(57)【要約】本発明は、治療上もしくは予防上効果的な量のランタン化合物を、骨疾患に罹患している、もしくは骨疾患に罹患し得るヒトまたは動物に投与することを含む、骨の形成を増強し、破骨細胞の分化および／または造骨細胞の分化を活性化する方法によって、骨疾患の予防を十分に処置するか、処置するか、または達成するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成を増強する必要がある哺乳動物に、効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物を投与することを含む、該哺乳動物において骨形成を増強する方法。
【請求項２】
該哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ヒトが骨不足を有するか、または骨不足を有する危険のある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該ヒトが骨再構築疾患を有するか、もしくは該疾患に罹患する危険のある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
骨再構築疾患が、骨粗鬆症、パジェット病、骨関節炎、リウマチ性関節炎、軟骨形成不全、骨軟骨炎、副甲状腺機能亢進症、骨形成不全、先天性高リン酸塩血症、線維種性障害、線維性骨異形成症、多発性骨髄腫、異常骨代謝回転、溶骨性骨疾患、くる病、骨軟化症、および歯周病を含む群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
骨再構築疾患が骨粗鬆症である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
骨粗鬆症が一次的骨粗鬆症、二次的骨粗鬆症、更年期後の骨粗鬆症、男性骨粗鬆症、およびステロイド誘発性骨粗鬆症の何れかである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該ヒトが、骨折、骨の外傷、または外傷の骨の手術後、人工関節の手術後、骨の形成手術後、歯の手術後、骨の化学療法処置、または骨の放射線治療処置に関する状態を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ランタン（ＩＩＩ）化合物が、塩化ランタン、炭酸ランタン、ランタン塩、ランタンキレートとその誘導体、ランタン樹脂、およびランタン吸着体を含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ランタン（ＩＩＩ）化合物が、炭酸ランタンおよび塩化ランタンを含む群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ランタン（ＩＩＩ）化合物の効果的な量が、０．０５ｍｇ／Ｋｇ／日から５０ｍｇ／Ｋｇ／日である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ランタン（ＩＩＩ）化合物の効果的な量が、０．１ｍｇ／Ｋｇ／日から１０ｍｇ／Ｋｇ／日である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
骨密度を増大させる必要がある哺乳動物に、効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物を投与することを含む、該哺乳動物において骨密度を増大させる方法。
【請求項１４】
造骨細胞を効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物と接触させることによって分化を刺激することを含む、造骨細胞の分化を刺激する方法。
【請求項１５】
破骨細胞を効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物と接触させることによって分化を阻害することを含む、破骨細胞の分化を阻害する方法。
【請求項１６】
造骨細胞を効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物と接触させることによって骨形成を刺激することを含む、分化した造骨細胞の骨形成活性を活性化する方法。
【請求項１７】
骨再構築疾患を有するか、もしくは骨構築疾患に罹患する危険がある哺乳動物に、効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物を投与することを含む、該哺乳動物において、造骨細胞の分化を刺激し、同時に破骨細胞の分化を阻害する方法。
【請求項１８】
骨形成を増強する必要がある哺乳動物に、効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物と少なくとも１つの骨増強薬を投与することを含む、該哺乳動物において骨形成を増強する方法。
【請求項１９】
骨増強薬が、合成ホルモン、天然ホルモン，エストロゲン、カルシトニン、タモキシフェン、ビホスホネート、ビホスホネート類似物、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似物、ミネラル補足、スタチン薬、選択的エストロゲン受容体調節剤、およびフッ化ナトリウムを含む群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
骨形成の増強が必要な哺乳動物において、骨形成を増強するのに使用する医薬を製造するための、ランタン（ＩＩＩ）化合物の使用。
【請求項２１】
該哺乳動物が、骨再構築疾患を有する、または該疾患に罹患する危険があるヒトである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
ランタン（ＩＩＩ）化合物と骨増強薬を含む、骨再構築疾患の処置または予防のための医薬組成物。
【請求項２３】
骨疾患に罹患している、もしくは骨疾患に罹患し得るヒトもしくは動物に、治療上もしくは予防上効果的な量のランタン化合物を投与することを含む、破骨細胞の分化を阻害することによって、骨疾患を制御するか、処置するか、またはその予防を達成する方法。
【請求項２４】
骨疾患に罹患している、もしくは骨疾患に罹患し得るヒトもしくは動物に、治療上もしくは予防上効果的な量のランタン化合物を投与することを含む、造骨細胞の分化を活性化することによって、骨疾患を制御するか、処置するか、またはその予防を達成する方法。
【請求項２５】
請求項１から１９または２３から２４の何れか１つに記載の方法における、ランタン（ＩＩＩ）化合物の使用。
【請求項２６】
請求項１から１９または２３から２４の何れか１つに記載の方法において使用する医薬を製造するための、ランタン（ＩＩＩ）化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の簡単な説明
本発明は、骨疾患の処置および予防、骨の形成を増強する方法、および骨折の処置に関する。
【０００２】
本発明の背景
生涯を通して、古い骨は、骨再吸収破骨細胞によって、絶え間無く除去され、そして造骨細胞によって形成された新しい骨に置き換えられている。このサイクルは、骨再構築サイクルと呼ばれ、そして通常高度に制御されている。すなわち、破骨細胞および造骨細胞の機能は、定常状態において、再吸収された骨と同じ量の骨が形成されるように、リンクされている。
【０００３】
骨再構築サイクルは、骨の表面の特定の部位で起こる。骨の中の適当な前駆体細胞から形成された破骨細胞は、骨の一部を再吸収し；次いで造骨細胞の活性化によって新しい骨を生成する。造骨細胞は、骨のマトリックスのコラーゲン前駆体を合成し、その石化を制御する。骨格の成長とマトリックスの要請に応えるための、および骨再構成サイクルの維持とその機構の機能を制御するための、骨再構成サイクルにおける造骨細胞の活動的な活性は、ホルモン、成長因子、身体的な活動、および他の刺激などの、様々な要因によって影響されていると考えられる。造骨細胞は、副甲状腺ホルモンとエストロゲンの受容体を有すると考えられている。破骨細胞は、再吸収する骨の表面に接着し、そして造骨細胞からの幾つかの形態のシグナルによって活性化されると考えられている。
【０００４】
骨再構築サイクルの１もしくはそれ以上の段階における不規則性（例えば骨形成と再吸収のバランスが崩れるなど）は、骨再構築疾患、または代謝性骨疾患を引き起こし得る。このような疾患の例は、骨粗鬆症、パジェット病、およびくる病である。これらの疾患の幾つかは、破骨細胞または造骨細胞による骨再構築サイクルの半分が、もう一方の半分と比べて活性が過剰であることによって引き起こされる。例えば、骨粗鬆症では、破骨細胞の活性がかなり増大し、骨密度および骨質量の減少を引き起こし得る。骨粗鬆症は、代謝性骨疾患の最も一般的なものであり、そして一次的な疾患であってもよく、または他の疾患の二次的な疾患であってもよい。
【０００５】
更年期後の骨粗鬆症は、現在骨粗鬆症の最も一般的な形態である。高齢の骨粗鬆症は、いずれの性別の高齢の患者をも悩まし、そして若年者も、時には骨粗鬆症に罹患する。
【０００６】
骨粗鬆症は、一般的に骨密度の低下によって特徴付けられる。骨が薄くなり弱くなることによって、ごくわずかな外傷で骨折することが増える。最もよく起こっている更年期後の骨粗鬆症における骨折は、手首と背骨である。高齢の骨粗鬆症は、大腿骨の骨折が平均より多いことによって特徴付けられる。
【０００７】
一方、骨粗鬆症は、治療標的となっており、大きな関心を引き続けているが、骨再構築サイクルの破骨細胞と造骨細胞の活性の間が密接に連携していることは、すでに失われた骨を補填することを非常に困難な挑戦としている。その結果、骨粗鬆症の阻害または予防のための処置（すでに失われた骨の置換を妨害するものとして）の研究は、現在までに、より多くの結果を得ている。
【０００８】
エストロゲンの不足は、更年期後の骨粗鬆症の主な原因であると考えられている。実際、エストロゲンを含むステロイドは、治療薬として用いられている （Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３０３， １１９５ （１９８０））。しかし、近年の研究は他の原因が存在するにちがいないとの結論を下している（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ７７， １４８７ （１９８６））。
【０００９】
他の骨疾患は、骨の再吸収の増大および骨の形成の増加の両方が起こることによる、骨再構築サイクルにおける不規則性によって起こり得る。パジェト病がこのような例の一つである。
【００１０】
ランタンは、リン酸と安定な錯体を形成する性質のゆえに、医薬において、以前からよく知られていた。この適応は、炭酸ランタンの使用による、高リン酸塩血症の処置で確かめられている。米国特許第 ５，９６８，９７６ 号は、高リン酸塩血症の処置のための、炭酸ランタンの特定の水和物の医薬組成物の、製造と使用を記載している。
【００１１】
Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｇａｖａｒｒｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ， ２８３−２９１ （１９８８）） は、１４０−ランタンの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ での歯の骨とハイドロキシアパタイトへの取り込みの研究を報告している。取り込みの深さは、推定上５μｍから１５μｍの間であるが（実験条件に依存）、著者らの結論は、ハイドロキシアパタイトにおいて、カルシウムのランタンへの交換が、酸誘発性の溶解への抵抗を増大させ得るというものであった。この示唆された増加した酸抵抗性に基づいて、著者らは、骨粗鬆症、歯根カリエス、および歯槽再吸収などの疾患の処置における、添加剤としてのランタンの臨床的な有用性を究明することを示唆している。
【００１２】
Ｖｉｊａｉ Ｓ． Ｓｈａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ９０７−９１２ （１９９２）） は、ランタン（ＩＩＩ）の細胞外の適用が、破骨細胞の細胞液中カルシウムの濃度依存性上昇を誘発することを報告している。著者らは、破骨細胞のカルシウム受容体が、三価のランタンカチオンによる活性化および不活性化に感受性であり得ると提案した。
【００１３】
Ｂｅｒｎｄ Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １１４−１２１ （１９９４）） は、ランタンが軟骨内の石化を阻害し、手足の骨芽の中胚葉細胞のオルガノイド培養物中で、カルシウムの蓄積を減少させたことを報告している。
【００１４】
本発明の要約
我々は、驚くべきことに、ランタン（ＩＩＩ）化合物が、骨形成を増強し、骨密度を増加させ、そして骨細胞の活性化および分化に有益な効果を有することを見出している。
【００１５】
それゆえに、本発明は、骨形成の増強が必要な哺乳動物に、効果的な量のランタン化合物、好ましくはランタン（ＩＩＩ）化合物を投与することを含む、該哺乳動物における骨形成を増強する方法に関する。本発明の一具体的態様において、哺乳動物はヒトである。該ヒトは、骨不足を有しているか、または骨不足を起こす危険がある。本発明はまた、該ヒトが骨の再構築疾患を有するか、該疾患に罹患している危険があることを前提としている。骨再構築疾患の例は、骨粗鬆症、パジェット病、骨関節炎、リウマチ性関節炎、軟骨形成不全、骨軟骨炎、副甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、先天性高リン酸塩血症、線維腫性障害、線維性骨異形成症、多発性骨髄腫、異常骨代謝回転、溶骨性骨疾患、および歯周病を含む。
【００１６】
具体的態様において、骨再構築疾患は、一次的骨粗鬆症、二次的骨粗鬆症、更年期後の骨粗鬆症、男性骨粗鬆症、およびステロイド誘発性骨粗鬆症を含む、骨粗鬆症である。
【００１７】
また、骨再構築疾患に起因していない骨不足を有する哺乳動物において、骨形成を増強するための方法を提供する。該骨不足は、例えば骨折、骨の外傷、または外傷性骨手術後、人口関節手術後、形成骨手術後、歯科手術後、骨の化学療法、もしくは放射腺治療に伴う状態を原因とする。
【００１８】
本発明の方法の具体的態様において、ランタン（ＩＩＩ）化合物は、塩化ランタン、炭酸ランタン、他のランタン塩、キレートもしくはその誘導体、ランタン樹脂、またはランタン吸着体から選択される。
【００１９】
本発明の方法のさらなる具体的態様において、ランタン（ＩＩＩ）化合物の効果的な量は、０．０１ｍｇ／Ｋｇ／日から１００ｍｇ／Ｋｇ／日であり、より好ましくは、０．０５ｍｇ／Ｋｇ／日から５０ｍｇ／Ｋｇ／日であるか、または０．１ｍｇ／Ｋｇ／日から１０ｍｇ／Ｋｇ／日である。
【００２０】
本発明はまた、骨密度の増大が必要な哺乳動物に、効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物を投与することを含む、該哺乳動物において骨密度を増大させるための方法を提供する。また、造骨細胞を効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物と接触させた結果、造骨細胞の分化を刺激することによる、造骨細胞の分化を刺激する方法を提供する。さらに、破骨細胞を効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物と接触させた結果、破骨細胞の分化を阻害することによる、破骨細胞の分化を阻害する方法を提供する。
【００２１】
さらなる具体的態様において、本発明は、造骨細胞を効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物と接触させた結果、骨形成を刺激することによる、分化した造骨細胞の骨形成活性を活性化する方法を提供する。本発明はまた、骨再構築疾患を有するか、もしくは骨再構築疾患に罹患する危険のある哺乳動物に、効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物を投与することによる、該哺乳動物における、造骨細胞の分化を刺激し、同時に破骨細胞の分化を阻害する方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、骨形成が必要な哺乳動物に、効果的な量のランタン（ＩＩＩ）化合物と、少なくとも１つの骨増強薬を投与することによる、該哺乳動物における、骨形成を増強する方法を意図する。適切な骨増強薬の例は、合成ホルモン、天然ホルモン、エストロゲン、カルシトニン、ビホスホネート、ビホスホネート類似物、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似物、ミネラル補足、スタチン薬、選択的エストロゲン受容体調整剤、およびフッ化ナトリウムを含む。
【００２３】
さらに本発明は、骨形成が必要な哺乳動物において、骨形成を増強するのに使用する医薬の製造のための、ランタン（ＩＩＩ）化合物の使用を提供する。具体的態様において、該哺乳動物は、骨再構築疾患を有するか、もしくは該疾患に罹患する危険のあるヒトである。さらなる具体的態様において、本発明は、ランタン（ＩＩＩ）化合物と骨増強薬を含む、骨再構築疾患を処置するもしくは予防する医薬組成物を提供する。
【００２４】
我々はまた、破骨細胞の分化を選択的に阻害するために、ランタン化合物を用い得ることを見出している。特定の低い濃度で、造骨細胞の分化は活性化され得る。増大した骨形成は、これらの現象の何れかもしくは両方を発現させることに起因する。
【００２５】
本発明の１つの態様に従って、治療上もしくは予防上効果的な量のランタン化合物を、骨疾患に罹患している もしくは骨疾患に罹患し得るヒトまたは動物に投与することを含む、破骨細胞の分化を阻害することによって、骨疾患を制御するか、処置するか、またはその予防を達成するための方法を提供する。
【００２６】
さらなる態様から、治療上もしくは予防上効果的な量のランタン化合物を、骨疾患に罹患している もしくは骨疾患に罹患し得るヒトまたは動物に投与することを含む、造骨細胞の分化を活性化することによって、骨疾患を制御するか、処置するか、またはその予防を達成するための方法を提供する。
【００２７】
本明細書中において、「骨疾患に罹患し得る」とは、骨疾患の罹患に対する疾病素質が平均よりも高いことを含むことを意図している。例として、骨粗鬆症にかかり得るヒトは、更年期後の女性、高齢（例えば６５歳以上）の男性、および副作用として骨粗鬆症を引き起こす（例えばステロイド誘発性骨粗鬆症）ことが知られている薬剤で処置されたヒトを含む。
【００２８】
本発明のさらなる態様に従って、本発明の何れかの方法に使用するための医薬の製造のための、ランタン化合物の使用を提供する。
本発明のさらなる態様に従って、本発明の何れかの方法における、ランタン化合物の使用を提供する。
【００２９】
本発明のこれらの、および別の態様は、以下の詳細な記載および添付の図面で述べている証拠となるであろう。加えて、本明細書中様々な文献を言及しているが、これによって本明細書中に組み込まれている。
【００３０】
図面の簡単な記載
本発明は、下記の図面を参照することによってよりよく理解されるであろう。
図１は、骨の再吸収へのＬａの効果を重ね合わせた結果を示した棒グラフである。バーは、異なるランタン濃度での、破骨細胞当たりの造骨細胞の中間クロスラップ量の相対値±ＳＤを表している。
【００３１】
図２は、造骨細胞の分化へのＬａの効果を重ね合わせた結果を示した棒グラフである。バーは、異なるランタン濃度での、ＴＲＡＰ ５ｂ活性の相対値±ＳＤを表している。
【００３２】
図３は、造骨細胞の分化へのＬａの効果を重ね合わせた結果を示した棒グラフである。バーは、細胞のアルカリ性ホスファターゼの比活性の相対値±ＳＤを表している。
【００３３】
図４は、成熟造骨細胞の骨形成活性へのＬａの効果を重ね合わせた結果を示した棒グラフである。バーは、異なるランタン濃度での、ＨＣｌ抽出後の骨小結節から放出されたカルシウムの量（ｍｍｏｌ／ｌ）を表している。
【００３４】
本発明の詳細な記載
上記のように、本発明は、効果的な量のランタン化合物、より好ましくはランタン（ＩＩＩ）化合物を、骨形成が必要な哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における骨形成を増強する方法を提供する。骨形成は、新しい骨実体を生成することを言う。骨形成は、この過程によって、新しい骨の構造が成長する、または今存在している骨の密度が増大することを含む。造骨細胞は、細胞外有機マトリックスもしくは骨様物質を生産し、次いで該マトリックスを石化し、その結果骨を形成することによって、骨を形成する。骨の主なミネラル成分は、結晶性ハイドロキシアパタイトであり、これは普通の成人の骨の質量の大部分を構成している。我々は、驚くべきことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ および ｉｎ ｖｉｖｏ において、ランタンが骨形成を非常に増強することを見出した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ において、増強された骨形成は、成熟造骨細胞の培養物に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で濃度１００から１５，０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ランタン（ＩＩＩ）を添加した場合に観測された。増強された骨形成を、造骨細胞によって形成された骨小結節に組み込まれたカルシウムの量を測定することによって定量した。
【００３５】
我々は、ランタン（ＩＩＩ）が、成長中の犬においても、骨形成を増強することを見出した。また、２，０００ｍｇ／ｋｇ／日の用量のランタンは、骨の形成を増強し、骨の体積と密度を、コントロール動物と比べて非常に増大させた。
【００３６】
本発明の方法において、ランタン（ＩＩＩ）化合物は、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、およびヤギのような家畜を含む、そしてイヌ、ネコ、およびげっ歯類のようなペットと実験哺乳動物を含む、哺乳動物の範囲で骨形成を増強するために用い得る。
【００３７】
本発明の具体的態様において、該哺乳動物は、骨形成を増強する必要があるヒトである。１つの態様において、該処置が必要なヒトは、骨不足であり、このことは該ヒトが所望されるよりも骨が少ないことを意味するか、または所望されるよりも骨密度が低い、もしくは骨の強度が低いことを意味する。骨不足は、骨折によって起こる場合のように、局所でもあり得、または骨粗鬆症によって起こる場合のように全身でもあり得る。骨不足は、骨再構築疾患に由来し、それによって骨形成と骨の再吸収の間のバランスがシフトし、骨不足を引き起こし得る。
【００３８】
このような骨再構築疾患の例は、骨粗鬆症、パジェット病、骨関節炎、リウマチ性関節炎、軟骨形成不全、骨軟骨炎、副甲状腺機能亢進症、骨形成不全、先天性高リン酸塩血症、線維腫性障害、線維性骨異形成症、多発性骨髄腫、異常骨代謝回転、溶骨性骨疾患、および歯周病を含む。骨再構築疾患は、有機マトリックス、骨の石化、骨再構築における障害、および内分泌の要因、栄養上の要因、骨格とミネラルのホメオスタシスを制御する他の要因での障害によって特徴付けられる、代謝性骨疾患を含む。該疾患は、遺伝であるか、または獲得されたものであり、そして一般的に全骨格系に影響を与え有る全身性であり得る。
【００３９】
従って、１つの態様において、該ヒトは、骨再構築疾患を有し得る。本明細書中で用いる骨再構築は、破骨細胞による骨の再吸収と造骨細胞による骨形成を含む、骨のマトリックスとミネラルの連続的な代謝回転によって、古い骨が除かれ新しい骨が形成される過程を言う。
【００４０】
骨粗鬆症は、通常石化された骨より骨密度が減少し、その結果骨の皮層と柵状組織が薄くなり、その多孔性が増大することに特徴付けられる、一般的な骨再構築疾患である。骨粗鬆症によって生じる骨格のもろさは、患者の骨の痛みを起こし易くし、かつ骨折の可能性を増大させ易くする。この状態における進行性の骨の損失は、当初の骨の質量の５０％までの損失を引き起こし得る。
【００４１】
一次的骨粗鬆症は、子供または若い成人において正常な生殖腺機能によって起こる特発性骨粗鬆症、更年期後の骨粗鬆症として記載したタイプ Ｉ 骨粗鬆症、およびタイプ ＩＩ 骨粗鬆症、主に７０歳以上のヒトに起こる高齢の骨粗鬆症を含む。二次的な骨粗鬆症の原因は、内分泌性（例えばグルココルチコイド過剰、副甲状腺機能亢進症、生殖腺機能低下（ｈｙｐｏｇａｎｏｄｉｓｍ））、薬物誘発性（例えばコルチコステロイド、ヘパリン、タバコ）、および種々の原因（例えば慢性腎臓疾患、肝臓疾患、および吸収不良症候群骨粗鬆症）であり得る。本明細書で用いる「骨不足起こす危険がある」というフレーズは、骨不足の進行に対して、疾病素質が平均よりも高い哺乳動物およびヒトを含むことを意図している。例えば、骨粗鬆症になり得るヒトは、更年期後の女性、高齢の男性（例えば６５歳以上のヒト）、および副作用（例えばステロイド誘発性骨粗鬆症）として骨粗鬆症を起こすことが知られている薬剤で処置されたヒトを含む。骨粗鬆症のような骨再構築疾患のために骨不足を有する危険があるヒトを識別するために用いられ得る特定の要因は、当業界で周知である。重要な因子は、骨質量の低下、家族の病歴、生活様式、エストロゲンもしくはアンドロゲン不足、およびネガティブなカルシウムバランスを含む。更年期後の女性は、特に骨粗鬆症に罹患している危険がある。以後、骨疾患の処置についての言及は、別記した場合を除いて、十分な処置および／または予防を含むことを意図する。
【００４２】
本発明の方法はまた、骨不足が骨再構築疾患以外の要因によって起こった状態において、骨形成を増強するためにも用いられ得る。該骨不足は、骨折、骨の外傷、骨の外傷の手術後に伴う状態、人工関節手術後、形成骨手術後、歯科手術後、骨化学療法、歯の手術後、および骨の放射線治療を含む。骨折は、微細な骨折およびマクロな骨折の全てのタイプを含む。
【００４３】
骨折の例は、剥離骨折、粉砕骨折、横断骨折、斜方骨折、らせん状骨折、部分骨折、変位骨折、嵌入骨折、若木骨折、膨隆骨折、疲労骨折、関節内骨折（骨端骨折）、閉鎖骨折（単純骨折）、開放骨折（複雑骨折）、および潜在骨折を含む。
【００４４】
前述のように、本発明に従って、広く様々な骨疾患、例えば骨再構築サイクルに関連する全ての骨疾患を処置し得る。該疾患の例は、全ての形態の骨粗鬆症、骨軟化症、くる病、およびパジェット病を含む。特に更年期後の、男性の、およびステロイド誘発性の骨粗鬆症を、特に記載する。加えて、ランタン化合物は、一般的に抗再吸収薬、骨促進薬、および骨同化薬としての使用を見出されている。該使用は、本発明の別の態様を形成する。
【００４５】
我々は、驚くべきことに、ランタンが造骨細胞の分化を刺激することを見出している。造骨細胞の分化は、増殖し成熟造骨細胞に分化し得る、骨芽前駆細胞に由来する骨髄の ｉｎ ｖｉｔｒｏ での培養物中で、石化した骨小節を形成することができるかで測定した。分化は、細胞内のアルカリ性ホスファターゼの比活性を決定することによって測定された。低用量のランタン（１００ｎｇ／ｍｌ）は、造骨細胞の分化を刺激することが見出された。
【００４６】
我々はまた、驚くべきことに、コントロール培養物と比較して、マウスの骨髄培養物中で、ＴＲＡＰ（酒石酸耐性−酸性ホスファターゼ：Ｔａｒｔｒａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）−陽性多核細胞の減少による検定で、ランタンが ｉｎ ｖｉｔｒｏ での破骨細胞の分化を阻害することを見出した。骨粗鬆症を含む多くの骨再構築疾患において、骨不足は、分化した破骨細胞による骨の再吸収過剰に起因し得る。本発明の方法と組成物は、破骨細胞の分化を阻害するのに用い得、従って骨の再吸収を阻害するのに用い得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ において、骨の再吸収の阻害が幾らか見出された。
【００４７】
低用量のランタンは、従って、骨の形成を増強することと共に造骨細胞の分化を刺激することと、また破骨細胞の分化と骨の再吸収を阻害することが見出されている。
【００４８】
ランタン化合物の範囲は、本発明の方法および組成物中で用い得る。より好ましくは、生物学的に利用可能な形態のランタン（ＩＩＩ）であり得る。より好ましいランタン化合物は、例えばランタン塩とその誘導体、ランタン樹脂、およびランタン吸着体を含む。該ランタンは所望によりキレートの形態であり得る。適切なランタン塩の例は、炭酸ランタン、炭酸ランタン水和物、塩化ランタンを含む。
【００４９】
本発明に使用するための効果的な量のランタンは、前述のレジメに従って投与して、望ましい利益もしくは治療効果を提供するであろうランタン（ＩＩＩ）化合物の量である。効果的な量のランタンの例は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であり得、これに制限されない。
【００５０】
該用量はまた、ランタンの効果的な血漿濃度を提供するために選択され得る。　ランタンの濃度の効果的な血漿濃度の例は、約０．１ｎｇ／ｍｌから約１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌの範囲であり得る。
【００５１】
該用量は、さらに主な骨の表面とその周辺において、ランタンの効果的なレベルを提供するために選択され得る。
主な骨の表面とその周辺に効果的な量の例は、０．１μｇ／ｇから５００μｇ／ｇ、好ましくは０．５μｇ／ｇから１００μｇ／ｇ、より好ましくは１μｇ／ｇから２５μｇ／ｇの範囲であり得る。
【００５２】
“ランタン化合物”の用語は、本明細書中で、生物学的に利用し得ることが確認し得る、何れの薬理学的に許容されるランタン化合物をも示すために用いられる。より好ましい化合物は、例えばランタン塩およびその誘導体、ランタン樹脂、およびランタン吸着体などを含む。該ランタンは、所望によりキレートの形態であり得る。以後、本発明を特定のランタン塩と誘導体について特に言及することで記載する。
【００５３】
本発明のランタン化合物は、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤と混合した、またはそれと共に、活性な成分を含む医薬組成物の形態で投与され得る。活性な成分は、何れかの慣用の経路による、例えば経口で（舌下を含む）、局所で、非経腸で（静脈、筋肉内、腹膜内、および皮下投与を含む）、および直腸での投与に適切な組成物で処方され得、経口での投与が望ましい。しかし、本発明はランタンを全身もしくは局所で利用可能とする全ての投与形態を含むと理解すべきである。経口で投与可能な組成物は、所望により、１もしくはそれ以上の生理的に混合可能な担体および／または賦形剤を含み得、そして固体であっても、液体であってもよい。該組成物は、例えば錠剤、コーティングした錠剤、カプセル、トローチ剤、水性もしくは油性の懸濁液、溶液、乳液、シロップ、エリキシル、および使用する前に水もしくは別の適切な液体の賦形剤で再構成するのに適切な乾燥した製品を含む、何れかの便宜的な形態をとり得る。該組成物は、単位投与形を製造するのに有利であり得る。本発明の錠剤およびカプセルは、所望により、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、もしくはポリビニル−ピロリドンなどの結合剤；例えばラクトース、糖、とうもろこし澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール、もしくはグリシンなどの充填剤；例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、もしくはシリカなどの潤滑剤；例えば じゃがいも澱粉などの崩壊剤；またはラウリル硫酸ナトリウムのような許容される湿化剤などの、慣用の成分を含み得る。錠剤は、当業界で既知の方法でコートされ得る。
【００５４】
液体の組成物は、例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、もしくは水素化した食用油などの懸濁化剤；例えばレシチン、ソルビタン モノオレート、もしくはアラビアゴムなどの乳化剤；例えば落花生油、アーモンド油、分別したココナッツ油のような植物油、魚の肝油などの食用油、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ のような油性エステル、プロピレングリコール、もしくはエチルアルコールを含み得る非水性賦形剤；および例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、もしくはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、またはソルビン酸などの保存料のような、慣用の添加剤を含み得る。液体の組成物は、便宜的に例えばゼラチンのカプセルに入れて、単位投与形で製品を提供し得る。
【００５５】
経口の送達のための製剤は、ランタンを大腸に送達されるような徐放剤で処方され得る。このことは、ランタンと食事のリン酸塩が相互作用し、その結果腸で吸収されにくいリン酸ランタンが沈殿するのを減少させるであろう。徐放剤は、当業界で周知であり、例えば徐放カプセルもしくはタイム・ピル、浸透圧送達カプセルなどを含む。
【００５６】
非経腸の投与のための組成物は、滅菌処理した発熱性物質を含まない水、滅菌処理した過酸化物を含まないオレイン酸エチル、無水のアルコールもしくはプロピレングリコール、または無水のアルコール／プロピレングリコール混合物などの注射可能な液体の担体を用いて処方され得、そして静脈に、腹膜内に、皮下に、または筋肉内に注射され得る。
【００５７】
直腸の投与のための組成物は、ココアバター、または別のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤を用いて製剤され得る。
【００５８】
局所の投与のための組成物は、軟膏、クリーム、ゲル、外用水薬、シャンプー、ペイント、粉剤（スプレー粉剤を含む）、膣坐薬、タンポン、スプレー、ディップ、エアゾール、注入液（ｐｏｕｒ−ｏｎｓ）、ドロップを含む。活性な成分は、例えば適切な親水性のもしくは疎水性の基剤中で製剤され得る。
【００５９】
保存できる時間を長くするために、本発明の組成物中に、例えばアスコルビン酸、ブチル化したヒドロキシアニソール、またはハイドロキノンなどの抗酸化剤を混合することが有利であり得る。
【００６０】
本発明において、投与は１もしくはそれ以上のサイクルを含み得る。これらのサイクルの期間に、１もしくはそれ以上の破骨細胞と造骨細胞の活性期があり、そして破骨細胞の活性も造骨細胞の活性もない、１もしくはそれ以上の期間も含まれる。
また、投与は、連続したレジメでも行われ得る。該レジメは、長期間のレジメであり得、例えば永続的なレジメであり得る。
【００６１】
本発明の組成物の用量と投与の持続時間は、特定の患者の要請に依存して変化すると解する。正確な用量レジメは、特に体重、年齢、および（もしあれば）症候などの要素を考慮して、内科医もしくは獣外科医にかかることによって決定される。該組成物は、所望により１もしくはそれ以上のさらなる活性な成分を混合し得る。
【００６２】
投薬レジメの期間、投与を１日当たり１回もしくはそれ以上、例えば１日当たり１回、２回、３回、または４回行い得る。
【００６３】
所望により、該ランタン化合物は、他の活性な成分と、同時にまたは連続して投与され得る。これらの活性な成分は、例えば骨再構築サイクルと相互作用し得る薬剤もしくは組成物、および／または、骨折の回復に用いる薬剤もしくは組成物を含む。該薬剤もしくは組成物は、例えば骨関節炎または骨粗鬆症の処置に用いる薬剤もしくは組成物であり得る。
【００６４】
骨増強薬は、骨形成、骨密度、もしくは骨の石化を増加させるか、または骨の再吸収を妨げることが、当業界において知られている。これらの薬剤は、本発明の方法および医薬組成物に用いられ得る。適切な骨増強薬は、エストロゲン、アンドロゲン、カルシトニン、プロスタグランジン、および副甲状腺ホルモンのような天然のもしくは合成ホルモン；血小板由来成長因子、インシュリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子、上皮細胞成長因子、結合組織成長因子、および線維芽細胞成長因子；ビタミン、特にビタミンＤ；カルシウム、アルミニウム、ストロンチウム、およびフッ化物などのミネラル；プラバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、およびアトルバスタチンを含むスタチン薬；副甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体、およびプロスタグランジン受容体を含む、破骨細胞と造骨細胞の表面の受容体のアゴニストもしくはアンタゴニスト；ビホスホネートおよび骨同化薬を含む。
【００６５】
図１から図４は、骨の再吸収、破骨細胞の分化、造骨細胞の分化、および骨形成へのランタン（ＩＩＩ）イオンの効果を、それぞれ示している。
下記の実施例は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ での骨の培養物のアッセイ中におけるランタン（ＩＩＩ）イオンの効果、および ｉｎ ｖｉｖｏ 試験におけるランタン（ＩＩＩ）イオンの効果を記載しており、本発明を例示しているが、本発明を制限するものではない。
【００６６】
実施例１
ｉｎ ｖｉｔｒｏ における骨の再吸収アッセイ
試験物質
試験物質は、炭酸ランタン四水和物（以後、炭酸ランタンと述べる）であった。１ｍｇのランタンは、１．９０７７ｍｇの炭酸ランタンと当量である。炭酸ランタンは、２Ｍ ＨＣｌに溶解し、２８．６ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を得る（すなわち１５ｍｇ／ｍｌのランタン濃度）。この保存溶液のアリコートを、２Ｍ ＨＣｌで希釈して、溶液の濃度を変化させ、そしてこれらの溶液１μｌを培地に添加し、培地中のランタンの最終試験濃度を１００、５００、１０００、５０００、および１５０００ｎｇ／ｍｌとした。これらの溶液／濃度を、以後 ＬＡ １００， ＬＡ ５００， ＬＡ １０００， ＬＡ ５０００ および ＬＡ １５０００ と述べる。
【００６７】
コントロール物質
我々は、それぞれのアッセイ中におけるコントロール・グループを用い、該アッセイは、阻害（骨の再吸収アッセイと破骨細胞の分化アッセイ）の、または活性化（造骨細胞の分化と骨形成アッセイ）の効果を検出することが可能であることを示した。該コントロール物質は：
バフィロマイシン Ａｌ （骨再吸収アッセイにおいて）；
１７−β エストラジオール （造骨細胞の分化アッセイと骨形成アッセイにおいて）；
を用いた。
破骨細胞の分化アッセイ中、コントロール・グループは、ビタミンＤを含まなかった。
【００６８】
骨の薄片上での破骨細胞の培養方法は、当初 Ｂｏｙｄｅ ｅｔ ａｌ． （１９８４）、および Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９８４） によって記載された方法であった。細胞培養物に対し、我々は元の方法（Ｌａｋｋａｋｏｒｐｉ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｌａｋｋａｋｏｒｐｉ ａｎｄ Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ， １９９１）をわずかに修飾した方法を用いた。培養物中の骨の再吸収速度は、各々の骨の上での、もしくは歯の象牙質の薄片上での、再吸収による孔の数を、相対照対物レンズを有する顕微鏡を用いて計数することによって、最初は決定された（Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ． １９９０）。その後、骨中の再吸収部位に特異的に結合する小麦胚芽凝集素レクチンを用いて、孔を視覚化し（Ｓｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９４）、顕微鏡とコンピューター画像分析システムを用いて、再吸収部位の全領域を定量することを可能にした（Ｌａｉｔａｌａ ａｎｄ Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ １９９４， Ｈｅｎｔｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ． １９９５）。我々は、市販されている方法（ＣｒｏｓｓＬａｐｓ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｏｓｔｅｏｍｅｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｈｅｒｌｅｖ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、培地中でコラーゲン架橋が切断された量を、骨再吸収速度の指標として検出するのに用いた（Ｂａｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００６９】
試験プロトコルは、破骨細胞を骨の薄片上で培養し、骨を再吸収させる方法を用いている。該系は、破骨細胞の骨の再吸収活性に対する、薬剤の候補物の効果を決定するのに理想的である。薬剤の候補物を、培養周期の初期に、細胞培養物に加え、そして３日間破骨細胞に骨を再吸収させた。培養周期中に再吸収された骨の量を決定し、コントロール培養物（薬剤の候補物の非存在下で培養した培養物）中で再吸収された骨の量と比較する。薬剤の候補物が、破骨細胞の機能を阻害するならば、これらの培養物中で再吸収された骨の量は、コントロール培養物より非常に低い。
【００７０】
操作：
低速ダイアモンド製のこぎりを用いて、新しいウシの大腿骨の骨幹（Ａｔｒｉａ Ｓｌａｕｇｈｔｅｒｈｏｕｓｅ， Ｏｕｌｕ， Ｆｉｎｌａｎｄ）から、皮層の骨の０．１ｍｍの厚さの横断薄片を切り取り、滅菌した蒸留水を幾度も代えて、超音波洗浄し、用いる前に４℃で保存した。首を切ることによって殺した１日令のラットの子から、長い骨を除いた。骨を接着柔組織がない状態で解剖し、そして外科用メスの刃で、骨内層の表面を、１００ ＩＵ／ｍｌのペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン （ペニシリン／ストレプトマイシン溶液， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）と、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）と、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清 ｐＨ ６．９（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）を供給した破骨細胞の培地にかきとった（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＩＥＭ）， （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ））。得られた細胞と骨のフラグメントが分散した懸濁液を、プラスチック・ピペットを用いて攪拌した。より大きなフラグメントを数秒間で沈殿させ、培地中で前もって湿らせてあった骨の薄片上に、上清を加えた。３７℃で３０分間置いた後、骨の薄片を新しい培地に浸すことによって洗浄し、次に破骨細胞の培地を含む２４ウェル培養皿のウェルに移した。骨の薄片を、９５％空気と５％二酸化炭素の加湿雰囲気中で、３７℃で７２時間インキュベートした。
【００７１】
培養期間後、市販のキット（ＣｒｏｓｓＬａｐｓ ｆｏｒ ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｏｓｔｅｏｍｅｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を製造者の指示に従って用いて、培地中で切断されたコラーゲン架橋の量を測定することによって、骨の再吸収量を決定した。顕微鏡でＴＲＡＰ陽性の多核細胞の量を計数することによって、それぞれの培地中の破骨細胞の数を決定し、その結果を破骨細胞当たりの切断されたコラーゲン架橋の数として示している。
【００７２】
本試験において、破骨細胞の骨の再吸収活性へのランタン（ＩＩＩ）イオンの効果を試験した。
下記の試料グループ：
ベースライン（賦形剤を含む）
コントロール（ベースライン＋１０ｎＭ バフィロマイシン Ａｌ）
ベースライン＋１００ｎｇ／ｍｌのランタン
ベースライン＋５００ｎｇ／ｍｌのランタン
ベースライン＋１０００ｎｇ／ｍｌのランタン
ベースライン＋５０００ｎｇ／ｍｌのランタン
ベースライン＋１５０００ｎｇ／ｍｌのランタン
を含む。
【００７３】
それぞれのグループには６個含まれ、そしてその試験を２回行った。破骨細胞のＶ−ＡＴＰアーゼのプロトン・ポンプの非常に強力な阻害剤であるバフィロマイシン Ａｌは、試験系が骨の再吸収の阻害を検出し得ることを示すために、コントロールとして用いられた。
【００７４】
結果の表
骨の再吸収アッセイにおいて、培地中で切断された中間クロスラップ量（ｎＭ）（ｍｅｄｉｕｍ ＣｒｏｓｓＬａｐａ）を決定し、相当する培地中の破骨細胞の数を計算した。中間クロスラップ量は、相当する培地中の破骨細胞の数で割り、その結果を破骨細胞当たりの中間クロスラップ量の相対値として表１に示している。相対値は、ベースラインのグループの平均値で個々の値を割ることによって得られた。
【００７５】
表１：第１次骨再吸収アッセイにおける破骨細胞当たりの中間クロスラップ量の相対値
【表１】
2004501198.tif 000002
【００７６】
表２：第２次骨再吸収アッセイにおける破骨細胞当たりの中間クロスラップ量の相対値
【表２】
2004501198.tif 000003
表１と表２に示した全てのデータは、重ね合わせて分析した。
【００７７】
表３および図１に、重ね合わせた結果を示す。
表３：骨の再吸収への ＬＡ １００−ＬＡ １５０００の効果を重ね合わせた結果
【表３】
2004501198.tif 000004
【００７８】
結果
骨の再吸収アッセイにおいて、培地中で切断されたクロスラップ量への、または破骨細胞の数への、ランタン（ＩＩＩ）イオンの効果は、有意ではなかった。コントロール物質であるバフィロマイシン Ａｌは、骨の再吸収を完全に阻害した。表３と図４に示したように、ランタン（ＩＩＩ）イオンは、試験した何れの濃度においても、個々の成熟破骨細胞の骨の再吸収活性に対して、統計学的に有意な効果を有しない。しかし、より低い濃度（ＬＡ １００ ａｎｄ ＬＡ ５００）で、用量依存性の阻害が起こったことには、注意すべきである。ＬＡ １５０００ で見られるわずかな減少は、この高い濃度におけるわずかな毒性の効果のためであり得る。
【００７９】
参考文献
培地のクロスラップ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ で骨の再吸収を測定するための、改善された酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ） − Ｂａｇｇｅｒ Ｙ Ｚ， Ｆｏｇｅｄ Ｎ Ｔ， Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｌ， Ｌｏｕ Ｈ， Ｑｖｉｓｔ Ｐ （１９９９） Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １４， Ｓｕｐｐｌ． １， Ｓ３７０；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ での単離された破骨細胞による歯の象牙質の再吸収 − Ｂｏｙｄｅ Ａ， Ａｌｉ Ｎ Ｎ， Ｊｏｎｅｓ Ｓ Ｊ （１９８４） Ｂｒ Ｄｃｎｔ Ｊ １５６： ２１６−２２０；
単離されたウサギの破骨細胞による骨の再吸収 − Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｔ Ｊ， Ｒｅｖｅｌｌ Ｐ Ａ， Ｆｕｌｌｅｒ Ｋ， Ａｔｈａｎａｓｏｕ Ｎ Ａ （１９８４） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ ６６： ３８３−３９９；
破骨細胞様細胞の分化と骨の再吸収に対する、レコンビナントのヒトの骨形成タンパク質−１の効果 − Ｈｅｎｔｕｎｅｎ Ｔ Ａ， Ｌａｋｋａｋｏｒｐｉ Ｐ Ｔ， Ｔｕｕｋｋａｎｅｎ Ｊ， Ｌｅｈｅｎｋａｒｉ Ｐ Ｐ， Ｓａｍｐａｔｈ Ｔ Ｋ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｂ Ｋ （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０９： ４３３−４４３；
カルボニック・アンヒドラーゼ ＩＩ もしくは液胞Ｈ＋−ＡＴＰアーゼの２つのサブユニットを標的とする、アンチセンスＲＮＡ分子とアンチセンスＤＮＡ分子による ｉｎ ｖｉｔｒｏ での骨の再吸収の阻害 − Ｌａｉｔａｌａ Ｔ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｈ Ｋ （１９９４） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９３： ２３１１−２３１８；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ で骨の表面へ接着する間における破骨細胞ミクロフィラメントの組織化 − Ｌａｋｋａｋｏｒｐｉ Ｆ， Ｔｕｕｋｋａｎａｎ Ｉ， Ｈｅｎｔｕｎｅｎ Ｔ， Ｊａｅｒｖｅｌｉｎ Ｋ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｈ Ｋ （１９８９） Ｉ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ４：８ １７−８２５；
ｉｎ ｖｉｔｒｏ での再吸収サイクル中における破骨細胞の細胞骨格の速度論 − Ｌａｋｋａｋｏｒｐｉ Ｐ Ｔ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｈ Ｋ （１９９１） Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ６： ８１７．８２６；
単離した破骨細胞の再吸収サイクルへのビスホスホネートの効果 − Ｓｅｌａｎｄｅｒ Ｋ， Ｌｅｈｅｎｋａｒｉ Ｐ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｈ Ｋ （１９９４） Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ ５５： ３６８−３７５；
バフィロマイシン Ａ１による破骨細胞プロトン輸送の阻害が骨の再吸収を止める − Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ Ｋ， Ｌａｋｋａｋｏｒｐｉ Ｐ， Ｗａｌｌｍａｒｋ Ｂ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｈ Ｋ （１９９０） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １６８：３０９−３１３；
【００８０】
実施例２
ｉｎ Ｖｉｔｒｏ における破骨細胞の分化アッセイ
マウスの骨髄培養系として知られる方法が、破骨細胞の分化を調べるのに最も広く用いられている方法である。元来、この方法は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８ａ） によって開発された。マウスの骨髄中の破骨細胞の前駆体は、ビタミン Ｄ３（１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）の活性な代謝産物、または副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の何れかの存在下で、多核の破骨細胞様細胞（ＭＮＣ）の形成を誘発し得る。マウスの骨髄の培養物中に形成されたＭＮＣは、幾つかの破骨細胞に特徴的な性質を有することが示されている。ＭＮＣは、骨もしくは歯の薄片の上に孔を形成する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９８８ａ， Ｈａｔｔｅｒｓｌｅｙ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｓ １９８９， Ｓｈｉｎａｒ ｅｔ ａｌ． １９９０）。ＭＮＣは、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）とカルシトニン受容体を高レベルで発現する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９８８ｂ， Ｓｈｉｎａｒ ｅｔ ａｌ． １９９０）。そして、ＭＮＣは、カルシトニンに応答し（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９８８ａ）、かつプロスタグランジン Ｅ２に応答する（Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｅｒｓ １９９２）。従って、該方法は、破骨細胞の分化の刺激剤および阻害剤の両方を調べるのに理想的な方法である。
【００８１】
元々の培養系において、破骨細胞の形成は、８日間培養した後に決定した。骨髄中では、非接着型破骨細胞前駆体と間質細胞の両方が存在し、また間質細胞は破骨細胞の形成を維持するのに必要とされる。形成された破骨細胞の数は、一般的に、少なくとも３個の核を含有するＴＲＡＰ−陽性のＮＭＣの数を計数することによって決定される。ネガティブ・コントロールでは、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３を添加せず、ＴＲＡＰ−陽性のＭＮＣは形成されない。
【００８２】
我々は、元のアッセイを修飾し、マウス骨髄細胞 １×１０６個／ｍｌを、６日間培養する。この修飾で、ＴＲＡＰ−陽性のＮＭＣ／培地の数は、約１５０であることが示されている（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｈｅｎｔｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ． １９９８）。形成された分化した破骨細胞の数を計数する代わりに、我々は速い簡単なＴＲＡＰ免疫アッセイを用いて、破骨細胞から培地中に放出されたＴＲＡＰの量を測定する（Ｈａｌｌｅｅｎ ｅｔ ａｌ． １９９９， ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｅｐ． ３０−Ｏｃｔ． ４， １９９９， ｉｎ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．， ＵＳＡ）。我々の結果は、培地中に放出されたＴＲＡＰの量が、形成された破骨細胞の量と非常に相関関係がある（ｒ＝０．９４、ｐ＜０．０００１、ｎ＝１２０）ことを示している。
【００８３】
操作；
生後８−１０週のマウスをＣＯ２で殺した。脛骨と大腿骨を解剖し、接着柔組織を除いた。骨端をメスで切り落とし、骨髄を１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加した α−基礎培地（α−ＭＥＭ， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）で流した。２７口径の針を有する１０ｍｌのシリンジを、流すのに用いた、細胞を６００×Ｇで１０分間遠心分離し、細胞のペレットを１０％のウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ中で再度懸濁した。５％ ＣＯ２ インキュベーター中で、２時間プラスチックに細胞を接着し、単球とマクロファージを除去した。非接着型細胞を十分に除去し、そして接着された骨髄細胞を、２４ウェル・プレート中で６日間培養した（１×１０６細胞／ウェル（＝１ｍｌ））。培地の半分を３日目に変え、処置を交換した。培養終了時に、プレートをＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒドで、２０分間固定した。破骨細胞の形成を、新規のＴＲＡＰ免疫アッセイ（以下参照）を用いた培地のＴＲＡＰ活性を測定することによって決定した。ここで、我々は、精製したヒトの骨のＴＲＡＰに対して、ウサギ内で形成されたポリクローナルＴＲＡＰ抗血清を用いている。ＴＲＡＰ抗体は、マイクロタイターウェルにコートされた抗ウサギＩｇＧ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ） に結合し、次に培地のＴＲＡＰは、抗体に結合した。結合したＴＲＡＰの活性は、ｐＮＰＰを基質として用い、酢酸ナトリウム緩衝液中で測定した。
【００８４】
本試験において、破骨細胞の分化へのランタン（ＩＩＩ）イオンの効果は、１，２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３ の存在下で試験した。下記の試料グループ：
ベースライン（賦形剤を含む）；
コントロール（１，２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３を含まないベースライン）；
ベースライン＋１００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋５００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋１０００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋５０００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋１５０００ｎｇ／ｍｌのランタン；
を含む。
【００８５】
各グループには６個含まれ、そして試験を２回行った。１，２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３を含まないベースラインをコントロールとして用い、試験系が破骨細胞の分化の阻害を検出し得ることを示した。ＬＡ １００ の結果が、２回の試験の両方で統計学的に同じ結果が出なかった（著しく異なるか、またはベースラインと比較されない）ので、ＬＡ １００ での試験をさらにもう１度行った。
【００８６】
結果の表
破骨細胞の分化アッセイにおいて、培地中に放出されたＴＲＡＰ ５ｂの活性の量を、破骨細胞の数の指標として決定した。ベースラインのグループのＴＲＡＰ ５ｂの活性の平均値で、それぞれのＴＲＡＰ ５ｂの活性を割ることによって得られたＴＲＡＰ ５ｂの活性の相対値として、その結果を示した。
【００８７】
表４：第１次破骨細胞分化アッセイにおける ＴＲＡＰ ５ｂ の活性の相対値
【表４】
2004501198.tif 000005
【００８８】
表５：第２次破骨細胞分化アッセイにおける ＴＲＡＰ ５ｂ の活性の相対値
【表５】
2004501198.tif 000006
【００８９】
ＬＡ １００ の結果が、第２次アッセイのベースラインとは有意に異なり、かつ１番目のアッセイでは有意に異なっていなかったため、 ＬＡ １００ のアッセイを、さらにもう１回繰り返した。
【００９０】
表６：ＬＡ １００ を伴う第３次破骨細胞分化アッセイにおける ＴＲＡＰ ５ｂ の活性の
相対値
【表６】
2004501198.tif 000007
表４−６に示した全てのデータは、重ね合わせて分析した。重ね合わせた結果を、表７と図２に示している。
【００９１】
表７：破骨細胞の分化へのＬＡ １００ − ＬＡ １５０００ の効果を重ね合わせた結果
【表７】
2004501198.tif 000008
【００９２】
結果
破骨細胞の分化アッセイにおいて、ＬＡ ５００−ＬＡ １５０００ ではっきりとした用量依存性阻害が観察され、それはＬＡ １０００ から ＬＡ １５０００ の間で統計学的に有意であった。統計学的に有意な阻害はまた、ＬＡ １００ でも観測された。ビタミンＤを含まないコントロール・グループにおいて、破骨細胞の分化は、ベースライン・グループよりも有意に低かった。
【００９３】
参考文献
破骨細胞の培地のための新規ＴＲＡＰ ５ｂの免疫アッセイ − Ｈａｌｌｅｅｎ Ｎ， Ａｌａｔａｌｏ Ｓ， Ｈｅｎｔｕｎｅｎ Ｔ Ａ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｈ Ｋ （１９９９） Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １４， Ｓｕｐｐｌ． １， Ｓ２４４．
破骨細胞の形成と骨再吸収の新規の阻害剤としてのヒトのＳｃａのクローニングと同定 − Ｃｈｏｉ Ｓ Ｊ， Ｄｅｖｌｉｎ Ｒ Ｄ， Ｍｅｎａａ Ｃ， Ｃｈｕｎｇ Ｈ， Ｒｏｏｄｍａｎ Ｇ Ｄ， Ｒｅｄｄｙ Ｓ Ｖ （１９９８） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０２： １３６０−１３６８．
プロスタグランジン Ｅ２は、海洋造血培地中で、造血細胞に対する作用を介して、破骨細胞の形成を促進する − Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄ Ａ， Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｔ Ｊ （１９９２）　Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ７： ５５５−５６１．
マウスの骨髄培地中での破骨細胞の機能の形成：多核・酒石酸耐性酸性ホスファターゼは、破骨細胞の分化のための信頼できないマーカーである − Ｈａｔｔｅｒｓｌｅｙ Ｇ， Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｔ Ｊ （１９８９） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２４： １６８９−１６９６．
トランスジェニック・マウス中における、ｂｃｌ−ＸＬと破骨細胞系列へのサルのウイルス４０ラージＴ抗原を標的とすることによる、破骨細胞前駆体の不死化 − Ｈｅｎｔｕｎｅｎ Ｔ Ａ， Ｒｅｄｄｙ Ｓ Ｖ， Ｂｏｙｃｅ Ｂ Ｆ， Ｄｏｖｌｉｎ Ｒ， Ｐａｒｋ Ｈ−Ｒ， Ｃｈｉｍｇ Ｈ， Ｓｅｌａｎｄｅｒ Ｋ Ｓ， Ｄａｌｌａｓ Ｍ， Ｋｕｒｉｈａｒａ Ｎ， Ｇａｌｓｏｎ Ｏ Ｌ， Ｇｏｌｄｒｉｎｇ Ｓ Ｒ， Ｋｏｏｐ， Ｂ Ａ Ｗｉｎｄｌｅ Ｊ Ｊ， Ｒｏｏｄｍａｎ Ｇ Ｄ （１９９８） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０２： ８８−９７．
マウスの骨髄培地中の破骨細胞様細胞の形成への造血成長因子の効果 − Ｓｈｉｎａｒ Ｄ Ｍ， Ｓａｔｏ Ｍ， Ｒｏｄａｎ Ｇ Ａ （１９９０） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２６： １７２８−１７３５．
マウスの骨髄培地中の骨向性ホルモンによる、破骨細胞様細胞の形成とその制御 − Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ， Ｙａｍａｎａ Ｈ， Ｙｏｓｈｉｋｉ Ｓ， Ｒｏｏｄｍａｎ Ｇ Ｄ， Ｍｕｎｄｙ Ｇ Ｒ， Ｊｏｎｅｓ Ｓ Ｊ， Ｂｏｙｄｅ Ａ， Ｓｕｄａ Ｔ （１９８８ａ） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：１３７３−１３８２．
マウスの骨髄細胞から形成された破骨細胞様多核細胞における、１，２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３によるカルシトニン受容体の誘発 − Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ． Ａｋａｔｓｕ Ｔ， Ｓａｓａｋｉ Ｔ， Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ｇ Ｃ， Ｍｏｓｅｌｅｙ Ｊ Ｍ， Ｍａｒｔｉｎ Ｔ Ｊ， Ｓｕｄａ Ｔ （１９８８ｂ） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２３： １５０４−１５１０．
【００９４】
実施例３
ｉｎ ｖｉｔｒｏ における造骨細胞の分化アッセイ
造骨細胞は、間葉幹細胞由来の骨形成細胞である。造骨細胞の発生の間は、３つの異なる期間が認められ、定義される：
１）細胞増殖および細胞外マトリックスの分泌；
２）ＥＣＭの成熟；および
３）ＥＣＭの石化。
これらの期間、造骨細胞の表現型のマーカーの連続した発現に特徴付けられる。アルカリ性ホスファターゼは、骨細胞の表現型と関連し、そして破骨細胞の成熟期間中活発に発現される。石化の始まりでは、大量のカルシウムが成熟有機マトリックスに沈着し、骨様小節を形成する。次にこれらのマーカーによって、我々はこの培養系における造骨細胞の分化の全ての段階を調べ得る。
【００９５】
造骨細胞を試験するために、幾つかの方法が発案されている。これらのうちの１番目の方法は、造骨細胞の表現型を伴う頭蓋冠からの細胞の単離を含む。しかし、頭蓋冠の細胞の小さなフラクションは、造骨細胞の前駆体であるため、これらの細胞は、造骨細胞の成熟段階でのみ表される （Ｂｅｌｌｏｗｓ ａｎｄ Ａｕｂｉｎ １９８９， Ｂｅｌｌｏｗｓ ｅｔ ａｌ． １９９４）。造骨細胞の細胞株は、使用に便利であるが、それらは初期の造骨細胞としてふるまわないことがある（Ｍｕｎｄｙ １９９５）。造骨細胞の前駆体は、骨髄に存在すると考えられており（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ １９７６， Ｏｗｅｎ １９８８）、そして、骨髄の間質細胞は骨芽前駆細胞の源として、長く認識されている。
【００９６】
我々は、マウスの骨髄由来の骨芽前駆細胞が始めに増殖し、次いで骨の小節を石化することができる造骨細胞への分化が起こる、培養モデルを確立している（Ｑｕ ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｑｕ ｅｔ ａｌ． １９９９）。我々は、幾つかの造骨細胞の表現型のマーカーを発現させることによって、かつ光学顕微鏡と電子顕微鏡のレベルで培養物の形態を調べることによって、このことを確かめている。カルシウムの遅い沈着を伴う原線維性細胞外マトリックスの合成は、造骨細胞の分化と成熟を確かめる。従って、この培養系は、骨芽前駆細胞の骨合成を行う造骨細胞への分化を調べるのに有用な ｉｎ ｖｉｔｒｏ でのモデルの要請を満たす。
【００９７】
操作
骨髄細胞は、生後１０週目のメスのＮＭＲＩマウスの大腿骨から得られた。動物は、頸部の脱臼によって殺した。両方の大腿骨を除去し、無菌で柔組織を分離した。両端から骨幹端を切り取り、培地：フェノール・レッドを含まないα−修飾された基本培地（α−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ））で骨幹を洗い流すことによって、骨髄細胞を集めた。２２口径のニードルを通して、細胞の調整液を繰り返し吸引することによって、骨髄細胞の懸濁液を得て、そして核のある細胞を血球計数器で計数した。細胞は、Ｔ−７５組織培養フラスコ中で、１０％ ＦＣＳ、１０−８Ｍ デキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸、１０−２Ｍ β−グリセロリン酸ナトリウム、１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを加えた、フェノール・レッドを含まないα−ＭＥＭで、１０６細胞／ｃｍ２で培養した。該細胞を６日間培養し、３日目に培地の半分を置換した。６日目に、継代培養を調整した。細胞を暖かいＰＢＳで洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて接着細胞を除去した。トリプシン処理した細胞を２２口径のニードルを有するシリンジに通し、単一細胞の懸濁液を作り、計数し、５×１０３細胞／ｍｌの密度で、２４ウェルプレート中に置いた。これらの骨芽前駆細胞を、１０−１０Ｍ エストロゲン（１７β−エストラジオール）の存在下で、８日間培養することによって刺激し、成熟造骨細胞へ分化させる。エストロゲンがない状態で、二代目の培養の始めに、および培地を変えるときに毎回、試験物質を加えた。
【００９８】
形成された造骨細胞の数は、細胞のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定することによって決定した。細胞は、ＰＢＳで２回細胞の層を洗浄することによって破壊し、２００μｌの０．１％、ｐＨ７．６の Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ 緩衝液（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．， ＵＳＡ）で抽出し、一晩凍結した。ＡＬＰ活性を、ｐＨ９．７で基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを用い、４０５ｎｍで光学密度を決定することで、比色定量的に決定した。同時に、ウェルのタンパク質含有量を、ＢＩＯ−ＲＡＤ タンパク質アッセイによって決定し、ＡＬＰの比活性を、ユニット／ｍｇ タンパク質として表している。
【００９９】
本試験において、造骨細胞の分化に対するランタン（ＩＩＩ）イオンの効果を試験した。下記の試料のグループ：
ベースライン （＋賦形剤）；
コントロール （ベースライン＋１０−１０Ｍ １７β−エストラジオール）；
ベースライン＋１００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋５００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋１０００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋５０００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋１５０００ｎｇ／ｍｌのランタン；
を含む。
【０１００】
結果の表
細胞のアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性と、細胞のライセート（ｌｙｓａｔｅ）の全タンパク量を測定することによって、造骨細胞の分化を決定した。ＡＬＰ活性を相当するタンパク質の量で割り、ＡＬＰの比活性を得た。ベースラインのグループの平均値で個々の値を割ることによって得られる比活性の相対値として、その結果を示している。
【０１０１】
表８：初期造骨細胞の分化のアッセイにおける細胞内アルカリ性ホスファターゼの比活性の相対値
【表８】
2004501198.tif 000009
【０１０２】
表９：第１次造骨細胞分化アッセイにおける細胞内アルカリ性ホスファターゼの比活性の相対値
【表９】
2004501198.tif 000010
【０１０３】
表１０：第２次造骨細胞分化アッセイにおける細胞内アルカリ性ホスファターゼの比活性の相対値
【表１０】
2004501198.tif 000011
表８−１０で示した全てのデータを重ね合わせて分析した。重ね合わせた結果は、表１１と図３に示している。
【０１０４】
表１１：造骨細胞の分化への ＬＡ１００−ＬＡ１５０００ の効果を重ね合わせた結果
【表１１】
2004501198.tif 000012
【０１０５】
結果
ランタン（ＩＩＩ）イオンは、造骨細胞分化アッセイにおいて、はっきりとした用量依存性の応答を示した。最も高い試験濃度（ＬＡ ５０００ と ＬＡ １５０００）では、造骨細胞の分化を阻害し、最も低い試験濃度（ＬＡ １００）では、造骨細胞の分化を有意に活性化した。ＬＡ ５００ と ＬＡ １０００ では、有意な応答は観測されなかった。コントロール物質である１７β−エストラジオールは、造骨細胞の分化を有意に活性化した。
【０１０６】
参考文献
単離したラットの胎児の頭蓋の細胞における、ｉｎ ｖｉｔｒｏ での骨芽前駆体の数の決定 − Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｃ Ｇ， Ａｕｂｉｎ Ｊ Ｅ （１９８９） Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｂｉｏｌ １１３：８−１３
ラットの胎児の頭蓋の細胞の培養物における、１，２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３が脂肪細胞の分化を刺激する：デキサメタゾンの効果との比較 − Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｃ Ｇ， Ｗａｎｇ Ｙ Ｈ， Ｈｅｅｒｓｃｈｅ Ｊ Ｎ， Ａｕｂｉｎ Ｊ Ｅ （１９９４） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４： ２２２１−２２２９．
メカノサイト（ｍｅｃｈａｎｏｃｙｔｅ）の前駆細胞− Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ Ａ Ｊ （１９７６） Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏｌ ４７： ３２７−３５５．
造骨細胞、骨形成、および石化：骨再構築とその疾患 − Ｍｕｎｄｙ Ｒ Ｇ （１９９５） Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ Ｌｔｄ ｐｐ． ２９−３０．
間質幹細胞：骨髄由来造骨細胞前駆体− Ｏｗｅｎ Ｍ． Ｆｒｉｅｎｄｅｎｓｔｅｉｎ Ａ Ｊ （１９８８） Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ １３６：４２−６０．
マウスの骨髄の培養物中でエストロゲンが造骨細胞の分化を増強する− Ｑｕ Ｑ， Ｐｅｒａｅｌａｅ−Ｈｅａｐｅ Ｍ， Ｋａｐａｎｅｎ Ａ， Ｄａｈｌｌｕｎｄ Ｊ， Ｓａｌｏ Ｊ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ， Ｈ Ｋ， Ｈａｅｒｋｏｅｎｅｎ， Ｐ （１９９８） Ｂｏｎｅ ２２：２０１．２０９．
マウスの骨髄の培養物中で、造骨細胞の分化に対する、エストロゲンと抗エストロゲンの効果の比較 − Ｑｕ Ｑ， Ｈａｅｒｋｏｅｎｅｎ Ｐ Ｌ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｈ Ｋ （１９９９） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７３： ５００−５０７．
【０１０７】
実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏ での骨形成アッセイ
成熟造骨細胞の活性は、石化した骨のマトリックスを形成する能力を定量することによって、決定され得る。これは、形成された骨のマトリックスを脱石化し、放出されたカルシウムの量を決定することによって行う。従って、この培養系は、成熟造骨細胞の骨形成活性を調べるのに有用な ｉｎ ｖｉｔｒｏ でのモデルの要請を満たす。
【０１０８】
操作
エストロゲンも上記の何れの試験物質も存在しない状態で、二次培養を行って８日目に得られた成熟造骨細胞は、さらに７日間それらを培養することによって、骨小節を形成した。培養の終了時に、培養の間に沈着したカルシウムの量を決定し、骨形成（カルシウム沈着）の量を計算した。
【０１０９】
沈着したカルシウムの量を定量するために、Ｃａ２＋もＭｇ２＋も含まないＰＢＳで細胞の培養物をで３回洗浄し、０．６Ｍ ＨＣｌ中で室温で一晩インキュベートした。５０μｌの抽出物と、１ｍｌの決定されたｏ−クレゾール−フタレイン・コンプレクソンで、コンプレックスを形成させた。分光器で５７０ｎｍで着色反応を決定した。絶対カルシウム濃度を、販売者が提供している換算された標準値と比較することによって決定した。
【０１１０】
本試験において、骨形成に対する炭酸ランタンの効果を試験した。下記の試料グループ：
ベースライン （賦形剤を含む）
コントロール （ベースライン＋１０−１０Ｍ １７β−エストラジオール）
ベースライン＋１００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋５００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋１０００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋５０００ｎｇ／ｍｌのランタン；
ベースライン＋１５０００ｎｇ／ｍｌのランタン；
を含む。
【０１１１】
結果の表
成熟細胞によって形成された骨小節に沈着したカルシウムの量を測定することによって、骨形成の量を決定した。ＨＣｌ抽出後骨小節から放出されたカルシウムの量として、その結果を示している。ベースラインの値は、他のアッセイで行ったように、量の相対値を用いて結果を示すには低すぎる。
【０１１２】
表１２：初期骨形成アッセイにおけるカルシウム沈着（ｍｍｏｌ／Ｌ）
【表１２】
2004501198.tif 000013
【０１１３】
表１３：第１次骨形成アッセイにおけるカルシウム沈着（ｍｍｏｌ／Ｌ）
【表１３】
2004501198.tif 000014
【０１１４】
表１４：第２次骨形成アッセイにおけるカルシウム沈着（ｍｍｏｌ／Ｌ）
【表１４】
2004501198.tif 000015
【０１１５】
表１３と表１４に示したデータを重ね合わせて分析した。表１２からの結果は、ベースラインとコントロール・グループの間で有意な差が無かったので、含めなかった。重ね合わせた結果を表１５と図４に示している。
【０１１６】
表１５：成熟造骨細胞の骨形成活性への ＬＡ １００−ＬＡ １５０００の 効果の重ね合わせた結果
【表１５】
2004501198.tif 000016
【０１１７】
結果
試験したランタン（ＩＩＩ）イオンの全濃度で、成熟造骨細胞の骨形成活性の非常に高い活性化を示した。最も高い試験濃度で最も高い活性化を示した。コントロール物質である１７β−エストラジオールは、骨形成を有意に活性化した。
【０１１８】
参考文献
単離されたラットの胎児の頭蓋の細胞における、ｉｎ ｖｉｔｒｏ での骨芽前駆細胞の数の決定 − Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｃ Ｇ， Ａｕｂｉｎ Ｊ Ｅ （１９８９） Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １１３：８−１３
ラットの胎児の頭蓋の細胞の培養物において、１，２５−ジヒドロキシビタミン Ｄ３ は脂肪細胞の分化を刺激する：デキサメタゾンの効果の比較 − Ｂｅｌｌｏｗｓ Ｃ Ｇ， Ｗａｎｇ Ｙ Ｈ， Ｈｅｅｒｓｃｈｅ Ｊ Ｎ， Ａｕｂｉｎ Ｊ Ｅ （１９９４） Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３４：２２２１−２２２９メカノサイトの前駆細胞 − Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ Ａ Ｊ （１９７６） Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏｌ ４７：３２７−３５５
造骨細胞、骨形成、および石化：骨再構築とその疾患において − Ｍｕｎｄｙ Ｒ Ｇ （１９９５） Ｍａｒｔｉｎ Ｄｕｎｉｔｚ Ｌｔｄ ｐｐ． ２９−３０．
間質幹細胞：骨髄由来造骨細胞前駆体 − Ｏｗｅｎ Ｍ， Ｆｒｉｅｎｄｅｎｔｅｉｎ Ａ Ｊ （１９８８） Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ １３６：４２−６０．
マウスの骨髄培養物においてエストロゲンが造骨細胞の分化を増強する − Ｑｕ Ｑ， Ｐｅｒａｅｌａｅ−Ｈｅａｐｅ Ｍ， Ｋａｐａｎｅｎ Ａ， Ｄａｈｌｌｕｎｄ Ｊ， Ｓａｌｏ Ｊ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｈ Ｋ， Ｈａｒｋｏｅｎｅｎ， Ｐ （１９９８） Ｂｏｎｅ ２２：２０１−２０９．
マウスの骨髄培養物における造骨細胞の分化に対する、エストロゲンおよび抗エストロゲン物質の効果の比較 − Ｑａ Ｑ， Ｈａｒｋｏｎｅｎ Ｐ Ｌ， Ｖａｅａｅｎａｅｎｅｎ Ｈ Ｋ （１９９９） Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７３： ５００−５０７．
【０１１９】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ の試験のための動物
【表１６】
2004501198.tif 000017
【０１２０】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ の結果の統計学的な分析
それぞれのグループの平均値と標準偏差（ＳＤ）を決定した。異なるグループ（ベースラインとコントロール、ベースラインと試験物質）の間で得られた値が、統計学的に異なっていた（ｐ＜０．０５）ならば、１元変動分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）を用いた。それぞれのグループおよび図において、統計学的な優位性を、アスタリスクで示し、１つのアスタリスク（＊）はｐ値が０．０５から０．０１の間であることを示し、２つのアスタリスク（＊＊）はｐ値が０．０１から０．００１の間であることを示し、３つのアスタリスク（＊＊＊）はｐ値が＜０．００１であることを示している。アスタリスクがないものは、相当するベースラインのグループの結果と有意な差がないことを示している。
【０１２１】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ での結果の要約
骨細胞の活性化および分化に対する試験濃度のランタン（ＩＩＩ）イオンの効果は、表１７に要約される。表中において、（＋）は有意な活性化を意味し、（−）は有意な阻害を意味し、そして（０）は効果がなかったことを意味する。１つの符号（＋または−）は、ｐ値が０．０５から０．０１の間であることを意味し、２つの（符号（＋＋または−−）は、ｐ値が０．０１から０．００１の間であることを意味し、そして３つの符号（＋＋＋または−−−）は、ｐ値が＜０．００１であることを意味する。
【０１２２】
【表１７】
2004501198.tif 000018
【０１２３】
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ での試験の結論
ランタン（ＩＩＩ）イオンは、試験した全ての濃度で、成熟造骨細胞の骨形成活性の強力な刺激剤である。最も良い応答は、最も高い試験濃度（ＬＡ ５０００ と ＬＡ １５０００）で観測された。しかし、これらの濃度はまた、造骨前駆細胞に対する細胞毒の効果を有し、このことが ｉｎ ｖｉｖｏ での成熟造骨細胞の活性化を補い得る。
【０１２４】
ＬＡ ５００ と ＬＡ １０００ はまた、骨形成を刺激するが、これらの濃度は造骨細胞の分化アッセイにおいて造骨細胞の形成を減少させず、造骨前駆細胞への細胞毒の効果がないことを示唆している。しかし、ＬＡ １０００ は、破骨細胞分化アッセイにおいて、破骨細胞の形成を減少させるが、この濃度では破骨前駆細胞への細胞毒の効果があると考えられる。４つのアッセイにおいて、ＬＡ ５００ の有意な効果のみが、骨形成の活性化を行った。従って、ＬＡ のこの濃度が、細胞毒の効果がなく骨形成を増大させるのに有用であり得る。
【０１２５】
ＬＡ １００ は、骨形成と造骨細胞の分化の活性化、および造骨細胞の分化と骨再吸収の阻害の両方を示す（しかし骨再吸収の阻害は統計学的に有意ではない）。これらの全ての効果は、骨を強化させる。
【０１２６】
実施例５
Ｉｎ Ｖｉｖｏ での骨形成の研究
操作：
成長中の未成熟なイヌの腸骨の頂から採取した検体を分析した。そのグループをコントロール・グループと、処置するグループに分けた。処置するグループに炭酸ランタン １０００ｍｇ／Ｋｇ／日を経口で１日に２回投与した。該グループを１３週間処置した。その後、骨の試料を腸骨稜を経て直角に採取し、メタクリル酸メチルをベースとした樹脂に固定し、トルイジン・ブルーと Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ 染料で染色した。測定したパラメータは：
骨の柵状組織と皮層の質量；
骨の表面と体積；
造骨細胞表面；
骨の皮層の体積；
柵状組織と皮層の破骨細胞の数；
骨の皮層と柵状組織における再吸収表面；
骨中のランタンの組み込み（修飾されたソロクローム・アズリン法）；
であった。
【０１２７】
結果
これらの動物の腸骨稜は、成長プレートとして作用している。未成熟の動物の腸骨稜は、活発な成長を示している。サンプリングされた検体には非常に活性な骨再構築があり、さらに皮層の表面および皮層から他の層の上の範囲に対する非常に活性な骨膜の破骨を伴う骨構築が見られた。
【０１２８】
異なる動物の間で皮層の厚さに違いが記録され、そして生体検体中の骨の量には偏差が記録された。この偏差値は、動物のそれぞれの２つのグループ、または特定の性別の動物に制限されていない。
【０１２９】
骨の柵状組織の体積は、２つのグループの間で統計学的に有意な差があった。骨の柵状組織の体積は、ランタンで処置したグループよりも、コントロール・グループの方が低かった（処置したグループの約半分）。２つのグループの間で、調べられた他の骨のパラメーターは、何れも統計学的に有意な差がなかった。
【０１３０】
処置した動物において、コントロール・グループと比べて、骨の柵状組織の増大（約２倍）があった。これらの結果は、ランタンが成長プレートで、骨成長に影響を及ぼすことを提案している。
【０１３１】
より好ましい具体的態様において、本発明の主要部を例示および記載しており、当業者が本発明をこの主要部から逸脱しない範囲で、その組み合わせと細部を修飾し得ることを認めるべきである。我々は、下記の請求項の範囲で、全ての修飾を請求している。
【０１３２】
本明細書中で言及した全ての出版物、特許、および特許明細書は、言及することによって、個々の出版物、特許、または特許明細書が、全体で言及することによって、その全てが組み込まれ、特記している内容および個々に示されている内容と同じ内容で、全て本明細書中に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】骨の再吸収へのＬＡの効果の重ね合わせた結果
【図２】破骨細胞へのＬＡの効果の重ね合わせた結果
【図３】造骨細胞へのＬＡの効果の重ね合わせた結果
【図４】成熟した造骨細胞へのＬＡの効果の重ね合わせた結果
【図１】
2004501198.tif 000019
【図２】
2004501198.tif 000020
【図３】
2004501198.tif 000021
【図４】
2004501198.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004501198.tif 000023
2004501198.tif 000024
2004501198.tif 000025
2004501198.tif 000026
2004501198.tif 000027
2004501198.tif 000028
2004501198.tif 000029
2004501198.tif 000030
2004501198.tif 000031
2004501198.tif 000032
2004501198.tif 000033
2004501198.tif 000034
2004501198.tif 000035
2004501198.tif 000036
2004501198.tif 000037
2004501198.tif 000038
2004501198.tif 000039
2004501198.tif 000040
2004501198.tif 000041
2004501198.tif 000042
2004501198.tif 000043
2004501198.tif 000044
2004501198.tif 000045
2004501198.tif 000046
2004501198.tif 000047
2004501198.tif 000048
2004501198.tif 000049
2004501198.tif 000050
2004501198.tif 000051
2004501198.tif 000052
2004501198.tif 000053
2004501198.tif 000054
2004501198.tif 000055
2004501198.tif 000056
2004501198.tif 000057
2004501198.tif 000058
2004501198.tif 000059
2004501198.tif 000060
2004501198.tif 000061
2004501198.tif 000062
2004501198.tif 000063
2004501198.tif 000064
2004501198.tif 000065
2004501198.tif 000066
2004501198.tif 000067
2004501198.tif 000068
2004501198.tif 000069
2004501198.tif 000070
2004501198.tif 000071
2004501198.tif 000072
2004501198.tif 000073
2004501198.tif 000074
2004501198.tif 000075
2004501198.tif 000076
2004501198.tif 000077
2004501198.tif 000078
2004501198.tif 000079
2004501198.tif 000080
2004501198.tif 000081
2004501198.tif 000082
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501198.tif 000083
【国際調査報告】
2004501198.tif 000084
2004501198.tif 000085
2004501198.tif 000086
2004501198.tif 000087
2004501198.tif 000088