(57)【要約】高度に有効かつ安全なＨＳＶ由来の混成殺腫瘍ベクターを、個体中の充実性腫瘍の治療に提供する。該ベクターは、それぞれ細胞破壊能力をもつ誘導可能な毒性遺伝子を担持するアンプリコン型反復単位の複数の反復をもつ欠損ウイルスゲノム、および第二の成分としての非分裂細胞中で複製が不能であるＨＳＶ突然変異体ヘルパーウイルスである、２個の主成分を含んで成る。該ベクターは、脳の悪性病変ならびに肺、膵、腎、結腸、胃および他の型の癌を包含する多様な種類の充実性腫瘍の治療に使用してよい。提供されるベクターはまた、付加的な治療と組合せでの個体への投与にも適する。
2004529158.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の、最低1種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来のアプリコン欠損ウイルスゲノム、およびＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーウイルス、ならびに製薬学的に許容できる担体、賦形剤もしくは希釈剤を含んで成る、個体における充実性腫瘍の治療での使用のための製薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＨＳＶ由来のヘルパーベクターが、ビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ）遺伝子中に１個の突然変異を含んで成る、請求項１記載の製薬学的組成物。
【請求項３】
前記ヘルパーベクターが、リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）遺伝子中に１個の突然変異を含んで成る、請求項１もしくは２記載の製薬学的組成物。
【請求項４】
前記細胞傷害性外来遺伝子が、Ｐ５３、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＩＡＬ）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）から選択される、上の請求項のいずれか記載の製薬学的組成物。
【請求項５】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍である、上の請求項のいずれか記載の製薬学的組成物。
【請求項６】
個体における充実性腫瘍の治療のための製薬学的組成物の製造のための、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来のアンプリコン欠損ウイルスゲノムおよびＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーウイルスの使用。
【請求項７】
前記突然変異体ヘルパーウイルスがｖｈｓ遺伝子中に１個の突然変異を含んで成る、請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記ヘルパーベクターがＲＲ遺伝子中に１個の突然変異を含んで成る、請求項６もしくは７記載の使用。
【請求項９】
前記細胞傷害性外来遺伝子が、Ｐ５３、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＩＡＬ）およびチミジンキナーゼ（ＴＫ）から選択される、請求項６−８のいずれか記載の使用。
【請求項１０】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍である、請求項６−９のいずれか記載の使用。
【請求項１１】
有効量の、最低１種の細胞傷害性外来遺伝子を含んで成るＨＳＶ由来のアンプリコン欠損ウイルスゲノム、およびＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーウイルスの組合せ剤を含んで成る、ＨＳＶ由来ウイルスベクターの充実臓器の腫瘍を有する個体への投与を含んで成る、前記個体の治療方法。
【請求項１２】
前記突然変異体ヘルパーベクターがｖｈｓ遺伝子中に１個の突然変異を含んで成る、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘルパーベクターがＲＲ遺伝子中に１個の突然変異を含んで成る、請求項１１もしくは１２記載の方法。
【請求項１４】
ＨＳＶ由来アプリコン中の細胞傷害性外来遺伝子が、Ｐ５３、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＩＡＬ）もしくはチミジンキナーゼ（ＴＫ）である、請求項１１−１３のいずれか記載の方法。
【請求項１５】
前記充実性腫瘍が脳腫瘍である、請求項１１−１４のいずれか記載の方法。
【請求項１６】
有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る第一の製薬学的組成物、および、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来アプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を包含する２種の製薬学的組成物の組合せ剤であって、該組合せ剤は充実性腫瘍の治療のために個体に投与するために意図され、その治療において前記第二の組成物が前記第一の製薬学的組成物の投与の前、間もしくは後に投与される、組合せ剤。
【請求項１７】
前記第一および前記第二の製薬学的組成物を包含する包装の形態にある、請求項１６記載の２種の製薬学的組成物の組合せ剤。
【請求項１８】
前記第二の製薬学的組成物中の前記ウイルス由来アンプリコンが、ヒトヘルペス６（ＨＨＶ−６）もしくはヒトヘルペス７（ＨＨＶ−７）由来アンプリコンである、請求項１６もしくは１７記載の組合せ剤。
【請求項１９】
有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る、有効量の第一の製薬学的組成物を個体に投与すること、および前、間もしくはその後の時間Ｔに、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来アプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を前記個体に投与すること、を含んで成る、前記個体における充実性腫瘍の治療方法。
【請求項２０】
前記第二の製薬学的組成物中の前記ウイルス由来アプリコンが、ＨＨＶ−６もしくはＨＨＶ−７由来アンプリコンである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
個体における充実性腫瘍の治療のための、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る第一の製薬学的組成物の使用であって、その治療は、前記第一の組成物を個体に投与すること、および、前、間もしくはその後の時間Ｔに、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来アンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を前記個体に投与すること、を包含する使用。
【請求項２２】
前記第二の製薬学的組成物中の前記ウイルス由来アンプリコンがＨＨＶ−６もしくはＨＨＶ−７由来アンプリコンである、請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
使用のための指示書と一緒に、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る第一の製薬学的組成物、および、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来アンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を含んで成るキット。
【請求項２４】
前記第二の製薬学的組成物中の前記ウイルス由来アンプリコンがＨＨＶ−６もしくはＨＨＶ−７由来アンプリコンである、請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
前記組成物が付加的な治療を受領する個体に投与される、請求項１−５のいずれか記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が付加的な治療を受領する個体に投与される、請求項１１−１５のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）由来ベクター、および悪性疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
参考文献の一覧
以下は、本願明細書にて引用される従来技術の刊行物の一覧である。
【０００２】
【表１】
2004529158.tif 000003
【０００３】
上記の技術の本明細書により認容は、本技術が添付されたクレームで特定される本発明の特許性に何らかの様式で関連することの表示として解釈されるべきでない。
【背景技術】
【０００４】
ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２（顔および性器系統のＨＳＶ）に感染した細胞は、典型的に、重大なウイルス複製前の細胞を破壊するよう運命づけられた自殺遺伝子を発現するよう誘導される。この影響を克服しかつウイルス複製のための細胞を確保するために、ウイルスは、強力なｍＲＮＡ不安定化／分解活性をもつＨＳＶ−１ビリオンの５８ｋＤａの構造的成分、ビリオン宿主シャットオフ（ｖｉｒｉｏｎ  ｈｏｓｔ  ｓｈｕｔｏｆｆ）（ｖｈｓ）（ＵＬ４１）遺伝子を発現することにより、即座の反撃に着手する。ｖｈｓタンパク質は、細胞中へのウイルスの進入の間に、ウイルスの脱殻に際して細胞の細胞質中に出される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。最近の実験に基づけば、ｖｈｓタンパク質は、ハウスキーピング遺伝子およびウイルス後感染に誘導されるストレス関連自殺遺伝子を包含する、感染した細胞のｍＲＮＡの即座の不活性化／分解により細胞の自殺機能を無効にし、また、抗アポトーシス遺伝子をコードするかもしれないと思われる。ｍＲＮＡ分解活性の結果、宿主細胞のタンパク質合成が止められ、自殺タンパク質が産生されず、そして細胞はある時間の期間の間生き延びて、標的細胞の死亡の前にウイルス複製を可能にする。
【０００５】
ｖｈｓ遺伝子中に１個の突然変異を担持するＨＳＶ−１突然変異体が開発された。野性型ＨＳＶ−１の感染は宿主ｍＲＮＡの分解を伴う一方、ビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ）機能に欠陥のあるＨＳＶ突然変異体（「ｖｈｓ１突然変異体」）は継続される細胞タンパク質合成を可能にする。細胞へのその感染が複製しかつ潜伏から再活性化するその能力において減弱されることが示された、ＵＬ４１ＮＨＢと命名される１個のこうした突然変異体が開発された（特許文献１）。
【０００６】
ヘルパーＨＳＶとともにプロモーターの制御下に最低１種の挿入された遺伝子を含んで成るＨＳＶ由来アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）が開示されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。こうした系の一例において、関連するヘルパーウイルスは正常宿主細胞中で制限された複製能力のものである（特許文献２）。別の例において、組換えＨＳＶベクターは選択された細胞型に標的を定めかつそれを感染させるよう改変されている（特許文献３）。
【０００７】
脳腫瘍の発生率は１００，０００人あたり５〜１４．１であると推定される。神経膠腫は原発性腫瘍の４０〜６０％に上り、その７５％は悪性である。神経膠種はヒト脳で生じる最も普遍的な原発性腫瘍である。悪性神経膠腫は成人の原発性脳腫瘍の３０％に上り、そして等級により２つの範疇すなわち未分化星状細胞腫および膠芽腫に分割される。米国における悪性神経膠種の推定される発生率は１００，０００人あたり１４．７であり、年間およそ１０，０００〜１５，０００の新たな症例を表す。改良された攻撃的外科治療、放射線治療および化学療法にもかかわらず、悪性神経膠種はほぼ常に致死的であり；膠芽腫（大部分の悪性神経膠種）の全体の５年生存率は５．５％未満であり、そして生存の中央値はおよそ５２週間である。これらの数字は過去３０年にわたって事実上変えられないままである。全身腫瘍の治療は、中枢神経系の転移の発生のためしばしば失敗する。進行した段階は治癒可能性を示さない。大部分の神経膠腫は、いかなる完全に有効な治療も伴わない乏しい予後を有する。
【０００８】
最近、ＨＳＶウイルスベクターがヒトでの臨床使用におけるそれらの有効性および安全性について評価された。一研究において、３４．５タンパク質（神経病理学の主要な一決定子）をコードする遺伝子に欠陥のあるＨＳＶ突然変異体ウイルスを含んで成るＨＳＶ由来ベクターを、再発性神経膠腫を伴う患者で試験した。この突然変異は、非分裂細胞中での複製に必要とされる３４．５遺伝子座およびＩＣＰ６（リボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ））中の双方の枯渇を有する「Ｇ２０７」と命名される多突然変異された条件付きで複製するＨＳＶベクターである（非特許文献７）。Ｇ２０７突然変異体は現在、再発性膠芽腫についてフェーズＩ臨床試験で試験されており、ここで、それが非毒性でありかつ重大な有害事象を伴わないことが示されたが、しかしその有効性は未だ示されていない。加えて、突然変異されたベクター中への抗腫瘍形成遺伝子（とりわけサイトカイン遺伝子）の挿入が提案されている（非特許文献８）。
【０００９】
別の研究において、ＨＳＶタイプ１のチミジンキナーゼおよびガンシクロビル遺伝子治療が、以前に未治療の多形膠芽腫を伴う成人において、外科的切除および放射線に対する補助療法として評価された（非特許文献９）。フェーズＩＩＩ試験において、未治療の多形膠芽腫を伴う患者は、標準的な外科および放射線治療、もしくは標準的治療および外科手術の間の補助遺伝子治療のいずれかを受領した。該治療の臨床的安全性が決定され、かつ、双方の群で比較に値したが、しかし、遺伝子治療と対照患者との間で有意の臨床的差異は存在しなかった。
【００１０】
それらの安全性をなお維持する、ヒト腫瘍の治療に対する高い有効性を有するＨＳＶ由来のウイルス殺腫瘍（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）ベクターが望ましい。
【特許文献１】
Ｌｅｉｂ，Ｄ．，１９９７
【特許文献２】
Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ  Ｓ．ら，１９９９
【特許文献３】
Ｓｐｅａｒ，Ｍ．Ａ．２０００
【非特許文献１】
ＲｅａｄとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８３
【非特許文献２】
Ｋｗｏｎｇら  １９８８
【非特許文献３】
ＫｗｏｎｇとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８７
【非特許文献４】
ＳｐａｅｔｅとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８２
【非特許文献５】
Ｆｒｅｎｋｅｌら，１９９４
【非特許文献６】
Ｖｌａｚｎｙ，Ｄ．Ａ．ら，１９８１
【非特許文献７】
Ｒａｂｋｉｎ，Ｓら  ２０００
【非特許文献８】
ｍａｒｋｅｒｔ，Ｊ，２００１
【非特許文献９】
Ｒａｎｏｖ，Ｎ．Ｇ．，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
悪性疾患の治療のための安全かつ高度に有効なＨＳＶ由来ベクターを提供するために、標的腫瘍細胞を排除することの機会を高め、それが分裂しない非悪性細胞中で複製しないよう設計されるためになお安全のままであることができる、最低１種の二元的なウイルス武器（ｄｕａｌ  ｖｉｒａｌ  ｗｅａｐｏｎｒｙ）をこうしたベクター中で提供することが望ましい。
【００１２】
本発明により、こうした配合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）ベクターが提供される。本発明のＨＳＶ由来ベクターは２つの主成分、すなわち、それぞれが細胞破壊能力をもつ誘導可能な毒性遺伝子を担持する、アンプリコン型の反復単位（ｒｅｐｅａｔ  ｕｎｉｔ）の複数の反復（ｒｅｉｔｅｒａｔｉｏｎ）をもつ欠損ウイルスゲノムである一成分（「アンプリコン」）、および、第二の成分、非分裂細胞中での複製が不能であるか、もしくは少なくともこうした細胞中で有意に低い複製能力を有するＨＳＶ突然変異体ヘルパーウイルス（「ヘルパーウイルス」）を含んで成る。本発明のこうした混成ベクターは、本明細書でときに「混成殺腫瘍ベクター」と称することができる。
【００１３】
好ましくは、ヘルパーウイルスはビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ−ＵＬ４１）遺伝子中で突然変異される。より好ましくは、ヘルパーウイルスは、ｖｈｓ遺伝子ならびにリボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）遺伝子双方中で二重突然変異される。
【００１４】
こうしたベクターの二元的なウイルスアーム（ｄｕａｌ  ｖｉｒａｌ  ａｒｍ）は、その安全性を維持しつつ該ベクターの有効性を実質的に高める。短い時間の期間に多コピーで発現されるアンプリコン上の細胞傷害性外来遺伝子の効果的発現、ならびに、（見かけ上アポトーシスを誘導することにより）細胞を細胞死に駆動する突然変異されたヘルパーの能力の双方により標的の悪性細胞を攻撃する、本発明のベクターの二元的な成分は、その安全性を維持しつつ該ベクターの有効性を実質的に高める。「高められた有効性」という用語は、該ベクターの１成分のみ（すなわち毒性遺伝子を含んで成るアンプリコンもしくはヘルパーベクター）の有効性より高い有効性を意味すると理解されるべきである。
【００１５】
アンプリコンおよびＨＳＶの突然変異体の組合せを含んで成るこうした混成殺腫瘍ベクターは記述されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一態様によれば、有効量の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来アンプリコン欠損ウイルスゲノム、およびＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーウイルス、ならびに製薬学的に許容できる担体、賦形剤もしくは希釈剤を含んで成る、個体における充実性腫瘍の治療での使用のための製薬学的組成物が提供される。
【００１７】
「有効量」という用語は、個体への投与に際して所望の治療効果を達成することができるＨＳＶ由来のウイルス成分のそれぞれの量を指す。アンプリコンに関して、有効量は、短い時間の期間に外来毒性遺伝子の所望の発現量をもたらすようであることができる。ヘルパー成分の有効量は、（遺伝子発現に必要な機能を提供することにより）アンプリコンの効果を高めるような、および、好ましくは、ヘルパーウイルスを細胞に対し細胞傷害性にする量であることができる。ヘルパーウイルスがｖｈｓ突然変異体である場合、有効量は標的細胞の死亡に至るようであることができる。
【００１８】
該混成ベクターのアンプリコン成分において、欠損ゲノムは外来毒性遺伝子を担持するよう工作される。「外来毒性遺伝子」という用語は、標的細胞により天然に発現されずかつ制御された様式で細胞を破壊するよう設計される遺伝子に関する。いかなるこうした毒性遺伝子も本発明により使用してよく、そして、該遺伝子は、治療されるべき腫瘍の種類ならびに付加的な因子に基づき当業者により選ばれてよい。アンプリコン中のこうした毒性遺伝子の一例はチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子であり、これは細胞中で発現される場合にそれらをガンシクロビルに対して感受性にして、宿主ＤＮＡの複製の完全な阻害および分裂細胞の破壊を生じさせる。アンプリコン中に配置されるべき他の型の毒性外来遺伝子は、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）およびＰ５３である。こうした毒性遺伝子はＴｅｔ  Ｏｎ系の制御下に置くことができ、テトラサイクリンで治療される場合にのみ毒性遺伝子の発現を可能にする。他の毒性遺伝子を、他の適するプロモーターもしくは誘導物質の制御下で発現されるように構築してよい。本発明のアンプリコンはまた、１種もしくはそれ以上のプロモーターの制御下の多数の毒性遺伝子を含んでもよい。こうした毒性遺伝子を、所望の細胞もしくは組織中でのみ発現される細胞もしくは組織特異的プロモーター（例えば、前立腺細胞のみでの前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の発現を制御するプロモーター）の制御下に構築してもまたよい。
【００１９】
本発明はまた、個体における充実性腫瘍の治療のための製薬学的組成物の製造のための、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来のアンプリコン欠損ウイルスゲノムおよびＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーウイルスの使用も提供する。
【００２０】
その局面の別のものにより、本発明は、有効量の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来のアンプリコン欠損ウイルスゲノム、およびＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーウイルスの組合せ剤を含んで成るＨＳＶ由来ウイルスベクターの投与を含んで成る、充実臓器の腫瘍を有する個体の治療方法を提供する。好ましくは、ヘルパーウイルスはｖｈｓ遺伝子中に１個の突然変異を含んで成る。最も好ましくは、突然変異体ヘルパーウイルスはＲＲ遺伝子中にもまた１個の突然変異を担持する。
【００２１】
本発明の「治療」という用語は、充実性腫瘍に罹っている患者の病状のいかなる軽減も意味すると理解されるべきである。こうした軽減は、腫瘍の大きさの低下、腫瘍の成長速度の低下、腫瘍関連の症状の軽減、転移の予防などであるかもしれない。
【００２２】
好ましい一態様により、本発明のヘルパーウイルスは、突然変異されたビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ）遺伝子を担持するよう構築され、こうしたベクターはときに「ｖｈｓ突然変異体」と称される。ｖｈｓ突然変異体ウイルスの細胞傷害性効果は、感染した細胞における顕著な細胞のアポトーシスの誘導に関連することが示された。加えて、突然変異されたｖｈｓ遺伝子により、該混成ベクターのアンプリコン成分により担持される毒性遺伝子の転写されたｍＲＮＡは、（突然変異されないｖｈｓ遺伝子の場合でのとおり）即座に分解かつ不活性化されず、従って、毒性遺伝子の発現およびｖｈｓ成分のアポトーシス効果の増強を可能にし、全体として該混成ベクターの高められた有効性をもたらす。
【００２３】
本発明のヘルパーウイルスはＲＲ遺伝子中にもまた１個の突然変異を含んでよい。ＲＲ酵素は休止中の非分裂細胞中でのウイルス複製に不可欠である一方、ウイルスは成長する細胞中で活性である細胞のＲＲを使用することができる。ＲＲ突然変異が、該酵素の小さなＲＲサブユニット（ＩＬ３９遺伝子）中に導入された。これはそれを不活性にする。ＲＲ突然変異の使用は、いかなる複製するウイルスも隣接する正常細胞に広がらせないことにより、該ベクターを遺伝子治療における使用により安全にさせる。該ヘルパーベクターは、ＲＲ突然変異を単独でもしくは突然変異体ｖｈｓと一緒に含有してよい。とは言え、（下の図３に示されるとおり）、ニューロン細胞中でのｖｈｓ突然変異体の成長は該ベクターをより安全にすることに制限され、ｖｈｓヘルパーの機械装置中へのＲＲ突然変異体の導入は、遺伝子治療における潜在的使用にそれをなおより安全にすることができる。
【００２４】
本発明の混成ベクターの２成分は、細胞をヘルパーウイルスに感染させること、および同一の細胞をアンプリコンプラスミドでトランスフェクトすることによるか、もしくは、ヘルパーウイルスＤＮＡおよびアンプリコンプラスミドでの細胞の二重トランスフェクション、次いで、その後個体に投与することができる双方の成分を含んで成る細胞のストックを生成させるためのウイルスおよびアンプリコンの混合物の反復される連続的繁殖によるかのいずれかで得られるかもしれない。あるいは、アンプリコンを、最初に、Ｐａｃ−１およびＰａｃ−２シグナルを欠きそして従ってパッケージングされることが可能でない非感染性のｖｈｓ突然変異されたＨＳＶヘルパーウイルスを含んで成る細胞系の細胞中で成長させてもよい。この様式で、感染性のヘルパーウイルスなしにエクスビボで大量のアンプリコンを調製することが可能であり、ｖｈｓ突然変異体ウイルスのビリオン中にパッケージングされたアンプリコンをもたらす。こうしたパッケージングされたアンプリコンは感染性である。すなわち、それらは細胞中に進入しかつ外来細胞傷害性遺伝子ならびにｖｈｓ−１突然変異体遺伝子双方を導入することができる。こうしたアンプリコンを、ヘルパーウイルスを伴わずに個体に投与してよい。すなわち、本発明のベクターの双方の成分が、パッケージングされたアンプリコン中に存在することができる。
【００２５】
本発明のＨＳＶ由来の混成殺腫瘍ベクターは、上皮、線維芽細胞およびニューロン細胞を包含する広範な宿主範囲を有し、そして従って、例えば、神経芽腫および多形膠芽腫を包含する脳の悪性病変、肺、膵、腎、結腸および胃癌のような多様な充実臓器の腫瘍の治療に適する。
【００２６】
典型的には、本発明により、該ベクターは腫瘍中に直接局所注入により個体に投与することができる。しかしながら、ときに、ベクターの成分を、全身で、静脈内に（ｉ．ｖ．）、皮下に（ｓ．ｃ．）、筋肉内に（ｉ．ｍ．）、腹腔内に（ｉ．ｐ．）もしくは経口でを包含する他の投与経路により投与してもまたよい。こうした成分は、当業者により選ばれる特定の投与経路に適する当該技術分野で既知の製剤のいずれかで製造することができる。
【００２７】
本発明のＨＳＶ由来の混成ベクターは、典型的には、以下の特徴を有することができる：（ＳｐａｅｔｅとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８２，Ｆｒｅｎｋｅｌら，１９９４）
（ｉ）ＨＳＶアンプリコンは、線維芽細胞、上皮およびニューロン細胞に標的を定めることができる用途の広いベクターである。
（ｉｉ）該系は、ヘルパーウイルス、およびアンプリコンＤＮＡ配列の複数の反復を含有する構築された欠損ゲノムよりなる。
（ｉｉｉ）２個のｃｉｓに作用するシグナル、すなわちＤＮＡ複製起点および切断パッケージングシグナルが、ヘルパーウイルスの存在下でのアンプリコンの繁殖に必要とされる。
【００２８】
該アンプリコンは、ＯｒｉＳもしくはＯｒｉＬいずれかの複製起点を使用することができる。
（ｉｖ）該欠損ウイルスゲノムは、クローン化されたトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｇｅ）配列を包含するアンプリコン配列の複数の頭から尾の（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｔａｉｌ）反復を伴う「循環（ｅｎｄｌｅｓｓ）」コンカテマーＤＮＡ分子を生じる回転する環の機構（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）により複製する。
（ｖ）該ヘルパーウイルスは、ｔｒａｎｓに、複製酵素（例えばウイルスのＤＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ、プライマーゼ、リガーゼおよびＤＮＡ結合タンパク質）を包含するＤＮＡ複製およびパッケージングの機械装置、ならびにＨＳＶビリオンのタンパク質および糖タンパク質を包含するパッケージング機能を供給する。
（ｖｉ）長い複製されたＤＮＡコンカテマーは、パッケージング過程の間に切断される。ＨＳＶにおいて、切断／パッケージングシグナル「ｐａｃ−１」および「ｐａｃ−２」が配列中に存在する。
（ｖｉｉ）切断されたＤＮＡ分子は、大きさが単一から複数の反復単位までの範囲にわたる（それらの全体の大きさが個々のアンプリコンの大きさから無傷のＨＳＶ−１ゲノム（１５２ｋｂ）までに対応する）。切断／パッケージング過程の詳細を決定するために、われわれは、異なる大きさのアンプリコンを受領した細胞中に存在するウイルスＤＮＡ分子をパルスフィールド電気泳動により分析した。これらの実験の結果は、切断／パッケージングがｈｅａｄｆｕｌの拘束もまた必要としたことを示し、パッケージングされた分子の大多数はそれらの大きさが１３６−１５０ｋｂの範囲のおおよそゲノム長のＤＮＡにわたった。切断は、ウイルスゲノムがパッケージングの過程で構造的ビリオンに「供給」される際に起こる。
（ｖｉｉｉ）切断の正確な位置、およびその結果のパッケージングは、全部のヘルペスウイルス中で良好に保存されるｐａｃ−１およびｐａｃ−２シグナルにより決定される（Ｒｏｍｉら、１９９９）。切断はｐａｃ−１シグナルから４０〜４４ｂｐ、およびｐａｃ−２シグナルから３５〜３５ｂｐ離れて起こることが示されている。
（ｉｘ）ｐａｃ−１およびｐａｃ−２要素はヘルパーウイルスのパッケージングにもまた必要とされる。ＨＳＶ−１欠損ゲノムの反復単位はそれらの大きさが１７ｋｂに達する可能性がある。より大きな大きさのウイルスアンプリコンは、反復単位の大きさが１７ｋｂに達するまで、ＤＮＡ複製の過程で無作為に欠失される（ＫｗｏｎｇとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８５）。１７ｋｂより小さい大きさの反復を含有する欠損ウイルスゲノムは、５０回以上の連続継代の間、ウイルスストック中で安定繁殖することができる。
【００２９】
ＨＳＶ由来のアンプリコンはまた、該ベクターの検出を可能にするマーカー遺伝子も担持してよい。こうした遺伝子は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子のような既知のマーカー遺伝子のいずれであってもよい。
【００３０】
本発明により、２種の上述された成分を含んで成る混成殺腫瘍ＨＳＶ由来ベクターを、付加的な治療もしくは成分と組合せで個体に投与してよい。こうした一成分は、例えば、治療される個体の免疫活性を高めるペプチドをコードする遺伝子を含んで成る付加的なウイルスベクターであるかもしれない。こうしたベクターの一例は、「免疫原性」遺伝子を含有するヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）もしくはＨＨＶ−７由来のアンプリコン（Ｒｏｍｉら、１９９９）のようなリンパ球向性細胞を感染させることが可能なものである。免疫原性遺伝子は、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０もしくはインターフェロンのようなインターロイキンをコードしかつ投与に際して細胞中のこうしたペプチドの発現を高める遺伝子であるかもしれない。「免疫原性」ベクターは、ＨＳＶ由来ベクターとの多様な組合せで投与してよい。付加的な成分は、上述された投与経路のいずれかにより、かつ、混成殺腫瘍ＨＳＶ由来ベクターの投与の前、間もしくは後の多様な時点で個体に投与してよい。
【００３１】
従って、本発明はさらに、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る第一の製薬学的組成物、および、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来のアンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を包含する、２種の製薬学的組成物の組合せ剤を提供し、該組合せ剤は充実性腫瘍の治療のために個体に投与することを意図しており、この治療において、前記第二の組成物は時間Ｔに投与され、前記時間Ｔは前記第一の製薬学的組成物の投与の前、間もしくは後である。
【００３２】
上の組合せ剤は、前記第一および前記第二の製薬学的組成物を包含する包装の形態であってよい。
【００３３】
本発明は、さらに、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る、有効量の第一の製薬学的組成物を前記個体に投与すること、および、前、間もしくはその後の時間Ｔに、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来アンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を前記個体に投与することを含んで成る、個体における充実性腫瘍の治療方法を提供する。
【００３４】
本発明は、さらに、個体における充実性腫瘍の治療のための、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る第一の製薬学的組成物の使用を提供し、この治療は、前記第一の組成物を個体に投与すること、および前、間もしくはその後の時間Ｔに、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来のアンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を前記個体に投与することを包含する。
【００３５】
なおさらに、本発明は、使用のための指示書（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）と一緒に、有効量の、ＨＳＶ由来の突然変異体ヘルパーベクターと一緒の、最低１種の毒性外来遺伝子を担持するＨＳＶ由来の欠損ウイルスアンプリコンゲノムを含んで成る第一の製薬学的組成物、および、有効量の、治療される個体の免疫系を高めることが可能なペプチドをコードする遺伝子を担持するウイルス由来のアンプリコンを含んで成る第二の製薬学的組成物を含んで成るキットを提供する。
【００３６】
さらに、治療される個体に投与される付加的な治療は、例えば免疫応答のレベルを高めることが意図される治療（例えばインターフェロン）、または放射線もしくは化学療法のような腫瘍細胞の治療およびターゲッティングのような、充実性腫瘍を有する個体に典型的に投与されるいずれの他の治療であってもよい。
【００３７】
以下において、本発明は以下の制限しない実施例に関して例示されることができる。
【００３８】
実施例
実施例１
材料および方法
細胞培養物：−小脳顆粒ニューロン（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｎｅｕｒｏｎ）について高度に濃縮された初代培養物を、８日齢のＢＡＬＢ−Ｃマウスから調製した。培養物はマウス脳から作成した。細胞をトリプシン処理し、そして標準培地（１ｍｇ／ｍｌブドウ糖を補充されたイーグル基礎培地、１０％ウシ胎児血清、２５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび２５０ｎｇ／ｍｌアムホテリシンＢ）中のポリ−Ｌ−リシンで被覆された皿上に置いた。シトシン−β−アラビノフラモシド［Ｃｙｔｏｓｉｎｅ−β−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｍｏｓｉｄｅ：（Ａｒａ−Ｃ）］（１０μＭ）を、プレーティングの１８〜２２時間後に培地に添加して、非ニューロン細胞の複製を予防した。
ウイルス：−ＨＳＶ−１（ＫＯＳ）が野性型ウイルスとしてはたらいた。ビリオン関連宿主シャットオフ（ｖｉｒｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｏｓｔ  ｓｈｕｔｏｆｆ）突然変異体を、一般的ＢｕｄＲ突然変異誘発、および、これが感染性ビリオン内で細胞中にもたらされるビリオン機能であることを再保証するためのアクチノマイシンＤの存在下で宿主タンパク質合成を止めなかった突然変異体の選択により、−１（ＫＯＳ）からわれわれの研究室で生じさせた（ＲｅａｄとＦｒｅｎｋｅｌ，１９８３）。ウイルスストックを、０．０１ｐｆｕ／細胞の入力（ｉｎｐｕｔ）感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）でＶｅｒｏ細胞を使用して制限継代を用いて作成した。
小脳顆粒細胞のＨＳＶ感染：−顆粒ニューロンを、ニューロンをプレーティングした後に４日感染させた。生存可能な細胞の数を、トリパンブルー排除アッセイを使用する各実験で測定した。ニューロンを馴化培地で２回洗浄してＡｒａ−Ｃを除去し、そしてその後、本文中に述べられたとおり適切なウイルスのｍ．ｏ．ｉ．に曝露させた。感染は１％胎児血清を含む１９９Ｖ培地中でであった。細胞を３７℃で２時間感染させた。その後、接種を除去し、そして、馴化培地を、３７℃でさらなるインキュベーション前に添加した。
感染性ウイルス収量のアッセイ：−異なるｐ．ｉ．時間で、感染した小脳顆粒ニューロンを収穫し、そして、３周期の凍結および融解により破壊してウイルスを放出させた。感染性ウイルスを、Ｖｅｒｏ細胞でのプラークアッセイにより力価測定した（ｔｉｔｅｒｅｄ）。
トリパンブルー生存率アッセイ：−ニューロンの生存はトリパンブルー排除アッセイにより測定した。細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中０．１％のトリパンブルーの溶液中で１０分間インキュベートし、そしてその後ＰＢＳで２回洗浄した。それぞれおよそ５００個の細胞を含有した３個の無作為に選ばれた野を、位相差および明視野顕微鏡検査により分析した。暗青色色素を排除する細胞を生存可能として計数した一方、青色に染色された細胞を死亡として評価した。
ＭＴＴアッセイ：−以前に記述された手順の一変法を使用した。すなわち、ニューロン培養物（９６穴プレート中）を、標準培地中０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴとともに３７℃で６０分間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を吸引し、そして細胞を２００ｍｌ  ＤＭＳＯ中で溶解した。ＭＴＴホルマザンの量を、バイオテック（Ｂｉｏ−ｔｅｋ）マイクロプレートリーダー（Ｗｉｏｏｓｋｉ、米国バーモント州）にて４９０／６９０での吸光度を測定することにより定量した。
ＤＡＰＩでのＤＮＡ染色：−細胞をポリ−ｌ−リシンで被覆されたカバーガラス上で成長させた。細胞を感染させた。実験の完了に際して、細胞をリン酸緩衝生理的食塩水ｐＨ−７．４（ＰＢＳ）で洗浄し、そして４％ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）中で１０分間固定した。固定後に、ニューロンをＰＢＳで洗浄し、１０μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）で５分間染色し、そしてＰＢＳで２回洗浄し；一滴の没食子酸Ｎ−プロピルもしくはグリセロールのいずれかを添加して蛍光を増強し、それをＵＶ光学顕微鏡検査により検出した。完了した場合に、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ中４５ホルムアルデヒド中で固定した。固定および洗浄した後に、１０ｍｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩで染色し、洗浄し、そして一滴のグリセロールを添加して蛍光を増強し、それをＵＶ光学顕微鏡検査により検出した。
結果
マウス小脳顆粒ニューロン中の野性型（ｗｔ）およびｖｈｓ−１突然変異体ウイルスの複製：
マウス小脳顆粒ニューロン中でのｗｔ  ＨＳＶ−１（ＫＯＳ）およびｖｈｓ−１突然変異体ウイルスの複製を多様な感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で分析した。図３は、０．１、１および１０ＰＦＵ／細胞の入力ｍ．ｏ．ｉ．での感染後（ｐ．ｉ．）４８時間までのニューロン細胞中の感染性ウイルスの収量を比較する。結果として生じるウイルスストックの力価測定はＶｅｒｏ細胞で行った。該結果は、ｗｔウイルスがニューロン細胞中で豊富に複製したことを示した。感染性ウイルスの収量は、０．１ｐｆｕ／細胞の入力ｍ．ｏ．ｉ．に感染した培養物で最高であった（入力ウイルスの１４２８倍増幅）。それらは１および１０ＰＦＵ／細胞の入力ｍ．ｏ．ｉ．でより低かった（ｐ．ｉ．４８時間までに入力ウイルスのそれぞれ６２および４．６倍増幅。対照的に、ｖｈｓ−１突然変異体はニューロンサンプル中で十分に複製せず、感染性ウイルスの収量は、それぞれ、０．１ＰＦＵ／細胞のｖｈｓ−１突然変異体ウイルスに感染した細胞で２倍の入力ウイルス、ならびに１および１０ＰＦＵ／細胞に感染した細胞でウイルス増幅なしに対応した。該データに基づけば、ｖｈｓ−１突然変異体が脳細胞中で複製する制限された能力のみを所有すると結論することができる。
プログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導：ＭＴＴアッセイ：
ｖｈｓ機能は宿主細胞のｍＲＮＡの不安定化／分解を引き起こすため、感染した細胞がプログラムされた細胞死を経験するよう誘導されたかどうか、および、ｖｈｓ−１突然変異体が小脳顆粒ニューロンに対しより毒性であったかどうかを決定することは興味深かった。精製された小脳ニューロン培養物の二重の９６穴の培養物をＨＳＶ−１（ＫＯＳ）もしくはｖｈｓ−１突然変異体ウイルスに感染させた。細胞の生存率を、ｐ．ｉ．１２、２４、３６および４８時間にＭＴＴホルマザンの取り込みにより測定し、バイオテック（Ｂｉｏ−ｔｅｋ）マイクロプレートリーダーでの４９０／６９０の吸光度により定量した。該実験を、異なる入力ｍ．ｏ．ｉ．を使用して類似の結果を伴い、数回反復した。例示的一実験は、１、５および１０ＰＦＵ／細胞のＨＳＶ−１（ＫＯＳ）もしくはｖｈｓ−１突然変異体ウイルスの入力ｍ．ｏ．ｉ．での精製された顆粒ニューロン培養物の９６穴単層の感染を伴った。図４に示されるとおり、ｗｔ  ＨＳＶ−１（ＫＯＳ）でのニューロンの感染はｐ．ｉ．４８時間までにアポトーシスを引き起こさなかった一方、ｖｈｓ−１突然変異体ウイルスの感染は顕著な（５０％まで）アポトーシスに付随された。
トリパンブルーアッセイ：
ＭＴＴアッセイと平行して、ニューロンの生存率をトリパンブルー排除アッセイにより測定した。暗青色色素を排除する細胞を生存として計数した一方、青色に染色された細胞を死亡として評価した。図５に示されるとおり、３ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．でのＫＯＳウイルス感染はｐ．ｉ．４８時間までに実質的な細胞死を引き起こさなかった一方、５０および７０％近い死亡ニューロン細胞が、ｖｈｓ−１に感染した細胞中で死亡していた。
細胞死の特徴づけ：ＤＡＰＩアッセイ
感染がアポトーシス死を生じさせたかどうかを検査するために、ニューロンの培養物を、ポリ−Ｌ−リシン支持体を伴うカバーガラス上で成長させた。異なる時間の長さの間のｗｔおよびｖｈｓ突然変異体ウイルスでの感染後に、細胞をホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩ（４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）で染色し、そして蛍光顕微鏡で検査した。図６は、未感染の顆粒ニューロンの核が楕円形状を伴い大きさが均一に見え、そして、マウス細胞に典型的な、中程度の強度でむしろ均一に染色されかつ光る領域で斑点を付けられたことを示す。ＫＯＳへの曝露の１２時間後に、細胞は変化されないように見えた一方、ｖｈｓウイルスに曝露された細胞では、いくつかのニューロンの核がそれらの楕円形状を喪失し、そして明るい円形の点のように見えた。死亡過程が進行した際に、分解された核（円形区画）の数が増大した。ｖｈｓウイルスへの曝露の２４時間後に、全部の核は辺縁化、断片化、および個々の粒子への凝集を受けた一方、ＫＯＳに曝露された細胞のいくつかが、劣化過程の最初の兆候を示した。これらの結果は、アポトーシスのニューロン死につながる高カリウムを枯渇された小脳顆粒ニューロンのＤＡＰＩ染色の観察結果と区別できない。一緒にすれば、われわれの結果は、ウイルス感染に誘発される死亡がアポトーシスの特徴を有することを示す。
【００３９】
偽感染した細胞、もしくはＨＳＶ−１（ＫＯＳ）、ＨＳＶ−２（６）およびｖｈｓ−１突然変異体に感染した細胞中の、ハウスキーピング遺伝子ならびに感染後に誘導されるストレス関連遺伝子（チューブリンおよび熱ショック７０タンパク質（ＨＳＰ−７０）のような）のｍＲＮＡの分解に対するウイルス感染の影響を分析した（結果は示されない）。いくつかの結論をこの例示的実験から引き出すことができる。すなわち、（ｉ）ｖｈｓ機能は、細胞をアクチノマイシンＤの存在下で感染させた場合もまたｍＲＮＡの分解が起きて一緒になって宿主ウイルス遺伝子の感染後の転写を予防するために、感染後のウイルス遺伝子発現を必要としない。（ｉｉ）ｖｈｓ機能はチューブリンのような遺伝子を分解する。（ｉｉｉ）熱ショック「ストレス」ｍＲＮＡは、ウイルス感染に応答して誘導される７０タンパク質を感染後に誘導した。アクチノマイシンＤ処理は、ＫＯＳ中のその蓄積およびｖｈｓ−１突然変異体ウイルス感染を予防した。
【００４０】
上の図に示されるとおり、８日齢のＢａｌｂＣマウスの小脳顆粒ニューロンを使用する上の実験は：（ｉ）ｗｔウイルスは小脳顆粒ニューロン中で良好に複製する一方、ｖｈｓ−１突然変異体の複製は感染後４８時間まででさえ起こらなかった（ｉｉ）ｗｔウイルス感染はアポトーシスを誘導しない一方、突然変異体ウイルス感染は、細胞生存率のミトコンドリアＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェンルテトラゾリウム）アッセイにより測定されるところの誘導された顕著な細胞死を有する（ｉｉｉ）同様に、トリパンブルーアッセイは、ｖｈｓ−１感染での顕著な死亡に比較して、ｗｔウイルス感染後に細胞死を示さなかった。（ｉｖ）ニューロン細胞死は、Ｄａｐｉ蛍光により判断されるところの細胞の劣化および核の破壊を伴うアポトーシスを反映した、ことを示す。ｖｈｓ−１突然変異体ウイルス感染は、より顕著なアポトーシス、およびより早期にｗｔウイルスにより引き起こされる制限されたアポトーシスを引き起こす。
【００４１】
上の結果はまた、ｗｔウイルスが、ウイルス感染に応答して誘導される宿主の死亡遺伝子を包含する感染した細胞のｍＲＮＡの不安定化／分解をｖｈｓのＲＮアーゼに開始させることにより、感染後の宿主遺伝子発現を阻害することも示す。対照的に、細胞のｍＲＮＡはｖｈｓ−１突然変異体ウイルス感染において効率的に発現されて顕著なアポトーシスをもたらす。上に示されたとおり、細胞の生存はウイルス複製に有利であり、また、アポトーシスを引き起こさなかったｗｔウイルスは小脳ニューロン中で良好に複製した一方、細胞を殺すｖｈｓ−１突然変異体は、感染後４８時間まででさえマウスニューロン中で複製しなかった。
【００４２】
実施例２
材料および方法
Ｈ１２９９ヒト肺癌細胞系の細胞を、１および１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度でＨＳＶ−１突然変異体（ｖｈｓ−１、γ３４．５および３４．５、ｖｈｓ二重突然変異体により例示される）に感染させた。肺細胞中で、ヘルパーウイルスは、安全であるためにその複製を予防する突然変異を担持しなければならない。生存可能および死亡した細胞の数を、トリパンブルーアッセイにより感染後１４、２４、３６、４８、７２および９６時間に測定した。
トリパンブルーアッセイ
細胞を、リン酸緩衝生理的食塩水中０．１％のトリパンブルーを含有する溶液中で１分インキュベートした。その後、５００個の細胞を明視野顕微鏡により計数した。青色色素を排除する細胞を生存可能として計数した一方、青色に染色された細胞を死亡として評価した。
結果
結果は図７〜９に示し、そして以下のとおり要約することができる：
（１）肺細胞中の（アンプリコンを含有する全部のサンプル中の）ｐ５３遺伝子の良好な発現が、ヒト肺癌細胞中でのウェスタンブロットで示される。
（２）感染における細胞死に関して：
（ｉ）１（図７Ａ）および１０（図７Ｂ）ｐｆｕ／細胞のｖｈｓ−１感染（図７）は、感染後３および４日にピーク（それぞれ９０、および９３％の細胞死）に達する、指数的に作用する顕著な細胞死をもたらした。
（ｉｉ）ｐ５３を含有するアンプリコンの添加は細胞死を増大させた。すなわち、図に示されるとおり、ｖｈｓ−１ヘルパーおよびｐ５３アンプリコンの二重感染は、各時点で増大された細胞死を伴い生じた（例えば、感染後（ｐ．ｉ．）２日に、ｖｈｓおよびｖｈｓ＋ｐ５３に感染した培養物中でそれぞれ２０および４０％の細胞死が存在した）。
（ｉｉｉ）図８に示されるとおり、１および１０ｐｆｕ／細胞での３４．５での感染は不完全な死をもたらし、それは徐々に増大して、１ｐｆｕ／細胞の感染で３０％の死亡、および３ｐｆｕ／細胞の感染で６０％の死亡に達した。死亡は感染後３ないし４日にゆっくりとプラトーに達していた。
（ｉｖ）３４．５突然変異体ヘルパーおよびｐ５３アンプリコンでの細胞の二重感染は、有意に増大された死亡をもたらした。死亡は感染後２と３日との間に指数的に増大して、ｐ．ｉ．３日に８８％に達し、また、ｐ．ｉ．４日に９０％でプラトーに達した。
（ｖ）図９に示されるとおり、二重突然変異体３４．５×ｖｈｓに感染した肺癌細胞は、ｐ．ｉ．２と３日との間で既に指数的な細胞死を受けた。死亡は、感染後２日までに１０％であり、そしてｐ．ｉ．３日までに指数的に９０％まで増大した。
（ｖｉ）死亡は、ｐ５３アンプリコンの添加により、より迅速に増大しかつ付加的な有効性に達し、ｐ．ｉ．３および４日にそれぞれ９３および１００％に達した。
（３）類似の結果が、ＭＴＴアッセイ（ミトコンドリアの機能性により細胞の生存率を測定する）を使用して得られた（示されない）。
【００４３】
実施例３
チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を含有するＨＳＶ−１アンプリコンを構築した。該アンプリコンを多様な細胞に感染させ、そして、感染した細胞中でのｔｋ遺伝子発現を、上述されたところのウェスタンブロット分析により評価する。
【００４４】
加えて、単独、もしくは突然変異されたｈｖｓ遺伝子を含有するＨＳＶヘルパーウイルスと組合せの、ｔｋを含んで成るアンプリコンに感染した細胞のガンシクロビル誘導性の死亡を、上述されたところのトリパンブルーもしくはＭＴＴアッセイを使用して評価する。
【００４５】
実施例４
ＴＮＦをコードする遺伝子を含有するＨＳＶ−１アンプリコンを構築した。多様な感染した細胞中でのＴＮＦ遺伝子の発現、ならびに、単独、もしくは突然変異されたｈｖｓ遺伝子を含有するＨＳＶ由来のヘルパーベクターと組合せの、ＴＮＦを含んで成るアンプリコンに感染した細胞の細胞死を、上述されたとおり評価する。
【００４６】
実施例５
インビボでの腫瘍の成長に対するＨＳＶ  ｖｈｓ突然変異体ベクターのインビボでの影響
ヌードマウスに、ヒト膠芽腫細胞系の細胞を皮下で注入する。腫瘍の成長の多様な段階で、マウスを以下の群に分割する：
（ａ）偽注入を受領する対照マウス。
（ｂ）ｖｈｓ−１突然変異体ＨＳＶベクターの注入を受領するマウス；
（ｃ）１種もしくはそれ以上の毒性遺伝子を担持するＨＳＶアンプリコンおよびｖｈｓ−１突然変異体ＨＳＶヘルパーウイルスの組合せ剤の注入を受領するマウス；
（ｄ）感染性ヘルパーウイルスを欠くがしかしアンプリコンを被包化するビリオン中に１種もしくはそれ以上の毒性遺伝子およびｖｈｓ−１突然変異体タンパク質を担持する、純粋なＨＳＶアンプリコン（ｐａｃ−１、ｐａｃ−２欠失およびｖｈｓ突然変異体ヘルパーウイルスを含んで成る細胞中で成長される）の注入を受領するマウス；
（ｅ）ＨＳＶベクターの注入の前、それと一緒にもしくは後の多様な時点で、ＩＬ−２をコードする遺伝子を含有するＨＶＶ−６もしくはＨＶＶ−７由来アンプリコンの全身注入と一緒に（ａ）−（ｄ）の治療のそれぞれを受領するマウス。
【００４７】
ウイルスベクターをマウスの腫瘍中に直接注入し、そして、群のそれぞれでの腫瘍の成長を、注入後の多様な時点で測定し、かつ、対照群の腫瘍の成長と比較する。
【００４８】
付加的なインビボ実験において、前述のベクターを、内的臓器内の高度に悪性の腫瘍に対する別の例としての、ヌードマウスの膵悪性細胞もしくは肺悪性細胞（ｌｏｎｇ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌ）から成長された腫瘍に注入する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】発明にかかる、本発明の混成殺腫瘍ＨＳＶ−１由来ベクターの２成分の一例を示す図解である。示される一成分は、最低１種の毒性遺伝子の複数の反復を担持するＨＳＶ−１アンプリコンであり、そして、第二の成分は、分裂細胞中での複製能力をもちかつ細胞の自殺死機能を誘導するビリオン宿主シャットオフ（ｖｈｓ）機能中の１個の突然変異ならびにリボヌクレオチド還元酵素（ＲＲ）遺伝子中の１個の突然変異を担持する、突然変異体のＨＳＶ−１由来ヘルパーウイルスである。
【図２】発明にかかる、ｐ５３、ウイルスの複製起点（ｏｒｉ）およびパッケージングシグナル（ｐａｃ）を担持するＨＳＶ由来の殺腫瘍ＨＳＶ−１アンプリコンである、本発明の混成殺腫瘍ベクターの一成分の一例を示す図解である。
【図３】発明にかかる、こうした細胞中に感染した野性型ＨＳＶ（ＫＯＳ）ベクターに比較した、マウス小脳顆粒ニューロン中への感染後のｖｈｓ−１突然変異体ヘルパーウイルスの複製を示す図解である。複製を、多様な感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）および感染後多様な時点で測定した。
【図４】発明にかかる、非感染マウスニューロン細胞（偽対照）、および多様な感染多重度での細胞の感染後多様な時点のかつＭＴＴアッセイにより測定されるところのｖｈｓ−１突然変異体ベクターでの感染後のマウスニューロン細胞の生存率を示す図解である。
【図５】発明にかかる、非感染（偽）対照細胞と比較した、細胞の感染後多様な時点でのかつトリパンブルーアッセイにより測定されるところの、ＨＳＶ由来ベクター（ＫＯＳ）もしくはｖｈｓ−１突然変異体ベクターのいずれかでの細胞の感染後のニューロン細胞の生存率を示す図解である。
【図６】発明にかかる、感染およびＤＡＰＩ染色後多様な時点での、ＫＯＳもしくはｖｈｓ−１ウイルスベクターに感染したマウスニューロン細胞培養物の写真を示す。アポトーシスが、ｖｈｓ−１に感染した細胞でみられる。
【図７】発明にかかる、単独、もしくはｐ５３遺伝子を担持するＨＳＶ−１アンプリコンベクターと組合せの、ｖｈｓ−１突然変異体ヘルパーウイルスに感染したＨ１２９９ヒト肺癌細胞の細胞死のパーセントを示す図解である。ベクターを、１プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞（図７Ａ）および１０ｐｆｕ／細胞（図７Ｂ）の感染多重度で感染させ、そして、生存可能な死細胞の数を、感染後多様な時点でトリパンブルーアッセイにより測定した。
【図８】発明にかかる、１ｐｆｕ／細胞（図８Ａ）もしくは３ｐｆｕ／細胞（図８Ｂ）の感染多重度の単独、もしくはｐ５３遺伝子を含んで成るＨＳＶ−１由来アンプリコンと組合せの、３４．５突然変異を担持するＨＳＶ由来ベクターで感染後の、細胞の感染後多様な時点でのかつトリパンブルーアッセイにより測定されるところの、Ｈ１２９９ヒト肺癌細胞の細胞死を示す図解である。
【図９】発明にかかる、１ｐｆｕ／細胞（図９Ａ）もしくは１０ｐｆｕ／細胞（図９Ｂ）の感染多重度での、ｐ５３細胞傷害性遺伝子を担持するＨＳＶ−１アンプリコンと組合せの３４．５およびｖｈｓ突然変異体遺伝子を担持する二重に突然変異されたＨＳＶ−１ベクターでの感染後の、細胞の感染後多様な時点でのかつトリパンブルーアッセイにより測定されるところの、Ｈ１２９９ヒト肺癌細胞の生存率を示す図解である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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