(57)【要約】ＲＥＭＳ−ＰＣＲ法、制限エンドヌクレアーゼを使用するネステッドＰＣＲ法、および分子ビーコンを使用するＲＥＭＳ−ＰＣＲ法においてターゲット特異的プライマーおよびプローブを使用して、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、およびＨ−ｒａｓにおける突然変異を決定された。
2004518412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１３を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
１または２以上の蛍光成分と、１または２以上の蛍光クエンチング成分とをさらに含んでなる請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
（ｉ）    １または２以上の蛍光成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されておりそして１または２以上の蛍光クエンチング成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されておりそして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的であり、あるいは
（ｉｉ）   １または２以上の蛍光成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されておりそして１または２以上の蛍光クエンチング成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されておりそして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的である、
請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記蛍光成分がカルボキシフルオレセイン、カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ジメトキシフルオレセイン、またはカルボキシローダミンであり、そしてクエンチング成分が （４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ） 安息香酸） または４−（ジメチルアミン） アゾベンゼンスルホン酸である、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは１または２以上の蛍光成分と、１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなる１又は複数のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
（ｉ）   １または２以上の蛍光成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的であり、あるいは
（ｉｉ）   １または２以上の蛍光成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的である、
請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記蛍光成分がカルボキシフルオレセイン、カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ジメトキシフルオレセイン、またはカルボキシローダミンであり、そしてクエンチング成分が （４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ） 安息香酸） または４−（ジメチルアミン） アゾベンゼンスルホン酸である、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
１または２以上の蛍光成分と、１または２以上の蛍光クエンチング成分とをさらに含んでなる請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
（ｉ）   １または２以上の蛍光成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的であり、あるいは
（ｉｉ）   １または２以上の蛍光成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的である、
請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記蛍光成分がカルボキシフルオレセイン、カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ジメトキシフルオレセイン、またはカルボキシローダミンであり、そしてクエンチング成分が （４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ） 安息香酸） または４−（ジメチルアミン） アゾベンゼンスルホン酸である、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
下記の工程を含んでなる試料中の突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを増幅する方法：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、および野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、
を含んでなる混合物形成し；そして、
（Ｂ）   前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付す。
【請求項１９】
下記の工程を含んでなるＤＮＡ中の突然変異ｒａｓを決定する方法：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、および野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、
を含んでなる混合物形成し；そして、
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  ＤＮＡを電気泳動により分離し；そして
（Ｄ）  工程 （Ｃ） における電気泳動により分離された突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを検出する。
【請求項２０】
下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、および野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、
を含んでなる混合物形成し；そして、
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  増幅したＤＮＡを含んでなる混合物を１または２以上の固定化オリゴヌクレオチドまたは固定化することができる１または２以上のオリゴヌクレオチドと組み合わせ、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、これにより突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを捕捉することができ；そして
（Ｄ）  突然変異体ｒａｓ配列を含んでなる捕捉されたＤＮＡを検出する。
【請求項２１】
１または２以上の固定化オリゴヌクレオチドまたは固定化することができる１または２以上のオリゴヌクレオチドの配列を配列番号７、配列番号８、または配列番号９から選択する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、および野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、および
（ｉｖ） １または２以上の蛍光成分と１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションしかつそれに対してハイブリダイゼーションしたとき検出可能な蛍光を生成することができる、
を含んでなる混合物形成し；
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；そして   （Ｃ）  蛍光を検出する。
【請求項２３】
（ｉ）   １または２以上の蛍光成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖しており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的であり、あるいは
（ｉｉ）   １または２以上の蛍光成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的である、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光成分がカルボキシフルオレセイン、カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ジメトキシフルオレセイン、またはカルボキシローダミンであり、そしてクエンチング成分が （４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ） 安息香酸） または４−（ジメチルアミン） アゾベンゼンスルホン酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
下記の工程を含んでなる試料中の突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを増幅する方法：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
を含んでなる混合物形成し；
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  前記混合物を配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対と組み合わせ、ただし前記プライマーの少なくとも１つは工程 （Ａ） におけるプライマーと異なり；
（Ｄ）   前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｅ）   前記混合物を野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと組み合わせる。
【請求項２６】
下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
を含んでなる混合物形成し；
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  前記混合物を配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対と組み合わせ、ただし前記プライマーの少なくとも１つは工程 （Ａ） におけるプライマーと異なり；
（Ｄ）   前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｅ）   前記混合物を野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと組み合わせ；
（Ｆ）   電気泳動によりＤＮＡを分離し；そして
（Ｇ）   工程 （Ｆ） において電気泳動により分離された突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを検出する。
【請求項２７】
下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
を含んでなる混合物形成し；
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し、
（Ｃ）  前記混合物を配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対と組み合わせ、ただし前記プライマーの少なくとも１つは工程 （Ａ） におけるプライマーと異なり；
（Ｄ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｅ）   前記混合物を野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと組み合わせ；
（Ｆ）   増幅されたＤＮＡを含んでなる混合物を１または２以上の固定化オリゴヌクレオチドまたは固定化することができる１または２以上のオリゴヌクレオチドと組み合わせ、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、これにより突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを捕捉することができ；そして
（Ｇ）   突然変異体ｒａｓ配列を含んでなる捕捉されたＤＮＡを検出する。
【請求項２８】
下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
（ｉｖ） １または２以上の蛍光成分と１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションしかつそれに対してハイブリダイゼーションしたとき検出可能な蛍光を生成することができる、
を含んでなる混合物形成し；
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  前記混合物を配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対と組み合わせ、ただし前記プライマーの少なくとも１つは工程 （Ａ） におけるプライマーと異なり；
（Ｄ）   前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｅ）   前記混合物を野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと組み合わせ；そして
（Ｆ）   蛍光を検出する。
【請求項２９】
（ｉ）   １または２以上の蛍光成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的であり、あるいは
（ｉｉ）   １または２以上の蛍光成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的である、
請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記蛍光成分がカルボキシフルオレセイン、カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ジメトキシフルオレセイン、またはカルボキシローダミンであり、そしてクエンチング成分が （４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ） 安息香酸） または４−（ジメチルアミン） アゾベンゼンスルホン酸である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
１または２以上の容器中に、
（ｉ）   配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）    配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、１または２以上のオリゴヌクレオチドは１または２以上の蛍光成分と１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなる、
を含んでなるキット。
【請求項３２】
（ｉ）    １または２以上の蛍光成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的であり、あるいは
（ｉｉ）   １または２以上の蛍光成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的である、
請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記蛍光成分がカルボキシフルオレセイン、カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ジメトキシフルオレセイン、またはカルボキシローダミンであり、そしてクエンチング成分が （４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ） 安息香酸） または４−（ジメチルアミン） アゾベンゼンスルホン酸である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
１または２以上の容器中に、
（ｉ）   １または２以上のヌクレオシドトリホスフェート、
（ｉｉ）   野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ、および
（ｉｉｉ）   １または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
をさらに含んでなる請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のターゲット突然変異配列を増幅し、決定する方法：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 突然変異ターゲット配列に対して特異的な１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、
（ｉｖ） １または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
（ｖ） １または２以上のターゲットの野生型ＤＮＡ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位、または両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、
（ｖｉ） １または２以上の蛍光成分と１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションしかつそれに対してハイブリダイゼーションしたとき検出可能な蛍光を生成することができる、
を含んでなる混合物形成し；
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；そして
（Ｃ）  蛍光を検出する。
【請求項３６】
（ｉ）   １または２以上の蛍光成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的であり、あるいは
（ｉｉ）   １または２以上の蛍光成分が５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、５’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分が３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖されているか、３’末端のヌクレオチドに連鎖されているか、またはその両方に連鎖されており、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的である、
請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記蛍光成分がカルボキシフルオレセイン、カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ジメトキシフルオレセイン、またはカルボキシローダミンであり、そしてクエンチング成分が （４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ） 安息香酸） または４−（ジメチルアミン） アゾベンゼンスルホン酸である、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、突然変異の存在を決定するプライマー、プローブおよび方法に関する。より詳しくは、本発明は、制限仲介選択ポリメラーゼ連鎖反応 （ＲＥＭＳ−ＰＣＲ） およびネステッドＰＣＲ法を使用してｒａｓ突然変異の存在を決定するプライマー、プローブおよび分子ビーコンに関する。
【０００２】
発明の背景
オンコジーンのｒａｓファミリー （Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、およびＮ−ｒａｓ） は、ＧＴＰアーゼ活性を有する膜タンパク質をコードする。通常ｒａｓコドン１２、１３、または６１内の、特異的点突然変異はこれらのプロトオンコジーンを活性化し、引き続いて新形成を生ずることがある（Ｂｏｓ Ｊ． Ｌ．、１９８９、 Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ４９：４６８２−４６８９）。
【０００３】
ｒａｓ突然変異が起こる頻度は異なる腫瘍型の間で変化する。最高の頻度は内分泌膵臓からの腫瘍の中に見出され、ここで腫瘍の８０％より多くが突然変異したＫ−ｒａｓ遺伝子を収容する （Ｂｏｓ他、１９８９、Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ４９：４６８２−４６８９）。Ｈ−ｒａｓ突然変異は、尿道腫瘍におけるＮ−ｒａｓおよびＫ−ｒａｓ突然変異より高い頻度で起こる。Ｈ−ｒａｓオンコジーンの頻度は５％〜１７％において推定された （Ｓａｔｉｔｏ Ｓ． 他、１９９６、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｕｒｏｌ． ４：１７８−１８５）。Ｈ−ｒａｓオンコジーンの突然変異は膀胱腫瘍の患者の尿中で検出され （Ｈａｌｉａｓｓｏｓ Ａ． 他、１９９２、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １：７３１−７３４）；潜在的に新形成を検出する非侵襲性手段を表す。Ｈ−ｒａｓの突然変異は他の癌、例えば、甲状腺および腎臓の癌腫 （Ｂｏｓ Ｊ． Ｌ．、１９８８、Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． １９５：２５５−７１）、およびヒト一次乳癌 （Ｔｈｅｉｌｌｅｔ Ｃ． 他、１９８６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６：４７７６−４７８１） において報告された。
【０００４】
Ｎ−ｒａｓ遺伝子の突然変異は最も普通には骨髄およびリンパ系の癌の中に見出される。Ｂｏｓ （Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． １９５：２５５−７１） の報告によると、白血病患者の約１／３は、初期段階の白血病前および急性白血病の両方において、突然変異したｒａｓ遺伝子、主としてＮ−ｒａｓを有する。また、Ｎ−ｒａｓの突然変異はヒトリンパ系悪性疾患において報告された （Ｎｅｒｉ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：９２６８−９２７２）。より稀には、Ｎ−ｒａｓの突然変異は他の癌腫、例えば、骨髄腫、および肝臓および甲状腺の癌腫において検出された。
【０００５】
結腸癌のほぼ４０〜５０％はｃ−Ｋ−ｒａｓ遺伝子において突然変異を示し、これらを突然変異の８６％はコドン１２および１３に存在する （Ｂｏｓ Ｊ． Ｌ．、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ ３２７：（６１２０） ２９３−７、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ． 他、１９８８、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１９：５２５−５３２）。ｒａｓ突然変異は、ｒａｓタンパク質の本来のＧＴＰアーゼ活性が減少するために、細胞増殖を増加させる。
【０００６】
リンパ節の転移は結腸直腸癌腫における予後の重要な予測因子である （Ｃａｌａｌｕｃｅ Ｒ他、１９９８、Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ． ６７：１９４−２０２）。Ｔｕｒｎｂｕｌｌ他（１９６７， Ａｎｎ． Ｓｕｒｇ． １６６：４２０−７） は結腸の腺癌のもとの分類 （Ｄｕｋｅｓ Ｃ． Ｅ．、１９３２、Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ３５：３２３−３３２） を４つの臨床病理学的段階に拡張した：段階Ａ−結腸およびそのコートに制限される腫瘍；段階Ｂ−結腸周囲の脂肪の中への腫瘍の拡張；段階Ｃ−領域的腸間膜リンパ節への腫瘍の転移、しかし遠い広がりの証拠は存在しない；段階Ｄ−肝臓、肺、骨への腫瘍の転移。アジュバント療法はＤｕｋｅｓ Ｃ （段階ＩＩＩ） の結腸癌においてかなり有益であるが、アジュバント治療の統計的利益はＤｕｋｅｓ Ｂ患者において証明されてなかった （Ｍｏｅｒｔｅｌ Ｃ． Ｇ． 他、１９９０、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２２：３５２−８）。こうして、Ｄｕｋｅｓ Ｂ患者は一般に外科手術後アジュバント療法を受けない。これらの患者のほぼ２０〜３０％は転移性疾患を発生させるであろう。
【０００７】
全１１７３人のＤｕｋｅｓ Ｂを含む２７２１人の患者の大きいマルチセンター研究において、多変量の解析において、ｒａｓ突然変異の存在がＤｕｋｅｓの段階において再発性および死亡の危険を増加させることが示唆された （Ａｎｄｒｅｙｅｖ Ｈ． Ｊ． Ｎ． 他、１９９８、Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９０ （９）：６７５−６８４）。再発および死亡の危険は Ｄｕｋｅｓの段階が高くなるととともに増加した。サウスウェスト・オンコロジー・グループ （Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ） からの研究において、Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の突然変異は結腸癌の４１％において起こり、段階ＩＩＩではなく、段階ＩＩの劣った予後に関係付けられることが結論された。段階ＩＩにおいて、ｒａｓ突然変異を有する患者の７年の生存率は５８％であったが、野生型ｒａｓの患者の７年の生存率は８６％であった （Ａｈｎｅｎ Ｄ． Ｊ． 他、１９９８、Ｃａｎ． Ｒｅｓ． ５８：１１４９−１１５８）。
【０００８】
最近、研究者らは、結腸直腸癌におけるリンパ節転移の感度の高い検出手段としてＫ−ｒａｓにおける突然変異の決定の利用を検査した。Ｈａｙａｓｈｉ他 （１９９４， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：３８５３−３８５６） は、突然変異体アレレ特異的増幅 （ＭＡＳＡ） 法を使用して、一次腫瘍におけるＫ−ｒａｓまたはｐ５３突然変異について陽性であった２２人の結腸直腸癌患者のリンパ節を検査した。遺伝的変更がリンパ節において検出された１４症例のうちの７症例は、組織学により決定して陰性のリンパ節を有した。引き続く研究 （Ｈａｙａｓｈｉ Ｎ． 他、１９９５、Ｌａｎｃｅｔ ３４５：１２５７−１２５９） において、組織学により陰性のリンパ節を有する１２０人の結腸直腸癌患者がスクリーニングされた。遺伝的に陽性のリンパ節を有する３７人のうち、２７人は外科手術の５年以内に腫瘍を再発したが、分子アッセイにより陰性であった３４人の患者のいずれも再発しなかった。
【０００９】
Ｎａｋａｍｏｒｉ他 （１９９７、Ｄｉｓ． Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ：４０ （Ｓｕｐｐｌ １０）：Ｓ２９−３６） は、一次腫瘍においてＫ−ｒａｓまたはｐ５３の突然変異を有する１７人の患者からの９のリンパ節においてこれらの突然変異のいずれかが検出されることを報告した。突然変異陽性リンパ節を有する９人の患者のうちの２人は肝臓に対する再発を示し、そして突然変異陰性リンパ節を有するすべての８人の患者は無疾患に止まった。Ｋ−ｒａｓおよびｐ５３遺伝子の突然変異ならびにＰ１６プロモーター超メチル化を使用して結腸直腸癌患者におけるリンパ節の転移についてスクリーニングし、分子をベースとする方法は腫瘍細胞の検出の感度を増加させ、そして切除可能な肝臓転移を有する患者においてすぐれた予測因子であることが報告された （Ｍｏｎｓｅｒｒａｔ Ｓ． 他、１９９９、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５：２４５０−２４５４）。
【００１０】
Ａｎｄｒｅｙｅｖ他が指摘するように （１９９８、Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９０ （９）：６７５−６８４）、７５より多い研究グループは結腸直腸癌におけるＫ−ｒａｓ遺伝子の突然変異の意味についてのデータを発表した。幾人かの研究者らはＫ−ｒａｓの突然変異の存在が予後の意味を知らせることを示唆し、そして他の研究者らは反対の結論に到達した。この不一致は、一部分、ｒａｓ突然変異の検出に使用する方法の感度の変動性、および過剰の野生型配列の存在下の突然変異の検出が困難であることにより説明することができる。さらに、試料調製およびＰＣＲ増幅の間の汚染は重大な問題であることがある。
【００１１】
こうして、急速であり、感度が高く、特異的であり、自動化することができる方法を使用して、特に高いレベルの野生型核酸の存在下にｒａｓ突然変異、および他の核酸の突然変異を決定することが要求されている。
【００１２】
発明の要約
前述の要求に従い、本発明は、１または２以上の核酸中の１または２以上の突然変異を増幅し、決定する方法を提供する。
本発明は、ｒａｓ突然変異を増幅し、決定する核酸プライマーおよびプローブを提供する。
本発明は、ｒａｓ突然変異を決定するＲＥＭＳ−ＰＣＲ法を提供する。
本発明は、過剰の野生型核酸の存在下にｒａｓ突然変異を決定するＲＥＭＳ−ＰＣＲ法を提供する。
本発明は、ｒａｓ突然変異を増幅し、決定するために１または２以上の制限エンドヌクレアーゼを使用するプライマー、プローブおよびネステッドＰＣＲ法を提供する。
【００１３】
本発明は、過剰の野生型核酸の存在下にｒａｓ突然変異を増幅し、決定するために１または２以上の制限エンドヌクレアーゼを使用するプライマー、プローブおよびネステッドＰＣＲ法を提供する。
本発明は、低いコピー数のターゲット核酸を有する試料中のｒａｓ突然変異を増幅し、決定するために１または２以上の制限エンドヌクレアーゼを使用するプライマー、プローブおよびネステッドＰＣＲ法を提供する。
１つの態様において、本発明は、自動化することができる汚染を減少する封じ込め装置のような手段および方法を使用して実施される。
【００１４】
１つの面において、本発明は、プローブ、蛍光体および蛍光クエンチャーを使用して１または２以上のＤＮＡ核酸配列中の１または２以上のターゲット突然変異配列を決定する、均質な方法を提供する。より詳しくは、ＤＮＡ試料中の１または２以上のターゲット突然変異配列を増幅し、決定する方法が提供され、この方法は下記の工程を含んでなる：
【００１５】
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 前記ターゲット突然変異配列に対して特異的な１または２以上の１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、
（ｉｖ） １または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
（ｖ） 前記１または２以上のターゲット突然変異配列の１または２以上の野生型配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位、または両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、
（ｖｉ） １または２以上の蛍光成分と１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドはターゲット突然変異配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションしかつそれに対してハイブリダイゼーションしたとき検出可能な蛍光を生成することができる、
を含んでなる混合物形成し；
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し、これにより前記１または２以上のターゲット突然変異配列を含んでなるＤＮＡを増幅し；
（Ｃ）  蛍光を検出する。
【００１６】
他の面において、本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１７】
特に、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７は１または２以上の蛍光成分と１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなることができる。
【００１８】
本発明は、また、下記の工程を含んでなる試料中の突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを増幅する方法に関する：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、および野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、
を含んでなる混合物形成し；そして
（Ｂ）   前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し、これにより突然変異体ｒａｓ突然変異を含んでなるＤＮＡを増幅する。
【００１９】
本発明は、また、下記の工程を含んでなるＤＮＡ中の突然変異ｒａｓを決定する方法に関する：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、および野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、
を含んでなる混合物形成し；その後
【００２０】
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  ＤＮＡを電気泳動により分離し；そして
（Ｄ）  工程 （Ｃ） における電気泳動により分離された突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを検出する。
【００２１】
本発明は、また、下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法に関する：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、および野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、
を含んでなる混合物形成し；
【００２２】
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  増幅したＤＮＡを含んでなる混合物を１または２以上の固定化オリゴヌクレオチドまたは固定化することができる１または２以上のオリゴヌクレオチドと組み合わせ、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、これにより突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを捕捉することができ；そして
（Ｄ）  突然変異体ｒａｓ配列を含んでなる捕捉されたＤＮＡを検出する。
【００２３】
本発明の１または２以上の固定化オリゴヌクレオチドまたは任意の組成で固定化することができる１または２以上のオリゴヌクレオチドの配列、方法またはキットは、配列番号７、配列番号８、または配列番号９から選択することができる。
【００２４】
本発明は、また、下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法に関する：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェート、１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、および野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの熱安定性制限エンドヌクレアーゼ、および
（ｉｖ） １または２以上の蛍光成分と１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションしかつそれに対してハイブリダイゼーションしたとき検出可能な蛍光を生成することができる、
を含んでなる混合物形成し；
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し、これにより突然変異体ｒａｓ突然変異を含んでなるＤＮＡを増幅し；
（Ｃ）  蛍光を検出する。
【００２５】
本発明は、また、下記の工程を含んでなる試料中の突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを増幅する方法に関する：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
を含んでなる混合物形成し；
【００２６】
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  前記混合物を配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対と組み合わせ、ただし前記プライマーの少なくとも１つは工程 （Ａ） におけるプライマーと異なり；
【００２７】
（Ｄ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し、これにより突然変異体ｒａｓ突然変異を含んでなるＤＮＡを増幅し；
（Ｅ）   前記混合物を野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと組み合わせる。
【００２８】
本発明は、また、下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法に関する：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
を含んでなる混合物形成し；
【００２９】
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  工程 （Ｂ） を実施した後製造された混合物を、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対と組み合わせ、ただし前記プライマーの少なくとも１つは工程 （Ａ） におけるプライマーと異なり；
【００３０】
（Ｄ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し、これにより突然変異体ｒａｓ突然変異を含んでなるＤＮＡを増幅し；そして
（Ｅ）   前記混合物を野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと組み合わせ；
（Ｆ）   電気泳動によりＤＮＡを分離し；そして
（Ｇ）   工程 （Ｆ） において電気泳動により分離された突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを検出する。
【００３１】
本発明は、また、下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法に関する：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
を含んでなる混合物形成し；
【００３２】
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  工程 （Ｂ） を実施した後製造された混合物を配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対と組み合わせ、ただし前記プライマーの少なくとも１つは工程 （Ａ） におけるプライマーと異なり；
【００３３】
（Ｄ）   前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し、これにより突然変異体ｒａｓ突然変異を含んでなるＤＮＡを増幅し；
（Ｅ）   前記混合物を野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと組み合わせ；
【００３４】
（Ｆ）   増幅されたＤＮＡを含んでなる混合物を１または２以上の固定化オリゴヌクレオチドまたは固定化することができる１または２以上のオリゴヌクレオチドと組み合わせ、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションし、これにより突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡを捕捉することができ、そして
（Ｇ）   突然変異体ｒａｓ配列を含んでなる捕捉されたＤＮＡを検出する。
【００３５】
本発明は、また、下記の工程を含んでなるＤＮＡ試料中の１または２以上のｒａｓ突然変異を決定する方法に関する：
（Ａ） 下記の成分：
（ｉ） 試料、
（ｉｉ） 配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対、
（ｉｉｉ） 少なくとも４つの異なるヌクレオシドトリホスフェートおよび１または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
（ｉｖ） １または２以上の蛍光成分と１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、前記１または２以上のオリゴヌクレオチドは突然変異体ｒａｓ配列を含んでなるＤＮＡに対してハイブリダイゼーションしかつそれに対してハイブリダイゼーションしたとき検出可能な蛍光を生成することができる、
を含んでなる混合物形成し；
【００３６】
（Ｂ）  前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し；
（Ｃ）  工程 （Ｂ） において製造された混合物を、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のプライマー対と組み合わせ、ただし前記プライマーの少なくとも１つは工程 （Ａ） におけるプライマーと異なり；
【００３７】
（Ｄ）   前記混合物を加熱および冷却の１または２以上のサイクルに付し、これにより突然変異体ｒａｓ突然変異を含んでなるＤＮＡを増幅し；
（Ｅ）   前記混合物を野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼと組み合わせ；そして
（Ｆ）   蛍光を検出する。
【００３８】
なお他の面において、本発明は、１または２以上の容器中に、
（ｉ）   配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、
【００３９】
（ｉｉ）    配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、または配列番号６７から選択される配列を含んでなる１または２以上のオリゴヌクレオチド、１または２以上のオリゴヌクレオチドは１または２以上の蛍光成分と１または２以上の蛍光クエンチング成分とを含んでなる、
を含んでなるキットに関する。
【００４０】
キットは、１または２以上の容器中に、
（ｉ）   １または２以上のヌクレオシドトリホスフェート、
（ｉｉ）   野生型Ｋ−、Ｈ−、またはＮ−ｒａｓ配列を直接切断するか、あるいはプライマー誘導切断部位を切断するか、あるいは両方を切断することができる少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ、および
（ｉｉｉ）   １または２以上の熱安定性ポリメラーゼ、
をさらに含むことができる。
【００４１】
前述のすべての場合において、１または２以上の蛍光成分を３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖するか、３’末端のヌクレオチドに連鎖するか、またはその両方に連鎖し、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分を５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖するか、５’末端のヌクレオチドに連鎖するか、またはその両方に連鎖することができ、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドを５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的であるか、あるいは
【００４２】
１または２以上の蛍光成分を５’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖するか、５’末端のヌクレオチドに連鎖するか、またはその両方に連鎖し、そして１または２以上の蛍光クエンチング成分を３’末端のヌクレオチドに隣接する１または２以上のヌクレオチドに連鎖するか、３’末端のヌクレオチドに連鎖することができまたはその両方に連鎖することができ、そして３’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドが５’末端を含んでなる１または２以上のヌクレオチドに対して相補的である。
【００４３】
例えば、蛍光成分をカルボキシフルオレセイン、カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ジメトキシフルオレセイン、またはカルボキシローダミンから選択することができ、そしてクエンチング成分は （４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ） 安息香酸） または４−（ジメチルアミン） アゾベンゼンスルホン酸であることができる。
【００４４】
詳細な説明
本発明の種々の態様において使用するＲＥＭＳ−ＰＣＲ （Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｎ． Ｊ． 他、１９９９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：（３） ４１８−４２２；Ｗａｒｄ Ｒ． 他、１９９８、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３ （２）：３７３−３７９；ＷＯ ９６／３２５００；Ｆｕｅｒｙ Ｃ． Ｊ． 他、２０００、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４６ （５） ６２０−５２４） において、熱安定性制限酵素および適当に設計したプライマーを使用する；ＰＣＲ熱的サイクリングの間に、野生型配列および／またはプライマー誘導部位を切断し、そして突然変異体配列を濃縮する。
突然変異を検出するするために要求される時間を簡素化し、短縮することに加えて、本発明は大過剰の野生型ＤＮＡ （１０００倍以上） の存在下に突然変異の検出を可能とする。
【００４５】
コドン１２におけるＫ−ｒａｓ突然変異の決定に特に有用である、制限酵素ＢｓｔＮ Ｉを使用して、本発明を実施例１〜４において詳細に後述する。本発明は、他の酵素を使用する消化に基づくＲＥＭＳ−ＰＣＲまたは多ラウンドのネステッドＰＣＲに従い、分析の道具として実施することができ、このような酵素は下記のものを包含するが、これらに限定されない：Ｂｓｌ Ｉ、Ｍｓｃ Ｉ、Ｍｓｅ Ｉ、Ｍｓｐ Ｉ、Ｂｆａ Ｉ、およびＨａｅ ＩＩＩ、これらはコドン１２ におけるＫ−ｒａｓ突然変異 （略してＫ−１２ 、類似する略号を他のｒａｓコドンについて使用する） 、Ｋ−１３、Ｋ−６１、Ｈ−１２、Ｈ−１３、Ｎ−１２、Ｎ−１３、Ｎ−６１およびＨ−ｒａｓイントロンＤにおける突然変異の決定に有用である。実施例５〜７は、ＲＥＭＳ−ＰＣＲ法、ネステッドＰＣＲおよび引き続く制限エンドヌクレアーゼ消化を含む方法、および分子ビーコンを使用するＲＥＭＳ−ＰＣＲ法においてこのような突然変異を決定するために使用したプライマーおよびプローブの特異的配列を提供する。
【００４６】
ネステッドＰＣＲ法は、増幅反応混合物中の単一コピーをアプローチする低レベルのターゲットＤＮＡを有する試料中のｒａｓ突然変異を決定するために、特に有用であることが発見された。この方法は、野生型Ｋ−ｒａｓ配列をネステッドＰＣＲ増幅後に一夜の制限酵素消化で切断するようなプライマー設計の使用を包含した。Ｐｕｉｇ他、２０００、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８５：７３−７７には、Ｋ−ｒａｓ突然変異を決定するネステッドＰＣＲ法が記載されている。
【００４７】
分子ビーコンを使用して、個体からの一次腫瘍試料をＫ−１２ ｒａｓ突然変異の存在について検査した。分子ビーコンは、米国特許第５，１１８，８０１号、米国特許第５，３１２，７２８号および米国特許第５，９２５，５１７号に記載されており、生成物の検出を自動化しかつ生成物を定量するためのＲＥＭＳ−ＰＣＲにおいて特に有用である。分子ビーコンは、均質法を使用して特異的核酸の存在を報告することができるオリゴヌクレオチドプローブである。分子ビーコンは、過剰のハイブリダイゼーションプローブからプローブ−ターゲットハイブリッドを単離することが不可能であるか、あるいは望ましくない状況において、例えば、シールした管中のポリメラーゼ連鎖反応の実時間モニターまたは生きている細胞中のＲＮＡの検出において有用である。
【００４８】
分子ビーコンは内部的にクエンチした発蛍光団を有するヘアピン形分子であり、それらがターゲット核酸に結合するとき、それらの蛍光は回復する。その分子のループ部分がターゲット核酸分子に対して相補的であるプローブ配列であるような方法において、分子ビーコンは設計される。プローブ配列の末端上に相補的アーム配列をアニーリングすることによって、幹は形成される。蛍光成分は一方のアームの末端に結合されており、そしてクエンチング成分は他方のアームの末端に結合されている。幹はこれらの２つの部分を互いに密接な近位状態に保持し、発蛍光団の蛍光をエネルギー転移によりクエンチさせる。
【００４９】
クエンチャー部分は非蛍光化合物であり、発蛍光団から熱として受け取るエネルギーを放射するので、プローブは蛍光を放射することができない。プローブはターゲット分子に直面するとき、それは幹よりも長くかついっそう安定であるハイブリッドを形成し、そしてその剛性および長さは幹ハイブリッドの同時の存在を排除する。こうして、分子ビーコンは自発的コンフォメーション再編成を行い、この再編成は幹を分離し、発蛍光団およびクエンチャーを互いに引き離し、検出できる蛍光の回復に導く。同一溶液中の多数のターゲットを検出するために、広い範囲の発蛍光団を利用して多数の異なる色で分子ビーコンを作ることができる （Ｔｙａｇｉ Ｓ． 他、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６、４９−５３）。ＤＡＢＣＹＬ、非蛍光化合物は、分子ビーコン中のいずれかの発蛍光団の万能クエンチャーとして働くことができる。
【００５０】
切片化およびＤＮＡ抽出
特記しない限り、この開示に記載するプロトコルにおいて使用するすべての試薬はシグマ−アルドリッヒ （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ） （ミゾリー州セントルイス） から購入し、そしてすべてのオリゴヌクレオチドはオルソ−クリニカル・ダイアグノスチクス （Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｃｓ） において合成された。
【００５１】
ミクロトームを使用して、腫瘍またはリンパ節組織を含んでなるパラフィンブロックを切片化した：一次腫瘍試料について厚さ１０ミクロン、およびリンパ節試料について厚さ５０ミクロン。試料間のＤＮＡ汚染を回避するために、過剰のパラフィンをミクロトームから除去した後、第１切片を切断した。すべての過剰のパラフィンをブラシにより除去し、ブレード領域をキシレンでぬぐい、空気乾燥した後、使用した。新鮮なブレードを患者試料パラフィンブロック間で使用した。切断後、切片を木製アプリケータースティックにより別々の１．５ ｍｌ円錐形ねじぶた管の中に注意して移した。新しいスティックを各パラフィンブロックのために使用した。対照実験において、この方法は、ＲＥＭＳ−ＰＣＲにより測定して、Ｋ−１２ ｒａｓ陽性試料とＫ−１２ ｒａｓ陰性試料との間のキャリーオーバーを首尾よく排除することが示された。
【００５２】
ＤＮＡを抽出するために、管を１４，０００ ｒｐｍにおいて２分間遠心してパラフィンを沈降させ、８０ μｌの溶解緩衝液 （１０ ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および０．５％のツイーン２０） および１０ μｌのＰｒｅＴａｑ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．、マリーランド州ガイサーバーグ） を添加し、管を１００ ℃において加熱ブロック中で ５分間インキュベートした。１０ μｌの２５０ ｍＭの水酸化ナトリウムを添加し、管を１０５ ℃において加熱ブロック中で１０分間インキュベートした。熱時、管を１４，０００ ｒｐｍにおいて２分間遠心した。パラフィン層の下の液体を注意して除去し、新しい管に移し、使用する前に凍結貯蔵した。
【００５３】
細胞系統
すべてのヒト細胞系統をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） （バージニア州マナッサス） から購入した。Ｃａｌｕ １ （ＡＴＣＣ ＨＴＢ５４） は、野生型 （ＧＧＴ） および突然変異 （ＴＧＴ） 配列 （５） の両方を有するＫ−ｒａｓコドン１２においてヘテロ接合である、肺腺癌に由来する細胞系統である。Ｋ５６２ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３） は、Ｋ−ｒａｓのコドン１２において野生型である、ヒト白血病に由来する細胞系統である（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｎ． Ｊ． 他、１９９９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：（３） ４１８−４２２）。
【００５４】
使用したｒａｓ突然変異を有することが知られている他のヒト細胞系統は下記のものを包含する：コドン１２においてＮ−ｒａｓ突然変異を有するＭｏｌｔ−４ （ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８２） （Ｂｏｓ Ｊ． Ｌ．、１９８８、Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． ２：５５−６３）、コドン１３においてＫ−ｒａｓ突然変異を有するＨＣＴ−１１６ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７） （Ａｏｋｉ Ｔ． Ｓ． 他、１９９４、Ｈｕｍ． Ｍｕｔａｔ． ３ （４）：３４２−６）、コドン６１においてＮ−ｒａｓを有するＨＬ−６０ （ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０） （Ｂｏｓ Ｊ． Ｌ．、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２ （２３）：９１５５−６３） およびコドン１２ （Ｃａｐｏｎ Ｄ． Ｊ． 他、Ｎａｔｕｒｅ ３０２：３３−３７） およびイントロンＤ （Ｃｏｈｅｎ Ｊ． Ｎ． およびＡ． Ｄ． Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３４ （６１７８）：１１９−１２４） においてＨ−ｒａｓ突然変異を有するＴ２４ （ＡＴＣＣ ＨＴＢ−４）。高温において溶解緩衝液中で細胞をインキュベートすることを包含するプロトコルを使用して、ゲノムＤＮＡを細胞系統から抽出した。
【００５５】
突然変異体配列を有するオリゴヌクレオチド
いくつかの実験において、Ｒｏｃｈｌｉｔｚ他 （１９８８、ＤＮＡ ７ （７）：５１５−５１９） の方法に従い調製したオリゴヌクレオチドをターゲット核酸として使用した （表２において「オリゴ」として示す）。それらはシトシン→チミン （Ｃ→Ｔ） の突然変異を有するＮ−ｒａｓコドン１３の塩基配列を含んでなっていた。
【００５６】
定義
問題の特定配列を含んでなるオリゴヌクレオチド中の末端ヌクレオチドに「隣接する」ヌクレオチドについて言及するとき、用語「隣接する」は末端のヌクレオチドと問題の配列を開始する第１ヌクレオチドとの間の任意のヌクレオチドを意味する。例えば、下記の仮定の５’ → ３’ 方向の配列を有するオリゴヌクレオチドを考える：
【００５７】
ＡＧＴＣＧＴＴＡＧＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＡＧＡＧＡＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＡＣＴＡＧ
下線が引かれている配列ＣＡＴＣＴＡＴＡＧＡＧＡは問題の特定配列を表し、５’ 末端のヌクレオチド（ボールドフェースの前） はＡであり、そして３’ 末端のヌクレオチド （ボールドフェースの後） はＧである。５’ 末端のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドはＡとＣとの間の任意の配列であり、ここでＣは５’ → ３’ 方向で問題の配列を開始する第１ヌクレオチドである。同様に、３’ 末端のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドは配列ＣＴＣＧＧＧＣＣＴＧＡＣＴＡ中の任意のヌクレオチドである。
【００５８】
「３’ 末端」について言及するとき、それは上に定義したように３’ 末端のヌクレオチドに隣接するヌクレオチドと、３’ 末端のヌクレオチドとを含んでなるヌクレオチドを意味する。同様な定義は「５’ 末端」に適用される。
【００５９】
問題の配列を含んでなるオリゴヌクレオチドは天然源から得るか、あるいは調製することができるか、あるいは任意の適当な化学的合成法により調製することができる。オリゴヌクレオチドは問題の配列のみから成るか、あるいは問題の配列それ自体はオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの大きい配列の一部分のみであることができる。オリゴヌクレオチドはそれに１または２以上のヌクレオチドにより、ヌクレオチドに加えて、任意の１または２以上の分子を結合して有することができ、このような分子例は次の通りである：他の分子または基質に対して共有結合するためのリンカー分子；標識、例えば、蛍光体、色素、放射性同位体または酵素；またオリゴヌクレオチドに結合するか、あるいは結合しないことができる他の分子と相互作用する分子、例えば、蛍光クエンチャー；特異的レセプターに結合するためのリガンド、例えば、ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジン、およびその他。
【００６０】
本明細書において使用するとき、用語「野生型配列」は生物学的種における遺伝子、好ましくはヒト遺伝子内に保存されたヌクレオチド配列、すなわち、大部分の代表的数の種において観測される配列を意味する。
【００６１】
用語「プライマー」は、核酸鎖 （すなわち、鋳型） に対して相補的であるプライマーエクステンション生成物の合成が誘導される条件下に配置されたとき、合成の開始点として作用することができる、天然に存在するか、あるいは合成的に製造されるかどうかにかかわらず、オリゴヌクレオチドを意味する。プライマーはターゲット配列に完全に合致することができるか、あるいは特異的ターゲット配列中の制限エンドヌクレアーゼの認識／切断部位の誘導を生ずることができる、内部のミスマッチ塩基を含有することができる。
【００６２】
本明細書の目的に対して、これはプライマー誘導認識／切断部位として言及されるであろう。１または２以上のターゲット配列中に切断部位を誘導することができる多数のプライマーを反応混合物において使用することができ、そして「プライマー誘導切断部位」という語句は１または２以上のターゲット配列中の単一のプライマー誘導部位または多数のプライマー誘導の異なる切断部位を包含することを意味する。
【００６３】
用語「プライマー対」は２つのプライマーを意味し、一方はデュプレックスＤＮＡターゲットの一方の鎖上またはデュプレックスＤＮＡターゲットに由来する一方の鎖上のプライマーエクステンション生成物の合成開始点として作用することができ、そして他方のプライマーはデュプレックスＤＮＡターゲットの他方の鎖上またはデュプレックスＤＮＡターゲットに由来する他方の鎖上のプライマーエクステンション生成物の合成開始点として作用することができる。
【００６４】
実施例
実施例１．ＲＥＭＳ−ＰＣＲを使用する一次腫瘍試料におけるｒａｓ突然変異の検出
Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｎ． Ｊ． 他、１９９９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：（３） ４１８−４２２；Ｗａｒｄ Ｒ． 他、１９９８、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３ （２）：３７３−３７９；およびＷＯ ９６／３２５００の方法に従いＲＥＭＳ−ＰＣＲにより、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２における突然変異を検出した。各ＰＣＲ混合物は３対のプライマーを含有した。診断プライマーは野生型ｒａｓ中のＢｓｔＮ Ｉ制限部位を誘導するが、コドン１２におけるｒａｓ突然変異を誘導しない。こうして、ｒａｓ野生型ＤＮＡはＰＣＲ熱的サイクリング間に選択的に切断され、そしてコドン１２におけるｒａｓの突然変異配列は濃縮される。ＰＣＲ対照プライマーを使用してＰＣＲ増幅可能なＤＮＡが抽出されることを確認し、そして酵素制御プライマーを使用して制限酵素が熱的サイクリング間に機能していることを確認した。
【００６５】
反応混合物は下記の成分を含有した：１２単位／１００ μｌの組換えＴａｑポリメラーゼ （Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｃｓにおいて開発された）、およびポリメラーゼの５倍モル過剰 （０．８４２ μｌ） のＴａｑ阻害性抗体ＴＰ４−９．２ （米国特許第５，３３８，６７１号および米国特許第５，５８７，２８７号に記載されているプロトコルに従いＯｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｃｓにおいて開発された）、ＨＴ５０緩衝液 （１００ ｍＭの塩化ナトリウム、および５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３）、０．３ μＭの診断プライマー （下文参照）、５ＢＫＩＴ （配列番号１）、（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｎ． Ｊ． 他、１９９９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：（３） ４１８−４２２；Ｗａｒｄ Ｒ． 他、１９９８、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３ （２）：３７３−３７９） および３Ｋ２ （配列番号２） （Ｗａｒｄ Ｒ． 他、１９９８、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３ （２）：３７３−３７９）、０．０５ μＭのＰＣＲ対照プライマー対、５ＢＫ５ （配列番号３） および３Ｋ６ （配列番号４）、０．０５ μＭの酵素対照プライマー対、５ＢＫ２８ （配列番号５） および３Ｋ２９ （配列番号６）、０．２ ｍＭの全デオキシヌクレオシド三リン酸 （ｄＮＴＰ）、０．６単位／μｌのＢｓｔＮ Ｉ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州べバーリイ）、１ ｍＭのジチオスレイトール （ＤＴＴ）、４ ｍＭの塩化マグネシウム、試料 （典型的には３μｌ） および最終体積１００ μＬまでの脱イオン水。
【００６６】
実施例１において使用するプライマーの少なくとも１つはビオチニル化された。ポリメラーゼによるエクステンション後、シグナルを発生させるアビジン試薬を使用してビオチニル化プライマーを捕捉する。すべての実施例において、オリゴヌクレオチドの名称中に出現する文字「Ｂ」はそれがビオチニル化されていることを示す。オリゴヌクレオチドがビオチニル化されていない場合、文字「Ｂ」はそれを同定する名称中に出現しない。
【００６７】
例えば、配列番号５を有するプライマーが、ビオチニル化されている場合、その名称は５ＢＫ２８であり、ビオチニル化されていない場合、その名称は５Ｋ２８であった。ビオチニル化および非ビオチニル化プライマーは、ゲルをベースとする検出により測定して、実質的に同一の結果を提供する。下記のプライマーを５’ 末端においてビオチニル化した：５ＢＫＩＴ （配列番号１）、５ＢＫ５ （配列番号３）、５ＢＫ２８ （配列番号５）、５ＢＫＩＴＳＣ （配列番号１２）、５ＢＮ２ （配列番号２８）、５ＢＮ４ （配列番号２９）、３ＢＮ１３ （配列番号５５）、５ＢＫ１５ （配列番号６０）、および５ＢＫ３７ （配列番号６１）。プライマーのヌクレオチド配列は次の通りである：
【００６８】
配列番号１
ＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧ  ＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧ  ＡＣＣＴ
配列番号２
ＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡ  ＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡ
配列番号３
ＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡ  ＣＡＡＧＡＣＡＧＧＴ  Ａ
配列番号４
ＡＧＣＡＡＴＧＣＣＣ  ＴＣＴＣＡＡＧＡ
配列番号５
ＡＧＴＡＡＡＡＧＧＴ  ＧＣＡＣＴＧＴＡＡＴ  ＡＡＴＣ
配列番号６
ＧＴＧＴＣＧＡＧＡＡ  ＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧ  ＣＣＡ
【００６９】
Ｔａｑポリメラーゼおよび抗Ｔａｑ抗体を含んでなる溶液を組み合わせ、１０〜１５分間インキュベートした後、他のＰＣＲ成分を添加した。試料添加直前に反応混合物にＢｓｔＮ Ｉ制限酵素を添加し、最後の成分を添加した。
【００７０】
一次腫瘍の試料の場合において、Ｆｉｎｄｌａｙ他 （１９９３、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９ （９）：１９２７−１９３３） および米国特許第５，２２９，２９７号に記載されているように核酸を増幅し、検出するためのオルソ−クリニカル・ダイアグノスチクス・インコーポレーテッド （Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｃｓ， Ｉｎｃ．） のパウチ封じ込めシステムを使用して、反応混合物を増幅し、検出した。試料 （ほぼ０．８ μｇのＤＮＡ） を、前述したようにＰＣＲ試薬と８５ μｌの全体積に組み合わせ、パウチのブリスター中に負荷し、パウチをシールした。
【００７１】
ＰＣＲブリスターを９４ ℃に１分間加熱し、次いで３０のＰＣＲサイクル （９４ ℃の溶融温度、１０秒間、次いで５８ ℃のアニーリング温度、７５秒間） に付した。増幅後１０３ ℃において５分間インキュベートした後、生成物をパウチの「検出」ブリスター中で検出し、ここで生成物はビーズに結合した相補的オリゴヌクレオチド （捕捉オリゴ） とハイブリダイゼーションした。ポリスチレンビーズに対するオリゴの結合方法はＦｉｎｄｌａｙ他 （１９９３、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９ （９）：１９２７−１９３３） および米国特許第５，３８０，４８９号に記載され、そして既知の乳濁重合技術により製造されたポリ （スチレン−コ−モノ２ （ｐ−ビニルベンジルチオ） エチルスクシネート （９５：５の重量比） のポリマー粒子 （平均直径１．２ μｍ） の使用を包含する。
【００７２】
これらの粒子に示した捕捉オリゴＫ−ＣａｐＤ−８ （配列番号７）、Ｃａｐ−２Ｅ （配列番号８）、またはＫ−Ｃａｐ６ （配列番号９）の分子が結合した。米国特許第４，９６２，０２９号の教示に従い製造し、オリゴヌクレオチドに取り付けられた２つのテトラエチレングリコールスペーサー基を介してアミンジオールリンキングを通して結合は形成された。米国特許第５，３８０，４８９号、実施例３に記載されているように、オリゴヌクレオチド炭酸マグネシウムを粒子に取り付けて核酸試薬を形成した。
【００７３】
捕捉オリゴ、Ｋ−ＣａｐＤ８ （配列番号７） は、ビオチニル化ＲＥＭＳ−ＰＣＲ診断生成物に対してハイブリダイゼーションし、捕捉オリゴ、Ｃａｐ−２Ｅ （配列番号８） は、ビオチニル化酵素対照ＰＣＲ生成物に対してハイブリダイゼーションし、そして捕捉オリゴ、Ｋ−Ｃａｐ６ （配列番号９） は、ビオチニル化ＰＣＲ対照生成物に対してハイブリダイゼーションした。ヌクレオチド配列次の通りである：
【００７４】
配列番号７
ＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧ  ＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣ  ＣＴＡＣＧＣＣＡ
配列番号８
ＧＡＣＴＧＴＧＴＴＴ  ＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣ  ＡＧＧＡＴＴＣＣ
配列番号９
ＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧ  ＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴ  ＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡ  ＧＡＴＣ
【００７５】
セイヨウワサビペルオキシダーゼ （ＨＲＰ） チャンネルおよびパウチの洗浄チャンネルは５５ ℃であった。検出チャンネルは４０ ℃であった。ＨＲＰ−ストレプトアビジンおよびＨＲＰ−色素基質を使用して、ハイブリダイゼーションした生成物を検出した。各パウチは３つの検出ブリスターを含有し、各々は２００ μｌの試薬溶液 （ストレプトアビジン−ＨＲＰ、２００ μＬ／ブリスター；洗浄２００ μＬ／ブリスター；および色素／ゲル２００ μＬ／ブリスター） を有した。ブリスターの使用順序は次の通りであった：ＨＲＰ−ストレプトアビジン、洗浄、および最後に色素／ゲルブリスター。捕捉オリゴビーズはパウチにおいて次のような順序であった （試薬の流れ方向）：ビーズなし、 Ｋ−Ｃａｐ２Ｅ、ビーズなし、Ｋ−ｃａｐＤ８、ビーズなし、Ｋ−Ｃａｐ６Ｍ、およびビーズなし。
【００７６】
記載したようなパウチフォーマットにおいてＲＥＭＳ−ＰＣＲをベースとする方法を使用して、１０６人のＤｕｋｅｓのＢ結腸癌の患者からの一次腫瘍試料のほぼ５１％はコドン１２においてＫ−ｒａｓ突然変異を有することが見出された。比較すると、マルチ−センター研究 （Ａｎｄｒｅｙｅｖ Ｈ． Ｊ． Ｎ． 他、１９９８、 Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９０ （９）：６７５−６８４） において、結腸癌一次腫瘍の４３．８％は、一本鎖コンフォメーション多形性 （ＳＳＣＰ） 技術により測定して、３３．１％は直接的配列決定により、そして３２．７％はアレレ特異的ポリマーＰＣＲにより、Ｋ−１２ ｒａｓ突然変異を示すことが報告された。本発明の方法を使用して観測されたＫ−１２ ｒａｓ突然変異のより大きい発生率は、大過剰の野生型ＤＮＡ中の突然変異を検出する各方法の能力に差があるためであることがある。また、生成物は酵素仲介比色法、蛍光、または化学発光信号形成法を使用して検出することができるので、感度の増加は可能である。
【００７７】
ＲＥＭＳ−ＰＣＲをベースとする方法は感度の高く、内部のＰＣＲおよび酵素対照を利用し、急速である。この方法はパウチ封じ込め装置中で実施し、これは自動化が可能であった。この方法は汚染の可能性を減少し、電気泳動に引き続くゲル中の生成物の検出と対照的に、酵素を触媒とする色素形成を使用して生成物が検出されるので、検出感度の増加を可能とした （Ｆｉｎｄｌａｙ他、１９９３、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９ （９）：１９２７−１９３３）。この方法は、ＤＮＡ抽出後、完結まで９０分以下を要した。
【００７８】
実施例２．ネステッドＰＣＲを使用するリンパ節試料中のＫ１２ −ｒａｓ突然変異の検出
一次腫瘍中にＫ−１２ ｒａｓ突然変異を有するとして同定された、合計３８人のＤｕｋｅｓのＢ結腸癌患者からのリンパ節を、Ｋ−１２ ｒａｓ突然変異の存在について分析した。パラフィンブロック中のリンパ節組織は少量であり、したがって核酸は少量であり、そして熱的サイクリング間のＢｓｔＮ Ｉ制限酵素の安定性は制限され、わずかに約３４増幅サイクルを可能とするので、一次腫瘍試料について上のＢｓｔＮ Ｉをベースとする記載したＲＥＭＳ−ＰＣＲ法は低いコピー数の試料の増幅および検出について望むよりも低い感度であった。したがって、２つの別々のラウンドの増幅、および引き続く制限酵素消化を含む、いっそう感度の高いネステッドＰＣＲ法を使用した。
【００７９】
この方法における延長したＰＣＲ熱的サイクリング （ラウンド１において１２サイクルおよびラウンド２において４０サイクル） は、低いコピー数の試料についてより大きい感度を可能とした。本発明の実験について、ストラタジーン・イーグル・アイＩＩスチル・ビデオ・システム（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ Ｅａｇｌｅ Ｅｙｅ ＩＩ Ｖｉｄｅｏ Ｓｙｓｔｅｍ） （Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラジョラ） を使用した。この計装は感度の高いＣＣＤオプチックスおよびビデオおよびソフトウェア増強を使用してゲルバンドの分解能を改良する。
【００８０】
ラウンド１のＰＣＲ混合物は下記の成分を含有した：４単位／５０ μｌの組換えＴａｑポリメラーゼ、５倍モル過剰のＴａｑ阻害性抗体ＴＰ１−１２．２、Ｃｅｔｕｓ ＩＩ緩衝液 （１０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３中の５０ ｍＭのＫＣｌ）、１．２ μＭのプライマー５ＫＩＤ （配列番号１０） および３ＫｉＥ （配列番号１１）の各々、０．２ ｍＭの全デオキシヌクレオシド三リン酸 （ｄＮＴＰ）、０．０４ ｍＭの塩化マグネシウム、試料 （典型的には５ μＬ） および最終体積を５０ μＬまでとする脱イオン水。ポリメラーゼと抗Ｔａｑ抗体を組み合わせ、１０〜１５分間インキュベートした後、他のＰＣＲ成分を添加した。ラウンド１について下記のパラメーターを使用してＧｅｎｅ−Ａｍｐ ９６００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、コネチカット州ノーウォーク） 中で熱的サイクリングを実施した：９４ ℃における３分間の初期インキュベーション、次いで１２サイクルの９４ ℃における１０秒間、および６０ ℃における３０秒間の交互するインキュベーション。プライマー配列は次の通りである：
【００８１】
配列番号１０
ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡ  ＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡ  ＡＴＡ
配列番号１１
ＣＴＣＡＴＧＡＡＡＡ  ＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡ  ＡＡＣ
【００８２】
ラウンド２のＰＣＲ混合物は下記の成分を含有した：４単位／１００ μｌの組換えＴａｑポリメラーゼ、５倍モル過剰のＴａｑ阻害性抗体ＴＰ１−１２．２、ＨＴ５０緩衝液 （１００ ｍＭの塩化ナトリウム、および５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３）、０．２ μＭのプライマー５ＢＫＩＴＳＣ （配列番号１２） および３ＫｉＵ （配列番号１３）の各々 （下文参照）、０．２ ｍＭの全ｄＮＴＰ、０．０４ ｍＭの塩化マグネシウム、２ μｌの試料および最終体積を１００ μＬまでとする脱イオン水。Ｇｅｎｅ−Ａｍｐ ９６００上で実施したラウンド２の熱的サイクリング次の通りであった：９４ ℃における３分間の初期インキュベーション、次いで４０サイクルの９４ ℃における１０秒間および６０ ℃における３０秒間の交互するインキュベーション。プライマー配列は次の通りである：
【００８３】
配列番号１２
ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣ  ＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴ  ＴＧＧＡＣＣＴ
配列番号１３
ＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴ  ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣ  Ｃ
【００８４】
４０単位のＢｓｔＮ Ｉ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州べバーリイ）、および１５ μｌのラウンド２からの増幅生成物をマイクロ遠心機管中で組み合わせることによって、制限酵素消化を実施した。管を６０ ℃において一夜インキュベートした。
４％ｗ／ｖのＮＵＳｉｅｖｅアガロースゲル （ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、メイン州ロックランド） 上の電気泳動により試料を分析し、ストラタジーン・イーグル・アイＩＩスチル・ビデオ・システム （カリフォルニア州ラジョラ） により造影した。
【００８５】
第１図は、Ｋ−ｒａｓについて野生型である、Ｋ５６２細胞系統のＤＮＡを使用して得られた結果を示す。制限酵素消化の前、レーン１、および後、レーン２。Ｃａｌｕ１細胞系統のＤＮＡ：レーン１、および後、レーン２。Ｃａｌｕ１ ＤＮＡは、コドン１２におけるＫ−ｒａｓ突然変異についてヘテロ接合性であり、制限酵素消化の前 （レーン３） および後 （レーン４） 示される。こうして、ＢｓｔＮ Ｉ消化後に残留する１５２ ｂｐにおけるゲルバンドはコドン１２におけるＫ−ｒａｓ突然変異について特徴的であるが、１２８ ｂｐおよび２４ ｂｐのゲルバンドはＫ−ｒａｓ野生型生成物のＢｓｔＮ Ｉ消化の結果として形成される。
【００８６】
第２図は、ネステッドＰＣＲプロトコルおよび引き続く制限フラグメント長さ多形性 （ＲＦＬＰ） ゲル分析により評価した、Ｋ−１２ ｒａｓ突然変異陽性および陰性の両方のリンパ節について得られた結果を示す。第２図において、ＢｓｔＮ Ｉ制限酵素消化の前 （レーン２、４、および６） および後 （レーン３、５、および７） の３つの異なるリンパ節試料についての結果を示す。制限酵素消化後に残留する１５２ ｂｐの生成物 （レーン５） はコドン１２におけるＫ−ｒａｓ突然変異について診断的であり、そして消化後の１５２ ｂｐの生成物の非存在はコドン１２における野生型Ｋ−ｒａｓについて特徴的である （レーン３および７）。レーン２および３におけるリンパ節試料、およびレーン６および７におけるリンパ節試料はＫ−１２ ｒａｓ突然変異について陰性であり、そしてレーン４および５におけるリンパ節試料はこの突然変異について陽性である。
【００８７】
３８試料のうちで、１４ （３７％） は１または２以上のリンパ節におけるＫ−１２ ｒａｓ突然変異について陽性であったが、２４試料 （６３％） はｒａｓ突然変異について陰性であった。Ｋ−１２ ｒａｓ突然変異を示す１４リンパ節試料について、合計１４２のリンパ節を評価した （平均１０リンパ節／患者）。同様に、１または２以上のリンパ節におけるＫ−１２ ｒａｓ突然変異について陰性であった２４試料について、合計９７のリンパ節を評価した （平均４リンパ節／患者）。
【００８８】
ＲＥＭＳ−ＰＣＲおよびネステッドＰＣＲをベースとする方法において、１または２以上の下記の「陰性」対照を使用した： （ａ） 実施例１に記載されているようにパラフィンブロックから調製した扁桃腺試料、 （ｂ） 細胞系統Ｋ５６２からのゲノムＤＮＡ （Ｋ−ｒａｓ野生型）、および （ｃ） ＤＮＡ鋳型を添加しない試薬対照。細胞系統Ｃａｌｕ−１からのゲノムＤＮＡを「陽性」対照として使用した。この出願において前に記載されているように、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００８９】
実施例３．ＲＥＭＳ−ＰＣＲにおいて分子ビーコンを使用するＫ−１２ ｒａｓ突然変異の検出
０．２ μＭの診断用プライマーを使用する以外、試料、反応混合物、およびプライマーは実施例１に記載されている通りであった。３ μｌのウェルの各々に、１ μｌの分子ビーコンの２０ μＭのストックを添加した。分子ビーコンの合成は、シンセティック・ジェネティクス （Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンディエゴ） において実施した。各分子ビーコンを５’ 末端において色素カルボキシフルオレセイン、ＦＡＭ、で標識化し、そして３’ 末端において蛍光クエンチャーＤＡＢＣＹＬ （４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ） 安息香酸） で標識化した。
【００９０】
典型的には、分子ビーコン合成の出発物質は５’ 末端にスルフヒドリル基および３’ 末端に第一級アミノ基を含有するオリゴヌクレオチドである。ＤＡＢＣＹＬのアミン反応性誘導体を利用して、ＤＡＢＣＹＬを第一級アミノ基に結合する。次いで、ＤＡＢＣＹＬに結合したオリゴヌクレオチドを精製する。次いで、保護のトリチル部分を５’ −スルフヒドリル基から除去し、ヨードアセトアミド誘導体を使用して発蛍光団をその位置に導入する。最近、オリゴヌクレオチドの３’ 末端にＤＡＢＣＹＬ部分導入することができるコントロール孔のカラムが入手可能となった。これにより、ＤＮＡ合成装置上で分子ビーコンを完全に合成することができる。
【００９１】
プローブ配列は次の通りである：
配列番号１４
ＧＣＧＡＧＣＴＡＴＣ  ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣ  ＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ  ＧＣＣＡＧＣＴＣＧＣ
配列番号１５
ＣＣＧＡＧＣＧＡＣＡ  ＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴ  ＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧ  ＡＡＡＡＣＡＧＡＧＣ  ＴＣＧＧ
配列番号１６
ＧＣＧＡＧＣＡＡＧＣ  ＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴ  ＣＣＴＣＡＴＧＴＡＴ  ＴＧＧＴＧＣＴＣＧＣ
配列番号１７
ＧＣＧＡＧＣＧＡＣＴ  ＧＴＧＴＴＴＣＴＣＣ  ＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡ  ＴＴＣＣＧＣＴＣＧＣ
【００９２】
各分析について、３つの別々のマイクロタイタープウェルを使用した。ＢＤ２ （配列番号１４） を第１ウェルに突然変異体Ｋ−１２ ｒａｓ診断用プローブとして添加した；蛍光の増加はコドン１２におけるＫ−ｒａｓ突然変異を示す。第２ウェルはＰＣＲ対照としてＢＰＩＧ （配列番号１５） を含有した：蛍光の増加は十分な増幅可能なＤＮＡを示す。第３ウェルはＢＥ１ （配列番号１６） またはＢＥ２ （配列番号１７） を酵素対照として含有した。酵素対照の蛍光の増加は、ＰＣＲ熱的サイクリング間に制限酵素が不活性化されることがあり、アッセイの失敗を表すことを示す。
【００９３】
ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出器 （ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー） を使用して、熱的サイクリングおよび蛍光の検出を実施した。熱的サイクリングのパラメーター次の通りであった：５０ ℃において１分間の第１インキュベーション、９４ ℃において１分間の第２インキュベーション、次いで４０サイクルの９４ ℃における１０秒間および５８ ℃における７５秒間の交互する加熱。最後のサイクル後、反応混合物を５０ ℃において２分間インキュベートした。単一リポーターモードを蛍光の検出に使用した。結果を下記表１に要約する。
【００９４】
有効な決定のために、診断およびＰＣＲ対照は限界レベル以上に蛍光信号を増加させなくてはならないが、酵素対照の蛍光はこの限界レベル以下に止まらなくてはならない。表１に報告するＣｔは、ほぼ最初の１５ ＰＣＲサイクル間に確立された基線限界値を蛍光信号が超える点における、計算したサイクル数である （下記の文献を参照のこと、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００、″Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｙｔｅｍ″、Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ、１９９８、ｐｐ Ｄ４−Ｄ５、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ． 、カリフォルニア州フォスターシティー）。Ｃｔ値が小さくなるほど、より早く増幅された生成物が検出される。したがって、Ｃｔは試料中のターゲットの存在および量に関係づけられる。
【００９５】
【表１】
2004518412.tif 000003
【００９６】
１：１０重量比のＫ−１２ ｒａｓ突然変異／野生型ＤＮＡ （１：１０ （Ｃ：Ｋ）） を含有する試料についての二重反復実験の決定を表１に示す。ＢＰ１Ｇ、ＰＣＲ増幅対照を使用する二重反復実験のウェルは２５．７６および２５．３２のＣｔ値を有し、試料がＰＣＲ増幅ＤＮＡを含有したことを示す。ＢＤ２を使用する二重反復実験の決定は３０．０１および２８．０１のＣｔを生じ、試料がＫ−１２ ｒａｓ突然変異について陽性であったことを示す。酵素対照ＢＥ１およびＢＥ２を使用するＣｔ値は、それぞれ、４０．００および３７．３１においてかなり高く、制限酵素が熱的サイクリング間に活性であったことを示す。
【００９７】
野生型Ｋ５６２細胞系統のＤＮＡ単独 （表１中のＫ５６２） では、ＢＰＩＧ ＰＣＲ対照を使用する二重反復実験は２８．２８および２７．７０のＣｔ値を有し、増幅可能なＤＮＡが存在したことを示す。
ＢＤ２を含有するウェルは４０および３８．２のＣｔ値を有し、試料がＫ−１２ ｒａｓ突然変異について陰性であったことを示す。酵素対照ＢＥ１またはＢＥ２を含有するウェルは４０．００のＣｔ値を有した。
【００９８】
実施例４．多重ＲＥＭＳ−ＰＣＲ法において分子ビーコンを使用するＫ−１２ ｒａｓ突然変異の検出
この実施例は、Ｋ−１２ ｒａｓ突然変異の多重ＲＥＭＳ−ＰＣＲをベースとする決定のための異なる発蛍光団を含んでなる分子ビーコンの使用を例示する。
【００９９】
プライマー５ＢＫＩＴＳＣ （配列番号１２） をプライマー５ＢＫＩＴ （配列番号１） の代わりに使用し、そして０．１ μＭの酵素対照プライマーおよび０．１ μＭのＰＣＲ対照プライマーを使用した以外、各ＲＥＭＳ−ＰＣＲ反応混合物は実施例１に記載されている通りであった。また、各マイクロタイタープウェルは０．１ μＭの分子ビーコンＢＰ１−ＴＥＴ （配列番号１９） およびＢＥ６−ＪＯＥ （配列番号２１） および０．２０ μＭの分子ビーコンＢＤ−ＦＡＭ （配列番号２０） を含有した。分子ビーコンＢＰ１−ＴＥＴは、その５’ 末端に蛍光体テトラクロロフルオレセイン （ＴＥＴ） を含んでいた。分子ビーコンＢＤ３−ＦＡＭは、その５’ 末端に蛍光体カルボキシフルオレセイン （ＦＡＭ） を含んでいた。
【０１００】
分子ビーコンＢＥ６−ＪＯＥは、その５’ 末端に蛍光体カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン （ＪＯＥ） を含んでいた。クエンチャーＤＡＢＣＹＬを３’ 末端に取り付けた。ＦＡＭまたはＴＥＴを含んでなる分子ビーコンはシンセティック・ジェネティクス （Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンディエゴ） から購入し、そしてＪＯＥ標識化ビーコンはトリ−リンク・バイオテクノロジーズ・インコポレーテッド （Ｔｒｉ−Ｌｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ） から購入した。ターゲット特異的ＤＮＡ配列は次の通りである：
【０１０１】
配列番号１８
ＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣ  ＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧ  ＧＴＴ
配列番号１９
ＧＣＧＡＧＣＧＡＣＡ  ＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴ  ＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧ  ＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣ ＧＣＴＣＧＣ
配列番号２０
ＧＣＧＡＧＣＣＴＡＴ  ＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡ  ＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ ＣＧＣＣＡＧＣＴＣＧ  Ｃ
配列番号２１
ＧＣＧＡＧＣＡＧＧＡ  ＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡ  ＧＧＧＡＧＡＡＡＣＡ  ＣＡＧＴＣＧＣＴＣＧ Ｃ
【０１０２】
ＡＢＩ Ｐｒｉｍｅ ７７００配列検出器上の熱的サイクリング条件は、実施例３に記載されている通りであった。
ＰＣＲ対照ビーコンＢＰ１−ＴＥＴについて、１：１００重量比の突然変異体／野生型ＤＮＡにおいて、二重反復実験の決定についてのＣｔ値は３１．９０２および３１．１７６であり、増幅可能なＤＮＡが存在したことを示す。１：１００比の突然変異体／野生型ＤＮＡにおいて、診断用ビーコンＢＤ３−ＦＡＭについて、３５．０５８および３６．２２５のＣｔ値が得られ、Ｋ−１２ ｒａｓ突然変異が存在したことを示す。酵素対照ＢＥ６−ＪＯＥについてのＣｔ値は４０．０００および４０．０００であり、ＢｓｔＮ Ｉ制限酵素が活性であったことを示す。
これらの結果が示すように、多重ＲＥＭＳ−ＰＣＲをベースとする方法において分子ビーコンを使用してＫ−１２ ｒａｓ突然変異を決定することができる。
【０１０３】
実施例５．普通のＫ−、Ｈ−、およびＮ−ｒａｓ突然変異についての多重法
ｒａｓ突然変異の多重検出のために、２ラウンドのＰＣＲを含むネステッドＰＣＲプロトコルを使用した。ラウンド１のＰＣＲ反応混合物は下記の成分を含有した：実施例１に記載する濃度においてＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、およびＴａｑポリメラーゼ、および抗Ｔａｑ抗体ＴＰ１．１２．２ならびに０．２ μＭの表２に示すラウンド１のプライマー、０．８ μｇのＤＮＡ、セツス （Ｃｅｔｕｓ） 緩衝液ＩＩ （５０ ｍＭのＫＣｌおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．３） および最終体積を５０ μＬとする水。表２に示すように、適当な野生型および突然変異体細胞系統または合成ＤＮＡを各アッセイについて添加した。
【０１０４】
ラウンド１について下記のパラメーターを使用してＧｅｎｅ−Ａｍｐ ９６００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、コネチカット州ノーウォーク） 中で熱的サイクリングを実施した：９４ ℃における３分間の１サイクル、次いで１２サイクルの９４ ℃における１０秒間、および５５ ℃における３０秒間の交互するインキュベーション。Ｈ−ｒａｓイントロンＤにおける突然変異のアッセイのために、１２サイクルの代わりに２０サイクルのＰＣＲ増幅を使用した。
【０１０５】
ラウンド２のＰＣＲ反応混合物は下記の成分を含有した：１０単位／１００ μＬのＴａｑポリメラーゼ （Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｃｓにおいて開発された）、およびポリメラーゼの５倍モル過剰 （０．８４２ μＬ） のＴａｑ阻害性抗体ＴＰ１−１２．２、ＨＴ５０緩衝液 （１００ ｍＭの塩化ナトリウム、および５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５）、０．２ ｍＭの全デオキシヌクレオシド三リン酸 （ｄＮＴＰ）、３ ｍＭの塩化マグネシウム、０．２ μＭの表２に示すラウンド２のプライマー、ラウンド１からのＤＮＡ試料 （典型的には３ μＬ） および最終体積を１００ μＬまでとする脱イオン水。
【０１０６】
ラウンド２について下記のパラメーターを使用してＧｅｎｅ−Ａｍｐ ９６００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、コネチカット州ノーウォーク） 中で熱的サイクリングを実施した：９４ ℃における３分間の１サイクル、次いで３２サイクルの９４ ℃における１０秒間、および６０ ℃における３０秒間の交互するインキュベーション。Ｈ−ｒａｓイントロンＤにおける突然変異のアッセイのために、３２サイクルの代わりに３８サイクルのＰＣＲ増幅を使用した。
【０１０７】
１５ μＬのラウンド２からのＰＣＲ生成物、２ μＬの制限酵素緩衝液 （１０×ストック）、表２に示す単位の各制限酵素および最終体積を１７〜２０ μＬとする水を混合することによって、制限酵素消化物を調製した。制限酵素消化用緩衝液は、ニュー・イングランド・バイオラブス （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ） （マサチューセッツ州ベッドフォード） から購入した。ＢｓｔＮ Ｉ、Ｍｓｅ Ｉ、Ｈａｅ ＩＩＩ消化のために、ＮＥＢ２緩衝液を使用し、そしてＢｓｌ Ｉ消化のために、ＮＥＢ３を使用した。表２に示すすべての他の消化酵素を使用する消化において、ＮＥＢ４緩衝液を使用したが、ただしＭｓｅ Ｉについて、ロシェ・モレキュラー・バイオケミカルス （Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インジアナ州インジアナポリス） から購入したＳｕＲＥ／Ｃｕｔ緩衝液を使用した。表２に示す温度において一夜の消化を使用した。
【０１０８】
制限酵素消化後、４％ｗ／ｖのＮＵＳｉｅｖｅアガロースゲル （ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、メイン州ロックランド） 上の電気泳動により試料を分析し、ストラタジーン・イーグル・アイＩＩスチル・ビデオ・システム （カリフォルニア州ラジョラ） により造影した。表２に記載されているように、特定のｒａｓ遺伝子における突然変異は未消化生成物のそれに類似するゲルバンドの存在により示される。野生型ＤＮＡは、表２に記載されている期待される分子量の制限酵素により２つの同様なゲルバンドに切断される。
【０１０９】
下に同定するターゲット特異的配列を有するプライマーをＲＥＭＳ−ＰＣＲおよび／またはネステッドＰＣＲ法において使用して、Ｋ−１２ 、Ｋ−１３、Ｋ−６１、Ｈ−１２、Ｈ−１３、Ｎ−１２、Ｎ−１３、Ｎ−６１中の突然変異およびＨ−ｒａｓイントロンＤ中の突然変異を決定する。
【０１１０】
配列番号２２
ＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧ  ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣ ＣＴＧＴ
配列番号２３
ＴＧＧＡＣＡＴＡＣＴ  ＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴ  ＧＧＡＣＴ
配列番号２４
ＣＧＧＣＣＣＣＴＣＧ  ＣＧＣＴＴＴＡ
配列番号２５
ＡＧＣＴＧＴＧＴＣＧ  ＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴ ＧＣＡ
配列番号２６
ＡＴＧＴＧＡＣＣＣＡ  ＧＣＧＧＣＣＣＣＴＣ  Ｇ
配列番号２７
ＣＴＡＴＡＡＴＧＧＴ  ＧＡＡＴＡＴＣＴＴＣ  ＡＡＡＴＧ
配列番号２８
ＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴ  ＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴ  ＧＧＡＧ
配列番号２９
ＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧ  ＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧ  ＧＴ
【０１１１】
配列番号３０
ＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴ  ＧＴＧＧＴＡＧＴＴＣ  ＣＡＧＣＴＧＧＴ
配列番号３１
ＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴ  ＴＡＧＣＴＧＧＡＴＴ  Ｇ
配列番号３２
ＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣ  ＧＡＣＡＣＡＧＣＡＧ  ＧＣ
配列番号３３
ＧＧＧＡＧＡＣＧＴＧ  ＣＣＴＧＴＴＧＧＡＣ
配列番号３４
ＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡ  ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧ  ＧＡ
配列番号３５
ＡＣＡＡＧＴＧＧＴＴ  ＡＴＡＧＡＴＧＧＴＧ  ＡＡＡＣ
配列番号３６
ＴＧＡＴＧＧＣＡＡＡ  ＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧ  Ａ
配列番号３７
ＧＧＡＣＡＴＡＣＴＧ  ＧＡＴＡＣＡＧＣＴＧ  ＧＣ
配列番号３８
ＴＴＧＧＡＣＡＴＣＣ  ＴＧＧＡＴＡＣＣＧＣ  ＴＧＧ
【０１１２】
配列番号３９
ＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧ  ＣＧＡＴＧＡＣＧＧＡ  Ａ
配列番号４０
ＡＧＴＧＧＧＧＴＣＧ  ＴＡＴＴＣＧＴＣＣ
配列番号４１
ＴＣＡＣＣＴＣＴＡＴ  ＡＧＴＧＧＧＧＴＣＧ  ＴＡ
配列番号４２
ＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧ  ＧＴＧＴＧＡＡＡＴＧ  ＡＣ
配列番号４３
ＡＧＧＴＣＣＴＴＧＣ  ＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡ  ＴＧＡＣＴＧ
配列番号４４
ＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧ  ＡＴＴＡＧＣＴＧＧＡ  ＴＴＧＴＣＡＧ
配列番号４５
ＧＴＴＧＧＡＣＡＴＡ  ＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧ  ＣＴＧＧＣ
配列番号４６
ＧＧＣＡＡＡＴＡＣＡ  ＣＡＧＡＧＧＡＡＧＣ  ＣＴＴＣＧ
配列番号４７
ＧＴＴＧＧＡＣＡＴＡ  ＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧ  ＣＴＧＧＡＣＴ
【０１１３】
ネステッドＰＣＲにおいて使用する特定のプライマー組およびそれらのｒａｓターゲットを下記表２及び表３において同定する。ラウンド２の増幅に引き続いて添加した制限酵素は、野生型遺伝子を切断する。
【０１１４】
【表２】
2004518412.tif 000004
【０１１５】
【表３】
2004518412.tif 000005
【０１１６】
列２における括弧の中の数字、例えば、Ｋ−６１は、５’ → ３’ 方向において突然変異についてスクリーニングしたヌクレオチド塩基を特定する （Ｋ−ｒａｓのコドン１２、ヌクレオチド塩基２および３）。Ｋ−１２ 、Ｋ−１３、Ｎ−１２、Ｎ−１３、およびＨ−１２についての括弧の非存在は、アッセイがコドン中の最初の２つのヌクレオチド塩基のいずれかにおける突然変異を検出することができたことを示す。列１において、同一アッセイ数が多数の行中に出現する場合、それらの行中に示したプライマーを使用して特定したターゲット突然変異についての多重アッセイを実施した。
【０１１７】
単一の行中に単一のアッセイ数が出現する場合、その行中に示したプライマーを使用して特定したターゲット突然変異のみを決定した。表２中のターゲット配列源が「なし」として示されている場合、特定したｒａｓ突然変異を含んでなる細胞系統は入手不可能であった。これらの場合において、細胞系統Ｋ５６２からの野生型ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化に基づいて、ラウンド２の消化生成物のサイズを決定した。
【０１１８】
上に同定したプライマーおよび方法を使用して、細胞系統においてまたはｒａｓ突然変異配列を含んでなるオリゴヌクレオチドにおいてｒａｓ突然変異は検出された。各特定の突然変異について消化生成物および未消化生成物のサイズを表２に記載する。
【０１１９】
実施例６．Ｎ−１２、Ｎ−１３、およびＨ−１２ｒａｓ突然変異についてのＲＥＭＳ−ＰＣＲ
コドン１２におけるＮ−ｒａｓ突然変異およびコドン１２におけるＨ−ｒａｓ突然変異を検出するために、各ＰＣＲ混合物は３組のプライマーを含有した。診断用プライマーは野生型ｒａｓ中のＢｓｌ Ｉ制限部位を誘導するが、Ｎ−ｒａｓコドン１２、Ｎ−ｒａｓコドン１３、またはＨ−ｒａｓコドン１２における示したｒａｓ突然変異において誘導しない。こうして、ｒａｓ野生型ＤＮＡはＰＣＲ熱的サイクリング間に選択的に切断され、そして上に示したｒａｓ突然変異の突然変異体配列は濃縮される。ＰＣＲ対照プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅可能なＤＮＡが抽出されたことが確認され、そして酵素対照プライマーを使用して、制限酵素が熱的サイクリング間に機能していたことが確認された。
【０１２０】
反応混合物は下記の成分を含有した：１２単位／１００ μｌの組換えＴａｑポリメラーゼ （Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｃｓにおいて開発された）、およびポリメラーゼの２倍モル過剰 （０．８４５ μＬ） のＴａｑ阻害性抗体ＴＰ４−９．２、ＨＴ５０緩衝液 （１００ ｍＭの塩化ナトリウム、および５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５）、０．２ μＭの示した診断用プライマー対 （下文参照）、０．０５ μＭのＰＣＲ対照プライマー対、０．１ μＭの酵素対照プライマー対 （下文参照）、０．２ μＭの全デオキシヌクレオシド三リン酸 （ｄＮＴＰ）、０．６単位／μｌのＢｓｌ Ｉ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）、１ ｍＭのジチオスレイトール （ＤＴＴ）、４ ｍＭの塩化マグネシウム、試料 （典型的には３ μＬ） および最終体積を１００ μＬまでとする脱イオン水。
【０１２１】
配列番号３ （５ＢＫ５） および配列番号４ （３Ｋ６） をＰＣＲ対照プライマー対として使用し、そして配列番号６３ （５Ｎ１２） および配列番号５５ （３ＢＮ１３） を酵素対照プライマー対として使用した。下記のプライマー対を使用した：コドン１２におけるＨ−ｒａｓ突然変異の検出について：配列番号５１ （５Ｈ１２Ａ） および配列番号５２ （３ＨＢ１）；コドン１３におけるＨ−ｒａｓ突然変異の検出について：配列番号５３ （５Ｈ１３） および配列番号５２ （３ＨＢ１）；コドン１２におけるＮ−ｒａｓ突然変異について：配列番号２８ （５ＢＮ２） および配列番号３１ （３Ｎ５）；およびコドン１３におけるＮ−ｒａｓの検出について：配列番号２９ （５Ｎ４） および配列番号３１ （３Ｎ５）。
【０１２２】
ラウンド１について下記のパラメーターを使用してＧｅｎｅ−Ａｍｐ ９６００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、コネチカット州ノーウォーク） 中で熱的サイクリングを実施した：９４ ℃における３分間の１サイクル、次いで３２サイクルの９４ ℃における１０秒間、および６０ ℃における３０秒間の交互するインキュベーション。Ｈ−ｒａｓイントロンＤにおける突然変異のアッセイのために、３２サイクルの代わりに３８サイクルのＰＣＲ増幅を使用した。
Ｎ−ｒａｓコドン１２および１３における突然変異およびＣＨ−ｒａｓコドン１２において突然変異を決定するために、制限酵素としてＢｓｌ Ｉを使用するＲＥＭＳ−ＰＣＲにおいて下記のプライマーを使用した：
【０１２３】
配列番号４３
ＡＡＴＡＴＡＡＧＣＴ  ＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧ  ＧＧＣＧ
配列番号４９
ＡＴＡＡＧＣＴＧＧＴ  ＧＧＴＧＣＣＣＧＣＣ  ＧＴ
配列番号５０
ＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡ  ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＣ  ＣＴＧＧＡＧＣＴ
配列番号５１
ＡＡＴＡＴＡＡＧＣＴ  ＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧ  ＧＧＣＧＣ
配列番号５２
ＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧ  ＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧ  ＡＴＧ
配列番号５３
ＡＴＡＡＧＣＴＧＧＴ  ＧＧＴＧＧＴＧＣＣＣ  ＧＣＣＧ
配列番号５４
ＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴ  ＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴ  ＴＧＴＴＧＧ
配列番号５５
ＣＴＡＴＴＡＴＴＧＡ  ＴＧＧＣＡＡＣＣＡＣ  ＡＣＡＧ
【０１２４】
上に同定したプライマーおよび方法を使用して、細胞系統においてまたはｒａｓ突然変異配列を含んでなるオリゴヌクレオチドにおいてｒａｓ突然変異は検出された。
【０１２５】
実施例７．分子ビーコンアッセイをベースとするＨ−１２、Ｎ−１２およびＮ−１３ｒａｓ突然変異の検出
Ｈ−１２、Ｎ−１２およびＮ−１３における突然変異を決定するために、下記のプローブを使用した。また、Ｈ−１２についてのプローブをＨ−１３突然変異の検出に使用することができる。ターゲット特異的プローブを５’ 末端に蛍光体ＦＡＭおよび３’ 末端にクエンチャーＤＡＢＣＹＬを含んでなる分子ビーコンの形態で調製した。実施例５からのプライマーをＲＥＭＳ−ＰＣＲにおいて使用した。
【０１２６】
配列番号５６
ＧＣＧＡＧＣＧＴＧＧ  ＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡ  ＡＧＣＧＣＡＧＣＴＣ  ＧＣ
配列番号５７
ＧＣＧＡＧＣＣＧＴＣ  ＧＧＴＧＴＧＧＧＣＡ  ＧＡＧＴＧＣＧＣＴＧ  ＣＴＣＧＣ
配列番号５８
ＧＣＧＡＧＣＧＡＡＡ  ＣＣＴＣＡＧＣＣＡＡ  ＧＡＣＣＡＧＡＣＡＧ  ＧＣＴＣＧＣ
配列番号５９
ＧＣＧＡＧＣＧＡＣＡ  ＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴ  ＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧ  ＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣ  ＧＣＴＣＧＣ
配列番号６０
ＡＴＡＴＡＡＡＣＴＴ  ＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧ  ＧＡＧＣＴ
配列番号６１
ＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴ  ＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴ  ＴＧ
【０１２７】
配列番号６２
ＣＴＴＧＣＴＡＴＴＡ  ＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡ  ＣＣＡＣＡＣＡＧＡ
配列番号６３
ＴＡＴＡＧＡＴＧＧＴ  ＧＡＡＡＣＣＴＧＴＴ  ＴＧ
配列番号６４
ＡＴＡＡＧＣＴＧＧＴ  ＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣ  Ｇ
配列番号６５
ＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧ  ＡＴＣＡＧＣＴＧＧ
配列番号６６
ＡＡＴＡＴＡＡＧＣＴ  ＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧ  ＧＧＣＧ
配列番号６７
ＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧ  ＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧ  ＡＴＧＧＴＣ
【０１２８】
反応混合物は下記の成分を含有した：１２単位／１００ μｌの組換えＴａｑポリメラーゼ （Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｃｓにおいて開発された）、およびポリメラーゼの４倍モル過剰 （０．８４２ μＬ） のＴａｑ阻害性抗体ＴＰ４−９．２、ＨＴ５０緩衝液 （１００ ｍＭの塩化ナトリウム、および５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５）、０．２ μＭの全デオキシヌクレオシド三リン酸 （ｄＮＴＰ）、０．３単位／μｌのＢｓｌ Ｉ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）、１ ｍＭのジチオスレイトール （ＤＴＴ）、４ ｍＭの塩化マグネシウム、突然変異体の示した希釈物および野生型ＤＮＡから構成された試料 （典型的には３ μＬ） および最終体積を１００ μＬまでとする脱イオン水。
【０１２９】
ＲＥＭＳ−ＰＣＲおよび分子ビーコンをベースとするＮ−１２ｒａｓ突然変異を検出するために、下記のプライマーおよび分子ビーコンを個々の反応混合物に添加した。ＰＣＲ対照プライマー５ＢＫ５ （配列番号３） および３Ｋ６ （配列番号４） を０．１ μＭで添加した。０．２ μＭの酵素対照プライマー５Ｎ１２Ａ （配列番号５４） および３Ｎ１３Ａ （配列番号４９）、および０．３ μＭの診断用プライマー５ＢＮ２ （配列番号２８） および３Ｎ５Ｓ （配列番号４４） を添加した。ＰＣＲ対照分子ビーコンはＢＰＩＧ （配列番号１５） であり、酵素対照分子ビーコンはＢＥ１ （配列番号１６） であり、そして診断用分子ビーコンはＢＮＤ１２ （配列番号５６） であった。すべての分子ビーコンの各々は０．２ μＭで添加し、ＦＡＭ色素で標識化した。ＡＢＩ Ｐｒｉｍｅ ７７００配列検出器上のＰＣＲ熱的サイクリング条件は、４５のＰＣＲサイクルを使用した以外、実施例３に記載されている通りであった。
【０１３０】
ＲＥＭＳ−ＰＣＲおよび分子ビーコンをベースとするＨ−１２ｒａｓ突然変異を検出するために、下記のプライマーおよび分子ビーコンを個々の反応混合物に添加した。ＰＣＲ対照プライマー５ＢＫ５ （配列番号３） および３Ｋ６ （配列番号４） を０．０５ μＭで添加した。０．１ μＭの酵素対照プライマー５Ｎ１２Ａ （配列番号５４） および３Ｎ１３Ａ （配列番号４９）、および０．２ μＭの診断用プライマー５Ｈ１２Ｂ （配列番号６６） および３ＨＢ２ （配列番号６７） を添加した。ＰＣＲ対照分子ビーコンはＢＰ１ （配列番号５９） であり、酵素対照分子ビーコンはＢＥ１ （配列番号１６） であり、そして診断用分子ビーコンはＢＨＤ１２ （配列番号５７） であった。すべての分子ビーコンの各々は０．２ μＭで添加し、ＦＡＭ色素で標識化した。ＡＢＩ Ｐｒｉｍｅ ７７００配列検出器上のＰＣＲ熱的サイクリング条件は、４５のＰＣＲサイクルを使用した以外、実施例３に記載されている通りであった。
【０１３１】
ＲＥＭＳ−ＰＣＲおよび分子ビーコンをベースとするコドン１３におけるＮ ｒａｓ突然変異を検出するために、下記のプライマーおよび分子ビーコンを個々の反応混合物に添加した。ＰＣＲ対照プライマー５ＢＫ５ （配列番号３） および３Ｋ６ （配列番号４） を０．１ μＭで添加した。０．１ μＭの酵素対照プライマー５Ｎ１２Ａ （配列番号５４） および３Ｎ１３ （配列番号５５）、および０．３ μＭの診断用プライマー５Ｎ４ （配列番号２９） および３Ｎ５Ｓ （配列番号４４） を添加した。ＰＣＲ対照分子ビーコンはＢＰ１ （配列番号５９） であり、酵素対照分子ビーコンはＢＥＬ （配列番号５８） であり、そして診断用分子ビーコンはＢＮＤ１２ （配列番号５６） であった。すべての分子ビーコンの各々は０．２ μＭで添加し、ＦＡＭ色素で標識化した。ＡＢＩ Ｐｒｉｍｅ ７７００配列検出器上のＰＣＲ熱的サイクリング条件は、４５のＰＣＲサイクルを使用した以外、実施例３に記載されている通りであった。
【０１３２】
これらの研究の結果を下記表４に示す。すべてのＰＣＲ対照は２８．３１〜３４．４３のＣｔ値を示し、試料がＰＣＲ増幅可能なＤＮＡを含有したことを示す。コドン１２におけるＨ−ｒａｓ突然変異およびコドン１２および１３におけるＮ−ｒａｓ突然変異についてのすべての診断試料は、コドン１２におけるＮ−ｒａｓ突然変異についての野生型試料に対する大部分の希釈１：１０００突然変異体を除外して、４０以下のＣｔ値を示し、突然変異体配列が検出可能であったことを示す。制限酵素を欠失した対照試料を除外して、酵素対照試料は＞４０または＞４５のＣｔ値を示した。この試料は２９．１のＣｔ値を有し、酵素対照が制限酵素の非存在下に機能したことを示す。これらの結果が示すように、上に同定したプライマー、プローブおよび方法をベースとする野生型に対する１：１０００またはそれより大きい突然変異体の希釈においてｒａｓ突然変異を検出できることを示す。
【０１３３】
【表４】
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【０１３４】
本発明を特定の好ましい態様に関して詳細に説明した。本発明の範囲および精神から逸脱しないで、変更および変化が可能であることが理解されるであろう。すべての特許、特許出願、および非特許の開示およびそれらの引用の全内容は特別の目的で引用することによって本明細書の一部とされる。
【０１３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
第１図は、細胞系統におけるＫ−１２ ｒａｓ突然変異についてのネステッドＰＣＲ／ＲＦＬＰ分析を示す。Ｋ５６２細胞系統のＤＮＡ：制限酵素消化の前、レーン１、および後、レーン２。Ｃａｌｕ１細胞系統のＤＮＡ：レーン１、および後、レーン２。
【図２】
第２図は、患者の試料中のＫ−１２ ｒａｓ突然変異についてのネステッドＰＣＲ／ＲＦＬＰ分析を示す；ＢｓｔｎＩ制限酵素消化の前 （レーン２、４、および６） および後 （レーン３、５、および７）。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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