(57)【要約】HIVに対する免疫応答を誘導するための多価初代分離株核酸組成物を開示する。本明細書に記載した組成物および方法は、1つまたは複数の異なるHIVエンベロープ糖タンパク質をコードするDNA組成物の使用にかかわる。本DNA組成物はHIV Gagタンパク質をコードしうる。1つまたは複数のHIVタンパク質をコードするDNAは、HIV主要群（major group）の異なる遺伝学的クレードの初代分離株DNAおよび/または異なるタンパク質から作製された、異なる核酸（DNAプラスミドなど）の組み合わせである。HIVに対する免疫応答を誘導するためのHIVタンパク質組成物を開示する。タンパク質組成物をDNA組成物の投与後の追加免疫原として用いるための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれの核酸分子がヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質をコードする、核酸分子の複数のセットを含む核酸組成物であって、核酸分子の各セットが、異なるタイプのHIVエンベロープ糖タンパク質をコードするか、または異なる遺伝学的クレード（genetic clade）からの初代分離株配列（primary isolate sequence）を含む、核酸組成物。
【請求項２】
核酸がDNAプラスミドを含む、請求項1記載の核酸組成物。
【請求項３】
HIVエンベロープ糖タンパク質が、gp120、gp140、gp160およびgp41のうちの任意の1つまたは複数である、請求項1記載の核酸組成物。
【請求項４】
HIV gagタンパク質をコードする核酸分子のセットをさらに含む、請求項1記載の核酸組成物。
【請求項５】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、HIV-1エンベロープ糖タンパク質である、請求項1記載の核酸組成物。
【請求項６】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、gp120エンベロープ糖タンパク質である、請求項1記載の核酸組成物。
【請求項７】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、主要（major）（M）群のクレードに属するクレードからのものである、請求項1記載の核酸組成物。
【請求項８】
クレードがクレードA、B、C、D、E、F、G、H、I、JまたはKである、請求項7記載の核酸組成物。
【請求項９】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、アウトライアー（outlier）（O）群のクレードに属するクレードからのものである、請求項1記載の核酸組成物。
【請求項１０】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、N群のクレードに属するクレードからのものである、請求項1記載の核酸組成物。
【請求項１１】
クレードがクレードBである、請求項8記載の核酸組成物。
【請求項１２】
エンベロープ糖タンパク質が、B715分離株のエンベロープ糖タンパク質である、請求項8記載の核酸組成物。
【請求項１３】
クレードがクレードCである、請求項8記載の核酸組成物。
【請求項１４】
核酸のセットの1つまたは複数が、最適化されたコドンを含む、請求項1記載の核酸組成物。
【請求項１５】
核酸分子の複数のセットを含む核酸組成物であって、この複数のセットが、以下のセットのうちの2つまたはそれ以上を含み、以下の核酸分子の各セットは、エンベロープ糖タンパク質の初代分離株配列をコードする、核酸組成物：
それぞれがクレードAのヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子のセット；
それぞれがクレードBのHIVエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子のセット；
それぞれがクレードCのHIVエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子のセット；および
それぞれがクレードEのHIVエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子のセット。
【請求項１６】
組成物が各セットのうちの1つを含む、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）gagタンパク質をコードする核酸分子のセットをさらに含み、そのセットが、gagタンパク質の初代分離株配列をコードする、請求項15記載の組成物。
【請求項１８】
gagタンパク質がクレードCのgagタンパク質である、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
gagタンパク質がクレードBのgagタンパク質である、請求項17記載の組成物。
【請求項２０】
組成物が各セットの核酸を50μg〜2,500μgの範囲で含む、請求項1記載の組成物。
【請求項２１】
請求項1記載の組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
後天性免疫不全症候群（AIDS）の個体を治療する方法であって、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）による疾患の進行を抑制するのに十分な量の請求項21記載の薬学的組成物を個体に投与する段階を含む方法。
【請求項２３】
投与の様式が、局所投与、経口投与、針による注射、針を用いないジェット式注射、皮内投与、筋肉内投与および遺伝子銃投与からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
免疫応答が防御免疫応答である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
免疫応答が細胞性免疫応答である、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
免疫応答が体液性免疫応答である、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
免疫応答が細胞性免疫応答および体液性免疫応答である、請求項22記載の方法。
【請求項２８】
組成物を、HIV感染症に対する第2の治療法と組み合わせて投与する、請求項22記載の方法。
【請求項２９】
HIV感染症に対する第2の治療法が、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬による治療法、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬による治療法、またはHIVプロテアーゼ阻害薬による治療法を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
HIV感染症に対する第2の治療法が、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬による治療法、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬による治療法、およびHIVプロテアーゼ阻害薬による治療法を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
脊椎哺乳動物におけるヒト免疫不全ウイルス（HIV）またはHIVエピトープに対する免疫応答を誘導する方法であって、脊椎哺乳動物におけるHIVまたはHIVエピトープを誘発するのに十分な量の請求項1記載の組成物を哺乳動物に投与する段階を含む、方法。
【請求項３２】
脊椎哺乳動物から免疫細胞を単離する段階；および単離された免疫細胞の免疫応答をインビトロで検査する段階をさらに含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
組成物を長期間にわたり（例えば、4週間またはそれ以上の期間にわたり）多回投与する、請求項31記載の方法。
【請求項３４】
アジュバント、追加免疫原（boost）または促進因子（facilitating agent）を、組成物の投与の前、最中または後に投与する段階をさらに含む、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
脊椎哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物またはヒトである、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
投与の様式が、局所投与、経口投与、針による注射、針を用いないジェット式注射、皮内投与、筋肉内投与および遺伝子銃投与である、請求項31記載の方法。
【請求項３７】
異なるクレードがA、B、C、D、E、F、G、H、I、JおよびKのうち任意の2つまたはそれ以上である、請求項31記載の方法。
【請求項３８】
脊椎哺乳動物がヒトである、請求項31記載の方法。
【請求項３９】
ヒトがヒト免疫不全ウイルスに対するリスクを有するか、またはそれに感染している、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
単離されたヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質分子のセットを含む単離されたタンパク質組成物であって、セット中の各分子が初代分離株配列を含む、組成物。
【請求項４１】
単離されたヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質分子の複数のセットを含むタンパク質組成物であって、セット中の各分子が異なるタイプのHIVエンベロープ糖タンパク質を含むか、または異なる遺伝学的クレードからの初代分離株配列を含む、組成物。
【請求項４２】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、HIV-1エンベロープ糖タンパク質である、請求項41記載の組成物。
【請求項４３】
各セットのエンベロープ糖タンパク質が、gp120、gp140、gp160およびgp41からなる群より選択される、請求項41記載の組成物。
【請求項４４】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、gp120エンベロープ糖タンパク質である、請求項43記載の組成物。
【請求項４５】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、主要（M）群のクレードに属するクレードからのものである、請求項41記載の組成物。
【請求項４６】
クレードがクレードA、B、C、D、E、F、G、H、I、JまたはKである、請求項45記載の組成物。
【請求項４７】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、アウトライアー（O）群のクレードに属するクレードからのものである、請求項41記載の組成物。
【請求項４８】
複数のセットのうちの1つまたは複数のエンベロープ糖タンパク質が、N群のクレードに属するクレードからのものである、請求項41記載の組成物。
【請求項４９】
クレードがクレードBである、請求項48記載の組成物。
【請求項５０】
エンベロープ糖タンパク質が、B715分離株のエンベロープ糖タンパク質である、請求項41記載の組成物。
【請求項５１】
クレードがクレードCである、請求項41記載の組成物。
【請求項５２】
薬学的組成物を形成するための薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項41記載の組成物。
【請求項５３】
後天性免疫不全症候群（AIDS）の個体を治療する方法であって、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）による疾患の進行を抑制するのに十分な量の請求項52記載の薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、方法。
【請求項５４】
脊椎哺乳動物におけるヒト免疫不全ウイルス（HIV）またはHIVエピトープに対する免疫応答を誘導する方法であって、
請求項30記載の核酸組成物を哺乳動物に投与する段階；
請求項52記載のタンパク質組成物を哺乳動物に投与する段階を含み、
核酸組成物およびタンパク質組成物を、脊椎哺乳動物におけるHIVまたはHIVエピトープに対する検出可能な免疫応答を誘発するのに十分な量として投与する、方法。
【請求項５５】
脊椎哺乳動物から免疫細胞を単離する段階；および単離された免疫細胞の免疫応答をインビトロで検査する段階をさらに含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
タンパク質組成物を核酸組成物の後に投与する、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
タンパク質組成物を核酸組成物の4〜8週後に投与する、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
細胞性免疫応答を検査する、請求項54記載の方法。
【請求項５９】
体液性免疫応答を検査する、請求項54記載の方法。
【請求項６０】
中和性の体液性応答を検査する、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
以下を含むキット：
請求項1記載の核酸組成物、および核酸組成物を個体に投与するための指示書。
【請求項６２】
単離されたヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質分子のセットを含むタンパク質組成物をさらに含む、請求項61記載のキット。
【請求項６３】
単離されたHIVエンベロープ糖タンパク質の1つまたは複数の別のセットをさらに含み、各セットが、異なるタイプのHIVエンベロープ糖タンパク質であるか、または異なる遺伝学的クレードからの初代分離株配列を含む、請求項61記載のキット。
【請求項６４】
核酸組成物の核酸分子によってコードされるHIVエンベロープ糖タンパク質の1つまたは複数が、タンパク質組成物のエンベロープ糖タンパク質の1つまたは複数と同じタイプまたはクレードである、請求項61記載のキット。
【請求項６５】
核酸組成物の核酸分子のセットによってコードされるHIVエンベロープ糖タンパク質のそれぞれが、タンパク質組成物のエンベロープ糖タンパク質のそれぞれと同じタイプまたはクレードである、請求項64記載のキット。
【請求項６６】
以下を含むキット：
単離されたヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質分子のセットを含むタンパク質組成物であって、各セットが、異なるタイプのHIVエンベロープ糖タンパク質を含むか、または異なる遺伝学的クレードからの初代分離株配列を含む、組成物；および
HIVワクチンを投与された個体に対して組成物を投与するための指示書。
【請求項６７】
個体に核酸HIVワクチンが投与されている、請求項66記載のキット。
【請求項６８】
タンパク質組成物が賦形剤をさらに含む、請求項66記載のキット。
【請求項６９】
賦形剤がシクロデキストリンである、請求項68記載のキット。
【請求項７０】
タンパク質組成物がアジュバントをさらに含む、請求項66記載のキット。
【請求項７１】
アジュバントがQS-21である、請求項70記載のキット。
【請求項７２】
以下の方法に従った、個体に対する投与のための指示書を含む、請求項61記載のキット：
核酸組成物を個体に投与する段階、および
単離されたヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質分子のセットを含むタンパク質組成物を個体に投与する段階を含む方法であって、タンパク質組成物を核酸組成物の後に投与する、方法。
【請求項７３】
個体が哺乳動物である、請求項72記載のキット。
【請求項７４】
哺乳動物がヒトである、請求項73記載のキット。
【請求項７５】
タンパク質組成物が、単離されたHIVエンベロープ糖タンパク質の1つまたは複数の別のセットをさらに含み、各セットが、異なるタイプのHIVエンベロープ糖タンパク質であるか、または異なる遺伝学的クレードからの初代分離株配列を含む、請求項72記載のキット。
【請求項７６】
核酸組成物を個体に2回またはそれ以上の回数投与する、請求項75記載のキット。
【請求項７７】
タンパク質組成物を個体に2回またはそれ以上の回数投与する、請求項75記載のキット。
【請求項７８】
以下の方法に従った、個体に対する投与のための指示書をさらに含む、請求項61記載のキット：
核酸組成物を個体に投与する段階、およびタンパク質組成物を個体に投与する段階を含む方法であって、タンパク質組成物を核酸組成物の後に投与する、方法。
【請求項７９】
個体が哺乳動物である、請求項78記載のキット。
【請求項８０】
哺乳動物がヒトである、請求項79記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、後天性免疫不全症候群（AIDS）の治療のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）はAIDSの原因病原体である。現在認識されているHIVの種類にはHIV-1およびHIV-2の2つがある。HIV-1は世界的に多数を占める型である。世界的流行の主体をなすHIV-1の型はHIV-1の主要群（major group）と呼ばれる。HIV-1には主要群（M群）、アウトライアー群（outlier group）（O群）および非M/非O群（N群）の3つの群がある。M群はさらに少なくとも11種の遺伝学的サブタイプに分けられ、これらは一般にクレード（clade）A、B、C、D、E、F、G、H、I、JおよびKと呼ばれており、この後にもさらに追加されることが予想される。クレードBは米国で最も頻度の高いものであり、クレードCは世界的にみて最も頻度が高い。遺伝学的サブタイプの地理的分布は絶えず変化しつづけており、最新のデータも不完全な推測値を示すにとどまる。
【０００３】
新たなHIV感染例の約95％は途上国で生じているため、この流行を抑制するために最も有効な手法はワクチンであると思われる。しかし、HIV感染の予防またはHIV感染の中和のために有効なワクチンを開発することは科学界にとって困難な課題となっている。HIVの感染を予防し、その拡大を抑制するためには、複数の遺伝学的クレードにわたって広範囲の反応性を示す潜在能力を備えた、特異的な抗ウイルス中和抗体ならびに細胞性免疫応答を効果的に誘発しうるHIVワクチンを開発することが最も重要な目標である。HIVの遺伝的多様性が極めて高度であることはワクチン開発上の障害となっている。
【発明の開示】
【０００４】
概要
本明細書に提供する方法および組成物は、一部には、多価初代分離株DNAワクチンがHIV（例えば、HIV-1）に対する免疫応答を効果的に誘導するという発見に基づく。組換えHIVタンパク質組成物による追加免疫処置が、多価初代分離株DNAワクチンを投与された対象におけるHIVに対する免疫応答を増大させることも見いだされた。
【０００５】
全体的には、本発明は、それぞれの核酸分子がヒト免疫不全ウイルス（HIV）（例えば、HIV-1）エンベロープ糖タンパク質をコードする、核酸分子（例えば、DNAプラスミド）の複数のセットを含む核酸組成物であって、核酸分子の各セットが、異なるタイプのHIVエンベロープ糖タンパク質をコードするか、または異なる遺伝学的クレードからの初代分離株配列を含むような核酸組成物を特徴とする。核酸は野生型配列でもよく、または野生型配列との一致度が80、90、95、98もしくは99パーセントである配列でもよい。コードされるタンパク質は野生型配列でもよく、保存的アミノ酸置換を、例えばアミノ酸位置10箇所につき1つ、20箇所につき1つ、30箇所につき1つ、またはそれ未満、例えば1、2、5もしくは10箇所のアミノ酸位置に含んでもよい。ある種の態様においては、コンセンサス配列（種々の野生型配列の集成物に基づく）を用いることができる。
【０００６】
さまざまな態様において、HIVエンベロープ糖タンパク質は、gp120、gp140、gp160およびgp41のうち任意の1つまたは複数でありうる。核酸組成物はさらに、HIV gagタンパク質をコードする核酸分子のセットを含みうる。エンベロープ糖タンパク質は主要（M）群のクレードに属するクレードであってよく、例えば、クレードはクレードA、B、C、D、E、F、G、H、I、JまたはKでありうる。代替的な態様において、エンベロープ糖タンパク質は、アウトライアー（O）群のクレードまたはN群のクレードに属するクレードでありうる。エンベロープ糖タンパク質は、Ba-L分離株またはB715分離株のエンベロープ糖タンパク質でありうる。クレードはクレードCでありうる。エンベロープ糖タンパク質がCzm分離株からのものであってもよい。ある種の態様において、核酸のセットの1つまたは複数は、1つまたは複数の最適化されたコドンを含みうる。
【０００７】
もう1つの面において、本発明は、核酸分子の複数のセットを含む核酸組成物であって、この複数のセットが以下のセット：それぞれがクレードAのヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子のセット；それぞれがクレードBのHIVエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子のセット；それぞれがクレードCのHIVエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子のセット；および、それぞれがクレードEのHIVエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸分子のセット；のうち2つまたはそれ以上を含み、核酸分子の各セットがエンベロープ糖タンパク質の初代分離株配列をコードするような核酸組成物を含む。ある種の態様において、本組成物はさらに、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）gagタンパク質をコードする核酸分子のセットであって、gagタンパク質の初代分離株配列、例えばクレードCからおよび/またはCzm分離株からのものをコードするようなセットを含みうる。gagタンパク質がクレードBのgagタンパク質であってもよい。
【０００８】
さまざまな態様において、本組成物は、各セットの核酸を50μg〜2,500μgの範囲で含みうる。
【０００９】
もう1つの面において、本発明は、本明細書に記載した新たな組成物の1つまたは複数、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物を含む。
【００１０】
本発明はまた、後天性免疫不全症候群（AIDS）の個体を治療する方法であって、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）による疾患の進行を抑制するのに十分な量の新たな薬学的組成物を個体に投与することによる方法も特徴とする。これらの方法において、投与の様式は、局所投与、経口投与、針による注射、針を用いないジェット式注射、皮内投与、筋肉内投与および遺伝子銃投与でありうる。免疫応答は、防御免疫応答（例えば、細胞性免疫応答）、体液性免疫応答、またはその両方でありうる。
【００１１】
ある種の方法においては、新たな組成物を、HIV感染症に対する第2の治療法、例えば、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬による治療法、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬による治療法、および/またはHIVプロテアーゼ阻害薬による治療法と組み合わせて投与することができる。
【００１２】
本発明はまた、脊椎哺乳動物におけるヒト免疫不全ウイルス（HIV）またはHIVエピトープに対する免疫応答を誘導する方法であって、脊椎哺乳動物におけるHIVまたはHIVエピトープを誘発するのに十分な量の新たな組成物を哺乳動物に投与することによる方法も含む。これらの方法はさらに、脊椎哺乳動物から免疫細胞を単離すること；および単離された免疫細胞の免疫応答をインビトロで検査することを含みうる。これらの方法では、組成物を、長期間にわたり（例えば、2、3、4週間またはそれ以上、例えば、数カ月間にわたり）多回投与することができる。
【００１３】
本方法はまた、アジュバント、追加免疫原（boost）または促進因子（facilitating agent）を、組成物の投与の前、最中または後に投与することも含みうる。脊椎哺乳動物はマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物またはヒトであってよく、例えば、HIVに感染したかそれによる感染のリスクを有するヒトであってよい。投与の様式は、局所投与、経口投与、針による注射、針を用いないジェット式注射、皮内投与、筋肉内投与および遺伝子銃投与でありうる。
【００１４】
もう1つの面において、本発明は、単離されたヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質分子のセットを含む単離されたタンパク質組成物であって、セット中の各分子が初代分離株配列を含むような組成物を特徴とする。
【００１５】
本発明はまた、単離されたヒト免疫不全ウイルス（HIV）（例えば、HIV-1）エンベロープ糖タンパク質分子の複数のセットを含むタンパク質組成物であって、セット中の各分子が異なるタイプのHIVエンベロープ糖タンパク質、または異なる遺伝学的クレードからの初代分離株配列を含むような組成物も含む。例えば、各セットのエンベロープ糖タンパク質は、gp120、gp140、gp160およびgp41のうち1つまたは複数でありうる。クレードおよび分離株は、核酸組成物に関して本明細書に記載したものと同じでありうる。タンパク質組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物中に含めることができる。
【００１６】
本発明はまた、後天性免疫不全症候群（AIDS）の個体を治療する方法であって、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）による疾患の進行を抑制するのに十分な量の新たな薬学的組成物を個体に投与することによる方法も特徴とする。
【００１７】
もう1つの面において、本発明は、脊椎哺乳動物におけるヒト免疫不全ウイルス（HIV）またはHIVエピトープに対する免疫応答を誘導する方法であって、核酸組成物の1つまたは複数を哺乳動物に投与すること、および新たなタンパク質組成物の1つまたは複数を哺乳動物に投与すること；を含み、核酸組成物およびタンパク質組成物を、脊椎哺乳動物におけるHIVまたはHIVエピトープに対する検出可能な免疫応答を誘発するのに十分な量として投与する方法を含む。また、脊椎哺乳動物から免疫細胞を単離して、単離された免疫細胞の免疫応答をインビトロで検査することも可能である。
【００１８】
これらの方法においては、タンパク質組成物を核酸組成物の後、例えば、核酸組成物の4および8週後に投与することができる。さらに、細胞性免疫応答を検査すること、体液性免疫応答を検査すること、および/または中和性の体液性応答を検査することができる。
【００１９】
本発明はまた、新たな核酸組成物の1つまたは複数、および、例えば本明細書に記載した方法の1つまたは複数に従って、核酸組成物を個体に投与するための指示書を含むキットも特徴とする。キットはまた、単離されたヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質分子のセットを含む新たなタンパク質組成物の1つまたは複数も含みうる。キットはさらに、単離されたHIVエンベロープ糖タンパク質の1つまたは複数の別のセットであって、各セットが、異なるタイプのHIVエンベロープ糖タンパク質であるか、または異なる遺伝学的クレードからの初代分離株配列を含むようなセットも含みうる。これらのキットにおいて、核酸組成物の核酸分子によってコードされるHIVエンベロープ糖タンパク質の1つまたは複数は、タンパク質組成物のエンベロープ糖タンパク質の1つもしくは複数またはそれぞれと同じタイプまたはクレードでありうる。
【００２０】
キットはまた、単離されたヒト免疫不全ウイルス（HIV）エンベロープ糖タンパク質分子のセットを含む新たなタンパク質組成物の1つまたは複数であって、各セットが、異なるタイプのHIVエンベロープ糖タンパク質を含むか、または異なる遺伝学的クレードからの初代分離株配列を含むような組成物；および、HIVワクチン（例えば、核酸HIVワクチン）を投与された個体に対する組成物の投与のための指示書、も含みうる。キットは、賦形剤（例えば、シクロデキストリン）および/またはアジュバント（QS-21など）を含みうる。
【００２１】
キット中の指示書は、核酸組成物および/またはタンパク質組成物を個体に対して2回またはそれ以上の回数投与すべきであることを指示することができる。
【００２２】
本発明はまた、HIVワクチンを接種された個体におけるHIVに対する免疫応答を増大させる方法であって、新たな組成物の1つまたは複数を、HIVに対する免疫応答を対照と比較して増大させるのに有効な量として個体に投与することによる方法も含む。例えば、個体は核酸HIVワクチンの接種を受けていてもよい。
【００２３】
「ワクチン」とは、ワクチンのレシピエントまたは宿主における免疫応答を誘導する組成物のことである。本明細書に記載の方法および組成物は、現在または将来のHIV（例えば、HIV-1）感染に対する防御として、レシピエントにおける体液性（例えば、中和抗体）応答および/または細胞性免疫応答（例えば、細胞傷害性Tリンパ球（CTL））応答を誘導する核酸（例えば、DNAプラスミド）ワクチンを範囲に含む。ワクチンは、その後にHIVに曝露された時に、感染に対する防御を誘導することができる。防御とは、HIVによる持続感染に対する宿主動物の抵抗性（例えば、部分的抵抗性）のことを指す。ワクチン接種を受けた宿主において産生された中和抗体はこの防御をもたらしうる。また別の状況では、CTL応答がこの防御をもたらしうる。状況によっては、中和抗体および細胞性免疫（例えば、CTL）応答はいずれもこの防御をもたらす。
【００２４】
防御応答はさまざまな方法によって評価しうる。例えば、HIVタンパク質（例えば、エンベロープ糖タンパク質、「Env gp」）に対する中和抗体の産生、およびHIVタンパク質に対する細胞性免疫応答の産生はいずれも防御応答を示しうる。また、防御応答には、ワクチン投与を受けずにウイルスの接種物に曝露させた宿主動物と比較して、ワクチン接種を行った上で所定のウイルス接種物に曝露させた宿主動物におけるウイルス量（例えば、血液中またはリンパ系器官中）の低下を引き起こす応答も含まれる。
【００２５】
「多価性（polyvalency）」および「多価性（multivalency）」は本明細書において互換的に用いられ、複数の異なるタンパク質をコードまたは包含する核酸組成物またはタンパク質組成物（例えば、DNAワクチンまたはタンパク質追加免疫組成物）の特徴のことを指す。それぞれの核酸、例えばプラスミドは、異なるHIVエンベロープ糖タンパク質（Env gp）もしくは欠損HIVウイルス粒子の形態にあるEnv gp、またはクレードの異なるHIVエンベロープ糖タンパク質、またはこれらの可能性の組み合わせをコードし、この多価核酸（例えば、DNAプラスミド）ワクチンに柔軟性をもたらす。本明細書で用いる場合、「エンベロープ糖タンパク質」（Env gp）とは、単離されたEnv gpだけでなく、欠損ウイルス粒子の形態にあるEnv gpのことも指す。「3価（3-valent）」とは、3種類の異なる抗原（例えば、クレードA分離株のenv遺伝子およびクレードB分離株のenv遺伝子およびクレードC分離株のenv遺伝子）の組成物のことを指す。同様に、「4価」および「8価」とは、それぞれ4種および8種の他と異なる抗原を有する組成物のことを指す。
【００２６】
「DP6-001」「DP6-001製剤（formulation）」および「DP6-001ワクチン」とは、DNAおよびタンパク質の製剤のことを指す。DP6-001のDNA成分は、5種類の異なるHIV-1 Env（gp120）抗原および単一のGag抗原をコードする、コドン最適化がなされた核酸を含む組成物である。gp120抗原はHIV-1分離株A、B715、Ba-L、CzmおよびEに由来する。Gag抗原は分離株Czmに由来する。DP6-001のタンパク質成分は、HIV-1分離株A、B715、Ba-L、CzmおよびEに由来する6種類の異なるHIV-1 gp120抗原を含むタンパク質組成物である。
【００２７】
「初代ウイルス分離株」または「初代分離株」核酸配列またはアミノ酸配列とは、HIVの実験室株からではなく、HIV（例えば、HIV-1）に感染した個体の細胞または血清からの、核酸配列またはアミノ酸配列のことを指す。初代ウイルス分離株とは、初代ヒトT細胞、単球および/またはマクロファージのみにおいて増殖および維持がなされていて、細胞株における増殖および維持はなされていないウイルス分離株のことである。したがって、初代分離株は「実験室株」と呼ばれるものとは異なる。
【００２８】
HIVの実験室株は、実験室において何度も、場合によっては何年にもわたって継代されている。それらはTCLA株と呼ばれることもあり、これは組織培養実験室に適合化された株（tissue culture laboratory adapted strain）またはT細胞株に適合化された株（T cell line adapted strain）の略である。これに対して、初代ウイルス分離株は現場から（例えば、感染したヒト患者）から収集された上で、例えば、ウイルスが増殖可能であるか否かを判定し、その後にウイルス配列を入手することことのみを目的として、実験室で増殖または継代される。初代分離株の増殖または継代は、例えばウイルスの増殖が起こりうるか否かを判定するために、ウイルスを末梢血単核細胞と共培養することによって行われる。増殖/継代の量は個々のウイルスに依存し、広範囲にわたりうるが、いずれの場合にも増殖/継代は以上のことから最小限または限定的であると考えられる。この最小限または限定的な継代が、初代ウイルス分離株を実験室株と区別する点である。
【００２９】
本発明はいくつかの利点を提供する。まず、その多価性のため、新たなワクチンはHIVの高い変異速度が原因で有効性が失われる可能性が低いと考えられる。本明細書に記載した核酸ワクチンは、多くの異なる抗原を遺伝学的クレードの異なる配列の形態で提供するため、感染性ウイルスに単一の変異が起こってもレシピエントにおけるワクチンの有効性は直ちには低下しないと考えられる。本発明が提供するもう1つの利点は、この種々のタンパク質は実験室株ではなく初代ウイルス分離株配列によってコードされるため、より幅広い免疫応答が誘導されることである。
【００３０】
多価DNA組成物およびタンパク質追加免疫原の投与はいずれも、非常に強い体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘発する。本明細書に記載した組成物の組成物の組み合わせを用いることにより、中和抗体応答がもたらされる。体液性応答および細胞性応答の存在は、ナイーブ個体においては感染に対するより優れた防御を付与する。体液性免疫応答および細胞性免疫応答の存在は、ワクチン接種の前にウイルスに感染した個体では疾患の進行を遅らせることが可能である。
【００３１】
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。本発明の実施または検討のために本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は以下に説明するものである。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、それらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。対立が生じた場合には、定義を含め、本明細書が支配的であるものとする。さらに、材料、方法および実施例は例示のためのものであって発明の範囲の制限を意図したものではない。
【００３２】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【００３３】
詳細な説明
本明細書に提供する方法および組成物は、一部には、HIVの多数の異なる遺伝学的サブタイプからの初代HIV-1分離株を組み合わせると、広範囲にわたる抗体応答（例えば、中和抗体応答）および細胞性免疫応答（例えば、細胞傷害性Tリンパ球（CTL））を誘導しうる多価DNA組成物を作り出せるという発見に基づく。また、本明細書に提供する方法および組成物は、多価DNA組成物を投与された対象における免疫応答の増強のために初代分離株からのHIVタンパク質を用いうるという、タンパク質追加免疫処置の発見にも基づく。最近の戦略は、CTL認識を免れることが原因で免疫防御がごくわずかしか得られないという問題に直面している（Barouch et al., 2002, Nature, 415: 335-339；Goulder et al., 2001, Nature, 412: 334-338；Goulder et al., 1997, Nature Med., 3: 212-217）。この問題に対処するために、多価組成物を作製し、それによって細胞性免疫応答を向上させ、ウイルスによるCTLエスケープの確率を低下させ、さらに中和抗体応答も向上させるという目的で、初代HIV-1分離株からの核酸配列が用いられている。この新たな方法は、種々のHIV-1タンパク質をコードするベクターの組み合わせおよびHIV-1タンパク質の組み合わせに基づく組成物の設計において柔軟性をもたらす。
【００３４】
タンパク質追加免疫処置には、事前のDNAワクチン接種段階で投与されたDNAによってコードされるタンパク質のすべてに対応するHIVタンパク質を含めることができる。または、DNAワクチンに対応するタンパク質のサブセットを投与する。例えば、5種類の異なるHIVタンパク質をコードするDNA（例えば、5種類の異なるHIV-1分離株からのEnv遺伝子）を投与する場合には、その後のタンパク質追加免疫処置には、Envタンパク質の5種類すべて、Envタンパク質のうち4つ、またはそれ未満を含めることができる。
【００３５】
DNA組成物およびタンパク質組成物は、複数のHIV分離株からの種々の遺伝子およびタンパク質を含みうる。いくつかの態様においては、Env抗原およびGag抗原をDNA組成物によりコードさせ、Env抗原をタンパク質組成物に含める。したがって、本明細書で提供するのは、Env糖タンパク質（gp）、複数のHIV-1初代分離株（例えば、クレードA、B、C、D、E、FまたはG）の配列に由来するEnv糖タンパク質をコードするベクターの組み合わせ、異なるタイプかつ異なるクレードの組み合わせ、および/またはHIV-1 gagタンパク質をコードする組み合わせ、を含む組成物である。
【００３６】
DNA組成物およびタンパク質組成物は、多数のクレードの分離株からの配列、または単一クレードの多数の分離株からの配列を含みうる。異なる組み合わせを用いてもよい。例えば、DNA組成物は、1つのクレードA分離株、1つのクレードB分離株、1つのクレードC分離株および1つのクレードE分離株のそれぞれからの抗原をコードする遺伝子を含むことが可能である。組成物がさらに、第2のクレードB分離株からの抗原を含むこともできる。
【００３７】
初代HIV-1 Env gpに関するコード配列を、核酸（例えば、DNA）ワクチンベクター中にクローニングして、一群のDNAワクチンプラスミドを作製することが可能である。HIVエンベロープは、HIVに感染した個体における中和抗体の主要な標的である。したがって、中和抗体を誘導する目的で、Env gpをコードするワクチンを用いることができる。初代HIV-1 Env gpにはgp120、gp140、gp160およびsgp41が含まれる。新たなワクチンを調製するために、これらのEnv gpを、HIV-1主要群の7つの遺伝学的クレード、A、B、C、D、E、FおよびGをカバーする初代分離株からの核酸（例えば、DNA）によってコードさせることができる。これらの配列は異なる地理学的地域：北米、アフリカ、アジアおよび南米から分離されている。また、Env gpを、HIV-1主要群の他の遺伝学的クレード（例えば、H、I、JおよびK）、HIV-1 O群の遺伝学的クレード、およびHIV-1 N群の遺伝学的クレードをカバーする初代分離株からのDNAによってコードさせることも可能である。
【００３８】
HIVの遺伝的多様性のため、HIV-1の実験室株（初代分離株ではなく）由来の抗原に基づくワクチンは、蔓延している複数のHIV初代株に対して幅広い免疫応答を生じさせる能力に乏しい（例えば、Barouch et al., 2002, Nature, 415: 335-339；Johnston and Flores, 2001, Curr. Op. In. Pharmac., 1: 504-510；およびMascola et al., 1996, J. Infect. Dis.,173: 340-348を参照）。初代分離株タンパク質（例えば、多数の Env gp）をコードする多数の核酸分子（例えば、DNAプラスミド）を組み合わせて1つの多価ワクチンとすることにより、この新たなワクチンは、複数の遺伝学的クレードにわたる非常に広範囲の反応性を有する。初代分離株DNAをHIV感染患者から直接収集し（継代を行うにしても最小限とする）、配列を決定した上で、多数のDNAワクチンベクター中にクローニングして、多価ワクチンを作製することができる。シークエンシングのために十分なDNAが得られない場合には、DNAを増殖させるために最小限の継代が必要なこともある。この多価ワクチンは、種々の分離株に由来するEnv gpに対する幅広い免疫応答および幅広い中和を誘発する。この多価性により、HIVの絶えず変化しつづける遺伝的多様化および変異が原因となって有効性が低くなるという可能性が低下する。
【００３９】
核酸ワクチン
ワクチンは、個体における抗原または抗原に対する免疫応答を誘導することにより、感染症または疾患を予防または軽減する点で有用である。例えば、ワクチンをナイーブ個体において予防的に用いること、またはHIVにすでに感染した個体において治療的に用いることが可能である。不活化ウイルスまたはサブユニットタンパク質抗原を含む従来のワクチンは、免疫原性が乏しく、細胞性免疫誘導能に乏しく、安全性および安定性に懸念がある上に効果が低い。核酸ワクチンの開発は有望であることが実証されている。
【００４０】
新たなDNAワクチンは、その多価性のため、HIVの急速な進化および変異に対する順応性が高い。この新たなDNAワクチンには初代分離株に由来するという別の利点もあり、これが多価性と相まって、HIV（例えば、HIV-1）に対するより幅広い免疫応答、すなわちより有効な中和抗体、および/または細胞性免疫応答（例えば、細胞傷害性Tリンパ球（CTL））を誘導することができ、すなわちよりHIVワクチンが得られる。多価性および初代分離株DNAに由来するということの組み合わせにより、これにはHIV（例えば、HIV-1）に対する新規ワクチンとしての利点が付与される。
【００４１】
核酸組成物
初代HIV分離株の抗原をコードする核酸組成物を提供する。抗原をコードする核酸を宿主に提示するためのやり方は数多くある。DNAワクチンが、抗原をコードする裸のDNAプラスミドからなってもよい。細菌ベクター、レプリコンベクター、弱毒化生菌、DNAワクチンと弱毒化生ベクターとの同時送達、およびウイルスベクターを用いることもできる。BCGおよびリステリアなどの細菌ベクターを異種遺伝子の発現のために用いることもできる。裸のDNAレプリコンベクターの場合には、哺乳動物発現プラスミドがレプリコンの初期転写のための媒体としての役割を果たす。レプリコンは細胞質中で増幅され、異種遺伝子をコードするmRNAの量がその結果増えるため、初期トランスフェクション効率は免疫原性にとってそれほど重要ではない。弱毒化生ウイルスベクター（例えば、組換えワクシニア（例えば、改変ワクシニアAnkara（MVA）、IDT Germany）、組換えアデノウイルス、禽痘ウイルス（例えば、カナリア痘（例えば、ALVAC（（登録商標））, Aventis Pasteur）または鶏痘）、ポリオウイルスおよびアルファウイルスビリオンベクター）は細胞性免疫応答の誘導に成功しており、これらを用いることもできる。禽痘ウイルスは哺乳動物宿主における複製能を欠損しているが、挿入された異種遺伝子を初期プロモーターの下で発現することができる。組換えアデノウイルスベクターおよびポリオウイルスベクターは消化管内で生存できるため、効率的な粘膜免疫応答を誘発することができる。さらに、弱毒化細菌をDNAワクチン送達のための媒体として用いることもできる。適した細菌の例には、サルモネラ菌（S. enterica）、ネズミチフス菌（S. tymphimurium）、リステリア菌およびBCGが含まれる。細胞壁が脆弱な変異型細菌は細菌の外にDNAプラスミドが出るのを助ける。
【００４２】
適切なアジュバントの利用によってDNA取り込みを向上させることができる場合も時にある。合成ポリマー（例えば、ポリアミノ酸、アミノ酸の共重合体、サポニン、パラフィン油、ムラミルジペプチド、Regressin（Vetrepharm, Athens GA）およびアブリジン（Avridine））およびリポソーム配合物を、DNAの安定性および宿主細胞によるDNA取り込みを向上させるためのアジュバントとしてワクチン製剤に加えることもでき、これらによって有効な免疫応答を誘導するために必要な投与量が減らせることもある。経路とは無関係に、アジュバントは、核酸の投与の前、最中または後に投与することができる。アジュバントは宿主細胞への核酸の取り込みを増加させるだけでなく、細胞内での核酸からの抗原の発現を増加させ、抗原が発現される組織領域への抗原提示細胞の浸潤を誘導し、またはリンパ球によって得られる抗原特異的応答を増大させることもできる。
【００４３】
核酸の取り込みを他のやり方で向上させることもできる。例えば、ワクチンのIM送達によるDNA取り込みは、製剤にリン酸ナトリウムを添加することによって向上させることができる。IM送達によるDNA取り込みの増加を、エレクトロトランスファーによって達成することもできる（例えば、DNA免疫処置の直後に筋肉に一連の電気インパルスを加えることによる）。DNAの安定性および取り込みを向上させるとともに免疫誘導を向上させるためにワクチンに添加することが可能なそのほかのアジュバントには、水性エマルション（例えば、完全および不完全フロイントアジュバント）、油、コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）、カルメット・ゲラン桿菌、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、水酸化アルミニウム、アルミニウム塩およびカルシウム塩（すなわち、ミョウバン）、非メチル化CpGモチーフ、グルカンおよびデキストラン硫酸が含まれる。サイトカイン、ユビキチンまたは共刺激分子の同時注入も免疫誘導の向上に役立つ。本明細書に記載した抗原を、サイトカイン遺伝子、ヘルパーエピトープ、ユビキチン、または免疫応答を増強するためのシグナル配列と融合させることもできる。融合物を特定の種類の細胞へのターゲティングに用いることもできる。
【００４４】
DNAベクターを投入する媒質は、安全面の理由から生理的に許容されるものであるべきである。適した薬学的担体には、滅菌水、食塩水、デキストロース、グルコースまたは他の緩衝液（例えば、リン酸緩衝食塩水）が含まれる。媒質中に含まれるものとしては、生理的に許容される保存料、安定剤、希釈剤、乳化剤、pH緩衝剤、増粘剤、着色料などが可能である。
【００４５】
ひとたびDNAワクチンが送達されれば、核酸分子（例えば、DNAプラスミド）は宿主細胞内に取り込まれ、それがプラスミドDNAをタンパク質として発現する。ひとたび発現されれば、タンパク質はプロセシングを受け、自己の主要組織適合性（MHC）クラスIおよびクラスII分子との関連下で提示される。すると宿主はDNAにコードされた免疫原に対する免疫応答を生じる。ワクチンの有効性を高める目的で、多数回の注射を長期間にわたって治療または予防のために用いることができる。免疫誘導を向上させるために、初回免疫-追加免疫（prime-boost）戦略を用いることができる。DNAによる初回ワクチン接種および異なる手段による追加免疫処置（例えば、生ウイルスベクターまたはタンパク質抗原）は細胞性免疫の誘導に成功している。初回免疫処置と追加免疫処置との時間的関係はさまざまであり、それぞれのワクチン用に調整される。
【００４６】
DNAワクチンの投与
本明細書に記載した核酸組成物は、水、食塩水、Tris-EDTA（TE）緩衝液またはリン酸緩衝食塩水（PBS）などの生理的適合性のある溶液中にある裸の核酸分子（例えば、裸のDNAプラスミド）として、個体に投与することができる。また、それらを、核酸の取り込みを促進する能力または免疫系細胞を接種部位に動員させる能力のある物質（例えば、促進因子およびアジュバント）の存在下で投与することもできる。アジュバントについては本明細書の別の箇所で述べた。ワクチンには多くの投与様式および投与経路がある。それらは皮内（ID）、筋肉内（IM）への投与が可能であり、いずれの経路による場合も、それらを針注射、遺伝子銃または針を用いないジェット式注射（例えば、Biojector（商標）（Bioject Inc., Portland, OR））によって投与することができる。その他の投与様式には、経口、静脈内、腹腔内、肺内、硝子体内および皮下接種が含まれる。局所接種も可能であり、これらは粘膜ワクチン接種と呼ぶことができる。これらには、鼻腔内、眼球、経口、腟内または直腸内の局所経路が含まれる。これらの局所経路による送達は、点鼻薬、点眼薬、吸入薬、坐薬またはミクロスフェアによることが可能である。
【００４７】
ヒトに対する核酸組成物の適した投与量は、総核酸量で1μg/kg〜1mg/kg、例えば、総DNA量で5μg/kg〜500mg/kg、総DNA量で10μg/kg〜250μg/kg、または総DNA量で10μg/kg〜170μg/kgである。1つの態様では、ヒト対象（18〜50歳、45〜75kg）に対して1.2mg〜7.2mgのDNAを投与する。「総DNA」および「総核酸」とは、種々の抗原をコードする核酸を合わせたもののことを指す。例えば、5種類の異なるEnv抗原をコードする50mg用量の総DNAは、各抗原を1mg有しうる。DNAワクチンは多数回、例えば、2〜6回（例えば3回）投与することができる。1つの例示的な方法では、100μgのDNA組成物をヒト対象に対して0、4および12週（投与1回当たり100μg）の時点で投与する。
【００４８】
タンパク質組成物
初代HIV分離株の抗原をコードするタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）を、核酸組成物によるワクチン接種後に「追加免疫処置」として投与することができる。組換えタンパク質（例えば、標準的な分子生物学の技法を用いる、初代分離株の抗原をコードするDNAのクローニングによって作製されたタンパク質）は、追加免疫処置用の単離されたタンパク質の源の1つでありうる。個体の追加免疫処置のために用いられるタンパク質は、その個体に対して事前に投与されたDNAワクチンと同じ配列、例えば、gp120、gp140、gp160および/またはgp41を含みうる。
【００４９】
組換えHIVタンパク質の大規模生産のためには、トランスフェクタント細胞系（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞トランスフェクタント）を作製し、HIVタンパク質を安定的に発現する細胞系をトランスフェクタントから作製する。タンパク質を過剰発現する細胞系を生産用に選択する。選択した細胞のマスター細胞バンクおよび作業用細胞バンクを維持する。タンパク質を発現させる。タンパク質非含有培地中での大規模培養下で細胞を増殖させることにより、タンパク質を発現させる。細胞の上清を収集する。続いてタンパク質を精製し（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および/またはゲル濾過クロマトグラフィーを用いる）、純度に関して検査する。タンパク質の精製および濃縮を、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーなどの技法を用いて行う。次に、タンパク質を、その実体、効力、純度、量、無菌性、エンドトキシンの存在および一般的安全性に関して、医薬品の製造および品質管理に関する基準（Good Manufacturing Practice（GMP））」の指針に従って評価する。実体は、そのクレードのタンパク質に対して特異的な抗体を用いるELISAによって判定することができる。効力は、ELISAを用いて評価可能である（例えば、ウサギ血清と精製されたタンパク質との反応性）。純度は、タンパク質のSDS-PAGE分析および銀染色分析ならびにサイズ排除高速液体クロマトグラフィーを用いて評価可能である。量は、クーマシーを用いるアッセイ、分光学的アッセイおよび容積の測定によって決定可能である。タンパク質調製物の質は、目視検査およびpH測定によって判定可能である。無菌性は、連邦規則集第21編610.12条（21 C.F.R. 610.12）に記載された方法によって判定可能である。エンドトキシンはリムラス（Limulus Amebocyte）アッセイによって評価可能である。一般的安全性は連邦規則集第21編610.11条（21 C.F.R. 610.11）に記載された方法によって判定可能である。
【００５０】
組換えHIVタンパク質またはその断片の免疫原的有効量を含むタンパク質組成物を投与することができる。適した組成物には、例えば、リポペプチド（例えば、Vitiello et al., 1995, J. Clin. Invest., 95: 341）、DL-乳酸グリコール酸共重合体）（「PLG」）ミクロスフェア中に封入されたペプチド組成物（例えば、Eldridge et al., 1991, Molec. Immunol., 28: 287-94；Alonso et al., 1994, Vaccine, 12: 299-306；Jones et al., 1995, Vaccine 13: 675-81を参照）、および免疫刺激複合体（ISCOMS）中に含めたペプチド組成物（例えば、Takahashi et al., 1990, Nature 344: 873-75；Hu et al., 1998, Clin. Exp. Immunol. 113: 235-43を参照）が含まれる。
【００５１】
本明細書に記載した免疫原性組成物およびワクチンとともに用いうる有用な担体は周知であり、これには例えば、チログロブリン、アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（ポリL-リジン、ポリL-グルタミン酸など）、インフルエンザ、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などが含まれる。組成物およびワクチンは、水または食塩水、一般的にはリン酸緩衝食塩水などの、生理的な忍容性のある（すなわち、許容される）希釈剤を含みうる。また、組成物およびワクチンは一般にアジュバントも含む。QS21、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンなどのアジュバントは、当技術分野で周知の材料の例である。さらに、プロテイン（またはその断片、誘導体もしくは類似体）をトリパルミトイル-S-グリセリルシステイニル-セリル-セリン（P3CSS）などの脂質と結合させることによってCTL応答の初回免疫処置を行うこともできる。
【００５２】
タンパク質組成物の投与
HIVタンパク質組成物を含む組成物による免疫処置、例えば注射、エアロゾル、経口的、経皮的、経粘膜的、胸膜内、髄腔内またはその他の適した経路によるものは、宿主の免疫系が組成物に対して応答するように誘導する。1つの態様では、Envタンパク質の組成物を投与する。1つの態様では、Envタンパク質およびGagタンパク質の組成物を投与する。
【００５３】
タンパク質組成物の免疫原量の範囲の一例は、アジュバントを伴う場合、総タンパク質量で5μg/kg〜500μg/kg、例えば10〜100μg/kgである。1つの態様では、用量325μgのタンパク質組成物をヒト（18〜55歳、45〜75kg）に投与する。タンパク質組成物の投与プログラムの一例は、最後の核酸免疫処置から8週後に1回目の筋肉内追加免疫処置を行い、1回目の追加免疫処置から8週後に2回目の筋肉内追加免疫処置を行うことを含む。
【００５４】
キット
核酸組成物およびタンパク質組成物を含むキットを提供する。キットは、以下を含む1つまたは複数の他の要素を含みうる：使用のための指示書；その他の試薬、例えば、投与用の組成物を調製するための希釈剤、装置もしくは他の材料；薬学的に許容される担体；および対象への投与のための装置または他の材料。使用のための指示書は、本明細書に記載したような、推奨される投与量および/または投与様式（例えばヒト対象における）を含む、治療的適用（例えば、DNAワクチン接種およびタンパク質追加免疫処置）のための指示書を含みうる。
【００５５】
キットはさらに、診断薬または治療薬などの少なくとも1つの別の試薬、例えば、対象における組成物に対する免疫応答に対する応答をモニターするための診断薬、または本明細書に記載したような別の治療薬（例えば、以下の「併用療法」を参照されたい）を含みうる。
【００５６】
1つの態様において、キットは、2種、3種、4種、5種または6種の異なるHIV Env gpをコードする核酸を含むバイアル（または他の適した容器）を含む。キットはまた、キット中の核酸によってコードされるものと同じEnv gpである組換えHIV Env gpを含む第2のバイアルを含む。キットは、QS-21アジュバント（50μg/投与1回/対象）および賦形剤としてのシクロデキストリン（30mg/対象）を含みうる。アジュバントおよび賦形剤はタンパク質とともに製剤化され、製剤中に含めることもキット内に別々にパッケージ化することもできる。
【００５７】
併用療法
本明細書に記載した核酸組成物およびタンパク質組成物は、HIVに感染した対象の治療方法に用いることができる。これらの組成物を用いてこれらの対象を治療する方法には、他のHIV治療薬も投与する併用療法が含まれうる。例えば、DNAワクチン接種とタンパク質追加免疫処置を受ける対象に対して、抗レトロウイルス薬を個別に、または高活性抗レトロウイルス療法（「HAART」）（これはヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬およびHIVプロテアーゼ阻害薬の種々の組み合わせを用いる治療法のことを指す）として投与することができる。
【００５８】
ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬には、例えば、ジドブジン（AZT）；ジダノシン（ddI）；ザルシタビン（ddC）；スタブジン（d4T）；ラミブジン（3TC）；アバカビル（1592U89）；アデフォビルジピボキシル［ビス(POM)-PMEA］；ロブカビル（BMS-180194）；およびロデノシン（FddA）、9-(2,3-ジデオキシ-2-フルオロ-b-D-トレオ-ペントフラノシル）アデニンが含まれる。
【００５９】
ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬には、ネビラピン（BI-RG-587）；デラビラジン（delaviradine）（BHAP、U-90152）；およびエファビレンツ（DMP-266）が含まれる。
【００６０】
プロテアーゼ阻害薬には、サキナビル（Ro 31-8959）；リトナビル（ABT-538）；インジナビル（MK-639）；VIRACEPT（商標）という商標名でAgouron Pharmaceuticals, Inc.から販売されているネルフィナビル（AG-1343）；非ペプチド系プロテアーゼ阻害薬で商標名がAGENERASE（商標）であるアンプレナビル（141W94）；およびラビナビル（BMS-234475）が含まれる。
【００６１】
本明細書に記載した新たな核酸組成物およびタンパク質組成物は、例えば、感染患者におけるHIVウイルス量を減少させることにより、あらゆる既知のAIDS治療法の有効性を増強することができる。本明細書に記載した組成物および方法は、感染個体のウイルスに対する免疫応答を増強するための補助療法として用いうる。
【００６２】
ワクチン接種およびタンパク質追加免疫処置に対する免疫応答の評価
免疫学の分野の進歩により、HIVワクチン候補に対する細胞応答のより徹底的かつ高感度な評価が可能になった。細胞内染色（例えば、フローサイトメトリー）およびELISPOT（固相酵素結合免疫アッセイ形式）などのアッセイにより、抗原に応答してサイトカイン（例えば、TNFαおよびIFN-γ）を産生する細胞の検出および算定が可能となる。例えば、動物またはヒト患者から脾細胞または末梢血単核細胞（PBMC）を単離した後に、V3などのHIVエピトープによるインビトロ曝露を行い、最後にELISPOTおよび/または細胞内サイトカイン染色（ICS）による検査を行うことにより、ワクチンのレシピエントにおける細胞性免疫応答の可能性を判定することができる。テトラマー（すなわち、所定のクラスI分子の4つのコピーがそのコグネイトペプチドおよびアルカリホスファターゼと結合したものからなる分子）を用いるフローサイトメトリーにより、抗原特異的T細胞の計数（例えば、主要組織適合性複合体（MHC）クラスI分子と結合した特異的ペプチドを認識するT細胞の検出）が可能となる。細胞毒性の評価には標準的なクロム遊離アッセイを用いることができる。DNAワクチンに対する細胞性免疫応答を評価するために、抗原に応答したT細胞増殖およびHIVエピトープを発現する自己細胞のCTLを介した死滅を測定するより一般的なアプローチを用いることもできる。
【００６３】
体液性免疫応答の評価にはELISAアッセイおよびウエスタンブロット法を用いうる。詳細には、ELISAおよびウエスタンブロット法は、抗体の結合性、抗体の中和能力、抗体を介した融合阻害および抗体依存的細胞傷害性を評価するために用いることができる。
【００６４】
MT-2アッセイ
中和抗体応答を測定するためにMT-2アッセイを行うことができる。HIV-1 IIIBおよびMN（Bクレード実験室株の1つ）の抗体を介した中和は、以前に記載されたMT-2細胞死滅アッセイで測定可能である（Montefiori et al., 1988, J. Clin. Microbiol., 26: 231-237）。HIV-1 IIIBおよびMNはMT-2 T細胞における合胞体の形成を誘導する。血清による合胞体形成の阻害によって、ワクチン接種によって誘導された血清内に存在する中和抗体の活性が示される。手短に述べると、ワクチン接種を受けた被験血清および対照血清をウイルス感染細胞（例えば、MT-2 T細胞株）に対して曝露させる。中和は生細胞を染色することによって測定しうる（例えば、対照ウェルにおける細胞変性作用が約70％を上回るが100％未満である場合にはFinterのニュートラルレッドを用いる）。防御率は、被験ウェル（細胞＋ウイルス）間の吸光度（A540）の差を算出して、この結果を細胞対照ウェル（細胞のみ）とウイルス対照ウェル（ウイルスのみ）との間の吸光度の差で除算することによって決定しうる。続いて、中和力価を、細胞の少なくとも50％をウイルスにより誘導される死滅から防御するために必要な血漿希釈度の逆数として表す。
【００６５】
実施例
本発明について以下の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【００６６】
実施例1：クレードA〜Gの初代分離株からのHIV-1エンベロープ糖タンパク質gp120、gp140およびgp41 DNAワクチンの構築
HIV-1初代Env gpの細胞外部分をコードする遺伝子断片を、gp120の形態、またはgp120とgp41との間の完全な天然切断部位を有する切断可能なgp140のいずれかとして、HIV-1 M群の7つの遺伝学的クレード（AからGまで）に相当する9種類の初代Env遺伝子からPCR増幅した（表1）。一対のコンセンサスPCRプライマーを設計し、9種類のgp120遺伝子の増幅に用いた：プラス鎖プライマーGP120-p-f1（p-cttgtgggtcacagtctattatggggtacc）（SEQ ID NO: 1）およびマイナス鎖プライマーGP120-p-b1（ggtcggatccttactccaccactcttctctttgcc）（SEQ ID NO: 2）。gp140遺伝子を増幅するためのコンセンサスプライマーはプラス鎖に対してはGP120-p-f1とし、マイナス鎖に対してはJAPCR502（cgacggatccttatgttatgtcaaaccaattccac）（SEQ ID NO: 3）とした。
【００６７】
設計された平滑末端を5'側に有するPCR産物の3'末端をBamHIによってさらに消化し、DNAワクチンベクターpJW4303（Chapman, et al., 1991, Nucleic Acids Res 19: 3979-3986；Lu et al., 1996, J Virology 70: 3978-3991；Lu et al., 1998, AIDS Res and Hum Retroviruses 14: 151-155）中にクローニングした。ベクターpJW4303をまずNheIで消化し、続いてクレノウ断片で処理して末端を平滑化した上で、再びBamHIで切断した。Envインサート（これはpJW4303中の組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）リーダー配列に対してインフレームにある）との連結後にNheI部位を再生させた。
【００６８】
これらのDNAワクチンプラスミドをそれぞれ、pJW4303/gp120またはpJW4303/gp140.A1、A2、B、C1、C2、D、E、FおよびGと命名した（表1）。表1は、有用な多価ワクチン成分、株およびその由来となったGenebankアクセッション番号、遺伝学的クレード、ならびに起源国を示している。可溶性gp41（sgp41）DNAワクチンに関しては、コンセンサスプライマーGP41-P-F1（gtcgctccgctagcgcagtgggaataggagctgtgttccttgggttc）（SEQ ID NO: 4）およびJAPCR502を用いてsgp41遺伝子を増幅し、これをpJW4303のNheI部位およびBamHI部位にクローニングした。任意の多価ワクチンに対して、表1に列記した成分の2つまたはそれ以上の任意の組み合わせを用いることができる。多価ワクチンは、裸のDNAプラスミドとして、促進因子とともに、アジュバントとともに、および/または本明細書に記載のタンパク質追加免疫原とともに、投与することができる。
【００６９】
（表１）多価HIV-1エンベロープ糖タンパク質DNAワクチンの成分
2006509039.tif 000002
【００７０】
実施例2：HIV-1初代分離株DNAワクチンによって生じた免疫応答
DNA免疫処置
雌性New Zealandウサギ（2kg）に対して月3回のDNA免疫処置を遺伝子銃により行った。3回の各時点で、IACUCの承認を受けたプロトコールに従ってウサギに麻酔を施した後、剃毛した腹部皮膚の表面に、1回の注入毎にDNA 1μgを送達する形式で、重複しないように合計36回の注入による送達を各ウサギに対して行った。各々の免疫処置の直前および4週後に血清試料を採取した。
【００７１】
ELISA（固相酵素結合免疫アッセイ）
ELISAにより、ウサギ血清試料をgp120特異的IgG抗体応答に関して検査した。マイクロタイタープレートにConA（1ウェルにつき5μg）を1時間コーティングした後に、洗浄バッファー（PBS pH 7.2、0.1％ Triton X-100を含む）で5回洗浄した。Env抗原を1μg/mlとなるように添加し（1ウェルにつき100μl）、室温で1時間インキュベートした。ブロッキングは200μl/ウェルの4％乳清ブロッキングバッファーにより室温で1時間行った。ブロッキングバッファーを除去してさらに5回洗浄した後、連続希釈した血清100μlを添加し、1時間インキュベートした。プレートを5回洗浄し、1：1000に希釈したビオチン化抗ウサギIgG 100μlと1時間インキュベートした後に洗浄した。続いて、1：2000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（100μl/ウェル）を添加し、1時間インキュベートした。最後の洗浄の後に、新たなTMB基質100μlを各ウェルに添加し、3.5minインキュベートした。2M H2SO4 25μlを添加することによって反応を停止させ、プレートの光学密度（OD）を450nmで測定した。gp120に対する血清反応性を評価するELISAアッセイについては以下の実施例で説明している。
【００７２】
ウエスタンブロット分析
293T細胞上清および細胞可溶化物から一時的に発現されたgp120抗原を変性SDS-PAGEにかけ、ポリビニリデンフルオリド（PVDF）膜に対してブロットした。ブロッキングは0.1％のI-Blockにより行った。混合型多価gp120DNAワクチンによる免疫処置を行ったウサギ血清を1：500希釈して検出用抗体として用い、45分間インキュベートした。その後に膜をブロッキングバッファーで洗浄し、APを結合させたヤギ抗ウサギまたはヒトIgG（1：5000希釈）と反応させた。最後の洗浄の後に、ウエスタンライト（Western-light）基質を膜に5分間適用した。膜を乾燥させた上で、膜によりKodakフィルムを感光させ、X-Omat処理装置で現像した。Env反応性もウエスタンブロット法によって観察した。
【００７３】
実施例3：中和アッセイ
動物におけるワクチンの有効性を判定する1つの手法は、その動物の免疫細胞のインビトロ機能アッセイを行うことである。上記の末梢血単核細胞（PBMC）アッセイおよびMT-2アッセイは、ワクチン接種を受けた被験動物における体液性応答のインビトロでの評価の例である。以下に述べるように、ワクチン接種を受けた動物の免疫細胞の機能的能力を評価するために細胞性免疫応答を検査することもできる。ワクチンの有効性の判定において、これらのアッセイを、ヒト対象から単離した免疫細胞を用いてインビトロで行うこともできる。
【００７４】
PBMCアッセイ
ワクチン接種を受けた動物の血清中の中和抗体の存在を、中和アッセイと呼ばれる機能アッセイで調べた。ウサギに対して、1価ワクチン（行3〜10）または多価ワクチン（行11）を用いて、上記の実施例2に記載した通りに免疫処置を行った。左の列に、ウサギがワクチン接種を受けた初代分離株ワクチンを示している。3回目の免疫処置から4週後に採取した血清を、種々の初代ウイルス分離株（一番上の行に示した）に感染させた末梢血単核細胞（PBMC）に対して適用した。表2は、1価および多価免疫処置ならびにウサギ免疫処置に関するこのPBMC中和アッセイの結果を示している。このアッセイによる結果は、免疫処置したウサギ血清を含まないウイルス対照と比較したウイルス抑制率として表されている。1価ワクチン接種による結果は、自己に対する応答能力はあるという一般的な傾向を示している。しかし、多価ワクチンを用いた一番下の行では、被験初代ウイルス分離株ウイルスのいずれに対しても57％を上回る抑制率が得られたことが見てとれ、このことは、多価初代HIV-1 Envワクチンが、このワクチンを接種したウサギにおける幅広い中和抗体応答を生じさせることができたことを示している。
【００７５】
（表２）中和アッセイの結果
2006509039.tif 000003
【００７６】
実施例4：防御免疫のアッセイ
新たなDNAワクチンの有効性を動物モデルで調べることが可能である。非ヒト霊長動物（例えば、チンパンジー）などのようにHIVに感染しうる動物、または流血中にヒト免疫細胞が存在するマウスなどの動物における応答を調べることが好ましい。統計学的有意性を得るためには十分に多い数の動物を用いるべきであるが、非ヒト霊長動物の場合にはその数が限られていることがあるため、例えば同一の個体で実験を繰り返す場合もある。ひとたび被験動物にワクチン接種を行い、同じベクターを含むが異種Env gp DNAは含まない陰性対照によるワクチン接種を対照動物に行った上で、両群の動物にHIVを感染させる。それらには初代分離株を感染させても実験室株を感染させてもよく、またはその両方を感染させてもよい。HIV感染が起こり、陰性対照ワクチンによる接種を受けた動物でT細胞数の低下が認められはじめるまで適した期間を置いた後に、被験動物および対照動物を防御免疫応答に関して検査する。
【００７７】
防御免疫応答を検査するための1つの手法は、動物から血清を入手し、ELISA（上記参照）を用いて特異的IgG抗体応答の存在に関して検査することである（上記の実施例2参照）。当技術分野で知られた方法を用いて、HIV感染の存在、遅延または欠如を、陰性対照動物と比較してモニタリングすることができる。
【００７８】
ワクチン接種を受けた動物の免疫細胞に対してインビトロ機能アッセイを行うことにより、ワクチンの有効性を非感染動物で評価することができる。中和抗体の存在は、HIVに感染していない、ワクチン接種を受けた動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長動物）で調べることができる。この中和アッセイに関しては実施例3ですでに述べている。細胞性免疫応答（例えば、CTL）応答は、HIVに感染させずに、動物（例えば、マウスまたは非ヒト霊長動物）で調べることができる。細胞性免疫応答を調べるために脾細胞を単離することが可能である。続いて脾細胞を、T細胞が細胞性免疫応答を生じる能力をインビトロで検査するための優れたエピトープを提供する、よく用いられるHIV抗原であるペプチド抗原V3に対して曝露させる。続いて、T細胞の機能を判定するためにELISPOTおよび/または細胞内サイトカイン染色（ICS）を行う。感染に対する抵抗能力に関する、当技術分野で知られた他の検査を行うこともできる。HIVに対する防御に関する最も優れた検査は、動物にHIVを曝露させることであるが、現時点では非ヒト動物をHIVに感染させる決定的な手法はない。非ヒト霊長動物のSHIV感染に関しては検査が行われている。ワクチン接種に関する検査のための動物における現在の標準となる検査は、考察したように、ワクチン接種を受けた動物の免疫細胞を単離して、V3などの抗原に対する活性、または中和抗体の産生に関する機能的検査を行うことである。
【００７９】
DNAワクチンおよびタンパク質追加免疫原を検査する実験について以下に述べる。
【００８０】
実施例5：ウサギにおける抗gp120 DNAワクチン接種および追加免疫処置
表3に列記した抗原を用いてDNA組成物およびタンパク質組成物を調製した。図1に示した試験デザインに従ってウサギに抗原を投与した。
【００８１】
手短に述べると、ウサギに対して、図1に列記したように、1価、3価、8価DNAワクチンまたは対照DNAワクチンによる免疫処置を0、4、8および16週の時点で行った。ウサギに対するタンパク質追加免疫は図1に示したように第24週および28週の時点で行った。免疫処置を行った動物からの血清による初代HIV-1分離株の中和を測定した。最後のDNA免疫処置の後（および初回のタンパク質免疫処置の前）に採取した血清に関する中和力価は図2に示されている。初回のタンパク質免疫処置後に採取した血清に関する中和力価は図3に示されている。2回目のタンパク質免疫処置後に採取した血清（1：5希釈）に関する中和率は図4に示されている。力価は、非処置対照と比較して感染を50％抑制する免疫血清の希釈度に基づいて算出した。各表の「陽性抗体」の下にある行には、これらのアッセイにおける中和性が判明している抗体HIVIG、2F5および2G12を用いて得られた中和値が列記されている。高レベルの中和活性が認められた血清測定値は各図中で網掛け表示している。図2は、1価および多価DNAワクチン接種により、クレードB分離株SF162に対して高レベル（50％+）の中和活性が得られたことを示している。
【００８２】
他のクレードB、C、AおよびE分離株に対する中和活性も検出された。図3は、DNAワクチン接種と1回のタンパク質追加免疫処置により、クレードB SF162、Ba-LおよびJRCSF分離株に対して高レベルの中和活性が誘導され、他の分離株に対する活性は低レベルであったことを示している。活性は、多価ワクチン接種を受けた個体のすべておよび1価ワクチン接種を受けた個体の約半数で観察された。1価レジメンおよび多価レジメンはいずれも一部の個体では高レベルの応答を生じさせた。図4は、2回目の追加免疫処置によってすべてのウサギで高い中和活性が生じたが、種々の分離株に対する応答性の程度はさまざまであったことを示している。
【００８３】
別のクレードBウイルス（MN、HXB2-GFPおよび89.6 GFP）に対する中和応答も調べた。緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するウイルスの構築については以下の実施例9で説明する。図5A、BおよびCは、図1中の表に列記された個体からの血清に関して観察された中和率を示している。DNAワクチン接種後および1回のタンパク質追加免疫処置後にウサギから採取した血清からは、1価および多価DNAのいずれを投与された個体においても分離株MNに対する高レベルの中和活性が誘導されたことが示されている。HXB2および89.6分離株に対する中和活性は低かったが、タンパク質追加免疫処置を行った一部の個体では高レベルが得られた。モノクローナル抗体2F5および2G12は、このアッセイにおける株に対して高レベル（75％）の中和活性で中和を示した（非提示データ）。
【００８４】
（表３）ウサギにおけるDNAワクチン接種およびタンパク質追加免疫処置の試験に用いたgp120免疫原
2006509039.tif 000004
【００８５】
実施例6：HIV-1 Gag DNAワクチンはマウスにおいて免疫原性がある
コドン最適化がなされたGag DNAワクチン（tPAリーダー配列を含む、または含まない）によって誘発される細胞性免疫（CMI）応答について検討した。
【００８６】
DNAワクチンの免疫原性を評価するために、Balb/Cマウス（雌）に対して遺伝子銃を用いて免疫処置を行った。このワクチンはHIV-1分離株Czm由来のコドン最適化がなされたgag遺伝子インサートを含んでいた。各個体に対して月4回の免疫処置を行い、1回の免疫処置につき6μgのDNAを送達した。最後の免疫処置から1週後に、マウスを屠殺し、CMI応答の分析のために脾臓を採取した。この試験では、Gag遺伝子インサートを有する2種類の構築物の相対的免疫原性を比較した（表4）。一方の構築物（.wt）はコドンが最適化されたgag遺伝子配列を有し、コードされるアミノ酸にそれ以外の修飾はなされていない。もう一方のもの（.tPA）は、N-末端近くにヒト組織プラスミノーゲンのリーダー配列（tPA）が追加されている。tPAリーダーはGag DNAワクチンの発現および免疫原性の向上をもたらすことが報告されている（Qiu, et al., 2000, J. Virology. 74(13): 5997-6005）。しかし、実験室で改変されたHIV-1分離株（IIIB）由来のコドン最適化がなされていないgag遺伝子を用いた本発明者らの以前の検討では、野生型gag遺伝子インサートの方がtPAリーダーを有するgag遺伝子インサートよりもCMI応答の誘導に関して免疫原性が強いことが明らかになっている。この試験は、HIV初代分離株96ZM651（Czm）由来のコドン最適化がなされたgag遺伝子インサートが同様の所見を示すか否かを調べる目的で行った。これらのワクチンによって誘発されるCMI応答を、Gag p24抗原刺激による免疫優性ペプチドを用いて、ELISPOTアッセイおよび細胞内サイトカイン（IFN-γ）染色（ICS）によって分析した。
【００８７】
ELISPOT法および細胞内サイトカイン染色（ICS）法の両方を細胞性免疫応答の測定に用いた。その結果は表4に示されている。2種類のgag DNAワクチンのいずれかを投与された個体はすべて、Gag特異的CMI応答を示し、これはELISPOTデータおよびICSデータの両方によって示された。ベクターのみの群は有意なGag特異的CMI応答を示さなかった。野生型gagインサートはtPAリーダーを有するgagインサートよりも免疫原性が幾分高いように思われた。
【００８８】
（表４）Gag DNAワクチンによる免疫処置を受けたマウスにおけるGag特異的細胞性免疫応答の平均
2006509039.tif 000005
* Gag p24ペプチド（199-207）AMQMLKDTI；参照ペプチド配列、p24（aa 65-73）
【００８９】
このように、コドン最適化がなされたCzm gagインサートはpSW3891ベクターにおいて高い免疫原性を有し、その天然のN末端配列とともに発現させた場合の方がtPAリーダー配列を伴う場合よりも免疫原性が高かった。これがDP6-001に用いた構築物のデザインである。
【００９０】
実施例7：1価および4価Envワクチンはウサギにおいて抗HIV-1 Env IgG応答を誘導する
1価または4価製剤のいずれかとしてのHIV-1 Env DNAワクチンの免疫原性を検討した。この試験では、New Zealand White（NZW）ウサギ（雌）に対して、初代HIV-1 Env抗原を発現するDNAワクチンによる免疫処置を行った。各群には2匹（群10、11、14および17）または3匹のウサギ（群1および3）を含めた。各個体に月4回のDNA免疫処置を行い、1回の免疫処置につき合計36μgのDNAプラスミド（1価群に関しては単一のDNAを36μg、4価群に関しては各DNAを9μgずつ）を遺伝子銃（Bio-Rad）によって送達した。この試験にはコドンが最適化されていないDNAワクチンを用いた。最終DNA免疫処置から2週後に採取した血清を、抗Env IgG応答のレベルに関してELISAにより測定した。ELISAプレートには組換え初代Env抗原をコーティングした。これらの実験における開始時の血清希釈度は1：500とした。
【００９１】
1種類のHIV-1 Env DNAワクチン成分（1価）または4種類のEnv DNAワクチン成分の組み合わせ（4価）のいずれかによって誘導されたNZWウサギ血清に関するELISAデータを表5にまとめた。1価血清は一般に、それぞれの自己Env抗原に対する力価の方が異種Env抗原に対するものよりも高かったが、4価DNAワクチンは、同種抗原（B、Ba-L、CzmおよびEなど）および異種抗原（A2、D、FおよびGなど）の両方を含む、広範囲の初代HIV Env抗原に対して力価の高い抗体を生じた。
【００９２】
このように、1価ワクチン製剤および多価ワクチン製剤のいずれを用いるDNA免疫処置も、力価の高い抗Env抗体応答を誘導する上で有効であった。多価製剤は、多数の初代HIV-1 Env抗原に対して1価製剤よりも高いレベルの抗体応答を誘導することができた。
【００９３】
（表５）ウサギ血清の抗Env IgGの滴定終点力価
2006509039.tif 000006
【００９４】
実施例8：3価および8価のDNA＋タンパク質ワクチン接種に対する抗HIV-1 Env IgG応答
ウサギにおける多価Env DNA＋タンパク質ワクチンの免疫原性を評価した。New Zealand Whiteウサギ（雌）に対して、初代HIV-1 Env抗原を発現するDNAワクチンによる免疫処置を行った。各群にはウサギ3匹を含めた。各個体に月4回のDNA免疫処置を行い、1回の免疫処置につき36μgのDNAプラスミド（3価群に関しては各DNAを12μgずつ、8価群に関しては各DNAを4.5μgずつ）を遺伝子銃（Bio-Rad）によって送達した。この試験にはコドンが最適化されていないDNAワクチンを用いた。
【００９５】
2カ月の安静期間を置いた後に、タンパク質追加免疫原を月2回、フロイント不完全アジュバント（IFA）中にある状態で皮下投与した。タンパク質追加免疫処置はDNA初回免疫処置と対応させ、同じ初代ウイルス分離株からのgp120抗原を用いた（表6）。各ウサギに対して、1回のタンパク質追加免疫処置につき合計100μgの組換えgp120タンパク質を投与した（C4群では各タンパク質を33.3μg、C7群では各タンパク質を25μg）。
【００９６】
（表６）DNA初回免疫＋タンパク質追加免疫のための動物群のデザイン
2006509039.tif 000007
最終DNA免疫処置の2週後および各タンパク質追加免疫処置の後に採取した血清を、抗Env IgG応答のレベルに関してELISAにより測定した。
【００９７】
抗Env応答の測定のためには、指定された種々の初代gp120抗原（Ba-L、C1、E、B、A、D、FまたはG）をELISAプレートにコーティングした。3つのHIV-1 Env DNAワクチン成分（3価、B、C1およびE）または8つのEnv DNAワクチン成分（8価、B、C1、E、Ba-L、A、D、FおよびG）のいずれかによって誘導されたNZWウサギ血清に関するELISAデータを図6にまとめた。3価および8価のDNA製剤はいずれも、初代HIV-1 Env抗原に対して力価の高い抗体応答を誘導した。3価製剤は、同種（B、C1およびEなど）および異種Env抗原（Ba-L、A、D、FおよびGなど）の両方に対して、力価の高い抗体応答を誘発した。用いた条件下では、8価製剤はこの免疫応答を向上させないように思われた。
【００９８】
3価Env DNAワクチン製剤を投与した個体におけるタンパク質追加免疫処置後の抗Env IgG応答を測定した（図7）。この試験では、1：10,000；1：40,000および1：160,000という3つの血清希釈度を調べた。「最終DNA」群では、血清を4回目のDNA免疫処置後に採取した。「タンパク質I」群では、1回のタンパク質追加免疫処置後に血清を採取した。「タンパク質II」群では、2回のタンパク質追加免疫処置後に血清を採取した。1回のタンパク質追加免疫処置（タンパク質-I）の後、同じDNAワクチンによる初回刺激を行ったウサギにおける抗Env IgG応答は急速にピークレベルに到達した。この実験では、2回目のタンパク質追加免疫処置（タンパク質-II）後に応答は増大しなかった。このことは、このELISA試験で検討した3種類のEnv抗原（B、C1およびE）のすべてに当てはまった。
【００９９】
しかし、8価Env DNAワクチンを投与した個体の場合には、抗Env IgGが3価群で認められたものと同じレベルに到達するには2回のタンパク質追加免疫処置が通常必要であった。図8A中のデータは、DNA初回免疫処置およびタンパク質追加免疫処置の両方に含めた初代Env抗原に対するウサギIgG応答を示している。図8B中のデータは、DNA初回免疫処置段階のみに含めた初代Env抗原に対するIgG応答を示している。これらの群におけるパターンは極めて類似していた。より高いレベルの抗Env IgG応答を誘導するためには2回のタンパク質接種が必要であった。
【０１００】
これらのデータは、3価HIV-1 Env製剤を用いたDNA免疫処置により、HIV-1の同種株およびいくつかの異種株からのgp20に対する効果的な免疫応答が誘導されたことを示している。これらの試験に用いた条件下では、この応答は8価製剤を用いても向上しなかった。組換えHIV-1 Envタンパク質は、DNA初回免疫処置を行ったすべての個体で、抗ENV応答の増強に関して極めて有効であった。3価DNA初回免疫処置を受けた個体ではピーク抗体レベルに達するために1回のタンパク質追加免疫処置が必要であったが、8価群が同じピークレベルに達するためには2回のタンパク質追加免疫処置が必要であった。DP6-001では、DNA初回免疫処置の免疫原性を損なうことなく少なくとも4つのクレードのHIV-1 Env抗原をカバーするために、初回免疫処置段階に5種類の初代Env DNAワクチンを含めている。DP6-001の場合、追加免疫処置の効果を最大限に高めるためには、2回のタンパク質追加免疫処置が推奨される。
【０１０１】
実施例9：1価および多価Env DNA＋タンパク質製剤による免疫処置を行ったウサギ血清による中和抗体応答
多数の初代HIV-1分離株に対するDNA初回免疫＋タンパク質追加免疫ワクチンレジメンによって誘発される中和抗体応答について検討した。表7に示したように、各個体に対する月4回のDNA免疫処置（DNA初回免疫処置）および月2回のタンパク質追加免疫処置を、以下に述べるさまざまな個別の用量で行った。1価群および3価群に関しては、タンパク質追加免疫処置をDNA初回免疫処置と対応させ、同じ初代gp120抗原を用いた。1価群（C1群）には初代HIV-1 Env抗原の1つであるgp120.Ba-Lを投与した。3価群（C4群）には3種類の初代HIV-1 Env抗原を投与した：gp120-B、gp120-C1およびgp120-E。8価群（C7群）の場合には、以下の8種類の初代HIV-1 Env抗原：gp120.A、gp120-B、gp120-Ba-L、gp120-C、gp120-D、gp120-E、gp120-Fおよびgp120-Gを発現するDNAワクチンを投与し、その後に以下の4種類の組換えgp120抗原：gp120-B、gp120-Ba-L、gp120-Cおよびgp120-Eを含むタンパク質追加免疫処置を行った。C10群は対照群であり、ウサギに対してエンプティDNAベクターpSW3891をまず4回接種し、その後に4種類のEnvタンパク質抗原（第7群と同じ）の混合物によるタンパク質追加免疫処置を行った。この前臨床試験では、DNAワクチン中に挿入されたenv遺伝子のコドンは最適化しなかった。
【０１０２】
（表７）HIV-1中和抗体応答に関する動物群のデザイン
2006509039.tif 000008
【０１０３】
表7に記載された個体からのウサギ血清を、免疫処置の前、4回目のDNA免疫処置後ならびに初回および2回目のタンパク質追加免疫処置後に収集した。陽性の抗Env IgG抗体応答を示すウサギ血清が初代HIV-1分離株を中和しうるか否かを検討するために、中和アッセイを行った。各血清の中和活性を、1：5希釈した上で緑色蛍光タンパク質（GFP）指標アッセイシステムを用いて検査した。
【０１０４】
中和アッセイに用いるための組換え緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターウイルスは、293T細胞に対するpNL4-3env-プラスミド（envにフレームシフトを有し、nefの代わりにGFPをコードする、完全長NL4-3 HIV-1プロウイルスDNA）およびpSVIIIenvプラスミド（クレードBの89.6 Envタンパク質をコードする）の同時トランスフェクションによって作製した。レポーターウイルスを含む上清をトランスフェクション48hr後に採取し、遠心処理によって清澄にした上で、0.45μmでの濾過を行い、使用時まで-80℃で保存した。アッセイを行うためには、ヒトPBMCを抗体の存在下または非存在下でレポーターウイルスとともにインキュベートした。中和抗体応答は、免疫処置前の血清を用いた対照における数との比較によるGFP陽性ヒトPBMCの減少率によって計測した。
【０１０５】
一組の中和データを図9に示している。中和抗体の強度は3つのレベルにランク付けされる：強（GFP陽性ヒトPBMCの減少率が80％を上回る）、中等（減少率が60％を上回る）および弱（減少率が40％を上回る）。DNA＋タンパク質ワクチン接種によるアプローチは、初代HIV-1ウイルスの1つである分離株89.6のEnv-GFPを発現するウイルスに対する中和抗体応答の誘導に関して非常に有効であった。
【０１０６】
対照動物を除くすべての個体が、DNAワクチン接種後かつタンパク質投与の前に低レベルの中和抗体を産生した。1価ワクチン接種を受けた1個体は低（約50％）レベルの中和抗体を産生した。1価群における第2の個体は中等（約75％）レベルのものを生じた。3価ワクチン接種を受けた個体は中和レベルが高いまたはほぼ高い（約78％）レベルの抗体を産生した。8価群は約40％の中和率という低レベルのものを生じた。エンプティDNAベクターの4回の接種後に1回のEnvタンパク質免疫処置を受けた対照ウサギ（C10-1）は、DNAワクチン接種後に検出可能な中和抗体を産生せず、タンパク質投与後の中和抗体応答も極めて弱かった（約10％）。
【０１０７】
別のクレードB初代HIV-1ウイルスに対するこれらのウサギ血清のさらなる分析からも、中和活性が陽性であることが示された（図10〜15）。図9〜12は、多価製剤を用いたDNA初回免疫/タンパク質追加免疫アプローチが、さまざまな初代HIV-1クレードB分離株に対する中和抗体応答の誘導に関して非常に有効であることを示している。これらのアッセイでは、中和抗体応答を、FACSを用いるアッセイによる、免疫処置前の血清を用いた対照における数との比較によるp24陽性PBMCの減少率によって計測した（Mascola, et al., 2002 J. Virol. 76, 4810-4821）。
【０１０８】
図10に示されているように、DNA初回免疫処置の終了時点で著明なレベルの中和抗体応答が存在した。3価および8価のDNA＋タンパク質ワクチン接種プロトコールを受けたマウスからの血清は、1回および2回のタンパク質追加免疫処置後に、初代HIV-1分離株SF162に対して高（80％超）レベルの中和活性を示した。中和活性のピークレベルには初回のタンパク質追加免疫処置後に到達した。8価タンパク質ワクチン接種（DNAワクチン接種は用いない）による2回の追加免疫処置を受けた個体の血清において、高レベルの中和活性が得られた。
【０１０９】
Ba-L（図11）およびJRCSF（図12）の場合には、タンパク質追加免疫処置は、DNA初回免疫処置のみの場合よりも高いレベルの中和活性を生じさせるのに有効であった。図11および12に示されているように、3価ワクチン接種プロトコールを受けた個体では、初代HIV-1株Ba-LおよびJRCSFのそれぞれに対する高レベルの中和活性が得られた。8価群では、2回のタンパク質追加免疫処置後に約60〜80％のレベルが認められた。用いた条件では、8価env DNA製剤は、3価製剤によって誘発されたものよりも強い抗体応答を引き起こさなかった。3価群がピーク中和抗体レベルに達するためには1回のタンパク質追加免疫を要したが、8価群では2回目のタンパク質追加免疫が必要であった。この所見は、以下の実施例で示す固相結合抗体分析の結果と一致する。
【０１１０】
対照動物10-1からの血清は、DNA初回免疫処置後に中和活性を全く示さなかった。この個体はエンプティDNAベクターの投与のみを受けている。しかし、1回または2回のタンパク質追加免疫処置後には若干の低レベルの中和活性が認められた。中和活性のレベルはDNA＋タンパク質アプローチの場合よりもはるかに低く、このことは1〜2回のタンパク質追加免疫処置による中和抗体応答の迅速な誘導のためにはDNA初回免疫処置が非常に有用であり、中和することがしばしば困難である初代HIV-1分離株に対する場合には特にそうであることを裏づけている。
【０１１１】
これらのウサギ血清が他のHIV-1クレードに相当する初代ウイルス分離株も中和するか否かを検討するために、さらに別の中和アッセイを行った。図13は、1価および多価の注射を受けた個体において2回目のタンパク質追加免疫後に得られたデータを示している。2回のタンパク質追加免疫後に、免疫処置したいくつかのウサギ血清（1：5希釈）はHIV-1 DJ263（クレードA）およびTV1（クレードC）サブタイプに対して陽性の中和活性を示した。
【０１１２】
以上を総合すると、これらのデータは、DNA初回免疫/タンパク質追加免疫ワクチン接種という手段が、複数のサブタイプにまたがる初代HIV-1分離株に対する中和抗体応答の誘導に関して有効であることを示している。
【０１１３】
実施例10：製剤DP6-001中のコドン最適化がなされたEnv遺伝子インサートによるウサギ抗Env IgG応答
DP6-001ワクチンに用いる予定であったコドン最適化がなされたenvおよびgag DNAワクチン成分ならびにEnvタンパク質追加免疫成分の免疫原性を検討した。ウサギに対して、遺伝子銃、IDまたはIM接種によってDP6-001ワクチンのDNA成分による免疫処置を行い、その後に、抗Env抗体応答を比較しうるように、gp120タンパク質追加免疫処置をIM経路によって行った。DP6-001タンパク質追加免疫処置に用いたタンパク質のアミノ酸配列は図14に示されており、配列は互いに整列化されている。以前のウサギ試験では、コドン最適化がなされていないDNAワクチンのみを用いた。
【０１１４】
以前の試験で示されたデータに関しては、DNAプラスミドを遺伝子銃による免疫処置法によって送達した。本実施例で述べる試験は、筋肉内（IM）および皮内（ID）注射によるDNAワクチンの免疫原性を示す。
【０１１５】
雌性ウサギに対して、5種類の初代HIV-1 Env抗原および1種類の初代HIV-1 Gag抗原を発現するDNAワクチンによる免疫処置を行い、そのgに5種類の初代gp120抗原を含む2回のタンパク質追加免疫処置を行った。免疫処置プロトコールの詳細は表8に示されている。この試験に用いたDNA成分およびタンパク質成分はDP6-001製剤中のものと同じである。New Zealand Whiteウサギ（1群当たり2匹）に対して、3回のDNA免疫処置を第1週、5週および13週に行い、2回のタンパク質追加免疫処置を第21週および29週に行った。ウサギに対するDNA免疫処置は遺伝子銃（GG）、IMまたはID注射のいずれかにより行った。タンパク質をQS-21アジュバント中に配合し、IM経路による免疫処置を行った。それぞれの免疫処置に関する免疫原の総投与量は表8に列記されている。
【０１１６】
（表８）コドン最適化がなされたDNAワクチンによる免疫処置を受けたウサギ群のデザイン
2006509039.tif 000009
【０１１７】
種々の経路（遺伝子銃、IMまたはID）によるDNA初回免疫処置を受けたNZWウサギにおける抗Env IgG応答を示すELISAデータが図15A〜Eに示されている。図15A、15B、15C、15Dおよび15Eはそれぞれ、HIV-1 A、HIV-1 B、HIV-1 Czm、HIV-1 EおよびHIV-1 Ba-L分離株に対する応答を示している。全体的にみて、多価製剤は、5種類の初代Env抗原のすべてを認識する幅広い抗体応答を誘導することができた。
【０１１８】
遺伝子銃による免疫処置はこの場合も抗Env抗体応答の初回刺激に関して最も有効なアプローチであるが、IMおよびID経路はいずれもウサギの初回刺激を行うことができ、1回のタンパク質追加免疫の直後に抗Env IgG応答を誘導することができた。IDによる抗体応答のばらつきはIM注射群よりも大きいように思われる。抗体応答は最後の追加免疫処置の後、8週間以上にわたって比較的高いレベルに保たれた。
【０１１９】
これらのデータはDP6-001製剤がNZWウサギにおいて免疫原性を有することを示している。IM経路およびID経路はいずれも、遺伝子銃アプローチと同様に抗Env抗体応答の初回刺激に有効である。タンパク質追加免疫処置は、主としてID経路およびIM経路によるDNAの免疫処置を受けた動物において、抗体応答をピークレベルに至らせるのに非常に有効である。gag DNA構築物を含めても多価Envを発現するDNAプラスミドの免疫原性は妨げられないように思われた。
【０１２０】
実施例11：ウサギにおける毒性試験の際にDP6-001ワクチンの筋肉内、皮内または筋肉内かつ皮内への反復投与によって誘発された血清抗体価
毒性試験に用いたウサギからの血清にDP6-001ワクチン免疫原に反応する抗Env抗体および抗Gag抗体があるか否かを検討するために、New Zealand Whiteウサギに対するDP6-001ワクチンの反復投与によって誘発される抗体応答に関して評価した。DNA免疫処置段階に関しては、ウサギ（少なくとも合計5匹/各性別/群）に対して、多価DNAワクチンによる筋肉内免疫処置を4週毎に計4回行い、1回の免疫処置につき1個体当たり合計7.2mg（1つのDNAにつき1.2mlの希釈液として）の用量を投与するか、または皮内に1回の免疫処置につき1個体当たり合計3.6mg（1つのDNAにつき0.6mgの希釈液として）の用量を投与した。対照動物には食塩液対照の皮内注射と筋肉内注射を（注射日毎に）交互に行った。タンパク質追加免疫段階に関しては、ウサギに対して、筋肉内多価DNAワクチンによる筋肉内免疫処置を4週毎に計3回行い、1回の免疫処置につき1個体当たり合計0.375mg（1つのgp120につき0.075mg）の用量を投与した。タンパク質の1回の用量は、0.05mgのアジュバントQS-21および賦形剤として30mgのシクロデキストリンを含む。QS-21は、キラヤ（Quillaja saponaria Molina）皮抽出物から高純度で入手しうるサポニンアジュバント（3,28-O-ビスグルコシドキラヤ酸）である（Kensil, et al., 1998, Dev Biol Stand., 92: 41-7）。4回のDNA免疫処置または4回のDNAと3回のタンパク質免疫処置のいずれかの14日後に各ウサギから血清を採取し、プールしたgp120（DP6-001中の免疫原）およびGagタンパク質に対する抗体に関してELISAによりアッセイした。対照動物からの血清もバックグラウンドの反応性に関してアッセイした。
【０１２１】
図16は、IM経路による7.2mgのDNAの免疫処置、またはIM経路による7.2mgのDNAの免疫処置後に0.375mgのgp120による筋肉内への追加免疫処置を行った雄および雌のウサギにおける抗Env抗体価を示している。図17は、ID経路による3.6mgのDNAの免疫処置、またはID経路による3.6mgのDNAの免疫処置後に0.375mgのgp120による筋肉内への追加免疫処置を行った雄および雌のウサギにおける抗Env抗体価を示している。図18は、IM経路による7.2mgのDNAの免疫処置、またはIM経路による7.2mgのDNAの免疫処置後に0.375mgのgp120による筋肉内への追加免疫処置を行った雄および雌のウサギにおける抗Gag抗体価を示している。図19は、ID経路による3.6mgのDNAの免疫処置、またはID経路による3.6mgのDNAの免疫処置後に0.375mgのgp120による筋肉内への追加免疫処置を行った雄および雌のウサギにおける抗Gag抗体価を示している。
【０１２２】
IM経路およびID経路により送達されたDNAはいずれも、ウサギにおいてgp120タンパク質およびGagタンパク質の両方に対する強い抗体応答を誘発することができた。gp120に対する抗体価は、gp120タンパク質による追加免疫処置後に有意に増強された。このタンパク質追加免疫原はGagタンパク質を含まないため、予想された通り、Gagタンパク質に対する抗体価は影響を受けなかった。DNAを3.6mgした群と7.2mg投与した群との間に抗体価に関する有意差は認められなかった。対照動物からの血清はgp120タンパク質、Gagタンパク質のいずれに対しても反応性を示さなかった（提示せず）。
【０１２３】
ウサギにおける毒性試験の際に行ったDP6-001ワクチンのDNAおよびgp120タンパク質による免疫処置はいずれも強い抗体応答を誘発することができた。DNA免疫処置は極めて強い初回刺激作用を有し、これはgp120タンパク質免疫処置後に有意に増強された。
【０１２４】
実施例12および13：非ヒト霊長動物におけるgp120タンパク質追加免疫処置後の、コドン最適化がなされたenv遺伝子およびgag遺伝子をコードする多価DNAワクチンの免疫原性
多価DNA初回免疫・gp120タンパク質追加免疫ワクチンの免疫原性を評価するために、非ヒト霊長動物において2つの試験を行った。第1の試験（DNA wt/タンパク質試験1と呼ぶ）では、野生型gp120（B715、Ba-L、CzmおよびE）遺伝子およびgag（pNL4-3）遺伝子をコードする5種類のDNAワクチンをID経路または遺伝子銃経路により送達した。タンパク質追加免疫原はクレードB715、Ba-L、CzmおよびEからのgp120からなる。この試験により、遺伝子銃によって送達したDNAでは抗体応答の方がCMI応答よりも上回り、一方、ID経路により送達したDNAでは測定可能なCMI応答がみられることが明らかになった。ID群および遺伝子銃群のいずれにおいても、抗体応答はgp120追加免疫処置後に著しく増大した。CMI応答および抗体応答の両方を誘発するために、A、B715、Ba-L、CzmおよびE分離株由来のコドン最適化がなされたgp120遺伝子ならびにCzm gag遺伝子を含むDP6-001ワクチンの免疫原性を検討する、第2の試験（DNA opt/タンパク質試験2と呼ぶ）を行った。この試験ではDNAをID経路またはIM経路のいずれかにより送達した。
【０１２５】
実施例12：アカゲザル（Rhesus Macaque）における、4種類の野生型gp120 Envタンパク質および1種類のGagタンパク質をコードするDNAの多価併用ワクチンならびに4種類のgp120タンパク質による追加免疫処置の免疫原性を調べるためのDNA wt/タンパク質-試験1
本実施例における実験は、アカゲザルにおいて、1種類のGagタンパク質および4種類のEnvタンパク質をコードする多価DNAワクチンによる初回免疫処置に続いて、DNAワクチンと同種の4種類のgp120タンパク質による追加免疫処置を行うことによって誘発される免疫応答を検討する目的で行った。6頭のアカゲザル（雄）をこの試験に含めた。この試験で検査した多価ワクチン製剤は1種類のGag抗原および4種類のEnv抗原を有しており、1種類のGag抗原および5種類のEnv抗原を有するDP6-001製剤とは異なる。これらのサルに対して、5種類のDNAプラスミド（クレードB Ba-L、クレードB B715、クレードC CzmおよびクレードE 976からの野生型env遺伝子をコードするプラスミド4種；ならびにHIV-1クレードBのgag遺伝子をコードするプラスミド1種）の混合物の食塩水溶液による免疫処置を4回行った。3頭（961L、963Lおよび969L）には遺伝子銃によりDNAを接種し、一方、残りの3頭（971L、974Lおよび975L）にはID経路によりDNAを投与した。続いて各個体に対して、B、Ba-L、CzmおよびEに相当する4つの分離株由来の精製gp120による追加免疫処置をIM経路により2回行った。各々のID免疫処置では、各プラスミドDNAを500μgずつ（合計2.5mg）別々に注射した。遺伝子銃接種に関しては、各DNAを20μgずつ（合計100μg）を送達した。それぞれのサルに、各gp120を75μgずつ（プールgp120として300μg）、QS-21アジュバント100μgを含むPBS溶液中に配合したものを投与した。サルに対するDNA免疫処置を第0週、6週、12週および18週に行い、続いてタンパク質追加免疫処置を第24週および32週に行った。血清の採取は指定された時点、一般的には各々の免疫処置の2週後に行った。
【０１２６】
DNAおよびタンパク質による各々の免疫処置の後に、5種類のエンベロープタンパク質および1つのGagタンパク質のすべてに対する血清抗体価をELISAによりアッセイした（図20）。これらの結果は、遺伝子銃により送達されたDNAはID接種によって投与されたDNAよりもgp120タンパク質およびGagタンパク質に対してより高度の抗体応答を誘発し、抗体価が各々のDNA免疫処置毎に徐々に上昇することを明らかに示している。しかし、DNA初回刺激を行った個体に単一のgp120タンパク質による追加免疫処置を行ったところ、どちらの群の個体でも抗体価はかなり高いレベルに著しく上昇した。2回目のgp120追加免疫処置後には抗体応答のわずかな増大が認められた。予想された通り、gp120免疫処置後に抗gag抗体価の変化は認められなかった（図20E）。
【０１２７】
このワクチンによって誘発された抗体が機能的であるか否かを明らかにするために、4回目のDNA接種および2回のタンパク質追加免疫処置の後に採取した血清を、DP6-001ワクチンのgp120遺伝子と同種のenv遺伝子をコードするHIV-1分離株およびSHIV分離株の中和に関してアッセイした。これらのウイルスには、Ba-L env遺伝子をコードするSHIVBa-L分離株および初代HIV-1Ba-L分離株の両方、Czm env遺伝子をコードするHIV-1Czm、ならびにB715 env遺伝子をコードするHIV-1B715を含めた。4回のDNA免疫処置およびgp120追加免疫処置の後にアカゲザルから入手した血清はSHIVBa-Lを中和した（図21）。4回のDNA免疫処置ではSHIVBa-L分離株に対する中和活性は誘発されなかった（図21A）。しかし、各々のgp120追加免疫処置後に採取した免疫処置動物の血清はSHIVBa-L感染を抑制することができた（図21BおよびC）。HIV-1のさまざまな同種分離株および少数の異種分離株に対する、タンパク質追加免疫後に採取したこれらの動物の血清の中和力価を表9Aに示した。これらの血清による感染阻止率を表9Bに示した。4回のDNA接種後に採取した血清はこれらの分離株のどれも中和しなかった（非提示データ）。しかし、これらの分離株の少数はタンパク質追加免疫後の血清によって中和された。
【０１２８】
（表９Ａ）HIV-1/SHIV分離株に対する免疫処置を行った動物からの血清の中和力価
2006509039.tif 000010
【０１２９】
2回のタンパク質追加免疫処置後に採取した血清をアッセイした。中和力価は、非処置対照と比較して感染を50％抑制する免疫血清の希釈度に基づいて算出した。
【０１３０】
（表９Ｂ）
2006509039.tif 000011
【０１３１】
4回のDNA接種および2回のタンパク質追加免疫処置の後に採取した血清をアッセイした。各血清を1：16に希釈し、指定されたHIV-1分離株の中和に関してヒトPBMC標的を用いて検査した。阻止率は、免疫血清の存在下で観察された感染の程度と非処置対照との比較を基にした。
【０１３２】
以上を総合すると、4種類のenv遺伝子および1種類のgag遺伝子をコードする多価DNAワクチンによるアカゲザルの免疫処置により、免疫系は高度の初期免疫を受ける。タンパク質追加免疫処置は幅広い抗体応答の誘導に関して非常に有効である。この抗体応答は同種の初代HIV-1分離株を中和することができ、程度は落ちるが異種初代HIV-1分離株も中和することができた。
【０１３３】
実施例13：DNA opt/タンパク質-試験2：アカゲザルにおけるDP6-001ワクチンの免疫原性
アカゲザルにおいてDP6-001ワクチンによって誘発される体液性免疫応答および細胞性免疫応答について検討した。6頭（雄5頭および雌1頭）のアカゲザルをこの試験の対象とした。これらのサルに対して、6種類のDNAプラスミド（クレードA、B Ba-L、クレードB B715、クレードC CzmおよびクレードE 976由来のコドン最適化がなされたenv遺伝子をコードするプラスミド5種；ならびにHIV-1クレードCのgag遺伝子をコードするプラスミド1種）の混合物の食塩水溶液による免疫処置を4回行った。3頭（51M、978L、980L）にはIM経路によりDNAを接種し、3頭（991L、997L、998L）にはID経路によりDNAを投与した。続いて各個体に対して、A、B、Ba-L、CzmおよびEに相当する5つの分離株由来の精製gp120による追加免疫処置をIM経路により2回行った。各々の免疫処置では、各プラスミドDNAを500μgずつプールし（合計3mg）、総容量2mlの食塩水中に懸濁させた。各個体に対して、IM経路またはID経路により、合計3mgのDNAを投与した。ID接種に関しては、DNAを19の部位（1部位当たり100μl）に送達した。IM接種に関しては、DNAを4つの部位（1部位当たり500μl）に送達した。サルに対して、375μgのプールgp120（各gp120につき75μg）を、QS-21アジュバント100μgを含むPBS溶液中に配合したものを投与した。サルに対するDNA免疫処置を第0週、6週、12週および18週に行い、続いてタンパク質追加免疫処置を第24週および32週に行った。血清の採取は各免疫処置から約2週後に行った。結合抗体アッセイのために血清を最長49週まで採取した。
【０１３４】
DNAおよびタンパク質による各々の免疫処置の後に、5種類のエンベロープタンパク質のすべてに対する血清抗体価をELISAによりアッセイし、その結果を図22に示した。これらの結果は、5種類のエンベロープタンパク質のうち少なくとも3種については、IM経路により送達されたDNAはID経路によって投与されたDNAよりも高度の抗体応答を誘発し、抗体価が各々のDNA免疫処置毎に徐々に上昇することを明らかに示している。しかし、DNA初回刺激を行った個体に単一のgp120タンパク質による追加免疫処置を行ったところ、どちらの群の個体でも抗体価はかなり高いレベルに著しく上昇した。2回目のタンパク質追加免疫処置後に抗体レベルは幾分低下し、時間経過とともにさらに徐々に低下した。DNA接種期およびタンパク質接種期のいずれにおいても各個体における抗Gag抗体の力価は低かった （非提示データ）。
【０１３５】
DP6-001ワクチンによって誘発された抗体が機能的であるか否かを明らかにするために、4回目のDNA接種および2回のタンパク質追加免疫処置の後に採取した血清を、DP6-001ワクチンのgp120遺伝子と同種のenv遺伝子をコードする少数のHIV-1分離株およびSHIV分離株の中和に関してアッセイした。これらのウイルスには、Ba-L env遺伝子を含むSHIVBa-L分離株および初代HIV-1Ba-L分離株の両方、Czm env遺伝子を含むHIV-1Czm、ならびにB715 env遺伝子を含むHIV-1B715を含めた。高度免疫血清による無細胞下での中和およびHIV-1/SHIVの細胞間伝達の中和の両方をアッセイした。無細胞下でウイルスを用いるアッセイに関しては、熱不活化血清を無細胞下のウイルスとともに37℃でインキュベートし、続いてこのウイルス/血清混合物を用いて、レポーター遺伝子-ガラクトシダーゼを含むU373細胞株を感染させた。HIV-1の細胞間伝達の中和は、慢性的な感染細胞を血清の存在下で非感染細胞と共培養する合胞体阻害アッセイによって行った。細胞の共培養によって合胞体形成が誘導され、それが中和血清により阻害された。各々の中和アッセイには、感染アッセイを血清の非存在下または免疫処置前もしくは正常なアカゲザル血清の存在下で行う対照を含めた。
【０１３６】
図23は、4回のDNA免疫処置およびgp120追加免疫処置の後のアカゲザルからの血清によるSHIVBa-L分離株の中和を示している。4回のDNA免疫処置では、SHIVBa-L分離株に対する中和活性は誘発されなかった。しかし、各々のgp120追加免疫処置後に採取した免疫処置動物の血清はSHIVBa-L感染を抑制することができた。4回のDNA接種後に採取した血清はこれらの分離株のどれも中和しなかった（非提示データ）。しかし、これらの同種HIV-1分離株はタンパク質追加免疫後の血清によって中和された。さまざまな同種HIV-1分離株に対する、初回のタンパク質追加免疫後のこれらの個体からの血清の中和力価を表10に示した。初回のタンパク質追加免疫後の血清をさまざまな異種HIV-1分離株の中和に関しても検査し、その結果を表11に示した。4回のDNA接種ならびに初回および2回目のタンパク質追加免疫処置の後に採取した血清をクレードA、B、CおよびEからの広範囲の初代HIV-1分離株に対して用いる別の中和アッセイも行い、その結果を表12に示した。
【０１３７】
（表１０）同種HIV-1/SHIV分離株に対する、初回のタンパク質追加免疫後に採取した免疫処置動物からの血清の中和力価
2006509039.tif 000012
1 中和力価は、非処置対照との比較で50％を抑制する免疫血清の希釈度に基づいて算出している。
2 HIV-1CzmおよびHIV-1B715の中和は、HIV-1CzmまたはHIV-1B715に慢性的に感染させたCEM細胞を免疫血清の存在下で非感染性CEM細胞と共培養し、48hr後に合胞体を評価するという細胞間伝達アッセイによってアッセイした。
【０１３８】
（表１１）異種HIV-1分離株に対する、初回のタンパク質追加免疫後に採取した免疫処置動物からの血清の中和力価
2006509039.tif 000013
1 中和力価は、非処置対照との比較で50％を抑制する免疫血清の希釈度に基づいて算出している。
3 各血清を1：15希釈し、指定されたHIV-1分離株の中和に関して指標細胞株を用いて検査した。抑制率は、化学発光出力により測定した、免疫血清の存在下で観察された感染の程度と非処置対照との比較を基にした。
【０１３９】
（表１２）4回のDNA接種および初回および2回目のタンパク質追加免疫処置の後に採取した免疫処置動物の血清による初代HIV-1分離株の中和
2006509039.tif 000014
【０１４０】
血清は1：5希釈して検査した。アッセイは別稿に記載された通りに行った（Mascola, et al., 2002, J. Virol. 76, 4810-4821）。
【０１４１】
DP6-001ワクチンによって誘発された抗Gag特異的CMI応答を、IFN-γの産生に関してELISPOTによりアッセイした。このアッセイには、11アミノ酸の重複を有する6種の15merペプチドをそれぞれが含むGagペプチドのプールを用い、2つの連続したペプチドプールを刺激のために混合した。Gag配列はHIV-1 HXB-2分離株からのものとした。図24に示されているように、4回のDNA接種後に多くの個体が抗Gag特異的陽性ELISPOT応答を示し、ID接種の方が細胞性免疫応答の誘導に関してIM接種よりも有効性が高いように思われた。
【０１４２】
野生型およびコドン最適化を行ったgagワクチンによって誘発される抗Gag特異的CMI応答（試験1および試験2）も比較した。図25に示されているように、コドン最適化を行ったgag遺伝子をアカゲザルに接種すると、野生型gag遺伝子をコードするDNAよりも有意に高度のELISPOT応答が誘発される。
【０１４３】
Ba-LエンベロープおよびクレードEエンベロープに対するDP6-001ワクチンによって誘発される抗Env特異的CMI応答を、IFN-γの産生に関してELISPOTによりアッセイした。その結果は図26に示されている。4回のDNA免疫処置後の個体で弱いELISPOT応答が誘発されたものの、DNA初回免疫を受けた個体に対する多価gp120タンパク質を用いた追加免疫処置により、この種の応答は著しく増強された。
【０１４４】
DP6-001DNAワクチンによるアカゲザルの免疫処置は、免疫系に対して高度の初回刺激作用を有する。タンパク質追加免疫処置は幅広い抗体応答を誘発するのに非常に有効である。ELISPOTアッセイによる測定で、Gag抗原に対するCMI応答が、主としてID経路によるDNA免疫処置後に観察された。以上を総合すると、これらの結果は、DP6-001ワクチンによるアカゲザルの免疫処置がCMI応答および幅広い結合抗体応答を誘発し、それがさまざまなHIV-1分離株を中和しうることを示している。
【０１４５】
実施例14：DP6-001―New Zealand Whiteウサギにおける皮内または筋肉内への63日反復投与による生体内分布・組込み試験
IM経路またはID経路によるDNAの単回免疫処置後の64日間にわたるDNAの生体内分布を調べた。54匹のウサギ（雌雄各27匹）をこの試験に用いた。ウサギを3つの群に等分した。まずウサギを体重および身体検査所見に基づいて無作為化用プールに含めた。コンピュータにより生成された乱数を用いてそれらを試験群に割り当てた。無作為化に際しては、各群の平均体重が対照の平均と有意差がないようにした。ウサギを表13に示した3つの群に割り当てた。対照動物（第1群）に対しては食塩水を皮内および筋肉内に1回注射した。第2群のウサギには7.2mgのHIVワクチン（プラスミド）DP6-001の単回投与を筋肉内に行い（注射部位1つにつき1.2ml、合計2.4ml）、第3群のウサギには皮内経路により3.6mgのHIVワクチン（プラスミド）DP6-001を単回接種した（注射部位1つにつき0.12ml、合計1.2ml）。筋肉内投与は左および右の大腿筋の2つの注射部位に均等に配分した（大腿毎に1.2mlを投与）。皮内投与は背部に位置する10箇所の注射部位に均等に配分した（注射部位1つ当たり約0.12ml）。注射部位はすべて剃毛し、標示を付した。全体的な試験デザインは表13に記載されている。
【０１４６】
（表１３）ウサギにおけるDNAの生体内分布を検討するために行った試験のデザイン
2006509039.tif 000015
2 IM：筋肉内；IM/ID：筋肉内と皮内の併用（投与日毎に筋肉内と皮内の投与経路を交互に用いる）；ID；皮内；NA：該当せず
3 投与容量は動物の体重にかかわらず一定とする。
【０１４７】
飼育ケージ外からの観察項目には、死亡、瀕死状態、一般的健康状態および中毒徴候の観察を含めた。臨床的観察には、皮膚および毛皮の特徴、眼および粘膜、呼吸器系、循環系、自律神経系および中枢神経系、ならびに体運動性および行動パターンの評価を含めた。
【０１４８】
6匹のウサギ（各時点につき雌雄各3匹）を試験日（SD）第8、29および64日にペントバルビタールナトリウム注射によって屠殺し、以下の組織を摘出して液体窒素中で急速凍結させ、-70±10℃で保存した：血液（安楽死させる前に、中耳介動脈へのEDTAチューブの穿刺により1mLを採取し、数回転置させた上でクリオバイアルチューブに移した）；卵巣/精巣；胸腺；心臓；肺；肝臓；消化管（小腸切片）；腎臓；脾臓；皮下組織（皮内注射部位のみ）；皮膚、皮内注射部位のみ（代表的な試料）；皮内注射部位の筋肉、両方の部位（代表的な試料；組込み分析用にSD 64に余分に約2gの試料を採取）；筋肉内注射部位の筋肉、両方の部位（組込み分析用にSD 64に余分に約2gの試料を採取）；対側の腋窩または腸間膜リンパ節；骨髄（大腿から単離）；および脳。
【０１４９】
すべての組織を処理し（皮膚試料を除く）、医薬品の安全性試験の実施に関する基準（Good Laboratory Practice）（GLP）で承認された生体内分布に関する方法を用いて、qPCRによりプラスミドの有無に関して分析した。
【０１５０】
死亡、中毒の臨床徴候、体重、体重変化または食物摂取に関して、被験物と関係のある変化は観察されなかった。生体内分布qPCR（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）分析により、HIVワクチン（プラスミド）DP6-001が、皮内注射部位の筋肉および皮下組織の内部、ならびに筋肉内注射部位の筋肉内に存在することが明らかになった。発見頻度およびコピー数はSD 8剖検時が最も多く、SD 29および64の剖検時になるに従って徐々に減少した。他の組織中ではわずかに散発的に認められるに過ぎず、これらは生物学的なばらつきの結果であると判断された。プラスミドが皮内および筋肉内の注射部位にSD 64まで存続したため、代表的な注射部位筋肉試料に対して組込み分析を行った。組込み分析は、DNAを投与部位から抽出し、ワクチン配列が高分子量（すなわち、染色体）DNA中に存在するか否かを判定するためにqPCRを行うことによって実施した。このアッセイにより陽性の検査結果が得られた場合には、染色体DNAを組織から抽出し、電場反転ゲル電気泳動を用いて精製した上で、ワクチンDNAの存在に関して再び検査した。この試験では試料への組込みは検出されなかった。
【０１５１】
以上をまとめると、New Zealand WhiteウサギにおけるHIVワクチン（プラスミド）DP6-001の単回の筋肉内注射または皮内注射は、用いた試験条件下では明らかな中毒の徴候を呈さなかった。プラスミドは皮内注射部位の筋肉、皮下組織および筋肉内注射部位の筋肉に分布し、注射部位への組込みは認められなかった。
【０１５２】
実施例15：DP6-001の忍容性および安全性
DP6-001ワクチン製剤の忍容性および安全性のプロファイルをウサギモデルで検討した。このワクチン製剤はDNA成分およびタンパク質成分の両方を含むため、これらの成分の両方の毒性の有無に関して、第I相試験に用いる予定の最大用量を用い、各ウサギに対して臨床的プロトコールよりも1回余分に接種を行う形式で検討した。臨床試験で提案されているように、この毒性試験ではDNAはIM経路またはID経路のいずれかによって送達し、タンパク質はIM経路により接種した。タンパク質免疫原はQS-21アジュバントおよび賦形剤シクロデキストリンとともに製剤化される可能性があるため、QS-21/シクロデキストリン混合物の毒性に関しても、試験の別の項目で、臨床試験に用いる予定の用量を用いて検討した。この毒性試験の目立った特徴および全体的な結論について以下に考察する。
【０１５３】
プラスミド初回免疫・タンパク質追加免疫型HIVワクチンDP6-001を、雄性および雌性New Zealandウサギに対して26週の試験期間にわたって筋肉内経路または皮内経路により多回反復投与した場合の毒性を検討した。ウサギモデルを選択した理由は、ワクチンの前臨床試験にこれを用いることがFDAにより推奨されているためである。免疫処置に筋肉内経路および皮内経路を選択した理由は、これらがヒトへの投与経路となると考えられるためである。このDNAワクチン成分は、6種類の異なるHIVタンパク質バリアントを発現する同一濃度の6種類の異なるDNAプラスミドの混合物であり、これを試験のDNA初回免疫段階に用いた。DP6-001ワクチンのタンパク質成分は5種類の異なるHIVタンパク質バリアントを発現する同一濃度の5種類の異なるタンパク質の混合物であり、これを試験のタンパク質追加免疫段階に用いた。筋肉内に送達するプラスミド免疫原に関して選択した用量（7.2mgのプールDNA）は、予想される臨床用量に基づく。しかし、皮内免疫処置の場合には、プラスミドDNAの中毒量（3.6mg）は提案されている臨床用量の3倍であった。毒性試験に用いるタンパク質の用量は臨床用量と同程度にした。
【０１５４】
まずウサギを体重および身体検査所見に基づいて無作為化用プールに含めた。コンピュータにより生成された乱数を用いて、それらを試験群に割り当てた。無作為化に際しては、各群の平均体重が対照の平均と有意差がないようにした。ウサギを表14に示した群に割り当てた。
【０１５５】
（表１４）DP6-001ワクチンを用いて行った毒性試験のデザイン
2006509039.tif 000016
1 示した値はヒトで予想される最大の臨床用量に対する倍数である。
2 タンパク質は50μgのQS-21および30mgのシクロデキストリンとともに投与される。
3 IM：筋肉内；IM/ID：筋肉内と皮内の併用（投与日毎に筋肉内と皮内の投与経路を交互に用いる）；UDL；皮内；NA：該当せず
4  投与容量は動物の体重にかかわらず一定とする。
【０１５６】
DNA免疫原およびタンパク質免疫原の両方に関する投与計画を表15に示した。
【０１５７】
（表１５）毒性試験におけるDNA免疫原およびタンパク質免疫原の投与計画
2006509039.tif 000017
a―注射は剃毛/標識部位に投与した。必要に応じて、これらの部位を再び剃毛し、再び標示を付した。
IM―筋肉内  ID―皮内
【０１５８】
New Zealand Whiteウサギ（少なくとも5匹/各性別/群）に対して、DP6-001 HIV DNAワクチンまたは食塩水対照の筋肉内（投与容量2.4ml、1回の投与で7.2mg/匹）または皮内（投与容量1.2ml、1回の投与で3.6mg/匹）投与を、試験日（SD）1、29、57および85に行った。試験のタンパク質追加免疫段階では、ウサギに対して、DP6-001 HIVタンパク質ワクチン（投与容量1.0ml、1回の投与で0.375mg/匹）、リン酸緩衝食塩水対照またはQS-21およびシクロデキストリンアジュバント対照（それぞれ1回の注射につき50μgおよび30mg）の筋肉内投与を、SD 113、141および169に行った。続いて、ウサギをSD 87（DNA接種急性期剖検）、SD 99（DNA接種回復期剖検）、SD 171（タンパク質接種急性期剖検）またはSD 183（タンパク質接種回復期剖検）に剖検した。評価したパラメーターには、死亡、臨床的観察所見、ドレイズ観察所見、体重、食物摂取、臨床的病態、臓器重量、肉眼的病理所見および組織学的病理所見が含まれた。DNAおよびタンパク質の接種によって誘発された結合性抗体価も測定した。
【０１５９】
死亡、臨床的観察所見、体重、臓器重量、臨床的病態、肉眼的病理所見および組織病理所見に関して、被験物と関係のある変化は観察されなかった。ELISAによる評価で、DNA初回免疫処置およびタンパク質追加免疫処置はいずれも強い血清抗体応答を誘発した。DNAワクチンの皮内注射部位では回復性のドレイズ所見の頻度の増加が認められた。検討した各パラメーターに関するいくつかの具体的な観察所見を以下に示す。
【０１６０】
死亡および臨床的観察所見：HIVワクチンDP6-001は死亡を引き起こさず、臨床的観察所見にも飼育ケージ外からの観察所見にも影響を及ぼさなかった。第3群の1匹の雄ではSD 64および78に鼻に擦過創が認められた。第10群の1匹の雄ではSD 92に陰嚢腫脹が認められたが、第10群および第6群の他のウサギには観察されなかった。第3、4、5、7、9および10群の雄の各1匹は試験期間中のさまざまな時点で痩せていることが観察された。これらの観察所見は3週間以内に消失するか初回の観察よりも軽減し、それらの発生率の低さから被験物による影響はないことが示唆された。第1群の雄1匹には前肢および後肢に擦過創/膿瘍がみられた。これは対照動物であったため、これらの所見は被験物とは関係ないと判断した。これらの膿瘍のため、このウサギには食欲不振がみられ、この期間中は弱々しい様子であった。ウサギ数匹には試験期間を通じて流涙が間欠的に認められた。
【０１６１】
ドレイズ観察所見：
HIVプラスミドワクチンDP6-001の筋肉内投与は皮膚観察所見に影響を及ぼさなかった。プラスミドの筋肉内注射の場合（投与部位1および2）には、主としてごく軽微なスコアの紅斑および浮腫が認められた（例外として少数は軽度スコアであった）。これらの観察所見は対照群（第1群および第2群）にもみられたため、それらは被験物とは関係なく、注射処置に伴うものと判断された。
【０１６２】
HIVプラスミドワクチンDP6-001の皮内投与は皮膚観察所見に影響を及ぼした。皮内プラスミド投与の場合（投与部位3）には、対照（第1群および第2群、SD 29および85の時点）で、紅斑および浮腫のスコアが軽度レベルの強度に達した。第5、7、9および11群では、この観察所見の強度および頻度は対照を上回り、このことから被験物に関連した皮膚反応の増加が示唆された。しかし、被験物によって媒介されたものの、これらの観察所見は時間経過に伴って回復した。
【０１６３】
HIVタンパク質ワクチンDP6-001の筋肉内注射の場合には、紅斑および浮腫に関してごく軽微ないし軽度の所見が対照群（第1〜3群）およびタンパク質接種群（第6、7、10および11群）に認められた。これらの所見は対照群、タンパク質接種群とも同程度であったため、被験物とは関係なく、注射手順に起因するものと判断された。
【０１６４】
体重および食物摂取：
いずれの群においても体重および体重増加に関して処置と関係のある影響は認められなかった。さらに、食物摂取に関しても処置と関係のある影響はいずれの群にも認められなかった。
【０１６５】
臨床的病態：
ウサギにおいて、HIVワクチンDP6-001の多回反復投与に起因する、被験物と関係のある明らかな影響はみられなかった。いくつかの群でSD31および87に認められたグロブリン高値は極めてわずかに過ぎず、抗体産生に起因する可能性もあるが、動物個体間のばらつきに起因する可能性が最も高いと考えられた。他の軽微な変化はすべて動物個体間のばらつきに起因するものとされ、生物学的な意味は認められなかった。
【０１６６】
血液学、臨床化学、凝固：対照群と免疫処置群との間に統計学的な差は認められず、差はすべて動物個体間のばらつきによるものであった。
【０１６７】
肉眼的病理所見：
肉眼的病理所見に関して、処置と関係のある影響はみられなかった。組織病理学な相関がみられず、容量反応関係も認められず、所見の大半は対照動物にも認められたことから、これらの所見は被験物とは関係ないと判断された。
【０１６８】
臓器重量：
いずれの群においても臓器重量に関して処置と関連のある変化はみられなかった。臓器重量、臓器-体重比および臓器-脳重量比における統計学的に有意な変化には以下が含まれる：第4群の雌のSD 87での脳重量の減少、第3群の雌のSD 171での胸腺重量の減少、第3群の雌のSD 183での副腎、心臓および脾臓重量の減少、ならびに第3群の雌のSD 183での脾臓-体重比および心臓-脳重量比の低下。明らかなパターンが認められず、それらは食塩水対照である第1群または2群との比較による第3群アジュバント対照動物における組織重量または比の変化を含んでいたため、これらの変化は被験物とは関係ないと判断された。
【０１６９】
組織病理所見：
いずれの群においても組織病理所見に関して処置と関連のある影響はみられなかった。
【０１７０】
注射部位で観察された炎症反応、異物および時にみられた出血は、投薬処置と関係があると判断された。被験物または媒体の投与による毒性作用と考えられた組織病理学的変化はなかった。注射部位での所見にはごく軽微または軽度の炎症性細胞浸潤または炎症が含まれ、出血が稀にみられ、異物の限局性屈折性沈着物がかなり低い頻度でみられた。これらの所見は対照ウサギおよび処置ウサギの両方で起こっており、処置群と関係のある明らかな差異はなく、すべて投薬処置に伴うものと判断された。
【０１７１】
腎臓に関しては、腎障害（尿細管崩壊、高色素細胞、尿細管細胞空胞変性、ならびに集合尿細管の下位における淡い線状物質および細胞片の集積を伴う、尿細管上皮細胞の再生および/または変性変化の散在性微小病巣として認識される）が全群を通じてごく軽微な程度で認められた。多巣性の尿細管石灰化または尿細管細胞空胞形成が腎障害とは別個または同時にみられた。これらの腎所見は、この年齢のNew Zealand Whiteウサギの腎臓では一般的な自然発生的な病態である；これらと被験物の投与に明らかな関係は認められなかった。
【０１７２】
肝細胞の脂肪変性および空胞形成、ならびに肝内での限局的な混合細胞性または単核細胞性浸潤は、肉眼的に観察された肥大および変色と顕微鏡的に相関していた。これらの肝所見はウサギで自然発生的にみられ、投薬との明らかな関係はみられなかった。
【０１７３】
脾臓におけるヘモジデリン沈着、肺における限局的炎症反応、心外膜における脂肪変性の散発的発生、および他の臓器における発生率の低いその他の散発的所見は投薬と明らかな関係が認められず、被験物の投与とは関係ないと判断された。
【０１７４】
以上より、これらの試験条件下では、New Zealand Whiteウサギに対するHIVワクチンDP6-001の筋肉内反復投与は、注射部位での可逆的なドレイズ観察所見を除き、全身毒性に関するいかなる特異的な徴候も呈さなかった。
【０１７５】
実施例16：DP6-001の第I相臨床試験
ヒトでの臨床試験は、ワクチンの安全性を判定するため、およびワクチンの有効性を判定するために行われる。安全性を判定するためには、健常志願者に対してワクチンを接種する。副作用の発生率を調べる。有効性を判定するためには、NIHにより確立されたプロトコールに従う。高リスク集団（例えば、薬物乱用者、高リスクの性行為を行っている集団、HIVの発生率が高い集団）。高リスク集団の試験を行うためには、ベクターのみを含むDNAワクチンを接種した陰性対照群におけるHIV感染の発生率を、初代分離株配列（例えば、gp120、gp140、gp160および/またはgp41の配列）を含む多価DNAワクチンを投与した被験群におけるHIV感染の発生率と比較する。二重盲検試験を行う。免疫処置レジメンは、例えば、それぞれ1カ月間隔で行われる、遺伝子銃による3回のDNAワクチン免疫処置である。レジメン期間間に血清を採取し、上記の実施例2〜4に記載したような実験により、免疫状態をモニタリングする。さらに、ヒト患者における細胞性免疫（CTL応答）を調べる。PBMCを単離した後に、これらの細胞のインビトロ機能検査を、上記の実施例4に脾細胞に関して記載したようにして行う。次に、上記の実施例3に記載した通りに、患者の血清中の中和抗体の存在を調べる。HIVによる感染を検査し、対照群と被験群との間で発生率に有意差があるか否かを判定する。
【０１７６】
DP6-001を評価するための第I相臨床試験は以下のようにして行う。試験の目的は、DP6-001多回投与の安全性を評価すること、DP6-001がワクチン成分に対する体液性免疫応答を誘導する能力を評価すること、およびDP6-001が細胞性免疫応答を誘導する能力を評価することである。
【０１７７】
試験には約36例の被験者に参加してもらう。これらの被験者は、健康でHIVに感染していない18〜55歳の成人志願者とする。彼らは、HVTNリスク分類（HVTN Risk Status）による定義ではHIV感染のリスクが低いか極めてわずかである。被験者は以前にHIVワクチン接種の実験を受けていない者とする。
【０１７８】
各被験者に対して、DP6-001をID経路またはIM経路によって投与する3種類の投与レジメンのうち1つの投与を行う。投与は無作為化し、DNA成分の多回投与から始めて、その後にタンパク質ワクチンの追加免疫処置を行う。ヒトに対する投与試験プログラムの1つは以下の通りである：約50μg/kgのDP6-001 DNA組成物を第0週、第4週および第12週に投与する（すなわち、1人につき3回投与、体重50kgの人では約2.5mgを投与）；および7μg/kgのDP6-001タンパク質組成物を第20週および第28週に投与する。
【０１７９】
DP6-001がワクチン成分に対する免疫応答を誘導する能力を評価するためには、ワクチン接種に用いたgp120糖タンパク質のプールを用いてELISAを行う。HIV-1 Czm Gagタンパク質を用いるELISAも行う。一群の実験室改変HIV-1株および初代HIV-1分離株に対する中和抗体アッセイが、HVTN認可を受けた試験室によって行われる。免疫をさらに確認し、免疫応答の特性を決定し、ワクチン接種と新たな感染の可能性とを区別するために、ウエスタンブロット法などの別の固相アッセイを用いることもできる。例えば、ワクチンがgp41を含んでいない場合には、ワクチン接種を受けた対象はgp41に対する応答を示さないと考えられる。このため、被験者におけるgp41反応性は新たな感染の可能性を示すと考えられる。
【０１８０】
DP6-001が細胞性免疫応答を誘導する能力を評価するためには、HIV-1 GagエピトープまたはEnvエピトープに対して特異的なIFN-γ ELISPOTアッセイを行うことができる。大量培養物の細胞傷害性T細胞アッセイおよびフローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色アッセイを用いることもできる。
【０１８１】
その他の態様
本発明をその詳細な記載とともに説明してきたが、以上の説明は本発明を例示するためのものであって、その範囲を制限するものではなく、それは添付する特許請求の範囲によって規定されることが理解される必要がある。その他の面、利点および改変は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
（図１）DNA抗原およびタンパク質抗原、ならびにウサギに対するワクチン接種試験におけるDNA抗原およびタンパク質抗原の投与プログラムを示した表である。
（図２）1価ワクチンおよび多価ワクチンによる免疫処置を行ったウサギから単離した血清による初代HIV-1分離株の中和率を示した表である。血清はDNA免疫処置後に単離した。動物番号は図1に示したウサギ番号に対応する。
（図３）1価ワクチンおよび多価ワクチンによる免疫処置を行ったウサギから単離した血清による初代HIV-1分離株の中和率を示した表である。血清は初回のタンパク質追加免疫処置後に単離した。動物番号は図1に示したウサギ番号に対応する。
（図４）1価ワクチンおよび多価ワクチンによる免疫処置を行ったウサギから単離した血清による初代HIV-1分離株の中和率を示した表である。血清は2回のタンパク質追加免疫処置後に単離した。動物番号は図1に示したウサギ番号に対応する。
（図５）図5A〜5Cは、1価ワクチンおよび多価ワクチンによる免疫処置を行ったウサギからの血清による中和率を示した一組のグラフである。「最終DNA」は、最後のDNA免疫処置後に採取した血清に関するアッセイに対応する。「タンパク質-I」は、初回のタンパク質免疫処置後に採取した血清に関するアッセイに対応する。
（図６）ELISAにより測定した、DNA初回免疫処置後の抗env IgG応答の滴定終点力価を示した表である。ELISAプレートは、表記した種々の初代gp120抗原（Ba-L、C1、E、B、A、D、FまたはG）によりコーティングした。
（図７）図7A〜7Fは、3価gp120ワクチンによる免疫処置動物群C4における、DNA初回免疫処置およびタンパク質追加免疫処置の後の抗gp120抗体応答を示したグラフである。「最終DNA」は、4回目のDNA免疫処置後に収集した血清のことを指す。「タンパク質I」は、1回のタンパク質追加免疫処置後に収集した血清のことを指す。「タンパク質II」は、2回のタンパク質追加免疫処置後に収集した血清のことを指す。B、C1およびE DNAならびにB、C1およびEタンパク質による免疫処置を行ったウサギからの血清に関するデータを提示している。図7Aおよび7Bは、B Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。図7Cおよび7Dは、C1 Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。図7Eおよび7FはE Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。
（図８）図8A〜8Pは、8価gp120ワクチンによる免疫処置動物群C7における、タンパク質追加免疫原に含まれるEnv抗原に対する抗gp120 IgG応答を示したグラフである。Ba-L、B、C1、E、A、D、FおよびG DNAによる免疫処置を行った上で、B、Cl、EおよびBa-Lタンパク質による追加免疫処置を行ったウサギからの血清に関するデータを提示している。図8Aおよび8Bは、B Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。図8Cおよび8Dは、Ba-L Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。図8Eおよび8Fは、C Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。図8Gおよび8Hは、E Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。図8Iおよび8Jは、A2 Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。図8Kおよび8Lは、D Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。図8Mおよび8Nは、F Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。図8Oおよび8Pは、G Envタンパク質に対して検査した血清に関するデータを示している。
（図９）免疫処置の前、DNA免疫処置後および1回のタンパク質追加免疫処置後に入手したウサギ血清による、HIV-1 89.6-GFPレポーターウイルスに対する中和率を示したグラフである。各動物群に対して、表記した種々のgp120製剤による免疫処置を行った。
（図１０）免疫処置の前、DNA免疫処置後、1回のタンパク質追加免疫処置後および2回のタンパク質追加免疫処置後に入手したウサギ血清による、HIV-1 SF162に対する中和率を示したグラフである。各動物群に対して、表記した種々のgp120製剤による免疫処置を行った。
（図１１）免疫処置の前、DNA免疫処置後、1回のタンパク質追加免疫処置後および2回のタンパク質追加免疫処置後に入手したウサギ血清による、HIV-1 Ba-Lに対する中和率を示したグラフである。各動物群に対して、表記した種々のgp120製剤による免疫処置を行った。
（図１２）免疫処置の前、DNA免疫処置後、1回のタンパク質追加免疫処置後および2回のタンパク質追加免疫処置後に入手したウサギ血清による、HIV-1 JRCSFに対する中和率を示したグラフである。各動物群に対して、表記した種々のgp120製剤による免疫処置を行った。
（図１３）図13A〜13Dは、DNA初回免疫処置およびタンパク質追加免疫処置の後のウサギ血清による、HIV-1クレードA初代分離株DJ263（図8Aおよび8D）およびクレードC初代分離株TV1（図8Bおよび8C）の中和率を示した一組のグラフである。各動物群に対して、表記した種々のgp120製剤による免疫処置を行った。
（図１４）A、Ba-L、B715、CzmおよびB分離株からのgp120のアミノ酸配列を示している。
（図１５）図15A〜15Eは、各々のDNA免疫処置後および各々のgp120タンパク質追加免疫処置後の抗gp120 IgG応答のレベルを示した一組のグラフである。ELISAのためにコーティングした抗原を各図の上に示している（図15A、15B、15Cおよび15DはそれぞれクレードA、B、CzmおよびE）。DNAおよびタンパク質の投与の時点はそれぞれ、実線および点線の矢印で示されている。「GG」は遺伝子銃投与を表す。「IM」は筋肉内投与を表す。「ID」は皮内投与を表す。
（図１６）図16Aおよび16Bは、DNAをIM経路により送達する様式でDP6-001ワクチンによる免疫処置を行ったウサギにおける抗gp120応答のレベルを示した一組のグラフである。4回のDNA接種（IM）（●）、または4回のDNA接種（IM）と3回のタンパク質接種（IM）（○）による免疫処置を行ったウサギの血清のELISA反応性を示している。血清は最終DNAまたはタンパク質による免疫処置から14日後に収集し、クレードB（B715およびBa-L）、C、EおよびAのHIV-1分離株からプールしたgp120に対して検査した。雄に関するデータを図16Aに示した。雌に関するデータを図16Bに示した。
（図１７）図17Aおよび17Bは、DNAをID経路により送達する様式でDP6-001製剤による免疫処置を行ったウサギにおける抗gp120応答のレベルを示した一組のグラフである。4回のDNA接種（ID）（●）、または4回のDNA接種（ID）と3回のタンパク質接種（IM）（○）による免疫処置を行ったウサギの血清のELISA反応性を示している。血清は最終DNAまたはタンパク質による免疫処置から14日後に収集し、クレードB（B715およびBa-L）、C、EおよびAのHIV-1分離株からプールしたgp120に対して検査した。雄に関するデータを図17Aに示した。雌に関するデータを図17Bに示した。
（図１８）図18Aおよび18Bは、DNAをIM経路により送達する様式でDP6-001製剤による免疫処置を行ったウサギにおける抗gag応答のレベルを示した一組のグラフである。4回のDNA接種（IM）（●）、または4回のDNA接種（IM）と3回のタンパク質接種（IM）（○）による免疫処置を行ったウサギの血清のELISA反応性を示している。血清は最終DNAまたはタンパク質による免疫処置から14日後に収集し、Gagタンパク質に対して検査した。雄に関するデータを図18Aに示した。雌に関するデータを図18Bに示した。
（図１９）図19Aおよび19Bは、DNAをID経路により送達する様式でDP6-001製剤による免疫処置を行ったウサギにおける抗Gag応答のレベルを示した一組のグラフである。4回のDNA接種（ID）（●）、または4回のDNA接種（ID）と3回のタンパク質接種（IM）（○）による免疫処置を行ったウサギの血清のELISA反応性を示している。血清は最終DNAまたはタンパク質による免疫処置から14日後に収集し、Gagタンパク質に対して検査した。雄に関するデータを図19Aに示した。雌に関するデータを図19Bに示した。
（図２０）図20A〜20Eは、多価DNAおよびgp120タンパク質による免疫処置を行ったマカクザル（macaque）における抗体価を示した一組のグラフである。2回（DNA2）、3回（DNA3）および4回（DNA4）のDNA免疫処置ならびに1回（タンパク質1）および2回（タンパク質2）の追加免疫処置を受けたマカクザルの血清における抗体価を、B715 gp120（A）、Ba-L gp120（B）、Czm gp120（C）、E960 gp120（D）およびGag（E）タンパク質に対するELISAによってアッセイした。血清は各々の免疫処置から2週後に収集した。抗体価はエンドポイントELISA力価に基づいており、ナイーブ動物からの血清の対応する希釈度と比較して、450nmでの光学密度が2倍となる免疫血清の希釈度から得た。
（図２１）図21A〜21Cは、DNA初回免疫処置およびタンパク質追加免疫処置による免疫処置を行ったマカクザルの血清によるSHIV Ba-Lの中和率を示した一組のグラフである。4回のDNA（DNA 4）ならびに1回（タンパク質1）および2回（タンパク質2）の追加免疫処置の後に各動物から収集した血清を、U373細胞内のSHIVBa-L分離株に対する中和活性に関してアッセイした。感染の阻止率は、免疫血清の存在下で観察された感染の程度と非処置対照との比較を基とした。
（図２２）図22A〜22Eは、多価DNAおよびgp120タンパク質による免疫処置を行ったマカクザルにおける血清のエンドポイントELISA力価を示した一組のグラフである。2回（DNA 2）、3回（DNA 3）および4回（DNA 4）のDNA免疫処置ならびに1回（タンパク質1）および2回（タンパク質2）の追加免疫処置を受けたマカクザルの、タンパク質追加免疫処置から5、9および13週後の血清における抗体価を、Ba-L gp120（A）、A gp120（B）、E760 gp120（C）、B715 gp120（D）およびCzm gp120（E）タンパク質に対するELISAによってアッセイした。血清は各々の免疫処置から2週後ならびに2回目のタンパク質追加免疫処置から5、9および13週後に収集した。抗体価はエンドポイントELISA力価に基づいており、ナイーブ動物からの血清の対応する希釈度と比較して、450nmでの光学密度が2倍となる免疫血清の希釈度から得た。
（図２３）図23A〜23Cは、DNA初回免疫処置およびタンパク質追加免疫処置による免疫処置を行ったマカクザルの血清によるSHIV Ba-Lの中和率を示した一組のグラフである。4回のDNA（DNA 4；図23A）ならびに1回（タンパク質1；図23B）および2回（タンパク質2；図23C）の追加免疫処置の後に各動物から収集した血清を、U373細胞内のSHIVBa-L分離株に対する中和活性に関してアッセイした。感染の阻止率は、免疫血清の存在下で観察された感染の程度と非処置対照との比較を基とした。
（図２４）図24A〜24Rは、DNA/タンパク質製剤による免疫処置を行ったマカクザルにおけるIFN-γを発現するPBMCの数を示した一組のグラフであり、PBMCはGagペプチドで刺激した。ELISPOTアッセイを、4回目のDNA処置（DNA 4）、初回（タンパク質1）および2回目（タンパク質2）のgp120タンパク質追加免疫処置の後に単離したマカクザルのPBMCを用いて行った。HIV-1HXB2分子クローン由来のGagタンパク質からの11アミノ酸の重複のある15merペプチドのいくつかのプールを用いてPBMCを18hr刺激し、その後にスポットの現像および定量を行った。ID免疫処置に関するデータを図24A〜24Iに示した。IM免疫処置に関するDNAを図24J〜24Rに示した。
（図２５）図25Aおよび25Bは、野生型およびコドン最適化を行ったgag遺伝子をコードするDNA製剤による免疫処置を行ったマカクザルからのIFN-γを発現するPBMCの数を示した一組のグラフであり、PBMCはGagペプチドで刺激した。野生型およびコドン最適化を行ったgag遺伝子をコードするDNAによる免疫処置を皮内経路によって行ったマカクザルにおける、Gagタンパク質に対するELISPOTにより測定した、IFN-γを発現するPBMCの比較（試験1は図25A、試験2は図25B）。
（図２６）図26A〜26Dは、パク質製剤による免疫処置を行ったマカクザルからのIFN-γを発現するPBMCの数を示した一組のグラフであり、PBMCはクレードEおよびBa-L Envペプチドで刺激した。ELISPOTアッセイを、4回目のDNA処置後（DNA 4；図26Aおよび26C）および初回タンパク質追加免疫処置後（タンパク質1；図26Bおよび26D）に単離したマカクザルのPBMCを用いて行った。HIV-1Ba-LおよびクレードE分離株由来のgp120タンパク質からの11アミノ酸の重複のある15merペプチドの4つのプールを用いてPBMCを18hr刺激し、その後にスポットの現像および定量を行った。
（図２７〜図３８）図27〜38は、Czm、Ba-L、B、EおよびA HIV-1分離株のgp120遺伝子およびgag遺伝子の野生型およびコドン最適化を行ったDNA配列を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月5日(2005.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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