(57)【要約】本発明は、アビラマイシン誘導体、遺伝子工学、生合成を用いたその製造方法、上記化合物を含有する薬剤、及び感染症に対する薬剤の製造における上記化合物の利用に関する。本発明はまた、上記アビラマイシン誘導体の生成に関わる核酸、蛋白及び遺伝子クラスター、及び対応細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアステレオマーまたは光学異性体、ラセミ混合物または他の混合物、または、純粋なジアステレオマー及び／または光学異性体からなる、
一般化学式Ｉに基づくアビラマイシン誘導体。
【化１】
2004518803.tif 000016
ここで、Ｒ１〜Ｒ９は、以下の例外により互いに独立しており、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣ４Ｈ９、ＣＯＣＨ（ＣＨ３）２、またはＣＯＣＨ２ＣＨ３から選択されており、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３またはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３から選択されており、
Ｒ３は、ＯＣＨ３に対応し、
Ｒ４は、Ｃｌに対応し、
Ｒ５は、Ｃｌに対応し、
Ｒ６は、ＣＨ３に対応し、
Ｒ７は、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨに対応し、
Ｒ８は、ＣＨ３に対応し、
Ｒ９は、ＣＨ３に対応している。
ここで、上記の定義の他に、化学式Ｉの残基Ｒ３〜Ｒ６、Ｒ８またはＲ９のうち少なくとも１つを以下のように参照して適用され、
Ｒ３はＯＨで置き換えられ、
Ｒ４はＨで置き換えられ、
Ｒ５はＨで置き換えられ、
Ｒ６はＨで置き換えられ、
Ｒ８はＨで置き換えられ、及び／または
Ｒ９はＨで置き換えられている。
ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、各々の例として、それぞれ化合物１〜４の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【表１】
2004518803.tif 000017
【請求項２】
少なくとも、Ｒ３はＯＨで置き換えられていることを特徴とする請求項１に記載のアビラマイシン誘導体。ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、化合物１の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【表２】
2004518803.tif 000018
【請求項３】
化学式Ｉの少なくともＲ４及びＲ５が、Ｈに置き換えられていることを特徴とする請求項１または２に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項４】
少なくともＲ６、Ｒ８及び／またはＲ９が、Ｈに置き換えられていることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のアビラマイシン誘導体。ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、化合物３の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない、またはＲ１〜Ｒ９は、化合物４の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【表３】
2004518803.tif 000019
【請求項５】
少なくともＲ３がＨに置き換えられており、これとは別に少なくともＲ４及びＲ５はＨに置き換えられており、または少なくともＲ６、Ｒ８及び／またはＲ９がＨに置き換えられていることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項６】
ジアステレオマーまたは光学異性体、ラセミ混合物または他の混合物、または、純粋なジアステレオマー及び／または光学異性体からなる、
一般化学式Ｉに基づくアビラマイシン誘導体であって、
Ｒ１〜Ｒ９が以下の組み合わせからなる化合物の中から選択されることを特徴とするアビラマイシン誘導体。
【表４】
2004518803.tif 000020
【表５】
2004518803.tif 000021
【表６】
2004518803.tif 000022
好ましくは、
【表７】
2004518803.tif 000023
【請求項７】
ａ）ジクロロエベリン酸末端成分（化学式ＩのＡ成分）と、
ｂ）ｉ）２つのＤ−オリボース成分（Ｂ及びＣ成分）
ｉｉ）２−デオキシ−Ｄ−エバロース成分（Ｄ成分）
ｉｉｉ）Ｄ−フコース成分（Ｅ成分）
ｉｖ）Ｄ−マンノース成分（Ｆ成分）
ｖ）Ｌ−リクソース成分（Ｇ成分）、及び
ｖｉ）（メチル）エウレカン酸成分（Ｈ成分）
上記の成分が正規のエステル結合及びオルトエステル結合を介して連結しているエステル化した７単糖（化学式ＩのＢ〜Ｈ成分）とからなるオルトソマイシン基体の合成に必要な遺伝子及び／または酵素を含有する培養細胞から得られるアビラマイシン誘導体であって、
図１〜５４のうち１つに基づく核酸配列の少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応する核酸配列の、少なくとも１つの核酸を遺伝子工学的な改変、欠損及び／または発現不能にして、
上記のように改変した細胞を培養して、培養上清を回収及び処理して、アビラマイシン誘導体を精製及び単離して、該当する場合、異なるアビラマイシン誘導体を互いに分離することにより得られることを特徴とするアビラマイシン誘導体。
ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、各々の例として、以下に示すような化合物１〜１６のうち１つの組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【表８】
2004518803.tif 000024
【請求項８】
上記培養細胞が、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または、遺伝子工学的な改変、欠損、または発現不能にした核酸を除いて、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４のうち１つの配列に基づく核酸を含有する、または、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または特にはストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７型の細胞から選択される、上記核酸と少なくとも９５％、好ましくは９７％相同性を有する、または図１０９に基づく遺伝子クラスターを含む核酸を含有する細胞から選択されることを特徴とする請求項７に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項９】
上記の改変された核酸が、メチルトランスフェラーゼ及び／またはハロゲナーゼをコードすることを特徴とする請求項７または８に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項１０】
改変前の改変される核酸が、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１または２〜７に基づく配列のうち少なくとも１つ、好ましくは（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１、２、４または６に基づく配列のうち１つ、特には（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号２の配列または配列番号２及び１、２及び４、または２及び６に基づく配列の核酸配列に対して、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることを特徴とする請求項９に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項１１】
上記核酸の改変を行った結果、遺伝子工学的に改変された核酸によりコードされる蛋白またはポリペプチドが、遺伝子工学的に改変した後に、全く合成されないことを特徴とする請求項７〜１０の何れか１項に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項１２】
アビラマイシンＡまたはＣ、またはエバリニマイシン（ジラシン）よりも親水性であることを特徴とする請求項１〜５、６、または７〜１１に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項１３】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５１の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している配列中の核酸。
【請求項１４】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号が１〜３２及び４８〜５１、好ましくは１〜７、より好ましくは１、２、４、または６の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることを特徴とする請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４の配列に基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応し、かつ、好ましくは図１０９に基づいて核酸鎖で構成されている、好ましくは５４個の「読み枠」を含む遺伝子クラスター。
【請求項１６】
アミノ酸配列で、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号５５〜１０５の配列のうち１つに基づくアミノ酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している蛋白またはポリペプチド。
【請求項１７】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号が５５〜８６、好ましくは５５〜６１、特には５５、５６、５８、または６０の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることを特徴とする請求項１６に記載の蛋白またはポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３または１４に記載の核酸によりコードされる蛋白またはポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１３または１４に係る非内因性の核酸、請求項１５に係る非内因性の遺伝子クラスター、及び／または請求項１６〜１８のうち何れか１項に係る非内因性の蛋白又はポリペプチドのうち少なくとも１つを含有する、遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項２０】
改変前に、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４の配列に基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している配列を遺伝子工学的に改変した核酸を少なくとも１つ含有する細胞。
【請求項２１】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４の配列の１つに基づく配列を有する核酸のうち少なくとも１つが遺伝子工学的に改変されている、または、欠損していることを特徴とするストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、好ましくはＴｕｅ５７亜型の細胞。
【請求項２２】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１または２〜７の配列のうち１つ、好ましくは（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１、２、４または６の配列のうち１つ、特には（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号２の配列または配列番号２及び１、２及び４、または２及び６の配列に基づく配列を有する核酸の、少なくとも１つが遺伝子工学的に改変されている、または、欠損していることを特徴とする請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
Ｒ３＝ＯＨのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ４により合成されており、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝Ｈ、及びＲ５＝Ｈのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ４−ＡＭ１により合成されており、Ｒ３＝ＯＨ及びＲ６＝Ｈのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ２により合成されており、Ｒ３＝ＯＨ及びＲ９＝Ｈのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ５により合成されていることを特徴とするストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ４−ＡＭ１、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ２、またはストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ５の請求項２１に記載の細胞。
【請求項２４】
アビラマイシン誘導体、好ましくは請求項１〜１２の何れか１項に係るアビラマイシン誘導体を製造するための、請求項１３または１４に係る核酸、請求項１６〜１８の何れか１項に係る蛋白またはポリペプチド、及び／または請求項１９〜２３のうち何れか１項に係る細胞の利用。
【請求項２５】
請求項１〜６の何れか１項に記載のアビラマイシン誘導体の製造方法であって、
（１）ａ）ジクロロエベリン酸末端成分（化学式ＩのＡ成分）と、
ｂ）ｉ）２つのＤ−オリボース成分（Ｂ及びＣ成分）
ｉｉ）２−デオキシ−Ｄ−エバロース成分（Ｄ成分）
ｉｉｉ）Ｄ−フコース成分（Ｅ成分）
ｉｖ）Ｄ−マンノース成分（Ｆ成分）
ｖ）Ｌ−リクソース成分（Ｇ成分）、及び
ｖｉ）（メチル）エウレカン酸成分（Ｈ成分）
上記の成分が正規のエステル結合及びオルトエステル結合を介して連結しているエステル化した７単糖（化学式ＩのＢ〜Ｈ成分）とからなるオルトソマイシン基体の合成に必要な遺伝子及び／または酵素を含有する培養細胞において、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している核酸配列のうち少なくとも１つの核酸を遺伝子工学的に改変する、欠損する、及び／または発現不能にする工程と、
（２）上記のように遺伝子工学的に改変された細胞を培養する工程と、
（３）培養上清を回収する工程と、
（４）培養上清を処理し、上記の構造のアビラマイシン誘導体を精製及び単離する工程と、
（５）該当する場合、異なる誘導体を互いに分離する工程とを含むことを特徴とするアビラマイシン誘導体の製造方法。
【請求項２６】
上記培養細胞が、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または、遺伝子工学的な改変、欠損、または発現不能にした核酸を除いて、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４の配列に基づく核酸を含有する、または、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または特にはストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７型の細胞から選択される、上記の核酸配列と９５％、好ましくは９７％相同性を有する核酸、または請求項１５に係る遺伝子クラスターを含有する細胞から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
改変される核酸は、メチルトランスフェラーゼ及び／またはハロゲナーゼをコードすることを特徴とする請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
改変前の改変される上記核酸の配列が、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１または２〜７の配列のうち少なくとも１つ、好ましくは（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１、２、４または６の配列のうち１つ、特には（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号２の配列または配列番号２及び１、２及び４、または２及び６の配列の核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記核酸の改変により、遺伝子工学的に改変された核酸によりコードされる蛋白またはポリペプチドが、上記遺伝子工学的な改変後に、全く合成されないことを特徴とする請求項２５〜２８のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
必要に応じて、適した添加物及び／または補助薬物といった、請求項１〜１２の何れか１項のアビラマイシン誘導体を含有する医薬品。
【請求項３１】
治療のための抗生物質の効果をもつ医薬品の製造のための、または、例えば、感染症といった疾病を治療するための医薬品の製造のための、請求項１〜１２の何れか１項のアビラマイシン誘導体の利用。
【発明の詳細な説明】
〔外国優先に対する請求〕
本出願は、２００１年２月２５日出願のＤＥ１０１０９１６６．４及び２００１年８月２４日出願の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／０９８１５の優先権を主張する。これら先行出願のすべての内容は、参照により、ここに盛り込まれている（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）。
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、アビラマイシン誘導体（ａｖｉｌａｍｙｃｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）（以下、ガビバマイシン（Ｇａｖｉｂａｍｙｃｉｎ）としても記載されている）、当該アビラマイシン誘導体生産のための遺伝子工学的生合成工程、上記化合物を含有する薬剤、すなわち当該薬剤生産のための上記化合物の利用（例えば、感染症に対する薬剤）、及び、上記アビラマイシン誘導体生産に関連する、核酸、蛋白、遺伝子クラスター、及び対応細胞に関するものである。
【０００２】
〔発明の背景〕
多数の抗生物質に対して耐性である病原性細菌の出現により、ヒトの健康は脅かされ、新薬の探索が激化している。過去２０年の間、標的−特異性薬剤スクリーングで発見された新薬は益々少なくなってきており、そのため研究者達は、新しい抗生物質の探索に加え、新化合物の生産のための新技術を利用しはじめた。期待できる新技術としては、組換え生合成が挙げられ、新規活性剤の生産手段として生合成遺伝子を使用している。
【０００３】
上記において、他と比較して化合物の興味深い分類としては、オルトソマイシン（ｏｒｔｈｏｓｏｍｙｃｉｎ）がある。オルトソマイシンは様々な放線菌類から生産される抗生物質の分類であることが知られている。上記分類に属する抗生物質は、糖ペプチド耐性腸球菌、メチシリン耐性ブドウ球菌、ペニシリン耐性レンサ球菌を含む広い範囲のグラム陽性病原細菌に作用する。
【０００４】
オルトソマイシンの代表的な例としては、アビラマイシンおよびエバルニマイシンが挙げられ、これらの抗生物質は、それぞれストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  Ｔｕｅ５７）及びマイクロモノスポラ  カルボナセア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃａｒｂｏｎａｃｅａ）から生産される。これらの抗生（物質）は、７単糖（ｈｅｐｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の側鎖、及びアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎ）としてポリケチド（酢酸ユニット）から由来するジクロロイソエバリニン酸の構成である。上記ジクロロイソエバリニン酸において、上記７単糖成分は、その一部分で、オルトエステル結合を介して相互に結合している。オルトソマイシンの全体分類の名前は、このオルトエステル結合に由来している。オルトソマイシンの正確な作用形態は知られていない。特定のオルトソマイシン（ジラシン）に関しては、細胞膜の効果が議論されている（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ），１９７６；ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）  １９８７）一方で、より最近の刊行物（フォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）及びライバック（Ｒｙｂａｋ），１９９９）には、リボソーム蛋白Ｌ１６との相互作用が掲載されている。また、もう一つのオルトソマイシンであるアビラマイシンＡに関しては、蛋白質生合成の阻害が予想されており、そして翻訳開始複合体を阻害していると示唆されている（ウォルフ（Ｗｏｌｆ）  １９７３）。
【０００５】
既知のアビラマイシンは、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７の培養濾過から、１９５９年に単離された（ブゼッチら（Ｂｕｚｚｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ），１９６８；マーツら（Ｍｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ），１９８６）。上述したとおり、アビラマイシンＡは、その主要構成のひとつとして糖類からなる。各構成は、Ｄ−オリボース、２−デオキシ−Ｄ−エバロース、４−Ｏ−メチル−Ｄ−フコース、２，６−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノース、Ｌ−リクソース、そしてメチルエウレカン酸（ｍｅｔｈｙｌ  ｅｕｒｅｋａｎａｔｅ）である。研究により、アビラマイシンＡは、多耐性のスタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）株に対して際立った活性を示した（ザッハナー（Ｚａｅｈｎｅｒ），１９９９）。オルトエステルに加えて、末端ジクロロイソエバリニン酸ユニットが上記アビラマイシンＡの効果に必須であることが支持された（ウライト（Ｗｒｉｇｈｔ），１９７９）。ＤＥ  １１１６８６４には、アビラマイシンの生産及びその効果とともに、誘導体に対する一般的な参照を含むアビラマイシンの物質分類が記載されている。米国特許３，１３１，１２６にも同様に記載されている。
【０００６】
ジラシンもまた、オルトソマイシン類に属するものである。ジラシン（ＳＣＨ２７８９９）はエバルニマイシンであり、その臨床試験はすでに実施されている。
【０００７】
【化２】
2004518803.tif 000002
【０００８】
しかしながら、アビラマイシンＡとジラシンに関しては、特定の実験により、親水性の度合いが十分満たされないために治療のために使用するには限界があるようだと示されている。
【０００９】
具体的にはオルトマイシンの分類、とりわけアビラマイシンに関しては、アビラマイシンＡの生合成を決定する酵素の、分子クローニング及び特徴決定（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、この情報により新しい（抗菌性の）抗生物質の発見を指し示すことになるので、非常に関心の興味深い。デオキシ糖類の形成及び独特の結合を研究することにより、上記遺伝子群は興味深いシステムであり、さらに組み合わせ合成（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に関しては、非常に価値あるものになるであろう。
【００１０】
アビラマイシンの生合成遺伝子クラスターの初期の研究の結果としては、ＮＤＰ−グルコース−シンターゼ遺伝子（ａｖｉＤ（表１の配列番号５３））、ＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ遺伝子（ａｖｉＥ１（表１の配列番号５４））、及びポリケチド−シンターゼ遺伝子（ａｖｉＭ（表１の配列番号５２））の配列から解読された。これらの遺伝子は、ジクロロイソエバリニン酸の生合成の中間生産物である、オルセリン酸を形成するための相互結合性の（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）Ｉ型ポリケチドシンターゼの一部分としての機能を有していると推定される。Ｓ． ｌｉｖｉｄａｎｓ内でａｖｉＭが発現することにより、オルセリン酸が形成された。［ガイザー、Ｓ（Ｇａｉｓｓｅｒ，Ｓ），トレフザー、Ａ（Ｔｒｅｆｚｅｒ，Ａ），ストッカート、Ｓ（Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，Ｓ），カーシュニング、Ａ（Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇ，Ａ），及びベックホルド、Ａ（Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ，Ａ）著、「ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」，１７９巻：ｐ．６２７１−６２７８（１９９７）］
したがって、本発明の課題は、適切な酵素システム及び合成経路を検索し同定することに加えて、特に改善した親水性を示す抗生物質を含む新規抗生物質の取得することである。
【００１１】
〔発明の要約〕
驚いたことに、従来技術に以前記載されているものとは異なり、特定のアビラマイシン誘導体（本発明ではガビバマイシンと記載する）、特にアビラマイシンＡと比較して決定的な領域が改変された置換パターン（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ）を有するアビラマイシン誘導体は、本課題を達成し、抗生物質の効果及び改善された親水性の両方を示すことができることがわかった。したがって、本発明の対象は、一般化学式Ｉに基づくアビラマイシン誘導体であり、ジアステレオマーまたは光学異性体、ラセミ混合物または他の混合物、または、純粋なジアステレオマー及び／または光学異性体からなる。
【００１２】
【化３】
2004518803.tif 000003
【００１３】
ここで、Ｒ１〜Ｒ９は、以下の例外により互いに独立しており、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣ４Ｈ９、ＣＯＣＨ（ＣＨ３）２、またはＣＯＣＨ２ＣＨ３から選択されており、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３またはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３から選択されており、
Ｒ３は、ＯＣＨ３に対応し、
Ｒ４は、Ｃｌに対応し、
Ｒ５は、Ｃｌに対応し、
Ｒ６は、ＣＨ３に対応し、
Ｒ７は、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨに対応し、
Ｒ８は、ＣＨ３に対応し、
Ｒ９は、ＣＨ３に対応している。
ここで、上記の定義の他に、化学式Ｉの残基Ｒ３〜Ｒ６、Ｒ８またはＲ９のうち少なくとも１つを以下のように参照して適用され、
Ｒ３はＯＨで置き換えられ、
Ｒ４はＨで置き換えられ、
Ｒ５はＨで置き換えられ、
Ｒ６はＨで置き換えられ、
Ｒ８はＨで置き換えられ、及び／または
Ｒ９はＨで置き換えられている。
ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、各々の例として、それぞれ化合物１〜４の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【００１４】
【表９】
2004518803.tif 000004
【００１５】
上記において、「以下の例外により（ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｘｃｅｐｔｉｏｎ）」という表現は、成分Ｒ１〜Ｒ９の一般的定義の例外があり、以下の、「ここで、上記の定義の他に、化学式Ｉの成分Ｒ３〜Ｒ６、Ｒ８またはＲ９のうち少なくとも１つを以下のように参照して適用され、（ｗｈｅｒｅ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｐｐｌｉｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔｏ ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ Ｒ３−Ｒ６，Ｒ８，ｏｒ Ｒ９ ｉｎ ｆｏｒｍｕｌａ Ｉ）」という語句に導入された表現に直接的に係る（ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ）と理解されている。
【００１６】
本発明に係るアビラマイシン誘導体は全体として特徴決定され、その特徴は、エバルニマイシン（＝エバルニノマイシン＝エバルニミシン）と同様のアビラマイシンＡまたはＣといった既知のオルトソマイシンと比較して、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に対する抗菌性が驚異的に強いだけではなく、親水性が明らかに改善されるということである。特に、この増大した親水性は治療学的利用において非常に望ましいので、上記の増大した親水性によりそれら化合物、とりわけ抗生物質に対して関心が高まる。これに加えて、このアビラマイシン誘導体に関しては、他の全てのもの、また以下に記すものも同様に、実質的に従来の有機合成のみを用いて開発することが困難な構造を有する。従って、本発明のアビラマイシン誘導体生産のために、ここでの根本的因子である遺伝子工学的生合成の利用することにより、改変された、新規の、そして以前に得られなかった活性剤、特に抗生物質を発見することができる。
【００１７】
［発明の詳細な説明］
本発明の適用範囲内ではアビラマイシン（ａｖｉｌａｍｙｃｉｎ）誘導体は、少なくとも、Ｒ３はＯＨで置き換えられていることが好ましい。ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、化合物１の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【００１８】
【表１０】
2004518803.tif 000005
【００１９】
さらに、本発明のアビラマイシン誘導体は、化学式Ｉの少なくともＲ４及びＲ５が、Ｈに置き換えられていることが好ましい。
【００２０】
さらに、アビラマイシン誘導体は、少なくともＲ６、Ｒ８及び／またはＲ９が、Ｈに置き換えられていることが好ましい。ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、化合物３の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない、または化合物４の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【００２１】
【表１１】
2004518803.tif 000006
【００２２】
さらに、上記の特性を組み合わせることがより好ましく、結果としては、本発明のアビラマイシン誘導体は、少なくともＲ３がＨに置き換えられており、これとは別に少なくともＲ４及びＲ５はＨに置き換えられており、または少なくともＲ６、Ｒ８及び／またはＲ９がＨに置き換えられている。
【００２３】
上記において、特に有利な方法で課題を達成する、本発明の特に好ましい対象としての、化学式Ｉに基づくアビラマイシン誘導体は、各々の例として、Ｒ１〜Ｒ９が以下の表に示されているような意味を有する化合物の中から選択される。そして、これらは、以下のような組み合わせである。
【００２４】
【表１２】
2004518803.tif 000007
【００２５】
【表１３】
2004518803.tif 000008
【００２６】
【表１４】
2004518803.tif 000009
【００２７】
好ましくは
【００２８】
【表１５】
2004518803.tif 000010
【００２９】
上記課題は、遺伝子工学的操作及び生合成を含む特別な工程手段により製造されうるアビラマイシン誘導体によっても達成される。さらに、本発明のもう１つの目的物としては、
ａ）ジクロロエベリン酸末端成分（化学式ＩのＡ成分）と、
ｂ）ｉ）２つのＤ−オリボース成分（Ｂ及びＣ成分）
ｉｉ）２−デオキシ−Ｄ−エバロース成分（Ｄ成分）
ｉｉｉ）Ｄ−フコース成分（Ｅ成分）
ｉｖ）Ｄ−マンノース成分（Ｆ成分）
ｖ）Ｌ−リクソース成分（Ｇ成分）、及び
ｖｉ）（メチル）エウレカン酸成分（Ｈ成分）
上記の成分が正規のエステル結合及びオルトエステル結合を介して連結しているエステル化した７単糖（化学式ＩのＢ〜Ｈ成分）とからなるオルトソマイシン基体の合成に必要な遺伝子及び／または酵素を示す培養細胞から得られるアビラマイシン誘導体であって、
図１〜５４のうち１つに基づく核酸配列の少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応する核酸配列の、少なくとも１つの核酸を遺伝子工学的な改変、欠損及び／または発現不能にして、
上記のように改変した細胞を培養して、培養上清を回収及び処理して、アビラマイシン誘導体を精製及び単離して、該当する場合、異なるアビラマイシン誘導体を互いに分離することにより得られるアビラマイシン誘導体である。
ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、各々の例として、以下に示すような組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【００３０】
【表１６】
2004518803.tif 000011
【００３１】
この明細書の本発明の意味では、「オルトソマイシン基体の合成に必要な遺伝子及び／または酵素を示す細胞」という記載は、通常存在する前駆体の段階から「オルトソマイシン基体」の合成に必要とする、必要な酵素及び／または機能的な酵素自体をコードする遺伝子が細胞内に存在するということを意味することは理解される。例えば、図１０９に基づいた、本発明の遺伝子クラスターまたは「読み枠」（ＯＲＦ）、及び／または表１と図１との組み合わせに基づく配列番号１〜５４に基づく遺伝子、及び／または表１と図１との組み合わせに基づく配列番号５５〜１０８に基づく関連酵素及び／または蛋白が挙げられる。
【００３２】
「オルトソマイシン基体」の定義としては、すでに与えられているが、この定義では、オルトエステル結合及び正規のエステル結合の構成が化学式Ｉに由来している。本発明のアビラマイシン誘導体のように、数ある中で（ａｍｏｎｇ ｏｔｈｅｒｓ）アビラマイシン及びエバリニマイシンが上述の基体を示している。
【００３３】
さらに、本発明の意味では、「遺伝子」は、（個々のポリペプチドまたは蛋白に翻訳される）個々のｍＲＮＡ分子、または機能的ＲＮＡ分子（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）が転写されるＤＮＡの区分を意味すると理解されている。
【００３４】
さらに、本発明の意味では、「読み枠」（ＯＲＦ）は、開始コドンで開始し終止コドンで終了し、アミノ酸のコドンの連続した（ｕｎｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）配列を含むＤＮＡの区分を意味すると理解されている。また、ここでは、「読み枠」（ＯＲＦ）の用語は、クローニング及び配列決定された、遺伝子に対応するＤＮＡ区分を示すのに用いられている。
【００３５】
「コドン」は、コードする遺伝子の基本単位を意味すると理解されている。このコドンは、３つの連続したヌクレオチドの３つ組で構成され、ポリペプチド鎖のアミノ酸あるいは開始または終止をコードしている。
【００３６】
さらに、本発明の意味では、「培養細胞（Ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ）」は、液体又は液体状の栄養溶液により栄養分が付与された固体又は液体培地、すなわち培養培地中で、試験管内で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）生育し繁殖している細胞を意味すると理解されている。狭い意味では、特に、微生物の細胞、または、対応する遺伝子が発現されうる、容易に遺伝子導入が可能な細胞がある。例えば、グラム陽性菌及びストレプトマイセス属の細胞（例えば、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７といったグラム陰性菌、その他にＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣（ｏｖａｒｙ））といったシステム、または、ＨｅＬａまたはＨＥＫ細胞といった不死化した細胞株（Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、更にその他に昆虫、魚、両生類、カビ、または酵母などの細胞が挙げられる。
【００３７】
本発明の意味では、「核酸」は、ＤＮＡ及びＲＮＡの基本単位、さらに特に遺伝子及びＯＲＦの基本単位を意味すると理解されている。同様に、核酸は遺伝子またはＯＲＦを構成し、特異的な核酸配列（核酸のバックボーンであるリン酸−糖鎖にある塩基の配列）は、遺伝子またはＯＲＦを定義している。核酸という用語はまた、コードする領域のほかに、特に、当該コードする領域の５’又は３’末端に付加的な配列領域を含む配列を意味すると理解されている。これらの配列は、機能していなくてもよい、またプロモーターもしくはエンハンサーシグナル、好ましくは細菌のシグナル、または発現に用いられる宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）のシステムに対応するシグナルであってもよい。本発明の蛋白をコードする配列領域に、いわゆる「タグ（Ｔａｇ）」（ＨｉｓまたはＦｌａｇタグ）をコードするヌクレオチド領域を付加することが尚好ましい。こうすることにより、宿主細胞中で発現している本発明の蛋白を、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法により、容易に精製することができる。このように、本発明のコードしているヌクレオチド配列、好ましくは５’又は３’末端に、アミノ酸配列をコードし、抗体と結合するためのタグ（例えば、抗原）を含む所望の配列を付加することができる。本発明のコードしている核酸にその他のヌクレオチド配列を組み合わせた結果のアミノ酸配列もまた開示されている。
【００３８】
本発明の意味では、「遺伝子工学（Ｇｅｎｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」は、ＤＮＡを宿主細胞に導入する、または細胞内のＤＮＡを特異的に変える手段による様々な技術の利用を意味すると理解されている。また、上記遺伝子工学には、クローニング技術、ベクター、制限酵素等の利用も含まれる。
【００３９】
同様に、本発明の意味では、「遺伝子工学により改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」は、介在（ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）により、塩基配列すなわち核酸配列が変化する、特には、塩基配列が短くなる（以下、欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ））、または、変異を起こすことを意味すると理解されている。たいていの場合、結果として核酸（遺伝子）がｍＲＮＡに転写されない、または改変された状態でのみ転写される。
【００４０】
この場合、「欠損した」は、たいていの場合、遺伝子またはＯＲＦを構成する核酸がＤＮＡから、完全にまたは少なくとも遺伝子の範囲で削除されることを意味する。これにより、核酸（遺伝子）がｍＲＮＡに転写されない、または改変された状態でのみ転写される。同様に「発現不能な（ｎｏｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）」は、核酸（遺伝子）がｍＲＮＡに転写されない、または改変された状態でのみ転写されるように、核酸を改変することを意味する。これにより、この核酸（遺伝子またはＯＲＦ）が元々コードしている蛋白またはポリペプチドが、翻訳により生成されなくなる。
【００４１】
中程度に厳しいハイブリダイゼーションの条件とは、ハイブリダイゼーションに用いる核酸配列（オリゴヌクレオチド、それよりも長い断片、または完全な配列）及び野生型の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に依存した、標準的な条件とは異なる条件を意味すると理解されている。例えば、同じ長さで、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの融解温度よりも約１０℃低い。標準的な条件は、例えば、上記の核酸に依存して、０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度の緩衝水溶液中、または当該緩衝水溶液に５０％ホルムアミドを添加した状態で４２℃と５８℃との間の温度、例えば、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミドで４２℃を意味すると理解されている。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件を０．１×ＳＳＣで約２０℃〜４５℃の間の温度、好ましくは約３０℃〜４５℃の間の温度にした場合のほうが有利である。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドでは、ハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣ及び約３０℃〜５５℃の間の温度、好ましくは約４５℃〜５５℃の間の温度にした場合のほうが有利である。ハイブリダイゼーションに示されるこれらの温度は、約１００ヌクレオチドの長さの核酸及びホルムアミド非存在下で５０％のＧＣ含量を例として計算された融解温度値である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験的な条件は、サンブルークらといった遺伝学について該当する教科書（「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」コールドスプリングハーバーラボラタリー、１９８９）に記載されており、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドのタイプ、またはＧＣ含量の機能として、当業者にも知られている数式に基づいて計算することができる。当業者は以下の教科書からハイブリダイゼーションに関連する付加的な情報を得ることができる。
オーソベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ）著、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョンウィリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ）（１９８５）
ハムズ及びヒギンズ（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ）著「核酸ハイブリダイゼーション：実用的な方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄａｉｚａｔｉｏｎ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、オクスフォード大学出版のＩＲＬ出版物（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、オクスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）（１９８５）
ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）著、「必須分子生物学：実用的な方法（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、オクスフォード大学出版のＩＲＬ出版物、オクスフォード（１９９１）
本発明の意味では、「培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）」は培養細胞の試験管内での培養を意味すると理解されている。ここでは、これらの培養細胞は、液体又は液体状の栄養溶液により栄養分が付与された固体又は液体培地で、試験管内で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）生育し繁殖している。
【００４２】
この明細書では、「培養上清（ｔｏｐ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、培養細胞のための栄養分だけでなく当該培養細胞により細胞外、すなわち培地中に放出する代謝産物及び薬物（ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）（例えば、アビラマイシン誘導体）も含有する液体培養培地を意味すると理解されている。この培養上清は「回収されて」「処理される」。これは、培養及び細胞から、余った固体分を分離するために上記上清を吸引及び／または濾過することを意味すると特に理解されている。
【００４３】
上記培養上清は、たいていの場合、本発明のアビラマイシン誘導体を含有するが、処理した後「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」されうる。これは、クロマトグラフィーによる分離及び／または液相（ｌｉｑｕｉｄ ｐｈａｓｅ）法による分離、またはこれらの方法手順の組み合わせを意味すると一般的に理解されている。上記の例としては、水中でのメタノール勾配（ａ ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）の固相抽出または酢酸エチル抽出が挙げられる。上記において、アビラマイシン誘導体を含有する分画は、上記上清のほかの構成因子を含有する他の分画から、大部分で分離される。そして、アビラマイシン誘導体は大部分「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）される」。他の分離及び／または精製工程としては、塩析（ｓａｌｔｉｎｇ−ｏｕｔ）法または再結晶化（ｒｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）法または結晶化析出（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚｉｎｇ−ｏｕｔ）法が挙げられる。必要ならば、単離、及び、特にクロマトグラフィー法が用いられている「個々の誘導体の分離」により、上記工程を行うことができる。ＨＰＬＣ法またはアフィニティークロマトグラフィー法が特に好ましい。
【００４４】
また、本発明のアビラマイシン誘導体の製造方法としては、上記培養細胞が、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または、遺伝子工学的な改変、欠損、または発現不能にした核酸を除いて、表１と図１との組み合わせに基づく配列番号１〜５４のうち１つの配列に基づく核酸を含有する、及び／または、上記核酸と少なくとも９５％、好ましくは９７％相同性を有する、または中程度に厳しい条件下で上記の配列とハイブリダイズする、または図１０９に基づく遺伝子クラスターを含む核酸を含有する細胞から選択されるかどうかを限定していることが好ましい。選択の上記２番目のポイントは、遺伝子工学的方法を用いて、アビラマイシン合成に必要な酵素を発現している細胞を意味すると特に理解されている。上記遺伝子工学的方法では、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７の内因性の酵素をコードする核酸の１つが、遺伝子工学的に改変または欠損または発現不能になっている、特には、核酸／ＤＮＡは、第１の段階で遺伝子工学により宿主細胞に導入されていない。しかしながら、上記細胞は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、特にはストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７またはＡ２３５７５型の細胞から選択されることが好ましい。
【００４５】
各々の場合で、改変された（例えば、欠損した、または宿主細胞に導入されない）核酸が、メチルトランスフェラーゼ及び／またはハロゲナーゼをコードすることが好ましい。
【００４６】
言い換えれば、上記の生成は生体内の（ｉｎ ｖｉｖｏ）の過程の外で起こっている、すなわち試験管内の合成である。上記において、合成に必要な酵素及び／または酵素システムは少なくとも１つの実験上のバッチ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｔｃｈ）に存在する。ここで、合成に必要な反応ステップとしては、触媒、必要な酵素及び本発明の酵素による連続的な実験バッチを実行することが好ましい。必要ならば、それぞれの例で、所望の中間生成物を精製するために、安定した系列で実行する分離及び／または精製ステップを個々の反応の間に挿入してもよい。
【００４７】
「メチルトランスフェラーゼ」は、有機分子にメチル基を転移することができる酵素であると理解されている。本発明の意味では、特に、メチルトランスフェラーゼとしては、好ましくは７単糖生成後に、オルセリン酸または糖類の何れかにメチル基を転移する酵素が挙げられる。メチルトランスフェラーゼとしては、特に、ａｖｉＧ２，ａｖｉＧ３，ａｖｉＧ５，ａｖｉＧ６，ａｖｉＧ１，ａｖｉＧ４のＯＲＦ、更に特にはａｖｉＧ４が挙げられる。
【００４８】
「ハロゲナーゼ」は、有機分子にハロゲンを酵素的に転移することができる酵素であると理解されている。本発明の意味では、ハロゲナーゼとしては、オルセリン酸、すなわちＲ４及び／またはＲ５に１つ、好ましくは２つのＣｌ原子を転移する酵素が挙げられ、特にはａｖｉＨのＯＲＦが挙げられる。
【００４９】
同様に、本発明の対象としては、上述した生成工程に関して、改変前の改変される核酸が、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１または２〜７に基づく配列のうち少なくとも１つ、好ましくは（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１、２、４または６に基づく配列のうち１つ、特には（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号２の配列または配列番号２及び１、２及び４、または２及び６に基づく配列の核酸配列に対して、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している、または中程度に厳しい条件下で上記の配列とハイブリダイズすることが好ましい。
【００５０】
上記において、本発明の意味では、「改変前の（ｂｅｆｏｒｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、改変された核酸が遺伝子工学により操作する前の一定の核酸配列を示すことを意味している。例えば、「改変前の」としては、「いくつかの欠損または改変（特に、塩基配列を短くすること、あるいは変異をかけること）の前」の他に、「遺伝子工学的手段により宿主細胞に核酸／ＤＮＡを導入しないステップの前」が挙げられる。
【００５１】
さらに、アビラマイシン誘導体を定義する生成過程において核酸の改変を行った結果、遺伝子工学的に改変された核酸によりコードされる蛋白またはポリペプチドが、上記遺伝子工学的に改変した後に、全く合成されないことが好ましい。
【００５２】
上記において、「ポリペプチド」とは、１０残基以上と１００残基未満との間のアミノ酸を有するペプチドを意味すると理解され、「蛋白」とは、ペプチド結合を介して連結された１０アミノ酸残基以上の高分子を意味すると理解されている。上記において、本発明に関連する蛋白は、酵素が好ましい。もちろん、本発明の意味では、他の蛋白もこの用語に置き換えられる。
【００５３】
本発明のアビラマイシン誘導体は、これまで記載しているように、優位にまたは全てにおいて利点を有している。すなわち、本発明のアビラマイシン誘導体は、従来技術（ｔｈｅ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔ）に記載しているように、関連するオルトソマイシンと比較して利点を有している。特にアビラマイシンＡと比較した場合、本発明のアビラマイシン誘導体は、より親水性がある点で利点を有しており、治療的に顕著な利点がある。
【００５４】
新規の抗生物質を利用できるようにすることに加えて、アビラマイシンＡに基づいた新規の抗微生物薬物を開発するために、アビラマイシンＡの生合成を明らかにすることもまた、本発明の課題である。上記において鍵となるポイントは、アビラマイシン生合成に含まれる遺伝子の分子クローニング及びその特徴決定である。既に知られているａｖｉＤ、ａｖｉＥ１、及びａｖｉＭの周辺約６０ｋｂの塩基配列を決定した。上記において、これらの遺伝子は、クラスター内で互いにすぐ隣に近接した構成であることがわかった。個々のＯＲＦの配列及び主要な遺伝子クラスターにおけるこれらの構成は、表１及び図１０９と組み合わせて図１に示されている。既に説明したように、ＮＤＰ−グルコースシンターゼ遺伝子（ａｖｉＤ［図１と組み合わせた表１に基づく配列番号５３］）、ＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ遺伝子（ａｖｉＥ１［図１と組み合わせた表１に基づく配列番号５４］）、及びポリケチドシンターゼ遺伝子（ａｖｉＭ［図１と組み合わせた表１に基づく配列番号５２］）は、既に知られており、その推定機能としては、ジクロロイソエバリニン酸の生合成の中間生成物である、オルセリン酸を形成するための相互結合性の（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）Ｉ型ポリケチドシンターゼの一部分として機能することが知られている。［ガイザー、Ｓ（Ｇａｉｓｓｅｒ，Ｓ），トレフザー、Ａ（Ｔｒｅｆｚｅｒ，Ａ），ストッカート、Ｓ（Ｓｔｏｃｋｅｒｔ，Ｓ），カーシュニング、Ａ（Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇ，Ａ），及びベックホルド、Ａ（Ｂｅｃｈｔｈｏｌｄ，Ａ）著、「ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）」，１７９巻：ｐ．６２７１−６２７８（１９９７）］
上記広範囲のクローニングの結果発見された、アビラマイシンの生合成に含まれる他のＯＲＦの配列は、図１に示されており、これらの相対的な構成は図１０９に示されている。ここで、表１から配列番号を付することにより、上記のＯＲＦの記号表示を名前で割り当てることが可能になる。名前により割り当てる場合、配列は図１に由来しており、特に図１の記載に示された方法で成される。配列決定に関わる詳細などの明確なクローニングストラテジーは、実施例に記載されている。実施例では、発見された遺伝子（ＯＲＦ）の機能解析及びその特徴決定を行っている。機能及び配列（由来する蛋白の配列も含む）に基づいたＯＲＦの略語（ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ）の割り当ては、後述する図の説明にある表１に示されている。
【００５５】
さらにもう１つの本発明の重要な対象としては、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５１の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している、または中程度に厳しい条件下で上記の配列の１つとハイブリダイズする核酸である。特に本発明では、ｒＲＮＡ−メチルトランスフェラーゼ（ａｖｉＲａ及びａｖｉＲｂ）として機能する（図１の配列の提示及び表１に基づく）配列番号４８及び４９の配列、及びアビラマイシンに対する耐性を付与するＡＢＣトランスポーター遺伝子（ａｖｉＡＢＣ１及びａｖｉＡＢＣ２）として機能する（図１の配列の提示及び表１に基づく）配列番号５０及び５１の配列、及び／または後述する配列番号の配列と少なくとも９５％対応するまたは中程度に厳しい条件下で上記の配列の１つとハイブリダイズする配列が記載されている。注意すべき点としては、上記核酸のいかなるサブコンビネーションを表わす核酸の混合（ｍｉｘｔｕｒｅ）であっても、図１及び表１の配列番号１〜５１に基づき存在している点である。例えば、２、３、４、…、５０の核酸のいかなる組み合わせの混合は、本発明に開示されている。該当する場合には、核酸鎖またはそれとは異なる核酸鎖における組み合わせにおいても、本発明に開示されている。
【００５６】
上記において、（図１との組み合わせで）表１に基づく配列番号が１〜３２、好ましくは１〜７、より好ましくは１、２、４、または６、あるいは（図１との組み合わせで）表１に基づく配列番号が４８〜５１、または４３，４４、または４６の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している、または中程度に厳しい条件下で上記の配列の１つとハイブリダイズする核酸であることが特に好ましい。
【００５７】
同様に、本発明のもう１つの対象としては、遺伝子クラスターが、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４の配列に基づく核酸配列と少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応する、または中程度に厳しい条件下で上記の配列の１つとハイブリダイズし、かつ、好ましくは図１０９に基づいて、核酸鎖またはそれとは別鎖の一つのいかなる組み合わせで構成されている、「読み枠」（好ましくは５４個）を含むことである。いかなる鎖の分布及びサブコンビネーションであっても、また該当する場合、既知の遺伝子との組み合わせでも、本発明の遺伝子クラスター内の遺伝子は、本発明の２、３、４…５４個の遺伝子を含んでいる。但し、上記ＯＲＦ同士の間にある区分（ｓｅｇｍｅｎｔ）は、ヌクレオチド配列である。
【００５８】
このことは、図１０９に基づく遺伝子クラスターだけでなく、他の構成で対応する核酸を含有する遺伝子クラスターにも関連する。上記他の構成の遺伝子クラスターは、特に限定しないが（ｂｕｔ ｎｏｔ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ）、（表１と図１とを組み合わせて）配列番号１〜５４に基づく遺伝子クラスター内で、上記ＯＲＦが全て見られることが好ましい。
【００５９】
本発明の意味では、「遺伝子クラスター」という用語は、数個の遺伝子が閉空間的に近接して（ｉｎ ｃｌｏｓｅ ｓｐａｔｉａｌ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）配置されている一つのＤＮＡの区分を意味すると理解されている。本発明の上記のような遺伝子クラスターとしては、例えば、ＢＡＣまたはＹＡＣ、コスミドまたはプラスミド等のベクターが挙げられる。本発明の配列を少なくとも１つ含むベクターもまた、本発明の対象に含まれる。また、本発明のベクターに、本発明の遺伝子と、付加的にシグナル配列または遺伝子（特に抗生物質耐性遺伝子）とを共に組み合わせてもよい。
【００６０】
新規に発見されたＯＲＦまたは遺伝子の配列から、蛋白及びポリペプチドの配列を導くことも可能になる。したがって、本発明のもう１つの対象としては、アミノ酸配列で、（図１との組み合わせて表１での）配列番号５５〜１０１の配列のうち１つに基づくアミノ酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している蛋白またはポリペプチドが挙げられる。
【００６１】
上記において、本発明の蛋白またはポリペプチドは、（図１との組み合わせて表１での）配列番号が５５〜８６または９７、９８または１００または１０２〜１０５、好ましくは５５〜６１、特には５５、５６、５８、または６０の配列の１つに基づくアミノ酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることが好ましい。
【００６２】
さらに、もう１つの対象には、請求項１３または１４に記載の核酸によりコードされる蛋白またはポリペプチドも挙げられる。上記において「コードされる」は、本発明の意味では対応アミノ酸配列に対応核酸区分（遺伝子またはＯＲＦ）コードのコドン（上述）を意味すると理解されている。換言すれば、上記のアミノ酸配列を有する対応蛋白またはポリペプチドは、転写及び翻訳後に形成されることを意味する。
【００６３】
特に、本発明の蛋白は、酵素、または多酵素からなる複合体の一部分である。もちろん、これらもまた他の機能を有する。
【００６４】
本発明のアビラマイシン誘導体は、遺伝子工学的または生物工学的工程の方法により定義される、または当該方法により生産される。その一方で、対応する抗生（物質）生産のために、新規に発見された遺伝子またはタンパク質（酵素）を遺伝子工学的または生物工学的工程に利用することができる。そして遺伝子工学的に改変された細胞は、本発明の範囲内で、必ずといっていいほど重要な機能を有するのである。
【００６５】
したがって、本発明に係る内因性の核酸のうち少なくとも１つ、本発明に係る非内因性の遺伝子クラスターのうち少なくとも１つ、及び／または本発明に係る非内因性の蛋白あるいはポリペプチドのうち少なくとも１つを含有する遺伝子工学的に改変された細胞は、本発明のもう一つの対象となるのである。
【００６６】
同様に、改変前に、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４の配列に基づく核酸配列の１つと、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には中程度に厳しい条件下で上記の配列の１つとハイブリダイズするほど正確に対応している配列を遺伝子工学的に改変した核酸を少なくとも１つ含有する細胞もまた、本発明の対象である。
【００６７】
本発明の特に好ましい対象は、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４のうち１つの配列を有する核酸のうち少なくとも１つが遺伝子工学的に改変されている、または、欠損しているストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、好ましくはＴｕｅ５７亜型の細胞である。上記において、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１または２〜７の配列のうち１つ、好ましくは（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１、２、４または６の配列のうち１つ、特には（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号２の配列または配列番号２及び１、２及び４、または２及び６の配列に基づく配列を有する核酸の、少なくとも１つが遺伝子工学的に改変されている、または、欠損している細胞であれば特に好ましい。
【００６８】
同様に、細胞がストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ４−ＡＭ１、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ２、またはストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ５であれば特に好ましく、Ｒ３＝ＯＨのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ４により合成されており、その一方で、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝Ｈ、及びＲ５＝Ｈのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ４−ＡＭ１により合成されており、一方で、Ｒ３＝ＯＨ及びＲ６＝Ｈのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ２により合成されており、Ｒ３＝ＯＨ及びＲ９＝Ｈのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ５により合成されている。
【００６９】
したがって、上述の説明に基づき本発明のもうひとつの対象は、本発明に係る核酸、本発明に係る遺伝子クラスター、本発明に係るタンパク質またはポリペプチド、及び／またはアビラマイシン誘導体、好ましくは本発明に係るアビラマイシン誘導体の生産のための本発明の上記細胞の利用である。
【００７０】
本発明のもうひとつの対象は、本発明に係るアビラマイシン誘導体の製造方法である。すなわち、その製造方法は、以下に示す、
（１）ａ）ジクロロエベリン酸末端成分（化学式ＩのＡ成分）と、
ｂ）ｉ）２つのＤ−オリボース成分（Ｂ及びＣ成分）
ｉｉ）２−デオキシ−Ｄ−エバロース成分（Ｄ成分）
ｉｉｉ）Ｄ−フコース成分（Ｅ成分）
ｉｖ）Ｄ−マンノース成分（Ｆ成分）
ｖ）Ｌ−リクソース成分（Ｇ成分）、及び
ｖｉ）（メチル）エウレカン酸成分（Ｈ成分）
上記の成分が正規のエステル結合及びオルトエステル結合を介して連結しているエステル化した７単糖（化学式ＩのＢ〜Ｈ成分）とからなるオルトソマイシン基体の合成に必要な遺伝子及び／または酵素を含有する培養細胞において、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している核酸配列のうち少なくとも１つの核酸、または中程度に厳しい条件下で上記の配列の１つとハイブリダイズする核酸を遺伝子工学的に改変する、欠損する、及び／または発現不能にする工程と、
（２）上記のように遺伝子工学的に改変された細胞を培養する工程と、
（３）培養上清を回収する工程と、
（４）培養上清を処理し、上記の構造のアビラマイシン誘導体を精製及び単離する工程と、
（５）該当する場合、異なる誘導体を互いに分離する工程とを含む。
【００７１】
この工程において、培養細胞がストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または、遺伝子工学的な改変、欠損、または発現不能にした核酸を除いて、表１と図１との組み合わせに基づく配列番号１〜５４の配列に基づく核酸、上記の核酸配列と９５％、好ましくは９７％相同性を有する核酸、上記の配列とハイブリダイズする配列、または本発明に係る遺伝子クラスターを含有する細胞から選択されれば好ましい。この技術文献において、後半部分は異種発現（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）といえる。上記において、上記細胞は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス、ストレプトマイセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス  アルバス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．ａｌｂｕｓ）、ストレプトマイセス  フラジアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）、特にストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７またはＡ２３５７５型の細胞から選択されることが特に好ましい。
【００７２】
本発明においては、上記方法を行う上で、他の方法もまた可能である。ステップ（１）と（２）の後、アビラマイシン誘導体が、培養上清に回収されずに、その代わりに宿主細胞に蓄積されている場合がある。したがって、上記他の方法によれば、ステップ（３）で上記宿主細胞を回収し消化する。そして他の細胞構成からアビラマイシン誘導体を単離し最終的に精製する。上述した方法及び当業者（ａ ｐｅｒｓｏｎ ｓｋｉｌｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｔ）の間で知られている他の方法を、単離及び精製に利用することが可能である。
【００７３】
本発明の方法において、上記改変される核酸は、メチルトランスフェラーゼ及び／またはハロゲナーゼをコードするものであればさらに好ましい。上記において、改変前の改変される上記核酸の配列が、表１と図１との組み合わせに基づく配列番号１または２〜７の配列のうち少なくとも１つ、好ましくは（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１、２、４または６の配列のうち１つ、特には（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号２の配列または配列番号２及び１、２及び４、または２及び６の配列の核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることが尚好ましい。
【００７４】
本発明の方法において、上記核酸、特にメチルトランスフェラーゼ及び／またはハロゲナーゼの改変により、遺伝子工学的に改変された核酸によりコードされる蛋白またはポリペプチドが、上記遺伝子工学的な改変後に、全く合成されないことがさらに好ましい。
【００７５】
本発明に係るアビラマイシン誘導体は、毒物学という観点から、基本的に問題ない、したがって医薬品の薬剤の活性成分に最適である。したがって、本発明のもう一つの対象としては、本発明に係るアビラマイシン誘導体を少なくとも一つ、好ましくは少なくとも２つ、特に好ましくは、従来技術から少なくとも一つの他の抗生物質を適した添加物及び／または補助薬物とともに、一つまたはそれ以上のアビラマイシン誘導体と混合したものも含む医薬品が挙げられる。上記従来技術から少なくとも一つの他の抗生物質としては、例えばバンコマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、シソマイシン、アミカシン及び／またはトブラマイシンが挙げられる。他の静菌剤や殺菌物質も本発明に係る物質と組み合わせることが可能である。例えば、セファロスポリン、クロラムフェニコール、エタンブトール、イソニコチンアミド類、テトラサイクリン類、サルファ剤、オキサラクタム（例えばフロモキセフ、クラブラン酸）及び／またはニトロフラン類が挙げられる。
【００７６】
上述の物質はまた、特に、キャリア物質（ｃａｒｒｉｅｒ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、充填剤、溶媒、希釈剤、顔料及び／または結合剤として理解されている。上記医薬品は、注射液、ドロップ、またはシロップなどの形状の液状薬として、また顆粒、錠剤、小丸薬、膏薬、カプセル、接着絆創膏または噴霧などの形状の半固形薬として投与することが可能である。これらの使用量と同様に上記補助薬物等の選択は、医薬品が経口、非経口、静脈注射、腹腔内、皮膚内、筋肉内、鼻腔内、口腔内、直腸内、または局所的投与（例えば皮膚、粘膜、眼）によって適宜行われる。錠剤、被覆錠剤、カプセル、顆粒、ドロップ、シロップ及び液体の形状の組成物（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は経口投与に好適で、スプレーと同様に、溶液、懸濁液、及び容易に液体に戻すことの出来る乾燥組成物は、非経口的、局所的、及び吸入投与に好適である。
【００７７】
経口的または経皮的に使用できる組成物は、本発明に係るアビラマイシン誘導体を徐放性様式において放され、これにより均一なプラズマレベル（ｐｌａｓｍａ ｌｅｖｅｌ）に達する。基本的に、当業者により知られている付加的な活性因子は、本発明に係る医薬品に添加することが可能である。
【００７８】
患者へ投与される活性物質の量は、患者の体重、投与方法、疾患の兆候と重大度により様々である。通常、少なくとも１つのアビラマイシン誘導体が、０．００５から１，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５から５ｍｇ／ｋｇ投与される。
【００７９】
本発明に係るアビラマイシン誘導体に関して、抗生物質の効果が示されているので、これらは、疾患（特に感染症）の治療、及び／またはそのような疾患の治療のための医薬品の生産に基本的に好適である。従って、本発明のもう一つの対象としては、本発明に係るアビラマイシン誘導体を、例えば感染症などの治療用の抗生物質効果を有する医薬品を生産するための利用が挙げられる。
【００８０】
感染症は、ウイルス性、細菌性、原虫性病原体によって引き起こされる疾患を意味すると理解される。従って、本発明に係る抗生物質はまた真菌症、局所的皮膚または皮下真菌症の治療にも好適である。
【００８１】
しかしながら、本発明に係るアビラマイシン誘導体は細菌感染と戦うために使用されるのが好適である。とりわけ、病原体による感染症としては、らい菌、放線菌、双球菌、結核菌、アクチノミセトーマ、コリネバクテリア、リステリア、クロストリジウム、バチルス、腸球菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカスが挙げられ、特にスタフィロコッカス  アウレウス株、リケッチア菌、クラミジア、マイコプラズマ、ボレリア菌、スピロヘータ、ブルセラ菌、ボルテデラエ（Ｂｏｒｔｅｄｅｌｌａｅ）、シュードモナス菌、ヘリコバクター、ヘモフィルス、ビブリオ菌、赤痢菌、エルシニア菌、サルモネラ菌、及び他の腸内細菌科ファミリーの代表による感染症に好適である。
【００８２】
したがって、本発明に係る上記物質は、上述したような細菌の株によって起こるすべての臨床の疾患性質の治療に対して用いられる。疾患状態としては、例えば以下に記すものが挙げられる。結核症、肺炎、チフス、梅毒、パラチフス、胃炎、胃腸炎、赤痢、ペスト、腸炎、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、または（腸管組織）侵入性大腸菌（ＥＩＥＣ）による腸管の感染症と同様、大腸菌による腸外感染症や腹膜炎や虫垂炎、コレラ、レジオネラ病、百日咳、ブルセラ病、ライムボレリア症、レプトスピラ病、斑点熱、トラコーマ、淋病、髄膜炎、敗血症、らい（ハンセン）病などが挙げられる。
【００８３】
本発明のアビラマイシン誘導体による、感染症の場合に好適で、特に好適なのはスタフィロコッカス  アウレウスが含まれる場合での、上記治療の必要なヒトまたは動物の治療は、本発明のもう一つの対象である。
【００８４】
以下の欄には、本発明を実施例と図を用いて、限られることなく、さらに説明するものである。
【００８５】
［実施例］
〔実施例１〕  方法と材料の概略
ａ）菌株、プラスミド、及び、培養条件
ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７は、１％麦芽エキス、０．４％酵母エキス、０．４％グルコース、及び１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．２（ＨＡ培地）中で、３７℃で培養された。アビラマイシンＡの生産に関しては、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７及びすべての変異体は、２％Ｄ−マンニトール、２％大豆ミール、２０ｍＭ  Ｌ−バリンを含むＮＬ１９＋培地をｐＨ７．５に調整したもので培養した。ＤＮＡ操作に対しては、大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（ストラタジーン）が宿主細胞として使用された。ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７の形質転換前に、メチル化されていないＤＮＡを得るために、プラスミドを大腸菌ＥＴ１２５６７（ｄａｍ−、ｄｃｍ−、ｈｓｄＳ−、ＣｍＲ）で生成した。大腸菌株は適切な抗生物質を含むＬＢ寒天または液体培地上で培養された。
ｂ）遺伝子テクノロジー操作、ＰＣＲ／ＤＮＡシーケンス／配列解析の概略
当業者であれば知られている分子生物学の一般的な方法を用いた。大腸菌プラスミドＤＮＡの単離、ＤＮＡ切断、ＤＮＡ改変は、突出末端を埋めることや、サザンハイブリダイゼーションと同様に、それぞれ会社のキット、酵素、及び試薬（アマシャム−フャルマシア、ベーリンガーマンハイム、プロメガ、ストラタジーン）の説明書（プロトコール）に従って行った。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プロトプラスト形成、形質転換、及び再生は通常方法によって行った。ＰＣＲは、パーキンエルマーＧｅｎｅＡｍｐ２４００サーマルサイクラーで行い、その条件は記載のそして一般的な条件を用いた。オリゴヌクレオチドプライマーは、
ＡｖｉＧ４Ｆ    （５’−ＧＧＡＣＧＣＣＴＡＴＣＴＧＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＧＴ−３’）
ＡｖｉＧ４Ｒ    （５’−ＴＧＡＧＣＧＣＴＣＧＣＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＴＣＣＣ−３’）
Ｓ２Ａ          （５’−ＧＣＧＴＣＣＡＴＣＴＴＧＣＣＧＧＧＡ−３’）
Ｓ２Ｂ          （５’−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＣＣ−３’）
を使用した。
【００８６】
ヌクレオチドシーケンスはジデオキシヌクレオチド鎖の停止反応を用いて行い、自動レーザー蛍光シーケンサー（パーキンエルマーＡＢＩ）を用いた。シーケンシング反応は、７−デアザ−ｄＧＴＰでサーモシークエナーゼＣｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アマシャム）及びスタンダードプライマー（Ｍ１３ユニバーサルとリバース、Ｔ３、Ｔ７）を用いて行った。コンピューターサポートの配列解析はＤＮＡＳＩＳソフトウエアパッケージ（バージョン２．１、日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて行い、データベース検索はＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡのサーバー上のＢＬＡＳＴ２．０プログラムを用いて行った。得られた配列は、「ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）」にアクセス番号（“Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ”）ＡＦ３３３０３８として登録されていた。
ｃ）遺伝子不活性化プラスミドの構築
ａｖｉＧ４：ｐＢＳＫ‐のＳａｃＩとＥｃｏＲＩサイトにライゲーションされた１．９ｋＢ断片上にあるａｖｉＧ４遺伝子内の珍しいＮｃｏＩ制限酵素サイトは、読み枠をずらすことによる標的遺伝子不活性化のために選択された。上記１．９ｋＢ断片はＳａｃＩとＫｐｎＩで切断し、遺伝子不活性化プラスミドｐＳＰ１にライゲーションを行った。ＮｃｏＩで切断したのち、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、再度ライゲーションしたのち、改変の確認をＤＮＡシーケンシングにより行った。構築されたプラスミドはｐＭＩＫＧ４Ｅ３とした。
【００８７】
ａｖｉＨ：プラスミドｐＢＳＫ‐にライゲーションされた３．７ｋｂＳａｃＩ断片上にあるａｖｉＨ遺伝子内の珍しいＮａｒＩ制限酵素サイトは、ａｖｉＧ４と同様にＮａｒＩ制限酵素処理そして配列処理により改変された。上記３．７ｋｂ断片は、遺伝子不活性化プラスミドｐＳＰ１Ｓ２Ｎａｒを構築するためにｐＳＰ１にクローニングされた。
ｄ）新規アビラマイシン誘導体の分析
ＴＬＣ分析：ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７、変異型ＧＷ−４とＧＷ４−ＡＭ１は３日間培養された。培養物はろ別され、ろ液は固相抽出カートリッジ（ＳｅｐＰａｋ１８、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））にかけられた。上記カートリッジは、１０％から１００％メタノール（溶媒は水）までの濃度勾配によって溶出された。アビラマイシン誘導体は６０〜７０％メタノールを含むあたりでフラクションに溶出した。酢酸エチルによる抽出と溶媒回収の後、アビラマイシン誘導体は、もう一度メタノールに溶解され、ジクロロメタン／メタノール（９：１ｖ／ｖ）を溶媒とするシリカゲルプレート（シリカゲル６０Ｆ２５４、メルク（Ｍｅｒｃｋ））上のＴＬＣによって測定された。アビラマイシンは、アニスアルデヒド／Ｈ２ＳＯ４で処理した後に検出された。
ｅ）ＨＰＬＣ−ＵＶ分析
分析用ＨＰＬＣ−ＵＶは、フォトダイオードアレイ検出器及びＨＰ−ＯＤＳ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ５μｍ、２００×２ｍｍカラムをもつホーレットパッカード１０９０液体クロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １０９０ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）上で行った。溶液の組成は以下のとおりである。溶液Ａ：０．０４Ｍ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４  ｐＨ７．０緩衝液、溶液Ｂ：１００％メタノール、溶液Ｂを３０から６２％までで、流速０．２ｍＬ／分で２５分間の非線形勾配で流した。
ｆ）ＨＰＬＣ−ＭＳ分析
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析に対して、アビラマイシン誘導体は、流速０．１ｍＬ／分でＨＰ−ＯＤＳ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ；５ｍｍ）を用い、２２０ｎｍで検出し、以下の勾配：０〜５分ではＢを０％から２０％、５．１〜１２０分まででＢを９０％（溶液Ａ  Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨが３：２、溶液Ｂ  ＭｅＯＨ）で、ＨＰＬＣシステム（ＨＰ１１１０、ホーレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）、ウォルブロン（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ））に流すことが可能であった。
ｇ）ＧＣ−ＭＳ分析
変異型細胞プトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ−４によって合成される新規ガビバマイシン（本発明のアビラマイシン誘導体）の分析は、ＧＣ−ＭＳ分析を用いて、エチル化された後に行われた。上記誘導体は、ＤＭＳＯとアセトニトリル（３：４０）の混合物に溶解された。ヨウ化エチルとＫ２ＣＯ３の添加後、反応は一晩行われた。溶媒を濃縮（蒸発）させたのち、上記誘導体はジエチルエーテルとともに抽出され、ＧＣ−ＭＳにより分析された。ホーレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）５９７３  ＭＳＤシステムは、電子衝撃（ＥＩ）分析（カラム：ＳＥ５４、１２ｍ×０．２５ｍｍ；ｄｆ＝０．１２５ｍ）を得るために使用された。カラム温度は、５０℃で２分；２５℃／分昇温で１００℃まで；５℃／分昇温で２５０℃までというプログラムで管理された。
【００８８】
〔実施例２〕  アビラマイシンクラスターのクローニングとシーケンシング
アビラマイシンの生合成を含む遺伝子を含有するストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７の染色体の６０ｋｂセグメントを、クローニングし、配列解析した。ＤＮＡ配列の解析で、５４の“読み枠”があるということがわかった。ＮＤＰ−グルコース−４，６−デヒドラターゼ遺伝子ａｖｉＥ１及びオルセリン酸シンターゼ遺伝子ａｖｉＭはアビラマイシンＡの生合成に必須であることはすでに知られていた。ａｖｉＥ１及びａｖｉＭ遺伝子に隣接するＤＮＡを、生合成アビラマイシン遺伝子クラスターを同定するために単離し、配列解析した。ａｖｉＭから上流に１７．６ｋｂ、及びａｖｉＥ１から下流に３５．９ｋｂを配列解析した。それらの領域で配列解析された遺伝子は表１に示されている。図１０９は、アビラマイシン生合成遺伝子クラスターの遺伝子配置を示している。上記クラスターはアビラマイシン耐性遺伝子（ａｖｉＲｂ）及びデオキシ糖合成遺伝子（ａｖｉＺ２）により隣接されている。上記配列解析されたセグメントの中心には２５の遺伝子（ａｖｉＸ１０−ａｖｉＧＴ４）があり、すべて同じ方向に転写されている。
【００８９】
〔実施例３〕  ＯＲＦ分析
ａ）一般情報
ＯＲＦが見つかった配列のコンピュータ解析が行われた。大部分において、配列比較の結果、アビラマイシンＡの生合成について知識に関連してくる。本実施の形態に基づく熟考の結果は表１から読み取ることができる。
【００９０】
以下に、機能に関する熟考は選択した例、特にメチルトランスフェラーゼ及びハロゲナーゼ、を用いることで表されるだろう。
ｂ）ジクロロイソエバリニン酸生合成機能をもつ遺伝子
ａｖｉＭは、アビラマイシン生合成の間のオルセリン酸の形成に対応する。ａｖｉＭの上流に位置するａｖｉＮは、おそらくオルセリン酸合成のための開始因子ユニットを制御する酵素をコードする。オルセリン酸に由来するジクロロイソエバリニン酸（化学式ＩのＡ）生合成はメチル化や脱ハロゲン化（ｄｉｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ）と仮定する。驚くことに、ストレプトマイセス  アルボニガー（Ｓ．ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）のＯ−脱メチルピューロマイシン−Ｏ−メチルトランスフェラーゼであるＤｍｐＭに似ているＡｖｉＧ４及び、シュードモナスフルオレセンスＰｆ−５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｐｆ−５）のハロゲナーゼであるＰｌｔＡと似ているＡｖｉＨはオルセリン酸の改変が原因であることがわかった。
ｃ）デオキシ糖の合成機能をもつ遺伝子
２−デオキシ−Ｄ−エバロースは、Ｄ−オリボースとは炭素の３位の位置のメチル基が異なる。ｄＮＴＰ−４−ケト−２，６−ジデオキシ−Ｄ−グルコースはこのメチル化デオキシ糖の生合成における重要な中間生成物であると仮定することが出来る。ストレプトマイセス  フラジアエ（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）の３Ｃ−メチルトランスフェラーゼであるＴｙｌＣＩＩＩと似ているＡｖｉＧ１（５４％アミノ酸相同性）を用いたメチル化及び、ＡｖｉＺ１またはＡｖｉＺ２によるケト還元化が生合成を完了させる。
ｄ）ヘプタサッカライド（７単糖）鎖の改変機能をもつ遺伝子
ａｖｉＧ１、ａｖｉＧ４、ａｖｉＲａ、ａｖｉＲｂに加え４つのメチルトランスフェラーゼが上記クラスターから見つかった（ａｖｉＧ２、ａｖｉＧ３、ａｖｉＧ５、ａｖｉＧ６）。これらは潜在的メチルトランスフェラーゼと同定された。なぜなら、これらの生産物は他の生物のメチルトランスフェラーゼと似ていて、さまざまなメチル化蛋白に典型的に見られるモチーフを含んでいるという事実があるためである。本発明に係る細胞株は、分子内の異なる位置にメチル基をまったく含まない様々なアビラマイシン誘導体を生産した。これはメチル化が上記合成の最も遅い時点で行われるということを示す。ＡｖｉＧ２、ＡｖｉＧ３、ＡｖｉＧ５、ＡｖｉＧ６はＤ−フコース部分（化学式ＩのＥ）、Ｄ−マンノース部分（化学式ＩのＦ）そしてメチルエウレカン酸部分（化学式ＩのＨ）をメチル化するのであろう。
【００９１】
〔実施例４〕  ａｖｉＧ４遺伝子置換変異体の生産
変異対立遺伝子で野生株遺伝子の置換を可能にし、ａｖｉＧ４の不活性化のためのプラスミドｐＭＩＫＧ４Ｅ３が構築された。プロトプラストの形成及び、上記プラスミドｐＭＩＫＧ４Ｅ３を用いてプトマイセス  ビリドクロモゲナスの形質転換ののち、エリスロマイシン耐性コロニーが得られた。形質転換効率はおよそ１０コロニー／ｍｇプラスミドＤＮＡであった。コロニーの中には、耐性喪失を選択するため、プレート上においてエリスロマイシンなしで培養された。いくつかの感受性のあるコロニーが得られ、これは“２回交叉（ダブルクロスオーバー）”の結果であることを示す。２つの変異体、Ｇ４／２４／２０及びＧ４／２４／３０は更に研究された。Ｇ４／２４／２０及びＧ４／２４／３０から増幅されたＰＣＲ断片はＮｃｏＩによって切断できない。反対に野生株から増幅したＰＣＲ断片はＮｃｏＩによって切断できる。ＮｃｏＩで切断される染色体ＤＮＡはＧ４／２４／２０及びＧ４／２４／３０から得られた。このＤＮＡを完全長のａｖｉＧ４遺伝子を含む１．９ｋｂ断片を用いてハイブリダイゼーションさせたところ、１１ｋｂ断片が検出された。一方で期待した５ｋｂ及び６ｋｂ断片はストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７株において見つかった（図１１０）。変異体Ｇ４／２４／３０は、新しい名称プトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４として、追加実験に用いられた。
【００９２】
〔実施例５〕  ａｖｉＧ４−ａｖｉＨ二重遺伝子置換変異体の生産
プラスミドｐＳＰ１Ｓ２Ｎａｒは、ａｖｉＨ遺伝子を欠失させるために構築された（実施例１）。ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４プロトプラストは該プラスミドによって形質転換された。およそ２０個のエリスロマイシン耐性コロニーが１ｍｇＤＮＡ当たりに現われた。それらの中にはエリスロマイシン耐性が喪失したのか（すなわち“２回交叉（ダブルクロスオーバー）”を示す）どうかをスクリーニングするために培養された。変異体ＧＷ４−ＡＭ１は追加実験のために選択された。プライマーＳ２Ａ及びＳ２Ｂを用いてＧＷ４−ＡＭ１からＰＣＲにより得られた１．３４ｋｂ断片は、ＮａｒＩによって切断されない。一方でＧＷ４からのＰＣＲ断片はＮａｒＩによって切断される。ａｖｉＨ内で欠失が起こったことを確かめるために、サザンブロット解析が行われた。ＧＷ４−ＡＭ１の染色体ＤＮＡはＮａｒＩによって切断する。そしてａｖｉＨ遺伝子を含む３．７ｋｂのプローブとハイブリッドする。ＧＷ４の染色体ＤＮＡの場合は４．３ｋｂと１．４ｋｂの断片だったのに対し、予想した通り５．７ｋｂ断片が検出された（図示なし）。
【００９３】
〔実施例６〕  ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４及びストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４−ＡＭ１の完成
上記変異が所望の遺伝子及びその他の遺伝子に関連するかどうかを明らかに検討するために、ｅｒｍＥ上流プロモーターの後ろにａｖｉＧ４及びａｖｉＨを連結し（ｌｉｇａｔｅｄ）、インテグレーションプラスミドｐＳＥＴ１５２にクローニングした。そして、このプラスミドを、プロトプラスト形質転換手段により、対応する変異株に導入した。そして、アビラマイシン及びガビバマイシンそれぞれの生産を復元した。これにより、「上流」または「下流」の効果を排除することができる。
【００９４】
〔実施例７〕  ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４及びストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４−ＡＭ１からの新規に形成されたアビラマイシン誘導体の分析
アビラマイシンＡ（Ｍ＋Ｎａ：１４２５）及びアビラマイシンＣ（Ｍ＋Ｎａ：１４２７）は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析を用いてストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴＵＥ５７（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ Ｔｕｅ５７）の抽出物から検出された。アビラマイシンＣが主要構成である。高い分析での測定で両構成は、それらの典型的同位体パターンにより認識されることが可能な２つの塩素元素を有していることがわかった。ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４によって形成される２つの主要構成の質量は１４１１（Ｍ＋Ｎａ）及び１４１３（Ｍ＋Ｎａ）であり、事実ａｖｉＧ４がメチルトランスフェラーゼをコードしていることを示す。変異体ＧＷ４の主要生産物は単離され、ヨウ化エチルで処理することによりエチル化され、メタノール及び塩酸を用いて加水分解された。反応生成物はＧＣ−ＭＳを用いて分析された。そのマススペクトルは図１１２に示すようにいくつかのピークが示された。ｍ／ｚ４３６のピークはジクロロ−ジ−Ｏ−エチルオルセリン酸のＤ−オリボシルエステルに相当し、他のピーク（ｍ／ｚ４０５、ｍ／ｚ２７５、ｍ／ｚ２４７）のほとんどが、オルセリン酸分子から由来した断片に相当した（図１１２）。これは、アビラマイシンＡ（Ｃ）と新規誘導体ガビバマイシンＡ１（Ａ３）との違いが、オルセリン酸分子の構造の改変に由来するという結果を明らかにするものである。
【００９５】
Ｒ１からＲ９残基に対する以下の意味をもつ、一般化学式Ｉに相当するガビバマイシンＡ１及びＡ３：
【００９６】
【表１７】
2004518803.tif 000012
【００９７】
ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４−ＡＭ１もまたＨＰＬＣ−ＭＳを用いて解析された。２つの主要アビラマイシン誘導体の質量は、１３４３（Ｍ＋Ｎａ）及び１３４５（Ｍ＋Ｎａ）であった。変異体ＧＷ４の主要誘導体の同位体パターンの比較において、変異体ＧＷ４−ＡＭ１の主要誘導体の同位体パターンは塩素原子に対するシグナルをまったく示さなかった（図１１１）。これはａｖｉＨの不活性化が両塩素原子の喪失を導いたということを示すものである。新規誘導体は、ガビバマイシンＢ１（アビラマイシンＡアナログ）及びガビバマイシンＢ３（アビラマイシンＣアナログ）という名前が付けられた。
【００９８】
Ｒ１からＲ９部分に対する以下の意味をもつ、一般化学式Ｉに相当するガビバマイシンＢ１及びＢ３：
【００９９】
【表１８】
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【０１００】
〔実施例８〕  ガビバマイシンＡ３の生物学的特性
ガビバマイシンＡ３の抗菌範囲は決定され、アビラマイシンＡのものと比較された。この背景において、クリニカルラボラトリースタンダードに対する国際委員会（ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）の規則に従って“液体微量希釈”方法が用いられた。両代謝物質はバチルス  ズブチリス（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ６５３８、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ６５３８Ｐ、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ２９２１３、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｑ４８−１．２．１、エンテロコッカス  ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ２９２１２、エンテロコッカス  ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｈ−７−６、スタフィロコッカス  プネモニア（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｍｏｎｉａｅ）ＡＴＣＣ４９６１９に対して抗菌性を示した。
【０１０１】
さらに、予備試験から、ガビバマイシンはさまざまなスタフィロコッカス  アウレウス株に対してアビラマイシンＡよりもいくらか活性が高いということがわかった。加えてＲｆ値から明らかになったように、はるかに親水性が高いということが示された。非塩素化ガビバマイシン誘導体もまた抗菌性を示した。
【０１０２】
〔実施例９〕  本発明に係るアビラマイシン誘導体と同様、変異型ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ２及びＧＷ５はそれらから形成される。
【０１０３】
変異型ＧＷ２及びＧＷ５は、すべてのアビラマイシン誘導体がそれぞれの実施例においてＲ３＝ＯＨである２つの変異型によって合成される場合、Ｒ６＝Ｈである変異型ＧＷ２の生成物の場合、Ｒ９＝Ｈである変異型ＧＷ５の生成物の場合にストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスに基づいて生産された。この背景において、生産方法は実施例４から６、特に実施例５と完全に相似であった。そのため、二重変異であるＧＷ２の場合に、ａｖｉＧ４だけではなく、ａｖｉＧ２においてもまた遺伝子的に改変（欠失）された。二重変異である変異型ＧＷ５の場合もまた、ａｖｉＧ４だけではなく、ａｖｉＧ５においても遺伝子的に改変（欠失）された。これら変異型ＧＷ２及びＧＷ５によって生産される本発明に係る生産物が、対応するメチルトランスフェラーゼ（実施例における、ａｖｉＧ２またはａｖｉＧ５のそれぞれ、及びａｖｉＧ４）が欠失されたということを明らかにする。
【０１０４】
〔実施例１０〕  非経口投与
注入目的のために、５ｇガビバマイシンＡ３は室温で１Ｌの水に溶解した。ここでもし必要ならば製薬に耐性をもつ溶解性促進剤を使用し、無水グルコースを加えることによって注入目的のための等張性条件に調整する。
【０１０５】
略６５ｋｇの体重である平均的な患者においては、上記溶液を０．５ｍｌ投与する。すなわち、２．５ｇまたは略４０ｍｇ／ｋｇである。投与した量は、あらゆる種類の禁忌を示さず、上記患者によって十分耐えられると証明した。たとえガビバマイシンＡ３の投与量が２０倍になっても、中毒性に問題はなく、十分許容された。
【０１０６】
〔実施例１１〕
要約すると、本発明によれば、ａｖｉ遺伝子群の詳細な配列解析により、本発明の複合オリゴ糖抗生物質の生合成代謝経路のモデルを示唆するいくつかの特徴が示されている。糖の生合成に関わる遺伝子の機能は、他の生物におけるＤ−オリボースの生合成に含まれる蛋白と類似性のあるアミノ酸配列に由来している。上述したように、ストレプトマイセス  ビオラセオルバーＴｕｅ２２（グラナチシン生産菌）及びストレプトマイセス  フラディエ（アーダマイシン生産菌）のＤ−オリボースの生合成において、この生合成は、グルコース−１−リン酸から始まり、当該グルコース−１−リン酸は、いくつかの酵素により、ｄＴＤＰ−Ｄ−オリボース及びｄＴＤＰ−２−デオキシ−Ｄ−オリボースに変換される。
【０１０７】
上記の代謝経路における新規の特徴としては、３つの異なるｄＴＤＰ−ヘキソース−４，６−ヒドラターゼ遺伝子が、この経路に含まれることである。配列の相同性に基づいて、ＡｖｉＥ１はｄＴＤＰ−グルコース−４，６−ヒドラターゼであり、ＡｖｉＥ３はＧＤＰ−マンノース−４，６−ヒドラターゼである。このことは、これらの異なる糖ユニット（ｓｕｇａｒ ｕｎｉｔ）のいくつかの生合成が、異なるヌクレオチドと結合するヘキソースプール（ｈｅｘｏｓｅ ｐｏｏｌ）から開始することを示している。アビラマイシンＡの構造に基づいて、いくつかの遺伝子産物の推定される機能から示されるように、Ｌ−リクソースの生合成は実質的に第３の糖プールで開始しており、これはペントース−リン酸代謝経路の生成物になりうる。
【０１０８】
アビラマイシンＡの成分Ｈは元々、２，３−ジ−Ｏ−メチレン−４，５−ジヒドロキシヘキサン酸由来のメチルエウレカン酸として記載していた。しかしながら、本発明の配列解析により、メチルエウレカン酸はまた、糖合成代謝経路（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｕｇａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｐａｔｈ）の生成物であることが示された。以上を総合すると、糖ユニットの数に基づいて、アビラマイシンクラスターは６つのグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子を有するという結果となる。しかしながら、４つのみが本発明のアビラマイシンクラスターで見られた。可能な説明としては、いくつかの合成ステップで１つまたはそれ以上のグルコシルトランスフェラーゼが含まれていること、または上記の遺伝子クラスター外の領域にコードしているグルコシルトランスフェラーゼが含まれていることが挙げられる。４つのグルコシルトランスフェラーゼのうち３つは、Ｏ−抗原構造または細胞壁の多糖の生合成に関して、より強く連想させるグルコシルトランスフェラーゼである。上記の細胞壁の多糖は、多糖の構造と類似性のあるアビラマイシンの構造により説明することができる。
【０１０９】
上記ａｖｉ代謝は、実際に他のいくつかの興味深い特徴、すなわちオルトエステル架橋（ｂｒｉｄｇｅ）及びメチレン架橋の２つの特徴を含んでいる。これらのＣ−Ｏ−Ｃ構成の酸化的性質を考慮すると、ａ−ケトグルタル酸依存性オキシゲナーゼＡｖｉＯ１、ＡｖｉＯ２、及びＡｖｉＯ３は、おそらく上記のまれな結合（ｒａｒｅ ｂｏｎｄ）の形成を触媒している。さらに記載すると、本発明によれば、上記の酵素は、いわゆる「基質」としてａ−ケトグルタル酸を用いることにより、酸化のための直接的な電子受容体として酸素分子を用いており、最終的にＣ−Ｏ−Ｃ結合、クエン酸及びＣＯ２を生成している。アビラマイシンＡ７単糖は、メチル化の手段、酢酸の接触、ジクロロイソエバリニン酸の接触、及びイソブチリルユニットの接触により改変される。６つのメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、数に関してはアビラマイシンの生合成に十分であるクラスターに存在している一方で、他の残基の接触に関する遺伝子は未だ局在しない（ｌｏｃａｌｉｚｅ）。
【０１１０】
本発明によれば、さらに興味深いことに、ａｖｉＢ１及びａｖｉＢ２は、２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体の構成因子Ｉのα鎖及びβ鎖と類似性のある酵素をコードしていることがわかった。これらの複合体は、通常、ＴＰＰ依存性デヒドロゲナーゼ（ヘテロ４量体（ａ２ｂ２））、ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼ（ホモ多量体）、及びジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ホモ２量体）の３つの酵素ユニットで構成されている。上記の複合体の後者の構成因子をコードするＯＲＦは、上記クラスター内に局在しない、または上記クラスター内に配置されていない、またはアビラマイシンの生合成に関して全て用いられない。
【０１１１】
さらに、抗生物質の効果に関して、ガビバマイシンＡ３を試験した。第１のＭＩＣ実験から、ガビバマイシンＡ３は、アビラマイシンよりもスタフィロコッカス  アウレウス株に対していくらかの強い活性を有することが示された。さらに、ＴＬＣ及びＨＰＬＣ分析から保持因子（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）が示すように、ガビバマイシンＡ３は、アビラマイシンよりもいくらか親水性があった。塩素処理していないガビバマイシン誘導体もまた、抗生物質活性を有している。
【０１１２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７のＯＲＦの５４核酸配列で、全遺伝子クラスターの配列を示すものである。図１は対応する核酸配列の略語を含んでおり、これらの略語（“Ａｖｉ”は除く）は、各例において、５４配列の開示コドンを含む配列に挿入される。各例において、開始コドンによりコードされたアミノ酸は丸をつけられている。各例の、矢印のついたところは、開始コドンを開始点として遺伝子が読まれる（前方または後方に）方向を示すものである。
２つのヌクレオチド配列の合計と潜在的にそれらからなる６つの蛋白質配列（一文字コード）をつくる図１は、３つのリーディングラスター全てにおける両方の鎖に対する２つの相補ＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列を、アミノ酸配列（一部想像）とともに含んでいる。上側のヌクレオチド鎖の３つの蛋白質配列は、関連するヌクレオチド配列上に描かれ、下側の補足のヌクレオチド配列の３つの蛋白質配列は、関連する下側のヌクレオチド鎖の下に描かれている。図１の名前によって書かれた遺伝子クラスターにおける５４蛋白質配列は、丸をつけられたアミノ酸は開始点として選択され、その後アミノ酸配列が上記リーディングラスターにおいて矢印で示された方向、すなわちそこから前方または後方、へ読み切られる（対応する配列において、例えば下側のヌクレオチド配列の下の２番目の配列）ということにおいて、図１のようになる。上記配列は、対応するリーディングラスターにおいて、対応するライン（行）内に星印で記された終止コドンで終わる。
ＯＲＦのアミノ酸に従ったヌクレオチド配列は、（上側の鎖に対して）上または下に位置された対応するトリプレット（３塩基連鎖）となる。この背景において、このアミノ酸をコードするコドンの真ん中の上または下にある、アミノ酸の一文字表記は、それぞれの例において、そのように配置される。
続く表では、遺伝子クラスター内の５４のコード領域の名前表記はそれぞれ、配列番号に対して当てられ、各例において、配列番号１から５４はヌクレオチド配列を示し、配列番号５５から１０８は関連するアミノ酸に対応する。例えば、配列番号１のヌクレオチド配列は配列番号５５のアミノ酸配列をコードし、配列番号２のヌクレオチド配列は配列番号５６のアミノ酸配列をコードするということである。
【図１０９】
図１０９は、遺伝子クラスター上で見つけられたＯＲＦの位置関係を示したものである。
【図１１０】
図１１０は、変異型ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４のサザンブロットを示したものである。
【図１１１】
図１１１は、変異型ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４の生産物のマススペクトルを示したものである。
【図１１２】
図１１２は、変異型ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＧＷ４の加水分解物のマススペクトルを示したものである。
略したＯＲＦのその機能と配列（誘導された蛋白質の配列も含む）に対する表記は以下の表に示す。
【表１９】2004518803.tif 000014
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【図１１１】
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【図１１２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年4月4日(2003.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアステレオマーまたは光学異性体、ラセミ混合物または他の混合物、または、純粋なジアステレオマー及び／または光学異性体からなる、
一般化学式Ｉに基づくアビラマイシン誘導体。
【化１】
2004518803.tif 000332
ここで、Ｒ１〜Ｒ９は、以下の例外により互いに独立しており、
Ｒ１は、Ｈ、ＣＯＣＨ３、ＣＯＣ４Ｈ９、ＣＯＣＨ（ＣＨ３）２、またはＣＯＣＨ２ＣＨ３から選択されており、
Ｒ２は、Ｈ、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３またはＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３から選択されており、
Ｒ３は、ＯＣＨ３に対応し、
Ｒ４は、Ｃｌに対応し、
Ｒ５は、Ｃｌに対応し、
Ｒ６は、ＣＨ３に対応し、
Ｒ７は、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨに対応し、
Ｒ８は、ＣＨ３に対応し、
Ｒ９は、ＣＨ３に対応している。
ここで、上記の定義の他に、化学式Ｉの残基Ｒ３〜Ｒ６、Ｒ８またはＲ９のうち少なくとも１つを以下のように参照して適用され、
Ｒ３はＯＨで置き換えられ、
Ｒ４はＨで置き換えられ、
Ｒ５はＨで置き換えられ、
Ｒ６はＨで置き換えられ、
Ｒ８はＨで置き換えられ、及び／または
Ｒ９はＨで置き換えられている。
ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、各々の例として、それぞれ化合物１〜４の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【表１】
2004518803.tif 000333
【請求項２】
少なくとも、Ｒ３はＯＨで置き換えられていることを特徴とする請求項１に記載のアビラマイシン誘導体。ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、化合物１の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【表２】
2004518803.tif 000334
【請求項３】
化学式Ｉの少なくともＲ４及びＲ５が、Ｈに置き換えられていることを特徴とする請求項１または２に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項４】
少なくともＲ６、Ｒ８及び／またはＲ９が、Ｈに置き換えられていることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のアビラマイシン誘導体。ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、化合物３の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない、またはＲ１〜Ｒ９は、化合物４の組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【表３】
2004518803.tif 000335
【請求項５】
少なくともＲ３がＨに置き換えられており、これとは別に少なくともＲ４及びＲ５はＨに置き換えられており、または少なくともＲ６、Ｒ８及び／またはＲ９がＨに置き換えられていることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項６】
ジアステレオマーまたは光学異性体、ラセミ混合物または他の混合物、または、純粋なジアステレオマー及び／または光学異性体からなる、
一般化学式Ｉに基づくアビラマイシン誘導体であって、
Ｒ１〜Ｒ９が以下の組み合わせからなる化合物の中から選択されることを特徴とするアビラマイシン誘導体。
【表４】
2004518803.tif 000336
【表５】
2004518803.tif 000337
【表６】
2004518803.tif 000338
好ましくは、
【表７】
2004518803.tif 000339
【請求項７】
ａ）ジクロロエベリン酸末端成分（化学式ＩのＡ成分）と、
ｂ）ｉ）２つのＤ−オリボース成分（Ｂ及びＣ成分）
ｉｉ）２−デオキシ−Ｄ−エバロース成分（Ｄ成分）
ｉｉｉ）Ｄ−フコース成分（Ｅ成分）
ｉｖ）Ｄ−マンノース成分（Ｆ成分）
ｖ）Ｌ−リクソース成分（Ｇ成分）、及び
ｖｉ）（メチル）エウレカン酸成分（Ｈ成分）
上記の成分が正規のエステル結合及びオルトエステル結合を介して連結しているエステル化した７単糖（化学式ＩのＢ〜Ｈ成分）とからなるオルトソマイシン基体の合成に必要な遺伝子及び／または酵素を含有する培養細胞から得られるアビラマイシン誘導体であって、
図１を組み合わせた表１に基づく、図１〜５４のうち１つに基づく核酸配列の少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応する核酸配列の、少なくとも１つの核酸を遺伝子工学的な改変、欠損及び／または発現不能にして、
上記のように改変した細胞を培養して、培養上清を回収及び処理して、アビラマイシン誘導体を精製及び単離して、該当する場合、異なるアビラマイシン誘導体を互いに分離することにより得られることを特徴とするアビラマイシン誘導体。
ただし、Ｒ１〜Ｒ９は、各々の例として、以下に示すような化合物１〜１６のうち１つの組み合わせに従い、同時に意味をとることができない。
【表８】
2004518803.tif 000340
【請求項８】
上記培養細胞が、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または、遺伝子工学的な改変、欠損、または発現不能にした核酸を除いて、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４のうち１つの配列に基づく核酸を含有する、または、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または特にはストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７型の細胞から選択される、上記核酸と少なくとも９５％、好ましくは９７％相同性を有する、または図１０９に基づく遺伝子クラスターを含む核酸を含有する細胞から選択されることを特徴とする請求項７に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項９】
上記の改変された核酸が、メチルトランスフェラーゼ及び／またはハロゲナーゼをコードすることを特徴とする請求項７または８に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項１０】
改変前の改変される核酸が、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１または２〜７に基づく配列のうち少なくとも１つ、好ましくは（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１、２、４または６に基づく配列のうち１つ、特には（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号２の配列または配列番号２及び１、２及び４、または２及び６に基づく配列の核酸配列に対して、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることを特徴とする請求項９に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項１１】
上記核酸の改変を行った結果、遺伝子工学的に改変された核酸によりコードされる蛋白またはポリペプチドが、遺伝子工学的に改変した後に、全く合成されないことを特徴とする請求項７〜１０の何れか１項に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項１２】
アビラマイシンＡまたはＣ、またはエバリニマイシン（ジラシン）よりも親水性であることを特徴とする請求項１〜５、６、または７〜１１に記載のアビラマイシン誘導体。
【請求項１３】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜７、１０、１６、２１または２２の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している配列中の核酸。
【請求項１４】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号が１〜７、好ましくは１、２、４、または６の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることを特徴とする請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜７、１０、１６、２１、及び２２の配列に基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応し、かつ、好ましくは図１０９に基づいて核酸鎖で構成されている、好ましくは５４個の「読み枠」を含む遺伝子クラスター。
【請求項１６】
アミノ酸配列で、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号５５〜６１、６４、７０、７５、または７６の配列のうち１つに基づくアミノ酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している蛋白またはポリペプチド。
【請求項１７】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号が５５〜６１、好ましくは５５、５６、５８、または６０の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることを特徴とする請求項１６に記載の蛋白またはポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３または１４に係る非内因性の核酸、請求項１５に係る非内因性の遺伝子クラスター、及び／または請求項１６または１７に係る非内因性の蛋白又はポリペプチドのうち少なくとも１つを含有する、遺伝子工学的に改変された細胞。
【請求項１９】
改変前に、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜７、１０、１６、２１、または２２の配列に基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している配列を遺伝子工学的に改変した核酸を少なくとも１つ含有する細胞。
【請求項２０】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜７、１０、１６、２１、または２２の配列の１つに基づく配列を有する核酸のうち少なくとも１つが遺伝子工学的に改変されている、または、欠損していることを特徴とするストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、好ましくはＴｕｅ５７亜型の細胞。
【請求項２１】
（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１または２〜７の配列のうち１つ、好ましくは（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１、２、４または６の配列のうち１つ、特には（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号２の配列または配列番号２及び１、２及び４、または２及び６の配列に基づく配列を有する核酸の、少なくとも１つが遺伝子工学的に改変されている、または、欠損していることを特徴とする請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
Ｒ３＝ＯＨのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ４により合成されており、Ｒ３＝ＯＨ、Ｒ４＝Ｈ、及びＲ５＝Ｈのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ４−ＡＭ１により合成されており、Ｒ３＝ＯＨ及びＲ６＝Ｈのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ２により合成されており、Ｒ３＝ＯＨ及びＲ９＝Ｈのアビラマイシン誘導体は、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ５により合成されていることを特徴とするストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ４−ＡＭ１、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ２、またはストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス変異型ＧＷ５の請求項２０または２１に記載の細胞。
【請求項２３】
アビラマイシン誘導体、好ましくは請求項１〜１２の何れか１項に係るアビラマイシン誘導体を製造するための、請求項１３または１４に係る核酸、請求項１６または１７に係る蛋白またはポリペプチド、及び／または請求項１８〜２２のうち何れか１項に係る細胞の利用。
【請求項２４】
請求項１〜６の何れか１項に記載のアビラマイシン誘導体の製造方法であって、
（１）ａ）ジクロロエベリン酸末端成分（化学式ＩのＡ成分）と、
ｂ）ｉ）２つのＤ−オリボース成分（Ｂ及びＣ成分）
ｉｉ）２−デオキシ−Ｄ−エバロース成分（Ｄ成分）
ｉｉｉ）Ｄ−フコース成分（Ｅ成分）
ｉｖ）Ｄ−マンノース成分（Ｆ成分）
ｖ）Ｌ−リクソース成分（Ｇ成分）、及び
ｖｉ）（メチル）エウレカン酸成分（Ｈ成分）
上記の成分が正規のエステル結合及びオルトエステル結合を介して連結しているエステル化した７単糖（化学式ＩのＢ〜Ｈ成分）とからなるオルトソマイシン基体の合成に必要な遺伝子及び／または酵素を含有する培養細胞において、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜７、１０、１６、２１、または２２の配列の１つに基づく核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応している核酸配列のうち少なくとも１つの核酸を遺伝子工学的に改変する、欠損する、及び／または発現不能にする工程と、
（２）上記のように遺伝子工学的に改変された細胞を培養する工程と、
（３）培養上清を回収する工程と、
（４）培養上清を処理し、上記の構造のアビラマイシン誘導体を精製及び単離する工程と、
（５）該当する場合、異なる誘導体を互いに分離する工程とを含むことを特徴とするアビラマイシン誘導体の製造方法。
【請求項２５】
上記培養細胞が、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または、遺伝子工学的な改変、欠損、または発現不能にした核酸を除いて、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１〜５４の配列に基づく核酸を含有する、または、ストレプトマイセス  ビリドクロモゲナス型の細胞、または特にはストレプトマイセス  ビリドクロモゲナスＴｕｅ５７型の細胞から選択される、上記の核酸配列と９５％、好ましくは９７％相同性を有する核酸、または請求項１５に係る遺伝子クラスターを含有する細胞から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
改変される核酸は、メチルトランスフェラーゼ及び／またはハロゲナーゼをコードすることを特徴とする請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
改変前の改変される上記核酸の配列が、（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１または２〜７の配列のうち少なくとも１つ、好ましくは（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号１、２、４または６の配列のうち１つ、特には（表１と図１との組み合わせに基づく）配列番号２の配列または配列番号２及び１、２及び４、または２及び６の配列の核酸配列と、少なくとも９５％、好ましくは９７％、特には正確に対応していることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記核酸の改変により、遺伝子工学的に改変された核酸によりコードされる蛋白またはポリペプチドが、上記遺伝子工学的な改変後に、全く合成されないことを特徴とする請求項２４〜２７のうち何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
必要に応じて、適した添加物及び／または補助薬物といった、請求項１〜１２の何れか１項のアビラマイシン誘導体を含有する医薬品。
【請求項３０】
治療のための抗生物質の効果をもつ医薬品の製造のための、または、例えば、感染症といった疾病を治療するための医薬品の製造のための、請求項１〜１２の何れか１項のアビラマイシン誘導体の利用。
【国際調査報告】
2004518803.tif 000341
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2004518803.tif 000343
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