(57)【要約】活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素の阻害剤を識別するスクリーニング検定であって、該酵素と試験化合物とを、酵素基質および適当な緩衝剤の存在下において接触させ、そして試験化合物によるいずれかの酵素活性モジュレーションを検出することを含む検定における該活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素の使用。
2006503573.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素の阻害剤を識別するスクリーニング検定であって、該酵素と試験化合物とを、酵素基質および適当な緩衝剤の存在下において接触させ、そして試験化合物によるいずれかの酵素活性モジュレーションを検出することを含む、スクリーニング検定における活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素の使用。
【請求項２】
活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素が、アミノ酸残基Ｇ９６、Ａ１１２、Ａ１１６、Ｖ１２６、Ｌ１２９、Ｍ１３３、Ｇ２９６、Ｐ２９８およびＶ４２２の内の一つまたはそれを超えるアミノ酸残基が変異アミノ酸残基であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素が、アミノ酸残基Ｋ９６、Ｃ１１２、Ｇ１１６、Ｔ１２６、Ｍ１２９、Ｌ１３３、Ｎ２９６、Ｓ２９８およびＩ４２２の内の一つまたはそれを超えるアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素が、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）ＭｕｒＤ酵素である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素が、アミノ酸配列
ＭＫＫＩＴＴＹＱＮＫ  ＫＶＬＶＬＧＬＡＫＳ  ＧＶＳＡＡＫＬＬＨＥ
ＬＧＡＬＶＴＶＮＤＡ  ＫＱＦＤＱＮＰＤＡＱ  ＤＬＬＴＬＧＩＲＶＶ
ＴＧＧＨＰＩＥＬＬＤ  ＥＥＦＥＬＩＶＫＮＰ  ＧＩＰＹＴＮＰＬＶＡ
ＥＡＬＴＲＫＩＰＩＩ  ＴＥＶＥＬＡＧＱＩＡ  ＥＣＰＩＶＧＩＴＧＴ
ＮＧＫＴＴＴＴＴＭＩ  ＧＬＬＬＮＡＤＲＴＡ  ＧＥＡＲＬＡＧＮＩＧ
ＦＰＡＳＴＶＡＱＥＡ  ＴＡＫＤＤＬＶＭＥＬ  ＳＳＦＱＬＭＧＩＥＴ
ＦＨＰＱＩＡＶＩＴＮ  ＩＦＥＡＨＬＤＹＨＧ  ＳＲＫＥＹＶＡＡＫＷ
ＡＩＱＫＮＭＴＶＥＤ  ＴＬＩＬＮＷＮＱＶＥ  ＬＱＴＬＡＫＴＴＡＡ
ＮＶＬＰＦＳＴＫＥＡ  ＶＥＧＡＹＬＬＤＧＫ  ＬＹＦＮＥＥＹＩＭＰ
ＡＤＥＬＧＩＰＧＳＨ  ＮＩＥＮＡＬＡＡＩＣ  ＶＡＫＬＫＮＶＳＮＶ
ＱＩＲＱＴＬＫＮＦＳ  ＧＶＰＨＲＴＱＦＶＧ  ＥＶＱＱＲＲＦＹＮＤ
ＳＫＡＴＮＩＬＡＴＥ  ＭＡＬＳＧＦＤＮＱＫ  ＬＬＬＬＡＧＧＬＤＲ
ＧＮＳＦＤＥＬＶＰＡ  ＬＬＧＬＫＡＩＶＬＦ  ＧＥＴＫＥＫＬＡＥＡ
ＡＫＫＡＮＩＥＴＩＬ  ＦＡＥＮＶＱＴＡＶＴ  ＩＡＦＤＹＳＥＫＤＤ
ＴＩＬＬＳＰＡＣＡＳ  ＷＤＱＹＰＮＦＥＶＲ  ＧＥＡＦＭＱＡＶＱＱ
ＬＫＥＳＥＭ
またはそれと少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素が、アミノ酸配列のＮ末端から最大１６個までのアミノ酸を除去されているまたはＣ末端から最大１２個までのアミノ酸を除去されている、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
酵素基質が、ＵＤＰ−ＭｕｒＮａｃ−Ｌ−Ａｌａ、Ｄ−グルタメートおよびＡＴＰである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
酵素を、試験化合物と一緒にプレインキュベートした後、それを基質と接触させる、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、改良されたスクリーニング検定、詳しくは、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）（Ｅ．フェカリス（E. faecalis））などのムレイン（murein）生合成酵素ＭｕｒＤの活性化物質に非依存性の形の使用に関する。このようなスクリーニング検定は、ＭｕｒＤ酵素のモジュレーターを識別し、そして特性決定するのに用いられる。
【０００２】
細菌のムレイン（Ｍｕｒ）生合成経路に関心が示されてきたが、これは、細菌細胞壁合成の不可欠な成分である。この経路中の酵素は、広域の且つ選択的な抗細菌薬に可能性のある標的である。
【０００３】
細菌酵素ＭｕｒＤ（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン：Ｄ−グルタメートリガーゼ）は、細胞質ペプチドグリカン前駆体であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンへのＤ−グルタメートの結合を触媒する。この反応は、Ｄ−グルタメートのアミノ官能基と、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンのカルボキシル末端との間にペプチド結合の形成を引き起こす。ＡＴＰの化学量論的消費は、このペプチド結合形成に必要なエネルギーを供給し、そして、ＡＤＰおよびオルトホスフェートを生成する。
【０００４】
Walsh et al（Journal of Bacteriology, Sept 1999, 181, No.17, 5395-5401）は、２種類のグラム陰性細菌、すなわち、大腸菌（Escherica coli）およびインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、および２種類のグラム陽性細菌、すなわち、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）からのＭｕｒＤ酵素の生化学的性質を調べた。彼らは、これら酵素の生化学的性質に関するデータを確定し、そしてそれらの間の類似性および相違を、具体的には、グラム陰性細菌の塩活性化に関して考察した。彼らは、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との間に認められる相違は、それら２種類のグラム陰性細菌が、２種類のグラム陽性細菌の場合よりも、ペプチドグリカン生合成経路の初期における細胞壁生合成の一層厳しい調節を働かせているかもしれないということを示すと報告している。しかしながら、熟練した読者は、Walsh et al が用いた基質精製法が、酵素活性化物質として機能しうる全ての塩を除去し得ないということを承知している。したがって、それら２種類のグラム陽性細菌の塩依存性または塩依存性の欠如に関して意味のある結論を引き出すことは不可能である。
【０００５】
実際に、本発明者は、ここで、グラム陽性細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）からのＭｕｒＤ酵素も塩活性化されるということを発見した。これが、Ｅ．フェカリス（E. faecalis）ＭｕｒＤ酵素は、活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素を用いた改良されたスクリーニング検定を考案することを可能にさせる独特の性質を有するという本発明者の発見をもたらした。
【０００６】
したがって、本発明の第一の側面において、本発明者は、活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素の阻害剤を識別するスクリーニング検定であって、その酵素と試験化合物とを、酵素基質および適当な緩衝剤の存在下において接触させ、そして試験化合物による酵素活性のモジュレーションを検出することを含む検定における活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素の使用を提供する。
【０００７】
「活性化物質に非依存性の（activator-independent）」により、本発明者は、ＭｕｒＤ酵素が、通常は基質（ここでは、Ｄ−グルタミン酸またはより好ましくは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン）に付随している塩種または他の検定成分によって活性化されないということを意味する。アンモニウム（ＮＨ４+）およびカリウム（Ｋ+）などの一価陽イオンは、ＭｕｒＤを活性化する具体的な塩種である。本発明者は、いろいろな量の基質を、例えば、Ｋm決定または阻害様式研究についての検定に用いる場合、アンモニウムイオンなどの活性化陽イオンの量が一定でないということに注目している。したがって、活性増加が活性化のためであるかまたは基質濃度の増加のためであるかどうかを明確に識別することはできない。Walsh et al によって報告された結果とは対照的に、本発明者は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）ＭｕｒＤ酵素が、ＮＨ４+およびＫ+などの陽イオンによって活性化されるということを発見した（図２を参照せよ）。
【０００８】
本発明者の分析は、ＭｕｒＤ酵素の活性化物質依存性の形が、次の共通アミノ酸残基、すなわち、Ｇ９６、Ａ１１２、Ａ１１６、Ｖ１２６、Ｌ１２９、Ｍ１３３、Ｇ２９６、Ｐ２９８およびＶ４２２を有するということを示している。指定の位置は、図８に挙げられる E. faecalis ＭｕｒＤ配列（および該当する配列アラインメント）に基づいている。
【０００９】
したがって、本発明のもう一つの側面において、本発明者は、上に与えられた位置にある一つまたはそれを超えるアミノ酸残基が、その具体的なアミノ酸について示された通りでないＭｕｒＤアミノ酸配列を含有している活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素の使用を提供する。より好都合には、少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または全９個のアミノ酸残基が、示された通りでない。
【００１０】
活性化物質に非依存性のＭｕｒＤは、好都合には、次の残基、すなわち、Ｋ９６、Ｃ１１２、Ｇ１１６、Ｔ１２６、Ｍ１２９、Ｌ１３３、Ｎ２９６、Ｓ２９８およびＩ４２２の内の一つまたはそれを超える残基を含むアミノ酸配列を含有してよい。より好都合には、少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または全９個のアミノ酸残基が、ここに示された通りである。
【００１１】
活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素は、好都合には、次の E. faecalis アミノ酸配列
ＭＫＫＩＴＴＹＱＮＫ  ＫＶＬＶＬＧＬＡＫＳ  ＧＶＳＡＡＫＬＬＨＥ
ＬＧＡＬＶＴＶＮＤＡ  ＫＱＦＤＱＮＰＤＡＱ  ＤＬＬＴＬＧＩＲＶＶ  Ｔ
ＧＧＨＰＩＥＬＬＤ  ＥＥＦＥＬＩＶＫＮＰ  ＧＩＰＹＴＮＰＬＶＡ
ＥＡＬＴＲＫＩＰＩＩ  ＴＥＶＥＬＡＧＱＩＡ  ＥＣＰＩＶＧＩＴＧＴ
ＮＧＫＴＴＴＴＴＭＩ  ＧＬＬＬＮＡＤＲＴＡ  ＧＥＡＲＬＡＧＮＩＧ
ＦＰＡＳＴＶＡＱＥＡ  ＴＡＫＤＤＬＶＭＥＬ  ＳＳＦＱＬＭＧＩＥＴ
ＦＨＰＱＩＡＶＩＴＮ  ＩＦＥＡＨＬＤＹＨＧ  ＳＲＫＥＹＶＡＡＫＷ
ＡＩＱＫＮＭＴＶＥＤ  ＴＬＩＬＮＷＮＱＶＥ  ＬＱＴＬＡＫＴＴＡＡ
ＮＶＬＰＦＳＴＫＥＡ  ＶＥＧＡＹＬＬＤＧＫ  ＬＹＦＮＥＥＹＩＭＰ
ＡＤＥＬＧＩＰＧＳＨ  ＮＩＥＮＡＬＡＡＩＣ  ＶＡＫＬＫＮＶＳＮＶ
ＱＩＲＱＴＬＫＮＦＳ  ＧＶＰＨＲＴＱＦＶＧ  ＥＶＱＱＲＲＦＹＮＤ
ＳＫＡＴＮＩＬＡＴＥ  ＭＡＬＳＧＦＤＮＱＫ  ＬＬＬＬＡＧＧＬＤＲ
ＧＮＳＦＤＥＬＶＰＡ  ＬＬＧＬＫＡＩＶＬＦ  ＧＥＴＫＥＫＬＡＥＡ
ＡＫＫＡＮＩＥＴＩＬ  ＦＡＥＮＶＱＴＡＶＴ  ＩＡＦＤＹＳＥＫＤＤ
ＴＩＬＬＳＰＡＣＡＳ  ＷＤＱＹＰＮＦＥＶＲ  ＧＥＡＦＭＱＡＶＱＱ
ＬＫＥＳＥＭ
またはそれと少なくとも８５％の相同性（例えば、９０％または９５％の相同性）を有するＭｕｒＤアミノ酸配列を含む。
【００１２】
或いは、活性化物質に非依存性のＭｕｒＤアミノ酸配列は、上のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する。
本発明者は、理論的な考察によって制限されたくはないが、活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素は、その酵素のＮ末端から１６個、１４個、１２個、１０個、８個、６個、４個または２個までのように最大１６個までのアミノ酸を除去されていてよい、および／またはＣ末端から１２個、１０個、８個、６個、４個または２個までのように最大１２個までのアミノ酸を除去されていてよいと考えている。
【００１３】
公表されたＭｕｒＤ酵素配列に該当していない活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ配列は、新規であるし且つ本発明のもう一つの側面である。
いずれかの好都合なスクリーニング検定形式を用いることができる。非制限的な例として、本発明者は、以下を開示する。
【００１４】
酵素基質は、好都合には、ＵＤＰ−ＭｕｒＮａｃ−Ｌ−Ａｌａ、Ｄ−グルタメートおよびＡＴＰである。
酵素を、好都合には、試験化合物と一緒にプレインキュベートして、阻害剤を酵素に結合させる。これは、酵素への遅い結合様式を有する阻害剤の検出を可能にすることができるし、または基質によって競合の外に置かれる（out-competed）ことがありうる特異的に修飾された阻害剤（specifically modifying inhibitors）の検出を可能にすることができる。
【００１５】
E. faecalis ＭｕｒＤが活性であるｐＨ範囲（ｐＨ７．０〜１０．０）にあるｐＫａを有する適当な緩衝剤を用いることができる。好都合な緩衝剤の例には、ＧＯＯＤ Buffer、すなわち、トリス（Tris）またはヘペス（Hepes）（Good, et al. (1966) Biochemistry, 5, 467-477）などの、ホスフェートを含有しない緩衝剤が含まれる。酵素活性のモジュレーションは、例えば、マラカイトグリーンを用いた色変化を含む検出システム等、いずれか好都合な検出システムを用いて検出することができる。これらには、吸光分光光度計、吸光度プレートリーダー、または例えば、４００〜８００ｎｍの波長範囲間の溶液の吸収を測定することができるいずれか他の機器が含まれる。
【００１６】
酵素活性のモジュレーションは、酵素活性の阻害または活性化、好都合には、酵素阻害でありうる。
好都合には、ある化合物が検出システムを妨害するかどうか、及び／または検出波長に吸収を持つかどうかを測定するために適当な対照反応を行うことができる。
試験化合物は、医薬研究に有用でありうるいずれか好都合な化合物である。それは、６個までのアミノ酸のような２個またはそれを超えるアミノ酸、１０個または１２個までのアミノ酸、２０個のまでのアミノ酸、または５０個までのアミノ酸のような２０個を超えるアミノ酸のポリペプチドであってよい。薬物スクリーニング目的に好適な化合物は、低分子量の化合物および可能性のある治療薬である。それらは、例えば、８００、６００または４００ダルトン未満のような約１０００ダルトン未満の分子量を有する。所望ならば、試験化合物は、化学ライブラリーのメンバーであってよい。化学ライブラリーは、いずれか好都合な数の個々のメンバー、例えば、何十も〜何百も〜何千も〜何百万も等の適当な化合物、例えば、ペプチド、ペプトイドおよび他のオリゴマー化合物（環状または直鎖状）、および鋳型に基づく（template-based）一層小さい分子、例えば、ベンゾジアゼピン類、ヒダントイン類、ビアリール類、炭素環式化合物および多環式化合物（例えば、ナフタレン類、フェノチアジン類、アクリジン類、ステロイド類等）、炭水化物およびアミノ酸の誘導体、ジヒドロピリジン類、ベンズヒドリル類および複素環類（例えば、トリアジン、インドール、チアゾリジン等）を含んでよい。引用された数および挙げられた化合物のタイプは、例示するものであり、制限するものではない。好適な化学ライブラリーは、低分子量の化合物および可能性のある治療薬を含む。
【００１７】
本発明のもう一つの側面において、本発明者は、本発明の検定法の使用によって得られるＭｕｒＤ酵素モジュレーターを提供する。
活性化物質に非依存性のＭｕｒＤ酵素は、クローニングおよび発現のための既知の組換え技術を用いて生産することができる（Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. を参照せよ）。ＭｕｒＤ酵素に好都合な発現系には、適当な宿主、より好都合には、大腸菌（E. coli）中のｍｕｒＤ遺伝子のＴ７プロモーターに駆動される転写が含まれる。好都合な発現ベクターの例には、Ｔ７プロモーターと、ｐＥＴ２８ｂおよびｐＥＴ３０ａのような適当なクローニング部位を有するものが含まれる（Novagen Inc. Madison WI USA）。このような系における発現に用いられる E. coli 宿主菌株には、ｍｕｒＤ遺伝子の転写を開始するように誘導されうるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するもの、より具体的には、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＨＭＳ１７４（ＤＥ３）が含まれる。
【００１８】
本発明をここで、次の具体的な説明および図面を参照して詳しく説明する。
具体的な説明：
本発明者は、E. faecalis ＭｕｒＤ酵素が、他の種からのＭｕｒＤ酵素と比較して、スクリーニング目的のために以下の追加の利点を有するということを確かめた。
【００１９】
（ａ）それは、５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）濃度まで影響を受けない。ＤＭＳＯは、スクリーニングおよびＩＣ50測定において一般的に用いられるので、これは、検定結果の安定性に寄与する。
【００２０】
（ｂ）その反応速度の温度への依存性は、４℃〜４０℃で低い。検定中の温度変化は、酵素活性に僅かに作用するだけである。
（ｃ）それは、最も広範な最適ｐＨ（ｐＨ７．５〜９．５）を有する。化合物添加によるｐＨの変化は、活性に影響を与えるとはあまり考えられないので、検定結果に影響を与えるとはあまり考えられない。
【００２１】
（ｄ）それは、低いバックグラウンドＡＴＰアーゼ活性を有する。無為な（idle）ＡＴＰアーゼ活性は、スクリーニングにおいてバックグラウンドシグナルを生じることがありうるので（ホスフェートは、触媒作用が存在することなく生産されている）、この活性が低いことは、感受性の高い検定をもたらすのに望ましい。
【００２２】
本発明者は、ホスフェート生成物の検出のためにマラカイトグリーンを用いたこのオーソログ（ortholog）についてのスクリーニング検定を考案した。その検定には、化合物についてシグナルとの干渉および検出方法との干渉を検査する対照が含まれる。
【００２３】
１．  化合物を、E.faecalis ＭｕｒＤと一緒に５〜３０分間プレインキュベートする。
２．  ３種類の基質、ＡＴＰ、ＵＤＰ−ＭｕｒＮａｃ−Ｌ−ＡｌａおよびＤ−グルタメートを加えて、反応を開始させる。
【００２４】
３．  ３０〜６０分後、マラカイトグリーン溶液で反応を止める。シグナルは、マラカイトグリーン溶液を加えて４〜１０分後に、分光光度法によって記録する。化合物について検定シグナルとの干渉を照合するために、工程１において E.faecalis ＭｕｒＤの不存在下であることを除いた同じ手順を化合物に施す。シグナルと干渉する化合物は、E.faecalis ＭｕｒＤが不存在であった場合の対照に相対して増加したシグナルを示す。
化合物についてマラカイトグリーン検出法との干渉を照合するために、一定量のホスフェート（１０〜１５μＭ）を、工程１において E.faecalis ＭｕｒＤの代わりに置き換える。化合物が不存在であった場合の対照に相対するシグナルの増加または減少により、干渉を検出する。
【００２５】
具体的な検定条件は、５０ｍＭ Tris、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．０１％ Triton Ｘ−１００、５０μＭ  ＡＴＰ、５０μＭ  ＵＭＡ、１００μＭ  Ｄ−Ｇｌｕ、ｐＨ８．０中に０．３ｎＭ E.faecalis ＭｕｒＤである。典型的には、ＭｕｒＤを、基質の不存在下において阻害剤と一緒に１５分間プレインキュベートする。続いて、その反応を、基質を加えることによって開始し、６０分後にマラカイトグリーンの添加によって止める。反応停止後５分に、シグナルを読み取る。ＭｕｒＤ活性は、この検定では、ホスフェートの形成によって検出されるが、それは、この検出法に制限されるわけではなく、代わりに、例えば、他の反応生成物（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−グルタメート，ＡＤＰ）の形成を測定することによって、更には、基質（Ｄ−グルタメート，ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン，ＡＴＰ）の消失によって追跡することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、E. faecalis ＭｕｒＤについての塩活性化の欠如を示し、ＳＯ4−イオン（＝阻害剤）以外の全ての塩が、E. faecalis ＭｕｒＤに作用しないということを示している。
【図２】図２は、S. aureus ＭｕｒＤの塩活性化を示す。
【図３】図３は、E. coli 酵素活性は、ギ酸アンモニウムの存在に依存するが、E. faecalis 酵素活性は、この塩の存在に依存しないということを示している。
【図４】図４は、５％までの濃度のＤＭＳＯ中における E. faecalis ＭｕｒＤの安定性を示す。
【図５】図５は、E. faecalis を含めたいくつかのＭｕｒＤオーソログ（orthologues）の活性化エンタルピーについてのグラフ（Eyring Plot）を示す。この値が高いほど、反応速度は一層温度依存性である。
【図６】図６（ａ）および（ｂ）は、E. faecalis を含めたいくつかのＭｕｒＤオーソログのｐＨ依存性を示す。
【図７】図７は、E. faecalis を含めたいくつかのＭｕｒＤオーソログのバックグラウンドＡＴＰアーゼ活性を示す。
【配列表】
2006503573.tif 000003
2006503573.tif 000004
2006503573.tif 000005
2006503573.tif 000006
2006503573.tif 000007
2006503573.tif 000008
2006503573.tif 000009
2006503573.tif 000010
2006503573.tif 000011
2006503573.tif 000012
2006503573.tif 000013
【図１】
2006503573.tif 000014
【図２】
2006503573.tif 000015
【図３】
2006503573.tif 000016
【図４】
2006503573.tif 000017
【図５】
2006503573.tif 000018
【図６】
2006503573.tif 000019
【図７】
2006503573.tif 000020
【国際調査報告】
2006503573.tif 000021
2006503573.tif 000022
2006503573.tif 000023