(57)【要約】本発明は、特にリンパ球のＣＤ２８−依存性活性化を阻害するために用いるための、ＣＤ２８レセプターに対するものであり、ＣＤ２８／Ｂ７相互作用を阻害しうる抗体及び該抗体由来のタンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリドーマＣＮＣＭ Ｉ−２５８２によって産生される免疫グロブリンＣＤ２８．３の重鎖と軽鎖のＣＤＲを少なくとも含むことを特徴とする、ＣＤ２８リンパ球のレセプターに特異的に結合でき、ＣＤ２８／Ｂ７相互作用を阻害できるタンパク質。
【請求項２】
ａ）  ハイブリドーマＣＮＣＭ Ｉ−２５８２によって産生される抗体ＣＤ２８．３；
ｂ）  抗体ＣＤ２８．３のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２ 又はｓｃＦｖフラグメント；
ｃ）  ＣＤ２８．３の可変領域から得られるキメラ又はヒト化抗体；
ｄ）  抗体ｂ）のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２又はｓｃＦｖフラグメント；
ｅ）  フラグメントｂ） 又はｄ）及び異種ポリペプチドからなる組換えタンパク質
から選択される請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
請求項１及び２のいずれかひとつに記載のタンパク質をエンコードする核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子からなる発現ベクター。
【請求項５】
プラスミドＣＮＣＭ Ｉ−２７６２であることを特徴とする、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
請求項１又は２のいずれか１つに記載のタンパク質を発現する細胞。
【請求項７】
ハイブリドーマＣＮＣＭ Ｉ−２５８２であることを特徴とする、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項３に記載の核酸分子で形質転換された細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の細胞。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかひとつに記載の少なくともひとつの細胞を培養し、該培養物からタンパク質を回収することを特徴とする、請求項１又は２のいずれかひとつに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
医薬品を得るための請求項１又は２のいずれか１つに記載のタンパク質の使用。
【請求項１１】
タンパク質がＣＤ２８レセプター−結合部位を１つ有し、医薬品がＣＤ２８レセプターを介してＴ細胞の活性化を選択的に阻害する免疫抑制剤であることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
医薬品が、移植拒絶、移植片−対−宿主疾患、Ｔ−リンパ球−媒介自己免疫疾患、アレルギー現象及び慢性炎症性疾患から選択される病状の治療用であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、ＣＤ２８リンパ球レセプターに対する抗体とそのフラグメント、及び特にＴ細胞活性化制御に関連したその治療用途に関する。
【０００２】
Ｔ細胞の異常活性化は、多くの自己免疫疾患の病因、また生長するように移植された臓器に対して免疫反応を引き起こす移植拒絶現象に関わっている。
Ｔリンパ球の活性化は、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と結合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示された抗原のＴレセプター（ＴＣＲ）による認識で誘導される活性化シグナルを要する。しかし、この活性化は、他の共刺激系も活性化されると、Ｔ細胞の増殖及び特異的な免疫調節サイトカイン（例えばインターロイキン２、ガンマインターフェロン又はインターロイキン４）の分泌のみを引き起こす。
【０００３】
Ｔリンパ球の活性化を制御する最も重要な系のひとつは、分子系Ｂ７／ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４である。この系は、例えば移植拒絶の機序に本質的な役割を果たしている［Ｗｏｏｄｗａｒｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ６６， １４−２０， （１９９８）］。ＡＰＣによって担持される分子Ｂ７．１ （ＣＤ８０）及びＢ７．２ （ＣＤ８６）は、 ＣＤ２８レセプター、またＴリンパ球のＣＴＬＡ４レセプターを活性化できる。ＣＤ２８の活性化は、細胞を刺激する陽性シグナルをＴリンパ球に送る；他方、ＣＴＬＡ４の活性化は、無−反応（アネルギー）をもたらす陰性シグナルを送る［ＦＡＬＬＡＲＩＮＯら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８８， ２０５−２１０， （１９９８）］。
潜伏Ｔリンパ球は、大量のＣＤ２８を発現し、ＣＴＬＡ４をほとんど発現しない。ＡＰＣとＴリンパ球とに最初の認識接触がある際には、細胞を活性化するＣＤ２８／Ｂ７相互作用が好まれる。ＣＴＬＡ４の膜発現増加によって、活性化の開始からわずか数時間後に、Ｂ７に対する親和性が、ＣＤ２８の５〜１０倍となり、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用が、Ｂ７／ＣＴＬＡ４相互作用のためにシフトする。
【０００４】
現在、サイクロスポリンは、特に臓器移植の関連で主にＴリンパ球活性化を阻害するために用いられている。しかし、この医薬品の有効性にもかかわらず、それは絶対的な保護を付えない。さらに、それはカルシウム−依存性細胞の活性化経路を全て阻害することによって作用し、このために厳密にはＴリンパ球に特異的でない生物活性を有し、相当数の副作用をもたらす。したがって、所定の作用法と大きな特異性を有する新規な免疫抑制剤を開発することが望ましい。
ＣＤ２８／Ｂ７相互作用の特異的な阻害を介して完全なＣＴＬＡ４／Ｂ７対からなるアンタゴニスト系を残すので、ＣＤ２８によってＴ細胞に与えられるアゴニストシグナルの選択的阻害は、Ｔリンパ球活性化を妨げられるものと仮定される。ＣＤ２８／Ｂ７相互作用のこのような特異的な阻害は、ＣＤ２８に対する抗体を用いて生ずることができる。
【０００５】
Ｂ７へのＣＤ２８の結合を妨げることのできる抗−ＣＤ２８抗体は、公知である。しかし、それらは、二価の天然型で用られる際、このレセプターとの結合を介して二量体を生じ、ＣＤ２８の活性化を生じるという欠点を有する。しかし、これらの抗体由来の一価のフラグメントは、それを活性化せずにＣＤ２８レセプターを阻害することができる［ＤＡＭＬＥら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０， １７５３−１７６１， （１９８８）； ＮＵＮＥＳら、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５， ３１１−３１５ （１９９３）； ＰＡＧＥＳら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１， ９４０３， （１９９６）］。
したがって、抗−ＣＤ２８抗体由来のＦａｂフラグメントは、ミエリンの投与又は冒されている動物由来のＴ細胞の転移によってマウスに誘導される実験的な自己免疫脳炎の臨床的な症状を抑制できることが報告されている［ＰＥＲＲＩＮら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３， １７０４−１７１０， （１９９９）］。
【０００６】
抗−ＣＤ２８抗体由来の一価のＦａｂ又はｓｃＦｖフラグメントを用い、ＣＤ２８／Ｂ７相互作用の特異的阻害を介してＴリンパ球の活性化を妨げることのできる可能性がある。
Ｆａｂフラグメントは、免疫グロブリン分子に対するパパインの作用から生じ、各々が軽鎖と最初の半分の重鎖を含む； ｓｃＦｖフラグメントは、可変リンカーを介して互いに結合される抗体の重鎖と軽鎖の可変部分からなり［ＣＬＡＣＫＳＯＮら、Ｎａｔｕｒｅ， ３５２， ６２４−６２８， （１９９１）］、この結果、単鎖タンパク質を形成する。
これらの一価フラグメントは、しばしば天然の抗体よりも抗原に親和性を示さず、診断又は治療上の用途で用いるためのその可能性を制限し得る。
【０００７】
本発明者らは、ＣＤ２８抗原を認識する種々の抗体から、その一価フラグメントが抗原に十分な親和性を示し、インビトロ又はインビボで用いてＣＤ２８レセプターを活性化することなくこのレセプターを阻害できる、ＣＤ２８／Ｂ７相互作用を阻害しうる抗体の選択に成功している。
ＣＤ２８．３と称されるこの抗体は、番号Ｉ−２５８２でＣＮＣＭ （Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ， ２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， ７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５）に２０００年１１月２８日にブダペスト条約にしたがって寄託されたハイブリドーマによって生産される。
【０００８】
この発明の対象は、免疫グロブリンＣＤ２８．３の重鎖と軽鎖のＣＤＲを少なくとも含むことを特徴とする、ＣＤ２８リンパ球のレセプターに特異的に結合でき、ＣＤ２８／Ｂ７相互作用を阻害できるタンパク質である。
ＣＤＲ（相補性決定領域）は、抗原認識特異性に関わる免疫グロブリンの可変領域の部分である。
【０００９】
したがって、本発明によるタンパク質には、特に
ａ）  ハイブリドーマＣＮＣＭ Ｉ−２５８２によって産生される抗体ＣＤ２８．３；
ｂ）  抗体ＣＤ２８．３のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２ 又はｓｃＦｖフラグメント；
ｃ）  ＣＤ２８．３の可変領域から得られるキメラ又はヒト化抗体；
ｄ）  抗体ＣＤ２８．３のＣＤＲと一価の Ｆｖ、ＦａｂもしくはｓｃＦｖフラグメント、又は二価のＦａｂ’２フラグメントからなる上記の抗体ｂ）のフラグメント；
ｅ）  フラグメントｂ） 又はｄ）及び異種ポリペプチドからなる組換えタンパク質
が包含される。
【００１０】
それらは、例えば以下であってもよい：
−  ｓｃＦｖ フラグメントの二価又は多価誘導体、例えば２又は３個のｓｃＦｖフラグメントの結合から生じる「ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」又は「トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）」；
−  抗体ＣＤ２８．３のＣＤＲからなる少なくともひとつの抗体フラグメントを、特異性の異なる抗体のＣＤＲからなる少なくともひとつの抗体フラグメントと組み合わせているタンパク質； 例として、二重特異性免疫グロブリン、ＣＤ２８．３ のＣＤＲを含むＦｖ又はＦａｂフラグメントの特異性の異なる抗体のＦｖ又はＦａｂフラグメントとの接合体、及びＣＤ２８．３ のＣＤＲを含むｓｃＦｖフラグメントの特異性の異なる抗体のＦｖ又はＦａｂフラグメントとの結合から生じる「二重特異性ジアボディ」が挙げられる；
−  抗体ＣＤ２８．３のＣＤＲからなる少なくともひとつの抗体フラグメントを、薬理活性を有する分子（例えば毒素）又はエフェクター特性を有する分子（例えばＦｃフラグメント）と組み合わせているタンパク質；
【００１１】
−  抗体ＣＤ２８．３のＣＤＲからなる少なくともひとつの抗体フラグメントを、インビボでの投与時にその血漿半減期を延長しうる分子と組み合わせているタンパク質； 例えば該抗体フラグメントを、融合ポリペプチドの分子量に対し十分な分子量の水溶性ポリペプチドと組み合わせ、腎臓ろ過の閾値より大きくなるように得ることができる。この場合、Ｆｃフラグメントと異なって、二量体のように結合できず、望ましくない副作用を生じがちな自身のエフェクター活性を有しないポリペプチドが、選択されるであろう。これらの性質を有するポリペプチドは、抗−ＣＤ２８抗体由来のｓｃＦｖフラグメントとの融合タンパク質を製造するために、水溶性血清タンパク質、つまり、特に血清アルブミン、ハプトグロブリン、ＩＴＩＨ２ （インター−α（グロブリン）阻害剤、Ｈ２ポリペプチド）、トランスフェリン、ＣＢＧ （コルチコステロイド結合グロブリン）、α１−抗トリプシン、ＩＴＩＨ４ （インター−α（グロブリン）阻害剤、Ｈ４ポリペプチド）、 ＡＡＣＴ （α−１−抗キモトリプシン）、ＴＢＧ （チロキシン結合グロブリン）、フィブリノーゲン及びプロトロンビンから有利に得ることができる。また、本発明によるタンパク質を、ポリオール、例えば米国特許４，１７９，３３７に記載されるようなポリエチレングリコールと接合することができる。
【００１２】
本発明によるタンパク質の例を、図１に示す。これは、抗体ＣＤ２８．３由来のｓｃＦｖフラグメントを示す。抗体ＣＤ２８．３のＣＤＲの配列は、図１で示す配列中、囲んでいる。
このｓｃＦｖフラグメントをエンコードするヌクレオチド配列は、番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １で別紙の配列リストに示しており、対応するペプチド配列は、番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２で示している。
本発明によるＦｖ、Ｆａｂ又はＦａｂ’２フラグメントは、抗体ＣＤ２８．３から酵素消化の従来技術によって得ることができる。
【００１３】
α１−抗トリプシンの５３〜４２５アミノ酸をエンコードするポリヌクレオチドに融合したＣＤ２８．３のｓｃＦｖフラグメントをエンコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを、番号Ｉ−２７６２でＣＮＣＭ （Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ， ２５ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， ７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５）に２００１年１２月１１日にブダペスト条約の下で寄託した。
本発明によるタンパク質、例えばキメラ又は組換え抗体、ｓｃＦｖフラグメント及びその誘導体などは、従来の遺伝子工学技術、例えば ＳＡＭＢＲＯＯＫら ［ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， （１９８９）］によって記載される技術によって得ることができる。
【００１４】
抗−ＣＤ２８．３抗体の可変領域をエンコードするポリヌクレオチドは、例えばハイブリドーマＣＤ２８．３のｃＤＮＡライブラリー又はプラスミドＣＮＣＭ Ｉ−２７６２由来の可変領域をクローニングして得ることができる。また、それらは、該可変領域のヌクレオチド配列に基づいて、核酸合成によって、完全に又は部分的に調製することができる。例えば、ＣＤ２８．３のＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドを合成し、それらを別の抗体、特にヒト由来の抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）に、ＣＤＲグラフティングのそれ自体公知の技術、例えばＲＯＵＴＬＥＤＧＥら ［”Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ”， ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｎ， １３−４４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｔｉｔｌｅｓ， Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ， Ｅｎｇｌａｎｄ （１９９３）］又はＲＯＧＵＳＫＡら ［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ９（１０）， ８９５−９０４， （１９９６）］によって記載される技術を用いて組み込むことができる。
【００１５】
本発明の対象は、抗体ＣＤ２８．３のＣＤＲからなる本発明によるタンパク質をエンコードするいずれかの核酸分子、また該核酸分子からなるいずれかの組換えベクター、特にいずれかの発現ベクターである。
また、本発明の対象は、抗体ＣＤ２８．３のＣＤＲからなる本発明によるタンパク質を発現するいずれかの細胞である。これは、特にハイブリドーマＣＮＣＭ Ｉ−２５８２、またこの発明による核酸分子で形質転換された宿主細胞を包含する。
【００１６】
本発明による核酸分子は、本発明によるタンパク質をエンコードする配列に加えて、該タンパク質を分泌できるシグナルペプチドをエンコードする配列を有利に含んでいてもよい； それらは、該タンパク質の検出、及び／又は精製の容易化のため、１以上のマーカーペプチドをエンコードする１以上の配列を含んでいてもよい。
本発明による発現ベクターは、選択された宿主細胞で活性な転写−及び翻訳−制御要素と結合した本発明によるタンパク質をエンコードする少なくともひとつの核酸配列を含む。本発明による発現ベクターを構築するのに使用できるベクターは、それ自体公知であり、特に用いられる宿主細胞の機能として選択されるであろう。
【００１７】
本発明に関連して使用できる宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってもよい。使用できる真核細胞には、特に植物細胞、酵母、例えばサッカロミセス由来の細胞、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）又はヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）の細胞、及び哺乳動物細胞、例えばＨｅＬａ、ＣＨＯ、３Ｔ３、Ｃ１２７、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの細胞が挙げられる。
本発明による発現ベクターの構築と宿主細胞の形質転換は、分子生物学の従来技術によって行うことができる。
この発明の対象は、本発明による少なくともひとつの細胞を培養し、該培養物から本発明によるタンパク質を回収することからなることを特徴とする、本発明によるタンパク質の製造方法である。
【００１８】
タンパク質が分泌されれば、培養培地から直接回収することができる； そうでなければ、あらかじめ細胞溶解が行われるであろう。
次いで、タンパク質を、当業者にそれ自体公知の従来法、例えば分画沈澱、特に硫酸アンモニウムでの沈澱、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティクロマトグラフィーなどによって、培養培地又は細胞溶解物から精製することができる。
本発明によるタンパク質をインビトロで用いて、抗原性、ウイルス性、同種異系又は異種性の刺激に応じたＴリンパ球の増殖応答又は分化をインビトロで研究することができる。また、それらを用いて、インビトロで患者から採取したＴリンパ球の分化、例えばインビボで後に再投与が意図された抗原又はアロ抗原に対する耐性の誘導を誘導できる。
【００１９】
また、それらを用いて、医薬品又は診断試薬を得てもよい。
二価、つまりＣＤ２８レセプター−結合部位を２個有し、そのためにこのレセプターの二量体化を誘導できる本発明によるタンパク質は、このＣＤ２８レセプターの活性化、つまり抗原に対するＴリンパ球反応の増強が望まれる全ての状況で使用することができる。
一価、つまりＣＤ２８レセプター結合部位を１個有する本発明によるタンパク質は、免疫抑制を誘導するために、活性化することなくこのレセプターを選択的に阻害することが望まれる全ての状況で用いることができる。
【００２０】
抗−ＣＤ２８ 抗体由来の一価のフラグメントからなる本発明によるタンパク質を特に用いて、ＣＤ２８レセプターに関わるＴ細胞の活性化現象を選択的に阻害し、サイクロスポリンのような既知の免疫抑制剤の欠点を有しない免疫抑制医薬品を得ることができる。
本発明によるタンパク質を用いるＣＤ２８の選択的阻害によるＴ免疫抑制は、全てのＴリンパ球−依存性病状に適用性を有する。
これらは、本質的に、移植拒絶、移植片−対−宿主疾患、Ｔリンパ球−媒介自己免疫疾患、例えばＩ型糖尿病又多発硬化症、及びアレルギー性の現象、また病原性剤での感染後の慢性炎症性疾患（特にハンセン病、結核症、リーシュマニア症、リステリア病など）の病因に関わるＩＶ型過敏症である。
【００２１】
本発明は、本発明による抗体の製造及び使用の非制限的な例に言及する以下のさらなる記載からより明らかに理解されるであろう。
実施例１： 一価フラグメントを生じる抗体の選択、ＣＤ２８．３由来一価Ｆａｂフラグメントの性質
幾つかの抗−ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．１、ＣＤ２８．２、ＣＤ２８．３、ＣＤ２８．４、ＣＤ２８．５及びＣＤ２８．６）の性質のいくつかは、ＮＵＮＥＳら［Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５， ３１１， （１９９３）］によって文献に記載されている。一般には入手できないこれらの種々の抗体は、Ｄａｎｉｅｌ ＯＬＩＶＥ （ＩＮＳＥＲＭ）の研究室によって提供された。これらの種々の抗体の一価のＦａｂフラグメントの抗原結合性を比較した。
【００２２】
これらの各抗体の５ ｍｇのＦａｂフラグメントは、２４時間３７℃でパパインで消化（パパイン／抗体モル比＝１／１００）し、０．０３Ｍヨードアセトアミドで酵素を不活化し、ＰＢＳに透析して、ヨードアセトアミドを除くことにより調製した。
１） ＣＤ２８＋ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ 細胞へのＦａｂフラグメントの結合：
１００μｌ中１００，０００個のＣＤ２８＋ Ｊｕｒｋａｔ細胞を、抗−ＣＤ２８抗体又はそのＦａｂフラグメントの濃度を増しながら、４℃で３０分ＰＢＳ−１％ ＢＳＡ−０．１％ ＮａＮ３でインキュベートする。洗浄後、細胞をＦＩＴＣ−接合抗−マウスＩｇＧ ヤギ抗体と同様にインキュベートし、洗浄し、サイトフルオロメトリーで分析する。
【００２３】
結果を図２に示す：
【式１】
2004516034.tif 000002
【００２４】
これらの結果は、Ｆａｂフラグメントのうち、ＣＤ２８．３由来のフラグメントのみがＣＤ２８＋ Ｊｕｒｋａｔ細胞に１０μｇ／ｍｌ未満の濃度で有意に結合できることを示している。
【００２５】
２） Ｂ７−１分子を発現するトランスフェクトしたマウスのＬ細胞に対するＣＤ２８＋ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ 細胞の付着に対するＦａｂフラグメントの作用：
ヒトＢ７．１でトランスフェクトした１０５個の付着性のＬＴＫ− 又はＬＢ７＋ 細胞 （マウス線維芽細胞）［ＰＡＧＥＳら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１， ９４０３， （１９９６）］を予め２４時間播種したマイクロタイタープレートで、５１Ｃｒでラベルした４×１０５個のヒトＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ， ＣＤ２８−陽性）を２時間インキュベートする。これらのインキュベーションを、Ｃａ２＋ 又はＭｇ２＋のないＰＢＳ緩衝液で種々の希釈液に希釈した抗体ＣＤ２８．１〜ＣＤ２８．６由来のＦａｂフラグメント又は抗体ＣＤ２８．３の存在下で行う。ベータカウンター（ＰＡＣＫＡＲＤ ＴＯＰＣＯＵＮＴ）で残留放射活性を読みとって、洗浄後の付着細胞を定量する。
【００２６】
結果を図３に示す：
【式２】
2004516034.tif 000003
【００２７】
これらの結果は、ＣＤ２８．３由来のＦａｂフラグメントが、ＣＤ２８／Ｂ７相互作用の阻害にもっとも有効であることを示している。それらは、３μｇ／ｍｌの濃度で付着の９０％を阻害し、全抗体 ＣＤ２８．３の阻害に匹敵する有効性を有するが、この濃度では、他の抗体由来のＦａｂフラグメントは、付着阻害が５０％未満である。
３）  混合されたリンパ球反応での増殖に対するＦａｂフラグメントの作用：
１０５個の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、抗体ＣＤ２８．１〜ＣＤ２８．６又はこれらの抗体由来のＦａｂフラグメントの種々の濃度の存在下で、３５ Ｇｙで照射した１０５個の同種異系の単核細胞と混合する。これらの培養物における増殖反応を、１６時間（３Ｈ）チミジンを導入することにより３日後に評価する。
【００２８】
結果を図４に示す：
【式３】
2004516034.tif 000004
【００２９】
これらの結果は、ＣＤ２８．３又はＣＤ２８．６由来のＦａｂフラグメントが、単核細胞の増殖阻害にもっとも有効であることを示している。同時に試験された全抗体ＣＤ２８．１〜ＣＤ２８．６は阻害作用を有さず、実際にＣＤ２８に対する刺激作用によって増殖を刺激する。
【００３０】
スーパー抗原によって誘導される増殖に対するＣＤ２８．３由来Ｆａｂフラグメントの作用
この実験のため、抗体の不在下又は抗−Ｂ７−１ （１μｇ／ｍｌ）、抗−Ｂ７−２ （０．５μｇ／ｍｌ）、ＣＴＬＡ４Ｉｇ （１０μｇ／ｍｌ）又はＣＤ２８．３ 由来のＦａｂフラグメント（１０μｇ／ｍｌ）の存在下でＶβ２＋ Ｔ細胞を特異的に刺激する５０ ｎｇ／ｍｌの毒性ショック症状毒素−１ （ＴＳＳＴ−１）の存在下、応答個体のＣＤ４＋ Ｔ細胞を照射した同質遺伝子性ＰＢＭＣと混合した。
これらの培養物における増殖反応を、１６時間（３Ｈ）チミジンを導入することにより１、３、６及び８日後に評価する。
【００３１】
結果を図５に示す：
【式４】
2004516034.tif 000005
【００３２】
ＴＳＳＴ−１は、かなりＣＤ４＋ Ｔ細胞の増殖を誘導する。抗−Ｂ７、ＣＴＬＡ４Ｉｇ又はＣＤ２８．３のＦａｂフラグメントの存在下で、この増殖の７０％阻害が、６日後に認められる。
【００３３】
サイトカインの産生に対するＣＤ２８．３由来Ｆａｂフラグメントの作用
ＣＤ２８．３ 由来のＦａｂフラグメントがインビトロで免疫偏向を誘導しうるかどうかを決定するために、混合されたリンパ球反応（ドナーＡ由来ＰＢＭＣ／ドナーＢ由来照射ＰＢＭＣ）を、ＣＤ２８．３由来のＦａｂフラグメントの存在下で行なった。ドナー由来の１０５個の末梢血液単核細胞を、３５ Ｇｙ で照射した１０５個の同種異系単核細胞と混合し、抗体ＣＤ２８．３由来Ｆａｂ １０ μｇ／ｍｌ の存在又は不在下で５日間培養する。
【００３４】
応答個体の細胞のＲＮＡを抽出し、ＴａｑＭａｎ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＨＰＲＴの量に関連した転写物量の定量測定によりサイトカインｍＲＮＡの量を評価した。
ＣＤ２８．３由来Ｆａｂフラグメントの存在下で、γＩＦＮ及びＩＬ２の産生低下及びＩＬ１０の産生増加が認められる。免疫反応のこの偏向は、Ｔｈ２−型反応に対する配向を示唆している。ＣＴＬＡ４ （ＣＤ２８のみの阻害に介在すると考えられる）の関与がＴｈ１−型反応をもたらすことが報告されている限りでは、この結果は意外である。
【００３５】
ヒトＴ細胞による、抗体ＣＤ２８．３ならびにそれ由来のＦａｂフラグメントのインビトロプロセシング
ヒトＴ細胞における抗体ＣＤ２８．３のＦａｂフラグメントの潜在的な内在化を、全抗体ＣＤ２８．３と比較して研究した。
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、１００μｇ／ｍｌの抗体ＣＤ２８．３とともに３７℃又は０℃で培養培地でインキュベートした。種々の時間で、０．１％ウシ血清アルブミンとＮａＮ３を含む冷ＰＢＳ緩衝液で細胞を洗浄し、膜運動性を阻害した。結合した抗体を、フルオレセイン−ラベルしたヤギ抗−マウス二次抗体を用いて顕在化した。細胞をＭＯＶＩＯＬに載せ、共焦顕微鏡で分析した。
【００３６】
この結果、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ 細胞に結合する全ＣＤ２８．３抗体が捕捉され、３７℃で細胞表面から消失するが、０℃では消失しないことが認められる。他方、Ｆａｂフラグメントは細胞表面に付着したままである。これは、二価抗体 ＣＤ２８．３の付着がＣＤ２８の二量体化をもたらし、細胞への侵入を生じるが、この二量体化を誘導しない一価のＦａｂフラグメントは表面に残ったままであることを示している。
【００３７】
実施例２： 抗体ＣＤ２８．３由来のｓｃＦｖフラグメントの性質
図１は、抗体ＣＤ２８．３由来ｓｃＦｖフラグメントのヌクレオチド配列と、推定されるポリペプチド配列を示す。重鎖と軽鎖の可変フラグメントに相当するこの配列の部分は、大文字で示している。また、軽鎖の可変フラグメントに相当する配列に、下線を付している。リンカーの配列は、下に事例（ｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒ）で示している。重鎖と軽鎖のＣＤＲ配列は、囲んでいる。
このｓｃＦｖフラグメントをエンコードするヌクレオチド配列も、番号 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で別紙の配列リストに示している。
【００３８】
このｓｃＦｖフラグメントをエンコードするｃＤＮＡを、ベクターｐＩＧ６ （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ）に挿入した。このベクターは、特にアンピシリン耐性マーカー及び誘導性ｌａｃプロモーターの制御下にあるｏｍｐＡシグナルペプチドをエンコードする配列、配列（１−文字コード） ＤＹＫＤのマーカーペプチドをエンコードする配列、ｃ−ｍｙｃ マーカーペプチドをエンコードする配列及びポリヒスチジン−５ マーカーをエンコードする配列からなる発現カセットを含む。
上記のｓｃＦｖフラグメントをエンコードするｃＤＮＡを、ｐＩＧ６のＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＶの部位間、ペプチドＤＹＫＤをエンコードする配列の下流ならびにｃ−ｍｙｃマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
得られた構築物を、ｐＩｇ６−２８．３と称する。
【００３９】
原核細胞での生産
ベクターｐＩｇ６−２８．３を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ８３ 細胞を形質転換した。細胞を、０．５のＯＤ５５０まで２５℃で培養する。ＩＰＴＧで誘導後、ｓｃＦｖフラグメントをペリプラズムに可溶性形態で産生する。電気泳動し、ウエスタンブロッティングした後、約３０ ｋＤａでバンドの形態が見られる。
それを細菌のペリプラズム抽出物から精製し、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ での浸透ショック、Ｎｉ−ＮＴＡマトリクスでのクロマトグラフィーによる不溶性物質の超遠心分離及びＤＥＡＥ−セファロースでのイオン交換後に得る。
ＮｉＮＴＡカラムの溶出液中に存在するｓｃＦｖフラグメントのＣＤ２８＋ Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合は、パパインでの消化による抗体ＣＤ２８．３ から得たＦａｂフラグメントを用いて得られるものに匹敵する。
【００４０】
真核細胞での生産
ベクターｐＳｅｃ−２８．３を用いて、Ｃｏｓ細胞をトランスフェクトした。細胞を３７℃で３日間培養する。ｓｃＦｖフラグメントは、上清中に可溶性形態で生産される。この上清は、混合されたリンパ球反応を阻害する： 健康なドナー由来の１０５個の末梢血液単核細胞を、別の健康な同種異系ドナー由来の１０５個の末梢血液単核細胞と混合する。これらの培養物における増殖反応を、１６時間の（３Ｈ）チミジンの導入により５日後に評価する。使用した上清の希釈物に応じたかなりの導入阻害が、認められる。対照の上清は、増殖−阻害活性を示さない。
【００４１】
実施例 ３： ＣＤ２８．３のｓｃＦｖフラグメントからなる融合タンパク質の生産
実施例２に記載されるｓｃＦｖフラグメントをエンコードするヌクレオチド配列を、配列ＶＡＡＰＳのヒンジペプチドを介して、アミノ酸５３〜４２５に相当するヒトα１−抗トリプシン（ＧＥＮＢＡＮＫ アクセス番号Ｋ０１３９６）のｃＤＮＡの一部の５’末端に連結した。得られた配列を番号 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３で別紙の配列リストに示し、相当するポリペプチドを番号ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４で示す。
【００４２】
実施例４： α１−抗トリプシンをエンコードする配列からなり、ｓｃＦｖ フラグメントをエンコードする配列を導入できる発現ベクターの構築
原核細胞発現ベクター：
ベクターｐＩＧ６を用いた（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ）。このベクターは、特にアンピシリン耐性マーカー及び誘導性ｌａｃプロモーターの制御下にある ｏｍｐＡシグナルペプチドをエンコードする配列、配列（１−文字コード）のＤＹＫＤのマーカーペプチドをエンコードする配列、ｃ−ｍｙｃマーカーペプチドをエンコードする配列及びポリヒスチジン−５マーカーをエンコードする配列からなる発現カセットを含む。
アミノ酸５３〜４２５に相当するヒトα１−抗トリプシンのフラグメントをエンコードするｃＤＮＡを、ｐＩｇ６のＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＶ部位の間、ペプチドＤＹＫＤをエンコードする配列の下流及びｃ−ｍｙｃマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
図１は、ｐＩｇ６−Ｈａａｔと称される、得られた構築物を概略で示している。
【００４３】
真核細胞発現ベクター：
ベクターｐＳＥＣＴａｇＢ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｄｅ Ｓｃｈｅｌｐ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いた。このベクターは、特にアンピシリン耐性マーカー、ゼオシン耐性マーカー及びＣＭＶプロモーターの制御下にあるＩｇＧκ軽鎖のシグナルペプチドをエンコードする配列、ｃ−ｍｙｃマーカーペプチドをエンコードする配列及びポリヒスチジン−６マーカーをエンコードする配列からなる発現カセットを含む。
アミノ酸５３〜４２５に相当するヒトα１−抗トリプシンのフラグメントをエンコードするｃＤＮＡを、ベクターＰＳＥＣ Ｂ ＴａｇのＢａｍＨＩ 〜ＥｃｏＲＩ部位の間、ｃ−ｍｙｃマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
図２は、ｐＳｅｃＨａａｔと称される、得られた構築物を概略で示している。
【００４４】
実施例５： ＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質をエンコードする配列を組み込む発現ベクターの構築
原核細胞発現ベクター：
上記の実施例３に記載されるＣＤ２８．３ ＳｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質をエンコードするｃＤＮＡを、ｐＩＧ６のＥｃｏＲＩ〜ＸｈｏＩ部位の間、ペプチドＤＹＫＤをエンコードする配列の下流及びｃ−ｍｙｃマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
図３は、ｐＩｇ６−２８．３Ｈａａｔと称される、得られた構築物を概略的に示している。
【００４５】
真核細胞発現ベクター：
上記実施例３に記載されるＣＤ２８．３ ＳｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質をエンコードするｃＤＮＡを、ベクターＰＳＥＣ Ｂ ＴａｇのＢａｍＨＩ〜ＸｈｏＩ部位の間、ｃ−ｍｙｃマーカーをエンコードする配列の上流に導入した。
図４は、ｐＳｅｃ−２８．３Ｈａａｔと称される、得られた構築物を概略的に示している。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに保有されるこのベクターを、番号Ｉ−２７６２で２００１年１２月１１日にＣＮＣＭに寄託した。
【００４６】
実施例６： 融合タンパク質の発現と精製
原核細胞で：
ベクターｐＩｇ６−２８．３Ｈａａｔを用い、Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ８３細胞を形質転換した。０．５のＯＤ５５０まで、細胞を２５℃で培養する。ＩＰＴＧで誘導後、タンパク質がペリプラズムで可溶性形態で生産される。電気泳動及びウエスタンブロッティングの後、約７４ ｋＤａでバンドの形態が見られる。
それを、ＮＩ−ＮＴＡ アフィニティクロマトグラフィーマトリクス及び／又は抗−ｃ−ｍｙｃ アフィニティクロマトグラフィーマトリクスを用いて、ペリプラズム抽出物から精製することができる。また、抗−α１−抗トリプシンアフィニティカラムを用いて、それを精製することができる。
【００４７】
真核細胞で：
ベクターｐＳｅｃ−２８．３Ｈａａｔを用いて、リポフェクションによりＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ 培地中２００μｇ／ｍｌのゼオシンの存在下で、細胞を培養する。
タンパク質が、培養培地に分泌される。
電気泳動による分離、ウエスタンブロッティング及び抗−ｃ−ｍｙｃ抗体での顕在化後、約８０ ｋＤａでバンドの形態が見られる。
【００４８】
実施例７： ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質の活性についてのアッセイ
上記実施例６で得たＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質の抗−ＣＤ２８活性を、ＣＤ２８分子又は膜上のＣＤ２８発現細胞への結合、ならびにＣＤ２８を発現しない細胞への結合の欠失によって評価した。
上記実施例６で得たＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質の免疫抑制活性は、Ｂ７への付着阻害及びＴリンパ球の誘導活性化阻害によって評価される。
【００４９】
これらの抗−ＣＤ２８及び免疫抑制活性は、以下のアッセイを用いて測定した：
抗−ＣＤ２８活性
ＣＤ２８−結合パラメータのバイオセンサー測定：
組換えヒトＣＤ２８を、バイオセンサー（ＢＩＡＣＯＲＥ）検出器で固定した。上記の実施例６に記載されるようにして得たＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質を、検出器に接触させた。結合パラメータは、 ＫＡ （１／Ｍ）２．８６ｅ９； ＫＤ （Ｍ）： ３．４９ｅ−１０である。比較として、抗体ＣＤ２８．３ のＦａｂフラグメントについて測定されるこれらのパラメータは、ＫＡ （１／Ｍ）： ９．６９ｅ８； ＫＤ （Ｍ）： １．０３ｅ−９である。したがって、抗体ＣＤ２８．３ のＦａｂフラグメントならびに融合タンパク質のＣＤ２８の親和性は、比較できる。
【００５０】
ＣＤ２８の特異的な認識についてのサイトフルオロメトリーアッセイ：
１０５個のＪｕｒｋａｔ （Ｃｄ２８＋）及びＵ９３７ （ＣＤ２８−）細胞を、ＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質の濃度を増しながら、４℃で１時間ＰＢＳ−１％ ＢＳＡ−０．１％ ＮａＮ３中でインキュベートする。洗浄後、細胞を抗−α−１−抗トリプシンウサギ抗体と、次いでＦＩＴＣ−接合ヤギ抗−ウサギ抗体とインキュベートし、洗浄し、サイトフルオロメトリーで分析する。Ｊｕｒｋａｔ細胞の用量に応じた結合（ＣＤ２８＋）とＵ９３７への非結合（ＣＤ２８−）細胞が、認められた。これは、ＣＤ２８分子に対する融合タンパク質の特異性と、ヒト造血細胞によって発現される他の分子に対する反応性欠如を示している。
【００５１】
免疫抑制活性
ＣＤ２８／Ｂ７−依存性付着アッセイ：
１０５個の付着性ＬＴＫ− 又はＬＢ７＋ 細胞 （ヒトＢ７．１ ［ＰＡＧＥＳら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１， ９４０３ （１９９６）］でトランスフェクトしたマウス線維芽細胞）を予め２４時間播種したマイクロタイタープレートで、５１Ｃｒ でラベルした４×１０５個のヒトＴ細胞（ＣＤ２８−陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞）を２時間インキュベートする。これらのインキュベーションを、Ｃａ２＋ 又はＭｇ２＋のないＰＢＳ緩衝液で種々の濃度に希釈したＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質の不在又は存在下で行う。ベータカウンター（ＰＡＣＫＡＲＤ ＴＯＰＣＯＵＮＴ）を用いて残留放射活性を読み取ることで、洗浄後の付着細胞を定量する。ＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質の存在下における付着阻害が認められる。この阻害は、使用した融合タンパク質の用量に直接依存している。
【００５２】
活性化阻害：
５×１０４個のＴ細胞（ＣＤ１１ｂ細胞の涸渇したヒトポリクローナル細胞）を、１×１０４ 個の照射ＯＫＴ３ ハイブリドーマ細胞（抗−ＣＤ３）、又は同種異系のＣＤ２８− Ｂ細胞（ＣＤ２８＋細胞を涸渇）とともに、種々の量のＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質の不在又は存在下で刺激する。これらの培養での増殖反応を、抗−ＣＤ３を用いる刺激を行ってから３日後、又は同種異系細胞を用いる刺激を行ってから７日後に、１６時間の （３Ｈ）チミジンの導入により評価する。かなりの導入阻害が、ＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質の存在下で観察される。その阻害は、使用した融合タンパク質の用量に直接依存している。
【００５３】
混合されたリンパ球反応の阻害：
健康なドナー由来の１０５個の末梢血液単核細胞を、別の同種異系の健康なドナー由来の１０５個の末梢血液単核細胞と混合する。これらの培養における増殖反応を、１６時間の（３Ｈ）チミジンの導入により５日後に評価する。かなりの導入阻害が、ＣＤ２８．３ ｓｃＦｖ／α１−抗トリプシン融合タンパク質の存在下で観察される。その阻害は、使用した融合タンパク質の用量に直接依存している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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2004516034.tif 000048
2004516034.tif 000049
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516034.tif 000050
【国際調査報告】
2004516034.tif 000051
2004516034.tif 000052
2004516034.tif 000053
2004516034.tif 000054
2004516034.tif 000055
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