(57)【要約】  本発明は、ヒトおよび/または動物由来の血清および/または血清画分と、インスリンまたはインスリン誘導体と、抗酸化剤および/またはビタミン類の部類から選ばれた一つまたは幾つかの化合物とを含む、筋組織に由来する前駆/幹細胞の培地組成物に関する。本発明は、また前駆/幹細胞の培養方法、細胞/遺伝子治療用の産物として用いられることの出来る筋芽細胞の産生方法に関する。本発明は、前駆/幹細胞からの筋芽細胞の産生を最大限利用することを目的とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒト由来および／または動物由来の血清および／または血清画分と、
（ｉｉ）インスリンまたはインスリンの誘導体と、
（ｉｉｉ）抗酸化剤および／またはビタミンの部類から選択された１つまたはそれ以上の化合物とを含む、細胞培地組成物。
【請求項２】
請求項１において、ヒト血清が用いられる組成物。
【請求項３】
請求項１において、ウシ血清が用いられる組成物。
【請求項４】
請求項１において、さらにＦＧＦ型増殖因子の部類から選択された１つまたはそれ以上の化合物を含む組成物。
【請求項５】
請求項４において、ＦＧＦ型増殖因子の部類がｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２〜ＦＧＦ−１０からなる組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項において、インスリン誘導体がＩＧＦの部類およびバナジウム酸塩型のインスリン模倣物の部類から選択される組成物。
【請求項７】
請求項１〜２および４〜６のいずれか１項において、ヒト血清濃度が５容積％未満である組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項において、さらにグルココルチコイドを含む組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項において、前記ビタミンがアスコルビン酸である組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項において、前記抗酸化剤がＮ−アセチル−システインおよび／またはセレンである組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項において、さらに（ａ）リポホスファチジン酸、ならびに／または（ｂ）ＥＧＦ、ヘレグリン、トロンビン、ＰＤＧＦ、甲状腺ホルモンおよびＬＩＦの部類の中の１つまたはそれ以上の化合物、を含む組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物が、細胞増殖工程の間の培地として用いられる前駆細胞および／または幹細胞の培養方法。
【請求項１３】
請求項１２において、細胞分化工程が、前記細胞増殖工程の前、間または後に行なわれる方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３において、用いられる前記ヒト血清が前記前駆細胞および／または幹細胞と自系である方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法の実行による筋芽細胞の産生方法。
【請求項１６】
請求項１５において、前記前駆細胞および／または幹細胞が筋組織からの細胞抽出の工程によって得られる、筋芽細胞の産生方法。
【請求項１７】
請求項１６において、前記抽出工程が酵素消化によって行なわれる、筋芽細胞の産生方法。
【請求項１８】
請求項１５〜１７のいずれか１項において、前記得られた細胞の回収および分離が行なわれる、筋芽細胞の産生方法。
【請求項１９】
請求項１８において、前記細胞の回収および分離の工程が酵素消化とその後の遠心分離および／またはろ過によって行なわれる、筋芽細胞の産生方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１９のいずれか１項において、機能性試験が、コロニーを形成するための筋芽細胞の安定性に対して行なわれる、筋芽細胞の産生方法。
【請求項２１】
請求項１５〜２０のいずれか１項において、キャラクタリゼーション工程が、さらに行なわれる、筋芽細胞の産生方法。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれか１項において、細胞周期マーカーが用いられる、筋芽細胞の産生方法。
【請求項２３】
請求項１５〜２２のいずれか１項において、筋芽細胞の凍結の工程が行なわれる、筋芽細胞の産生方法。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の培地中に前駆細胞および／または幹細胞および／または筋芽細胞を含む細胞集団。
【請求項２５】
請求項１５〜２３のいずれか１項による産物が細胞治療用に使用される筋芽細胞の使用方法。
【請求項２６】
請求項２５において、小筋肉の機能的処置用の産物の調製のための筋芽細胞の使用方法。
【請求項２７】
請求項２５において、尿失禁の処置用の産物の調製のための筋芽細胞の使用方法。
【請求項２８】
請求項１５〜２３のいずれか１項による筋芽細胞を遺伝子治療用として使用する筋芽細胞の使用方法。
【請求項２９】
請求項１５〜２３のいずれか１項に従って得られた方法による筋芽細胞を、毒性学的スクリーニングおよび／または薬理学的スクリーニングに使用する筋芽細胞の使用方法。
【請求項３０】
請求項２９において、横紋筋融解症に関与する１つまたはそれ以上の物質を検出するための筋芽細胞の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋組織に由来する前駆細胞／幹細胞用の培地組成物、前駆細胞／幹細胞のための培養方法、および細胞／遺伝子治療用の産物として用いることができる筋芽細胞を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養方法に関する多くの研究は、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのような筋退化を一般に被っている患者に投与するための筋芽細胞に富んだ細胞画分を得る目的のために行なわれている。これらの多くは、例えば、初代細胞(initial cells)の選択、培養条件または細胞同定工程に関連している。
【０００３】
これに関して、培養中の筋芽細胞へのＤＮＡの組み込みから生じる筋タンパク質のインビボ合成のための方法を提唱する特許文献１をあげることができるが、これらの筋芽細胞は少なくとも５回の細胞複製を受けている。
【特許文献１】米国特許公報第５５３８７２２号
【０００４】
特許文献２は、培養に由来する筋原細胞、および以前にクローニングされている筋原細胞を得るためのプロセスも開示しており、これはその優れた発達能力に起因して前者を上回る利点を有する。
【特許文献２】米国特許公報第５１３０１４１号
【０００５】
特許文献３は、特有の分化を促進するための低酸素培養のコントロールされた使用による前駆体細胞の培養プロセスを開示する。
【特許文献３】米国特許公開公報２００１−００３４０６１号
【０００６】
最後に、特許文献４は、細胞治療における所望の使用のために適切かつ特に調整された、筋由来の十分キャラクタリゼーションされた細胞集団を提唱する。
【特許文献４】国際公開公報０１/９４５５５号
【０００７】
しかし、細胞／遺伝子治療における使用に適切な細胞集団を産生するという観点から培地自体の組成について行なわれた研究はさらに限られた数しかない。
【０００８】
このような研究のうちでは、不死化された筋細胞株、すなわち、多数回継代された後に得られており、遺伝子治療において、欠損した筋組織を「修復（repairing）」するのに、または１つまたはそれ以上の遺伝子を導入して所定の産物を得るベクターとして用いられる細胞株の培養のためのプロセスに関する特許文献５が存在する。
【特許文献５】欧州特許公開公報１０４８７２４号
【０００９】
特許文献６は、移植された筋芽細胞の泳動距離を増大するために、そして筋肉の機能的なタンパク質を発現する融合された筋芽細胞の数を増大するために、ｂＦＧＦのような増殖因子およびメタロプロテイナーゼ産生の誘導因子の両方の存在下においてドナーの筋芽細胞を「プレコンディショニング（preconditioning）」することによって、移植片が定着するのを改善するための手段を教示している。
【特許文献６】国際公開公報９７/００７７４号
【００１０】
特許文献７は、筋機能不全部位に注射する前に遺伝子的に改変されている筋細胞を産生するためのプロセスを開示する。このプロセスは、尿失禁を処置することを特に意図している。
【特許文献７】国際公開公報９９/５６７８５号
【００１１】
特許文献８は、特定のプロフィールの細胞マーカーの発現を有し、尿失禁の処置に用いることができる長期の生存（in situ survival）を有する前駆細胞について言及している。
【特許文献８】国際公開公報０１/７８７５４号
【００１２】
最後に、特許文献９は、幹細胞に結合する細胞マトリックスを用いることによって幹細胞を調製するプロセスに関する。このプロセスは尿失禁の処置を特に意図する。
【特許文献９】国際公開公報０２/０６７８６７
【００１３】
上述の先行技術のこれら全ての文献を含む文献は、補充していない動物血清（非ヒト、例えば、ウシまたはウマ）を実際の細胞培養を通じて用いるという特徴を共有しているが、動物血清はおそらく、細胞増殖に必要な全ての要素の十分な供給物と考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
移植には、多数の筋芽細胞の産生が必要であり、筋組織由来の前駆細胞／幹細胞で開始することによってこの産生を改善することが重要である。本発明は、培地に用いられて、この培地を最適化することが可能な血清（または血清画分）への補充を提唱する。従って、これによって培養時間を短くすることが可能である。この最適化によって、そのアベイラビリティーが制限されている、ヒト血清の場合に必要なことである、使用する血清（または血清画分）が少なくて可能になり、同時に、プリオンまたはウイルスによる汚染の潜在的供給源である動物タンパク質の使用なしに行うことが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前駆細胞／幹細胞で開始する筋芽細胞の産生の最適化の問題を解決するために、本発明は、
（ｉ）ヒト由来および／または動物由来の血清および／または血清画分と、
（ｉｉ）インスリンまたはインスリンの誘導体と、
（ｉｉｉ）抗酸化剤および／またはビタミンの部類から選択された１つまたはそれ以上の化合物とを含む、細胞培地組成物を提案する。
【００１６】
ウシ由来、好ましくはヒト由来の血清および／または血清画分が用いられる。有利には、ヒト血清の濃度は、５容積％未満、さらに有利には１〜３容積％である。
【００１７】
代表的には、インスリン誘導体は、（ａ）ＩＧＦおよび（ｂ）バナジウム酸塩型のインスリン模倣物（vanadate type insulomimetics）の部類から選択される。
【００１８】
有利には、ビタミンは、アスコルビン酸であり、そして抗酸化剤がＮ−アセチルシステインまたはセレンである。
【００１９】
ある実施形態では、ＦＧＦ型の増殖因子の部類から選択された１つまたはそれ以上の化合物がさらに用いられ得る。代表的にはこの増殖因子は、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２〜ＦＧＦ−１０の部類から選択される。
【００２０】
別の実施形態では、培養培地は、必要に応じてグルココルチコイドを含んでもよい。
【００２１】
別の実施形態では、培地組成物はさらに、（ａ）リポホスファチジン酸(lipophosphatic acid)ならびに／または（ｂ）ＥＧＦ、ヘレグリン、トロンビン、ＰＤＧＦ、甲状腺ホルモンおよびＬＩＦの部類からの１つまたはそれ以上の化合物をさらに含む。
【００２２】
本発明はまた、前駆細胞および／または幹細胞の培養のための方法に関するが、ここで前述の組成物は細胞増殖工程を通じて培養培地として用いられる。
【００２３】
ある実施形態によれば、細胞分化工程は、細胞増殖工程の前、間または後に行なわれる。代表的には、用いられるヒト血清は、前駆細胞／幹細胞と自系（自己由来）である。
【００２４】
本発明はまた、前述の方法の実行によって筋芽細胞を産生するための方法に関する。
【００２５】
ある実施形態によれば、前駆細胞および／または幹細胞は、筋組織から細胞抽出の工程によって得られる。有利には、抽出工程は酵素消化によって行なわれる。
【００２６】
別の実施形態によれば、得られた細胞の回収および分離が行なわれる。代表的には、細胞の回収および分離は、酵素消化、その後の遠心分離および／または濾過によって行なわれる。酵素消化の工程はさらに省略されてもよい。
【００２７】
別の実施形態によれば、コロニーを形成するための筋芽細胞の適合性を試験する。
【００２８】
別の実施形態によれば、細胞のキャラクタリゼーションを行なう。有利には細胞周期マーカーを用いる。
【００２９】
別の実施形態によれば、筋芽細胞の凍結の工程を行なう。
【００３０】
本発明はまた、培養培地中に前駆細胞／幹細胞、筋芽細胞またはこれらの混合物を含む細胞集団に関する。
【００３１】
本発明によれば、前述のプロセスによって産生した筋芽細胞は、細胞治療のために用いられる。好ましくは、それらの筋芽細胞は、尿失禁の処置、または小筋肉の機能的処置を意図する産物の調製に用いられる（その小さいサイズによって特徴付けられるそれらの筋肉としては、尿道括約筋または肛門括約筋のような括約筋、眼瞼筋肉、指の筋肉、喉頭の筋肉が挙げられるが、これに限定されない）。
【００３２】
別の実施形態によれば、このように産生された筋芽細胞は、遺伝子治療に用いられる。
【００３３】
最後に、本発明は、毒性学的スクリーニングおよび／または薬理学的スクリーニングにおける、産生された筋芽細胞の使用に関する。代表的には、このスクリーニングは、横紋筋融解症に関与する１つまたはそれ以上の物質を検出する目的である。
【００３４】
本発明の他の特徴および利点は、例示のみのために提示された、本発明の実施形態に従う説明を読み、以下に示す図面を参照すれば明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明はまず、細胞増殖および／または分化のための培地組成物に関する。特に、この培地は、筋芽細胞において筋前駆細胞および／または幹細胞の増殖および分化を確実にするために用いてもよい。基本的栄養培地に加えて、本発明のこの培地組成物は、最低限、ヒト由来および／または動物由来の血清、インスリン（またはその誘導体の１つ）ならびに抗酸化剤および／またはビタミンを含む。
【００３６】
用いられる基本栄養培地は、ＣＯ２濃度に依存性または非依存性の緩衝液で緩衝される。緩衝液が１５ｍＭの濃度でヒト筋細胞の増殖を長期に阻害するので、培養培地からＨｅｐｅｓを排除することが好ましい。用いられる培地は、ほとんどの場合、ＤＭＥ型、ＨａｍのＦ１２型およびＭＥＭα型培地の混合物によって構成される。これらのなかで、例えば、ＤＭＥ／Ｆ１２およびＤＭＥ／ＭＣＤＢ  ２０２の混合物があげられる。前駆細胞および／または幹細胞の培養を通じて特に適切である基本栄養培地は、また、４．５ｇ／ｌのグルコースおよび３．７ｇ／ｌの重炭酸塩を含む。好ましい培地の別の例は、Ｄ−バリンでＬ−バリンを置換することによって改変した培地ＭＣＤＢ  １２０である。
【００３７】
本発明の組成物には動物（例えば、ウシまたはウマ）由来の血清を使用することが可能であるが、ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得ることができるヒト由来の血清が、動物由来の血清によるヒトでの汚染の健康リスクを回避する目的で好ましい。血清の代わりに、通常市販されている（ヒトアルブミンまたはトランスフェリンなど）血清画分（血清の１つまたはそれ以上の部分要素によって構成される）を使用することも好ましい。豊富であって入手が比較的容易な動物血清とは異なり、ヒト血清はより限定された「供給源」、すなわち患者から得られること、そして血液採集の回数を制限してできるだけ少ない血液を採取することが所望されることを考慮すれば、細胞培養を通じて可能である限りヒト血清の濃度を低下させることが特に有利である。本発明による実施形態は、血清またはヒト由来の血清画分を、５％未満の濃度、さらに好ましくは１〜３％の濃度で用いることからなる。
【００３８】
図１は驚くべき事に、ヒト血清に混合物Ｍを添加することによって、ＨＳ（ヒト血清）単独よりも３倍、筋芽細胞の産生を得ることができるということを示す。ヒトおよびウシ胎仔血清への補充をそれぞれしている実施例２および３は、これをさらに詳細に示す。
【００３９】
細胞培地組成物はまた、インスリンおよびインスリン模倣物を含む。後者の中では、ソマトメジンまたはインスリン様増殖因子の部類に属するホルモン、例えばＩＧＦ１およびＩＧＦ２、または金属、例えばバナジウム酸塩であって、特定のホスファターゼ群を阻害するものが見出される。
【００４０】
本発明による組成物では、少なくとも１つの抗酸化剤および／または１つのビタミンが、培地に添加されるべきである。抗酸化剤のなかで、０〜１０ｍＭの濃度のＮ−アセチル−システインまたはセレンが好ましい。一般には、セレンを亜セレン酸ナトリウムまたはセレノメチオニン（Ｓｉｇｍａ）の形態で０〜１ｍＭの濃度で用いる。「抗酸化（antioxidant）」という用語はまた、酸素還元分圧(oxygen-reduced partial pressure)が用いられる培養条件を指すことに注意のこと。
【００４１】
ビタミンのなかでは、アスコルビン酸は０〜１ｍＭの濃度で、ニコチンアミドは０〜１００ｍＭの濃度で用いられ得る。ビタミンＥも用いることができる。それにもかかわらず、アスコルビン酸が好ましいビタミンである。なぜならアスコルビン酸では実施例４に示すとおり最高の結果が得られるからである。
【００４２】
血清に前に記載された化合物を組み合わせるほかに、本発明の培地に対してＦＧＦ増殖因子の部類に属する１つまたはそれ以上の化合物を添加することが可能である。これらの因子によって、培養中の細胞、詳細には幹細胞または前駆細胞を増殖させること、および特定の様式で分化させることが可能になる。この部類の増殖因子としては、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２〜ＦＧＦ−１０が挙げられる。一般には、これらの増殖因子は、０．１ｎｇ／ｍｌと１００ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で用いられる。
【００４３】
本発明の実施形態によれば、少なくとも１つのグルココルチコイドを培地に添加してもよい。これらのホルモンは、とりわけ糖質の代謝に対して作用する。天然または半合成のグルココルチコイド、すなわち、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロンまたはトリアムシノロンを用いてもよい。デキサメタゾン（Ｄｅｘ）は好ましいグルココルチコイドである。実施例５に示されるように、グルココルチコイドは、細胞増殖に対して刺激性かつ特定の効果を有する。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、リポホスファチジン酸、増殖因子ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ヘレグリン、トロンビン（ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ−１５）、ＬＩＦおよび甲状腺ホルモン（Ｔ３、Ｔ４を含む）から選択される１つまたはそれ以上のさらなる添加物を用いる。
【００４５】
必要に応じて、重金属に対する防御因子としてトランスフェリンを添加することも可能である。他のホルモンまたは活性分子、例えば、肝細胞増殖因子、ＨＧＦ／ＳＦおよび、例えば、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦｂ、ＴＮＦａ、トロンボポイエチンまたは増殖ホルモンのごとく特徴付けられた種々の因子を培地組成物に含んでもよい。
【００４６】
プロゲストゲンおよび誘導体（例えば、プロゲステロン）、エストロゲンおよび誘導体（例えば、エストラジオール）、アンドロゲンおよび誘導体（例えば、テストステロン）、鉱質コルチコイドおよび誘導体（例えば、アルドステロン）、ホルモンＬＨ、ＬＨ−ＲＨ、ＦＳＨおよびＴＳＨ、レチノイン酸およびその誘導体、カルシトニン、プロスタグランジンＥ２およびＦ２／αまたは副甲状腺ホルモンが用いられてもよい。
【００４７】
本発明の実施形態によれば、上記で規定された組成物は、筋組織由来の前駆細胞および／または幹細胞の培地として極めて適切である。
【００４８】
本発明によれば、培養された前駆細胞および／または幹細胞と自系であるヒト血清を使用することが好ましい。なぜなら、このような血清によって、異種血清の使用の間に存在する汚染のリスクを排除することが可能になるからである。この場合、細胞培養の枠組み内で血清の使用の前に血清を処理することはもはや必須ではないということが結論である。
【００４９】
本発明はまた、筋肉の前駆細胞および／または幹細胞が、上述の組成の培地で培養される間に筋芽細胞を産生するための方法に関する。この産生方法は以下の段階に分けることができる。
・抽出：細胞が、例えば酵素処理によって筋組織から得られる、
・増殖：前の工程の間に得られた細胞が培養され、それらが選択的な増殖を受ける、
・増殖に由来する細胞の凍結（必要な場合）、
・患者に再移植する前の増殖に由来する細胞のキャラクタリゼーション。
【００５０】
この産生方法の前に、前駆細胞および／または幹細胞を収穫するために筋生検を行なう。これは、局所麻酔下での切開によって行なう。サンプルのサイズは約１ｇであり、それから１０６個の細胞を抽出することができる。一旦生検を行なえば、組織を保護的培地に入れる。この保護的培地は本質的に、前に言及した基本栄養培地からなり、これに抗生物質、例えば、アレルギーの形質が乏しい点でペニシリン誘導体より好ましいゲンタマイシン、保護因子、例えばカルニチン（１ｍＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（５・１０−９Ｍ）、アスコルビン酸、ニコチンアミドおよびトレハロース（trealose）を添加してもよい。温度は２５℃未満であり、かつ４℃を越えていなければならない。輸送培地の容積については、筋組織の容積の少なくとも１０倍であり、輸送時間については２４時間を超えないことが好ましい。細胞は詳細には、外側広筋、中間広筋、二頭筋、四頭筋、脛骨筋、腓腹筋、腓骨筋、三角筋、広背筋、胸鎖乳突筋、肋間筋、肩甲舌骨筋、腹筋または腰筋から得ることができる。ミンチにする工程を行って引き続く酵素消化をさらに良好にすることができる。この工程は、適切な培地に入れた好ましくは０．５ｍｍより小さいサイズの切片に生検を切断する工程からなる。ミンチにする工程は、微細なハサミを用いて手で行なうことができる。電力または機械的エネルギーを供給された例えばカッティングミルを用いて補助して、スライスする工程も行なうことができる。このような有用なミルの例は、Ｍｅｄｉｍａｃｈｉｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎが販売）である。
【００５１】
本発明の実施形態は、筋組織から細胞を抽出する工程からなる。実際、筋組織は、筋線維によって構成され、筋線維の基板の下に衛星細胞が位置する。筋線維の解離および衛星細胞の分離の工程によって、細胞を単離することが可能になる。本発明による好ましい解離の工程は、細胞外基質消化酵素の使用からなる。サンプリングされた組織の筋繊維および衛星細胞の解離のために用いられる酵素の選択およびその濃度は、酵素有効性の研究によって導かれるが、求められる基準は、できるだけ低い酵素濃度かつ最小のインキュベーション時間で、同様の有効性を得ることである。濾過後に得られる細胞の収率は、一部は酵素解離工程の質に依存する。本発明の方法において、単独で、または組み合わせて用いることができる消化酵素は、例えば、部分的に精製されたＩＡ、ＳおよびＨ型、ならびに、Ｒｏｃｈｅ−ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒからＬｉｂｅｒａｓｅの商品名で市販される精製型を含む全てのコラゲナーゼ、プロナーゼ、または、ＥＤＴＡを含むまたは含まない緩衝液の溶液に含まれる種々の起源のトリプシン、ディスパーゼ（プロテアーゼとしても公知）、エラスターゼ、またはヒアルロニダーゼがあげられる。特に、トリプシン−コラゲナーゼまたはプロナーゼ−コラゲナーゼの酵素組み合わせは、実施例１の結果によって示されるとおり適切である。これらのなかでも、プロナーゼ−コラゲナーゼの組み合わせが好ましい。なぜなら、これらは抽出に由来する酵素ではないので、プリオンまたはウイルスによる汚染の健康リスクを回避することが可能になるからである。コラゲナーゼを単一の酵素として用いることもできる。細胞が酵素に曝される時間を最低限にするために、連続プロセスによってこの抽出工程を行なうことが好ましい。酵素処理時間が１０分を超えないこと、そして２０〜２５℃の処理温度を用いることも所望される。この全ての工程について、用いられる培地は保護的培地である。酵素の作用の阻害は、希釈、洗浄および遠心分離によって行う。
【００５２】
抽出処理の変法も適用可能である。一方では、解離工程は、コラゲナーゼの存在下での第一のインキュベーションとトリプシンの存在下での第二のインキュベーションの２段階で行なうことがでる。他方では、ピペットによる懸濁物の吸引と排出による機械的解離によって酵素解離を完了することが可能になる。
【００５３】
次いで、組織フラグメントから遊離される細胞の顕微鏡的観察によって酵素消化の有効性をモニターすることが可能になる。この観察によって、種々のサイズの細胞、赤血球またはサルコメア（筋節）断片の存在に気が付くことが可能になる。これらのサルコメア断片は、筋組織の酵素消化の有効性の良好な指標である。酵素によって消化されていない組織断片は、前に記載したのと同じ処理による新規の酵素消化に再度供することが推奨される。この操作を５回繰り返すことが特に適切である。当該分野で周知のプロトコールに従ってこの工程で（培養前に）細胞を凍結することができる。
【００５４】
本発明はまた、既に記載された培地を用いて細胞増殖工程が行なわれている間に筋芽細胞を産生する方法に関する。この増殖段階の終わりに、筋芽細胞の細胞集団がほとんど得られ、すなわち最低７０％の筋芽細胞が見られる。この細胞増殖工程に分化工程が続く。従って前述の増殖培地は、分化培地によって置き換えられ、その例は本明細書の以降において示される（実施例６）。
【００５５】
筋原性前駆細胞の増殖を改善するため、細胞培養の分野では、コラーゲン、またはその誘導体、例えばゼラチンを使用することが一般的である。これらの物質は、ウシの死体からの抽出によって得られ、例えばプリオンによる汚染という健康リスクの問題を有する。従って、本発明は、遺伝子操作によって得られるタンパク質を用いることによってこの問題を解決することを提案する。フィブロネクチンのＲＧＤＳフラグメントのポリマーである、プロネクチンＦ（Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ  Ｆ）と呼ばれる市販の分子は、極めて適切である。筋組織の前駆体であるようなヒト細胞の増殖に対してゼラチンに匹敵する有効性があり、このタンパク質は基質として本発明の枠組み内で用いることができる。ＬリジンまたはＤリジンポリマーを用いることも可能である。
【００５６】
接着細胞の培養に適したリアクターで細胞を培養することが好ましい。かき混ぜ速度、その規則性および調製物の均一性をチェックするという拘束を回避するために、この培養リアクターは好ましくは静的である。２〜３日の間に大きい細胞集団を回収するためには、標準的な支持体（ペトリ皿、フラスコ）と比べて大きい培養表面積がなければならない。このような培養リアクターの例は、プレート培養デバイス（シングル、ダブルおよび／または多段式）である。
【００５７】
このプロセスで用いることができる培養デバイスによってまた、無菌方式で細胞のサンプリングを行なうことが可能になる。これによって、特定のマーカーの分析により、種々の培養段階に存在する細胞タイプの同定に必要なサンプリングを行なうことが可能になる。これによって培地を空にすること、細胞の洗浄および分離、そして最終的に無菌方式でのその細胞の回収が可能になる。
【００５８】
バッグおよび特に適切な滅菌試験管を用い、このバッグをこのリアクターに連結して、培地をデカントすることまたは細胞を回収することが可能になる。従ってこのデバイスによって、閉鎖系で操作を何度も行なうことが可能になる。所望の細胞集団によるが、培養日数は０〜４５日に変化する。
【００５９】
さらに、数ヶ月におよぶ期間にわたって、標準的な増殖または灌流技術によって培養を継続してもよい。
【００６０】
回収される細胞の数を増大するために、１回以上の増殖段階が可能である。この増殖段階は、細胞の分離の工程と、細胞の洗浄の工程と、大きい培養表面積での再培養の工程とを包含し、これらの工程を行なうために用いられる溶液および酵素は、当業者に周知である。
【００６１】
詳細には、本発明のプロセスは、少なくとも１つの細胞増殖段階を含む。このようなプロセスによって、初期の前駆細胞および／または幹細胞が各々の増殖培養の最後でほとんど筋芽細胞に分化することを確実にしたうえに、細胞の数を増やすことが可能になる。本発明の実施形態に従って、増殖工程を受けている細胞の一部を凍結することを行なう。凍結プロトコールは実施例８に示す。例えば、培養の１／５、すなわち約２・１０５個の細胞を凍結してもよく、残りの４／５を細胞増殖プロセスに供する。このように調製した細胞を適切な時期に使用することを可能にするために、引き続く解凍工程によって細胞の十分な生存、好ましくは９０％を超える生存が可能になるような条件下で、それらの細胞を凍結させることが有利である。例えば、細胞を凍結培地に懸濁する。これらの凍結培地組成物は代表的にはＤＭＥ／Ｆ１２培地であり、これは１ｍＭ  Ｌカルニチン、０．２５２１ｍＭのアスコルビン酸、５・１０−９Ｍデキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌのインスリンおよび２％のヒト血清を含み、そしてこれを２つの滅菌凍結バッグに、１０５〜１０７細胞／ｍｌの濃度で、または凍結試験管中に１ｍｌあたり１０５〜１０７細胞の濃度で、移す。これらの条件下で、保存因子は、１０％の濃度のＤＭＳＯである。トレハロースＬアルギニン（最大０．５Ｍ）を、この凍結培地に添加してもよい。このジサッカライド（diholoside）への細胞の浸漬によって、細胞の保存を改善することが可能になる。凍結はデバイス（ＤｉｇｉｃｏｏｌまたはＮｉｃｏｏｌ）を用いて行ない、これによって制御された温度低下を確実にする。解凍の時点まで液体窒素中で細胞を保管する。培養後の凍結した細胞の解凍は、例えば、３７℃の水槽で行なってもよい。等張性生理食塩水を用いて細胞調製物を２回洗浄する。等張性溶液のバッグおよび空のバッグへの無菌的接続によってリンスを行なう。細胞の生存度および質の評価のためにアリコートをとっておく。
【００６２】
細胞増殖後、酵素消化による細胞の分離が行なわれる。この工程の間、そして健康リスクを低下する目的で、市販されている組み換え由来のトリプシンを用いることが得策である。
【００６３】
将来の診療使用の枠組みのもとで、細胞移植を行う前に、本発明に従って、上記の筋芽細胞産生プロセスによって得られた細胞懸濁液を分子および機能的レベルでキャラクタリゼーションすることが好ましい。このキャラクタリゼーションは、表面抗原、または分析されるべき種々の細胞タイプに特異的な任意の抗原のマーキングの後、フローサイトフルオリメトリー（細胞蛍光測定法）またはＦＡＣＳによる細胞マーカーの分析によって行なうことができる。本明細書では、「細胞マーカー（cell marker）」という用語は、単独で、または細胞タイプについて他のマーカーと組み合わせて情報を与えることを可能にする任意の細胞抗原を指す。
【００６４】
このキャラクタリゼーションは、以下のような他の細胞マーカーを用いてタンパク質レベルで行なわれる。
・内皮細胞マーカーとして、Ｐ−Ｃａｍ、
・神経細胞および筋細胞マーカーとして、Ｎ−Ｃａｍ、
・平滑筋マーカーとして、「平滑筋アクチン（smooth muscle actin）」、
・グリア細胞マーカーとして、ＧＦＡＰ
・筋細胞マーカーとしてＭｙｏＤ  Ｍｙｆ５、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｃ−ｍｅｔおよびＭ−カドヘリン、Ｎ−ｃａｍ、
・幹細胞マーカーとして、Ｓｃａｌ＋、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ５６、
・細胞周期マーカーとして、ＰＣＮＡ、Ｐ２１、Ｐ１６、Ｋｉ６７。
【００６５】
このキャラクリゼーションはまた、細胞遺伝子（例えば、特定の転写因子および細胞周期機構因子）をコードするオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡチップ（遺伝子アレイ）の使用によって転写レベルで行なうことが可能であり、これによって細胞懸濁液中で細胞を同定することが可能になる。
【００６６】
高い純度の細胞集団を得ることは、細胞治療産物として特定の用途に必須であることが証明される。当業者は当該分野の状況で提唱される種々の技術を実行して、このような細胞を選択的にスクリーニングすることが可能であることは明らかである。例えば、クローニングによる、フローサイトフルオロメトリー(flow cytofluorimetry)による、または該当の細胞に特異的な抗体を用いる免疫親和性もしくは免疫磁気カラムによるスクリーニングの技術が挙げられる。このためには、分子キャラクタリゼーションおよび機能的な生物学的キャラクタリゼーションの両方を用いるべきである。選択された細胞マーカーによって、筋線維の前駆細胞を同定することが可能になる。この同定は、単一のマーカーによって行なわれるのではなくマーカーの組み合わせによって行なわれる。これらは、膜マーカー、例えば、Ｎ−Ｃａｍ、Ｖｌａ４、Ｍ−カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５６、細胞質マーカー、例えば、デスミン、および核マーカー、例えば、ｐａｘ７およびｍｙｏＤである。コロニー形成および増殖の能力を増大するために、一旦生物体に移植されれば、細胞治療に用いられる細胞は、細胞周期機構のマーカー、例えば、Ｋｉ６７、ＰＣＮＡに陽性であり、細胞周期インヒビター、例えばＰ２１およびＰ１６に陰性である。他方では、これらの細胞は、ミオゲニンおよびトロポニンＴ（ＴＮＴ）のような最終筋分化の最終マーカーについて陰性である。細胞機能性の分析は、培養物中での生物学的試験によって行なう。これらの試験の目的は、細胞サンプルで培養中でコロニーを形成する能力および筋原性コロニーの頻度を決定することである。この試験は、細胞抽出の後、または凍結の前、または凍結の後のいずれに行なうこともできる。この原理は、特定の分化培地の使用による、細胞表現型の低蜜度増殖と発現(development)の分析に基づく。細胞の播種密度は、できるだけ低く維持しなければならないことに注意のこと。事前に、前駆細胞／幹細胞を増殖段階に、続いて細胞分化段階に供する。次いで、得られた細胞をアルコール溶液で固定して、当該分野で周知のプロトコールに従ってギムザで染色し、次いでデジタル装置によって写真を撮る。機能性試験の枠組み内において、次いで、これを以下に供する。
・顕微鏡観察、これによってコロニーの総数をカウントして、これによってクローン増殖能力を有する細胞の割合を決定することが可能になる、
・顕微鏡観察、これによって筋前駆細胞のコロニーの数および割合を決定することが可能になる。筋前駆体のコロニーは、生物体において筋繊維を形成する筋管である、多核の紡錘細胞を、細胞融合によって形成する。
【００６７】
機能性試験を実施例６に示す。本発明はまた、上記のような培地に含まれる任意の細胞集団をカバーする。細胞集団とは、一般に優勢な細胞タイプと１つまたはそれ以上の少数派の細胞タイプを含む、任意の純粋でない細胞集団を意味する。従ってこの実施形態は、筋芽細胞に富んだ集団（細胞増殖段階後）においてだけでなく、これらの細胞のどのカテゴリーも多数派ではない場合、すなわち増殖プロセスの間に相当する「中間（intermediate）」集団における、ほとんど前駆細胞および／または幹細胞である集団（すなわち、増殖段階が行なわれる前）に関する。従って、これは、種々の細胞タイプの混合物であってもよい。
【００６８】
本発明は、ヒトの骨格筋、心筋および内臓筋肉組織および血管組織における再構成のための細胞治療産物の調製において、優勢な細胞タイプが筋芽細胞によって構成される細胞集団の使用に関する。
【００６９】
好ましい実施形態において、筋芽細胞の集団を細胞治療の産物として、男性および女性の尿失禁を治療するために用いる。尿失禁は、尿道を閉鎖する圧力が不十分であることに由来し得るが、正常な尿道の抵抗性の半分は平滑筋性括約筋(smooth sphincter))に起因し、半分は尿道中間の横紋筋性括約筋(striated sphincter)に起因する。
【００７０】
この細胞治療産物はまた、前立腺ガン治療後の失禁、ならびに先天性または後天性の筋ジストロフィーを治療するためにも用いることができる。ジストロフィーの患者では、筋芽細胞の移植によってジストロフィン発現の回復が可能になる。これは、例えば、本発明のプロセスによって得た筋由来の細胞を直接、骨格筋にまたは全身の循環に針を用いて注射することからなる。
【００７１】
ヒト投与に適切な細胞治療の産物は、細胞が再懸濁されている等張性溶液を含む。この溶液については、凍結培地に毒性成分が存在しないことが好ましい。
【００７２】
尿失禁の治療の場合、これは、詳細には、細胞治療として調製された、その優勢なタイプが筋芽細胞の特徴を有する細胞集団を、尿道閉鎖機構の機能を改善する目的のために、尿道または横紋筋性括約筋に、針を用いて直接注射することからなる。注射した細胞の数は１０５〜１０７個の細胞である。
【００７３】
経尿道超音波プローブによって筋芽細胞の注射を制御すること、およびその注射の前後に尿道圧を測定することが可能であり、これによって特にＭＲＩを用いて尿道閉鎖圧の変化を見積もることが可能になる。
【００７４】
本発明によって提供されるプロセスの細胞培養および増殖(expansion)段階の間、異種核酸のトランスフェクションによる細胞の遺伝的改変の工程を行なうことができる。核酸は、トランスフェクトされた細胞においてポリペプチドの発現、またはタンパク質の発現を可能にするように選択される。次いで、このトランスフェクトされた細胞は移植されて、その異種核酸で始まるポリペプチドまたは発現されるタンパク質のデリバリーが可能になり、このポリペプチドまたはタンパク質は生物学的に活性な産物である。従って、本発明は、生物学的に活性な産物のデリバリーのためのプラットフォームとして細胞治療産物としての細胞の集団の使用に関する。前駆細胞を遺伝的に改変するために、培養中の細胞を急速にかつ有効に改変することを可能にするウイルスアプローチを使用することが好ましい。モロニー型のレトロウイルスは、この場合特に有効である。このウイルスに、例えばＧＦＰ型蛍光タンパク質のような分子マーカーを挿入することが可能である（実施例７）。このように改変された細胞は、一旦動物に導入されれば細胞の運命を追跡するツールである。
【００７５】
本発明による別の実施形態は、毒性学的スクリーニングおよび／または薬理学的なスクリーニングにおいて筋芽細胞の集団を用いる工程からなる。この目的は、患者の要求に対してできるだけ迅速に答えるために、開発ならびに前臨床および臨床試験をできるだけ短縮することである。実際、医薬の開発において「モデル」として、この細胞集団を使用することは有利であり、これによってハイスループットスクリーニングを行うことが可能になる。次いで、疾患の発生時に機構を解明すること、および活性成分となる治療標的または候補分子を見出すことが可能になる。このスクリーニングはまた、毒性学において、特に薬の相互作用を研究するために有用であり得る。
【００７６】
薬理学／毒性学における専門家には、自動的な技術を行なう方法は周知であり、数千の新規な分子または他の病状のための医薬として既に利用されている分子のライブラリーから、到達される標的の機能として、目的の分子を選択することができる。本発明による好ましい実施形態は、横紋筋融解症、すなわち、横紋筋の溶解に関与する標的分子を検出するために、薬理学／毒性学スクリーニングを用いることからなる。
【００７７】
実際、スタチンのファミリーのコレステロール合成インヒビター（ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼインヒビター）による致死的な事故は、毒性学的標的として真っ先に筋組織をもってきている。セリバスタチン（Ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）についてＢａｙｅｒに知られるこのリスクの評価は乏しく、ヒトおよび経済的な結果にかなりの影響があった。
【００７８】
多数の薬物が筋疾患をもたらすことが可能である。急性および重篤な場合、筋組織のかなりの溶解（横紋筋融解）が経験され、その機構は依然としてほとんど未解明である。いくつかの仮説が提示されている。これらのうち特定の仮説は膜透過性の増大をいい、他の仮説ではミトコンドリアのレベルの異常をいう。
【００７９】
ほとんどの場合、多剤化学療法（polychemotherapy）の状況で生じる事故によって、医薬（マクロライド、免疫抑制剤、抗癌剤、フィブラート、コカイン、ＨＩＶ抗プロテアーゼ、麻酔薬など）の相互作用の役割が示唆される。
【００８０】
関与した多くの薬物の中で、Ｐ４５０チトクロム、アポトーシスに関与する分子、例えば、ＢＣＬ２、抗酸化剤、ＮＦＫｂ複合体のタンパク質、ＰＰＡＲまたは外科的インターベンションがあげられる。
【００８１】
急性の事故を除いて、重要な予後診断（横紋筋融解症）を脅かして、筋障害の臨床的徴候は、衰弱、筋疼痛（筋肉痛）、倦怠感、疼痛性筋痙攣（cramps）であり、そして急性の偶発事故に付加される、生物学的徴候ＣＰＫレベルは正常であることが極めて頻繁である。スタチンの場合、最近のデータでは、筋の障害を示す患者が、この薬理学的因子の血漿レベルと毒性障害との間の相関も、ＣＰＫの上昇も示さないということが示されている。これらの場合、組織学によって、筋組織におけるミトコンドリアの改変（ｐｕｆｆ）と脂質滴の蓄積が明らかになっている。
【００８２】
可能性のある標的分子のなかで、ＨＭＧ−コエンザイムＡリダクターゼインヒビター、クレアチンキナーゼ、スタチン、フィブレート、麻酔薬、ヘロイン、マクロライド、サイクロスポリン、およびそれらの誘導体が挙げられる。
【００８３】
以下の節は、本発明の詳細な例を示す。しかし、当業者がこの分野の知識によって、本発明によってカバーされる２〜３の改良型を得る事ができるという意味で、本発明は、これらの例に限定されない。
【実施例１】
【００８４】
（抽出に由来するタンパク質非存在下での筋組織生検からの細胞抽出）
本実験では、種々の細胞抽出プロトコールの有効性を比較する。参照のプロトコールは、２つの酵素（トリプシンおよびコラゲナーゼ）の混合物を用いた。トリプシンは、ブタ由来であり、そしてコラゲナーゼは細菌由来である。これらの酵素の作用は、ウシ胎仔血清の存在によって停止される。以下のプロトコールでは、細菌由来の酵素を選択して、ウシ胎仔血清を排除した。
【００８５】
用いた前駆細胞／幹細胞は成体雌ヒツジの筋肉組織の生検に由来する。
【００８６】
細胞抽出プロトコールは、経時的なタイプである。酵素の作用は、希釈、洗浄および遠心分離によって阻害される。酵素処理の期間は、１０分を超えない。処理温度は、２０〜２５℃にある。筋組織（ミンチ処理した後の１ｇの組織）は、筋組織の容積より少なくとも１０倍多い容積、すなわち、１０ｍｌの酵素溶液の存在下に持ち込まれる。酵素溶液は、血清の添加なしのコラゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）およびトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）の組み合わせ、またはウシ胎仔血清の添加の有りまたはなしで、コラゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ）およびプロナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）の組み合わせによって構成されるが、これらの酵素は、ＤＭＥ／Ｆ１２に溶解されて、これに１５ｍＭのＨｅｐｅｓが添加される。
【００８７】
細胞抽出のために用いられる補充された基本培地（血清なし）は、１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓが添加されているＤＭＥ／Ｆ１２であり、ヒトインスリンが１０μｇ／ｍｌ、ＦＧＦ−２が１０ｎｇ／ｍｌ、デキサメタゾンが５・１０−９Ｍ、アスコルビン酸が（０．２５２ｍＭ）そしてＬ−カルニチンが１ｍＭである。酵素溶液との１０分間の接触後、混合物（酵素溶液および組織フラグメント）を３０ｍｌの容積に希釈して、酵素を阻害して、次いで遅い遠心分離（３分あたり１０ｇ未満）に供する。このプロセスによって、最初の酵素消化によって抽出された細胞を含む上清と残りの組織フラグメントが回収される。最初の消化からの細胞を回収するために、２００ｇでの遠心分離を約３分間行なう。このようにして得た細胞を、血清なしの培地に再懸濁する。酵素消化の有効性を、組織フラグメントから遊離された細胞の顕微鏡観察によってモニターする。残りの組織フラグメントを同じプロトコールに従って、再度酵素消化に供する。この操作を連続して５回繰り返す。
【００８８】
細胞接着のために用いた基質はウシゼラチンである。２０％ウシ胎仔血清、１０μｇ／ｍｌインスリン、５〜１０−９Ｍデキサメタゾンおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を補充したＤＭＥ／Ｆ１２を培養培地として用いる。培養条件は、温度は３７℃、２０％酸素および５％二酸化炭素の湿潤雰囲気下である。培養期間は７日である。細胞をアルコール溶液で固定して、ギムザ染色で染色する。次いで、ディッシュを写真に撮る。
【００８９】
この結果によって、培養の１週間後に３つの異なる抽出条件下、ウシ血清なしのトリプシン＋コラゲナーゼ、ウシ血清（ＦＣＳ）のあるプロナーゼ＋コラゲナーゼ、およびウシ血清（ＦＣＳ）なしのプロナーゼ＋コラゲナーゼで観察された細胞の数が、それらの分化能力と同様に、類似であることが示される。この実施例によって、プロナーゼおよび／またはコラゲナーゼのような抽出に由来しない酵素を用いる細胞抽出技術の有効性が示される。
【実施例２】
【００９０】
（ヒト筋前駆体細胞の増殖（amplification）に対するヒト血清への「補充（supplementation）」の効果）
本実験では、ヒト細胞は、正常な被験体由来の生検に由来する。
【００９１】
細胞抽出工程は、前と同様に行なう。
【００９２】
第一段階では、ヒト血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下での培養中で細胞を増殖し、次いで記載された種々の条件下で播種する。増殖因子ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ  Ａ／Ｂは、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈによって生成されて、トロンビンはＳｉｇｍａから得られる。
【００９３】
細胞培養の間、以下を用いる。
・  １２ウェルを有する２マルチウェルプレート（ＴＰＰ）
・  ウシゼラチン（Ｍｅｒｃｋ）
・  １０，０００個の細胞／ウェル
・  １ｍｌの培地／ウェル
【００９４】
種々の培地は以下の方式で調製される。基本栄養培地はＤＭＥであり、ここに、それぞれ以下が添加されている。
・  補充なし（０）
・  １％ヒト血清（１％ＨＳ）
・  ５％ヒト血清（５％ＨＳ）
・  混合物Ｍ：ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋インスリン（１０μｇ／ｍｌ）＋ＰＤＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）＋ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋デキサメタゾン（５・１０−９Ｍ）＋トロンビン（１単位）
・  １％ヒト血清＋混合物Ｍ（１％ＨＳ＋Ｍ）
・  ５％ヒト血清＋混合物Ｍ（５％ＨＳ＋Ｍ）
・  ２０％ウシ胎仔血清（２０％ＦＣＳ）
【００９５】
混合物Ｍは、動物由来のタンパク質を含まないことに注意のこと。
【００９６】
培地の第二の交換は、最初の３日後に行なう。培養の３日後（全部で７日間）、固定およびギムザによる染色を行なう。固定および染色した細胞の数を決定する。
【００９７】
結果（１ウェルあたりの細胞の数として表す）を、以下の表１に示す。
【表１】
2006509516.tif 000002
【００９８】
これらの結果によれば、増殖因子およびヒト血清のカクテルの組み合わせによって、ウシ胎仔血清で補充なしで得られる増殖よりも３倍大きい増殖を得ることが可能になるということが観察される。これらの条件下では、増殖係数は、増殖の１週後３０よりも大きい。驚くべきことに、混合物Ｍを補充された１％および５％の濃度のヒト血清は、補充されていない２０％ウシ胎仔血清と比較して、これらの低い濃度で、それぞれ２倍および３倍の筋芽細胞の数が得られるので、細胞増殖を活発に刺激することに注意することが重要である。最終的には、混合物Ｍを補充した血清は、補充していない血清と比較して４倍大きく、増殖改善をする。
【実施例３】
【００９９】
（ウシ胎仔血清への補充をしている場合の筋細胞前駆体の増殖能力の改善）
本実験では、細胞抽出および増殖の工程は、前に記載したのと同様である。しかし、用いた培養パラメーターは、以下のように規定されている。正常なヒト細胞を選択して、細胞抽出後７継代で得る。温度は３７℃で、湿潤雰囲気下で、２０％酸素および５％二酸化炭素を用いる。細胞密度は１つの培養皿あたり１０３個の細胞である。用いる基質はゼラチンである。
【０１００】
以下の増殖段階の培養培地を試験する。
・  ２０％ウシ胎仔血清を添加しているＤＭＥ／Ｆ１２、
・  インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（０．２５２ｍＭ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した２０％ウシ胎仔血清、ＰＤＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、トロンビン（１単位）、ＬＰＡ（５ｍＭ）を添加しているＤＭＥ／Ｆ１２。
【０１０１】
増殖の期間は、３日ごとの培地の交換で、それぞれ１０日および７日である。
【０１０２】
アルコール中での固定およびギムザでの染色後、ペトリ皿のデジタル写真を撮る。
【０１０３】
結果を以下の表２に記録する。
【表２】
2006509516.tif 000003
【０１０４】
得られた結果によれば、驚くべきことに、ウシ胎仔血清のみと比較して上述のカクテルの添加後にはヒト筋細胞の数について、極めて多大な改善が観察される。なぜならこの細胞数は、わずか７日の増殖期間にわたって５倍まで増大されるからである。
【実施例４】
【０１０５】
（ヒト筋前駆細胞の増殖に対するアスコルビン酸およびニコチンアミドの効果）
本実験では、ヒト細胞は、１６歳の正常な被験体由来の生検に由来する。
【０１０６】
用いられる抽出プロトコールは、実施例１のプロトコールと同一である。増殖工程の手順は、ＤＭＥ／Ｆ１２が以下のいずれかを補充されていること以外は、以下に従い、前述の実施例と同様である。
・２％ヒト血清＋混合物Ｍ（インスリン（１０μｇ／ｍｌ）＋デキサメタゾン（５・１０−９Ｍ）＋ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋トロンビン（１単位）（２％ＨＳ＋Ｍと命名される）、
・アスコルビン酸が０．２５２ｍＭの濃度で添加されている、前述の補充された血清（２％ＨＳ＋Ｍ）、
・ニコチンアミドが１０ｍＭの濃度で添加されている、補充された血清（２％ＨＳ＋Ｍ）、または、
・アスコルビン酸およびニコチンアミドが前述の濃度で添加されている、補充された血清（２％ＨＳ＋Ｍ）が、培養培地として用いられる。
【０１０７】
培養の８日間の間、培養培地の３つの交換を行なう。この期間の終わりに、細胞を前と同じ操作プロセスに従って染色する。
【０１０８】
結果（１ウェルあたりの細胞の数で表した）を以下の表３に示す。
【表３】
2006509516.tif 000004
【０１０９】
本実験において抗酸化剤として用いられるアスコルビン酸の添加によって、８日という培養の期間後に増殖された細胞の数は２倍にすることができる。別の抗酸化剤としてニコチンアミドを用いても、増殖に対して正の効果は観察されない。これらの２つの抗酸化剤の添加によって、中間の結果が生じ、それによって増殖細胞数を増やすことが可能になるが、ただしアスコルビン酸単独での増大と同じレベルではない。
【実施例５】
【０１１０】
（筋線維前駆細胞の増殖に対するグルココルチコイドの特異的効果）
細胞抽出後２３継代で得られたラット細胞を用いる。インキュベーション温度は３７℃で、湿潤雰囲気下で、２０％酸素および５％二酸化炭素を用いる。細胞密度は１２の倍数で３・１０３個の細胞である。基質はゼラチンである。
【０１１１】
増殖段階の培養培地として、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した、２０％ウシ胎仔血清を添加しているＤＭＥ／Ｆ１２を用いる。
【０１１２】
以下のいずれかをこの培地に添加する。
・  漸増する濃度（１０−６Ｍから１０−１０Ｍに）のデキサメタゾン、または
・  固定濃度（１０−７Ｍ）で、ステロイドホルモン（エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、ＤＥＨＡ、ＳＤＥＡＨ、アルドステロン）の単独、もしくは、デキサメタゾンと抗プロゲスト−ゲン（antiprogestogen）ＲＵ４８６のような組合せ。
【０１１３】
培養の期間は培地の交換なしで５日である。
【０１１４】
アルコール固定およびギムザ染色後に、デジタル写真を撮る。
【０１１５】
結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。
【０１１６】
図２Ａおよび図２Ｂにおいては、染色の強度（ここでは暗染色dark stainによって提示する）は細胞密度とともに増大する。一連の３つの培養ウェルを各々の濃度で行なった。
【０１１７】
これらの結果によれば、デキサメタゾンの添加は、細胞増殖を極めて明確に改善すること、およびその最適濃度は１０−６Ｍ〜５・１０−９Ｍであることが示される。さらに、このグルココルチコイドの効果は、増殖を改善しない、試験された他のステロイドホルモンと異なり、筋前駆細胞の増殖に特異的である。最後に、ＲＵ４８６のような抗プロゲストゲンの存在によって、グルココルチコイドの効果は排除される。
【実施例６】
【０１１８】
（ヒト筋細胞前駆体の機能的試験）
健常なヒト細胞を抽出後１継代で用いる。細胞培養条件は、温度は３７℃で、湿潤雰囲気下で、２０％酸素および５％二酸化炭素である。細胞密度は、１００ｍｍの筋組織に由来する１培養皿あたり１０３個の細胞である。基質はゼラチンである。増殖段階のために本実験で用いる培養培地は、２０％ウシ胎仔血清、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、５・１０−９Ｍデキサメタゾンおよび２・１０ｎｇ／ｍｌＦＧＦを添加しているＤＭＥ／Ｆ１２である。増殖期間は、３日ごとに培地を交換して９日である。次いで、２％ヒト血清、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦおよび５・１０−９Ｍ  甲状腺ホルモンＴ３を添加しているＤＭＥ／Ｆ１２を分化培地として用いる。分化期間は、２日ごとに交換して４日である。次いでアルコール固定およびギムザ染色を行い、続いてその皿のデジタル写真を撮る。
【０１１９】
本実験によれば、顕微鏡的観察によって、１０７個のコロニーをカウントすることが可能になる。このうち、２つのタイプのコロニーがあることが注目される。第一のタイプのコロニーは、強度に染色されて、顕微鏡観察によって多くの分化した筋細胞、筋管の存在が明らかになる。これらは筋前駆細胞によって形成されるコロニーである。第二のタイプのコロニーは、顕微鏡観察下でさらに青白く、筋管を含まない。これらは非筋肉細胞のコロニーである。
【０１２０】
以下の結果が得られた。全部で１０７のコロニーのうち、筋組織前駆細胞の９１コロニー、および非筋細胞の１６コロニーがカウントされる。従って、全体として、播種した１０００個の細胞のうち、１０．７％の細胞は、コロニー形成可能であり、そのうち８５．６％が筋組織前駆細胞のコロニーを形成し得る。
【実施例７】
【０１２１】
（筋線維前駆細胞の遺伝的改変）
前駆細胞を遺伝的に改変するために、本発明者らは、「緑色蛍光タンパク質（green  fluorescent  protein）（ＧＦＰ）」をコードする配列を挿入されている、モロニー型レトロウイルス（ＭＭＬＶ）を用いた。配列「ｇａｇ」および「ｐｏｌ」を含むプラスミド、ＶＳＶｇエンベロープを含むプラスミド、ならびにＧＦＰ構築物を含むプラスミドを当業者に周知のプロトコールに従ってパッケージングすることによって、感染スクリーニングを行なう。
【０１２２】
細胞抽出後２１継代で得たラット細胞を用いる。インキュベーション温度は３７℃で、湿潤雰囲気下で、２０％酸素および５％二酸化炭素を用いる。細胞密度は、３５ｍｍの皿あたり２・１０４個の細胞である。用いる基質はゼラチンである。
【０１２３】
増殖段階のための培養培地としては、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（５・１０−９Ｍ）およびＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した、２０％ウシ胎仔血清を添加している基本栄養培地ＤＭＥ／Ｆ１２を用いる。
【０１２４】
感染プロトコールは以下である。細胞の播種の翌日、ウイルスｒＭＬＶ（ＶｓＶｇ）ＬＴＲ−ｅＧＦＰを８．３・１０６ｉｐ／ｍＬの用量で用いて細胞の感染を行なう。１細胞あたり１０個の感染性粒子（ＭＯＩ）を用いて感染を行なう。
【０１２５】
サンプルは、以下を含む１０ｍｍ皿の培地について最終容積５ｍＬに希釈する。
・  ＤＭＥＭ／Ｆ１２
・  ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）（細胞へのＤＮＡの導入を補助する分子）
・  インスリン（１０μｇ／ｍｌ）
・  ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）
【０１２６】
細胞を３７℃で６時間インキュベートし、次いで培地を、２０％ＦＣＳおよびインスリン（１０ｎｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（５・１０−９Ｍ）およびＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥ／Ｆ１２の１０ｍＬで交換する。
【０１２７】
３日目および７日目に、蛍光顕微鏡を用いる顕微鏡写真によって生存している細胞を観察する。筋芽細胞をカウントし、同様に、緑に見え、従ってウイルスによってトランスフェクトされている筋管をカウントする。
【０１２８】
予想どおり、感染していない細胞は、蛍光を発色せず、細胞の極めて大部分がＧＦＰを発現し、従って緑になり、これらの条件下では細胞の９０％より多くがＧＦＰを発現する。ＧＦＰはまた、筋芽細胞の融合から生じる筋管において正確に発現される。これらの条件下では、複製細胞である筋芽細胞、および分化した細胞である筋管は遺伝的に改変され得、そしてこの改変は安定である。ＧＦＰを発現する細胞の数は、培養継代によって改変されない。動物への再導入後、このように改変された細胞はＧＦＰを発現し、従って観察可能である。このツールは、動物に一旦再導入されれば、細胞の運命および機能を分析するのに重要である。
【実施例８】
【０１２９】
（低濃度のヒト血清の使用による細胞凍結技術の改良）
用いる細胞は、１６歳の正常個体に由来する。それらは、７継代で培養されて回収される。
【０１３０】
培養段階の間、１０μｇ／ｍｌインスリン、０．２５２ｍＭアスコルビン酸、増殖因子ＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）ならびにトロンビン（１単位）およびＬＰＡ（５ｍＭ）を補充した２％ヒト血清（ＨＳ）を培地として用いる。
【０１３１】
酵素処理は、酵素としてトリプシン−ＥＤＴＡ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、実施例１と同様に行なう。処理時間は１０分である。
【０１３２】
それらの基質から一旦剥落すれば、細胞を以下のような種々の凍結培地に、１ｍｌあたり１０５個の細胞の濃度で入れる。
ＤＡＥ／Ｆ１２培地単独または以下を補充した培地を、凍結保存剤として１０％ＤＭＳＯの溶液および９０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）に加える。
・  ９０％  ＦＣＳ
・  １０％  ＦＣＳ
・  １０％  ＨＳ
・  ２％  ＨＳ
・  ５・１０−９Ｍデキサメタゾン
・  １０μｇ／ｍｌインスリン
・  ０．２５２ｍＭアスコルビン酸
・  デキサメタゾン＋インスリン＋アスコルビン酸（前述の濃度で）
・  ２％ＨＳ＋５・１０−９Ｍデキサメタゾン
・  ２％ＨＳ＋１０μｇ／ｍｌ  インスリン
・  ２％ＨＳ＋０．２５２ｍＭアスコルビン酸
・  ２％ＨＳ＋デキサメタゾン（５・１０−９Ｍ）＋インスリン（１０μｇ／ｍｌ）＋アスコルビン酸（０．２５２ｍＭ）
【０１３３】
周囲温度で１０分後、細胞を−８０℃の温度まで徐々に冷却する。
【０１３４】
解凍はインキュベーターまたは水槽中において３７℃で行なう。液体窒素中に保存したバイアルを、培養インキュベーターに置く。５分後、解凍した細胞を、以下の存在下で１０ｍｌの遠心分離チューブに入れる。ピルビン酸塩、抗生物質、例えばゲンタマイシンおよび保護因子、例えば１ｍＭ  Ｌカルニチン、１０μｇ／ｍｌ  インスリン、５・１０−９Ｍ  デキサメタゾン、０．２５２ｍＭアスコルビン酸を補充したＤＭＥ／Ｆ１２。遠心分離は、環境温度において１０分間２００ｇで行なう。このように解凍した細胞を、基質としてゼラチン、および２％ヒト血清（ＨＳ）であって、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸（０．２５２ｍＭ）および増殖因子ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＤＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）を補充したＨＳ、ならびに培地としてトロンビン（１単位）およびＬＰＡ（５ｍＭ）を用いて１２の倍数で培養する。
【０１３５】
培養の２日後、新しいマルチ・ウェル・ディッシュを用いて培地を交換する。この段階では、細胞の一部の染色は、マルチ・ウェル・ディッシュで行なう。他の部分は、さらに４日間の新しい培養段階、および培地の新規の交換に供する。染色は２日後に行なう。
【０１３６】
結果を以下の表４に記録する。
【表４】
2006509516.tif 000005
【０１３７】
これらの結果によって、凍結培地は、良好な細胞保存のために、血清またはアルブミンのような血清の画分を含まなければならないことが確認される。それらによってまた、驚くべきことに、インスリン、デキサメタゾンおよびアスコルビン酸のような種々の添加物の存在によって、低濃度の血清、そして詳細にはヒト由来の血清の存在下での凍結の有効性を増大することが可能になることが示される。これらの手段によって、動物由来のプリオンおよびウイルスによる汚染のリスクを回避しながら、良好な引き続く細胞増殖を保持することを目的として、血清濃度を低下することによって凍結培地を最適化することが可能になることが示される。
【実施例９】
【０１３８】
（生検由来の筋前駆細胞の選択および増殖）
培養技術によって生物学的サンプルに存在する筋前駆細胞を選択および増殖させることが可能になる。細胞の観点から、筋組織生検は、極めて均一である。細胞治療のため、ならびに薬理学および毒性学的な利用のため、その両方についてこの均一性が障害となる。
【０１３９】
用いられる技術は、筋前駆細胞増殖期間から筋前駆細胞選択期間を切り離す培養技術の構築に基づく。前駆細胞選択培地および引き続いて増殖培地を用いる。
【０１４０】
筋前駆細胞の完全な選択のための培地は、非筋肉細胞の増殖を阻害する因子と、筋前駆細胞の増殖を刺激する因子の両方を組み合わせる。この非筋肉細胞の増殖を阻害する因子とは、グルココルチコイドのファミリーに属し、そして筋前駆細胞の増殖を刺激する因子とは、抗酸化剤および金属である。この選択段階では、酵素消化後に筋生検に由来する細胞を、この阻害因子および刺激因子の存在下においてクローン性密度（clonal density）
で培養する。
【０１４１】
この増殖培地は、増殖因子を含み、これによって、選択された細胞の増殖の促進が可能になる。これらの因子は、ＦＧＦのファミリーに属する。この段階では、細胞は、低密度および高密度のいずれで培養されてもよい。
【０１４２】
２工程で記載されるプロトコールによって、９５％より多く富化された筋細胞集団を得ることが可能になる。
【０１４３】
実施例６についてと同様に、細胞をクローン性密度で播種する。このタイプの試験では、各々の細胞が、細胞コロニーを生じ、その表現型が分析される。
【０１４４】
細胞は、筋の病理のない正常な個体由来である。細胞を、１０ｍｌの培養培地に、１００ｍｍの皿あたり２５０細胞のクローン性密度で播種する。以下の培地を選択期間：０日目のために用いる。
・  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＦＣＳ、
・  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＦＣＳ＋ＦＧＦ、
・  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＦＣＳ＋インスリン＋デキサメタゾン＋セレノメチオニン＋アスコルビン酸、
・  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＦＣＳ＋ＦＧＦ＋インスリン＋デキサメタゾン＋セレノメチオニン＋アスコルビン酸。
【０１４５】
３日目に、４つのシリーズの培地について、同一の培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＦＣＳ＋ＦＧＦ＋インスリン＋デキサメタゾンに交換する。
【０１４６】
４つのシリーズで培地は６日目および１０日目に交換する。１４日目に培地を、以下から構成される筋細胞の分化を可能にする培地で交換する。
・  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％ＦＣＳ＋フェチュイン＋インスリン＋ＥＧＦ＋Ｔ３。
１９日目に細胞を固定して、実施例６に記載のとおり染色する。
【０１４７】
以下の結果が得られた。
・  ＦＣＳで培養した細胞によって、１０％筋原性コロニーを含む、１皿あたり７０コロニーが得られる。
・  ＦＣＳ＋ＦＧＦで培養した細胞によって、０％筋原性コロニーを含む、１皿あたり７０コロニーが得られる。
・  ＦＣＳ＋インスリン＋デキサメタゾン＋セレノメチオニン＋アスコルビン酸で培養した細胞によって、１００％筋原性コロニーを含む、１皿あたり１５０コロニーが得られる。
・  ＦＣＳ＋ＦＧＦ＋インスリン＋デキサメタゾン＋セレノメチオニン＋アスコルビン酸で培養した細胞によって、５０％筋原性コロニーを含む、１皿あたり８０コロニーが得られる。
【０１４８】
インスリン、デキサメタゾン、セレノメチオニンおよびアスコルビン酸の組み合わせの存在によって、筋前駆細胞の高度に有効な選択が可能になる。
【実施例１０】
【０１４９】
（筋毒性の予測の細胞試験）
インビトロの毒性学的試験を可能にする細胞培養を構築するために、本発明者らは、ラットの筋肉および脂肪細胞を用いて、筋毒性の特異性を分析した。
【０１５０】
以下の実験条件で行なった。
細胞の起源およびそれらのタイプは、ラット（筋細胞）およびラット１６０ｍｇ（脂肪細胞）である。それらの継代数はＰ９およびＰ４である。培養条件はＦＣＳ＋ＦＧＦ＋インスリン＋デキサメタゾンである。
【０１５１】
酵素処理は、トリプシン−ＥＤＴＡ（ＰＡＡ）で行い、処理時間は５分である。
【０１５２】
遠心分離を行なう。
【０１５３】
取り扱い条件は以下である。ディッシュのタイプ：１２ウェルを有する４マルチウェルプレート（ＴＰＰ）、基質：ゼラチン、密度：５，０００細胞／ウェル、培地：ＤＭＥ／Ｆ１２＋２０％  ＦＣＳ＋ＦＧＦ＋インスリン＋デキサメタゾン＋スタチン（０；０．１；０．５または１μＭの濃度）である。
【０１５４】
濃度はＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ、インスリン  １０μｇ／ｍｌ、デキサメタゾン  ５・１０−９Ｍである。
【０１５５】
細胞はこのようにして２日間培養し、次いで固定し、染色して、分析する。
【０１５６】
この分析によって、筋細胞についてのロバスタチンの優先的な毒性が明らかになる。０．５μＭでは、筋細胞は、その増殖が極めて阻害され、一方、脂肪細胞は、それに対して非感受性である。図３は、毒性試験結果のデジタル処理の結果を示す。
【０１５７】
これらの実験により、ヒト筋細胞を再生して、市販のスタチン類の毒性を試験した。
【０１５８】
以下の実験条件で行なった。
・ディッシュのタイプは９６ウェルを有する２マルチウェルプレート（ＴＰＰ）である。
・細胞密度は２，５００細胞／ウェルである。
・培養培地はＤＭＥ／Ｆ１２＋２０％ＦＣＳ＋ＦＧＦ＋インスリン＋デキサメタゾン＋Ｘを含む。
【０１５９】
Ｘは以下から選択される。
０；０．０１；０．０５；０．１；０．５μＭの濃度のロバスタチン（Lovastatin）、または
０；０．０１；０．０５；０．１；０．５；１μＭの濃度のセリバスタチン（Cerivastatin）、または
０；０．０１；０．０５；０．１；０．５；１μＭの濃度のアトルバスタチン（Atorvastatin）、または
０；０．０１；０．０５；０．１；０．５；１μＭの濃度のプラバスタチン（Pravastatin）、または
０；０．０１；０．０５；０．１；０．５；１μＭの濃度のフルバスタチン（Fluvastatin）、または
０；０．０１；０．０５；０．１；０．５；１μＭの濃度のシンバスタチン（Simvastatin）。
【０１６０】
実験手順は以下のとおりである。
【０１６１】
１日目に培地を交換する。３日目に染色を行なう。
【０１６２】
総培養時間は５日である。
【０１６３】
培養培地の吸引後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１００％エタノールで固定する。１０分後、その細胞を水で洗浄し、次いで１０％ギムザの溶液で１０分間染色する。最終工程は水で洗浄する。
【０１６４】
デジタルカメラおよび電動ステージを装備した倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いて細胞の画像を得る。
【０１６５】
デジタル処理を図４に示す。この図によって、セリバスタチンの高い毒性が明らかになる。セリバスタチン分子は、ヒトでの臨床使用において最も毒性のスタチンであることが証明された。従って、この試験によって、ヒト筋細胞に対するセリバスタチンの優先的な毒性を明らかにすることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】下記の培地を用いた、単位表面積あたりのヒト筋細胞の核の数を示すヒストグラムである。  図１において、（Ａ）増殖因子なし；（Ｂ）本発明による５％ヒト血清を含む；（Ｃ）ＦＧＦ＋インスリン＋ＰＤＧＦ＋ＥＧＦ＋デキサメタゾン＋トロンビン（混合物Ｍ）；（Ｄ）（Ｂ）＋（Ｃ）に対応；（E）２０％ウシ胎仔血清を含む「ＦＣＳ」培地。
【図２Ａ】２３継代に由来するラット細胞の増殖に対する、インスリンおよびＦＧＦを補充したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培地に添加したデキサメタゾンの用量（０〜１０−６Ｍの濃度）の効果を示す図である。
【図２Ｂ】デキサメタゾンの特異性を観るため、インスリンおよびＦＧＦを補充したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培地において、細胞増殖に対する、デキサメタゾン（１０−７Ｍ）、別のステロイドホルモン（エストラジオール、テストステロン、プロゲステロン、ＤＥＨＡ、ＳＤＥＡＨ、アルドステロン）の固定用量（１０−７Ｍ）またはデキサメタゾンと抗プロゲスタゲンＲＵ４８６との組み合わせの添加の効果を示す図である。
【図３】筋細胞および脂肪細胞に対するロバスタチンの毒性の比較を示すグラフである。
【図４】ヒト臨床用途における種々のスタチンのヒト筋細胞に対する毒性の比較を示すグラフである。
【図１】
2006509516.tif 000006
【図２Ａ】
2006509516.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2006509516.tif 000013
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