(57)【要約】本発明は、単離された混合系統キナーゼ（７）（ＭＬＫ）ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、単離されたポリペプチド、ポリペプチドの製造方法、単離された抗体、前述を有する組成物、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを結合する化合物の同定方法、および、ポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２を含んで成るポリペプチドをコードする配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクター。
【請求項５】
前記ベクターがプラスミドもしくはウイルス粒子である、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項４記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞である、請求項６記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
ａ）請求項４記載の組換え発現ベクターを適合性の宿主細胞に導入すること；
ｂ）配列番号２を含んで成るポリペプチドの発現のための条件下で前記宿主細胞を成長させること；および
ｃ）前記ポリペプチドを回収すること
の段階を含んで成る、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１記載のポリヌクレオチドおよび担体もしくは希釈剤を含んで成る組成物。
【請求項１０】
請求項４記載の組換え発現ベクターおよび担体もしくは希釈剤を含んで成る組成物。
【請求項１１】
請求項１記載のポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが配列番号２を含んで成る、請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１１記載のポリペプチドおよび担体もしくは希釈剤を含んで成る組成物。
【請求項１５】
請求項１２記載のポリペプチドおよび担体もしくは希釈剤を含んで成る組成物。
【請求項１６】
請求項１２記載のポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
請求項１６記載の抗体および担体もしくは希釈剤を含んで成る組成物。
【請求項１９】
請求項１２記載のポリペプチドに結合する抗体を含んで成るキット。
【請求項２０】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含んで成るキット。
【請求項２１】
請求項１２記載のポリペプチドを含んで成るキット。
【請求項２２】
ａ）請求項１２記載のポリペプチドを化合物と接触させること；および
ｂ）前記化合物が前記ポリペプチドに結合するかどうかを決定すること
の段階を含んで成る、前記ポリペプチドを結合する化合物の同定方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドへの前記化合物の結合がタンパク質結合アッセイにより測定される、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質結合アッセイが、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射標識競争アッセイ、ファージに基づく発現クローニング、クロマトグラフィーによる共分画、共沈殿法、架橋、相互作用捕捉／２ハイブリッド分析、サウスウェスタン分析およびＥＬＩＳＡよりなる群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ａ）請求項１記載のポリヌクレオチドを化合物と接触させること；および
ｂ）前記化合物が前記ポリヌクレオチドを結合するかどうかを決定すること
の段階を含んで成る、前記ポリヌクレオチドを結合する化合物の同定方法。
【請求項２６】
結合がゲルシフトアッセイにより測定される、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
ａ）請求項１２記載のポリペプチドを化合物と接触させること；および
ｂ）前記ポリペプチド活性が調節されたかどうかを決定すること
の段階を含んで成る、前記ポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２８】
前記活性が基質のリン酸化である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記活性がＪＮＫ活性化である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項２２記載の方法により同定される化合物。
【請求項３１】
請求項２５記載の方法により同定される化合物。
【請求項３２】
請求項２７記載の方法により同定される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００１年５月２４日出願の米国仮出願第６０／２９３，３８１号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、部分的に、新規混合系統キナーゼ７（ＭＬＫ７）ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドに結合するもしくはその活性を調節する化合物の同定方法、およびＭＬＫ７の酵素活性のアッセイ方法に向けられる。
【背景技術】
【０００３】
ＭＬＫファミリーは、該ファミリーメンバーのキナーゼドメインのタンパク質配列がチロシンおよびセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ双方と相同性を示す酵素の一群を含んで成る。とりわけ、この領域は、チロシンキナーゼ間で高度に保存される多くのアミノ酸を含有するが、しかし、触媒ドメインすなわちサブドメイＶＩｂおよびＶＩＩＩ中のセリン／トレオニンタンパク質キナーゼに対する相同性は、ＭＬＫ３の既知のセリン／トレオニンキナーゼ活性と矛盾しない（非特許文献１）。加えて、全部のファミリーメンバーは、ロイシンジッパー（平行コイルドコイル構造を形成するための最低２２アミノ酸の伸長について７番目のアミノ酸ごとのロイシンもしくはイソロイシンの周期的反復を特徴とするα−らせん構造）を含有する（非特許文献２）。これらのキナーゼは、例えば、とりわけｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）（順に、とりわけｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２およびＥＬＫ１を包含する転写因子を調節する）の調節を必要とするストレスシグナル伝達カスケードのような非常に複雑なキナーゼカスケードの一部分を含んで成る。ＪＮＫは特許文献１、２、３および４に記述される。
【０００４】
ＭＬＫファミリーは、６種の報告されたファミリーメンバー、すなわち１）混合系統キナーゼ１（ＭＬＫ１）；２）混合系統キナーゼ２（ＭＬＫ２）；３）混合系統キナーゼ３（ＭＬＫ３）；４）二重ロイシンジッパーを担持するキナーゼ（ＤＬＫ）；５）ロイシンジッパー担持キナーゼ（ＬＺＫ）および６）ＭＬＫ様マイトジェン活性化プロテイン三重キナーゼ／混合系統キナーゼ６（ＭＬＴＫ／ＭＬＫ６）よりなる。部分的配列がＭＬＫ１について報告されている（非特許文献３）。混合系統キナーゼ１、２および３は、上述された特徴に加えて、キナーゼドメインに対しＮ末端のｓｒｃ−相同性−３（ＳＨ３）ドメインを有する（非特許文献４；５；および６）。それらのロイシンジッパー領域はキナーゼドメインに対しすぐＣ末端にあり、そして、二重ロイシンジッパーと命名される小さなスペーサー領域により分離される４個のαらせん領域の２個の繰り返しより構成される。欠失分析は、ホモ二量体化におけるこのドメインの機能的役割を示唆する（非特許文献７）。このドメインの後に、数種のタンパク質からの核局在化シグナルに類似の圧倒的に優勢の塩基性アミノ酸より構成される小さな領域が続く（非特許文献５）。Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ相互作用結合（ＣＲＩＢ）ドメインがそれにすぐ隣接する（非特許文献８）。Ｃ末端は全般に低レベルの複雑さを有し、ここで３種のアミノ酸（プロリン、セリンおよびグリシン）が一次アミノ酸配列の４１％（ＭＬＫ３）まで含んで成る。ＭＬＫ２はＭＳＴとしてもまた知られる（非特許文献９）。ＭＬＫ３は、ｓｃｒ−相同性３（ＳＨ３）ドメインを含有するプロリン豊富なキナーゼ（ＳＰＲＫ）（非特許文献１）およびプロテインチロシンキナーゼ１（ＰＴＫ１）（非特許文献１０）としてもまた知られる。
【０００５】
ＤＬＫおよびＬＺＫは同一の全般的特徴を共有するが、しかしＳＨ３およびＣＲＩＢドメインは有さず、また、二重ロイシンジッパー中のそれらのスペーサー領域は、ＭＬＫ１−３中でより約１８アミノ酸より長い（非特許文献１１；１２）。ＤＬＫは、ロイシンジッパープロテインキナーゼ（ＺＰＫ）（非特許文献１３）およびＭＡＰＫ上流キナーゼ（ＭＵＫ）（非特許文献１４）としてもまた知られる。
【０００６】
ＭＬＴＫ／ＭＬＫ６はなおより互いに異なる。それらはキナーゼドメインおよび推定のロイシンジッパー領域を共有するが、しかし、ＤＬＫ／ＬＺＫ群と同様、ＳＨ３結合ドメインもしくはＣＲＩＢドメインが存在せず、また塩基性アミノ酸領域も存在しない。むしろ、２種のｃＤＮＡ配列は推定のロイシンジッパー領域の後で異なり、２個の異なるアイソフォームαおよびβをもたらす。さらに、「二重の」４＋４反復を含有する他のファミリーメンバーと異なり、推定のロイシンジッパー領域は６個の連続するα−らせん反復を含有する。加えて、他のファミリーメンバーと異なり、該キナーゼドメインは本質的にＮ末端にある（非特許文献１５）。ＭＬＴＫα／ＭＬＫ６αは、ロイシンジッパー不毛（ｓｔｅｒｉｌｅ）αモチーフキナーゼ（ＺＡＫ）としてもまた知られる（非特許文献１６）。
【０００７】
ＭＬＫファミリーのメンバーはまた、例えば、特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；および非特許文献２８にも記述される。ヒトキナーゼ相同物のキナーゼドメインの部分はまた特許文献９にも報告されている。加えて、混合系統キナーゼのｍＲＮＡのヌクレオチド配列はジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）データベースに報告されている（受託番号ＡＦ２３８２５５およびＡＦ２５１４４１を参照されたい）。
【０００８】
ストレスシグナル伝達カスケードのメンバーを調節しかつ細胞死もしくは細胞生存のいずれかを促進する化合物のスクリーニングの不十分により、化合物の新たな選択的スクリーニング方法に対する必要性が存在し続けている。加えて、炎症および神経変性性障害の治療において有用であるかもしれない治療薬のスクリーニングアッセイに対する必要性が存在し続けている。本発明は、これらならびに他の重要な目的に向けられる。とりわけ、本発明は、ＭＬＫファミリーの付加的な一メンバー、すなわち、ＭＬＫ１−３サブファミリーに７３〜７６％相同なキナーゼドメインをコードするヒトゲノム配列から同定される、本明細書でＭＬＫ７と命名される第７のファミリーメンバーを記述する。ＭＬＫ７はキナーゼドメインに対しＮ末端にＳＨ３ドメインを含有する。ＭＬＫ７はまた、キナーゼドメインに対しＣ末端の二重ロイシンジッパー、次いで、数種のタンパク質からの核局在化シグナルに類似の圧倒的に優勢の塩基性アミノ酸より構成される小さな領域も含有する。これを、機能的キナーゼタンパク質をコードするｃＤＮＡをクローン化するのに使用した。本発明の新規ポリペプチドは、例えばＭＡＰキナーゼキナーゼ４（ＭＫＫ４）およびＭＫＫ７をリン酸化するのに使用することができ、そしてＪＮＫのストレス活性化キナーゼ経路の活性化である役割を演じている。従って、本発明のポリペプチドは、例えばそれの阻害剤を同定するのに使用することができ、そして、こうした阻害剤を使用して神経細胞の生存を促進することができる。ＭＬＫポリペプチドの活性を低下させる化合物は、例えば細胞の生存を促進し、神経変性性障害を治療し、および炎症を治療するのに有用である。
【特許文献１】
米国特許第５，５３４，４２６号明細書
【特許文献２】
米国特許第５，５９３，８８４号明細書
【特許文献３】
米国特許第５，６０５，８０８号明細書
【特許文献４】
国際特許公開第ＷＯ  ９５／０３３２４号明細書
【特許文献５】
米国特許第５，６７６，９４５号明細書
【特許文献６】
米国特許第５，５５４，５２３号明細書
【特許文献７】
国際特許公開第ＷＯ  ９３／１５２０１号明細書
【特許文献８】
カナダ国特許第２，１４８，８９８号明細書
【特許文献９】
米国特許第５，８１７，４７９号明細書
【非特許文献１】
Ｇａｌｌｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，１５０９２−１５１００
【非特許文献２】
Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｔｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４０，１７５９−１７６４
【非特許文献３】
Ｄｏｒｏｗら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１３，７０１−７１０
【非特許文献４】
Ｄｏｒｏｗら，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．，１９９４，１３，４５８−４６０
【非特許文献５】
Ｄｏｒｏｗら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９５，２３４，４９２−５００
【非特許文献６】
Ｉｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９４，９，１７４５−１７５０
【非特許文献７】
Ｌｅｕｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，３２４０８−３２４１５
【非特許文献８】
Ｂｕｒｂｅｌｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，２９０７１−２９０７４
【非特許文献９】
Ｋａｔｏｈら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９５，１０，１４４７−１４５１
【非特許文献１０】
Ｅｚｏｅら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９４，９，９３５−９３８
【非特許文献１１】
Ｈｏｔｌｚｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２６９，３０８０８−３０８１７
【非特許文献１２】
Ｓａｋｕｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，２８６２２−２８６２９
【非特許文献１３】
Ｒｅｄｄｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９４，２０２，６１３−６２０
【非特許文献１４】
Ｈｉｒａｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９６，１２，６４１−６５０
【非特許文献１５】
Ｇｏｔｏｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６，４２７６−４２８６
【非特許文献１６】
Ｌｉｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０００，２７４，８１１−８１６
【非特許文献１７】
Ｄｉｅｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４，９６８７−９６９２
【非特許文献１８】
ＤｅＡｉｚｐｕｒｕａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１６３６４−１６３７３
【非特許文献１９】
Ｔｕｎｇら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９７，１４，６５３−６５９
【非特許文献２０】
Ｓｅｌｌｓら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９７，７，１６１−１６７
【非特許文献２１】
Ｍａｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，１６８８８−１６８９６
【非特許文献２２】
Ｈｉｒａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１５１６７−１５１７３
【非特許文献２３】
Ｆａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，２４７８８−２４７９３
【非特許文献２４】
Ｂｌｏｕｉｎら，ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９６，１５，６３１−６４２
【非特許文献２５】
Ｐｏｍｂｏら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７７，７５０−７５４
【非特許文献２６】
Ｋｉｅｆｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９６，１５，７０１３−７０２５
【非特許文献２７】
Ｈｕら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１９９６，１０，２２５１−２２６４
【非特許文献２８】
Ｓｕら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９７，１６，１２７９−１２９０
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、新規ＭＬＫ７ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
とりわけ、本発明は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチド、配列番号１に相同なポリヌクレオチド、配列番号２を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および配列番号２に相同なアミノ酸配列を含んで成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに向けられる。
【００１１】
本発明はまた、配列番号１の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチドにも向けられる。
【００１２】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクターおよびそれを含んで成る宿主細胞にも向けられる。
【００１３】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる単離されたポリペプチド、ならびに、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換え発現ベクターを適合性の宿主細胞に導入すること、該ポリペプチドの発現のための条件下で該宿主細胞を成長させること、およびポリペプチドを回収することによる、配列番号２を含んで成るポリペプチドおよびそれに相同なポリペプチドの製造方法にも向けられる。
【００１４】
本発明は、本発明のポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体にもまた向けられる。
【００１５】
本発明はまた、ポリヌクレオチド、発現ベクター、ポリペプチド、または抗体、および担体もしくは希釈剤を含んで成る組成物、ならびにポリヌクレオチド、発現ベクター、ポリペプチドもしくは抗体を含んで成るキットにも向けられる。
【００１６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを化合物と接触させること、および該化合物が該ポリペプチドに結合するかどうかを測定することによる、該ポリペプチドを結合する化合物の同定方法にも向けられる。
【００１７】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを化合物と接触させること、および該化合物が該ポリヌクレオチドを結合するかどうかを測定することによる、該ポリヌクレオチドを結合する化合物の同定方法にも向けられる。
【００１８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを化合物と接触させること、および該ポリペプチドの活性が調節されたかどうかを測定することによる、該ポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法にも向けられる。
【００１９】
本発明はまた、本発明の同定方法により同定される化合物にも向けられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、本明細書で「ＭＬＫ７」と称されるヒトＭＬＫポリペプチドをコードする精製かつ単離されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ転写物、キメラＲＮＡ／ＤＮＡ分子、そのスプライス変異体を包含する一本鎖および二本鎖双方のセンスおよび相補的アンチセンス双方の鎖）を提供する。本発明のＤＮＡポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学的に合成されたＤＮＡを包含する。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「活性」は、直接もしくは間接的のいずれかの結合を示唆するもしくは示す；例えば本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを直接結合するための化合物の親和性を包含する何らかの曝露もしくは刺激に応答して測定可能な影響（ａｆｆｅｃｔ）、または、例えば上流もしくは下流のタンパク質（例えばＪＮＫ）の量もしくはその活性の測定値、あるいは刺激もしくは事象後の他の類似の機能を有するような応答に影響を及ぼす、多様な測定可能な徴候を意味する。
【００２２】
本明細書で使用されるところの「抗体」は、完全な無傷の抗体、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、ならびにそれらの他のフラグメントを意味する。完全な無傷の抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体および人化抗体を包含する。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「結合」は、２種のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物、あるいはそれらの組合せ間の物理的もしくは化学的相互作用を意味する。結合は、限定されるものでないが、イオン、非イオン、水素結合、ファンデルワールス、疎水性相互作用などを挙げることができる。結合は、別のタンパク質もしくは化合物の影響によりもしくはそのために直接もしくは関節的のいずれであることもできる。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「化合物」は、限定されるものでないが小分子、ペプチド、タンパク質もしくはポリペプチド、糖、ヌクレオチドまたは核酸などを挙げることができるいずれかの化学物質もしくは分子を意味する。化合物は天然もしくは合成であることができる。
【００２５】
本明細書で使用されるところの「接触させること」は、化合物を直接的にもしくは間接的にのいずれかで、本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの物理的近接に一緒にもたらすことを意味する。ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドはいずれかの数の緩衝剤、塩、溶液など中にあることができる。接触させることは、限定されるものでないが、化合物を、ＭＬＫ７ポリペプチドもしくはそのフラグメント、それをコードするポリヌクレオチド、またはそれに結合する抗体を含有するビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコ、もしくはマイクロアレイなど中に置くことを挙げることができる。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「相同なヌクレオチド配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変形は、少なくともある指定される割合のヌクレオチドレベルもしくはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を意味する。相同なヌクレオチド配列は、限定されるものでないが哺乳動物を挙げることができるヒト以外の種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。相同なヌクレオチド配列はまた、限定されるものでないが、天然に存在する対立遺伝子変異および本明細書に示されるヌクレオチド配列の突然変異も挙げることができる。相同なヌクレオチド配列は、しかしながら、他の既知のＭＬＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に同一でない。相同なアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換をコードするアミノ酸配列、ならびにキナーゼ活性を有するポリペプチドを包含する。相同なアミノ酸配列は、しかしながら、他の既知のＭＬＫポリペプチドをコードするアミノ酸配列に同一でない。相同性パーセントは、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる））を使用する、デフォルトの設定を使用するＧａｐプログラム（ウィスコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ）、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ、ジェネティックス  コンピュータ  グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ユニバーシティ  リサーチ  パーク、ウィスコンシン州マディソン）により決定することができる。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「調節する」もしくは「改変する」は、特定の活性もしくはポリペプチドの量、質もしくは影響の増大もしくは減少を意味する。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「治療すること」は、ある生物体において治療効果を示すことおよび異常な状態を少なくとも部分的に軽減もしくは阻止することを意味する。
【００２９】
本明細書で使用されるところの「治療効果」は、異常な状態を引き起こすもしくはそれに寄与する因子の阻害もしくは活性化を意味する。治療効果は、少なくとも若干の程度まで、異常な状態の症状の１つもしくはそれ以上を軽減する。異常な状態の治療に関して、治療効果は、以下、すなわちｉ）細胞の増殖、成長および／もしくは分化の増大；ｉｉ）細胞死の阻害（すなわち遅延もしくは停止）；ｉｉｉ）変性の阻害；ｉｖ）該異常な状態に関連する症状の１つもしくはそれ以上を若干の程度まで楽にすること；ならびにｖ）細胞の冒された集団の機能を高めること、の１つもしくはそれ以上を指すことができる。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「異常な状態」は、その生物体においてそれらの正常な機能から逸脱する生物体の細胞もしくは組織中の機能を意味する。異常な状態は個体により望まれないいかなる状態であることもできる。異常な状態は、細胞増殖、細胞分化、細胞のシグナル伝達もしくは細胞の生存に関係する可能性がある。異常な分化状態は、限定されるものでないが神経変性性もしくは炎症性障害を挙げることができる。異常な細胞の生存の状態はまた、プログラムされた細胞死（アポトーシス）経路が活性化もしくは阻止される状態にも関係する可能性がある。
【００３１】
本明細書で使用されるところの「投与すること」は、生物体の細胞もしくは組織中への化合物の取り込み方法を意味する。生物体内の細胞について、投与技術は、限定されるものでないが、経口、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内に、眼内に、心もしくは脳室内に（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）および経皮で、ならびに吸入もしくは坐剤によりを挙げることができる。生物体の外側の細胞について、投与技術は、限定されるものでないが細胞微小注入、形質転換および担体技術を挙げることができる。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「生物体」は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットもしくはヤギのような哺乳動物、より好ましくはサルもしくは類人猿のような霊長類、そして最も好ましくはヒトを意味する。
【００３３】
本明細書で使用されるところの「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」もしくは「ストリンジェントな条件」は、プローブ、プライマーもしくはオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズするがしかし他の配列にしないことができる条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる環境で異なることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されるイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱的融点（Ｔｍ）より約５Ｃより低いように選択される。標的配列は一般に過剰に存在する。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０ないし８．３で塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０．０１ないし１．０Ｍナトリウムイオン（もしくは他の塩）でありかつ温度が短いプローブ、プライマーもしくはオリゴヌクレオチド（例えば１０ないし５０ヌクレオチド）について最低約３０Ｃ、およびより長いプローブ、プライマーもしくはオリゴヌクレオチドについて最低約６０Ｃであるものであることができる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加でもまた達成することができる。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドのタンパク質コーディング領域を含んで成りかつ対立遺伝子変異体もしくはそれらのスプライス変異体を包含することもまた意図しているゲノムＤＮＡを包含することができる。本発明のスプライス変異体は同一の元のゲノムＤＮＡ配列によりコードされるが、しかし別個のｍＲＮＡ転写物から生じる。対立遺伝子変異体は改変された形態の野性型遺伝子配列であり、該改変は、染色体分離、もしくは遺伝子突然変異を生じさせる条件への曝露の間の組換えから生じる。対立遺伝子変異体は、野性型遺伝子と同様、インビトロ操作から生じる天然に存在しない変異体と反対に、天然に存在する配列である。
【００３５】
本発明において、ＭＬＫ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを配列番号１に示す。本発明の好ましいポリペプチドは二本鎖分子を含んで成る。普遍的核遺伝暗号の公知の縮重によって配列番号１に示される特定のポリヌクレオチドと配列が異なる本発明の特定のＭＬＫ７ポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドもまた好ましい。
【００３６】
本発明は、ヒトＭＬＫ７ポリヌクレオチドの付加的な種の相同物（好ましくは哺乳動物の）にさらに向けられる。ときに「類似物（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」と称される種の相同物は、一般に、本発明のヒトポリヌクレオチドと最低３５％、最低４０％、最低４５％、最低５０％、最低６０％、最低６５％、最低７０％、最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、最低９８％、もしくは最低９９％の相同性を共有する。一般に、本発明のポリヌクレオチドに関しての配列の「相同性」パーセントは、最大の配列の同一性パーセントを達成するように配列を整列しかつ必要な場合はギャップを導入した後に特定のポリヌクレオチド配列中に示されるＭＬＫ７配列中のヌクレオチドに同一である候補配列中のヌクレオチド塩基のパーセンテージとして計算することができる。
【００３７】
関係するポリヌクレオチドの例は、対立遺伝子変異体を包含するヒトおよび非ヒトゲノム配列、ならびに、ＭＬＫ７ポリペプチドに相同なポリペプチドならびにＭＬＫ７ポリペプチドの１種もしくはそれ以上の生物学的、免疫学的および／もしくは物理的特性を共有する構造的に関係するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。ＭＬＫ７ポリペプチドに相同なタンパク質をコードする非ヒト種の遺伝子は、サザンおよび／もしくはＰＣＲ分析によってもまた同定することができ、そしてＭＬＫポリペプチド障害の動物モデルで有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、ＭＬＫ７ポリペプチドを発現する細胞の能力を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイでも有用である。本発明のポリヌクレオチドはまた、疾患状態（１種もしくは複数）の根底にあるＭＬＫ７遺伝子座の遺伝子変化（１個もしくは複数）を同定するために有用な診断方法の基礎も提供する可能性があり、こうした情報は診断、および治療戦略の選択双方に有用である。
【００３８】
ＭＬＫ７ポリペプチドをコードする完全長のポリヌクレオチドの本明細書の開示は、完全長のポリヌクレオチドのすべての可能なフラグメントを当業者に容易に利用可能にする。ＭＬＫ７ポリヌクレオチドは、従って、ＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチドの最低１４、および好ましくは最低１６、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０もしくは３０００の連続するヌクレオチドを含んで成るフラグメントを包含する。好ましくは、本発明のフラグメントポリヌクレオチドは、ＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチド配列に独特の配列を含んで成り、そして従って、高度にストリンジェントなもしくは中程度にストリンジェントな条件下でＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチド（もしくはそれらのフラグメント）にのみ（すなわち「特異的に」）ハイブリダイズする。本発明のゲノム配列のポリヌクレオチドフラグメントは、コーディング領域に独特の配列を含むのみならず、しかしまた、イントロン、調節領域および／もしくは他の非翻訳配列由来の完全長配列のフラグメントも包含する。本発明のポリヌクレオチドは、放射活性、蛍光および酵素的標識を包含するそれらの検出を可能にする様式で標識することができる。
【００３９】
フラグメントポリヌクレオチドは、完全長もしくはフラグメントのＭＬＫ７ポリヌクレオチドの検出のためのプローブとしてとりわけ有用である。１種もしくはそれ以上のポリヌクレオチドを、ＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するのに使用される、もしくはＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチド配列中の変異を検出するのに使用されるキットに包含することができる。
【００４０】
本発明はまた、配列番号１のポリヌクレオチドの非コーディング鎖もしくは相補体に中程度にストリンジェントなもしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするＭＬＫ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも向けられる。例示的な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のとおりである。すなわち、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸を含んで成るハイブリダイゼーション溶液中４２Ｃでのハイブリダイゼーション、ならびに、０．１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳを含んで成る洗浄溶液中６０Ｃで３０分間２回洗浄すること。同等なストリンジェンシーの条件はＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ジョン  ワイリー  アンド  サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）（１９９４），ｐｐ．６．０．３ないし６．４．１０に記述されるところの温度および緩衝液もしくは塩濃度の変動により達成することができることが、当該技術分野で理解される。ハイブリダイゼーション条件の改変は、経験的に決定することができるか、もしくはプローブの長さおよびグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対形成のパーセンテージに基づいて正確に計算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９），ｐｐ．９．４７ないし９．５１（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり計算することができる。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドを組み込むプラスミドおよびウイルスＤＮＡベクターのような組換え発現構築物もまた提供される。好ましくは、ＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチドは、内因性もしくは外因性のプロモーター、エンハンサー、オペレーターもしくは調節要素結合部位、またはそれらのいずれかの組合せに操作をもたらして連結される。本発明の発現構築物はまた、該構築物を担持する宿主細胞の同定を可能にする１種もしくはそれ以上の選択可能なマーカーをコードする配列も包含することができる。発現構築物はまた、宿主細胞中での相同的組換えを助長（および好ましくは促進）する配列も包含することができる。本発明の好ましい構築物は、宿主細胞中での複製に必要な配列もまた包含する。発現構築物は、好ましくはコードされるタンパク質の産生に利用されるが、しかし、ＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチド配列を増幅するのにもまた利用することができる。
【００４２】
本発明の別の態様において、コードされるＭＬＫ７ポリペプチドの発現を可能にする様式で本発明のポリヌクレオチド（もしくは本発明のベクター）を含んで成る、原核生物および真核生物細胞を包含する宿主細胞が提供される。本発明のポリヌクレオチドは、プラスミドの一部として、または単離されたタンパク質コーディング領域を含んで成る直鎖状ＤＮＡもしくはウイルスベクターとして、宿主細胞に導入することができる。宿主細胞中へのＤＮＡの導入方法は当該技術分野で公知かつ慣例に実施され、そして、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔法、核注入、もしくはリポソーム、ミセル、ゴースト細胞およびプロトプラストのような担体との融合を包含する。本発明の発現系は、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、無脊椎動物、脊椎動物および哺乳動物細胞系を包含する。
【００４３】
本発明の宿主細胞は、ＭＬＫ７と特異的に免疫反応性である抗体の発生にＭＬＫ７ポリペプチドに基づく免疫原を提供することができる。本発明の宿主細胞はまた、細胞を適する培地中で成長させ、そして所望のポリペプチド産物を当該技術分野で既知の精製方法、例えば免疫親和性クロマトグラフィー、受容体アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオンもしくは陰イオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣなどを包含する慣習的クロマトグラフィー法により細胞からもしくは細胞が成長された培地から単離する、ＭＬＫ７ポリペプチドの大スケール製造方法においても有用である。なお他の精製方法は、所望のタンパク質を、特異的結合パートナーもしくは作用物質により認識される特異的標識（ｔａｇ）、標識（ｌａｂｅｌ）もしくはキレート形成部分を有する融合タンパク質として発現させかつ精製する方法を包含する。精製されたタンパク質を切断して所望のタンパク質を生じさせることができるか、もしくは無傷の融合タンパク質として残すことができる。融合成分の切断は、切断過程の結果として付加的なアミノ酸残基を有する所望のタンパク質の形態を生じるかもしれない。
【００４４】
本発明はまた、ＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチドを認識かつそれらにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドにも向けられる。完全長およびフラグメントのアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。本発明のフラグメントアンチセンス分子は、ＭＬＫ７のＲＮＡもしくはＤＮＡを特異的に認識しかつそれらにハイブリダイズするものを包含する。アンチセンスポリヌクレオチドは、ＭＬＫ７のｍＲＮＡを発現する細胞によるＭＬＫ７の発現を調節することにとりわけ直接的に関連する。ＭＬＫ７の発現制御配列もしくはＮＬＫ７のＲＮＡに特異的に結合することが可能なアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくは１０ないし２０塩基対のオリゴヌクレオチド）を（例えばウイルスベクターもしくはリポソームのようなコロイド分散系により）細胞に導入する。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートアンチセンスオリゴヌクレオチドが本発明による治療的使用にとりわけ企図される。転写もしくは翻訳いずれかのレベルでのＭＬＫ７発現の抑制は、異常なＭＬＫ７発現を特徴とする疾患／病状の細胞もしくは動物モデルを生成させるのに有用である。
【００４５】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる精製かつ単離された哺乳動物のＭＬＫ７ポリペプチドも提供する。好ましくは、ＭＬＫ７ポリペプチドは配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んで成る。本発明はまた、本発明の好ましいポリペプチドに対する最低９９％、最低９５％、最低９０％、最低８５％、最低８０％、最低７５％、最低７０％、最低６５％、最低６０％、最低５５％もしくは最低５０％の同一性および／もしくは相同性を有するポリペプチドにも向けられる。本発明の好ましいポリペプチドに関してのアミノ酸配列の「同一性」パーセントは、最大の配列の同一性パーセントを達成するために双方の配列を整列しかつ必要な場合はギャップを導入した後、ならびに配列の同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、ＭＬＫ７配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと本明細書で定義する。本発明の好ましいポリペプチドに関しての配列の「相同性」パーセントは、最大の配列の同一性パーセントを達成するために配列を整列しかつ必要な場合はギャップを導入した後、ならびにまた配列の同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮することなく、ＭＬＫ７配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと本明細書で定義する。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、天然の細胞供給源から単離することができるか、もしくは化学的に合成することができるが、しかし、好ましくは、本発明の宿主細胞を必要とする組換え手順により製造する。哺乳動物宿主細胞の使用は、本発明の組換え発現産物に至適の生物学的活性を賦与するために必要とされるかもしれないところのこうした翻訳後修飾（例えばグリコシル化、短縮、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびリン酸化）を提供すると期待される。グリコシル化されたおよびグリコシル化されない形態のＭＬＫ７ポリペプチドもまた提供される。
【００４７】
本発明はまた、ＭＬＫ７ポリペプチド変異体もしくは類似物にも向けられる。一例において、１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基がＭＬＫ７アミノ酸配列を補う挿入変異体が提供される。挿入はタンパク質のいずれかのもしくは双方の末端に配置されることができるか、または、ＭＬＫ７アミノ酸配列の内部領域内に配置されることができる。いずれかのもしくは双方の末端に付加的な残基をもつ挿入変異体は、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸標識（ｔａｇ）もしくは標識（ｌａｂｅｌ）を包含するタンパク質を包含することができる。挿入変異体は、１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基がＭＬＫ７酸配列もしくはその生物学的に活性のフラグメントに付加されるＭＬＫ７ポリペプチドを包含する。本発明の変異体産物はまた、付加的なアミノ末端残基を伴いリーダーもしくはシグナル配列が除去される成熟ＭＬＫ７ポリペプチドも包含する。該付加的アミノ末端残基は別のタンパク質由来であることができるか、または、特定のタンパク質由来であるとして同定可能でない１個もしくはそれ以上の残基を包含することができる。
【００４８】
本発明はまた、特定の発現系の使用から生じる付加的アミノ酸残基を有するＭＬＫ７変異体も提供する。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合産物の一部として所望のポリペプチドを発現する商業的に入手可能なベクターの使用は、所望のポリペプチドからのＧＳＴ成分の切断後に位置−１に付加的なグリシン残基を有する所望のポリペプチドを提供する。他のベクター系中での発現から生じる変異体もまた企図される。挿入変異体はまた、ＭＬＫ７のアミノ末端および／もしくはカルボキシ末端が別のポリペプチドに融合される融合タンパク質も包含する。加えて、ＭＬＫ７もしくはそのフラグメントを含んで成る他の融合タンパク質が本発明により企図される。多数の融合パートナータンパク質が当業者に公知である。
【００４９】
別の局面において、本発明は、ＭＬＫ７ポリペプチド中の１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基が除去される欠失変異体を提供する。欠失は、ＭＬＫ７ポリペプチドの一方もしくは双方の末端で、またはＭＬＫ７の１個もしくはそれ以上の非末端アミノ酸残基の除去で遂げることができる。欠失変異体は、従って、ＭＬＫ７ポリペプチドの全部のフラグメントを包含する。
【００５０】
本発明はまた、フラグメントがＭＬＫ７ポリペプチドの生物学的（例えば、リガンド結合および／もしくはキナーゼ活性）または免疫学的特性を維持する配列番号２のポリペプチドフラグメントも包含する。本明細書に記述されるポリペプチドのいずれかの最低５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０もしくは１０００の連続するアミノ酸を含んで成るフラグメントが本発明により企図される。好ましいポリペプチドフラグメントは、ヒトＭＬＫ７ならびにその対立遺伝子および種の相同物に独特のもしくは特異的な抗原特性を有する。所望の生物学的および免疫学的特性を有する本発明のフラグメントは、当該技術分野で公知かつ慣例に実施される方法のいずれかにより製造することができる。付加的な好ましいフラグメントは、ＭＬＫ７のキナーゼドメイン（ＭＬＫ７ＫＤ）、ＭＬＫ７のロイシンジッパー領域（ＭＬＫ７ＬＺ）およびＭＬＫ７のロイシンジッパー領域に連結されるキナーゼドメイン（ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺ）を包含する。
【００５１】
本発明の別の局面において、ＭＬＫ７ポリペプチドの置換変異体が提供される。置換変異体は、ＭＬＫ７ポリペプチドの１個もしくはそれ以上のアミノ酸が除去されかつ代替残基で置き換えられるポリペプチドを包含する。一局面において、該置換は性質が保存的である。本発明は、しかしながら、非保存的でもまたある置換もまた包含する。この目的上の保存的置換は下に示されるとおり定義することができる。変異体ポリペプチドは、保存的置換が本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変により導入されているものを包含する。保存的置換は、類似の特性を有する１アミノ酸についての別のアミノ酸の置換として当該技術分野で認識される。例示的保存的置換は、限定されるものでないが、非極性（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌ）、極性の荷電していない（Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）、極性の荷電した（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）、芳香族（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ）ならびに他者（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＡｓｐおよびＧｌｕ）を挙げることができる。あるいは、保存的アミノ酸はＬｅｈｎｉｎｇｅｒ，（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版；ワース  パブリッシャーズ  インク（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｃｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．），ニューヨーク州ニューヨーク（１９７５），ｐｐ．７１−７７）に記述されるとおりグループ分けすることができ、ここで、保存的置換は、限定されるものでないが非極性（疎水性）１）脂肪族：Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＰｒｏ；２）芳香族：ＰｈｅおよびＴｒｐ  ３）イオウ含有：Ｍｅｔ；４）境界：Ｇｌｙ；もしくは、荷電していない極性１）ヒドロキシル：Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒ；２）アミド：ＡｓｎおよびＧｌｎ；３）スルフヒドリル：Ｃｙｓ；４）境界：Ｇｌｙ；または正に荷電した（塩基性）：Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ；もしくは負に荷電した（酸性）：ＡｓｐおよびＧｌｎを挙げることができる。なお別の代替として、例示的保存的置換は、限定されるものでないが、Ａｌａ（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）、Ａｒｇ（Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、Ａｓｎ（Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、Ａｓｐ（Ｇｌｕ）、Ｃｙｓ（Ｓｅｒ）、Ｇｌｎ（Ａｓｎ）、Ｇｌｕ（Ａｓｐ）、Ｈｉｓ（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、Ｉｌｅ（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ）、Ｌｅｕ（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ）、Ｌｙｓ（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、Ｍｅｔ（Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ）、Ｐｈｅ（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ）、Ｐｒｏ（Ｇｌｙ）、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒ（Ｓｅｒ）、Ｔｒｐ（Ｔｙｒ）、Ｔｙｒ（Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ）およびＶａｌ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ）を挙げることができる。本発明のポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の挿入、欠失もしくは置換以外の改変を担持するポリペプチドを包含することを意図していることが理解されるべきである。例として、改変は、性質が共有であるかもしれず、そして、例えばポリマー、脂質、他の有機物および無機部分との化学結合を包含する。
【００５２】
関係する一態様において、本発明は本発明の精製されたポリペプチドを含んで成る組成物を提供する。好ましい組成物は、本発明のポリペプチドに加え、ベヒクル、賦形剤、担体もしくは媒体として作用する液体、半固体もしくは固体の希釈剤を含んで成る。該組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、ベヒクル、賦形剤、担体もしくは媒体として作用する製薬学的に許容できる（すなわち無菌かつ非毒性の）液体、半固体もしくは固体の希釈剤もまた含むことができる。限定されるものでないが水、生理的食塩水溶液、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ステアリン酸マグネシウム、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、アルギン酸塩、デンプン、乳糖、ショ糖、Ｄ−ブドウ糖、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、リン酸カルシウム、鉱物油ならびにカカオバターを挙げることができる当該技術分野で既知のいかなる希釈剤も使用することができる。
【００５３】
上述されたＭＬＫ７ヌクレオチド配列のいずれかを含んで成るポリヌクレオチドは、本明細書に提供されるヌクレオチド配列から製造されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲにより合成することができる。米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号明細書を参照されたい。加えて、多数のクローン化およびインビトロ増幅の方法論が当業者に公知である。これらの技術の例は、例えば、Ｂｅｒｇｅｒら，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２，アカデミック  プレス  インク（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ），カリフォルニア州サンディエゴ（Ｂｅｒｇｅｒ）（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に見出される。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドおよびそれら由来のフラグメントは、特定の障害に関連する制限断片長多形（ＲＦＬＰ）についてのスクリーニング、ならびに遺伝子マッピングに有用である。
【００５５】
配列番号１に示されるヌクレオチド配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはフラグメント、またはＭＬＫ７をコードする本発明のヌクレオチド配列由来のそれらに相補的もしくは相同な配列は、多様な組織中での遺伝子発現をプロービングするための診断ツールとして有用である。例えば、組織は、ポリヌクレオチドの天然の発現もしくはそれに関係する病理学的状態を決定するために慣習的オートラジオグラフィー技術により検出可能な基を運搬するオリゴヌクレオチドプライマーを用いてインサイチューでプロービングすることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の調節領域、もしくは、限定されるものでないが開始コドン、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー配列、他の調節配列などを挙げることができるそれに対応するｍＲＮＡに向けられる。
【００５６】
自動化配列決定法を使用して、ＭＬＫ７ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を得るもしくは確認することができる。本発明のＭＬＫ７ポリヌクレオチド配列は１００％正確であると考えられる。しかしながら、当該技術分野で既知であるとおり、自動化された方法により得られるヌクレオチド配列は若干の誤りを含有する可能性がある。自動化により決定されるヌクレオチド配列は、典型的には、所定の核酸分子の実際のヌクレオチド配列に最低約９０％、より典型的には最低約９５％ないし最低約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野で公知である人的配列決定法を使用してより正確に決定することができる。
【００５７】
本発明の別の局面は、上述された核酸分子のいずれかを含んで成るベクターもしくは組換え発現ベクターに向けられる。ベクターは、ＭＬＫ７をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅しかつ／またはＭＬＫ７をコードするＤＮＡを発現させるのいずれかのために本明細書で使用される。好ましいベクターは、限定されるものでないが、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子もしくはウイルス、および組込み可能なＤＮＡフラグメントを挙げることができる。好ましいウイルス粒子は、限定されるものでないが、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスを挙げることができる。好ましい発現ベクターは、限定されるものでないが、ｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびｐＳＶＬ（ファルマシア  バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を挙げることができる。他の発現ベクターは、限定されるものでないが、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ｐＰＲＯＥＸベクター（ＬＴＩ、メリーランド州ベセスダ）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＱＥベクター（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））、ｐＳＥ４２０（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。
【００５８】
好ましい発現ベクターは、ＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチド配列が適する宿主中でのＭＬＫ７の発現を遂げることが可能な適する制御配列に操作可能に連結（ｌｉｎｋｅｄ）もしくは結合（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）される複製可能なポリヌクレオチド構築物である。一般に、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適するｍＲＮＡリボソーム結合をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列を包含する。好ましいベクターは、好ましくは宿主生物体により認識されるプロモーターを含有する。本発明のプロモーター配列は原核生物、真核生物もしくはウイルスであることができる。適する原核生物配列の例は、バクテリオファージλのＰＲおよびＰＬプロモーター（Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ａ．Ｄ．編，コールド  スプリング  ハーバー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９７３）（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）；Ｌａｍｂｄａ  ＩＩ，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．Ｗ．編，コールド  スプリング  ハーバー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８０）（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる））；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショックおよびｌａｃＺプロモーター、ならびにＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８１，２９０，３０４−３１０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる））を包含する。付加的なプロモーターは、限定されるものでないが、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの末端反復配列、マロニーウイルス、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、エプスタイン−バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、およびヒトメタロチオネインを挙げることができる。
【００５９】
付加的な調節配列もまた好ましいベクター中に包含されることができる。適する調節配列の好ましい例は、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子、およびバクテリオファージλの遺伝子ｃＩＩのシャイン−ダルガーノにより代表される。シャイン−ダルガーノ配列は、ＭＬＫ７をコードするＤＮＡに直接後に続かれることができ、そして成熟ＭＬＫ７の発現をもたらす。さらに、適する発現ベクターは、形質転換された宿主細胞のスクリーニングを可能にする適切なマーカーを包含することができる。複製起点もまた、外因性の起点を包含するようなベクターの構築により提供されることができるか、もしくは宿主細胞の染色体複製機構により提供されることができるかのいずれかである。ベクターが宿主細胞の染色体中に組込まれる場合は後者が十分であるかもしれない。あるいは、ウイルスの複製起点を含有するベクターを使用するよりはむしろ、当業者は、選択可能なマーカーおよびＭＬＫ７  ＤＮＡでの共形質転換の方法により哺乳動物細胞を形質転換することができる。適するマーカーの一例はデヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）もしくはチミジンキナーゼ（ｔｋ）である（米国特許第４，３９９，２１６号明細書を参照されたい）。哺乳動物発現ベクターの構築方法は、例えば、Ｏｋａｙａｍａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８３，３，２８０，Ｃｏｓｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８６，２３，９３５，Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８４，３１２，７６８，欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０３６７５６６号明細書および国際特許公開第ＷＯ  ９１／１８９８２号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に開示される。
【００６０】
本発明の別の局面は、上述された核酸分子のいずれかを含んで成る発現ベクターを有する形質転換された宿主細胞に向けられる。ヌクレオチド配列の発現は、発現ベクターが適する宿主細胞に導入される場合に起こる。本発明のポリペプチドの発現に適する宿主細胞は、限定されるものでないが原核生物、酵母および真核生物を挙げることができる。原核生物発現ベクターを使用する場合には、適切な宿主細胞はクローン化される配列を発現することが可能ないかなる原核生物細胞でもあることができる。適する原核生物細胞は、限定されるものでないが、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｍｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）を挙げることができる。
【００６１】
真核生物発現ベクターを使用する場合には、適切な宿主細胞はクローン化される配列を発現することが可能ないかなる真核生物細胞でもあることができる。好ましくは、真核生物細胞は高等真核生物の細胞である。適する真核生物細胞は、限定されるものでないが、非ヒト哺乳動物組織培養細胞およびヒト組織培養細胞を挙げることができる。好ましい宿主細胞は、限定されるものでないが、昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ細胞）、ヒト２９３細胞およびマウス３Ｔ３線維芽細胞を挙げることができる。細胞培養物中でのこうした細胞の繁殖は慣例の処置となっている（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編（１９７３）（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００６２】
加えて、酵母宿主を宿主細胞として使用してよい。好ましい酵母細胞は、限定されるものでないが、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）およびクルベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｕｃｅｓ）を挙げることができる。好ましい酵母宿主はビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。好ましい酵母ベクターは、２Ｔ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル酸化のための配列、転写終止のための配列および選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）双方での複製のためのシャトルベクターもまた本明細書に包含される。
【００６３】
あるいは、昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよい。好ましい一態様において、本発明のポリペプチドはバキュロウイルス発現系を使用して発現される（Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８，６，４７，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏ’Ｒｉｅｌｌｙら（編），Ｗ．Ｈ．フリーマン  アンド  カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク、１９９２、および米国特許第４，８７９，２３６号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。加えて、ＭＡＸＢＡＣＴＭ完全バキュロウイルス発現系（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣＴＭ系（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を、例えば昆虫細胞中での産生に使用することができる。
【００６４】
好ましくはＭＬＫ７もしくはそのフラグメントに特異的な、ＭＬＫ７に結合する抗体（例えばモノクローナルおよびポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性／二特異性抗体、人化抗体、ヒト抗体、ならびに本発明のポリペプチドを特異的に認識する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を包含する化合物を包含するＣＤＲグラフト化（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体もまた本発明により企図される。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを包含する抗体フラグメントもまた本発明により提供される。本発明の抗体を記述するのに使用される場合の「に特異的」という用語は、本発明の抗体の可変領域がＭＬＫ７ポリペプチドを独占的に認識かつ結合する（すなわち、ＭＬＫ７とこうしたポリペプチドとの間の位置を突き止められた配列の同一性、相同性もしくは類似性の可能な存在にもかかわらず結合親和性の測定可能な差異によって他の既知のＭＬＫポリペプチドとＭＬＫ７ポリペプチドを区別することが可能である）ことを示す。特異的抗体は抗体の可変領域の外側、およびとりわけ該分子の定常領域中の配列との相互作用により他のタンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡ技術における黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡもしくは他の抗体）ともまた相互作用するかもしれないことが理解されよう。本発明の抗体の結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは当該技術分野で公知かつ慣例に実施される（Ｈａｒｌｏｗら（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８），第６章を参照されたい）。
【００６５】
本発明の抗体は、（ＭＬＫ７の活性を調節することによる）治療目的、ＭＬＫ７を検出もしくは定量するための診断目的、およびＭＬＫ７の精製に有用である。本明細書に記述される目的のいずれかのための本発明の抗体を含んで成るキットもまた企図される。一般に、本発明のキットは、抗体が免疫特異的である対照抗原もまた包含する。
【００６６】
他のヒト疾患状態もしくは異常な状態において、ＭＬＫ７の発現を予防することもしくはその活性を阻害することが、疾患状態もしくは異常な状態の治療において有用であることができることが企図される。アンチセンス療法もしくは遺伝子治療が、ＭＬＫ７ポリペプチドの発現もしくは活性を調節するのに適用されるかもしれないことが企図される。
【００６７】
本発明はまた、製薬学的キットを包含するキットにも向けられる。該キットは、上述されたポリヌクレオチドのいずれか、上述されたポリペプチドのいずれか、もしくは上述されたところの本発明のポリペプチドに結合するいずれかの抗体、ならびに陰性対照を含むことができる。該キットは、好ましくは、例えば、説明書、固体支持体、定量に役立つ試薬などのような付加的な構成要素を含んで成る。
【００６８】
本発明の別の局面は、上述されたポリヌクレオチドもしくは組換え発現ベクターのいずれかおよび許容できる担体もしくは希釈剤を含んで成る製薬学的組成物を包含する組成物に向けられる。好ましくは、該担体もしくは希釈剤は製薬学的に許容できる。適する担体は、この分野の標準的参照教科書、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌ（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）の最新版に記述される。こうした担体もしくは希釈剤の好ましい例は、限定されるものでないが、水、生理的食塩水、リンゲル液、Ｄ−ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げることができる。リポソーム、および固定油のような非水性ベヒクルもまた使用することができる。製剤は、普遍的に使用される技術により滅菌する。
【００６９】
天然のリガンドおよび合成化合物を包含する特異的結合化合物は、単離されたもしくは組換えのＭＬＫ７産物、ＭＬＫ７変異体、または、好ましくはこうした産物を発現する細胞を使用して同定もしくは発生させることができる。結合化合物は、ＭＬＫ７産物を精製するために、および既知の免疫学的手順を使用する液体および組織サンプル中のＭＬＫ７産物の検出もしくは定量に有用である。結合化合物はまた、ＭＬＫ７の生物学的活性、とりわけＪＮＫストレス活性化キナーゼ経路に関与する活性の調節（すなわち封鎖、阻害もしくは刺激）においてもはっきりと有用である。従って、ＭＬＫ７ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを結合する化合物を同定することができる。
【００７０】
本発明により提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列情報はまた、ＭＬＫ７ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドが相互作用することができる結合化合物の同定も可能にする。結合化合物の同定方法は、溶液アッセイ、ＭＬＫ７ポリペプチドが固定されるインビトロアッセイ、および細胞に基づくアッセイを包含する。ＭＬＫ７ポリペプチドの結合化合物の同定は、正常および異常なＭＬＫ７の生物学的活性に関連する病変における治療的もしくは予防的介入に候補を提供する。
【００７１】
本発明は、ＭＬＫ７結合化合物を同定するためのいくつかのアッセイ系を包含する。溶液アッセイにおいて、本発明の方法は、ｉ）ＭＬＫ７ポリペプチドを１種もしくはそれ以上の候補結合化合物と接触させること、およびｉｉ）ＭＬＫ７ポリペプチドに結合する化合物を同定することの段階を含んで成る。ＭＬＫ７ポリペプチドを結合する化合物の同定は、ＭＬＫ７ポリペプチド／結合化合物複合体を単離すること、および結合化合物をＭＬＫ７ポリペプチドから分離することにより達成することができる。結合化合物の物理的、生物学的および／もしくは生化学的特性を特徴づけることの付加的な一段階もまた、本発明の他の態様で企図される。一局面において、ＭＬＫ７ポリペプチド／結合化合物複合体を、ＭＬＫ７ポリペプチドもしくは候補の結合化合物のいずれかに対し免疫特異的な抗体を使用して単離することができる。
【００７２】
なお他の態様において、ＭＬＫ７ポリペプチドもしくは候補の結合化合物のいずれかが、その単離を助長する標識（ｌａｂｅｌ）もしくは標識（ｔａｇ）を含んで成り、そして、結合化合物の本発明の同定方法は、該標識（ｌａｂｅｌ）もしくは標識（ｔａｇ）との相互作用によりＭＬＫ７ポリペプチド／結合化合物複合体を単離することの段階を包含する。この型の例示的一標識（ｔａｇ）は、そのように標識された化合物の単離を、ニッケルキレート形成を使用して可能にするポリヒスチジン配列、一般に約６個のヒスチジン残基である。当該技術分野で公知かつ慣例に使用されるＦＬＡＧ（Ｒ）標識（ｔａｇ）（イーストマン  コダック（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）、ニューヨーク州ロチェスター）のような他の標識（ｌａｂｅｌ）および標識（ｔａｇ）が本発明により包含される。
【００７３】
インビトロアッセイの一変法において、本発明は、ｉ）固定されたＭＬＫ７ポリペプチドを候補の結合化合物と接触させること、およびｉｉ）ＭＬＫ７ポリペプチドへの候補化合物の結合を検出すること、の段階を含んで成る方法を提供する。代替の一態様において、候補の結合化合物が固定されそしてＭＬＫ７の結合が検出される。固定は、支持体、ビーズもしくはクロマトグラフィー樹脂への共有結合、ならびに抗体結合のような非共有の高親和性相互作用、または固定される化合物がビオチン部分を包含するストレプトアビジン／ビオチン結合の使用を包含する、当該技術分野で公知の方法のいずれかを使用して達成することができる。結合の検出は、ｉ）固定されない化合物上の放射活性標識を使用して、ｉｉ）固定されない化合物上の蛍光標識を使用して、ｉｉｉ）固定されない化合物に対し免疫特異的な抗体を使用して、もしくはｉｖ）固定される化合物が結合される蛍光支持体を励起する固定されない化合物上の標識、ならびに当該技術分野で公知かつ慣例に実施される他の技術を使用して、達成することができる。
【００７４】
本発明はまた、ＭＬＫ７ポリペプチドの結合化合物を同定するための細胞に基づくアッセイも提供する。一態様において、本発明は、細胞の表面上で発現されたＭＬＫ７ポリペプチドを候補の結合化合物と接触させること、およびＭＬＫ７ポリペプチドへの候補の結合化合物の結合を検出することの段階を含んで成る方法を提供する。好ましい一態様において、検出は、化合物の結合により引き起こされるカルシウムの流れもしくは細胞中の他の生理学的事象を検出することを含んで成る。
【００７５】
ＭＬＫ７の活性もしくは発現を調節する（すなわち増大させる、減少させる、もしくは封鎖する）作用物質は、ＭＬＫ７ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含有する細胞とともに推定の調節物質をインキュベートすること、およびＭＬＫ７の活性もしくは発現に対する該推定の調節物質の影響を測定することにより同定することができる。ＭＬＫ７の活性を調節する化合物の選択性は、ＭＬＫ７に対するその影響を他のＭＬＫ化合物に対するその影響と比較することにより評価することができる。選択的調節物質は、例えば、抗体および他のタンパク質、ペプチド、またはＭＬＫ７ポリペプチドもしくはＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する有機分子を包含することができる。ＭＬＫ７活性の調節物質は、正常なもしくは異常なＭＬＫ７活性が関与する疾患および病理学的状態の治療で治療上有用であることができる。本明細書に記述される方法の結果として同定される化合物（結合化合物ならびに／またはＭＬＫ７ポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドの調節物質）は、限定されるものでないが、神経変性性疾患もしくは病状および炎症性の病状もしくは疾患を挙げることができるＪＮＫストレス活性化キナーゼ経路に関係する疾患および病状の治療で有用である可能性がある。代表的な疾患もしくは病状は、限定されるものでないが、アルツハイマー病（Ｚｈｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２００１，７６，４３５−４４１）、ハンチントン病（Ｙａｓｕｄａら，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，１９９９，４，７４３−７５６；Ｌｉｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，２８８７３−２８８７７）、多発性硬化症（Ｂｏｎｅｔｔｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９９９，１５５，１４３３−１４３８）、ニューロパシー疼痛（Ｒａｕｓｃｈら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，１０１，７６７−７７７）、パーキンソン病（Ｓａｐｏｒｉｔｏら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２０００，７５，１２００−１２０８）、外傷性脳傷害（Ｒａｇｈｕｐａｔｈｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，２０００，１７，９２７−９３８）、慢性関節リウマチ（Ｓｃｈｅｔｔら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，２０００，４３，２５０１−２５１２）、神経発達の間のエタノール曝露（ＭｃＡｌｈａｎｙら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２０００，１１９，２０９−２１６）、膵炎（Ｈｏｆｋｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０００，２７６，６８０−６８５）、腎嚢胞（Ａｒｎｏｕｌｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，６０１３−６０１８）、心血管系虚血（Ｆｏｒｃｅら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１９９６，７８，９４７−９５３）、高血圧（Ｘｕら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１９９６，９７，５０８−５１４）、化学療法に誘発される内皮アポトーシス、膠芽腫（Ｐｏｔａｐｏｖａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５，２４７６７−２４７７５）、タモキシフェン耐性乳癌（Ｓｃｈｉｆｆら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，２０００，９２，１９２６−１９３４）、糖尿病における高血糖レベルから生じる内皮細胞の影響（Ｈｏら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００���，１０１，２６１８−２６２４）などを挙げることができる。ＭＬＫ７ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにＭＬＫ７調節物質はまた、こうした疾患もしくは病状についての診断アッセイでも使用することができる。
【００７６】
本発明の別の局面は、ＭＬＫ７もしくはそれをコードするポリヌクレオチドを化合物と接触させること、および該化合物がＭＬＫ７もしくはそれをコードする核酸分子を結合するかどうかを決定することを含んで成る、ＭＬＫ７もしくはＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチドのいずれかに結合する化合物の同定方法に向けられる。結合は、限定されるものでないが、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，ジョン  ワイリー  アンド  サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射標識競争アッセイ、ファージに基づく発現クローニング、クロマトグラフィーによる共分画、共沈殿、架橋、相互作用捕捉／２ハイブリッド分析、サウスウェスタン分析、ＥＬＩＳＡなどを挙げることができる、当業者に公知である結合アッセイにより測定することができる。スクリーニングされるべき化合物は、限定されるものでないが、細胞外、細胞内、生物学的もしくは化学的起源を挙げることができる（ＭＬＫ７もしくはそれをコードする核酸分子を結合することが疑われる化合物を包含してよい）。こうした試験で使用されるＭＬＫ７ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドは、溶液中で遊離、固体支持体に結合される、細胞表面上を運ばれる、もしくは細胞内に配置される、または細胞の一部分と会合されるのいずれかであってよい。当業者は、例えば、ＭＬＫ７と試験されている化合物との間の複合体の形成を測定することができる。あるいは、当業者は、試験されている化合物により引き起こされるＭＬＫ７とその基質との間の複合体形成の減少を検査することができる。
【００７７】
本発明の別の局面は、ＭＬＫ７をある化合物と接触させること、および、該化合物がＭＬＫ７の活性を改変するかどうかを決定することを含んで成る、ＭＬＫ７の活性を調節する（すなわち増大もしくは減少させる）化合物の同定方法に向けられる。比較された試験の存在下での活性は、試験化合物の非存在下での活性に対する尺度である。本発明のＭＬＫ７ポリペプチドの活性は、例えばキナーゼ活性、もしくは限定されるものでないがＭＫＫ４およびＭＫＫ７を挙げることができる特定の基質をリン酸化する能力を検査することにより測定することができる。
【００７８】
本発明の好ましい態様において、ＭＬＫ７活性を調節する化合物のスクリーニング方法は、試験化合物をＭＬＫ７と接触させること、および該化合物とＭＬＫ７との間の複合体の存在についてアッセイすることを含んで成る。こうしたアッセイにおいてはリガンドが典型的に標識される。適するインキュベーション後に、遊離のリガンドを結合された形態で存在するものから分離し、そして遊離のもしくは複合体形成されない標識の量が、ＭＬＫ７に結合する特定の化合物の能力の尺度である。
【００７９】
本発明により企図される候補調節物質は、潜在的活性化物質もしくは潜在的阻害剤のいずれかのライブラリーから選択される化合物を包含する。ｉ）化学物質のライブラリー、ｉｉ）天然産物のライブラリーおよびｉｉｉ）無作為のペプチド、オリゴヌクレオチドもしくは小有機分子より構成されるコンビナトリアルライブラリーを包含する、小分子調節物質の同定に使用される多数の多様なライブラリーが存在する。化学物質のライブラリーは無作為の化学構造よりなり、そのいくつかは、既知化合物の類似物または他の薬物発見スクリーニングにおいて「ヒット（ｈｉｔ）」もしくは「リード（ｌｅａｄ）」と同定された化合物の類似物であり、そのいくつかは天然産物由来であり、そしてそのいくつかは直接的でない（ｎｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成有機化学から生じる。天然産物のライブラリーは：ｉ）土壌、植物もしくは海洋微生物からの培養液の醗酵および抽出、またはｉｉ）植物もしくは海洋生物体の抽出によりスクリーニングのための混合物を創製するのに使用される微生物、動物、植物もしくは海洋生物体の集合物である。天然産物のライブラリーは、ポリケチド、非リボソームペプチドおよびそれらの（天然に存在しない）変異体を包含する。コンビナトリアルライブラリーは、混合物としての多数のペプチド、オリゴヌクレオチドもしくは有機化合物から構成される。これらのライブラリーは伝統的な自動化合成法、ＰＣＲ、クローニングもしくは占有の合成法により製造するのが相対的に容易である。非ペプチドコンビナトリアルライブラリーがとりわけ興味深い。目的の他のライブラリーは、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、多平行（ｍｕｌｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）合成集合物、リコンビナトリアル（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）およびポリペプチドのライブラリーを包含する。本明細書に記述される多様なライブラリーの使用による調節物質の同定は、活性を調節する「ヒット」の能力を至適化するような「ヒット」（もしくは「リード」）候補の改変を可能にする。
【００８０】
試験リガンドの標的タンパク質への直接結合を測定することにより標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイ、ならびにイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法もしくは他の物理的および分析方法を用いる親和性限外濾過により標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイを包含する他のアッセイを、ＭＬＫ７ポリペプチドに結合するもしくはその活性を調節する化合物を同定するのに使用することができる。あるいは、こうした結合相互作用は、Ｆｉｅｌｄｓら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４０，２４５−２４６、およびＦｉｅｌｄｓら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，１０，２８６−２９２（それらの双方はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される酵母２ハイブリッド系を使用して間接的に評価される。
【００８１】
特定の一態様において、本発明のスクリーニング方法により同定される新規化合物は低分子量有機分子であり、この場合に、組成物もしくは製薬学的組成物を経口摂取用として、例えば錠剤として調製することができる。本明細書に記述されるスクリーニング法により同定される核酸分子、ベクター、ポリペプチド、抗体および化合物を含んで成る組成物もしくは製薬学的組成物は、限定されるものでないが、経口、静脈内、皮膚、皮下、鼻、筋肉内もしくは腹腔内を挙げることができるいずれかの投与経路のために製造することができる。担体もしくは他の成分の性質は、特定の投与経路、および投与されるべき本発明の特定の態様に依存することができる。この情況で有用である技術およびプロトコルの例は、とりわけ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ（編），１９８０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）で見出される。
【００８２】
これらの低分子量化合物の投薬量は、治療されるべき疾患状態もしくは病状、ならびにヒトもしくは動物の体重および病状のような他の臨床的要因、ならびに該化合物の投与経路に依存することができる。ヒトもしくは動物を治療するために、およそ０．５ｍｇ／ｋｇ体重ないし５００ｍｇ／ｋｇ体重の間、およそ１．０ｍｇ／ｋｇ体重ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重の間、もしくはおよそ１０ｍｇ／ｋｇ体重ないし５０ｍｇ／ｋｇ体重の間の化合物を投与することができる。治療は、典型的にはより低い投薬量で投与し、そして所望の治療転帰が観察されるまで継続する。適正投薬量は、治療されている疾患の型、使用されている特定の組成物、ならびに患者の大きさおよび生理学的状態のような多様な因子に依存する。本明細書に記述される化合物の治療上有効な用量は、当初は、細胞培養物および動物のモデルから推定することができる。例えば、細胞培養物アッセイで決定されるところのＩＣ５０を最初に考慮に入れる循環濃度範囲を達成するように、用量を動物モデルで処方することができる。動物モデルのデータを使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【００８３】
本発明の別の局面は、ＭＬＫ７、およびＭＬＫタンパク質のいずれかを含有するヘテロ二量体に向けられる。ファミリーメンバー間のロイシンジッパー依存性のヘテロ二量体の報告が存在する。例えば、ＭＬＫ３は共発現されたＭＬＫ２を共免疫沈降させることができる（Ｌｅｕｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，３２４０８−３２４１５）。同一細胞中での共発現は、これらのタンパク質のヘテロ二量体ならびにホモ二量体をもたらす可能性がある。ヘテロ二量体はホモ二量体に比較して独特の活性を有しかつ上述された方法でのスクリーニングのための付加的な標的を表す可能性がある。
【００８４】
本明細書に開示される発明がより効率的に理解されることができるために、実施例を下に提供する。これらの実施例は具体的説明の目的上のみであり、そしていかなる様式でも本発明を制限すると解釈されるべきでないことが理解されるべきである。これらの実施例を通じて、分子クローニング反応および他の標準的組換えＤＮＡ技術は、別の方法で示される場合を除き、商業的に入手可能な酵素を使用して、Ｍａｎｉｔａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，コールド  スプリング  ハーバー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）（下で「Ｍａｎｉｔａｔｉｓら」）に記述される方法に従って実施した。下の実施例１および２は実際である。実施例３は予言的である。
【実施例】
【００８５】
実施例１：ヒトＭＬＫ７をコードするポリヌクレオチドの単離
Ａ．ヒトＭＬＫ７をコードするｃＤＮＡの単離
最近付加されたヒトゲノムＤＮＡ配列の調査は、混合系統キナーゼファミリーの推定の第７のメンバーを示した。ＭＬＫ７と呼称されるこのヒトキナーゼは、第一染色体のｑ４２．２−ｑ４３への完了されたゲノム配列マッピング、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）受託番号ＡＬ１３３３８０で見出された。推定のキナーゼドメインの整列は、このタンパク質を、その最も近い関係物（ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）ＭＬＫ１および３に対する７６％の相同性を伴い、以前に定義されたＭＬＫ１−３サブファミリーに置く。図２に示される推定のロイシンジッパー領域もまた、このタンパク質を、わずか６アミノ酸伸長により分離される４個の推定のα−らせん反復を有するそのサブファミリー中に置くとみられる。完全長タンパク質はＭＬＫ１と最高の相同性を有し（４４％の同一性）、これは該タンパク質の推定のＮおよびＣ末端双方の試験的同定を可能にするのに十分であった。２個のみの最近寄託されたＭＬＫ７  ＥＳＴがジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）に存在し（胃からの受託番号ＡＷ８１３６７５およびリンパ組織（胚中心Ｂ細胞）からのＡＷ４０８６３９）、このゲノム領域が発現されそして偽遺伝子でなかったことの付加的な証明を必要とした。ＭＬＫ７をコードするｃＤＮＡの部分を含有するクローンを、プールされたヒト副腎、成体脳、腎、肝、リンパ節、膵、前立腺および胃のｃＤＮＡライブラリー（エッジ  バイオシステムズ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））のＰＣＲスクリーニングを使用して得た。該ライブラリーをスクリーニングするのに使用されたＰＣＲプライマーは、５’−ＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣ−３’（配列番号４）および５’−ＡＧＧＴＡＡＡＣＴＧＡＴＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号５）であった。該ｃＤＮＡの中央部分をコードする１つの部分的ｃＤＮＡを反復して単離した。他のクローンはゲノム配列を含有したか、もしくは無関係であった。これらのデータは、このｃＤＮＡがこれらのライブラリー中で非常に低い豊富さ（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）のものであることと矛盾しない。この配列をその後、ＭＬＫ１との相同性に基づくＰＣＲにより５’および３’端で伸長させた。５’ＲＡＣＥによる伸長もまた試みたが、しかし、このｃＤＮＡの低い豊富さおよび例外的に高いＧＣ含量により不成功であった。
【００８６】
完全長ヒトＭＬＫ７  ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ６−Ｖ５Ｈｉｓプラスミド（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に集成した。該プラスミドは、Ｃ末端エピトープおよび親和性精製融合パートナーと同じ読み枠で完全長のヒトｃＤＮＡ（終止コドンを伴わない）を含有し、そしてｐｃＤＮＡ６−ｈＭＬＫ７と同定される。このプラスミド、ｐｃＤＮＡ６−ｈＭＬＫ７を、受託番号ＡＴＣＣのもとに２００１年５月２４日にアメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９への寄託のため提出した。ヒトＭＬＫ７の完全長ｃＤＮＡおよび推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および２に提供する。
Ｂ．混合系統キナーゼファミリーのメンバーとの構造比較
混合系統キナーゼファミリーの６メンバーのキナーゼドメインを、ＭＬＫ７の推定のキナーゼドメインと整列されて示す（図１）。チロシンキナーゼ、セリン／トレオニンキナーゼもしくは双方で保存されるアミノ酸を呼称されるとおり示す（Ｈａｎｋｓら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９１，２００，３８−６２からのコンセンサスアミノ酸）。ＭＬＫ７は、混合系統キナーゼファミリーの他のメンバー同様、キナーゼドメインの大部分を通じてチロシンキナーゼと相同性を共有する。サブドメインＶＩｂの触媒ドメインの配列ＨＲＤＬＫＳＲＮ（配列番号３）中のリシンの存在は、ＭＬＫファミリーの他のメンバー同様、これがセリン／トレオニンリン酸化を触媒するとみられることを示唆する。ＭｅｇＡｌｉｇｎプログラム（レーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）ＤＮＡｓｔａｒ）中のクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（ＰＡＭ２５０残基重み表（ｒｅｓｉｄｕｅ  ｗｅｉｇｈｔ  ｔａｂｌｅ）を用いる）を使用するこれらのキナーゼドメインの整列は、ＭＬＫ７がＭＬＫ１−３サブファミリーのメンバーであることを予測する（図２）。ＭＬＫファミリーのキナーゼドメイン間の相同性パーセントを表１に示す。
【００８７】
【表１】
2004537291.tif 000002
【００８８】
完全長のＭＬＫ７タンパク質は、キナーゼドメインのものより、該ファミリーに対するより弱い相同性（上述されたと同一の分析を使用して）を示す（表２）。
【００８９】
【表２】
2004537291.tif 000003
【００９０】
キナーゼドメインに対しＮ末端に推定のＳＨ３ドメインが存在する。キナーゼドメインに対しＣ末端に推定の二重ロイシンジッパー領域、次いで数種のタンパク質からの核局在化シグナルに類似の圧倒的に優勢な塩基性アミノ酸から構成される小さい領域もまた存在する。推定のロイシンジッパー領域（図４）もまた、ＭＬＫ７をＭＬＫ１−３サブファミリーに置き、わずか６アミノ酸伸長により分離される４個の推定のα−らせん反復を有する。完全長のタンパク質はＭＬＫ１との高い相同性を有し（４３．１％）、これは該タンパク質の推定のＮおよびＣ末端双方の同定を可能にするのに十分であった。この相同性を使用して、完全長のＭＬＫ７  ｃＤＮＡをクローン化した。ＭＬＫ７のドメイン構造を図３に示す。ＭＬＫ７のロイシンジッパー領域の配列を図４に示しかつ他のＭＬＫタンパク質と比較する。
Ｃ．ｈＭＬＫ７の発現プロフィル
ｈＭＬＫ７の組織分布を、ＲａｐｉｄＳｃａｎＴＭ遺伝子発現パネル（オリジーン（Ｏｒｉｇｅｎｅ））を使用して評価した。ＲａｐｉｄＳｃａｎＴＭは、２４種の異なる組織由来の第一鎖ｃＤＮＡを使用して９６穴プレートの形式での発現プロフィルを生成させるための、ＰＣＲに基づくアプローチである。これら２４種のｃＤＮＡを、ＰＣＲの直線範囲内での増幅および可視化を可能にする４対数希釈で配列する。該プロトコルは、ＰＣＲ反応が、遺伝子特異的プライマー対を使用しかつ増幅をアガロースゲル上で可視化する、９６穴サーマルサイクラーで実施されることを必要とする。表３は、パネルの二重のスクリーニングから得られた定性的データを示す。
【００９１】
【表３】
2004537291.tif 000004
【００９２】
これらの実験は、プライマー対ＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣ（配列番号４）およびＡＧＧＴＡＡＡＣＴＧＡＴＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧ（配列番号５）を利用した。このＭＬＫ７分析における＋＋の得点は、２種の最高のｃＤＮＡ濃度での可視的ＰＣＲ産物を示す。組織スクリーニングの半分以上がほとんどもしくは全くない検出可能な産物を生じ、これはＭＬＫ７  ｍＲＮＡがいかなる組織中でも高い豊富さにないことを示唆した。
実施例２：生物学的に活性のＭＬＫ７の組換え発現
Ａ．哺乳動物細胞中での完全長のＭＬＫ７発現によるＪＮＫ経路の活性化
哺乳動物細胞中で過剰発現されるＭＬＫファミリーメンバーはｃＪｕｎ−ＮＨ２末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路を活性化する（Ｈｉｒａｉら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５１６７；Ｍｅｒｒｉｔｔら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１０１９５）。完全長ＭＬＫ７が同一のことをなすかどうかを決定するために、ＣＨＯ細胞を、ＭＬＫ７の構成的発現およびＪＮＫ１の構成的発現を駆動するプラスミドでコトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡによりライセート中のＪＮＫ活性を測定した。
【００９３】
完全長のＭＬＫ７のコーディング領域を、Ｃ末端Ｖ５エピトープおよびＨｉｓ６親和性精製融合パートナーと同じ読み枠で哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ６Ｖ５／ＨｉｓＡ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に挿入した。各プラスミドを、製造元の推奨に従って、試薬リポフェクタミンプラス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰＬＵＳ）（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用して、６穴皿中にプレーティングされたＣＨＯ細胞に、ＪＮＫ１発現ベクターとともにコトランスフェクトした。二重の培養物を各条件についてトランスフェクトした。陽性対照として、ＭＬＫ３の発現ベクターをＭＬＫ７の代わりに用い；陰性対照として、空（ｅｍｐｔｙ）ベクター（タンパク質コーディング領域なし）を代わりに用いた。トランスフェクション２日後に、血清使用量低減培地（ＤＭＥＭおよび０．５％ウシ胎児血清）中で、細胞を３濃度（２５０ｎＭ、１μＭおよび５μＭ）のＣＥＰ１１００４もしくはＤＭＳＯベヒクル対照で６時間処理した。この処理の終了時に、細胞を氷冷リン酸緩衝生理的食塩水で２回洗浄し、そして、ウェルあたり０．１ｍｌの１％（ｖ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、２０ｍＭトリス  ｐＨ７．６、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１ｍＭペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）ＳＣ、１０μＭ  Ｅ−６４、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル（２５ｍＭ  β−グリセロリン酸、２ｍＭ活性化オルトバナジン酸ナトリウム）で溶解した。トランスフェクトされた細胞のライセート中のＪＮＫ活性を、受容体チロシンキナーゼについて記述されたところのＥＬＩＳＡに基づく形式（Ａｎｇｅｌｅｓら，１９９６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３６，４９−５５）を使用して測定した。ＪＮＫ基質ｃＪｕｎ（残基１−７９）のＮＨ２末端をＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させ、そして標準的グルタチオン親和性法により精製した。Ｓｍｉｔｈら，Ｇｅｎｅ，１９８８，６７，３１−４０。９６穴マイクロタイタープレート（フルオロヌンク（ＦｌｕｏｒｏＮＵＮＣ）マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ））を基質溶液（トリス緩衝生理的食塩水中１０μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ｃＪｕｎ）で被覆し、その後洗浄緩衝液（トリス緩衝生理的食塩水中０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０）で数回洗浄した。プレートを、ブロッキング緩衝液（トリス緩衝生理的食塩水中３％ＢＳＡおよび０．２％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０）で３７Ｃで１時間ブロッキングし、その後洗浄緩衝液で数回洗浄した。その後、濃縮されたアッセイ緩衝液、次いで各サンプルについて等しいタンパク質に相当するライセートを各ウェルに添加した。キナーゼ反応を、ＡＴＰを５０μＭまで添加すること、および３７Ｃで１５分間インキュベートすることにより開始した。最終アッセイ混合物（ウェルあたり１００μｌ）は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．０２％ＢＳＡ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、２５ｍＭ  β−グリセロリン酸、０．１ｍＭ活性化オルトバナジン酸ナトリウムおよび５０μＭ  ＡＴＰを含有した。キナーゼ反応を、８３ｍＭまでのＥＤＴＡの添加により終了させ、そしてプレートを洗浄緩衝液で数回洗浄した。リン酸化された生成物を、抗ホスホ−ｃＪｕｎ（Ｓｅｒ７３）抗体（ＮＥＢ  ９１６４、ブロッキング緩衝液中５０００倍）とのインキュベーション、洗浄、ヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合物（サザン  バイオテクノロジー  アソシエーツ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）＃４０５０−０４；ブロッキング緩衝液中２５００倍）とのインキュベーション、洗浄、および３７Ｃで３０分間の蛍光発生性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）アルカリホスファターゼ基質４−メチルウンベリフェリルホスフェート（１．０Ｍジエタノールアミン、ｐＨ９．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中０．０２ｍｇ／ｍｌ）との反応により検出した。反応を１．０Ｍ二塩基性リン酸ナトリウムで停止し、そして生成物をマイクロプレートリーダー（サイトフルオル（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）、励起３６０ｎｍ、発光４６０ｎｍ）で測定した。予備的ＥＬＩＳＡを実施して、直線状シグナルを生じたライセートタンパク質の最大量を決定した。この実験で、ＭＬＫ３が制限するサンプルであり、８０ｎｇまでのみのライセートタンパクが直線性を維持した。その後、アッセイを８０ｎｇの各ライセートで実施した。
【００９４】
ＭＬＫ７の発現を、Ｖ５エピトープ標識に対する抗体で細胞ライセートのウェスタンブロットをプロービングすることにより確認した（データは示されない）。ＭＬＫ７は１２０ｋＤａに対応する見かけの移動度で出現した（１１７．４ｋＤａと期待される）。ＭＬＫ７の発現は、ＪＮＫ活性を、ベクター対照を上回り上昇させた（図５）。ＭＬＫ７でトランスフェクトされた細胞の、ＣＥＰ１１００４での処理は、この処理がＭＬＫ３でトランスフェクトされた細胞になすまさにそのとおりにＪＮＫ活性を部分的に低下させた。これらのデータは、ＭＬＫ７が、他のＭＬＫファミリーメンバーとまさに同様に、およびインビトロデータにより予測されるまさにそのとおりに、哺乳動物細胞中でＪＮＫ経路を活性化することを確認する。
Ｂ．組換えＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＭＤ／ＬＺのインビトロ活性
キナーゼドメイン（アミノ酸９３−４１６）もしくはキナーゼドメイン／ロイシンジッパー（アミノ酸９３−４８９）のいずれかをコードするヒトＭＬＫ７タンパク質の一部分を、標準的方法（例えば、Ｍｅｙｅｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，１９９４，６２，８２５−８３３）を使用してＳｆ２１昆虫細胞中でＮＨ２末端ＧＳＴ融合パートナーとともに発現させ、そしてグルタチオン親和性精製法（Ｓｍｉｔｈら，Ｇｅｎｅ，１９８８，６７，３１−４０）を使用して精製した。バキュロウイルスのヒトＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺのキナーゼ活性を、３種の異なる基質、すなわちキナーゼが死んだ（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ）形態のＧＳＴ−ＭＫＫ４およびＧＳＴ−ＭＫＫ７、ならびにミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を使用して立証した。加えて、２種のＧＳＴ−ＭＬＫ７の形態によるＪＮＫ経路の活性化の活性化がインビトロで示された。ＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺ双方が、不活性化されたＭＬＬ４をリン酸化することが可能であり、そしてこのリン酸化事象の結果として、ＭＫＫ４が活性化され、そしてそのタンパク質基質ＧＳＴ−ＪＮＫ１β１（Ｋ５５Ａ）をリン酸化することが可能であった。類似の結果が、不活性化されたＭＫＫ７をＭＬＫ７の下流の標的として使用した場合に得られた。
Ｃ．ミエリン塩基性タンパク質のリン酸化
バキュロウイルスのＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺのキナーゼ活性を、プロテインキナーゼＣについて記述された（Ｐｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，１９９６，１：４７−５１）ところのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）マルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）ＴＣＡ「プレート中（ｉｎ−ｐｌａｔｅ）」形式を使用して個別に評価した。簡潔には、各５０μｌのアッセイ混合物は、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  β−グリセロリン酸、１００μＭ  ＡＴＰ、０．２５μＣｉ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ、５００μｇ／ｍｌミエリン塩基性タンパク質（ＵＢＩ＃１３−１０４）および０．１〜５μｇ／ｍｌのバキュロウイルスのＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ（もしくはＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺ）を含有した。サンプルを３７Ｃで１５分間インキュベートした。氷冷５０％ＴＣＡを添加することにより反応を停止し、そしてタンパク質を４Ｃで３０分間沈殿させた。その後、プレートを氷冷２５％ＴＣＡで洗浄した。スーパーミックス（Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）シンチレーションカクテルを添加し、そして、プレートを、ワラック（Ｗａｌｌａｃ）マイクロベータ（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ）１４５０ＰＬＵＳシンチレーション計数器を使用して計数する前に１〜２時間平衡化させた。
【００９５】
ＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺ双方が、包括的タンパク質キナーゼ基質、ミエリン塩基性タンパク質をリン酸化することが可能であった（図６）。形成されるリン酸化された生成物の量（放射活性カウントとして報告される）はアッセイで使用される酵素の量に依存した。バキュロウイルスのＧＳＴ−ＫＬＭ３ＫＤを、混合系統キナーゼファミリーのメンバーによるミエリン塩基性タンパク質のリン酸化を示すために、この分析において対照酵素として使用した。
Ｄ．キナーゼ不活性のＧＳＴ−ＭＫＫ４およびＧＳＴ−ＭＫＫ７のリン酸化
ＪＮＫ経路中の２種の既知のＭＡＰＫＫタンパク質のキナーゼ不活性バージョン、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７を、細菌中でＮ末端ＧＳＴ融合パートナーとともに完全長タンパク質として発現させ、そして標準的グルタチオン親和性精製プロトコルを使用して精製する。Ｓｍｉｔｈら，Ｇｅｎｅ，１９８８，６７，３１−４０。これらを使用してＭＬＫ７のキナーゼドメインの活性化を評価する。
【００９６】
バキュロウイルスのヒトＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺのキナーゼ活性の評価を、受容体チロシンキナーゼについて記述されたＥＬＩＳＡに基づくアッセイ（Ａｎｇｅｌｅｓら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，２３６，４９−５５）の変法を使用して実施した。９６穴マイクロタイタープレート（フルオロヌンク（ＦｌｕｏｒｏＮＵＮＣ）マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ））を、２０μｇ／ｍｌの基質溶液（トリス緩衝生理的食塩水中ＧＳＴ−ＭＫＫ４（Ｋ１１３Ａ）もしくはＧＳＴ−ＭＫＫ７β１（Ｋ１４９Ａ））で４Ｃで一夜被覆した。その後、プレートをブロッキング緩衝液（０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含有するトリス緩衝生理的食塩水中３％ＢＳＡ）で３７Ｃで１時間ブロッキングした。２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、５０μＭ  ＡＴＰ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＥＧＴＡおよび２５ｍＭ  β−グリセロリン酸を含有する１００μｌのアッセイ混合物をその後プレートに添加した。キナーゼ反応を、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトバキュロウイルスＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤもしくはＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺを添加することにより開始し、そしてプレートを３７Ｃで１５分間インキュベートさせた。リン酸化された産物を、ブロッキング緩衝液中５０００倍希釈のホスホトレオニン抗体（ＮＥＢ＃２２６−１）を添加することにより検出した。３７Ｃで１時間インキュベーション後に、１００μｌのブロック緩衝液中２００００倍希釈のユーロピウム−Ｎ１標識抗ウサギ抗体（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）＃ＡＤ０１０５）を添加し、そしてプレートを３７Ｃで別の１時間インキュベートした。その後、低ｐＨ増強溶液（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）＃１２４４−１０５）を添加し、そしてプレートを室温で５分間穏やかに攪拌した。生じる溶液の蛍光を、ビクター（Ｖｉｃｔｏｒ）２マルチラベル  カウンター（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）（モデル＃１４２０−０１８）を使用して測定した。
【００９７】
セリン／トレオニンタンパク質キナーゼの混合系統キナーゼサブファミリーのメンバーは、ＭＫＫ４（Ｒａｎａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，２７１，１９０２５−１９０２８；Ｈｉｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１５１６７−１５１７３）、ならびにＭＫＫ７（Ｈｉｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，７４０６−７４１２；Ｍｅｒｒｉｔｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４，１０１９５−１０２０２）をリン酸化かつ活性化することが示されている。これら２種のＭＫＫタンパク質を、従って、バキュロウイルスのＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺの酵素活性を検査するために利用した。図７に示されるとおり、双方の形態のバキュロウイルスのＧＳＴ−ＭＬＫ７は、２種のＭＫＫタンパク質基質すなわちＧＳＴ−ＭＫＫ４（Ｋ１１３Ａ）およびＧＳＴ−ＭＫＫ７（Ｋ１４９Ａ）のリン酸化を触媒した。生成物の形成（蛍光単位として報告される）は使用された酵素の濃度に比例した。比活性に関して、双方のＧＳＴ−ＭＬＫ７の形態はＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤ（対照酵素）より少なく活性であり、ＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤはＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺより約２倍より高い活性を表した。他のＭＬＫ反応に一致して、ＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺ双方の活性はＥＤＴＡにより阻害され、金属イオン（Ｍｇ＋２）に対する要件を賦与した（データは示されない）。ここで記述されるＥＬＩＳＡに基づくアッセイはＭＬＫ７の阻害剤を同定するために潜在的に利用することができる。
Ｅ．ＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺによるＪＮＫ経路のインビトロ活性化
双方の形態のＭＬＫ７がインビトロでＭＫＫ４およびＭＫＫ７をリン酸化することが可能であった（図７）ため、ＭＬＫ７は、ＭＬＫファミリーの他のメンバーと同様、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ経路を活性化することができる（Ｔｉｂｂｌｅｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９６，１５，７０２６−７０３５；Ｈｉｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１５１６７−１５１７３；Ｈｉｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，７４０６−７４１２）。ＭＬＫ７がＭＫＫの直接活性化物質であることを立証するために、インビトロキナーゼカスケード反応を実施した。この系は、組換えＧＳＴ−ＭＬＫ７、不活性化されたＭＫＫ４／７、およびキナーゼ不活性のＧＳＴ−ＪＮＫ１β１（Ｋ５５Ａ）を利用し、そして、ＭＫＫ４／７のＭＬＫ７に触媒されるリン酸化／活性化を、活性化されたＭＫＫ４／７による不活性のＧＳＴ−ＪＮＫ１のリン酸化に結び付けた。
【００９８】
アッセイは、最初に、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２、５０μＭ  ＡＴＰ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＥＧＴＡおよび２５ｍＭ  β−グリセロリン酸を含有するキナーゼ反応混合物中で、不活性化されたＭＫＫ４／７をＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤもしくはＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺとともに３７Ｃで１５分間インキュベートすることにより実施した。ＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤは対照酵素として利用した。この混合物のアリコート（前活性化されたＭＫＫ４／７；生成物１）を、ＭＫＫ４／７アッセイ混合物を含有するポリプロピレン製の未処理の９６穴マイクロタイタープレートに添加した。ＭＫＫ４／７反応は、キナーゼが死んだＧＳＴ−ＪＮＫ１β１（Ｋ５５Ａ）の添加を除き、ＧＳＴ−ＭＬＫ７反応と同一のアッセイ緩衝液を利用した。反応を３７Ｃで１５分間進行させ、その後１００ｍＭ  ＥＤＴＡで停止させた（生成物２）。リン酸化されたＪＮＫ１の分析を、生成物２をフルオロヌンク（ＦｌｕｏｒｏＮＵＮＣ）マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）９６穴マイクロタイタープレートに移すことにより実施した。３７Ｃで１時間インキュベーション後に、プレートをＴＢＳＴ中３％ＢＳＡでブロッキングした。検出抗体、ホスホ特異的ＪＮＫ抗体（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）＃Ｖ７９３１／２）を添加し、そしてプレートを３７Ｃで１時間インキュベートした。二次抗体、Ｅｕ−Ｎ１標識抗ウサギ抗体（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）＃ＡＤ０１０５）の添加が直ちに続き、そしてプレートを３７Ｃで別の１時間インキュベートした。低ｐＨ増強溶液（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）＃１２４４−１０５）をその後添加し、そして生じる溶液の蛍光を、ビクター（Ｖｉｃｔｏｒ）２マルチラベルカウンター（Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）（モデル＃１４２０−０１８）を使用して測定した。
【００９９】
図８（棒７および８）に示されるとおり、ＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺ双方がＭＫＫ４をリン酸化することが可能であり、そして、このリン酸化事象の結果として、ＭＫＫ４は活性化され、また、そのタンパク質基質ＧＳＴ−ＪＮＫ１β１（Ｋ５５Ａ）をリン酸化することが可能であった。類似の結果が、ＭＬＫ７の下流の標的としてのＭＫＫ７で観察された（図８、棒１０および１１）。ＭＬＫ３（対照酵素；図８の挿入図を参照されたい）に関して、ＭＬＫ７ＫＤおよびＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺに駆動されるＪＮＫ活性化シグナルはより弱く、これらの酵素調製物の観察されたより低い比活性を反映した（図６および７）。全体として、インビトロのデータは、ＭＬＫ７がＭＫＫ４／７をリン酸化かつ活性化することができ、それによりＪＮＫ／ＳＡＰＫ経路中でＭＡＰＫＫキナーゼとして作用することを示す。
実施例３：阻害剤についてスクリーニングするためのＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ酵素アッセイを使用することの実行可能性
ＭＬＫの酵素活性を、ＭＢＰリン酸化アッセイでさらに評価し、そしてＡＴＰおよびＭＢＰの見かけのミカエリス定数（Ｋｍ）を決定することができる。ＡＴＰおよびＭＢＰの見かけのＫｍ値は、それぞれ約１０３μＭおよび２１μＭであると期待される。これらの値をＭＬＫ１−３について得られた値と比較することができる。それらのタンパク質は、キナーゼドメイン、もしくはＮ末端ＧＳＴ融合パートナーを伴うキナーゼおよびロイシンジッパードメインのいずれかの短縮としてもまた発現される。
【０１００】
ＭＬＫ７活性の初期評価を、放射活性ＭＢＰリン酸化アッセイを使用して実施する。ＥＬＩＳＡアッセイを、動的および阻害研究を実施するためにより低い酵素濃度で十分なシグナルを得るために採用する。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡアッセイプロトコル：アッセイは、トリス緩衝生理的食塩水（ＴＢＳ）で希釈された１０μｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＭＫＫ４（キナーゼが死んだ突然変異体）で被覆された９６穴フルオロヌンク（ＦｌｕｏｒｏＮｕｎｃ）マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）ＥＬＩＳＡプレートで実施する。被覆は、ＭＫＫ４基質をウェル中で加湿チャンバー中４Ｃで１６時間静置させることにより達成する。被覆した後に、過剰の緩衝液を吸引し、プレートを０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（ｖ／ｖ）を含有するＴＢＳで３回洗浄し、そしてＴＢＳ−Ｔ中３％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）（２００μｌ／ウェル）で３７Ｃで１時間ブロッキングする。全部のその後のインキュベーションは、１００μｌ／ウェルの容量を使用して加湿チャンバー中３７Ｃで１時間実施する。ブロッキングした後にプレートをＴＢＳ−ＴおよびＴＢＳでそれぞれ３回洗浄する。キナーゼ反応は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３０μＭ  ＡＴＰ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５ｍＭ  ＥＧＴＡおよび２５ｍＭ  β−グリセロリン酸（９０μｌ／ウェル）、ならびに５０ｎｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ（１０μｌ／ウェル）中、３７Ｃで３０分間実施する。陰性対照として、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（３０μｌ／ウェル）を、インキュベーション前に反応に添加する。プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、そしてリン酸化されたＭＫＫ４を検出するポリクローナル抗体２２６．１（ニュー  イングランド  バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を、ブロッキング緩衝液中５０００倍希釈でウェルに添加する。インキュベーション後にプレートを洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体を、ブロッキング緩衝液中２５００倍希釈で添加する。１時間のインキュベーションおよびプレート洗浄後に、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度）をウェルに添加し、そして４５分間発色させる。反応を０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４で終了させ、そして３６０ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長で蛍光プレートリーダーで読み出す。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡの至適化：ＥＬＩＳＡを、基質の好みおよびコーティング濃度、一次抗体希釈ならびに蛍光発生性基質の発色時間に関して至適化する。マグネシウムイオンの要件、還元剤に対する感受性およびＤＭＳＯもまた評価することができる。ＭＫＫ４およびＭＫＫ７双方の、キナーゼが死んだ突然変異体は、ＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤによるリン酸化に適する基質であり、そして増大する基質濃度とのシグナル強度の用量依存性の増大を立証すると期待される。その後の実験は基質として２０μｇ／ｍｌのＭＫＫ４を使用して慣例に実施する。一次抗体２２６．１（ニュー  イングランド  バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））希釈物をアッセイし、そして、ＥＬＩＳＡに使用される条件下で、５０００倍希釈が至適であると決定した。
【０１０３】
２種の参照キナーゼ阻害剤、Ｋ２５２ａおよびスタウロスポリンを、ＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ活性を阻害するそれらの能力について検査することができる。
【０１０４】
本文書で引用もしくは記述される各特許、特許出願および刊行物の開示は、これによりそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
本発明の多様な改変が、本明細書に記述されるものに加えて、前述の記述から当業者に明らかであろう。こうした改変もまた、付属として付けられる請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】発明にかかる、代表的キナーゼサブドメイン整列、ならびにｓｄｓｃ．ｅｄｕ／Ｋｉｎａｓｅｓ／ｐｋｒ／ｐｋ＿ｃａｔａｌｙｔｉｃ／ｐｈ＿ｈａｎｋｓ＿ｓｅｑ＿ａｌｉｇｎ＿ｌｏｎｇ．ｈｔｍ＃ＯＰＫ−ＸＩのインターネットのワールドワイドウェブからのＭＬＫ１およびＭＬＫ３の機能的ドメインを示す。他のタンパク質はＰＡＭ２５０残基重み表を用いるクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用するＤＮＡｓｔａｒプログラムにより整列した。太字のアミノ酸はタンパク質チロシンキナーゼで高度に保存されるアミノ酸であり；太字斜体のアミノ酸はタンパク質セリン−トレオニンキナーゼで保存され；下線を付けられる太字斜体のアミノ酸は双方で高度に保存される（Ｈａｎｋｓら，Ｍｅｔｈ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９１，２００，３８−６２）。これらのタンパク質中で変えられたチロシンキナーゼの保存されるアミノ酸を配列の上に太字で示す（保存されるものを大文字、好ましいものを小文字）。
【図２】発明にかかる、ヒト混合系統キナーゼファミリーのキナーゼドメインの代表的系統樹を描く。この分析はＤＮＡＳｔａｒプログラム（ＰＡＭ２５０残基重み表を用いるクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法）のＭｅｇＡｌｉｇｎ機能を使用して実施した。タンパク質は、上から下へ、ＭＬＫ３、ＭＬＫ７、ＭＬＫ１、ＭＬＫ２、ＤＬＫ、ＬＺＫおよびＭＬＴＫ／ＭＬＫ６である。この整列は、７種のタンパク質を３つのサブファミリー、すなわちＭＬＫ１−３サブファミリー（ＭＬＫ１、２、３および７）、ＤＬＫサブファミリー（ＤＬＫ、ＬＺＫ）ならびにＭＬＴＫ／ＭＬＫ６サブファミリーに組織化する。
【図３】発明にかかる、ＭＬＫ７ポリペプチドの代表的ドメイン構造および該ポリペプチドの予測される分子量（ＭＷ）を示す。
【図４】発明にかかる、キナーゼドメインの後に続く推定のロイシンジッパー領域の配列を示す。７番目のアミノ酸（１個のα−らせんターン）ごとに間隔を置かれたロイシン／イソロイシン残基を太字で示しかつ下線を付ける。この領域に先行するおよび後に続く７番目のアミノ酸は、示される配列を開始かつ終了し、このパターンが継続しないことを立証する。
【図５】発明にかかる、ＭＬＫ７の過剰発現がＣＨＯ細胞ライセート中のＪＮＫ活性を増大させること、およびＣＥＰ１１００４での６時間の処理がＭＬＫ７により駆動されるＪＮＫ活性を部分的に阻害することを示す。
【図６】発明にかかる、放射活性マルチスクリーントリクロロ酢酸沈殿アッセイを使用するバキュロウイルスのＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ（白丸）およびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺ（黒丸）によるミエリン塩基性タンパク質のリン酸化を具体的に説明する。陽性酵素対照ＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤ（黒菱形）を含有するデータの組全体を挿入図中に示す。
【図７】発明にかかる、時間分解型蛍光読み出しを用いるＥＬＩＳＡに基づくアッセイを使用するバキュロウイルスのＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ（白丸）およびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺ（黒丸）による（Ａ）ＧＳＴ−ＭＫＫ４（Ｋ１１３Ａ）および（Ｂ）ＧＳＴ−ＭＫＫ７（Ｋ１４９Ａ）のリン酸化を示す。ＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤ（黒菱形）を陽性酵素対照として使用した。
【図８】発明にかかる、バキュロウイルスのＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤおよびＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺによるＪＮＫ経路のインビトロ活性化を立証する。不活性化された形態のＭＫＫ４およびＭＫＫ７を、バキュロウイルスのＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤにより個別にリン酸化した。その後、これら２種のＭＫＫタンパク質を、ホスホ特異的ＪＮＫ抗体によりプロービングされるところのＧＳＴ−ＪＮＫ１β１（Ｋ５５Ａ）のリン酸化を触媒するように活性化しかつ進行させた。類似の結果が、異なる効率までのものの、ＧＳＴ−ＭＬＫ７ＫＤ／ＬＺおよびＧＳＴ−ＭＬＫ３ＫＤ（酵素対照）について観察された。挿入図は対照を包含するデータの組全体を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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