(57)【要約】更なる官能基および修正された活性スペクトルおよび修正された適応性を有する活性物質が、酵素または酵素活性および幅広い基質のスペクトルを有する組成物による触媒作用を受ける一電子反応を用いることにより、少なくとも１つのアミノまたはヒドロキシ官能基を有する基質としての医薬物質および植物保護剤から得られ得る、生物学的活性化合物の調製方法であって、酵素として、フリーラジカル形成酵素が使用され、および／または、溶液中のリグニン溶解菌類の上清が、酵素活性を有する組成物として使用されることを特徴とし、更なる官能基として、Ａ）活性物質に、水系および親油系における変化した溶解挙動ならびに高い界面活性をもたらす多官能性シントン；Ｂ）芳香族分子、複素環式芳香族化合物；Ｃ）複素環式化合物；Ｄ）独立した生物学的活性を有する活性物質；Ｅ）一分子中に独立した活性と界面活性剤の性質を併せ持つ活性物質が導入され得て、それにより、原料と共有結合し、かつターゲット生物との多官能性相互作用を可能にする変化した分離挙動を有するカップリング生成物が得られる、生物学的活性化合物の調製方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
更なる官能基および修正された活性スペクトルおよび修正された適応性を有する活性物質が、酵素または酵素活性および幅広い基質のスペクトルを有する組成物による触媒作用を受ける一電子反応を用いることにより、少なくとも１つのアミノまたはヒドロキシ官能基を有する基質としての医薬物質および植物保護剤から得られ得る、生物学的活性化合物の調製方法であって、酵素として、フリーラジカル形成酵素が使用され、および／または、溶液中のリグニン溶解菌類の上清が、酵素活性を有する組成物として使用されることを特徴とし、更なる官能基として、
Ａ）活性物質に、水系および親油系における変化した溶解挙動ならびに高い界面活性をもたらす多官能性シントン；
Ｂ）芳香族分子、複素環式芳香族化合物；
Ｃ）複素環式化合物；
Ｄ）独立した生物学的活性を有する活性物質；
Ｅ）一分子中に独立した活性と界面活性剤の性質を併せ持つ活性物質
が導入され得て、それにより、原料と共有結合し、かつターゲット生物との多官能性相互作用を可能にする変化した分離挙動を有するカップリング生成物が得られる、生物学的活性化合物の調製方法。
【請求項２】
前記基質が、β−ラクタム抗生物質、テトラサイクリン抗生物質、アントラサイクリン抗生物質、ポリエン抗生物質、アミノグリコシド、ベンゾフラン誘導体、スルホンアミド、キノイド化合物、および有機酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、好ましくは、国際酵素命名法（酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、１９９２、ｐ．２４−１５４）による以下の分類：ＥＣ １．１０．３．２ （ラッカーゼ）、ＥＣ １．１１．１．１３ （マンガンペルオキシダーゼ）、ＥＣ １．１１．１７ （ペルオキシダーゼ）、ＥＣ １．１４．９９．１ （モノフェノール−モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ １．１０．３．３ （アスコルビン酸オキシダーゼ）に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記水溶液が、５℃〜６０℃の間の温度において、２〜８のｐＨ値を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ａ）に記載の前記多官能性シントンが、Ｃ１−Ｃ１８ アルキル、Ｃ１−Ｃ１８アルケニル、Ｃ１−Ｃ１８アルキニル、Ｃ１−Ｃ１８アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１８オキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ１８オキソアルキル、Ｃ１−Ｃ１８アルキルスルファニル、Ｃ１−Ｃ１８アルキルスルホニル、Ｃ１−Ｃ１８アルキルイミノ、またはアルキルアミノシントンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｂ）に記載の前記芳香族分子が、好ましくは、ハロゲン；スルホ；スルホン；スルファミノ；スルファニル；アミノ；アミド；ニトロ；アゾ；イミノ；カルボキシ；シアノ；ホルミル；ヒドロキシ；ハロカルボニル；カルバミル；カルバミドイル；ホスホン；ホスホニル；Ｃ１−１８アルキル；Ｃ１−１８アルケニル；Ｃ１−１８アルキニル；Ｃ１−１８アルコキシ；Ｃ１−１８オキシカルボニル；Ｃ１−１８オキソアルキル；Ｃ１−１８アルキルスルファニル；Ｃ１−１８アルキルスルホニル；Ｃ１−１８アルキルイミノ、またはアルキルアミノ置換基の群から選択される、１つまたはそれ以上の官能基または置換基をそれぞれ任意に有する、単環式、二環式、または多環式芳香族シントンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｂ）に記載の前記芳香族分子が、それぞれが置換され得る、アントラセン、アズレン、ベンゼン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、ベンゾチアゾリン、カルボリン、カルバゾール、シンノリン、クロマン、クロメン、クリセン、フルベン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インデン、インドール、インドリン、インドリジン、イソチアゾール、イソキノリン、イソオキサゾール、ナフタレン、ナフチレン、ナフチルピリジン、オキサゾール、ペリレン、フェナントレン、フェナジン、フタリジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラゾール、ピレン、ピリダジン、ピリダゾン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、キナゾリン、キノリン、キノキサリン、スルホニル、チオフェン、およびトリアジンからなる群から選択される単環式、二環式、または多環式芳香族化合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｃ）に記載の前記複素環式化合物が、ハロゲン、スルホ、スルホン、スルファミノ、スルファニル、アミノ、アミドの群から選択される、１つまたはそれ以上の官能基または置換基をそれぞれ任意に有する、ピロリジン、ピリジン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、インドール、アクリジン、キナゾリン、およびプリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｄ）に記載の前記活性物質が、イミダゾール、アゾール、フラボン、イソフラボン、テトラサイクリン、アミノ酸アナログおよびヌクレオチドアナログである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
最適ｐＨの変化が、組み換え型ラッカーゼの使用によって達成されることを特徴とする、請求項１〜９の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記カップリング反応が、ヒドロキシルアミンおよび／またはヒドロキサム酸の群から選択される少なくとも１つの媒介物、ならびに任意にアミドの群から選択される媒介物の存在下で任意に行われることを特徴とする、請求項１〜１０の少なくとも１項に記載の方法。
【請求項１２】
反応生成物が、反応完了後に安定化されることを特徴とする、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２に記載の生体内変化によって、異なる物質の種類の活性物質から得られ得る化合物。
【請求項１４】
ヒトおよび獣医薬における、ならびに植物保護における、請求項１３に記載の生物学的活性化合物の使用。
【請求項１５】
ヒトおよび獣医薬における、ならびに植物保護における、唯一の活性成分としての、または混合調製物の形態での、請求項１３および／または１４に記載の生物学的活性化合物の使用。
【請求項１６】
好ましくは局所的および／または全身的適用のための殺菌および抗ウイルス効果を有する薬剤としての、感染症を抑制するための請求項１３〜１５に記載の生物学的活性化合物の使用。
【請求項１７】
多耐性グラム陽性菌による感染症における請求項１３〜１５に記載の生物学的活性化合物の使用。
【請求項１８】
多耐性グラム陰性菌による感染症における請求項１３〜１５に記載の生物学的活性化合物の使用。
【請求項１９】
ヒトおよび獣医薬における、ならびに植物保護における、局所的および／または全身的適用のための殺菌剤としての請求項１３〜１５に記載の生物学的活性化合物の使用。
【請求項２０】
細胞分裂抑制剤としての請求項１３〜１５に記載の生物学的活性化合物の使用。
【請求項２１】
生体内変化において得られる化合物が、単独で使用されるか、またはお互いに組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
請求項１３〜２０のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の化合物を含む薬剤。
【請求項２３】
グラム陽性病原菌による感染症の治療のための薬剤を調製するための、請求項１３〜１７のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の化合物を含む薬剤。
【請求項２４】
請求項１３〜１９のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の化合物を含む植物保護剤。
【請求項２５】
表面活性剤としての前述の請求項のいずれかに記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規な生物学的活性化合物、それらの調製方法、およびそれらの使用に関する。抗生物質および化学療法薬から、酵素ラッカーゼまたはマンガンペルオキシダーゼによる触媒作用を受ける生体内変化（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）において、高い（ｉｍｐｒｏｖｅｄ）殺菌活性または高い適応性のいずれかを有するカップリング生成物が得られ得る。
【０００２】
従来技術
ヒトおよび獣医薬において、ならびに植物保護において主に使用される治療薬に属する、構造および生物学的活性に関して異種な化合物が、抗生物質から形成される。抗生物質には、体内に適用されると感染症を抑制することができる、微生物によって形成された物質およびそれらから形成された誘導体が含まれる。抗菌性抗生物質のほかに、殺菌性、抗ウイルス性、抗トリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｃｉｄａｌ）性、または発癌抑制（ｃｅｎｃｅｒｏｓｔａｔｉｃ）性を有する抗生物質が発見された。発酵経路において調製された抗生物質を、癌の化学療法に適用することにより、更に、それらを抗麦角剤（ｅｒｇｏｔｒｏｐｉｃｓ）として動物飼育に、および除草剤、殺虫剤、病虫害防除剤、ダニ駆除剤、殺線虫剤、殺陸貝剤として植物保護に適用することにより、それらの本来の定義が拡張された（Ｕ．グラフェ（Ｇｒａｅｆｅ）： Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ｄｅｒ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ハイデルベルグ、ベルリン、ニューヨーク、１９９２）。抗生物質に対する新たな細胞ターゲット部位、および類似の生物学的活性物質に関する研究は、未だに完了しておらず、それにより、ヒトおよび獣医薬における、ならびに、例えば植物保護における、新たな考えられ得る適用が導かれる。
【０００３】
最終的に、部分的な合成によって幅広く修飾された自然発生的（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）抗生物質、およびその全化学合成により、天然物質の本来の可能性を顕著に高める医学的物質が得られた。最終的に、微生物生成物とは何の関係もないが、微生物におけるそられの効果およびその作用機構に関して古典的な抗生物質と同等である、全合成の生成物も見出された（Ｕ．グラフェ（Ｇｒａｅｆｅ）： Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ｄｅｒ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋａ， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， ハイデルベルグ、ベルリン、ニューヨーク、１９９２）。
【０００４】
以下、“抗生物質”という語は、病原性微生物（バクテリア、真菌、ウイルス）および系統的に優位な（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｕｐｅｒｉｏｒ）生物（例えば、リケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ）、トリパノゾーマ、腫瘍細胞、または寄生虫）の異なる作用部位において選択的な効果を有する生物学的活性物質に対して幅広い意味で使用される。
【０００５】
異なる分野の適用に対して様々な生物学的活性を有する抗生物質は、それらを新たな目的（ｔａｓｋｓ）に適応させるために、化学反応によって絶えず修飾される。他の群の抗生物質は、β―ラクタム抗生物質のような大きな半合成による修飾を受けない。ペニシリンの原料（ｐａｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）としてのアミノペニシラン酸、およびセファロスポリンの原料としての７−アミノセファロスポラニン酸の発見により、未だに完成されていない、最適な効果を有する誘導体に対する修飾は、新たな段階に導かれた。
【０００６】
非常に低い毒性および高い殺菌効果のような、最初に発見されたペニシリンおよびセファロスポリンの利点は、連続的な化学的修飾によって増加する要求に適合された。ＵＳ−Ａ−５，６９５，９５１およびＵＳ−Ａ−５，９３９，２９９には、ハロペルオキシダーゼを用いてセファロスポリン誘導体セファレキシンを塩素化するための方法が開示されている。ハロペルオキシダーゼを使用する、ハロゲンの酵素的導入方法は、ＷＯ−Ａ−００／１５７７１に開示されている。
【０００７】
しかし、β―ラクタム抗生物質のこれらの化学的および生化学的修飾は、病原性微生物における耐性の発達に対応できなかったので、多くの細菌、特に、多耐性ブドウ球菌は、もはや、現在使用可能なβ−ラクタム抗生物質によって治療することはできない。
【０００８】
ラッカーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１０．３．２）は、基質の酸化に触媒作用を及ぼす酵素である。それらは、微生物、植物、および動物から得られる。現実に、ラッカーゼおよびペルオキシダーゼは、例えば、リグニンの生物学的分解において、重要な役割を果たす。なぜなら、それらは、特に、白腐れ病菌（ｗｈｉｔｅ ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ）から単離され得るからである。そのようなリグニン溶解（ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ）酵素は、様々な環境的に危険な物質を酸化によって転換することができる（ジョナス（Ｊｏｎａｓ）， Ｕ．， ハンマー（Ｈａｍｍｅｒ）， Ｅ．， シャウアー（Ｓｃｈａｕｅｒ） Ｆ．， ボラッグ（Ｂｏｌｌａｇ）， Ｊ．−Ｍ．： バイオデグラデーション（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ） １９９８； ８： ３２１−３２８； ボラッグ（Ｂｏｌｌａｇ）， Ｊ．−Ｍ．， シュトルワース（Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ）， Ｋ．Ｌ．， アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）， Ｄ．Ｈ．： Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９８８； ５４： ３０８６−３０９１； バンパス（Ｂｕｍｐｕｓ）， Ｊ．Ａ．， Ａｕｓｔ， Ｓ．Ｄ．： バイオエッセイズ（Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ） １９８６； ６： １６６−１７０； バンパス（Ｂｕｍｐｕｓ）， Ｊ．Ａ．， ティエン（Ｔｉｅｎ）， Ｍ．， ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）， Ｄ．Ａ．： サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） １９８５； ２２８： １４３−１４７）。
【０００９】
ＤＥ−Ａ−１９７　２６　２４１は、特に、白腐れ病菌から得られる酸化還元酵素も含み得る、排水処理のための広範な多成分系を開示する。特に、ラッカーゼは、０．００１〜１Ｕ／ｍｌの濃度で、排水処理のためにも使用され得る。排水処理のために開発された多成分系は、有機合成のためにも、例えば、不飽和脂肪族化合物の酸化およびアルコールのアルデヒドへの酸化のためにも使用され得る。ＤＥ−Ａ−２４　０２　４５２によれば、水と有機溶媒との二相系においてラッカーゼ媒介酸化（ｌａｃｃａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎｓ）を行うことが有利であることが見出された。
【００１０】
ＵＳ−Ａ−５，３８９，３５６およびＵＳ−Ａ−５，４６８，６２８には、ペルオキシダーゼがフリーラジカルを生じる触媒として働く選択的酸化または還元の方法が記載されている。この方法は、例えば、四塩化炭素の分解に適している。
【００１１】
更に、ラッカーゼまたはペルオキシダーゼを用いてフェノールを酸化することが知られており、ここで、反応溶液は、殺菌効果を有し、細菌抑制のための工業的方法において使用され得る。チロシナーゼおよびラッカーゼを使用する穏やかな酸化の特異的適用が、ＵＳ−Ａ−６，０１５，６８３に記載されている。よって、ラッカーゼを用いて、水溶液中のアセトアミノフェンの分光測定器による検出を可能にする中間生成物として、着色剤が調製される。
【００１２】
酸素の存在下でのラッカーゼの既知の殺菌効果は、それらの酸化力にも起因する。更に、酸化に基づいて、ラッカーゼの影響下で、殺菌効果を有するフェノキサジノン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｏｎｅ）誘導体が形成される。ラッカーゼおよびマンガンペルオキシダーゼは、既に、広範な目的のために、経済的に使用されている。それらは、リグニン含有材料を漂白するので、製紙業において使用される。ＷＯ−Ａ−９５／０１４２６から、少なくとも２つの芳香環からなる有機化学化合物が、ラッカーゼの活性を向上させ得ることが知られている。この向上は、溶液中の色素またはリグニンおよびリグニン含有材料を漂白するために利用された。
【００１３】
ＵＳ−Ａ−４，４７８，６８３には、ラッカーゼおよびペルオキシダーゼの添加によって、工業的排水処理における微生物の成長を妨げることが記載されている。
【００１４】
いくつかの場合には、ラッカーゼおよびマンガンペルオキシダーゼは、異なる生物学的化合物間でカップリングを引き起こすために使用された。活性にとって極めて重要な官能基への優先的な攻撃が予想され得るので、一般に、効果の低下が予期され得る。このことは、おそらく、抗生物質の誘導体化のためのマンガンペルオキシダーゼおよびラッカーゼの使用に関する実験が、いくつかの例に制限される理由である。現在まで行われた（ｒｅａｌｉｚｅｄ）例において、求められている（ｓｏｕｇｈｔ）殺菌効果の向上の目的は達成されていない。例えば、ラッカーゼは、オーレオリン酸群の抗生物質をヒドロキノンと結合させるために使用された（アニアンウォンタク（Ａｎｙａｎｗｕｔａｋｕ）， Ｉ．Ｏ．， ペトロウスキー（Ｐｅｔｒｏｗｓｋｉ）， Ｒ．Ｊ．， ロサッザ（Ｒｏｓａｚｚａ）， Ｉ．Ｐ．： Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９４； ２： ５４３−５５１）。これは、原料の生物学的活性の損失を伴っていた。アゲマツ（Ａｇｅｍａｔｕ）ら（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７ （８）， １３８７−１３８８ （１９９３））には、ラッカーゼによる触媒作用を受けるフェノール酸化による７−（４−ヒドロキシフェニルアセトアミド）セファロスポリニン酸（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ）の転換が記載されている。この場合にも、反応生成物の効果は本来のセファロスポリンより低かった。ウエマツ（Ｕｅｍｔｓｕ）ら（特開平５−１６３２８１（Ｊｐｎ． Ｋｏｋａｉ Ｔｏｋｙｏ ＪＰ ０５，１６３，２８１））では、セファロスポリンの酸化のためにオキシダーゼが使用されている。
【００１５】
ペニシリンメチルエステルから、全てが生物学的に不活性である、３つの異なるタイプの二量体が、ラッカーゼの影響下で、特定の条件下で得られる （アゲマツ（Ａｇｅｍａｔｕ）， Ｈ．， ツチダ（Ｔｓｕｃｈｉｄａ）， Ｔ．， コミナト（Ｋｏｍｉｎａｔｏ）， Ｋ．， シバモト（Ｓｈｉｂａｍｏｔｏ）， Ｎ．， ヨシオカ（Ｙｏｓｈｉｏｋａ）， Ｔ．， ニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ）， Ｈ．， オカモト（Ｏｋａｍｏｔｏ）， Ｒ．， シン（Ｓｈｉｎ）， Ｔ．， ムラノ（Ｍｕｒａｎｏ）， Ｓ．： Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ． Ｔｏｋｙｏ １９９３； ４６： １４１−１４８）。フェノールおよびペニシリンの二量体の酵素的合成は、アゲマト（Ａｇｅｍａｔｏ）によって要約されている（Ｂａｉｏｓａｉｎｓｕ ｔｏ Ｉｎｄａｓｕｔｏｒｉ １９９６， ５４， ７１５−７１８）。
【００１６】
ハロペルオキシダーゼのような、抗生物質の修飾のために今まで使用されていた酵素は、基質のスペクトルが限定されている。ハロペルオキシダーゼによって媒介される塩素化は、特定の場合にのみ使用され得る。
【００１７】
微生物が致死量に近い抗生物質濃度の永続的な作用を受けると、それらは、周囲の条件の変化に対する、それらの遺伝的にプログラムされた適応メカニズムの一部として、抗生物質耐性を発達させる。即ち、それらは、問題の活性物質の本来の最小阻害濃度によっては、もはや阻害されない。致死量に近い投与量の作用は、決して完全には回避できないので、病原性微生物によって、新たな抗生物質活性物質それぞれに対する耐性が発達するであろう。ペルオキシダーゼまたはラッカーゼの影響下で形成された、耐性を有するようになる細菌に対して効果を有する活性物質は、未だに記載されていない。
【００１８】
増大する耐性の問題により、依然として、抗生物質に対する高い要求があり、その要求は、従来技術に相当する活性物質によっては満たされていない（ｎｏｔ ｃｏｖｅｒｅｄ）。
【００１９】
このことは、特に、臨床的に抑制することが困難な感染症における抗生物質の使用に当てはまる。グラム陽性菌による感染では、一般に、グリコペプチド抗生物質は、依然として十分効力を有する。ブドウ球菌および腸球菌のようなグラム陽性病原菌は、多数の耐性をますます発達させている。しかし、将来は、グラム陰性病原菌によって引き起こされる感染症も、安全な臨床的抑制ができなくなるであろう。獣医薬においても、多耐性ブドウ球菌による家畜の感染症がますます脅威になってきている。耐性を持つようになった細菌のヒトへの移動が起こり得ることから、更なる危険が迫ってきている。
【００２０】
本発明の目的は、生体内変化を用いて生物学的活性物質を更に発達させること、および、それらを、他の抗生物質活性物質とともにカップリング生成物として医学的に使用する場合に有用なものにすることである。特に、本発明の目的は、それによって今のところ未知の活性物質が、既知の抗生物質活性物質から得られ得る生体内変化プロセスを開発することにより、ヒトおよび獣医薬において、特に、感染症の治療において、通常の抗生物質に対してバクテリアによって耐性が大きく発達することにより存在する、対策（ｍｅａｓｕｒｅｓ）に対する要求を満たすことである。
【００２１】
本発明によれば、この目的は、更なる官能基および修正された活性スペクトルおよび修正された適応性を有する活性物質が、酵素または酵素活性および幅広い基質のスペクトルを有する組成物による触媒作用を受ける一電子反応を用いることにより、少なくとも１つのアミノまたはヒドロキシ官能基を有する基質としての医薬物質および植物保護剤から得られ得る、生物学的活性化合物の調製方法であって、酵素として、フリーラジカル形成酵素が使用され、および／または、溶液中のリグニン溶解菌類の上清が、酵素活性を有する組成物として使用されることを特徴とし、更なる官能基として、
Ａ）活性物質に、水系および親油系における変化した溶解挙動ならびに高い界面活性をもたらす多官能性シントン；
Ｂ）芳香族分子、複素環式芳香族化合物；
Ｃ）複素環式化合物；
Ｄ）独立した生物学的活性を有する活性物質；
Ｅ）一分子中に独立した活性と界面活性剤の性質を併せ持つ活性物質
が導入され得て、それにより、原料と共有結合し、かつターゲット生物との多官能性相互作用を可能にする変化した分離挙動を有するカップリング生成物が得られる、生物学的活性化合物の調製方法によって達成される。
【００２２】
好ましくは、基質は、β−ラクタム抗生物質、テトラサイクリン抗生物質、アントラサイクリン抗生物質、ポリエン抗生物質、アミノグリコシド、ベンゾフラン誘導体、スルホンアミド、キノイド化合物、および有機酸である。
【００２３】
本発明によれば、請求項１〜１２に記載の方法によるこれら殺菌活性物質の転換により、好ましくは、多耐性菌に対して、原料では検出することができなかった活性が得られることを特徴とする化合物を得ることができる。本発明による方法による転換から得られ得る化合物は、異なる作用機構および異なる分子ターゲット部位を有する分子の共有結合によって、耐性の発達がより困難になるということを、更に特徴とし得る。しかし、本発明によれば、活性のスペクトルの変化なしに、更なる親水性および／または疎水性成分の導入により、適応性の向上も達成される。
【００２４】
本発明によれば、国際酵素命名法（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）、１９９２、ｐ．２４−１５４）による以下の分類：ＥＣ １．１０．３．２ （ラッカーゼ）、ＥＣ １．１１．１．１３ （マンガンペルオキシダーゼ）、ＥＣ １．１１．１７ （ペルオキシダーゼ）、ＥＣ １．１４．９９．１ （モノフェノール−モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ １．１０．３．３ （アスコルビン酸オキシダーゼ）に属するそれら酵素を使用することが好ましい。
【００２５】
本発明による方法が、水溶液中で行われるならば、後者は、ｐＨ値が２〜８、好ましくは３〜５であり、温度が５℃〜６０℃の間であることが好ましい。
【００２６】
Ａ）に記載の多官能性シントンとして：
Ｃ１−Ｃ１８アルキル、Ｃ１−Ｃ１８アルケニル、Ｃ１−Ｃ１８アルキニル、Ｃ１−Ｃ１８アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１８オキシカルボニル、Ｃ１−Ｃ１８オキソアルキル、Ｃ１−Ｃ１８アルキルスルファニル、Ｃ１−Ｃ１８ アルキルスルホニル、Ｃ１−Ｃ１８アルキルイミノ、またはアルキルアミノシントン
が使用され得る。
【００２７】
本発明によれば、Ｂ）に記載の芳香族分子が、好ましくは、ハロゲン；スルホ；スルホン；スルファミノ；スルファニル；アミノ；アミド；ニトロ；アゾ；イミノ；カルボキシ；シアノ；ホルミル；ヒドロキシ；ハロカルボニル；カルバミル；カルバミドイル；ホスホン；ホスホニル；Ｃ１−１８アルキル；Ｃ１−１８アルケニル；Ｃ１−１８アルキニル；Ｃ１−１８アルコキシ；Ｃ１−１８オキシカルボニル；Ｃ１−１８オキソアルキル；Ｃ１−１８アルキルスルファニル；Ｃ１−１８アルキルスルホニル；Ｃ１−１８アルキルイミノ、またはアルキルアミノ置換基の群から選択される、１つまたはそれ以上の官能基または置換基をそれぞれ任意に有する、単環式、二環式、または多環式芳香族シントンである。特に好ましい単環式、二環式、または多環式芳香族化合物は、それぞれが置換され得る、アントラセン、アズレン、ベンゼン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、ベンゾチアゾリン、カルボリン、カルバゾール、シンノリン、クロマン、クロメン、クリセン、フルベン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インデン、インドール、インドリン、インドリジン、イソチアゾール、イソキノリン、イソオキサゾール、ナフタレン、ナフチレン、ナフチルピリジン、オキサゾール、ペリレン、フェナントレン、フェナジン、フタリジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラゾール、ピレン、ピリダジン、ピリダゾン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、キナゾリン、キノリン、キノキサリン、スルホニル、チオフェン、およびトリアジンからなる群から選択されるものである。その他のものを排除するものではないが（ｗｉｔｈｏｕｔ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ ｏｔｈｅｒｓ）、そのような化合物の例は、芳香族ジアミン類、アミノフェノール類、フェノール類、ナフトキノン類、および２，５−ジヒドロキシル化安息香酸誘導体である。更に、その他のものを排除するものではないが、以下の化合物を使用することもできる：
３，４−ジエトキシアニリン、２−メトキシ−ｐ−フェニレンジアミン、１−アミノ−４−ベータ−メトキシエチルアミノベンゼン（Ｎ−ベータ−メトキシエチル−ｐ−フェニレンジアミン）、１−アミノ−４−ビス（ベータ−ヒドロキシ−エチル）アミノベンゼン、２−メチル−１，３−ジアミノベンゼン（２，６−ジアミノトルエン）、２，４−ジアミノトルエン、１−アミノ−４−スルホナトベンゼン（ｓｕｌｆｏｎａｔｏｂｅｎｚｅｎｅ）、１−Ｎ−メチルスルホナト−４−アミノベンゼン、１−メチル−２−ヒドロキシ−４−アミノベンゼン（３−アミノ−ｏ−クレゾール）、１−メトキシ−２，４−ジアミノベンゼン（２，４−ジアミノアニソール）、１−エトキシ−２，３−ジアミノベンゼン（２，４−ジアミノフェネトール）、１−ベータ−ヒドロキシエチルオキシ−２，４−ジアミノベンゼン（２，４−ジアミノフェノキシエタノール）、１，３−ジヒドロキシ−２−メチルベンゼン（２−メチルレゾルシノール）、１，２，４−トリヒドロキシベンゼン、１，２，４−トリヒドロキシ−５−メチルベンゼン（２，４，５−トリヒドロキシトルエン）、２，３，５−トリヒドロキトルエン、４，８−ジスルホナト−１−ナフトール、３−スルホナト−６−アミノ−１−ナフトール、１，４−フェニレンジアミン、２，５−ジアミノトルエン、２−クロロ−１，４−フェニレンジアミン、２−アミノフェノール、３−アミノフェノール、４−アミノフェノール、１，３−フェニレンジアミン、１−ナフトール、２−ナフトール、４−クロロレゾルシノール、１，２，３−ベンゼントリオール（ピロがロール）、１，３−ベンゼンジオール（レゾルシノール）、１，２−ベンゼンジオール（ピロカテコール）、２−ヒドロキシ桂皮酸、３−ヒドロキシ桂皮酸、４−ヒドロキシ桂皮酸、２，３−ジアミノ安息香酸、２，４−ジアミノ安息香酸、３，４−ジアミノ安息香酸、３，５−ジアミノ安息香酸、メチル２，３−ジアミノベンゾエート、エチル２，３−ジアミノベンゾエート、イソプロピル２，３−ジアミノベンゾエート、メチル２，４−ジアミノベンゾエート、エチル２，４−ジアミノベンゾエート、イソプロピル２，４−ジアミノベンゾエート、メチル３，４−ジアミノベンゾエート、エチル３，４−ジアミノベンゾエート、イソプロピル３，４−ジアミノベンゾエート、メチル３，５−ジアミノベンゾエート、エチル３，５−ジアミノベンゾエート、イソプロピル３，５−ジアミノベンゾエート、Ｎ，Ｎ−ジエチル−３，４−ジアミノベンゾイック（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ）アミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピル−３，４−ジアミノベンゾイックアミド、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、アントラニル酸、４−アミノ安息香酸、エチルヒドロキノン、マンデル酸、ｏ−ニトロベンズアルデヒド、１，５−ジヒドロキシナフタレン、２，６−ジヒドロキシナフタレン、２，３−ジヒドロキシナフタレン、ベンジルイミダゾール、サリチル酸、３−アミノサリチル酸、４−アミノサリチル酸、５−アミノサリチル酸、メチル３−アミノサリチレート（ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、メチル４−アミノサリチレート、メチル５−アミノサリチレート、エチル３−アミノサリチレート、エチル４−アミノサリチレート、エチル５−アミノサリチレート、プロピル３−アミノサリチレート、プロピル４−アミノサリチレート、プロピル５−アミノサリチレート、サリチル酸アミド、４−アミノチオフェノール、４−ヒドロキシ地オフェノール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−１，４−フェニレンジアミン、Ｎ−フェニル−１，２−フェニレンジアミン、６−アミノ−２−ナフトール、３−アミノ−２−ナフトール、５−アミノ−１−ナフトール、１，２−フェニレンジアミン、４−アミノキナルジン、２−ニトロアニリン、３−ニトロアニリン、２−クロロアニリン、３−クロロアニリン、４−クロロアニリン、４−アミノアセトアニリド、アリザリン、１−アントラミド（１−アミノアントラセン）、１−アミノアントラキノン、アントラキノン、２，６−ジヒドロキシアントラキノン、１，５−ジヒドロキシアントラキノン（アントラルフィン）
【００２８】
本発明によれば、Ｃ）に記載の複素環式化合物として、ハロゲン、スルホ、スルホン、スルファミノ、スルファニル、アミノ、アミドの群から選択される、１つまたはそれ以上の官能基または置換基をそれぞれ任意に有する、ピロリジン、ピリジン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、インドール、アクリジン、キナゾリン、およびプリンを使用することが好ましい。
【００２９】
本発明によれば、Ｄ）に記載の活性物質として、特に、イミダゾール、アゾール、フラボン、イソフラボン、テトラサイクリン、アミノ酸アナログおよびヌクレオチドアナログが使用され得る。
【００３０】
本発明による方法では、最適ｐＨの変化は、組み換え型ラッカーゼの使用によって達成され得る。
【００３１】
本発明によれば、ヒドロキシルアミンおよび／またはヒドロキサム酸の群から選択される少なくとも１つの媒介物、ならびに任意にアミドの群から選択される媒介物の存在下で、カップリング反応を、任意に行うことができる。
【００３２】
任意に、反応生成物は、反応の完了後に安定化され得る。
【００３３】
本発明はまた、本発明による生体内変化によって、異なる種類の物質からの活性物質から得られ得る化合物に関する。
【００３４】
本発明による生物学的活性化合物は、ヒトおよび獣医薬において、ならびに植物保護において、唯一の活性成分として、または混合調製物の形態で、使用され得る。
【００３５】
本発明による生物学的活性化合物は、特に、感染症を抑制するために、好ましくは、局所的および／または全身的適用のための殺菌および抗ウイルス効果を有する薬剤として、多耐性グラム陽性またはグラム陰性菌による感染症において、局所的および／または全身的適用のための殺菌剤として、かつ、ヒトおよび獣医薬において、ならびに植物保護において、除草剤、殺虫剤、または殺陸貝剤として、使用され得る。
【００３６】
本発明はまた、本発明による化合物を１つまたはそれ以上含む薬剤に関する。
【００３７】
本発明はまた、グラム陽性病原菌による感染症を治療するための薬剤の調製のための、１つまたはそれ以上の本発明による化合物の使用に関する。
【００３８】
本発明による方法により、少なくとも１つの本発明による化合物を含む、新規植物保護剤も得られる。
【００３９】
本発明による方法により、細胞分裂抑制剤として使用され得る生物学的活性化合物が得られる。生体内変化において得られる化合物は、単独で、またはお互いに組み合わせて使用され得る。
【００４０】
本発明によれば、更なる親水性および／または疎水性成分を導入することにより、原料化合物の適応性の改善が達成され得る。本発明による化合物は、特に、表面活性物質として使用され得る。
【００４１】
本発明による方法による転換によって殺菌活性剤から得られ得る、本発明による化合物は、好ましくは、多耐性菌に対して、原料物質では観察することができない活性を有利に示す。
【００４２】
本発明による方法による転換によって殺菌活性物質から得られ得る、本発明による化合物は、フリーラジカル形成酵素の作用によって達成される、異なる作用機構および異なる分子ターゲット部位を有する分子の共有結合によって、耐性の形成をより困難にする。
【００４３】
ラッカーゼおよびラッカーゼに類似のフリーラジカル形成酵素による触媒作用を受けるカップリング反応に基づいて、本発明により、一般的に適用され得る生体内変化法が、利用可能になり、それにより、アミノまたはヒドロキシ官能基を含む、様々な生物学的活性物質を結合させ、生物学的活性の向上および／または適応性の向上を達成することができる。新規化合物の調製における重要な特徴的段階は、酵素的触媒作用を受ける一電子酸化、酵素的触媒作用を受ける超酸化物フリーラジカルの形成、または酵素的触媒作用を受けるアリール基を含むフリーラジカルの形成である。
【００４４】
驚くべきことに、これらの酵素的触媒作用を受ける反応は、原料よりも明らかに優れた生物学的活性を有する活性物質を得ることを可能にすることが見出された。本発明によれば、これらの酵素的触媒作用を受ける反応段階のために、特に、ラッカーゼまたはラッカーゼに類似の酵素の存在が必要とされる。これに関連して、“ラッカーゼおよびラッカーゼに類似の酵素”とは、特に、ＥＣ　１．１０．３．２の分類の下に要約された酵素、ならびにカテコールオキシダーゼ（ＥＣ　１．１０．３．１）、ビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ　１．３．３．５）、モノフェノールモノオキシゲナーゼ（ＥＣ　１．１４．１８．１）、及びｏ−アミノ−フェノールオキシダーゼ（１．１０．３．４）を意味する。ラッカーゼは、ピクノポルス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、コリビア（Ｃｏｌｌｙｂｉａ）、ホメス（Ｆｏｍｅｓ）、レンチナス（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、フィレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）もしくはミセリオフェトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）から、または生物工学的経路において、得られることが好ましい。ラッカーゼの代わりに、ペルオキシダーゼ、特に、マンガンペルオキシダーゼ（１．１１．１．１３）およびリグニンペルオキシダーゼ（１．１１．１．１４）のような、他のリグニン用（ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃａｌ）酵素を使用することもできる。
【００４５】
本発明による方法によって、異なる種類の化学物質からの活性物質を、お互いに結合させることができる。有利には、結合させるべき活性物質は、異なるターゲット部位とともに、生物学的活性を有する。しかし、適応性、例えば、分離（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）挙動を向上させるために、本発明による方法を用いて、生物学的活性物質を、独立の殺菌活性を有さない物質と結合させることもできる。本発明による殺菌活性原料におけるラッカーゼまたはマンガンペルオキシダーゼの作用により、改善された適応性を有する、新規な生物学的活性物質が得られる。特に、ペニシリン、セファロスポリン、およびカルバペネム（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ）のような、β−ラクタム抗生物質が、それらの殺菌活性を保持しながら、本発明による方法によって、変換され得ることは、まったく驚くべきことである。スルホンアミド抗生物質ならびに様々に置換されたサリチル酸も、本発明による方法によって転換することができ、それら生成物は、殺菌性を示した。β−ラクタムおよびスルホンアミド抗生物質ならびに置換されたサリチル酸と、キノイドおよびヒドロキノイド活性物質を、ラッカーゼによる触媒作用を受ける反応によって結合させることは、特に有利である。本発明による生体内変化によって得られ得る新規活性物質は、多耐性菌に対しても、殺菌活性を示す。よって、感染症を抑制するために、その新規活性物質を、ヒトおよび獣医薬に適用することへの要求がある。本発明による方法によって得られ得る新規活性物質は、単独または混合調製物の形態で、局所的および全身的のいずれにも使用され得る。
【００４６】
【実施例】
以下に、本発明を、いくつかの実施例によってより詳細に説明するが、本発明はそれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドと６−アミノペニシラン酸のカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：
１．１　酵素溶液の調製
糸状菌の培養
最初に、斜面培養（ｓｌａｎｔ）寒天（モルト寒天）上で、３０℃で７日間、次いで、モルト寒天板上で、３０℃で７日間、糸状菌の培養を行った。その後、それぞれ約１ｃｍ２の大きさでモルト寒天片のコロニーを作った３つのウェルを、滅菌スパチュラによって寒天板培養物から切り取り、６０ｍｌのＢＳＭを含む３００ｍｌのエルレンマイアー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコに移した。この予備培養物を、継続（ｓｔａｎｄｉｎｇ）培養物として、３０℃でインキュベートした。
【００４７】
糸状菌のグルコース予備培養物中で形成された菌糸体を、１７，０００ｒｐｍで、ウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）装置によって、それぞれ１０秒間、３回均質化した。実験のために、２．５ｍｌの均質化物を、２５ｍｌのＢＳＭを含む１００ｍｌのエルレンマイアーフラスコに通した（ｐａｓｓａｇｅｄ）。オートクレーブ中での熱殺菌中の培地の損失を回避するために、フラスコと培地を別々に殺菌した。接種前に、培地をフラスコに満たした。これらの充填物（ｃｈａｒｇｅｓ）に、０．０５％の滅菌濾過したツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０溶液を補充した。攪拌インキュベーター（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）において、１５８ｒｐｍ、３０℃にてフラスコを培養した。
【００４８】
アニオン交換クロマトグラフィー
Ｔ．バーシカラー（ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）の培地内への、リグニン用酵素の分泌を増やすために、ベラトリル（ｖｅｒａｔｒｙｌ）アルコールを使用した。この化合物およびその代謝産物は、培養濾過物を用いるその後のインキュベーション実験を妨げ得るので、それらは、Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を用いて分離された。よって、１ｍｌのアニオン交換マトリックスが、１００ｍｌのヒスチジンバッファーによって、３回平衡化された。その後、平衡化されたＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を、８０ｍｌの培養濾過物とともに、室温で、マグネチックスターラー上で、１時間ゆっくり攪拌した。その後、水性上清を、ＧＦ−６ガラス繊維フィルターを通して、Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）から濾過し、マトリックスを、それぞれ１０ｍｌのヒスチジンバッファーによって２０回洗浄し、蛋白質を、１０ｍｌの高塩ヒスチジンバッファーによって溶出した。
【００４９】
限外濾過
比較され得るべき培養濾過物による実験のために、インキュベーション充填物において、同じ酵素活性が使用されるべきである。よって、精製された培養物上清を濃縮すること、および反応に応じてそれらを希釈することが必要であった。セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−３０およびセントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）−３０ミクロ濃縮器（ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）を用いて、冷却遠心分離機において、３０００ｒｐｍ、４℃で、６０分間、限外濾過によって濃縮を行った。
【００５０】
脱塩
培養濾過物との反応のために、精製され、かつ濃縮された蛋白質試料の脱塩が必要であった。パックド・セファデックス・Ｇ−２５・スーパーファインカラム（ｐａｃｋｅｄ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ ｃｏｌｕｍｎ）上へ、２．５ｍｌの試料を載せ、３．７ｍｌのヒスチジンバッファーによって溶出した。
得られた蛋白質溶出液を、−２０℃で保存した。
【００５１】
１．２　カップリング反応
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ； トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ　５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシメチル）ベンズアミドを、室温で３５分間、６−アミノペニシラン酸（１ｍＭ）と、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、反応溶液を、オクタデカン固相を用いて抽出する。生成物の抽出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒の除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００５２】
結果：抗生物質原料６−アミノペニシラン酸と２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとのカップリングの結果、殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、６６％である。
【００５３】
質量分析法による、得られた化合物の分析では、質量は４１１であった。
【００５４】
構造分析の結果の全体（ｓｕｍ）から、得られたカップリング生成物について、以下の構造が推定され得る：
【００５５】
【化１】
2004501619.tif 000002
【００５６】
実施例２
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドと７−アミノセファロスポリン酸（ａｍｉｎｏｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ）とのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；ピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドを、７−アミノセファロスポリン酸（１ｍＭ）と、室温で３５分間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００５７】
結果：抗生物質原料７−アミノセファロスポリン酸と２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、６８％である。
【００５８】
実施例３
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドと７−アミノデアセトキシセファロスポリン酸（ａｍｉｎｏｄｅａｃｅｔｏｘｙｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ）とのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ； トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ　５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドを、室温で４０分間、７−アミノデアセトキシセファロスポリン酸（１ｍＭ）と、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、反応溶液を、オクタデカン固相を用いて抽出する。生成物の抽出を、酢酸エチルによって行う。溶媒の除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００５９】
結果：抗生物質原料７−アミノデアセトキシセファロスポリン酸と２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、７３％である。
【００６０】
質量分析法による、得られた化合物の分析では、質量は４０９であった。核共鳴分光分析の結果を、以下の表にまとめる。１Ｈ　ＮＭＲのシグナルを比較するため、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチルベンズアミド）も調べた。ＡＲＸ３００（ブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）、カールスルヘ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）、ドイツ）を用いて、溶媒ＤＭＳＯ−ｄ６中で、内部標準ＴＭＳを用いて測定を行った。
【００６１】
【表１】
2004501619.tif 000003
【００６２】
構造分析の結果の全体から、得られたカップリング生成物について、以下の構造が推定され得る：
【００６３】
【化２】
2004501619.tif 000004
【００６４】
実施例４
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとアモキシシリンとのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ； トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ　５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドを、室温で５０分間、アモキシシリン（１ｍＭ）と、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、反応溶液を、オクタデカン固相を用いて抽出する。生成物の抽出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒の除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００６５】
結果：抗生物質アモキシシリンと２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−エチル）ベンズアミドとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は５５％である。
【００６６】
質量分析法によって、得られた化合物を分析したところ、質量は５６０であった。核共鳴分光分析の結果を、以下の表にまとめる。１Ｈ　ＮＭＲシグナルを比較するために、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミド（実施例３の表を参照）およびアモキシシリンも調べた。ＡＲＸ３００（ブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）、カールスルヘ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）、ドイツ）を用いて、溶媒ＣＤ３ＯＤ中で、内部標準ＴＭＳを用いて測定を行った。
【００６７】
【表２】
2004501619.tif 000005
【００６８】
構造分析の結果の全体から、得られたカップリング生成物について、以下の構造が推定され得る：
【００６９】
【化３】
2004501619.tif 000006
【００７０】
実施例５
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとアンピシリンとのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ； トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ　５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドを、室温で５０分間、アンピシリン（１ｍＭ）と、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、反応溶液を、オクタデカン固相を用いて抽出する。生成物の抽出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒の除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００７１】
結果：抗生物質アンピシリンと２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ベンズアミドとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は７５％である。
【００７２】
質量分析法によって、得られた化合物を分析したところ、質量は５４４であった。
【００７３】
構造分析の結果の全体から、得られたカップリング生成物について、以下の構造が推定され得る：
【００７４】
【化４】
2004501619.tif 000007
【００７５】
実施例６
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとスルホンアミドとのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；ピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドを、ｐ−アミノベンゼンスルホンアミド（１ｍＭ）と、室温で３０分間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００７６】
結果：生物学的活性物質ｐ−アミノベンゼンスルホンアミドと２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、７４％である。
【００７７】
実施例７
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドと置換されたサリチル酸とのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；例えば、トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）またはピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドを、４−アミノ−２−ヒドロキシ安息香酸（１ｍＭ）と、室温で５０分間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００７８】
結果：４−アミノ−２−ヒドロキシ安息香酸と２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、７３％である。
【００７９】
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸およびエステルと６−アミノペニシラン酸とのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；ピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルを、６−アミノペニシラン酸（１ｍＭ）と、室温で１時間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００８０】
結果：抗生物質原料６−アミノペニシラン酸と２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルとのカップリングの結果、それまで知られていなかった、高活性を有するさっき居ん活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、６６％である。
【００８１】
実施例９
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸およびエステルと７−アミノセファロスポリン酸とのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；例えば、トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルを、７−アミノセファロスポリン酸（１ｍＭ）と、室温で１時間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００８２】
結果：抗生物質原料７−アミノセファルスポリン酸と２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、６３％である。
【００８３】
実施例１０
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸およびエステルと７−アミノデアセトキシセファロスポリン酸とのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；ピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルを、７−アミノデアセトキシセファロスポリン酸（１ｍＭ）と、室温で１時間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００８４】
結果：２，５−ジヒドロキシ安息香酸およびエステルと７−アミノデアセトキシセファロスポリン酸とのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、７１％である。
【００８５】
実施例１１
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸およびエステルとアモキシシリンとのカップリングによる新規活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルを、アモキシシリン（１ｍＭ）と、室温で４５分間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００８６】
結果：抗生物質アモキシシリンと２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、６６％である。
【００８７】
構造分析の結果の全体から、得られたカップリング生成物について、以下の構造が推定され得る：
【００８８】
【化５】
2004501619.tif 000008
【００８９】
実施例１２
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸およびエステルとアモキシシリンとのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルを、アンピシリン （１ｍＭ）と、室温で４５分間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００９０】
結果：抗生物質アンピシリンと２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、５６％である。
【００９１】
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸およびエステルとスルホンアミドとのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；例えば、トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）またはピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルを、ｐ−アミノベンゼンスルホンアミド（１ｍＭ）と、室温で４５分間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００９２】
結果：抗生物質ｐ−アミノベンゼンスルホンアミドと２，５−ジヒドロキシ−安息香酸メチルエステルとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、６６％である。
【００９３】
実施例１４
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−安息香酸およびエステルと置換されたサリチル酸とのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；例えば、トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）またはピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルを、４−アミノ−２−ヒドロキシ安息香酸（１ｍＭ）と、室温で４５分間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００９４】
結果：４−アミノ−２−ヒドロキシ安息香酸と２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、６３％である。
【００９５】
実施例１５
生体内変化による、ヒドロカフェイック・アシッド（ｈｙｄｒｏｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）と６−アミノペニシラン酸とのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；ピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸を、６−アミノペニシラン酸（１ｍＭ）と、室温で２時間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。
【００９６】
結果：抗生物質原料６−アミノペニシラン酸とヒドロカフェイック・アシッドとのカップリングの結果、それまで知られていなかった、高い活性を有する殺菌活性化合物が得られる。
【００９７】
実施例１６
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとメルカプタンとのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；例えば、トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）またはピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドを、３−メルカプト−１，２，４−トリアゾール（１ｍＭ）と、室温で５０分間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【００９８】
結果：３−メルカプト−１，２，４−トリアゾールと２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−エチル）ベンズアミドとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、４５％である。
【００９９】
実施例１７
生体内変化による、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドとメルカプタンとのカップリングによる新規殺菌活性物質の調製
方法：酵素溶液の調製は、実施例１に従って行った。
ラッカーゼ（９７５ｎｍｏｌ／２ｍｌ／ｍｉｎ；例えば、トラメテス・バーシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）またはピクノポラス・シナバリナス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）から得られた）の影響下、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ５；０．０２Ｍ）中で、２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ベンズアミドを、２−メルカプトニコチン酸（１ｍＭ）と、室温で５０分間、等モル比で反応させる。転換速度を速くするために、反応溶液を、１００ｒｐｍで攪拌する。処理のために、オクタデカン固相を用いて、反応溶液を抽出する。生成物の溶出を、酢酸エチルまたはアセトニトリルによって行う。溶媒除去後に残った残渣を、高速液体クロマトグラフィーによって精製する。
【０１００】
結果：２−メルカプトニコチン酸と２，５−ジヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−エチル）ベンズアミドとのカップリングの結果、それまで知られていなかった殺菌活性化合物が得られる。カップリング生成物の収率は、５５％である。
【０１０１】
実施例１８
本発明によるカップリング生成物の殺菌活性の試験
方法：バークハート（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ）による寒天拡散試験（バークハート（Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ）， Ｆ． （編）： Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ， Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， ニューヨーク， １９９２， ７２４頁）を行った。試験物質を、徐々に濃度を上げながら（ｉｎ ｇｒａｄｕａｔｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）、センシ−ディスク（Ｓｅｎｓｉ−Ｄｉｓｃ）試験板（ベクトン・ディキンソン・ミクロバイオロジー・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）， コッキーズビル（Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ）， 米国）に載せる。試験のために、スタッカー・ペトリ皿（Ｓｔａｃｋｅｒ Ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈｅｓ）（ベクトン・ディキンソン・ミクロバイオロジー・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）， コッキーズビル（Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ）， 米国））において、ミュラー−ヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ） ＩＩ寒天を使用した。試験菌株として、Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）菌株ＡＴＣＣ　６５３８を選択した。インキュベーションの１６〜２０時間後に、密に配置されるが、非融合性である個々のコロニーが成長するように、この試験菌株の接種速度を選択した。接種処理をされた栄養（ｎｕｔｒｉｅｎｔ）基質を乾燥させた後、最大で６枚の試験板を、わずかに加圧しながら、寒天表面上に配置する。３６℃でのインキュベーションの１８＋２時間後、阻害円光（ｉｎｈａｂｉｔａｔｉｏｎ ｈａｌｏｓ）を測定する。内部の品質制御のために（Ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）、Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ　２５９２３を用いる方法によって確認した。
【０１０２】
結果：本発明による生体内変化によって得られ得る活性物質は、殺菌活性を有する（表１）。実施例４、９および１０によるカップリング生成物において、最も高い殺菌活性が観察される。
【０１０３】
【表３】
2004501619.tif 000009
【０１０４】
実施例１９
多耐性菌に対する殺菌活性の試験
方法：実施例１３に記載の方法に従って、寒天拡散試験によって試験を行った。試験菌として、多耐性Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）対照菌株“ノードイチャー・スタム（Ｎｏｒｄｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ｓｔａｍｍ）（スミス・クライン・ビーチャムＳｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）”を使用した。
【０１０５】
結果：驚くべきことに、カップリング生成物も、ある程度高レベルで（ｉｎ ｐａｒｔ ｈｉｇｈｌｙ）、多耐性菌に対して有効であった（表２）。原料物質の活性を、明らかに上回っている（表４）。
【０１０６】
【表４】
2004501619.tif 000010
【０１０７】
実施例２０
方法：実施例１３に記載の方法に従って、寒天拡散試験によって試験を行った。試験菌として、患者の材料から単離した、多耐性コアグラーゼ陰性Ｓ．エピデルミディス（ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）菌株９９８４７を使用した。
【０１０８】
結果：本発明によるカップリング生成物は、例えば、カテーテル材料のコロニー形成（ｃｏｌｏｎｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）において役割を果たすため、院内で問題となる菌に属する、制御困難な（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ−ｔｏ−ｃｏｎｔｒｏｌ）コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に対しても有効である（表２）。原料物質の活性を明らかに上回っている（表４）。
【０１０９】
【表５】
2004501619.tif 000011
【０１１０】
【表６】
2004501619.tif 000012
【０１１１】
実施例２１
本発明によるカップリング生成物の安定化方法
実施例１０によって調製された、アモキシシリンと２，５−ジヒドロキシ安息香酸メチルエステルを等モル含むクロスカップリング生成物の安定性を向上させるために、オクタデカン固相上での特ベルな抽出法を開発した。このように、固相を、メタノールによって活性化し、そして蒸留水によって平衡化した。その後、ｘ　ｍｌの水性クロスカップリング充填物（ｃｈａｒｇｅ）を適用し、成分を結合させた後、空気流中で、２０分間乾燥させた。その後、１０％メタノール／９０％蒸留水による洗浄段階を行う。クロスカップリング生成物の溶出を、さらに１００％脱気されたアセトニトリルによって行った。こうして得られた抽出物を、暗所にて４℃で保存した。
【０１１２】
結果：２１日間の観察期間中、カップリング生成物は安定である。
【国際公開パンフレット】
2004501619.tif 000013
2004501619.tif 000014
2004501619.tif 000015
2004501619.tif 000016
2004501619.tif 000017
2004501619.tif 000018
2004501619.tif 000019
2004501619.tif 000020
2004501619.tif 000021
2004501619.tif 000022
2004501619.tif 000023
2004501619.tif 000024
2004501619.tif 000025
2004501619.tif 000026
2004501619.tif 000027
2004501619.tif 000028
2004501619.tif 000029
2004501619.tif 000030
2004501619.tif 000031
2004501619.tif 000032
2004501619.tif 000033
2004501619.tif 000034
2004501619.tif 000035
2004501619.tif 000036
2004501619.tif 000037
2004501619.tif 000038
2004501619.tif 000039
2004501619.tif 000040
2004501619.tif 000041
2004501619.tif 000042
2004501619.tif 000043
2004501619.tif 000044
2004501619.tif 000045
2004501619.tif 000046
2004501619.tif 000047
2004501619.tif 000048
2004501619.tif 000049
2004501619.tif 000050
2004501619.tif 000051
2004501619.tif 000052
2004501619.tif 000053
2004501619.tif 000054
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501619.tif 000055
2004501619.tif 000056
【国際調査報告】
2004501619.tif 000057
2004501619.tif 000058
2004501619.tif 000059
2004501619.tif 000060
2004501619.tif 000061
2004501619.tif 000062
2004501619.tif 000063
2004501619.tif 000064