(57)【要約】本発明は、筋肉カルシニューリン相互作用タンパク質（ＭＣＩＰ）として知られるポリペプチドに関する。これらの分子は、カルシニューリンに結合し、そしてその場合に、その機能（筋肉における細胞応答に対してＣａ２＋を連結させる経路の一部としてのホスフェートの除去を含む）を調節する。ＭＣＩＰは、カルシニューリンの触媒性サブユニットと生理的な複合体を形成し、そしてＭＣＩＰのレベルを増加させる。このＭＣＩＰレベルの増加は、特定の標的遺伝子の転写を刺激するカルシニューリンの能力の減少に対応する。これらの知見を探索する方法もまた提供される。この方法は、ＭＣＩＰの発現およびカルシニューリンに対する結合のモジュレーターについてスクリーニングする工程を包含する。ＭＣＩＰ欠損を診断する方法、および心肥大を含む心筋症を処置するための方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシニューリンに対するＭＣＩＰの結合のモジュレーターについてスクリーニングする方法であって：
（ａ）ＭＣＩＰおよびカルシニューリンを提供する工程；
（ｂ）候補モジュレーターの存在下で該ＭＣＩＰおよび該カルシニューリンを混合する工程；
（ｃ）ＭＣＩＰ／カルシニューリン結合を測定する工程；ならびに
（ｄ）該候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰとカルシニューリンとの結合と、工程（ｃ）での結合を比較する工程、
を包含し、ここで、該候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰとカルシニューリンとの結合と比較した場合の、該候補モジュレーターの存在下での結合における差異により、該候補モジュレーターが、カルシニューリンに対するＭＣＩＰの結合のモジュレーターとして同定される、方法。
【請求項２】
ＭＣＩＰおよびカルシニューリンが、無細胞系の一部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＣＩＰおよびカルシニューリンが、インタクトな細胞内に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が筋細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、Ｈ９Ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、新生児心筋細胞、または筋管細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記インタクトな細胞が、動物中に位置する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記モジュレーターが、カルシニューリンに対するＭＣＩＰの結合を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記モジュレーターが、カルシニューリンに対するＭＣＩＰの結合を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＭＣＩＰおよびカルシニューリンのいずれかまたは両方が、標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＣＩＰおよびカルシニューリンの両方が標識されており、一方が消光可能な標識で標識されており、もう一方が消光剤で標識されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＣＩＰおよびカルシニューリンの両方が標識されているが、該標識は、互いに近位に運ばれない限り検出可能でない、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記インタクトな細胞が、ＭＣＩＰ、カルシニューリン、または両方を過剰発現するよう操作されている、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定する工程が、ＭＣＩＰ、カルシニューリン、または両方の免疫学的検出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰとカルシニューリンとの結合を測定する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＣＩＰがＭＣＩＰ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＣＩＰがＭＣＩＰ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＭＣＩＰがＭＣＩＰ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＣＩＰの脱リン酸化のモジュレーターについてスクリーニングする方法であって：
（ａ）リン酸化ＭＣＩＰおよびカルシニューリンを提供する工程；
（ｂ）候補モジュレーターの存在下で該ＭＣＩＰおよび該カルシニューリンを混合する工程；
（ｃ）ＭＣＩＰのリン酸化を評価する工程；ならびに
（ｄ）該候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰのリン酸化状態と、工程（ｃ）でのＭＣＩＰのリン酸化状態を比較する工程、
を包含し、ここで、該候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰのリン酸化と比較した場合の、該候補モジュレーターの存在下でのリン酸化における差異により、該候補モジュレーターが、ＭＣＩＰのリン酸化のモジュレーターとして同定される、方法。
【請求項１９】
ＭＣＩＰおよびカルシニューリンが、無細胞系の一部分である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＣＩＰおよびカルシニューリンが、インタクトな細胞内に位置する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が筋細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、Ｈ９Ｃ２細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、新生児心筋細胞、または筋管細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記インタクトな細胞が、哺乳動物中に位置する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記モジュレーターが、カルシニューリンによるＭＣＩＰの脱リン酸化を増加させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記モジュレーターが、カルシニューリンによるＭＣＩＰの脱リン酸化を減少させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
総リン酸化が評価される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記インタクトな細胞が、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＧＳＫ３、およびＭＡＰＫ、ならびにそれらのアイソフォームおよび改変体からなる群より選択されるタンパク質を発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記インタクトな細胞が、ＭＣＩＰおよびカルシニューリンのうちの１つ以上を過剰発現するよう操作されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記評価する工程が、放射標識したリンの検出、電気泳動の移動度の変化の検出、またはリン酸化状態間を識別する抗体による結合の検出を包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰの脱リン酸化を評価する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
ＭＣＩＰがＭＣＩＰ１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
Ｓｅｒ１０８でのリン酸化が評価される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＭＣＩＰがＭＣＩＰ２である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
ＭＣＩＰがＭＣＩＰ３である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３５】
ＭＣＩＰ発現のモジュレーターについてスクリーニングする方法であって：
（ａ）ＭＣＩＰおよびカルシニューリンを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞に候補モジュレーターを投与する工程；
（ｃ）ＭＣＩＰ発現を測定する工程；ならびに
（ｄ）該候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰの発現と、工程（ｃ）での発現を比較する工程、
を包含し、ここで、該候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰ発現と比較した場合の、該候補モジュレーターの存在下での発現における差異により、該候補モジュレーターが、ＭＣＩＰ発現のモジュレーターとして同定される、方法。
【請求項３６】
前記細胞が筋細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記筋細胞が心筋細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰ発現を測定する工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＭＣＩＰ発現を測定する工程が、ノーザン分析により転写を評価する工程を包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＭＣＩＰ発現を測定する工程が、定量ＲＴ−ＰＣＲにより転写を評価する工程を包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＭＣＩＰ発現を測定する工程が、ＥＬＩＳＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＭＣＩＰ発現を測定する工程が、ウェスタンブロットを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＭＣＩＰが、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、およびＭＣＩＰ３からなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記モジュレーターが、ＭＣＩＰ発現を増加させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記モジュレーターが、ＭＣＩＰ発現を減少させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
筋肉細胞増殖のモジュレーターについてスクリーニングする方法であって：
（ａ）ＭＣＩＰおよびカルシニューリンを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞に候補モジュレーターを投与する工程；
（ｃ）筋肉細胞増殖の指標となる標的分子の転写を測定する工程；ならびに
（ｄ）該候補モジュレーターの非存在下での該標的分子の転写と、工程（ｃ）での転写を比較する工程、
を包含し、ここで、該候補モジュレーターの非存在下での筋肉細胞増殖と比較した場合の、該候補モジュレーターの存在下での増殖における差異により、該候補モジュレーターが、筋肉細胞増殖のモジュレーターとして同定される、方法。
【請求項４７】
前記細胞が筋細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記筋細胞が心筋細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記候補インヒビターの非存在下での前記標的分子の転写を測定する工程をさらに包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的分子がＭＥＦ２である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＭＣＩＰがＭＣＩＰ１である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＭＣＩＰがＭＣＩＰ２である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＭＣＩＰがＭＣＩＰ３である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記モジュレーターが、筋肉細胞増殖を増加させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
前記モジュレーターが、筋肉細胞増殖を減少させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞が哺乳動物中に位置する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５７】
筋肉細胞増殖を調節する方法であって：
（ａ）カルシニューリンに対するＭＣＩＰの結合のモジュレーターを提供する工程；および
（ｂ）筋肉細胞に該モジュレーターを投与する工程、
を包含し、ここで、該モジュレーターの投与により筋肉細胞増殖が調節される、方法。
【請求項５８】
筋肉細胞増殖を調節する方法であって：
（ａ）カルシニューリンによるＭＣＩＰの脱リン酸化のモジュレーターを提供する工程；および
（ｂ）筋肉細胞に該モジュレーターを投与する工程、
を包含し、ここで、該モジュレーターの投与により筋肉細胞増殖が調節される、方法。
【請求項５９】
筋肉細胞増殖を調節する方法であって：
（ａ）ＭＣＩＰ発現のモジュレーターを提供する工程；および
（ｂ）筋肉細胞に該モジュレーターを投与する工程、
を包含し、ここで、該モジュレーターの投与により筋肉細胞増殖が調節される、方法。
【請求項６０】
前記筋肉細胞が哺乳動物中に位置する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記モジュレーターが筋肉細胞増殖のアゴニストである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記アゴニストが低分子である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記アゴニストが、前記筋肉細胞中で活性なプロモーターに作動可能に連結されたＭＣＩＰをコードするＤＮＡセグメントを含む発現カセットを含む発現構築物である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＭＣＩＰがＭＣＩＰ１である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記プロモーターが、ミオシン軽鎖−２プロモーター、αアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、α７インテグリンプロモーター、脳ナトリウム排泄増加性ペプチドプロモーター、αＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、αミオシン重鎖プロモーター、および心房性ナトリウム利尿因子プロモーターからなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記発現カセットが、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記発現構築物が、複製起点をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記発現構築物が、ウイルス発現構築物である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記ウイルス発現構築物が、アデノウイルス構築物、レトロウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物、ヘルペスウイルス構築物、ワクシニアウイルス構築物、ポリオーマウイルス構築物、およびシンドビスウイルスベクターからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
心臓疾患を処置するために使用される薬剤を前記哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項６０に記載の方法。
【請求項７１】
ＭＣＩＰ１プロモーターをコードする、単離され、かつ精製されたＤＮＡセグメント。
【請求項７２】
配列番号１１の配列から単離され得る、ＭＣＩＰ１プロモーター。
【請求項７３】
ＭＣＩＰ１以外のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結された、配列番号１１の５０〜１０００塩基対を含む、発現カセット。
【請求項７４】
前記ポリペプチドが、スクリーニング可能なマーカータンパク質である、請求項７３に記載の発現カセット。
【請求項７５】
ＭＣＩＰ１以外のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結された、配列番号１１の５０〜１０００塩基対を含む発現カセットを含む、宿主細胞。
【請求項７６】
ＭＣＩＰ１発現のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって：
（ａ）スクリーニング可能なマーカータンパク質をコードするＤＮＡセグメントに作動可能に連結された、配列番号１１の５０〜１０００塩基対を含む発現カセットで形質転換された細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞に候補モジュレーターを投与する工程；
（ｃ）該マーカータンパク質の発現を測定する工程；および
（ｄ）該候補モジュレーターの非存在下での該マーカータンパク質の発現と、工程（ｃ）での該マーカータンパク質の発現を比較する工程、
を包含し、ここで、該候補モジュレーターの非存在下での該マーカータンパク質発現と比較した場合の、該候補モジュレーターの存在下での該マーカータンパク質発現における差異により、該候補モジュレーターが、ＭＣＩＰ発現のモジュレーターとして同定される、方法。
【請求項７７】
心肥大または心不全を処置する方法であって、カルシニューリンに対するＭＣＩＰの結合を促進する薬剤を、心肥大または心不全に罹患した被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７８】
イオノトロープ、βブロッカー、抗不整脈薬、利尿薬、血管拡張薬、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、アンジオテンシン２型アンタゴニスト、またはサイトカインインヒビター／ブロッカーで前記被験体を処置する工程をさらに包含する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記薬剤が、ＭＣＩＰのＳｅｒ１０８に作用するホスファターゼまたはＭＣＩＰのＳｅｒ１０８に作用するホスファターゼのインデューサーである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記薬剤が、カルシニューリンに結合するが、Ｓｅｒ１０８の除去可能なホスフェートを欠くＭＣＩＰアナログである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記薬剤が低分子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記薬剤が経口投与または静脈内投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
前記薬剤が遅延型放出性の処方物中で投与される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
前記薬剤が、心臓組織中で活性なプロモーターの制御下にあるＭＣＩＰコード配列を含む発現カセットである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
前記プロモーターが構成性プロモーターである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
エキソン１、エキソン２、およびエキソン３によりコードされる配列を欠くＭＣＩＰ１ポリペプチドをコードする、単離され、かつ精製された核酸。
【請求項８８】
プロモーターをさらに含む、請求項８７に記載の核酸。
【請求項８９】
前記プロモーターが、筋肉特異的プロモーターである、請求項８８に記載の核酸。
【請求項９０】
前記筋肉特異的プロモーターが、ミオシン軽鎖−２プロモーター、αアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、α７インテグリンプロモーター、脳ナトリウム排泄増加性ペプチドプロモーター、αＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、αミオシン重鎖プロモーター、および心房性ナトリウム利尿因子プロモーターである、請求項８９に記載の核酸。
【請求項９１】
前記プロモーターがネイティブのＭＣＩＰ１プロモーターである、請求項８８に記載の核酸。
【請求項９２】
複製起点をさらに含む、請求項８７に記載の核酸。
【請求項９３】
前記核酸が非ウイルスベクターである、請求項９２に記載の核酸。
【請求項９４】
前記核酸がウイルスベクターである、請求項９２に記載の核酸。
【請求項９５】
配列番号２の残基１〜８０を欠くＭＣＩＰ１ポリペプチドをコードする、単離され、かつ精製された核酸。
【請求項９６】
プロモーターをさらに含む、請求項９５に記載の核酸。
【請求項９７】
前記プロモーターが筋肉特異的プロモーターである、請求項９５に記載の核酸。
【請求項９８】
前記筋肉特異的プロモーターが、ミオシン軽鎖−２プロモーター、αアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、α７インテグリンプロモーター、脳ナトリウム排泄増加性ペプチドプロモーター、αＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、αミオシン重鎖プロモーター、および心房性ナトリウム利尿因子プロモーターである、請求項９７に記載の核酸。
【請求項９９】
エキソン１、エキソン２、およびエキソン３に対応するアミノ酸残基を欠く、単離され、かつ精製されたＭＣＩＰ１ポリペプチド。
【請求項１００】
配列番号２の残基１〜８０を欠く、単離され、かつ精製されたＭＣＩＰ１ポリペプチド。
【請求項１０１】
心肥大または心不全を処置する方法であって、カルシニューリンに対するＭＣＩＰの結合を阻害する薬剤を、心肥大または心不全に罹患した被験体に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
政府は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金番号Ｒ０１−ＡＲ４０８４９により本発明における権利を保有し得る。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、一般的に、発生生物学および分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、カルシニューリン機能を調節すると同定される、ＭＣＩＰとここでは分類されるタンパク質に関する。
【０００３】
（２．関連技術の説明）
カルシニューリンは、多種多様な細胞型の発生および恒常性調節において重要な役割を果たすセリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼである（Ｋｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｃｒａｂｔｅｅｅ，１９９９）。白血球中のＴ細胞レセプターの活性化後のＮＦＡＴファミリーの転写因子とのカルシニューリンの相互作用は、カルシニューリンが如何に遺伝子発現を調節するかの最大の特徴を示す例を提供する（Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。細胞内カルシウムの変化は、カルシニューリンの触媒サブユニット（ＣｎＡ）へのＣａ２＋／カルモジュリンの結合を促し、それにより自己阻害領域を置換して、触媒ドメインへのタンパク質基質の接近を可能にする。活性カルシニューリンによるＮＦＡＴの脱リン酸化は、細胞質から核へのその転位を促すが、この場合、ＮＦＡＴは、ＡＰ１へテロ二量体とＤＮＡを協同的に結合して、ＩＬ−２のようなサイトカインをコードする遺伝子の転写を活性化する。ＮＦＡＴ活性化のこの基本モデルは、多数の細胞型においてカルシニューリンを介してＣａ２＋シグナルを伝達すること、および各細胞環境に独特の種々の組の標的遺伝子の転写を制御することが示されている（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。いずれの場合も、ＮＦＡＴは、ＡＰ１（Ｒａｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）、ｃＭＡＦ（Ｈｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）、ＧＡＴＡ（Ｍｅｓａｅｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９；Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｍｕｓａｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）またはＭＥＦ２（Ｃｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７；Ｍａｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９；Ｍａｏ　ａｎｄ　Ｗｉｅｄｍａｎｎ，１９９９）ファミリーのタンパク質を包含する他の転写因子と協同的に作用する。Ｔ細胞活性化のほかに、カルシニューリンシグナル伝達により制御される細胞応答としては、シナプス可塑性（Ｍａｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９；Ｇｒａｅｆ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９；　Ｚｈｕｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）およびアポトーシス（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９；Ｙｏｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）が挙げられる。
【０００４】
心臓および骨格筋の横紋筋細胞におけるカルシニューリンシグナル伝達の最新の研究により、この普遍的に発現されるタンパク質により制御される重要な生理学的および病理学的事象の範囲は広がった。トランスジェニックマウスの心臓中の構成的に活性型のカルシニューリンの強制発現は、ヒト疾患の特徴を反復する方法で、拡張型心筋症、心不全および死に進行する心肥大を促す（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。さらに、これらの動物における、そして心筋症のある種のその他の動物モデルにおける肥大および心不全は、カルシニューリンアンタゴニストであるシクロスポリンＡまたはＦＫ−５０６の投与により防止される（Ｓｕｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。骨格筋においては、カルシニューリンシグナル伝達は、インスリン様成長因子−１により刺激される肥大性成長（Ｍｕｓａｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９；Ｓｅｍｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）と、特有の筋線維サブタイプを確立する遺伝子発現の特殊プログラムの制御（Ｃｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｄｕｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）との両方に関連がある。これらの観察は、他の細胞型におけるカルシニューリンシグナル伝達変更の望ましくない結果を回避しながら、筋肉細胞におけるカルシニューリン活性を選択的に改質することの治療的可能性への関心を刺激した（Ｓｉｇａｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１）。
【０００５】
哺乳動物細胞中のカルシニューリンの活性は、他のタンパク質との相互作用により調整され得る。これらの例としては、免疫抑制剤シクロスポリンＡおよびＦＫ−５０６の標的であるイムノフィリンだけでなく、近年同定された２つの非関連タンパク質（ＡＫＡＰ７９およびｃａｂｉｎ−１／ｃａｉｎ）も挙げられる。ＡＫＡＰ７９は、プロテインキナーゼＣおよびプロテインキナーゼＡと協同してカルシニューリンを結合して、大型へテロオリゴマーシグナル伝達複合体の集合のための足場として機能する（Ｋａｓｈｉｓｈｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。ｃａｂｉｎ−１／ｃａｉｎは、カルシニューリンおよび転写因子ＭＥＦ２の両方を結合する（Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８；Ｌａｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。ｃａｂｉｎ−１過剰発現の結果として、カルシニューリン活性は阻害され、ＭＥＦ２は不活性状態に隔絶される。別のカルシニューリン結合タンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＲｅｘ１ｐ（ＹＫＬ１５９ｃ）である。予備報告では、この小型２４ｋＤａタンパク質が、酵母菌中で過剰発現されると、カルシニューリンシグナル伝達を阻害すると記述された（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ　ａｎｄ　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，１９９８）。
【０００６】
カルシニューリン調節タンパク質の存在は、これらの分子を標的とする治療的介入の可能性を生じる。心臓組織中のカルシニューリン機能を調整する能力を有する新規のより適切な候補の同定は、現在の研究の努力の重要な目標である。
【０００７】
（発明の要旨）
したがって、本発明によれば、カルシニューリンに結合するＭＣＩＰのモジュレーターに関するスクリーニング方法であって、（ａ）ＭＣＩＰおよびカルシニューリンを供給する工程、（ｂ）候補モジュレーターの存在下でＭＣＩＰおよびカルシニューリンを混合する工程、（ｃ）ＭＣＩＰ／カルシニューリン結合を測定する工程、および（ｄ）工程（ｃ）における結合を上記候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰおよびカルシニューリンの結合と比較して、それにより、上記候補モジュレーターの非存在下での結合と比較した場合の上記候補モジュレーターの存在下でのＭＣＩＰおよびカルシニューリンの結合の差が、上記候補モジュレーターをカルシニューリンと結合するＭＣＩＰのモジュレーターと同定する工程、を包含する方法が提供される。一実施形態において、ＭＣＩＰおよびカルシニューリンは、無細胞系の一部である。別の実施形態では、ＭＣＩＰおよびカルシニューリンは、例えば動物における、インタクトな細胞内に位置する。有用な細胞としては、筋細胞、心筋細胞、Ｈ９Ｃ２細胞、新生児心筋細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞および筋管細胞が挙げられる。
【０００８】
モジュレーターは、カルシニューリンと結合するＭＣＩＰを増大または低減し得る。ＭＣＩＰおよびカルシニューリンのいずれかまたは両方が、例えば一方が消光可能標識で、そして他方を消光剤で標識され得る。あるいは、ＭＣＩＰおよびカルシニューリンの両方が標識される場合、標識は、互いに近位に運ばれない限り、検出可能でない。細胞は、ＭＣＩＰ、カルシニューリンまたはその両方を過剰発現するように操作され得る。本方法は、ＭＣＩＰ、カルシニューリンまたは両方の免疫学的検出を包含し得る。ＭＣＩＰは、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３であり得る。
【０００９】
本発明の別の態様では、ＭＣＩＰ脱リン酸化のモジュレーターに関するスクリーニング方法であって、（ａ）リン酸化ＭＣＩＰおよびカルシニューリンを供給する工程、（ｂ）候補モジュレーターの存在下でＭＣＩＰおよびカルシニューリンを混合する工程、（ｃ）ＭＣＩＰリン酸化を評価する工程、および（ｄ）工程（ｃ）におけるＭＣＩＰのリン酸化状態を候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰのリン酸化状態と比較して、それにより、上記候補モジュレーターの非存在下でのリン酸化と比較した場合の上記候補モジュレーターの存在下でのＭＣＩＰリン酸化の差が、上記候補モジュレーターをＭＣＩＰリン酸化のモジュレーターと同定する工程、を包含する方法が提供される。
【００１０】
モジュレーターは、カルシニューリンによるＭＣＩＰ脱リン酸化を増大または低減し得る。インタクトな細胞は、ＰＫＣ、ＣａＭＫ、ＧＳＫ３およびＭＡＰＫならびにそれらのアイソフォームおよび改変体からなる群から選択されるタンパク質を発現し得る。インタクトな細胞はまた、１つまたはそれ以上のＭＣＩＰおよびカルシニューリンを過剰発現するように操作され得る。評価は、放射能標識リンの検出、電気泳動移動度の変化の検出、またはリン酸化状態間を区別する抗体による結合の検出を包含し得る。ＭＣＩＰは、ＭＣＩＰ１（例えば、評価されるＳｅｒ１０８でリン酸化を有する）、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３であり得る。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、ＭＣＩＰ発現のモジュレーターに関するスクリーニング方法であって、（ａ）ＭＣＩＰおよびカルシニューリンを発現する細胞を供給する工程、（ｂ）候補モジュレーターを上記細胞に投与する工程、（ｃ）ＭＣＩＰ発現を測定する工程、および（ｄ）工程（ｃ）における発現を候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰの発現と比較し、それにより、上記候補モジュレーターの非存在下での発現と比較した場合の上記候補モジュレーターの存在下でのＭＣＩＰ発現の差が、上記候補モジュレーターをＭＣＩＰ発現のモジュレーターと同定する工程、を包含する方法が提供される。
【００１２】
細胞は、筋細胞または心筋細胞であり得る。ＭＣＩＰ発現の測定は、ノーザン分析による転写の評価、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによる転写の評価を包含し得る。ＭＣＩＰは、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３からなる群から選択され得る。モジュレーターは、ＭＣＩＰ発現を増大または低減し得る。
【００１３】
本発明のさらに別の態様では、筋肉細胞増殖のモジュレーターに関するスクリーニング方法であって、（ａ）ＭＣＩＰおよびカルシニューリンを発現する細胞を供給する工程、（ｂ）候補モジュレーターを上記細胞に投与する工程、（ｃ）筋肉細胞増殖を示す標的分子の転写を測定する工程、および（ｄ）工程（ｃ）における転写を候補モジュレーターの非存在下での標的分子の転写と比較し、それにより、上記候補モジュレーターの非存在下での増殖と比較した場合の上記候補モジュレーターの存在下での筋肉細胞増殖の差が、上記候補モジュレーターを筋肉細胞増殖のモジュレーターと同定する工程、を包含する方法が提供される。
【００１４】
細胞は、筋細胞または心筋細胞であり得る。本方法は、候補阻害剤、例えばＭＥＦ２の非存在下での標的分子の転写を測定する工程をさらに包含し得る。ＭＣＩＰは、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３であり得る。モジュレーターは、筋肉細胞増殖を増大または低減し得る。細胞は、哺乳動物中に位置し得る。
【００１５】
前述のスクリーニングの実施形態の各々においては、モジュレーターの産生のための同様の方法であって、上記スクリーニング工程の各々と、その後のそのように同定されたモジュレーターを産生する付加的工程を包含する方法も提供される。
【００１６】
本発明の別の態様では、筋肉細胞増殖の調整方法であって、（ａ）カルシニューリンと結合するＭＣＩＰのモジュレーターを供給する工程、および（ｂ）上記モジュレーターを筋肉細胞に投与して、それにより上記モジュレーターの投与が筋肉細胞増殖の調整を生じる工程を包含する方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様では、筋肉細胞増殖の調整方法であって、（ａ）カルシニューリンによるＭＣＩＰ脱リン酸化のモジュレーターを提供する工程、および（ｂ）上記モジュレーターを筋肉細胞に投与して、それにより上記モジュレーターの投与が筋肉細胞増殖の調整を生じる工程を包含する方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様では、筋肉細胞増殖の調整方法であって、（ａ）ＭＣＩＰ発現のモジュレーターを供給する工程、および（ｂ）上記モジュレーターを筋肉細胞に投与して、それにより上記モジュレーターの投与が筋肉細胞増殖の調整を生じる工程を包含する方法が提供される。
【００１９】
筋肉細胞は、哺乳動物中に位置し得る。モジュレーターは、筋肉細胞増殖のアゴニスト、例えば低分子、または上記筋肉細胞中で活性なプロモーターに操作可能に連結されるＭＣＩＰをコードするＤＮＡセグメントを含む発現カセットであり得る。プロモーターは、ミオシン軽鎖−２プロモーター、αアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、α７インテグリンプロモーター、脳ナトリウム排出増加性ペプチドプロモーター、αＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、心房性ナトリウム利尿因子プロモーターまたはαミオシン重鎖であり得る。発現カセットは、ポリアデニル化シグナルまたは複製起点をさらに含み得る。発現構築物は、ウイルス発現構築物、例えばアデノウイルス構築物、レトロウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物、ヘルペスウイルス構築物、ワクシニアウイルス構築物、ポリオーマウイルス構築物またはシンドビスウイルスベクターであり得る。本方法は、心疾患を治療するために用いられる薬学的薬剤を上記の哺乳動物に投与することをさらに包含する。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、ＭＣＩＰ１プロモーターをコードする単離および精製されたＤＮＡセグメント、例えば配列番号１１の配列から単離可能であるものが提供される。ＭＣＩＰ１以外のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントに操作可能に連結される配列番号１１の５０〜１０００塩基対を含む発現カセットも提供される。ポリペプチドは、スクリーニング可能マーカータンパク質であり得る。ＭＣＩＰ１以外のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントに操作可能に連結される配列番号１１の５０〜１０００塩基対を含む発現カセットを含む宿主細胞も提供される。
【００２１】
本発明のさらに別の態様では、ＭＣＩＰ１発現のモジュレーターに関するスクリーニング方法であって、（ａ）スクリーニング可能マーカータンパク質をコードするＤＮＡセグメントに操作可能に連結される配列番号１１の５０〜１０００塩基対を含む発現カセットで形質転換された細胞を供給する工程、（ｂ）候補モジュレーターを上記細胞に投与する工程、（ｃ）上記マーカータンパク質の発現を測定する工程、および（ｄ）工程（ｃ）における上記マーカータンパク質の発現を上記候補モジュレーターの非存在下での上記マーカータンパク質の発現と比較し、それにより、上記候補モジュレーターの非存在下での発現と比較した場合の上記候補モジュレーターの存在下でのマーカータンパク質発現の差が、上記候補モジュレーターをＭＣＩＰ発現のモジュレーターと同定する工程、を包含する方法が提供される。
【００２２】
本発明のさらに別の態様では、心肥大または心不全の治療方法であって、カルシニューリンに結合するＭＣＩＰを促す薬剤を心肥大または心不全に罹患している被験体に投与することを包含する方法が提供される。本方法は、イオノトロープ（ｉｏｎｏｔｒｏｐｅ）、ベータ遮断薬、抗不整脈薬、利尿薬、血管拡張薬、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、アンギオテンシン２型アンタゴニストまたはサイトカイン阻害薬／遮断薬で上記の被験体を治療することをさらに包含し得る。薬剤は、ＭＣＩＰのＳｅｒ１０８に作用するホスファターゼ、ＭＣＩＰのＳｅｒ１０８に作用するホスファターゼの誘導物質、カルシニューリンを結合するが、Ｓｅｒ１０８で除去可能ホスフェートを欠くＭＣＩＰ、あるいは心臓組織中で活性なプロモーターの制御下でのＭＣＩＰコード配列を含む発現カセットであり得る。薬剤は、静脈内または経口投与することができ、遅延型放出性の処方物中にあり得る。薬剤は、低分子モジュレーターであり得る。
【００２３】
本発明の別の態様では、エキソン１、２および３によりコードされる配列を欠くＭＣＩＰ１ポリペプチドをコードする単離および精製された核酸が提供される。核酸は、プロモーター、例えば筋特異的プロモーター、例えばミオシン軽鎖−２プロモーター、αアクチンプロモーター、トロポニン１プロモーター、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、α７インテグリンプロモーター、脳ナトリウム排出増加性ペプチドプロモーターまたはαＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター、αミオシン重鎖プロモーターまたは心房性ナトリウム利尿因子プロモーターをさらに含み得る。あるいはプロモーターは、ネイティブなＭＣＩＰ１プロモーターであり得る。核酸は、複製起点をさらに含み得る。核酸は、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターであり得る。
【００２４】
本発明のさらに別の態様では、任意にプロモーターを含む配列番号２の残基１〜８０を欠くＭＣＩＰ１ポリペプチドをコードする単離および精製された核酸が提供される。本発明の関連態様では、エキソン１、２および３に対応するアミノ酸残基を欠く単離および精製されたＭＣＩＰ１ポリペプチドが提供される。本発明の別の関連態様では、配列番号２の残基１〜８０を欠く単離および精製されたＭＣＩＰ１ポリペプチドが提供される。
【００２５】
（例証的実施形態の説明）
心不全、すなわち、心臓がホメオスタシスを持続するのに十分な速度で血液をポンプ輸送できないことは、今日、世界中の大きな健康問題である。これは、心疾患により引き起こされる最終的な死によるだけでなく、長期入院を含めた必要とされる患者支援により被る莫大な費用についてもいえる。したがって、この経費がかかり、衰弱性である疾患を取り扱う大きな必要性が依然として存在する。
【００２６】
本発明者らは、哺乳動物ＭＣＩＰ（筋細胞で豊富なカルシニューリン相互作用タンパク質）はカルシニューリンの触媒サブユニットを結合および阻害することができることをここに報告する。ＭＣＩＰタンパク質は、カルシニューリンのシグナル伝達機能を調整することが従来示されているイムノフィリン、ＡＫＡＰ７９およびｃａｂｉｎ−１／ｃａｉｎタンパク質と構造的に異なる。さらに、ＭＣＩＰは、心臓および骨格筋の横紋筋細胞中で最も豊富に発現され、そのパターンはこの組の既知のカルシニューリン相互作用タンパク質の中で独特である。
【００２７】
特にｃａｂｉｎ−１／ｃａｉｎは、他の組織中より横紋筋中で低レベルに発現される（Ｓｕｎら，１９９８；Ｌａｉら，１９９８）ＡＫＡＰ７９およびｃａｂｉｎ−１／ｃａｉｎは、カルシニューリンを含むヘテロオリゴマー複合体が集合される分子足場として機能すると思われるタンパク質より大きい（Ｓｕｎら，１９９８；Ｌａｉら，１９９８；Ｋｌａｕｃｋら，１９９６）。対照的に小さいサイズ（２２ｋＤａ）のＭＣＩＰは、作用の異なるメカニズムを示唆する。
【００２８】
上記のように、Ｒｅｘ１ｐ（ＹＫＬ１５９ｃ）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのカルシニューリン結合タンパク質である。この予備報告によって、この小２４ｋＤａタンパク質は、酵母菌中で過剰発現された場合、カルシニューリンシグナル伝達を阻害することが特に言及された（ＫｉｎｇｓｂｕｒｙおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ　１９９８）。Ｒｅｘ１ｐの３０アミノ酸セグメントは、ヒト遺伝子配列データベース中で同定された２つの異なる遺伝子ＤＳＣＲ１およびＺＡＫＩ−４と相同性を共有する。ＤＳＣＲ１は、ヒト第２１染色体の「ダウン症候群決定領域」内に存在するため、そのように呼ばれた（Ｆｕｅｎｔｅｓら，１９９７）。５０〜１００の異なるタンパク質をコードすると推定されるこの領域に関する三染色体の個体は、ダウン症候群表現型の特徴を示す。ＺＡＫＩ−４は、甲状腺ホルモンに応答して転写的に活性化される遺伝子に関するスクリーニングにおいてヒト線維芽細胞株から同定された（Ｍｉｙａｚａｋｉら，１９９６）。
【００２９】
本発明者らはこれらの観察により刺激され、哺乳動物細胞におけるカルシニューリンシグナル伝達に関してこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質の詳細な分析に着手した。これらの研究に基づくと、ＤＳＣＲ１（ＭＣＩＰ１）遺伝子およびＺＡＫＩ−４（ＭＣＩＰ２）遺伝子は、マウス筋細胞におけるカルシニューリン依存性転写応答を阻害することができる。ＭＣＩＰは、心筋細胞および骨格筋細胞におけるカルシニューリンシグナル伝達を選択的に調節する努力のための独特の標的を代表する。
【００３０】
ＭＣＩＰタンパク質は、カルシニューリンに対する最も強力に特性化されたリンタンパク質基質であるＲｅｘ１ｐおよびＮＦＡＴの両方と共有する構造的モチーフを示す。ＭＣＩＰ内のこれらの保存モチーフは、これらの領域が取り出された切断型のＭＣＩＰ１がカルシニューリンとの結合を欠いているこのによって、機能的重要性を有すると思われる。ＭＣＩＰ１は、カルモジュリンの結合に必要なカルボキシル末端領域から離れたカルシニューリンＡの触媒ドメイン内で結合する。この結果は、ＭＣＩＰ１がカルシニューリンの活性部位と接触して、おそらくはＮＦＡＴおよびその他のリンタンパク質基質の接近を阻害するよう機能することを示唆する。
【００３１】
ＭＣＩＰ１転写物は、心臓特異的プロモーターの制御下で構成的に活性型のカルシニューリンを過剰発現するトランスジェニックマウスの心臓において数倍に増大される。これらの心臓のマイクロアレイ分析は、野生型と比較して、ＭＣＩＰ１を、最も劇的にアップレギュレートされる単一遺伝子として分類する。これに対して、ＭＣＩＰ２転写は、カルシニューリン活性の増大に応答して変化せず、このことは、ＭＣＩＰ１はカルシニューリン活性に応答してネガティブフィードバックループで機能するがＭＣＩＰ２はそうではないことを示唆する。しかしながらＭＣＩＰ２は、甲状腺ホルモンによりアップレギュレートされる。
【００３２】
ＭＣＩＰ１の転写はカルシニューリン活性によりそのように強力に調節されるため、ＭＣＩＰ１遺伝子プロモーターは、カルシニューリンシグナル伝達を変える化合物を同定するためのハイスループットの薬剤スクリーニングのための有益な試薬になる。ＭＣＩＰ１遺伝子の７００ｂｐ遺伝子内セグメントは、エキソン４に対する（５’）のすぐ上流に１５ＮＦＡＴ結合エレメントの独自の密なクラスターを含有し、カルシニューリンにより誘導されるＭＣＩＰ１の形態はエキソン４から開始される。このゲノム組織は、カルシニューリン活性に対するＭＣＩＰ１転写の強い感受性のための基礎を提供すると考えられる。ＭＣＩＰ１の転写は、酸化ストレスにも応答して、刺激後４時間あたりでピークとなる。ＭＣＩＰ２レベルは４時間で変化しないが、ＭＣＩＰ１レベルがピークに達すると減少する。
【００３３】
特に、本発明者らは、ＭＣＩＰ１のアミノ酸１０８のホスホセリン残基をカルシニューリンホスファターゼ活性のための基質と同定した。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）によるＭＣＩＰ１のアミノ酸１１２におけるセリンのプライミングリン酸化は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）によるセリン１０８のその後のリン酸化に必要とされる。カルシニューリンはセリン１０８を脱リン酸化し得るが、セリン１１２のリン酸塩を除去しない。しかしながら、セリン１０８をアラニンに変換された突然変異ＭＣＩＰ１は、依然としてカルシニューリンを阻害する。
【００３４】
近年、ヒトゲノムデータベースへの付加は、２つのスプライス変異体を有する第３のＭＣＩＰ遺伝子を包含する。この遺伝子は第１染色体上に位置し、登録番号ＡＦ１７６１１６（配列番号１６および１７）およびＡＦ１７６１１７（配列番号５および６）を有する変異体を伴う。これらの遺伝子産物は、本発明者らによりＭＣＩＰ３ａおよびＭＣＩＰ３ｂと命名されている。ここでＭＣＩＰ２ａおよびＭＣＩＰ２ｂと呼ばれるＭＣＩＰ２のスプライス変異体も存在すると考えられる。
【００３５】
カルシニューリン依存性シグナル伝達カスケードを調節するよう機能するタンパク質の発見は、細胞調節の基本的理解を進めるため、および薬剤発見のための新規の標的を提供するためにも重要である。カルシニューリン活性を強力に阻害するＭＣＩＰの能力は、ＭＣＩＰタンパク質が発現される細胞型中でのカルシニューリンシグナル伝達の調節にある水準の複雑さを付加する。ＭＣＩＰそれ自体は、タンパク質のリン酸化および脱リン酸化による調節を施され、それにより他のシグナル伝達入力をカルシニューリン経路と調和させるのに役立ち得る。これらのタンパク質は筋肉組織における非拘束性カルシニューリン活性の悪い結果を防止するための負の調節因子として機能すると本発明者らは推測する（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら，Ｍｕｓａｒｏら，１９９９；Ｓｅｍｓａｒｉａｎら，１９９９；Ｄｕｎｎら，１９９９）。しかしながら、ＭＣＩＰとの相互作用が、カルシニューリンを特定の細胞内の場所に、または特定のリンタンパク質基質に誘導するということも考えられる。
【００３６】
最新の結果は、ＭＣＩＰとカルシニューリンとの間の相互作用がヒト疾患の病理生物学に、そして最終的には療法に直接関連することを示す。例えば家族型の肥大性心筋症は、カルシニューリンシグナル伝達（Ｍａｒｂａｎら，１９８７）を包含すると思われる方法で、筋節のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異により引き起こされる（ＳｅｉｄｍａｎおよびＳｅｉｄｍａｎ，１９９８）。カルシニューリンアンタゴニストシクロスポリンＡまたはＦＫ−５０６の投与は、家族型の肥大性心筋症のトランスジェニック動物モデルにおける心肥大を防止する（Ｓｕｓｓｍａｎら，１９９８）が、類似の臨床試験は、既存の薬剤の毒性副作用（例えば免疫抑制および高血圧）のために妨げられる。
【００３７】
いくつかの臨床状況では、疾患の他の形態を伴わない心肥大の促進が有益であることを証明し得ることも考えられる。また、この過程におけるＭＣＩＰの関与により今度は、カルシニューリンではなくＭＣＩＰを拮抗することにより、介入のための適切な候補になる。
【００３８】
カルシニューリンアンタゴニストは、ヒト集団において一般的である後天性の心筋症のすべてではないがいくつかの動物モデルにおける心肥大および心不全も防止する（Ｓｕｓｓｍａｎら，１９９８；Ｄｉｎｇら，１９９９；Ｚｈａｎｇら，１９９９）が、臨床試験に対して同一の制限が当てはまる。心筋中の相対的に多量のＭＣＩＰ１は、それを、一般的カルシニューリンアンタゴニストのこれらの制限を阻止するための薬剤開発のための標的として推奨する。
【００３９】
（Ｉ．ＭＣＩＰペプチドおよびポリペプチド）
ＭＣＩＰ１をコードするヒト遺伝子（ＤＳＣＲ１）は、第２１染色体の決定領域内に存在する５０〜１００の遺伝子のうちの１つであり（Ｆｕｅｎｔｅｓら，１９９７；Ｆｕｅｎｔｅｓら，１９９５）、その三染色体性は、顕著な特徴として心臓異常および骨格筋の緊張低下を含むダウン症候群の複雑な発生異常を生じる（Ｅｐｓｔｅｉｎ，１９９５）。ＺＡＫＩ−４は、甲状腺ホルモンに応答して転写活性化される遺伝子に関するスクリーニングにおいてヒト線維芽細胞株から同定された（Ｍｉｙａｚａｋｉら，１９９６）。
【００４０】
出願人らは、ヒトＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３（配列番号２、４、６および１７）ならびにマウスＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２（配列番号８および１０）に関するタンパク質配列を提供する。全ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３分子のほかに、本発明は、下記の種々の機能を保有し得るかまたは保有し得ないポリペプチドの断片にもまた関連する。分子のＮ末端を含めた断片は、コード領域内の翻訳停止部位の遺伝子操作により生成され得る（下記）。あるいは、プロテアーゼとして既知のタンパク質分解酵素によるＭＣＩＰの処理は、種々のＮ末端、Ｃ末端および内部断片を生じ得る。断片の例としては、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００またはそれより長いアミノ酸長の配列番号２、４、６、８、１０および１７の連続残基が挙げられ得る。これらの断片は、既知の方法、例えば沈殿（例えば硫酸アンモニウム）、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（イムノアフィニティクロマトグラフィを含む）または種々のサイズ分離（沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過）により精製され得る。
【００４１】
（Ａ．構造的特徴）
ＭＣＩＰ１は、従来ＤＳＣＲ１と呼ばれているヒト遺伝子の産物であり、それは、立証済みのまたは考え得る生物学的当該物のいくつかのドメインを含む：酸性ドメイン（ＥＫＥＥＥＥＥＭＥ）、セリン−プロリンモチーフ（ＳＰＰＡＳＰＰ）、ロイシンリッチ推定ＤＮＡ結合ドメイン（ＬＨＫＴＥＦＬＧＫＥＭＫＬＹＦＡＱＴＬ）およびＳＨ３またはＳＨ２ドメインリガンドの特徴を有する領域（それぞれＨＬＡＰＰＮＰＤＫおよびＰＥＹＴＰＩ）（Ｆｕｅｎｔｅｓら、（１９９７））。４つの代替的な第１のエキソン（これらはエキソン５〜７と代替的に連結される）に起因して、複数の型のＭＣＩＰ１が存在する。カルシニューリン活性によって転写的に誘導されるのは、エキソン４で開始されたＭＣＩＰ１の形態である。ＺＡＫＩ−４としても既知のＭＣＩＰ２は、ＭＣＩＰ１と６２％の相同性を有する１９２ＡＡポリペプチドである。プロリンおよびバリン残基が、ＭＣＩＰ２内に豊富に見出される（Ｍｉｙａｚａｋｉら、（１９９６））。
【００４２】
（Ｂ．機能的形態）
ＭＣＩＰ１は、カルシニューリンの結合相手である。さらに、ＭＣＩＰ１はカルシニューリン依存性転写活性化のアンタゴニストである。ＭＣＩＰ１は、ＭＡＰＫおよびＧＳＫ−３、ならびにカルシニューリンホスファターゼ活性によるリン酸化のための基質としても作用する。ＭＣＩＰ１の残基８１〜１７７は、カルシニューリン阻害作用を保有する。
【００４３】
カルシニューリンとのＭＣＩＰ１の結合はカルモジュリンを必要とせず、ＭＣＩＰはカルシニューリンと結合するカルモジュリンも妨害しない。これは、ＭＣＩＰ１が結合するカルシニューリンの表面がカルモジュリン結合ドメインを包含しないことを示唆する。これに対比して、ＭＣＩＰ１のカルシニューリンとの相互作用はＦＫ５０６：ＦＫＢＰまたはシクロスポリン：シクロフィリンにより崩壊され、このことは、ＭＣＩＰ１が結合するカルシニューリンの表面が免疫抑制薬の活性に必要なものと重複することを示す。
【００４４】
（Ｃ．ＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２の変異体）
ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、置換変異体、挿入変異体または欠失変異体であり得る。欠失変異体は、機能または免疫原性活性に不可欠でない自然タンパク質の１つまたはそれ以上の残基を欠き、その例としては上記の膜貫通配列を欠く変異体が挙げられる。別の一般的な型の欠失変異体は、分泌シグナル配列または細胞の特定部分と結合するようタンパク質を指図するシグナル配列を欠くものである。挿入突然変異体は、典型的にはポリペプチド中の非末端点での物質の付加を包含する。これは、免疫反応性エピトープまたは単に単一残基の挿入を包含し得る。融合タンパク質と呼ばれる末端付加は、以下で考察される。
【００４５】
置換変異体は、典型的には、タンパク質内の１つまたはそれ以上の部位におけるあるアミノ酸の別のアミノ酸との交換を含有し、他の機能または特性の損失を伴わずに、タンパク質分解性切断に対する安定性のようなポリペプチドの１つまたはそれ以上の特性を調整するよう設計され得る。この種の置換は、好ましくは保存的であり、すなわちあるアミノ酸が同様の形状および電荷のもので置換される。保存的置換は当該技術分野で既知であり、このような保存的置換としては例えば：アラニンのセリンへの；アルギニンのリジンへの；アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの；アスパラギン酸のグルタミン酸への；システインのセリンへの；グルタミンのアスパラギンへの；グルタミン酸のアスパラギン酸への；グリジンのプロリンへの；ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの；イソロイシンのロイシンまたはバリンへの；ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの；リジンのアルギニンへの；メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの；フェニルアラニンのチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの；セリンのトレオニンへの；トレオニンのセリンへの；トリプトファンのチロシンへの；チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの；ならびにバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変更が挙げられる。
【００４６】
以下は、等価のまたは改良さえされた第二世代分子を作製するためのタンパク質のアミノ酸の変更に基づいた考察である。例えば、ある種のアミノ酸は、例えば抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造との相互作用的結合能力の感知できるほどの損失を伴わずにタンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに置換され得る。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのはそのタンパク質の相互作用能力および性質であるため、ある種のアミノ酸置換は、タンパク質配列、ならびにその根元的ＤＮＡコード配列中でなされ、それにもかかわらず同様の特性を有するタンパク質を獲得する。したがって、以下で考察されるように、それらの生物学的有用性または活性の感知できるほどの損失を伴わずに遺伝子のＤＮＡ配列において種々の変更がなされ得ることが本発明者らにより企図される。表１は、特定のアミノ酸をコードするコドンを示す。
【００４７】
このような変更を加えるに際して、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質に関する相互作用的生物学的機能を付与する場合のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は一般に、当該技術分野で理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的ハイドロパシーの特徴はその結果生じるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に他の分子、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原等とのタンパク質の相互作用を規定することが認められている。
【００４８】
各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指数を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリジン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００４９】
同様のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸によりある種のアミノ酸が置換され、同様の生物学的活性を有するタンパク質を生じる、すなわち生物学的機能的に等価のタンパク質を依然として獲得し得るということは当該技術分野で既知である。このような変更を加える場合、そのハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらに特に好ましい。
【００５０】
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効に実行され得ることも当該技術分野で理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（この記載内容は、参考として本明細書中で援用される）は、タンパク質の最大局所平均親水性が、その隣接アミノ酸の親水性により支配される場合、タンパク質の生物学的特性と相関すると記述している。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリジン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン＊（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００５１】
アミノ酸は同様の親水性値を有する別のものに代えて置換されることができ、それでも生物学的に等価の、かつ免疫学的に等価のタンパク質を獲得すると理解される。このような変更においては、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、そして±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
【００５２】
上で概説したように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づいている。種々の上記の特徴を考慮に入れる例示的置換は当業者に既知であり、このような置換としては、以下のものが挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００５３】
本発明のポリペプチドの調製のための別の実施形態は、ペプチド擬似体の使用である。擬似体は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９３）。ペプチド擬似体の使用の背後の根元的根拠は、タンパク質のペプチド主鎖が主に、分子相互作用、例えば抗体と抗原の相互作用を促すような方法でアミノ酸側鎖を配向するよう存在するというものである。ペプチド擬似体は、天然分子に類似した分子相互作用を可能にすると予測される。これらの原理を、上記の原理とともに用いて、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３の天然特性の多くを有するが、変更され、かつ改良さえされた特性を伴う第二世代分子を操作し得る。
【００５４】
（Ｄ．ドメインスイッチング）
実施例に記載されているように、本発明人等は、マウスＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３を同定した。他のミッドライン（Ｍｉｄｌｉｎｅ）タンパク質との相同性を考えれば、当該シリーズの突然変異体は、種々のタンパク質の相同領域を置換することにより作製され得る。これは、ある種の状況においては、「ドメインスイッチング」として公知である。
【００５５】
ドメインスイッチングは、異なるが、この場合は関連したポリペプチドを用いたキメラ分子の生成を包含する。種々のＭＣＩＰタンパク質を比較することにより、これらの分子の機能的有意領域に関して予測し得る。次に、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３機能に対するこれらの領域の重要性を確定しようとする努力において、これらの分子の関連ドメインをスイッチすることが可能である。これらの分子は、これらの「キメラ」が、同一機能をおそらくは提供しながら、天然分子から区別され得るという点で、付加的価値を有し得る。
【００５６】
（Ｅ．融合タンパク質）
特殊化された種類の挿入変異体は、融合タンパク質である。この分子は一般に、ＮまたはＣ末端で第２のポリペプチドの全部または一部に連結された自然分子の全部または実質的部分を有する。例えば、融合は、典型的には他の種からのリーダー配列を用いて、異種宿主中でのタンパク質の組換え発現を可能にする。別の有用な融合としては、融合タンパク質の精製を促すための、免疫学的活性ドメイン、例えば抗体エピトープの付加が挙げられる。融合連結部またはその付近での切断部位の含入は、精製後の外来ペプチドの除去を促す。その他の有用な融合としては、機能性ドメイン、例えば酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞標的化シグナルまたは膜貫通領域の連結が挙げられる。
【００５７】
（Ｆ．タンパク質の精製）
ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、ＭＣＩＰ３またはそれらの変異体を精製するのが望ましい。タンパク質精製技法は、当業者には周知である。これらの技法は、ある水準での、細胞環境のポリペプチドおよび非ポリペプチド分画への粗製分別を包含する。他のタンパク質からポリペプチドを分離した後、当該ポリペプチドは、部分的または完全な精製（または均質性への精製）を達成するためにクロマトグラフィおよび電気泳動技法を用いてさらに精製され得る。純粋ペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィ、排除クロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。ペプチドを精製するための特に効率的な方法は、迅速タンパク質液体クロマトグラフィまたはＨＰＬＣでもある。
【００５８】
本発明のある種の態様は、コードタンパク質またはペプチドの精製に、特定の実施形態では、実質的精製に関する。「精製タンパク質またはペプチド」という用語は、本明細書中で用いる場合、他の構成成分から単離可能な組成物を指すよう意図されるが、この場合、タンパク質またはペプチドはその天然獲得可能状態に対して任意の程度に精製される。したがって精製タンパク質またはペプチドは、それが天然に生じ得る環境にないタンパク質またはペプチドをも指す。
【００５９】
一般に、「精製された」とは、種々のその他の構成成分を除去するために分別を施されたタンパク質またはペプチド組成物を指し、この組成物は、その発現された生物学的活性を実質的に保有する。「実質的に精製された」という用語が用いられる場合、この言い方は、タンパク質またはペプチドが、組成物の主要構成成分を構成する、例えば組成物中の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上のタンパク質を構成する組成物を指す。
【００６０】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量化するための種々の方法は、本開示を鑑みれば、当業者に公知である。これらの例としては、例えば活性分画の特異的活性を確定すること、あるいはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により分画内のポリペプチドの量を評価することが挙げられる。分画の純度を評価するための好ましい方法は、分画の特異的活性を算定して、それを初期抽出物の特異的活性と比較し、したがって「〜倍精製数」により本明細書中で評価される純度の程度を算定することである。活性の量を表すために用いられる実際の単位は、もちろん、精製を追跡調査するために選択される特定のアッセイ技法に、そして発現タンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かによって決まる。
【００６１】
タンパク質精製に用いるのに適切な種々の技法は、当業者には周知である。これらの例としては、例えば硫酸アンモニウム、ＰＥＧおよび抗体等による沈殿、または熱変性とその後の遠心分離；クロマトグラフィ工程、例えばイオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよびアフィニティクロマトグラフィ；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこのような、およびその他の技法の組合せが挙げられる。当該技術分野で一般的に既知であるように、種々の精製工程を実行する順序は変更することができ、あるいはある種の工程は省略することができるが、それでも依然として実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のための適切な方法を生じると考えられる。
【００６２】
タンパク質またはペプチドがそれらの最も精製された状態でいつも提供される一般要件はない。実際、実質的にあまり精製されていない製品がある種の実施形態において有用性を有することが意図される。部分的な精製は、より少数の精製工程を組合せて用いることにより、または同一の一般精製方式の種々の形態を利用することにより成し遂げられ得る。例えばＨＰＬＣ装置を利用して実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィは一般に、低圧クロマトグラフィ系を利用する同一技法より大きい「倍増」精製を生じると理解される。低度の相対的精製を示す方法は、タンパク質産物の全体的回収において、あるいは発現タンパク質の活性を維持するに際して、利点を有し得る。
【００６３】
ポリペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの種々の条件を用いて、時としては有意に変わり得ることは公知である（Ｃａｐａｌｄｉら，１９７７）。したがって異なる電気泳動条件下では、精製または部分的精製発現産物の見かけの分子量が変わり得ると考えられる。
【００６４】
高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）は、ピークの非常に優れた分解を伴う非常に迅速な分離を特徴とする。これは、極微細粒子および高圧を用いて適性流量を維持することにより達成される。分離は、数分間で、または長くても１時間で達成され得る。さらに、空容積が床容積の極小部分であるよう粒子が小さくそして密封されるため、極小容積の試料のみが必要とされる。また、バンドが狭く試料の希釈が極少であるので、試料の濃度は非常に大きい必要はない。
【００６５】
ゲルクロマトグラフィまたは分子ふるいクロマトグラフィは、分子サイズを基礎にした特殊なタイプの分配クロマトグラフィである。ゲルクロマトグラフィの背後にある理論は、小孔を含有する不活性物質の極小粒子を用いて調製されるカラムが、孔を通るかまたはその周囲を通過すると、小型分子から大型分子を、それらのサイズによって分離するというものである。粒子が作製される物質が分子を吸着しない限り、流量を決定する唯一の要因はサイズである。それゆえ、形状が比較的一定である限り、分子は漸減サイズでカラムから溶離される。分離がｐＨ、イオン強度、温度などのような他のすべての因子に依存しないため、ゲルクロマトグラフィは異なるサイズの分子の分離に関して卓絶していない。また、吸着は事実上認められず、帯域拡大は低く、溶離容積は、分子量に関する簡単な事項に関連する。
【００６６】
アフィニティクロマトグラフィは、単離される物質とそれが特異的に結合し得る分子との間の特異的親和性に依存するクロマトグラフィ手順である。これはレセプター−リガンド型相互作用である。カラム物質は、不溶性マトリックスに結合相手の１つを共有結合することにより合成される。次にカラム物質は、溶液から物質を特異的に吸着し得る。溶離は、結合が起こらないものに条件を変える（ｐＨ、イオン強度、温度等を変える）ことにより起こる。
【００６７】
炭水化物含有化合物の精製に有用な特定のタイプのアフィニティクロマトグラフィは、レクチンアフィニティクロマトグラフィである。レクチンは、種々の多糖および糖タンパク質と結合する物質の一種類である。レクチンは、通常は臭化シアンによりアガロースに結合される。セファロースに結合されたコンコナバリンＡは、用いられるこの種類の最初の物質であり、レンチルレクチン、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基の精製に有用であったコムギ胚芽アグルチニン、およびＨｅｌｉｘ　ｐｏｍａｔｉａのレクチンを包含する他のレクチンを多糖および糖タンパク質から単離するのに広範に用いられてきた。レクチンそれ自体は、炭水化物リガンドによるアフィニティクロマトグラフィを用いて精製される。ラクトースは、トウゴマおよび落花生からレクチンを精製するために用いられてきた。マルトースは、レンズマメおよびタチナタマメからレクチンを抽出するために有用であった。Ｎ−アセチル−Ｄガラクトサミンは、大豆からレクチンを精製するために用いられる。Ｎ−アセチルグルコサミニルは、コムギ胚芽からのレクチンと結合する。Ｄ−ガラクトサミンは、二枚貝からレクチンを得るために用いられてきた。Ｌ−フコースは、ハスからのレクチンと結合する。
【００６８】
マトリックスは、それ自体、有意程度に分子を吸着せず、かつ広範囲の化学的、物理的および熱安定性を有する物質であるべきである。リガンドは、その結合特性に影響を及ぼさない方法でカップリングされるべきである。リガンドは、比較的密接な結合も提供するべきである。また、試料またはリガンドを破壊せずに物質を溶離することが可能であるべきである。最も一般的な形態のアフィニティクロマトグラフィの１つは、イムノアフィニティクロマトグラフィである。本発明にしたがって用いるのに適した抗体の生成は、以下で考察される。
【００６９】
（Ｇ．合成ペプチド）
本発明は、本発明の種々の実施形態において用いるためのより小さいＭＣＩＰ関連ペプチドも記載する。それらの比較的小さいサイズに起因して、本発明のペプチドは、慣用的技法にしたがって溶液中または固体支持体上でも合成され得る。種々の自動合成機が市販されており、公知のプロトコールにしたがって用いられ得る（例えばＳｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ，（１９８４）；Ｔａｍら，（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９８６）；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）参照）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中に援用される）。本明細書中に記載された選定領域に対応する通常約６から約３５〜５０のアミノ酸までの短いペプチド配列、または重複ペプチドのライブラリーは、容易に合成され得、次に反応性ペプチドを同定するよう設計されたスクリーニングアッセイでスクリーニングされ得る。あるいは、組換えＤＮＡ技術が用いられ得るが、この場合、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクター中に挿入され、適切な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトされて、発現に適した条件下で培養される。
【００７０】
（Ｈ．抗原組成物）
本発明は、抗体の産生に関連した動物の免疫のための抗原としてのＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３タンパク質またはペプチドの使用も提供する。ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、ＭＣＩＰ３またはその一部分が、リンカー、ポリリンカーまたは誘導体化アミノ酸を介して１つまたはそれ以上の薬剤にカップリング、接着、結合、接合または化学的連結されることが想定される。これは、二重特異的または多価組成物またはワクチンが生成されるように実施され得る。これらの組成物の調製に用いられる方法は当業者には既知であり、動物への投与に適している、すなわち薬学的に受容可能であるべきであることがさらに想定される。好ましい薬剤は担体であり、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【００７１】
（ＩＩ．核酸）
本発明は、別の実施形態において、ＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２をコードする遺伝子も提供する。ヒトＭＣＩＰ１（配列番号１）、ＭＣＩＰ２（配列番号３）およびＭＣＩＰ３（配列番号５および１６）に関する遺伝子が同定されている。マウスからのＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２（配列番号７および９）も提供される。しかしながら、これらの核酸を用いて、当業者は種々のその他の種（例えばラット、ウサギ、イヌ、サル、テナガザル、ヒト、チンパンジー、類人猿、ヒヒ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびその他の種）における関連同族体を容易に同定できるので、本発明はこれらの遺伝子に範囲を限定されない。
【００７２】
さらに、本発明が本明細書中に開示された特定の核酸に限定されないことは明らかであろう。以下で考察されるように、「ＭＣＩＰ遺伝子」は種々の異なる塩基を含有し得るが、本明細書中に開示されたヒトおよびマウス遺伝子から機能的に、そしてある場合には構造的に区別できない対応するポリペプチドを依然として産生する。
【００７３】
同様に、核酸に対する任意の参照は、その核酸を含有し、ある場合にはその核酸の産物を発現することができる宿主細胞を包含すると読み取られるべきである。治療的考察のほかに、本発明の核酸を発現する細胞は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３の機能を誘導、抑制、阻害、増強、妨害、遮断、排除、刺激、または強化する薬剤に関するスクリーニングの状況において有用であることが立証され得る。
【００７４】
（Ａ．ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３をコードする核酸）
本発明の核酸は、本明細書中に記載されるように、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３遺伝子の全体、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３のドメイン、あるいはＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３の任意のその他の断片をコードし得る。核酸は、ゲノムＤＮＡから得られ得、すなわち特定の生物のゲノムから直接クローニングされ得る。しかしながら、好ましい実施形態では、核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。ｃＤＮＡ＋天然イントロンまたは別の遺伝子由来のイントロンも意図される。このような操作分子は、「ミニ遺伝子」と呼ばれることがある。最小限、本発明のこれらおよびその他の核酸は、例えばゲル電気泳動において分子量標準として用いられ得る。
【００７５】
「ｃＤＮＡ」という用語は、鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて調製されるＤＮＡを指すよう意図される。ゲノムＤＮＡ、あるいはゲノムＲＮＡ鋳型、プロセシングされていないＲＮＡ鋳型、または部分的にプロセシングされたＲＮＡ鋳型から重合されるＤＮＡではなくｃＤＮＡを用いることの利点は、ｃＤＮＡが主として対応するタンパク質のコード配列を含有することである。完全または部分ゲノム配列が好ましい時、例えば最適発現のために非コード領域が必要とされる場合、あるいは非コード領域、例えばイントロンがアンチセンス戦略で標的とされる場合もあり得る。
【００７６】
わずかに異なる核酸配列を有するが、それにもかかわらず同一タンパク質をコードする天然変異体により、所定の種からの所定のＭＣＩＰが表され得ることも考えられる（以下の表１参照）。
【００７７】
本出願に用いる場合、「ＭＣＩＰをコードする核酸」という用語は、全細胞核酸を含有しない単離された核酸分子を指す。好ましい実施形態では、本発明は、本質的に配列番号１、３、５、７、９および１６で示されるような核酸配列に関する。「配列番号１、３、５、７、９または１６で示されるような」という用語は、核酸配列が実質的に配列番号１、３、５、７、９または１６の一部分に実質的に対応することを意味する。「機能的等価コドン」という用語は、同一アミノ酸をコードするコドン、例えばアルギニンまたはセリンに関しては６つのコドンを指すために（以下の表１）、そして以下のページで考察されるような生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンを指すために、本明細書中で用いられる。
【００７８】
【表１】
2004502444.tif 000002
遺伝暗号の縮重を考慮に入れると、配列番号１、３、５、７、９および１６のヌクレオチドと同一であるヌクレオチドの少なくとも約５０％、通常は少なくとも約６０％、さらに通常は約７０％、もっとも通常は約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、もっとも好ましくは約９５％を有する配列が意図される。配列番号１、３、５、７、９および１６で示されるものと本質的に同一である配列はまた、機能的に、標準条件下で配列番号１、３、５、７、９および１６の相補体を含有する核酸セグメントとハイブリダイズし得る配列と定義され得る。
【００７９】
本発明のＤＮＡセグメントは、上記のように、生物学的機能的等価ＭＣＩＰタンパク質およびペプチドをコードするものを包含する。このような配列は、核酸配列およびこのようにコードされたタンパク質内で天然に起こることが公知であるコドン重複性およびアミノ酸機能的等価性の結果として生じ得る。あるいは、機能的等価タンパク質またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術の適用により作製され得るが、この場合、タンパク質構造の変化は、交換されるアミノ酸の特性を考慮して操作され得る。ヒトにより設計された変化は、下記のように、部位指向的突然変異誘発技術の適用により導入され得るか、または無作為に導入されて、後に所望の機能に関してスクリーニングされ得る。
【００８０】
（Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー）
当然、本発明は、配列番号１、３、５、７、９および１６で示される配列と相補的であるかまたは本質的に相補的であるＤＮＡセグメントも包含する。「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリック相補規則にしたがって塩基対合し得るものである。本明細書中で用いる場合、「相補配列」という用語は、前述の同一ヌクレオチドの比較により評価され得るように、または本明細書中に記載するもののような比較的緊縮性の条件下で配列番号１、３、５、７、９および１６の核酸セグメントとハイブリダイズし得ると定義されるように、実質的に相補的である核酸配列を意味する。このような配列は、ＭＣＩＰタンパク質全体、あるいはその機能的または非機能的断片をコードし得る。
【００８１】
あるいは、ハイブリダイズ用セグメントは、より短いオリゴヌクレオチドであり得る。１７塩基長の配列は、ヒトゲノム中に１回だけ生じるはずであり、したがって独特の標的配列を特定するのに十分である。より短いオリゴマーは作製するのが容易であり、そしてｉｎ　ｖｉｖｏアクセシビリティーを増大するが、多数のその他の因子がハイブリダイゼーションの特異性の確定に関与する。その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性および配列特異性の両方は、長さの増大に伴って増大する。８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれより多い塩基対の例示的オリゴヌクレオチドが用いられるよう意図されるが、その他のものも意図される。２５０、５００、１０００、１２１２、１５００、２０００、２５００、３０００または３４３１塩基およびそれより長い塩基をコードするより長いポリヌクレオチドも同様に意図される。このようなオリゴヌクレオチドは、例えばサザンブロットおよびノーザンブロットにおけるプローブとしての、そして増幅反応におけるプライマーとしての用途を見出す。
【００８２】
適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者には周知である。ある種の適用、例えば部位指向的突然変異誘発によるアミノ酸の置換において、より低い緊縮条件が必要とされることが理解される。これらの条件下では、ハイブリダイゼーションはプローブおよび標的鎖の配列が完全に相補的でなく、１つまたはそれ以上の位置でミスマッチであるにもかかわらず、起こり得る。条件は、塩濃度を増大しそして温度を低減することによって、より低緊縮にされ得る。例えば中等度緊縮条件は、約３７℃〜約５５℃の温度で約０．１〜０．２５ＭのＮａＣｌにより提供され得るが、一方、低緊縮条件は、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ塩により、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で提供され得る。したがってハイブリダイゼーション条件は容易に操作され得るし、したがって一般的に所望の結果によって選択される方法である。
【００８３】
別の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、例えば約２０℃〜約３７℃の間の温度で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのジチオトレイトールの条件下で達成され得る。用いられる他のハイブリダイゼーション条件としては、約４０℃〜約７２℃の範囲の温度での、約１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５μＭのＭｇＣｌ２が挙げられ得る。ホルムアミドおよびＳＤＳも、ハイブリダイゼーション条件を変えるために用いられ得る。
【００８４】
本発明のプローブおよびプライマーを用いる一方法は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３に、あるいはより具体的に他の種からのＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３の相同体に関する遺伝子の検索におけるものである。普通は、標的ＤＮＡはゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーであるが、しかしスクリーニングはＲＮＡ分子の分析を包含し得る。ハイブリダイゼーションの緊縮性およびプローブの領域を変えることにより、異なる程度の相同性が発見され得る。
【００８５】
本発明のプローブおよびプライマーを活用する別の方法は、部位指向的または部位特異的突然変異誘発におけるものである。部位特異的突然変異誘発は、根元的ＤＮＡの特異的突然変異誘発による、個々のペプチドの、あるいは生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドの調製に有用な技法である。本技法はさらに、ＤＮＡ中に１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列変化を導入することにより、配列改変体を調製および試験する容易さを提供して、１つまたはそれ以上の上記の考えを組入れる。部位特異的突然変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用により変異体の産生を可能にして、横断される欠失連接部の両端に安定二重鎖を形成する十分なサイズおよび配列複雑性を有するプライマー配列を提供する。典型的には、約１７〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、配列の連接部の両側の約５〜１０残基が変更される。
【００８６】
当該技法は、典型的には、一本鎖および二本鎖形態の両方で存在するバクテリオファージベクターを用いる。部位指向的突然変異誘発に有用な典型的ベクターとしては、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージベクターは市販されており、それらの使用は一般に、当業者には周知である。二本鎖プラスミドもまた、部位指向的突然変異誘発に慣用的に用いられ、これはファージからプラスミドへの目的の遺伝子の移入の工程を排除する。
【００８７】
概して、部位指向的突然変異誘発は、一本鎖ベクターをまず得るか、または所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をその配列内に含む二本鎖ベクターの２つの鎖の融解することにより実施される。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、合成的に調製される。このプライマーは次に、ハイブリダイゼーション条件を選択した場合のミスマッチの程度を考慮しながら、一本鎖ＤＮＡ調製物を用いてアニーリングされ、そして突然変異保有鎖の合成を完了するために、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩＫｌｅｎｏｗフラグメントのようなＤＮＡ重合酵素に供される。したがってヘテロ二重鎖が形成されるが、この場合、一方の鎖は元の突然変異していない配列をコードし、そして第二の鎖は所望の突然変異を保有する。このヘテロ二重鎖ベクターは次に、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために用いられ、そして突然変異配列配置を保有する組換えベクターを包含するクローンが選択される。
【００８８】
部位指向的突然変異誘発を用いた選択した遺伝子の配列変異体の調製は、潜在的に有用な種を産生する一手段として提供され、遺伝子の配列変異体が得られる他の方法が存在するので、それに限定されるものではない。例えば所望の遺伝子をコードする組換えベクターは、突然変異誘発物質、例えばヒドロキシルアミンで処理されて、配列変異体を生成し得る。
【００８９】
（Ｃ．アンチセンス構築物）
アンチセンス法は、核酸が「相補的」配列と対合する傾向があるという事実を利用する。相補的とは、ポリヌクレオチドが標準的なワトソン−クリック相補性法則にしたがって塩基対形成し得るものであることを意味する。すなわち、より大きなプリンはより小さいピリミジンと塩基対形成して、シトシンと対形成したグアニン（Ｇ：Ｃ）、そしてＤＮＡの場合、チミンと対形成したアデニン（Ａ：Ｔ）の、あるいはＲＮＡの場合にはウラシルと対形成したアデニン（Ａ：Ｕ）の組合せを形成する。配列をハイブリダイズするに際してのイノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンなどのようなあまり一般的でない塩基の封入は、対形成を妨げない。
【００９０】
ポリヌクレオチドを用いた二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡのターゲティングは、三重螺旋形成をもたらす。ＲＮＡのターゲティングは、二重螺旋形成をもたらす。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞中に導入されると、それらの標的ポリヌクレオチドと特異的に結合して、転写、ＲＮＡプロセシング、輸送、翻訳および／または安定性を妨害する。アンチセンスＲＮＡ構築物またはこのようなアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡは、インビトロまたはインビボでの、宿主細胞内（例えば、ヒト被験体を含む宿主動物内）での遺伝子転写もしくは翻訳またはその両方を阻害するために用いられ得る。
【００９１】
アンチセンス構築物は、遺伝子のプロモーターおよびその他の制御領域、エキソン、イントロン、またはエキソン−イントロン境界とでさえ結合するよう設計され得る。もっとも有効なアンチセンス構築物は、イントロン／エキソンスプライス連接部と相補的な領域を含むことが意図される。したがって、好ましい実施形態としては、５０〜２００塩基のイントロン−エキソンスプライス連接部内の領域との相補性を有するアンチセンス構築物が挙げられる、ということが提唱される。いくつかのエキソン配列は、その標的選択性に重篤な影響を及ぼすことなく構築物内に含入され得ることが観察された。含入されるエキソン物質の量は、用いられる特定のエキソンおよびイントロン配列に依存する。正常細胞機能が影響されるか否か、あるいは相補的配列を有する関連遺伝子の発現が影響されるか否かを確定するために、インビトロで構築物を単に試験することにより、多すぎるエキソンＤＮＡが含入されるか否かを容易に試験し得る。
【００９２】
上記のように、「相補的」または「アンチセンス」とは、それらの全長にわたって実質的に相補的であり、そして非常に少ない塩基ミスマッチを有するポリヌクレオチド配列を意味する。例えば１５塩基長の配列は、それらが１３または１４個の位置に相補的ヌクレオチドを有する場合、相補的と呼ばれ得る。天然では、完全に相補的である配列は、それらの全長を通して完全に相補的であり、そして塩基ミスマッチを有さない配列である。より低度の相同性を有するその他の配列も意図される。例えば高相同性の限定領域を有するが、非相同領域も有するアンチセンス構築物（例えばリボザイム；下記参照）が設計され得る。これらの分子は、５０％未満の相同性を有するが、しかし適切な条件下で標的配列と結合する。
【００９３】
特定の構築物を生成するために、ゲノムＤＮＡの一部分をｃＤＮＡまたは合成配列と組合せることは有益であり得る。例えばイントロンが最終的構築物中で望ましい場合、ゲノムクローンが用いられる必要がある。ｃＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドは、構築物の残りの部分のためのより便利な制限部位を提供し、したがって残りの配列に用いられる。
【００９４】
（Ｄ．リボザイム）
タンパク質は伝統的に核酸の触媒作用のために用いられてきたが、しかし別の種類の高分子がこの試みに有用であるとして出現した。リボザイムは、部位特異的方式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（Ｋｉｍ　ａｎｄ　Ｃｏｏｋ，　１９８７；　Ｇｅｒｌａｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８７；　Ｆｏｒｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ，　１９８７）。例えば多数のリボザイムは、高度の特異性でホスホエステル転移反応を促し、多くの場合オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８１；　Ｍｉｃｈｅｌ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｈｏｆ，　１９９０；　Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ　ａｎｄ　Ｓｈｕｂ，　１９９２）。この特異性は、基質が特定の塩基対形成相互作用を介して、化学反応前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）と結合する、という要件によるものとされている。
【００９５】
リボザイム触媒作用は、核酸を包含する配列特異的切断／連結反応の一部として主に観察されてきた（Ｊｏｙｃｅ，　１９８９；　Ｃｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８１）。例えば米国特許第５，３５４，８５５号は、ある種のリボザイムは、既知のリボヌクレアーゼの場合より大きい、そしてＤＮＡ制限酵素の値に近い配列特異性で、エンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告する。したがって遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性阻害は、治療的用途に特に適している（Ｓｃａｎｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１；　Ｓａｒｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９０）。近年、リボザイムが、それらが適用されたいくつかの細胞株において遺伝子変化を引き出し、変更された遺伝子としては癌遺伝子Ｈ−ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶの遺伝子が挙げられることが報告された。この研究のほとんどが、特定のリボザイムにより切断される特異的突然変異コドンに基づいて、標的ｍＲＮＡの修飾を包含した。
【００９６】
（Ｅ．クローニング、遺伝子移入および発現のためのベクター）
ある種の実施形態において、発現ベクターは、ＭＣＩＰポリペプチド産物を発現するために用いられ、次にこれは精製され、例えばこれを用いて動物に予防接種して、抗血清またはモノクローナル抗体を生成し、これを用いてさらなる研究が実行され得る。別の実施形態では、発現ベクターは、遺伝子療法に用いられる。発現は、適切なシグナルがベクター中に提供されることを必要とし、その例としては、宿主細胞中での当該遺伝子の発現を駆動するウイルス供給源および哺乳動物供給源の両方からの種々の調節エレメント、例えばエンハンサー／プロモーターが挙げられる。宿主細胞中でのメッセンジャーＲＮＡの安定性および翻訳可能性を最適化するよう設計されたエレメントも規定される。薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と関連させる一エレメントと同様に、生成物を発現する恒久的安定細胞クローンを確立するための多数の優性な薬剤選択の使用のための条件も提供される。
【００９７】
（ｉ）調節エレメント
本出願を通して、「発現構築物」という用語は、核酸コード配列の一部または全部が転写され得る遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意の型の遺伝子構築物を包含するものを意味する。転写体はタンパク質に翻訳され得るが、それは必ずしも翻訳される必要はない。ある種の実施形態では、発現は、遺伝子の転写、ならびに遺伝子産物へのｍＲＮＡの翻訳の両方を包含する。他の実施形態では、発現は、当該遺伝子をコードする核酸の転写のみを包含する。
【００９８】
ある種の実施形態では、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」とは、遺伝子の特定の転写を開始するために必要な細胞の合成機構により、または導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列を指す。「転写制御下」という語句は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に関連した正しい位置および配向で存在することを意味する。
【００９９】
プロモーターという用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関して開始部位周囲に群を成して集められる一群の転写制御モジュールを指すために本明細書中で用いられる。プロモーターが編成される方法についての考察の多くは、いくつかのウイルスプロモーターの分析から、例えばＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写単位に関する分析から得られる。さらに最近の研究により増強されるこれらの試験は、プロモーターが別個の機能的モジュールで構成され、各々が約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして転写活性化因子またはリプレッサータンパク質に関する１つまたはそれ以上の認識部位を含有することを示した。
【０１００】
各プロモーター中の少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成のための開始部位を配備するよう機能する。この最もよく知られるの例はＴＡＴＡボックスであるが、しかしＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター、例えば哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子に関するプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子に関するプロモーターでは、開始部位それ自体の上にくる別個のエレメントは、開始の場所を固定するのに役立つ。
【０１０１】
付加的プロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の上流３０〜１１０ｂｐ領域に位置するが、しかし多数のプロモーターが、近年、開始部位の下流にも機能的エレメントを含有することが示された。プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、したがってプロモーター機能は、エレメントが互いに関して転化または移動される場合、保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、活性が減少し始める前に、５０ｂｐ間隔に増大され得る。プロモーターによって、個々のエレメントは、転写を活性化するために共同でまたは個別に機能し得ると思われる。
【０１０２】
ある種の実施形態では、ネイティブのＭＣＩＰプロモーターは、対応するＭＣＩＰ遺伝子、異種ＭＣＩＰ遺伝子、スクリーニング可能または選択マーカー遺伝子、あるいは任意のその他の当該遺伝子の発現を駆動するために用いられる。特に興味深いのは、ヒトＭＣＩＰ遺伝子のエキソン４のすぐ上流の７００ｂｐである。上記のように、この領域は、転写因子ＮＦＡＴに関する高濃度の結合部位を含有し、したがって、特にエキソン４で開始する転写体の存在の点から見て、重要な調節機能を果たすと思われる。
【０１０３】
他の実施形態では、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、ラットインスリンプロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いて、当該コード配列の高レベル発現を得ることができる。当該コード配列の発現を達成することが当業界で既知であるその他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージプロモーターの使用も同様に意図されるが、ただしこれは、発現のレベルが所定の目的のために十分である場合に限る。
【０１０４】
周知の特性を有するプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換後の当該タンパク質の発現のレベルおよびパターンは最適化され得る。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能にし得る。表２および３は、当該遺伝子の発現を調節するために、本発明の状況で用いられ得るいくつかの調節エレメントを列挙する。この一覧表は、遺伝子発現の促進に関与すると考えられるすべてのエレメントを網羅するものではなく、単にそれらを例示するよう意図される。
【０１０５】
エンハンサーは、ＤＮＡの同一分子上の離れた位置にあるプロモーターからの転写を増大する遺伝子エレメントである。エンハンサーは、プロモーターに酷似して編される。すなわちそれらは多数の個々のエレメントから構成され、その各々は１つまたはそれ以上の転写タンパク質と結合する。
【０１０６】
エンハンサーとプロモーターとの間の基本的区別は、操作的である。エンハンサー領域は、全体としてある距離で転写を刺激することができなければならない。これはプロモーター領域またはその構成成分エレメントについてはその限りでない。他方、プロモーターは、特定の部位ならびに特定の配向でＲＮＡ合成の開始を指図する１つまたはそれ以上のエレメントを有さなければならないが、一方、エンハンサーはこれらの特殊性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーはしばしば重複し、連続しており、しばしば非常によく似たモジュール編成を示すと思われる。
【０１０７】
以下は、発現構築物中の当該遺伝子をコードする核酸と組合せて用いられ得るウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサーならびに誘導性プロモーター／エンハンサーの一覧表である（表２および表３）。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤのとおり）も、遺伝子の発現を駆動するために用いられ得る。真核生物細胞は、送達複合体の一部として、または付加的遺伝子発現構築物として適切な細菌ポリメラーゼが提供される場合、ある種の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持し得る。
【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
【表３】
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特に興味深いのは、筋特異的プロモーター、特に心臓特異的プロモーターである。これらの例としては、ミオシン軽鎖−２プロモーター（Ｆｒａｎｚら、１９９４；Ｋｅｌｌｙら、１９９５）、αアクチンプロモーター（Ｍｏｓｓら、１９９６）、トロポニン１プロモーター（Ｂｈａｖｓａｒら、１９９６）、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換物質プロモーター（Ｂａｒｎｅｓら、１９９７）、ジストロフィンプロモーター（Ｋｉｍｕｒａら、１９９７）、クレアチンキナーゼプロモーター（Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｍ．Ｅ．、１９９６）、α７インテグリンプロモーター（Ｚｉｏｂｅｒ　＆　Ｋｒａｍｅｒ、１９９６）、脳ナトリウム排出増加性ペプチドプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら、１９９６）、およびαＢ−クリスタリン／小熱ショックタンパク質プロモーター（Ｇｏｐａｌ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｒ．、１９９５）、αミオシン重鎖プロモーター（Ｙａｍａｕｃｈｉ−Ｔａｋｉｈａｒａら、１９８９）およびＡＮＦプロモーター（ＬａＰｏｉｎｔｅら、１９８８）が挙げられる。
【０１１０】
ｃＤＮＡ挿入物が用いられる場合、典型的には遺伝子転写体の適正なポリアデニル化を実行するためのポリアデニル化シグナルを含むことを所望する。ポリアデニル化シグナルの性質が本発明の上首尾の実施に決定的であるとは考えられず、そして任意のこのような配列、例えばヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが用いられ得る。発現カセットの一エレメントとしてターミネーターも意図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強するのに、そしてカセットから他の配列までの通読を最小限にするのに役立ち得る。
【０１１１】
（ｉｉ）選択マーカー
本発明の特定の実施形態では、細胞は本発明の核酸構築物を含有し、ある細胞は、発現構築物中にマーカーを含入することによりインビトロまたはインビボで同定され得る。このようなマーカーは細胞に同定可能な変化を付与して、発現構築物を含有する細胞の容易な同定を可能にする。通常は、薬剤選択マーカーの含入が、クローニングに、および形質転換体の選択に役立ち、例えばネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。あるいは、酵素、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）が用いられ得る。免疫学的マーカーも用いられ得る。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限り、重要であるとは考えられない。選択マーカーのさらなる例は、当業者には周知である。
【０１１２】
（ｉｉｉ）多重遺伝子構築物およびＩＲＥＳ
本発明の特定の実施形態では、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子またはポリシストロン性メッセージを作製するために用いられる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを回避して、内部部位で翻訳を開始し得る（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ピカノウイルス（ｐｉｃａｎｏｖｉｒｕｓ）ファミリー（ポリオおよび脳心筋炎）の２つのメンバーからのＩＲＥＳエレメントが記載されており（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）、同様に哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳも記載されている（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結され得る。多オープンリーディングフレームは一緒に転写され、各々がＩＲＥＳにより分離されて、ポリシストロン性メッセージを作製し得る。ＩＲＥＳエレメントによって、各オープンリーディングフレームは効率的翻訳のためにリボソームに近づき得る。多重遺伝子は、単一メッセージを転写するために単一プロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現され得る。
【０１１３】
任意の異種オープンリーディングフレームは、ＩＲＥＳエレメントに連結され得る。これは、分泌タンパク質、個々の遺伝子によりコードされる多サブユニットタンパク質、細胞内または膜結合タンパク質、ならびに選択マーカーに関する遺伝子を含有する。このようにして、いくつかのタンパク質の発現は同時に操作されて、単一構築物および単一選択マーカーを有する細胞となり得る。
【０１１４】
（ｉｖ）発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞中に導入し得る多数の方法がある。本発明の特定の実施形態では、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノム由来の操作構築物を含む。レセプター媒介性エンドサイトーシスにより細胞中に進入し、宿主細胞ゲノムと一体化し、そしてウイルス遺伝子を安定的且つ効率的に発現する特定のウイルスの能力は、それらを哺乳動物細胞中への外来遺伝子の移入のための魅力的な候補にした（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。遺伝子ベクターとして用いられた最初のウイルスは、ＤＮＡウイルス、例えばパポーバウイルス（サルウイルス４０、ウシパピローマウイルスおよびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）であった。これらは、外来ＤＮＡ配列に関しては相対的に低い能力を有し、そして制限宿主範囲を有する。さらに許容細胞におけるそれらの腫瘍形成能力および細胞変性作用は、安全性問題を提起する。それらは８ｋＢまでの外来遺伝子物質のみを収容し得るが、しかし種々の細胞株および実験室動物中に容易に導入され得る（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。
【０１１５】
インビボ送達のための好ましい方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）構築物のパッケージングを支持し、（ｂ）その中でクローニングされたアンチセンスポリヌクレオチドを発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含有するものとする。この状況では、発現は遺伝子産物が合成されることを必要としない。
【０１１６】
発現ベクターは、遺伝子操作形態のアデノウイルスを含む。３６ｋＢ線状二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子編成についての知識は、７ｋＢまでの外来配列とのアデノウイルスＤＮＡの大型片の置換を可能にする（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスと対照を成して、宿主細胞のアデノウイルス感染は、アデノウイルスＤＮＡが考え得る遺伝子毒性を伴わずにエピソーム方式で複製し得るため、染色体の統合をもたらさない。さらにアデノウイルスは構造的に安定であり、そしてゲノム再配列は広範な増幅後に検出されなかった。アデノウイルスは、事実上すべての上皮細胞に、それらの細胞周期段階にかかわらず感染し得る。今までのところ、アデノウイルス感染は軽症疾患、例えばヒトにおける急性呼吸器疾患にのみ関連があるようである。
【０１１７】
アデノウイルスは、その中型ゲノム、易操作性、高力価、広範な標的細胞範囲および高感染性のために、遺伝子移入ベクターとして用いるのに特に適している。ウイルスゲノムの両端は、１００〜２００塩基対逆方向反復（ＩＴＲ）を含有するが、これはウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始により分けられる異なる転写単位を含有する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび２〜３の細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現および宿主細胞遮断に関与する（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。大多数のウイルスキャプシドタンパク質を含めた後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）が発する単一一次転写体の有意のプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は感染の後期中は特に効率的であり、そしてこのプロモーターから発せられるｍＲＮＡはすべて、５’−三連リーダー（ＴＰＬ）配列を保有し、これがそれらを翻訳のための好ましいｍＲＮＡにする。
【０１１８】
一般的系では、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターおよびプロウイルスベクター間の相同組換えから生成される。２つのプロウイルスベクター間の考え得る組換えのために、野生型アデノウイルスはこの過程から生成され得る。したがって、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そしてそのゲノム構造を調べることは重要である。
【０１１９】
複製欠陥性である一般的アデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ａｄ５ＤＮＡ断片によりヒト胚腎臓細胞から形質転換された２９３と呼ばれる独自のヘルパー細胞株に依存しており、そして構成的にＥ１タンパク質を発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムがなくてもすむものであるため（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、一般的アデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを伴って、Ｅ１、Ｄ３または両領域に外来ＤＮＡを保有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。天然において、アデノウイルスは野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングして（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）、ＤＮＡの約２ｋｂ余分な能力を提供する。Ｅ１およびＥ３領域において置き換え可能である約５．５ｋｂのＤＮＡと組合せると、一般的アデノウイルスベクターの最大能力は７．５ｋｂ以下であるか、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスゲノムの８０％より多くが、ベクター主鎖中に残存し、そしてベクター保有細胞傷害性の供給源である。さらにＥ１欠失ウイルスの複製欠陥は、不完全である。例えばウイルス遺伝子発現の漏出は、高感染多重度（ＭＯＩ）で一般的に利用可能なベクターを用いて観察されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【０１２０】
ヘルパー細胞系は、ヒト胚腎細胞、筋肉細胞、造血細胞、または他のヒト胚間葉細胞もしくは上皮細胞のようなヒト細胞に由来してもよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容される他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。かかる細胞としては、例えばベロ細胞または他のサル胚間葉細胞もしくは上皮細胞が挙げられる。上述のように、好ましいヘルパー細胞系は、２９３である。
【０１２１】
Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞を培養し、アデノウイルスを繁殖させる改良方法を開示した。一形式では、培地１００〜２００ｍｌを含有する１ｌのシリコン処理したスピナフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に個々の細胞を接種して、自然細胞凝集体を増殖させる。４０ｒｐｍで攪拌した後、細胞生存度をトリパンブルーで推定する。別の形式では、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌミクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ　Ｓｔｅｒｌｉｎ，Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を以下のように使用する。培地５ｍｌ中に再懸濁した細胞接種物を、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、ときどき攪拌しながら１〜４時間静置した。次に、培地を、新鮮な培地５０ｍｌと交換し、振盪を開始する。ウイルス生産のために、細胞を約８０％集密にまで増殖させて、その後、培地を（最終容量の２５％になるように）交換し、ＭＯＩ０．０５でアデノウイルスを添加する。培養物を一晩静置した後、容量を１００％に増加して、さらに７２時間振盪を開始する。
【０１２２】
アデノウイルスベクターが、複製欠陥性または少なくとも条件的に欠陥性であるという要件以外、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の首尾よい実施には決定的ではないと考えられる。アデノウイルスは、４２種の異なる既知の血清型または亜群Ａ〜Ｆのいずれかであってもよい。亜群Ｃのアデノウイルス５型は、本発明で使用するための条件付き複製欠陥アデノウイルスベクターを得るために、好ましい出発原料である。この理由は、アデノウイルス５型が、多くの生化学的情報および遺伝情報が既知であるヒトアデノウイルスであり、歴史上ベクターとしてアデノウイルスを使用したほとんどの構築に使用されてきたためである。
【０１２３】
上述のように、本発明による典型的にベクターは、複製欠陥性であり、アデノウイルスＥ１領域を有さない。したがって、Ｅ１コード配列が除去された位置に目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も利便性が高い。しかしながら、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は、本発明にとって重要ではない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）が記載するようなＥ３置換ベクター中の欠失Ｅ３領域の代わりに、あるいはヘルパー細胞系またはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補完するＥ４領域中に挿入してもよい。
【０１２４】
アデノウイルスは、増殖および操作しやすく、インビトロおよびインビボで広範な宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高力価、例えば１０９〜１０１２プラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、それらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターにより送達される外来遺伝子は、エピソームであり、したがって宿主細胞に対して遺伝毒性が低い。野生型アデノウイルスによるワクチン接種の研究で、副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのそれらの安全性および治療的潜在力を実証している。
【０１２５】
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）、およびワクチン開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）で使用されてきた。最近では、動物研究により、組換えアデノウイルスが遺伝子治療に使用することができることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｒｅｅｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｄら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。種々の組織への組換えアデノウイルスの投与の研究には、気管内滴注（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、および脳への定位接種（Ｌｅ　Ｇａｌ　Ｌａ　Ｓａｌｌｅら、１９９３）が含まれる。
【０１２６】
レトロウイルスは、逆転写プロセスにより感染細胞中でそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへ変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルス群である（Ｃｏｎｆｆｉｎ、１９９０）。次に、生じたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を誘導する。組込みは、レシピエント細胞およびその子孫中のウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子、すなわちそれぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードするｇａｐ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含有する。２つの末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含有し、それらはまた宿主細胞ゲノム中の組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【０１２７】
レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を、複製欠陥性であるウイルスを生産するために特定のウイルス配列の場所でウイルスゲノムに挿入する。ビリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を有さないパッケージング細胞系が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列とともにｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを、（例えばリン酸カルシウム沈殿により）この細胞系に導入する場合、パッケージング配列により、組換えプラスミドのＲＮＡ転写体をウイルス粒子にパッケージングすることが可能となり、次に、それは培地中に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次に、組換えレトロウイルスを含有する培地を収集して、任意に濃縮して、遺伝子移入に使用する。レトロウイルスベクターは、広範囲の細胞型を感染することが可能である。しかしながら、組込みおよび安定な発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１２８】
ウイルスエンベロープにラクトース残基を化学的に付加することによるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて、レトロウイルスをベクターを特異的に標的とすることができるように設計された新規のアプローチが近年開発された。この修飾により、唾液糖タンパク質レセプターによる肝細胞の特異的感染が可能となった。
【０１２９】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特定細胞レセプターに対するビオチン化抗体を使用した、組換えレトロウイルスを標的とする種々のアプローチが設計された。抗体は、ストレプトアビジンを使用することで、ビオチン成分を介して結合することができる（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主な組織適用複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、インビトロでエコトロピックウイルスによる、これらの表面抗原を有する様々なヒト細胞の感染を実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０１３０】
本発明のすべての態様では、レトロウイルスベクターの使用に対して特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは通常、細胞ゲノム中のランダム部位に組込まれる。これは、宿主遺伝子の妨害による、またはフランキング遺伝子の機能を妨害し得るウイルス調節配列の挿入による挿入性突然変異誘発を引き起こし得る（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠陥レトロウイルスベクターの使用による別の懸念は、パッケージング細胞中の野生型複製適格ウイルスの出現の可能性である。これは、組換えウイルス由来のインタクトな配列が、宿主細胞ゲノム中に組み込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列から上流に挿入されるという組換え事象に起因し得る。しかしながら、組換えの可能性を多いに減少させるはずの新規パッケージング細胞系が現在利用可能である（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。
【０１３１】
他のウイルスベクターを、本発明において発現構築物として使用してもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８：ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｄｇｅｎ、１９８６；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを使用してもよい。それらは、様々な哺乳動物細胞にとって魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０１３２】
欠陥Ｂ型肝炎ウイルスの最近の認識により、種々のウイルス配列の構造と機能との関係に対する新たな洞察が得られた。インビトロの研究により、ウイルスが、そのゲノムの最大８０％を欠失しているにもかかわらず、ヘルパー依存性パッケージングおよび逆転写の能力を保持することができることがわかった（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。これにより、大部分のゲノムが、外来遺伝物質で置換され得ることが示唆された。肝向性および残留性（組込み）は、肝臓誘導性遺伝子移入とって特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇらは最近、ポリメラーゼ、表面および前表面コード配列の場所でアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を導入した。それを、野生型ウイルスを用いてトリの肝癌細胞系に同時トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含有する培地を使用して、初代子カモ肝細胞を感染させた。トランスフェクション後少なくとも２４日間、安定なＣＡＴ遺伝子発現を検出した（Ｃｈａｎｇら、１９９１）。
【０１３３】
センスまたはアンチセンス遺伝子構築物の発現を達成するために、発現構築物を細胞に送達しなくてはならない。この送達は、細胞系を形質転換するための実験室手順の場合のようにインビトロで、あるいは特定の疾患状態の治療の場合のようにインビボまたはエキソビボで達成され得る。送達用の一メカニズムは、ウイルス感染によるものであり、ここで発現構築物は、感染性ウイルス粒子中でキャプシド形成されている。
【０１３４】
発現構築物を培養哺乳動物細胞へ移入するための幾つかの非ウイルス方法も、本発明で意図される。これらとしては、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接マイクロインジェクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡ負荷リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）およびリポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子照射（Ｙａｎｇら、１９９０）、ならびにレセプター媒介性トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）が挙げられる。これらの技法の幾つかは、インビボまたはエキソビボ用途に首尾よく適合し得る。
【０１３５】
いったん発現構築物が細胞へ送達されれば、目的の遺伝子をコードする核酸は、種々の部位に位置して発現されてもよい。特定の実施形態では、遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれてもよい。この組込みは、相同組換え（遺伝子置換）により同族位置および配向性であってよく、あるいはそれは、ランダムな非特異的位置（遺伝子増大）で組み込まれてもよい。さらなる実施形態では、核酸は、別個のＤＮＡエピソームセグメントとして、細胞中に安定に維持されてもよい。かかる核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期に関係なく、またはそれと同調して、維持および複製を可能とするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞にどのように送達されるか、また核酸は細胞中のどこにとどまるかは、使用する発現構築物の型に依存する。
【０１３６】
本発明のさらに別の実施形態では、発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなり得る。構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過性にする上述の方法のいずれかにより達成され得る。これは、インビトロでの移入に特に適用可能であるが、同様にインビボ用途に適用してもよい。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）は、リン酸カルシウム沈殿物の形態のポリオーマウイルスＤＮＡを、成体および新生マウスの肝臓ならびに脾臓に注射することに成功し、有効なウイルス置換および急性感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（１９８６）もまた、リン酸カルシウム沈殿させたプラスミドの直接腹腔内注射が、トランフェクトした遺伝子の発現をもたらすことを実証した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡはまた、類似の様式でインビボで移入して、遺伝子産物を発現し得る。
【０１３７】
裸のＤＮＡ発現構築物を細胞に移入するための本発明のさらに別の実施形態では、粒子照射を包含し得る。この方法は、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルを高速に加速させ、細胞膜を貫通させ、死滅することなく細胞へ侵入させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小粒子を加速する装置が幾つか開発された。かかる装置の１つは、電流を発生するための高電圧放電によるものであり、続いて電流は原動力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。使用するマイクロプロジェクタイルは、タングステンまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質から構成されていた。
【０１３８】
ラットおよびマウスの肝臓、皮膚および筋組織を含む選択器官をインビボで照射した（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１）。これは、銃と標的器官との間のいかなる介在組織も除去するために、組織または細胞の外科的露出、すなわちエキソビボ処理が必要であり得る。また、特的の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法により送達されてもよく、依然として本発明に組み込まれ得る。
【０１３９】
本発明のさらなる実施形態では、発現構築物は、リポソーム中に封入されてもよい。リポソームは、リン脂二分子膜および内部水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒質で分離された複数脂質層を有する。リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると、それらは自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に、自己再構成を受けて、脂質二分子膜間に水および溶解した溶質を封入する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。リポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体もまた意図される。
【０１４０】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのリポソーム媒介性核酸送達および外来ＤＮＡ発現は非常にうまくいった。Ｗｏｎｇ等（１９８０）は、培養したヒヨコ胚、ＨｅＬａ細胞および肝癌細胞でのリポソーム媒介性送達および外来ＤＮＡの発現の可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕ等（１９８７）は、静脈内注射後に、ラットにおいて首尾よいリポソーム媒介性遺伝子移入を達成した。
【０１４１】
本発明のある実施形態では、リポソームは、センダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体形成してもよい。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームに被包されたＤＮＡの細胞侵入を促進することがわかった（Ｋａｎｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）。別の実施形態では、リポソームは、核内非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と併せて、複合体形成または使用してもよい（Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１）。さらに別の実施形態では、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と併せて、複合体形成または使用してもよい。かかる発現構築物は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏで核酸の移入および発現で首尾よく使用された場合、それらは本発明に適用可能である。細菌プロモーターがＤＮＡ構築物で使用される場合、リポソーム内に適切な細菌ポリメラーゼを含むことも望ましいであろう。
【０１４２】
特定遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するのに使用することができる他の発現構築物は、レセプター媒介性送達媒体である。これらは、ほとんどすべての真核細胞中のレセプター媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的摂取を利用する。様々なレセプターの細胞型特異的分布により、送達は非常に特異的であり得る（Ｗｕ　ａｎｄ　Ｗｕ，１９９３）。
【０１４３】
レセプター媒介性遺伝子ターゲティング媒体は、一般に、２つの成分：細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤から構成される。レセプター媒介性遺伝子移入のためにいくつかのリガンドが使用されてきた。もっとも広く特性化されたリガンドは、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ）（ＡＳＯＲ）（Ｗｕ　ａｎｄ　Ｗｕ，１９８７）、およびトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０）である。近年、ＡＳＯＲと同じレセプターを認識する合成ネオ糖タンパク質が、遺伝子送達媒体として使用されている（Ｆｅｒｋｏｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）、および上皮増殖因子（ＥＧＦ）もまた、扁平上皮癌細胞に遺伝子を送達するのに使用されている（Ｍｙｅｒｓ，欧州特許第０２７３０８５号）。
【０１４４】
他の実施形態では、送達媒体は、リガンドおよびリポソームを含んでもよい。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕ等（１９８７）は、ラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドを使用して、リポソームへ組み込み、肝細胞によるインスリン遺伝子の摂取の増加を観察した。したがって、特定遺伝子をコードする核酸はまた、リポソーム有りまたは無しで、任意数のレセプター−リガンド系により細胞型へ特異的に送達され得ることが可能である。例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を、ＥＧＦレセプターのアップレギュレーションを示す細胞への核酸の媒介性送達用のレセプターとして使用してもよい。マンノースは、肝細胞上のマンノースレセプターを標的とするのに使用することができる。また、ＣＤ５（ＣＬＬ）、ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（Ｔ細胞白血病）、およびＭＡＡ（黒色腫）に対する抗体も同様に、標的部分として使用することができる。
【０１４５】
ある実施形態では、遺伝子移入は、ｅｘ　ｖｉｖｏ条件下でより容易に実施され得る。ｅｘ　ｖｉｖｏ遺伝子治療は、動物から細胞を単離すること、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞に核酸を送達すること、続いて改変した細胞を動物に戻すことを指す。これは、動物からの組織／器官の外科的摘出または細胞および組織の初代培養を包含し得る。
【０１４６】
（ＩＩＩ．ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３と反応性のある抗体の生成）
別の態様では、本発明は、本発明のＭＣＩＰ分子と免疫反応性のある抗体、またはその任意の部分を意図する。抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。好ましい実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体の調製および特性化の手段は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，１９８８を参照）。
【０１４７】
簡単に述べると、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを含む免疫原で動物を免疫化し、免疫化した動物から抗血清を収集することで調製される。抗血清生産用に、広範囲の動物種を使用することができる。典型的に、抗−抗血清の生産に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ブタまたはウマを含む非ヒト動物である。ウサギは血液容量が比較的多いため、ウサギは、ポリクローナル抗体の生産にとって好ましい選択である。
【０１４８】
抗原のアイソフォームに特異的な抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、当業者に一般に公知であるように、従来型免疫化技法を用いて調製してもよい。本発明の化合物の抗原エピトープを含有する組成物は、ウサギまたはマウスのような１つまたは複数の実験動物を免疫化するのに使用することができ、続いて本発明の化合物に対する特定抗体を産生するであろう。ポリクローナル抗血清は、抗体生成用の許容期間後に、単にその動物を出血させて、全血から血清試料を調製することで得られ得る。
【０１４９】
本発明のモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法のような標準的免疫化学的手順で、また組織染色のような免疫組織化学的手順で、ならびにＭＣＩＰ関連抗原エピトープに特異的な抗体を利用し得る他の手順で、有用な用途が見出されることが提唱される。さらに、異なる種の特定ＭＣＩＰに特異的なモノクローナル抗体は、他の有用な用途で利用し得ることが提唱される。
【０１５０】
一般に、ＭＣＩＰに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方は、様々な実施形態で使用され得る。例えば、それらは他のＭＣＩＰをコードするｃＤＮＡまたは遺伝子を得るために、抗体クローニングプロトコルで使用してもよい。それらはまた、細胞または動物中のＭＣＩＰ関連ペプチドの影響を分析するために、阻害研究に使用してもよい。ＭＣＩＰ抗体はまた、様々な細胞事象中のＭＣＩＰの分布を分析するために、例えば細胞周期中の異なる時点下でのＭＣＩＰポリヌクレオチドの細胞または組織特異的分布を決定するために、免疫局在性研究で有用であろう。かかる抗体の特に有用な用途は、例えば抗体アフィニティカラムを使用したネイティブまたは組換えＭＣＩＰの精製においてである。かかる免疫学的技法すべての操作は、本発明の開示を鑑みて、当業者に公知であろう。
【０１５１】
抗体の調製および特性化の手段は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，１９８８を参照、これは参照により本明細書に援用されている）。モノクローナル抗体調製のより具体的な例を以下の実施例に記載する。
【０１５２】
当該技術分野で周知のように、所定の組成物は、その免疫原性が様々であり得る。したがって、ペプチドまたはポリペプチド免疫原をキャリアに結合することで達成され得るように、多くの場合、宿主免疫系をブーストする必要がある。例示的であり、好ましいキャリアは、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもキャリアとして使用することができる。キャリアタンパク質へポリペプチドを結合する手段は当該技術分野で周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビスビアゾ化ベンジジンが挙げられる。
【０１５３】
また当該技術分野で周知であるように、特定免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的賦活剤を用いて増強することができる。例示的であり、好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（死ヒト結核菌を含有する免疫応答の非特異的賦活剤）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【０１５４】
ポリクローナル抗体産生で使用する免疫原組成物量は、免疫原の性質および免疫化に使用する動物により多様である。免疫原を投与するのに、様々経路を使用することができる（皮下、筋内、皮内、静脈内および腹腔内）。ポリクローナル抗体産生は、免疫化後の様々な時点で、免疫化した動物の血液をサンプリングすることでモニターすることができる。また第２のブースター注射をしてもよい。ブースタープロセスおよび力価決定プロセスは、適切な力価が達成されるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られると、免疫化した動物を出血させて、血清を単離および貯蔵することができ、および／またはその動物を用いてｍＡｂを産生することができる。
【０１５５】
ＭＡｂは、米国特許第４，１９６，２６５号（参照により本明細書に援用される）に例示されるもののような周知の技法を使用して容易に調製され得る。典型的に、この技法は、選択した免疫原組成物、例えば精製または部分的精製ＭＣＩＰタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、あるいは高レベルのＭＣＩＰを発現する細胞で、適切な動物を免疫化することを包含する。免疫化用組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに効果的な様式で投与される。マウスおよびラットのようなげっ歯類が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、カエル細胞の使用もまた可能である。ラットの使用は、ある利点を提供し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６）が、マウスが好ましく、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、もっとも日常的に使用され、一般的に、高い割合の安定な融合を提供することから最も好ましい。
【０１５６】
（ＩＶ．ＭＣＩＰの欠損の診断および処置）
本発明者等は、ＭＣＩＰはカルシニューリン調節の重要な役割を果たし、続いて心肥大の重要な調節因子であることを明らかにした。さらに、ＭＣＩＰ活性の減少は、続いてカルシニューリンを調節解除し、心疾患で重要な役割を果たし得る。したがって、別の実施形態では、ＭＣＩＰ発現および機能の欠損の診断方法を提供する。より具体的には、ＭＣＩＰに関連する点変異、欠失、挿入または調節混乱を、以下に記載するように、標準的技術を用いて評価し得る。
【０１５７】
（Ａ．遺伝子診断）
本発明の一実施形態は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３の発現の変化を検出する方法を含む。これは、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３のレベルを決定すること、あるいは発現産物の特定の改変を決定することを含む。
【０１５８】
適切な生物学的試料は、任意の組織または液体であり得る。様々な実施形態には、皮膚、筋肉、顔面、脳、前立腺、胸部、子宮内膜、肺、頭部および頸部、膵臓、小腸、血球、肝臓、精巣、卵巣、結腸、皮膚、胃、食道、脾臓、リンパ節、骨髄、または腎臓の細胞が包含される。他の実施形態には、末梢血、リンパ液、腹水、漿液、胸水、痰、脳脊髄液、涙液、便または尿のような液体試料が包含される。
【０１５９】
使用する核酸は、標準的な方法論（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）に従って、生物学的試料中に含入される細胞から単離される。核酸は、ゲノムＤＮＡであってもよく、あるいは分画または全細胞ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡを使用する場合、ＲＮＡを相補的ＤＮＡに変換することが望ましい場合がある。一実施形態では、ＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり、別の実施形態では、それはポリＡ　ＲＮＡである。通常は、核酸は増幅される。
【０１６０】
形式に応じて、増幅を用いて直接試料中で、あるいは増幅後に第２の既知の核酸を用いて、目的の特定核酸を同定する。次に、同定した産物を検出する。ある用途では、目視による手段（例えば、ゲルの臭化エチジウム染色）で検出が達成されてもよい。あるいは、検出は、化学発光、放射標識の放射性シンチグラフィー、または蛍光標識により、あるいはさらには電気または熱衝撃シグナルを用いたシステム（Ａｆｆｙｍａｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｌｌｕｓ，１９９４）による産物の間接同定を包含し得る。
【０１６１】
様々な型の欠損を、本方法により同定し得る。したがって、「改変」は、欠失、挿入、点変異および重複を含むと解釈すべきである。点変異は、終止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換をもたらす。体細胞変異は、非生殖系列組織に見られるものである。生殖系列組織は、任意の組織に出現することができ、遺伝される。コード領域中および外側の変異もまた、遺伝子の転写を改変することで、あるいは転写体（ｍＲＮＡ）もしくはタンパク質のいずれかのプロセシングを不安定化するか、そうでなければ改変することで、産生されるＭＣＩＰ量に影響を及ぼし得る。
【０１６２】
ＭＣＩＰ遺伝子中の他の変異を本発明に従って同定し得ることが意図される。様々な異なるアッセイがこの観点で意図され、蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡシーケンシング、ＰＦＧＥ分析、サザンまたはノーザンブロッティング、一本鎖コンホメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析、変性グラジエントゲル電気泳動、ＲＦＬＰおよびＰＣＲＴＭ−ＳＳＣＰが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
（ｉ）プライマーおよびプローブ
本明細書で定義する場合、プライマーという用語は、鋳型依存性プロセスでの新生核酸の合成を準備することが可能な任意の核酸を包含することを意味する。典型的に、プライマーは、１０〜２０塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を使用することができる。プライマーは、二本鎖または一本鎖の形態で提供され得るが、一本鎖の形態が好ましい。プローブは、異なって定義されるものであるが、それらをプライマーとして使用してもよい。おそらく準備することが可能なプローブは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計され、増幅プロセスで使用する必要はない。
【０１６４】
好ましい実施形態では、プローブまたはプライマーを、放射性種（３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、または他の標識）、フルオロフォア（ローダミン、フルオレセイン）、または化学発光物質（ルシフェラーゼ）で標識する。
【０１６５】
（ｉｉ）鋳型依存性増幅方法
多数の鋳型依存性プロセスが、所定の鋳型試料中の存在するマーカー配列を増幅するのに利用可能である。最良の公知の増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭと称される）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号、ならびにＩｎｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０（その各々がその全体を参照により本明細書に援用される）に詳述されている。
【０１６６】
簡潔に述べると、ＰＣＲＴＭでは、マーカー配列の逆の相補鎖上の領域に相補的な２つのプライマー配列を調製する。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合物に添加する。マーカー配列が試料中に存在する場合、プライマーは、マーカーに結合し、ポリメラーゼにより、ヌクレオチドを付加することでマーカー配列に沿ってプライマーは伸長する。反応混合物の温度の上昇および低下により、伸長プライマーは、マーカーから解離して、反応産物を形成し、過剰のプライマーはマーカーおよび反応生成物に結合し、プロセスが繰り返される。
【０１６７】
逆転写酵素ＰＣＲＴＭ増幅手順は、増幅したｍＲＮＡ量を定量化するために実施され得る。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する方法は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９に記載されている。逆転写の代替的方法は、熱安定性のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は、１９９０年１２月２１日に出願された国際公開第９０／０７６４１号に記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該技術分野で周知である。
【０１６８】
別の増幅方法は、欧州特許第３２０　３０８号（その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されるリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲでは、２つの相補的プローブ対を調製し、標的配列の存在下で、各対を、それらが隣接するように、標的の逆の相補鎖に結合する。リガーゼの存在下では、２つのプローブ対が連結して、単一ユニットを形成する。ＰＣＲＴＭと同様に、温度循環により、結合した連結ユニットが標的から解離し、続いて過剰のプローブ対の連結用の「標的配列」として作用する。米国特許第４，８８３，７５０号には、標的配列にプローブ対を結合するためのＬＣＲに類似した方法が記載されている。
【０１６９】
生じた「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で、２つ（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドを連結して、ジ−オリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法もまた、本発明の増幅工程で使用してもよい（Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９（その全体が参照により本明細書に援用される））。
【０１７０】
（ｉｉｉ）サザン／ノーザンブロッティング
ブロッティング技法は、当業者には周知である。サザンブロッティングは、標的としてＤＮＡの使用を包含するが、ノーザンブロッティングは、標的としてＲＮＡの使用を包含する。それぞれが、異なるタイプの情報を提供するが、多くの態様では、ｃＤＮＡブロッティングは、ブロッティングまたはＲＮＡ種に類似している。
【０１７１】
簡潔に述べると、プローブを使用して、適切なマトリクス、多くの場合ニトロセルロースフィルター上の固定化したＤＮＡまたはＲＮＡ種を標的とする。分析を容易にするために、種々の種を空間的に分離させるべきである。これは多くの場合、核酸種のゲル電気泳動後に、フィルター上に「ブロッティング」することで達成される。
【０１７２】
次に、ブロットした標的を、変性およびリハイブリダイゼーションを促進する条件下でプローブ（通常標識してある）とともにインキュベートする。プローブは、標的と塩基対を形成するように設計されているので、プローブは、再生条件下で標的配列の一部を結合する。次に未結合のプローブを除去して、上述のように検出を行う。
【０１７３】
（ｉｖ）分離方法
通常、ある段階または別の段階で、特定の増幅が起きたかどうかを決定する目的で、鋳型および過剰のプライマーから増幅産物を分離することが望ましい。一実施形態では、標準的方法を用いて、増幅産物を、アガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９を参照されたい。
【０１７４】
あるいは、クロマトグラフィ技法を使用して分離を達成してもよい。本発明で使用してもよい多種のクロマトグラフィ：吸着、分配、イオン交換およびモレキュラーシーブ、ならびにそれらを使用するためのカラム、紙、薄層およびガスクロマトグラフィを含む多くの特殊技法が存在する（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，１９８２）。
【０１７５】
（ｖ）検出方法
マーカー配列の増幅を確認するために、産物を可視化してもよい。１つの典型的な可視化方法には、臭化エチジウムによるゲルの染色およびＵＶ光下での可視化が包含される。あるいは、増幅産物が放射標識ヌクレオチドまたは蛍光定量的標識ヌクレオチドで完全に標識される場合、分離後に、増幅産物をＸ線フィルムに感光させるか、あるいは適切な刺激スペクトル下で可視化することができる。
【０１７６】
一実施形態では、可視化は間接的に達成される。増幅産物の分離後に、標識核酸プローブを増幅マーカー配列と接触させる。プローブは好ましくは、発色団に結合しているが、放射標識されてもよい。別の実施形態では、プローブは、抗体またはビオチンのような結合パートナーに結合しており、結合対の他の成員は、検出可能部分を保有する。
【０１７７】
一実施形態では、検出は、標識プローブによるものである。関連技法は、当業者に周知であり、分子プロトコルに関する多くの標準的な書物も見出すことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９を参照されたい。例えば、発色団もしくは放射標識プローブまたはプライマーは、増幅中または増幅後に標的を同定する。
【０１７８】
先述の一例は、核酸の自動電気泳動および移入のための装置ならびに方法を開示している米国特許第５，２７９，７２１号（参照により本明細書に援用される）に記載されている。この装置は、ゲルを外部から操作することなく電気泳動およびブロッティングが可能であり、理論上本発明による方法を実施するのに適している。
【０１７９】
さらに、標準的な配列分析技法を用いて、上述の増幅産物を、特定種の変化を同定するために、配列分析にかけてもよい。ある方法内では、遺伝子の包括的な分析は、最適なシーケンシング用に設計されたプライマーセットを用いた配列分析により実行される（Ｐｉｇｎｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）。本発明は、これらのタイプの分析のいずれかまたはすべてを使用し得る方法を提供する。本明細書中に開示する配列を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＭＣＩＰ遺伝子全体にわたる配列増幅を可能とし、続いて直接シーケンシングにより分析し得るように設計され得る。
【０１８０】
（ｖｉ）キット成分
ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、およびＭＣＩＰ３、ならびにそれらの改変体の検出およびシーケンシングに必要な必須物質および試薬全てをキット中に一緒にまとめてもよい。これは一般的に、あらかじめ選択したプライマーおよびプローブを含むであろう。また、増幅に必要な反応混合物を提供するための、様々なポリメラーゼを含む核酸増幅に適した酵素（ＲＴ、Ｔａｑ、ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ等）、デオキシヌクレオチド、および緩衝液が含まれてもよい。かかるキットはまた、一般に、適切な手段で、それぞれ個々の試薬および酵素、ならびに各プライマーまたはプローブ用の別個の容器を含むであろう。
【０１８１】
（Ｂ．免疫学的診断）
本発明の抗体は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングのような技法により、健常組織および罹患組織のＭＣＩＰ含量を特性化する際に使用することができる。これは、心筋症の有無に関して、あるいは心疾患の前兆としてのスクリーニングを提供する。
【０１８２】
ＥＬＩＳＡアッセイでの本発明の抗体の使用が意図される。例えば、抗ＭＣＩＰ抗体を選択表面、好ましくは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す表面上に固定化する。洗浄して、不完全に吸着した物質を除去した後に、アッセイプレートウェルを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは粉乳溶液のような試験抗血清に関して抗原的に自然であることが知られている非特異的タンパク質と結合させるか、またはそれで被覆することが望ましい。これにより、固定化用表面上の非特異的吸着部位をブロックすることが可能となり、従って、表面上へ抗原の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドを減少させる。
【０１８３】
抗体をウェルに結合させ、バックグラウンドを減少させるために非反応性物質で被覆し、洗浄して未結合物質を除去した後、免疫複合体（抗原／抗体）形成を誘導する様式で、固定化用表面を試験すべき試料と接触させる。
【０１８４】
試験試料と結合抗体との間での特定免疫複合体の形成、続く洗浄後に、免疫複合体形成の出現、さらにはその量を、第１の抗体と異なるＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３に対して特異性を有する第２の抗体にそれを供することで決定してもよい。適切な条件は、好ましくは、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）、およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）のような希釈剤で試料を希釈することを包含する。これらの添加剤はまた、非特的バックグラウンドの減少を助ける傾向がある。次に層状抗血清を約２〜約４時間、好ましくは約２５℃〜約２７℃程度の温度でインキュベートさせる。インキュベーション後、免疫複合体形成していない物質を除去するように、抗血清被覆表面を洗浄する。好ましい洗浄手順は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）またはホウ酸緩衝液のような溶液で洗浄することを包含する。
【０１８５】
検出手段を提供するために、第２の抗体は、好ましくは、適切な色素産生基質と一緒にインキュベートすると着色するような関連酵素を有する。従って、例えば免疫複合体形成の発生に好都合な時間および条件下（例えば、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）のようなＰＢＳ含有溶液中で室温にて２時間のインキュベーション）で、ウレアーゼまたはペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧと、第２の抗体が結合した表面を接触させて、インキュベートすることが望ましい。
【０１８６】
第２の酵素タグ化抗体とのインキュベーション、続いて未結合物質を除去するための洗浄の後に、尿素およびブロモクレゾールパープルまたは２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）および、酵素標識としてペルオキシダーゼの場合にＨ２Ｏ２のような色素産生基質とともにインキュベーションすることにより、標識量を定量化する。次に、例えば可視スペクトル分光光度計を用いて、発色度を測定することで、定量化が達成される。
【０１８７】
先述の形式は、まずアッセイプレートに試料を結合することで変更され得る。次に、一次抗体をアッセイプレートとともにインキュベートした後に、一次抗体に対して特異性を有する標識二次抗体を用いて結合一次抗体を検出する。
【０１８８】
本発明の抗体組成物は、免疫ブロットまたはウェスタンブロット分析で多数の用途が見出される。抗体は、ニトロセルロース、ナイロンまたはそれらの組合せのような固体支持マトリクス上に固定化されたタンパク質の同定用の高親和性一次試薬として使用してもよい。免疫沈降、続くゲル電気泳動と併用して、抗原検出に使用する二次試薬が逆のバックグラウンドを引き起こす抗原を検出するのに使用する一工程試薬としてこれらを使用してもよい。ウェスタンブロッティングと併用して使用するための免疫学的に基づいた検出方法は、毒素部分がこの観点で特定用途を有するとみなされる、酵素的タグ化二次抗体、放射標識タグ化二次抗体、または蛍光的タグ化二次抗体を包含する。
【０１８９】
（Ｃ．ＭＣＩＰ発現または機能の欠損の治療）
本発明はまた、別の実施形態では、ＭＣＩＰの異常発現および／または機能に関連する疾患状態の治療を包含する。特に、ＭＣＩＰ活性の減少が、カルシニューリンの調節解除により心不全において役割を果たすことが予測される。従って、ＭＣＩＰレベルを増加させるか、あるいはＭＣＩＰの活性を低減または排除する突然変異を相殺することは、心筋症において治療上の介入を提供すると考えられる。
【０１９０】
本発明者等が意図する治療的実施形態の１つは、心不全に関与した事象における分子レベルでの介入である。具体的には、本発明者等は、心臓細胞にＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３を提供することが可能な発現構築物を、心臓細胞に提供することを意図する。そこで使用する発現ベクターおよび遺伝因子の長い議論については、参照によりこの節に援用される。特に好ましい発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルスベクターである。また、リポソーム被包性の発現ベクターも好ましい。
【０１９１】
当業者は、遺伝子送達をインビボ状況に適用する方法について精通している。ウイルスベクターに関しては、一般にウイルスベクターストックを調製する。ウイルスの種類および達成し得る力価に応じて、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２個の感染粒子を患者に送達する。相対摂取効率を比較することによって、リポソームまたは他の非ウイルス処方物に関して類似した様子が推定され得る。薬学的に受容可能な組成物としての処方物については以下に記載する。様々な経路が意図されるが、心臓に対する局所供給および全身供給（動脈内または静脈内）が好ましい。
【０１９２】
別の実施形態では、カルシニューリンのホスファターゼ活性の阻止もまた、心疾患の治療に有益であることを示すことが意図される。これは、幾つかの方法の１つで達成され得る。まず、ＭＣＩＰ１のＳｅｒ１０８部位を含有するリン酸化型のペプチドを提供することで、カルシニューリンが内因性ＭＣＩＰ１からホスファターゼを除去する能力を単純に制圧し得る。第２に、同様のアプローチを用いて、除去不可能なリン酸基を有するこの同一ペプチドのアナログを使用して、カルシニューリンに対する「自殺基質」を効率的に作製し得る。このアプローチはまた、擬似体を用いて利用することもできる（上記参照）。第３に、カルシニューリンに結合し、そして／またはそれを切断する分子を含有するキメラの他の部分とともに、「おとり」としてＭＣＩＰのＳｅｒ１０８部位を含有するペプチドキメラを使用することができる。そして第４に、Ｓｅｒ１０８ペプチドをコードする発現構築物を用いることで、先述の方法のいずれかを達成することができる。
【０１９３】
（Ｄ．併用療法）
多くの臨床的状況では、個別療法の組合せを使用することが望ましい。従って、上述の療法に加えて、より「標準的な」薬学的心臓療法を患者に適用することが望ましいこともまた推測される。標準的療法の例としては、いわゆる「ベータブロッカー」、抗高血圧薬、強心薬、抗血栓薬、血管拡張薬、ホルモンアンタゴニスト、エンドセリンアンタゴニスト、カルシウムチャネルブロッカー、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アンジオテンシン２型アンタゴニスト、およびサイトカインブロッカー／阻害剤が挙げられる。また、本明細書中に記載するスクリーニング方法により同定される医薬品との併用も想定される。
【０１９４】
心臓細胞を、両方の薬剤を含む単一組成物または薬理学的処方物と接触させることで、あるいは細胞を２つの別個の組成物または処方物（ここで、一方の組成物は、発現構築物を含み、他方は薬剤を含む）を同時に接触させることで、併用が達成され得る。あるいは、遺伝子治療は、数分から数週間範囲の間隔で他の薬剤治療を続行または追従してもよい。他の薬剤および発現構築物を細胞に別々の適用する実施形態では、薬剤および発現構築物が、細胞に有利な複合効果を発揮することが依然として可能であるように、一般的には有意な時間が各送達時間の間で確実に途切れないようにする。このような場合では、互いに約１２〜２４時間以内で、より好ましくは互いに６〜１２時間以内で、両方の様式と細胞を接触させることが意図され、ほんの約１２時間の遅延時間が最も好ましい。しかしながら、状況によっては、治療期間を有意に延長することが望ましい場合があり得、その場合それぞれの投与間で数日（２日、３日、４日、５日、６日または７日）から数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間または８週間）が経過する。
【０１９５】
ＭＣＩＰ−１もしくはＭＣＩＰ−２遺伝子、または他の薬剤のいずれかの１回を超える投与が望ましいことも考えられる。以下に例示するように、様々な組合せを使用してもよい。ここで、ＭＣＩＰが「Ａ」であり、他の薬剤が、「Ｂ」である：
2004502444.tif 000006
【０１９６】
他の組合せも同様に意図される。
【０１９７】
（Ｅ．患者に投与するための処方物および経路）
臨床用途を意図する場合、意図する用途に適した形態で、薬学的組成物（発現ベクター、ウイルスストックおよび薬剤）を調製する必要がある。一般に、これは、発熱物質、ならびにヒトまたは動物に害を与え得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを必要とする。
【０１９８】
送達ベクターを安定させて、標的細胞による摂取を可能にする適切な塩および緩衝液を使用することが一般に望ましい。組換え細胞を患者に導入する場合にも、緩衝液を使用する。薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒質中に溶解または分散させた本発明の水性組成物は、細胞にとって有効な量のベクターを含む。このような組成物を接種材料とも呼ぶ。「薬学的にまたは薬理学的に受容可能」という語句は、動物またはヒトに投与する場合、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物をいう。本明細書中で使用する場合、「薬学的に受容可能なキャリア」には、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等のいずれかおよびすべてが包含される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野で既知である。任意の従来型媒質または薬剤が本発明のベクターまたは細胞に不適合である場合を除いて、治療用組成物でのその使用が意図される。補足有効成分もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０１９９】
本発明の活性組成物は、古典的な薬学的調製物を包含し得る。本発明によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路で利用可能である限り、任意の一般的経路を介する。これには、経口、鼻、頬、直腸、膣、または局所が挙げられる。あるいは、投与は、同所性注射、皮内注射、皮下注射、筋内注射、腹腔内注射、または静脈内注射によってもよい。このような組成物は通常、上述した薬学的に受容可能な組成物として投与される。
【０２００】
活性化合物はまた、非経口的に、あるいは腹腔内に投与してもよい。遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩としての活性化合物溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合した水中で調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、および油中で調製することができる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐ防腐剤を含有する。
【０２０１】
注射可能な用途に適した薬学的形態としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末が挙げられる。すべての場合において、形態は滅菌でなくてはならず、かつ容易に注入できる程度の液体でなくてはならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなくてはならず、かつ細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなくてはならない。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）を含有する溶媒または分散媒、それらの適切な混合物、および植物油であり得る。例えばレシチンのようなコーティングを用いることにより、分散液の場合には所要粒径の維持により、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持し得る。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により実現することができる。多くの場合に、等張剤、例えば糖および塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能な組成物の持続性吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することで実現することができる。
【０２０２】
滅菌注射可能溶液は、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分とともに、適切な溶媒中に所要量で活性化合物を組み込んだ後、滅菌濾過することで調製される。一般に、分散液は、塩基性分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体に様々な滅菌有効成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌濾過した溶液から、有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥技法である。
【０２０３】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等のいずれかおよびすべてを包含する。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来型媒質または薬剤が有効成分に不適合である場合を除いて、治療用組成物でのその使用が意図される。補足有効成分もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０２０４】
経口投与に関して、本発明のポリペプチドを、賦形剤と共に組み込み、非摂取性うがい薬および歯みがき剤の形態で使用してもよい。うがい薬は、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）のような適切な溶液中に所要量で有効成分を組み込んで調製され得る。あるいは、有効成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含有する消毒洗浄液に組み込んでもよい。有効成分はまた、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む歯みがき剤に分散させてもよい。水、結合剤、研磨剤、風味剤、気泡剤、および湿潤剤を含み得るペースト歯磨みがき剤に、治療上有効な量で有効成分を添加してもよい。
【０２０５】
本発明の組成物は、中性または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、例えば塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸を用いて形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基により形成）が挙げられる。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来し得る。
【０２０６】
処方する際に、投薬処方物に適合した様式で、かつ治療上有効な量で、溶液を投与する。処方物は、注射可能溶液、薬物放出カプセル等のような様々な投薬形態で容易に投与される。水溶液での非経口投与に関して、例えば、必要であれば溶液を適切に緩衝液化して、液体希釈物をまず、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、および腹腔内投与に特に適している。これに関係して、使用することができる滅菌水性媒質は、本発明の開示の観点から、当業者に既知であろう。例えば、１回の投与量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解して、皮下注入液１００ｍｌに添加するか、または提唱される注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，第１５版，１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投与量のいくらかの変更は、治療すべき被験体の状態に応じて必然的に生じる。投与の責任者が、いかなる場合でも、個々の被験体に対して適切な用量を決定する。さらに、ヒトの投与に関して、調製物は、ＦＤＡ　Ｏｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　ｓｔａｎｄａｒｄｓが要求するように、滅菌性、発熱性、一般的な安定性、および純度水準を満たすべきである。
【０２０７】
（Ｖ．トランスジェニックマウスの作製方法）
本発明の特定の実施形態は、ＭＣＩＰ関連構築物を含有するトランスジェニックマウスを提供する。ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２およびＭＣＩＰ３を発現するトランスジェニックマウス、このような動物に由来する組換え細胞株、およびトランスジェニック胚は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２またはＭＣＩＰ３の機能を調節する薬剤に関してスクリーニングして、それを同定する方法において有用であり得、それによりこれらの分子の過剰発現または過少発現に関連した病状を緩和する。構成的に発現したＭＣＩＰの使用により、過剰発現または調節されていない発現に関するモデルが提供される。また、トランスジェニック動物は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２および／またはＭＣＩＰ３に関して「ノックアウト」される。
【０２０８】
（Ａ．トランスジェニックの生産方法）
一般的な局面において、トランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を可能にする様式で、所定の導入遺伝子をゲノムに組み込むことで生産される。トランスジェニックマウスの生産方法は、一般に、ＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号、これは参考として本明細書に援用される）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）、ならびに「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」，第２版（Ｈｏｇａｎ，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＣｏｓｔａｎｔｉｍｉおよびＬｏｎｇ編，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９４、これはその全体が参考として本明細書に援用される）によって記載されている。
【０２０９】
典型的に、ゲノム配列に隣接する遺伝子を、マイクロインジェクションにより受精卵に移入する。マイクロインジェクションを行った卵を宿主雌に移植して、導入遺伝子発現に関して子孫をスクリーニングする。トランスジェニック動物は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳動物、および魚類を含むが、これらに限定されない多数の動物由来の受精卵から生産してもよい。
【０２１０】
マイクロインジェクション用のＤＮＡクローンは、当該技術分野で既知の任意の手段により調製され得る。例えば、マイクロインジェクション用のＤＮＡクローンを、標準的技法を用いて、細菌プラスミド配列を除去するのに適した酵素で切断して、ＤＮＡフラグメントをＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上で電気泳動することができる。臭化エチジウムで染色することでＤＮＡバンドを可視化して、発現配列を含有するバンドを切除する。次に、切除したバンドを０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含有する透析バッグに入れる。透析バッグにＤＮＡを電気溶出させて、１：１のフェノール：クロロホルム溶液で抽出して、２倍量のエタノールで沈殿させる。低塩緩衝液（０．２Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、および１ｍＭ　ＥＤＴＡ）１ｍｌ中にＤＮＡを再溶解させて、Ｅｌｕｔｉｐ−ＤＴＭカラムで精製した。カラムは、まず高塩緩衝液（１Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、および１ｍＭ　ＥＤＴＡ）３ｍｌで準備した後に、低塩緩衝液５ｍｌで洗浄する。ＤＮＡ溶液を３回このカラムに通して、カラムマトリクスにＤＮＡを結合させる。低塩緩衝液３ｍｌで１回洗浄した後、高塩緩衝液０．４ｍｌでＤＮＡを溶出させて、２倍量のエタノールで沈殿させる。ＤＮＡ濃度を、ＵＶスペクトロメーターにて２６０ｎｍでの吸収により測定する。マイクロインジェクション用に、ＤＮＡ濃度を、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ中３μｇ／ｍｌに調節する。
【０２１１】
マイクロインジェクション用のＤＮＡ精製の他の方法は、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｏｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８６）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３００：６１１（１９８２）；Ｔｈｅ　Ｑｉａｇｅｎｏｌｏｇｉｓｔ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第３版（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡにより出版）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載されている。
【０２１２】
例示的なマイクロインジェクション手順では、六週齢の雌マウスを、妊娠雌ウマの血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ）５ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）、続いて４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ）５ＩＵ注射（０．１ｃｃ、ｉｐ）で過剰排卵するように誘導する。ｈＣＧ注射直後に、雌を雄と一緒に入れる。ｈＣＧ注射の２１時間後に、交尾した雌をＣＯ２窒息または頸部脱臼により屠殺して、切除した卵管から胚を回収し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）を有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水中に入れる。周囲の卵丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去する。次に前核胚を洗浄して、注射時まで、５％ＣＯ２、９５％空気の加湿雰囲気を有する３７．５℃のインキュベーター中で０．５％ＢＳＡを含有するアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）に入れておく。２細胞期で胚を移植することができる。
【０２１３】
ランダムに循環している成体雌マウスを精管切除した雄とつがいにする。この目的で、Ｃ５７ＢＬ／６もしくはスイスマウスまたは他の匹敵する系統を使用することができる。レシピエント雌を、ドナー雌と同時に交尾させる。胚移入時に、レシピエント雌を、体重１ｇ当たり２．５％アバーティン０．０１５ｍｌを腹腔内注射して麻酔する。単一正中背面切開により、卵管を露出させる。次に、卵管上で直接体壁を通して切開を行う。次に時計工鉗子で卵巣嚢を引き剥がす。移入すべき胚をＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水）中に入れて、移入ピペットのチップに入れる（約１０〜１２個の胚）。ピペットチップを卵管漏斗に挿入し、胚を移入する。移入後、２針の縫合により切開を閉じる。
【０２１４】
（Ｂ．疾患モデル）
ＭＣＩＰの欠損は、カルシニューリン活性の増加を引き起こすと考えられる。したがって、ＭＣＩＰの発現および／または活性が減少することにより、カルシニューリン活性が有効に増加することが意図される。先の研究により、カルシニューリンの過剰発現は、心肥大を引き起こすことがわかっている。したがって、カルシニューリンレベルが変更されないことが望ましい実施形態では、ＭＣＩＰ発現または活性を阻害または阻止することで、肥大状況をもたらすことも可能である。
【０２１５】
（ＶＩ．スクリーニングアッセイ）
したがって、本発明は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、およびＭＣＩＰ３発現または機能と相互作用し、および／またはそれに影響を及ぼす様々な能力に関して、化合物をスクリーニングすることを意図する。特に好ましい化合物は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、およびＭＣＩＰ３のカルシニューリンへの結合を阻害または促進するのに有用なものである。本発明のスクリーニングアッセイでは、候補物質を、まず基本的な生化学活性（例えば、標的分子に対する結合）に関してスクリーニングし、次に、細胞レベル、組織レベルまたは動物全体レベルで、発現を阻害または調節するその能力について試験してもよい。
【０２１６】
（Ａ．モジュレーターおよびアッセイ方式）
（ｉ）アッセイ方式
本発明は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、およびＭＣＩＰ３発現のモジュレーターに関してスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、本発明は、以下の：
（ｉ）ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、またはＭＣＩＰ３ポリペプチドを供給する工程；
（ｉｉ）上記ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、またはＭＣＩＰ３ポリペプチドを候補物質と接触させる工程；
（ｉｉｉ）上記ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、またはＭＣＩＰ３をカルシニューリンと接触させる工程；および
（ｉｖ）ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、またはＭＣＩＰ３ポリペプチド、あるいはカルシニューリンの結合を確定する工程
を包含する方法に関する。
【０２１７】
別の実施形態では、このアッセイは、カルシニューリンへの、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２および／またはＭＣＩＰ３の結合に対する候補物質の影響を観察するように容易に修飾することができる。別のアッセイは、以下：
（ａ）リン酸化ＭＣＩＰ１およびカルシニューリンを供給する工程；
（ｂ）候補モジュレーターの存在下で、上記ＭＣＩＰ１およびカルシニューリンを混合する工程；
（ｃ）ＭＣＩＰ１リン酸化を評価する工程；および
（ｄ）上記候補モジュレーターの非存在下でのＭＣＩＰ１のリン酸化状態と、工程（ｃ）のＭＣＩＰ１のリン酸化状態を比較する工程
を含み、ＭＣＩＰ１脱リン酸化に関してスクリーニングする。
【０２１８】
上記候補モジュレーターの非存在下でのリン酸化と比較した場合の上記候補モジュレーターの存在下でのＭＣＩＰリン酸化の違いにより、ＭＣＩＰリン酸化のモジュレーターとして上記候補モジュレーターを同定する。
【０２１９】
さらに別の実施形形態では、アッセイは、結合を観察しないが、ＭＣＩＰ発現を観察する。かかる方法は、例えば、以下の：
（ｉ）ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、またはＭＣＩＰ３ポリペプチドを発現する細胞を供給する工程；
（ｉｉ）上記細胞を、候補物質と接触させる工程；および
（ｉｉｉ）ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、またはＭＣＩＰ３ポリペプチドの発現に対する上記候補物質の影響を確定する工程
を包含する。
【０２２０】
ＭＣＩＰを直接スクリーニングする必要さえない。むしろ、マーカー遺伝子をＭＣＩＰプロモーターに連結することができる。アッセイするのがかなり容易であるマーカータンパク質の発現を、ＭＣＩＰ発現の代わりとして使用する。さらに他の実施形態では、ｍＲＮＡ合成に対する候補物質の影響を観察するが、ｍＲＮＡ安定性および転座の変更は考慮しない。
【０２２１】
さらに別の実施形態では、候補物質が供給された筋肉細胞の１つまたは複数の特徴を観察してもよい。この細胞を、様々な様式で操作してもよい。第１に、ＭＣＩＰ、カルシニューリン、またはその両方が過剰または過少発現するように操作することができる。第２に、カルシニューリン、またはカルシニューリンの下流にある幾つかの転写活性因子により調節される、プロモーター制御下にあるマーカー遺伝子を含有するように操作することができる。
【０２２２】
（ｉｉ）阻害剤および活性化剤
本発明による阻害剤は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２および／またはＭＣＩＰ３の機能の発現に対して阻害性効果を発揮するものであり得る。同様に、本発明による活性化剤は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２および／またはＭＣＩＰ３の機能の発現に対して刺激性効果を発揮するものであり得る。
【０２２３】
（ｉｉｉ）候補物質
本明細書中で使用する場合、「候補物質」という用語は、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２および／またはＭＣＩＰ３の発現または機能を調節する可能性があり得る任意の分子を指す。候補物質は、タンパク質もしくはその断片、小分子阻害剤、またはさらには核酸分子であってもよい。それは、最も有用な薬理学的化合物が、ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２および／またはＭＣＩＰ３と自然に相互作用する化合物に構造的に関連するという事実であることを証明し得る。かかる分子を創り出し、その作用を検査することは、「合理的薬剤設計」として知られており、標的分子の構造に関連する予測を行うことを包含する。
【０２２４】
合理的薬剤設計の目標は、生物学的に活性なポリペプチドまたは標的化合物の構造アナログを生成することである。かかるアナログを創出することで、様々に改変を受けやすいか、または様々な他の分子の機能に影響を及ぼし得る、天然分子よりも活性または安定な薬剤を作製することが可能である。一アプローチでは、ＭＣＩＰのような分子に関する三次元構造を作成し、次に、そのＭＣＩＰと相互作用する能力を持つように分子を設計する。あるいは、ＭＣＩＰの部分的機能性断片（結合するが、活性はない）を設計し、それにより競合阻害剤を創出することができる。これは、Ｘ線結晶学、コンピュータモデリングにより、またはこの両方のアプローチの組合せにより達成することができる。
【０２２５】
標的化合物または阻害剤の構造を確認するために、抗体を使用することも可能である。原則的に、このアプローチは、その後の薬剤設計の基礎となり得る薬学的コア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）をもたらす。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を生成することで、タンパク質結晶学を完全に回避することができる。鏡像の鏡像として、抗イディオタイプの結合部位は、元の抗原のアナログであると予測される。次に、抗イディオタイプを用いて、化学的または生物学的に生産されたペプチドバンクからペプチドを同定および単離することができる。次に、選択したペプチドは、薬学的コアとして作用する。抗イディオタイプは、抗原として抗体を使用して、抗体を生産するための本明細書に記載した方法を用いて生成し得る。
【０２２６】
この場合では、ＭＣＩＰのカルシニューリンへの結合を実証する十分な証拠が存在する。この標的分子へのＭＣＩＰの結合を分析することで、カルシニューリンを認識するＭＣＩＰの能力に関する多くの情報を収集することができる。この情報を用いて、ＭＣＩＰの潜在的阻害剤または活性化剤の構造に関する予測を行うことができる。
【０２２７】
他方で、様々な市販の供給源から、有用な化合物の「強引な」同定に対する努力における有用な薬剤に関する基本的な基準を満たすと考えられる小分子ライブラリーを簡単に獲得し得る。コンビナトリアル的に作成したライブラリー（例えば、ペプチドライブラリー）を含むかかるライブラリーのスクリーニングは、活性に関して、多数の関連（および非関連）化合物をスクリーニングする迅速かつ効率的な方法である。コンビナトリアルアプローチはまた、活性であるが、望ましくない化合物をモデルにした第２、第３、および第４の化合物の創出により、潜在的薬剤の迅速な進展に役立つ。
【０２２８】
候補化合物は、天然に存在する化合物の断片または一部を含んでもよく、あるいは他の点では不活性な既知の化合物の活性な組合せとして見出されてもよい。動物、細菌、葉および樹皮を含む植物源、および海洋試料のような天然源から単離される化合物を、潜在的に有用な薬学的作用物質の存在に関して候補物として評価してもよいことが提唱される。スクリーニングされるべき薬学的作用物質は、化学的組成物または人工化合物から得られ得るか、あるいは合成され得ることが理解されよう。したがって、本発明により同定される候補物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子阻害剤、または肥大性応答の既知の阻害剤から開始する合理的薬剤設計により設計され得る任意の他の化合物であってもよいことが理解されよう。
【０２２９】
他の適切な阻害剤としては、アンチセンス分子、リボザイム、および抗体（単鎖抗体を含む）が挙げられ、それらは各々、カルシニューリン経路内に位置する標的に特異的である。かかる化合物は、この文書中の他の箇所で詳述している。
【０２３０】
当然のことながら、本発明の全てのスクリーニング方法は、有用な候補を見出さない場合があるという事実にも関わらずそれ自体有用であることを理解されたい。本発明は、単に候補を見つけ出す方法だけでなく、かかる候補に関してスクリーニングする方法を提供する。
【０２３１】
（Ｂ．インビトロアッセイ）
速くて安くて、実施するのが簡単なアッセイは、結合アッセイである。標的に対する分子の結合は、立体化学的に、アロステリック的に、または電荷−電荷相互作用により、それ自体自然に阻害性であり得る。これは、溶液中、または固相上で実施することができ、より精巧なスクリーニングアッセイへと進む前に、ある種の化合物を迅速に排除するための第１回目のスクリーンとして利用することができる。この種の１つの実施形態では、ＭＣＩＰ１、ＮＣＩＰ２、またはＭＣＩＰ３分子、あるいはそれらの断片に結合する化合物のスクリーニングを提供する。
【０２３２】
標的は、溶液中で遊離していてもよく、支持体に固定してもよく、細胞の表面でまたは表面上で発現してもよい。標的または化合物のいずれかを標識してもよく、それにより結合を決定することが可能となる。別の実施形態では、アッセイは、天然もしくは人工の基質または結合パートナー（ＭＣＩＰのような）に対する標的の結合の阻害を測定してもよい。競合結合アッセイを実施することができ、ここで作用物質（例えばＭＣＩＰ）の１つが標識される。通常、標的が標識種であり、標識が結合部分の機能を妨害する可能性を減少させる。結合または結合の阻害を確定するために、遊離の標識と結合した標識の量を測定し得る。
【０２３３】
化合物のハイスループットスクリーニングに関する技法は、国際公開第８４／０３５６４号に記載されている。多数の小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたは幾つか他の表面のような固体基板上で合成する。ペプチド試験化合物を、例えばＭＣＩＰと反応させて、洗浄する。結合ポリペプチドを各種方法で検出する。
【０２３４】
ＭＣＩＰのような精製標的を、上述の薬剤スクリーニング技法で使用するためのプレート上に直接コーティングすることができる。しかしながら、固相にポリペプチドを固定化するために、ポリペプチドに対する非中和抗体を使用することができる。また、固相に活性領域（ＭＣＩＰのＣ末端）を連結するために、反応性領域（好ましくは、末端領域）を含有する融合タンパク質を使用することができる。
【０２３５】
（Ｃ．インサイト（ｉｎ　ｃｙｔｏ）アッセイ）
ＭＣＩＰ１、ＭＣＩＰ２、またはＭＣＩＰ３を発現する様々な細胞系を、候補物質のスクリーニングに利用することができる。例えば、操作された指標を有するＭＣＩＰを含有する細胞を、候補化合物の様々な機能属性を研究するのに使用することができる。かかるアッセイでは、化合物を、適切に処方して、その生化学的状態を提供し、標的細胞と接触させる。
【０２３６】
アッセイに応じて、培養が必要な場合がある。上述のように、次に、多数の種々の生理学的アッセイ（成長、サイズ、Ｃａ＋＋効果）により、細胞を検査してもよい。あるいは、ＭＣＩＰの機能と関連経路を研究し得る分子解析を実施してもよい、これは、タンパク質発現、酵素機能、基質利用、ｍＲＮＡ発現（全細胞またはポリＡ　ＲＮＡのディファレンシャルディスプレイを含む）等に関するもののようなアッセイを包含する。
【０２３７】
（Ｄ．インビボアッセイ）
本発明は、様々な動物モデルの使用を特に意図する。トランスジェニック動物を、ＭＣＩＰ発現および活性を制御およびモニターすることが可能な構築物を用いて創出してもよい。これらの動物の生成は、この文書中の他の箇所に記載している。
【０２３８】
これらの動物を試験化合物で処理することは、適切な形態で、動物に化合物を投与することを包含する。投与は、臨床的または非臨床的目的で利用することができる任意の経路によってなされ、経口、鼻、頬、さらには局所が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、投与は、気管内滴注、気管支滴注、皮内、皮下、筋内、腹腔内、または静脈内注射によってなされてもよい。全身性静脈内注射、血液またはリンパ供給を介した局所性投与が具体的に意図される。
【０２３９】
（Ｅ．阻害剤の生産）
上述のスクリーニングアッセイのいずれかの延長で、本発明はまた、阻害剤を生産する方法を提供する。この方法は、先述のスクリーニング工程のいずれかの後に、スクリーニングした活性の「モジュレーターとして同定される候補物質を生産する」さらなる工程を含む。
【０２４０】
（ＶＩＩ．実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために包含される。以下の実施例に開示する技法は、本発明の実施において十分に機能を果たすように本発明者等が開示する技法を表し、したがってその実施の好ましい形態を構成するものと解釈することができることは当業者に理解されるはずである。しかしながら、本開示を鑑みて、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、開示した特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それは依然として同等または類似の結果を得ることができるということが当業者には理解されよう。
【０２４１】
（実施例１）
（Ａ．物質および方法）
（プラスミド構築物）
ヒトＭＣＩＰ１のＨＡでタグ化スプライス変異体４（ＧｅｎＢａｎｋ　登録番号第Ｕ８５２６７号）を、以下のプライマー：
５’−ＡＧＡＡＣＣＡＴＧＣＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＣＴＴＴＡＡＣＴＡＣＡＧＴＴＴＴＡＧ−３’、および
５’−ＴＡＧＡＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＣＧＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧ−３’
を用いてＰＣＲにより、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離した。
【０２４２】
マウスＭＣＩＰ１のｃ−ｍｙｃでタグ化スプライス変異体４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＡＡ２００９８４号）を、以下のプライマー：
５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＡＧＧＧＡＣＴＴＴＡＧＣＴＡＣ−３’、および
５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＡＧＧＧＴＧＧ−３’
を用いてＰＣＲにより、マウス心臓ｃＤＮＡライブラリーから単離した。
【０２４３】
マウスＭＣＩＰ１のｃ−ｍｙｃでタグ化スプライス変異体１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＡＡ７３４３６０号）を、以下のプライマー：
５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＡＧ−３’、および
５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＡＧＧＧＴＧＧ−３’
を用いてＰＣＲにより、マウスＥＳＴ　ｃＤＮＡクローン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＩＭＡＧＥ　１２２３３３８８）から単離した。
【０２４４】
ｃ−ｍｙｃでタグ化ＭＣＩＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第ＡＵ０３５９２７号）を、以下のプライマー：
５’−ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＣ−３’、および
５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＡＧＧＧＴＧＧ−３’
を用いてＰＣＲにより、マウスＥＳＴクローンＭＮＣｂ−１０５４（Ｋ．Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎにより提供）から単離した。
【０２４５】
上述の単離ＰＣＲ産物を、哺乳類発現プラスミドｐＴＡＲＧＥＴＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にサブクローニングした。
【０２４６】
ＧＳＴ−ＭＣＩＰ１融合を、細菌発現プラスミドｐＧＥＸ−ＣＳ（Ｔ．Ｄ．Ｐａｒｋｓら，１９９４）から発現した。ルシフェラーゼレポータープラスミドであるＭｂ−ｌｕｃおよびＩＬ−２−ｌｕｃを、それぞれヒトミオグロビン（Ｃｈｉｎら，１９９８）またはＩＬ−２（Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅら，１９９２）をコードする遺伝子由来のプロモーター／エンハンサー領域を挿入することでｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）に構築した。さらに、デスミンプロモーター（Ｎａｙａら，２０００）に由来する高親和性ＭＥＦ２結合配列の３つのコピーから構成される合成エンハンサーを、最小プロモーター（ｈｓｐ６８）に連結して、ｐＧＬ３に挿入して、ｄｅｓ−ＭＥＦ−ｌｕｃレポーターを得た。β−ガラクトシダーゼレポータープラスミドｐＣＭＶ−ｌａｃＺ（Ｊ．Ｇｒａｙｓｏｎら，１９８８）、および構成的に活性型のＮＦＡＴ（ＮＦＡＴ）（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら，１９９８）、カルシニューリン（ＣｎＡ＊）（Ｃｈｉｎら，１９９８，Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９２）、またはカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＶ型（ＣａＭＫＩＶ）（Ｈｏら，１９９６）をコードする発現ベクターについてはすでに記載した。制限マッピングおよび部分的ＤＮＡシーケンシングにより、プラスミド構築物の同定を確認した。
【０２４７】
（組織培養、細胞トランスフェクション、およびリポーター遺伝子アッセイ）
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を、２０％ウシ胎児血清および抗生物質（１ｍｌ当たりペニシリン１００ユニット、およびストレプトマイシン１００μｇ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地中で成長させた。４８〜７２時間集密細胞を分化培地（２％熱非働化ウマ血清を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地）に交換することで、筋管形成を誘導した。一過性のトランスフェクションアッセイ用に、５×１０４細胞／ウェルで１２ウェル組織培養皿中でトランスフェクションする前に、Ｃ２Ｃ１２細胞を１２時間平板培養し、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ　Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、総計プラスミドＤＮＡ０．５μｇでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、筋芽細胞を収集した。トランフェクションの２４時間後に培養物を分化培地に換えて、４８時間後に収集することで、筋管を得た。トランスフェクトした細胞を刺激するために、収集の４．５時間前に１μＭのイノマイシン、および１０ｎｇ／ｍｌの酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）を添加した。全細胞抽出物のルシフェラーゼアッセイを上述のように（Ｙａｎｇら，１９９７）に行った。
【０２４８】
（インビトロタンパク質−タンパク質相互作用アッセイ）
ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＭＣＩＰ１融合タンパク質を上述のように（Ｇｒａｙｓｏｎら，１９９８）調製した。［３５Ｓ］メチオニン標識ＣｎＡ３９８、ＣｎＡ３４２、およびＣｎＡ２６６を、インビトロ転写／翻訳系と連結したＴＮＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて生産した。インビトロ結合アッセイ用に、グルタチオンに結合した等量のＧＳＴ融合タンパク質を、５００μｌの結合緩衝液（２０ｍＭ　トリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、１０％　グリセロール、および１ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン）中に再懸濁させた。［３５Ｓ］メチオニン標識ＣｎＡタンパク質を、再懸濁したＧＳＴ融合タンパク質に添加して、１時間インキュベートした。次に、ビーズをスピンダウンさせ、結合緩衝液中で３回洗浄した。等量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液を添加して、懸濁液を３分間沸騰させた。次に、結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解して、オートラジオグラフィにより可視化した。３５Ｓ−標識ルシフェラーゼタンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ）をネガティブ対照として使用した。結合効率を概算するために、放射標識したタンパク質２５％をインプット対照として負荷した。
【０２４９】
（蛍光顕微鏡検査法）
ＯｌｙｍｐｕｓのＩＭＴ−２倒立蛍光顕微鏡写真機を、ＧＦＰ発現プラスミドでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２細胞の評価および写真のために使用した。ＧＦＰ蛍光（励起ピーク＝４８８ｎｍ、発光ピーク＝５０７ｎｍ）を、ＯｐｔｒｏｎｉｃｓのＶＩ−４７０　ＣＣＤカメラおよび、Ｓｃｉｏｎ　ＣＧ−７フレーム取込み器およびＳｃｉｏｎのイメージソフトウェアを装備したパワーマッキントッシュＧ３を用いて撮影した。
【０２５０】
（細胞分画）
３５ｍｍプレート中のＣ２Ｃ１２細胞を、活性型のカルシニューリン（ＣｎＡ＊）をコードする哺乳動物発現プラスミドおよびＭＣＩＰ１−ＧＦＰでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を２回洗浄し、次いで、氷冷溶解緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０％　グリセロール、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍＭ　ジチオトレイトール、およびプロテアーゼインヒビター混合物（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））５５μｌ中にプレートから掻爬した。４℃にて１，０００ｒｐｍで１分間、微量遠心機中で細胞を回転させた。上清は、細胞質分画を含有していた。核ペレットを、溶解緩衝液６０μｌ中に再懸濁させて、８．３μｌの５Ｍ　ＮａＣｌを添加して、核を溶解させた。この混合物を４℃で１時間回転させ、次いで４℃にて１５分間最高速度で、微量遠心機中で回転させた。上清は、可溶性核分画を含有していた。ペレットを、溶解緩衝液６０μｌに再懸濁させた。等量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液を各分画に添加した。試料を３分間沸騰させて、その後１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードした。タンパク質をナイロン膜に移し、次いでマウスモノクローナルＧＦＰ抗体（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）で、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウス二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）でプローブした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）を検出に使用した。
【０２５１】
（ＲＮＡの単離および分析）
製造業者のプロトコルに従って、ＲＮＡｚｏｌ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、マウス組織またはＣ２Ｃ１２細胞から、総ＲＮＡを調製した。各レーン中総ＲＮＡ２０μｇでノーザンブロット分析を行い、プライマー（５’−ＧＧＣＡＴＣＡＧＧＴＴＡＴＴＣＡＧＡＧＴ−３’および５’−ＧＴＧＧＡＧＴＣＣＧＴＣＧＴＡＧＣＣＡＴ−３’）を用いたＰＣＲによりマウスＥＳＴクローン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＩＭＡＧＥ　１２２３３８８）から単離したマウスＭＣＩＰ１の３’−非翻訳領域、またはマウスＭＣＩＰ２　ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム由来のＤＮＡ断片で、Ｕｌｔｒａｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ）中でプローブした。
【０２５２】
（Ｂ．結果）
（ＭＣＩＰ１の強制発現は、培養骨格筋芽細胞および筋管のカルシニューリン依存性転写活性化をブロックする）
ＭＣＩＰが哺乳動物筋肉細胞におけるカルシニューリンシグナル伝達を変更するかどうかを確決定するために、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２を、最小プロモーター（ＴＡＴＡ−ｌｕｃ）またはヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２−ｌｕｃ）（Ｃｌｉｐｓｔｏｎｅら、１９９２）遺伝子もしくはミオグロビン（Ｍｂ−ｌｕｃ）（Ｃｈｉｎら、１９８８）遺伝子由来の２つの異なるカルシニューリン応答性エンハンサー構築物のいずれかで制御されるルシフェラーゼレポータープラスミドと一緒に、ヒトＭＣＩＰ１および構成的に活性な形態のカルシニューリン（ＣｎＡ＊）を発現するプラスミドＤＮＡ構築物でトランスフェクトした（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９２）。最小ＴＡＴＡプロモーターは、増殖中の筋芽細胞および分化した筋管の両方で、ＣｎＡ＊またはＭＣＩＰ１のいずれかに非応答性であった（図１Ａ）。ＩＬ−２およびＭｂエンハンサー構築物の両方がＣｎＡ＊で活性化され、この効果は、ＭＣＩＰ１の強制発現によって消された。ＭＣＩＰ１単独では、いかなる構築物の活性にも影響を有さなかった。
【０２５３】
興味深いことに、ＩＬ−２エンハンサーのカルシニューリン依存性の活性化は、分化中の筋管よりも増殖中の筋芽細胞でのほうが大きいことに留意されたい。逆に、筋特異的Ｍｂエンハンサーは、分化した細胞のバックグランドにおいてより応答性であり、おそらくＮＦＡＴと、ＭＥＦ２のような筋原性決定因子との間の機能的協調を反映している。ＭＣＩＰは、いずれかの発達段階でいずれかのエンハンサーのカルシニューリン依存性の活性化を逆転させ、阻害メカニズムが、カルシニューリンシグナルを伝達する特定の下流エフェクターに非依存的であることを示唆する。
【０２５４】
カルシニューリン依存性遺伝子転写を阻害するＭＣＩＰの能力は、カルシニューリンシグナル伝達によって影響されない異なるレポーター構築物の分析により、一般化転写抑制とは区別された。Ｃ２Ｃ１２細胞を、多量体化Ｇａｌ４ｐ結合モチーフの制御下にあるルシフェラーゼレポータープラスミド（ＵＡＳｇ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃ）でトランスフェクトした。ＶＰ１６の強力なトランス活性化ドメインに、Ｇａｌ４ｐのＤＮＡ結合ドメインを連結する融合タンパク質（Ｇａｌ４−ＶＰ１６）の強制発現は、レポーター遺伝子転写を著しく増加させた（図１Ｂ）が、この誘導は、ＭＣＩＰ１により影響されなかった。
【０２５５】
（ＭＣＩＰ１は、ＰＭＡ／イオノフォア刺激により活性化された内因性カルシニューリンを阻害する）
図１Ａ〜Ｂの結果は、ＭＣＩＰの過剰発現が、構成的に活性な形態のカルシニューリンを阻害するが、異なる設計が、この阻害性機能がネイティブのタンパク質にまで拡張されるかどうかを決定するために必要であったことを示す。Ｃ２Ｃ１２細胞の内因性カルシニューリンを、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）およびＣａ２＋イオノフォアの組合せを用いて、他の細胞型においてこれまでに記載されているように刺激した（Ｌｏｈら、１９９６）。ＰＭＡ／イオノフォア刺激は、筋芽細胞および筋管の両方でミオグロビンエンハンサー（Ｍｂ−ｌｕｃ）を活性化し（図２Ａ）、この応答は、ＭＣＩＰ発現プラスミドの同時トランスフェクションにより阻害された。ＰＭＡ／イオノフォアにより駆動されるＭｂエンハンサー活性のＭＣＩＰによる不完全な逆転は、この刺激により誘発されるカルシニューリン非依存性シグナル伝達成分を反映し得る。この結論は、シクロスポリンＡが、同じ実験系でＰＭＡ／イオノフォア刺激の効果を部分的に逆転させるという観察により支持される（データは示さず）。
【０２５６】
（ＭＣＩＰ１は、構成的に活性な形態のＮＦＡＴを阻害しない）
カルシニューリンシグナル伝達の下流エフェクターに作用する阻害性メカニズムから、カルシニューリン自体に対する影響を区別するために、カルシニューリンシグナル伝達の非存在下で構成的に活性なＮＦＡＴの改変体形態（Ｒａｏら、１９９７）により駆動される転写活性化を妨害するＭＣＩＰ１の能力を評価した。このＮＦＡＴｃの改変体（本明細書中ではＮＦＡＴと称する）は、短縮されて、アミノ末端調節ドメインを除去されているが、これは、ネイティブのタンパク質のＤＮＡ結合機能および転写活性化機能を保持している。この短縮の結果として、ＮＦＡＴは、核コンパートメントに構成的に区画化され、ここでそれは、カルシニューリン活性を必要とせずにＩＬ−２エンハンサーを活性化する（図２Ｂ）。ＭＣＩＰの強制発現は、カルシニューリン依存性転写に対する影響に対比して（図１Ａ〜Ｂ、および２Ａ〜Ｃ）、ＮＦＡＴによって媒介される転写活性化を阻害しない（図２Ｂ）。この結果は、カルシニューリンシグナル伝達に対するＭＣＩＰの阻害性作用が、カルシニューリン依存性シグナル伝達経路の下流成分の妨害ではなく、カルシニューリンの直接妨害に基づくことを示すと解釈される。
【０２５７】
（ＭＣＩＰは、ＭＥＦ２のカルシニューリン依存性調節を阻害する）
（Ｃｈｉｎら、１９８８）における、そして他者（Ｌｉｕら、１９９７、Ｍａｏら、１９９９、Ｙｏｕｎら、１９９９）によるこれまでの実験により、ＮＦＡＴタンパク質に加えて、ＭＥＦ２転写因子のトランス活性化機能が、カルシニューリン活性により改変されることが示されている。この応答の正確なメカニズムは解明されていないが、この相互作用は、ヒトデスミン遺伝子由来の高親和性ＭＥＦ２結合部位の３つのコピーを、最小プロモーターと連結することで構築されるＭＥＦ２依存性レポータープラスミド（ｄｅｓ−ＭＥＦ２−ｌｕｃ）を用いて、筋細胞バックグラウンド中で実証し得る（Ｎａｙａら、２０００）。ｄｅｓ−ＭＥＦ２−ｌｕｃレポーターの転写は、構成的に活性な形態のカルシニューリン（ＣｎＡ＊）およびカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ＊）によって、骨格筋芽細胞中で相乗的にアップレギュレートされる（図２Ｃ）。ミオグロビンおよびＩＬ−２プロモーター／レポーター構築物のカルシニューリン依存性活性化に対する影響と類似の様式で（図１Ａ〜Ｂを参照）、ＭＣＩＰ１は、ＣｎＡ＊単独で、あるいはＣａＭＫＩＶとＣｎＡ＊との組合せにより、ｄｅｓ−ＭＥＦ２−ｌｕｃレポーターの活性化を阻害した（図２Ｃ）。ｄｅｓ−ＭＥＦ２−ｌｕｃレポーターは、ＮＦＡＴ結合部位を欠如しているので、このレポーターを用いて観察されるＭＣＩＰの阻害効果は、ＭＣＩＰが、ＮＦＡＴ：カルシニューリン相互作用に限定される妨害によるのではなく、複数の基質に対するカルシニューリンの作用を阻害するように作用することを示唆する。
【０２５８】
（ＭＣＩＰタンパク質ファミリーの複数のメンバーが、カルシニューリンを阻害することができる）
ここでＭＣＩＰ１と称するタンパク質をコードするヒトＤＳＣＲ１遺伝子は、７つのエキソンから構成される（Ｆｕｅｎｔｅｓら、　１９９７）。ヒトでは、異なる開始エキソン（１、２、３、または４）からそれぞれ開始し、エキソン５、６および７が続く４つのスプライス改変体が存在する。スプライス変異体１および４は、検出可能な転写物の大部分を占める。エキソン１および４はそれぞれ、この遺伝子がコードするタンパク質の最初の２９アミノ酸をコードし、７０％を超える同一性である。全てのスプライシング変異体から生成されるタンパク質は、エキソン５〜７がコードする領域を共有する。本明細書で報告する実験のほとんどで、エキソン４から始まるＭＣＩＰ１のスプライス変異体（配列番号２０および２１）を使用した。しかしながら、ヒトスプライス変異体１（配列番号１８および１９）、ならびにマウススプライス変異体１および４（配列番号１２、１３、１４、１５）がコードするタンパク質が、筋細胞バックグラウンドにおいてミオグロビンエンハンサーに対するカルシニューリンシグナル伝達を阻害するように同様に機能することを決定した（図３）。同様に、ＺＡＬＩ−４遺伝子がコードする、本明細書中でＭＣＩＰ２と称されるタンパク質は、ＭＣＩＰ１に対して７０％同一であり、この同時トランスフェクションアッセイにおいて、カルシニューリン依存性転写活性化を阻害する（図３）。
【０２５９】
（ＭＣＩＰ１は、ＣｎＡの触媒ドメインと相互作用する）
組換えＭＣＩＰタンパク質、あるいはその短縮形態を、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに連結した融合タンパク質（ＧＳＴ−ＭＣＩＰ１）として細菌細胞溶解物から精製した。無細胞環境中でのＧＳＴ−ＭＣＩＰ１のカルシニューリンへの結合を、インビトロの転写／翻訳反応と組み合わせて、発現され、そして代謝的に［３５Ｓ］メチオニンで標識された構成的に活性なカルシニューリン改変体（ＣｎＡ３９８）、またはその短縮形態を用いて評価した。
【０２６０】
自己阻害性ドメイン（Ｉ）およびカルモジュリン結合部位（Ｍ）の一部を欠如したインビトロで翻訳されたＣｎＡ（３９８）は、ＧＳＴ−ＭＣＰ１と物理的複合体を形成する（図４Ａ〜Ｂ）。ＣｎＡ（３４２）で表されるように、カルモジュリン（Ｍ）およびカルシニューリンＢ（Ｂ）を結合するＣｎＡの領域の欠失は、ＭＣＩＰ１との相互作用を崩壊させなかった。しかしながら、さらに短縮され、ＣＡＮ（ＣｎＡ（２６６））の触媒ドメインのカルボキシル末端側の半分を除去されたタンパク質は、もはやＭＣＩＰ１を結合することは不可能であった。したがって、ＭＣＩＰ１が、カルシニューリンＡの触媒ドメインと相互作用すると結論付ける。したがって、ＭＣＩＰ１の結合は、インビボで観察された機能的阻害に関するメカニズムとして活性部位を閉塞し得る。
【０２６１】
カルシニューリンとの相互作用を媒介するＮＦＡＴに見出されるモチーフに類似したＭＣＩＰタンパク質の２つの領域が存在する（図５Ａ〜Ｂ）。これらの１つ目は、酵母ＲＥＸ１ｐにも相同であるＭＣＩＰの３０アミノ酸の領域内に含まれるＳＰ反復モチーフである（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙら、１９９８）。ＮＦＡＴタンパク質は、これらの反復を３組含み（Ｍａｓｕｄａら、１９９５、Ｈｏら、１９９５、Ｈｏｅｙら、１９９５）、カルシニューリンによるこの領域内のセリン残基の脱リン酸化が、ＮＦＡＴによる核内局在化および転写活性化を生じる（Ｌｏｈら、１９９６、Ｓｈｉｂａｓａｋｉら、１９９６、Ｌｕｏら、１９９６、Ｂｅａｌｓら、１９９７およびＭａｓｕｄａら、１９９７）。ＭＣＩＰ１は、１つだけＳＰ反復モチーフを有し、それまた、３つのＳＰ対に対して２つのＳＰ対（ＮＦＡＴでのＳＰＸＸＳＰＸＸＳＰＸＸＸＸＸ（Ｅ／Ｄ）（Ｅ／Ｄ）に対して、ＭＣＩＰでのＳＰＸＸＳＰＸＸＸＸＸＸＸＥＥ）を含むことでもＮＨＡＴと相違する。ＭＣＩＰ１のアミノ酸残基１８１〜１８６にあるＭＣＩＰの第２の領域であるＰＸＩＸＸＴは、カルシニューリンドッキング部位として機能的に定義されたＮＦＡＴ　ＰＸＩＸＩＴモチーフと類似している（４３、４４）。カルボキシル末端からＰＸＩＸＸＴモチーフを欠失するためのＭＣＩＰ１の短縮（ＧＳＴ−ＭＣＩＰ１−１７７）は、ＣｎＡ＊に対するＭＣＩＰの結合を減少させたが、それを抹消させなかった（図５Ａ〜Ｂ）。ＳＰ反復をインタクトなままにするＭＣＩＰのカルボキシル末端のさらなる欠失（ＧＳＴ−ＭＣＩＰ１−１３６）は、結合をさらに有意には減少させなかった。しかしながら、ＰＸＩＸＸＴモチーフおよびＳＰ反復の両方を欠如した短縮変異体（ＧＳＴ−ＭＣＩＰ１−１０２）は、このアッセイではカルシニューリン結合について、親和性がより低かった。本発明者等は、これらのドメインの両方が、カルシニューリンとＭＣＩＰ１との相互作用に寄与すると結論付ける。
【０２６２】
（ＭＣＩＰ１の細胞下局在は、活性化カルシニューリンにより改変される）
ＧＦＰタグ化ヒトＭＣＩＰ１タンパク質（ＭＣＩＰ−ＧＦＰ）を、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞で発現させ、この細胞バックグラウンドにおけるＭＣＩＰ１の細胞下分布を評価した。トランスフェクションの２０時間後に、ＧＦＰタグ化ＭＣＩＰ１は、核コンパートメントに優位に局在化した（図６Ａ）。４８時間後、非常に少量のＭＣＩＰ−ＧＦＰタンパク質が残留していた。ＣｎＡ＊をコードするプラスミドの同時トランスフェクションは、このパターンを変更し、その結果、２４時間後に、ＭＣＩＰ−ＧＦＰは、細胞質中に優位に観察され、蛍光シグナルは数日間検出可能のままであった。幾つかの細胞の形態は、ＣｎＡ＊の存在下でＭＣＩＰ−ＧＦＰがほぼ完全に核内から排除されたことを示唆した（図６Ｂ）。トランスフェクション後、培地にＰＭＡ／イオノフォアを添加することで内因性カルシニューリンを活性化することによってまた、細胞質中のＭＣＩＰ−ＧＦＰの蓄積が生じる（図６Ｃ）。ネイティブのＧＦＰの細胞下分布は、カルシニューリンの同時発現により影響を受けなかった。
【０２６３】
ＭＣＩＰ−ＧＦＰでトランスフェクトしたＣ２Ｃ１２筋芽細胞を、細胞質（Ｃ）、可溶性核（Ｓ）、および不溶性核マトリックス（Ｍ）成分に分画して、分離した。活性化カルシニューリンの非存在下では、ＭＣＩＰ１−ＧＦＰは、核可溶性（Ｓ）分画および核マトリクス（Ｍ）分画の両方に存在した。しかしながら、活性化形態のカルシニューリン（ＣｎＡ＊）の発現により、核マトリックスとのＭＣＩＰ１のこの会合が変更され、その結果、可溶性ＭＣＩＰ１は、可溶性核分画および細胞質分画の両方で検出可能になった（図６Ｆ）。トランスフェクトした細胞中のタンパク質の過剰発現は、多数の人為現象を導き得る。それにも関わらず、ＭＣＩＰ１の核内区画化およびクロマチン結合に対するカルシニューリン発現の影響は、ＭＣＩＰ１とカルシニューリンとの間の物理的相互作用が、観察された機能的相互作用と関連するという結論を支持する。
【０２６４】
（ＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２は、横紋筋細胞において最も豊富に発現され、それらの発現は、筋分化の間にアップレギュレートされる）
マウスＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２のｃＤＮＡの３’非翻訳領域に相補的な遺伝子特異的プローブを用いて、成体マウスの培養筋原細胞および組織中でのこれらの遺伝子の発現を検査した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は、低レベルのＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡ転写物を発現するが、これらの細胞の横紋筋管への分化時には、発現は数倍増加する（図６Ａ〜Ｂ）。成体マウスでは、ＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２は、心臓および骨格筋で最も豊富に発現される。ＭＣＩＰ２はまた、脳で高度に発現されるが、他の組織は全て、より低レベルの両方の転写物を発現する（図６Ａ〜Ｂ）。これらの結果は、ヒト組織における、ＤＳＣＲ１遺伝子およびＺＫＩ−４遺伝子に由来する転写物のこれまでの説明と一致する（Ｍｉｙａｚａｋｉら、１９９６、Ｆｕｅｎｔｅｓら、１９９５）。
【０２６５】
マウス組織中のＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２　ｍＲＮＡの分析からはまた、異なる骨格筋群間でこれらの転写物の差次的発現が明らかとなった。マウス（および他の動物）のヒラメ筋は、遅延性の酸化的（Ｉ型）筋原線維に富むが、足の長指伸筋は、迅速性の解糖的亜型（ＩＩｂ型）の筋原線維に富む（Ｓｃｈｉａｆｆｉｎｏら、１９９６）。ＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２の発現は、足の長指伸筋に対してヒラメ筋で著しく増加し（図６Ａ〜Ｂ）、Ｉ型線維におけるこれらの遺伝子の選択的活性化が示唆される。この結果は、カルシニューリン活性が遅延性線維表現型の重要な決定因子であるという証拠（Ｃｈｉｎら、１９９８、Ｄｕｎｎら、１９９９）を考慮すると特に興味深い。
【０２６６】
（カルシニューリン−ＭＣＩＰ二重トランスジェニックは、心肥大を発症しない）
すでに報告されているように、α−ＭＨＣプロモーターの制御下にあるカルシニューリン導入遺伝子を含有するトランスジェニックマウスは、重度の心肥大を発症する。本発明者等は、α−ＭＨＣ−ＭＣＩＰ１トランスジェニックマウスを構築した。これらのマウスは正常であるように見えたが、それらの心臓は、野生型同腹子よりもわずかに小さかった。
【０２６７】
α−ＭＨＣ−カルシニューリントランスジェニックマウスとα−ＭＣＨ−ＭＣＩＰ１トランスジェニックマウスとの間で交雑を実施した。両方の導入遺伝子を保有するマウスは正常であるように見えた。この印象的な結果は、ＭＣＩＰ１の過剰発現が、心肥大および心不全を防止するのに十分であるという本発明者等の仮説を確認する。２ヶ月齢の雄動物に関するデータは以下の通りである：
表４
2004502444.tif 000007
（実施例２）
（Ａ．物質および方法）
（プラスミド構築）
ヒトＭＣＩＰ１（ＤＳＣＲ１）遺伝子由来のイントロン３のセグメントを、鋳型としてのヒトゲノムＤＮＡ、およびヒト２１番染色体データバンク（２９）からの配列情報に基づいたプライマーを用いてＰＣＲにより単離した。このおよそ９００ｂｐのフラグメントを、ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。他のプラスミドは、すでに記載されていた（Ｃｈｉｎら、１９９８；Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌら、２０００）。
【０２６８】
（組織培養、細胞トランスフェクションまたは感染、レポーター遺伝子アッセイ）
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞および筋管を、すでに記載されているように培養した（Ｇｒａｙｓｏｎら、１９９５）。イオノマイシン（２ｍＭ）およびシクロスポリンＡ（５０〜２００ｎＭ）を添加してから４時間後に、細胞を収集した。含まれる場合、シクロヘキサミド（２５ｍＭ）を、イオノマイシンの１５分前に添加した。プラスミドによる一過性のトランスフェクションまたは組換え複製欠損アデノウイルスによる感染、およびルシフェラーゼアッセイを、すでに報告されているように実施した（Ｃｈｉｎら、１９９８；Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌら、２０００；Ｗｕら、１９７３）。
【０２６９】
（動物実験）
α−ミオシン重鎖プロモーターを使用して、構成的に活性な形態のカルシニューリンの発現を心臓で選択的に駆動するトランスジェニックマウス系統が作成され、これはすでに記載されていた（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９８）。野生型雄Ｃ５７Ｂ１／６マウスに、３，５，３’−トリヨードチロミン（Ｔ３）（０．１ｍｇ／ｇ（体重））または等量の０．９％生理食塩水を、１日に１回、１０日間腹腔内に注射した（Ｒｏｂｂｉｎｓ　＆　Ｓｗａｉｎ、１９９２）。動物を含む実験すべてを、ＩＡＣＲＡＣが承認したプロトコルを用いて行った。
【０２７０】
（ＲＮＡ単離およびノーザンブロット分析）
総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＴｒｉｐｕｒｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｃ．）を用いて、マウス組織またはＣ２Ｃ１２細胞から調製した。各レーンにおいて総ＲＮＡ２０ｍｇを用いてノーザンブロット分析を実施し、ＭＣＩＰ１の３’ＵＴＲ（既知のスプライシング改変体すべてに共通）、ＭＣＩＰ１のエキソン１、ＭＣＩＰ１のエキソン４、またはＭＣＩＰ２もしくはＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡのＯＲＦセグメントを表す相補的配列で、Ｕｌｔｒａｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ）においてプローブした。プローブは、ＰＣＲにより生成し、そしてすでに記載されているように標識した（Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌら、２０００）。ノーザンブロットからのシグナルを、ＳｔｏｒｍＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で検出し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（バージョン１．２）を用いて定量化した。
【０２７１】
（カルシニューリントランスジェニックマウスのｃＤＮＡマイクロアレイ分析）
１０週齢の２匹のカルシニューリントランスジェニックマウス（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９８８）、および野生型同腹子からＲＮＡを単離した。大量の腹水を伴う全身水腫に基づいて、トランスジェニックマウスの１匹は、心不全と決定され、他方は、肉眼で見ると正常であるように見えた。両方のトランスジェニックマウスは、野生型コントロールに対して、１００％を超える心臓重量の増加を示した（それぞれ、９６ｍｇに対して、２５０ｍｇおよび２４０ｍｇ）。野生型（２６ｇ）および非不全のカルシニューリントランスジェニックマウス（２７．５ｇ）の総体重は匹敵したが、心不全のカルシニューリントランスジェニックマウスは、水腫状態を反映して、３５．６ｇの、より重い体重を有していた。他に記載されるように（Ｓｃｈｅｎａら、１９９６）、Ｉｎｃｙｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓによってマイクロアレイ分析を行った。簡潔に述べると、ポリＡ＋ＲＮＡをＣｙ３／Ｃｙ５蛍光色素で標識し、８，７３４個のエレメント（各７，８３２個の特有遺伝子：注釈付の３３３６個の遺伝子／注釈なしの４４９６個の遺伝子）を含有するマウスｃＤＮＡマイクロアレイ（マウスＧＥＭ１．１４）とハイブリダイズさせた。バックグラウンドを差し引いた後、蛍光シグナルの比として、差次的発現を算出した。
【０２７２】
（Ｂ．結果）
（カルシニューリンは、ＭＣＩＰ１の発現を誘導するが、ＭＣＩＰ２の発現を誘導しない）
マイクロアレイ分析による遺伝子発現プロファイリングを行い、正常コントロールと比較して、構成的に活性形態のカルシニューリンを発現するように操作したトランスジェニックマウスの心臓において差次的に調節される遺伝子を同定した。カルシニューリントランスジェニック動物（α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊）は、拡張型心筋症３へと進行する重度の心肥大を発症する。この分析により、このモデルにおいて強力にアップレギュレートされる遺伝子としてＭＣＩＰ１が同定された（図７）。肥大性シグナルにより制御されることが既知の他の遺伝子（例えば、心房性ナトリウム利尿因子）もまたこの分析によって同定され、野生型同腹子と比較して、１０週齢の動物の肥大性の非不全の心臓で、ＭＣＩＰ１と匹敵する程度（約３倍）にまで誘導された（図７、上部パネル）。ＭＣＩＰ１転写物およびカルシニューリンＡ転写物の両方は、肥大性の非不全の心臓で注目されたレベルと比較して、明白な心不全に進行した、年齢の一致した動物の心臓ではさらに上昇した（図７、下部パネル）。活性化カルシニューリンによるインタクトな心筋層内のこのＭＣＩＰ１遺伝子発現誘導は、ノーザンブロット分析により確認された。ａＭＨＣ−ＣｎＡ＊心臓におけるＭＣＩＰ１誘導の程度の定量的概算（表５）は、匹敵する年齢の個々の動物間で多様であり（３〜１７倍）、おそらく疾患進行の異なる段階を反映する。ノーザンブロットにより、ＭＣＩＰ１遺伝子が同様には調節されないことも明らかとなった。このモデルにおけるＭＣＩＰ１　ｍＲＡＮのアップレギュレーションと対照的に、ＭＣＩＰ２　ｍＲＮＡにおいては検出可能な変化は存在しなかった（表５、右側パネル）。
【０２７３】
（表５．カルシニューリンおよび甲状腺ホルモンに応答したＭＣ１Ｐ１　ｍＲＮＡおよびＭＣ１Ｐ２　ｍＲＮＡの変化の定量的概算）
【０２７４】
【表４】
2004502444.tif 000008
各ラインは、バックグラウンドの差し引きおよび負荷コントロール（ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ）に対する正規化後に、二重または三重反復試験でのノーザンブロットのＰｈｏｓｐｈｏｒｌｍａｇｅｒ分析により定量化した、単一実験動物（心臓）、２匹の動物からプールした筋肉（ヒラメ筋）、または単一細胞培養皿（Ｃ２Ｃ１２）内での刺激による誘導される変化倍数を示す。カルシニューリン（Ｃａｎ）および甲状腺ホルモン（Ｔ３）の総計の効果を、これらの１４の実験の平均値（±ＳＥ）として表す。ＮＤは、測定しなかったことを示す。
【０２７５】
本発明者等はまた、カルシニューリンの、細胞培養物中で骨格筋管に分化するＣ２Ｃ１２細胞におけるＭＣＩＰ１発現を刺激する能力を評価した。カルシウムイオノフォアイオノマイシンの投与により誘発される細胞内カルシウム濃度の増加は、Ｃ２Ｃ１２細胞中で増加した多量のＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡを迅速に（４時間未満）導いた。ＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡは、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化中に増加する（すでに報告されている（Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）、ここでは示していない）が、イオノマイシンによるＭＣＩＰ１の２倍誘導は、分化段階（筋芽細胞または筋管）、およびＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡに応じて低いかまたは高い初期レベルに関係なく明らかであった。対照的に、ＭＣＩＰ２　ｍＲＮＡの発現は、イオノマイシンによる影響を受けなかった（表５、左側パネル）。他のカルシウムに調節されるシグナル伝達事象とは対照的に、カルシニューリンイオノフォアによるＭＣＩＰ１遺伝子発現の誘導がカルシニューリン活性に起因し得るかどうかを決定するために、本発明者等は、この応答に対するシクロスポリンＡの影響を評価した。用量依存性様式で、シクロスポリンＡは、おそらく基底およびイオノフォアに刺激されるカルシニューリン活性を阻止することにより、Ｃ２Ｃ１２細胞中のＭＣＩＰ１転写物レベルをアップレギュレートするイオノマイシンの能力を阻止し、さらにはいずれの薬物でも処理していない細胞で観察されるレベル以下にＭＣＩＰ１転写物を減少させた。最高用量のシクロスポリンで処理した細胞と比較して、ＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡは、シクロスポリン非存在下で、イオノマイシンにより４倍増加した。さらに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするコントロールウイルスによる感染の影響と比較して、構成的に活性型のカルシニューリンをコードする組換えアデノウイルスベクターによる感染により、ＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡは、培養筋細胞中で２倍増加した。したがって、培養筋細胞中の機能喪失型および機能獲得型アプローチに基づく実験戦略は、ＭＣＩＰ１遺伝子発現はカルシニューリンシグナル伝達により調節されるが、ＭＣＩＰ２の遺伝子発現は調節されないという結論を支持する。
【０２７６】
（カルシニューリンによるＭＣＩＰ１発現の誘導は、新規タンパク質合成を必要としない）
タンパク質合成の阻害剤であるシクロヘキサミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｍｉｄｅ）の存在下では、イオノマイシンによるカルシニューリンの活性化は、Ｃ２Ｃ１２細胞中のＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡをアップレギュレートさせ続け、この誘導が、新規タンパク質の生成に依存しないことを示した。シクロヘキサミドの存在下でのイオノマイシンに刺激されるＭＣＩＰ１アップレギュレーションの規模（およそ１０倍）は、シクロヘキサミドが存在しない場合で観察される規模（およそ２倍）よりも大きかった。本発明者等は、これらのデータを、カルシニューリンがＮＦ−ＡＴタンパク質（およびおそらく他の転写因子）の既存プールの翻訳後修飾によりＭＣＩＰ１遺伝子転写を刺激するという仮説を支持するものと解釈する。新規タンパク質合成が阻止される場合のカルシニューリンによるＭＣＩＰ１誘導のより大きな規模は、内因性ＭＣＩＰ１合成のカルシニューリン依存性誘導の抑止に潜在的に起因すると考えられ、それにより別の状況ではカルシニュアリン活性を抑制するネガティブフィードバックを排除する。
【０２７７】
（甲状腺ホルモンは、ＭＣＩＰ２の発現を誘導するが、ＭＣＩＰ１の発現を誘導しない）
ＭＣＩＰ２をコードする遺伝子は、培養ヒト線維芽細胞において甲状腺ホルモンによりアップレギュレートされる遺伝子を同定するように設計したサブトラクティブなクローニング実験で最初は同定された（Ｍｉｙａｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。ＭＣＩＰ遺伝子がインタクトな動物の心臓において甲状腺ホルモンにより調節されるかどうかを決定するために、１０日間、Ｔ３を腹腔内注射することにより、野生型マウスに甲状腺機能亢進症を誘導した。すでに記載されているように（Ｒｏｂｂｉｎｓ　＆　Ｓｗａｉｎ，１９９２）、Ｔ３で処理した心臓は、一様に肥大した（平均心臓重量＝１３０ｍｇに対して１８０ｍｇ、平均心臓重量／体重比＝４．９ｍｇ／ｇｍに対して７．２ｍｇ／ｇｍ、各群ｎ＝４の動物）。マウス心臓における活性化されたカルシニューリンの影響（図７）と対比して、ＭＣＩＰ１の発現は、甲状腺機能亢進性心臓では変化しなかった。しかしながら、ＭＣＩＰ２転写物レベルは、Ｔ３処理したマウスの心臓およびヒラメ骨格筋の両方で約２倍増加した（表５、右側パネル）。Ｔ３の効果は、ＭＣＩＰ２遺伝子の調節エレメントへの核レセプター結合の直接的な結果、または間接的メカニズムの結果であるかどうかはいまだに決定していない。
【０２７８】
（ＭＣＩＰ１遺伝子のエキソン４の５’に位置する遺伝子内領域は、カルシニューリンに対する転写応答を促進するのに十分である）
ヒトＭＣＩＰ１遺伝子（ＤＳＣＲ１として初めに注釈をつけた）は、発現された転写物の５’末端に選択的に組み込まれた４つの代替的エキソンのそれぞれを有する４つの変異ｍＲＮＡを発現することが報告された（Ｆｕｅｎｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。これら転写物の大部分は、エキソン１またはエキソン４のいずれかによりコードされる配列を含むアイソフォームを表すことが同定された（Ｆｕｅｎｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。これらの改変体は、特有の５’ＵＴＲ領域を有し、最初の２９個のアミノ酸内で異なるタンパク質をコードする。エキソン５〜７によりコードされるＭＣＩＰ１の残りの１６８残基は、ＭＣＩＰ１改変体すべてで同一であった（図８Ａ）。トランスジェニックマウスの心臓での実験では、本発明者等は、ＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡのエキソン４改変体の発現がカルシニューリン活性に特に感受性が高いことを決定した。３’ＵＴＲに相補的なプローブにより検出される増加して多量のＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡ（ＭＣＩＰ１のすべての改変体内に含まれる（図８Ａ））は、特有のエキソン４配列にのみ相補的なプローブで検出される増加を反映した。対照的に、エキソン１配列を含むＭＣＩＰ１転写物は、野生型マウス心臓での検出に限定して存在しただけであり、活性されたカルシニューリン導入遺伝子により誘導されなかった（示していない）。
【０２７９】
選択的に増加したＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡのエキソン４改変体の発現は、カルシニューリン活性化の機能として代替的プロモーターの使用の可能性を示唆し、本発明者等は、転写調節エレメントが、ＭＣＩＰ１遺伝子のエキソン４に近接したこのシグナル残基を変換することに関与するかどうかを決定しようとした。したがって、本発明者等は、この位置からおよそ９００ｂｐのゲノムセグメント（エキソン４の最初のヌクレオチドに対して、−８７４〜＋３０）を単離した。この領域は、コンセンサスＮＦ−ＡＴ結合モチーフ（Ｔ／ＡＧＧＡＡＡＮＡ／Ｔ／Ｃ）３５の顕著に密集したクラスターを含有することがわかった（図８Ａ）。レポータープラスミドを、このＭＣＩＰ１ゲノム領域をルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結するように構築し（図８Ｂ）、この構築物を、Ｃ２Ｃ１２細胞へのトランスフェクション後にカルシニューリンに応答するその能力に関して試験した。内因性ＭＣＩＰ１遺伝子と同様に、この導入遺伝子の発現は、活性化されたカルシニューリンにより増加し（図８Ｃ）、これはコントロールプラスミド（最小ＴＡＴＡ＋ルシフェラーゼ、示していない）に影響しなかった。ＭＣＩＰ１の同時過剰発現によるカルシニューリン活性の阻害は、この応答を抑制する（示していない）。エキソン４の５’側に位置するこのゲノム領域のより短いセグメント（−２３１〜＋３０または−１６３〜＋３０、図８Ｂ）により制御されるルシフェラーゼレポータープラスミドは、−８７４〜＋３０セグメントと等価な基本的な活性を保持するが、ＮＦ−ＡＴ結合部位の数が減少するにつれ、カルシニューリン応答性を漸次損失する（図８Ｃ）。
【０２８０】
（実施例３）
（Ａ．材料および方法）
（プラスミド構築物およびトランスジェニックマウスの生成）
ヒトインフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のＨＡエピトープタグを有するｈＭＣＩＰ１（ｈＭＣＩＰ１−ＨＡ）のエキソン４スプライス改変体をコードする全長ヒトＭＣＩＰ１　ｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に保有されている、α−ミオシン重鎖プロモーター（α−ＭＨＣ）の５．５ｋｂセグメントの３’側かつヒト成長ホルモン遺伝子からの０．６ｋｂのポリアデニル化シグナルの５’側にクローニングした（図１０）。ＮｏｔＩで消化した後に、導入遺伝子を線状化して原核生物配列から分離し、Ｃ５７／ＢＬ６マウスからの受精卵母細胞中にマイクロインジェクションし、これを標準的技法を用いて偽妊娠雌に導入して、トランスジェニックマウス系統を生成した。ＥｃｏＲＩで消化し、ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子でプローブしたテールゲノムＤＮＡのサザンブロット分析により動物の遺伝子型を決定した。α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子を保有する動物を、これもまたα−ＭＨＣプロモーターの制御下で構成的に活性型のカルシニューリンを発現するトランスジェニックマウスと交雑させて（Ｇｕｌｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１）、二重トランスジェニックマウス（α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１×α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊）を生産した。ＭＣＩＰ発現プラスミドを、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあるｐＴＡＲＧＥＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）において構築した。ｐＣＭＶ−ｈＭＣＩＰ１は、ＨＡでタグ化全長ｈＭＣＩＰ１（アミノ酸１〜１９７）をコードする。ｐＣＭＶ−ΔｈＭＣＩＰ１は、ＨＡでタグ化切断型ｈＭＣＩＰ１（アミノ酸８１〜１９７）をコードする。他の発現ベクターおよびレポーター遺伝子は、すでに記載されている（Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。
【０２８１】
（細胞培養研究）
すでに記載されているように（Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を維持して、トランフェクトした。すでに記載されているように（Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌ　ｅｔ　ｌａ．，２０００）、「全細胞抽出物のルシフェラーゼアッセイを実施した。結果はすべて、同時トランスフェクトしたｐＣＭＶ−ＬａｃＺプラスミドの発現に対して正規化することにより、トランスフェクション効率の変化に関して補正した。
【０２８２】
（インタクトな動物研究）
α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊動物に対する遺伝的交雑のほかに、α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１トランスジェニックマウスおよび野生型同腹子を、心肥大を誘発することが公知の２つの別個の刺激にさらした。１２週齢および２８週齢の雄性マウスに、７日間かけて体重２５ｋｇにつき１時間当たり２８ｍｇの速度で０．９％ＮａＣｌ中のイソプロテレノールを放出する皮下ミニ浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔモデル２００１）を外科的に移植した。コントロールポンプは、０．９％ＮａＣｌ溶液を送達した。８日目に心臓を収集した。イソプロテレノールで処理した動物の心臓／体重比（ｈｔｗ／ｂｗ）を、同一遺伝子型を有し、年齢が一致した生理食塩水で処理した動物の平均ｈｔｗ／ｂｗと比較した。運動誘発性肥大のために、２８週齢雄動物を、別個のおりに入れて、そこではランニングホイールに自由に出入りさせた。回転運動の回数を２８日間連続的にモニターした。動物は、１日平均３〜５ｋｍ走行した。運動させた動物の心臓／体重比（ｈｔｗ／ｂｗ）を、同一遺伝子型を有し、年齢が一致した静かにさせたままの動物の平均ｈｔｗ／ｂｗ比と比較した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を用いて、処理群間の統計学的有意差を決定した（ｐ＜０．０５）。動物プロトコルはすべて、適切な施設内審査委員会により審査および承認されたものである。
【０２８３】
（ＲＮＡ単離および分析）
製造業者のプロトコルに従って、ＲＮＡｚｏｌ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、マウス心臓および骨格筋から全ＲＮＡを調製した。各レーンで全ＲＮＡ２０ｍｇを用いてノーザンブロット分析を行い、ヒトＭＣＩＰ１導入遺伝子のコード領域からのＤＮＡフラグメントを用いてＵｌｔｒａｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）においてプローブした。全ＲＮＡ　２ｍｇを用いて調製したＲＮＡドットブロットを、マウスＧＡＰＤＨ、α−ＭＨＣ、β−ミオシン重鎖（ｂ−ＭＨＣ）、α−骨格アクチンまたは心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）に特異的な末端標識オリゴヌクレオチオドでプローブした。結合プローブを、Ｓｔｏｒｍ　ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｌｅ，ＣＡ）で検出して、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（バージョン１．２）を用いて定量化した。
【０２８４】
（ウェスタンブロット分析）
ポリトロンホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてリン酸緩衝生理食塩液＋２０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ　１００および１ｍＭ　ＤＴＴ中で凍結マウス心臓および骨格筋を均質化することで、タンパク質抽出物を作製した。ＳＤＳを含有するタンパク質ローディング緩衝液中で試料を沸騰させて、続いてガラスウールに通して、ＤＮＡを除去した。タンパク質ローティング緩衝液中に直接溶解することで組織培養細胞から抽出物を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した。エピトープでタグ化導入遺伝子由来タンパク質を、一次ラット抗ＨＡモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）およびホースラディッシュペルオキシダーゼでタグ化ヤギ抗ラット二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて検出した。
【０２８５】
（心臓の肉眼による分析および組織学的分析）
心臓を灌流固定し、パラフィン中に包埋し、組織学的評価用に５ｍｍに薄切した。切片をＨ＆Ｅおよびマッソン三色で染色し、標準的な明視野光学を用いて顕微鏡写真を撮った。
【０２８６】
（経胸的エコー検査）
１２ＭＨｚプローブ（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）を、アベルチン（０．１＊０．１５ｃｃ／ｍｇ（体重））で鎮静させたマウスの剃毛した胸壁に当てて、左心室腔の胸骨傍の短軸方向の図が得られるようにうまく操作した。二次元およびＭモード心エコー検査画像をデジタル化して、光ディスク上に記憶させた。掃引速度１５０を用いてデータを収集した。左心室拡張期終期径（ＬＶＥＤＤ）から左心室収縮期終期径（ＬＶＥＳＤ）を減算したものをＬＶＥＤＤで除算して、短縮期（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）（ＦＳ）を算出した。
【０２８７】
（Ｂ．結果）
（α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子産物の発現および機能）
３つの別個の系統のα−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１トランスジェニックマウスを樹立した。これらの系統の３つすべてにおいて、Ｆ１世代の動物の心臓で、導入遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質産物の両方が発現した。しかしながら、導入遺伝子により産生されるタンパク質は、１４ｋＤであり、予想した２４ｋＤの全長ｈＭＣＩＰ１タンパク質よりもかなり小さかった。逆転写酵素を用いて、導入遺伝子産物のｃＤＮＡコピーを生成した。ｃＤＮＡの配列は、α−ＭＨＣ遺伝子の第２の非コードエキソン内の潜在性スプライスドナー部位から、ｈＭＣＩＰ１　ｃＤＮＡ内のアクセプター部位までの導入遺伝子が異常ＲＮＡスプライシングされ（図１０に示した）、それにより真正翻訳開始コドンを除去することを実証した。幸運にも、安定であるが、切断されているタンパク質産物は、アミノ酸８１にある内部のインフレームメチオニンコドンから開始される。この切断型ＭＣＩＰ１タンパク質は、心臓内に測定可能なレベルに蓄積される。
【０２８８】
１４ｋＤの導入遺伝子産物がカルシニューリン活性を阻害するかどうかを試験するために、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株を、カルシニューリン応答性ＩＬ−２プロモータ（ＩＬ−２−Ｌｕｃ）により駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトした。空のコントロールベクター（ｐＣＭＶ−ｎｅｏ）または全長ｈＭＣＩＰ１を発現するプラスミド（ｐＣＭＶ−ｈＭＣＩＰ１）のいずれかによる、構成的に活性なカルシニューリン発現ベクター（ｐＣＭＶ−ＣｎＡ＊）の同時トランスフェクションは、ｈＭＣＩＰ１の、ＩＬ−２−Ｌｕｃレポーター遺伝子のカルシニューリン誘導をほぼ完全に阻害する能力を実証した（図１１）。導入遺伝子からの切断型ｃＤＮＡを発現するプラスミド（ｐＣＭＶ−ΔｈＭＣＩＰ１）は、野生型の全長ＭＣＩＰ１タンパク質と同じくらい有効なカルシニューリンの阻害剤であり（図１１）、α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１マウスの心臓に見られる切断型の１４ｋＤの導入遺伝子産物が、カルシニューリン活性の強力な阻害剤であることを立証する。３つの創始系統中の心臓ΔＭＣＩＰ１タンパク質レベルを比較するウェスタンブロットにより、Ｌ１およびＬ３で匹敵する導入遺伝子のタンパク質レベルが示されたが、Ｌ２系統では、ΔｈＭＣＩＰ１タンパク質レベルは、２〜３倍高かった（データは示していない）。
【０２８９】
強力な心臓特異的発現は、α−ＭＨＣプロモーターの制御下で出生時付近に開始される（Ｇｕｌｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ，１９９１）。α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子は、成体マウスで有害な影響の徴候なく、Ｌ１およびＬ３において正常な１対１のメンデル比で受け継がれた。Ｌ２導入遺伝子の伝達は、わずかに減少し、おそらくこの系統での導入遺伝子の胚発現に起因した部分的胚致死性を示唆した。しかしながら、出生後、Ｌ２マウスは、正常な成長および寿命を証明した。同程度に機能するＬ１およびＬ３創始系統からの動物を用いて、続く実験すべてを行った。
【０２９０】
ＭＣＩＰ１は、心筋症の遺伝的モデルにおいて心肥大を抑制する。すでに報告されているように（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）、本発明者等は、α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊トランスジェニックマウスにおいて重度の心肥大を観察した。しかしながら、α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子の同時発現により、α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊トランスジェニックにより誘導される肥大性成長度が弱まった。α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子を保有する動物は、生育可能であり、増殖性であり、野生型動物と比較して心臓質量が穏やかに（５〜１０％）減少すること以外は、明白な心臓血管異常を示さなかった（表６）。α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊およびα−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子の両方を保有するマウスでは、心肥大の程度は、α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊導入遺伝子単独で観察される応答の約２８％に減少した（表６）。２つの群の別個の観察試料に関してＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を用いると、α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊×α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１二重トランスジェニックマウスは、α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊トランスジェニックマウスよりも有意に少なく心肥大を発症した（ｐ＜０．０１）。４匹の雄性同腹子の対応組の経胸的心エコー検査により評価した場合に、ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子の発現もまた、ＣｎＡ＊導入遺伝子により誘導される拡張型心筋症を防止した（表７）。心臓の排出容量の指標としての短縮率（ＦＳ）は、心収縮性が非常に障害されているα−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊導入遺伝子単独を保有する動物（ＦＳ＝０．３０）と比較して、α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１×α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊二重トランスジェニックでは野生型レベル（ＦＳ＝０．６３）にまで回復した。α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊トランスジェニックマウスは頻繁に急死する（Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）一方で、かかる早死は、α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１×α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊二重トランスジェニックマウスでは明らかではなかった。α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊導入遺伝子の形態学的および機能的結果を減少させることのほかに、ｈＭＣＩＰ１過剰発現は、心肥大のこのモデルおよび他のモデルに特徴的な遺伝子発現の胎児プログラムの再誘導を減少させた。β−ＭＨＣ、α−骨格アクチンおよびＡＮＦ転写物のレベルが、野生型の心臓と比較してα−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊トランスジェニックの心臓で上昇した。α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１×α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊二重トランスジェニックでは、α−骨格アクチンおよびＡＮＦ転写物レベルの両方が、野生型の心臓で見られるレベルに匹敵した。同様に、β−ＭＨＣ発現は、野生型レベルよりも大きいが、α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊マウスの心臓で検出されるレベルに比較して減少した。
【０２９１】
（表６．トランスジェニックマウスの心臓重量／体重比）
【０２９２】
【表５】
2004502444.tif 000009
心臓重量／体重（ｍｇ／ｇ；平均値±ＳＥＭ）としてデータを算出。試験した各遺伝子型を有する動物の数を括弧内に示す。野生型およびα−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１マウスは、１２〜１５週齢であった。α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊およびα−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１×α−ＭＨＣ−ＣｎＡ＊マウスの中央齢は、１２週であった。
【０２９３】
（表７．左心室の心エコー検査評価）
【０２９４】
【表６】
2004502444.tif 000010
２０週齢雄性同胞子からデータを収集
†ＬＶＥＤＤ：左心室拡張期終期径、ＬＶＥＳＤ：左心室収縮期終期径、ＦＳ：短縮率；ＦＳ＝（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／ＬＶＥＤＤ
ＭＣＩＰ１は、インタクトな動物のおいて他の刺激に対する心肥大性応答を制限する。カルシニューリン活性は、病的および順応性心肥大の両方の進行に関与していた（Ｅｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。移植可能な浸透圧ミニポンプを用いて、７日間にわたってβ−アドレナリン作用性レセプターアゴニストであるイソプロテレノールを慢性的に投与することで、すでに記載されているように（Ｆｒｉｄｄｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）、雄性野生型動物において穏やかな程度の心肥大をもたらした（心臓重量対体重比が２２．８±１．９５％増加）。この肥大性応答は、ｈＭＣＩＰ１のトランスジェニック過剰発現（９．４±０．８７％増加）により、根絶はしないものの減少した（図１２）。同様に、野生型雄性マウスにおける２８間の夜間のホイールランニングに起因する生理学的順応性肥大は、α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子を保有する動物では減少した（野生型では２９．２±４．２３％増加、それに対してトランスジェニックマウスでは１２．３±４．１５％増加）（図１２）。２つの群の別個の観察試料に関してＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を用いると、α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１マウスは、イソプロテレノールまたは運動のいずれかに応答した心肥大を有意に少なく発症した（ｐ＜０．０５）。
【０２９５】
本明細書中に開示し、特許請求した組成物および方法のすべては、本発明の開示を鑑みて、過度の実験をせずに作製および実施することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書中に記載の組成物および方法、ならびに方法の工程または一連の工程において、変更が適用され得ることは、当業者に明らかである。さらに具体的には、化学的および生理学的の両方に関連するある種の薬剤を本明細書中に記載する薬剤と置き換え得るが、同一または類似の結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかなこのような類似の置換および改変のすべてが、併記の特許請求の範囲に規定されるように本発明の精神、範囲および概念内であると考えられる。
【０２９６】
（参考文献）
以下の参考文献は、それらが例示的な手順の詳細または本明細書中で示される詳細を補助する他の詳細を提供する範囲で、本明細書中で参考として詳細に援用される。
【０２９７】
【表７】
2004502444.tif 000011
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以下の図面は本発明の明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために包含される。本発明は、本明細書中に示された特定の実施形態の詳細な説明とともに１つまたはそれ以上のこれらの図面を参照することによって、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＭＣＩＰ１が、Ｃ２Ｃ１２筋原細胞におけるカルシニューリン依存性転写応答を阻害することを示す。最小プロモーター（ＴＡＴＡ−ｌｕｃ）あるいはミオグロビン（Ｍｂ−ｌｕｃ）またはインターロイキン−２（ＩＬ−２−ｌｕｃ）遺伝子からのプロモーター／エンハンサーエレメントの制御下のルシフェラーゼレポーター構築物を、無挿入物（ｐＣＩ）あるいはＣｎＡ＊またはＭＣＩＰ１を含有する発現プラスミドとともにＣ２Ｃ１２細胞中に同時トランスフェクトした。データは、コントロール状態（ｐＣＩ）で観察されたルシフェラーゼ活性に関連して表され、３つまたはそれ以上の独立した実験からの二重反復測定の平均値（±Ｓ．Ｅ．）を示す。結果はすべて、同時トランスフェクトしたｐＣＭＶ−ｌａｃＺプラスミドの発現に対する正規化によりトランスフェクション効率における変動に関して補正される。図１Ａ：トランスフェクションの２４時間後に収集した筋芽細胞またはトランスフェクションの７２時間後に収集した筋管。図１Ｂ：Ｇａｌ４ｐ結合部位の３つのコピーの制御下でのルシフェラーゼレポーター（ＵＡＳｇ−ＴＡＴＡ−ｌｕｃ）、およびＧａｌ４−ＶＰ１６融合タンパク質またはＭＣＩＰ１をコードするプラスミドによる同時トランスフェクションの７２時間後に収集した筋管。
【図２】
図２は、ＭＣＩＰ１の阻害作用が、カルシニューリンシグナル伝達の下流エフェクターにというよりむしろ、カルシニューリンそれ自体に及ぶことを示す。図２Ａ：ＭＣＩＰ１は、内在性カルシニューリンの活性化に対する転写応答を阻害する。Ｃ２Ｃ１２細胞を、Ｍｂ−ｌｕｃレポーター＋または−ＭＣＩＰ１でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、収集の４．５時間前に、１μＭイオノマイシンおよび１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで刺激した。データは、図１Ａ〜図１Ｂに記載したように算定した。図２Ｂ：ＭＣＩＰ１は、構成的に活性（カルシニューリン非依存性）型のＮＦＡＴｃに対する転写応答を阻害できない。Ｃ２Ｃ１２細胞を、上記のように、ＩＬ−２−ｌｕｃレポーターおよびＭＣＩＰをコードするプラスミドまたは構成的に活性型のＮＦＡＴｃ（ＮＦＡＴ）で同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を収集した。図２Ｃ：ＭＣＩＰ１は、ＭＥＦ２のトランス活性化機能のカルシニューリン依存性刺激を阻害する。デスミン遺伝子からの高親和性ＭＥＦ２結合部位の３つのコピーを含有するルシフェラーゼレポーター（ｄｅｓ−ＭＥＦ２−ｌｕｃ）で、Ｃ２Ｃ１２細胞をトランスフェクトした。上記のように構成的に活性型のカルシニューリン（ＣｎＡ＊）をコードするプラスミド、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＶ（ＣａＭＫＩＶ）およびＭＣＩＰ１での同時トランスフェクションにより、レポーターを刺激した。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を収集した。結果はすべて、同時トランスフェクトしたｐＣＭＶ−ｌａｃＺプラスミドの発現に対する正規化によりトランスフェクション効率における変動に関して補正される。
【図３】
図３は、ＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２のスプライス改変体が、カルシニューリンシグナル伝達を阻害することを示す。Ｃ２Ｃ１２細胞を、上記のようにＭｂ−ｌｕｃレポータープラスミド、空コントロールベクター（ｐＣｌ）、あるいは構成的に活性なカルシニューリン（ＣｎＡ＊）をコードする発現ベクター、ヒトＭＣＩＰ１（ｈＭＣＩＰ１）、マウスＭＣＩＰ１（ｍＭＣＩＰ１／エキソン１またはｍＭＣＩＰ１／エキソン４）の２つのスプライス改変体またはマウスＭＣＩＰ２（ｍＭＣＩＰ２）とともに同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を収集した。構成的に活性なカルシニューリン（ＣｎＡ＊）の非存在下（中白棒）または存在下（中黒棒）で、ルシフェラーゼ発現を確定した。図１Ａ〜図１Ｂに記載したようにデータを算定した。結果はすべて、同時トランスフェクト化ｐＣＭＶ−ｌａｃＺプラスミドの発現に対する正規化によりトランスフェクション効率における変動に関して補正される。
【図４】
図４は、ＭＣＩＰ１が、カルシニューリンＡの触媒ドメインを結合することを示す。図４Ａ：従来の研究（１）により限定されるような、そして触媒ドメイン、カルシニューリンＢ（Ｂ）およびカルモジュリン（Ｍ）に関する結合部位、ならびにカルボキシル末端自己阻害ドメイン（Ｉ）を含めたカルシニューリンＡの機能性ドメインの模式図である。切断型のカルシニューリンＡは、完全長タンパク質内の位置に対応する特定のアミノ酸（ａａ）残基でのそれらの終結により、ならびにＭＣＩＰ１とのそれらの結合により同定される。図４Ｂ：カルシニューリンＡタンパク質をウサギ網状赤血球溶解物中で翻訳し、［３５Ｓ］メチオニンで標識した。組換えＧＳＴ−ＭＣＩＰ１を細菌から精製し、グルタチオン−アガロースビーズに結合させた。ＧＳＴ−ＭＣＩＰ１との切断型のカルシニューリンＡの結合を、ＧＳＴ単独と、そして結合反応に含入された代謝的標識タンパク質（インプット）の全プールの２５％と比較した。ルシフェラーゼはＧＳＴ−ＭＣＩＰ１と相互作用できず、ネガティブコントロールとして役立った（データは示していない）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【図５】
図５は、ＭＣＩＰ１の保存領域が、カルシニューリンＡとの相互作用を媒介することを示す。図５Ａ：酵母Ｒｅｘ１ｐ（２４）および哺乳動物ＮＦＡＴ（３）タンパク質と共に保存された、そしてＳＰ反復領域およびカルシニューリンドッキングモチーフ（Ｐ）を含めた、アミノ酸配列モチーフを例証するＭＣＩＰ１の模式図。切断型のＭＣＩＰ１は、完全長タンパク質内の位置に対応する特定のアミノ酸（ａａ）残基でのそれらの終結により、ならびにカルシニューリンＡとのそれらの結合により同定される。図５Ｂ：カルシニューリンＡ（アミノ酸１〜３９８）をウサギ網状赤血球溶解物中で翻訳し、［３５Ｓ］メチオニンで標識した。組換え完全長または切断型のＧＳＴ−ＭＣＩＰ１を細菌から精製し、グルタチオン−アガロースビーズに結合させた。ＧＳＴ−ＭＣＩＰ１の各改変体とのカルシニューリンＡの結合を、ＧＳＴ単独と、そして結合反応に含入された代謝的標識タンパク質（インプット）の全プールの２５％と比較した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【図６】
図６は、ＭＣＩＰ１およびＭＣＩＰ２　ｍＲＮＡの筋選択的発現を示す。図６Ａ：２．２ｋＢ対ＭＣＩＰ１転写物、ならびに成体マウスの組織中の３．４および１．４ｋＢ対の２つのＭＣＩＰ２転写物の発現を実証するノーザンブロット。両遺伝子は、他の組織中よりも心臓およびヒラメ骨格筋中で、より高度に発現されるが、ＭＣＩＰ２転写物は例外的に、脳においても多量に発現される。各レーンに、２０μｇの全ＲＮＡを負荷し、臭化エチジウム染色により等価負荷を確証した。図６Ｂ：培養におけるＣ２Ｃ１２筋原細胞の分化中のＭＣＩＰ１の発現増大を示すノーザンブロット。
【図７】
図７は、マイクロアレイ分析（Ｉｎｃｙｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）による遺伝子発現プロファイリングを示す。代償性肥大中に（上パネル）、ならびにこのモデル（３）の特徴を示している明白な心不全への遷移において（下パネル）、強力にアップレギュレートされることが見出された８つの遺伝子を、登録番号およびｍＲＮＡ存在量の倍増変化概算値とともに列挙する。カルシニューリンＡはこのモデルにおける導入遺伝子産物であり、そして心房性ナトリウム利尿因子遺伝子発現のアップレギュレーションは心肥大の明確なマーカーである。ＭＣＩＰ１（矢印）は、ａＭＨＣ−ＣｎＡ＊動物の肥大性の非不全心臓においてもっとも強力に活性化された遺伝子の１つであり、明白な心不全に進行した動物の心臓においてさらにアップレギュレートされる。
【図８】
図８は、ＭＣＩＰ１遺伝子由来の遺伝子内カルシニューリン応答エレメントを示す。図８Ａは、４つの代替的な最初のエキソン（Ｅ１〜Ｅ４）およびＭＣＩＰ１　ｍＲＮＡのすべての形態に共通の３つのエキソン（Ｅ５〜Ｅ７）３４を示すヒトＭＣＩＰ１（ＤＳＣＲ１）遺伝子の組織化の模式図である。エキソン４と側面を接するヌクレオチド配列を、ＮＦ−ＡＴ転写因子に関する１５のコンセンサス結合部位（矩形）の存在を例証するために示す。エキソン４の最初のヌクレオチドは、＋１として示されている。図８Ｂは、ＭＣＩＰ１−ルシフェラーゼレポータープラスミドを示す。ヒトＭＣＩＰ１遺伝子のエキソン４に近位の限定ゲノムセグメントをルシフェラーゼレポーター遺伝子に連結するように、プラスミドを構築した。各セグメント内に含入されるＮＦ−ＡＴコンセンサス結合部位の数を括弧内に示す。図８Ｃは、ＭＣＩＰ１−ルシフェラーゼレポータープラスミドの一過性トランスフェクションアッセイを示す。同時トランスフェクトしたｐＣＭＶ−ｌａｃＺプラスミドの発現に対する正規化により、トランスフェクション効率の変動に関して結果を補正した。＋３０ＭＣＩＰ１−ルシフェラーゼレポーター構築物に対する＊８７４の基礎活性に関して、倍増活性化を確定した。ヒストグラムは、Ｃ２Ｃ１２筋原細胞の３つの個々のトランスフェクションの平均値＋ＳＥＭを示す。
【図９】
カルシニューリン活性の調節に関するネガティブフィードバックループを示す。本書類に示した証拠は、おそらくはＭＣＩＰ１遺伝子のエキソン４に近位するカルシニューリン応答領域と結合するＮＦ−ＡＴの直接的結果として、心臓および骨格筋中のカルシニューリンによる正の転写調節のための標的としてＭＣＩＰ１を同定する。ＭＣＩＰ１はカルシニューリンの酵素活性を阻害し得る（２４）ため、この調節回路は、カルシウム／カルモジュリンによる持続性刺激の条件下でカルシニューリン活性を阻害し、それにより非拘束性カルシニューリン活性化の有害作用から細胞を保護するのに役立つと思われる。
【図１０】
図１０は、α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１導入遺伝子の設計および発現を示す。３つの非コードエキソン（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３）およびα−ＭＨＣ遺伝子の介在非転写セグメントと、その後のカルボキシル末端エピトープタグ（ＨＡ）およびヒト成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化（ｐＡ）シグナルを伴う完全長ヒトＭＣＩＰ１　ｃＤＮＡを有する５．５ｋｂ　α−ＭＨＣプロモーター断片を含めた導入遺伝子の構成成分の模式図である。下の行は、野生型（ＷＴ）タンパク質と比較してアミノ酸８１で開始される切断タンパク質（ＤｈＭＩＣＰ１）の翻訳を生じるインビボで観察されたｍＲＮＡ巣プライシングの予期せぬパターンを示す。
【図１１】
図１１は、Ｃ２Ｃ１２筋原細胞中のカルシニューリン依存性活性化の阻害により評価される完全長ｈＭＣＩＰ１と比較した場合の短縮型（切断）ＤｈＭＣＩＰ１タンパク質産物の機能活性を示す。カルシニューリン応答ＩＬ−２−プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＩＬ−２−Ｌｕｃ）でＣ２Ｃ１２細胞をトランスフェクトした。構成的に活性なカルシニューリン発現プラスミド（ｐＣＭＶ−ＣｎＡ＊）および空のコントロールベクター（ｐＣＭＶ−ｎｅｏ）または示したＭＣＩＰコードプラスミド（ｐＣＭＶ−ｈＭＣＩＰ１またはｐＣＭＶ−△ｈＭＣＩＰ１）により、細胞を同時トランスフェクトした。
【図１２】
図１２は、インタクトな動物におけるｂ−アドレナリン作用性レセプター刺激または運動に応答するｈＭＣＩＰ１の心肥大に及ぼす作用を示す。グラフは、雄野生型（ｎ＝７）および７日間にわたってイソプロテレノールの長期注入を施されたα−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１トランスジェニック（ｎ＝９）マウスのｈｔｗ／ｂｗにおける増大％、あるいは雄野生型（ｎ＝４）および２８日間の自発的ホイールランニング運動後のα−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１トランスジェニック（ｎ＝４）マウスのｈｔｗ／ｂｗにおける増大％を示す。α−ＭＨＣ−ｈＭＣＩＰ１マウスは、イソプロテレノールまたは運動に応答して有意に低い心肥大を発症した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004502444.tif 000222
2004502444.tif 000223
2004502444.tif 000224
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