(57)【要約】本発明は、プロテアーゼ、洗浄剤またはカオトロピック薬剤を用いて前処理されている髄液（ＣＳＦ） 試料中の少なくとも１つの終末糖化物質（ＡＧＥ） の測定方法、および神経変性疾患の評価におけるこの方法の使用に関する。
2004516027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄液（ＣＳＦ） 試料を前処理することを特徴とする、ＣＳＦ 試料中の少なくとも１つの終末糖化物質（ＡＧＥ） の測定方法。
【請求項２】
前記前処理によりタンパク質変性を生じることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記前処理が、洗浄剤、カオトロピック試薬および／またはタンパク質分解酵素の群より選ばれる試薬を用いて行われることをさらに特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記前処理が、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を用いて行われることをさらに特徴とする請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫであることをさらに特徴とする請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載のように測定した少なくとも１つのＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルを、既知のＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルまたは１つ以上のＣＳＦ 対照試料から得られるＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルと比較することを含む、神経変性疾患の評価方法。
【請求項７】
アルツハイマー病をモニターするための請求項１〜６いずれか記載の方法の使用。
【請求項８】
アルツハイマー病を診断するための請求項１〜６いずれか記載の方法の使用。
【請求項９】
ＣＳＦ 中のＡＧＥ のレベルに影響を与える薬物をスクリーニングするための請求項１〜６いずれか記載の方法の使用。
【請求項１０】
タンパク質分解酵素の使用を含む、ＣＳＦ 試料中に存在するＡＧＥ−エピトープを露出させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、髄液試料中の終末糖化物質（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔ） の測定、ならびに特にかかる測定に基づく神経変性障害の評価およびモニタリングに関する。
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最終的に死をもたらす進行性痴呆により特徴づけられる最も一般の神経変性障害である。それはまた、最も痛烈な脳疾患の１つであり、現代社会における深刻な医学的、心理学的および経済的問題である。例えば、日本にはアルツハイマー病を罹患している約６００．０００ 人の患者がいる。
【０００３】
莫大な数の症例および健康管理システムに対する巨大なコストにもかかわらず、アルツハイマー病の適切な診断は、当該分野における臨床医の主な挑戦である。
【０００４】
いくつかのうち少なくとも３つの異なるアプローチ全てが、限定された有用性にもかかわらず利用できる。
【０００５】
第１に、いわゆる精神または認識調査がある。かかる調査は、標準化すること、および１つの機関から他に移すことが非常に困難である。最も広く使用されている調査の１つは、神経学的およびコミュニケーション障害ならびに脳卒中国立研究所−アルツハイマー病および関連障害協会により与えられる教示、いわゆるＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準に従う（ＭｃＫｈａｎｎ， Ｇ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３４（１９８４） ９３９−９４４） 。
【０００６】
第２に、アルツハイマー病を診断する物理学的アプローチがあり、それは調査された脳の代謝活性に主に基づく。かかる物理学的方法としては、例えば、近赤外線分光学（ＮＩＲＳ）およびＰＥＴ が挙げられる。これらの方法は、例えば、Ｃ． Ｈｏｃｋ ら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７５５（１９９７） ２９３−３０３に記載のように、脳におけるヘモグロビンの酸素化レベルを調査するために使用されうる。
【０００７】
第３に、生物学的マーカーによりアルツハイマー病を診断するためのアプローチが言及される。生物学的マーカーの使用に関する主な問題および障害は、アルツハイマー病が非常にゆっくり進行するという事実である。非常に長い病状発現前期、すなわちはっきりと見えるか、または診断により知見できる症状またはマーカーの発現をもたらすことなく疾患が開始および進行する期間があると想定される。臨床的開始の後であってさえ、疾患における進行は遅く、患者が疾患により死亡するまで５〜１０年かかる（Ｃ． Ｈｏｃｋ， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ １９（１９９８）１４９−１５５）。生物学的マーカーは、それにもかかわらず、ＡＤを良好に検出する、モニターするおよび診断するための極めて魅力的なツールになる。それらは繰り返し回収され得、その測定は比較的安価でかつ簡単に行なわれ、かかる測定の結果は、例えば、精神調査ほど標準化するのが困難ではない。
【０００８】
いくつかのタンパク質マーカー、例えば、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ） として公知のタンパク質、および特にアミロイドβ− ペプチド（Ａβ） として公知であるこのＡＰＰ の分解産物（Ｗｅｉｄｅｍａｎｎ Ａ． ら、Ｃｅｌｌ ５７ （１９８９） １１５−１２６） 、タウタンパク質およびアポリポタンパク質Ｅ４が、この１０年の間、主要な注目を集めている。
【０００９】
アポリポタンパク質Ｅ４のみが、血液から診断される。タウタンパク質または異なる程度のリン酸化を含むそのバリアント、ならびに種々の形態の Ａβは、通常髄液（ＣＳＦ） において試験される。
【００１０】
終末糖化物質（ＡＧＥ） は対照的に、糖尿病のホールマークであり、そこで広範囲に研究されている。
【００１１】
ＡＧＥ の形成では、最初の段階に、グルコースおよび他の還元糖が、タンパク質のアミノ基に濃度依存様式で非酵素的に付着する。
【００１２】
アマドリ産物として公知の安定なアミノ， １−デオキシケトシル付加物を形成するためのグルコースとタンパク質の遊離のアミノ基との間の非酵素反応は、ヘモグロビンを用いて生じることが示されており、ここでグルコースとの反応によるヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端の転位は、付加物を形成し、ヘモグロビンＡｌｃとして公知の産物を生じる。類似の反応がまた、水晶体、コラーゲンおよび神経タンパク質などの種々の他の身体タンパク質を用いて生じることが、見出されている（Ｂｕｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ６７ （１９７５） １０３−１０９； Ｋｏｅｎｉｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５２ （１９７５） ２９９２−２９９７； ＭｏｎｎｉｅｒおよびＣｅｒａｍｉ、Ｍａｉｌｌａｒｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ 、Ｗａｌｌｅｒ， Ｇ．Ａ．編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ （１９８３） ４３１−４４８； ならびにＭｏｎｎｉｅｒ およびＣｅｒａｍｉ、Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １１ （１９８２） ４３１−４５２ を参照のこと）。
【００１３】
経時的に、これらの初期のアマドリ付加物は、さらなる酸化、転位、脱水および他のタンパク質群との架橋のような２次反応を受け、最終的にＡＧＥ と呼ばれる複合体構造物のファミリーとして蓄積しうる。終末糖化物質の生物学的役割および臨床的重要性の解明に対する実質的な進歩がなされ、その結果これまで加齢プロセスまたは糖尿病などの疾患の病理学的影響に帰因する多くの状態が、少なくとも部分的にはインビボでのＡＧＥ の形成、蓄積および／または活性に帰因することが現在認められる。
【００１４】
上記２次反応はゆっくり生じるので、タンパク質は、インビボで測定可能な量のＡＧＥ を蓄積する前に有意な量のアマドリ産物を蓄積しうる。ＡＧＥ は、レセプター、膜または酵素のような重要な生物学的分子／構造物を改変しうる。それらは、タンパク質架橋を生じ得、順番に器官または器官部分の構造的および／または機能的な完全性を減少し、したがって結局器官機能を低減または損なう。
【００１５】
終末糖化プロセスは、それが長い半減期を有するタンパク質、例えば糖尿病などの比較的高い糖濃度の条件下でのコラーゲンなどに主に影響することが特に注目される。ＡＧＥ が、加齢の間および慢性疾患においてタンパク質に生じる構造的および機能的変化において重大な役割をはたすことを多数の研究が示している。
【００１６】
ＡＧＥ−改変生体分子を生じさせる第２の生理学的条件は、酸化性ストレスとして要約されている。他の事象の中でも酸化性ストレスは、終末糖化物質の形成を生じ、神経変性障害、例えばＡＤにおける病態メカニズムの１つでありうることが知られている（Ｂｅｈｌ， Ｃｈｒ． 、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５７ （１９９９） ３０１−３２３） 。例えば、 Ａβのインビトロ特性と、ホールマークとして公知のいわゆるプリオンタンパク質または伝染性海綿状脳障害（ＴＳＥ） として要約されている疾患由来の病原因子とを比較した場合に、著しい類似点が見出されることもまた知られている。酸化性ストレスは、ＴＳＥ 、例えばウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ） およびヒトにおけるクロイツフェルト−ヤーコブ病（ＣＪＤ） の病因論において主に重要である（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ （１９９６） ３８０：３４５−３４７）。酸化性ストレス現象は、したがって、ＡＤ、ＢＳＥ またはＣＪＤ のようなかかる神経変性疾患におけるＡＧＥ の形成を誘発する。
【００１７】
最近、抗体試薬が入手可能になっており、かつ方法が記載されており、それは十分に規定されたＡＧＥ−構造物の再現可能な検出に使用されうる。
【００１８】
米国特許第 ５，６１０，０７６号明細書は、ＡＧＥ−構造物保有ヘモグロビン（Ｈｂ−ＡＧＥ）の特異的な検出を開示する。この特許に記載される改良は、洗浄剤および／またはカオトロピック試薬を用いた試料の前処理にある。かかる前処理のポジティブな効果は、さもなければ抗ＡＧＥ 抗体に接近可能でないであろうＨｂ−ＡＧＥエピトープの露出により説明される。
【００１９】
米国特許第 ５，６９８，１９７号明細書は、インビボで形成されたＡＧＥ と反応的なモノクローナル抗体（４Ｇ９） を記載する。１つの態様において、この抗体は、Ａｐｏ−Ｂ−ＡＧＥ 、ＩｇＧ−ＡＧＥ 、コラーゲン−ＡＧＥ、血清ＡＧＥ−ペプチドおよびタンパク質、ならびに尿ＡＧＥ−ペプチドおよびタンパク質を検出するために、サンドイッチ型ＥＬＩＳＡ において使用される。これらのＡＧＥ−サンドイッチアッセイを行うために、モノクローナル抗体４Ｇ９ またはその免疫反応性フラグメントは、直接固相にコートされる。競合イムノアッセイセッティングはまた、４Ｇ９ を使用して記載されている。ＢＳＡ−ＡＧＥ は、抗原として使用され、かかる競合型アッセイの固相にコートされる。
【００２０】
さらに上記で論じられたアルツハイマー病の分野におけるアプローチ（ＰＥＴ−スキャン、精神調査、または所定の生化学的マーカーなど）は全て、アルツハイマー病の評価においてある程度まで使用されうるが、アルツハイマー病、ＢＳＥ またはＣＪＤ のような神経変性疾患を検出する、診断するまたはモニターするために利用可能なツールをさらに改良するために生化学的または生物学的マーカーの改良および使用の容易性に対して特に非常に大きな必要性がまだある。
【００２１】
驚くべきことに、特に測定がＡＧＥ−エピトープの露出を生じる場合、ＣＳＦ−試料中の終末糖化物質（ＡＧＥ） のレベルは、ＡＤ、ＢＳＥ またはＣＪＤ のような神経変性疾患の評価および診断において非常に有効に使用されうることが現在見出されている。
【００２２】
発明の要旨
本発明は、髄液（ＣＳＦ） 試料を前処理してＡＧＥ−エピトープを露出させることを特徴とする、ＣＳＦ 試料中の少なくとも１つの終末糖化物質（ＡＧＥ） の測定に基づく神経変性疾患、特に、ヒトにおけるアルツハイマー病（ＡＤ）およびクロイツフェルト−ヤーコブ病（ＣＪＤ） ならびにウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ） の評価方法を開示する。
【００２３】
髄液の前処理がＡＧＥ−エピトープの露出に有効な手段であることが見出された。露出されうるＡＧＥ−エピトープのレベルは、対照から回収されたＣＳＦ−試料と比較して、アルツハイマー病と診断された患者から得られたＣＳＦ 中で非常に高いことがまた見出された。
【００２４】
１つの態様において、本発明の方法は、アルツハイマー病を有することが知られている患者またはアルツハイマー病を有する疑いのある患者から回収された試料において測定されたＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルを比較することによりアルツハイマー病を評価するため、およびかかるレベルをパラレルで測定されたレベルまたは対照試料由来の既知のレベルと比較するために使用される。
【００２５】
本発明の方法はまた、アルツハイマー病をモニターするために使用される。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、エスペラーゼ（ｅｓｐｅｒａｓｅ）またはプロテイナーゼＫのようなタンパク質分解酵素の使用を含む、ＣＳＦ 試料に存在するようなＡＧＥ−エピトープを露出させるための方法である。
【００２７】
もちろん、ＣＳＦ 中のＡＧＦ のレベルに影響を与えるアルツハイマー病に作用する薬物のスクリーニングの努力における本発明の方法の使用は、ＡＤの分野に主に関連する本発明の別の好ましい態様を表わす潜在的適用の主要な範囲である。
【００２８】
発明の詳細な説明
好ましい態様において、本発明は、髄液（ＣＳＦ） 試料が前処理されることを特徴とする、ＣＳＦ 試料中の少なくとも１つの終末糖化物質（ＡＧＥ） の測定方法に関する。かかる前処理は、かかる前処理無しの同一試料の別のアリコート中の特異的な結合パートナーにより認識されないＡＧＥ−エピトープの露出をもたらす。
【００２９】
終末糖化物質（ＡＧＥ） は、糖尿病のホールマークであり、そこで広範囲に研究されている。
【００３０】
さらに上記で述べたように、ＡＧＥ は公知であり、糖尿病のマーカーとして使用される。
【００３１】
したがって、驚くべきことに、髄液に含まれるＡＧＥ−構造物は、ＡＤ、ＣＪＤ またはＢＳＥ などの神経変性疾患の評価において主に重要であることが現在見出され、かつ証明された。さらに驚くべきことは、ＣＳＦ 液の前処理は、さらなるＡＧＥ−エピトープの露出が必要とされ、特にかかる露出が、健常対照から採取された試料と比較して、アルツハイマー病の疑いのある患者またはアルツハイマー病と診断された患者から回収されたＣＳＦ 試料において異なる影響を有するという事実である。明らかに、アルツハイマー病を有する患者のＣＳＦ は、適切な処置により露出されうる有意な比率のＡＧＥ−エピトープを含むはずである一方、比較的低いレベルのかかる露出されうるＡＧＥ−エピトープが、健常ヒト由来のＣＳＦ に存在する。
【００３２】
上記したように、神経変性疾患の分野におけるいくつかの非常に異なる疾患の存在が、ニューロンの損失、認識障害、ならびに異なる型および性質の臨床発現により特徴づけられる。これらの神経変性疾患は、特にアルツハイマー病、パーキンソン病およびＴＳＥ の下で分類される疾患を含む。これらのＴＳＥ は、スクラピー、ＢＳＥ 、クールー−クールー、ゲルストマン−シュトロイスラー−シェインカー−症候群およびＣＪＤ のような動物およびヒトのかかる異なる疾患を含む。酸化性ストレスは、ＣＪＤ またはＢＳＥ のような疾患にまた寄与する１つの因子として知られている（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ、上記） 。これらの疾患は、ＡＧＥ−ＣＳＦ レベルにおける変化を示すこともまた現在見出された。
【００３３】
本発明の好ましい態様は、したがって、ＣＳＦ−試料を前処理してＡＧＥ−エピトープを露出させることを特徴とする、髄液中の少なくとも１つの終末糖化物質の測定に基づく神経変性疾患の評価方法である。
【００３４】
用語「ＡＧＥ−エピトープ」は、非酵素的グリケーション＋酸化プロセスの結果である構造物、または酸化性ストレスに付随した反応の結果としての構造物であって、特異的結合パートナーにより、特にこの構造と特異的に反応する抗体により、結合されるかまたは認識される構造物を記載するために使用される。かかるＡＧＥ−エピトープ− 特異的結合パートナーの１つの周知の例は、米国特許第 ５，６９８，１９７号明細書に記載されるモノクローナル抗体４Ｇ９ である。
【００３５】
「前処理」の多くの方法があり、そのいくつかがより詳細に以下に論じられる。かかる前処理は、試験混合から完全に別に行われ得、それは最終的にＡＧＥ−レベルを評価するために使用される。しかしながら、変性試薬との非常に短いプレインキュベーションを使用することもまた可能である。極端には、前処理は解析と同時に行われうる。しかしながら、ＣＳＦ−試料を最初に適切な薬剤および／または方法を用いて前処理し、その後ＡＧＥ のレベルを適切なアッセイ、例えばイムノアッセイを用いて測定することが好ましい。
【００３６】
用語「露出される」は、前処理なしには特異的結合パートナーに接近可能でないエピトープが適切な処理後に接近可能である（露出される）ことを示すために使用される。
【００３７】
前処理に使用可能な多くの方法の中で、タンパク質変性を生じる方法が最も適切であることが見出された。かかる変性は、例えば、球状タンパク質構造物のアンホールディングならびにタンパク質および／またはペプチド複合体の解離を生じる。したがって、本発明の方法は、タンパク質変性を生じる前処理工程を含ませることにより行われるのが好ましい。
【００３８】
かかる前処理を行うための当該分野で公知の種々の方法および薬剤の中で、洗浄剤、カオトロピック試薬および／またはタンパク質分解酵素の群より選ばれる試薬を使用することが好ましい。また、ＣＳＦ−試料中のさらなるＡＧＥ−エピトープを露出させるために熱処理の方法または酸処理の方法を適用することもできる。これらの試薬または方法は全てタンパク質および／またはペプチド凝集体のタンパク質−アンホールディングおよび解離を生じることが知られている。
【００３９】
ＡＧＥ−エピトープは、通常、かなり小さい構造を表す。かかるエピトープは、タンパク質またはペプチド分子内にマスクされているか、または隠されているかもしれない。これらのエピトープを露出させるための１つの好ましい方法は、タンパク質分解酵素の使用である。本発明の好ましい態様は、ＣＳＦ 試料中に存在するＡＧＥ−エピトープを露出させる方法であり、該方法はタンパク質分解酵素の使用を含む。
【００４０】
タンパク質分解酵素の使用は、好ましくは、他の前処理方法の使用と組み合わされうる。例えば、カオトロピック変性剤を最初に使用し、その後、タンパク質分解酵素を適用することができる。また、いくつかのタンパク質分解酵素を組み合わせて使用することは、本発明の好ましい態様である。
【００４１】
ＣＳＦ 中に存在する種々のＡＧＥ−構造物またはＡＧＥ−エピトープのレベルを、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＭＳ（質量分析法）または特異的結合アッセイのような種々の方法により測定することができる。
【００４２】
特異的な抗体による免疫学的検出方法が好ましい。例えば、「Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」Ｔｉｊｓｓｅｎ 、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ 、１９９０などのような関連するテキストに記載されるような、または方法のセクションに記載される実施例により説明されるような標準イムノアッセイ手順により、調査中のＡＧＥ 構造物のレベルが測定される。
【００４３】
本発明の好ましい方法では、少なくとも１つのタンパク質分解酵素がＣＳＦ−試料の前処理において使用される。
【００４４】
理論的に、多くの異なるタンパク質分解酵素が使用されうる。しかし、扱い易く、活性が高く、安価な酵素を使用することが好ましい。かかる酵素の例は、エスペラーゼおよびプロテイナーゼＫである。プロテイナーゼＫの使用が最も好ましい。
【００４５】
タンパク質分解酵素を用いた酵素的前処理は、例えば、使用される酵素濃度、時間または温度に関して種々の条件下で実施されうる。全体の測定にさらなる変化を導入しないために、この工程を標準化することが好ましい。好ましくは、ＡＧＥ−エピトープの最大の露出を導く条件が選ばれる。例えば、ＡＧＥ−ＣＭＬ （カルボキシ− メチル− リジン＝ＣＭＬ に由来する構造物を含むＡＧＥ エピトープ）の検出において、プロテイナーゼＫは、好ましくは０．３ 〜５ｍｇ／ｍｌ 、またはさらに好ましくは０．５ 〜２ｍｇ／ｍｌ の濃度で、好ましくは０．５ 〜２４時間、より好ましくは１〜６時間使用される。また、酵素消化の間、温度を制御することが好ましい。温度は、例えば、２５℃または３７℃に設定されうる。３７℃のように上昇した温度が好ましい。
【００４６】
上記のように測定されるＡＣＥ−値の臨床的意味を良好におよびより確実に評価するために、測定したレベルを、既知のレベルまたは１つ以上のＣＳＦ−対照試料からパラレルで得られたレベルと比較することが有利である。したがって、既知のＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルまたは１つ以上のＣＳＦ−対照試料から得られたＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルと、評価対象の試料中の少なくとも１つのＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルとを比較することを含む、神経変性疾患を評価するための方法において、上記の測定を使用することが好ましい。用語「ＡＧＥ−ＣＳＦ 」は、ＣＳＦ 試料由来のＡＧＥ が調査されることを示すために使用される。もちろん、臨床ＣＳＦ−試料中で測定したＡＧＥ−レベルを、対照個体から得られたＣＳＦ−試料の大きな群における該ＡＧＥ に対して得られた平均値またはカットオフ値と比較することもできる。
【００４７】
ＡＤ、ＣＪＤ 、およびＢＳＥ からなる群より選ばれる神経変性疾患を評価するために、本発明の方法を使用することが特に好ましい。最も好ましくは、本発明の方法は、ヒトにおけるＡＤまたはウシにおけるＣＪＤ を評価するために使用される。
【００４８】
ＡＤを診断する目的のために、本発明の方法を使用することがさらに好ましい。診断適用のために、通常、目的のマーカーのレベルが、健常個体において、または臨床的に関連する患者コーホートから得られる臨床試料における鑑別診断について、注意深く調査される。これらの対照試料において測定された値から、平均値ならびにこの平均値の標準偏差が計算される。これらの値に基づいて、通常平均±２を表わすか、またはある場合には±３標準偏差を示すカットオフ値が規定される。このカットオフ値を超えるかまたはそれ未満の臨床試料における測定値が、所定の疾患を示すかまたはその診断でありうる。確立されたかかるカットオフ値を用いて、本発明の方法が、アルツハイマー病を診断するために使用される。したがって、アルツハイマー病を診断するためまたはＡＤを他の関連する神経学的障害と区別するための本発明の使用は、本発明のさらに好ましい態様を表す。
【００４９】
上記したように、アルツハイマー病は非常にゆっくり進行する障害である。アルツハイマー病の進行または改善を評価するための手段は、たとえあるとしても少なく、生化学的マーカーはこれまでその点で使用が限定される。
【００５０】
ＣＳＦ 中のＡＧＥ レベルは、疾患の進行の間で、ならびに薬物の使用量に依存して変化しうる。かかる変化は、現在、経時的に追って測定されうる、すなわちモニターされうる。ＡＤをモニターするための本発明の方法の使用は、さらに好ましい態様を表わす。
【００５１】
アルツハイマー病のための治療手段は不足しており、非常にわずかの薬物のみがこの重大な疾患を治療するために利用可能である。新規薬物のスクリーニングは、信頼度が高い生化学的マーカーが多くは入手できないという事実により妨げられている。多くのＡＧＥ−構造物が、動物種ならびにヒトにおいて同一でないにしても、類似していることが知られている。
【００５２】
本発明のＣＳＦ−ＡＧＥ−レベルの測定の改良された方法に基づいて、ＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルにおける変化を介して薬物効能を評価するために、実験動物または患者のＣＳＦ−試料を解析および調査することが現在可能である。現在、ＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルに影響を与える薬物をスクリーニングすることが可能であり、精神障害、特にＣＳＦ 中のＡＧＥ のレベルに影響を与えるか、またはそのレベルに作用するＡＤの分野において、薬物をスクリーニングするために本発明の方法を使用することがさらに好ましい。
【００５３】
以下の実施例、参考文献および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示される手順において変更がなされうることが理解される。
【００５４】
実施例１
髄液の前処理
１．１  緩衝液および試薬
ａ）緩衝液
１０ｍＭ ＴＲＩＳ
１５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．００１ ％（ｗ／ｖ） Ｎ−メチル− イソ− チアゾロン
０．０１％（ｗ／ｖ） ２−クロロ− アセトアミド
０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０
ｐＨ７．４
【００５５】
ｂ）プロテイナーゼＫ
Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， カタログ番号２３６ ６０８
上記緩衝溶液中１３ｍｇ／ｍｌ の溶液を使用する。
【００５６】
ｃ）ＰＭＳＦ（＝フッ化フェニルメチルスルホニル）
Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， カタログ番号２３６ ６０８
エタノールに溶解して１００ｍＭｏｌ／ｌ を得たＰＭＳＦを、使用する直前に上記緩衝液に１＋５０で希釈する。
【００５７】
１．２  ＣＳＦ の消化
６０μｌ のＣＳＦ に、５ μｌ のプロテイナーゼＫ溶液を添加する（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）。試薬を混合し、３７℃にて３時間インキュベートする。プロテイナーゼＫ活性を阻害するために、６５μｌ のＰＭＳＦを添加し（最終濃度１ｍＭ ）、試薬混合物をさらに３０〜６０分間インキュベートする。
【００５８】
その後、前処理試料を、ＡＧＥ−ＣＭＬ 測定のために準備する。
【００５９】
実施例２
ＡＧＥ−ＣＭＬ の測定
２．１  試薬および溶液
ａ）インキュベーション緩衝液
市販されるインキュベーション緩衝液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ製フィブリンモノマーアッセイ、製品番号５６５ ４４０ ）を使用している。
【００６０】
ｂ）洗浄溶液
１０ｍＭ ＴＲＩＳ
１５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．００１ ％（ｗ／ｖ） Ｎ−メチル− イソ− チアゾロン
０．０１％（ｗ／ｖ） ２−クロロ− アセトアミド
０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０
ｐＨ７．４
【００６１】
ｃ）基質：
市販されるＥｎｚｙｍｕｎ （登録商標）− アッセイ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、製品番号１ ２９５ ２５０ ）を使用している。
【００６２】
２．２  アッセイを実施するために使用する試薬
ａ）Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ 、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、注文番号１２６５７ ）を、終末糖化にインビトロで供している。この目的のため、ＢＳＡ−ＡＧＥ を、３５℃にて３週間のＤ−グルコース（０．５Ｍ）とＢＳＡ （５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、２０μＭ 硫酸銅、ｐＨ７．４ 中に５０ｍｇ／ｍｌ ）のインキュベーション後に得、次いで１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ８．０ に対して透析した。
【００６３】
ビオチン化のため、５０ｍｇのＢＳＡ−ＡＧＥ を、３．４ｍｇ のＤ−ビオチン化− ［ε］− アミノカプロン酸−Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドエステルと共に９０分間インキュベートし、反応を一塩化リジンの添加によって停止して最終濃度１０ｍＭを得た。最後に、溶液を、リン酸緩衝化生理食塩水、５０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．５ に対して一晩透析した。ビオチン化産物を、「Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥ」と呼ぶ。
【００６４】
Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥを、上記インキュベーション緩衝液に１μｇ／ｍｌ溶液として使用する。
【００６５】
ｂ）標準
６−（Ｎ− カルボキシメチルアミノ） カプロン酸、ジナトリウム塩（ＭＷ２３３ を有するＣＭＬ 型合成分子）を、標準物質として使用する。０／６．２５／１２．５／２５／５０／１００ｎｇ／ｍｌの標準を含む溶液を、インキュベーション緩衝液中のこの物質の適切な希釈によって調製する。
【００６６】
ｃ）検出試薬
カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ ）構造物（例えば、上記６−（Ｎ− カルボキシメチルアミノ） カプロン酸など）と反応することが公知のモノクローナル抗体４Ｇ９ を、標準的手順に従って精製し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ ）と結合体化している。このような結合体の活性をペルオキシダーゼ単位によって表し得る。下記のアッセイにおいて、モノクローナル抗体ＰＯＤ 結合体を、インキュベーション緩衝液中に希釈して、おおよそ９０ｍＵ／ｍｌ のＰＯＤ 活性を得る。
【００６７】
２．３  ストレプトアビジンをコーティングした固相
ＢＳＡ−ビオチンを欧州特許第０ ３３１ １２７ 号（実施例１）に従って調製し、溶解し、５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４ 中１０μｇ／ｍｌに希釈し、それぞれ３００ μｌ をマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標） ）のウェル中で室温にて５時間インキュベートした。このプレートを空にし、３００ μｌ／ウェルで均一に架橋したストレプトアビジン（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４ 中１０μｇ／ｍｌ）を再充填した（欧州特許第０ ３３１ １２７ 号の実施例２に従う）。室温にて１８時間インキュベーション後、このウェルを空にし、９ｇ／ｌの塩化ナトリウム、１０ｇ／ｌ のデキストランＴ４０ および３ｇ／ｌのＢＳＡ の溶液で再充填した（３００ μｌ／ウェル）。３０分後、このプレートを完全に空にし、２５℃、２％相対湿度にて３時間乾燥し、気密バッグ内に密閉した。
【００６８】
２．４  ＡＧＥ−ＣＭＬ についてのイムノアッセイ
ストレプトアビジンをコーティングしたマイクロタイタープレートのウェルを、Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥ（１μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートする。１００ μｌ／ウェルを１時間室温にてインキュベートする。３ ×３００ μｌ 洗浄用液を用いて全てのウェルを洗浄することで任意の未結合Ｂｉ−ＢＳＡ−ＡＧＥを除去する。
【００６９】
試料およびペルオキシダーゼ結合体化モノクローナル抗体を同時インキュベートする。５０μｌ の試料（プロテイナーゼＫ で前処理したＣＳＦ 、未処理ＣＳＦ 、または標準物質のいずれか）をウェルに添加し、直後に上記で調製した５０μｌ の結合体溶液を添加する。この混合物を１時間室温にてインキュベートする。
【００７０】
未結合試薬を上記のように洗浄によって除去する。
【００７１】
結合ペルオキシダーゼを標準基質反応によって検出する。この目的のため、１００ μｌ の基質溶液を１ウェルあたりに添加し、室温にておおよそ３０分間インキュベートする。ペルオキシダーゼ活性を、基質中の変化を介して４０５ｎｍ の波長で測定する。
【００７２】
すべてのインキュベーション工程中、マイクロタイタープレートのウェル中の反応混合物を、プレート振盪装置を使用して穏やかに動かす。
【００７３】
ＣＳＦ 中のＡＧＥ−ＣＭＬ の濃度を、標準的な手順に従って標準曲線から外挿する。
【００７４】
未処理ＣＳＦ 試料または上記のような前処理試料を用いて得られるような代表的データを表１／１ および１／２ にまとめる。表１／１ は、測定した個々のデータを与え、表２／２ は、その統計的評価である。
【００７５】
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【００７６】
2004516027.tif 000004
【００７７】
参考文献のリスト
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米国特許第５，６１０，０７６ 号
米国特許第５，６９８，１９７ 号
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、前処理および未処理ＣＳＦ 試料中のＡＧＥ−ＣＭＬ レベルを表す。健常な対照由来およびアルツハイマー病を有する患者由来の髄液試料が、試料前処理ありおよびなしで研究されている。示され得るように、モノクローナル抗体４Ｇ９ によって検出されるＡＧＥ−構造カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ ）のレベルは、処理前では両群ともほぼ同じである。しかし、前処理によるＣＭＬ エピトープの露出後、対照個体由来の前処理ＣＳＦ 試料と比較して、ＡＧＥ−ＣＭＬ レベルの増加が、ＡＤ患者由来のＣＳＦ 試料で見出される。縦方向の棒は、計算される標準偏差を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月20日(2002.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄液（ＣＳＦ） 試料を前処理し、該前処理によりタンパク質変性を生じることを特徴とする、ＣＳＦ 試料中の少なくとも１つの終末糖化物質（ＡＧＥ） の測定方法。
【請求項２】
前記前処理が、洗浄剤、カオトロピック試薬および／またはタンパク質分解酵素の群より選ばれる試薬を用いて行われることをさらに特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記前処理が、少なくとも１つのタンパク質分解酵素を用いて行われることをさらに特徴とする請求項１または２いずれか記載の方法。
【請求項４】
タンパク質分解酵素がプロテイナーゼＫであることをさらに特徴とする請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載のように測定した少なくとも１つのＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルを、既知のＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルまたは１つ以上のＣＳＦ 対照試料から得られるＡＧＥ−ＣＳＦ−レベルと比較することを含む、神経変性疾患の評価方法。  
【請求項６】
アルツハイマー病をモニターするための請求項１〜５いずれか記載の方法の使用。
【請求項７】
アルツハイマー病を診断するための請求項１〜５いずれか記載の方法の使用。
【請求項８】
ＣＳＦ 中のＡＧＥ のレベルに影響を与える薬物をスクリーニングするための請求項１〜５いずれか記載の方法の使用。
【請求項９】
タンパク質変性を生じるタンパク質分解酵素の使用を含む、ＣＳＦ 試料中に存在するＡＧＥ−エピトープを露出させる方法。
【国際調査報告】
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