(57)【要約】組織培養で増殖したＬａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを含有する増殖性回腸炎ワクチン及び該ワクチンを生産する方法。ここで述べる増殖性回腸炎ワクチンは、全Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出物、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの防護的免疫原性サブユニット、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの組換え免疫原及びＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの裸のＤＮＡを含有するものを含む。本発明のワクチンは不活性化されているか又は修飾生ワクチンであり、アジュバント及び／又は安定剤を含みうる。本発明のワクチンは液体又は凍結乾燥形態でありうる。また、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖を中和し、増殖性回腸炎を診断するためならびにワクチン生産の際に抗原を定量するために使用しうるモノクローナル抗体も開示する。
2004529854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、４１ｋＤａ、４３ｋＤａ、４４ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ、１１５ｋＤａ及び＞１１５ｋＤａから成る群より選択される抗原の少なくとも１つと反応する抗体をブタにおいて産生する、組織培養で増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを含有する増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項２】
組織培養で増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓが、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの全培養、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの不活性化組織培養、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの修飾生製剤、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓからの抽出物、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから得られるサブユニット、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから得られる組換え体及びＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原をコードする裸のＤＮＡから成る群より選択される抗原を含む、請求項１に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項３】
不活性化剤及びアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項４】
不活性化剤が、ホルマリン、β−プロピオラクトン、熱、二元性エチレンイミン、界面活性剤及び凍結／融解から成る群より選択される、請求項３に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項５】
アジュバントが、ポリマー、水中油型乳剤、水中油中水型乳剤、脂質、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、免疫調節剤及びそれらの組合せから成る群より選択される、請求項３に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項６】
ポリマーアジュバントが、Ｃａｒｂｏｐｏｌ、ＨＡＶＬＯＧＥＮ（登録商標）及びＰＯＬＹＧＥＮ（登録商標）から成る群より選択される、請求項５に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項７】
水中油型乳剤アジュバントが、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ  ＰＬＵＳ（登録商標）及びＥＭＵＧＥＮ（登録商標）から成る群より選択される、請求項５に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項８】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓが修飾された生菌である、請求項１に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項９】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓがサブユニット免疫原及び組換え型免疫原から成る群より選択される、請求項１に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項１０】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓサブユニット又は組換え型が、２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、４１ｋＤａ、４３−４４ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ及び≧１１５ｋＤａの分子量を持つ抗原群から選択される、請求項９に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【請求項１１】
２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、４１ｋＤａ、４３−４４ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ及び≧１１５ｋＤａから成る群より選択される分子量を持つＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原を認識するモノクローナル抗体。
【請求項１２】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを組織培養に接種すること、組織培養で増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを採集すること、採集したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓをワクチンに製剤することを含む、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを、感受性組織培養においてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる増殖性回腸炎から哺乳類を防護するのに十分な量に増殖させるための方法。
【請求項１３】
ａ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを感受性組織培養において増殖する段階、
ｂ．該組織培養増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを採集する段階、
ｃ．該採集菌を不活性化する段階、および
ｄ．該不活性化採集菌にアジュバンドを加えてワクチンにする段階
を含む、増殖性回腸炎ワクチンを生産する方法。
【請求項１４】
ａ．修飾した生Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを感受性組織培養で増殖させる段階、
ｂ．該組織培養増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを採集する段階、
ｃ．採集した該組織培養増殖Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを安定化する段階、および
ｄ．安定化した採集組織培養増殖Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを製剤してワクチンを生産する段階
を含む、増殖性回腸炎ワクチンを生産する方法。
【請求項１５】
ａ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを感受性組織培養において増殖させる段階、
ｂ．該組織培養増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを採集する段階、
ｃ．採集した組織培養増殖Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから免疫原を抽出してサブユニットを生成する段階、
ｄ．任意にサブユニットを不活性化する段階、および
ｅ．サブユニットにアジュバンドを加えてワクチンを生産する段階
を含む、増殖性回腸炎サブユニットワクチンを生産する方法。
【請求項１６】
ａ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを感受性組織培養において増殖させる段階、
ｂ．組織培養増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを採集する段階、
ｃ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ採集菌を不活性化する段階、
ｄ．採集した不活性化組織培養増殖Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓから防護抗原を抽出してサブユニットを生成する段階、および
ｅ．サブユニットにアジュバンドを加えてワクチンを生産する段階
を含む、増殖性回腸炎ワクチンを生産する方法。
【請求項１７】
ａ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を同定する段階、
ｂ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノムライブラリーを構築して、スクリーニングする段階、
ｃ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を産生する組換えクローンを同定する段階、
ｄ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原の免疫反応性エピトープをコードする遺伝子を同定する段階、
ｅ．生産ベクターを用いて免疫反応性エピトープを発現する段階、および
ｆ．免疫反応性エピトープをワクチンに製剤する段階
を含む、組換え型増殖性回腸炎ワクチンを生産する方法。
【請求項１８】
ａ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を同定する段階、
ｂ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノムライブラリーを構築して、スクリーニングする段階、
ｃ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を産生する組換えクローンを同定する段階、
ｄ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原の免疫反応性エピトープをコードする遺伝子を同定する段階、
ｅ．生生産ベクターを用いて免疫反応性エピトープを発現する段階、および
ｆ．生生産ベクターをワクチンに製剤する段階
を含む、組換え型増殖性回腸炎ワクチンを生産する方法。
【請求項１９】
ａ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を同定する段階、
ｂ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を配列決定する段階、
ｃ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原の配列を生産ベクターに挿入する段階、
ｄ．生産ベクターによってＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を発現する段階、
ｅ．標的免疫原を発現する生産ベクターを増殖させる段階、および
ｆ．標的免疫原をワクチンに製剤する段階
を含む、組換え型増殖性回腸炎ワクチンを生産する方法。
【請求項２０】
ａ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を同定する段階、
ｂ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を配列決定する段階、
ｃ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原の配列を生生産ベクターに挿入する段階、
ｄ．標的免疫原を発現する生生産ベクターを増殖させる段階、および
ｅ． 生生産ベクターをワクチンに製剤する段階
を含む、組換え型増殖性回腸炎ワクチンを生産する方法。
【請求項２１】
ａ．Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの機能的免疫原に対するモノクローナル抗体を調製する段階、
ｂ．モノクローナル抗体によって検出された機能的免疫原を標的免疫原として同定する段階、
ｃ．標的免疫原を配列決定する段階、
ｄ．生産ベクターにおいて標的免疫原を発現する段階、
ｅ．標的免疫原を発現する生産ベクターを増殖させる段階、および
ｆ．標的免疫原をワクチンに製剤する段階
を含む、組換え型ワクチンを調製する方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のワクチンを該哺乳類に投与することを含む、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる疾患から哺乳類を防護する方法。
【請求項２３】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原をＦＡ、ＩＦＡ、ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡから成る群より選択されるアッセイによって検出する、増殖性回腸炎を診断する方法。
【請求項２４】
２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、４１ｋＤａ、４３−４４ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ及び≧１１５ｋＤａから成る群より選択される分子量を持つ抗原を検出することを含む、ワクチン生産の際に抗原量（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｍａｓｓ）を定量する方法。
【請求項２５】
ＥＬＩＳＡ及びＰＣＲから成る群より選択されるアッセイを用いて抗原を定量する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、４１ｋＤａ、４３ｋＤａ、４４ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ、１１５ｋＤａ及び＞１１５ｋＤａから成る群より選択される抗原と反応する抗体をブタにおいて産生する、請求項１に記載の増殖性回腸炎ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、全般に、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる増殖性回腸炎からブタを防護するためのワクチンの調製及び診断に関する。
【０００２】
（先行技術の簡単な説明）
時としてブタ増殖性腸炎と称されるブタ増殖性回腸炎は、米国の養豚産業にとって重要な問題である。増殖性回腸炎は、陰窩過形成と細胞内のキャンピロバクター様生物の存在によって特徴付けられるブタの腸疾患複合体である。かかる疾患の認識はこの１０年間に劇的に上昇し、発生率は２０％に上り、損失は米国だけで年間５０００万ドルと推定される。特に懸念されるのは、種家畜産業における発生率の明らかな上昇である。この疾患は世界中で認められ、通常６週から２０週齢の離乳後のブタを冒す。増殖性回腸炎に罹患したブタの臨床徴候は、間欠的な下痢、食欲不振、著明な濁音と無関心、及びるいそう症候群を含む。死亡もまれではなく、しばしば腸への出血作用に結びつく。疾患の４つの異なる形態が記述されているが、大部分の文献は病変を２つの形態、急性と慢性に分類しており、慢性は時として壊死性と称される。
【０００３】
疾患の急性期には、肉眼的病変は腸間膜及び漿膜下水腫の存在ならびに漿膜の著しい細網化によって特徴付けられる。粘膜と筋層は肥厚し、粘膜は深い縦ひだ又は横ひだを形成する。ひだの隆線はしばしば、多少の出欠を伴って充血する。時として病巣に隣接する生存粘膜の領域で粘膜の潰瘍化が明らかである。顕微鏡レベルでは、急性病変は、粘膜固有層における充血と水腫、上皮細胞の増殖、及び回腸筋系の肥厚を伴う急性非特異的炎症によって特徴付けられる。絨毛及び腸の陰窩構造は不規則になり、上皮細胞形成異常を伴う。陰窩が分枝形成し、炎症細胞で満たされると共に陰窩膿瘍が形成される。絨毛と粘膜固有層は、水腫と炎症細胞が存在するために腫脹する。粘膜下組織は通常リンパ組織結節を含む。回腸、特に輪状層の粘膜が肥厚することがある。
【０００４】
疾患の慢性期には、肉眼的病変は下部小腸の肥厚によって特徴付けられる。一部の場合には、炎症と上皮細胞壊死が線維素性滲出物の形成をもたらす。粘膜はしばしば、充血及び時として潰瘍化を伴う出血を示す。腸は通常、下部小腸全体にわたって肥厚するが、粘膜の肥厚は不連続であり、そのため粘膜は常に腸間膜結合に沿ってより薄くなる。時として、内腔は形成された血餅を含み、結腸は血液と消化物が混合したタール状糞便を含むことがある。罹患した小腸の粘膜表面は、肥厚を除いてほとんど肉眼的損傷を示さないこともある。びらん、出血点及び潰瘍は通常認められない。さらに、局所リンパ節が著明に腫脹する。慢性期における顕微鏡的病変は、経壁炎症反応によって特徴付けられる。粘膜は長い不規則な上皮様突出を伴ってより歪曲する。陰窩は分枝形成して、過形成領域の縁で粘膜内に裂溝を生じる。潰瘍が見られることもある。これらの領域では陰窩膿瘍も顕著である。陰窩上皮には通常、屈曲した杆のような形態の細胞内細菌が存在する。過形成上皮細胞は円柱状である。再生組織は、強い好塩基性細胞質を有する不規則な形態の上皮細胞を含む。杯細胞は、通常再生領域にはまれであるが、過形成領域にはおびただしく存在する。粘膜固有層は典型的には炎症細胞浸潤を示す。潰瘍化した領域には時として肉芽腫が存在する。粘膜下組織は、拡張したリンパ管と液体で満たされた組織空隙を含む。筋層は肥厚し、炎症細胞と繊維素の存在による変性を伴う。
【０００５】
罹患した動物の陰窩上皮における細胞内細菌の存在は、この疾患の細菌性病因を確認する。そのような動物から単離された細菌はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐと形態学的に類似するが、様々なキャンピロバクター菌株を用いたハイブリダイゼーション試験及び再現実験は、この微生物が病原菌ではないことを明らかにした。ＪｏｅｎｓとＧｌｏｃｋ（米国特許第５，６１０，０５９号）は、現在はＬａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓとして知られる、ブタ増殖性腸炎生物の単離と特性指摘、及びかかる生物を使用した疾患の再現を記述し、特許請求している。
【０００６】
有効な増殖性回腸炎の制御手段は限られている。経口及び非経口の広域抗生物質、抗ヒスタミン薬、コルチコステロイド、ニトロイミダゾール、及びビタミンＢ群の使用を含めて、基本的な試行錯誤の治療レジメンは通常極めて費用がかかり、典型的には無効であると判明する。現在まで、この疾患の問題を制御するためのワクチンを調製する試みは報告されていない。
【０００７】
（図面の簡単な説明）
図１は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを含むワクチンでのブタのワクチン接種によって生じる抗体応答を、ワクチン接種していない対照ブタと比較している。
【０００８】
図２は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出物に反応した回復期のブタからの血清のウエスタンブロットである。
【０００９】
図３は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出物に反応した、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓワクチン接種したブタからの血清のウエスタンブロットである。
【００１０】
図４は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出物に反応したモノクローナル抗体のウエスタンブロットである。
【００１１】
図５は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出物に反応したモノクローナル抗体のウエスタンブロットである。
【００１２】
図６は、モノクローナル抗体５Ａ２及びＶｏｒ４を非中和モノクローナル抗体と比較した、用量依存的なＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの中和曲線である。
【００１３】
（発明の要約）
米国特許第５，６１０，０５９の対象であり、これまでＰＰＥ起因菌、回腸炎作用物質、ＩＬ−Ａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５５３７０）と称されてきた、臨床的増殖性回腸炎を示すブタから単離された細胞内生物は、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓと命名された。初期分離菌は増殖性回腸炎の疾患を再現することが示された。この初期報告以後、少なくとも４つの追加分離菌が得られ、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５５３７０と同じ増殖特性を示すことが明らかになり、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５５３７０が新しい属及び種の細菌についての基本型生物であることが確認された。
【００１４】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる、集合的に増殖性回腸炎と称される疾患複合体に対して防護する改善されたワクチンを提供することが本発明の目的である。そのようなワクチンは、不活性化、生、修飾生、サブユニット、組換え型、ベクター送達組換え型又は裸のＤＮＡを含むがこれらに限定されない、いかなるタイプのものでもありうる。
【００１５】
サブユニット又は組換え型ワクチンの調製において有用でありうる、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの免疫原の同定を導く抗原を同定することが本発明のもう１つの目的である。「免疫原」とは、宿主動物に注入したとき宿主動物において防護応答を生じる、あるいはインビボ又はインビトロでＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによる感染を阻止する抗体を生じる抗原又はその部分を意味する。「同定する」とは、特定抗原を探索し、検出して、それらの分子量を特性付け、それらが免疫原として機能する能力を明らかにすることを意味する。ここで述べる免疫原の一部は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖を中和する能力を示すモノクローナル抗体（ＭｏＡＢ）を産生する。本発明のモノクローナル抗体は、１５キロダルトン（ｋＤａ）から２５０ｋＤａの範囲の分子量、より特定すると２１、３１、４１、４３−４４、６０、７１及び≧１１５（１１５−２５０）ｋＤａの分子量を持つ抗原と反応する。理解されるように、これらの抗原の配列決定は、組織試料においてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを検出し、組織内での増殖を監視するためのＰＣＲプローブを開発するのに必要な情報を提供する。
【００１６】
増殖性回腸炎の診断のため又は抗原定量試験の開発のために使用できるモノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）を提供することが本発明の最終的な目的である。これらのＭｏＡｂｓの一部は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓがヘンレ細胞において増殖するとき細胞障害作用（ＣＰＥ）の発現を抑制するという意味で、中和性であることが明らかになった。ＣＰＥとは、組織培養細胞単層がＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって強い有害作用を受け、そのために細胞が死滅して、それらが付着している脈管の表面から脱落することを意味する。有用なＭｏＡｂｓは、それぞれ４３−４４、６０ｋＤａ、４１及び４３−４４ｋＤａ、４１ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ及び≧１１５ｋＤａの分子量を持つ抗原に対応する、クローン２Ａ２、２Ｂ６、５Ａ２、３Ａ１、２Ｃ１、３Ｄ４及び１Ｃ２を含むが、これらに限定されない。これらのうちで、ＭｏＡｂｓ２Ａ２（４３から４４ｋＤａの分子量を持つ抗原を検出する）、５Ａ２（４１、４３−４４ｋＤａの分子量を持つ抗原を検出する）、３Ａ１（４１ｋＤａの分子量を持つ抗原を検出する）、３Ｄ４（７１ｋＤａの分子量を持つ抗原を検出する）及び１Ｃ２（１１５ｋＤａ又はそれ以上の分子量を持つ抗原を検出する）は中和性であり、診断及び抗原定量アッセイにおける使用のため、ならびに組換え型抗原を含む標的ワクチン抗原を同定する上での使用のために最も大きな潜在的可能性を有する。これらの試験は、有効なＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓワクチンは４１ｋＤａ、４３−４４ｋＤａ、７１ｋＤａ及び１１５ｋＤａ又はそれ以上の分子量を持つ抗原の１つ又はそれ以上に対する免疫応答、おそらくは抗体を産生しなければならないことを示唆している。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
上述したように、本発明は、基本型生物、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５５３７０及び同様の免疫原特性を有するすべての菌株及びそれらの突然変異体によって引き起こされる、集合的に増殖性回腸炎と称される疾患複合体に対して防護する改善されたワクチンを対象とする。同様の免疫原特性とは、ＡＴＣＣ  ５５３７０と免疫学的に交叉反応する能力及び／又は増殖性回腸炎からブタを防護する能力と定義される。
【００１８】
改善されたワクチンは、修飾生ワクチン、弱毒化ワクチン、不活性化ワクチン、サブユニットワクチン、及びＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓからの１つ又はそれ以上の防護抗原がＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ以外の生物によって産生され、この生物からの粗又は精製形態で使用される組換え型ワクチンのような従来のタイプのワクチン、あるいは１つ又はそれ以上の防護抗原がもう１つ別の生又は修飾生菌、生又は修飾生ウイルス、生原核細胞又は他の何らかの種類の生存生物のような生ベクターによって運搬される組換えワクチンを含むが、これらに限定されない。また、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの防護免疫原をコードする裸のＤＮＡを含むワクチンも本発明に包含され、かかる防護免疫原はここで説明される。
【００１９】
生物の増殖あるいはその生物からの抗原の同定は、ワクチンが生産できることを保証し得ないことは当業者には明白である。すべての生物、特に細菌は何千もの抗原を含み、そのうちのあるものはワクチンとして使用したとき宿主において有害な応答を生じさせ、またあるものは有意の応答をもたらさず、少数（一般には５未満）が実際に動物の防護に関与する免疫応答を生じさせる。これらの免疫原は、未変化形態（構造、形及び配列が無傷である）で調製され、それらが動物の免疫系によって動物に提示され、動物の免疫系が防護を生じるために十分に高い免疫応答（免疫学的に有効な量）を発現できる場合に防護的である。動物の防護のためのワクチンを調製する際には、特にＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓのような脆弱な細菌においては、免疫原の構造と立体配置を維持すること、十分に高いレベルの免疫原（抗原量）を産生すること、および特に不活性化、組換え型又はサブユニットワクチンではアジュバント又は免疫調節剤を含むことが、成功を収めるために決定的に重要である。修飾生、弱毒化又は生ワクチンの調製においては、脆弱な生物の免疫原を維持することも不可欠である。ほとんどの場合、これは安定化剤の添加、凍結乾燥又は透化によって実現される。しかし、この場合でも、免疫原の構造を保存する特定増殖方法を使用すること、及び正しい安定化剤を加えることが重要である。
【００２０】
米国特許第５，６１０，０５９号（Ｊｏｅｎｓら）は、不活性化及び修飾又は弱毒化ワクチンを調製するための一般的方法を述べている。本発明は、ここで述べるようなＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓについての不活性化ワクチンを調製するための方法であって、１）培地を含むフラスコ、回転ビン及びバイオリアクターを含むがこれらに限定されない容器を用いた感受性組織培養において、組織培養細胞の付着のために容器表面、ビーズ又は他の基質を用いてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物を増殖させるか、若しくはバイオリアクターにおいて組織培養細胞の懸濁液中でＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させる段階、２）増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物を組織培養容器から取り出してＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを採集する段階、３）免疫原を損傷することなくＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物を不活性化する段階、および４）不活性化したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物にアジュバントを加える段階、を含む、前記方法を述べる。「感受性」の語は、免役原が修飾又は変化を受けず、生物の高い抗原量が産生されるようにＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物を増殖させ、その免疫原を発現するように組織培養が特異的に選択されている又はクローン化されていることを意味する。
【００２１】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させるために有用な感受性組織培養は、サル細胞、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ハムスター細胞、ヒト細胞、ウマ細胞、魚細胞、ハムスター細胞、ウシ細胞及びブタ細胞から成る群より選択されうる。より特定すると、組織培養は、ベロ細胞、ＭＡ−１０４細胞、９００９Ｂ細胞（ＣＲＬ１１３０２）、バッファローミドリザル腎細胞（ＢＧＭ）、マッコイ細胞、Ｌ−９２９細胞、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、Ｃｕｔｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓイヌ腎細胞（ＣＬＤＫ）、クランデル細胞（ＣＲＦＫ）、ウシ胚鼻甲介細胞（ＥＢＴ）、ＥＨＴｈ細胞、ＢＦＳｐ細胞、ブタ精巣細胞（ＳＴ）、ブタ腎細胞（ＳＫ）、ＰＫ−１５細胞、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１）、ヘンレ４０７細胞及びラット腸上皮細胞（ＩＥＣ）から成る群より選択される。好ましい細胞は、ベロ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ヘンレ４０７細胞及びＩＥＣ細胞を含むがこれらに限定されず、前記の細胞は生物又は細胞の修飾を伴わずに有意の量の細胞障害作用（ＣＰＥ）を生じることが示されている。他の細胞における増殖は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法によって明らかにされた。ＣＰＥを伴って又は伴わずに、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させるいかなる細胞も、ワクチン生産のために許容される感受性組織培養細胞であると予想される。免疫原の修飾を伴わないＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖のために最も好ましい細胞は、感受性であり、短期間（１０日以内）に高い抗原量のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを特異的に増殖させる上記の組織培養細胞のクローンである。
【００２２】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させる改善された工程は、懸濁液中の感受性組織培養を、容器壁又はビーズ基質に付着した細胞シートとして、又は生物の増殖を支持する培地の存在下で容器又はビーズ基質に付着した集密単層として接種することから始まる。増殖のための培地は、最小必須培地（ＭＥＭ）のような、但しこれに限定されない典型的な組織培養培地のいずれかでありうる。次に、感染した組織培養をＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖を支持することができる温度、一般に３０℃−４０℃、好ましくは３４℃−３８℃、より好ましくは３５℃−３７℃で、生物が必要な抗原量を産生する事ができる期間インキュベートする。期間は１−３０日間の範囲をとりうるが、好ましくは５−１０日間のインキュベーションで必要な抗原量が産生される。増殖は、蛍光抗体染色（ＦＡ）、間接蛍光抗体染色（ＩＦＡ）、ＰＣＲ、及び酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を含めた数多くの手段によって測定できる。後者の手法は、ワクチンが防護を生じるのに十分な免疫原を含むことを保証する特定抗原量を定量するために使用できる。最大抗原量が産生されたときに増殖を終了する。増殖を終了した後、培養を採集する。
【００２３】
集菌工程は容器から液体を除去することを必要とする。該液体は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに加えて細胞デブリス又は全組織培養細胞を含みうる。集菌段階は、組織培養細胞を破壊して開き、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物及び／又は抗原量を放出させるための、凍結−融解段階、酵素又は界面活性剤による処理、あるいは高圧処理を含みうる。さらに、集菌段階は、遠心分離、カラムクロマトグラフィー又は限外ろ過のような当該技術で既知の手法を用いた濃縮を含みうる。
【００２４】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの不活性化は、生物を二元性エチレンイミン、β−プロピオラクトン、ホルムアルデヒド、熱、界面活性剤又は免役原性を損なわずに生物を不活性化することができる当該技術において既知の他の何らかの作用物質で生物を処理することによって実現できる。これに関して、免役原性とは、ワクチンがＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる増殖性回腸炎の臨床的又は準臨床的徴候からブタを防護する能力、あるいは免疫原に対する抗体がＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖を阻止する能力と定義される。本発明のワクチンによって惹起される好ましい抗体は、４１、４３−４４、６０、７１及び１１５ｋＤａ又はそれ以上の分子量を持つ抗原と反応するものを含むが、それらに限定されない。
【００２５】
アジュバント及び／又は免疫調節剤は、典型的にはより高い免疫応答を刺激し、より強力な防護を与えるために不活性化ワクチン抗原に加えられる。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓと共に使用できるそのようなアジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオン酸菌属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含む細菌ベースのアジュバント；ＰＯＬＹＧＥＮ（登録商標）、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、Ｈａｖｌｏｇｅｎ（登録商標）、ＣＡＲＢＩＧＥＮ（登録商標）、メタクリレート、ＤＥＡＥデキストラン及び硫酸デキストランのようなポリマーベースのアジュバント；ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ  ＰＬＵＳ（登録商標）及びＥＭＵＧＥＮ（登録商標）のような油性アジュバント；スクアラン又はスクアレンのような動物油；Ｄｒａｋｅｏｌ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅｓのような鉱油；落花生油のような植物油；ブロックコポリマー；水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；Ｂａｙｐａｍｕｎのようなポックスウイルスタンパク質；Ａｖｒｉｄｉｎｅ；Ｌｉｐｉｄ  Ａ；サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ及びＱＳ２１のようなトリテルペノイドグリコシド；Ｔｗｅｅｎ−８０、Ｓｐａｎ２０及びＰｌｕｒｏｎｉｃｓのような界面活性剤；モノカイン及びインターフェロンのようなインターロイキン；リポソームＩＳＣＯＭＳ；ムラミルジペプチド及びコレラ毒素の誘導体のような合成グリコペプチド、あるいは上記の組合せから成る群より選択されうる。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓのような脆弱生物と共に使用するための好ましいアジュバントは、ＰＯＬＹＧＥＮ（登録商標）、エチレン無水マレイン酸型アジュバント、エチレンマレイン酸ポリマー、ＣＡＲＢＩＧＥＮ（登録商標）、ＨＡＶＬＯＧＥＮ（登録商標）、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）、ＰＯＬＹＧＥＮＴＭ、ＢＡＹ  Ｒ１００５のような合成グリコペプチド、一部のアルミニウム塩、免疫調節剤、毒素及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。そのような好ましいアジュバントは、毒性がないこと及び脆弱な生物及び免疫原を分断する傾向がある界面活性剤が存在しないことに基づいて選択される。
【００２６】
あるいは、本発明は、修飾生又は弱毒化Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物を含むワクチンを述べる。この種のワクチンを生産するためには、組織培養での多数の継代によって、又は生菌であって、ブタに対して病原性ではなく、免疫原を無傷で保持するＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物を生じる安定な突然変異体を生成するために突然変異誘発物質で処理することによってＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを弱毒化する。組織培養、好ましくは非ブタ組織培養における多数の継代は弱毒化Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを生じると予想される。安定な突然変異体を生じるもう１つの手順は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓをＮ−メチルニトロソグアニジン又はアクリジンオレンジのような突然変異誘発物質で処理して、ブタに対して非病原性であるＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物を選択することである。これに関して、「非病原性」の語は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓがブタにおいて複製するが、豚において疾患の臨床的又は準臨床的徴候を再現しないことを意味する。あるいは、修飾生又は弱毒化Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物は、当該技術において既知のトランスポゾン誘導の突然変異誘発の手法によって生産することができる。修飾生又は弱毒化Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓワクチンを生産するための方法は、１）培地を含むフラスコ、回転ビン及びバイオリアクターを含むがこれらに限定されない何らかの種類の容器中での感受性組織培養において、組織培養細胞の付着のために容器表面、ビーズ又は他の基質を使用して修飾生又は弱毒化Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させるか、若しくはバイオリアクターにおいて組織培養細胞の懸濁液中で修飾生又は弱毒化Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させる段階、２）増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物を組織培養容器から取り出してＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを採集する段階、３）必要に応じて生Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを安定化する段階、および４）あるいは、生Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓにアジュバントを加える段階を含む。
【００２７】
増殖と集菌の段階は先に述べたのと同様である。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを安定化する段階は、凍結−融解、凍結乾燥のような乾燥、透化、あるいはポリマー又は糖安定化剤又は他の種類の液体安定化剤を加えうる液体形態での安定化を含みうる。
【００２８】
アジュバントを加える段階は先に述べたのと同様であり、上述したアジュバントのいずれかを含みうる。
【００２９】
サブユニットワクチンは、生物の一部であるが全生物未満である部分を含むワクチンである。サブユニットワクチンはわずかに１個の免疫原を含むこともある。これらのタイプのワクチンは下記の手段のいずれかによって調製できる。それらは、全生物から調製したワクチンが有害な抗原を含む場合にはいつでも調製できる。それらは、免疫原が優性な干渉抗原によって動物の免疫系から隠されている又は隠蔽されているために無効である、全生物から調製することができる。サブユニットの調製が商業的により便利である場合、又はより純粋な形態のワクチンを所望する場合にはいつでも調製することができる。サブユニットワクチンは、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物の簡単な抽出と、免疫原を含む部分の貯留によって作製することができる。サブユニットワクチンは、１）培地を含むフラスコ、回転ビン及びバイオリアクターを含むがこれらに限定されない何らかの種類の容器中での感受性組織培養において、組織培養細胞の付着のために容器表面、ビーズ又は他の基質を使用してＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させるか、若しくはバイオリアクターにおいて組織培養細胞の懸濁液中でＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させる段階、２）増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物を組織培養容器から取り出してＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを採集する段階、３）界面活性剤、酵素又は凍結−融解、あるいはフレンチプレスを用いるような高圧で処理することによって、又は組織培養細胞ならびにＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを破壊して開く他の何らかの方法によってＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを抽出する段階、４）サブユニットを生成するための免疫原性に干渉する成分を除去するために防護抗原（免疫原）を精製する段階、および５）サブユニットにアジュバントを加える段階を用いて調製される。増殖、集菌及びアジュバント添加の段階は上記で述べたのと同様である。免疫原を精製する段階は、１）Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの免疫原を同定すること、および２）カラムクロマトグラフィー、限外ろ過、遠心分離、電気泳動及び分画遠心分離を含むがこれらに限定されない当該技術で既知の手法によって免疫原を取り出すことを含むが、これらに限定されない。サブユニットワクチンのための標的抗原は、４１、４３−４４、６０又は７１及び１１５ｋＤａに等しいか又はそれ以上の分子量を持つＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓタンパク質である。
【００３０】
ここで述べる改善された常用ワクチンは、担体を用いて筋肉内、皮下、鼻内、皮内、経口、静脈内又は局所的に投与することができる。
【００３１】
本発明はまた、組換え型ワクチンの調製を述べる。組換え型ワクチンを調製する最も重要な段階は、１個又はそれ以上の標的免疫原を同定すること、次にそれらを配列決定して発現すること、かかる配列を生産ベクター又はワクチンベクターに挿入することを含む。これに関連して使用するとき「同定」の語は、既知の分子量を持つ特定抗原の存在を明らかにすることを意味する。「生産ベクター」の語は、ここでは、大量の標的免疫原がベクターによって発現されるように標的免疫原をコードする配列がその中に挿入されている細菌、ウイルス又は真核細胞のような生物を表わすために使用される。標的免疫原は、生産ベクターから精製して除去するか又は生産ベクターの一部として使用することができる。そのような生産ベクターの例は、大腸菌、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バキュロウイルス、トランスフェクションされた組織培養細胞、アデノウイルス、レトロウイルス及び酵母である。「ワクチンベクター」の語は、ここでは、ワクチン接種する動物に標的免疫原を送達するために使用される生又は不活性化生産ベクターを意味するために使用される。ワクチンベクターの例は、サルモネラ属、大腸菌、アデノウイルス、又は外来ＤＮＡを受け入れ、免疫原の免疫原性を変化させずにそれを発現し、ワクチンを接種される動物内で複製することができる他の何らかの生存生物である。
【００３２】
組換え型ワクチンを調製する１つの方法は、１）標的免疫原を同定する段階、２）Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノムライブラリーを構築して、スクリーニングする段階、３）Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓのタンパク質を産生する組換えクローンを同定する段階、４）免疫反応性エピトープをコードする遺伝子を同定する段階、５）発現ベクター又は生産ベクターを通して免疫反応性エピトープを発現する段階、および６）組換え標的免疫原又は生生産ベクターをワクチンに製剤する段階、を含む。
【００３３】
組換え型ワクチンを調製する第二の方法は、
１）Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対するＭｏＡｂｓを調製する段階、２）Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖を中和するＭｏＡｂｓを同定する段階、
３）ＭｏＡｂｓによって検出された抗原を標的免疫原として同定する段階、
４）標的免疫原を配列決定する段階、
５）１又はそれ以上の発現又は生産ベクターにおいて標的免疫原を発現させて組換え免疫原を産生する段階、および
６）組換え免疫原又は生生産ベクターをワクチンに製剤する
段階、を含む。
【００３４】
発現された免疫原を発現ベクターから回収し、粗形態で使用するか又は、あるいは、精製して、その後上述したようにアジュバントを加えることができる。さらに、発現ベクターは、免疫原を宿主に送達し、ブタにおいて循環する免疫原の量を上昇させる複製を可能にする生ワクチンとして投与することができる。後者の系は、ワクチンが、直接に又は飲用水中で、経口的により容易に投与できるという利点を持つ。それに加えて、担体を使用して鼻内、筋肉内、皮下又は局所的に送達することができる。代替的には、標的免疫原の裸のＤＮＡ配列をワクチンとして使用することができる。
【００３５】
ここで述べる組換え型又は裸のＤＮＡワクチンはすべて、当該技術において既知の手法を用いて製剤すれば、筋肉内、皮下、皮内、鼻内、静脈内、経口的又は局所的に投与することができる。
【００３６】
先に指摘したように、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓについてのサブユニット、組換え型又は裸のＤＮＡワクチンを生産する重要な段階は標的免疫原の同定である。本発明は、同定された、サブユニット、組換え型又は裸のＤＮＡワクチンのために有用であると期待されるＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を述べる。そのような標的免疫原はまた、ここで述べる定量的ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡテクノロジーのような手法を用いて疾患状態の豚において増殖性回腸炎を診断する又はワクチン中の抗原を定量する上でも有用である。
【００３７】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原を同定するための成功を収めた１つの方法は、電気泳動、及び回復期のブタ（増殖性回腸炎から回復したブタ）からの血清でＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原抽出物をウエスタンブロットし、これらの血清によって一貫して認識される抗原を探索する方法を使用した。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの免疫原を同定するための成功を収めた第二の方法は、上述したように調製したワクチンを接種したブタによって発現され、異種菌株のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによる攻撃誘発に対して防護を示すキー抗体に注目することであった。これら２つの方法を用いて、２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、４１ｋＤａ、４３−４４ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ及び≧１１５ｋＤａの分子量を持つ抗原を標的免疫原として同定した。これらの抗原は、サブユニット、組換え型又は裸のＤＮＡワクチンの調製において有用であると考えられ、あるいは増殖性回腸炎に関する診断又は抗原定量法を開発するために使用できる。
【００３８】
上述した抗原の機能性の証明、及びサブユニット、組換え型及び裸のＤＮＡワクチン生産のための標的免疫原としてのそれらの同定を次のように実施した。最初に、当該技術において既知の手法を用いて３１ｋＤａ、４１ｋＤａ、４３−４４ｋＤａ及び６０ｋＤａ、４３−４４ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ及び１１５ｋＤａタンパク質を認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）の調製をここで提供する。これらのＭｏＡｂｓを産生するハイブリドーマをそれぞれ６Ｂ１、３Ａ１、２Ａ２、２Ｂ６、５Ａ２、２Ｃ１、３Ｄ４及び１Ｃ２として同定した。これらの抗原が実際に免疫原であることの確認は、それらの機能性（すなわち、それらに対して産生されるＭｏＡｂｓが組織培養においてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの細胞傷害作用の発現を中和する能力）を証明することによって明らかにした。実際に、列挙した４１、４３−４４、７１及び１１５又はそれ以上のｋＤａ抗原は中和ＭｏＡｂｓを産生した。それ故、これらの免疫原はいずれも、サブユニット、組換え型又は裸のＤＮＡワクチンのための候補物質である。ここで述べるモノクローナル抗体は、増殖性回腸炎を診断するため、あるいはワクチン中の抗原の検出ならびに組織試料、糞便試料中に存在する又は動物の血液中を循環するＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの検出のための定量的ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡアッセイを開発するために有用であると期待される。
【００３９】
さらに、サブユニット、組換え型又は裸のＤＮＡワクチンの開発のために、標的免疫原を同定した後、従来の細菌細胞のＳＤＳ／プロテイナーゼＫ溶解を用いたＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ染色体ＤＮＡの抽出と、それに続くクロロホルムイソアミルアルコール抽出及びエタノール沈殿によってゲノムライブラリーを作製した。精製したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳａｕ  ３Ａ１で部分消化し、エチジウムブロマイドを含む低融点アガロースゲルを通して電気泳動によってフラグメントを分離した。３−６ｋｂの長さのフラグメントをゲルから切り出し、精製して、ベクターλ−ＺａｐのＢａｍＨＩ部位にライゲートした。Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ  Ｇｏｌｄ  λファージ抽出物を使用してライゲーション産物をインビトロパッケージングし、組換えファージを、製造者によって指示されているように大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’に形質導入した。形質導入ファージを、Ｘ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを含む融解した寒天上部において連続希釈し、あらかじめ温めておいた固体寒天上に塗布した。平板を４から８時間インキュベートしてプラークを発現させた。プラークを光学密度とβ−ガラクトシダーゼ活性（非組換えファージ及び認められるバックグラウンド発現頻度を示唆する）に関して検査した。ローンとプラークをＩＰＴＧに浸したＩｍｍｏｂｉｌｏｎで覆って、さらに５時間インキュベートした。膜を取り出し、遮断溶液中でプレインキュベートした後、モノ又はポリクローナル抗体でスクリーニングした。すべての抗体株によるスクリーニングを可能にするために２つのコロニーリフトを調製した。免疫反応性プラークを取り出し、新鮮大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’と混合して、上述したようにプラークを生成した。反応性プラークのクローン性と安定性を保証するために適切な抗体によるコロニーブロットとスクリーニングを繰り返した。安定なクローン免疫反応性プラークと新鮮細菌を混合してウエスタン分析用の溶解産物を生成し、反応性エピトープを担う抗原の分子量を決定した。免疫反応性プラークを拡大して、大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’をＭ１３由来のヘルパーファージＲＥ７０４に感染させることによって一本鎖ファージミドＤＮＡ（ｐＢＫ−ＣＭＶ）に変換した。組換えヘルパーファージを非許容大腸菌宿主ＸＬＯＬＲに形質導入し、選択培地で平板培養して、二本鎖プラスミドＤＮＡを回収した。アルカリ溶解によってプラスミドＤＮＡを抽出し、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩとＩｃｏＲＩで消化して、ＤＮＡのインサートの大きさを決定した。ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントをゲル精製し、ジゴキシゲニン（ｄｉｇ）で標識してサザン分析に使用し、ＤＮＡのソース（ＩＥＣ又はＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）を決定した。ＩＥＣ感染ＤＮＡだけに結合するプローブを、Ｍ１３正及び逆プライマーを担うベクターを用いてインサートＤＮＡを配列決定することによりさらに特性付けた。その後の配列決定反応はプライマー歩行によって触媒した。インサートＤＮＡが大きい場合には（＞３ｋｂ）、配列決定作業を焦点化するためにサブクローナル分析を使用した。ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムを使用して、配列データを関連タンパク質との相同性に関し���スクリーニングした。同様に、ＤＮＡ  Ｓｔｉｄｅｒを使用して配列データをオープンリーディングフレームの存在に関して分析し、ＢＬＡＳＴｐ検索を用いてＯＲＦをスクリーニングした。宿主細胞ＤＮＡが調製したすべてのＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ中に普遍的に存在するため、汚染されていないＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出と精製は困難であった。それ故、免疫反応性クローンの同定を容易にするために、クローンが生成されたときにモノ及びポリクローナル抗体の両方を使用して組換えクローンの免疫スクリーニングを実施した。反応性エピトープをコードするＤＮＡのソースとしてのＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの確認検定は、ＰＣＲ及びサザンブロット分析によって実施した。
【００４０】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノムライブラリーを構築し、スクリーニングするために、ファージ発現ベクターγ−Ｚａｐを使用した。このライブラリーは、後程先に述べた標的免疫原と比較する、免疫反応性エピトープをコードする細菌配列の同定を可能にする。
【００４１】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノムの大きさが不明であるので、ライブラリーのスクリーニングによって免疫反応性エピトープをコードする遺伝子を単離し、同定することは問題があると考えられる。より重要な点として、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノムライブラリーの構築は半精製Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出を必要とし、これは宿主細胞と細菌染色体のＤＮＡ複合体を生じさせる可能性が高い。そのため、逆ＰＣＲを使用して免疫反応性エピトープをコードするＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノム配列の同定と単離を容易にした。
【００４２】
免疫反応性抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するための最初の段階は、分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる免疫反応性抗原の精製を含んだ。分離した因子をＩｍｍｏｂｉｌｏｎに移し、全タンパク質をアミノブラック染色によって視覚化した。適切な大きさで移動するタンパク質を切り出し、エドマン分解に供してＮ末端配列データを得た。数個のコドンによってコードされる残基を同定するために少なくとも３０個のアミノ酸を配列決定し、それによって低縮重プライマーの合成が可能となる。縮重プライマーを使用して、タッチダウンＰＣＲにおいてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノムＤＮＡ及び宿主ＤＮＡ（対照）からの産物を増幅した。増幅産物を２％アガロースゲル上で分析した。期待された大きさの産物をゲル精製し、Ｔ尾部のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにクローニングして、Ｍ１３正及び逆プライマーを担うベクターを用いて配列決定した。配列データをＯＲＦに関して分析し、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒを使用して翻訳した。翻訳した配列をアミノ末端配列と比較して、ＰＣＲ産物がコード由来であることを確認する。次にＰＣＲ産物をジゴキシゲニン標識して、一連の制限エンドヌクレアーゼで切断したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノムＤＮＡ及び宿主細胞ＤＮＡ（対照）をプローブするために使用した。ハイブリダイゼーションプロフィールを分析して、ＴａｑＰｌｕｓを介した逆ＰＣＲによって増幅されうるフラグメント及び完全な下流Ｏｒｆ（所望する制限フラグメントの大きさは免疫反応性抗原、すなわち〜５００ｂｐ  ＯＲＦによってコードされる２０ｋＤａ抗原、〜１５００ｂｐ  ＯＲＦによってコードされる６０ｋＤａ抗原の大きさに依存する）を生じる消化条件を同定した。ひとたびＰＣＲ産物のソース（Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）と最適消化パターンが決定されれば、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓゲノムＤＮＡを所望する制限エンドヌクレアーゼで消化して、低融点アガロースゲルを通してフラグメントを分離し、所望する大きさのフラグメント（上記のサザン分析によって決定されるような）を切り出して精製した。精製フラグメントを、分子内ライゲーションを促進する濃度に希釈し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて共有結合によって閉じた。ライゲーション産物を逆ＰＣＲのための鋳型として使用した。逆ＰＣＲは最初のＰＣＲ産物配列データから誘導したプライマーを使用した。Ｎ末端コード配列の５’末端の上流及びＮ末端コード配列の３’末端の下流のＤＮＡの重合を開始させるようにプライマーを設計した。逆ＰＣＲは、長い正確なアンプリコンを作製するためにＴａｑＰｌｕｓ  Ｌｏｎｇ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを利用する。エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルを通して逆ＰＣＲの産物を分離し、分析した。Ｎ末端コード配列の上流及び下流のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ配列から誘導されるもののような期待される大きさの産物の確認検定は制限マッピングを使用する。ＰＣＲ産物をＴ尾部のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにクローニングして、Ｍ１３正及び逆プライマーを担うベクターを用いて配列決定する。その後の配列決定反応はプライマー歩行によって触媒した。クローン���したＤＮＡによってコードされるエピトープの免疫反応性を、ＩＰＴＧ誘導の組換えクローンから誘導した溶解産物のウエスタン分析を用いて評価した。インサートＤＮＡが大きい場合には（＞３ｋｂ）、免疫反応性エピトープをコードする領域に配列決定作業を集中するためにサブクローナル分析を使用する。Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒコンティグ構築ソフトウエアを用いてＮ末端コードＤＮＡ配列データと共に配列データを構築した。分子内ライゲーションのために使用される制限部位を同定することにより、リンクしていない配列（分子内ライゲーションによって人為的にリンクされた）を分離する結合の同定を実施した。ひとたび配列データが構築されれば、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムを用いて関連タンパク質との相同性に関してスクリーニングした。同様に、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒを使用して配列データをオープンリーディングフレームの存在に関して分析し、ＢＬＡＳＴｐ検索を用いてＯＲＦをスクリーニングした。免疫反応性エピトープをコードするＯＲＦを適切なＨｉｓタグ又はカルモジュリンタグベクターに組み込むことにより、免疫試験のためのワクチンを調製する際に使用する精製組換えタンパク質抗原の生産を実施する。
【００４３】
組換え型ワクチンの調製を先に述べた。該ワクチンの効果の試験は、ブタにワクチン接種し、血清中和によって抗体応答を測定することを含む、従来のワクチンに関して既に使用されている方法によって実施する。下記の実施例の中で提示するデータは、体液性応答がブタにおける増殖性回腸炎に対する免疫の発現において非常に重要であることを示唆する。体液性抗体応答を測定し、その後ブタをＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓのビルレント菌株で攻撃誘発する。１又はそれ以上の標的免疫原又は該標的免疫原からのエピトープは動物において抗体応答を惹起した。それ故、同様にワクチン接種したブタは従来のワクチンを用いる場合のように防護される。
【００４４】
先に指摘したように、ひとたび標的免疫原をコードするＤＮＡ配列が同定されれば、裸のＤＮＡワクチンは容易に調製される。裸のＤＮＡワクチンは、既知の手法と担体を用いて筋肉内、皮下、静脈内、鼻内、皮内、経口的及び局所的に投与しうる純粋なＤＮＡを利用する。
【００４５】
従来の又は組換え型のワクチンを調製するとき、特に免疫原が不活性化又はサブユニット形態であるときには、抗原量の定量が決定的に重要である。抗原の定量は、ＥＬＩＳＡに組み込まれたここで述べる抗原の使用によって実現できる。また競合ＰＣＲ手法によっても定量しうる。この後者の手法を使用して、本発明の免疫原又は免疫原のエピトープを定量した。
【００４６】
下記の非制限的実施例は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓワクチンの組成物を示し、この生物をいくつかの多様な組織培養細胞系統において増殖させることを含むそれらの生産方法を説明し、ならびに防護抗体価を産生し、ビルレントＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによる攻撃誘発から防護するためにブタにワクチン接種する際のそれらの使用を述べる。実施例はまた、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原の同定ならびにそれらの機能性の証明を明らかにする。
【００４７】
本発明を下記の実施例によってさらに例示するが、限定を意図するものではなく、実施例中のすべての割合及びパーセンテージは、特に異なる規定がない限り重量ベースである。
【００４８】
実施例１
組織培養におけるＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖は常套的に実施した。１つの方法は、臨床的増殖性回腸炎を呈するブタの腸ホモジネートから単離したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ細菌接種生物でヘンレ４０７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６）を感染させることにより、該細胞において生物を増殖させることを含む。感染ブタからの腸の切片を採取し、洗浄して粘膜を取り除き、粘膜固有層から上皮細胞を分離するためにヒアルロニダーゼを含むハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した。次に切片を洗い、遠心分離によって腸細胞を収集した。腸細胞の２回目の洗浄を行い、その後汚染腸微生物叢を死滅させるために４℃で２４時間、硫酸ゲンタマイシンとアンフォテリシンＢに暴露した。処理した細胞を収集し、ＨＢＳＳ中で洗って、０．５％デオキシコレートにより３７℃で１時間、絶えず攪拌しながら溶解して、細胞内生物を放出させた。溶解産物を無菌０．６５μ膜フィルターに通した。ろ過した溶解産物を２５ｃｍ２フラスコ中のヘンレ４０７ヒト腸細胞の集密的単層に加えた（フラスコ当り接種物１ｍｌ）。１０日間のインキュベーション期間中、感染細胞を細胞傷害作用（ＣＰＥ）に関して検査した。腸細胞溶解産物の接種後３−４日目にヘンレ４０７細胞においてＣＰＥが認められた。ＣＰＥは通常、細胞の伸長、それに続く７−１０日目の細胞の丸まりと脱落によって構成された。
【００４９】
実施例２
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓをラット腸上皮細胞（ＩＥＣ）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１５８９でも増殖させた。これらの細胞でのＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖はＣＰＥをもたらさないので、標準ＰＣＲ法の使用によって又はモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を用いた標準蛍光抗体検出法によって増殖のモニタリングを実施した。ＰＣＲ法による定量は、濃度計及び当該技術で既知の競合ＰＣＲ手法を使用して測定した。
【００５０】
ＩＥＣ細胞上でＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させる工程は、１）Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物によるＩＥＣ細胞の接種、２）該生物の増殖ならびにＩＥＣ細胞の増殖を可能にする大気条件の存在下に３７℃でＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの増殖を支持することができる培地中での感染ＩＥＣ細胞培養のインキュベーション、３）Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの採集、及び４）生物の収量を増大させるための約１０日の間隔での培養の継代の段階を含んだ。
【００５１】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを接種する好ましい方法は、ＩＥＣ細胞を懸濁液培養中のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに感染させ、その後感染した懸濁液培養を付着表面に植えつけることを含んだ。フラスコが付着表面として常套的に使用されてきた。しかし、そのような付着表面は、フラスコ、細胞キューブ、細胞ファクトリー、回転ビン、懸濁液中のビーズ又は組織培養細胞の増殖のために使用される他のいかなる種類の表面も含みうることは当業者には明白である。Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを接種するより好ましい方法は、懸濁液培養を感染させた後、感染した懸濁液培養を付着表面に植えつける前に遠心分離段階を加えることを含んだ。
【００５２】
ＩＥＣ細胞及びＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ生物の増殖を支持するいかなる培地もインキュベーション工程において使用できる。好ましい培地は、胎児ウシ血清、ウシ血清、子ウシ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、又は他の何らかの増殖促進血清のような血清又は代用血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）である。
【００５３】
ＩＥＣ細胞においてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを増殖させるための好ましい大気条件は、二酸化炭素（ＣＯ２）、酸素（Ｏ２）及び窒素（Ｎ２）の存在下でインキュベートすることを含み、特にこれらは８％ＣＯ２、８％Ｏ２、及び８４％Ｎ２を含む組合せでありうる。
【００５４】
感染ＩＥＣ細胞からのＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの採集は、１）感染フラスコから培地を取り出すこと、２）感染細胞を削り取る又は当該技術で既知のトリプシン又はトリプシン／ベルゼン濃度で処理することによって感染細胞を付着表面から採取すること、および３）細胞からＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを放出させることを含んだ。ＩＥＣ細胞からＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを放出させるために使用した工程は、凍結融解及び塩化カリウム（ＫＣｌ）による処理を含んだ。塩化カリウムを使用する場合には、０．１から０．２％の濃度を使用した。組織培養から微生物を放出させる他のいかなる処理（例えば凍結融解、トリプシン処理、音波破砕、等々）も使用しうることは当業者に認識される。
【００５５】
ＩＥＣ細胞においてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを継代するための工程は、上述した段階を複数回反復することを含んだ。
【００５６】
実施例３
先に述べた手順により（実施例２）、Ｔ−２５フラスコを使用してＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ  ＩＬ−Ｂ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５５３７０）をＩＥＣ細胞で増殖させた。感染ＩＥＣ細胞をＣＯ２：Ｏ２：Ｎ２（８：８：８４）の大気中でガスパックにおいて５−７日間培養した。上清を採取し、細胞を０．２％ＫＣｌで５分間、０．１％ＫＣｌで２５分間処理した。ＫＣｌを除去し、細胞を削り取って採集した。採集した細胞を２２ゲージ針に通して細胞構造を破壊した。細胞溶解産物を１０分間低速遠心分離に供し、上清中に残存する半精製生物を高速遠心分離によって収集した。２５のフラスコから抗原をプールし、抗原の一部を可溶性抗原の生産のためにフレンチプレス処理に供した。残りの抗原をアリコートに分け、−７０℃で保存した。この可溶性抗原を次の手順によりワクチンに製剤した。ワクチン抗原を５００μｇ抗原／用量の濃度でＴｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）アジュバント又はフロイント不完全アジュバントと共に製剤した。Ｔｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）アジュバントに関しては、０．５ｍＬを抗原０．５ｍＬと混合して、抗原５００μｇを含む１．０ｍＬ用量を生成した。フロイント不完全アジュバントに関しては、アジュバント２．０ｍＬを、総用量がやはり５００μｇを含むように抗原２．０ｍＬと混合した。
【００５７】
産生された抗原が、同種攻撃誘発からあるいは異種分離菌又は菌株への暴露からブタを防護しうるかどうかを調べるために、１０頭の４週齢ブタにワクチン接種し、その後攻撃誘発した。１０頭の対照ブタには、組織培養培地、最小必須培地（ＭＥＭ）とアジュバント（抗原なし）だけを含む等しい用量の偽ワクチンを接種した。初回のワクチン接種に使用したワクチンはＴｉｔｅｒｍａｘ（登録商標）アジュバントを含み、２回目のワクチン接種に使用したワクチンはフロイント不完全アジュバントを含んだ。ワクチン接種後の免疫応答の産生を明らかにするため、ワクチン接種の前（予備採血）、ブースターの当日（１４日目）及び攻撃誘発の当日（３５日目）に血清試料を採取した。９６穴平板のウエルを、ワクチンを生産するために使用した分離菌とは異なるソースからの臨床分離菌のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原（ブタ腸上皮細胞から精製した）で被覆したＥＬＩＳＡによってＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する抗体に関して血清を試験した。それ故、ワクチン接種後の抗体応答の上昇は、ワクチン菌株が異種分離菌／菌株と交叉反応し、その結果異種分離菌／菌株による感染に対して交叉防護することを示唆する。
【００５８】
ブタに番号を付して、２つの異なる処置群に分け、各々の処置を２つの異なる反復で与えるために４つの異なる畜舎に入れた。ブースターワクチン接種後２１日目に、ブタ１頭につき生育可能なＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ感染細胞７５ｍＬを挿管注入してブタをＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに攻撃暴露した。２４日間、疾患の臨床徴候に関してブタを観察し、その後剖検して、回腸炎の病変（肉眼的病変及び過形成）を検査した。攻撃誘発の前と剖検時に、直腸スワブをＳ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）に関して培養した。これらのスワブのいずれもが陽性ではなく、ブタがＳ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ又はサルモネラ属に感染していないことを示唆した。
【００５９】
表１は攻撃誘発の結果を示す。２頭のブタ（１頭がワクチン接種、１頭が対照）が攻撃誘発の前に呼吸器系病変のために死亡した。残りの対照ブタは散発性の下痢を示した。ワクチン接種したブタはいずれも、肉眼で認められるいかなる疾病も示さなかった。攻撃誘発後２４日目の剖検時には、８頭のワクチン接種したブタのうち７頭が正常であったのに対し、９頭の対照ブタのうち５頭がＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの典型的な腸病変を有していた。１頭のワクチン接種ブタが肉眼的病変と過形成の両方を有しており、一方５頭の対照ブタが肉眼的病変と過形成の両方を示した。１頭の対照は過形成を有していたが、肉眼的病変を示さなかった。
【００６０】
ＥＬＩＳＡ血清学データ（図１）は、一次ワクチン接種後の抗体応答の発現とブースター後の抗体応答の有意の上昇を示している。対照ブタで見られた抗体応答は、ワクチン接種動物で認められたものに比べてごくわずかであった。この抗体応答はＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの異種圃場分離菌に対して測定されたので、これは非常に有意であるとみなされた。ワクチンはブタにおいて有意の異種血清学的応答を刺激し（異種圃場分離菌に対して）、一方対照ブタはセロネガティブのままであると結論された。このワクチン接種後の血清学的応答は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ基本型分離菌ＡＴＣＣ  ５５３７０が、ワクチンに製剤したとき、この生物の異種分離菌による圃場感染に対してブタを防護する能力を明らかにしている。
【００６１】
【表１】
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これらの結果は、組織培養増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓとアジュバントを含有するワクチンがＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓによって引き起こされる増殖性回腸炎からブタを防護することを示している。
【００６２】
実施例４
増殖性回腸炎から回復したブタからの血清とＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抗原抽出物との相互作用は、生物から標的免疫原を同定する最初の方法の１つである。先に述べたように（実施例１）Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓをヘンレ４０７細胞において増殖させることにより、ウエスタンブロット法のために使用する抗原を調製した。感染又は非感染細胞のいずれかのタンパク質５０μｇを、１０％アクリルアミド分離ゲルと４％濃縮用ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲルの各々のウエルに充填した。トリス／グリシン／ＳＤＳ実施緩衝液を用いてゲルを流動した。定電圧、定出力で３０ｍ  Ａｍｐｓ／ゲルで実施した。染料の最前部がゲルの底に達するまで、通常４時間ゲルを流動させた。
【００６３】
酢酸及びメタノール中で２５％のクマシーブルーＲ−２５０を用いてゲルのクマシーブルー染色を行った。ゲルを染料と共にオンハイマイクロ波中に２分間入れた。次に室温で２０分間振とう機にかけた。種々の濃度のメタノールと酢酸を用いて脱染色した。ゲルを２分間オンハイマイクロ波に入れた。次に室温で２０分間振とう機でインキュベートした。背景が無色になるまで脱染色の手順を反復した。
【００６４】
ウエスタンブロット分析のためにゲルをＰＶＤＦ膜に移した。転移は４℃で一晩実施した。それらを１０から１５Ｖでトリス／グリシン緩衝液中で移動させた。次に膜を５％脱脂乳で３０分間遮断した。その後５％乳中で１：１００希釈の血清と共に一晩インキュベートした。膜をＰＢＳ／トゥイーンで２回洗った。次のそれらを５％乳中で１：２００希釈のビオチン標識ヤギ抗ブタと共に２時間インキュベートした。再び膜を洗って、ＰＢＳ／トゥイーン中１：４００希釈のペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと共に１時間インキュベートした。ＰＢＳ／トゥイーンでもう一度洗った後、ブロットを４ＣＮ／Ｈ２Ｏ２で約１０−１５分間又は良好な呈色が得られるまで展開した。６頭の回復期ブタの血清のウエスタンブロット分析の結果を図２に示す。４３−４４ｋＤａ抗原がすべてのブタにおいて共通して認められた（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｉ及びＫ）。ブタの多くにおいて、このタンパク質は優性認識されるタンパク質であった。しかし、一部の場合には、ヘンレ細胞抽出物レーン（対照）も同様の分子量を持つタンパク質の存在を示した（レーンＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ及びＬ）。２１ｋＤａと３１ｋＤａ抗原は、６０ｋＤａ及び７１ｋＤａ抗原と同様に、回復期ブタ血清によって常套的に検出され、対照ブタ血清によっては検出されなかった。≧１１５ｋＤａ抗原も、対照ブタ血清よりは回復期ブタ血清によってより一貫して検出された。これらのバンドは標的免疫原を示しており、中和モノクローナル抗体を生成し、防護ワクチンを生産する潜在的可能性に関して評価すべきであると結論される。
【００６５】
実施例５
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原をさらに同定し、実施例４で同定した標的免疫原の重要性をさらに調べるため、実施例３で使用したブタからの血清を、実施例４で述べたようなウエスタンブロット分析を用いてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの重要な抗原を検出する能力に関して評価した。初期電気泳動のために使用したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原は、不活性化及びアジュバント添加の前の実施例１で調製したようなワクチン抗原であった。この場合には、ブロッティング工程のためにブタ血清を１：２５０に希釈した。ワクチン接種ブタ及び対照ブタのウエスタンブロットを図３に示す。４３−４４ｋＤａダブレットがすべてのワクチン接種動物（主動物（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ））において著明であり、対照ではそうでないことは明らかである。２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、４１ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ及び≧１１５ｋＤａのバンドも、ワクチン接種ブタでは対照ブタにおけるよりも一貫して認められる。これは、本発明の方法により調製したワクチンで予防接種したブタが、４３−４４ｋＤａダブレットに対する反応性の優位性を伴って、２１ｋＤａ、３１ｋＤａ、４１ｋＤａ、４３−４４ｋＤａ、６０ｋＤａ、７１ｋＤａ及び≧１１５ｋＤａ抗原に対するＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓキャリー抗体による攻撃誘発から防護されることを確認している。上記に列挙した抗原は確実に重要であり、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓからの防護に関連すると思われる。
【００６６】
実施例６
最後の方法は、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原をさらに同定すること、及びＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抗原のいずれが回復期のブタにおける抗体応答（実施例４）、ワクチン接種したブタにおける防護（実施例５）に関連していたのか、いずれがサブユニット、組換え型又は裸のＤＮＡワクチンを生産するための標的免疫原となるかを決定することを使用し、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対するモノクローナル抗体を調製して、それらの機能性（組織培養においてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを中和する能力）に関して評価した。
【００６７】
当該技術で既知の方法を用いてＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対するモノクローナル抗体を生成した。実施例１で調製したような、但しヘンレ４０７細胞で増殖させたワクチンでマウスを超免疫化した。無菌手法を用いて１匹のマウスから脾臓を切除し、ＲＰＭＩ  ５ｍＬと共にペトリ皿に入れた。ペトリ皿において無菌注射器のプラスチックプランジャーを用いて脾細胞を分離した。脾細胞懸濁液を１５ｍＬの円錐型チューブに入れ、１７００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去した。ペレットを５−１０ｍＬのＲＰＭＩに懸濁し、細胞を計数した。１ｍＬ当り１×１０８脾細胞が存在するようにＲＰＭＩを加えた。この脾細胞懸濁液１ｍＬを約１×１０７の濃度で骨髄腫細胞の試験管に加え、細胞を１００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットをばらばらにした。ばらばらにしたペレットに温かいＰＥＧ混合物１ｍＬを１分間かけて加えた（約１滴／５秒）。細胞懸濁液を室温で１分間放置し、その後注射器を用いて４分間かけてＲＰＭＩ  ２１ｍＬを加えた（約３滴／３から４秒）。細胞懸濁液を７００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、胸腺細胞順化培地１００ｍＬに再懸濁した。この懸濁液１ｍＬを、細胞懸濁液全部が分配されるまで２４穴平板の各々のウエルに加えた。２４穴平板で増殖している細胞を、２×ＨＡＴ、１×ＨＡＴ及び１×ＨＴにおいて２４日間連続的にインキュベートすることにより選択に供した。次にハイブリドーマをサブクローニングして、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓと反応するモノクローナル抗体を産生する細胞を単離した。実施例４で述べたような標準ウエスタンブロット法を使用して、モノクローナル抗体を含む上清を組織培養増殖したＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓからの電気泳動抽出物と相互作用させることによってハイブリドーマを選択した。
【００６８】
様々なモノクローナル抗体でブロットしたＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原又は非感染細胞抗原（対照）を用いてウエスタンブロット分析を実施した。これらのウエスタンブロット法の結果を図４及び５に示す。図４のレーン１、３、５、７、９及び１１と図５のレーン１、３、５及び７はＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ抗原のウエスタンブロットを示し、図４のレーン２、４、６、８、１０及び１２と２、４、６、及び８は細胞抗原対照を示す。クローン１Ｃ２は≧１１５ｋＤａ抗原に特異的であり、図４においてレーン１と２に示されている。クローン２Ａ２は６０、４３及び４１ｋＤａバンドを検出する（図５、レーン３と４）。クローン２Ｂ６も６０、４３及び４１ｋＤａ抗原を検出するが、最大密度は４１ｋＤａバンドと４３−４４ｋＤａダブレットで認められる（図４、レーン５と６）。クローン２Ｃ１は６０ｋＤａ抗原に特異的であり（図４、レーン７と８）、クローン３Ａ１は４１ｋＤａ抗原に特異的である（図４、レーン９と１０）、クローン３Ｄ４は７１ｋＤａ抗原に特異的であり（図４、レーン１１と１２）、クローン５Ａ２は４３−４４ｋＤａダブレットに特異的である（図４、レーン５と６）。図５において、レーン７及び８は抗原抽出物とＶｏｒ４と称される回復期血清との反応を示す。
【００６９】
これらのモノクローナル抗体を、次に、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに感染させたヘンレ細胞培養において認められるＣＰＥを中和する能力に関して試験した。図６では、クローン５Ａ２についての中和試験の結果を圃場血清（Ｖｏｒ４）及び非中和ＭｏＡｂ（Ｍａｂ  ７Ｄ３）による中和と比較している。Ｍａｂ  ５Ａ２はＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓのＣＰＥの有意の中和を示す。クローン２Ａ２、３Ｄ４、１Ｃ２及び３Ａ１からのＭｏＡｂｓはＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ  ＣＰＥの同様の中和を明らかにした。
【００７０】
それ故、≧１１５、７１、６０及び４３−４４、４１、３１及び２１ｋＤａの分子量を持つＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの標的免疫原が同定された。これらの標的免疫原の１又はそれ以上が、満足しうるサブユニット、組換え型又は裸のＤＮＡワクチンならびに増殖性回腸炎を診断する際に使用するための好結果の抗原を生産し、ワクチン生産の間に抗原を定量すると期待される。これらの抗原に対して特異的に調製したとき、モノクローナル抗体は培養中のＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを中和する能力を明らかにし、あるいはＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓに対する免疫の発現において非常の免疫原性であり、重要であると思われる。
【００７１】
説明のために上記において本発明を詳細に述べたが、そのような詳細は単に説明のためだけのものであり、当業者が、特許請求の範囲によって限定される場合を除いて本発明の精神と範囲から逸脱することなく変更を加えることは明白である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓを含むワクチンでのブタのワクチン接種によって生じる抗体応答を、ワクチン接種していない対照ブタと比較した実験結果を示す。
【図２】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出物に反応した回復期のブタからの血清のウエスタンブロットの結果を示す。
【図３】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出物に反応した、Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓワクチン接種したブタからの血清のウエスタンブロットの結果を示す、。
【図４】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出物に反応したモノクローナル抗体のウエスタンブロットの結果を示す。
【図５】
Ｌ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの抽出物に反応したモノクローナル抗体のウエスタンブロットの結果を示す。
【図６】
モノクローナル抗体５Ａ２及びＶｏｒ４を非中和モノクローナル抗体と比較した、用量依存的なＬ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓの中和曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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