤であると見られる場合、可逆性という追加的な特性がさらなる工程において試験され、その工程は、先の細胞培養にＬメバロン酸を添加し、そして阻害効果の全体的又は部分的な逆転を検知することを含んでいる。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が、少なくとも部分的に復帰されることを意味する。この発現をアッセイする方法は上記と同じである。この方法は、さらにスタチンの機能的に等価であることを同定するための試験を提供する。
【００７４】
このスクリーニング方法を実行すると、次にこうした使用可能なＣＩＩＴＡの発現の阻害剤を選択することができる。
【００７５】
選択モードにより、これらのＣＩＩＴＡ上の作用が、Ｌ−メバロン酸の添加により少なくとも部分的に逆転可能である。このスクリーニング法により見出された阻害剤は、免疫阻害効果又は抗炎症効果を有する薬剤として、あるいはたとえばインターフェロン−γによる刺激におけるＬ−メバロン酸誘導体がいかに干渉するかを決定するための基礎生物学において有益となっている。
【００７６】
本発明の第２の観点においては、スタチンの効果を利用する治療方法に関する。有効なＭＨＣクラスＩＩ阻害剤として、より詳細にはＭＨＣ−ＩＩトランスアクチベータＣＩＩＴＡのプロモータＩＶの阻害を介するこうした効果機構としてスタチンの新規な効果は、器官の移植における免疫阻害剤としてこの薬剤を使用するための確かな科学的根拠を提供する。さらに、新規な免疫調節剤として、より詳細にはＭＨＣクラスＩＩの異常発現及び／又はＣＤ４　Ｔリンパ球の異常な活性化が密接に結びつく疾患において、スタチンの多数ある他の実際的臨床適用例が示唆している。器官の移植範囲を超えて、これは、多様な自己免疫疾患 （１型糖尿病、多発性硬化症、及び慢性関節リウマチを含む） から乾癬、及びアテローム性硬化症などの慢性的な炎症疾患などの症状に範囲が及んでいる。スタチンが十分に寛容性のある薬剤であることは、免疫阻害剤を制約するが目下の在庫に喜んで追加されるものとして、これらを適正化することができる。
【００７７】
特に第１の例において、本発明は、こうした治療を必要とする対象物に免疫調節を行う方法に関し、この免疫調節がＭＨＣクラスＩＩを介し仲介される。対象物、たとえば哺乳動物が、不適切な免疫応答を含む症状に罹るか、又はそれに罹りやすい場合、前記対象物が、おそらくこの方法により治療されると予想される。この方法は、少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、対象物におけるＭＨＣクラスＩＩの発現を調節する有効量により、前記対象物に投与することを含んでいる。前記調節が、スタチンを投与すると直ちに効き始める場合と、投与から数時間の内に、たとえば８から４８時間の内に効くようになる場合がある。
【００７８】
第２の例において、本発明は、こうした治療の必要な哺乳動物に免疫阻害を行う方法に関しこの免疫阻害が、ＭＨＣクラスＩＩを介して仲介される。好ましい変異においてこの阻害化は、Ｔリンパ球の活性化を阻害する結果である。哺乳動物が有害な免疫応答を含む症状に罹っている場合、又はそれに罹りやすい場合、前記哺乳動物が、おそらくこの第２の方法により治療されると予想される。上記方法が、少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、対象物におけるＭＨＣクラスＩＩの発現を阻害するための有効量により、前記哺乳動物に投与することを含んでいる。上記阻害が、スタチンを投与すると直ちに起こる場合と、投与から数時間の内に、たとえば８から４８時間の内に効くようになる場合がある。
【００７９】
第３の例において、本発明が、１般的な炎症過程においてＭＨＣクラスＩＩの発現という主要な役割を用いる方法、すなわちこうした治療の必要な哺乳動物において、ＭＨＣ−クラスＩＩにより仲介される抗炎症効果を実現するための方法に関する。
【００８０】
哺乳動物が、有害な免疫応答を含む症状に罹る場合、又はそれに罹りやすい場合、前記哺乳動物が、おそらくこの第２の方法により治療されると予想される。この方法が、少なくとも１種のスタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子を、対象物にＭＨＣクラスＩＩの発現を阻害するための有効量により、哺乳動物に投与することを含んでいる。
【００８１】
第４の例において、本発明が、こうした治療の必要な哺乳動物に、ＣＤ−４０により仲介される抗免疫炎症効果を実現するための方法に関する、この方法が、少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を、ＣＤ４０の発現、特にＣＤ４０の誘発可能な発現、最も好ましくはＩＦＮ−γにて誘発されるＣＤ４０の発現を調節する有効量にて、哺乳動物に投与することを含む。
【００８２】
記載された４種の方法のいずれかにより治療された対象物としては、ヒトが好ましい。
【００８３】
これら方法の以下の特性又は適用例が、ヒトに対し記載されていることが必須であるが、さらにヒト以外の哺乳動物、たとえば霊長類、サル、イヌ、マウスなどにも適用することができる。そのため本発明は、獣医関係においても使用できる。
【００８４】
本発明の方法により治療される感染し易い患者集団は、不適切又は有害な免疫応答を含む症状に罹っていることに加えて、高コレステロール血症又は脂質代謝における諸問題、特に高レベルな特定脂質を含むＬＤＬ（低密度糖タンパク質） の問題に罹る可能性のある患者を含んでいる。３種の方法の１つにより治療されような対象物の特に好ましいグループは、心臓疾患及び発作という他の危険因子を有していてもいなくても関係なく、高コレストロール血症に罹っていない対象物である。高コレストロール血症とは、食後のＬＤＬ−コレステロール値が約２２０ｍｇ／ｄＬを超え、好ましくは約１９０ｍｇ／ｍＬを超えることを意味する。患者が、心臓疾患及び発作として危険因子を有する症例において、高コレストロール血症が発症すると考えられる「閾値」レベルが、有意的に低い、たとえば１６０ｍｇ／ｄＬより低い場合、さらには１３０ｍｇ／ｄＬより低い場合さえ発症する可能性がある。
【００８５】
ＭＨＣクラスＩＩの発現におけるスタチンによる阻害化は、ＩＦＮ−γ誘発される状態に対し特異的である。この特異性が、全体としてこの免疫系がスタチンにより妨害されないことから、極めて都合がよい。治療下の患者が、さらに日和見的感染から戦うことができることから、本発明のこうした特徴的な治療は、極めて利点の多いものである。
【００８６】
対象物が、ＩＦＮ−γにて誘発可能なＣＩＩＴＡの発現を伴う症状に罹っている場合、上記方法が特に適したものである。幾つかの自己免疫疾患が、ＣＩＩＴＡを正常に発現しない細胞において、ＣＩＩＴＡの発現を誘導するような不適切なＩＦＮ−γを放出することに関与していることが知られている。通常自己免疫疾患は、対象物が罹っている特に好ましい症状であることが、この理由のためである。
【００８７】
自己免疫であると考えられる疾患は多数ある。本発明に記載の方法（すなわち免疫調節、免疫阻害、及び炎症の調節）が、特に感受性が高く、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、クローン病（Ｃｒｏｈｎｅ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）及び紅斑性狼瘡（Ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）に特に効果を与える。
【００８８】
記載された方法におけるの他の適切な１適応例であるが、特に免疫阻害的である１つが、器官又は組織の移植から発生するものである。こうした操作において、対象物（すなわち移植片レシピエント）と移植片ドナーとの間の総免疫的な適合性は、それが同種異系の移植片でなければほとんど不可能である。非自己細胞の存在を検知するレシピエント細胞が、移植片を拒絶反応に導くこれらの細胞を殺すと想定される。上記受容体の寛容性を改良することが必要とされ、上記免疫阻害方法を用いて達成することができる。
【００８９】
スタチンによる治療は、皮膚移植に特に適している。皮膚移植片として必要性が、たとえば、皮膚の潰瘍により生じる。皮膚潰瘍の治療が、通常アプリグラフト（商標）の器官形成系（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ａｐｐｌｉｇｒａｆｔ（商標））を含んでいるが、この系が同種異系の拒絶反応を受ける。従って本発明によるスタチンとの併用治療が、本発明における適用の１例である。
【００９０】
スタチンによる治療では、幾つかの生物的に移植可能な人工的補充器と、たとえば、種々の形状に加工操作可能で、そして哺乳動物の組織や器官を修復、増大，又は組み換えに使用できる、復元力に富み、生物的に適応可能な２層以上の層状化組織の補充器とを組み合わせて使用することができる。スタチンによる治療では、移植部分の炎症及び免疫拒絶反応を減少又は阻害され、従ってその人工補充器官が、生命活性の十分有す細胞の置き換えに伴う制御された生物的劣化を受けるか、あるいは元から移植された補充器がホスト酵素により劣化される前に、ホスト細胞により再構成されるような新組織を形成するかである。
【００９１】
本発明の方法は、有害な免疫反応が発症する可能性があると、予防的な方法として使用できる。これは有害な免疫反応が、移植片にて引き金となる場合があることが知られており、移植する場合特に有益である。寛容性が増大すれば移植前に行わなければならず、それが操作の重要な役割である。
【００９２】
本発明の方法により治療できる別の症状は、乾癬及び１般的な炎症疾患、又はアテローム硬化症などの慢性炎症疾患である。
【００９３】
特に本発明の方法は、局部的な適用、たとえば皮膚科学において極めて適切である。スタチンを、局所的たとえば皮膚又は眼に導入することが、副作用のない局部的に濃度を高くして行うには非常に有益である。この適用には、炎症部分に直接局部化することができる。スタチンを投与するこの方法は、乾癬、湿疹、及び他の皮膚炎症の局部的な治療に有益である。これは、さらにブドウ膜炎のような眼の炎症治療にも有益である。
【００９４】
この種の適応例として炎症が発生した場合、スタチンあるいはこれらの構造的、機能的な誘導体が、クリーム、スプレイ、ローション、軟膏、粉末、又は注射によらない注入形態にて投与される。
【００９５】
上記方法の１を行うために用いられるスタチンは、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、プロバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、ロスバスタチン、又はシンバスタチンが好ましい。本発明として好ましいスタチンが、親脂質特性を有するスタチンである。器官又は組織を移植する場合に、親脂質の性質による好ましいスタチンは、コンパクチン、アトロバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、又はシンバスタチンである。最も好ましいスタチンが、アトロバスタチンである。
【００９６】
上記新たに用いられているスタチンによる脂質低下効果が、ある環境下にて不適切な効果となる場合があることから、脂質低下効果でなく、スタチンの免疫調節、免疫阻害、又は抗炎症性からの利点として、これらの環境下では都合がよいことになろう。それで、こうした場合における本発明の方法は、従来の用量にて投与される時、治療として有意的に脂質低下効果を伴わない免疫調節効果を呈する、スタチンあるいは機能的又は構造的な誘導物質にて行うことが好ましい。「療法的な有意差」とは、こうした化合物が、ある程度のＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼを阻害化することを提供できるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて測定される時でさえ、高コレステロール血症又は脂質代謝における問題などの症状を治療する際に使用する選択として適切でないことが理解されよう。
【００９７】
前記方法は、対象物の１般的治療の一部として、又は異なる療法と併用して行うことが出来る。この場合スタチン又はその誘導体が、他の免疫阻害剤と併用して、あるいは併用しなくて投与することができる。他の免疫阻害の薬剤を投与する場合、免疫阻害薬剤を、別々か、同時か、又は順次投与することができる。特定の場合に、上記スタチンは、他の任意の免疫阻害剤がない状態で投与されるが、上記スタチンが、シクロスポリンＡ、又はシクロフォスフォアミドと組み合わせて投与されない。
【００９８】
それぞれの方法において、選択されるスタチン、あるいは構造的又は機能的に等価な誘導体により、対象物に与えられる量が、適切で、ＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現を特異的に調節するため、特に効果のあるようにしなければならない。
【００９９】
あらゆる薬剤に対する用量は、治療における成功及び患者の健康に対し重要な部分である。免疫調節剤、免疫阻害剤、又は抗炎症剤としての有効度が、使用されるスタチン又は誘導体に依存する。適切な量は、たとえば１日当り約１から約５００ｍｇの間に、好ましくは、１日当り約１０から約８０ｍｇの間に含まれる。最も好ましくは、市場にて入手できるスタチンを使用した時、現在使用されるスタチンとして、１日当り約２０から約４０ｍｇの間である。有意的に有効なスタチンが、将来的に発見される可能性がある、これらの分子が、有意的に少ない量で対象物に投与されると予測される。あらゆる場合における、特異的範囲は、医者が、所与の患者の性別、年齢、体重、病状及び他の項目により、前記所与の患者に対し最良の用量を決定しなければならない。
【０１００】
本明細書記載の本発明による方法の内容における投与形態としては、病巣内に、腹腔内に、筋肉内に、又は静脈内への注入、輸液、あるいは局所的な、鼻腔、経口、眼又は耳からの導入を含んでいる。化合物を連続的に投与することが可能であるが、特にスタチン又は誘導体を投与する従来の頻度は、１日１回である。
【０１０１】
スタチンが、免疫応答の役割をはたすことから、これらが、ＭＨＣクラスＩＩの異常性、望ましくなく、又は有害な発現を含む症状を治療する際に使用される医薬製造物に対し、免疫阻害剤、免疫調節剤、又は抗炎症剤として使用することができる。スタチンを、構造的又は機能的に等価な分子と置き換えることができる。
【０１０２】
本発明は、さらに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）リダクターゼを阻害する化合物を、疾患を治療する有効量にて患者に投与することを含む、自己免疫疾患に苦しんでいる前記患者を治療する方法に関する。好ましい化合物は、脂質低下効果に治療として有意性がなく、ＭＨＣクラスＩＩの発現を阻害する化合物である。
【０１０３】
本発明は、さらに測定可能なＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの阻害、及び患者におけるＭＨＣクラスＩＩの発現の阻害を行うことのできる少なくとも１つの化合物を、こうした自己免疫疾患又は症状を治療するための有効量にて、前記患者に投与することを含む、自己免疫疾患又はその症状に罹っている前記患者を治療する方法に関する。
【０１０４】
本発明は、さらに測定可能なＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの阻害、及び患者におけるＭＨＣクラスＩＩの発現の阻害を行うことのできる少なくとも１つの化合物を、組織拒絶反応を防止ための有効量で前記患者に投与することを含む、器官、組織の移植中か、移植した後の前記患者を治療する方法にも関する。
【０１０５】
本発明は、さらに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａリダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ）を阻害する化合物を、組織又は器官の拒絶反応を防止又は治療する有効量にて患者に投与することを含む、前記患者の組織又は器官の拒絶反応を予防又は治療する方法にも関する。
【０１０６】
さらに本発明は、疾患の症状が、少なくとも部分的に緩和されるように、対象物にＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣ−クラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を調節する有効量にて、少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は構造的に等価な分子を前記対象物に投与することを含む、自己免疫疾患、又は免疫炎症疾患を治療する方法にも関する。特に好ましい疾患は、慢性関節リウマチである。好ましい対象物は、高コレステロール血症に罹っていないことである。
【０１０７】
本発明による慢性関節リウマチを治療するために、スタチンを、別の慢性関節リウマチ療法と結びつけて投与する。好ましいリウマチ関節炎療法は、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ），疾患を修飾する抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＡＲＤｓ）、及びその組み合わせから成る群から選択される。
【０１０８】
好ましい非ステロイド系抗炎症剤が、サリチル酸、フェノプロフェン、ナプロイセン、ピロキシカン、トルメチン、インドメタシン、スリンダク、メクロフェナメイト、及びその組み合わせから成る群から選択される。好ましい疾患修飾抗リウマチ薬剤が、Ｄ−ペニシルアミン、金塩（非経口、経口の両方）、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスホアミド、及びその組み合わせから成る群から選択される。
【０１０９】
さらに本発明は、スタチンが、ＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣ−クラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を調節するための有効量にて提示され、これにより前記疾患の症状が、少なくとも部分的に緩和されるように、自己免疫疾患又は免疫炎症疾患を治療するため医薬剤の調製を行うため、スタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子を使用することにも関する。
【０１１０】
本発明は、拒絶反応が、少なくとも部分的に防止又は治療されるよう、ＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣ−クラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を阻害するための有効量にて、少なくとも１種のスタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子を対象物に投与することを含む、前記対象物中の組織における拒絶反応を防止又は治療する方法にも関する。
【０１１１】
さらに本発明は、炎症又は組織の拒絶反応あるいはその両方を減少させるよう、ＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣ−クラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を阻害するための有効量にて、スタチンあるいは機能的又は構造的に等価な分子を患者に投与することを含む、移植前、移植中、移植後の組織移植片を治療する方法に関する。
【０１１２】
好ましい組織移植片は、皮膚、骨、腹壁、心膜、髄膜、軟骨膜、推間板、関節軟骨、真皮、表皮炎、靭帯、腸及び腱から成る群から選択される組織移植片である。
【０１１３】
本発明は、組織移植片を移植前、移植中、移植後に対象物に投与するために、こうしたスタチンが、炎症又は組織の拒絶反応あるいはその両方を、減少させるよう、ＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣ−クラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を阻害するための有効量にて提示されてよう、炎症を減少させ、又は組織反応を減少、あるいはその両方を減少させるための医薬剤の調製におけるスタチンあるいは機能的又は組織的に等価な分子を使用することに関する。
【０１１４】
さらに本発明は、同一の風袋、又は別々の風袋のいずれかにて、組織移植片材料及びスタチン、あるいは機能的、又は構造的に等価な分子を含むキットに関する。上記キットとして、組織移植片材料は、皮膚、骨、腹壁、心膜、髄膜、軟骨膜、推間板、関節軟骨、真皮、表皮炎、靭帯、腸及び腱から成る群から選択されることが好ましい。
【０１１５】
さらに本発明は、拒絶反応が、少なくとも部分的に防止又は治療されるよう、ＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣ−クラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を阻害するための有効量にて、少なくとも１種のスタチン、あるいは、機能的又は組織的に等価な分子を、移植前、移植中に対象物に投与することを含む，前記対象物中における器官の拒絶反応を防止又は治療する方法に関する。好ましい器官は、心臓、腎臓、及び肝臓である。
【０１１６】
さらに本発明は、その炎症が減少されるよう、ＩＦＮ−γにて誘発可能なＭＨＣ−クラスＩＩの発現及び／又はＣＤ４０の発現を阻害する有効量にて、少なくとも１種のスタチン、あるいは機能的又は組織的に等価な分子を前記対象物に投与することを含む，炎症疾患を治療する方法に関する。炎症疾患が、皮膚炎症疾患、眼の炎症疾患，及び紅斑性狼瘡から成る群から選択されることが好ましい。
【０１１７】
本発明は、皮膚炎症疾患における炎症を減少させるための治療薬剤の調製における炎症を減少させるための有効量にて提示され、前記スタチンあるいは機能的に、又は構造的に等価な分子を使用することに関する。本発明の状況における好ましい炎症疾患が、眼の疾患特にブドウ膜炎である。
【０１１８】
本発明は、炎症性眼の疾患における炎症を減少させるための治療薬剤の調製における炎症を減少させるための有効量にて提示される、前記にスタチンあるいは機能的に又は構造的に等価な分子を使用することに関する。
【０１１９】
実施例
実施例１
材料及び方法
試薬：ヒト組み換え型ＩＦＮ−γを、Ｅｎｄｏｇｅｎ（Ｃａｍｂｒｉｇｅ，ＭＡ）から入手した。これらの研究に用いられる３種のスタチン ［アトロバスタチン、（Ｐａｒｋｅ　Ｄａｖｉｓ）、ロバスタチン（Ｍｅｒｃｋ　Ｓｈａｒｐ　ａｎｄ　Ｄｏｈｍｅ）、及びプラバスタチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ）］が、市販製品として利用することができ、市場の供給資源として得ることができる。マウスの抗−ヒトＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩフルオレセイン・イソシアネート結合（ＦＩＴＣ）モノクロナール抗体、及び未結合モノクロナール抗体を、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。シクロヘキシイミド、アクチノマイシン及びＬ−メバロン酸を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。
【０１２０】
細胞の単離及び培養：ヒト血管内皮細胞（ＥＣｓ）を、コラゲナーゼ処理により（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）により伏在静脈から単離し、そして別に記載されている１５ゲラチン（Ｄｉｆｃｏ　Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，Ｅｎｇｌａｎｄ）にてコートした皿中において培養した。
【０１２１】
細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）， ５％のＦＣＳ （Ｇｉｂｃｏ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），１００μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）及び５０μｇ／ｍｌの ＥＣＧＦ（内皮細胞増殖因子；Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｒｏｇｅｒｓ， ＡＫ）により補給される培地１９９（Ｍ１９９；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）にて保持した。培養培地及びＦＣＳでは、色素産生リムルス・アモエボサイト ・アッセイ（ＱＬＣ−ｌＯ０Ｏ； ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）分析による決定のように、４０ｐｇのＬＰＳ／ｍｌより低くしか含有していない。内皮細胞は、フロー・サイトメトリーにより特徴付けられているように、９９％以上のＣＤ３１ポジテブであり、全実験に対して２−４の継代にて使用した。
【０１２２】
単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）を、フィコル−ハイパーキュ勾配（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）処理後、プラスチック製の培養フラスコ（９０分、３９℃）に付着させ、健康なドナーの白血球（ｌｅｕｋｏｐａｃｓ）から得られ、新に準備されたヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ）から単離された。単球を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）にて、１０日間１５培養した。単球由来のマクロファージは、フロー・サイトメトリーにて決定されるように、９８％を越えたＣＤ６４ポジテブであった。
【０１２３】
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から得られたヒト・ラジ細胞株（Ｒａｊｉ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ）（Ｅｐｓｔｕｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）−ｐｓｉｔｉｖｅ　Ｂｕｒｋｉｔｔ　ｌｙｍｐｈｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）、及び記載されているように１６得られた樹上細胞株を、１０％のＦＣＳを含んでいるＲＰＭＩ−１６４０ 培地にて増殖させた。
【０１２４】
フロー・サイトメトリー：細胞を、ＦＩＴＣ−結合特異的抗体（６０分、４℃）にてインキュベートし、そして記載１５のようにａ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒにおいて分析した。少なくとも１００，０００の変異可能な細胞を、１症状につき分析した。データを、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ ソフトウエア （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【０１２５】
免疫標識：カバーガラス上に増殖した細胞を、メタノールにて２０℃、５分間固定した。カバーガラスをすすぎ洗いし、ＰＢＳ 中０．２％ のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ にて、１時間、そしてＰＢＳ 中０．５ Ｍ ＮＨ４Ｃ１にて１５分間、そしてＰＢＳ 中０．２％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を補給し、さらに３０分間続けてインキュベートした。次に細胞を、正常なヤギの１０％血清（Ｓｉｇｍａ）／ＰＢＳ中に１次抗体（１：２００）により１昼夜インキュベートした。すすぎ洗い後、カバーガラスをＦＩＴＣ−結合２次抗体（１：１０００）により、４時間インキュベートした。全工程を室温にて行い、インキュベート工程間における細胞をＰＢＳによりすすぎ洗いした。細胞を、０．０３％ のＥｖａｎｓ ｂｌｕｅ／ＰＢＳにより対比染色した。カバーガラスを、ベクターシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ））におけるスライド上に取り付けた。細胞を、適切なフィルターを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを用いて試験した。免疫標識する特異性は、ＰＢＳを伴う１次抗体を置き換えて検査した。
【０１２６】
ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（ＲＮＡｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓｅｙｓ）：全ＲＮＡは、製造業者の指示に従い、Ｔｒｉ試薬（ＭＲＣ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）により調製した。反応当り１５μｇのＲＮＡを用いるＲＮＡｓｅ保護アッセイを、ＭＨＣ クラスＩＩ（ＤＲ−α、ＣＩＩＴＡ、ＣＩＩＴＡ（ｐＩＶ−ＣＩＩＴＡ）のプロモータＩＶ特異的形状のｅｘｏｎ１）としてヒトプローブを、及びＲＮＡを入れるためのコントロールとしてＧＡＰＤＨを用い、前に記載１２のように行った。シグナルの定量化は、リン酸画像装置分析システム（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を用いて決定した。所定の試料におけるＤＲ−α， ＣＩＩＴＡ， 及び ｐ１Ｖ−ＣＩＩＴＡ ＲＮＡのレベルを、その試料に対するＧＡＰＤＨシグナルに対し正規化した。
【０１２７】
ウエスターン・ブロット分析：細胞を、氷冷したＲＩＰＡの可溶化緩衝液中にて採取し、そしてタンパク質の総量を、ビシンクロン酸定量法（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定した。総タンパク質／レーンの５０μｇを、還元条件下ＳＤＳ／ＰＡＧＥにて分離し、そして半乾燥状ブロッテング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用い，ポリビニリデン・ジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）にブロットした。ブロットを、５％の脱脂乾燥ミルク／ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ中にて１昼夜ブロックし、さらに１次抗体（１：２００）（マウスモノクロナール抗ヒトｐ−Ｓｔａｔ１α Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）、又は装入するコントロールとしてマウスモノクロナール抗ヒトβアクチン（１：５０００）（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）により、室温にて１時間インキュベートした。これを、以後２次のパーオキシダーゼ結合抗体（１：１０，０００），（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）により、１時間インキュベートした。全工程を室温にて行い，そしてインキュベート工程の間における細胞を、ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎによりすすぎ洗いした。免疫反応性を、製造業者の指示に従う（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、強化性化学蛍光検出方法を用い検出し、その後上記膜をＸ線フイルムに暴露した。
【０１２８】
サイトカイン・アッセイ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｓｓａｙ）：Ｔリンパ球からＩＬ−２の放出を、製造業者（Ｒ＆Ｄ，Ａｂｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）に示唆されたように、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。実験をポリミクシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ（１μｇ／ｍＬ）の存在下にて行った。抗体の結合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸塩（１．３９ｍｇ／ｍｌ）を添加することにより検出され、そして吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ｐｌａｔｅ 読み取り装置の ４０５ ｎｍ にて測定した。ＩＬ−２の検出量を、ヒト組み換えＩＬ−２により作成された標準曲線から計算した。試料を３重にして評価した。
【０１２９】
結果
免疫機構と単為生殖との間の可能なインターフェースのある領域の診査、及び脂質低下剤としての周知な効果に依存しない、スタチンの良好な可能性のある効果を評価するため、ＭＨＣクラスＩＩの発現、及びその後のリンパ球活性化を制御する種々の特徴に及ぼすスタチンの効果を分析した。
【０１３０】
幾つかのスタチン効果が、ヒト内皮細胞（ＥＣｓ）及び単球−マクロファージ（Ｍφ）の１次培養を含む、種々の他の細胞型における、高い特異性のある抗原提示細胞（ＡＰＣ）における構成的なＭＨＣクラスＩＩの発現、とインターフェロン・ガンマー（ＩＦＮ−γ）により誘発可能なＭＨＣクラスＩＩの発現との両方を、調節することに関して研究された。実験を、細胞表面の発現（ＦＡＣＳでは図１ａ−ｆにより、免疫蛍光では図１ｇ及びＭＨＣクラスＩＩのｍＴＮＡレベル（ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、図２ａ）の両方にて評価した）を監視するために行った。
【０１３１】
これらの研究により、以下の決定、すなわち１）スタチンが、ＩＦＮ−γによりＭＨＣ−ＩＩの発現の誘発を効果的に阻害し、それを用量依存方法において行う（図１ａ−ｂ，ｇ）。２）Ｌ−メバロン酸の存在下において、ＭＨＣクラスＩＩの発現に及ぼすスタチンの効果を終わらせ、それが、実際にＭＨＣクラスＩＩ（図１ｃ）の阻害を仲介するＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤としてスタチン効果が、実際にあることを示している。３）興味あることに、スタチンによるＭＨＣクラスＩＩの発現の阻害が、ＭＨＣ ＩＩの発現の誘発可能な形状に高い特異性があるが、樹状細胞及びＢリンパ球（図１ｄ，ｅ）など高い固有性のＡＰＣｓにおいてＭＨＣ ＩＩの構成的発現に関係していない。４）このスタチン効果が、ＭＨＣクラスＩＩの発現として特異的であるが、ＭＨＣクラスＩの発現（図１ｆ）に関与していない。５） ＭＨＣクラスＩＩ発現をスタチンにより誘発される阻害において、機能的な関連性を研究するため混合リンパ球反応（ＩＦＮ−γにより前処理されたヒトＥＣ又はＭφによりインキュベートされた同種異系のＴリンパ球）を行った。Ｔ細胞の増殖は、抗−ＭＨＣクラスＩｉｍＡｂ（モノクロナール抗体）によりブロックすることが可能である。スタチンによりＥＣｓ又はＭφの前処理を行い、ＭＨＣクラスＩＩの誘発を阻害し、次のチミジンの組み込み（図３ａ）又はＩＬ−２の放出（図３ｂ）により測定されたＴリンパ球の活性作用、及び増殖を減少させる。
【０１３２】
ＭＨＣクラスＩＩ阻害剤としてスタチンの新規な効果がさらに、１次ヒト平滑筋細胞、及び繊維芽細胞を含む他の細胞種、及びＴｈＰ１，メラノーマ及びＨｅｌａ細胞など確立された細胞株において観察され、そして確認された。ＭＨＣクラスＩＩ誘発化に与えるこうしたスタチン効果が、臨床薬剤にて新たに用いられるスタチンの異なる形態により観察される。しかしながら興味深いことに、スタチンが異なると、ＭＨＣクラスＩＩ「阻害剤」（図１ａを参照）として全く異なる性能を呈する。試験された形態（ｆｏｒｍｓ）のうち、最も強いＭＨＣクラスＩＩ阻害剤は、アトロバスタチンである。ＭＨＣクラスＩＩの阻害化に及ぼす新たに記載された効果は、スタチンファミリーの他のメンバー、及びスタチンの類似体をスクリーニングすることにより最適化することができる。
【０１３３】
スタチン処理された試料において、ＩＦＮ−γによりＭＨＣクラスＩＩの誘発を阻害することが、ＩＦＮ−γによりＣＩＩＴＡｍＲＮＡ（図２ａ，ｂ）の誘発を減少させることにより並列的であり、そのことがスタチンによるＣＩＩＴＡ遺伝子誘発を阻害すること指摘している。興味深いことに、スタチンの異なる形状（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｏｒｍｓ（図２ｂ）にて観察されるＣＩＩＴＡ　ｍＲＮＡの誘発を阻害する差異程度が、同じ薬剤（図１ａ）にて観察されるＭＨＣクラスＩＩを阻害する差異レベルに反映される。これは、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の活性１３を通してＣＩＩＴＡのコントロールの定量的性質を確認する。ＣＩＩＴＡプロモータＩ及びＩＩＩにより仲介されると知られているＭＨＣクラスＩＩの構成的発現が、スタチン（図１ｄ，ｅ）により影響されることなく、プロモータＩＶがこれらの作用部位である可能性を示唆している。実際に、さらにＣＩＩＴＡプロモータＩＶにより特異的に制御される第１のエクソン（ｆｉｒｓｔ　ｅｘｏｎ）の発現を誘発することが、スタチンにより影響される（図４ａ）ことも示した。最終的に、新たなＲＮＡの合成をブロックするため、及びｍＲＮＡの半減期（図４ｂ）を探査するために用いられるアクチノマイシンＤの実験により実証されたように、スタチンの効果が転写性であり、そしてシクロヘキシイミドの効果が欠けているという実験で示されるように、それが新たなタンパク質の合成を対象としているが、それを必要とされていない。
【０１３４】
ＭＨＣクラスＩの誘発（Ｓｔａｔ１αを必要とすると知られた）１４に及ぼすスタチンの効果がないと予期されるように、Ｓｔａｔ１αのリン酸化及び核内転移が、スタチンの影響下（図４ｃ）正常に起こるため、本明細書に記載のスタチンの効果が、Ｓｔａｔ１α活性化の傷害に起因しない。
【０１３５】
実施例２：スタチンがＣＤ４０の発現を減少させる
材料及び方法
試薬：ヒト組み換え型ＩＦＮ−γを、Ｅｎｄｏｇｅｎ（Ｃａｍｂｒｉｇｅ，ＭＡ）から入手した。これらの研究においてスタチンが使用され、アトロバスタチン （Ｐａｒｋｅ　Ｄａｖｉｓ）；シンバスタチン及びロバスタチン（Ｍｅｒｃｋ　Ｓｈａｒｐ　ａｎｄ　Ｄｏｈｍｅ）；ならびにプラバスタチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）］が、市販品として利用することができ、市場による資源から入手できる。内皮細胞は、シンバスタチン、アトロバスタチン及びロバスタチンを活性状態に処理するラクトナーゼがないことから、前記のように［Ｂｉｕｍ，１９９４，５３］使用する前に、こうした薬剤を化学的に活性化する。ウサギの抗−ヒトＣＤ４０ポリクロナールＡｂ、蛍光イソシアネート−結合（ＦＩＴＣ）抗−ラビットＡｂ，及びＨＲＰヤギ抗−ラビットＡｂを、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅｌ）、及びＶｅｃｔｏｒ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）よりそれぞれ購入した。ＦＩＴＣ結合ハムスター抗−マウスＣＤ４０モノクロナール抗体及びＦＩＴＣ結合ハムスター抗−マウスＩｇＭを、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）から購入した。Ｌ−メバロン酸を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）より購入した。ヒト組み換え型ＣＤ４０リガンド（ｒＣＤ４０Ｌ）が、Ｐ．Ｇｒａｂｅｒ博士（Ｓｅｒｏｎｏ　 Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より贈られ、前に記載された［Ｍａｚｚｅｉ，１９９５，５４］ように生成した。ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＭＣＰ−１に対する抗体が、Ｒ＆Ｄ（Ｏｘｏｎ）より得られた。
【０１３６】
細胞の単離及び培養：ヒト血管内皮細胞（ＥＣｓ）を、コラゲナーゼ処理（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）により伏在静脈、及び哺乳動物の動脈から単離し、そして別に記載された［１５］ゲラチン（Ｄｉｆｃｏ）によりコートされた皿にて培養した。
【０１３７】
細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）， ５％のＦＣＳ （Ｇｉｂｃｏ），１００μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）及び５０μｇ／ｍｌの ＥＣＧＦ（内皮細胞増殖因子、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）により補給される培地１９９（Ｍ１９９；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ）において保持した。ヒト血管平滑筋（ＳＭＣｓ）細胞を、ヒト伏在静脈、及び哺乳動物の動脈から、体外移植組織の生育により単離し、そして１％のＬ−グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０％のＦＣＳにより補給されるＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）において培養した。両方の細胞種を、Ｐ１００−培養皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中にて、以下のようなトリプシン化（０．５％のトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）／０．２％のＥＤＴＡ（ＥＭ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）） によりサブ培養（ｓｕｂｃｕｉｔｕｒｅ）した。培地及びＦＣＳを、色素産生リムルス・アモエボサイト ・アッセイ分析（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ−ａｓｓａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ（ＱＬＣ−ｌＯ０Ｏ； ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））により決定されたように、４０ｐｇのＬＰＳ／ｍｌより低い含有であった。フロー・サイトメトリーにより特徴付けられるようにＥＣｓ及びＳＭＣｓそれぞれが、＞９９％のＣＤ３１及びα−アクチン（Ｄａｋｏ）ポジテブであり、そして総ての実験に対して２から４の継代で用いた。
【０１３８】
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）から得られたヒト・ラジ細胞株（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂｕｒｋｉｔｔ Ｉｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ）を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地において増殖させた。
【０１３９】
単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）を、フィコル−ハイパーキュ勾配（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ）処理後プラスチック製の培養フラスコ（９０分、３７℃）に付着させ、健康なドナーの白血球（ｌｅｕｋｏｐａｃｓ）から得られる新しく準備されたヒト末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ）から単離した。単球を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）に、１０日間［Ｋｗａｋ，２００１，３１］培養した。単球から由来するマクロファージ（Ｍφ）を、フロー・サイトメトリーにより決定されたように、９８％を越えるＣＤ６４ポジテブであった。
【０１４０】
マウスの単球が、記載の様な腹膜洗浄により得られた。動物は、採集する前［Ｋｏｌ，１９９８，５５］にある日数、高コレステロール食餌（１．２５％）を行った。細胞を、１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０ 培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）にて１０日間増殖させた。
【０１４１】
ウエスターン・ブロット分析：細胞を、氷冷したＲＩＰＡ可溶化緩衝液にて採取し、そしてタンパク質の総量を、ビシンクロン酸定量法（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定した。総タンパク質／レーンのうち２０μｇを、還元条件下ＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離し、そして半乾燥ブロッテング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用い，ポリビニリデン・ジフルオライド膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）にブロットした。ブロットを、５％の脱脂乾燥ミルク／ＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎ中で１昼夜ブロックし、そしてさらに１次抗体（１：４０）（ラビット・ポリクロナール抗−ＣＤ４０　Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚｅ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、又は装入のコントロールとしてマウスモノクロナール抗ヒトβアクチン（１：５０００）（Ｐｈａｍｉｎｇｅｎ）で室温にて１時間インキュベートした。これは、後に２次のパーオキシダーゼ結合抗体（１：１０，０００）、（Ｊａｃｋ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ ＰＡ）により、１時間インキュベートしたものである。全工程を室温にて行い、そしてインキュベート工程間においては、細胞をＰＢＳ／０．１％のＴｗｅｅｎですすぎ洗いした。免疫反応性を、製造業者の指示に従い（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、強力な化学蛍光検出方法を用い検出し、次に上記膜をＸ線フイルムに暴露した。検出量の分析を、ＡＩＤＳソフトウエアを用いて行った。
【０１４２】
サイトカイン・アッセイ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｓｓａｙ）：実験によるＩＬ−６、ＩＬ−８及びＭＣＰ−１の放出を、製造業者（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）にて示唆されるように、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを用いて測定した。実験を、ポリミクシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ（１μｇ／ｍＬ））の存在下にて行った。抗体の結合を、基質（Ｒ＆Ｄ）を添加することにより検出し、そして吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ｐｌａｔｅ 読み取り装置を用い ４０５ ｎｍ にて測定した。検出されたＩＬ−６、ＩＬ−８及びＭＣＰ−１の量を、組み換えタンパク質により準備された標準曲線から計算した。試料を２重にして評価した。
【０１４３】
免疫標識：カバーガラス上に増殖したヒト及びマウスのマクロファージをすすぎ洗いし、そしてパラホルムアルデヒド（４％）で、室温（ＲＴ）にて１５分間固定した。カバーガラスをすすぎ洗いし、０．５ Ｍ ＮＨ４Ｃ１／ＰＢＳにて１５分間、そして０．２％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）より補給されたＰＢＳにて、さらに２０分間続けてインキュベートした。次に細胞を、標準的な１０％ヤギの血清（Ｓｉｇｍａ）／ＰＢＳ）において１次抗体（１：５０）と１昼夜インキュベートした。マウスのマクロファージを、１次抗体ＦＩＴＣにより２時間インキュベートした。すすぎ洗いした後、ヒト・マクロファージをＦＩＴＣ−結合（１：８００）２次抗体にて３時間インキュベートした。全工程を室温にて行い、インキュベート化工程間においては、細胞をＰＢＳによりすすぎ洗いした。細胞を、０．０３％ のＥｖａｎｓ ｂｌｕｅ／ＰＢＳの対比染色した。最後にカバーガラスを、ベクターシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ （Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ））内のスライド上に取り付けた。細胞を、適切なフィルターを備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ顕微鏡を用いて試験した。ＰＢＳ／１０％標準ヤギ血清、又はＩｇＭ−ＦＩＴＣと１次抗体とを置き換えることが、ヒト・マクロファージ及びマウス・マクロファージそれぞれの免疫標識の特異性を制御するために用いられた。
【０１４４】
ヒト免疫化学：ヒト頚動脈アテローマの外科手術による試験片が、スタチンであるアトロバスタチンにより治療された、あるいは治療されていない患者からｔｈｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｒｅｖｉｅｗ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｇｅｎｅｖａにより認められた方法により得たものである。一連の結晶性断片（５μｍ）を切り出して、顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にて、空気乾燥、そしてアセトンにより−２０℃、５分間固定した。断片部を、ブロッキング緩衝液（８％の標準的なウマの血清によるＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）にて前もってインキュベートし、そのうえＣＤ４０ Ａｂ（ヤギ抗−ヒト）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）により、続けて１時間インキュベートした。最後に断片を、ビオチン化２次Ａｂ（４５分、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、その後アビジン−ビオチン−アルカリン・ホスファターゼ複合体（ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣｋｉｔ）によりインキュベートした。そして抗体の結合は、アルカリン・ホスファターゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により視覚化した。細胞は対比染色されなかった。１次抗体をブロッキング緩衝液による置き換えは、免疫標識化の特異性として検査した。ＣＤ４０に対する免疫化学の分析を、コンピュータを基盤とする定量化カラー画像分析システムにて行った。免疫染色するためのカラー閾値マスクが、サンプリングすることにより赤色を検知するために画定され、同じ閾値全てを全ての試験片に適用した。
【０１４５】
フロー・サイトメトリー：細胞を、ＦＩＴＣ−結合特異的抗体（６０分、４℃）にてインキュベートし、そして記載のａ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ１５にて分析した。１症状につき少なくとも２０，０００の異なる細胞を分析した。データを、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ ソフトウエア （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて分析した。
【０１４６】
結果
ＩＦＮ−γにて誘発されるＣＤ４０の発現の及ぼすスタチン効果を研究するため、密集血管内皮細胞（Ｅｃｓ）を、５００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γの存在下シンバスタチン、ロバスタチン、及びアトロバスタチンと組み合わせて培養した。表面におけるＣＤ４０の発現を、ウエスターン・ブロッテングにより２４時間後分析した。図６にて観察できるように、ＥＣｓが、休止状態下ＣＤ４０を発現し、そしてＩＦＮ−γによる処理がこの分子の発現を誘発した。ＩＦＮ−γとスタチンとを併用治療すると、ＣＤ４０の発現が減少した。同じ結果がＦＡＣＳ分析により得られた。
【０１４７】
興味深いことに、スタチンが、ＦＡＣＳ分析によりＣＤ４０を構成的に発現するＢリンパ球（Ｒａｊｉ）に与えるどのような効果をも示さなかった。
【０１４８】
アトロバスタチンが、用量依存方法（図７）においてこうしたＣＤ４０の誘発を阻害した。アトロバスタチンの効果が、０．０８−５μＭの範囲にわたり観察された。アトロバスタチンのみによる治療は、ＣＤ４０の発現に与える効果を有した。アトロバスタチンなどのＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤が、コレステロール合成経路における速度を制限する酵素（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）をブロックし、Ｌメバロン酸の産生を防止する。Ｌメバロン酸の存在下においては、ＩＦＮ−γにて誘発されるＣＤ４０に及ぼすアトロバスタチンの効果が極めて減少する。
【０１４９】
ＣＤ４０Ｌによって内皮細胞の活性化に関し、スタチンによりＣＤ４０の発現を阻害する機能的結果を研究するため、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、マクロファージ走化性因子タンパク質−１（ＭＣＰ−１）など分泌されたサイトカインを分析した。抗−ＣＤ４０Ｌ ｍＡｂを添加すると、ＣＤ４０の結合に応答して分泌される３種全てのサイトカインの誘発をブロックした。
【０１５０】
サイトカインを、２４時間後にＥＬＩＳＡにより測定した。図８ａ、ｂ、ｃ、において観察されるように、サイトカインが停止状態下にて分泌され、シンパスタチンを添加すると分泌を大きく減少させる。ＣＤ１５４による治療では、この分子の発現を誘発させた。しかしスタチンによるＣＤ１５４の刺激によりＣＤ４０の発現が有意に減少した。Ｌ−メバロン酸を添加すると、その処理を有意に逆転した。
【０１５１】
この場合スタチンが、マクロファージに影響を与えたかを決定するため免疫蛍光法を行った。コントロール条件は、ＩＦＮ−γによる刺激により誘発されるＣＤ４０の基本的レベルを示した。予期したようにスタチンを添加すると、ＩＮＦ−γ及びＬ−メバロン酸の添加により誘発される発現が減少した。
【０１５２】
動脈、頚動脈プラークを免疫染色により分析した。スタチン治療を受けている患者は、炎症プラークが有意的に少なく、ＣＤ４０の発現も有意的に少ない。
【０１５３】
考察
ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０のシグナル経路の重要な役割は、アテローマ性動脈硬化症、移植片とホストによる疾患、多発性硬化症、及びループス腎炎、自然発生自己免疫糖尿病、コラーゲン誘発関節炎などの自己免疫性疾患を含む、幾つかの免疫炎症過程において応答するというこを、多くの実証により裏付けられている。
【０１５４】
ＩＦＮ−γにより誘発されるＣＤ４０の発現をスタチンにより減少させると、ケモカイン（ＭＣＰ−１）、サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８）の放出を減少させる。したがって、プロアグラント（ｐｒｏａｇｕｌａｎｔ）活性（組織因子）（血栓の形成に誘導する）、ＭＭＰｓ（マトリックス化合物を消化でき、その上繊維性キャップの維弱に関与する）、接着分子、およびプラークの安定化を呈示できるＢ細胞の活性化を減少させることができる。
【０１５５】
本発明においてスタチンが、血管細胞のＩＦＮ−γにて誘発されるＣＤ４０の発現を減少させ、その上リガンドと結合することにより誘発される炎症を減少させることを示している。
【０１５６】
実施例３：マウスの皮膚移植片に及ぼすスタチン（アトロバスタチン）の影響
マウスの皮膚移植片を、動物の背部（〜２ｃｍ２）から採取し、受け入れマウスの背部の同じ部分に移植し、４．０のＥｔｈｉｂｏｎｄ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）にて縫い合わせた。その方法を、動物になんらかの苦痛を避けるようにガゼ麻酔（ｇａｚ ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）（Ｈａｌｏｔｈａｎ）下、〜２０分にて行った。回復と同時にその動物を、これらの籠に入れ換えした（１カゴ当たり１匹の動物）。皮膚移植片を移植する方法の対象基準を、たとえ同じ巣（兄弟及び姉妹）であっても同じ血統のマウスにて行った。さらに皮膚移植を、移植方法の内部コントロールとして同じマウス（ドナー及びレシペントである）にて行った。
【０１５７】
従って皮膚移植片の移植を、２種類の異なる血統（血統Ｃ５７／Ｂ１６からの黒色マウスより血統ＢＡＬＢ／Ｃからの白色マウスに、及びその逆）からのマウスにて行った。
【０１５８】
移植後直ちに、マウスを無作為であるが３種の異なる治療群に分けた、すなわち
１）コントロール
２）低スタチン用量（投与方法として下記を参照）
３）高スタチン用量（投与方法として下記を参照）
１群当たり７匹のマウスにて行われた。
【０１５９】
皮膚移植片の移植を、処理後（図１０）７、１０、及び１４日にて分析した。
【０１６０】
処理後７、１０、及び１４日にて拒絶反応が画定され、それを全マウスの移植片を置いた位置で（顆粒化組織、及び血管新生）、Ｌａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（ＬＤＰＩ）ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｓｃａ，Ｉｎｃ）を用いて測定した。
【０１６１】
２０日に全マウスを犠牲にし、レシペント組織を含む皮膚移植片を単離し、そして免疫組織化学分析のためＯＴＣにて包埋し冷凍した。
【０１６２】
内部コントロール：
マウスは、群の間において重量の有意的変化がなかった。
【０１６３】
血液のコレステロール値（全コレステロール、トリグリセライド）が、比較されるコントロール群から低スタチン用量の群まで、実験中に変化がなかった。高スタチンによる治療群のマウスが、血液測定にわずかな減少を示した。
【０１６４】
スタチンによる治療（食餌に溶かし）
アトロバスタチンのヒト用量：〜８０ｋｇ（１ｍｇ／ｋｇ）に対して８０ｍｇ／日、
マウスの重量：２０ｇｒ
マウスの食料：〜１０ｇ／日
用量１（低）：　１ｍｇ／ｋｇ／日　２０μｇ／日／マウス
用量２（高）：　１００ｍｇ／ｋｇ／日２ｍｇ／日／マウス
アトロバスタチン・ストック溶液
１）　２０ｍｌのＨ２Ｏ中２００ｍｇ、すなわち１０ｍｇ／ｍｌ
２）　２０ｍｌのＨ２Ｏ中２ｍｇ、すなわち１００μｇ／ｍｌ
食料の調製１：１１０ｇｒの食料 ＋ １１５ｍｌのＨ２Ｏ ＋ ３ｍｌ（３０ｍｇ）のストック溶液１
食料の調製２：１１０ｇｒの食料 ＋ １１５ｍｌのＨ２Ｏ ＋ ３ｍｌ（３０ｍｇ）のストック溶液２
用量１：１カゴに対し５匹のマウス：７５ｇｒ／食料調製１（上記）の１日当り
用量２：１カゴに対し５匹のマウス：７５ｇｒ／食料調製２（上記）の１日当り
実施例４：炎症疾患の治療におけるスタチン
ｉ）コラーゲンにより誘発される関節炎に罹っているマウスにおけるスタチンの効果。
【０１６５】
コラーゲンにより誘発される関節炎は、ヒトＰＡ（３２）の幾つかの典型的な臨床的、及び病態的特徴を再生するという、良く記載されている動物のモデルである。ＤＢＡ／１マウスは、典型的にこのモデルにて用いられ、免疫化後４週間から８週間以内に関節炎を発症する。ＣＩＡにおける組織的な知見では、ＲＡの病態的な特徴に類似してパンヌスの形成、と以後の軟骨及び骨の破壊を伴う滑膜における炎症細胞の存在、及び滑液における繊維芽細胞の増殖を含む。この関節炎の実験としてのモデルは、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｒｙ局（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ））の実験室において利用できる。ＣＩＡ発症の頻度、及び重篤度にてスタチンを投与する効果を試験することができる。この実験にＤＢＡ／１マウスが使用された。治療される群に対しスタチンを飲料水中に加えた。アトロバスタチンを、コントロール（治療を行わないマウス）と比較して１ｍｇ／ｋｇ／日及び２０ｍｇ／ｋｇ／日にて使用した。スタチン治療におけるこれらの用量は、たとえばＦ．Ｍａｃｈ博士（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ）の実験室にて新たな研究におけるアテローマ性動脈硬化症を対象とするなど、通常マウスのモデルに向けられている。次にマウスを、最近の記載（３３）のように２１日後に、完全なフロンドのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）中のウシコラーゲン型ＩＩを注射により注入した。その動物を、記載された指標（３３）を用いて関節炎の外観と、重篤度を１週当り３回試験した。各群内における結果（関節炎の出現率、結合部の腫張、及び結合部疾患の拡張）が、統計的分析として用いられた。コラーゲン−誘発関節炎のモデルが、Ｃ．Ｇａｂａｙ博士（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ）の実験により行われた。この研究の最後（最初の注射後８週間）にマウスを犠牲にし、マウスの脚を組織的試験のため取り出した。その肢を取り出し固定し、石灰質を除去し、そしてヘマトキシリン及びエオジンにより染色した。組織的な変化、特にパンヌスの存在、及び軟骨劣化の兆候を試験した。各群において得られた結果を比較する。ＭＨＣ．ＩＩ、炎症性細胞のサブタイプ、及びサイトカインの発現に対し組織学的、及び免疫組織学的に染色が行われる。この実験では、統計的に正確な分析として２回繰り返した。さらに何匹かのマウスを、研究過程における疾患の異なった段階で犠牲にした。結合から総ＲＮＡが調製され、そして異なるサイトカイン及びケモカインに対するｍＲＮＡのレベルを、Ｒｎａｓｅ保護アッセイにより決定した。加えて炎症反応のマーカとして、マウスにおける主要急性期タンパク質として血清アミロイドＡの血漿レベルを、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＣＩＡを有するマウスで得られた予備的な結果から、血清アミロイドＡの循環レベルが、関節炎の存在と関係することを示した。これら全ての結果を、治療を受けたマウスとコントロールマウス間の局所的、及び全体的な炎症反応を比較して使用した。
【０１６６】
免疫反応の細胞及びホルモン成分に及ぼすアトロバスタチンの効果を試験した。治療を受けたマウス及びコントロールマウスにおける股の付け根にあるリンパ節を、免疫化１４日後に取り出す。リンパ節Ｔ−細胞の調製を行い、そしてウシ・コラーゲン型ＩＩによりｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて刺激した。Ｔ−細胞の増殖を、３Ｈ−チミジンの摂取により評価した。さらに刺激されたＴリンパ球によりインターフェロン−γの生成を、細胞の上澄物中のＥＬＩＳＡによって測定する。ホルモンの応答に及ぼすアトロバスタチンの効果を、循環する抗−ウシコラーゲン型ＩＩ抗体のレベルを測定することにより試験した。
【０１６７】
さらにＣＩＡの過程に及ぼすスタチンの効果を、関節炎を発症するマウスにアトルバスタチンによる治療を導入して試験する。この目的のためアトルバスタチンを、ウシ・コラーゲン型ＩＩを注射により注入すると同時に添加する。実際には、関節炎の明らかな発生を注射器による注入より数日後に検出する。同じ項目（ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を、関節炎の重篤度、免疫仲介反応、および結合部分が損傷する兆候を明確にするために、上記ように使用する。
【０１６８】
方法：
研究　Ａ：１０匹から成る３群のマウス（３ｘ２（１籠５匹から成る））を、コントロール、低スタチン用量、及び高スタチン用量に分けた。慢性関節リウマチによる結合部の劣化を、第２の免疫化後に評価する。
【０１６９】
研究　Ｂ： ５匹から成る３群のマウス（３ｘ１（１籠５匹から成る））を、コントロール、低スタチン用量、及び高スタチン用量に分けた。第２の免疫化の後直ぐに股の付け根のリンパ節を単離し、分析した（Ｔリンパ球増殖、ＩＦＮ−γの生成）。
【０１７０】
全マウスを分けたが、到達するとするところ（コントロール、低スタチン用量、高スタチン用量）無作為である。
【０１７１】
全マウスに対して、最初の免疫化を同じ日に行い、そして第２の免疫化を２１日後に行う。
【０１７２】
スタチンの治療（食料に解して）：
アトロバスタチンのヒト用量：８０ｍｇ／日〜８０ｋｇ（１ｍｇ／ｋｇ）
マウスの重量：２０ｇｒ
マウスの食料：〜１０ｇ／日
用量１（低）：　　　１ｍｇ／ｋｇ／日　　　２０μｇ／日／マウス
用量２（高）：　　　１００ｍｇ／ｋｇ／日／２ｍｇ／日／マウス
アトロバスタチン・ストック溶液：
１）　Ｈ２Ｏ ２０ｍｌ中２００ｍｇ　　すなわち１０ｍｇ／ｍｌ
１）　Ｈ２Ｏ ２０ｍｌ中２ｍｇ　　　すなわち１００μｇ／ｍｌ
食料の調製１：食料１１０ｇｒ ＋ Ｈ２Ｏ１１５ｍｌ ＋ ３ｍｌ（３０ｍｇ）のストック溶液１
食料の調製２：食料１１０ｇｒ ＋ Ｈ２Ｏ１１５ｍｌ ＋ ３ｍｌ（３０ｍｇ）のストック溶液２
用量１：１籠５匹のマウスに対して：７５ｇｒ／食料調製１（上記）を１日当り
用量２：１籠５匹のマウスに対して：７５ｇｒ／食料調製２（上記）を１日当り
ｉｉ）ＲＡに罹った患者に１２週開放先導臨床試験（ｐｉｌｏｔ １２−ｗｅｅｋ ｏｐｅｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ）におけるスタチン効果
慢性関節リウマチは、古典的な治療に上手く、または完全に応答しないことを特徴とする重篤な炎症疾患であり、進行し２０年後の症例のうち８０％に接合部分の破壊及び使用不能に導く。最後の１０年から抗−リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤｓ）を変更させる２又は３種の異なる病状を組み合わせるなどの精力的な治療が、幾人かの患者の病状作用を制御するために必要であることが極めて明確になってきた。強化を強める過程において、第２又は第３のＤＭＡＲＤｓを添加することは、ほとんどのリウマチ専門医により１般的に用いられている。したがってこの研究の狙いは、スタチンが、旧来のＤＭＡＲＤｓに付加的な効果をもたらすことを示すことである。この目的にたいしてＤＭＡＲＤｓによる治療にかかわらず作用が減少する臨床的兆候を有するＲＡに罹っている患者が、この研究に含まれている。作用性のあるＲＡは、４以上の膨潤した接合部、４以上の脆弱性（ｔｅｎｄｅｒ） 接合部の存在、及び以下のような、すなわち４５分間継続する朝の硬直化、及び１リッター当り少なくとも２０ｍｇの血清ＣＲＰ濃度の少なくとも１つが存在することにより画定される。
【０１７３】
このパイロット（ｐｉｌｏｔ）研究におけるＲＡに対し１９８７年のＡＣＲ基準、及び上記画定された適正基準を満たす２０人の患者を登録する。免疫阻害治療を必要とするリウマチ性血管炎など関節外の重篤な炎症の存在が、例外的基準として考えられる。脂質レベルの判定が、研究に登録されることで（コレステロール、ＨＤＬ−ｃ、ＬＤＬ−ｃ、トリグリセリド）決定される。患者は、本研究前と同じＤＭＡＲＤｓ治療を継続して受け、さらに８０ｍｇのアトロバスタチン／日を受ける。この用量が、近年の３種の臨床試験（３４−３６）にすでに用いられてきた。さらに、炎症の生物的標識に及ぼすアトロバスタチン効果が用量依存性であり、そしてＣＲＰのレベルの減少が、８０ｍｇ／日の用量にて観察された。患者がこの研究に登録される前に使用されてきたＤＭＡＲＤｓ，非ステロイド抗炎症薬剤、及び経口グルココルチコイド（プレドニゾン≦１０ｍｇ／日）を同量継続することができる。研究における各患者には、インフォームド・コンセント（ｉｎｆｏｒｍｅｄ　ｃｏｎｓｅｎｔ）サインを含んでいる。この研究の手順が、ｔｈｅ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａに提出される。
【０１７４】
１２及び２４週の臨床的な進展が、同じ研究者により評価される。臨床応答が、２０パーセント （５０パーセント及び７０パーセント）の改良のＡＣＲの定義により画定される。ＡＣＲ基準による改良は、触れると痛くそして膨潤した接合部の数、患者における症状の全体的な評価、患者の痛みに対する評価、及び医者の疾患状態の全体にわたる評価を含み、その全てを、目視アナログ・スケール（ＶＡＳ）を用いて評価する。関節炎による機能的な能力不全が、健康評価アンケート（Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＨＡＱ））で測定され、十分に明確にされ、自己投与の形態になるようにする。さらにその応答が、ＥＳＲ及びＣＲＰの血清濃度により評価される。
【０１７５】
さらに、血液を封入状（治療の開始前）、及び研究の最後に（１２週）に採集した。血清を調製し、そしてサイトカイン及びケモカインの判定に使用されるまで凍結保存（−８０℃）した。
【０１７６】
スタチンに関する副作用は、クレアチンキナーゼの上昇に伴う筋痛症、及び肝炎の発症を含む。ほとんどの研究において前に用いられるように、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、及びトランスアミナーゼ（ＡＳＡＴ／ＡＬＡＴ）の血清レベルを、研究の開始、及び１２週及び２４週の過程に試験する。トランスアミナーゼが≦３ｘ上限の場合、及びＣＫ≦１０ｘ上記上限の場合、治療を停止する。肝臓トランスアミナーゼの血清レベルの判定が、２種の最も良く使用されるＤＭＡＲＤｓとしてメトトレキセート又はサルファーサラジンにより治療されるＲＡ−患者を追跡することを含む。
【０１７７】
ｉｉｉ）１２週開放式パオロット臨床試験（ｐｉｌｏｔ １２−ｗｅｅｋ ｏｐｅｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ）における、ＲＡに罹った患者に及ぼすスタチンの効果
予備研究により得られた結果により、アトロバスタチンによる２４週無作為な二重盲検臨床試験を行う。この研究のために患者を、本研究前に同じＤＭＲＤｓ治療＋スタチン又はプラセボ薬を受けるよう、無作為に割り当てる。患者が、この研究に登録する前に用いられてきた、非ステロイド抗炎症薬剤、及び経口グルココルチコイド（プレドニゾン≦１０ｍｇ／日）を同用量にて継続することができる。各患者は、研究においてインフォームド・コンセント（ｉｎｆｏｒｍｅｄ　ｃｏｎｓｅｎｔ）サインを含んでいる。この研究の手順が、関係するｔｈｅ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに提出される。
【０１７８】
例外的基準：血清コレステロール濃度を、この研究に適格な患者において測定した。環状動脈疾患にポジテブな履歴があり、そして全コレステロールの血清レベルが≧７ｍモル／Ｌの患者を除外する。さらに免疫阻害治療を必要とするリウマチ性血管炎など関節外の重篤な発症の存在が、例外的基準として考えられる。
【０１７９】
１２及び２４週の臨床的進展が、上記の機能項目（ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）を用いることにより、患者を治療する知識のない無関係な評価者により評価される。さらに、サイトカイン及びケモカインのレベルを検査し、そして臨床項目（ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）との関連性が行われる。
【０１８０】
文献
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３７． Ｌｕｔｇｅｎｓ， Ｅ． ｅｔ ａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ＣＤ１５４ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ５， １３１３−６．（１９９９）．
３８． Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ， Ｕ．， Ｓｕｋｈｏｖａ， Ｇ． Ｋ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．， Ｍａｃｈ， Ｆ． ＆ Ｌｉｂｂｙ， Ｐ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４Ｏ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｉｍｉｔｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７， ７４５８−６３．（２０００）．
３９． Ｄｕｎｅ， Ｆ． Ｈ．ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｇｐ３９， ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ＣＤ４Ｏ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１， １３２８−３０．（１９９３）．
４０． Ｇｅｒｎｉｔｓｅ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． ＣＤ４Ｏ−ＣＤ４Ｏ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３， ２４９９−５０４．（１９９６）．
４１． Ｊｅｎｓｅｎ， Ｊ．， Ｋｒａｋａｕｅｒ， Ｍ． ＆ Ｓｅｌｌｅｂｊｅｒｇ， Ｆ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ １５４ （ＣＤ４Ｏ−ｌｉｇａｎｄ） ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． ＥｕｒＪＮｅｕｒｏｌ ８， ３２１−８．（２００１）．
４２． Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｋ．， Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ， Ｕ．， Ｍａｃｈ， Ｆ．， Ｌｉｂｂｙ， Ｐ． ＆ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｒ． Ｎ． Ｈｏｓｔ ＣＤ４Ｏ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｄｏｎｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｃａｒｄｉａｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｐｒｅｖｅｎｔ ｇｒａｆｔ ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５， ３５０６−１８．（２０００）．
４３． Ｌａｒｓｅｎ， Ｃ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｋｉｎ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ａｆｔｅｒ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＣＤ４Ｏ ａｎｄ ＣＤ２８ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３８１， ４３４−８． （１９９６）．
４４． Ｋａｒｍａｎｎ， Ｋ．， Ｈｕｇｈｅｓ， Ｃ．Ｃ．， Ｓｃｈｅｃｈｎｅｒ， Ｊ．， Ｆａｎｓｌｏｗ， Ｗ． Ｃ． ＆ Ｐｏｂｅｒ， Ｊ． Ｓ． ＣＤ４Ｏ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ： ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２，４３４２−６．（１９９５）．
４５． Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ， Ｄ．ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ４Ｏ ｂｙ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２， ３３−４０． （１９９５）．
４６． Ｙｅｌｌｉｎ，Ｍ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４ＯＬ−ＣＤ４Ｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２， １８５７−６４．（１９９５）．
４７． Ｍａｃｈ， Ｆ．， Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ， Ｕ．， Ｂｏｎｎｅｆｏｙ， Ｊ． Ｙ．， Ｐｏｂｅｒ， Ｊ． Ｓ． ＆ Ｌｉｂｂｙ， Ｐ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ａｃｕｔｅ ａｔｈｅｒｏｍａ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４Ｏ： ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ， ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ， ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９６， ３９６−９．（１９９７）．
４８． Ｍａｃｈ， Ｆ．ｅｔ ａｌ． Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａ ＣＤ４ＯＬ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｕｂｕｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ　１５４， ２２９−３８．（１９９９）．
４９． Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，Ｕ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ： ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＣＤ４Ｏ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｐｌａｑｕｅ ｒｕｐｔｕｒｅ？ Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８１， ４４８−５４． （１９９７）．
５０． Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．ＣＤ４Ｏ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５６， ７−１４．（２０００）．
５１． Ｍａｃｈ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０４， １０４１−５０．（１９９９）．
５２． Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＣＤ４Ｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ ａｎｄ ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ： ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４Ｏ−ＣＤ４Ｏ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ １Ｌ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−Ｉ５， ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ １６４， ６５９３−６００．（２０００）．
５３． Ｂｌｕｍ，Ｃ．Ｂ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ． Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ７３， ３Ｄ−１１Ｄ．（１９９４）．
５４． Ｍａｚｚｅｉ， Ｇ． Ｊ．ｅｔ ａｌ． Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｒｉｍｅｒｉｃ ＣＤ４Ｏ ｌｉｇａｎｄ ｉｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０， ７０２５−８．（１９９５）．
５５． Ｋｏｌ， Ａ．， Ｓｕｋｈｏｖａ， Ｇ． Ｋ．， Ｌｉｃｌｉｔｍａｎ， Ａ． Ｈ． ＆ Ｌｉｂｂｙ， Ｐ． Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ６０ ｌｏｃａｌｉｚｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｍａ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８， ３００−７．（１９９８）．
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１では、前記スタチンが、ヒト内皮細胞及びマクロファージ上、ＩＦＮ−γにより誘発されるＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現を減少させることを、１連のグラフパネルに示している。図１ａから図１ｆは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質（ａ−ｅ）、及びＭＨＣクラスＩ（ｆ）に対しフローサイトメトリー分析を示すグラフである。図１ａは、ＩＮＦ−γ（５００Ｕ／ｍｌ、４８時間）だけ（太線）、又はアトロバスタチン１０μＭ（左側点線）、ロバスタチン１０μＭ （太い点線），又はプラバスタチン２０μＭ（右側点線）、により治療されたヒト血管内皮細胞（ＥＣｓ）にて行われたフローサイトメトリー分析を示している。図１ｂは、ＩＮＦ−γ（５００Ｕ／ｍｌ、４８ｈｒｓ）だけ（太線）、又はアトロバスタチン４０ｎＭ、０．２μＭ、２μＭ、又は１０μＭ（右から左の各点線） により治療されたヒト血管内皮細胞（ＥＣｓ）にて行われたフローサイトメトリー分析を示している。図１ｃは、ＩＮＦ−γ（５００Ｕ／ｍｌ、４８ｈｒｓ）だけ（太線）、又はアトロバスタチン及びＬ−メバロン酸（１００μＭ）（点線）により治療されたＥＣｓにより行われたフローサイトメトリー分析を示している。図１ｄは、コントロール条件下、又はアトロバスタチン１０μＭ（点線）にて治療されたヒト樹状細胞にて行われたフローサイトメトリー分析を示している。図１ｅが、コントロール条件下、又はアトロバスタチン（１０μＭ、４８時間）（点線）にて治療されたヒト細胞株Ｒａｇｉ上にて行われたフローサイトメトリー分析を示している。図１ｆは、ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ、４８時間）だけ（太線）、又はアトロバスタチン（１０μＭ、４８時間）（点線）にて治療されたＥＣにて行われたフローサイトメトリー分析を示している。全パネルに対し棒グラフにより、刺激されない状態下におけるＭＨＣクラスＩＩ（ａ−ｅ）又はＭＨＣクラスＩ（ｆ）の発現を表している。各パネルが、３０，０００の変動可能な細胞に対する対数（ｌｏｇ）蛍光強度（Ｘ軸）、対細胞数（ｙ軸）を表す棒グラフである。同様の結果が、５種の異なるドナーから、ＥＣｓ及びＤＣｓによる独立した実験により得られた。
図１ｇは、ヒト・マクロファージのＭＨＣクラスＩＩの発現に対する蛍光分析（相対強度として表す）を示すグラフである。（１）は、刺激されない条件下における細胞、（２），（３），（４）及び（５）が、ＩＦＮ−γだけ（５００Ｕ／ｍｌ、４８時間）か、アトロバスタチン（１０μＭ）、ロバスタチン（１０μＭ）、又はプラバスタチン（２０μＭ）それぞれにより処理された細胞である。（６）は、ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ、４８時間）により処理され、そして２次抗体だけ（ネガテブ・コントロール）により染色された細胞である。マクロファージを用いて３種の異なるドナーから別々の実験にて、同様の結果が得られた。
【図２】
図２は、ＩＦＮ−γにより誘発されるＭＨＣクラスＩＩの発現に及ぼすスタチンの効果が、トランスアクチベータＣＩＩＴＡに仲介されることを示しているブロットの関連性、及びそのグラフ表示である。
図２ａは、ＭＨＣクラスＩＩ（ＤＲ−α）に対するＲＮＡｓｅプロテクション・アッセイ（ＲＰＡ）の再生、図２ｂは、ＣＩＩＴＡに対するＲＮＡｓｅプロテクション・アッセイによる再生である。刺激されない（１），ＩＦＮ−γだけ（５００Ｕ／ｍｌ、１２時間）にて処理された（２）、又はアトロバスタチン（１０μＭ）（３）、ロバスタチン（１０μＭ）（４）、プラバスタチン（２０μＭ）（５）又はトロバスタチン（１０μＭ）及びＬ−メバロン酸（１００μＭ）（６）にて処理された血管内皮細胞である。ＧＡＰＤＨが、ＲＮＡを負荷するためのコントロールとして用いられた。ＲＰＡブロットの定量化が、各試料に対しＤＲ−α／ＧＡＯＤＨ及びＣＩＩＴＡ／ＧＡＰＤＨシグナルの比率として表される。同様の結果が、４種の異なるドナーからのＥｃｓにより、独立した実験にて得られた。＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０２が、ＩＦＮ−γにて処理された細胞（２）と比較、＊＊＊ｐ＜０．００１が、ＩＦＮ−γ／アトロバスタチン処理細胞（３）と比較してものである。
【図３】
図３は、Ｔリンパ球の活性化において、スタチンによってＭＨＣクラスＩＩ抗原を阻害する２種の異なる機能的結果の比較である。
第１の結果は棒グラフにて示され、ヒトＥＣｓ（ソリッド棒グラフ）又はヒトＭφ（オープン棒グラフ）に曝され（５日間）るか、あるいはＩＦＮ−γだけ（５００Ｕ／ｍｌ）（１，３）により又はＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）にアトロバスタチン（１０μＭ）（２，４）を伴い前処理された、同種異系のＴリンパ球において測定された［３Ｈ］チミジンの取り組み量を表している。同様の結果が、独立した実験における３種の異なるドナーから、Ｍφ又はＥＣｓにより得られた。ＩＦＮ−γにて処理された細胞と比較して＊ｐ＜０．０２である。
第２の結果が棒グラフを用いて示され、ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）だけ（１，３）又はＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）にアトロバスタチン（１０μＭ）（２，４）を伴い４８時間前処理された、ヒトＥＣｓ（ソリッド棒グラフ）又はヒトＭΦ（オープン棒グラフ）に暴露され（４８時間）た同種異系のＴリンパ球における上澄液におけるＥＬＩＳＡにより測定されたＩＬ−２の放出を表している。同様の結果が、独立した実験において４種の異なるドナーからＭφ又はＥＣｓにより得られた。ＩＦＮ−γにて処理された細胞と比較して＊＊ｐ＜０．０１である。
【図４】
図４は、スタチンが、転写レベルの状態にてトランスアクチベータＣＩＩＴＡのプロモータＩＶの発現を特に減少させたことを示すグラフと電気泳動ゲルの組み合わせである。
図４ａは、ＣＩＩＴＡ（ｐＩＶ−ＣＩＩＴＡ）のプロモータＩＶのに特異的な形状のエクソン（ｅｘｏｎ）１のためのＲＮＡｓｅプロテクション・アッセイ（ＲＰＡ）の再生である。ヒト刺激されないもの（１），ＩＦＮ−γだけ（５００Ｕ／ｍｌ、１２時間）にて処理されたもの（２）、又はアトロバスタチン（１０μＭ）（３）、ロバスタチン（１０μＭ）（４）、又はプラバスタチン（２０μＭ） （５）、又はアトロバスタチン（１０μＭ）及びＬ−メバロン酸（１００μＭ）（６）により処理された血管内皮細胞である。ＧＡＰＤＨが、ＲＮＡを負荷するためのコントロールとして用いられた。ＲＰＡブロットの定量化が、各試料に対してＤＲ−α／ＧＡＯＤＨ及びＣＩＩＴＡ／ＧＡＰＤＨのシグナルの比率として表される。同様の結果が、３種の異なるドナーからのＥｃｓにより、独立した実験にて得られた。＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０２（２）が、ＩＦＮ−γにて処理された細胞と比較したものである。＊＊＊ｐ＜０．００１が、ＩＦＮ−γ／アトロバスタチン処理細胞（３）と比較したものである。図４ｂは、ｐＩＶ−ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡレベルに及ぼすアトロバスタチンの影響を示す、アクチノマイシンＤ（Ａｃｔ Ｄ）の研究からＲＰＡのデンシトメトリック分析を表すグラフである。ＥＣｓをＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ，１２時間）にて前処理し、その上Ａｃｔ Ｄ（１０μｇ／ｍｌ）を単独にて添加するか、又はアトロバスタチン（１０μＭ）を伴い添加し、そしてＲＮＡを異なる時間にて分析した。
ｐＩＶ−ＣＩＩＴＡ／ＧＡＰＤＨのバンド強度によるｍＲＮＡ比が、時間の（時間数）半対数関数としてプロットされた。データが、３種の異なるドナーからの細胞を用い、別々にした実験における平均値±ＳＥＭを表している。図４ｃは、ＩＦＮ−γ（５００Ｕ／ｍｌ）にて処理され、ロバスタチン（１０μＭ）（Ｌｏｖａ）の存在する場合としない場合のＥＣｓのウエスターン・ブロット分析（４０μｇタンパク質／レーン）を示すブロットである。試料を、Ｓｔａｔ１−αのリン酸化した形状（ｐＳｔａｔ１−α）に、異なる時間（分）にて分析した。アクチンタンパク質を負荷するためのコントロールとして使用した。ブロットは、４種の異なるドナーから細胞により得られた異なる実験により表示したものである。
【図５】
図５は、幾つか市場から入手できるスタチンの化学的構造を表示したものである。図５ａは、アトロバスタチン及びロバスタチンを化学的に表示したものである。図５ｂは、プラバスタチン・ナトリウム及びフラバスタチンを化学的に表示したものである。図５ｃは、メバスタチン及びシンバスタチンを化学的に表示したものである。
【図６】
図６は、スタチンがヒト・アテローマ関連細胞におけるＩＦＮ−γによる誘発されるＣＤ４０の発現を減少させることを示すウエスターン・ブロットとの関係及びそのグラフ表示である。
ＣＤ４０（１−８）対するウエスターン・ブロット分析である。刺激されない条件下（１），ＩＦＮ−γだけ（５００Ｕ／ｍｌ、２４時間）にて処理されたもの（２）、又はプラバスタチン（５μＭ、３）、又はロバスタチン（５μＭ、４）、又はアトロバスタチン（５μＭ、５）を又はシンバスタチン（５μＭ、６）、又はシンバスタチン（１０μＭ）及びＬ−メバロン酸（２００μＭ）（７）にて処理されたヒトの血管内皮細胞（ＥＣｓ）、ポジテブなコントロール（８）として刺激されない条件下のＲａｊｉ細胞である。同様な結果が、３種の異なるドナーからＥＣｓにより、独立した実験にて得られた。
【図７】
図７は、アトロバスタチンが、ヒトアテローム関連細胞におけるＩＦＮ−γにより誘発されるＣＤ４０のタンパク質の発現を、用量依存方法にて減少させることを、ウエスターン・ブロットにより示している。
ＣＤ４０（１−６）に対するウエスターン・ブロット分析である。刺激されない条件（１）、ＩＦＮ−γだけ（５００Ｕ／ｍｌ、２４時間）にて処理された（２）、又はアロバスタチン、５μＭ（３）、２μＭ（４）、０．４μＭ（５）、０．０８μＭ（６）を伴い処理されたヒトの血管内皮細胞（ＥＣｓ）である。同様の結果が、３種の異なるドナーからのＥＣｓにより、独立した実験により得られた。
【図８】
図８は、ＣＤ４０仲介経路に及ぼすスタチンの機能的効果を示す１連のグラフパネルである。
ａ．ＭＣＰ−１の放出を、通常のメデア（１）、ＣＤ４０Ｌ（５μｇ／ｍｌ）だけ（２）、又はプラバスタチン（５μｇ）（３）、ロバスタチン（５μＭ）（４）、アトロバスタチン（５μＭ）（５）、又はシンバスタチン（５μＭ）（６）、又はシンバスタチン（５μＭ）及びＬ−メバロン酸（２００μＭ）（７）を伴い暴露（２４時間）されたＥＣｓの浮遊物中のＥＬＩＳＡにより測定した。同様の結果を、４種の異なるドナーからＥＣｓにて、独立した実験により得られた。３−６が２対する比較して、７が６に対する比較して、＊ｐ＜０．０５である。
ｂ．ＩＬ−６の放出を、通常のメデア（１）、ＣＤ４０Ｌ（５μｇ／ｍｌ）（２）、又はプラバスタチン（５μｇ）（３）、ロバスタチン（５μＭ）（４）、アトロバスタチン（５μＭ）（５）、又はシンバスタチン（５μＭ）（６）により暴露（２４時間）されたＥＣｓの浮遊物中のＥＬＩＳＡにより測定した。同様の結果を、４種の異なるドナーからのＥＣｓにより、独立した実験により得られた。３−５が２と比較され、６が５と比較され、＊ｐ＜０．０５である。
ｃ．ＩＬ−８の放出を、通常のメデア（１）、ＣＤ４０Ｌ（５μｇ／ｍｌ）（２）、又はプラバスタチン（５μｇ）（３）、ロバスタチン（５μＭ）（４）、アトロバスタチン（５μＭ）（５）、又はシンバスタチン（５μＭ）（６）により暴露（２４時間）されたＥＣｓの浮遊物中のＥＬＩＳＡにより測定した。同様の結果を、４種の異なるドナーからのＥＣｓにて、独立した実験により得られた。３−５が２と比較して、６が５と比較して、＊ｐ＜０．０５である。
【図９】
図９は、スタチンが、ヒト頚動脈・アテローマにおけるＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの発現を減少させることを示している免疫染色とそのグラフ表示の関係である。
患者からのヒト頚動脈・アテローマにおけるバンクが、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの発現を（図９Ｂ）免疫染色することによって分析され、上記１５人患者が、３ヶ月を超えてスタチンにより治療され、１３人の患者が、スタチンにて治療されていなかった。スタチンは、シンバスタチン又はアトバスタチンであり、１日当り２０と４０ｍｇの間を含む用量である。図９Ａは、２つのグループに対してＣＤ４０染色領域のグラフ表示を示している。図９Ｃは、２つのグループに対してＣＤ４０Ｌ染色領域のグラフ表示を示している。
【図１０】
図１０は、マウスの皮膚移植片に及ぼすスタチンの効果を示すグラフである。
マウスの皮膚移植片を、動物の背部領域（〜２ｃｍ２）から採取して、レシュペント・マウスの同じ背部領域に移植した。皮膚の移植片における移植状態を、その処理から７，１０及び１４日後に分析した。マウスを毎日の用量を以下のような、すなわち１ｍｇ／ｋｇ（低）又は１００ｍｇ／ｋｇ（高）にて経口食料の中に所定のスタチンにより治療した。移植から１０日、及び１４日後に、拒絶反応が画定され、マウスにおける移植片の置かれた部位に、マウス （粒状化組織、及び血管新生）において、レザー・ドプラー分散画像（ＬＤＰＩ）系（Ｌｉｓｃａ Ｉｎｃ）を用いて、測定される。
【図１１】
図１１は、スタチンによる処理が、コラーゲンにより誘発される関節炎の臨床得点（ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅ）を減少させることを示すグラフである。
コラーゲンによる最初の免疫感作の日から、マウスを、毎日の用量を以下のような、すなわち１ｍｇ／ｋｇ（低）又は１００ｍｇ／ｋｇ（高）にて経口食料の中に所定のスタチン（アトロバスタチン）により治療した。マウスを、コントロールとして用いられる通常の食品にて処理した。グループ当り１５匹のマウスであった。１匹のマウスが、コントロールグループにおいて、第１の免疫感作（２日）後に死んだ。
示されているのは、種別としてコラーゲンによる誘発関節炎の６日経過、及び１０日経過の臨床得点（ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｃｏｒｅ）である。＊＝ｐ＜０．０５
【図１２】
図１２は、スタチンによる治療が、コラーゲンに特異的なＴリンパ球応答を阻害することを示す一覧表である。
コラーゲンによる最初の免疫感作の日から、マウスを、毎日の用量を以下のような、すなわち１ｍｇ／ｋｇ（低）又は１００ｍｇ／ｋｇ（高）にて経口食料の中に所定のスタチン（アトロバスタチン）により治療した。グループ当り１５匹のマウスであった。１匹のマウスが、コントロールグループにおいて、第１の免疫感作（２日）後に死んだ。
第１の免疫感作の日から１５日にて、マウスを殺して、股の付け根のリンパ球を、コラーゲンの存在下培養した。７２時間後、Ｔ−リンパ球の増殖、及びＩＦＮ−γの放出が測定された。結果は、処理グループ当り４匹の個々のマウスの平均値＋／−ＳＤであり、これらのそれぞれを、３重にして試験した。＊＝ｐ＜０．０５。
【図１ｇ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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