(57)【要約】本発明は、動脈硬化症、これから生じる不安定プラーク、急性冠状動脈血栓症、心筋梗塞、卒中、末梢動脈閉塞性疾患、慢性静脈性潰瘍、および再狭窄過程の治療用活性物質を見つけるための、β３−エンドネキシン−ロングまたはβ３−エンドネキシン−ショートの使用に関する。
2004511755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈硬化症、これから生じる不安定プラーク、急性冠状動脈血栓症、心筋梗塞、卒中、末梢動脈閉塞性疾患、慢性静脈性潰瘍、および再狭窄過程の治療用活性物質を見つけるための、β３−エンドネキシン−ロングまたはβ３−エンドネキシン−ショートの使用。
【請求項２】
β３−エンドネキシン−ショートのβ３−インテグリンへの結合を阻害する化合物の同定方法であって、以下の工程：
（ａ）（ａ１）β３−エンドネキシン−ショート、またはβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ２）β３−インテグリン、またはβ３−エンドネキシン−ショートへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ３）試験すべき化合物；
とを含む混合物をインキュベートする工程；そして
（ｂ）化合物（ａ３）の非存在下と比較して、化合物（ａ３）の存在下での成分（ａ１）の成分（ａ２）への結合の阻害を検出する工程、を特徴とする上記方法。
【請求項３】
β３−エンドネキシン−ロングのβ３−インテグリンへの結合を阻害する化合物の同定方法であって、以下の工程：
（ａ）（ａ１）β３−エンドネキシン−ロング、またはβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的である同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ２）β３−インテグリン、またはβ３−エンドネキシン−ロングとの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ３）試験すべき化合物；
とを含む混合物をインキュベートする工程；そして
（ｂ）化合物（ａ３）の非存在下と比較して、化合物（ａ３）の存在下での成分（ａ１）による成分（ａ２）への影響の阻害を検出する工程、を特徴とする上記方法。
【請求項４】
β３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングへのβ３−インテグリンの結合の競合を移動させる化合物の同定方法であって、以下の工程：
（ａ）（ａ１）β３−エンドネキシン−ショート、またはβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ２）β３−エンドネキシン−ロング、またはβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ３）β３−インテグリン、またはβ３−エンドネキシン−ショートおよび／またはβ３−エンドネキシン−ロングへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ４）試験すべき化合物；
とを含む混合物をインキュベートする工程；そして
（ｂ）試験すべき化合物（ａ４）の非存在下と比較して、成分（ａ１）の成分（ａ３）への結合と、成分（ａ２）の成分（ａ３）への結合の比の移動を検出する工程、を特徴とする上記方法。
【請求項５】
β３−エンドネキシン−ショートまたはβ３−エンドネキシン−ロングのβ３−インテグリンへの結合を阻害する化合物を同定するための試験混合物であって、以下の成分：
（ａ）β３−インテグリン、およびβ３−エンドネキシン−ショートおよび／またはβ３−エンドネキシン−ロングへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる群から選択される第１の成分；
（ｂ）第１の群および／または第２の群から選択される第２の成分、ここで
（ｂ１）第１の群は、β３−エンドネキシン−ショート、およびβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる；
（ｂ２）第２の群は、β３−エンドネキシン−ロング、およびβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる、
を特徴とする上記混合物。
【請求項６】
β３−エンドネキシン−ショートまたはβ３−エンドネキシン−ロングのβ３−インテグリンへの結合を阻害する化合物を同定するためのキットであって、以下の成分：
（ａ）β３−インテグリン、およびβ３−エンドネキシン−ショートおよび／またはβ３−エンドネキシン−ロングへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる群から選択される第１の成分；
（ｂ）第１の群および／または第２の群から選択される第２の成分、ここで
（ｂ１）第１の群は、β３−エンドネキシン−ショート、およびβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる；
（ｂ２）第２の群は、β３−エンドネキシン−ロング、およびβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる、
を特徴とする上記キット。
【請求項７】
請求項２、３または４のいずれか１項に記載の方法により得られる得ることができるかまたは得られた化合物。
【請求項８】
β３−インテグリン依存性細胞内過程に影響を与える化合物を含む薬剤であって、化合物は、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程を促進し、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害し、かつ内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現を阻害するために、β３−エンドネキシン−ショートへの活性化作用および／またはβ３−エンドネキシン−ロングへの阻害作用を有することを特徴とし、化合物は、
（ａ）（ｉ）β３−エンドネキシン−ショート、または（ｉｉ）β３−エンドネキシン−ショートをコードするＤＮＡを含有する発現ベクター；
（ｂ）β３−エンドネキシン−ロングｍＲＮＡに特異的に結合してこれを切断することができるが、β３−エンドネキシン−ショートｍＲＮＡには結合できず、従ってβ３−エンドネキシン−ロングの合成が特異的に低下するかまたは阻害されることを特徴とする、リボザイムまたはこれをコードするベクター；
（ｃ）β３−エンドネキシン−ロングｍＲＮＡに特異的に結合することができるが、β３−エンドネキシン−ショートｍＲＮＡには結合できず、従ってβ３−エンドネキシン−ロングの合成が特異的に低下するかまたは阻害されることを特徴とする、アンチセンスＲＮＡまたはこれをコードするベクター；
（ｄ）抗β３エンドネキシン−ロング抗体；および
（ｅ）請求項７の化合物
から選択される、上記薬剤。
【請求項９】
３−インテグリン依存性細胞内過程に影響を与える化合物を含む薬剤であって、化合物は、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程を阻害し、および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害するために、β３−エンドネキシン−ロングへの活性化作用および／またはβ３−エンドネキシン−ショートへの阻害作用を有することを特徴とし、化合物は、
（ａ）（ｉ）β３−エンドネキシン−ロング、または（ｉｉ）β３−エンドネキシンをコードするＤＮＡを含有する発現ベクター；
（ｂ）ＮＩＴＹモチーフを含有するペプチドまたはポリペプチド；
（ｃ）β３−インテグリンのＮＩＴＹモチーフへのβ３−エンドネキシン−ショートの結合を阻害する化合物；および
（ｄ）請求項７の化合物
から選択される、上記薬剤。
【請求項１０】
請求項７、８または９の化合物の使用であって、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の活性の低下、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の増加、および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現の増加に関連する症状、またはおよびβ３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の促進、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の阻害、および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現の阻害により治療することができる症状、の治療のための上記使用。
【請求項１１】
症状は急性および慢性血管疾患である、請求項１０の使用。
【請求項１２】
請求項９で定義される化合物の使用であって、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の活性の上昇、および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の増加に関連する症状、またはおよびβ３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の阻害、および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の阻害により治療することができる症状の治療のための上記使用。
【請求項１３】
症状は急性および慢性血管疾患である、請求項１２の使用。
【請求項１４】
血管疾患は、動脈硬化症、これから生じる不安定プラーク、急性冠状動脈血栓症、心筋梗塞、卒中、末梢動脈閉塞性疾患、慢性静脈性潰瘍、および再狭窄過程である、請求項１１または１３の使用。
【請求項１５】
急性および慢性血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および不安定血管プラーク、急性心筋梗塞、卒中、末梢血動脈閉塞性疾患、四肢の慢性静脈性潰瘍、手術介入後の再狭窄のような急性および慢性血管疾患の治療法であって、請求項７または８の薬剤を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、急性および慢性血管疾患の治療を目的とするβ３−インテグリン依存性細胞内過程への影響に関する。本発明は、特に活性物質を見つけるための既知のたんぱく質であるβ３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングの新しい使用、および急性および慢性血管疾患の治療のための活性物質の具体的な同定法に関する。本発明はさらに、活性物質を同定するための試験混合物、および活性物質を同定するための具体的なキットに関する。本発明はまた、急性および慢性血管疾患の治療を目的とするβ３−インテグリン依存性細胞内過程に影響を与える活性物質を含む薬剤、およびそのような薬剤を使用する治療法に関する。
【０００２】
インテグリンは、α／βヘテロダイマー性表面タンパク質であり、細胞間のまたは細胞と細胞外マトリックスとの間の相互作用を仲介する接着受容体のクラスに属する。
【０００３】
β３−インテグリンは、インテグリンのサブクラスを形成し、細胞と細胞外マトリックスの間の動的結合を提供し、β３−インテグリンの以下の２つの重要な領域の間の情報移動が関与する（細胞外リガンドの結合ドメインと細胞内細胞質受容体ドメイン）。β３−インテグリンを介するシグナル伝達は、双方向である。「インサイドアウト」シグナルは、リガンドに対するβ３−インテグリンの親和性を制御し、細胞接着を調節する。「アウトサイドイン」シグナルは、β３−インテグリンコネクションから細胞外マトリックスに移動し、多くの基本的細胞内過程（細胞生存と増殖、細胞分化、形態形成、細胞移行、食作用、遺伝子転写、およびインテグリン局在化を含む）を制御する。
【０００４】
β３−インテグリンは、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、フィブリノゲン受容体）とビトロネクチン受容体の成分である。糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａは、血小板、特に活性化血小板の機能にとって重要であり、急性心血管疾患（例えば、急性冠状動脈血栓症）において重要な役割を果たす。ビトロネクチン受容体は、内皮細胞の接着と移動に関与し、例えば、アテローム性動脈硬化症または不安定なプラークの場合は内皮細胞活性化などの慢性心血管疾患において重要な役割を果たす。
【０００５】
β３−インテグリンは、止血、血栓、創傷治癒および血管形成に重要な役割を果たし、多くの血管細胞（例えば、血管の血小板、好中球、内皮細胞および平滑筋細胞）で高度に発現されている。β３−インテグリンは、多くの細胞機能のモジュレーターであり、例えば細胞増殖、細胞内シグナル伝達機構および遺伝子制御のモジュレーターである。
【０００６】
先行技術から、これは、β３−インテグリンを含有する受容体ファミリーのタンパク質へのリガンド結合に拮抗することがわかっている。すでにいくつかの薬剤（いわゆる「ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト」、例えばアブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、ＲＧＤペプチド、フィバン（ｆｉｂａｎ）およびフィバチド（ｆｉｂａｔｉｄｅ））が、急性および慢性冠状動脈症候群の治療に使用されている。しかし、存在している受容体がブロックされた後に、細胞内貯蔵からのさらなる受容体タンパク質が細胞膜に外在化されるという事実のため、そのような既知のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの有効性は限定されている。一方ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、高濃度では重い副作用を引き起こすことがあるため、そのようなＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは狭い範囲内でしか増加することができない。β３−インテグリンを含有する受容体ファミリーの受容体タンパク質の外在化の調節は、先行技術からは不明である。
【０００７】
従って本発明の目的は、β３−インテグリン依存性細胞内過程への影響を可能にし、従って
−　ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストの活性を安定化または改良することを可能にし、
−　その起源と経過がβ３−インテグリン依存性細胞内過程に関係し、β３−インテグリン依存性細胞内過程の制御（阻害または促進）により治療できる疾患を治療することを可能にする、物質を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、血管疾患治療用の活性物質を見つけるための、具体的なタンパク質の新しい使用を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、既知のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストとの併用に適し、その有効性を確保または上昇させる活性物質を見つける方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、同定された活性物質を含む薬剤、および急性および慢性血管疾患の治療法を提供することである。
【００１１】
これらの目的は、請求項に従って達成される。本発明は、既知のタンパク質であるβ３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロング（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号ＨＳ３７１３９１）の拮抗活性により、急性および慢性血管疾患を治療するために、β３−インテグリン依存性細胞内過程に影響を与えるという技術的特徴に基づく。これらのタンパク質は既知であり、例えばシャチル（Ｓｈａｔｔｉｌ　Ｓ．Ｊ．）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３１（１９９５）８０７−８１６および５．１２．１９９５のジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）第Ｕ３７１３９号から知られている。特に本発明は、驚くべきことに、既知のタンパク質であるβ３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとビトロネクチン受容体のインターナリゼーションとシグナル伝達を特異的に調節するという事実に基づく。インターナリゼーションは、β３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロング、β３−エンドネキシン−ショート促進性インターナリゼーションの活性の拮抗、および両方の受容体と受容体のβ３−エンドネキシン−ロング阻害性インターナリゼーションのリサイクリングにより調節される。特に、β３−エンドネキシン−ショートは、ヒト血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびヒト内皮細胞上のビトロネクチン受容体のインターナリゼーションとリサイクリングを、特異的に促進することがわかっている。さらに、生理学的に重要なメディエーターの種々の核ＤＮＡ転写プロモーターは、β３−エンドネキシン−ショートによりアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。一方、アンタゴニストとして３−エンドネキシン−ロングは、両方の受容体のインターナリゼーションを阻止することがわかっている。
【００１２】
また、β３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングは、ヒト内皮細胞中のビトロネクチン受容体の細胞内シグナル伝達、内皮細胞の活性化、アテローム発生促進性メディエーターの核転写にとって非常に重要であり、従って一般に、アテローム発生とプラーク不安定化の過程にとって、重要であることがわかっている。
【００１３】
β３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングはまた、心血管疾患（急性血栓症、アテローム性動脈硬化症、プラーク破裂）にとって決定的に重要なシグナル物質の表面発現または分泌を制御する。
【００１４】
両方のインテグリン受容体で保存されているペプチド配列モチーフは、両方の受容体へのβ３−エンドネキシン−ショートの結合に決定的に重要である。β３−エンドネキシン−ショートとβ３−インテグリンの細胞質ドメインとの結合特異性は、β３−インテグリンの細胞質ドメイン内の膜−遠位ＮＩＴＹモチーフによる。一方β３−エンドネキシン−ロング（２０ｋＤａ）は、β３−エンドネキシン−ショート介在インテグリン受容体インターナリゼーションを阻害する。
【００１５】
本発明は、β３−エンドネキシンでの介入により、すでに存在する薬剤の活性を確保または改良することができるという長所を提供する。特に、既存の薬剤（例えば、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、ＲＧＤペプチド、フィバン（ｆｉｂａｎ）およびフィバチド（ｆｉｂａｔｉｄｅ））により、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびビトロネクチン受容体への外因性リガンドの結合に影響を与え、かつ本発明に従って、インターナリゼーション依存性細胞内作用に影響を与えることが可能である。有利なことは、β３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングと調節することにより、両方の受容体の表面発現、インターナリゼーションおよびシグナル伝達をコントロールすることが可能であり、β３−エンドネキシン−ショートはインターナリゼーションを促進することが可能であり、β３−エンドネキシン−ロングはインターナリゼーションを阻止することが可能である。
【００１６】
従って上記より、すでに存在する薬剤の有効性を確保または改良することが可能なだけでなく、一方では血小板アルファ顆粒の性質（すなわちそのメディエーター再摂取能とその分泌性）に特異的に影響を与えることができる。他方、内皮細胞の活性化は同様に、ビトロネクチン受容体インターナリゼーションによりエンドネキシンにより影響を受ける。
【００１７】
従って、β３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングは、急性および慢性血管過程の場合に、新しい薬剤活性物質の開発のための決定的に重要なシグナル伝達分子であり標的タンパク質である。
【００１８】
従って本発明は、動脈硬化症、これから生じる不安定プラーク、急性冠状動脈血栓症、心筋梗塞、卒中、末梢動脈閉塞性疾患、慢性静脈性潰瘍、および再狭窄過程の治療用活性物質を見つけるための、β３−エンドネキシン−ロングまたはβ３−エンドネキシン−ショートの使用を提供する。
【００１９】
本発明はまた、β３−エンドネキシン−ショートのβ３−インテグリンへの結合を阻害する化合物の同定方法であって、以下の工程：
（ａ）（ａ１）β３−エンドネキシン−ショート、またはβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ２）β３−インテグリン、またはβ３−エンドネキシン−ショートへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ３）試験すべき化合物；
とを含む混合物をインキュベートする工程；そして
（ｂ）化合物（ａ３）の非存在下と比較して、化合物（ａ３）の存在下での成分（ａ１）の成分（ａ２）への結合の阻害を検出する工程、を特徴とする上記方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、β３−エンドネキシン−ロングのβ３−インテグリンへの結合を阻害する化合物の同定方法であって、以下の工程：
（ａ）（ａ１）β３−エンドネキシン−ロング、またはβ３−インテグリンへの影響に関してこれと機能的である同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ２）β３−インテグリン、またはβ３−エンドネキシン−ロングとの相互作用に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ３）試験すべき化合物；
とを含む混合物をインキュベートする工程；そして
（ｂ）化合物（ａ３）の非存在下と比較して、化合物（ａ３）の存在下での成分（ａ１）による成分（ａ２）への影響の阻害を検出する工程、を特徴とする上記方法を提供する。
【００２１】
成分（ａ２）への成分（ａ１）の影響は、特に直接または間接結合の結果として起きる。
【００２２】
本発明はまた、β３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングへのβ３−インテグリンの結合の競合を移動させる化合物の同定方法であって、以下の工程：
（ａ）（ａ１）β３−エンドネキシン−ショート、またはβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ２）β３−エンドネキシン−ロング、またはβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ３）β３−インテグリン、またはβ３−エンドネキシン−ショートおよび／またはβ３−エンドネキシン−ロングへの結合に関してこれと機能的に同等であるペプチドまたはポリペプチド；
（ａ４）試験すべき化合物；
とを含む混合物をインキュベートする工程；そして
（ｂ）試験すべき化合物（ａ４）の非存在下と比較して、成分（ａ１）の成分（ａ３）への結合と、成分（ａ２）の成分（ａ３）への結合の比の移動を検出する工程、を特徴とする上記方法を提供する。
【００２３】
本発明のスクリーニング方法は、高処理能スクリーニング（ＨＴＳ）法として実施できることが有利である。
【００２４】
β３−エンドネキシン−ショートを阻害する新しい「小分子」についてのＨＴＳに適したスクリーニング試験は、例えば大きい物質のライブラリーからの小分子を、β３−エンドネキシン−ショートのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまたはビトロネクチン受容体への結合を阻害する適合性について試験することにより、実施することができる。
【００２５】
一方では、１つの可能な測定法は、個々のタンパク質成分を使用する測定法である。他方、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとβ３−エンドネキシン−ショートを発現する（特に、安定に）ＣＨＯ細胞を使用する測定法が可能であろう。このタイプの測定法は、当業者の選択の問題であるが、例として以下の可能性が開示される。
【００２６】
個々のタンパク質成分を使用する以下の測定法を、具体的に説明する。ある実施態様においてβ３−エンドネキシン−ショートは、ビオチン化後のマイクロタイタープレート上にアビジン固定化される。別の実施態様においてβ３−エンドネキシン−ショートは、Ｈｉｓタグでニッケルプレートに適用される。両方の受容体へのβ３−エンドネキシン−ショートの特異的結合部位は公知（エイゲントハーラー（Ｅｉｇｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｍ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）７６９３−７６９８）であり、好ましくは１０量体ペプチドとして、システインブリッジを介してフルオレセインに結合される。この構築体は、プレート上で種々の試験分子の存在下でインキュベートされ、次に残存蛍光に基づき、残っている構築体の量を定量するために洗浄される。別の実施態様においては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して測定が行われる。このためにβ３−エンドネキシン−ショート−緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる融合タンパク質が、上記のようにプレートに固定化される。上記構築体（１０量体ペプチド＋フルオレセイン）が、プレート上でインキュベートされる。真の結合がある場合、フルオレセインとＧＦＰとの間に非常に特異的に蛍光エネルギー移動が起きるため、β３−エンドネキシン−ショートの指示ペプチドへの結合は、励起するする青い光から発光する赤い光への波長の移動に基づき測定される。
【００２７】
本発明の方法の目的のために、可能な結合パートナーである物質を含有する親和性カラムを使用することができる。従って、精製したβ３−エンドネキシン−ショートとＧＦＰとの融合タンパク質は、可能な結合パートナーであり得る物質を含有する親和性カラムに適用される。洗浄後、残存蛍光が定量される。
【００２８】
β３−エンドネキシン−ショートのインヒビターを見つけるための細胞測定法は、以下の工程を含む：
（ａ）イレネ（Ｙｌａｎｎｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９５５０−９５５７（１９９５）の指示に従って調製した、β３−インテグリンを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の、従来の細胞培養培地での培養；
（ｂ）好ましくは細胞へのリポソーム遺伝子の移動による、β３−エンドネキシン−ショートの発現の誘導；
（ｃ）細胞の培養培地への試験化合物の添加；
（ｄ）ある時間経過後（例えば、２４時間後）に従来の特異抗体を使用する蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）による、細胞上のβ３−インテグリンの表面密度の測定；
（ｅ）工程（ｃ）の物質の非存在下と比較したその存在下での表面密度の上昇の検出。
【００２９】
あるいは、図５Ｂに記載のように、テキサスレッド結合抗ＩｇＧ１−ＭＡＫの構成性インターナリゼーションを、蛍光法を使用して測定することができる。この場合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａインターナリゼーション（抗体結合とＦＡＣＳによる測定）は、小分子による阻害について調べることができる。
【００３０】
β３−エンドネキシン−ロングを阻害する新しい小分子についてのＨＴＳに適したスクリーニング試験は、例えば大きい物質のバンクから、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまたはビトロネクチン受容体へのロングの結合を阻害する適合性について、小分子を試験することにより、実施することができる。
【００３１】
一方、１つの可能な測定法は、個々のタンパク質成分を使用する測定法である。他方では、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびβ３−エンドネキシン−ロングを、特に安定に発現するＣＨＯ細胞を使用する測定法も可能であろう。このタイプの測定法は、当業者の選択の問題であるが、例えば以下の可能性が例として開示される。
【００３２】
個々のタンパク質成分を使用する以下の測定法を、具体的に記載する。ある実施態様において、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）またはβ３−エンドネキシン−ロングには存在するがβ３−エンドネキシン−ショートには存在しないタンパク質領域に特異的な抗体が選択される。このためにβ３−エンドネキシン−ショートと、β３−エンドネキシン−ロング中にのみ存在するタンパク質ドメインが、細菌で過剰発現されＧＳＴ−タグを用いて精製される。次にＮＥＢ技術により、この構築体にのみ結合し、精製したβ３−エンドネキシン−ショートには結合しない特異的なアプタマーまたは抗体を選択することが可能である。次にアプタマーは、変換技術により小分子に変換され、これは次に、以下に記載する技術を用いてインヒビターを同定するのに使用される。
【００３３】
特にβ３−エンドネキシン−ロングは、ビオチン化後のマイクロタイタープレート上にアビジン固定化される。別の実施態様においてβ３−エンドネキシン−ショートは、Ｈｉｓタグでニッケルプレートに適用することができる。β３−インテグリンは、例えばシステインブリッジによりフルオレセインに結合される。この構築体は、プレート上で種々の試験分子の存在下でインキュベートされ、次に残存蛍光に基づき、残っている構築体の量を定量するために洗浄される。
【００３４】
また、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して測定することがで可能である。このためにβ３−エンドネキシン−ロング−緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる融合タンパク質が、上記のようにプレートに固定化される。上記構築体（β３−インテグリン＋フルオレセイン）が、プレート上でインキュベートされる。真の結合がある場合、フルオレセインとＧＦＰとの間に非常に特異的に共鳴エネルギー移動が起きるため、β３−エンドネキシン−ロングのインテグリンへの結合は、励起するする青い光から発光する赤い光への波長の移動に基づき測定される。
【００３５】
別の実施態様において、可能な結合パートナーである物質を含有する親和性カラムを使用することができる。特に、精製したβ３−エンドネキシン−ロングとＧＦＰとの融合タンパク質は、可能な結合パートナーであり得る物質を含有する親和性カラムに適用される。洗浄後、残存蛍光が定量される。
【００３６】
β３−エンドネキシン−ロングのインヒビターを見つけるための細胞測定法は、以下の工程を含む：
（ａ）イレネ（Ｙｌａｎｎｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９５５０−９５５７（１９９５）の指示に従って調製した、β３−インテグリンを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の、従来の細胞培養培地での培養；
（ｂ）好ましくは細胞へのリポソーム遺伝子の移動による、β３−エンドネキシン−ロングの発現の誘導；
（ｃ）細胞の培養培地への試験化合物の添加；
（ｄ）ある時間経過後（例えば、２４時間後）に従来の特異抗体を使用する蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）による、細胞上のβ３−インテグリンの表面密度の測定；
（ｅ）工程（ｃ）の物質の非存在下と比較した、その存在下での表面密度の低下の検出。
【００３７】
あるいは、図５Ｂに記載のように、テキサスレッド結合抗ＩｇＧ１−ＭＡＫの構成性インターナリゼーションを、蛍光法を使用して測定することができる。この場合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａインターナリゼーション（抗体結合とＦＡＣＳによる測定）は、小分子による阻害について調べることができる。
【００３８】
本発明はまた、β３−エンドネキシン−ショートまたはβ３−エンドネキシン−ロングのβ３−インテグリンへの結合を阻害する化合物を同定するための試験混合物であって、以下の成分：
（ａ）β３−インテグリン、およびβ３−エンドネキシン−ショートおよび／またはβ３−エンドネキシン−ロングへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる群から選択される第１の成分；
（ｂ）第１の群および／または第２の群から選択される第２の成分、ここで
（ｂ１）第１の群は、β３−エンドネキシン−ショート、およびβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる；
（ｂ２）第２の群は、β３−エンドネキシン−ロング、およびβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる、
を特徴とする上記混合物を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、β３−エンドネキシン−ショートまたはβ３−エンドネキシン−ロングのβ３−インテグリンへの結合を阻害する化合物を同定するためのキットであって、以下の成分：
（ａ）β３−インテグリン、およびβ３−エンドネキシン−ショートおよび／またはβ３−エンドネキシン−ロングへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる群から選択される第１の成分；
（ｂ）第１の群および／または第２の群から選択される第２の成分、ここで
（ｂ１）第１の群は、β３−エンドネキシン−ショート、およびβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる；
（ｂ２）第２の群は、β３−エンドネキシン−ロング、およびβ３−インテグリンへの結合に関してこれと機能的に同等のペプチドまたはポリペプチドよりなる、
を特徴とする上記キットを提供する。
【００４０】
本発明はまた、β３−インテグリン依存性細胞内過程に影響を与える化合物を含む薬剤であって、化合物は、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性細胞内過程を促進するために、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害するために、および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現を阻害するために、β３−エンドネキシン−ショートへの活性化作用および／またはβ３−エンドネキシン−ロングへの阻害作用を有するか、またはβ３−インテグリンインターナリゼーション依存性細胞内過程を阻害するために、および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害するために、β３−エンドネキシン−ロングへの活性化作用、および／またはβ３−エンドネキシン−ショートへの阻害作用を有する、ことを特徴とする化合物を提供する。この薬剤は、そこに含有される活性物質に従って、急性および慢性血管疾患、例えば動脈硬化症、これから生じる不安定プラーク、急性冠状動脈血栓症、心筋梗塞、卒中、末梢動脈閉塞性疾患、慢性静脈性潰瘍、および冠状動脈、脳動脈および末梢動脈の領域での手術的介入後の再狭窄過程、の治療のために使用される。この薬剤はまた、アテローム発生症候群、例えば脳動脈または末梢動脈の領域での冠状動脈狭窄の発症を予防するために、予防的に使用することができる。
【００４１】
驚くべきことに、β３−エンドネキシンは、β３−インテグリンの表面発現とβ３−インテグリン依存性細胞内過程を制御し、これはβ３−エンドネキシンにより影響を受けることがわかった。特に、β３−インテグリンのインターナリゼーション、β３−インテグリンの表面リサイクリング、および血小板と内皮細胞貯蔵小胞の組成に影響を与えることができる。さらに、β３−エンドネキシンにより、内皮細胞中の表面受容体遺伝子のプロモーターの活性化が影響を受ける。
【００４２】
本発明に至る実験において、すべての細胞質β３−ドメインの変種と突然変異型を用いて１本鎖キメラが産生された。ＣＨＯ細胞とＨＵＶＥＣ細胞の初代培養物中で一過性トランスフェクション後、β３−Ａキメラは、対応するβ３−Ｂまたはβ３−Ｃ融合タンパク質またはテイルの無い構築体と比較して、大幅に低下した細胞表面発現を示すが、すべてのキメラの「定常状態」レベルはほとんど同じであることがわかった。細胞質ドメインの変異体を使用する研究はまた、ａ３−Ａ（７５６〜７５９位）の場合のＮＩＴＹモチーフは、β３−Ａの原形質発現にとって決定的に重要であることを、示した。さらに細胞表面へのβ３−Ａへの輸送は、細胞質タンパク質β３−エンドネキシンにより特異的に調節された。β３−エンドネキシンは、β３テイルとの相互作用に関する能力が異なることを特徴とする２つの異なるスプライス変種として存在する。β３テイルと相互作用しないβ３−エンドネキシンの未変性の長い型（β３−エンドネキシン−ロング；Ｅｎ−Ｌ）の同時発現は、β３−Ａインターナリゼーションの優勢−陰性インヒビターとして作用した。さらにＴｙｒ７５９−Ａｌａ置換変異体α１１ｂβ３（Ｙ７５９Ａ）の場合、未変性のβ３−インテグリンα１１ｂβ３の抗β３−ＭＡＫ誘導エンドサイトーシスは劇的に低下し、β３−エンドネキシンの長いアイソフォーム（Ｅｎ−Ｌ；β３−エンドネキシン−ロング）の発現は、野生型α１１ｂβ３のインターナリゼーションを実質的に低下させた。従ってβ３−エンドネキシンは、β３−Ａアイソフォームを特異的受容体リサイクリング経路に結合させる。
【００４３】
さらに、リサイクリング経路は、ヒト血小板（α顆粒）と内皮細胞（ウェイベルパレード体（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ　ｂｏｄｉｅｓ））中の貯蔵小胞のメディエーター再摂取能に影響を与え、従ってその分泌挙動に影響を与えることが認識された。血管作動性物質、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、および血小板α顆粒中の種々のケモカインおよびサイトカインは、急性および慢性血管疾患に決定的に重要な役割を果たすことが知られている。さらに、β３−エンドネキシンによりこれらの過程に介入できることがわかった。さらに、ヒト内皮細胞のアテローム発生促進性シグナル経路（例えば単核細胞化学走性誘因タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の発現およびヒト内皮細胞からのその分泌、または細胞表面上のウロキナーゼ型のプラスミノーゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）の発現）においてβ３−エンドネキシンに介入することができ、これはその移動挙動に大きな影響を与えることが、認識された。
【００４４】
従って本発明は特に、
（Ａ）β３−インテグリン依存性細胞内過程に影響を与える化合物を含む薬剤であって、化合物は、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程を促進するために、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害するために、かつ内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現を阻害するために、β３−エンドネキシン−ショートへの活性化作用および／またはβ３−エンドネキシン−ロングへの阻害作用を有することを特徴とし、化合物は、
（ａ）（ｉ）β３−エンドネキシン−ショート、または（ｉｉ）β３−エンドネキシン−ショートをコードするＤＮＡを含有する発現ベクター；
（ｂ）β３−エンドネキシン−ロングｍＲＮＡに特異的に結合してこれを切断することができるが、β３−エンドネキシン−ショートｍＲＮＡには結合できず、従ってβ３−エンドネキシン−ロングの合成が特異的に低下するかまたは阻害されることを特徴とする、リボザイムまたはこれをコードするベクター；
（ｃ）β３−エンドネキシン−ロングｍＲＮＡに特異的に結合することができるが、β３−エンドネキシン−ショートｍＲＮＡには結合できず、従ってβ３−エンドネキシン−ロングの合成が特異的に低下するかまたは阻害されることを特徴とする、アンチセンスＲＮＡまたはこれをコードするベクター；および
（ｄ）抗ｆ５３エンドネキシン−ロング抗体、
から選択される、上記薬剤、および
【００４５】
（Ｂ）β３−インテグリン依存性細胞内過程に影響を与える化合物を含む薬剤であって、化合物は、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程を阻害するために、および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害するために、β３−エンドネキシン−ロングへの活性化作用および／またはβ３−エンドネキシン−ショートへの阻害作用を有することを特徴とし、化合物は、
（ａ）（ｉ）β３−エンドネキシン−ロング、または（ｉｉ）β３−エンドネキシンをコードするＤＮＡを含有する発現ベクター；
（ｂ）ＮＩＴＹモチーフを含有するペプチドまたはポリペプチド；および
（ｃ）β３−インテグリンのＮＩＴＹモチーフへのβ３−エンドネキシン−ショートの結合を阻害する化合物、
から選択される、上記薬剤に関する。
【００４６】
β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の促進および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の阻害および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現の阻害は、一方では、β３−エンドネキシン−ロングの発現を阻害（アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムにより）するか、またはβ３−エンドネキシン−ロングの活性を阻害（例えば、抗体により）して、他方では、例えばβ３−エンドネキシン−ショートの発現または活性を上昇（タンパク質自体またはタンパク質を発現するベクターの投与により）することにより、達成することができる。β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の阻害および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の阻害は、β３−インテグリンのＮＩＴＹモチーフへのβ３−エンドネキシン−ショートの結合を阻害する化合物（例えばＮＩＴＹモチーフに対する抗体）により、β３−エンドネキシン−ショートの活性を阻害することにより行うことができる。β３−インテグリンの細胞質ドメインへのβ３−エンドネキシン−ショートの結合もまた、ＮＩＴＹモチーフを含有するペプチド（競合的アンタゴニスト）を投与することにより阻害することができる。
【００４７】
本明細書において「β３−エンドネキシン−ショート」および「β３−エンドネキシン−ショートをコードするＤＮＡを含有する発現ベクター」という用語は、β３−インテグリンの細胞質ドメインβ３−Ａに結合することができ、従ってβ３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程を促進、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害、および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現を阻害する、すべての型のタンパク質自体およびＤＮＡにコードされる型に適用され、野生型型のみでなく、野生型と比較して、元々の生物活性があまり変化せずに、アミノ酸配列の変化（例えば、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を含む）を示す型も含む。
【００４８】
β３−エンドネキシン−ロングの発現を低下または阻害することにより、同様に、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程を促進し、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害し、内皮細胞の移動促進表面受容体の発現を阻害することが可能である。これは例えば、β３−エンドネキシン−ロングの翻訳を低下または排除するリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡにより、達成することができる。アンチセンスＲＮＡとリボザイムは、好ましくはｍＲＮＡのコード領域に相補的である。
【００４９】
当業者は、β３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングの公表されたＤＮＡ配列（関連する配列は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）／ＥＭＢＬ受け入れ番号ｈｓ２７１３９１からわかる）から出発して、適当なアンチセンスＲＮＡを産生し使用する立場にある。適当な方法は、例えばＥＢ−Ｂ１０２２３３９９またはＥＰ−Ａ１０４５８に記載されている。リボザイムはＲＮＡ酵素であり、単一のＲＮＡ鎖からなる。これは、他のＲＮＡ（例えば、Ｅｎ−Ｌ−ｍＲＮＡ）を分子内切断することができる。これらのリボザイムは、原則として２つのドメインを有する：（１）触媒ドメイン、および（２）標的ＲＮＡに相補的であり、それに結合することができるドメイン（これは、標的ＲＮＡの切断にとって必須である）。文献に記載の方法から進んで、現在は、所望のＲＮＡを特定のあらかじめ選択した部位で切断するリボザイムを、特異的に構築することができる（例えば、タンネ（Ｔａｎｎｅ）ら、「アンチセンス研究と応用（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、シーアールシープレス社（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）（１９９３）、４１５−５２６を参照）。上記リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡは、好ましくは少なくとも１５塩基、さらに好ましくは少なくとも２５塩基、および最も好ましくは少なくとも５０塩基にわたって、Ｅｎ−Ｌ−ｍＲＮＡとハイブリダイズする．
【００５０】
β３−エンドネキシン−ショート、リボザイムおよびアンチセンスＲＮＡをコードする上記ＤＮＡの挿入と発現のために、当業者に公知の多くの発現ベクターを使用することができる。「発現ベクター」という用語は、プラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＢＬｕｅＳｃｒｉｐｔなど）、ウイルスまたは他の適当なビヒクルを意味する。上記ＤＮＡ配列は、原核または真核宿主細胞中でその発現を可能にする制御成分に、発現ベクター中で機能的に連結している。制御成分以外に、そのようなベクターは、例えばプロモーター、一般的には複製開始点、および形質転換宿主細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含有する。原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））中の発現のための制御成分は、真核生物中の発現のために、ｔｒｐプロモーターまたはＴ７プロモーターを含有し、酵母中の発現のためにＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモーター、および動物細胞中での発現のためにＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＶＳＡＯプロモーター、ＣＭＶまたはＳＶ４０エンハンサーを含有する。適当なプロモーターのさらなる例は、メタロチオネインＩとポリヘドリンプロモーターである。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の適当な発現ベクターには、例えばｐＧＥＭＥＸ、ｐＵＣ誘導体、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＥＴＧ３ｂ、およびｐＱＥ−８があり、後者が好ましい。酵母での発現に適したベクターには、ｐＹ１００とＹｃｐａｄ１がり、哺乳動物細胞中での発現には、ｐＭＳＸＮＤ、ｐＫＣＲ、ｐＥＦＢＯＳ、ｃＤＭ８、ｐＣＥＶ４、および以下の例に記載のベクターがある。適当な発現ベクターには、昆虫細胞での発現のためのバキュロウイルス、例えばｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａがある。
【００５１】
上記のＤＮＡ配列は好ましくは、遺伝子治療に適したベクター中に、例えば組織特異的プロモーターの制御下で挿入され、細胞中に潜入させられる。好適な実施態様において、上記ＤＮＡ配列を含有するベクターはウイルスであり、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、またはワクシニアウイルスである。適当なレトロウイルスの例は、ＭｏＭｕＬＶ、ＨａＭｕＳＶ、ＭｕＭＴＶ、ＲＳＶまたはＧａＬＶである。遺伝子治療の目的において、本発明のＤＮＡ配列は、コロイド分散物として標的細胞に輸送することもできる。これは、例えばリポソームまたはリポプレックスを含む（マニノ（Ｍａｎｎｉｎｏ）ら、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６（１９８８），６８２）。さらにこれらのベクターは、標的特異的な方法であるように、従来の方法により修飾することができる。インビトロとインビボの遺伝子治療のさらなる適当なベクターと方法は、文献に記載されており、当業者に公知である；例えば、ＷＯ９３／０４７０１、ＷＯ９２／２２６３５、ＷＯ９２／２０３１６、ＷＯ９２／１９７４９、ＷＯ９２／０６１８０、ＷＯ９４／２９４８９およびＷＯ９７／００９５７を参照されたい。この遺伝子治療は、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程を促進するため、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害するため、および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現を阻害するため（例えば、β３−エンドネキシン−ショートの遺伝子を含有するベクター、または抗β３−エンドネキシン−ロングｍＲＮＡリボザイムのＤＮＡ配列を使用して）、およびβ３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程を阻害するため、および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害するため（例えば、β３−エンドネキシン−ロングの遺伝子を含有するベクター、またはＮＩＴＹモチーフを含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を使用して）に、使用することができる。
【００５２】
上記ＤＮＡ配列と適当な制御配列を含有する発現ベクターの構築に、専門家の分野で知られている一般的な方法を使用することができる。これらの方法には、例えばインビトロ組換え法、合成法、および上記のインビボ組換え法（例えば、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述）がある。
【００５３】
本発明の薬剤に含有されるβ３−エンドネキシン−ショートは、好ましくは上記の発現ベクターを用いて組換え法により産生される。適当な宿主細胞には、例えば細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１、ＤＨ１、×１７７６、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＢＬ２１、およびＳＧ１３００９）、酵母、好ましくはエス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、好ましくはｓｆ９細胞、および動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞がある。好適な哺乳動物細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３およびＷ１３８細胞がある。形質転換体の表現型選択、および上記の発現ベクターを使用するＤＮＡ配列の発現のための、これらの宿主細胞の形質転換法は、専門家の分野で公知である。当業者は、形質転換または形質転換宿主細胞を培養する条件は周知している。適当な精製法（例えば、術前クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、例えば免疫親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなど）は、一般的に公知である。
【００５４】
本明細書において「抗β３−エンドネキシン−ロング抗体」は、β３−エンドネキシン−ロングに特異的に結合するがβ３−エンドネキシン−ショートには結合しない抗体またはその断片を意味する。この抗体（および、本発明の薬剤に関して記載された他の抗体）は、モノクローナル、ポリクローナルまたは合成抗体またはその断片でもよい。本発明において「断片」という用語は、完全な抗体と同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体の一部（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖまたは「１本鎖Ｆｖ」断片）でもよい。当業者は、そのような断片の産生については周知している。本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の抗体は、標準的方法、好ましくはβ３−エンドネキシン−ロングまたはその合成断片（好ましくは、β３−エンドネキシン−ショート中には存在しないアミノ酸配列を有する断片であって、免疫原として作用する）を使用して産生される。当業者は、同様にモノクローナル抗体を回収する方法を周知している。
【００５５】
特に好適な実施態様において該モノクローナル抗体は、動物（例えば、マウス）由来の抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、またはその断片である。ヒト抗体に似たキメラ抗体またはヒト化抗体は、抗原性は低下しているが、標的に対する親和性は低下していない。キメラ抗体およびヒト化抗体の産生、またはヒト抗体に類似した抗体の産生は、詳細に説明されている（例えば、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６（１９８９），１００２９、およびバーホーヤン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９（１９８８），１５３４を参照）。ヒト化免疫グロブリンは、主にヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリンと呼ぶ）に由来する可燃の基本的な構造領域と、主に非ヒト免疫グロブリン（例えば、マウス由来）（ドナー免疫グロブリンと呼ぶ）に由来する決定領域のｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｄｔａｔｅを有する。定常領域も、もし存在するなら、主にヒト免疫グロブリンに由来する。ヒト患者への投与の場合、ヒト化（およびヒト）抗体は、マウスまたは他の種の抗体に対していくつかの利点を有する：
【００５６】
（ａ）ヒト免疫系は、ヒト化抗体の基本的構造または定常領域を外来物として認識せず、従ってそのような注入抗体に対する抗体応答は、完全に外来のマウス抗体または部分的に外来のキメラ抗体に対するより小さい；
（ｂ）ヒト化抗体のエフェクター領域はヒトであるため、これはヒト免疫系の他の部分とよく相互作用する；および
（ｃ）注入されたヒト化抗体は、天然に存在するヒト抗体の半減期と実質的に同等の半減期を有し、これは、他の種の抗体と比較して、より少量でより少ない頻度で投与することを可能にする。
【００５７】
本明細書において「β３−エンドネキシン−ロング」および「β３−エンドネキシン−ロングをコードするＤＮＡを含有する発現ベクター」という用語は、それぞれすべての型のタンパク質自体、およびＤＮＡにコードされる型て適用され、これはβ３−Ａインターナリゼーションの優勢−陰性インヒビターとして作用することができ、従ってβ３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌を阻害する（野生型のみでなく、野生型型と比較して、元々の生物活性が大きく変化することなく、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加のようなアミノ酸配列の変化を示す型も含む）。
【００５８】
β３−エンドネキシン−ロングをコードする上記ＤＮＡの挿入と発現について、当業者に公知の多くの発現ベクターを使用することができ、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の促進、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の阻害、および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現の阻害に関する説明は、これらの発現ベクターに同様に適用される。β３−エンドネキシン−ショートに関する上記説明は、同様にβ３−エンドネキシン−ロングの組換え産生、適切な発現ベクター、宿主細胞、培養法および精製法に適用される。
【００５９】
本明細書において「ＮＩＴＹモチーフを含有するペプチドまたはポリペプチド」という用語は、ＮＩＴＹモチーフを有し、β３−エンドネキシン−ショートに結合することができ、従って後者がβ３−インテグリンに結合することを防ぐ、任意の種類のペプチドまたはポリペプチドを意味する。ＮＩＴＹモチーフは、野生型でも、野生型型と比較して、β３−エンドネキシン−ショートの結合親和性が大きく変化することなく、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加のようなアミノ酸配列の変化を示す型でもよい。
【００６０】
本明細書において「β３−インテグリンのＮＩＴＹモチーフへのβ３−エンドネキシン−ショートの結合を阻害する化合物」という用語は、例えばβ３−インテグリンのＮＩＴＹモチーフに結合することにより、これができる任意の種類の化合物、例えば合成または天然に存在する化合物で、その結果としてβ３−エンドネキシン−ショートにもう結合できなくする化合物を意味する。そのような化合物の例は、β３−インテグリンのＮＩＴＹモチーフを認識する抗体である。抗体に関する上記の一般的説明を参照されたい。一般に、β３−インテグリンのＮＩＴＹモチーフへのβ３−エンドネキシン−ショートの結合を阻害することができる化合物は、種々の方法により同定し作成することができる。後述の説明と方法を参照されたい。
【００６１】
本発明はまた、ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄβ３−インテグリン依存性細胞内過程に関連する疾患、または一方では、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の促進、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの阻害、および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現の阻害により治療することができ、他方では、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の阻害および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の阻害により、治療することができる疾患、の場合に治療処置が行われることを可能にする。上記化合物は、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の活性の上昇、および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の上昇に関連する症状、またはβ３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の阻害および／または血小板からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の阻害により、治療することができる症状の治療に使用することができる。そのような障害は、好ましくは血小板のα顆粒または内皮細胞のウェイベルパレード体（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ　ｂｏｄｉｅｓ）からの血管メディエーター（増殖因子、サイトカイン、凝固因子など）の分泌の上昇に付随する症候群である。
【００６２】
一方、上記化合物は、β３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の活性の低下、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の低下、および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現の低下に関連する症状、およびβ３−インテグリンインターナリゼーション依存性過程の促進、および／または内皮細胞からのアテローム発生促進性メディエーターの分泌の阻害、および内皮細胞上の移動促進表面受容体の発現の阻害により治療することができる症状、の治療に使用することもできる。
【００６３】
これらの疾患は、好ましくは急性および慢性血管疾患、例えばアテローム性動脈硬化症および不安定血管プラーク、急性心筋梗塞、卒中、末梢血動脈閉塞性疾患、四肢の慢性静脈性潰瘍、手術介入後の再狭窄などである。
【００６４】
本発明の薬剤は好ましくは、薬剤学的に許容される担体をさらに含む。そのような薬剤の適当な担体と調製物は、当業者に公知である。適当な担体には、例えばリン酸緩衝化生理食塩水、水、エマルジョン、例えば水中油エマルジョン、湿潤剤、無菌溶液などがある。薬剤は、経口または非経口的に投与することができる。非経口投与法には、局所的、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下、脳室内、腹腔内または鼻内投与がある。適当な投与量は、担当の医師が決定し、例えば患者の年齢、性および体重、疾患の性質と段階、投与法などに依存する。
【００６５】
本発明はさらに、β３−インテグリンのＮＩＴＹモチーフへのβ３−エンドネキシン−ショートの結合を阻害する化合物を同定することができる方法に関する。そのような方法は、β３−エンドネキシン−ショートをａ３−インテグリンおよび試験化合物とともにインキュベートし、β３−インテグリンへのｆ５３−エンドネキシン−ショートの結合阻害を検出することからなる。β３−エンドネキシン−ショートは、ＮＩＴＹモチーフを認識するペプチドまたはポリペプチドの形であることが有利である。これはさらに、２つの代替物の組合せがあることが有利である。さらに、β３−エンドネキシン−ショートまたはＮＩＴＹモチーフを認識するそのペプチドまたはポリペプチド、および／またはβ３−インテグリンまたはＮＩＴＹモチーフを含むペプチドまたはポリペプチドが、これらをコードする発現ベクターの形であることが有利である。
【００６６】
特に有利な方法は、β３−エンドネキシンがビオチン化後にアビジンマイクロタイタープレート上に固定化され、フルオレセインに結合した１０量体ペプチドの形のＮＩＴＹモチーフが、試験化合物とともに加えられる方法である。試験化合物の結合阻害は、蛍光を測定することにより確認される。
【００６７】
特に有利な方法は、緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したβ３−エンドネキシン−ショートが、上記のようにマイクロタイタープレート上に固定化され、上記１０量体ペプチドが試験化合物とともに加えられる方法である。試験化合物の結合阻害は、フルオレセインとＧＦＰとの共鳴エネルギー移動を測定することにより確認される。
【００６８】
さらに別の有利な方法は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびβ３−エンドネキシン−ショートを発現する細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）が使用される方法である。試験化合物の添加後、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａインターナリゼーションによる化合物の結合阻害を、抗体結合とＦＡＣＳで測定して決定する。
【００６９】
以下の例は本発明を例示する。
【００７０】
例１：一般的方法
（Ａ）抗体と試薬
ＭＡＫＡｂ−１５は、β３の細胞外ドメインに対するものであり、標準的方法に従ってビオチンと結合させた。抗ＩｇＧ１とポリクローナルウサギ抗ＧＦＰ抗体は、ジアノーバ（Ｄｉａｎｏｖａ）（ハンブルグ）から蛍光色素結合体（ＦＩＴＣまたはテキサスレッド、記載の通り）として得られた。フィコエリトリン（ＰＥ）結合ストレプトアビジンは、イッムノテク（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）（マルセイユ、フランス）から得た。オリゴヌクレオチドは、エムダブリュージー（ＭＷＧ）（エバースバーグ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ））から得て、ビトロネクチンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）（デイセンホーフェン／タウフキルチェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ／Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ））から得た。
【００７１】
（Ｂ）ｃＤＮＡクローニングと突然変異誘発
修飾ポリリンカー領域を含有するｐＲＫ５の誘導体であるＰ５Ｃ７を、哺乳動物発現ベクターとして使用した。細胞質Ｉｇ融合タンパク質と膜貫通ＣＤ１６／ＣＤ１７キメラを、最近記載された方法で産生した（コラヌス（Ｋｏｌａｎｕｓ，Ｗ）ら、Ｃｅｌｌ　８６（１９９６），２３３−２４２）。膜貫通Ｉｇ融合タンパク質は、記載のようにＣＤ５のリーダー配列、ヒトＩｇＧ１の細胞外ＣＨ２とＣＨ３ドメイン、完全長のβ３−インテグリンのＣＤ７膜貫通ドメインと細胞内テイルを含む（図１）。細胞質ドメインが欠如したＩｇ構築体を対照とした（Ｉｇ対照）。β１−Ａとβ３−Ａの細胞質ドメインは、対応するコード配列と読みとり枠の最初と最後に制限部位を有するプライマーを使用して、野生型β１−Ａ−とβ３−ｃＤＮＡ配列のＰＣＲにより増幅した。ＭｌｕｌとＮｏｔＩで切断した後、対応するＰＣＲ産物をＰ５Ｃ７中でクローン化した。β３−Ｂとβ３−Ｃ構築体を、同様の方法で産生した。β３−Ａ変種であるＶ−Ａ−ＮＰＫＹ、β３−Ａ−Ｙ７５９Ａ、β３−Ａ−１７５７Ｐ、およびβ１−Ａ変種であるβ１−Ａ−ＮＩＴＹを、同様にＰＣＲにより産生した。
【００７２】
β３−インテグリンの細胞質ドメインとその変異体を、以下のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより増幅してクローン化した：β３−Ａ：５’−ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＣＴＣ　ＣＴＣ　ＡＴＣ　ＡＣＣ　ＡＴＣ　ＣＡＣ−３’（前進）／５’−ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＴＴＡ　ＡＧＴ　ＧＣＣ　ＣＣＧ　ｇＴＡ　ＣＧＴ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＡ−３（逆進）’；β３−１７５７Ｐ：５’−ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＴＴＡ　ＡＧＴ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＧＴＡ　ＣＧＴ　ｇｇｇ　ＡＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧ３（逆進）’；β３−Ｙ７５９Ａ：５’−ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＴＴＡ　ＡＧＴ　ＧＣＣ　ＣＣＧ　ＧＧＣ　ＣＧＴ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧ−３（逆進）’；β３−ＮＰＫＹＥＧＫ：５’−ＧＧＧ　ｇＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣＣ　ＣＴＣ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＣＧＧ　ＡＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧＡ　ＣＧＴ　ＧＧＣ　ＣＴＣ−３’（逆進）’；β１−ＮＩＴＹＲＧＴ：５’−Ｇｇｇ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＴＴＡ　ＡＧＴ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＧＴＡ　ＣＧＴ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＧＡＣ　ＣＡＣ　ＡＧＴ　ＴＧＴ　ＴＡＣ　ＧＧＣ　ＡＣＴ−３’（逆進）。
【００７３】
両方のβ３−エンドネキシンアイソフォームを、ナチュラルキラー細胞ｃＤＮＡバンク（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ハイデルベルグ）から、以下のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより増幅してクローン化した：５’−ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＣＴＧ−３’（前進）／５’−ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＴＴＧ　ＴＧＡ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＴＧ−３’（逆進）（β３−エンドネキシン−ロング）または５’−ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＣＴＧ−３’（前進）／５’−ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＴＡＴ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＴＡＡ　ＡＴＴ　ＴＴＧ　ＣＡＴ　ＴＡＴ　ＣＴＣ　ＣＡＴ−３’（逆進）（β３−エンドネキシン−ショ−ト）。生じたＰＣＲ断片を、ｅＧＦＰクローニングカセット（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ハイデルベルグ）の対応する３末端と融合した。推定の核インポート配列Ｋ６２ＲＫＫの欠失を有するβ３−エンドネキシン変異体を、２工程ＰＣＲ法により産生した。すべての構築体を、制限切断により同定し、ＣｓＣｌ遠心分離により精製し、ＤＮＡ配列決定により確認した後トランスフェクションした。
【００７４】
β３−エンドネキシンを同様に、ｅＧＦＰの無い構築体として、同じ発現ベクター中にクローン化した。
【００７５】
（Ｃ）細胞株と一過性感染
ＣＨＯ細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）から得て、１０％胎児牛血清（ＦＣＳ）、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリンとストレプトマイシン、および１％非必須アミノ酸を補足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で維持した。αＩＩｂβ３とαＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ）を発現する安定なＣＨＯ細胞株は、すでに性状解析されている（イレーネ（Ｙｌａｎｎｅ，Ｊ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９９５），９５５０−９５５７）。細胞株を、０．７５ｍｇ／ｍｌのゲネチシン（Ｇ４１８）ジサルフェートを補足したＤＭＥＭ中で培養した。
【００７６】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、クロネティクス（ＣＬｏｎｅｔｉｃｓ）（カリホルニア州、米国）から購入した。これらは、「内皮細胞基礎培地」（同じ製造業者から）中で培養し、最大５回継代した。
【００７７】
ｃＤＮＡ構築体を、リポソーム介在トランスフェクション（スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（登録商標）、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））によりＣＨＯ細胞中で発現させた。トランスフェクションの２４時間前に、細胞を６ウェルを有する培養プレートに蒔いた。全部で２μｇの各構築体と１０μｇのスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（登録商標）（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を、１１０μｌの非補足ＤＭＥＭまたはＭ−１９９（ギブコビライフ（ＧＩｂｃｏ　Ｌｉｆｅ）、カリスルエ（Ｋａｒｉｓｒｕｈｅ））中で、室温で１０分間インキュベートした。次にここに６００μｌの補足培地を加え、細胞の上にＤＮＡ−スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（登録商標）複合体をのせた。細胞を３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、次に３７℃で完全培地でインキュベートした。２４時間後、培地を交換し、４８時間目に細胞を分析した。
【００７８】
（Ｄ）フローサイトメトリーと共焦点レーザー免疫蛍光顕微鏡
一過性トランスフェクション体を、Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で処理した０．１ｍｇ／ｍｌのトリプシンと３．５ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液中に採取した。室温で５分間インキュベート後、細胞を、０．１％ダイズトリプシンインヒビター（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液で希釈し、等量のＰＢＳ中２％ホルムアルデヒドを添加して室温で３０分間固定した。次に細胞を１２００ｒｅｖ／ｍｉｎ（５分間）で遠心分離して回収し、タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液中で１回洗浄した。表面ＩｇＧ染色のために、固定した細胞を、過剰のフィコエリトリン（ＰＥ）結合マウス抗ＩｇＧ１−ＭＡＫ（５０μｇ／ｍｌ）を含有する１００μｌのタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液中で再懸濁した。１時間インキュベート後、細胞を、ＰＢＳ中２％グリシンで２回洗浄し、細胞内Ｉｇ染色のために、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合マウス抗ＩｇＧ１−ＭＡＫ（５０μｇ／ｍｌ）と、固定細胞の透過性化のための０．２％トリトンＸ−１００（登録商標）を含有するタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液中でもう一度再懸濁した。さらに１時間インキュベート後、細胞を再度２回洗浄し、０．５ｍｌのタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液中に再懸濁し、「ＦＡＣＳｃａｎ」（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ハイデルベルグ）でフローサイトメトリーにより解析した。１０，０００の緑蛍光トランスフェクション体（細胞内ＦＩＴＣ−抗ＩｇＧ染色陽性）を、赤の免疫蛍光（ＰＥ）（表面−ＰＥ−抗ＩｇＧ染色）について分析した。ＧＦＰ標識タンパク質を用いた実験では、固定細胞を、透過性化無しでＰＥ−抗ＩｇＧで表面染色した。共焦点レーザー免疫蛍光顕微鏡のために、トランスフェクションした細胞を、ビトロネクチン（５μｇ／ｍｌ）で被覆したカバーガラス上で４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ中５％ＢＳＡで室温で１時間ブロックした。次に細胞単層を固定し、上記のようにフローサイトメトリー解析のために染色した。適当なソフトウェアを有する共焦点レーザー顕微鏡（ライカ（Ｌｅｉｃａ）、ベンシェイム（Ｂｅｎｓｈｅｉｍ））により、免疫蛍光解析を行った。
【００７９】
（Ｅ）細胞溶解と免疫沈降
免疫沈降のために、ＣＨＯ細胞のコンフルエンスに近い単層を、ＩｇまたはＧＦＰ融合タンパク質で一過性にトランスフェクションした。１００ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１％トリトンＸ−１００Ｔ（登録商標）を含有する溶解緩衝液を添加して、細胞を溶解した。４℃で２０分間インキュベート後、溶解物を２０，０００×ｇで遠心分離して、不溶性物質を除去した。次にＩｇ融合タンパク質を、プロテインＡ−６ＭＢ−セファロースビーズ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、フライバーグ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））により、直接回収した。免疫沈降物を溶解緩衝液で３回洗浄後、ＳＤＳ添加緩衝液で解離させた。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜に移した。ペルオキシダーゼ結合２次抗体（ジアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））と化学発光（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ））により、免疫学的検出を行った。
【００８０】
（Ｆ）エンドサイトーシス
β３−インテグリンのエンドサイトーシスを、ブレッチャー（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ）（１９９２）（ブレッチャー（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｓ．）、ＥＭＢＯ　Ｊ．１１（１９９２），４０５−４１０）に従って改変した過程を使用して、測定した。αＩＩｂβ３とαＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ）を発現する安定な細胞の類似レベルを、直径３５ｍｍのプレート上で一晩培養し、ダルベッコー改変ＰＢＳ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ））で２回洗浄し、ビオチン標識抗β３−ＭＡＫ（５μｇ／ｍｌ）で氷上で１５分間プレインキュベートし、ダルベッコー改変ＰＢＳ中で３７℃でさらに０、２、５、１５、３０または６０分間インキュベートした。次に細胞を２回洗浄し、続いて５０ｍＭ　２−メルカプトエタンスルホン酸（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリスおよび０．２％ウシ血清アルブミン（ｐＨ８．６）を含有する還元溶液で、５分間のインキュベートを３回連続で行った。細胞を離し、そのアリコートを、氷上で２％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、２％グリシンで２回洗浄し、０．２％トリトンＸ−１００（登録商標）の存在下でＰＥ−ストレプトアビジンでさらに３０分間インキュベートした。次に細胞をフローサイトメトリーで解析し、１０，０００イベントのＰＥ−ストレプトアビジンの平均強度を、β３−インテグリンエンドサイトーシスの尺度として使用した。ＣＨＯ細胞のさらなるアリコートを、ビオチン結合抗β３−ＭＡＫで、記載の時間インキュベートし、２−メルカプトエタンスルホン酸で還元後、４℃でダルベッコー改変ＰＢＳ中２００μｌの２００ｍＭ　ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフロリド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で溶解し、１２，０００×ｇで５分間遠心分離した。次に同量の１００ｍＭトリス、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１％トリトンＸ−１００（登録商標）、０．１％ＳＤＳおよび０．１％ノニデットＰ−４０（ｐＨ７．４）を加えた。最後にレーン当たり２０μｇのタンパク質を、８％アクリルアミドフラットゲルに適用し、非還元条件下で分離後、２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、ｐＨ８．３（イレンネ（Ｙｌａｎｎｅ　Ｊ．）ら、前述）を使用して、タンパク質をイモビロン（登録商標）膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、エッシュボーン（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ））に移した。ビオチン標識抗β３−ＭＡＫを、２μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ジアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））と化学発光免疫ブロッティングキット（ロッシュダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、マンハイム）を使用して、視覚化した。
【００８１】
ＮＦ−ｋＢ活性を測定するためのゲルシフト測定法
核抽出物を、記載のようにＨＵＶＥＣから調製した。原型の免疫グロブリンカッパ鎖−オリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、クレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、マンハイム）で標識した。核タンパク質を、２０μｌの結合緩衝液中で３２Ｐ−ｄＣＴＰとともに２５℃で３０分間インキュベートした。試料を０．２５％ＴＢＥ（トリス、ホウ酸塩、ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で非変性４％ポリアクリルアミドゲルで分離した。次にゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーを行った。
【００８２】
（Ｇ）トランスフェクション
レポータープラスミドを、３×１０５ＣＨＯ細胞で、スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（登録商標）（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ヒルデン、ドイツ）を使用してトランスフェクションし、６ウェルを有するプレート中で一晩インキュベートした。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）測定法のために、すべての一過性トランスフェクションを、１μｇのｕ−ＰＡＲ−ＣＡＴレポーター構築体と１μｇのルシフェラーゼ発現ベクター（次の段落を参照）の存在下で行い、記載している場合は、β３−インテグリンをコードする３μｇの発現プラスミドまたは等量の対照ベクターと加えた。３時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次に１０％ＦＣＳ含有培地に交換し、さらに４５時間増殖させた。細胞を採取し、次に０．２５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．８）中で凍結／融解サイクルを繰り返して溶解した。トランスフェクション効率は、ルシフェラーゼ活性測定法により測定した。トランスフェラーゼ効率を標準化後、細胞溶解物を４μＭの［１４Ｃ］−クロラムフェニコールおよび１ｍｇ／ｍｌのアセチル補酵素と、３７℃でインキュベートして測定した。酢酸エチルで抽出して混合物を分離し、アセチル化産物を薄層クロマトグラフィーで、クロロホルム／メタノールを移動相として使用して分離した。反応産物を、オートラジオグラフィーで視覚化し、放射能は、４４５ＳＩホスホロイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　Ｉｍａｇｅｒ）（モレキュラーダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ））を用いて定量した。
【００８３】
ルシフェラーゼ測定法のために、一過性トランスフェクションを、１μｇのｕ−ＰＡＲ−ＣＡＴレポーター構築体と、対照として１０ｎｇのレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）−ルシフェラーゼプラスミド（ｐＲＬ−ＳＶ４０；プロメゲ（Ｐｒｏｍｅｇｅ）、マンハイム）の存在下で、３μｇのβ３−インテグリンコード発現プラスミドまたは対照ベクターとともに行った。トランスフェクション後、細胞を無血清培地中で３時間増殖させ、次にさらに１０％ＦＣＳとともにさらに４５時間行った。ホタルルシフェラーゼ活性を、内部対照として使用したレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）−ルシフェラーゼについて標準化した。
【００８４】
例２：
β３−インテグリンキメラのアイソフォーム依存性示差的細胞表面発現
【００８５】
β３−インテグリンは、重要な生物学的過程に関与しており、βサブユニットの細胞質ドメインは、例えばリガンドの細胞外結合（「インサイドアウトシグナル伝達」）、受容体のシグナル伝達とインターナリゼーション／リサイクリングの制御において、ある役割を果たすと考えられている。３つの公知の細胞質β３ドメインアイソフォームの機能的意義を理解するために、細胞表面のヒトＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３部分を有する１本鎖キメラ受容体、ＣＤ７の膜貫通ドメイン、および完全長（図１）の細胞質ドメインβ３−Ａ、−Ｂ、および−Ｃを作成した。β１−Ａの細胞質ドメインを有する類似構築体またはテイルの無いＩｇ構築体を、さらなる対照として使用した。すべての構築体は、最近記載されたキメラ受容体に基づく（コラヌス（Ｋｏｌａｎｕｓ，Ｗ）ら、Ｃｅｌｌ　７４（１９９３），１７１−１８３）。種々の細胞系でこれらのキメラを発現すると、他のβ３アイソフォーム融合タンパク質または対照キメラと比較して、β３−Ａキメラが大きく低下した細胞表面発現を示すことがわかった。ＣＨＯ細胞（図２Ａ）をＩｇキメラで一過性にトランスフェクションし、細胞を、融合タンパク質の細胞表面の割合と細胞内発現を検出するために、フルオレセイン−またはテキサスレッド結合抗Ｉｇ抗体で連続的に染色した。図２Ａに示すように、Ｉｇ−β３−Ｂ、Ｉｇ−β３−ＣおよびＩｇ−β１−Ａは、分散した細胞内のかつ「定常状態」の原形質膜表面染色パターンを示し、これはテイルの無いＩｇキメラの染色パターンと似ていた。これに対して、Ｉｇ−β３−Ａは主に細胞内に局在化された（図２Ａ）。融合タンパク質の表面発現のより定量的な評価のために、ＣＨＯ細胞を、対応した構築体で一過性にトランスフェクションし、固定し、２重染色し、フローサイトメトリーを用いて細胞内と表面発現に関して観察した。図２Ｂに示すように、Ｉｇ−β３−Ａの表面発現は、代替スプライシング部位（Ｉｇ−β３−Ｂ、Ｉｇ−β３−Ｃ）を有する変異体、Ｉｇ−β１キメラまたはテイルの無いＩｇ構築体と比較して、有意に低下した。細胞内免疫蛍光の平均強度は、すべてのトランスフェクション構築体で同じであるため、試験キメラの表面発現の差は、総タンパク質濃度の差ではなく、免疫ブロッティング解析は、すべての試験したキメラの「定常状態」発現レベルは非常に似ていることを確認した（図２Ｃ）。従ってこれらの結果は、細胞質β３−Ａドメインが、特定のβ３−インテグリンの細胞表面発現の制御に関与することを暗示する。
【００８６】
例３：
β３−Ａ　７５６−７５９のＮＩＴＹモチーフは、Ｉｇ−β３キメラの表面発現に決定的に重要である
【００８７】
β３−インテグリンの細胞質ドメインは、細胞骨格の多くのタンパク質およびシグナルタンパク質と相互作用する。保存領域、例えばＮＰＸＹとＮＸＸＹ（これは、ほとんどの細胞質βドメインに存在する）は、細胞が拡散する間および心臓形接着物の形成の間の原形質膜内へのβ３−インテグリンの局在化を仲介する。従って問題は、もっぱら細胞質β３−Ａ配列（図１）中で発現されるＣ末端ＮＩＴＹモチーフの突然変異または欠失が、対応するキメラの表面発現に影響を与えるかどうかである。実際、細胞質β３−ドメインのＣ末端の７残基（７５６−７６２）（ＮＩＴＹＲＧＴ、図１）による、β１のカルボキシ末端の置換、またはβ１−Ａ（図１）のＮＰＫＹＥＧＫモチーフ（７７２−７７８）によるβ３−Ａ中のＮＩＴＹＲＧＴモチーフの置換は、Ｉｇ−β３−Ａ−ＮＰＫＹ変異体の大きく増加した表面発現と、Ｉｇ−β１−Ａ−ＮＩＴＹキメラ（図３Ａと３Ｂ）の表面検出の同時の低下とを引き起こすことがわかった。さらに、細胞質β３−Ａドメインへのβ１−ＡのＰｒｏ７７３の導入（β３−Ａ−１７５７Ｐ）は、キメラの表面発現を大きく増加させた（図３Ａと３Ｂ）。細胞表面発現が増加した同様の結果が、Ｔｙｒ７５９でのアラニン置換によりβ３−Ａで得られた（β３−Ａ−Ｙ７５９Ａ）（図３Ａと３Ｂ）。これらのデータは、β３−Ａ　Ｎ７５６ＩＴＹの線形配列モチーフが、β３Ａ−β３−インテグリン融合タンパク質の細胞表面発現の低下にとって決定的に重要であることを示す。Ｎ７５６ＩＴＹモチーフはまた、血小板とＣＨＯ細胞中の「インサイドアウト」シグナル伝達に必要であり、細胞質タンパク質β３−エンドネキシンとの相互作用を仲介する。
【００８８】
例４：
β３−エンドネキシンはＩｇ−β３融合タンパク質の表面発現を制御する
【００８９】
β３−エンドネキシンは、β３−Ａサブユニットの細胞質ドメインに結合する。この相互作用は、他のβ３−インテグリンの細胞質ドメインで観察されていないため、この作用は特異的である。これは、β３−Ａへのβ３−エンドネキシンの結合が、β３−Ａ中にのみ存在するＮ７５６ＩＴＹモチーフに依存する（図１）ことを示すことが可能であった。β３−エンドネキシンの２つのアイソフォームが検出され、これらはサイズが異なり、さらに重要なことは、β３−Ａの細胞質ドメインに結合する細胞能力が異なることである（図４Ａ）。「短い」β３−エンドネキシンスプライス変種（β３−エンドネキシン−Ｓ；Ｅｎ−Ｓ）は１１１アミノ酸からなり、β３−Ａに結合するが、β３−エンドネキシンのより長い型（１７０アミノ酸、β３−エンドネキシン−Ｌ；Ｅｎ−Ｌ）は、β３−Ａテイルとは相互作用しない（図４Ａの略図を参照）。両方のポリペプチド変種のＮ末端は同じなため、これらの２つのアイソフォームを使用して、β３−エンドネキシンがβ３−Ａの細胞表面発現の制御に関与するかどうかを調べるのに使用した。β３−Ａの細胞表面発現に及ぼすβ３−エンドネキシンの両方のアイソフォームの作用を調べるために、両方のアイソフォームのｃＤＮＡを、ナチュラルキラー細胞株ｃＤＮＡバンクから単離し、通常の細胞下構造検出のために、緑の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＣ末端に融合した。ＧＦＰ／β３−エンドネキシンは細胞質と核の両方で発現されるため、細胞質中で構成性に局在化している２つのβ３−エンドネキシンアイソフォームの両方の変異体（Ｋ６２ＲＫＫ位での核局在化の推定シグナルは欠失されている）を構築した。図４Ｃに示すように、両方のβ３−エンドネキシンアイソフォーム（Ｅｎ−ＳΔＫ６２ＲＫＫとＥｎ−ＬＳΔＫ６２ＲＫＫ）の核インポートに関して、変異体は、野生型のβ３−エンドネキシンキメラと比較して、非常に大きい程度の細胞質ＧＦＰ−蛍光を示した。野生型と突然変異β３−エンドネキシンアイソフォーム（図４Ｃ）を、ＣＨＯ細胞またはＨＵＶＥＣ中のＩｇ−β３−インテグリンキメラと同時トランスフェクションすると、β３−エンドネキシンの長い型で同時形質転換した細胞中のＩｇ−β３−Ａの表面発現は、β３−エンドネキシンの短い型または対照構築体で同時形質転換した細胞と比較して、顕著に増加した（図４Ｃと図４Ｄ）。細胞が、β３−エンドネキシンの長い型の核インポート変異体（Ｅｎ−ＬΔＫ６２ＲＫＫ）で同時トランスフェクションされたなら、β３−Ａの表面発現の増加はわずかに大きかった。短い型の変異体（Ｅｎ−ＳΔＫ６２ＲＫＫ）は、Ｉｇ−β３−Ａの細胞表面発現に大きな影響は示さなかった（図４Ｃと４Ｄ）。ＧＦＰ／β３−エンドネキシンとＩｇ−β１−Ａ−ＮＩＴＹキメラの同時トランスフェクションにより、Ｅｎ−Ｌが融合タンパク質の表面発現を大きく上昇させること（図４Ｃと４Ｄ）、一方他のＩｇ−β３−インテグリンキメラの表面発現には２つのβ３−エンドネキシンアイソフォームの実質的な作用は観察されなかった（図４Ｃと４Ｄ）。これらの知見は、β３−エンドネキシンシステムがβ３−Ａの細胞表面発現を特異的に制御することを、明確に示す。両方のＧＦＰ／β３−エンドネキシンが主に核内に局在化して��るという事実は、この関連ではあまり重要な役割を果たさないようである；しかし、ＧＦＰ−β３−エンドネキシンＬの構成性細胞質局在化は、β３−Ａの原形質膜発現を、野生型のものよりわずかに良好な程度まで上昇させ、両方の構築体は、定量的に類似の作用を示す。
【００９０】
例５
β３−インテグリン融合タンパク質はβ３−エンドネキシン依存性機構によりインターナリゼーションされる
【００９１】
β３−インテグリンは、エンドサイトーシスを介してインターナリゼーションされ、この過程で細胞質ドメインが重要な役割を果たすことが知られている。エンドサイトーシス機構におけるβ３−インテグリンの細胞質ドメインの役割を評価するために、ＣＨＯ細胞をＩｇ−β３−インテグリンキメラで一過性にトランスフェクションした。２４時間後、蛍光色素標識抗Ｉｇ−ＭＡＫを生きている細胞に１５分間加えた。次に抗体を除去し、細胞を、記載の時間に２％ホルムアルデヒドで固定した。抗Ｉｇ抗体はβ３−Ａトランスフェクション細胞に急速にインターナリゼーションされ、数分以内に、原形質膜下の小胞コンパートメント中で検出できた（図５Ａ）。インキュベート時間を長くすると、抗ＦＩＴＣ免疫蛍光が集中した。β３−ＡのＮ７５６ＩＴＹモチーフを含有したＩｇ−β１構築体で、同様の結果が見いだされた。これに対して、抗Ｉｇ−ＭＡＫの細胞吸収が実質的に無いかまたはほんのわずかである優勢なまたは独占的な表面染色が、他のアイソフォームβ３−Ｂまたはβ３−Ｃまたはβ１−Ａまたはテイルの無いＩｇキメラで一過性にトランスフェクションした細胞で観察された（図５Ａ）。これらの結果は、β３−Ａの「定常状態」表面発現は大きく低下（図２Ａと２Ｂ）しており、Ｉｇ−β３−Ａ融合タンパク質の細胞プールの比率は、原形質膜と細胞内小胞コンパートメントの間で、明らかに循環することを示す。これに対して、かなりの「定常状態」表面発現を示した（図２と３）、β３−Ａ、β３−Ａ−Ｙ７５９Ａおよびβ３−Ａ−１７５７Ｐの点突然変異体でトランスフェクションした細胞、または他のβ３アイソフォームは、抗Ｉｇ抗体のかなり低いインターナリゼーションを示した（図５Ａ）。従って、Ｎ７５６ＩＴＹモチーフは、β３−Ａ−インテグリンのインターナリゼーションまたはエンドサイトーシスに関与していると結論することができる。
【００９２】
次に、β３−エンドネキシンがβ３−Ａのインターナリゼーションを調節するかどうかを調べた。このために、ＣＨＯ細胞を、β３−エンドネキシンアイソフォーム−ＧＦＰ融合タンパク質またはその変異体およびＩｇ−β３キメラで同時トランスフェクションした。ＦＩＴＣ結合抗Ｉｇ−ＭＡＫの吸収を、記載の間隔で免疫蛍光顕微鏡で追跡した。長いアイソフォームとＩｇ−β３−Ａのキメラで同時トランスフェクションした細胞では、Ｅｎ−Ｓ構築体で同時トランスフェクションした細胞と比較して、ＦＩＴＣ−抗Ｉｇ−ＭＡＫの吸収はほとんど目立たなかった（図５Ｂ）。これらの結果は、抗Ｉｇ−ＭＡＫ結合β３−Ａインテグリンのインターナリゼーションは、細胞質β３−Ａ結合性タンパク質β３−エンドネキシンにより制御されることを示す。
【００９３】
例６
未変性のβ３−インテグリンの抗β３−ＭＡＫ誘導エンドサイトーシスは、β３−エンドネキシン依存性機構により制御される
【００９４】
β３−エンドネキシンが未変性のβ３−インテグリンのインターナリゼーションに関与するかどうかを調べたために、野生型αＩＩｂβ３とαＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ）を発現する細胞株を、ビオチン標識抗β３−ＭＡＫで、氷上でまたは３７℃で記載の間隔でインキュベートし、膜透過性低下剤に付した。この化合物は、抗体のストレプトアビジン−ＦＩＴＣ介在検出を破壊し、従って受容体のインターナリゼーションを測定するための手段を提供した。
【００９５】
図６Ａは、野生型と変異体β３−インテグリンが、ＣＨＯ細胞の表面で同様の密度で発現されたことを示す。以後の免疫ブロッティング実験は、４℃で細胞表面に結合したビオチン標識抗β３抗体の約４０％は、もし野生型αＩＩｂβ３を発現する細胞を使用するなら、低下から防御されたことを示した（図６Ｂと６Ｃ）。しかしαＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ）を発現する細胞では、低温で結合した物質のわずかに５〜６％のみが低下から防御され（図６Ｂと６Ｃ）、これは、変異体β３を発現する細胞ではなく野生型で、かなりのエンドサイトーシスが起きることを示している。従って、β３−インテグリンキメラについて上記したように、未変性のβ３−インテグリンとＮＩＴＹ７５９配列の細胞質ドメインは、ＣＨＯ細胞へのαＩＩｂβ３のかなりのエンドサイトーシスに必要である。
【００９６】
次に免疫蛍光法を使用して、同様の実験を行った。顕微鏡分析は、野生型αＩＩｂβ３を発現する細胞の細胞内部位に、多量の表面結合ビオチン標識ＭＡＫが移動したことを示した（図７Ｂ、左の部分）。これに対して、αＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ）を発現する細胞中のビオチン標識抗β３−ＭＡＫのインターナリゼーションは、大きく低下した（図７Ｂ、右の部分）。変異体では（図７Ｂ、右の部分）、検出に使用した抗体は、野生型β３を発現する細胞で観察されるようには、検出されなかった。防御された任意の表面結合抗体は、細胞皮質に関連するすべての場合に維持された。
【００９７】
免疫蛍光により測定されるβ３−インテグリン依存性インターナリゼーションのより定量的評価を得るために、細胞をフローサイトメトリーで調べた。図７Ａに示すように、αＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ）（白丸）を発現する細胞のＰＥ−ストレプトアビジン蛍光の吸収は、野生型αＩＩｂβ３（四角）を発現する細胞と比較して大きく低下した。
【００９８】
例７
ＧＦＰ−エンドネキシン−Ｌの一過性過剰発現はＣＨＯ細胞でのαＩＩｂβ３のエンドサイトーシスを阻害する
【００９９】
β３−エンドネキシンの過剰発現は、未変性のβ３−インテグリンのエンドサイトーシスも調節するかどうかを評価するために、αＩＩｂβ３またはαＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ）を発現する細胞を、種々のＧＦＰ／β３−エンドネキシン融合構築体で一過性にトランスフェクションし、ビオチン標識抗β３−ＭＡＫで３７℃で１５分間インキュベートした。２−メルカプトエタンスルホン酸で還元後、細胞をＰＥ−ストレプトアビジンで染色し、フローサイトメトリーで観察した。β３−Ａキメラを使用した実験に一致して、β３−エンドネキシンの長い型または欠失変異体Ｅｎ−ＬΔＫ６２ＲＫＫの発現は、ＰＥ−ストレプトアビジン蛍光吸収の大きな用量依存性阻害を引き起こし、一方Ｅｎ−Ｓは影響がなかった。これらの結果は、未変性のβ３−インテグリンのエンドサイトーシスが細胞質β３−エンドネキシンに制御されることを示している（図８）。
【０１００】
例８
冠状動脈心疾患患者からの血小板の貯蔵小胞（α顆粒）の中β３−インテグリンインターナリゼーション
【０１０１】
ヒト血小板（ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ）上のβ３−インテグリンはどの程度α顆粒中でインターナリゼーションされるかを調べるために、血小板多血漿を、冠状動脈心疾患患者の血液から分離し、酸性クエン酸−デキストロース（ＡＣＤ；国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）の処方Ａに従う、ベセスダ、メリーランド州、米国）で抗凝固処理し、２３０×ｇで１６分間遠心分離した。次に血小板を洗浄し、９０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭグルコース、３０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）を含有する培地中に再懸濁した。血小板を２０μｇ／ｍｌの７Ｅ３モノクローナル抗体（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのフィブリノゲン結合部位を阻害し、コラー（Ｃｏｌｌｅｒ）博士、ニューヨーク州、米国から供与された）で、２０℃で５分間インキュベートした。陰性対照として、２０μｇ／ｍｌの非特異的マウスＩｇＧでインキュベーションを行った。再度遠心分離（５分間、１８０×ｇ）し、１２０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭグルコース、１ｍＭリン酸塩緩衝液および３０ｍＭ　ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に再懸濁し、１０μｇ／ｍｌの５ｎｍ金標識抗マウスＩｇＧＦａｂ断片（バイオトレンド（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ）、コロン（Ｃｏｌｏｇｎｅ））を加えた。懸濁物を１０、２０、６０および９０分間インキュベートした。次に免疫標識試料を０．２％グルタルアルデヒドで固定し、電子顕微鏡のために調製した。
【０１０２】
図９Ａ〜Ｃに示す時間進行は、血小板α顆粒が、細胞表面からインターナリゼーションされた糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（血小板のβ３−インテグリン受容体）に実質的に覆われることを示す。ここから、β３−インテグリン阻害は、貯蔵小胞の組成と機能に実質的な影響を及ぼすことが明らかである。
【０１０３】
例９
α顆粒中のβ３−インテグリンインターナリゼーションはα脱顆粒の低下を引き起こす
【０１０４】
ヒト血小板上のＰ−セレクチン表面発現に基づいて、その脱顆粒活性と従ってα顆粒からの血管作動性およびアテローム発生メディエーターの放出を評価できるようにするために、上記全血からの血小板多血漿を遠心分離（２００×ｇで２０分間）により濃縮した。最終血小板数は、自己血漿により２×１０８／ｍｌに調整した。ゼロ値を設定後、５μｌのＴＲＡＰ（２５μＭ）を加えた；Ｐ−セレクチン表面発現をフローサイトメトリーにより測定した（ガワツ（Ｇａｗａｚ　Ｍ．）ら、Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ　８０（１９９８），９９４−１００１）。脱顆粒した血小板表面上でＰ−セレクチンを特異的に認識する、イムノテク（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）（マルセイユ、フランス）が産生したモノクローナル抗ＣＤ６２Ｐ抗体（Ｋｌａｎ　ＣＬＢＴｈｒｏｍｂ／６）を、この目的に使用した。
【０１０５】
血小板からのＰ−セレクチン表面発現／分泌（セロトニン、増殖因子またはサイトカインのような、種々の血管作動性メディエーターの分泌の例として）は、その表面β３−インテグリンである同時に存在する糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体（図９）のインターナリゼーションに依存することがわかった（図１０）。
【０１０６】
β３−インテグリンインターナリゼーションの上昇は、α顆粒のメディエーター再摂取能が低下するため、血管作動性物質の分泌を時間依存的に低下させる。従ってインターナリゼーション過程（例えば、β３−エンドネキシン−ショート過剰発現／活性化、またはエンドネキシン−ロング阻害）の直接促進は、この分泌を顕著に低下させる。
【０１０７】
例１０
β３−エンドネキシン−ショートはｕＰＡＲプロモーターをダウンレギュレートする
【０１０８】
３×１０５のＣＨＯ細胞を６ウェルプレートに一晩接種し、次にスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（登録商標）（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））を用いて一過性にトランスフェクションした。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ試験のために、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）プロモーターの制御下にある１μｇのＣＡＴレポーター構築体を使用した。このために、ｕＰＡＲ遺伝子の４４９ｂｐ断片（配列−３９８位から＋５１位）を、ｐＣＡＴ基本ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マンハイム）のＸｂａＩ切断部位にクローン化した。さらに各場合の１μｇのルシフェラーゼ発現ベクターと、種々の量のβ３−エンドネキシン−ショートプラスミド（２００ｎｇ〜５μｇ）または等量の空の発現ベクター（ｐＥＧＦＰ）を、同時トランスフェクションした。３時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％胎児牛血清（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、カールスルーヘ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ））を含有する培地に移し、さらに４５時間培養した。次に細胞を採取し、０．２５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．８）中で凍結／融解サイクルを繰り返して溶解した。ルシフェラーゼ活性について標準化した細胞抽出物を、４μＭの１４Ｃ−クロラムフェニコールと１ｍｇ／ｍｌのアセチル補酵素でインキュベートし、酢酸エチルで抽出し、クロロホルム／メタノールを移動相として使用して薄層クロマトグラフィーに付した。１４Ｃ−クロラムフェニコールのアセチル化誘導体への変換は、ホスホロイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　Ｉｍａｇｅｒ）（モレキュラーダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、ハイデルベルグ、４４５ＳＩ型）を用いて行った。結果を図１１に示す。エンドネキシン−ショートの発現は、ｕＰＡＲプロモーターの活性化を濃度依存性に顕著に阻害する。これは、ｕＰＡＲ受容体の発現が、濃度依存性にβ３−エンドネキシン−ショートの存在に依存することを示し、これは、細胞移動の過程、および従ってプラーク不安定化における後者の重要性を強調する。
【０１０９】
例１１
ヒト内皮細胞からのＭＣＰ−１の放出
【０１１０】
培養したＨＵＶＥＣ細胞を、例５と６に記載のようにβ３−エンドネキシン−ショートまたはβ３−エンドネキシン−ロングをコードするプラスミド構築体とともに、または空の対照ベクターとともにトランスフェクションした。２４時間後、細胞をビヒクルとともにまたは１００ｐｇ／ｍｌのインターロイキン−１βとともに、１２０分間インキュベートした。次に吸引して上清を除去し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、−８０℃で保存した。製造業者の説明書によると検出限界が５ｐｇ／ｍｌであるＥＬＩＳＡ（アールアンドディー・システムズ（Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウィーズバーデン（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）、注文番号ＤＣＰ００）を用いて、単核細胞化学走性誘因タンパク質１（ＭＣＰ−１）の濃度を測定した。結果（図１２）は、β３−エンドネキシン−ショートの過剰発現が、アテローム発生性ＭＣＰ−１の基礎放出とインターロイキン誘導性放出の両方を低下させ、従ってアテローム性動脈硬化症過程に良好に作用することを示す。
【０１１１】
例１２
β３−エンドネキシン−ロングはビトロネクチン受容体の密度を増加させ、ヒト内皮細胞でのそのインターナリゼーションも低下させる
【０１１２】
図１３の実験は、トランスフェクションしたＣＨＯ細胞の結果と同様に、ヒト内皮細胞でも、β３−エンドネキシン−ロングの過剰発現によりビトロネクチン受容体の密度が顕著に増加することを示す。これは、Ｅｎ−Ｌがまた、内皮細胞上のβ３−インテグリンのインターナリゼーションをも低下させることができることを明瞭に示す。
【０１１３】
例１３
β３−エンドネキシン−ショートは、ＮＦ−ｋＢの転写因子ｐ６５と直接相互作用し、従ってサイトカイン誘導性のＮＦ−ｋＢの刺激を防止する
【０１１４】
図１４と１５の実験は、Ｅｎ−ＳとＥｎ−Ｌが直接ＮＦ−ｋＢの核転写因子と相互作用することを示す。ゲル中のＮＦ−ｋＢ結合活性の明瞭な低下を参照することにより明らかなように、この結合は、サイトカインによるこの因子の利用可能性を低下させる。
【０１１５】
例１４
β３−エンドネキシン−ショートではなくβ３−エンドネキシン−ロングはヒト血小板と内皮細胞における優勢なタンパク質である
【０１１６】
図１６は、ヒト血小板と内皮細胞における優勢なタンパク質は、これまで考えられてきたようなβ３−エンドネキシン−ショートではなく、β３−エンドネキシン−ロングであることを示す。トランスフェクションしたＣＨＯ細胞での結果に基づき、血小板フィブリノゲン受容体のインターナリゼーションがこのタンパク質により阻害されると結論することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１：使用したキメラ受容体の略図
β１−Ａ、野生型β３−Ｂ、あるいはβ３のスプライス型と変異体β３−Ａの細胞質ドメインのアミノ酸配列を示す。β３−インテグリン（野生型と変異体）の細胞内ドメインは、ヒトＩｇＧのＣＨ２とＣＨ３ドメイン、およびＣＤ７抗原に対応する、それぞれ異種細胞外ドメインと膜貫通ドメインに融合させたキメラ１本鎖受容体として発現させた。下線は、変化したアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】
図２Ａ：β３アイソフォーム融合タンパク質で一過性にトランスフェクションしたＣＨＯ細胞の２重免疫蛍光顕微鏡写真：Ｉｇ−β３−Ａの表面発現が大幅に低下する
ＣＨＯ細胞をカバーガラス上にのせ、コンフルエンス近くまで増殖させた。次に細胞を、種々のＩｇ−β３−インテグリンキメラ（β３−Ａ、β３−Ｂ、β３−Ｃ、β１−Ａ）またはＩｇ対照構築体をコードするプラスミドＤＮＡのアリコートでトランスフェクションした。２４時間後、細胞を固定し、融合タンパク質の細胞表面発現を、ＴｘＲ結合マウス抗ＩｇＧ抗体で染色して検出した（赤色の免疫蛍光）。次に細胞を０．０２％トリトンＸ−１００（登録商標）で透過性処理し、キメラの細胞内発現を、ＦＩＴＣ結合マウス抗ＩｇＧ抗体で染色して検出した（緑の蛍光）。重要なことに、Ｉｇ−β３以外のすべてのキメラを、細胞表面上で検出することができた（赤）。
【図２Ｂ】
図２Ｂ：ＣＨＯ細胞中のβ３アイソフォームキメラの細胞表面発現のフローサイトメトリー解析
ＣＨＯ細胞のコンフルエンスに近い単層を、β３アイソフォームのキメラ構築体（Ｉｇ−β３−Ａ、Ｉｇ−β３−Ｂ、Ｉｇ−ｆｂ３−Ｃ）で一過性にトランスフェクションした。Ｉｇ−１３１−Ａキメラまたはテイルの無いＩｇ対照構築体を対照として使用した。細胞を２％ホルムアルデヒドで固定し、ＴｘＲ結合マウス抗ＩｇＧ１抗体で染色した。次に細胞を洗浄し、対応するキメラの細胞内発現の検出のために、０．０２％トリトンＸ−１０ｄＴＭと、飽和濃度のＦＩＴＣ結合マウス抗ＩｇＧ１抗体を含有するＰＢＳに再懸濁した。次に試料をフローサイトメトリーで解析した。独立に行ったこれらの実験の結果の平均値を示す。バックグランド免疫蛍光レベルを、「モック」トランスフェクション体（ベクターＤＮＡ）により規定した。
【図２Ｃ】
図２Ｃ：β１とβ３アイソフォームキメラの発現
ＣＯＳ細胞のコンフルエンスに近い層を、記載のキメラ構築体で一過性にトランスフェクションした。２４時間後、細胞を溶解し、Ｉｇ融合タンパク質をプロテインＡ−セファロースで沈降させた。次に抗Ｉｇ抗体を用いて免疫ブロット解析を行った。
【図３Ａ】
図３Ａ：β−β３−インテグリン−ＮＩＴＹモチーフ変異体または変種の融合タンパク質を一過性に発現するＣＨＯ細胞の２色免疫蛍光顕微鏡写真：細胞質ＮＩＴＹモチーフを有するキメラは細胞内に局在化される
ビトロネクチンをプレコーティングしたカバーガラスにＣＨＯ細胞をのせ、β３−インテグリン変異体β１−Ａ−ＮＩＴＹ、β３−Ａ−ＮＰＫＹ、β３−Ａ−１７５７Ｐ、β３−Ａ−７５９Ａ、β３−Ａとβ１−Ａアイソフォーム、またはテイルの無いＩｇ対照ベクターで一過性にトランスフェクションした。２４時間後、細胞を固定し、図２の凡例に記載のように染色した。赤色の免疫蛍光は、表面発現を示し、緑は、キメラ構築体の細胞内発現を示す。すべてのキメラは、等しく発現され細胞内に拡散（緑）して、ＮＩＴＹモチーフの点突然変異または欠失により、細胞表面発現が増加することが注目される。
【図３Ｂ】
図３Ｂ：ＮＩＴＹモチーフ変異体の細胞表面発現の定量
ＣＨＯ細胞を、β３−ＮＩＴＹ変異体のキメラ構築体で一過性にトランスフェクションした。細胞を染色し、キメラの細胞表面発現を、図２の凡例に記載のように解析した。独立に行った３つの実験の結果の平均値を示す。
【図４Ａ】
図４Ａ：β３−エンドネキシンアイソフォームの略図
【図４Ｂ】
図４Ｂ：ＣＨＯ細胞中のＧＦＰ−エンドネキシン融合タンパク質のウェスタンブロット解析
記載の構築体でトランスフェクションしておいたＣＨＯ細胞の全溶解物のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫ブロッット解析を行った。
【図４Ｃ】
図４Ｃ：β３−エンドネキシンアイソフォームのＧＦＰ融合タンパク質（緑）で同時トランスフェクションしたＣＨＯ細胞中のβ３−アイソフォーム−Ｉｇ融合タンパク質（赤）の細胞表面発現：ＧＦＰ−Ｅｎ−ＬとＧＦＰ−Ｅｎ−Ｌ−ΔＫ６２ＲＫＫは、Ｉｇ−β３−Ａキメラの細胞表面発現を特異的に仲介するが、Ｉｇ−β３−ＢまたはＩｇ−β３−Ｃのそれは仲介しない
ＣＨＯ細胞を、β３−インテグリンとＧＦＰ／β３−エンドネキシンアイソフォームで一過性に同時トランスフェクションした。２４時間後、細胞を固定し、β３キメラの細胞表面発現に関して、ＴｘＲ結合マウス抗ＩｇＧ１抗体で染色した（赤色の免疫蛍光）。Ｉｇ−β３−Ａは、β３−エンドネキシンの長い型（上の列、左から３つ目の画像）で同時トランスフェクションした細胞の細胞表面上で発現されることが注目される。
【図４Ｄ】
図４Ｄ：β３−エンドネキシンアイソフォームで同時トランスフェクションしたＣＨＯ細胞中のβ３−インテグリンの細胞質ドメインのキメラの細胞表面発現の定量
ＣＨＯ細胞を、Ｉｇ−β３−Ａ、Ｉｇ−β１−Ａ、Ｉｇ−β１−ＮＩＴＹまたはＩｇ−β３−ＮＰＫＹ発現構築体で、ＧＦＰ／β３−エンドネキシンアイソフォームとともに、一過性にトランスフェクションした。２４時間後、細胞を固定し、融合タンパク質の細胞表面発現に関して、ＴｘＲ結合マウス抗ＩｇＧ１で染色した（赤色の免疫蛍光）。１０，０００個の緑（ＧＦＰ）陽性細胞を評価した。独立に行った３つの実験の結果の平均値を示す。
【図５Ａ】
図５Ａ：外因性抗ＩｇＧ抗体はＩｇ−β３−Ａを発現する細胞により急速にインターナリゼーションされる
ビトロネクチンをプレコーティングしたカバーガラスにＣＨＯ細胞をのせ、Ｉｇ−β３−Ａ、Ｉｇ−β３−Ｂ、Ｉｇ−β３−Ｃ、Ｉｇ−β１−Ａ、またはテイルの無いＩｇ対照構築体で一過性にトランスフェクションした。２４時間後、細胞を固定し、５μｇ／ｍｌのＴｘＲ結合抗ＩｇＧ１−ＭＡＫを培地に加えて、１５分間インキュベートした。氷冷した固定剤を、記載の間隔で細胞に加えて、インターナリゼーションを停止させた。次に、免疫蛍光顕微鏡を用いて細胞を評価した。他のキメラと比較して、β３−Ａでトランスフェクションした細胞は、細胞表面染色が認められないことが注目される。しかし緑の免疫蛍光が、数分以内に細胞内小胞コンパートメント内に蓄積している。
【図５Ｂ】
図５Ｂ：Ｒ３−エンドネキシン−Ｌ構築体はＩｇ−β３−Ａの構成性インターナリゼーションを阻止する
ビトロネクチンをプレコーティングしたカバーガラスにＣＨＯ細胞をのせ、β３−インテグリン−β３−Ａとβ３−エンドネキシンアイソフォームで同時トランスフェクションした。２４時間後、５μｇ／ｍｌのＴｘＲ結合抗ＩｇＧ１−ＭＡＫを培地に加えて、１５分間インキュベートした。氷冷した固定剤を、記載の間隔で細胞に加えて、インターナリゼーションを停止させた。次に、２色免疫蛍光顕微鏡写真を用いて緑の蛍光細胞を評価した。Ｅｎ−Ｌ構築体でトランスフェクションした細胞では、β３−Ａのインターナリゼーションが大幅に低下していることが注目される。
【図６】
図６：未変性のβ３−インテグリンのエンドサイトーシスの測定：生化学的評価
（Ａ）野生型β３またはβ３変異体Ｙ７５９Ａを用いるａＩＩｂを発現する安定な細胞株のフローサイトメトリー解析。フルオレセインイソチオシアネートを結合させた陰性対照抗体（抗ＣＤ６２、左）または抗β３（ｍＡｂ１５）（右）による蛍光ヒストグラムを示す。
（Ｂ）ＣＨＯ細胞をビオチン標識抗β３−ＭＡＫと氷上で１５分間プレインキュベートし、次に記載の時間３７℃でインキュベートした。還元剤でインキュベート後、細胞を溶解し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを使用して免疫ブロッティングにより検出した。還元剤で保護したビオチン標識ＭＡＫの一部の半定量評価のために、冷インキュベーション後に平行試料のアリコートを取り、総インプットのうちの割合としてインターナリゼーションした物質の評価を容易にするために、標準化対照としてのせた（右のレーン、１００、５０、１０％、αＩＩｂβ３、および８０、４０、２０％、αＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ））。すべての試料は二重で取った。
（Ｃ）抗体バンドの密度スキャニングの対応する結果（ＯＤ＝光学密度、任意の単位）
【図７】
図７：未変性のβ３−インテグリンのエンドサイトーシスの測定；免疫蛍光
（Ａ）野生型αＩＩｂβ３とαＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ）を発現するＣＨＯ細胞中でビオチン標識抗β３−ＭＡＫのインターナリゼーションの定量的評価。細胞をビオチン標識抗β３−ＭＡＫ（５μｇ／ｍｌ）と氷上で１５分間プレインキュベートし、次に培地で希釈し、記載の時間３７℃でインキュベートした。次にダルベッコー改変ＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭ　２−メルカプトエタンスルホン酸（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリスおよび０．２％ウシ血清アルブミン、ｐＨ値８．６を含有する溶液で３回連続してインキュベートした。次に細胞を２％ホルムアルデヒドで固定し、次に細胞を０．０２％トリトンＸ−１００（登録商標）で透過性処理し、ＦＩＴＣ結合ストレプトアビジンで染色し、フローサイトメトリーで分析した。
（Ｂ）野生型αＩＩｂβ３とαＩＩｂβ３（Ｙ７５９Ａ）の吸収の定量的比較；細胞を上記のように処理した。１５分試料の代表的な細胞を示す。分析は、共焦点スキャニング顕微鏡（ライカ（Ｌｅｉｃａ））により行った。
【図８】
図８：β３−エンドネキシンアイソフォームで一過性にトランスフェクションした細胞中の未変性の野生型β３−インテグリンのエンドサイトーシスの用量依存性分析
野生型αＩＩｂβ３を発現するＣＨＯ細胞を、ＧＦＰ／β３−エンドネキシン構築体またはＧＦＰ対照ベクターで、２４時間一過性トランスフェクションを行った。細胞をビオチン標識抗β３で４℃で１５分間プレインキュベートし、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。２−メルカプトエタンスルホン酸で還元後、細胞をＰＥ−ストレプトアビジンで染色し、約１０８ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーで調べた。ＰＥ−ストレプトアビジンの平均強度は、β３−インテグリンエンドサイトーシスの指数として使用し、ＧＦＰ対照ベクターに対して種々のＧＦＰ平均発現レベルで測定した。これは、種々のレベルのＧＦＰ蛍光（緑）について種々のＰＭＴ蛍光ゲート内の赤の蛍光を分析することにより行った。１つの実験の結果を示す；３つの独立した実験で、ほぼ同じ結果が観察された。
【図９】
図９：冠状動脈心疾患患者の血小板の貯蔵小胞（α顆粒）中の時間依存性β３−インテグリンインターナリゼーション
急性冠状動脈症候群を治療した患者の洗浄した血小板の電子顕微鏡写真。血小板は、室温でβ３−インテグリン糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するアゴニスト性抗体（７Ｅ３抗体）とインキュベートし、次に金標識抗マウスＦａｂ断片と、１０分（Ａ）、２０分（Ｂ）、または４０分（Ｃ）インキュベートした。１０分後、免疫標識７Ｅ３抗体（矢印）が、血小板表面上でのみ見つかった。２０分後、表面標識が減少し、標識７Ｅ３は、α顆粒の表面連結膜系（「ＳＣＳ」）で見つかるものが増えてきた。４０分後、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを示す７Ｅ３抗体は、α顆粒中で区別される。
【図１０】
図１０：ヒト血小板上のＴＲＡＰ誘導性Ｐ−セレクチン表面発現として測定すると、α顆粒中のインテグリンのインターナリゼーションはα顆粒化を低下させる
ＴＲＡＰ（トロンビン受容体活性化ペプチド）活性化血小板中のＰ−セレクチン表面発現に及ぼす、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストであるアブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）の作用。アブシキシマブ（イーライリリイ（Ｅｌｉ−Ｌｉｌｌｙ））の静脈内投与後、急性冠状動脈症候群を治療した患者から、記載の時間に血小板多血漿を採取し、ＴＲＡＰ（トロンビン受容体活性化ペプチド；２５μＭ）誘導性Ｐ−セレクチン発現を測定した。使用した抗体ＣＤ６２Ｐは、脱顆粒後にそこで発現される表面セレクチンを認識する。単離した血小板多血漿を、インドメタシン（６０μＭ）単独またはインドメタシンと７Ｅ３抗体（５０μｇ／ｍｌ）でインビトロでインキュベートした。次にＰ−セレクチン表面発現を、フローサイトメトリーにより測定した。
＊は、初期値と比較して大きな変化を示す（ｐ＜０．０５）。
【図１１】
図１１：β３−エンドネキシン−ショートはｕＰＡＲプロモーターをダウンレギュレートする
ＣＨＯ細胞を、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ受容体（ｕＰＡＲ）プロモーターの制御下にあるＣＡＴレポーター遺伝子で一過性にトランスフェクションした。さらに、種々の量のβ３−エンドネキシン−ショートプラスミド（２００ｎｇ〜５μｇ；レーン１〜５）、空の発現ベクター（ｐＥＧＦＰ、レーン６）または空のリポソーム（レーン８）を同時トランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性について標準化した細胞抽出物を、１４Ｃ−クロラムフェニコールでインキュベートし、酢酸エチルで抽出し、薄層クロマトグラフィーに付した。１４Ｃ−クロラムフェニコールのアセチル化誘導体への変換は、ホスホリメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を用いて行った。結果を図１１に示す。
【図１２】
図１２：内皮細胞からのＭＣＰ−１の分泌に及ぼすβ３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングの発現の作用
培養したＨＵＶＥＣ細胞を、例５と６に記載のようにβ３−エンドネキシン−ショートとβ３−エンドネキシン−ロングをコードするプラスミド構築体で、または空の対照ベクターでトランスフェクションした。２４時間後、細胞を、ビヒクルまたは１００ｐｇ／ｍｌのインターロイキン−１βと１２０分インキュベートした。次に吸引して上清を除去し、単核細胞化学走性誘因タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。棒は、独立の実験の結果であり、標準偏差の平均を示す。
【図１３】
図１３：エンドネキシン−ロングの過剰発現はヒト内皮細胞上のビトロネクチン受容体（ＶＮＲ）の密度を上昇させる（フローサイトメトリー解析）
新に単離したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ細胞）を、両方のβ３−エンドネキシンをコードするプラスミドまたはその核インポート変異体でトランスフェクションさせた。細胞を採取し、前記したように固定し、抗体で染色した。このために、β３−インテグリンに対する「抗β３」抗体、およびビトロネクチン受容体（ＶＮＲ）に対するＬＭ６０９抗体を使用した。対照として、接着受容体ＩＣＡＭ−１に対する抗体を使用した。各場合の３つの独立した試験の平均値を示す。ＶＮＲに対する両方の抗体の結果は一致して、ＶＮＲの密度がＥｎ−Ｌの過剰発現後に顕著に増加したことを示す。
【図１４】
図１４：ＨＵＶＥＣ細胞の免疫沈降は、β３−エンドネキシン−ショートおよびβ３−エンドネキシン−ロングの、ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットとの同時沈降を示す。
ＨＵＶＥＣを組換えＥｎ−ＳまたはＥｎ−Ｌでトランスフェクションした。２４時間後、基本的条件下で調べたかまたはインターロイキン−１βで刺激した細胞の抽出物を、前記のように溶解し精製した。次にＮＦ−ｋＢに対する抗体（ビオチン結合マウス抗ｐ６５ｍＡｂ、ロッシュバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、マンハイム）を用いて、免疫沈降を行った。これらの沈殿物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに適用し、ニトロセルロースに移し、β３−エンドネキシンに対する記載の抗体でブロットさせた。結果は、特にサイトカイン刺激後に、Ｅｎ−ＳとＥｎ−Ｌは直接ＮＦ−ｋＢのｐ６５に結合し、これと相互作用することを示す。
【図１５】
図１５：ＮＦ−ｋＢ活性を測定するためのゲルシフト測定法は、組換えβ３−エンドネキシン−ショートおよびβ３−エンドネキシン−ロングの存在下での種々のサイトカインによる活性化の中和を示す
ＩＬ−１β刺激ＨＵＶＥＣから核抽出物を調製し、記載のように解析した。ＮＦ−ｋＢ結合は、ＨＵＶＥＣ中のＥｎ−Ｓの過剰発現により中和され、Ｅｎ−Ｌにより顕著に低下する。精製に使用したタンパク質ＧＳＴを、陰性対照とした。結果は、ＮＦ−ｋＢ結合活性が、増加する用量のＥｎ−ＳｔＥｎ−Ｌの存在下で顕著に低下することを示す。従ってＥｎ−ＳおよびＥｎ−Ｌのｐ６５との相互作用の機能的意義が、明らかになる。
【図１６】
図１６：β３−エンドネキシン−ショートではなくβ３−エンドネキシン−ロングがヒト血小板と内皮細胞における優勢なタンパク質である
ブロットは、エンドネキシンに対する特異抗体でブロットしたヒト血小板と内皮細胞の抽出物を示す。不死化した内皮細胞株ＥＣＶと初代培養臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用した。別の細胞株（「Ｌ−６０」、「ＣＨＯ」）と精製した組換えタンパク質（右のレーン）を、対照として使用した。β３−エンドネキシン−ロングのレベルで明瞭なバンドが見られ、一方内因性β３−エンドネキシン−ショートは区別することができない。これらの知見は、Ｅｎ−Ｌがヒト血小板と内皮細胞における優勢なタンパク質であることを証明する。
【図１７】
図１７：血小板（図１７Ａ）と内皮細胞（図１７Ｂ）におけるβ３−エンドネキシン−ショート、β３−エンドネキシン−ロングおよびさらに細胞内成分と細胞外成分の機能的関係の略図
【図１】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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