(57)【要約】関節リウマチは、関節の破壊を引き起こす、慢性炎症性疾患である。通常の治療は、手術による介入のための時間を遅くするための、痛みの低減および関節の摩擦性の改善に基づいている。関節炎のための薬剤に基づく治療のための特異的に作用する薬剤が不足している。それら製剤は、様々な硫酸化度を有する硫酸化ヒアルロン酸、または薬理的に許容され得るそれらの塩類、ならびに、任意に、ヒアルロン酸および／またはヒアルロン酸ウロニドを含む。それら薬剤は、水性、粘性、ゲル状、もしくはペースト状の状態の、高度に濃縮された注射用調製物であるか、または、関節内適用のための低濃度のすすぎ液である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトおよび動物における炎症性関節炎を抑制するための硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項２】
等張水性〜高粘性溶液、ゲル、およびペーストから選択される製剤が使用されることを特徴とする、請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項３】
前記製剤が、更なる活性物質および／または１つ以上の補助剤を含むことを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項４】
前記製剤が、関節の関節内空洞もしくは腱の周辺へ投与されるか、または、関節内空洞が、前記製剤によってすすぎ洗いされることを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項５】
液体製剤中の硫酸化ヒアルロン酸の濃度が、１．０ｍｇ／ｍｌ〜２００．０ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０．０ｍｇ／ｍｌ〜５０．０ｍｇ／ｍｌの間であることを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項６】
すすぎ液中の硫酸化ヒアルロン酸の濃度が、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの間であることを特徴とする、請求項４に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項７】
注射溶液中のヒアルロン酸の硫酸化度が、０．１〜２の範囲内であることを特徴とする、請求項４に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項８】
すすぎ液中のヒアルロン酸の硫酸化度が、２〜４の範囲内であることを特徴とする、請求項４に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項９】
硫酸化ヒアルロン酸の分子量が、１，０００〜５００，０００の間であることを特徴とする、請求項１に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１０】
製剤が、ゲル状またはペースト状または高粘性構造を有することを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１１】
製剤が、親水コロイド、好ましくはヒアルロン酸を、更に含むことを特徴とする、請求項３に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１２】
製剤が、ヒアルロン酸のウロニドを更に含むことを特徴とする、請求項３に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１３】
製剤が、リウマチ性疾患における小さな脊椎関節および仙腸関節への関節内注射のために使用されることを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１４】
製剤が、リウマチ性および特発性由来の腱鞘炎における腱の周辺部への関節内注射のために使用されることを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１５】
製剤が、関節粘膜の炎症成分が見られ得る、大小の関節における関節鏡検査による介入後に関節内注射のために使用されることを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１６】
製剤が、炎症段階における、変形性股関節症、膝関節炎、または肩関節炎のような、大小の関節の関節炎における関節内注射のために使用されることを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１７】
製剤が、関節粘膜の炎症成分が見られ得るすべての大小の関節における関節鏡検査による介入後に関節内注射のために使用されることを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１８】
製剤が、リウマチ性疾患における初期の、かつ急性または慢性の段階において、すすぎ洗いおよび／または注射のために使用されることを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項１９】
製剤が、体内プロテーゼによるか、または表立った滑膜切除による、関節鏡検査によって治療される大小の関節の手術後のすすぎ洗いのために使用されることを特徴とし、そこでは、関節リウマチ、反応性関節炎、または活性化関節炎のような、関節粘膜の炎症成分が見られ得る、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【請求項２０】
製剤が、核切開後症候群（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅｏｔｏｍｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に関する炎症性の変化および連続した傷跡になる膠着を抑制するために、椎間板手術後に局部注射のために使用されることを特徴とする、請求項２に記載の硫酸化ヒアルロン酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）に対する有効性を有する新規製剤に関する。ＲＡは、数段階を経て、最終的に関節の顕著な破壊および腱領域における炎症を引き起こす、慢性炎症性疾患である。近年の知識状況によれば、Ｔ細胞が、炎症を引き起こし、かつ持続させると考えられている。この工程では、サイトカインならびに間葉細胞（マクロファージおよび滑膜線維芽細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ））は、活性である。サイトカインＴＮＦ−αが、炎症の媒介物の１つであることは、かなり確かである。このサイトカインは、主に、マクロファージによって放出される。それは、パンヌスの形成を促進し、このことは、ＲＡに特有であり、かつ、軟骨の破壊を促進する。ＴＮＦ−αは、内皮細胞の表面において、白血球に対する粘着性分子の数を増やし、かつ、キャピラリー内皮層の穿孔を増やす。このことは、滑液内への白血球の流入量を増加させる。サイトカインは、滑液細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ）によるマトリックスメタロプロテイナーゼの分泌を促進する。これらの酵素は、骨および軟骨の破壊に直接関連する。ＴＮＦ−αは、さらに、痛みのレセプターを敏感にし、このことは、痛みの感覚の誘発に関連する。ＴＮＦ−αは、関節リウマチの開始および持続において、重要な役割を果たす。
【０００２】
ヒアルロン酸は、関節および他の組織、例えば、目の硝子体、の滑液の成分として、動物によって、ならびに、ストレプトコッカス属のバクテリアによっても形成される。その粘弾性のため、それは、関節の滑りを増し、かつ、衝撃吸収剤として作用する。それは、粘弾性溶液を形成する。
【０００３】
ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなる二糖の繰り返しを含む、内因性グルコサミノグリカンである。各二糖は、β−（１−４）結合を介して、次に結合している。この結合は、同様に内因性である、酵素ヒアルロニダーゼによる加水分解によって切断される。体内には、ヒアルロン酸の同化作用と異化作用との平衡状態（代謝回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ））が存在する。炎症を引き起こすフリーラジカルの影響下で、ヒアルロン酸が連続的に分解され、その間、その粘弾性は低下する。よって、ＨＡの間に、内因性ヒアルロン酸の代謝回転平衡の位置が妨害される。ヒアルロン酸のウロニドは、ヒアルロン酸への酵素ヒアルロン酸リアーゼの作用によって調製される（ＷＯ  ００／３８６４７）。
【０００４】
最新技術により、症状を緩和する効果を有する薬剤と軟骨保護効果または構造修正効果を有する物質が区別される。ＲＡの薬剤による治療のために、多数の経口および皮下投与されるステロイドならびに非ステロイド抗リウマチ薬、さらに、滑液または軟骨の形成材料との高い類似性を有し、関節内投与される（ｉ．ａｒｔ．）薬剤のグループが、使用される。ステロイド系抗リウマチ薬は、抗炎症剤として全身的効果を有する。
【０００５】
経口投与される薬剤には、例えば、メトトレキサート（ランタレル（Ｌａｎｔａｒｅｌ））， プリンアンタゴニストおよび細胞分裂抑制剤、ならびにレフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）（アラバ（Ａｒａｖａ））、ピリミジンアンタゴニストおよび免疫抑制剤が含まれる。皮下投与される薬剤には、例えば、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ））、ＴＮＦ−α阻害剤が含まれる。他の製剤には、硫酸ヒドロキシクロロキン、ゴールド（トレドン（Ｔａｕｒｅｄｏｎ））、およびペニシラミン（トリソルシン（Ｔｒｉｓｏｒｃｉｎ））が含まれる。
【０００６】
カルソ（Ｃａｒｕｓｏ）ら（ＵＳ ４，３１２，８６６）は、塩基性アミノ酸と組み合わせた抗生物質リファマイシンＳＶによるＲＡの処置のための治療を記載している。
【０００７】
軟骨保護剤には、例えば、変性関節およびＲＡの両方において使用され得る、動物由来のムコ多糖類ポリ硫酸エステルの混合物が含まれる。３，０００〜１７，０００Ｄの間の分子量を有するポリ硫酸化されたグリコサミノグリカンは、動物における使用のために、アルテパロン（Ａｒｔｅｐａｒｏｎ）またはアデクアン（Ａｄｅｑｕａｎ） ＲＴＭの名前で使用される（ルートポルド・ファーマシューティカルズ（Ｌｕｉｔｐｏｌｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））。ポリ硫酸グリコサミノグリカンは、滑膜において、ヒアルロン酸の形成を促進する（ニシカワ（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ）ら、「ウサギの膝の滑膜におけるヒアルロン酸の生合成に対する硫酸化グリコサミノグリカンの影響」、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２４０、１４６−１５３）。単量体グルコサミンサルフェート（ドナ（Ｄｏｎａ）、ロッタファルム（Ｒｏｔｔａｐｈａｒｍ））も、関節の治療のための薬剤として使用される。
【０００８】
硫酸化ヒアルロン酸または硫酸化デキストランは、全身的活性とともに、抗炎症性を有する（ＪＰ ８．２７７．２２４）。それを、例えば、呼吸困難において、０．５〜１０ｍｇ／ｍｌの硫酸化ポリマーを含む溶液の状態で、体重１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇの量で、静脈内注射することが提案されている。
【０００９】
硫酸化ヒアルロン酸は、そのヘパリンのような抗凝血性および抗血栓溶解性および抗炎症性について更に知られている。また、細胞粘着性を低減させる効果が記載されている。
【００１０】
ランフランコ（Ｌａｎｆｒａｎｃｏ）ら（ＷＯ ９８／４５３３５およびＷＯ ９９／４３７２８）は、硫酸化ヒアルロン酸を、製剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）および生体材料において、ならびに、生物学的対象物のコーティングのために使用している。
【００１１】
シアルディ（Ｃｉａｌｄｉ）ら（ＵＳ ６，０２７，７４１）は、生体材料において使用するための、抗凝血性および細胞粘着性を低減する性質を有する、硫酸化多糖類、例えば、硫酸化ヒアルロン酸およびそのエステルを記載している。
【００１２】
変性関節において良好な効果を有する（ＵＳ ４，８０８，５７６）純粋なヒアルロン酸は、徐々に作用する薬剤に属し、３−５回注射した後にのみ、効果を示し、そこでは、軟骨保護効果が観察され得る。この効果は、今のところはまだ、ＲＡの治療においては示されていないので、改質されていないヒアルロン酸は、ＲＡにおいて使用されることはほどんどない。よって、５００，０００Ｄ〜９００，０００Ｄの間の平均分子量を有するヒアルロン酸を含む市販の注射用製剤は、ＲＡの臨床像において、何ら効果を有さない。
【００１３】
ＲＡの治療のために実施された方法は、抗炎症性を有する添加剤を含む、ヒアルロン酸を含む注射用製剤の動脈内注射である（リンドブラッド（Ｌｉｎｄｂｌａｄ）、ＵＳ ４，８０１，６１９）。これらの添加剤は、例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾンのようなステロイド、更に、イブプロフェン（抗リウマチ剤）または動物材料から調製されたヒアルロン酸中の副生物としての硫酸化ムコ多糖類である（ドリゼン（Ｄｒｉｚｅｎ）ら、ＵＳ ５，０７９，２３６）。ＵＳ ５，０７９，２３６において、獣医学的用途のために提案された滅菌製剤の欠点は、細胞に有毒なパラベンのような防腐剤の添加によって、滅菌が達成されるという点である。硫酸化ムコ多糖類の規定された量は、注射溶液１ｍｌ当たり、ヒアルロン酸ナトリウムの規定された５〜２０ｍｇに基づいて、０．７５〜１．２５％の間であり、即ち、０．０３７〜０．２５ｍｇ／ｍｌの硫酸化ムコ多糖類が、製剤中に不純物として含まれる。
【００１４】
関連する技術状況によれば、関節リウマチの臨床像の発生および徴候の異なる段階に対して特異的な効果を有する、局所適用される薬剤が不足している。
【００１５】
本発明の目的は、関節リウマチの狙いどころのよい（ｗｅｌｌ−ａｉｍｅｄ）治療のための、そのような、特に有効であり、かつ局所的に作用する治療効果を有する製剤を提案することである。この目的によれば、それら製剤は、耐容性が良好であるべきであり、動物由来でないべきであり、かつ、可能であれば、所定の化学的組成を有するべきである。
【００１６】
本発明は、腱領域における関節内適用（類）のための、特に、等張滅菌製剤の形の硫酸化ヒアルロン酸の使用に関する。驚くべき治療の成功とともに、そのような製剤は、初期の急性および慢性段階の、炎症性および変性関節ならびに腱疾患の治療のために使用される。本発明によれば、それらは、より高度に濃縮された注射用調製物として投与されて体内に留まることができるか、または、より低濃度に濃縮されたすすぎ液として使用され得る。本発明に基づく研究において、関節リウマチの治療において、それ自体既知の等張ヒアルロン酸溶液による注射またはすすぎ洗いと比べて、きわめて明確に向上した効果が見出された。
【００１７】
本発明による硫酸化ヒアルロン酸の使用は、水溶液中、特に、適用に特異的な（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）硫酸化度を有する硫酸化ヒアルロン酸を治療に効果的な量で含む等張水溶液中で行われる。そのような溶液は、関節の関節内空洞または腱の周辺の腱鞘へ注射され、そこに留まる。すすぎ液として使用される場合、関節内空洞または腱の周辺は、それら製剤によってすすぎ洗いされ、かつ、活性物質は、炎症部位には残らない。別の態様では、硫酸化ヒアルロン酸を含む、より高粘度の製剤も、関節内空洞のための注射用調製物として使用される。本発明による他の態様では、カニューレまたは注射針によって、任意に注射装置中に高い圧力を適用し、高粘性溶液が注射されるか、または、本発明によるゲルもしくはペーストが、腱の周辺の関節包へ投与される。高粘性またはゲル状もしくはペースト状製剤の適用は、除放性製剤の形成が好ましいそれぞれの場合に有利である。
【００１８】
本発明の別の態様では、本発明による使用において使用される高粘性〜ペースト状製剤は、硫酸化ヒアルロン酸に加えて、粘度増加またはゲル形成親水コロイド、好ましくはヒアルロン酸を、補助剤として含む。一般に、ヒアルロン酸または他の親水コロイドは、製剤の高粘度化またはゲル形成を引き起こす。製剤中でヒアルロン酸を使用する利点は、ヒアルロン酸が、更に、軟骨保護効果をもたらすという点である。ヒアルロン酸の他に、例えば、キサンタン、アルギン酸、またはペクチン酸のような、他のポリアニオニック多糖類が使用され得る。
【００１９】
別の態様では、ヒアルロン酸の代わりに利益をもたらすために、ヒアルロン酸のウロニドも使用され得る。ウロニドは、微生物の酵素であるヒアルロン酸リアーゼによるヒアルロン酸の酵素切断によって、それ自体既知の方法で調製される。ウロニドは、末端のグルクロン酸残基に不飽和結合を含む。その分子量は一般に低いので、ウロニドは、粘度の増加にはあまり寄与しない。利点は、その特に高いラジカル結合性であり、それは、ヒアルロン酸の効果に勝っている。関節または腱の周辺における炎症プロセスがより強力に弱められると、製剤の治療効果は高くなる。
【００２０】
高粘性のペースト状またはゲル状製剤は、例えば、以下の方法で調製される。更なる親水コロイド、例えば、ヒアルロン酸またはヒアルロン酸ウロニド、を任意に含む、滅菌濾過された液体製剤から、例えば、無菌条件下で凍結乾燥することにより、水を除去する。この後、高粘性〜ペースト状製剤が得られる量で、等張に調整した滅菌水を添加する。
【００２１】
注射溶液は、１．０ｍｇ／ｍｌ〜２００．０ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０．０ｍｇ／ｍｌ〜５０．０ｍｇ／ｍｌの間の、硫酸化ヒアルロン酸を含む。
【００２２】
本発明により使用されるすすぎ溶液において、硫酸化ヒアルロン酸の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの間である。１つの態様において、好ましくは、それほど強く現れていない関節リウマチに対する適用において、ヒアルロン酸の硫酸化度は、二糖単位に基づいて、０．１〜２．０の範囲内であり、その硫酸化度の最大値は、４．０であることができる。好ましくは、関節リウマチの多数の臨床像において使用される、別の態様では、本発明によって使用される硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度は、２．０〜４．０の範囲内である。
【００２３】
本発明による硫酸化ヒアルロン酸の分子量は、１，０００〜５００，０００Ｄの間である。水性製剤の等張性は、無機塩、好ましくは、一般的な塩を含有することによってもたらされる。
【００２４】
本発明による硫酸化ヒアルロン酸の使用における治療効果を補助するために、抗生物質または更なる抗炎症物質のような別の活性成分、例えば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、を製剤へ任意に添加することができる。
【００２５】
炎症性関節炎の驚くべき阻害が検出された、本発明のいくつかの適用分野を説明するが、それらにより、本発明が限定されることはない。
【００２６】
その製剤は、本発明によって使用される注射用調製物として、リウマチ性疾患において、関節内空洞、小さな脊椎関節、および仙腸関節へ関節内注射される。リウマチ性および特発性由来の腱鞘炎において、腱鞘または腱のより広い周辺部への直接注射が、うまく行われた。その中で関節粘膜の炎症成分が見られ得る大小の関節すべてにおいて、関節鏡検査による介入（ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｉｃ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ）後、関節内注射も使用され得る。
【００２７】
炎症段階における大小の関節の関節炎（例えば、変形性股関節症、膝関節炎、肩関節炎）における製剤の使用も、治療に有利であった。
【００２８】
別の態様では、本発明によるすすぎ溶液は、体内プロテーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ）によるか、または表立った（ｏｐｅｎｌｙ）滑膜切除による、関節鏡検査によって治療される大小の関節の手術後のすすぎ洗いのために好ましくは使用され、そこでは、関節粘膜の炎症成分が見られ得る（例えば、関節リウマチ、反応性関節炎、または活性化関節炎）。
【００２９】
本発明によって使用される硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が異なるために、異なる種類の治療に採用される製剤がある。硫酸化度が高いほど、硫酸化ヒアルロン酸の特異的効果は強いのに対し、軟骨保護性またはヒアルロン酸に特異的な性質は減少する。治療の強さは、臨床像によって変えることができる。すすぎ洗いのために、硫酸化度がより低い活性物質を使用することができ、それは、重症度が低い疾患または疾患の前段階のためにも有効である。炎症が重症な場合、高度に硫酸化されたヒアルロン酸を使用することが好ましいのに対し、その後、徴候が治まった場合は、硫酸化度が低いヒアルロン酸および任意にヒアルロン酸を含む製剤も使用され得る。
【００３０】
製剤中の多量の硫酸化ヒアルロン酸さえ、予期せぬ非常に強い効果および非常に高い耐容性を有することに加え、硫酸化ヒアルロン酸の他の性質も、純粋なヒアルロン酸の溶液と比べて有利である。
【００３１】
よって、硫酸化ヒアルロン酸の溶液は一般に低分子量であるため、同じ濃度の（ｅｑｕａｌｌｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）純粋なヒアルロン酸溶液と比べて低粘度であることは有利である。従って、硫酸化ヒアルロン酸は、より高濃度および／またはより少量で注射することができる。さらに、その製剤は、滅菌濾過された状態で使用され得る。
【００３２】
他の活性物質と比べて、硫酸化ヒアルロン酸は、ヒトに共通の（ｈｕｍａｎ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）ヒアルロン酸の誘導体である。活性物質の検出された高い耐容性は、固有のヒアルロン酸または硫酸化グリコサミノグリカンとの、本発明による活性物質の構造的類似性（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ）に関連すると考えることができる。別の大きな利点は、硫酸化ヒアルロン酸の血栓溶解性からもたらされる。これは、注射による関節内および周辺の血管の損傷後の血栓の形成を同時に妨げる。
【００３３】
関節および腱領域における抗炎症効果は、硫酸化ヒアルロン酸に特有の効果のようである。一般的な抗炎症作用を凌ぐ、この驚くべき効果は、関節および腱領域における本発明による製剤の適用に関して、予測可能でもなく、あらかじめ知られてもいなかった。
【００３４】
硫酸化されていないヒアルロン酸と比べた場合の、関節炎の特異的治療のための、および、軟骨の保護における、硫酸化ヒアルロン酸を含む本発明による製剤の高い能力は、動物による実験的試験によって、インビボで示される（実施例２）。
【００３５】
本発明の重要性は、関節炎の治療における硫酸化ヒアルロン酸の使用、ならびに、関節の腫脹減退の症状に関する結果に対してだけでなく、すべての段階の疾患における軟骨および骨の破壊の抑制に対するその効果にある。記載のヒアルロン酸調製物の適用は、徐々に変性し、かつ主に非炎症性のコースを有する関節炎を患っている患者の治療に限定される。従って、本発明による製剤の使用は、関節リウマチを患う非常に多くの患者に、特にきわめて重要である。
【００３６】
【実施例】
実施例１
ピロゲンを含まない滅菌溶液の調製
１００，０００〜３，０００，０００ダルトンの所定の分子量を有するストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）からのピロゲンを含まない滅菌濾過されたヒアルロン酸を使用した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）／マルチアングルレーザー光スペクトロメトリー（ＭＡＬＬＳ）によって、分子量を決定した。ＤＥ１９．８１３．２３４ Ａ １に従って高分子量ヒアルロン酸の硫酸化により、硫酸化ヒアルロン酸を得て、その分子量を、光散乱法（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）によって決定した。
【００３７】
１％ヒアルロン酸溶液を、ピロゲンを含まない水に対して、水の伝導度が２０ｍＳ以下に下がるまで透析した。溶液を凍結乾燥した。２リットルの０．２％ヒアルロン酸を、活性炭で処理し、濾過補助物としての“コストロソルブ（Ｋｏｅｓｔｒｏｓｏｒｂ）”型（ケミエウェーク・バッド・コストリッツ社（Ｃｈｅｍｉｅｗｅｒｋ Ｂａｄ Ｋｏｅｓｔｒｉｔｚ ＧｍｂＨ）、バッド・コストリッツ（Ｂａｄ Ｋｏｅｓｔｒｉｔｚ））のシリカゲルの１〜２ｃｍの厚さの層を通して濾過した。その後、０．８μｍの、次いで、０．２μｍの酢酸セルロースフィルターによって、濾過を行った。
【００３８】
この段階で（ｎｏｗ）ピロゲンを含まないヒアルロン酸を、無菌条件下で凍結乾燥させ、次いで、滅菌生理食塩水を添加する。
【００３９】
比較目的のために、高分子量ヒアルロン酸またはそれらの塩類の１％溶液を含む生理食塩溶液を調製し、室温で滅菌濾過する。
【００４０】
実施例２
ラットにおける膝関節への抗炎症効果の試験
使用した動物モデルである抗原誘発性（ａｎｔｉｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ）関節炎のラットは、関節リウマチ（ＲＡ）のメカニズムを非常に良好に反映する、確立された（ｗｅｌｌ−ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ）動物モデルである。軟骨と骨との間の変わり目（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）における未処理の膝関節についての組織外形計測試験（ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ）により、それらの比較的強固に発達した軟骨下薄膜のために、この状態のマウスでは見られない、典型的な変化が示された。
【００４１】
この試験のために、雌のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットが使用される。１週間隔で、完全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）中のメチルアルブミン（ｍＢＳＡ）０．１ｍｇによって、動物の皮下にあらかじめ免疫性を与える（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｐｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）。二回目の免疫化の２週間後、０．１ｍｇのｍＢＳＡを、左膝関節へ関節内注射する。この注射により、関節炎が誘発され、急性期後、数週間持続する。関節炎の誘発の１日後、硫酸化ヒアルロン酸溶液または高分子量ヒアルロン酸（ＭＷ＝１，８００ｋＤａ）を用いて、それらを膝関節へ関節内注射して、治療を開始する。
【００４２】
微生物によって得られた高分子量ヒアルロン酸および硫酸化ヒアルロン酸の抗原誘発性関節炎に対する影響を表すパラメーターを調べる：
１．関節炎の局所的証拠（実験中）
２．組織学的な関節炎のスコア
３．石灰化軟骨の領域における微小破壊の形成および形態学
４．生化学的パラメーター
実験の経過は、表１に示す通りであった。
【００４３】
【表１】
2004531460.tif 000002
それぞれの介入に対して、エーテル麻酔によって動物に麻酔をかけた。
【００４４】
動物の免疫化は、７日間隔で行われた。最初の免疫化では、それぞれ０．２５ｍｌ（完全フロインドアジュバント中のメチルアルブミン０．１ｍｇに相当）の合計４回の皮下注射が、肩甲骨の高さおよび臀部の上の脊柱の両側に行われた（それぞれ、脊柱の背骨から約１．５ｃｍ離れている）。二回目の免疫化では、それぞれ０．３ｍｌの除放性製剤を３つ導入した；１つは正確に２つの肩甲骨の間、および、２つは脊椎傍の（ｐａｒａｖｅｒｔｅｂｒａｌｌｙ）両側の腹部。
【００４５】
二回目の免疫化の二週間後に、１０ｍｇ／ｍｌのｍＢＳＡ溶液を含む生理食塩水各０．０５ｍｌを、それぞれ右膝関節に関節内注射することによって、関節炎の誘発が行われた。
【００４６】
関節炎の誘発の１日後、硫酸化ＨＡを含む製剤各０．０５ｍｌを、実験群の動物２０匹の右膝関節に注射した（インシュリンシリンジ、細いカニューレ、０．３５×４０ｍｍを使用）。その後、週１回、注射を行った（長期の群）。
【００４７】
関節炎の誘発前、ならびにその１、４、および８日後、その後、実験が完了するまで毎週、すべての動物の外側の（ｌａｔｅｒａｌ）関節の直径を、距離計（マタツヨ（Ｍａｔａｔｕｙｏ））によって測定した。動物の体重も毎回測定した。
【００４８】
関節炎の誘発の翌日すぐに、すべての動物は、右膝関節の腫脹を示した。それらの体重は、大きな変化を何ら示さなかった。
【００４９】
７日目に、実験群の動物１０匹および対照群の動物１０匹を殺した。それら動物は、エーテル麻酔によって殺され（ｐｕｔ ｄｏｗｎ）、硫酸化ＨＡを含有する製剤の右膝関節内への最後の注射の１週間後に、残りの動物を殺した。
【００５０】
３週間にわたる特に長期の実験により、関節の直径（炎症性腫脹の尺度として）の大幅な減少が、硫酸化ＨＡによって治療された動物において検出され得ることが示された。
【００５１】
【表２】
2004531460.tif 000003
【００５２】
実施例３
すすぎ液の調製：１５０，０００Ｄの分子量を有する硫酸化ヒアルロン酸１．０ｇおよび２０，０００Ｄの平均分子量を有するヒアルロン酸ウロニド１．０ｇを、１リットルの生理食塩溶液に溶解し、その溶液を、室温で滅菌濾過する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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