(57)【要約】リポソーム内容物質に対して制御された放出温度を有する熱不安定性リポソームは、本質的に０〜８０℃の範囲内にある主要変換温度を有する少なくとも１つのホスファチジルコリンおよびホスファチジルオリゴグリセリン２〜１５質量％から形成されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム内容物質に対して制御された放出温度を有する熱不安定性リポソームにおいて、本質的に０〜８０℃の範囲内にある主要変換温度を有する少なくとも１つのホスファチジルコリンおよびホスファチジルオリゴグリセリン２〜１５質量％から形成されていることを特徴とする、制御された放出温度を有する熱不安定性リポソーム。
【請求項２】
１−パルミトイル−２−オリオイルグリセロ−３−ホスホコリン、１−ステアロイル−２−オリオイル−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−ラウロイルグリセロ−３−ホスホコリン、１−ベヘノイル−２−オリオイルグリセロ−３−ホスホコリン、１−ステアロイル−２−ラウロイルグリセロ−３−ホスホコリン、１，３−ジミリストイルグリセロ−２−ホスホコリン、１，２−ジミリストイルグリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルグリセロ−３−ホスホコリン、１−ステアロイル−２−ミリストイルグリセロ−３−ホスホコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルグリセロ−３−ホスホコリン、１，３−パルミトイルグリセロ−２−ホスホコリン、１，２−ジパルミトイルグリセロ−３−ホスホコリン、１−ミリストイル−２−ステアロイルグリセロ−３−ホスホコリン、１−ステアロイル−３−ミリストイルグリセロ−２−ホスホコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルグリセロ−３−ホスホコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルグリセロ−３−ホスホコリン、１，３−ジステアロイルグリセロ−２−ホスホコリン、１，２−ステアロイルグリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキノイルグリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジベヘノイルグリセロ−３−ホスホコリンおよび１，２−ジリグノセロイルグリセロ−３−ホスホコリンからなる群から選択された少なくとも１つのホスファチジルコリンを含有する、請求項１記載のリポソーム。
【請求項３】
ホスファチジルオリゴグリセリンとしてジパルミトイルホスホグリセログリセリンを含有する、請求項１または２記載のリポソーム。
【請求項４】
本質的にジパルミトイルレシチン６５〜７５％（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルレシチン１５〜２５％（ＤＳＰＣ）およびジパルミトイルホスホグリセログリセリン５〜１０％（ＤＰＰＧ２）からなる、請求項１から３までのいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項５】
コレステリンを含有しない、請求項１から４までのいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項６】
作用物質および／または標識物質を含有する、請求項１から５までのいずれか１項に記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポソーム単位のために制御された放出温度を有する熱不安定性リポソーム、殊に４０〜８０℃の制御された放出温度を有する、３７℃で血清中で安定したリポソームに関する。
【０００２】
リポソームは、水性区画を含む脂質二重層から人工的に形成されるベシクルである（Bangham等1965）。リポソームは、元来なお細胞膜のための雛型系として利用されており、最近では、なかんずく医薬輸送のためにさらに開発された。この場合、リポソームは、作用物質の認容性を７５倍だけ（Proffitt他 1991）上昇させることができる（リポソーム配合物によるAmphothericin Bの活性毒性の低下）。しかし、医薬品を意図的に罹病した組織中に輸送する可能性も開示されている（Forssen他, 1992）。静脈内投与の後、リポソームは、主に肝臓および脾臓の細網内皮系統（ＲＥＳ）の細胞内に吸収される（Gregoriadis und Nerunhun 1974）。リポソームをＲＥＳの外側の細胞のための医薬品担体として利用することができるようにするために、血中のリポソームの循環時間を高めることが試みられた。それによって、なかんずく、しばしば極めて良好に血管化されかつ拡大された内皮化合物、多数の開窓および非連続的な基底膜（Murray and Carmichael 1995）によって特に透過性である腫瘍中で、リポソームの吸収可能性は、実質的に高められるであろう。
【０００３】
従って、体液中に作用物質または標識物質を輸送するためにリポソームを使用する際の第１の問題は、血清中での循環時間の上昇にある。実際に、リポソーム膜上へのメトキシポリエチレングリコールの共有結合によって、ＲＥＳによるリポソームの早期の認識を回避することができ、ひいては循環時間を改善することができることが既に見い出された。しかし、循環時間の改善とともに、温度の作用によってリポソーム内容物質の意図的な放出を一定の温度で達成するという可能性についての興味は大きい。
【０００４】
従って、本発明は、公知のリポソームの通常の半価時間と比較して４時間程長い程度に、血清中の本質的に改善された半価時間を有し、かつリポソームの内容物質が一定の温度で急速に放出される程度に得ることができるリポソームを得るという課題を基礎とする。
【０００５】
この課題は、本発明によれば、リポソーム内容物質に対して制御された放出温度を有するリポソームによって解決され、この場合このリポソームは、本質的に０〜８０℃の範囲内にある主要変換温度を有する少なくとも１つのホスファチジルコリンおよびホスファチジルオリゴグリセリン２〜１５質量％から形成されていることによって特徴付けられる。
【０００６】
本発明により形成されたリポソームは、本質的に血清中で２０時間までの改善された半価時間を有し、成分の適当な選択および成分の量により主要変換温度に依存して無いよう物質を予め定められ予め選択された温度で急速および完全に放出することができる。
【０００７】
好ましくは、本発明によるリポソームは、ジパルミトイルレシチン（１，２−ジパルミトイルグリセロ−３−ホスホコリン）６５〜７５％、ジステアロイルレシチン（１，２−ジステアロイルグリセロ−３−ホスホコリン）１０〜３０％およびジパルミトイルホスホグリセログリセリン５〜１０％から構成されている。この好ましい組成物は、３７℃で血清中で安定であるが、しかし、４０℃の温度を上廻る時点で内容物質を放出する。
【０００８】
本発明によるリポソームの前記の好ましい組成物は、それぞれの適当な主要変換温度を有する成分の選択によって別の温度範囲に対して調合することができる。第１表中には、主要変換温度が０〜８０℃の範囲内にある、ホスファチジルコリンの主要変換温度（Ｔｗ）が記載されている。主要変換温度は、表から確認することができるように、グリセロ−３−ホスホコリンの位置１および２またはグリセロ−２−ホスホコリンの位置１および３上の鎖長および分布に依存する。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
第１表中に記載された値は、グリセリン基本骨格上に奇数の鎖長および適当な分布を有する脂肪酸を使用することによって、実際に０〜８０℃の記載された範囲内の全ての望ましい温度を調節することができることを示す。
【００１１】
本発明によるリポソーム中のホスファチジルオリゴグリセリンの含量は、血清中の必要とされる長い循環時間にとって本質的なことである。ホスファチジルオリゴグリセリンおよびその製造は、ドイツ連邦共和国特許第１９６２２２２４号明細書の記載から公知である。好ましくは、ジパルミトイルホスホグリセログリセリン（ＤＰＰＧ２）が使用される。
【００１２】
本発明による熱不安定性リポソームは、顕著に種々の分野での使用に好適であるが、しかし、殊に局所的な深部温熱療法の範囲内に好適である。体系的な化学治療との組合せで特殊化された臨床中心で使用される局所的な深部温熱療法は、腫瘍特異性のリポソーム輸送にとって理想的な技術として提供され、リポソームカプセルからの医薬品の引続く放出を提供する。即ち、温熱療法は、一面で腫瘍毛管から間質中のリポソームの溢出を促進する（Gaber等 1996）。他面、特異的な感熱リポソームからの医薬品の放出は、加熱によって誘発されることができる（Magin und Niesman 1984）。付加的に、細胞成長抑制剤（Hahn他 1975）の上昇された細胞毒性効果ならびに局所的な深部温熱療法による免疫変調（NK細胞の活性化；Multhoff他 1999）についての数多くの指摘がある。
【００１３】
本発明によるリポソームの熱不安定性は、リポソーム膜内でのリン脂質の相変換に左右される。相変換温度を通過した場合には、本発明によるリポソームは、短時間の膜不安定性を生じ、引続きリポソーム内容物質の放出を生じる。
【００１４】
上記の局所的な深部温熱療法の場合、腫瘍は、局所的に特異的に過熱され、したがって温度は、リポソーム内容物質の放出のために限界温度を超えて上昇する。この場合、リポソーム内容物質としては、殊に治療学で使用可能な作用物質、例えば細胞成長抑制剤がこれに該当する。しかし、また、造影剤、例えばガドリニウム、カルボキシフルオレセインまたは類似物も単独でかまたは作用物質と一緒に放出されてもよい。造影剤、例えばガドリニウムの使用によって、非観血的な温度測定が可能になり、この場合には、達成された温度は、放出されたガドリニウムを測定するＭＲＣによって測定されることができる。この本発明によるリポソームを使用する場合には、有利にＭＲＣ装置を備えた温熱療法装置が使用される。
【００１５】
更に、本発明によるリポソームのための使用の種類には、眼の治療がある。蛍光標識物質をカプセル化する場合には、例えばレーザー処理の際に蛍光作用物質、例えばカルボキシフルオレセインの放出によって検出することができ、この場合には、達成しようと努力された過熱が実際に生じている。
【００１６】
従って、眼について説明された使用可能性と同様に、本発明によるリポソームは、例えば一定の加熱温度等を測定する場合には、達成された温度を事後に測定可能にするために使用されてもよい。
【００１７】
本発明によるリポソームは、本質的に有利に純粋な形で存在する上記の物質からなる。不純物は、できるだけ僅かになるように維持され、殊にできるだけ僅かなコレステリン含量が存在する。好ましいのは、完全にコレステリンを含有しないリポソームである。それというのも、コレステリンは、相変換温度の不明瞭さをまねき、ひいては広すぎる熱的委広範囲をまねく。
【００１８】
本発明による熱不安定性リポソームの製造は、通常、脂質を例えばクロロホルムまたはクロロホルム／水／イソプロパノール、抽出性溶剤に、有利に真空中でロータリーエバポレーター中で溶解し、脂質を相変換温度を上廻る温度で、カプセル化すべき内容物質の水溶液を用いて温度処理することによって行なわれる。この温度処理の時間は、有利に３０〜６０分間であるが、しかし、よりいっそう短くても長くてもよい。数回繰り返される凍結乾燥−融解工程、例えば２〜５回の凍結乾燥および再度の融解によって、均質化が行なわれる。最後に、得られた脂質懸濁液は、達成しようと努力されるリポソームの大きさを達成させるために、相変換温度を上廻る温度で定義された孔径の膜を通して押し出される。膜としては、例えば適宜された孔径、例えば１００〜２００ｎｍのポリカーボネート膜が適している。最後に、場合によってはカプセル化されていない内容物質は、例えばカラムクロマトグラフィー等によって分離されることができる。
【００１９】
次の実施例は、本発明をさらに詳説する。
【実施例１】
【００２０】
ａ）上記方法でＤＰＰＣ７０％、ＤＳＰＣ２０％およびＤＰＰＧ２  １０％から構成されているリポソームを得る。このリポソームは、カプセル化されたカルボキシフルオレセインを含有する。先に、遊離カルボキシフルオレセインをセファデックス（Sephadex）Ｇ７５を用いてカラムクロマトグラフィーによって分離した。
ｂ）チャンバーモデル：
温熱療法の分野における熱不安定性リポソームからのＣＦ放出量の生体内での鏡検法による検出のためには、シリア生まれのハムスターのチャンバーモデル（シリア生まれのハムスターのＡ−Ｍｅｌ−３−黒色腫）が適している。この場合には、シリア生まれのゴールドハムスターに透明の背側皮膚ろう（Hautkammer）が移植されている。皮膚ろうの移植後、皮膚ろう中に存在する皮下組織上へハムスターのＡ−Ｍｅｌ−３−黒色腫の細胞が移植される。数日間で背側皮膚内で数ミリメートルの大きさの腫瘍が成長する。微細循環ならびに腫瘍内での蛍光強化は、変形された生体顕微鏡を用いて観察されうる。動物は、付加的に中心の血管カテーテルを受けることができる。皮膚ろうの下に存在する熱交換体を用いた場合には、局所的に４２℃への腫瘍の加熱を達成させることができる。腫瘍の温度は、温度プローブを用いて直接に測定されることができる（Endrich 1988）。
【００２１】
また、生体顕微鏡とともに、チャンバーモデルについてのＭＲＴ測定の方法が確立される（Pahernik他 1999）。この場合には、顕微鏡の場合と同様に、ＭＲＴ画像を撮影することができる。
【００２２】
試験管内で得られた値は、第２表に示されている。
【００２３】
【表２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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