(57)【要約】この発明は、乾燥した吸収性の材料と、少なくとも１種の保護物質とを収める再シール可能なストリップデバイス中に、微生物を含有する調製物を配置することによる、細胞を長期保存のために乾燥させる方法およびデバイスであって、ここで微生物調製物の体積と、乾燥性調製物の量および種類とが、微生物の調製物の添加後に、吸水性調製物が添加された試料に含有される水分を吸収し、実質的に乾燥したままにし、その際、微生物を実質的に乾燥するように選択される、前記方法およびデバイスに関する。
2006509513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の乾燥および保存のための再シール可能なストリップデバイスであって、
−少なくとも１種の吸水性物質と、少なくとも１種の保護物質とを含有する吸水性調製物を含むストリップ、
−シールされた場合、ストリップの周囲に、閉鎖された不透水性の系を提供する、再シール可能なハウジング、
を含む、前記再シール可能なストリップデバイス。
【請求項２】
吸水性調製物が、保護特性および吸水特性の両方を有する１種または２種以上の物質を組み込んでいることを特徴とする、請求項１に記載の再シール可能なストリップデバイス。
【請求項３】
第１の吸水性調製物が、１種または数種の吸収性の吸水性フォームまたは繊維ベースのパッドまたはその他のマトリクスをさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の再シール可能なストリップデバイス。
【請求項４】
吸水性調製物が、第２の吸水性調製物と接触しているか、またはそれに近接していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の再シール可能なストリップデバイス。
【請求項５】
第２の吸水性調製物が、ストリップデバイス内に封入された、１個または数個の吸収性のビーズ、錠剤、プラグ、吸水性フォームまたは繊維ベースのパッドの形態を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の再シール可能なストリップデバイス。
【請求項６】
再シール可能なハウジングがホイルポーチであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の再シール可能なストリップデバイス。
【請求項７】
再シール可能なハウジングが、一度再シールされるとデバイスがその不透水特性を回復するように開封および再シールできる不透水性カバーが各々の上にある、１個または２個以上の操作窓を備えていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の再シール可能なストリップデバイス。
【請求項８】
再シール可能なハウジングがラベルを有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の再シール可能なストリップデバイス。
【請求項９】
再シール可能なハウジングが、無菌的にストリップを取り出すために開封することができる第２の切り取りシールまたは剥離シールを有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれかに記載の再シール可能なストリップデバイス。
【請求項１０】
ａ）請求項１〜９のいずれかに記載の再シール可能なストリップデバイスを提供すること、
ｂ）ストリップへのアクセスを得るために、ストリップデバイスのハウジングにおける再シール可能な操作窓カバーを開封すること、
ｃ）乾燥させる微生物調製物を、該窓を通して、ストリップ上に位置する吸水性調製物上に添加すること、
ｄ）該ハウジング上の再シール可能な窓カバーを閉鎖することにより、ストリップデバイスをシールすること、
ｅ）ストリップデバイスを保存すること、
による生存微生物の乾燥および保存のための方法であって、微生物調製物の量と、デバイス内の吸水性調製物の量とが、微生物調製物の添加後に、吸水性調製物が微生物調製物に含有される水分を吸収し、かつ実質的に乾燥したままにすることができるように選択される、前記方法。
【請求項１１】
工程ｅ）の後、微生物が、
ｆ）ストリップデバイスを開封し、そしてハウジングからストリップを取り出すこと、
ｇ）微生物を再水和すること、
により回復されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｅ）において、ストリップデバイスが０℃〜３０℃の間の温度で保存されることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の再シール可能なストリップデバイスを少なくとも含む、微生物の乾燥および保存のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、システムに外部からの乾燥／減圧を適用する必要のない、氷点より上の温度での、微生物の実質的に乾燥した保存のための簡易化された手順に関する。本方法は、微生物を含有する少量の材料を、より大きな質量の、乾燥した吸水性材料を含有する再シール可能なストリップデバイス中に配置することを含み、その際、微生物を実質的に乾燥させ、保存において安定にする。
【０００２】
背景技術
固有の実験室的操作を伴わず、天然に、増殖状態での保存に耐えることができる微生物は極めて少ない。微生物の長期にわたる維持のために開発された最初の実験室的方法の１つは、細胞を継続的に増殖させ、継代することであった。しかしながら、これは、退屈で時間を要する、外来生物による汚染の機会の高い方法であり、遺伝的に有意な変化（例えば、プラスミドおよび／またはその他の重要な遺伝的決定基の喪失）をもたらし得る。微生物の増殖状態での長期保存のための、その他の多くの確立された方法があり、すべて代謝活性を低減させることに基づくものである。これらは、
（i）極めて低い保存温度（しばしば−６０℃またはそれ未満）および／または
（ii）外部からの物理的処理（真空または熱）の適用による、シール可能な容器における微生物からの水分の除去と、それに続く、後の保存中の水蒸気の滲入に対する容器のシール
を共通して有している。
【０００３】
既存の乾燥および保存方法に対する改善は、それが、外部からの物理的処理の適用による微生物からの水分の除去のために必要な複雑な乾燥設備なしに、細胞の前処理なしに行われ、そして氷点より上の温度で保存できる乾燥微生物を産生することができるならば、顕著な利益をもたらすだろう。
Ｐ２Ｏ５、シリカゲルまたはＣａＣｌ２などの乾燥性化学物質（desiccating chemical）を用いて、細胞を室温で乾燥させるためにいくつかの試みがなされた。しかしながら、文献に開示されたこれら全ての方法は、大きな欠点を示すものである。
【０００４】
B. Janningら、Journal of Applied Bacteriology、77（1994）、319〜324では、微生物をシリカゲルに直接接触させることによりこれらを乾燥することが研究された。Janningらにより報告されたデータは、この方法により乾燥することに対する種々の細菌株の脆弱性の幅広い変動を示すものであり、大腸菌株の貧弱な生存率と回復とを示すデータを含むものである。
この方法でのように、細胞を乾燥性化学物質に直接接触させた場合、乾燥性化学物質が微生物に対して毒性であり得るために、微生物のいくつかしか生存しない。加えて、シリカゲルなどの乾燥性化学物質の水和は熱をもたらし、これがまた微生物にとって致死的であり得る。B. Janningらの方法において、試料の再水和は、この理由のため、低温で極めて慎重に行わなければならない。
【０００５】
J. Antheunisseら、Antonie van Leeuwenhoek 47（1981）、539〜545は、乾燥性化学物質としてＣａＣｌ２とシリカゲルとを含む乾燥機（exsiccator）中で微生物を乾燥させることを開示している。微生物と乾燥性化学物質との直接接触は、折り畳んだ濾紙のストリップを含む、綿のストッパーを備えたアンプル中に微生物をおくことにより回避されている。乾燥は、１週間以内に達成され得る。この後、便利な長期保存のためにパラフィンワックスでシールする前に、アンプルを乾燥機の乾燥環境から取り出す必要があり、その際、培養物を大気中の湿気を吸収する危険にさらしてしまう。J. Antheunisseらは、乾燥の直後に、生細胞数の対数的指数（logarithmic exponent）が２〜３単位減少し、ある場合には、この初期の生存率の低下がより一層大きかったことを報告しており、これは、この乾燥方法が多くの細菌株にとって最適ではないことを反映するものである。
【０００６】
T. Popovicら、Journal of Clinical Microbiology、36（6）（1998）、1765〜1766では、無菌シリカゲルを含むホイル包装（foil envelope）の使用が報告されている。微生物は、ポリエステルスワブで採取し、採取した微生物を有するスワブをホイル包装内に置く。T. Popovicらは、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）の室温での生存を報告しており、全ての菌株が少なくとも４日間激しい増殖を示したが、また、平均して中程度の増殖が第９日まで持続したと述べることにより回復を説明しているが、これは、室温での比較的短い期間における、生存率の有意な減少を示唆するものである。T. Popovicら中の表１は、９０日間までの室温での保存における菌株の生存率の有意な減少をさらに例証している。
【０００７】
J. AntheunisseらおよびT. Popovicらによって開示されたような、微生物を乾燥性化学物質または任意のその他の吸水性調製物と直接接触させない方法は、延長された乾燥時間、より複雑な手技およびより複雑なデバイスの設計をもたらす。これらの方法についての公開された結果は、テスト微生物の生菌数の低下が顕著であるという側面を示しており、これは、これらの方法が長期保存には最適ではないか、または適切でないことを示すものである。
【０００８】
従来技術の欠点にもかかわらず、乾燥性化学物質を用いた、微生物を乾燥させるための簡易で便利なデバイスおよび方法が、乾燥および保存の間中微生物を安定化する保護物質をさらに含有する乾燥した吸水性調製物に微生物を直接接触させる一方、加えて、好ましくは、シリカゲルまたは分子篩材料などの乾燥性化学物質が、微生物に直接接触させることなく組み込まれる場合に実現できることが見出された。加えて、デバイスの設計は、微生物の適用、乾燥、保存および再水和が可能な限り迅速で、便利にそして効果的に行われるように選択される。
【０００９】
発明の簡単な説明
本発明は、微生物の乾燥および保存のための再シール可能なストリップデバイスであって、
−少なくとも１種の吸水性物質と少なくとも１種の保護物質とを含有する吸水性調製物を含むストリップ
−シールされた場合、ストリップの周囲に、閉鎖された不透水性の系を提供する再シール可能なハウジング
を含む、前記デバイスに関する。
本発明の一態様では、吸水性調製物は、保護特性および吸水特性の両方を有する物質を組み込んでいる。
【００１０】
本発明の別の態様では、第１の吸水性調製物は、１種または数種の吸収性の吸水性フォーム（bibulous foam）または繊維ベースのパッドまたはその他のマトリクスをさらに含む。
本発明の一態様では、吸水性調製物は、第２の吸水性調製物に接触しているか、またはそれに近接している。
本発明の一態様では、第２の吸水性調製物は、シリカゲルまたは分子篩材料などの乾燥性化学物質を含む。
【００１１】
本発明の好ましい態様では、第２の吸水性調製物は、ストリップデバイス内に封入された、１個または数個の吸収性のビーズ、錠剤、試片（coupon）、ラベル、ポリマーフィルム、プラグ、吸水性フォームもしくは繊維ベースのパッドの形態（format）を有する。
さらに好ましい態様では、再シール可能なハウジングは、ホイルポーチである。
さらなる態様では、再シール可能なハウジングは、１個または２個以上の操作窓（access window）を含み、その各々の上には、一度再シールされるとデバイスがその不透水特性を回復することができるように、開封および再シールできる不透水性カバーが存在する。
さらなる態様では、再シール可能なハウジングはラベルを有し、そこに微生物調製物の詳細をメモすること、および／または、バーコードなどの方法により記録することができる。
さらなる態様では、再シール可能なハウジングは、ストリップを無菌的に取り出すために開封できる、第２の切り取り（tear）シールまたは剥離（peel）シールを有する。
【００１２】
本発明はさらに、
ａ）本発明による再シール可能なストリップデバイスを提供すること、
ｂ）ストリップへのアクセスを得るために、ストリップデバイスのハウジングにおける再シール可能な操作（接種）窓カバーを開封すること
ｃ）乾燥させる微生物調製物を、該窓を通して、ストリップ上に位置する吸水性調製物上に添加すること、
ｄ）該ハウジング上の再シール可能な窓カバーを閉鎖することにより、ストリップデバイスをシールすること、
ｅ）ストリップデバイスを保存すること、
による生存微生物の乾燥および保存のための方法であって、微生物調製物の量とデバイス内の吸水性調製物の量とが、微生物調製物の添加後に、吸水性調製物が微生物調製物に含有される水分を吸収し、かつ実質的に乾燥したままにすることができるように選択され、その際、微生物を実質的に乾燥させ、保存において安定させるために保護物質と接触させる、前記方法に関する。
【００１３】
好ましい態様では、工程ｅ）の後、微生物は、
ｆ）ストリップデバイスを開封し、そしてハウジングからストリップを取り出すこと、
ｇ）微生物を再水和すること
により回復させる。
本発明による方法の一態様では、工程ｅ）において、ストリップデバイスは−７０℃〜３７℃の間の温度で保存される。
本発明による方法の好ましい態様では、工程ｅ）において、ストリップデバイスは、０℃〜３０℃の間の温度で保存される。
本発明はさらに、本発明の方法による再シール可能なストリップデバイスを少なくとも含む、微生物の乾燥および保存のためのキットに関する。該キットはまた、手順に必要な任意の情報、および／または関連する溶液、例えばバッファーまたは保護物質を組み込んだ溶液の容器などの、該手順を最適化し、保存手順の最大限の効率を達成するために必要となり得る、補助的な構成要素を含んでもよい。
【００１４】
図面の説明
図１は、本発明による再シール可能なストリップデバイスのための形態の例を示す。
図２は、再シール可能なストリップデバイスにおける保存により細胞を保存するために用いる本発明による方法例のフローチャート表示を示す。
図３の詳細な説明は、実験１に見出すことができる。
【００１５】
発明の詳細な説明
この発明は、微生物を長期保存のために乾燥するためのデバイスおよび方法に関する。これは、微生物を含有する調製物（微生物調製物）を再シール可能なストリップデバイス中に配置することにより達成される。ストリップデバイスは、不透水性の再シール可能なハウジングと、ハウジング内のストリップとを含む。ストリップは、１または２以上の吸水性調製物がその上に付着した固体支持体を含む。吸水性調製物は、少なくとも１種または２種以上の吸水性物質と、１種または２種以上の保護物質とを含み、それにより、微生物調製物の体積と、吸水性調製物の量および組成とが、吸水性調製物上への微生物調製物の添加、およびテストストリップの再シールの後に、該吸水性調製物が、添加された微生物調製物に含まれる水分を吸収し、かつ実質的に乾燥したままにすることができるように選択され、その際、その中の微生物を実質的に乾燥させ、かつ保存に対して安定にする。
【００１６】
固体支持体は、典型的には非吸水性材料であり、しばしばポリエステルシートなどのプラスチックである。吸水性調製物は、典型的には接着剤により固体支持体に結合している。別の態様では、吸水性調製物は、固体支持体に結合し、かつ１種または２種以上の吸水性物質および１種または２種以上の保護物質を組み込んだ、１種または数種の吸収性の吸水性フォームまたは繊維ベースのパッドまたはマトリクスをさらに含む。
本発明において、「再シール可能なデバイス」なる表現は、使用前に水分の滲入に対してシールされているデバイスであって、該デバイスの不透水性の外部ハウジング内に１個または２個以上の孔（操作窓）が存在し、その上にある不透水性カバーがデバイス内へのアクセスを許容するために開封可能であり、その後、水分滲入に対するバリアを回復するために再シール可能であるようになっているデバイスを意味する。
【００１７】
本発明により乾燥および保存することができる微生物または細胞は、限定されることなく、大腸菌（形質転換を包含する分子生物学的手順に用いられる菌株を含み、そしてすでに形質転換された菌株を含む）などの腸内細菌科細菌、Vibrio fischeriなどのビブリオ科細菌、産業上重要な生物（乳酸桿菌）、医学に関連する生物、シュードモナス科細菌などの細菌を包含する。細胞は、栄養形態である必要はないが、胞子状態であることもできる。
この発明の別の側面では、細胞、例えばE.coli NovaBlue（Novagen Inc.、Madison、USA）を、本発明の方法を用いて乾燥させ、そして次に、保存後、WO 02/50252の方法にしたがい、細胞を、好適なコンピテンシー誘導溶液で再水和し、その後プラスミド分子などの外来のＤＮＡで直接形質転換することを可能にすることができる。
【００１８】
本発明では、デバイスに添加される微生物の試料のことを、それがどのように添加されるか（例えば、直接または再懸濁の後）とは無関係に、微生物調製物と呼ぶ。様々な微生物の給源、例えば、コロニー、液体培養物、野外試料、血液試料などを用いることができる。微生物調製物は、例えば、固形微生物増殖培地上で増殖しているコロニーからサンプリングすることにより得ることができる。この微生物調製物は、デバイス内のストリップ上の吸水性調製物上に直接添加するか、または、デバイスへの添加の前に、まず好適な溶液中に懸濁することができ、後者は図２のフローチャート表示に示してある。あるいは、微生物調製物は、液体培養物または細胞懸濁液からサンプリングすることができる。上記のいずれの場合にも、例として、１μｌのループ（loop）を、微生物調製物をデバイスに移すのに用いることができる。
【００１９】
全ての場合において、微生物調製物は、デバイスへの添加の前に、保護物質を含有する溶液と事前に混合することができる。これは、かかる溶液による希釈、または、微生物調製物を遠心分離し、その後かかる溶液に再懸濁することにより達成することができる。吸水性調製物の一部である同一の保護物質、または異なる保護物質を用いることができる。
例として、後期の対数期または静止期の細菌培養物は、１μｌあたり１０６細胞に相当する、１ｍｌあたり約１０９細胞を含んでもよく、このように、比較的少量の液体中の極めて顕著な数の細胞をストリップデバイスに容易に適用することができる。
【００２０】
微生物調製物の体積、ならびに吸水性調製物または再シール可能なストリップデバイス内の調製物の量および種類は、微生物の添加後、吸水性調製物が添加した試料に含まれる水分を吸収し、その際、微生物を実質的に乾燥させることができるように選択される。重要なことに、これは外部の物理的処理なしに自己乾燥する閉鎖系を意味している。実質的に乾燥しているとは、調製物への細胞の添加後の水分の終量が、好ましくは１０％ｗ／ｗ未満、より好ましくは５％ｗ／ｗ未満、そしてより一層好ましくは水分２％ｗ／ｗ未満であることを意味する。吸水性調製物の必要量は、乾燥すべき微生物調製物の量、および材料の吸水度（water absorbing capacity）に依存する。当業者は、微生物調製物の添加後に実質的に乾燥したままであり、かつその際微生物を実質的に乾燥させるような、吸水性調製物の好適な量を見出すことができる。
【００２１】
これらの実質的に乾燥した条件、ならびにそこでの吸水性調製物および保護物質の慎重な選択は、微生物の長期の安定性を、氷点より上の温度においてさえ増強する。本発明の手順により細胞を乾燥するのに用いることができる吸水性調製物は、少なくとも１種の吸水性物質および１種の保護物質を含む。保護物質とは、細胞の生存率の維持を、乾燥の最中および乾燥後に積極的に促進する物質である。
吸水性調製物中に好ましく組み込まれ、そして、したがって、微生物と接触する保護物質は、乾燥処理中に細胞を安定化させ、かつ、生存率の低下を最小化するように選択される。特に、保護物質は、乾燥状態において、そしてまたとりわけ、乾燥状態へおよび乾燥状態からの移行段階（それぞれ乾燥および再水和）において、細胞の構造的完全性を保つことを補助する。かかる保護物質はまた、吸水性調製物中に組み込まれた場合、吸水性物質として作用することもできる。
【００２２】
保護物質の例としては、炭水化物（天然もしくは合成のいずれも）、例えば、糖類（例えばショ糖、乳糖、ラクチトール、トレハロース、ブドウ糖、セロビオース、ラフィノース、シクロデキストリン）およびその誘導体、および／または（糖ベースおよび非糖ベースの）ポリマーおよびその誘導体、および／またはアミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質およびその誘導体、および／またはタンパク質ベースの調製物およびウシ血清アルブミンのフラクションＶなどのフラクションが挙げられる。かかる保護物質は当業者によく知られているため、このリストは完全であることを意図していない。
吸水性物質は、水分を吸収することができ、その特性（例えば、酸性度、化学反応性）が微生物調製物中の細胞の生存率に負の影響を有しない任意の物質を包含することができる。かかる材料は、例えば、微生物調製物を乾燥する処理の最中に、発熱反応により顕著な熱を発生すべきではない。
【００２３】
好適な吸水性物質の具体例は、乾燥した炭水化物またはその他の有機もしくは無機ポリマー、例えば、デンプン、デキストリン、デキストラン、セルロース、タンパク質、ポリペプチド、寒天、アガロース、ポリアクリルアミド、セファデックス、セファロース、またはこれらの混合物である。
一態様では、吸水性物質は、保護物質の特性をさらに示すものであり、これにより、吸水性調製物は、吸水性物質および保護物質の両方として機能する１種の物質のみを含むことができる。かかる物質の一例は、トレハロースまたはショ糖などの乾燥した炭水化物であり得る。
【００２４】
加えて、吸水性調製物は、生物学的に適合性の緩衝成分などの、当業者によく知られたその他の生物学的に適合性の物質、例えばＨＥＰＥＳ［Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）］、微生物培養培地もしくはかかる培地の成分、活性炭、エクトイン（参考文献：Louis Pら、Appl. Microbiol Biotechnol（1994）41: 684-688）などの適合性の溶質、ビタミンＣ、またはその他の生物学的に適合性の還元剤もしくは抗酸化剤、および、スーパーオキシドジスムターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素または直接的もしくは間接的にフリーラジカルを中和し、または容易に反応してフリーラジカルを生じる化学物質を中和する化学物質、を含むように作製してもよい。
【００２５】
好ましくは、吸水性調製物は、トレハロースおよび／またはショ糖などの糖類と、１種または２種以上の生物学的に適合性の緩衝成分とからなる。
本発明の別の態様では、吸水性調製物は前記形態を有し、そしてそのため、ストリップデバイス内に組み込まれた固体支持体上の、保護物質、１種または数種の吸収性の吸水性フォームまたは繊維ベースのパッドまたはマトリクスの担体として用いられる。好適なパッド材料は、慣用のセルロース紙、ニトロセルロースまたはその誘導体などの材料を包含する。グラスファイバー材料、Porex（登録商標）シート材料（Porex Corporation）などの繊維性プラスチック（fibrous plastic）材料、かかる材料をビスコースとして含む活性炭クロスおよび不織布、およびポリエステルを用いることもできる。上記のかかる材料は全て、当業者によく知られている。
【００２６】
本発明の別の好ましい態様では、吸水性調製物（以下では、理解を容易にするために「第１の吸水性調製物」と呼ぶ）に加え、ストリップデバイスは第２の吸水性調製物をさらに含む。第２の吸水性調製物（第１の吸水性調製物と直接接触しているかまたはこれから離れており、かつ、いずれの場合にもストリップデバイス内にある）は、デバイス内での微生物調製物の乾燥の効率をさらに高める。第１の吸水性調製物は、微生物調製物と直接接触するように置かれる。第１の吸水性調製物の量が、微生物調製物の量に対して、微生物を完全に実質的に乾燥させるか、または微生物調製物の迅速な乾燥を保証するにはあまりに少ない場合、第２の吸水性調製物は、システム内の過剰な水分を除去するのに用いられる。第２の吸水性調製物の量は、混合物全体が実質的に乾燥するのに十分である。典型的には、ある微生物調製物については、第１および第２の吸水性調製物の量は合計で、差別化がなされておらず、かつ吸水性調製物全体が微生物調製物と直接接触するように置かれた場合に必要な、吸水性調製物の量に等しい。
【００２７】
第１および第２の吸水性調製物は、同じまたは異なる吸水性物質でできていてもよく、そして同じまたは異なる保護物質を組み込んでいてもよい。これらは、同じまたは異なる物理的形態を有していてもよい。典型的には、第２の吸水性調製物は、それが微生物調製物とわずかな接触しか有しない場合は、いずれの保護物質も組み込むことを要しない。
【００２８】
好ましくは、第２の吸水性調製物は、ストリップに付着していてもいなくてもよい１個または数個のビーズ、サシェ、タブレット、試片、ラベル、ポリマーフィルム、またはペレットの形態を有する。吸水性調製物のためのかかる形態の組み合わせは、保存、および再シール可能なストリップデバイスの不透水性の外部保護ハウジングの第２のシールの開封後、第１の吸水性調製物からの微生物調製物を再水和する前に、ストリップを第２の吸水性調製物から容易に分離できるため、有利であり得る。このように、第１の吸水性調製物からの微生物調製物の再水和に必要な溶液の体積は、第１および第２の乾燥性調製物の両方を再水和するのに要求されるものより小さい。これは、より少ない再水和溶液を用いてもよく、得られる微生物懸濁液がより濃厚であるため、さらなる利点を有する。
【００２９】
本発明の別の態様では、生物学的に適合性であることを要しない吸水性物質（乾燥性化学物質）が、デバイス内、第２の吸水性調製物中に存在してもよいが、それは微生物から物理的に離れている。このように、優れた吸水特性を有する乾燥性化学物質を、例えば、水和時の発熱反応により引き起こされる、微生物調製物への有害な効果なしに、デバイス内において、第２の吸水性調製物中に配置することができる。生物学的に適合性であることを要しないかかる乾燥性化学物質の好ましい例は、ゼオライトなどの分子篩、酸化アルミもしくはシリカゲルなどの無機酸化物、モンモリロナイト粘土、または当業者に知られたその他の材料である。
【００３０】
本発明の別の態様では、生物学的に適合性であることを要しない吸水性物質または乾燥性化学物質は、デバイス内に、これらの物質の、ストリップの固体支持体の材料中への組み込みにより存在することができる。
本発明によるストリップデバイスの再シール可能なハウジングは、アルミホイルポーチなどの不透水性の保護用外部包装を含む。その他の不透水性の保護用外部包装は当業者によく知られている。
【００３１】
好ましい態様では、ハウジング内に、１個または２個以上の操作窓であって、その各々の上に、開封および再シールすることができ、一旦これを行うことによりデバイスがその不透水特性を回復するようになっている不透水性カバーのある操作窓が存在する。典型的には、不透水性カバーは、デバイスに対し、好適な再シール可能な接着剤により、その周囲を固定される。不透水性カバーは、この場合、剥離可能なテープの形をとることができる。
あるいは、カバーがデバイスの不透水性の保護用外部包装の一体化した部分であり、そして、したがって、好適な再シール可能な接着剤により、その周囲の一部のみが固定されるヒンジ設計を構想することができる。
【００３２】
あるいは、所定の操作窓上の第１のカバーが剥離および除去可能であり、そして、テープなどの第２のカバーを、その後、操作窓の上に、デバイスがその不透水特性を回復するように設置する、２工程の機構を構想することができる。
さらなる態様では、アルミホイルポーチなどの不透水性の保護用ハウジングは、その上に微生物調製物の詳細をメモし、および／またはバーコードなどにより記録するラベルを有する。
【００３３】
さらなる態様では、ハウジングは、乾燥微生物調製物を使用のために再構成する目的で、微生物調製物を担持するストリップを無菌的に取り出すために、保存後必要なだけ開封することができる第２の切り取りシールまたは剥離シールを有する。
典型的には、吸水性調製物を含む再シール可能なストリップデバイスの内容物は、微生物調製物を添加する前に無菌である必要がある。デバイスの構成要素は、組み立ての前に別々に滅菌してもよく、または、デバイスを、これの後であるが、微生物調製物を添加する前に、例えばガンマ線照射もしくは同様の処理により滅菌してもよい。したがって、デバイスの製造中に系内に導入されてしまうことが起こる、微生物からの汚染のリスクがない。
【００３４】
図１は、本発明による再シール可能なストリップデバイスのための形態の例を示す。部品Ａはストリップを、部品Ｂはハウジングを示す。ストリップは、プラスチック製ストリップ（１）を含み、その上に、少なくとも１種の吸水性物質および少なくとも１種の保護物質を有するパッドを含む吸水性調製物（２）が付着している。少なくとも１種の吸水性物質を有するパッドを含む第２の吸水性調製物（３）は、ストリップのさらに下方に位置している。
ハウジングは、１個の再シール可能な操作窓（５）を有するホイルポーチ（４）を含む。操作窓が剥離可能なシール（５ａ）において剥離開封されると、ストリップ上の吸水性調製物へのアクセスが得られ、吸水性調製物上に微生物調製物を接種することができる。ハウジングからストリップを無菌的に取り出すために、ハウジングは、切取線（６）を破ることにより開けることができる。
【００３５】
本発明はさらに、
ａ）本発明による再シール可能なストリップデバイスを提供すること、
ｂ）ストリップへのアクセスを得るために、ストリップデバイスのハウジングにおける再シール可能な操作（接種）窓カバーを開封すること、
ｃ）乾燥させる微生物調製物を、該窓を通して、ストリップ上に位置する吸水性調製物上に添加すること、
ｄ）該ハウジング上の再シール可能な窓カバーを閉鎖することにより、ストリップデバイスをシールすること、
ｅ）ストリップデバイスを保存すること、
による生存微生物の乾燥および保存のための方法であって、微生物調製物の量と、デバイス内の吸水性調製物の量とが、微生物調製物の添加後に、吸水性調製物が微生物調製物に含まれる水分を吸収し、そして実質的に乾燥したままにすることができるように選択され、その際、微生物を実質的に乾燥させ、保存において安定であるように、これらを保護物質と接触させる方法に関する。
【００３６】
本発明により乾燥された微生物を有するシールされたストリップデバイスは、−７０℃〜＋３７℃の間、好ましくは０℃〜＋３０℃の間の温度で安定して保存することができる。「安定して保存された」細胞は、その生存率を認め得る程低下させることなく、好適な温度で長時間の保存に耐えることができる。保存期間は、約０日〜約２０００日、典型的には約２０日またはそれ未満〜約５００日の範囲であることができるが、約−２０℃未満の温度では、さらに長い保存期間を用いることができる。
【００３７】
保存後、微生物は、
ｆ）ストリップデバイスを開封し、そしてハウジングからストリップを取り出すこと
ｇ）微生物を再水和すること、
により回復させる。
再水和は、典型的には保存された微生物調製物を担持する吸水性調製物に、好適な再構成溶液を添加することにより、または、テストデバイスを、微生物培養培地もしくは緩衝溶液などの好適な溶液中に挿入することにより行われる。
【００３８】
本発明による方法の手順の一例を図２に示す。工程１では、細胞が、寒天プレート上の微生物のコロニーから取り出される。工程２では、細胞が、保護物質を含み得る少量の無菌液体培地中に懸濁される。工程３では、ストリップデバイス上の再シール可能な窓カバーが、再シール可能なストリップデバイスのパッドへのアクセスを得るために開封される。工程４では、乾燥すべき少量（この例では１μｌ）の微生物調製物が取られ、デバイス上の窓を通してストリップデバイス上のパッドにおける吸水性調製物上に接種される。工程５では、ストリップデバイスが、テストストリップデバイス上の再シール可能な窓カバーを閉鎖することにより、直ちに再シールされる。工程６では、微生物調製物の詳細が、ストリップデバイスの外部包装上のラベル上に記入される。工程７では、テストストリップが、使用前に保存場所（例えば４℃の冷蔵庫中）に置かれる。工程８では、保存された細菌へのアクセスを得るために、ストリップデバイスが、第２のシール、この例では剥離シールを開封することにより開封される。工程９では、その後、ストリップデバイスがその包装から取り出される。工程１０では、細胞が、好適な再水和溶液の、パッドへの直接添加（工程１０ａ）またはテストデバイスのパッドの、好適な再水和溶液への挿入（工程１０ｂ）のいずれかによる添加によって再水和される。工程１０ａまたは工程１０ｂのいずれにおいても、微生物培養培地は、好適な再水和溶液となることができる。
【００３９】
本方法の手順の別の例において、工程２は、次の工程で、ストリップデバイス上の再シール可能な窓カバーが、再シール可能なストリップデバイスのパッドへのアクセスを得るために開封され、その後、寒天プレート上の微生物のコロニーから取り出された細胞が、デバイス上の窓を通して、液体への事前の懸濁なしに、ストリップデバイス上のパッドにおける吸水性調製物上に直接接種されるように、省略してもよい。
【００４０】
本方法の手順の別の例において、工程１および２は、次の工程で、ブロス培養物などのすでに存在している液体懸濁液である少量（この例においては１μｌ）の微生物調製物が取られ、デバイス上の窓を通して、ストリップデバイス上のパッド内の吸水性調製物上に接種されるように、省略してもよい。かかる懸濁液は、追加の保護物質を含有していてもよい。あるいは、かかる懸濁液は、ブロス培養物もしくは他の微生物懸濁液の事前の遠心分離と、保護物質を含み得る選択した溶液への微生物の再懸濁により構成してもよい。遠心分離および再懸濁のこれらの追加の準備工程は、デバイス上の窓を通してストリップデバイスへ接種される懸濁液中の微生物の濃度を調節するため、典型的には微生物を濃縮するために用いてもよい。
【００４１】
本発明の他の側面では、本発明の方法による微生物の簡易かつ即時の乾燥のためのキットが提供される。キットは、本発明による１種または２種以上の保護物質を組み込んだ少なくとも１種の吸水性調製物を含有する少なくとも１個の再シール可能なストリップデバイスを含む。好ましくは、吸水性調製物は、使用者が単純にデバイスの操作窓のカバーを開封し、微生物を含有する微生物調製物をパッドに添加し、保存のためにデバイスの操作窓を再シールすれば済むように、ストリップデバイス内に封入されたストリップ上に展開された１個または数個の吸収性の吸水性フォームもしくは繊維ベースのパッドもしくはその他のマトリクスの形態に構成される。該キットはまた、手順に関する任意の必要な情報、および／または、バッファーもしくは保護物質を組み込んだ溶液などの関連溶液の容器といった、保存手順の最高の効率を達成するために該手順を最適化するのに要し得る補助的な構成要素を含んでもよい。
【００４２】
本発明によるデバイスおよび方法は、微生物を添加した後、外部の乾燥設備を適用する必要性を排除するものである。システム内の調製物の乾燥は、生物が添加される前に行われ、したがって、本システムは、使用前に事前に準備され、（必要に応じて）滅菌され、そして（温度制御された保存条件を要することなく）保存される。本システムは、したがって、微生物調製物試料がいつどこで添加されるかについて極めてわずかな制約を有し、すなわち極めてフレキシブルである。生物に依存するかも知れないが、一般的に、微生物調製物の添加後の長期保存のためには、４℃またはそれ未満での保存が推奨される。
【００４３】
使用者にとって、実験室内での、０℃を超える温度での保存は、いずれもより便利かつユーザーフレンドリーであり、そしてまたより経済的である。さらに、本発明による方法で保存された細胞の発送は、凍結することなく達成することができ、したがってまた、より便利である。
【００４４】
従来の保存方法に比べ、本発明による自己乾燥方法論の主要な利点は、関連する手順の簡易さおよび便利さであり、そこでは、使用者は、典型的には、少量の微生物懸濁液（または半固形材料、例えばコロニー）を添加し、そしてその後、保存のために冷蔵庫に配置するだけでよい。例えば、典型的な冷凍庫における保存のための必須条件であるグリセロールを含む無菌溶液を調製すること、または細胞を液体窒素上で保存することが不要であり、したがって、本処理はより簡易であり、より安全であり、かつより迅速である。加えて、本デバイスは閉鎖系であり、したがって、微生物調製物の乾燥処理の最中に、デバイスが大気に対して開放されている時間が顕著ではない。これは、例えば、乾燥処理中にエアロゾルが生じ得る多くの凍結乾燥処理とは大きく異なるところであり、したがって、本発明は、病原生物を扱い、そして乾燥させる処理をより一層安全にする。
【００４５】
さらなる詳述なしに、当業者は、上記の記載を用い、本発明を最大限活用することができると考えられる。好ましい具体的な態様および例は、したがって、単に説明的であり、そして、決していかなる場合にも本開示の残りを限定しないと解釈されるべきである。
本明細書中で引用された全ての出願、特許および刊行物、ならびに２００２年１２月１３日に出願された対応出願EP 02027875.0の全開示は、本明細書に参照により組み込まれる。
【００４６】
例
実験１  パッド上に保護剤を有するテストストリップ上の細胞の生存を示す
ストリップデバイスの製造
HY-RiSE（登録商標）Colour Hygiene Test Strips（Merck KGaA、製品番号1.31200.0001）からのシールされたテストストリップを、自己乾燥保存ストリップを製造するために適応させた。メスを用いて、テストストリップを囲むホイルポーチに操作窓を切り取り、これによりテストストリップパッドへのアクセスを可能にした。これは、５ｍｍ×５ｍｍの領域の３辺に切れ目を設けることにより行った。ホイルポーチは、パッドから最も離れた端で切り開き、そしてストリップを取り出した。プラスチック製ストリップのおよそ１ｃｍを、パッドから遠位の端からトリミングした。保護剤（ろ過滅菌された栄養ブロス、ＮＢ（Nutrient Broth No.2、Merck KGaA、製品番号10136）中の５０％（ｗ／ｗ）のショ糖（BDH、製品番号102745C））の８６μｌのアリコートをパッドに分注し、そしてストリップを温風ファン（T.I Sunhouse Ltd製Sunhouse 2000）の下に３０分間配置した。温風ファンはベンチ上に吊し、温風が吹き出るグリルが下方を向くようにした。ベンチの上端とグリルとの距離は３５０ｍｍであった。ファンヒーターは、最大加熱を選択し、そしてこれは、達成温度が７５〜９５℃である、およそ１９０ｍｍ×２７０ｍｍの領域をもたらした。乾燥すべきストリップをこの領域内に、プラスチックグリッド（Denleystor、低温保存ＡＢＳプラスチックグリッド入りラック、１５０ｍｍ×１５０ｍｍ、グリッドは５ｍｍ離れて配置）上に配置し、これは、ストリップをベンチ上２０ｍｍ持ち上げた。ストリップは、３６個の組で製造し、乾燥した。
【００４７】
接着性乾燥剤（self adhesive desiccant）（CSP Technologies、ACTIV-STRIP、M-0002-58）を保護ホイルポーチから取り外し、４４．０ｍｍ×〜１２．６ｍｍ×０．６０ｍｍの３片にカットし、乾燥シリカ乾燥剤ビーズ（Sigma、乾燥剤用シリカビーズ、Type II、サイズ1/8"のビーズ）のサシェを含有するスズ製容器中に直ちに配置した。ストリップ上のパッドが乾燥した後、乾燥剤片をスズ製容器から取り出し、ストリップに付着させた（位置については図１を参照）。次に、ストリップをホイルポーチに戻し、そして、ポーチを、一時保存のために乾燥シリカ乾燥剤ビーズを含有する第２のスズ製容器に配置した。ポーチをこのスズ製容器から取り出し、そしてこれらの切断された端をMultivac A300 Packagerを用いてホイルでシールした。包装機（packager）は、３．５秒の熱／圧力シール時間、シール圧力１気圧で、およそ６００ｍｂａｒの真空を引くようにプログラムした。次に、ポーチを乾燥シリカ乾燥剤を含有する第３のスズ製容器に配置した。ポーチをスズ製容器から取り出し、そして接着性プラスチックフィルム（Tenza Clearview Film 製品番号329111）のストリップを操作窓上に配置した。ストリップを、接種の前に、室温で少なくとも１６時間維持した。
【００４８】
濃縮細胞接種物の調製
Ｋ１２の由来株（derivative）である大腸菌ＪＭ１０９（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH {German Collection of Microorganisms and Cell培養物} DSM 3423）の初代培養を以下のとおりに調製した。ＪＭ１０９細胞を、ＬＢ寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン（カゼインからのペプトン−Merck KGaA.、製品番号1.07213）、５ｇ／ｌの酵母エキス（Merck KGaA.、製品番号1.03753）、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ（BDH、製品番号10241）、１５ｇ／ｌの寒天（Merck KGaA.、製品番号536025J）、ｐＨはＮａＯＨで７．５に調節）に画線し、そしてプレートを、２０℃で７２時間インキュベートした。
【００４９】
これから、単一コロニーを、３０μｌの２Ｍ  Ｍｇ２＋溶液（１Ｍ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０（Fluka、製品番号63138）、１Ｍ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（Fluka、製品番号63068））が添加された、３ｍｌのＳＯＢ培地（２０ｇ／ｌのトリプトン（カゼインからのペプトン−Merck KGaA.、製品番号1.07213）、５ｇ／ｌの酵母エキス（Merck KGaA.、製品番号1.03753）、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ（BDH、製品番号10241）、０．１８６ｇ／ｌのＫＣｌ（BDH、製品番号101984L））を含む３０ｍｌの汎用バイアル（Sterilin、製品番号128A）中に接種し、そして３７℃でインキュベートした。得られた培養物（初代培養物）を０．４０のＯＤ６５０ｎｍ（Pharmacia LKB、Novaspec II Visible Spectrophotometer）に増殖させ、＋４℃に移し、一晩保存した。
【００５０】
シードストック（seed stock）を生成するため、初代培養物の１ｍｌのアリコートを、２５０ｍｌの三角フラスコ（Pyrex、製品番号1140/14）中、５００μｌの２Ｍ  Ｍｇ２＋（１Ｍ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０（Fluka、製品番号63138）、１Ｍ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（Fluka、製品番号63068））溶液が添加された５０ｍｌのＳＯＢ培地に接種するのに用い、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。ＯＤ６５０ｎｍを、培養物が０．６５になるまで追跡した。３５０μｌの２Ｍ  Ｍｇ２＋（１Ｍ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０（Fluka、製品番号63138）、１Ｍ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（Fluka、製品番号63068））が添加された３５ｍｌのＳＯＢ培地（２０ｇ／ｌのトリプトン（カゼインからのペプトン−Merck KGaA.、製品番号1.07213）、５ｇ／ｌの酵母エキス（Merck KGaA.、製品番号1.03753）、０．５ｇ／ｌのＮａＣｌ（BDH、製品番号10241）、０．１８６ｇ／ｌのＫＣｌ（BDH、製品番号101984L））のアリコートを、培養物を含むフラスコに加え、そして穏やかに攪拌して混合した。培養物を、８５０μｌのアリコートで、事前に冷却されたcryovialバイアル（NUNC、製品番号3.68632）に分注した。１５０μｌのグリセロール（Fluka、製品番号49767）のアリコートを各バイアルに加え、内容物を穏やかに転倒することにより混合し、そして直ちにドライアイス上に配置した。各シードストックバイアルの内容物が凍結されたら、これらを−７０℃保存に移した。
【００５１】
接種物を調製するために、シードストックＪＭ１０９のバイアルを−７０℃保存から取り出した。１０μｌのループを用い、試料を、バイアルの内容物の表面を削り取ることにより取り出した。試料は、個別の分離した単一の細菌コロニーの増殖を保証するために、ルリアブロス寒天プレート（１０ｇ／ｌのトリプトン（Difco、製品番号211705）、５ｇ／ｌの酵母エキス（Difco、製品番号212750）、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ（Sigma、製品番号S7653）、１５ｇ／ｌの寒天（Merck、KGaA、536025J）、ｐＨはＮａＯＨで７．５に調節）上に、従来の方法で播種した。プレートは、３７℃で１６時間インキュベートし、そして＋４℃保存に移した。
【００５２】
上記のプレートを＋４℃保存から取り出し、そして３個のコロニーを、１００ｍｌのＬＢブロス（１０ｇ／ｌのトリプトン（Difco、製品番号212750）、５ｇ／ｌの酵母エキス（Difco、製品番号212750）、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ（Sigma、製品番号S7653）、ｐＨはＮａＯＨで７．５に調節）を含む１ｌの三角フラスコ（Pyrex、製品番号1130/26）に移した。２個のフラスコをこのようにして準備した。フラスコは、３７℃にて、１８０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。およそ１６時間後、培養物は１．４９および１．４５のＯＤ６００ｎｍ（Pharmacia LKB、Novaspec II Visible Spectrophotometer）に達した。フラスコの内容物をプールし、直ちに氷上に１５分間配置した。
【００５３】
冷却した培養物の４５ｍｌのアリコートを、２本の事前に冷却した遠心チューブ（Falcon、製品番号352070）に移した。細胞は、5804R Eppendorf遠心分離機における、F34-6-38型ローターおよびインサート（Eppendorf、製品番号5804 774000）を用いた、６０００ｒｐｍでの、４℃で５分間の遠心分離により回収した。上清（すなわち使用済みの培地）のおよそ５ｍｌのアリコートを汎用バイアル中にデカントし、ペレットを乱さないよう注意しながら残りを廃棄した。上清を含有する汎用バイアルを氷上に配置した。ペレットを、それぞれ０．４５ｍｌの上清に、１ｍｌの無菌プラスチック製パスツールピペットを用いた穏やかな吸引により再懸濁した。再懸濁したペレットをプールし、氷浴に戻した。この濃縮細胞懸濁液を接種物として用いた。
【００５４】
接種物中の細胞の生存率は、この時点で決定した。ＮＢ中に標準希釈系列を調製し、そして栄養寒天、ＮＡ（Merck KGaA、製品番号1.05450）上に二重に（in duplicate）プレーティングした。プレートは、３７℃で少なくとも１８時間、または２０℃で少なくとも７２時間インキュベートし、そしてコロニーを計数した。
【００５５】
ストリップの接種
接種物に用いられる細胞は、この手順の間中氷浴中に維持した。操作窓をシールしている接着フィルムを後方に剥離し、パッドへのアクセスを可能にした。細胞懸濁液の１μｌのアリコートを、標準的なマイクロピペット（BRAND TRANSFERPETTE、０．１〜１μｌ、PLASTIBRAND Tips、０．１〜２０μｌ）を用いて分注した。接種後直ちに接着フィルムを元に戻し、操作窓をこのようにして再シールした。この手順を、接種すべきストリップのそれぞれについて繰り返した。接種されたストリップは、室温（すなわち２０℃）で１時間放置した。対照として６個のストリップを、ストリップ上の平均初期生存細胞数を以下の手順に従って決定するためにテストした。残りのストリップは、その後、所定の期間、高い温度（３０℃）での保存に移した。必要に応じて、保存温度での設定した期間後、ストリップを、各時点で合計６個、このインキュベーションから取り出し、室温に平衡化し、その後、以下の手順に従って、ストリップ上の残りの生存細胞数を決定するためにテストした。
【００５６】
ストリップ上の生存細胞数を決定する
ホイルを、接種されたパッドと反対の端で切り取ること（tearing）により、ホイルポーチを開封した。ストリップを無菌的に取り出し、そしてパッドを浸漬するために、２ｍｌのＮＢを含有するビジュ（Bijou）（Sterilin 製品番号129A）に移した。ビジュと内容物とを穏やかに攪拌し、そしてパッドから細胞／保護剤を再水和するために５分の期間を許容した。標準希釈系列をＮＢ中に調製し、栄養寒天、ＮＡ（Merck KGaA、製品番号1.05450）上に二重にプレーティングした。プレートは、３７℃で少なくとも１８時間、または、２０℃で少なくとも７２時間インキュベートし、そしてコロニーを計数した。
【００５７】
対照Ａ−ストリップパッド上に保護剤が存在せず、かつ接種物中に保護剤が存在しないように製造したストリップ
ストリップデバイスを、パッド上の保護剤の分注および乾燥を省略したこと以外は、上記の方法に記載されたとおりに製造およびテストした。ストリップデバイスは、したがってまた、温風ファンの下に３０分間配置されなかった。
【００５８】
対照Ｂ−パッド上に保護剤が存在しないように製造したストリップ。接種物中に保護剤は存在する。
ストリップデバイスを、パッド上の保護剤の分注および乾燥を省略したこと以外、および、接種物の調製への以下の変更以外は、上記の方法に記載されたとおりに製造およびテストした。
接種物は、各ペレットを０．４５ｍｌの保護剤溶液（ろ過滅菌された、栄養ブロス（Nutrient Broth No.2、Merck KGaA、製品番号110136）中の２５％（ｗ／ｗ）のショ糖（BDH、製品番号102745C））に再懸濁したこと以外は、上記のとおりに調製した。
【００５９】
結果
良好な安定性（高い温度（３０℃）での保存における、２０９日を超える生存）が、デバイスのパッド上への保護剤の組み込みによってのみ達成されたという驚くべき結果を、表Ａから見ることができる。パッド上に乾燥した保護剤が存在しない場合、デバイス中に接種された細菌は、７日を超えて生存しなかった。
【００６０】
【表１】
2006509513.tif 000003
表Ａ
【００６１】
これらの結果のグラフによる表示は、図３に見出すことができる。Ｘ軸には、時間が日数で与えられている。Ｙ軸には、１ストリップあたりのｃｆｕが示してある。円は、本発明によるテストストリップ（パッド上に保護剤あり／接種物中に保護剤なし）により得られたデータを示し、四角および三角は、それぞれ対照Ａおよび対照Ｂによって得られたデータを示す。
【００６２】
実験２  ３種の接種物、コロニー、培養物および濃縮細胞を用いて、テストストリップ上のCampylobacter jejuni ss. jejuni ATCC-33560による細胞の生存を示す
ストリップデバイスの製造
実験１について記載したとおりである。
【００６３】
接種物の調製
７ｍｌのビジュ中の、およそ６ｍｌのボルトン（Bolton）ブロス（Oxoid、製品番号CM983、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌済）に、５％のウマ溶血液（SR0048C、ブロスを一度５０℃未満に冷却してから添加）を加えたものに、Campylobacter jejuni ss. jejuni ATCC33560細胞を接種し、３７℃で７２時間インキュベートした。この培養物は、１ｍｌの培養物を、ビジュに含有された、５ｍｌのボルトンブロスに５％のウマ溶血液を加えたものに移し、そして３７℃で４８〜７２時間インキュベートすることにより、連続培養物（serial culture）として維持した。
【００６４】
上記培養物の１ｍｌのアリコートを、ビジュ中の５ｍｌのボルトンブロス（血液無添加）に接種するのに用い、そして３７℃で４８〜７２時間インキュベートした。この培養物は、１ｍｌの培養物を、ビジュに含有された、５ｍｌのボルトンブロス（血液無添加）に移し、そして３７℃で４８〜７２時間インキュベートすることにより、連続培養物として維持した。
この培養物から、細胞をコロンビア血液寒天プレート（１２１℃で１５分間滅菌した３９ｇ／ｌのコロンビア寒天基剤、Oxoid CM331、および５０℃未満に冷却された時に添加した５％のウマ溶血液、Oxoid SR0048C）に画線し、そして３７℃で４８時間、ＣＯ２が富化された雰囲気にてインキュベートした。このプレートを、ストリップにコロニーを接種するのに用いた（コロニー接種物）。
【００６５】
培養物を、連続培養物から、ビジュに含有された６×５ｍｌのボルトンブロス（血液無添加）に、各々１ｍｌの培養物を接種することにより用意した。培養物は、３７℃で４８時間増殖させた。
ビジュの内容物を３０ｍｌの汎用バイアル（Sterilin、製品番号128A）にプールし、そして直ちに氷上に１５分間配置した。プールした培養物のＯＤ６００ｎｍ（Pharmacia LKB、Novaspec II Visible Spectrophotometer）を測定したところ０．２１であった。この培養物のおよそ３ｍｌのアリコートを氷上に維持し、そしてストリップに接種するのに用いた（培養物接種物）。
【００６６】
冷却された培養物の２×１３ｍｌのアリコートを、事前に冷却した２本の遠心チューブ（Falcon、製品番号352096）に移した。細胞を、5804R Eppendorf遠心分離機での、F34-6-38型ローターとインサート（Eppendorf、製品番号5804 774000）を用いた、６０００ｒｐｍでの４℃で５分間の遠心分離により回収した。上清（すなわち、使用済培地）のおよそ５ｍｌのアリコートを汎用バイアル中にデカントし、ペレットを乱さないように注意しながら残りを廃棄した。上清を含有する汎用バイアルは氷上に配置した。ペレットは、各々０．１３ｍｌの冷却上清で、１ｍｌの無菌プラスチック製パスツールピペットを用いた穏やかな吸引により再懸濁した。濃縮細胞懸濁液はプールし、ストリップに接種するために用いた（濃縮細胞接種物）。
【００６７】
培養物接種物および濃縮細胞接種物における細胞の生存率は、この時点で決定した。標準希釈系列をボルトンブロス（血液無添加）中に調製し、そして、コロンビア血液寒天上に二重にプレーティングした。プレートは、３７℃で少なくとも４８時間、ＣＯ２が富化された環境にてインキュベートし、そしてコロニーを計数した。
【００６８】
ストリップへの接種
コロニーを用いた接種
そこから単一コロニーが使用されるプレートをインキュベーターから取り出し、２０℃の作業台上に配置した。ストリップ上のシールを後方に剥離し、操作窓を介したパッドへのアクセスを可能にした。各コロニーを寒天プレートから１μｌのループ（Nunc Brand、1μl Clear、製品番号254410）を用いて取り出し、そしてパッド/保護剤上に「擦りつけた（rubbed）」。シールは直ちに元に戻した。この手順を、接種されるべきストリップの各々について繰り返した。
プレートからの代表的なコロニーの細胞生存率を、この時点で決定した。コロニーを１ｍｌのボルトンブロス（血液無添加）中に再懸濁し、標準希釈系列を同じブロス中に調製し、コロンビア血液寒天上に二重にプレーティングし、そして必要な温度および期間でインキュベートした。コロニーを計数し、コロニーあたりのｃｆｕを確定した。
【００６９】
培養物および濃縮細胞懸濁液を用いた接種
実験１について記載したとおりである。
この手順を、接種物の種類の各々について行った。
【００７０】
ストリップ上の生存細胞数を決定する
以下を除き、実験１に記載されたとおりである。
ボルトンブロス（血液無添加）を希釈剤として、およびコロンビア血液寒天を増殖培地として用いた。プレートは、３７℃で少なくとも４８〜７２時間、ＣＯ２が富化された雰囲気にてインキュベートした。
【００７１】
対照Ｃ−接種なしに上記のとおりに製造されたストリップ
いかなる種類の接種物も省略されていることを除き、ストリップデバイスを上記の方法に記載されたとおりに製造し、そしてテストした。ストリップは、合計３６本、保存後の細胞生存率の決定のために、上記のとおりにテストした。
【００７２】
結果
下表Ｂは、本発明の方法を用いることによる、高い温度（３０℃）での保存における良好な安定性を示している（５６日を超える生存）。
【表２】
2006509513.tif 000004
表Ｂ
【００７３】
これらの結果のグラフによる表示は、図４に見出すことができる。Ｘ軸には、時間が日数で与えられている。Ｙ軸には、ストリップあたりのｃｆｕが示されている。三角、四角および菱形は、それぞれ、単一コロニー、培養物および濃縮細胞接種物で得られたデータを示す。
【００７４】
実験３  ３種の接種物、コロニー、培養物および濃縮細胞を用いて、テストストリップ上のCandida albicans ATCC-10231による細胞の生存を示す
ストリップデバイスの製造
以下を除き、実験１に詳述したとおりである。
接着性乾燥剤（CSP Technologies、ACTIV-STRIP、M-0002-58）を保護用ホイルポーチから取り除き、４４．０ｍｍ×〜１２．６ｍｍ×０．３０ｍｍの小片にカットした。
【００７５】
接種物の調製
Candida albicans ATCC-10231をTWISTER 0006として入手し、そこからシードストックを調製した。TWISTERを提供された再水和溶液で再水和し、サブロー４％マルトース寒天（６５ｇ／ｌ、Merck、製品番号105439）上に画線し、そして２５℃で７２時間インキュベートした。
よく分離されたコロニーを寒天プレートから選択し、クライオビーズ（cryobeads）（Microbank、PROLAB Diagnostics、製品番号PL160）を含有するバイアルに移し、そして保護培地中に乳化した。バイアルを数回転倒し、可能な限り多くの保護剤培地を吸引により除去した。バイアルは、接種後直ちに−７０℃に移した。
【００７６】
生物を、このクライオビーズストックからサブロー４％マルトース寒天プレート上に、菌の個々の分離した単一コロニーの増殖を保証するために従来の方法で画線し、２５℃で７２時間インキュベートした。この寒天プレートを、ストリップへの接種用の単一コロニー（コロニー接種物）を提供するため、および、培養物および濃縮細胞接種物に用いられるブロスに接種するために用いた。
上記で調製したプレートからの単一コロニーを、１００ｍｌのステリリンポット（Sterilin pot）（Sterilin 製品番号185AM）中の、５０ｍｌのマルトースブロス（１０ｇ／ｌのペプトン、Merck、製品番号107213、４０ｇ／ｌのマルトース、Merck、製品番号291314H）に接種するのに用い、２５℃で７２時間インキュベートした。光学密度、ＯＤ６００ｎｍを測定したところ（Pharmacia LKB、Novaspec II Visible Spectrophotometer）０．８６であった。培養物を氷上に１５分間配置した。この培養物のおよそ４ｍｌのアリコートを氷上に維持し、そしてストリップに接種するのに用いた（培養物接種物）。
【００７７】
冷却した培養物の４５ｍｌのアリコートを、事前に冷却した遠心チューブ（Falcon、製品番号352070）に移した。細胞は、5804R Eppendorf遠心分離機での、F34-6-38型ローターおよびインサート（Eppendorf、製品番号5804 774000）を用いた、６０００ｒｐｍでの、４℃で５分間の遠心分離により回収した。上清（すなわち、使用済培地）のおよそ５ｍｌのアリコートを汎用バイアル中にデカントし、そして、ペレットを乱さないように注意しながら残りを廃棄した。上清を含有する汎用バイアルを氷上に配置した。ペレットを、０．４５ｍｌの上清中、１ｍｌの無菌プラスチック製パスツールピペットを用いた穏やかな吸引により再懸濁した。再懸濁したペレットをプールし、氷浴に戻した。この濃縮細胞懸濁液を、ストリップに接種するのに用いた（濃縮細胞接種物）。
【００７８】
培養物接種物および濃縮細胞接種物における細胞の生存率は、この時点で決定した。標準希釈系列をマルトースブロス中に調製し、そしてサブロー４％マルトース寒天上に二重にプレーティングした。プレートを２５℃で少なくとも７２時間インキュベートし、そしてコロニーを計数した。
【００７９】
ストリップへの接種
コロニーを用いた接種
以下を除き、実験２に記載のとおりである。
マルトースブロスを希釈剤として、そしてサブロー４％マルトース寒天を増殖培地として用いた。プレートは、２５℃で少なくとも７２時間インキュベートした。
【００８０】
培養物および濃縮細胞懸濁液を用いた接種
実験１について記載したとおりである。
この手順を、接種物の種類の各々について行った。
ストリップ上の生存細胞数を決定する
以下を除き、実験１に記載のとおりである。
マルトースブロスを希釈剤として、そしてサブロー４％マルトース寒天を増殖培地として用いた。プレートは、２５℃で少なくとも７２時間インキュベートした。
【００８１】
対照Ｄ−接種なしに上記のとおりに製造したストリップ
実験２について記載したとおりである。
結果
下表Ｃは、本発明の方法を用いることによる、高い温度（３０℃）での保存における良好な安定性を示している（５６日を超える生存）。
【００８２】
【表３】
2006509513.tif 000005
表Ｃ
【００８３】
これらの結果のグラフによる表示は、図５に見出すことができる。Ｘ軸には、時間が日数で与えられている。Ｙ軸には、ストリップあたりのｃｆｕが示されている。三角、四角および菱形は、それぞれ、単一コロニー、培養物および濃縮細胞接種物で得られたデータを示す。
【００８４】
実験４  ３種の接種物、コロニー、培養物および濃縮細胞を用いて、テストストリップ上のPseudomonas aeruginosa ATCC 27853による細胞の生存を示す
ストリップデバイスの製造
以下を除き、実験１に詳述したとおりである。
接着性乾燥剤（CSP Technologies、ACTIV-STRIP、M-0002-58）を保護用ホイルポーチから取り除き、４４．０ｍｍ×〜１２．６ｍｍ×０．３０ｍｍの小片にカットした。
【００８５】
接種物の調製
Pseudomonas aeruginosa ATCC-27853は、TWISTER 0026（PROLAB Diagnostics）として入手し、そこからシードストックを調製した。TWISTERを提供された再水和溶液で再水和し、そして栄養寒天（Merck KGaA、製品番号1.05450）上に画線し、３７℃で１６時間インキュベートした。
よく分離されたコロニーを寒天プレートから選択し、クライオビーズ（Microbank、PROLAB Diagnostics、製品番号PL160）を含有したバイアルに移し、そして保護培地中に乳化した。バイアルを数回転倒し、可能な限り多くの保護剤培地を吸引により除去した。バイアルは、接種後直ちに−７０℃に移した。
【００８６】
生物を、このクライオビーズストックから栄養寒天プレート上に、菌の個々の分離した単一コロニーの増殖を保証するために従来の方法で画線し、３７℃で１６時間インキュベートした。この寒天プレートを、ストリップへの接種のため単一コロニー（コロニー接種物）を提供するため、および、培養物および濃縮細胞接種物に用いられるブロスに接種するために用いた。
上記で調製したプレートからの単一コロニーを、１００ｍｌのステリリンポット（Sterilin 製品番号185AM）中の、５０ｍｌの栄養ブロス（Nutrient Broth No.2、Merck KGaA、製品番号110136、１０ｇ／ｌ）に接種するのに用い、３７℃で１６時間インキュベートした。光学密度、ＯＤ６００ｎｍを測定したところ（Pharmacia LKB、Novaspec II Visible Spectrophotometer）０．４８であった。培養物を氷上に１５分間配置した。この培養物のおよそ４ｍｌのアリコートを氷上に維持し、そしてストリップに接種するのに用いた（培養物接種物）。  
【００８７】
冷却した培養物の４５ｍｌのアリコートを、事前に冷却した遠心チューブ（Falcon、製品番号352070）に移した。細胞は、5804R Eppendorf遠心分離機での、F34-6-38型ローターおよびインサート（Eppendorf、製品番号5804 774000）を用いた、６０００ｒｐｍでの、４℃で５分間の遠心分離により回収した。上清（すなわち、使用済培地）のおよそ５ｍｌのアリコートを汎用バイアル中にデカントし、そして、ペレットを乱さないように注意しながら残りを廃棄した。上清を含有する汎用バイアルを氷上に配置した。ペレットを、０．４５ｍｌの上清中、１ｍｌの無菌プラスチック製パスツールピペットを用いた穏やかな吸引により再懸濁した。再懸濁したペレットをプールし、氷浴に戻した。この濃縮細胞懸濁液を、ストリップに接種するのに用いた（濃縮細胞接種物）。
培養物接種物および濃縮細胞接種物における細胞の生存率は、この時点で決定した。これは、実験１に記載のとおりに行った。
【００８８】
ストリップへの接種
コロニーを用いた接種
以下を除き、実験２に記載のとおりである。
栄養ブロスを希釈剤として、そして栄養寒天を増殖培地として用いた。プレートは、３７℃で少なくとも１６時間インキュベートした。
培養物および濃縮細胞懸濁液を用いた接種
実験１について記載したとおりである。
この手順を、接種物の種類の各々について行った。
ストリップ上の生存細胞数を決定する
実験１について記載したとおりである。
プレートは、３７℃で少なくとも１６時間インキュベートした。
対照Ｅ−接種なしに上記のとおりに製造したストリップ
実験２について記載したとおりである。
【００８９】
結果
表Ｄは、本発明の方法を用いることによる、高い温度（３０℃）での保存における良好な安定性を示している（５６日を超える生存）。
【表４】
2006509513.tif 000006
表Ｄ
【００９０】
これらの結果のグラフによる表示は、図６に見出すことができる。Ｘ軸には、時間が日数で与えられている。Ｙ軸には、ストリップあたりのｃｆｕが示されている。三角、四角および菱形は、それぞれ、単一コロニー、培養物および濃縮細胞接種物で得られたデータを示す。
【００９１】
実験５  ３種の接種物、コロニー、培養物および濃縮細胞を用いて、テストストリップ上のLactobacillus acidophilus ATCC 4356による細胞の生存を示す
ストリップデバイスの製造
実験１に記載のとおりである。
【００９２】
接種物の調製
Lactobacilus acidophilus ATCC-4356は、TWISTER 0018（PROLAB Diagnostics）として入手した。TWISTERを提供された再水和溶液で再水和し、ＭＲＳ寒天（５２．４ｇ／ｌのＭＲＳブロス、Merck KGaA、製品番号11066、１４ｇ／ｌの寒天、Merck KGaA、製品番号101614）上に画線した。寒天プレートは、３５℃で７２時間、ＣＯ２が富化された雰囲気にてインキュベートした。
この寒天プレートは、ストリップへの接種のために単一コロニーを提供するのに用いた（コロニー接種物）。
【００９３】
TWISTERからの再水和された細胞の１００μｌのアリコートを、１００ｍｌのステリリンポット（Sterilin 製品番号185AM）中の、５０ｍｌのＭＲＳブロス（５２．４ｇ／ｌのＭＲＳブロス、Merck KGaA、製品番号110661）に移し、３５℃で７２時間インキュベートした。光学密度、ＯＤ６００ｎｍを測定したところ（Pharmacia LKB、Novaspec II Visible Spectrophotometer）、０．９７であった。培養物を氷上に１５分間配置した。この培養物のおよそ４ｍｌのアリコートを氷上に維持し、そしてストリップに接種するのに用いた（培養物接種物）。
【００９４】
冷却した培養物の４５ｍｌのアリコートを、事前に冷却した遠心チューブ（Falcon、製品番号352070）に移した。細胞は、5804R Eppendorf遠心分離機での、F34-6-38型ローターおよびインサート（Eppendorf、製品番号5804 774000）を用いた、６０００ｒｐｍでの、４℃で５分間の遠心分離により回収した。上清（すなわち、使用済培地）のおよそ５ｍｌのアリコートを汎用バイアル中にデカントし、そして、ペレットを乱さないように注意しながら残りを廃棄した。上清を含有する汎用バイアルを氷上に配置した。ペレットを、０．４５ｍｌの上清中、１ｍｌの無菌プラスチック製パスツールピペットを用いた穏やかな吸引により再懸濁した。再懸濁したペレットをプールし、氷浴に戻した。この濃縮細胞懸濁液を、ストリップに接種するのに用いた（濃縮細胞接種物）。
【００９５】
培養物接種物および濃縮細胞接種物における細胞の生存率は、この時点で決定した。標準希釈系列は、ＭＲＳブロス中に調製し、そしてＭＲＳ寒天上に二重にプレーティングした。プレートは、３５℃で少なくとも７２時間、ＣＯ２が富化された雰囲気にてインキュベートし、そしてコロニーを計数した。
【００９６】
ストリップへの接種
コロニーを用いた接種
以下を除き、実験２について記載したとおりである。
ＭＲＳブロスを希釈剤として、そしてＭＲＳ寒天を増殖培地として用いた。プレートは、３５℃で少なくとも７２時間、ＣＯ２が富化された雰囲気にてインキュベートした。
培養物および濃縮細胞懸濁液を用いた接種
実験１について記載したとおりである。．
この手順を、接種物の種類の各々について行った。
【００９７】
ストリップ上の生存細胞数を決定する
以下を除き、実験１について記載したとおりである。
ＭＲＳブロスを希釈剤として、そしてＭＲＳ寒天を増殖培地として用いた。プレートは、３５℃で少なくとも７２時間、ＣＯ２が富化された雰囲気にてインキュベートした。
対照Ｆ−接種なしに上記のとおりに製造したストリップ
実験２について記載したとおりである。
【００９８】
結果
下表Ｅは、高い温度（３０℃）での保存における良好な安定性を示している（５６日を超える生存）。
【表５】
2006509513.tif 000007
表Ｅ
【００９９】
これらの結果のグラフによる表示は、図７に見出すことができる。Ｘ軸には、時間が日数で与えられている。Ｙ軸には、ストリップあたりのｃｆｕが示されている。三角、四角および菱形は、それぞれ、単一コロニー、培養物および濃縮細胞接種物で得られたデータを示す。
【０１００】
実験６  システム中に乾燥剤が存在するテストストリップ上の細胞の生存を示す
ストリップデバイスの製造
以下を除き、実験１に記載のとおりである。
乾燥剤は、接着剤を有しなかった。ホイルポーチは、３５０℃の温度の半田ごて（Weller WHS40）を用いてシールした。
【０１０１】
接種物の調製
大腸菌ATCC-25922は、TWISTER 0014（PROLAB Diagnostics）として入手し、そこからシードストックを調製した。TWISTERを提供された再水和溶液で再水和し、そして栄養寒天（Merck KGaA、製品番号1.05450）上に画線し、そして３７℃で１６時間インキュベートした。
よく分離されたコロニーを寒天プレートから選択し、クライオビーズ（Microbank、PROLAB Diagnostics、製品番号PL160）を含有したバイアルに移し、そして保護培地中に乳化した。バイアルを数回転倒し、可能な限り多くの保護剤培地を吸引により除去した。バイアルは、接種後直ちに−７０℃に移した。
【０１０２】
生物を、このクライオビーズストックから栄養寒天プレート上に、菌の個々の分離した単一コロニーの増殖を保証するために従来の方法で画線し、３７℃で１６時間インキュベートした。
上記で調製したプレートからの単一コロニーを、１００ｍｌのステリリンポット（Sterilin 製品番号185AM）中の、５０ｍｌの栄養ブロス（Nutrient Broth No.2 Merck KGaA、製品番号110136、１０ｇ／ｌ）に接種するのに用い、３７℃で１６時間インキュベートした。光学密度、ＯＤ６００ｎｍを測定したところ（Pharmacia LKB、Novaspec II Visible Spectrophotometer）、０．５２であった。培養物を氷上に１５分間配置した。この培養物をストリップに接種するのに用いた。
培養物中の細胞の生存率は、この時点で決定した。これは、実験１に記載のとおりに行った。
【０１０３】
ストリップへの接種
培養物を用いた接種
以下を除き、実験１について記載したとおりである。
接種後直ちに、第１のシールを操作窓をシールするために元に戻し、そしてアルミホイルテープ、５０ミクロン（RS 製品番号408-9574）の第２のシールをこの第１のシールの上に設置した。
ストリップ上の生存細胞数を決定する
実験１について記載したとおりである。
対照Ｇ−乾燥剤なしで上記のとおりに製造されたストリップ
乾燥剤の省略を除き、ストリップデバイスは、上記方法に記載のとおりに製造およびテストした。
【０１０４】
結果
表Ｆ。良好な安定性（高い温度（３０℃）での保存における、１４日を超える生存）が、デバイス内への乾燥剤の組み込みによってのみ達成されたという驚くべき結果を、表Ｆから見ることができる。デバイス内の乾燥剤が存在しない場合には、デバイス中に接種された細菌は、７日を超えて生存しなかった。
【０１０５】
【表６】
2006509513.tif 000008
表Ｆ
これらの結果のグラフによる表示は、図８に見出すことができる。Ｘ軸には、時間が日数で与えられている。Ｙ軸には、ストリップあたりのｃｆｕが示されている。円は、乾燥剤ありで製造されたストリップについて得られたデータを、そして三角は乾燥剤なしについてのものを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】本発明による再シール可能なストリップデバイスのための形態の例を示した図である。
【図２】再シール可能なストリップデバイスでの保存により細胞を保存するために用いる本発明による方法の例を示したフローチャートである。
【図３】実験１の結果を示したグラフである。
【図４】実験２の結果を示したグラフである。
【図５】実験３の結果を示したグラフである。
【図６】実験４の結果を示したグラフである。
【図７】実験５の結果を示したグラフである。
【図８】実験６の結果を示したグラフである。
【図１】
2006509513.tif 000009
【図２】
2006509513.tif 000010
【図３】
2006509513.tif 000011
【図４】
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【図５】
2006509513.tif 000013
【図６】
2006509513.tif 000014
【図７】
2006509513.tif 000015
【図８】
2006509513.tif 000016
【国際調査報告】
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2006509513.tif 000018
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