(57)【要約】【課題】【解決手段】定量分析で、活性酸素種（ＡＯＳ）の検出を含む、植物や作物の病気や損傷に対する応答を検出する方法；損傷や病気を被った植物や作物組織の抽出物、それらの活性成分、またはそれらの合成相当物や誘導体を含む診断試薬；じゃがいも（種子、プロセッサまたはコンシューマ）、りんご、ライチ、洋梨、アプリコット、オレンジ（ジュース）、バナナ、切り花では褐色になる葉や茎、レタス、ざくろ、ブドウ、きのこ、ローガン、びわ、ブルーベリー、カラメル、野バラ、ランブータン、ココナッツ、アボカド、オオバコ、パイナップル、クルミ、アーティチョーク、テンサイ、及び、たまねぎから選択した植物や作物の損傷や病気に対する応答を検出する方法または試薬の使用；植物や作物の品種、育成または環境条件を修正する関連方法；損傷や病気に対する多数の植物と作物の感受性に関するデータでプログラム化したコンピュータ。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
定量分析で、活性酸素種（ＡＯＳ）の検出を含む、植物や作物の病気や損傷に対する応答を検出する方法。
【請求項２】
組織のサンプルから得た、または本来の位置での調査により（by in situ probe）、植物や作物のセルから外に出たＡＯＳの検出を含むクレーム１に記載された方法。
【請求項３】
活性酸素種が１又はそれ以上の酸素フリーラジカルを含むことを特徴とするクレーム１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
活性酸素種がスーパーオキサイド（・Ｏ2-）、ヒドロペルオキシラジカル・Ｏ2Ｈ、窒素酸化物ラジカルＮＯ・、ペルオキシ亜硝酸塩ラジカルＯＮＯＯ-、ヒドロキシラジカル・ＯＨとそれらの誘導体から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
損傷や病気により、ある時間ｔでＡＯＳの第１と第２のピーク濃度を起こす二相性の応答（a bi-phasic response）で発生したＡＯＳを検出し、損傷や病気の状況を比較して示すことを含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
二相性応答の第２ピークにおいてＡＯＳを検出することを含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
損傷や病気を被ったかどうかを検出する方法であって、損傷や病気の疑いのあるサイトの分析評価を行うことを含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
損傷や病気に応答する所定の植物や作物の感受性を診断する方法であり、第１段階で植物や作物を損傷や病気に露出し、第２段階で露出後（after exposure）のある時間ｔでの定量分析でＡＯＳを検出することを含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
時間ｔは、露出後最大７時間、好ましくは０．５〜６時間、より好ましくは０．５〜２、または４．５〜６時間であることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
露出は作為的（deliberate）または偶発的（incidental）であり、そして、植物や作物の体内に直接、または損傷や病気サイトから得た皮下植物や作物の物質からなるサンプルや抽出物、例えば、組織外植体（tissue explant）、コア、スライスや小片（piece）などのサンプルに間接的に露出することを特徴とする請求項８または９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
損傷や病気への露出が直接的で、機械的な衝撃、圧力、振動、ショックへの作為的または偶発的な露出、若しくは接触、注入、あるいは汚染による病原性物質、有機体、菌類、バクテリア、ウイルスへの露出を含むことを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
機械的な衝撃は作為的であり、代表的な（representative）制御衝撃エネルギーであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
損傷や病気への露出が間接的で、損傷や病気を被った組織またはその構成要素への露出、若しくは膨張、湿気、冷凍などの組織や細胞の損傷や病気を誘発する状態への露出を含むことを特徴とする請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
損傷や病気を被った組織は、同一または異なる植物や作物種（species）または品種（variety）に属し、好ましくは同一の種（species）であるが異なる品種（variety）であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
定量分析におけるＡＯＳ検出は露出後のｔ時間に行い、この場合ｔは実質的に１〜２時間の間であることを特徴とする請求項１３または１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
植物や作物に損傷を直接誘発する段階、または、抽出するために損傷を被った組織を準備し、植物や作物を間接的にさらす段階では、０．０１〜１．５ジュールのエネルギー（仕事）の適当な衝撃強度で前記に定義されたような分析評価がなされるサイトで植物や作物に衝撃を与えることを含む請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
間接的に損傷にさらす段階では、衝撃を受けた組織から得た抽出物と部分的または全体的に接触することを含む請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
衝撃にさらされた組織から得た抽出物は、浄化した溶性の抽出物にするために均質化され、遠心分離にかけて摘出された組織を含むこと、さらに、任意に抽出物の特別な成分を分離する処理、または拡散エンハンサや原皮消化剤などの別の成分を付加する処理がなされたことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抽出物は、損傷組織の抽出物、それらの誘導体や類似物から成る、合成して準備された同等物を含む請求項１７または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
損傷を被っていない又は病気の同一の植物や作物のサンプル（the same plant or crop sample which is undamaged or dieseased ）中の別の領域で、または、損傷や病気にさらす前の同一の植物や作物で、対応する損傷のない又は病気の植物や作物サンプル（a corresponding undamaged or dieseased plant or crop sample）のＡＯＳを検知することで、バックグラウンドのＡＯＳレベルを減じるためにコントロールを使用して定量分析を実行することを特徴とする請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＡＯＳの定量分析は化学的または電気化学的であり、着色強度や電気信号の大きさによって徐々に変化する、着色または電気的信号の応答のような視覚的応答を提供することを特徴とする請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
化学的な分析評価は、植物や作物にさらすことによって、ＡＯＳとの応答の結果として視覚的または検出可能な変化をすることが知られている化学的マーカを分析することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
化学的な分析評価に使用する化学物質は、ホルマザン類またはテトラゾリウム類の色素、若しくは関連の着色または蛍光光度の変化とラジカル反応する同類の共役芳香性色素からなる化学物質であることを特徴とする請求項２１または２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
強度測定による化学的な分析評価の定量化は、削除された組織と化学分析試薬を含むサンプルの表示（readings）と、ブランク溶液（solution blank）または損傷を受けていない組織と化学分析評価試薬を含む制御サンプルとを比較しながら、分光測定によって（by spectrophotometry）、特定の波長の光で照射し、透過光線の強度を測定することにより行われる請求項２１または２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
分析評価はｐＨ７〜１３、より好ましくはｐＨ１０〜１３の範囲で行われることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２６】
分析評価用サンプルは透過光線を照射し、検出する前に培養されること（incubated）を特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２７】
分光測定はラムダ（lamda）４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の波長で行われることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
電気化学的な分析評価は、参照電極とＡＯＳと結合、吸収、あるいはそうでなければ相互に作用することができるテスト電極との膜の間の電位差を維持する電気的な調査用プローブ（probe）やセンサを分析評価対象の植物や作物に接触（contact）することにより行われ、その結果、電位の変更を引き起こし、増幅可能な電位差における電位を変えることであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
分析評価は病気や損傷への露出のコアサイトで行われることを特徴とする請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
損傷や病気を被った植物や作物の組織の抽出物、それらの活性成分、またはそれらの合成相当物（synthetic equivalent）や誘導体を含み、任意に診断対象のサンプルへの浸透や接触の促進に役立つ追加の成分を含むことを特徴とする診断試薬（diagnostic reagent）。
【請求項３１】
有効な診断量の抽出物または成分を含むことを特徴とする請求項３０に記載の診断試薬。
【請求項３２】
診断される対象と同一または異なる作物の天然または合成の抽出物、及び、好ましくは高い診断値を有するのが分かる、望ましくは塊茎である異なる植物や作物を含むことを特徴とする請求項３０または３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜２９のいずれかに定義された、定量分析でＡＯＳを検出する手段によって植物や作物の損傷や病気に対する応答を検出する装置。
【請求項３４】
サンプルの植物や作物に直接または間接的に損傷や病気を被らせる手段と、その後ＡＯＳを分析評価するために損傷や病気を被ったサイトから得たサンプルを切除する手段を含むことを特徴とする請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
定量分析で、サンプルの植物や作物に直接または間接的に損傷や病気を被らせる手段と、損傷や病気を被った結果、発生したＡＯＳを検出する手段を含むことを特徴とする請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
じゃがいも（種子、プロセッサまたはコンシューマ（consumer））、りんご、ライチ、洋梨、アプリコット、オレンジ（ジュース）、バナナ、切り花では褐色になる葉や茎、レタス、ざくろ、ブドウ、きのこ、ローガン、びわ、ブルーベリー、カラメル、野バラ、ランブータン、ココナッツ、アボカド、オオバコ、パイナップル、クルミ、アーティチョーク、テンサイ、及び、たまねぎから選択した植物や作物の損傷や病気に対する応答を検出する請求項１〜３５のいずれかに記載の方法、試薬または装置。
【請求項３７】
別々のまたは一体的な分析評価手段と、別々のまたは一体的な制御分析評価手段、必要な組織抽出物試薬、分析評価試薬およびバッファを有する前記に定義された装置を含む請求項１〜３６のいずれかに記載の損傷や病気に応答する感受性を診断するキット。
【請求項３８】
請求項１〜３６のいずれかに記載の方法や装置によって、損傷や病気に対する有害な応答を生じることが示された植物や作物の品種、育成または環境条件を修正する方法。
【請求項３９】
所定の育成、環境、収穫条件に適する程度まで、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法や装置によって、損傷や病気に対する抵抗力があると測定された品種を選択する方法。
【請求項４０】
一連の特定条件下で育成、出荷、または貯蔵する植物や作物を選択するのに使用するデータベースを提供するため、または、特定の植物や作物の育成、貯蔵または出荷に最適な条件を選択するための、クレーム１〜３６のいずれかに記載された本発明の使用、装置またはキットによって得られた、損傷や病気に対する多数の植物と作物の感受性に関するデータでプログラム化したコンピュータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物や作物の損傷や病気に対する応答を検出して、損傷や病気に応答する植物や作物の感受性を診断する方法、当該方法に使用する装置と診断用具、損傷や病気のリスクを最小限に抑えるために植物や作物の生育又は出荷条件を改善し、予定された生育又は出荷条件下で最小限の損傷や病気を有すると診断される植物や作物を選択する方法、所定の植物や作物の損傷や病気の感受性に関するデータでプログラムされたコンピュータ、予定された生育又は出荷条件に適した所定の植物や作物を選択するためにそれらを使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
収穫・輸送・出荷の際に最も頻繁に、衝撃損傷の結果として感受性の高い作物に打撲（bruising）や軟化（softening）が生じる。その結果、病原性疾患への入口点ができて、影響を受けた品目が滅失したり、隣接品目や全作物の腐敗が局部的又は広範囲に波及したりする場合がある。打撲や軟化に対する感受性はある作物においては可変的な現象であり、例えば、じゃがいもの塊茎に打撲黒斑がつくと、品種、生育、環境の条件によって影響を受けることが知られている。機械的な又は手作業での収穫・出荷手順を調整して衝撃や打撲（bruise）による損傷を減らすことができるが、これは当該作物の感受性レベルを予測して、栽培者が収穫開始前に問題を予測できれば可能である。すばやく正確に植物や作物の打撲状態を予測できれば、栽培者が収穫器の設定を最適化して感受性の強い作物を慎重に扱うことができ、資源を最大限に活用できる。
【０００３】
じゃがいもの塊茎の打撲黒斑に特徴的な色素は塊茎要因と酸素に関わる複雑な化学的現象によって生じ、初めに赤褐色の化学的中間体を産出し、最終的には独特の暗青色のメラニン色素を形成する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
打撲黒斑に対する塊茎の感受性評価は、従来、人工的に衝撃を加えた後の塊茎の変色を直接ビジュアル化したものに基づいて行われてきた。これは、最長４８時間の塊茎の保温培養（incubation）を伴う長期的な分析評価であり、特殊な設備と訓練されたスタッフを必要とする。打撲に対する塊茎の感受性を確実に示す前記方法に変わる塊茎要因や性質を見つけ出す試みがなされてきた。これらには、チロシン、酵素、細胞呼吸などの化学的要因、又は、比重、水分含有量、乾物重（dry matter content）、塊茎の膨圧、「硬度（firmness）」などの物理的特性が含まれる。これらのいずれも信頼性が証明されておらず、あらゆる状況での打撲黒斑の感受性との再現可能な相関関係を確認できるデータはその後でていない。
【０００５】
過酸化水素や超酸化物（スパーオキサイド）などのＡＯＳ合成は、病原体の攻撃や化学的な誘導因子を用いた処理に対する植物細胞の一次応答であるが、機械的な刺激に対する当該応答を説明したレポートはほとんどない。ヤーラス他（Yahraus et al）「機械的に誘発された活性酸素発生（oxidative burst）の証明。植物生理学１０９：１２５９〜１２６６、１９９５」は、チオ硫酸ナトリウム浸透媒体（hypo-osmotic media）によって、大豆細胞懸濁液の培養基に機械的なストレスをシミュレートして、数分以内に過酸化水素の合成を示した。 また、顕微鏡用スライドの下の細胞に物理的な圧力を加えることによって直接機械的なストレスを課して、３分後に過酸化物の生成を組織化学的に（histochemically）示した。 ルジャンドル他（Legendre et al）「培養大豆（グリシンマックス）細胞におけるオリゴガラクタルノイド（oligogalacturonide）で誘発された活性酸素発生の特徴付け。植物生理学１０２：２３３〜２４０、１９９３」と、カザール他（Cazale et al）「タバコ細胞の懸濁液における活性酸素発生とチオ浸透圧ストレス。植物生理学１１６：６５９〜６６９、１９９８、タバコ細胞の懸濁液のチオ浸透圧ストレスによるＭＡＰキナーゼ起動（MAP Kinase activation）：活性酸素発生応答に対して？  植物Ｊ１９：２９７〜３０７、１９９９」は、機械的なストレスを課すため細胞懸濁液を混入して、過酸化物の合成による活性酸素発生を示した。しかしながら、これらの研究のいずれも受けた損傷との量的な関係（quantitative relations）を引き出すことができなかった。
【０００６】
衝撃損傷の結果としてのスーパーオキサイドラジカルの発生は、誘導因子で処理した培養細胞が６〜８時間の間に過酸化水素の発生ピークを２つ示す二相性の活性酸素の発生として、ベイカーとオルランディによって報告された（植物病理学における活性酸素。年次改訂植物病理学３３：２９９〜３２１、１９９５）。第１段階では、ストレスに対する不特定の生物学的応答であることが示された。一方、第２段階では、過敏性の細胞死につながる病原体ｈｒｐの複合体と植物細胞の受容体との特定の相互作用であることが測定された。これらの研究はやはり、打撲に対する感受性の定量分析やインジケータとして、スーパーオキサイドの測定を用いることを開示も示唆もしていない。
【０００７】
従って、打撲黒斑に対するじゃがいもの塊茎の感受性を評価して、かつ、実際に打撲や軟化に対する植物や作物全般の感受性を評価するための方法を改良する必要がある。そのため、本発明の目的は打撲感受性に関わり、測定しやすい要因を確定することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
我々は衝撃損傷に対する塊茎組織の初期応答を調べた。驚くべきことに、フリーラジカルを発生させる能力がじゃがいもの品種群（varieties）によってかなり違うこと、及び、事実上フリーラジカルを発生させる能力のバリエーションは品種群の打撲に対する感受性の程度とまさに相関性があることが分かった。しかしながら、これらの種（species）は組織内で通常多量に存在しない非常に反応的な分子であるので、検出するのに十分なレベルで合成されることが分かったのはさらに驚くべきことである。
【０００９】
従って、本発明の最も広い側面では、定量分析における活性酸素種（ＡＯＳ、Active Oxygen Species）の検出を含む、植物や作物の損傷や病気に対する応答の検出方法を提供する。当該方法が酸素フリーラジカルの検出を含むのは好ましい。
【００１０】
損傷（damage）と病気（disease）という用語は異なるＡＯＳの発生源を示すのに使用されるが、どちらを使用してもよい場合がある。例えば、当該発生源が他に対して感受性を高めるような事象、又はＡＯＳ発生に導く不確定的事象を含む場合がある。従って、損傷という用語はここでは包括的又は具体的に使用される場合がある。
【００１１】
ここで損傷（damage）とは、特に、損傷（injury）、負傷（wounding）、打撲（bruising）、ストレス、又はトラウマ、さらに、打撃（strike）、衝撃（impact）、（打撲（bruising））、強圧（force）、又は増圧（increased pressure）、振動、衝撃（shock）、スライシング（slicing）、刺傷（stabbing）、貫通（penetration）、突然又は長引く気温の高低などの結果として被るものなどの機械的損傷（damage）のいずれをも指す。
【００１２】
ここで病気（disease）とは、細胞含有物の僅かな漏出から完全破壊にひろがる細胞破裂を引き起こす菌類病などの病原性疾患のいずれをも指す。
【００１３】
ここで打撲（bruise）又は打撲（bruising）とは、独特の呈色だけでなく、軟化や細胞死などの他の応答をも含む衝撃的又は機械的な損傷を原因とする植物や作物の打撲作用又は現象を指す場合がある。打撲現象は機械的損傷に起因する変色を含むことになっているので、衝撃による物理的損傷ではなく、衝撃を受けた組織の目に見える変色を導く最終的に起こる生化学及び化学的事象を必然的に示す。果実と野菜の中にはこれが起こるものもあるが、全ての作物が必ずしもこのように衝撃的又は他の機械的損傷に応答するわけではない。例えば、色素の生成（例えば、軟化、細胞死による）によっては応答せず、変色しない場合がある。従って、本発明は変色が起こらない作物における感受性の検出を含んでいる。
【００１４】
作物の打撲を引き起こす化学的事象はある程度知られている。しかしながらこの理論に限定されることなく、衝撃損傷がセル分裂を引き起こし、チロシンなどのモノフェノール基質剤に混合する酵素ポリフェノール・オキシダーゼの反−区画化（de-compartmentalisation）を招くという証拠がある。酸素依存応答（Oxygen dependent reactions）は、初めにジヒドロキシフェニルアラニンの赤褐色中間体を産出し、最終的に水に溶解不能な複合体に重合する独特の暗青色のメラニン色素を形成する。証拠によると当該複合体における塊茎タンパク質が限定的に関わっていることが分かる。多分、セルが破損した結果、酵素とアミノ酸チロシンの接触が可能になり、ＡＯＳが同時又はその後複合体組成物（complex formation）に発生すると考えられる。
【００１５】
従って、我々の発明の驚くべき利点は、当該方法が組織のサンプルから得た、または原位置での調査（by in situ probe）により、細胞外側のＡＯＳの検出を含むことである。
【００１６】
実際、ＡＯＳの生成と打撲との間には因果関係がある。一連の事象は以下のように起こりうる；衝撃原因  １）おそらく生菌（例えば非分裂細胞）中の（受容体などを通る）ＡＯＳ生成の活性化、２）ＰＰＯ酵素とチロシンの混合を引き起こす細胞分裂、３）ＡＯＳはメラニンの合成につながる応答を促す（ある応答におけるＰＰＯの活性化、及び／又はフリーラジカルの優先的使用を示す何らかの証拠がある）。動物のメラニン色素の合成に起因する証拠は、最終的なメラニン色素を含む応答中間体がフリーラジカルを消費できる「フリーラジカル捕捉剤（scavengers）」であることを示す。他の証拠はチロシンとメラニンとの特定の応答が現実にフリーラジカル（ＡＯＳ）を再生する可能性を示す。どのように総合的な応答バランスがとれているかは知られておらず、多分非常に複雑である。また、フリーラジカルの生成を特に抑制する本発明の利点においては、打撲の色素生成を抑制する。
【００１７】
同様の結果が菌類病原体からサンプリングするために細胞を抽出する際に起こり、それによって再び細胞の外側で検出されるＡＯＳを生成するのが見受けられる。従って、本発明は、植物と作物が損傷や病気の感受性と相互に関連して、そのうえ測定するのに都合の良い損傷や病気のシグナル又はマーカとして役立つ特別の細胞要素により特徴付けられるという調査結果に基づく。
【００１８】
ここで活性酸素種とは分子状の酸素種ではなく、特に１つ又はそれ以上の酸素フリーラジカル、さらに特定すればスーパーオキサイド（・Ｏ2-）、ヒドロペルオキシラジカル・Ｏ2Ｈ、窒素酸化物ラジカルＮＯ・、ペルオキシ亜硝酸塩ラジカルＯＮＯＯ-、ヒドロキシラジカル・ＯＨとそれらの誘導体から選択したものを指す。
【００１９】
当該種は非常に反応的で（ミリ秒の位の）短命なので、それらの検出が敏感で（sensitive）、急速で（rapid）、特有（specific）であることは本発明の特別な利点である。この利点により、当該種は実地使用の診断方法とキットの使用に理想的に合うものになる。ＡＯＳの発生が打撲応答と比較して急速な応答であるのはさらなる利点である。４８時間後に発現だけする可能性のある打撲自体と比較すると、ＡＯＳは塊茎衝撃後１時間以内に検出でき、次第に発生するＡＯＳのレベルはその後５〜６時間増加する。当該応答が直線的であることは本発明のさらに驚くべき利点であり、それにより、打撲抵抗力のある作物が非常に低レベルのＡＯＳ合成だけを示す一方で、打撲に非常に敏感な作物が高レベルのＡＯＳの発生を示す。
【００２０】
当該方法が、量的に検出するのに容易で、急速で、正確な１以上のラジカルタイプを検出する方法であるのは望ましい。当該方法がスーパーオキサイドを検出する方法であるのはさらに望ましい。
【００２１】
図１に示すように、分子酸素種が相互連関する活性酸素種を形成するので、個々の種が短命であることは知られている。我々は、損傷や病気に対する応答として植物や作物に起こる「活性酸素発生（Oxidative burst）」により半減期（half time）をはるかに超える合成率でＡＯＳを産出するので検出可能であることが分かった。より明確には、個々の種と特定のスーパーオキサイドラジカルが、時間ｔで容易に検出可能な損傷や病気を原因とするＡＯＳの第１番目と第２番目のピーク濃度を起こす二相応答において生じ、損傷や病気の状態を示す比較研究が可能であることが分かった。
【００２２】
本発明の方法により二相応答（bi-phasic responce）の第２番目のピークでＡＯＳを検出するのは好ましい。第２番目のバースト（burst）がエリシタ（elicitors）や病原体（pathogens）のない、機械的に圧力を加えた組織に起こるという結果は機械的ストレスと活性過程（activation process）を検出する細胞受容体の可能的な役割を示す。これは機械的ストレスへの特有の応答可能性に関する最初の証明である。
【００２３】
当該方法は損傷や病気が発生したかどうかを探知し、その場合に損傷や病気の疑いのあるサイトで分析評価を行うことを含む。
【００２４】
上記方法に代えて、望ましくは、当該方法により、例えば所定の植物や作物の一般的な「健康状態」が映し出されたものとして、成長状態、栽培品種などにより影響を受ける損傷や病気に応答するそれらの感受性を分析調査する。
【００２５】
従って、当該方法が第１段階で植物や作物を損傷や病気にさらし（露出し）、第２段階でさらした（露出）後（after exposure）のある時間ｔでの定量分析でＡＯＳを検出することを含むことは望ましい。時間ｔは、露出後最大７時間であり、好ましくは露出後０．５〜６時間、さらに好ましいのは露出後０．５〜２時間、又は４．５〜６時間である。
【００２６】
前述したように、我々は、驚くべきことにフリーラジカルを発生させる能力が、植物や作物種の中の異なる品種と作物との間で非常に異なることを発見した。従って、有利に行うには、本発明の方法は、損傷や病気に不利な態様で応答する植物や作物の感受性を都合良く分析調査する方法である。打撲抵抗力のある作物や品種のＡＯＳ合成は最大５時間までのある時間ｔの後でさえ損傷を被っていない又は病気の（nonndamaged or diseased）バックグラウンドレベルよりもわずかに大きい。
【００２７】
ＡＯＳの発生を誘発して検出することを目的とする本発明の方法により損傷や病気への露出は直接的でも間接的でもよい。
【００２８】
ＡＯＳの発生を誘発して検出することを目的とする損傷や病気への直接的な露出は、例えば、衝撃、圧力、振動、ショックなどによる、いかなる機械的損傷でもよいが、典型的な制御衝撃エネルギーであるのが望ましい。そして、それらが機械的損傷の本質、又は、例えば接触、注入、あるいは汚染による病的気質や有機体、菌類、バクテリア、ウイルスなどへの応答を示すのに役立つ。
【００２９】
ＡＯＳの発生を誘発して検出することを目的とする損傷や病気への間接的な露出は、損傷や病気を被った組織またはその構成要素への露出、若しくは膨張、湿気、冷凍などにより組織や細胞の損傷や病気を誘発する状態にさらすことを含む。
【００３０】
損傷や病気を被った組織は、同一または異なる植物や作物種（species）若しくは品種（variety）に属し、好ましいのは同一の種（species）であるが、コントロールした露出（a control exposure）としての使用に適した、異なる品種（variety）であってもよい。特に塊茎でのＡＯＳの発生に有益なのは、衝撃を受けた、または病気を被った塊茎組織から取り出した抽出物の部分的又は全体的な応用に関わる間接的な損傷や病気の露出である。
【００３１】
植物や作物に損傷を直接誘発する段階、または、抽出するために損傷を被った組織を準備し、植物や作物を間接的にさらす段階では、０．０３〜５ニュートンの力の範囲に相当する、０．０１〜１．５ジュールのエネルギー（又は仕事）の適当な範囲の衝撃強度で前記に定義されたような分析評価がなされるサイトで植物や作物に衝撃を与えることを含む。衝撃は、所定の損傷や病気の状態をモデル化するための、一定の速度又は適時加速する衝撃（重力またはそれ以外の）を適当に付加する方向性（垂直や、水平など）のある手段または方向性のない手段によってもよい。じゃがいもの塊茎および同様の硬質の組織、又は硬い皮の植物や作物の場合には、適当な強度の範囲は０．５〜１ジュール、より望ましくは０．６〜０．７５ジュールで、軟質の植物や作物の場合には実質的に減少したエネルギーが種を基礎に確かめられた。約５〜１０ｍｍ3の衝撃サイトを引き起こすような適当な強度が、所定の植物や果物について決定されてもよい。これはエネルギーの範囲を使用した試験的衝撃を用いて変色や打撲したサイトを測定することによって実験だけで簡単に決定される。
【００３２】
損傷に間接的に露出する段階で、前記に定義された衝撃を受けた組織から取り出した一部又は全部の抽出物と接触することを含むのは望ましい。驚くべきことに、我々は前記に定義された間接的な露出が検出の感受性とスピードを高めるのを見出した。抽出物への露出はＡＯＳの最適な検出期間の衝撃を受けてから４，５時間のレベルから、抽出物への露出から１，２時間のレベルに短縮する方法で二相応答を共に修正し、さらに、露出後１，２時間実施されるレスポンス曲線が分析の再現精度と信頼性をより確実にするために十分な持続時間のものとする。従って、本発明の方法は間接的に損傷や病気に植物や作物をさらすことを含み、定量分析でのＡＯＳを検出する第二段階の、露出後の時間ｔ（ｔは実質的に１〜２時間の範囲）で、損傷や病気を被った組織の抽出物に接触することによるのが望ましい。
【００３３】
衝撃を与えた組織から得た抽出物が、浄化した溶性の抽出物にするために均質化し、遠心分離にかけて摘出した組織を含むのは望ましい。抽出物の特定の成分を分離し、または拡散エンハンサや原皮消化剤などの別の成分を付加する処理がなされる。
【００３４】
その代わりに、抽出物は、損傷組織の抽出物またはそれらの誘導体や類似物のうち、合成して用意した同等物を含んでもよい。当該組織抽出物の活性成分を特定することにより、本発明で先に定義されたように使用する診断試薬として用いることが可能になる。
【００３５】
従って、本発明の別の側面では、損傷や病気を被った植物や作物の組織、それらの活性成分、または、それらの合成同等物や誘導体からなる抽出物を含む診断試薬が提供される。試薬は診断対象のサンプルに浸透または接触するのを促進するのに役立つ別の成分を含んでもよい。試薬は診断に効果的な量で抽出物や成分を含むのが望ましい。試薬は診断対象の同一又は異なる作物、及び、高い診断値を有すると思われる植物や作物、好ましくは塊茎からなる天然または合成の抽出物を含むのは望ましい。診断対象に対して同一または異なる作物の天然または合成の抽出物、好ましくは高い診断値（diagnostic value）を有するのが知られている、異なる植物や作物、望ましくは塊茎からなる、天然または合成の抽出物を含む。
【００３６】
本発明の方法による定量分析は、例えば、損傷を被っていない又は病気の同一の植物や作物サンプル（undamaged or dieseased plant or crop sample）の別の領域で、または、損傷や病気にさらす前の同一の植物や作物において、対応する損傷を被っていない又は病気の植物や作物（a corresponding undamaged or dieseased plant or crop sample）におけるＡＯＳを探知して、バックグラウンドＡＯＳレベルを減らすための適当な調節を行う既知の手段で実行してもよい。損傷を被っていない又は病気のＡＯＳレベルを減らすのは手動でも自動でもよく、計算された結果または同時の結果を、ＡＯＳ検出後または同時に出すものであってもよい。
【００３７】
本発明の方法で検出された積極的な応答は、作物の価値を低下させる、外観に影響与える植物や作物への損傷を示唆し、最終的には、収穫や貯蔵中に、打撲、紛糾した打撲（組織構造の穴）、変色、軟腐病、色素沈着などが生じるか、収穫された植物や作物の日持ちを短縮化させる場合がある。
【００３８】
ＡＯＳの定量分析は化学的または電気化学的で、着色の強度や電気信号の大きさによって徐々に変化する、着色または電気的信号の応答のような視覚的応答を得るのに適する。
【００３９】
化学分析評価で、植物や作物に露出することによりＡＯＳと反応して視覚的または検出可能な変化をすることが知られている化学的マーカが分析されるのは望ましい。植物や作物の体内に直接的に、または損傷や病気サイトから得た皮下植物や作物物質からなるサンプルや抽出物、例えば、組織外植体、コア、スライスや片（piece）などのサンプルに間接的に露出してもよい。化学物質は適当な支持物、例えば、紙、片（strip）、棒、膜、フィルムなどの上で支持されてもよく、浮遊状態でも溶解していてもよい。
【００４０】
化学分析評価に用いるのに適した化学物質は、例えば、サザーランド、Ｍ．Ｗ、リアマンスのプロトコルに開示され、かつ後続の、Ｂ．Ａの「テトラゾリウム色素のＭＴＳとＸＴＴはスーパーオキサイドとスーパーオキサイドジスムターゼのための新しい定量分析を提供する」、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ，Ｒｅｓの第２７巻（３）、２８３〜２８９頁にあり、その内容がここで引用されている、関連する色や蛍光の変化とラジカル応答をするホルマザン類またはテトラゾリウム類の色素、類似の共役芳香性色素（similar conjugated aromatic dyes）からなる化学物質であるのは望ましい。
【００４１】
化学分析評価には、ホルマザン色素やテトラゾリウム色素が好ましく、モノテトラゾリウム色素、ＸＴＴ（2,3-bis(2-methoxy-4-nitoro-5-sulphophenyl)-5[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide, sodium salt）、ＭＴＴの誘導体（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium）、ＷＳＴ系列のテトラゾリウム化合物のいずれか、または日本国東京の同仁堂化学研究所で製造されたＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８（水溶性テトラゾリウムの総称）はより好ましい。ＭＳＴは還元されると（when reduced）、荷電された水溶性ホルマザンを発生させ、ＭＴＳはフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）の存在、すなわち両方の分析評価に必要な酸化還元中間体の存在下でＸＴＴよりも安定している。全ての試薬が・Ｏ2‐の定量分析基準を満たす。
【００４２】
化学分析評価の結果は、ソリューションブランクと比較した着色強度を測定することにより定量化される。強度測定による化学分析評価の定量化に適当な手段は、その内容がここで引用されているサザーランドとリアマンス（上記参照）の方法を使用する分光測定による。
【００４３】
従って、当該方法は、望ましくは、切除された組織と化学分析試薬を備えるサンプル用の記録と、ソリューションブランク、または損傷を受けていない組織と化学分析試薬を備えるコントロールサンプルと比較しながら、露出した植物や作物、望ましくはそれらの切除された組織のサンプルに特定の波長の光を照射して、透過光線の強度を測定することを含む。
【００４４】
我々は、驚くべきことに、二相応答で生じた高レベルのＡＯＳは、高ｐＨで比色変化を測定するとさらに強まることを見出した。従って、分析評価はｐＨ７〜１３の範囲で行われるが、１０〜１３の範囲がより望ましい。
【００４５】
また、二相応答で生じた高レベルのＡＯＳは、比色変化を測定する前に培養すると、さらに強まることを見出した。従って、分析用サンプルは透過光線を照射して検出する前に３〜１５分間培養されるのが望ましい。
【００４６】
また、驚くべきことに、二相応答で生じた高レベルのＡＯＳは、高波長の光の下で比色変化を検出するとさらに強まることを見出した。従って、分光測定はλ＝４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲、例えばλ＝４５０ｎｍ、５５５ｎｍ、又は６００ｎｍで実行されるのが望ましい。
【００４７】
電気化学的分析は、例えば、分析される植物や作物に参照電極とテスト電極との膜の間の電位差を維持する電気的なプローブ（probe）やセンサを接触させることにより行われるが、そこで、テスト電極がＡＯＳと結合、吸収、あるいは相互に作用することにより、電位の変更を引き起こし、増幅可能な電位差を変化させる。植物や作物の体内に直接的に、または損傷や病気サイトの皮下植物や作物体（crop matter）からなるサンプルや抽出物、例えば、組織外植体（tissue explant）、コア、スライスや小片（piece）などのサンプルに間接的に接触してもよい。
【００４８】
電気化学的分析技術は、メディエータ（mediators）と適当なプロモータ（Ｌ．Campanella、Ｇ．Favero、Ｍ．Tomassetti、Sens.  Actuators、Ｂ４４（１９９７）５５９〜５６５）を利用して修正されたボルタンメトリー（voltammetric）電極上の周期性ボルタンメトリー(cyclic voltammetry)、ＰＶＣとセベケート膜（sebecate membrane）に含まれた特に合成された特殊なニトロン（nitrone）によって引き起こされた「回転トラッピング(spin tapping)」応答により選択的に示された電位差センサと重合体膜ＩＳ−ＦＥＴｓ（Ｌ．Campanella、Ｇ．Favero、Ｆ．Occhionero、Ｍ．Tomassetti、分析２６（１９９８）２２３〜２２８。Ｌ．Campanella、Ｇ．Favero、Ｆ．Occhionero、Ｍ．Tomassetti、Ｃ．DiNatale、Ａ．D'amico、Ｓ．Sberveglieri、（Eds.）、センサとマイクロシステム、１９９８年２月１１日〜１３日、イタリア、ジェノバでの第３回イタリア会議、１９９９年、シンガポール、世界科学、２１９〜２２４）を含めて開示され、さらに最近ではバイオセンサ技術、例えばスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）酵素センサを利用し、そこで酵素が酸素用ガス拡散電極や過酸化水素用アンペロメトリック電極に加えられる（Ｌ．Campanella、Ｇ．Faver、Ｍ．Tomassetti、Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．３２（１９９９）２５２９〜２５８１）ことが開示されている。
【００４９】
電子化学的分析評価は、プロトコル（Ｌ．Campanella、Ｌ．Persi、Ｍ．Tomassetti、「適当な酵素センサを用いたスーパーオキサイドと窒素酸化物ラジカルの決定用新ツール」、センサとアクチュエータ  Ｂ６８（２０００）３５１〜３５９）を修正して利用したバイオセンサを用いるのは望ましく、そこで、応答がスーパーオキサイドや酸化窒素ラジカルの存在により抑制されたり、高められたり（調整されたり）する。なお、その内容はここで引用されている。
【００５０】
バイオセンサは、各電極の間に前記に定義された膜（membrane）や類似の膜（film）に、例えば、膜に架橋処理するか、吸収、吸着、または不溶化させて担持させた酵素を含むのが望ましい。酵素は、チロシナーゼ、スーパーオキサイドジスムターゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびシトクロムオキシダーゼから選択されるのが望ましい。
【００５１】
損傷や病気に直接さらすのに用いる本発明の方法は典型的な破壊方法であり、そのうえ、ＡＯＳの定量分析には植物や作物組織への皮下浸透が求められるが、あらゆる植物や作物は通常大量に収穫、貯蔵、販売されるので、当該方法は所定の収穫物や貯蔵から得た１又はそれ以上の品種（item）のサンプルの応答結果から分析評価をするのに適し、その結果が一般的な全体の（in general）収穫量や貯蔵量を示す。しかしながら、ある特定の利点では、間接的に損傷や病気、好ましくは損傷を受けた組織の抽出物にさらすのに用いる本発明の方法は、単に打撲応答を引き出すだけの非破壊的なものであり、望む場合は植物や作物のために、非破壊的な評価と共に使用してもよい。
【００５２】
しかしながら、我々は、ＡＯＳの合成が損傷や病気のサイトに非常に局所的に存在し、特有であることを発見した。従って、当該方法は、損傷や病気の疑いのあるまたは誘発されたサイトと完全に一致または部分的に一致する（local）植物や作物の皮下組織の定量分析でＡＯＳを検出することが望ましい。分析評価は、周辺部よりも病気や損傷に露出する中心部のサイトで行われるのが望ましく、それによってＡＯＳの最大の合成箇所が分析される。
【００５３】
分析評価は所定の植物や作物に適したサイトで行われるのが望ましい。じゃがいもの塊茎の場合には、分析評価はストロン（stolon）の端部（植物に取り付けられた）で、コントロールは目端（eye-end）（植物に取り付けられていない新芽（つぼみ）の端部により特徴付けられた端部）で行われる。じゃがいもの塊茎の場合では、血管輪は、塊茎の表皮から１〜１０ｍｍ離れたところにある本部管と師部管を含む目に見える組織の管であるので、組織は血管輪の２ｍｍ外から分析評価または分析するために摘出されるのが望ましい。
【００５４】
ＡＯＳの定量分析は、損傷や病気を被っている、または疑いのあるサイトまで皮下に評価手段を挿入すること、若しくは、分析評価手段と接触するサイトから組織のサンプルを摘出することが望ましい。分析評価手段との接触は、化学分析評価の場合には化学反応を達成するのに適当な間、電気化学的分析評価においてはラジカル反応を達成するのに適当な間続くのが望ましい。
【００５５】
本発明の特別の利点は、打撲の強度は検出されたＡＯＳ濃度と一致すること、さらに、前記に定義された通り、第１番目と第２番目の時間ｔで最高になる濃度プロファイル(with time having a maximum at first and second times t)によって特徴付けられることが分かったので、分析評価は量的でもよいことである。打撲の強度を量的に示す必要があれば、複数の分析評価をｔ＝０〜７時間の範囲内で、ある継続した時間行なえばよい。
【００５６】
本発明の方法は、機械的損傷や病気により打撲や変色の影響を受けやすい野菜、果物および植物製品を含むいずれの植物や作物に使用してもよい。当該方法は、育成・収穫中や収穫後の植物や作物の応答を検出するのに使用してもよく、いったん収穫された植物や作物、または収穫された植物や作物の潜在的な応答のインジケータとして育成や収穫サイクルの間のどの段階においても本発明の方法を使用することが本発明では特に想定されている。従って、当該方法が、育成中、収穫後または貯蔵中に生体内（in vivo）抽出がなされる植物や作物の選択を先駆物質段階（a precursor stage）で含むのが望ましい。
【００５７】
本発明により損傷や病気に対する応答を検出するのに適当な野菜、果物、および植物製品リストを以下に例示列挙する。
じゃがいも（種子、プロセッサまたはコンシューマー（consumer））、りんご、ライチ、洋梨、アプリコット、オレンジ（ジュース）、バナナ、切り花では褐色になる葉や茎、レタス、ざくろ、ブドウ、きのこ、ローガン、びわ、ブルーベリー、カラメル、野バラ、ランブータン、ココナッツ、アボカド、オオバコ、パイナップル、クルミ、アーティチョーク、テンサイ、たまねぎ。
【００５８】
当該方法が、じゃがいも、りんご、洋梨、切り花では褐色になる葉や茎、レタス、きのこ、テンサイの応答を検出するのは望ましく、じゃがいも、テンサイ、りんごの塊茎の応答を検出するのは最も望ましい。
【００５９】
本発明の別の側面では、定量分析でＡＯＳを検出することにより、植物や作物の損傷や病気に対する応答を検出する装置を提供することである。本発明の装置は応答に対する感受性を診断する装置であるのは望ましい。
【００６０】
第１の実施例では、本発明の装置は植物や作物のサンプルを直接的または間接的に損傷や病気に露出する手段と、その後ＡＯＳを分析評価するために当該露出したサイトからサンプルを切除する手段を含む。
【００６１】
別の実施例では、本発明の装置は定量分析においてサンプルの植物や作物を直接的または間接的に損傷や病気に露出する手段（means for exposing a sample plant or crop to direct or indirect damage or disease）と、損傷や病気への露出の結果として発生したＡＯＳを検出する手段を含む。
【００６２】
本発明の装置は、既知の分析手段で、望ましくは化学的または電気化学的な分析評価をするために、分析評価のため固体、液体または懸濁状態の化学物質（chemical）をサポートまたはリザーバする形態で、電気化学的な分析評価などのためのプローブ（probe）やセンサを含み、使用されてもよい。
【００６３】
前記に定義された通り、ＡＯＳの合成は損傷や病気に露出したサイトに非常に特有で局在的であり、主要な露出サイト以外のサイトで植物や作物を検出すると間違った結果を得る場合がある。損傷や病気の露出手段とサンプリングまたは分析評価手段の両方を有する結合した装置は、露出サイトを正確に指摘して、サンプリングや本来の場所での分析評価をするためにその位置を突き止めることができるのは、本発明の特有の利点である。
【００６４】
直接的または間接的に損害や病気に露出する本発明の装置は、損傷を引き起こす適当なインパクタ（impactor）、または、例えば、汚染された前進式ブレード、前進式シリンジなどにより、病気物質や有機体、破損した塊茎抽出物などの損傷や病気を被った組織やそれらの抽出物を皮下に取り込むための手段、若しくは、リザーバや細胞含有物を放出または接触させる膜や透過性サイトを有する、損傷や病気を被った組織やそれらの抽出物のためのリザーバや細胞を含む。
【００６５】
インパクタの強度は必要に応じて変更されるのが望ましい。ブレードや注射器の伸長（advance）は必要に応じて変更されるのが望ましい。リザーバや細胞の接触サイトに植物や作物のサンプルを貫通させ、皮下注入（subcutaneous impregnation）を成し遂げる手段を含んでもよい。その代わりに、抽出物が植物や作物の表面を消化する消化手段を含んでもよい。
【００６６】
本発明の装置は、損傷を受ける植物や作物の必要なサイトに近接して位置を定めるのに適当で、損傷や病気にさらされるサイトの表面と一致する接触面を含むのが好ましい。当該接触面は、例えば、着色、刻み目や切込みマークにより、サイトに印をつける手段や、植物や作物のコアサンプルを切込み切除する、より主要な要素を含むサンプリング手段を含むことが好ましい。当該装置は分析評価をする前に、損傷や病気への露出から遅延時間ｔを記録するための手段と共に使用するのに適する。
【００６７】
当該装置は前記に定義された通り、その後の分析評価のための分離式または一体式の手段を含む。分析評価手段が分離式である場合、従来の分析評価キットはその後、印の付けられたサイトまたは除芯サイト(cored site)に適用される。分析評価手段が一体式である場合、インパクタ、インサイザ（incisor）、インジェクタ、またはリザーバが、損傷や病気を被ったサイト中の所定の深さまで、影響を受けた、注入された、切開された、または別の方法で露出した植物や作物の部分を貫通する、または当該サイトで植物や作物の物質（matter）と接触する、化学的なサポート、プローブ（probe）、センサのアクセスを可能にするアクセス手段を含む。分析評価手段は、植物や作物体（matter）と紙、センサ、メンブレンの直接接触、または同様の化学物質の拡散接触のために、化学物質を紙上、リザーバ内、またはセンサの一部を形成する電極に吸収させる前進プローブ（an advancing probe）を含むのが望ましい。化学的分析評価の前進手段（advancing means）は、化学物質をその間に挿入するための衝撃サイトまたは注入サイトを分割するブレードまたはその他のデバイダ（divider）でもよい。
【００６８】
ＡＯＳの制御検出は、本発明の第２の装置の使用、または制御された非露出サイト（a control no-exposed site）での、もしくは制御された非露出植物や作物における第２の分析評価手段の使用に用いられてもよい。化学的な分析評価の場合は、視覚による比較、光伝導や光放出（蛍光）の強度の測定などにより応答を比較してもよい。当該装置は当該分野におけるいかなる既知のキャリブレーション（calibration）や強度測定装置をも含む。当該装置は各キャリブレーションと強度測定手段との間で伝達するコミュニケーション手段を含むのが望ましく、それにより局所的な化学物質の濃度のために調整され、その後、露出サイトと制御サイトでのＡＯＳとレベルの相違を含む単一の反応が表示される。
【００６９】
電気化学的分析評価の場合では、当該発明の装置は、一方のシグナルを他方から減じて単一の結果を得るのに寄与する、または一方のセンサの極性を他方について逆にするのに寄与し、それによりシグナルを減じて最終結果を生じるいずれかの回路の形態で、各シグナルを比較する手段と共に分析評価センサとコントロールセンサの間で伝達する手段を含むのが望ましい。
【００７０】
前記に定義された装置は少数または多数のサンプルを迅速に分析するのに適し、作物畑や貯蔵の断面状況（the status of a cross section）を評価する際に使用できるのは本発明の特別の利点である。当該発明の装置は、前記に定義されたような異なる種類の作物や植物に適した構成や能力（capacity）で提供される。特に、例えば、じゃがいもなどの固い植物や作物や、バナナのような外皮を持つ植物や作物には０．７ジュールの範囲のより大きなエネルギーを加えるため、そして、マッシュルームなどのようなやわらかい植物や作物にはより少ないエネルギーを与えるために、異なる範囲のインパクタレベルで、かつ、異なるサイズで提供される。
【００７１】
本発明の別の側面では、分離式のまたは一体的な分析評価手段と、分離式のまたは一体的な制御分析評価手段、必要な組織抽出物試薬、分析評価試薬およびバッファを有する前記に定義された装置を備えた、前記に定義されたような損傷や病気に応答する感受性を診断するキットを提供する。
【００７２】
本発明の別の側面では、前記に定義されたような損傷や病気に対する植物や作物の応答を検出する前記に定義された装置の使用を提供する。
【００７３】
本発明の別の側面では、損傷や病気に対して有害反応を起こすことが示される植物や作物（a plant or crop which has been shown to produce a deleterious response）の品種、育成または環境条件を変更する方法を提供する。影響を受けやすい品種の損傷や病気に対する感受性は、例えば、カリ栄養、作物の成熟度、植え付け回数などの育成または環境条件に左右される。有利な育成または環境条件を決定し、影響を受けやすい品種に適用して感受性を緩和し、収穫高を最適化するのが望ましい。あるいは、品種が損傷や病気に対して高感受性を有するとして測定されると、収穫や貯蔵条件が収穫と貯蔵の間の衝撃やストレス損傷を最小にするように変更される。
【００７４】
本発明の別の側面では、所定の育成、環境、収穫条件に適した、ある程度まで損傷や病気に対する抵抗力のある品種を選択する方法を提供する。
【００７５】
本発明の別の側面では、前記に定義されたような本発明の方法により、または装置の使用やキットを使用して得た、一連の特定条件下で育成、出荷、または貯蔵する植物や作物を選択するのに使用するデータベースを提供する、または、特定の植物や作物の育成、貯蔵または出荷に最適な条件を選択するための、損傷や病気に対する多数の植物と作物の感受性に関するデータでプログラムされたコンピュータを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
ここで、本発明を以下の実施例や図面を参照して非限定的な態様で図示する。
図１は、考えられる分子酸素種と活性酸素種の相互関係機構を示す。
【００７７】
図２は、不可欠の損傷を引き起こす手段と抽出手段を含む本発明の使い捨て装置を示す。当該装置はハンマー３を支持するスプリング２に弾みをつける引き金１のある衝撃ガン（impact gun）を装着したスプリングを含む。スプリングを装着したハンマーは調整可能で、例えば約０．７ジュール（落下ボルトと振り子衝撃システムと同じ）の再現可能な力を課すように調整される。張力調節装置４は植物、作物または品種／栽培品種に応じて衝撃強度を改変するのに使用される。
【００７８】
当該装置は、実験用のじゃがいもの塊茎の表面に調整され、限定された衝撃を課して、その後に分析評価する打撲範囲を正確に位置づけるように設計される。位置決め用のリング５は、塊茎の表面にインパクタを置き、同時に塊茎組織のサンプルを含む正確な大きさのコアを切るサーキュラカッタまたは芯抜き器である。当該図は、Ａ）位置に付き、発射の準備の整ったガンと、Ｂ）コアの中の衝撃ゾーンを示す発射後のガンを示す。
【００７９】
図３（Ａ〜Ｅ）は、じゃがいもの塊茎におけるスーパーオキサイドラジカルの分析評価の時間プロフィールを図示する。時間の経過（衝撃後の時間）と機械的ストレスを受けた塊茎で発生するスーパーオキサイドのレベル（ｎｍｏｌｇ-1ｍｉｎ-1）。実験された５つの栽培品種は、Ａ）ルセットバーバンク（Russet Burbank）、Ｂ）サターナ（Saturna）、Ｃ）キャラ（Cara）、Ｄ）キング・エドワード（King Edward）、Ｅ）マリスパイパー（Maris Piper）である。（四角の付いた線図は機械的に圧力を加えられた組織、三角の付いた線図はコントロールされた組織を示す。）示された結果は２つの独立した推定値の平均値である。
【００８０】
図４（Ａ、Ｂ）は栽培品種の打撲インデックスと、タンパク質の修正レベル（表１）と、機械的ストレス（図３）後に発生したスーパーオキサイドの最大レベルのヒストグラムの比較を示す。示された結果は制御レベルに合わせて修正された２つの独立した推定値の平均値で、Ａ）打撲インデックス（ベタの棒）とタンパク質の修正（十字状にハッチングした棒）との間の相関関係、Ｂ）打撲インデックス（ベタの棒）とスーパーオキサイドの発生（十字状にハッチングした棒）との間の相関関係を視覚的に表示したものである。栽培品種略語：ＲＢ＝ルセットバーバンク、ＳＡ＝サターナ、ＣＡ＝キャラ、ＫＥ＝キング・エドワード、ＭＰ＝マリスパイパー。
【００８１】
図５は打撲インデックス値、タンパク質の修正およびスーパーオキサイドレベルの相関関係プロットを示す。グラフはメラニン色素の合成（打撲インデックス）と両方のスーパーオキサイドの発生とタンパク質の修正レベルのほぼ直線的な関係を示す。（四角の付いた線図はタンパク質の修正、三角の付いた線図はスーパーオキサイドの発生を示す。）
図６はｐＨを高めて、５５５ｎｍまたは６００ｎｍの波長で測定して達成した、高検出感度を図示する。
【００８２】
図７は衝撃を受けた品種ルセットバンクの塊茎から取り出した水性の抽出物で処理した後に切除された塊茎組織に発生したＡＯＳを示す。図は抽出物の適用に応答した、同じ品種（ルセットバンク、四角の付いた線図）と他の品種（キャラ、三角の付いた線図）で発生したＡＯＳ示す。
【００８３】
実施例１
ＸＴＴに基づく分析評価は、機械的に圧力を加えたじゃがいもの塊茎から得た組織におけるスーパーオキサイドラジカルの生成を直接測定するのに使用された。また、当該結果は打撲黒斑に対して異なる感受性を示すじゃがいもの品種間でスーパーオキサイドの合成レベルが変わるのを示す。当該合成は６時間にわたってスーパーオキサイドを蓄積する２つピークのある二相性（biphasic）の合成である。また、機械的圧力を加えた塊茎におけるタンパク質の修正レベルの変化が、打撲黒斑に対する仮定した感受性の検証として測定された。また、打撲の目視検査が検証として行われた。
【００８４】
材料
機械的ストレスを避けるため、特に育成され、慎重に収穫された、選りすぐりのじゃがいもの品種から得た塊茎は、エードリアンブリッドン博士（サットンブリッジの実験用ユニット、サットンブリッジ、リンカンシャー、イギリス）によってもたらされた。他の塊茎は民間の販路から現地調達した。５品種のじゃがいも、即ち、キャラ、キングエドワード、マリスパイパー、ルセットバーバンク、およびサターナが使用された。塊茎は全て、緑化と発芽を抑制するため暗がりの中に１０℃で保管された。
【００８５】
塊茎の機械的ストレス−打撲：塊茎は冷水で洗浄され、水分を吸い取り乾かし、暗がりの中に４℃で４８時間培養され、室温に戻し、それから、０．７Ｊの力を加えながら２４０ｇの標準的な落錘と３００ｍｍの落高を利用して、走茎端部に衝撃を与えた。ボルトはプラスチック・パイプを通って直接衝撃を吸収するように落とされ、衝撃領域が消えないマークでマークされた。衝撃を受けたコントロール塊茎は、打撲色素を最大限合成するため２６℃で８時間培養された。
【００８６】
塊茎抽出物：適当な箇所に抽出物が制御された強さの衝撃にされされた塊茎組織から得られた。衝撃サイト（血管輪と共に２ｍｍ外側から得た）中心部から得た、きれいでよく切れるカミソリ刃を使用して切除された塊茎組織の５ｍｍ3のスライス。切除された組織は１ｍリットルの蒸留水で均質化され、遠心分離され（１５，０００ｇ×５分、室温）、浄化された可溶性の抽出物であった。走茎端の損傷を受けなかった塊茎組織の５ｍｍ3のスライスは、きれいなよく切れるカミソリ刃を使用して切除され、２００ミリリットルの抽出物に露出された。
【００８７】
塊茎組織におけるスーパーオキサイドラジカル発生の分析評価： 前述の通り、機械的ストレスにさらされた各品種の塊茎は、スーパーオキサイドラジカルの発生を分析評価する前に、様々の期間２６℃の暗がりの中で培養された。衝撃サイトの（血管輪と共に２ｍｍ外側から得た）中心部、および末端の制御サイトから得たきれいなよく切れるカミソリ刃を使用して切除された塊茎組織の５ｍｍ3のスライスは、徹底的に蒸留水（３×１５ｓ）で洗浄されて、水分を吸い取り乾かし、その後、ｐＨ８．２の５０ｍＭのリン酸塩バッファ、２００μｌ  ０．６ｍＭＸＴＴ（Ａｂｌｅら、１９９８年）において２０分間１６℃で培養された。組織片はピンセットで取り除かれ、分析評価溶液は室温で５分間遠心分離された（１３，０００ｇ）。ＸＴＴ溶液のブランク（ｐＨ８．２、５０ｍＭのリン酸塩バッファにおける６００マイクロモルＸＴＴのうちの２００マイクロリットル）に対して比較しながら分光測光器（λ＝４５０ｎｍ）の１００マイクロリットルのサンプル上でＡ450上澄み液を取り出し、２３，６００Ｍ-1ｃｍ-1のＸＴＴホルマザンにモル吸光率を用いて発生させたモル超酸化物に変えた（SutherlandとLearmonth、１９９７年；SutherlandＭ、パーソナルコミュニケーション）。 溶液は１０ＭのＮａＯＨを使用してｐＨ１２．５に調整されて、５５５ｎｍで読み取られた。それから、溶液はｐＨ１２．５で１０分間培養され、波長は６００ｎｍで読み取られた。スーパーオキサイドの評価は２回行い（in duplicate）、全ての分析評価が繰り返された（be replicated）。
【００８８】
図３（Ａ〜Ｅ）は塊茎組織スライスでのスーパーオキサイドの発生の時間的経過を表す結果を示す。全ての品種が衝撃に対してある程度のスーパーオキサイドの発生を示した。マリスパイパー種（図３−Ｅ）がコントロール値と比べてわずかにレベルの上昇を示したのに対し、ルセットバーバンク種とサターナ種（図３−Ｂ）では非常に著しいレベルになった。
【００８９】
衝撃後１〜２時間の時点での初期ピーク応答に、４〜５時間の時点でより大きな応答が続き、時間が経過するにつれてスーパーオキサイドの発生パターンの二相性は最も大きくなる。最も高い打撲インデックスも示す、ルセットバーバンク種、サターナ種、キャラ種（図３Ａ〜Ｃ）で最も明白であったが、当該パターンは全５品種で再現可能であり、明らかであった。スーパーオキサイドの発生ピーク値は、急激な活性酸素発生とメラニン色素の合成との関係を図示するため５つの栽培種の打撲インデックスに対して示された（図４Ｂ）。詳述した通り、ｐＨを高めることにより当該方法の高まった感受性は図６に示されている。衝撃を与えた塊茎組織から得た抽出物に衝撃を与えない塊茎組織をさらすことによるＡＯＳの発生の誘導は図７に示される。品種特有の方法でＡＯＳの発生を活性化する全体または部分的な塊茎の抽出物が、特に検出感度と検出スピードが高まるので打撲に対する感受性を診断する手段の補助になる。
【００９０】
塊茎組織でのタンパク質の変更に関する評価：酸化的に変更された塊茎タンパク質のカルボニル含有量は、レヴィンＲＬのジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）誘導化と分光光度の分析評価方法、「複雑な機能酸化またはヒスチジン残基（Mixed function oxidation or histidine residues）」、エンティモロギィ方法（Methods in Entymology）、１０７、３７０〜３７６８（１９８４年）によるオキシイブロット（OxyBlot）キット（Oncor Appligene）を使用して定量化された。前記に詳述された本発明の方法により機械的ストレスにさらされた塊茎は４８時間培養された。塊茎タンパク質は１５０ｍｇのコントロールから抽出されて、５０ｍＭのリン酸塩バッファ、ｐＨ７．４中の３ｍｌで塊茎に影響を与えた。
【００９１】
抽出されたタンパク質のカルボニル基はＤＮＰＨと応答し、２２，０００Ｍ-1ｃｍ-1のモル吸光係数を使用することで３５５〜３９０ｎｍでのピーク吸収から見積もられた、結果的に生じるヒドラゾン誘導体であった。複製サンプル(duplicate sample)のタンパク質含有量はＡ280から見積もられた。値はｎｍｏｌのカルボニルｍｇ-1塊茎タンパク質として表された。
【００９２】
結果は、スーパーオキサイドの発生と視覚的な打撲インデックスに関連する表１、図４Ａ及び図５に示される。
【００９３】
打撲評価：目視検査
塊茎は機械的ストレスにさらされ、それから、衝撃サイトで４分の１にカットされ、０（変色なし）から１０（深い暗青色の呈色）までのスケールで視覚による色素沈着の強度評価と同様に影響を受けた組織の体積が測定された。５品種につきそれぞれ３０塊茎ずつ使用され、平均的な打撲インデックスが打撲の程度と強度に基づき計算された。その結果を表１に示す。
【表１】
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【００９４】
表１は、５つの実験的な品種のそれぞれの打撲感受性を評価した値の一覧である。使用される品種は、感受性の高いもの（ルセットバーバンク種）から抵抗力の強いもの（マリスパイパー種）まで打撲の進行に対する広範囲の感受性を示した。ここで使用した品種の打撲インデックスに関する我々の評価は、同様の方法を使用して公表された値と類似する（Ｄｉｘｏｎ、１９９２年：イギリスじゃがいも協議会、２０００年）。
【００９５】
マリスパイパーが最も低いタンパク質の修正レベルを示したのに対し、ルセットバーバンク種は最も高い修正レベルを示した点で、当該結果はタンパク質の修正値（図３Ａ）が密接にスーパオキサイドの発生（図３Ｂ）のレベル値に反映されるのを示す。さらに、栽培品種（表１）の打撲インデックスのタンパク質修正レベル（図３Ａ）とスーパオキサイド発生（図３Ｂ）との比較は、これらの変数に直接関係があることを示す。従って、スーパオキサイドの発生は高タンパク質の修正につながり、両方ともに打撲の高受性に関連する。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明は、植物や作物の損傷や病気に対する応答を検出して、損傷や病気に応答する植物や作物の感受性を診断する方法、当該方法に使用する装置と診断用具、損傷や病気のリスクを最小限に抑えるために植物や作物の生育又は出荷条件を改善し、予定された生育又は出荷条件下で最小限の損傷や病気を有すると診断される植物や作物を選択する方法、所定の植物や作物の損傷や病気の感受性に関するデータでプログラムされたコンピュータ、予定された生育又は出荷条件に適した所定の植物や作物を選択するためにそれらを使用することに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】考えうる分子酸素種と活性酸素種の相互関係機構を示す。
【図２】不可欠の損傷を引き起こす手段と抽出手段を含む本発明の使い捨て装置を示す。
【図３】じゃがいもの塊茎におけるスーパーオキサイドラジカルの分析評価の時間プロフィールを図示する（Ａ〜Ｅ）。
【図４】栽培品種の打撲インデックスと、タンパク質の修正レベル（表１）と、機械的ストレス（図３）後に発生したスーパーオキサイドの最大レベルのヒストグラムの比較を示す（Ａ、Ｂ）。
【図５】打撲インデックス値、タンパク質の修正およびスーパーオキサイドレベルの相関関係プロットを示す。
【図６】ｐＨを高めて、５５５ｎｍまたは６００ｎｍの波長で測定して達成した、高検出感度を図示する。
【図７】衝撃を受けた品種ルセットバンクの塊茎から取り出した水性の抽出物で処理した後に切除された塊茎組織に発生したＡＯＳを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月4日(2003.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷により、ある時間ｔでの二相性（a bi-phasic response）のＡＯＳ応答の第１又は第２のピーク濃度において、ＡＯＳの生成の観点から見ると当該応答は打撲応答に対して直線的である応答の定量分析で、スーパーオキサイド（・Ｏ2-）、窒素酸化物ラジカルＮＯ・、ペルオキシ亜硝酸塩ラジカルＯＮＯＯ-、ヒドロキシラジカル・ＯＨから選択される活性酸素種（ＡＯＳ）の検出を含む、じゃがいも植物や作物の損傷に対する応答を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
損傷により、ある時間ｔでの二相性（a bi-phasic response）のＡＯＳ応答の第１又は第２のピーク濃度において、ＡＯＳの生成の観点から見ると当該応答は打撲応答に対して直線的である応答の定量分析で、スーパーオキサイド（・Ｏ2-）、窒素酸化物ラジカルＮＯ・、ペルオキシ亜硝酸塩ラジカルＯＮＯＯ-、ヒドロキシラジカル・ＯＨから選択される活性酸素種（ＡＯＳ）の検出を含む、じゃがいも植物や作物の病気に対する応答を検出することを特徴とする方法。
【請求項３】
活性酸素種がスーパーオキサイドラジカル（・Ｏ2-）を含むことを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
定量分析が化学的または電気化学的であり、着色強度や電気信号の大きさによって徐々に変化する、着色または電気的な信号の応答を提供する場合において、発生したＡＯＳを検出し、損傷や病気の状況を比較して示すことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
時間ｔは、露出後（after exposure）０．５〜２時間、又は４．５〜６時間であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
二相性応答の第２ピークにおいてＡＯＳを検出することを含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
損傷や病気を被ったかどうかを検出する方法であって、損傷や病気の疑いのあるサイトの分析評価を行うことを含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
損傷や病気に応答するじゃがいも植物や作物由来の塊茎の感受性を診断する方法であり、第１段階でじゃがいも植物や作物由来の塊茎を損傷や病気に露出し、第２段階で露出後のある時間ｔでの定量分析でＡＯＳを検出することを含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
露出は作為的（deliberate）または偶発的（incidental）であり、そして、じゃがいも植物や作物由来の塊茎内に直接、またはじゃがいも植物や作物由来の塊茎の損傷や病気のサイトから得た皮下物質からなる組織外植体（tissue explant）、コア、スライスや小片（piece）を含むサンプルに間接的に露出することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
損傷や病気への露出が直接的で、機械的な衝撃、圧力、振動、ショックへの作為的または偶発的な露出、若しくは接触、注入、あるいは汚染による病原性物質、有機体、菌類、バクテリア、ウイルスへの露出を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
機械的な衝撃は作為的であり、代表的な（representative）制御衝撃エネルギーであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
損傷や病気への露出が間接的で、損傷や病気を被った組織またはその構成要素への露出、若しくは膨張、湿気、冷凍などの組織や細胞の損傷や病気を誘発する状態への露出を含むことを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
損傷や病気を被った組織は、同一または異なるじゃがいも品種（variety）、好ましくは異なる品種（variety）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
じゃがいも植物や作物由来の塊茎に損傷を直接誘発する段階、または、抽出するために損傷を被った組織を準備し、じゃがいも植物や作物由来のじゃがいも塊茎に間接的に露出する段階では、０．５〜１．０ジュールのエネルギー（または仕事）の範囲の衝撃強度で前記に定義されたような分析評価がなされるサイトで塊茎に衝撃を与えることを含む請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
間接的に損傷に露出する段階では、衝撃を受けた組織から得た抽出物と部分的または全体的に接触することを含む請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
衝撃にさらされた組織から得た抽出物は、浄化した溶性の抽出物にするために均質化され、遠心分離にかけて摘出された組織を含むこと、さらに、任意に抽出物の特別な成分を分離する処理、または拡散エンハンサや原皮消化剤などの別の成分を付加する処理がなされたことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抽出物は、損傷組織の抽出物、それらの誘導体や類似物から成る、合成して準備された同等物を含む請求項１５または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
化学的な分析評価は、じゃがいも植物や作物の塊茎にさらすことによって、ＡＯＳとの応答の結果として視覚的または検出可能な変化をすることが知られている化学的マーカを分析することを特徴とする４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
化学的な分析評価に使用する化学物質は、テトラゾリウム類の色素からなる化学物質、より好ましくは、還元されると（when reduced）、荷電された水溶性ホルマザンを発生させるモノテトラゾリウム色素を含むことを特徴とする請求項４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
強度測定による化学的な分析評価の定量化は、分光測定によって（by spectrophotometry）行われることを特徴とする請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
分析評価用サンプルはある一定期間培養され、分析評価はｐＨ７〜１３、より好ましくはｐＨ１０〜１３の範囲で行われることを特徴とする請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
分光測定はラムダ（lamda）４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲の波長で行われることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
損傷や病気を被ったじゃがいもの塊茎の組織の抽出物、それらの活性成分、またはそれらの合成相当物（synthetic equivalent）や誘導体を含み、任意に診断対象のサンプルへの浸透や接触に役立つ追加の成分であって、診断される対象と同一または異なるじゃがいも植物や作物から成る天然または合成の抽出物である成分を含むことを特徴とする請求項１〜２２のいずれかに記載の方法を使用する診断試薬（diagnostic reagent）。
【請求項２４】
有効な診断量の抽出物または成分を含むことを特徴とする請求項２３に記載の診断試薬。
【請求項２５】
抽出物は、高い診断値を有するのが分かる、異なるじゃがいも植物や作物から成ることを特徴とする請求項２３または２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれかに定義した方法を使用するじゃがいも植物や作物の損傷に対する応答を検出する装置において、当該装置は損傷を誘発するために調整された衝撃エネルギを０．５〜１．０ジュールの範囲で課し、さらにその後の分析評価のために衝撃サイトの位置を正確に突き止めるインパクタ（impactor）を含むことを特徴とする装置。
【請求項２７】
ＡＯＳを後発的に分析評価するために露出されたサイトから得たサンプルを切除する手段を含むことを特徴とする請求項２７に記載の装置。
【請求項２８】
じゃがいも植物や作物の損傷や病気に対する応答を検出することを特徴とする請求項１〜２７のいずれかに記載の方法、試薬または装置。
【請求項２９】
請求項２６に定義された装置、別々のまたは一体的な化学的分析評価手段、及び／又は請求項３０〜３２のいずれかに定義した診断試薬、必要な組織抽出物試薬、分析評価試薬およびバッファ、さらに、請求項４に定義した化学的分析評価から得た着色応答を徐々に変える着色手段を含む請求項１〜２２のいずれかに記載の方法を使用する、じゃがいも植物や作物の損傷や病気に対する応答感受性を診断するキット。
【請求項３０】
請求項１〜２２のいずれかに定義された方法によって、損傷や病気に対する有害な応答を発生させることが示された、じゃがいも植物や作物の品種、育成または環境条件を修正する方法。
【請求項３１】
所定の育成、環境、収穫条件に適する程度まで、請求項１〜２２のいずれかに定義された方法によって、損傷や病気に対する抵抗力があると測定されたじゃがいも植物や作物の品種を選択する方法。
【国際調査報告】
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