(57)【要約】本発明は感染性キメラパピローマウイルス、特に初期遺伝子がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８に由来し、後期遺伝子が別のＨＰＶに由来するものに関する。本発明はラフト細胞培養でウイルスを培養する方法と、これらのキメラウイルスを利用するアッセイにも関する。
2004502452.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性キメラパピローマウイルス。
【請求項２】
初期遺伝子が第１のソースに由来し、後期遺伝子が第２のソースに由来する、請求項１に記載のパピローマウイルス。
【請求項３】
初期遺伝子がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来する、請求項２に記載のパピローマウイルス。
【請求項４】
初期遺伝子がＨＰＶ１８に由来する、請求項３に記載のパピローマウイルス。
【請求項５】
後期遺伝子がＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４１、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４７、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５７、ＨＰＶ５８、ウシパピローマウイルス、ワタオウサギパピローマウイルス及びイヌパピローマウイルスからなる群から選択されるソースに由来する、請求項３に記載のパピローマウイルス。
【請求項６】
感染性キメラパピローマウイルスをコードするベクター。
【請求項７】
感染性キメラパピローマウイルスを含む宿主細胞。
【請求項８】
感染性キメラパピローマウイルスの取得方法であって、
（ａ）初期遺伝子が第１のパピローマウイルスソースに由来し、後期遺伝子が第２のパピローマウイルスソースに由来するキメラパピローマウイルスを作製する段階と、
（ｂ）分化しつつある上皮細胞のラフト細胞培養物を作製する段階と、
（ｃ）細胞培養物にキメラパピローマウイルスを感染させる段階と、
（ｄ）ウイルス複製を維持する条件下で細胞培養物をインキュベートする段階と、
（ｅ）得られたキメラパピローマウイルスを回収する段階を含む、前記方法。
【請求項９】
初期遺伝子がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
初期遺伝子がＨＰＶ１８に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
後期遺伝子がＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ウシパピローマウイルス、ワタオウサギパピローマウイルス及びイヌパピローマウイルスからなる群から選択されるソースに由来する、請求項９に記載のパピローマウイルス。
【請求項１２】
血清中のヒトパピローマウイルス中和抗体の存在を検出するためのアッセイであって、
（ａ）感染性キメラパピローマウイルスを含む細胞培養物を血清と接触させる段階と、
（ｂ）血清の存在下に細胞培養物内でキメラパピローマウイルス複製が生じるか否かを調べる段階を含む、前記アッセイ。
【請求項１３】
段階（ｂ）がキメラウイルスからの核酸を逆転写酵素と接触させ、得られたｃＤＮＡを増幅する段階を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
得られたｃＤＮＡの量を対照細胞からの量と比較する段階を更に含む請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は感染性キメラヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）とその製造方法に関する。本発明はこれらのウイルスを利用する種々のアッセイにも関する。
【０００２】
発明の背景
感染性ヒトパピローマウイルスはｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏウイルス増殖が困難であるため、作製能が阻まれている。少数のウイルス型を増殖させるために数種の方法が利用されているが、複製要件が型毎に固有であるため、これらの方法は全ウイルスに有用ではない。感染性ＨＰＶ１８（米国特許第５，９９４，１１５号（Ｍｅｙｅｒｓ）及びＭｅｙｅｒｓら，１９９７　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（１０）：７３８１−６）及びＨＰＶ３１ｂ（Ｍｅｙｅｒｓら，１９９２　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：９７１−９７３，１９９２）を作製するためにラフト培養が使用されている。異種移植マウスモデルを使用して感染性ＨＰＶ１１の作製も行われている（Ｋｒｅｉｄｅｒら，１９８７　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：５９０）。
【０００３】
現在までに作製されている感染性ＨＰＶの型は同定されている８０種を越えるＨＰＶ型のうちのほんの少数に過ぎない。キメラＨＰＶを含む他のＨＰＶ血清型を簡便に培養できるシステムを開発することが最も望ましい。更に、感染性および中和抗体の存在を検出するために使用可能な感度の高いアッセイを開発することも望ましい。
【０００４】
発明の詳細な説明
本発明は、感染性キメラパピローマウイルスに関する。１つの好ましい実施態様において、パピローマウイルスは、初期遺伝子（例えばＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７）が第１のパピローマウイルスに由来し、後期遺伝子（Ｌ１及びＬ２）が第２のパピローマウイルス型に由来するキメラである。１つの好ましい実施態様において、初期遺伝子はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に由来し、より好ましい態様ではＨＰＶ１８に由来する。好ましい実施態様において、後期遺伝子は他のヒトパピローマウイルス血清型又は非ヒトパピローマウイルス（即ちウシパピローマウイルスＢＰＶ、ワタオウサギパピローマウイルスＣＲＰＶ、及びイヌ口腔パピローマウイルスＣＯＰＶ）を含んでいてもよい。
【０００５】
後期遺伝子がヒトパピローマウイルスに由来する態様において、後期遺伝子は生殖器癌及び疣贅等のヒト疾患に関連する血清型、即ちＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８からなる群から選択することが好ましい。他の好ましい血清型としては、ＨＰＶ１、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４１、ＨＰＶ４７、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５７及びＨＰＶ５８が挙げられる。
【０００６】
本発明の別の態様は感染性キメラパピローマウイルスの取得方法であり、
（ａ）初期遺伝子が第１の型のパピローマウイルスに由来し、後期遺伝子が第２のパピローマウイルスに由来するキメラパピローマウイルスを作製する段階と、
（ｂ）分化しつつある上皮細胞のラフト細胞培養物を作製する段階と、
（ｃ）細胞培養物にキメラパピローマウイルスを感染させる段階と、
（ｄ）ウイルス複製を維持する条件下で細胞培養物をインキュベートする段階を含む。
【０００７】
本発明の更に別の態様は血清中のヒトパピローマウイルス中和抗体の存在を検出するためのアッセイであり、
（ａ）感染性キメラパピローマウイルスを含む細胞培養物を血清と接触させる段階と、
（ｂ）血清の存在下に細胞培養物内でキメラパピローマウイルス複製が起こるか否かを決定する段階を含む。
【０００８】
好ましい実施態様において、この検出はキメラウイルスを感染させた細胞からのＲＮＡを逆転写酵素と接触させてｃＤＮＡを得ることにより実施される。その後、ｃＤＮＡをＰＣＲアッセイで増幅する。場合により、増幅したＤＮＡの量を対照群（例えば同様に感染させるが、血清に暴露していない細胞系）と比較する。
【０００９】
本発明の更に別の態様は、キメラウイルスを構築するために使用するベクターと、感染性キメラパピローマウイルスを含む宿主細胞である。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１は、キメラＨＰＶの作製方法の概要図である。
【００１１】
図２Ａ及び２Ｂはキメラ配列をもつプラスミドの作製を示す。図２Ａは、ＨＰＶ１８のゲノム配列を含み、構造タンパク質Ｌ１及びＬ２のコーディング配列をＢｇｌＩＩクローニング部位で置換したプラスミドを示す。図２Ｂは、ＨＰＶ１８のゲノム配列を含み、構造タンパク質Ｌ１及びＬ２のコーディング配列をＨＰＶ１６の相同タンパク質で置換したプラスミドを示す。
【００１２】
図３Ａ及び３Ｂは、ＨＰＶを含むクローン細胞系のサザンブロット分析を示す。ＨＰＶ１８／１６キメラＤＮＡをトランスフェクトした数種の細胞系についてエピソームウイルスＤＮＡの有無を調べた。ＤＮＡを各細胞系から抽出し、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ又はＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化するか又は消化せずにサザンブロットにより評価した。ＨＰＶ１８特異的プローブ（図３Ａ）でＤＮＡを探査した処、クローン２ａ、３ａ、３ｂ、３ｃ、４ｃ及び５ｃは、ＥｃｏＲＩで消化した場合には約８ｋｂのバンドを含んでいることが判明し、全ウイルス配列はエピソームであることが明らかになった。ＢｇｌＩＩで消化した場合には５．６Ｋｂのバンドが検出され、エピソームＤＮＡがＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１コーディング配列を含むことが更に立証された。未消化ＤＮＡはスーパーコイル及びニックゲノムウイルスＤＮＡを示す。ＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１特異的プローブ（図３Ｂ）を使用したサザンブロット分析により、ウイルスＤＮＡはエピソーム種であることが確認され、キメラウイルスＤＮＡ内に２．４Ｋｂ　ＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１配列が存在することが実証された。
【００１３】
図４は、ＨＰＶを含むクローン細胞系のＲＮＡプロテクションアッセイである。ラフト培養物として増殖させた細胞系２ａ及び５ｃから抽出したＲＮＡでＲＮＡプロテクションアッセイを実施した。ＨＰＶ１６Ｌ１特異的リボプローブを使用すると、クローン２ａは多量のＨＰＶ１６Ｌ１特異的ＲＮＡを産生するが、クローン５ｃは産生量が少ないことが判明した。Ｙ１はＲＮアーゼで消化した酵母由来ＲＮＡ対照である。Ｙ２は未消化酵母ＲＮＡ対照である。
【００１４】
図５は、感染性キメラウイルスの存在を示すものである。ＨＰＶ１８／１６キメラクローン２Ａからのウイルスの希釈液をＨａＣａｔ細胞に感染させた。７日後に細胞を回収し、４８６ｂｐＨＰＶ１８Ｅ１∧Ｅ４入れ子ＲＴ−ＰＣＲ産物（矢印）の存在によりウイルス感染を検出した。ウイルス希釈比を図面の上部に示す。「モック（ｍｏｃｋ）」は偽感染細胞を示す。
【００１５】
図６Ａ及び６Ｂは、ＨＰＶ１６特異的中和を示す。アカゲザル免疫前血清又はＨＰＶ１６Ｌ１ＶＬＰ免疫後血清の希釈液の存在下にＨａＣａｔ細胞をインキュベートした後、キメラウイルスクローン２Ａを加えた。７日後に細胞を回収し、４８６ｂｐＨＰＶ１８Ｅ１∧Ｅ４入れ子ＲＴ−ＰＣＲ産物（矢印）の存在によりウイルス感染を検出した。ウイルス希釈比を図面の上部に示す。図Ａ及びＢは２頭の異なるアカゲザルからの結果を示す。
【００１６】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して以下の用語を適用する。
【００１７】
感染性−適当な宿主細胞で複製できる場合にウイルスは感染性である。これは核酸を含まない空のキャプシドタンパク質から構成され、従っていかなる細胞でも複製できないウイルス様粒子（ＶＬＰ）からウイルスを区別するために用いる。
【００１８】
ＨＰＶは初期遺伝子が未分化細胞でしか活性でないと思われるが、（キャプシド形成のために構造タンパク質をコードする）後期遺伝子は分化細胞で活性であるため、細胞培養で特に増殖しにくいウイルスであった。しかし、参考資料として本明細書に組込む米国特許第５，９９４，１１５号に記載されているように、感染性ＨＰＶ１８はラフト培養で増殖できることが公知である。
【００１９】
本発明によると、ＨＰＶ１８に使用されるラフト培養系は感染性キメラパピローマウイルスの増殖を維持することが判明した。
【００２０】
本発明のキメラウイルスは一般に２つのゲノムソースをもつ。第１のソースはウイルス初期遺伝子のソースである。初期遺伝子は感染性ウイルスの産生に必要なパピローマウイルスの非構造タンパク質をコードし、これを発現する。これらの遺伝子としてはＥ１、Ｅ１∧Ｅ４（ＲＮＡの一部がＥ１から、その他の部分がＥ４に由来する、スプライス転写産物）、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６及びＥ７が挙げられる。
【００２１】
第２のＤＮＡソースは後期遺伝子Ｌ１及びＬ２をコードする遺伝子のソースである。これらの配列は、キメラウイルスゲノムＤＮＡを含む感染性ウイルス粒子に組込まれるＬ１及びＬ２構造タンパク質の産生を可能にする。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様では、初期遺伝子のソースはヒトパピローマウイルスであり、特にＨＰＶ１８である。しかし、他の血清型のウイルスも本発明で利用可能であり、初期遺伝子のソースとしてＨＰＶ１８を挙げたのは例示の目的であり、これに限定されない。
【００２３】
後期遺伝子のソースは、ヒト又は非ヒトのいかなるパピローマウイルスとすることができる。特に好ましいソースとしてはＨＰＶ６ａ、６ｂ、１１、１６、１８、他の疾患関連ＨＰＶが挙げられる。他の血清型としてはＨＰＶ１、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４１、ＨＰＶ４７、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５７及びＨＰＶ５８が挙げられる。その他、動物パピローマウイルス、特にワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）及びイヌ口腔パピローマウイルス（ＣＯＰＶ）等の動物疾患モデルで使用されるパピローマウイルスに由来するものも好ましい血清型である。「研究者がする必要があることのすべては、Ｌ１及び／又はＬ２遺伝子配列を得て、それによって、本明細書に記載の技術を使用してクローニングすることである。」多数のヒト及び動物パピローマウイルスＬ遺伝子の配列が公知である。
【００２４】
従って、本発明の１態様は感染性キメラパピローマウイルスである。好ましい実施態様において、本発明のキメラパピローマウイルスは以下のウイルス（命名の前の部分は初期遺伝子のソースを表し、後の部分は後期遺伝子のソースを表す）即ちＨＰＶ１８−１６、ＨＰＶ１８−１１、ＨＰＶ１８−６ａ、ＨＰＶ１８−６ｂ、ＨＰＶ１８−３１、ＨＰＶ１８−３３、ＨＰＶ１８−３５、ＨＰＶ１８−３９、ＨＰＶ１８−４１、ＨＰＶ１８−４２、ＨＰＶ１８−４７、ＨＰＶ１８−５１、ＨＰＶ１８−５７、ＨＰＶ１８−５８、ＨＰＶ１８−ＣＯＰＶ、ＨＰＶ１８−ＢＰＶ、ＨＰＶ１８−ＣＲＰＶの１種から選択される。
【００２５】
キメラウイルスゲノムはプラスミドと標準分子生物学技術を使用して作製することができる。要約すると、これはパピローマウイルス構造Ｌ１及びＬ２遺伝子のコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを作製し、ウイルス複製に必要なＨＰＶ１８の初期遺伝子を含むプラスミドの適当な位置にこのＤＮＡをクローニングすることにより行われる。
【００２６】
本発明のキメラウイルスはラフト培養系（器官型培養系とも言う）で増殖させる。要約すると、Ｉ型コラーゲンとフィブロブラストの混合物から皮膚に相当するもの（以下皮膚等価物とする。）を作製する。分化しつつある上皮細胞に由来する細胞系からの細胞を皮膚等価物の表面に載せ、培地中で、飽和するまで培養する。次に、上皮細胞を表面に載せた皮膚等価物を金網上に引上げ、空気−液体界面に維持する。この時点から上皮細胞は培地に接触しなくなる。上皮細胞の補充は皮膚等価物に拡散させることにより行う。上皮細胞は約２週間で層を形成し分化する。タンパク質キナーゼＣのインデューサーを培地に加え、キメラウイルスＤＮＡのエピソームコピーを維持している細胞がビリオンを生合成するようにすることが好ましい。
【００２７】
本発明のキメラウイルスの特筆すべき用途の１つはアッセイ、特に中和アッセイである。血清が中和抗体を含むか否かを評価するアッセイは当分野で利用されているが、これらのアッセイはいずれも非感染性ウイルスを利用するか又はｉｎ　ｖｉｖｏである。これに対して、本発明のアッセイは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施することができ、研究者にとってはるかに簡便でしかも感染性粒子を使用することができる。従って、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで生じる現象よりも感染中に実際に生じる現象に似た結果が得られ易い。更に、いかなるキメラパピローマウイルスにも本質的に同一手順を使用することができるので、同一培養方法を使用しながら多数の血清型を容易に調べることができる。
【００２８】
従って、本発明の別の態様はパピローマウイルスキャプシド上に存在するエピトープに特異的な中和抗体が試料中に存在するか否かを決定するためのアッセイであり、
（ａ）試料を感染性キメラパピローマウイルスと接触させる段階と、
（ｂ）キメラウイルスの感染性が変化するか否かを調べる段階を含む。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様において、感染性キメラパピローマウイルスは初期遺伝子をコードする第１の遺伝子ソースと、後期遺伝子をコードする第２の遺伝子ソースをもつ。これらの後期遺伝子はＨＰＶ６、１１、１６又は１８に由来することが好ましい。他の態様では、試料は後期遺伝子のソースと同一血清型ＨＰＶに暴露されたとされる個体からの血清試料である。従って、例えば個体がＨＰＶ１６に対する中和抗体をもつか否かを調べたいならば、キメラウイルスはＨＰＶ１６後期遺伝子をもつべきであり、１例はＨＰＶ１８−１６キメラである。このアッセイは後期タンパク質が数個のアミノ酸しか相違しない遺伝的に密接に関連する血清型（例えばＨＰＶ６及び１１）を鑑別するのにも有用である。
【００３０】
キメラウイルスの感染性が変化するか否かは多数の方法で調べることができる。ウイルス感染性の変化は相対測定であり、即ち他の全型と比較する標準ウイルス調製物を作製することができる。中和アッセイの好ましい実施態様において、例えば「無血清」陽性対照は感染性の完全低下を測定する標準である。
【００３１】
本発明に含まれる別のアッセイでは、キメラウイルスが実際に細胞に感染（即ち侵入）しているのか、又は単に表面に結合しているだけでまだ細胞に侵入していないかを検出する。このアッセイでは、初期遺伝子に由来するＲＮＡ転写産物のＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ＰＣＲ）を使用することができる。キメラウイルスがヒト細胞内で複製すると、（スプライスしていないウイルスゲノムの長さである）数Ｋｂではなく、４８６ｂｐ長のＥ１∧Ｅ４遺伝子のスプライス変異体が形成される。従って、感染が生じたことの指標としてスプライス変異体の検出を使用することができる。Ｅ１∧Ｅ４スプライス変異体は任意変異体とすることができる（Ｅ１及びＥ４の配列は当分野で公知である）。好適配列を以下に示す（ＰＣＲ増幅でプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドを下線で示す）。
【００３２】
【化１】
2004502452.tif 000003
【００３３】
Ｅ１∧Ｅ４ＲＮＡはヌクレオチド９２９〜３４３４間でスプライスした。
【００３４】
【化２】
2004502452.tif 000004
【００３５】
更に、感染検出能を改善すためにゲノムＤＮＡにリポーター遺伝子を導入してもよい。これらのキメラウイルスはパピローマウイルスタンパク質に対する免疫応答を誘発するように設計されたワクチンの評価に有用である。更に、ウイルス複製の分子的側面を研究するためのツールにもなり、パピローマウイルス感染に関連する治療処置の開発に重要な役割を果たすと思われる。
【００３６】
以下、非限定的な実施例により本発明を更に詳細に説明する。
【００３７】
実施例１：ＨＰＶ１８ΔＬ２／Ｌ１トランスファープラスミドの作製
ＰＢＳ−ＨＰＶ１８プラスミド（Ｈｅｒｓｈｅｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ｐａ．のＣｒａｉｇ　Ｍｅｙｅｒｓ博士から入手）２０μｇをＡａｔＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃａｔ＃７７５２０７）で消化した。消化したＤＮＡをＣｅｎｔｒｉｓｅｐカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｃａｔ＃ＣＳ−９０１）で精製した後、ＡｆｌＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｃａｔ＃５２０Ｓ）で消化した。得られた６６４７ｂｐバンドをＱＩＡＥＸゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ　Ｃａｔ＃２００２１）で精製した。
【００３８】
下記オリゴヌクレオチド（Ｍｉｄｌａｎｄ　Ｃｏ．）及びｐｆｕ　Ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して２つのＰＣＲフラグメントを作製した。
【００３９】
１．ＡａｔＩＩ部位のヌクレオチド３５４２からヌクレオチド４２４６のＨＰＶ１８Ｌ２配列の始点までのＨＰＶ１８ゲノムＤＮＡを含む７２０ｂｐＰＣＲ産物。このＰＣＲフラグメントの５’側はＡａｔＩＩ制限部位を含み、３’側はＢｇｌＩＩ制限部位を含む。このＰＣＲ産物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、
１８ＡａｔＩＩ：５’ＣＧＧ　ＣＣＡ　ＧＡＣ　ＧＴＣ　ＧＧＣ　ＴＧＣ　ＴＡＣ　ＡＣＧ３’（配列番号１）
１８ＢｇｌＩＩＢ：５’ＧＣＴ　ＡＧＣ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　ＧＣ３’（配列番号２）
であった。
【００４０】
２．ＨＰＶ１８Ｌ１の停止部位のヌクレオチド７１３７からヌクレオチド７７３０のＡｆｌＩＩ制限部位までのＨＰＶ１８ゲノムＤＮＡを含む５９３ｂｐＰＣＲ産物。このＰＣＲフラグメントの５’側はＢｇｌＩＩ制限部位を含み、３’側はＡｆｌＩＩ制限部位を含む。このＰＣＲ産物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、
１８ＡｆｌＩＩ：５’ＧＴＡ　ＴＧＣ　ＡＡＴ　ＴＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＧ　ＴＡＡ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＡＣ３’（配列番号３）
１８ＢｇｌＩＩＦ：５’ＧＣＴ　ＡＧＣ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＴＡＴ　ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＡＴＡ　ＣＡＴ　Ｃ３’（配列番号４）
であった。
【００４１】
ＡａｔＩＩ／ＢｇｌＩＩ及びＡｆｌＩＩ／ＢｇｌＩＩＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ　Ｃａｔ＃２８１０４）で精製した。ＡａｔＩＩ／ＢｇｌＩＩＰＣＲ産物をＡａｔＩＩで消化した。ＡｆｌＩＩ／ＢｇｌＩＩＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩで消化した。消化したＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ　Ｃａｔ＃２８１０４）で精製した。
【００４２】
ＡｆｌＩＩ／ＡａｔＩＩで消化したプラスミドをＡａｔＩＩ／ＢｇｌＩＩ及びＡｆｌＩＩ／ＢｇｌＩＩで消化した２種のＰＣＲ産物に連結した。得られた連結物をＢｇｌＩＩで消化し、Ｇｅｎｉｅｐｒｅｐで精製し、連結した。
【００４３】
ＤＨ５α（ＢＲＬ　Ｃａｔ＃１８２５８）を形質転換し、ＨＰＶ１８Ｌ２／Ｌ１配列がＢｇｌＩＩクローニング部位で置換された適正プラスミドのコロニーをスクリーニングした。この新規７９３２ｂｐプラスミドをｐＢＳ−ＨＰＶ１８ΔＬ２／Ｌ１と呼ぶ。
【００４４】
実施例２：ＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１コーディング配列を含むプラスミドｐＢＳ−ＨＰＶ１８／１６の作製
下記オリゴヌクレオチド（Ｍｉｄｌａｎｄ　Ｃｏ．）及びｐｆｕ　Ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してＨＰＶ１６Ｌ２及びＬ１オープンリーディングフレームを含む２．９ＫｂＰＣＲ産物を作製した。ＰＣＲ鋳型に使用したＤＮＡはｐＵＣ１８にクローニングしたＣａｓＫｉ細胞からのＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２ゲノムＤＮＡに由来した。このＰＣＲフラグメントの５’及び３’側はいずれもＢｇｌＩＩ制限部位を含む。このＰＣＲ産物を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは、
１６Ｌ２ＢｇｌＩＩＦ：５’ＧＣＴ　ＡＧＣ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＡＴＧ　ＣＧＡ　ＣＡＣ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＣＧ３’（配列番号５）
１６Ｌ１ＢｇｌＩＩＢ：５’ＧＣＴ　ＡＧＣ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＴＡ　ＣＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＧＣＧ　ＴＴＴ　ＡＧＣ　ＡＧ３’（配列番号６）
であった。
【００４５】
２．９Ｋｂ　ＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１ＰＣＲ産物をＱＩＡＥＸ　ＩＩ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）でゲル精製した。精製産物をＢｇｌＩＩで消化し、熱不活化した後、Ｇｅｎｉｅｐｒｅｐ（Ａｍｂｉｏｎ　Ｃａｔ＃１９５０）を使用して精製した。
【００４６】
ｐＢＳ−ＨＰＶ１８ΔＬ２／Ｌ１をＢｇｌＩＩで消化し、エビアルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃａｔ＃１７５８２５０）で脱リン酸し、ホスファターゼと共に６５℃で１５分間熱不活化した。
【００４７】
ＨＰＶ１６Ｌ２及びＬ１オープンリーディングフレームに相当するＢｇｌＩＩで消化した２．９ＫｂＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩで消化したｐＢＳ−ＨＰＶ１８ΔＬ２／Ｌ１に連結し、Ｌ２／Ｌ１コーディング配列をＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１コーディング配列で置換した以外は全ＨＰＶ１８ゲノム配列を含む１０８５７ｂｐプラスミドを得た。このプラスミドをｐＢＳ−ＨＰＶ１８／１６と命名した。
【００４８】
実施例３：ＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１コーディング配列と突然変異ＥｃｏＲＩ部位を含むプラスミドｐＢＳ−ＨＰＶ１８／１６の作製
ラフト培養で感染性ウイルスを作製するプロトコールはＪ２細胞へのトランスフェクション前にＨＰＶゲノムＤＮＡの放出を必要とする。ＨＰＶ１８ゲノム配列はＥｃｏＲＩ部位を含まないので、この制限エンドヌクレアーゼを使用してゲノムＤＮＡをプラスミドから放出させる。キメラＤＮＡプラスミドｐＢＳ−ＨＰＶ１８／１６はＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１コーディング配列内にＥｃｏＲＩ部位を含む。Ｑｕｉｃｋ　Ｃｈａｎｇｅ　Ｓｉｔｅ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃａｔ＃２００５１８）を製造業者の指示に従って使用して部位特異的突然変異誘発を実施した。以下のオリゴヌクレオチド：５’ＣＡＴ　ＡＣＡ　ＴＡＣ　ＡＴＴ　ＣＴＡ　ＴＧＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＣＴＡ　ＴＴＴ　ＴＧＧ　ＡＧ３’（配列番号７）及び５’ＣＴＣ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＡＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＣＡＴ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　ＴＧ３’（配列番号８）を使用し、アミノ酸配列を変えずにＥｃｏＲＩ部位を改変した。得られたプラスミドをｐＢＳ−ＨＰＶ１８／１６Ｍと命名した。
【００４９】
実施例４：キメラウイルスの作製
キメラウイルスＤＮＡのケラチノサイトエレクトロポレーションプロトコール　（参考資料として本明細書に組込む）米国特許第５，９９４，１１５号に記載されているラフト培養法を原則的に使用して細胞を培養した。要約すると、以下の手順を使用した。
【００５０】
エレクトロポレーションの前日にマイトマイシンＣで処理した３Ｔ３Ｊ２細胞のプレート（１０ｃｍプレート）を準備した。これらの細胞を１：３に分割し、Ｅ培地＋５％ＦＣＳで、一晩インキュベートした。ｐＢＳ−ＨＰＶ１８／１６ＭプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して直鎖化し、ゲノムキメラウイルスＤＮＡを放出させた。ウイルスＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出で抽出し、ＥｔＯＨ沈澱させ、ＴＥ［ｐＨ８］緩衝液に１０μｇ／１０λ（初期重量に基づく）となるように再懸濁した。サケ精子ＤＮＡ１０ｍｇ／ｍｌを調製（変性及び音波処理）した。滅菌蒸留水で５００ｍＭ　ＢＥＳ［ｐＨ７．２］ストックを調製した。
【００５１】
トランスフェクション
サケ精子ＤＮＡを５分間煮沸し、直ぐに氷上に取り、消化プラスミドＤＮＡ１０λとサケ精子ＤＮＡ４．２５λを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分注した。
【００５２】
ケラチノサイトをトリプシン処理し、計数した。以下の式と培地組成を使用して再懸濁した。
【００５３】
細胞＝ｍｌ（Ｅ＋１０％ＦＣＳ＋５ｍＭ　ＢＥＳ［ｐＨ７．２］）
２０×１０６細胞／ｍｌ。
【００５４】
上記からのＤＮＡ混合物を使用して２５０λ細胞溶液（約５×１０６細胞）を調製した。溶液を室温で１０分間インキュベートした。溶液をエレクトロポレーションキュベット（ＢＩＯ−ＲＡＤ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｃｕｖｅｔｔｅ；ｃａｔ＃１６５−２０８８）に移した。ＢＩＯ−ＲＡＤ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒを使用して２１０ｖ／９６０μＦｄでエレクトロポレーションを行った。次に細胞を室温で１０分間インキュベートした。
【００５５】
次に各エレクトロポレーションサンプルをＥ＋１０％ＦＣＳ１０ｍｌに重層した後、約３００ｒｐｍで１０分間遠心した。各サンプルをＥ＋１０％ＦＣＳ６ｍｌに再懸濁した。
【００５６】
マイトマイシンで処理したＪ２細胞にＥ＋１０％ＦＣＳ（約８ｍｌ）を再補充した後、マイトマイシンＣで処理したＪ２細胞のプレートに播種した。
【００５７】
翌日、プレートにＥ＋１０％ＦＣＳ＋ＥＧＦ１０ｍｌを再補充し、Ｅ＋１０％ＦＣＳ＋ＥＧＦを２日おきに約７日間再補充した。その後、プレートに２日ごとにＥ＋５％ＦＣＳ＋ＥＧＦを補充した。マイトマイシンＣで処理したフィーダーが培養物上に得られた。
【００５８】
実施例５：ラフト培養物の作製
ウイルスＤＮＡをエピソーム状態に維持して感染性ウイルスストックを調製するためにラフト培養物を作製した。Ｊ２フィーダー細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー染色により生存細胞濃度を測定した。各ラフトに合計６．２５×１０５細胞／ｍＬを使用した。
【００５９】
Ｊ２細胞を６分間遠心し、再構成緩衝液に６．２５×１０５細胞／ｍＬとなるように再懸濁した。ラット尾コラーゲン（Ｉ型）を各チューブに加えると共に、各チューブにコラーゲンミックス１ｍｌ当たり１０Ｎ　ＮａＯＨ３μＬを加えた。５分間チューブを転倒して混合した。６ウェルクラスタープレートの各ウェルに２．５ｍＬを分注し、プレートを３７℃で１２〜１６時間インキュベートした。
【００６０】
Ｅ培地２ｍＬをウェルに加えてインキュベートした。上皮細胞を約０．５〜１．０×１０６上皮細胞／ラフトの密度でラフト上に播種した。細胞を３７℃で４時間〜一晩インキュベートし、必要に応じて培地を交換した。
【００６１】
細胞が飽和した後、１００ｍｍペトリ皿に金網を置いた。コラーゲンゲルを金網上に引上げ、金網の下側が培地で満たされるまでＥ培地を加えたが、培地が金網の網目を通過しないようにした。上皮細胞を空気／液界面で層を形成させ、分化させた。
【００６２】
分析のために４％パラホルムアルデヒドに固定することによりラフトを回収し、ラフトをパラフィン包埋した。免疫組織化学分析のために４μｍ切片を切り取った。
【００６３】
サザンブロット分析のために感染細胞から全細胞ＤＮＡを抽出した。ＲＮＡプロテクションアッセイのために感染細胞からＲＮＡを抽出した。
【００６４】
ビリオンをラフト培養物からＣｓＣｌ等密度勾配により精製し、ＥＭ分析と感染性及び中和アッセイに使用した。
【００６５】
実施例６：感染性及び中和アッセイ
増殖培地（１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１×ペニシリン及びストレプトマイシン）を加えた１２ウェルプレートにＨａＣａｔ細胞を１０５細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、培地を細胞から吸引し、Ｏｐｔｉｍｅｎ（Ｇｉｂｃｏ）で連続希釈したウイルスストック１００μＬを細胞上に加え、３７℃５％ＣＯ２インキュベーターで１時間インキュベートした。中和アッセイのために、ウイルス添加前に試験血清を細胞に加えた。ウイルス吸着後、新鮮培地をウェルに加え、細胞を更に７日間インキュベートした。その後、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｉｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の指示に従って使用して細胞から全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ２μｇを１段階ＲＴ−ＰＣＲ反応（Ｔｉｔａｎ　Ｏｎｅ　Ｔｕｂｅ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に使用した。ＲＴ−ＰＣＲで使用したオリゴヌクレオチドは、
順方向プライマー；ｎｔ５３０〜５５２：５’ＣＡＡ　ＣＣＧ　ＡＧＣ　ＡＣＧ　ＡＣＡ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　ＡＣ３’（配列番号９）及び
逆方向プライマー；ｎｔ３６０３〜３５８２：５’ＣＡＧ　ＧＴＣ　ＣＡＣ　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　Ｃ３’（配列番号１０）
であった。
【００６６】
ＲＴ段階は５０℃で３０分間実施した。その後、９５℃で５分後、９５℃１５秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を４０サイクル、７２℃７分間の最終伸長の条件でＰＣＲ反応を実施した。１回目のＲＴ−ＰＣＲ反応から２μＬを取出し、入れ子オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴヌクレオチド５’ＴＣＣ　ＡＡＣ　ＧＡＣ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　ＣＡＣ３’（順方向プライマー；ｎｔ５５３〜５７３）（配列番号１１）及び５’ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＡＣＡ　ＧＴＧ　ＴＣＣ　ＡＧＧ　ＴＣ３’（逆方向プライマー；ｎｔ３５７８〜３５５８）（配列番号１２））を使用した次のＰＣＲ反応に使用した。
【００６７】
２回目のＰＣＲ反応の条件は９６℃で６０秒後、９４℃１５秒、６５℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクルと、７２℃７分間の最終伸長とした。ＥｔＢｒを加えた１％アガロースゲルで入れ子ＰＣＲ産物を可視化した。４８６ｂｐＰＣＲ産物の存在はＨａＣａｔ細胞がＨＰＶ１８特異的Ｅ１∧Ｅ４スプライス転写産物を産生したウイルスに感染したことを示す。
【００６８】
実施例７：ＨＰＶ１８／１６キメラＤＮＡを含む細胞系の作製
ＨＰＶ１８／１６キメラＤＮＡを感染させた数種の細胞系についてエピソームウイルスＤＮＡの有無を調べた。各細胞系からＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ又はＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化するか又は消化せず、サザンブロットにより評価した。ＤＮＡがエピソームであるならばＥｃｏＲＩはゲノムウイルスＤＮＡを直鎖化して７．９Ｋｂバンドとなるが、ＢｇｌＩＩはキメラゲノムウイルスＤＮＡから２．４Ｋｂ　ＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１コーディング配列を放出する。ＤＮＡをＨＰＶ１８特異的プローブで探査したサザンブロットの結果、ＥｃｏＲＩで消化した場合にはクローン２ａ、３ａ、３ｂ、３ｃ、４ｃ及び５ｃは約８ｋｂバンドを含むことが判明し、全ウイルス配列はエピソームであると思われた。ＢｇｌＩＩで消化した場合には５．６Ｋｂバンドが検出され、エピソームＤＮＡはＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１コーディング配列を含むことが更に立証された。未消化ＤＮＡはスーパーコイル及びニックゲノムウイルスＤＮＡを示す。ＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１特異的プローブを使用したサザンブロット分析により、ウイルスＤＮＡはエピソーム種であることが確認され、キメラウイルスＤＮＡ内に２．４Ｋｂ　ＨＰＶ１６Ｌ２／Ｌ１配列が存在することが実証された。
【００６９】
実施例８：ＨＰＶ１６Ｌ１転写の立証
ＨＰＶ１６Ｌ１コーディング配列が転写されているか否かを調べるために、ラフト培養物として増殖させた細胞系２ａ及び５ｃから抽出したＲＮＡでＲＮＡ保護アッセイを実施した。ＨＰＶ１６Ｌ１特異的リボプローブを使用すると、クローン２ａは多量のＨＰＶ１６Ｌ１特異的ＲＮＡを産生するが、クローン５ｃは産生量が少ないことが判明した。Ｙ１はＲＮアーゼで消化した酵母由来ＲＮＡ対照である。Ｙ２は未消化酵母ＲＮＡ対照である。予想通り、ＨＰＶ１８Ｌ１特異的プローブを使用した場合にはＲＮＡは検出されなかった。
【００７０】
実施例９：クローンの免疫組織化学的分析
４種のクローンのラフト培養物についてＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質の有無を免疫組織化学分析した。クローン２ａ及び３ａのラフト培養物はクローン５ｃ及び５ｅよりも多数のＨＰＶ１６Ｌ１陽性細胞を示す。興味深いことに、クローン２ａ及び３ａはクローン５ｃ及び５ｅよりもコイロサイトの数も多く、表現型も異常である。これらの結果は、２ａがクローン５ｃよりも多数のウイルスゲノムＤＮＡ及びＨＰＶ１６Ｌ１ＲＮＡを含むという事実に一致している。
【００７１】
実施例１０：キメラＨＰＶ１８／１６ウイルスの感染性
キメラＨＰＶ１６／１８ゲノムＤＮＡのエピソームコピーを含むラフト培養物により感染性キメラウイルスが産生されたか否かを調べるために、クローン２ａ及び５ｃからの精製ウイルスの連続希釈液をヒトケラチノサイト細胞系（ＨａＣａｔ）に感染させた。入れ子ＲＴ−ＰＣＲ増幅による４８６ｂｐＨＰＶ１８Ｅ１∧Ｅ４スプライス転写産物の検出を使用してＨａＣａｔ細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの感染を調べた。クローン２ａから抽出したＨＰＶ１８／１６キメラウイルスは希釈比１：８００でも検出されたが、クローン５ｃに由来するウイルスは希釈比１：５０でしか検出されなかった。これはクローン５ｃがクローン２ａよりも少量のウイルスゲノムＤＮＡ、ＨＰＶ１６Ｌ１ＲＮＡ及びＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質を含むという先の結果に一致している。モック感染ＨａＣａｔ細胞から抽出したＲＮＡではウイルスは検出されず、このアッセイの特異性が明らかにされた。これらの結果は感染性キメラＨＰＶウイルスを作製できることを立証した最初のものである。
【００７２】
実施例１１：ＨＰＶ１６特異的ウイルス中和
本発明者らはＨＰＶ１６Ｌ２及びＬ１構造タンパク質を含む感染性ＨＰＶ１８／１６キメラウイルスがＨＰＶ１６特異的ポリクローナル血清により中和できたか否かを調べることに注目した。アカゲザル免疫前血清又はＨＰＶ１６Ｌ１ＶＬＰ免疫後血清の希釈液の存在下にＨａＣａｔ細胞をインキュベートした後、キメラウイルスストックの１５０又は１：１００希釈液を加えた。１時間インキュベーション後に培地を細胞に加え、細胞を更に７日間培養した。全ＲＮＡを抽出し、４８６ｂｐＨＰＶ１８Ｅ１∧Ｅ４スプライス転写産物の有無をＲＴ−ＰＣＲにより分析した処、ウイルス感染が生じたことが判明した。２頭のアカゲザルからの免疫後血清は希釈比１：１０及び１：１００でウイルス感染を阻害することができた。２種の血清の一方は１：１０００でウイルスを中和した。同様の希釈比で免疫前血清は感染性に無効であり、このウイルス中和は非特異的血清効果によるものではないことが判明した。ＨＰＶ１８ＶＬＰに対して作製した免疫血清で中和しても効果はなく、結果の特異性が更に明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
キメラＨＰＶの作製方法の概要図である。
【図２Ａ】
キメラ配列をもつプラスミドの作製を示し、ＨＰＶ１８のゲノム配列を含み、構造タンパク質Ｌ１及びＬ２のコーディング配列をＢｇｌＩＩクローニング部位で置換したプラスミドを示す。
【図２Ｂ】
キメラ配列をもつプラスミドの作製を示し、ＨＰＶ１８のゲノム配列を含み、構造タンパク質Ｌ１及びＬ２のコーディング配列をＨＰＶ１６の相同タンパク質で置換したプラスミドを示す。
【図３Ａ】
ＨＰＶを含むクローン細胞系のサザンブロット分析を示す。
【図３Ｂ】
ＨＰＶを含むクローン細胞系のサザンブロット分析を示す。
【図４】
ＨＰＶを含むクローン細胞系のＲＮＡプロテクションアッセイである。
【図５】
感染性キメラウイルスの存在を示すものである。
【図６Ａ】
ＨＰＶ１６特異的中和を示すものであり、２頭の異なるアカゲザルからの結果を示す。
【図６Ｂ】
ＨＰＶ１６特異的中和を示すものであり、２頭の異なるアカゲザルからの結果を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
2004502452.tif 000011
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2004502452.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004502452.tif 000014
2004502452.tif 000015
2004502452.tif 000016
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2004502452.tif 000045
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502452.tif 000046
【国際調査報告】
2004502452.tif 000047
2004502452.tif 000048