(57)【要約】有効量のクロモラエナ・オドラータのエキスから成ることを特徴とする、皮膚のしわ、たるみ、老化及び／または光損傷肌の治療または予防、皮膚内のデコリン産生の増進、皮膚内のトランスグルタミナーゼＩ型及びＩＩＩ型の活性の増進、角質層の柔軟性の増加、皮膚落屑及び表皮分化の改善、肌の明色化、皮脂分泌の抑制、炎症肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静、皮膚の表面組織、滑らかさ、肌理細かさの改善、並びに、皮膚の質の全般的な向上、から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与える化粧方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のクロモラエナ・オドラータのエキスから成ることを特徴とする、皮膚のしわ、たるみ、老化及び／または光損傷肌の治療または予防、皮膚内のデコリン産生の増進、皮膚内のトランスグルタミナーゼＩ型及びＩＩＩ型の活性の増進、角質層の柔軟性の増加、皮膚落屑及び表皮分化の改善、肌の明色化、皮脂分泌の抑制、炎症肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静、皮膚の表面組織、滑らかさ及び肌理細かさの改善、並びに、皮膚の質の全般的な向上、から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与える化粧方法。
【請求項２】
クロモラエナ・オドラータのエキスが水性抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エキスが組成物の０．０００１重量％から１重量％のレベルで存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
皮膚のしわ、たるみ、老化及び／または光損傷肌の治療または予防、皮膚内のデコリン産生の増進、皮膚内のトランスグルタミナーゼＩ型及びＩＩＩ型の活性の増進、角質層の柔軟性の増加、皮膚落屑及び表皮分化の改善、肌の明色化、皮脂分泌の抑制、炎症肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静、皮膚の表面組織、滑らかさ及び肌理細かさの改善、並びに、皮膚の質の全般的な向上、から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与える局所化粧組成物を製造するためのクロモラエナ・オドラータのエキスの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は皮膚の状態及び外観を改善する化粧方法、皮膚の状態及び外観を改善する局所組成物の製造におけるある種の植物抽出物の使用に関する。本発明は特に、しわ及び／または光損傷肌を治療するためのクロモラエナ・オドラータ（Ｃｈｒｏｍｏｌａｅｎａ　Ｏｄｏｒａｔａ）（Ｓｉａｍ　ＷｅｅｄまたはＤｅｖｉｌｓ　Ｗｅｅｄとしても知られている）のエキスの使用に関する。本発明はまた、このようなエキスを含有する局所組成物に関する。
【０００２】
皮膚は、皮膚病、環境の弊害（風、空調、セントラル・ヒーティング）によって、または、正常な老化の進行（加齢老化）によって劣化する。加齢老化は、皮膚の日光被曝によって加速される（光老化）。近年、皮膚の外観及び状態を改善する化粧方法、特に、皮膚のしわ、老化及び／または光損傷の目に見える徴候を回復、抑制または予防する化粧方法に対する要望が非常に大きくなっている。
【０００３】
消費者は、小じわ、深いしわ、たるみ、色素沈着過剰及び老人斑のような皮膚の加齢老化及び光老化の目に見える徴候を回復、治療または遅らせる“老化防止用”化粧品を益々求めるようになった。
【０００４】
皮膚の主要マトリックスタンパク質であるコラーゲンが皮膚に引張強度を与えることは公知である。また、老化肌及び／または光損傷肌では皮膚のコラーゲンレベルが有意に低下していることも当業界で公知である。多くの研究は、加齢及び／または光損傷の増加に伴って皮膚のＩ型コラーゲンのレベルが低下することを示した（例えば、Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍ．，（１９７９），７３，７９−６６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．ｍｅｄ．（１９９３）３２９，５３０−５３５参照）。皮膚のコラーゲンレベルの低下は、従って皮膚の引張強度の低下を伴い、しわ及びたるみの原因になる。皮膚のコラーゲンレベルを高めることによって皮膚マトリックスを強化すると、老化防止効果及び皮膚修復効果が得られることは広く認められている。また、デコリンが皮膚修復のマーカーとして作用できることも例えば国際特許出願ＷＯ９９／４７１１０から知られている。
【０００５】
クロモラエナ・オドラータのエキスから成るＳｉａｍ　ｗｅｅｄ抽出物は公知の皮膚治療用抽出物であり、例えばベトナムで柔軟組織の創傷、火傷及び皮膚感染症の治療に使用されている。このことを示す従来技術の典型例は、“Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．３，１９９６　ｐｐ　３３５−３４３，Ｐｈａｎら、である。この文献は、上述の目的でＳｉａｍ　ｗｅｅｄの葉の水性抽出物を使用すること、及び、ヒトの皮膚線維芽細胞による水和コラーゲン格子収縮に対するＳｉａｍ　ｗｅｅｄ抽出物（ＰｈａｎらによってＥｕｐｏｌｉｎと命名された）の効果を記載している。ペトロラタムを基剤としてこれまでに製造されたＳｉａｍ　ｗｅｅｄ軟膏は、フラボノイド（サルビゲニン、サクラネチン、イソサクラネチン、ケーンフェリド、ベツレノール、２−５−７−３−テトラ−Ｏ−メチルケルカタゲチン、タマリキセチン、カルコン１及びカルコン２）、精油（ギーレン、酢酸ボルニル、ベータユーベデン）、サポニントリテルペノイド、タンニン、有機酸及び微量元素を含有することは知見されていた。局所的に使用された組成物中のＳｉａｍ　ｗｅｅｄ抽出物のｉｎ　ｖｉｔｒｏレベルは典型的には５０−２００μｇ／ｍｌであった。
【０００６】
更に、“Ｐｌａｓｔｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　Ｓｕｒｇｅｒｙ”，Ｍａｒｃｈ　１９９８，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｂｒｏｐｌａｓｔｓ　ａｎｄ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ　Ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎ　Ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍｏｌａｅｎａ　Ｏｄｏｒａｔａ　（Ｅｕｐｏｌｉｎ），ａ　Ｈｅｒｂａｌ　Ｒｅｍｅｄｙ　ｆｏｒ　Ｔｒｅａｔｉｎｇ　Ｗｏｕｎｄｓ”　Ｐｈａｎら、には、同じく火傷治療に関連して線維芽細胞及び内皮細胞の成長を増進させるためにＳｉａｍ　ｗｅｅｄ抽出物を使用することが記載されている。より特定的には、皮膚移植組織を使用する場合、Ｓｉａｍ　ｗｅｅｄ抽出物の使用が肉芽組織の形成を促進し、また、コラーゲン合成速度を増加させることが知見された。この研究では、Ｓｉａｍ　ｗｅｅｄ抽出物を１０−２３０μｇ／ｍｌの局所濃度で使用した。
【０００７】
我々は意外にも、小じわ、深いしわ、たるみ、色素沈着過剰及び老人斑のような加齢老化または光老化に起因する正常な皮膚状態の有効な治療及び予防がクロモラエナ・オドラータのエキスを含有する化粧組成物の局所適用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）によって得られることを知見した。我々はまた、化粧組成物中にクロモラエナ・オドラータのエキスを使用すると、老化防止以外の効果例えば過敏肌及び／または炎症肌の鎮静のような効果が得られることを知見した。
【０００８】
従って第一の側面としては、皮膚のしわ、たるみ、老化及び／または光損傷肌の治療または予防、皮膚内のデコリン産生の増進、皮膚内のトランスグルタミナーゼＩ型及びＩＩＩ型の活性の増進、角質層の柔軟性の増加、皮膚落屑及び表皮分化の改善、肌の明色化、皮脂分泌の抑制、炎症肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静、皮膚の表面組織、滑らかさ及び肌理細かさの改善、並びに、皮膚の質の全般的な向上、から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与える化粧方法が提供される。該方法は、好ましくはクロモラエナ・オドラータの水性エキスを含む局所組成物を皮膚に適用することから成る。
【０００９】
別の側面としては、特に光損傷肌及び細くて深いしわや小じわを治療するための組成物を製造するために有効量のクロモラエナ・オドラータの水性エキスを使用することが提案される。
【００１０】
また別の側面としては、有効量のクロモラエナ・オドラータの水性エキスを含むことを特徴とする、ヒトの皮膚に適用するための局所組成物、好ましくは水基剤の局所組成物が提供される。
【００１１】
好ましくは、本発明の方法に使用される局所組成物は、クロモラエナ・オドラータのエキスを、局所組成物の０．００００５−１０重量％のレベル、より好ましくは０．０００１−１．０重量％のレベル、またある状況では最も好ましくは０．００１−０．１重量％のレベルで含有する。
【００１２】
“水基剤の”という用語は、局所組成物が、局所組成物の好ましくは少なくとも３０重量％、より好ましくは６０重量％の水を含有することを意味する。局所製品の便利な形態は水中油型エマルジョンであろう。
【００１３】
光損傷肌の修復に関しては、創傷修復及び皮膚の再構築に関連した生化学的及び生物学的なプロセスは光損傷の修復に関与するプロセスと同じではないというのが一般的に認められている。例えば、皮膚の創傷修復を誘発するマリーゴールド及びミルラの抽出物のような他の材料は、光損傷の修復には有効でないことが知られている。
【００１４】
従って、本発明の組成物、方法及び使用は、老化防止効果を提供し、その結果として、弾力性が改善された滑らかでしなやかな皮膚を増進し、しわ及び老化肌の出現を抑制または遅らせ、かつ皮膚の色も改善する。また、外観、表面組織及び状態の全般的な改善、特に輝き、透明度に関する改善が達成され、全体的に若々しい皮膚の外観が得られる。本発明は、皮膚保護効果を与えるために特に有効に使用し得る。
【００１５】
本文中で使用された“治療する”という用語は、正常な加齢の進行によって生じる正常ではあるが美容的には望ましくない上記のような皮膚の状態を抑制し、遅らせ及び／または予防することをその範囲に含む。小じわ、深いしわ及び／またはたるみのような目に見える老化の徴候は遅らせられまたは抑制され得る。一般にしわを予防または抑制することによって、及び、皮膚の柔軟性、肌理細かさ、滑らかさ、しなやかさ及び弾力性を向上させることによって、皮膚の質は向上され、かつ皮膚の外観及び表面組織は改善される。
【００１６】
本発明の組成物、方法及び使用は、既にしわ、老化及び／または光損傷の状態が生じている皮膚を治療するために、または、正常な加齢老化及び／または光老化による上記のような望ましくない変化から予防もしくは抑制するために若年者の皮膚を処理するために有効であろう。
【００１７】
本発明に使用される組成物はまた、活性物質の希釈剤、分散剤または担体として作用する皮膚科学的／美容的に許容しうるビヒクルを含む。該ビヒクルは、水、液状または固形の皮膚柔軟剤、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤、粉末、噴射剤などのような皮膚保護製品に常用されている物質を含み得る。
【００１８】
ビヒクルは典型的には組成物の５−９９．９重量％、好ましくは２５−８０重量％を形成し、別の化粧品添加物が存在しない場合には、組成物の残余成分を形成し得る。
【００１９】
活性物質となるクロモラエナ・オドラータのエキス以外に、日光遮断剤、皮膚明色化剤及び皮膚褐色化剤のような別の特定の皮膚有益活性物質が含まれていてもよい。また、ビヒクルが更に、抗酸化剤、香料、乳白剤、保存剤、色素及びバッファのような添加剤を含有してもよい。
【００２０】
本発明方法に使用される局所組成物を調製するためには、皮膚保護製品の常用の調製方法を使用し得る。有効成分は一般に、皮膚科学的／美容的に許容し得る担体に慣用の方法で添合される。適当な方法では、有効成分は先ず組成物に添合すべき水または別の溶媒または液体の一部分に溶解または分散させる。好ましい組成物は水中油型または油中水型または水中油中水型エマルジョンであるが、ある状況においては油中水型組成物が好ましい。
【００２１】
組成物はクリーム、ジェルまたはローション、カプセルなどのような従来法の皮膚保護製品の形態でよい。組成物はまた、場合によってはすすぎ中に活性物質が皮膚に付着することを促進するデリバリー系を含有する、いわゆる“ウォッシュオフ”製品、例えば、浴用またはシャワー用のジェルの形態でもよい。最も好ましくは製品が“リーブオン”製品、即ち、皮膚に適用直後にすすぎ段階をわざわざ組み込むことなく皮膚に適用し得る製品であってもよい。
【００２２】
組成物は、従来法に従ってジャー、瓶、チューブ、ロールボールなどのような任意の適当な方法で包装し得る。予定され得る別の形態は、噴射剤駆動エアロゾルまたはポンプスプレーから噴霧として放出されるのに適した配合物の形態である。
【００２３】
本発明の組成物はまた、カプセル、錠剤などのような経口摂取に適した形態に配合されてもよい。
【００２４】
本発明の方法は、治療を要する皮膚に対して１日あたり１回または数回の頻度で行うとよい。皮膚の状態、本発明方法に使用される有効成分の濃度、組成物の使用量及び組成物の適用頻度などに依存して、通常は３−６カ月後またはもっと早い時期に皮膚外観の改善が見た目に明らかになる。一般に、少量、例えば０．１−５ｍｌの組成物を適当な容器またはアプリケーターから皮膚に適用し、手や指または適当なデバイスを使用して皮膚に塗り拡げたり及び／または擦り込んだりする。組成物が“リーブオン”製品として配合されたかまたは““リンスオフ”製品として配合されたかに依存して、場合によってはその後にすすぎ段階を行う。
【００２５】
本発明をより理解し易くするために、単なる代表例として示す実施例を添付図面を参照して以下に説明する。
【００２６】
（図面の簡単な説明）
図１は、ヒトの皮膚線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ＰＧＥ２レベルに対するＥｕｐｏｌｉｎの効果を示す。
【００２７】
実施例
ｉｎ　ｖｉｖｏのプロコラーゲンＩ及びデコリンの正の調節（アップレギュレーション）を惹起するためにレチノイン酸による局所処理を使用できることは我々の同時係属欧州出願ｎｏ．９９９０８９５６．８から公知である。このために該出願中の“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｉ　ａｎｄ　ｄｅｃｏｒｉｎ　ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｋｉｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｔｏｐｉｃａｌ　ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｐｕｒｐｏｓｅｓ”という標題の文節はその全文が参照によって本明細書に含まれるものとする。
【００２８】
実施例１
ヒトの皮膚線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリン合成の測定手順
皮膚線維芽細胞ならし培地の調製
ヒト包皮の一次線維芽細胞を継代２（Ｐ２）で１２ウェルプレートに１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で５％二酸化炭素及び４％酸素の雰囲気下に２４時間維持した。この時間の経過後、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いで新しい無血清ＤＭＥＭ中で更に６０時間インキュベートした。次に線維芽細胞単層を無血清ＤＭＥＭで再び洗浄した。三重複試験で、被験試薬及びビヒクル対照を最終容量０．４ｍｌ／ウェルの新しい無血清ＤＭＥＭ中の細胞に添加し、更に２４時間インキュベートした。この線維芽細胞ならし培地を直ちに分析するかまたは後で分析するために液体窒素で瞬間凍結して−７０℃で保存した。次に細胞をカウントし、次いでドット−ブロット分析で得られたデータを細胞数に標準化した。
【００２９】
皮膚線維芽細胞ならし培地中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンタンパク質のドットブロットアッセイ
ビヒクル（対照）または被験試薬で処理した皮膚線維芽細胞のならし培地のサンプルに、２０ｍＭのジチオトレイトール（２００ｍＭの予製液を１：１０に希釈）と０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（１０％の予製液を１：１００に希釈）とを補充し、よく撹拌し、次いで７５℃で２分間インキュベートした。１７５ｃｍ２容のフラスコに１０，０００細胞／ｃｍ２で播種し上述のような無血清ＤＭＥＭ中に維持した線維芽細胞から得られた何も混ぜない線維芽細胞ならし培地を系列希釈することによってアッセイ標準を作製した。
【００３０】
引き続いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄの９６−ウェルＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を製造業者の使用説明書の記載通りに使用し、三重複試験で、アッセイサンプルを予め湿らせたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜シートに適用した。ウェルあたり約２００μｌの培地を適用した。培地を重力下で膜濾過した（３０分間）後、膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄した。これらのＰＢＳ洗液を重力下で膜濾過した（２×１５分）。次にＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を真空マニホルドに接続し、吸引下で３回目及び最終回のＰＢＳ洗浄を行った。
【００３１】
装置を分解し、膜を取り外し、必要に応じて速やかに裁断した後、ブロッキングバッファに入れて４℃で一夜維持した。デコリン分析用に調製した膜はＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０でブロックし、他方、プロコラーゲン−Ｉ分析用の膜はＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳／０．５％トゥイーン２０でブロックした。
【００３２】
翌日、１：１０，０００に希釈したヒトのプロコラーゲン−Ｉに対する一次抗体（ＭＡＢ１９１２；ラットモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはヒトのデコリンに対する一次抗体（ウサギポリクローナル；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）で膜を室温で２時間プローブした。その後に、ＴＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で膜を洗浄し（３×５分）、次いで、必要に応じて１：１，０００に希釈した１２５　Ｉ−コンジュゲート抗ラットまたは抗ウサギＦ（ａｂ′）２フラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に室温で１時間インキュベートした。次に、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎストリップをＴＢＳ／トゥイーン２０で再び洗浄した後（３×５分）、室温で風乾した。
【００３３】
乾燥した膜をセロファンに包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ蓄積型リン光スクリーンに１６−１８時間露光した。この時間の経過後、露光したスクリーンはＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭソフトウェアを使用し、ホスホイメージ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ　ＳＦ）によって走査した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ中の定量ツールを使用するコンピュータ援用画像解析によってドットの輝度を評価し、細胞数に標準化し、デコリン及びプロコラーゲン−Ｉの合成に対する種々の被験試薬の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に比較した相対値として決定した。
【００３４】
以下の表１は、ヒトの皮膚線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの合成に対するクロモラエナ・オドラータのエキスの効果、並びに、このエキスの適用量を示す。結果を正規化するために、被験物質の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に比較した相対値として決定した。比較のために、レチノイン酸を使用してヒトの皮膚線維芽細胞中のデコリン合成に対する効果の評価試験を行った。試験に使用した試薬の濃度は細胞生存率に全く影響を与えなかった。
【００３５】
クロモラエナ・オドラータのエキスは、Ｓｉａｍ　ｗｅｅｄの葉を水中で３０分間煮沸することによって得られた水性抽出物を濃縮することによって調製した。
【００３６】
このエキスを前述のような４％酸素を含有するｉｎ　ｖｉｔｒｏ線維芽細胞モデル中で０．１−１μｇ／ｍｌのレベルで試験した。
【００３７】
モデルをプロコラーゲン−Ｉ及びデコリンの双方について分析した。それらの結果を以下に示す。
【００３８】
【表１】
2004512351.tif 000002
【００３９】
結果は、比較的低いレベル（例えば０．０１μｇ／ｍｌ）のエキスによってもモデル中のデコリン合成が実質的に正の調節を受けたことを示す。プロコラーゲン−Ｉの合成についても対照に比較して小さいがプラスの効果が観察された。また比較のために１．０μｇ／ｍｌのサンプルをレチノイン酸（１μｍ）で試験すると、デコリンがビヒクル処理対照の１００任意単位の値に比べて１３８±１４．０（ｐ＝０．０３５，ｎ＝４）という正の調節を示した。これはまた、ヒトの皮膚線維芽細胞中のデコリン合成についてクロモラエナ・オドラータエキスによって得られた増加がレチノイン酸の効果に比較して極めて大きいことを示している。
【００４０】
実施例２
線維芽細胞ＰＧＥ２アッセイ
以下の実施例は、クロモラエナ・オドラータのエキスがｉｎ　ｖｉｔｒｏ線維芽細胞から分泌されたプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の基底レベルを効果的に低下させることを示す。
【００４１】
ヒト包皮の一次線維芽細胞を継代２（Ｐ２）で９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで播種し、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で５％二酸化炭素の雰囲気下に２４時間維持した。エタノールに溶解させたクロモラエナ・オドラータエキスを新しい細胞培地（１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中に１％ＥｔＯＨの最終濃度）に添加し、三重複試験として、ウェル内の細胞に添加し、更に２４時間インキュベートした。培地にホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）を添加して、細胞を更に２４時間インキュベートした。ＰＭＡは細胞内で酸化性ストレス及び炎症反応を誘発するストレス物質として作用する。次に線維芽細胞／培地を直ちに以下に記載のように分析するかまたは後で分析するために液体窒素中で瞬間凍結して−７０℃で保存した。
【００４２】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）アッセイ
培養皿を穏やかに振盪した後で５０μｌ量の培養培地を採取しＰＧＥ２アッセイに使用した。培地中のＰＧＥ２レベルをＢｉｏｔｒａｋ　ＰＧＥ２イムノアッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）で測定した。このアッセイは、限定量の固定したＰＧＥ２特異的抗体に対するサンプル中の非標識ＰＧＥ２と一定量の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＰＧＥ２との競合に基づく。非標識サンプル中のＰＧＥ２の濃度を標準曲線に従って決定する。標準曲線は同時に得られた。
【００４３】
被験化合物の抗炎症能力は、分泌ＰＧＥ２の基底レベルを低下させる化合物の能力を対照に比較することによって評価した。得られた結果を以下の表にまとめ、図１に表す。
【００４４】
【表２】
2004512351.tif 000003
【００４５】
ＰＧＥ２はよく知られた皮膚の炎症媒介物質である。Ｇｒｅａｖｅｓら，“Ｐｒｏｓｔａｇｌｕｄｕｓ，ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｍｅｓ，ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ，ｐｌａｔｅｌｅｔ　ａｃｔｕａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：　ａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｓｋｉｎ”，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．（１９８８）２８０［ｓｕｐｐ］：５３３−５４１。結果は、クロモラエナ・オドラータのエキスで処理した線維芽細胞ではプロ炎症プロスタグランジンＰＦＥ２の産生量が減少し、これによって皮膚の炎症能力が低下することを示した。
【００４６】
実施例３
器官培養−ＴＧアーゼ法
材料
Ｄｅｔｔｏｌ（Ｒｅｃｋｉｔｔ　＆　Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｈｕｌｌ，ＵＫ）、ｇｌｕｔａｍａｘ含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ改質イーグル培地）、ＡＢＡＭ（抗生物質／抗真菌物質Ｘ１００）溶液（５０，０００単位のペニシリンＧ、５０，００μｇの硫酸ストレプトマイシン及び１２５μｇのアムホテリシンＢ／５ｍＬ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ））、ヒドロコルチゾン２１−ヘミスクシネート（ナトリウム塩）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、３５×１０ｍｍのシャーレ（Ｎｕｎｃｌｏｎ，Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ提供）、Ｍａｒｂｒｏｏｋのミニプラスチック三脚（Ｃ．Ａ．Ｈｅｎｄｌｅｙ　Ｌｔｄ，ＵＫ提供）、Ｎｙｂｏｌｔナイロン網（Ｊｏｈｎ　Ｓｔａｎｉａｒ　Ｌｔｄ，ＵＫ）、使い捨ての４ｍｍ滅菌バイオプシー用パンチ（Ｓｔｅｉｆｅｌ　Ｌａｂｓ　Ｌｔｄ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）。
【００４７】
ビオチニル化モノダンシルカダベリン、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８ストレプトアビジン、Ｐｒｏｌｏｎｇ非褪色溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ提供）、ウシアルブミン（ＢＳＡ）、塩化カルシウムＣａＣｌ２、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＺＭＡ塩基）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ．，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）、塩酸（（ＨＣｌ），Ｍｅｒｃｋ，Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ））。
【００４８】
器官培養法
ブタの背から皮膚を採取し、皮下脂肪及び筋肉を丁寧に除去することによって厚み３−４ｍｍの皮膚サンプルを作製した。毛を刈り落とし、皮膚を水洗し、残留する血液または汚れを完全に除去した。皮膚サンプルを７ｃｍ×７ｃｍ平方に裁断し、５％Ｄｅｔｔｏｌ（滅菌）中、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。次にＡＢＡＭ（５ｍＬ／５００ｍＬ培地）を含有するＤＭＥＭ中で１時間インキュベートした。ヒドロコルチゾン２１−ヘミスクシネート（１００μｇ／ｍＬ、滅菌濾過済み）をＤＭＥＭ＋ＡＢＡＭに添加した。３ｍｌの培地（ＤＭＥＭ／ＡＢＡＭ／ヒドロコルチゾン）を入れたシャーレに三脚と網とを据え付け、負のメニスカスを生じさせた。パンチ生検を皮膚から採取し、網（シャーレあたり４個）に載せ、処理前に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。培地を毎日交換した。
【００４９】
ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＴＧアーゼ法
０．０１３ＭのＨＣｌ中の１０ｍＭのビオチニル化モノダンシルカダベリンの予製液を調製し、−２０℃で保存した。予製液から基質バッファを調製した：１００ｍＭのトリスＨＣｌ中に０．１ｍＭのビオチニル化モノダンシルカダベリン、５ｍＭのＣａＣｌ２。陽性対照としては５ｍＭのＣａＣｌ２に代えて２００ｍＭのＥＤＴＡを使用した。
【００５０】
ブタの皮膚生検を液体窒素で瞬間凍結し、−２０℃で保存した。切片を裁断し（５−８ミクロン厚み、Ｂｒｉｇｈｔｓクリオスタット）、室温（ＲＴ）で１０分間風乾した。切片を０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８．４中の１％のＢＳＡと共にＲＴで３０分間インキュベートし、次いで基質バッファ中でＲＴで２時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ中の２５ｍＭのＥＤＴＡで５分間洗浄して反応を停止させ、次いでＰＢＳ中で２回洗浄した。次にスライドをＡｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ４８８ストレプトアビジン（１：２５０）中でＲＴで３０分間インキュベートし、次いでＰＢＳ中で上記同様に洗浄した。スライドを１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで１０秒間対比染色し、次いで水洗し、ｐｒｏｌｏｎｇ非褪色溶液に封入した。切片を顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｌｅｉｔｚ　ＤＭＲＢ，Ｌｅｉｔｚ　ｐｌｏｅｍｏｐａｋ　ｆｉｌｔｅｒ　ｂｌｏｃｋ　Ｌ３，Ｍｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｎｅｓ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）で観察し、Ｉｍａｇｅ　Ｇｒａｂｂｅｒ　ＰＣソフトウェア（Ｎｅｏｔｅｃｈ　Ｌｔｄ．Ｅａｓｔｌｅｉｇｈ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して像を保存した。
【００５１】
ブタの器官培養物を上記と同様にして種々の濃度のクロモラエナ・オドラータエキスによって４８時間処理した。ブタの器官生検のクリオスタット切片中のＴＧアーゼ活性を上記の手順で定量し、ＴＧアーゼアッセイから得られた結果を以下の表３に示す。
【００５２】
表３
ブタの４８時間器官培養物中のＴＧアーゼ活性に対するクロモラエナ・オドラータの効果
【００５３】
【表３】
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【００５４】
表３の結果は、クロモラエナ・オドラータのエキスで処理したブタ皮膚中のＴＧアーゼ活性が対照に比べて有意に増加したことを示す。ブタとヒトとの皮膚の類似性を考慮すると、クロモラエナ・オドラータのエキスがヒトの皮膚中のＴＧアーゼ活性に同様の効果を有することは十分に有り得る。
【００５５】
データは、クロモラエナ・オドラータエキスが表皮分化及び関門形成の鍵酵素を刺激すること、従ってこの植物エキスが皮膚の状態に有益な効果を有することを示している。
【００５６】
実施例５
以下の配合表は本発明の方法及び使用に好適な水中油型クリームを表す。指定されたパーセンテージは組成物に対する重量％である。
【００５７】
【表４】
2004512351.tif 000005
＊Ｂｒｉｊ　５６はセチルアルコールＰＯＥ（１０）
＊＊Ａｌｆｏｌ　１６ＲＤはセチルアルコール
【００５８】
実施例６
以下の配合表は本発明のエマルジョンクリームを表す。
【００５９】
【表５】
2004512351.tif 000006
【００６０】
上記の実施例５及び６の局所組成物は双方ともが、加齢または光老化によって劣化した皮膚に適用されたときにはしわのある肌、老化肌、光損傷肌及び／または炎症肌の外観を改善するため、若年者の肌に適用されたときにはこのような劣化性変化の予防または遅延を助けるために有効な美容処理を提供する。組成物は従来の方法で加工できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトの皮膚線維芽細胞中のＰＭＡ刺激ＰＧＥ２レベルに対するＥｕｐｏｌｉｎの効果を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月18日(2002.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のクロモラエナ・オドラータのエキスから成ることを特徴とする、皮膚のしわ、たるみ、老化及び／または光損傷肌の治療または予防、皮膚内のデコリン産生の増進、皮膚内のトランスグルタミナーゼＩ型及びＩＩＩ型の活性の増進、角質層の柔軟性の増加、皮膚落屑及び表皮分化の改善、肌の明色化、皮脂分泌の抑制、炎症肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静、から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与える化粧方法。
【請求項２】
クロモラエナ・オドラータのエキスが水性抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エキスが組成物の０．０００１重量％から１重量％のレベルで存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
皮膚のしわ、たるみ、老化及び／または光損傷肌の治療または予防、皮膚内のデコリン産生の増進、皮膚内のトランスグルタミナーゼＩ型及びＩＩＩ型の活性の増進、角質層の柔軟性の増加、皮膚落屑及び表皮分化の改善、肌の明色化、皮脂分泌の抑制、炎症肌、赤焼け肌及び／または敏感肌の鎮静、から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与える局所化粧組成物を製造するためのクロモラエナ・オドラータのエキスの使用。
【国際調査報告】
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