(57)【要約】【課題】ポリペプチド消化物由来のマスフィンガープリントを決定する方法に関する。本発明は、特に、マスフィンガープリントを改善する標識の使用に関する。本発明は、さらに、組織、細胞又は細胞画分中のタンパク質発現の決定、あるいは、大型タンパク質複合体の分析における上記方法の使用の提供。【解決手段】ポリペプチドの特徴を分析する方法であって、（ａ）任意の工程としてポリペプチドのシステインジスルフィド架橋を還元して遊離チオールを形成し、該遊離チオールを防護し、（ｂ）配列特異的開裂試薬で該ポリペプチドを開裂してペプチド断片を形成し、（ｃ）任意の工程として開裂試薬を不活性化し、（ｄ）存在する１以上のεアミノ基をリジン反応剤で防護し、（ｅ）ペプチド断片を質量分析法により分析して該ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成し、かつ（ｆ）該マスフィンガープリントから該ポリペプチドを同定する工程を包含する方法が提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの特徴を分析する方法であって、
（ａ）任意の工程としてポリペプチドのシステインジスルフィド架橋を還元して遊離チオールを形成し、該遊離チオールを防護する工程、
（ｂ）配列特異的開裂試薬で該ポリペプチドを開裂してペプチド断片を形成する工程、
（ｃ）任意の工程として開裂試薬を不活性化する工程、
（ｄ）存在する１以上のεアミノ基をリジン反応剤で防護する工程、
（ｅ）ペプチド断片を質量分析法により分析して該ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程、及び
（ｆ）該マスフィンガープリントから該ポリペプチドを同定する工程、
を含むことを特徴とするポリペプチドの特徴分析方法。
【請求項２】
複数のポリペプチドの特徴を分析する方法であって、
（ａ）任意の工程として１以上のポリペプチドのシステインジスルフィド架橋を還元して遊離チオールを形成し、該遊離チオールを防護する工程、
（ｂ）１以上のポリペプチドを該複数のポリペプチドから分離する工程、
（ｃ）配列特異的開裂試薬で１以上のポリペプチドを開裂してペプチド断片を形成する工程、
（ｄ）任意の工程として開裂試薬を不活性化する工程、
（ｅ）存在する１以上のεアミノ基をリジン反応剤で防護する工程、
（ｆ）ペプチド断片を質量分析法により分析して１以上のポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程、及び
（ｇ）該マスフィンガープリントから１以上のポリペプチドを同定する工程、
を含むことを特徴とするポリペプチドの特徴分析方法。
【請求項３】
各試料が１以上のポリペプチドを含有する複数の試料を比較する方法であって、
（ａ）任意の工程としてシステインジスルフィド架橋を還元し該試料由来の１以上のポリペプチド中の遊離チオールを防護する工程、
（ｂ）１以上のポリペプチドを各試料から分離する工程、
（ｃ）配列特異的開裂試薬で該ポリペプチドを開裂してペプチド断片を形成する工程、
（ｄ）任意の工程として開裂試薬を不活性化する工程、
（ｅ）存在する１以上のεアミノ基をリジン反応剤で防護する工程、
（ｆ）ペプチド断片を質量分析法により分析して該試料中の１以上のポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程、及び
（ｇ）１以上のマスフィンガープリントから試料中の１以上のポリペプチドを同定する工程、
を含むことを特徴とする比較方法。
【請求項４】
リジン反応剤が標識したリジン反応剤である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
各試料が１以上のポリペプチドを含有する複数の試料を比較する方法であって、
（ａ）任意の工程としてシステインジスルフィド架橋を還元し該試料由来の１以上のポリペプチド中の遊離チオールを防護する工程、
（ｂ）各試料中に存在する１以上のεアミノ基を被標識リジン反応剤で防護する工程、
（ｃ）試料をプールする工程、
（ｄ）プールした試料から１以上のポリペプチドを分離する工程、
（ｅ）配列特異的開裂試薬で該ポリペプチドを開裂してペプチド断片を形成する工程、
（ｆ）任意の工程として開裂試薬を不活性化する工程、
（ｇ）ペプチド断片を質量分析法により分析して試料中の１以上のポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程、及び
（ｈ）１以上のマスフィンガープリントから試料中の１以上のポリペプチドを同定する工程、
を包含し、さらに、同一の試料に由来するポリペプチド又はペプチドには同一の標識を使用し、別の試料に由来するポリペプチド又はペプチドには別の標識を使用し、ポリペプチド又はペプチドが由来する試料をその標識によって決定可能となるようにする請求項３に記載の比較方法。
【請求項６】
配列特異的開裂試薬がリジン残基のＣ末端側で該１以上のポリペプチドを開裂する請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
配列特異的開裂試薬がＬｙｓ−Ｃ及びトリプシンのいずれかを包含する請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
εアミノ基が防護されたペプチド断片を親和捕捉により除去し、かつリジン反応剤がビオチンを包含する請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
リジン反応剤が立体障害のあるミカエル試薬を包含する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
立体障害のあるミカエル試薬が次の構造を有する化合物である請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【化１】
2004537716.tif 000008
ただし、式中、Ｘは電子吸引基であり陰電荷を安定化することができ、各々のＲ基は独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基及び芳香族基のいずれかを包含し、Ｒの少なくとも１は立体障害基を包含し、Ｒ２基は水素原子、ハロゲン原子、炭化水素基、電子吸引基、及び、親和捕捉官能基に付着可能なリンカー及び固相担体に付着可能なリンカーのいずれか、から選択される少なくとも１つを包含する。
【請求項１１】
一つのＲがメチル基及びフェニル基のいずれかを包含する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１のＲが電子吸引基を包含する請求項１０から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１のＲが、環状及び複素環状のいずれかの芳香環及び縮合環のいずれかを包含する請求項１０から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
Ｘが−ＳＯ２Ｒ１であり、Ｒ１はアルキル基及びアリール基のいずれかを表し、該アリール基が芳香族基、環状基、縮合環状基及び複素環状基から選択されるいずれかを含む請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１が電子吸引基を包含する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
環がフェニル、ピリジル、ナフチル、キノリル、ピラジン、ピリミジン、及びトリアジンのいずれかの環を包含する請求項１４から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
Ｘ基が電子吸引基で置換されている請求項１０から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
電子吸引基がフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、ニトロ基及びニトリル基から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｘ基が水溶性を向上可能な構造を包含する請求項１０から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチド又は試料が、細胞画分を包含する請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
更に液体クロマトグラフィーによりポリペプチド又は試料を調製する工程を含む請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
テスト試料中の１以上の特定標的ポリペプチドを分析する方法であって、請求項１から２１のいずれかに記載の方法を実行し、１以上のマスフィンガープリントを該標的ポリペプチドに特異的な既定のマスフィンガープリントについて分析して該標的ポリペプチドの配列を決定することを特徴とする方法。
【請求項２３】
１以上の試料の発現プロファイルを決定する方法であって、請求項１から２２のいずれかに記載の方法に従って、１以上の試料由来の１以上のポリペプチドの特徴を分析することを包含する方法。
【請求項２４】
質量分析法により探知した各ポリペプチドの量を確定することを包含する請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド消化物由来のマスフィンガープリントを決定する方法に関する。本発明は、特に、マスフィンガープリントを改善する標識の使用に関する。本発明は、さらに、組織、細胞又は細胞画分中のタンパク質発現の決定、あるいは、大型タンパク質複合体の分析における上記方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物試料中のタンパク質の同定は、生化学分析、特にタンパク質の配列決定のための必須の作業である。理由は、配列によってタンパク質の構造が決まり、次に構造によりタンパク質の機能が決まるからである。タンパク質同定の従来の技術は厄介で遅い。タンパク質同定の頼みの綱は、ペプチドの化学配列を決めるにあたりエドマン分解を使用することであり、それによればペプチドのアミノ酸をＮ末端から順次同定することができる。この配列決定技術は、タンパク質又はポリペプチドの酵素的消化と合わせて使用するのが普通である。一般的には、未同定ポリペプチドを消化し、その成分ペプチドをクロマトグラフィーによって互いに分離する。次に、個々のペプチドをエドマン分解する。配列特異的な開裂試薬でポリペプチドを消化して得られたペプチド配列を相互に比較すれば、それらペプチド配列の順番を決めることができる。このプロセスによって、ポリペプチドの完全配列を決定できる。これはタンパク質同定に高い成果を上げる技術であったが、かなり骨が折れる。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ)質量分析法などの新規テクノロジーによって迅速なタンパク質同定がさらに実行可能になった。この技術は、比較的迅速なタンパク質同定法としてペプチドマスフィンガープリント法の開発を可能にしている。
【０００３】
典型的なペプチドマスフィンガープリント法のプロトコールでは、未同定タンパク質の質量を決定し、次にトリプシンによりタンパク質を消化する。トリプシンは、ポリペプチドをアルギニン及びリジン残基で選択的に開裂し、産生したペプチドのＣ−末端にアルギニンかリジンを残す。ポリペプチド配列中のリジン及びアルギニンの位置によって、どこでポリペプチドが切断されて特徴的なペプチドシリーズが生じるかが決定する。ペプチドパターンは、ＭＡＬＤＴ−ＴＯＦ質量分析法で容易に探知できる。この質量分析技術は、質量範囲が広く、大型生体分子を容易にイオン化でき、優先的に単一の荷電イオンを生じるので、この技術ではイオン化の競合が深刻ではない。ただし、競合は問題ではあり得る。以上のことは、一般的に質量スペクトルではペプチド毎に一つのピークがあり、各ピークの質量対荷電比の値はプロトンが加わってイオン化したペプチドの質量と基本的に同じであり、したがって未同定タンパク質のトリプシン消化由来のペプチドは大部分(時には全て)同時に分析可能であるということを意味する。
【０００４】
実際、質量スペクトルは「バーコード」であり、そのスペクトル線によってタンパク質の特徴的な開裂によって生じたペプチドの質量が表現されている。何かのタンパク質のあるペプチドが他のタンパク質由来のペプチドと質量が同じであることは予測されるが、二つの異なるタンパク質から生じたペプチドが全て同一質量となることは極めてあり得ない。これは、トリプシンタンパク質消化物の質量パターンがそのタンパク質のかなり特異的な識別子であり、それゆえにペプチドマスフィンガープリント（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｓｓ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ  ＰＭＦ）と呼ばれることを意味する。ＰＭＦが相対的に特異であるということは、既知タンパク質配列あるいはゲノムＤＮＡから予測した配列あるいは発現した配列タグ（ＥＳＴ）から決めた予測ＰＭＦのデータベースを使用すれば、生物学試料中のタンパク質を同定することができることを意味する（非特許文献１〜３参照）。未知タンパク質のＰＭＦをデータベース中の全てのＰＭＦと比較すれば、最良の一致が見出され、そのタンパク質を同定することができる。この種の検索には、消化前にタンパク質質量を決めなければならないという制約を受ける。しかし、このようにして未同定ポリペプチドの質量パターンは、その配列に関連付けることができ、順次、特定試料中のタンパク質の役割を決定するに役立てることができる。
【０００５】
しかし、タンパク質に対するＰＭＦ決定には、多くの技術的難題が含まれる。典型的なタンパク質は、トリプシンによる開裂後、２０〜３０個のペプチドを生じるが、これらのペプチドの全部が質量スペクトルに現われるわけではない。これに関する正確な理由は、十分に理解されていない。不完全なスペクトルを引き起こすと考えられるある要因がイオン化の過程でプロトン化と競合し、結果的にはアルギニン含有ペプチドが優先的にイオン化してしまう（非特許文献４参照）。さらに、ＭＡＬＤＩ標的の調製過程に起因する表面効果がある。標的は、ペプチド消化物をマトリックス材料の飽和溶液に溶解して調製する。ペプチド/マトリックス溶液の小滴を金属標的上に滴下し、乾燥する。ペプチドの溶解度に差があるために、あるペプチドはマトリックス上面近くで優先的に結晶化し、その場所で一層容易に脱着することになる。
【０００６】
PMFからタンパク質を同定する従来のプロトコールでは感度もまた問題である。そのプロトコールが有効なツールであるためには、できるだけ小さなタンパク質試料でPMFを決定することができ、分析可能なタンパク質試料の範囲が拡大されなければならない。
【０００７】
アルギニンを含有しないタンパク質のイオン化を増大しようとする試みもある。リジンをホモアルギニンに変換するのも一つのアプローチであり、多少成功している（非特許文献５〜６参照）。リジンをホモアルギニンに変換すると、トリプシン消化に由来する全てのペプチド、ただしＣ末端ペプチドを除く、にグアニジノ官能基が導入され、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルにおけるリジン含有ペプチドの出現が増大する。
【０００８】
生体試料中のタンパク質の発現を決定する従来の技術は、タンパク質の同定に左右される。タンパク質発現をプロファイルするに当っては、試料中のできる限り多くのタンパク質を同定し、好ましくは、試料中のタンパク質量を決定することを目標にする。典型的なタンパク質のプロファイリング法は、２次元電気泳動による（非特許文献７参照）。この方法では、生体試料から抽出したタンパク質試料が二つの独立した電気泳動法によって分離される。通常、第一の分離はタンパク質の等電点に基づく分離であり、ｐＨ勾配のあるゲル充填毛細管又はゲルストリップを使用する。タンパク質はｐＨ勾配に沿って電気泳動的に移動し、最終的にはタンパク質に荷電が存在しなくなるｐＨ、これを等電点と呼ぶが、に達するとそれ以上タンパク質は移動できない。試料中の全タンパク質が等電点に達した後、第二の電気泳動法を使って、タンパク質をさらに分離する。第二の方法を実施するために、次に、等電点電気泳動ゲルストリップ全体を、長方形のゲルの１つの角に合わせて置く。その後、ストリップ中の分離されたタンパク質を、そのサイズに基づいて、第二ゲルで電気泳動によって分離する。
【０００９】
即ち、タンパク質は、長方形のアクリルアミド板中の2次元スポット列で解像される。しかし、試料中のタンパク質を相互に分離した後には、タンパク質の探知とその後の同定の問題が残っている。現時点でタンパク質を同定する好ましいアプローチは、ゲル上の特定スポットにあるタンパク質をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析法を利用してタンパク質マスフィンガープリント解析により分析することである（非特許文献８参照）。
そこで、この２−ＤＥ技法は、ゲルスポット中のタンパク質同定に使用するペプチドマスフィンガープリント法の探知能に制限される。既存の技法では、2つ以上の試料の発現レベルを容易には比較できない。タンパク質を分別し続いて２Ｄゲルから回収する間に試料が失われるので、プロセスが複雑であると共に感度の問題がある。更に、２Ｄゲルから抽出したタンパク質は一般に質量分析法に不適な溶質を含有している緩衝液中にある。
【００１０】
【非特許文献１】
Pappin  DJC,  Hoejrup  P及びBleasby  AJ,  Current  Biology  3:327-332,「ペプチドマスフィンガープリントによるタンパク質の迅速同定」1993
【非特許文献２】
Mann  M,  Hojrup  P,  Roepstorff  P.  Biol  Mass  Spectrom  22(6):  338-345,「配列データベース中のタンパク質同定への質量スペクトル分子量情報の使用」1993;
【非特許文献３】
Yates  JR  3版,  Speicher  S,  Griffin  PR,  Hunkapiller  T,  Anal  Biochem  214(2):397-408,「ペプチド質量マップ：高度情報タンパク質同定法」1993
【非特許文献４】
Krause  E.  &  Wenschuh  H.  &  Jungblut  P.R.,  Anal  Chem.  71(19):4160-4165,  「MALDI-誘導トリプシン処理タンパク質のマスフィンガープリントにおけるアルギニン含有ペプチドの優位性」1999
【非特許文献５】
V.Bonettoら,  Journal  of  Protein  Chemistry  16(5):  371-374,  「MALDI  MSによる修飾ペプチドのC-末端配列決定」1997
【非特許文献６】
Branciaら,  Electrophoresis  22:  552-559,  「化学的誘導と改良型バイオインフォーマティクスツールは、プロテオミクス用タンパク質同定を最適化する」2001
【非特許文献７】
R.A.  Van  Bogelen.,  E.R.  Olson,  「バイオテクノロジーにおける2次元タンパク質ゲルの応用」,  Biotechnol  Annu  Rev,  1:69-103,  1995
【非特許文献８】
Jungblut  P,  Thiede  B.  「2-DEゲルMALDI質量分析法からのタンパク質同定」Mass  Spectrom  Rev.  16:145-162,  1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、上記既知方法に付随する諸問題の解決である。したがって、更に本発明の目的は、標識（タグ）を使用してペプチドマスフィンガープリントを産生する改良方法の提供である。更に本発明の目的は、ペプチドマスフィンガープリントを決めるにあたり、水中で安定でリジン選択性があり、試薬の分解がない緩和な反応条件下で機能するタンパク質反応試薬を使用する方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以上にかんがみ、本発明は、ポリペプチドの特徴を分析する方法であって、
(a)任意の工程としてポリペプチド中のシステイン-ジスルフィド架橋を還元して、遊離チオールを形成し、得られる遊離チオールを防護し、
(b)該ポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂して、ペプチド断片を形成し、
(c)任意の工程として開裂試薬を不活性化し、
(d)存在する1以上のε-アミノ基をリジン反応剤、好ましくは被標識リジン反応剤、で防護し、
(e)ペプチド断片を質量分析法で分析して、該ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成し、及び
(f)マスフィンガープリントからポリペプチドを同定する
の工程を包含する方法を提供する。
【００１３】
上述の工程の順序は、その工程を実施しなければならない順序を表すことを意図しておらず、望むならば一部の工程の順序は交換できると当業者は認識するであろう。従って、任意でない工程の好ましい順序は、(b)、(d)、（e）、そして（f）であるが、別の考えられる順序は、(d)、(b)、(e)、そして(f)である。従って、防護工程(d)は、開裂の前でも、後でも実施できる。これらの両順序に関しては、還元工程(a)は、防護工程(d)の前であれば、いつでも実施できる。また、これらの両順序に関しても、不活性化工程(c)は、開裂工程(b)の後であれば、いつでも実施できるが、開裂工程(b)の直後であるのが好ましい。
以上から、特に本方法は、既に単離された未知ポリペプチドを含有する試料中に存在する未知ポリペプチドの同定に関することが認識される。
【００１４】
本発明は、複数のポリペプチドの特徴を分析する方法であって、
(a)１以上のポリペプチドに存するシステインジスルフィド架橋を還元して遊離チオールを形成し、得られた遊離チオールを防護し、
(b)該複数のポリペプチドから1以上のポリペプチドを分離し、
(c)１以上のポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂して、ペプチド断片を形成し、
(d)任意の工程として開裂試薬を不活性化し、
(e)存在する1以上のε-アミノ基をリジン反応剤、好ましくは被標識リジン反応剤、で防護し、
(f)ペプチド断片を質量分析法で分析して、1以上の該ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成し、及び
(g)マスフィンガープリントから1以上の該ポリペプチドを同定する
の工程を包含する方法も提供する。
【００１５】
上述の工程の順序は、やはり、その工程を実施しなければならない順序を表すことを意図しておらず、希望すれば、一部の工程の順序を交換できる、と当業者は了解するであろう。従って、好ましい任意でない工程の順序は、(b)、(c)、(e)、（f）の後に（g）であるが、別の考えられる順序は、(b)、(e)、(c)、(f)の後に(g)であり、(e)、(b)、(c)、(f)の後に(g)でもある。従って、防護工程(e)は、分離及び開裂の前に、分離及び開裂後に、あるいは、分離と開裂の間でさえ実施できる。これらの全順序に関しては、分離工程(b)は、開裂工程(c)の前に実施しなければならない。また、これらの全順序に関しても、還元工程(a)は、防護工程(e)の前であれば、いつでも実施できる。やはり、これらの全順序に関して、不活性化工程(d)は、開裂工程(c)の後であれば、いつでも実施できるが、開裂工程(c)の直後であるのが好ましい。
【００１６】
この方法は、試料中の複数のポリペプチドの同定を可能にし、希望すれば、この方法を利用して、試料の完全発現プロファイルを決定できると認識される。別の用途として、この方法を利用して、組成が不明の試料中の既知ポリペプチドについて検定できる。これらの態様では、試料中のポリペプチドのペプチドマスフィンガープリントを決定し、既知のポリペプチドのペプチドマスフィンガープリントと比較することによって、実際に存在するポリペプチド及び好ましくはそれらの存在量を確認する。
【００１７】
本発明は、各試料が1以上のポリペプチドを含む複数の試料を比較する方法であって、
(a)任意の工程としてポリペプチド中のシステイン-ジスルフィド架橋を還元して、試料の1以上のポリペプチド中に生じた遊離チオールを防護し、
(b)試料のそれぞれから1以上のポリペプチドを分離し、
(c)該ポリペプチドを配列特異的開裂試薬で開裂して、ペプチド断片を形成し、
(d)任意の工程として開裂試薬を不活性化し、
(e)存在する1以上のε-アミノ基をリジン反応剤、好ましくは被標識リジン反応剤で防護し、
(f)ペプチド断片を質量分析法で分析して、試料中の1以上の該ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成し、及び
(g)１以上のマスフィンガープリントから１以上の該ポリペプチドを同定する
の工程を包含する方法も提供する。
【００１８】
上述の工程の順序は、その工程を実施しなければならない順序を表すことを意図しておらず、希望すれば、一部の工程の順序を交換できる、と当業者は認識できる。従って、好ましい任意でない工程の順序は、(b)、(c)、(e)、（f）の後に（g）であるが、別の考えられる順序は、(b)、(e)、(c)、(f)の後に(g)であり、(e)、(b)、(c)、(f)の後に(g)でもある。従って、防護工程(e)は、分離及び開裂の前に、分離及び開裂後に、あるいは、分離と開裂の間でさえ実施できる。これらの全順序に関しては、分離工程(b)は、開裂工程(c)の前に実施しなければならない。また、これらの全順序に関しても、還元工程(a)は、防護工程(e)の前であれば、いつでも実施できる。やはり、これらの全順序に関して、不活性化工程(d)は、開裂工程(c)の後であれば、いつでも実施できるが、開裂工程(c)の直後であるのが好ましい。
【００１９】
この本発明の実施態様では、本方法のある工程で、処理をさらに効率的にするため、試料をプールする。試料をプールする場合、ポリペプチド又はペプチドが由来する試料をその標識から決定できるように、同一試料からのポリペプチド又はペプチドに同一標識を利用し、また、異なる試料からのポリペプチド又はペプチドには異なる標識を利用することを確実に行うことで、それらを解像できる。該標識は、防護工程で導入するのが好ましく、従って、リジン反応剤に付着させるのが好ましい。上述の通り、試料を個別に標識すれば、いつでもプーリング工程を行うことができる。従って、防護工程中に標識を導入する場合、標識を導入する前に確実に試料が混ざり合わないように、プーリングは、防護後に行わなければならない。好ましくは、全試料中の全タンパク質を同一工程で一度に分離するように、個々のタンパク質を分離する前に試料をプールする。これは、特に効率的である。
【００２０】
ある場合、特定のタンパク質が1以上の試料に存在することがある。これらのタンパク質は、明らかに、同一のマスフィンガープリントを持つ。該タンパク質を分離しないと、これらのマスフィンガープリントは、開裂生成物に対する質量分析実施後に重なってくる。しかし、各指紋は、標識が存在するために、解像できる。即ち、タンパク質が由来する試料の同一性が解像できるので、２以上の試料を比較する場合には、同一タンパク質を同一スペクトルにて一緒に同定してから発現レベルを比較するのが有利である。従って、ある実施態様では、異なる試料からの同一タンパク質は、分離しないのが好ましい。これは、各試料に使用する各種標識が、確実に、すべて同一質量を持つようにすることによって達成できる。本発明に使用できるこの種の標識は、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０１１２２に開示されている。
【００２１】
この方法の上記工程順序から明らかなように、異なるポリペプチドから同一断片が生成されるる可能性があり、ある場合、これが、異なるマスフィンガープリントの決定を妨げる可能性があるので、一般に、試料中のポリペプチドは、開裂が起こる前に分離するのが好ましい。あるポリペプチドの断片が他のポリペプチドの断片と混ざり合わないようにするため、開裂工程は、分離後に行うのが好ましい。多数の試料を分離前の防護工程でより簡便に標識できるため、これは、特に、これらの多数の試料に関する方法に適用できる。
【００２２】
本方法は、感度を改善するという長所があり、１タンパク質から探知されるペプチド数を増加できる。さらに、適当なタグの使用を通して、複数の試料を一斉に分析することが、本発明で可能であり、異なる試料中の対応するペプチドの比率を決定することも可能である。適当な標識法によって、質量分析による探知のためのポリペプチド試料の調整を容易にすることも可能である。
【００２３】
本発明の方法(b)及び(d)は、ペプチド断片を単離できれば、どんな順序でも実施できる。従って、ある実施態様では、ペプチドは、防護前に開裂でき、あるいは、他の実施態様では、依然としてポリペプチドの一部を形成しながら、残基を防護でき、その後、該ペプチドを開裂する。後者の実施態様では、開裂試薬は、これらの残基を防護した後でもリジン残基のＣ-末端側で開裂できるのが好ましい。
【００２４】
防護されたεアミノ基を包含するペプチド断片は、好ましくは、例えば、固相上でこれらの断片を捕捉することによって除去する。この実施態様では、リジン反応剤は、リジン選択性捕捉剤である。選択的捕捉は、捕捉基をリジン反応剤(ビオチンなど)に付着させることによって達成でき、これは、防護が起こった後、該捕捉剤が、確実に、防護されたペプチド断片と共に、固相(アビジン処理固相など)に付着するようにする。別の実施態様では、ペプチド断片を防護反応自体によって固相上で捕捉するように、リジン反応剤は、防護が起こる前に固相に付着できる。
【００２５】
従って、防護された断片は、防護された断片を固相の上に付着させたまま試料を固相から分離することによって、試料から除去できる。その後、これらの断片を分析し、元の試料に存在するポリペプチドを決定できる。
本発明の方法は、比較的高ｐＨで、比較的低い試薬濃度を使用可能である。本発明者らは、これらの両要因によりリジン反応の選択性と完璧性が向上することを見出した。以下の説明でリジンのアミノ基をイプシロンアミノ基(ε-アミノ基)と呼ぶ。
【００２６】
リジン反応剤は、立体障害のあるミカエル試薬であるのが好ましい。ミカエル試薬の一般式は以下のごとくである。
【化２】
2004537716.tif 000002
上記式中、Ｘは、陰電荷を安定化可能な電子吸引基である。官能基-Ｘは、下の表1に挙げるものから選択するのが好ましい。
【００２７】
【表１】
2004537716.tif 000003
【００２８】
Ｒ１は、どのようなアルキル基又は芳香族基でもよいが、好ましくは電子吸引基であり、更に好ましくは環状又は複素環状の芳香環又は縮合環である。環構造は電子吸引性であるのが好ましい。更に好ましくは、Ｒ１は小さな環又は縮合環、例えばフェニル、ピリジル、ナフチル又はキノリル環構造である。環構造は適当な電子吸引基、例えばフッ素等のハロゲン又はニトロ基で置換されているのが好ましい。ピリジル環及びナフチル環等の環構造は水溶性を向上させるので好ましい。Ｘがアミドである場合はＲ１基の一つ又は両方が水素原子であってよい。Ｘがニトリルの場合は好ましい化合物としてクロトニトリル、例えばトリフルオロクロトニトリルが挙げられる。さらに、Ｒ１は、ビオチンなどのアフィニティー捕捉官能基へのリンカー又は固相担体へのリンカーであるのがよい。
【００２９】
上記の式中、Ｒ２は、水素原子であるか、電子吸引基及び/又はアフィニティー捕捉官能基へのリンカー又は固相担体へのリンカーを含むことができる。Ｒ２とすることのできるさらに特異的な基団を、Ｓｕｂ基の定義において以下に挙げる。
【００３０】
本発明の「立体障害のある」ミカエル試薬となるためには、Ｒ基の少なくとも１が水素ではなく、立体障害基であるとみなされるものでなければならない。少なくとも１のＲ基はアルキル基又は芳香族基、例えばメチル基又はフェニル基であってよい。更に好ましくは、Ｒ基の少なくとも１は電子吸引性であり、ハロゲン原子又はハロゲン化アルキル基、例えばフルオロメチル、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチル基、あるいはハロゲン又はニトロ基等の電子吸引性置換基を有するフェニル環であってよい。反対に、本発明での「立体障害のない」ミカエル試薬であるためにはＲ基は両方が水素である。
【００３１】
好ましい実施態様では、Ｘ-、Ｒ-、Ｒ１-及びＲ２-基のいずれか（及び好ましくは1のみ）は、ビオチンなどのアフィニティー捕捉官能基へのリンカー又は固相担体へのリンカーを含む。
【００３２】
ある実施態様では、Ｘ基は、Ｒ基のいずれかと結合し、環を形成する。好ましいこの種の化合物は、次式のマレイミドがある:
【化３】
2004537716.tif 000004
式中、Ｒは前記と同義であり、Ｒ’は炭化水素基又は電子供与基である。好ましいＲはアルキル基又はアリール基であり、特に好ましいＲはＣ１−Ｃ６アルキル基、例えばメチル基又はエチル基である。
【００３３】
上の式でＳｕｂ基は、このミカエル試薬がεアミノ基と反応可能であるかぎり、特に限定はない。該基は、一般に、上記の通り、Ｒ２基であり、さらに具体的には、本発明の好ましい実施例ではＳｕｂにはアルキル基又はアリール基等の炭化水素基、又はシアノ基(CN)、ハロゲン(F、Cl、Br、I)、ハロゲン含有基等の電子吸引基が挙げられる。最も好ましい実施例ではSubには水素又はＣ１−Ｃ６アルキル基、例えばメチル基又はエチル基が挙げられる。特に好ましい化合物では、ＳｕｂとＲが共にＨであり、Ｒ’がメチル基又はエチル基である。
【００３４】
本発明において、リジン選択性試薬の語は、その試薬がリジンのεアミノ基と全てのアミノ酸のαアミノ基との間を識別することができることを言う。本発明の試薬がヒスチジンのイミダゾール環等の側鎖官能基、アルギニンのグアニジノ基及びセリン、スレオニン、チロシンに存在するヒドロキシル官能基と反応しないことも好ましい。
【００３５】
本発明において、捕捉試薬の語は、その試薬が固相担体上に分子を捕捉できることを言う。従って、上述のように、捕捉試薬は、固相担体に共有結合する反応官能基を含むことができ、あるいは、固相担体に化学結合できる官能基に結合する反応官能基を含むことができ、あるいは、固相担体に結合される特異的リガンドとの相互作用によって固相担体に捕捉することができるアフィニティー捕捉官能基と結合する反応官能基を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明の各種態様を以下にさらに詳細に説明する。
本発明のある実施態様では、ポリペプチドのマスフィンガープリントを決定する方法で、
1.  配列特異的開裂試薬でポリペプチドを完全に消化し、
2.  ポリペプチド中の存在し得るεアミノ基を全て該試薬で防護し、好ましくは、ポリペプチド中の存在し得る各εアミンと該アルキル化ミカエル試薬唯１分子が反応するように、ポリペプチドをリジン反応性で立体障害のあるミカエル試薬と反応させ、
3.  消化ポリペプチド由来の被標識ペプチドを質量分析法で分析する
の工程を包含する方法を提供する。
【００３７】
本発明の各種実施態様では、ジスルフィド結合が存在する場合、さらに任意の工程も実施できる。この工程は、ポリペプチド中のジスルフィド架橋を還元し、ポリペプチド中で生じた遊離チオール（及び/又は初めに存在する遊離チオール）を防護する工程に関する。希望すれば、この工程は、開裂剤で試料を消化する前に実施できる。例えば、次の通りである。
1.  任意の工程としてシステインジスルフィド架橋を還元し、遊離チオールを防護する。
2.  配列特異的開裂試薬でポリペプチドを完全に消化する。
3.  ポリペプチド中の存在し得るεアミノ基を全て該試薬で防護し、好ましくはポリペプチド中の存在し得る各εアミンとアルキル化ミカエル試薬唯１分子が反応するように、ポリペプチドをリジン反応性で立体障害のあるミカエル試薬と反応させる。
4.  消化ポリペプチド由来の被標識ペプチドを質量分析法で分析する。
【００３８】
さらなる態様では、本発明は、試料の発現プロファイルを決定する方法であって、この方法が上記方法に従って、1以上のポリペプチド混合物からの多数のポリペプチドの特徴を分析することをふくむ方法を提供する。従って、本発明のこの態様は、少なくとも1のポリペプチド混合物の発現プロファイルを決定する方法を提供し、該混合物中の各ポリペプチドを同定し、好ましくは定量も行う方法である。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様で、配列特異的開裂試薬は、トリプシン又はＬｙｓ−Ｃである。
本発明の好ましい実施態様では、リジン反応タグは、感度増強基を含む。この感度増強基は、タグされたペプチドのイオン化効率を向上させる。好ましい感度増強基は、桂皮酸誘導体などの非蛍光染料、３級アミノ基、グアニジノ基、４級アンモニウム基又はピリジウム基である。
【００４０】
本発明のある実施態様では、リジン反応タグは、ビオチンなどのアフィニティー捕捉剤を含むことができる。
【００４１】
さらに別の態様では、本発明は、次式のチオール及びアミノ反応性の、立体障害のあるアルケニルスルフォン化合物を含むリジン選択性タンパク質標識試薬を提供する。
【化４】
2004537716.tif 000005
式中、Ｒ１はどのようなアルキル基又は芳香族基でもよいが、好ましくは電子吸引基であり、更に好ましくは環状又は複素環状の芳香環又は縮合環である。環構造は電子吸引性であるのが好ましい。更に具体的は、Ｒ１は小さな環又は縮合環、例えばフェニル、ピリジル、ナフチル又はキノリル環構造である。環構造は適当な電子吸引基、例えばフッ素等のハロゲン又はニトロ基で置換されているのが好ましい。ピリジル環及びナフチル環等の環構造は水溶性を促進するので好ましい。さらに、Ｒ１は、ビオチンなどのアフィニティー捕捉官能基へのリンカー又は固相担体へのリンカーを含むことができる。
【００４２】
上の式で、Ｒ２は、水素原子であるのが最も好ましいが、代わりに、電子吸引基及び/又はアフィニティー捕捉官能基へのリンカー又は固相担体へのリンカーを含むことができる。
【００４３】
本発明の「立体障害のある」ミカエル試薬となるためには、Ｒ基の少なくとも１が水素原子ではなく、立体障害基であるとみなされなければならない。少なくとも１のＲ基はアルキル基又は芳香族基、例えばメチル基又はフェニル基であってよい。更に好ましくは、Ｒ基の少なくとも１は電子吸引性であり、ハロゲン原子又はハロゲン化アルキル基、例えばフルオロメチル、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチル基、あるいはハロゲン又はニトロ基等の電子吸引性置換基を有するフェニル環であってよい。反対に、本発明での「立体障害のない」ミカエル試薬であるためにはＲ基は両方が水素である。
Ｒ-、Ｒ１-及びＲ２-基の好ましくは１以上、さらに好ましくは１のみは、ビオチンなどのアフィニティー捕捉官能基へのリンカー又は固相担体へのリンカーを含む。
【００４４】
なおも別の態様では、本発明は、ポリペプチドに対するマスフィンガープリントを決定することによって、ポリペプチド混合物を含む２以上の生体試料中のポリペプチドの発現レベルを比較する方法を提供する。好ましい方法は、以下の工程を含む。
1.  試料毎に、任意の工程としてシステインジスルフィド架橋を還元し、全ポリペプチド中の遊離チオールを防護し、
2.  ポリペプチド中の存在し得るεアミノ基を全て該試薬で防護し、好ましくはポリペプチド中の存在し得る各εアミンとアルキル化ミカエル試薬の唯１分子が反応するように、各ポリペプチド試料をリジン反応性で立体障害のあるミカエル試薬と反応させる。各試料を他の試料とは異なるタグで標識するが、その場合、タグの相違は、質量分析法で決定できる。
3  .標識した試料をプールし、
4.  各種ポリペプチドを単離できるように、プールした試料の成分ポリペプチドを分離し、
5.  配列特異的開裂試薬で各ポリペプチドを完全に消化し、
6  .消化ポリペプチド由来の被標識ペプチドを質量分析法で分析する。
【００４５】
ここで、本発明の方法で使用するリジン反応（リジン選択性）試薬をさらに詳細に説明する。
当分野で公知のアミン選択性タンパク質反応試薬は多数ある。これらの試薬にはある程度の識別力があり、高ｐＨでリジンと反応するが、十分な識別力がありほぼ独占的にリジンを標識することができるものは多くない。多数のリジン選択性試薬が先行技術で記述されており、これらは全て、特に環状無水物は本発明での使用に適している。ピロメリト酸無水物及びｏ−スルフォ安息香酸無水物はリジン選択性アシル化試薬であると報告されている（Bagreeら、FEBS  Lett.120(2):275-277,1980）。同様にフタール酸無水物は構造、反応性がピロメリト酸無水物に類似しているのでリジン選択性があると期待される。フタール酸無水物は他のアミノ酸との副反応が少ないと報告されている（Palacian  Eら、Mol  Cell  Biochem.97(2):101-111,1990）。さらに重要な点として、リジンとの反応に広く使用される多くの試薬、特に活性エステル、例えばカルボン酸無水物、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル及びペンタフルオロフェニルエステルは高ｐＨで安定でない。これらの試薬は大過剰に使用する必要があり、過剰の結果かえって反応の選択性が欠如する。
【００４６】
ミカエル試薬にはタンパク質反応にとって魅力的な特性が多数あるので広く使用される（Friedman  M  &  Wall  J.S.、J.Org.Chem.31,2888-2894,「アミノ基とα−、β−不飽和化合物との反応速度論における線形自由エネルギーの相加的関係」1966;  Morpurgo  M  &  Veronese  F.M.&  Kachensky  D  &  Harris  J.M.,  Bioconjug.  Chem.7(3)363-368、「ポリ（エチレングリコール）ビニルスルフォンの製造とキャラクテリゼーション」1996；Friedman  M.  &  Finley  J.M.,Int.J.Pept.Protein  Res.7(6)481-486,「タンパク質とエチルビニルスルフォンの反応」1975；Masri  M.S.  &  Friedman  M.,  J.Protein  Chem.7(1)49-54、「メチル及びエチルビニルスルフォンとタンパク質の反応」1988；Graham  L.  &  Mechanic  G.L.Anal.Biochem.153(2)354-358「[14C]アクリロニトリル：安定なトシル中間体を経由する製造及びコラーゲン中のアミン残基との定量的反応」1986；Esterbauer  H.  &  Zollner  H  &  Scholz  N.,Z.  Naturforsch[C]30(4)466-473,「グルタチオンと共役カルボニルの反応」1975）。
【００４７】
多数のこれら試薬は水溶液で比較的に安定であり、反応性及び選択性の程度を各種用意するためにこれら化合物の構造を広い範囲に改変することができる。タンパク質の標識に使用される他の試薬は水中で安定はなく、修飾は容易でない。特に、タンパク質中アミノ基との反応はしばしば活性エステルで行われるが、これらは加水分解を受けやすい。スルフォンに基づく試薬は、広汎に使用されている活性エステルに比較するとアミノ基の標識には便利で有効である。タンパク質と共に使用されているミカエル試薬には、例えばアクリロニトリル、アクリルアミド、ビニルピリジン、メチルビニルスルフォン、メチルビニルケトン等の化合物が挙げられる。これら化合物の反応性を比較し（Friedman  M  &  Wall  J.S.上記）、これら構造的に類似の化合物の反応速度に直線関係があることが観察されている。直線関係があることから、このクラスの化合物の反応は、速度は異なるがメカニズムは同じであることが判る。スルフォンとケトンの化合物が最も反応的な試薬であるとその著者は見出した。ビニル化合物、例えばアクリロニトリル、アクリルアミド、ビニルピリジン、メチルビニルスルフォン、メチルビニルケトンは広く基質ごとに反応速度は相対的に同じであるが、全体の反応速度は相互に異なる。これらに直線関係があることからすると、このクラスの化合物は同じメカニズムで反応し、かつクラス全部の化合物において置換体への変化、特に反応性の二重結合のベータ位置で変化があると挙動も同様に変化をすると考えるのが合理的である。例えば、アクリロニトリルを比較対照としたクロトノニトリルと一連の基質との反応の相対的な反応速度の変化は、メチルビニルスルフォンを比較対照としたメチルプロペニルスルフォンと一連の基質との反応の相対的な反応速度の変化と本質的には同じであると推測される。このことは、メチルプロペニルスルフォンの特性はクロトノニトリルと本質的に同じであり、スルフォンの方が反応速度が大きいというだけである。
【００４８】
本発明の目的に合うミカエル試薬の選択は、反応速度、ミカエル付加とは別の副反応の可能性、各種化合物の合成の難易を含めた多数の基準に依る。例えば、ビニルケトンはミカエル付加以外の他の反応、特にミカエル付加後のケトンの求核攻撃を受けやすい。このケトンの官能基は各種求核剤、例えば通常の生物学的求核剤との更なる反応を受ける。同様に、ニトリル化合物はカルボン酸へのニトリル官能基が加水分解を受けやすい。ただし、ほとんどの生物学的測定の条件下ではこの加水分解は通常は起こらない。代表的な生物学的測定の条件下ではアルケニルスルフォンはミカエル付加以外の反応を受けない。一般に、アルケニルスルフォンは生物学的求核剤と急速に反応するので、各種形態のアルケニルスルフォンの合成に関する文献は包括的である。これらの理由から、アルケニルスルフォンは本発明の生物学的測定で使用するミカエル試薬として好ましい。Ｎ−エチルマレイミド等のマレイミド化合物もミカエル付加によりタンパク質と急速に反応し、タンパク質を標的する条件下で適切に安定である。ただし、これらの試薬をポリマーに結合するとアルカリ加水分解が見られる。以上よりマレイミド化合物も本発明の生物学的測定で使用するミカエル試薬として好ましい。ニトリル試薬も、対応するスルフォンに比較すると反応が遅い傾向があるが試薬として好ましい。同様に、アクリルアミドの反応は更に遅い。これらが好ましいからといって、入手可能な他のミカエル試薬が本発明に不適であるという意味ではないが、これら試薬の反応が速いということは大部分の目的にとって好ましい。適切な条件下であればほぼ全てのミカエル試薬は本発明方法で使用できる筈である。
【００４９】
本発明で使用するのに好ましいクラスのリジン選択性試薬は、リジン選択性反応基として、立体障害のあるアルケニルスルフォンである。適当に緩和な条件でこれら試薬を組み合わせれば、アミンを標識する反応の際にαアミノ基とリジンのεアミノ基との間の識別が高い程度に可能になる。ビニルスルフォンは１級アミンと容易に反応してジアルキル化体を生成することが知られている。本発明者らが示していることであるが、これらの試薬は高ｐＨ(＞9.0)でαアミノ基よりもεアミノ基の方に急速に反応するが、立体障害のないスルフォンの識別力は劣る。立体障害が比較的大きいアルケニルスルフォン、例えばプロペニルスルフォン及びブテニルスルフォンは、ビニルスルフォンに比べてεアミノ基への識別力が大きく増大している。更にこれらの立体障害のある試薬によりモノアルキル化体がほぼ独占的に生成する。更に、リジンのεアミノ基は、比較的に立体障害のあるスルフォンでモノアルキル化されると、他のアミン反応性試薬との更なる反応には抵抗する。
【００５０】
立体障害のあるスルフォンによりこの識別が可能ということは、緩和な水溶液条件下でεアミノ基はαアミノ基に優先して簡便安全な水溶性試薬で選択的に標識可能であるという意味である。リジン選択的捕捉試薬が必要な場合には、本発明の立体障害のあるアルケニルスルフォンの官能基を固相担体に結合できる。あるいは、本発明の立体障害のあるアルケニルスルフォンの官能基を例えばビオチン又はジゴキシゲニンに結合することによってアフィニティー捕捉試薬を形成することができる。次の代替法としては、適宜に導入した固相担体と反応する第２反応官能基に立体障害のあるアルケニルスルフォン官能基を共有結合できる。ボロン酸は、隣接するシス-ジオールやサリチルヒドロキシム酸などの化学的に類似するリガンドと選択的に反応することが知られている。ボロン酸を含む試薬は、サリチルヒドロキサム酸を導入した固相担体へのタンパク質捕捉のために開発されている（Stolowitz  M.L.,ら、Bioconjug  Chem.  12(2):  229-239、「フェニルボロン酸-サリチルヒドロキサム酸バイオ共役体1.  タンパク質固定のための新規ボロン酸複合体」2001;  Wiley  J.P.ら、Biioconjug.  Chem.  12(2):  240-250、「フェニルボロン酸-サリチルヒドロキサム酸バイオ共役体2.  アフィニティークロマトグラフィー用タンパク質リガンドの多価固定」2001、Prolinx  Inc,  Washington  State,  USA）。フェニルボロン酸官能基を立体障害のあるアルケニルスルフォン官能基に結合し、選択的化学反応によって捕捉できる捕捉試薬を生成するのは比較的簡単であろうと予想される。この種の化学の使用は、隣接するシス-ジオール含有糖を帯びたタンパク質と直接適合するのではないと思われるが、この種の糖は、ボロン酸誘導リジン選択試薬との反応に先行して、フェニルボロン酸又は関連試薬で封鎖できるはずである。固相担体に捕捉できる液相捕捉試薬は、リジン反応を大過剰の試薬と液相で行い、反応を速やかに完了させることができるので、有利である。
【００５１】
立体障害のあるアルケニルスルフォンを合成する方法は、当分野で多数公知である。α-、β-不飽和スルフォンの合成に使用されてきた合成法の概観については、Simpkins  N.,  Tetrahedron  46:  6951-6984,  「ビニールスルフォン類の化学」,  1990;  及びFuchs  P.L.とBraish  T.F.,  Chem.  Rev.  86:  903-917,  「シクロアルケニルスルフォンへの共役体-付加反応を経る多重収束型合成法multiply  convergent  Synthesis」1986を参照。
本発明の好ましい立体障害のあるアルケニルスルフォン化合物は次式を有する:
【化５】
2004537716.tif 000006
式中、Ｒ１はどのようなアルキル基又は芳香族基でもよいが、好ましくは電子吸引基であり、更に好ましくは環状又は複素環状の芳香環又は縮合環である。環構造は電子吸引性であるのが好ましい。更に好ましくは、Ｒ１は小さな環又は縮合環、例えばフェニル、ピリジル、ナフチル又はキノリル環構造である。環構造は適当な電子吸引基、例えばフッ素等のハロゲン又はニトロ基で置換されているのが好ましい。ピリジル環及びナフチル環等の環構造は水溶性を向上させるので好ましい。Ｒ１は、アフィニティー捕捉官能基へのリンカー、例えばビオチン、又は固相担体へのリンカーを追加的に含むことができる。
上式中、Ｒ２は、水素原子であり、あるいは、電子吸引基及び/又はアフィニティー捕捉官能基へのリンカー又は固相担体へのリンカーであることもできる。
【００５２】
本発明の「立体障害のある」ミカエル試薬となるためには、Ｒ基の少なくとも１が水素ではなく、立体障害基であるとみなされるものでなければならない。少なくとも１のＲ基はアルキル基又は芳香族基、例えばメチル基又はフェニル基であってよい。更に好ましくは、Ｒ基の少なくとも１は電子吸引性であり、ハロゲン原子又はハロゲン化アルキル基、例えばフルオロメチル、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチル基、あるいはハロゲン又はニトロ基等の電子吸引性置換基を有するフェニル環であってよい。さらに、1のR基は、アフィニティー捕捉官能基へのリンカー、例えばビオチン、又は固相担体へのリンカーを追加的に含むことができる。反対に、本発明での「立体障害のない」ミカエル試薬であるためにはＲ基は両方が水素である。本発明での「立体障害のない」ミカエル試薬であるためにはＲ基は両方が水素である。
Ｒ-、Ｒ１及びＲ２基のいずれか及び好ましくは唯一は、アフィニティー捕捉官能基へのリンカー、例えばビオチン、あるいは、固相担体へのリンカーを含むことができる。
【００５３】
アルケニルスルフォンの合成に各種の点を工夫し、本発明との使用に適するような置換をした化合物を製造するのがよい。アルドール縮合型の反応を使用できる。メチルフェニルスルフォンは各種のケトン及びアルデヒドと反応して立体障害のあるアルケニルスルフォンを生成することができる(図１及び上記概観を参照)。適切なケトンにはアセトン、ヘキサフルオロアセトンがあげられる。アルデヒドにはベンツアルデヒド、フルオロベンツアルデヒド、ジフルオロベンツアルデヒド、トリフルオロメチルベンツアルデヒド、ニトロベンツアルデヒドが挙げられる。４−（メチルスルフォニル）安息香酸は、安息香酸を介して固相又はアフィニティー捕捉試薬に結合可能な立体障害のあるスルフォンを合成する出発点を提供する。アミノ導入ポリスチレンはSigma-Aldrich,UK等の各種供給元から入手可能である。官能基のある安息香酸がカルボジイミド結合し固相にアミド架橋を形成すれば、適切なアルケニルスルフォンを導入した固相担体を作成するのに十分である。アミノ官能化ビオチンの各種形態はPierce  Chemical  Company,  IL,USAから入手可能である。これによれば各種アルケニルスルフォンを導入したビオチン化合物の合成が可能となる。
【００５４】
フェニル−プロペニルスルフォン、ピリジン−１−プロペニルスルフォン、フェニル−１−イソブテニルスルフォン、ピリジン−１−イソブテニルスルフォンの製造用合成経路は後記実施例に記述される。1,1,1−トリフルオロ−３−フェニルスルフォニルプロペンの製造用合成経路は、Tsuge  H．J.Chem.Soc.Perkin  Trans、1：2761-2766,1995に開示されている。この試薬もAldrich(Sigma-Aldrich,Dorset,UK)から入手可能である。
【００５５】
本発明で使用するのに好ましい第二のクラスの試薬はマレイミド化合物である。適当に緩和な条件でこれら試薬を組み合わせれば、アミンを標識する反応の際にαアミノ基とリジンのεアミノ基との間の識別が高い程度に可能になる。マレイミド化合物は１級アミンと容易に反応してモノアルキル化体を生成することが知られている(例えば、Sharpless  N.E.  &  Flavin  M.,  Biochemistry  5(9):  2963-2971,  「マレイミドとのアミン及びアミノ酸の反応。赤外分光分析及び核磁気共鳴分析から推測した反応生成物の構造」1966;  Papini  A  &  Rudolph  S.  &  Siglmuller  G.  &  Musiol  H.J.  &  Gohring  W.  &  Moroder  L.,  Int  J  Pept  Protein  Res  39(4):  348-355,  「ヒスチジンのマレイミド化合物によるアルキル化」1992;  Khan  M.N.,  J  Pharm  Sci  73(12):  1767-1771,  「マレイミドのアルカリ性加水分解の反応速度論とメカニズム」1984)。本発明者らが示していることであるが、マレイミド(マレイミドブチラミドポリスチレン、Fluka)を導入した固相担体は塩基性条件下でαアミノ基よりもεアミノ基の方に急速に反応する。しかし、この試薬は水溶液条件では安定ではないので、ペプチドとこの担体との反応は無水の非プロトン性有機溶媒で実施する必要がある。疎水性タンパク質、例えば細胞膜中、及びそのようなものとしてこのクラスのタンパク質の分析に多分有用なマレイミドブチラミドポリスチレン中に埋没しているタンパク質には有機溶媒の使用が容認できる。
【００５６】
立体障害の比較的に少ないミカエル試薬、例えばＮ−エチルマレイミド(NEM)及びプロペニルスルフォンはプロリンのαアミノ基と極めて急速に反応する。しかし本発明の大部分の態様ではこれは問題にならない。理由は、プロリンはありふれたものでなく、大部分のエンドプロテアーゼはプロリン結合部を開裂しないからである。本発明の好ましい実施態様は、Lys−C型酵素によるタンパク質及びポリペプチドの開裂を基礎にしている。このクラスの既知酵素の大部分はリジン−プロリン結合を開裂しないので、プロリンの遊離αアミノ基の存在は問題にならない。固相担体に結合したマレイミドもプロリンを効果的に識別する。マレイミドは、液相試薬として使用した場合には、αアミノ基よりもεアミノ基を識別する力は適度なものに過ぎないが、固相化試薬とした場合には識別力が大幅に上昇するということは留意に値する。他の試薬は、液相では適度の識別力しか示さないが、固相担体上に固定化された場合には、緩徐に上昇した識別力を示すことができる。
【００５７】
本発明の別の実施例では、ポリペプチド混合物の「発現プロファイル」を決定する方法、即ち混合物中の各ポリペプチドを同定し、好ましくは定量もする方法、また、２以上の混合物（例、２以上の別々の試料から）中のペプチドを比較する方法も提供する。これらの方法は、本発明の第２の実施態様に従って混合物中の２以上のポリペプチドの発現プロファイルを決定することを含む。混合物中の各試料には、様々な標識を使用できる。標識を決定することによって、各発現プロファイルあるいは、比較する各個別のポリペプチドを特定試料に関連付けることができる。
【００５８】
本発明で使用するのに好ましい質量標識はＰＣＴ／ＧＢ０１／０１１２２に開示されており、それには選択した反応モニタリング方法により分析される有機分子質量マーカーが開示されている。この出願には衝突によって開裂可能な基によって連結した二成分系質量マーカーが開示されている。数組のタグを合成するが、この場合に作成されるマーカーの全質量は二成分の質量の合計と同じになる。質量マーカーはそれらの被検体から開裂後に分析してもよいし、あるいは被検体に結合のまま探知してもよい。本発明では質量マーカーは同定中のペプチドに結合させたまま探知する。タンデム機器の第一質量分析装置が質量マーカーとそれが関連するペプチドの質量を選定することにより、マークの付いたペプチドを背景から浮き上がらせることができる。第二工程の機器中でマーカーが衝突することにより、タグの二成分は互いに分離する。これら成分の中の１個のみを第三質量分析装置で探知する。これにより、第一質量分析装置で選定されたピークは質量マークを付けたペプチドであるとの確認が可能になる。このプロセス全体により、分析のシグナル対ノイズ比が大幅に引き上げられ、感度が向上する。質量マーカーをこのようにデザインすれば、並列する質量マーカーが展開する質量範囲が圧縮される。更に、化学的に同一であり、質量も同一であるが質量分析法により解像可能なマーカーをデザインすることができる。これは分析技術、例えば液体クロマトグラフィー質量分析法(ＬＣ−ＭＳ)にとって必須である。即ち、異なるマーカーが異なるペプチド試料の移動度に及ぼす影響を最小にする必要があり、そうすれば、各試料由来の対応ペプチドを質量分析計に一緒に流入することにより対応ペプチドの比率を測定することができる。したがって、これらのマーカーは高い選択性の探知の利用であり密接に関連した構造をしているので、本発明の目的には最も好ましい。ただし、他のマーカーも利用可能である。
【００５９】
本発明の様々な実施態様において、任意だが、好ましい第１工程は、システインジスルフィド架橋を還元し、遊離チオールを防護することである。本発明のアルケニルスルフォン試薬は遊離チオールと反応する。本発明の方法において、遊離チオールの干渉を防ぐため、また、ポリペプチド中のジスルフィド架橋に付随する問題を避けるために、ジスルフィド架橋を還元して遊離チオールとし、本発明の方法を適用する前に該チオール成分を防護するのが好ましい。タンパク質中で、チオールは、他の側鎖よりもはるかに反応性が高いので、この工程は、非常に選択的に達成できる。
【００６０】
ジスルフィッド結合の還元には各種の還元剤が使用されてきた。その試薬の選択は費用、反応効率、チオール防護に使用する試薬との両立性に基づいて決定してよい（これら試薬及び使用に関する概説には、Jocelyn  P.C.  Methods  Enzymol.  143、246-256、「ジスルフィッドの化学還元」1987参照）。
【００６１】
代表的な防護剤には、Ｎ−エチルマレイミド、ヨードアセタミド、ビニルピリジン、4−ニトロスチレン、メチルビニルスルフォン、エチルビニルスルフォンが挙げられる(例えば、Krull  L.H.&  Gibbs  D.E.  &  Friedman  M.,  Anal  Biochem.  40(1):80-85,「2-ビニルキノリン：タンパク質スルフヒドリル基の分光光度法測定試薬」1971；Masri  M.S.  &  Windle  J.J.  &  Friedman  M.Biochem  Biophys.Res.Commun.47(6):1408-1413「p-ニトロスチレン：還元可溶性タンパク質及びケラチン中スルフヒドリル基の新アルキル化剤」1972；Friedman  M.  &  Zahnley  J.C.  &  Wagner  J.R.,  Anal.  Biochem.  106(1):27-34「トリプシン阻害剤のジスルフィッド含量をS−ベータ−(2−ピリジルエチル)−Ｌ−システインとして測定」1980参照)。
【００６２】
代表的な還元剤にはメルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)、水素化ホウ素ナトリウム、フォスフィン、例えばトリブチルフォスフィン（Ruegg  U.T.  &  Rudinger  J.,  Methods  Enzymol.  47,  111-116によるシステインジスルフィッドの還元的開裂）1977参照）及びトリス(カルボキシエチル)フォスフィン（Burns  J.A.ら,  J.  Org.  Chem.  56,  2648-2650「トリス(２−カルボキシエチル)フォスフィンによるジスルフィッドの選択的還元」1991）が挙げられる。メルカプトエタノール及びDTTは、これら自身がチオールを含有しているのでチオール反応性防護剤と使用するのに比較的好ましくない。フォスフィンを基礎とする還元剤はビニルスルフォン試薬と両立可能である（Masri  M.S.  &  Friedman  M.,  J.  Protein  Chem.  7(1),49-54「メチル及びエチルビニルスルフォンとのタンパク質反応」1988）。還元とチオール封鎖を本発明の第２態様のε-アミノ標識工程と共に同時に行うことができる点は注目に値する。
【００６３】
本発明の各種実施態様において、配列特異的開裂試薬が必要である。本発明で使用する好ましい開裂試薬は酵素試薬である。トリプシンはポリペプチドの開裂に好ましい酵素である。この試薬は、従来のペプチドマスフィンガープリント法に最も広く使用される酵素である。トリプシンは、多くの理由で好ましい。非常に頑強な酵素であり、少量の洗剤や変性剤には耐えてポリペプチド開裂能を維持する。さらに、ポリペプチドの開裂が進行し完了すると、各消化物ペプチドの各末端には塩基性残基が出現する。ただしC-末端ペプチドと一部の既封鎖Ｎ-末端ペプチドには出現しない。塩基性残基が存在すると、該ペプチドのプロトン化は促進される。Ｃ-末端がリジン残基に接続するアミド結合でポリペプチド又はペプチドを切断する酵素は各種市販されている。例えば、Lysobacter酵素遺伝子のEndoproteinase  Lys-C(以前はBoehringer  Mannheimから、現在はRoche  Biochemicalsから入手可能)である。これらの酵素は、一般に、Lys-Cと呼ばれ、本発明での使用にも好ましい酵素である。同様に、C-末端がアルギニン残基に接続するアミド結合でポリペプチド又はペプチドを切断する酵素が市販されており、一般にArg-C酵素と呼ばれる。これらも、本発明での使用に好ましい酵素である。化学開裂剤もこの方法で適用できる。メチオニン残基を開裂する臭化シアンなどの試薬が適当と思われる。化学開裂剤は、生物由来のポリペプチド試料の単離中にプロテアーゼ阻害剤を使用できるので有利と思われる。プロテアーゼ阻害剤の使用は、体内プロテアーゼによる試料の非特異的分解を減少させる。化学試薬は、適当なクエンチング試薬の添加によって容易に不活性にすることもできる。
【００６４】
本発明の特定の実施態様では、質量マーカーは、アフィニティー捕捉リガンドである。アフィニティー捕捉リガンドは、非常に特異的な結合相手を持つリガンドである。これらの結合相手により、リガンドをタグした分子は選択的に捕捉される。好ましくは、固相担体には結合相手を導入する。そうすればアフィニティーリガンドをタグした分子が固相担体上に選択的に捕捉される。好ましいアフィニティー捕捉リガンドはビオチンで、これは、当分野で公知の標準的な方法によって本発明のペプチド質量タグに導入することができる。特に、リジン残基をアミノ酸2の後に取り込むと、このアミノ酸を介してアミン反応性ビオチンがペプチド質量タグに結合される(例えば、Geahlen  R.L.ら,  Anal  Biochem  202(1):  68-67,  「カルボキシ末端でビオチン処理したペプチドの一般的調製法」1992;  Sawutz  D.G.ら,  Peptides  12(5):  1019-1012,  「[Lys]ブラディキニンのビオチン化類似物質の合成と分子特性分析」1991;  Natarajan  S.ら,  Int  J  Pept  Protein  Res  40(6):  567-567,  「部位特異性ビオチン化.  エンドセリン-1類似物質及びPTH-類似物質の新規アプローチとその応用」1992)。イミノビオチンも適用できる。ビオチンに対する多様なアビジンカウンターリガンドが利用でき、これには、単量体及び四量体アビジン及びストレプトアビジンがあり、共に多数の固相担体上で利用できる。
【００６５】
他の親和捕捉リガンドには、ジゴキシゲニン、フルオレッセイン、ニトロフェニル基及び多数のペプチド抗原決定基、例えば対リガンドとして選択的なモノクロナール抗体が存在するc-mycが挙げられる。Ni2+イオンと容易に結合する金属イオン結合リガンド、例えばヘキサヒスチジンも利用できる。例えば、イミノ二酢酸キレート化N2+イオンを提供するクロマトグラフ用樹脂が市販されている。これらの固定化ニッケルカラムは、オリゴマーヒスチジンを含むタグ化ペプチドの捕捉に使用できる。他の別法として、アフィニティー捕捉官能基を適当物を導入した固相担体と選択的に反応させることができる。例えばボロン酸は、隣接するシス-ジオールや化学的に類似するリガンド、例えばサリチルヒドロキサム酸と選択的に反応することが知られている。ボロン酸を含む試薬は、サリチルヒドロキサム酸を導入した固相担体上でのタンパク質捕捉用に開発されている(Stolowitz  M.L.ら,  Bioconjug  Chem  12(2):  229-239,  「フェニルボロン酸-サリチルヒドロキサム酸バイオ共役体  1.  タンパク質固定のための新規ボロン酸複合体」2001;  Wiley  J.P.ら,  Bioconjug  Chem  12(2):  240-250,  「フェニルボロン酸-サリチルヒドロキサム酸バイオ共役体  2.  アフィニティークロマトグラフィーのためのタンパク質リガンド多価固定」2001,  Prolinx  Inc,  Washington  State,  USA)。本発明のタグにフェニルボロン酸官能基を結合し、選択的化学反応で捕捉できる捕捉試薬を生成するのは、比較的簡単であろうと予想される。この種の化学の使用は、隣接するシスジオール含有糖を有する生体分子と直接両立しないと思われる。しかし、この種の糖はフェニルボロン酸又は関連試薬で封鎖すれば、ボロン酸導入タグ試薬との反応が可能になるはずである。
【００６６】
本発明方法を使用して多様に生成したタンパク質をプロファイルすることができる。酵母等の微生物に由来する未精製のタンパク質抽出物を直接に本発明方法を使用して分析するのも可能である。比較的大きなプロテオームを有する微生物では組織から未精製のタンパク質抽出物を分画する必要があるかもしれない。或る種の特徴を基礎にしてタンパク質を仕分ける各種の分画技術がある。例えば、哺乳動物の組織から抽出したタンパク質は相当数の別個のタンパク質種を含有している。ヒトの平均的な細胞では10000の水準で転写物が発現され、それらの中には多数の遺伝子由来の別途にスプライスされた産生物も含まれていると考えられ  (Iyer  V.R.ら  Science  283(5398)83-87「ヒト繊維芽細胞の血清に対する応答における転写プログラム」1999)、また2Dゲルでの実験によると特定組織から抽出したタンパク質のゲルにもそれと類似の数のタンパク質スポットがあると判っている(Klose  J.,  Kobalz  U.,  Electrophore(電気泳動）sis  16(6)1034-59「タンパク質の二次元電気泳動：ゲノムの官能分析のための最新のプロトコール及び意義」1995)。ヒト組織から単離したような複雑なタンパク質試料は、本発明を実施する前に分画するのが望ましく、そうすれば分析を簡素化でき、あるいは追加の情報、例えば翻訳後に改変のあったタンパク質を同定する、等が得られる。本発明方法を使用してタンパク質から単離した末端ペプチドを分画してから次の操作又は分析をするのも望ましいと思われる。
【００６７】
分画工程を使用すれば、タンパク質を多数の小集団に分割するのでタンパク質郡の複雑さを減少することができる。これは、広範で連続的な範囲に渉って変動するタンパク質の包括的な特性、例えばサイズとか表面電荷を基礎にして分離すれば最も容易に達成される。これらの特性は２−Ｄゲル電気泳動で最も効果的に利用されている特性である。この分離は液体クロマトグラフィーを利用すればゲル電気泳動よりも更に急速に達成可能である。液体クロマトグラフィー分離を繰り返すことによりタンパク質は任意の程度に分割することができる。ただし、多数の連続的クロマトグラフィー分離工程を経ると、タンパク質又はペプチドが様々なクロマトグラフィーのマトリックスに非特異的に付着するので試料損失や他の副生物が生ずる結果となる。
【００６８】
−細胞分画−
タンパク質は細胞内の区分で仕分けられている。細胞内区分を基礎にしてタンパク質を分画する技法は当分野で各種知られている。分画のプロトコールには細胞分解の各種技法、例えば超音波、界面活性剤あるいは物理手段による細胞分解及びこれらに続く分画技法、例えば遠心分離が包含される。膜タンパク質、細胞質ゾルタンパク質、及び主要な膜結合細胞区分、例えば、核及びミトコンドリアに分離するのが標準的なプラクチスである。したがってあるクラスのタンパク質は、効率的に無視してよくあるいはそれだけを分析することが可能である。特定タンパク質が多数の細胞内領域に存在する場合には、この形式の分画は極めて有用な情報を提供する。即ちそのタンパク質の機能に関する情報はその所在から明らかになる可能性があるからである。
【００６９】
−タンパク質の分画−
タンパク質は高度に不均質な分子であるから、可能な分離技法は多数ある。サイズ、疎水性、表面電荷を基礎にして、及び／又は特定配位子への親和性によってタンパク質を分離することができる。分離は、各種の官能基を導入した固相マトリックスを分割することによりなされるが、このマトリックスはカラムを流れるタンパク質を特性に基づいて付着し、流速を下げる。疎水性部分を導入したマトリックスを使用するとそれの疎水性に基づいてタンパク質を分離することができ、また帯電樹脂を使用するとその電荷に基づいてタンパク質を分離することができる。代表的なクロマトグラフィー分離では、固相マトリックスへの付着に有利な緩衝液又は溶媒の中にあるこれら導入樹脂を充填したカラムに被検分子を注入する。続いてカラムを確実に増量した溶出に有利な第二の緩衝液又は溶媒で洗浄する。マトリックスとの相互作用が最も弱いタンパク質が最初に溶出する。
【００７０】
−アフィニティーによる分画−
タンパク質はアフィニティー法により分画することができる。この種の分画法はタンパク質又はあるクラスのタンパク質と特定リガンドとの間の特異的相互反応に依存する。
【００７１】
例えば、他のタンパク質との複合体として存在するタンパク質は多く、そのような複合体の分析はしばしば困難である。複合体の構成員と推定されるクローン化タンパク質を利用すると、そのクローン化タンパク質がアフィニティーリガンドとして機能するアフィニティーカラムを作成することができ、これによって他のタンパク質はこれに結合して捕捉される。本発明はこのように捕捉されたタンパク質複合体の分析に極めて適合している。
【００７２】
−翻訳後に修飾されたタンパク質の単離−
特定の目的、例えば翻訳後に修飾されたタンパク質の単離のためのアフィニティーリガンドが多数市販品として入手可能である。多数のタグ付け手順も知られており、その手順によりビオチン等のアフィニティータグを翻訳後に修飾されたタンパク質に導入することができる。ビオチン−アビジンアフィニティークロマトグラフィーを使用すればそのタグによってタンパク質は捕捉可能となる。
【００７３】
−炭水化物修飾タンパク質の単離−
炭水化物はタンパク質の翻訳後修飾体としてしばしば存在する。この種のタンパク質の単離のために各種のアフィニティークロマトグラフィーが知られている(概説のために、Gerard  C.,  Methods  Enzymol.  182,  529-539「糖タンパク質の精製」1990参照)。炭水化物に対する各種天然タンパク質受容体が知られている。受容体のこのクラスの構成員はレクチンとして知られており、特定の炭水化物官能基に対して高度の選択性がある。特定のレクチンを導入したアフィニティーカラムを使用すれば、特定の炭水化物で修飾されたタンパク質を単離することができる。他方、各種の異なるレクチンを含有するアフィニティーカラムを使用すれば、各種の異なる炭水化物で修飾されたタンパク質を単離することができる。隣接−ジオール基、即ち隣接する炭素上に存在するヒドロキシル基を有する炭水化物は多数ある。1,2−シスジオール立体配位に隣接ジオールを含有するジオール含有炭水化物はボロン酸誘導体と反応して環状エステルを形成する。
【００７４】
この反応は塩基性ｐＨでは優勢であるが、酸性ｐＨでは容易に逆転する。シス−ジオール含有炭水化物を有するタンパク質を親和捕捉するリガンドとして、樹脂に固定化されたフェニルボロン酸誘導体が使用されている。隣接−ジオールはまた、例えばシアール酸において、過ヨード酸塩で酸化的に開裂するとカルボニル基に変換することができる。末端にガラクトース又はガラクトサミンを有する糖をガラクトース酸化酵素で酵素的に酸化することによっても、これらの糖のヒドロキシル基をカルボニル基に変換することができる。複合炭水化物も炭水化物開裂酵素、例えばノイラミダーゼで処理すると、この酵素により特定の糖修飾体は除去し、酸化可能な糖は後に残すことができる。これらのカルボニル基にタグを付ければ、上記の修飾をしたタンパク質を探知又は単離することができる。
【００７５】
ビオシチンヒドラジッド（Pierce  &  Warriner  Ltd.,  Chester,UK）はカルボニル含有炭水化物種中のカルボニル基と反応する(E.A.Bayerら  Anal.Biochem.170,  271-281「ビオシチンヒドラジッド−アビジンビオチン技法を利用する糖複合体中のシアール酸、ガラクトース及び他の糖のための選択的標識」1988)。あるいはまた、カルボニル基にアミン修飾ビオチン、例えばBiocytin及びEZ−Link(商標)PEO−Biotin（Pierce  &  Warriner  Ltd.,  Chester,UK）のタグを還元的アルキル化（Means  G.E.,  Methods  Enzymol  47,  469-478「アミノ基の還元的アルキル化」1977；Rayment  L.,  Methods  Enzymol  276:  171-179「リジン残基を還元的アルキル化してタンパク質の結晶特性を変更」1997）を利用して付けることができる。したがって、隣接−ジオール含有炭水化物修飾体を有する複合体混合物中タンパク質をビオチニル化することができる。ビオチニル化した、したがって炭水化物を修飾したタンパク質はアビジン化固相担体を使用して単離することができる。
【００７６】
次に、上記の方法を使って単離したタンパク質を有する捕捉炭水化物からペプチドを単離し、分析できる。
【００７７】
−リン酸化タンパク質の単離−
リン酸化は翻訳後における普遍的な可逆修飾であり、ほとんど全ての微生物のシグナル経路の大半において出現する。これは重要な研究領域であり、リン酸化動力学の解析を可能にするツールは細胞の刺激応答、例えば細胞の薬物応答を完全に理解するのに必須である。
【００７８】
各種広汎のタンパク質に存在するリン酸チロシン残基に結合する抗体を産生することについて報告している研究グループは多い(例えば、A.R.Frackeltonら  Method  Enzymol.201,  79-92「抗リン酸チロシンモノクロナール抗体及びリン酸チロシン含有タンパク質のアフィニティー精製への利用」1991及びMethod  Enzymol  同号中の他の論文参照)。このことは、翻訳後にチロシンがリン酸化修飾を受けたタンパク質のかなり多数のものは、これら抗体をアフィニティーカラムのリガンドとして使用するアフィニティークロマトグラフィーによって単離されることを意味する。
【００７９】
これらのリン酸チロシンに結合する抗体を本発明において使用すれば、リン酸チロシン残基を含有するタンパク質から末端ペプチドを単離することができる。複合体混合物中のチロシンリン酸化タンパク質は、抗リン酸チロシン抗体アフィニティーカラムを使用して単離することができる。したがって燐タンパク質の分画混合物由来のＮ末端ペプチドは本発明方法に従って単離、分析することができる。
【００８０】
リン酸セリン及びリン酸スレオニン含有ペプチドの分析技術も知られている。それらの方法のあるクラスはリン酸塩のベータ除去のための公知反応を基礎にしている。その反応の結果、リン酸セリン及びリン酸スレオニンからデヒドロアラニン及びメチルデヒドロアラニンが形成され、それらは共にミカエル受容体でありチオールと反応する。これを利用してアフィニティークロマトグラフィー用の疎水基を導入している（例えば、Holmes  C.F.,  FEBS  Lett.  215(1),21-24「リン酸セリン含有ペプチドの選択的単離の新方法」1987参照）。
【００８１】
また、ジチオールのリンカーも使用されており、これによりリン酸セリン及びリン酸スレオニン含有ペプチドにフルオレッセイン及びビオチンを導入している(Fadden  P,  Haystead  TA,  Anal.  Biochem.  225(1),  81-8,「ペプチド及びタンパク質上のリン酸セリンを定量的及び選択的に発蛍光団標識する：毛細管電気泳動及びレーザー誘導蛍光によってアットモルの水準で特徴化」1995；Yoshida  O.  Nature  Biotech  19,  379-382「リン酸プロテオームをプローブ化するツールとしてのリン酸化タンパク質の濃縮分析」2001)。末端ペプチドのみを分析する必要があるので、セリン及びスレオニンでリン酸化したタンパク質をビオチンの使用によりアフィニティー濃縮すれば、これを本発明方法と共に利用できる。同様に抗フルオレッセイン抗体が知られており、フルオレッセインをタグしたペプチドをこの抗体によるアフィニティークロマトグラフィーをもって単離することができる。これは、その後に本発明方法に従って単離、分析することができる。
【００８２】
リンタンパク質を固相担体上で単離する化学手順も公開されている(Zhou  H.ら、  Nature  Biotech  19,  375-378「タンパク質リン酸化分析への系統的アプローチ」2001.)。
この手順は、フォスフォルアミデートは酸性条件下で容易に加水分解するという事実に基づいている。この手順には、タンパク質混合物中の遊離アミンを全て防護し、次に、アミン官能基を含有する防護剤で遊離リン酸基とカルボン酸基とを結合して封鎖し、対応するフォスフォルアミデート及びアミドを形成することが包含される。次に、封鎖タンパク質を酸で処理してリン酸基の封鎖を解除する。次に、チオールが保護された第二番目のアミン試薬でペプチドを処理する。この工程でリン酸基は再び封鎖される。保護チオールを脱保護し、チオール反応性樹脂上でリンペプチドを選択的に捕捉するのに使用する。樹脂を十分に洗浄後にこれらのペプチドを酸加水分解により溶出する。この手順はリン酸基全てに適用可能であるとクレームされているが、リン酸チロシンは酸に不安定であるので、この方法はリン酸チロシンには適用できない可能性がある。
【００８３】
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）はリン酸タンパク質及びリン酸ペプチドを単離する別の技術を代表する。リン酸塩は三価金属イオンを含有する樹脂、特にガリウム（ＩＩＩ）イオンに付着する（Posewitch,  M.C.,Tempst,  P.,  Anal.  Chem.,  71:2883-2892「リン酸ペプチドの固定化ガリウム（ＩＩＩ）アフィニティークロマトグラフィー」1999）。この技術は有利である。理由は、セリン／スレオニンリン酸化及びチロシンリン酸化したペプチド及びタンパク質を同時に単離することができるからである。
【００８４】
したがって、IMACはリン酸化タンパク質試料の分析に本発明においても使用することができる。本発明第二態様の別の実施例では、リン酸化タンパク質試料を分析するに当たり、
まず、リン酸化タンパク質を単離し、次にリン酸タンパク質のＣ末端ペプチドを分析してもよい。リン酸化タンパク質含有タンパク質試料を分析するプロトコールには以下の工程が包含される。
タンパク質試料を固定化金属イオン含有アフィニティーカラムに通し、リン酸化タンパク質のみを単離する、
捕捉されたリン酸化タンパク質からＣ末端ペプチドを本発明方法を利用して単離、分析する。
【００８５】
−タンパク質の他の翻訳後修飾−
ユビキチン化、リポイル化及び他の翻訳後修飾によって修飾されたタンパク質もクロマトグラフィー技術  (Gibson  J.C.,  Rubinstein  A.,  Ginsberg  H.N.  &  Brown  W.V.  Methods  Enzymol  129,  186-198,「免疫アフィニティークロマトグラフィーによるアポリポタンパク質E含有リポタンパク質の単離」1986；Tadey  T.  &  Purdy  W.C.  J.Chromatogr.  B.Biomed.  Appl.  671(1-2)237-253、「リポタンパク質を単離及び精製するクロマトグラフィー技術」1995)  又はアフィニティーリガンドを基礎とする技術、例えば免疫沈降(Hershko  A.  Bytan  E.  Ciechanover  A.  &  Haas  A.  L.、  J.Biol.Chem.  257(23),13964-13970「生細胞でのユビキチン−タンパク質複合体代謝回転の免疫化学的分析」1982)  により単離又は濃縮することができる.。これらの修飾をしたタンパク質は全て本発明方法により分析することができる。
【００８６】
本発明の好ましい実施態様では、リジン選択性タグは、増感基を含む。増感基として各種官能基を使用できる。官能基の選択は、概ね質量分析技術を使って決定される。グアニジノ基及び3級アミノ基は、共に、電子スプレー質量分析法に役立つ増感基である(Francesco  L.  Branca,  Stephen  G.  Oliver及びSimon  J.  Gaskell,  Rapid  Commun.  in  Mass  Spec.,  14,  2070-2073,  「リジン含有ペプチドのグアニジン化後のタンパク質トリプシン水解物の改良型マトリックス-支援レーザー脱着/イオン化質量分析法」2000)。
【００８７】
様々な他のペプチド誘導法も開発されている。これらには、陽イオン質量分析法のための、4級アンモニウム誘導体、4級フォスフォニウム誘導体及びピリジル誘導体の使用がある。ハロゲン化化合物、特にハロゲン化芳香族化合物は、周知のエレクトロフォアである。即ち、該化合物は、熱電子を非常に容易に拾い上げる。フッ素化芳香族化合物を基礎とする多様な誘導化試薬(Bian  N.ら,  Rapid  Commun  Mass  Spectrom  11(16):  1781-1784,  「多重エレクトロフォア標識アルブミンのレーザー脱着及び質量分析法による探知」1997)が電子捕捉探知用に開発されており、これは、高感度なイオン化及び検知プロセスで、陰イオン質量分析法に使用できる(Abdel-Baky  S.  &  Giese  R.W.,  Anal  Chem.  63(24):  2986-2989,  「ゼプトモルレベルでのガスクロマトグラフィー/電子捕捉陰イオン質量分析法」1991)。増感基としてフッ素化芳香族基も使用できるはずである。芳香族スルフォン酸も、陰イオン質量分析法で増感に使用されている。
【００８８】
各種の増感基は、効果が異なり、使用するイオン化法、また、使用する質量分析法に左右される。感度を増強するメカニズムは、基団のタイプ毎に異なることができる。ある導入法は塩基性を高め、それによって、プロトン化と電荷局在を促進するが、他の方法は、タグ化ペプチドの表面活性を高め、マトリックス支援レーザー脱着イオン化(MALDI)や高速中性粒子衝突イオン化法(FAB)のような表面脱着技術で感度を改善する。陰イオン質量分析法は、背景ノイズが少ないために、多くの場合に感度が高い。誘導されたペプチドの分断生成物を電荷を導入して変化させ、その際に誘発された衝突解離を使用することもできる。特に、ペプチドを衝突誘発解離などの技術によって分析しなければならない場合には、ある誘導技術が分断パターンを簡素化し、非常に有利である。増感基の選択は、利用する予定の質量分析技術によって決定する(概説については、Rothら,  Mass  Spectrometry  Review  17:  255-274,  「質量分析法による分析のためのペプチド電荷導入」1998参照)。本発明の目的のために、既知の増感基はすべて、本発明のリジン選択性タグと共に使用できる。
【００８９】
本発明の好ましい実施態様では、リジン選択性アルケニルスルフォン試薬は、非蛍光染料を含む。好ましくは、タグには、特定の光周波数に対し高い吸光係数を有し、振動モードで吸収されたエネルギーを散逸させる染料が含まれる。上記染料のある例は、MALDI-TOF用マトリックスとして使用され、その場合、レーザー光によって該染料が励起されると該染料は急速に昇華する。この昇華過程でも共結晶材料は気化する。桂皮酸誘導体は、MALDI  TOFで汎用されている好ましい染料である(Beavis  RC,  Chait  BT,  Rapid  Commun  Mass  Spectrom  3(12):  432-435,  「タンパク質の紫外線レーザー脱着質量分析法」1989)。本発明者らは、出願予定中の出願の中で、桂皮酸及び他の染料のペプチドへの共有結合誘導体によって、付着ペプチドからのイオン収量が著しく増加することを認めている。そのため、桂皮酸誘導体を含むアルケニルスルフォン試薬は、本発明での使用に好ましいタグである。
【００９０】
本発明のある実施態様では、消化されたポリペプチド由来のペプチドのα-アミノ基を増感剤でタグしてよい。4-ヒドロキシ-α-シアノ-桂皮酸などの桂皮酸誘導体のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルは、この目的に対して優れたタグである。
【００９１】
−ペプチドマスフィンガープリントの決定−
立体障害の比較的に少ないミカエル試薬、例えばＮ−エチルマレイミド(NEM)及びプロペニルスルフォンはプロリンのαアミノ基と極めて急速に反応する。しかし本発明の大部分の態様ではこれは問題にならない。理由は、プロリンは普遍的でなく、大部分のエンドプロテアーゼはプロリン結合部を開裂しないからである。本発明のある態様は、Lys-C型酵素によるタンパク質及びポリペプチドの開裂に基づく。このクラスの既知酵素の大半は、リジン-プロリン結合部では開裂しないので、それがタンパク質のN-末端で起こらない限り、遊離プロリンα-アミノの存在はありえない。同様に、トリプシンは、リジン-プロリン又はアルギニン-プロリン結合を開裂しないので、本発明の第1及び第2態様で使用した場合にプロリンの遊離α-アミノ基の生成が避けられる。
未封鎖のN-末端プロリンが本発明の問題になるだけである。しかし、イソブチルスルフォン、トリフルオロプロペニルスルフォン及びヘキサフルオロイソブテニルスルフォンなどの立体障害の比較的著しいアルケニルスルフォンでは、プロリンとリジンに対する識別力の向上が認められるので、これらの試薬は、プロリンに対する識別力が必要な場合に使用すべきである。
【００９２】
本発明のある実施態様ではリジン標識ポリペプチドのペプチドマスフィンガープリントを生成する一般的方法が記載されているが、そこでは、立体障害のあるスルフォンの識別力を利用してε-アミノ基が特異的に標識されている。この反応は、配列特異的開裂試薬でのポリペプチド又はポリペプチド混合物の開裂、例えばトリプシンなどの酵素での酵素開裂、あるいは臭化シアンなどの化学物質での化学的開裂、の後に行なわれる。配列特異的開裂試薬によりポリペプチド混合物が開裂すると、生じる開裂ペプチド全てにおいてα-アミノ基が露出される。本発明のリジン選択性タグが消化されたペプチドと反応する際には、該タグは、存在可能ないずれのα-アミノ基よりも優先的にε-アミノ基と選択的に反応する。次に、これらの被標識ペプチドを質量分析法で分析し、被標識ペプチド由来のマスフィンガープリントを決定する。
【００９３】
本発明実施態様の特定の実施態様では、リジン選択性タグは、アフィニティータグを包含してよい。これによって、リジン残基上を標識されてたペプチドを、リジンを含有せず、標識消化物由来の質量スペクトルを汚染する可能性のあるペプチドから選択的に単離することが可能になる。
ある好ましい実施態様では、図２に示しように、分析対象のポリペプチドは、トリプシン消化物である。トリプシンは、アルギニンとリジンの両方で開裂し、アルギニンとリジンを末端とするペプチドを生成する。消化が進行し、完了すれば、実質的にすべての存在可能なリジン及びアルギニン残基で開裂が起こり、各消化物ペプチドには、リジンもアルギニンも含まないC-末端ペプチドを除いて、唯１個のリジン又はアルギニンが含有される。このことは、消化物ペプチドをリジン選択性タグで標識すると、これらリジン含有ペプチドには唯１個のタグが導入されることを意味する。
【００９４】
図４に示すように、リジン選択性タグがビオチンのようなアフィニティータグを含む場合には、標識されたリジン含有ペプチドは、アビジン化固相担体を使ってアフィニティークロマトグラフィーで単離される。この結果、消化物ペプチドのサブセットが減少するので、その選択されたポリペプチドをMALDI  TOFで分析することによりそのペプチドマスフィンガープリントを決定することができる。アフィニティータグの使用は非常に有利である。理由は、ペプチド単離によりリジン含有ペプチドをアルギニン含有ペプチドから分離できるからである。この結果、イオン化過程での競合の可能性が減少し、これはアルギニン含有ペプチドのイオン化に都合が良い。さらに、該タグと反応しなかったリジン含有ペプチドから、また、リジンやアルギニンを含有しない末端ペプチドから標識ペプチドを単離できる。加えて、固相担体へのペプチドの捕捉は、単離されたペプチドを質量分析用に調整できる。このことは、ポリペプチドの単離中、ポリペプチドの消化中、ポリペプチドの標識中に使用されたと思われる洗浄剤、変性剤及び重合緩衝剤を洗い流すことができることを意味する。担体上のペプチドを適当なアンモニウムイオン含有緩衝液で洗浄して、ペプチド緩衝剤からの金属イオンなどの非揮発性緩衝成分をアンモニウムイオンと交換し、確実にペプチドの金属イオン付加物がペプチド消化物の質量スペクトルを汚染しないようにすることもできる。
【００９５】
アフィニティータグとカウンターリガンドとしてビオチンとアビジンをそれぞれ使用する場合、ポリペプチドを消化するのに使用する配列特異性開裂試薬は、標識ペプチドをアビジン化担体上で単離する前に不活性化しなければならない。開裂剤が依然として活性であれば、アビジンか担体を消化し、捕捉したペプチドを放出する。リジン官能基の標識は、酵素的であれば、開裂試薬を不活性化できるが、消化完了後、該酵素の阻害剤を添加することも好ましい。アフィニティータグを含むリジン選択性タグは、さらに増感基を含むことによってペプチドマスフィンガープリントを改善することができる。別法として、捕捉されたペプチドは、ほとんどの場合に露出したα-アミノ基を有するので、アミノ反応試薬と反応させることによって、増感剤を該ペプチドに結合することができる。ポリペプチドのN-末端由来のペプチドは、時折封鎖されているので、これらの封鎖ペプチドは、α-アミノ標識法を使用しても封鎖されない。
【００９６】
本発明の他の実施態様では、アフィニティータグを含むリジン選択性タグを、トリプシン以外の配列特異的開裂試薬と合わせて使用できる。図3は、Lys-Cの使用を示す。しかし、Lys-Cは、トリプシンほど好ましくない。理由は、Lys-Cでポリペプチドを消化して得られるペプチドは1以上のアルギニン残基を含むことがあり、この残基がアルギニンを含まないペプチドとイオン化を競合する可能性があり、かつ多重プロトン化したイオンの形成を促進する可能性があるからである。しかし、Lys-Cは有利である。理由は、消化が完全に進行すると仮定し、かつLys-Cによるポリペプチドの開裂後には大半のC-末端ペプチドにはリジンが含有されていないことを念頭におくと、各ペプチドはペプチド当たり唯1個のタグを確実に受理することななるからである、トリプシンでは、C-末端リジンかC-末端アルギニンの一方を有するペプチドが生成することになる。
【００９７】
アルギニンのグアニジノ官能基の塩基性が非常に高いために、アルギニン含有ペプチドの方が、MALDI-TOF質量分析法で容易に探知できる傾向がある(Krause  E.  &  Wenschuh  H.  &  Jungblut  P.R.,  Anal  Chem.  71(19):  4160-4165,  「MALDI誘導によるタンパク質のトリプシンマスフィンガープリント」1999)。リジン選択性タグを使用して、アルギニンを含まないペプチドを選択的に標識できる。該タグを使用してグアニジノ官能基を導入でき、これはリジン含有ペプチドの探知を容易にする助けとなることができる(Branciaら,  Electrophoresis  22:  552-559,  「化学的導入と改良型バイオインフォーマティクスツールの併用は、プロテオミクスのためのタンパク質同定を最適化する」2001)。
【００９８】
−発現プロファイリング及びペプチドマスフィンガープリント−
本発明のこの実施態様は、ペプチドマスフィンガープリントを使って、各種試料中のポリペプチドの発現レベルを比較する方法を提供する。２試料の発現プロフィルを比較するには、上記の２試料中の各成分ポリペプチドの同一性と相対量を決定する必要がある。この実施態様は、２以上の異なる試料中の成分ポリペプチドのそれぞれの同一性と相対量の両方を決定する方法を提供する。これを達成するには、各試料中のポリペプチドを質量分析で解像できる標識で標識する。次に、標識されたポリペプチドをプールする。プールした試料の成分を、電気泳動又はクロマトグラフィー操作を使って成分を分離することによって、互いに解像する。その後、分離されたタンパク質は、ペプチドマスフィンガープリント法で同定できる。本発明で述べる標識操作を使用すると、各成分ポリペプチドの相対レベルをポリペプチドの質量分析による同定過程で決定することも可能である。
【００９９】
質量分析法による分析物の直接定量は、非常に不確かなので、質量分析法による正確な定量は、分析物とは同位体としての質量が異なる既知量の同一物質を通常含む「標準品」と分析物を比較して達成するのが一般的である。該標準品は、分析直前に試料にスパイクする。分析物対標準品比を使って、材料の量を算出できる。ある場合には、正確な量は必要なく、ある物質の二つの同位体の比で十分である。これは、タンパク質発現プロファイリングに当てはまる。異なる試料中の同一ポリペプチド比を決定し、試料がどのくらい互いに異なるのかを理解できることで十分である。これを達成するために、質量分析法で分析する前に、二つのポリペプチドを同位体として区別しなければならない。これは、あるタグ化合物の異なる同位体で各試料中のポリペプチドを標識することで達成できる。本発明によれば、異なる試料中のポリペプチドの標識は、試料中のポリペプチドの分離前に行う。これは、標識が標識タンパク質のクロマトグラフィー挙動を変化させてはならないことを意味する。
【０１００】
本発明で使用するのに好ましい、必要な性質を持った標識はＰＣＴ／ＧＢ０１／０１１２２に開示されており、それには、連続質量分析が可能な質量分析計、例えばイオン捕捉器又は三重四極子質量分析計で選択した反応をモニタリングすることにより分析される有機分子質量マーカーが開示されている。ＰＣＴ／ＧＢ０１／０１１２２には衝突によって開裂可能な基によって連結した二成分系質量マーカーが開示されている。数組のタグを合成するが、この場合に作成されるマーカーの全質量は二成分の質量の合計と同じになる。質量マーカーの各成分が異なる同位体である場合に、化学的に同一であり、質量は同一だが、衝突によって開裂可能な結合の片側に質量分布の異なる質量マーカーが生成する。質量マーカーは、その分析物からの開裂後に分析でき、あるいは、分析物に付着しながら探知できる。本発明の場合、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０１１２２に開示された質量マーカーは、それらが同定するペプチドに付着したままで探知できる。タンデム機器の第一質量分析装置が質量マーカーとそれが付随するペプチドとの質量を選定することにより、マークの付いたペプチドを背景から浮き上がらせることができる。異なるタグを持つ2個の同一ペプチドが存在する場合、即ち異なる試料からのペプチドの場合、分析の第一工程では同一質量を持つので一緒に選択される。しかし第二工程の機器中でマーカーが衝突することにより、タグの二成分は互いに分離する。これら成分の中の１個のみを第三質量分析装置で探知する。各ペプチドからのタグ断片の強度比は、元の試料材料中のペプチド比の直接的な目安になる。タグ断片の同定によって、第一質量分析装置で選定されたピークは質量マークを付けたペプチドであるとの確認が可能になる。このプロセス全体により、分析のシグナル対ノイズ比が大幅に引き上げられ、感度が向上する。質量マーカーをこのようにデザインすれば、並列する質量マーカーが展開する質量範囲は圧縮される。更に、化学的に同一であり、質量も同一であるが質量分析法により解像可能なマーカーをデザインすることができる。これは分析技術、例えば２−Ｄゲル電気泳動や液体クロマトグラフィー質量分析法(ＬＣ−ＭＳ)にとって必須である。即ち、異なるマーカーが異なるペプチド試料の移動度に及ぼす影響を最小にする必要があり、そうすれば、各試料由来の対応ペプチド及びポリペプチドを、分画操作中に一緒に流入する。これは、対応するペプチドの比を決定できるために不可欠である。したがって、これらのマーカーは高い選択性の探知の利用であり密接に関連した構造をしているので、本発明の目的には最も好ましい。ＰＣＴ／ＧＢ０１／０１１２２に開示されている標識化合物は、本発明が提供する好ましいアルケニルスルフォン反応官能基を使ってペプチドと反応できるように、修飾できる。ただし、他のマーカーも利用できる。
【０１０１】
ＰＣＴ／ＧＢ０１／０１１２２に開示されている形態の１組又は１系列の標識は、本発明の方法と共に使用すると、生体試料のポリペプチドの２−Ｄゲル電気泳動分析の処理量を増加させることができる。各質量標識は、同様に付随するポリペプチドの移動性を変化させるが、依然として、個別に探知できる。使用するタグがビオチンなどの固相担体上に固定できる基を含めば、タンパク質は、アビジン化樹脂に固定し、質量分析用に調整できる。
【０１０２】
本発明の好ましい実施態様では、一連のポリペプチド含有試料であって、各試料が1以上のポリペプチドを含有している場合に、それらの分析方法であって、その方法が以下の工程を包含する方法が提供される:
1.  各試料のポリペプチドを少なくとも1個の分離して解像可能な質量タグと共有結合で反応させ、その結果、各試料のポリペプチドが、他のあらゆる試料のタンパク質と反応する標識とは異なる1個以上の質量標識で標識される。
2.  質量標識試料をプールする。
3.  任意の工程として、プールした試料をゲル電気泳動、等電点電気泳動、液体クロマトグラフィー又は他の適当な手段で分離し、個別の分画を生成する。これらの分画は、ゲル上のバンド又はスポットであることも、あるいは、クロマトグラフィーで分離された液体分画であることもできる。ある分離による分画は、第二分離技術を使ってさらに分離することができる。同様に、その後の分析工程用にタンパク質が十分な解像度を持つまで、再度分画を進めることができる。
4.  配列特異的開裂試薬で、各分画のポリペプチドを消化する。
5.  消化物を質量分析法で分析し、分画中のポリペプチドを同定し、タンパク質に付着した標識を探知する。
【０１０３】
図６は、本発明の別の実施態様で使用する適切な標識手順を示す。この図では、該手順は、単一ポリペプチドについて示されており、分離工程が省略されている。図６の第一工程で、ポリペプチドを還元剤で処理し、分子中のジスルフィド架橋を切断した後、生じた遊離チオールを防護する。次に、遊離εアミノ基を立体障害のあるアルケニルスルフォンタグで防護する。異なる試料を比較しなければならない場合、試料毎に異なるタグを使用するのがよい。この工程で、標識試料をプールし、必要な分画手順を実施するのがよい。図６の最終工程は、トリプシンによる標識ポリペプチドの消化で、これは、ここでは、アルギニン残基のみを開裂できる。この工程は、複雑な混合物を分析しなければならない場合、標識ポリペプチドの分画後に行うのがよい。
【０１０４】
本発明のさらに好ましい実施態様は、１以上のタンパク質を含む試料中のタンパク質を同定する方法であって、その方法が以下の工程を包含する方法を提供する:
1.  各試料のタンパク質を本発明の各組及び系列の少なくとも1個の、分離して解像可能な質量標識と共有結合で反応させる。
2.  任意の工程として、タンパク質をゲル電気泳動、等電点電気泳動、液体クロマトグラフィー又は他の適当な手段で分離し、個別の分画を生成する。これらの分画は、ゲル上のバンド又はスポットであることも、あるいは、クロマトグラフィーで分離された液体分画であることもできる。ある分離による分画は、第二分離技術を使ってさらに分離することができる。同様に、その後の分析工程用にタンパク質が十分な解像度を持つまで、再度分画を進めることができる。
3.  配列特異的開裂試薬で、各分画のタンパク質を消化する。
4.  任意の工程として、試料中のタンパク質を追加質量標識と反応させる。
5.  消化した分画を液体クロマトグラフィー質量分析法で分析し、その場合、液体クロマトグラフィーカラムからの質量マークしたペプチドの溶出時間を、ペプチドに付着した質量標識を探知することで決定する。質量分析は、好ましくは本発明の態様に従って実施し、タンパク質に付着した標識を探知する。
6.  質量分析法で消化物を分析し、分画中のポリペプチドを同定し、タンパク質に付着した標識を探知する。
【０１０５】
本発明のこの態様の上記の好ましい実施態様では、タンパク質を分画する工程は、第一次元の等電点電気泳動と第二次元のＳＤＳ  ＰＡＧＥを使った2-次元ゲル電気泳動を実施することにより達成されるのが好ましい。一般的には、該ゲルを可視化し、タンパク質がゲル上のどこに移動したかを突き止める。ゲルの可視化は、ゲルを染色し、タンパク質スポットを示すことによって実施するのが一般的である。各種の染色手順と試薬が開発されているが、多くの染色剤は質量分析に適さないか、質量分析前に広範囲な脱色手順を必要とする。質量分析前に脱色を必要とするが、銀染色が、一般に、最も感度の高い染色法の1つであると見なされている(Gharahdaghi  Fら,  Electrophoresis  20(3):  601-605,  「銀染色ポリアクリルアミドゲルからのタンパク質の質量分析による同定:  感度増強のための銀イオンの除去法」1999)。質量分析に適合する新規蛍光染色剤も開発されている(Lopez  MFら,  Electrophoresis  21(17):3673-3683,  「二次元ゲル中のタンパク質探知及びペプチド質量プロファイリングによる同定に関する銀染色剤とSYPRO  Rubyタンパク質ゲル染色剤の比較」2000)。
【０１０６】
本発明の目的で、質量分析法に適合する従来の染色法は、いずれも、本発明の方法で使用できる。次に、各スポット中のタンパク質を同定する。これには、2つの方法がある。第1法では、タンパク質をゲルから抽出する。ロボット装置を使用して、ゲルからタンパク質含有スポットを切り取ることができる。次に、切り取ったゲルスポットからタンパク質を抽出する。その後、これらの抽出タンパク質を消化し、ポリペプチドからの消化物ペプチドを質量分析法で分析し、ペプチドマスフィンガープリントを、通常、MALDI  TOF質量分析法で決定するが、電子スプレー質量分析法もかなり広く使用されている。タンパク質は、ポリビニリデンジフロライド膜上のエレクトロブロッティングによっても抽出し、その後、タンパク質の酵素的消化を該膜上で行うことができる（Vestling  MM,  Fenselau  C,  Biochem  Soc  Trans  22(2):547-551,  「ポリビニリデンジフロライド(PVDF):ゲル電気泳動及びマトリックス支援レーザー脱着/イオン化マススペクトロメトリー」1994）。第２法では、ポリペプチドをゲル中で消化し、質量分析法によるペプチドマスフィンガープリントの決定のため、消化ペプチドをゲルから、あるいは、切り取ったゲルスポットから抽出する(Lamer  S,  Jungblut  PR,  J  Chromatogr  B  Biomed  Sci  Appl  752(2):311-322,  「プロテオーム分析のためのマトリックス支援レーザー脱着-イオン化質量分析法ペプチドマスフィンガープリント法:脱塩処理利用又は非利用によるブロット上又はゲル内消化後の同定効率」2000)。
【０１０７】
第４工程では、消化したタンパク質を、任意の工程として、本発明の追加質量標識と反応させる。大半の酵素的消化と一部の化学的開裂法では、消化分画タンパク質から生じたペプチドに遊離アミンが残り、これが質量標識と反応することができる。このことは、同一の標識が全ペプチド上に出現し、それが選択的に探知されることによりこの分析の感度が最大化されることを意味する。この標識は、増感官能基を含み、好ましくは、タグは、桂皮酸誘導体を含む。
【０１０８】
質量分析法によるペプチドの分析
質量分析法の基本的な特徴は以下の通りである。
導入系→イオン源→質量分析器→イオン探知器→データ捕捉系
ペプチド分析の目的に好ましい導入系、イオン源及び質量分析器がある。
【０１０９】
−導入系−
各種の質量分析法の技術は分離技術、特に毛細管ゾーン電気泳動及び高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)と両立する。ただし、分離が必要な場合にイオン化源の選択はある程度限定してもよい。理由は、ＭＡＬＤＩ及びＦＡＢ等のイオン化技術は固体表面から物質を削除するのでクロマトグラフィー分離には比較的適さないからである。これらの技術の一つによりクロマトグラフィー分離と質量スペクトル分析とを一線に連結することは困難である。動的ＦＡＢ及びスプレーを基礎とするイオン化技術、例えば電子スプレー、熱スプレー、ＡＰＣＩは全てインラインでのクロマトグラフィー分離と両立する。そのような液体クロマトグラフィー質量分析法を実施する装置は市販品として入手可能である。
【０１１０】
−イオン化技術−
質量分析法の生物学への応用には、いわゆる「ソフト」イオン化技術を利用することが多い。それらの技術によりタンパク質及び核酸等の大型分子を本質的に原型のままイオン化することができる。液相技術を使用すれば大型の生物分子を緩和なｐＨの溶液状態でかつ低濃度で質量分析計に導入することができる。電子スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、高速中性粒子衝突イオン化法(ＦＡＢ)、マトリックス支援レーザー脱着イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、大気圧化学的イオン化質量分析法(ＡＰＣＩ−ＭＳ)等の多数の技術が本発明と共に使用するのに適している。ただしこれらに限定されない。
【０１１１】
−電子スプレーイオン化−
電子スプレーでイオン化するには、検体分子の希釈溶液を分析器中に「噴霧する」、即ち微細なスプレー状態で注入することが必要である。例えば、溶液を荷電針の先端から乾燥窒素の気流及び静電界に噴霧する。イオン化のメカニズムは十分に解明されていないが、次のように考えられている。窒素気流中に溶媒が気化する。小滴になると共に検体分子が濃縮される。大部分の生物分子には正味の電荷があるとすると、溶解した分子の静電的な反撥力が増大する。気化を続けるに従いその反撥力は最終的には滴の表面張力より大きくなるので、その滴は更に小さな滴に崩壊する。このプロセスは時々「クーロン破裂」と言われる。静電界が加わると滴の表面張力は更に打破されて噴霧過程は支援される。更に小さな滴からの気化が続くと滴は破裂を繰り返し、遂には溶媒だけの蒸気相に本質的には生物分子が存在する。この技術は質量標識を使用する場合には特に重要である。即ちこの技術では、イオン化の過程でイオンに賦課されるエネルギー量が比較的に小さく、かつ群の中でのエネルギー分布の範囲が他の技術に比較すると狭い傾向にある。電極を適切に配置してセットアップした電界を使用するとイオン化チャンバからイオンが加速されて出てくる。電界の極性を変えて負又は正のイオンを抽出してもよい。電極間の電位差により、質量分析器を通過するイオンの正負が決まり、またイオンが質量分析計に入るための運動エネルギーも決まる。このことは質量分析計でのイオンの分裂を考察する際に重要である。イオンに賦課されるエネルギーが多いほど、検体分子が供給源に存在する浴ガスとの衝突を介して分裂が起こる可能性が大きくなる。電界を調節してイオン化チャンバからイオンを加速すれば、イオンの分裂を制御することができる。これは、標識した生物分子からタグを除去する手段としてイオンの分裂を利用する必要がある場合には有利である。電子スプレーイオン化は、液体クロマトグラフィーとのインライン、即ち液体クロマトグラフィー質量分析法において使用することができるので、特に有利である。
【０１１２】
−マトリックス支援レーザー脱着イオン化(ＭＡＬＤＩ)−
ＭＡＬＤＩでは、生物分子の溶液を大過剰モルの光励起「マトリックス」に埋設する必要がある。適切な振動数のレーザー光を当てると、マトリックスが励起し、次に閉じ込めた生物分子と一緒にマトリックスが迅速に気化する。酸性マトリックスから生物分子にプロトンが移動して生物分子のプロトン形が生じ、これは陽イオン質量分析法、特にフライト時間(ＴＯＦ)質量分析法により探知することができる。陰イオン質量分析法もＭＡＬＤＩ  ＴＯＦにより可能である。この技術ではかなりの量の翻訳エネルギーがイオンに賦課されるが、過剰の分裂を誘導する傾向はない。しかし、電圧を上げると再びこの技術で分裂を制御することができる。この技術はペプチドのマスフィンガープリントを決定するのに有利である。理由は、この技術は質量範囲が大きいこと、スペクトルにおいて単一荷電イオンが優勢であること、そして多重ペプチドを同時に分析可能であることである。
【０１１３】
−高速中性粒子衝突イオン化法−
高速中性粒子衝突イオン化法(ＦＡＢ)では、比較的に揮発しにくい分子を気化しイオン化する技術が多数記述されている。これらの技術では、試料と高エネルギー光線のキセノン原子又はセシウムイオンとの衝突により試料が表面から脱着する。簡単なマトリックス、通常は非揮発性物質、例えばｍ−ニトロベンジルアルコール(ＮＢＡ)又はグリセロールで試料を表面上にコートする。ＦＡＢの技術も液相導入システムと両立する。毛細管電気泳動導入システム又は高圧液体クロマトグラフィーシステムから溶出する液体が半溶ガラスを通過し、本質的にその半溶ガラスの表面を検体溶液がコートし、それを原子衝突によりその半溶ガラスの表面からイオン化する。
【０１１４】
−質量分析器−
衝突誘導解離によりペプチドを分裂し、それらの配列を決定することを本発明で利用すれば、タンパク質の消化生成物の質量パターンでは同定されないタンパク質を同定することができる。質量分析器の各種結合構成を使用すれば、ペプチドを分裂し、その断片の質量を決定することができる。
【０１１５】
−ペプチドのMS/MS及びMSn分析−
タンデムの質量分析計によって、質量対電荷の比を予め決めてあるイオンが衝突誘導解離(CID)によって選択され分裂される。次に分裂断片を探知することにより、選択されたイオンに関する構造情報が得られる。タンデム質量分析計でCIDによりペプチドを分析すると、特徴的な開裂パターンが観察され、このパターンによってペプチドの配列を決定することができる。一般に天然ペプチドはペプチド骨格のアミド結合の位置で無作為に分裂し、そのペプチドに特徴的なイオンシリーズが得られる。イオンの電荷がイオンのＮ末端断片に保持される場合には、ｎ番目のペプチド結合での開裂に対するCID断片シリーズはａn、bn、cn、等と表示される。同様に、電荷がイオンのC末端断片に保持される場合には断片シリーズはxn、yn、zn、等と表示される。
【０１１６】
【化６】
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【０１１７】
トリプシンとトロンビンは、タンデム質量分析法にとって好ましい開裂剤である。理由は、これらは分子の両末端に塩基性基、即ちＮ末端にαアミノ基、Ｃ末端にリジン又はアルギニン側鎖を持ったペプチドを産生するからである。これは二重荷電イオンの形成に有利であり、このイオンでは荷電中心が分子の反対末端にある。CIDをすると、これら二重荷電イオンからＣ末端イオンシリーズ及びＮ末端イオンシリーズが産生する。これを手がかりにしてペプチドの配列を決定する。一般的に言うと、所与のペプチドのCIDスペクトルには可能なイオンシリーズの唯1個又は２個が観察される。四重極装置に特徴的な低エネルギー衝突ではｂシリーズのＮ末端断片又はｙシリーズのＣ末端断片が優勢である。二重荷電イオンを分析する場合には両方のシリーズがしばしば探知される。一般に、ｙシリーズイオンはｂシリーズより優勢である。
【０１１８】
一般に、ペプチドが分裂するメカニズムには、アミド骨格のプロトン化とその後の分子内親核攻撃が関与しており、それは５員環オキサゾロン構造の形成とプロトン化したアミド結合の開裂に至る(Schlosser  A.及びLehmann  W.D.  J.  Mass  Spectrom.  35:  1382-1390「ペプチドの単分子反応における５員環形成：低エネルギー衝突で誘導される解離」2000)。図16aは、この種の分裂が行われるメカニズムの一つの提案を示す。このメカニズムでは、親核攻撃を実行するために、プロトン化したアミドのＮ末端側にありかつプロトン化したアミドに隣接するアミド結合に由来するカルボニル基が必要である。荷電したオキサゾロニウムイオンによってｂ−シリーズのイオンが生成し、他方Ｎ末端断片からＣ末端断片にプロトンが移動すると図16aに示すようにｙ−シリーズのイオンが生成する。カルボニル基が適切な位置に存在するためのこの必要条件は、Ｎ末端が保護されておらずかつ一般的にペプチドのＮ末端とその次のアミノ酸の間のアミド結合に対しｂ−シリーズイオンが存在しない場合には、Ｎ末端アミノ酸に隣接するアミド結合を開裂する原因とはならない。しかし、Ｎ末端をアセチル化したペプチドがこのメカニズムの構造上の必要条件を実際に充足する場合には、このメカニズムに従って第一アミノ酸に直接続くアミド結合で分裂が起こり得る。
【０１１９】
ポリペプチド又はペプチドのアミド骨格が容易に分裂するか否かはペプチドの側鎖官能基によって有意に調節される。したがって、ペプチドは、どこで最も容易に分裂するかはその配列によって決まる。ペプチド配列のどのアミド結合が容易に分裂するかを予測することは一般に困難である。本発明のペプチド質量タグをデザインするに当たりこのことは重要な結果を招く。しかし、ある種の観察によると、所望するアミド結合で開裂するペプチド質量タグをデザインすることは可能である。例えば、プロリンはそのＮ末端アミド結合で分裂を促進することが知られている(Schwartz  B.L.、Bursey  M.M.,  Biol.  Mass  Spectrom.  21：９2,1997)。この理由は、Ｃ末端アミドで開裂するとエネルギー的に不利な歪のある二環状オキサゾロン構造が生ずるからである。アスパラギン酸もそのＮ末端アミド結合で分裂を促進する。しかし、Asp−Pro結合は特に低エネルギーCID分析において不安定であり(Wysocki  V.H.ら  J.Mass  Spectrom.  35(12)：１399-1406「移動性かつ局在化プロトン：ペプチド解離を理解するための枠組み」2000)、この状態ではアスパラギン酸はそのＣ末端側のアミド結合の開裂を促進するように見える。
【０１２０】
タンデム質量分析計の代表的な結合構造は四重極の三連式であり、衝突チャンバで分離された２個の四重極質量分析器と１個の四重極を含有している。この衝突四重極は二つの質量分析器四重極の間のイオンガイドとして機能し、これら質量分析器四重極の中にガスが導入されると第一の質量分析器からのイオン気流と衝突することができる。第一の質量分析器によりイオンはその質量／電荷の比を基礎にして選択され、通過する衝突セルで分裂する。分裂の程度は、イオンを加速する電界を変えることによって、あるいは衝突セルのガスを変えることによって制御してよい。例えばヘリウムをネオンに置換することができる。断片イオンを第三の四重極で分離し探知する。タンデム質量分析計以外の結合構造で誘導開裂を実行してもよい。ガスがトラップに導入される過程で、イオン捕捉質量分析計により分裂は促進される。即ち、トラップで捕捉されたイオンは加速されて衝突することができる。イオントラップには通常は浴ガス、例えばヘリウムが含有されているが、例えばネオンを追加すると分裂が促進される。同様に、フォトン誘導分裂を捕捉されたイオンに適用することができる。他の好ましい結合構造は四重極／直交飛行時間式タンデム装置であり、これでは高走査速度の四重極と高感度のレフレクトロンＴＯＦ質量分析器とを結合して分裂産生物を同定する。
【０１２１】
従来の「セクター」方式装置はタンデム質量分析法で普通に使用する結合構造である。セクター質量分析器は二つの別々の「セクター」を包含しており、電気セクターがイオン光線に焦点を合わせると供給源が電界を使用して同一の運動エネルギーを持つイオン流の中に放置される。磁気セクターはイオンをその質量に基づいて分離し探知器でスペクトルが形成される。タンデム質量分析法には、この種の二つのセクターからなる質量分析器を使用することができ、その分析器では電気セクターが第一質量分析器に、磁気セクターが第二質量分析器に、二つのセクター間に置かれる衝突セルを提供する。この結合構造は質量標識の付いた核酸から標識を開裂するのに極めて効果と思われる。衝突セルで分離された二つの完全セクターからなる質量分析器は質量標識したペプチドの分析にも使用することができる。
【０１２２】
−イオン捕捉器−
イオン捕捉質量分析計は四重極スペクトル計に関係する。一般にイオン捕捉器には3個の電極からなる構造をしており、即ち各端に「キャップ」電極があり、それらによって空洞が形成されている円筒状電極である。円筒状電極には交流高周波電位を与え、キャップ電極にはＤＣ又はＡＣ電位でバイアスを架ける。空洞に注入されたイオンは円筒状電極の振動電界により捕捉器内の安定な軌道に拘束される。しかし、与えられた振幅の振動電位に対してある種のイオンは不安定な軌道をとり、捕捉器から放出される。振動高周波電位を変化することによって、捕捉器に注入したイオン試料をそれらの質量／電荷比に応じて捕捉器から連続的に放出させることができる。次に放出されたイオンを探知することによって質量スペクトルが得られる。
【０１２３】
一般にイオン捕捉器は、イオン捕捉器の空洞に存在する少量の「浴ガス」、例えばヘリウムで操作される。これにより装置の解像度と感度の両方が増加する。その理由は、捕捉器に入ったイオンは本質的には浴ガスとの衝突を経て浴ガスの環境温度にまで冷却されるからである。衝突すると、試料を捕捉器に導入した時のイオン化は増加するが、それと共にイオン軌道の振幅と速度は落着しイオン軌道は捕捉器の中央近傍に保持される。このことは、振動電位を変更することにより軌道が不安定になったイオンは落着している回流イオンに比べると急速にエネルギーを獲得し、緊密な束となって捕捉器から飛び出し、その結果、ピークが狭く大きくなる。
【０１２４】
イオン捕捉器は、タンデム質量分析計の結合構造を模倣することができ、実際に多重質量分析計の結合構造を模倣することにより、捕捉イオンの複雑な分析が可能になっている。試料由来の単一の種は捕捉器に保持できる、即ちその他の種は全て捕捉器から放出させることができ、保持した種は、注意しながら第一振動周波の上に第二振動周波を超負荷することにより励起することができる。次に励起されたイオンは浴ガスと衝突し、十分に励起されると分裂する。次にその断片を更に分析することができる。更なる分析をする断片イオンは、他のイオンを捕捉器から排出することによって保持し、その断片を励起して分裂させることができる。十分な試料が存在する限りこのプロセスを反復することにより、更なる分析が可能になる。留意すべきこととして、これらの機器は一般に誘導分裂後の断片イオンを高い存在割合で保持する。これらの機器及びFTICR質量分析計(後記)は、線形質量分析計に存在する空間的に解決されタンデム質量分析法というもむしろ一時的に解決されたタンデム質量分析法の形態を代表するものである。
【０１２５】
−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法(FTICR  MS)−
FTICR質量分析計には、イオン試料が空洞内に保持されるという点でイオン捕捉器と類似の特徴があるが、FTICR  MSではイオンは交差電磁界により高真空チャンバに捕捉される。電界は箱の二つの側面を形成する一対の平板電極によって形成される。この箱は磁石の磁界に含まれる。この磁石は、電界を形成しかつ捕捉平板と呼ばれる二枚の平板に連結しており、捕捉平板の間にあってかつ架けた磁界に直交する円形軌道に注入イオンを拘束する。箱の他の対立側を形成する二枚の「送信板」に高周波パルスを架けるとイオンはより大きな軌道の中に励起される。イオンの円形運動によりそれに対応する電界が、「受信板」を含む箱の残りの二つの対立側に発生する。励起パルスによりイオンはより大きな軌道に励起されるが、衝突を経てイオンの固有運動が失われるに従いこの軌道は崩壊する。受信板が探知した対応シグナルはフーリエ変換解析により質量スペクトルに変換する。
【０１２６】
誘起分裂実験のために、これらの機器は、イオン捕捉器と類似の方法、即ち問題の単一種を除く全てのイオンが捕捉器から排出可能となるという方法で動作することができる。衝突ガスを捕捉器に導入して分裂を誘起することができる。その後に断片イオンを分析することができる。一般に分裂産生物と浴ガスとが結合すると、「受信板」が探知したシグナルのFT分析によって分析する場合に解像性が貧しくなる。しかし、断片イオンを空洞から放出させ、例えば四重極のあるタンデム構成の中で分析することができる。
【実施例】
【０１２７】
（実施例１）
−チオール基及びεアミノ基標識のための標識条件−
一般に大部分のタンパク質には１以上のシステイン残基があり、それが架橋結合してジスルフィッド架橋を形成し、しかもシステインのチオール基はポリペプチドの中で最も反応性のある側鎖であるから、任意の遊離εアミノ基と同様にこの官能基を封鎖するプロトコールを見出すことは重要である。本発明で使用する立体障害のあるミカエル試薬はεアミノ基と同様にチオール基とも容易に反応するので、1個の反応で両方の官能基を標識することができる。
あるいはまた、εアミノ基を本発明の立体障害のあるミカエル試薬で標識する前にチオール基を別の試薬で標識してもよい。
【０１２８】
−別々のタグでチオール基とεアミノ基を防護−
本実験では、2個のシステイン残基がジスルフィッド架橋になっているサケのカルシトニン(10nmol、Calbiochem)をpH7.5の10mM炭酸ナトリウム中に2M尿素と0.5Mチオウレアを含有するタンパク質変性用緩衝液に0.2μMトリス(カルボキシエチル)フォスフィン(TCEP）の存在下で溶解した。TCEPはジスルフィッド架橋を還元する。また反応混合液にはヨードアセタミド(チオール1部位当たり20等量、400nmol)が含有されたが、これは遊離チオールと容易に反応する。この反応液を室温で90分間放置した。次に水酸化ナトリウムを添加して緩衝液のpHを10と12の間に上昇した。次にピリジルプロペニルスルフォンを反応液に添加しサケのカルシトニン中の遊離リジン残基を防護した。このペプチドにはリジン残基が二つある。次に反応液を脱塩（オアシス親水親油バランス抽出カートリッジ、Waters）し、MALDI  TOF質量分析法により分析した。質量スペクトルを図７に示す。この質量スペクトルから見られるように、多数の異なる種がペプチドの異なる標識体に対応して質量スペクトルに出現している。二つの異なる標識によっていろいろな組み合わせの不完全反応液が生ずる。
【０１２９】
−一つのペプチド上のチオール基とεアミノ基を同一のタグで防護−
本実験では、ヒトのカルシトニン10nmolをpH7.5の10mM炭酸ナトリウム中に2M尿素と0.5Mチオウレアを含有するタンパク質変性用緩衝液に0.2μMトリス(カルボキシエチル)フォスフィン(TCEP）の存在下で溶解した。TCEPはジスルフィッド架橋を還元する。この反応液を30分間放置し、全てのジスルフィッド架橋を完全に還元した。還元反応後に、εアミノ基とチオール基を含むだけであると仮定した反応部位当たり40当量のピリジルプロペニルスルフォンを反応混合物に加えた。反応液をpH8で室温に90分間放置した。次に水酸化ナトリウムを添加して緩衝液のpHを10と12の間に上昇した。反応液をこの高いpHで室温に4時間放置し、ペプチド中の遊離リジン残基を防護した。反応しなかったタグは過剰のリジンで消化した。次に反応液を脱塩（オアシス親水親油バランス抽出カートリッジ、Waters）し、MALDI  TOF質量分析法により分析した。質量スペクトルを図８に示す。この質量スペクトルから見られるように、各ペプチドの異なる標識体に対応して質量スペクトルに出現している異なる種の数は、チオール基とεアミノ基に二つの別々のタグを使用したプロトコールでの数よりも遥かに小さい。
【０１３０】
−混合ペプチド上のチオール基とεアミノ基を同一のタグで防護−
本実験では、βメラニン細胞刺激ホルモン(βMSH)、αメラニン細胞刺激ホルモン(αMSH)、サケのカルシトニン及び残基数１〜24個の副腎皮質刺激ホルモン(ACTH(1〜24))(全てSigma-Aldrich,  Dorset,  UKから入手)を含有する混合ペプチド(各10nmol)をpH7.5の10mMホウ酸ナトリウム中に2M尿素と0.5Mチオウレアを含有するタンパク質変性用緩衝液に0.2μMトリス(カルボキシエチル)フォスフィン(TCEP）の存在下で溶解した。この反応液を30分間放置し、全てのジスルフィッド架橋を完全に還元した。還元反応後に、εアミノ基とチオール基を含むだけであると仮定した反応部位当たり40当量のピリジルプロペニルスルフォンを反応混合物に加えた。反応液をpH8で室温に90分間放置した。次に水酸化ナトリウムを添加して緩衝液のpHを10と12の間に上昇した。反応液をこの高いpHで室温に4時間放置し、ペプチド中の遊離リジン残基を防護した。反応しなかったタグは過剰のリジンで消化した。次に反応液を脱塩（オアシス親水親油バランス抽出カートリッジ、Waters）し、MALDI  TOF質量分析法により分析した。質量スペクトルを図９に示す。この質量スペクトルから見られるように、各ペプチドの異なる標識体に対応して質量スペクトルに出現している異なる種の数は、チオール基とεアミノ基に二つの別々のタグを使用したプロトコールでの数よりも遥かに小さい。
【０１３１】
−未封鎖αアミノ基の防護−
上記混合ペプチドの防護後に、未封鎖αアミノ基をN−ヒドロキシサクシニミド酢酸エステルで封鎖した。チオール基とεアミノ基が防護されたペプチドを、αアミノ基当たり40当量の活性エステル試薬にpH11で前に使用した同じホウ酸ナトリウム緩衝液中で室温2時間曝した。この反応の産生物のMALDI  TOF質量スペクトルを図１０に示す。図から見られるように、反応が予想されるペプチド、即ちαMSHを除く４つのペプチド全部の各々とは唯１個のアセチル基が反応している。このことは、防護されたεアミノ基は活性エステル試薬との反応に抵抗することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、本発明での使用に好ましい立体障害のあるアルケニルスルフォン試薬の例を示す。これら試薬の一部の製造に用いる合成手順は、実施例の節で説明されている。
【図２】図２は、本発明の第１態様の図解であり、この場合、ペプチドマスフィンガープリント法に用いるために、配列特異的開裂試薬としてトリプシンを使ってポリペプチドを調製する。
【図３】図３は、本発明の第１態様の図解であり、この場合、ペプチドマスフィンガープリント法に用いるために、配列特異的開裂試薬としてLys-Cを使ってポリペプチドを調製する。
【図４】図４は、本発明の第１態様の図解であり、この場合、ペプチドマスフィンガープリント法に用いるために、配列特異的開裂試薬としてトリプシン、また、ビオチンアフィニティータグを含むリジン選択性タグを使ってポリペプチドを調製する。
【図５】図５は、本発明の第１態様の図解であり、この場合、ペプチドマスフィンガープリント法に用いるために、配列特異的開裂試薬としてLys-Cを使ってポリペプチドを調製する。
【図６】図６は、本発明の第１態様の図解であり、この場合、ペプチドマスフィンガープリント法に用いるために、配列特異的開裂試薬としてトリプシンを使った開裂に先行してポリペプチドと反応させるリジン選択性タグを使ってポリペプチドを調製する。
【図７】図７は、ペプチドのチオール及びεアミノ基の両方を標識するプロトコール実施例のマススペクトルを示す。この実施例では、該ペプチドはカルシトニンSであり、εアミノ基のとは異なるタグでチオールを標識する。
【図８】図８は、ペプチドのチオール及びεアミノ基の両方を同一標識で標識するプロトコール実施例の質量スペクトルを示す。
【図９】図９は、ペプチド混合物のチオール及びεアミノ基の両方を標識するプロトコール実施例の質量スペクトルを示す。この実施例では、チオールをεアミノ基のタグと同一のタグで標識する。
【図１０】図１０は、ペプチド混合物のα-アミノ基を標識するプロトコールの実施例で、この場合、ペプチドのチオールとε-アミノ基は、両方とも、すでに同一質量タグで封鎖されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月8日(2003.5.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの特徴を分析する方法であって、
（ａ）任意の工程としてポリペプチドのシステインジスルフィド架橋を還元して遊離チオールを形成し、該遊離チオールを防護する工程、
（ｂ）配列特異的開裂試薬で該ポリペプチドを開裂してペプチド断片を形成する工程、
（ｃ）任意の工程として開裂試薬を不活性化する工程、
（ｄ）存在する１以上のεアミノ基を立体障害のあるミカエル試薬を包含するリジン反応剤で防護する工程、
（ｅ）ペプチド断片を質量分析法により分析して該ポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程、及び
（ｆ）該マスフィンガープリントから該ポリペプチドを同定する工程、
を含むことを特徴とするポリペプチドの特徴分析方法。
【請求項２】
複数のポリペプチドの特徴を分析する方法であって、
（ａ）任意の工程として１以上のポリペプチドのシステインジスルフィド架橋を還元して遊離チオールを形成し、該遊離チオールを防護する工程、
（ｂ）１以上のポリペプチドを該複数のポリペプチドから分離する工程、
（ｃ）配列特異的開裂試薬で１以上のポリペプチドを開裂してペプチド断片を形成する工程、
（ｄ）任意の工程として開裂試薬を不活性化する工程、
（ｅ）存在する１以上のεアミノ基を立体障害のあるミカエル試薬を包含するリジン反応剤で防護する工程、
（ｆ）ペプチド断片を質量分析法により分析して１以上のポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程、及び
（ｇ）該マスフィンガープリントから１以上のポリペプチドを同定する工程、
を含むことを特徴とするポリペプチドの特徴分析方法。
【請求項３】
各試料が１以上のポリペプチドを含有する複数の試料を比較する方法であって、
（ａ）任意の工程としてシステインジスルフィド架橋を還元し該試料由来の１以上のポリペプチド中の遊離チオールを防護する工程、
（ｂ）１以上のポリペプチドを各試料から分離する工程、
（ｃ）配列特異的開裂試薬で該ポリペプチドを開裂してペプチド断片を形成する工程、
（ｄ）任意の工程として開裂試薬を不活性化する工程、
（ｅ）存在する１以上のεアミノ基を立体障害のあるミカエル試薬を包含するリジン反応剤で防護する工程、
（ｆ）ペプチド断片を質量分析法により分析して該試料中の１以上のポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程、及び
（ｇ）１以上のマスフィンガープリントから試料中の１以上のポリペプチドを同定する工程、
を含むことを特徴とする比較方法。
【請求項４】
リジン反応剤が標識したリジン反応剤である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
各試料が１以上のポリペプチドを含有する複数の試料を比較する方法であって、
（ａ）任意の工程としてシステインジスルフィド架橋を還元し該試料由来の１以上のポリペプチド中の遊離チオールを防護する工程、
（ｂ）各試料中に存在する１以上のεアミノ基を被標識リジン反応剤で防護する工程、
（ｃ）試料をプールする工程、
（ｄ）プールした試料から１以上のポリペプチドを分離する工程、
（ｅ）配列特異的開裂試薬で該ポリペプチドを開裂してペプチド断片を形成する工程、
（ｆ）任意の工程として開裂試薬を不活性化する工程、
（ｇ）ペプチド断片を質量分析法により分析して試料中の１以上のポリペプチドのマスフィンガープリントを形成する工程、及び
（ｈ）１以上のマスフィンガープリントから試料中の１以上のポリペプチドを同定する工程、
を包含し、さらに、同一の試料に由来するポリペプチド又はペプチドには同一の標識を使用し、別の試料に由来するポリペプチド又はペプチドには別の標識を使用し、ポリペプチド又はペプチドが由来する試料をその標識によって決定可能となるようにする請求項３に記載の比較方法。
【請求項６】
配列特異的開裂試薬がリジン残基のＣ末端側で該１以上のポリペプチドを開裂する請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
配列特異的開裂試薬がＬｙｓ−Ｃ及びトリプシンのいずれかを包含する請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
εアミノ基が防護されたペプチド断片を親和捕捉により除去し、かつリジン反応剤がビオチンを包含する請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
立体障害のあるミカエル試薬が次の構造を有する化合物である請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【化１】
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ただし、式中、Ｘは電子吸引基であり陰電荷を安定化することができ、各々のＲ基は独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基及び芳香族基のいずれかを包含し、Ｒの少なくとも１は立体障害基を包含し、Ｒ２基は水素原子、ハロゲン原子、炭化水素基、電子吸引基、及び、親和捕捉官能基に付着可能なリンカー及び固相担体に付着可能なリンカーのいずれか、から選択される少なくとも１つを包含する。
【請求項１０】
一つのＲがメチル基及びフェニル基のいずれかを包含する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１のＲが電子吸引基を包含する請求項９から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１のＲが環状及び複素環状のいずれかの芳香環及び縮合環のいずれかを包含する請求項９から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
Ｘが−ＳＯ２Ｒ１であり、Ｒ１はアルキル基及びアリール基のいずれかを表し、該アリール基が芳香族基、環状基、縮合環状基及び複素環状基から選択されるいずれかを含む請求項９から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ１が電子吸引基を包含する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
環がフェニル、ピリジル、ナフチル、キノリル、ピラジン、ピリミジン、及びトリアジンのいずれかの環を包含する請求項１３から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
Ｘ基が電子吸引基で置換されている請求項９から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
電子吸引基がフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子、ニトロ基及びニトリル基から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｘ基が水溶性を向上可能な構造を包含する請求項９から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチド又は試料が、細胞画分を包含する請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
更に液体クロマトグラフィーによりポリペプチド又は試料を調製する工程を含む請求項１から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
テスト試料中の１以上の特定標的ポリペプチドを分析する方法であって、請求項１から２０のいずれかに記載の方法を実行し、１以上のマスフィンガープリントを該標的ポリペプチドに特異的な既定のマスフィンガープリントについて分析して該標的ポリペプチドの配列を決定することを特徴とする方法。
【請求項２２】
１以上の試料の発現プロファイルを決定する方法であって、請求項１から２１のいずれかに記載の方法に従って、１以上の試料由来の１以上のポリペプチドの特徴を分析することを包含する方法。
【請求項２３】
質量分析法により探知した各ポリペプチドの量を確定することを包含する請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
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