(57)【要約】標的活性化バイオセンサーを設計する方法が提供される。バイオセンサーは、第１のシグナル伝達部分および第２のシグナル伝達部分で標識された複数の核酸センサー分子を含む。核酸センサー分子は、天然にはＤＮＡへ結合しない標的分子を認識する。標的分子のセンサー分子への結合はシグナル伝達部分の近接に変化を引き起こし、これにより、バイオセンサー上の核酸センサー分子の光学特性が変化させられる。該方法を実行するための試薬およびシステムも提供される。該方法は、診断用途および薬剤最適化において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子を認識する構造と、光シグナル伝達ユニットとを含む標的分子活性化部位を含む核酸センサー分子であって、該光シグナル伝達ユニットが、シグナル伝達部分へ結合された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、該シグナル伝達部分が、該標的分子の認識に続く該核酸センサー分子のアロステリック調節時に、その光学特性を変化させる、核酸センサー分子。
【請求項２】
前記光シグナル伝達ユニットが、第１のシグナル伝達部分へ結合された第１のヌクレオチドと、第２のシグナル伝達部分へ結合された第２のヌクレオチドと、を含み、該第１および第２のシグナル伝達部分が、前記標的活性化部位による前記標的分子の認識の際に互いに近接を変化させる、請求項１に記載の核酸センサー分子。
【請求項３】
前記第１および第２のシグナル伝達部分が、蛍光標識および蛍光クエンチャを含み、前記標的分子の前記核酸センサーによる認識が、該蛍光標識の検出可能な蛍光の増大をもたらす、請求項２に記載の核酸センサー分子。
【請求項４】
前記第１のシグナル伝達部分および前記第２のシグナル伝達部分が、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーおよびアクセプター基を含み、前記標的分子の前記核酸センサー分子による認識が該ドナーおよびアクセプター基の間の距離に変化をもたらすことにより、該分子の光学特性が変化される、請求項２に記載の核酸センサー分子。
【請求項５】
前記光シグナル伝達ユニットが、本質的に第１のシグナル伝達部分からなり、前記標的活性化部位の前記標的分子による認識の際に、該第１のシグナル伝達部分がコンフォメーションを変化させることにより、検出可能な光シグナルがもたらされる、請求項１に記載の核酸センサー分子。
【請求項６】
前記核酸センサー分子が、少なくとも１つの修飾された核酸を含む、請求項１に記載の核酸センサー分子。
【請求項７】
前記核酸センサー分子が、ＲＮＡである、請求項１に記載の核酸センサー分子。
【請求項８】
前記核酸センサー分子が、ＤＮＡである、請求項１に記載の核酸センサー分子。
【請求項９】
前記核酸センサー分子が、ＲＮＡである、請求項４に記載の核酸センサー分子。
【請求項１０】
前記標的分子が、ポリペプチドである、請求項１に記載の核酸センサー分子。
【請求項１１】
標的分子を認識する構造と、光シグナル伝達ユニットとを含む標的分子活性化部位を含む核酸センサー分子を提供する方法であって、該方法が、以下：
該光シグナル伝達ユニットが、シグナル伝達部分へ結合された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、該シグナル伝達部分が、該核酸センサー分子のアロステリック調節の際にその光学特性を変化させる、核酸センサー分子を提供する工程；
標的分子を含有することが知られているか、あるいは予想されるサンプルと、該核酸センサー分子を接触させる工程；および
該集団において該標的分子の存在を示す該光シグナルを検出する工程
を包含する、標的分子の検出方法。
【請求項１２】
前記光シグナル伝達ユニットが、第１のシグナル伝達部分へ結合された第１のヌクレオチドと、第２のシグナル伝達部分へ結合された第２のヌクレオチドとを含み、該第１および第２のシグナル伝達部分が、前記標的活性化部位による前記標的分子の認識の際に互いに近接を変化させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および第２のシグナル伝達部分が、蛍光標識および蛍光クエンチャを含み、前記標的分子の前記核酸センサーによる認識が、該蛍光標識の検出可能な蛍光の増大をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のシグナル伝達部分および前記第２のシグナル伝達部分が、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーおよびアクセプター基を含み、前記標的分子の前記核酸センサー分子による認識が該ドナーおよびアクセプター基の間の距離に変化をもたらすことにより、該分子の光学特性が変化させられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記光シグナル伝達ユニットが、本質的に第１のシグナル伝達部分からなり、前記標的活性化部位による前記標的分子の認識の際に、該第１のシグナル伝達部分がコンフォメーションを変化させることにより、検出可能な光シグナルがもたらされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的分子が、病理状態または遺伝子改変に関連する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
複数の核酸センサー分子が提供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
複数の標的分子が検出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によって作成される診断プロファイル。
【請求項２０】
前記診断プロファイルが、野生型状態、病理状態または遺伝子改変と相関される、請求項１９に記載の診断プロファイル。
【請求項２１】
ランダムヌクレオチド配列を含む第１の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド集団を提供する工程；
該集団を標的分子と接触させる工程；
該標的分子の認識時にコンフォメーションを変化させる、該集団内のオリゴヌクレオチドを同定する工程
を包含する、核酸センサー分子の同定方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、前記ランダム配列へ結合された１つまたは複数の固定配列をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記固定配列のうちの少なくとも１つが、化学反応を触媒するための触媒部位の少なくとも一部を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記触媒部位が、リガーゼ部位、自己切断部位、グループＩ触媒部位、グループＩＩ触媒部位、およびハンマーヘッド触媒部位からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固定配列のうちの少なくとも１つが、前記オリゴヌクレオチドのクローニングまたは配列決定を容易にする配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記配列が、ＰＣＲプライマ部位、ＲＮＡポリメラーゼプライマ活性化部位、および制限エンドヌクレアーゼ認識部位からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが、複製可能な核酸配列上に提供される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記複製可能な核酸配列が、プラスミドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項２９】
前記ランダム配列が、ランダム配列を有する標的活性化部位を含み、前記触媒配列が、該標的活性化部位への前記標的分子の認識時に活性化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
（Ｉ）前記標的分子の非存在下で触媒活性を有する、標的分子非依存性の触媒オリゴヌクレオチドを前記集団内で同定する工程；
（ＩＩ）該標的分子と該集団を接触させる前に、該オリゴヌクレオチドを該集団から除去する工程
をさらに含み、
ステップ（Ｉ）および（ＩＩ）を繰り返す工程を任意で包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
（Ｉ）前記標的分子の認識時に触媒活性を有する、標的分子依存性の触媒オリゴヌクレオチドを前記集団において同定する工程；
（ＩＩ）該標的分子依存性の触媒オリゴヌクレオチドを該オリゴヌクレオチド集団から除去する工程
を包含し、
ステップ（Ｉ）および（ＩＩ）を繰り返す工程を任意で包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
（Ｉ）前記標的分子の認識時に触媒活性を有する、標的分子依存性の触媒オリゴヌクレオチドを前記集団において同定する工程；および
（ＩＩ）該標的分子依存性の触媒オリゴヌクレオチドを該オリゴヌクレオチド集団から除去する工程
を包含し、ステップ（Ｉ）および（ＩＩ）を繰り返す工程を任意で包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記固定配列が、触媒部位の一部であり、該触媒部位が非機能性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが、第１のシグナル伝達部分へ結合可能な３’ヌクレオチドと、第２のシグナル伝達部分へ結合可能な５’部分とを含み、該第１および第２のシグナル伝達部分が、前記標的活性化部位による前記標的分子の認識時に互いに近接を変化させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１および第２のシグナル伝達部分が、蛍光標識および蛍光クエンチャを含み、前記標的分子の認識に続く前記核酸センサーのアロステリック調節が、該蛍光標識の検出可能な蛍光の増大をもたらす、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のシグナル伝達部分および前記第２のシグナル伝達部分が、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーおよびアクセプター基を含み、前記標的分子の認識に続く前記核酸センサー分子のアロステリック調節が該ドナーおよびアクセプター基の間の距離に変化をもたらすことにより、該分子の光学特性が変化させられる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的分子が、ポリペプチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、分泌ポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、膜関連ポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記膜が、形質膜である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、細胞質ポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、核ホルモンレセプター（ＮＨＲ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）ポリペプチドの少なくとも断片のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＧＰＣＲポリペプチドが、ヒトＧＰＣＲポリペプチドである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、ＧＰＣＲポリペプチドのリガンド結合部分のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４８】
前記ＰＤＥポリペプチドを認識する際の前記オリゴヌクレオチドのコンフォメーション変化が、サイクリックヌクレオチドの存在に依存する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
前記サイクリックヌクレオチドが、ｃＡＭＰである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記サイクリックヌクレオチドが、ｃＧＭＰである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが、修飾されたポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリペプチドが、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ポリペプチドまたはタンパク質キナーゼポリペプチド（ＰＫ）のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＰＤＥまたはＰＫポリペプチドが、修飾型ＰＤＥまたはＰＫポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記修飾型ＰＤＥポリペプチドまたはＰＫポリペプチドが、リン酸化ＰＤＥポリペプチドである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記オリゴヌクレオチドが、非修飾型ＰＤＥまたはＰＫポリペプチドに対するよりも高い親和性で前記修飾型ＰＤＥポリペプチドまたはＰＫポリペプチドへ結合する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
請求項２０に記載の方法によって同定されるオリゴヌクレオチド。
【請求項５７】
標的分子を認識する構造と、光シグナル伝達ユニットとを含む標的分子活性化部位を含む、２つ以上の核酸センサー分子を含む複数の核酸センサー分子であって、該光シグナル伝達ユニットが、シグナル伝達部分へ結合された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、該シグナル伝達部分が、該標的分子の認識に続く該核酸センサー分子のアロステリック調節の際に、その光学特性を変化させる複数の核酸センサー分子。
【請求項５８】
前記２つ以上の核酸センサー分子の前記光シグナル伝達ユニットが、第１のシグナル伝達部分へ結合された第１のヌクレオチドと、第２のシグナル伝達部分へ結合された第２のヌクレオチドとを含み、該第１および第２のシグナル伝達部分が、前記標的分子の前記標的活性化部位による認識に続く該標的分子のアロステリック調節の際に互いに近接を変化させる、請求項５７に記載の複数。
【請求項５９】
前記第１および第２のシグナル伝達部分が、蛍光標識および蛍光クエンチャを含み、前記標的分子の認識に続く前記核酸センサーのアロステリック調節が、該蛍光標識の検出可能な蛍光の増大をもたらす請求項５８に記載の複数。
【請求項６０】
前記第１のシグナル伝達部分および前記第２のシグナル伝達部分が、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーおよびアクセプター基を含み、前記標的分子の認識に続く前記核酸センサー分子のアロステリック調節が該ドナーおよびアクセプター基の間の距離に変化をもたらすことにより、該分子の光学特性が変化させられる請求項５９に記載の複数。
【請求項６１】
前記２つ以上の核酸センサー分子の前記光シグナル伝達ユニットが、本質的に第１のシグナル伝達部分からなり、前記標的活性化部位への前記標的分子の認識の際に、該第１のシグナル伝達部分がコンフォメーションを変化させることにより、検出可能な光シグナルがもたらされる、請求項５７に記載の複数。
【請求項６２】
前記２つ以上のバイオセンサー分子が、溶液で提供される、請求項５７に記載の複数。
【請求項６３】
前記２つ以上のバイオセンサー分子が、基板へ結合されて提供される、請求項５７に記載の複数。
【請求項６４】
前記基板が、ガラス、シリコン、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックである、請求項５３に記載の複数。
【請求項６５】
前記結合が、共有結合性である請求項５７に記載の複数。
【請求項６６】
前記結合が、非共有結合性である請求項５７に記載の複数。
【請求項６７】
前記複数のうちの少なくとも２つのメンバーが異なる標的分子を認識する、請求項５７に記載の複数。
【請求項６８】
標的分子を検出するための診断システムであって、
標的分子を認識する構造と、光シグナル伝達ユニットとを含む標的分子活性化部位を含む少なくとも１つの核酸バイオセンサーであって、該光シグナル伝達ユニットが、シグナル伝達部分へ結合された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、該シグナル伝達部分が、該標的分子の認識に続く該核酸センサー分子のアロステリック調節の際に、その光学特性を変化させる少なくとも１つの核酸バイオセンサーと、
該核酸バイオセンサーと光学的に連通し、該核酸バイオセンサーの光学特性の変化を検出する検出器とを備えた、標的分子を検出するための、診断システム。
【請求項６９】
前記バイオセンサーと光学的に連通する光源をさらに備えた、請求項６８に記載の診断システム。
【請求項７０】
検出器によって検出される光シグナルを処理するためのプロセッサをさらに備えた、請求項６８に記載の診断システム。
【請求項７１】
複数の核酸バイオセンサー分子を含み、該バイオセンサー分子の少なくとも２つが２つの異なる標的分子を認識する請求項６８に記載の診断システム。
【請求項７２】
標的分子を検出するためのキットであって、
標的分子を特異的に認識する構造を含む標的分子活性化部位を含む少なくとも１つの核酸バイオセンサーであって、前記光シグナル伝達ユニットが、第１のシグナル伝達部分へ結合された第１のヌクレオチドと、第２のシグナル伝達部分へ結合された第２のヌクレオチドとを含み、該第１および第２のシグナル伝達部分が、該標的活性化部位への該標的分子によるアロステリック調節の際に互いに近接を変化させる少なくとも１つの核酸バイオセンサーと、
該第１のシグナル伝達部分を結合させるための試薬と、
該第２のシグナル伝達部分を結合させるための試薬と、
任意のコントロール標的分子と、
任意の１つまたは複数の検体検出用緩衝液とを含む、標的分子を検出するためのキット。
【請求項７３】
患者の疾病形質に関連する標的分子の、核酸バイオセンサーベースの分子プロファイルを同定する工程；
該患者へ候補化合物を投与する工程；および
該プロファイルの変化をモニターする工程
を包含する、薬剤化合物の同定方法。
【請求項７４】
前記プロファイルが、参照集団のプロファイルと比較される請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記参照集団が、健常な集団である請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記参照集団が、病気の集団である請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
複数の経路標的分子を同定する工程；
疾病形質を有する患者へ候補化合物を投与する工程；および
核酸バイオセンサー生体分子を用いて該複数の経路標的分子の２つ以上の構造、レベルまたは活性の変化をモニターする工程
を包含する、薬剤化合物の同定方法。
【請求項７８】
前記変化が、参照集団と比較される請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記参照集団が、健常な集団である請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記参照集団が、病気の集団である請求項７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、核酸に関し、さらに詳細には、核酸センサー分子に関する。
【０００２】
（発明の背景）
遺伝情報を保有することに加えて、核酸は、複雑な三次元構造をとることができる。これらの三次元構造は標的分子へ特異的に結合することができ、さらに、化学反応を触媒することができる。したがって、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡへ天然には結合しないものを含む種々の標的分子の検出分子候補を提供するであろう。アプタマー選択方法（「インビトロ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ」）（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ，  １９９０）は、核酸のこの特性を利用する。アプタマー選択では、予め選択された標的に対して高い親和性で結合するオリゴヌクレオチド、またはアプタマーを同定するために、オリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリがスクリーニングされる。
【０００３】
小さい生体分子（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、ＮＡＤ、Ｓ−デノシルメチオニン（Ｓ−ｄｅｎｏｓｙｌ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、クロラムフェニコール）、および大きい生体分子（トロンビン、Ｋｕ、ＤＮＡポリメラーゼ）はいずれも、アプタマーの有効な標的である。
【０００４】
アプタマーの親和性は、解離定数（Ｋｄ）が例えば０．３ｐＭ〜５００ｎＭの範囲であり、多くのアプタマーは１〜１０ｎＭの範囲の結合親和性を有する。最近の観察では、ピリミジンの２’−フルオロ置換のように、アプタマーライブラリのオリゴヌクレオチドの化学構造の単純な変化は、これらの親和性を約１〜３桁増大可能であることが示唆される。結合の特異性の増大も観察される。例えば、修飾された抗ヒトケラチノサイト成長因子（ｈＫＧＦ）アプタマーは、ラットＫＧＦよりも５倍強固に、関連の成長因子よりも１０４〜１０１０倍強固に、トロンビンなどの無関連タンパク質よりも１０１０倍強固に、ｈＫＧＦと結合することが分かっている（Ｐａｇｒａｔｉｓ  Ｃｔ  ａｌ．，  １９９７）。またＧｏｌｄら（１９９５，  １９９７）、  Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ  Ｃｔ  ａｌ．（１９９６）およびＥａｔｏｎら（１９９５）も、化学修飾におけるアプタマー結合の親和性および特異性の増大を報告する。
【０００５】
アプタマーバイオセンサーは、特異的な検体分子を検出するために使用されている。例えば、ガラス表面へ付着された蛍光標識抗トロンビンアプタマーは、アプタマーの光学特性変化を検出することによって、サンプル中のトロンビンタンパク質の存在を検出するために使用されている（Ｐｏｔｙｒａｉｌｏら，  １９９８）。このシステムでは、標識アプタマーへのトロンビンの結合は、エバネッセントフィールドによる励起の際にアプタマーの蛍光発光を検出することでモニターされる。また、アプタマーへのリガンドの結合の検出方法は蛍光−消光対の使用に依存し、この蛍光はリガンド結合時にアプタマーの二次構造変化に敏感であると記載されている（Ｓｔａｎｔｏｎら，  ２０００）。しかしながら、二次構造のリガンド媒介による変化は、トロンビン結合領域の３’末端の塩基と相補的なアプタマーの５’末端へ４〜６個のヌクレオチドが付加される困難な操作プロセスによって、アプタマー分子内へ設計された。トロンビンが不在の場合、この構造はステムループ構造（ｓｔｅｍ  ｌｏｏｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成するが、トロンビンが存在する場合にはＧ−四重構造を形成する。５’および３’末端に結合された蛍光および消光基は、この変化を付加する。
【０００６】
他の核酸ベースの検出スキームは、例えばリボザイムなどの幾つかの核酸のリガンド感受性の触媒特性を利用している。例えば、ＲｏｂｅｒｔｓｏｎおよびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ（２０００）は、リガンド結合時にリガーゼ活性を獲得するリボザイムを使用して、小さな標識した第２のオリゴヌクレオチドのリボザイムへの連結をモニターすることによって、リガンドを検出することができることを実証した。補足的なアプローチでは、リガンドへの結合時に切断を受ける標識アロステリックリボザイムは、リボザイムからの標識の遊離をモニターすることによって、リガンドを検出するために使用されている（Ｓｏｕｋｕｐら，  ２０００およびＢｒｅａｋｅｒ，  １９９８）。しかしながら、これらの検出技法の全ては、シグナルを発生する過程でリガンド活性化リボザイムが不可逆的に修飾されるという不利益を被る。したがって、これらのタイプのリボザイムは、アッセイにおいて１回だけしか使用できない。さらに、これらのリボザイムではシグナルの発生がゆっくりであり、１分〜１時間、またはそれ以上かかる。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、１つには、標的分子への結合時にその光学特性が変化する核酸センサー分子を含む核酸標的活性化バイオセンサーの発見に基づく。本発明は、標的分子の検出のための多数のアッセイにおいて使用することができる標的活性化バイオセンサー（ｔａｒｇｅｔ  ａｃｔｉＶａｔｅｄ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を提供する。本発明に従うバイオセンサーは感度が高く、標的のわずか１０２〜１０３分子を検出する能力があり、また特異性が高く、密接に関連する分子間の区別が可能である。バイオセンサー上の核酸センサー分子による認識は即時のシグナル発生をもたらすので、標的分子は迅速に検出される。バイオセンサーは臨床検査室での使用に理想的であり、選択および設計の間の簡単で容易な自動化学、ならびに検出プロセス中の容易な自動化学が提供される。診断アッセイを実行するために使用されるのと同じバイオセンサーは、新しい薬剤の開発において使用することができる。
【０００８】
本発明の利点の１つとして、溶液中のリガンド（標的）または検体の存在を検出および合図することができるが、リガンドが除去された後、またはリガンド−バイオセンサー複合体が解離した後でも同様であるバイオセンサー試薬が提供される。本明細書に記載される核酸センサー分子としては、標的分子と特異的に相互作用をする構造および光シグナル伝達ユニットを含む標的分子活性化部位を含むものがある。光シグナル伝達ユニットは、シグナル伝達部分へ結合された少なくとも１つのヌクレオチドを有する。シグナル伝達部分によるシグナルの発生は、標的分子による標的分子活性化部位のアロステリック活性化の際に生じる核酸センサー分子のコンフォメーションの変化に敏感である。核酸センサー分子のアロステリック活性化は、結果として、光シグナル伝達ユニットの光シグナル伝達特性の不可逆変化をもたらすことができる。あるいは、核酸センサー分子のアロステリック活性化は、光シグナル伝達ユニットの光シグナル伝達特性の完全に可逆的な変化をもたらすことができる。１つの実施形態では、アロステリック活性化は、標的分子活性化部位か、その光シグナル伝達ユニットか、あるいは標的分子活性化部位の一部および光シグナル伝達ユニットの一部からなる部位のいずれかにおいて、核酸センサー分子への標的分子の結合によって生じる。本発明の１つの実施形態では、標的活性化バイオセンサーの標的分子によるアロステリック活性化は、標的分子がバイオセンサーから分離された後でも検出可能な光シグナルが連続的に発生されるように、核酸センサー分子の不可逆的な修飾をもたらす。したがって、本発明では、シグナル伝達は、標的分子がバイオセンサーへ結合されたままであることを必要としない。
【０００９】
１つの局面では、本発明は、標的分子活性化部位を含有する核酸センサー分子を提供する。標的分子活性化部位には、例えば、標的分子を認識する構造および光シグナル伝達ユニットが含まれる。光シグナル伝達ユニットには、シグナル伝達部分へ結合された少なくとも１つのヌクレオチドが含まれ、シグナル伝達部分は、標的分子の認識に続いて、核酸センサー分子のアロステリック調節の際に、その光学特性を変化させる（例えば、シグナル伝達部分はシグナルを発生することができる）。
【００１０】
１つの実施形態では、少なくとも１つのバイオセンサーと、バイオセンサーと光通信する光シグナル検出器とを備えた診断システムが提供される。本発明はさらに、疾病に関連する標的分子の検出において診断システムを使用する方法、および疾病に対して有効な薬剤の開発のための方法に関する。また、該方法を実行するために有用な試薬およびキットも提供される。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、分子スイッチは親和性タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン）であり、その活性は標的の存在によって変更される。標的の存在下では、親和性タグは活性になり、センサー分子と親和性タグの結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン、抗ＤＩＧ）との間の会合を促進することができる。親和性タグ結合パートナーにより媒介される光シグナル伝達（例えば、ルシフェラーゼ結合ストレプトアビジンによる光発生）はこのようにセンサーへ局在化されることができ、したがって、標的の存在を検出する手段を提供することができる。（１）標的により誘導されたセンサーのコンフォメーション変化、（２）センサー分子自体により誘導された化学変化、または（３）センサー分子に作用する触媒による変化の結果として、核酸センサー分子と関連された光学センサーの局所環境または相対的な近接に変化が生じ得る。第１の場合には、標的はセンサーと特異的に相互作用をし、１つのコンフォメーションから別のコンフォメーションへ、あるいは折りたたまれていない状態から折りたたみ状態へ促進することができる。第２の場合は、センサー分子は、標的の存在によってその活性が制御されるリボザイムまたはデオキシリボザイムである。第３の場合は、センサーは、化学薬品または触媒（例えば、酵素）による修飾のための基質である。センサーが基質としての機能を果たす範囲は、標的（化学薬品／触媒として直接的に、化学薬品／触媒の調節剤として、あるいは化学薬品／触媒に対するその感受性を変化させるためのセンサーの調節剤として作用することができる）の存在によって制御される。
【００１２】
１つの実施形態では、標的活性化バイオセンサーは、核酸分子が標的分子へ結合する際に生じる核酸センサー分子の光学特性の変化によって、標的分子を検出するために使用される。本発明は、核酸分子へ標的が結合するときに活性化される分子スイッチを使用する。１つの実施形態では、分子スイッチは蛍光標識であり、その発光はクエンチャの近接によって消光される。標的分子の核酸分子への結合によって、標識およびクエンチャは、標識の蛍光効率が急激に増大するように互いに離される。別の実施形態では、分子スイッチは蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である。標的分子の核酸センサー分子への結合は、ドナー基とアクセプター基の間の距離に変化を引き起こし、分子の光学特性に変化がもたらされる。
【００１３】
１つの実施形態では、核酸センサー分子は、標的活性化可能な触媒活性を有する核酸分子を選択することによって生成される。この実施形態では、標的分子と接触されるオリゴヌクレオチド集団が提供され、標的分子が特異的に結合する標的分子活性化部位を含む核酸センサー前駆体分子が選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、結合は分子内にコンフォメーション変化を引き起こす。集団の各オリゴヌクレオチドはランダムな配列を含み、必要に応じて、ランダム配列へ結合された１つまたは複数の固定配列を含む。固定配列は、少なくとも、化学反応を触媒するための触媒部位の一部を含有することができる（残りの部分はランダム配列によって供給することができる）。触媒部位は、リガーゼ部位、自己切断部位、グループＩイントロンの触媒部位、グループＩＩイントロンの触媒部位、ハンマーヘッド型リボザイムの触媒部位、ヘアピン型リボザイム、ＨＤＶリボザイム、Ｌ１リガーゼ、Ｂａｒｔｅｌリガーゼ、自己ビオチン化リボザイム、およびＬｏｒｓｈキナーゼであり得るが、これらに限定はされない。
【００１５】
１つの実施形態では、固定配列はさらに、同定された分子のクローニング及び／または配列決定に役立つ配列を含む。このような配列には、ＰＣＲプライマー活性化部位、インビトロ転写を指向するプロモータ配列、ＲＮＡポリメラーゼプライマー活性化部位、および制限酵素認識部位などが含まれる。また分子は、標的分子活性化部位への標的分子の結合時に化学反応を触媒することができる配列を含む触媒部位を含む。
【００１６】
標的分子へ特異的に結合し、活性化部位へ結合する標的分子によってその触媒活性が修飾可能（例えば、活性化可能）である標的活性化部位を、ランダム配列内に含む核酸センサー前駆体分子が同定される。１つの実施形態では、核酸前駆体は複製可能な核酸配列（例えば、プラスミド）上に提供される。
【００１７】
１つの実施形態では、触媒部位の少なくとも一部を欠失または修飾し、触媒部位を非機能的にし、第１のシグナル伝達部分に結合可能な３’ヌクレオチドと、第２のシグナル伝達部分に結合可能な５’ヌクレオチドとを露出させることによって、核酸センサー前駆体分子は核酸センサー分子へ変換される。標的分子の標的分子活性化部位への結合は、第１および第２のシグナル伝達部分が３’および５’ヌクレオチドへ結合される場合に第１のシグナル伝達部分の第２のシグナル伝達部分への近接を変化させ、これにより、核酸センサー分子の光学特性に変化が引き起こされる。１つの実施形態では、第１のシグナル伝達部分はドナー蛍光団であり、第２のシグナル伝達部分は消光分子であり、ドナー蛍光団は、センサー分子が標的分子によって結合されていない場合には消光分子によって消光される。
【００１８】
１つの実施形態では、核酸センサー分子は、標識分子へ特異的に結合する構造と、光シグナル伝達ユニットとを含む標的分子活性化部位を備える。光シグナル伝達ユニットは、シグナル伝達部分へ結合された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、シグナル伝達部分によるシグナルの発生は、標的分子への結合時に生じる核酸センサー分子のコンフォメーション変化に敏感である。１つの実施形態では、光シグナル伝達ユニットは、第１のシグナル伝達部分へ結合された第１のヌクレオチドと、第２のシグナル伝達部分へ結合された第２のヌクレオチドとを含む。第１および第２のシグナル伝達部分は、標的分子が標的活性化部位へ結合すると、相互による近接を変化させる。この近接変化は、標的分子の存在を示すシグナルを発生する。もう１つの実施形態では、光シグナル伝達ユニットは、核酸センサー分子内の内部位置または末端位置のどちらかに導入された単一のシグナル伝達部分からなる。この実施形態では、標的分子の結合は、結果として、核酸センサー分子のコンフォメーション及び物理態様（例えば、分子の体積または質量、およびそれによる回転性拡散速度など）の両方の変化をもたらす。標的結合時の核酸センサー分子のコンフォメーション変化はシグナル伝達部分の化学的な環境を変更し、核酸センサー分子の物理態様の変化は、シグナル伝達部分の動力学的特性を変更する。どちらの場合にも、結果は、核酸センサー分子の光学特性の検出可能な変化となる。
【００１９】
１つの実施形態では、複数の核酸センサー分子を含む標的活性化バイオセンサーが提供される。本発明に従うバイオセンサーは、溶液中で遊離している核酸センサー分子を含むことができる。あるいは、核酸センサー分子は、ガラス、シリコン、ニトロセルロース、ナイロン、プラスチックまたは他のポリマーなどの基板へ、共有結合か、または非共有結合で、直接または間接的（例えば、リンカー分子によって）に結合され得る。１つの実施形態では、標的活性化バイオセンサーは、異なるタイプの標的分子に対する結合特異性を有する少なくとも２つの核酸ベースのバイオセンサー分子を含む。
【００２０】
１つの実施形態では、核酸ベースのバイオセンサーと、上記バイオセンサー上の核酸センサー分子の光学特性の変化を検出する、バイオセンサーと光通信する検出器とを含む少なくとも１つの標的分子の検出のための診断システムが提供される。もう１つの実施形態では、診断システムは、さらに、バイオセンサーと光通信する光源と、検出器により検出された光シグナルを処理するためのプロセッサとを含む。更なる実施形態では、診断システムは複数のバイオセンサーを含み、そのそれぞれは、標的分子に対して異なる特異性を有することができる。
【００２１】
また、本発明に従う核酸センサー分子を用いて標的分子を検出するための標準試薬を含むキットも提供される。キットは、標的活性化部位と、シグナル伝達部分へ結合可能な少なくとも１つのヌクレオチドとを含む核酸センサー分子を含む。第１のシグナル伝達部分を結合させるための試薬、第２のシグナル伝達部分を結合させるための試薬、コントロール標的分子、および検体検出のための適切な緩衝剤のいずれかを含む、少なくとも１つの更なる試薬が提供される。更なる実施形態では、標的分子と核酸センサー分子の複合体が提供される。
【００２２】
１つの実施形態では、標的活性化核酸バイオセンサーを使用して、標的分子を検出する。バイオセンサーはサンプルと接触され、サンプル中の標的分子の有無と相関することができるバイオセンサーの光学特性変化が決定される。１つの実施形態では、標的分子は、病理学的状態または遺伝子改変と関連される。別の実施形態では、複数の異なる標的分子が検出される。また更なる実施形態では、複数の異なる標的分子の検出を用いて、サンプルを獲得した患者の診断プロファイルを作成する。プロファイルは、野生型の状態、病理学的な状態、または少なくとも１つの遺伝子改変のいずれかと相関することができる。
【００２３】
本発明の１つの実施形態では、薬剤化合物を同定するための方法が提供され、患者の疾病形質と関連される標的分子のプロファイルを同定し、候補化合物を患者へ投与し、プロファイルの変化をモニターすることを含む。もう１つの実施形態では、モニターされたプロファイルは、１人の健常な患者または健常な患者集団のプロファイルと比較され、健常な患者（単数または複数）の標的分子のプロファイルと実質的に同様のプロファイルを生成する化合物（慣用的な統計試験に基づく）が薬剤として同定される。更なる実施形態では、プロファイリング工程および薬剤同定工程は、標的分子への結合時にその特性が変化する少なくとも１つのセンサー分子を用いて実行される。
【００２４】
更なる実施形態では、薬剤化合物を同定するための方法は、それぞれが経路に属する複数の経路標的分子を同定し、疾病形質を有する患者の経路標的分子のレベル、化学構造、および／または活性をモニターし、候補化合物を患者へ投与し、経路標的分子のレベル、化学構造、および／または活性の変化をモニターすることを含む。別の実施形態では、モニターされる経路標的分子のレベル、化学構造、および／または活性は、野生型の患者（単数または複数）の経路標的分子のレベルおよび活性と比較される。更なる実施形態では、複数の経路標的分子のプロファイリングと候補薬剤の同定はどちらも、経路標的分子への結合時にその特性が変化する少なくとも１つのセンサー分子を用いて実行される。この態様に従う特性には、例えば、光学特性、配列の変化、化学構造、触媒活性、または分子量が含まれる。好ましい実施形態では、センサー分子は標的活性化核酸センサー分子である。
【００２５】
１つの実施形態では、治療される患者からのサンプルはインビトロで試験されるが、サンプルはエキソビボまたはインビボで試験されてもよい。多数の標的分子を同時にモニターすることができるので、該方法は、多数の薬剤標的に対する化合物の影響を同時に評価する手段を提供し、特定の形質（例えば、疾病または遺伝子改変）に関連する最も敏感な薬剤標的の同定を可能にする。
【００２６】
他に特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術において当業者に一般的に理解されているものと同一の意味を有する。本発明の実施および試験において本明細書に記載されるものと同様または等価な方法および材料を使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として本明細書中で援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は単なる例証であって、限定されることを意図しない。
【００２７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、標的分子の結合に応答してそのコンフォメーションおよび／または活性を変化させるアロステリック核酸センサー分子を提供する。このセンサー分子は、標的活性化部位と、少なくとも１つのシグナル伝達部分へ結合可能なヌクレオチドとを含む。この核酸センサー分子を第１および第２のシグナル伝達部分で標識すると、第１および第２のシグナル伝達部分の近接の変化により、標的分子の結合に応答してその光学特性を変化することができる光シグナル伝達ユニットが作製される。１つの実施形態では、複数の核酸センサー分子は、溶液中か、基板上に固定化されるかのどちらかで提供されて、標的活性化バイオセンサーが作製される。更なる実施形態では、光シグナル検出器と光通信する少なくとも１つのバイオセンサーを含む診断システムが提供される。また、診断システムの使用方法も、該方法を実行するためのキットと同様に提供される。
【００２９】
本発明の主題をより明確かつ簡潔に説明および指摘するために、次の定義は、以下に記載される説明および併記の特許請求の範囲で使用される特定の用語に対して提供される。
【００３０】
本明細書の定義では、「オリゴヌクレオチド」は「核酸」という用語と交換可能に使用され、一本鎖または二本鎖のいずれかの型の、２つ以上のヌクレオチドのＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含む。「修飾オリゴヌクレオチド」には、改変されたヌクレオチド間連結（単数または複数）、改変糖質（単数または複数）、改変塩基（単数または複数）またはそれらの組み合わせのいずれかを有する、少なくとも１つの残基が含まれる。
【００３１】
本明細書中での定義では、「標的分子」は検出すべき任意の分子である。「標的分子」という用語は、アプタマーがそのために存在するかまたはそのために発生され得て、天然に存在するかまたは人工的に作製され得る任意の分子のことを示す。
【００３２】
本明細書中での定義では、「特徴的標的分子」は、その発現が個体の形質と相関可能な標的分子である。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「診断特徴的標的分子」は、それ自体で、あるいは他の診断特徴的標的分子と組み合わせて、その発現が、その形質の診断に役立つ標的分子である。
【００３４】
本明細書中での使用では、「経路標的分子」は同じ経路に含まれる標的分子であり、その蓄積および／または活性は他の経路標的分子に依存する。あるいは、その蓄積および／または活性は他の経路標的分子の蓄積および／または活性に影響を与える。
【００３５】
本明細書中での使用では、「特徴的経路標的分子」は、その発現／活性および／または構造特性が特定の形質の診断に役立つ複数の標的分子のことを示す。
【００３６】
本明細書中での使用では、「ＤＮＡまたはＲＮＡへ天然に結合する」分子は、天然に発見される生物体の細胞内に見られるものである。
【００３７】
本明細書中での定義では、「標的活性化部位」は、標的分子が特異的に結合する配列の三次元構造部分である。
【００３８】
本明細書中での使用では、「ランダム配列」または「ランダム化配列」は、完全または部分的にランダムな配列の１つまたは複数の領域を有する核酸のセグメントである。完全にランダムな配列は、各塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ）が配列内の各位置に存在している確率がほぼ等しい配列である。部分的にランダムな配列では、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ塩基が各位置に存在する可能性が２５％であるが、これらは等しい確率で存在しない。
【００３９】
本明細書中での定義では、「固定領域」は選択された配列または既知の配列である。
【００４０】
本明細書中での定義では、「増幅」は、分子または分子の種類のコピーの量または数を増大させる任意のプロセスまたはプロセス工程の組み合わせを意味する。
【００４１】
本明細書中での定義では、「核酸センサー前駆体分子」は、標的活性化部位と、化学反応を触媒する触媒部位とを含む配列の少なくとも一部を含む核酸分子であり、この触媒部位は標的活性化部位への標的分子の結合によって活性化することができる。
【００４２】
本明細書中での定義では、「核酸センサー分子」は、光シグナル発生ユニットが付加された、あるいは挿入された核酸センサー前駆体分子である。
【００４３】
本明細書中での定義では、「光シグナル発生ユニット」は、核酸センサー分子のコンフォメーションの変化に応答して光学特性を変化させる１つまたは複数の配列である。
【００４４】
本明細書中での定義では、「標的分子を認識する」核酸センサー前駆体分子または核酸センサー分子は、サンプル中の標的でない物質へ結合するよりも親和性の度合いが遥かに高い標的分子を認識する核酸分子である。核酸センサー前駆体分子または核酸センサー分子間の認識事象は、得られたアロステリック調節が発生している時間中永続的である必要はない。したがって、認識事象は、核酸前駆体分子または核酸センサー分子のその後のアロステリック調節（例えば、コンフォメーション変化）に関して一時的でよい。
【００４５】
幾つかの実施形態では、核酸センサー分子は、標的分子へ結合、例えば特異的に結合することができる。ここでの定義では、「標的分子へ特異的に結合する」は、サンプル中の標的でない物質へ結合するよりも親和性が遥かに高い標的分子へ結合する核酸分子である。核酸センサー前駆体分子のその標的分子に対するＫｄは、サンプル中の非標的分子に対してよりも、少なくとも約５０倍大きい。
【００４６】
本明細書中での使用では、「プロファイリング核酸センサー分子」は、診断標的分子により活性化可能な核酸センサー分子である。
【００４７】
本明細書中での定義では、「経路核酸センサー標的分子」は、経路標的分子により活性化可能な核酸センサー分子である。
【００４８】
本明細書中での定義では、「バイオセンサー」は、複数の核酸センサー分子を含む。
【００４９】
本明細書中での定義では、「プロファイリングバイオセンサー」は、複数の異なるプロファイル標的分子の発現を同時にモニターまたはプロファイルするために使用することができる複数のプロファイリング核酸センサー分子を含む。
【００５０】
本明細書中での定義では、「経路プロファイリングバイオセンサー」は、複数の異なる経路標的分子の発現を同時にモニターするために使用することができる複数の経路１０核酸センサー分子を含む。
【００５１】
本明細書中での定義では、「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体基板上に複数の核酸センサー分子を含むバイオセンサーのことを示す。
【００５２】
本明細書中での定義では、「基質」は、剛性、可撓性、固体、多孔性、ゲルベース、または任意の他の材料または組成物のいずれかの任意の物理的支持表面をいう。
【００５３】
本明細書中での定義では、「連結」は、基質分子（そのうちの１つは、連結事象を担う触媒であってもよい）間の共有結合の形成である。
【００５４】
（１．標的特異性核酸センサー分子の作製）
標的分子感受性の触媒活性（例えば、連結または自己切断）を有する核酸センサー前駆体分子は、ランダム化オリゴヌクレオチドのプールから選択される。前駆体分子は、標的分子が特異的に結合する標的活性化部位と、触媒反応を媒介するための触媒部位とを有する。標的分子の標的活性化部位への結合は、触媒部位を活性化する、核酸センサー前駆体分子のコンフォメーションの変化および／または活性の変化を引き起こす。１つの実施形態では、少なくとも触媒部位の一部を修飾（例えば、除去）して、それを光シグナル発生ユニットへ結合させることによって、標的分子へ結合したときにその光学特性が変化する核酸センサー分子が作製される。１つの実施形態では、ランダム化オリゴヌクレオチドのプールは、リボザイムの触媒部位を含む。
【００５５】
（Ａ．核酸センサー前駆体分子の選択）
１つの実施形態では、ランダム化配列を含むオリゴヌクレオチド分子の不均一な集団は、標的分子の結合によって修飾（例えば、活性化）される触媒活性を有する核酸センサー前駆体分子を同定するためにスクリーニングされる。集団内の各オリゴヌクレオチドは、ランダム配列および少なくとも１つの固定配列をその５’および／または３’末端に含む。１つの実施形態では、固定配列は、触媒部位の少なくとも一部を含む。図１および図４に示される実施形態では、ランダム配列は、両末端で固定配列に隣接される。
【００５６】
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、約１５〜７０個（例えば、３０〜４０個）のヌクレオチド長であり、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。ランダムなオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技法を用いて、リン酸ジエステル連結のヌクレオチドから合成することができる（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、１９８６ａ、１９８６ｂが参照され、その全体は参照により本明細書中で援用される）。オリゴヌクレオチドは、トリエステル合成法（例えば、Ｓｏｏｄら、１９７７およびＨｉｒｏｓｅら、１９７８を参照）などの液相法を用いて合成することもできる。自動ＤＮＡ合成装置で実行される典型的な合成は、１０１５〜１０１７分子をもたらす。配列設計において十分に大きな領域のランダム配列は、各合成分子がおそらく独特の配列を表すであろうということを意味する。
【００５７】
ランダム化配列を合成するために、合成プロセス中の各ヌクレオチド添加工程で、４つ全てのヌクレオチドの混合物が添加され、ヌクレオチドのランダムな組み込みを可能にする。１つの実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含むが、他の実施形態では、ランダムオリゴヌクレオチドは、ランダムでない、あるいは部分的にランダムな一続きの配列を含むことができる。部分的にランダムな配列は、各添加工程において、４つのヌクレオチドを異なるモル比で添加することによって作製することができる。
【００５８】
ヌクレアーゼおよび加水分解に耐性のオリゴヌクレオチド集団を作製するために、修飾オリゴヌクレオチドを使用でき、これらには、１つまたは複数の置換ヌクレオチド間連結、改変糖質、改変塩基、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。１つの実施形態では、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（ホルムアセタール）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）（ここで、各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈもしくは置換または非置換アルキルである）で置換される、オリゴヌクレオチドが提供される。連結基は、−Ｏ−連結によって、あるいは−Ｎ−または−Ｓ−連結によって、隣接するヌクレオチドへ結合させることができる。オリゴヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。
【００５９】
更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ハロゲン、脂肪族基で置換された、あるいはエーテルまたはアミンとしての官能性が備えられた１つまたは複数の水酸基を含む修飾された糖質基を含む。１つの実施形態では、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル、またはハロ基のいずれかで置換される。２’−修飾糖質の合成法は、Ｓｐｒｏａｔら、１９９１、Ｃｏｔｔｅｎら、１９９１、およびＨｏｂｂｓら、１９７３に記載され、その全体は参照により本明細書中で援用される。２’−フルオロリボヌクレオチドのオリゴマー分子の使用は、標的分子に対する核酸センサー分子の感度を、置換されていないリボまたはデオキシリボオリゴヌクレオチドを用いて発生されるものよりも１０倍〜１００倍増大することができ（Ｐａｇｒａｔｉｓら、１９９７）、標的分子との付加的な結合相互作用が提供され、核酸センサー分子の二次構造（単数または複数）の安定性が増大される（Ｋｒａｕｓら、１９９８、Ｐｉｅｋｅｎら、１９９１、Ｌｉｎら、１９９４、Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、１９９５、Ｐａｇｒａｔｉｓら、１９９７）。
【００６０】
図１および図４に示される実施形態では、オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、オリゴヌクレオチド集団の全ての分子によって共有される配列を含む少なくとも１つの固定配列によって隣接される。固定配列には、ＰＣＲプライマーのためのハイブリッド形成部位などの配列、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、およびＳＰ６など）のためのプロモータ配列、制限部位、またはポリＡまたはポリＴ路（ｔｒａｃｔ）などのホモポリマー配列、触媒コア（以下にさらに記載される）、アフィニティカラムへの選択的結合のための部位、および所定のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にするための他の配列が含まれる。１つの実施形態では、固定配列は約５０個のヌクレオチド長である。
【００６１】
好ましい実施形態では、固定配列は、化学反応を触媒することができるオリゴヌクレオチド分子（例えば、リボザイム）の触媒部位の少なくとも一部を含む。触媒部位は当該技術分野で周知であり、例えば、リガーゼ部位（図２を参照）、グループＩまたはグループＩＩイントロンの触媒部位（例えば、米国特許第５，７８０，２７２号を参照）、ハンマーヘッド型リボザイム（例えば、米国特許第５，７６７，２６３号および同第５，７００，９２３号、ならびに本明細書の図３を参照）またはヘアピン型リボザイム（例えば、米国特許第５，６３１，３５９号を参照）の触媒コアが含まれる。他の触媒部位は、米国特許第６，０６３，５６６号、Ｋｏｉｚｕｍｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３９：２８５−２８８（１９８８）、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９（１９８８）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４９２９−４９３３（１９８９）、ｉ．Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：５９６−６００（１９８７）、ならびにＦｅｄｏｒおよびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１６６８−１６７２（１９９０）に開示される。
【００６２】
核酸センサー前駆体は、一般的に、５〜２０サイクルの手順で選択される。１つの実施形態では、不均一性は最初の選択段階でのみ導入され、反復プロセスの間には発生しない。図１は、オリゴヌクレオチド集団が、標的分子活性化可能なリガーゼ活性を含む核酸センサー前駆体分子についてスクリーニングされる概略図を示す。
【００６３】
この実施形態では、連結反応には、オリゴヌクレオチド基質がリン酸ジエステル連結の形成によってセンサー前駆体の５’末端へ共有結合することが包含される。他の連結化学は、センサー前駆体の選択のための基礎を成すことができる（例えば、３’末端へのオリゴヌクレオチド連結、アルキル化（Ｗｉｌｓｏｎ  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ）、ペプチド結合形成（Ｚｈａｎｇ  ＆  Ｃｚｅｃｈ）、アルケンおよびジエンを結合させるためのディールズ−アルダー反応（Ｓｅｅｌｉｇ  ＆  Ｊａｓｃｈｋｅ）など）。幾つかの化学では、連結反応において反応物を構成する化学的官能基は核酸内に天然には出現しない場合がある。したがって、連結反応物の１つがプールの各メンバーへ共有結合されるＲＮＡプールを合成することが必要である場合がある（例えば、ＲＮＡの５’末端へ第一アミンを結合させて、ペプチド結合形成の選択を可能にする）。
【００６４】
この実施形態では、オリゴヌクレオチド集団は、始めに、標的分子結合の非存在下でもリガーゼ活性を有する分子を排除するために、ネガティブ選択手順でスクリーニングされる。５’および３’固定配列を含む（「５’−固定：ランダム：３’−固定」）オリゴヌクレオチド溶液（例えば、１００ｐＭ）は、３’固定配列の少なくとも一部へ結合する３’−プライマー配列（「３’プライム」）（例えば、２００ｐＭ）を用いて変性される。１つの実施形態では、５’−固定：ランダム：３’−固定配列は、５’−ＧＧＡＣＵＵＣＧＧＵＣＣＡＧＵＧＣＵＣＧＵＧＣＡＣＵＡＧＧＣＣＧＵＵＣＧＡＣＣ−Ｎ３０−５０ＣＵＵＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＵＵＡＧＧＵＧＣＣＵＣＧＵＧＡＵＧＵＣＣＡＧＵＣＧＣ−３’（配列番号１）であり、ここで、Ｎは、３０〜５０個のヌクレオチドを有するランダム配列を表し、使用される３’プライマー配列は５’−ＧＣＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＡＧ−３’（配列番号２）である。
【００６５】
連結緩衝液（例えば、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．４、６００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ−４０、６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）およびタグ付き基質配列（「タグ−基質」）（例えば、Ｔａｇ−ＵＧＣＣＡＣＵ）が添加され、混合物は標的分子の非存在下、２５℃で約１６〜約２４時間インキュベートされる（工程１）。範囲内に包含されるタグには、例えば、放射性標識、蛍光標識、チオリン酸塩などの化学反応種が含まれ、結合対の第１のメンバーは第１および第２の結合メンバーを含み、各メンバーは他のメンバーへ結合可能である（例えば、ビオチン、抗体により認識される抗原、またはタグ核酸配列）。反応はＥＤＴＡの添加により停止される。あるいは、反応は、基質の除去または変性剤（例えば、尿素、ホルムアミド）の添加によって、終結させることができる。
【００６６】
連結された分子は選択可能な分子のプールから除去され（工程２）、連結された分子が実質的に存在しない（溶液中のタグ配列の不在によって測定される）オリゴヌクレオチドの集団が作製される。図１に示される実施形態では、タグは結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン）であり、連結分子（「ビオチン−基質：５’−固定：ランダム：３’−固定」）は、結合対の第２のメンバーが結合される（「５」）（例えば、ストレプトアビジン）固体支持体へサンプルを接触させることによって、溶液から物理的に除去される。収集された溶離液は、非連結分子（５’−固定：ランダム：３’−固定）が濃縮されたオリゴヌクレオチドの集団を含む。標的に非感受性のリガーゼ活性を有する分子がオリゴヌクレオチド集団に実質的に存在しなくなるまで、この工程が何度も繰り返し可能であることは、当業者には容易に明白であるに違いない。
【００６７】
この工程は、構成的に活性な分子の能力が次の選択サイクルまで持続されることの抑制を可能にする。連結分子および非連結分子の物理的な分離は、これを構成することができる１つのメカニズムである。あるいは、ネガティブ選択工程は、次のポジティブ選択工程の間保持されるかまたは次の選択サイクルで増幅されるか、そのどちらかの能力を阻止する形へ、触媒が活性分子を転換するように達成することができる。例えば、ネガティブ選択工程において連結に使用される基質は、捕獲タグなしに合成することができる。標的非依存性リガーゼは、ネガティブ選択工程中にタグなし基質へ共有結合で自己結合し、その後、次のポジティブ選択工程中に提供されるタグ付き型の基質を受け取ることができない。もう１つの実施形態では、ネガティブ選択工程中に提供されるオリゴヌクレオチド基質は、ポジティブ選択工程中に提供されるものとは異なる配列を有する。ポジティブ選択基質に相補的なプライマーを使用してＰＣＲが実行される場合、標的活性化リガーゼだけが増幅することができるであろう。
【００６８】
ポジティブ選択段階が続いて起こる。この段階では、より多くの３’プライマーおよびタグ付き基質が、ネガティブ選択工程から得られたプールへ添加される。次に標的分子が添加されて、反応溶液が形成され、反応溶液は、２５℃で約２時間インキュベートされる（工程３）。範囲に包含される標的分子には、例えば、タンパク質またはその一部分（例えば、レセプター、抗原、抗体、酵素、成長因子）、ペプチド、酵素阻害剤、ホルモン、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、脂質、リン脂質、代謝産物、金属イオン、補因子、阻害剤、薬剤、色素、ビタミン、核酸、膜構造、レセプター、細胞小器官、およびウィルスが含まれる。標的分子は溶液中で遊離していても、大きい細胞構造の一部であってもよい（例えば、細胞膜に包埋されたレセプターなど）。１つの実施形態では、標的分子は天然には核酸と結合しない分子である。
【００６９】
１つの実施形態では、同定された生物活性（例えば、既知の酵素活性、レセプター活性、または既知の構造的役割）を有する分子を含む標的分子によって活性化される核酸センサー分子が選択される。しかしながら、もう１つの実施形態では、少なくとも１つの標的分子の生物活性は未知である（例えば、標的分子は、ＥＳＴ配列のオープンリーディングフレームから発現されたポリペプチドであるか、予測されるオープンリーディングフレームに基づいて合成された、特徴付けがされていないポリペプチドであるか、あるいはその機能が知られていない精製または半精製タンパク質である）。
【００７０】
１つの実施形態では、標的分子は核酸と天然には結合しないが、もう１つの実施形態では、標的分子は、配列特異性または非特異性であるように核酸センサー分子へ結合する。更なる実施形態では、複数の標的分子が核酸センサー分子へ結合する。複数の標的分子へ特異的に応答する（すなわち、複数の中の単一の標的によって活性化されるのではない）センサー前駆体の選択は、標的分子のサブセットが提供されるネガティブ選択工程を少なくとも２つ含むことによって達成することができる。
【００７１】
また更なる実施形態では、修飾標的分子へ特異的に結合するが、非修飾標的分子へは結合しない核酸センサー前駆体分子が選択される。標的とされる修飾には、例えば、リン酸化、リボシル化、メチル化（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｎ、５、または０−に向けられた）、プレニル化（例えば、ファルネシル、ゲラニルゲラニルなど）、アセチル化、アシル化、タンパク質内の対立形質変動（例えば、タンパク質中の単一のアミノ酸変化）、およびタンパク質中の切断部位などのタンパク質の翻訳後修飾が含まれる。別の実施形態では、化学合成経路の中間体は、出発物質および最終産物と同様に、標的とされ得る。また更なる実施形態では、立体化学的に異なる種類の分子が標的とされ得る。
【００７２】
反応溶液は、溶液からタグの付いていない分子（５’−固定：ランダム：３’−固定）を除去することによって、連結分子（ビオチン−基質：５’−固定：ランダム：３’−固定）が濃縮される。例えば、１つの実施形態では、タグ付き基質はビオチンタグを含み、連結された分子は、ストレプトアビジン（Ｓ）が結合された固体支持体上に反応溶液を通過させることによって単離される（工程４）。結合されない非連結分子（５’−固定：ランダム：３’−固定）を含有する溶離液は廃棄され、結合した連結分子（ビオチン−基質：５’−固定：ランダム：３’−固定）は核酸センサー前駆体分子であると同定され、触媒活性分子の捕獲を可能にする結合対の相互作用を破壊することによって、支持体から遊離される。例えば、１０ｍＭのビオチンの存在下で９５℃へ加熱すると、固定化ストレプトアビジン支持体からのビオチンタグ付き触媒の遊離が可能になる。別の実施形態では、捕獲された触媒は固体支持体へ結合されたままであり、固定化されたまま直接増幅される（以下に記載される）。もう１つの実施形態では、捕獲された触媒は固体支持体へ結合されたままであり、固定化されたまま直接増幅される（以下に記載される）。多数のポジティブ選択段階を実行することができる（工程３および４）。１つの実施形態では、各ポジティブ選択段階のストリンジェンシーはインキュベーション時間を半分に短縮することによって増大される。
【００７３】
プールから不活性種を物理的に除去することは、選択プロセスにストリンジェンシーを付加する。しかしながら、連結反応が活性センサー前駆体の増幅の可能性を増大させる限りは、この工程は省略することができる。図示される実施形態では、例えば、オリゴヌクレオチドの活性種への連結は、元の基質に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて次のＰＣＲ増幅を可能にするプライマー結合部位を提供する。非連結種は、共有結合で束縛されたプライマー結合部位の非存在下では増幅する可能性が低いと思われるので、必ずしも、他の種から物理的に分離される必要なない。
【００７４】
選択された核酸センサー前駆体分子は、基質配列へ特異的に結合する基質プライマー（「Ｓプライマー」）（例えば、５’−ＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＡＣＴ−３’（配列番号３））を用いて増幅される（あるいは、ＲＮＡ分子の場合には、まず逆転写されてから増幅される）（工程５）。１つの実施形態では、増幅された分子は、５’固定および基質配列からＴ７プロモータを再生するネステッドＰＣＲプライマー（「Ｔ７プライマー」）によりさらに増幅される（工程６）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写（工程７）に続いて、核酸センサー前駆体配列プールは、工程３〜７を繰り返すことによって、残存している任意の非連結配列（５’−固定：ランダム：３’−固定）を除去するために、さらに選択および増幅され得る。ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲに加えて、多数の増幅方法（酵素的、化学的、あるいは例えばクローニングなどの複製ベース）を単独で、あるいは組み合わせて使用することができることは、当業者には明らかなはずである。典型的な増幅方法は、Ｓａｉｋｉら、１９８５、Ｓａｉｋｉら、１９８８、Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｊｏｙｃｅ、１９８９およびＧｕａｔｅｌｌｉら、１９９０に開示されている。
【００７５】
３’プライマー（３’−プライム）（図１の工程３参照）は連結混合物中に含有されるので、選択された核酸センサー前駆体分子は活性化のためにこの配列を要求するかもしれない。これが望ましくない場合には、３’プライマーは混合物から取り除かれてもよい。あるいは、最終の核酸センサー分子は、核酸センサー分子の３’末端へ短い配列ループまたは化学リンカーを介して３’プライマーを結合させることによって修飾でき、これにより、添加されたプライマーに対する要求が排除され、３’プライマー配列は分子を自己プライミングすることができるようになる。
【００７６】
もう１つの実施形態では、図４に示されるように、オリゴヌクレオチド集団は、標的分子活性化可能な自己切断活性を含む核酸センサー前駆体分子についてスクリーニングされる。この実施形態では、オリゴヌクレオチド分子の出発集団は、５’および３’固定領域（「５’−固定および３’固定Ａ−３’固定Ｂ」）を含み、少なくとも１つの固定領域、この例では３’固定領域は、自己切断部位（３’固定Ａ−３’固定Ｂ間の接合部）を有するリボザイム触媒コアを含む。１つの実施形態では、５’−固定：ランダム：３’固定Ａ−３’固定Ｂ分子は、ＧＧＧＣＧＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＣＣＵＧＧ−Ｎ２０−５０−ＵＵＡＧＡＣＧＡＡＡＣＧＧＵＧＡＡＡＧＣＣＧＵＡＧＧＵＵＧＣＣＣ（配列番号４）であり、ここでＮ２０−５０は、２０〜５０個のヌクレオチドのランダム配列である。
【００７７】
固定５’および３’配列で隣接されたランダムオリゴヌクレオチド（５’−固定：ランダム：３’−固定Ａ：３’固定Ｂ）を含むオリゴヌクレオチド分子の集団は、標的分子の非存在下でも自己切断するオリゴヌクレオチド（すなわち、５’−固定：ランダム：３’−固定−Ａ分子）を除去するために、ネガティブ選択される。オリゴヌクレオチドプールは、反応緩衝液（例えば、５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中２５℃で５時間インキュベートされ、１時間おきに６０℃で１分間のインキュベーションによって中断される（工程１）。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチド集団の非切断部分（５’−固定および３’固定Ａ−３’−固定Ｂ分子を含有する）は、変性１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製される（工程２）。標的分子依存性の切断活性は、次に、標的分子を存在させて、反応緩衝液の存在下、２３℃で約３０秒〜約５分間のインキュベーションによって選択される（工程３）。切断された分子（５’−固定：ランダム：３’固定−Ａ分子）は核酸センサー前駆体分子であると同定され、ＰＡＧＥによって精製される（工程４）。
【００７８】
切断分子の増幅は、５’−固定および３’−固定Ａ配列へ特異的に１０結合するプライマーを用いて実行され、Ｔ７プロモータおよび３’−固定Ｂ部位が再生され（工程５）、Ｔ７ポリメラーゼを用いるＲＮＡ転写によって分子はさらに増幅される（工程６）。１つの実施形態では、プロセス（工程１〜６）は、核酸センサー前駆体集団が約１〜５個の特有の配列へ減少されるまで繰り返される。
【００７９】
非切断ＲＮＡから切断ＲＮＡを分離するための代替方法を使用することができる。３’−固定Ｂ配列へタグを結合でき、分離は、工程４でタグ付き配列をタグなし配列から分離することに基づくことができる。電気泳動の代わりに、分子をサイズに基づいて分離するクロマトグラフィ手順（例えば、ゲルろ過）を使用することができる。ＲＮＡプールの各分子の一端を固体支持体へ結合させ、切断の結果支持体から遊離されることで、触媒活性分子を単離することができる。代替の触媒コアを使用してもよい。これらの代替触媒コアおよびこれらのコアを使用する方法も本発明の範囲内に包含される。
【００８０】
切断活性およびリガーゼ活性の両方を単一分子中で組み合わせる核酸センサー前駆体は、リガーゼおよびエンドヌクレアーゼについて上記で独立的に概説した選択戦略の１つまたは両方を組み合わせて使用することによって単離することができる。例えば、ヘアピン型リボザイムは、切断を触媒した後、第２のオリゴヌクレオチド基質と連結することが知られている（Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒｒａｎｚら）。５’−ＧＧＡＧＴＴＡＣＣＴＡＡＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＮｇａａｇｔｃａａｃｃａｇＮｇａａａｃＮＣＡＣＧＧＡＧＡＣＧＴＧＮＮａＮａｔｔａＮｃｔｇｇｔ（Ｎ２０−Ｎ５０）ＧＧＡＣＣＴＡＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＧＴＴＴＧＡＴＧＣＡＴＡＣＣＧＡＧＴＡＡＧＴＧ−３’の型の配列（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドを示し、小文字はドープされたヌクレオチドを示し、大文字は固定されたヌクレオチドを示す）で、前述のように作製されたランダム化配列ＲＮＡのプールから、ヘアピン活性に基づく標的活性化センサー前駆体を単離することができる。ヘアピンベースのセンサー前駆体は、ハンマーヘッドベースのセンサー前駆体の単離と同じようにして（例えば、エフェクタ依存性の電気泳動移動度の増大、あるいはエフェクタ依存性の固体支持体からの遊離）、５’−ＧＵＣＣＵＧＵＵＵＧＡＵＧＣＡＵＡＣＣＧＡＧＵＡＡＧＵＧ−３’断片のエフェクタ独立性の遊離に基づいて単離することができる。あるいは、Ｂｅｒｚａｌ−Ｈｅｒａｎｚらによるエフェクタ独立方法に記載されるように、センサー前駆体は、切断時に遊離される３’−配列を別の配列と置換することができることに基づいて選択することができる。このスキームでは、リボザイムの元の３’−末端は最初の切断事象で遊離され、外因的に提供されたフリーの５’−ヒドロキシルを有するオリゴヌクレオチド基質が連結し直される。新たに結合した３’−末端は、触媒活性分子の優先的増幅の基礎を形成することができるプライマー結合部位を提供する。提供されたエフェクタにより活性化されない構成的に活性な分子は、（１）標的が存在しない場合に電気泳動移動度の増大を示す（外因的オリゴヌクレオチド基質の非存在下）分子を分離除去するか、あるいは（２）外因的オリゴヌクレオチド基質を獲得する分子を捕獲する（例えば、３’−ビオチン化基質およびアビジンカラムに捕獲された再連結種を用いる）ことによって、プールから除去することができる。
【００８１】
ヘアピン型リボザイムと同様に、グループＩイントロン自己スプライシングリボザイムは、切断および連結活性を組み合わせて、隣接するエキソンの連結を促進する。グループＩイントロン触媒スプライシングの第１の工程では、外因的なグアノシン補因子は、５’−スプライス部位を攻撃する。イントロン媒介によるリン酸ジエステル交換反応の結果、グアノシン補因子がリボザイムへ結合するのと同時に、５’−エキソンは遊離される。第２の化学工程では、５’−エキソン末端の３’−ヒドロキシルはイントロンと３’−エキソンの間のリン酸ジエステル連結を攻撃し、２つのエキソンの連結およびイントロンの遊離がもたらされる。グループＩイントロン由来リボザイムは、順方向または逆方向のどちらかで作用する化学工程のどちらか１つまたは両方に基づいて分子を選択することによって、変性配列プールから単離することができる。エフェクタの非存在下では触媒作用を促進できないが、その存在下では触媒活性である分子を特異的に濃縮することによって、センサー前駆体としての潜在的な実用性を有するエフェクタ依存性リボザイムを単離することができる。選択スキームの特定の実施例は以下である。それぞれの場合において、代表的なグループＩイントロン（例えば、テトラヒメナサーモフィラのｐｒｅ−ｒＲＮＡイントロンまたはファージＴ４ｔｄイントロン）と配列が関係するＲＮＡのプールは、選択の出発点としての機能を果たす。ランダム配列領域は、適切な折りたたみ及び活性に重要であることが知られている部位で、イントロン内に包埋される（例えば、テトラヒメナイントロンのＰ５ａｂｃドメインを置換する、Ｗｉｌｌｉａｍｓら）。
【００８２】
（第１の工程、順方向）
イントロンは、短い５’−エキソンにより合成される。ネガティブ選択工程において、グアノシン補因子が提供され、構成的に活性な分子はスプライシングを受ける。ポジティブ選択工程では、センサー標的が、チオ−ＧＭＰとともに提供される。標的に応答するリボザイムは活性化スプライシングを受け、その結果、その５’−末端に独自のチオリン酸塩を獲得する。チオ−タグ付きリボザイムは、水銀ゲルまたは活性化チオールアガロースカラム上でのその特異的な保持によって、タグなしリボザイムから分離することができる。
【００８３】
（第１の工程、逆方向）
方法は、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋに記載されたように実行される。イントロンは、５’−エキソンを使用せずに、５’−グアノシンを用いて合成される。５’−内部ガイド配列に相補的なオリゴヌクレオチド基質はネガティブ選択工程の間に提供され、構成的に活性な分子はその５’−末端へ基質を連結させ、元の末端グアノシンを遊離させる。異なる５’−配列を有する第２のオリゴヌクレオチド基質は、ポジティブ選択工程で標的とともに提供される。標的によって特異的に活性化されたリボザイムは、第２のオリゴヌクレオチド基質をその５’−末端へ連結させる。第２の基質に相当するプライマーを用いるＰＣＲ増幅を実行して、標的センサー前駆体を優先的に増幅することができる。
【００８４】
（第２の工程、逆方向）
方法は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＆  Ｊｏｙｃｅに記載されたように実行される。イントロンは隣接エキソンを用いずに合成される。ネガティブ選択工程の間、プールＲＮＡは、触媒反応が進行することができるようにする条件下で、短いオリゴヌクレオチド基質とともにインキュベートされる。ポジティブ選択工程では、異なる３’−配列を有する第２のオリゴヌクレオチド基質がセンサー標的とともに提供される。標的依存性リボザイムは活性化され、第２の基質の３’−末端の連結を触媒する。第２の基質の３’−末端に相補的なプライマーを用いて実行される逆転写は、次の増幅のために、標的活性化リボザイムを特異的に選択する。
【００８５】
核酸センサー分子は、同定されるとすぐに、単離され、クローニングされ、配列決定され、および／または天然のまたは修飾されたヌクレオチドを用いて再合成されることができる。したがって、核酸センサー分子の合成中間体も、核酸センサー前駆体分子および核酸センサー分子を含む複製可能な配列（例えば、プラスミド）であるとして、範囲内に包含される。
【００８６】
（Ｂ．核酸センサー前駆体分子の核酸センサー分子への変換）
上記で同定された核酸センサー前駆体分子は、標的分子が特異的に結合する標的活性化部位と、触媒部位とを含む。概して、標的活性化部位は、標的分子が特異的に結合することができる（すなわち、標的分子および標的でない分子の両方を含む溶液中で標的分子へ優先的に結合する）三次元構造を形成するために必要な最小限の数のヌクレオチドによって定義される。１つの実施形態では、結合の特異性は、Ｋｄに関して定義することができる。Ｋｄ値は、周知の方法によって直接決定することができる（例えば、Ｃａｃｅｃｉら、１９８４を参照）。あるいは、標的分子へ結合することが分かっているコントロール基質に関して、標的分子の競合結合アッセイを実行することができる。５０％の阻害が生じる濃度の値（Ｋｄ）は、理想条件下ではＫｄに等しく、Ｋｄ値の最大値を設定する（例えば、米国特許第５，７５６，２９１号を参照）。
【００８７】
１つの実施形態では、標的分子に関する核酸センサー前駆体分子のＫｊは、サンプル中の非標的物質のＫｊよりも５０倍、例えば５０〜５００倍、さらに５００〜１，０００，０００倍も小さい。
【００８８】
上記の例では、触媒部位は既知の配列（リガーゼ部位またはハンマーヘッド触媒コア）であり、５’および／または３’のいずれかの固定領域（他の部分は無作為な配列によって供給される）の少なくとも一部であるか、あるいは完全な触媒部位である。しかしながら、他の実施形態では、触媒部位は、オリゴヌクレオチドプール内のオリゴヌクレオチドの標的結合活性とともに選択され得る。
【００８９】
１つの実施形態では、同定された核酸センサー前駆体分子を核酸センサー分子へ変換するために、触媒部位の少なくとも一部が修飾（例えば、除去）される。１つの実施形態では、この除去は、結合型または非結合型における核酸センサー分子の高次構造の安定性を高める。図６Ａおよび図６Ｂに示される１つの実施形態では、図５Ａおよび図５Ｂに示される核酸前駆体分子の触媒ドメイン全体の除去は、核酸センサー分子の非結合型を安定化することが示されている。別の実施形態では、不対グアノシン（Ｇ）残基の固有の蛍光−消光特性を考慮して、除去を選択し得る（Ｗａｌｔｅｒ，Ｎ．Ｇ．およびＢｕｒｋｅ，Ｊ．Ｍ．「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｈａｉｒｐｉｎ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」，ＲＮＡ  ３：３９２（１９９７））。
【００９０】
別の実施形態では、以前に同定された核酸センサー前駆体分子由来のリガンド結合ドメイン配列は、標的結合時に高次構造を変化させる（例えば、二重鎖ヘアピンからＧ−四重鎖へ）オリゴヌクレオチド配列に組み込まれる。このタイプの核酸センサー分子は、アロステリックリボザイムから獲得され得るか（例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、Ｌ１リガーゼ、またはグループ１イントロンリボザイムなどから獲得され得る核酸センサー分子）、あるいは、アプタマービーコン（ｂｅａｃｏｎ）またはシグナル伝達アプタマーから獲得され得、そしてこれら全ては、分子認識を検出可能なシグナルへ変換する。例えば、３’、５’−環状ヌクレオチド一リン酸（ｃＮＭＰ）依存性ハンマーヘッドリボザイムは、ｃＮＭＰへ特異的に結合する（ＲＮＡ）核酸センサー分子に再設計された（Ｇａｒｒｅｔｔａら，２００１）。ハンマーヘッドリボザイムの触媒コアは除去され、そして５塩基二重鎖形成配列で置換された。次いで、これらの再設計されたＲＮＡセンサー分子のｃ−ＮＭＰへの結合は、実験により確認された。二重鎖の長さを調整することによって、これらは、顕著な高次構造変化を起こすよう再設計され得る。高次構造変化は、ＦＲＥＴによる検出、または単なる蛍光強度の変化（分子ビーコンの場合のように）へ結び付けられ得る。例えば、二重鎖の各末端に適切なプローブを付加することによって、標的結合による二重鎖の安定化は、蛍光変化によりモニターされ得る。
【００９１】
特定の実施形態では、核酸センサー分子は、図９に示されるように、次の配列：５’−ＣＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号５）を有する一本鎖ＤＮＡから作製される（Ｈａｍａｇｕｃｈｉら、２００１を参照のこと）。さらに、フルオレセインベースの蛍光標識（ＦＡＭ）は、合成時またはその後に５’末端へ結合される。同様に、消光部分（ＤＡＢＣＹＬ）は、核酸センサー分子の３’末端へ結合される。核酸センサー分子の最終構造は、５’−ＦＡＭ−ＣＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−ＤＡＢＣＹＬ−３’（配列番号６）である。この特定の配列は、Ｇ−四重鎖の形成によってトロンンビンへ特異的に結合するように設計された。非結合状態では（図９Ａを参照のこと）、核酸センサー分子は、分子の３’および５’末端においてヌクレオチドの相補性し、ステム（ｓｔｅｍ）に沿って二重鎖が形成されたステム−ループ高次構造を形成する。標的（ここでは、トロンビン）の存在下では、核酸センサー分子はリガンド−結合Ｇ−四重鎖構造を形成する（図９Ｂを参照）。この高次構造の再編成は、５’末端へ結合したフルオロフォアと３’末端へ結合したクエンチャとの間の距離の変化をもたらす結果となる。クエンチャがフルオロフォアのすぐ近くから空間的に除かれると、フルオロフォアから検出される蛍光発光強度は急激に増大する。
【００９２】
上記の実験例は溶液中で実行され、キュベットベースの蛍光スペクトロメータを利用するが、代替の実施形態では、方法は、高処理量の液相測定のためのマイクロウェルマルチプレートリーダー（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ  ＦｕｓｉｏｎまたはＴｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ）中で実行される。
【００９３】
別の実施形態では、核酸センサー分子は、分子の一端に結合されたリンカーによって表面へ結合される。図１０Ａに示される特定の実施形態では、以前に記載された（Ｈａｍａｇｕｃｈｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９４，１２６（２００１）を参照のこと）トロンビン結合センサー分子は５’修飾され、末端がアミノ基の１２−炭素原子リンカー、ならびに、３’−結合フルオレセインベースのフルオロフォア（ＦＡＭ）：５’−ＮＨ２−Ｃ１２−ＤＡＢＣＹＬ−ＣＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−ＦＡＭ−３’（配列番号７）を含む。この遊離アミン基は、シッフ塩基形成および還元のための標準プロトコルによって、アルデヒド誘導体化ガラス表面へセンサー分子が付着されるのを可能にする。核酸センサー分子は、アレイを形成するために異なる領域またはスポットにおいて結合され得るか、あるいは広範な領域を覆うように均一に分配され得る。標的（ここでは、トロンビン）が存在しない場合には、核酸センサー分子は、分子の３’および５’末端においてヌクレオチドの相補性に起因して、ステムに沿って二重鎖が形成されたステム−ループ高次構造を形成する。標的の存在下では、核酸センサー分子はリガンド−結合Ｇ−四重鎖構造を形成する。この高次構造の再編成は、５’末端へ結合したフルオロフォアと３’末端へ結合したクエンチャとの間の距離の変化をもたらす結果となる。クエンチャがフルオロフォアから離されると、フルオロフォアから検出される蛍光発光強度は急激に増大する。標的濃度により検出される蛍光強度の増大は、表面に導入されたサンプル溶液中に存在する標的の量を検出および定量するために使用され得る。サンプル溶液は、カバースリップ、マイクロウェル、インキュベーションチャンバシール、またはフローセルによって、センサー表面に側方向に拘束される。
【００９４】
１つの実施形態では、核酸センサー前駆体分子から触媒部位の少なくとも一部が除去された後、光シグナル伝達ユニットが核酸センサー分子へ付加されるか、あるいは核酸センサー分子内へ挿入されて、標的分子への結合に応答してその光学特性が変化可能なセンサー分子が生成される。１つの実施形態では、光シグナル伝達ユニットは、未だ露出されていない少なくとも５’または３’ヌクレオチドを露出させることによって付加される。分子の５’ヌクレオチドまたは５’末端付近のヌクレオチド（例えば、内部ヌクレオチド）は第１のシグナル伝達部分と結合可能であり、分子の３’ヌクレオチドまたは３’末端付近のヌクレオチドは第２のシグナル伝達部分と結合可能である。核酸センサー分子への標的の結合は、５’および３’ヌクレオチド（または末端付近のヌクレオチド）の近接を互いに対して変更し、第１および第２のシグナル伝達部分がそのそれぞれのヌクレオチドへ結合されると、近接のこの変化によって、核酸センサー分子の光学特性に標的感受性の変化がもたらされる。
【００９５】
したがって、核酸センサー分子の光学特性の変化の検出は、サンプル中の標的分子の存在および／または量と相関し得る。しかしながら、ある実施形態では、分子の触媒特性を保持することが望ましい。この実施形態では、第１および第２のシグナル伝達部分は、それぞれ、分子の５’末端または末端付近の配列および３’末端または末端付近の配列に結合される。シグナル伝達分子は、既に核酸センサー分子の一部であるヌクレオチドへ結合されてもよいし、核酸センサー分子内へ挿入されるヌクレオチドへ結合されてもよいし、あるいは合成されるときに核酸センサー分子へ付加されてもよい。シグナル伝達分子を結合させるための結合化学は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒ．Ｈａｕｇｈｌａｎｄを参照のこと）。適切な化学には、例えば、ピリミジン塩基の５位の誘導体化（例えば、５’−アミノアリル前駆体を用いて）、５’−末端の誘導体化（例えば、化学合成されたオリゴヌクレオチドの５’末端へ第１級アミンを付加するホスホロアミダイト）、または３’末端の誘導体化（例えば、３’−リボースを、その後ヒドラジド保持シグナル伝達分子と反応可能なジアルデヒドへ転換するためのＲＮＡの過ヨウ素酸処理）が含まれる。
【００９６】
別の実施形態では、単一のシグナル伝達部分は、核酸センサー分子へ付加されるか、あるいは核酸センサー分子内へ挿入される。この実施形態では、標的分子の結合の結果、核酸センサー分子の高次構造および物理的局面（例えば、分子体積、およびそれによる回転性拡散速度など）の両方に変化が起こる。標的結合時の核酸センサー分子の高次構造変化はシグナル伝達部分の化学的な環境を修飾し、核酸センサー分子の物理的局面の変化は、シグナル伝達部分の動力学的特性を変更する。どちらの場合にも、結果は、核酸センサー分子の光学特性における検出可能な変化である。
図９Ａおよび図９Ｂに示される実施形態では、核酸センサー分子は、クエンチャ基を含まずに作製される。得られる分子は、５’−ＮＨ２−Ｃｌ２−ＣＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−ＦＡＭ−３’の配列（配列番号８）を有する。この遊離アミン基は、シッフ塩基形成および還元のための標準プロトコルを介してアルデヒド誘導体化したガラス表面にセンサー分子を付着させることを可能にする。核酸センサー分子は、アレイを形成するために異なる領域またはスポットで結合され得るか、または広範な領域を覆うように均一に分配される。標的（ここでは、トロンビン）が存在しない場合には、核酸センサー分子は、表面への付着点の周りを、その分子体積および質量の速度特性で拡散的に回転する。標的が結合した後、センサー標的複合体は、相応して、大きい体積および質量を有することになる（トロンビンの質量〜５５ｋＤ）。分子体積（質量）のこの変化は、回転性拡散速度を低下させ、その結果、フルオロフォアからの蛍光発光の偏光状態における測定可能な変化がもたらされる。
【００９７】
この本発明の実施形態の１つの例では、触媒反応の結果として遊離されるリボザイムの一部に単一のシグナル伝達部分が結合される（例えば、自己切断リボザイムのいずれかの末端、またはリガーゼの５’末端のピロリン酸）。標的活性化触媒は、リボザイムからのシグナル伝達部分の遊離を引き起こし、標的の存在と相関するシグナルを発生する。遊離を、（１）シグナル伝達部分の固有の光学特性の変化（例えば、遊離した部分が溶液中でより自由に回転し得るような、減少した蛍光偏光）か、または（２）シグナル伝達部分の分割の変化（チップの全体の蛍光を洗浄後に低減させる、固定化リボザイムを含有するチップからのフルオロフォアの遊離）のいずれかによって、検出し得る。
【００９８】
本発明の別の実施形態では、核酸センサー前駆体は修飾され、リボザイムの基質として、光シグナル伝達ユニットが提供される。この実施形態の１つの例は、リガーゼ活性によりリボザイムへ結合され得る蛍光性タグ化オリゴヌクレオチドを含む。センサー分子としてリガーゼを用いる不均一性アッセイにおいて、検体含有サンプルは、リガーゼを機能させる条件下で、蛍光オリゴヌクレオチド基質およびリガーゼとともにインキュベートされる。インキュベーション期間の後、リガーゼは遊離オリゴヌクレオチド基質から分離される（例えば、リガーゼ特異性配列へのハイブリダイゼーションに基づいて固体支持体にリガーゼを捕獲することによって、あるいはリガーゼを予め固体支持体へ固定化し、広範に洗浄することによって）。捕獲した蛍光シグナルの定量は、サンプル中の検体の濃度を推測するための手段を提供する。この実施形態の第２の例では、リボザイム活性は、それ自体の修飾をもたらすことなく、基質の蛍光特性を変化させる。フルオロフォア対またはフルオロフォア／クエンチャ対は、トランス作用性エンドヌクレアーゼリボザイムのオリゴヌクレオチド基質の切断部位の両側に隣接するヌクレオチドへ結合され得る（Ｊｅｎｎｅら）。基質の標的活性化切断によって、対の分離、およびその光学特性の変化がもたらされる。
【００９９】
本発明の別の実施形態では、センサーリボザイムおよびその基質は修飾されず、そして検出は、リボザイムが酵素で増幅される能力における触媒に結合される変化に依存する。１つの例では、標的活性化リガーゼは、リガーゼを機能させる条件下で、オリゴヌクレオチド基質および検体含有サンプルとともにインキュベートされる。インキュベーション期間の後、反応は消光され、混合物は、連結基質に対応するオリゴ配列を含むプライマー対を用いて、ＲＴ／ＰＣＴ増幅に供される。増幅産物は、一般的に実行される種々の方法（例えば、Ｔａｑｍａｎ）によって検出され得る。オリゴヌクレオチド基質を自己連結したリボザイムだけがこれらの条件下で増幅し得、センサー標的の濃度と結合され得るシグナルを発生する。
【０１００】
（Ｃ．高次構造依存性シグナル伝達部分）
（Ｉ．近接依存性シグナル伝達部分）
多くの近接依存性シグナル伝達部分が当該技術分野で公知であり、本発明の範囲内に包含される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９２，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｋｒｉｃｋａ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，第１３章、ならびにＨｅｌｌｅｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，２４５−２５６頁を参照のこと）（これら全ては参照によって本明細書中で援用される）。これらの部分を使用するシステムは、これらの部分が極めて近接する場合に生じる蛍光変化に依存する。このようなシステムは、蛍光エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）、無放射エネルギー移動（ｎｏｎｒａｄｉａｔｉＶｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、長期的エネルギー移動（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、双極子結合エネルギー移動（ｄｉｐｏｌｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、またはフォルスタエネルギー移動（Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）として文献に記載されている（例えば、米国特許第５，４９１，０６３号，Ｗｕ，およびＢｒａｎｄ，１９９４を参照のこと）。
【０１０１】
シグナル伝達部分の間の直接のエネルギー移動には依存しない他の近接依存性シグナル伝達システムもまた当該技術分野で公知であり、本明細書中で記載される方法において使用され得る。これらには、例えば、標的分子の結合による活性化の際にシグナル伝達部分が刺激されて蛍光またはルミネッセンスを発するシステムが含まれる。この活性化は、直接的（例えば、結合された標的により放射される光子または放射性核種の崩壊産物による表面近接アッセイ（ＳＰＡ）の場合など）でも、間接的（例えば、イルミネーション時に光増感したドナービーズから放出される一重項酸素との反応によるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭアッセイの場合など）でもよい。どちらのシナリオでも、検出されたシグナル伝達部分の活性化は、シグナル伝達部分および活性化種の緊密な近接に依存する。一般に、蛍光、蛍光偏光、およびシンチレーション−近接型のどのアッセイでも、核酸センサー分子は、液相または固相形式で使用され得る。すなわち、機能的な形態では、核酸センサー分子は固体支持体に固定（直接、またはリンカーを介して）されてもよいし、溶液中で遊離していてもよい。
【０１０２】
１つの実施形態では、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）が使用される。この実施形態では、核酸センサー分子は、標的分子の存在下で基質を連結するアロステリックリボザイムであり（図２Ａおよび図２Ｂを参照のこと）、例えば、エフェクターオリゴヌクレオチド配列（例えば、図２ＡのＧＣＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＡＧ（配列番号２））の５’末端に結合された（ビオチン）リンカーを介してストレプトアビジンで被覆されたシンチラント含浸マイクロウェルプレート（例えば、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅｓ，ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に結合される。種々のプレート−センサー結合化学はプレートの型および製造業者によって決定され、当該技術分野で周知である。連結緩衝液中に標的分子と過剰の放射標識（例えば３２Ｐまたは３５Ｓによって）基質とを含有する溶液の添加の際、リボザイムは基質オリゴヌクレオチドとハイブリダイズおよび連結する。いくらかの放射標識基質の分画は、プレート上の表面固定化されたリボザイムセンサー分子に連結され、連結されない基質は溶液中で遊離となる。プレート上の表面固定化されたリボザイムセンサー分子に連結された基質だけが、プレートに包埋されたシンチラント分子へ十分緊密に近接して、それらを励起し、それにより、照度計（例えば、ＴｏｐＣｏｕｎｔルミネッセンスプレートリーダー、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を用いて容易に検出され得るルミネッセンスが刺激される。このタイプの均一性アッセイフォーマットは、標的分子結合の直接的なリアルタイム検出、定量化、および動力学的特性を提供する。
【０１０３】
別の実施形態では、シンチラント含浸ビーズ（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、同様のＳＰＡアッセイ形式が実行される。この実施形態では、標的分子の存在下で基質と連結するアロステリックリボザイムセンサー分子（図２Ａおよび図２Ｂを参照のこと）は、例えば、マイクロウェルプレート中で、溶液中に懸濁されるシンチラント含浸ビーズへ結合される。種々のビーズ−センサー結合化学はビーズのタイプおよび製造業者によって決定され、当該技術分野において周知である。連結緩衝液中に標的分子と過剰の放射標識（例えば３２Ｐまたは３５Ｓによって）基質とを含有する溶液の添加の際、リボザイムは基質オリゴとハイブリダイズおよび連結する。いくらかの放射標識基質の画分はビーズ上に表面固定化されたリボザイムセンサー分子へ連結され、連結されない基質は溶液中で遊離となる。ビーズに表面固定化されたリボザイムセンサー分子に連結された基質だけが、ビーズに包埋されたシンチラント分子へ十分緊密に近接して、それらを励起し、それにより、照度計（例えば、ＴｏｐＣｏｕｎｔルミネッセンスプレートリーダー、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を用いて容易に検出され得るルミネッセンスが刺激される。リアルタイムの標的検出および定量化を可能にすることに加えて、このタイプの均一アッセイ形式は、インサイチュでリアルタイムの細胞プロセスを研究するために使用され得る。これは、細胞をマイクロウェルプレート上へ直接培養し、細胞によるシンチラントビーズおよび放射性同位元素の取り込みを可能にすることによって実施され得る。次いで、生合成、増殖、薬剤取り込み、細胞移動などは、選択された標的分子の存在下、ビーズにより発生されるルミネッセンスシグナルによりモニターされ得る（Ｃｏｏｋら、１９９２またはＨｅａｔｈら、１９９２を参照のこと）。
【０１０４】
図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭビーズ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）とともに使用される核酸センサー分子に基づく非同位体近接アッセイの例示的な実施形態を示す。この実施形態では、核酸センサー分子は標的分子の存在下で基質を連結するアロステリックリボザイムであり（図２Ａおよび図２Ｂ参照）、例えば、エフェクターオリゴヌクレオチド配列（図２ＡのＧＣＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＡＧ（配列番号２））の５’末端に結合された（ビオチン）リンカーを介してストレプトアビジンで被覆されたケミルミネッサー（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）含浸アクセプタービーズへ結合される。種々のビーズ−センサー結合化学はビーズの型および製造業者によって決定され、これは当該技術分野で周知である。基質のオリゴは、例えば、基質の３’末端へ結合された（ビオチン）タグを介してストレプトアビジンで被覆された光増感剤含浸ドナービーズへ結合される。次いで、ドナー（基質）およびアクセプター（リボザイム）ビーズならびに標的分子は、マイクロウェルプレートにおいて溶液中で混合される。いくらかのリボザイムは基質オリゴとハイブリダイズおよび連結し、ドナーおよびアクセプタービーズは緊密に近接されるようになる（＜２００ｎｍ）。６８０ｎｍでのイルミネーションで、ドナービーズ中の光増感剤は、ビーズ当たり約６０，０００／秒の速度で周囲の酸素を一重項状態へ変換する。一重項酸素は溶液中で最大距離約２００ｎｍ拡散する。ケミルミネッサーを含有するアクセプタービーズがこの範囲内にある場合、すなわち連結が標的分子の存在下で生じた場合、３７０ｎｍの化学ルミネッセンスが発生する。この放射は直ちに、アクセプタービーズ内で、崩壊半減期が０．３秒の５２０〜６２０ｎｍの可視ルミネッセンスへ変換される。５２０〜６２０ｎｍの可視ルミネッセンスは、時間分解蛍光／ルミネッセンスプレートリーダー（例えば、Ｆｕｓｉｏｎ多機能プレートリーダー，Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）を用いて検出される。この型の非同位体均一性近接アッセイ形式は、ハイスループットスクリーニングのために、２５マイクロリットル未満の容量で、標的分子濃度の高感度検出および定量化を提供する（Ｂｅａｕｄｅｔら、２００１を参照のこと）。
【０１０５】
適切な蛍光標識は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）から市販されている。これらには、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  ＴＭ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ピレンブチレート（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイリジル１−ピレンスルホネート（ＰＹＳ）／ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ（ＲＯＸ）、およびＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などのドナー／アクセプター（すなわち、第１および第２のシグナル伝達部分）分子が含まれる。既に記載した有機フルオロフォアに加えて、種々のタイプの非有機的な蛍光標識が当該技術分野で公知であり、例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡから市販されている。これらには、例えばドナー／アクセプター（すなわち、第１および第２のシグナル伝達部分）半導体ナノ結晶（すなわち、「量子ドット」）が含まれ、その吸収および発光スペクトルは、ナノ粒子の材料、サイズおよび組成の選択によって、正確に制御され得る（例えば、Ｂｒｕｃｈｅｚら，１９９８、ＣｈａｎおよびＮｉｅ，１９９８、Ｈａｎら，２００１を参照のこと）。
【０１０６】
特定のドナー／アクセプター対の選択は、ドナーとアクセプターの間でエネルギーが移動可能であるならば、本発明を実施するために重要ではない。Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は非蛍光アクセプター色素の一例であり、隣接のフルオロフォア、例えばフルオレセインまたは５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン（ＥＤＡＮＳ）からの蛍光を効果的に消光する。
【０１０７】
図３ＡおよびＢならびに図６ＡおよびＢは、実施形態に従い、核酸前駆体分子（それぞれ、図２ＡおよびＢならびに図５ＡおよびＢ）から獲得された例示的な核酸センサー分子を示す。図３は、触媒部位がリガーゼ部位であったオリゴヌクレオチドプールから得られた核酸センサー分子を示す。図６は、触媒部位が自己切断を媒介する部位であったオリゴヌクレオチドプールから得られた核酸センサー分子を示す。
【０１０８】
図３Ａおよび図３Ｂに示される実施形態では、リガーゼ部位の一部（例えば、図２に示されるように、核酸センサー前駆体分子の３’末端のＡＧＵＣＧ配列）が除去された核酸センサー前駆体分子は、第１のヌクレオチド（１）では第１のシグナル伝達部分（Ｆ）に結合され、第２のヌクレオチド（２）では第２のシグナル伝達部分（Ｄ）に結合される。更なる実施形態では、第１および第２のシグナル伝達部分の分子は、非末端配列へ結合される。シグナル伝達部分へ結合された非末端配列の位置は、５’または３’ヌクレオチドからの最大距離に制限されるが、分子の光学特性の近接依存性変化をなおも可能にする。結合化学は当該技術分野において慣用的に実施されており、商業的に提供されるオリゴヌクレオチド合成サービス（例えば、ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣｏｒａｌＶｉｌｌｅ，ＩＡ）もまた使用して、標識分子を生成し得る。更なる実施形態では、核酸センサー分子は、複雑な生物体液中の標的分子の存在および濃度を検出するために、固体支持体に固定されるか、または溶液中で遊離な状態で使用される。
【０１０９】
図３Ａおよび図３Ｂに示される実施形態では、第１のシグナル伝達部分（Ｆ）は５’末端へ結合されたフルオレセイン分子であり、第２のシグナル伝達部分（Ｄ）は３’末端へ結合されたＤＡＢＣＹＬ分子（消光基）である。非標的分子結合型のほぼ完全な塩基対形成（図３Ｂを参照のこと）が理由で、これは、標的分子の非存在下における核酸センサー分子の好ましい形態である。核酸センサー分子が標的分子により結合されない場合、蛍光基および消光基は緊密に近接し、蛍光基からの蛍光はほとんど検出されない。標的分子の付加によって、図３Ｂに示される核酸センサー分子の高次構造は、図３Ａに示される高次構造へと変化する。その分子が図３Ａに示される高次構造である仮定する場合、第１および第２のシグナル伝達部分（それぞれ、ＦおよびＤ）は、消光基が蛍光基の蛍光を消光するために十分に近接状態になく、その結果、標的分子の結合の際には、検出可能な蛍光シグナルが発生される。
【０１１０】
１つの実施形態では、以前に同定された核酸センサー分子からのリガンド結合ドメイン配列は、図９１ＡおよびＢ、ならびに図６ＡおよびＢに示されるように、標的結合時に高次構造を変化させる別のオリゴヌクレオチド配列へ組み込まれる。合成中または合成後に、光学シグナル発生ユニットは、誘導された核酸センサー分子を含むオリゴヌクレオチド配列へ付加または挿入される。前述したように、この型の核酸センサー分子は、アロステリックリボザイムから獲得され得るか（例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、Ｌ１リガーゼ、およびグループ１イントロンリボザイムなどに由来する核酸センサー分子）、あるいはアプタマービーコンまたはシグナル伝達アプタマーから獲得され得る（Ｓｏｕｋｕｐら、２００１またはＨａｍａｇｕｃｈｉら、２００１を参照のこと）。これら全ては、分子認識を検出可能な光シグナルへ変換する。
【０１１１】
図９Ａおよび図９Ｂに示される実施形態では、核酸センサー分子は、一本鎖ＤＮＡで構成され、次の配列：５’−ＣＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号８）を有する。第１のシグナル伝達部分は５’末端へ結合されたフルオレセインベースの標識（ＦＡＭ）であり、第２のシグナル伝達部分は、３’末端へ結合された消光基（ＤＡＢＣＹＬ）である。核酸センサー分子の最終構造は、５’−ＦＡＭ−ＣＣＡＡＣＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−ＤＡＢＣＹＬ−３’である。非結合状態では、核酸センサー分子は二重鎖ステム−ループを形成する。標的（ここでは、トロンビン）の存在下では、センサー分子はＧ−四重鎖構造と推定される。この高次構造の再編成の結果、５’−結合フルオロフォア末端と３’−結合クエンチャとの間の距離が変化する。クエンチャがフォルスタ半径（５０％共鳴エネルギー移動のための半径、代表的には約１０〜５０オングストローム）より大きい距離だけフルオロフォアから離される場合、図９Ｃに示されるように、フルオロフォアから検出される蛍光発光強度は急激に増大する。飽和濃度の標的分子では、センサー分子からの蛍光強度の増大は約２．５倍であった（Ｈａｍａｇｕｃｈｉら、２００１を参照のこと）。
【０１１２】
図１０Ａおよび図１０Ｂに示される実施形態では、非結合状態におけるハンマーヘッドなどの蛍光標識された自己切断リボザイム（この場合には、リンカー分子を介して固体支持体へ結合される）は、第２の蛍光標識を有するトランス作用性基質とハイブリダイズされる。非結合状態、すなわち標的の非存在下で、ドナーフルオロフォア（リボザイム上の）およびアクセプターフルオロフォア（基質上の）はＦＲＥＴが発生するのに十分緊密に近接しており、したがって、波長１、λ１のエピイルミネーション励起の際に、波長２、λ２における最小の蛍光発光がドナーフルオロフォアから検出される。標的結合時には、アクセプターフルオロフォアを有する基質の切断断片は、リボザイム−標的複合体から解離する。アクセプターフルオロフォアからいったん離されると、ドナーフルオロフォアはＦＲＥＴを介した脱励起を受け得ず、その結果、波長２、λ２におけるその蛍光発光が検出可能に増大する（例えば、Ｓｉｎｇｈ、１９９９、ＷｕおよびＢｒａｎｄ，１９９４、ＷａｌｔｅｒおよびＢｕｒｋｅ，１９９７、Ｗａｌｔｅｒら，１９９８を参照のこと）。更なる実施形態では、蛍光発光強度の変化に加えて、ドナーフルオロフォアからの蛍光発光の偏光状態の変化（より小さい切断断片の拡散回転速度の増大による）が検出／モニターされ得る（Ｓｉｎｇｈ，２０００を参照のこと）。更なる実施形態では、リボザイムセンサー分子は溶液中で遊離となる。
【０１１３】
図１０Ｂに示される別の実施形態では、基質へ結合されたアクセプターフルオロフォアは、クエンチャ基で置換される。この置換も、波長１、λ１でのエピイルミネーション励起において、リボザイムが非結合状態にある場合に、波長２、λ２における最小の蛍光ドナー発光をもたらす。標的結合時には、ドナーおよびクエンチャ基を有する基質の切断断片は、リボザイム−標的複合体から解離する。クエンチャからいったん離されると、ドナーフルオロフォアは、波長２、λ２におけるその蛍光発光の検出可能な増大を示す。更なる実施形態では、蛍光発光強度の変化に加えて、ドナーフルオロフォアからの蛍光発光の偏光状態の変化（より小さい切断断片の拡散回転速度の増大による）が検出／モニターされ得る。更なる実施形態では、リボザイムセンサー分子は溶液中で遊離である。
【０１１４】
異なる実施形態では、図１０Ｃに示されるように全反射（ＴＩＲ）−イルミネーションによる励起を提供するために、光学的な立体配置が設計される。また、ドナーフルオロフォアはリボザイム本体へ結合され、アクセプターは基質へ結合される。この立体配置では、表面固定化リボザイムは非結合状態にあり、波長２、λ２における蛍光ドナー発光は最小になる。標的結合時には、クエンチャ基を有する基質の切断フラグメントは、リボザイム−標的複合体から解離する。クエンチャからいったん分離されると、ドナーフルオロフォアは、波長３、λ３におけるその蛍光発光の検出可能な増大を示す。図１０Ｃに示されるものの代替の実施形態では、クエンチャ基はアクセプターフルオロフォアで置換することができる。図１０Ａ、ＢおよびＣに示されるものの更に別の代替実施形態では、ドナーフルオロフォアはリボザイム基質の切断フラグメントへ結合され、アクセプターフルオロフォアまたはクエンチャ基は除去される。標的結合および切断フラグメントの解離の際には、ドナーフルオロフォアからの蛍光発光の偏光状態は、表面結合リボザイム−標的複合体および遊離の切断フラグメントの拡散回転速度の違いのために、検出可能な変化を受けるであろう。
【０１１５】
１つの実施形態では、自己切断アロステリックリボザイムに由来する全てのセンサー分子のために、普遍的なＦＲＥＴトランス−基質が合成される。この基質は、合成オリゴヌクレオチド配列の反対の末端へ結合された相補的な光シグナル伝達ユニット（すなわち、ドナー基およびアクセプター基）を有する。このような普遍的な基質は、光シグナル伝達ユニットをセンサー（すなわち、リボザイム）分子自体へ結合する必要性を予め除去する。
【０１１６】
核酸センサー分子の結合および非結合型の相対的な安定性は、標的分子の最高の検出感度を達成するために最適化される。１つの実施形態では、核酸センサー分子は、１つの型の安定性を別の型よりも高めるように、さらに操作される。１つの実施形態では、図３Ａおよび図３Ｂに太くマークされたＵＡはＣＣへ変化され、標的分子結合型の形成を有利にする。核酸センサー分子が結合されていない場合には、これらの塩基は塩基対を形成しないので、非結合型は安定化されない。
【０１１７】
本明細書中で記載される方法に加えて、当該技術分野で公知の更なる近接依存性のシグナル伝達システムのいずれかを使用して、本発明に従う方法を実行することができ、これも本発明の範囲内に包含される。
【０１１８】
多数の方法を使用して、核酸センサー分子の異なるコンフォメーションの相対的な安定性を評価することができる。１つの実施形態では、核酸センサー分子により形成される構造の自由エネルギーは、ｍｆｏｌｄ（登録商標）などのソフトウェアプログラムを用いて決定され、このプログラムは、Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ  Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＩ）のウェブサイト（ｗｗｗ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ｄｅｐｔ．）上に見出すことができる。
【０１１９】
別の実施形態では、核酸センサー分子の異なるコンフォメーションの検出を可能にするゲルアッセイが実行される。この実施形態では、核酸センサー分子は、室温または核酸センサー分子が使用される温度で、平衡にされる。分子は次に４℃に冷却され、４℃でネイティブ（未変性）のゲル上で電気泳動される。核酸センサー分子により形成されるコンフォメーションのそれぞれは、ゲル上の異なる位置へ移動し、各コンフォメーションの相対的濃度の視覚化が可能になる。同様に、標的分子の存在下で形成される核酸センサー分子のコンフォメーションは、次に、円偏光二色性（ＣＤ）などの方法によって決定される。標的分子の存在下で形成された核酸センサー分子のコンフォメーションを標的分子の非存在下で形成されたコンフォメーションと比較することによって、結合コンフォメーションに相当するコンフォメーションを、標的分子が存在しないサンプル中で同定することができる。核酸センサー分子を、次に、標的分子の非存在下で結合コンフォメーションの形成を最小化するように操作することができる。核酸センサー分子の感受性および特異性は、既知量の標的分子による標的分子結合アッセイを用いるためにさらにアッセイすることができる。
【０１２０】
図６Ａおよび図６Ｂに示される別の実施形態では、自己切断部位の一部が除去された核酸センサー前駆体分子は、第１のヌクレオチドにおいて第１のシグナル伝達部分（Ｆ）へ、第２のヌクレオチドにおいて第２のシグナル伝達部分（Ｄ）へ結合される。この実施形態では、核酸前駆体分子の触媒部位全体（図５Ａおよび図５Ｂ参照）が除去されている。１つの実施形態（図６Ａおよび図６Ｂ）では、核酸センサー分子の非結合型（図６Ｂ）を安定化するために、標的活性化部位配列を含む核酸センサー分子の部分の一端に、更なる塩基（例えば、ＵＧＧＵＡＵ）が付加される。これらの塩基は、核酸センサー分子の反対の末端にある塩基（ＡＣＣＡＵＡ）に相補的であるように選択される。更なる塩基は、核酸センサー分子の５’末端または３’末端のどちらに付加されてもよい。
【０１２１】
核酸センサー分子の１つのコンフォメーションを別のコンフォメーションよりも安定化するための修飾は、上記で論考したｍｆｏｌｄプログラムまたはネイティブゲルアッセイを使用して同定することができる。標識核酸センサー分子は、上記で論考したように、第１のシグナル伝達部分（Ｆ）を第１のヌクレオチドに、第２のシグナル伝達部分（Ｄ）を第１および第２のヌクレオチドに結合することによって作成される。上記のように、核酸センサー分子の感受性および特異性は、既知量の標的分子による標的分子結合アッセイを用いるためにさらにアッセイすることができる。更なる実施形態では、米国特許第５，５８７，２９３号（その全体は、参考として本明細書中で援用される）に開示されるような親和性フィンガープリント技術を用いて、標的分子に対して最適な親和性を有する核酸センサー分子が選択される。
【０１２２】
（ＩＩ．単一のシグナル伝達部分を有する光シグナル発生ユニット）
１つの実施形態では、核酸センサー分子は、核酸センサー分子の内部か、または末端位置のいずれかに導入された単一のシグナル伝達部分を有する光シグナル伝達ユニットを含む。この実施形態では、標的分子の結合は、核酸センサー分子のコンフォメーション及び物理的側面（例えば、分子の体積または質量、回転拡散速度など）の両方に変化を引き起こす。標的結合時の核酸センサー分子のコンフォメーション変化は、シグナル伝達部分の化学的な環境を変更する。化学的環境のこのような変化は、一般的に、シグナル伝達部分の光学特性を変化させる。適切なシグナル伝達部分は、ＪｈａＶｅｒｉら、２０００に記載されており、例えば、フルオレセイン、アクリジン、および他の有機および無機のフルオロフォアが含まれる。
【０１２３】
１つの実施形態では、シグナル伝達部分は、核酸前駆体分子内の標的活性化部位（例えば、フットプリント研究によって同定可能）の近くの位置に導入される。標的分子の結合は、（核酸前駆体分子のコンフォメーションの変化によって）化学的環境を変化させ、これにより、シグナル伝達部分の光学特性に検出可能な様式で影響を与える。
【０１２４】
核酸センサー分子の標的分子との結合は、核酸センサー分子のコンフォメーション及び物理的側面の変化をもたらし、従って、シグナル伝達部分の動力学的特性を変更する。特に、センサー標的複合体のコンフォメーションおよび質量の変化は、センサー標的複合体の回転拡散速度を低下させ、シグナル伝達部分からの、観察される定常状態の蛍光偏光（ＦＰ）に検出可能な変化をもたらす。標的濃度に対して期待されるＦＰシグナルの変化を、リガンド結合動力学について周知のミカエリス−メンテンモデル（Ｌａｋｏｗｉｃｚ、１９９９参照）の改変型を用いて得ることができる。したがって、ＦＰは、サンプル溶液中の標的分子の濃度を検出し、定量的に決定する高感度の手段である（Ｊａｍｅｓｏｎおよびｓａｗｙｅｒ、１９９５；ＪａｍｅｓｏｎおよびＳｅｉｆｒｉｅｄ、１９９９；Ｊｏｌｌｅｙ、１９９９；Ｓｉｎｇｈ、２０００；Ｏｗｉｃｋｉら、１９９７）。ＦＰ法は、溶液相および固相の実施態様の両方で機能することができる。
【０１２５】
前述の節の実施形態で記載されたように、標的の検出および定量においてＦＲＥＴの使用を可能にするために、例えば単一の蛍光標識および不対グアノシン残基（クエンチャ基の代わり）を使用する、多数の更なる方法を使用することができる（ＷａｌｔｅｒおよびＢｕｒｋｅ、１９９７を参照）。
【０１２６】
図１１Ａおよび図１１Ｂに示される更なる実施形態では、標識自己切断リボザイムは、リゾチーム依存性Ｌ１リガーゼなどの非標識連結リボザイムによって置換される（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．およびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ、２０００を参照）。非結合状態、すなわち標的が存在しない場合には、全反射（ＴＩＲ）イルミネーションの下で、表面結合リボザイムから蛍光発光は検出されない。タグ（タグは、続いて添加される蛍光標識へ相互作用により結合でき、ビオチン／ストレプトアビジン、アミン／アルデヒド、ヒドラジド、チオール、または他の反応基が含まれるが、これらに限定はされない）を有する基質の存在下における標的分子の結合時には、リボザイムとハイブリダイズするこれらの基質は、連結反応を受け、リボソームへ共有結合される。所与のリボザイムについてハイブリダイゼーションの確率を最大にするために、基質を、リボザイムに対して過剰に添加することができ、反応が生じる周囲溶液の温度は室温より低く（例えば、４℃）保持され、そして反応容器の攪拌は、溶液中の種の拡散律速輸送の動力学的制限を克服するために使用することができる。上記条件、ならびに最大のハイブリダイゼーションおよび引き続く連結反応が生じるのに十分な時間を考慮して、基質タグを結合するための適切な反応基を有する蛍光標識が、反応混合物へ添加される。再度、基質−標識結合の度合いは、標識濃度、溶液温度および攪拌の制御によって最大化できる。一旦、蛍光標識が、全ての利用可能な連結された基質−リボザイム−標的複合体に結合すると、ハイブリダイズされたが連結されていない基質を全て排除するために、溶液温度を上昇させることができる。ＴＩＲイルミネーションでは、リボザイムが結合された固体基板表面の上の励起領域の空間的範囲は、わずか１００ｎｍ程度である。したがって、基板表面の上のバルク溶液は照射されず、検出される蛍光発光は、主に、基板表面へ拘束された連結基質−リボザイム−標的複合体へ結合されたフルオロフォアに起因するものである。この均一性固相アッセイフォーマットにおける表面結合リボザイム−標的複合体からの蛍光発光は、容易に検出可能な光シグナルを示す。別の実施形態では、標識基質の蛍光偏光（ＦＰ）をモニターすることができる。連結時には、基質−リボザイム複合体からの定常状態の蛍光偏光シグナルは、遊離型と連結型の間の拡散回転速度の違いに起因して、溶液中で遊離している標識基質からのＦＰシグナルに対して検出可能に増大する。
【０１２７】
別の実施形態では、リゾチーム依存性Ｌ１リガーゼなどの非標識連結リボザイム（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．およびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ、２０００を参照）は固体表面へ結合される。この実施形態では、基質オリゴは、タグ（ここでタグは、続いて添加される標識へ相互作用により結合でき、ビオチン／ストレプトアビジン、アミン／アルデヒド、ヒドラジド、チオール、または他の反応基が含まれるが、これらに限定はされない）によって、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素結合発光部分へ結合される。非結合状態、すなわち標的が存在しない場合には、表面結合リボザイムから発光放射は全く検出されない。標識基質の存在下における標的分子の結合時には、リボザイムへハイブリダイズされた基質は連結反応を受け、リボソームへ共有結合される。過剰の非結合リボザイム基質が除去された後、酵素結合発光標識のための活性化基質が反応容積へ添加される。得られる発光シグナル（例えば、ＨＲＰ、ルシフェラーゼなどから）は、標準照度計（例えば、Ｆｕｓｉｏｎ多機能プレートリーダー、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて容易に検出可能である。更なる実施形態では、活性化溶液を、沈殿させた後、比色検出を行うことができる。
【０１２８】
（２．標的活性化バイオセンサーの作成）
目的の標的分子の検出のための標的活性化バイオセンサーは、選択された標的分子により改変可能な（例えば、活性化可能な）触媒活性を有する核酸前駆体分子をまず選択することによって作成される。１つの実施形態では、次いで、前駆体分子の触媒部位の少なくとも一部が除去され、そして光シグナル発生ユニットが付加または挿入される。標的分子の標的活性化バイオセンサーへの結合は、光シグナル伝達ユニットの特性の変化を活性化する。
【０１２９】
１つの実施形態では、標的分子に特異的な第１および第２のシグナル伝達部分で標識された複数の核酸センサー分子を含む標的活性化バイオセンサーが提供される。別の実施形態では、センサー分子は単一のシグナル伝達部分で標識される。１つの実施形態では、標識核酸センサー分子は、溶液（例えば、緩衝液）中に提供される。別の実施形態では、標識核酸センサー分子は、基板へ直接的または間接的（例えば、リンカー分子によって）に結合される。更なる実施形態では、核酸センサー分子は、基板上へ直接合成されることができる。本発明の範囲内に包含される適切な基板としては、例えば、ガラスまたは石英、シリコン、カプセル化または非カプセル化の半導体ナノ結晶材料（例えば、ＣｄＳｅ）、ニトロセルロース、ナイロン、プラスチック、および他のポリマーが挙げられる。基板は種々の構造（例えば、平面、スライド状、ウェハ、チップ、管状、ディスク様、ビーズ、容器、またはマイクロタイタープレートなどのプレート、および他の形状）を取ることができる。
【０１３０】
多数の結合化学は、直接的でも間接的でも、センサー分子を固体支持体上に固定化するために使用することができる。これらには、例えば、アミン／アルデヒド、ビオチン／ストレプトアビジン（アビジン、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａＶｉｄｉｎ））、ＡＤＨ／酸化３’ＲＮＡが含まれる。特定の実施形態では、核酸センサー分子は、標的分子の存在下で基質を連結するアロステリックリボザイムである（図２Ａおよび図２Ｂを参照）。この実施形態では、リボザイムは、エフェクタのオリゴヌクレオチド配列（例えば、図２ＡのＧＣＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＡＧ（配列番号２））によって固体基板へ結合される。
【０１３１】
１つの実施形態では、固体基板上に固定化された核酸センサー分子のアレイを作成するために、手動またはコンピュータ制御ロボットのマイクロアレイヤーが使用される。１つの実施形態では、アレイヤーは、接触プリンティング技術を利用する（すなわち、クイル−スロット、あるいは他の改変を有するかまたは有さない金属、ガラスなどのプリンティングピンを使用する）。異なる実施形態では、アレイヤーは、非接触プリンティング技術を利用する（すなわち、インクジェットまたはキャピラリベースの技術、もしくは配列されるべき材料を含有する溶液を分配する他の手段を使用する）。マイクロアレイを調製、処理、および分析するための多数の方法が当該技術分野で公知である（Ｓｃｈｅｎａら、２０００；Ｍａｃｅら、２０００；Ｈｅｌｌｅｒら、１９９９；Ｂａｓａｒａｒｓｋｙら、２０００；Ｓｃｈｅｍｅｒ、１９９９を参照）。ロボットおよび手動のアレイヤーは、例えば、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴからのＳｐｏｔＡｒｒａｙ、およびＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭｉからのＲＡ−１が市販されている。
【０１３２】
１つの実施形態では、バイオセンサーのアレイを形成する複数の小さいバイオセンサーを組み合わせることによって、より大きい基板を作成することができる。更なる実施形態では、基板上に配置される核酸センサー分子はアドレス指定され（例えば、核酸センサー分子上の特異的リンカーまたはエフェクタオリゴヌクレオチド配列によって）、そして各核酸センサー分子の場所およびその標的分子の特異性に関する情報がプロセッサ内に記憶される。この技術は、空間的アドレス指定または空間的多重化として公知である。基板上の核酸をアドレス指定するための技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，０６０，２５２号、米国特許第６，０５１，３８０号、米国特許第５，７６３，２６３号、米国特許第５，７６３，１７５号、米国特許第５，７４１，４６２号に記載されており、その全体は参考として本明細書中で援用される。
【０１３３】
図１３Ａおよびｂに示される実施形態では、ビオチンリンカーによって、ストレプトアビジン誘導体化ガラス基板上に４つの異なる核酸センサー分子が固定化される。センサーのためのバイオセンサー標的は、４つの異なる生理的タンパク質：トロンビン、ＩＭＰＤＨ、ＶＥＧＦ、およびＢＦＧＦである。各バイオセンサーは、単一の５’ＦＡＭ（フルオレセイン）基で標識される。この場合の個々のセンサースポットは手動で配列された。標的濃度の溶液測定は、目的の標的（検体）を含有する溶液中にバイオセンサーレイの表面を浸すことによって行われる。実際には、これは、アレイをマイクロフローセル（フロー速度は約２５マイクロリットル／分）内に組み込むことによってか、あるいはアレイ表面に少量（約６〜１０マイクロリットル）の標的溶液を配置するかのいずれかによって、それをカバースリップで被覆することによって達成される。標的（ここではタンパク質）濃度の検出および定量化は、４８８ｎｍのレーザー放射によるイルミネーションの下でフルオレセイン標識から放出される蛍光偏光（ＦＰ）シグナルの変化をモニターすることによって達成される。図１３Ａは、バイオセンサーから放出された蛍光の偏光状態の変化についての物理的根拠を示す。回転拡散速度は分子体積に反比例し、したがって、およそ２０ヌクレオチドの非結合センサー（すなわち、標的の非存在下）に対する回転相関時間は、＞５５ｋＤの標的−センサー複合体に対するよりも著しく少ない。従って、標的−センサー複合体からの蛍光発光は、放射寿命内でセンサーフルオロフォアの発光双極子軸が回転することができる角度がより小さいことに起因して、より大きい残留偏光を経る。約５１６ｎｍで検出された蛍光発光の偏光は、図１３Ｃに示されるように、タンパク質濃度と定量的に相関した。問い合わせ容積（Ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ  Ｖｏｌｕｍｅ）へのタンパク質の滴定は、リガンド結合動力学についてのミカエリス−メンテンモデルへ適合させることにより、標的−センサー相互作用の解離定数Ｋｄの決定を可能にする（Ｌａｋｏｗｉｃｚ、１９９９参照）。このようなＦＰ滴定曲線は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％ヒト血清からなる生物学的液体中のトロンビン特異的バイオセンサーについて、図１３Ｃに示される。別の実施形態では、異なる表面結合化学を使用して、固体基板上にバイオセンサーを固定化する。前述のように、これらには、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、アミン／アルデヒド、ヒドラジド、チオール、または他の反応基が関与する相互作用が含まれる。
【０１３４】
本発明に従う標的活性化バイオセンサーの特異性は、核酸センサー分子の標的活性化部位の特異性によって決定される。１つの実施形態では、全ての核酸センサー分子が同一の分子を認識する核酸バイオセンサーが提供される。別の実施形態では、少なくとも２つの異なる標的分子を認識でき、多検体検出を可能にする核酸バイオセンサーが提供される。第１および第２のシグナル伝達分子の異なる組み合わせを用いることによって、複数の検体を区別することができる。前述の波長／色および空間的多重化技術に加えて、核酸バイオセンサーを、強度多重化を用いて複数の検体を検出するために使用することができる。これは、制御された様式で各バイオセンサー分子上の蛍光標識分子の数を変更することによって達成される。単一の蛍光標識は、可能な最小の完全な標識ユニットなので、所与のバイオセンサー分子からのフルオロフォアの数（すなわち強度）は多重化の指標を提供する。バイオ結合体（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）として誘導体化された半導体ナノ結晶に関して実施される６波長（色）および１０レベル強度の多重化の組み合わせの使用によって、理論的には、１００万個の異なる検体特異的バイオセンサーのコード化が可能になる（Ｈａｎら、２００１）。
【０１３５】
１つの実施形態では、複数の単一標的バイオセンサーを組み合わせて、ユーザーの必要に応じて溶液ベースまたは基板ベースのいずれかの多検体検出システムを形成することができる。この実施形態では、ユーザーが単一検体検出システムへ戻すことを所望するならば、個々のバイオセンサーを後でシステムから取り外すことができる（例えば、支持体へ結合された標的分子を用いて、あるいは、例えば、基板ベースのバイオセンサーの場合、選択されたバイオセンサーを手動で取り外すことによって）。更なる実施形態では、複数の検体へ結合する核酸センサー分子は、基板上の核酸センサー分子のアドレスを参照し、そしてその場所を、それが結合する適切な標的分子と相関させることによって、互いに区別される（空間的アドレス指定または多重化として既に説明した）。
【０１３６】
１つの実施形態では、異なる検体溶液を適切なセンサーサブアレイへ導入するために、サブアレイとマイクロ流体経路およびインジェクタとの間の流体の流れを阻止する基板の仕切りまたは囲いの使用によって、バイオセンサーレイの小区分を、個々に別々の検体溶液に供することが可能である。
【０１３７】
（３．標的活性化バイオセンサーシステム）
１つの実施形態では、検出器システムと連絡する標的活性化バイオセンサーを含む標的活性化バイオセンサーシステムが提供される。更なる実施形態では、検出器システムで検出された光シグナルを処理するためのプロセッサが提供される。なお更なる実施形態では、プロセッサはサーバーへ接続可能であり、サーバーは他のプロセッサへも接続可能である。この実施形態では、バイオセンサーシステムが存在する部位で得られた光データは、サーバーを通って伝送されることができ、データが得られ、そして光データ伝送の数秒以内にオフサイトプロセッサのディスプレイ上にレポートが表示される。１つの実施形態では、患者からのデータは、システムのユーザーがアクセスすることができるデータベースに１０記憶される。
【０１３８】
本発明に従ってバイオセンサーから獲得可能なデータとしては、診断データ、リード化合物開発に関するデータ、および核酸センサー分子のモデリングデータ（例えば、個々のセンサー分子の配列を、特定の標的分子に対する結合親和性と相関させる情報）が挙げられる。１つの実施形態では、これらのデータはコンピュータデータベ−スに記憶される。更なる実施形態では、データベースは、バイオセンサーによりサンプルから得られた診断データとともに、病歴および支払い情報などの特定の患者に関する情報も含む。１つの実施形態では、データベースは標的活性化バイオセンサーシステムの一部であるが、データベースは、他の検出アッセイ法および薬剤開発法とは別に使用することができる。
【０１３９】
本発明に従う標的活性化バイオセンサーシステムとともに使用される検出器は、変化し得、核酸分子における光学的変化を検出するために適切な任意の検出器が含まれる。これらには、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電化結合デバイス（ＣＣＤ）、強化ＣＣＤ、およびアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）が含まれる。１つの実施形態では、標識核酸センサー分子を含む標的活性化バイオセンサーは、バイオセンサーと連絡する光源によって励起される。更なる実施形態では、光シグナル伝達ユニットが、ドナー／アクセプター対である第１および第２のシグナル部分を含む場合（すなわち、シグナル発生は、クエンチャアクセプター分子の近接から移動された場合、ドナー分子の蛍光に依存する）、標的分子の認識は、低バックグラウンドシグナルレベルを越える、蛍光発光強度の大幅な増大を引き起こす。高いシグナル対ノイズ比によって、ＰＭＴまたはＡＰＤなどの高ゲイン検出器を用いて、小さなシグナルを測定することができるようになる。強化ＣＣＤおよびＰＭＴを用いて、単一分子蛍光測定は、ドナー／アクセプターＦＲＥＴ対からの蛍光発光および蛍光寿命の変化をモニターすることによって行われている（Ｓａｋｏら、２０００；Ｌａｋｏｗｉｃｚら、１９９１を参照）。
【０１４０】
光源としては、例えば、フィルタ処理された広帯域光源（例えば、タングステン、またはキセノンアークなど）、ガスレーザーなどのレーザー光源、固相結晶レーザー、半導体ダイオードレーザー（多量子井戸、分散フィードバック、および鉛直キャビティ面放出レーザー（ＶＣＳＥＬ）を含む）、色素レーザー、金属蒸気レーザー、自由電子レーザー、およびゲイン媒体として他の任意の物質を用いるレーザーが挙げられる。一般的なガスレーザーには、アルゴンイオン、クリプトンイオン、および混合ガス（例えば、Ａｒ−Ｋｒ）イオンレーザーが含まれ、４５５、４５８、４６６、４７６、４８８、４９６、５０２、５１４、および５２８ｎｍ（Ａｒイオン）；ならびに４０６、４１３、４１５、４６８、４７６、４８２、５２０、５３１、５６８、６４７、および６７６ｎｍ（Ｋｒイオン）で発光する。また、ガスレーザーには、５４３、５９４、６１２、および６３３ｎｍで発光するヘリウムネオンレーザーも含まれる。固相結晶レーザーからの典型的な出力線には、５３２ｎｍ（ダブルＮｄ：ＹＡＧ）および４０８／８１６ｎｍ（Ｔｉ：サファイアからダブル／一次）が含まれる。半導体ダイオードレーザーからの典型的な出力線は、６３５、６５０、６７０、および７８０ｎｍである。
【０１４１】
励起波長および発光検出波長は、使用されるシグナル伝達部分に依存して変化する。第１および第２のシグナル伝達部分がフルオレセインおよびＤＡＢＣＹＬである１つの実施形態では、励起波長は４８８ｎｍであり、発光波長は５１４ｎｍである。半導体ナノ結晶ベースの蛍光標識の場合には、広くスペクトル的に分離された発光波長で幾つかのプローブを励起するために、単一の励起波長または広帯域ＵＶ光源を使用することができる（Ｂｒｕｃｈｅｚら、１９９８；Ｃｈａｎら、１９９８を参照）。
【０１４２】
１つの実施形態では、核酸センサー分子の光学特性の変化の検出は、冷却ＣＣＤカメラ、冷却強化ＣＣＤカメラ、単一光子カウント検出器（例えば、ＰＭＴまたはＡＰＤ）、または他の光感受性センサーのいずれかを用いて実行される。１つの実施形態では、検出器は、光学顕微鏡（例えば、共焦点顕微鏡）などのレンズシステムによって、標的活性化バイオセンサーへ光学的に結合される。別の実施形態では、光ファイバ結合器が使用され、この場合、光ファイバイへの入力は、基板の上か下のどちらかで、バイオセンサーの基板表面に緊密に近接して配置される。さらに別の実施形態では、光ファイバは、核酸センサー分子の結合のための基板を提供し、バイオセンサーは光ファイバの不可欠な部分である。
【０１４３】
１つの実施形態では、ガラスまたはプラスチックの毛細管の内部表面は、核酸センサー分子結合のための基質を提供する。毛細は断面が円形でも矩形でもよく、任意の寸法を有することができる。バイオセンサーを含有する毛細部分は、種々の洗浄液、緩衝液、および検体含有溶液をセンサー管により注入することができるマイクロ流体の液体処理システムへ統合されることができる。センサーの空間的コード化は、管軸に沿って長手方向、並びに管内周のまわりで半径方向にそれらをパターン化することによって達成することができる。励起は、毛細管を形成するガラスまたはプラスチック層内へレーザー源（例えば、ＶＣＳＥＬからのビームのように、成形された出力ビームを用いる）を結合することによって達成することができる。結合された励起光は、管の内部表面／溶液界面においてＴＩＲを受け、それにより、管壁へ結合された蛍光標識バイオセンサーが選択的に励起されるが、バルク溶液は励起されないであろう。１つの実施形態では、検出は、ＣＣＤなどのレンズ結合型または近接結合型の広域セグメント化（ピクセル化（ｐｉｘｉｌａｔｅｄ））検出器を用いて達成することができる。特定の実施形態では、走査型（すなわち、縦／軸、および方位角）顕微鏡の対物レンズ／発光フィルタの組み合わせを用いて、バイオセンサー基質をＣＣＤ検出器上へイメージングする。異なる実施形態では、発光フィルタをその正面に有する高解像度のＣＣＤ検出器は、バイオセンサーの直接的なイメージングを可能にするために、毛細に極めて緊密に近接して配置される。異なる実施形態では、断面が楕円形の鏡付き管状キャビティを用いて、高効率検出が達成される。センサー管はキャビティの１つの焦点軸に沿って配置され、その正面に発光フィルタを有するサイドウィンドウＰＭＴは、他の焦点軸に沿って配置される。任意の方向でバイオセンサー管から発光される光はキャビティによって集められ、ＰＭＴのウィンドウ上に焦点が合わせられる。
【０１４４】
さらにもう１つの実施形態では、標的活性化バイオセンサーの光学特性は、バイオセンサーと連通するスペクトロメータ（例えば、ルミネッセンススペクトロメータなど）を用いて分析される。スペクトロメータは、モノクロメータ（すなわち、回折格子）または波長帯域通過フィルタのいずれかを用いて、励起および検出のための波長の識別を実行することができる。この実施形態では、バイオセンサー分子は使用中のシグナル標識部分（例えば、４５０ｎｍのアクリジン、４９５ｎｍのフルオレセイン）に適した最大吸収で励起され、使用される標識部位に適切な発光波長で蛍光強度が測定される（例えば、４９５ｎｍのアクリジン、５１５ｎｍのフルオレセイン）。励起波長と発光波長の間における十分なスペクトル分離（すなわち、十分大きいストークスシフト）の達成は、検出感度の最終限界にとって重要である。励起光の強度が発光蛍光の強度よりもはるかに大きいとすれば、検出システムで検出または増幅中の励起光のほんの小さい部分でも、バイオセンサーの弱い蛍光発光シグナルを見えなくするであろう。１つの実施形態では、バイオセンサー分子は溶液中にあり、スペクトロメータ内のマイクロタイタープレート中のキュベットまたはウェルに、ピペットで取られる（手動またはロボットで）。更なる実施形態では、スペクトロメータは、Ｆｕｓｉｏｎ多機能プレートリーダーシステム（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）のように、蛍光またはルミネッセンス強度（１つまたは複数の波長）、時間分解蛍光、蛍光偏光（ＦＰ）、吸収（エピおよび伝送）などの光学変化を検出することができる多機能プレートリーダーである。このようなシステムは、溶液中か、プレートのマイクロエウェル表面へ結合されるか、あるいは固体基板表面に固定化された（例えば、ガラス基板上のバイオセンサーマイクロアレイ）バイオセンサーの光学変化を検出するために使用することができる。ロボットの液体処理およびサンプル操作と結合されたこのタイプのマルチプレート／多基質の検出システムは、特に、ハイスループットで少量のアッセイフォーマットへ修正可能である。
【０１４５】
ガラススライドなどの、またはマイクロアレイフォーマットの基板へ核酸センサー分子が結合された実施形態では、非常に低い強度の蛍光シグナルの検出を可能にするために、迷光またはバックグラウンド光は拒絶されるのが望ましい。１つの実施形態では、少量サンプル（約１０ｎＬ）は、エバネッセント励起または共焦点イメージングのように、適切な光学的構造を用いることによって、空間的識別を得るために探索される。さらに、サンプルと検出器の間の狭い帯域通過波長フィルタの使用によって、および測定システムからの周辺光を除去するために不透明なシールディングを使用することによって、バックグラウンド光を最小限にすることができる。
【０１４６】
１つの実施形態では、基質界面に垂直な方向で基質へ結合された核酸センサー分子の空間的識別（すなわち、バイオセンサー分子の基質表面への結合面の真上および周囲のほんのわずかの厚さの溶液層の励起）は、エバネッセント波励起によって得られる。これは、図１４に示される。エバネッセント波励起は、高屈折率材料と低屈折率材料の間の界面で電磁波が完全に内部反射される場合に低屈折率媒体内へ伝播する電磁エネルギーを利用する。この実施形態では、平行レーザービームは、全内部反射（ＴＩＲ）の臨界角度よりも大きい角度で、基質／溶液界面（バイオセンサーが固定化された）に入射される。これは、適切な形状のプリズムまたは光ファイバ内へ光を方向付けることによって達成することができる。プリズムの場合、図１４に示されるように、基質はプリズムの上側表面へ光学的に結合される（屈折率整合流体によって）ので、バイオセンサーが固定化された基質／溶液界面でＴＩＲが発生する。この方法を用いて、励起は、基質／溶液界面の数百ナノメートル以内へ局在化させることができ、したがって、バルク検体溶液、光学系または基質からの自己蛍光バックグラウンドが除去される。標的認識は、強度変化であれ偏光変化であれ、核酸センサーの蛍光発光の変化によって検出される。界面の平面における（すなわち、ラテラルへの）空間的識別は、光学系によって達成される。
【０１４７】
１つの実施形態では、広い領域のバイオセンサー基質は、エバネッセント波励起または上からのエピイルミネーションのいずれかによって均一に照射され、検出されたシグナルは、ＣＣＤカメラなどのピクセル化検出器の使用によって空間的にコード化される。固体基板上のマイクロアレイ化バイオセンサーの場合、このタイプの均一イルミネーション／ＣＣＤ検出システム（エピイルミネーションを用いる）の一例は、ＧｅｎｅＴＡＣ２０００スキャナ（ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉ）である。異なる実施形態では、小さい領域（例えば、１０×１０ミクロン〜１００×１００ミクロン）のバイオセンサー基質は、マイクロ平行ビームまたは収束スポットによって照射される。１つの実施形態では、励起スポットは静的バイオセンサー基質表面を横切って二次元走査でラスタ処理され、各ポイントで検出された（ＰＭＴなどの積算検出器によって）シグナルは、バイオセンサー基質上のそのポイントの空間的な場所と相関される（例えば、励起スポットの走査を担う機械的位置決めシステムによって）。固体基板上のマイクロアレイ化バイオセンサーの場合、このタイプの移動スポット検出システムの２つの例は、ＤＮＡＳｃｏｐｅスキャナ（共焦点、エピイルミネーション、ＧｅｎｅＦｏｃｕｓ，Ｗａｔｅｒｌｏｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）、およびＬＳ  ＩＶスキャナ（非共焦点、エピイルミネーション、ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）である。さらにもう１つの実施形態では、小さい領域（例えば、１０×１０ミクロン〜１００×１００ミクロン）のバイオセンサー基質は固定マイクロ平行ビームまたは収束スポットによって照射され、バイオセンサー基質は静的励起スポットの下で、二次元走査でラスタ処理され、各ポイントで検出された（ＰＭＴなどの積算検出器によって）シグナルは、バイオセンサー基質上のそのポイントの空間的な場所と相関される（例えば、基質の走査を担う機械的位置決めシステムによって）。固体基板上のマイクロアレイ化バイオセンサーの場合、このタイプの移動基質検出（共焦点のエピイルミネーションを用いる）システムの一例は、ＳｃａｎＡｒｒａｙ５０００スキャナ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｃｈｉｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）である。
【０１４８】
図１４に示される実施形態では、ＴＩＲエバネッセント波励起の光学的構造は、静的基質およびデュアル毛細検出システムとともに実施される。検出システムは、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）の一般的な蛍光顕微鏡のフレーム上に構築される。システムには、一方の光学ポート上の２つのＰＭＴと、他方の光学ポート上に搭載された強化ＣＣＤカメラ（Ｃｏｏｋｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とが備えられる。光学経路は、スポットを形成するために光学系を焦点合わせすることによって、あるいは対物レンズの視点の領域にわたってその中央部分がほぼ均一なより大きい（＞１ｃｍ）ビームを形成するためのビームエキスパンダによって、平行偏光レーザービームを方向付けられる移動可能な鏡を利用する。もう１つの移動可能な鏡は、広い領域の均一イルミネーションを用いる場合には、光を強化ＣＣＤカメラへ方向付け、あるいは走査スポットモードでは、光をＰＭＴへ方向付けることができる。スポット走査モードでは、偏光ビームスプリッタは、発光された蛍光の平行成分と垂直成分を分離し、それぞれをその指定されたＰＭＴへ方向付ける。光学カラム内の発光フィルタは、いずれかのタイプの検出器から散乱された励起光を拒絶する。ＣＣＤイメージングモードでは、顕微鏡の光学カラム内の手動偏光器は平行および垂直画像を得るために調整されなければならず、これから、蛍光偏光または異方性を計算することができる。ソフトウェアプログラムは、ＰＭＴおよびＣＣＤ両方からのデジタル出力データを収集するコンピュータ内のデータ収集ボードとインターフェースで連結する。またこのプログラムは、ＰＭＴ出力、電気機械シャッタ、およびガルバノミラースキャナを制御し、リアルタイムの蛍光偏光を計算およびプロットし、ＦＰおよび強度画像を表示する。図１３に示される画像およびデータは、ＸおよびＹにおいて４０×４０ポイントの解像度で、２．５倍対物レンズ、３０ｍＷのレーザー出力、およびポイント当たり１００ミリ秒の積算時間を用いて収集された。図１２Ｃに示されるＦＰ滴定曲線は、トロンビン特異性バイオセンサースポットに対するものである。測定されたＫｄ値は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％のヒト血清からなる生物体液中で、約１５ｎＭであった。
【０１４９】
もう１つの実施形態では、検出システムは、より大きい領域をイメージングしてバイオセンサー上の異なる結合領域を調査するために、センサー基質のラスタ処理を必要とする単一光子カウンタシステム（例えば、米国特許第６，０１６，１９５号および同第５，８６６，３４８号を参照）である。
【０１５０】
（Ｂ．生理的および薬理的に重要な標的の検出）
生物学的および非生物学的媒体中の全てのセンサーフォーマットにおける全ての所定の標的の検出および／または定量化では、上記の方法に加えて、当該技術分野分野で知られる任意の光学的方法を使用することができる。これらの標的には、例えば、セクション４ＢＩＩの「典型的な経路標的分子に含まれるものの例」という題の表に記載されるものが含まれる。
【０１５１】
（４．核酸センサー分子を使用する方法）
（Ａ．診断アッセイ）
本発明に従う標的活性化バイオセンサーを使用して、適切な核酸前駆体分子の選択において、事実上任意の標的分子を検出することができる。１つの実施形態では、標的分子は病的な状態に関連する標的分子であり、バイオセンサーの核酸センサー分子の光学特性変化の検出は、状態を診断する手段を提供する。特許範囲にあることが企図される標的分子には、例えば、上記のように、タンパク質、修飾型タンパク質、代謝産物、有機分子および金属イオンなどが含まれる。このシステムにおけるシグナル発生は可逆的なので、適切な緩衝液でバイオセンサーを洗浄すれば、バイオセンサーは複数回の使用が可能であり、同じ試薬を何回も使用することができるので、診断アッセイの再生能力が向上される。適切な洗浄緩衝液には例えば標的を含まない結合緩衝液が含まれ、また、より迅速な洗浄のためには、高塩濃度の緩衝液または他の変性条件で洗浄した後、結合緩衝液で再度平衡にする。
【０１５２】
バイオセンサーの再利用は、最適なフルオロフォアを選択することで向上される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓによって製造されるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８は、フルオレセインと比較して同様の光学特性を有するが、寿命がはるかに長い。しかしながら、１つの実施形態では、ヌクレアーゼにより認識される部位はシグナル発生部位に近接して設計され、シグナル伝達部分を含む配列はバイオセンサーから除去され、必要に応じて、新しい配列で置き換えられる。
【０１５３】
（Ｉ．診断アッセイで使用するためのバイオセンサーのプロファイリング）
１つの実施形態では、複数の標的分子の発現パターンが決定され、個体の形質と関連する標的分子のプロファイルを得て、その形質の診断である発現パターンを決定する。この実施形態では、個々の標的分子を標的とするバイオセンサーの組み合わせは、形質の特性である特徴的光学プロファイルが決定されるまで選択される。形質としては、例えば、疾病、遺伝子改変、遺伝子改変の組み合わせ（例えば、多遺伝子障害）、環境条件への生理反応、または野生型状態（例えば、生物体の、または臓器系の）が挙げられる。特徴的光学プロファイルを作成する標的分子は特徴的標的分子として同定される（使用されるバイオセンサーのタイプに基づいて）。したがって、特徴的標的分子の発現を決定して、患者におけるその形質の存在を同定することができる。
【０１５４】
標的分子の発現は当該技術分野分野で知られている任意の分子検出システムを用いて同定することができるが、好ましい実施形態では、検出システムは核酸センサー分子を含み、特徴的光学プロファイルを検出することによって形質が同定される。１つの実施形態では、特徴的光学プロファイルに関連するデータは、コンピュータのメモリに記憶される。特徴的光学プロファイルは、個々の患者に対して作成することもできるし、個体集団に対して作成することもできる。後者の実施形態では、合成の特徴的プロファイル（例えば、正規化データを含む）がコンピュータのメモリ、またはコンピュータプログラムプロダクトに記憶される。
【０１５５】
標的分子の生物学的機能が分かっている必要はないので、その生物学的根拠がまだ分かっていないか、あるいは複雑な多遺伝子的相互作用および／または環境的な影響の結果である疾病／形質の診断に用いる、本発明に従うバイオセンサーを作成することができる。１つの実施形態では、ヒトゲノムプロジェクトおよび／または他の配列決定努力において同定された推定のオープンリーディングフレームから得られる合成ポリペプチドによって活性化可能な核酸センサー分子が同定される。診断用の光シグナルを発生するこれらの活性化可能な核酸センサー分子の組み合わせ（既知の機能を有する標的分子に対して特異的に活性化可能な核酸センサー分子とともに）が同定され、特定の形質へ結合される特徴的な標的分子が次に同定され、まだ特徴付けられていない分子と生物活性を関連させることができる。
【０１５６】
特徴的な標的分子に関連するデータ、または特徴的標的分子への結合時に核酸センサー分子が活性化されて発生した光シグナルへ関連するデータは、データベースに記憶され、特徴的標的分子に関連する配列情報や化学構造情報などの更なる情報を含むことができる。特定の形質に関する特徴的プロファイルは、複数の試験からの正規化データに基づいて作成される。１つの実施形態では、特徴的プロファイルは、健常な個体集団からのサンプル中の疾病に関連する特徴的標的分子のレベル、化学構造、または活性のどれかまたは全てを決定することによって得られ、健常状態に相当する特徴的プロファイルを決定する。更なる実施形態では、特徴的プロファイルは、性別、年齢、環境因子への暴露、民族的背景、および疾患の家族歴に基づいてグループへ分割された集団のサブセットからのデータを用いて得られる。
【０１５７】
（Ｂ．創薬）
一般的に、創薬の方法は、１）疾病に関連する標的（単数または複数）分子を同定する工程と、２）標的分子を確認する（例えば、動物または細胞モデルで疾患を模倣する）工程と、３）その標的に影響を与えるリード化合物を同定するためのアッセイを開発する（例えば、化合物が標的へ結合する能力を評価するためにライブラリを用いるなど）工程と、４）生化学的および細胞試験によって同定されたリード化合物に優先順位をつけて修飾する工程と、５）動物モデルで試験する工程と、６）ヒトで試験する（臨床試験）工程とを含む。ゲノム化学およびコンビナトリアルケミストリの力によって、ハイスループットアッセイで多数のリード化合物を同定することができるが（工程３）、リード化合物に優先順位をつけ、最適化するため、および実際に臨床試験の可能性を提供する化合物を同定するための効果的方法がないので、工程４でボトルネックが生じる。本発明に従う標的活性化可能な核酸センサー分子は、薬剤開発プロセスの各工程で使用することができる試薬を提供することによって、この問題を解決する方法を提示する。最も重要なことに、本発明に従う標的活性化可能な核酸センサー分子は、インビトロ生化学および細胞アッセイからの生化学的データを、生物学的アッセイからの生理的応答に対する薬剤効果と相関させる方法を提供する。
【０１５８】
本発明の１つの実施形態では、患者の疾病形質に関連する標的分子のプロファイルを同定すること、候補化合物を患者へ投与すること、プロファイルの変化をモニターすることを含む、薬剤化合物を同定するための方法が提供される。もう１つの実施形態では、モニターされたプロファイルは、健常な患者または健常患者の集団のプロファイルと比較され、健常な患者（単数または複数）の標的分子のプロファイルと実質的に同様のプロファイルを作成する（ルーチンの統計的試験に基づく）化合物が薬剤として同定される。更なる実施形態では、プロファイリングおよび薬剤同定工程は、標的分子との結合時にその特性が変化する少なくとも１つのセンサー分子を用いて実行される。
【０１５９】
更なる実施形態では、薬剤化合物を同定するための方法は、それぞれが経路に属する複数の経路標的分子を同定し、疾患形質を有する患者において経路標的分子のレベル、化学構造、および／または活性をモニターし、候補化合物を患者へ投与し、経路標的分子のレベル、化学構造、および／または活性の変化をモニターすることを含む。もう１つの実施形態では、モニターされた経路標的分子のレベル、化学構造、および／または活性は、野生型の患者（単数または複数）における経路標的分子のレベル、化学構造、および／または活性と比較される。更なる実施形態では、プロファイリングおよび薬剤化合物の同定は両方とも、経路標的分子への結合時にその特性が変化する少なくとも１つのセンサー分子を用いて実行される。
【０１６０】
この局面に従う特性としては、例えば、光学特性、配列変化、化学構造、触媒活性、および／または分子量などが挙げられる。好ましい実施形態では、センサー分子は標的活性化核酸センサー分子である。
【０１６１】
（Ｉ．リード化合物の同定で使用するための標的活性化バイオセンサー）
１つの実施形態では、上記のように同定され、特徴的標的分子で活性化可能なバイオセンサーが提供され、これらの分子によって発生した光シグナルが特定疾患の診断に用いられることを立証するために、インビトロで多数の患者のサンプルに対して試験することによって確認される。例えば細胞培養においてエキソビボで（米国特許第５，８４３，６５８号、同第５，７７６，７８２号、同第５，６４８，２６９号、および同第５，５８５，２４５号に記載されるように、顕微鏡ベースの検出システムおよび他の光学的システムを用いる）、および／または、例えば光ファイバと連通するプロファイルバイオセンサーを提供することによってインビボで、確認を行うこともできる。
【０１６２】
バイオセンサーの光ファイバ導波管への組み込みは、当該技術分野分野で知られている（例えば、米国特許第４，５７７，１０９号、同第５，０３７，６１５号、同第４，９２９，５６１号、同第４，８２２，７４６号、同第４，７６２，７９９号が参照され、これらの全体は参照によって本明細書中で援用される）。インビボ使用のための蛍光エネルギー移動分子の選択は、例えば、欧州特許出願第６４９８４８号に記載される。この実施形態では、核酸ベースのバイオセンサーは、内視鏡またはカテーテルなどの任意の適切な医療アクセス装置によって体内へ導入される。光ファイバはアクセス装置の作動ルーメン内に提供され、光学イメージングシステムと連通する。
【０１６３】
１つの実施形態では、標的分子／核酸センサー分子の組み合わせの特定セットの診断値を確認するために使用されるのと同じ方法を使用して、薬剤として機能することができるリード化合物を同定する。したがって、１つの実施形態では、標的依存性の光シグナル伝達に対する化合物の効果は、候補化合物による処置の結果生じる特徴的プロファイルの変化を同定するためにモニターされる。
【０１６４】
１つの実施形態では、処置された患者からのサンプルはインビトロで試験されるが、サンプルは、エキソビボまたはインビボで試験されることもできる。バイオセンサーにより同定される診断プロファイルが、疾病の特徴であるプロファイルから、野生型状態の特徴と実質的に同様のプロファイルへ変化する場合（例えば、ルーチン的な統計試験を用いて決定される）、リード化合物は薬剤であると同定される。バイオセンサーを活性化する標的分子は、特徴付けられた活性を有する分子および／または特徴付けをされていない活性を有する分子を含むことができる。多数の標的分子を同時にモニターすることができるので、該方法は化合物が多数の薬剤標的に与える影響を同時に評価する方法を提供し、特定の形質（例えば、疾患または遺伝子改変）に関連する最も敏感な薬剤標的の同定が可能になる。
【０１６５】
適切な標的分子の例としては、例えば、核ホルモンレセプター（ＮＨＲ）ポリペプチド、Ｇ−結合タンパク質レセプター（ＧＰＣＲ）ポリペプチド、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）、ＮＨＲポリペプチドが挙げられる。
【０１６６】
（ＮＨＲポリペプチド）
本発明には、核ホルモンレセプターのコンフォメーションアイソフォームを検出するためのアロステリックリボザイム、シグナル伝達アプタマー、またはアプタマービーコンなどのリボレポーター（ｒｉｂｏｒｅｐｏｒｔｅｒ）を同定する方法と、本明細書中で記載される方法で同定されたリボレポーターとが含まれる。
【０１６７】
核ホルモンレセプター（ＮＨＲ）は、標的遺伝子のＤＮＡ応答要素との複合体で単量体、ホモ二量体、またはヘテロ二量体として直接相互作用することによって、リガンド誘発性転写因子の役割を果たす。これらの転写制御因子の活性化は、リガンドとの複合体形成の際に、ＮＨＲのコンフォメーション変化によって誘発される。
【０１６８】
それぞれのＮＨＲリガンド結合ドメインごとに独特のバイオセンサーを作成するための方法が提供される。本明細書中で記載されるバイオセンサーは、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、Ｌ１リガーゼ、またはグループ１イントロンリボザイムなどに由来するものを含むアロステリックリボザイム（ＡＲ）などのリボレポーターを含むことができ、あるいは、リボレポーターはアプタマービーコンまたはシグナル伝達アプタマー由来のものでもよく、これらはどれも、分子認識を検出可能なシグナルへ変換する。
【０１６９】
また、ＮＨＲファミリーのメンバーの小分子リガンド−アゴニズム、−アンタゴニズム、および部分アンタゴニズムの作用についての直接機械的アッセイも提供される。機械的アッセイは、インビトロ生化学およびインビトロ細胞ベースの設定の両方で機能する。インビトロアッセイ設定では、リボレポーター（アロステリックリボザイム、シグナル伝達アプタマー、またはアプタマービーコン）は、ＮＨＲの１つのコンフォメーション異性体を認識するように設計される。１つの実施形態では、リボレポーターは、エストロゲンへ結合する際にエストロゲンレセプターリガンド結合ドメインＥＲ（ＬＢＤ）で観察されるような、ホルモンレセプターのアゴニスト結合型のために存在する唯一のコンフォメーションを認識し（Ｓｈｉａｕ  ＡＫ，Ｂａｒｓｔａｄ  Ｄ，Ｌｏｒｉａ  ＰＭ，Ｃｈｅｎｇ  Ｌ，Ｋｕｓｈｎｅｒ  ＰＪ，Ａｇａｒｄ  ＤＡ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＧＬ．Ｃｅｌｌ．１９９８  Ｄｅｃ  ２３；９５（７）：９２７−３７）、次に、蛍光標識オリゴヌクレオチド、放射標識オリゴヌクレオチドの遊離などの検出可能なシグナルを生成するか、あるいは蛍光変化などによってリガンド結合で推進されるリボレポーターコンフォメーションの変化を明らかにする。したがって、この実施形態では、リボレポーターは、ＥＲ−エストロゲンアゴニスト複合体の分子認識を検出可能なシグナルに変換する。次に、シグナルのレベルを用いて、溶液中に存在するＥＲ−エストロゲンアゴニスト複合体の量を定量化する。もう１つの実施形態では、ＥＲ−エストロゲン特異性リボレポーターは、ＥＲ−エストロゲン複合体形成の阻害剤を検出するように設計されたアッセイにおいてスクリーニング手段として使用される。これらのスクリーニング手段は、インビトロ生化学アッセイまたはインビトロ細胞ベースのアッセイにおいて、化合物の阻害効力を決定するために使用することができる。ＥＲ（ＬＢＤ）へ結合するエストロゲンの阻害剤は、乳がん（例えば、タモキシフェン）および他のエストロゲン依存性疾患の治療のための抗増殖剤として有用である。もう１つの実施形態では、リボレポーターは、形質導入、トランスフェクション、もしくはタット（ｔａｔ）またはアンテノペアディア（ａｎｔｅｎｏｐｅａｄｉａ）ペプチドなどのペプチド転位剤への結合などの既知の方法で細胞系に導入される。もう１つの実施形態では、ＥＲ−エストロゲン複合体特異性リボレポーターは、ＧＦＰまたはルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子などに包埋されたアロステリックイントロンである。イントロン由来リボレポーターはレポーター遺伝子内で発現される場合、レポーター遺伝子発現をエフェクタ依存性であるとみなす。したがって、１つの実施形態では、機能性ＧＦＰタンパク質は、ＥＲ−エストロゲン複合体が細胞中に存在する場合にのみ発現され、したがって、ＥＲ−エストロゲン複合体形成の阻害剤は、ＭＣＦ７またはＴ４７Ｄなどの適切な哺乳類、酵母、または細菌の細胞系において機能性ＧＦＰタンパク質の発現を阻止する。更なる実施形態では、ＧＦＰ−ＥＲ−エストロゲンリボレポーター感受性構築物でトランスフェクトされたＭＣＦ７またはＴ４７Ｄ腫瘍細胞系を使用して、ヌードマウスにおいて腫瘍異種移植を形成する。したがって、トランスフェクトされた腫瘍異種移植細胞系を使用して、エストロゲン依存性であるだけでなく、ＥＲ−エストロゲンに依存してレポーター遺伝子発現も調節する腫瘍をマウスに形成することができる。これらの細胞系および腫瘍モデルを使用して、インビボでＥＲ−エストロゲン複合体形成の阻害剤を発見する。
【０１７０】
ＮＨＲリガンド結合ドメインはアンタゴニストと結合し、更なるコンフォメーション異性体を形成する。アンタゴニストがレセプターへ結合されると、タモキシフェンがエストロゲンレセプターへ結合して安定なＥＲ−タモキシフェン複合体を形成する際に観察されるように、新しい配座異性体が得られる（Ｓｈｉａｕ  ＡＫ，Ｂａｒｓｔａｄ  Ｄ，Ｌｏｒｉａ  ＰＭ，Ｃｈｅｎｇ  Ｌ，Ｋｕｓｈｎｅｒ  ＰＪ，Ａｇａｒｄ  ＤＡ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＧＬ．Ｃｅｌｌ．１９９８  Ｄｅｃ  ２３；９５（７）：９２７−３７）。したがって、本発明には、上記のように、インビトロの生化学的、細胞ベースのアッセイ、およびインビボアッセイにおいてアンタゴニスト特異性複合体のレベルを検出するために使用されるＥＲ−タモキシフェン特異性リボレポーターの使用が含まれる。
【０１７１】
全てのＮＨＲのリガンド結合ドメインに特異的なリボレポーターを開発することができる。さらに、アゴニスト、アンタゴニスト、二量体または多量体型のＮＨＲ  ＬＢＤのためのリボレポーターを使用して、ＬＢＤ機能の阻害剤について、それによりＮＨＲ依存性の転写活性化または抑制の阻害剤についてスクリーニングすることができることは明らかなはずである。個々のＬＢＤ複合体に特異的なリボレポーターを使用して、インビトロおよびインビボアッセイにおいてＮＨＲ機能を変更する作用物質についてスクリーニングすることができることは、当業者には明らかなはずである。
【０１７２】
ＮＨＲは、可変ＮＨ２−末端領域（Ａ／Ｂ）と、保存ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）または領域Ｃと、リンカー領域Ｄと、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む保存領域Ｅとを含むマルチドメインタンパク質である。またＮＨＲは転写活性化に必要とされる領域も含み、特に重要なのは、ＣＯＯＨ−末端に配置され、その機能がリガンドに厳密に依存する領域ＡＦ−２である。６３個の既知のヒトＮＨＲｍＬＢＤのそれぞれに対して独自のリボレポーターを作製するための方法が本明細書中で提供される。さらに、活性化または不活性化コンフォメーション（結合リガンドを有するＮＨＲ）のどちらかの存在を示すが、そのシグナル伝達作用はＮＨＲの他の形の存在下では休止しているリボレポーター幾何学の選択により、ＮＨＲの活性化状態を認識することができるリボレポーターの作製を可能にする方法が記載される。
【０１７３】
リボレポーターは、全てのＮＨＲの活性化状態の直接的で同時、かつ高速の検出を可能にする。この手段は、アゴニストおよびアンタゴニストによるレセプター活性化についてのインビトロアッセイにおいて使用でき、生物学的設定において、および薬剤または薬剤リードの機能として、このようなレセプターの活性状態について報告する細胞株および動物モデルを作製するために使用することができる。
【０１７４】
（ＧＰＣＲリボレポーター）
また本発明によって、Ｇタンパク質共役レセプターのコンフォメーション異性体検出のための、アロステリックリボザイム、シグナル伝達アプタマー、またはアプタマービーコンのようなリボレポーターも提供される。
【０１７５】
Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、事実上全ての細胞の活性を調節する際に基礎的な役割を果たす。細胞外リガンドの結合の際には、ＧＰＣＲはヘテロ三量体Ｇタンパク質の特定のサブセットと相互作用をし、これは次に、その活性化型において、種々のエフェクタ酵素および／またはイオンチャネルを阻害または活性化することができる。分子クローニング研究は、多数のヒトＧＰＣＲについて同定しており、これらの多くに対するリガンドを同定している。
【０１７６】
ＧＰＣＲには、細胞外Ｎ末端、７回膜貫通ヘリックスの中央ドメイン、および細胞質Ｃ末端の３つのドメインが含まれる。ＧＰＣＲの活性化はリガンド結合によって誘発され、これによりレセプターのコンフォメーション変化が生じ、細胞質ヘリックスＩＩおよびＩＩＩ、ならびにヘリックスＶＩＩが露出される。本発明は、各ＧＰＣＲに対して唯一のバイオセンサーを作製するための方法を提供する。本明細書中で記載されるバイオセンサーには、ハンマーヘッド、ヘアピン、Ｌ１リガーゼ、またはグループ１イントロンリボザイムなどに由来するようなアロステリックリボザイム（ＡＲ）などのリボレポーターが含まれ、あるいはリボレポーターは、アプタマービーコンまたはシグナル伝達アプタマー由来のものでもよく、そのトランスデューサ分子は、認識を検出可能なシグナルへ変換する。
【０１７７】
細胞外リガンドまたは刺激による活性化の際、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）ポリペプチドは、細胞内Ｇαタンパク質を活性化する。ＧＰＣＲは多数のＧαタンパク質を活性化することができる。例えば、アドレナリン作用性レセプターは、アデニリルシクラーゼを阻害するＧｉ、アデニリルシクラ−ゼを刺激するＧｓ、および細胞のＣａイオンレベルを調節するＧｑを活性化する（Ｗｅｎｚｅｌ−ＳｅｉｆｅｒｔおよびＳｅｉｆｅｒｔ  ２０００）。したがって、細胞中の所定のＧＰＣＲにより活性化されるＧαタンパク質の種類を区別することが非常に望ましい。
【０１７８】
ＧＰＣＲの最初の薬剤スクリーニングは、通常、放射標識リガンドとの競合アッセイによって実行される。細胞ベースのＧＰＣＲアッセイでは、放射標識ＧＴＰの組み込みは、Ｇαタンパク質およびＧＰＣＲの結合を検出するために測定することができるが、このアッセイは関連されるＧαタンパク質のタイプを区別しない。Ｃａ＋＋流動または細胞ｃＡＭＰレベルのような、個々のエフェクタに与える効果についてのアッセイも使用されるが、選択された下流シグナルだけが一度に測定することができる。
【０１７９】
活性化の際には、Ｇαタンパク質は顕著なコンフォメーション変化を起こし、これは、ＧＤＰの遊離およびＧＴＰとの会合をもたらす（ＣｏｌｅｍａｎおよびＳｐｒａｎｇ  １９９８）。また、そのβγ−サブユニットから解離する。Ｇαタンパク質のこの活性化型は、次に、そのエフェクタと相互作用をできるようになる（Ｌｉ，Ｓｔｅｒｎｗｅｉｓら  １９９８）。十分に特徴付けられたコンフォメーション変化は、スイッチＩ（Ｇｉα１の残基１７７−１８７）、スイッチＩＩ（Ｇｉα１の残基１９９−２１９）、およびスイッチＩＩＩ（Ｇｉα１の残基２３１−２４２）の３つのスイッチにおいて発生する。これらのスイッチの配列およびコンフォメーション変化は、Ｇαタンパク質の間で十分に保存される。
【０１８０】
ｒａｓは小さいＧＴＰａｓｅタンパク質のメンバーであり、顕著な類似性を共有する。ＧＴＰ−結合ｒａｓおよびＧＤＰ結合ｒａｓは、Ｒａｆ−１のＲＢＤ（ｒａｓ結合ドメイン）によって区別することができる（Ｔａｙｌｏｒ，Ｒｅｓｎｉｃｋら  ２００１）。Ｒａｐ１の活性化状態は、ＲａｌＲＤＳによって同定することができる（Ｆｒａｎｋｅ，Ａｋｋｅｒｍａｎら１９９７）。これはタンパク質表面に顕著な変化を示し、エフェクタ結合表面は、ＧＴＰ複合体型における相互作用にのみ利用可能である。
【０１８１】
本発明は、ＧＴＰ結合におけるコンフォメーション変化を認識し、および／または、活性化の際に新たに露出したＧタンパク質エフェクタ結合部位と特異的に相互作用する、リボレポーターを選択するための方法を提供する。種類特異性の活性化Ｇαタンパク質リボレポーターは、活性化Ｇαタンパク質またはそのエフェクタ結合部位を認識し、これにより、ＧＰＣＲによる下流シグナルの影響の多数の型が解釈可能になる。それは、インビトロ  ＨＴＳおよび細胞ベースのＨＴＳの両方で使用することができる。
【０１８２】
また、ＧＰＣＲファミリーのメンバーの小分子リガンドのアゴニズム、アンタゴニズムおよび部分的アンタゴニズムの作用についての直接機械的アッセイを開発するための方法が記載される。機械的アッセイは、インビトロ生化学およびインビトロの細胞ベースの設定の両方で機能する。インビトロアッセイ設定では、リボレポーター（アロステリックリボザイム、シグナル伝達アプタマー、またはアプタマービーコン）は、ＧＰＣＲの１つのコンフォメーション異性体を認識するように設計される。
【０１８３】
１つの実施形態では、人工リガンドイソプロテレノールと複合体化される場合にβ−２アドレナリン作用性レセプターで観察されるように（Ｇｈａｎｏｕｎｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９８：５９９７−６００２（２００１））、リボレポーターは、リガンドと複合体化される場合の活性化状態で存在する唯一のコンフォメーションを認識し、次に、蛍光標識オリゴヌクレオチド、放射標識オリゴヌクレオチドの遊離のように検出可能なシグナルを生成する。あるいは、蛍光変化などによるリガンド結合によって促進されるリボレポーターコンフォメーションの変化を明らかにする。したがって、この実施形態では、リボレポーターは、エピネフリン、ノルエピネフリン、またはイソプロテレノールなど人工リガンドと複合体化したβ−２アドレナリン作用性レセプターの分子認識を検出可能なシグナルへ変換する。次に、シグナルのレベルを使用して、溶液中に存在するβ−２アドレナリン作用性レセプター−アゴニスト複合体の量を定量化する。
【０１８４】
もう１つの実施形態では、β−２アドレナリン作用性アゴニストリボレポーターは、β−２アドレナリン作用性レセプターのアゴニストを検出するために設計されたアッセイにおけるスクリーニング手段として使用される。これらのスクリーニング手段は、インビトロ生化学アッセイ、またはインビトロ細胞ベースのアッセイにおいて化合物の活性化効力を決定するために使用することができる。β−２レセプターのアゴニストは、喘息の治療において有用である（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：２００７−２０１１（２００１））。もう１つの実施形態では、リボレポーターは、形質導入、トランスフェクション、あるいはタットまたはアンテナポエディア（ａｎｔｅｎｎａｐｏｅｄｉａ）ペプチドなどのペプチド転位剤への結合などの既知の方法で細胞株に導入される。
【０１８５】
もう１つの実施形態では、β−２アドレナリン作用性レセプター−アゴニスト複合体特異性のリボレポーターは、ＧＦＰまたはルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子などに包埋されたアロステリックイントロンである。イントロン由来レポーターがレポーター遺伝子内で発現される場合、レポーター遺伝子発現をエフェクタ依存性であるとみなす。したがって、１つの実施形態では、機能性ＧＦＰタンパク質は、β−２アドレナリン作用性レセプター−アゴニスト複合体が細胞中に存在する場合にのみ発現され、したがって、β−２アドレナリン作用性レセプター−アゴニスト複合体形成の阻害剤は、哺乳類ヒト末梢血白血球、酵母、昆虫、または細菌細胞株などの適切な細胞において機能性ＧＦＰタンパク質の発現を阻止する。
【０１８６】
更なる実施形態では、β−アドレナリン作用性レセプターを発現しないチャイニーズハムスター繊維芽細胞（Ｓｈｅｐｐａｒｄら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８０：２３３−２３６（１９８３））は、構成的プロモータの下でリボレポーターとβ−アドレナリン作用性レセプターをコードする遺伝子とでトランスフェクトされ、候補のβ−２アゴニストのＨＴＳスクリーニングに適切なモデル細胞株を形成するために使用される。さらに、肥満に関連するｇｌｎ２７−ｇｌｕなどの既知の対立形質改変体を細胞に発現させることができ（Ｌａｒｇｅら，Ｊ  Ｃｌｉｎ．ｉｎＶｅｓｔ  １００：３００５−３０１３）、特定の疾病状態をモデリングする細胞株が形成される。さらには、「ノックイン」（Ｍｏｎｒｏｅら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：２０１−２１２（１９９９））によって、胚盤胞融合の結果全ての細胞中にリボレポーターを発現する（Ｃｈｅｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：４５２８−４５３２（１９９３））であろうキメラマウスを作製することができ、これは、生物体の種々の組織のＧＰＣＲ活性化状態が対象である薬動力学または生物学的利用の研究に使用される。
【０１８７】
ＧＰＣＲはアンタゴニストと結合し、これは、ＧＰＣＲをコンフォメーション変化に対して耐性にし、または活性化に感受性でないコンフォメーションをもたらし、あるいは、リガンド結合ドメインを適切なリガンドとの相互作用から遮断し、これにより、β−２アドレナリン作用性レセプターアンタゴニストのブトキサミンなどのＧＰＣＲの活性化を防止する（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６２：９８−１０２（２００１））。したがって、本発明は、アンタゴニストへのＧＰＣＲの結合から生じる配座異性体を検出するためにリボレポーターを使用するための方法も提供する。さらに、ｌｙｓ２７２−ｔｏ−ａｌａなどの自発的に活性コンフォメーションをとるＧＰＣＲの変異体改変体を用いて上記の細胞株がトランスフェクトされる（Ｐｅｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：２６９９−２７０２（１９９４）、およびその中の参考文献）場合、β−２アンタゴニストである化合物のスクリーニングにおいて、リボレポーターを使用することができる（Ｒａｍｓａｙら，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３３：３１５−３２３（２００１））。β−２レセプターのアンタゴニストは、心臓血管疾患の治療において有用である（Ｎａｇａｔｏｍｏら，ＣａｒｄｉｏＶａｓｃ  Ｄｒｕｇ  ＲｅＶ  １９：９−２４（２００１））。したがって、本発明はβ−２アドレナリン作用性レセプター−ブトキサミン複合体に特異性のリボレポーターを使用するための方法を提供し、上記のようにインビトロ生化学、細胞ベース、およびインビボアッセイおいて、アンタゴニスト特異性複合体のレベルを検出するために使用される。
【０１８８】
また、全てのＧＰＣＲのリガンド結合ドメインの占有状態に対して特異的なリボレポーターを開発することできる。さらに、全てのＧＰＣＲのアゴニスト、アンタゴニスト、二量体または多量体型のためのリボレポーターを使用して、ＧＰＣＲ機能の阻害剤または活性化剤をスクリーニングでき、したがって、ＧＰＣＲ依存性の細胞シグナル伝達経路の阻害剤または活性化剤をスクリーニングすることができる。個々のＧＰＣＲ複合体に特異的なリボレポーターは、さらに、インビトロおよびインビボアッセイでＧＰＣＲを修飾する作用物質をスクリーニングするために使用することができる。
【０１８９】
ＧＰＣＲは、概して、細胞外Ｎ末端と、細胞質Ｃ末端と、非構造化ループによって接続された７回膜貫通ヘリックスを有する中央ドメインとの３つのドメインに分割される。ＧＰＣＲ活性化の際には、ループＣ−ＩＩおよびＣ−ＩＩＩならびにヘリックスＶＩＩは細胞質的に利用することができるようになる。本明細書中で記載される方法によって、どのＧＰＣＲに対しても唯一のリボレポーターを作製することが可能になる。さらに、可動ドメインの１つまたは全ての認識によりレセプターの活性化コンフォメーションの有無を示すが、そのシグナル伝達作用はＧＰＣＲの他の形の存在下では休止しているリボレポーター幾何学を選択することによって、ＧＰＣＲの活性化状態を認識することができるリボレポーターの作製を可能にする方法が記載される。
（ホスホジエステラーゼ特異性リボレポーター）
多種類のホスホジエステラーゼがヒトにおいて同定されている。これらの酵素は、第２のメッセンジャｃＡＭＰおよびｃＧＭＰを５’−ＡＭＰおよび５’−ＧＭＰへ転換する反応を触媒する。異なる種類のＰＤＥは、異なる基質特異性ならびに異なる生理的機能を有する。例えば、ＰＤＥ４はｃＡＭＰに特異的であり、ＰＤＥ５はｃＧＭＰに特異的である。
【０１９０】
本発明は多種類のＰＤＥリボレポーターを提供する。第１の種類のリボレポーターは、ｃＡＭＰ対５’ＡＭＰ（ｃＧＭＰ対５’ＧＭＰ）を区別することができる（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｋｅｒｒら１９９９）（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｓｏｕｋｕｐら  １９９９）。第２の種類のリボレポーターは、種類特異性であるようにＰＤＥの活性部位へ結合し、ＰＤＥ触媒活性を阻害する。この種類のリボレポーターは、高親和性の既知の阻害剤（例えば、ＰＤＥ４に対するＲｏｐａｌｉｍ）の存在および非存在下でＰＤＥを用いて産生することができる。第３の種類のリボレポーターは、種類特異性か（例えば、ＰＤＥ１−１１）、またはサブクラス特異性（ＰＤＥ４Ａ−Ｄ）であるように、ＰＤＥを認識する。
【０１９１】
（プロテインキナーゼ特異性リボレポーター）
また本発明は、プロテインキナーゼに対して産生されるリボレポーターを提供する。１つの実施形態では、本発明は、所与のペプチド配列におけるリン酸化状態に感受性のリボレポーターを提供する。あるいは、リン酸化状態に感受性のリボレポーターを産生するために、天然タンパク質を異なるリン酸化状態で使用することができる。例えば、ＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２は、特定のリボレポーターによって区別することができる（Ｓｅｉｗｅｒｔ，Ｓｔｉｎｅｓ  Ｎａｈｒｅｉｎｉら  ２０００）。またリボレポーターは、ＡＴＰまたは基質結合部位で結合することによってキナーゼの競合阻害剤でもよい。
【０１９２】
あるいは、ＡＤＰ依存性のリボレポーターは、より低いｐＨで得ることができる。これらのリボレポーターはＡＤＰの産生を検出するために使用することができる。
【０１９３】
（ＩＩ．経路プロファイリングバイオセンサー）
図７に示されるように、生理的機能は、多数の重複および交差工程をそれぞれが有することができる複雑な経路によって調節される。さらに、これらの経路に関与するタンパク質は相同性が高く、重複する基質および薬剤特異性を有することができる。現在の技法を用いると、経路の単一要素の応答をモニターすることだけが可能である。これらの技法は薬剤の相互作用のメカニズムを理解するためには不十分である。例えば、生化学アッセイで単一の標的に対して特定のインビトロ活性を有することが分かっている特定の薬剤は、同じ経路または他の非関連経路の他のタンパク質と相互作用をするかもしれない。したがって、生理的機能は、単一標的の生化学アッセイの結果と相関しないことが多い。
【０１９４】
本発明に従う核酸センサー分子は、分子経路内の全ての成分のレベルおよび化学状態を同時に定量化するための試薬を提供する。本明細書で使用される場合、「経路標的分子」は同一経路に含まれる標的分子であり、その蓄積／活性および／または化学構造は他の経路標的分子に依存する、あるいはその蓄積／活性および／または化学構造は、他の経路標的分子の蓄積／活性および／または化学構造に影響を与える。本発明に従う経路標的分子には、例えば、酵素などのタンパク質、リン酸化、硫酸化、リボシル化タンパク質、メチル化タンパク質（Ａｒｇ、Ａｓｐ；Ｎ、Ｓ、またはＯ指向性）、プレニル化タンパク質（例えば、ファルネシル、ゲラニルゲラニルおよび他のタイプのプレニル化）、アセチル化またはアシル化タンパク質などの修飾型タンパク質、切断または分割タンパク質、結合または非結合型タンパク質、タンパク質の対立遺伝子改変体（例えば、タンパク質中の単一のアミノ酸変化によって互いに異なるタンパク質）、ならびに、酵素（タンパク質および非タンパク質分子を含む）の基質、中間体、および産物が含まれる。
【０１９５】
もう１つの実施形態では、特徴的経路標的分子は、経路特異性標的分子により活性化可能な複数の核酸センサー分子をあらかじめ選択することによって同定される。１つの実施形態では、経路内のあらゆる分子種のレベル、化学構造、および／または活性をモニターすることができるバイオセンサーを作製するために、経路（例えば、シグナル伝達経路）内のあらゆる分子種に特異的な少なくとも１つの核酸センサー分子を含む経路プロファイリングバイオセンサーが提供される。
【０１９６】
有限数の標的分子（ヒトゲノムプロジェクトから得られるデータより決定される）および本発明のハイスループットバイオセンサー（１０，０００より多い標的分子を同時にモニターすることができる）のために、本発明の経路プロファイリング１０バイセンサーは、薬剤化合物に対する経路の全ての成分の応答を同時に評価することを実現可能にする。
【０１９７】
１つの実施形態では、経路全体の成分に反応する経路プロファイリングバイオセンサーは、疾病を有する患者からのサンプルが接触され、その疾病の診断となる特徴的経路標的分子を同定するために、疾病状態に相当する光シグナルが決定される。複数の患者からのサンプルが得られ、疾病の診断となる経路プロファイルを同定するために、経路プロファイリングバイオセンサーを用いて試験される。経路プロファイルには、特徴的経路分子のレベル、構造、および活性のどれかまたはすべてに関連する正規化データが含まれる。野生型状態に相当する経路プロファイルは、健常患者の集団または健常患者集団のサブセットからのサンプルに対して経路プロファイリングバイオセンサー分子を試験して決定される。１つの実施形態では、特徴的経路標的分子で活性化された核酸センサー分子によって発生された光シグナルに関連するデータは、コンピュータのメモリ内、またはコンピュータプログラム製品内に記憶される。
【０１９８】
上記のように、経路プロファイルは診断試験において使用することができる。１つの実施形態では、経路が、特定の形質を有する（例えば、特定の疾病または遺伝子改変（単数または複数）を有する）患者で破壊されていることが分かっているか予測される経路である経路プロファイリングバイオセンサーが使用される。例えば、１つの実施形態では、心臓血管疾患の患者からのサンプルを評価するために使用される１つの経路プロファイリングバイオセンサーは、コレステロール代謝経路プロファイリングバイオセンサーである。しかしながら、その分子的基礎がまだ同定または特徴付けされていない疾病の診断である特徴的経路プロファイルを同定するために、経路プロファイリングバイオセンサーのランダムな組み合わせを使用して、患者の生理的状態を評価することができる。
【０１９９】
１つの実施形態では、本発明に従う経路プロファイリングバイオセンサーは、特徴的経路標的分子のレベル、化学構造、または活性のどれかまたは全てに対する候補薬剤の影響を評価して、薬剤処置経路プロファイルを作製するために使用される。この実施形態では、経路プロファイリングバイオセンサーは、細胞または生理的系（細胞群、組織系、臓器系、または患者）からのサンプルと接触され、上記のように、得られた光シグナルを核酸センサー分子のアドレスへ関連させることによって、特定の経路標的分子のレベル、化学構造、または活性のどれかまたは全てと相関する光シグナルの変化が得られる。１つの実施形態では、健常患者集団から得られる特徴的経路プロファイルと実質的に同様（９５％の信頼水準内で、ルーチン統計試験によってプロファイル中に有意差が観察されないことで決定される）の薬剤処置プロファイルは、候補薬剤を更なる試験に適切であると同定するために使用される。このような薬剤で作製されたプロファイルを使用して有効な薬剤処置プロファイルを作製し、これに対して他の候補薬剤を比較させることができる。
【０２００】
もう１つの実施形態では、他の経路プロファイルにおける有意な変化を生じることなく有効な薬剤処置プロファイルを作製する薬剤を同定するために、候補薬剤は、診断特徴的プロファイルを作製するはずのものを含む複数の経路バイオセンサーに対して試験される。この実施形態では、候補薬剤の全身的な効果を予測することができる。
【０２０１】
更なる実施形態では、経路全体を示すのではないバイオセンサーを使用するのが望ましい。１つの実施形態では、特徴的経路標的分子に特異的な核酸センサー分子を含むバイオセンサーが提供される。更なる実施形態では、疾病に関係することが推測される経路の特定の成分を評価するのに必要な核酸センサー分子を含むバイオセンサーが提供される。例えば、欠陥ＤＮＡ修復に関する疾病を改善する効力のある候補薬剤を同定するためにスクリーニングされている化合物は、Ｓ期細胞周期標的分子に反応性の核酸センサー分子だけを含む経路バイオセンサーに対して試験され得る。
【０２０２】
典型的な経路標的分子としては、例えば以下のものが挙げられる。
【０２０３】
【表１】
2004527220.tif 000002
所望されるならば、標的活性化可能なセンサー分子（本明細書中ではリボレポーターとも呼ばれる）は、ポリペプチドの特定のアミノ酸配列に対して産生されることもできる。幾つかの代表的なペプチド領域は以下に示される。
【０２０４】
【表２】
2004527220.tif 000003
１つの実施形態では、細胞周期経路の成分によって活性化可能な標的活性化可能な核酸センサー分子を含む経路バイオセンサーレイが作製される。この実施形態では、ＭＰＳ、細胞分裂停止因子（ＣＳＦ）（ＭＯＳを含む）、ｃｄｋ４、サイクリンＤＩ−３、ｃｄｋ６、ｃｄｋ２、サイクリンＥ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ、ｐ２’７、Ｅ２Ｆ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、ｃｄｋ１、サイクリンＢ１−３、Ｃｄｃ２、ＳＰＡ−１、および細胞周期調節に関与する他の生体分子からなる群から選択される少なくとも２つのメンバーによって活性化可能な核酸センサー分子を含む細胞周期バイオセンサーが作製される。
【０２０５】
もう１つの実施形態では、作製される細胞周期バイオセンサーレイは、細胞増殖に影響を与える障害（例えば、がん）を有することが推測される患者からの１０個のサンプルを評価するために使用され、この障害の診断である特徴的標的分子プロファイルが決定される。次に、がん治療において使用するためのリード化合物を同定および／または確認するために、上記のように、インビトロ、エキソビボおよびインビボ方法のどれかまたは全てによって、候補化合物による処置の際の特徴的標的分子プロファイルの変化がモニターされる。
【０２０６】
更なる実施形態では、細胞周期の異なる部分を同定する標的分子によって活性化可能な核酸センサー分子のセットをそれぞれの場所が含む、複数の場所を備えた細胞周期バイオセンサーが提供される。したがって、１つの実施形態では、細胞周期バイオセンサーは、第１の場所にＧ０特異性標的分子（例えば、ＭＰＳ、細胞分裂停止因子（ＣＳＦ）（Ｍｏｓを含む））によって活性化可能な核酸センサー分子を含み、第２の場所にＧ１特異性標的分子（ｃｄｋ４、サイクリンＤ１−３、ｃｄｋ６、ｃｄｋ２、サイクリンＥ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ、ｐ２７、Ｅ２Ｆ）によって活性化可能な核酸センサー分子を含み、第３の位置にＳ特異性標的分子（例えば、サイクリンＡ／ＣＤＫ２、サイクリンＢ／Ｃｄｃ２、ＳＰＡ−）によって活性化可能な核酸センサー分子を含み、第４の位置にＧ２特異性標的分子（例えば、ｃｄｋ１、サイクリンＢ１−３、サイクリンＡ）によって活性化可能な核酸センサー分子を含み、第５の位置にＭ特異性標的分子（例えば、Ｃｄｃ２、サイクリンＢ）によって活性化可能な核酸センサー分子を含む。このようにして、細胞周期の特定の相に対する疾病および／または薬剤の効果を評価することができる。
【０２０７】
同様に、上に記載された典型的な標的分子、またはそれぞれの経路の他の標的分子成分を用いて、経路特異性バイオセンサーは、アポトーシス経路、血液凝固経路、カルシウム調節経路、コレステロール代謝経路、ｆｉｔ５  ３経路、ＪＡＫＩＳＴＡＴＳシグナル伝達経路、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路、ｐ５３経路、Ｐ１３キナーゼ経路、ｒａｓ活性化経路、ＳＩＰシグナル伝達経路、ＳＨＣシグナル伝達経路、ＴＧＦ−１３シグナル伝達経路、Ｔ細胞レセプター複合体、およびＭＨＣ−Ｉ経路のどれに対しても作製することができる。
【０２０８】
その成分が特徴付けられている他の多くの経路が存在し、これらの経路内の標的分子も範囲内に包含される（例えば、ホスファターゼ経路、転写因子経路、ホルモン依存性経路、ならびに中間代謝経路、および発達経路が含まれるが、これらに限定はされない）ことは、当業者には明らかなはずである。さらに上記で論考された核酸ベースのバイオセンサープロファイリング技法を用いて更なる経路を同定でき（例えば、心臓血管系、中枢神経系、消化器系、生殖器系、呼吸器系（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）、および皮膚系などの、野生型または病変臓器系の機能性に関係する経路分子を同定する）、これらもまた本発明の範囲内に包含される。
【０２０９】
あるいは、またはさらに、経路特異性分子は、当該技術分野分野で既知の他の技法（例えば、米国特許第６，０８７，４７７号、同第６，０５４，５５８号、同第６，０４８，７０９号、および同第６，０４６，１６５号を参照）によって同定でき、更なる経路標的活性化可能な核酸センサー分子を操作するために使用することができる。各経路には有限数の経路標的分子が存在するので（同定された遺伝子産物の絶対数によって抑制される）（例えば、Ｄｒｅｗｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１９６０−１９６４を参照のこと）、経路全体を表すバイオセンサーを作製するために、標的活性化可能な核酸センサー分子を使用することは実現可能である。
【０２１０】
更なる実施形態では、経路バイオセンサーのセットを使用して、複合系を表す標的分子の発現／活性をモニターする。従って、例えば、心臓血管系および呼吸器系に対する標的分子の効果は、同時にモニターすることができる。１つの実施形態では、体内の多数の系に対する薬物化合物の効果を評価するための方法において、ヒトの体内の複数の系を表すアレイが使用される。
【０２１１】
（ＩＩＩ．薬物最適化における経路核酸センサー分子の使用）
本発明に従う経路核酸センサー分子は、図８に示されるように、薬物最適化プロセスの全ての工程において使用でき、従来のハイスループットスクリーニングシステムでの使用に適切な試薬であり、単独での使用または他の薬物開発アッセイとの併用に対してそれらを極めて適合可能にする。
【０２１２】
（工程１．薬物標的の発見または薬物標的の確認）
上記で論考したように、経路核酸センサー分子は、疾病などの特定形質の診断となる特徴的標的分子を同定するために使用することができる。特徴的標的分子は薬物標的であり、そのレベル、構造および／または活性は、化合物の効力を評価するために使用することができる。多数の特徴的薬物標的は、特徴付けされていてもいなくても、１つの実施形態に従う単一経路バイオセンサーを用いて同時に同定することができる。１つの実施形態では、経路バイオセンサーは約１〜５，０００個の分子を認識し、それらによって独立的に活性化される。別の実施形態では、経路バイオセンサーは約５００〜１０，０００個の分子を認識し、それらによって独立的に活性化され、１つの実施形態では、１０，０００個の分子よりも多い。
【０２１３】
（工程２．ハイスループットスクリーニング）
１つの実施形態では、工程１で同定された薬物標的は、薬物標的の生物活性を特徴付けるために、溶液ベースのバイオセンサーまたは基質ベースのバイオセンサーのいずれかを用いて、ハイスループットスクリーニングアッセイで評価される。例えば、１つの実施形態では、核酸センサー分子は、野生型対疾病状態において、基質、産物、および酵素により産生される中間体のレベルを評価して、その標的に作用する薬物により影響される経路の他の成分（すなわち、第２の薬物標的）を同定するために使用される。別の実施形態では、薬物標的の全ての修飾型、または薬物標的の活性型及び不活性型（例えば、レセプター）のレベル、構造、および／または活性は、特徴的経路標的分子の診断プロファイルをさらに開発するため、および薬物の存在下でそのプロファイルの変化を評価するために、野生型対疾病状態において決定される。
【０２１４】
更なる実施形態では、診断プロファイルを同定するために使用される同一タイプの経路バイオセンサーは、化合物へ曝された患者からのサンプルと接触される。健常患者からのサンプルにおいて実質的に同様のレベル、構造、および／または活性の標的および第２の薬物標的を産生する化合物処置サンプルは、候補薬物として化合物を同定するために使用される。この試験はハイスループットフォーマットで実行されるので、単一用量の候補薬物は、所与の任意の試験で評価される。
【０２１５】
（工程３．インビトロ生化学アッセイ）
１つの実施形態では、工程２で使用される核酸センサー分子は、化合物の効力を決定するために、インビトロ生化学アッセイにおいて試験される。この実施形態では、候補薬物のＩＣ５０を同定するために、予備的な投薬効果が決定される。１つの実施形態では、工程２で使用されるタイプの多数のバイオセンサーは、最高の効力を有する（例えば、野生型プロファイルまたは有効な薬物プロファイルを作製するために最少量の薬物を要求する）候補薬物を同定するために、工程２で同定された種々の用量の候補薬物へ曝された患者からのサンプルと接触される。
【０２１６】
（工程４．細胞アッセイ）
１つの実施形態では、核酸センサー分子は細胞アッセイにおいて使用され、この場合、化合物の添加が細胞の生理機能に与える影響は既知であり、研究者は、工程１〜３で選択された薬物標的により薬物が実際に作用することの決定を望む。ここで、候補薬物は生理システム（例えば、細胞、組織、臓器、または患者）へ添加される。生理システムからの細胞は溶解され、基質または酵素反応産物は、ＥＬＩＳＡフォーマットまたは他の固体支持体ベースのフォーマット（例えば、経路プロファイリングアレイ）、もしくは液相フォーマットにおいて、核酸センサー分子を用いてモニターされる。別の実施形態では、細胞溶解液は、溶解サンプル中の標的分子のプロファイルを決定するために、目的の標的または経路に特異的な経路プロファイリングバイオセンサーと接触される。次に、薬物がインビボで作用して、細胞をその野生型状態に回復させるかを決定するために、プロファイルは、野生型プロファイルおよび疾病プロファイルと比較される。従って、候補薬物が生理システムに与える生理的影響は、候補薬物の作用のインビボメカニズムと相関される。
【０２１７】
好ましい実施形態では、固体支持体へ結合された核酸センサー分子で構成される分子経路プロファイリングアレイは、シグナル伝達経路または別の生化学経路において、経路内の１つの標的に対する化合物の選択性を、他の候補標的に対して決定するために、細胞アッセイで使用される。このデータは、薬物リードまたは薬物標的を確認するために使用することができる。
【０２１８】
１つの実施形態では、核酸センサー分子は、プラスミド、ウィルス、または他の染色体外ＤＮＡベクターを用いて、インビボまたは細胞内で発現され、細胞核酸センサー分子は、薬物または薬物標的の活性を決定するために抽出および使用される。またこれらの細胞アッセイも、シグナル伝達経路または別の生化学経路において、経路内の１つの標的に対する化合物の選択性を、他の候補標的に対して決定することができる。このデータは、薬物リードまたは薬物標的を確認するために使用することができる。
【０２１９】
（インビボ検出：）
核酸センサー分子へ結合された（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＳＰＡシンチラントビーズを用いて、細胞をマイクロタイタープレート上へ直接培養し、細胞によるシンチラントビーズおよび放射性同位元素の取込みを可能にすることによって、インサンチュでリアルタイムの細胞プロセスを見ることができる。次に、選択された標的の存在下、ビーズにより発生されるルミネッセンスによって、生合成、増殖、薬物摂取、細胞運動などをモニターすることができる。
【０２２０】
（工程５．医薬品化学）
１つの実施形態では、薬物−リードの効力、特異性、および／またはインビボ活性は、工程１〜４のいずれかまたは全ての反復性の繰り返しによって最適化される。１つの実施形態では、工程１〜４は、候補薬物の所望の効力、選択性およびインビボの作用メカニズムが得られるまで繰り返される。効力は、インビトロＩＣ５０値で測定されるように、ピコモルの親和性からナノモルの親和性の範囲に及ぶことができる。薬物候補のその標的に対する所望の選択性は２倍〜１００万倍まで変動でき、他の関連標的（標的の関連性は、研究中の生物システムの要件によって決定される）への薬物の効力（ＩＣ５０）値に対して、薬物標的への薬物リードの効力（ＩＣ５０）を測定することで得られる。効力、選択性、および細胞作用のパラメータが互いに関して最適化される場合に、薬物リードは最適であると判断される。
【０２２１】
別の実施形態では、工程６からの既知の薬物リードは、工程２で研究者が知らなかった標的に特異性であることが分かる。これはまた、標的発見および確認と呼ばれ、工程のいずれかまたは全てを反復するように工程１〜４が繰り返される場合に起こり、薬物標的は、経路プロファイリングアレイによって、代替のシグナル伝達経路に実際に存在すること、あるいは初めに研究中の経路中の新規なタンパク質または酵素であることが同定される。従って、ＭＰＰアレイは薬物リードの作用部位を同定でき、薬物標的経路の１つの薬物標的に対する薬物の相対的な選択性を決定することができる。
【０２２２】
（工程６．動物モデルアッセイ）
この実施形態では、標的細胞（例えば、組織）は、処置の標的である疾病の動物モデルに由来するものであり、試験のために溶解される。標的または経路において、前述の任意の工程または他のいくつかの方法によって同定された候補薬物のインビボ生物活性を評価するために、溶解液は、固相アッセイ、液相アッセイ、または経路プロファイリングバイオセンサーレイフォーマットのいずれかにおいて、核酸センサー分子と接触される。従って、この実施形態では、病変組織または正常組織に対する薬物の生理的影響は、薬物作用のインビボ機構と相関される。
【０２２３】
（工程７．薬物リードの最適化）
１つの実施形態では、薬物−リードの効力、特異性、および／またはインビボ活性は、工程１〜６のいずれかまたは全ての反復性の繰り返しによって最適化される。１つの実施形態では、工程１〜５は、候補薬物の所望の効力、選択性およびインビボの作用メカニズムが得られるまで繰り返される。
【０２２４】
（工程８．薬物動態学的研究）
１つの実施形態では、核酸センサー分子は薬物動態学的研究で使用され、細胞、細胞群、組織、臓器、または動物モデルの生理機能に対する薬物の影響は、血液、血漿、組織または細胞を獲得し、固相（例えば、ＥＬＩＳＡ）、溶液またはアレイフォーマットでこの材料を核酸センサー分子と接触させることによって評価され、化合物のインビボにおける薬理的または毒物学的活性を評価する。この実施形態では、使用される核酸センサー分子は、候補薬物自体、その代謝産物、および／または、薬物処置への生体異物または毒物的な応答に関与するタンパク質および小さいリガンドの代謝産物に対して開発される。
【０２２５】
１つの実施形態では、薬物またはその代謝副産物の最終結果を追跡するために、核酸センサー分子が使用される。この実施形態では、核酸センサー分子は薬物およびその代謝物に対して作製される。薬物は、皮下、腹腔内、またはチューブ（ｇａＶａｇｅ）のいずれかによって試験動物へ投与される。投与に続いて、血漿または疾病組織が取り出され、その内容物は、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）またはＬＣ−質量分析によって、残存薬物についてスクリーニングされる。次に、薬物暴露は、時間、用量、および投与方法の関数として決定され、半減期、生物学的利用能、ＡＵＣおよびＣｍａｘの値で報告される。薬物リードの代謝産物も同様に追跡することができる。
【０２２６】
薬物代謝に関与することが当業者に知られている酵素またはタンパク質（Ｐ４５  ０酵素、多薬物トランスポータ）に対して作製された核酸センサー分子は、薬物処置への生体異物または毒物的な応答に対する薬物の影響を追跡するために使用することができる。
【０２２７】
（工程９．薬物リードの最適化）
１つの実施形態では、薬物−リードの効力、特異性、および／またはインビボ１０活性ならびに薬物動態学または毒物学的特性は、工程１〜７のいずれかまたは全ての反復性の繰り返しによって最適化される。１つの実施形態では、工程１〜７は、候補薬物の所望の効力、選択性およびインビボ活性ならびに薬物動態学または毒物学的特性が得られるまで繰り返される。
【０２２８】
（工程１０．臨床試験）
１つの実施形態では、核酸センサー分子は、ヒトおよび動物モデルにおける薬物の最終結果を決定するために、臨床試験で使用される。あるいは、上記のように、選ばれた標的または分子経路に対する薬物処置の影響を追跡するために使用される。１つの実施形態では、核酸センサー分子は、固相アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡフォーマット）、液相アッセイ、または経路プロファイリングバイオセンサーレイフォーマットにおいて、上記のように溶解細胞サンプルを用いて、試験中の薬物のインビボ生物活性を評価するために使用される。
【０２２９】
別の実施形態では、例えば、患者に挿入される光ファイバプローブと連通するバイオセンサーを提供することによって、あるいは顕微鏡ベースの検出システムを用いて細胞内の光シグナルをエキソビボでモニターすることによって、患者に対する化合物の影響をモニターするために適切な経路プロファイリングバイオセンサーがインビボで使用される。別の実施形態では、薬物標的のレベル、構造、または活性を決定し、標的分子のレベル、構造、または活性を薬物の有効性へ関連させる手段として、その触媒活性を保持している核酸センサー分子を生理システムに導入し（例えば、リポソームキャリアによる体の標的部位での注入、および当該技術分野分野で日常的に使用される他の投与手段によって）、生理システムから細胞を取得し、核酸センサー分子の触媒活性に対する化合物の影響を検出する（例えば、核酸センサー分子の配列を評価することによって）ことによって、インビボアッセイが実行される。
【０２３０】
（工程１１．薬物リードの最適化）
１つの実施形態では、工程１〜１０のいずれかまたは全ては、候補薬物の特性をさらに最適化するために繰り返される。
【０２３１】
（工程１２．診断用途）
１つの実施形態では、工程１〜１１で同定された候補薬物による治療に適切である個体は、前述の診断アッセイの核酸センサー分子を用いて同定される。
【０２３２】
（工程１３．ゲノム化学）
１つの実施形態では、核酸センサー分子はゲノム化学アッセイにおいて使用される。この場合、既知または未知の生理的効果、および未知の標的を有する薬物または複数の薬物リードは生理システムと接触され、薬物または複数の薬物の作用部位は、前述の複数のプロファイリングバイオセンサーまたは経路プロファイリングバイオセンサーを用いて決定される。次に薬物最適化は工程１〜１１のように起こる。
【０２３３】
（５．標的分子の分離における標的活性化バイオセンサーの使用）
検出方法および創薬方法における使用に加えて、あるいはその代わりに、本発明に従う標的活性化バイオセンサーはまた、特異的に結合する標的分子を回収するためにも使用することができる。開示されるバイオセンサーの結合能力を利用する更なる実施形態は範囲内に意図され包含される。
【０２３４】
（核酸センサー分子を作製および使用するための試薬）
１つの実施形態では、核酸センサー分子を作製および使用するための試薬が提供される。１つの実施形態では、本発明に従って核酸センサー分子を製造および／または使用するための標準試薬を含むキットが提供される。１つの実施形態では、キットは、標的分子の結合時にその光学的特性が変化する少なくとも第１の核酸センサー分子を含む。別の実施形態では、キットは、さらに、コントロール標的分子、異なる標的分子へ結合する第２の核酸センサー分子、適切な緩衝液、印刷された使用説明書、およびこれらの組み合わせのどれでも含む。更なる実施形態では、標的分子の存在に対して核酸分子の光学特性を敏感にすることができる、標識および／またはクエンチャを核酸センサー分子へ結合させるための試薬、あるいは電荷移動分子を結合させるための試薬と共に、核酸センサー分子が提供される。
【０２３５】
別の実施形態では、標的分子および核酸センサー分子を含む組成物が提供される。標的に対する親和性がより高いものを選択するために、組成物は、同一の標的へ結合する修飾型核酸センサー分子を比較するための参照を提供する。更なる実施形態では、複合体セットが提供される。また更なる実施形態では、一組の経路標的分子およびセンサー分子が提供される。別の実施形態では、一組のプロファイリング標的分子および核酸センサー分子が提供される。また更なる実施形態では、核酸センサー分子から標的分子を単離するための固体支持体が提供される。
【０２３６】
さらに別の実施形態では、プロファイリングおよび／または経路標的分子によって発生された光シグナルに関して記憶されたデータを含むコンピュータプログラムプロダクトが提供される。別の実施形態では、このデータを他の光シグナルと比較するための手段が提供される。更なる実施形態では、メモリは、患者情報もしくは標的分子または核酸センサー分子に関する化学構造情報に関連するデータを含む。
【０２３７】
本発明に従う核酸センサー分子および標的活性化バイオセンサーはハイスループットスクリーニングシステムおよび方法での使用のために修正可能であり、これらのシステムおよび方法における核酸センサー分子および標的活性化バイオセンサーの使用は、範囲内に包含される。１つの実施形態では、システムはロボットワークステーションであり、アレイヤー、マイクロプレートまたはマイクロアレイフィーダ、スタッカ、洗浄器、分配器、光学系、カルーセル、システムの１つの部分から別の部分へマイクロプレートまたはマイクロアレイを搬送するためのコンベヤ（鉛直方向または水平方向）、シェーカーシステムまたは他の混合システム、温度制御システム、合成器、固相抽出システム、およびサンプル濃縮器のうちの少なくとも１つを含む。ロボットワークステーションの構成要素は単一の統合システムの一部でもよいし、本発明に従って、薬物最適化プロセスの任意の段階で使用するために別に提供されてもよい。更なる実施形態では、システムは、本発明に従って核酸センサー分子を用いて得られたプロファイリング情報に関する記憶データを含む適用、および／または統計適用、標的分子および核酸センサー分子の構造／活性分析を実行するための適用、タンパク質の核酸配列比較および同時的な構造重ね合わせ（例えば、ＭＯＥ−Ａｌｉｇｎ’ＴＭ）を実行するための適用、分子のレセプター構造への結合コンフォメーションを予測するための適用、およびロボットワークステーションの処理機能を制御するための適用を含むか、あるいはそれらにアクセス可能なネットワークへ接続可能なプロセッサを含む。
【０２３８】
本発明は以下の非限定的な実施例においてさらに説明される。
【０２３９】
（実施例１．固定化エフェクタオリゴヌクレオチドのアレイの作製）
以下のプロトコルは、アルデヒド基で誘導体化された固体基板へ末端アミン基で固定化されたエフェクタオリゴヌクレオチドのアレイを作製するための方法について説明する。次に、得られたアレイは、固相アッセイで使用する前に、リボザイムセンサー分子を空間的にアドレス処理して（すなわち、各エフェクタオリゴについてのヌクレオチドの配列は特定の標的分子に特異的なリボザイムセンサーと同族であるように合成することができる）、固定化するために使用することができる（例えば、Ｚａｍｍａｔｔｅら，２０００を参照）。
【０２４０】
（オリゴヌクレオチドをアルデヒド基質へ結合させるためのプロトコル（ｗｗｗ．ａｒｒａｙｉｔ．ｃｏｍ）：）
１．  マイクロアレイ作製ピン、ピペットなどを用いて、アミン反応性末端基、または末端がアミン基のリンカーを有するオリゴヌクレオチドを含有する溶液の離散的なスポットをプリントする。
【０２４１】
２．  室温および３０％未満の相対湿度で１２時間、基質を乾燥させる。
【０２４２】
３．  ０．２％ＳＤＳを含むｄＨ２０中で２分間、室温で激しく攪拌しながら基質を２回洗浄する。
【０２４３】
４．  ｄＨ２０中で２分間、室温で激しく攪拌しながら基質を１回洗浄する。
【０２４４】
５．  ＤＮＡを変性させるために、沸騰（１００℃）ｄＨ２０へ３分間、基質を移動させる。
【０２４５】
６．  ５００ｘｇで１分間、遠心分離により基質を乾燥させる。
【０２４６】
７．  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７）中０．１ＭのＮａＢＨ４内で５分間、室温で穏やかに攪拌しながら基質を処理する。
【０２４７】
８．  ０．２％ＳＤＳを含むｄＨ２０中で１分間、室温で激しく攪拌しながら基質を２回洗浄する。
９．  ｄＨ２０中で２分間、室温で激しく攪拌しながら基質を１回洗浄する。
【０２４８】
１０．  ＤＮＡを変性させるために、沸騰（１００℃）ｄＨ２０へ１０秒間、基質を移動させる。
【０２４９】
１１．  ５００ｘｇで１分間、遠心分離により基質を乾燥させる。
【０２５０】
１２．  ハイブリッド形成の前に、オリゴヌクレオチド結合基質を４℃で保存する。
【０２５１】
所望される場合には、核酸センサー分子は、標的分子の存在下で基質を連結または自己切断するアロステリックリボザイムでよい（連結物質（ｌｉｇａｔｅｒ）については図２Ａおよび図２Ｂを参照、切断物質（ｃｌｅａＶｅｒ）については図５を参照）。ここでは、リボザイムは、その３’末端により固体基板へ直接結合される。リボザイムの３’付近のジオールがアルデヒド基へ酸化することによって（例えば、過ヨウ素酸Ｎａを用いて）、結合が達成される。このアルデヒド基はヒドラジド基と反応してヒドラゾン結合を形成する。ヒドラゾン結合は加水分解などに対して非常に安定であるが、さらに還元され得る（例えば、ＮａＢＨ４またはＮａＣＮＢＨ３での処理によって）。アルデヒド表面を誘導体化するためのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ、二官能性リンカー）の使用はヒドラジド誘導体化表面をもたらし、これは、基質表面と、約１０個の原子の生体分子結合点との間のリンカーを提供する（Ｒｕｈｎら，１９９４；Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ，１９９０、Ｒｏｂｅｒｓｔｏｎら，１９７２，Ｓｃｈｌｕｅｐら，１９９９；Ｃｈａｎら，１９９８を参照）。ＡＤＨ処理によるヒドラジド末端化表面の作製は、次のプロトコルに従って、アルデヒド誘導体化基質を処理することによって達成することができる。
【０２５２】
（アルデヒド基質のＡＤＨ処理のためのプロトコル：）
１．  ５０ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５）へ、基質表面のアルデヒド基の濃度に対して１００倍過剰のアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加する。
【０２５３】
２．  リン酸緩衝液中にＡＤＨを含有する５０ｍＬの管内に基質を配置し、混合物を２時間振とうする。
【０２５４】
３．  基質を取り出し、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で４回洗浄する。
【０２５５】
４．  ０．１Ｍリン酸緩衝液中に２５倍過剰のＮａＢＨ４またはＮａＣＮＢＨ３を含有する５０ｍＬ管内に基質を配置することによって、基質表面の遊離アルデヒド基を還元する。
【０２５６】
５．  混合物を９０分間振とうする。
【０２５７】
６．  ０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で４回洗浄する。
【０２５８】
７．  ＡＤＨ処理された基質を４℃で０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中に保存する。
【０２５９】
ＡＤＨ末端化表面へその３’末端により特異的に結合するための核酸分子の作製は、以下のプロトコルにしたがって達成することができる（ＰｒｏｕｄｎｉｋｏＶら，１９９６、Ｗｕら，１９９６を参照）。
【０２６０】
（ＲＮＡの過ヨウ素酸塩酸化のためのプロトコル）
１．  最大２０マイクログラムのＲＮＡを５マイクロリットルのＨ２Ｏに２０℃で溶解させる。
【０２６１】
２．  １マイクロリットルの０．１ＭのＮａＩＯ４（ＲＮＡに対して約２０倍過剰）を添加する。
【０２６２】
３．  遮光性の管または筐体中で３０分間インキュベートする。
【０２６３】
４．  反応を停止させるために、１マイクロリットルの０．２Ｍの亜硫酸Ｎａ（ＮａＩＯ４に対して約２倍過剰）を添加する。
【０２６４】
５．  室温で３０分間インキュベートする。
酸化ＲＮＡを回収するために、エタノール沈殿させるか、スピン分離カラムを使用する。
【０２６５】
（実施例２．エストロゲンレセプターＬＢＤに対して選択性のリボレポーターの選択）
エストロゲンレセプターのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に特異的なリボレポーターは、エストロゲンレセプターＬＢＤへ結合する候補核酸を同定することによって得られる。
【０２６６】
エストロゲンレセプターの完全長遺伝子は知られている。完全長エストロゲンレセプタークローンの１つの供給源は、アクセッション番号Ｍ１２６７４である（Ｇｒｅｅｎｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：１１５０−５４，１９８６も参照）。クローンは、以下の配列を有する２０９２ヌクレオチドｍＲＮＡを含む：
【０２６７】
【化１】（配列番号９）
2004527220.tif 000004
2004527220.tif 000005
このポリヌクレオチドは以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０２６８】
【化２】（配列番号１０）
2004527220.tif 000006
完全長ＥＲまたはリガンド結合ドメインいずれかをコードする遺伝子は、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＳ大腸菌細胞においてクローニングおよび発現される（Ｓｈｉａｕ  ＡＫ，Ｂａｒｓｔａｄ  Ｄ，Ｌｏｒｉａ  ＰＭ，Ｃｈｅｎｇ  Ｌ，Ｋｕｓｈｎｅｒ  ＰＪ，Ａｇａｒｄ  ＤＡ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＧＬ．Ｃｅｌｌ．１９９８  Ｄｅｃ  ２３；９５（７）：９２７−３７）。ヒトのＥＲαＬＢＤ（残基２９７−５５４）は、公開された手順（Ｓｈｉａｕ  ＡＫ，Ｂａｒｓｔａｄ  Ｄ，Ｌｏｒｉａ  ＰＭ，Ｃｈｅｎｇ  Ｌ，Ｋｕｓｈｎｅｒ  ＰＪ，Ａｇａｒｄ  ＤＡ，Ｇｒｅｅｎｅ  ＧＬ．Ｃｅｌｌ．１９９８  Ｄｅｃ  ２３；９５（７）：９２７−３７）によって、エストラジオール−セファロースカラムから精製される。ＥＲ−ＬＢＤ複合体は、次に、エストロジオールまたはタモキシフェンとの１：１の複合体化において形成される。
【０２６９】
（実施例３．リガンドへ結合されていないＥＲ−ＬＢＤによって活性化されるリボレポーターの選択）
インビトロ合成リボザイムの最高で１０１７個の変異体のライブラリは、１μＭの最終濃度で精製アポ−ＥＲ−ＬＢＤと反応させることができる。アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。
【０２７０】
（実施例４．ＥＲ−ＬＢＤ−エストラジオール複合体により活性化されるリボレポーターの選択）
インビトロ合成リボザイムの最高で１０１７個の変異体のライブラリは、１μＭの最終複合体濃度で精製ＥＲ−ＬＢＤ−エストラジオールと反応させることができる。アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。
【０２７１】
（実施例５．ＥＲ−ＬＢＤ−タモキシフェン複合体により活性化されるリボレポーターの選択）
インビトロ合成リボザイムの最高で１０１７個の変異体のライブラリは、１μＭの最終複合体濃度で精製ＥＲ−ＬＢＤ−エストラジオールと反応させることができる。アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。
【０２７２】
（実施例６．既知の全ての核ホルモンレセプターＬＢＤの存在をシグナル伝達するリボレポーターのライブラリの選択）
構造的な相同性に基づいて定義されるＮ末端ＧＳＴタグ付きのリガンド結合ドメイン、またはＮ末端／Ｃ末端Ｈｉｓタグ付きのリガンド結合ドメインは、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＳ大腸菌細胞においてクローニングおよび発現される。あるいは、標準バキュロウィルス発現系においてクローニングおよび発現される。配列の参照は以下に提供される。
【０２７３】
【表３】
2004527220.tif 000007
2004527220.tif 000008
2004527220.tif 000009
2004527220.tif 000010
ヒトＮＨＲ  ＬＢＤ（領域ａａ２９７−５５４を含有するＥＲ−α残基と相同）は、製造業者から入手可能な公開された手順によって、ＧＳＨ−セファロースまたはニッケルアフィニティカラムから精製される。ＬＢＤは平行的または連続的のどちらかで産生され、精製タンパク質は、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ，および５０−２５０のＮａＣｌ／ＳＣＮ塩、ｐＨ７〜ｐＨ８．５、１０％グリセロールまたは他の安定化剤を含有する緩衝液中などで保存される。タンパク質の配列およびＭＷは標準質量分析で確認される。
【０２７４】
１）非リガンド結合６３ＮＨＲ−ＬＢＤにより活性化されるリボレポーターの選択：インビトロ合成リボザイムの最高１０Ｅ＋１７の変異体のライブラリは、１μＭ  ＬＢＤの最終濃度で精製アポ−ＮＨＲ−ＬＢＤと反応させることができる。アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。選択は平行して実行され、５〜１０のＮＨＲ  ＬＢＤのどこの混合プール中で実行されてもよい。リボレポーター選択の最終ラウンドでは、ＲＮＡプールは一定分量に分けられ、次にこれらを使用して、単一のＮＨＲ  ＬＢＤタンパク質に対するインビトロ選択を実行し、多数のＮＨＲ  ＬＢＤに対して選択的な特異なリボレポーターが得られる。
【０２７５】
２．リガンド結合型のＮＨＲ−ＬＢＤによって活性化されるリボレポーターの選択。多数のＮＨＲのためのリガンドが知られている。これらのリガンドは以下に提供される。
【０２７６】
【表４】
2004527220.tif 000011
2004527220.tif 000012
2004527220.tif 000013
2004527220.tif 000014
それぞれのＮＨＲ  ＬＢＤの安定な複合体は、１〜１０個のリガンド相当物由来のものと共に形成される。ＮＨＲ−ＬＢＤ−リガンド複合体により活性化されるリボレポーターの選択。インビトロ合成リボザイムの最高１０１７個の変異体のライブラリは、１μＭの最終複合体濃度で精製ＥＲ−ＬＢＤ−エストラジオールと反応させることができる。アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。選択は平行して実行され、５−１０のＨＮＲ  ＬＢＤ−リガンド複合体のどこの混合プール中で実行されてもよい。リボレポーター選択の最終ラウンドでは、ＲＮＡプールは一定分量に分けられ、次にこれらを使用して、単一のＮＨＲ  ＬＢＤ−リガンド複合体に対するインビトロ選択を実行し、すべてのＮＨＲ  ＬＢＤに対して選択的な特異なリボレポーターが得られる。
【０２７７】
したがって、本発明は、既知のそれぞれのＮＨＲの精製ＬＢＤ対するインビトロ選択プロトコルを提供する。インビトロ選択は、１ｍｇよりも少ない量の精製型ＬＢＤを用いて実行することができる。さらに、リボレポーターの選択は、ＬＢＤの混合プールを用いてインビトロで実行でき、次に選択が完了したら、デコンボリュートされる。あるいは、最終選択は、わずかに過剰の組換えＬＢＤを含有する画分で精製された抽出物を用いて実行することができる。１つの実施形態では、ＬＢＤは、大腸菌または昆虫細胞株、もしくは哺乳類細胞株において発現される。もう１つの実施形態では、選択は無細胞溶解液において実行され、ＬＢＤは、文献に記載されるようなインビトロ転写−翻訳手順で発現されるか、あるいはＲｏｃｈｅまたはＰｒｏｍｅｇａから一般的な試薬を用いて入手することができる。もう１つの実施形態では、分画または精製されたＬＢＤは、既知のリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、または部分的アゴニスト／アンタゴニストと結合されて安定な複合体を形成し、これらの複合体は、次に、リボレポーターのインビトロ選択のために使用される。この選択では、リガンドとの複合体中のタンパク質全体、またはＮＨＲに由来するペプチド成分が利用される。リボレポーターとＮＨＲとの相互作用では、シグナルは、外部モニター装置に検出可能に発生される。この方法では、ＮＨＲのどれかまたは全ての活性化状態をインビボまたはインビトロでモニターすることができる。
【０２７８】
（実施例７．β−２アドレナリン作動性レセプターに選択的なリボレポーターの選択。）
β−２アドレナリン作動性レセプターの完全長遺伝子は、Ｅｍｏｒｉｎｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６９９５−９９，１９８７に記載されており、アクセッション番号ＡＡＡ８８０１７で入手可能である。核酸配列は以下に示される：
【０２７９】
【化３】（配列番号１１）
2004527220.tif 000015
2004527220.tif 000016
この核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は以下に示される：
【０２８０】
【化４】（配列番号１２）
2004527220.tif 000017
完全長β−２アドレナリン作動性レセプターまたは細胞質ループＩＩもしくはループＩＩＩまたはヘリックスＶＩＩをコードする遺伝子は、公開された手順にしたがって大腸菌またはバキュロウィルス感染細胞からクローニング、発現および精製され（Ｈａｍｐｅら，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７：２１９−２３４（２０００））、細胞環境をシミュレートするために界面活性剤ミセルに組み込まれる（Ｍｉｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：９４００−９４０４（１９９３））。インビトロ合成リボザイムの最高１０１７個の変異体のライブラリは、１μＭの最終濃度で精製β−２アドレナリン作動性レセプターと反応させることができる。アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。複合体はブトキサミンまたはイソプロテレノールと１：１で形成される。
【０２８１】
（実施例８．ブトキサミン−β−２アドレナリン作用性複合体により活性化されるリボレポーターの選択）
ブトキサミンおよび精製β−２アドレナリン作用性レセプターの１：１複合体が形成され、アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。
【０２８２】
（実施例９．イソプロテレノール−β−２アドレナリン作用性複合体により活性化されるリボレポーターの選択）
イソプロテレノールおよび精製β−２アドレナリン作用性レセプターの１：１複合体が形成され、アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。
【０２８３】
（実施例１０．既知の全てのＧＰＣＲの存在を示すリボレポーターのライブラリの選択）
４００を超えるＧＰＣＲの完全長の遺伝子配列が知られている。遺伝子全体、またはこれらの配列に由来するペプチドは、Ｎ−末端タグ、またはＮ−末端／Ｃ−末端Ｈｉｓ−タグが付けられ、上記のようにクローニング、発現、および精製されるか、化学的手段によって合成される。４００すべてのＧＰＣＲは連続的または並行的のいずれかの様式で産生され、精製タンパク質またはペプチドは、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ，および５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ／ＳＣＮ塩、ｐＨ７〜ｐＨ８．５、１０％グリセロールまたは他の安定化剤を含有する緩衝液中に保存される。タンパク質の配列およびＭＷは標準質量分析で確認される。
【０２８４】
（１．リガンドへ結合されていないＧＰＣＲにより活性化されるリボレポーターの選択）
インビトロ合成リボザイムの最高１０１７個の改変体のライブラリを、１ｕＭのＧＰＣＲの最終濃度で精製ＧＰＣＲと反応させる。アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。選択は並行した様式で実行されても、５〜１０のＧＰＣＲのいずれかの混合プール中で実行されてもよい。リボレポーター選択の最終ラウンドでは、ＲＮＡプールはアリコートに分けられ得、次にこれらを使用して、単一のＧＰＣＲタンパク質に対するインビトロ選択を実行し得、４００すべてのＧＰＣＲに対して選択的な特異的リボレポーターが得られる。
【０２８５】
（２．リガンド結合型によって活性化されるリボレポーターの選択）
４０００の既知のＮＨＲのうち、添付の表に記載されるように、約１２０個の既知のリガンド−ＧＰＣＲ対が存在する。それぞれのＧＰＣＲ  ＬＢＤの安定な複合体は、１〜１０のリガンド相当物由来のものと共に形成される。アロステリック活性化リボザイムの選択は前の実施例で概説した手順によって実行される。選択は並行様式で実行されても、５〜１０のＧＰＣＲ−リガンド複合体のいずれかの混合プール中で実行されてもよい。リボレポーター選択の最終ラウンドでは、ＲＮＡプールはアリコートに分けられ得、次にこれらを使用して、単一のＧＰＣＲ−リガンド複合体に対するインビトロ選択を実行し得、すべてのＧＰＣＲ−リガンド複合体に対して選択的な特異的リボレポーターが得られる。
【０２８６】
（実施例１１．ＧＰＣＲのペプチド断片を用いるリボレポーターの選択）
本実施例は、リガンド結合の際に現れるＧＰＣＲのコンフォメーションアイソフォームを特異的に認識するリボレポーターを開発するための方法を記載する。
【０２８７】
分子クローニングの研究は４００を超えるヒトＧＰＣＲを同定しており、１２０についてはリガンドが同定されている。ＧＰＣＲは、細胞外Ｎ−末端、７つの膜貫通ヘリックスの中央ドメイン、および細胞質Ｃ末端の３つのドメインから成る。ＧＰＣＲの活性化はリガンド結合によって誘発され、これによりレセプターのコンフォメーション変化が生じ、細胞質ヘリックスＩＩおよびＩＩＩ、ならびにヘリックスＶＩＩが露出される。この方法は、各ＧＰＣＲに対して特有のバイオセンサーの作製を提供する。代表的なＧＰＣＲペプチドおよびポリペプチドは実施例１２および１３に示される。
【０２８８】
本発明に記載されるバイオセンサーには、ハンマーヘッド、ヘアピン、Ｌ１リガーゼ、または１型イントロンリボザイムなどを含むアロステリックリボザイム（ＡＲ）などのリボレポーターが含まれ、あるいはリボレポーターはアプタマービーコンまたはシグナル伝達アプタマーに由来してもよく、これらはいずれも、分子認識を検出可能なシグナルへ変換する。１つの実施形態では、ＧＰＣＲに特異的なリボレポーターは、細胞質ヘリックスＩＩおよびＩＩＩ、ならびにヘリックスＶＩＩの領域を含むＧＰＣＲのペプチド断片の認識のために、インビトロ選択によって作製される。例示の適切なＧＰＣＲペプチド断片は実施例１１に示される。次いで、細胞質ヘリックスＩＩおよびＩＩＩ、ならびにヘリックスＶＩＩを認識するリボレポーターは、完全長タンパク質の状況において細胞質ヘリックスＩＩを認識する。完全長タンパク質を認識するリボレポーターを作製するために使用されるペプチド断片の例は当該技術分野で知られており、本明細書中で援用される。例えば、ＨＩＶ  ｒｅＶペプチドおよび完全長タンパク質のリボレポーター選択および認識に関するデータを参照されたい（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  ２００１，  ＵｎｉＶｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ，  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｐｈ．Ｄ．  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ）。ＨＩＶ  ｒｅＶの場合、遊離ペプチドとして、および完全タンパク質の状況の両方で、特有のペプチド配列が認識される。
【０２８９】
（実施例１２：ＧＰＣＲペプチド断片）
【０２９０】
【表５】
2004527220.tif 000018
2004527220.tif 000019
2004527220.tif 000020
2004527220.tif 000021
（実施例１３：ＧＰＣＲポリペプチド）
【０２９１】
【表６】
2004527220.tif 000022
2004527220.tif 000023
2004527220.tif 000024
2004527220.tif 000025
2004527220.tif 000026
2004527220.tif 000027
2004527220.tif 000028
（実施例１４．リボレポーターＰＤＥ標的確認）
リボレポーターを、標的確認のためにＰＤＥの種々のサブクラスに対して産生する。例えば、リボレポーターを、４つのＰＤＥ４サブタイプのそれぞれに対して産生する。ＰＤＥ４の４つのサブクラスは、細胞間で、およびその細胞内分布に関して異なって、それぞれ別に局在化する。この差別的局在化は、転写調節および翻訳後修飾と共に、細胞の環境に応答する細胞のｃＡＭＰレベルを制御する（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｅｎｇｅｌｓら  １９９６）。
【０２９２】
４つのＰＤＥ４サブタイプのｃＤＮＡは、記載されるようにヒトの白血球ｃＤＮＡライブラリからクローニングされる（Ｗａｎｇ，Ｍｙｅｒｓら  １９９７）。それぞれのサブクラスは、大腸菌または昆虫細胞中でＨｉｓ−タグと融合された組換え型タンパク質として発現され得る（Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｈｅｒｍｓｄｏｒｆら  ２０００）（Ｗａｎｇ，Ｍｙｅｒｓら  １９９７）。発現されたタンパク質を、製造者の推奨事項（Ｐｒｏｍｅｇａ）にしたがって、Ｎｉ＋＋カラムを通して精製する。ＰＤＥ４の４つのサブクラスに対するリボレポーターを上記の通りに産生する。リボレポーターを、サブクラス特異性について試験する。
【０２９３】
異なる器官からの組織サンプルを調製し、ＰＤＥ４サブクラス特異的リボレポーターのパネルに対して細胞抽出物を試験し、器官中の各ＰＤＥのタンパク質レベルを決定することができる。したがって、ｍＲＮＡレベルの測定に基づく方法に対して、ＰＤＥ４レベルについてのより正確な情報を得ることができる（ＢｌｏｏｍおよびＢｅａＶｏ  １９９６）（Ｏｂｅｒｎｏｌｔｅ，Ｒａｔｚｌｉｆｆら  １９９７）（Ｎａｇａｏｋａ，Ｓｈｉｒａｋａｗａら  １９９８）。
【０２９４】
異なる種類のＰＤＥ（ＰＤＥ１−１１）は組織特異的様式で発現されて、異なる生理的役割を果たし（Ｃｏｎｔｉ  ２０００）、ＰＤＥの亜細胞性の局在は、その活性を調節する。したがって、リボレポーターを使用して、分画された細胞抽出物からの各ＰＤＥの亜細胞性の局在を決定するか（Ｂｏｌｇｅｒ，Ｅｒｄｏｇａｎら  １９９７）、あるいはインサイチュハイブリダイゼーション技術（Ｓｉｒｉｎａｒｕｍｉｔｒ，Ｐａｕｌら  １９９７）において使用することができる。
【０２９５】
（実施例１５．ｃＡＭＰ依存性ＰＤＥリボレポーターのヌクレオチド配列および活性）
ｃＡＭＰ依存性ＰＤＥリボレポーターおよびｃＧＭＰ依存性リボレポーターのヌクレオチド配列を以下に提供する。アロステリックドメインおよび切断部位のヌクレオチドを太いフォントで示す。
ｃＡＭＰ−ハンマーヘッドＲＮＡ配列：
【０２９６】
【化５】
2004527220.tif 000029
（配列番号３４）
ｃＧＭＰ−ハンマーヘッドＲＮＡ配列：
【０２９７】
【化６】
2004527220.tif 000030
（配列番号３５）
ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存性リボレポーターを、種々の量のＰＤＥと、対応するサイクリックヌクレオチド（ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ）を含有する溶液へ添加した。サイクリックヌクレオチド量の減少は、ＰＤＥ量の増加に相当する。これらの結果は、サクリックヌクレオチド依存性のリボレポーターがＰＤＥ活性を測定するために使用することができることを実証する。
【０２９８】
（実施例１６．ｃＡＭＰ依存性ＰＤＥリボレポーターを用いるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ）
ｃＡＭＰ依存性リボレポーターは、ＰＤＥ（ＰＤＥ１、ＰＤＥ２、ＰＤＥ３、ＰＤＥ４、ＰＤＥ７、ＰＤＥ８、ＰＤＥ１０、およびＰＤＥ１１）のためのＨＴＳアッセイにおいて使用することができる。同様に、ｃＧＭＰ依存性−リボレポーターは、ＰＤＥ（ＰＤＥ５、ＰＤＥ９、ＰＤＥ１０、およびＰＤＥ１１）のためのＨＴＳアッセイにおいて使用することができる。代表的なｃＡＭＰ依存性およびｃＧＭＰ依存性のＰＤＥリボレポーターを、実施例１５に示す。
【０２９９】
各種類のＰＤＥは、ヒト組織から単離する（Ｂａｌｌａｒｄ，Ｇｉｎｇｅｌｌら  １９９８）か、あるいは種々の系（例えば、大腸菌、ＳＦ９細胞）で組換え型タンパク質として発現させることができる。したがって、リボレポーターは、候補薬剤の存在および非存在下において、ＰＤＥ活性をモニターすることができる。例えば、ＰＤＥおよびその基質（すなわち、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰ）を、スクリーニングのために種々の濃度の化合物を用いて、マルチウェルチャンバ（例えば、９６，３８４ウェル）で所定期間インキュベートし、緩衝液条件を変化させる（例えば、十分な量のＥＧＴＡの添加で緩衝液ｐＨをシフトさせる）ことによって、あるいは酵素および基質を分離させること（例えば、ろ過）によって、反応を終結させる。次に、基質、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの濃度の変化を測定するために、リボレポーターを添加する。あるいは、前述のように、再設計されたリボレポーター（例えば、ＦＲＥＴ、リボレポータービーコン）を、ＰＤＥ活性を終了させることなく添加してもよい。
【０３００】
また、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ依存性のリボレポーターは、インビトロで薬剤のＩＣ５０を特徴付けるためにも使用することができる。ＰＤＥアッセイは、当該の化合物の連続希釈と共に実行される。細胞からの精製ＰＤＥまたは可溶性抽出物（Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら  １９９８）は、アッセイのために使用することができる。アッセイは上記のとおりに実行することができる。
【０３０１】
あるいは、ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ依存性のリボレポーターを使用して、アデニルおよびグアニルシクラーゼで合成されたｃＡＭＰまたはｃＧＭＰを分析することによって、インビトロで薬剤候補のＩＣ５０値を特徴付ける。アデニル酸およびグアニル酸シクラーゼアッセイは、当該化合物の連続希釈とともに構成されるであろう。アデニル酸およびグアニル酸シクラーゼを含有する膜画分を、アッセイのために使用する。アッセイは、基質としてＡＴＰまたはＧＴＰを用いて、文献に記載されるとおりに構成することができる。
【０３０２】
（実施例１７．ＰＤＥリボレポーターを用いる競合的アッセイ）
ＰＤＥの活性部位と相互作用をするリボレポーターを作成する。ＰＤＥ４タンパク質を上記のように得る。リボレポーターを、ナノモル以下の阻害剤（ロリプラム）と複合体化されたＰＤＥ４の存在下で、ネガティブ選択によりＰＤＥ４に対して選択する。したがって、リボレポーターはＰＤＥ４を認識するために空の活性部位を必要とし、阻害剤とのＰＤＥ結合と競合する。
【０３０３】
リボレポーターによる直接阻害は、市販のＰＤＥアッセイキット（ｃＡＭＰのためのＡｍｅｒｓｈａｍＳＰＡアッセイキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＤｅＶｉｃｅｓ  ＨＥＥＰ  ｃＡＭＰアッセイキット）を用いて試験することができる。薬剤スクリーニングでは、競合を、種々の阻害剤の存在下、リボレポーターからのシグナルをモニターして実行する。適切な源（例えば、ウィスターラットの脳（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｇｅｍａｌｍａｚら  １９９９））からの精製ＰＤＥまたは可溶性細胞抽出物を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７．５中、化合物の存在および非存在下で、リボレポーター（１００ｎＭ）とともにインキュベートする。薬剤の存在および非存在下における各リボレポーターの応答の初期速度の変化を、相同性システムにおいてモニターすることができる。同一のウェル内で同一の化合物に対して、多数のＰＤＥを試験することができる。各種類のＰＤＥおよび任意の化合物の組織特異性の相互作用を決定することが所望される場合、このアッセイを拡大する。
【０３０４】
（実施例１８．サイクリックヌクレオチド依存性のＰＤＥリボレポーターを用いる細胞ベースのアッセイ）
リボレポーターを、組織またはラット細胞株における薬剤注入に対する応答として、細胞のｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルをモニターするために使用する。例えば、ヒト脳梁（ｃｏｒｐｕｓ  ｃｏｌｌａｓｕｍ）（ＨＣＣ）組織片またはラットＨＣＣ細胞系（Ｎ１Ｓ１およびＭｃＡ−ＲＨ７７７７細胞）を、ＰＤＥ５に対する薬剤の存在および非存在下でインキュベートでき（Ｍｉｎ，Ｋｉｍら  ２０００）（Ａｒｏｒａ，ｄｅ  Ｇｒｏｅｎら  １９９６）、ｃＧＭＰ特異性リボレポーターを、上記のような組織または細胞サンプルからの可溶性抽出物中のｃＧＭＰ量を測定するために使用することができる。
【０３０５】
あるいは、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ−依存性のリボレポーターを、上記のようにレポーター−遺伝子プラスミド内へ組み込む。この構築物を、標準的なトランスフェクション（例えば、液体によるトランスフェクション、リン酸カルシウム共沈殿、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、レトロウィルス感染）によって、細胞株に導入する。細胞中のｃＧＭＰまたはｃａｍｐのレベルは、レポーター遺伝子の発現によって測定される。
【０３０６】
（実施例１９．リボレポーターを用いる薬物動態学的研究）
薬物動態学的研究のための前臨床試験および臨床試験における薬剤のリボレポーターを作製する。薬剤または他の治療剤が投与された、または投与されないヒトの血清サンプルを調製する（Ｂｅｒｚａｓ  ＮｅＶａｄｏ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｆｌｏｒｅｓら  ２００１）。リボレポーターをサンプルへ添加する。次にリボレポーターを検出し、これにより、全血清中または血清からの抽出物中の薬剤濃度を測定する。
【０３０７】
また、薬剤のリボレポーターを使用して、動物モデルシステムにおける薬剤分布を決定することができる。例えば、薬剤を、ＩＶまたは経口によって、動物（すなわち、ＳＤラット、ニュージーランドホワイトウサギ）に投与することができる（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｇｅｍａｌｍａｚら  １９９９）（Ｊｅｒｅｍｙ，  Ｂａｌｌａｒｄら  １９９７）。薬剤投与の後、様々な時間間隔で、動物を屠殺する。薬剤依存性のリボレポーターを用いるＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、薬剤分布について種々の器官が試験する。あるいは、それぞれの器官／血清を、上記のように薬物動態学的研究のために調製する。
【０３０８】
（実施例２０．リボレポーターを用いる細胞浸透性の研究）
試験化合物に対するリボレポーターを、化合物の細胞浸透性を試験するために使用する。これらのリボレポーターを、上記のように薬剤感受性レポーター遺伝子システムを作成するために、所望であれば、レポーター遺伝子構築物へ組み込むことができる。この構築物は、樹立された細胞株（例えば、ＨＥＬＡ細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞）に導入する。細胞を培地において種々の濃度の薬剤中で培養し、レポーター遺伝子の発現をモニターする。
【０３０９】
（実施例２１．種類特異性ＰＤＥアッセイ）
各種類のＰＤＥ１−１１の触媒ドメインに対して産生されるリボレポーターを調製する。リボレポーターを全てのＰＤＥの触媒ドメインに対して産生する。これらのリボレポーターは、上記のように、標的の確認のために使用できる。
【０３１０】
あるいは、リボレポーターを、競合的阻害アッセイにおいて使用する。競合リボレポーターを、上記のように、多数のアッセイにおいて多数のＰＤＥに対する化合物をスクリーニングするためにインビトロアッセイで使用する。
【０３１１】
（実施例２２．天然ＥＲＫ１および天然ＥＲＫ２酵素によって活性化されるリボレポーター）
天然ＥＲＫ１および天然ＥＲＫ２酵素によって活性化される７４ヌクレオチドハンマーヘッドリボレポーター、ヌクレオチド配列および二次構造領域を、基質（配列番号３８）と共に、図１５Ａ（ＥＨＨ１．３）（配列番号３７）に示す。ＥＨＨ１．３リボレポーターを発現するために使用することができる部分的に二本鎖のＤＮＡ構築物も示す（配列番号３９および配列番号４０）。ハンマーヘッドリボレポーターおよび更なる基質を、図１５Ｂに配列番号４１−４５として示す。
【０３１２】
非リン酸化ＥＲＫ、リン酸化ＥＲＫが存在し、タンパク質が存在しない場合のシグナル発生の時間的経過を、放射標識リボレポーターにより時間に関して放出されたシグナルを測定することによって決定する。非リン酸化ＥＲＫがある場合にだけ、リボレポーターの切断に相当する顕著な量のシグナルが時間に関して観察された。リボレポーターがＥＲＫ阻害剤の存在下で酵素とともにインキュベートされる場合には、リボレポーターを用いて得られたシグナルは減少する。リボレポーターシグナルの減少は、阻害剤の濃度に依存する。
【０３１３】
これらの結果は、リボレポーターがＥＲＫの非リン酸化型に対して特異的であることを実証する。
【０３１４】
（実施例２３．ｐｐＥＲＫによって活性化されるリボレポーター）
ｐｐＥＲＫによって活性化されるリボレポーターを、関連の基質（配列番号４７−５１）と共に、配列番号４６として図１６に示す。リボレポーターおよび基質ＨＳ１．１（配列番号４７）はｐｐＥＲＫによりアロステリックに活性化される。
【０３１５】
（実施例２４．ｐｐＥＲＫリボプローブを用いるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ）
競合阻害剤リボレポーターを、ＨＴＳアッセイにおいて使用することができる。リン酸化ＥＲＫに特異的なリボレポーターを、ＡＴＰ結合のための競合阻害剤として使用する（Ｓｅｉｗｅｒｔ，Ｓｔｉｎｅｓ  Ｎａｈｒｅｉｎｉら  ２０００）。０．５ｕｇ／ｕｌのｔＲＮＡおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．５中で、種々の濃度の阻害剤の存在下、１０ｍＭのリボレポーターと共にＥＲＫをインキュベートすることによって、化合物のための競合アッセイを確立する。ＥＤＴＡの添加によって反応は終結し、反応したリボレポーターの量を決定する（図）。
【０３１６】
他の実施形態では、ペプチド（またはタンパク質基質）のリン酸化状態に感受性のリボレポーターを、キナーゼ活性のためのＨＴＳアッセイで使用することができる。リボレポーターは、基質またはそのペプチド（表を参照）のリン酸化状態に対して特異的に産生し得る。ＨＴＳアッセイを、これらの基質を用いて実行することができる（Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｃａｎｄｉａら  １９９６）。例えば、ＭＥＫはＧＳＴタグ付きタンパク質として発現され、標準法によって精製できる。種々の濃度の化合物の存在下で、ＭＥＫ濃度０．５ｎＭで、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭのジチオトレイトール、０．０１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＡＴＰ、および１ＭのＨｉｓタグ付きＥＲＫ２の標準反応条件下で、活性を３０Ｃで測定する。インキュベーション後、反応を、ＧＳＴ−カラムでＭＥＫを吸収することによって終結する。ＥＲＫ２のリン酸化を、リボレポーターによって定量化する。あるいは、リボレポーターをウェスタン−ブロットフォーマットで使用することができる（Ｂｉａｎｃｈｉｎｉ，Ｒａｄｒｉｚｚａｎｉら  ２００１）。
【０３１７】
実施例２３に記載されるホスホＥＲＫ（ｐｐＥＲＫ）に特異的なリボレポーターは、キナーゼ酵素の活性部位において、おそらく競合的な方法でｐｐＥＲＫへ結合し、ｐｐＥＲＫ酵素によるｐｐＥＲＫ基質のリン酸化を阻害する。最高２００ｎＭのリボレポーターは、ＥＲＫ基質のｐｐＥＲＫリン酸化の最高８０％を阻害する。
【０３１８】
（実施例２４．リン酸化状態に感受性のリボレポーターを用いるインビボアッセイ）
リン酸化状態感受性ｐｐＥＲＫリボレポーターを、インビボ（組織および細胞培養）で薬剤の効力を決定するために使用する。例えば、ガラスカバースリップ上のＴ８４細胞をＭＥＫキナーゼ阻害剤の存在および非存在下でインキュベートし、細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定し、０．３％トリトンＸ−１００を用いて透過処理する。スライドをＦＲＥＴリボレポーターとともにインキュベートする（Ｂｉａｎｃｈｉｎｉ，Ｒａｄｒｉｚｚａｎｉら  ２００１）。リン酸化基質の局在化を、共焦点顕微鏡を用いて観察することができる。
【０３１９】
あるいは、リン酸化状態感受性リボレポーターを、上記のレポーター−遺伝子構築物に組み込む。これらの構築物を細胞内に導入し、基質のリン酸化をモニターする。
【０３２０】
アロステリックハンマーヘッド、リガーゼ、またはヘアピンリボザイムのヌクレアーゼ耐性型から作られるリボレポーターを、ポリヌクレオチドの内部移行および細胞組み込みをもたらすことが知られている標準リポフェクタミン試薬またはリポソーム溶液を用いて哺乳類細胞にトランスフェクトする。
【０３２１】
所望であれば、アロステリックハンマーヘッド、リガーゼ、またはヘアピンリボザイム、もしくはアプタマービーコンまたはシグナル伝達アプタマーを、ｔａｒまたはアンテナポエディアなどのポリペプチドへ結合し、当該技術分野で既知の方法によって哺乳類細胞へ輸送する。
【０３２２】
リボレポーター系の活性を、リボレポーターが蛍光タグ付きの場合には蛍光の変化によって、あるいはアロステリックリボザイムの産物および基質型のＲＴ−ＰＣＲにより決定されるサイズの変化によって追跡される。
【０３２３】
（実施例２５．Ｇタンパク質リボレポーターを用いるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ）
活性化Ｇαタンパク質に依存性のリボレポーターを、任意のＧＰＣＲに対するアゴニストおよびインバースアゴニストの効力を試験するためにインビトロで使用する。Ｇｉαタンパク質ｃＤＮＡを得（ＧｕｔｈｒｉｅのｃＤＮＡリソースセンター）、Ｈｉｓタグ付きタンパク質として大腸菌中で発現する（Ｌｅｅ，Ｌｉｎｄｅｒら  １９９４）。ＧＤＰまたはＧＴＰ−γＳを、分解を回避するために精製中に添加する。ＧＤＰ−複合体Ｇｉαタンパク質およびＧＴＰ−複合体Ｇｉαタンパク質を、リボレポーターを産生するために使用する。
【０３２４】
ＧＴＰ−複合体Ｇｉαタンパク質（活性化−Ｇｉαタンパク質）に依存性のリボレポーターを、望ましい特性を有する選択されたリボレポーターをスクリーニングするために、結合アッセイにおいて試験する。例えば、１２ウェルプレート中のＣ６グルーム細胞（ｇｌｏｏｍ  ｃｅｌｌ）の膜画分を、アドレナリンの存在および非存在下で１６時間ロードする。活性化Ｇｉαタンパク質−依存性リボレポーターの応答について、細胞溶解液を試験することができる。あるいは、アデニリルシクラーゼに対する競合的結合を、前述のアッセイに基づく修正型アッセイによって、リボレポーターの存在下で活性化Ｇｉαタンパク質によるアデニリルシクラーゼ活性の阻害に続いて試験する（Ｂｕｒｔ，Ｓａｕｔｅら  １９９８）。
【０３２５】
アデニリルシクラーゼ活性を、リボレポーターの存在および非存在下で、記載されたように測定する（ＫｏｚａｓａおよびＧｉｌｍａｎ  １９９５）。緩衝液に再懸濁されたヒトのクローン化５−ＨＴ１ＡレセプターでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの細胞膜を、化合物をスクリーニングするために使用する。膜は、３０ＭのＧＤＰおよび減少濃度の試験薬剤（１００ｐＭ〜０．１ｎＭ）または１００Ｍ〜０．１ｎＭ（参照曲線）への減少濃度の５−ＨＴと共に、約０．５ｍＬの最終体積において、３０Ｃで２０分間インキュベートする（ＳｔａｎｔｏｎおよびＢｅｅｒ  １９９７）。次にサンプルを、ＧＴＰＳおよびリボレポーターが添加された後、３０Ｃでさらに３０分間インキュベートする。
【０３２６】
あるいは、Ｇαタンパク質と複合体化されていないＧβタンパク質の存在に依存するリボレポーターを産生する。４つの既知の種類のＧβタンパク質が存在する。またＧγタンパク質とのＧβタンパク質複合体も、シグナル伝達において重要な役割を果たすことができる。αサブユニットから解離した後、この複合体は、ＧＲＫ、Ｒａｆキナーゼ、アデニリルシクラーゼ、ＰＬＣおよびイオンチャネルなどの種々の標的タンパク質を調節することが知られている。産生はそのエフェクタを活性化するための複合体を遮断する。
【０３２７】
（実施例２６．ＧＰＣＲリボレポーターを用いる細胞ベースのアッセイ）
ＧＰＣＲリボレポーターは、前記のＧＰＣＲアッセイの変形を用いる細胞ベースのアッセイで使用する（Ｈｕｎ，Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら  ２００１）。例えば、β−アドレナリンレセプターを、ＣＨＯ細胞中で発現し得る。ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、マルチウェル組織培養プレートにおいて増殖する。アッセイの日には、培地を、２５０ＭのＩＢＭＸ（イソブチル−１−メチルキサンチン）および１ｍＭのアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地を含む０．２ｍＬの処理培地と取り替え、試験化合物をＤＭＳＯに溶解する。試験化合物を所望の濃度範囲（例えば１０−９〜１０−４Ｍ）で添加する。イソプロテレノール（１０−５Ｍ）を、活性の比較のために内部標準として使用する。細胞を、ロッカー上で１５〜３０分間、３７Ｃでインキュベートする。次に、細胞を溶解し、活性化Ｇαタンパク質のレベルをリボレポーターにより測定する。アンタゴニストを、既知のアゴニストの存在下、活性化Ｇαタンパク質量の減少を検出することによって、同じフォーマットでスクリーニングされることが可能である。
【０３２８】
あるいは、特異的または一般的ＧＰＣＲのための化合物のアゴニズムおよびアンタゴニズムを、リボレポーターを用いて測定する。例えば、１−アンタゴニズムのための化合物の評価を、ＳＤラットを用いて実行することができる。動物からの大動脈を単離し、付着している結合組織を取り除く。ノルアドレナリンの神経細胞および神経外の組み込み遮断するためのデスメチルイミプラミン（０．１Ｍ）およびコルチコステロン（１Ｍ）、β−レセプターを遮断するための（±）−プロプラノロール（１Ｍ）、および２−レセプターを遮断するためのヨヒンビン（０．１Ｍ）を添加することができる。動脈片を、１０Ｍのノルアドレナリンの存在および非存在下で、種々の濃度の化合物とともにインキュベートする。次に、細胞抽出物を調製し、細胞中の活性化Ｇｉαタンパク質レベルをリボレポーターで測定することができる（Ｂａｒｌｏｃｃｏ，Ｃｉｇｎａｒｅｌｌａら  ２００１）。
【０３２９】
（実施例２７．ＩＭＰＤＨリボレポーターを用いる多重アッセイ）
ＩＭＰＤＨタイプ１ポリペプチドおよびＩＭＰＤＨタイプ２ポリペプチドは、８４％相同性を共有する。アプタマーはポリペプチドＩＭＰＤＨ−１へ結合する能力に基づいて単離され（「ＩＭＰＤＨ−１アプタマー」）、調製され、ポリペプチドＩＭＰＤＨ−２へ結合する能力に基づくアプタマーも同様である（「ＩＭＰＤＨ−２アプタマー」）。アプタマーの活性は、ＩＭＰＤＨ−１の存在下、ＩＭＰＤＨ−２の存在下、または外来性タンパク質の非存在下で決定される。結合はＩＭＰＤＨ−１アプタマーまたはＩＭＰＤＨ−２アプタマーではほとんど観察されず、外来性タンパク質の非存在下ではほとんど観察されない。ＩＭＰＤＨ−１はＩＭＰＤＨ−１およびＩＭＰＤＨ−２ポリペプチドの両方へ結合するが、ＩＭＰＤＨ−１アプタマーはＩＭＰＤＨ−１ポリペプチドへより高い親和性で結合し、ＩＭＰＤＨ−２はＩＭＰＤＨ−２ポリペプチドへの著しい結合を示すが、ＩＭＰＤＨ−１ポリペプチドへの有意の結合を示さない。
【０３３０】
（実施例２８．Ｇαタンパク質依存性リボレポーターを用いてＧαタンパク質の遊離を伴うことによるＧＰＣＲ活性のためのインビトロアッセイ）
Ｇαタンパク質サブユニットに対して産生されたリボレポーターを、活性化Ｇを用いてインビトロで任意のＧＰＣＲについてアゴニストおよびインバースアゴニストの効力を試験するために使用する。例えば、Ｇｉαタンパク質ｃＤＮＡを得て（ＧｕｔｈｒｉｅのｃＤＮＡリソースセンター）、Ｈｉｓタグ付きタンパク質として大腸菌中で発現することができる（Ｌｅｅ，Ｌｉｎｄｅｒら  １９９４）。ＧＤＰまたはＧＴＰ−γＳを、分解を回避するために精製中に添加する。ＧＤＰ−複合体Ｇｉαタンパク質およびＧＴＰ−複合体Ｇｉαタンパク質を、リボレポーターを産生するために使用する。ＧＴＰ−複合体Ｇｉαタンパク質（活性化−Ｇｉαタンパク質）に依存性のリボレポーターを、望ましい特性を有する選択されたリボレポーターをスクリーニングするために、結合アッセイに対して試験することができる。例えば、１２ウェルプレート中のＣ６神経膠腫細胞の膜画分を、アドレナリンの存在および非存在下で１６時間ロードした。活性化Ｇｉαタンパク質−依存性リボレポーターの応答について、細胞溶解液を試験することができる。あるいは、アデニリルシクラーゼに対する競合的結合は、前述のアッセイに基づく修正型アッセイによって、リボレポーターの存在下で活性化Ｇｉαタンパク質によるアデニリルシクラーゼ活性の阻害に続いて試験することができる（Ｂｕｒｔ，Ｓａｕｔｅｌら  １９９８）。
【０３３１】
アデニリルシクラーゼ活性を、リボレポーターの存在および非存在下で、記載されたように測定することができる（ＫｏｚａｓａおよびＧｉｌｍａｎ  １９９５）。緩衝液に再懸濁されたヒトのクローン化５−ＨＴ１ＡレセプターでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの細胞膜を、化合物をスクリーニングするために使用することができる。膜を、３０ｍＭのＧＤＰおよび減少濃度の試験薬剤または１００Ｍ〜０．１ｎＭ（参照曲線）への減少濃度の５−ＨＴと共に、約０．５ｍＬの最終体積において、３０Ｃで２０分間インキュベートする（ＳｔａｎｔｏｎおよびＢｅｅｒ  １９９７）。次にサンプルを、ＧＴＰＳおよびリボレポーターが添加した後、３０℃でさらに３０分間インキュベートする。
【０３３２】
またＧαタンパク質と複合体化されていないＧβタンパク質の存在に依存するリボレポーターも産生することができる。４つの既知の種類のＧβタンパク質が存在する。またＧγタンパク質とのＧβタンパク質複合体も、シグナル伝達において重要な役割を果たすことができる。αサブユニットから解離した後、この複合体は、ＧＲＫ、Ｒａｆキナーゼ、アデニリルシクラーゼ、ＰＬＣおよびイオンチャネルなどの種々の標的タンパク質を調節することが知られている。フォスデューシンはそのエフェクタを活性化するための複合体を遮断する。
【０３３３】
（実施例２９．Ｇα−活性化に続く細胞ベースのアッセイ  ＧＰＣＲアッセイ）
リボレポーターを、既に記載されているアッセイと同様に、細胞ベースのアッセイにおいて使用する（Ｈｕ，Ｅｌｌｉｎｇｂｏｅら  ２００１）。例えば、β−アドレナリンレセプターを、ＣＨＯ細胞中で発現し得る。ＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、マルチウェル組織培養プレートにおいて増殖する。アッセイの日には、培地を、２５０ｍＭのＩＢＭＸ（イソブチル−１−メチルキサンチン）および１ｍＭのアスコルビン酸を含有するＤＭＥＭ培地を含む０．２ｍＬの処理培地と取り替え、試験化合物をＤＭＳＯに溶解する。試験化合物を所望の濃度範囲（例えば１０−９〜１０−４Ｍ）で添加する。（イソプロテレン１０−５Ｍ）は、活性の比較のために内部標準として使用する。細胞を、ロッカー上で１５〜３０分間、３７℃でインキュベートする。次に、細胞を溶解し、活性化Ｇαタンパク質のレベルをリボレポーターにより測定することができる。アンタゴニストを、既知のアゴニストの存在下、活性化Ｇαタンパク質量の減少を検出することによって、同じフォーマットでスクリーニングすることが可能である。
【０３３４】
あるいは、特異的または一般的ＧＰＣＲのための化合物のアゴニズムおよびアンタゴニズムを、リボレポーターを用いて測定することができる。例えば、アンタゴニズムのための化合物の評価を、ＳＤラットを用いて実行することができる。動物からの大動脈を単離し、付着している結合組織を取り除く。ノルアドレナリンの神経細胞および神経外の組み込みを遮断するためのデスメチルイミプラミン（０．１Ｍ）およびコルチコステロン（１Ｍ）、β−レセプターを遮断するための（±）−プロプラノロール（１Ｍ）、および２−レセプターを遮断するためのヨヒンビン（０．１ｍＭ）を添加することができる。動脈片を、１０ｍＭのノルアドレナリンの存在および非存在下で、種々の濃度の化合物とともにインキュベートすることができる。次に、細胞抽出物を調製でき、細胞中の活性化Ｇｉαタンパク質レベルをリボレポーターで測定することができる（Ｂａｒｌｏｃｃｏ，Ｃｉｇｎａｒｅｌｌａら  ２００１）。
【０３３５】
（実施例３０．Ｇαタンパク質のための多重アッセイ）
多数の活性化Ｇタンパク質にその活性が依存するリボレポーターを産生する。ヒトのＧタンパク質ｃＤＮＡは公に利用可能なデータベースから得られるか、あるいは、適切な源のｐｏｌｋａ−ＲＮＡプールからＲＴ−ＰＣＲによってクローニングされる。これらは、上記のように発現させることができ、リボレポーター選択のために使用することができる。多重アッセイシステムのための読み取りは上記で論考される。
【０３３６】
以下に提供される参考文献は更なる情報を含み、その全体は参照により本発明細書中に援用される。
【０３３７】
（参考文献）
【０３３８】
【数１】
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本明細書中に記載されるもののバリエーション、改変、および他の実行は、特許請求される精神および範囲から逸脱することなく、当業者に思い浮かぶ。従って、本発明は、前述の例示的な説明によって規定されず、代わりに上記の特許請求の精神および範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、１つの実施形態にしたがって、標的分子活性化可能なリガーゼ活性を有する核酸センサー前駆体分子を選択する方法を示す流れ図である。
【図２】
図２Ａおよび２Ｂは、１つの実施形態に従う核酸センサー前駆体分子を示し、触媒部位はリガーゼ部位を含む。図２Ａは、核酸センサー前駆体分子の標的分子結合型のコンフォメーションを示す。図２Ｂは、核酸センサー前駆体分子の非標的結合型のコンフォメーションを示す。
【図３】
図３Ａおよび３Ｂは、図２Ａおよび図２Ｂに示される核酸センサー前駆体分子に由来する核酸センサー分子を示し、第１および第２のヌクレオチドは、第１および第２のシグナル伝達部分（それぞれ、ＦおよびＤ）で標識される。
【図４】
図４は、１つの実施形態に従って、標的分子活性化可能な自己切断活性を有する核酸センサー前駆体分子を選択する方法を示す流れ図である。
【図５】
図５Ａおよび５Ｂは、１つの実施形態に従う核酸センサー前駆体分子を示し、触媒部位は、ハンマーヘッド型リボザイムの触媒コアである自己切断部位を含む。図５Ａは、核酸センサー前駆体分子の標的分子結合型のコンフォメーションを示す。図５Ｂは、核酸センサー前駆体分子の非標的結合型のコンフォメーションを示す。
【図６】
図６Ａおよび６Ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに示される核酸センサー前駆体分子に由来する核酸センサー分子を示し、第１および第２のヌクレオチドは、第１および第２のシグナル伝達部分（それぞれ、ＦおよびＤ）で標識される。
【図７】
図７は、１つの１０実施形態に従う経路標的分子を説明する略図である。
【図８】
図８は、１つの実施形態に従う薬剤最適化方法におけるステップを示すフローチャートであり、核酸センサー分子は該方法の各ステップで使用される。
【図９】
図９Ａは、結合および非結合の両方のコンフォメーションにおいて、トロンビンに特異的なアプタマービーコンに由来する核酸センサーを示す。図９Ｂは、図９Ａに描かれる核酸センサーで作製されるタンパク質滴定データを示す。
【図１０】
図１０Ａは、エピ−照射型（ｅｐｉ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ）ＦＲＥＴ検出スキームで使用される場合に、固体支持体へ結合された自己切断核酸センサーの一例を示す。図１０Ｂは、アクセプターフルオロフォアがクエンチャ基で置換されたエピ−照射型ビーコン構成の同じセンサーを示す。図１０Ｃは、ＴＩＲ照射型ビーコン構成の同じセンサーを示す。
【図１１】
図１１は、ＴＩＲ照射型検出スキームで使用される場合に、固体支持体へ結合された自己連結核酸センサーの一例を示し、標的結合時にシグナルの増大が存在する。図１１Ｂはエピ−照射型構成の同一のセンサーを示し、標的結合は、基質へ結合されたフルオロフォアの蛍光偏光の変化をモニターすることによって検出される。
【図１２】
図１２は、自己連結核酸センサーを利用する均一性アッセイフォーマットにおけるビーズの使用を説明する。図１２Ａは、標的の結合および連結前（アクセプターからの発光なし）のビーズを示す。図１２Ｂは標的の結合および連結後（アクセプターからの発光が検出される）のビーズを示す。
【図１３】
図１３Ａは、単一のフルオロフォアを有し、クエンチャを有さないアプタマービーコン由来センサーを用いるＦＰベースの検出のための物理的な基礎を示す。図１３Ｂは、ガラス基板上の４要素バイオセンサーの、図１４に記載される走査型ＴＩＲ／ＰＭＴ検出システムで獲得された画像を示す。図１３Ｃは、希釈ヒト血清の生物体液中でトロンビンセンサーにより発生されたＦＰ滴定曲線を示す。
【図１４】
図１４は、広い領域の照射／ＣＣＤイメージングモードか、走査スポット／ＰＭＴイメージングモードのいずれかにおいて、ＴＩＲレーザーのエバネッセント波励起を利用する、予め構成された走査型検出システムの略図を示す。略図は、どのようにしてアレイが走査され、ＦＰまたは蛍光強度データが抽出できるかを示す。
【図１５Ａ】
図１５Ａは、ＥＲＫ１リボレポーターのヌクレオチド配列を示す略図である。
【図１５Ｂ】
図１５Ｂは、ＥＲＫ１リボレポーターのヌクレオチド配列を示す略図である。
【図１６】
図１６は、ｐｐＥＲＫリボレポーターのヌクレオチド配列を示す略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004527220.tif 000201
【国際調査報告】
2004527220.tif 000202
2004527220.tif 000203
2004527220.tif 000204
2004527220.tif 000205
2004527220.tif 000206
2004527220.tif 000207