(57)【要約】本発明は、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合物において、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させる方法であって、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させるのに十分なｐＨ条件下で、クロマトグラフィーカラムと混合物を接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記Ｆｃ含有分子がプロテインＡを実質的に含まないように、クロマトグラフィーカラムからＦｃ含有分子を溶出することをさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ｐＨ条件が約６．０未満のｐＨを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ｐＨ条件が約３．７より高いｐＨを含んでなる、請求項１の方法。
【請求項５】
ｐＨ条件が、前記混合物に、疎水性相互作用を減少させるかまたは阻害する剤を添加することによって達成される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記剤がエチレングリコールである、請求項５の方法。
【請求項７】
前記ｐＨ条件が、前記混合物に、アルギニンを添加することによって達成される、請求項４の方法。
【請求項８】
前記ｐＨ条件が、エチレングリコールと組み合わせてアルギニンを添加することによって達成される、請求項４の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィーカラムが金属キレートクロマトグラフィーカラムである、請求項１の方法。
【請求項１０】
ｐＨ条件が約５．０〜約５．７の間である、請求項９の方法。
【請求項１１】
ｐＨ条件が約５．０である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
エチレングリコールを前記混合物に添加する、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記クロマトグラフィーカラムがＩＭＡＣカラムであり、そして前記カラムを、５０％エチレングリコール、１Ｍ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する緩衝液を用いて、約５．０のｐＨで洗浄し、それによって、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子の複合体を解離させる、請求項１の方法。
【請求項１４】
混合物において、プロテインＡおよびＦｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させる方法であって、プロテインＡおよびＦｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させるのに十分なｐＨ条件下で、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムと混合物を接触させて、アルギニンを含有する緩衝液で、前記カラムを洗浄することを含んでなる、前記方法。
【請求項１５】
ｐＨ条件が約４．１〜約４．５の間である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ｐＨ条件が約４．１である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
クロマトグラフィーカラムがＱカラムである、請求項１の方法。
【請求項１８】
ｐＨ条件が約５．５〜約５．７の間である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
ｐＨ条件が約５．５である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
エチレングリコールを前記混合物に添加する、請求項１７の方法。
【請求項２１】
前記Ｆｃ含有分子がｒＰＳＧＬ−Ｉｇである、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、仮特許出願第６０／２９６，４０２号、２００１年６月５日出願の優先権の利益を請求する。
関連出願
本出願はまた、先願仮特許出願第６０／１９３，３５１号、２０００年３月２７日出願、先願米国特許出願第０９／８１９，１５７号、２００１年３月２７日出願（係属中）、および先願国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０９８１５号、２００１年３月２７日出願にも関する。上に引用した出願各々の全内容が、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
発明の分野
［０００１］本発明は、混合物において、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させる方法に関する。
【０００３】
関連背景技術
［０００２］標的タンパク質の精製は、ＤＮＡ／タンパク質相互作用のため、ＤＮＡ除去が不十分になることによって、しばしば妨げられる。ＤＮＡ／タンパク質相互作用は、非常に陰イオン性である標的タンパク質、例えば硫酸化タンパク質の精製において、より問題である。タンパク質、例えば免疫グロブリンドメインを含有するタンパク質の精製もまた、プロテインＡからＦｃ含有分子を分離するのに必要な解離のｐＨが低いことに基づいて、しばしば困難である。標的タンパク質からＤＮＡを除去するのに有用な方法の同定および標的タンパク質からプロテインＡを除去する方法の同定は、多様なタンパク質の精製に非常に有益であろう。
【０００４】
［０００３］国際公開第ＷＯ０１／７２７６９号は、非常に陰イオン性である標的タンパク質、および免疫グロブリンドメインを含んでなる標的タンパク質、例えば硫酸化タンパク質を単離し、そして精製する方法を記載する。陰イオン性タンパク質は、正味の負荷電を有するタンパク質である。硫酸化タンパク質は、正味の負荷電が、少なくとも約１つの硫酸化残基のためであるタンパク質である。標的タンパク質の硫酸化は、標的タンパク質内に含有されるアミノ酸（類）上またはアミノ酸（類）間の、少なくとも１つの水酸基（−ＯＨ）の−ＳＯ4Ｈでの置換を指す。好ましい態様において、硫酸化タンパク質は、少なくとも約１つの硫酸基を有する。少なくとも約２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多い硫酸基を含有する硫酸化タンパク質もまた、本方法に含まれ、例えば、ＰＳＧＬ−１（Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１）に具体化されるＮ末端チロシン上の６つの硫酸基がある。
【０００５】
［０００４］特に、国際公開第ＷＯ０１／７２７６９号は、１つの側面において、非常に陰イオン性である標的タンパク質を精製する方法であって、標的タンパク質の精製に適した条件下でのイオン交換クロマトグラフィー工程を含んでなる、前記方法を開示する。例えば、開示される方法は、（１）荷電分子と可逆的に結合可能な支持体と試料を接触させ、それによって標的タンパク質を支持体に結合させ、（２）試料中の複数のタンパク質性不純物および非タンパク質性不純物が支持体に結合しないかまたは支持体から洗い流される一方、非常に陰イオン性である標的タンパク質が結合しつづけるのに適した条件下で、支持体を第一の洗浄溶液で洗浄し、（３）高いモル濃度の塩溶液を含んでなる第一の溶出溶液で試料を溶出し、そして（４）精製された陰イオン性標的タンパク質を含有する溶出試料を収集することを提供する。
【０００６】
［０００５］１つの態様において、第一の洗浄溶液のｐＨは約４．０〜８．０であることが開示される。別の態様において、第一の洗浄溶液のｐＨは約６．５であることが開示される。
【０００７】
［０００６］好ましい態様において、非常に陰イオン性である標的タンパク質が硫酸化タンパク質であり、そして不純物には標的タンパク質の硫酸化型が含まれることが開示される。
【０００８】
［０００７］国際公開第ＷＯ０１／７２７６９号はまた、精製された標的タンパク質を含有するイオン交換クロマトグラフィー精製由来の溶出試料を、さらに精製することが可能であることも開示する。このさらなる精製は、例えば、非常に陰イオン性である標的タンパク質を精製するのに適した条件下での疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび／または金属キレートクロマトグラフィー工程を含んでなる。例えば、このさらなる精製は、（１）標的タンパク質を含有する溶出試料を、金属キレートクロマトグラフィーカラムまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに通過させ、それによって溶出試料をカラム上に捕捉し、（２）試料に含有されるＤＮＡ／ヒストン複合体が解離するのに適した条件下、第二の洗浄溶液でカラムを洗浄し、（３）第二の溶出溶液で試料を溶出し、そして（４）精製された非常に陰イオン性である標的タンパク質を含有する溶出試料を収集することを提供する。
【０００９】
［０００８］１つの開示される態様において、第二の洗浄溶液は高い塩濃度を含んでなり、そして第二の溶出溶液は、第二の洗浄溶液より低い塩濃度を含んでなる。例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー条件下で、第二の洗浄溶液中の塩濃度は約４Ｍであり、そして第二の溶出溶液中の塩濃度は約０．４８Ｍである。あるいは、疎水性相互作用クロマトグラフィー下で、第二の洗浄溶液は（ａ）約４ＭのＮａＣｌおよび約２０ｍＭのＴｒｉｓを含んでなり、そして約７．４のｐＨである溶液、（ｂ）約５％のイソプロパノールおよび約１．２Ｍの硫酸アンモニウムを含んでなる溶液、（ｃ）約５％のエタノールおよび約１．２Ｍの硫酸アンモニウムの溶液、並びに（ｄ）約５％のエタノールおよび約４ＭのＮａＣｌの溶液からなる群より選択される。
【００１０】
［０００９］鉄キレートクロマトグラフィー条件下で、例えば、第二の洗浄溶液が約２Ｍの塩濃度を含んでなり、そして第二の溶出溶液が約２００ｍＭ〜１Ｍの塩濃度を含んでなることがさらに開示される。あるいは、鉄キレートクロマトグラフィー条件下で、第二の洗浄溶液は、約４０ｍＭのＭＥＳ、約２ＭのＮａＣｌ、および約５ｍＭのイミダゾールを含んでなり、そして第二の溶出溶液は、約４０ｍＭのＭＥＳ、約１ＭのＮａＣｌ、および約３５ｍＭのイミダゾールを含んでなる。
【００１１】
［００１０］国際公開第ＷＯ０１／７２７６９号は、標的タンパク質が少なくとも約１つの硫酸化を有することを開示する。少なくとも約２、３、４、５、６、またはそれより多い硫酸化を有する陰イオン性標的タンパク質、例えばＰＳＧＬ−１タンパク質もまた開示される。開示される方法で精製可能な陰イオン性タンパク質は、天然存在タンパク質または組換えタンパク質であることが可能である。
【００１２】
［００１１］国際公開第ＷＯ０１／７２７６９号にやはり開示されるのは、免疫グロブリンドメイン（例えば免疫グロブリンＦｃドメイン）を含んでなる非常に陰イオン性であるタンパク質、例えばＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製法である。この開示される方法は、（１）免疫グロブリンドメインを含んでなる標的タンパク質のＦｃ部分に結合可能な支持体と試料を接触させ、それによって標的分子が支持体に結合し、（２）試料に含有される混入物質が洗い流されるのに適した条件下、第一の洗浄溶液で支持体を洗浄し、（３）ｐＨが低い、例えば約４．０、好ましくは約３．７である、第一の溶出溶液で、試料を溶出し、そして（４）精製された陰イオン性標的タンパク質を含有する溶出試料を収集する工程を含んでなる。
【００１３】
［００１２］免疫グロブリンドメインを含んでなる、精製された非常に陰イオン性である標的タンパク質を含有するＦｃ結合支持体から溶出した試料をさらに精製することが可能であることが、さらに開示される。例えばさらなる精製は、（１）免疫グロブリンドメインを含んでなる、精製された陰イオン性標的タンパク質を含有する溶出試料を、荷電分子に可逆的に結合可能な支持体と接触させ、それによって試料中の複数のタンパク質性不純物および非タンパク質性不純物が支持体に結合しないかまたは支持体から洗い流される一方、標的タンパク質が支持体に結合しつづけるようにし、（２）ｐＨが低い、例えば約４．０、好ましくは約３．８である、第二の洗浄溶液で、支持体を洗浄し、（３）試料を第二の溶出溶液で溶出し、そして（４）免疫グロブリンドメインを含んでなる、精製された陰イオン性標的タンパク質を含有する溶出試料を収集する工程を含んでなる。
【００１４】
［００１３］１つの側面において、免疫グロブリンドメインを含んでなる標的タンパク質が少なくとも約１つの硫酸化を有することが開示される。少なくとも２、３、４、５、６、またはそれより多い硫酸化を持つタンパク質を含んでなる免疫グロブリン、例えばＰＳＧＬ−Ｉｇもまた、国際公開第ＷＯ０１／７２７６９号に開示される。
【００１５】
［００１４］好ましい態様において、開示される精製法は、混入タンパク質を少なくとも約９９．９％含まない、精製された非常に陰イオン性である標的タンパク質、および免疫グロブリンドメインを含んでなる精製された非常に陰イオン性であるタンパク質（例えばＰＳＧＬ−Ｉｇ）を提供する。
【００１６】
［００１５］別の開示される態様において、該発明の精製法は、非常に陰イオン性である標的タンパク質、および免疫グロブリンドメインを含んでなる非常に陰イオン性であるタンパク質から、混入ＤＮＡを少なくとも約９５％または２．５ｌｏｇ10除去値（ＬＲＶ）分、除去する。
【００１７】
［００１６］しかし、混合物において、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させる方法が、非常に望ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
発明の概要
［００１７］本発明は、例えば疎水性相互作用によって会合する、プロテインＡおよび例えばｒＰＳＧＬ−Ｉｇ分子などのＦｃ含有分子を含有する混合物から、プロテインＡ（例えばｒプロテインＡまたはｒＰＡ）を除去する新規方法を提供する。解離のｐＨを上昇させると、例えば約ｐＨ３．７より高くすると、限定されるわけではないが、Ｑカラム、例えばＱセファロースTMＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム、金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、あるいは陰イオン交換カラムまたは陽イオン交換カラムを含むクロマトグラフィーカラムに混合物を通過させ、それによって混合物からプロテインＡを除去することによって、プロテインＡからｒＰＳＧＬ−ＩｇなどのＦｃ含有分子を分離することが可能になる。解離のｐＨは、アルギニン、および／または限定されるわけではないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、メタノール等を含む、疎水性相互作用を減少させる（壊す）かまたは阻害する（妨げる）組成物または剤いずれかの添加によって上昇させることが可能である。解離のｐＨがより高いと、そうでなく解離が起こる場合より、より正常なｐＨでのｒＰＡの除去が可能になる。また、より高いｐＨ、例えば約ｐＨ３．７より高いｐＨを使用した結果、より低いｐＨ、例えばｐＨ３．７による、いくつかのＦｃ含有タンパク質に対するダメージ、例えば硫酸化またはシアル化の喪失、あるいはＡｓｐ−Ｐｒｏ切断の導入がより少なくなる。
【００１９】
［００１８］以前は、一般的に、ＱカラムへのＦｃ分子またはｒプロテインＡの結合を可能にするにはｐＨが低すぎたため、Ｑカラムは、Ｆｃ含有タンパク質（非常に陰イオン性であるＦｃ含有タンパク質以外）からのｒＰＡの解離には使用不能であった。例えばアルギニンおよび／またはエチレングリコールの使用によって、解離のｐＨを上昇させると、解離のｐＨは、解離条件下で、非常に陰イオン性ではない分子を含むＦｃ含有分子に対して、Ｑカラムの使用を可能にするのに十分に高い。
【００２０】
［００１９］また、以前は、解離が起こるのに必要な、通常の低ｐＨ下では、Ｆｃ含有分子およびｒＰＡはやはり、ＩＭＡＣに結合しつづけないであろうため、解離条件下、例えば低ｐＨ下では、ＩＭＡＣカラムは使用不能であった。例えばエチレングリコールの使用によって、解離のｐＨを上昇させることを通じて、ｒプロテインＡを除去するのにＩＭＡＣカラムが使用可能になるように、Ｆｃ含有タンパク質はＩＭＡＣカラムに結合しつづける。
【００２１】
［００２０］ＨＩＣカラムもまた、例えばアルギニンおよび／またはエチレングリコールの使用によって、解離のｐＨを上昇させることを通じて、解離が通常起こるであろうより、より正常なｐＨで、Ｆｃ含有分子からｒＰＡを除去するのに使用可能である。
【００２２】
［００２１］１つの側面において、本発明は、混合物において、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させる方法であって、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させるのに十分なｐＨ条件下で、クロマトグラフィーカラムと混合物を接触させることを含んでなる、前記方法を提供する。１つの態様において、Ｆｃ含有分子がプロテインＡを実質的に含まないように、クロマトグラフィーカラムからＦｃ含有分子を溶出する。別の態様において、ｐＨ条件は約６．０未満のｐＨを含んでなる。さらなる態様において、ｐＨ条件は約３．７より高いｐＨを含んでなる。さらに別の態様において、ｐＨ条件は、前記混合物に、例えばエチレングリコールなどの、疎水性相互作用を減少させるかまたは阻害する剤を添加することによって達成される。別の態様において、ｐＨ条件は、前記混合物に、アルギニンを添加することによって達成される。さらに別の態様において、ｐＨ条件は、エチレングリコールと組み合わせてアルギニンを添加することによって達成される。
【００２３】
［００２２］さらなる態様において、クロマトグラフィーカラムは金属キレートクロマトグラフィーカラムである。さらなる態様において、ｐＨ条件は約５．０〜約５．７の間である。好ましくは、ｐＨ条件は約５．０である。別の態様において、エチレングリコールを前記混合物に添加する。さらに別の態様において、クロマトグラフィーカラムはＩＭＡＣカラムであり、そして該カラムを、５０％エチレングリコール、１Ｍ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する緩衝液を用いて、約５．０のｐＨで洗浄し、それによって、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子の複合体を解離させる。
【００２４】
［００２３］別の側面において、本発明は、混合物において、プロテインＡおよびＦｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させる方法であって、プロテインＡおよびＦｃ含有分子の複合体からＦｃ含有分子を解離させるのに十分なｐＨ条件下で、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムと混合物を接触させて、アルギニンを含有する緩衝液で、該カラムを洗浄することを含んでなる、前記方法を提供する。１つの態様において、ｐＨ条件は約４．１〜約４．５の間である。好ましい態様において、ｐＨ条件は約４．１である。
【００２５】
［００２４］別の態様において、クロマトグラフィーカラムはＱカラムである。さらなる態様において、ｐＨ条件は約５．５〜約５．７の間である。好ましい態様において、ｐＨ条件は約５．５である。さらなる態様において、エチレングリコールを混合物に添加する。
【００２６】
［００２５］別の態様において、Ｆｃ含有分子はｒＰＳＧＬ−Ｉｇである。
［００２６］本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明の詳細な説明
［００２７］本発明は、少なくとも部分的に、非常に陰イオン性である標的タンパク質、および免疫グロブリンドメインを含んでなる非常に陰イオン性であるタンパク質、例えば硫酸化タンパク質（例えば、ＰＳＧＬ−１）を精製する新規方法の発見に基づく。陰イオン性タンパク質は、正味の負荷電を有するタンパク質である。硫酸化タンパク質は、負荷電が、少なくとも約１つの、またはより好ましくは５以上の硫酸化、例えば少なくとも約６の硫酸化のためである陰イオン性タンパク質である。標的タンパク質の硫酸化は、標的タンパク質内に含有されるアミノ酸（類）上またはアミノ酸（類）間の、少なくとも１つの水酸基（−ＯＨ）の−ＳＯ4Ｈでの置換を指す。硫酸化は、例えば、ＰＳＧＬ−１に具体化されるように、Ｎ末端チロシンで起こることが可能である。
【００２８】
［００２８］本発明はまた、部分的に、例えば疎水性相互作用によって会合する、プロテインＡ、および例えばｒＰＳＧＬ−Ｉｇ分子などのＦｃ含有分子を含有する混合物から、プロテインＡ（例えば、ｒプロテインＡまたはｒＰＡ）を除去する新規方法の発見にも基づく。解離のｐＨを上昇させると、例えば約ｐＨ３．７より高くすると、限定されるわけではないが、Ｑカラム、例えばＱセファロースTMＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム、金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、あるいは陰イオン交換カラムまたは陽イオン交換カラムを含むクロマトグラフィーカラムに混合物を通過させ、それによって混合物からプロテインＡを除去することによって、プロテインＡから、ｒＰＳＧＬ−ＩｇなどのＦｃ含有分子を分離することが可能になる。解離のｐＨは、アルギニン、および／または限定されるわけではないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、メタノール等を含む、疎水性相互作用を減少させる（壊す）かまたは阻害する（妨げる）組成物または剤いずれかの添加によって上昇させることが可能である。解離のｐＨがより高いと、そうでなく解離が起こる場合より、より中性のｐＨでのｒＰＡの除去が可能になる。また、より高いｐＨ、例えば約ｐＨ３．７より高いｐＨを使用した結果、より低いｐＨ、例えばｐＨ３．７による、いくつかのＦｃ含有タンパク質に対するダメージ、例えば硫酸化またはシアル化の喪失、あるいはＡｓｐ−Ｐｒｏ切断の導入がより少なくなる。
【００２９】
［００２９］プロテインＡおよびＦｃ含有分子の解離に好ましいｐＨ条件には、３．７〜６．０、４．０〜６．０、４．５〜６．０、５．０〜６．０、５．０〜５．７、５．２〜５．７、および５．５〜５．７のｐＨ範囲が含まれる。プロテインＡおよびＦｃ含有分子の解離に好ましいｐＨ条件には、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、および６．０のｐＨでの条件が含まれる。プロテインＡおよびＦｃ含有分子の解離に特に好ましい条件は、６．０未満のｐＨである。やはりプロテインＡおよびＦｃ含有分子の解離に特に好ましい条件は、５．０のｐＨである。
【００３０】
［００３０］疎水性相互作用を減少させる（壊す）かまたは阻害する（妨げる）、好ましい組成物または剤には、限定されるわけではないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、メタノール等が含まれる。プロテインＡおよびＦｃ含有分子を解離させる際に使用するのに特に好ましいのはエチレングリコールである。疎水性相互作用を減少させる（壊す）かまたは阻害する（妨げる）組成物または剤を、例えば１０％〜５０％、１０〜４０％、２０％〜４０％、および２０％〜３０％の間の、例えばエチレングリコールの濃度範囲を含む、クロマトグラフィーカラムを用いたプロテインＡ／Ｆｃ含有分子複合体の分離を可能にするのに十分にｐＨを増加させるのに成功する濃度いずれで用いることも可能である。疎水性相互作用を減少させる（壊す）かまたは阻害する（妨げる）、組成物または剤、例えばエチレングリコールの好ましい濃度には、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、および５０％が含まれる。Ｆｃ含有化合物、例えばｒＰＳＧＬ−ＩｇおよびプロテインＡの解離に特に好ましいのは、５０％の濃度のエチレングリコールである。
【００３１】
［００３１］１つの態様において、プロテインＡからのＦｃ含有分子、例えばｒＰＳＧＬ−Ｉｇの分離には、プロテインＡのかなりの（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ）量を除去するのに十分なｐＨで用いた場合、ＩＭＡＣカラムを使用可能である。好ましい態様において、プロテインＡおよびＦｃ含有分子は、解離のｐＨを上昇させるために５０％エチレングリコールを含有する緩衝液を用いた場合、約５．０〜５．７の間のｐＨ条件下、好ましくは５．０のｐＨで、ＩＭＡＣカラムを用いて解離される。特に好ましい態様において、５０％エチレングリコール、１Ｍ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有する緩衝液を用いて、約５．０のｐＨでＩＭＡＣカラムを洗浄し、結合したＦｃ含有分子、例えばｒＰＳＧＬ−１からｒＰＡを解離させて、それによって、ＩＭＡＣカラムを用いることによって、Ｆｃ含有分子からｒＰＡの有意な部分を除去する。
【００３２】
［００３２］別の態様において、プロテインＡからのＦｃ含有分子、例えばｒＰＳＧＬ−Ｉｇの分離には、プロテインＡのかなりの量を除去するのに十分なｐＨで用いた場合、ＨＩＣカラムを使用可能である。好ましい態様において、プロテインＡおよびＦｃ含有分子は、アルギニンを含有する緩衝液を用いた場合、約４．１〜４．５の間のｐＨ条件下、好ましくは４．１のｐＨで、ＨＩＣカラムを用いて解離される。ＨＩＣカラムは、どちらも５００ｍＭアルギニン中、直前にｐＨ４．１でａｃｖ洗浄して、ｐＨ４．１で用いるか、または５００ｍＭアルギニンを用いてｐＨ４．１で溶出させるが、アルギニン添加前に洗浄せずに、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子複合体からプロテインＡを除去することが可能である。
【００３３】
［００３３］さらなる態様において、プロテインＡからのＦｃ含有分子、例えばｒＰＳＧＬ−Ｉｇの分離には、プロテインＡのかなりの量を除去するのに十分なｐＨで用いた場合、Ｑカラムを使用可能である。好ましい態様において、約５．５〜５．７の間のｐＨ条件下、好ましくは５．５で、Ｑカラムを洗浄する。好ましい態様において、５０％エチレングリコールを用いて、解離のｐＨを上昇させて、Ｆｃ含有分子、例えばｒＰＳＧＬ−ＩｇからプロテインＡを解離させるためのＱカラムの使用を可能にする。
【００３４】
［００３４］本明細書において、用語、プロテインＡの「かなりの量の除去」は、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子複合体からのプロテインＡの１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、５０％〜９０％、または好ましくは、９０％〜１００％の除去を指す。好ましくは、プロテインＡの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％が除去される。
【００３５】
［００３５］本明細書において、Ｆｃ含有分子が実質的にプロテインＡを含まないようなプロテインＡの除去は、例えば混合物における、プロテインＡ／Ｆｃ含有分子複合体からのプロテインＡの１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、５０％〜９０％、または好ましくは、９０％〜１００％の除去を指す。好ましくは、プロテインＡの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％が除去される。
【００３６】
［００３６］好ましい態様において、硫酸化タンパク質はＰＳＧＬ−１、例えば本明細書にその内容が援用される米国特許第５，８２７，８１７号に示すアミノ酸を含んでなるＰＳＧＬ−１、またはその活性部分である。ＰＳＧＬ−１タンパク質の完全アミノ酸配列（すなわちリーダー配列を加えた成熟ペプチド）は、米国特許第５，８２７，８１７号、アミノ酸１〜アミノ酸４０２に示され、そして本明細書において配列番号１と示すアミノ酸配列に特徴付けられる。疎水性解析および既知の切断パターンとの比較によって、シグナル配列は２０〜２２アミノ酸、すなわちＰＳＧＬ−１のアミノ酸１〜２０またはアミノ酸１〜２２と予測される。ＰＳＧＬ−１は、アミノ酸残基３８〜４１に、ＰＡＣＥ（対形成塩基性アミノ酸変換酵素）切断部位（−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−）を含有する。成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質は、配列番号１、アミノ酸４２〜アミノ酸４０２に示すアミノ酸配列によって特徴付けられる。Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質の可溶性型は、米国特許第５，８２７，８１７号に示すアミノ酸配列のアミノ酸２１〜３１０によって特徴付けられる。成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質の別の可溶性型は、米国特許第５，８２７，８１７号、アミノ酸４２〜アミノ酸３１０に示すアミノ酸配列によって特徴付けられる。Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質の可溶性型は、室温で、水性溶液中で可溶性であることによってさらに特徴付けられる。
【００３７】
［００３７］ＰＳＧＬ−１の融合タンパク質（例えばＰＳＧＬ−Ｉｇ）は、当該技術分野に認識される教示を用い、そして本明細書に援用される米国特許第５，８２７，８１７号の教示を用いて作成可能である。ＰＳＧＬ−１タンパク質の断片を、免疫グロブリンなどのキャリアー分子に融合させて、Ｐ−セレクチンリガンド結合部位の価数を増加させることが可能である。例えば、配列番号１のアミノ酸４２〜アミノ酸２９５またはアミノ酸４２〜アミノ酸８８の断片などのＰ−セレクチンリガンドタンパク質の可溶性型を、「リンカー」配列を通じて、免疫グロブリンのＦｃ部分（天然配列、または生じるキメラに望ましい特質（より長い半減期または免疫原性減少など）を与えるために突然変異させた配列）に融合させることが可能である。Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質の二価型に関しては、こうした融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に対するものであることが可能である（例えばｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）。他の免疫グロブリンアイソタイプもまた用いて、こうした融合を生成することが可能である。例えば、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質−ＩｇＭ融合は、本発明のＰ−セレクチンリガンドタンパク質の十価型を生成するであろう。
【００３８】
［００３８］本明細書において、用語「Ｆｃ含有タンパク質」または「Ｆｃ含有分子」には、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合しているかまたは該部分を含むいかなるタンパク質も含まれる。Ｆｃ含有タンパク質の例はｒＰＳＧＬ−Ｉｇである。
【００３９】
［００３９］ＰＳＧＬ−１は、以下の末端炭水化物の１以上を含有する可能性がある糖タンパク質である：
【００４０】
【化１】
2004537042.tif 000002
【００４１】
式中、Ｒ＝Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質に直接共有結合しているか、またはＰ−セレクチンリガンドタンパク質に共有結合している脂質部分に共有結合している、残りの炭水化物鎖である。ＰＳＧＬ−１は、さらに硫酸化されていることが可能であるし、または別の方式で翻訳後修飾されていることが可能である。ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞で発現されるように、全長Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、非還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に示されるように、２２０ｋＤの見かけの分子量を有するホモ二量体タンパク質である。
【００４２】
［００４０］全長ＰＳＧＬ−１の構造には、細胞外ドメイン（ほぼアミノ酸２１〜３１０）、膜貫通ドメイン（ほぼアミノ酸３１１〜３３２）、および細胞内の細胞質ドメイン（ほぼアミノ酸３３３〜４０２）が含まれる。細胞外ドメインは、Ａｓｎ残基６５、１１１、および２９２で始まる、潜在的なＮ結合型グリコシル化の３つのコンセンサス・トリペプチド部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含有する。細胞外ドメインは、残基４６、４８、および５１で、チロシン硫酸化の３つの潜在的な部位をさらに含有する。残基５５〜２６７で構成される領域は、高い割合のプロリン、セリン、およびスレオニンを含有して、１０アミノ酸コンセンサス配列、Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｘ−Ｐｒｏ／Ｌｅｕ−Ａｌａ／Ｔｈｒ、式中、Ｘは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、またはＡｒｇのいずれかであることが可能である、の１５の１０量体反復のサブドメインを含む。これらなどの領域は、非常にＯグリコシル化されたタンパク質に特徴的である。
【００４３】
［００４１］Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質活性を保持しながら、ＰＳＧＬ−１配列の実質的な欠失を行うことが可能である。例えば、配列番号１のアミノ酸４２〜アミノ酸１８９の配列、アミノ酸４２〜アミノ酸１１８の配列、またはアミノ酸４２〜アミノ酸８９の配列を含んでなるＰＳＧＬ−１は、各々、Ｐ−セレクチンタンパク質結合活性およびＰ−セレクチンに結合する能力を保持する。１以上のＮ結合型グリコシル化部位（アミノ酸６５、１１１および２９２のものなど）が他のアミノ酸に変化しているかまたは欠失しているＰＳＧＬ−１タンパク質もまた、Ｐ−セレクチンタンパク質結合活性およびＥ−セレクチンに結合する能力を保持する。アミノ酸４２〜アミノ酸６０（アミノ酸４５〜アミノ酸５８の、該タンパク質の非常に陰イオン性である領域を含む）を含んでなるＰ−セレクチンリガンドタンパク質もまた、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質活性を保持する；しかし、こうした配列に限定されたＰ−セレクチンリガンドタンパク質は、Ｅ−セレクチンに結合しない。好ましくは、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、その硫酸化がＰ−セレクチンリガンドタンパク質活性に寄与する可能性がある、アミノ酸４６、４８および５１に見られるチロシン残基の少なくとも１つ（より好ましくは少なくとも２つ、そして最も好ましくは３つすべて）を保持する。
【００４４】
［００４２］本発明は、以下の実施例にさらに例示され、これらの実施例は限定と解釈されるべきではない。本出願全体を通じて引用される、すべての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、本明細書に援用される。ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列に対するすべての言及は、米国特許第５，８２７，８１７号に示され、そして本明細書において配列番号１と示すＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列に基づく。
【実施例】
【００４５】
実施例
［００４３］方法：タンパク質を精製するための一般的な方法は、本明細書に援用される、Ｊａｎｓｏｎ，  Ｊ．Ｃ．およびＬ．  Ｒｙｄｅｎ（監修）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  ニューヨーク（１９８９）、米国特許第５，４２９，７４６号、表題“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、および米国特許第５，１１５，１０１号、表題“Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”に見られる。
【００４６】
実施例１：組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製−プロセス１
［００４４］本実施例は、カラムクロマトグラフィーによる組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製を記載する。
【００４７】
［００４５］可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質をＣＨＯ細胞で発現させ、そしてタンパク質精製のため、馴化培地を採取した。製造者の指示にしたがって、８ｃｍのベッドの深さを持つＱセファロースTMＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムを調製した。馴化培地中のＰＳＧＬに対するカラム容量は、およそ１ｍｇ  ＰＳＧＬ／ｍｌ樹脂である。
【００４８】
［００４６］陰イオン交換クロマトグラフィーを以下のように行った。マイクロフィルターにかけたＣＨＯ馴化培地を、およそｐＨ７、２０ｍＳ／ｃｍ未満の伝導度で、カラム上に装填した。カラムを２０ｍＭヒスチジン、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で洗浄して、低硫酸化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ、例えば４以下の硫酸化のｒＰＳＧＬ−Ｉｇを除去した。装填工程および洗浄工程を、３．５ｃｍ／分で行った。＜１．１ｃｍ／分で、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．５を用いて、ｐＨ６．５でカラムから溶出させた。この工程のｐＨは、ｐＨ４〜８の間であることが可能であるが、好ましくはｐＨ６．５である。溶出ピークはＰＳＧＬ−Ｉｇ、ＤＮＡ、およびヒストンと共に他の混入物質も含有する。ＱカラムはＤＮＡに結合し、そしてヒストンはＤＮＡに付着する。ＰＳＧＬ溶出（塩濃度を上昇させることによって引き起こされる）は、ＤＮＡ溶出と同時に起こる。ＰＳＧＬ−Ｉｇの純度は＞８０％である。ＤＮＡの５０％のみがこの工程によって除去される。
【００４９】
［００４７］これらの条件下で、高硫酸化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ分子、例えば５または６の硫酸化のｒＰＳＧＬ−Ｉｇ分子が優先的に精製される。活性ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは、理想的には、Ｎ末端チロシン上に５または６の硫酸化を有する。
【００５０】
［００４８］以下のように、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを用いて、陰イオン交換カラムからの溶出物をさらに精製した。
［００４９］製造者の指示にしたがって、９ｃｍのベッドの深さを持つフェニルＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃカラム（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）を調製した。ＨＩＣカラムの容量はおよそ３．５ｍｇ  ＰＳＧＬ／ｍｌ樹脂である。１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中、≦１．３ｃｍ／分で、カラムを平衡化した。３Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４を添加することによって、Ｑセファロースカラムからの溶出物を、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４に調整し、そしてＨＩＣ上に装填した。あるいは、装填は、１．２Ｍ硫酸アンモニウムでなく４Ｍ  ＮａＣｌ中で行うことが可能であった。カラムを１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４で洗浄した。装填工程および洗浄工程はどちらも、およそ１．３ｃｍ／分の速度で行った。０．６５ｃｍ／分で、０．４８Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４を用いて、ＨＩＣカラムから溶出させた。これらの条件下で、ＨＩＣカラムは、Ｈ３およびＨ４ヒストンほど緊密にＤＮＡに結合しないＨ２ＡおよびＨ２Ｂヒストンを主に除去する。Ｈ２ヒストンは、洗浄分画に現れ、そしてピークはＨ３およびＨ４ヒストン、およびある程度のＨ２ヒストンを含有する。さらに、ＤＮＡの大部分は、ヒストン上に留まり、そしてピーク中に溶出する。産物は、混入タンパク質を＞９５％含まず、そしてＤＮＡの８５％は、この工程によって除去される。
【００５１】
［００５０］以下のように、金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを用いて、ＨＩＣカラムからの溶出物をさらに精製した。
［００５１］製造者の指示にしたがって、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ（Ｍ）（Ｅ．  Ｍｅｒｃｋ）上にＩＭＡＣ銅（ＩＩ）カラムを調製した。ＩＭＡＣカラムは６．４〜７．２ｃｍのベッドの深さ、およびおよそ６．６ｍｇ  ＰＳＧＬ／ｍｌ樹脂の容量を有した。
【００５２】
［００５２］≦５ｃｍ／分で、５ｃｖに渡って、５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰ０４）、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭイミダゾール、ｐＨ７でカラムを平衡化した。ＨＩＣカラムからの溶出物を２ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ＫＰＯ４、ｐＨ７、２００ｍＭ  ＮａＣｌに調整して、そしてＩＭＡＣカラム上に装填した。まず平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、そしてその後、≦５ｃｍ／分で、４０ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６を用いて洗浄した。この低塩濃度は、ＩＭＡＣカラム上のヒストン／ＤＮＡ複合体を壊さない。４０ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６を用いてカラムから溶出させた。ＩＭＡＣカラムは、主にＨ３およびＨ４ヒストンを除去する。Ｈ３およびＨ４ヒストン、並びにある程度のＨ２は、ストリップ中にあるが、ある程度のＨ３およびＨ２ヒストンがＩＭＡＣピークに見られる。生じた産物は、混入タンパク質を＞９９．９％含まず、そしてこの工程はＤＮＡの９５％を除去する。全体として、この全プロセスからＤＮＡのおよそ２．５ＬＲＶクリアランスがある。
【００５３】
［００５３］ＤＮＡはＱカラムに直接結合するため、このプロセスは、全プロセス結果を通じて、ＤＮＡが最後まで残ることを可能にした。Ｑ工程では、ＤＮＡはまた、Ｑカラムへの装填に存在する天然存在ＤＮＡ結合タンパク質であるヒストン（例えば、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、および１１４）にも結合した。したがってＱカラム上で、ＤＮＡがＱカラムに結合し、そしてヒストンがＤＮＡに結合するサンドイッチがあった。ＤＮＡはＨＩＣカラムまたはＩＭＡＣカラムに直接結合しないため、続く工程で、サンドイッチが逆転した。その代わり、ヒストンがＨＩＣカラムまたはＩＭＡＣカラムに結合し、そしてＤＮＡがヒストンに結合した。ヒストンがＨＩＣカラムまたはＩＭＡＣカラムから溶出する際、これらはＤＮＡ混入を共に運び去る。特に非常に陰イオン性である標的タンパク質の場合、そして特にこれらの陰イオン性タンパク質が陰イオン交換カラムから溶出する場合、タンパク質精製において、しばしば、ＤＮＡ／タンパク質相互作用のためにＤＮＡ除去が劣る可能性がある。
【００５４】
実施例２：組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製−プロセスＩＩ
［００５４］本実施例は、混入ヒストン／ＤＮＡ複合体を塩またはアルコールを用いて解離させ、それによってＰＳＧＬ−Ｉｇタンパク質の純度を増加させる工程を含む、カラムクロマトグラフィーによる、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質（ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）の精製を記載する。
【００５５】
［００５５］実施例１に記載するように、Ｑセファロース上の陰イオン交換クロマトグラフィー工程を行った。
［００５６］以下のように、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを用いて、陰イオン交換カラムからの溶出物をさらに精製した。製造者の指示にしたがって、９ｃｍのベッドの深さを持つフェニルＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃカラム（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）を調製し、そして１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中で平衡化した。この工程のｐＨは、６〜８の間であることが可能であるが、好ましくはｐＨ７．４である。
【００５６】
［００５７］３Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４を添加することによって、Ｑピークを、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４に調整し、そしてカラム上に装填した。あるいは、装填は、１．２Ｍ硫酸アンモニウムでなく４Ｍ  ＮａＣｌ中で行うことが可能であった。カラムを１．２Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４で洗浄し、その後、４Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で洗浄した。４Ｍ  ＮａＣｌでの洗浄は、カラムからＤＮＡの９０％を除去する（あるいは１ｌｏｇ10除去または１ＬＲＶ）。あるいは、５％イソプロパノールおよび１．２Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄することが可能であった。これは、カラムからＤＮＡの９９．９％を除去する（“３ｌｏｇ10除去”、または３ＬＲＶ）。あるいは、５％エタノールおよび１．２Ｍ硫酸アンモニウムで洗浄することが可能であった。これは、カラムからＤＮＡの９９．９％を除去する（“３ｌｏｇ10除去”、または３ＬＲＶ）。あるいは、５％エタノールおよび４Ｍ  ＮａＣｌで洗浄することが可能であった。これは、カラムからＤＮＡの９９．９％を除去する（“３ｌｏｇ10除去”、または３ＬＲＶ）。あるいは、５％イソプロパノールおよび４Ｍ  ＮａＣｌで洗浄することが可能であった。これは、カラムからＤＮＡの９９．９％を除去する（“３ｌｏｇ10除去”、または３ＬＲＶ）。装填工程および洗浄工程は、およそ１．３ｃｍ／分の速度で行った。その後、０．６５ｃｍ／分の速度で、０．４８Ｍ硫酸アンモニウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４を用いて、カラムから溶出させた。
【００５７】
［００５８］先と同様、これらの条件でこのＨＩＣは、Ｈ３およびＨ４ヒストンほど緊密にＤＮＡに結合しないＨ２ＡおよびＨ２Ｂヒストンを主に除去する。Ｈ２ヒストンは洗浄液中に現れる。ピークは、Ｈ３およびＨ４と共にある程度のＨ２ヒストンを含有する。しかし、我々は、より高い塩濃度で洗浄することによって、ＤＮＡ／ヒストン相互作用を壊すことが可能であることを見出した。したがって、例えば、１．２Ｍ硫酸アンモニウムでなく、４Ｍ  ＮａＣｌで洗浄することによって、ＤＮＡがヒストンから離脱し、そして洗浄液中に移る。これらの条件下では、ＤＮＡの大部分が洗浄液中に移り、そしてヒストンはやはり、ピーク中に溶出する。このＨＩＣ工程は、あるいは、ＩＭＡＣ工程後に行うことが可能であった（以下を参照されたい）。これは９９．９％多いＤＮＡの除去を生じることが可能であった（３ＬＲＶ）。
【００５８】
［００５９］以下のように、金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを用いて、ＨＩＣカラムからの溶出物をさらに精製した。
［００６０］製造者の指示にしたがって、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ（Ｍ）（Ｅ．  Ｍｅｒｃｋ）上にＩＭＡＣ銅（ＩＩ）カラムを調製した。ＩＭＡＣカラムは６．４〜７．２ｃｍのベッドの深さ、およびおよそ６．６ｍｇ  ＰＳＧＬ／ｍｌ樹脂の容量を有した。この工程のｐＨは、４．８〜８の間であることが可能であるが、好ましくはｐＨ６．６である。
【００５９】
［００６１］≦５ｃｍ／分で、５ｃｖに渡って、５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰ０４）、２．０Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭイミダゾール、ｐＨ７でカラムを平衡化した。あるいは、２Ｍ  ＮａＣｌでなく、２００ｍＭ  ＮａＣｌでカラムを平衡化することが可能である。ＨＩＣカラムからの溶出物を２ｍＭイミダゾール、５０ｍＭＫＰＯ４、ｐＨ７、２００ｍＭ  ＮａＣｌに調整して、そしてＩＭＡＣカラム上に装填した。装填は、あるいは、２Ｍ  ＮａＣｌでなく２００ｍＭ  ＮａＣｌで行うことが可能である。
【００６０】
［００６２］まず平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、そしてその後、≦５ｃｍ／分で、４０ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６を用いて洗浄した。４０ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、３５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．６を用いてカラムから溶出させた。ＩＭＡＣカラムは、主にＨ３およびＨ４ヒストンを除去する。これらのヒストン、およびある程度のＨ２ヒストンは、ストリップ中にある。ある程度のＨ３およびＨ２ヒストンはまた、ＩＭＡＣピークにも見られる。
【００６１】
［００６３］この工程は、高塩装填または高塩洗浄いずれかを用いて、実施例１のプロセスＩ工程より、９０％多いＤＮＡを除去する（１ＬＲＶ）。この工程の新規性は、２Ｍ  ＮａＣｌで装填するか、または２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄して、ヒストン／ＤＮＡ複合体からＤＮＡを除去することである。ヒストンはＩＭＡＣカラムに固着し、そしてＤＮＡはヒストンに固着する。ＤＮＡはＨ３／Ｈ２複合体または単にＨ２複合体に結合するよりも、Ｈ３／Ｈ４複合体によく結合するため、プロセス中、できるだけ早くＨ３／Ｈ４複合体を除去することが有益であろう。したがって、ＩＭＡＣ後にＨＩＣを実行すると、より高いＤＮＡクリアランスが達成可能であることが示されている（９９．９％多いクリアランスまたは３ＬＲＶ）。したがって、プロセス中、ＩＭＡＣをできるだけ早く設定することによって、あるいは、ＤＮＡのさらなる減少が生じる可能性がある。しかし、第一工程としてのＩＭＡＣは、低分子量アミノ酸および他のアミン含有基を装填物から除去するのに、限外ろ過／ダイアフィルトレーションを必要とするであろう。
【００６２】
実施例３：組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質の精製−プロセスＩＩＩ
［００６４］本実施例は、カラムクロマトグラフィーによる組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ融合タンパク質、例えばｒＰＳＧＬ−Ｉｇの精製のための代替法を記載する。実施例１に記載する精製スキームと対照的に、このプロセスは、第一の精製工程として、アフィニティー工程を用いる。アフィニティー精製工程は、ｒＰＳＧＬ−ＩｇキメラのＦｃ部分に結合するｒプロテインＡ（本明細書においてｒＰＡとも称する）を用いる。ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは、低いｐＨ、この場合、３．７のｐＨで、ｒプロテインＡから溶出する。ｒプロテインＡ工程は、装填後、カラムを１Ｍ  ＮａＣｌで洗浄すると、より優れたクリアランスを生じる。この塩濃度は、典型的に用いるもの（通常、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）より高く、そしてしたがって新規である。この工程からのＤＮＡのクリアランスは、この塩工程の付加に伴って、４ｌｏｇ10除去値（ＬＲＶ）から６ＬＲＶに上昇する。これはＤＮＡ除去の１００倍の増加に相当する。
【００６３】
［００６５］ｒプロテインＡ工程は、ヒストンに結合しないようであり、そして優れたＤＮＡクリアランスを生じる。したがって、ヒストンは、ｒプロテインＡ工程後の工程に、顕著には存在しない。しかし、ｒプロテインＡは、ｒプロテインＡカラムから浸出するため、ｒプロテインＡを除去するために、続く工程を行う。浸出プロテインＡを除去する新規方法は、中性または低ｐＨいずれかで、Ｑカラム上にプロテインＡ溶出物を直接装填するか、または低ｐＨでＱカラムを洗浄することである。Ｑカラムは通常、低ｐＨで実行されず、特にｐＨ４では実行されない。したがって、プロテインＡ溶出物からのｒＰＳＧＬ−Ｉｇの直接の捕捉または低ｐＨでのＱカラムの洗浄、あるいはその組み合わせが新規である。ｒＰＳＧＬ−ＩｇおよびｒプロテインＡが低ｐＨであるため、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇの大部分は、浸出したｒプロテインＡに結合しない。その結果、ｒプロテインＡはＱカラムに結合せず、Ｑのフロースルー中に見られる。これもまた、新規である。したがって、Ｑカラムを用いてｒプロテインＡを除去する。この新規方法を用いて、非常に陰イオン性であるタンパク質を精製することが可能である。製造者の指示にしたがって、６〜１０ｃｍのベッドの深さを持つプロテインＡ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を調製する。カラム容量は、およそ１ｍｇ／ｍｌ〜６ｍｇ／ｍｌである。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２〜８、好ましくはｐＨ７．４でカラムを平衡化する。マイクロフィルターにかけた馴化培地を、ｐＨ７〜ｐＨ８の間で、好ましくはｐＨ７．４で、およそ３０〜３００ｃｍ／時間、好ましくは１５０ｃｍ／時間、カラム上に装填する。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７．４でカラムを洗浄し、そして２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３〜４、好ましくはｐＨ３．７で５０〜３００ｃｍ／時間、カラムから溶出させる。純度は、タンパク質に関して＞９５％であり、そしてＤＮＡの＞９９％がこの工程で除去される。
【００６４】
［００６６］８ｃｍのベッドの深さを持つＱセファロースTMＦａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で、ｒプロテインＡカラムからの溶出物をさらに精製する。ｒプロテインＡ工程後、ｐＨ３．６〜４．０、好ましくは約ｐＨ３．８で、ＱセファロースカラムのＰＳＧＬに対する容量は、およそ≧６ｍｇ  ＰＳＧＬ／ｍｌ樹脂である。
【００６５】
［００６７］ｐＨを調整せずに、ｒプロテインＡピークを直接Ｑセファロースカラム上に装填するか、またはＱセファロースカラム上への装填前に、ピークを中和する。どちらの場合でも、ｐＨ３．５〜４、好ましくは約ｐＨ３．８で、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭクエン酸塩を用いて、カラムを洗浄して、残ったプロテインＡを除去する。どちらの方法も浸出プロテインＡ、低硫酸化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ、Ｎ末端切断ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ、およびプロ−ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ（Ｎ末端の酵素的切断を持たないｒＰＳＧＬ−Ｉｇの前駆体種）を除去する。ｐＨ３．５〜４の洗浄後、２０ｍＭヒスチジン、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５でカラムを洗浄して、低硫酸化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇを除去することが可能であった。低硫酸化ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ分子は、４以下の硫酸化を有するが、活性ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは、理想的には、Ｎ末端チロシン上に５または６の硫酸化を有する。カラム装填工程および洗浄工程は、３．５ｃｍ／分の速度で行う。１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．５を用いて、ｐＨ６．５でカラムから溶出させる。あるいは、＜１．１ｃｍ／分で、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭクエン酸塩中、ｐＨ３．５〜４．０で、好ましくは約３．８で、溶出させることが可能である。タンパク質は、ピークの＜２％に相当する。
【００６６】
［００６８］あるいは、プロテインＡ／ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ複合体解離のｐＨを上昇させることを通じて、浸出ｒプロテインＡを除去することが可能である。解離のｐＨを上昇させることによって、Ｑカラム、例えばＱセファロースTMＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム、金属キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、陰イオン交換カラムまたは陽イオン交換カラムなどのクロマトグラフィーカラムの使用を通じて、プロテインＡから、Ｆｃ含有化合物、例えばｒＰＳＧＬ−Ｉｇをより容易に分離し、そして除去することが可能である。解離のｐＨは、アルギニン、および／または疎水性相互作用を壊すかまたは妨げ、それによって解離のｐＨを上昇させる他の組成物いずれか、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、プロパノール、メタノール等の使用を通じて上昇させることが可能である。解離のｐＨがより高いと、そうでなく解離が起こる場合より、より正常なｐＨでのｒＰＡの除去が可能になる。また、より高いｐＨ、例えば約ｐＨ３．７より高いｐＨを使用した結果、より低いｐＨ、例えばｐＨ３．７による、いくつかのＦｃ含有タンパク質、例えばｒＰＳＧＬ−Ｉｇに対するダメージ、例えば硫酸化またはシアル化の喪失、あるいはＡｓｐ−Ｐｒｏ切断がより少なくなる。
【００６７】
［００６９］以前は、一般的に、ＱカラムへのＦｃ分子またはｒプロテインＡの結合を可能にするにはｐＨが低すぎたため、Ｑカラムは、Ｆｃ含有タンパク質（非常に陰イオン性であるＦｃ含有タンパク質以外）からのｒＰＡの解離には使用不能であった。例えばアルギニンおよび／またはエチレングリコールの使用によって、解離のｐＨを上昇させると、解離のｐＨは、解離条件下で、非常に陰イオン性ではない分子を含むＦｃ含有分子に対して、Ｑカラムの使用を可能にするのに十分に高い。
【００６８】
［００７０］また、以前は、解離が起こるのに必要な、通常の低ｐＨ下では、Ｆｃ含有分子およびｒＰＡは、やはりＩＭＡＣに結合しつづけないであろうため、解離条件下、例えば低ｐＨ下では、ＩＭＡＣカラムは使用不能であった。例えばエチレングリコールの使用によって、解離のｐＨを上昇させることを通じて、ｒプロテインＡを除去するのにＩＭＡＣカラムが使用可能になるように、Ｆｃ含有タンパク質はＩＭＡＣカラムに結合しつづける。
【００６９】
［００７１］ＨＩＣカラムもまた、例えばアルギニンおよび／またはエチレングリコールの使用によって、解離のｐＨを上昇させることを通じて、解離が通常起こるであろうより、より正常なｐＨで、Ｆｃ含有分子からｒＰＡを除去するのに使用可能である。
【００７０】
ＩＭＡＣ条件下でのｒＰＡおよびｒＰＳＧＬ−Ｉｇの解離
［００７２］以下の実施例は、ＩＭＡＣカラム、ＨＩＣカラム、およびＱカラムを用いた、ｒＰＳＧＬ−ＩｇからｒプロテインＡを除去するのに適した条件の性質決定を記載する。ｒプロテインＡを除去する一方、ｒＰＳＧＬ−ＩｇをＩＭＡＣカラム上に吸収させる、ＩＭＡＣカラムのｒＰＡ除去工程を発展させるため、いかなるキレート剤、例えばクエン酸塩、またはアミノ酸、例えばアルギニンも含有しない条件を発展させなければならず、そして該条件は、ＩＭＡＣ表面およびｒＰＳＧＬ−Ｉｇ表面両方とのイオン性相互作用を最小限にするため、比較的高い塩濃度を持たなければならない。この実験にアルギニンを用いて、プロテインＡの除去のため、ＱカラムまたはＨＩＣカラムを用いたアルギニンのありうる有用性を検討した。
【００７１】
［００７３］ｒＰＳＧＬ−ＩｇおよびｒプロテインＡの解離を性質決定するため、上述のように、ｒプロテインＡカラムを調製した。ｒプロテインＡカラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、２００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した。ｒＰＳＧＬ−ＩｇをｒＰＡカラム上に装填した。５Ｍ  ＮａＣｌを添加して、伝導度を２５〜３０ｍＳ／ｃｍに上昇させ、そしてカラムをＴｒｉｓ  ＨＣｌまたはＴｒｉｓ塩基でｐＨ７．８に滴定した。平衡化緩衝液を用いて、カラムを４ｅｖ洗浄した。試験した溶出条件には、以下が含まれる：
溶出１：５０％エチレングリコール（ＥＧ）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、約５．７のｐＨ；
溶出２：５０％  ＥＧ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、約５．７のｐＨ、および５００ｍＭアルギニン；
溶出３：５０％  ＥＧ、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、約５．０のｐＨ；並びに
溶出４：５０％  ＥＧ、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、約５．０のｐＨ、および５００ｍＭアルギニン。
【００７２】
［００７４］すべての溶出は２ｍｌ／分で５ｃｖである。２０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ約２．７で最終溶出を行った。
［００７５］結果は、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ／ｒプロテインＡ複合体が、溶出２、例えばｐＨほぼ５．７で壊れる可能性があり、そして溶出３、例えばｐＨ約５．０でも壊れることを示した。アルギニンを添加したため、溶出２は、ＩＭＡＣカラムでは使用不能であった。結果は、ＩＭＡＣカラムに適用した際、３ｃｖの溶出３（５０％ＥＧ、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、約５．０のｐＨ）が、結合したｒＰＳＧＬ−１からｒＰＡを解離し、そしてｒＰＳＧＬ−１プロセス結果からｒＰＡの有意な部分を除去することが可能であることを示した。
【００７３】
［００７６］結果はまた、ＰＳＧＬ−Ｉｇを別の樹脂、例えばＱカラムまたはＨＩＣカラムに結合させた際、溶出２（５０％  ＥＧ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、約５．７のｐＨ、および５００ｍＭアルギニン）を用いて、ほぼ２０％のｒＰＡがｒＰＳＧＬ−Ｉｇから２ｃｖ洗浄液中に剥がれるであろうことも示す。アルギニン、および例えばエチレングリコール（ＥＧ）などの疎水性相互作用を壊す組成物または剤を用いて解離のｐＨを増加させることによって、ＱカラムをプロテインＡの除去に使用することが可能である。例えば、約ｐＨ５．０〜ｐＨ５．７の間で、例えば２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％エチレングリコール、および２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび５００ｍＭアルギニンを用いて洗浄する。プロテインＡを除去するために、解離のｐＨを増加させると共に、ＨＩＣカラムを使用することもまた可能である。
【００７４】
［００７７］ＰＳＧＬを伴うｒプロテインＡカラム上で、５０％ＥＧ、１Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ勾配を用いて、ｒＰＳＧＬ−ＩｇからプロテインＡを除去するためにＩＭＡＣが使用可能な最大ｐＨを決定した。ｒプロテインＡカラムを上述のように調製し、そしてｐＨ５．７〜ｐＨ５．０で勾配を試験した。
【００７５】
［００７８］結果は、５０％エチレングリコールおよび１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いると、ｐＨ５．３で、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ／ｒプロテインＡ凝集物がほぼ完全に分離可能であることを示した。ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ／ｒプロテインＡ凝集物は、５０％ＥＧおよび１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて、ｐＨ５．０で部分的に壊れる可能性がある。ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは、５．５と同程度に高いｐＨ値で、ｒＰＡカラムから溶出することが可能であり、そして５０％ＥＧ、および場合によって１Ｍ  ＮａＣｌ中、ｐＨ５．３で比較的よく溶出することが可能であるが、溶出には高いＮａＣｌ濃度は必要ではない。５０〜２００ｍＭ量の濃度のＮａＣｌが最適であろう。
【００７６】
［００７９］より高いｐＨでの溶出は、低いｐＨで加速する、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇの硫酸化、シアル化の喪失の可能性、およびａｓｐ−ｐｒｏ切断発生の可能性がある、ｐＨ３．７での溶出より勝る。
【００７７】
［００８０］ＨＩＣ条件およびカラム条件下でのｒＰＡおよびｒＰＳＧＬ−Ｉｇの解離
［００８１］ＨＩＣ溶出条件およびＱカラム洗浄条件下でのｒＰＳＧＬ−ＩｇおよびｒＰＡの解離特性を決定するため、２０ｍＭクエン酸塩、５００ｍＭアルギニン、および５００ｍＭ硫酸アンモニウム中での２０ｃｖに渡るｐＨ６〜ｐＨ４のｐＨ勾配を実行して、ＨＩＣ溶出条件を厳密に模倣した。ＨＩＣ溶出条件は、約０．５Ｍ硫酸アンモニウムである。
【００７８】
［００８２］ｒプロテインＡカラムを上述のように調製した。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．８、２００ｍＭ  ＮａＣｌで、カラムをまず平衡化した。カラムにｒＰＳＧＬＩｇを装填し、そしてＴｒｉｓ  ＨＣｌまたはＴｒｉｓ塩基でｐＨ７．８に滴定し、そして平衡化緩衝液で４ｃｖ洗浄した。２０ｍＭクエン酸塩、５００ｍＭアルギニン、および５００ｍＭ硫酸アンモニウムｐＨ６から、２０ｃｖで、２０ｍＭクエン酸塩、５００ｍＭアルギニン、および５００ｍＭ硫酸アンモニウムｐＨ４で勾配を実行した。
【００７９】
［００８３］結果は、ｒＰｒＡ／ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ会合が、アルギニンを含まない場合、約３．７のｐＨで壊れたのと対照的に、５００ｍＭアルギニン、０．５Ｍ硫酸アンモニウム、および２０ｍＭクエン酸塩では、約ｐＨ４．２で壊れることが可能であることを示した。これらの結果は、アルギニンが、ｒＰＳＧＬ−ＩｇおよびｒＰｒＡの解離特性に強く影響を及ぼす可能性があることを示す。約ｐＨ４．１でＨＩＣカラムに通過させると、プロセス流からｒＰＡが除去され、ｒＰＡを含まないｒＰＳＧＬ−Ｉｇを溶出することが可能になる。ＨＩＣカラムは、どちらも５００ｎＭアルギニン中、直前にｐＨ４．１でａｃｖ洗浄して、ｐＨ４．１で用いることが可能である。あるいは、５００ｍＭアルギニンを用いてｐＨ４．１でＨＩＣカラムから溶出させるが、アルギニン添加前に洗浄しなくてもまた、ｒＰＡを減少させることが可能である。
【００８０】
［００８４］２０ｍＭ酢酸塩、５００ｍＭアルギニン、および５００ｍＭ硫酸アンモニウム中、２０ｃｖに渡って０％〜５０％でエチレングリコール勾配を実行した。結果は、大部分のｒＰＳＧＬＩｇが、３０％エチレングリコール、ｐＨ４．７、および５００ｍＭアルギニンでＰｒＡから完全に解離することを示す。
【００８１】
［００８５］さらに、ｒＰＡの２ＬＲＶは、ＨＩＣカラムを５００ｍＭアルギニン、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ４．１で洗浄後、５００ｍＭアルギニン、４００ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ４．１中にｒＰＳＧＬ−Ｉｇを溶出することによって、影響を受ける可能性がある。
【００８２】
［００８６］さらなる実験を行って、アルギニンの添加およびｐＨ増加が、ＨＩＣカラム上のｒＰＳＧＬ−Ｉｇの溶出条件を変化させ、そしてｒＰＡを含有する装填物を含むＨＩＣカラム上のｒＰＡからｒＰＳＧＬ−Ｉｇをよりよく分離するかどうかを調べた。
【００８３】
［００８７］結果は、ｒＰＡの１．１ＬＲＶがｐＨ４．１の溶出条件に影響を受け、０．９ＬＲＶがｐＨ４．３の溶出条件に影響を受け、．７ＬＲＶがｐＨ４．５の溶出条件に影響を受けることを示した。
【００８４】
［００８８］ｒプロテインＡ／ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ複合体を分離するのに、Ｑカラムもまた使用可能であり、これはＱカラムを用いて、ｒプロテインＡを分離するのに使用可能なカラムにＦｃ含有分子が結合することを可能にするレベルまでｐＨを上昇させるのに十分な濃度で、疎水性相互作用を分離するよう作用する組成物または剤、例えばエチレングリコールを添加することを通じる。例えば、約５．５〜５．７の間のｐＨ、好ましくは約５．５のｐＨが使用可能である。
【００８５】
均等物
［００８９］当業者は、本明細書に記載する本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、または日常的な実験以上のものを用いずに、これらの均等物を確かめることが可能であろう。こうした均等物は請求項に含まれると意図される。
【国際公開パンフレット】
2004537042.tif 000003
2004537042.tif 000004
2004537042.tif 000005
2004537042.tif 000006
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【国際調査報告】
2004537042.tif 000035