(57)【要約】本発明は中枢神経系における細胞の機能に影響を及ぼす薬理的活性成分を特定する方法に関し、この方法は以下の工程から構成される。ａ）試料を、少なくとも１つの潜在的活性成分と接触させるｂ）細胞におけるＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの作用を測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程からなる、中枢神経系における細胞の機能に影響を及ぼす薬理的活性成分を特定する方法。
ａ）試料を少なくとも１つの潜在的活性成分と接触させる。
ｂ）試料におけるＢ−Ｒａｆの作用を測定する。
【請求項２】
上記試料は、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの細胞抽出物、少なくとも１つのタンパク質混合物及び／またはＢ−Ｒａｆ、とりわけ活性化したＢ−Ｒａｆ、あるいはその一部を含む混合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記細胞の種類は、グリア細胞；例えば感覚、交感神経または運動ニューロン細胞などのニューロン細胞；ニューロン幹細胞；ニューロン、とりわけ前脳基底におけるコリン作用性ニューロン、中脳におけるドーパミン作用性神経細胞、顆粒細胞、小脳または海馬におけるプルキンエ細胞；網膜神経節細胞または光受容体細胞であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記細胞において、Ｂ−Ｒａｆの作用は抑制されているかあるいは全く作用していないことを特徴とする請求項２または３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
上記細胞におけるＢ−Ｒａｆの作用は、細胞の生存率の変化から測定されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１に記載の方法。
【請求項６】
上記試料におけるＢ−Ｒａｆの作用は、Ｂ−Ｒａｆタンパク質の量、Ｂ−Ｒａｆのための核酸コーディングの量及び／またはＢ−Ｒａｆの酵素的作用によって直接的または間接的に測定されることを特徴とする請求項１から４のいずれか１に記載の方法。
【請求項７】
上記のさらなる工程において、ＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の作用が測定されることを特徴とする請求項１から６のいずれか１に記載の方法。
【請求項８】
上記のさらなる工程において、薬理的活性成分が単離されることを特徴とする請求項１から７のいずれか１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１の方法によって特定される活性成分。
【請求項１０】
上記細胞及び／または細胞抽出物におけるＢ−Ｒａｆ、ＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の作用が測定されることを特徴とする、中枢神経系における細胞の機能を生体外的に分析するための方法。
【請求項１１】
上記Ｂ−Ｒａｆ、ＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の作用を探知するための作用物質を少なくとも１つ含んだ、中枢神経系における細胞の機能の生体外分析のための診断物質。
【請求項１２】
以下の物質から構成される、中枢神経系における細胞の機能に影響を及ぼす薬理的活性成分を特定するための検査システム。
ａ）少なくとも１つの試料
ｂ）試料におけるＢ−Ｒａｆの作用を測定するための少なくとも１つの作用物質
【請求項１３】
上記Ｒａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆと、もし適用可能であれば適切な補助的または付加的な物質を含んだ、中枢神経系における細胞の機能の障害に伴い発生する病気を治療するための薬物。
【請求項１４】
上記の中枢神経系における細胞の機能の障害は、細胞の生存率の低下によって特定されることを特徴とする請求項１３に記載の薬物。
【請求項１５】
上記薬物において、ベクターにはＢ−Ｒａｆが含まれることを特徴とする請求項１３または１４に記載の薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題となるのは、中枢神経系における細胞の機能に影響を及ぼす薬理的活性成分を特定する方法であり、この方法は以下の工程から構成される。ａ）試料を、少なくとも１つの潜在的活性成分と接触させる  ｂ）細胞におけるＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの作用を測定する。
【背景技術】
【０００２】
分化ニューロンは哺乳類において最も長く生存する細胞の類に属するが、未分化神経細胞は神経系の発達の際に大量に死ぬ。さらに、神経細胞の死は急性及び慢性神経変性病の根本的な特徴である。どのようにして神経細胞が死ぬかという問題は、いまだ詳細に至るまで完全に解明されていない。
【０００３】
しかしながら、他の全ての細胞と同様に、神経細胞も生存のためには栄養的補助が必要であることは解明されている。
【０００４】
また神経細胞は、感覚あるいは運動機能の有無に関係なく、いわゆる神経栄養性因子が大量に存在する環境でのみ生存できることが判っている。これらの神経栄養性因子は異なる群に属しており、これらには脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、（ＮＴ−３）や神経成長因子（ＮＧＦ）（Ｋａｐｌａｎ ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０：３８１−２９１，２０００）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（Ｍａｉｎａ  ａｎｄ  Ｋｌｅｉｎ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：２１３−２１７，１９９９）、そしてグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）（Ｂａｌｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０：１０３−１１０，２０００）などの神経栄養因子が属する。
【０００５】
上記のような神経栄養因子は、チロシン・ホスホキナーゼ・レセプタと結合し、それが活性化することにより作用する。活性化信号は、細胞質内にある信号伝導タンパク質によってこのレセプタから細胞核へと伝達される。ニューロンには幾つかの信号伝導経路が存在することが知られており、これらにはＰＩ−３Ｋ−ＡＫＴ形質導入経路及びＲａｓ−Ｒａｆ信号伝導経路が属する。双方の活性化経路は、活性化したＲＡＳによって交差結合され、Ｒａｆ形質伝達経路における重要な役割はタンパク質が担う（Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ｙａｎｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８０２−８０９，２０００）。付加的なＲａｆ依存性の信号伝導経路としては、Ｂａｇ−１−Ｃ−Ｒａｆ信号経路（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９３：７０６３−７０６８，１９９６）及びＲａｐ−１−Ｂ−Ｒａｆ−ＡＭＰ信号経路（Ｇｒｅｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３７２２−３７２８、２０００）などがある。
【０００６】
神経栄養性因子によってニューロン細胞とグリア細胞が活性化すると本質的な結果として、制御された細胞死から細胞を保護するタンパク質が細胞内に大量に発現する（Ｎｅｗｍｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ、Ｎｅｕｒｏｎ２１：６５３−６５５，１９９８；Ｗｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：９７８−８９３，１９９９）。これらのタンパク質には、とりわけＩＡＰ−１，ＩＡＰ−２，Ｘ−ＩＡＰそしてサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）などのＩＡＰ／ＩＴＡ群の阻害剤が属する。ＩＡＰ／ＩＴＡ群に属するタンパク質は、プロカスパーゼ−９（Dｅｖｅｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：２２１５−２２２３,１９９８）の活性化を抑制し、プロカスパーゼ−９はその代わりにシトクロム−Ｃ及びＡｐａｆ−１によって活性化される。さらに、ＩＡＰ／ＩＴＡ群のタンパク質は活性化したカスパーゼ−３、−６、−７の機能を抑制し、それによってこれらの酵素によって引き起こされるアポトーシスを抑制する（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：３００−３０４，１９９７；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６９１４−６９２５、１９９７）。
【０００７】
Ａｋｔは３つの細胞異性体を持ち、Ａｋｔ−３は特にニューロン内で発現する（Ｄａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２９０５−２９２７，１９９９）。哺乳生物の細胞におけるＲａｆ信号伝導経路のために、Ｃ−Ｒａｆ（別名Ｒａｆ−１）、Ａ−Ｒａｆ及びＢ−Ｒａｆの３つの異なるＲａｆタンパク質は特別な役割を担う。異なるスプライシングから生じる幾つかの形態はＢ−Ｒａｆのためである。中枢神経系の細胞においては、主にＢ−Ｒａｆ及びＣ−Ｒａｆが検知され、検知されるＡ−Ｒａｆタンパク質はそれよりも少ない（Ｍｏｒｉｃｅ  ｅｔ  al．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：１９９５−２００６，１９９９）。
【０００８】
Ｂ−Ｒａｆ及びＣ−Ｒａｆはニューロン内だけで検出されるわけではなく、グリア細胞においても検出される（Ｍｉｋａｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ.２７：２２５−２３８,１９９３；Ｍｉｋａｌｙ  ａｎｄ  Ｒａｐｐ．、Ａｃｔａ  Ｂｉｓｔｏｃｈｅｍ.９６：１５５−１６４,１９９４）。
【０００９】
神経栄養成分（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）及び／または膜脱分極が、どのような方法で信号伝導経路を活性化し、神経細胞の生存を保護するかは比較的解明されているにもかかわらず、神経変性病の場合における神経細胞の死がどのようなメカニズムによって引き起こされるのかは定かではない。実験的調査によると（調査は、Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ｙｎａｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８０２−８０９,２０００において公開されている）、神経細胞の死は以下の事項に由来すると指摘されている。
―  例えば、リン酸化の欠如、またはＡＫＴ及び／またはＲａｆ信号伝導経路のためのアポトーシスタンパク質（Ｂａｄ、しかしとりわけＢａｘ）の非活性化による神経細胞内におけるアポトーシス誘発性因子の相互的な活性化。
―  アポトーシス誘発性タンパク質（例：Ｂｃｌ−２、しかしとりわけＢｃｌ−ＸＬ）を発現させる遺伝子の転写を活性化する転写調節因子の活性化（例えばＲａｆ信号伝導経路のため）の欠乏。
―  例えば異常なタンパク質構造または集合体による、シトクロムＣの開放やアポトーシス誘発的酵素（カスパーゼ）の活性化によって生じるミトコンドリアに対する損傷
―  例えば神経栄養成分（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）レセプタＰ７５ＮＴＲによる、神経栄養性因子によるアポトーシス誘発的信号カスケードの活性化。
―  例えばスーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）の突然変異による酸化的損傷、ＮＯの大量生産、または酵素の誤作用。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
神経細胞の死を引き起こすとされるこれらの多岐に渡る可能性を考慮すると、神経細胞の死を抑制するどの物質が具体的に検知され、検査されるのかというモデルシステムを確証することは今日まで非常に困難であった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
驚くべきことに、神経栄養性因子が原因する感知及び運動ニューロンの生存は、細胞内における信号タンパク質Ｂ−Ｒａｆの有無によるということが解明されている。Ｂ−Ｒａｆを保持しない神経細胞は、神経栄養性因子が存在するにもかかわらず死んでしまう。これと対照に、Ｂ−Ｒａｆのみ発現しＣ−Ｒａｆを発現しない神経細胞は、Ｂ−ＲａｆだけでなくＣ−Ｒａｆも含む神経細胞（いわゆる正常（＝野生型）神経細胞）と同様に、神経栄養性因子が存在しても生存することができる。本発明は、このように神経細胞が生存するにはＢ−Ｒａｆが機能している（すなわち酵素的に活性している）ことが必要であるという驚くべき発見を基盤にしている。さらに、Ｂ−Ｒａｆ作用が欠乏している神経細胞において、例えばＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２やｘ−ＩＡＰなどのＩＡＰ／ＩＴＡ群の抗アポトーシスタンパク質の発現に明らかな減少がみられるという驚くべき発見があった。
【００１２】
このように本発明の主題となるのは、ａ）試料を、少なくとも１つの潜在的活性成分と接触させる  ｂ）試料におけるＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの作用を測定する、という工程から構成される、中枢神経系における細胞の機能に影響を与える薬理的活性成分を特定する方法である。
【００１３】
本件において中枢神経系における細胞の「機能」という語は、例えば刺激の導入やその他の関連する生化学及び／または電気化学の過程のことを指す。またさらに、細胞の機能という語句は、細胞の生存という意味も包含する。中枢神経系における細胞死は、例えばアポトーシスを探知する検査方法によって測定することができる。前記の検査方法の例を挙げると、トンネル測定法（ｔｕｎｎｅｌ  ａｓｓａｙ）（Ｇａｖｒｉｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１９：４９３−５０１，１９９２，Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ７１：２１９−２２５，１９９４）、クロマチン分裂（G oｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍ.  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：２４７９−２４８９，２０００)、生存する細胞と死ぬ細胞の計測（Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０,３５０７−３５１５,１９９０）、細胞培養における細胞死を計測するための検体の使用法（Ｕｌｉａｓｚ  ａｎｄ  Ｈｅｗｅｔｔ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １００,１５７−１６３,２０００）、神経細胞におけるサイリン（ｃｙｌｉｎ）などの細胞死に関連する遺伝子の発現の計測（Ｔｉｍｓｉｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１，２６３−２７８，１９９９）、そしてＡaを添加した後のニューロン細胞死の測定（Ｉｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．１，６５−７１、１９９６）、または酸化的ストレスを誘発した後のニューロン細胞死の測定（Ｍａｎｅｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３３，１９８−２０６，１９９５）などがある。
【００１４】
本発明に関して言えば、中枢神経系の細胞とはグリア細胞またはニューロン細胞のことを指し、その例としては感知または交感神経ニューロン細胞、基底前脳におけるコリン作用性ニューロン、中脳（黒質）におけるドーパミン作用性神経細胞、小脳及び海馬における顆粒細胞及びプルキンエ細胞、ニューロン幹細胞に加えて網膜神経節や感光体などが挙げられる。
【００１５】
試料を少なくとも１つの潜在的活性成分と接触させる方法としては、どのような混合の形態をとる事も可能で、試料に潜在的成分が加えられても、また潜在的成分に試料が加えられてもどちらでもよい。試料及び／または潜在的成分は、固形状、溶液、懸濁液、浮揚状または固相に結合された形態（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ）で用いられてもよい。もし潜在的成分と接触される試料が細胞であるならば、例えば感染、トランスフェクション及び／または変質などの、損傷のない完全な細胞への物質の導入を可能にする先行技術の方法が接触を行なう過程に含まれる。前記の方法は潜在的成分が裸ＤＮＡ、ウィルス、ヴィロソーム及び／またはリポソームである場合に特に好ましく、リポソームまたはヴィロソームは、潜在的活性核酸分子だけでなく、さらなる潜在的成分を試料に接触させるのにも適する。潜在的活性成分を細胞に導入するのに適した多数のさらなる方法は、当業者には周知の事項である。
【００１６】
本発明において用いられる潜在的活性成分とはどのような分子群であってもよく、例としてはペプチド（アミノ酸の数値が１から５０）、タンパク質（５０以上のアミノ酸数値）、ペプトイド、オリゴ糖または多糖類、核酸、例えば同素環・複素環などのモノマー、脂質、ステロイドやその類が挙げられる。基本的には、どのような化学物質または物質の混合物であっても、本発明による方法において潜在的活性成分として用いることができる。しかし、潜在的活性成分の濃度は試料におけるＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの作用に及ぼす影響が、試料が細胞である場合には単に細胞のリーシス（細胞溶解）に基づかず、試料がタンパク質またはタンパク質の混合物である場合には単にＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの変性に基づかないように選択されなければならない。従って細胞及び／または変性したタンパク質を溶解する程度に濃縮された、例えばグアニジン−ＨＣｌ溶液、尿素液や濃い浄化剤は、本発明に関して言えば潜在的活性成分ではない。
【００１７】
本発明において試料として用いられるのは、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの細胞抽出物、少なくとも１つのタンパク質混合物及び／またはＲａｆタンパク質、とりわけＢ−Ｒａｆまたは活性化されたＢ−Ｒａｆ、あるいはその一部を含む少なくとも１つの混合物である。これらの細胞は、例を挙げるとｐｒｏや真核細胞などが含まれ、とりわけ野生型細胞としてＲａｆ、特にＢ−Ｒａｆを発現する細胞が含まれる。野生型細胞として全くＲａｆを発現しない、あるいは非常に低い程度でのみＲａｆを発現する細胞において、Ｒａｆタンパク質は当業者には周知である方法によって発現させることができる。その方法には、例えば感染、トランスフェクションまたは変質などの工程を細胞とＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆ、またはその一部のための核酸コーディングを保持したベクターとの間で行なう方法が含まれる。本発明による方法に用いられる好ましい試料は、Ｒａｆ作用、とりわけＢ−Ｒａｆ作用が抑制されているか、あるいは全く作用していない細胞である。上記のような細胞は、同型複合体、または異型複合体のＲａｆ実験用マウスなどから得ることが可能である。これらの細胞はすなわち、ａ−ｒａｆ、ｂ−ｒａｆまたはｃ−ｒａｆ（−／−）または（＋／−）である。本発明による方法において好ましいとされる細胞は、同型複合体または異型複合体のＲａｆ実験用マウス、またはマウスの胎児から採取されるニューロンまたはニューロン幹細胞である。このような細胞は、例としてはｂ−ｒａｆ（−／−）が欠乏したマウスから採取される（Ｗｏｊｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２９３―２９７、１９９７）。
【００１８】
またさらに、本発明における試料という語句には、当業者には周知である慣例的な方法によって上記に記載の細胞のうちいずれかから採取可能な細胞抽出物も包含される。しかし、これに適した方法は「凍解法」、「ソニフィケーション（Ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、または「フレンチ・プレス法」のみに制限されるわけではない。適用可能であれば、上記のような細胞抽出物はさらなる工程において処理または純化されることも可能である。その好ましい工程としては、例として沈殿、ろ過、色層分析法（クロマトグラフィ）などが挙げられる。適した色層分析法は当業者には周知であり、例を挙げると陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティ・クロマトグラフィ及び／または規模排除クロマトグラフィなどが含まれる。
また、試料はＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆが含まれた純化されるかあるいは組み替えられたタンパク質の混合物、及び／またはＢ−Ｒａｆの作用を測定するために用いられる、例えばＲａｆの基質、緩衝液、洗浄液、プロテアーゼ・インヒビターＮＴＰｓ及び／または適切な金属イオンなどの、さらなる要素を含んだタンパク質混合物であってもよい。試料に含まれるＲａｆタンパク質はＢ−Ｒａｆタンパク質またはＣ−Ｒａｆタンパク質、もし適用可能であればＡ−Ｒａｆタンパク質でもよいが、とりわけＢ−Ｒａｆタンパク質が好ましい。ｗｔＲａｆタンパク質と比べるとセリン／トレオニン・ホスホキナーゼの作用が活発であるので、試料に含まれるＲａｆタンパク質は活性化したＲａｆタンパク質であることが好ましい。Ｒａｆタンパク質は、例えば可逆可能なリン酸化などによって活性化される。しかしながら構成的な活性化は、突然変異種の導入によってまた可能となり、適切な突然変異は例として酵素におけるＮ−末端部分、とりわけＣ−Ｒａｆ−１における259Ｓｅｒから259Ａｌａへの突然変異、そしてＢ−Ｒａｆにおけるアナログ位置の変異またはＣＲ２領域内での変異、この領域へのリンカー構造の挿入、またはＲａｆ−１における完全なるＮ−末端の削除（Ｄａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．、ＴＩＢＳ  １９,４７４−４８０；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｔｌｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，１７４−１７９，１９９７）などに関連する。
【００１９】
試料におけるＲａｆの作用の測定は、直接的及び間接的な様々な検知方法によって可能である。試料の性質によって、それに適した方法がそれぞれにとられる。細胞におけるＲａｆの作用は、一方では細胞内で発現したＲａｆの量によって測定され、一方では活性化したＲａｆの量によって測定される。Ｒａｆタンパク質、とりわけＢ−Ｒａｆタンパク質のための遺伝子コーディングの転写における活性化は、例えばＲａｆ  ｍＲＮＡの量の測定などによって行なうことが可能である。先行技術における通常の方法には、例えばＤＮＡチップの交雑（ハイブリダイゼーション）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、プライマ伸長法及びＲＮＡ保護などが含まれる。
さらに、それぞれのＲａｆ遺伝子の転写の誘導または抑制に基づいたＲａｆ作用は、Ｒａｆプロモータがそれに適応するレポーター遺伝子構造と結合することによって測定することができる。適したレポーター遺伝子の例としては、クロラムフェニコール・トランスフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）やその変体、発光酵素（ルシフェラーゼ）遺伝子やレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）遺伝子などがある。一方でＲａｆタンパク質の発現の増加は、タンパク濃度によって探知することも可能であり、この場合、例えばＲａｆタンパク質に対する抗体などによってタンパク質の量は探知される。しかしＲａｆタンパク質の作用における変化は、タンパク質のリン酸化または脱ホスホリル化の増加または減少に由来するとも考えられる。例としては、Ｂ−Ｒａｆキナーゼは、５９８Ｔｈｒ及び６０１Ｓｅｒ遺物（残留物）のリン酸化によって調節されるという事項が挙げられる（Ｚｈａｎｇ  Ｂ．Ｈ．ａｎｄ  Ｇｕａｎ  Ｋ．Ｌ．ＥＭＢＯＪ．１９：５４２９，２０００）。Ｂ−Ｒａｆタンパク質におけるリン酸化の変化は、例えばリン酸化されたトレオニンまたはセリンに対する抗体によって探知することができる。
【００２０】
Ｒａｆタンパク質はトレオニンキナーゼやセリンキナーゼであるので、Ｒａｆタンパク質の作用はそれらの酵素的活性によって測定することも可能である。ＭＥＫタンパク質は、例えばＢ−Ｒａｆの基質であった場合、ＭＥＫにおけるリン酸化の程度によって試料におけるＢ−Ｒａｆ作用を測定することが可能となる。これと同様に、Ｒａｆタンパク質におけるその他の基質（例としては、Ｒａｆによってのみリン酸化反応が起きると限定されるＭＥＰやペプチド（Ｓａｌｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，７１３−７４０，１９９９、Ｂｏｎｄｚｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，５０３０−５０３３，２０００））が各々の作用を測定するのに用いられることも可能である。
Ｒａｆは、一連のキナーゼが上位化されたキナーゼによってそれぞれリン酸化及び活性化された信号カスケードの一部であるので、Ｒａｆの作用はＲａｆに従属するそれぞれのキナーゼのリン酸化の程度を観測することでもまた測定することができる。この、いわゆるマップキナーゼ（ｍａｐ  ｋｉｎａｚｅ）経路は、その他の特質の中でも転写因子におけるある特定の活性化、延いては遺伝子の転写的活性化へとつながり、Ｒａｆの作用はこれらの標的遺伝子の作用を測定することにより間接的に特定可能となる。前記のような標的遺伝子には、例えばＩＡＰ／ＩＴＡタンパク質の分類をコードする遺伝子などが含まれる。このように、Ｒａｆの作用はＩＡＰ／ＩＴＡタンパク質、とりわけＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰやサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の活性化を測定することでまた特定することができる。標的遺伝子における活性化を測定するには、上記に記載した方法が適しているといえる。
【００２１】
試料が例えば細胞抽出物、タンパク質混合物及び／またはＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆを含んだ混合物またはその一部であった場合、作用を特定するためには、主に上記の方法を用いたＲａｆタンパク質そのものの組み換え、またはＲａｆタンパク質における酵素的作用によってもたらされる変化の測定が行なわれる。
この好ましい方法には、ＭＥＫなどのＲａｆの直接基質のリン酸化を判断する過程が包含され、この方法においてＭＥＫの32Ｐの組込みまたはリン酸化は、リン酸化されたＭＥＫのみを探知する、活性化が特定されたＭＥＫの抗体によって可能となる（Ｂｏｎｄｚｉ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：５０３０−５０３３，２０００）。その他の可能性としては例えば、上記で説明した信号伝導連鎖を用いてミエリンなどのＲａｆに従属する基質のリン酸化によってＲａｆの作用を測定する連動測定法を導入する方法がある（Ｂｏｎｄｚｉ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：５０３０−５０３３，２０００）。
【００２２】
本発明によると、未処理の試料（対照）と比べてみると、試料におけるＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの作用を促進または抑制する潜在的活性成分は、中枢神経系における細胞の機能に影響を及ぼす薬理的活性成分である。中枢神経系における細胞の機能に影響を及ぼす薬理的活性成分は、対照と比べて１０％以上もＲａｆの作用を変化させ、好ましい変化量は少なくとも５０％、また少なくとも１００％、ことさら好ましいのは少なくとも５００％である。
【００２３】
また別の実施案においては、工程ａ）の後に培養期間が設けられるが、培養される期間は試料によってそれぞれ異なる。試料に細胞が含まれる場合、作用（工程ｂ）は１時間から１００日、好ましくは１日から５０日、ことさら好ましくは３日から１０日、その中でもとりわけ好ましくは３日間の期間をおいた後に測定される。試料に細胞が含まれていない場合、作用は一例では約０秒（接触を行なって即時に起こる作用の測定）から２０日のタイム・スパンで測定される。試料を潜在的活性成分に接触させた後に設けられる培養期間のためのタイム・スパンとしては、５、１０、２０、３０，４０，５０，６０，９０，１２０，１５０または１８０分が好ましいとされる（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８，３１８−３２９，１９９９）。
【００２４】
本発明による方法のより好ましい実施案では、試料には少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの細胞抽出物、少なくとも１つのタンパク質混合物及び／またはＲａｆ、とりわけ活性化したＲａｆまたはその一部を含む混合物が含まれることとする。本発明による方法を実行する上で適したＲａｆタンパク質の一部は、例えばＭＥＫなどのようにリン酸化することが可能であるか、またはそれぞれの基質に対してセリンキナーゼ及び／またはトレオニンキナーゼとして作用することが可能である。本発明に適したＲａｆタンパク質の一部は、標準方法によるＲａｆのリン酸化のために、例えばＲａｆ基質またはＲａｆキナーゼキナーゼ（Ｋｉｎｕｙａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、（２０００）  Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ.２３．１１５８−６２）としてＭＥＫを用いることで測定することができる。
【００２５】
本発明による方法のより好ましい実施案では、細胞はグリア細胞またはニューロン細胞、とりわけ感知ニューロン細胞、運動ニューロン細胞、ニューロン幹細胞、またはニューロンであることが好ましく、本発明による方法においては、例えば細胞培養においてニューロン幹細胞と識別可能なニューロンが使用されることとする（Ｖｅｓｃｏｖｉ  ａｎｄ  Ｓｎｙｄｅｒ、Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．９,５６９−５９８,１９９９）。
【００２６】
本発明による方法の実施案において、細胞におけるＲａｆの活性化は細胞の生存率の変化によって測定することができる。これは、例えば突然変異などによってＲａｆの作用が抑制されるかあるいは完全になくなり、これによって各々のｗｔ細胞と比べて神経栄養性因子の有無に関わらず低い細胞生存率を持つ細胞に関しては、特に興味深い事項である。とりわけｂ−ｒａｆ（−／−）の細胞に関しては、神経栄養性因子が存在する場合でも、ｗｔ細胞と比べて著しく低い生存率を示す。少なくとも１つの潜在的活性成分との培養後にみられるこれらの細胞の生存率の上昇は、Ｒａｆの作用を特定する間接的手段となりうる。
【００２７】
本発明による方法のより好ましい実施案において、ｂ−ｒａｆまたはｃ−ｒａｆの異型接合体マウスの対合のｂ−ｒａｆ（−／−）またはｃ−ｒａｆ（−／−）が欠乏したそれぞれのマウスの胎児から感知及び／または脊髄の運動ニューロン細胞が用いられる。さらに、これらのマウス胎児から神経幹細胞を脳及び脊髄から単離させ、細胞培養で繁殖し、神経細胞と区別することも可能である。適切な神経栄養性因子（例えば運動ニューロンにはＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、感知ニューロンにはＮＧＦ）を付加すれば、ｃ−ｒａｆが欠乏した神経細胞の生存には繋がるが、ｂ−ｒａｆが欠乏した神経細胞の生存には繋がらない。同様の調査はｂ−ｒａｆ（−／−）またはｃ−ｒａｆ（−／−）マウスの神経幹細胞から単離された神経細胞においても試行されてよい。
【００２８】
本発明による方法の実施案において、同一の（場合によっては複数の）潜在的活性成分が一方ではｃ−ｒａｆ（−／−）が欠乏した細胞と接触され、その一方ではｂ−ｒａｆ（−／−）が欠乏した細胞と接触され、この（これらの）検体が存在する場合でもｂ−ｒａｆ（−／−）欠乏の神経細胞は生存するかそれぞれ測定される。
【００２９】
このような間接的測定法によって、Ｒａｆキナーゼに従属する信号伝導反応におけるＲａｆの作用が抑制されたまたは探知不可能な、細胞内で作用する薬理的活性物質を測定することもまた可能となる。
【００３０】
本発明による方法のより好ましい実施案において、試料におけるＲａｆの作用はＲａｆタンパク質の量、Ｒａｆの核酸コーディングの量及び／またはＲａｆの酵素的活性化によって直接的または間接的に測定される。これに適した方法は、既に上記で説明されている。
【００３１】
本発明の別の実施案において、（場合によっては複数の）潜在的活性成分が一方ではＣ−Ｒａｆを含んだ細胞抽出物またはタンパク質混合物、あるいは純化されたまたは組み換えられたＣ−Ｒａｆと接触され、その一方ではＢ−Ｒａｆを含んだ細胞抽出物またはタンパク質混合物、あるいは純化されたまたは組み換えられたＢ−Ｒａｆと接触されることによって、Ｃ−ＲａｆとＢ−Ｒａｆのそれぞれの作用が測定される。好ましい薬理的活性成分は、Ｃ−Ｒａｆの作用よりもＢ−Ｒａｆの作用に対して、より高い程度で影響を及ぼす。Ｂ−Ｒａｆの作用に対する影響がＣ−Ｒａｆの作用に対する影響よりも、少なくとも約２倍、より好ましくは約４倍、特に好ましくは約１０倍高い場合に、より強力な影響があると言える。
【００３２】
本発明のもう１つの主題となるのは、さらなる工程において試料におけるＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の作用を測定する方法である。この方法において、試料は細胞であることが好ましい。ＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の作用及び／または量の測定は、上記で説明したように抗体によるタンパク質濃度及び／または核酸濃度に基づいて行なわれてもよい。
【００３３】
本発明のまた別の実施案では、例えば９６、３４８または１５５２のくぼみ（ｗｅｌｌ）が施されたマイクロタイタープレートの上などで試料は区分化される。このようなマイクロタイタープレートは、短時間で何万もの異なる潜在的活性成分を検査する全自動で大規模な平行検査法において通常の過程として既に用いられている。基本的には、試料に接触される潜在的活性成分の影響を空間的に制限し、試料においてそれぞれに用いられた潜在的活性成分がＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの作用に及ぼす影響を測定することが可能であれば、どのような区分化でも適切である。
試料は、例えばマイクロタイタープレートなどの試料キャリアの表面と共有または非共有であってもよく、また溶液、懸濁液または浮揚体と結合されるかその中に含まれてもよい。本発明による方法を行なうのに適した先行技術のマイクロタイター形態に加えて、平面的試料キャリア、またはくぼみあるいは溝が施された試料キャリアでも適する。試料キャリアは、例えばガラス、シリコン、金属またはプラスチックであってもよい。
【００３４】
本発明による方法のまた別の実施案において、少なくとも１つの潜在的活性成分は試料キャリアに共有または非共有に結合することも可能で、この際の試料キャリアの表面はくぼみまたは溝が施された構造であるか、平面状であることが好ましい。上記試料は非活性の状態にある潜在的活性成分と接触され、試料におけるＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの作用が潜在的活性成分におけるそれぞれの非活性箇所において測定される。
例を挙げると、例えばＷＯ８９／１０９７７、ＷＯ９０／１５０７０、ＷＯ９５／３５５０５及びＵＳ５，７４４，３０５などによって周知である通常の方法で作られたタンパク質チップに関しては、タンパク質チップはその表面に異なるペプチド断片を含んで作られることも可能であり、それが例えばＲａｆタンパク質、好ましくは純化されたＢ−Ｒａｆタンパク質の作用に及ぼす影響が測定される。これと同様に、先行技術による組み合わせ化学方法では、表面において複数の異なる化学物質を生成することが可能であり、本発明による方法を用いてそれらの物質がＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの作用に及ぼす影響を測定することができる。
【００３５】
本発明による方法のまた別の実施案とは、試料におけるＢ−Ｒａｆの作用が測定された後、引き続いて１つまたは２つの工程が存在し、それらの工程において薬理的活性成分が単離されるという方法である。活性成分の混合物は例えば植物抽出物や微生物の抽出物などに存在するため、潜在的活性成分が活性成分の混合物である場合、この方法は特に興味深い事項となる。薬理的活性成分を複合物質混合物から単離するために用いられるさらなる工程における技術は周知のものである。これらの方法は、例えば異なる溶媒におけるそれぞれの要素の識別的溶解度に基づく、例えば沈殿法、結晶化法、クロマトグラフ法または分離法などから構成される。それぞれの単離工程の終了後、活性成分の効力はその活性成分を試料に接触させ、試料におけるＲａｆの作用を測定することで再び見られる。
【００３６】
本発明による方法のまた別の実施案では、薬理的活性成分はまた別の工程から調製される。
【００３７】
本発明による方法を用いて薬理的活性成分が測定及び／または単離された後、この薬理的活性成分は、例えばハロゲン、中でもとりわけフッ素または塩素の組み換え法及び／または組み合わせ化学法などを含む、当業者には周知である方法によって組み換えることが可能で、組み換えられた薬理的活性成分の試料におけるＲａｆの作用を基の活性成分を用いた際の試料におけるＲａｆの作用と比較することで、本発明による方法を用いて再び測定することができる。
【００３８】
このように、上記に記載の方法のいずれか１つを用いて特定される薬理的活性成分もまた本発明の主題となる。好ましいのは、Ｒａｆ、特にＢ−Ｒａｆの作用を増幅させる薬理的活性成分であり、（場合によっては複数の）薬理的活性成分のとりわけ好ましい効果は中枢神経系における細胞の生存率の修飾を行なうことである。本発明による方法によって測定される薬理的活性成分は、Ｂ−Ｒａｆのみの作用を増幅または抑制し、Ｃ−ＲａｆまたはＡ−Ｒａｆの作用には影響しないことが好ましい。
【００３９】
Ｂ−Ｒａｆの作用には、好ましくは増幅または抑制といった影響を及ぼし、Ｃ−Ｒａｆの作用には影響を及ぼさない薬理的活性成分を測定するためには、ｃ−ｒａｆ遺伝子が欠乏した細胞を対象に用いるとよい。上記のような細胞は、例えばｃ−ｒａｆ（−／−）が欠乏したマウスから得ることができる（Ｗｏｊｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．７６：１１−１４９,１９９８）。
【００４０】
本発明のまた別の主題は、細胞及び／または細胞抽出物におけるＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆ、ＩＡＰ−１，ＩＡＰ−２，ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の作用を測定することを特徴とした、中枢神経系の細胞の機能を生体外分析（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ）するための方法である。このために、中枢神経系の細胞が患者から摘出される。これらの細胞は上記のタンパク質の作用を見るために直ちに実験されてもよく、細胞そのもの、または細胞から採取された細胞抽出物を検査するのに上記に記載のいずれの方法を用いてもよい。
さらに、患者から単離された細胞を培養することも可能で、中枢神経系の細胞を培養するには先行技術における方法が用いられてもよい。例えば中枢神経系における単離された細胞の数が少ない場合及び／または細胞の摘出後、間を置かずに分析を行うことが不可能な場合、この方法は望ましい。培養することによって、時間が経つと、上記のタンパク質の作用を細胞及び／または細胞抽出物において直接的に測定することができる。
【００４１】
本発明のまた別の主題となるのは、Ｒａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆ、ＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の作用を検知するための少なくとも１つの作用物質を含んだ、中枢神経系における細胞の機能を生体外分析（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ）するための診断物質である。
【００４２】
本発明による上記の診断物質は、例えばＤＮＡ断片、とりわけタンパク質Ｒａｆ（中でも特にＢ−Ｒａｆ、ＩＡＰ−１，ＩＡＰ−２，ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ））のためのｃＤＮＡ断片コーディングの増殖（ＰＣＲ）を可能にする１つまたはそれ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチド対を包含する。本発明による好ましい診断物質は、Ｂ−Ｒａｆの作用を探知するためのＤＮＡプローブ対と、Ａ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、ＩＡＰ−１，ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）の作用を探知するためのもう１つのプローブ対を含む。
本発明によるさらなる診断物質の例としては、特にＢ−Ｒａｆ、ＩＡＰ−１，ＩＡＰ−２，ｘ−ＩＡＰ、サーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、活性化したＲａｆ、中でも特にＭＥＫなどの活性化したＢ−Ｒａｆ及び／またはＲａｆによって直接的または間接的に活性化されたタンパク質などを含むＲａｆに対する抗体が挙げられる。本発明による診断物質における好ましい材料は、上記に記載の抗体の中から選択された２つの抗体から構成される。その好適な組み合わせは、Ｂ−Ｒａｆに対する抗体と活性化したＢ−Ｒａｆに対する抗体、活性化したＢ−Ｒａｆに対する抗体とＩＡＰ−１，Ｉａｐ−２,ｘ−ＩＡＰ及び／またはサーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）に対する抗体である。
【００４３】
本発明のまた別の主題は、中枢神経系における細胞の機能に影響を及ぼす薬理的活性物質を特定するための検査システムである。この検査システムは以下の物質から構成される。
ａ）少なくとも１つの試料、とりわけ少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの細胞抽出物、少なくとも１つのタンパク質混合物及び／またはＲａｆ、とりわけ活性化したＢ−Ｒａｆまたはその１部分を含んだ混合物
ｂ）Ｒａｆの作用、とりわけＢ−Ｒａｆの作用を特定するための少なくとも１つの作用物質
【００４４】
上記の検査システムの好ましい実施案では、試料は例えば９６、３４８または１５５２のくぼみ（ｗｅｌｌ）が施されたマイクロタイタープレートの上などで区分化される。このようなマイクロタイタープレートは、短時間で何万もの異なる潜在的活性成分を検査する全自動で大規模な平行検査法において通常の手段として既に使用されている。基本的には、試料に接触される潜在的活性成分の影響を空間的に制限し、試料においてそれぞれに用いられた潜在的活性成分がＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆの作用に及ぼす影響を測定することが可能であれば、どのような区分化の方法でもこの検査に適する。試料は、例えばマイクロタイタープレートなどの試料キャリアの表面と共有または非共有であってもよく、あるいは溶液、懸濁液または浮揚体の中に含まれていてもよい。
【００４５】
本発明のまた別の主題は、中枢神経系における細胞の機能の障害に伴い発生する病気を治療するための、Ｒａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆと、もし適用可能であれば適切な補助的または付加的な物質を含んだ薬物である。この薬物は、例えばＲａｆタンパク質及び／またはＲａｆタンパク質のためのＤＮＡ断片符号化（ＤＮＡセクションコーディング）など含むこともある。適切な補助的または付加的な物質の例としては、プロテアーゼ阻害剤、洗浄剤、緩衝液、例えば組み換え型アデノウィルス（Ｇｒａｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：７６５−７７０,１９９７）などのウィルス性ベクター、例えばリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）や同様の操作方式を持つ物質などのトランスフェクション試薬（Ｇoｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９：２４７９−２４８９,２０００）、または一過性膜透過性を持つ細胞における発現ベクターの転移のための緩衝試薬（Ｗｅｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ    Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：９７８−９８３,１９９９）などが挙げられる。
【００４６】
本発明における薬物は、例えば脳虚血性梗塞（梗塞）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、神経障害、多発性硬化症、パーキンソンズ病、糖尿病性神経障害、脊髄性筋萎縮症、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）などのプリオン病などに見られる細胞の生存率の低下によって特徴づけられる中枢神経系における細胞の機能の障害に用いられる。
【００４７】
本発明において好ましい薬物は、ベクターにおけるＲａｆ、とりわけＢ−Ｒａｆを含むこととする。本発明で用いられるベクターという語句は、プラスミド・ベクター、その中でもとりわけエピソマル（ｅｐｉｓｏｍａｌ）複製ベクターやウィルス性ベクターに関し、好ましいウィルス性ベクターの例としてはヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、パピローマウィルスまたはＨＩＶ１、またはこれらのウィルスから派生するウィルスなどが挙げられる。Ｒａｆタンパク質の転移、とりわけＢ−Ｒａｆタンパク質及び／またはＲａｆタンパク質、特にＢ−Ｒａｆのための核酸コーディングの転移に同様に適した、例えばリポソーム、ヴィロソームや、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）（Ｔｈｏｒｅｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８２：２６５−２６８,２０００）やＨＩＶ−ＴＡＴ（Ａｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１３８０−１３８８,２００１）を含んだ融合タンパク質などの一連のその他のウィルスは当業者には周知の事項である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下に記載の例は、本発明のより詳細な説明を付すためのものであるが、その範囲を制限するものではない。
【００４９】
例）
１．ニューロンの単離及び培養
ｂ−ｒａｆ（＋／−）の異型接合体またはｃ−ｒａｆ（＋／−）の異型接合体の親動物が異種交配される（Ｗｏｊｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．７６：１４１−１４９,１９９８；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２９３−２９７,１９９７）。ｂ−ｒａｆ（−／−）またはｃ−ｒａｆ（−／−）の同型接合体のマウスの新生児と同様の１２．５日目の胎児から、モノクローナルラットのａｎｔｉ−ｐ７５抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｈｏｆｈｅｉｍ、ドイツ）を用いたパンニング技術（Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７３５−１７４２,１９９８）によって脊髄運動ニューロンが単離される。このために、腰部脊髄における腹外側部は機械的に分解され、（１０iＭ  ２−メルカプトエタノールを含んだ）ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝溶液の中に移動され、トリプシン（０．０５％、１０分）と共に培養される。上清における各々の細胞浮遊物はａｎｔｉ−ｐ７５抗体で覆われた培養皿に移され、常温で３３０分間培養される。
【００５０】
次に各々の培養皿が洗浄され、堆積した細胞は３５ｍＭ  ＫＣｌと１iＭ  ２−メルカプトエタノールを含んだ０．８％の塩性溶液によって培養貝（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｈｅｌｌ）から除去される。
【００５１】
このようにして得られた細胞は１ｃｍ2につき２０００細胞の密度（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｎuｒｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）でポリオニチン（Ｐｏｌｙｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）とラミニンで予め覆われた培養皿に植付けられる。細胞は、神経基底（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）培養基（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ,Ｂ２７の補助物質、１０％のウマ血清、５００iＭのグルタマックス、そして５０iｇ／ｍｌのアポトランスフェリン（Ａｐｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ））に二酸化炭素を５％含有した空間で３７度の温度で保存される。細胞培養基のうちの５０％は１日目に取り替えられ、その後は２日に１回のペースで交換される。
【００５２】
ＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰ及びｔ−ＩＡＰ（サーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ））のためのｍＲＮＡの分析は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて行なわれる。ＲＮＡはトリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を用いて単離され、ＴＲ−ＰＴＲ反応のために合計１０ｎｇのＲＮＡがそれぞれ用いられる。
ＩＡＰ−１、ＩＡＰ−２、ｘ−ＩＡＰ及びｔ−ＩＡＰ（サーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ））の増幅のためのプライマ配列は次の通りである。ＩＡＰ−１ｆ：  ５'−ＴＡＣＴＡＣＡＴＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡ−３'、ＩＡＰ−１ｒ：  ５'−ＣＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡ−３'、焼なまし温度：  ５５℃、ＩＡＰ２ｆ：５'ＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣ−３'、ＩＡＰ−２ｒ：  ５'−ＧＣＴＴＧＴＡＡＧＧＧＴＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣ−３'、焼なまし温度：  ５５℃；  ｔ−ＩＡＰ（サーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ））、ｔＩＡＰｆ：  ５'−ＣＣＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＧＴＡ  ＣＣ−３'  及び  ｔＩＡＰｒ：  ５'−ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＴＴ  ＧＡＣ  ＴＧ−３'、焼なまし温度    ６４℃。  ＲＮＡの完全性を制御するために、aアクチンｍＲＮＡの一部は次のプライマと共に増幅される：a―アクチンｆ：  ５'ＧＴＧＧＧＣＣＧＣＣＣＴＡＧＧＣＡＣＣＡＧ−３'、 aアクチンｒ：  ５'ＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ−３'、焼なまし温度：  ６４℃。製造者のプロトコルを受けるとＲＴ−ＰＣＲは、ランダム６量体プライマを用いて行なわれる。ＰＣＲ増幅は次の要領で行なわれる：９４℃、３０秒、指定焼なまし温度、１分、７２℃、１分。ＩＡＰ−１及びｔ−ＩＡＰ（サーバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ））は３３及び３５サイクルで処理され、ＩＡＰ−２及びｘ−ＩＡＰは２８及び３０サイクル、そしてaアクチンは２６及び２８サイクルで処理される。
ｂ−ｒａｆ及びｃ−ｒａｆ＋／−対合のＥ１２．５脳におけるＲＮＡのＰＴ−ＰＣＲは、結果的にはｂ−ｒａｆおよびｃ−ｒａｆ−／−の胎児では野生型対照と比べて平均して６０％と５５％のＩＡＰ−１の減少、ｂ−ｒａｆ−／−では５２％のＩＡＰ−２の減少、そしてｂ−ｒａｆ−／−胎児では４６％のｘ−ＩＡＰの減少がそれぞれ野生型対照と比べて顕著に見られた。
【００５３】
ｂ−ｒａｆ（−／−）またはｃ−ｒａｆ（−／−）に関しては同型接合体である生まれる前のマウスと同様の１２．５日の胎児からさらなる感覚ニューロンが単離される。このために後根神経節が単離され、トリプシン（ヘペス緩衝液（Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ）０．０５％）と共にリン酸緩衝生理食塩水にて３０分間培養される。１０％のウマ血清を含むＬ１５溶剤を加えることでトリプシン消化を制止させ、細胞は培養皿で３〜４時間プレートアウトされる。浮遊物における細胞は遠心分離され（１０分４００ｇ）、脊髄運動ニューロンについての説明と同様に、細胞は神経基底媒体において保存される。
【００５４】
２．ニューロン幹細胞の単離及び培養
正常ｂ−ｒａｆ（−／−）またはｃ−ｒａｆ（−／−）が欠乏したマウス胎児の脳から神経幹細胞が単離され、同様に生まれたばかりのマウスからも単離される。プレパラート顕微鏡に置かれた状態で前脳一帯が摘出され、さらに発育した胎児の場合には海馬、脳室周囲一帯も摘出される。これらの脳部分は２００iｌ  ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）に移され、０．１％トリプシン（ＨＢＳＳの終末濃度）で３７℃の温度で１０分間培養され、反応はＨＢＳＳの終末濃度の０．１％トリプシン阻害剤（卵の黄身袋から得られるトリプシン阻害剤（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）、原液：ＨＢＳＳ／２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳの１％）によって制止される。その後、細胞は２００iｌのピペットで１０回練和され、５ｍｌの容積の媒介物[（神経基底媒介物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｂ２７付録（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｓｔｏｃｋ  ５０ｘ、ＥＫ  ｌｘ）Ｇｌｕｔａｍａｘ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｓｔｏｃｋ  １００ｘ、ＥＫ  ｌｘ）、ｂａｓｉｃＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）Ｉ）]に移される。
単離された細胞はサーステッド皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  ｐｌａｔｅ）（５０ｍｌ）（繁殖室、３７℃、二酸化炭素５％、大気飽和湿度）にて培養され、媒介物は２日に一回取り替えられる。細胞はエンブロイド体（ｅｍｂｒｏｉｄ  ｂｏｄｙ）として発育し互いに結合しないので、媒介物交換のためにはファルコン試験管に移され、４００ｇで５分間遠心分離される。浮遊物は吸い取られ、細胞の堆積物は滴定され新しい媒介物に置かれる。遅くても３回の工程を経ると大きなエンブロイド体（ｅｍｂｒｏｉｄ  ｂｏｄｙ）が形成され、これはトリプシン処理（上記参照）が施され、低い細胞密度（最高でも１つの皿につき細胞1万個）で１０ｃｍの皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に置かれる。ここでそれぞれの細胞は９６のくぼみ皿(ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ)に広げられ、のちには２４、そして１２のくぼみ皿（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に広げられる。このようにして神経幹細胞のそれぞれの細胞クローンは、それらの分化能力を検査され、検査方法に用いられることができる。
【００５５】
再現性のある結果を得るために、細胞は断層として形成され冷凍され、のちの実験のために保存される。
【００５６】
神経幹細胞は、通常プロトコルの後、すなわち遠心分離が行なわれた後に冷凍され、１０％のＤＭＳＯを含んだ媒介物に置かれ、1℃／分の速度で−８６℃まで（ＭｒＦｒｏｓｔｉ内において）冷却され、Ｎ2液の中で−１８６℃で保存される。
【００５７】
３．ｂ−ｒａｆ（−／−）欠乏ニューロンにおける神経栄養性因子の影響
運動ニューロンには神経栄養性因子としてグリア細胞由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及び毛様態神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）（それぞれ１ｎｇ／ｍｌ）が加えられ、感覚ニューロンにはＮＧＤ（１ｎｇ／ｍｌ）が加えられる。正常マウスの対照培養において、各神経栄養性成長因子を添加しなければ細胞のうち約１０〜２５％しか生存しなかったにもかかわらず、各神経栄養性成長因子を添加すると、最初に散布したニューロン細胞のうち約７０％が生存した。これに関して、ｃ−ｒａｆ（−／−）、ｃ−ｒａｆ（＋／−）またはｂ−ｒａｆ（＋／−）が欠乏した胎児またはマウスは正常マウスの培養となんら変わりはないにもかかわらず、ｂ−ｒａｆ（−／−）欠乏胎児または新生児マウスにおける運動ニューロン及び感覚ニューロンの生存に対する神経栄養性因子の影響は検知されなかった。ｂ−ｒａｆ（−／−）欠乏ニューロンにおいて、細胞培養に神経栄養性因子を添加した場合もしなかった場合も、その３日後の生存率は最初に散布したニューロンの３％を下回るものだった。
【００５８】
これらの結果は、Ｂ−Ｒａｆは感覚及び運動神経細胞の生存のための決定的な信号誘導タンパク質であることを明示している。
【００５９】
４．神経細胞を保護する物質を特定するための方法
例として上記に記載の方法などから得られた神経細胞は、細胞死から神経細胞を守る物質を検索するためにも用いられる。
【００６０】
このために、上記のｂ−ｒａｆ（−／−）、ｂ−ｒａｆ(＋／−)、ｃ−ｒａｆ（−／−）が欠乏した運動ニューロン及び感覚ニューロンと、正常の運動ニューロン及び感覚ニューロンが用いられ、細胞培養に散布されたのち検体を用いて反応を起こさせる。神経細胞を保護する物質は、ｂ−ｒａｆ（＋／−）、ｃ−ｒａｆ（−／−）または正常ニューロンの生存率を低下させることなく、ｂ−ｒａｆ（−／−）ニューロンの死を防ぐことが可能である。
【００６１】
上記方法のモデル型検査として、感覚ニューロン細胞はウィーズ及びその他（Ｗｉｅｚｅ  ｅｔ  ａｌ．）による方法を用いてＢ−Ｒａｆ遺伝子（Ｗｏｊｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９１：９７−１０４、２０００）の読み取り枠を含むプラスミド（ｐＣＤＮＡ３）、またはＬａｃＺ発現プラスミドと共にトランスフェクションされ、細胞培養においてこのようにしてトランスフェクションされたニューロンの生存が検査される。
【００６２】
ＬａｃＺ発現プラスミドと共にトランスフェクションされた、またはされていないｂ−ｒａｆ（−／−）欠乏ニューロンは、神経栄養性因子が加えられた細胞培養においても加えられていない細胞培養においても死んでしまったにもかかわらず、ｂ−ｒａｆ遺伝子を含んだプラスミドと共にトランスフェクションされたｂ−ｒａｆ（−／−）欠乏ニューロンは生存した。Ｂ−Ｒａｆタンパク質に特定の抗体を用いて（Ｓｉｔｈａｎａｎｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：１７７５−１７８０、１９９０）、ｂ−ｒａｆ遺伝子を含んだプラスミドと共にトランスフェクションされて生存したｂ−ｒａｆ（−／−）欠乏ニューロン細胞の免疫蛍光検査による調査を行なった結果、これらの細胞はＢ−Ｒａｆタンパク質を含むことが判明した。
【００６３】
これらの調査から、適した活性化成分（Ｂ−Ｒａｆのためのプラスミドコーディング）によってｂ−ｒａｆ（−／−）欠乏ニューロン細胞は死から保護されることが証明され、故にこの方法は神経細胞を保護する物質を特定するのに適しているといえる。
【００６４】
５．活性成分の検査
以下の活性成分は本発明による方法を用いて検査された：
−ＧＷ  ５０７４、Ｃ−Ｒａｆキナーゼの阻害剤（９ｎＭのＩＣ５０値；Ｌａｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０：２２３（２００）
−ＥＭＤ  ４０００７３；Ｂ−Ｒａｆキナーゼの阻害剤（１iＭのＩｃ５０値；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ２００１）
−ＺＭ  ３３８３７２；Ｃ−Ｒａｆキナーゼの阻害剤（７０ｎＭのＩＣ５０値；Ｈａｌｌ-Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．６：５５９（１９９９）
【００６５】
物質は０．１、１．０、１０及び１００iｌの濃度で、毛様態神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）（１ｎｇ/ｍｌ）を含んだ培養と含まない培養に置かれた運動ニューロンに加えられ、２４時間後アポトーシスを起こした細胞及び生存した細胞の数がそれぞれ数えられる。毛様態神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）の有無に関係なくＢ−Ｒａｆ阻害剤が強いアポトーシスを引き起こした一方で、Ｃ−Ｒａｆ阻害剤によって処理された細胞培養においては、阻害剤が全く加えられていないそれぞれの対照グループと同様に多くの細胞が生存した。
【００６６】
これらの結果は、Ｂ−Ｒａｆの特定の阻害はニューロンにアポトーシスを引き起こし、これと対照的にＣ−Ｒａｆの阻害はニューロンの生存に影響を及ぼさないことを証明している。
【００６７】
６．神経の再生のための活性成分の検査
成体マウスにおいて、ケタネスト・ロンプン（Ｋｅｔａｎｅｓｔ／Ｒｏｍｐｕｎ）麻酔（１００ｍｇ/ｋｇ）をかけて顔面神経を切断し、ＧＷ５０７４及びＥＭＤ４０００７３活性成分がそれぞれ２０iＭづつゲル泡状断片に湿布され、切断された神経の局所的に末梢神経断端に置かれる。対照グループにおいて神経を損傷させ、ゲル泡状断片の上に溶剤（１００％ＤＭＳＯ）が施されると以下のような結果が得られる。成育マウスの顔面神経における運動ニューロンは軸索の損害を受けると再度の反応を示すため、１４日後の動物の対照においては９０％の生存率がみられた。ＧＷ５０７４の使用は運動ニューロンの再生能力に不利に働くことはないが、一方でＥＭＤ４０００７３の使用は明白に運動ニューロンの欠損につながる。（生体内での滴定は周囲の組織による不明確な吸収によって不可能なため、それぞれの物質は飽和量用いられる。）
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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