(57)【要約】本発明は、前立腺上皮細胞および多数の乳癌細胞のＴＣＲγ転写物由来の配列を含有する核酸と、そのような配列の翻訳により発現されるＴ細胞受容体γの代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（「ＴＡＲＰ」）とを提供する。 ＴＡＲＰから作製されるワクチンは、前立腺癌細胞および多数の乳癌の細胞を含む、そのタンパク質が発現される細胞に対する免疫応答を高めるのに有用である。本発明はまた、前立腺癌およびＴＡＲＰを発現する乳癌の存在を診断するための方法と、被験者にＴＡＲＰおよびＴＡＲＰをコードする核酸を投与する方法とを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（「ＴＡＲＰ」）、その免疫原性の断片、ＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチド、およびＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつ処理されて主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されたとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドがＴＡＲＰの配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、ＴＡＲＰの免疫原性断片の配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドがＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドがＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつ処理されて主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されたとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項２に記載のポリペプチドと薬学的に許容されうる担体とを含む組成物。
【請求項７】
請求項３に記載のポリペプチドと薬学的に許容されうる担体とを含む組成物。
【請求項８】
請求項４に記載のポリペプチドと薬学的に許容されうる担体とを含む組成物。
【請求項９】
請求項５に記載のポリペプチドと薬学的に許容されうる担体とを含む組成物。
【請求項１０】
ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（「ＴＡＲＰ」）のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その免疫原性の断片、ＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチド、およびＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつ処理されて主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されたとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された組換え核酸分子。
【請求項１１】
ＴＡＲＰの配列を含む、請求項１０に記載の単離された組換え核酸分子。
【請求項１２】
ポリペプチドがＴＡＲＰの免疫原性断片である、請求項１０に記載の単離された組換え核酸分子。
【請求項１３】
ポリペプチドがＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識される、請求項１０に記載の単離された組換え核酸分子。
【請求項１４】
ポリペプチドがＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつ処理されて主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されたとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化する、請求項１０に記載の単離された組換え核酸分子。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列に機能的に結合するプロモーターを含む発現ベクターである、請求項１０に記載の単離された組換え核酸分子。
【請求項１６】
ヌクレオチド配列がＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（「ＴＡＲＰ」）のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の単離された組換え核酸分子。
【請求項１７】
該ヌクレオチド配列が、ＴＡＲＰの免疫原性断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の単離された組換え核酸分子。
【請求項１８】
ヌクレオチド配列がＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の単離された組換え核酸分子。
【請求項１９】
ヌクレオチド配列が、ＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、処理されて主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されたとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の単離された組換え核酸。
【請求項２０】
ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（「ＴＡＲＰ」）のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、その免疫原性の断片、ＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドおよびＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつ処理されて主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されたとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチド、これらのポリペプチドの１つをコードする単離された核酸、ＴＡＲＰのエピトープを含むポリペプチドを標識した抗原提示細胞、ならびにＴＡＲＰ、その免疫原性の断片、ＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、ＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチド、またはＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、処理されて主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されたとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチドに対してインビトロにおいて感作した細胞からなる群から選択される組成物を被験者に投与する段階を含む方法。
【請求項２１】
ＴＡＲＰまたはその免疫原性断片を被験者に投与する段階を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドがＴＡＲＰと少なくとも９０％の配列の同一性を有し、かつＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドがＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、かつ処理されてＭＨＣ分子と共に抗原提示細胞によって提示されるとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
投与が、前立腺癌罹患被験者に対するものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
投与が、乳癌罹患被験者に対するものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
投与が、乳癌と診断された経験のない女性被験者に対するものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
投与が、ＴＡＲＰタンパク質のエピトープに対してＣＤ８＋細胞をインビトロ感作する段階と、被験者に感作細胞を投与する段階とを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
非特異的免疫アジュバント、微生物の細胞内産物および画分、ハプテン、免疫原性タンパク質、免疫調節物質、インターフェロン、胸腺ホルモンおよびコロニー刺激因子から選択される免疫アジュバントを被験者に同時投与する段階をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
ＴＡＲＰのエピトープを含むポリペプチドで標識した抗原提示細胞を投与する段階を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
ＴＡＲＰのエピトープを含むポリペプチドをコードする核酸配列を投与する段階であって、核酸が組換えウィルス内にある請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
ＴＡＲＰタンパク質のエピトープを含むポリペプチドをコードする核酸配列を投与する段階を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
ＴＡＲＰタンパク質のエピトープを含むポリペプチドを発現する発現ベクターを投与する段階を含み、該発現ベクターが組換え微生物細胞内にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＡＲＰタンパク質のエピトープを含むポリペプチドを発現する発現ベクターで被験者を免疫化する段階を含み、該発現ベクターが自己の組換え細胞内にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
ＣＤ８＋細胞がＴｃ細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
Ｔｃ細胞が腫瘍浸潤性リンパ球である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
男性において上皮起源の前立腺細胞を、または女性において乳癌細胞を検出するための方法であって、男性由来の細胞または女性由来の細胞においてＴＡＲＰをコードする核酸転写物を検出する段階、ならびに転写物の翻訳によって作製されるＴＡＲＰを検出する段階を含み、それによって該男性由来の細胞における転写物またはタンパク質の検出が該細胞を前立腺上皮細胞と同定し、該女性由来の細胞における転写物またはタンパク質の検出が該細胞を乳癌細胞と同定する方法。
【請求項３７】
転写物を検出する段階を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
タンパク質を検出する段階を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ハイブリダイゼーション条件下において転写物に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを細胞由来のＲＮＡに接触させる段階と、ハイブリダイゼーションを検出する段階とを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
細胞を粉砕して、細胞内容物の一部に、タンパク質に特異的に結合する標的部分と検出可能な標識とを含むキメラ分子を接触させる段階と、タンパク質に結合した標識を検出する段階とを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
細胞がリンパ節から採取される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
細胞が乳房生体組織検査試料から採取される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のエピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項４４】
細胞においてＴＡＲＰのレベルを調節する方法であって、ＴＡＲＰをコードする核酸を特異的に切断するリボザイム、ＴＡＲＰをコードする核酸に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＡＲＰをコードする核酸に特異的に結合するＤＮＡ結合タンパク質およびプロモーターに機能的に結合するＴＡＲＰをコードする核酸からなる群から選択される組成物を該細胞に導入する段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、１９９９年７月１３日に提出された米国仮出願番号第６０／１４３，５６０号および１９９９年１０月１日に提出された米国暫定出願番号第６０／１５７，４７１号の優先権を主張する。これらの出願の両者の内容は参照として本明細書に組み入れられている。
【０００２】
連邦政府の援助による研究および開発に基づいて実施された発明の権利に関する陳述
適用なし。
【０００３】
発明の背景
本発明は、分子生物学と、医学的な診断および治療とに関する。
【０００４】
前立腺癌はヒトの癌として最も一般的なもので、ヒトにおける癌の死亡原因の第３位である。この疾患を早期検出し、治療する方法により前立腺癌の死亡率を低下すると思われる。悪性細胞によって発現されるが、悪性細胞以外の細胞によってはほとんど発現されないタンパク質である腫瘍関連タンパク質は検出および治療の標的として有用である。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を含む前立腺癌に関連するいくつかのタンパク質が同定されている。
【０００５】
免疫治療は癌に対する強力で新しい武器である。免疫治療は、標的抗原の産生に基づいて癌細胞に対する免疫応答を誘発することに関係する。癌細胞抗原に対する液性免疫応答も用途を有するが、癌細胞に対する細胞性免疫応答を誘発することが好ましい。細胞性免疫応答に基づいた免疫治療は、特定の抗原決定因子を産生する細胞に対する細胞性応答を形成することに関係する。癌細胞は、免疫治療の標的となりうる種々のタンパク質を産生する。ある種の癌は、例えば、突然変異の結果として、免疫原性である新規タンパク質を産生する。しかし、研究者達はまた、癌細胞の突然変異していないタンパク質を特異的に認識する腫瘍浸潤性リンパ球も発見した。例えば、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）らは、腫瘍浸潤性リンパ球は、正常なメラニン形成細胞および悪性の黒色腫によって産生されるタンパク質ＭＡＲＴ−１の抗原性決定因子を標的化し、認識することを示している。さらに、Ｉ型ＭＨＣ分子（特に、ＨＬＡ Ａ２のエピトープ）に結合するＭＡＲＴ−１またはそのペプチドに対して向けられる能動的または受動的免疫治療により、ＭＡＲＴ−１を産生する正常な細胞と同様に黒色腫細胞が破壊される。カワカミ（Ｙ． Ｋａｗａｋａｍｉ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１： ２３７（１９９８）。
【０００６】
新規癌抗原は、免疫系が非自己タンパク質としてそれらを認識するので、免疫応答を誘発すると期待される。しかし、免疫系は自己タンパク質に耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を形成するので、突然変異していない自己タンパク質に対して免疫系が免疫応答を誘発する能力は驚くべきことである。この免疫応答は、耐性または免疫応答を誘発するほど十分には通常免疫系に暴露されていない抗原性決定因子に対して向けられると考えられている。しかし、癌では、これらの決定因子は免疫系による検出を免れない。これは、Ｉ型ＭＨＣ分子による決定因子の提示の増加による場合がある。
【０００７】
細胞性免疫応答は主要組織適合性抗原複合体分子の活動を誘発する。ヒトでは、この複合体は「ＨＬＡ」（ヒト白血球抗原）複合体と呼ばれる。マウスでは、それは「Ｈ−２」複合体と呼ばれる。主要組織適合性抗原複合体は３つのクラスのタンパク質、Ｉ型ＭＨＣ、ＩＩ型ＭＨＣおよびＩＩＩ型ＭＨＣを含む。Ｉ型ＭＨＣ分子はほとんど全ての有核細胞の表面において提示されている。それらはＴｃ細胞（ＣＤ８＋）に抗原ペプチドを提示する。ヒトでは３つのＩ型ＭＨＣ遺伝子座、ＨＬＡ Ａ、ＨＬＡ ＢおよびＨＬＡ Ｃが存在する。各遺伝子座は多型性が高い。従って、１人の人が６種類までの異なる種類のＨＬＡ分子を細胞表面に有することがある。ＩＩ型ＭＨＣタンパク質は主に、ＴＨ細胞に処理済みの抗原ペプチドを提示するマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞などの抗原提示細胞上で発現される。ヒトには３つのＩＩ型ＭＨＣ遺伝子座、ＨＬＡ ＤＰ、ＨＬＡ ＤＱおよびＨＬＡ ＤＲが存在する。ＩＩＩ型ＭＨＣタンパク質は種々の免疫過程に関連し、可溶性血清タンパク質、補体系の成分および腫瘍壊死因子を含む。クビィ（Ｊ． Ｋｕｂｙ）、第９章、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， 第３版、Ｗ． Ｈ． ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）。
【０００８】
癌細胞ならびに健康な細胞では、Ｉ型ＭＨＣ分子はＴｃ細胞に提示するための内因性タンパク質由来のエピトープを提示する。ＨＬＡ Ａ、ＨＬＡ ＢおよびＨＬＡ Ｃ分子は、特定の固定残基を有する鎖長がアミノ酸約８〜１０のペプチドに結合する。Ｉ型ＨＬＡ分子によって認識される固定残基はＨＬＡ分子の特定の対立遺伝子形態に依存する。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞上で特定のＨＬＡ分子によって提示されるとき、特定のエピトープを認識するＴ細胞受容体を保有する。抗原提示細胞によって刺激されて細胞障害性Ｔリンパ球になるＴｃ細胞が、このようなＨＬＡ−ペプチド複合体を保有する細胞と接触すると、ＣＴＬは細胞と結合体を形成して細胞を破壊する。
【０００９】
Ｉ型ＭＨＣ分子によるペプチドの提示は、内因的に産生されるタンパク質のプロテアソームによるペプチドへの切断、ＥＲおよびゴルジ装置による処理、ペプチドのアンカー残基によるＩ型ＭＨＣ分子の間隙への結合および細胞表面における最終的な提示を誘発する。とりわけ、特定のアンカー残基に応じて、ある種のペプチドは他よりも特定のＨＬＡ分子により強く結合することがある。十分に結合するペプチドは「優先的な」エピトープと呼ばれるが、弱く結合するものは「亜優先的な」または「潜在的な」エピトープと呼ばれる。自己タンパク質または異種タンパク質の優先的なエピトープは強力な耐性または免疫応答を誘発する。亜優先的なまたは潜在的なエピトープは弱い応答を生ずるかまたは応答を全く生じない。ＨＬＡに対して優先的なエピトープによってより強力に結合すると、細胞表面上により密に提示され、免疫細胞と反応する機会がより大きくなり、免疫応答または耐性誘発する可能性がより高くなることが仮定されている。
【００１０】
研究は、自己タンパク質であるＭＡＲＴ−１タンパク質の場合には、免疫系は亜優先的または潜在的なエピトープに対して最も大きいＣＴＬ応答を生ずることを示している。カワカミ（Ｙ． Ｋａｗａｋａｍｉ）ら、１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． １６： ３１３。癌細胞では、亜優先的または潜在的なエピトープは正常よりかなりより密にまたはより大量に提示され、結果的に、免疫系はこれらの以前には検出されなかったエピトープに遭遇して、それらを異種として認識し、それらに対して免疫応答を生ずることが起こる。理由は何であっても、そのタンパク質を産生する細胞に対する免疫応答を誘発する手段として自己タンパク質の大量の亜優先的または潜在的なエピトープに免疫系を暴露させることが、癌の免疫治療の主要な要素である。当然のことながら、自己タンパク質に免疫応答を誘発することにより癌細胞および健康な細胞が共に破壊される。従って、このような免疫治療を成功させるためには、健康な細胞は生命にとって必須でないかまたは他の治療によって置換可能な機能を持たなければならない。前立腺癌および乳癌の場合には、前立腺または乳房それぞれの外科的な切除が頻度の高い治療的介入である。この場合には、前立腺または乳房抗原を示す組織のほとんどまたは全てが腫瘍細胞である。
【００１１】
発明の開示
本発明者らは、健康および癌性の両方の上皮起源の前立腺細胞が転移していないＴＣＲγ遺伝子の一部を転写することを発見した。インビトロでは、この転写物は２種のタンパク質を生じ、その一方は切断された形態のＴＣＲγであるが、本発明者らの研究は、驚くべきことに、インビボでは、発現されるタンパク質はＴＣＲγタンパク質ではなく、代替リーディングフレーム（ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）から発現されるタンパク質であることを示している。従って、タンパク質はＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）または「ＴＡＲＰ」と命名されている。
【００１２】
本発明者らは、ＴＡＲＰは上皮起源前立腺細胞および前立腺癌細胞において発現されていることを発見した。驚くべきことに、本発明者らは、同じタンパク質が多数の乳癌細胞において発現されていることを発見した。従って、ＴＡＲＰは、ＴＡＲＰを発現する前立腺癌細胞および乳癌細胞のマーカーとして（「ＴＡＲＰを発現する乳癌」）および免疫治療の基礎として有用である。本発明は単離された形態または組換え形態の核酸およびタンパク質を提供する。本発明者らはこのタンパク質が多数の乳癌細胞において発現されていることを本明細書において見いだしたが、それは前立腺細胞において初めて同定され、以下には前立腺特異的（「ＰＳ」）ＴＣＲγと呼ばれることがある。
【００１３】
一局面において、本発明は、ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（「ＴＡＲＰ」）のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。本発明はさらに、ＴＡＲＰの免疫原性断片（全長のＴＡＲＰを特異的に認識し、結合する抗体を形成することができる、またはＴ細胞を活性化してＴＡＲＰを発現する細胞を認識させる断片）、Ｔ細胞と少なくとも９０％配列の同一性を有し、ＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドおよびＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、処理されて主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されるとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチドを提供する。本発明はさらに、ＴＡＲＰ、その免疫原性断片または少なくとも９０％配列の同一性を有し、上記の機能的な基準を満たすペプチドの形態で薬学的に許容されうる担体中に存在する組成物を提供する。
【００１４】
別の組の態様において、本発明は、ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（「ＴＡＲＰ」）のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、その断片をコードする、ＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、ＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドをコードする、またはＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、処理されて、主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されるとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチドをコードする、単離された組換え核酸分子を提供する。
【００１５】
さらに別の一連の態様において、本発明は、被験者に組成物を投与する段階であって、組成物が、ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（「ＴＡＲＰ」）のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド、その免疫原性断片、ＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、ＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドおよびＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、処理されて、主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されるとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチドからなる群から選択される段階を含む方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、被験者に組成物を投与する方法であって、組成物が、ＴＡＲＰ、その免疫原性断片、ＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、ＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドおよびＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、処理されて、主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されるとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチドをコードする、単離された核酸からなる群から選択される方法を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、被験者に組成物を投与する方法であって、組成物がＴＡＲＰのエピトープを含むポリペプチドで標識した抗原提示細胞を含む方法を提供する。さらに、本発明は被験者に組成物を投与する方法であって、組成物が、インビトロにおいてＴＡＲＰ、その免疫原性断片、ＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、ＴＡＲＰを特異的に認識する抗体によって特異的に認識されるポリペプチドまたはＴＡＲＰと少なくとも９０％配列の同一性を有し、処理されて、主要組織適合性抗原複合体分子に関連して提示されるとき、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するポリペプチドに対して、感作された細胞を含む方法を提供する。
【００１８】
上記の方法の組成物は、前立腺癌に罹患にしている被験者、乳癌に罹患している被験者または乳癌と診断された経験のない女性被験者に投与することができる。
【００１９】
本発明の方法はさらに、インビトロにおいてＴＡＲＰのエピトープに対してＣＤ８＋細胞を感作する段階と、被験者に感作した細胞を投与する段階とを含む。ＣＤ８＋細胞はＴｃ細胞であってもよい。いくつかの態様において、Ｔｃ細胞は腫瘍浸潤性リンパ球であってもよい。
【００２０】
また、本発明の方法は、被験者に、非特異的免疫アジュバント、微生物の細胞内産物および画分、ハプテン、免疫原性タンパク質、免疫調節物質、インターフェロン、胸腺ホルモンおよびコロニー刺激因子から選択される免疫アジュバントを同時投与する段階を含んでもよい。
【００２１】
本発明の方法は、さらに、ＴＡＲＰのエピトープを含むポリペプチドで標識した抗原提示細胞を投与する段階またはＴＡＲＰのエピトープを含むポリペプチドをコードする核酸配列を投与する段階であって、核酸が組換えウィルスの形態である段階を含んでもよい。本発明の方法はさらに、ＴＡＲＰタンパク質のエピトープを含むポリペプチドをコードする核酸配列を投与する段階を含む。
【００２２】
また、本発明の方法は、ＴＡＲＰタンパク質のエピトープを含むポリペプチドを発現する発現ベクターを投与する段階であって、発現ベクターが組換え細菌細胞の形態である段階を含む。さらに、本発明の方法は、ＴＡＲＰタンパク質のエピトープを含むポリペプチドを発現する発現ベクターで被験者を免疫化する段階であって、発現ベクターが自己組換え細胞の形態である段階を含む。
【００２３】
別の局面において、本発明の方法は、男性において上皮起源の前立腺細胞を検出し、または女性において乳癌細胞を検出する方法であって、男性または女性由来の細胞においてＴＡＲＰをコードする核酸転写物を検出する段階または転写物の翻訳によって産生されるＴＡＲＰを検出する段階を含み、該男性由来の細胞における転写物またはタンパク質の検出が該細胞を前立腺上皮細胞と識別し、該女性由来の細胞における転写物またはタンパク質の検出が該細胞を乳癌細胞と識別する方法を提供する。本発明の方法は、細胞由来のＲＮＡに、ハイブリダイゼーション条件下において転写物と特異的にハイブリダイズする核酸プローブを接触させる段階と、ハイブリダイゼーションを検出する段階とを含んでもよい。さらに、本発明の方法は、細胞を粉砕して、細胞内容物の一部を、タンパク質と特異的に結合する標的部分と検出可能な標識とを含むキメラ分子に接触させる段階と、タンパク質に結合した標識を検出する段階とを含んでもよい。標的部分自体も標識されてもよい（例えば、ｓｃＦｖなどの抗体が放射性残基を有してもよい）。
【００２４】
検討される細胞はリンパ節由来であっても、または乳房の生検試料由来であってもよい。
【００２５】
最後に、本発明は、ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。
【００２６】
発明の詳細な説明
１． 序文
驚くべきことに、上皮起源の前立腺細胞および多数の乳癌の細胞はＴ細胞受容体γ鎖（「ＴＣＲγ」）のｍＲＮＡを発現することが発見されている。前立腺における主要なＴＣＲγ転写物はＴリンパ球とはサイズが異なる。前立腺上皮細胞および多数の乳癌細胞が、Ｔリンパ球において主に発現されると考えられている遺伝子から多量の転写物を発現するという所見はほとんど予測されていない。
【００２７】
ＴＣＲγリーディングフレームは有効なコザック配列（Ｋｏｚａｋ， Ｍ． Ｃｅｌｌ ４４： ２８３−９２（１９８６））を含有するので、本発明者らは最初は、切断された形態のＴＣＲγタンパク質がコードされること仮定した。従って、前立腺上皮細胞および乳癌細胞において発現されるＴＣＲγ遺伝子座が７ ｋＤａの核タンパク質をコードすることを見いだしたのはさらに驚きであった。タンパク質はＴＣＲγとは別のリーディングフレームからコードされるので、本発明者らはそれをＴＣＲγの代替リーディングフレームタンパク質（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、「ＴＡＲＰ」と名付けた。ＴＣＲγ遺伝子座のイントロン内から生ずる転写物の代替リーディングフレームから翻訳されること以外に、ＴＡＲＰは２つの他の通常ではない特徴を有する。第一に、ほとんどが通常分泌されるため、このような小さいペプチドを細胞内で見いだすことは驚くべきことである。第二に、ＴＡＲＰは有効なコザック配列を欠損している。
【００２８】
インビトロおよびインビボにおける用途
前立腺上皮細胞、前立腺癌細胞および多数の乳癌細胞におけるこのタンパク質の存在はインビトロおよびインビボにおける用途のための数多くの機会を形成する。最初に、このタンパク質に対して形成される抗体は、試料中のＴＡＲＰを発現する細胞の存在を検出するインビトロにおけるアッセイ法に使用することができる。例えば、以下の実施例は、ＴＡＲＰおよびＴＡＲＰ転写物は正常な乳房細胞では存在しないかまたはごく低いレベルでしか存在しないが、ＴＡＲＰを発現する乳癌細胞では容易に検出されることを実証している。従って、被験者から切除された乳房細胞における高いレベルのＴＡＲＰ転写物またはＴＡＲＰの検出は、被験者においてＴＡＲＰを発現する乳癌の存在を示すと思われる。前立腺細胞におけるＴＡＲＰ発現に関しては、当業者は、前立腺の切除が進行性の前立腺癌における頻度の高い外科的治療法であることに気づいている。前立腺が切除された個人由来の細胞中でのＴＡＲＰの検出は前立腺癌が存在することを示している。（当業者は、年間約１，０００人が乳癌と診断されることを認識している。従って、患者も独立に乳癌に罹患することが不可能ではない。前立腺癌は男性では２００倍を越えるほど多数であり、考察は前立腺癌に罹患していることがすでに見いだされている患者を考慮していることを考えると、患者も乳癌に独立に罹患している確立は小さい。診断は、試料を採取した部位、細胞の組織学的および形態学的特徴ならびに他の通常の診断基準をしることによって確認することができる。いかなる事象においても、どちらかの状態の存在はさなる評価およびモニタリングを要求するので、前立腺を切除された男性においてＴＡＲＰ発現細胞の存在が測定されること自体、個人が前立腺、乳癌または両方を有するかどうかにかかわらず、非常に有用である。前立腺癌のない男性におけるＴＡＲＰ発現細胞の検出は乳癌を示している。）
【００２９】
ＴＡＲＰ自体、ＴＡＲＰの免疫原性断片およびＴＡＲＰまたはその免疫原性断片をコードする核酸も、被験者に注入されたとき、前立腺癌細胞およびＴＡＲＰ発現乳癌細胞を攻撃するために、被験者から誘導される細胞障害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）をインビトロにおいて活性化するのに使用することができる。
【００３０】
ＴＡＲＰ自体、ＴＡＲＰの免疫原性断片、ＴＡＲＰまたはその免疫原性断片をコードする核酸を、前立腺癌またはＴＡＲＰ発現乳癌に対する免疫応答を形成または高めるために、一般に薬学的に許容されうる担体の形態で被験者に投与することができる。このような組成物は、前立腺癌またはＴＡＲＰ発現乳癌を罹患していると診断された患者に対して治療的に投与することができる。
【００３１】
以下に考察するように、ＴＡＲＰは、転写を調節するタンパク質を特徴とする構造的な特徴を含有する核タンパク質である。細胞内でのＴＡＲＰレベルの調節は細胞の増殖、細胞の複製または両方に影響を与えることが予期される。従って、ＴＡＲＰレベルの調節は、癌細胞の進行をコントロールする際に重要となりうる。ＴＡＲＰレベルは、ＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害するリボザイムおよびアンチセンス分子などの種々のモダリティによって細胞内で低下されることがある。例えば、強力な構成的プロモーターによって駆動される、ＴＡＲＰをコードする核酸を含有する発現ベクターを細胞に導入することができる。核酸の構成的な転写により細胞内でのタンパク質の発現はより高レベルになる。
【００３２】
この項の残りはＴＡＲＰの種々の構造的な特徴について記載する。内容は本発明の開示に使用される定義に続き、ＴＡＲＰの免疫原性断片の選択、被験者へのＴＡＲＰの投与、ＴＡＲＰに対する抗体の形成、ＴＡＲＰ転写物およびタンパク質の検出ならびに薬学的組成物の考察に続く。
【００３３】
ＴＡＲＰの構造的な特徴
ＴＡＲＰは７アミノ酸リピート中に５つのロイシンを含有し、これは、ＴＡＲＰがロイシンジッパー２量体モチーフを含有することを示唆している（図７Ａ）。これが真実であるためには、ＴＡＲＰは両親媒性ヘリックスを含有しなければならない。ＴＡＲＰが両親媒性ヘリックスを含有することを示す１つの証拠は、ヘリックスの開始因子として作用することが考えられている残基であるセリンおよびプロリン残基が最初のロイシンリピートの直前に見いだされることである。第二に、多数の荷電アミノ酸が７アミノ酸リピート内に見いだされ、それによってヘリックスに両親媒性を与え、おそらく他のヘリックスとの塩橋として作用する。７アミノ酸リピート内にロイシンが存在することがロイシンジッパーモチーフの良好な指標物であったとしても、７アミノ酸リピート内にはロイシンと考えられない５つのロイシンを含有する同定されたタンパク質が存在する。例えば、カリオフェリン（ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎ）（Ｃｈｏｏｋ， Ｙ． Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９９： ２３０−２３７（１９９９））、Ｂ．ステラロサーモフィラス（ｓｔｅｒａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（Ｐｕｇｍｉｒｅ， Ｍ． Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６： １４６７−１４７９（１９９８））およびＴ． サーモフィラス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）フェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｏｓｙａｋ， Ｌ．ら、Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２： ５３７−５４７（１９９５））の結晶構造は、これらのタンパク質は、配列が７アミノ酸リピート中に５つのロイシンを含有する領域にαヘリックス構造を含有しないことを示している。ＴＡＲＰ中に見いだされるロイシンリピートの重要性を決定するには相互作用および構造研究が必要とされる。
【００３４】
ＴＡＲＰアミノ酸配列の別の通常ではない特徴は、塩基性アミノ酸の領域がロイシンジッパーモチーフと思われる領域の次にあることであり（図７Ａ）、これはＤＮＡ結合モチーフの可能性を示唆している。しかし、塩基性領域の配向は、ロイシンリピートの手前ではなくそれらのあとにあるという点において独自である。ＤＮＡに結合するほとんどのロイシンジッパータンパク質はロイシンリピートの手前に塩基性領域を有する（総説として、（Ｃｈｏｏｋ， Ｙ． Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９９： ２３０−２３７（１９９９））を参照）。ＴＡＲＰの塩基性領域は核局在化シグナルとして機能しているだけの可能性があるが、ＴＡＲＰが核タンパク質であるという事実は、ＴＡＲＰがＤＮＡに結合するという仮定を強化している。
【００３５】
ＴＡＲＰが任意の既知のタンパク質との相同性を有するかどうかを判定するために、本発明者らはジェンバンクへのタンパク質のＢＬＡＳＴ検索を実施した。この検索は、ＴＡＲＰのアミノ酸配列はディクチオステリウム ディコイデム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｃｏｉｄｅｕｍ、細胞性粘菌） Ｔｕｐ１（ジェンバンクアクセッション番号ＡＡＣ２９４３８）およびサッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｔｕｐ１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｆ． Ｅ．ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０： ６５００−６５１１（１９９０））とのある程度の相同性を有することを示した（図７Ｃ）。酵母Ｔｕｐ１は通常Ｃｙｃ８（Ｓｓｎ６）との複合体の形態で見いだされ、ブドウ糖、酸素およびＤＮＡ損傷によって調節される遺伝子の転写抑制に必要とされる（Ｔｚａｍａｒｉａｓ， Ｄ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９： ８２１−８３１（１９９５））。Ｃｙｃ８（Ｓｓｎ６）もＴｕｐ１もＤＮＡに結合しないが、各々は、α２、Ｍｉｇ１、Ｒｏｘ１およびａ１などの特定のＤＮＡ結合タンパク質との相互作用によりコリプレッサー複合体の一部として作用する（Ｔｚａｍａｒｉａｓ， Ｄ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ９： ８２１−８３１（１９９５））。Ｔｕｐ１のＣ’側末端の半分は、ＷＤ−４０またはβトランスデューシンリピートとして周知である、アスパラギン酸およびトリプトファンが豊富な４３アミノ酸配列の６つのリピートを含有する（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｆ． Ｅ．ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０： ６５００−６５１１（１９９０）； Ｆｏｎｇ， Ｈ． Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ２１６２−２１６６（１９８６））。ＷＤ−４０リピートは多数のタンパク質において同定されており、タンパク質−タンパク質相互作用に何らかの役割を果たしている。重要なことに、Ｔｕｐ１は、ＷＤ−４０リピートの２つによってα２と相互作用することが示されている（Ｋｏｍａｃｈｉ， Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ８： ２８５７−２８６７（１９６７））。ＴＡＲＰがＴｕｐ１の５番目のＷＤ−４０リピートと相同性を有することに気づくことは興味深い（図７Ｃ）。ＴＡＲＰは核タンパク質であるので、Ｔｕｐ１との相同性は、ＴＡＲＰが、転写調節に関与する機能的な核タンパク質複合体の一員であることを示唆している。
【００３６】
ＴＡＲＰ抗体は前立腺および乳房核抽出物中の二重バンドを認識する（図６Ａ）。７ ｋＤａのバンドはＨｉｓ−ＴＡＲＰ組換えタンパク質と同時により早く移動するが、より大きい分子量ではより弱いバンドが移動する。９ ｋＤａのバンドの考えられる１つの説明は翻訳後修飾である。ＴＡＲＰが任意の既知の翻訳後修飾部位を含有するかどうかを判定するために、本発明者らは、スイス生物情報科学研究所（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）のＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）を使用してＴＡＲＰアミノ酸配列を分析した（Ａｐｐｅｌ， Ｒ． Ｄ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９： ２４８−２６０（１９９４）； Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７： ２１５−２１９（１９９９））。図７Ａに示すように、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ依存的プロテインキナーゼリン酸化部位（ＲＲＡＴおよびＲＲＧＴ）ならびにプロテインキナーゼＣリン酸化部位（ＳＳＲおよびＳＲＲ）を含む多数の可能なリン酸化部位が見いだされている。リン酸化は、多数の場合において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でタンパク質をより大きい見かけの分子量として移動させることが示されている。これが事実である場合には、図６の結果は未修飾の形態がＬＮＣａＰ細胞に多数含有され、リン酸化された形態だけがＭＣＦ７およびＳＫ−ＢＲ−３細胞において存在することを示すことができる。従って、ＴＡＲＰは、前立腺および乳癌細胞において発現される場合には翻訳後修飾されていることがある。
【００３７】
ＴＡＲＰ転写物の本発明者らの最初の研究は乳房においてＴＡＲＰ発現を明らかにしなかった（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６： ９２８７−９２９２（１９９９））。１つの考えられる説明は、ＴＡＲＰは正常な乳房では低いレベルで発現されており、検出が困難であるということである。結果の項に記載するように、癌試料において検出される強力なシグナルと比較すると、非常に弱いシグナルが正常な乳房試料のＰＣＲ分析において検出された。従って、乳癌細胞におけるＴＡＲＰの存在は、乳房細胞の発癌形質転換後にＴＡＲＰの発現が誘導されることを示すことができる。また、乳癌細胞におけるＴＡＲＰの存在は、ＴＡＲＰがエストロゲンによって調節されることを示すことができる。この仮定は、アンドロゲン応答性要素（ＡＲＥ）をエストロゲン応答性要素（ＥＲＥ）を組み合わせるＴＡＲＰのイントロンプロモーター内に要素を同定することによって強化される。このハイブリッド要素はＡＲＥの５’末端およびＥＲＥの３’末端に特異的な２つの半分の部位からなる［（Ｚｉｌｌｉａｃｕｓ， Ｊ．ら、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ９： ３８９−４００（１９９５））および未発表データ］。エストロゲンがＴＡＲＰを調節するかどうかを判定するためには追加の実験が必要である。しかし、突然変異ＡＲＥが乳癌においてある種の前立腺特異的遺伝子の発現を生ずる例がある。例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は乳癌において発現されることが示されている（Ｍａｊｕｍｄａｒ， Ｓ．ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７９： １５９４−１６０２（１９９２））。ＰＳＡの異常な発現の分子的な分析により、ＰＳＡプロモーター内に見いだされるＡＲＥの１つの１つの点変異が発見される。この突然変異により、乳癌においてアンドロゲンによって調節されるＰＳＡ発現が損失されると考えられている（Ｍａｊｕｍｄａｒ， Ｓ．ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７９： １５９４−１６０２（１９９９））。この時点では、ＴＡＲＰプロモーターの同様の突然変異が、試験した３つの乳房細胞系統において生ずるかどうかは不明である。
【００３８】
前立腺は、その構造および機能の維持にアンドロゲンに依存している。前立腺細胞が悪性化する場合には、それらはアンドロゲン依存性を損失することが多い。本発明の検討において、本発明者らは、増殖のためのアンドロゲンへの依存性が異なる２種類の前立腺細胞系統、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞を使用した。アンドロゲン受容体はアンドロゲン依存的ＬＮＣａＰ細胞系統に存在するが、アンドロゲン非依存的ＰＣ３細胞系統には存在しない（Ｔｉｌｌｅｙ， Ｗ． Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５０： ５３８２−５３８６（１９９０））。図３に示すように、ＴＡＲＰはＬＮＣａＰ細胞において発現されるが、ＰＣ３細胞では発現されない。この結果は、ＴＡＲＰの発現はアンドロゲン刺激によって調節されることを示唆している。ＴＡＲＰプロモーター内のＡＲＥ様要素の同定は、ＴＡＲＰがアンドロゲンによって誘導されるという考えを強化する。ＬＮＣａＰ細胞内で発現されるが、ＰＣ３細胞で発現されないことは、ＴＡＲＰがアンドロゲン依存的応答を調節する際に重要であることを示唆している。
【００３９】
ＩＩ．　定義
特に明記しない限り、本明細書において使用する全ての技術的用語および科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解される意味を有する。以下の参照文献は、本発明において使用する用語の多数の一般的な定義を提供している：シングルトン（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）ら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４）；ＴＨＥ ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ 編、 １９８８）； ＴＨＥ ＧＬＯＳＳＡＲＹ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣＳ， 第５版、リーガー（Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒ）ら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）； ならびにハーレおよびマーハム（Ｈａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ）， ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。本明細書において使用される、以下の用語は、特に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。
【００４０】
「Ｔ細胞受容体」とは、α鎖とβ鎖またはγおよびδ鎖を含むＴ細胞の表面に見いだされるヘテロダイマーを指す。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣ分子に関連する処理済みの抗原を認識する。
【００４１】
「Ｔ細胞受容体γ鎖の代替リーディングフレームタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」および「ＴＡＲＰ」とは、その配列が例えば図１４に記載されているポリペプチドを指す。ポリペプチドは上皮起源の前立腺細胞、前立腺癌細胞および多数の乳癌における転写物として提示されるＴ細胞受容体γ遺伝子の形態から翻訳される。「ＴＡＲＰ」はその最後の部分が「タンパク質」という言葉を表す頭字語であるので、「ＴＡＲＰタンパク質」は冗長である。
【００４２】
本明細書において使用する、ＴＡＲＰを翻訳することができる核酸転写物は、「ＴＡＲＰ核酸」または「ＴＡＲＰをコードする核酸」と呼ばれる。ＴＡＲＰが転写される遺伝子は本明細書において「ＴＡＲＰ遺伝子」と呼ばれる。
【００４３】
本明細書において使用する、ＴＡＲＰの「免疫原性断片」とは、主要組織適合性抗原複合体分子に関連して細胞によって提示されるとき、Ｔ細胞活性化アッセイ法におて、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化することができるＴリンパ球の一部を指す。典型的には、このような断片は鎖長が８〜１２連続するアミノ酸のＴＡＲＰであるが、当然のことであるが、さらに長い断片を使用してもよい。
【００４４】
１つのポリペプチドを別のポリペプチドと比較することに関連して、「配列の同一性」は、基準の配列としてのＴＡＲＰの配列を試験配列に比較することによって判定される。典型的には、２つの配列は、最大または最適に整列させるために整列される。
【００４５】
「リガンド」とは、標的分子に特異的に結合する化合物である。
【００４６】
「受容体」とは、リガンドに特異的に結合する化合物である。
【００４７】
「細胞障害性Ｔリンパ球」（「ＣＴＬ」）とは、腫瘍細胞に対する免疫応答において重要である。ＣＴＬは、ほとんど全ての有核細胞の表面に発現されるＩ型ＨＬＡ分子に関連してペプチドエピトープを認識する。
【００４８】
腫瘍特異的ヘルパーＴリンパ球（「ＨＴＬ」）はまた効果的な抗腫瘍免疫を維持するために重要であることも知られている。抗腫瘍免疫におけるそれらの役割は、これらの細胞がＣＴＬおよび抗体応答の誘導のための助力を提供する働きをするだけでなく、直接的な細胞接触によってまたリンホカイン（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦα）の分泌によっても仲介される、エフェクター機能も提供する動物モデルにおいて実証されている。
【００４９】
「抗体」とは、エピトープ（例えば、抗原）を特異的に認識し、結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを指す。これは無傷の免疫グロブリンならびにＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、１本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）などの当該技術上周知のそれらの変異体および一部を含む。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合されている融合タンパク質である。天然の免疫グロブリンは免疫グロブリン遺伝子によってコードされる。これらには、κおよびλ軽鎖不変領域遺伝子、α、γ、δ、εおよびμ重鎖不変領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。「抗体」という用語には、ハイブリドーマからまたは組換え的に免疫化によって作製される、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体が含まれる。
【００５０】
「エピトープ」または「抗原性決定因子」とは、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続するアミノ酸またはタンパク質の三次元的な折りたたみによって隣接化される連続していないアミノ酸から形成されうる。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性性溶媒に暴露しても保持されるが、三次元的な折りたたみによって形成されるエピトープは、典型的には、変性性溶媒で処理すると損失される。エピトープは、独自の空間的立体配座に典型的には、少なくとも３、より普通には、少なくとも５または８〜１０アミノ酸を含む。エピトープの空間的立体配座を決定する方法には、例えば、ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、「分子生物学におけるエピトープマッピングプロトコール（Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」， ６６巻、モリス（Ｇｌｅｎｎ Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ）， 編（１９９６）を参照のこと。
【００５１】
リガンドまたは受容体は、異種化合物の試料における分析物の存在を決定する結合反応においてリガンドまたは受容体が機能する場合に化合物の分析物に「特異的に結合する」。従って、リガンドまたは受容体は特定の分析物に優先的に結合し、試料中に存在する他の化合物に大量には結合しない。例えば、ポリヌクレオチドは相補的配列を含む分析物ポリヌクレオチドに特異的に結合し、抗体は、抗体が形成されたエピトープを保有する抗原分析物に免疫アッセイ条件下において特異的に結合する。
【００５２】
「免疫アッセイ法」とは、分析物の特異性が、抗体とリガンドとの間の特異的な結合によって与えられる試料中の分析物を検出する方法を指す。特異的な免疫反応性を測定するために使用することができる免疫アッセイ方式および条件の説明はハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）「抗体、実験室マニュアル（ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００５３】
「ワクチン」とは、生物に治療程度の免疫を与えるのに効果的であるが、ごく低いレベルの罹病率または致死率しか生じない薬剤または薬剤を含む組成物を指す。ワクチンを作製する方法は、当然のことながら、免疫系の検討ならびに動物またはヒトの疾患を予防および治療する際に有用である。
【００５４】
「免疫量」とは、被験者に免疫応答を誘発するのに効果的な量である。
【００５５】
「ポリペプチド」とは、アミノ酸残基、関連する天然型構造変異体およびペプチド結合によって結合される合成非天然型類似物、関連する天然型構造変異体および合成非天然型類似物を含むポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動式ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。「タンパク質」という用語は、典型的には、大型のポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は、典型的には、短いポリペプチドを指す。
【００５６】
ポリペプチドの配列を表記するためには従来の表記方法が本明細書において使用される：ポリペプチド配列の左側末端はアミノ末端であり、ポリペプチド配列の右側末端はカルボキシ末端である。
【００５７】
「融合タンパク質」とは、１つのポリペプチドのアミノ末端と他のポリペプチドのカルボキシ末端によって形成されるペプチド結合による２つ以上のポリペプチドの結合によって形成されるポリペプチドを指す。融合タンパク質は、典型的には、１つの連続する融合タンパク質をコードする核酸配列から１つのポリペプチドとして発現されてもよい。しかし、融合タンパク質は、構成ポリペプチドの化学的カップリングによって形成されてもよい。
【００５８】
「保存的置換」とは、アミノ酸を機能的に類似したアミノ酸とポリペプチド中で置換することを指す。以下の６つの群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５９】
２つのタンパク質は、異なる種に存在し、共通の遺伝的祖先由来であり、少なくとも７０％アミノ酸の配列の同一性を有する場合にはそれらは互いの「相同物」である。
【００６０】
「実質的に純粋な」または「単離された」とは、目的の種が存在する主要な種である（すなわち、分子的に、組成物中の任意の他の個別の高分子種より多量である）ことを意味し、実質的に純粋な画分は、目的の種が存在する全ての高分子種の（分子に）少なくとも約５０％を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する高分子種の約８０％〜９０％以上が関心のある純粋な種であることを意味する。組成物が本質的に１つの高分子種からなる場合には、目的の種は本質的な均一性にまで精製されている（従来の検出方法によって汚染種が組成物中に検出され得ない）。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、安定化剤（例えば、ＢＳＡ）および元素状イオン種は本発明の定義の目的のためには高分子種と考えられない。
【００６１】
「核酸」とは、ホスホジエステル結合により結合されるヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然型構造変異体および合成非天然型類似物）、関連する天然型構造変異体および合成非天然型類似物を含むポリマーを指す。従って、この用語は、ヌクレオチドとそれらの間の結合が非天然型合成類似物を含む、例示的ではあるが、限定的ではないホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等などのヌクレオチドポリマーを含む。このようなポリヌクレオチドは、例えば、自動式ＤＮＡ合成装置を使用して合成することができる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、短いポリヌクレオチドをいい、一般的には約５０ヌクレオチドを越えない。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって示されるとき、これはまた、「Ｕ」が「Ｔ」に変わるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含む。
【００６２】
本明細書においてヌクレオチド配列を記載するために従来の表記法が使用され、単離された１本鎖ヌクレオチド配列の左側は５’末端であり、２本鎖ヌクレオチド配列の左側方向は５’側方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５’から３’方向への付加は転写方向と呼ぶ。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と呼ばれ、そのＤＮＡから転写されるｍＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側に位置するＤＮＡ鎖の配列を「上流配列」と呼び、ＲＮＡと同じ配列を有し、コードするＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側にあるＤＮＡ鎖の配列を「下流配列」と呼ぶ。
【００６３】
「ｃＤＮＡ」とは、１本鎖または２本鎖の形態のｍＲＮＡと相補的または同一のＤＮＡを指す。
【００６４】
「コードする」とは、規定された配列のヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または規定された配列のアミノ酸およびそれらから生ずる生物学的特性を有する生物過程において、他のポリマーおよび高分子を合成するための鋳型として作用する、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の本質的な特性を指す。従って、細胞または他の生物系においてその遺伝子によって作製されるｍＲＮＡの転写および翻訳がタンパク質を作製する場合には、遺伝子はタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一で、通常配列リストに提供されているコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖は共に、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードするということができる。特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの変性型であり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでもよい。
【００６５】
「組換え核酸」とは、天然では互いに結合しないヌクレオチド配列を有する核酸を指す。これは、好適な宿主細胞を形質変換するために使用することができる増幅または集成された核酸を含む核酸ベクターを含む。組換え核酸を含む宿主細胞は「組換え宿主細胞」と呼ばれる。次いで、遺伝子は、例えば「組換えポリペプチド」を作製するために組換え宿主細胞中で発現される。組換え核酸は、同様に非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位等）を提供することができる。
【００６６】
「発現コントロール配列」とは、機能的に結合するヌクレオチド配列の発現（転写および／または翻訳）を調節するポリヌクレオチド中のヌクレオチド配列を指す。「機能的に結合する」とは、一方の部の活動（例えば、転写を調節する能力）により他方の部に作用（例えば、配列の転写）を生ずる２つの部の間の機能的な関係を指す。発現コントロール配列は、例示的であって、限定的ではないが、プロモーター（例えば、誘導的または構成的）、エンハンサー、転写停止因子、開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナルおよび停止コドンの配列を含んでもよい。
【００６７】
「発現カセット」とは、発現可能なヌクレオチド配列に機能的に結合する発現コントロール配列を含む組換え核酸構築物を指す。発現カセットは、一般に、発現に十分なシス作用型要素を含み、発現の他の要素は宿主細胞またはインビトロ発現系によって供給されうる。
【００６８】
「発現ベクター」とは、発現カセットを含むベクターを指す。発現ベクターは、などのコスミド、プラスミド（例えば、未処理またはリポソームに含有される）および発現カセットを組み入れるウィルスなどの当該技術上周知の全てを含む。
【００６９】
配列が第１の配列であるポリヌクレオチドが、配列が第２の配列であるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする場合には、第１の配列は第２の配列に関して「アンチセンス配列」である。
【００７０】
２つ以上のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の配列の関係を記載するために使用される用語には、「基準配列」、「から選択される」、「比較ウィンドウ」、「同一な」、「配列の同一性の割合」、「実質的に同一な」、「相補的な」および「実質的に相補的な」を含む。
【００７１】
核酸配列を配列比較するためには、典型的には、一方の配列が、試験配列を比較する基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列および基準配列をコンピュータに入力し、適宜部分列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。比較のために配列を整列させる方法も当該技術上周知である。例えば、スミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ）， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズム、ニードルマンおよびウーシ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム、ピアソンおよびリプマン（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４（１９８８）の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｏｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または手作業による整列と目視による検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ １９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））によって、比較のための配列の最適な整列を実施することができる。
【００７２】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、フェンおよびドーリットル（Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３５：３５１−３６０（１９８７）の進歩的な整列方法の単純化を使用している。使用する方法は、ヒギンスおよびシャープ（Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ）， ＣＡＢＩＯＳ ５： １５１−１５３（１９８９）によって記載されている方法と同様である。ＰＩＬＥＵＰを使用して、基準配列を他方の試験配列と比較して、以下のパラメータを使用して配列の同一性の関係の割合を求める：デフォルトギャップウェイト（３．００）、デフォルトギャップ鎖長ウェイト（０．１０）および重みをつけた末端のギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐｓ）。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えばバージョン７．０から入手することができる（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２： ３８７−３９５（１９８４）。
【００７３】
配列の同一性の割合および配列の類似性を求めるのに好適なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０）およびオースベル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２（１９７７））に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、生物工学情報センター（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により公共的に入手可能である。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）はデフォルトとして、ワード長（Ｗ）＝１１、アラインメント（Ｂ）＝５０、期待値（Ｅ）＝１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴＰプログラム（アミノ酸配列用）はデフォルトとしてワード長（Ｗ）＝３、および期待値（Ｅ）＝１０、およびＢＬＯＵＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８９： １０９１５（１９８９）。
【００７４】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳと共に４２℃でインキュベーションする、または５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳと共に６５℃でインキュベーションし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳと共に６５℃で洗浄することを指す。
【００７５】
物体に適用される「天然型」とは、物体が天然に見いだされることを指す。例えば、天然の起源から単離から単離することができ、実験室において人為的に意図的に改変されていない（ウィルスを含む）生物に存在するアミノ酸またはヌクレオチド配列が天然型である。
【００７６】
「リンカー」とは、共有結合またはイオン結合、ファンデルワールス結合または水素結合により２つの他の分子、例えば、１つの相補的な配列の５’末端および別の相補的な配列の３’末端にハイブリダイズして、それによって２つの非相補的な配列を結合する核酸分子を結合する分子を指す。
【００７７】
「薬学的に有効な量」とは、目的の薬理学的結果を生ずるのに有効な薬剤の量を指す。
【００７８】
「薬学的に許容されうる担体」とは、リン酸緩衝生理食塩液、デキストロースの５％水溶液などの標準的な薬学的担体、緩衝液および賦形剤ならびに水中油型または油中水型エマルジョンなどのエマルジョン、ならびに種々の型の湿潤剤および／または補助剤のいずれかを指す。好適な薬学的担体および製剤はレミントン（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ）の製薬科学（ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ）， 第１９版（Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， １９９５）に記載されている。好ましい薬学的担体は作用薬の目的の投与様式に依存する。典型的な投与様式には、腸内（例えば、経口）または非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは腹腔内注射、または局所、経皮または経粘膜投与）が含まれる。「薬学的に許容されうる塩」は、例えば金属塩（ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等）およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含む薬学的用途のために化合物に製剤化することができる塩である。
【００７９】
診断または治療の「被験者」とはヒトまたはヒト以外の哺乳類である。
【００８０】
組成物の「投与」とは、選択された投与経路によって被験者内に組成物を導入することを指す。例えば、選択された経路が静脈内である場合には、組成物は、被験者の静脈内に組成物を導入することによって投与される。
【００８１】
「治療」とは、予防的治療または治療的治療を指す。
【００８２】
「予防的」治療とは、異常を発症するリスクを低下する目的のために疾患の徴候を示さない被験者または早期徴候のみを示す被験者に与えられる治療である。
【００８３】
「治療的」治療とは、異常の徴候を軽減または排除する目的のために、そのような徴候を示す被験者に与えられる治療である。
【００８４】
「診断」とは、異常な状態の存在または性質を同定することを意味する。診断の方法は感受性および特異性において異なる。診断アッセイ法の「感受性」とは、陽性の結果を生ずる罹患患者の割合（真の陽性の割合）である。診断アッセイ法の「特異性」は、１−偽陽性率で、ここで、偽陽性率は、陽性の結果を生じるが、疾患を認めない患者の割合と規定される。特定の診断方法は、状態の決定的な診断を提供することができなくても、診断の助力となる陽性の結果をその方法が提供すれば十分である。
【００８５】
「予想（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）」とは、異常な状態の確率的な発症（例えば、重症度）を予測することを意味する。
【００８６】
ＩＩＩ． ＴＡＲＰ
本発明は、単離された組換えＴＡＲＰを提供する。本発明者らが最初に単離された前立腺特異的ＴＣＲγ転写物をを見いだしたので、〜１．１ ｋｂ ＰＳ−ＴＣＲγ転写物からいずれかのリーディングフレームに翻訳されると思われる任意のポリヌクレオチドを指すために、「ＰＳ−ＴＣＲγタンパク質」および「ＰＳ−ＴＣＲγポリペプチド」という用語を最初に使用した。特に、この用語は、インビトロにおける翻訳系において翻訳される２つのタンパク質、ＰＳ−ＴＣＲγ−１（配列番号：１４）およびＰＳ−ＴＣＲγ−２（配列番号：１５）を指す。本発明者らは本明細書において、これらのリーディングフレームのうち最初のものだけが前立腺細胞において翻訳されることを測定した。このリーディングフレームは、ＴＣＲγ鎖を生ずるリーディングフレームではないので、このタンパク質は本明細書では「Ｔ細胞受容体代替リーディングフレームのタンパク質（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）」と呼ぶ。全長のＴＡＲＰは５８アミノ酸のタンパク質で、その配列は配列番号：１４および図１４に記載されている。
【００８７】
ある種の態様において、本発明は、ＴＡＲＰの連続する少なくとも５アミノ酸〜少なくとも１５アミノ酸からなるエピトープを含むポリペプチドを提供する。このようなタンパク質は、全長のＴＡＲＰに対して形成された抗体に結合する（この項では、「ＴＡＲＰ」への言及は、内容によって特に要求されないかぎり、全長のタンパク質を指す。）。他の態様において、本発明は、タンパク質部分の一方が、ＴＡＲＰのエピトープを同定する少なくとも５アミノ酸のアミノ酸配列を含む第１および第２のポリペプチド部分を含む融合タンパク質を提供する。一態様において、ＴＡＲＰ部分はＴＡＲＰの全てまたは実質的である。他の部分は、例えば、免疫原性タンパク質であってもよい。このような融合物も、ＴＡＲＰに対する免疫応答を誘発するのに有用である。他の態様において、本発明は、アミノ酸配列がＴＡＲＰと少なくとも９０％同一であり（ＴＡＲＰと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはさらに高い配列の同一性を有してもよいが）、ＴＡＲＰに特異的に結合する抗体によって特異的に結合されるＴＡＲＰ様ペプチド（「ＴＡＲＰ類似物」）を提供する。さらに他の態様において、本発明は、アミノ酸配列がＴＡＲＰと少なくとも９０％同一であり（ＴＡＲＰと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはさらに高い配列の同一性を有してもよいが）、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するＴＡＲＰ様ペプチド（「ＴＡＲＰ類似物」と本明細書において呼ばれることもある）を提供する。このようなタンパク質は、ＰＳ−ＴＣＲγタンパク質に対する耐性を破壊する免疫原として有用である。
【００８８】
別の態様において、ポリペプチドは、例えばＨＬＡ分子またはＤＲ分子のようなＭＨＣ分子に結合するエピトープを含む。これらの分子は、約８アミノ酸または９アミノ酸によって分離されている適切なアンカーアミノ酸を有するポリペプチドに結合する。これらのペプチドは、ＴＡＲＰのアミノ酸配列を調べ、当該技術上周知のＭＨＣ結合モチーフを知ることによって同定することができる。
【００８９】
ＴＡＲＰ、その免疫原性断片およびＴＡＲＰ類似物を、組換えによって合成することができる。ＴＡＲＰの免疫原性断片および５８残基のＴＡＲＰ自体も標準的な方法によって化学的に合成されうる。望ましい場合には、ポリペプチドを新興技術によって化学的に合成することもできる。このような方法の１つは、Ｗ． ルー（Ｌｕ）ら、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ． ４２９： ３１−３５（１９９８）に記載されている。
【００９０】
ＩＶ．　ＴＡＲＰ核酸
一局面において、本発明は、ＴＡＲＰポリペプチド（例えば、図１４参照）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された組換え核酸分子を提供する。この核酸分子は、例えば、診断目的のために抗体を形成するのに使用することができるＴＡＲＰを発現するのに有用である。記載されているように、核酸分子は３つのリーディングフレームを有し、その各々は異なるオープンリーディングフレームによって規定される異なるポリペプチドをコードする。本明細書に含まれる態様において、関心のあるリーディングフレームはＴＡＲＰをコードするものである。
【００９１】
記載されているように、２つのリーディングフレームはインビトロ翻訳系において翻訳される。ＬＮＣａＰｃＤＮＡから得られる〜１．１ ｋｂのＰＳ−ＴＣＲγ転写物（配列番号：１３）のヌクレオチド配列ならびに転写物が７４位のヌクレオチド部位（ＰＳ−ＴＣＲγ−１、配列番号：１４）および２４７位のヌクレオチド部位（ＰＳ−ＴＣＲγ−２、配列番号：１５）から翻訳される場合の推定アミノ酸配列を図１に示す。転写開始点（下線部）は、Ｊγ１．２セグメントの最初の１０ヌクレオチド内である。配列データは、ＥＭＢＬ／ジェンバンク／ＤＤＢＪからアクセッション番号ＡＦ１５１１０３で入手可能である。ただし、実際の「＋１」部は本明細書において図１に記載された配列の６番目のヌクレオチドであると現在決定されていることが留意されるべきである。
【００９２】
実施者は、本発明のヌクレオチド配列を単離するためのＰＣＲプライマーを作製するためにこの配列を使用することができる。ＬＮＣａＰ細胞は、〜１．１ ｋｂの転写物の配列の有用なｃＤＮＡ源である。ＴＣＲγ遺伝子転移を受けていないヒト細胞、例えば、Ｔリンパ球前駆体以外の細胞由来のゲノムＤＮＡは、転写の結果、〜１．１ ｋｂ転写物に処理することができるより長い配列に有用である。配列は、周知の技法を使用して、本発明の関連する分子をコードする核酸を操作するように修飾することができる。
【００９３】
本発明の配列を含む核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づいた増幅系（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＴＡＳ）、自己持続性配列複製系（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（３ＳＲ）およびＱＢレプリカーゼ増幅系（ＱＢ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｙｔｅｍ）（ＱＢ）などのインビトロにおける方法によってクローニングまたは増幅することができる。例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分子のＤＮＡ配列に基づいたプライマーを使用してｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。
【００９４】
多種多様のクローニングおよびインビトロにおける増幅方法が当業者に周知である。ＰＣＲ方法は、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．５１： ２６３、およびエルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）編， 「ＰＣＲ技術（ＰＣＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）」，（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， １９８９）に記載されている。ポリヌクレオチドはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において望ましいポリペプチドの配列から選択されるプローブでゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによっても単離することができる。
【００９５】
操作された形態の核酸は、タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドの部位特異的な突然変異または０．１ ｍＭのＭｎＣｌ２およびアンバランスなヌクレオチド濃縮を用いて元のポリヌクレオチドのＰＣＲのエラー率を増加することによって生じるランダム突然変異によって作製することができる。
【００９６】
１．発現ベクター
本発明はまた、ＴＡＲＰ転写物によってコードされるポリペプチドを発現するための発現ベクターを提供する。発現ベクターは、例えばｍＲＮＡの転写および翻訳のために、適当なプロモーター、複製配列、マーカーを含ませることによって、原核細胞または真核細胞において機能するように適合させることができる。発現ベクターの構築およびトランスフェクトした細胞における遺伝子の発現は当該技術上周知の分子クローニング技法の使用に関係する。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング−−実験室マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ−−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）および「分子生物学における最新プロトコール（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」， Ｆ． Ｍ． アウスーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編，（「最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」， ａ ｊｏｕｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）この目的のために有用なプロモーターには、メタロチオネインプロモーター、構成性アデノウィルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成性ＭＰＳＶプロモーター、（ヒト即時型ＣＭＶプロモーターなどの）テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーターおよび構成性ＣＭＶプロモーターが含まれる。遺伝子治療に有用なプラスミドは、選択可能なマーカー、識別領域および他の遺伝子などの他の機能的要素を含んでもよい。
【００９７】
本発明に有用な発現ベクターは目的の用途に依存する。このような発現ベクターは、当然のことながら、宿主細胞に適合する発現および複製シグナルを含有しなければならない。生物活性な結合物を発現するのに有用な発現ベクターは、レトロウィルス、アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルスなどのウィルスベクター、プラスミドベクター、コスミド等を含む。ウィルスベクターおよびプラスミドベクターが哺乳類細胞にトランスフェクトするのに好ましい。発現コントロール配列がＣＭＶプロモーターを含む、発現ベクターｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）は良好なトランスフェクション率および発現率を提供する。アデノ関連ウィルスベクターは本発明の遺伝子治療方法に有用である。
【００９８】
例えば、溶液から細胞による分子の直接的な取り込み、リポフェクションによる取り込みの促進（例えば、リポソームまたはイムノリポソーム）、粒子媒介性トランスフェクションおよび抑制性ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に結合する発現コントロール配列を有する発現カセットからの細胞内発現を含む、種々の手段が細胞にポリヌクレオチドを送達するために利用可能である。米国特許第５，２７２，０６５号（Ｉｎｏｕｙｅら）、「酵素学における方法（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）」， ｖｏｌ． １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（Ｄ． Ｖ． Ｇｏｅｄｄｅｌ編）（１９９０）またはＭ． クリーガー（Ｋｒｉｅｇｅｒ）， 「遺伝子転移および発現−−実験室マニュアル（ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ−−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， （１９９０）も参照のこと。遺伝子治療以外の手段によって送達するために本発明のポリヌクレオチドを作製するために組換えＤＮＡ発現プラスミドも使用することができるが、インビトロにおける化学合成によって短いオリゴヌクレオチドを作製することがより経済的である。
【００９９】
構築物はまたタンパク質の単離を容易にするために標識を含有してもよい。例えば、６つのヒスチジン残基のようなポリヒスチジン標識をタンパク質のアミノ末端部位に組み入れることができる。ポリヒスチジン標識により、ニッケル−キレートクロマトグラフィーによる１段階でタンパク質を簡便に単離することができる。
【０１００】
２．組換え細胞
本発明はまた、本発明のヌクレオチドを発現するための発現ベクターを含む組換え細胞を提供する。タンパク質を精製するために、高レベルの選択のために宿主細胞を選択することができる。細胞は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）などの原核細胞または真核細胞であってもよい。有用な真核細胞には酵母および哺乳類細胞が挙げられる。細胞は、例えば、培養中の組換え細胞またはインビボにおける細胞であってもよい。
【０１０１】
ＴＡＲＰを発現する細胞は、これらのペプチドを発現する細胞に対して被験者を能動的または受動的に免疫化するのに有用である。ある態様において、細胞は細菌細胞である。一形態の能動免疫において、組換え細胞は、ＨＬＡ分子に関連してポリペプチドを提示することができる被験者の自己細胞である。例えば、抗原提示細胞はこの目的に有用である。この場合には、「自己細胞」すなわち、被験者由来の細胞を使用することが好ましい。このような細胞はＭＨＣ適合性である。一目標が細胞表面上に高密度にポリペプチドを発現することであり、好ましくは健康な前立腺上皮細胞において発現されるよりより高密度にポリペプチドを発現させることであるので、ＴＡＲＰをコードするヌクレオチド配列はこのような細胞における構成性プロモーターのコントロール下におかれるべきである。
【０１０２】
Ｖ．ＴＡＲＰを発現する細胞に対する細胞媒介性免疫応答を誘発する方法
ＴＡＲＰは上皮起源の前立腺癌細胞および多数の乳癌細胞によって発現される。従って、ＴＡＲＰは、前立腺癌およびＴＡＲＰを発現する乳癌を治療する際の治療の標的ならびに前立腺または乳房からそれぞれ転移した癌細胞のマーカーとして使用することができる。本発明は、免疫治療で前立腺癌およびＴＡＲＰを発現する乳癌を治療する方法を提供する。本発明の方法は、ＴＡＲＰに対して被験者を免疫化し、それによってＴＡＲＰを発現する細胞に対する細胞性免疫応答を誘発することに関係する。免疫化は能動的であっても、受動的であってもよい。能動免疫では、免疫応答はインビボにおいて被験者において誘発される。受動免疫では、ポリペプチドに対して活性化されたＴｃ細胞がインビトロにおいて培養され、被験者に投与される。このような方法は、ＴＡＲＰを発現する健康な上皮性前立腺組織を破壊すると予測されることがある。しかし、前立腺は必須な器官ではない。前立腺の損失は前立腺癌により被験者の生命を損失する可能性を相殺するはずであり、前立腺は実際には、ＴＡＲＰ免疫治療の開始前に外科的に切除されていることがある。正常な乳房組織をＴＡＲＰを大量に発現するとは見いだされていないので、ＴＡＲＰを発現する細胞に対する免疫化により女性において正常な細胞を損失するとは思われない。従って、ＴＡＲＰを発現する乳癌が後に発症する事象において免疫防御を提供するために、ＴＡＲＰ組成物を予防的に女性に投与することができる。
【０１０３】
免疫化する薬剤は、全長のＴＡＲＰ、ＴＡＲＰの抗原性決定因子を含むペプチド、例えばＴＡＲＰの免疫原性断片またはＴＡＲＰと実質的に同一であるタンパク質もしくはペプチドであってもよい。ＴＡＲＰに対する細胞性免疫応答を誘発しようとするとき、抗原性決定因子を含む好ましいペプチドは、被験者のＨＬＡ分子のための結合モチーフを保有するようなペプチドである。これらのモチーフは当該技術上周知である。例えば、ＨＬＡ Ａ２はヒト集団の共通の対立遺伝子である。この分子の結合モチーフには、２番めの位置にロイシンまたはメチオニンを有し、最後の位置にバリンまたはロイシンを有する９または１０のアミノ酸を有するポリペプチドが含まれる。ＴＡＲＰのポリペプチド配列に基づいて、任意の特定のＨＬＡ分子のモチーフを保有するアミノ酸配列を同定することができる。これらのモチーフを含むペプチドは典型的な方法（例えば、組換え法、化学的方法等）のいずれかによって作製することができる。ＴＡＲＰは自己タンパク質なので、ＨＬＡ結合モチーフを保有する好ましいアミノ酸配列は亜優先的または潜在的なエピトープをコードするものである。そのようなエピトープは、分子の他のエピトープに対してまたはＨＬＡ分子に結合する他の分子と比較して、ＨＬＡ分子に対する結合親和性の低さによって識別することができる。
【０１０４】
ＨＬＡ結合モチーフを含むＴＡＲＰのアミノ酸配列を含むポリペプチドも免疫応答を誘発するのに有用である。これは、一部には、このようなタンパク質は、ＨＬＡ分子に結合することができ、ＴＡＲＰエピトープを有するペプチドに細胞によって処理されるからである。
【０１０５】
ＨＬＡ分子とペプチド抗原の複合体は、ＨＬＡに制限されるＴ細胞によって認識されるリガンドとして作用する（Ｂｕｕｓ， Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ４７： １０７１， １９８６； Ｂａｂｂｉｔｔ， Ｂ． Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７： ３５９， １９８５； Ｔｏｗｎｓｅｎｄ， Ａ．およびＢｏｄｍｅｒ， Ｈ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７： ６０１， １９８９； Ｇｅｒｍａｉｎ， Ｒ． Ｎ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１： ４０３， １９９３）。１つのアミノ酸が置換された抗原を研究し、内因的に結合し、天然に処理されたペプチドを配列決定することにより、ＨＬＡ抗原分子に対する特異的な結合に必要なモチーフに相当する重要な残基が同定されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０： ３３６３， １９９８； Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１： １７８， １９９５； Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｓｅｔｔｅ， Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ， Ｊ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０： ４７８， １９９８； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ， Ｖ． Ｈ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：１３， １９９４； Ｓｅｔｔｅ， Ａ．およびＧｒｅｙ， Ｈ． Ｍ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４： ７９， １９９２）。
【０１０６】
さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体のｘ線結晶解析分析は、ペプチドリガンドによって形成される残基を対立遺伝子特異的に収容するＨＬＡ分子のペプチド結合間隙内にポケットを明らかにしており、これらの残基が、それらが存在するペプチドのＨＬＡ結合能力を決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ， Ｄ． Ｒ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：５８７， １９９５； Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４： ２０３， １９９６； Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８： ３０５， １９９８； Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２： ２４５， １９９４； Ｊｏｎｅｓ， Ｅ． Ｙ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：７５， １９９７； Ｂｒｏｗｎ， Ｊ． Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４： ３３， １９９３．）
【０１０７】
従って、Ｉ型およびＩＩ型対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフまたはＩ型もしくはＩＩ型スーパーモチーフを規定することにより、特定のＨＬＡ分子に結合する可能性を有する領域をＴＡＲＰ内で同定することができる。
【０１０８】
ＴＡＲＰと高レベルの配列の同一性を有する分子も免疫応答を誘発するのに有用である。このような分子は免疫系に対して「異種」として認識されることができ、さらに、ＴＡＲＰと交差反応する抗体またはＣＴＬを作製する。ＴＡＲＰと高い配列の同一性を有する分子には、非ヒトＴＣＲγ相同物、特に霊長類由来のものが含まれる。アミノ酸配列がＴＡＲＰと少なくとも９０％同一であり（ＴＡＲＰと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはさらに高い配列の同一性を有してもよいが）、ＴＡＲＰに特異的に結合する抗体によって特異的に結合されるＴＡＲＰ類似物を使用することができる。ＴＡＲＰ類似物、すなわち、アミノ酸配列がＴＡＲＰと少なくとも９０％同一であり（ＴＡＲＰと９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはさらに高い配列の同一性を有してもよいが）、ＴＡＲＰを発現する細胞に対するＴリンパ球を活性化するペプチドがこれに関してさらに有用である。
【０１０９】
ＴＡＲＰ抗原性決定因子に実質的に相同である別の分子は、ＨＬＡ分子に対してより高い親和性で結合するように、天然のＴＡＲＰエピトープの配列を改変することによって作製することができる。
【０１１０】
抗原性決定因子をコードする遺伝子を同定する１つの方法は以下のようである：転移癌を有する被験者のＴＩＬを増殖させ、インビトロにおいて自己癌を認識する能力について試験する。腫瘍退縮を生ずるものを同定するために、これらのＴＩＬを被験者に投与する。ＴＩＬは、ＴＩＬによって認識されるエピトープを発現する遺伝子について発現ライブラリーをスクリーニングするために使用される。次いで、これらの遺伝子で被験者を免疫化する。または、リンパ球をこれらの遺伝子によってコードされる抗原に対してインビトロにおいて感作する。次いで、感作したリンパ球を養子的に被験者に導入し、腫瘍退縮を生ずる能力について試験する。ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら，（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １９９７ １８： １７５。
【０１１１】
これらの分子の用途をここで記載する。これらの方法はローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら （１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １８：１７５およびＲｅｓｔｉｆｏら（１９９９）Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１：５０にも記載されている。
【０１１２】
免疫応答を誘発する１つの方法は、被験者をＴＡＲＰの抗原性決定因子を含むポリペプチドで単独で、またはさらに好ましくは、フロインドの不完全アジュバント、脂質またはリポソーム、ｇｐ９６、Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ９０などのアジュバントと併用して免疫化することに関係する。ポリペプチドはＴＡＲＰ、ＴＡＲＰの抗原性断片、抗原性決定因子を含む融合タンパク質またはこのような抗原性決定因子と実質的に同一な配列を含むペプチドであってもよい。
【０１１３】
別の方法は、ＴＡＲＰのエピトープを含むポリペプチドを抗原提示細胞に修飾し、その細胞を被験者に投与することに関係する。
【０１１４】
別の方法において、発現カセットにＴＡＲＰの抗原性決定因子を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含有する組換えウィルスを被験者に投与する。ウィルスはまた、選択的に、免疫応答を増強するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）、同時刺激分子または他の遺伝子をコードすることもできる。ウィルスは、例えば、アデノウィルス、鶏痘ウィルスまたはワクシニアウィルスであってもよい。感染の結果、感染細胞はＴＡＲＰペプチドを発現し、抗原性決定因子と同じモチーフを有するペプチドに結合するＨＬＡ分子と組み合わせて細胞表面上に抗原性決定因子を発現する。次いで、これらの細胞は、提示されている抗原を認識するＣＴＬの活性化を刺激し、決定因子も保有する癌細胞を破壊する。
【０１１５】
別の方法において、被験者は、ＴＡＲＰの抗原性決定因子を含むポリペプチドをコードする未処理のＤＮＡで、例えば筋肉内、微粒子銃注射または脂質に結合した状態によって免疫化される。このような方法は、コードされたペプチドを発現する細胞に対する細胞性免疫応答を刺激することが示されている。
【０１１６】
別の方法において、エピトープを発現し、選択的に免疫応答を増強するサイトカイン、同時刺激分子または他の遺伝子もコードするカルメット−ゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）またはリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）などの組換え細菌が被験者に投与される。
【０１１７】
別の方法において、抗原を発現する細胞を被験者に投与する。これには、例えばＴＡＲＰエピトープで標識した樹状細胞、ＴＡＲＰ抗原性決定因子、ＨＬＡおよびＢ７遺伝子を含むポリペプチドをトランスフェクトした細胞が含まれる。多重トランスフェクションにより、細胞表面に抗原性決定因子を提示するのに必要ないくつかの構成要素が作製される。一態様において、分子は、ＨＬＡ分子に対するペプチドの結合を改善するように、抗原性決定因子を保有するポリペプチドがＨＬＡ分子に（通常はリンカーにより融合されている）融合タンパク質である。一態様において、細胞は抗原提示細胞である。好ましくは、細胞は真核細胞であり、さらに好ましくは哺乳類細胞であり、さらに好ましくはヒト細胞であり、さらに好ましくは被験者由来の自己ヒト細胞である。
【０１１８】
別の方法において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）はインビトロにおいてＴＡＲＰのエピトープを含むペプチドで標識されるかまたは同時インキュベーションされる。これらの細胞は、前立腺癌腫瘍の腫瘍浸潤性リンパ球または末梢血リンパ球などの、ＣＤ８細胞を感作するために使用される。ＴＩＬまたはＰＢＬは好ましくは被験者由来である。しかし、それらは、少なくとも被験者が保有するＨＬＡ型に制限されるＩ型ＭＨＣでなければならない。次いで、感作した細胞を被験者に投与する。
【０１１９】
補足的な方法において、これらの免疫治療の任意のものはＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンなどのサイトカインを投与することによって増強される。
【０１２０】
上記のペプチドの免疫原性を評価するための方法以外に、免疫原性は、正常な個人由来の初代Ｔ細胞培養物を評価すること（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ， Ｐ． Ａ．ら、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２： ６０３， １９９５； Ｃｅｌｉｓ， Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ． ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ２１０５， １９９４； Ｔｓａｉ， Ｖ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８： １７９６， １９９７； Ｋａｗａｓｈｉｍａ， Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５９： １， １９９８を参照）、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ， Ｐ． Ａ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６： ９７， １９９６； Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ， Ｐ． Ａ．ら、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８： ６５１， １９９６； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｊ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： ４７５３， １９９７を参照）および効果的にワクチン形成された患者または腫瘍を有する患者のリコールＴ細胞応答を実証すること（例えば、Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ， Ｂ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８１： １０４７， １９９５； Ｄｏｏｌａｎ， Ｄ． Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７： ９７， １９９７； Ｂｅｒｔｏｎｉ， Ｒ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００： ５０３， １９９７； Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ， Ｓ． Ｃ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９： １６４８， １９９７； Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ， Ｈ． Ｍ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１： ６０１１， １９９７を参照）によっても評価することができる。
【０１２１】
ワクチン組成物のために関心のあるＣＴＬ誘導性ペプチドを選択する際に、Ｉ型ＨＬＡ分子に対するより高い結合親和性を有するペプチドが一般に好ましい。ペプチドの結合は、インビトロにおいて精製されたＨＬＡ分子に候補ペプチドが結合する能力を試験することによって評価される。
【０１２２】
ワクチンとして使用するとき、ＴＡＲＰ類似物が実際にインビボにおいてＴＡＲＰに対するＣＴＬ応答を確実に誘発するために（または、ＩＩ型エピトープの場合には、野生型ペプチドと交差反応するヘルパーＴ細胞を誘発する）、ＴＡＲＰ類似物は、適当なＨＬＡ対立遺伝子の個人由来のＴ細胞をインビトロにおいて免疫化するために使用することができる。その後、ＴＡＲＰ感作した標的細胞の融解を誘発する免疫化した細胞の能力を評価する。
【０１２３】
さらに一般的には、ＴＡＲＰまたはその類似物のペプチド（「本発明のペプチド」を合成し、ＨＬＡタンパク質に結合してＨＬＡもしくはＣＴＬ応答または両方を活性化する能力について試験することができる。）
【０１２４】
Ｔ細胞応答を検出するために使用される従来のアッセイ法には、増殖アッセイ法、リンホカイン分泌アッセイ法、直接細胞毒性アッセイ法および限界希釈アッセイ法が挙げられる。例えば、ペプチドと共にインキュベーションされた抗原提示細胞を、免疫応答細胞集団においてＣＴＬ応答を誘発する能力についてアッセイすることができる。
【０１２５】
ＰＢＭＣを、ＣＴＬ前駆体の免疫応答細胞源として使用することができる。適当な抗原提示細胞をペプチドと共にインキュベーションし、その後ペプチド付加した抗原提示細胞を次いで最適な培養条件下において免疫応答細胞集団と共にインキュベーションする。放射性標識した標的細胞、特定のペプチド標識した標的ならびにペプチド配列が誘導された内因的に処理された形態の抗原を発現する標的細胞の両者を死滅させるＣＴＬの存在について培養物をアッセイすることによって陽性のＣＴＬ活性化を判定することができる。
【０１２６】
抗原特異的Ｔ細胞の直接定量を可能にする方法は、フルオレセイン標識したＨＬＡテトラマー複合体による染色である（Ａｌｔｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： １０３３０（１９９３）； Ａｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４： ９４（１９９６））。または、細胞内リンホカインの染色、インターフェロン−γ放出アッセイ法またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法をＴ細胞応答を評価するために使用することができる。
【０１２７】
ＨＬＡ活性化は、Ｔ細胞増殖、ＩＬ−２のようなリンホカインの分泌などの当業者に周知の技法を使用して評価することができる（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １： ７５１−７６１（１９９４））　。
【０１２８】
ＶＩ．　ＴＡＲＰに対する抗体
一局面において、本発明は、ＴＡＲＰに特異的に結合する抗体を含む組成物を提供する。抗体は、好ましくは、少なくとも１０６ Ｍ−１、１０７ Ｍ−１、１０８ Ｍ−１または１０９ Ｍ−１の親和性を有する。本発明はポリクローナル抗体組成物およびモノクローナル抗体組成物の両方を含む。
【０１２９】
ＴＡＲＰに特異的に結合する抗体を形成するために数多くの免疫原を使用することができる。全長のＴＡＲＰは好適な免疫原である。典型的には、関心のある免疫原は少なくとも約３アミノ酸のペプチドであり、さらに典型的には、ペプチドは鎖長が少なくとも５アミノ酸であり、好ましくは断片は鎖長が１０アミノ酸であり、さらに好ましくは断片は鎖長が少なくとも１５アミノ酸である。ペプチドは担体タンパク質に結合されてもよく（例えば、融合タンパク質として）または免疫ベクター内で組換えにより発現される。抗体が結合するペプチドの抗原性決定因子は、典型的には、鎖長が３アミノ酸〜１０アミノ酸である。天然型ポリペプチドも純粋な形態または純粋でない形態で使用される。
【０１３０】
組換えポリペプチドは真核細胞または原核細胞において発現され、標準的な技法を使用して精製される。次いで、ポリペプチドまたはその合成形態を、抗体を形成することができる動物に注射する。ポリペプチドの存在および量を測定するための免疫アッセイ法にその後使用するためのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を作製することができる。
【０１３１】
ポリクローナル抗体を作製するための方法は当業者に既知である。簡単に説明すると、免疫原、好ましくは精製したポリペプチド、適当な担体（例えば、ＧＳＴ、キーホールリンペットヘモシアニン等）に結合したポリペプチドまたは組換えワクシニアウィルスなどの免疫化ベクターに組み入れたポリペプチド（米国特許第４，７２２，８４８号を参照）をアジュバントと混合し、この混合物で動物を免疫する。採血し、関心のあるポリペプチドに対する反応力価を求めることによって免疫原調製物に対する動物の免疫応答をモニターする。免疫原に対する適度に高い力価の抗体が得られたら、動物から採血し、抗血清を調製する。望ましい場合には、ポリペプチドに反応性の抗体を濃縮するために抗血清のさらなる分画化を実施する。例えば、コーリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）（１９９１）「免疫学の最新プロトコール（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ， ＮＹ；ならびにハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８９）「抗体：実験室マニュアル（ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．を参照。
【０１３２】
ＴＡＲＰの所定の断片に対する結合断片および１本鎖組換え形態を含む抗体を、例えば断片の上記の担体タンパク質との結合物で動物を免疫化することによって形成する。
【０１３３】
モノクローナル抗体は、望ましい抗体を分泌する細胞から調製される。これあらの抗体は、通常のポリペプチドまたは修飾ポリペプチドに対する結合についてスクリーニングされるか、または作用性または拮抗性についてスクリーニングされる。マウス、齧歯類、霊長類、ヒト等などの種々の哺乳類からモノクローナル抗体を調製することが望ましい場合もある。このようなモノクローナル抗体を調製するための技法の説明は、例えばスティーツ（Ｓｔｉｔｅｓ）ら（編），「基礎的、臨床的免疫学（ＢＡＳＩＣ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ， ＣＡ， およびそこに引用されている参照文献、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），前記、Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）「モノクローナル抗体：原理と実践（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ；およびコーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５−４９７に見いだされる。
【０１３４】
他の好適な技法はファージまたは同様のベクターにおいて組換え抗体のライブラリーを選択することに関係する。フーセ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５−１２８１；およびワード（Ｗａｒｄ）ら （１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１： ５４４−５４６。
【０１３５】
また、組換え免疫グロブリンを作製することができる。米国特許第４，８１６，５６７（Ｃａｂｉｌｌｙ）；およびクイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： １００２９−１００３３参照。
【０１３６】
しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、共有結合または非共有結合により、検出可能なシグナルを提供する物質を結合することによって標識される。多種多様の標識および結合技法が周知で、科学的な文献および特許文献に広範に報告されている。従って、分析物を検出するために使用される抗体は検出可能な部分で直接標識されても、または例えば、それ自体直接または間接的に標識されている二次抗体に抗体を結合することによって間接的に標識されてもよい。
【０１３７】
本発明の抗体はまた、ＴＡＲＰを単離する際にアフィニティークロマトグラフィーに使用される。カラムは、細胞溶解物をカラムに通し、洗浄し、精製されたＴＡＲＰを放出される軽度な変性剤の濃度を増加させて処理する例えばアガロース、セファデックス等などの粒子のような固相支持体に結合した抗体を用いて調製される。
【０１３８】
別の方法は、非ヒト抗体のＣＤＲ領域を組換えＤＮＡ技法によってヒトの不変領域に結合することによって、ヒト化免疫グロブリンを作製することである。米国特許番号第５，５８５，０８９号（Ｑｕｅｅｎら）を参照。
【０１３９】
ヒトモノクローナル抗体またはその結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離するためのさらに別の方法は、フーセ（Ｈｕｓｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５−１２８１（１９８９）に概略が示されている一般的なプロトコールによりヒトＢ細胞のＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、次いで望ましい特異性の抗体（または結合断片）をコードする配列をクローニングし増幅することによる。Ｈｕｓｅによって記載されているプロトコールは、ファージディスプレイ技術と併用するとより効率的になる。例えば、国際公開公報第９１／１７２７１号（Ｄｏｗｅｒら）および国際公開公報第９２／０１０４７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）を参照。ファージディスプレイ技術はまた、ＴＡＲＰに対する親和性を有することが以前に示されている抗体のＣＤＲ領域を突然変異させるために使用することができる。結合親和性が改善された抗体が選択される。
【０１４０】
本発明の別の態様において、ＴＡＲＰまたはタンパク質類似物に対する抗体の断片が提供される。典型的には、これらの断片は完全な免疫グロブリンと同様のＴＡＲＰへの特異的な結合を示す。抗体断片には別個の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖが含まれる。断片は組換えＤＮＡ技法または無傷の免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって作製される。
【０１４１】
ＶＩＩ．ＴＡＲＰを標的とするキメラ分子
本発明は、ＴＡＲＰを標的とするキメラ分子を提供する。キメラ分子は、標的部分とエフェクター部分とを含む。キメラタンパク質は、ポリペプチドおよびポリペプチドを保有する細胞を検出する際に有用である。
【０１４２】
Ａ．標的部分
本発明のキメラ分子は標的部分を含む。標的部分は、ＴＡＲＰに特異的に結合するリガンドを含む。好ましいリガンドは、抗体の結合断片を含む、その用語が本明細書において使用されるとおりの抗体である。しかし、これらの分子の他の天然のリガンドを使用することもできる。
【０１４３】
Ｂ．エフェクター部分
エフェクター部分は、抗体、増殖因子またはリガンドなどの別の特異的な結合部分であってもよい。次いで、キメラ分子は特異性の高い二官能性リンカーとして作用する。このリンカーは、融合タンパク質が結合する細胞または細胞成分を結合し、細胞または細胞成分間の相互作用を増強する作用をする。
【０１４４】
よりさらに別の態様において、エフェクター分子は、薬剤（例えば、薬物）または薬剤を含有する溶媒であってもよい。従って、ＴＡＲＰに特異的に結合する部分を、ビンブラスチン、ドキソルビシン、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）（チロシンキナーゼ阻害剤）、アンチセンス分子および当業者に周知の他の薬剤などの薬物に結合し、それによって薬剤を腫瘍細胞に特異的に標的化することができる。
【０１４５】
または、標的部分を、治療用組成物を含有する溶媒に結合してもよい。このような溶媒には、リポソーム、ミセル、種々の合成ビーズ等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
当業者は、本明細書のキメラ分子は１つのエフェクターに結合される多数の標的部分を含んでもよく、逆に、１つの標的部分に結合される多数のエフェクター分子を含んでもよいことを理解している。本発明のキメラ分子のエフェクター分子成分として使用するのに好適な検出可能な標識には、全て上記されている分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物を含む。
【０１４７】
当業者は、標的部分およびエフェクター分子は任意の順序で一体として結合されてもよいことを理解している。従って、標的分子がポリペプチドである場合には、エフェクター分子は標的分子のアミノ末端またはカルボキシ末端に結合することができる。結合が分子のそれぞれの活性を妨害しないかぎり、標的分子はまた、エフェクター分子の内部領域に結合してもよく、逆に、エフェクター分子は標的分子の内部位置に結合してもよい。
【０１４８】
標的分子およびエフェクター分子は、当業者に周知の数多くの手段のいずれかによって結合することができる。典型的には、エフェクター分子は直接的またはリンカー（スペーサー）によって、標的分子に結合される。しかし、エフェクター分子および標的分子のどちらもポリペプチドである場合には、１本鎖融合タンパク質としてキメラ分子を組換えによって発現することが好ましい。
【０１４９】
一態様において、標的分子はエフェクター分子に化学的に結合される（例えば、サイトトキシン、標識、リガンドまたは薬物もしくはリポソーム）。化学的に分子を結合する手段は当業者に周知である。薬剤を抗体または他のポリペプチド標的分子に結合するための手法は、薬剤の化学構造により異なる。ポリペプチドは典型的には、エフェクターを結合するためにエフェクター分子の好適な官能基と反応するのに利用可能である、カルボン酸基（ＣＯＯＨ）または遊離アミン基（−ＮＨ２）のような種々の官能基を含有する。または、標的分子および／またはエフェクター分子は、別の反応性官能基に暴露または結合されるように誘導体化されることができる。誘導体化は、ピアス化学会社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ロックフォード、イリノイ州、から入手可能なものなどの数多くのリンカー分子のいずれかの結合に関係してもよい。
【０１５０】
特定の薬剤の基と反応する１つの官能基および抗体と反応する別の基を有する二官能性リンカーを使用して、望ましい免疫結合物を形成することができる。または、誘導体化は、過ヨウ素酸塩により糖タンパク質抗体の糖部分をグリコール切断して、遊離のアルデヒド基を形成するような、標的分子の化学的処理を含んでもよい。抗体の遊離のアルデヒド基は、薬剤の遊離のアミンまたはヒドラジン基と反応して、薬剤を結合することができる。（米国特許第４，６７１，９５８号参照）。抗体または抗体断片などのポリペプチドに遊離のスルフィドリル基を形成する手法も周知である（米国特許第４，６５９，８３９号参照）。
【０１５１】
放射性核種金属キレート、毒素および薬物を含む種々の化合物を抗体などのタンパク質に結合するための多数の手法およびリンカー分子は周知である。例えば、欧州特許出願番号第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号、同第４，６８０，３３８号、同第４，５６９，７８９号および同第４，５８９，０７１号ならびにボーリンガウス（Ｂｏｒｌｉｎｇｈａｕｓ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７： ４０７１−４０７５（１９８７）を参照。特に、種々のイムノトキシンの作製は当該技術上周知であり、例えば、「モノクローナル抗体−トキシン接合体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）： マジックブレット（ｔｈｅ Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔ）用」、トープ（Ｔｈｏｒｐｅ）ら、臨床医薬におけるモノクローナル抗体（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＩＮ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １６８−１９０（１９８２）、ウォルドマン（Ｗａｌｄｍａｎｎ）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５２： １６５７（１９９１）、米国特許第４，５４５，９８５および同第４，８９４，４４３号に見いだすことができる。
【０１５２】
標的分子および／またはエフェクター分子が比較的短い場合には（すなわち、約５０未満のアミノ酸）、標準的な化学的ペプチド合成技法を使用してそれらを合成することができる。両分子が比較的短い場合には、基分子は１つの連続ポリペプチドとして合成することができる。または、標的分子およびエフェクター分子を別個に合成し、次いで一方の分子のアミノ末端と他方の分子のカルボキシ末端とを縮合し、それによってペプチド結合を形成することによって融合することができる。または、標的およびエフェクター分子を各々ペプチドスペーサー分子の一方の末端に縮合し、それによって連続する融合タンパク質を形成することができる。
【０１５３】
配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に結合し、次に配列の残りのアミノ酸を逐次的に付加する固相合成は、本発明のポリペプチドの化学的合成の好ましい方法である。固相合成の技法は、バレニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ），「固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」； ｐｐ．３−２８４ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２巻： 「ペプチド合成における特別方法（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」， パートＡ、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５： ２１４９−２１５６（１９６３）、およびスチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、ピアス化学会社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ． Ｃｏ．）、ロックフォード、イリノイ州（１９８４）によって記載されている。
【０１５４】
好ましい態様において、キメラ融合タンパク質は組換えＤＮＡ方法を使用して合成される。一般に、これは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を作製し、発現カセット中にこのＤＮＡを特定のプロモーターのコントロール下におき、宿主においてタンパク質を発現させ、発現したタンパク質を単離し、必要があれば、タンパク質を再生することに関係する。
【０１５５】
本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、ナラング（Ｎａｒａｎｇ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８： ９０−９９（１９７９）のホスホトリエステル方法、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８： １０９−１５１（１９７９）のホスホジエステル方法、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら、Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ．， ２２： １８５９−１８６２（１９８１）のジエチルホスホルアミダイト方法および米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体方法などの方法による適当な配列のクローニングおよび制限または直接的な化学的合成を含む任意の好適な方法によって作製することができる。
【０１５６】
２つの分子は、好ましくは、本質的には直接一体として結合されるが、当業者は、分子は、１つ以上のアミノ酸からなるペプチドスペーサーによって分離されていてもよいことを理解している。一般に、スペーサーは、タンパク質を結合するまたはタンパク質の間に最低の距離または他の空間的な関係を維持する以外には特定の生物的作用を持たない。しかし、スペーサーの構成アミノ酸は、折りたたみ、総電荷または疎水性などの分子のいくつかの特性に影響を与えるように選択することができる。
【０１５７】
融合タンパク質をコードする核酸配列は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、他の細菌宿主、酵母およびＣＯＳ、ＣＨＯおよびＨｅＬａ細胞系統などの種々の高等真核細胞ならびに骨髄腫細胞系を含む種々の宿主細胞において発現することができる。組換えタンパク質遺伝子は、各宿主の適当な発現コントロール配列に機能的に結合される。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）では、これはＴ７、ｔｒｐまたはλプロモーターなどのプロモーター、リボソーム結合部位を含み、好ましくは転写停止シグナルを含む。真核細胞では、コントロール配列はプロモーターを含み、好ましくは免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウィルス等由来のエンハンサーおよびポリアデニル化配列を含み、スプライスドナーおよびアクセプター配列を含んでもよい。本発明のプラスミドおよびベクターは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の塩化カルシウム形質転換および哺乳類細胞のリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションなどの周知の方法によって選択された宿主細胞に導入することができる。
【０１５８】
一旦発現されたら、組換え融合タンパク質を、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当該技術の標準的な手法により精製することができる（一般に、Ｒ． Ｓｃｏｐｅｓ， ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．（１９８２）， Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ． １８２： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照）。薬学的用途には少なくとも約９０〜９５％の均一性で実質的に純粋な組成物が好ましく、９８〜９９％以上の均一性が最も好ましい。部分的または望ましい均一性にまで一旦精製されたら、ポリペプチドを治療的に使用することができる。
【０１５９】
ＶＩＩＩ．ＴＡＲＰを発現する細胞を検出する方法
別の局面において、本発明は、ＴＡＲＰを発現する細胞を検出する方法を提供する。本発明の方法は、ＴＡＲＰ転写物またはポリペプチドを検出することに関係する。上皮起源の前立腺癌細胞および多数の乳癌細胞がＴＡＲＰを発現するので、検出方法は、前立腺癌およびＴＡＲＰを発現する乳癌を検出する際に有用である。特に、前立腺癌細胞および多数の乳癌細胞は、ＴＡＲＰを発現することによって他の細胞から識別することができる。
【０１６０】
前立腺および乳房を含む原発癌または転移癌の任意の可能な部位ならびにリンパ節および他の器官などの遠位部位から組織試料を選択することができる。当業者は、女性だけでなく男性が乳癌に罹患することに気づいている。男性における乳癌は比較的まれであり、全ての乳癌の症例の約１％しか占めていない。しかし、男性の乳癌は一般的ではないので、生存の可能性に影響与える後期に診断されることが多い。従って、男性における乳癌の診断の改善が望ましい。
【０１６１】
１つの方法において、被験者に生体試料検査を実施し、採取した組織をインビトロにおいて試験する。典型的には、細胞は、核のタンパク質を変性させることなく、核のタンパク質に接近できるように、細胞溶解、超音波破壊、浸透圧、凍結および融解、酵素的な処理または当該技術上通常の他の手段によって破壊される。細胞内容物（または、内容物が分画化されている場合には、核内容物）を次いで、例えば抗ＴＡＲＰ抗体に接触させる。結果として生ずる任意の免疫複合体は生検試料中のＴＡＲＰの存在を示す。このような検出を容易にするために、抗体を放射性標識しても、放射性標識されているエフェクター分子に結合してもよい。別の方法において、細胞は、典型的な画像形成方法を使用してインビボにおいて検出することができる。例えば、本発明の方法は、細胞の核に到達することができる標識組成物の被験者への投与に関係する。次いで、標識の局在化を、標識を検出するための既知の方法のいずれかによって測定する。画像診断を可視化するための任意の従来の方法を使用することができる。例えば、常磁性同位体をＭＲＩに使用することができる。
【０１６２】
ＴＡＲＰの検出
ＴＡＲＰは、当該技術上周知の任意の方法によって同定することができる。一態様において、本発明の方法は、ポリペプチドを特異的に認識するリガンドを用いてポリペプチドを検出することに関係する（例えば、免疫アッセイ法）。本発明の抗体は、ＴＡＲＰの特異的な検出に特に有用である。抗体に基づいた種々の検出方法が当該技術上周知である。これらには、例えば、放射免疫アッセイ法、サンドイッチ免疫アッセイ法（ＥＬＩＳＡを含む）、免疫蛍光アッセイ法、ウェスタンブロット、アフィニティークロマトグラフィー（固相に結合したアフィニティーリガンド）および標識抗体を用いたインサイチュー検出が挙げられる。ＴＡＲＰを検出する別の方法は、例えば、ゲル電気泳動、質量分析法またはＨＰＬＣによってその質量によりポリペプチドを同定することに関係する。被験者の試料は、唾液、腹液、血液または血液産物（例えば、血清）、組織生検（例えば、リンパ節組織）等などの任意の数の適当な起源から採取することができる。
【０１６３】
ＴＡＲＰは、インビトロにおいて、生検試料においておよび上記の画像形成方法を使用してインビボにおいて細胞中で検出することができる。
【０１６４】
ＴＡＲＰをコードする転写物の検出
ＴＡＲＰ転写物を発現する細胞は、転写物に特異的にハイブリダイズする核酸プローブを試料に接触させ、ハイブリダイゼーションを検出することによって検出することができる。これには、例えば、標識したプロモーターを試料に接触させ、結合した標識を検出することによってハイブリダイゼーションを検出するインサイチューハイブリダイゼーションの方法を含む。しかし、試料中に存在する転写物の両は少量であることがある。従って、他の方法は、ＲＴ−ＰＣＲ法などの増幅を使用している。これらの方法では、ｍＲＮＡからＴＡＲＰ配列を特異的に増幅する増幅プライマーとして機能するプローブを選択する。次いで、増幅した配列を典型的な方法を使用して検出する。
【０１６５】
プローブは、ＴＡＲＰ転写物と特異的にハイブリダイズするように選択される。一般に、相補的なプローブを使用する。しかし、プローブがストリンジェントな条件下において、ハイブリダイズするのに十分な配列の相同性および鎖長を有する場合には、プローブは正確に相補的である必要はない。
【０１６６】
ＩＸ．薬学的組成物
別の局面において、本発明は、薬学的に許容されうる担体と本発明の組成物とを含む薬学的組成物を提供する。
【０１６７】
一態様において、薬学的組成物はＴＡＲＰ、ＴＡＲＰエピトープを含むポリペプチドなどのその免疫原性断片またはＴＡＲＰ類似物を、被験者において細胞性免疫応答または液性応答を誘発するのに有効な量を含む。例えばＭＨＣ結合モチーフを保有するポリペプチド。このような薬学的組成物は本発明の治療方法におけるワクチンとしておよび抗体を作製するために有用である。
【０１６８】
別の態様において、薬学的組成物は、被験者においてＴＡＲＰを発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに有効な量の、ＴＡＲＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。このような組成物はまた、本発明の治療方法に有用である。
【０１６９】
別の態様において、薬学的組成物は、関心のある細胞においてＴＡＲＰの発現を調節するために、ＴＡＲＰをコードするヌクレオチド配列を特異的に切断することができるリボザイム、このような核酸に結合することができるアンチセンス分子またはＴＡＲＰをコードする核酸を含む発現カセットを含む。
【０１７０】
さらに別の態様において、薬学的組成物は、ＴＡＲＰを発現する細胞を検出し得るために、標的分子および検出分子を含むキメラ分子を含むことができる。検出分子が、ＴＡＲＰをコードする核酸に特異的に結合することができるものである場合には（ＴＡＲＰをコードするＤＮＡに特異的に結合することができるＤＮＡ結合タンパク質など）、その核酸を発現する細胞を検出するために組成物を使用することができる。
【０１７１】
本発明の薬学的組成物は、被験者に投与するための単位投与剤形で製剤化することができる。投与量および投与時期は、望ましい目的を実施する担当医の選択の範囲である。
【０１７２】
実施例
実施例１　前立腺細胞におけるＴ細胞受容体γ鎖の検出
Ｔ細胞受容体γ鎖（ＴＣＲγ）ｍＲＮＡがヒト前立腺で発現していることを同定し、それが前立腺上皮細胞に由来し、浸潤性Ｔリンパ球には由来しないことを示した。対照的にＴ細胞受容体δ鎖（ＴＣＲγ）遺伝子はヒト前立腺ではサイレントである。前立腺における主要なＴＣＲγ転写物は胸腺、脾臓および血液リンパ球で発現されている転写物とは異なるサイズを有する。正常前立腺上皮、前立腺アデノカルチノーマおよび前立腺アデノカルチノーマ細胞株ＬＮＣａＰにおいてそれは発現している。そのＲＮＡは未再構成ＴＣＲγ座位に由来し、Ｊγ１．２遺伝子セグメントの直接上流のイントロン配列内から開始されている。前立腺特異的ＴＣＲγ転写物はＪγ１．２およびＣγ１遺伝子セグメントからなり、３’末端にポリアデニル化シグナルおよびポリ（Ａ）配列を含む非翻訳配列を有する。Ｔリンパ球でのみ限定的に発現されていると考えられていた遺伝子から前立腺上皮細胞が高いレベルの転写物を発現するという発見は新規で非常に予想外である。
【０１７３】
１．材料および方法
ＲＮＡドットブロット法およびノーザンブロットハイブリダイセーション法
ＲＮＡドットブロット法（ＲＮＡマスターブロット、クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）が様々なヒト組織に関して実施した。ノーザンブロット法はまた前立腺アデノカルチノーマ細胞株ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）由来のｍＲＮＡに関しても実施した。ポリ（Ａ）ＲＮＡの単離はファストトラック（ＦａｓｔＴｒａｃｋ）キット（インビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて実施した。ＲＮＡを、確立された方法に従い、１％アガロースゲル中で電気泳動し、ナイロン性の膜（ジーンスクリーンプラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ）、デュポン、ウィルミントン、ドイツ）に転写した。オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、上述。ＴＣＲγ転写物の非翻訳３’末端（３’ＵＴＲ）に特異的なｃＤＮＡプローブをＥＳＴプラスミドｎｇ７９ｄ１１（ゲノムシステムズ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、セントルイス、ミズーリ州）から作製した。ＴＣＲγ転写物の定常領域（ＴＣＲ Ｃγ）に特異的なプローブはＬＮＣａＰｃＤＮＡから作製し、ＴＣＲδ転写物の定常領域（ＴＣＲ Ｃδ）のプローブはＴＣＲδプラスミドから作製した。ヒトβアクチンプローブをｍＲＮＡ調製の品質対照として使用した。プローブは３２Ｐを用いてランダムプライマー伸長（ロフストランドラボリミテッド（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ゲイザースバーグ、メリーランド州）により１μＣｉ／ｎｇの比活性で標識した。ＲＮＡ膜は５０％ホルムアミドを含むハイブリダイセーション溶液（ハイブリゾルＩ（ＨｙｂｒｉｓｏｌＩ）、オンコー（Ｏｎｃｏｒ）、ゲイザースバーグ、メリーランド州）中にて４５℃２時間ブロッキングし、その後２０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液中で２０μＣｉのｃＤＮＡを用いて４５℃、１５時間プロービングした。膜は２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で室温にて１５分間、２回洗浄され、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で５５℃〜６５℃にて２０分間、２回洗浄された。膜を現像前に、−８０℃にてイメージングフィルム（Ｘ−ＯＭＡＴ、コダック、ロチェスター、ニューヨーク州）に露光した。
【０１７４】
ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション法
ＴＣＲγ定常領域およびＴＣＲγ非翻訳３’末端ヌクレオチド配列は逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＬＮＣａＰ ｍＲＮＡから増幅し、プラスミドブルースクリプトＩＩＳＫ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ）（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）にクローン化し、ＤＮＡ配列決定により確認した。アンチセンスおよびセンスＴＣＲγの３５Ｓリボプローブは各々、Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼにより作製した。国立癌研究所（ＮＣＩ）から、保管されていた８症例の前立腺経尿道切徐標本のパラフィンブロックを検索した。悪性および良性両方の前立腺管を含む症例を選択した。症例の平均年齢は６９歳であり、腫瘍のグリーソン（Ｇｌｅａｓｏｎ）スコアは３＋３＝６／１０から４＋５＝９／１０の範囲であった。ブロックはスライドガラス上で処理し、リボプローブ（モレキュラーヒストロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）、ゲイザースバーグ、メリーランド州）を用いてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションに続き、スライドをヘマトキシリンおよびエオジンを用いて対比染色し、明視野および暗視野を提供する可変コンデンサーを具備したツァイスアキシオフォト顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて検査した。
【０１７５】
ＲＴ−ＰＣＲ解析
１本鎖ｃＤＮＡを各々１５０〜２５０ｎｇのＬＮＣａＰおよびＰＣ−３ポリ（Ａ）ｍＲＮＡからオリゴｄＴプライミング（ファルマシアバイオテク、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）を用いて調製した。ＰＣＲプライマーはＴＣＲγ転写物の異なる部分を増幅するように設計した。ｃＤＮＡのみを増幅し、かつｍＲＮＡ調製物中に存在するかもしれない微量のゲノムＤＮＡを増幅しないために、プライマー組は常に２つ以上のエクソンに渡るＰＣＲ産物を生成するように組み合わせた。ＰＣＲ法は２つのＴＣＲγ定常領域遺伝子Ｃγ１またはＣγ２のいずれかを、エクソンＣＩ中のフォワードプライマー（ＴＣＲＣγ．Ｆ）およびエクソンＣＩＩＩ中のリバースプライマー（ＴＣＲＣγ．Ｒ４）を用いて増幅するように設定した、図８。可変領域から定常領域にまたがるＰＣＲ法は、ＴＣＲγ可変遺伝子セグメントの４つのサブグループの各々に特異的なフォワードプライマー（ＴＣＲＶγＩ．Ｆ、ＴＣＲＶγＩＩ．Ｆ、ＴＣＲＶγＩＩＩ．Ｆ、ＴＣＲＶγＩＶ．Ｆ）とＴＣＲγ定常遺伝子セグメント中のリバースプライマー（ＴＣＲＣγ．Ｒ１）とを組み合わせるよう設定した、図８。ワックス媒介性ホットスタートＰＣＲ法は高正確性ＰＣＲ成分（エキスパンド（Ｅｘｐａｎｄ）、ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて３０サイクル実施した。ＰＣＲ産物は０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１．２％アガロースゲル上で解析した。特異的ＰＣＲ産物をゲル精製（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州）し、Ｔ／Ａクローン化（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）し、パーキンエルマーのディーローダミン（ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ）ターミネーターサイクルシークエンシングキットを用いて自動化キャピラリーシークエンサー（パーキンエルマーアプライドシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）でシークエンスした。
【０１７６】
ＴＣＲγＶＪ遺伝子再構成の分析
ゲノムＤＮＡは確立された処理に従い、５ｘ１０７のＬＮＣａＰ細胞から調製した、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、上述。Ｖγ遺伝子セグメントの４つのサブグループの一つに由来するフォワードプライマー（ＴＣＲＶγＩ．Ｆ、ＴＣＲＶγＩＩ．Ｆ、ＴＣＲＶγＩＩＩ．Ｆ、ＴＣＲＶγＩＶ．Ｆ）と、３つのＪγ１遺伝子セグメントの１つに由来するリバースプライマー（ＴＣＲＪγ１．１．Ｒ、ＴＣＲＪγ１．２．Ｒ、ＴＣＲＪγ１．３．Ｒ、）とを各々組み合わせるようにした、１２組のＰＣＲ法を実施した、図８。ホットスタートＰＣＲ法は５００ｎｇゲノムＤＮＡを用いて３０サイクル実施し、ＰＣＲは０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１．２％アガロースゲル上で分析した。ヒト胎盤ＤＮＡ（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）をプライマーの陽性対照として使用し、Ｊγ１．１からＪγ１．２のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅を鋳型の陽性対照として実施した。
【０１７７】
ＲＮＡのプライマー伸長解析
前立腺ＴＣＲγ転写物の開始点はＬＮＣａＰ ｍＲＮＡのプライマー伸長解析により決定した。５μｇのｍＲＮＡをＣγ１の５’末端から４８〜７５ヌクレオチドにアニールする３２Ｐ末端標識されたＴＣＲＣγ．Ｒ２プライマー０．０８ｐｍｏｌと混合した。解析は、確立された処理に基づき２０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（スーパースクリプト、ギブコＢＲＬ、ゲイザースバーグ、メリーランド州）を用いて実施した。ジョージ（Ｃ．Ｐ．Ｇｅｏｒｇｅ）ら、（１９９６）「ＲＮＡのプライマー伸長解析（Ｐｒｉｍｅｒ―ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ）」、研究室におけるＲＮＡ、単離、解析および合成のための手引き書（ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＲＮＡ、ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ、ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＡＮＤ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）Ｐ．Ａ．Ｋｒｉｅｇ編集、（ウィレイリス社（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、ニューヨーク、ニューヨーク州）、１３３〜１３９ページ。サンプルは６％ポリアクリルアミド尿素ＤＮＡシークエンシングゲルで３２Ｐ末端標識された分子量マーカー（ＭｓｐＩ消化されたｐＢＲ３２２、ロフストランドラボリミテッド、ゲイザースバーグ、メリーランド州）と平行して電気泳動した。電気泳動後、ゲルはワットマンろ紙にブロットし、乾燥して、オートラジオグラフ法に供した。
【０１７８】
５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ解析
二重鎖ｃＤＮＡは５００ｎｇのＬＮＣａＰポリ（Ａ）ｍＲＮＡからマラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）および２５ｐｍｏｌのＴＣＲγ遺伝子特異的プライマー（ＴＣＲＣγ．Ｒ３）、図８、を用いて作製した。その後、マラソンアダプターを合成ｃＤＮＡの末端に結合した。ｃＤＮＡの５’末端の迅速増幅（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ５’−ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）（５’ＲＡＣＥ）ＰＣＲは、逆転写に使用されたプライマーの上流にアニールする遺伝子特異的プライマー（ＴＣＲＣγ．Ｒ２）、図８、およびアダプター特異的プライマーを用いて実施した。ホットスタート条件を適用し（アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）、クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）、ＰＣＲ産物はＲＴ−ＰＣＲ解析で記載されているように解析およびクローン化した。５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ分析ゲル由来のＤＮＡをナイロン膜に転写し、さらに上流にハイブリダイズする３２Ｐ末端標識されたプライマー（ＴＣＲＣγ．Ｒ１）、図８、を、臭化エチジウム／紫外線により検出されない可能性のあるバンドを同定するために適用した。
【０１７９】
インビトロ転写共役翻訳
ＲＴ−ＰＣＲ法および５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ法により獲得した完全な前立腺ＴＣＲγ転写物をＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、プラスミドブルースクリプトＩＩＳＫ（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）にクローン化し、シークエンスし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよび小麦胚芽抽出物（ＴＮＴ、プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）を用いたインビトロ転写共役翻訳系で試験した。３５Ｓメチオニン（ＩＣＮ、コスタメサ、カリフォルニア州）を翻訳産物の可視化のために反応物中に取り入れた。反応は還元条件下、前染色マーカー（ギブコＢＲＬ、ゲイザースバーグ、メリーランド州）と共にポリアクリルアミドゲル（１６．５％ トリス／トリシン、バイオラッド、ヘラクレス、カリフォルニア州）で解析した。ゲルは乾燥し、オートラジオグラフ法に供した。
【０１８０】
結果
Ａ．ＴＣＲγを表す前立腺ＥＳＴをデータベース解析により同定した
６個の腫瘍および２個の正常前立腺ｃＤＮＡライブラリーに由来する２０個のｃＤＮＡクローンから、２３種のＴＣＲγ発現配列タグ（ＥＳＴ）を同定した。前立腺ＥＳＴを集合したＴＣＲγ複合配列は、７６ヌクレオチドのＴＣＲγ定常領域配列、４４８ヌクレオチド非翻訳３’領域配列およびポリ（Ａ）配列を有している。前立腺ＥＳＴを末梢血Ｔリンパ球から確立された細胞株由来の成熟ＴＣＲγ転写物（ジェンバンクアクセション番号、Ｍ１６７６８、Ｍ１６８０４およびＭ３０８９４）に対して整列化することにより、発明者らは、前立腺ＥＳＴ複合配列が末梢血Ｔリンパ球由来のＴＣＲγ転写物と同一であることを見出した。ｄｂＥＳＴデータベース解析はＴＣＲγ遺伝子がヒト前立腺において非常に強く転写されていることを示している。
【０１８１】
Ｂ．ＲＮＡドットブロット法により確認されたヒト前立腺におけるＴＣＲγ（３’ＵＴＲ）の発現
ヒト前立腺におけるＴＣＲγ遺伝子の転写活性を解析するために、ＴＣＲγ転写物の非翻訳３’末端（３’ＵＴＲ）由来のｃＤＮＡプローブが５０の異なるヒト組織由来のｍＲＮＡに関して分析された、図２Ａ。発明者らは正常前立腺（Ｃ７位）がＴＣＲγｍＲＮＡを発現していることを確認し、さらにドットブロット膜に提示されている全ての組織の中で、前立腺がはるかに最も強い発現を有していることを観察した。ＴＣＲγ遺伝子発現はまた、小腸（Ｅ３）、脾臓（Ｅ４）、胸腺（Ｅ５）、末梢リンパ球（Ｅ６）、リンパ節（Ｅ７）、骨髄（Ｅ８）および肺（Ｆ２）においても見られた。
【０１８２】
Ｃ．ノーザン解析はヒト前立腺において２つの大きさの特異的ＴＣＲγ転写物を示す
脾臓、胸腺、小腸および血液リンパ球における主要な転写物は１．５ｋｂであるが、３’ＵＴＲプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイセーション法は前立腺が約１．１ｋｂおよび２．８ｋｂの２つのＴＣＲγ転写物を有することを明らかにした、図２Ｂ（レーン３）。１．５ｋｂの転写物の大きさはγδＴリンパ球由来のＴＣＲγｍＲＮＡと一致している（ジェンバンクアクセション番号、Ｍ１６７６８、Ｍ１６８０４（Ｋｒａｎｇｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７、６４〜６７（１９８７））、Ｍ３０８９４（Ｌｉｔｔｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２６、８５〜８８（１９８７））。データベース解析はＴＣＲγの定常領域が前立腺転写物の一部であることを示したため、ＴＣＲγ定常領域プローブ（ＴＣＲＣγ）も使用した。発明者らは前立腺において、同一の１．１ｋｂおよび２．８ｋｂのバンドを見出した、図３Ａ（レーン３）。
【０１８３】
Ｄ．ＴＣＲγを発現する前立腺細胞はＴＣＲδおよびＣＤ３転写物を発現しない。
ＴＣＲγ鎖タンパク質は通常、ＴＣＲδ鎖タンパク質と共に共発現される。ＴＣＲγ遺伝子はヒト前立腺において転写的に活性であるので、発明者らは続けてＴＣＲδ遺伝子の転写活性を解析した。ＴＣＲδ転写物ヌクレオチド配列を用いてｄｂＥＳＴデータベースを解析した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。前立腺ｃＤＮＡライブラリー由来のＥＳＴはＴＣＲδ鎖転写物のいかなる部分にも一致しなかった。さらに、ノーザンブロット解析はＴＣＲδｍＲＮＡの前立腺でのいかなる発現も検出しなかった、図３Ｂ（レーン３）。発明者らは、ＴＣＲδ遺伝子が前立腺ではサイレントであると結論した。予期された通り、ＴＣＲδ転写物は脾臓、胸腺および血液リンパ球で発現している、図３Ｂ。
【０１８４】
Ｅ．ＬＮＣａＰ細胞は前立腺特異的ＴＣＲγ転写物を発現するが、ＰＣ−３細胞は発現しない　ＴＣＲγｍＲＮＡが正常前立腺において発現しているとして、発明者らは続いて、前立腺癌においてもまた発現しているかを解析した。前立腺特異的な１．１ｋｂ転写物ＬＮＣａＰ由来のｍＲＮＡ調製物において検出されたが、ＰＣ−３由来のｍＲＮＡ調製物においては検出されなかった、図３Ｃ。正常前立腺で発現している前立腺特異的な２．８ｋｂ転写物もまた、程度はかなり低いけれどもＬＮＣａＰに存在している。
【０１８５】
Ａ．ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション法は前立腺上皮細胞におけるＴＣＲγ発現を示す
前立腺は、腺状画分の複合型過形成性の管にわたる、単純管内壁上皮細胞（ｓｉｍｐｌｅ ｄｕｃｔ ｌｉｎｉｎｇｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ）の多様かつ混合型の集団を伴った腺房腺組織からなる。これらの画分は平滑筋細胞、線維芽細胞および前立腺間質の他の細胞型に緊密に連結している。ヒト前立腺ＴＣＲγ発現の細胞局在を決定するために、ＴＣＲ（Ｃγ―３’ＵＴＲ）センスおよびアンチセンスリボプローブを用いて、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション法を実施した。ＴＣＲγｍＲＮＡが、前立腺の間質細胞および他の細胞型は陰性であるが、前立腺腺房管内の上皮細胞において非常に強く発現していることを見出した、図４Ａ、図４Ｃ。ＴＣＲγ発現は前立腺の過形成性および腫瘍性の領域においてもまた検出された。良性および腫瘍性の腺房上皮における発現は同程度である。ＴＣＲγ発現はヒト腎臓組織、図４Ｅ、またはヒト脳においては観察することができなかった。
【０１８６】
Ｇ．前立腺ＴＣＲγ転写物はＣγ１を含むが、いかなるＶＪγ遺伝子も含まない
前立腺におけるＴＣＲγδ発現プロファイルを確立した後で、続いて主要な１．１ｋｂの前立腺特異的なＴＣＲγ転写物の特性を明らかにした。大きな前立腺組織から抽出されたｍＲＮＡ調整物内に浸潤性Ｔ細胞由来のｍＲＮＡ混入が存在する可能性を排除できないため、特性解明のためにはＬＮＣａＰ細胞株が使用された。発明者らは、データベース解析から前立腺ＴＣＲγ転写物の３’末端配列が末梢血リンパ球由来のものと同一であること、およびポリアデニル化シグナルの位置が同一であることは知っていた。したがって、前立腺およびリンパ球間の転写物の大きさの差は、前立腺ＥＳＴにより同定された範囲より上流の配列差異に起因する。ＴＣＲγ転写物の定常領域部分を増幅するよう設定されたＲＴ−ＰＣＲ法ではＴＣＲＣγ１遺伝子を同定した。わずかに大きいＴＣＲＣγ２はＬＮＣａＰにおいては発現されていない。可変領域（Ｖγ）から定常領域（Ｃγ）にわたるＲＴ−ＰＣＲ法ではいかなる産物も生じず、Ｖγが前立腺特異的ＴＣＲγ転写物の一部分ではないことを示している。
【０１８７】
Ｈ．ＬＮＣａＰではＴＣＲγ座位におけるＶＪ遺伝子再構成は行われていない
ＴＣＲγの可変領域を増幅することを意図したＲＴ−ＰＣＲ法ではいかなる産物も生じなかったので、続いてＴＣＲγ座位を解析した。γδＴ細胞の発生中に、ＴＣＲ座位はＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成を行い、受容体の可変領域を構成する遺伝子セグメントを集成させる。ＬＮＣａＰ細胞がＴＣＲγＶＪ遺伝子再構成を行ったかを明らかにするために、考えられる全ての再構成をカバーする（材料および方法を参照）ＴＣＲＶγおよびＴＣＲＪγプライマーの組み合わせを用いて、ゲノムＤＮＡのＰＣＲを実施した。いかなるプライマーの組み合わせもＰＣＲ産物を生じず、ＬＮＣａＰ細胞がＴＣＲγ座位におけるＶＪ遺伝子再構成を行っていないことを示した。ＴＣＲγＶＪ再構成が前立腺上皮細胞において生じていない事実は前立腺の発現は成熟γδＴリンパ球の発現とは異なっていることを示している。
【０１８８】
Ｉ．前立腺上皮細胞はＴＣＲ（ＪＣ）γ転写物を発現する
同定された前立腺ＴＣＲγ転写物はＣγからなるが、いかなるＶγ遺伝子セグメントからは構成されないので、次にＣγ１の上流にどのような配列が存在するかを解析した。ＲＮＡプライマー伸長法および５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ法を実施し、転写開始点を得た。ＬＮＣａＰ ｍＲＮＡに関して実施したプライマー伸長実験は、約１２８ヌクレオチドの主要なバンドと１３０〜１３５ヌクレオチド領域の弱いバンドを示した、図５。逆転写はＣγ１の５’末端から７５塩基から開始されているので（材料および方法を参照）、転写物はＣγ１の上流に約５３ヌクレオチドを有する。ＬＮＣａＰｃＤＮＡに関して実施した５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ法は単一の特異的ＰＣＲ産物を示した。増幅産物が、Ｃγ１遺伝子セグメントに正確にスプライシングされたＪγ１．２遺伝子セグメントを含んでいることが発見された。ＲＡＣＥ ＰＣＲ法により単離された多くのクローンをシークエンスした。それらはプライマー伸長実験により決定した開始部位に近接したところから開始していた。若干変動した転写開始点は、プライマー伸長実験において主要なバンドよりも若干大きい弱いバンドの同定と一致している。どのように前立腺ＴＣＲγが転写されスプライシングされるかの図解は図６に示されている。ＬＮＣａＰから得られているＴＣＲγ転写物のヌクレオチド配列が表１に示されている。複合配列は１０２０±３ヌクレオチド長である。それはＪγ１．２遺伝子セグメント由来の〜５３塩基、Ｃγ１の５１９塩基を含み、それに続くポリアデニル化シグナルおよび３’末端のポリ（Ａ）配列を含む４４８塩基の非翻訳配列を含む。
【０１８９】
Ｊ．前立腺特異的ＴＣＲγ転写物のインビトロ翻訳
前立腺転写物は、表１に二重下線で示された本来のＴＣＲγリーディングフレーム内に４つの翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を有する。４つの異なる開始点に対する計算上のタンパク質の大きさは、各々１２．８、１２．０、７．２および３．２ｋＤａである。前立腺転写物の翻訳活性を解析するために、全長の前立腺ＴＣＲγｃＤＮＡを用いてインビトロ転写共役翻訳を行った。約８ｋＤａおよび約１３ｋＤａの２つのタンパク質が得られた、図７（レーン１）。陰性対照反応はいかなるタンパク質産物も生じなかった。
【０１９０】
考察
前立腺上皮細胞におけるＴＣＲγ転写物の特異的発現
ヒト前立腺におけるＴ細胞受容体γ鎖（ＴＣＲγ）の発現を同定し、それが前立腺上皮細胞に由来し、浸潤性γδＴリンパ球に由来しないことを示した。またＴ細胞受容体δ鎖（ＴＣＲδ）遺伝子は、前立腺においてサイレントであることも証明した。ＴＣＲγｍＲＮＡは前立腺癌と同様に前立腺の腺房管内の上皮細胞で発現している。１．１ｋｂおよび２．８ｋｂの２つのＴＣＲγ転写物がヒト前立腺において存在する。それらは脾臓、胸腺および末梢血リンパ球において見出される１．５ｋｂのＴＣＲγ転写物と比べて大きさが異なる。ＴＣＲγδｍＲＮＡ発現プロファイルは、前立腺における転写がγδＴリンパ球の通常の経路に従わないことを示唆している。前立腺のＴＣＲγ発現は、最初に公共に利用可能なＥＳＴデータベースの解析により発見された。発明者らの結果は、ＥＳＴクラスター化が新規のおよび予想外の遺伝子発現を同定するための強力なツールであることを示している。ＴＣＲγ転写物を表す前立腺ＥＳＴは、全てレーザーキャプチャーマイクロダイセクション法により単離された細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリーに由来する（Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、９９８〜１００１（１９９６））。ＴＣＲγ転写物が前立腺上皮細胞に由来し、浸潤性γδＴリンパ球に由来しないことが証明されたという事実は、マイクロダイセクション法が組織の特定の顕微鏡的領域に由来する純粋な細胞亜集団を獲得するための貴重な技術であるということを立証している。
【０１９１】
前立腺ＴＣＲ（ＪＣ）γ転写物
リンパ節転移から単離された前立腺アデノカルチノーマ細胞株ＬＮＣａＰ（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４３、１８０９〜１８１８（１９８３））は容易に検出可能なレベルの１．１ｋｂの前立腺特異的ＴＣＲγ転写物を発現する。ＬＮＣａＰ細胞における発現は、転写物が上皮細胞に由来すること、および前立腺悪性腫瘍の発生中において発現し続けることが可能であることを示している。ＬＮＣａＰ転写物はＪγ１．２遺伝子セグメント由来の〜５３塩基、Ｃγ１の３つのエクソン、ポリ（Ａ）配列を伴う非翻訳配列からなる。前立腺転写物は、Ｖγ遺伝子セグメントを欠如する点、およびＪγ１．２の直接上流のイントロン配列内から開始する点において成熟Ｔリンパ球転写物とは異なる（データ未発表）。前立腺ＴＣＲγ転写物を駆動するプロモーターおよび前立腺上皮細胞における活性化機構は現在研究中である。２．８ｋｂの前立腺特異的ＴＣＲγ転写物はＬＮＣａＰにおいて非常に薄く、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ実験は２．８ｋｂ転写物に一致するいかなる産物も生じなかった。したがって２．８ｋｂ転写物はさらなる研究を必要とする。
【０１９２】
Ｔリンパ球におけるＴＣＲ（ＪＣ）γ転写物との比較
多くの研究が造血系細胞におけるＶ（Ｄ）Ｊ再構成の開始に先立ちまたは同時にＴＣＲ遺伝子転写を検出することが可能であることを示してきた（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３、９５７〜９６４（１９９６）、Ｓｈｉｍａｍｕｒａ， Ｍ．およびＯｈｔａ、Ｓ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５、１５４１〜１５４６（１９９５）、Ｖｉｌｌｅｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、１６１９〜１６２５（１９９７）、Ｓｉｋｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、１３９９〜１４０５（１９９８））。ＴＣＲγ遺伝子は未再構成γ座位を有するマウス骨髄常在性Ｔリンパ球前駆細胞においても転写的に活性であり、不毛なＴＣＲＣγ転写物を生じることが報告されている（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３、９５７〜９６４（１９９６））。加えて、未再構成ＴＣＲＶγ転写物の発現もまた個体発生期間中に報告されている（Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７、７２９〜７３９（１９９３））。ＴＣＲおよび免疫グロブリン遺伝子セグメントの不毛な転写はこれまでのところリンパ系列由来の細胞に限定されている（Ｌａｕｚｕｒｉｃａ， Ｐ．およびＫｒａｎｇｅｌ、Ｍ．Ｓ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９、１９１３〜１９２１（１９９４））。さらに、ほとんど全てのＴＣＲおよび免疫グロブリン座位の生殖細胞系列転写活性化は時間的に座位組換えの活性化と相関する（Ｓｉｋｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１、１３９９〜１４０５（１９９８）、Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７、７２９〜７３９（１９９３）、Ｌａｕｚｕｒｉｃａ， Ｐ．およびＫｒａｎｇｅｌ、Ｍ．Ｓ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９、１９１３〜１９２１（１９９４）、Ｓｌｅｃｋｍａｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４、４５９〜４８１（１９９６））。発明者らはゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを用いての独立した実験により、前立腺上皮細胞のＴＣＲγ座位の組換えは生じていないことを示した。したがって、前立腺上皮のＴＣＲ（ＪＣ）γ転写物の発現は組換えと相関せず、Ｔリンパ球前駆細胞で観察された不毛な転写物とは異なる機能を果たしているかもしれない。
【０１９３】
ＴＣＲγ座位における新規前立腺特異的タンパク質の可能性に関する最初の仮説
前立腺ＴＣＲγ転写物は非常に強く発現しており、発明者らは、生物学的に重要な基本的な理由があると仮定する。ＶＪ遺伝子再構成が前立腺上皮細胞のＴＣＲγ座位において生じないという事実は、成熟ＴＣＲγ鎖タンパク質が作製される可能性を排除する。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）はＣγの上流には見出されないので、ＴＣＲγ可変領域なしにＴＣＲγ定常領域タンパク質が作製されるという可能性もまた排除する。ＴＣＲγ鎖タンパク質においてＪγ断片は１６〜２０アミノ酸の可変領域をコードし、一方可変領域の主要な部分はＶγ断片の１つによりコードされる。Ｊγ断片によりコードされるアミノ酸がＶγ遺伝子セグメントによりコードされるアミノ酸と連結されることがなければ、それらはＭＨＣ認識においてＴＣＲとして機能することができない。これはＣγ内からコードされる新規の前立腺特異的タンパク質の可能性を高める。異なるリーディングフレームまたはあまり頻繁には使用されない開始コドンが使用されるかもしれないが、発明者らの最初の仮説は、本来のＴＣＲγリーディングフレーム内のＡＴＧコドンの１つが翻訳を開始するということであった。
【０１９４】
前立腺ＴＣＲγｃＤＮＡを用いたインビトロ転写共役翻訳実験は、転写物が完全に機能的であることを明らかにした。２つのタンパク質を得た。１３ｋＤａのタンパク質が、計算上１２．８ｋＤａのタンパク質の大きさ（ＰＳ―ＴＣＲγ―１）を生じる、図１の最初の二重下線のＡＴＧに由来する可能性が最も高い。８ｋＤａのタンパク質は、計算上７．２ｋＤａの大きさである二番目の二重下線のＡＴＧに由来する可能性が最も高い（ＰＳ―ＴＣＲγ―２）。これらのタンパク質は続く実施例で報告される研究においてさらに探索した。結論として、前立腺上皮細胞または非リンパ系由来細胞型が、リンパ系列由来の細胞により限定的に発現されていると考えられていた遺伝子から高いレベルの転写物を発現するという事実は、非常に予想外の発見であった。
【０１９５】
実施例２　ＴＣＲγの代替リーディングフレームタンパク質の発見
前述の実施例は前立腺および前立腺癌細胞におけるＴＣＲγ転写物の予想外の発見、転写物のインビトロ翻訳、およびその転写物がこの細胞における短縮型ＴＣＲγ鎖の切断型の存在下に生じるという最初の仮説を実証した。これらの実施例は、転写物が実際は、代替リーディングフレームから発現されているタンパク質で、現在「ＴＡＲＰ」と名づけられている以前には知られていないタンパク質を生じるという、さらに予想外の発見を明らかにした。さらに予想外のことに、以下で報告する研究はＴＡＲＰが核タンパク質であり、多くの乳癌細胞において存在することを示す。
【０１９６】
材料および方法
プライマー
2004512809.tif 000002
プライマーはシグマジェノシス（ウッドランド、テキサス州）およびロフストランドラボリミテッド（ゲイザースバーグ、メリーランド州）により合成された。
【０１９７】
構築物
プラスミドブルースクリプトＩＩＳＫ（＋）（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）にクローン化したＴＡＲＰ転写物は以前記載されている（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９２８７〜９２９２（１９９９））。本明細書において、このプラスミドをｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγと称する。６９部位のＡＴＧがＡＴＡに変異導入されたｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ変異体ＡＴＧ上流１はクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ）部位特異的突然変異キット（ストラタジーン）を用いて構築した。ＰＣＲ反応はＴＣＲγ―上流ＡＴＧ変異体＃１およびＴＣＲγ―上流ＡＴＧ変異体＃２をプライマーとして、ｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγを鋳型として使用した。７３部位のＡＴＧがＡＴＡに変異導入されたｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ変異体ＡＴＧ上流２はＴＣＲγ―上流ＡＴＧ変異体＃３およびＴＣＲγ―上流ＡＴＧ変異体＃４をプライマーとして、ｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγを鋳型として用い、上記のように構築した。６９および７３部位のＡＴＧがＡＴＡに変異導入されたｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ変異体ＡＴＧ上流−両方はＴＣＲγ―上流ＡＴＧ変異体＃５およびＴＣＲγ―上流ＡＴＧ変異体＃６をプライマーとして、ｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ変異体ＡＴＧ上流１を鋳型として用い、上記のように構築した。２４２部位のＡＴＧがＡＴＡに変異導入されたｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ変異体ＡＴＧ下流はＴＣＲγ―下流ＡＴＧ変異体＃１およびＴＣＲγ―下流ＡＴＧ変異体＃２をプライマーとして、ｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγを鋳型として用い、上記のように構築した。ｐＥＴ−ＴＣＲγはｐＥＴ２３ａベクター（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、マジソン、ウィスコンシン州）にサブクローニングしたＴＡＲＰ転写物（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９２８７〜９２９２（１９９９））の２４２〜４６９のヌクレオチドを含む。ｐＥＴ−ＴＡＲＰはｐＥＴ２３ａベクターにサブクローニングしたＴＡＲＰ転写物（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９２８７〜９２９２（１９９９））の５６〜２４２のヌクレオチドを含む。ｐＶＣ４Ｄ−ＴＡＲＰはｐＶＣ４Ｄベクター（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ、Ｅ．Ｐ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：２０２〜２０９（１９９１））にサブクローニングしたＴＡＲＰ転写物（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９２８７〜９２９２（１９９９））の６９〜２４２のヌクレオチドを含む。
【０１９８】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ法）
ポリ（Ａ）ＲＮＡの単離は製造メーカの指示書に従い、Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ（商標）２．０キット（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて実施した。５００ｎｇのポリ（Ａ）ＲＮＡまたは５μｇの総ＲＮＡを５０ｐｍｏｌのオリゴｄＴプライマー（インビトロジェン）の存在下で７０℃、２分間変性した。一本鎖ｃＤＮＡは２５０μＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＤＴＴ、８Ｕ ＲＮａｓｉｎ（ロシュモレキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス、インディアナ州）、５０Ｕ ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（商標）ＲＴ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ロックビル、メリーランド州）を含む１０μｌ反応中で調製し、４２℃で９０分間インキュベーションした。サンプルはその後、７５μｌの１０ｍＭトリス塩酸［ｐＨ７．５］を用いて稀釈し、７２℃で１０分間インキュべーションした。３μｌのｃＤＮＡを２５０μＭ ｄＮＴＰｓ、２５ｐｍｏｌの各々のプライマー、１ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ）を含むＰＣＲに使用し、３５サイクルで増幅した。ヒト乳房ＲＡＰＩＤ−ＳＣＡＮ（商標）遺伝子発現パネル（オリジーンテクノロジーズ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ロックビル、メリーランド州）に関して、類似のＰＣＲ条件を使用した。ＴＣＲγＪ１．２Ｒ、ＴＣＲ５．１およびＴＣＲ３．１プライマーをＴＡＲＰ転写物を検出するために使用し、ＢアクチンフォワードプライマーおよびＢアクチンリバースプライマーをアクチン転写物を検出するために使用した。
【０１９９】
ノーザンブロットハイブリダイゼーション法
２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーション法を以前記載されたとおりに実施した（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９２８７〜９２９２（１９９９））。
【０２００】
インビトロ転写共役翻訳
インビトロ転写共役翻訳反応を以前記載されたとおりに実施した（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９２８７〜９２９２（１９９９））。ｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ、ｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ変異体ＡＴＧ下流、ｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ変異体ＡＴＧ上流１、ｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ変異体ＡＴＧ上流２およびｐＢＳＳＫ−ＴＣＲγ変異体ＡＴＧ上流―両方が鋳型として使用した。
【０２０１】
細胞培養
ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＭＣＦ７、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地（クオリティバイオロジカル社（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、ゲイザースバーグ、メリーランド州）中で３７℃、５％二酸化炭素下で維持した。培地は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、クオリティバイオロジカル社）、２ｍＭ Ｌ―グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含んでいた。Ｈｓ５７Ｂｓｔ細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃、５％二酸化炭素下で維持した。培地は１０％ＦＢＳ、３０ｎｇ／ｍｌ上皮細胞成長因子（ＥＧＦ、ハーラン（Ｈａｒｌａｎ）、シンシナティ、オハイオ州）、２ｍＭ Ｌ―グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含んでいた。
【０２０２】
抗体生産
ポリクロナールΔＰＥ−ＴＡＲＰ抗体は以下のように作製された。酵素学的に不活性型のシュードモナス外毒素のＣ’末端（ΔＰＥ）（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｅ．Ｐ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１０：２０２〜２０９、（１９９１））に融合したＴＡＲＰオープンリーディングフレーム全体を含むｐＶＣ４Ｄ−ＴＡＲＰをＥｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ（登録商標）ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（商標）（ＤＥ３）−ＲＩＬ細胞（ストラタジーン）中で発現した。封入体の調製およびウサギ免疫は以前に記載された（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ， Ｕ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８６１６〜８６２０（１９９１））。抗血清はＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標）ＩｇＧ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）精製キットを用いて、製造メーカ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州）の指示書に従い精製した。
【０２０３】
ＴＣＲγ抗体は、Ｃ’末端の６ヒスチジン標識に融合したＴＣＲγの細胞外ドメインを含む発現プラスミドｐＥＴ−ＴＣＲγを用いて、上記のように作製した。免疫に先立ちヒスチジン標識したＴＣＲγタンパク質を製造メーカ（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州）の指示書に従いＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムを用いて精製した。
【０２０４】
細胞抽出物の調製
全細胞タンパク質抽出物を以下のように調製した。各々の細胞株から、５ｘ１０６の増殖細胞を回収し、タンパク質加水分解酵素阻害剤を含む１ｘＲＩＰＡ緩衝液に再懸濁した（５０ｍＭトリス塩酸［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％トライトンＸ−１００、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ アプロチニン、１μｇ／ｍｌ ロイペプチン）。抽出物は短時間超音波処理し、かつ遠心分離により浄化した。タンパク質濃度を製造メーカ（ピアス）の指示書に従い、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）プラスタンパク質分析試薬を用いて決定した。前立腺組織由来のタンパク質抽出物は、―８０℃で凍結された０．５ｇの前立腺癌組織を、冷却した乳鉢および乳棒を用いて粉砕し、微細な粉末にすることにより調製した。粉末化された組織は回収し、１ｘＲＩＰＡに再懸濁して、上記のように処理した。
【０２０５】
前立腺および乳房細胞株由来の核、膜および細胞質抽出物は以前に発表されたプロトコールに基づいて調製した（Ｄｉｇｎａｍ， Ｊ．Ｄ．ら、Ｎｕｃｌｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１４７５〜１４８９（１９８３）、Ｓｌａｄｅｋ， Ｆ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：２３５３〜２３６５（１９９０））。
【０２０６】
ウエスタンブロット解析
２０または４０μｇのタンパク質抽出物、１μｇの組換え型Ｈｉｓ−ＴＡＲＰまたは１００ｎｇの組換え型Ｈｉｓ−ＴＣＲγを１６．５％トリストリシンゲル（バイオラッド、ヘラクレス、カリフォルニア州）にて泳動し、０．２μｍのＩｍｍｕｎｅ−Ｂｌｏｔ（商標）ＰＶＤＦ膜（バイオラッド）に４℃にて３０Ｖで４時間、転写緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノール、ｐＨ８．３）中で転写した。フィルターを１０μｇ／ｍｌのΔＰＥ−ＴＡＲＰ抗血清または１μｇ／ｍｌのＴＣＲγ抗血清を用いてプロービングし、かつ各々のシグナルは化学発光ウエスタンブロッティングキットを用いて製造メーカ（ロシュ）の指示書に従い検出した。
【０２０７】
ＴＡＲＰは前立腺癌細胞において発現している核タンパク質である
ＴＡＲＰまたはＴＣＲγが前立腺癌細胞に存在するかを決定するために、発明者らは両タンパク質に対する抗体を生成し、異なる前立腺癌細胞抽出物に関してウエスタンブロット法を実施した。図３Ａ（上部パネル）に示されているように、ＴＡＲＰは前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞株および前立腺癌腫瘍抽出物中で検出された。７ｋＤａのバンドは組換え型Ｈｉｓ−ＴＡＲＰと共移動しており、ＬＮＣａＰおよび癌抽出物において検出される産物がＴＡＲＰであることを示唆している。以前発明者らは、前立腺特異的ＴＣＲγ転写物が前立腺癌ＰＣ３細胞株において発現していないことを証明した（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９２８７〜９２９２（１９９９））。したがって、発明者らはＰＣ３細胞抽出物を陰性対照として使用し、７ｋＤａバンドがこれらの抽出物に存在しないことを証明した（図３Ａ、上部パネル）。重要なことに、免疫前抗血清またはシュードモナス外毒素（ＰＥ、材料および方法を参照）に対する抗血清が使用された時には、７ｋＤａバンドは検出されなかった（データ未発表）。組換えタンパク質は使用した抗体を用いて非常に強いシグナルを示すけれども、ＴＣＲγはこれらのいかなる抽出物においても検出されなかった（図３Ａ、下部パネル）。これらのデータは前立腺特異的ＴＣＲγ転写物がＴＡＲＰをコードすることを示している。
【０２０８】
ＴＡＲＰの細胞内局在を決定するために、発明者らは、ＬＮＣａＰ細胞由来の核、細胞質および膜画分を調製した。図３Ｂに示されているように、ＴＡＲＰは核において検出されたが、細胞質および膜画分においては検出されなかった。ショ糖クッションを通して細胞抽出物を分画することにより精製された核を用いても、同様の結果が得られた（Ｓｌａｄｅｋ， Ｆ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：２３５３〜２３６５（１９９０））（データ未発表）。
【０２０９】
ＴＡＲＰ転写物は乳房細胞で発現している
以前、発明者らは、ＴＣＲγＥＳＴクラスターもまた脳ライブラリー由来のいくつかのＥＳＴを含むことを報告した（Ｖｅｓｍａｔｚｉｓ， Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：３００〜３０４（１９９８））。この最初の報告後、付加的なＥＳＴがデータベースに寄託され、クラスターは現在、乳房、大腸、腎臓および胃のライブラリーにも由来するＥＳＴを含む。これらＥＳＴの存在がこれらの細胞におけるＴＡＲＰ転写物の発現を示すのか、またはそれはこれらのライブラリーが作成された時の浸潤性γδＴリンパ球の存在に起因し得るのかを決定するために、発明者らは、様々な細胞株に関してＲＴ−ＰＣＲ法を実施し、ＴＡＲＰ転写物の存在を試験した。図４Ａに示されるようにＴＡＲＰ転写物の発現は乳房細胞株ＭＣＦ７、ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３およびＣＲＬ−１８９７で検出された。神経芽細胞腫細胞株であるＡ１７２、神経膠芽細胞腫細胞株であるＩＭＲ３２、大腸細胞株であるＣＯＬＯ２０５、胃細胞株であるＫＡＴＯＩＩＩまたは腎臓細胞株であるＣＯＳ７および２９３においてはシグナルが検出されなかった（図４Ａおよびデータ未発表）。ＴＡＲＰ転写物が細胞株に加えてヒト乳房組織で発現しているかを決定するために、１２個の異なる正常乳房ｃＤＮＡおよび１２個の異なる乳癌ｃＤＮＡをＲＡＰＩＤ−ＳＣＡＮ（商標）パネル（オリジーンテクノロジーズ、ロックビル、メリーランド州）を用いて試験した。ＴＡＲＰ ｍＲＮＡはいくつかの乳癌サンプルにおいて大量に存在することが示されたが（図４Ｂ、上部パネル）、正常乳房サンプルにおいては、３５ラウンドのＰＣＲの後、かろうじて検出できる程度であった（データ未発表）。重要なことにｃＤＮＡを欠く反応ではシグナルは検出されなかった。各レーンに同程度の量のｃＤＮＡが存在することを示すためにアクチンを使用した。正常乳房サンプルにおける弱いシグナルは、正常乳房組織由来の乳房細胞株であるＨｓ５７Ｂｓｔ細胞株についての、図４Ａおよび５におけるＴＡＲＰシグナルの欠失とよく相関している。これらの結果は、乳房におけるＴＡＲＰ転写物の発現が腫瘍性形質転換後に増加することを示唆している。しかしながら、何らかの断定的な結論を出す前にはさらなる研究が必要である。
【０２１０】
乳房細胞株で観察されたＴＡＲＰ転写物が前立腺細胞株で見出された転写物と同一であるかを決定するため、発明者らは、ＴＡＲＰ転写物の異なる領域に対するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。図５Ａに示されるように、前立腺のＴＡＲＰ転写物はＪγ１．２遺伝子セグメントの一部、３つのＣγ１エクソンおよびポリ（Ａ）テイルを伴ういくらかの非翻訳配列を含んでいる（７）。プライマー組１および３はＴＡＲＰ転写物全体を増幅する（図５Ｂ、上部パネル）、一方プライマー組２および３はＣγ１領域のみを増幅する（図５Ｂ、中部パネル）。図５Ｂに示されるように、各プライマー組を用いて前立腺細胞株（ＬＮＣａＰ）と比較すると、３つの乳房細胞株（ＭＣＲ７、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３）において類似の大きさのバンドが検出された。重要なことにｃＤＮＡを欠く反応（ｄＨ２Ｏ）ではシグナルは検出されず、アクチン対照により証明されているように同程度の量のｃＤＮＡを使用した（図５Ｂ、下部パネル）。これらのデータは乳房細胞株で見出されたＴＡＲＰ転写物が前立腺細胞株で見られた転写物と同一であることを示している。この結論をさらに支持するために、発明者らはノーザンブロット法により各細胞株由来のＴＡＲＰ転写物の大きさを解析した。以前、発明者らは、ＬＮＣａＰ細胞においては、１１００ヌクレオチドの転写物が主要型であり、１１００および２８００ヌクレオチドの転写物が存在することを証明した（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９２８７〜９２９２（１９９９））。図５Ｃに示されるように、前立腺細胞株（ＬＮＣａＰ）と比較して、より弱い強度であるが、３つの乳房細胞株（ＭＣＦ７、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３）において類似の大きさのＴＡＲＰ転写物を見出した。したがって発明者らは、ＴＡＲＰ ｍＲＮＡは前立腺および乳房細胞株において発現していると結論した。
【０２１１】
ＴＡＲＰタンパク質が乳癌細胞株に存在するかを決定するために、ＴＡＲＰに対する抗体を用いて乳癌核抽出物でウエスタンブロット法を実施した。図６（上部パネル）に示されるようにＴＡＲＰ反応性バンドがＭＣＦ７、ＢＴ−４７４およびＳＫ−ＢＲ−３細胞において検出された。ＴＡＲＰはこれらの乳癌細胞株の膜および細胞質画分には検出されなかった（データ未発表）。重要なことに、組換えタンパク質は使用した抗体を用いて非常に強いシグナルを示すけれども、ＴＣＲγはこれらのいずれの核抽出物においても検出されなかったので、ＴＡＲＰは乳房細胞株において、ＴＡＲＰ転写物によりコードされるタンパク質産物である（図６、下部パネル）。これらのデータはＴＡＲＰがまた乳癌細胞にも存在することを示している。
【０２１２】
前立腺および乳癌細胞において発現しているＴＣＲγ座位由来の特異的転写物によりコードされる７ｋＤａの核タンパク質を同定したことを報告する。そのタンパク質はＴＣＲγとは異なるリーディングフレームにコードされているので、発明者らは、ＴＣＲγ Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質）にちなんでＴＡＲＰと名づける。ＴＣＲγ座位のイントロン内に由来する転写物の別のリーディングフレームから翻訳されることのほかに、ＴＡＲＰは他に２つの普通でない特徴を有する。第１に、ほとんどのものは通常細胞外に分泌されるので、そのように小さなペプチドを細胞内に見出すことは驚くべきことである。第２にＴＡＲＰは有効なコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ． Ｃｅｌｌ ４４：２８３〜９２（１９８６））を欠いている。ＴＣＲγリーディングフレームは有効なコザック配列を有するので、発明者らは、最初は短縮型ＴＣＲγタンパク質がコードされていると仮定した。しかしながら図３に示されているように、発明者らの最初の仮説は間違っていた。インビトロ翻訳の結果がＴＡＲＰタンパク質に対する優先度を示し、かつＴＡＲＰリーディングフレーム内のいずれかのＡＴＧが、タンパク質合成を開始するために使用されることが可能であることは興味深い。ＴＡＲＰタンパク質合成を開始するためにどのＡＴＧが使用されるかを決定するためには、タンパク質配列決定が必要とされるであろう。
【０２１３】
ＴＡＲＰタンパク質配列の非常に興味深い特徴は７アミノ酸リピート内に５個のロイシンを有することであり、ＴＡＲＰがロイシンジッパー二量体化モチーフを含んでいるかもしれないことを示唆している（図７Ａ）。これが真実であるためには、ＴＡＲＰは両親媒性ヘリックスを含まなければならない。ＴＡＲＰが両親媒性ヘリックスを含むかもしれないという１つの証拠は、ヘッリクス開始残基として機能すると信じられている残基であるセリンおよびプロリン残基が、最初のロイシンリピートの直前に見出されることである。２番目に、それによりヘリックスに両親媒性特性を与え、かつ他のヘリックスとの塩橋として機能する可能性のある多くの荷電性アミノ酸が７アミノ酸リピートの中に見出されることである。７アミノ酸リピートのロイシンの存在はロイシンジッパーモチーフの良い証拠ではあるが、ロイシンジッパータンパク質とは見なされていない７アミノ酸リピート内に５個のロイシンを含むタンパク質も同定されている。例えば、カリオフェリン（ｋａｒｙｏｐｈｅｒｉｎ）（Ｃｈｏｏｋ， Ｙ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２３０〜２３７（１９９９））、Ｂ．ステラロサーモフィラス（Ｓｔｅｒａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（Ｐｕｇｍｉｒｅ， Ｍ．Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：１４６７〜１４７９（１９９８））およびＴ．サーモフィラスのフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｍｏｓｙａｋ、Ｌ．ら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５３７〜５４７（１９９５））の結晶構造は、その配列が７アミノ酸リピートの中に５個のロイシンを含む領域において、これらのタンパク質がαヘリックス構造を含まないことを示した。ＴＡＲＰで見出されたロイシンリピートの意義を決定するためには相互作用および構造に関する研究が必要である。
【０２１４】
ＴＡＲＰアミノ酸配列の別の通常ではない特徴は、塩基性アミノ酸の領域が潜在的なロイシンジッパーモチーフに続くことであり（図７）、ＤＮＡ結合モチーフの可能性を示唆している。しかしながら塩基性領域の配置は、ロイシンリピートに先行するのではなくむしろそれらに続く点で独特である。ＤＮＡに結合するほとんどのロイシンジッパータンパク質は、ロイシンリピートの前に塩基性領域を有する（総説は（Ｃｈｏｏｋ， Ｙ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２３０〜２３７（１９９９）を参照）。ＴＡＲＰの塩基性領域は単に核移行シグナルとして機能しているのかもしれないが、しかしＴＡＲＰが核タンパク質であるという事実はＴＡＲＰがＤＮＡに結合するかもしれないとの仮説を強化する。何らかの断定的な結論を出す前に機能研究が必要である。
【０２１５】
ＴＡＲＰが何らかの既知のタンパク質に類似性を有するかを決定するために、ジェンバンクに対してタンパク質ブラスト（ＢＬＡＳＴ）検索を実施した。この検索はＴＡＲＰのアミノ酸配列がディクチオステリウム ディコイデム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｃｏｉｄｅｕｍ、細胞性粘菌）Ｔｕｐ１（ジェンバンクアクセション番号ＡＡＣ２９４３８）およびサッカロミセスセレビジエＴｕｐ１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｆ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：６５００〜６５１１（１９９０））（図７Ｃ）とある程度の類似性を有することを示した。酵母Ｔｕｐ１は通常はＣｙｃ８（Ｓｓｎ６）との複合体中に見出され、ブドウ糖、酸素およびＤＮＡ傷害により制御されている遺伝子の転写抑制に必要である（Ｔｚａｍａｒｉａｓ， Ｄ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：８２１〜８３１（１９９５））。Ｃｙｃ８（Ｓｓｎ６）またはＴｕｐ１はいずれもＤＮＡに結合せず、しかし各々はα２、Ｍｉｇ１、Ｒｏｘ１およびａ１等の特異的ＤＮＡ結合タンパク質との相互作用を介して共抑制複合体の一部として作用する（Ｔｚａｍａｒｉａｓ， Ｄ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：８２１〜８３１（１９９５））。Ｔｕｐ１のＣ’末端側半分は、ＷＤ−４０またはβトランスデューシンリピートとして知られている、アスパラギン酸およびトリプトファンに富む４３アミノ酸配列の７アミノ酸リピートを含む（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｆ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：６５００〜６５１１（１９９０）、Ｆｏｎｇ、Ｈ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：２１６２〜２１６６（１９８６））。ＷＤ−４０リピートは多くのタンパク質において同定され、タンパク質―タンパク質相互作用において役割を果たしている。重要なことに、Ｔｕｐ１はその２つのＷＤ−４０リピートを介してα２と相互作用することが示されている（Ｋｏｍａｃｈｉ， Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８：２８５７〜２８６７（１９９４））。ＴＡＲＰがＴｕｐ１の５番目のＷＤ−４０リピートと類似性を有していることは非常に興味深い（図７Ｃ）。ＴＡＲＰは核タンパク質であるので、Ｔｕｐ１と類似性を有することはＴＡＲＰが転写制御に関与する機能的核タンパク質複合体の一員であるかもしれないことを示唆している。したがって、その機能を決定するためにはＴＡＲＰが相互作用するタンパク質を同定することが必要である。
【０２１６】
ＴＡＲＰ抗体は前立腺および乳房核抽出物において二重バンドを認識する（図６Ａ）。移動度の速い７ｋＤａのバンドはＨｉｓ−ＴＡＲＰ組換えタンパク質と共移動し、より弱いバンドはより大きな分子量として泳動する。９ｋＤａバンドに関する可能性のある１つの説明は、翻訳後修飾であるということである。ＴＡＲＰが何らかの既知の翻訳後修飾部位を有しているかを決定するために、発明者らは、ＴＡＲＰアミノ酸配列をスイス生物情報科学研究所（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）のＰＲＯＳＩＴＥプログラムを用いて解析した（Ａｐｐｅｌ， Ｒ．Ｄ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：２４８〜２６０（１９９４）、Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２１５〜２１９（１９９９））。図７Ａに示されているように、ｃＡＭＰ依存的およびｃＧＭＰ依存的プロテインキナーゼリン酸化部位（ＲＲＡＴおよびＲＲＧＴ）およびプロテインキナーゼＣリン酸化部位（ＳＳＲおよびＳＲＲ）を含む多くの可能性のあるリン酸化部位が見出された。リン酸化は多くの場合において、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で見かけ上より大きな分子量で泳動させることが示されている。これが正しければ、図６の結果は未修飾型がＬＮＣａＰ細胞において主要であり、ＭＣＦ７およびＳＫ−ＢＲ−３細胞においてはリン酸化型のみが存在することを示している。９ｋＤａのバンドの真の性質、および前立腺および乳癌細胞において発現される時にＴＡＲＰが翻訳後修飾されるかを決定するためには付加的な実験が明らかに必要である。
【０２１７】
乳癌細胞においてＴＡＲＰ ｍＲＮＡおよびタンパク質が発現していることをここで報告する。ＴＡＲＰ転写物に関する発明者らの最初の研究は、乳房におけるＴＡＲＰ発現を明らかにしなかった（Ｅｓｓａｎｄ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：９２８７〜９２９２（１９９９））。可能性のある１つの説明は、ＴＡＲＰが正常乳房において低いレベルで発現しており、検出するのが困難であるということである。結果の節で記載されているように、癌サンプルにおいて検出される強いシグナルと比較して、正常乳房サンプルのＰＣＲ分析において、非常に弱いシグナルが検出された。したがって、乳癌細胞におけるＴＡＲＰの存在はＴＡＲＰ発現が乳房細胞の腫瘍性形質転換の後に誘導されることを示しているのかもしれない。加えて、乳癌細胞におけるＴＡＲＰの存在は、ＴＡＲＰがエストロゲンにより制御されていることを示しているのかもしれない。この仮説は、アンドロゲン応答因子（ＡＲＥ）とエストロゲン応答因子（ＥＲＥ）とを組み合わせた因子をＴＡＲＰのイントロン性プロモーター中に同定したことにより、強化される。この混成因子は、５’末端におけるＡＲＥに、３’末端におけるＥＲＥに特異的な２つの半部位からなる（Ｚｉｌｌｉａｃｕｓ， Ｊ．ら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９：３８９〜４００（１９９５）および未発表データ）。エストロゲンがＴＡＲＰを制御するかを決定するためには付加的な実験が必要である。しかしながら変異体ＡＲＥが乳房腫瘍においてある前立腺特異的遺伝子の発現を引き起こす例がある。例えば、前立腺特異的タンパク質（ＰＳＡ）が乳房腫瘍において発現していることが示されている（Ｍａｊｕｍｄａｒ， Ｓ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７９：１５９４〜１６０２（１９９９））。ＰＳＡの異常発現の分子的解析は、ＰＳＡプロモーター内に見出されたＡＲＥの１つにおける単一点突然変異の発見につながる。この変異は乳房腫瘍におけるアンドロゲン制御性ＰＳＡ発現の喪失につながると信じられている（Ｍａｊｕｍｄａｒ， Ｓ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７９：１５９４〜１６０２（１９９９））。試験された３つの乳房細胞株において、ＴＡＲＰプロモーターにおける類似の変異が生じているかは現時点では不明である。
【０２１８】
前立腺はその構造および機能を維持するためにアンドロゲンに依存している。前立腺細胞が悪性化する時、それらはしばしばアンドロゲン依存性を失う。この研究では、発明者らは、増殖におけるアンドロゲン依存性が異なる２つの前立腺細胞株、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞を使用した。アンドロゲン受容体はアンドロゲン依存性のＬＮＣａＰ細胞株では存在しているが、アンドロゲン非依存性のＰＣ３細胞株では存在していない（Ｔｉｌｌｅｙ， Ｗ．Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：５３８２〜５３８６（１９９０））。図３に示されるように、ＴＡＲＰはＬＮＣａＰ細胞においては発現しているが、ＰＣ３細胞では発現していない。この結果は、ＴＡＲＰ発現がアンドロゲン刺激により制御されているかもしれないことを示唆している。ＴＡＲＰプロモーター内にＡＲＥ様因子を同定したことは、ＴＡＲＰがアンドロゲンにより誘導されるという考えを強化する。アンドロゲンがＴＡＲＰｍＲＮＡ発現を誘導するかを決定するために、実験が現在進行中である。ＬＮＣａＰ細胞における発現およびＰＣ３細胞における非発現は、ＴＡＲＰがアンドロゲン依存性応答を制御することにおいて重要であることを示しているのかもしれない。
【０２１９】
本発明は、特に前立腺細胞、前立腺癌および乳房細胞および乳癌に関連する新規の材料および方法を提供する。具体的な例が提供されているが、上記の記載は例証的であり制限的ではない。本発明の多くの変形形態は本明細書の総説により当業者に明白であろう。したがって本発明の範囲は上記の参照を用いて決定されるべきではなく、代わりに、添付された特許請求の範囲と同一性を有するもの全範囲と共に、添付された特許請求の範囲に関する参照を用いて決定されるべきである。
【０２２０】
個々の刊行物および特許文献が各々そのように示されているのと同じ範囲内で、本出願において引用された全ての刊行物および特許は、全ての目的において参照として本明細書に組み入れられる。本明細書において様々な文献を引用することにより、いかなる特定の文献も本発明の「公知の技術」となることを出願人は許容しない。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＳ−ＴＣＲγ転写物のヌクレオチド配列（配列番号：１３）。インビトロにおける翻訳系では、この転写物は２つのポリペプチドを産生する。第１のポリペプチドはＭＱＭ．．．で始まる推定アミノ酸配列を有する（「ＰＳ−ＴＣＲγ−１」、本明細書では「ＴＡＲＰ」と呼ぶ、配列番号：１４）。このポリペプチドは７．２ ｋＤの予測質量を有する。それは、天然のＴＣＲγリーディングフレームに一致しないリーディングフレームから翻訳される。第２のポリペプチドはＭＫＴ．．．で始まる推定アミノ酸配列を有する（「ＰＳ−ＴＣＲγ−２」配列番号：１５）。それは１３ ｋＤの予測質量を有する。それは、ＴＣＲγと同じリーディングフレームから翻訳され、切断された形態のＴＣＲγを示す。図中の１本の下線を漬けた配列は転写開始部位およびポリアデニル化部位を示す。
【図２】ＴＣＲγｍＲＮＡ発現のハイブリダイゼーション分析。図２Ａ）はヒトＴＣＲγの異なる発現を示す多数の組織のドットブロットである。陽性の組織は前立腺（Ｃ７）、小腸（Ｅ３）、脾臓（Ｅ４）、胸腺（Ｅ５）、末梢リンパ球（Ｅ６）、リンパ節（Ｅ７）、骨髄（Ｅ８）および肺（Ｆ２）。図２Ｂ）。正常な組織のＴＣＲγ転写物サイズを示すノーザンブロット分析である。前立腺において発現される２つのＴＣＲγ転写物は１．１ ｋＢおよび２．８ ｋＢであるが、脾臓、胸腺および末梢血リンパ球中の優先的な転写物は１．５ ｋｂである。フィルムは２０時間露出した。
【図３】ＴＣＲγδ発現のノーザンブロット分析。図３Ａ）ＴＣＲγ不変領域（ＴＣＲＣγ）プローブは１．１ｋｂおよび２．８ｋｂの前立腺特異的転写物を示す（図２Ｂと比較）。フィードバックは２０時間露出した。図３Ｂ）ＴＣＲδ不変領域（ＴＣＲＣδ）ｃＤＮＡプローブは、ＴＣＲδｍＲＮＡは前立腺では発現されないが、発現は脾臓、胸腺および末梢血白血球において見られる。フィルムは５０時間露出した。図３Ｃ）ＴＣＲＣγｃＤＮＡプローブは、ＮＣａＰ細胞系統はＴＣＲγを発現するが、ＰＣ−３細胞系統は発現しないことを示している。フィルムは２０時間露出した。ヒトβアクチンｍＲＮＡ発現を対照として分析した。
【図４】ＴＣＲγ（Ｃγｌ−３’ＵＴＲ）アンチセンス、３５Ｓ標識リボプローブを使用したパラフィン包埋組織切片上のＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション分析。左側のパネルの写真は暗視野顕微鏡法によるが、対応する右側のパネルの写真は明視野顕微鏡法による。暗視野で撮影した写真に示す明るいつぶはＲＮＡハイブリダイゼーションのシグナルである。４Ａ）陽性の腺房上皮細胞および陰性の間質細胞を示す６７歳の男性由来の前立腺組織である。（５倍）。４Ｂ）４Ａの明視野。４Ｃ）下の右コーナーの陽性領域を示す高倍率（４０倍）。４Ｄ）４Ｃの明視野。４Ｅ）ＲＮＡハイブリダイゼーションを示さない腎臓組織、（５倍）。４Ｆ）４Ｅの明視野。
【図５】ＬＮＣａＰ ｍＲＮＡのプライマー伸長分析。逆方向のプライマーはＴＣＲγの不変領域でアニーリングし、Ｃγ１の５’末端から７５ヌクレオチドから開始する。逆転写は約１２８ヌクレオチドで停止した。これは矢印で示され、転写はＣγ１の上流の約５３ヌクレオチドで開始されることを示している。ＬＮＣａＰのＴＣＲγ逆転写が見られるレーンは７２時間露出したが、マーカーレーンは８時間露出した。
【図６】前立腺ＴＣＲγ転写物。前立腺ＴＣＲγがどのように転写され、スプライシングされるかを例示する。転写物はＪγ１．２セグメント、Ｃγ１の３つのエクソンその後の非翻訳配列からなる。
【図７】前立腺ＴＣＲγのインビトロ転写共役翻訳分析。８ｋＤａおよび１３ｋＤａの推定サイズを有する２つのタンパク質が得られた（レーン１）。空ベクターを使用した陰性対照反応（レーン２）はどのようなタンパク質産物も生じなかった。
【図８】ＰＳ−ＴＣＲγ転写の分析に使用されるプライマー。（配列番号：１から配列番号：１２）。
【図９】前立腺特異的ＴＣＲγ転写物のインビトロ翻訳分析。前立腺特異的ＴＣＲγ転写物はインビトロにおいて２つのタンパク質をコードする。３５Ｓ−Ｍｅｔ標識したインビトロにおいて翻訳されたタンパク質は１６．５％トリストリシンゲルで走査し、オートラジオグラフ法で分析した。使用した突然変異構築物の略図を右に示す。白抜きの囲みは太字で示す開始コドンと思われるものを有する第一のリーディングフレームを示すが、第二のリーディングフレームは斜字体で示す開始コドンと思われるものを有する黒塗りの囲みで示す。「Ｘ」はＡＴＡに突然変異されたＡＴＧコドンを示す。ｋＤａで示すサイズマーカーを上部に示す。
【図１０】ＴＡＲＰは前立腺抽出物中に発現される核タンパク質である。ＬＮＣａＰ細胞、ＰＣ３細胞または前立腺腫瘍試料（癌）から由来するタンパク質抽出物のウェスタンブロットである。２０μｇの各タンパク質抽出物を１６．５％トリストリシンゲルで走査し、ＴＡＲＰ（上のパネル）またはＴＣＲγ（下のパネル）に対する抗体でプロービングした。陽性対照として、１μｇのヒスチジン標識したＴＡＲＰ（上のパネル）または１００ｎｇのヒスチジン標識したＴＣＲγ（下のパネル）をゲル上で走査した（Ｒｅｃｏｍｂ．）。ｋＤａ単位のサイズマーカーは左に示す。ＬＮＣａＰ細胞の（Ｂ）細胞質画分（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）、膜画分（Ｍｅｍｂｒａｎｅ）および核画分（Ｎｕｃｌｅｕｓ）のウェスタンブロット分析である。４０μｇの各画分を１６．５％トリストリシンゲル上で走査し、ＴＡＲＰに対する抗体でプロービングした。陽性対照として、１μｇのヒスチジン標識したＴＡＲＰをゲル上で走査した（Ｒｅｃｏｍｂ．）。ｋＤａ単位のサイズマーカーは左に示す。
【図１１】ＴＡＲＰｍＲＮＡは乳癌細胞において発現される。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ法は、以下の細胞系統由来のＲＮＡを使用して、ＴＡＲＰ（上のパネル）またはアクチン（下のパネル）に特異的なプライマーを用いて実施した。前立腺（ＬＮＣａＰおよびＰＣ３）、神経芽細胞腫（Ａ１７２）、結腸（ＣＯＬＯ２０５）、胃（ＫＡＴＯ ＩＩＩ）および乳房（ＭＣＦ７、ＢＴ−４７４、Ｈｓ５７Ｂｓｔ、ＳＫ−ＢＲ−３、ＣＲＬ−１８９７およびＭＤＡ−４６８）。鋳型を使用しないで実施したＲＴ−ＰＣＲ反応はｄＨ２Ｏとして示す。（Ｂ）ＰＣＲ法は、ＴＡＲＰ（上のパネル）またはアクチン（下のパネル）に特異的なプライマーを使用し、１２のヒト乳癌組織試料由来のｃＤＮＡを使用して実施した。鋳型を使用しないで実施したＲＴ−ＰＣＲ反応はｄＨ２Ｏとして示す。両パネルについて、ＰＣＲ産物の２０％は１％アガロースガル上で走査し、臭化エチジウム染色で可視化した。
【図１２】乳癌細胞系統において見いだされるＴＡＲＰ転写物は前立腺特異的な形態と同一である。（Ａ）ＴＣＲγ遺伝子座およびＴＡＲＰが前立腺細胞においてどのように転写され、スプライシングされるかの略図。パネルＢのＲＴ−ＰＣＲ分析に使用されるプライマーを示す。（Ｂ）ＴＡＲＰｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ＴＡＲＰプライマー１および３（上のパネル）、ＴＡＲＰプライマー２および３（真ん中のパネル）またはアクチンプライマー（下のパネル）を使用したＰＣＲ反応は、前立腺細胞系統（ＬＮＣａＰおよびＰＣ３）および乳癌細胞系統（ＭＣＦ７、ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３およびＨｓ５７８Ｂｓｔ）由来のｃＤＮＡを用いて実施した。鋳型を使用しないで実施したＲＴ−ＰＣＲ反応はｄＨ２Ｏとして示す。ＰＣＲ産物の２０％は１％アガロースガル上で走査し、臭化エチジウム染色で可視化した。（Ｃ）ＴＡＲＰ転写物のノーザンブロット分析。前立腺細胞系統（ＬＮＣａＰおよびＰＣ３）および乳癌細胞系統（ＭＣＦ７、ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３およびＨｓ５７８Ｂｓｔ）由来の２μｇのポリ（Ａ）ｍＲＮＡをプローブとして不変領域断片を使用して分析した。２４時間の露出後オートラジオグラフを作製した（上のパネル）。同じフィルターを帯状にし、ヒトβ−アクチンＲＮＡプローブを用いて分析して等しい負荷量を証明した。１時間の露出後にオートラジオグラフを作製した（下のパネル）。ヌクレオチドにおけるＲＮＡサイズマーカーは左に示す。
【図１３】ＴＡＲＰは乳癌細胞の核に存在する。（Ａ）ＬＮＣａＰ、ＭＣＦ７、ＢＴ−４７４、ＳＫ−ＢＲ−３およびＨｓ５７８Ｂｓｔ細胞由来の核抽出物のウェスタンブロット。各核抽出物の４０μｇを１６．５％トリストリシンゲル上で走査し、ＴＡＲＰ（上のパネル）またはＴＣＲγ（下のパネル）に対する抗体でプロービングした。陽性対照として、１μｇのヒスチジン標識したＴＡＲＰ（Ｈｉｓ−ＴＡＲＰ）および１００ｎｇのヒスチジン標識したＴＣＲγ（Ｈｉｓ−ＴＣＲγ）をゲル上で走査した。ｋＤａで示すサイズマーカーを左に示す。
【図１４】ＴＡＲＰの可能な機能的領域。（Ａ）ＴＡＲＰはロイシンジッパーモチーフおよびリン酸化部位と思われるものを含有する。ロイシンジッパーモチーフと思われるものを箱つきロイシンと次の下線つき塩基領域で示す。ｃＡＭＰ依存的およびｃＧＭＰ依存的タンパク質キナーゼリン酸化部位（アミノ酸４６〜４９および５５〜５８）ならびにプロテインキナーゼＣリン酸化部位（アミノ酸１９〜２１および２０〜２２）を概略する。（Ｂ）ＴＡＲＰとＴｕｐ １のタンパク質配列の比較。ＴＡＲＰのアミノ酸配列（４２〜５７）、ディクチオステリウム ディコイデム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｃｏｉｄｅｕｍ） Ｔｕｐ１（ｄＴｕｐ１， ５２１〜５３６）およびサッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） Ｔｕｐ１（ｙＴｕｐ１， ６２６〜６６０）を示す。保存されている残基を囲みにしてある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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