(57)【要約】本発明はフェノール検出及び／又は測定の為の方法に関連し：ａ）試験される試料を、フェノール又はその類似体によるインプリントした重合体と接触させ、そしてｂ）フェノールの前記重合体に対するフェノールの結合を測定することを含んで成る。重合体は重合可能な単量体を重合化し、これにフェノールは加水分解可能なリンカーによって共有結合し、そしてその後、当該フェノールを加水分解によってとり除くことによって調製されて良い。プロポホルは本発明中で用いる為の好適なフェノールである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェノールを検出及び／又は測定する為の方法であって、
（ａ）試験される試料をフェノール又はその類似体をインプリントした重合体と接触させ；
（ｂ）当該重合体に対するフェノールの結合を測定すること
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記インプリント重合体が、重合可能な単量体を重合し、フェノールを加水分解可能なリンカーによってそれに共有結合させ、そしてその後加水分解によってフェノールを除去することによって調製された、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記単量体は式ＭＸＰ
（式中、
Ｐは（置換された）フェノキシ基であり；
Ｍはアルケニル基を含む重合可能な基であり；
Ｘは重合体の骨格の破壊をもたらさない条件下で加水分解を受けやすい結合又はリンカー基である）
を有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
Ｘ又はＭ及び／もしくはＰと一緒にＸは−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−基を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｍはビニルフェニル基であり、そしてＸ及びＰのオキシ基が−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−基を形成する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記インプリント重合体がフェノールの存在において重合体を調製又は架橋し、その後フェノールを除去することによって調製された、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記重合体が架橋したポリアクリレート又はポリメタクリレートである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記重合体がエチレンジメタクリレートで架橋したポリメタクリレートである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
（重量で）５０％以上の重合体の粒度が０．５−５ミクロンの範囲にある、請求項１−８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記インプリント重合体が、重合化混合物を多孔質の重合体膜上に置き、そしてその混合物を重合することにより形成されている請求項１−９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記多孔質の重合体膜がＰＴＦＥ膜である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記フェノールがフェノール又はモノ、ジ、トリ置換フェノールである、請求項１−１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記フェノールが、Ｃ１ −Ｃ６ アルキル、ハロゲン、Ｃ１ −Ｃ６ アルコキシ、Ｃ１ −Ｃ６ アルキルチオ、アミノ、Ｃ１ −Ｃ６ アルキルアミノ、ジ（Ｃ１ −Ｃ３ アルキル）アミノ、−ＣＯＮＨ２ 、−ＣＮ、カルボキシ、ヒドロキシ、Ｃ１ −Ｃ６ アルキルスルホニル、ニトロ、及び置換したＣ１ −Ｃ６ アルキル又はアルコキシ（ここにおいて置換基はハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１ −Ｃ３ アルコキシ、アミノ、−ＣＯＮＨ２ 、−ＣＮ及びカルボキシから選択されている）から選択された１−３個の置換基によって置換されている、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記フェノールが１−３個のＣ１−Ｃ３アルキル基によって置換されている、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記フェノールがプロポホル又はクレゾールである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記フェノールがプロポホルある、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
プロポホルを検出／測定する為のセンサーであって、請求項１−１６のいずれか１項記載のインプリント重合体を有するプローブを含んで成る、センサー。
【請求項１８】
重合可能な単量体を重合し、フェノールを加水分解可能なリンカーによりそれに共有結合させ、そしてその後加水分解によってフェノールを除去することによって調製されたインプリント重合体。
【請求項１９】
前記単量体が式ＭＸＰ（式中、
Ｐは（置換された）フェノキシ基であり；
Ｍはアルケニル基を含む重合可能な基であり；
Ｘは重合体の骨格の破壊をもたらさない条件下で加水分解を受けやすい結合又はリンカー基である）
を有する、請求項１８記載のインプリント重合体。
【請求項２０】
Ｘ又はＭ及び／もしくはＰと一緒にＸは−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−基を含む、請求項１９記載のインプリント重合体。
【請求項２１】
Ｍはビニルフェニル基であり、そしてＸ及びＰのオキシ基が−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−基を形成する、請求項２０記載のインプリント重合体。
【請求項２２】
フェノールの存在において重合体を調製又は架橋し、その後フェノールを除去することによって調製された、インプリント重合体。
【請求項２３】
前記重合体が架橋したポリアクリレート又はポリメタクリレートである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記重合体がエチレンジメタクリレートで架橋したポリメタクリレートである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記フェノールがフェノールか又はモノ、ジ、トリ置換フェノールである、請求項１８−２４のいずれか１項記載のインプリント重合体。
【請求項２６】
前記フェノールが、Ｃ１ −Ｃ６ アルキル、ハロゲン、Ｃ１ −Ｃ６ アルコキシ、Ｃ１ −Ｃ６ アルキルチオ、アミノ、Ｃ１ −Ｃ６ アルキルアミノ、ジ（Ｃ１ −Ｃ３ アルキル）アミノ、−ＣＯＮＨ２ 、−ＣＮ、カルボキシ、ヒドロキシ、Ｃ１ −Ｃ６ アルキルスルホニル、ニトロ、及び置換したＣ１ −Ｃ６ アルキル又はアルコキシ（ここにおいて置換基はハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１ −Ｃ３ アルコキシ、アミノ、−ＣＯＮＨ２ 、−ＣＮ及びカルボキシから選択されている）から選択された１−３個の置換基によって置換されている、請求項２５記載のインプリント重合体。
【請求項２７】
フェノールが１−３個のＣ１−Ｃ３アルキル基によって置換されている、請求項２６記載のインプリント重合体。
【請求項２８】
前記フェノールがプロポホル又はクレゾールである、請求項２７記載のインプリント重合体。
【請求項２９】
前記フェノールがプロポホルである、請求項２８記載のインプリント重合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はフェノールの重合体への結合及びその用途に関連する。
【０００２】
背景
麻酔薬、及びとり分けて全身麻酔薬は患者に対する治療の危険性が高い形態である。各個体においての麻酔薬の代謝の速度は効果のレベルと同様に大きく変化する患者の安全性には、それらが、苦痛の信号及び意識の程度について連続的に監視されることが要される。所定の各々の患者について麻酔薬の効果の水準、達成される速度、及び無意識の水準を適当に保つのに必要な麻酔薬の投与レベルを確認できることが望ましい。故に、患者の治療は、副作用及び回復時間を最小限にすること、並びに、麻酔の効果を最大限にすることによって至適化できうる。
【０００３】
至適化された患者の治療の為の、急速且つ特異的な解析方法が、近縁の化合物と区別して、生物学的流体中の麻酔薬の濃度を測定する為に要請されている。この要請は、患者における意識の水準及び血液又は血しょう中の麻酔薬のレベルの両方を監視する為の様々な方法の開発につながる。
【０００４】
患者を観測する技術は一般的に、心拍数、血圧及び眼のちらつきのような指標による生体観測を含んで成る。ＥＥＧ観測も又実行可能である。
【０００５】
麻酔薬の観測は、呼気の測定、最近は生物学的流体試料中の検体に関する高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はＥＬＩＳＡに頼っている。
【０００６】
２０数年前、米国特許第４，０６９，１０５号では、麻酔薬、実例として、アニリド、リドカイン等の測定の為の酵素免疫アッセイを開示した。そこで記載された麻酔薬は、一般的に静脈以外の投与用に処方されていた。この場合アッセイは患者から取り出した試料に対して行われている。
【０００７】
そこに記載された麻酔薬の誘導体は、抗原性の複合体を産み出す為に、環状のアミノ置換基を介して抗原に結合している、アニリド官能薬を含んで成る。そして、抗原性の複合体を薬剤に掛けそして免疫アッセイにおいて用いる為に抗体の生産に用いた。
【０００８】
１９８３の米国特許第４，６５０，７７１号において、芳香族性のメチル置換基の１つを介して抗原に結合したアニリド誘導体の麻酔薬を提供することにより、技術は更に進展した。流体試料によるイムノアッセイが再度提案された。
【０００９】
これら米国特許の公開の後１５−２０年で、麻酔薬の分野における多くの進展があった。現在好まれている麻酔薬は、静脈内又は筋肉投与用に処方されており、そしてプロポホルのようなフェノール誘導体麻酔薬を含む。ディプリバンとして通常知られている、プロポホルは、医薬麻酔において、通常静脈内に投与される、すぐ作用する麻酔である。この好適な麻酔薬の存在は１０年に渡り知られている。
【００１０】
この麻酔薬は、ＨＰＬＣ法を用いて測定できうる一方、現在、患者中の静脈内／筋内麻酔の濃度を、リアルタイムで、オンラインで、又は医療現場において容易に簡単に測定する方法がない。更に、臨床で用いる場合には、これらの型の麻酔薬に対する抗体検出法は知られていない。これらの麻酔薬の作用機序に関しても又あまり理解されておらず、故に、キットもしくはオフラインもしくはリアルタイム生物センサーを用いた、急速且つ臨床上適切な検出方法を可能にする、これら麻酔薬に対する結合物質の開発は、長年の要求を満たすだろう。
【００１１】
他のフェノールは、医薬工業において、そして環境汚染物質として重要である。これらの化合物に関する改良された便利なアッセイも同様に望まれている。
【００１２】
本発明の目的は、フェノールの検出及び生物センサー及び／もしくは上記の問題を解決するもしくは少なくとも有用な選択を公共に提供する方法において用いる為の新たなる結合物質を供することである。
【００１３】
発明の開示
本発明のある局面に従い、
ａ）試験される試料をフェノール又はその類似体をインプリント（ｉｍｐｒｉｎｔ）した重合体と接触させ、
ｂ）前記重合体に対するフェノールの結合を測定すること
を含んで成る、フェノールの検出及び／又は測定する為の方法が供されている。
【００１４】
他の局面において、本発明は、フェノールを結合する重合体を供する。ここにおいて、前記重合体はフェノール又はその類似体でインプリントされている。
【００１５】
他の局面において、本発明は、インプリント重合体を生産する為に除去できうる共有結合又は非共有結合したフェノールを含む重合体を供する。
【００１６】
フェノールは、フェノールそれ自体か又は単一の六員環を有する置換されたフェノールであって良い。環はモノ、ジ、又はトリ置換体であって良い。好適な置換基は、Ｃ１ −Ｃ６ アルキル、ハロゲン、Ｃ１ −Ｃ６ アルコキシ、Ｃ１ −Ｃ６ アルキルチオ、アミノ、Ｃ１ −Ｃ６ アルキルアミノ、ジ（Ｃ１ −Ｃ３ アルキル）アミノ、−ＣＯＮＨ２ 、−ＣＮ、カルボキシ、ヒドロキシ、Ｃ１ −Ｃ６ アルキルスルホニル、ニトロ、及び置換したＣ１ −Ｃ６ アルキル又はアルコキシが挙げられ、ここにおいて置換基はハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１ −Ｃ３ アルコキシ、アミノ、−ＣＯＮＨ２ 、−ＣＮ及びカルボキシから選択されている。好適な置換基はＣ１ −Ｃ３ アルキル基である。
【００１７】
本発明中で用いる為の好適なフェノールは、クレゾール及びプロポホル、特にプロポホルである。
【００１８】
本発明の好適な実施態様において、
ａ）試験される試料を、プロポホル又はその類似体をインプリントした重合体と接触させ、
ｂ）前記重合体に対するプロポホルの結合を測定すること
を含んで成るプロポホルの検出及び／又は測定する為の方法が供されている。
【００１９】
他の好適な実施態様において、本発明はプロポホルに結合する重合体を供する。ここにおいて前記重合体は、プロポホル又はその類似体でインプリントされている。
【００２０】
他の実施態様において、本発明はインプリント重合体を生産するのに除去されて良い共有結合又は非共有結合したプロポホルを含む重合体を供する。
【００２１】
好適な試料物質は、血液、血しょう及び血清のような生物学的流体が挙げられる。
【００２２】
フェノールの重合体への結合は様々な方法において検出されて良い。例えば、インプリント重合体は、重合体が抗体を置換する放射免疫測定に相当するアッセイにおいて、か又は光学的もしくは電気化学的検出のどちらかによる生物センサーにおいて用いられて良い。
【００２３】
インプリント重合体膜は化学センサーの原理として用いられうる。係る化学センサーは、イオン選択電極の形態をとりうる。
【００２４】
本発明に係るインプリント重合体は様々な方法において調製できうる。共通の特徴は、フェノールが重合過程の間に組み込まれ、そして後に除去されることである。フェノールは共有結合して良い。代わりに非共有結合していても良い。フェノールは加水分解可能なリンカーを介して重合可能な単量体に結合して良い。これは、インプリント重合体を残しプロポホルを解放する重合体形成後のリンカーの加水分解を可能にする。様々な型の基をプロポホルを重合体に結合するのに用いることができうる。これらは全て当業界で周知であり、且つボロン酸エステル基、シッフ塩基（ｓｉｆｆ　ｂａｓｅ）、ケタール、アセタール及びキレート錯体が挙げられるが、Ｇ Ｗｕｌｆｆ Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ （１９９５） ３４， １８１２−１８３２を参照のこと。アミド及びエステル結合も又用いられて良いが、インプリント物質の除去が困難であるので好ましくはない。
【００２５】
特に好ましいのは炭酸塩のエステルの利用であり、ＣＯ２ の欠失により効果的に加水分解により解裂できうる。結合部位フェノール生成は、水素結合を介するアルコールとの相互作用により可能である。
【００２６】
本発明中での使用に関して好ましいのは、式ＭＸＰ（式中、Ｐは、フェノキシ基、例えば２，６−ジイソプロピルフェノキシ基であり、
Ｍは、好ましくはアルケニル基、更に好ましくはプロペニル又はビニル基を含む重合可能な基であり、
最も好ましくはＭがビニルフェノキシ基であり、
Ｘは加水分解を受けやすいリンカー基又は結合である）の単量体の重合により形成された共有結合のインプリント重合体である。Ｘ又はＸ−Ｍ結合もしくはＸ−Ｐ結合は、形成される重合体の骨格の破壊をもたらさない状条下で解裂されて良い。好適にＸ（又はＭ及び／もしくはＰと一緒にＸ）はボロン酸エステル基、ケタール、アセタールもしくは−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−基、最も好適には−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−基を形成する。
【００２７】
非共有結合反応も又使用できうる。重合体は、重合体の形成又は架橋をする間インプリンティングフェノールを添加することにより形成されている。重合体は、フェノールに対する結合部位を形成するフェノールとの電子的な相互作用、水素結合の形成又は疎水性相互作用により選択されている。
【００２８】
好適な非共有結合性の重合体は架橋したポリアクリレート及びポリメタクリレート、好適には、架橋したポリメタクリレートが挙げられる。好適な架橋剤は、エチレンジメタクリレートである。共重合体の、架橋剤に対する比は１：１〜１：１５が好ましく、１：４〜１：１５のが最も好ましい。
【００２９】
本発明の好適な実施態様において、本アッセイ中で用いられる重合体は、非特異的な結合を減らすのに繰り返し細かくされている。５０重量％以上の重合体の粒度は、０．５−５ミクロンの範囲にあるのが好ましい。更に８０％超の物質がその範囲にある粒子から構成されているのが好ましい。
【００３０】
上記の重合体は放射免疫測定に類似のアッセイ中で用いられて良い。例えば放射性同位標識したフェノール（例えば〔Ｃ１４〕プロポホル）は試料中に取り込まれる。放射性フェノールの重合体への結合は、試料中に存在する当該フェノールの量に反比例するだろう。フェノールの結合は、重合体を液状の媒質より分離した後に決定されて良い。これは遠心によって都合良く達成されうる。
【００３１】
プロポホルを分析する為の他の方法は生物センサー中への重合体の組み込みが挙げられる。
【００３２】
好適な生物センサーは、電極、好適には、白金の網により覆われた分子式のインプリント重合体（ＭＩＰ）による電流式のプローブを含んで成る。参照プローブは標準的な設計技術に従い組み込まれている。参照電極の材料は、銀、金、白金又はステンレス鋼が挙げられる。好ましい電極はＡｇ，Ａｇ／ＡｇＣｌの組合わせである。電極は外部端子に接続されて良い。
【００３３】
プローブのアセンブリーは、筐体又は本体中に、指示プローブを形成する為に埋め込まれている。係るプローブを実施例７及び８中に例示してある。
【００３４】
本発明の好適な実施態様において、インプリント重合体は、重合化混合物を、０．５ｍｍのカットオフ値を有するＰＴＦＥ膜のような多孔性の重合体膜上に置き、そして重合させることによって形成されている。生じた膜を生物センサー中で用いることができうる。
【００３５】
本発明の他の局面において、フェノールはプロポホルであり、そしてその麻酔中の濃度は、予めプロポホルでインプリントした重合体上へのプロポホルの結合に基づくアッセイを用いることで、光学的又は電気化学的検出のどちらかにより観測されている。
【００３６】
本発明の好適な所定の局面は、以下の非限定例との関連において記載されるだろう。
【００３７】
【化１】
2004502149.tif 000002
【００３８】
１．１　２，６ジイソプロピルベンゾイルクロリドの調製
反応はＢｒｉｍｂｌｅ及びＬｅｅ ｉｎ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ： Ａｓｙｍｅｔｎｙ ９ （１９９８） ８７３−８８４ による記載に基づいている。用いたモル比は、プロポホル：ホスジーン：アミン１：３：１．１であった。ホスジーン（トルエン中１２．５％溶液）をアイスバス中に浸したフラスコの中に入れ、そしてプロポホル及びジイソプロピルエチルアミンを１５分間滴下した。フラスコが室温になるようにし、そして反応を、全てのプロポホルが消える迄ＴＬＣ（６０−４０シクロヘキサン−ジクロロメタン）によって観測した。クロロホルメートをＮＭＲで特定決定し、そして更なる精製を伴わずに３番の反応に用いた。反応時間は約４８時間だった。
【００３９】
１．２　４−ビニルフェノールの調製
この反応はＣｏｎｓｏｎら、Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ （１９５８） ５４４−５４９ による記載に基づいている。分子の比はアセトキシスチレン：塩基１：１．５。塩基の、水中のＫＯＨ（３０％）をアイスバス中に浸しそしてアセトキシスチレンを３０分間に渡り滴下した（全反応をＮ２ の下で行った）。反応を、全てのアセトキシスチレンが消える迄ＴＬＣ観測（２０−８０シクロヘキサン−ジクロロメタン）した。次いでＣＯ２ によりｐＨを８に下げた。生じた沈澱をろ過し、そして水で洗浄して、その後ヘキサンを沸騰させることにより再結晶化しそしてＮＭＲで特性決定した。
【００４０】
１．３　単量体（２，６−ジイソプロピル）フェニル（４−ビニル）フェニルカーボネートの調製
この反応はＷｈｉｔｅｃｏｍｂｅら（Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１７， ７１０５−７１１１ （１９９５））による記載に基づいている。分子の比はクロロホルメート：ビニルフェノール：ジイソプロピルエチルアミン１：１：２であった。ビニルフェノールを無水ＴＨＦ中に溶かしそして塩基を添加した。フラスコをアイスバス中にあるままにし、そしてクロロホルメートを滴下して加えた。フラスコを室温になるようにし、そして反応を観測（ＴＬＣ６０−４０シクロヘキサン−ジクロロメタン）した。溶媒を取り除き、そして粗製の混合物をＣＨ２ Ｃｌ２ 中に溶かした。水による抽出後、有機層を乾燥状態にし、そして単量体をＣＨ２ Ｃｌ２ ヘキサン（ＣＨ２ Ｃｌ２ ５〜８０％）の段階的な公配を用いるシリカゲルカラム上での抽出によって分離した。解析で純度＞９８％が示された。単量体の調製に関する全体の反応のしくみを、反応のしくみＩに図示している。
【００４１】
【化２】
2004502149.tif 000003
【００４２】
重合はＷｈｉｔｃｏｍｂｅ らに似た方法において行われた。用いたモル比（２，６−ジイソプロピル）フェニル（４−ビニルフェニル）カーボネート：架橋剤（エチレンジメタクリル酸）：ＡＢＣＨＣは、嵩で１：１９：０．１２５且つ膜に関しては１：１：０．１２５、であった。ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）（トルエン）として２ｍｌ／ｇ単量体を用いた。重合は６０−８０℃で塊重合体に関しては完了するのに４８時間、そして膜に関しては２４時間を要した。
【００４３】
塊重合体（脆性固体）及びブランク（単量体の以外の全て）を３０ｓ−１にて７５分間で粉砕した。次いでＣＨ３ ＯＨ中の１ＭのＮａＯＨ中で６時間に渡り還流した。わずかに過剰の希ＨＣｌにより中性にした後、水、メタノール及びエーテルで洗浄した。
【００４４】
空気中で２４時間に渡る乾燥−−メタノールで１８時間そしてヘキサンで８時間に渡るソックスヘレット（Ｓｏｘｈｌｅｔ）抽出の後、重合体を試験する前に空気乾燥した。
【００４５】
１．５　結合試験
重合体をプロポホル溶液（メタノール中０．２ｍＭ及び２ｍＭ溶液）と接触させることにより、回分の結合試験を行った。遠心の後、上清を分析（ＨＰＬＣ　６０−４０　ＣＨ３ ＣＮ−Ｈ２ Ｏ）し、そして結合率を評価した。
【００４６】
０．２ｍＭではインプリント重合体において最初の結合率は、８９％、ブランク重合体においては７８％、２ｍＭではインプリント重合体においては７３％、ブランク重合体においては５４％であった。
【００４７】
（ブランク重合体における接着率として定義した）非特異的な結合率は高かった。そしてこれを我々は粒子が大きすぎるからだと推定した。更なる粉砕（全３０ｓ−１で２時間に渡る）の後、吸着率は、０．２ｍＭではインプリント重合体については１８％、ブランク重合体については３％、２ｍＭではインプリント重合体は１２％、プランク重合体は３％であった。
【００４８】
膜について、インプリント及び非インプリント膜を２分間（結合の速度を研究することによって決定した時間）に渡り、既知濃度のプロポホル溶液と接触させた。試験後溶液中に残留するプロポホルをＨＰＬＣによって解析し、そして光学的な解析により二重に調べた。
【００４９】
水ですすいだ後、膜をｐＨ９．６のメタノール−重炭酸の１：１混合物に接触させた。１分後、接触溶液をメタノール中０．５ｍＭのギブス（Ｇｉｂｂｓ）試薬（１部のギブスに対して２部の重ソウ）と反応させ、そして５９４ｎｍでの色（濃度により黄〜青に変わる）を読んだ。
【００５０】
実施例２−非共有結合のインプリント重合体
この重合化は、エチレンジメチルアクリル酸（ＥＤＭＡ）を用いたメタクリル酸（ＭＡＡ）の重合化を伴った。プロポホルをインプリントした重合体を調製するのに用いた比は、プロポホル：ＭＡＡ：ＥＤＭＡ：開始剤ＡＢＣＨＣ
（ａ）１：４：３０：０．１７（ポロゲン（ヘキサン）中１．６５ｍｌ／ｇ）
（ｂ）１：４：２５：０．１２５（ヘキサン中２ｍｌ／ｌ）
【００５１】
ブランクの重合体をプロポホルを除いた他は、同様に調製している。
【００５２】
溶液を２４時間に渡り熱的に（６０−８０℃）重合した。
【００５３】
粉砕及びメタノール−ヘキサンによる抽出後、回分の結合試験を、重合体を溶液（メタノール中０．２Ｍ及び２Ｍのプロポホル）と接触させることにより行った。遠心後、上清を分析（ＨＰＬＣ、６０−４０　ＣＨ３ ＣＮ−Ｈ２ Ｏ）し、そして結合率を評価した。両方の重合体について我々は又対応するブランク（単量体の外全て）も行った。
【００５４】
吸着（結合）率は
（ａ）０．２では、インプリント重合体においては８７％、ブランクの重合体においては６６％
２では、インプリント重合体においては６４％、ブランクの重合体においては２８％
（ｂ）０．２では、インプリント重合体においては６７％、ブランクの重合体においては６７％
２では、インプリント重合体においては２６％、ブランクの重合体においては３１％
であった。
【００５５】
これらの結果で、高い非特異的な結合（即ちブランクの重合体による結合）を示された。
【００５６】
しかし、（ａ）のインプリント重合体はそのブランクの重合体よりもより高い結合率を示した。
【００５７】
実施例３
他のフェノールに対する試験
我々は実施例１の、共有結合によってインプリントした重合体及び実施例２の、非共有結合インプリントした重合体のｍ−クレゾールに対する試験をした。試験：
１．ｍ−クレゾール溶液のみで、
回分結合を既に述べたように行い、吸着は：
共有結合　−インプリント重合体及びブランク重合体において０；
非共有結合−インプリント重合体において０、インプリント重合体において７％；
２．プロポホル及びｍ−クレゾールの混合物で、
吸着の百分率は：
共有結合　−ブランク重合体（プロポホル９４％、６３％／ｍ−クレゾール）；インプリント重合体（プロポホル１００％及び７６％ｍ−クレゾール）
非共有結合−ブランク（プロポホル９１％−４７％／ｍ−クレゾール）；インプリント重合体（プロポホル９４％及びｍ−クレゾール４６％）を行った。
【００５８】
試験を粗く粉砕した重合体で行った。これは高い非特異的な結合につながるが、結果はインプリント重合体に対するプロポホルの好ましい結合を示す。
【００５９】
実施例４−粉砕の効果
（実施例１に従い）プロポホル用に作成した共有結合の重合体を清浄しそして抽出した。ブランク及び重合体を３０Ｈｚで１５分間に渡り粉砕した。これを最初の粉砕と考えた。
【００６０】
全ての回分結合試験を以下の同じ形態で行った。即ちメタノール中の０．２ｍＭのプロポホルの溶液と共に１５分間に渡り、２０ｍｇの重合体又はブランク（ブランクとは非インプリント重合体を意図している）を振とうし、次いで２０００ｒｐｍ で５分間遠心し、上清を除去しその後溶液中に残ったプロポホルの量について分析（ＨＰＬＣ）した。
【００６１】
このように粉砕及び清浄した重合体をプロポホルに対して試験した。そして我々の最初の特異的な結合率３６．４６％及び非特異的な結合率４１．２５の値を得た。
【００６２】
重合体は他の粉砕の回分（別の１５分、同じ周波数）で得られ、そして次の試験は特異的３６．７３％及び非特異的３５．８３％を示す。
【００６３】
同じ周波数による別の３０分の粉砕の後、それらを試験した。結果は特異的１７．６６％及び非特異的２．６２％であった。重合体に最後の回分の粉砕（１５分）を与えた。最後の回分の結合試験は１０．７７％の特異的なそして２．５７％の非特異的な結合率を示す。この時点で実験を停止した。その理由は、非特異的な結合はこれ以上減らず、そして特異的な結合が進むのはとても低いからである。
【００６４】
粒度が減少するにつれて非特異的及び特異的な結合は減少する（最終的な粒度は大部分が０．５−５ミクロンである）。しかし非特異的な結合が２−３％（実際はかなり０に近い）になる迄、非特異的なのは１８％のままであり、従ってとても正確な分離−計測の為の生物センサー中で働きうる。ｏ及びｍ−クレゾールに対する最終段階の粉砕は、プロポホルと構造においてとても似ている。そして、ｏ−クレゾールは０％の結合率、ｍ−クレゾールは２．９％の結合率を有する。これらの値はプロポホル生物センサーの結合に干渉しないだろう。
【００６５】
実施例５−時間、重合体の量による結合量の変化
図１は時間によるプロポホルの結合を示している。インプリント重合体（ポリ）の結合速度はコントロールの重合体（ブランク）と比べて最初の１５分において最大である。重合体を様々な時間に渡り同量の溶液と接触させ、結合量を所定の時間後評価した。実験は、実施例４に記載した結合実験に従った（全ての回分の結合実験は同じやり方に従う）。２０ｍｇの重合体を様々な時間に渡り（図１を参照のこと）２ｍＬのメタノール中０．２ｍＭのプロポホル溶液と共に振とうし、次いで、２５００ｒｐｍ で５分に渡る遠心により粒子をとり除いた後、ＨＰＬＣによって溶液中に残っているプロポホルを評価した。
【００６６】
図２は存在する重合体の量共に増加するプロポホルの結合率を示している。これを実施例２のインプリント重合体（ａ）、対応する非インプリント重合体（ブランク１非共有結合）並びに実施例１のインプリント重合体（ポリ２共有結合）及び対応する非インプリント重合体（ブランク２共有結合）に対する結合率に適用している。再度回分の結合の後の実験は、この時様々の量の重合体を伴った。
【００６７】
実施例６
重合の方法を実施例１のように行った。次いで既知の量の液体重合化混合物を０．５ミクロンのカットオフ値のＰＴＦＥ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｆｌｕｏｒｏｐｏｒｅ， ＦＨＵＰＯ４７００）上に置き、そして重合した（熱、又はＵＶ）。生じた重合体は特異的及び非特異的結合で顕著な差を示している。結果：
−インプリント重合体２４．１％
−非インプリント重合体０％
【００６８】
この種の膜は、急速且つ正確な結果を与えるだろう一度限りの「ジップイン（ｄｉｐ　ｉｎ）」解析の時、生物センサー中で用いることができうる。
【００６９】
膜上の重合体を、ＣＨ３ ＯＨ（１Ｍ）中のＮａＯＨでの１時間の清浄しかる後にＣＨ３ ＯＨ中での抽出（冷却抽出、ソックスヘレットではない）、そして（強く振とうしながら）水中で５分間の浸とうを伴う方法によって清浄されて良い。膜は高い疎水性を有し、そしてそれらは修飾された後でもこの特性を維持する。水中でそれらを浸とうすることによって、それらは溶媒の最後の残りをはね退けるだろうし、非常に素速く乾くであろう。
【００７０】
実施例７
図３には、本発明において記載したようなプローブの構成部品の概略図を示している。これらは、例えばプローブ中へ麻酔薬の採り込みをし、例えばオンライン観測による流速によるのが絶対ではないが、様々な形において観測できうる、吸入管（１８）、プローブ（１０）の本体（１１）が含まれ、例えば同心様に鋼、合金、プラスティック、ガラスのような公知の物質で構築されており、プローブ内の解析作用を試料及び／又は基質から分離することを目的とする選択的な膜（２４）を含む。プローブの本体内にはセンサーのプロポホルをインプリントした重合体により囲まれた、接触した又は方向性がある構成部品（１２，１６，２５）がある。
【００７１】
内部プローブは、実際の分離膜の前の短い距離迄仕切りによって２つの室に分けられている。プローブは又、吸入口に関して記載したような観測の機会を有する排出口も構成している。この排出口は又実際の試料の集収の為の望まれるべき機会を提案する。プローブ内のセンサーの配置は、データの検層又はある離れた受信器への無線−電気伝達の措置を伴う増幅、表示及び定量装置に接続できうる。
【００７２】
実施例８
図３ａ及び図３ｂに描いたプローブの１つは受容器の領域を含んで成る応答部位を含んで成る。これらは、支持基材（３２）に結合しておりプロポホルに特異的な本発明のインプリント重合体（３０）を含んで成る。構成部品は本体（１１）中に収容されており、試料による流体を応答部位（２６）にアクセス可能にする。応答部位（２６）は本体（１１）の頭部に収容されて良く、一方で標識した標準品の評価に関連した大部分の装備は、その大きさを減らすのに頭部以外に配置できうる。
【００７３】
多くの型において、受容器はプローブの基底部位周辺に配置されたインプリント重合体を含んで成る。これらは、測定電極（１２）上での重合体の形成に関連しうる。電極は、非常に薄い層もしくは単層として、インプリント重合体で被覆した白金メッシュ、金、ステンレス鋼、炭素、合金もしくは光ファイバーであって良い。重合体を付着する他の方法を無視してはいない。
【００７４】
光ファイバー（２５）は光源から励磁する電磁放射線を輸送し、そして又適切な電子的循環の為に、応答部位の表層で、導入された標準品の標識から発された蛍光光をも輸送する。
【００７５】
図３ｂにおいて、試料中の注目の麻酔薬の使用（３０）において、プローブの膜（３４）を介して測定部位に選択的に移動しうるようだ。一度そこで（３０）はプローブ中に固定化された本発明の重合体への結合があって良い。採り込まれたリガンド（３６）は同じ一組の受容器（２８）に競合して結合する。次いで、この採り込まれたリガンド（３６）は、結合したリガンド（３６）の数に比例してエネルギーを生産するに至る。このエネルギーが観測され、そして結合（３６）それゆえに結合（３０）したものの相対的な測定を得るのに測定される。
【００７６】
この相対的な測定は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ校正における（３６）及び（３０）の標準品又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ内部標準試験を用いることでプローブの性能を基に校正されている。
【００７７】
ある使用方法によると、一般的に１００％の読込みを得るのに、純粋な印がついた試料中でプローブは校正されるべきだ。公知の標準品は、標識した又は標識していない競合して結合する物質の公知の混合物を含んで成り、校正又は後の比較及び分析の為の様々なデータの点を得るのに用いられて良い。通常、校正は、使用前後にｉｎ　ｖｉｔｒｏで行うのだが、内部標準を用いるｉｎ　ｖｉｖｏ校正も又可能である。洗浄後プローブを試料中に置きそして平衡にする。標準の標識した物質を、観測される試料又は系に入れ、受容器部位に分配及び競合して結合させる。平衡の後センサー部分からの有用なデータは収集及び解析されて良い。
【００７８】
単一結合抗体による多重標識を用いることにより、とても微量な濃度の麻酔薬を測定する為のプローブの測定の可能性を高めることが可能である。
【００７９】
実施例９
この実施例中で用いる為の膜を実施例６におけるように調製した。重合化混合物（プロポホル４（ビニルフェニル）カーボネート（単量体）及びエチレングリコールメタクリレート（１：１のモル比）、５％の開始剤（ＡＢＣＨＣ）及びトルエン（０．５ｍＬ／ｇ単量体＋ＥＤＴＡ）からなる）を窒素で１分間に渡り浄化し、次いで２００μｌを膜上に適用した。
【００８０】
このようにして修飾した膜を７０℃で２４時間に渡り重合させた。ブランクを同じ製法に従い作成したが、単量体を加えなかった。膜をそのプロポホルを結合する能力について試験した。既知の濃度プロポホル（０−１０ｐｐｍ 、段階的に０．５ｐｐｍ ずつ増加）を血液に注射し、２分／バイアルでボルテックス（１０００ｒｐｍ ）に掛け、そして（タンパク質へプロポホルが結合すること及び試験試料におけるように働くことを確認する為に）定着させた。血液の試料（４００μｌ）を１．６ｍＬのメタノールと混合した。混合物を全ての血液を沈殿させるのに１０秒間ボルテックス（１０００ｒｐｍ ）に掛けた。メタノールと沈殿した血液の混合物を０．２ミクロンのフィルターを通過させた。１ｍＬのろ液をインプリント膜と接触させ、そして２分間に渡る接解をさせた。膜の入れられている溶液を、結合しなかったプロポホルを評価するのにＨＰＬＣにより試験をした。
【００８１】
膜を、未結合のプロポホル及びそれらをとり囲むメタノールを除く為に、水中で清浄（注いだだけ）した。
【００８２】
密封バイアル中でプロポホルを膜から、４００μｌの混合物（重炭酸緩衝液）：メタノール１：１（重炭酸緩衝液ｐＨ９．６、１０ｍＭ）で置換しそして１分間音波（超音波洗浄槽）処理して抽出した。
【００８３】
溶液を、ＨＰＬＣ又は比色試験（ギブス試薬との反応、そして５９２ｎｍでの多重色の読込み）により、プロポホルの濃度に関して評価した。
【００８４】
ギブス試験：メタノール中４００μｌの抽出物＋２００μｌ　０．５ｍＭのギブスの試薬、色は即座に形成され、放出されたプロポホルの濃度により黄〜青に変わる。
【００８５】
測定したプロポホル濃度は元の血液のプロポホルの濃度と強く一致する（図４を参照のこと）。
【００８６】
この試験用に用いた膜は更に３０分間に渡りメタノールと接触させ（振とう）そして実施例６中に記載したように溶媒をはじく為に強く振とうしながら５分間に渡り水中に浸してそして新たな試験用に用いることができうる。記載した系は、感度の損失がなく５０００回迄同じ膜を使用できうる。
【００８７】
本発明は様々な改変及び変化を伴い行うことができ、そして上記の例は説明のためにのみのものであることに気づくべきである。例えば、本発明は他のフェノールを用いて行われて良く、そして用いた重合体は、様々な単量体及び／もしくは割合及び／もしくは架橋剤を用いて調製されて良い。
【図面の簡単な説明】
【図１】インプリント重合体及びコントロールの重合体に対するプロポホルの結合の時間経過を示している。
【図２】プロポホルの量に対してプロットした吸着の百分率を示している。
【図３】本発明のプローブの概略図を示している。
【図４】血中のプロポホルの濃度と本発明を用いて決定したプロポホルの濃度との関係のグラフを示している。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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