(57)【要約】本発明は、アルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液及びそれを用いた染色方法に関するものであって、さらに詳細には、ＣＢＢ(Coomassie Brilliant Blue)染色試薬によりタンパク質を染色する時に使用する、アルミニウムイオンを含む処理溶液及びそれを用いたタンパク質染色方法に関するものである。  本発明により、アルミニウムイオンを含む処理溶液を使用しタンパク質をＣＢＢ−ステインすると、検出限界が低くなってその感度が向上し、且つ、染色時間が短縮されるだけではなく、デステイン(destaining)過程を省いてもよいという長所を有する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＢＢ(Coomassie Brilliant Blue)染色試薬によりタンパク質を染色する時に使用されることを特徴とする、アルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液。
【請求項２】
前記アルミニウムイオンは、硫酸アルミニウム(aluminium sulfate)、塩化アルミニウム(aluminium chloride)及び酢酸アルミニウム(aluminium acetate)からなる群から選択されるアルミニウム塩から提供されることを特徴とする、請求項１に記載のアルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液。
【請求項３】
前記アルミニウムイオンは、全体染色液に対し１〜４０％の含量で含まれることを特徴とする、請求項１に記載のアルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液。
【請求項４】
前記染色液は、アルコール化合物を５〜４０％含量で含むことを特徴とする、請求項１に記載のアルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液。
【請求項５】
(a)所定の精製されたタンパク質にドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)を行って得られたゲルを脱イオン水により洗浄する段階と；
(b)前記結果物を第１の溶液及び第２の溶液により処理する段階と；
(c)前記結果物を、アルミニウムイオンを含む第３の溶液により処理する段階と；
(d)前記結果物に、ＣＢＢ染色試薬を含む第４の溶液を添加する段階と、を含むことを特徴とする、タンパク質染色方法。
【請求項６】
前記アルミニウムイオンは、硫酸アルミニウム(aluminium sulfate)、塩化アルミニウム(aluminium chloride)及び酢酸アルミニウム(aluminium acetate)からなる群から選択されるアルミニウム塩から提供されることを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質染色方法。
【請求項７】
前記アルミニウムイオンは、第３の溶液に対し１〜４０％の含量で含まれることを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質染色方法。
【請求項８】
前記第３の溶液は、アルコール化合物を５〜４０％含量で含むことを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質染色方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液及びそれを用いた染色方法に関するものであって、さらに詳細には、ＣＢＢ(Coomassie Brilliant Blue)染色試薬によりタンパク質を染色する時に使用する、アルミニウムイオンを含む処理溶液及びそれを用いたタンパク質染色方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
染色(staining)は、プロテオミクス(proteomics)における実験結果を解析するに重要なものであって、二次元空間にタンパク質を可視化する段階を意味する。以下、明細書上の用語‘染色’と‘ステイン’は、同じ意味として使用する。
【０００３】
また、二次元ゲル電気泳動(2-dimentional gel electrophoresis；以下、２−Ｄゲル電気泳動)は、二次元空間に、タンパク質固有の特性である分子量と電荷量との差を利用し、細胞内の全てのタンパク質を展開してみせるものであって、様々な環境におけるタンパク質発現の差を比較分析する基礎となる。
【０００４】
一般に、プロテオミクスにおいて、２−Ｄゲル電気泳動を基にするタンパク質染色は、シルバー(silver)染色液、蛍光を用いた染色液及びＧ２５０またはＲ２５０のようなＣＢＢ染色液など、通常の吸収型染色液により行われてきた。
【０００５】
この中でシルバー染色液により行われるシルバーステインの場合、優れた感度を示すが、タンパク質タイプに依存するという短所がある。
【０００６】
その反面、ＣＢＢ染色液は、他の染色液に比べ、経済的に有利で、高価の装置を使用する必要がなく、容易な実験過程により行われて、且つ、タンパク質タイプに依存しないという長所を有するため、２−Ｄゲル電気泳動によりタンパク質を分析するか、その他の毛細管電気泳動によりタンパク質を分析するなど、様々な条件におけるタンパク質の分析時、染色に有効に適用されてきた。
【０００７】
しかしながら、ＣＢＢ染色液は、プロテオミクスにおいて最も代表的に使用されるものではあるが、検出限界が約３０ｎｇ/バンド以上であってその感度が低いだけではなく、ステイン及びデステインするに１〜２日程度の時間が所要されることから分かるように、時間がたくさんかかるという問題があった。
【０００８】
一方、従来のＣＢＢ−ステイン時、染色液とタンパク質との疎水性の相互作用を向上させることにより染色感度を高めるために、アンモニウムイオンを含む処理溶液を使用したことがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＣＢＢ−ステインによりタンパク質を染色する際、検出限界を低めて感度を向上させると共に染色時間を短縮させるために、アルミニウムイオンを含む処理溶液及びこれを用いたタンパク質染色方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明では、アルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液及びこれを用いたタンパク質染色方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
以上説明したように、本発明により、アルミニウムイオンを含む処理溶液を使用しタンパク質をＣＢＢ−ステインすると、検出限界が低くなってその感度が向上し、且つ、染色時間が短縮されるだけではなく、デステイン(destaining)過程を省いてもよいという長所を有する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
まず、本発明では、ＣＢＢ−ステインによりタンパク質を染色する時に使用するアルミニウムイオンを含む処理溶液を提供する。
【００１４】
これは、３価のカチオンのアルミニウムイオンを使用することで、溶液のイオン強度を増加させて、タンパク質と染色液との相互作用を強化させる働きをする。
【００１５】
前記アルミニウムイオンは、アルミニウム塩から提供されるが、このアルミニウム塩は、硫酸アルミニウム(aluminium sulfate)、塩化アルミニウム(aluminium chloride)及び酢酸アルミニウム(aluminium acetate)からなる群から選択されることが好ましく、特に、硫酸アルミニウムを使用することが最も好ましい。
【００１６】
このようなアルミニウム塩の使用量は、全体処理溶液に対し１〜４０％の含量で含まれることが好ましい。アルミニウム塩の使用量が１％より少ないと、染色時間及び程度に係わる効果が減少し、４０％より多いと、バックグラウンド部分の染色が強くなり、タンパク質の確認が不可能になる。
【００１７】
また、前記処理溶液は、アルコール化合物を５〜４０％の含量で含むが、アルコール化合物は、適切な染色のための必須的な構成成分であって、その使用量が５％より少ないと、染色が遅延されて、４０％より多いと、染色がうまくできない。
【００１８】
前記アルコール化合物は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール及びイソブタノールからなる群から選択されることが好ましく、最も好ましくは、エタノールを使用する。
【００１９】
さらに、本発明は、前記アルミニウム塩を含む処理溶液を用いたタンパク質染色方法を提供する。
【００２０】
本発明によるタンパク質染色方法は、次の段階を含む：
(a)所定の精製されたタンパク質にドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)を行って得られたゲルを脱イオン水により洗浄する段階；
(b)前記結果物を第１の溶液及び第２の溶液により処理する段階；
(c)前記結果物を、アルミニウムイオンを含む第３の溶液により処理する段階；
(d)前記結果物に、ＣＢＢ染色試薬を含む第４の溶液を添加する段階。
【００２１】
まず、(a)段階では、所定の精製されたタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ガラスプレートから除去されたゲルを脱イオン水により簡単に洗浄する。
【００２２】
次に、(b)段階では、前記(a)段階から得られたゲルを、第１の溶液である３０％のエタノール及び２％のリン酸を含む水溶液により３回ずつ処理した後、第２の溶液である２％のリン酸を含む水溶液により３回ずつ処理する。
【００２３】
次に、(c)段階では、前記(b)段階から得られたゲルを第３の溶液である１〜４０％のアルミニウムイオン、５〜４０％のアルコール化合物及び２％のリン酸を含む水溶液に沈殿させる。
【００２４】
最後に、(d)段階では、前記(c)段階から得られた結果物である、ゲルの沈殿された第３の溶液に、第４の溶液であるＣＢＢ染色試薬として２％のＧ２５０及び０．２ｇ/Ｌのアジ化ナトリウム(sodium azide)を含む水溶液を添加するが、第４の溶液の最終濃度が０．５〜２％となるように調節する。
【００２５】
この際、ゲルの大きさが７×１０ｃｍである場合は、前記第１乃至第４の溶液の使用量を５０ｍｌにして、２０×２４ｃｍである場合は、２５０ｍｌにする。また、前記第１乃至第３の溶液での処理時間は、各々３０分にして、ＣＢＢ染色液を含む第４の溶液での処理時間は、３０分〜４８時間にする。
【００２６】
図１ａ〜図１ｄは、本発明の効果を表すために、うさぎ、大腸菌、牛または卵などから抽出した様々な種類のタンパク質を二次元空間でゲルで電気泳動した後染色したものを示した図面である。
【００２７】
図１ａの場合、本発明によるタンパク質染色方法により、アルミニウムイオン１５％を含む処理溶液を使用しＣＢＢ−ステインした結果を示しており、図１ｂも、本発明によるタンパク質染色方法により、アルミニウムイオン５％を含む処理溶液を使用しＣＢＢ−ステインした結果を示している。
【００２８】
一方、図１ｃは、従来のアンモニウムイオンを含む処理溶液を使用しＣＢＢ−ステインした結果を示して、図１ｄは、酸性の銀を使用しシルバー−ステインした結果を示している。
【００２９】
ここで、図１ａ〜図１ｄに表れているレーン(lane)は、それぞれのタンパク質分子量(単位：ｋＤａ)を表するものであって、上から順に、うさぎ骨格筋肉のミオシン(２００ｋＤａ)、大腸菌のガラクトシダーゼ(１１６ｋＤａ)、うさぎ筋肉のホスホリラーゼｂ(９７ｋＤａ)、牛血清のアルブミン(６６ｋＤａ)、卵白のオバルブミン(４５ｋＤａ)及び牛のカーボニックアンヒドラーゼ(３１ｋＤａ)を示す。また、図面上端の数字は、タンパク質が希釈された程度を表するものであって、その数値が大きくなるほど希釈の程度が大きくなることを意味する。
【００３０】
本発明により、アルミニウムイオンを含む処理溶液を使用しＣＢＢ−ステインした結果を示す図１ａ及び図１ｂの場合は、アンモニウムイオンを含む処理溶液を使用しＣＢＢ−ステインした結果を示す図１ｃに比べ、薄く希釈された時も優れた染色度を示すことから、検出限界が低くなったことが分かる。
【００３１】
本発明におけるタンパク質検出限界は、０．５ｎｇ/バンド以下であって、アンモニウムイオンを含む処理溶液を使用した場合に比べ、染色感度が約２倍〜１０倍くらい向上する。
【００３２】
さらに、本発明により、アルミニウムイオンを含む処理溶液を使用しＣＢＢ−ステインした結果を示す図１ａ及び図１ｂの場合は、シルバー−ステインした結果を示す図１ｄと比較してみると、シルバー−ステインの場合、一番上のミオシンタンパク質の場合は染色がほとんどされていないなど、タンパク質タイプに依存する様相を示すが、本発明の溶液は、使用された全てのタンパク質が検出されたことから、タンパク質タイプに依存しないことが分かる。
【００３３】
また、図２は、タンパク質の染色時間の経過による相対的な強度変化を示すグラフであって、本発明によりアルミニウムイオンを含む処理溶液を使用してＣＢＢ−ステインした場合の染色強度が、アンモニウムイオンを含む処理溶液を使用してＣＢＢ−ステインした場合の染色強度より遥かに優秀であるため、染色にかかる時間が短縮されたことが分かる。
【００３４】
本発明によると、アンモニウムイオンを含む処理溶液を使用した場合に比べ、染色時間が１０％程度短縮されるだけではなく、９０％程度の染色が完成されるまで２時間程度の時間が所要される。
【００３５】
最後に、図３は、マウスの脳細胞から得られた１００μｇのタンパク質を、本発明によりＣＢＢ−ステインした結果を示す図面であって、図面から見られる鮮明なスポットから、本発明のアルミニウムイオンを含む処理溶液を使用することで、ＣＢＢ−ステインによるタンパク質の染色が優秀に進行されたことが分かる。
【００３６】
一方、タンパク質がない状態でも染料がゲルに結合してバックグラウンドを形成するが、本発明においては、アルミニウムイオン、アルコール化合物及びＣＢＢ染色液の量を前述の量に調節することにより、デステインを行うことなくタンパク質の位置や量を測定することができるようになる。
【００３７】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこの実施例に限定されるものではない。
【００３８】
うさぎ骨格筋肉のミオシン、大腸菌のガラクトシダーゼ、うさぎ筋肉のホスホリラーゼｂ、牛血清のアルブミン、卵白のオバルブミン及び牛のカーボニックアンヒドラーゼからなる精製されたタンパク質を、大きさ７×１０ｃｍのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ガラスプレートから除去されたゲルを脱イオン水により簡単に洗浄した。その後、第１の溶液である３０％のエタノール及び２％のリン酸溶液５０ｍｌを使用し３０分間３回ずつ処理して、さらに第２の溶液である２％のリン酸溶液５０ｍｌを使用し３０分間３回ずつ処理した。
【００３９】
その後、第３の溶液である１５％の硫酸アルミニウム、２０％のエタノール及び２％のリン酸溶液５０ｍｌに３０分間沈殿させた後、第４の溶液である２％のＧ２５０及び０．２ｇ/Ｌのアジ化ナトリウム(sodium azide)溶液を添加し第４の溶液の最終濃度が１％となるように処理して、この際の染色時間は、１２０分となるように調節し、本発明によりタンパク質にＣＢＢ−ステインを行った。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１ａ】本発明における、１５％のアルミニウムイオンを含む処理溶液を使用しゲルで電気泳動した各種タンパク質をＣＢＢ−ステインした結果を示す図である。
【図１ｂ】本発明における、５％のアルミニウムイオンを含む処理溶液を使用しゲルで電気泳動した各種タンパク質をＣＢＢ−ステインした結果を示す図である。
【図１ｃ】アンモニウムイオンを含む処理溶液を使用しゲルで電気泳動した各種タンパク質をＣＢＢ−ステインした結果を示す図である。
【図１ｄ】ゲルで電気泳動した各種タンパク質をシルバ−ステインした結果を示す図である。
【図２】染色時間の経過による染色の相対的強度の変化を示すグラフである。
【図３】マウスの脳細胞から得た１００μｇのタンパク質を本発明に従いＣＢＢ−ステインした結果を示す図である。
【図２】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月13日(2004.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＢＢ(Coomassie Brilliant Blue)染色試薬によりタンパク質を染色する時に使用されることを特徴とする、アルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液。
【請求項２】
前記アルミニウムイオンは、硫酸アルミニウム(aluminium sulfate)、塩化アルミニウム(aluminium chloride)及び酢酸アルミニウム(aluminium acetate)からなる群から選択されるアルミニウム塩から提供されることを特徴とする、請求項１に記載のアルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液。
【請求項３】
前記アルミニウムイオンは、全体染色液に対し１〜４０ｗ/ｖ％の含量で含まれることを特徴とする、請求項１に記載のアルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液。
【請求項４】
前記染色液は、アルコール化合物を５〜４０ｖ/ｖ％含量で含むことを特徴とする、請求項１に記載のアルミニウムイオンを含むタンパク質染色用処理溶液。
【請求項５】
(a)所定の精製されたタンパク質にドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)を行って得られたゲルを脱イオン水により洗浄する段階と；
(b)前記結果物を第１の溶液及び第２の溶液により処理する段階と；
(c)前記結果物を、アルミニウムイオンを含む第３の溶液により処理する段階と；
(d)前記結果物に、ＣＢＢ染色試薬を含む第４の溶液を添加する段階と、を含むことを特徴とする、タンパク質染色方法。
【請求項６】
前記アルミニウムイオンは、硫酸アルミニウム(aluminium sulfate)、塩化アルミニウム(aluminium chloride)及び酢酸アルミニウム(aluminium acetate)からなる群から選択されるアルミニウム塩から提供されることを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質染色方法。
【請求項７】
前記アルミニウムイオンは、第３の溶液に対し１〜４０ｗ/ｖ％の含量で含まれることを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質染色方法。
【請求項８】
前記第３の溶液は、アルコール化合物を５〜４０ｖ/ｖ％含量で含むことを特徴とする、請求項５に記載のタンパク質染色方法。
【国際調査報告】
2006503262.tif 000009
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