(57)【要約】【課題】油類製品用サイレントマーカー物質およびこれの検出方法を提供する。【解決手段】本発明は、蛍光材料のエステル誘導体であるサイレントマーカー物質で石油製品を標識すること、そしてそれを検出することに関する。本発明によれば、サイレントマーカー物質は酵素作用下でのエステル部分の選択的加水分解により生じる蛍光を測定することにより検出され得る。
2004502764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式Ｉ：
【化１】
2004502764.tif 000010
［式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表す。］で表される化合物。
【請求項２】
次式ＩＩ：
【化２】
2004502764.tif 000011
［式中、Ｒ３は、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表し、Ｒ４は、メチル基またはトリフルオロメチル基を表し、そしてＲ５は、水素原子、ハロゲン原子またはシアノ基を表す。］で表される化合物。
【請求項３】
次式ＩＩＩ：
【化３】
2004502764.tif 000012
［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、炭素原子数１９ないし２４のアルキル基を表す。］で表される化合物。
【請求項４】
マーカー物質を石油製品に添加し、該マーカー物質は蛍光物質のエステル誘導体である、石油製品のためのサイレント標識方法。
【請求項５】
前記マーカー物質は、次式Ｉ：
【化４】
2004502764.tif 000013
［式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表す。］で表される、請求項４記載のサイレント標識方法。
【請求項６】
前記マーカー物質は、次式ＩＩ：
【化５】
2004502764.tif 000014
［式中、Ｒ３は、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表し、Ｒ４は、メチル基またはトリフルオロメチル基を表し、そしてＲ５は、水素原子、ハロゲン原子またはシアノ基を表す。］で表される、請求項４記載のサイレント標識方法。
【請求項７】
前記マーカー物質は、次式ＩＩＩ：
【化６】
2004502764.tif 000015
［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、炭素原子数１９ないし２４のアルキル基を表す。］で表される、請求項４記載のサイレント標識方法。
【請求項８】
前記マーカー物質は、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−ヒドロキシクマリン、３−シアノ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、４−ヒドロキシクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンおよび３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンのエステル誘導体、レソルフィンのエステル誘導体、フルオレセインのエステル誘導体、並びにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項４記載のサイレント標識方法。
【請求項９】
式中、Ｒ４はメチル基を表し、そしてＲ５は塩素原子を表す、請求項６記載のサイレント標識方法。
【請求項１０】
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々はＣ１５Ｈ３１基を表す、請求項５または６に記載のサイレント標識方法。
【請求項１１】
前記マーカー物質は、０．０１ないし３０ｐｐｍの量で前記石油製品に添加される、請求項４記載のサイレント標識方法。
【請求項１２】
前記石油製品は、ガソリン、液化天然ガス（ＬＮＧ）、液化石油ガス（ＬＰＧ）、ディーゼル燃料、灯油および重油からなる群より選択される、請求項４記載のサイレント標識方法。
【請求項１３】
ａ）蛍光物質のエステル誘導体であるサイレントマーカー物質で石油製品を標識する工程、
ｂ）前記石油製品に、前記サイレントマーカー物質のエステル部分を特異的に分解することができる酵素を含有する検出組成物を添加する工程、および
ｃ）工程ｂ）から生じる蛍光を測定する工程
を含む、石油製品用サイレントマーカー物質の検出方法。
【請求項１４】
前記マーカー物質は、次式Ｉ：
【化７】
2004502764.tif 000016
［式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表す。］で表される、請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】
前記マーカー物質は、次式ＩＩ：
【化８】
2004502764.tif 000017
［式中、Ｒ３は、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表し、Ｒ４は、メチル基またはトリフルオロメチル基を表し、そしてＲ５は、水素原子、ハロゲン原子またはシアノ基を表す。］で表される、請求項１３記載の検出方法。
【請求項１６】
前記マーカー物質は、次式ＩＩＩ：
【化９】
2004502764.tif 000018
［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、炭素原子数１９ないし２４のアルキル基を表す。］で表される、請求項１３記載の検出方法。
【請求項１７】
前記蛍光物質は、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−ヒドロキシクマリン、３−シアノ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、４−ヒドロキシクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンおよび３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンのエステル誘導体、レソルフィンのエステル誘導体、フルオレセインのエステル誘導体、並びにそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１３記載の検出方法。
【請求項１８】
式中、Ｒ４はメチル基を表し、そしてＲ５は塩素原子を表す、請求項１５記載の検出方法。
【請求項１９】
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々はＣ１５Ｈ３１基を表す、請求項１４または１５に記載の検出方法。
【請求項２０】
前記マーカー物質は、０．０１ないし３０ｐｐｍの量で前記石油製品に添加される、請求項１３記載の検出方法。
【請求項２１】
前記石油製品は、ガソリン、液化天然ガス（ＬＮＧ）、液化石油ガス（ＬＰＧ）、ディーゼル燃料、灯油および重油からなる群より選択される、請求項１３記載の検出方法。
【請求項２２】
前記酵素は、前記マーカー物質のエステル部分を選択的に加水分解することができる、請求項１３記載の検出方法。
【請求項２３】
前記酵素は、エステラーゼおよびセルラーゼからなる群より選択される、請求項１３記載の検出方法。
【請求項２４】
前記酵素はリパーゼである、請求項１３記載の検出方法。
【請求項２５】
前記酵素は、それに結合した少なくとも一つのポリマー性部分と共に使用される、請求項１３記載の検出方法。
【請求項２６】
前記酵素は、連結剤によりポリマー性部分に結合される、請求項２５記載の検出方法。
【請求項２７】
前記連結剤は塩化シアヌリルである、請求項２６記載の検出方法。
【請求項２８】
前記ポリマー結合酵素は、以下の一般式ＩＶ：
【化１０】
2004502764.tif 000019
で表される、請求項２５記載の検出方法。
【請求項２９】
前記ポリマー性部分はポリエチレングリコールである、請求項２５記載の検出方法。
【請求項３０】
蛍光物質のエステル誘導体である石油製品中のサイレントマーカー物質の検出用組成物であって、前記マーカー物質のエステル部分を選択的に加水分解できる酵素を含有するｐＨ７以上の水溶液からなる組成物。
【請求項３１】
前記酵素は、セルラーゼおよびエステラーゼからなる群より選択される、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
前記酵素はリパーゼである、請求項３０記載の組成物。
【請求項３３】
ａ）蛍光物質のエステル誘導体であるサイレントマーカー物質で標識されている石油製品に、前記マーカー物質のエステル部分を特異的に分解することができる酵素を含有する組成物を添加する工程、および
ｂ）工程ａ）から生じる蛍光を測定する工程
を含む、石油製品の識別方法。
【請求項３４】
前記酵素は、前記マーカー物質のエステル部分を選択的に加水分解できる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記酵素は、エステラーゼおよびセルラーゼからなる群より選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記酵素はリパーゼである、請求項３３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、サイレントマーカー物質で石油製品を標識すること、および該サイレントマーカー物質の検出に関する。より特に、本発明は、蛍光物質のエステル誘導体であるサイレントマーカー物質で石油製品を標識する方法、および酵素加水分解によりそれから生じた蛍光を測定することによりサイレントマーカー物質を検出する方法に関する。
【０００２】
従来技術
近年、例えば政府税政、石油製品用原材料の高騰等の様々な理由のために、偽造石油製品の販売が劇的に増加している。さらに、車両の寿命および環境についての偽造燃料の深刻な影響を考慮すると、その使用を防止することが必要である。しかしながら、そのような偽造石油製品を肉眼で識別することは非常に困難であるので、複雑な化学分析が行わなければならない。
【０００３】
本明細書において使用される用語“蛍光物質”は、特定波長の光で照射されたとき、電子共鳴構造を形成することにより照射光のものとは異なる波長を有する光を生じる物質として定義される。それ故、蛍光物質が少量で石油製品中に存在しても、それに可視光線または紫外線を照射することにより容易に検出し得る。しかしながら、ほとんどの蛍光物質はガソリンのような石油製品中で低い溶解性を有する。
【０００４】
本明細書において、“マーカー物質”は、炭素原子数４ないし１８の炭化水素基が蛍光物質の活性部位にエステル化を通して結合された物質を意味する。上述したようなマーカー物質は、石油製品中で高い溶解性を示し、そしてそれはエステル化により電子共鳴構造を喪失しているので、それら自身は蛍光を呈しない。しかしながら、該エステル部分がそれから分解されると、該蛍光物質は蛍光を再び呈するほど水中で溶解性である。それ故、石油製品が流通に先立ちそのようなマーカー物質で標識されている場合、流通網で該石油製品中の該マーカー物質の蛍光を定量分析することにより、真正な石油製品が他の会社により製造された低価格製品、または低品質製品と交換および／または混合されたか否かを確認できる。さらに、税の軽い製品は、重い税の対象である類似製品から上記で説明されたと同じ方法において識別され得る。
【０００５】
これに関して、米国特許第５，９８０，５９３号は、石油製品を標識するためのサイレント蛍光物質として直線状または分岐した炭素原子数１ないし１８のアルキル酸エステル７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンを開示する。上記特許を含む慣用技術においては、エステル部分がアルカリ溶液を使用して分解される化学的方法が用いられている。しかしながら、蛍光物質は前記過程中に破壊され、蛍光物質を定量的に分析することを非常に困難にしている。それ故、慣用の方法に利用可能な蛍光物質はかなり限定される。さらに、石油製品中に自然に含まれる他の蛍光物質はアルカリ溶液により所望の蛍光物質と共に抽出できるので、それによりサイレントマーカー物質の正確な定量分析を妨げる。
【０００６】
特に、上述した過程を行うには、さらなる加熱装置および触媒が必要である。それ故、蛍光物質を検出するのに長時間かかるだけでなく、実際的な有効性に欠ける。また、エステル部分は比較的安定であり、そのためエステル部分より安定でない他の部分がアルカリ溶液により分解される。結果として、慣用の方法で用いることが可能なサイレントマーカー物質は、例えば前記特許に開示されたような特定のものに限定される。
【０００７】
発明の開示
本発明の目的は、石油製品を標識するために適した蛍光物質のエステル誘導体であるサイレントマーカー物質を提供することにある。
本発明の他の目的は、サイレントマーカー物質のエステル部分を選択的に加水分解することができる酵素またはポリマー結合酵素を含むサイレントマーカー物質を検出するための組成物を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、石油製品のためのサイレント標識方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、サイレントマーカー物質のエステル部分を選択的に加水分解することができる酵素またはポリマー結合酵素を使用する石油製品用サイレントマーカー物質の検出方法を提供することにある。
本発明のさらなる他の目的は、石油製品を酵素反応を通して識別する方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の第一の目的によると、次式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ：
【化１１】
2004502764.tif 000003
［式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表す。］
【化１２】
2004502764.tif 000004
［式中、Ｒ３は、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表し、Ｒ４は、水素原子、メチル基またはトリフルオロメチル基を表し、そしてＲ５は、水素原子、ハロゲン原子またはシアノ基を表す。］
【化１３】
2004502764.tif 000005
［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、炭素原子数１９ないし２４のアルキル基を表す。］で表されるサイレントマーカー物質が提供される。
【０００９】
本発明の第二の目的によると、マーカー物質を石油製品に添加し、該マーカー物質は蛍光物質のエステル誘導体である、石油製品のためのサイレント標識方法が提供される。
【００１０】
本発明の第三の目的によると、
ａ）蛍光物質のエステル誘導体であるサイレントマーカー物質で石油製品を標識する工程、
ｂ）前記石油製品に、前記サイレントマーカー物質のエステル部分を特異的に分解することができる酵素を含有する検出組成物を添加する工程、および
ｃ）工程ｂ）から生じる蛍光を測定する工程
を含む、石油製品用サイレントマーカー物質の検出方法が提供される。
【００１１】
本発明の第四の目的によると、
ａ）蛍光物質のエステル誘導体であるサイレントマーカー物質で標識されている石油製品に、前記マーカー物質のエステル部分を特異的に分解することができる酵素を含有する組成物を添加する工程、および
ｂ）工程ａ）から生じる蛍光を測定する工程
を含む、石油製品の石油製品の識別方法が提供される。
【００１２】
本発明の第五の目的によると、蛍光物質のエステル誘導体である石油製品中のサイレントマーカー物質の検出用組成物であって、該マーカー物質のエステル部分を選択的に加水分解できる酵素を含有するｐＨ７以上の水溶液からなる組成物が提供される。
【００１３】
図面の簡単な説明
本発明の前記目的、および他の特徴および利点は、図面を参照すると以下の詳細な説明からより明らかになり、
図１は、本発明の実施例１２に従う、携帯蛍光分析計の使用による１００ｐｐｂまでのレソルフィンジパルミテート含量についての石油の定量分析を示すグラフであり、
図２は、本発明の実施例１３に従う、携帯蛍光分析計の使用による１００ｐｐｂまでのフルオレセインジパルミテート含量についての石油の定量分析を示すグラフであり、
図３は、本発明の実施例１４に従う、携帯蛍光分析計の使用による１００ｐｐｂまでの３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテート含量についての石油の定量分析を示すグラフであり、
図４は、本発明の実施例２０に従う、蛍光光度計の使用による３５０ｎｍの波長の光で励起させた蛍光物質についての石油の定量分析を示すグラフであり、そして
図５は、本発明の実施例１９に従う、サイレントマーカー物質のルミネセンスと濃度間の関係を示すグラフである。
【００１４】
発明を実施するための最良の様態
本発明によると、サイレントマーカー物質は、水酸基のような蛍光物質の反応部位にエステル化を通して炭化水素基が結合された蛍光物質のエステル誘導体に関する。前記サイレントマーカー物質がそのエステル部分の加水分解を通して蛍光を再獲得することができるのであれば、本明細書において前記サイレントマーカー物質に関して制限は無い。特に、レソルフィン、フルオレセインまたはクマリンのアルキル酸エステルが、サイレントマーカー物質として好ましく使用され得る。
【００１５】
本発明に従うサイレントマーカー物質は、次式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにより表され得る：
【化１４】
2004502764.tif 000006
［式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表す。］。式中、Ｒ１およびＲ２の各々は好ましくはＣ１５Ｈ３１基を表す。
【化１５】
2004502764.tif 000007
［式中、Ｒ３は、炭素原子数４ないし１８のアルキル基を表し、Ｒ４は、水素原子、メチル基またはトリフルオロメチル基を表し、そしてＲ５は、水素原子、ハロゲン原子またはシアノ基を表す。］。好ましくは、Ｒ３はＣ１５Ｈ３１基を表し、Ｒ４はメチル基を表し、そしてＲ５は塩素原子を表す。
【化１６】
2004502764.tif 000008
［式中、Ｒ６およびＲ７は、同一または異なって、炭素原子数１９ないし２４のアルキル基を表す。］。特に、Ｒ６およびＲ７は、式ＩＩＩで表されるサイレントマーカー物質の有機溶媒中での溶解性を増大するのに役立つ。
【００１６】
本発明において、前記サイレント標識物資の代表は、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン、７−ヒドロキシクマリン、３−シアノ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、４−ヒドロキシクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（米国特許第５，９８０，５９３号）、３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンおよび３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンのエステル誘導体、レソルフィンのエステル誘導体、フルオレセインのエステル誘導体（米国特許第５，４９８，８０８号）、並びにそれらの混合物である。
【００１７】
本発明に従うと、上記マーカー物質が添加される石油製品として、ガソリン、液化天然ガス（ＬＮＧ）、液化石油ガス（ＬＰＧ）、ディーゼル燃料、灯油、重油等の自動車用燃料が使用され得る。それ故、脱税者により製造および／または流通される様々な用途の石油製品、並びにベンゼン、トルエン等のような有機溶媒を混合することにより製造された偽造石油製品は、容易に識別されることができる。
【００１８】
本発明において、前記マーカー物質は、石油製品中で、０．０１ないし３０ｐｐｍ、好ましくは０．５ないし１０ｐｐｍの量で使用され得る。検出されるとき、前記サイレントマーカー物質に相当する蛍光物質は、互いに固有の蛍光波長を放出する。互いに既知の比率で混合された二種のマーカー物質の混合物を使用して石油製品が標識された場合、二つの異なる蛍光の組み合わせから生じた第三の蛍光が検出され得る。これに関して、例えば、ガソリンおよび灯油を異なるサイレントマーカー物質で標識することが可能である。
【００１９】
さらに、前記サイレントマーカー物質は所定量で石油製品に添加されるので、試料中の標識された石油製品の量が決定されることができるほど定量的に検出することができる。即ち、前記マーカー物質が真正な石油製品に一定量で添加されると、生じる蛍光を観測することにより石油製品が真正であるか否かだけでなく、蛍光の強度を測定することにより石油製品が他の液体と混合されたか否かを確認することができる。
【００２０】
本発明に従うと、前記マーカー物質を検出するために、前記マーカー物質のエステル部分を選択的に加水分解することができる酵素が使用される。特に、一定濃度の酵素を含有する水性溶液（ｐＨ７以上）は、一定量で検出キットに分注され、そしてその後、凍結乾燥して有機液に対する許容性および検出用反応の再現性を増大させる。凍結乾燥した酵素を使用する反応の再現性を向上させる上記方法は、大韓民国特許第１６２２７０号に開示されている。
【００２１】
好ましくは、本発明に適した酵素は、リパーゼ、エステラーゼおよびセルラーゼからなる群より選択され、これらは様々な微生物からまたは動物の内臓器官から得られ得る。これらの酵素の殆どは、例えば５０℃以上の比較的高温で活性があり、そして前記マーカー物質を検出するための組成物が容易に貯蔵され得るほど優秀な熱安定性を有する。それらのうち、リパーゼは、生体内で脂肪についての消化酵素として作用するので、他の酵素より有機液中で安定である。
【００２２】
さらに、有機液中での酵素の溶解度および安定性の双方を増加するために、酵素は、それに結合された（一つ以上の）ポリマー性部分（炭化水素ポリマー性部分）と共に使用され得る。好ましくは、酵素に結合されるこの炭化水素ポリマーは、２０００ダルトン以上の分子量を有し、そしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリトンＸ等がより好ましく使用されることができる。
【００２３】
前記酵素をポリマー性部分に連結させるために、アミノ酸中のアミン基、スルフィドリル基、またはヒドロキシル基と反応することができる部分と、ポリマー中のヒドロキシル基と反応することができる部分の双方を含む化合物が、連結剤として好ましく使用されることができる。酵素が塩化シアヌリルのような連結剤によりポリマー性部分に連結された例の構造は、次式ＩＶ
【化１７】
2004502764.tif 000009
で表される。
【００２４】
前記酵素と前記ポリマーとの間の連結反応において、前記酵素の表面上に存在するリジン残基は、前記酵素と前記ポリマーとの混合比が酵素上のリジン残基の数と共に変化するので、１：１または２：１のいずれかの比率でポリマーに結合され得る。
【００２５】
ポリマー性部分に連結された酵素がマーカー物質の検出のために使用される場合、以下のような利点が得られる。
【００２６】
第一に、酵素を失活させ得るプロテアーゼが酵素に接近することを防止することができる。第二に、酵素が水分子との水素結合を通して活性三次元構造を形成する環境が有機溶媒中でも形成されて、その中での酵素活性が大きく向上されることができる。第三に、温度が上昇するにつれて酵素の疎水性部分の溶媒への暴露により引き起こされる酵素の三次元構造の破壊（Ｉｎａｄａ，Ｙ．等、１９８６）が、炭化水素ポリマー性部分により防止されるので、酵素が有機溶媒中、常温で貯蔵されても、３ヶ月間以上、酵素活性が保持される。
【００２７】
上記されたポリマー性部分に連結された酵素を含有する水溶液（ｐＨ７以上）は、検出用組成物として使用されることができる。好ましくは、上記の水溶液は凍結乾燥後に使用される。
【００２８】
上記の水溶液は、サイレントマーカー物質で標識された石油製品に適切な比率で添加され、そして良く混合される。その後、生じた水溶液層はある特定波長の光で照射されて、他の特定波長の光がそれから放出される。この場合、水溶液層から蛍光された殆どの光は可視光である。例えば、レソルフィンは赤色光を放出し、フルオレセインは緑色光を放出し、そしてクマリンは青色光を放出する。該蛍光能力は、エステル分解酵素の使用によるサイレントマーカー物質のエステル結合の加水分解より生じる。水溶液中の酵素は石油相中に溶解されたマーカー物質のエステル結合を分解するために水を使用するので、酵素反応は石油と水との間の界面で起こり、そしてその後、マーカー物質の炭化水素部分から分離された蛍光物質が水相中に放出される。それ故、水相から生じた蛍光は、蛍光光度計の使用により検出されることができる。また、いかなる携帯蛍光光度計が使用されても、石油製品内の蛍光は正確に容易に検出されることができる。
【００２９】
以下、本発明は、以下の例を参照して詳細に説明される。該例は本発明の説明のために与えられ、そして本発明を限定すると理解されるべきでない。
【００３０】
実施例１
レソルフィンジパルミテートの合成
レソルフィン１．６ｇを、２５０ｍＬフラスコ中のテトラヒドロフラン４０ｍＬ中に溶解し、そしてその後、炭酸カリウム３．１ｇおよびトリエチルアミン３．１ｍＬを該溶液に添加した。３０分後、パルミトイルクロリド７．０ｍＬをそれに添加し、そして該混合物を室温で２時間撹拌した。その後、蒸留水５０ｍＬおよびエチルアセテート２５０ｍＬを添加して、標題化合物をエチルアセテート相中に抽出した。エチルアセテート相を塩水２００ｍＬで洗浄し、そしてその後、無水マンガンで乾燥した。蒸留および溶媒の蒸発後、残渣をヘキサンおよびエチルアセテートで再結晶化して、赤色がかったレソルフィンジパルミテートを得た。
【００３１】
実施例２
フルオレセインジパルミテートの合成
フルオレセイン２．５ｇを、２５０ｍＬフラスコ中のテトラヒドロフラン中に溶解し、そしてその後、炭酸カリウム３．１ｇおよびトリエチルアミン３．１ｍＬを該溶液に添加した。３０分後、パルミトイルクロリド７．０ｍＬをそれに添加し、そして該混合物を室温で２時間撹拌した。次ぎに、蒸留水５０ｍＬおよびエチルアセテート２５０ｍＬを添加して、標題化合物をエチルアセテート相に抽出した。エチルアセテート相を塩水２００ｍＬで洗浄し、そしてその後、無水マンガンで乾燥した。蒸留および溶媒の蒸発後、残渣をヘキサンおよびエチルアセテートで再結晶化して肌色のフルオレセインジパルミテートを得た。
【００３２】
実施例３
３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートの合成
３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリン２．５ｇを、２５０ｍＬフラスコ中のテトラヒドロフラン６０ｍＬ中に溶解し、そしてその後、炭酸カリウム３．６ｇおよびトリエチルアミン３．６ｍＬを該溶液に添加した。３０分後、パルミトイルクロリド１０．０ｍＬをそれに添加し、そして該混合物を室温で２時間撹拌した。その後、蒸留水５０ｍＬおよびエチルアセテート２５０ｍＬを添加して、標題化合物をエチルアセテート相に抽出した。エチルアセテート相を塩水２００ｍＬで洗浄し、そしてその後、無水マンガンで乾燥した。蒸留および溶媒の蒸発後、残渣をヘキサンおよびエチルアセテートで再結晶化して、白色の３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートを得た。
【００３３】
実施例４
７−ヒドロキシクマリンパルミテートの合成
７−ヒドロキシクマリン１．０ｇを、５００ｍＬフラスコ中のピリジン１００ｍＬ中に溶解し、そしてパルミトイルクロリド２．９ｍＬを添加し、次いで室温で攪拌した。３時間の反応後、ピリジンを真空下での蒸発により除去した。１：１の比率での蒸留水およびメチレンクロリドの添加は、標題化合物をメチレンクロリド相中に抽出させた。メチレンクロリド相に、メチレンクロリドで溶出するクロマトグラフィーを受けさせた。溶媒を最初の溶出液から除去して、白色の７−ヒドロキシクマリンパルミテートを得た。
【００３４】
実施例５
３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリラウレートの合成
３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリン２．５ｇを、２５０ｍＬフラスコ中のテトラヒドロフラン６０ｍＬ中に溶解し、次いで、炭酸カリウム３．６ｇおよびトリエチルアミン３．６ｍＬを添加した。３０分後、ラウロイルクロリド８．０ｍＬをそれに添加し、そして該混合物を室温で２時間撹拌した。その後、蒸留水５０ｍＬおよびエチルアセテート２５０ｍＬを添加して、標題化合物をエチルアセテート相に抽出した。エチルアセテート相を塩水２００ｍＬで洗浄し、そしてその後、無水マンガンで乾燥した。蒸留および溶媒の蒸発後、残渣をヘキサンおよびエチルアセテートで再結晶化して、白色の３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンラウレートを得た。
【００３５】
実施例６
検出用リパーゼ含有試薬の調製
４℃で、シュードモナスセパシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉｓ）から精製したリパーゼ１ｇを、塩酸でｐＨ８．０に調節した１００ｍＭトリス緩衝液２５ｍＬに完全に溶解した。２ｍＬチューブに２０μｌづつ分注した後、該溶液をＣｅｎｔｒａ・ｅｖａｐｏｒａｔｏｒＴＭ（韓国、バイオニア・コーポレイション）で乾燥させ、そして冷凍貯蔵した。
【００３６】
実施例７
ポリエチレングリコールに連結したリパーゼの調製
モノメトキシポリエチレングリコール（分子量、約４，５００）２０ｇを、５００ｍＬフラスコ中のベンゼン１００ｍＬ中に、連結剤としての塩化シアヌリル０．３７ｇと共に溶解した。それへのＮａＣＯ３６．５ｇの添加後、反応を８０℃で４０時間行った。ポリエチレングリコールの二つの末端ヒドロキシル基の一方についてメトキシ基を置換することにより調製された、モノメトキシポリエチレングリコールは唯一つの活性ヒドロキシル基を含む炭化水素ポリマーである。塩を濾過除去し、そして溶媒を除去して、白色の固形分を得た。固形分５ｇを、塩酸でｐＨ８．０に調節した１００ｍＭトリス緩衝液２５ｍＬ中に、シュードモナスセパシスから精製したリパーゼ７８ｍｇと共に溶解し、そして反応を４℃で２時間行った。１キロダルトンカットオフを有する濾過による未反応ポリエチレングリコールの除去後、該溶液を１．５ｍＬチューブに２０μｌづつ分注し、Ｃｅｎｔｒａ・ｅｖａｐｏｒａｔｏｒＴＭ（韓国、バイオニア・コーポレイション）により乾燥し、そして冷凍貯蔵した。これを引き続く実験で検出組成物として使用した。
【００３７】
実施例８
石油中のレソルフィンジパルミテートの定性検出
実施例６で得た検出用酵素溶液に、蒸留水０．５ｍＬおよび実施例１で得たレソルフィンジパルミテート１ｐｐｍを含有する石油１．０ｍＬを添加し、続いて溶液を撹拌した。水相を自然光で照射したとき、赤色光が肉眼により検出された。
【００３８】
実施例９
石油中のフルオレセインジパルミテートの定性検出
実施例６で得た検出用酵素溶液に、蒸留水０．５ｍＬおよび実施例２で得たフルオレセインジパルミテート１ｐｐｍを含有する石油１．０ｍＬを添加し、続いて該溶液を撹拌した。水相を自然光で照射したとき、緑色光が肉眼により検出された。
【００３９】
実施例１０
石油中の３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートの定性検出
実施例６で得た検出用酵素溶液に、蒸留水０．５ｍＬおよび実施例３で得た３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテート１０ｐｐｍを含有する石油１．０ｍＬを添加し、次いで該溶液を撹拌した。水相を波長３６５ｎｍの光で照射したとき、青色光が肉眼により検出された。
【００４０】
実施例１１
石油中のレソルフィンジパルミテートおよび３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートからなる混合物の定性検出
実施例１および３で得たレソルフィンジパルミテートおよび３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートを、それぞれ１および１０ｐｐｍの量で石油に添加した。実施例６で得た酵素溶液に、蒸留水０．５ｍＬおよびマーカー物質を含有する石油１．０ｍＬを添加し、ついて該溶液を撹拌した。水性層を波長３６５ｎｍの光で照射したとき、紫色光が肉眼により検出された。
【００４１】
実施例１２
石油中のレソルフィンジパルミテートの定量検出
実施例１で得たマーカー物質１００ｐｐｂ（ｗ／ｖ）を含有する灯油を、０／１００、１／１００、２／１００、１０／１００、２０／１００および１００／１００で希釈して、それぞれ０ｐｐｂ、１ｐｐｂ、２ｐｐｂ、５ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、５０ｐｐｂおよび１００ｐｐｂの溶液を与え、それらの各々をその後、実施例６で得た酵素溶液に１ｍＬづつ分注し、次いで蒸留水１．５ｍＬを混合した。水相を波長５７０ｎｍの光で照射する間、５８５ｎｍでの蛍光を蛍光光度計の使用により定量測定し、そして結果を図１に示した。
【００４２】
実施例１３
石油中のフルオレセインジパルミテートの定量検出
実施例２で得たマーカー物質１００ｐｐｂ（ｗ／ｖ）を含有する石油を、０／１００、１／１００、２／１００、５／１００、１０／１００、２０／１００、５０／１００および１００／１００で希釈して、それぞれ０ｐｐｂ、１ｐｐｂ、２ｐｐｂ、５ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、５０ｐｐｂおよび１００ｐｐｂの溶液を与え、それらの各々を実施例６で得た酵素溶液に１ｍＬづつ分注し、次いで蒸留水１．５ｍＬを混合した。水相を波長４９０ｎｍの光で照射し、５１４ｎｍでの蛍光を蛍光光度計の使用により定量測定し、そして結果を図２に示した。
【００４３】
実施例１４
石油中の３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートの定量検出
実施例３で得たマーカー物質１００ｐｐｂ（ｗ／ｖ）を含有する石油を、０／１０、１／１０、２／１０、５／１０および１０／１０で希釈し、それぞれ０ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、５０ｐｐｂ、１００ｐｐｂの溶液を与え、それらの各々を実施例６で得た酵素溶液に１ｍＬづつ分注し、次いで蒸留水１．５ｍＬを混合した。水相を波長３５０ｎｍの光で照射し、４７０ｎｍでの蛍光を蛍光光度計により定量測定し、そして結果を図３に示した。
【００４４】
実施例１５
石油中の４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートの定量検出
４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテート１００ｐｐｂ（ｗ／ｖ）を含有する石油を、０／１０、１／１０、２／１０、５／１０および１０／１０で希釈して、それぞれ０ｐｐｂ、１０ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、５０および１００ｐｐｂの溶液を与え、それらの各々を実施例６で得た酵素溶液に１ｍＬづつ分注し、次いで蒸留水１．５ｍＬを混合した。水相を波長３６５ｎｍの光で照射する間、４７０ｎｍでの蛍光を蛍光光度計の使用により測定した。
【００４５】
実施例１６
石油中のフルオレセインジパルミテートの定性検出
実施例７で得た酵素溶液に、蒸留水および実施例２で得たフルオレセインパルミテート１０ｐｐｍを含有する石油を同量で添加し、次いで撹拌した。水相を波長３６５ｎｍの紫外線で照射したとき、青色光が肉眼により検出された。
【００４６】
実施例１７
石油中の３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートの定性検出
実施例７で得た酵素溶液に、蒸留水および実施例３の３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテート１０ｐｐｍを含有する石油を同量で添加し、次いで撹拌した。水相を波長３６５ｎｍの紫外線で照射したとき、青色光が肉眼により検出された。
【００４７】
実施例１８
フルオレセインジパルミテートおよび３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートからなる混合物を含有する石油の定性検出
石油中に、実施例２および３で得たフルオレセインジパルミテートおよび３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートをそれぞれ溶解した。実施例７で得た酵素溶液に、蒸留水および上記したようなマーカー物質を含有する石油を同量で添加し、次いで撹拌した。水性層を波長３６５ｎｍの紫外線で照射したとき、黄色がかった光が肉眼により検出された。
【００４８】
実施例１９
石油中のフルオレセインジパルミテートの定量検出
実施例２で得たフルオレセインパルミテート２５０ｐｐｍ（ｗ／ｖ）を含有する石油を、１、１／２、１／４、１／８、１／１６および１／３２で希釈して、それぞれ２５０ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、６２．５ｐｐｍ、３１．３ｐｐｍ、１５．６ｐｐｍおよび７．８ｐｐｍの溶液を与え、それらの各々を実施例７で得た酵素溶液中に０．５ｍＬづつ分注し、次いで蒸留水０．６ｍＬと混合した。水性層０．５ｍＬを４倍希釈した後、希釈された水相から放出された蛍光性光を、蛍光光度計（ＪＡＳＣＯ、ＦＰ−７５０）の使用により定量測定した。結果を図５に示し、４５０ｎｍでの蛍光の強度は、マーカー物質の濃度に対して線形的にプロットされる。
【００４９】
実施例２０
３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテートの定量検出
実施例３で得た３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテート２５０ｐｐｍ（ｗ／ｖ）を含有する石油を、１、１／２、１／４、１／８、１／１６および１／３２で希釈して、それぞれ２５０ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、６２．５ｐｐｍ、３１．３ｐｐｍ、１５．６ｐｐｍおよび７．８ｐｐｍの溶液を与え、それらの各々を実施例７で得た酵素溶液に０．５ｍＬづつ分注し、次いで蒸留水０．６ｍＬと混合した。水相を４倍に希釈した後、希釈された水相から放出された蛍光を、蛍光光度計（ＪＡＳＣＯ、ＦＰ−７５０）の使用により定量測定した。波長３５０ｎｍの光で照射したとき、図４に示すな最高ピークが４７０ｎｍで得られた。
【００５０】
産業上の利用可能性
本発明は、エステル部分を選択的に加水分解できる酵素を使用してサイレントマーカー物質を検出し、そして石油製品中に自然に存在する蛍光物質による背景信号を大幅に減少させることができるので、非常に高い感度を有する。また、マーカー物質の検出工程は、エステル結合を選択的に加水分解できる酵素溶液のみが石油製品に添加されるので、非常に簡単かつ容易である。加えて、本発明の酵素系は石油中のいくつかのマーカー物質を同時に検出することができる。
【００５１】
本発明を真正の石油に適用する場合、蛍光は真正の石油のみから放出され、それ故、偽造石油が真正のものから区別されることができる。さらに、本発明によれば、マーカー物質を検出するための化学分析のような複雑な過程は必要でなく、それにより本発明は消費者により現場で行われることができる。例えば、マーカー物質を含有する石油および水を乾燥した酵素溶液を含有するキットに添加し、そして振盪した後、石油が真正であるか否かを確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の実施例１２に従う、携帯蛍光分析計の使用による１００ｐｐｂまでのレソルフィンジパルミテート含量についての石油の定量分析を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例１３に従う、携帯蛍光分析計の使用による１００ｐｐｂまでのフルオレセインジパルミテート含量についての石油の定量分析を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例１４に従う、携帯蛍光分析計の使用による１００ｐｐｂまでの３−クロロ−４−メチル−７−ヒドロキシクマリンパルミテート含量についての石油の定量分析を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例２０に従う、蛍光光度計の使用による３５０ｎｍの波長の光で励起させた蛍光物質についての石油の定量分析を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例１９に従う、サイレントマーカー物質のルミネセンスと濃度間の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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