(57)【要約】本発明は、個体の免疫調節のための新規組成物及び方法を提供する。免疫調節は、免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体の投与によって達成される。ＩＭＰ／ＭＣ複合体は共有結合していても、又は非共有結合していてもよく、そして非生物分解性マイクロキャリア又はナノキャリアと結合した少なくとも１つの免疫刺激配列を含んで成るポリヌクレオチドを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非生物分解性マイクロキャリア（ＭＣ）と結合した免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含んで成るポリヌクレオチドを含んで成る、免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体であって、ＩＳＳが配列５’−Ｃ，Ｇ−３’を含んで成り、但し、ＭＣが金、ラテックス又は磁気性のものである場合、結合はビオチン／アビジン以外のものである、複合体。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが前記マイクロキャリアと共有結合している、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが前記マイクロキャリアと非共有結合している、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項４】
前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項５】
前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項６】
前記マイクロキャリアが１０ｎｍ〜１０μｍのサイズである、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項７】
前記マイクロキャリアが２５ｎｍ〜５μｍのサイズである、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項８】
抗原を含まない、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項９】
ＩＳＳが配列５’−Ｔ，Ｃ，Ｇ−３’を含んで成る、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項１０】
ＩＳＳが配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成る、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項１１】
ＩＳＳが配列番号１を含んで成る、請求項１に記載のＩＭＰ／ＭＣ複合体。
【請求項１２】
個体の免疫応答を調節する方法であって、前記個体の免疫応答を調節するのに十分な量の、免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体を個体に投与することを含んで成り、前記ＭＣが非生物分解性ＭＣであり、そしてＩＳＳが配列５’−Ｃ，Ｇ−３’を含んで成る、方法。
【請求項１３】
前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体が共有結合している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体が非共有結合している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロキャリアが約１０μｍ未満のサイズである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体が抗原を含まない、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
Ｔｈ１型免疫応答が刺激される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
Ｔｈ２型免疫応答が抑制される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＳＳが配列５’−Ｔ，Ｃ，Ｇ−３’を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＳＳが配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
ＩＳＳが配列番号１を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
個体のインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を増大する方法であって、有効量の免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体を前記個体に投与することを含んで成り、前記ＭＣが非生物分解性ＭＣであり、ＩＳＳが配列５’−Ｃ，Ｇ−３’を含んで成り、そして有効量が、前記個体のＩＦＮ−γを増大せしめるのに十分な量である、方法。
【請求項２５】
前記個体が特発性肺線維症を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体が共有結合している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体が非共有結合している、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記マイクロキャリアが約１０μｍ未満のサイズである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記複合体が抗原を含まない、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
ＩＳＳが配列５’−Ｔ，Ｃ，Ｇ−３’を含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
ＩＳＳが配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
ＩＳＳが配列番号１を含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
個体のインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）を増大する方法であって、有効量の免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体を前記個体に投与することを含んで成り、前記ＭＣが非生物分解性ＭＣであり、ＩＳＳが配列５’−Ｃ，Ｇ−３’を含んで成り、そして有効量が、前記個体のＩＦＮ−αを増大せしめるのに十分な量である、方法。
【請求項３６】
前記個体がウイルス感染している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体が共有結合している、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体が非共有結合している、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記マイクロキャリアが約１０μｍ未満のサイズである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記複合体が抗原を含まない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
ＩＳＳが配列５’−Ｔ，Ｃ，Ｇ−３’を含んで成る、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
ＩＳＳが配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成る、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
ＩＳＳが配列番号１を含んで成る、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
個体のＩｇＥのレベルを低下させる方法であって、有効量の免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体を個体に投与することを含んで成り、前記ＭＣが非生物分解性ＭＣであり、ＩＳＳが配列５’−Ｃ，Ｇ−３’を含んで成り、そして有効量が、前記個体のＩｇＥレベルを低下せしめるのに十分な量である、方法。
【請求項４７】
前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体が共有結合している、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体が非共有結合している、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記マイクロキャリアが約１０μｍ未満のサイズである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記複合体が抗原を含まない、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
ＩＳＳが配列５’−Ｔ，Ｃ，Ｇ−３’を含んで成る、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
ＩＳＳが配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成る、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
ＩＳＳが配列番号１を含んで成る、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体を含んで成る容器を含んで成るキットであって、ここで、前記ＭＣは非生物分解性ＭＣであり、ＩＳＳは配列５’−Ｃ，Ｇ−３’を含んで成る；そして、個体の免疫調節におけるＩＭＰ／ＭＣ複合体の使用のための説明書を含んで成るキット。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチドが前記マイクロキャリアと共有結合している、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記ポリヌクレオチドが前記マイクロキャリアと非共有結合している、請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
前記マイクロキャリアが液相のマイクロキャリアである、請求項５６に記載のキット。
【請求項６０】
前記マイクロキャリアが固相のマイクロキャリアである、請求項５６に記載のキット。
【請求項６１】
前記マイクロキャリアが１０ｎｍ〜１０μｍのサイズである、請求項５６に記載のキット。
【請求項６２】
前記マイクロキャリアが２５ｎｍ〜５μｍのサイズである、請求項５６に記載のキット。
【請求項６３】
前記複合体が抗原を含まない、請求項５６に記載のキット。
【請求項６４】
ＩＳＳが配列５’−Ｔ，Ｃ，Ｇ−３’を含んで成る、請求項５６に記載のキット。
【請求項６５】
ＩＳＳが配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成る、請求項５６に記載のキット。
【請求項６６】
ＩＳＳが配列番号１を含んで成る、請求項５６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる、２０００年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／１８８，５７７号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド配列（ＩＳＳ）を含んで成る免疫調節組成物に関する。特に、本発明は、非生物分解性微粒子と結合したＩＳＳを含んで成る免疫調節組成物に関する。これはまた、少なくとも１つの免疫応答を調節するポリヌクレオチド／マイクロキャリア複合体の投与にも関する。
【０００３】
背景技術
感染又は他の抗原に対する曝露に対して生じる免疫応答の型は、一般には応答に関与するＴヘルパー（Ｔｈ）細胞のサブセットにより識別され得る。Ｔｈ１のサブセットは、古典的な細胞媒介性機能、例えば、遅延型過敏症及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化、の原因であるのに対し、Ｔｈ２のサブセットは、Ｂ細胞活性化のためのヘルパーとしてより効果的に機能する。抗原に対する免疫応答の型は、一般には抗原に応答する細胞により生成されるサイトカインにより影響を受ける。Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞により分泌されるサイトカインにおける差異は、これら２つのサブセットの異なる生物学的機能を反映すると考えられている。例えば、Ｒｏｍａｇｎａｎｉ（２０００） Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８５：９−１８を参照のこと。
【０００４】
Ｔｈ１サブセットがウイルス感染、細胞内病原及び腫瘍細胞体に応答するために特に適切であると思われるのは、それがＣＴＬを活性化するＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌するためである。Ｔｈ２のサブセットが、好き勝手に生きている細菌及び寄生虫に対する応答にさらに適切であり、そしてアレルギー性反応を媒介すると思われるのは、ＩＬ−４及びＩＬ−５が、それぞれＩｇＥ産生及び好酸球の活性化を誘導することが知られているためである。一般には、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞は、異なるパターンのサイトカインを分泌し、従って、ある型の応答は、他の型の応答の活性を緩和し得る。Ｔｈ１／Ｔｈ２のバランスの変化は、例えば、アレルギー応答を、あるいは、ＣＴＬ応答の増大を生じ得る。
【０００５】
多くの感染病、例えば、結核及びマラリアにとって、Ｔｈ２型応答は、感染に対する予防的価値がほとんどない。標的抗原由来の低分子ペプチドを用いるワクチンの案及び潜在的に感染性である未処理ウイルス粒子の使用を避ける、他の現在使用されている抗原性物質は、治療効果を達成するために必要な免疫応答を常に誘発するわけではない。治療上で有効なヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンがないことは、この失敗の不幸な例である。タンパク質を基にしたワクチンは典型的に、高力価であるが、有意な細胞性免疫のない中和抗体によって特徴づけられる、Ｔｈ２型免疫応答を誘導する。
【０００６】
更に、抗体応答のうちの複数の型は、ある徴候において、最も顕著にはＩｇＥ抗体の応答がアナフィラキシーショックをもたらしうるアレルギーにおいて不適当である。通常、アレルギー応答はまた、Ｔｈ２型免疫応答に関与する。アレルギー応答、例えばアレルギー性喘息のものは、アレルゲンの曝露から数秒〜数分以内に発生し、そして細胞の脱顆粒を特徴とする初期相の応答、及びアレルゲンの曝露から４〜２４時間後に発生し、そしてアレルゲンが曝露された部位への好酸球の浸潤を特徴とする後期相の応答を特徴とする。具体的には、アレルギー応答の初期相の間に、アレルゲンは好塩基球及び肥満細胞上でＩｇＥ抗体を架橋し、続いて脱顆粒及びその後のヒスタミン及び他の炎症媒介物の肥満細胞及び好塩基球からの放出の引き金を引く。後期相の応答の間、好酸球はアレルゲンの曝露部位（組織の損傷及び機能障害が生じた場所）に浸潤する。
【０００７】
アレルギー性疾患のための抗原免疫療法は、小さいが、徐々に量が増大する抗原の皮下注射を含む。その様な免疫化処置には、ＩｇＥ媒介型アナフィラキシーを誘導する危険性が存在し、そしてこれはアレルギー性の後期相応答のサイトカイン媒介型事象を有効に処理しない。今までのところ、このアプローチはわずかに限定された成功をもたらしている。
【０００８】
一般的に免疫刺激配列又は「ＩＳＳ」として知られている、あるＤＮＡ配列の投与は、Ｔｈ１関連サイトカインの分泌によって示されるように、Ｔｈ１型に偏った免疫応答を誘導する。免疫刺激ポリヌクレオチドと抗原の投与は、投与される抗原に対するＴｈ１型の免疫応答をもたらす。Ｒｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ３：８４９−８５４． 例えば、エスケリッチャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｅ ｃｏｌｉ）のβガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）／生理食塩水又はアジュバントのミョウバンを皮内注射されたマウスは、特異的なＩｇＧ１及びＩｇＥ抗体、並びにＩＬ−４及びＩＬ−５は分泌したが、ＩＦＮ−γを分泌しなかったＣＤ４＋細胞を産生することによって応答し、Ｔ細胞が支配的にＴｈ２サブセットのものであったことを示した。しかしながら、β−Ｇａｌをコードし、かつＩＳＳを含むプラスミドＤＮＡ（生理食塩水中）を皮内に（又はｔｙｎｅ ｓｋｉｎ ｓｃｒａｔｃｈ ａｐｐｌｉｃａｔｏｒで）注射されたマウスは、ＩｇＧ２ａ抗体、ならびにＩＦＮ−γを分泌したがＩＬ−４及びＩＬ−５を分泌しなかったＣＤ４＋細胞を産生することにより応答し、Ｔ細胞が支配的にＴｈ１のサブセットのものであることを示した。更に、プラスミドＤＮＡを注射されたマウスによる特異的なＩｇＥの産生は、６６〜７５％減少した。Ｒａｚ ｅｔ ａｌ． （１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５１４１−５１４５． 通常、裸のＤＮＡの免疫に対する応答は、Ｔｈ１型の応答であることを示す、抗原刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−２、ＴＮＦα及びＩＦＮ−γの産生によって特徴づけられる。これはＩｇＥ産生の減少により示されるようにアレルギー及び喘息の処置において特に重要である。Ｔｈ１型の免疫応答を刺激する免疫刺激ポリヌクレオチドの能力は、細菌性抗原、ウイルス抗原及びアレルゲンによって証明されている（例えば、ＷＯ９８／５５４９５を参照のこと）。
【０００９】
微粒子（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ビーズ）に結合したＩＳＳ含有オリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫刺激活性を有することがこれまでに示されている（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９６）， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：１１１９−１１２９）。しかしながら、近年の結果は、金、ラテックス及び磁気粒子に結合したＩＳＳ含有オリゴヌクレオチドが、ＩＳＳ含有オリゴヌクレオチドに応じて増殖する、７ＴＤ１細胞の増殖を刺激するのに活性でないことを示している（Ｍａｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ９：４５９−４６４）。
【００１０】
ＩＳＳを記載している他の引用文献は：
【表１】
2004502645.tif 000002
【表２】
2004502645.tif 000003
【００１１】
更に、Ｇｏｄａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９５）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３２：４０４−４１０は、ポリイソヘキシルシアノアクリラートのナノ粒子と結合したコレステロール修飾型のアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。
【００１２】
本明細書に列記されている全ての特許、特許出願、及び刊行物は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【００１３】
本発明の開示
本発明は、個体、特にヒトの個体において免疫応答を修飾するための新規組成物及び方法に関する。
【００１４】
１つの観点において、本発明は免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体を含んで成る組成物に関する。ＩＭＰ／ＭＣ複合体は非生物分解性マイクロキャリア（ＭＣ）と結合した免疫刺激配列（ＩＭＰ）を含んで成るポリヌクレオチド（ＩＭＰ）を含んで成るが、但し、ＭＣは金、ラテックス又は磁気性のものである場合、当該結合はビオチン／アビジン（又はビオチン／ストレプトアビジン）を介する以外のものである。ＩＭＰは、複合体においてマイクロキャリアと共有結合的に又は非共有結合的に結合してもよく、そしてＩＭＰは複合体の形成を容易にするために修飾されることがある。ＩＭＰ／ＭＣ複合体において使用されるマイクロキャリアは、液相のマイクロキャリア又は固相のマイクロキャリアであってもよい。マイクロキャリアは、通常サイズが約１００μｍ未満であり、そしてサイズが約１０ｎｍ〜約１０μｍ又は約２５ｎｍ〜５μｍであってもよい。ある態様において、本発明の組成物はＩＭＰ／ＭＣ複合体及び医薬として許容される補形剤を含んで成る。ある態様において、本発明の組成物は、抗原を含まないＩＭＰ／ＭＣ複合体、すなわち抗原と結合（直接的又は間接的のいずれか）していないＩＭＰ／ＭＣ複合体を含んで成る。
【００１５】
別の観点において、本発明は個体の免疫応答を調節する方法であって、個体に対し、前記個体において免疫応答を調節するのに十分な量のＩＭＰ／ＭＣ複合体を投与することを含んで成る方法、に関する。本発明の方法に従う免疫調節は、Ｔｈ２型の免疫応答に関連する疾患（例えば、アレルギー又はアレルギー誘導型の喘息）に苦しむ者を含む個体、ワクチン、例えば治療用ワクチン（例えばアレルギーのエピトープ、放線菌のエピトープ、又は腫瘍関連型のエピトープ）又は予防用ワクチンを受けている個体、ガンを有する個体、感染病を有する個体及び感染因子に曝露される恐れのある個体に対して実施され得る。
【００１６】
更なる観点において、本発明は、個体におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）を増大する方法であって、当該個体に対し有効量のＩＭＰ／ＭＣ複合体を投与することを含んで成る方法、に関する。本発明に従うＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与は、個体のＩＦＮ−γを増大する。これらの方法に適した対象者は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、強皮症、皮膚性放射線誘導型線維症、肝線維症、例えば住血吸虫症誘導型肝線維症、腎線維症並びにＩＦＮ−γの投与によって改善され得る他の症状を有する個体を含む。
【００１７】
別の観点において、本発明は個体におけるＩＦＮ−αを増大する方法であって、有効量のＩＭＰ／ＭＣ複合体を個体に投与することを含んで成る方法、に関する。本発明に従うＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与は、個体のＩＦＮ−αレベルを増大する。これらの方法に適した対象者は、ＩＦＮ−αの投与に応答する疾患、例えばウイルスの感染症及びガン、を有する個体を含む。
【００１８】
別の観点において、本発明は、感染病の１又は複数の症状を緩和する方法であって、感染病を有する個体に対し、有効量のＩＭＰ／ＭＣ複合体を投与することを含んで成る方法、に関する。本発明に従うＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与は、感染病の１又は複数の症状を緩和する。本発明に従い処置されうる感染病は、細胞内病原によって生じる感染病（例えば放線菌性疾患、マラリア、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、住血吸虫症又は肝吸虫症）を含み、そしてウイルス病を含んでもよく、又は排除してもよい。
【００１９】
本発明は更に、本発明の方法を実施するためのキットに関する。本発明のキットは、個体の免疫調節における、例えば当該個体がＴｈ２型の免疫応答に関連する疾患（例えば、アレルギー又はアレルギー誘導型の喘息）に苦しみ、ワクチン、例えば治療用ワクチン（例えばアレルギーエピトープ、放線菌のエピトープ、又は腫瘍関連型エピトープ）又は予防用ワクチンを受け、ガンに苦しみ、感染病に苦しみ、又は感染因子に曝露される恐れがある場合の、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の使用ためのＩＭＰ／ＭＣ複合体の説明書を含んで成る容器を含んで成る。
【００２０】
本発明の実施形態
我々は、個体、特にヒトにおける免疫応答を調節するための新規組成物及び方法を発見した。本発明の組成物は、非生物分解性マイクロキャリア（ＭＣ）と複合した免疫調節ポリヌクレオチド（ＩＭＰ）を含んで成る。我々は、ナノメーター規模のマイクロキャリア（５０〜２００ｎｍの直径のビーズ）と組み合わせた免疫調節ポリヌクレオチドが、ヒトの細胞を含む免疫細胞を効率的に調節することを発見した。小さいマイクロキャリア（約１〜４．５μｍ、２．０μｍ又は約１．５μｍ未満の直径）と組み合わせたＩＭＰも、ヒト細胞を免疫調節した。我々の発見が特に注目されるべきものであるのは、ヒト細胞が、当業界で公知の様に、一般的に使用される研究動物、例えばマウス由来の細胞より、ＩＭＰによる免疫調節に耐性があると思われるためである。
【００２１】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、抗原を含んでいても、又は排除していてもよい。いくつかの態様において、本発明は、抗原を含まないＩＭＰ／ＭＣ複合体、すなわち抗原と結合（直接的又は間接的のいずれか）していないＩＭＰ／ＭＣ複合体を含んで成る組成物を提供する。他の態様において、本発明は、１又は複数の抗原と混合したＩＭＰ／ＭＣ複合体を含んで成る組成物を提供する。他の態様において、本発明は、抗原と結合したＩＭＰ／ＭＣ複合体を含んで成る組成物を提供する。
【００２２】
我々は更に、非生物分解性ナノキャリア粒子を含んで成る共有結合型のＩＭＰ／ＭＣ複合体が高度に活性な免疫調節物質であることを発見した。従来技術は、非生物分解性の微粒子及びナノ粒子と強固に結合した免疫刺激オリゴヌクレオチドが有効でないことを示唆している（Ｍａｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．， 上記）。当業界におけるこの理解を考慮して、我々は、我々の結果が当業者にとって驚くべきものであり、そして予期されないものであると考える。
【００２３】
本発明の免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体は、共有結合していても、又は非共有結合していてもよく、そして水不溶性のマイクロキャリア（例えば、約１０μｍ未満のサイズのキャリア）を含んで成る。マイクロキャリアは固相（例えば、ポリスチレンビーズ）であっても、又は液相（例えばリポソーム、ミセル、又は油−水の乳濁液中の油滴）であってもよい。ＩＭＰは、ＭＣと結合させ、又はそれを強化するように修飾されることがある（例えば、共有結合的な架橋のための遊離スルフヒドリルの組込又は疎水性部分の挿入、例えば、疎水性結合の場合、コレステロール）。
【００２４】
本発明は、共有結合型のＩＭＰ／ＭＣ複合体を形成するために非生物分解性のマイクロキャリアと共有結合したＩＭＰを含んで成る新規組成物を提供する。ＩＭＰとＭＣの間の結合は直接的であってもよく（例えば、ＩＭＰ及びＭＣ上のスルフヒドリル間のジスルフィド結合を介する）、あるいは構成成分が、ＩＭＰとＭＣに対する結合を分離する、１又は複数の分子の架橋部分によって結合されることもある。
【００２５】
更に提供されるものとして、非共有結合型のＩＭＰ／ＭＣ複合体を提供するために、マイクロキャリアと非共有結合したＩＭＰを含んで成る組成物がある。非共有結合型のＩＭＰ／ＭＣ複合体は、通常、マイクロキャリアと結合せしめるように修飾されているＩＭＰを含んで成る（例えば、油又は脂質を基にしたマイクロキャリアと疎水性結合をさせるための、コレステロール部分の挿入による）。
【００２６】
本発明はまた、個体に対しＩＭＰ／ＭＣ複合体を投与することによって、個体における免疫応答を調節する方法を提供する。
【００２７】
更に提供されるものとして、本発明の方法を実施するためのキットがある。当該キットは、対象者における免疫調節のためのＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与のための説明書及びＩＭＰ／ＭＣ複合体を含んで成る包装又は容器を含んで成る。
【００２８】
一般的技術
本発明の実施は、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の常用の技術を用いる。その様な技術は、文献、例えば
【表３】
2004502645.tif 000004
において完全に説明されている。
【００２９】
定義
本明細書で使用する場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」）は特に断らない限り、複数の言及を含む。例えば（「ａｎ」）ＩＳＳは１又は複数のＩＳＳを含む。
【００３０】
本明細書で交換可能に使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、修飾されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド、又はこれらの組み合わせを含む。オリゴヌクレオチドは、直鎖状又は環状の構造であってもよく、又はオリゴヌクレオチドは、直鎖状及び環状のセグメントの両方を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、一般に、ホスホジエステル結合を介して連結したヌクレオシドのポリマーであるが、別の結合、例えばホスホロチオエートエステルもオリゴヌクレオチドにおいて使用され得る。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン（アデニンもしくはグアニン又はそれらの誘導体）又はピリミジン（チミン、シトシン、もしくはウラシル、又はそれらの誘導体）塩基からなる。ＤＮＡにおける４つのヌクレオシド単位（又は塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、及びデオキシシチジンと称される。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００３１】
用語「ＩＳＳ」は、本明細書で使用する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｅｘ ｖｉｖｏで測定される場合に測定可能な免疫応答をもたらすオリゴヌクレオチド配列を言及する。測定可能な免疫応答の例は、限定しないが、抗原特異的抗体産生、サイトカインの分泌、リンパ球群、例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂリンパ球等の活性化又は増殖を含む。好ましくは、ＩＳＳ配列は、Ｔｈ１型応答を優先的に活性化する。本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＩＳＳを含む。本明細書で使用する場合、「ＩＳＳ」は、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドのための省略された用語でもある。
【００３２】
用語「免疫調節ポリヌクレオチド」又は「ＩＭＰ」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つのＩＳＳを含んで成るポリヌクレオチドを言及する。ある態様において、ＩＭＰはＩＳＳである。
【００３３】
用語「非生物分解性」は、本明細書で使用する場合、正常な哺乳類の生理学的条件下で分解されない、又は浸蝕されないマイクロキャリアを言及する。一般的に、マイクロキャリアは、それが正常なヒトの血清中での３７℃での７２時間のインキュベーション後に分解されない（すなわち、その体積及び／又は平均のポリマーの長さの５％も失われない）場合、非生物分解性であるとみなされる。
【００３４】
用語「マイクロキャリア」は、水不溶性であり、且つ約１００μｍ未満、好ましくは約５０〜６０μｍ未満、好ましくは約１０μｍ未満、好ましくは約５，２．５、２又は１．５μｍ未満、のサイズを有する、粒子組成物を言及する。マイクロキャリアは、約１μｍ未満、好ましくは約５００ｎｍ未満のサイズを有するマイクロキャリアである、「ナノキャリア」を含む。マイクロキャリアは、固相の粒子、例えば生物学的適合性のある天然のポリマー、合成ポリマー又は合成コポリマーから形成される粒子を含むが、アガロース又は架橋されたアガロースから形成されたマイクロキャリアは、本明細書のマイクロキャリアの定義を含んでいても、又はそれから除外されていてもよい。固相のマイクロキャリアは、哺乳類の生理学的条件下で非浸蝕性及び／又は非分解性のポリマー又は他の材料、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、金、ラテックス、ハイドロキシアパタイト、デキストラン、並びに強磁性及び常磁性材料、から形成される。マイクロキャリアは更に、リポソーム、抗原を含まないｉｓｃｏｍ（免疫刺激複合体。コレステロール、及びリン脂質、アジュバント活性サポニンの安定な複合体である）、あるいは水中油又は油の乳濁液における水中油に見られる小滴又はミセルの様な、油又は脂質を基にしたものであってもよい。マイクロキャリアは典型的に球状の形であるが、球状から逸脱しているマイクロキャリアも許容される（例えば、長円形、竿状、等）。それらの不溶性の性質（水に関する）に起因して、マイクロキャリアは、水及び水を基にした（水性の）溶液から濾過することができる。
【００３５】
マイクロキャリアの「サイズ」は、一般的に製造業者によって述べられている、粒子の「設計サイズ」又は意図されるサイズである。サイズは、直接的に測定される寸法、例えば平均又は最大直径であってもよく、又は間接的なアッセイ、例えば濾過スクリーニングアッセイによって決定されてもよい。マイクロキャリアのサイズの直接的な測定は、典型的に、顕微鏡、通常光学顕微鏡又は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって、既知のサイズの粒子と比較して、又はマイクロメータを参照することによって実施される。サイズの軽微な変化が、製造工程の間に生じる場合、測定値が、マイクロキャリアが規定の測定値の±約５〜１０％であることを示すならば、マイクロキャリアは規定のサイズであるとみなされる。サイズの特徴は、動的光散乱によって決定されうる。あるいは、マイクロキャリアのサイズは、濾過スクリーニングアッセイによって決定によって決定されうる。マイクロキャリアは、少なくとも９７％の粒子が、規定のサイズの「スクリーン形」フィルター（すなわち、保持された粒子がフィルターの表面上にあるフィルター、例えばポリカーボネート又はポリエーテルスルホンフィルターであり、これに対し、「デプスフィルター」は、保持された粒子がフィルター内に引っかかる）を通過する場合に規定のサイズ未満である。マイクロキャリアは、少なくとも約９７％のマイクロキャリアが、規定のサイズのスクリーン形フィルターによって保持される場合、規定のサイズより大きい。従って、約１０μｍ〜約１０ｎｍのマイクロキャリアの、少なくとも約９７％が、１０μｍの孔のスクリーンフィルターを通過し、そして１０ｎｍのスクリーンフィルターによって保持される。
【００３６】
上述の議論が示唆するように、マイクロキャリアのためのサイズ又はサイズ範囲に対する言及は、規定のサイズ及び／又はサイズ範囲のおおよその変動及び概算を暗に含む。これは、サイズ及び／又はサイズ範囲を言及する場合の、用語「約」の使用によって反映され、そして、「約」について言及していない、サイズ又はサイズ範囲の言及は、サイズ及び／又はサイズ範囲が正確であることを意味しない。
【００３７】
用語「免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア複合体」又は「ＩＭＰ／ＭＣ複合体」は、本発明のＩＳＳ含有ポリヌクレオチドとマイクロキャリアとの複合体を言及する。当該複合体の成分は、共有結合していても、又は非共有結合していてもよい。非共有結合は、任意な非共有結合力によって、例えば疎水性相互作用、イオン（静電的）結合、水素結合及び／又はファンデルワールス引力によって媒介されうる。疎水性結合の場合、当該結合は、一般的にＩＭＰと共有結合した疎水性部分（例えば、コレステロール）を介する。
【００３８】
用語「免疫調節」又は「免疫応答の調節」は、本明細書で使用する場合、免疫刺激及び免疫抑制効果を含む。免疫調節は、主に、全体的な免疫応答における定性的な変化であるが、定量的な変化は、免疫調節と一緒に生じてもよい。本発明に従い免疫調節される免疫応答は、「Ｔｈ２型」免疫応答ではなく、「Ｔｈ１型」の免疫応答へと推移するものである。Ｔｈ１型の応答は、典型的に細胞性免疫系（例えば、細胞傷害性リンパ球）の応答であると考えられるが、Ｔｈ２型の応答は、通常「体液性」であるか、又は抗体を基にしている。Ｔｈ１型の免疫応答は通常、抗原に対する「遅延型過敏症」によって特徴づけられ、そしてＴｈ１関連サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、及びＴＮＦ−β、並びにＩＦＮ−α及びＩＬ−６のレベルの増大によって、生化学的なレベルで検出されうるが、ＩＬ−６はＴｈ２型免疫応答にも関連していることがある。Ｔｈ１型免疫応答は、通常細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）の産生及び低レベル又は一過性の抗体の産生と関連している。Ｔｈ２型免疫応答は、通常高レベルの抗体産生、例えばＩｇＥの産生、全く産生されない又は最低限産生されるＣＴＬ、並びにＴｈ２関連型サイトカイン、例えばＩＬ−４の発現、と関連している。従って、本発明に従う免疫調節は、例えば、本発明の方法に従い処置された個体における、未処置のものと比較した場合のＩＦＮ−γの増大及び／又はＩｇＥの産生の低下によって認識されうる。
【００３９】
用語「接合体」は、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドと抗原とが結合した複合体を言及する。その様な接合体の結合は、共有結合及び／又は非共有結合を含む。
【００４０】
用語「抗原」は、抗体又はＴ細胞抗原受容体によって特異的に認識及び結合される物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、複合多糖、糖類、ガングリオシド、脂質及びリン脂質；それらの部分、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。抗原は、天然に存在するものであってもよく、又は合成物であってもよい。ＩＳＳとの投与に適した抗原は、Ｂ細胞又はＴ細胞の抗原特異的応答を誘発し得る任意な分子を含む。好ましくは、抗原は、当該抗原に特異的な抗体応答を誘発する。ハプテンは、「抗原」の範囲内に含まれる。ハプテンは、それ自体は免疫原性ではないが、抗原決定基を含む免疫原性分子と接合した場合に免疫原性となる低分子量化合物である。小分子は、抗原性になるためにハプテン化される必要があり得る。好ましくは、本発明の抗原は、ペプチド、脂質（例えば、ステロール、脂肪酸、及びリン脂質）、多糖、例えばヘモフィルスインフルエンザワクチンにおいて使用されるようなもの、ガングリオシド及び糖タンパク質を含む。
【００４１】
「アジュバント」は、免疫原性物質、例えば抗原に添加した場合に、混合物に曝露した際にレシピエントの宿主中の当該物質に対する免疫応答を非特異的に増し又は増強する物質を言及する。
【００４２】
用語「ペプチド」は、当該ペプチドがハプテンであろうとなかろうと、生物学的応答、例えば、抗体産生又はサイトカイン活性をもたらすのに十分な長さ及び組成のポリペプチドである。典型的には、ペプチドは、少なくとも６アミノ酸残基の長さである。用語「ペプチド」は、修飾されたアミノ酸（天然又は非天然のいずれか）を更に含み、その様な修飾は、限定しないが、リン酸化、グリコシル化、ペグ化、脂質化及びメチル化を含む。
【００４３】
「抗原性ペプチド」は、精製された天然のペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化若しくは不活化ウイルス、細胞、微生物、又はその様なペプチドのフラグメントを含みうる。「抗原性ペプチド」又は「抗原ポリペプチド」は、従って、１又は複数の抗原性の特性を示すポリペプチドの全部又は一部を意味する。この様に、例えば「Ａｍｂ ａ １抗原性ポリペプチド」又は「Ａｍｂ ａ １ポリペプチド抗原」は、Ａｍｂ ａ １由来のアミノ酸配列であり、これは抗原性特性を示す（すなわち、抗体又はＴ細胞受容体と特異的に結合する）、全長配列、当該配列の一部、及び／又は当該配列の修飾物のいずれかである。
【００４４】
「送達分子」又は「送達担体」は、特定の部位に対し、そして／あるいは特定の時期に関して、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の送達を容易にし、可能にし、そして／あるいは増強する化学的部分である。送達担体は、付加的に免疫応答を刺激することもあり、又は刺激しないこともある。
【００４５】
「抗原に対するアレルギー応答」は、好酸球及び／又は抗原特異的ＩｇＥの発生並びにそららの結果による効果によって一般的に特徴づけられる免疫応答を意味する。当業界で周知な様に、ＩｇＥは肥満細胞及び好塩基球上のＩｇＥ受容体と結合する。ＩｇＥによって認識される抗原に対する後の曝露によって、当該抗原は肥満細胞及び好塩基球上のＩｇＥを架橋し、これらの細胞の脱顆粒、例えば、限定しないがヒスタミン放出を招く。用語「抗原に対するアレルギー応答」、「アレルギー」、及び「アレルギー症状」は、本発明の方法のいくつかの利用に、等しく適切であると理解され、そして意図される。更に、本発明の方法が、アレルギー応答の予防及びこれまでに存在しているアレルギー症状の処置に等しく適切であるものを含むと理解され、そして意図される。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「アレルゲン」は、対象者に対する曝露によってアレルギー応答を誘発する、抗原又は分子の抗原性部分、通常タンパク質を意味する。典型的に、当該対象者は、例えば、発赤及び膨疹試験又は当業界で公知の任意な方法によって示されるような、アレルゲンに対するアレルギーである。分子は、対象者のごくわずかなサブセットでも、当該分子に対する曝露によってアレルギー性（例えば、ＩｇＥ）の免疫応答を示している場合にアレルゲンであると称される。多くの単離されたアレルゲンが当業界で知られている。これらは、限定しないが、本明細書の表１に提示されているものを含む。
【００４７】
用語「脱感作」は、対象者が感受性を示したアレルゲンの量を増大する投与方法を言及する。脱感作に使用されるアレルゲンの量の例は、当業界で知られており、例えばＦｏｒｎａｄｌｅｙ（１９９８）Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ． Ｃｌｉｎ． Ｎｏｒｔｈ Ａｍ． ３１：１１１−１２７を参照のこと。
【００４８】
「抗原特異的免疫治療」は、抗原に関与し、そして免疫応答の抗原特異的調節を発生させる免疫治療の任意な形態を言及する。アレルゲンの状況において、抗原特異的免疫治療は、限定しないが、脱感作治療を含む。
【００４９】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒトである。哺乳類は、限定しないが、ヒト、霊長類、家畜、猟の動物、齧歯類及びペットを含む。脊椎動物はまた、限定しないが、鳥類（すなわち、鳥類の個体）及び爬虫類（すなわち、爬虫類の個体）を含む。
【００５０】
物質の「有効量」又は「十分量」は、有益な又は所望の結果、例えば臨床的な結果をもたらすのに十分な量であり、そしてその結果、「有効量」は、適用される状況に依存する。抗原に対する免疫応答を調節する組成物の投与の状況において、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の有効量は、抗原が単独で投与される場合に得られる免疫応答と比較されるような調節を達成するのに十分な量である。有効量は、１又は複数の投与で投与されうる。
【００５１】
用語「同時投与」は、本明細書で使用する場合、免疫応答を調節するために、十分に近い時間で少なくとも２つの異なる物質を投与することを言及する。好ましくは、同時投与は、少なくとも２つの異なる物質の同時の投与を言及する。
【００５２】
免疫応答、例えばＴｈ１応答の「刺激」は、応答の誘発及び／又は増強に起因しうる応答の増大を意味する。
【００５３】
「ＩｇＥ関連疾患」は、部分的に、持続性であっても、又はそうでなくてもよい上昇したＩｇＥレベルを特徴とする生理学的症状である。ＩｇＥ関連疾患は、限定しないが、アレルギー及びアレルギー性反応、アレルギー関連疾患（後述）、喘息、鼻炎、結膜炎、蕁麻疹、ショック、膜翅目の咬傷アレルギー、及び薬物アレルギー、及び寄生虫感染、を含む。当該用語はまた、これらの疾患の関連症状を含む。一般的に、その様な疾患において、ＩｇＥは抗原特異的である。
【００５４】
「アレルギー関連疾患」は、抗原特異的ＩｇＥ免疫応答の効果から生じる疾患を意味する。その様な効果は、限定しないが、低血圧及びショックを含むことがある。アナフィラキシーは、循環に放出されたヒスタミンが、血管拡張並びに血管の透過性の増大をもたらし、その結果循環からの血漿の著しい損失を招く間の、アレルギー関連疾患の一例である。アナフィラキシーは、身体全体を通じて経験する関連性の効果を伴い、全身的に発生することがあり、そして特異的な標的組織又は器官に限定された反応を伴い、局所的に発生することもある。
【００５５】
用語「ウイルス病」は、本明細書で使用する場合、ウイルスを、その病因学的物質として有する病気を言及する。ウイルス病の例は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、及び帯状疱疹を含む。
【００５６】
本明細書で使用され、そして当業界で周知な様に、「処置」は有益又は所望な結果、例えば臨床上の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益又は所望な臨床上の結果は、限定しないが、１又は複数の症候の軽減又は回復、病気の範囲の縮小、病気の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、病気の拡大の予防、病気の進行の遅延又は減速、病状の回復又は緩和、及び寛解（部分的又は全体的のいずれか）を含み、これらは検出可能又は検出不可能なもののいずれかである。「処置」は、処置を受けてなくても予期される生存と比較した場合に、生存を延長することを意味する。
【００５７】
病気又は疾患の「緩和」は、未処置の病気と比較して、疾患又は病気の状態の範囲及び／又は不所望な臨床上の症状が弱められ、そして／あるいは進行の時間経過が遅延され又は延長されることを意味する。特にアレルギーの状況において、当業者に十分に理解されているように、緩和は、アレルゲンに対する免疫応答の調節によって生じうる。更に、緩和は、必ずしも一回の量の投与で生じる必要はないが、しばしば一連の投与によって生じる。従って、応答又は疾患を緩和するのに十分な量が、１又は複数の投与で投与され得る。
【００５８】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体によって「誘発」される「抗体力価」、又は「抗体の量」は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与後の時点で測定される所定の抗体の量を言及する。
【００５９】
「Ｔｈ１関連抗体」は、産生及び／又は増大がＴｈ１免疫応答と関連している抗体である。例えばＩｇＧ２ａはマウスのＴｈ１関連抗体である。本発明の目的のために、Ｔｈ１関連抗体の測定は、１又は複数のその様な抗体の測定であってもよい。例えば、ヒトにおける、Ｔｈ１関連抗体の測定は、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ３の測定を伴うことがある。
【００６０】
「Ｔｈ２関連抗体」は、産生及び／又は増大がＴｈ２免疫応答と関連している抗体である。例えばＩｇＧ１はマウスのＴｈ２関連抗体である。本発明の目的のために、Ｔｈ２関連抗体の測定は、１又は複数のその様な抗体の測定であってもよい。例えば、ヒトにおける、Ｔｈ２関連抗体の測定は、ＩｇＧ２及び／又はＩｇＧ４の測定を伴うことがある。
【００６１】
機能又は活性、例えばサイトカイン産生、抗体産生、又はヒスタミン放出を「抑制」又は「阻害」することは、注目の条件又は要素を除いて他の点で同一の条件と比較した場合に、あるいは別の条件と比較した場合に、当該機能又は活性を低下することである。例えば、ヒスタミンの放出を抑制する抗原と一緒に投与される、又はそれを含むＩＭＰ／ＭＣ複合体は、例えば、抗原のみによって誘導されるヒスタミン放出と比較して、ヒスタミン放出を減少させた。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「含んで成る」及びその同族語は、それらの包括的な意味において使用され；すなわち、用語「含む」及びその相当する同族語と等しい。
【００６３】
本発明の組成物
本発明は、個体における免疫応答を調節するための新規組成物を提供する。当該新規組成物は、非生物分解性マイクロキャリアと複合したＩＳＳ含有ポリヌクレオチドを含んで成る免疫調節ポリヌクレオチド／マイクロキャリア（ＩＭＰ／ＭＣ）複合体である。ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、当該複合体のＩＭＰ部分が、ＭＣに対して直接的に又はリンカーを介して（すなわち、間接的に）共有結合している共有結合複合体であってもよく、又はそれらは非共有結合複合体であってもよい。
【００６４】
免疫調節ポリヌクレオチド
本発明に従い、免疫調節ポリヌクレオチドは少なくとも１つのＩＳＳを含み、そして複数のＩＳＳを含んでいてもよい。ＩＳＳはポリヌクレオチド内で隣接していてもよく、又はそれらはポリヌクレオチド内の追加のヌクレオチド塩基によって分離されることもある。従って、ＩＭＰは、本明細書に記載の１又は複数の組み合わせ、例えば修飾されたものを含むことがある。ある態様において、ＩＭＰはＩＳＳから成る。
【００６５】
ＩＳＳは、当業界で説明されており、そして免疫応答、例えばサイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化及びＴ細胞増殖の、様々な観点を示す標準的アッセイを用いて容易に同定され得る。例えば、
【表４】
2004502645.tif 000005
を参照のこと。
【００６６】
ＩＳＳは、６塩基又は塩基対以上の任意の長さのものであってもよく、そして通常配列５’−シトシン、グアニン−３’を含んで成り、好ましくは１５塩基又は塩基対以上、より好ましくは２０塩基又は塩基対以上の長さであってもよい。当業界で周知な様に、５’−シトシン、グアニン−３’配列のシトシンは、メチル化されていない。ＩＳＳはまた、配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成ることがある。ＩＳＳはまた、配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｃ−３’を含んで成ることがある。以下のポリヌクレオチド配列で示すように、ＩＳＳは、配列５’−Ｔ、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成ることもある（すなわち１又は複数のものを含む）。いくつかの態様において、ＩＳＳは配列５’−Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’（例えば、５’−ＣＧＴＴＣＧ−３’）を含んで成ることがある。いくつかの態様において、ＩＳＳは配列５’−Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ、プリン、プリン−３’を含んで成ることがある。いくつかの態様において、ＩＳＳは配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン−３（例えば５’−ＡＡＣＧＴＴ−３’）を含んで成ることがある。
【００６７】
いくつかの態様において、ＩＳＳは配列５’−プリン、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン−３’を含んで成ることがある。
【００６８】
いくつかの態様において、ＩＳＳは以下の配列：
【表５】
2004502645.tif 000006
のいずれかを含んで成ることがある。
【００６９】
いくつかの態様において、ＩＳＳは以下の配列：
【表６】
2004502645.tif 000007
のいずれかを含んで成ることがある。
【００７０】
いくつかの態様において、ＩＳＳは以下の配列：
【表７】
2004502645.tif 000008
（ここで、Ｂは５−ブロモシトシンである）のいずれかを含んで成ることがある。
【００７１】
いくつかの態様において、ＩＳＳは以下の配列：
【表８】
2004502645.tif 000009
（ここで、Ｂは５−ブロモシトシンである）のいずれかを含んで成ることがある。
【００７２】
いくつかの態様において、免疫調節ポリヌクレオチドは、配列５’−ＴＧＡＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号１）を含んで成る。他の態様において、ＩＳＳは配列：
【表９】
2004502645.tif 000010
のいずれかを含んで成る。
【００７３】
ＩＳＳ及び／又はＩＭＰは修飾を含んでいてもよい。ＩＳＳの修飾は、限定しないが、当業界で知られている任意な、３’ＯＨ又は５’ＯＨ基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、及びリン酸基の修飾を含む。様々なその様な修飾は後述する。
【００７４】
ＩＳＳ及び／又はＩＭＰは一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、及び一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、あるいは他の修飾されたポリヌクレオチドであってもよい。ＩＳＳは、上述のモチーフ内に存在することがあり、又は当該モチーフを超えて広がることもある、１又は複数のパリンドローム領域を含んでいても、又は含んでいなくてもよい。ＩＳＳは、いくつかは本明細書に記載した、追加の隣接配列を含んで成ることがある。ＩＳＳは、天然の、又は修飾された、非天然の塩基を含むことがあり、そして修飾された糖、リン酸、及び／又は末端を含むことがある。例えば、リン酸の修飾は、限定しないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホラミデート（架橋有り又は架橋無し）、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエートを含み、そして任意な組み合わせで使用され得る。他の非リン酸結合も使用され得る。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を含んで成る。当業界で知られている糖の修飾、例えば２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体及び２’−アルコキシ−又はアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ及び本明細書に記載の他のものも、生成され、そして任意なリン酸の修飾と一緒に組み合わされうる。塩基の修飾の例は、限定しないが、ＩＳＳのＣ−５及び／又はＣ−６（例えば、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヨードシトシン）への電子吸引性部分の挿入を含む。例えば、国際特許出願番号ＷＯ９９／６２９２３を参照のこと。
【００７５】
ＩＳＳ及び／又はＩＭＰは、限定しないが、酵素的方法、化学的方法、、及びより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解、を含む、当業界で周知な技術及び核酸合成装置を用いて合成され得る。例えばＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９８７）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９）を参照のこと。酵素的に構築された場合、個々の単位は、例えばリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いてライゲーションされ得る。米国特許第５，１２４，２４６号。オリゴヌクレオチドの分解は、米国特許第４，６５０，６７５号に例示されているように、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの曝露を介して達成され得る。
【００７６】
ＩＳＳ及び／又はＩＭＰはまた、常用のポリヌクレオチド単離手段を用いて単離され得る。その様な手順は、限定しないが、剪断されたヌクレオチド配列を検出するためのゲノム又はｃＤＮＡライブラリーに対するプローブのハイブリダイゼーション、剪断された構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング及びポリメラーゼ連鎖反応による特定の天然配列の合成、を含む。
【００７７】
環状ＩＭＰは単離され、組換え法を介して合成され、又は化学的に合成され得る。環状ＩＭＰが単離を介して、又は組換え法を介して得られる場合、ＩＭＰは、好ましくはプラスミドである。より小さな環状オリゴヌクレオチドの化学合成は、文献に記載される任意の方法を用いて実施され得る。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２０２５−２０２９；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２３２６−２３３３を参照のこと。
【００７８】
オリゴヌクレオチド及び修飾されたオリゴヌクレオチドを生成するための技術は当業界で知られている。ホスホジエステル結合を含む、天然ＤＮＡ又はＲＮＡは、３’末端で固体支持体に付着した伸長しているオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基に対する、適切なヌクレオシドホスホラミダイトの連続的なカップリング、それに続くリン酸トリエステルへの中間亜リン酸トリエステルの酸化によって通常合成される。一旦所望なオリゴヌクレオチド配列が合成されると、当該オリゴヌクレオチドは支持体から除去され、リン酸トリエステル基はリン酸ジエステルへと脱保護され、そしてヌクレオシド塩基は水性アンモニア又は他の塩基を用いて脱保護される。例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ （１９９３） ”Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” ｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ａｇｒａｗａｌ， ｅｄ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ； Ｗａｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８４） ＤＮＡ ３：４０１及び米国特許第４，４５８，０６６号を参照のこと。
【００７９】
ＩＳＳ及び／又はＩＭＰはまた、リン酸修飾型オリゴヌクレオチドを含むことがある。修飾されたリン酸結合又は非リン酸結合を含むポリヌクレオチドの合成も当業界で知られている。総説のために、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ （１９９７） ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ： ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ” ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ， （Ｄ． Ｊ． ｃｈａｄｗｉｃｋ ａｎｄ Ｇ． Ｃａｒｄｅｗ， ｅｄ．） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照のこと。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて糖又は糖類似体部分に結合し得る亜リン酸誘導体（又は修飾されたリン酸基）は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等であってもよい。上記のリン酸類似体の調製、ならびにヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、及びヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドへのそれらの組み込みも、本質的に公知であり、ここで詳細に記載する必要はない。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：１８４１−１８４８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２３１８−２３２３；及びＳｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４：２９６６−２９７３。例えば、ホスホロチオエートリゴヌクレオチドの合成は、酸化段階が硫化段階で置換されることを除き、天然のオリゴヌクレオチドのために上述したものと類似である（Ｚｏｎ（１９９３） ”Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ” ｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ （Ａｇｒａｗａｌ， ｅｄ．） Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １６５−１９０）。同様に、他のリン酸類似体、例えばホスホトリエステル（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９７１） ＪＡＣＳ ９３：６６５７−６６６５）、非架橋性ホスホラミデート（Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：７２４７−７２４６）、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホラミデート（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） ＪＯＣ ６２：７２７８−７２８７）及びホスホロジチオエート（米国特許第５，４５３，４９６号）の合成も記載されている。他の亜リン酸を基にしていない、修飾されたオリゴヌクレオチドも使用され得る（Ｓｔｉｒｃｈａｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：６１２９−６１４１）。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫原性であることがあり、そして宿主へのインジェクション後の分解に対しさらに耐性があるようである。Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４：２０８４−２０８９；及びＬａｔｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：１０５７−１０６４。
【００８０】
本発明で使用されるＩＳＳ含有ポリヌクレオチド及び／又はＩＭＰは、リボヌクレオチド（唯一の又は主な糖成分としてリボースを含む）、デオキシリボヌクレオチド（主な糖成分としてデオキシリボースを含む）を含んで成ることがあり、又は当業界で知られているように、修飾された糖又は糖類似体がＩＳＳ中に組み込まれることもある。従って、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「類似体」シクロペンチル基であってもよい。糖は、ピラノシル型又はフラノシル型であり得る。ＩＳＳにおいて、糖部分は、好ましくは、リボース、デオキシリボース、アラビノース、又は２’−Ｏ−アルキルリボースのフラノシドであり、そして糖は、それぞれのヘテロ環状塩基に対し、α又はβアノマー配置のいずれかで結合され得る。糖の修飾は、限定しないが、２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体及び２’−アルコキシ−又はアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含む。これらの糖又は糖類似体及びそれぞれの「ヌクレオシド」（ここでこのような糖又は類似体は、ヘテロ環状塩基（核酸塩基）に結合している）の調製は、本質的に知られており、そしてその様な調製が任意の具体例に関与し得る程度以外にはここで記載する必要はない。ＩＳＳ及び／又はＩＭＰの調製において、糖の修飾が行われることもあり、そして任意なリン酸塩の修飾と組み合わされることもある。
【００８１】
ＩＳＳ及び／又はＩＭＰ中に組み込まれるヘテロ環状塩基、又は核酸塩基は、天然の主なプリン及びピリミジン塩基（すなわち、上述したようなウラシル又はチミン、シトシン、アデニン、及びグアニン）、並びに前記の主な塩基の天然及び合成の修飾物であってもよい。
【００８２】
当業者は、種々のヘテロ環状塩基及び種々の糖部分（及び糖類似体）を含んで成る多数の「合成」非天然ヌクレオシドが当業界で利用可能であること、そして本発明の他の基準が満たされる限り、ＩＳＳが、天然の核酸の主な５つの塩基成分以外の１又は数個のヘテロ環状塩基を含み得ることを認識する。しかし、好ましくは、ＩＳＳ中のヘテロ環状塩基は、限定しないがウラシル−５−イル、シトシン−５−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−３−イル基を含み、ここで、プリンは９位を介して、ピリミジンは１位を介して、ピロロピリミジンは７位を介して、そしてピラゾロピリミジンは１位を介して、ＩＳＳの糖部分に結合する。
【００８３】
ＩＳＳ及び／又はＩＭＰは、例えば、公有されている国際特許出願ＷＯ９９／６２９２３に記載されているような、少なくとも１つの修飾された塩基を含んでなることがある。本明細書で使用する場合、用語「修飾された塩基」は、「塩基類似体」と同義語であり、例えば「修飾されたシトシン」は、「シトシン類似体」と同義語である。同様に、「修飾された」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、本明細書では、ヌクレオシド又はヌクレオチド「類似体」と同義語であると定義される。塩基の修飾の例は、限定しないが、ＩＳＳのシトシンのＣ−５及び／又はＣ−６への、電子吸引性部分の挿入を含む。好ましくは、電子吸引性部分は、ハロゲンである。そのような修飾されたシトンンは、限定しないが、アザシトシン、５−ブロモシトシン、ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、ウラシル、及び任意の他のピリミジン類似体又は修飾されたピリミジンを含むことがある。
【００８４】
塩基を修飾したヌクレオシドの調製、及び前駆体として前記の塩基を修飾したヌクレオシドを用いる修飾されたオリゴヌクレオチドの合成は、例えば米国特許第４，９１０，３００号、第４，９４８，８８２号、及び第５，０９３，２３２号に記載されている。これらの塩基を修飾したヌクレオシドは、それらが、化学合成によってオリゴヌクレオチドの末端又は内部の部位のいずれかに組み込まれ得るように設計されている。オリゴヌクレオチドの末端又は内部の部位のいずれかに存在している、その様な塩基を修飾したヌクレオシドは、ペプチド又は他の抗原の結合のための部位を務めることがある。それらの糖部分で修飾されたヌクレオシドも記載されており（限定しないが、例えば、米国特許第４，８４９，５１３号、第５，０１５，７３３号、第５，１１８，８００号、第５，１１８，８０２号を含む）、そして同様に使用され得る。
【００８５】
一部の態様において、ＩＭＰは、大体、次の長さ（塩基又は塩基対）のいずれかよりも短い：１０，０００；５，０００；２，５００；２，０００；１，５００；１，２５０；１，０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；５０；２５；１０。一部の態様において、ＩＭＰは、大体、次の長さ（塩基又は塩基対）のいずれかよりも長い：８；１０；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１，０００；２，０００；５，０００；７，５００；１０，０００；２０，０００；５０，０００。あるいは、ＩＳＳは、１０，０００；５，０００；２，５００；２，０００；１，５００；１，２５０；１，０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；５０；２５；又は１０の上限、及び独立して選択される、８；１０；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１，０００；２，０００；５，０００；７，５００の下限を有するサイズ範囲のいずれかであってもよいが、当該下限は、当該上限未満である。
【００８６】
マイクロキャリア
本発明において有用なマイクロキャリアは、約１００μ未満のサイズ、好ましくは約５０〜６０μ未満のサイズ、好ましくは約１０μ未満のサイズであり、そして純水中で不溶性である。マイクロキャリアは、固相（例えばビーズ）又は液相（例えばリポソーム）であってもよい。固相のマイクロキャリアは典型的に「ビーズ」又は他のほぼ球状の粒子であるが、非球状粒子も本発明に含まれる。本発明で使用されるマイクロキャリアは、非生物分解性である。マイクロキャリアとしての使用について許容される、広範な固相材料は、非生物分解性液相マイクロキャリアを製造するための製剤及び方法のように、当業界で知られている。
【００８７】
本発明の組成物又は方法における使用のためのマイクロキャリアは、通常約１０μｍ未満のサイズであり（例えば、約１０μｍ未満の平均直径を有し、又は少なくとも約９７％の粒子が１０μｍのスクリーンフィルターを通過する）、そしてナノキャリア（すなわち、約１μｍ未満のサイズのキャリア）を含む。好ましくは、マイクロキャリアは、約９、７、５、２、又は１μｍあるいは９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、又は１００ｎｍの上限、及び独立して選択される約４、２、又は１μｍあるいは８００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、又は１０ｎｍの下限の範囲内のサイズをもつものが選択されるが、当該下限は当該上限未満である。一部の態様において、マイクロキャリアは約１．０〜１．５μｍ、約１．０〜２．０μｍ又は約０．９〜１．６μｍのサイズを有する。ある好ましい態様において、マイクロキャリアは、約１０ｎｍ〜約５μｍ又は約２５ｎｍ〜約４．５μｍ、約１μｍ、約１．２μｍ、約１．４μｍ、約１．５μｍ、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍ又は約４．５μｍのサイズを有する。マイクロキャリアがナノキャリアである場合、好ましい態様は、約２５〜約３００ｎｍ、５０〜約２００ｎｍ，約５０ｎｍ〜約２００ｎｍのナノキャリアを含む。
【００８８】
マイクロキャリアの製造に適した広範な非生物分解性材料も公知であり、限定しないが、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ラテックス、金、及び強磁性又は常磁性材料を含む。ある態様は、金、ラテックス、及び／又は磁性ビーズを排除する。ある態様において、マイクロキャリアは、第２材料（例えば、ポリスチレン）に包まれる第１材料（例えば、磁性材料）から製造されることもある。
【００８９】
液相マイクロキャリアは、リポソーム、ミセル、油滴及び他の液体又は油を基にした粒子を含む。通常、液相マイクロキャリアは、１又は複数の、非生物分解性の油又は脂質、例えば鉱油を包含する。１つの好ましい液相マイクロキャリアは、水中油乳濁液中の油滴である。１つの好ましい態様において、マイクロキャリアは、水性ｐＨバッファー中での鉱油、トリオレイン酸ソルビタン、ＴＷＥＥＮ ８０（商標）の乳化によって調製される水中油乳濁液中の油滴である。
【００９０】
抗原
抗原を含んで成る、又は抗原を含まないＩＭＰ／ＭＣ複合体、すなわち抗原と結合していないＩＭＰ／ＭＣ複合体が調製され得る。任意な抗原が、抗原を含んで成るＩＭＰ／ＭＣ複合体の調製に使用され得る。
【００９１】
いくつかの態様において、抗原はアレルゲンである。組換えアレルゲンの例を表１に示す。多くのアレルゲンの調製が当業界で周知であり、限定しないが、ブタクサ花粉アレルゲン抗原Ｅ（Ａｍｂ ａｌ）（Ｒａｆｎａｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１２２９−１２３６）、主要なチリダニアレルゲンＤｅｒ ｐＩ及びＤｅｒ ＰＩＩ （Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． （１９８８）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６７：１７５−１８２；Ｃｈｕａ ｅｔ ａｌ． （１９９０）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１：１２４−１２９）、シラカバ花粉Ｂｅｔ ｖｌ（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１９３５−１９３８）、飼いネコアレルゲンＦｅｌ ｄｌ（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０：５５９−５６８）、及び木の花粉からのタンパク質抗原（Ｅｌｓａｙｅｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｓｕｐｐｌ． ２０４：１７−３１）の調製を含む。記載したように、木由来の抗原は公知であり、カバ、ネズ及びスギ由来のアレルゲンを含む。ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のための花粉の調製が報告されている。Ｍａｌｌｅｙ （１９８９） Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６：１７３−１８６。表１に示すように、一部の態様において、アレルゲンは、食物アレルゲン、例えばピーナッツアレルゲン、例えばＡｒａ ｈ Ｉであり、そして、一部の態様において、アレルゲンは草の花粉、例えばライムギアレルゲン、例えばＬｏｌ ｐ １である。表１は、使用され得るアレルゲンのリストを示す。
【表１０】
2004502645.tif 000011
【表１１】
2004502645.tif 000012
【表１２】
2004502645.tif 000013
【表１３】
2004502645.tif 000014
【００９２】
一部の態様において、抗原は感染因子、例えば原生動物、細菌、真菌（単細胞及び多細胞のものを含む）、及びウィルスの感染因子由来である。適当なウイルス抗原の例は本明細書に記載されており、そして当業界で公知である。細菌は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）及び百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を含む。原生動物の感染因子は、マラリアの変形体、リーシュマニア種、トリパノソーマ種及び住血吸虫種を含む。真菌はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を含む。
【００９３】
一部の態様において、抗原はウイルス抗原である。ウイルスポリペプチド抗原は、限定しないが、ＨＩＶタンパク質、例えばＨＩＶ ｇａｇタンパク質（限定しないが、膜固着（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）（ＭＡ）タンパク質、コアキャプシド（ＣＡ）タンパク質及びヌクレオキャプシド（ＮＣ）タンパク質を含む）、ＨＩＶポリメラーゼ、インフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質及びインフルエンザウイルスヌクレオキャプシド（ＮＰ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）、ｅ型肝炎タンパク質（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ型肝炎抗原等を含む。インフルエンザワクチン接種を考察している引用文献は、
【表１４】
2004502645.tif 000015
を含む。抗原ポリペプチドの他の例は群又は亜群特異的抗原であり、これは、限定しないが、アデノウイルス、ヘルペス単純ウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス及びポックスウイルスを含む、多くの感染因子に関して公知なものである。
【００９４】
多くの抗原性ペプチド及びタンパク質が当業界で公知であり、且つ利用可能であり；他のものは、常用の技術を用いて同定されうる。腫瘍の形成に対する免疫化及び既存の腫瘍の処置のために、免疫調節ペプチドは、腫瘍細胞（生細胞又は照射された細胞）、腫瘍細胞抽出物、又は腫瘍抗原、例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｍａｒｔ１、ガン胎児抗原（ＣＥＡ）、ガングリオシド、ヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）、ムチン（ＭＵＣ１）、ＭＡＧＥ抗原、ＢＡＧＥ抗原、ＧＡＧＥ抗原、ｇｐ１００、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、及びチロシナーゼを含むことがある。免疫に基づいた避妊用ワクチンは、ＩＳＳと一緒に投与される精子タンパク質を含めることによって形成され得る。Ｌｅａ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３０７：２６３。
【００９５】
弱毒化ウイルス及び不活性化ウイルスは、抗原としての本明細書での使用に適している。これらのウイルスの調製は当業界で周知であり、そして多くのものが市販されている（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （１９９８） ５２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， ｉｎｃ．を参照のこと）。例えば、ポリオウイルスはＩＰＯＬ（商標）（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ）及びＯＲＩＭＵＮＥ（商標）（Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）として、Ａ型肝炎ウイルスはＶＡＱＴＡ（商標）（Ｍｅｒｃｋ）として、麻疹ウイルスはＡＴＴＥＮＵＶＡＸ（商標）（Ｍｅｒｃｋ）として、ムンプスウイルスはＭＵＭＰＳＶＡＸ（商標）（Ｍｅｒｃｋ）として、そして風疹ウイルスはＭＥＲＵＶＡＸ（商標）ＩＩ（Ｍｅｒｃｋ）として入手可能である。更に、弱毒化及び不活化ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒト及び非ヒトパピローマウイルス及びスローブレインウイルスは、ペプチド抗原を提供し得る。
【００９６】
一部の態様において、抗原はウイルスベクター、例えばワクシニア、アデノウイルス、及びカナリア痘瘡を含んで成る。
【００９７】
抗原は、当業界で公知の精製技術を用いて、それらの供給源から単離されることがあり、又は、更に都合よくは、組換え法を用いて産生され得る。
【００９８】
抗原性ペプチドは、精製された天然ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化ウイルス又は不活性化ウイルス、細胞、微生物、又はその様なペプチドのフラグメントを含むことがある。免疫調節ペプチドは、天然であっても、又は化学的若しくは酵素的に合成されてもよい。当業界で公知の化学合成の任意の方法が、適切である。液相ペプチド合成は、適当なサイズのペプチドの構築のために使用されることがあり、又は、ペプチドの化学的構築のために、固相合成が使用されることもある。Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３６２：８３３−８３９。タンパク質分解酵素もまた、ペプチドを産生するようにアミノ酸をカップリングするために利用され得る。Ｋｕｌｌｍａｎｎ（１９８７） Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．。あるいは、ペプチドは、細胞の生化学的機構を使用することによって、又は生物学的供給源からの単離によって得られ得る。組換えＤＮＡ技術は、ペプチドの産生のために使用され得る。Ｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ。ペプチドはまた、アフィニティークロマトグラフィのような標準的技術を用いて単離され得る。
【００９９】
好ましくは、抗原は、ペプチド、脂質（例えば、コレステロール以外のステロール、脂肪酸、及びリン脂質）、インフルエンザワクチンに使用されるような多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質である。これらは、単離、並びに化学的方法及び酵素的方法を用いる合成を含む、当業界で公知の複数の方法を介して得られ得る。いくつかの場合において、例えば、多くのステロール、脂肪酸及びリン脂質の場合、分子の抗原部分は市販されている。
【０１００】
対象組成物及び当該組成物を用いる方法において有用なウイルス抗原の例は、限定しないが、ＨＩＶ抗原を含む。その様な抗原は、限定しないが、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｇｐ４１を含む、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質由来の抗原を含む。ＨＩＶ遺伝子及び抗原に関する多くの配列が知られている。例えば、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅは、ＨＩＶのヌクレオチド及びアミノ酸配列を回収し、預かりそして注釈をつけている。このデータベースは、インターネットを介して、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．／からアクセス可能であり、そして年刊の刊行物においては、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ（例えば１９９８ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。
【０１０１】
感染因子由来の抗原は、当業界で公知の方法を用いて、例えば天然ウイルス又は細菌抽出物から、感染因子に感染した細胞から、精製したポリペプチドから、組換え的に産生したポリペプチド及び／又は合成ペプチドから得られることがある。
【０１０２】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤は、限定しないが、サイトカイン、アジュバント及び抗体を含む、他の免疫治療物質を用いて調製されうる。これらのＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤は、抗原を用いて、又は用いずに調製されうる。
【０１０３】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体
ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、マイクロキャリアの表面に結合したＩＭＰを含んで成り（すなわち、ＩＭＰがＭＣに包まれていない）、そして好ましくは各マイクロキャリアと結合したＩＭＰの多数の分子を含んで成る。ある態様において、異なるＩＭＰの混合物は、マイクロキャリアと複合体化されることがあり、その結果、当該マイクロキャリアは、１より大きいＩＭＰの種類と結合する。ＩＭＰとＭＣとの間の結合は、共有結合であっても、又は非共有結合であってもよい。当業者によって理解されるように、ＩＭＰは修飾されても、又は誘導体化されてもよく、そしてマイクロキャリアの組成物は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の形成に所望とされる、結合の所望な型を確保するために選択され、そして／あるいは修飾されることがある。
【０１０４】
共有結合したＩＭＰ／ＭＣ複合体は、当業界で公知の任意な共有結合的架橋技術を用いて結合されうる。典型的に、ＩＭＰ部分は追加の部分（例えば、遊離アミン、カルボキシル又はスルフヒドリル基）を組み込むために、又はＩＭＰ部分がマイクロキャリアと結合し得る部位を提供するための、修飾された（例えば、ホスホロチオエート）ヌクレオチド塩基を組み込むために、修飾される。複合体のＩＭＰ部分とＭＣ部分との間の結合は、ＩＭＰの３’又は５’末端において、又はＩＭＰの内部にある、適当に修飾された塩基において生成されうる。マイクロキャリアは通常、共有結合が形成され得る部分を組み込むためにも修飾されるが、マイクロキャリア上に通常存在する官能基も利用されうる。ＩＭＰ／ＭＣは、共有結合複合体を形成せしめる条件下で（例えば、架橋剤の存在下で、又はＩＭＰと共に共有結合を形成する活性部分を含んで成る活性マイクロキャリアの使用によって）、ＩＭＰをマイクロキャリアとインキュベートすることによって形成される。
【０１０５】
広範な架橋技術が当業界で知られており、そしてアミノ、カルボキシル及びスルフヒドリル基と反応性のある架橋剤を含む。当業者に自明の様に、架橋剤及び架橋プロトコールの選択は、ＩＭＰ及びマイクロキャリアの配置並びにＩＭＰ／ＭＣ複合体の所望とされる最終的な配置に依存する。架橋剤は、同種二官能性又は異種二官能性のいずれであってもよい。同種二官能性架橋剤が使用される場合、当該架橋剤はＩＭＰ及びＭＣ上の同じ部分を利用する（例えば、アルデヒド架橋剤は、共に１又は複数の遊離アミンを含んで成るＩＭＰ及びＭＣを共有結合するために使用され得る）。異種二官能性架橋剤は、ＩＭＰとＭＣ上の異なる部分を利用し（例えばマレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ＩＭＰ上の遊離スルフヒドリル基及びＭＣ上の遊離アミンを共有結合させるために使用され得る）、そしてマイクロキャリア間の結合の形成を最小化するのに好ましい。多くの場合において、マイクロキャリア上の第１架橋部分及びＩＭＰ上の第２架橋部分（ここで、第２架橋部分はマイクロキャリア上に存在しない）を介して架橋することが好ましい。ＩＭＰ／ＭＣ複合体を生成する１つの好ましい方法は、異種二官能性架橋剤と一緒にインキュベートすることによってマイクロキャリアを「活性化」し、続いて、反応に適した条件下でＩＭＰと活性化されたＭＣをインキュベートすることによってＩＭＰ／ＭＣ複合体を形成することによる。架橋剤は、反応部分間に「スペーサー」アームを組み込むことがあり、又は架橋剤の２つの反応部分が直接結合されることもある。
【０１０６】
１つの好ましい態様において、ＩＭＰ部分は、マイクロキャリアと架橋するために、少なくとも１つの遊離スルフヒドリル（例えば、５’−チオールが修飾された塩基又はリンカーによって提供される）を含んで成り、一方、マイクロキャリアは遊離アミン基を含んで成る。これらの２つの基と反応性のある異種二官能性架橋剤（例えば、マレイミド基及びＮＨＳ−エステルを含んで成る架橋剤）、例えばスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラートは、ＭＣを活性化し、続いてＩＭＰを架橋してＩＭＰ／ＭＣ複合体を形成するために使用される。
【０１０７】
非共有結合ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、一般的に結合対がＩＭＰとＭＣを結合させるような場合と同様に、任意の非共有結合又は相互作用、例えばイオン（静電的）結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス引力、あるいは２又はそれ以上の異なる相互作用の組み合わせによって結合されうる。
【０１０８】
好ましい非共有結合ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、典型的に疎水性又は静電的（イオン性）相互作用、又はそれらの組み合わせによって複合体化される（例えば、ＩＭＰと、結合対を使用してＭＰに結合したポリヌクレオチドとの間の塩基対形成を介する）。ポリヌクレオチドの骨格の疎水性に起因して、複合体を形成するために疎水性の相互作用に依存するＩＭＰ／ＭＣ複合体は、高度に疎水性の部分を組み込むために、通常当該複合体のＩＭＰ部分の修飾を必要とする。好ましくは、疎水性部分は生物学的適合性で、非免疫原性のものであり、そしてその組成物が意図される個体において天然のものである（例えば、哺乳類、特にヒトにおいて見出される）。好ましい疎水性部分の例は、脂質、ステロイド、ステロール、例えばコレステロール、及びテルペンを含む。疎水性部分をＩＭＰに結合させる方法は、当然、ＩＭＰの配置及び疎水性部分の同一性に依存する。疎水性部分は、ＩＭＰの任意の便利な部位、好ましくは５’又は３’末端のいずれかに挿入されることがあり；ＩＭＰにコレステロールを挿入する場合、コレステロール部分は、好ましくは、常用の化学反応を用いて、ＩＭＰの５’末端に挿入される（例えば、Ｇｏｄａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９９５）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３２：４０４−４１０を参照のこと）。好ましくは、疎水結合によって結合されるＩＭＰ／ＭＣ複合体における使用のためのマイクロキャリアは、疎水性材料、例えば油滴又は疎水性ポリマーから製造されるが、疎水性部分を組み込むよう修飾された親水性材料も同様に利用されうる。マイクロキャリアがリポソーム又は管腔を含んで成る他の液相マイクロキャリアである場合、ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、ＭＣ調製工程の間のＩＭＰの封入を回避するために、ＭＣの調製後にＩＭＰとＭＣを混合することによって形成される。
【０１０９】
静電的結合によって結合した非共有結合型ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、典型的にポリヌクレオチド骨格の高度な負電荷性を利用する。従って、非共有結合したＩＭＰ／ＭＣ複合体における使用のためのマイクロキャリアは、生理学的ｐＨ（例えば、約ｐＨ６．８−７．４）で通常正に荷電している（例えば、陽イオン性）。マイクロキャリアは、本質的に正電荷を有するが、一般的に正電荷を有さない化合物から生成したマイクロキャリアは、正電荷（例えば、陽イオン性）となるように誘導体化され、又は他の方法で修飾され得る。例えば、マイクロキャリアを生成するために使用されるポリマーは、正に荷電した基、例えば第１級アミンを挿入するために誘導体化されうる。あるいは、正に荷電した化合物は、製造の間のマイクロキャリアの調製において組み込まれることがある。この様に、マイクロキャリアは正に荷電した部分を含んで成る。
【０１１０】
ヌクレオチドの塩基対形成によって結合した非共有結合性ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、常用の方法を用いて生成されうる。通常、塩基対合したＩＭＰ／ＭＣ複合体は、ＩＭＰと少なくとも部分的に相補性である、結合した、好ましくは共有結合したポリヌクレオチド（「捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）ポリヌクレオチド」）を含んで成るマイクロキャリアを用いて生成されうる。ＩＭＰと捕獲ポリヌクレオチドとの間の相補性のセグメントは、好ましくは、少なくとも６、８、１０又は１５個連続した塩基対、更に好ましくは少なくとも２０個連続した塩基対である。捕獲ヌクレオチドは、当業界で公知の任意な方法によってＭＣと結合されることがあり、そして好ましくは５’又は３’末端でＩＭＰと共有結合する。
【０１１１】
他の態様において、結合対は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体においてＩＭＰとＭＣを結合させるために使用され得る。結合対は、高い親和性（例えば約１０−８未満のＫｄ）で結合する受容体とリガンド、抗体と抗原（又はエピトープ）、又は任意な他の結合対であってもよい。好ましい結合対の１つの型は、非常に強固な複合体を形成するビオチンとストレプトアビジン、又はビオチンとアビジンであるが、一部の態様において、この結合の型は除外されることもある。ＩＭＰ／ＭＣ複合体の結合を媒介するために結合対を用いる場合、ＩＭＰは典型的に、結合対の一方を用いて、共有結合によって誘導体化され、そしてＭＣは結合対の他方を用いて誘導体化される。２つの誘導体化された化合物の混合物は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の形成をもたらす。
【０１１２】
多くのＩＭＰ／ＭＣ複合体の態様は抗原を含まず、そしていくつかの態様はＩＭＰ／ＭＣ複合体治療の対象である疾患又は病気と関連した抗原を除外する。更なる態様において、ＩＭＰはまた、１又は複数の抗原と結合する。抗原は、例えばＷＯ９８／１６２４７に記載の様に、共有結合的及び／又は非共有結合的相互作用を含む様々な方法で、ＩＭＰ／ＭＣ複合体のＩＭＰ部分とカップリングされうる。あるいは、抗原はマイクロキャリアと結合されうる（直接的又は間接的のいずれか）。
【０１１３】
ＩＭＰに結合した抗原を含んで成るＩＭＰ／ＭＣ複合体における抗原とＩＭＰの間の結合は、ＩＭＰの３’又は５’末端において、あるいはＩＭＰの内部にある適当に修飾された塩基において、生成されうる。抗原がペプチドであり、且つ適当な反応基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含む場合、それはシトシン残基のＮ４アミノ基と直接的に反応することがある。ＩＭＰにおけるシトシン残基の数及び位置に依存して、１又は複数の残基における特異的なカップリングが達成されうる。
【０１１４】
あるいは、当業界で公知のような、修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドは、ＩＭＰのいずれかの末端、又はその内側の部位において組み込まれることがある。これらは、脱ブロッキングされる場合に、注目の抗原上に存在することがあり、又はそれらに結合することがある種々の官能基と反応性である、ブロッキングされた官能基を含むことがある。
【０１１５】
抗原がペプチドである場合、接合体のこの部分は、固体支持体化学によってＩＭＰの３’末端に結合され得る。例えば、ＩＭＰ部分は、支持体上であらかじめ合成されているポリペプチド部分に付加され得る。Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９０ａ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：４９３−４９９；及びＨａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９０ｂ）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：５０１−５０５。あるいは、ＩＭＰは、３’末端から伸張している開裂可能なリンカーを通して固体支持体へ連結されるように合成され得る。支持体からＩＳＳの化学的開裂の際、末端チオール基が、オリゴヌクレオチドの３’末端に残されるか（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：５３０５−５３２１；及びＣｏｒｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１４０１−１４０３）、あるいは末端アミノ基が、オリゴヌクレオチドの３’末端に残される（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：１７８１−１１９４）。ペプチドのアミノ基に対するアミノ修飾型ＩＭＰの接合は、Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ ６：４３−７２に記載のように実施され得る。ペプチドのカルボキシル基に対するチオール修飾型ＩＭＰの接合は、Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓに記載のように実施され得る。ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖に対する、付加されたマレイミドを有するオリゴヌクレオチドのカップリングもまた、記載されている。Ｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． ２：４６４−４６５。
【０１１６】
接合体のペプチド部分は、合成の間にオリゴヌクレオチドへ組み込まれたアミン、チオール、又はカルボキシル基を介して、ＩＭＰの５’末端へ結合され得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドが固体支持体へ固定される間に、一方の末端において保護されたアミン、チオール又はカルボキシルを含んで成り、他方の末端においてホスホルアミダイトを含んで成る連結基は、５’ヒドロキシルと共有結合する。Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６２２７−６２４５；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ （１９８５） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：４４８５−４５０２；Ｋｒｅｍｓｋｙ ｅｔ ａｌ． （１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：２８９１−２９０９；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１５：３１３１−３１３９；Ｂｉｓｃｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９８７）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６４：３３６−３４４；Ｂｌａｎｋｓ ｅｔ ａｌ． （１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０２８３−１０２９９；及び米国特許第４，８４９，５１３号、同第５，０１５，７３３号、同第５，１１８，８００号、及び同第５，１１８，８０２号。脱保護に続いて、アミン、チオール及びカルボキシルの官能性は、ペプチドに対するオリゴヌクレオチドの共有結合のために使用され得る。Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ． （１９８７）；及びＳｉｎｈａ ｅｔ ａｌ． （１９９１）。
【０１１７】
ＩＭＰ−抗原接合体も、非共有的相互作用、例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合及び／又はファンデルワールス引力によって形成され得る。
【０１１８】
非共有的に連結された接合体は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体のような非共有的相互作用を含み得る。ビオチニル基は、例えば、ＩＳＳの修飾された塩基と結合され得る。Ｒｏｇｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：７６４３−７６５１。ペプチド部分へのストレプトアビジン部分の組み込みは、ストレプトアビジンと接合したペプチドとビオチン化オリゴヌクレオチドとの非共有結合複合体の形成を可能にする。
【０１１９】
非共有結合的会合も、ＩＭＰ及び抗原内の残基、例えば、荷電アミノ酸を含むイオン性相互作用を介して、又はオリゴヌクレオチド及び抗原の両方と相互作用し得る、荷電した残基を含むリンカー部分の使用を介して生じ得る。例えば、非共有結合的接合は、全体的に、負に荷電したＩＳＳと、ペプチドの正に荷電したアミノ酸残基、例えば、ポリリジン及びポリヒスチジン残基との間に生じ得る。
【０１２０】
ＩＭＰと抗原との間の非共有結合的接合は、天然のリガンドとしてＤＮＡと相互作用する分子のＤＮＡ結合モチーフを介して生じ得る。例えば、そのようなＤＮＡ結合モチーフは、転写因子と抗ＤＮＡ抗体において見出され得る。
【０１２１】
脂質へのＩＭＰの結合は、標準的な方法を使用して形成され得る。これらの方法は、限定しないが、オリゴヌクレオチド−リン脂質接合体（Ｙａｎａｇａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． １９：１８９−１９２）、オリゴヌクレオチド−脂肪酸接合体（Ｇｒａｂａｒｅｋ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８５：１３１−１３５；及びＳｔａｒｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５６：２２０−２２２）、及びオリゴヌクレオチド−ステロール接合体の合成を含む。Ｂｏｕｊｒａｄ ｅｔ ａｌ． （１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５７２８−５７３１。
【０１２２】
オリゴ糖に対するオリゴヌクレオチドの結合は、標準的な公知の方法を使用して形成され得る。これらの方法は、限定しないが、オリゴヌクレオチド−オリゴ糖接合体（ここで、オリゴ糖は、イムノグロブリンの一部である）を含む。Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ． （１９８５）Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７：３４７−３５５。
【０１２３】
ペプチド又は抗原に対する環状ＩＭＰの結合は、いくつかの方法で形成され得る。環状ＩＭＰが組換え方法又は化学的方法を使用して合成される場合、修飾されたヌクレオシドが適切である。Ｒｕｔｈ（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ。次に、標準的な結合技術が、抗原又は他のペプチドに対し環状ＩＭＰを結合するために使用され得る。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． １：１６５。環状ＩＭＰが単離される場合、又は組換え方法若しくは化学的方法を用いて合成される場合、結合は抗原又は他のペプチドに組み込まれている反応基（例えば、カルベン、ラジカル）を化学的活性化又は光活性化することによって形成され得る。
【０１２４】
オリゴヌクレオチドに対するペプチド及び他の分子の結合のためのさらなる方法は、米国特許第５，３９１，７２３号；Ｋｅｓｓｌｅｒ（１９９２）「Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」Ｋｒｉｃｋａ（ｅｄ．） Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びＧｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． ３：１３８−１４６において見出され得る。
【０１２５】
本発明の方法
本発明は、個体、好ましくは哺乳類、更に好ましくはヒトにおける免疫応答を調節する方法であって、免疫応答の所望な調節が達成されるように、個体に対し、ＩＭＰ／ＭＣ複合体（典型的に、当該複合体及び医薬として許容される補形剤を含んで成る組成物中に存在）を投与することを含んで成る方法を提供する。免疫調節は、Ｔｈ１型免疫応答を刺激し、そして／あるいはＴｈ２型免疫応答を阻害し、又は低下させることを含むことがある。
【０１２６】
いくつかの態様において、免疫調節は、ある（すなわち、１又は複数の）Ｔｈ１関連サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２及び／又はＩＦＮ−αを刺激することを含んで成る。いくつかの態様において、免疫調節は、ある（すなわち、１又は複数の）Ｔｈ２関連サイトカイン、例えばＩＬ−４及び／又はＩＬ−５の産生を抑制することを含んで成る。これらの要因の測定は、当業界で標準的な方法を使用し、そして本明細書において論じてきた。
【０１２７】
本明細書に記載のように、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与は更に、１又は複数の追加の治療物質（すなわち、免疫系を介して働き、そして／あるいは免疫系に由来する物質）、例えば、限定しないがサイトカイン、アジュバント及び抗体の投与を含んで成ることがある。治療抗体の例は、ガンの状況において使用されるものを含む（例えば、抗腫瘍抗体）。その様な追加の免疫治療物質の投与は、本明細書に記載の全ての方法に適用する。
【０１２８】
一部の態様において、個体はＴｈ２型免疫応答に関連する病気、例えばアレルギー又はアレルギー誘導型喘息に苦しんでいる。ＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与は、免疫調節をもたらし、その結果、アレルゲンに対する個体の応答と関連するＴｈ２型応答の特徴の低下をもたらしうる、サイトカインと関連する１又は複数のＴｈ１型応答のレベルを増大する。病気と関連するＴｈ２型応答関連疾患を有する個体の免疫調節は、当該病気の１又は複数の症候の軽減又は改善をもたらす。病気がアレルギー又はアレルギー誘導型喘息である場合、１又は複数の症候の改善は、以下の鼻炎、アレルギー性結膜炎、ＩｇＥの循環レベル、ヒスタミンの循環レベル及び／又は「救急」の吸入器治療についての必要性（例えば、定量吸入器又は噴霧器によって投与される吸入用アルブテロール）のうちの１又は複数の軽減を含む。
【０１２９】
更なる態様において、本発明の免疫調節治療の対象となる個体は、ワクチン接種を受ける個体である。ワクチンは予防用ワクチン又は治療用ワクチンであってもよい。予防用ワクチンは、個体にとって危険性があり得る病気と関連する１又は複数のエピトープを含んで成る（例えば、百日咳の予防のためのワクチンの場合、百日咳菌の抗原）。治療用ワクチンは、個体に影響を及ぼす特定の病気と関連する、１又は複数のエピトープを含んで成り、例えば結核患者においては結核菌又はウシ結核菌表面抗原、アレルギーの対象となる個体においては、個体がアレルギーとなる抗原（すなわち、アレルギー脱感作治療）、ガン患者においては、ガンを有する個体に由来する腫瘍細胞（例えば、米国特許第５，４８４，５９６号に記載のもの）、又は腫瘍関連抗原、を含んで成る。ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、ワクチンと一緒に（例えば、同じ注射で、又は同時であるが、別々の注射で）与えられることもあり、又は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体は別々に（例えば、ワクチンの投与の少なくとも１２時間前又はその後に）投与されることもある。一部の態様において、ワクチンの抗原は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体に対し、共有結合的又は非共有結合的のいずれかで連結した、ＩＭＰの一部である。ワクチン接種を受けている個体に対するＩＭＰ／ＭＣ複合体治療の投与は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体を含まないワクチン接種を受ける個体と比較して、Ｔｈ１型応答に偏っている、ワクチンに対する免疫応答をもたらす。Ｔｈ１型応答への偏りは、ワクチン中の抗原に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）によって、ＩＦＮ−γ及び他のＴｈ１型応答関連サイトカインの増大、ＩＦＮ−αの増大、ワクチンの抗原特異的ＣＴＬの産生、ワクチンの抗原に特異的なＩｇＥの低レベル又はレベルの低下、ワクチンの抗原に特異的なＴｈ２関連抗体の減少、及び／又はワクチンの抗原に特異的なＴｈ１関連抗体の増大、によって認識されうる。治療用ワクチンの場合、ＩＭＰ／ＭＣ複合体とワクチンの投与は、ワクチンの処置が意図される病気の症候の緩和をもたらす。当業者に自明な様に、正確な症候及びそれらの改善方法は、処置されることが求められる病気に依存する。例えば、治療用ワクチンが結核のためのものである場合、ワクチンによるＩＭＰ／ＭＣ複合体処置は、咳、胸膜又は胸壁の痛み、発熱、及び／又は当業界で知られている他の症候の低下をもたらす。ワクチンがアレルギーの脱感作治療で使用されるアレルゲンである場合、処置はアレルギーの１又は複数の軽減をもたらす（例えば、鼻炎、アレルギー性結膜炎、ＩｇＥの循環レベル、ヒスタミンの循環レベルの軽減）。
【０１３０】
本発明の他の態様は、既存の疾患又は病気、例えばガン又は感染病を有する個体の免疫調節治療に関する。ガンが免疫調節にとって魅力的な標的であるのは、多くのガンが、体内の他の細胞に見られない腫瘍関連及び／又は腫瘍特異的抗原を発現するためである。腫瘍細胞に対するＴｈ１型応答の刺激は、免疫系による腫瘍細胞の直接的殺傷及び／又は第三者による殺傷をもたらし、ガン細胞の減少及び症候の軽減を導く。ガンを有する個体に対するＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与は、腫瘍細胞に対するＴｈ１型免疫応答の刺激をもたらす。その様な免疫応答は、細胞性免疫系細胞（例えば、ＣＴＬ）又は体液性免疫系の成分の直接的作用によって、又は免疫系の標的となる細胞に近接した細胞上の第三者的効果によって、腫瘍細胞を殺傷し得る。
【０１３１】
本発明に従う免疫調節治療はまた、感染病、特に体液性免疫応答に耐性のある感染病（例えば、放線菌の感染及び細胞病原によって生じる疾患）を有する個体にとって有用である。免疫調節治療は、細胞内病原（例えば、細菌又は原虫）又は亜細胞病原（例えば、ウイルス）によって生じる感染病の処置に使用されることがある。ＩＭＰ／ＭＣ複合体治療は、放線菌の病気、例えば結核（例えば、結核菌及び／又はウシ結核菌の感染症）、らい病（すなわち、らい菌の感染症）、マイコバクテリウム・マリーヌム（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）又はＭ． ウルセランス（Ｍ． ｕｌｃｅｒａｎｓ）の感染症に苦しむ個体に対し投与されうる。ＩＭＰ／ＭＣ複合体治療は、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、特にヘルペス単純ウイルス、及びパピローマウイルスによる感染症を含むウイルス感染症の処置にも有用である。細胞内寄生虫、例えばマラリアによって生じる疾患（例えば、三日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、プラスモディウム・オバレ（Ｐ． ｏｖａｌｅ）、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐ． ｆａｒｃｉｐａｒｕｍ）及び／又はプラスモディウム・マラリア（Ｐ． ｍａｌａｒｉａｅ）による感染症）、リーシュマニア症（例えば、リーシュマニア・ドノバニ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、リーシュマニア・トロピカ（Ｌ． ｔｒｏｐｉｃａ）、リーシュマニア・メキシカナ（Ｌ． ｍｅｘｉｃａｎａ）、リーシュマニア・ブラジリエンシス（Ｌ． ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ）、リーシュマニア・ペルビアナ（Ｌ． ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、リーシュマニア・インファンタム（Ｌ． ｉｎｆａｎｔｕｍ）、リーシュマニア・カガシ（Ｌ． ｃｈａｇａｓｉ）及び／又はリーシュマニア・アエシオピカ（Ｌ． ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）による感染症）、及びトキソプラズマ症（例えば、トキソプラズモシス・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ ｇｏｎｄｉｉ）による感染症）も、ＩＭＰ／ＭＣ複合体治療から恩恵を受ける。ＩＭＰ／ＭＣ治療はまた、寄生虫症、例えば、住血吸虫症（すなわち、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）属の住血吸虫、例えばエジプト住血吸虫、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、及びメコン住血吸虫による感染症）及び肝吸虫症（すなわち、クロノルキス・シネンシス（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）による感染症）の処置にも有用である。感染病に苦しむ個体に対するＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与は、感染病の１又は複数の症候の緩和をもたらす。いくつかの態様において、感染病はウイルス病ではない。
【０１３２】
本発明は更に、個体における少なくとも１つのＴｈ１関連サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−β、及びＩＦＮ−γを増大せしめる方法を提供する。一部の態様において、本発明は、有効量のＩＭＰ／ＭＣ複合体を個体に投与することによってＩＦＮ−γを増大させる方法を提供する。ＩＦＮ−γレベルの増大が必要な個体は、ＩＦＮ−γの投与に応答する病気を有するものである。その様な病気は、多くの炎症性疾患、例えば、限定しないが潰瘍性大腸炎を含む。その様な病気はまた、多くの繊維病、例えば、限定しないが特発性肺線維症（ＩＰＦ）、強皮症、皮膚性放射線誘導型線維症、肝線維症、例えば住血吸虫症誘導型肝線維症、腎線維症並びにＩＦＮ−γの投与によって改善され得る他の症状を含む。本発明に従うＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与は、ＩＦＮ−γレベルの増大をもたらし、そして１又は複数の症候の緩和。１又は複数の症候の安定化、あるいはＩＦＮ−γに応答する病気の進行の予防（例えば、追加の病変又は症候の軽減又は排除）をもたらす。本発明の方法は、病気のための標準的な対処を構成する他の治療、例えばＩＰＦにおける抗炎症剤の投与、例えば全身性コルチコステロイド治療（例えば、コルチゾン）と一緒に実施されうる。
【０１３３】
一部の態様において、本発明は個体、特にＩＦＮ−αレベルの増大が必要な個体において、ＩＦＮ−αが増大するように、有効量のＩＭＰ／ＭＣ複合体を当該個体に対し投与することによって、ＩＦＮ−αを増大させる方法を提供する。ＩＦＮ−αの増大が必要な個体は、ＩＦＮ−α、例えば組換えＩＦＮ−αの投与に応答する病気、例えば、限定しないがウイルス感染症及びガンを有する者である。
【０１３４】
更に提供されるものとして、ＩｇＥ関連疾患を有する個体のＩｇＥのレベル、特に血清レベルを、ＩｇＥのレベルが低下するように有効量のＩＭＰ／ＭＣ複合体を当該個体に対し投与することによって低下させる方法がある。ＩｇＥの減少は、ＩｇＥ関連疾患の症候の緩和をもたらす。その様な症候は、アレルゲンに対する感受性の低下、アレルギーを有する個体におけるアレルギーの症候の低下、又はアレルギー性応答の重症度の低下における、アレルギーの症候、例えば鼻炎、結膜炎を含む。
【０１３５】
当業者に自明なように、本発明の方法の実施は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体が投与される特定の徴候のための、他の治療と組み合わせて実施されうる。例えば、ＩＭＰ／ＭＣ複合体治療は、マラリア患者のための抗マラリア薬、例えばクロロキンとともに、リーシュマニア症の患者のための殺リーシュマニア薬、例えばペンタミジン及び／又はアロプリノールとともに、結核の患者のための抗放線菌薬、例えばイソニアジド、リファンピン及び／又はエタンブトールとともに、あるいはアトピー（アレルギー）の患者のためのアレルゲン脱感作治療とともに投与されうる。
【０１３６】
投与及び免疫応答の評価
ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、他の医薬並びに／あるいは免疫原性物質及び／又は免疫刺激物質と組み合わせて投与されることがあり、そして生理学的に許容されるその担体と組み合わされることがある。
【０１３７】
従って、ＩＭＰ／ＭＣ複合体は他の免疫原性物質、例えば、限定しないがサイトカイン、アジュバント及び抗体と組み合わせて投与されることがある。
【０１３８】
ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、上述のもののいずれでもよい。配列番号１に示したように、好ましくは、投与されるＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、配列５’−Ｔ、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成る。好ましくは、投与されるＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは式５’プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成り；更に好ましくは配列５’−Ａ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｔ、Ｃ、Ｇ−３’を含んで成る。別の好ましい態様は、配列番号１を使用する。
【０１３９】
免疫原性組成物と同様に、特定のＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤の免疫学的な有効量及び投与方法は、個体、処置すべき全ての症状及び当業者に自明の他の因子に依存して変化し得る。考慮すべき因子は、抗原性、ＩＭＰ／ＭＣ複合体がアジュバント又は送達分子と一緒に投与されるか、又はそれらと共有結合するか否か、投与経路及び投与されるべき量で免疫する回数、を含む。その様な因子は当業界で知られており、そして過度の実験をすることなく、その様な決定を行うことは、当業者に周知である。適当な用量範囲は、抗原に対する免疫応答の所望な調節を提供するものである。通常、用量は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の全体的な量ではなく、患者に投与されるＩＭＰの量によって決定される。送達されるＩＭＰの量で示される、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の有用な用量範囲は、例えば、大体次のもののいずれかであってもよい：０．１〜１００μｇ／ｋｇ、０．１〜５０μｇ／ｋｇ、０．１〜２５μｇ／ｋｇ、０．１〜１０μｇ／ｋｇ、１〜５００μｇ／ｋｇ、１００〜４００μｇ／ｋｇ、２００〜３００μｇ／ｋｇ、１〜１００μｇ／ｋｇ、１００〜２００μｇ／ｋｇ、３００〜４００μｇ／ｋｇ、４００〜５００μｇ／ｋｇ。あるいは、用量範囲は、大体、次のもののいずれかであってもよい：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、２．０μｇ、５．０μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ。従って、用量範囲は、大体、次の：０．１μｇ、０．２５μｇ、０．５μｇ及び１．０μｇのうちのいずれかの下限を有するもの；並びに、大体、次の：２５μｇ、５０μｇ及び１００μｇのうちのいずれかの上限を有するものであってもよい。各患者に与えられる絶対量は、薬理学的特性、例えば生物学的適合性、クリアランス率及び投与経路に依存する。
【０１４０】
特定のＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤の有効量及び投与方法は、個々の患者及び病期及び当業者に自明の他の因子に基づいて変化しうる。特定の適用において有用な投与経路は、当業者に自明である。投与経路は、限定しないが、局所的、皮膚、経皮、経粘膜、表皮、非経口、消化管、及び鼻咽頭、並びに肺、例えば経気管支及び経肺胞を含む。適当な用量範囲は、血液レベルによって測定した場合に、約１〜１０μＭの組織濃度に達するのに十分なＩＳＳ含有組成物を提供する用量範囲である。各患者に与えられる絶対量は、薬理学的特性、例えば生物学的適合性、クリアランス率、及び投与経路に依存する。
【０１４１】
本明細書に記載のように、ＡＰＣ及び高濃度のＡＰＣを有する組織が、ＩＭＰ／ＭＣ複合体にとって好ましい標的である。従って、哺乳類の皮膚及び／又は粘膜に対するＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与が、ＡＰＣが比較的高濃度で存在する場合に好ましい。
【０１４２】
本発明は、限定しないが、生理学的に許容されるインプラント、軟膏、クリーム、リンス及びゲルを含む、局所適用適したＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤を提供する。局所投与は、例えば、送達系を分散せしめた包帯剤又は包帯によって、切開創又は開放創への送達系の直接投与、あるいは注目の部位に対する装置の経皮投与による。ＩＭＰ／ＭＣ複合体を分散せしめたクリーム、リンス、ゲル、又は軟膏は、局所的な軟膏又は創傷充填剤としての使用に適切している。
【０１４３】
皮膚からの投与にとって好ましい経路は、最も低侵襲なものである。これらの中の好ましい手段は、経皮伝達、表皮投与及び皮下注射である。これらの手段の中で、表皮投与が、皮内組織に存在することが予測される、より高濃度のＡＰＣにとって好ましい。
【０１４４】
経皮投与は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体が皮膚に浸透し、そして血流に侵入することを可能にし得る、クリーム、リンス、ゲルなどの適用によって達成される。経皮投与に適した組成物は、限定しないが、皮膚に直接適用されるか、又は保護担体、例えば経皮装置（いわゆる「パッチ」）へ組み込まれる医薬として許容される懸濁液、オイル、クリーム及び軟膏を含む。適当なクリーム、軟膏などの例は、例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅで見出すことができる。
【０１４５】
経皮伝達の場合、イオントフォレーシスが適当な方法である。イオントフォレーシスによる伝達は、数日間又はぞれ以上の間、未破壊の皮膚を通して、その生成物を連続的に送達する市販の送達パッチを用いて達成され得る。この方法の使用は、比較的高濃度の医薬組成物の制御された伝達を可能にし、併用薬物の注入を許容し、そして吸収促進因子の同時使用を可能にする。
【０１４６】
この方法に使用するための例示的なパッチ製品は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）のＬＥＣＴＲＯ ＰＡＴＣＨという商標の製品である。この製品は、中性ｐＨに貯蔵電極を電気的に保持し、そして異なる濃度の用量を提供し、連続的に及び／又は周期的に投与するように適合され得る。パッチの調製及び使用は、引用によって本明細書に組み入れられる、ＬＥＣＴＲＯ ＰＡＴＣＨ製品に添付された製造者の印刷した説明書に従い実施されるべきである。他の閉塞性のパッチ系も適している。
【０１４７】
経皮伝達のためには、低周波超音波送達もまた、適当な方法である。Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：８５０−８５３。低周波超音波周波数（約１ＭＨｚ）の適用は、治療組成物、例えば高分子量のものの、全般制御された送達を可能にする。
【０１４８】
表皮投与は、刺激物に対して免疫応答を引き起こすために十分に、表皮の最も外側の層を機械的又は化学的に刺激することを本質的に含む。具体的には、刺激は、刺激部位にＡＰＣを誘引するのに十分であるべきである。
【０１４９】
例示的な機械的刺激手段は、皮膚を刺激し、そして刺激部位へＡＰＣを誘引するために使用され得る多数の非常に小さな直径の短い尖叉を、尖叉の端から移されるＩＭＰ／ＭＣ複合体を取り込むように利用する。例えば、Ｐａｓｔｅｕｒ Ｍｅｒｉｅｕｘ（Ｌｙｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ）によって製造されたＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ旧ツベルクリン試験は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体含有組成物の導入のために適切な装置を含む。
【０１５０】
当該装置（Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ、ＰＡのＣｏｎｎａｕｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって米国で販売されているもの）は、一方の末端にシリンジプランジャーを、他方の末端に尖叉ディスクを有するプラスチック容器から成る。尖叉ディスクは、表皮細胞の最も外側の層を単に引っ掻くだけの長さの、小さな直径の多数の尖叉を支持する。ＭＯＮＯ−ＶＡＣＣキットの各尖叉は、旧ツベリクリンでコーティングされている；本発明において、各針は、ＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤の医薬組成物でコーティングされる。この装置の使用は、好ましくは、装置製品と一緒に含まれる製造者の書面による説明書に従う。この態様において使用され得る同様の装置は、アレルギー試験を実施するために現在使用されるものである。
【０１５１】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体の上皮投与に対する別の適切なアプローチは、表皮の最も外側の細胞を刺激する化学物質の使用により、十分な免疫応答を引き起こして領域に対してＡＰＣを誘引することである。一例として、ケラチン分解剤、例えばＮｏｘｅｍａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによりＮＡＩＲの商標のもとで販売される市販の局所的な脱毛クリームにおいて使用されるサリチル酸、がある。このアプローチはまた、粘膜における上皮投与を達成するために使用され得る。化学的刺激物も、機械的刺激物（例えば、ＭＯＮＯ−ＶＡＣＣ型の尖叉も化学的刺激物でコーティングされた場合に生じるようなもの）とともに適用され得る。ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、更に化学的刺激剤物もまた含む担体中で懸濁されるか、又はそれらと一緒に同時投与されることがある。
【０１５２】
投与の非経口経路は、電気的（イオントフォレーシス）又は直接的な注射、例えば中心静脈系統への直接注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、又は皮下注射のような直接注入を含む。非経口投与に適したＩＭＰ／ＭＣ製剤は通常、ＵＳＰ水又は注射用水において調製され、そして更に、ｐＨ緩衝剤、塩充填剤、保存剤、及び他の医薬として許容される補形剤を含んで成ることもある。非経口注射のためのＩＭＰ／ＭＣ複合体は、注射のための、医薬として許容される滅菌等張溶液、例えば生理食塩水及びリン酸緩衝化生理食塩水において調製されることがある。
【０１５３】
投与の消化管経路は、限定しないが、摂取及び直腸を含む。本発明は、限定しないが、摂取のための医薬として許容される粉末、丸剤、又は液体及び直腸投与のための坐薬を含む、消化管投与に適したＩＭＰ／ＭＣ複合体を含む。当業者に自明なように、丸剤又は座薬は更に、組成物のためにかさを提供するよう、医薬として許容される固体、例えばデンプンを含んで成ることがある。
【０１５４】
鼻咽頭及び経肺投与は、吸入によって達成されるものを含み、そして送達経路、例えば経鼻、経気管支及び経肺胞経路を含む。本発明は、吸入による投与に適したＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤を含み、これは、限定しないが、エアロゾルの形成のために液体懸濁物、及び、乾燥吸入送達系のためにエアロゾルを含む。ＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤の吸入投与に適した装置は、限定しないが、噴霧器、気化器、ネブライザー、及び乾燥粉末吸入送達装置を含む。
【０１５５】
送達経路の選択は、誘発される免疫応答を調節するのに使用され得る。例えば、ＩｇＧ力価及びＣＴＬ活性は、インフルエンザウイルスベクターが筋肉内経路又は上皮（遺伝子銃）経路を介して投与された場合に同一であった；しかし、筋肉接種は主にＩｇＧ２Ａを生成したのに対し、上皮経路はほとんどＩｇＧ１を生成した。Ｐｅｒｔｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０．６１１９−６１２５。従って、当業者は、本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドを投与する異なる経路によって誘発される、免疫原性におけるわずかな差異を利用し得る。
【０１５６】
上文で言及した組成物及び投与の方法は、限定しないが、本発明のＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤を投与する方法を説明することを意味する。種々の組成物及び装置を製造する方法は、当業者の能力の範囲内であり、本明細書中で詳細に記載しない。
【０１５７】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤に対する免疫応答の分析（定性及び定量の両方）は、当業界で公知である任意の方法、例えば、限定しないが、抗原特異的抗体産生（特異的抗体のサブクラスの測定を含む）、リンパ球の特定の集団、例えばＣＤ４＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞の活性化、サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０又はＩＬ−１２の産生及び／又はヒスタミンの放出の測定を含む。特異的抗体応答を測定するための方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含み、そして当業界で周知である。ＣＤ４＋Ｔ細胞のような特定の型のリンパ球の数の測定は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて達成され得る。細胞傷害性アッセイは、例えば、Ｒａｚ ｅｔ ａｌ． （１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５１９−９５２３に記載のように実施され得る。サイトカインの濃度は、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定され得る。免疫原に対する免疫応答を評価するためのこれらのアッセイ及び他のアッセイは当業界で周知である。例えば、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８０） Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ， ｅｄｓ．， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．を参照のこと。
【０１５８】
好ましくは、Ｔｈ１型応答は刺激され、すなわち誘発され、そして／あるいは増強される。本発明に従う、Ｔｈ１型の免疫応答の刺激は、ＩＳＳを用いずに処理したものと比較して、ＩＳＳで処理した細胞からのサイトカイン産生を測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで決定され得る。細胞のサイトカイン産生を決定する方法は、本明細書中に記載の方法、及び当業界で公知の任意のものを含む。ＩＳＳ処理に応答して産生されるサイトカインの型は、細胞による、Ｔｈ１型又はＴｈ２型に偏った免疫応答を示す。本明細書中で使用する場合、用語「Ｔｈ１型に偏った」サイトカイン産生は、刺激の無いなかでのこのようなサイトカインの産生と比較した場合の、刺激因子の存在下でのＴｈ１型免疫応答に関連したサイトカインの測定可能な増加した産生を言及する。このようなＴｈ１型に偏ったサイトカインの例は、限定しないが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、及びＩＦＮ−γを含む。対照的に、「Ｔｈ２型に偏ったサイトカイン」とは、Ｔｈ２型免疫応答に関連したものを言及し、そして、限定しないが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３を含む。ＩＳＳ活性の決定のために有用な細胞は、免疫系の細胞、宿主及び細胞株から単離される初代細胞、好ましくはＡＰＣ及びリンパ球、さらにより好ましくはマクロファージ及びＴ細胞を含む。
【０１５９】
Ｔｈ１型免疫応答の刺激はまた、ＩＭＰ／ＭＣ複合体製剤で処置した宿主において測定されることがあり、限定しないが、以下のことを含む当業界で公知の任意な方法によって決定され得る：（１）抗原の曝露の前及び後で測定したＩＬ−４のレベルの低下；又は抗原で初回刺激したコントロール、又は初回刺激し、そして曝露したコントロール、ＩＳＳなしで処置したコントロールと比較した場合に、ＩＭＰ／ＭＣ複合体で処理した宿主においてさらに低い（又は存在さえしない）レベルのＩＬ−４又はＩＬ−５の検出；（２）抗原の曝露の前及び後のＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び／又はＩＦＮ（α、β、もしくはγ）のレベルの上昇；又は抗原で初回刺激したコントロール、又は初回刺激し、そして曝露したコントロール、ＩＳＳなしで処置したコントロールと比較して、ＩＭＰ／ＭＣ複合体で処置した宿主におけるさらに高いレベルのＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び／又はＩＦＮ（α、β、もしくはγ）の検出；（３）ＩＳＳなしで処置したコントロールと比較して、ＩＳＳ−抗原処置宿主におけるＩｇＧ２ａ抗体産生；ならびに／あるいは（４）抗原の曝露の前及び後で測定した場合の抗原特異的ＩｇＥのレベルの低下；又は抗原で初回刺激したコントロール、又は初回刺激し、そして曝露したコントロール、ＩＳＳなしで処置したコントロールと比較して、ＩＭＰ／ＭＣ複合体で処置した宿主においてより低い（又は存在さえしない）レベルの抗原特異的ＩｇＥの検出。これらの種々の決定は、ＡＰＣ及び／又はリンパ球、好ましくはマクロファージ及び／又はＴ細胞によって生成されるサイトカインを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで、本明細書中に記載される方法又は当業界で公知の任意の方法を用いて測定することによって行なわれ得る。これらの決定のうちのいくつかは、本明細書に記載の方法又は当業界で公知の任意な方法を用いて、抗原特異的抗体のクラス及び／又はサブクラスを測定することによって行われ得る。
【０１６０】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体処理に応答して産生される抗原特異的抗体のクラス及び／又はサブクラスは、細胞による、Ｔｈ１型又はＴｈ２型に偏った免疫応答を示す。本明細書中で使用する場合、用語「Ｔｈ１型に偏った」抗体産生は、刺激の無いなかでのこのようなサイトカインの産生と比較した場合の、刺激因子の存在下でのＴｈ１型免疫応答に関連する抗体（すなわち、Ｔｈ１関連抗体）の測定可能な増加した産生を言及する。１又は複数のＴｈ１関連抗体は、限定しないが、ヒトＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ３（例えば、Ｗｉｄｈｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４７：５７５−５８１及びｄｅ Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８３：１６０−１６４を参照のこと）並びにマウスＩｇＧ２ａを含む。対照的に、「Ｔｈ２型に偏った抗体」は、Ｔｈ２型免疫応答に関連するものを言及し、そして、限定しないが、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ４及び／又はＩｇＥ（例えば、Ｗｉｄｈｅ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４７：５７５−５８１及びｄｅ Ｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｉｍｕｎｏｌ ８３：１６０−１６４を参照のこと）並びにマウスＩｇＧ１及び／又はＩｇＥを含む。
【０１６１】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体の投与の結果として生じる、Ｔｈ１型に偏ったサイトカイン誘導は、細胞性免疫応答の増強、例えば、ＮＫ細胞、細胞傷害性キラー細胞、Ｔｈ１ヘルパー及び記憶細胞により行なわれるもの、を発生させる。これらの応答は、ウイルス、真菌、原生動物、寄生体、細菌、アレルギー性疾患、及び喘息、ならびに腫瘍に対する防御的又は治療的ワクチン接種における使用に特に有益である。
【０１６２】
いくつかの態様において、Ｔｈ２応答は抑制される。Ｔｈ２応答の抑制は、例えば、Ｔｈ２関連サイトカイン、例えばＩＬ−４及びＩＬ−５のレベルの低下、並びにＩｇＥの減少及びアレルゲンに対するヒスタミン放出の減少、によって決定されうる。
【０１６３】
本発明のキット
本発明は、本発明の使用のためのキットを提供する。ある態様において、本発明のキットは、ＩＭＰ／ＭＣ複合体を含んで成る１又は複数の容器及び、意図される処置（例えば、免疫調節、感染病の１又は複数の症候の緩和、ＩＦＮ−γレベルの増大、ＩＦＮ−αレベルの増大、又はＩｇＥ関連疾患の緩和）のための使用に関する、一般的に書面の説明書である説明書集を含んで成る１又は複数の容器を含んで成る。更なる態様において、本発明のキットは、ＩＭＰ／ＭＣを産生するための材料の容器、ＩＭＰ／ＭＣ複合体を産生するための説明書、及び意図される処置のためのＩＭＰ／ＭＣ複合体の使用に関する説明書、を含んで成る。
【０１６４】
あらかじめ形成したＩＭＰ／ＭＣ複合体を含んで成るキットは、任意な常用の、適当な包装で包装されたＩＭＰ／ＭＣ複合体を含んで成る。例えば、ＩＭＰ／ＭＣ複合体が乾燥製剤（例えば、凍結乾燥したもの又は乾燥粉末）である場合、弾力性のある栓を有するバイアルが通常使用され、その結果ＩＭＰ／ＭＣ複合体は、弾力性のある栓を介して液体を注入することによって容易に懸濁されうる。弾力性のない、除去可能な封を有するアンプル（例えば、密封されたガラス）又は弾力性のある栓を有するアンプルは、ＩＭＰ／ＭＣ複合体の液体製剤にとって最も都合よく使用される。更に考えられるものとして、特異的な装置、例えば吸入器、経鼻投与装置（例えば、噴霧器）、注入装置、例えばミニポンプとの併用のための包装がある。
【０１６５】
ＩＭＰ／ＭＣ複合体の産生のための材料を含んで成るキットは、ＩＭＰとＭＣの別々の容器を通常含むが、ある態様においては、あらかじめ形成したＭＣよりもむしろ、ＭＣを産生するための材料が供給される。この構成が好ましいのは、ＩＭＰ／ＭＣ複合体が非共有結合によって連結される場合である。この構成がまた好ましいのは、ＩＭＰ及びＭＣが異種二官能性架橋剤を介して架橋されうる場合であり；ＩＭＰ又はＭＣのいずれかが、「活性」型で供給される（例えば、ＩＭＰと反応性のある部分が利用可能となるように、異種二官能性架橋剤と連結される）。
【０１６６】
液相のＭＣを含んで成るＩＭＰ／ＭＣ複合体のためのキットは、好ましくは、液相のＭＣを産生するための材料を含む、１又は複数の容器を含んで成る。例えば、水中油乳濁液のＭＣのためのＩＭＰ／ＭＣキットは、油層及び水層を含む１又は複数の容器を含んで成ることがある。当該容器の中身は、ＭＣを産生するために乳化され、これは、続いてＩＭＰ、好ましくは疎水性部分を組み込むように修飾されたＩＭＰと混合されうる。その様な材料は、水中油乳濁液の産生のために、油及び水、又は透析されたリポソーム成分（例えば、リン脂質、コレステロール及び界面活性剤の混合物）の容器＋水層（例えば、医薬として許容される水性緩衝液）の１又は複数の容器を含む。
【０１６７】
意図される処置のためのＩＭＰ／ＭＣ複合体の使用に関する説明書は、通常、意図される処置のための用量、投与計画、及び投与経路についての情報を含む。ＩＳＳの容器は、単位用量、バルクの包装（例えば、複数の用量の包装）又はサブユニットの用量であってもよい、本発明のキットにおいて提供される説明書は、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含まれる用紙）上に典型的に記載された説明書であるが、機械が読み取り可能な説明書（例えば、磁気的又は光学的なストレージディスクも許容される。
【０１６８】
以下の例は、限定しないが、本発明を例示するために提供される。
【０１６９】
例
例１：非共有結合性の、液相ＩＭＰ／ＭＣ複合体の製造
修飾したＩＭＰ及び液相ＭＣを含んで成るＩＭＰ／ＭＣ複合体を製造し、そして複合体の形成について試験した。
【０１７０】
ＩＭＰ（ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド ５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’）（配列番号１）は、ホスホラミダイト化学を用いて、ＩＭＰの５’末端に対するコレステロール分子の挿入によって修飾した。水中油乳濁液は、マイクロフルイダイザーを用いた、４．５％（ｗ／ｖ）スクアレン、０．５％（ｗ／ｖ）トリオレイン酸ソルビタン、０．５％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（商標）８０及び１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５の混合物のホモジェナイゼーションによって生成した。乳濁液の試験は、乳濁液中の油滴が約１６０ｎｍの平均直径を有していたことを明らかにした。
【０１７１】
乳濁液は、コレステロール修飾型ＩＭＰ又は同一のＩＭＰの非修飾型と混合され、続いて油層と水層を分離するために遠心された。ＲＰ−ＨＰＬＣは、ヌクレオチド含量を決定するために、各層に由来する試料について行った。約７５％のコレステロール修飾型ＩＭＰが油層において見られ、一方、１００％の非修飾型ＩＭＰが水層において見られた。
【０１７２】
例２：ＩＭＰ／ＭＣ混合物による免疫調節
ＩＭＰ（ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド ５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’）（配列番号１）又はコントロールオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド ５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３’）（配列番号９）の混合物は、硫酸誘導型ポリカーボネート微粒子又はナノ粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）と混合され、そしてマウスの脾臓細胞上で、免疫調節活性についてアッセイされた。
【０１７３】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓のフラグメントは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で溶解したコラゲナーゼ／ディスパーゼ（０．１Ｕ／ｍＬ／０．８Ｕ／ｍＬ）で、３７℃で４５分間消化し、続いて、消化したフラグメントに力をかけて金属ふるいを通過させることによって機械的に分散された。分散した脾臓細胞は遠心によってペレット化され、続いて新鮮な培地（１０％ウシ胎児血清と、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、及び０．０５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ １６４０）中で再懸濁された。
【０１７４】
４ｘ１０５のマウスの脾臓細胞を９６穴プレートの穴に分散させ、そして３７℃で１時間インキュベートした。１００μＬの２ｘ濃度の試験試料又はコントロールを添加し、そして当該細胞を更に２４時間インキュベートした。培地を各穴から採集し、そしてＥＬＩＳＡによってサイトカイン濃度について試験した。
【０１７５】
ＩＦＮ−γが、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてアッセイされた。マウスの脾臓細胞アッセイに由来する培地は、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｎｕｎｃ）でコーティングしたマイクロタイタープレート中でインキュベートされた。結合したＩＦＮ−γは、ビオチン化した抗ＩＦＮ−γ抗体及びストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合型二次抗体を用いて検出され、ペルオキシダーゼの存在下、色素原性のペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で展開され、そしてＥｍａｘ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定することによって定量された。
【０１７６】
ＩＭＰと混合した２００ｎｍのビーズは、マウスの脾臓細胞によるＩＬ−１２、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γの分泌を実質的に増大させ、そしてＩＭＰと混合した５０ｎｍのビーズは、ＩＬ−１２及びＩＬ−６の産生を増大させた。いくつかの非特異的活性を、コントロールオリゴヌクレオチドと混合した２００ｎｍのビーズは伴っていたが、これはＩＭＰ単独と比較した場合、刺激における増大を説明するのに不十分であった。更に、１μｍ及び４．５μｍのマイクロキャリアも、サイトカインの産生を増大させた。表２〜４は、それぞれＩＬ−１２、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γについてのアッセイの結果を要約する。
【表１５】
2004502645.tif 000016
【表１６】
2004502645.tif 000017
【表１７】
2004502645.tif 000018
【０１７７】
例３：ＩＭＰ／ＮＣ接合体によるマウス細胞の免疫調節
ポリスチレンビーズ（２００ｎｍの設計サイズ）と共有結合したＩＭＰは、マウスの脾臓細胞上で、免疫調節活性について試験された。
【０１７８】
アミン誘導型ポリスチレンビーズは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．，及びＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．から入手した。３つのタイプのビーズを利用した：アミン誘導型ビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．，カタログ番号１５６９９）、５８０ｎｍ及び６０５ｎｍの励起／発光極大を有するフルオロフォアと結合したアミン誘導型ビーズ（”Ｒｅｄ Ｂｅａｄｓ”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｆ８７６３）、及び５０５ｎｍ及び５１５ｎｍの励起／発光極大を有するフルオロフォアと結合したアミン誘導型ビーズ（”Ｙｅｌｌｏｗ Ｂｅａｄｓ”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｆ８７６４）は、取り扱い説明書に従い、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロペンタン−１−カルボキシレート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて活性化された。ビーズは、続いて、ＩＭＰ、コントロールホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド ５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３’）（コントロールＡ）（配列番号９）、５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３’（コントロールＢ）（配列番号１０）、又は５’−ＴＣＡＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＡＣＴＣＴＴＣＴ−３’（コントロールＣ）（配列番号１１）と結合され、又はＮＣのみのコントロールとしての使用のための、遊離マレイミド基をクエンチングするために処理した。
【０１７９】
ＩＭＰ／ＮＣ複合体の免疫調節効果は、上文の例２に記載のように、マウスの脾臓細胞を用いてアッセイされた。ＩＭＰ／ＮＣ複合体は、ＩＬ−１２、ＩＬ−６及び／又はＩＦＮ−γの分泌の増大によって示されるように、マウスの脾臓細胞上で免疫調節を示したが、ＮＣと接合したコントロールオリゴヌクレオチドは、サイトカインの分泌を刺激しなかった。ＩＦＮ−γの分泌についてのデータは、表５に要約する。
【表１８】
2004502645.tif 000019
【０１８０】
例４：ＩＭＰ／ＮＣ接合体によるヒト細胞の免疫調節
ポリスチレンビーズ（２００ｎｍの設計サイズ）と共有結合したＩＭＰは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上で、免疫調節活性について試験された。
【０１８１】
末梢血は、ヘパリン化シリンジを用いる静脈穿刺によって、ボランティアから回収した。血液は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のクッション上で層状にし、そして遠心した。ＦＩＣＯＬＬ（商標）の界面に位置するＰＢＭＣを回収し、続いて冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回洗浄した。細胞を再懸濁し、そして１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清と５０ユニット／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、３００μｇ／ｍＬのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含むＲＰＭＩ １６４０中で２ｘ１０６細胞／ｍＬで、２４穴又は４８穴プレート中で培養された。
【０１８２】
細胞は、試験試料（ＩＭＰ／ＮＣ製剤又はコントロール）の存在下で２４時間培養され、続いて細胞を含まない培地が各穴から回収され、そしてＩＦＮ−γ濃度についてアッセイされた。ＩＦＮ−γは、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．のＣＹＴＯＳＣＲＥＥＮ（商標）ＥＬＩＳＡキットを、取り扱い説明書に従い使用してアッセイした。
【０１８３】
ＩＭＰ／ＮＣ複合体は、ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−γの分泌を刺激した。結果を表６に要約する。
【表１９】
2004502645.tif 000020
【０１８４】
外国特許は、明瞭さ及び理解のための例示及び実施例によって多少詳細に記載されているが、当業者には、若干の変化及び修飾が実施されうることは自明である。従って、説明及び実施例は、特許請求の範囲によって表される本発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。
【国際公開パンフレット】
2004502645.tif 000021
2004502645.tif 000022
2004502645.tif 000023
2004502645.tif 000024
2004502645.tif 000025
2004502645.tif 000026
2004502645.tif 000027
2004502645.tif 000028
2004502645.tif 000029
2004502645.tif 000030
2004502645.tif 000031
2004502645.tif 000032
2004502645.tif 000033
2004502645.tif 000034
2004502645.tif 000035
2004502645.tif 000036
2004502645.tif 000037
2004502645.tif 000038
2004502645.tif 000039
2004502645.tif 000040
2004502645.tif 000041
2004502645.tif 000042
2004502645.tif 000043
2004502645.tif 000044
2004502645.tif 000045
2004502645.tif 000046
2004502645.tif 000047
2004502645.tif 000048
2004502645.tif 000049
2004502645.tif 000050
2004502645.tif 000051
2004502645.tif 000052
2004502645.tif 000053
2004502645.tif 000054
2004502645.tif 000055
2004502645.tif 000056
2004502645.tif 000057
2004502645.tif 000058
2004502645.tif 000059
2004502645.tif 000060
2004502645.tif 000061
2004502645.tif 000062
2004502645.tif 000063
2004502645.tif 000064
2004502645.tif 000065
2004502645.tif 000066
2004502645.tif 000067
2004502645.tif 000068
2004502645.tif 000069
2004502645.tif 000070
2004502645.tif 000071
2004502645.tif 000072
2004502645.tif 000073
2004502645.tif 000074
2004502645.tif 000075
2004502645.tif 000076
2004502645.tif 000077
2004502645.tif 000078
2004502645.tif 000079
2004502645.tif 000080
2004502645.tif 000081
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502645.tif 000082
【国際調査報告】
2004502645.tif 000083
2004502645.tif 000084
2004502645.tif 000085