(57)【要約】本発明は、ＨＩＶ−１のｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌ遺伝子を発現させる、αウィルスをベースとした発現ベクター、そのＲＮＡ転写物及び形質転換された宿主細胞に関するものである。本発明は、前記発現ベクターを用いてＨＩＶ−１のＧａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ及び／又はＰｒｏ蛋白質を発現させ、前記組換え蛋白質からなるＨＩＶ様粒子を製造した。本発明のウィルス様粒子は、好ましくは成熟、感染性ウィルス粒子であって、ＨＩＶ感染有無を診断するための診断用キットの抗原として使用することができ、ＨＩＶ感染を予防するためのワクチン組成物として有用に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子（６２６４−８８７９ｂｐ）が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子（８３２−２３２８ｂｐ）が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクター。
【請求項２】
請求項１において、前記発現ベクターはｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項３】
ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子（８３２−２３２８ｂｐ）が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子（６２６４−８８７９ｂｐ）が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクター。
【請求項４】
請求項３において、前記発現ベクターはｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項５】
ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子（６２６４−８８７９ｂｐ）が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子（８３２−２３２８ｂｐ）が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＨＩＶ−１のｐｒｏ遺伝子（２２６８−２６０６ｂｐ）が第３のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクター。
【請求項６】
請求項５において、前記発現ベクターはｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｒｏであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子（６２６４−８８７９ｂｐ）が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子（８３２−２３２８ｂｐ）が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＨＩＶ−１のｇａｇｐｒｏ遺伝子（８３２−２５７７ｂｐ）が第３のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクター。
【請求項８】
請求項７において、前記発現ベクターはｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇｐｒｏであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
請求項７において、前記発現ベクターはｐＳＦ Ｖ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇΔｐｒｏであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１０】
ＨＩＶ−１のｇａｇｐｏｌ遺伝子（８３２−５１３２ｂｐ）が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子（６２６４−８８７９ｂｐ）が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０において、前記発現ベクターはｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項において、ＣＴＥ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）遺伝子をさらに含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２において、前記発現ベクターはｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２において、前記発現ベクターはｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇΔｐｒｏ−ＣＴＥであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１２において、前記発現ベクターはｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖ−ＭＣＴＥであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１２において、前記発現ベクターはｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖ−ＭＣＴＥであることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１７】
寄託番号ＫＣＣＭ−１０２３３で寄託された発現ベクター。
【請求項１８】
寄託番号ＫＣＣＭ−１０２３４で寄託された発現ベクター。
【請求項１９】
寄託番号ＫＣＣＭ−１０３４８で寄託された発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項による発現ベクター又はそのＲＮＡ転写物を動物細胞に導入して発現させることを特徴とするＨＩＶ様粒子（ＨＩＶＬＰ）の製造方法。
【請求項２１】
請求項２０において、前記ＨＩＶ様粒子は成熟ＨＩＶ様粒子であることを特徴とする製造方法。
【請求項２２】
請求項２１において、前記成熟ＨＩＶ様粒子が感染性であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか１項のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
請求項２３において、動物細胞が安定的に形質転換された（ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項２５】
免疫反応を起こすのに充分な量の、請求項１〜１９のいずれか１項による発現ベクター又はそのＲＮＡ転写物を含むことを特徴とするＡＩＤＳワクチン組成物。
【請求項２６】
免疫反応を起こすのに充分な量の、請求項２１の方法によって製造された成熟ＨＩＶ様粒子を含むことを特徴とするＡＩＤＳワクチン組成物。
【請求項２７】
請求項２５のワクチン組成物又は請求項２６のワクチン組成物をヒトに投与することを特徴とするＡＩＤＳ予防法。
【請求項２８】
請求項２１の方法によって製造された成熟ＨＩＶ様粒子を含むことを特徴とするＨＩＶ感染を診断するための診断用キット。
【請求項２９】
（ａ）ＨＩＶ特異的抗体を含有するものと期待されるサンプルを採取する段階と、（ｂ）段階（ａ）から採取されたサンプルを抗原として請求項２１の方法によって製造された成熟ＨＩＶ様粒子と、抗原と抗体との結合がなされるようにして抗原−抗体免疫複合体を形成させる条件の下で接触させる段階と、（ｃ）免疫複合体の形成を検出する段階とを含むことを特徴とし、サンプル中でＨＩＶレトロウィルス抗原と特異的に反応する抗体の存在を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、ＨＩＶのＧａｇ蛋白質を発現させる発現ベクター、ＨＩＶのＥｎｖ蛋白質を発現させる発現ベクター、ＨＩＶのＧａｇとＥｎｖ蛋白質とを同時に発現させる発現ベクター、ＨＩＶのＧａｇｐｏｌポリプロテインを発現させる発現ベクター、及びＨＩＶのＧａｇｐｏｌポリプロテインとＥｎｖ蛋白質とを同時に発現させる発現ベクターに関するものである。
【０００１】
〔背景技術〕
ＨＩＶ−１（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ−１）は、後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：以下、「ＡＩＤＳ」という）の病因源である。ＨＩＶ−１はＨＩＶ−２と共にレトロウィルスのレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｄａ）に属し、感染性ビリオンは２つの同一の一重鎖（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）からなるＲＮＡ（＋）ゲノムをもっている。ＨＩＶ−１が細胞に感染すると、前記ＲＮＡ（＋）ゲノムがコードする逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）によってＲＮＡが二重鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）に転換され、このＤＮＡが宿主細胞の染色体に挿入されてプロウィルスを形成することになる。
【０００２】
ＨＩＶ−１ゲノム（９．２ｋｂ）はｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖの構造遺伝子（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｇｅｎｅ）とｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｘなどの付随遺伝子（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｇｅｎｅ）とから構成されている。図１にＨＩＶ−１のゲノム構造を図式化した。
【０００３】
ＨＩＶのＧａｇ蛋白質は、ｇａｇ−ｐｏｌの全長ＲＮＡから５５ｋＤａの前駆蛋白質（Ｐｒ５５ｇａｇ）として発現される。蛋白質のＮ末端にミリストイレーションされており、これにより原形質膜の内側にターゲットされてウィルス粒子を形成する。Ｐｒ５５ｇａｇはｐｏｌ遺伝子によって発現されるウィルスプロテアーゼ（Ｐｒｏ）によってマトリックス（ＭＡ、ｐ１７）、カプシド（ＣＡ、ｐ２４）、ヌクレオカプシド（ＮＡ、ｐ９）及びｐ６の蛋白質でプロセシングされて成熟化する （Ｇｈｅｙｓｅｎ Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ， ５９， １０３−１１２ （１９８９）； Ｂｒａｙ， Ｍ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， １２５６−１２６０ （１９９４）； Ｃａｎｎ， Ａ． Ｊ．， ａｎｄ Ｊ． Ｋａｒｎ， ＡＩＤＳ ３（Ｓｕｐｐｌ．１）， Ｓ１９−Ｓ３４ （１９８９）； Ｒａｔｎｅｒ， Ｌ．， Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３， ２７７−２８４ （１９８５）； Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．，  Ｃｅｌｌ ４０， ９−１７ （１９８５））。
【０００４】
皮膜糖蛋白質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅｎｖは、スプライシングされたＲＮＡから、ｇｐ１６０と呼ばれる前駆体として発現される。細胞内で宿主又はウィルスのプロテアーゼによってＮ末端のｇｐ１２０とＣ末端のｇｐ４１蛋白質に切断され、このように生成されたｇｐ１２０は細胞膜外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｏｍａｉｎ）に存在する糖蛋白質サブユニットを形成し、ｇｐ４１は膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を構成する。成熟ビリオンではｇｐ１２０とｇｐ４１が非共有結合してヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成しているが、これらはＨＩＶの感染性、細胞指向性（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒｏｐｉｓｍ）及び細胞病理（ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）に直接関与するものと知られている（Ｒｏｂｅｙ， Ｅ． ａｎｄ Ａｘｅｌ， Ｒ．， Ｃｅｌｌ ６０， ６９７−７００（１９９０））。このようにＨＩＶのＥｎｖ蛋白質は、抗原性と密接した関連があるため、ＨＩＶワクチンの製造において最も重要な研究対象である。
【０００５】
プロテアーゼ（Ｐｒｏ）はｇａｇ ｍＲＮＡの３’でリボソームフレームシフト（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔ）が生じて作られる前駆蛋白質（Ｐｒ１６０ｇａｇ−ｐｏｌ）から自己切断されて生成される （Ｊａｃｋｓ， Ｔ． ａｎｄ Ｖａｒｍｕｓ， Ｈ． Ｅ． Ｓｉｅｎｃｅ， ２３０， １２３７−１２４２ （１９８５）； Ｊａｃｋｓ， Ｔ． ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｄｏｎ）， ３３１， ２８０−２８３ （１９８８）； Ｓｏｎｉｇｏ， Ｐ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ， ４５， ３７５−３８５ （１９８６））。ＰｒｏはＰｒ１６０ｇａｇ−ｐｏｌポリプロテインの切断及びＥｎｖのプロセシングに関与し、ウィルス粒子の成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）と感染（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）に重要な役割を果たすものと報告されている （Ｋｏｈｌ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８５， ４６８６−４６９０ （１９８８））。
【０００６】
これまでＡＩＤＳワクチンとして開発されたものには、不活化ワクチン、弱毒化ワクチン、組換え生ワクチン、ウィルス様粒子ワクチン、サブユニットワクチンなどがある。次に、各ワクチン分野で試みられてきた技術を紹介する。
【０００７】
「不活化ワクチン（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）」は、分離したウィルス粒子を化学的又は物理的に処理して感染性を失わせたものである。製造容易で、略全てのエピトープを使用することが不可能な利点がある反面、ウィルスを完全に不活性化させていない場合には疾病を誘発するおそれがあり、逆に完全に不活化させるために強力な処理を行う場合にはエピトープが破壊されるという欠点がある。文献にＳＩＶの感染試験に成功した例が報告されたことがあるが （Ｓｃｏｔｔ Ｅ． Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ， ２５３， ３９３ （１９９１）； Ｌｅ Ｇｒａｎｄ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５５， ６８４ （１９９２）； Ｃｒａｎｇｅ Ｍ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５５， ６８５−６８６ （１９９２）； Ａｒｔｈｕｒ Ｌ． Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ ｖｉｒｏｌ， ６９， ３１１７−３１２４ （１９９５）； Ｎｅｉｄｒｉｇ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， １１， ６７−７４ （１９９３））、その結果が培養宿主細胞の異種抗原（ｘｅｎｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）によるものという疑問が提起されているので、未だ成功段階にあるワクチンとは認められない。
【０００８】
「弱毒性ワクチン（Ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）」は、例えばｎｅｆ遺伝子又はｎｅｆとｖｐｒ遺伝子を同時に欠乏させたように、ＨＩＶ遺伝子の一部を欠損させたものであるが （Ｄｅｓｃｒｏｓｉｅｒｓ ＲＣ．， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｓｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， ８， ４１１−４２１ （１９９２）； Ｇｉｂｂｓ Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， １０， ６０７−６１６（１９９４）； Ｃｒａｎａｇｅ Ｍ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２２９， １４３−１５４ （１９９７）； Ｗｙａｎｄ Ｍ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ， ３， ３２−３６ （１９９７））、ウィルスが動物体内で欠損した遺伝子を再び獲得する場合に病原性を示すので、安定性に問題がある比較的開発初期段階の技術であると言える。
【０００９】
「組換え生ワクチン（Ｌｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）は、非病原性ウィルスの非必須遺伝子をＨＩＶ抗原で代替させた形態のワクチンである。文献には、ワクチニアウィルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）、ポックスウィルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、カナリヤポックスウィルス（ｃａｎａｒｙｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、アビポックスウィルス（ａｖｉｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、ポリオウィルス（ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、インフルエザウィルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）などでｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖなどの遺伝子を発現させ、或いはＨＩＶのＶ３ｌｏｏｐなどを含有した抗原性部位をキメラ蛋白質の形態で発現させた例が報告されている（Ｔａｒｔａｇｌｉａ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １８８， ２１７−２３２ （１９９２）； Ａｂｉｍｉｋｕ Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ， １， ３２１−３２９ （１９９５）； Ｎａｔｕｋ ＲＪ． ｅｔ ａｌ．， ＡＩＤＳ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， ９， ３９５−４０４ （１９９３）； Ｌｉ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ６７， ６６５９−６６６６（１９９３）； Ｍｕｓｔｅｒ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９， ６６７８−６６８６ （１９９５））。この技法は一般に全体抗原の一部のみをワクチンとして用いるため、良い免疫源を提供するものとは考えられず、構成されたベクターが時々不安定であるという欠点がある （Ｍｏｒｒｏｗ Ｃ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， １０， Ｓ６１− Ｓ６６ （１９９４）； Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， １３， ５３−６２ （１９９７））。
【００１０】
天然から分離し或いは遺伝工学的に発現させたＨＩＶのサブユニットをワクチンとして用いる「サブユニットワクチン（ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）」は、比較的容易に作ることができるという利点があるが、これもＨＩＶ抗原決定部位の一部のみを使用するものであって、全体ウィルス粒子とは異なる立体構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を取るという点において制限点を抱えているワクチンである。組換えＥｎｖ糖蛋白質ｇｐ１２０とｇｐ１６０が哺乳動物細胞や昆虫細胞などで発現されたことがあるが （Ｌａｓｋｙ， Ｌ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ９３２−９３５ （１９８６）； Ｂａｒｒ， Ｐ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎｅ， ５， ９０−１０１ （１９８７）； Ｈｕ， Ｓ−Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｏｌ．， ６１， ３６１７−３６２０ （１９８７）； Ｒｕｓｃｈｅ， Ｊ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８４， ６９２４−６９２８ （１９８７）； Ｂｅｒｍａｎ， Ｐ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６３， ３４８９−３４９８ （１９８９）； Ｉｖｅｙ−Ｈｏｙｌｅ， Ｍ．， ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｍ．，  Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０， ６１５２−６１５９ （１９９０）； Ｌａｓｋｙ， Ｌ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ５０， ９７５−９８５ （１９８７））、ＣＨＯ細胞で発現されたｇｐ１２０はチンパンジーにおけるチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）実験では失敗した （Ｂｅｒｍａｎ， Ｐ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８５， ５２００−５２０４ （１９８８））。
【００１１】
ワクチンをウィルス粒子の形態で提供すると、サブユニット形態の抗原を提供することより免疫源性が高くて安定的である。従って、遺伝子を含んでいない非感染性「ウィルス様粒子（ＶＬＰ；Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」をワクチンとして用いる方法が最近開発された。パッケージング遺伝子に変異が起こった結果、ゲノムＲＮＡのないＶＬＰを生産し、或いは組換えバキュロウィルス又はワクチニアウィルスを用いて、プロセシングされていないＧａｇ蛋白質で構成されたＶＬＰを製造したことがその例である （Ｇｏｒｅｌｉｎｋ Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ６４， ３２０７−３２１１（１９９０）； Ｇｈｅｙｓｅｎ Ｄ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ５９， １０３−１１２（１９８９））。文献は （Ｈａｆｆａｒ Ｏ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １８３， ４８７−４９５（１９９１））ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子を含有した２つの組換えワクチニアウィルスを同時に感染させ、遺伝子のないウィルス様粒子を生産したことを報告している。ところが、このようなシュード粒子（ｐｓｅｕｄｏ−ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、体内で中和抗体、シンシチウム抑制（ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）、ｅｎｖ−ＣＤ４防御抗体などを生成することに成功したが、成熟したウィルス粒子ではなく、かつ感染性が欠乏しているという制限がある。
【００１２】
ＶＬＰ形態のワクチンとしては、この他にもＨＩＶの抗原基を含有するように作製されたポリオウィルスカプシド、ＨＢＶコア粒子、ＨＢｓＡｇ粒子又はイーストレトロトランスポゾンウィルス様粒子（ｙｅａｓｔ ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）などのハイブリッド粒子があるが、これらもウィルス様粒子に挿入できる抗原基部位が制限されるという限界点を克服できなかったものである （Ｇｒｅｎｅ Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ， １３， ４１−５１（１９９７）； Ｓｃｈｌｉｅｎｇｅｒ Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ６６， ２５７０−２５７６ （１９９１）； Ａｄａｍｓ Ｓ． Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２９， ６８−７０ （１９８７）； Ｌａｙｔｏｎ Ｇ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １５１， １０９７−１１０７ （１９９３）； Ｅｃｋａｒｔ Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ， ７７， ２００１−２００８ （１９９６））。
【００１３】
本発明者は、新しいＡＩＤＳワクチンを開発する試みであって、α−ウィルスベクターシステムを用いて、成熟ウィルス様粒子形態のワクチンを製造することにより、ＡＩＤＳ疾病を予防する方法を提供することになった。
【００１４】
〔発明の開示〕
本発明は、ＨＩＶのＧａｇ蛋白質を発現させる発現ベクター、ＨＩＶのＥｎｖ蛋白質を発現させる発現ベクター、ＨＩＶのＧａｇとＥｎｖ蛋白質を同時に発現させる発現ベクター、ＨＩＶのＧａｇｐｏｌポリプロテインを発現させる発現ベクター、及びＨＩＶのＧａｇｐｏｌポリプロテインとＥｎｖ蛋白質とを同時に発現させる発現ベクターを提供することを目的とする。
【００１５】
また、本発明の他の目的は、前記発現ベクターで形質転換されたことを特徴とする細胞株を提供することにある。
【００１６】
また、本発明のさらに他の目的は、前記組換え発現ベクター又はそのＲＮＡ転写物を動物細胞に導入して発現させることを特徴とするＨＩＶ様粒子（ＨＩＶＬＰ）の製造方法及びその方法によって製造されたＨＩＶ様粒子を提供することにある。
【００１７】
また、本発明のさらに他の目的は、成熟（ｍａｔｕｒｅ）ＨＩＶ様粒子を含むことを特徴とするＨＩＶ感染診断用キット及びこれを用いてＨＩＶ疾病の感染有無を診断する方法を提供することにある。
【００１８】
また、本発明のさらに他の目的は、成熟ＨＩＶ様粒子を含むことを特徴とするワクチン組成物、或いは前記発現ベクター及び／又はそのＲＮＡ転写物を含むことを特徴とするＡＩＤＳワクチン組成物を提供することにある。
【００１９】
また、本発明のさらに他の目的は、（ａ）ＨＩＶ特異的抗体を含有するものと期待されるサンプルを採取する段階と、（ｂ）段階（ａ）から採取されたサンプルを抗原として本発明の成熟ＨＩＶ様粒子と、抗原と抗体との結合がなされるようにして抗原−抗体免疫複合体を形成させる条件の下で接触させる段階と、（ｃ）免疫複合体の形成を検出する段階とを含むことを特徴とし、サンプル内でＨＩＶレトロウィルス抗原と特異的に反応する抗体の存在を決定する方法を提供することにある。
【００２０】
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明は、ＨＩＶの構造蛋白質を発現させる、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。本発明のＨＩＶにはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１又はＨＴＬＶ−２のようなヒトレトロウィルスが全て含まれる。
【００２１】
「αウィルス」とは、当業界で通常αウィルスとして分類されるウィルス種及びサブタイプをいい、例えば、Ｅａｓｔｅｒｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ （ＥＥＥ）， Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ （ＶＥＥ）， Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ ｖｉｒｕｓ， Ｍｕｃａｍｂｏ ｖｉｒｕｓ， Ｐｉｘｕｎａ ｖｉｒｕｓ， Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ （ＷＥＥ）， Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ， Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ Ａｒｂｏｖｉｒｕｓ Ｎｏ． ８６， Ｇｉｒｄｗｏｏｄ Ｓ．Ａ． ｖｉｒｕｓ， Ｏｃｋｅｌｂｏ ｖｉｒｕｓ， Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ， Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ， Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ， Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇ ｖｉｒｕｓ， Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ， Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ， Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ， Ｇｅｔａｈ ｖｉｒｕｓ， Ｓａｇｉｙａｍａ ｖｉｒｕｓ， Ｂｅｂａｒｕ ｖｉｒｕｓ， Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ， Ｕｎａ ｖｉｒｕｓ， Ａｕｒａ ｖｉｒｕｓ， Ｗｈａｔａｒｏａ ｖｉｒｕｓ， Ｂａｂａｎｋｉ ｖｉｒｕｓ， Ｋｙａｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ， Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ ｖｉｒｕｓ， Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ， Ｎｄｕｍｕ ｖｉｒｕｓ， Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ ｖｉｒｕｓ及びその他のウィルス学名に関する国際委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ）でαウィルスとして分類したものがこれに含まれる。
【００２２】
αウィルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）は、トガウィルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）に属する、皮膜をもっている（＋）鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ）ＲＮＡウィルスであって、広範囲な細胞（昆虫、鳥類、哺乳類）に感染することができる。ウィルスのＲＮＡゲノムがそれ自体で感染性があり、自らＲＮＡレプリカーゼをコードするため、ＲＮＡ複製と転写が効率よく行われるシステムである（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ， Ｐ． ａｎｄ Ｈ． Ｇａｒｏｆｆ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９， １３５６−１３６１ （１９９１））。
【００２３】
本発明のαウィルスは、好ましくは「セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ：Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）」と、「シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）」である。さらに好ましくは、本発明のαウィルスはＳＦＶである。本発明の具体例で使用された、ＳＦＶをベースとした発現ベクターｐＳＦＶは、ＳＰ６プロモータを有するプラスミドにＳＦＶのｃＤＮＡゲノムを挿入したもので、ＳＰ６７ポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写が可能であり、構造遺伝子の代わりに挿入された外来遺伝子が２６Ｓサブゲノミックプロモータによって発現できるように変換された発現ベクターである。
【００２４】
感染によって組換えＲＮＡを細胞内に導入させるためには、ｉｎ ｖｉｖｏパッケージングシステムを用いる必要がある。ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒはＳＦＶのＲＮＡ複製シグナルと構造遺伝子を発現させることが可能な情報を含んでいるが、ゲノミックＲＮＡパッケージングシグナルが欠如しているもので、ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒを組換えｐＳＦＶベクターと共に同時トランスフェクションさせると、ＳＦＶ構造蛋白質内に組換えＲＮＡのみがパッケージングされたウィルス粒子が生成される。前記ウィルス粒子は細胞に感染して組換え遺伝子を発現させるが、再びウィルス粒子を形成することはできない。本発明の実施例で使用されたｐＳＦＶとｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒの構造を図２に示した。本発明で使用されるＤＮＡベクターとそのＲＮＡ転写物は全て本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
本発明の一側面は、ＨＩＶ−１のｇａｇ、ｇａｇｐｒｏ、ｅｎｖ、ｅｎｖとｇａｇ、ｅｎｖとｇａｇとｇａｇｐｒｏ又はｇａｇ△ｐｒｏ、ｇａｇｐｏｌ又はｇａｇｐｏｌとｅｎｖ遺伝子がαウィルスのサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結された発現ベクターを提供する。
【００２６】
ｐｒｏ又は遺伝子を２６Ｓサブゲノミックプロモータの下でそれぞれ挿入してＧａｇ、Ｅｎｖ、Ｐｏｌ又はＰｒｏを発現させる、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。Ｐｒｏの発現はＧａｇ蛋白質の量に依存するものと考えられている （Ｖｅｌｉｓｓａｒｉｏｓ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １９３， ６６１−６７１ （１９９３）； Ｍａｇｄｅｌｅｉｎｅ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７２， ４８１９−１８２４ （１９９８）； Ｊｏｅｌ Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２４４， ８７−９６ （１９９８））。本発明では、ＧａｇのプロセシングのためにＰｒｏの発現を極大化するために、ｅｎｖ遺伝子の後ろにｇａｇｐｒｏ又はｇａｇｐｏｌの隣接部でフレームシフトされたコドン序列が削除されたｇａｇ△ｐｒｏ遺伝子をそれぞれ２６Ｓプロモータに連結させ、或いはｇａｇｐｏｌ遺伝子の後ろにｅｎｖ遺伝子を２６Ｓプロモータに連結させたベクターを製作した。
【００２７】
本発明は、ＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子がプロモータの下で作動できるように連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。本分野において、「作動できるように連結された」とは一般に連結されたＤＮＡ序列が相互接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味し、このような意味は同様に本願にも適用される。ｐＳＦＶ／ｇａｇは前記ベクターの例である（実施例１）。本発明は、ＨＩＶ−１のｇａｇｐｒｏ遺伝子がプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏは前記ベクターの例である（実施例１）。本発明は、ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子がプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ／ｅｎｖは前記ベクターの例である（実施例４）。
【００２８】
本発明は、ＨＩＶ−１のｅｎｖとｇａｇ遺伝子を同時に発現させるαウィルスベクター、好ましくはｅｎｖ遺伝子が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ｇａｇ遺伝子が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ−ｅｎｖ−ｇａｇは前記ベクターの例である（実施例９）。本発明は、ＨＩＶのｐｒｏ遺伝子がプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ／ｐｒｏは前記ベクターの例である（実施例９）。
【００２９】
本発明は、ひいてはＨＩＶ−１のｅｎｖ、ｇａｇ及びｐｒｏ遺伝子を同時に発現させるαウィルスベクター、好ましくはｅｎｖ遺伝子が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ｇａｇ遺伝子が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ｐｒｏ遺伝子が第３のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｒｏは前記ベクターの例である（実施例９）。
【００３０】
本発明は、ＨＩＶ−１のｇａｇｐｒｏ遺伝子及びＣＴＥ（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｅｌｅｍｅｎｔ）遺伝子を発現させるαウィルスベクター、好ましくはｇａｇｐｒｏ遺伝子がプロモータの下で作動できるように連結され、ＣＴＥ遺伝子がさらに連結された、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥは前記ベクターの例である（実施例９）。
【００３１】
本発明は、ＨＩＶ−１のｅｎｖ、ｇａｇ、ｇａｇｐｒｏ及びＣＴＥ遺伝子を発現させるαウィルスベクター、好ましくはｅｎｖ遺伝子が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ｇａｇ遺伝子が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ｇａｇｐｒｏ遺伝子が第３のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＣＴＥ遺伝子をさらに含む、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ−ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥは前記ベクターの例である（実施例１２）。
【００３２】
本発明は、ＨＩＶ−１のｅｎｖ、ｇａｇ及びｇａｇ ｍＲＮＡの３’末端でリボソームフレームシフトが生じなくてもＰｒｏ蛋白質を生産し得るように、ｇａｇとｐｒｏ遺伝子の連接部で拡散序列の欠損が生じたｇａｇｐｒｏ遺伝子及びＣＴＥ遺伝子を発現させるαウィルスベクター、好ましくはｅｎｖ遺伝子が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ｇａｇ遺伝子が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ｇａｇｐｒｏ遺伝子が第３のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＣＴＥ遺伝子をさらに含む、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥは前記ベクターの例である（実施例１３）。
【００３３】
本発明は、ＨＩＶ−１のｇａｇｐｏｌ全長遺伝子を同時に発現させるαウィルスベクター、好ましくはサブゲノミックプロモータの下で前記ｇａｇｐｏｌ全長遺伝子が作動できるように連結された、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌは前記ベクターの例である（実施例１４）。
【００３４】
本発明は、ＨＩＶ−１のｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子を同時に発現させるαウィルスベクター、好ましくはｇａｇ遺伝子が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ｅｎｖ遺伝子が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＭＣＴＥ遺伝子をさらに含む、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。
【００３５】
ｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥは前記ベクターの例である（実施例１６）。
【００３６】
本発明は、ＨＩＶ−１のｇａｇｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を同時に発現させるαウィルスベクター、好ましくはｇａｇｐｏｌ遺伝子が第１のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ｅｎｖ遺伝子が第２のサブゲノミックプロモータの下で作動できるように連結され、ＭＣＴＥ遺伝子をさらに含む、αウィルスをベースとした発現ベクターを提供する。ｐＳＦＶ−ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥは前記ベクターの例である（実施例１６）。
【００３７】
本発明のベクターは、当業界に公知になっている遺伝子組換え技術に基づいて、当業者が発明の内容に適した変形を加えて製造することができる。
【００３８】
本発明は、前記発現ベクターを用いてＨＩＶ−１構造蛋白質Ｇａｇ、Ｐｒｏ及び／又はＥｎｖ（前駆蛋白質及びプロセシングされたサブユニット）を製造する方法を提供する。本発明のαウィルスベクターは、広範囲な範囲の宿主細胞で蛋白質を発現させることができる。本発明は、前記の発現ベクター又はそのＲＮＡ転写物を宿主細胞、好ましくは動物細胞で発現させることにより、ＨＩＶ−１のＧａｇ、Ｐｒｏ及び／又はＥｎｖ蛋白質を製造する方法を提供する。本発明の動物細胞は、好ましくは鳥類、哺乳動物、爬虫類、両棲類、昆虫又は魚類細胞である。哺乳動物細胞の例としてはヒト、猿、ハムスタ、ネズミ及び豚細胞を挙げることができる。特に、好ましい宿主とベクターシステムの例はＢＨＫ／ｐＳＦＶとＣＯＳ／ｐＳＦＶであるが、本発明の発現システムはこれに制限されない。
【００３９】
αウィルス発現ベクター又はそのＲＮＡ転写物は、通常のトランスフェクション方法、例えばＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、リン酸カルシウム法、好ましくはエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によって動物細胞、例えばＢＨＫ−２１細胞に導入することができる。本発明を例示するｐＳＦＶベクターの場合、エレクトロポレーションによって非常に高い収率でＲＮＡ転写物を宿主細胞に導入することができる。一つ又は二つ以上の同時トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）する場合にも、前記方法を使用することができる。エレクトロポレーションを含んだトランスフェクションの技術は当業界に公知になっている。
【００４０】
細胞の形質転換は、感染性ウィルス粒子で感染させる場合、その発現効率が増大する。本発明は、ヘルパーウィルスを用いて作った本発明によるＲＮＡ転写物を含んでいる感染性ウィルス粒子を宿主細胞に感染させることにより、前記蛋白質を製造する方法を提供する。前記の方法は、実施例２及び実施例６に例示されている。本発明のベクター転写物又はヘルパーウィルスを用いて作った欠損ウィルス粒子（Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｖｉｒｕｓ Ｐａｒｔｉｃｌｅ）の感染によって生産されたＨＩＶ−１蛋白質は、様々な方法によって分離されることができる。分離方法としては当業界に公知になっている様々な方法、例えばイオン交換クロマトグラフィ、親和カラムクロマトグラフィ、ゲル浸透クロマトグラフィなどの方法を使用することができる。
【００４１】
本発明は、前記ベクターのＲＮＡ転写物、前記ＲＮＡを含んだＶＬＰで一時的に形質転換され、或いは前記ベクターで安定的に形質転換された（ｐｅｒｍａｎｅｎｔｌｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）宿主細胞又は細胞株を提供する。前記安定的に形質転換された細胞株は、例えばＨＩＶのｃＤＮＡゲノムが宿主細胞の染色体に挿入されるために必要なサイトメガロウィルス （ｃｙｔｏｍｅｇａｌｒｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）プロモータとｒｅｖ独立的な発現のためのＣＴＥ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｅｌｅｍｅｎｔ）遺伝子、選択マーカとしての抗ネオマイシン遺伝子を備えた動物細胞株である。前記ＣＴＥ遺伝子は、好ましくはＭＰＭＶ（Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒ ｍｏｎｋｅｙ ｖｉｒｕｓ）の遺伝子である。
【００４２】
本発明は、前記発現ベクター及び宿主細胞を用いて感染性ＨＩＶＬＰを製造する方法を提供する。本発明は、Ｇａｇ蛋白質を発現させるベクターを宿主細胞に導入して、ＨＩＶのＧａｇからなる未成熟ウィルス様粒子（ＨＩＶＬＰ）を製造する方法を提供する。ＨＩＶの場合、プロテアーゼによって切断されていないＧａｇは成熟粒子を形成することができず、未成熟ＶＬＰを形成する。「ウィルス様粒子（ＶＬＰ）」とは、野生型ウィルスと同一ではないが、類似の物理化学的性質を有する粒子をいう。「未成熟ウィルス様粒子（ｉｍｍａｔｕｒｅ ＶＬＰ）」とは野生のビリオンになるために必要なプロセシングを完全に経ていないウィルスであって、粒子的構造を形成するものをいう。「レプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）」とは、遺伝子複製に必須的な遺伝子を含有している遺伝体をいい、外来遺伝子を結合させてウィルスを増殖させ、外来遺伝子を発現する発現ベクターとして使用できる。
【００４３】
ＨＩＶはＧａｇのみでもウィルス粒子を形成するが、これは未成熟形態であり、感染性（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）を持っていない。ＨＩＶに対する中和抗体のエピトープは皮膜蛋白質に位置するものと知られており、この部分が最も様々なアミノ酸序列（ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を持っている。したがって、Ｇａｇのみからなる組換えウィルス粒子にＥｎｖ蛋白質を挿入することはＨＩＶワクチンを作るための重要な技法の一つであるといえる。本発明はＨＩＶのｇａｇ遺伝子を含有した前記発現ベクター及びｅｎｖ遺伝子を含有した前記発現ベクターを同時トランスフェクションして一つの宿主細胞で２つの蛋白質を同時に発現させることにより、ＨＩＶのＧａｇとＥｎｖ蛋白質からなる未成熟ウィルス様粒子（ＨＩＶＬＰ）を製造する方法を提供する。
【００４４】
同時トランスフェクションによるＨＩＶＬＰの製造は煩わしく、効率も低下する。従って、本発明では一つのベクターに２つ或いは３つの目的遺伝子をクローニングした組換えプラスミドを用いて簡便かつ経済的で効率よくＨＩＶＬＰを生産、回収できるようにした。従って、本発明は、αウィルスレプリコンにＨＩＶのｇａｇとｅｎｖ遺伝子をそれぞれのプロモータの下でクローニングした後、このベクターを細胞にトランスフェクションして、ＨＩＶ−１のＧａｇとＥｎｖ蛋白質からなる未成熟ＨＩＶ様粒子（ＨＩＶＬＰ）を製造する方法を提供する。
【００４５】
ＨＩＶウィルスは、アセンブル又はバッディング（ｂｕｄｄｉｎｇ）過程中、或いはその後にプロテアーゼによってＧａｇが切断され、切断された構造蛋白質がさらに再結合することにより、完全な成熟粒子を構成する。Ｇａｇ蛋白質のみからなるＨＩＶＬＰはそのサイズと模様などで天然のＨＩＶＬＰとは大きい差異があり、またＧａｇとＥｎｖからなるＨＩＶＬＰもプロテアーゼによってプロセシングされない限り、成熟ウィルス粒子を形成することができない。効果的な免疫反応を誘導するたために、天然に存在するＨＩＶと最も類似の形態を有する免疫源を提供することが重要であり、よって成熟ＨＩＶＬＰを製造することはＨＩＶワクチンで最も強力な手段を提供することになる。本発明では、ＨＩＶ−１のＧａｇとＰｒｏ蛋白質を同時に発現させ、或いはＧａｇ、Ｅｎｖ及びＰｒｏ蛋白質を同時に発現させることにより、ＨＩＶの成熟ＨＩＶＬＰを製造する方法を開発することになった。「成熟ウィルス様粒子」とは、ＨＩＶの場合、ＰｒｏによってＨＩＶの構造蛋白質が完全にプロセシングされたＨＩＶＬＰであって、その形態又は大きさが野生型ＨＩＶと実質的に類似のウィルス粒子をいう。本発明では、ｇａｇｐｏｌ遺伝子がｅｎｖ遺伝子と同時に発現される場合、成熟ＨＩＶＬＰが多く生成されることを発見した。
【００４６】
ＨＩＶ様粒子はワクチン又はＨＩＶ感染診断用抗原として最も好ましいと言える。ところが、ＨＩＶ様粒子を作るために必要なＧａｇ、Ｅｎｖ及び／又はプロテアーゼをそれぞれの発現ベクターによって発現させることは煩わしいうえ、その効率もよくなく、この場合にＨＩＶ様粒子を生産する安定的な細胞株を得ることも難しい。本発明では、ＨＩＶのＧａｇ、ＥｎｖとプロテアーゼをＨＩＶ様粒子の形成に充分な量で同時に発現させることが可能な、αウィルスをベースとした発現ベクターを成功的に製造し、これから感染性のあるウィルス様粒子を製造及び分離することに成功した。
【００４７】
従って、本発明は、ひいては免疫反応を起こすのに充分な量の前記発現ベクター、前記ベクターのＲＮＡ転写物又は前記ＨＩＶＬＰを含むＡＩＤＳ予防用ワクチン組成物、及びこれを投入してＡＩＤＳ疾病を予防ないし治療する方法を提供する。前記ＨＩＶＬＰには成熟及び未成熟ＨＩＶＬＰ、感染性及び非感染生ＨＩＶＬＰが全て含まれる。特に好ましくは成熟ＨＩＶＬＰである。成熟ＨＩＶＬＰをワクチンとして使用する場合、ＨＩＶが有する立体構造を提供することができるため、優れた免疫反応を誘導することができる。
【００４８】
本発明のワクチン組成物は、生体に適した形態で対象者に投与される。ここで、生体に適した形態とは、疾病の予防ないし治療効果がいずれの毒性効果より高い形で投与される物質の形態をいう。前記物質をいずれの動物、好ましくはヒトに投与することができる。
【００４９】
本発明のワクチンは、適した希釈剤、賦形剤及び／又は担体をさらに含むこともできる。好ましくは、前記ワクチンは生体内でワクチンの免疫源性を向上させることが可能な賦形剤を含む。前記賦形剤としては、グラム陰性バクテリアのエンドトキシン中のリピドＡ分部、マイコバクテリアのトレハロースジマイコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｉｍｙｃｈｏｌａｔｅ）、ホスフォリピドリゾレシチン（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｌｙｓｏｌｅｃｉｔｉｎ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＤＤＡ）、ある直鎖ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ−ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ、ＰＯＰ−ＰＯＥ）ブロックポリマー、アルミニウムヒドロキシド及びリポソームを含む本技術分野の公知の賦形剤から選択することができる。担体は前記ワクチン組成物を投与された個体内で好ましくない抗体を生成しない限り、いずれの担体を使用してもかまわない。特に塩水、緩衝塩水、及び非特異的な血清アルブミンと混合された塩水を含む多数の適した担体又は希釈剤を本発明で使用することができる。薬剤学的組成物としては補助剤、緩衝剤、抗酸化剤、グルコース、スクロース又はデキストリンのようなカーボハイドレイト、及びＥＤＴＡのようなキレート剤を含む以外に水、食塩水、グリセロール、エタノールなどや乳化剤、湿潤剤又はｐＨ調整剤などを含むことができる。ワクチン組成物は免疫反応を増強させるために、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含むことができる。アジュバントの例としてはアルミニウムヒドロキシド（ａｌｕｍ）、ｔｈｒ−ＭＤＰ、ｎｏｒ−ＭＤＰ、ＭＰＴ−ＰＥなどを挙げることができる。また、前記ワクチンはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ及びＩＦＮを含む免疫反応を向上させるものと知られたサイトカインを含むことができる。
【００５０】
ワクチンの投与量は患者の疾病状態、歳、性別及び体重と患者に所望の反応を誘導するための抗体能のような因子によって様々にすることができる。最適の治療反応を提供するために投与量療法を調節することができる。例えば、数個の分けられた投与量で毎日投与するか、或いは治療状況の緊急性に応じて投与量を比例的に減少させることができる。前記ワクチンは注射（例えば、皮下、静脈内及び筋肉内）、経口投与、吸入、経皮投与又は座薬のように通常の方法で投与することができる。ブースタ免疫処理は４〜６週後に制動することができる。
【００５１】
本発明は、ＨＩＶの感染を診断することが可能な診断用キット及びこれを用いて疾病を診断する方法を提供する。本発明は、（ａ）動物、特にヒトから得た生物学的サンプルを前記ＨＩＶＬＰと接触させ、（ｂ）ＨＩＶＬＰとサンプル中の抗体とが結合することを探知することにより、ＨＩＶに感染したか否かを診断するキット、及び前記キットを用いてＨＩＶに感染したか否かを診断する方法を提供する。抗原−抗体の結合程度を測定する方法は、当業界に既に十分公知になっている。ＥＬＩＳＡはこのために使用可能な一つの方法である。このような診断はまた直接結合法又は競争的結合法によって行われることができる。
【００５２】
前記と関連した観点として、本発明は（ａ）ＨＩＶ特異的抗体を含有するものと期待されるサンプルを採取する段階と、（ｂ）段階（ａ）から採取されたサンプルを抗原として、請求項１８の方法によって製造されたＨＩＶ様粒子と、抗原と抗体との結合がなされるようにして抗原−抗体免疫複合体を形成させる条件の下で接触させ、（ｃ）免疫複合体の形成を検出する段階とを含むことを特徴とし、サンプル中でＨＩＶレトロウィルス抗原と特異的に反応する抗体の存在を決定する方法を提供する。
【００５３】
本発明の成熟ＨＩＶ様粒子は、酵素連結された免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ及びその他非酵素連結された抗体結合検定を含んだ免疫検定又は抗レトロウィルス（例えばＨＩＶ）ＨＩＶ抗体及びレトロウィルス抗原（例えばＨＩＶ）の検出のために、本分野に知られた手続きで免疫源として、すなわち抗原として有用である。ＥＬＩＳＡ検定において、成熟ＨＩＶ様粒子は特定の表面、例えばポリスチレン微細力価平板のウェルのように蛋白質と結合することが可能な表面上に固定される。洗浄によって、不完全に吸着した成熟ＨＩＶ様粒子を除去した後、試験サンプルと抗原的に中性であると知られたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はカゼインの溶液のような非特異的蛋白質を特定の表面上に結合させることができる。これは、固定化がなされる表面上に非特異的吸着部位を遮断させることにより、その表面上に抗血清の非特異的結合によって発生する背景を減少させる。
【００５４】
次に、固定化がなされる表面を、免疫複合体（抗原／抗体）を形成させる方式で検索しようとする臨床学的材料又は生物学的材料のようなサンプルと接触させる。これはＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）及び／又はホスフェート緩衝塩水（ＰＢＳ）／ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）の溶液のような希釈剤でサンプルを希釈させることを含むことができる。その後、サンプルを、例えば約２５℃、３７℃の温度で順次約２〜４時間培養する。培養後、サンプルの接触表面を洗浄して非免疫複合体化された物質を除去する。洗浄手続きはＰＢＳ／ツイーンのような溶液又は硼酸塩緩衝液で洗浄することを含むことができる。
【００５５】
試験サンプルに結合した本発明の成熟ＨＩＶ様粒子の間に特定の免疫複合体を形成し、洗浄した後、免疫複合体形成の頻度及び場合によって量を、この免疫複合体を第１抗体に対して特異性を有する第２抗体に適用することにより決定することができる。試験サンプルがヒトから由来されたものである場合、第２抗体はヒト免疫グロブリン、一般にＩｇＧに対して特異性を有する抗体である。検出手段を提供するために、第２抗体は、例えば適切な発色基質と培養した際に色を展開する酵素活性のような連関した活性を持つことができる。その後、例えば可視光線分光光度計を用いて発色程度を測定することにより定量することができる。
【００５６】
複数のＨＩＶ分離体を認知する抗体を同定することが要求される一つの診断様態として、本発明の免疫学的に区分される複数の成熟ＨＩＶ様粒子を特定の表面上に固定させる。他の方法として、抗ＨＩＶ抗体がいろいろのＨＩＶ分離体の間に高度に保存されているエピトープを認知する際、一つ又は限定された数の成熟ＨＩＶ様粒子を固定させることができる。単一のＨＩＶ分離体（例えば、ＬＡ１、ＭＮ、ＳＦ２又はＨＸＢ２）を認知する抗体を特異的に同定することが要求される他の診断様態として、本発明の単一の特定成熟ＨＩＶ様粒子を固定させることができる。このような追加の診断様態は、抗体反応を含んだ免疫反応の誘発を担当する特定のＨＩＶ分離体を決定するのに重要な医薬、臨床試験、法医学分野で特定の用途を有する。
【００５７】
追加の診断様態として、免疫学的に区分されるＨＩＶ、例えばそれぞれ異なる部類に属するＨＩＶ分離体を特異的に同定することが必要であることもある。免疫学的に区分されるＨＩＶ分離体は、例えばＬＡ１、ＭＮ、ＳＦ２、ＨＸＢ２、又は原始ＨＩＶ−１分離体を含むことができる。このような診断様態において、本発明の特定成熟ＨＩＶ様粒子はそのような免疫学的に区分されるＨＩＶ分離体を特異的に認知するモノクローナル抗体を含んだ抗体の生成に有用である。
【００５８】
免疫学的に区分される成熟ＨＩＶ様粒子が、例えばワクチン又は診断剤において免疫源として使用できることは当然である。交差分離体の保護及び／又は診断を提供するために、成熟ＨＩＶ様粒子の混合物を使用する状況があり得る。このような場合、免疫源の混合物は通常「カクテル」製剤という。
【００５９】
追加の診断学的様態として、本発明の免疫学性組成物は、個別的に又はカクテル製剤を含む混合物であって、生物学的サンプルを含んだサンプル中でＨＩＶ又は抗原を検出し或いはＨＩＶを中和させるために使用できるＨＩＶ抗原特異的抗体（モノクローナル抗体を含む）の生成のために有用である。
【００６０】
さらに他の診断学的様態として、本発明の成熟ＨＩＶ様粒子は、例えば診断又は治療のためのＨＩＶ感染者から採取した生物学的サンプル中でＨＩＶ特異的Ｔ細胞を特異的に刺激するために使用することができる。
【００６１】
次の実施例は本発明を例示するためのものである。従って、本発明の範囲が下記の実施例によって制限されてはならない。
【００６２】
〔実施例〕
［実施例１］ｐＳＦＶ／ｇａｇ及びｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ発現ベクターの製造
Ｇａｇ蛋白質は、ＨＩＶ−１のｇａｇｐｏｌの全長ＲＮＡで発現されるビリオンの主な構成要素である。Ｇａｇ蛋白質はそれ自体のみでも他のウィルス蛋白質なしでウィルス様粒子（ＶＬＰ）をアセンブルすることができるものと知られている。Ｇａｇ蛋白質はｐｏｌ遺伝子によって発現されるウィルスプロテアーゼによってマトリックス（ＭＡ、ｐ１７）、カプシド（ＣＡ、ｐ２４）、ヌクレオカプシド（ＮＡ、ｐ９）及びｐ６の蛋白質でプロセシングされて成熟粒子（ｍａｔｕｒｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を形成する（Ｇｈｅｙｓｅｎ Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ， ５９， １０３−１１２（１９８９））。本発明ではＨＩＶ−１のｇａｇ遺伝子をαウィルスレプリコンに挿入してＧａｇを発現させる発現ベクターを製造した。
【００６３】
ＨＩＶ ｃｌａｄｅ Ｅ遺伝子を（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ５１１８８， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｌｙ， １９９６）鋳型として使用した。ｐＳＦＶ／ｇａｇを作るために、Ｇａｇの全長遺伝子に該当するＨＩＶ−１の塩基序列（８３２−２３２８ｂｐ）を下記のプライマー１及びプライマー２を用いてＰＣＲで増幅した。Ｇａｇと共に、プロテアーゼＰｒｏを発現させるためにｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏを製作した。ＨＩＶ−１のｇａｇ、フレームシフト部位及びプロテアーゼ部位を含んだ全長遺伝子（８３２−２５７７ｂｐ）をプライマー１及びプライマー３を用いてＰＣＲで増幅した。鋳型としてＨＩＶ−１ ｃｌａｄｅ Ｅ全長遺伝子を持っているｐＵＨＤ（１００ｎｇ／μｌ）に２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）４μｌ、センスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、アンチセンスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１０Ｘバッファ５μｌ、Ｄ．Ｗ．３７μｌを入れて混合液を作った後、９８℃で５分間変性させた後、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μｌを添加し、その後９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分に保たせる一連の反応を３０回繰り返し行った。増幅された遺伝子をそれぞれｐＳＦＶのＢａｍＨＩサイトに挿入してｐＳＦＶ／ｇａｇ（図３）及びｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ（図４）を作った。
プライマー１：センス（序列１）
５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＧＴ−３’
プライマー２：アンチセンス（序列２）
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＡ−３
プライマー３：アンチセンス（序列３）
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＡＴＣＴＧＡＧＴＣＡＡＣＡ−３’。
【００６４】
［実施例２］ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｇａｇ、又はｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏを用いたＶＬＰの製造
ＨＩＶ−１のプロテアーゼ（Ｐｒｏ）は、ビリオンのバッディング（ｂｕｄｄｉｎｇ）中或いはバッディング後に活性化され、Ｇａｇ又はＧａｇｐｏｌポリプロテインを切断することにより構造蛋白質をプロセシングするのに関与する。本実験ではｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒと共に実施例１で製造したｐＳＦＶ／ｇａｇ又はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏを宿主細胞で発現させた。
【００６５】
ｐＳＦＶ／ｇａｇ又はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏを制限酵素ＰｖｕＩで処理して線状ＤＮＡに作った後Ｐ／Ｃ処理した。前記ＤＮＡ１０μ、１０×ＳＰ６バッファ（ＴａＫａＲａ）５μｌ、１０ｍＭ ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＢＭ）５μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ２．５μｌ、ｒＮＴＰ ｍｉｘ（１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０ｍＭ ＵＴＰ、５ｍＭ ＧＴＰ、ＢＭ）５μｌ、ＲＮａｓｉｎ（ＢＭ）２μｌ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）１．５μｌ、Ｄ．Ｗ．１９μｌで混合液を作った後、３７℃で１時間３０分間反応させた。ｍＲＮＡ転写物（ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒＲＮＡ転写物２５μｌにそれぞれ前記ｐＳＦＶ／ｇａｇ又はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏＲＮＡ転写物５０μｌ）を、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ， １．３７ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ， ０．０２ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ， ０．１ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ／ｍｌ）バッファに浮遊させたＢＨＫ−２１細胞（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）８００μｌに入れた後、０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベットで８３０Ｖ／２５μＦで２番パルスを与えた（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）。トランスフェクション４８時間後に上澄液を３５００ｒｐｍで、１５分間遠心分離した後、さらに超高速遠心分離（ＳＷ４１ ｒｏｔｏｒ， ２ｈｒ， ３０，０００ｒｐｍ， ４ ， ＢＥＣＫＭＡＮ）してウィルス粒子を得た。このペレットをＴＮＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）バッファに浮遊させて−７０℃で保管した。上澄液から収集した欠損ＶＬＰ（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＶＬＰ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ＡＩＤＳ患者の血清（ｐａｔｉｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ）を用いてウェスタンブロットした（図５）（レインＭ：陰性対照群；レイン１：ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｌａｃＺから生成されたＶＬＰ；レイン２：ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｇａｇから生成されたＶＬＰ；レイン３：ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏから生成されたＶＬＰ）。
【００６６】
図５のレイン２からＧａｇ蛋白質が検出された。これはＢＨＫ−２１の細胞質内に入ったｐＳＦＶ／ｇａｇ ＲＮＡ転写物によってＧａｇ蛋白質が発現され、前記Ｇａｇ蛋白質からなるＨＩＶＬＰがＳＦＶＬＰ粒子と共に細胞上澄液に放出されたことを示す。Ｇａｇ蛋白質とＰｒｏを共に発現させるために作製されたｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ発現システムのウェスタンブロットではｐＳＦＶ／ｇａｇの場合に比べて少量のＧａｇ蛋白質が検出された（図５、レイン３）。
【００６７】
ＴＮＥバッファに浮遊しているウィルス粒子１００μｌにキモトリプシン（１０ｍｇ／ｍｌ）５μｌ、５０ｍＭ ＣａＣｌ２５μｌを入れて氷で３０分間反応させた後、アプロチニン（２ｍｇ／ｍｌ）４５μｌを入れて前記ＶＬＰを活性化させた。前記活性化された粒子を７０％単一層の（ｍｏｎｏｌａｙｅｒｅｄ）ＢＨＫ−２１細胞に感染させ、１時間３０分後に新しい培地を入れた後２日間培養した。２日後に細胞溶解バッファ（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ： １％ ＮＰ４０ （Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＥＤＴＡ， １μｇ／ＭｌＰＭＳＦ）２００μｌで１時間反応させ、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４、５分）して得た上澄液にサンプルバッファを入れて５分間沸した後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動した。電気泳動したゲルをＰＶＤＦウェスタンブロットメンブレイン（ＢＭ）で１５Ｖ、７ｍＡで２時間トランスファーした後、特異的抗体を用いてウェスタンブロットした。使用された１次抗体はＡＩＤＳ患者の血清、２次抗体はビオチン化された抗ヒトＩｇＧである。ブロットはＡＢ溶液と反応させた後、ＤＡＢ溶液で発色させた（図６）（レイン１：ｐＳＦＶ／ｇａｇから得られたＶＬＰで感染させたＢＨＫ−２１細胞；レイン２：ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏから得られたＶＬＰで感染させたＢＨＫ−２１細胞）。５５ｋＤａのバンドは、再感染結果、ＢＨＫ−２１細胞の細胞質でＧａｇ蛋白質が生成されたことを示す。従って、ｐＳＦＶ／ｇａｇ又はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏから得られたＶＬＰが、ｇａｇ遺伝子を有する感染性ＶＬＰであることが分る。
【００６８】
［実施例３］ｐＳＦＶ／ｇａｇ又はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏを用いたＶＬＰの製造
前記実施例２で作られたＶＬＰには、ＳＦＶのコアからなるＶＬＰ（ＳＦＶＬＰｇａｇ又はＳＦＶＬＰｇａｇｐｒｏ）とＨＩＶ−１コアを有するＶＬＰ（ＨＩＶＬＰｇａｇまたはＳＦＶＬＰｇａｇｐｒｏ）とが混合されているので、ＨＩＶ−１コアからなるＶＬＰのみを発現させようと、実施例１で作製されたｐＳＦＶ／ｇａｇとｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏをそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏ転写してｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒＲＮＡ転写物なしでＢＨＫ−２１細胞に、前記実施例２の方法でそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は−２０℃の冷たい１００％ＭｔＯＨで４〜６分間固定させ、１％のゼラチンで１時間ブロッキングした後、ＨＩＶのｐ２４（カプシド）に対するポリクローナル抗体（ウサギ）で免疫化学的ステイニングした。２次抗体はビオチン化された抗ウサギＩｇＧである。前記実験結果、形質転換されたＢＨＫ−２１細胞でＧａｇ蛋白質が発現されたことを確認することができた（図７）（Ａ：陰性対照群、トンラスフェクションされていないＢＨＫ−２細胞；Ｂ：ｐＳＦＶ／ｇａｇで形質転換されたＢＨＫ−２１細胞；Ｃ：ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏで形質転換されたＢＨＫ−２１細胞）。
【００６９】
細胞質内におけるＧａｇ蛋白質の検出に相次いで、実施例２の方法によって細胞培養培地上澄液からＶＬＰを分離してこれらをＥＭで観察した（図８）（Ａ：ｐＳＦＶ／ｇａｇから得られたＶＬＰ；Ｂ：ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏから得られたＶＬＰ）。ｐＳＦＶ／ｇａｇ又はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏＲＮＡ転写物をｐＳＶ−ｈｅｌｐｅｒ転写物なしで発現させた場合、ＨＩＶ−１のＧａｇのみからなる感染性ＶＬＰ（ＨＩＶＬＰｇａｇ）が生成されることが分った。
【００７０】
［実施例４］ｐＳＦＶ／ｅｎｖ発現ベクターの製造
ＨＩＶ−１のｇｐ１６０遺伝子を増幅するためにＨＩＶ ｃｌａｄｅ Ｅ遺伝子を（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ５１１８８， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｌｙ， １９９６）鋳型とし、プライマー４及びプライマー５を用いて塩基序列（６２６４−８８７９ｂｐ）をＰＣＲで増幅した。
プライマー４：センス（序列 ４）
５’−ＣＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＡＣＧＧＡ−３’
プライマー５：アンチセンス（序列 ５）
５’−ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＣ−３’
鋳型ＨＩＶ−１ ｃｌａｄ Ｅ全長遺伝子を持っているｐＵＨＤ（１００ｎｇ／μｌ）に２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）４μｌ、センスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、アンチセンスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１０Ｘバッファ５μｌ、Ｄ．Ｗ．３７μｌを入れて混合液を作った後、９８℃で５分間加温し、その後Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μｌを添加した後、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で３分に保たせる一連の反応を３０回繰り返し行った。増幅された遺伝子をｐＳＦＶベクターのＢａｍＨＩサイトに挿入してｐＳＦＶ／ｅｎｖ発現ベクターを製作した（図９）。
【００７１】
［実施例５］ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒ及びｐＳＦＶ／ｅｎｖを用いたＶＬＰの製造
ＨＩＶ−１のＥｎｖのみではＶＬＰを形成することができないので、ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｒとｐＳＦＶ／ｅｎｖを用いてＶＬＰを製造した。実施例４で製造されたｐＳＦＶ／ｅｎｖ発現ベクターを制限酵素ＳｐｈＩで処理して線状ＤＮＡに作った後、Ｐ／Ｃ処理した。このＤＮＡ１０μｌ、１０×ＳＰ６バッファ（ＴａＫａＲａ）５μｌ、１０ｍＭ ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＢＭ）５μｌ、１００ｍＭ ＤＴＴ２．５μｌ、ｒＮＴＰ ｍｉｘ（１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０ｍＭ ＵＴＰ、５ｍＭ ＧＴＰ、ＢＭ）５μｌ、ＲＮａｓｉｎ（ＢＭ）２μｌ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）１．５μｌ、Ｄ．Ｗ．１９μｌ）で混合液を作った後、３７℃で１時間３０分間反応させた。ｍＲＮＡ転写物（ｐＳＦＶ／ｈｅｌｐｅｒＲＮＡ転写物２５μｌ及びｐＳＦＶ／ｅｎｖＲＮＡ転写物５０μｌ）をＰＢＳに浮遊させたＢＨＫ−２１細胞に前記実施例２の方法でトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間の後、上澄液を３５００ｒｐｍで、１５分間遠心分離した後超高速遠心分離（ＳＷ４１ ｒｏｔｏｒ， ２ｈｒ， ３０，０００ｒｐｍ， ４ ， ＢＥＣＫＭＡＮ）してウィルス粒子を得た。このペレットはＴＮＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．４）， １００ｍＭ ＮａＣｌ， ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ） バッファに浮遊させて−７０℃で保管した。トランスフェクションされた細胞は−２０℃の冷たい１００％ＭｔＯＨで４〜６分間固定し、１％ゼラチンで１時間ブロッキングした後、特異的なモノクローナル抗体を用いて免疫化学的ステイニングした（図１０）（Ａ：陰性対照群、トランスフェクションされていないＢＨＫ細胞；Ｂ：ｐＳＦＶ／ｅｎｖでトランスフェクションされたＢＨＫ細胞）。１次抗体としてｇｐ１６０に対するモノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ）、２次抗体として、ビオチン化された抗マウスＩｇＧ（５μｌ／ｍｌ）を使用し、ＡＢ溶液 （ａｖｉｄｉｎ ５μｌ， ｂｉｏｔｉｎ ５μｌ／ＰＢＳ １Ｍｌ， ＶＥＣＴＯＲ）に３０分間反応させた後、ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｚｉｄｉｎｅ）溶液（ベクター）で発色させた。
【００７２】
ｐＳＦＶ／ｅｎｖでトランスフェクションされた細胞でＥｎｖ蛋白質が発現された。
【００７３】
ＴＮＥバッファに浮遊しているウィルス粒子１００μｌにキモトリプシン（１０ｍｇ／ｍｌ）５μｌ、５０ｍＭ ＣａＣｌ２５μｌを入れて氷で３０分間反応させた後、アプロチニン（２ｍｇ／ｍｌ）４５μｌを入れてＶＬＰを活性化させた。前記粒子をウィルス７０％単一層の（ｍｏｎｏｌａｙｅｒｅｄ）ＢＨＫ−２１細胞に感染させ、１時間３０分後に新しい培地を入れて２日間培養した。２日後に細胞溶解バッファ（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ： １％ ＮＰ４０， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ２ｍＭ ＥＤＴＡ， １μｇ／Ｍｌ ＰＭＳＦ）２００μｌで１時間反応させた後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、４、５分）して得た上澄液にサンプルバッファを入れて５分間沸した後、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動した。電気泳動したゲルをＰＶＤＦウェスタンブロットメンブレイン（ＢＭ）で１５Ｖ、７ｍＡで２時間トランスファーした後、特異的抗体を用いてウェスタンブロットした。使用された１次抗体はＡＩＤＳ患者の血清、２次抗体はビオチン化された抗ヒトＩｇＧであり、ブロットはＡＢ溶液と反応させた後ＤＡＢ溶液で発色させた（図１１）（レイン１：陰性対照群、ＢＨＫ−２１細胞；レイン２：ＶＬＰで感染させたＢＨＫ−２１細胞）。ＶＬＰを収去してこれをｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化させた後、ＢＨＫ−２１細胞に感染させた結果、ＢＨＫ−２１細胞の細胞質でＥｎｖ蛋白質が生成されたので、感染性ＳＦＶＬＰｅｎｖが生成されたことが分る。
【００７４】
［実施例６］ｐＳＦＶ／ｇａｇ及びｐＳＦＶ／ｅｎｖを用いたＶＬＰの製造
ＨＩＶのｇａｇ遺伝子のみを発現させた場合に未成熟ＶＬＰがアセンブルされるという事実、及びＨＩＶの中和抗体を形成するのにＥｎｖ蛋白質が重要な役割を果たすという事実が知られている（Ｇｈｅｙｓｅｎ Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ５９， １０３−１１２ （１９８９）； Ｌａｓｋｙ， Ｌ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ９３２−９３５ （１９８６）； Ｌａｓｋｙ，Ｌ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ５０， ９７５−９８５ ９１９８７）。 従って、Ｇａｇからなる粒子にＥｎｖを挿入するために、実施例１で製造されたｐＳＦＶ／ｇａｇと実施例４で製造されたｐＳＦＶ／ｅｎｖのＲＮＡ転写物とを同時にトランスフェクションする実験を行った。
【００７５】
ｐＳＦＶ／ｇａｇとｐＳＦＶ／ｅｎｖを前記実施例２に記述の方法によってそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏ転写して（ｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒなしで）ＢＨＫ−２１細胞に同時トランスフェクションさせ、４８時間培養した後、ＧａｇとＥｎｖを全て認識するＡＩＤＳ患者の血清、及びＥｎｖを認識するｇｐ１６０に対するモノクローナル抗体で細胞をイムノステイニングした。患者の血清でステイニングした場合（図１２のＣ）がｇｐ１６０に対するモノクローナル抗体でステイニングした場合（図１２のＢ）よりさらに多くステイニングされたことから、細胞でＨＩＶ−１のＧａｇ及びＥｎｖが全て発現されたことが分った（図１２）（Ａ：陰性対照群；Ｂ：ｇｐ１６０に対するモノクローナル抗体；Ｃ：ＡＩＤＳ患者の血清）。この結果からＨＩＶ−１のＧａｇとＥｎｖからなるＨＩＶＬＰが作られていることが分る。
【００７６】
［実施例７］ＶＬＰ内にパッケージングされたＲＮＡの分析
ｐＳＦＶ／ｇａｇＲＮＡ転写物のみを発現させて得られた実施例３のＶＬＰ、又はｐＳＦＶ／ｇａｇとｐＳＦＶ／ｅｎｖのＲＮＡ転写物を同時にトランスフェクションして得られた実施例６のＶＬＰが核酸を含んでいるかを確認するために、前記のＶＬＰを１０％スクロースクッションに透過させた。他のＲＮＡ又はＤＮＡの汚染を防ぐために１ｍｇ ＲＮａｓｅＡと７０ Ｕ ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅＩによって常温で１時間Ｍｇ２ＳＯ４−アセテートバッファ状態で反応させた。ＲＮＡ分離キット（Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ； Ｖｉｏｇｅｎｅ）を用いてＲＮＡを分離し、ＲＴ−ＰＣＲとＰＣＲを行った。ｇａｇ遺伝子のためには６５０ｂｐ程度のｐ２４遺伝子を増幅し、ｅｎｖ遺伝子のためには３５０ｂｐ程度のｇｐ４１の一部分を増幅させた。
【００７７】
４μｌの５倍濃縮したスーパースクリプトＩＩ逆転写バッファ（２５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ ８．５］， ３７５ ｍＭ ＫＣｌ， １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２）、２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、４μｌのデオキシヌクレオシドトリホスフェートバッファ（ｄＮＴＰ；２５ｍＭ；ＴａＫａＲａ）及びプライマーを入れた後、総２０μｌにして４２℃で２分間放置した。前記溶液に１μｌのスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓのｐｏｌ遺伝子から由来した逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））を入れて４２℃で５０分間反応させてｃＤＮＡを作った。ｇａｇＲＮＡに対しては１μｌの１００ｐｍｏｌのプライマー６を、ｅｎｖＲＮＡのためにはプライマー７を使用した。プライマー６：アンチセンス（序列 ６）
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＴＴＴＣ−３´
プライマー７：アンチセンス（序列 ７）
５’−ＧＧＴＴＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＣＣＡ−３´
生成されたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させた後、７０℃で１５分間逆転写酵素の活性を抑制させた。このように生成されたｃＤＮＡをＺ ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）とプライマーを用いて増幅した（プライマー８とプライマー６、ｇａｇＲＮＡ検索；プライマー９とプライマー７、ｅｎｖＲＮＡ検索）。
プライマー８：センス（序列 ８）
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＡＴＣＡＣＣＴ−３´
プライマー９：センス（序列 ９）
５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧ−３´
鋳型として前記のＲＴ−ＰＣＲで生成されたｃＤＮＡ１０μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）４μｌ、センスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、アンチセンスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｚ ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１０Ｘバッファ５μｌ、Ｄ．Ｗ．２８μｌ、Ｚ ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （ＴａＫａＲａ）１μｌを入れて混合液を作った後、９４℃で５分間変性し、その９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分の一連の反応を３５回行い、７２℃で７分間反応させた。増幅された産物はアガロースゲルに電気泳動した後、ＵＶイリューミネイション（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）で観察した。
【００７８】
ｐ２４遺伝子はｐＳＦＶ／ｇａｇＲＮＡ転写物のみを発現させて得られたＨＩＶＬＰ又はｐＳＦＶ／ｇａｇとｐＳＦＶ／ｅｎｖのＲＮＡ転写物を同時にトランスフェクションして得られた全ＨＩＶＬＰで増幅された（図１３のレイン１及び２）。ところが、ｇｐ４１遺伝子はいずれのＶＬＰでも増幅されなかった（図１３のレイン１ないし３）。前記結果は只ｇａｇ遺伝子を持ったＲｎＡのみがＶＬＰにパッケージングされてバッディングされることを示す。（レイン１：ｐＳＦＶ／ｇａｇから得られたＶＬＰ；レイン２と３：ｐＳＦＶ／ｇａｇとｐＳＦＶ／ｅｎｖの同時トランスフェクションによるＶＬＰ；レイン１と２はｐ２４プライマーを用いて増幅したもので、レイン３はｐ４１プライマーを用いて増幅したものである。６５０ｂｐはｇａｇ遺伝子部位を、３５０ｂｐはｅｎｖ遺伝子部位を示す ）。
【００７９】
［実施例８］欠損ＳＦＶＬＰの感染によるＶＬＰの生産
前記実施例２及び実施例５から得られたＶＬＰをｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化させてＣＯＳ−１細胞に感染させた後、ＶＬＰが生産したか否かを確認した。感染したＣＯＳ−１細胞溶解物と上澄液から得たＶＬＰとをＡＩＤＳ患者の血清とｐ２４に対するポリクローナル抗体（ウサギ）とｐ２４に対するモノクローナル抗体でウェスタンブロットした（図１４）。（Ａ：ＡＩＤＳ患者の血清；Ｂ：ｐ２４に対するポリクローナル抗体；Ｃ：ｐ２４に対するもモノクローナル抗体；陰性対照群（レイン１、４、７、１０、１３）；ＳＦＶＬＰｇａｇによる感染（レイン２、５、８、１１、１４）；ＳＦＶＬＰｇａｇとＳＦＶＬＰｅｎｖによる同時感染（レイン３、６、９、１２、１５）；細胞溶解物（レイン１、２、３、７、８、９、１０、１１、１２）；ＶＬＰ（レイン４、５、６、１３、１４、１５））。
【００８０】
図１４のＡとＢにおいて、ｇａｇ遺伝子を含有した欠損ＳＦＶＬＰで感染させた場合、細胞内（レイン２、８）とその上澄液のＶＬＰ（レイン５）からＧａｇ蛋白質が検出された。ｇａｇとｅｎｖ遺伝子をそれぞれ含有しているＳＦＶレプリコンを同時に感染させた場合には細胞内（レイン３、９）とその上澄液から得たＶＬＰ（レイン６）よりＧａｇとＥｎｖの蛋白質が全て検出された。従って、ＧａｇとＥｎｖ蛋白質が一つの細胞で同時に発現される場合、この２つの蛋白質からなるＶＬＰが生成されることを確認することができた。
【００８１】
図１４のＣでｐ２４に対するモノクローナル抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ， Ｃａｔ． Ｎｏ． ４９９９−８６０７）でウェスタンブロットした結果、Ｇａｇの前駆体であるＰｒ５５及びｐ２４が検出された。これはＣＯＳ−１細胞内でＨＩＶ−１のプロテアーゼが発現されなくてもＧａｇの前駆体がプロセシング或いは変性されることができるものと考えられる。
【００８２】
［実施例９］ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇとｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｒｏ発現ベクターの製作
２６Ｓサブプロモータを有するｐｒｏ（２２６８−２６０６ｂｐ）遺伝子をクローニングするためにｐＳＦＶ／ｐｒｏを製作した。プライマー１０及びプライマー１１を用いて、鋳型としてＨＩＶ−１ ｃｌａｄ Ｅ全長遺伝子を持っているｐＵＨＤ（１００ｎｇ／μｌ）に２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）４μｌ、センスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、アンチセンスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１０Ｘバッファ５μｌ、Ｄ．Ｗ．３７μｌを入れて混合液を作った後、９８℃で５分後、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μｌを添加し、その後９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で３０秒に保たせる一連の反応を４０回繰り返し行った
プライマー１０：センス（序列 １０）
５’−ＣＣＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣ−３’
プライマー１１：アンチセンス（序列 １１）
５’−ＣＡＡＣＣＣＧＧＧＴＣＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＧＴＣＡＡＴＡＧＧＡＣＴＡＡＴ−３’。
【００８３】
プライマーの両末端に装着したＥｃｏＲＶとＳｍａＩサイトを用いて、ｐＳＦＶのマルチクローニング部位であるＳｍａＩサイトに、前記反応で増幅された遺伝子を挿入した（図１５）。
【００８４】
ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇベクターは、前記実施例１で製造したｐＳＦＶ／ｇａｇを鋳型として２６Ｓサブゲノミックプロモータに対するプライマー１２（センス）、ｇａｇに対するプライマー２（アンチセンス）を用いて２６Ｓｇａｇ遺伝子を増幅した後、ｐＳＦＶ／ｅｎｖのＳｍａＩサイトに挿入することにより製造した（図１６）。
プライマー１２：センス（序列 １２）
５’−ＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＣＣＴＣＴＡＣＧＧＣＧＧＴＣＣＴＡ−３’
プライマー１３：アンチセンス（序列 １３）
５’−ＣＧＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣＴＧＴＧＡＣＡＡＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＡ−３’
前記で製造したｐＳＦＶ／ｐｒｏを鋳型として、サブゲノミックプロモータプライマー（序列１２）とｐｒｏのアンチセンスプライマー（序列１１）を用いて２６Ｓｐｒｏ遺伝子を増幅し、これを前記ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇのＳｍａＩサイトに挿入してｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇｅｇ−ｐｒｏを製作した（図１７）。ここで増幅されたｐｒｏ ｇｅｎｅは実施例１のｇａｇｐｒｏのｐｒｏ遺伝子よりＮ末端序列が減少し、Ｃ末端序列がさらに含まれている。これはセルフプロセシングするのに必要な序列を含んでｐｒｏ遺伝子を増幅したものである（Ｖｉｖｉａｎｅ Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７３， ６３９−６５１（１９９２））。本発明のｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｒｏベクターはブダペスト条約下の寄託機関であるＫｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託番号ＫＣＣＭ−１０２３３で寄託された。
【００８５】
［実施例１０］ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇｅｇの発現によるＶＬＰの生産
ＧａｇにＥｎｖが挿入されたＶＬＰを作るためにＨＩＶの２つの構造蛋白質がそれぞれのプロモータの下で一つのベクターに連続的にクローニングされた実施例９の発現ベクターｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇを細胞に感染させた。ｐＳＦＶ−ｅｎｖ−ｇａｇのＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションして４８時間後にその細胞溶解物又は培地上澄液から得たＶＬＰをＡＩＤＳ患者の血清でＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）方法を用いてウェスタンブロットした（図１８）（レイン１：陰性対照群、レイン２、３：細胞溶解物；レイン４、５：細胞上澄液）。ＶＬＰからＧａｇとＥｎｖの２つの蛋白質が全て発見されたので、２つのサブゲノミックプロモータの下でｅｎｖとｇａｇ遺伝子をそれぞれ連結してクローニングした際にこれらの２つの蛋白質が細胞で全て発現され、相互結合してウィルス粒子を形成することが分る。図１８において培地上澄液のＧａｇ蛋白質の大きさが小さく見えるのは、血清成分である６５ｋＤａのアルブミンによって押されて電気泳動されたためである。
【００８６】
［実施例１１］ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｒｏの発現によるＶＬＰの製造
前記実施例９で製造されたｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｒｏベクターを宿主細胞にトランスフェクションさせてそれぞれの蛋白質を発現した。ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｒｏのＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションさせた後、４８時間後に細胞をＡＩＤＳ患者の血清、ｇｐ１６０に対するモノクローナル抗体、ｐ２４に対するモノクローナル抗体及びプロテアーゼに対するポリクローナル抗体（羊）で免疫細胞化学ステイニングした（図１９）（Ａ：陰性対照群；Ｂ：患者の血清；Ｃ：ｇｐ１６０に対するモノクローナル抗体；Ｄ：ｐ２４に対するポリクローナル抗体；Ｅ：プロテアーゼに対するポリクローナル抗体）。これらの抗体が全て各抗原を認識したので、それぞれの２６ＳサブゲノミックプロモータからＧａｇ、Ｅｎｖ及びＰｒｏが全て発現されたことが分る。前記実験はひいてはαウィルス発現ベクターの３つのサブゲノミックプロモータにそれぞれ連結された３つ以上の外来遺伝子が全て発現できることを示す結果でもある。
【００８７】
［実施例１２］ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥ発現ベクターの製造
ｐＳＦＶ／ＣＴＥベクターを製造するために、ｐＧＥＭ７ｆｚ（−）／ＭＰＭＶを鋳型として下記のプライマー１４とプライマー１５を用いて増幅した後、ｐＳＦＶのＢａｍＨＩとＳｍａＩサイトに挿入した（図２０）。前記ベクターに実施例１で製造したｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏのｇａｇｐｒｏをＢａｍＨＩ処理してｐＳＦＶ／ＣＴＥのＢａｍＨＩサイトに挿入してｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥを製造した（図２１）。ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥベクターはｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ序列の後にＭａｓｔｏｎ−Ｐｆｚｉｅｒ ｍｏｎｋｅｙウィルスのＣＴＥ遺伝子を挿入したものである。
【００８８】
前記ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥを鋳型として、２６Ｓサブゲノミックプロモータを含んだｇａｇｐｒｏ全長遺伝子とＣＴＥ遺伝子をＰＣＲで増幅し、実施例９で製作されたｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇプラスミドのＳｍａＩサイトに挿入してｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥ発現ベクターを製造した（図２２）。増幅反応はプライマー１２及びプライマー１５を用いて鋳型ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥ１μｌに２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）４μｌ、センスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、アンチセンスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１０Ｘバッファ５μｌ、Ｄ．Ｗ．３７μｌを入れて混合液を作った後、９８℃で５分後、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μｌを添加し、その後９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で２分に保たせる一連の反応を４０回繰り返し行った。本発明のｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥベクターは、ブダペスト条約下の寄託機関であるＫｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託番号ＫＣＣＭ−１０２３４で寄託された。
プライマー１４：センス（序列 １４）
５’−ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＡＧＡＣＴ−３’
プライマー１５：アンチセンス（序列 １５）
５’−ＡＡＴＧＡＴＡＴＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＡＡ−３’
［実施例１３］ｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇΔｐｒｏ−ＣＴＥ発現ベクターの製造
ｇａｇΔｐｒｏはｇａｇｐｒｏのリボソームフレームシフトシグナルで保存された序列である５つのＴを除去したものである。このｇａｇΔｐｒｏを作るために、まず前記実施例１のｐＳＦＶ／ｇａｇを鋳型として、２６Ｓサブゲノミックプロモータ及びフレームシフトとなる直前のｇａｇ遺伝子（８３２−２１１３）をプライマー１２と下記のプライマー１６を用いてＰＣＲで増幅した後、ｐＧＥＭＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。
【００８９】
増幅は鋳型としてｐＳＦＶ／ｇａｇ１μｌに２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）４μｌ、センスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、アンチセンスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１０Ｘバッファ５μｌ、Ｄ．Ｗ．３７μｌを入れて混合液を作った後、９８℃で５分後、 Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μｌを添加し、その後９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分に保たせる一連の反応を４０回繰り返し行った。また、前記実施例１２のｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥを鋳型としてフレームシフトシグナルの保存序列を排除したｐｒｏの全長遺伝子をプライマー１７とプライマー１５を用いてＰＣＲで増幅した後、ｐＧＥＭＴベクターに挿入した。
プライマー１６：アンチセンス（序列 １６）
５’−ＡＡＴＡＧＧＣＣＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＧＣＡＧＴＣＴＴ−３’
プライマー１７：センス（序列 １７）
５’−ＣＡＣＡＧＧＣＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣ−３’
２つの遺伝子はＳｔｕＩ制限酵素で処理して連結し、この過程中にアミノ酸Ａｓｎ（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）がＴｙｒ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）で置換され、５つのＴを除去することによりＰｈｅ（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）アミノ酸２つが除去された。完成したｇａｇｐｒｏはＥｃｏＲＶ制限酵素を処理してｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇのＳｍａＩサイトに挿入してｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇΔｐｒｏ−ＣＴＥ発現ベクターを製造した（図２３）。
（序列１８）    Ｆ     Ｆ     Ｒ     Ｅ
ＣＡＧ ＧＣＴ ＡＡＴＴＴ ＴＴＴ ＡＧＧ ＧＡＡ     Ｇａｇ−ｐｏｌのフレームシフト部位
Ｑ      Ａ     Ｎ
（序列１９）
ＣＡＧ ＧＣＣ ＴＡＴ ＡＧＧ ＧＡＡ           ＧａｇΔｐｒｏの変形部位
Ｑ     Ａ    Ｙ     Ｒ     Ｅ。
【００９０】
［実施例１４］ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ発現ベクターの製造
本発明ではＨＩＶ−１のｇａｇｐｏｌ遺伝子をαウィルスレプリコンに挿入してＧａｇｐｏｌポリプロテインを発現させる発現ベクターを製造した。
【００９１】
ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌを作るために、Ｇａｇｐｏｌの全長遺伝子に該当するＨＩＶ−１の塩基序列（８３２−５１３２ｂｐ）を下記のプライマー１８及びプライマー１９を用いてＰＣＲで増幅した。鋳型としてＨＩＶ−１ ｃｌａｄｅ Ｅ全長遺伝子を持っているｐＵＨＤ（１００ｎｇ／μｌ）に２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）４μｌ、センスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、アンチセンスプライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１０Ｘバッファ５μｌ、Ｄ．Ｗ．３７μｌを入れて混合液を作った後、９８℃で５分間変性させ、その後Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μｌを添加した後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で３分に保たせる一連の反応を４０回繰り返し行った。
プライマー１８：センス（序列 ２０）
５’−ＴＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡ−３’
プライマー１９：アンチセンス（序列 ２１）
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＧＴＣＴＡＣＣ−３’
前記増幅された遺伝子をｐＳＦＶのＢａｍＨＩサイトに挿入してｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ（図２４）を作った。
【００９２】
［実施例１５］ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌを用いたＶＬＰの生産
プロセシングされたＨＩＶ−１コアからなるＶＬＰを発現させようと、実施例１４で作製された発現ベクターｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写してｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒＲＮＡ転写物なしでＢＨＫ−２１細胞に、前記実施例２の方法でそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は−２０℃の冷たい１００％ＭｔＯＨで４〜６分間固定させ、１％のゼラチンで１時間ブロッキングした後、細胞をＡＩＤＳ患者の血清、ｐ２４に対するポリクローナル抗体及びプロテアーゼに対するポリクローナル抗体で免疫細胞化学ステイニングした（図２５）（Ａ：陰性対照群；Ｂ：患者の血清；Ｃ：ｐ２４ｐに対するポリクローナル抗体；Ｄ：プロテアーゼに対するポリクローナル抗体）。前記実験結果、形質転換されたＢＨＫ−２１細胞でＧａｇ蛋白質だけでなくＧａｇｐｏｌポリプロテインが発現されたことを確認することができた。
【００９３】
ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌのＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションして４８時間後、その細胞溶解物又は培地上澄液からＶＬＰを分離してｐ２４に対するポリクローナル抗体でＥＣＬ方法を用いてウェスタンブロットした（図２６）（レイン１、４：陰性対照群；レイン２、５：ｐＳＦＶ／ｇａｇから得られたサンプル；レイン３、６：ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌから得られたサンプル；細胞溶解物（レイン１、２、３）；ＶＬＰ（レイン４、５、６））。
【００９４】
ｐＳＦＶ／ｇａｇをトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞内ではＰｒ５５のみが発現されて上澄液から未成熟ＶＬＰが検出されたが、ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌをトランスフェクションしたＢＨＫ−２１細胞内では殆どのＰｒ５５がプロセシングされて多量のｐ２４が発現され、上澄液ではプロセシングされた成熟ＶＬＰを発見することができた。
【００９５】
［実施例１６］ｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｔＭＣＴＥとｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥ発現ベクターの製造
本発明では、Ｅｎｖを持っている成熟ＨＩＶＬＰを製造するために２６ＳサブゲノミックプロモータとＭＣＴＥを含んだｅｎｖ遺伝子を増幅した後、ｐＳＦＶ／ｇｐｏｌのＳｍａＩサイトに挿入することにより、ｐＳＦＶ／ｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥを製造した。また、この作製物との比較実験のためにｐＳＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥを製造した。
【００９６】
ｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥを作るために、まずｐＳＦＶ／ｇａｇを新しく構築した。実施例１で作られたｐＳＦＶ／ｇａｇのｇａｇ遺伝子の前にはＳｍａＩサイトを含んでいるので、ＳｍａＩサイトを除去したプライマー１８とプライマー２を用いてＧａｇの全長遺伝子に該当するＨＩＶ−１の塩基序列（８３２−２１１３ｂｐ）をＰＣＲで増幅して前記実施例１と同一の方法で製造した。
【００９７】
ｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥは、実施例１２で製造されたｐＳＦＶ／ＭＣＴＥのＢａｍＨＩサイトに、前記実施例４と同一の方法で製造されたｐＳＦＶ／ｅｎｖＭＣＴＥ（図２７）を鋳型として２６Ｓサブゲノミックプロモータに対するプライマー１２（センス）とＭＣＴＥに対するプライマー１５（アンチセンス）を用いて２６ｅｎｖＭＣＴＥ遺伝子を増幅した後、ｐＳＦＶ／ｇａｇのＳｍａＩサイトに挿入することにより製造した（図２８）。
【００９８】
ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥは、前記の方法で２６ＳｅｎｖＭＣＴＥ遺伝子を増幅した後、ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌのＳｍａＩサイトに挿入することにより製造した（図２９）。本発明のｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖ−ＭＣＴＥベクターは、ブダペスト条約下の国際寄託機関であるＫｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託番号ＫＣＣＭ−１０３４８で寄託された。
【００９９】
［実施例１７］ｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥ及びｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥを用いたＶＬＰの生産
ｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写してｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒＲＮＡ転写物なしでＢＨＫ−２１細胞に、前記実施例２の方法によってトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は−２０℃の冷たい１００％ＭｔＯＨで４〜６分間固定させ、１％のゼラチンで１時間ブロッキングした後、細胞をＡＩＤＳ患者の血清、ｐ２４に対するポリクローナル抗体、プロテアーゼに対するポリクローナル抗体及びｅｎｖに対するモノクローナル抗体で免疫細胞化学ステイニングした（図３０）（Ａ：陰性対照群；Ｂ：患者の血清；Ｃ：ｐ２５ｐに対するポリクローナル抗体；Ｄ：プロテアーゼに対するポリクローナル抗体）。前記実験結果、形質転換されたＢＨＫ−２１細胞でＧａｇ蛋白質だけでなくＥｎｖ蛋白質が発現されたことを確認することができた。
【０１００】
ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥも前記実施例２の方法でトランスフェクションした（図３１）（Ａ：陰性対照群；Ｂ：患者の血清；Ｃ：ｐ２４に対するポリクローナル抗体；Ｄ：プロテアーゼに対するポリクローナル抗体；Ｅ：ｅｎｖに対するモノクローナル抗体）。前記実験結果、形質転換されたそれぞれのＢＨＫ−２１細胞でＧａｇｐｏｌ蛋白質だけではくＥｎｖ蛋白質が発現されたことを確認することができた。
【０１０１】
ｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥ及びｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥのＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションして４８時間後、その培地の上澄液からＶＬＰを分離してｐ２４に対するポリクローナル抗体、ｅｎｖに対するモノクローナル抗体でＥＣＬ方法を用いてウェスタンブロットした（図３２）（Ａ：患者の血清；Ｂ：ｅｎｖに対するモノクローナル抗体；レイン１、４：ｐＳＦＶ／ｇａｇから得られたＶＬＰ；レイン２、５：ｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥから得られたＶＬＰ；レイン３、６：ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥから得られたＶＬＰ）。前記の結果により、ｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥを発現させた場合、Ｅｎｖを含み、プロセシングされた成熟ＶＬＰを生産することができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＨＩＶ−１のゲノム構造を示す概要図である。
【図２】
図２はｐＳＦＶベクター及びｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒの構造を示す概要図である。
【図３】
図３はｐＳＦＶ／ｇａｇ発現ベクターの製造過程を示す概要図である。
【図４】
図４はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ発現ベクターの製造過程を示す概要図である。
【図５】
図５はｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｇａｇ、又はｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションして得たウィルス粒子をＡＩＤＳ患者の血清でウェスタンブロットした結果を示す写真である。
【図６】
図６はｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｇａｇ、又はｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションして得たウィルス粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化してＢＨＫ−２１細胞に感染させた後、感染したＢＨＫ−２１細胞の溶解物をＡＩＤＳ患者の血清でウェスタンブロットした結果を示す写真である。
【図７】
図７はｐＳＦＶ／ｇａｇ又はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした後、細胞をｐ２４（カプシド）に対するポリクローナル抗体で免疫化学ステイニングしてＧａｇの発現を確認した写真である。
【図８】
図８はｐＳＦＶ／ｇａｇ（Ａ）又はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ（Ｂ）のＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした後、その細胞培養培地の上澄液から得たＶＬＰをネガティブステイニングして電子顕微鏡で観察した写真である（Ｘ１４０，０００）。
【図９】
図９はｐＳＦＶ／ｅｎｖ発現ベクターの製造過程を示す概要図である。
【図１０】
図１０はｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒＲＮＡ転写物と共にｐＳＦＶ／ｅｎｖＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした後、ｇｐ１６０に対するモノクローナル抗体で免疫化学ステイニングしてｇｐ１６０の発現を確認した写真である。
【図１１】
図１１はｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒＲＮＡ転写物と共にｐＳＦＶ／ｅｎｖＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションして得た欠損ＳＦＶ粒子をさらにｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化してＢＨＫ−２１細胞に感染させ、感染したＢＨＫ−２１細胞の溶解物をＡＩＤＳ患者の血清でウェスタンブロットした結果を示す写真である。
【図１２】
図１２はｐＳＦＶ／ｇａｇとｐＳＦＶ／ｅｎｖＲＮＡ転写物を同時にＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした後、ｇｐ１６０に対するモノクローナル抗体（Ｂ）又はＡＩＤＳ患者の血清（Ｃ）で細胞を免疫化学ステイニングしてＨＩＶ−１ ＥｎｖとＧａｇ蛋白質が同時に発現されたことを示す写真である。
【図１３】
図１３はｐＳＦＶ／ｇａｇＲＮＡ転写物、又はｐＳＦＶ／ｇａｇとｐＳＦＶ／ｅｎｖＲＮＡ転写物を同時にＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションしてそれぞれＶＬＰを得た後、これらの粒子内にパッケージングされたＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲとＰＣＲ分析した結果を示す写真である。
【図１４】
図１４はｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ−ｇａｇＲＮＡ転写物、又はｐＳＦＶ−ｈｅｌｐｅｒとｐＳＦＶ／ｅｎｖＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞に同時トランスフェクションして得たそれぞれの欠損ＳＦＶ粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化させてＣＯＳ−１細胞に再感染させた結果、ＨＩＶ−１のＧａｇとＥｎｖからなるＶＬＰが生成されたことを示すウェスタンブロット写真である。
【図１５】
図１５はｐＳＦＶ／ｐｒｏ発現ベクターの製造過程を示す概要図である。
【図１６】
図１６はｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ発現ベクターの製造過程を示す概要図である。
【図１７】
図１７はｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｒｏ発現ベクターの製造過程を示す概要図である。
【図１８】
図１８はｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇのＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションして得たＶＬＰ又は細胞溶解物をＡＩＤＳ患者の血清でウェストブロットした結果を示す写真である。
【図１９】
図１９はｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｐｒｏのＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした結果、ＨＩＶ−１のＧａｇ、Ｅｎｖ及びＰｒｏが発現されたことを示す免疫細胞化学分析写真である。
【図２０】
図２０はｐＳＦＶ／ＣＥＴ発現ベクターの製造過程を示す概要図である。
【図２１】
図２１はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥ発現ベクターの製造過程を示す概要図である。
【図２２】
図２２はｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥ発現ベクターの製造工程を示す概要図である。
【図２３】
図２３はｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇ−ｇａｇｐｒｏ−ＣＴＥ発現ベクターの製造過程として、ｇａｇの３’末端で生ずるフレームシフト塩基序列を除去したｇａｇｐｒｏをｐＳＦＶ／ｅｎｖ−ｇａｇに挿入したことを示す概要図である。
【図２４】
図２４はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌの製造過程を示す概要図である。
【図２５】
図２５はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌをＢＨＫ−２１の細胞にトランスフェクションした後、細胞をｐ２４に対するポリクローナル抗体及びプロテアーゼに対するポリクローナル抗体で免疫細胞化学ステイニングしてＧａｇ及びＧａｇｐｏｌポリプロテインの発現を確認した写真である。
【図２６】
図２６はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌのＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした後、細胞をｐ２４に対するポリクローナル抗体でＥＣＬ方法を用いてウェスタンブロットした結果を示す写真である。
【図２７】
図２７はｐＳＦＶ／ｅｎｖＭＣＴＥの製造過程を示す概要図である。
【図２８】
図２８はｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥの製造過程を示す概要図である。
【図２９】
図２９はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥの製造過程を示す概要図である。
【図３０】
図３０はｐＳＦＶ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥをＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした後、細胞をｐ２４に対するポリクローナル抗体、プロテアーゼに対するポリクローナル抗体及びｅｎｖに対するモノクローナル抗体でＧａｇ及びＥｎｖ蛋白質の発現を確認した写真である。
【図３１】
図３１はｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥをＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした後、細胞をｐ２４に対するポリクローナル抗体、プロテアーゼに対するポリクローナル抗体及びｅｎｖに対するモノクローナル抗体で免疫細胞化学ステイニングしてＧａｇｐｏｌポリプロテイン及びＥｎｖ蛋白質の発現を確認した写真である。
【図３２】
図３２はｐＳＦｖ／ｇａｇ−ｅｎｖＭＣＴＥ及びｐＳＦＶ／ｇａｇｐｏｌ−ｅｎｖＭＣＴＥのＲＮＡ転写物をＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションし、４８時間後、細胞をｐ２４に対するポリクローナル抗体及びｅｎｖに対するモノクローナル抗体でＥＣＬ方法を用いてウェスタンブロットした結果を示す写真である。
【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１５】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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