(57)【要約】本発明は、物質の組換え産生のための方法に関するものであり、ここで、細胞は、該物質をコードするヌクレオチド配列で形質転換され、形質転換された細胞は、クローン化され、そのようにして得られた細胞は、受容生物に挿入される。より特定すると、本発明は、組換えタンパク質、組換え細胞および組換え組織の産生における、該方法の使用に関する。本発明は、さらに、個体の細胞が単離し、更なる成長のために該細胞を免疫不全動物中に挿入し、そしてその動物中で成長した細胞、組織および器官を、再度単離し、固体に挿入する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）物質をコードするヌクレオチド配列を使用して細胞を形質転換する工程と、
ｂ）該形質転換細胞をクローニング工程に供する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた細胞を宿主生物に導入する工程とを含む、物質の組換え製造方法。
【請求項２】
工程ａ）で形質転換すべき細胞を形質転換前にクローニング工程に供する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）で形質転換すべき細胞を既存の細胞クローンまたは既存の生物から単離する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該宿主生物が動物、胎、胚、または細胞凝集体である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
宿主クローン中の一定の細胞型を除去し、同一の細胞型の組換え細胞と置換する、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
該宿主生物が、形質転換すべき細胞と同一の遺伝子型を有する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に従って作製された、トランスジェニック動物の、組換え物質を製造するための使用。
【請求項８】
ａ）細胞を個体から単離する工程と、
ｂ）該細胞を免疫不全生物に導入する工程と、
ｃ）該生物を培養する工程と、
ｄ）該生物中で増殖した個体の細胞を単離する工程と、
ｅ）該単離細胞を個体に導入する工程とを含む、動物の細胞、組織、器官の製造方法。
【請求項９】
該細胞を組織および／または器官に成長させ、該成長組織／器官を個体に導入する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該細胞が該細胞を再導入する該個体に由来する、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
該動物がクローニングによって得られる、請求項６〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
該動物中で特定の型の内在性細胞を除去する、請求項８または９記載の方法。
【請求項１３】
移植片を製造するための、請求項８〜１２のいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項１４】
ヒト移植片、特に自己ヒト移植片が産生される、請求項１３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、物質をコードするヌクレオチド配列を使用して細胞を形質転換する工程と、該形質転換細胞をクローニング工程に供する工程と、このようにして得た細胞を宿主生物に組み込む工程とを含む、物質の組換え製造法に関する。本発明は、特に、組換えタンパク質、細胞、および組織の産生方法の使用に関する。さらなる局面によれば、本発明は、個体の細胞を単離する工程と、さらに成長させるためにこれらの細胞を免疫不全動物に導入する工程と、該動物中で培養した細胞、組織、および／または器官を再度単離して個体に導入する工程とを含む方法に関する。
【０００２】
組換え遺伝子技術が発達するにつれ、有用な物質の製造に生物系がますます必要とされている。ヒトゲノムのヌクレオチド配列の定義を使用して、新規のタンパク質およびヒトの身体におけるその役割の発見は、近い将来医学または他の目的のための多数の物質が利用可能となることを促進および加速し、これらの製造が望まれると予想することができる。それにもかかわらず、この目的のためのインビトロでの既存の細胞培養系の使用には、特定の物質の最適な産生まで少なくとも１〜２年間かかるという欠点を含む。さらに、このような系の取扱いは複雑であり、障害も起こりやすく、そして費用がかかる傾向がある。したがって、例えば、細胞培養系の大量操作における主な困難の１つは、培養液の汚染リスクである。
【０００３】
近年、目的の物質および医薬品の生産にますます動物が使用されている。これを行うために、いわゆる生殖系列トランスジェニック動物の作製にともなって、特定の物質をコードするＤＮＡを標的個体の体細胞に導入する体細胞遺伝子移入を使用する。これをインビボ（すなわち、完全な生物）またはインビトロもしくは実験で生物から採取した細胞で行い、該細胞への構築物の挿入後、これらの細胞を生物に再導入する。次いで、目的の物質が動物内でその効果を発揮することができるように動物内で構築物の発現を誘導する。
【０００４】
組み込んだ遺伝子が発現するか処理した個体のみで効果を発揮し、その効果が形質転換細胞の一生に限定されるという事実は、体細胞における遺伝子構築物移入における固有の欠点である。その後の世代には移入されない。
【０００５】
体細胞遺伝子移入では、標的細胞の特徴および／または挙動に否定的な影響を与え得る他の頻繁に遭遇する問題には、特に、多大な努力および挿入構築物組み込みの偶然性によってのみ、安定にトランスフェクションした十分に多数の特異的標的細胞が頻繁に得られるという事実が含まれる。さらに、挿入構築物によってコードされるポリペプチドの不十分な発現に関する問題がしばしば起こり、それに伴うＤＮＡレベルの問題点は細胞内および細胞外障害物にも関連し、それぞれ調査しなければならない。したがって、上記の問題は、広義での生物工学における体細胞遺伝子移入への適用の使用を制限し、これは特に家畜生産で顕著である。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、先行技術の欠点の排除であり、特定の目的の物質の新規の製造法を提供することにある。
【０００７】
この目的は、第１の工程で物質をコードするヌクレオチド配列を使用して細胞を形質転換し、形質転換細胞をクローニング工程に供し、クローニング工程で得られた細胞を宿主生物に導入する、物質の組換え製造法によって達成される。
【０００８】
この方法の第１の工程で使用した細胞は、クローニング法に供することができる個体から単離した任意の細胞であり得る。これらの例は、特に、胚または成体線維芽細胞、始原生殖細胞、顆粒膜細胞、胸腺細胞、脾細胞、肝細胞、マクロファージ、精巣もしくは卵巣細胞などである。したがって、細胞を単離または培養することにより、形質転換前にクローニング法に供することもできる。
【０００９】
好ましい実施形態によれば、形質転換に使用される細胞は、既に利用可能な細胞クローン、細胞培養物、または生物から単離される。本発明の意味では、細胞クローンを、インビトロでクローン化した培養細胞、クローニングによって得られた胎、またはクローン化動物と定義する。
【００１０】
次いで、細胞を、目的の物質をクローニングするヌクレオチド配列を使用して形質転換する。この文脈では、物質を、タンパク質、多糖類、脂質などならびに挿入ヌクレオチド配列を示す細胞、組織、および器官などの体内で合成される全ての物質と定義する。したがって、物質をコードするヌクレオチド配列は、配列を直接コードする配列だけでなく、細胞内または細胞外に目的の物質を形成する異なるポリペプチド／酵素をコードする配列である。本発明の文脈では、「組換え体」を、動物が外因的または内因的に変化するが、例えば分化特異的発現パターンまたは発現量などの組換え遺伝子技術によって発現パターンが変化する遺伝子と定義する。
【００１１】
現在公知の全ての技術を、物理的、化学的、またはウイルス技術などの形質転換に使用することができる。ゲノム中の特定の部位での構築物の標的化組み込みに照らして、相同組換えの使用が好ましい。巨大な遺伝子クラスターを宿主細胞に挿入する場合、人工染色体の使用も可能である。細胞ハイブリッドもまた、マッピングで使用されるように、産生動物ゲノムに加えて標的ゲノム由来の特異的染色体フラグメントも含むように作製および選択することができる。これは標的ゲノム系の全てが例えば免疫グロブリン遺伝子系などに移入された場合に特に有利である。
【００１２】
次いで、細胞をクローニング法に供する。クローニング法は公知であり、例えば、ＰＣＴ／欧州特許第９８／００２３０号（国際公開公報第９９／３６５１０号）およびＰＣＴ／欧州特許第００２２９号（国際公開公報第・・号）（参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。次いで、クローン化細胞を、インビボおよび／またはインビトロで特定の発達段階まで（例えば、胎まで）増殖させ、その後宿主細胞に組み込む（請求項１の工程ｃ）。同様に、クローン化細胞を、一定の分化時点まで増殖させ、一定の既に分化した細胞を宿主生物に組み込む。
【００１３】
次いで、クローン化細胞を宿主細胞に挿入し、宿主細胞は動物、動物の胎、動物の胚、または動物の細胞凝集体ならびにクローン化動物、クローン化動物胎児、クローン化動物胚、および細胞凝集体であり得る。好ましい実施形態では、形質転換してクローニング法に供した元のドナー細胞は、宿主生物と遺伝子型が同一である。
【００１４】
このような方法の利点は、好ましくは新規の発現のための遺伝子を含む同一の遺伝子型の細胞を有する、既に利用可能な、すなわち、ストックの宿主生物を非常に短時間で得ることができ、これが組換え物質を産生することができることである。従来の生殖細胞遺伝子移入と比較して産生準備ができた動物を得るまでの５年までもの時間の節約が実現された。さらに、本発明の方法は、節約時間ならびにより迅速に産生される産生系およびそれによるコストの節約にもかかわらず、産生生物をより高い費用効果で作製することができるので、より効率的でもある。したがって、クローンであり、先天的に同一の遺伝子型を有するので、既に生きた動物が利用可能であることに加えて、形質転換用の元のドナー細胞としてインビトロで利用可能なクローン細胞を使用し、形質転換およびクローニング後に宿主生物に導入することが可能である。
【００１５】
本明細書に記載の体細胞クローニング遺伝子移入法のさらなる利点はまた、組換えタンパク質が発現した場合の新たな要求または必要性に迅速に応答することができることである。通常、世代間隔の短い産生動物種（実施例７のウサギなど）を使用した場合でさえも、発現遺伝子の最初の研究に十分な材料が利用可能となるまでには構築物の作製後７ヶ月を要し得る。標的ポリペプチドの産生にはさらなる年月を要する。畜牛の場合、目的のポリペプチドをトランスジェニック動物によって得ることができるまでに、このプロセスに少なくとも３〜４年かかる。対照的に、本発明の方法は、既に利用可能な宿主生物で新規の構築物を使用して細胞を形質転換し、発現クローンを得るための時間を非常に短縮することができる（わずか２ヶ月）。
【００１６】
したがって、本発明の方法により、インビトロ細胞培養の期間に匹敵する期間で分析用の第１のタンパク質量を得ることが可能であり、本発明によれば、標的物質の産生に使用することができる産生系は既に付加的に利用可能である。したがって、標的物質の製造のために、宿主生物または動物を、迅速に使用することができる。
【００１７】
場合によっては、特にその後の体細胞遺伝子移入用のストックのために産生されるか産生すべきである宿主生物の調製に有利である。これは、発現または徴候（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）を改善するために宿主生物中に存在する細胞または構造と比較して有利な適用トランスジェニックまたはその他の処理細胞が得られる場合に特に必要である。
【００１８】
この目的のために、例えば宿主生物中の一定の細胞、組織、または器官を除去することができ、これを物理学的、化学的、免疫学的、分子遺伝学的、または手術による方法を使用して行うことができる。さらに、特定の遺伝子座でネガティブに交配した動物または胎児はホモ接合体ネガティブであるか（選別の概念）、保存して必要に応じて使用する。
【００１９】
宿主生物中の一定の細胞、組織、または器官を使い果たす１つの可能性は、発達段階特異的または誘導可能プロモーターの制御下にある構築物を含む、すでにトランスジェニックの生物を使用することである。第１の例では、特定の発生段階の間のプロモーターの活性化の際、組織特異的タンパク質が自動的に作製されて、特定の細胞（例えば、ジフテリア毒素）がアポトーシスを起こすかまたは死滅する。第２の例では、テトラサイクリンまたはエクジソンなどの特異的なエフェクターの適用によって適切な組織特異的プロモーターがプレプログラミングされた自殺遺伝子構築物が活性化され、細胞、組織、または器官が特異的に枯渇する。
【００２０】
このような生物の調製および成長を簡単にできるものは、一旦生物に導入されると確実に子孫に継代することができる構築物を使用したクローニングである。この使用により、生物中のこの任意の細胞、組織、または器官がその増殖または発達において必要に応じて影響を受け得ることが明白である。
【００２１】
一定の細胞の枯渇の例として、細胞／組織（通常、乳腺が発生する）の除去を使用することができる。動物の出生時に、これらの細胞が比較的少数で存在する。これらの細胞は最初の妊娠時のみで発生し、出生直前に爆発的に増殖して機能的乳腺を形成する。したがって、少数しか存在しないこれらの動物の乳腺幹細胞が宿主生物の発達初期段階で除去され、除去細胞が特定の組換え物質合成のための発現がプログラミングされたこの型の組換え（形質転換）細胞に置換される場合、この様式で得られた動物において、適用された形質転換細胞から乳腺が発達するという結果が得られる。したがって、産生動物中で、導入された哺乳動物系において、組み合え物質もまた発現する。このような方法で節約された時間は約３年である。
【００２２】
さらなる例は、例えば照射、または別の方法および本発明によって形質転換された形質転換幹細胞との置換、およびクローニング法による宿主生物からの血液幹細胞または免疫系の幹細胞の全部または部分的除去であり、これにより例えばヒト化抗体（ＡＢ）またはＡＢフラグメント（例えば、二重特異性ＡＢ）または他の動物もしくはヒト血液因子を発現可能である。クローン化された幹細胞において動物の免疫グロブリン遺伝子がインビトロでヒトの遺伝子と置換された場合、および本発明の方法を使用してこれらの細胞が宿主生物に導入された場合、該宿主生物はヒト疾患治療に非常に価値があり得るヒト同一性ポリクローナル抗体を形成する。
【００２３】
さらに、本発明の方法を用いて、動物中に存在するが回収するには動物中の濃度が低すぎて商業上の目的とされなかった因子についての有効且つ問題のない系を得ることができる。これの１つの例は、非常に強力なプロモーター下でのいくつかのヘパリン合成遺伝子の発現である。ヘパリンは生物中に天然に存在するので、同一遺伝子型であるならば好ましい細胞に対しても、産物に対しても免疫反応を起こさないであろう。
【００２４】
細胞の再クローニングは、少なくとも３回繰り返すことができる。細胞は１５０回分裂することができることが発見されている；言い換えれば、クローニング法由来の細胞は通常の細胞よりも実質的に長く生き延びるので、数回のクローニング後でさえも動物中で生存し、少なくとも動物が生存している限り遺伝子を発現することができる。
【００２５】
類似の様式および上記の適用範囲のさらなる開発において、入手利用可能な動物、胚、胎児から細胞を採取して、確立された細胞株をインビトロで培養することができる。次いでこれらの細胞株を、公知の方法を使用して遺伝的に改変する。次いで、細胞をインビトロ培養で直接分化させるか、再クローニング後に胎児の器官から単離して「移入遺伝子」または遺伝子型の同種発生細胞として成体の元のドナー生物に導入する。移入遺伝子を除いて、これらの細胞はもとの動物と異ならないので、細胞は動物中で細胞自体を確立することができ、例えば、遺伝子形質転換によって組換え物質を産生する。
【００２６】
さらなる局面によれば、本発明はまた、第１の工程では個体由来の細胞を単離する工程と、該細胞を免疫不全動物生物に導入する工程と、該動物を交配する工程と、該生物中で増殖した細胞を単離する工程と、該単離細胞を個体に導入する工程とを含む、細胞、組織、または器官の製造法に関する。
【００２７】
動物宿主生物中の細胞が増加するかさらに成長して組織および器官を形成するので、この方法は好ましくは動物中のヒト起源の細胞、組織、および器官の培養に特に適切である。
【００２８】
好ましい態様によれば、元のドナー個体の細胞またはこれから培養した組織もしくは器官を、これらを採取した個体と同一の個体に戻し、それにより、個体に再導入（移植）した場合に拒絶されない組織または器官を利用可能にする。
【００２９】
免疫不全動物を、元のドナー個体由来の細胞を拒絶しない任意の動物もしくは胎児または動物の胚／細胞凝集体と定義する。免疫欠損を付与された生物ならびに発達段階の免疫系が自己および非自己との間の相違を未だ「学習」していないこのような発生初期段階の生物がこの目的に適切である。したがって、元のドナー個体由来の細胞がこのような宿主生物に導入された場合、これらの細胞は拒絶されないが、本質的に自己として認識され、さらに適切に発達する。
【００３０】
したがって、好ましくは、クローニングによって維持された動物は動物宿主生物として適切である。したがって、ストック中で複数の胎児もしくは胚または細胞凝集体を維持し、必要に応じてもとのドナー個体の細胞を使用してこれらを処理することが可能である。胎児／胚／細胞凝集体を、所望の効果が得られる段階まで（例えば、成熟器官もしくは組織または十分な量の元のドナー個体の細胞が得られる時点まで）成長させる。次いで、この組織／器官またはこれらの細胞を、例えば動物からの器官の取り出しによって採取し、元のドナー個体に移植する。本来、これは、特定の器官の除去に依存した動物の屠殺を含み得る。
【００３１】
元のドナー個体の細胞を、従来の宿主生物に導入することができる。この場合、動物は動物自体の細胞／組織／器官を有する細胞／組織／器官由来のキメラを形成すると予想されるに違いない。動物自体の細胞が元のドナー個体に再導入されることを確認するために、特定の全組織／器官／細胞を単離し、動物細胞を分離し、例えば、動物細胞に対する抗体の使用およびＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離装置）を使用した分離によってこれを行うことができる。
【００３２】
しかし、好ましい態様によれば、宿主生物由来の罹患細胞／組織／器官を除去し、これを上記のように行うことができる。
【００３３】
したがって、例えば、器官系が除去された胎児宿主生物では、元のドナー個体（例えば、関連器官から直接採取した成体ヒト幹細胞など）の対応する器官特異的幹細胞を胎児に導入し、枯渇細胞と置換し、特定の器官を形成させる。これを行うと、移植に適切な異種器官を有するキメラ生物が作製される。罹患器官は動物中に免疫能を示さない胎児によって拒絶されない異種器官を示す。元のドナー個体（例えば、ヒト患者）への首尾の良い移植後、ヒト幹細胞を使用した場合、外因性ではなく同種異系移植であるか、適切ならば自家移植でさえも、器官が特定の個体／患者の成体幹細胞から作製された場合、約１年の時間が必要であるにもかかわらず一定の器官および疾患（例えば、腎臓または肝臓）の場合可能である。
【００３４】
したがって、本発明の方法の使用により、一定の患者でさえも実質的または絶対的にＭＨＣ型が一致した器官を迅速に得ることができるように短期間内で細胞、組織、または器官を作製可能である。したがって、本発明の方法により、移植に利用可能な器官／組織の不足という現在の問題が解決される。
【００３５】
以下の実施例は、本発明を制限することなく本発明を説明する。実施例では、非トランスジェニッククローン化子牛の血清由来の二重特異性抗体の採取を記載する。ＰＣＴ／欧州特許第９８／００２３０号およびＰＣＴ／欧州特許第９８／００２９号（参照として本明細書に組み入れられる）を参照して、トランスジェニック骨髄細胞を有する子牛の作製のために以下の工程を行った。
【００３６】
１．初代ウシ胎児線維芽細胞の採取および遺伝子形質転換。
２．宿主動物へのトランスジェニック胚の核移入によるクローニング。
３．胎児の採取および胎児肝臓からのトランスジェニック骨髄幹細胞の単離。
４．同一の染色体遺伝子型の利用可能なクローン子牛へのトランスジェニック細胞の注入。
５．採血による血清の採取。
６．二重特異性抗体による腫瘍細胞の溶解。
【００３７】
実施例１
１．初代ウシ胎児線維芽細胞（ＢＯＦＦ）の採取／遺伝子形質転換。
ａ）種々の抗生物質（選択マーカー）に対するウシ胎児線維芽細胞（ＢＯＦＦ）の感受性の調査
ＢＯＦＦを半コンフルエントにプレートし、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン、ピューロマイシンについての濃度および効果／時間に対する感受性を試験した。種々のＢＯＦＦ調製物は、ＬＤ１００への到達に必要な抗生物質の濃度が明確に（２１００倍まで）異なった。調製物間および調製物内の時間／効果ウィンドウは一部非常にシフトしていた。１．５μｇ／ｍｌで濃度でピューロマイシンを使用して最良の結果が得られた（安定なヒトまたはマウス線維芽細胞株の選択に対して３〜５倍の濃度）。
【００３８】
確立された細胞株のトランスフェクションのために従来から使用されている種々のトランスフェクション法を、ＢＯＦＦにおけるその効率（抗生物質耐性クローン／トランスフェクション比）について試験した。以下を試験した。
ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ、リポフェクション、ポリカチオン性脂質）；
ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、リポフェクチン、ポリカチオン性脂質）；
ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カチオン性および両親媒性［ｓｉｃ］脂質）；
ＴｒａｎｓＦａｓｔ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カチオン性および両親媒性脂質）；
１２％ＤＭＳＯの存在下でのＣａ３（ＰＯ４）２ＤＮＡ沈殿物。
【００３９】
抗生物質耐性クローンが得られるような高い希釈度で希釈することなく選択することができる確立された線維芽細胞株と対照的に、ＢＯＦＦは、一定の臨界密度未満でプレートすることができない。各クローンを単離するための１細胞クローンの選択または限界希釈物（ｅｘｔｒｅｍｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）からの増殖の場合、ＢＯＦＦは死滅するか、又は形態学および／または増殖挙動が変化することになる、１つ以上の危険性を経る。したがって、最適な増殖が可能となるようにプレーティング密度を選択した。しかし、これにより、集団を構成する細胞が抗生物質耐性を示し、これはクローン起源ではない。その後の単離およびサブクローニングにより、トランスジェニッククローン細胞を作製する。
【００４０】
ｂ）ＢＯＦＦにおけるＳｃＦｖおよびｐＪＷ６ｐｕｒｏでのトランスフェクション
使用プラスミド：
ＭＡＲ：：ＳｃＦｖ：ＭＡＲ配列（ニワトリリゾチーム遺伝子基質結合領域；Ｃａｓｔｉｌｌａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６、１９９８、３４９）を、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のＳｃＦｖ、ｐＵＣ１８（Ｎｏｒａｎｄｅｒら、Ｇｅｎｅ、２６、１９８３、１０１）中のｐ７７（Ｂｒｅｍら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、４３、１９９５、１７５）を使用してクローン化した。
【００４１】
ｐＪＷ６ｐｕｒｏ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ ＆ Ｌａｎｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８、１０６８）ｐ７７およびＭＡＲ：：ＳｃＦｖを線状化して、構築物の機能的組み込みを確認した。制限酵素切断点の利用可能性に基づいて、ベクター配列を遺伝子構築物の配列から分離できなかった。ｐＪＷ６ｐｕｒｏを、環状に突き刺す／スーパーコイルにした。使用ＤＮＡ量またはＳｃＦｖ：選択マーカー混合比は８：１（２．５μｇ  ｐ７７＋２．５μｇ  ＭＡＲ：：ＳｃＦｖ＋０．６μｇ  ｐＪＷ６ｐｕｒｏ＝５．６μｇの全ＤＮＡ）または３：１（０．７μｇ  ｐ７７＋０．９μｇ  ＭＡＲ：：ＳｃＦｖ＋０．６μｇ  ｐＪＷ６ｐｕｒｏ＝２．２μｇの全ＤＮＡ）であった。
【００４２】
これを行う場合、１年以上前の胚のトランスフェクションおよび移入後にＢＯＦＦ＃３２３３０２０１ｐ１細胞を使用して、クローン子牛（１０匹の子牛が誕生）を作製した。トリプシン処理後、細胞懸濁液を１０ｍｍの培養プレートに移し、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｂｅｒｌｉｎ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して培養した。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２を含む空気の下で細胞シートがサブコンフルエント（２〜３日間）になるまで培養し、この「０世代」の一部を凍結し（１０％ジメチルスルホキシド、Ｓｉｇｍａ）、液体窒素中で保存した。
【００４３】
トランスフェクション調製物：トランスフェクション前にＢＯＦＦを６ウェル培養皿（直径３５ｍｍ）（ＭＥＭ、１５％ＦＣＳ、１×グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン）中でプレートし、サブコンフルエント（約５×１０４〜１０５細胞）にした。細胞による線維芽細胞形態学の設定および発現後にトランスフェクションを行った。それぞれ直径３５ｍｍのプレートについてトランスフェクション実験を行った。トランスファースト（登録商標）リポフェクション：ＤＮＡ：リポソーム比＝１：２、インキュベーション時間は１．５時間。
【００４４】
Ｃａ３（ＰＯ４）２ＤＮＡ沈殿トランスフェクション：
４時間のインキュベーション後、２分間の１２％ＤＭＳＯの添加によってトランスフェクション効率が増加した（Ｍｕｌｌｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２、１９９３、４２２１）。
【００４５】
トランスフェクタントプールの選択、確立、および分析：
トランスフェクションの２４時間後に選択培地を添加した。６ウェル培養プレート中での選択から２日後、１つの直径３５ｍｍウェルの細胞を２４ウェルプレートに１：１５０で分割した（濃度２８×１０２細胞／ウェル）。プレート上でのプロ（登録商標）ＢＯＦＦとのサブコンフルエント増殖まで選択を継続した（４９日間）。プールを拡大し、低温保存し、ＰＣＲを使用してｐ７７ＭＡＲ：：ＳｃＦｖでの首尾の良いトランスフェクションについて試験した。
【００４６】
ＳｃＦｖトランスフェクタントのスクリーニング：
プライマー３７７Ｌ２／ｆ  ５′ＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＧ３′および
３７７Ｒ２５′ＣＧＣＡＧＡＧＴＣＣＡＣＡＧＡＧＧ３′
（アニーリング温度、６６℃；１ｋｂ増幅物）
【００４７】
ｐ７７トランスフェクタントのスクリーニング：
プライマー：  ２４６  ５′ＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＣＣＡＡＧ３′および
２５１  ５′ＧＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣ３′（アニーリング温度、６２℃；２．５ｋｂ増幅物）
プライマー：  ２４８  ５′ＧＡＴＧＣＴＴＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＣＴＧ３′および
２５１  ５′ＧＴＣＣＣＧＡＧＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣ３′（アニーリング温度、６０℃；１．２ｋｂ増幅物）
【００４８】
ＰＣＲの結果：
トランスファースト（登録商標）リポフェクション：両試験ＤＮＡ比を使用してｐ７７／ＭＡＲ：：ＳｃＦｖポジティブプールなし。
【００４９】
Ｃａ３（ＰＯ４）２ＤＮＡ沈殿トランスフェクション：目的のＤＮＡ：選択マーカー＝３：１：ｐ７７／ＭＡＲ：：ＳｃＦｖポジティブプールなし。
【００５０】
Ｃａ３（ＰＯ４）２ＤＮＡ沈殿トランスフェクション：目的のＤＮＡ：選択マーカー＝８：１（プール３）：ｐ７７にポジティブな２４プールのうちの６プールおよびポジティブクローン／プールのＭＡＲ：：ＳｃＦｖ特徴づけ：Ａ３、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ６（強いシグナル）。
【００５１】
実施例２
ＰＣＴ／欧州特許第９８／００２２９号に記載の方法に従って動物をクローン化し、トランスジェニック胚を宿主動物に移入した。
【００５２】
実施例３
胎児の採取および胎児肝臓由来のトランスジェニック骨髄幹細胞の単離。
妊娠中期のトランスジェニックウシ胎児を採取した。この期間（胎児発達の肝臓造血期（ｈｅｐａｔｏｌｉｎｅａｌ ｐｅｒｉｏｄ））では、肝臓は血液形成の主要部位であり、全血球の幹細胞（血球始原細胞）の所在地である。リンパ球産生の間の骨髄腔への移動後に、これらの血球始原細胞からＢリンパ球が発達する。胎児の肝臓を無菌状態で採取し、４μｇ硫酸ゲンタマイシンおよび抗凝固剤として２００ＩＵ／ｍｌヘパリンを含むＲＰＭＩ培地に置いた。厳密な滅菌条件下で各細胞の分離を行った。
【００５３】
実施例４
同一の染色体遺伝子型のクローン子牛へのトランスジェニック細胞の導入
静脈内カテーテル注入（１４ゲージ、１．７ｍｍ×６４ｍｍ、Ｔｅｒｎｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）によって胎児造血細胞の生理食塩水懸濁液または培地の移植を行う。
【００５４】
実施例５
採血による血清の採取および精製
トランスジェニック血球の導入後、頸静脈穿刺によって一定間隔で採血する。血液の遠心分離（１０００×ｇ、３０分）によって血球から血清を分離する。アジ化ナトリウム（最終濃度：０．０２％）を血清に添加し、その後酢酸セルロースフィルター（０．２２μｍ）で濾過する。残渣を、１Ｍ  ＮａＯＨｗｏ使用してｐＨ７．２に調整する。ｂｉｓｃＦＶ分子の浄化のために、培養残渣を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したタンパク質Ｌ−アガロースカラム（＃２０５２０ Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＩ、ＵＳＡ）に通過させる（タンパク質ＬはヒトＩｇＧの特に一本鎖可変エレメント（ＳｃＦｖ）に結合するが、ウシＩｇＧ１およびＩｇＧ２に結合しない）。培養残渣の適用後、カラムベッドを０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄する。結合タンパク質を、ｐＨ３．０および２．０の０．１Ｍグリシン緩衝液を段階的に使用して溶出する。回収した溶出液をＰＢＳに対して一晩透析し、０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存する。
【００５５】
実施例６
二重特異性抗体を使用した腫瘍細胞の溶解
二重特異性抗体の生物活性を、５０００個のＳＫＭｅｌ６３またはＭ２１腫瘍細胞を使用した細胞傷害性試験によって試験する。これら２つの黒色腫細胞株は、９．２．２７モノクローナル抗体（ｓｃＦｖ部分のみ）によって認識されるＨＭＷＧ（高分子量糖タンパク質）標的抗原に強い陽性を示す。末梢血リンパ球（健常なヒトドナーから新たに採取し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によって単離したＰＢＬ）を、１０：１の比で標的細胞に添加する。次いで、９．２．２７×ＣＤ３特異性を示す１５０μｇ／ｍｌの化学的に接合したｂｓＦ（ａｂ′）２（全Ｔリンパ球のパンクローナル（ｐａｎｃｌｏｎａｌ）刺激についての全細胞培養プレート中での黒色腫×Ｔリンパ球（この濃度のみでは移動特性を示さない））を添加し、血清から精製した組換えｂｉｓＦｖ分子を直接添加する。マイクロタイタープレート中の細胞培養プレートあたりの全実験調製物の体積は１５０μｌである。プレートを３７ｄｃ／５％ＣＯ２のインキュベーター中で５日間インキュベートする。ＰＢＳでの複数回の洗浄後に非接着血液リンパ球が除去され、残存する接着腫瘍細胞のみが細胞培養皿に残存する（目視）。１００μｌの新鮮な培地および１０μｌの細胞増殖株ＷＳＴ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、＜カテゴリー＞省略、Ｎ  １６４４  ８０７）を細胞培養皿に添加する。次いで、インキュベーター中で１〜４時間インキュベートし（４７ｄｃ／５％ＣＯ２）、ＥＬＩＳＡリーダー（４８０ｎｍ）で評価する。目視による評価および光学密度の低さは１００％の腫瘍細胞の死滅を示す。これは、トランスジェニック血球中で産生された組換え二重特異性抗体は非常に有効であることを証明している。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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