(57)【要約】部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏを含有するアミノ酸配列を有し、前記部分配列のＴｈｒはアミノ酸配列の２８５〜３１０位にあり、及びこの際１位は開始メチオニンであるホモセリントランススクシニラーゼ野生型酵素と比較してＬ−メチオニン又はＳＡＭに対して減少した感受性を示すホモセリントランススクシニラーゼにおいて、前記ホモセリントランススクシニラーゼは野生型酵素と比較して少なくとも２アミノ酸の変異を有し、前記の変異が部分配列のＴｈｒ又は前記部分配列のＣ末端にあることを特徴とする、ホモセリントランススクシニラーゼ。
2006503568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏを含有するアミノ酸配列を有し、前記部分配列のＴｈｒはアミノ酸配列の２８５〜３１０位にあり、及びこの際１位は開始メチオニンであるホモセリントランススクシニラーゼ野生型酵素と比較してＬ−メチオニン又はＳＡＭに対して減少した感受性を示すホモセリントランススクシニラーゼにおいて、前記ホモセリントランススクシニラーゼは野生型酵素と比較して少なくとも２アミノ酸の変異を有し、前記の変異が部分配列のＴｈｒ又は前記部分配列のＣ末端にあることを特徴とする、ホモセリントランススクシニラーゼ。
【請求項２】
ホモセリントランススクシニラーゼは、少なくとも５アミノ酸、有利には少なくとも１０アミノ酸の変異を有することを特徴とする、請求項１記載のホモセリントランススクシニラーゼ。
【請求項３】
野生型酵素と比較して、阻害剤ＳＡＭ及び／又はＬ−メチオニンに対して、少なくとも２倍上昇した耐性（上昇したＫｉ）を示すことを特徴とする、請求項１又は２記載のホモセリントランススクシニラーゼ。
【請求項４】
表１にまとめられた突然変異を有することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項記載のホモセリントランススクシニラーゼ。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項記載のホモセリントランススクシニラーゼをコードするｍｅｔＡ対立遺伝子。
【請求項６】
請求項５記載のｍｅｔＡ対立遺伝子を、プロモーターと共に含有することを特徴とするプラスミド。
【請求項７】
請求項５記載のフィードバック耐性ｍｅｔＡ対立遺伝子を含有することを特徴とする微生物株。
【請求項８】
グラム陰性細菌株、特にＥ．Ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求項７記載の微生物株。
【請求項９】
請求項７又は８記載の微生物株の培養によるＬ−メチオニン又はＳＡＭの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフィードバック耐性ホモセリントランススクシニラーゼ、これらの酵素を含有する微生物株、並びにＬ−メチオニン又はＳ−アデノシルメチオニンの製造のための前記微生物株の使用に関する。
【０００２】
メチオニンはヒトのために及び多くの動物のために必須なアミノ酸である。メチオニンは特に、飼料市場のために製造され、及びラセミ体として動物飼料に添加される。合成は化学的に、アクロレイン及びメタンチオールから、３−（メチルチオ）−プロピオンアルデヒドを経て行われ、前記３−（メチルチオ）−プロピオンアルデヒドは青酸、アンモニア及び二酸化炭素と、ヒダントインを経てＤ、Ｌ−メチオニンへと変換される。ラセミ体分離は酵素によって行われてよい。
【０００３】
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は代謝において最も重要なメチル基ドナーで、及び薬学の範囲内ではうつ病、肝臓疾患及び関節炎の治療の際に使用される。ＳＡＭ製造のための記載された方法は特にＬ−メチオニンの前駆体の存在下での酵母の培養（Ｓｃｈｌｅｎｋ  Ｆ．ｕｎｄ  ＤｅＰａｌｍａ  Ｒ．Ｅ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１０３７−１０５０（１９５７）、Ｓｈｉｏｚａｋｉ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３、３２６９−３２７４（１９８９））、及び自己分解の後のクロマトグラフィによる精製を含む。
【０００４】
メチオニンの微生物的合成は殊に主に細菌Ｅ．Ｃｏｌｉにおいて研究された（Ｇｒｅｅｎｅ、Ｒ．Ｃ．、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｉｎ：Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  Ｆ．Ｃ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ（１９９６）、５４２−５６０ｐ及びその中に含まれた参考文献）。これは酵素による一連の触媒反応からなり、及び強力に制御されている。アスパラギン酸塩から出発した、ホモセリンまでの合成の第１工程は、アミノ酸、トレオニン、ロイシン、イソロイシン及びバリンの形成のために並行に進行する。第１の、メチオニン合成のための特異的な工程は、補酵素Ａの脱離下でのスクシニルＣｏＡ及びホモセリンからなるＯ−スクシニルホモセリンの形成である。この反応は酵素、ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ（ホモセリン−Ｏ−トランススクシニラーゼ、ＭｅｔＡ、ＥＣ２．３．１．４６）により触媒される。ＳＡＭの合成はＬ−メチオニン及びＡＴＰからの一工程において行われる。
【０００５】
ホモセリントランススクシニラーゼの活性は、Ｌ−メチオニン及び／又はＳＡＭの存在下で阻害される（Ｌｅｅ  Ｌ．−Ｗ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１、５４７９−５４８０（１９６６））。これらの終産物阻害は一方では細菌における、メチオニン及びＳＡＭの、過剰な、エネルギーを消費する合成を妨げ、他方ではしかし工業規模におけるこれら両方の物質の微生物的製造を難しくする。ホモセリントランススクシニラーゼをコードする遺伝子は９３０（終止コドンもいれて）塩基対から、これをコードしたタンパク質は３０９アミノ酸からなる。これまでホモセリントランススクシニラーゼの構造は解明されず、及び従って終産物阻害に関与するアミノ酸の同定は可能でない。
【０００６】
代謝終産物の合成を強める公知の方法は変異した酵素の使用であり、前記酵素の活性は、その代謝経路の終産物によってもはや阻害可能でない（フィードバック耐性突然変異体）。従って例えばＬ−トリプトファン及びＬ−フェニルアラニンの合成の向上のために３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプチュロン酸−７−リン酸合成酵素のフィードバック耐性突然変異体が製造され（ＥＰ０７４５６７１Ａ２）、及びフェニルアラニンの製造の向上のためにコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドロゲナーゼのフィードバック耐性突然変異体が生産された（ＵＳ５１２０８３７）。
【０００７】
最近は、Ｅ．Ｃｏｌｉからの酵素ホモセリントランススクシニラーゼが、これをコードするＤＮＡ配列の突然変異によって、Ｌ−メチオニン又はＳＡＭの存在下で、生じたタンパク質がその活性の明らかに減少した阻害性を示すように変異された（ＪＰ２０００１３９４７１Ａ；ＤＥ１０２４７４３７（同一出願人の出願）。これはこの場合点突然変異であり、即ち、そのつど１個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置換された（ＪＰ２０００１３９４７１Ａ：２７位のアルギニンがシステインによって置換され、２９６位のイソロイシンがセリンによって、及び２９８位のプロリンがロイシンによって；ＤＥ１０２４７４３７：１０１位のアスパラギン酸塩又は２９４位のチロシンが他の天然のアミノ酸によって置換された）。変異されたホモセリントランススクシニラーゼは野生型酵素と比較して阻害剤Ｌ−メチオニン及び／又はＳＡＭの存在下で改善された活性を示した。これらの変異されたタンパク質を含有する細菌株は向上したＬ−メチオニン製造を示す。
【０００８】
その活性の度合い及びＬ−メチオニン及び／又はＳＡＭによるその阻害性の度合いにおいて異なるホモセリントランススクシニラーゼの可能な限り多くの変異体を提供することが望ましく、というのは、Ｌ−メチオニン及びＳＡＭの微生物的生合成は、その進行及びその制御においてもっとも複雑で、及び更に細胞中の多様な他の代謝経路と複雑に関係しているからである。従ってどの変異体で、微生物株の成長、その生命に必要な代謝進行のバランス、及びＬ−メチオニン及びＳＡＭの製造に対するどのような効果が獲得されることが可能か、予め予想することはできない。
【０００９】
本発明の課題は、野生型（ＷＴ）酵素と比較して、Ｌ−メチオニン及びＳＡＭに関してより高いフィードバック耐性を有する、ホモセリントランススクシニラーゼ（ＭｅｔＡタンパク質）の新規の変異体の幅広い多様性を提供することである。
【００１０】
この課題は、部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏを含有するアミノ酸配列を有し、前記部分配列のＴｈｒはアミノ酸配列の２８５〜３１０位にあり、及びこの際１位は開始メチオニンであるホモセリントランススクシニラーゼ野生型酵素と比較してＬ−メチオニン又はＳＡＭに対して減少した感受性を示すホモセリントランススクシニラーゼであって、前記ホモセリントランススクシニラーゼは野生型酵素と比較して少なくとも２アミノ酸の変異を有し、前記の変異が部分配列のＴｈｒ又は前記部分配列のＣ末端にあることを特徴とする、ホモセリントランススクシニラーゼにより解決された。
【００１１】
Ｅ．ＣｏｌｉのＭｅｔＡタンパク質においては部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏにおいて２９７位において保存されたＴｈｒがある（参照、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）。Ｘａａは任意の天然のアミノ酸を意味する。
【００１２】
特にこれは少なくとも５アミノ酸の変異、特に有利には少なくとも１０アミノ酸の変異である。変異とは、欠失または挿入であってもよい。
【００１３】
これまでは、野生型に対する変異は単独のアミノ酸の交換に基づく、フィードバック耐性ホモセリントランススクシニラーゼのみが公知である（ＪＰ２０００１３９４７１Ａ）。タンパク質のフォールディングは極度に複雑な事柄であり、及び酵素活性は直接的にタンパク質の立体構造に依存しているので、タンパク質のより大きな変異は大抵の場合、結果として活性の損失を有する。意外にも、しかしながら、ＭｅｔＡのカルボキシ末端部分における本発明による複数の変異は、Ｌ−メチオニン及びＳＡＭに対するフィードバック阻害性の減少を導くことが見出された。
【００１４】
本発明によるホモセリントランススクシニラーゼは、野生型酵素と比較して、阻害剤ＳＡＭ及び／又はＬ−メチオニンに対して改善された耐性を示す。特にこれは野生型と比較して、メチオニン及び／又はＳＡＭに対して、ホモセリントランススクシニラーゼの少なくとも２倍上昇した耐性を示す。殊に有利には本発明によるホモセリントランススクシニラーゼは、野生型と比較して、メチオニン及び／又はＳＡＭに対して、１０倍上昇した耐性、殊に有利には５０倍上昇した耐性を有する。
【００１５】
殊に有利には本発明によるホモセリントランススクシニラーゼのタンパク質配列は表１にまとめられた突然変異を有する。
【００１６】
本発明によるホモセリントランススクシニラーゼは例えば、本発明によるホモセリントランススクシニラーゼをコードするＤＮＡ配列の発現により得られてよい。
【００１７】
本発明は従って、本発明によるホモセリントランススクシニラーゼをコードするＤＮＡ配列にも関する。
【００１８】
前記ＤＮＡ配列は、１個又は複数個の変異した塩基が部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏ中のトレオニン、Ｔｈｒのためのコドン以降の３′領域内に存在し、この場合Ｔｈｒはこの配列において２８５〜３１０位の間にあることを特徴とする、ｍｅｔＡ遺伝子の１個又は複数個のコドンにおける少なくとも１個の塩基の突然変異により得ることが可能である。Ｅ．ＣｏｌｉのＭｅｔＡタンパク質においては部分配列のＴｈｒは配列の２９７位にある（参照、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）。
【００１９】
以下に、本発明によるＤＮＡ配列はフィードバック耐性ｍｅｔＡ対立遺伝子と呼ばれる。本発明の枠内においてはｍｅｔＡ対立遺伝子とは、アルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いた解析の場合に、Ｅ．ＣｏｌｉのＷＴ−ｍｅｔＡ遺伝子に対して５０％よりも高い配列同一性を有する遺伝子であるとも解釈することが可能である。同様に、Ｅ．Ｃｏｌｉの野生型ホモセリントランススクシニラーゼに対して、５０％よりも高い配列同一性（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｕｓ  ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）  Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びホモセリントランススクシニラーゼ活性を有するタンパク質は、ホモセリントランススクシニラーゼであると解釈することが可能である。
【００２０】
特に本発明によるｍｅｔＡ対立遺伝子のＤＮＡ配列は表１に挙げられた突然変異を含有する。
【００２１】
本発明によるｍｅｔＡ対立遺伝子は例えば非特異的変異誘発により又は目標を定めた変異誘発により、次に記載された出発材料から製造される。非特異的突然変異は、挙げられたＤＮＡ領域内で例えば化学的薬剤（例えば１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸その他）により、及び／又は物理的な方法により、及び／又は決まった条件下で実施されたＰＣＲ反応により、及び／又はミューテーター株（例えばＸＬ１−Ｒｅｄ）中のＤＮＡの増幅により発生されてよい。ＤＮＡフラグメント内の特異的な部位における突然変異の導入のための方法は公知である。フィードバック耐性ｍｅｔＡ対立遺伝子の生産のための更なる可能性は、新規の特性を有する複数の突然変異体となる、様々な、フィードバック耐性へと導く突然変異の組み合わせである。
【００２２】
変異誘発のための出発材料として、特に野生型ｍｅｔＡ遺伝子のＤＮＡが使用される。変異するｍｅｔＡ遺伝子は染色体に又は染色体外にコードされてよい。前述の変異誘発方法の適用により、ＤＮＡ配列の１個又は複数個のヌクレオチドは、今や遺伝子によりコードされたタンパク質が本発明による複数の突然変異を示すように変異される。
【００２３】
記載された技術によって、任意のｍｅｔＡ遺伝子に、挙げられたＤＮＡ領域中の１個又は複数個の突然変異が導入される。これらの突然変異により、コードされたホモセリントランススクシニラーゼはＳＡＭ及び／又はＬ−メチオニンに対するフィードバック耐性へと導くアミノ酸配列を有する。
【００２４】
例えば、記載されたように実施された変異誘発に関連して、所望の表現型を有する突然変異体の選択が、例えば変異されたホモセリントランススクシニラーゼのＬ−メチオニン感受性及び／又はＳＡＭ感受性の大きさの決定により行われる。
【００２５】
本発明の更なる対象は、フィードバック耐性ｍｅｔＡ対立遺伝子を含有する微生物である。そのような微生物の株は、少なくともフィードバック耐性ｍｅｔＡ対立遺伝子により制御解除されたＬ−メチオニン代謝又はＳＡＭ代謝を有することを特徴とする。全ての微生物の場合に、同一の、それ自体公知の経路を経てこの代謝は進行し、及び本発明による株の製造のために適用可能な技術は、例えば標準的な教書から一般に公知であり、及び全ての微生物に適用可能であるので、本発明による株は任意の微生物から製造可能である。有利には本発明による株の製造には細菌が適している。特に有利に適しているのは、グラム陰性細菌、殊にＥ．Ｃｏｌｉである。
【００２６】
本発明の更なる対象は、本発明による微生物の培養によるＬ−メチオニン又はＳＡＭの製造、更に、メチオニンを含有する生成物（例えばメチオニン含有ペプチド）又は微生物の代謝においてＬ−メチオニン又はＳＡＭから誘導される生成物（例えばポリアミン、リポ酸、ビオチン及びキノン）の製造のための本発明による微生物の使用である。更に野生型と比較してより増加した量においてＳＡＭを製造する本発明による微生物は、ＳＡＭのメチル基の転移により生じる生成物の製造のために使用されることが可能である。
【００２７】
フィードバック耐性ｍｅｔＡ対立遺伝子は、変異したホモセリントランススクシニラーゼ酵素の発現のために、通常の方法を用いて、宿主株に形質転換される。
【００２８】
ホモセリントランススクシニラーゼのＬ−メチオニン感受性及び／又はＳＡＭ感受性の決定のために、Ｌ−メチオニン又はＳＡＭの存在下で酵素の活性を決定することを可能にする、全ての方法が使用されてよい。例えば、セリンアセチルトランスフェラーゼの活性の決定のためのＫｒｅｄｉｃｈ及びＴｏｍｋｉｎｓによって記載された方法（Ｋｒｅｄｉｃｈ  Ｎ．Ｍ．ｕｎｄ  Ｔｏｍｋｉｎｓ  Ｇ．Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１、４９５５−４９６５（１９６６））にのっとって、ホモセリントランススクシニラーゼ活性の決定が行われてもよい。酵素活性は、ホモセリン及びスクシニルＣｏＡを含有するバッチにおいて測定される。反応は酵素添加により開始され、及び２３２ｎｍの際の吸光度の検査を介して、前記吸光度はスクシニル補酵素Ａ中のチオエステル結合の開裂により生じ、分光光度計において追跡される。記載された試験は、ホモセリントランススクシニラーゼのＬ−メチオニン感受性の決定のために適する。ホモセリントランススクシニラーゼ活性の阻害は様々な濃度のＬ−メチオニンの存在下で反応バッチにおいて試験される。様々なホモセリントランススクシニラーゼの触媒活性はＬ−メチオニンの存在下及び非存在下で決定され、及びそこから阻害定数Ｋｉが算出され、これは、どの濃度の場合に、活性はまだなお阻害剤の非存在下で測定可能な活性の５０％を有するか、その阻害剤濃度を示す。
【００２９】
様々なホモセリントランススクシニラーゼの活性のＳＡＭ感受性の決定のために、例えばＬｅｅ  Ｌ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１、５４７９−５４８０（１９６６）において記載されたような活性試験が行われる。この場合ホモセリン及びスクシニルＣｏＡと共に酵素抽出液はインキュベートされる。様々な時点の後に、試験バッチの一部はエタノール、水及び５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）からの混合物に対する添加によって終了される。吸光度は４１２ｎｍで測光的に決定される。記載された試験は例えばホモセリントランススクシニラーゼのＳＡＭ感受性の決定に適している。ホモセリントランススクシニラーゼ活性の阻害は、反応バッチ中の様々な濃度のＳＡＭの存在下において試験される。様々なホモセリントランススクシニラーゼの触媒活性はＳＡＭの存在下及び非存在下において決定され及びそこから阻害定数Ｋｉが算出される。
【００３０】
通常は、変化のない酵素活性で、減少したＬ−メチオニン感受性及び／又はＳＡＭ感受性を有するホモセリントランススクシニラーゼが有利である。その他の目的のためには、Ｌ−メチオニン感受性及び／又はＳＡＭ感受性と酵素活性との同時の減少が追求に値する可能性がある。
【００３１】
フィードバック耐性ｍｅｔＡ対立遺伝子の発現は、当業者に公知の、特有の、ｍｅｔＡ遺伝子の前に局在したプロモーターのコントロール下で、又は他の適したプロモーターシステムの使用により行われてよい。この場合、相応する遺伝子はそのようなプロモーターのコントロール下で、宿主生物の染色体に、又はベクター、特にプラスミドに、１個又は複数個のコピーで存在する。本発明は従って、本発明によるフィードバック耐性ｍｅｔＡ対立遺伝子を、プロモーターと共に含有することを特徴とするプラスミドにも関する。
【００３２】
クローニングのためにベクターが使用され、前記ベクターは既に遺伝的要素（例えば構成的な又は制御可能なプロモーター、ターミネーター）を含有し、これらはホモセリントランススクシニラーゼをコードする遺伝子の、持続する、又は制御された、誘導可能な発現を可能にする。更に発現ベクターには、特に他の制御的な要素、例えばリボソーム結合部及び終止配列並びに、選択マーカー及び／又はリポーター遺伝子をコードする配列がある。このような選択マーカーの発現は、形質転換体の同定を容易にする。選択マーカーとしては、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は他の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が適している。本発明によるｍｅｔＡ対立遺伝子が染色体外に複製されることが好ましい場合には、プラスミドベクターは特に複製起点を含有することが好ましい。殊に有利にはプラスミドベクター、例えば、Ｅ．Ｃｏｌｉベクター、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１及びそれらの誘導体である。誘導可能なプロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｍｂｄａ  ＰＬ、ａｒａプロモーター又はｔｅｔプロモーター又はそれから誘導される配列が適する。有利にはＧＡＰＤＨプロモーターの構成的な発現である。本発明の殊に有利な実施態様においては、ホモセリントランススクシニラーゼをコードする遺伝子はｐＡＣＹＣ１８４から誘導されたプラスミドにおけるＧＡＰＤＨプロモーターのコントロール下にある。染色体への遺伝子の挿入のための方法は公知技術である。
【００３３】
適した宿主株は、Ｌ−メチオニン非感受性ホモセリントランススクシニラーゼ及び／又はＳＡＭ非感受性ホモセリントランススクシニラーゼをコードする転写ユニットを含有する発現ベクターによって形質転換される。宿主株としては、Ｌ−メチオニン感受性タンパク質及び／又はＳＡＭ感受性タンパク質を含有する株、特に細菌が使用される。
【００３４】
宿主株としては特に、Ｅ．Ｃｏｌｉ野生型株又は、内在性のｍｅｔＡ遺伝子が不活性化されている株、例えばＥ．Ｃｏｌｉ株、ＤＬ４１、ＣＧＳＣ株収集番号７１７７が使用される。そのような株は、本発明によるｍｅｔＡ遺伝子により相補される。Ｌ−メチオニン又はＳＡＭの微生物的な製造のための本発明による株の能力は、付加的な処置により増強されることが可能である。例えば、この目的のために、メチオニン代謝の遺伝子のリプレッサーをコードする遺伝子ｍｅｔＪがもはや発現されていない株が使用されることが可能である（ＪＰ２０００１３９４７１Ａ）。更に改良されたホモセリントランススクシニラーゼを、本発明による突然変異株を他の突然変異、例えばＤＥ１０２４７４３７において又はＪＰ２０００１３９４７１Ａにおいて挙げられたアミノ酸交換と組み合わせて発生させるという可能性が更にある。
【００３５】
Ｌ−メチオニン又はＳＡＭの製造は、特に本発明による微生物株の培養により行われる。これに関して微生物株は例えば、発酵槽において培地中で培養され、前記培地は適した炭素源、及び適したエネルギー源並びに他の添加物を含有する。
【００３６】
発酵の間に形成された物質、例えばＬ−メチオニン又はＳＡＭは引き続き精製されてよい。
【００３７】
次の実施例は、本発明の更なる説明に用いられる。全ての使用された分子生物学的な方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント及びリガーゼによるＤＮＡの修飾、形質転換その他は、当業者に公知であり、文献に記載された又はそのつどの製造者によって勧められた方法において実施された。
【００３８】
実施例１：
ｍｅｔＡ構造遺伝子のカルボキシ末端部分の変異によるフィードバック耐性ホモセリントランススクシニラーゼの生産
出発プラスミドとして、プラスミドｐＫＰ４１３ＧＡＰを使用し、これはＥ．Ｃｏｌｉからの、ＧＡＰＤＨプロモーターのコントロール下の野生型ｍｅｔＡ遺伝子を含有し、及びＤＳＭ１５２２１の番号でＤｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  ＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎでＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇにおいて寄託されている（図１）。基質としてｐＫＰ４１３ＧＡＰを用いて、ＶｅｎｔＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、逆ポリメラーゼ連鎖反応を当業者に公知の規則によって実施した。プライマーとして、５′末端でリン酸化されたオリゴヌクレオチドの、配列
【００３９】
【化１】
2006503568.tif 000003
を有するｍｅｔＡｄｅｌ１及び配列
【００４０】
【化２】
2006503568.tif 000004
を有するｍｅｔＡｄｅｌ２を使用した。
約４．３ｋｂの大きさの生成物を電気泳動によって単離し、及びＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造者の指示に従って精製した。この後、製造者の指示に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼを用いた分子内ライゲーションが行われた。株ＤＨ５αのＥ．Ｃｏｌｉ細胞の形質転換は、ＣａＣｌ２方法に従って当業者に公知の方法で行われた。形質転換バッチをＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出液５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌ）に対してまき、及び一晩３７℃でインキュベートした。所望の形質転換体をプラスミド単離の後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、制限分析によって同定した。切断部位Ｅｓｐ３Ｉ及びＳｃａＩの間の領域を、配列決定し、単離し及び同じ酵素で処理されたプラスミドｐＫＰ４１３ＧＡＰに挿入した。生じたプラスミドｐＢａＢｍｅｔＡｄｅｌはＥ．Ｃｏｌｉからの、ＧＡＰＤＨプロモーターのコントロール下で生じる構造遺伝子ｍｅｔＡを含有し、これは３′末端で、野生型と比較して表１に示された変異を示す。これらの遺伝子によりコードされたタンパク質の、変異したアミノ酸配列は同様に表１に示されている。
【００４１】
上記に記載された方法と同様の方法により、オリゴヌクレオチドの、配列
【００４２】
【化３】
2006503568.tif 000005
を有するｍｅｔＡｅｘｔ１及び配列
【００４３】
【化４】
2006503568.tif 000006
を有するｍｅｔＡｄｅｌ１とのポリメラーゼ連鎖反応により、プラスミドｐＢａＢｍｅｔＡｅｘｔが生産される。
【００４４】
オリゴヌクレオチドの、配列：
【００４５】
【化５】
2006503568.tif 000007
を有するｍｅｔＡｅｘｔ１及び配列
【００４６】
【化６】
2006503568.tif 000008
を有するｍｅｔＡｅｘｔ２とのポリメラーゼ連鎖反応により、プラスミドｐＢａＢｍｅｔＡｅｘｔ２が生産される。
【００４７】
野生型と比較したｍｅｔＡ構造遺伝子における変異は表１に示されている。
【００４８】
【表１】
2006503568.tif 000009
【００４９】
実施例２：
ホモセリントランススクシニラーゼ突然変異体の活性及びＬ−メチオニンに対するフィードバック耐性
様々なホモセリントランススクシニラーゼの、活性及び活性に対するＬ−メチオニンの影響は細胞抽出液を用いた酵素検査により決定され、前記細胞抽出液中ではそのつどのタンパク質が製造されている。このために、相応する、変異したホモセリントランススクシニラーゼをコードするプラスミドを形質転換により、当業者に公知の方法に従ってＥ．Ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）に導入した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天プレート（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母抽出液５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／ｌ、テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌ）に対してまき、及び一晩３７℃でインキュベートした。得られた形質転換体をＳＭ１培地（１ｌ培地に対して：ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ  ０．０１４７ｇ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．３ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ  ０．１５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３２．５ｍｇ、ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ  ０．７ｍｇ、ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ  １．６ｍｇ、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．３ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ３．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  １２．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ、ＮａＣｌ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．００２ｇ、Ｎａ３−シトラート×２Ｈ２Ｏ  １ｇ、グルコース５ｇ、トリプトン１ｇ、酵母抽出液０．５ｇ）において培養し、６００ｎｍでの約０．８の吸収で遠心分離し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５において洗浄し、及び新たに遠心分離した。細胞を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ  ｐＨ７．５、２ｍＭジチオトレイトール、０．５ｍＭフェニルメチルスルホン酸フルオリドにおいて再懸濁し、及びフレンチプレスにおいて破砕した。更なる遠心分離の上清を、酵素抽出液として検査において使用した。酵素活性を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ホモセリン及び０．１ｍＭ  スクシニルＣｏＡを有するバッチにおいて決定し、この中で反応の際に発生する補酵素Ａを、セリンアセチルトランスフェラーゼの活性の決定のためにＫｒｅｄｉｃｈ及びＴｏｍｋｉｎｓによって記載された方法（Ｋｒｅｄｉｃｈ  Ｎ．Ｍ．ｕｎｄ  Ｔｏｍｋｉｎｓ  Ｇ．Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１、４９５５−４９６５（１９６６））にのっとって、２３２ｎｍの際の吸光度検査を介して測光により定量化した。活性に対する、添加されたＬ−メチオニンの影響を決定し、阻害性をＫｉとして定量化した。Ｋｉとして、ホモセリントランススクシニラーゼの活性がＬ−メチオニンの非存在下での活性の５０％をまだなお有する際の、Ｌ−メチオニンに関するその濃度が決定された。
全てのホモセリントランススクシニラーゼ突然変異体は野生型と比較してＬ−メチオニンに関するより高いフィードバック耐性を示す。表２は結果の要約を示す。
【００５０】
表２：ＷＴ酵素並びにホモセリントランススクシニラーゼ突然変異体の活性及びＬ−メチオニンに対するフィードバック耐性
【００５１】
【表２】
2006503568.tif 000010
【００５２】
実施例３：
ＳＡＭに対するホモセリントランススクシニラーゼのフィードバック耐性
様々なホモセリントランススクシニラーゼの活性に対するＳＡＭの影響を様々なＳＡＭ（Ｃｌ塩、Ｓｉｇｍａ）濃度の存在下における活性の定量化により決定した。培養及び細胞抽出液の調製は実施例２に記載されたように行われた。活性試験はＬｅｅ  Ｌ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１、５４７９−５４８０（１９６６）に記載されたように行われ、この場合酵素抽出液を５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．５、３ｍＭホモセリン及び０．３ｍＭスクシニルＣｏＡでインキュベートした。様々な時点の後、試験バッチ１００μｌをエタノール４００μｌ、水４００μｌ及び１０ｍＭ５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）１００μｌからなる混合物に対する添加によって終了した。バッチを５分間室温でインキュベートした後に、４１２ｎｍでの吸収を測光によって決定した。タンパク質濃度の決定の後に、吸光係数の使用下で酵素活性を算出した。ＳＡＭによる活性の阻害性のための大きさとして、Ｋｉを決定した。
【００５３】
表３：ホモセリントランススクシニラーゼ突然変異体の活性及びＳＡＭに対するフィードバック耐性
【００５４】
【表３】
2006503568.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は出発プラスミドとして使用したプラスミドｐＫＰ４１３ＧＡＰを示す。
【図１】
2006503568.tif 000012
【配列表】
2006503568000001.app
【国際調査報告】
2006503568.tif 000013
2006503568.tif 000014
2006503568.tif 000015
2006503568.tif 000016
2006503568.tif 000017
2006503568.tif 000018