(57)【要約】ある薬学的に活性な化合物の還元（または「ロイコ」）体は、メトヘモグロビン血症、あるいは酸化的ストレスに関連するか、もしくはそれに起因した疾患または障害（例えば、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、レーヴィ小体疾患、ピック病、進行性核上性麻痺、虚血、心筋梗塞、急性肺傷害、発作、パーキンソン病、または急性熱帯熱マラリアにおける溶血もしくは貧血）の治療または予防のために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メトヘモグロビン血症、あるいは酸化的ストレスに関連するか、またはそれに起因した疾患もしくは障害の治療または予防、あるいはシクロスポリンＡ誘発性腎毒性の治療または予防のための医薬の製造における、フェノチアジン、リボフラビン、ユビキノン、４，７−フェナントロリン−５，６−ヒドロキノンおよびダプソンから選択される薬学的に活性な化合物の還元体の使用。
【請求項２】
前記還元体は、アスコルビン酸との混合および少なくとも１つのスルフィドリル化合物との混合により安定化される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記スルフィドリル化合物は、含硫アミノ酸、またはかかるアミノ酸に由来する少なくとも１つのアミノ酸ユニットを含むペプチド、あるいはかかるアミノ酸またはペプチドの誘導体である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記誘導体は、塩、エステル、またはアミドである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記アミノ酸は、システインまたはメチオニンである、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
前記スルフィドリル化合物は、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、メチオニン、またはそれらのいずれか２つ以上の混合物である、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記薬学的に活性な化合物は、フェノチアジンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記フェノチアジンは、トルイジンブルーＯ、チオニン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、メチレンブルー、または１，９−ジメチルメチレンブルー、またはそれらのいずれか２つ以上の混合物である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記薬学的化合物は、メチレンブルーまたはチオニンである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記アスコルビン酸対前記薬学的に活性な化合物の重量比は、約１０：１〜約１００：１である、請求項２ないし９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
単数または複数の前記スルフィドリル化合物対前記薬学的に活性な化合物の重量比は、約２：１〜約２００：１である、請求項２ないし１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記スルフィドリル化合物対前記アスコルビン酸の重量比は、約１：０．５〜約１：５である、請求項２ないし１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、レーヴィ小体疾患、ピック病、もしくは進行性核上性麻痺の治療または予防のための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
酸化的組織損傷の改善または防止のための医薬の製造における、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記酸化的組織損傷は、虚血、心筋梗塞、急性肺傷害、発作、またはパーキンソン病に関連する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
メトヘモグロビン血症の治療または予防のための医薬の製造のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
急性熱帯熱マラリアにおける溶血および貧血の治療または予防のための医薬の製造における、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、様々な障害の治療および／または予防、特に、メトヘモグロビン血症および酸素損傷により生じる障害の治療ならびに予防における、特定薬学的化合物の還元体の使用に関する。
【０００２】
メトヘモグロビンは、ヘモグロビンの酸化生成物であり、そこでは鉄がその第二鉄の形態（Ｆｅ３＋）にあり、したがって、この分子は、酸素を可逆的に結合することはできない。通常、ヘモグロビンの１％が、この第二鉄の状態にある。０．５〜３％のデオキシヘモグロビンが通常、毎日自然にメトヘモグロビンに酸化されている。赤血球の正常な還元力により、酸化と還元間の平衡が保たれている。解糖（エムデン・マイヤーホフ経路）から作り出されるＮＡＤＨは、メトヘモグロビン（Ｆｅ３＋）を還元してヘモグロビンに戻すことを可能にするメトヘモグロビン還元酵素（ＮＡＤＨ−シトクロムｂ５還元酵素）の基質として作用する。ヘキソース一リン酸分路を介して生産されるＮＡＤＰＨは、メトヘモグロビン還元における別のメトヘモグロビン還元酵素の基質として作用する（フェイルセーフメカニズム）。遺伝性酵素欠乏症形態のメトメモグロビン血症では、患者は、ＮＡＤＨシトクロムｂ５還元酵素の欠損に関してホモ接合性または二重ヘテロ接合性である。したがって、これらの患者の赤血球は、過剰量の酸化（第二鉄）形態のヘモグロビンを含有し、酸素輸送が不可能である。
【０００３】
数多くの薬剤（ダプソン、スルファサラジン、フェナセチン、ニトログリセリン、塩酸フェナゾピリジン、プリマキンおよびビタミンＫ類縁体など）は、ヘモグロビンの酸素結合溝に自分自身を挿入させることができる。この作用により、かかる薬剤は、酸化されたフリーラジカルおよび過酸化物を生成することができる。赤血球の防御的還元メカニズムが壊滅している場合、ヘモグロビンは、ハインツ体およびメトヘモグロビンの形態へと酸化されて、メトヘモグロビン血症を生じる。
【０００４】
重度のメトヘモグロビン血症を患う患者は、１〜２ｍｇ／ｋｇのメチレンブルーの静脈内溶液で直ちに処置すべきである。赤血球酵素ＮＡＤＰＨ−メトヘモグロビン還元酵素および適切な量の電子供与体ＮＡＤＰＨの存在下にて、メチレンブルーは、ｉｎ ｖｉｖｏでロイコメチレンブルーへと迅速に還元される。次に、この生成物は、メトヘモグロビンをヘモグロビンへと迅速に還元する。
【０００５】
ロイコメチレンブルーによるメトヘモグロビンのヘモグロビンへの還元は、メチレンブルーを再生する。赤血球細胞でのペントース経路により十分量のＮＡＤＰＨが生産される限り、この循環性の還元−酸化プロセスは継続し続けることができる。したがって、メチレンブルー療法の成功は、ＮＡＤＰＨの適切な供給の存在に依存する。Ｇ６ ＰＤ欠損症のようなペントースリン酸経路に異常が見られる患者は、このアプローチに応答せず、緊急の交換輸血を受けなくてはならない。
【０００６】
Ｇ６ ＰＤ欠損症は、世界的に最も一般的な障害の１つであり、米国の黒人男性の約１０％が罹患しており、多数のアフリカ人および幾らかの地中海沿岸居住者もまた罹患している。したがって、相当数の被験者が、（酸化的）薬物誘発性メトヘモグロビン血症の危険性がある。かかる患者へのメチレンブルー自体の投与は無効であり（彼等のＧ６ ＰＤ欠損症が、ＮＡＤＰＨ不足を引き起こすため）、逆効果の可能性でさえ存在する一方で、安定化されたロイコメチレンブルーをこれらの患者に投与することにより、メトヘモグロビンはヘモグロビンに直接還元されるはずであり、このため正常な酸素輸送および送達を復活させるはずである。
【０００７】
高用量のメチレンブルーまたはチオニンの実験室動物への（慢性毒性の研究における）繰り返し投与は、ヘモグロビンのメトヘモグロビンへの酸化およびハインツ体の組織蓄積を引き起こす。これらの見解は、化合物が十分多い量で投与されると、両方のフェノチアジンは、ｉｎ ｖｉｖｏでヘム鉄を直接（その第二鉄形態に）酸化することを明示している。データはまた、メチレンブルーの毒性が、少なくとも部分的に、その酸化電位に関連し得ることを示唆している。赤血球で生産されるＮＡＤＰＨ量は、おそらく高用量レベルのメチレンブルーを、対応する（より毒性の低い）ロイコ体に変換するのに十分ではない。
【０００８】
チオニン、アズールＣおよびアズールＢの酸化還元電位の比較により、これらの色素の被還元能、すなわち、電子を引き付ける能力、そのため酸化剤として作用するそれらの能力が、それらの側鎖中のメチル基の数の増加に伴って減少することを示される（Ｍｕｒｔｈｙ Ａ ａｎｄ Ｒｅｄｄｙ Ｋ Ｓ， Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， Ｆａｒａｄａｙ Ｔｒａｎｓ． １９８４， ８０： ２７４５−５０）。したがって、メチル基を欠くチオニンは、メチレンブルーよりも強力な酸化剤である。
【０００９】
動物の毒性研究により、高用量のチオニンの投与もまた、ヘモグロビンのメトヘモグロビンへの酸化およびハインツ体の蓄積を引き起こすことが示された。メチレンブルーおよびチオニンの毒性の少なくとも一部が、ヘム鉄の酸化により引き起こされる可能性が高いため、これらの酸化還元研究からチオニンがメチレンブルーより毒性も高いであろうと推論することも可能であり、実際にそうである。したがって、これらの観察に基づくと、ロイコメチレンブルーは、酸化され且つ高度にイオン化された形態（すなわち、メチレンブルー）よりも相当毒性が低いと期待されるであろう。
【００１０】
さらに、酸素由来のラジカル（すなわち、反応性酸素種、「ＲＯＳ」）は、数多くの疾患における組織傷害および細胞死を直接引き起こすことを示す証拠が増大し続けている。特に、ＲＯＳは、急性心筋梗塞後に生じる心筋虚血−再灌流障害、および急性虚血性発作後に生じる大脳虚血−再灌流障害に原因として関与することが高い説得力で示されてきている。酸化的ストレスもまた、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、糸球体腎炎、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病のような数多くの他の疾患における組織傷害および細胞死を引き起こすと考えられる。
【００１１】
酸素スーパーオキシドアニオンおよび過酸化水素はまた、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）誘発性腎毒性の媒介物質であると提唱されており、抗酸化薬による処置が、ＣｓＡ腎毒性の防止に提案されている（Ｌｏｐｅｚ−Ｏｎｇｉｌ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９８， １２４： ４４７−５４； Ｐａｒｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １９９８， ６６： １３２５−２９）。
【００１２】
細胞傷害の程度は、生成されるラジカルの量および型に依存する。スーパーオキシドアニオンは、幾つかのより毒性のある種の前駆物質であり、それらの形成は、虚血性組織の再灌流時に加速される。したがって、１つの治療上の戦略は、抗酸化薬によるか、または酵素スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の投与による酸素スーパーオキシドの除去に基づく。
【００１３】
最近の研究では、安定化されたロイコメチレンブルーは、強力な酸素スーパーオキシドスカベンジャーであることが示されている。この見解は、安定化されたロイコメチレンブルーを用いたインターベンション治療により、急性心筋梗塞、急性虚血性発作および急性虚血後気管壊死（急性腎不全）のような状態にて、虚血−再灌流により生じる組織損傷性酸素スーパーオキシドラジカルの迅速な除去が可能となることを示唆する。ロイコメチレンブルーはまた、ＣｓＡ誘発性腎毒性を低減すると予測され、したがって、ＣｓＡ処置により一般に引き起こされ、それに関連した腎毒性を防止するために、肝臓または腎臓移植のような状態にてシクロスポリンＡと同時に投与されるべきである。
【００１４】
したがって、本発明は、メトヘモグロビン血症、あるいは酸化的ストレスに関連するかもしくはそれに起因した疾患または障害の治療または予防における医薬の製造における、フェノチアジン、リボフラビン、ユビキノン、および４，７−フェナントロリン−５，６−ヒドロキノンから選択される薬学的に活性な化合物の還元（ロイコ）体の使用を提供する。
【００１５】
本発明はまた、シクロスポリンＡ誘発性腎毒性の治療または予防のための医薬の製造における、フェノチアジン、リボフラビン、ユビキノン、および４，７−フェナントロリン−５，６−ヒドロキノンから選択される薬学的に活性な化合物の還元（ロイコ）体の使用を提供する。
【００１６】
フェノチアジンの例としては、トルイジンブルーＯ（塩化トロニウム）、チオニン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、メチレンブルー、および１，９−ジメチル−メチレンブルーが挙げられる。これらの化合物はすべて、共通してフェノチアジン骨格を有し、安定であるが不活性な酸化体と、活性であるが不安定なロイコ体と、を有する。これらの中で特に好ましいのは、メチレンブルーおよびチオニンである。
【００１７】
本発明にて使用され得る他の薬学的に活性な化合物としては、リボフラビン、ユビキノン、４，７−フェナントロリン−５，６−ヒドロキノン、およびダプソンが挙げられる。
【００１８】
本発明者等は、薬学的化合物の酸化体を、アスコルビン酸と、および少なくとも１つのスルフィドリル化合物と混合することによる、上記化合物の酸化体から還元体への変換のための新規な方法、および／または還元状態にある当該化合物の安定化のための新規な方法を発見した。この発明は、本出願と同日に提出した同時係属出願の主題を成す。
【００１９】
好ましくは、本発明で使用される薬学的に活性な化合物は、かかるプロセスにより安定化されるべきである。
【００２０】
この安定化に使用されるスルフィドリル化合物は、−ＳＲ基（式中、Ｓは、硫黄を表し、Ｒは、水素原子、または低級アルキル基、好ましくは１〜４個、より好ましくは１または２個の炭素原子を有するアルキル基を表す）を有するいかなる化合物であってもよい。−ＳＨ基は、ときには「メルカプト基」と称され、２つの用語「メルカプト」および「スルフィドリル」は、ときには互換可能に使用される。この安定化により、結果的に安定化剤のスルフィドリル化合物は酸化され、スルフィドリル化合物は、−ＳＨまたは−ＳＲ基が式−Ｓ−Ｓ−の基に酸化されるようであることが好ましい。好ましいスルフィドリル化合物は、含硫アミノ酸、およびかかるアミノ酸由来の少なくとも１つのアミノ酸ユニットを含めたペプチド、好ましくはオリゴペプチド、ならびにかかるアミノ酸およびペプチドの誘導体（それらの塩、エステルおよびアミドを含む）である。
【００２１】
好ましいかかるアミノ酸としては、システイン、メチオニンおよびエチオニンが挙げられる。かかるアミノ酸に由来するユニットを含むペプチドの例は、グルタチオンである。かかるアミノ酸の誘導体（アミド）の例は、Ｎ−アセチルシステインである。したがって、好ましいスルフィドリル化合物は、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、メチオニン、エチオニン、およびそれらのうちいずれか２つ以上の混合物である。
【００２２】
スルフィドリル化合物は、薬学的に活性な化合物とアスコルビン酸との混合の前に、後にまたは同時に、薬学的に活性な化合物と混合され得る。あるいは、薬学的に活性な化合物は、アスコルビン酸および少なくとも１つのスルフィドリル化合物を含有する組成物と混合されてもよい。
【００２３】
アスコルビン酸は、約１０：１〜約１００：１の重量比で、薬学的に活性な化合物と混合され得る。単数または複数のスルフィドリル化合物は、約２：１〜約２００：１の重量比で、薬学的に活性な化合物と混合され得る。スルフィドリル化合物対アスコルビン酸の重量比は、約１：０．５〜約１：５であり得る。
【００２４】
還元は、薬学的に活性な化合物の幾らかまたはすべてをより還元された酸化状態に変換する結果をもたらし得る。一例として、１０％よりも多い、２０％よりも多い、３０％よりも多い、４０％よりも多い、５０％よりも多い、６０％よりも多い、７０％よりも多い、８０％よりも多い、９０％よりも多い、または９５％よりも多い薬学的に活性な化合物が、より還元された形態に変換され得る。
【００２５】
本発明により還元される薬学的に活性な化合物の酸化体は、混合物または組成物内に存在してもよい。混合物または組成物は、薬学的組成物および医薬にて伝統的に使用される既知の型の物質のいずれかをも含んでよい。薬学的に活性な化合物が還元された後に、さらなる物質が、組成物と混合されてもよい。薬学的に活性な化合物の酸化体および／または還元体に添加され得る物質の例は、本明細書中の他の個所に記載されている。
【００２６】
薬学的に活性な化合物は、単独で、あるいは薬学的組成物を形成するための様々な慣用の添加剤と混合して、本発明に使用され得る。添加剤としては、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、キャリア、緩衝液、希釈剤、または防腐剤が挙げられる。
【００２７】
本発明による組成物または医薬、本発明により製造される組成物または医薬、あるいは本発明での使用のための組成物または医薬は、好ましくは、薬学的に活性な化合物に加えて、アスコルビン酸および少なくとも１つのスルフィドリル化合物を含有する。スルフィドリル化合物は、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、メチオニン、エチオニン、およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。薬学的に活性な化合物量に対するアスコルビン酸量は、重量に基づいて、約１０：１〜約１００：１であり得る。単数または複数のスルフィドリル化合物量は、薬学的に活性な化合物に対する重量に基づいて、約２：１〜約２００：１であり得る。スルフィドリル化合物対アスコルビン酸の重量比は、約１：０．５〜約１：５であり得る。
【００２８】
薬学的に活性な化合物またはそれを含有する組成物と混合され得る薬学的に許容可能な賦形剤、キャリア、緩衝液、希釈剤および防腐剤は、理想的には無毒性であるべきであり、好ましくは、薬学的に活性な化合物の活性を妨害すべきではない。賦形剤、キャリア、緩衝液、希釈剤、防腐剤、または組成物もしくは医薬内の他の物質のいずれもの正確な性質は、意図された投与経路に依存し得る。しかしながら、かかる物質は、当業者に既知であり、ここでさらなる説明を必要としない。
【００２９】
保管または投与の準備が完了している本発明の薬学的組成物または医薬は、適切な形態のいずれか、例えば、錠剤、カプセル、散剤、液剤、懸濁剤、または乳剤の形態であり得る。
【００３０】
液体薬学的組成物は一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油のような液体キャリアを含む。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール類は、単独で、あるいは他のキャリアと併用して使用されてもよい。
【００３１】
薬学的組成物は、発熱物質を含まず、かつ適切なｐＨおよび等張性を有する非経口投与上許容可能な水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば、塩化ナトリウム、リンゲル液、乳酸加リンゲル液のような等張性媒質を用いて、適切な溶液を調製することが十分に可能である。
【００３２】
本組成物が液体（例えば、液剤）の形態である場合、窒素または希ガス（例えば、アルゴン）のような不活性ガスを用いて、脱気または散布されてもよい。脱気または散布により、再酸化に対する薬学的化合物の還元体の安定性が改善され得る。液体組成物は、窒素またはアルゴンのような不活性ガス下にて保管されてもよい。それは、投与に適した気密生分解性カプセル内に含入されてもよい。
【００３３】
本組成物が錠剤である場合、薬学的化合物は溶液中で還元され得る。錠剤は、当業者に周知の、例えば噴霧乾燥技法により得られ得る。かかる噴霧乾燥は、還元体の薬学的化合物の維持を助長するために、窒素または別の不活性ガス下にて行われ得る。錠剤は、大気の酸素へのそれらの暴露を減少させるために、気密カプセル、コンテナまたはパック（例えば、ブリスターパック）中に保管され得る。かかるカプセル、コンテナおよびパックは、当業者に既知である。
【００３４】
被験体は、動物、特に、ヒトまたは非ヒト（ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のげっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマなど）であり得る哺乳類、あるいはニワトリのような鳥類であり得る。
【００３５】
薬学的に活性な化合物または組成物の投与は、好ましくは、「予防上有効な量」または「治療上有効な量」であり、場合に応じて（予防は治療とみなされ得るが）、かかる量は、被験体に有益性を示すのに十分である。投与される実際の量、投与の速度および時間的経過は、治療事項の性質および重篤性によって異なるであろう。治療の処方箋、例えば投与量の決定等は、例えば一般開業医および他の医師の責任の範囲内である。
【００３６】
フェノチアジンは、タウ−タウタンパク質会合、および神経フィラメント凝集の調節（例えば、阻害）にて使用することができることが知られている。これに関しては、国際特許出願公開第ＷＯ９６１３０７６６号を参照とし、その全開示が、参照により本明細書に援用される。タウ−タウタンパク質会合および／または神経フィラメント凝集の調節は、例えば、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、レーヴィ小体疾患、ピック病および進行性核上性麻痺の治療において有用であり得る。
【００３７】
現段階では、フェノチアジンが、酸化体にてまたは還元（「ロイコ」）体にて活性であるかどうかは認識されていない。
【００３８】
酸化的ストレスに関連するか、もしくはそれに起因し、かつ本発明に関する障害、疾患または状態は、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、レーヴィ小体疾患、ピック病、進行性核上性麻痺、ならびに急性熱帯熱マラリアにおける溶血および貧血からなる群から選択され得る。
【００３９】
理論に拘束されることは望まないが、フェノチアジンのロイコ体が、血液脳関門を横断することが可能であると考えられる。また、フェノチアジンの酸化（非ロイコ）体が、文献にて観察される変異原性および毒性問題の原因であると考えられる。
【００４０】
したがって、フェノチアジンの還元体の製造、安定化および使用に関する本発明の態様は、フェノチアジンを用いた治療において、例えば、タウ−タウ会合および／または神経フィラメント凝集に関連した状態、疾患または障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、レーヴィ小体疾患、ピック病および進行性核上性麻痺）の治療において、有意な向上を提供し得る。
【００４１】
したがって、本発明は、メトヘモグロビン血症を治療する方法であって、フェノチアジンの還元体の投与を含む方法を提供する。本発明はまた、メトヘモグロビン血症を治療するための医薬の製造におけるフェノチアジンの還元体の使用を提供する。
【００４２】
フェノチアジンの還元体のさらなる医療上の用途は、酸化的損傷からの組織の防御である。
【００４３】
虚血および再灌流障害に関連した組織損傷は、結果としてＦｅ（Ｖ）ＯおよびＦｅ（Ｖ）Ｏ状態のヘムタンパク質をもたらす。次に、これらのタンパク質は、その活性が酸化的損傷をもたらす細胞障害性酸素ラジカルの生産を促進する。
【００４４】
研究により、かかる酸化的損傷の改善または防止は、リボフラビンの投与により達成され得ることがわかっている。ＮＡＤＰＨ依存性メトヘモグロビン還元酵素は、リボフラビンのジヒドロリボフラビンへの細胞内還元を触媒する（Ｈｕｌｑｕｉｓｔ， Ｄ． Ｅ． ｅｔ ａｌ （１９９３） Ａｍ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ： Ｊａｎ １９９３； ４２（１）， ｐ．１３（以下参照））。次にジヒドロリボフラビンは、Ｆｅ（ＩＶ）ＯおよびＦｅ（Ｖ）Ｏ状態のヘムタンパク質を還元し、ラジカル生成を防止する。例えば心筋梗塞、急性肺傷害および発作に関連した酸化的損傷の改善または防止が可能である。
【００４５】
ロイコメチレンブルーのような還元フェノチアジンは、Ｆｅ（ＩＶ）ＯおよびＦｅ（Ｖ）Ｏ状態のヘムタンパク質の還元への他の経路を提供する。この経路は、これらの化合物の還元体を製造および安定化するための手段を提供する本発明によってのみ可能となった。
【００４６】
還元体のフェノチアジンの使用は、ＮＡＤＰＨ依存性を回避するのに、また酸化化合物に関連したいかなる毒性をも低減または防止するのに有益である。後者により、大量の化合物を投与することが可能となる。
【００４７】
酸化的組織損傷が生じる別の例は、パーキンソン病である。パーキンソン病では酸素スーパーオキシドが生成されて、フェノチアジン化合物のロイコ体がこの反応性酸素種をトラップし、それにより酸化的損傷を防止するという証拠が存在する。パーキンソン病脳で生成される神経毒性反応性酸素種レベルが結果的に減少し、それにより疾患病理学に寄与する酸化的損傷およびニューロン死から、ドーパミン作動性ニューロンを防御する。
【００４８】
また、熱帯熱マラリアにおける赤血球に対する酸化的ストレスの増大が、実質的に溶血および貧血に寄与し得ること［Ｄａｓ ＢＳ ａｎｄ Ｎａｎｄａ ＮＫ， Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ １９９９， ９３（１）： ５８−６２］、また酸化的ストレスおよび赤血球損傷が、危険な熱帯熱マラリア原虫を持つ子供の赤血球損失に寄与し得ること［Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２００１， １１３（２）： ４８６−９１］が最近わかってきており、それゆえ、例えばロイコメチレンブルーまたはロイコチオニンのようなフェノチアジンの還元体の投与は、これらの疾患の治療に貢献すると予測され得る。
【００４９】
したがって、様々なさらなる態様では、本発明は、酸化的組織損傷を改善または防止する方法、ならびに虚血、心筋梗塞、急性肺傷害、発作、パーキンソン病、ならびに急性熱帯熱マラリアにおける溶血および貧血からなる群から選択される疾患、障害または状態を治療する方法を提供する。各々の場合において、上記方法は、フェノチアジンの還元体の投与を包含する。
【００５０】
本発明はまた、酸化的組織損傷を改善または防止するための医薬の製造におけるフェノチアジンの還元体の使用、ならびに虚血、心筋梗塞、急性肺傷害、発作、パーキンソン病、ならびに急性熱帯熱マラリアにおける溶血および貧血からなる群から選択される疾患、障害または状態を治療するための医薬の製造におけるフェノチアジンの還元体の使用を提供する。
【００５１】
酸化的ストレスに起因するか、またはそれに関連した疾患および障害の治療におけるフェノチアジンのロイコ体の有効性を、以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例では、ロイコメチレンブルーまたはロイコチオニンの濃縮貯蔵物をシステイン／アスコルビン酸で安定化し、使用前にアルゴンブランケットした窒素処理緩衝液で大量に希釈した。
【００５２】
実施例１
フェリシトクロムＣの還元
以下のアッセイが基礎にしている原理は、酵素キサンチンオキシダーゼがキサンチンに作用して、キサンチンを酸化し、それにより、少なくとも部分的にスーパーオキシドを伴うメカニズムによりフェリシトクロムＣを還元するということである。したがって、フェリシトクロムＣの光学密度の減少（および増加）は、還元剤としてのスーパーオキシドに依存する。アッセイでのスーパーオキシドジスムターゼ（「ＳＯＤ」）の含入は、利用可能なスーパーオキシドの幾らかを不動変化するのに役立ち、したがってフェリシトクロムＣの還元率の減少を引き起こす。
【００５３】
ＳＯＤアッセイを５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中で実施した。ウマの心臓のフェリシトクロムＣ（１２．５μＭ）およびキサンチン（５０μＭ）をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（１００μＭ）と混合した。３０℃にて１分当たり０．０５〜０．１光学密度単位の吸光度（５５０ｎｍ）の増加率を付与するのに十分なバターミルクのキサンチンオキシダーゼ（８ｎｍ付近）を添加した（キサンチン酸化／シトクロムＣ還元に起因）。次に、２５〜７５％まで酸化還元反応率の抑制をもたらすのに十分なＢ．ステアロサーモフィルス（Ｂ． Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＳＯＤを添加した。
【００５４】
スーパーオキシドは、単電子還元剤または酸化剤である。ロイコメチレンブルーおよびロイコチオニンの酸化がスーパーオキシド感受性であること、したがって両作用物質が、スーパーオキシドスカベンジャーとして作用することができることを証明するために、以下のアッセイを設定した。両方の場合において、ＳＯＤの添加により、ロイコ化合物の酸化率が減少し、両方のロイコ化合物がスーパーオキシドスカベンジャーであることを示した。
【００５５】
ロイコチオニンおよびロイコメチレンブルーの効果を調べるために、これらの化合物を、キサンチン（５０μＭ）およびＥＤＴＡ（１００μＭ）を有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）中に１．２５μＭ濃度にて混合した。次に、ロイコチオニンまたはロイコメチレンブルー、リン酸カリウム緩衝液、キサンチンおよびＥＤＴＡのみを用いた対照に加えて、３０℃にて１分当たり約０．１光学密度単位の吸光度（メチレンブルーに関しては６６５ｎｍにて、チオニンに関しては６０５ｎｍにて）の増加率を付与するのに十分なバターミルクのキサンチンオキシダーゼ（１０ｎｍ付近）を添加した。
【００５６】
次に、ロイコ化合物の酸化がスーパーオキシドに起因することを証明するために、６分後にＢ．ステアロサーモフィルスＳＯＤを反応セルに添加して、吸光度の増加率を減少させるかどうかを確かめた。両方の場合で、ＳＯＤ５単位の添加により、増加率が有意に減少した。
結果を以下の表１に示す。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
６分後すぐのＳＯＤの添加前および後では、上記表に示される光学密度の変化率間の差異は顕著であり、本発明の化合物の活性を明らかに実証する。
【００５９】
実施例２
さらなる実験では、超酸化カリウムを、緩衝液、ＥＤＴＡおよび複数濃度のロイコチオニンおよびロイコメチレンブルーを含有する反応セルに添加した。スーパーオキシドによるロイコ化合物の直接酸化が観察された。
【００６０】
超酸化カリウムを、ＥＤＴＡ（１００μＭ）および約１０μＭ濃度のロイコチオニンおよびロイコメチレンブルーを含有する窒素処理したリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）に直接添加した。両方の場合で、激しい反応が起こり、ロイコ化合物は、それらの有色の酸化状態へと迅速に酸化された。
【００６１】
超酸化カリウムの水中での既知の特性であるセルの泡立ちにより、反応の最初の４分は測定が不可能であった。しかしながら、両方の場合で、セルでは、無色から青色（ロイコメチレンブルー）または紫色（ロイコチオニン）に至るのが観察された。最終光学密度に関する結果を以下の表２に示す。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
実施例３
別の実験では、上記実施例１の実験の結果を、アドレノクロム系を使用することにより確認した。この系では、ｄｌ−エピネフリンが、スーパーオキシド依存経路により、アルカリ性条件下にて自己酸化される。この反応の反応率は、スーパーオキシドを捕捉するＳＯＤの添加により減少または妨害することができる。反応率はまた、ロイコメチレンブルーまたはロイコチオニンの添加によっても減少または妨害することができ、それらもまたスーパーオキシドスカベンジャーであることを示している。この系では、ｄｌ−エピネフリンの自己酸化率が、いずれかのロイコ化合物の存在により減少される一方、ロイコ化合物自体は、率依存性様式でスーパーオキシドにより酸化される。
【００６４】
この実験で、ｄｌ−エピネフリン（５００μＭ）は、３０℃にてＥＤＴＡ（１００μＭ）を含有する５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．２）中で自己酸化させた。これらの条件下にて、エピネフリンは、アドレノクロムに酸化される（３１０または４８５ｎｍの吸収増加）。両方の場合で、ロイコメチレンブルー（５０μＭ）およびロイコチオニン（５０μＭ）は、３１０ｎｍでのアドレノクロムの出現を減少させるのに有効である一方、それら自体は、それぞれ６６５ｎｍおよび６０５ｎｍでの増大する酸化ピークにより示されるように、酸化された。
結果を以下の表３に示す。
【００６５】
【表３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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