(57)【要約】【課題】本発明は、免疫細胞の細胞傷害活性を測定する新しい方法、および異常な免疫応答を治療する方法および生成物に関する。【解決手段】十字流濾過を使用して、商業的に有効で重要な方法におけるサイズに従って粒子を分離する。選択されたサイズのフィルタの使用、およびさらに、異なるサイズのフィルタ（すなわち濾過システム）の連続的な使用または連続的な取付けが、特に所望のサイズの範囲の粒子を得るための粒子の分離について開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の分子種をフィードストリームから分離する方法において、
(a)流動対ＴＭＰ曲線の圧力依存性領域において転移点流動の約5から100％までの範囲のレベルで流動を維持しながら、前記フィードストリームから前記所定の分子種を分離する孔のサイズを有する濾過膜を通す十字流濾過法により前記フィードストリームを濾過する工程であって、前記濾過の転移点における膜圧以下のレベルで膜圧を前記膜に沿って実質的に一定に維持し、これによって、前記所定の分子種がその生物学的活性を保持するように前記所定の分子種を前記フィードストリームから選択的に分離する工程、
(b)精密濾過法により前記フィードストリームを濾過する工程、を有してなり、
前記所定の分子種がタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フィードストリームを分画する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記フィードストリームを浄化する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記フィードストリームをダイアフィルトレーションする工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記フィードストリームを濃縮する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記所定の分子種が約1から1000kDaの分子量を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
すべての濾過段階が限外濾過であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記フィードストリームがミルクであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記フィードストリームが細胞溶解溶液であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が生物薬剤であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ミルクの状態が、以下の状態：
a)未加工；
b)希釈された；
c)緩衝液で処理された；
d)化学的に処理された；および
e)一部蒸発した
の一つから選択されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記分画段階が、セラミックの濾過膜を使用することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１３】
前記浄化段階が、セラミックの濾過膜を使用することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１４】
前記分画段階が、高分子の濾過膜を使用することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１５】
前記浄化段階が、高分子の濾過膜を使用することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１６】
前記分画段階が、セルロースの濾過膜を使用することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１７】
前記浄化段階が、セルロースの濾過膜を使用することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項１８】
体系的なパラメータを最適化する工程をさらに含むことを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１９】
前記体系的なパラメータが、温度、フィードストリームの流速、膜圧、フィードストリームの濃度およびダイアフィルトレーションの量を含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
体系的なパラメータを最適化する工程をさらに含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項２１】
前記体系的なパラメータが、温度、フィードストリームの流速、膜圧、フィードストリームの濃度およびダイアフィルトレーションの量を含むことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記所定の分子種が、タンパク質、免疫グロブリン、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、RNAおよびDNAからなる群より選択される生物学的存在であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２３】
前記最適温度範囲が、15℃から50℃までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
前記最適温度範囲が、20℃から35℃までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
前記最適温度範囲が、25℃から29℃までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
前記最適温度範囲が、15℃から50℃までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
前記最適温度範囲が、20℃から35℃までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
前記最適温度範囲が、25℃から29℃までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
前記フィードストリームの流速が、10cm/秒から100cm/秒までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項３０】
前記フィードストリームの流速が、20cm/秒から60cm/秒までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項３１】
前記フィードストリームの流速が、25cm/秒から45cm/秒までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項３２】
前記フィードストリームの流速が、10cm/秒から100cm/秒までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項３３】
前記フィードストリームの流速が、20cm/秒から60cm/秒までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項３４】
前記フィードストリームの流速が、25cm/秒から45cm/秒までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項３５】
前記膜圧の範囲が、1.38×104Pa（2psi）から2.76×105Pa（40psi）までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項３６】
前記膜圧の範囲が、3.45×104Pa（5psi）から2.07×105Pa（30psi）までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項３７】
前記膜圧の範囲が、6.90×104Pa（10psi）から1.38×105Pa（20psi）までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項３８】
前記膜圧の範囲が、1.38×104Pa（2psi）から2.76×105Pa（40psi）までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項３９】
前記膜圧の範囲が、3.45×104Pa（5psi）から2.07×105Pa（30psi）までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項４０】
前記膜圧の範囲が、6.90×104Pa（10psi）から1.38×105Pa（20psi）までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項４１】
前記フィードストリームの濃度が、天然のミルクの0.25倍から4倍までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項４２】
前記フィードストリームの濃度が、天然のミルクの0.5倍から3倍までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項４３】
前記フィードストリームの濃度が、天然のミルクの1.0倍から2倍までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項４４】
前記フィードストリームの濃度が、天然のミルクの0.25倍から4倍までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項４５】
前記フィードストリームの濃度が、天然のミルクの0.5倍から3倍までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項４６】
前記フィードストリームの濃度が、天然のミルクの1.0倍から2倍までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項４７】
前記ダイアフィルトレーションの量の範囲が、濃縮されたMF保持液の量の1倍から20倍までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項４８】
前記ダイアフィルトレーションの量の範囲が、濃縮されたMF保持液の量の3倍から15倍までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項４９】
前記ダイアフィルトレーションの量の範囲が、濃縮されたMF保持液の量の5倍から10倍までであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項５０】
前記ダイアフィルトレーションの量の範囲が、濃縮されたMF保持液の量の1倍から20倍までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項５１】
前記ダイアフィルトレーションの量の範囲が、濃縮されたMF保持液の量の3倍から15倍までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項５２】
前記ダイアフィルトレーションの量の範囲が、濃縮されたMF保持液の量の5倍から10倍までであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項５３】
全ての濾過段階に限外濾過膜が使用されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５４】
全ての濾過段階に限外濾過膜が使用されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項５５】
前記ミルクが、
a)水；
b)緩衝化した水溶性塩溶液；
c)キレート剤；
d)酸溶液；および
e)アルカリ溶液
からなる群より選択される溶液で処理されることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項５６】
前記ダイアフィルトレーションが、限外濾過透過水を使用することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項５７】
前記ダイアフィルトレーションが、水を使用することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項５８】
前記ダイアフィルトレーションが、緩衝化塩溶液を使用することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項５９】
前記使用される膜が、20℃より高い温度の溶液で洗浄されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６０】
前記使用される膜が、20℃から70℃までの温度の溶液で洗浄されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６１】
前記使用される膜が、40℃から60℃までの温度の溶液で洗浄されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６２】
前記使用される膜が、酸溶液で洗浄されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６３】
前記使用される膜が、アルカリ溶液で洗浄されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６４】
前記使用される膜が、次亜塩素酸溶液で洗浄されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６５】
前記選択された溶液の使用後に、水で洗浄する工程をさらに含むことを特徴とする請求項６２、６３または６４記載の方法。
【請求項６６】
前記使用される膜が、使用前に水酸化溶液で消毒されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６７】
前記使用される膜が、使用前にアルコール溶液で消毒されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６８】
前記使用される膜が、使用前に次亜塩素酸溶液で消毒されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６９】
前記使用される膜が、20分間から45分間まで洗浄されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７０】
第一の濾過段階で使用される前記膜よりも小さい孔のサイズを有する膜を通す第二の十字流濾過段階における濾過から濾液を濾過する工程、およびこの第二の濾過段階の濾液を前記第一の濾過段階に再循環させる工程をさらに含み、これにより前記工程が繰り返されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、混入物から特定の標的分子を精製する改良された方法およびシステムを提供する。より具体的には、本発明の方法は、十字流濾過の改良された方法によるサンプル溶液の処理を提供し、これは所定のフィードストリームからの所望の分子の浄化、濃縮および分画を向上させる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、所定のフィードストリームから所定の分子を濾過する改良された方法を対称にする。相対的に純粋な、生物学的に活性の分子を大量の産生することは、ヒトおよび動物の薬剤、タンパク質、酵素、抗体および他の特製化学製品の製造のために経済的に重要であることに注意すべきである。多くのポリペプチド、抗体およびタンパク質の産生のために、組換えDNA技術は、大量の外因性タンパク質または抗体が細菌、酵母、昆虫または哺乳類細胞培養で発現できるので、最適の方法となっている。より最近には、形質転換動物、通常は哺乳類だけでなく鳥類、または形質転換植物が、操作またはそうでなければ修飾され、外因性のタンパク質、抗体、またはそれらの断片または融合物が大量に産生されている。生体触媒として機能する細胞または細胞の一部の産生のための組換えDNA技術によるタンパク質の発現もまた重要な用途である。
【０００３】
組換えタンパク質の産生は、タンパク質をコードするDNAで宿主細胞を形質導入し、所定の組換えタンパク質または他の分子の発現に有利な条件下で宿主細胞、形質転換動物または植物を成長させる工程を含む。原核生物の大腸菌は、高い収率で組換えタンパク質を産生するようにすることができるので、好ましい宿主系である。しかしながら、タンパク質をコードするDNAの通常の発現について多くの米国特許が存在し、大腸菌からウシまで様々の発現の構築基盤が発達してきた。
【０００４】
生物系からの所定の外因性のタンパク質または他の分子の産生における改良と共に、生物製剤および産生される医薬品についての精製および回収工程を向上させより有効にする新しい技術を発達させるという重圧が産業において大きくなってきた。すなわち、新しい製品の流通ルートが増加するにつれ、これらの治療を商業規模で市場に素早く提供するための方法を案出することに大きな関心が起こる。同時に、産業は、ミルクおよび尿を含む様々の体液から遺伝子導入タンパク質および抗体を回収する新しい方法の開発という点から、新しい課題に直面する。生産の規模がより大きくなると、これらの問題はしばしばより複雑になる。さらに、製品の純度および安全性を満たすという点から、特に、ウィルス安全性およびDNAおよび宿主細胞タンパク質のような残留混入物の点から、生物学的に有用な医薬品の産生を監督する様々の政府機関により満たされる必要があるかもしれないさらなる課題が課される。
【０００５】
タンパク質のような生物学的に関心のある分子をその混合物から分離するために、様々の方法が現在利用できる。一つの重要なそのような技術は、アフィニティクロマトグラフィであり、これは、アフィニティマトリクスまたはゲルへの所望の分子の特異的または選択的結合に基づいて分子を分離し、一方で所望でない分子は結合しないままであり、その後に系から除去できる。アフィニティゲルは通常、ゲル支持体上に固定されたリガンド結合成分からなる。例えば、特許文献１は、天然のヘモグロビンは特定のポリ陰イオン成分に特異的に結合するという事実に基づいて、ヘモグロビンおよびその科学的に修飾された誘導体を精製するためにアフィニティクロマトグラフィを使用する。捕獲のために、これらの成分はゲル自体の上に固定される。この方法において、修飾されていないヘモグロビンはアフィニティゲルにより保持され、修飾されたヘモグロビンは、ポリ陰イオン結合部位が変性剤により共有され占有されているためゲルに結合できず、系から除去される。アフィニティクロマトグラフィカラムは、高度に特異的であり、したがって非常に純粋な産物を産出する；しかしながら、アフィニティクロマトグラフィは比較的高価な方法であり、したがって商業運転のために設置するのは非常に困難である。
【０００６】
通常、遺伝的に操作された生物医薬品は、様々の宿主細胞混入物を含有する上澄みから精製される。逆相高速液体クロマトグラフィ（RP-HPLC）は、構造および重さの点で互いに非常に類似している分子種を効果的に分離することができるので、タンパク質精製に使用できる。RP-HPLCを使用する方法は、多くの分子について発表されている。非特許文献１。
【０００７】
商業規模での分子製品についての回収方法における膜の使用、および多くの種類の膜および膜技術の関連した使用もまた知られている。これらの方法において、本質的な特徴は、液体フィードストリーム中に懸濁された粒子がそれらのサイズに基づいて分離されるということである。この方法の最も単純な形態は、決まったサイズの孔を有する濾過膜に加圧下で溶液を強制的に通過させる。薄膜フィルタの孔サイズよりも大きい粒子は保持され、より小さい溶質は溶媒と共に膜を通過して対流的に運ばれる。そのような膜濾過方法は通常、膜の孔サイズに依存して、逆浸透、限外濾過、および精密濾過のカテゴリーに入る。
【０００８】
分離技術としての膜濾過は、バイオテクノロジーの分野で広く使用されることに言及することも重要である。膜の種類に依存して、精密濾過または限外濾過に分類できる。0.1から10μmまでの孔サイズを有する精密濾過膜が、微粒子の浄化、消毒、除去に、または細胞の採集に通常使用される。ずっと小さい0.001から0.1μmまでの孔サイズを有する限外濾過膜は、交換緩衝、および全体分画のために、溶解した分子（タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、および他の生物分子）の分離および濃縮に通常使用される。
【０００９】
現在、２つの主要な膜濾過方法が存在する：シングルパス（Single Pass）またはダイレクトフロー（Direct Flow）濾過（DFF）およびクロスフロー（Crossflow）または十字流濾過（TFF）。TFFに関しては、保持された溶質を膜表面から離しフィードのバルクに戻す輸送を向上させるように、フィードストリームの流速パターンをコントロールするために設計された限外濾過系である。この方法において、フィードストリームは、膜の平面の接線方向に高速で再循環される。これは、逆拡散を可能にするように物質移動係数を増加させるために行われる。フィルタ膜に平行な方向で流れる液体も、フィルタ表面を連続的に洗浄する作用をし、これにより目詰まりを防止する。
【００１０】
しかしながら、限外濾過で達成できるタンパク質精製の程度には限界がある。これらの限界は主に、濃度分極、付着物、および多くの膜の孔サイズにおける広範な分布の現象による。したがって、しばしば溶質の識別が乏しい。例えば、非特許文献２参照。
【００１１】
溶質の分極した層は、追加のフィルタとして作用し、実質的に本来の限外フィルタと直列に作用する。この作用は、所定の溶媒の濾過に大きな抵抗を提供する。分極の程度はフィード中に保持される溶質の濃度の増加に伴い増加し、実システムにおいて多くの一見異常なまたは予測できない効果を生じうる。例えば、濾過速度が圧力と通常直線的である極性のない条件と対照的に、高度に分極した条件下では、圧力の増加に伴い濾過速度はわずかにしか増加しない。分極した層は濾過に制限抵抗を提供しているので、より隙間のある高流量の膜を使用することによっても、濾過速度は増加しないかもしれない。この状態はさらに、保持されたおよび溶出された溶質の間の相互作用によりさらに複雑になる。
【００１２】
濃度分極および付着物工程の結果、血漿プラズマタンパク質のような高分子混合物の大規模な分解のための限外濾過膜の高分子分画能力を有効に使用することができない。非特許文献３参照。
【００１３】
したがって、より様々の生物分子の分離のための他のおよび追加の技術の使用は困難である。すなわち、ゲル浸透、吸着、またはイオン交換クロマトグラフィ、選択的沈殿、または電気泳動のような技術により行われる大規模の複雑な高分子混合物の分離のために膜限外濾過を使用することは、非常に困難であり、商業用途において有用でない。TFFは、混合物を再循環させることにより、この目詰まりの問題を解決する。
【００１４】
物質の分離のために十字流濾過を使用することが知られている。Marinaccio等の特許文献２には、血漿交換のために血液成分のような生物学的液体の分離において使用するための方法（「クロスフロー」と称される）が開示される。この方法において、血液は有機高分子微小孔フィルタ膜に対して接線方向に（すなわち横切って）通過し、粒状物質が除去される。現在の技術の別の例において、十字流濾過は、ビール溶液の濾過、特に酵母細胞および他の浮遊物質のような粒子の除去について開示されている（Shackleton、1987年1月14日に発行された特許文献３）。Kothe等の1987年2月17日に発行された特許文献４には、ミルクまたは初乳からの免疫グロブリンの精製におけるこの方法の使用が開示され、Castinoの1983年12月13日に開示された特許文献５には、インターフェロンのような抗ウィルス性物質を、これらの物質並びにウィルス粒子およびそれらが由来する細胞培養液の残りから分離する際の使用が記載されている。
【００１５】
十字流濾過ユニットは、細胞残屑からの細菌酵素の分離において使用されてきた（非特許文献４）。この技術を使用して、Quirk等は従来の遠心分離の技術を使用するよりも高い収率および少ない時間で酵素を単離することができた。製薬分野での様々の用途に十字流濾過を使用することは、注射のための滅菌水の濾過、溶媒系の浄化、および培養液および細胞培養液からの酵素の濾過を含み、非特許文献５に概説されている。
【特許文献１】英国特許第2178742号明細書
【特許文献２】米国特許第4,888,115号明細書
【特許文献３】欧州特許第0208450号明細書
【特許文献４】米国特許第4644056号明細書
【特許文献５】米国特許第4420398号明細書
【非特許文献１】McDonald and Bidlingmeyer, “Strategies for Successful Preparative Liquid Chromatography,” Preparative Liquid Chromatography, Brian A. Bidlingmeyer (New York: Elsevier Science Publishing, 1987), vol. 38, pp. 1-104; Lee et al., Preparative HPLC. 8th Biotechnology Symposium, Pt. 1, 593-610(1988)
【非特許文献２】Porter, ed., Handbook of Industrial Membrane Technology (Noyes Publications, Park Ridge, N.J., 1990), pp.164-173
【非特許文献３】Michaels, “Fifteen Years of Ultrafiltration: Problems and Future Promises of an adolescent Technology”, in Ultrafiltration Menbranes and Applications, Polymer Science and Technology, 13(Plenum Press, N.Y., 1979, Anthony R.Cooper, ed.,), pp.1-19
【非特許文献４】Quirk et al., 1984, Enzyme Microb. Technol., 6(5):201
【非特許文献５】Genovesi(1983, J. Parenter. Aci. Technol., 37(3):81)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、技術の商業的用途に必要な粒子サイズの精確なコントロールは困難であり、通常は成功していない。本発明においては、十字流濾過を使用して、商業的に有効で重要な方法におけるサイズに従って粒子を分離する。選択されたサイズのフィルタの使用、およびさらに、異なるサイズのフィルタ（すなわち濾過システム）の連続的な使用または連続的な取付けが、特に所望のサイズの範囲の粒子を得るための粒子の分離について開示される。
【００１７】
当該技術において、収率を高め、費用がかからず、変性の少ない方法を使用して、ペプチド、ポリペプチド、および非ペプチジル化合物を他の分子から選択的に分離するための有効なプロトコルも必要とされる。特に、細胞培養において使用される発酵培養液または形質転換哺乳類により産生されるミルクフィードストリームからの所定の分子の分離を可能とする精製技術が必要とされる。細胞培養の培養液または遺伝子導入ミルクフィードストリームから精製できる所定の分子の一つは、ヒトアルブミンである。ヒトアルブミンは、血液容量増量剤として臨床使用するための最初の天然のコロイド組成物であり、他のコロイド分子と比較して標準的なコロイド物質である。所定の他の分子には、ヒトアルファ-フェトプロテイン、抗体、抗体のFc断片、およびヒトアルブミンまたはアルファ-フェトプロテインタンパク質断片がキャリア分子として作用する融合分子が含まれるがこれに限定されない。
【００１８】
本発明の方法はまた、所定のフィードストリームからの所定の分子の収率を最適化することができるフィルタおよび条件の正確な組合せを提供する。これらの方法において重要なのは、pHおよび温度のようなプロセスパラメータが正確に操作されることである。
【００１９】
本発明の目的は、サイズにより粒子および分子のような種類を分離するための十字流濾過方法であって、所定の種類に選択的であり、その高度の（higher-fold）精製を生じる方法を提供することである。
【００２０】
本発明の別の目的は、限外濾過方法を含み、タンパク質のような生物学的高分子を分離するための改良された濾過方法であって、濃度分極を最小にし流動を増加させない方法を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、サイズの違いが10倍未満であるサイズの種類により分離することができ、濾過前に混合物の希釈が必要でない濾過方法を提供することである。
【００２２】
これらのおよび他の目的は、当業者に明らかとなるであろう。本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、以下の本発明の好ましい実施の形態の詳細な記載において明らかとなるであろう。
【００２３】
生物製剤産業は、製品の安全性および純度並びに商品の価格にますます関心を持ってきている。本発明による十字流濾過（TFF）の使用は、生物分子の分離のための迅速でより有効な方法である。これは、免疫学、タンパク質化学、分子生物学、生物化学、および微生物学のような様々の生物学的分野に利用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
発明の概要
簡単に言えば、本発明は、様々のフィードストリームから、好ましくは遺伝子導入された哺乳類のミルクからの、ヒトの治療タンパク質、タンパク質断片、または抗体の処理を促進する方法を提供する。したがって、本発明の好ましい実施の形態において、ここに開発され提供される濾過技術は、天然の成分またはミルクまたはそれらの混入物から、所望の組換えタンパク質または所定の他の分子を浄化し、濃縮しおよび分画する工程を提供する。生じた浄化されたバルク中間体は、産物を最終的な製剤形態および純度にするためにTFF工程から下流で使用されるクロマトグラフィーのような従来の精製技術のための適切なフィード物質である。
【００２５】
本発明の好ましいプロトコルは、所定の分子を含有する特定の遺伝子導入ミルク量から産物を浄化し、濃縮し、分画する、３つの濾過ユニット操作を使用する。浄化段階は、産物から、脂肪小球およびカゼインミセルのようなより大きい特定の粒状物質を除去する。その後、濃縮および分画段階は、ラクトース、無機物質および水を含む多くの小分子を除去し、生じた産物の組成の純度を増加し量を減少させる。TFF工程の産物は、最適な下流での精製および全体的な産物安定性に適切なレベルに濃縮される。この濃縮された産物は次に、無菌で濾過され、最小の生物負荷を確保し、長時間産物の安定性を高める。バルク産物は、65％から85％までの純度を実現し、ヤギ抗体、乳漿タンパク質（βラクトグロブリン、αラクトアルブミン、およびBSA）、および低レベルの残余脂肪およびカゼインのような成分を含有するかもしれない。この部分的に精製された産物は、従来の下流クロマトグラフィ技術に好ましい開始フィード物質である。
【００２６】
処理するために本発明を使用できる産物は通常、免疫グロブリン分子であるがこれに限定されない：IgG1（関節炎に対する抗体−「レミケード（Remicade）抗体」）、IgG4、IgM、IgA、Fc部、免疫グロブリン断片に結合したペプチドまたはポリペプチドを含有する融合分子。本発明により処理できる他のタンパク質には、組換えタンパク質、外因性タンパク質、融合タンパク質、または後に生物学的機能を回復するように処理できる生物学的に不活性のタンパク質が含まれる。これらの工程には、タンパク質アンチトロンビンIII、ヒト血清アルブミン、デコリン、ヒトアルファフェトプロテインウロキナーゼ、およびプロラクチンが含まれるがこれに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
好ましい実施の形態の説明
以下の略語は、明細書中で定められた意味を有する。
【００２８】
略語キー（Key）
BSA      ウシ血清アルブミン
CHO      チャイニーズハムスター卵巣細胞
CV       クロスフロー流速
DFF      ダイレクトフロー濾過
DV       ダイアフィルトレーション量
IEF      等電点電気泳動
GMH      質量流動（グラム/m2/時間）−JMでも表される
LMH      液体流動（リットル/m2/時間）−JLでも表される
LPM      リットル／分
M        モル
MF       精密濾過
NMWCO    名目分子量切断
NWP      正規化透水率
PES      ポリ（エーテル）−スルホン
pH       よく知られた科学的パラメーターによる化学物質または化合物の水素イオン活性を表すために使用される用語
PPM      100万分の1
SDS-PAGE SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリ−アクリルアミドゲル電気泳動
SEC      サイズ排除クロマトグラフィ
TFF      十字流濾過
PEG      ポリエチレングリコール
TMP      膜圧
UF       限外濾過
用語の説明：
浄化
溶液が0.2μmの膜を通過できるように溶するための溶液からの粒状物質の除去。
【００２９】
コロイド
毛管壁を容易に通過できない大きい分子を称する。これらの化合物は、コロイド（すなわち液体を引き付ける）負荷を及ぼし、通常は血管内容積を回復し組織潅流を改善するために与えられる。
【００３０】
濃縮
小さい分子に対する保持された分子の割合を増加するための、膜による水および小分子の除去。
【００３１】
濃度分極
因子：膜圧、クロスフロー流速、サンプル粘度、および溶質濃度の組合せにより生じる膜の表面上に保持された分子（ゲル層）の蓄積。
【００３２】
クロスフロー流速
膜表面の最上層を通る液体の流速。CF=Pi−Poにおいて、Piは入口における圧力、Poは出口における圧力であり、保持液の流速に関連する。
【００３３】
ダイアフィルトレーション
膜を通して所定の大きい分子を保持液中に残し、小さい分子を洗浄する分画工程。これは、塩の除去または交換、浄化剤の除去、結合した分子をなくす分離、低分子量物質の除去、またはイオンまたはpH環境の素早い変化に便利で有効な技術である。この工程は通常、精密濾過膜を使用し、これは懸濁液の濃度を一定に維持しながら懸濁液から所定の産物を除去するために使用される。
【００３４】
フィードストリーム
ある工程または方法に提供される、所定のタンパク質を含有し、微生物、ウィルスおよび細胞断片を含む様々の混入物を含有するかもしれない、未加工の物質または未加工の溶液。
【００３５】
濾液流動（J）
サンプルの一部が膜を通過する速度。
【００３６】
流速（V）
液体が膜の表面を通過する速度が液体流速であると考えられる。産物流動は、流速が様々であるとして測定される。２つの変数の間の関係により、流れについての最適な操作手段が特定できる。
【００３７】
分画
物理的または化学的成分に基づく分子の好ましい分離。
【００３８】
ゲル層
膜の最上層に形成できる分子の微視的に薄い層。これは、膜表面の目詰まりにより分子の保持液に影響を及ぼし、これにより濾液の流速を減少させうる。
【００３９】
名目分子量切断（NMWCO）
限外濾過膜についてのサイズ（キロダルトン）指定。MWCOは、膜により90％保持される球状タンパク質の分子量として定められる。
【００４０】
正規化透水率（NWP）
TFF装置の初期洗浄中のある再循環速度において定められる水の濾液流速。この数値は、膜の回収率の計算に使用される。
【００４１】
所定の分子
流動体、例えば液体中で溶液または懸濁液から分離される分子の粒子または他の種類。所定の粒子または分子は、流動体から分離され、多くの例では、流動体中の他の粒子または分子から分離される。分離される所定の分子のサイズは、使用される膜の孔サイズを決定する。好ましくは、所定の分子は、生物学的または生物化学的供給源のものであるか、または遺伝子導入または生体外の工程により産生され、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体または抗体断片を含む。好ましいフィードストリーム供給源の例には、哺乳類のミルク、哺乳類の細胞培養液および細菌、真菌、および酵母のような微生物の細胞培養液が含まれる。透過される種類には、所望でないポリペプチド、タンパク質、細胞成分、DNA、コロイド、マイコプラズマ、エンドトキシン、ウィルス、炭水化物、およびグリコシル化されていてもいなくても生物学的に関心のある他の分子が含まれることにも注意すべきである。
【００４２】
十字流濾過
濾過により分離される成分を含有する液体混合物が、逆拡散についての物質移動係数を増加するように膜の平面に対して接線方向に高速で再循環される工程。そのような濾過において、液体および濾過できる溶質をフィルタに通過させるために膜の長さに沿って圧力差が与えられる。この濾過は、バッチ工程並びに連続フロー工程として適切に実施される。例えば、溶液は膜上を反復的に通り、フィルタを通過する溶液は分離ユニット中に連続的に流出されるか、または溶液は一度膜上を通り、フィルタを通過する液体は連続的に下流に処理される。
【００４３】
膜圧
液体および濾過できる溶質をフィルタに通過させるために濾過膜の長さに沿って適用される圧力差勾配。十字流システムにおいて、最も高いTMPは入口（流路の最初）においてであり、出口（流路の終わり）で低い。TMPは、入口、出口、および濾液引込み口の平均圧力として計算される。
【００４４】
回収
工程後に回収できる所定の分子の量。通常は、出発物質の割合または収率として表される。
【００４５】
保持液
膜を通過しないサンプルの部分であり、濃縮物としても知られる。保持液は、TFF中再循環される。
【００４６】
十字流濾過の原理
すべての十字流装置に関係する２つの重要な変数が存在する：膜圧（TMP）およびクロスフロー流速（CF）。膜圧（TMP）は、分子をフィルタの孔を通して実際に押す力である。クロスフロー流速は、膜を通過する溶液の流速である。これは、膜を目詰まりさせそれにより工程の有効性を減少させうる大きい分子を押し流す力である。実際には、液体フィードストリームはポンプで流され、サンプルフィード容器からフィルタ中の膜表面を通り（クロスフロー）、保持液としてサンプルフィード容器に戻る。締め具により保持液チューブに与えられる逆圧力により、膜の孔より小さい分子をフィルタに通過させ濾液（または透過水）分画に入れる膜圧が生じる。クロスフローは、大きい分子を押し流し、これは膜の表面上に保持され保持液としてのフィードに戻る。TFFプロトコルの実施の成功の主要な目的は、TMPおよびDFを最適にし、膜を目詰まりするゲルを生じることなく最大量のサンプルを濾過することである。TMPが、膜の長さに沿って平均TMPの約10psiを超えて、および好ましくは約5psiを超えて増加または減少しない場合、TMPは「実質的に一定」である。濾過の全体に渡ってのTMPのレベルに関して、TMPは一定に保たれるか、または選択的に高い濃度で保持するために濃縮中に低くされる。したがって、「実質的に一定のTMP」とは、対濾過時間ではなく、膜の長さに対するTMPを称する。
【００４７】
フィードストリームとしてのミルク
本発明の好ましい実施の形態によれば、TFF工程は、ミルクフィードストリームからの産物の浄化、濃縮、および分画という３つの濾過ユニット操作を使用する。このミルクは、生物薬剤または所定の他の分子を含有する形質転換哺乳類の産物であるかもしれない。好ましい実施の形態において、システムは、所定の分子について高度に選択的であるように設計される。浄化工程は、脂肪小球およびカゼインミセルのような大きい粒状物質をミルクフィードストリームから除去する。濃縮／分画段階は、ラクトース、無機物質および水を含む多くの小分子を除去し、産物の組成の純度を増加し量を減少させる。その後TFF工程の産物は、最適な下流での精製および全体的な産物安定性に適切なレベルに濃縮される。所定の分子を含有するこの濃縮された産物は次に、無菌で濾過され、最小の生物負荷を確保し、長時間産物の安定性を高める。本発明の好ましい実施の形態によれば、バルク産物は、65％から85％までの純度を実現し、ヤギ抗体、乳漿タンパク質（βラクトグロブリン、αラクトアルブミン、およびBSA）、および低レベルの残余脂肪およびカゼインのような成分を含有するかもしれない。この部分的に精製された産物は、ミルク中で産生される組換えタンパク質、ミルク中で産生される免疫グロブリン、または融合タンパク質を含むがこれに限定されない所定の分子をさらに選択し単離するための、従来の下流クロマトグラフィ技術に好ましい開始フィード物質である。
【００４８】
段階＃１（浄化）
図１を参照すると、好ましくはヤギまたはウシ起源の遺伝子導入哺乳類ミルクは、回分式の精密濾過を使用して浄化される。ミルクは、フィードタンクに配置され、ループ中でミルク保持液を２倍に濃縮するようにポンプで送り込まれる（図１のフローチャート参照）。一度濃縮されると、ミルク保持液は次に、産物および小分子量のタンパク質、糖、および無機物を適切にサイズ化された膜を通過させるようにダイアフィルトレーションされる。本発明によれば、この操作は現在、2-3時間かかるように設計され、1日に1000リットルのミルクを処理する。本発明の技術および方法は、拡大することができ、産生できる産物の全量は、所定の特定の分子についての商業的および／または治療的必要性に依存する。
【００４９】
段階＃２（濃縮／分画）
再び図１を参照すると、第１段階から浄化された透過水は、限外濾過（「UF」）を使用して濃縮され分画される。浄化された透過水は、UFフィードタンク中に流れ、産物の２倍に濃縮されるようにループ中でポンプで送り込まれる。一度濃縮段階が開始すると、UFからの透過水は第１段階中の浄化フィードタンク中のミルク保持液中に配置される。第１および第２段階は、サイズ化され、同時に処理されるように調節される。UFからの透過水は、膜を通過する小分子量のタンパク質、糖、および無機物を含有する。産物の95％がUFの保持液中に蓄積されると、浄化が停止し、UF物質の濃縮／ダイアフィルトレーションが始まる。産物は、最初のミルクの量の5-10倍に濃縮され、UFフィードタンクに緩衝液が加えられる。これは、小分子量のタンパク質、糖、および無機物の大部分を洗い流す。この操作は現在、2.5-3.5時間かかるように設計され、浄化された透過水を1日に500リットルまで処理できる。上述のように、本発明の技術および方法は、拡大することができ、この濃縮／分画工程を通して産生できる産物の全量は、所定の特定の分子についての商業的および／または治療的必要性に依存する。
【００５０】
段階＃３（無菌濾過）
図１および本発明によれば、浄化されたバルク濃縮物は、次に無菌で精密濾過される。生じた50-100リットルのUF保持液を、絶対0.2μmの全量MF濾過システムを通してポンプで注入されるフィードタンク中に配置し、生物負荷の大部分を除去し、長時間産物の安定性を高める。産物は、本発明の濾過システムを通してポンプで注入され、その後最終包装形態に直接充填されてもよい。クリーンルーム規格（例えば、クラス100条件）を満たすGMP設備中における所定の分子を処理するための条件下で、この操作は現在0.5-1時間かかるように設計され、浄化されたバルク中間物を1日に100リットルまで処理する。上述のように、本発明の技術および方法は、拡大することができ、この濃縮／分画工程を通して産生できる産物の全量は、所定の特定の分子についての商業的および／または治療的必要性に依存する。
【実施例】
【００５１】
実施例１
所定の分子の産生のためのフィードストリームとしてのミルク
以下のデータは、未加工のミルクフィードストリームから遺伝子導入により産生されたIgG1抗体を浄化、濃縮、および分画する膜に基づく工程を提供する本発明の適用を示す。本発明のこの実施例によれば、処理のためのミルクを提供する形質転換哺乳類はヤギであったが、ウシ、ウサギ、マウス並びにヒツジおよびブタを含む他の哺乳類を使用してもよい。処理のための初期運転パラメータの範囲は、非形質転換ヤギミルク中に入れられたIgG1抗体を産生したCHO細胞を使用して最適化された。この所定の分子を産生できる形質転換ヤギが乳の分泌をするようになり、ミルク中で組換えIgG1抗体を産生し始めた時、非遺伝子導入ミルク中に入れられた組換えIgG1抗体を産生したCHO細胞を使用していくつかの実験が行われ、遺伝子導入ミルクについて繰り返された。
【００５２】
本発明に従って、ラージスケールでコントロールできる濾過工程変数（CM、V、TMP、T）の間の関係を特定するために実験計画が行われた、ここでVは流速であり、産物の通過、保持および特質が記録する。この関係は、それぞれのベンチスケールの実験のマトリクスを通して定められ、操作の最適の手段が同定された。これらの最適のパラメータは、「二段階TFF」実験系に組み入れられ、全体的な収率および物質収支が調査された。産物の収率、清澄さ、および流動効率により性能が特定された。以下の処理変数は、それぞれのベンチスケールの実験マトリクスにおいて調査される。
【００５３】
濃縮（Cm）最適のミルク濃縮因子が、経験的な産物経過データで特定された。決まった時間における1平方メートルごとの産物通過の速度は、産物流動（Jp）と称される。産物流動は、浄化段階（ユニット操作＃１）中の濃度因子と関連して測定される。
【００５４】
再び図１を参照して、本発明の要素の説明が以下に提供される。
【００５５】
図１の要素
工程の流れの説明
流れの番号            説明
1a            未加工のTgミルク
1b            精密濾過CIP溶液
2a            ダイアフィルトレーション後に排出する精密濾過保持液
2b            排出される使用されたCIP溶液
3             工程中のMF保持液（ループ）
4             MF CIP再循環（ループ）
5             精密濾過濾液
6             限外濾過CIP溶液
7             排出される使用されたCIP溶液
8             限外濾過フィード（精密濾過濾液）
9             工程中のUF保持液（ループ）
10            限外濾過透過水（ダイアフィルタMF保持液へ）
11            濃縮された浄化バルク
12            UF CIP再循環（ループ）
13            AF CIP溶液
14            無菌フィルタフィード
15            生物負荷が減少され、濃縮され浄化されたバルク
16            排出される使用されたCIP溶液
最も広い態様において、ここに提供される本発明により考えられる高速十字流濾過工程は、ある条件のTMPおよび流動下である種類の十字流濾過のために設計された装置またはモジュールにおいて、分離される種類の混合部を１つ以上の濾過膜に通過させる工程を含む。流動対TMP曲線の圧力依存性領域のある範囲で、すなわち、転移点におけるTMP値以下の範囲で、TMPは保持される。したがって、濾過は転移点流動の約5％から100％までの流動範囲で操作される。グラフ参照。流動対TMP曲線が転移点に沿って表されるAおよびBより下。結果として、小さい種類は濾液として膜を通過し、所定の種類は保持液として膜により選択的に保持される、または所定の種類は濾液として膜を通過し、混合物中の混入物は膜により保持される。限外濾過についての所定の種類は、好ましくは、少なくとも約1000ダルトンの分子量を有する生物学的高分子であり、最も好ましくはポリペプチドまたはタンパク質である。また好ましくは、所定の種類は、分離される種類、すなわち混入物より10倍未満で大きい、または分離される種類よりも10倍未満で小さい。
【００５６】
ここで用いたように、「濾過チャンバ中の液体の方向と平行に濾液チャンバを通して濾液を再循環させる手段」という表現は、濾過チャンバの入口から出口への隣接する濾過チャンバを通過する液体の流れと平行にまたは実質的に同じ方向に（流れに小さい渦が生じるのを許容する）流れるように、濾液チャンバから液体の一部を方向付けるメカニズムまたは装置を称する。好ましくは、この手段はポンプ手段である。
【００５７】
TMPは濾過時間と共に増加せず、濾過を通じて必ずしも一定に保たれないということに注意すべきである。TMPは、経時的におよそ一定に保たれるか、または濾過の進行と共に減少してもよい。保持された種類が濃縮されている場合、濃縮段階の進行中TMPを減少させることが好ましい。
【００５８】
それぞれの膜は好ましくは、10ミクロンまで、より好ましくは1kDaから10ミクロンまでのサイズを有する種類を保持する孔サイズを有する。限外濾過により分離できる種類の例には、タンパク質、ポリペプチド、コロイド、免疫グロブリン、融合タンパク質、免疫グロブリン断片、マイコプラズマ、エンドトキシン、ウィルス、アミノ酸、DNA、RNA、および炭水化物が含まれる。精密濾過により分離できる種類の例には、哺乳類細胞および細菌のような微生物が含まれる。
【００５９】
フィルタ膜は完全ではなく、意図された保持液物質を通過させるのに十分大きい穴または不整を有しているかもしれないので、ここで好ましい態様は、同じ孔サイズを有する１つ以上の膜を使用することであり、これらの膜は互いに平行に、好ましくは１枚ずつ、重ねられるように配置される。好ましくは、この目的のための膜の数は２枚である。
【００６０】
上記の工程で圧力が維持される流動は適切には約5から100％の範囲であるが、流動が低くなると必要とされる膜の表面積は大きくなる。したがって、膜の費用を最小にするために、流動が範囲の最高点となるような圧力で操作することが好ましい。好ましい範囲は、転移点流動の約50-100％であり、より好ましい範囲は約75-100％である。
【００６１】
TMPは膜表面に沿って実質的に一定に維持される必要はないが、TMPを実質的に一定に維持することが好ましい。そのような条件は通常、膜の濾液側において圧力勾配を生じさせることにより達成される。したがって、装置の保持液区画における混合物の流れと同じ方向および平行な濾過装置の濾液区画を通って濾液が再循環される。再循環された物質の入口および出口の圧力は、濾液区画を通る圧力低下が保持液区画を通る圧力低下と等しくなるように調節される。
【００６２】
いくつかの実際的な方法を使用して、この濾液圧力勾配を達成することができる。好ましい実施の形態のいくつかの例は、図２Aおよび２Bに示される構成である。これらの構成によれば、分離される溶質は、分離される産物が発酵培養液である場合、発酵槽タンク（図示せず）に通じる入口管36を通って装置に入る。これは、遺伝子導入（Tg）ミルクまたは細胞溶解物の供給源あるいは細胞培養系における細胞採集後の上澄みを保持する容器（図示せず）にも通じていてもよい。入口管36中の流速は、ポンプ手段40により調節される。ポンプは当業者に知られる任意の適切なポンプであり、当業者に知られるように濾過の性質に従って流速を調節できる。
【００６３】
本発明の精密濾過ユニット30において、圧力ゲージ45を必要に応じて使用して、ポンプ手段40から流れの入口の圧力を測定する。入口管36中の流れは濾過ユニット50に入る。この濾過ユニット50は、その入口の頂部に濾過チャンバ51および出口部に濾液チャンバ52を有する。これらの２つの区画は、濾過膜55により分けられる。入口の液体は、濾過チャンバ51内の濾過膜55と平行の方向に流れる。上方の濾過チャンバ51は、所定の分子を含有する溶質を含む混合物を受ける。標的分子より小さい分子は、膜55を通過して濾液中へ入るまたはチャンバ52を出ることができる。濃縮された保持液は、出口管60を通り濾過ユニット50から通過し、ここで、必要であれば追加の膜の通過を含む所定の所望の種類を得るために精密濾過（MF）膜65によりさらに収集および処理してもよい。この全工程中、および質のコントロールの目的のため、一連のサンプル点99は、分子濃度、pHおよび濃度を観察できるように本発明により考慮される−「経路B」。あるいは、保持液の流れは、混合物が生じた場所であるタンクまたは発酵槽35に戻るように循環され、さらなる精製のために入口管36を通って再循環される−「経路A」。
【００６４】
膜55を通過して濾液チャンバ52へ入る所定の分子を含有する溶液は、保持液体が出口管60を通って流出するのと同じ濾液ユニット50の終わりで、出口管70を通って濾液ユニット50を出てもよい。しかしながら、出口管70を通って流れる溶液および所定の分子は、タンク35に送り返され、さらなる工程のために圧力ゲージ72で測定される。
【００６５】
同様に、および図２Bに示されるように、本発明による二段階TFFシステムが考えられる。
【００６６】
図２Aに示される構成において、膜を通る望ましい流速および圧力差を提供するために、チャンバ51および52に関して膜を配置する必要がある。本発明の工程において有用な膜は通常、フラットシート、巻上げ式シート、円柱、同心円柱、様々の断面の管および他の構造であり、単一にまたはグループで組み立てられ、濾液ユニット内で直列にまたは平行に接続される。装置は通常、濾過および濾液チャンバが膜の全長に渡るように構成される。
【００６７】
適切な膜は、目詰まりの問題を生ぜず、システムの連続的な操作に十分な速度で、混合物中の所望でない種類から所望の種類を分離するものである。実施例には、通常0.1から10マイクロメートルまでの孔サイズを有する微小孔膜が含まれ、定格のサイズより大きい粒子を全て保持するように作製されてもよい。好ましくは、本発明による精密濾過用途およびTFF用途の両方について、膜はセラミックである。限外濾過膜はより小さい孔を有し、保持されるであろうタンパク質のサイズにより特徴付けられる。これらは、1000から1,000,000ダルトンまでの名目分子量制限の区切りで利用できる。
【００６８】
限外濾過膜は、本発明の工程において使用するために最も広く適切である。限外濾過膜は通常、分離能力の原因である上部表面上の薄膜または表皮と非対称である。これらは通常、再生セルロースまたはポリサルフォンで作製される。
【００６９】
十字流濾過システム80のための膜フィルタは、操作される液体の量に依存する、および様々の孔サイズの、異なる構成のユニットとして利用できる。本発明における使用に特に適切なものは、比較的ラージスケールで、既知の市販されている十字流濾過ユニットである。
【００７０】
別のおよび好ましい装置において、および上記の理由のために、図２Aの精密濾過ユニット30は、膜56および57として、それぞれ複数の、好ましくは二つの濾過膜を有する。これらの膜は、平行な構成で層になっている。
【００７１】
本発明はまた、多段式カスケード工程を考慮し、ここでは上記の工程からの濾液を第二の十字流濾過装置において第一の装置の膜よりも小さい孔サイズを有する濾過膜を通過させ、この第二の濾過からの濾液を第一の装置に再循環させ、この工程が繰り返される。
【００７２】
本発明による工程に適切な一つの十字流システム80または精密濾過ユニット30と同時の使用が図２Bに示される。ここで、第一の容器85は、入口管90を介して濾過ユニット95内に配置された濾過チャンバ96に連結される。第一の投入ポンプ手段100は、第一の容器85と濾過チャンバ96との間に配置される。濾過チャンバ96は、出口管110を介して第一の容器85に連結される。濾過チャンバ96は、第一の濾過膜115により濾過ユニット95内でその下に直接位置する第一の濾液チャンバ97から分離される。第一の濾液チャンバ97は、管98中に配置された濾液ポンプ手段120を有するチャンバ97の入口に連結された出口管98を有する。出口管98に連結された管45は、第二の容器120にも連結される。
【００７３】
この容器120は、入口管125を介して、第二の濾過ユニット130内に配置された第二の濾過チャンバ127に連結される。第二の投入ポンプ手段133は、第二の容器120と濾過チャンバ127との間に配置される。濾過チャンバ127は、第二の濾過膜128により濾過ユニット130内でその下に直接位置する第二の濾液チャンバ129から分離される。第二の濾液チャンバ129は、管135中に配置された濾液ポンプ手段140を有するチャンバ129の入口に連結された出口管135を有する。出口管135に連結された管125は、第三の容器150にも連結される。
【００７４】
この容器150は、入口管155を介して、第三の濾過ユニット160内に配置された第三の濾過チャンバ157に連結される。第三の投入ポンプ手段165は、第三の容器150と濾過チャンバ157との間に配置される。濾過チャンバ157は、第三の濾過膜165により濾過ユニット160内でその下に直接位置する第三の濾液チャンバ159から分離される。第三の濾液チャンバ159は、管155に連結された出口管170を有し、これは第一の容器150に連結され、濾液を最初のタンクに再循環させる。サンプル点99はまた、工程、並びに圧力ゲージ175を観察するために提供される。
【００７５】
本発明の工程は、商業規模での用途に適応する。これは、バッチまたは連続操作で、または半連続的態様で、例えば、所望の種類を含有する溶液の連続フローの基盤に基づいて、十字流フィルタを通過し、完全な大きいバッチが濾過されるまで、濾過段階間に洗浄段階を介入して、行ってもよい。次に、溶液の新しいバッチを処理してもよい。このようにして、連続サイクル工程を行い、比較的実時間時間に、許容できる純粋な形態で、所望の産物の大きい収率を提供する。
【００７６】
フィルタの目詰まりを生ぜずに固体含有溶液の連続濾過を提供することができることと共に、ここに記載されるように、十字流濾過の独特の特徴により、連続基盤および商業規模に基づき使用するために生物反応産物を分離および精製するための非常に有利な工程が生じる。さらに、この工程は、広範な生物分子、例えば、遺伝子導入起源のタンパク質産物、抗体、細胞断片および細胞培養溶解物に適用できる。
【００７７】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明するが、限定することを意図するものではない。これらの実施例において、引用される全ての参考文献の開示は、参照することにより明白に引用される。
【００７８】
物質および方法
フィード−アンド−ブリード（feed-and bleed）実験を除き精密濾過システムで考慮される全ての実験について、使用された装置は以下のものであった：
ポンプを相関させるために校正された60lpmポンプ（ポンプ曲線）
1”ODステンレス鋼衛生配管
0.2sqftまたは1.5sqftのいずれかの0.2μm孔サイズのセラミック膜
1.5”出口ポートを有するステンレス鋼衛生膜ホルダー
1/4”ID柔軟性透過水チュービング
保持液ラインにおけるダイヤフラム弁
二つの圧力ゲージ
スチールの1.2Lフィードリザーバ
3/4”ID柔軟性保持液チュービング。
【００７９】
全ての二段階TFF実験について、前記の装置が以下の装置に加えられた：
800mLPMの最大出力を有するダイヤフラムポンプ
全ての来における1/4”ID柔軟性圧力保持液チュービング
フィード圧力測定のための１つの圧力ゲージ
保持液および透過水ラインにおける２つのダイヤフラム弁
0.2sqftまたは1sqftのいずれかの30kDaのNMWCO PES Pall Filtron Centramate膜
ステンレス鋼Pall Filtron Centramate膜
保持液ポートを連結するための１つのステンレス鋼U字管
膜の選択
二段階TFFシステムのために選択される膜は、様々の図形および名目分子量を切断する膜の群から選択される。先の研究により、浄化段階のために、高分子に基づくMWCO UF膜、並びにセラミックの使用が調査された。ミルクを2倍に濃縮した後、全ての膜を検証する二段階TFFを行う。次に、複数の実行および洗浄で検証することにより再利用について膜を分析した。正規化水流動が最初の膜の80％以上を維持している場合には、膜は次の工程のために回収されると判断した。フラットシート高分子膜カセットは3回の使用後に目標の水流動回収を維持したものは一つもなかったのに対し、セラミック膜は60回以上回収された。これは、より高い化学濃度およびより高い温度のより厳しい条件を使用するセラミックを洗浄できることによる。30kDaの限外濾過膜は、20サイクルを超えて高い水流動回収を維持した。
【００８０】
ミルクを浄化しIgG1抗体を通過するために使用された第一のユニットを、0.2μmの名目上のセラミック管状膜を使用してテストした。IgG1抗体を捕獲するために使用された第二のシステムを、30kDaの分子量を切断するフラットシート限外濾過膜でテストした。
【００８１】
分析方法
それぞれの実験サンプルからのサンプルを、A HPLCによりIgG含量について、SDS-PAGEにより分解について、等電点電気泳動法（IEF）により修飾について、およびサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）により凝集について分析した。
【００８２】
手順
一連のコントロールされた実験は、工程作業関係を理解することを期待して、0.2μmの分子量切断セラミック精密濾過膜を使用した。流速（u）、膜圧（TMP）、温度（t）、およびミルク濃度（c）と関連して産物流動（Jp）を測定した。一度関係を確立すると、操作の最適な時間を特定し、編成した工程をテストした。サンプルを採取し、物質収支データを集め、当初の生産収率および処理能力を分析した。（図２Aおよび２B参照）。
【００８３】
温度実験
本発明の目的は、0.2μm、3mm流路のセラミックMF膜を通る最低量で最適のIgG1抗体流動を提供する操作温度の範囲を特定することであった。ミルクを溜める前に、それぞれのミルク区分のpHの処理中にSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによりIgG1抗体分解を分析した。ミルクをMFフィードタンクに溜め、全量を記録した。MFポンプコントローラは、このとき20Hzから45Hzに急上昇した（約20Lまで約5L/分）。連続時点ごとに、温度、圧力、クロスフロー流速、透過水流速、および量のような全てのパラメータを記録した。このMFループは、5分間再循環（経路A）に入れられる。膜圧は、12psigに調節され、5分間再循環（経路A）される（20℃の温度を維持した）。透過水ラインは、ミルクが最初のミルク量の2倍に濃縮されるまで排出管に向けられた（透過水が採集された）。温度は20℃に維持した。サンプル2および3をフィードリザーバおよび透過水ラインから採取した。次に透過水ラインを経路Aに戻し、10分間再循環させた。サンプル4および5を採取した。温度を25℃まで増加させた。次にシステムを10分間再循環させ、サンプル6および7を採取した。温度を30℃まで上昇させた。次にシステムを10分間再循環させ、サンプル8および9を採取した。温度を35℃まで上昇させた。次にサンプルを10分間再循環させ、サンプル10および11を採取した。温度を40℃まで上昇させた。次にシステムを10分間再循環させ、サンプル12および13を採取した。次にポンプを止め、サンプルを2-8℃で保存し、IgG定量に使用した（分解および凝集のためにサンプル1,3,5,7,9,11,13,15,17のSDS-PAGE。サンプル1および16をIEFにより分析した。サンプル1,3,16,17をSECにより分析した）。
【００８４】
MFミルク濃縮実験
本発明の好ましい実施の形態による本実験の目的は、0.2μm、3mm流露のセラミックMF膜を通る最低量における最適のIgG1抗体流動を提供する最初のミルク濃縮の範囲を特定することである。
【００８５】
手順の点で、それぞれのミルク区分のpHを、ミルクを溜める前に採取した。ミルクをMFフィードタンクに溜め、全量を記録した。MFポンプコントローラは、このとき20Hzから45Hzに急上昇した（約20Lまで約5L/分）。連続時点ごとに、温度、圧力、クロスフロー流速、透過水流速、および量のような全てのパラメータを記録した。このMFループは、5分間再循環（経路A）に入れられる。膜圧は、12psigに調節され、5分間再循環（経路A）される（20℃の温度を維持した）。膜圧を15psigに調節し、5分間再循環させた。ミルクが濃縮されるまで透過水ラインを排出管に向け、550mlの透過水を採集し、次に透過水を経路Aに戻した。（10分間再循環）。フィードリザーバおよび透過水ラインからそれぞれサンプル2および3を採取した。
【００８６】
透過水ラインは経路Bに向けられ、600mlのミルクがフィードリザーバに追加された。透過水ラインは、ミルクが濃縮されるまで排出管に向けられ、500mlの透過水が採取され、その後経路Aに戻された。（10分間再循環した）。サンプル4および5をフィードリザーバおよび透過水ラインからそれぞれ採取した。次に透過水ラインを経路Bに向け、500mlのミルクをフィードリザーバに加えた。ミルクが濃縮されるまで透過水ラインを排出管に向け、500mlの透過水を採集し、次に透過水ラインを経路Aに戻した（10分間再循環させた）。サンプル6および7をフィードリザーバおよび透過水ラインからそれぞれ採取した。次に透過水ラインを経路Bに向け、380mlのミルクをフィードリザーバに加えた。ミルクが濃縮されるまで透過水ラインを排出管に向け、400mlの透過水を採集し、次に透過水ラインを経路Aに戻した。（10分間再循環させた）。サンプル8および9をフィードリザーバおよび透過水ラインからそれぞれ採取した。次にポンプを止めた。サンプルを2-8℃で保存し、分解および凝集についてタンパク質A分析、SDS-PAGEおよびウェスタン、凝集についてSEC、および当電点シフトについてIEFによるIgG定量に使用した
流速およびTMP実験
0.2μm、3mm流路のセラミックMF膜を通る膜圧（TMP）、クロスフロー流速、濾液透明性、膜液体流動、およびIgG1抗体の通過の間の関係を特定する。3.7gのIgG1抗体（2.5g/L）を入れた非遺伝子導入ミルク1リットルを1.5Lのフィードタンクに入れた。以下の初期パラメータにおいて30L/分でMFループをポンプで通過させる間、物質を加えたミルク（spiked milk）を室温で連続的に攪拌した：
膜面積            0.164sqft
膜孔サイズ        0.20μm
最初のミルクの量  1.0L
フィード圧力      10psig
透過水圧力        0psig
フィード流速      20L/分
ミルク温度        30℃
サンプル＃１
物質を加えたミルクからこのサンプルを採取した。MFの透過水ラインをフィードリザーバに送り込んだ。10分間で透過水を経路「B」を通して方向付けた（透過水を排出管へ）。これにより、ミルクを500mlに濃縮する。ミルクが最初の2倍の濃度になると、透過水を経路「A」に戻す（フィードリザーバへの再循環）。再循環中10分後、サンプル番号2および3を採取し、ポンプの近くのフィード圧力が10psiを示すように逆圧弁を調節する。ポンプスピードを55Hzに調節することにより、フィード流速を13.35l/分に維持する。再循環中10分後、サンプル番号4および5を採取し、ポンプの近くのフィード圧力が14psiを示すように逆圧弁を調節する。ポンプスピードを60.66Hzに調節することにより、フィード流速を13.35L/分に維持する。再循環中10分後、サンプル番号6および7を採取し、ポンプの近くのフィード圧力が12psiを示すように逆圧弁を調節する。ポンプスピードを40Hzに調節することにより、フィード流速を7.75L/分に調節する。再循環中10分後、サンプル番号8および9を採取し、ポンプの近くのフィード圧力が14psiを示すように逆圧弁を調節する。
【００８７】
ポンプスピードを43.45Hzに調節することにより、フィード流速を7.75L/分に調節する。再循環中10分後、サンプル番号10および11を採取し、ポンプの近くのフィード圧力が10psiを示すように逆圧弁を調節する。ポンプスピードを48Hzに調節することにより、フィード流速を12.36L/分に調節する。再循環中10分後、サンプル番号12および13を採取し、ポンプの近くのフィード圧力が14psiを示すように逆圧弁を調節する。ポンプスピードを55.44Hzに調節することにより、フィード流速を12.36L/分に調節する。再循環中10分後、サンプル番号14および15を採取し、ポンプの近くのフィード圧力が20psiを示すように逆圧弁を調節する。ポンプスピードを61.69Hzに調節することにより、フィード流速を12.36L/分に調節する。再循環中10分後、サンプル番号16および17を採取し、ポンプスピードを64.64Hzに調節することによりフィード流速が13.35L/分を示すように調節し、ポンプの近くのフィード圧力が20psiを示すように逆圧弁を調節する。再循環中10分後、サンプル番号18および19を採取し、ポンプスピードを52.65Hzに調節することによりフィード流速を7.75L/分に調節し、ポンプの近くのフィード圧力が20psiを示すように逆圧弁を調節する。再循環中10分後、サンプル番号20および21を採取し、ポンプを止める。全てのサンプルを冷却し、全IgG含量についてタンパク質A分析により分析する。透過水サンプル（3,5,7,9,11,13,15,17,19,21）を透明性について視覚的に観察する。
【００８８】
二段階工程実験
非遺伝子導入ミルクから細胞培養IgG1抗体を回収するために、二段階TFFシステムにおいて先の実験で特定された工程パラメータをテストする。非遺伝子導入ミルクに、全量1000mlについて2.4gの細胞培養IgG1抗体を入れ、サンプル番号1を採取した。物質を加えたミルクを精密濾過システムのフィードリザーバ中に入れ13.4l/分でポンプで膜を通過させた。温度、圧力、透過水流速および量をそれぞれのその後の時点で記録した。システムを以下の初期パラメータに調節した：
膜面積：          0.2sqft
膜孔サイズ：      0.20μm
最初のミルク量：  1000mL
膜圧              14psig
透過水圧力        0psig
濃度              １倍
MFの透過水ラインをフィードリザーバに送り込んだ。10分間で透過水を経路「B」を通して方向付けた（透過水を排出管へ）。ミルクが最初の2倍の濃度または500mlになると、透過水を経路「A」に戻した（フィードリザーバへの再循環）。UFポンプを以下の初期条件で始動した：
膜面積：          0.2sqft
膜孔サイズ：      30kDa
最初のミルク量：  500mL
膜圧              7.3psig
透過水圧力        1.4psig
濃度              １倍
再循環中10分間で、UFの透過水流速がMFの透過水流速と等しくなるように、UFの保持液および透過水の圧力を調節した。次にUFの透過水ラインをMFのフィードリザーバへ方向付け、MFの透過水ラインをUFのフィードリザーバへ方向付け、ダイアフィルトレーションを開始した。システムを全部で326分間実施し、サンプルをそれぞれのダイア量（diavolume）から採取した。全てのサンプルを冷却し、全IgG含量についてタンパク質A分析および凝集についてSECにより分析した。
【００８９】
IgG1抗体を産生したCHO細胞を使用する実験により、最適の流速は14psigの膜圧で約23cm/秒であることが示された（グラフ＃CおよびD）。しかしながら、所定のタンパク質および免疫グロブリンを含有するフィードストリームは、外因性由来の組換えタンパク質を産生する形質転換動物を含むがこれに限定されない、そのような分子を産生できる任意の供給源からでもよい。本発明によれば、最適の温度は30-35℃である（グラフ＃A）。非遺伝子導入ミルクは、1.5-2倍で液体流動が最高であることを示した（グラフB）。これらのパラメータを二段階TFFシステムでテストした場合、82.3％の収率が得られた（グラフ＃H）。ヤギC1017からの天然遺伝子導入ミルクを使用して流速および膜圧実験を繰り返し、最適の流速は16psigの膜圧で40-45cm/秒であることが示された（グラフ＃EおよびF）。CHO細胞IgG1抗体を使用して発見されたパラメータにおいて天然の遺伝子導入ミルクで行われた二段階TFF工程テストにより、64％の収率が得られた（グラフ＃G）。形質転換ヤギの供給源は任意の哺乳類、好ましくは有蹄動物、最も好ましくはヤギまたはウシ起源からでよい。
【表１】
2006515227.tif 000002
【表２】
2006515227.tif 000003
【００９０】
CHO細胞IgG1抗体を非遺伝子導入ミルク中に加えることによりミルク中のIgG1抗体の作用を最初に見ることができたが、IgG1抗体を含有する天然に分泌されたミルクは、好ましくは本発明により使用される0.2mmのセラミック膜の使用のために異なる最適パラメータを必要とした。物質を加える研究により、遺伝子導入ミルク研究より低い最適流速および非常に高い産物流動が示された。さらに、遺伝子導入ミルクについて最適化されたパラメータを使用する二段階TFFシステムを実行することにより、IgG1抗体を加えられた天然の非遺伝子導入ミルクについてより低い産物回収率が提供された。
【００９１】
脂肪、カゼインミセル、および細菌のような粒状物質を未加工のミルクから除去することによりミルクマトリクス中のIgG1抗体を浄化し安定させるための処理として、十字流濾過（TFF）を実施した。TFFは、不純物を除去し産物を濃縮するために、バイオテクノロジーおよび乳業において広く使用されている。本発明によりTFFを有効に使用するために、適切な膜が選択され、処理パラメータ（温度、膜圧、クロスフロー流速、およびミルク濃度）が高い産物流動について最適化され、膜の長期耐用を保障する洗浄及び保存手段が開発されることが需要である。本発明による実験マトリクスパラメータがここに記載され、従来の操作上のパラメータを確かめるために遺伝子導入ヤギミルクに適用される。膜洗浄および保存条件も調べられた。無菌濾過段階を発達させ、TFF工程が完了した後、所定のタンパク質を含有する浄化されたミルク産物から残存する任意の細菌を除去した。その後、プロセス情報を試験的スケールの装置に移し、最初の設計の実行が考えられた。いくつかの処理設計基準には、注入のため水を必要としないために添加物を使用しない、長期耐用膜、高収率、および短い処理時間が含まれた。
【００９２】
本発明の処理は、好ましくは試験的および製造の工程に拡張可能に設計された。
【００９３】
工程の説明
セラミック0.2μm精密濾過膜を使用する二段階TFFを行い、ヤギD035から遺伝子導入ヤギミルクを浄化し濃縮するために、システムを0.1Mの次亜塩素酸ナトリウムで消毒した。その後、ミルクを溜め15-20℃に温度を上げなければならない。ミルクは、セラミック膜の透過水を採集することにより精密濾過システムにおいてその最初の量の半分に濃縮しなければならない。MFは15psiの膜圧で14lpmのクロスフロー流速において実施しなければならない。温度は27℃にまたはその近くに維持しなければならない。その後、限外濾過システムを1.6-2LPMのクロスフロー流速で開始しなければならない。UFの保持液および透過水の圧力を、透過水の流速をMFの透過水の流速に一致させるように調節しなければならない。UF透過水の流速がMFのものに一致すると、二つのシステムは、MFの透過水ラインがUFのフィードリザーバに方向付けられ、UFの透過水のラインがMFのフィードリザーバに方向付けられるように連結される。システムは5-6のダイアフィルトレーション量について連結されるべきである。ダイアフィルトレーションが完了すると、システムは切断され、MFが停止し、排出され洗浄され、UF透過水は、UFのフィードリザーバ中のバルク洗浄された濃縮物の量が４倍の全濃度のために半分の量に濃縮されるまで、排出に向かう。その後UFが排出され、バルク洗浄された濃縮物は無菌濾過され、UFが洗浄される。どちらのシステムも、0.1M水酸化ナトリウム中で保存される。処理の図式が図１に提供される。
【００９４】
膜選択
先の研究に基づき、ミルクを浄化しIgG1抗体を通過させるために使用された第一のユニットを、0.2μmの名目上のセラミック管状膜を使用してテストした。IgG1抗体を捕獲するために使用された第二のシステムを、30kDaの分子量を切断するフラットシート限外濾過膜でテストした。D035ミルクを使用するそれぞれの実験からのサンプルを、タンパク質A HPLCによりIgG含量について、SDS-PAGEにより分解について、当電点電気泳動法（IEF）により修飾について、およびサイズ排除クロマトグラフィ（SEC）により凝集について分析した。0.2μm、3mmの経路のMF膜を通る最低量で最適のIgG1抗体流動を提供する最初のミルク濃度の範囲を、測定した。IgG1抗体分解を、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットにより分析し、IgG1抗体における濃縮段階の効果（もしあれば）を特定した。１つの非遺伝子導入ミルク実行および１つの遺伝子導入ミルク実行を含む二つの実験を完了し、ミルク濃度を調べた。
【００９５】
非遺伝子導入フィード−アンド−ブリード実験
非遺伝子導入ミルクの潤沢な供給が利用できるので、非遺伝子導入ミルクを使用して、0.2μmのセラミック精密濾過膜を使用する濃縮中の液体流動の減少を分析した。この実験に使用された装置は、精密濾過実験について説明されたのと同じ装置を含むが、第二のフィードリザーバおよび透過水が膜から流出するのと同じ速度で精密濾過システムのフィードリザーバ中へミルクを流し入れるフィードポンプが補完された。この装置の概略図は以下のようである：
【表３】
2006515227.tif 000004
【００９６】
図式Iに示されるように、フィードリザーバは1500mlのミルクで満たされ、ポンプは45Hzで開始した。システムは保持液の圧力なしで10分間再循環された。全てのパラメータを記録した。その後、膜圧11psigについて保持液圧力を10psigに増加させた。この膜圧は、保持液弁を調節することにより実験中一定に維持した。保持液を排出管に送り、保持液が除去されたのと同じ速度でフィードリザーバに新鮮なミルクを送り込むために第二のポンプを始動させ、フィードリザーバ中の量を一定に維持した。5-10分間隔で全てのパラメータを記録し、第二のポンプ速度を調節してフィードリザーバ中のミルクのレベルを一定に維持した。ミルクが5.37倍または82％に濃縮されるまで実験を行った。
【００９７】
遺伝子導入ミルク濃度対産物流動
D035のそれぞれのミルキングのpHおよび量を測定し、pHチャートに記録した。D035のRM01-001PDからRM-004PDまでの区分を、3Lの全量まで溜めた。サンプルF1をプールから取り出し、1500Lをフィードリザーバに入れた。ポンプを始動させ、速度を20Hzから45Hzに増加させた（約20Lについて約5LPM）。温度、圧力、クロスフロー流速、透過水流速、および量を記録した。全ての連続的な時点で全てのパラメータを記録した。システムを5分間再循環（経路A）で行った。膜圧を12psigに調節し、5分間再循環させた（経路A）。ミルクが1.5倍に濃縮されるまで透過水ラインを排出管に方向付け、550mlの透過水を採集した。サンプルF2およびP1をフィードリザーバおよび採集した投下水から取り出した。透過水ラインを経路Aに戻し、10分間再循環させた。サンプルF3およびP2をフィードリザーバおよび透過水ラインからそれぞれ取り出した。その後、500mlの新鮮なミルクをフィードリザーバに加え、次に透過水を経路Bに方向付け、さらに500mlを採集することによりミルクを2倍に濃縮した。透過水ラインを経路Aに戻し、10分間再循環させた。サンプルF4およびP3を取り出した。これを繰り返し、ミルクを2.5倍および3倍に濃縮し、サンプリングを続けた。ポンプを停止した。サンプルを2-8℃で保存し、IgG定量およびSDS-PAGE分析に送った。
【００９８】
0.2μm、3mmの経路のセラミックMF膜を通る最低量で最適のIgG1抗体流動を提供する操作温度の範囲を特定した。処理によるIgG1抗体の分解を、SDS-PAGEにより分析した。アイソフォーム修飾をIEFにより追跡した。ヤギD035のそれぞれのミルキングのpHおよび量を測定し、pHチャートに記録した。D035のRM01-005PDからRM-008PDまでの区分を、3000mlの全量まで溜めた。サンプル番号F1をプールから取り出した。2Lをフィードリザーバに溜めた。ポンプを始動させ、速度を20Hzから45Hzに増加させた（約20Lについて約5LPM）。温度、圧力、クロスフロー流速、透過水流速、および量を記録した。全ての連続的な時点で全てのパラメータを記録した。システムを5分間再循環（経路A）で行った。膜圧を12psigに調節し、5分間再循環させた（経路A）。温度を20℃に維持した。ミルクが2.5倍に濃縮されるまで透過水ラインを排出管に方向付け、800mlの透過水を採集した。サンプルF2およびP1をフィードリザーバおよび採集した透過水から取り出した。透過水ラインを経路Aに戻し、再循環させ、TMPを2psiに減少し、ポンプ速度を17分間28Hz（17LPM）に減少させて温度を23℃に低下させた。ポンプ速度およびTMPを45Hzおよび15psiにそれぞれ増加させ、5分間24℃まで再循環させた。サンプルF3およびP2を取り出した。温度を27℃に増加させ、ミルクを5分間再循環させた。サンプルF4およびP3を取り出した。これを29℃および36℃について繰り返した。新鮮なミルクの残りをMF膜により浄化した。ポンプを停止した。サンプルを2-8℃で保存し、IgG定量、IEF,およびSDS-PAGE分析に送った。
【００９９】
流速およびTMP対産物流動
0.2μm、3mmの経路のセラミックMF膜を通る最適のIgG1抗体流動を提供する膜圧（TMP）およびクロスフロー流速の範囲を特定した。D035のそれぞれの区分のpHおよび量を測定し、pHチャートに記録した。D035のRM01-009PDからRM-012PDまでの区分を、3700mlの全量まで溜めた。サンプルF1をプールから取り出した。1Lをフィードリザーバに溜めた。ポンプを始動させ、速度を20Hzから45Hzに増加させた（約20Lについて約5LPM）。温度、圧力、クロスフロー流速、透過水流速、および量を記録した。全ての連続的な時点で全てのパラメータを記録した。システムを5分間再循環（経路A）で行った。膜圧を12psigに調節し、5分間再循環させた（経路A）。ミルクが2倍に濃縮されるまで透過水ラインを排出管に方向付け、500mlの透過水を採集した。サンプルF2およびP1をフィードリザーバおよび採集した透過水から取り出した。透過水ラインを経路Aに戻し、10分間再循環させた。サンプル4および5を取り出した。膜圧を10psigに調節し、ポンプ速度を38.81Hz（〜14LPM）に増加させることによりフィード流速を維持した。ミルクを10分間MFシステムを通して再循環させ、次にサンプルP3を採取した。この工程を以下のチャートにより繰り返した：
【表４】
2006515227.tif 000005
【０１００】
ポンプを停止した。サンプルを2-8℃で保存し、タンパク質A定量によるIgG定量、IEF、およびSDS-PAGE分析に送った。
【０１０１】
処理テスト
1.0sqftの30kDa UFを供給する1.5sqftの0.2μmセラミックMFを用いる二段階TFFを使用してD035ミルクを浄化し、それぞれのダイアフィルトレーション量でIgG1抗体の回収率を分析する。ヤギD035からのそれぞれのミルク区分のpHおよび量をpHチャートに記録した。1776-032601-01-BについてD035のRM01-029PDからRM-032PDまでおよびRM01-033PDからRM-036PDまでの区分を、それぞれの実験について約4Lの全量まで溜めた。サンプル番号F1をプールから取り出した。1500mLをフィードリザーバに注いだ。ポンプを始動させ、速度を20Hzから45Hzに増加させた（約20Lについて約5LPM）。温度、圧力、クロスフロー流速、透過水流速、および量を記録した。全ての連続的な時点で全てのパラメータを記録した。5分間再循環（経路A）で行った。膜圧を15psigに調節し、5分間再循環させた（経路A）。透過水をメスシリンダに方向付けた。減少した量として新鮮なミルクをフィードリザーバに加えた。ミルクが3倍に濃縮されるまで透過水を採集し、2770mlを採集した。サンプルF2およびP1をMFフィードリザーバおよび採集した透過水から採取した。透過水を再び経路Aに方向付けた。15psigの膜圧でクロスフロー流速を14LPMに増加させた。0.8LPMのクロスフロー流速および11psiフィード圧力でUFを開始した。それぞれのシステムを、10分間再循環で同時に行った。UFの透過水を排出管に方向付け、800mlの透過水を採集した。MFの透過水流速を測定した。UFにおける保持液および透過水の圧力を調節し、透過水の流速をMFのものと等しくした。MFの透過水をUFのフィードリザーバに方向付け、UFの透過水をMFのフィードリザーバに方向付けた。ダイアフィルトレーション時間を計算した（計算の区分を参照して）。それぞれのダイアフィルトレーションの終わりにサンプルを採取した。透過水の流速を測定し、ダイアフィルトレーションの時間を再計算した。7度のダイアフィルトレーション量を行った。二つのシステムを切断し、MFを停止した。UFの透過水を排出管に方向付け、浄化したミルクを合計で4倍の濃縮物に濃縮した。その後UFを停止した。サンプルを2-8℃で保存し、IgG定量、IEF、SEC、およびSDS-PAGEに送った。浄化した濃縮されたUF保持液をシステムから除去し、無菌濾過した。2-8℃で保存した。
【０１０２】
膜洗浄
サイクルからサイクルへの高い膜水洗浄の回収率を確保するために、厳格な洗浄方法を使用した。生物薬務の態様を考慮して、乳業における標準的な膜洗浄に似た洗浄段階を設計した。適切なpHおよび導電値にするために残余化学物質を流出させる間の水の使用を最小限にするために、水洗浄段階を最適化した。下記の表１および２に提供されるすべての処理段階の後に以下の洗浄サイクルを行った。
【表５】
2006515227.tif 000006
【０１０３】
最初に膜を使用する前に、正規化された水透過曲線を膜圧、温度および水流動に関連して作成した。実験で使用する前に、水流動の最小80％の回収率を維持するために正規化された水透過率をチェックした。セラミック膜は進行中95-105％の回収率を維持し、30kDa PES膜は80-90％の回収率を維持した。
【０１０４】
無菌濾過
下記のグラフJに示されるように、Pall Gelman Inc.は、カートリッジ中で組み合わされた0.8μmのプレフィルタ膜および0.2μmのフィルタ膜を有するSupor膜から作製される無菌フィルタを作製した。これらのカートリッジは、無菌濾過のためのカプセル形態で使用できる最小の膜面積である、200cm2を有する。それぞれのカプセルの濾過能力を特定するために、実験を行った。二段階TFFを使用して非遺伝子導入ミルクを浄化し、無菌処理中のフィードストリームに似た大量の浄化したミルクを産生した。Supor膜の37mmのディスクをステンレス鋼の標準フローホルダーに取り付け、デジタル圧力変換器および蠕動ポンプと組み合わせた。USP水を全システム中に流し、膜を湿らせ漏れをチェックした。次に、一定の流速で浄化した非遺伝子導入ミルクをシステム中にポンプで流し、圧力を定期的に記録した。データを直線に合わせ、以下のグラフ中の関連処理能力対圧力に示される。30psigにおいて、膜が目詰まりし、したがって容量を特定するために処理能力は30psigと推定された。推定された容量は37mmディスクについて7343mlであり、これは200cm2カプセルについて131Lと計算される。
【表６】
2006515227.tif 000007
【０１０５】
膜保存
膜についての洗浄プロトコルを特定し、保存条件をテストした。48時間の洗浄後、膜を水または0.1Nの水産化ナトリウム中で保存した。保存溶液を洗浄し、NWPをテストした。NWPを洗浄後のNWPと比較した。二つのNWP値は、常に保存前のNWPの10％以内の保存を示した。0.1N水酸化ナトリウムは抗菌性または抗真菌性であり、NWPが保存中減少しなかったので、保存剤として選択された。
【０１０６】
濃縮対産物流動
液体流動は、濃縮の開始のほぼ直後に減少し始め、実験中確実に減少し続けた。最後のいくつかの点は、膜の付着物による流動の急落を示す。適当なダイアフィルトレーション時間を可能とするのに十分低い量で操作する処理中に最適の液体流動を維持するために、1.5倍から3倍の濃縮が望ましい。
【表７】
2006515227.tif 000008
【０１０７】
Tgミルク
タンパク質A HPLCによるIgG定量により、IgG抗体および液体流動が、ミルク濃縮と共に徐々に減少することが示された。以下のグラフLから、1.5-2.5倍が二段階TFFの操作に適当である。SDS-PAGEは、ミルク濃縮による凝集または分解を示さなかった。
【表８】
2006515227.tif 000009
【０１０８】
温度対産物流動
精密濾過膜を通るIgG1抗体の質量流動は、以下のグラフで明らかなように、27℃、20.3gm/m2/時間で最大に達した。操作の最適範囲は、26-29℃であった。以下のグラフMを参照すると、IEFは、処理によるIgG1抗体のアイソフォームの修飾を示さなかった。SDS-PAGEは、ミルクサンプルについては情報価値がなく、浄化されたミルクサンプルは分解バンドを示した。これらの分解バンドは、D035からの最初のミルクサンプル中に存在し、TFF浄化されたバルク物質中ではより薄かった。
【表９】
2006515227.tif 000010
【０１０９】
流速およびTMP対産物流動
それぞれのTMPは最適の流速を与えたが、15psiのTMPおよび42cm/秒(14lpm)の流速で、IgG1抗体流動は全体で最高であった。以下のグラフは、それぞれの膜圧における流速の効果を示す曲線を示す。IEFは処理によるアイソフォームにおける変化を示さず、SDS-PAGEは先の実験と同様の結果を示した。
【表１０】
2006515227.tif 000011
【０１１０】
グラフNに示されるように、最初の処理テストはミルクプールからIgG1抗体の81％の全回収率を示した。しかしながら、その約20％が凝集した。浄化の終わりに、最初のミルクプールと同じIEFバンドが観察された。また、中間のダイアフィルトレーション量からのサンプルは、IgG1抗体の非常に低い濃度を示し、これはサンプルがUFフィードリザーバの混合されていない領域から採取されたことを示す。実験を繰り返した。
【０１１１】
第二の処理テストは、IgG1抗体の90％の回収率を示し、5％±0.5％のみが凝集した。IEFゲルは、処理によるアイソフォーム修飾を示さなかった。SDS-PAGEは、わずかな凝集および分解バンドを示したが、サイズ排除クロマトグラフィにより特定された最終サンプルが96.2％単量体であったので、これらのバンドは凝集または分解したタンパク質の割合が大きくなかったことを示した。IgG1抗体の低い開始濃度のために、IgG定量のためのタンパク質Aアッセイにより、IgG1抗体を回収するためのダイアフィルトレーションの数を特定することが困難になった。6度のダイアフィルトレーションにより90％の回収率が与得られたが、5度のダイアフィルトレーションによりタンパク質Aによって170％の回収率が得られた。したがって、おそらく5-6度のダイアフィルトレーションがIgG1抗体の回収に十分である。
【０１１２】
ミルクを浄化するための試験工場で使用される装置における多くの技術実施の後、澄んだ浄化されたミルクを常に生産するために、使用される装置および工程は変更を要することが特定された。試験工場のGMP環境から大規模なテストのために開発研究室に装置を除去した。システムへの変更には、洗浄および浄化段階中に洗浄をより容易にするためにシステム中の透過水の配管を減少し弁の位置を変えることが含まれた。洗浄効果を改良し水の使用を減少するために洗浄プロトコルをわずかに変更した。処理温度範囲を特定した。最後に、処理パラメータをGMP文書調査においてよりよく定めた。
【０１１３】
試験装置のための元の設計は完全にステンレス鋼で構成されていた。多くの長い管が処理形態から洗浄形態に分解される必要があったので、この設計は洗浄には扱いにくかった。UF透過水配管の長さおよび内部の直径のために、洗浄プロトコル中に効果的に洗浄またはすすぎがされなかった。洗浄を容易にするために多くの部品がMFシステムに追加されたが、その構成により破片が蓄積するデッドスペースが生じた。これらの問題は、長いUF透過水配管を1/4”の内部直径のチュービングに交換することにより改善された。洗浄の設備は、MF膜の上部が他の部分への必要性を排除して膜の透過水側の洗浄に使用されるように変更された。UF透過水チュービングは洗浄中のUF上に残った。また、MFにおいて良好な温度コントロールを可能にするが処理に適切な範囲内でUF温度のコントロールを回避する、大きい熱交換器がシステムのMF部分に取り付けられていた。熱交換器はシステムから除去され、適切な温度範囲内で両方のシステムを適切に冷却するために冷却器が設置された。最終設計は以下のようである。保存、浄化および処理のために装置が組み立てられた。本発明の好ましい実施の形態における装置の構成が、以下の図式OおよびPに提供される。
【表１１】
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【０１１４】
他の簡単な変更が装置に行われた。UF膜を通る十分なクロスフローを妨げる高圧を特定するために水を使用してUFシステムをテストした後、膜に与えられたトルクが強すぎたことが特定され、適切なトルクは60ft-poundsであった。ポンプのローターおよびシールも削減した。大きい断片を捕獲し、UF膜における流れの制限および圧力の増加を防止するために、80-メッシュの検査されたガスケットをUF膜の上流の配管中に挿入した。UFリザーバに隣接するようにUF保持液弁を移動させた。処理中にMF透過水弁をUFリザーバに連結するスプール部品を移動し、弁をリザーバに直接連結した。これらの変更により、洗浄段階中の洗浄およびすすぎが容易になり、浄化およびその後のすすぎおよび洗浄水透過性テスト中に処理形態で全システムを連結することが可能となる。
【０１１５】
処理変化
IgG1抗体を含有するミルクを処理するためのTFF操作SOPおよびバッチ記録を、MFおよびUFシステムについてクロスフロー流速、膜圧、および温度についての範囲を含むように変更した。温度範囲は一連の実験により特定した。調べたパラメータは、産生された浄化ミルクの質と共に以下の表３に概略される。HEXは、MFにおける熱交換器の使用を称する。最後の3度の実行（5-7）の温度範囲を比較するグラフは添付のB.1にある。
【表１２】
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【０１１６】
試験装置における全ての技術実行により、もやのかかったまたは濁った浄化ミルクが産生された。高すぎる温度で操作することにより、透明で黄色であるのと対照的に、浄化ミルクはもやのかかったほとんど緑色に見えた。高温処理により、通常は保持されるミルク中の様々の分子がMF膜を通過し、IgG1抗体の安定性に影響を与えるかもしれない。処理が適切なクロスフロー流速および膜圧で実行される場合、ポンプは技術実行中に見られたように温度を制御不能に増加させない。浄化ミルク中のもやは、いくつかの実行における洗浄中の不適切な洗浄からの化学残留物によっても生じ、サンプル中のpHが９であることにより特定される（通常はpH6.7）。装置および洗浄方法を変更することにより、全ての流れから先浄水のpHおよび伝導性を測定することにより示されるように、システムから化学物質を十分に洗い流した。
【０１１７】
低すぎる温度で操作することにより、浄化ミルクは、全体に均一に分散した白っぽい綿状のものを有し濁って見える。熱交換器がMFシステム中に取り付けられた場合、温度は容易にコントロールされるが、浄化ミルクは濁ったままであった。Dairy and Biochemistry by P.F.Fox and P.L.H.McSweeny(1998)によれば、カゼインは等電点において不溶性であり、不溶性範囲は温度の増加と共に増加する。これは、低温よりも高温におけるMFによってより多くのカゼインが除去されること、およびUFよりも低い温度におけるMFの処理により可溶性のカゼインが生じ、これはMFを通過しより暖かいUFで不溶性になることを意味する。SDS-PAGEにより、ベンチスケールおよび成功した試験スケールの実行中に産生された浄化ミルクと比較してより低い温度の実行において、カゼインが過剰であることを示す現象を確かめた（以下）。したがって、最も低い可能な温度においてカゼイン不溶性の高いレベルを維持することに均衡が発見された。行われた実行により、22℃におけるMFの実行は低すぎ、30℃における実行は高すぎた。MFにおける実行の多くについて25℃近くの温度を維持することにより、澄んだ浄化ミルクが再現可能に産生された。SDS-PAGEゲル比較が図３に示される。図３を参照すると、レーン１は分子量標準を示す。レーン２は細胞培養IgG1抗体である。レーン３は4/17/01における技術実行からの最終的な浄化バルクである。レーン４は試験実行６（適切な温度）からの最終的な浄化バルクであり、レーン５はベンチTFF浄化バルク物質である。技術実行サンプルは、試験実行６およびベンチ浄化物質からのサンプルと相対的にずっと多くのカゼインを示す。
【０１１８】
洗浄および浄化変化
装置の変化により、洗浄および浄化プロトコルが必然的に変化した。洗浄プロトコルは、上記の表の全ての実行後に行われた。MFにおける保持液弁は、弁とリザーバとの間に長い効力のない区間が存在するので、それぞれのすすぎ段階中に適切な洗浄を容易にするように半開きのままであること必要とされた。実行４の後、洗浄プロトコルを行い、水の消費を追跡記録した（ノート10586）。この実験で使用された水は、実行５、６、および７の後に検証され、GMP処理に使用するように提言された。上記のように、装置の変化によりシステムを処理形態で浄化できる。このことをテストした。システムからのサニタント（sanitant）の洗浄に必要なUSP水も特定した。
【０１１９】
操作
二段階TFを志欧するミルク処理を行うために取られる実際の段階は、以下の欄に説明される。これらには、システムの浄化から、処理、洗浄、および保存までの全工程が含まれる。この手段は、実行5-7の間開発研究実における装置において使用され、澄んだ浄化ミルクを産生した。
【０１２０】
浄化
ヤギD035から遺伝子導入ヤギミルクを浄化および濃縮するためセラミック0.2μmの精密濾過膜および30kDaの限外濾過膜を使用する二段階TFFを行うために、システムを0.1M水酸化ナトリウムで浄化しなければならない。上記のように、装置を浄化および処理のために組み立てた。USP水で作製された2Lの0.1M水酸化ナトリウムを、MFにおいて15LPMのクロスフローでおよびUFにおいて1LPMのクロスフローでそれぞれのシステムにポンプで通す。MFに保持液圧力は加えず、UFの保持液には5psiの圧力を加える。透過水弁を完全に開き、水酸化ナトリウムを全システムに再循環させる。再循環を15分間行い、その後タンクとポンプの間のブリード弁を通してシステムから溶液を排出する。必要なときはいつでもタンクをUSP水で完全に満たすことにより、USP水をシステムの洗浄に使用する。1Lの水をそれぞれのブリード弁から排出する。MFにおける保持液弁は半分閉じられ、透過水弁は完全に消費に向けられる。UFにおける保持液および透過水弁は完全に消費に向けられる。12LのUSP水を、20LPMのクロスフロー流速でMF保持液を通して流す。4LのUSP水を、15-20LPMのクロスフロー流速および6-8psiのTMPでMF保持液を通して流す。7LのUSP水を、1LPMのクロスフロー流速でUF保持液および透過水ラインを通して流し、その後透過水をさらに3Lで流した。
【０１２１】
USP水（必要であればさらに加える）を使用し、20LPMでMFをポンプで流し、透過水圧力なしで15psiのTMPに達するまで保持液圧力を増加した後、15LPMまでクロスフロー流速を調節する。温度（25-28℃の間でなければならない）、圧力、およびクロスフロー流速を記録する。透過水排出弁を通る透過水流速を測定する。1LPMのクロスフロー、および5psigの保持液圧力を使用し、透過水圧力なしで（約10psigのTMP）、UFにおいて繰り返す。透過水の流速を膜の最初の水透過性と比較する。透過水の速度が最初の値の80％未満である場合、膜を再洗浄するかまたは交換する。
【０１２２】
ミルク処理
ミルクを溜め、15-20℃に上昇させなければならない。ミルクをMFリザーバ中に溜め、その後MF透過水弁を閉じ、保持液弁を開き、20LPMのクロスフローでポンプを作動させる。5分後、最初のミルクサンプルを採取する。次に、15psigのTMPおよび15LPMのクロスフロー流速について圧力を増加させる。ミルク温度が20℃に達するまで再循環を続ける。その後、冷却器を10℃で作動させ、MF透過水弁を開き、セラミック膜の透過水を採集することにより精密濾過システムにおける最初の量の半分にミルクを濃縮する。15psigの膜圧で15lpmのクロスフロー流速でMFを実行する。MFの温度は26℃±2.0まで上昇させ維持すべきである。その後、限外濾過システムを0.8-1LPM/sqftのクロスフロー流速で始動させなければならない。それぞれの膜の透過水流速を、透過水弁を通し測定する。UFの保持液および透過水圧力は、透過水流速がMFの透過水流速に一致するように調節しなければならない。UF透過水流速がMFのものに一致する。システムは、5-6ダイアフィルトレーション量について連結される。一度ダイアフィルトレーションが完了すると、システムを分離し、MFを切断、排出および洗浄し、UFのフィードリザーバ中のバルク浄化濃縮液の量が4倍の全濃度について半分の量に濃縮されるまでUF透過水を排出に方向付ける。次にUFを排出し、バルク浄化濃縮液を無菌濾過し、UFを洗浄する。
【０１２３】
洗浄および保存プロトコル
システムは、この報告のページ14により切断される。MFは、保持液弁を半分開き20Lの温かい軟水（45-65℃）で洗浄され、透過水は排出に方向付けられる。弁は再循環溶液をフィードリザーバに戻すように方向付けられ、400ppmの次亜塩素酸ナトリウムを有する2Lの温かい0.5Mの水酸化ナトリウムを5分間再循環させる。溶液をシステムから排出し、2Lの同じ化学物質と交換する。新鮮な溶液を30分間再循環させた後、ブリード弁を通して排出する。システムを、半開きの保持液弁を通して20Lの温かい軟水で流す。6-8psiのTMPで20lpmで膜の保持液側に水を循環させることにより、4Lを保持液にのみ流す。残った水をブリード弁を通して排出する。2Lの温かい0.5Mクエン酸を、6-8psiのTMPで20LPMで30分間システム中に再循環させる。その後、クエン酸をブリード弁を通して排出する。15Lの軟水を使用してMFの保持液側を洗浄し、腐食段階後に行われたように4Lを使用して透過水側を洗浄する。400pmの漂白剤を有する2Lの温かい0.05M水酸化ナトリウムを、15分間MF中に再循環させ、排出し、保持液側において10Lの水でおよび腐食段階後に行われたように透過水中を4Lの水で洗浄する。保持液弁を排出に方向付けることにより、および膳透過水ラインを排出に方向付けることにより（弁によらずに）、UF保持液および透過水ライン最初の水洗浄のために排出する。ポンプを常に1LPMで作動する、すなわち、保持液圧力が増加する場合、ポンプスピードも1LPMを維持するために増加させなければならない。両方のラインに4LのUSP水を流す。USP水で作製された250ppm次亜塩素酸ナトリウムを有する2Lの0.5M水酸化ナトリウムを両方のラインに流す。フィードリザーバに取り付けられた透過水ラインと共にシステム中に2Lの新鮮な溶液を再循環させ、保持液弁を60分間リザーバに向けて開く。ブリード弁を通して溶液を排出する。両方のラインを最初の洗浄においてと同様に排出させる。リザーバをUSP水で満たし、ブリード弁を通して1Lを排出する。両方のラインを通して8Lを流し、5psiの保持液圧力でさらに4Lを透過水ラインに流す。次に、2Lの0.4Mクエン酸を60分間システム中を再循環させる。酸溶液をブリード弁を通して排出させた後、リザーバをUSP水で満たし、1Lをブリード弁を通して排出する。8Lの水を保持液および透過水ラインの両方に流した後、5psiの保持液圧力で膜を通して1LPMのクロスフローで透過水中にさらに8Lを流す。両方のシステムを洗浄および浄化した後、保存のために組み立てる（上記の図式）。2Lの0.1M水酸化ナトリウムをそれぞれのフィード容器中に注ぎ、消費のために閉じていた保持液および透過水弁を再循環のために開いて2分間ポンプでシステム中を流す。その後、容器を覆いきれいであるとして状態を標識し、0.1M水酸化ナトリウム中で保存する。
【０１２４】
処理パラメータは、一貫した物質の産生において重要であることが示される。浄化のために使用される膜は、CerCorセラミック0.2μm孔サイズ膜、1.5sqftおよび30kDa NMWCO Pall Filtron PESカセット、2sq.ft.（2カセット）である。精密濾過システムの温度は、最適のIgG1抗体浄化および流動のために26-29℃の間に保持されなければならない。精密濾過システムは、15psigの膜圧で14LPM（42cm/秒）の保持液流速で行わなければならない。ミルクは、最初のプールの量の40-70％に濃縮されなければならない（1.5-2.5倍）。システムの限外濾過部分は、20-30psigのフィード圧力で1.6-2LPMの保持液流速において行われなければならない。透過水流速は、透過水圧力を調節することにより、精密濾過システムのものに一致させなければならない。最終的なバルク浄化濃縮物は、最初のミルクプールの量の四分の一でなければならない（4倍濃縮）。
【０１２５】
組換え産物
より多くの組換えタンパク質が治療および診断用途のために開発されている。しかしながら、これらのタンパク質の多くは、従来の技術を使用して機能的形態および／または必要な量で生産するのは困難または高価であるかもしれない。従来の技術は、特定のタンパク質の産生を引き起こす遺伝子を、細菌、酵母、または哺乳類細胞、例えばCOSまたはCHO細胞中に挿入し、その後、培養培地中でその細胞を成長させる工程を含む。従来の細菌または酵母系は、機能的形態で多くの複雑なタンパク質を産生することはできないかもしれない。哺乳類細胞は複雑なタンパク質を再生産することができるが、それらは通常成長させるのが困難または高価であり、しばしばほんのmg/Lの量のタンパク質しか産生しない。さらに、非分泌タンパク質は、培養培地中に分泌されないので、原核細胞または哺乳類細胞から精製するのが相対的に困難である。
【０１２６】
通常、遺伝子導入技術は、通常分泌されないタンパク質（非分泌タンパク質）を作製し分泌する方法を特徴とする。この方法は、
(a)プロモーター、例えば哺乳類上皮特異的プロモーター、例えばミルクタンパク質プロモーター；
(b)タンパク質の分泌を方向付けることのできるシグナル配列、例えばミルク特異的タンパク質からのシグナル配列；
(c)必要に応じて、分泌されたタンパク質、例えばミルク中に分泌されたタンパク質の領域をコードするアミノ末端の、例えば形質転換動物のミルク中に非分泌タンパク質を分泌するのに十分な部分をコードする配列；および
(d)非分泌タンパク質をコードする配列
を含み、要素(a)、(b)、必要に応じて(c)、および(d)は好ましくは記載された順序で動作可能に結合される核酸構成物から、タンパク質を発現する工程を含む。
【０１２７】
好ましい実施の形態において：a、b、c（存在するなら）、およびdは、同じ遺伝子からである；要素a、b、c（存在するなら）、およびdは、2つ以上の遺伝子からである。
【０１２８】
好ましい実施の形態において、分泌は形質転換動物のミルク中にされる。
【０１２９】
好ましい実施の形態において：シグナル配列はβ−カゼインシグナル配列である；プロモーターはβ−カゼインプロモーター配列である。
【０１３０】
好ましい実施の形態において、非分泌タンパク質をコードする配列は：ヒト起源である；先端が切断された、核、または細胞質ポリペプチドをコードする；ヒト血清アルブミンまたは他の所望の所定のタンパク質をコードする。
【０１３１】
本発明の実施は、他に意図されていなければ、当該技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は、文献に記載される。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989);DNA Clonin, Volumes I and II(D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed.,1984);Mullis et al.米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Wlker, eds., Academic Press, London,1987)；Handbook O
f Experimental Immunology, Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell, eds.,1986)；Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1986)参照。
【０１３２】
ミルク特異的プロモーター
本発明の実施において有用な転写プロモーターは好ましくは、カゼイン、ベータラクトグロブリン（Clark et al.,(1989)Bio/Technology 7:487-492）、乳漿酸タンパク質（Borton et al.(1987)Bio/Technology 5:1183-1187）、およびラクトアルブミン（Soulier et al.,(1992)FEBS Letts.297:13）のようなミルクタンパク質をコードする遺伝子を子音とロールするプロモーターを含む、哺乳類上皮細胞中で活性化されるプロモーターである。カゼインプロモーターは、任意の哺乳類の種類のアルファ、ベータ、ガンマまたはカッパカゼイン遺伝子に由来してもよい；好ましいプロモーターは、ヤギベータカゼイン遺伝子に由来する（DiTullio, (1992)Bio/Technology 10:74-77）。ミルク特異的タンパク質プロモーターまたは哺乳類組織中で特異的に活性化されるプロモーターは、cDNAまたはゲノム配列のどちらかに由来してもよい。好ましくは、起源はゲノムである。
【０１３３】
DNA配列情報は、少なくとも一つ、およびしばしばいくつかの生物において、上記された哺乳類乳腺特異的遺伝子の全てについて利用できる。例えば、Richards et al.,J.Biol.Chem.256,526-532(1981)（α−ラクトアルブミンラット）；Cambell et al., Nucleic Acids Res.12,8685-8697(1984)（ラットWAP）；Jones et al., J.Biol.Chem.260,7042-7050(1985)（ラットβ−カゼイン）；Yu-Lee & Rosen, J.Biol.Chem.258,10794-10804(1983)（ラットγ−カゼイン）；Hall，Biochem.J.242,735-742(1987)（α−ラクトアルブミンヒト）；Stewart,Nucleic Acids Res.12,389(1984)（ウシαs1およびκカゼインcDNA）；Gorodetsky et al.,Gene 66,87-96(1988)（ウシβカゼイン）；Alexander et al.,Eur.J.Biochem.178,395-401(1988)（ウシκカゼイン）；Brignon et al.,FEBS Lett.188,48-55(1977)（ウシαS2カゼイン）；Jamieson et al.,Gene61m85-90(1987),Ivanov et al.,Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369,425-429(1988), Alexander et al.,Nucleic Acids Res.17,6739(1989)（ウシβラクトグロブリン）；Vilotte et al.,Biochimie 69,609-620(1987)（ウシα−ラクトアルブミン）参照。様々のミルクタンパク質遺伝子の構造および機能は、Mercier & Vilotte,J.Dairy Sci.76,3079-3098(1993)（全ての目的のために言及することにより完全に引用される）に概説されている。追加の配列データが必要となる程度まで、既に得られた領域の側面にある配列は、現存する配列をプローブとして使用して容易にクローン化することができる。異なる生物からの哺乳類の腺特異的調節配列は、既知の同起源のヌクレオチド配列、または同起源のタンパク質に対する抗体をプローブとして使用して、そのような生物からのライブラリをスクリーニングすることにより同様に得られる。
【０１３４】
前述の発明は理解の目的のための説明および例として詳細に説明されているが、特定の変化および修飾を行ってもよいことは当業者にとって明らかであろう。したがって、記載および実施例は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【０１３５】
アルブミンは様々の化合物で結晶化されるのに、ホスフェートで結晶化するためのエタノールおよびホスフェートを含む無機酸塩の産業方法は文献に見られないということにも注意すべきである。本発明の好ましい実施の形態において、発明された本発明の重要な処理パラメータおよび／または条件を十分に利用することによりヒトアルブミンをホスフェート塩で有利に結晶化できることが今や発見された。発明されたパラメータおよびその変化は、上に記載され説明される。
【０１３６】
したがって、所定のフィードストリームから所定の分子の高収率を産生する十字流濾過の改良された方法をここに提供する本発明の実施の形態は、単に本発明の原理の利用を説明するものである。本発明の精神または添付の請求の範囲から離れずに、形態、使用の方法、および開示される要素の利用において変化を行ってもよいことは、上記の説明から明らかであろう。
【参考文献】
【０１３７】
2006515227.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１は、フィードストリームからTFFを通り充填および終了までの物質の流れについて工程のフローチャートを示す。
【図２】図２Aは、精密濾過のために設定された工程および装置を示す。図２Bは、TFFのために設定された工程および装置を示す。
【図３】図３は、高いおよび低い温度でのカゼイン産物の比較除去を示す。
【図４】図４は、濾過工程のフローチャートを示す。
【図５】図５は、DNAコンストラクトから所定の組換えタンパク質を含有する浄化されたミルクの産生までの遺伝子導入の進行の工程を示す。
【図６】図６は、本発明の方法のためのプロセス用装置の概略図を示す。
【図７】図７は、様々のTMPにおけるクロスフロー流速に関してMF膜を通過するhMAb#Aの流体力学特性を示す。経過中の進行が、12psiから20psiまでで増加するTMPにおいて注目される。
【図８】図８は、MF膜を通るヒトMAb#A通過の温度依存性を示す。
【図９】図９は、GTC精密濾過工程からの様々の分画のSDS PAGE分析を示す。完全なミルク（レーン３）と比較して4倍の浄化されたミルク（レーン７）においてカゼインの現象が含まれる。
【図１０】図１０は、本発明による工程のTFF工程、物質収支並びに全体的な収率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006515227.tif 000021
【図８】
2006515227.tif 000022
【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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