(57)【要約】卵に存在する物質、例えばトリプシンインヒビタータイプＩＶ−０による阻害に対する低められた傾向を有する新規サブチラーゼ変異体に関する。特に、位置４２−４３、５１−５６， １５５−１６１， １８７−１９０， ２１６−２１７， ２１７−２１８又は２１８−２１９（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含んで成る変異体に関する。それらのサブチラーゼ変異体は、例えば清浄又は洗剤組成物、例えば洗濯洗剤組成物及び皿洗い組成物、例えば自動皿洗い組成物に使用される場合、卵のしみに対して卓越した又は改良された洗浄性能を示す。また、変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列、発現ベクター、宿主細胞、及び本発明の変異体の生成方法及び使用方法に関する。さらに、変異体を含んで成る清浄及び洗剤組成物が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置４２と４３との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
位置５１と５６との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
位置１５５と１６１との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
位置１８７と１９０との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
位置２１６と２１７との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
位置２１７と２１８との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；及び
位置２１８と２１９との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体から成る群から選択されたサブチラーゼ変異体。
【請求項２】
前記挿入が、位置５１と５２との間への挿入、位置５２と５３との間への挿入、位置５３と５４との間への挿入、位置５４と５５との間への挿入、及び位置５５と５６との間への挿入（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）から成る群から選択された請求項１記載の変異体。
【請求項３】
前記挿入が、位置１５５と１５６との間への挿入、位置１５６と１５７との間への挿入、位置１５７と１５８との間への挿入、位置１５８と１５９との間への挿入、位置１５９と１６０との間への挿入、及び位置１６０と１６１との間への挿入（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）から成る群から選択された請求項１記載の変異体。
【請求項４】
前記挿入が、位置１８７と１８８との間への挿入、位置１８８と１８９との間への挿入、及び位置１８９と１９０との間への挿入（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）から成る群から選択された請求項１記載の変異体。
【請求項５】
前記変異体が、本明細書における例４に開示される“卵−阻害アッセイ”において試験される場合、少なくとも１０％の残留活性を有する請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体。
【請求項６】
前記変異体が、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも２５％の残留活性を有する請求項５記載の変異体。
【請求項７】
前記変異体が、前記位置間に１つよりも多くの挿入を含む請求項１〜６のいずれか１項記載の変異体。
【請求項８】
前記変異体が、異なった組の上記位置間に２つ又はそれ以上の挿入を含む請求項１〜７のいずれか１項記載の変異体。
【請求項９】
前記変異体が、前記組みの個々の位置間に２以上の挿入を含む請求項８記載の変異体。
【請求項１０】
前記変異体が、少なくとも１つの追加の修飾を含んで成る請求項１〜９のいずれか１項記載の変異体。
【請求項１１】
前記修飾が、置換である請求項１０記載の変異体。
【請求項１２】
前記挿入が、Ｘ４２ＸＡ， Ｘ４２ＸＴ， Ｘ４２ＸＧ， Ｘ４２ＸＳ， Ｘ４２ＸＤ， Ｘ４２ＸＥ， Ｘ４２ＸＫ， Ｘ４２ＸＲ， Ｘ４２ＸＨ， Ｘ４２ＸＶ， Ｘ４２ＸＣ， Ｘ４２ＸＮ， Ｘ４２ＸＱ， Ｘ４２ＸＦ， Ｘ４２ＸＩ， Ｘ４２ＸＬ， Ｘ４２ＸＭ， Ｘ４２ＸＰ， Ｘ４２ＸＷ及びＸ４２ＸＹから成る群から選択される請求項１記載の変異体。
【請求項１３】
前記挿入が、Ｘ５１ＸＡ， Ｘ５１ＸＴ， Ｘ５１ＸＧ， Ｘ５１ＸＳ， Ｘ５１ＸＤ， Ｘ５１ＸＥ， Ｘ５１ＸＫ， Ｘ５１ＸＲ， Ｘ５１ＸＨ， Ｘ５１ＸＶ， Ｘ５１ＸＣ， Ｘ５１ＸＮ， Ｘ５１ＸＱ， Ｘ５１ＸＦ， Ｘ５１ＸＩ， Ｘ５１ＸＬ， Ｘ５１ＸＭ， Ｘ５１ＸＰ， Ｘ５１ＸＷ及びＸ５１ＸＹから成る群から選択される請求項２記載の変異体。
【請求項１４】
前記挿入が、Ｘ５２ＸＡ， Ｘ５２ＸＴ， Ｘ５２ＸＧ， Ｘ５２ＸＳ， Ｘ５２ＸＤ， Ｘ５２ＸＥ， Ｘ５２ＸＫ， Ｘ５２ＸＲ， Ｘ５２ＸＨ， Ｘ５２ＸＶ， Ｘ５２ＸＣ， Ｘ５２ＸＮ， Ｘ５２ＸＱ， Ｘ５２ＸＦ， Ｘ５２ＸＩ， Ｘ５２ＸＬ， Ｘ５２ＸＭ， Ｘ５２ＸＰ， Ｘ５２ＸＷ及びＸ５２ＸＹから成る群から選択される請求項２記載の変異体。
【請求項１５】
前記挿入が、Ｘ５３ＸＡ， Ｘ５３ＸＴ， Ｘ５３ＸＧ， Ｘ５３ＸＳ， Ｘ５３ＸＤ， Ｘ５３ＸＥ， Ｘ５３ＸＫ， Ｘ５３ＸＲ， Ｘ５３ＸＨ， Ｘ５３ＸＶ， Ｘ５３ＸＣ， Ｘ５３ＸＮ， Ｘ５３ＸＱ， Ｘ５３ＸＦ， Ｘ５３ＸＩ， Ｘ５３ＸＬ， Ｘ５３ＸＭ， Ｘ５３ＸＰ， Ｘ５３ＸＷ及びＸ５３ＸＹから成る群から選択される請求項２記載の変異体。
【請求項１６】
前記挿入が、Ｘ５４ＸＡ， Ｘ５４ＸＴ， Ｘ５４ＸＧ， Ｘ５４ＸＳ， Ｘ５４ＸＤ， Ｘ５４ＸＥ， Ｘ５４ＸＫ， Ｘ５４ＸＲ， Ｘ５４ＸＨ， Ｘ５４ＸＶ， Ｘ５４ＸＣ， Ｘ５４ＸＮ， Ｘ５４ＸＱ， Ｘ５４ＸＦ， Ｘ５４ＸＩ， Ｘ５４ＸＬ， Ｘ５４ＸＭ， Ｘ５４ＸＰ， Ｘ５４ＸＷ及びＸ５４ＸＹから成る群から選択される請求項２記載の変異体。
【請求項１７】
前記挿入が、Ｘ５５ＸＡ， Ｘ５５ＸＴ， Ｘ５５ＸＧ， Ｘ５５ＸＳ， Ｘ５５ＸＤ， Ｘ５５ＸＥ， Ｘ５５ＸＫ， Ｘ５５ＸＲ， Ｘ５５ＸＨ， Ｘ５５ＸＶ， Ｘ５５ＸＣ， Ｘ５５ＸＮ， Ｘ５５ＸＱ， Ｘ５５ＸＦ， Ｘ５５ＸＩ， Ｘ５５ＸＬ， Ｘ５５ＸＭ， Ｘ５５ＸＰ， Ｘ５５ＸＷ及びＸ５５ＸＹから成る群から選択される請求項２記載の変異体。
【請求項１８】
前記挿入が、Ｘ１５５ＸＡ， Ｘ１５５ＸＴ， Ｘ１５５ＸＧ， Ｘ１５５ＸＳ， Ｘ１５５ＸＤ， Ｘ１５５ＸＥ， Ｘ１５５ＸＫ， Ｘ１５５ＸＲ， Ｘ１５５ＸＨ， Ｘ１５５ＸＶ， Ｘ１５５ＸＣ， Ｘ１５５ＸＮ， Ｘ１５５ＸＱ， Ｘ１５５ＸＦ， Ｘ１５５ＸＩ， Ｘ１５５ＸＬ， Ｘ１５５ＸＭ， Ｘ１５５ＸＰ， Ｘ１５５ＸＷ及びＸ１５５ＸＹから成る群から選択される請求項３記載の変異体。
【請求項１９】
前記挿入が、Ｘ１５６ＸＡ， Ｘ１５６ＸＴ， Ｘ１５６ＸＧ， Ｘ１５６ＸＳ， Ｘ１５６ＸＤ， Ｘ１５６ＸＥ， Ｘ１５６ＸＫ， Ｘ１５６ＸＲ， Ｘ１５６ＸＨ， Ｘ１５６ＸＶ， Ｘ１５６ＸＣ， Ｘ１５６ＸＮ， Ｘ１５６ＸＱ， Ｘ１５６ＸＦ， Ｘ１５６ＸＩ， Ｘ１５６ＸＬ， Ｘ１５６ＸＭ， Ｘ１５６ＸＰ， Ｘ１５６ＸＷ及びＸ１５６ＸＹから成る群から選択される請求項３記載の変異体。
【請求項２０】
前記挿入が、Ｘ１５７ＸＡ， Ｘ１５７ＸＴ， Ｘ１５７ＸＧ， Ｘ１５７ＸＳ， Ｘ１５７ＸＤ， Ｘ１５７ＸＥ， Ｘ１５７ＸＫ， Ｘ１５７ＸＲ， Ｘ１５７ＸＨ， Ｘ１５７ＸＶ， Ｘ１５７ＸＣ， Ｘ１５７ＸＮ， Ｘ１５７ＸＱ， Ｘ１５７ＸＦ， Ｘ１５７ＸＩ， Ｘ１５７ＸＬ， Ｘ１５７ＸＭ， Ｘ１５７ＸＰ， Ｘ１５７ＸＷ及びＸ１５７ＸＹから成る群から選択される請求項３記載の変異体。
【請求項２１】
前記挿入が、Ｘ１５８ＸＡ， Ｘ１５８ＸＴ， Ｘ１５８ＸＧ， Ｘ１５８ＸＳ， Ｘ１５８ＸＤ， Ｘ１５８ＸＥ， Ｘ１５８ＸＫ， Ｘ１５８ＸＲ， Ｘ１５８ＸＨ， Ｘ１５８ＸＶ， Ｘ１５８ＸＣ， Ｘ１５８ＸＮ， Ｘ１５８ＸＱ， Ｘ１５８ＸＦ， Ｘ１５８ＸＩ， Ｘ１５８ＸＬ， Ｘ１５８ＸＭ， Ｘ１５８ＸＰ， Ｘ１５８ＸＷ及びＸ１５８ＸＹから成る群から選択される請求項３記載の変異体。
【請求項２２】
前記挿入が、Ｘ１５９ＸＡ， Ｘ１５９ＸＴ， Ｘ１５９ＸＧ， Ｘ１５９ＸＳ， Ｘ１５９ＸＤ， Ｘ１５９ＸＥ， Ｘ１５９ＸＫ， Ｘ１５９ＸＲ， Ｘ１５９ＸＨ， Ｘ１５９ＸＶ， Ｘ１５９ＸＣ， Ｘ１５９ＸＮ， Ｘ１５９ＸＱ， Ｘ１５９ＸＦ， Ｘ１５９ＸＩ， Ｘ１５９ＸＬ， Ｘ１５９ＸＭ， Ｘ１５９ＸＰ， Ｘ１５９ＸＷ及びＸ１５９ＸＹから成る群から選択される請求項３記載の変異体。
【請求項２３】
前記挿入が、Ｘ１６０ＸＡ， Ｘ１６０ＸＴ， Ｘ１６０ＸＧ， Ｘ１６０ＸＳ， Ｘ１６０ＸＤ， Ｘ１６０ＸＥ， Ｘ１６０ＸＫ， Ｘ１６０ＸＲ， Ｘ１６０ＸＨ， Ｘ１６０ＸＶ， Ｘ１６０ＸＣ， Ｘ１６０ＸＮ， Ｘ１６０ＸＱ， Ｘ１６０ＸＦ， Ｘ１６０ＸＩ， Ｘ１６０ＸＬ， Ｘ１６０ＸＭ， Ｘ１６０ＸＰ， Ｘ１６０ＸＷ及びＸ１６０ＸＹから成る群から選択される請求項３記載の変異体。
【請求項２４】
前記挿入が、Ｘ１８７ＸＡ， Ｘ１８７ＸＴ， Ｘ１８７ＸＧ， Ｘ１８７ＸＳ， Ｘ１８７ＸＤ， Ｘ１８７ＸＥ， Ｘ１８７ＸＫ， Ｘ１８７ＸＲ， Ｘ１８７ＸＨ， Ｘ１８７ＸＶ， Ｘ１８７ＸＣ， Ｘ１８７ＸＮ， Ｘ１８７ＸＱ， Ｘ１８７ＸＦ， Ｘ１８７ＸＩ， Ｘ１８７ＸＬ， Ｘ１８７ＸＭ， Ｘ１８７ＸＰ， Ｘ１８７ＸＷ及びＸ１８７ＸＹから成る群から選択される請求項４記載の変異体。
【請求項２５】
前記挿入が、Ｘ１８８ＸＡ， Ｘ１８８ＸＴ， Ｘ１８８ＸＧ， Ｘ１８８ＸＳ， Ｘ１８８ＸＤ， Ｘ１８８ＸＥ， Ｘ１８８ＸＫ， Ｘ１８８ＸＲ， Ｘ１８８ＸＨ， Ｘ１８８ＸＶ， Ｘ１８８ＸＣ， Ｘ１８８ＸＮ， Ｘ１８８ＸＱ， Ｘ１８８ＸＦ， Ｘ１８８ＸＩ， Ｘ１８８ＸＬ， Ｘ１８８ＸＭ， Ｘ１８８ＸＰ， Ｘ１８８ＸＷ及びＸ１８８ＸＹから成る群から選択される請求項４記載の変異体。
【請求項２６】
前記挿入が、Ｘ１８９ＸＡ， Ｘ１８９ＸＴ， Ｘ１８９ＸＧ， Ｘ１８９ＸＳ， Ｘ１８９ＸＤ， Ｘ１８９ＸＥ， Ｘ１８９ＸＫ， Ｘ１８９ＸＲ， Ｘ１８９ＸＨ， Ｘ１８９ＸＶ， Ｘ１８９ＸＣ， Ｘ１８９ＸＮ， Ｘ１８９ＸＱ， Ｘ１８９ＸＦ， Ｘ１８９ＸＩ， Ｘ１８９ＸＬ， Ｘ１８９ＸＭ， Ｘ１８９ＸＰ， Ｘ１８９ＸＷ及びＸ１８９ＸＹから成る群から選択される請求項４記載の変異体。
【請求項２７】
前記挿入が、Ｘ２１６ＸＡ， Ｘ２１６ＸＴ， Ｘ２１６ＸＧ， Ｘ２１６ＸＳ， Ｘ２１６ＸＤ， Ｘ２１６ＸＥ， Ｘ２１６ＸＫ， Ｘ２１６ＸＲ， Ｘ２１６ＸＨ， Ｘ２１６ＸＶ， Ｘ２１６ＸＣ， Ｘ２１６ＸＮ， Ｘ２１６ＸＱ， Ｘ２１６ＸＦ， Ｘ２１６ＸＩ， Ｘ２１６ＸＬ， Ｘ２１６ＸＭ， Ｘ２１６ＸＰ， Ｘ２１６ＸＷ及びＸ２１６ＸＹから成る群から選択される請求項１記載の変異体。
【請求項２８】
前記挿入が、Ｘ２１７ＸＡ， Ｘ２１７ＸＴ， Ｘ２１７ＸＧ， Ｘ２１７ＸＳ， Ｘ２１７ＸＤ， Ｘ２１７ＸＥ， Ｘ２１７ＸＫ， Ｘ２１７ＸＲ， Ｘ２１７ＸＨ， Ｘ２１７ＸＶ， Ｘ２１７ＸＣ， Ｘ２１７ＸＮ， Ｘ２１７ＸＱ， Ｘ２１７ＸＦ， Ｘ２１７ＸＩ， Ｘ２１７ＸＬ， Ｘ２１７ＸＭ， Ｘ２１７ＸＰ， Ｘ２１７ＸＷ及びＸ２１７ＸＹから成る群から選択される請求項１記載の変異体。
【請求項２９】
前記挿入が、Ｘ２１８ＸＡ， Ｘ２１８ＸＴ， Ｘ２１８ＸＧ， Ｘ２１８ＸＳ， Ｘ２１８ＸＤ， Ｘ２１８ＸＥ， Ｘ２１８ＸＫ， Ｘ２１８ＸＲ， Ｘ２１８ＸＨ， Ｘ２１８ＸＶ， Ｘ２１８ＸＣ， Ｘ２１８ＸＮ， Ｘ２１８ＸＱ， Ｘ２１８ＸＦ， Ｘ２１８ＸＩ， Ｘ２１８ＸＬ， Ｘ２１８ＸＭ， Ｘ２１８ＸＰ， Ｘ２１８ＸＷ及びＸ２１８ＸＹから成る群から選択される請求項１記載の変異体。
【請求項３０】
前記親サブチラーゼがサブグループＩ−Ｓ１に属する請求項１〜２９のいずれか１項記載の変異体。
【請求項３１】
前記親サブチラーゼが、ＢＳＳ１６８， ＢＳＳＡＳ， ＢＳＡＰＲＪ， ＢＳＡＰＲＮ， ＢＭＳＡＭＰ， ＢＡＳＢＰＮ， ＢＳＳＤＹ， ＢＬＳＣＡＲ， ＢＬＫＥＲＡ， ＢＬＳＣＡ１， ＢＬＳＣＡ２， ＢＬＳＣＡ３， ＢＳＳＰＲＣ及びＢＳＳＰＲＤ、又はサブグループＩ−Ｓ１の特徴を保持しているそれらの機能的変異体から成る群から選択される請求項３０記載の変異体。
【請求項３２】
前記親サブチラーゼが、サブグループＩ−Ｓ２に属する請求項１〜２９のいずれか１項記載の変異体。
【請求項３３】
前記親サブチラーゼが、ＢＳＡＰＲＱ， ＢＬＳ１４７， ＢＳＡＰＲＭ， ＢＡＨ１０１， ＢＬＳＡＶＩ （ＢＬ８３０９）， ＢＳＫＳＭＫ， ＢＡＡＬＫＰ （ＢＡＰＢ９２）， ＢＬＳＵＢＬ， ＢＳＥＹＡＢ， ＴＶＴＨＥＲ， 及びＢＳＡＰＲＳ、又はサブグループＩ−Ｓ２の特徴を保持しているそれらの機能的変異体から成る群から選択される請求項３２記載の変異体。
【請求項３４】
前記親サブチラーゼがＢＬＳＡＶＩ （Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標））である請求項３３記載の変異体。
【請求項３５】
前記変異体が、さらに、位置２７， ３６， ５６， ７６， ８７， ９５， ９６， ９７， ９８， ９９， １００， １０１， １０２， １０３， １０４， １２０， １２３， １２９， １３１， １３２， １３３， １４３， １５９， １６７， １７０， １９２， １９４， ２０６， ２１７， ２１８， ２２２， ２２４， ２３２， ２３５， ２３６， ２４５， ２４８， ２５２， 又は２７４（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）に、少なくとも１つの修飾を含んで成る請求項３２〜３４のいずれか１項記載の変異体。
【請求項３６】
前記変異体がさらに、下記修飾：
Ｓ１０１Ｇ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｄ＋Ａ２３２Ｖ＋Ｑ２３６Ｈ＋Ｑ２４５Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｎ２５２Ｋを含んで成る請求項３５記載の変異体。
【請求項３７】
前記変異体がさらに、位置９５〜１０３（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）からの活性部位ループ（ｂ）領域に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含んで成る請求項３２〜３６のいずれか１項記載の変異体。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか１項記載のサブチラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を有する単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項３８記載の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３９記載の発現ベクターにより形質転換された微生物宿主細胞。
【請求項４１】
細菌、好ましくはバチルス、特にバチル・レンタン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）である請求項４０記載の微生物宿主細胞。
【請求項４２】
菌類又は酵母、好ましくは糸状菌、特にアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）である請求項４０記載の微生物宿主細胞。
【請求項４３】
請求項１〜３７のいずれか１項記載のサブチラーゼ変異体の生成方法であって、請求項４０〜４２のいずれか１項記載の宿主が、変異体の発現及び分泌の助けとなる条件下で培養され、そして前記変異体が回収される方法。
【請求項４４】
請求項１〜３７のいずれか１項記載の変異体を含んで成る、清浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い組成物。
【請求項４５】
セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、もう１つのプロテアーゼ、アミラーゼ又はそれらの混合物をさらに含んで成る請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
洗濯及び／又は皿洗い洗剤への請求項１〜３７のいずれか１項記載の変異体の使用。
【請求項４７】
硬質表面又は洗濯物からの卵のしみの除去方法であって、卵のしみを含む硬質表面又は卵のしみを含む洗濯物と、請求項１〜３７のいずれか１項記載のサブチラーゼ変異体を含んで成る、清浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い組成物とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項４８】
前記組成物がさらに、セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、もう１つのプロテアーゼ、アミラーゼ又はそれらの混合物をさらに含んで成る請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
請求項１〜３７のいずれか１項記載のサブチラーゼ変異体を包む、洗浄又は洗剤組成物、好ましくは洗剤又は皿洗組成物の、洗濯物又は硬質表面から卵のしみを除去するためへの使用。
【請求項５０】
前記組成物がさらに、セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、もう１つのプロテアーゼ、アミラーゼ又はそれらの混合物をさらに含んで成る請求項４９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野：
本発明は、卵に存在する物質、例えばトリプシンインヒビタータイプＩＶ−０による阻害に対して低められた傾向を有する新規サブチラーゼ変異体に関する。特に、本発明は、位置４２−４３， ５１−５５， １５５−１６０， １８７−１８９， ２１７−２１８又は２１８−２１９（サブチリシンＢＰＮ’ （ＢＡＳＢＰＮ） 番号付けにおける；下記参照のこと）間に少なくとも１つの追加のアミノ酸残基を含んで成る新規サブチラーゼ変異体に関する。それらのサブチラーゼ変異体は、例えば清浄又は洗剤組成物、例えば洗濯洗剤組成物及び皿洗い用組成物、例えば自動皿洗い用組成物に使用される場合、卵のしみに対して卓越した又は改良された洗浄性能を示すのに有用である。本発明はまた、変異体をコードする単離されたＤＮＡ配列、発現ベクター、宿主細胞、及び本発明の変異体の生成及び使用方法にも関する。さらに、本発明は、本発明の変異体を含んで成る洗浄及び洗剤組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
洗剤産業においては、酵素は、洗浄配合物に３０年以上の間、使用されて来た。そのような配合物に使用される酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、及び他の酵素、又はそれらの混合物を包含する。商業的に最も重要な酵素は、プロテアーゼである。
多数の商業的に使用されるプロテアーゼは、天然に存在する野生型プロテアーゼのタンパク質構築された変異体、例えばＤＵＲＡＺＹＭ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）， ＲＥＬＡＳＥ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）， ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ Ｎ．Ｖ．）， ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ． ＩＮＣ．） である。
【０００３】
さらに、多くのプロテアーゼ変異体が当業界において記載されている。従来技術のプロテアーゼ変異体の完全な一覧表がＷＯ９９／２７０８２号に与えられている。
しかしながら、多くの有用なプロテアーゼ及びプロテアーゼ変異体が記載されて来たが、多くの産業使用のために新規の改良されたプロテアーゼ又はプロテアーゼ変異体の必要性がまだ存在する。
【０００４】
特に、例えば洗濯物又は硬質表面からの卵のしみの除去の問題が、卵白に存在する物質が多くのセリンプロテアーゼを阻害する事実のために言明されている。そのような物質の例は、トリプシンインヒビタータイプＩＶ−０（卵−インヒビター）及びトリプシンインヒビタータイプＩＩＩ−０（オボムコイド）を包含する。
従って、本発明の目的は、そのような物質により阻害されないか、又は制限された程度でのみ、阻害される改良されたサブチラーゼ酵素を供給することである。本発明のさらなる目的は、洗濯物及び／又は硬質表面からの卵のしみの除去のために適切である改良されたサブチラーゼ酵素を供給することである。
【０００５】
発明の要約：
従って、第１の観点においては、本発明は、
位置４２と４３との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
位置５１と５６との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
位置１５５と１６１との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
【０００６】
位置１８７と１９０との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
位置２１６と２１７との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；
位置２１７と２１８との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体；及び
位置２１８と２１９との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）への少なくとも１つの追加のアミノ酸残基の挿入を含んで成るサブチラーゼ変異体から成る群から選択されたサブチラーゼ変異体に関する。
【０００７】
第２の観点においては、本発明は、本発明のサブチラーゼ変異体をコードする核酸配列を含んで成る単離された核酸配列に関する。
第３の観点においては、本発明は、適切な宿主においてサブチラーゼの発現を指図することができる１又は複数の制御配列に操作可能的に連結される本発明の核酸配列を含んで成る核酸構造体に関する。
第４の観点においては、本発明は、本発明の核酸構造体、プロモーター、及び転写及び翻訳停止グルナルを含んで成る組換え発現ベクターに関する。
第５の観点においては、本発明は、本発明の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞に関する。
【０００８】
第６の観点においては、本発明は、
（ａ）サブチラーゼの生成の助けとなる条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）前記サブチラーゼ変異体を回収することを含んで成る、本発明のサブチラーゼ変異体の生成方法に関する。
第７の観点においては、本発明は、
（ａ）サブチラーゼ変異体を含んで成る上清液を生成するために、バチルス属、好ましくはバチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、例えばバチルス・クラウジイＤＳＭ１３５８５からの株を培養し；そして
（ｂ）サブチラーゼ変異体を回収することを含んで成る、本発明のサブチラーゼ変異体の生成方法に関する。
【０００９】
第８の観点においては、本発明は、本発明のサブチラーゼ変異体を含んで成る、清浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い組成物に関する。
本発明のさらなる観点は、本発明の清浄又は洗剤組成物への本発明のサブチラーゼの使用；卵のしみの除去のためへの本発明のサブチラーゼ又は組成物の使用；清浄又は洗浄方法、例えば硬質表面又は洗濯物と本発明の組成物とを接触せしめることを含んで成る、硬質表面又は洗濯物からの卵のしみの除去方法に関する。
【００１０】
さらなる観点においては、本発明は、卵のしみを含む硬質表面又は卵のしみを含む洗濯物と、本発明のサブチラーゼ変異体を含んで成る、清浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い組成物とを接触せしめることを含んで成る、硬質表面又は洗濯物からの卵のしみの除去方法に関する。
一列整列及び番号付けに関しては、スブチリシンＢＰＮ’（ａ）（ＢＡＳＢＰＮ）（配列番号７）とスブチリシン３０９（ｂ）（ＢＬＳＡＶＩ）（配列番号８）との間の一列整列を示す図１を参照のこと。
それらの一列整列は、残基を番号付けるための参照として、本特許出願に使用される。
【００１１】
定義：
本発明をさらに詳細に論じる前、次の用語及び慣例が最初に定義されるであろう。
アミノ酸及び核酸の命名法：
本明細書、図面及び請求項を通して、アミノ酸残基に関する認識されたＩＵＰＡＣ命名法が、ほとんど、１文字コード形で、但しまた、３文字コード形で使用されるであろう。同様に、核酸についての認識されるＩＵＰＡＣ命名法が、本明細書、図面及び請求項を通して使用されるであろう。
【００１２】
変異体の企画のための命名法及び慣例：
本発明に従って生成され又は企画される種々のサブチラーゼ酵素変異体を記載する場合、次の命名法及び慣例が参照の容易さのために適合されて来た：
参照の枠は、サブチリシンＢＰＮ’（ＢＡＳＢＰＮ）と単離された又は親酵素とを整列することによって、最初に定義される。
一列整列は、次のパラメーターを用いて、サブチラーゼを番号付けするためにＧＣＧパッケージバージョンのＧＡＰ慣例により得られる：ギャップ創造ペナルティー＝８及びギャップ延長ペナルティー＝８、並びにそれらのデフォールト値で維持されるすべての他のパラメーター。
【００１３】
もう１つの方法は、サブチラーゼ間の既知の認識される一列整列、例えばＷＯ９１／００３４５号に示される一列整列を使用することである。ほとんどの場合、差異は重要なものではないであろう。
それにより、多くの欠失及び挿入は、ＢＡＳＢＰＮに関して定義されるであろう。図１においては、スブチリシン３０９は、ＢＡＳＢＰＮに比較して、位置３６， ５８， １５８， １６２， １６３及び１６４で６個の欠失を有する。それらの欠失は、図１において、星印（★）により示される。
親酵素において行なわれる種々の修飾は、次の通りに３種の要素を用いて、一般的に示される：
【００１４】
原アミノ酸位置置換されるアミノ酸：
従って、表示Ｇ１９５Ｅは、グルタミン酸による位置１９５でのグリシンの置換を意味する。
原アミノ酸残基がいずれかのアミノ酸残基である場合、位置及び置換されるアミノ酸のみを示す短い表示が時々、使用され得る：
位置置換されるアミノ酸：
そのような表示は、相同サブチラーゼにおける修飾に関して、特に適切である（下記を参照のこと）。
同様に、置換するアミノ酸残基の本体が重要でない場合：
【００１５】
原アミノ酸位置：
原アミノ酸及び置換されるアミノ酸の両者がいずれのアミノ酸でもよい場合、その位置のみ、例えば１７０が示される。
原アミノ酸及び／又は置換されるアミノ酸が１つよりも多いが、しかしすべてではないアミノ酸を包含する場合、選択されるアミノ酸は括弧内に示される：
原アミノ酸位置｛置換されるアミノ酸１、−−−−、置換するアミノ酸ｎ｝：
特定の変異体に関しては、いずれでもよいアミノ酸残基を示すためにコードＸａａ及びＸを包含する特定の３又は１文字コードが使用される。
【００１６】
置換：
位置１９５におけるグルタミン酸によるグリシンの置換は、下記の通りに示される：
Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ　又は　Ｇ１９５Ｅ、
又は位置１９５におけるいずれかのアミノ酸残基によるグリシンの置換は次の通りに示される：
Ｇｌｙ１９５Ｘａａ　又は　Ｇ１９５Ｘ、又は
Ｇｌｙ１９５　又は　Ｇ１９５。
【００１７】
従って、位置１７０におけるセリンによるいずれかのアミノ酸残基の置換は次の通りに示される：
Ｘａａ１７０Ｓｅｒ　又は　Ｘ１７０Ｓ、又は
１７０Ｓｅｒ　又は　１７０Ｓ
そのような表示は、相同サブチラーゼにおける修飾に関して特に適切である（下記を参照のこと）。従って、１７０Ｓｅｒは、例えばＢＡＳＢＰＮにおけるＬｙｓ１７０Ｓｅｒ修飾及び本発明のサブチラーゼにおけるＡｒｇ１７０Ｓｅｒ修飾の両者を包含することを意味する（図１を参照のこと）。
【００１８】
原アミノ酸及び／又は置換されたアミノ酸が１個よりも多いが、しかしすべてではないアミノ酸を含んで成る修飾に関しては、位置１７０におけるグリシン、アラニン、セリン又はトレオニンによるアルギニンの置換は、下記変異体：
Ｒ１７０Ｇ、Ｒ１７０Ａ、Ｒ１７０Ｓ及びＲ１７０Ｔを示すために、
Ａｒｇ１７０｛Ｇｌｙ， Ａｌａ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ｝、又はＲ１７０｛Ｇ， Ａ， Ｓ， Ｔ｝により示される。
【００１９】
欠失：
位置１９５におけるグリシンの欠失は、下記のように示されるであろう：
Ｇｌｙ１９５★　又は　Ｇ１９５★。
従って、１個よりも多くのアミノ酸残基の欠失、例えば位置１９５及び１９６におけるグリシン及びロイシンの欠失は、次のように示されるであろう：
Ｇｌｙ１９５★＋Ｌｅｕ１９６★　又は　Ｇ１９５★＋Ｌ１９６★。
【００２０】
挿入：
Ｇ１９５の後への追加のアミノ酸残基、例えばリシンの挿入は、次のように示され：
Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ　又は　Ｇ１９５ＧＫ；又は
１個よりも多くのアミノ酸残基、例えばＬｙｓ及びＡｌａがＧ１９５の後に挿入される場合、これは次のように示されるであろう：
Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ　又は　Ｇ１９５ＧＫＡ。
【００２１】
そのような場合、挿入されるアミノ酸残基は、挿入されるアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号への小文字の付加により番号付けされる。上記例においては、従って、配列１９４〜１９６は、下記の通りである。
【００２２】
【化１】
2004511228.tif 000002
【００２３】
存在するアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基が挿入される場合、命名法における縮重が生じることは明白である。例えば、グリシンが上記例におけるグリシンの後に挿入される場合、これはＧ１９５ＧＧにより示される。同じ実際的な変化は、同様に、
【００２４】
【化２】
2004511228.tif 000003
【００２５】
への変化について、Ａ１９４ＡＧとして示される。
そのような物質は当業者に明らかであり、そして従って、表示Ｇ１９５ＧＧ及びこのタイプの挿入いついての対応する表示は、そのような同様の縮重表示を包含することを意味する。
【００２６】
ギャップの充填：
酵素における欠失が、番号付けのために使用されるサブチリシンＢＰＮ’配列との参照比較において存在する場合、そのような位置における挿入は、位置３６におけるアスパラギン酸の挿入に関して下記のように示される：
★３６Ａｓｐ　又は　★３６Ｄ。
【００２７】
複数の修飾：
複数の修飾を含んで成る変異体は、例えば下記のようにプラスにより分離され：
Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ　又は　Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ、ここで、それぞれチロシン及びグルタミン酸によりアルギニン及びグリシンを置換する、位置１７０及び１９５における修飾を表す。
【００２８】
従って、Ｔｙｒ１６７｛Ｇｌｙ， Ａｌａ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ｝＋Ａｒｇ１７０｛Ｇｌｙ， Ａｌａ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ｝は次の変異体を示す：
Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，　　 Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ，
Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｓｅｒ，　　 Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｔｈｒ，
Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，　　 Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ，
Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｓｅｒ，　　 Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｔｈｒ，
Ｔｙｒ１６７Ｓｅｒ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，　　 Ｔｙｒ１６７Ｓｅｒ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ，
Ｔｙｒ１６７Ｓｅｒ＋Ａｒｇ１７０Ｓｅｒ，　　 Ｔｙｒ１６７Ｓｅｒ＋Ａｒｇ１７０Ｔｈｒ，
Ｔｙｒ１６７Ｔｈｒ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，　　 Ｔｙｒ１６７Ｔｈｒ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ，
Ｔｙｒ１６７Ｔｈｒ＋Ａｒｇ１７０Ｓｅｒ， 及び Ｔｙｒ１６７Ｔｈｒ＋Ａｒｇ１７０Ｔｈｒ。
【００２９】
この命名法は、特定の共通する性質を有するアミノ酸残基、例えば正の電荷（Ｋ， Ｒ， Ｈ）、負の電荷（Ｄ， Ｅ）の置換、挿入又は欠失を意図する修飾、又は小さなアミノ酸によるもう１つの小さなアミノ酸の置換を表す、Ｔｙｒ１６７｛Ｇｌｙ， Ａｌａ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ｝＋Ａｒｇ１７０｛Ｇｌｙ， Ａｌａ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ｝の保存性アミノ酸修飾に関して、特に適切である。さらなる詳細については、セクション“発明の特定の記載”を参照のこと。
【００３０】
プロテアーゼ：
タンパク質基質におけるアミド結合を切断する酵素は、プロテアーゼ、又は（交換可能的には）ペプチダーゼとして分類される（Ｗａｌｓｈ， １９７９， Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃａｍｐａｎｙ， Ｓａｎ ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３を参照のこと）。
アミノ酸位置／残基の番号付け：
他に何も言及されていなければ、本明細書において使用されるアミノ酸番号付けは、サブチラーゼＢＰＮ’ （ＢＡＳＢＰＮ） 配列のそのアミノ酸番号付けに対応する。ＢＰＮ’配列のさらなる記載については、図１、又はＳｉｅｚｅｎなど．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ． ４ （１９９１） ７１９−７３７を参照のこと。
【００３１】
セリンプロテアーゼ：
セリンプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、そして活性部位で必須セリン残基が存在する酵素である（Ｗｈｉｔｅ， Ｈａｎｄｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， １９７３ “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ”， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮＹ， ｐｐ． ２７１−２７２）。
【００３２】
細菌セリンプロテアーゼは、２０，０００〜４５，０００ドルトン範囲の分子量を有する。それらはジイソプロピルフルオロホスフェートにより阻害される。それらは単純な末端エステルを加水分解し、そして活性的に、真核キモトリプシン、すなわちまたセリンプロテアーゼに類似する。サブグループを包含するより狭い用語アルカリプロテアーゼは、いくつかのセリンプロテアーゼの高い最適度（ｐＨ９．０〜１１．０）に影響を及ぼす（再考のためには、Ｐｒｉｅｓｔ（１９７７）Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ． ４１： ７１１−７５３を参照のこと）。
【００３３】
サブチラーゼ：
Ｓｉｅｚｅｎなどは、セリンプロテアーゼにより試験的に企画されたサブチラーゼのサブグループを提案している（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｎｇ， ４（１９９１） ７１９−７３７及びＳｉｅｚｅｎなど。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６（１９９７） ５０１−５２３）。それらは、サブチリシン−様プロテアーゼとして、これまで言及されているセリンプロテアーゼの１７０個よりも多くのアミノ酸配列の相同性分析により定義される。サブチリシンは、グラム−陽性細菌又は菌類により生成されるセリンプロテアーゼとしてこれまでしばしば定義されており、そしてＳｉｅｚｅｎなどによれば、現在、サブチラーゼのサブグループである。広範囲の種類のサブチラーゼが同定されており、そして多くのサブチラーゼのアミノ酸配列が決定されている。そのようなサブチラーゼ及びそれらのアミノ酸配列のさらなる詳細な記載に関しては、Ｓｉｅｚｅｎなど．（１９９７）を参照のこと。
【００３４】
サブチラーゼの１つのサブグループ、Ｉ−Ｓ１又は“真の”サブチリシンは、“標準的な”サブチリシン、例えばサブチリシン１６８（ＢＳＳ１６８）、サブチリシンＢＰＮ’ （ＢＡＳＢＰＮ）、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ （ＢＬＳＣＡＲ）（ＡＬＣＡＬＡＳＥ（商標）， ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ Ａ／Ｓ）、及びサブチリシンＤＹ（ＢＳＳＤＹ）を包含する。興味ある他のサブグループＩ−Ｓ１サブチラーゼは、ＢＳＳ１６８に密接に関連するスブチリシン、例えばスブチリシンアミロサッカリチカス（ＢＳＳＡＳ）、スブチリシンＪ（ＢＳＡＰＲＪ）、スブチリシンＮＡＴ（ＢＳＡＰＲＮ）及びメセンテリコペプチダーゼ（ＢＭＳＡＭＰ）；ＢＬＳＣＡＲに密接に関連するスブチリシン、例えばケラチナーゼ（ＢＬＫＥＲＡ）、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ １１５９４ （ＢＬＳＣＡ１）、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ１５４１３（ＢＬＳＣＡ２）、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ １４３５３ （ＢＬＳＣＡ３）； 及びスブチリシンセリンプロテアーゼＣ（ＢＳＳＰＲＣ）及びセリンプロテアーゼＤ（ＢＳＳＰＲＤ）、又はサブグループＩ−Ｓ１の特徴を保持しているそれらの機能的変異体である。
【００３５】
サブチラーゼのさらなるサブグループ、Ｉ−Ｓ３又は高アルカリサブチリシンは、Ｓｉｅｚｅｎなど． （前記）により認識されている。サブグループＩ−Ｓ２プロテアーゼは、高アルカリサブチリシンとして記載され、そして酵素、例えばサブチリシンＰＢ９２（ＢＡＡＬＫＰ）（ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）， Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ ＮＶ）、サブチリシン３０９（ＢＬＳＡＶＩ）（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）， ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ Ａ／Ｓ）、サブチリシン１４７（ＢＬＳ１４７）（ＥＳＰＥＲＡＳＥ（商標）， ＮＯＶＯ ＮＯＲＤＩＳＫ Ａ／Ｓ）及びアルカリエラスターゼＹａＢ（ＢＳＥＹＡＢ）を包含する。興味ある他のサブグループＩ−Ｓ２サブチラーゼは、スブチリシンＡＬＰ Ｉ （ＢＳＡＰＲＱ）、ＢＬＳ１４７に密接に関連するスブチリシン、例えばスブチリシンＡｐｒＭ（ＢＳＡＰＲＭ）、及びアルカリプロテアーゼＡＨ−１０１（ＢＡＨ１０１）、サビナーゼ（ＢＬＳＡＶＩ）（又は、密接に関連するスブチリシンＭ−プロテアーゼ（ＢＳＫＳＭＫ）、スブチリシンＰＢ９２（ＢＡＡＬＫＰ）、及びスブチリシンＢＬ（ＢＬＳＵＢＬ））、アルカリエラスターゼＹａＢ（ＢＳＥＹＡＢ）、サーミターゼ（ＴＶＴＨＥＲ）、及びスブチリシンＳｅｎｄａｉ（ＢＳＡＰＲＳ）、又はサブグループＩ−Ｓ２の特徴を保持しているそれらの機能的変異体である。
【００３６】
“サビナーゼ（商標）”
サブナーゼ（商標）は、ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ Ａ／Ｓにより市販されている。それは、Ｂ．レンタスからのスブチリシン３０９であり、そして１つの位置においてのみ、ＢＡＡＬＫＰとは異なる（Ｎ８７Ｓ； 本明細書における図１を参照のこと）。サビナーゼ（商標）は、図１のｂ）に表されるアミノ酸配列を有する。
【００３７】
親サブチラーゼ：
用語“親サブチラーゼ”とは、Ｓｉｅｚｅｎなど． （１９９１及び１９９７）に従って定義されるサブチラーゼを記載する。さらなる詳細については、上記“サブチラーゼ”の記載を参照のこと。親サブチラーゼはまた、天然源から単離されたサブチラーゼでもあり得、ここで続く修飾は、サブチラーゼの特徴を保持しながら、行なわれている。さらに、親サブチラーゼは、Ｊ．Ｅ． Ｎｅｓｓなど．， Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １７， ８９３−８９６ （１９９９） により記載されるＤＮＡシャフリング技法により調製されたサブチラーゼでもあり得る。他方では、用語“親サブチラーゼ”とは、“野生型サブチラーゼ”と呼ばれ得る。
【００３８】
サブチラーゼ変異体の修飾：
本明細書において使用される用語“修飾”とは、サブチラーゼの化学的修飾、及びサブチラーゼをコードするＤＮＡの遺伝子操作を包含するよう定義される。修飾は、アミノ酸側鎖の置換、興味あるアミノ酸における、又はそのアミノ酸での置換、欠失及び／又は挿入であり得る。
【００３９】
サブチラーゼ変異体：
本発明においては、用語サブチラーゼ変異体又は突然変異誘発されたサブチラーゼは、原又は親遺伝子を有し、そして対応する親酵素を生成する親微生物に由来する変異体又は修飾された遺伝子を発現する生物により生成されたサブチラーゼを意味し、ここで前記親遺伝子は、突然変異誘発されたサブチラーゼプロテアーゼが、適切な宿主において発現される場合、生成される、変異体遺伝子を生成するために突然変異誘発されている。同様に、変異体遺伝子はまた、ＤＮＡシャフリング技法により生成される親遺伝子から誘導され得る。
【００４０】
相同サブチラーゼ配列：
本発明においては、２種のアミノ酸配列間の相同性は、パラメーター“同一性”により記載される。
２種のサブチラーゼ間の同一性の程度を決定するためには、ＧＣＧパッケージバージョン９．１のＧＡＰルーチンが、同じ設定を用いて適用され得る（下記参照のこと）。前記ルーチンからの出力は、アミノ酸一列整列の他に、２種の配列間の“％同一性”の計算である。
この記載に基づけば、本発明に従って修飾され得る、適切な相同サブチラーゼ及び対応する相同活性部位ループ領域を同定することは、当業者にとって通常のことである。
【００４１】
単離されたＤＮＡ配列又はポリヌクレオチド：
用語“単離された核酸配列”とは、本明細書において使用される場合、単離され、そして精製されており、そして従って、遺伝的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在する定義された核酸配列を有するポリヌクレオチド分子を言及する。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃＤＮＡ及びゲノムクローンを含むそれらの分子、及びＤＮＡシャフリング実験又は特定部位の突然変異誘発実験由来のポリヌクレオチド又は核酸配列であり得る。
【００４２】
本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸配列は、それらが通常関連する他の遺伝子を有さないが、しかし５’及び３’未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。関連する領域の識別は、当業者に明らかであろう（例えば、Ｄｙｎａｎ ａｎｄ Ｔｉｊａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１６： ７７４−７８， １９８５ を参照のこと）。用語“単離された核酸配列”又は“単離されたポリヌクレオチド”とは、二者択一的に“単離されたＤＮＡ配列”、“クローン化されたポリヌクレオチド”、“クローン化された核酸配列”又は“クローン化されたＤＮＡ配列”と呼ばれる。
【００４３】
単離されたタンパク質：
タンパク質に適用される場合、用語“単離された”とは、タンパク質がその天然の環境から分離されていることを示す。
好ましい形においては、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質（すなわち、“相同不純物”（下記参照のこと）を実質的に有さない。
【００４４】
単離されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される場合、１０％以上の純度好ましくは２０％以上の純度、より好ましくは３０％以上の純度である。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される場合、高く精製された形、すなわち４０％以上の純度、６０％以上の純度、８０％以上の純度、より好ましくは９５％以上の純度、及び最も好ましくは９９％以上の純度で、タンパク質を供給することが好ましい。
用語“単離されたタンパク質”は、二者択一的に、“精製されたタンパク質”と称する。
【００４５】
相同不純物：
用語“相同不純物”（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｍｐｕｒｉｔｙ）とは、本発明のサブチラーゼが本来得られる相同細胞に起因するいずれかの不純物（例えば、本発明のサブチラーゼ以外のポリペプチド）を意味する。
〜から得られる：
用語“〜から得られる”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド及び／又はサブチラーゼが、特定の源、又は前記源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味する。
【００４６】
基質：
プロテアーゼのための基質に関して使用される用語“基質”とは、サブチリシンプロテアーゼによる加水分解に対して敏感な少なくとも１つのペプチド結合を含む化合物を含んで成るようなその広い形で解釈されるべきである。
生成物：
プロテアーゼ酵素反応から誘導された生成物に関して使用される用語“生成物”は、サブチラーゼプロテアーゼを包含する加水分解反応の生成物を包含するものとして、本明細書において解釈されるべきである。生成物は、続く加水分解反応における基質であるべきである。
【００４７】
洗浄性能：
本発明においては、用語“洗浄性能”とは、例えば洗浄又は硬質表面清浄の間、清浄される目的物上に存在する卵のしみを除去する酵素の能力として使用される。また、本明細書における例２の“モデル洗剤洗浄性能試験”を参照のこと。
【００４８】
性能因子：
用語“性能因子”とは、下記式により定義される：
Ｐ＝Ｒｖａｒｉａｎｔ−Ｒｐａｒｅｎｔ
式中、Ｐは性能因子であり、Ｒｖａｒｉａｎｔは、“モデル洗剤洗浄性能試験”に記載されるように、本発明のサブチラーゼ変異体により処理された後の試験材料の反射率（４６０ｎｍで測定される）であり、そしてＲｐａｒｅｎｔは、“モデル洗剤洗浄性能試験”に記載されるように、その対応する親サブチラーゼ により処理された後の試験材料の反射率（４６０ｎｍで測定される）である。さらなる詳細に関しては、本明細書における例３の“モデル洗剤洗浄性能試験”を参照のこと。
【００４９】
残留活性：
用語“残留活性”とは、本明細書における“卵−阻害アッセイ”に記載されるようにして定義される（例３を参照のこと）。
【００５０】
発明の特定の記載：
本発明者は、一定の領域が現在知られている領域よりも長いスブチリシン変異体が、卵に存在する物質、例えばトリプシンインヒビタータイプＩＶ−Ｏにより、親サブチラーゼよりも有意に低い程度、阻害され、そして結果的に、本発明の変異体が卵のしみの除去に関して改良された洗剤性能を示すことを見出した。
その同定は、特にスブチリシン３０９（ＢＬＳＡＶＩ又はサビナーゼ（商標））のスブチリシン変異体を構成することによって行われた。いずれの特定の理論にも制限されないが、立体的妨害及び／又は配座変化のために、サブチラーゼ変異体の基質結合領域における卵白の結合が妨げられると現在思われている。
【００５１】
従って、本明細書に記載される使用のために適切であると思われる変異体は、野生型サブチラーゼに比較される場合、１又は複数のアミノ酸残基が次の位置の１又は複数の位置に挿入されているそのような変異体である：位置４２と４３との間への挿入、位置５１と５２との間、位置５２と５３との間、位置５３と５４との間、位置５４と５５との間、位置５５と５６との間、位置１５５と１５６との間、位置１５６と１５７との間、位置１５７と１５８との間、位置１５８と１５９との間、位置１５９と１６０との間、位置１６０と１６１との間、位置１８７と１８８との間、位置１８８と１８９との間、位置１８９と１９０との間、位置２１６と２１７との間、位置２１７と２１８との間、又は位置２１８と２１９との間（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）、特に位置２１７と２１８との間。
【００５２】
本発明の第１観点のサブチラーゼ変異体は、天然から同定され、そして単離された親又は野生型サブチラーゼであり得る。
そのような親野生型サブチラーゼは特に、当業界において知られている標準技法によりスクリーンされ得る。
これを行うことの１つの好ましい手段は、多くの異なった微生物、好ましくは異なったバチルス株からのサブチラーゼにおける活性部位ループをコードすることが知られているＤＮＡ領域を特異的にＰＣＲ増幅することによることができる。
サブチラーゼは、それらのＤＮＡ及びアミノ酸配列が相同である点で、保存された酵素のグループである。従って、活性部位ループを両端に有する比較的特異的なプライマーを構成することが可能である。
【００５３】
これを行うことの１つの手段は、異なったサブチラーゼの一列整列を調査することによる（例えば、Ｓｉｅｚｅｎなど． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ （１９９７） ５０１−５２３）。例えば、ＢＬＳＡＶＩから、グループＩ−Ｓ１又はＩ−Ｓ２のいずれかにおける上記に示される位置を両端に有するＰＣＲプライマーを構成することは、当業者に明らかである。多くの異なった微生物、好ましくは異なったバチルス株からＤＮＡを増幅し、続いて、前記増幅されたＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列決定するために、そのようなプライマーを用いて、例えば、ＢＬＳＡＶＩ配列に比較して、挿入を含んで成るそれらのグループのサブチラーゼを生成する株を同定することが可能であろう。そのような興味あるサブチラーゼの株及び部分的ＤＮＡ配列を同定すると、そのようなサブチラーゼのクローニング、発現及び精製を完結することは当業者に明らかである。
【００５４】
しかしながら、本発明のサブチラーゼ変異体は優先的に親サブチラーゼの変異体であることが認識される。
本明細書に記載される使用のために適切なサブチラーゼ変異体は、当業界において知られている標準技法により、たとえば特定部位／ランダム突然変異誘発により、又は異なったサブチラーゼ配列のＤＮＡシャフリングにより構成され得る。さらなる詳細のためには、本明細書における“材料及び方法”のセクションを参照のこと。
【００５５】
当業者により理解されるであろうように、本明細書に記載される変異体は、１又は複数の追加の修飾、特に１又は複数の追加の挿入又は置換を含んで成る。
さらに、本明細書に記載される領域における挿入は、１個よりも多くのアミノ酸残基の挿入を包含することができる。例えば、本発明の変異体は、１個の挿入、２個の挿入、又は２個以上の挿入、例えば３，４又は５個の挿入を含むことができる。
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置４２と４３との間に挿入される。
【００５６】
位置４２と４３との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ４２Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ４２ＸＡ， Ｘ４２ＸＴ， Ｘ４２ＸＧ， Ｘ４２ＸＳ；
Ｘ４２Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ４２ＸＤ， Ｘ４２ＸＥ， Ｘ４２ＸＫ， Ｘ４２ＸＲ；
Ｘ４２Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ４２ＸＨ， Ｘ４２ＸＶ， Ｘ４２ＸＣ， Ｘ４２ＸＮ， Ｘ４２ＸＱ；及び
Ｘ４２Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ４２ＸＦ， Ｘ４２ＸＩ， Ｘ４２ＸＬ， Ｘ４２ＸＭ， Ｘ４２ＸＰ， Ｘ４２ＸＷ， Ｘ４２ＸＹ； 又は
【００５７】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｄ４２Ｄ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＤ４２ＤＡ， Ｄ４２ＤＴ， Ｄ４２ＤＧ， Ｄ４２ＤＳ；
Ｄ４２Ｄ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＤ４２ＤＤ， Ｄ４２ＤＥ， Ｄ４２ＤＫ， Ｄ４２ＤＲ；
Ｄ４２Ｄ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＤ４２ＤＨ， Ｄ４２ＤＶ， Ｄ４２ＤＣ， Ｄ４２ＤＮ， Ｄ４２ＤＱ；及び
Ｄ４２Ｄ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＤ４２ＤＦ， Ｄ４２ＤＩ， Ｄ４２ＤＬ， Ｄ４２ＤＭ， Ｄ４２ＤＰ， Ｄ４２ＤＷ， Ｄ４２ＤＹ。
【００５８】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置５１と５２との間に挿入される。
位置５１と５２との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ５１Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ５１ＸＡ， Ｘ５１ＸＴ， Ｘ５１ＸＧ， Ｘ５１ＸＳ；
Ｘ５１Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ５１ＸＤ， Ｘ５１ＸＥ， Ｘ５１ＸＫ， Ｘ５１ＸＲ；
Ｘ５１Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ５１ＸＨ， Ｘ５１ＸＶ， Ｘ５１ＸＣ， Ｘ５１ＸＮ， Ｘ５１ＸＱ；及び
Ｘ５１Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ５１ＸＦ， Ｘ５１ＸＩ， Ｘ５１ＸＬ， Ｘ５１ＸＭ， Ｘ５１ＸＰ， Ｘ５１ＸＷ， Ｘ５１ＸＹ； 又は
【００５９】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｖ５１Ｖ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＶ５１ＶＡ， Ｖ５１ＶＴ， Ｖ５１ＶＧ， Ｖ５１ＶＳ；
Ｖ５１Ｖ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＶ５１ＶＤ， Ｖ５１ＶＥ， Ｖ５１ＶＫ， Ｖ５１ＶＲ；
Ｖ５１Ｖ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＶ５１ＶＨ， Ｖ５１ＶＶ， Ｖ５１ＶＣ， Ｖ５１ＶＮ， Ｖ５１ＶＱ；及び
Ｖ５１Ｖ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＶ５１ＶＦ， Ｖ５１ＶＩ， Ｖ５１ＶＬ， Ｖ５１ＶＭ， Ｖ５１ＶＰ， Ｖ５１ＶＷ， Ｖ５１ＶＹ。
【００６０】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置５２と５３との間に挿入される。
位置５２と５３との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ５２Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ５２ＸＡ， Ｘ５２ＸＴ， Ｘ５２ＸＧ， Ｘ５２ＸＳ；
Ｘ５２Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ５２ＸＤ， Ｘ５２ＸＥ， Ｘ５２ＸＫ， Ｘ５２ＸＲ；
Ｘ５２Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ５２ＸＨ， Ｘ５２ＸＶ， Ｘ５２ＸＣ， Ｘ５２ＸＮ， Ｘ５２ＸＱ；及び
Ｘ５２Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ５２ＸＦ， Ｘ５２ＸＩ， Ｘ５２ＸＬ， Ｘ５２ＸＭ， Ｘ５２ＸＰ， Ｘ５２ＸＷ， Ｘ５２ＸＹ； 又は
【００６１】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｐ５２Ｐ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＰ５２ＰＡ， Ｐ５２ＰＴ， Ｐ５２ＰＧ， Ｐ５２ＰＳ；
Ｐ５２Ｐ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＰ５２ＰＤ， Ｐ５２ＰＥ， Ｐ５２ＰＫ， Ｐ５２ＰＲ；
Ｐ５２Ｐ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＰ５２ＰＨ， Ｐ５２ＰＶ， Ｐ５２ＰＣ， Ｐ５２ＰＮ， Ｐ５２ＰＱ；及び
Ｐ５２Ｐ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＰ５２ＰＦ， Ｐ５２ＰＩ， Ｐ５２ＰＬ， Ｐ５２ＰＭ， Ｐ５２ＰＰ， Ｐ５２ＰＷ， Ｐ５２ＰＹ。
【００６２】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置５３と５４との間に挿入される。
位置５３と５４との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ５３Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ５３ＸＡ， Ｘ５３ＸＴ， Ｘ５３ＸＧ， Ｘ５３ＸＳ；
Ｘ５３Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ５３ＸＤ， Ｘ５３ＸＥ， Ｘ５３ＸＫ， Ｘ５３ＸＲ；
Ｘ５３Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ５３ＸＨ， Ｘ５３ＸＶ， Ｘ５３ＸＣ， Ｘ５３ＸＮ， Ｘ５３ＸＱ；及び
Ｘ５３Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ５３ＸＦ， Ｘ５３ＸＩ， Ｘ５３ＸＬ， Ｘ５３ＸＭ， Ｘ５３ＸＰ， Ｘ５３ＸＷ， Ｘ５３ＸＹ； 又は
【００６３】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｇ５３Ｇ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＧ５３ＧＡ， Ｇ５３ＧＴ， Ｇ５３ＧＧ， Ｇ５３ＧＳ；
Ｇ５３Ｇ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＧ５３ＧＤ， Ｇ５３ＧＥ， Ｇ５３ＧＫ， Ｇ５３ＧＲ；
Ｇ５３Ｇ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＧ５３ＧＨ， Ｇ５３ＧＶ， Ｇ５３ＧＣ， Ｇ５３ＧＮ， Ｇ５３ＧＱ；及び
Ｇ５３Ｇ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＧ５３ＧＦ， Ｇ５３ＧＩ， Ｇ５３ＧＬ， Ｇ５３ＧＭ， Ｇ５３ＧＰ， Ｇ５３ＧＷ， Ｇ５３ＧＹ。
【００６４】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置５４と５５との間に挿入される。
位置５４と５５との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ５４Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ５４ＸＡ， Ｘ５４ＸＴ， Ｘ５４ＸＧ， Ｘ５４ＸＳ；
Ｘ５４Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ５４ＸＤ， Ｘ５４ＸＥ， Ｘ５４ＸＫ， Ｘ５４ＸＲ；
Ｘ５４Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ５４ＸＨ， Ｘ５４ＸＶ， Ｘ５４ＸＣ， Ｘ５４ＸＮ， Ｘ５４ＸＱ；及び
Ｘ５４Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ５４ＸＦ， Ｘ５４ＸＩ， Ｘ５４ＸＬ， Ｘ５４ＸＭ， Ｘ５４ＸＰ， Ｘ５４ＸＷ， Ｘ５４ＸＹ； 又は
【００６５】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｅ５４Ｅ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＥ５４ＥＡ， Ｅ５４ＥＴ， Ｅ５４ＥＧ， Ｅ５４ＥＳ；
Ｅ５４Ｅ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＥ５４ＥＤ， Ｅ５４ＥＥ， Ｅ５４ＥＫ， Ｅ５４ＥＲ；
Ｅ５４Ｅ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＥ５４ＥＨ， Ｅ５４ＥＶ， Ｅ５４ＥＣ， Ｅ５４ＥＮ， Ｅ５４ＥＱ；及び
Ｅ５４Ｅ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＥ５４ＥＦ， Ｅ５４ＥＩ， Ｅ５４ＥＬ， Ｅ５４ＥＭ， Ｅ５４ＥＰ， Ｅ５４ＥＷ， Ｅ５４ＥＹ。
【００６６】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置５５と５６との間に挿入される。
位置５５と５６との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ５５Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ５５ＸＡ， Ｘ５５ＸＴ， Ｘ５５ＸＧ， Ｘ５５ＸＳ；
Ｘ５５Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ５５ＸＤ， Ｘ５５ＸＥ， Ｘ５５ＸＫ， Ｘ５５ＸＲ；
Ｘ５５Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ５５ＸＨ， Ｘ５５ＸＶ， Ｘ５５ＸＣ， Ｘ５５ＸＮ， Ｘ５５ＸＱ；及び
Ｘ５５Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ５５ＸＦ， Ｘ５５ＸＩ， Ｘ５５ＸＬ， Ｘ５５ＸＭ， Ｘ５５ＸＰ， Ｘ５５ＸＷ， Ｘ５５ＸＹ； 又は
【００６７】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｐ５５Ｐ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＰ５５ＰＡ， Ｐ５５ＰＴ， Ｐ５５ＰＧ， Ｐ５５ＰＳ；
Ｐ５５Ｐ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＰ５５ＰＤ， Ｐ５５ＰＥ， Ｐ５５ＰＫ， Ｐ５５ＰＲ；
Ｐ５５Ｐ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＰ５５ＰＨ， Ｐ５５ＰＶ， Ｐ５５ＰＣ， Ｐ５５ＰＮ， Ｐ５５ＰＱ；及び
Ｐ５５Ｐ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＰ５５ＰＦ， Ｐ５５ＰＩ， Ｐ５５ＰＬ， Ｐ５５ＰＭ， Ｐ５５ＰＰ， Ｐ５５ＰＷ， Ｐ５５ＰＹ。
【００６８】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置１５５と１５６との間に挿入される。
位置１５５と１５６との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ１５５Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ１５５ＸＡ， Ｘ１５５ＸＴ， Ｘ１５５ＸＧ， Ｘ１５５ＸＳ；
Ｘ１５５Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ１５５ＸＤ， Ｘ１５５ＸＥ， Ｘ１５５ＸＫ， Ｘ１５５ＸＲ；
Ｘ１５５Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ１５５ＸＨ， Ｘ１５５ＸＶ， Ｘ１５５ＸＣ， Ｘ１５５ＸＮ， Ｘ１５５ＸＱ；及び
Ｘ１５５Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ１５５ＸＦ， Ｘ１５５ＸＩ， Ｘ１５５ＸＬ， Ｘ１５５ＸＭ， Ｘ１５５ＸＰ， Ｘ１５５ＸＷ， Ｘ１５５ＸＹ； 又は
【００６９】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｎ１５５Ｎ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＮ１５５ＮＡ， Ｎ１５５ＮＴ， Ｎ１５５ＮＧ， Ｎ１５５ＮＳ；
Ｎ１５５Ｎ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＮ１５５ＮＤ， Ｎ１５５ＮＥ， Ｎ１５５ＮＫ， Ｎ１５５ＮＲ；
Ｎ１５５Ｎ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＮ１５５ＮＨ， Ｎ１５５ＮＶ， Ｎ１５５ＮＣ， Ｎ１５５ＮＮ， Ｎ１５５ＮＱ；及び
Ｎ１５５Ｎ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＮ１５５ＮＦ， Ｎ１５５ＮＩ， Ｎ１５５ＮＬ， Ｎ１５５ＮＭ， Ｎ１５５ＮＰ， Ｎ１５５ＮＷ， Ｎ１５５ＮＹ。
【００７０】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置１５６と１５７との間に挿入される。
位置１５６と１５７との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ１５６Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ１５６ＸＡ， Ｘ１５６ＸＴ， Ｘ１５６ＸＧ， Ｘ１５６ＸＳ；
Ｘ１５６Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ１５６ＸＤ， Ｘ１５６ＸＥ， Ｘ１５６ＸＫ， Ｘ１５６ＸＲ；
Ｘ１５６Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ１５６ＸＨ， Ｘ１５６ＸＶ， Ｘ１５６ＸＣ， Ｘ１５６ＸＮ， Ｘ１５６ＸＱ；及び
Ｘ１５６Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ１５６ＸＦ， Ｘ１５６ＸＩ， Ｘ１５６ＸＬ， Ｘ１５６ＸＭ， Ｘ１５６ＸＰ， Ｘ１５６ＸＷ， Ｘ１５６ＸＹ； 又は
【００７１】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｓ１５６Ｓ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＳ１５６ＳＡ， Ｓ１５６ＳＴ， Ｓ１５６ＳＧ， Ｓ１５６ＳＳ；
Ｓ１５６Ｓ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＳ１５６ＳＤ， Ｓ１５６ＳＥ， Ｓ１５６ＳＫ， Ｓ１５６ＳＲ；
Ｓ１５６Ｓ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＳ１５６ＳＨ， Ｓ１５６ＳＶ， Ｓ１５６ＳＣ， Ｓ１５６ＳＮ， Ｓ１５６ＳＱ；及び
Ｓ１５６Ｓ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＳ１５６ＳＦ， Ｓ１５６ＳＩ， Ｓ１５６ＳＬ， Ｓ１５６ＳＭ， Ｓ１５６ＳＰ， Ｓ１５６ＳＷ， Ｓ１５６ＳＹ。
【００７２】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置１５７と１５８との間に挿入される。
位置１５７と１５８との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ１５７Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ１５７ＸＡ， Ｘ１５７ＸＴ， Ｘ１５７ＸＧ， Ｘ１５７ＸＳ；
Ｘ１５７Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ１５７ＸＤ， Ｘ１５７ＸＥ， Ｘ１５７ＸＫ， Ｘ１５７ＸＲ；
Ｘ１５７Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ１５７ＸＨ， Ｘ１５７ＸＶ， Ｘ１５７ＸＣ， Ｘ１５７ＸＮ， Ｘ１５７ＸＱ；及び
Ｘ１５７Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ１５７ＸＦ， Ｘ１５７ＸＩ， Ｘ１５７ＸＬ， Ｘ１５７ＸＭ， Ｘ１５７ＸＰ， Ｘ１５７ＸＷ， Ｘ１５７ＸＹ； 又は
【００７３】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｇ１５７Ｇ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＧ１５７ＧＡ， Ｇ１５７ＧＴ， Ｇ１５７ＧＧ， Ｇ１５７ＧＳ；
Ｇ１５７Ｇ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＧ１５７ＧＤ， Ｇ１５７ＧＥ， Ｇ１５７ＧＫ， Ｇ１５７ＧＲ；
Ｇ１５７Ｇ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＧ１５７ＧＨ， Ｇ１５７ＧＶ， Ｇ１５７ＧＣ， Ｇ１５７ＧＮ， Ｇ１５７ＧＱ；及び
Ｇ１５７Ｇ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＧ１５７ＧＦ， Ｇ１５７ＧＩ， Ｇ１５７ＧＬ， Ｇ１５７ＧＭ， Ｇ１５７ＧＰ， Ｇ１５７ＧＷ， Ｇ１５７ＧＹ。
【００７４】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置１５８と１５９との間に挿入される。
位置１５８と１５９との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ１５８Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ１５８ＸＡ， Ｘ１５８ＸＴ， Ｘ１５８ＸＧ， Ｘ１５８ＸＳ；
Ｘ１５８Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ１５８ＸＤ， Ｘ１５８ＸＥ， Ｘ１５８ＸＫ， Ｘ１５８ＸＲ；
Ｘ１５８Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ１５８ＸＨ， Ｘ１５８ＸＶ， Ｘ１５８ＸＣ， Ｘ１５８ＸＮ， Ｘ１５８ＸＱ；及び
Ｘ１５８Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ１５８ＸＦ， Ｘ１５８ＸＩ， Ｘ１５８ＸＬ， Ｘ１５８ＸＭ， Ｘ１５８ＸＰ， Ｘ１５８ＸＷ， Ｘ１５８ＸＹ； 又は
【００７５】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
＊１５８｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えば＊１５８Ａ， ＊１５８Ｔ， ＊１５８Ｇ， ＊１５８Ｓ；
＊１５８｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えば＊１５８Ｄ， ＊１５８Ｅ， ＊１５８Ｋ， ＊１５８Ｒ；
＊１５８｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えば＊１５８Ｈ， ＊１５８Ｖ， ＊１５８Ｃ， ＊１５８Ｎ， ＊１５８Ｑ；及び
＊１５８｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えば＊１５８Ｆ， ＊１５８Ｉ， ＊１５８Ｌ， ＊１５８Ｍ， ＊１５８Ｐ， ＊１５８Ｗ， ＊１５８Ｙ。
【００７６】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置１５９と１６０との間に挿入される。
位置１５９と１６０との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ１５９Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ１５９ＸＡ， Ｘ１５９ＸＴ， Ｘ１５９ＸＧ， Ｘ１５９ＸＳ；
Ｘ１５９Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ１５９ＸＤ， Ｘ１５９ＸＥ， Ｘ１５９ＸＫ， Ｘ１５９ＸＲ；
Ｘ１５９Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ１５９ＸＨ， Ｘ１５９ＸＶ， Ｘ１５９ＸＣ， Ｘ１５９ＸＮ， Ｘ１５９ＸＱ；及び
Ｘ１５９Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ１５９ＸＦ， Ｘ１５９ＸＩ， Ｘ１５９ＸＬ， Ｘ１５９ＸＭ， Ｘ１５９ＸＰ， Ｘ１５９ＸＷ， Ｘ１５９ＸＹ； 又は
【００７７】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ａ１５９Ａ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＡ１５９ＡＡ， Ａ１５９ＡＴ， Ａ１５９ＡＧ， Ａ１５９ＡＳ；
Ａ１５９Ａ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＡ１５９ＡＤ， Ａ１５９ＡＥ， Ａ１５９ＡＫ， Ａ１５９ＡＲ；
Ａ１５９Ａ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＡ１５９ＡＨ， Ａ１５９ＡＶ， Ａ１５９ＡＣ， Ａ１５９ＡＮ， Ａ１５９ＡＱ；及び
Ａ１５９Ａ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＡ１５９ＡＦ， Ａ１５９ＡＩ， Ａ１５９ＡＬ， Ａ１５９ＡＭ， Ａ１５９ＡＰ， Ａ１５９ＡＷ， Ａ１５９ＡＹ。
【００７８】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置１６０と１６１との間に挿入される。
位置１６０と１６１との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ１６０Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ１６０ＸＡ， Ｘ１６０ＸＴ， Ｘ１６０ＸＧ， Ｘ１６０ＸＳ；
Ｘ１６０Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ１６０ＸＤ， Ｘ１６０ＸＥ， Ｘ１６０ＸＫ， Ｘ１６０ＸＲ；
Ｘ１６０Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ１６０ＸＨ， Ｘ１６０ＸＶ， Ｘ１６０ＸＣ， Ｘ１６０ＸＮ， Ｘ１６０ＸＱ；及び
Ｘ１６０Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ１６０ＸＦ， Ｘ１６０ＸＩ， Ｘ１６０ＸＬ， Ｘ１６０ＸＭ， Ｘ１６０ＸＰ， Ｘ１６０ＸＷ， Ｘ１６０ＸＹ； 又は
【００７９】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｇ１６０Ｇ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＧ１６０ＧＡ， Ｇ１６０ＧＴ， Ｇ１６０ＧＧ， Ｇ１６０ＧＳ；
Ｇ１６０Ｇ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＧ１６０ＧＤ， Ｇ１６０ＧＥ， Ｇ１６０ＧＫ， Ｇ１６０ＧＲ；
Ｇ１６０Ｇ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＧ１６０ＧＨ， Ｇ１６０ＧＶ， Ｇ１６０ＧＣ， Ｇ１６０ＧＮ， Ｇ１６０ＧＱ；及び
Ｇ１６０Ｇ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＧ１６０ＧＦ， Ｇ１６０ＧＩ， Ｇ１６０ＧＬ， Ｇ１６０ＧＭ， Ｇ１６０ＧＰ， Ｇ１６０ＧＷ， Ｇ１６０ＧＹ。
【００８０】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置１８７と１８９との間に挿入される。
位置１８７と１８９との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ１８７Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ１８７ＸＡ， Ｘ１８７ＸＴ， Ｘ１８７ＸＧ， Ｘ１８７ＸＳ；
Ｘ１８７Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ１８７ＸＤ， Ｘ１８７ＸＥ， Ｘ１８７ＸＫ， Ｘ１８７ＸＲ；
Ｘ１８７Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ１８７ＸＨ， Ｘ１８７ＸＶ， Ｘ１８７ＸＣ， Ｘ１８７ＸＮ， Ｘ１８７ＸＱ；及び
Ｘ１８７Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ１８７ＸＦ， Ｘ１８７ＸＩ， Ｘ１８７ＸＬ， Ｘ１８７ＸＭ， Ｘ１８７ＸＰ， Ｘ１８７ＸＷ， Ｘ１８７ＸＹ； 又は
【００８１】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ａ１８７Ａ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＡ１８７ＡＡ， Ａ１８７ＡＴ， Ａ１８７ＡＧ， Ａ１８７ＡＳ；
Ａ１８７Ａ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＡ１８７ＡＤ， Ａ１８７ＡＥ， Ａ１８７ＡＫ， Ａ１８７ＡＲ；
Ａ１８７Ａ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＡ１８７ＡＨ， Ａ１８７ＡＶ， Ａ１８７ＡＣ， Ａ１８７ＡＮ， Ａ１８７ＡＱ；及び
Ａ１８７Ａ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＡ１８７ＡＦ， Ａ１８７ＡＩ， Ａ１８７ＡＬ， Ａ１８７ＡＭ， Ａ１８７ＡＰ， Ａ１８７ＡＷ， Ａ１８７ＡＹ。
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置１８８と１８９との間に挿入される。
【００８２】
位置１８８と１８９との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ１８８Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ１８８ＸＡ， Ｘ１８８ＸＴ， Ｘ１８８ＸＧ， Ｘ１８８ＸＳ；
Ｘ１８８Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ１８８ＸＤ， Ｘ１８８ＸＥ， Ｘ１８８ＸＫ， Ｘ１８８ＸＲ；
Ｘ１８８Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ１８８ＸＨ， Ｘ１８８ＸＶ， Ｘ１８８ＸＣ， Ｘ１８８ＸＮ， Ｘ１８８ＸＱ；及び
Ｘ１８８Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ１８８ＸＦ， Ｘ１８８ＸＩ， Ｘ１８８ＸＬ， Ｘ１８８ＸＭ， Ｘ１８８ＸＰ， Ｘ１８８ＸＷ， Ｘ１８８ＸＹ； 又は
【００８３】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｓ１８８Ｓ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＳ１８８ＳＡ， Ｓ１８８ＳＴ， Ｓ１８８ＳＧ， Ｓ１８８ＳＳ；
Ｓ１８８Ｓ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＳ１８８ＳＤ， Ｓ１８８ＳＥ， Ｓ１８８ＳＫ， Ｓ１８８ＳＲ；
Ｓ１８８Ｓ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＳ１８８ＳＨ， Ｓ１８８ＳＶ， Ｓ１８８ＳＣ， Ｓ１８８ＳＮ， Ｓ１８８ＳＱ；及び
Ｓ１８８Ｓ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＳ１８８ＳＦ， Ｓ１８８ＳＩ， Ｓ１８８ＳＬ， Ｓ１８８ＳＭ， Ｓ１８８ＳＰ， Ｓ１８８ＳＷ， Ｓ１８８ＳＹ。
【００８４】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置１８９と１９０との間に挿入される。
位置１８９と１９０との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ１８９Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ１８９ＸＡ， Ｘ１８９ＸＴ， Ｘ１８９ＸＧ， Ｘ１８９ＸＳ；
Ｘ１８９Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ１８９ＸＤ， Ｘ１８９ＸＥ， Ｘ１８９ＸＫ， Ｘ１８９ＸＲ；
Ｘ１８９Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ１８９ＸＨ， Ｘ１８９ＸＶ， Ｘ１８９ＸＣ， Ｘ１８９ＸＮ， Ｘ１８９ＸＱ；及び
Ｘ１８９Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ１８９ＸＦ， Ｘ１８９ＸＩ， Ｘ１８９ＸＬ， Ｘ１８９ＸＭ， Ｘ１８９ＸＰ， Ｘ１８９ＸＷ， Ｘ１８９ＸＹ； 又は
【００８５】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｆ１８９Ｆ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＦ１８９ＦＡ， Ｆ１８９ＦＴ， Ｆ１８９ＦＧ， Ｆ１８９ＦＳ；
Ｆ１８９Ｆ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＦ１８９ＦＤ， Ｆ１８９ＦＥ， Ｆ１８９ＦＫ， Ｆ１８９ＦＲ；
Ｆ１８９Ｆ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＦ１８９ＦＨ， Ｆ１８９ＦＶ， Ｆ１８９ＦＣ， Ｆ１８９ＦＮ， Ｆ１８９ＦＱ；及び
Ｆ１８９Ｆ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＦ１８９ＦＦ， Ｆ１８９ＦＩ， Ｆ１８９ＦＬ， Ｆ１８９ＦＭ， Ｆ１８９ＦＰ， Ｆ１８９ＦＷ， Ｆ１８９ＦＹ。
【００８６】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置２１６と２１７との間に挿入される。
位置２１６と２１７との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ２１６Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ２１６ＸＡ， Ｘ２１６ＸＴ， Ｘ２１６ＸＧ， Ｘ２１６ＸＳ；
Ｘ２１６Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ２１６ＸＤ， Ｘ２１６ＸＥ， Ｘ２１６ＸＫ， Ｘ２１６ＸＲ；
Ｘ２１６Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ２１６ＸＨ， Ｘ２１６ＸＶ， Ｘ２１６ＸＣ， Ｘ２１６ＸＮ， Ｘ２１６ＸＱ；及び
Ｘ２１６Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ２１６ＸＦ， Ｘ２１６ＸＩ， Ｘ２１６ＸＬ， Ｘ２１６ＸＭ， Ｘ２１６ＸＰ， Ｘ２１６ＸＷ， Ｘ２１６ＸＹ； 又は
【００８７】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｓ２１６Ｓ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＳ２１６ＳＡ， Ｓ２１６ＳＴ， Ｓ２１６ＳＧ， Ｓ２１６ＳＳ；
Ｓ２１６Ｓ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＳ２１６ＳＤ， Ｓ２１６ＳＥ， Ｓ２１６ＳＫ， Ｓ２１６ＳＲ；
Ｓ２１６Ｓ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＳ２１６ＳＨ， Ｓ２１６ＳＶ， Ｓ２１６ＳＣ， Ｓ２１６ＳＮ， Ｓ２１６ＳＱ；及び
Ｓ２１６Ｓ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＳ２１６ＳＦ， Ｓ２１６ＳＩ， Ｓ２１６ＳＬ， Ｓ２１６ＳＭ， Ｓ２１６ＳＰ， Ｓ２１６ＳＷ， Ｓ２１６ＳＹ。
【００８８】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置２１７と２１８との間に挿入される。
位置２１７と２１８との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ２１７Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ２１７ＸＡ， Ｘ２１７ＸＴ， Ｘ２１７ＸＧ， Ｘ２１７ＸＳ；
Ｘ２１７Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ２１７ＸＤ， Ｘ２１７ＸＥ， Ｘ２１７ＸＫ， Ｘ２１７ＸＲ；
Ｘ２１７Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ２１７ＸＨ， Ｘ２１７ＸＶ， Ｘ２１７ＸＣ， Ｘ２１７ＸＮ， Ｘ２１７ＸＱ；及び
Ｘ２１７Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ２１７ＸＦ， Ｘ２１７ＸＩ， Ｘ２１７ＸＬ， Ｘ２１７ＸＭ， Ｘ２１７ＸＰ， Ｘ２１７ＸＷ， Ｘ２１７ＸＹ； 又は
【００８９】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｌ２１７Ｌ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＬ２１７ＬＡ， Ｌ２１７ＬＴ， Ｌ２１７ＬＧ， Ｌ２１７ＬＳ；
Ｌ２１７Ｌ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＬ２１７ＬＤ， Ｌ２１７ＬＥ， Ｌ２１７ＬＫ， Ｌ２１７ＬＲ；
Ｌ２１７Ｌ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＬ２１７ＬＨ， Ｌ２１７ＬＶ， Ｌ２１７ＬＣ， Ｌ２１７ＬＮ， Ｌ２１７ＬＱ；及び
Ｌ２１７Ｌ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＬ２１７ＬＦ， Ｌ２１７ＬＩ， Ｌ２１７ＬＬ， Ｌ２１７ＬＭ， Ｌ２１７ＬＰ， Ｌ２１７ＬＷ， Ｌ２１７ＬＹ。
【００９０】
本発明の１つの興味ある態様においては、追加のアミノ酸残基は、位置２１８と２１９との間に挿入される。
位置２１８と２１９との間への挿入は好ましくは、下記から成る群から選択される（ＢＡＳＢＰＮ番号付けによる）：
Ｘ２１８Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ２１８ＸＡ， Ｘ２１８ＸＴ， Ｘ２１８ＸＧ， Ｘ２１８ＸＳ；
Ｘ２１８Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ２１８ＸＤ， Ｘ２１８ＸＥ， Ｘ２１８ＸＫ， Ｘ２１８ＸＲ；
Ｘ２１８Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ２１８ＸＨ， Ｘ２１８ＸＶ， Ｘ２１８ＸＣ， Ｘ２１８ＸＮ， Ｘ２１８ＸＱ；及び
Ｘ２１８Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ２１８ＸＦ， Ｘ２１８ＸＩ， Ｘ２１８ＸＬ， Ｘ２１８ＸＭ， Ｘ２１８ＸＰ， Ｘ２１８ＸＷ， Ｘ２１８ＸＹ； 又は
【００９１】
スブチリス３０９及び密接に関連するサブチラーゼ、例えばＢＡＡＬＫＰ， ＢＬＳＵＢＬ及びＢＳＫＳＭＫに対してより特異的な下記群：
Ｎ２１８Ｎ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＮ２１８ＮＡ， Ｎ２１８ＮＴ， Ｎ２１８ＮＧ， Ｎ２１８ＮＳ；
Ｎ２１８Ｎ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＮ２１８ＮＤ， Ｎ２１８ＮＥ， Ｎ２１８ＮＫ， Ｎ２１８ＮＲ；
Ｎ２１８Ｎ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＮ２１８ＮＨ， Ｎ２１８ＮＶ， Ｎ２１８ＮＣ， Ｎ２１８ＮＮ， Ｎ２１８ＮＱ；及び
Ｎ２１８Ｎ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＮ２１８ＮＦ， Ｎ２１８ＮＩ， Ｎ２１８ＮＬ， Ｎ２１８ＮＭ， Ｎ２１８ＮＰ， Ｎ２１８ＮＷ， Ｎ２１８ＮＹ。
【００９２】
さらに、本発明に従って行われる上記に言及された挿入の他に、位置９５〜１０３（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）の活性部位ループ（ｂ）領域における少なくとも１つの追加のアミノ酸の挿入がさらに、トリプシンインヒビタータイプＩＶ−Ｏによる阻害に対する傾向を低めるであろうことが予測される。位置９８と９９との間への追加の挿入及び／又は位置９９と１００との間への挿入が特に有益であることが認識される。そのような挿入の例は、次の通りである：
Ｘ９８Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ９８ＸＡ， Ｘ９８ＸＴ， Ｘ９８ＸＧ， Ｘ９８ＸＳ；
Ｘ９８Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ９８ＸＤ， Ｘ９８ＸＥ， Ｘ９８ＸＫ， Ｘ９８ＸＲ；
Ｘ９８Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ９８ＸＨ， Ｘ９８ＸＶ， Ｘ９８ＸＣ， Ｘ９８ＸＮ， Ｘ９８ＸＱ；及び
Ｘ９８Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ９８ＸＦ， Ｘ９８ＸＩ， Ｘ９８ＸＬ， Ｘ９８ＸＭ， Ｘ９８ＸＰ， Ｘ９８ＸＷ， Ｘ９８ＸＹ； 好ましくはＸ９８ＸＤ及びＸ９８ＸＥ又は
【００９３】
スブチリシン３０９及び密接に関連するサブリラーゼに対してより特異的なもの：
Ａ９８Ａ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＡ９８ＡＡ， Ａ９８ＡＴ， Ａ９８ＡＧ， Ａ９８ＡＳ；
Ａ９８Ａ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＡ９８ＡＤ， Ａ９８ＡＥ， Ａ９８ＡＫ， Ａ９８ＡＲ；
Ａ９８Ａ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＡ９８ＡＨ， Ａ９８ＡＶ， Ａ９８ＡＣ， Ａ９８ＡＮ， Ａ９８ＡＱ；及び
Ａ９８Ａ ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＡ９８ＡＦ， Ａ９８ＡＩ， Ａ９８ＡＬ， Ａ９８ＡＭ， Ａ９８ＡＰ， Ａ９８ＡＷ， Ａ９８ＡＹ；好ましくはＡ９８ＡＤ及びＡ９８ＡＥ。
【００９４】
さらなる例は、次の通りである：
Ｘ９９Ｘ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ９９ＸＡ， Ｘ９９ＸＴ， Ｘ９９ＸＧ， Ｘ９９ＸＳ；
Ｘ９９Ｘ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ９９ＸＤ， Ｘ９９ＸＥ， Ｘ９９ＸＫ， Ｘ９９ＸＲ；
Ｘ９９Ｘ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ９９ＸＨ， Ｘ９９ＸＶ， Ｘ９９ＸＣ， Ｘ９９ＸＮ， Ｘ９９ＸＱ；及び
Ｘ９９Ｘ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ９９ＸＦ， Ｘ９９ＸＩ， Ｘ９９ＸＬ， Ｘ９９ＸＭ， Ｘ９９ＸＰ， Ｘ９８ＸＷ， Ｘ９９ＸＹ； 好ましくはＸ９９ＸＤ及びＸ９９ＸＥ又は
【００９５】
スブチリシン３０９及び密接に関連するサブリラーゼに対してより特異的なもの：
Ｓ９９Ｓ｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＳ９９ＳＡ， Ｓ９９ＳＴ， Ｓ９９ＳＧ， Ｓ９９ＳＳ；
Ｓ９９Ｓ｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＳ９９ＳＤ， Ｓ９９ＳＥ， Ｓ９９ＳＫ， Ｓ９９ＳＲ；
Ｓ９９Ｓ｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＳ９９ＳＨ， Ｓ９９ＳＶ， Ｓ９９ＳＣ， Ｓ９９ＳＮ， Ｓ９９ＳＱ；及び
Ｓ９９Ｓ｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＳ９９ＳＦ， Ｓ９９ＳＩ， Ｓ９９ＳＬ， Ｓ９９ＳＭ， Ｓ９９ＳＰ， Ｓ９９ＳＷ， Ｓ９９ＳＹ； 好ましくはＳ９９ＳＤ及びＳ９９ＳＥ。
【００９６】
位置９９と１００との間への挿入に関しては、その挿入は、位置９９における置換と組合されることが好ましい。従って、上記の企画された挿入の他に、位置９９における次の置換が適切であると思われる：
Ｘ９９｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝， 例えばＸ９９Ａ， Ｘ９９Ｔ， Ｘ９９Ｇ， Ｘ９９Ｓ；
Ｘ９９｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＸ９９Ｄ， Ｘ９９Ｅ， Ｘ９９Ｋ， Ｘ９９Ｒ；
Ｘ９９｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＸ９９Ｈ， Ｘ９９Ｖ， Ｘ９９Ｃ， Ｘ９９Ｎ， Ｘ９９Ｑ；及び
Ｘ９９｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ， Ｗ， Ｙ｝， 例えばＸ９９Ｆ， Ｘ９９Ｉ， Ｘ９９Ｌ， Ｘ９９Ｍ， Ｘ９９Ｐ， Ｘ９９Ｗ， Ｘ９９Ｙ；又は
【００９７】
スブチリシン３０９及び密接して関連するサブチラーゼに対するより特異的なもの：
Ｓ９９｛Ａ， Ｔ， Ｇ｝， 例えばＳ９９Ａ， Ｓ９９Ｔ， Ｓ９９Ｇ；
Ｓ９９｛Ｄ， Ｅ， Ｋ， Ｒ｝， 例えばＳ９９Ｄ， Ｓ９９Ｅ， Ｓ９９Ｋ， Ｓ９９Ｒ；
Ｓ９９｛Ｈ， Ｖ， Ｃ， Ｎ， Ｑ｝， 例えばＳ９９Ｈ， Ｓ９９Ｖ， Ｓ９９Ｃ， Ｓ９９Ｎ， Ｓ９９Ｑ；及び
Ｓ９９｛Ｆ， Ｉ， Ｌ， Ｍ， Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，例えばＳ９９Ｆ， Ｓ９９Ｉ， Ｓ９９Ｌ， Ｓ９９Ｍ， Ｓ９９Ｐ， Ｓ９９Ｗ， Ｓ９９Ｙ。
【００９８】
好ましい態様においては、位置９９における置換は、Ｘ９９｛Ａ， Ｔ， Ｇ， Ｓ｝から成る群、特にＸ９９Ａ、又はスブチリシン３０９及び密接に関連するサブチラーゼに対してより特異的なＳ９９｛Ａ， Ｔ， Ｇ｝， 特にＳ９９Ａから選択される。
類似するアミノ酸残基への１つのアミノ酸残基のいわゆる保存性置換が、酵素の特徴においてマイナーな変化のみを生成することが予測されることは、当業界において良く知られている。
下記表Ｉは、保存性アミノ酸置換のグループを列挙する。
【００９９】
【表１】
2004511228.tif 000004
【０１００】
この原理によれば、保存性置換を含んで成るサブチラーゼ変異体は、お互い劇的には異ならない特徴を示すことが予測される。
本明細書における開示され、そして／又は例示されるサブチラーゼ変異体に基づいて、同様にして改良された洗浄性能を示す他のサブチラーゼ変異体を得るために、それらの変異体に対する適切な保存性修飾を同定することは当業者に知られている。
【０１０１】
好ましくは、親サブチラーゼは、天然又は種々の人工的創造物から酵素を単離し、そして親サブチラーゼから変異体を生成するために、サブグループＩ−Ｓ１及びＩ−Ｓ２、特にサブグループＩ−Ｓ２に属する。
サブグループＩ−Ｓ１からの変異体に関しては、好ましくは、ＢＳＳ１６８， （ＢＳＳＡＳ， ＢＳＡＰＲＪ， ＢＳＡＰＲＮ， ＢＭＳＡＭＰ）， ＢＡＳＢＰＮ， ＢＳＳＤＹ， ＢＬＳＣＡＲ， （ＢＬＫＥＲＡ， ＢＬＳＣＡ１， ＢＬＳＣＡ２， ＢＬＳＣＡ３）， ＢＳＳＰＲＣ及びＢＳＳＰＲＤ、又はサブグループＩ−Ｓ１の特徴を保持しているそれらの機能的変異体から親サブチラーゼを選択する。
【０１０２】
サブグループＩ−Ｓ２からの変異体に関しては、好ましくは、ＢＳＡＰＲＱ， ＢＬＳ１４７， （ＢＳＡＰＲＭ， ＢＡＨ１０１）， ＢＬＳＡＶＩ（ ＢＳＫＳＭＫ， ＢＡＡＬＫＰ （ＢＡＰＢ９２）， ＢＬＳＵＢＬ）， ＢＳＥＹＡＢ， ＴＶＴＨＥＲ， 及びＢＳＡＰＲＳ、又はサブグループＩ−Ｓ２の特徴を保持しているそれらの機能的変異体から親サブチラーゼ選択する。
特に、親サブチラーゼはＢＬＳＡＶＩ（Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）， ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ Ａ／Ｓ）であり、そして本発明の好ましいサブチラーゼ変異体はＳａｖｉｎａｓｅ（商標）の変異体である。
【０１０３】
本発明のまた、そのアミノ酸配列に対するいずれか他の修飾と組み合しての上記サブチラーゼ変異体のいずれかを包含する。特に、酵素に対して改良された性質を付与するために当業界において知られている他の修飾との組合せが認識されている。異なった改良された性質を有する多くのサブチラーゼ変異体が記載されており、そしてそれらの多くは、本明細書において“発明の背景”のセクションに言及されている（上記参照のこと）。それらの参照は、好都合には、本明細書において記載されているサブチラーゼ変異体と組合され得るサブチラーゼ変異体を同定するために参照として本明細書において開示される。
【０１０４】
そのような組合せは、位置：２２２（酸化安定性を改良する）、２１８（熱安定性を改良する）、酵素を安定化するＣａ−結合部位、例えば位置７６での置換を含んで成り、そして他の多くは従来技術から明らかである。
さらなる態様においては、本明細書に記載されるサブチラーゼ変異体は好都合には、下記位置のいずれかにおける１又は複数の修飾と組合され得る：
２７， ３６， ５６， ７６， ８７， ９５， ９６， ９７， ９８， ９９， １００， １０１， １０２， １０３， １０４， １２０， １２３， １２９， １３１， １３２， １３３， １４３， １５９， １６７， １７０， １９２， １９４， ２０６， ２１７， ２１８， ２２２， ２２４， ２３２， ２３５， ２３６， ２４５， ２４８， ２５２， 又は２７４（ＢＡＳＢＰＮ番号付け）。
【０１０５】
特に、スブチリシンサビナーゼ（ＢＬＳＡＶＩ）、ＢＬＳＵＢＬ， ＢＳＫＳＭＫ及びＢＡＡＬＫＰの次の変異体が組み合わせのために適切であると思われる：
Ｋ２７Ｒ， ★３６Ｄ， Ｔ５６Ｐ， Ｎ７６Ｄ， Ｎ８７Ｓ， Ａ９７Ｎ， Ａ９８ＡＴ， Ａ９８ＡＳ， Ｎ９９ＮＤ， Ｎ９９ＮＲ， Ｎ９９Ａ， Ｎ９９Ｔ， Ｒ１０１Ｇ， Ｐ１０３Ａ， Ｖ１０４Ａ， Ｖ１０４Ｔ， Ｖ１０４Ｎ， Ｖ１０４Ｙ， Ｄ１２０Ｈ， Ｎ１２３Ｓ， Ｐ１２９Ｋ， Ｐ１３１Ｈ， Ａ１３３Ｐ， Ａ１３３Ｄ， Ａ１３３Ｅ， Ｔ１４３Ｋ， ★１５９Ｄ， ★１５９Ｅ， Ｙ１６７Ｘ， Ｙ１６７Ａ， Ｒ１７０Ｘ， Ｒ１７０Ｓ， Ａ１９４Ｐ， Ｑ２０６Ｅ， Ｆ２１７Ｒ， Ｎ２１８Ｓ， Ｍ２２２Ｓ， Ｍ２２２Ａ， Ｔ２２４Ｓ， Ａ２３２Ｖ， Ｋ２３５Ｌ， Ｑ２３６Ｈ， Ｑ２４５Ｒ， Ｎ２４８Ｄ， Ｎ２５２Ｋ及びＴ２７４Ａ。
【０１０６】
修飾Ｒ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ， Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ， Ｓ８７Ｎ＋Ｓ１０１Ｇ＋Ｖ１０４Ｎ， Ｋ２７Ｒ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｎ１２３Ｓ＋Ｔ２７４Ａ， Ｎ７６Ｄ＋Ｖ１０４Ａ， 又はＲ１０１Ｇ＋Ｐ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋★１５９Ｄ＋Ａ２３２Ｖ＋Ｑ２３６Ｈ＋Ｑ２３６Ｈ＋Ｑ２４５Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｎ２５２Ｋのいずれかを含んで成る、本発明のサブチラーゼの変異体がさらに特に興味あるものであり；又は上記又は下記に示される１又は複数のいずれかの修飾と共に、それらの修飾（Ｋ２７Ｒ， Ｎ７６Ｄ， Ｒ１０１Ｇ， Ｓ１０１Ｇ， Ｐ１０３Ａ， Ｖ１０４Ｉ， Ｖ１０４Ｎ， Ｖ１０４Ａ， Ｖ１０４Ｙ， Ｎ１２３Ｓ， ★１５９Ｄ， Ａ２３２Ｖ， Ｑ２３６Ｈ， Ｑ２４５Ｒ， Ｎ２４８Ｄ， Ｎ２５２Ｋ， Ｔ２７４Ａ）の他の組み合わせが改良された性質を示す。
【０１０７】
本発明の挿入の他に、次の置換を含む変異体が、特に興味ある変異体である：
Ｓ１０１Ｇ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｄ＋Ａ２３２Ｖ＋Ｑ２３６Ｈ＋Ｑ２４５Ｒ＋Ｎ２４８Ｄ＋Ｎ２５２Ｋ。
さらに、本発明の主な観点のサブチラーゼ変異体は好ましくは、位置１２９， １３１及び１９４のいずれかにおける１又は複数の修飾、好ましくは１２９Ｋ， １３１Ｈ及び１９４Ｐ修飾として、及び最も好ましくはＰ１２９Ｋ， Ｐ１３１Ｈ及びＡ１９４Ｐ修飾として組合される。それらの修飾のいずれかが、その生成において、より高い発現レベルのサブチラーゼ変異体を供給することが予測される。
【０１０８】
上記で言及されたように、本発明の変異体は、トリプシンインヒビタータイプＩＶ−０により、ある制限された程度に阻害され、そして従って、それらは卵のシミに対して卓越した洗浄性能を示す。従って、当業者の開発研究の初期段階で、当業者によるこの目的のための効果的且つ好ましい変異体の選択を可能にするために、本発明者は、問題の変異体の性能を初期に評価するために、当業者により容易に行われ得る適切な予備試験を提供して来た。
【０１０９】
従って、本明細者の例４に開示される“卵−阻害アッセイ”は、選択された変異体の可能性を初期において評価するために使用され得る。換言すれば、“卵−阻害アッセイ”は、選択された変異体が、トリプシンインヒビタータイプＩＶ−０により阻害されるかどうかを評価するために使用され得る。この試験を用いて、卵のしみを除去するための選択された変異体の適合性が評価され得、すなわち、この基本的原理は、選択された変異体がトリプシンインヒビタータイプＩＶ−０により強く阻害される場合、通常、さらなる試験実験を行う必要がないことである。
【０１１０】
従って、本明細書に記載される目的のために特に興味ある変異体は、本明細書の例４に記載される“卵−阻害アッセイ”において試験される場合、少なくとも１５％、例えば少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、例えば少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％の残留活性を有する変異体である。本発明の特に興味ある態様においては、変異体は、本明細書の例４に記載される“卵−阻害アッセイ”において試験される場合、少なくとも４０％、例えば少なくとも４５％、例えば少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、例えば少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％の残留活性を有する。
【０１１１】
明らかに、本発明の変異体は、少なくとも言及された最低のレベルで、より好ましくは言及された中間レベルで、及び最も好ましくは言及された最高レベルで、上記基準を満たすことが好ましい。
【０１１２】
他方では、又は上記アッセイの他に、選択された変異体の適合性は、本明細書の例３に開示される“モデル洗剤洗浄性能試験”において試験され得る。“モデル洗剤洗浄性能試験”は、対照システム、すなわち親サブチラーゼ （同じモデル洗剤システムにおいて導入され、そして同一の条件下で試験される）に比較して、標準の洗剤組成物に導入される場合、標準の布から卵のしみを除去する変異体の能力を評価するために使用され得る。この試験下で、卵のしみを除去する選択された変異体の適性がまず調査され、その原理は、選択された変異体が親サブチラーゼに比較して、試験において有意な改良性を示さない場合、さらなる試験実験を通常行う必要がないことである。
【０１１３】
従って、本明細書に記載される目的のために特に興味あるサブチラーゼは、本明細書における“モデル洗剤洗浄性能試験”に記載のようにして、
６．２％　　　ＬＡＳ（Ｎａｎｓａ ８０Ｓ）；
２％　　　　Ｃ１６−Ｃ１８脂肪酸のナトリウム塩；
４％　　　　非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒａｆａｘ ＬＦ４０４）；
２２％　　　 ゼオライトＰ；
１０．５％　　 Ｎａ２ＣＯ３；
４％　　　　Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５；
２％　　　　カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；
６．８％　　　アクリレート液体ＣＰ５ ４０％；
２０％　　　 過硼酸ナトリウム（実験式ＮａＢＯ２・Ｈ２Ｏ）；
０．２％　　　ＥＤＴＡ；
２１％　　　 Ｎａ２ＳＯ４；及び
水（残余）
を含んで成るモデル洗剤組成物により試験される場合、同一の条件下で試験されるＳａｖｉｎａｓｅ（商標）に比較して、卵のしみに対して改良された洗浄性能を示すを示すそのようなサブチラーゼである。
【０１１４】
洗浄性能の改良性は、本明細書における例３に定義される、いわゆる“性能因子”を用いることによって定量化され得る。
本発明の非常に興味ある態様においては、本発明のサブチラーゼは、“洗浄性能試験”において試験される場合、少なくとも１、例えば少なくとも１．５、例えば少なくとも２、好ましくは少なくとも２．５、例えば少なくとも３、例えば少なくとも３．５、特に少なくとも４、例えば少なくとも４．５、例えば少なくとも５の性能因子を有する。
明らかに、本発明のサブチラーゼは、少なくとも言及された最低のレベルで、より好ましくは言及された中位のレベルで及び最も好ましくは言及された最高のレベルで、上記基準を満たすことが好ましい。
【０１１５】
サブチラーゼ変異体の生成：
サブチラーゼをクローニングし、そして遺伝子（例えば、サブチラーゼ遺伝子）中に挿入物を導入するための多くの方法は、当業界においてよく知られている。“発明の背景”のセクションに引用される引例を参照のこと。
【０１１６】
一般的に、遺伝子のクローニング及び前記遺伝子中への挿入物の導入（ランダム及び／又は特定部位）のための標準方法が、本発明のサブチラーゼ変異体を得るために使用され得る。適切な技法のさらなる記載は、本明細書における例（下記参照のこと）、及び（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． など． （ｅｄｓ．） “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９５； Ｈａｒｗｏｏｄ， Ｃ．Ｒ．， ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ， Ｓ．Ｍ． （ｅｄｓ．） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９０）； 及びＷＯ９６／３４９４６号に言及される。
【０１１７】
さらに、サブチラーゼ変異体は、多様性の人工的創造のための標準技法、例えば異なったサブチラーゼ遺伝子のＤＮＡシャフリングにより構成され得る（ＷＯ９５／２２６２５号；Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０： ３８９−９１ （１９９４））。ＢＬＡＳＡＶＩ（Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標））に比較して、示された位置のいずれかへの挿入を包含するよう、天然において同定される１又は複数の部分サブチラーゼ配列による、Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標）をコードする遺伝子のＤＮＡシャフリングは、卵−インヒビターアッセイにおける続くスクリーニングの後、本明細書に記載される目的のために適切であるサブチラーゼ変異体を提供するであろう。
【０１１８】
発現ベクター：
本発明の酵素をコードするＤＮＡ構造体を含んで成る組換え発現ベクターは、便利には、組換えＤＮＡ方法にゆだねられ得るいずれかのベクターであり得る。ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞にしばしば依存する。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在するベクター（この複製は染色体複製に無関係である）、例えばベクターであり得る。
他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、その宿主細胞ゲノム中に一部又は完全に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【０１１９】
ベクターは好ましくは、本発明の酵素をコードするポリヌクレオチドがそのＤＮＡの転写のために必要とされる追加のセグメントに操作可能に連結されている発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは、プラスミド又はウィルスＤＮＡに由来し、又は両要素を含むことができる。用語“操作可能的に連結される”とは、セグメントが、それらの意図された目的のために協調して機能し、例えば転写がプロモーターにより開始し、そして酵素をコードするＤＮＡ配列を通して進行するよう配置されることを示す。
【０１２０】
プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示す配列を有するいずれかのポリヌクレオチドであり、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。
細菌宿主細胞に使用するための適切なプロモーターの例は、バチルス・ステアロサーモフィラス　マルトゲン性アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子又はバチルス・プミラスキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージλＰＲ又はＰＬプロモーター又はＥ．コリｌａｃ， ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターを包含する。
【０１２１】
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列はまた、必要なら、適切なターミネーターに操作可能に連結され得る。
本発明の組換えベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするポリヌクレオチドを含んで成る。
ベクターはまた、選択マーカー、例えば宿主細胞における欠損を補足する生成物をコードする遺伝子、又は抗生物質、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン又は同様のものに対する耐性、又は重金属又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含んで成ることができる。
【０１２２】
宿主細胞の分泌経路中に本発明の酵素を方向づけるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、組換えベクターに供給され得る。分泌シグナル配列は、正しい読み取り枠で酵素をコードするＤＮＡ配列に連結される。分泌シグナル配列は、酵素をコードするＤＮＡ配列の５’側に通常、位置する。分泌シグナル配列は、酵素と通常関連するその配列であり得るか、又はもう１つの分泌されるタンパク質をコードする遺伝子からであり得る。
【０１２３】
それぞれ、本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列、プロモーター及び任意には、ターミネーター及び／又は分泌シグナル配列を連結するために、又は適切なＰＣＲ増幅によりそれらの配列をアセンブリーするために、及び複製又は組み込みのために必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Ｓａｎｂｒｏｏｋなど．， 前記）。
【０１２４】
宿主細胞：
宿主細胞中に導入される、本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドは、問題の宿主に対して相同であっても、又は異種であっても良い。宿主細胞に対して相同である場合、すなわち天然において宿主細胞により生成される場合、それは、典型的には、もう１つのプロモーター配列、又は適用できるなら、その天然の環境においてよりももう１つの分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に操作可能的に連結されるであろう。用語“相同”とは、問題の宿主生物に対して生来の酵素をコードするＤＮＡ配列を包含することが意図される。用語“異種”とは天然において宿主細胞により発現されないＤＮＡ配列を包含することが意図される。従って、ＤＮＡ配列は、もう１つの生物からであり得るか、又はそれは合成配列でもあり得る。
【０１２５】
本発明のＤＮＡ構造体又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の酵素を生成できるいずれかの細胞であり得、そして細胞、酵母、菌類及び高等真核細胞、例えば植物を包含する。
【０１２６】
培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる菌類宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバチルス株、例えばバチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・レンタス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラウタス、バチルス・メガテリウス、又はバチルス・スリンジエンシス、特にバチルス・レンタスの株；又はストレプトミセス、例えばストレプトミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリナスの株；又はグラム陰性細菌、例えばＥ．コリの株である。
【０１２７】
細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又はそれ自体知られている態様でのコンピテント細胞を用いることによりもたらされ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．， 前記を参照のこと）。
細胞、例えばＥ．コリにおいて酵素を発現する場合、酵素は、典型的には不溶性粒質物（封入体として知られている）として細胞質に保持され得るか、又は細菌分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして粒質物が回収され、そして変性され、この後、酵素は変性剤を希釈することによって再生される。後者の場合、酵素は、細胞周辺腔の内容物を放すために、例えば音波処理又は浸透ショックにより細胞を破壊することにより、細胞周辺腔から回収され得る。
【０１２８】
グラム−陽性細胞、例えばバチルス又はストレプトミセス株において酵素を発現する場合、酵素は細胞質に保持され得るか、又は細菌分泌配列により細胞外培地に向けられ得る。後者の場合、酵素は、下記のように培地から回収され得る。
【０１２９】
サブチラーゼ変異体の生成方法：
本発明は、本発明の単離された酵素の生成方法を提供し、ここで前記酵素をコードするＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチドにより形質転換されている適切な宿主細胞が、前記酵素の生成を可能にする条件下で培養され、そしてその得られる酵素が培養物から回収される。
前記酵素をコードするＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターが異種細胞中に形質転換される場合、本発明の酵素の異種組換え生成を可能にすることができる。
それにより、相同不純物を有さないことにおいて特徴づけられる高く精製されたサブチラーゼ組成物を製造することが可能である。
【０１３０】
この場合、相同不純物とは、本発明の酵素が本来得られる相同細胞に起因するいずれかの不純物（例えば、本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。
形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖するために適切ないずれかの従来の培地であり得る。発現されたサブチラーゼは、便利には、培養培地中に分泌され、そして良く知られている方法、例えば培地から細胞を、遠心分離又は濾過により分離し、培地のタンパク質性成分を、塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめ、続いて、クロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様の方法により、それらから回収され得る。
【０１３１】
清浄及び洗剤組成物：
一般的に、清浄及び洗剤組成物は、当業界において良く知られており、そして適切な清浄及び洗剤組成物のさらなる記載については、ＷＯ９６／３４９４６号；ＷＯ９７／０７２０２号；ＷＯ９５／３００１１号を参照のこと。
さらに、本明細書における例は、卵のしみに対する洗浄性能における本発明のサブチラーゼについての改良性を示す。
【０１３２】
洗剤組成物：
サブチラーゼ変異体は、洗剤組成物に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分になることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
【０１３３】
特定の観点においては、本発明は、本発明のサブチラーゼ酵素を含んで成る洗剤添加剤を提供する。前記洗剤添加剤及び洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カーボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ及び／又はポロキシダーゼを含んで成ることができる。
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合できるべきであり（すなわち、他の酵素及び非酵素の成分、等とのｐＨ−最適適合性）、そして酵素は効果的な量で存在すべきである。
【０１３４】
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に修飾された、又はタンパク質構築された変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン−様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルスに由来するそれらのもの、例えばスブチリシンＮｏｖｏ、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７及びスブチリシン１６８（ＷＯ８９／０６２７９号に記載される）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、及びＷＯ８９／０６２７０号及びＷＯ９４／２５５８３号に記載されるフサリウムプロテアーゼである。
【０１３５】
有用なプロテアーゼの例は、ＷＯ９２／１９７２９号、ＷＯ９８／２０１１５号、ＷＯ９８／２０１１６号及びＷＯ９８／３４９４６号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：２７， ３５， ５７， ７６， ８７， ９７， １０１， １０４， １２０， １２３， １６７， １７０， １９４， ２０６， ２１８， ２２２， ２２４， ２３５及び２７４。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、ＡｌｃａｌａｓｅＴＭ， ＳａｖｉｎａｓｅＴＭ， ＰｒｉｍａｓｅＴＭ， ＤｕｒａｌａｓｅＴＭ， ＥｓｐｅｒａｓｅＴＭ及びＫａｎｎａｓｅＴＭ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）， ＭａｘａｔａｓｅＴＭ， ＭａｘａｃａｌＴＭ， ＭａｘａｐｅｍＴＭ， ＰｒｏｐｅｒａｓｅＴＭ， ＰｕｒａｆｅｃｔＴＭ， Ｐｕｒａｆｅｃｔ ＯｘＰＴＭ， ＦＮ２ＴＭ及びＦＮ３ＴＭ （Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．） を包含する。
【０１３６】
リパーゼ：適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なリパーゼの例は、ヒューミコラ（別名、サーモミセス）、例えばヨーロッパ特許第２５８０６８号及び第３０５２１６号に記載のようなヒューミコラ・ラウギノサ（Ｔ．ラウギノサ）、又はＷＯ９６／１３５８０号に記載のようなヒューミコラ・インソレンス、Ｐ．アルカリゲネス又はＰ．プソイドアルカリゲネス（ヨーロッパ特許第２１８２７２号）、Ｐ．セパシア（ヨーロッパ特許第３３１３７６号）、Ｐ．スツゼリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（イギリス特許第１，３７２，０３４号）、Ｐ．フルオレセンス、プソイドモナスｓｐ． ＳＤ７０５株（ＷＯ７５／０６７２０号及びＷＯ９６／２７００２号）、Ｐ．ウイスコンシネンシス（ＷＯ９６／１２０１２号）からのリパーゼ、バチルスリーパーゼ、例えばＢ．スブチリス（Ｄａｒｔｏｉｓなど． （１９９３）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １１３１， ２５３−３６０）、Ｂ． ステアロサーモフィラス（日本特許６４／７４４９９２）又はＢ．プミラス（ＷＯ９１／１６４２２号）からのリーパーゼを包含する。
【０１３７】
他の例は、リパーゼ変異体、例えばＷＯ９２／０５２４９号、ＷＯ９４／０１５４１号、ヨーロッパ特許第４０７２２５号、ヨーロッパ特許第２０６１０５号、ＷＯ９５／３５３８１号、ＷＯ９６／００２９２号、ＷＯ９５／３０７４４号、ＷＯ９４／２５５７６号、ＷＯ９５／１４７８３号、ＷＯ９５／２２６１５号、ＷＯ９７／０４０７９号及びＷＯ９７／０７２０号に記載されるものを包含する。
好ましい市販のリパーゼ酵素は、ＬｉｐｏｌａｓｅＴＭ 及びＬｉｐｏｌａｓｅ ＵｌｔｒａＴＭ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ） を包含する。
【０１３８】
アミラーゼ：適切なアミラーゼ（α−及び／又はβ）は、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。アミラーゼは、バチルス、例えばイギリス特許第１，２９６，８３９号により詳細に記載される、Ｂ．リケニルホルミスの特許株から得られるα−アミラーゼを包含する。
【０１３９】
有用なアミラーゼの例は、ＷＯ９４／０２５９７号、ＷＯ９４／１８３１４号、ＷＯ９６／２３８７３号及びＷＯ／４３４２４号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：１５， ２３， １０５， １０６， １２４， １２８， １３３， １５４， １５６， １８１， １８８， １９０， １９７， ２０２， ２０８， ２０９， ２４３， ２６４， ３０４， ３０５， ３９１， ４０８及び４４４。
市販のアミラーゼは、ＤｕｒａｍｙｌＴＭ， ＴｅｒｍａｍａｙｌＴＭ， ＦｕｎｇａｍｙｌＴＭ 及びＢＡＭＴＭ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）， ＲａｐｉｄａｓｅＴＭ 及びＰｕｒａｓｔａｒＴＭ （Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）である。
【０１４０】
セルラーゼ：適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、バチルス、ヒューミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム属からのセルラーゼ、例えばアメリカ特許第４，４３５，３０７号、アメリカ特許第５，６４８，２６３号、アメリカ特許第５，６９１，１７８号、アメリカ特許第５，７７６，７５７号及びＷＯ８９／０９２５９号に開示されるヒューミコラ・インソレンス、マイセリオプソラ・サーモフィラ／オキシスポラムから生成される菌類セルラーゼを包含する。
【０１４１】
特に適切なセルラーゼは、色彩保護有益性を有するアルカリ又は中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許第０４９５２５７号、ヨーロッパ特許第０５３１３７２号、ＷＯ９６／１１２６２号、ＷＯ９６／２９３９７号、ＷＯ９８／０８９４０号に記載されるセルラーゼである。例の例は、ＷＯ９４／０７９９８号、ヨーロッパ特許第０５３１３１５号、アメリカ特許第５，４５７，０４６号、アメリカ特許第５，６８５，５９３号、アメリカ特許第５，７６３，２５４号、ＷＯ９５／２４４７１号、ＷＯ９８／１２３０７号及びＰＣＴ／ＤＫ９８／０２９９号に記載されるそれらのものである。
【０１４２】
市販のセルラーゼは、ＣｅｌｌｕｚｙｍｅＴＭ 及びＣａｒｅｚｙｍｅＴＭ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）， ＣｌａｚｉｎａｓｅＴＭ 及びＰｕｒａｄｅｘ ＨＡＴＭ （Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．） 及びＫＡＣ−５００ （Ｂ）ＴＭ （Ｋａｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ） を包含する。
【０１４３】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリナス、例えばコプリナス・シネレウス、及びＷＯ９３／２４６１８ 号、ＷＯ９５／１０６０２号及びＷＯ９８／１５２５７号に記載されるそれらのようなそれらの変異体からのペルオキシダーゼを包含する。
【０１４４】
市販のペルオキシダーゼは、ＧｕａｒｄｚｙｍｅＴＭ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ） を包含する。
洗剤酵素は、１又は複数の酵素を含む別々の添加剤を添加することにより、又はそれらの酵素のすべてを含んで成る組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち別々の添加剤又は組合された添加剤が、例えば粒質物、液体、スラリー、等として配合され得る。好ましくは洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非−ダスチング粒質物、液体、特に安定された液体又はスラリーである。
【０１４５】
非−ダスチング粒質物は、アメリカ特許第４，１０６，９９１号及び第４，６６１，４５２号に開示のようにして生成され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。蝋被覆材料の例は、１０００〜２０，０００の平均モル重量を有するポリ（酸化エチレン）生成物（ポリエチレングリコール、ＰＥＧ）；１６〜５０の酸化エチレン単位を有する、エトキシル化されたノニルフェノール；１２〜２０個の炭素原子を有するアルコールを有し、そして１５〜８０の酸化エチレン単位を有する、エトキシ化された脂肪アルコール；脂肪アルコール、脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。
【０１４６】
流動層技法による適用のために適切なフィルム形成被覆材料の例は、イギリス特許第１４８３５９１号に与えられている。例えば、液体酵素調製物は、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、硫酸又は硼酸を添加することによって、安定化される。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第２３８，２１６号に開示される方法に従って調製され得る。
【０１４７】
本発明の洗剤組成物は、いずれかの便利な形、例えば棒状、錠剤、粉末、顆粒、ペースト又は液体の形で存在することができる。液体洗剤は、水性であり、典型的には、７０％までの水及び０〜３０％の有機溶媒を含み、又は非水性であり得る。
【０１４８】
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は両性イオンであり得る１又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、０．１〜６．０重量％のレベルで存在する。そこに含まれる場合、洗剤は通常、約１％〜約４０％のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪酸スルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。
【０１４９】
そこに含まれる場合、界面活性剤は通常、約０．２％〜約４０％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（“グルコサミド”）を含むであろう。
【０１５０】
洗剤は、０〜６５％の洗剤ビルダー又は錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、三リン酸、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン六酢酸、アルキル−又はアルキニル琥珀酸、可溶性シリケート又は層化されたシリケート（例えばＨｏｅｃｈｓｔからのＳＫＳ−６）を含むことができる。
洗剤は、１又は複数のポリマーを含んで成る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート（例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーを含んで成る。
【０１５１】
洗剤は、Ｈ２Ｏ２源を含んで成る漂白システム、例えば過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートと共に組合され得る過硼酸塩又は過炭酸塩を含むことができる。他方では、漂白システムは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる。
【０１５２】
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばＷＯ９２／１９７０９号及びＷＯ９２／１９７０８号に記載のようにして配合され得る。
【０１５３】
洗剤はまた、他の従来の洗剤組成物、例えば布コンディショナー、例えばクレー、泡増強剤、石鹸泡抑制剤、抗腐蝕剤、土壌懸濁剤、抗−土壌再沈着剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇りインヒビター、又は香料を含むことができる。
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体１Ｌ当たり０．０１−１００ｍｇの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体１Ｌ当たり０．０５−５ｍｇの酵素タンパク質、特に洗浄液体１Ｌ当たり０．１−１ｍｇの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
【０１５４】
本発明の酵素はさらに、ＷＯ９７／０７２０２号（引例として本明細書組み込まれる）に開示される洗剤配合物に導入され得る。
本発明は、次の例によりさらに詳細に記載されるが、それらは本発明を制限するものではない。
【０１５５】
洗剤組成物においては、簡略された成分同定は次の意味を有する：
ＬＡＳ：ナトリウム線状Ｃ１２アルキルベンゼンスルホネート；
ＴＡＳ：ナトリウム牛脂アルキルスルフェート；
ＸＹＡＳ：ナトリウムＣ１Ｘ−Ｃ１Ｙアルキルスルフェート；
ＳＳ：２−ブチルオクタン酸の第二石鹸界面活性剤；
２５ＥＹ：平均Ｙモルの酸化エチレンにより縮合されたＣ１２−Ｃ１５主要線状第１アルコール；
４５ＥＹ：平均Ｙモルの酸化エチレンにより縮合されたＣ１４−Ｃ１５主要線状第１アルコール：
【０１５６】
ＸＹＥＺＳ：モル当たり平均Ｚモルの酸化エチレンにより縮合されたＣ１Ｘ−Ｃ１Ｙナトリウムアルカリスルフェ−ト；
非イオン性：平均３．８の程度のエトキシル化及び平均４．５の程度のプロポキシル化を有する、商標Ｐｌｕｒａｆａｘ ＬＦ４０４としてＢＡＳＦ ＧｍｂＨから市販されている、Ｃ１３−Ｃ１５の混合されたエトキシル化／プロポキシル化脂肪アルコール；
ＣＦＡＡ：Ｃ１２−Ｃ１４のアルキルＮ−メチルグルカミド；
ＴＦＡＡ：Ｃ１６−Ｃ１８のアルキルＮ−メチルグルカミド；
珪酸塩：非晶性珪酸ナトリウム（ＳｉＯ２：Ｎａ２Ｏの比＝２．０）；
ＮａＳＫＳ−６：δ−Ｎａ２Ｓｉ２Ｏ５の結晶性積層珪酸塩；
【０１５７】
炭酸塩：非晶性炭酸ナトリウム；
リン酸塩：トリポリリン酸ナトリウム；
ＭＡ／ＡＡ：約８０，０００の分子量を有する１：４のマレイン酸：アクリル酸のコポリマー；
ポリアクリレート：ＢＡＳＦ ＧｍｂＨにより商品名ＰＡ３０として市販されている、平均８，０００の分子量を有するポリアクリレートホモポリマー；
ゼオライトＡ：１〜２０μｍの主粒子サイズを有する、Ｎａ１２（ＡｌＯ２ＳｉＯ２）１２・２７Ｈ２Ｏの水和化されたアルミノ珪酸ナトリウム；
クエン酸塩：クエン酸三ナトリウム・２水和物；
クエン酸：クエン酸；
【０１５８】
過硼酸塩：実験式ＮａＢＯ２・Ｈ２Ｏを有する非晶性過硼酸ナトリウム・１水和物漂白剤；
ＰＢ４：非晶性過硼酸ナトリウム・４水和物；
過炭酸塩：実験式２Ｎａ２ＣＯ３・３Ｈ２Ｏを有する非晶性過炭酸ナトリウム漂白剤；
ＴＡＥＤ：テトラ−アセチルエチレンジアミン；
ＣＭＣ：ナトリウムカルボキシルメチルセルロース；
ＤＥＴＰＭＰ：Ｍｏｎｓａｎｔｏにより商品名Ｄｅｑｕｅｓｔ２０６０として市販されているジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）；
ＰＶＰ：ポリビニルピロリドンポリマー；
【０１５９】
ＥＤＤＳ：アトリウム塩の形でのエチレンジアミン−Ｎ， Ｎ’−二琥珀酸［Ｓ， Ｓ］異性体；
石鹸水：２５％パラフィンワックス、融点５０℃、１７％疎水性シリカ；
サプレッサー：粒質形でのスターチ；
硫酸塩：非晶性硫酸ナトリウム；
ＨＭＷＰＥＯ：高分子量ポリ酸化エチレン；
ＴＡＥ２５：牛脂アルコールエトキシレート（２５）。
【０１６０】
洗剤例Ｉ：
本発明の粒状布清浄組成物を次の通りに調製することができる：
【表２】
2004511228.tif 000005
【０１６１】
洗剤例ＩＩ：
本発明の圧縮粒状布清浄組成物（密度８００ｇ／ｌ）を次の通りに調製することができる：
【表３】
2004511228.tif 000006
【０１６２】
洗剤例ＩＩＩ：
着色された布の洗濯において特に有用である本発明の粒状布清浄組成物を次の通りに調製した：
【表４】
2004511228.tif 000007
【０１６３】
洗剤例ＩＶ：
本発明の重質液体布清浄組成物を次の通りにして調製することができる：
【表５】
2004511228.tif 000008
【０１６４】
【表６】
2004511228.tif 000009
【０１６５】
【表７】
2004511228.tif 000010
【０１６６】
【表８】
2004511228.tif 000011
【０１６７】
【表９】
2004511228.tif 000012
【０１６８】
【表１０】
2004511228.tif 000013
【０１６９】
【表１１】
2004511228.tif 000014
【０１７０】
【表１２】
2004511228.tif 000015
【０１７１】
【表１３】
2004511228.tif 000016
【０１７２】
【表１４】
2004511228.tif 000017
【０１７３】
【表１５】
2004511228.tif 000018
【０１７４】
【表１６】
2004511228.tif 000019
【０１７５】
ＸＩＩ）Ｉ， ＩＩ， ＩＩＩ， ＩＶ， ＶＩ 及びＸ に記載されるような自動皿洗い組成物、ここで過硼酸塩は過炭酸塩により置換されている。
ＸＩＩＩ）マンガン触媒をさらに含む、Ｉ−ＶＩに記載されるような自動皿洗い組成物。前記マンガン触媒は、例えば“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｗ−ｔｅｍｐｏｒａｔｕｒｅ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ”、Ｎａｔｕｒｅ ３６９， １９９４， ｐｐ．６３７−６３９に記載される化合物の１つであり得る。
材料及び方法：
【０１７６】
布：
ＷＦＫ１０Ｎ標準布断片（卵のしみ）を、ＷＦＫ Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ ＧｍｂＨ， Ｃｈｒｉｓｔｅｎｆｅｌｄ １０， Ｄ−４１３７９ Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙから得た。
株：
Ｂ．サブチリスＤＮ１８８５（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎなど．， １９９０）。
Ｂ．レンタス３０９及び１４７は、ＮＣＩＢにより寄託され、そして受託番号ＮＣＩＢ１０３０９及び１０１４７を付与されたバチルス・レンタスの特定株であり、そして引用により本明細書に組み込まれるアメリカ特許第３，７２３，２５０号に記載されている。
Ｅ．コリＭＣ１００（Ｍ．Ｊ． Ｃａｓａｄａｂａｎ ａｎｄ Ｓ．Ｎ． Ｃｏｈｅｎ （１９８０）； Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３８： １７９−２０７）は、従来の方法によりｒ−， ｍ＋にされ、そしてまた、アメリカ特許出願第０３９，２９８号に記載されている。
【０１７７】
プラスミド：
ｐＪＳ３： サブチラーゼ３０９をコードする合成遺伝子を含むＥ．コリ−Ｂ．サブチリスシャトルベクター（Ｊａｃｏｂ Ｓｃｈｉｏｄｔ など． Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ３： ３９−４４ （１９９６） により記載される）。
ｐＳＸ２２２： Ｂ．サブチリス発現ベクター（ＷＯ９６／３４９４６号に記載される）。
【０１７８】
一般的な分子生物学方法：
特にことわらない限り、ＤＮＡ操作及び形質転換は、分子生物学の標準方法を用いて行われた（Ｓａｍｂｒｏｏｋなど． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． など． （ｅｄｓ．） “Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９５： Ｈａｒｗｏｏｄ， Ｃ．Ｒ．， ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ， Ｓ．Ｍ． （ｅｄｓ．） “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ”， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９０）。
ＤＮＡ操作のための酵素は、その供給者の規格に従って使用された。
ＤＮＡ操作のための酵素：
特にことわらない限り、ＤＮＡ操作のためのすべての酵素、例えば制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、等は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ． から得られる。
【０１７９】
タンパク質加水分解活性：
発明においては、タンパク質加水分解活性を、キロＮＯＶＯプロテアーゼ単位（ＫＮＰＵ）で表す。活性は酵素標準（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標））に比較して決定され、そしてその決定は、標準条件、すなわち５０℃、ｐＨ８．３、９分の反応時間、３分の測定時間での、タンパク質加水分解酵素によるジエチルカゼイン（ＤＭＣ）溶液の消化に基づかれる。フォルダーＡＦ２２０／１は、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋへの要求に基づいて入手できる（これは、引用により本明細書に包含される）。
【０１８０】
標準の条件下で、基質としてＮ−アセチルカゼインを用いての１５分間のインキュベーションの間、グリシン１ｍモルに等しい量のＮＨ２−基を生成するタンパク質加水分解酵素活性として定義されるグリシン単位である。
酵素活性はまた、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｒｏｔｈｇｅｂ， Ｔ．Ｍ．， Ｇｏｏｄｌａｎｄｅｒ， Ｂ．Ｄ．， Ｇａｒｒｉｓｏｎ， Ｐ．Ｈ．， 及びＳｍｉｔｈ，Ｌ．Ａ．， （１９８８） に記載される、可溶性基質スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニル−アラニン−パラ−ニトロ−フェノールとの反応に従って、ＰＮＡアッセイを用いても測定され得る。
【０１８１】
発酵：
サブチラーゼ酵素の生成のための発酵を、１００ｍｌのＢＰＸ培地を含む５００ｍｌのそらせ板付き三角フラスコにおいて、３０℃で５日間、回転振盪テーブル（３００ ｒ．ｐ．ｍ．） 上で行った。
従って、２Ｌのブイヨンを製造するためには、２０個の三角フラスコを、同時に発酵せしめた。
【０１８２】
培地：
ＢＰＸ培地組成物（１Ｌ当たり）：
ジャガイモ澱粉　　　　　　　　１００ｇ
粉砕された大麦　　　　　　　　 ５０ｇ
大豆粉末　　　　　　　　　　　 ２０ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４×１２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　９ｇ
プルロニック　　　　　　　　　０．１ｇ
カゼイン酸ナトリウム　　　　　 １０ｇ
培地における澱粉を、α−アミラーゼにより液化し、そして培地を、１２０℃で４５分間、加熱することによって殺菌した。殺菌の後、培地のｐＨを、ＮａＨＣＯ３の添加により０．１Ｍにすることにより調節した。
【０１８３】
実施例
例１．酵素変異体の構造及び発現
特定部位の突然変異誘発
特定の挿入及び特定の置換を含んで成る本発明のサブチラーゼ３０９（Ｓａｖｉｎａｓｅ（商標））特定部位変異体を、所望する挿入を含むオリゴを用いて、ＰＣＲにより生成されたＤＮＡフラグメント（Ｂａｍｂｒｏｏｋなど．， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９）の従来のクローニングにより製造した（下記参照のこと）。
【０１８４】
鋳型プラスミドＤＮＡはｐＪＳ３（下記参照のこと）、又はサブチラーゼ３０９の変異体を含むこの類似体である。
挿入及び置換は、変異体の構成に対して、オリゴ指図された突然変異誘発により導入された。
サブチラーゼ３０９変異体を用いて、Ｅ．コリを形質転換した。それらの形質転換体の一晩の培養物から精製されたＤＮＡを用いて、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡフラグメントの精製、連結、Ｂ．サブチリスの形質転換により、Ｂ．サブチリスを形質転換した。Ｂ．サブチリスの形質転換は、Ｄｕｂｎａｕなど．， １９７１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５６， ｐｐ． ２０９−２２１による記載のようにして行われた。
【０１８５】
特定領域における挿入及び置換を導入するための特定部位の突然変異誘発
特定部位の突然変異誘発を行うために使用される全体的な手段は、次の通りであった：
挿入及び置換を定義するＤＮＡ塩基対により分離される、挿入及び置換の部位を両端に有するＤＮＡ配列に対応する突然変異誘発性プライマー（オリゴヌクレオチド）を合成した。
【０１８６】
結果的に、得られる突然変異誘発性プライマーを、修飾されたプラスミドｐＪ６３とのＰＣＲ反応において使用した（上記参照のこと）。得られるＰＣＲフラグメントを、第２のＰＣＲ反応において精製し、そして延長し、その得られるＰＣＲ生成物を、第３のＰＣＲ反応において精製し、そして延長し、その後、エンドヌクレアーゼにより消化し、そしてＥ．コリ−Ｂ．サブチリスシャトルベクター中にクローン化した（下記参照のこと）。ＰＣＲ反応を通常の条件下で行う。
【０１８７】
個の手段に続いて、２つの挿入及び１つの置換をＳａｖｉｎａｓｅ（商標）において構成し、ここで挿入がそれぞれ、位置９９（★９９ａＤ）及び２１７（★２１７ａＰ）で挿入され、そして置換が位置Ｓ９９Ａで挿入されている（下記参照のこと）。
突然変異誘発性プライマー（５’−ＣＣＧ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＡＣ ＣＡＴ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＣＣ ＣＴＡ ＧＧＡ ＣＴＴ ＴＡＡ ＣＡＧ Ｃ−３’ （センス）（配列番号３））により導入される位置９９での挿入及び置換を、反対のプライマー（５’−ＧＡＧ ＴＴＡ ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＴＧ ＧＡＣ ＧＣＧ−３’（アンチセンス）（配列番号４））とのＰＣＲ反応に使用した。
【０１８８】
生成されたＰＣＲフラグメントを、次のプライマーによる位置２１７での挿入を導入する第２回目のＰＣＲにより、ＳａｖｉｎａｓｅのＣ−末端方向に延長した：５’−ＣＡＴ ＣＧＡ ＴＧＴ ＡＣＣ ＧＴＴ ＴＧＧ ＴＡＡ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＴＡ ＴＧＴ ＴＧ−３’（配列番号５）。前記第２回目のＰＣＲ生成物を、ｐＪＳ３におけるＭｌｕＩ部位の下流に位置する、次のプライマーによる第３回目のＰＣＲにより、ＳａｖｉｎａｓｅのＣ−末端方向に延長した：５’−ＡＡＣ ＣＧＣ ＡＣＡ ＧＣＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＡＴ ＴＧＡ ＴＴＡ ＡＣＧ ＣＧＴ ＴＧＣ−３’（配列番号６）。すべてのＰＣＲ反応は、鋳型としてプラスミドｐＪＳ３を使用した。第３回目のＰＣＲに起因する延長されたＤＮＡフラグメントを、修飾されたプラスミドｐＪＳ３のＳａｌＩ−部位及びＭｌｕＩ−部位中にクローン化した（上記参照のこと）。
【０１８９】
プラスミドＤＮＡを用いて、良く知られている技法によりＥ．コリを形質転換し、そして１つのＥ．コリコロニーを配列決定し、企画された突然変異を確かめた。
本発明のサブチラーゼ変異体を精製するために、本発明の変異体を含んで成るＢ．サブチリスｐＪＳ３発現プラスミドを用いて、コンピテントＢ．サブチリス株を形質転換し、そして１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含む培地において、上記のようにして発酵せしめた。
【０１９０】
例２．酵素変異体の精製
この方法は、バチルス宿主細胞における本発明のサブチラーゼの生成のためへの２Ｌ規模の発酵の精製に関する。
約１．６Ｌの発酵ブイヨンを、１Ｌのビーカーにおいて、５０００ｒｐｍで３５分間、遠心分離した。上清液を、１０％酢酸を用いて、ｐＨ６．５に調節し、そしてＳｅｉｔｚ Ｓｕｐｒａ Ｓ１００フィルタープレート上で濾過した。
【０１９１】
Ａｍｉｃｏｎ ＳＩＹ１０ ＵＦカートリッジを備えたＡｍｉｃｏｎ ＣＨ２Ａ ＵＦユニットを用いて、前記濾液を約４００ｍｌに濃縮した。そのＵＦ濃縮物を遠心分離し、そして吸収の前、Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ親和性カラム上で、室温でｐＨ７で濾過した。サブチラーゼを、０．０１Ｍのジメチルグルタル酸、０．１Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カルシウムを含む、ｐＨ７に調節された緩衝溶液中、２５％の２−プロパノール及び１Ｍの塩化ナトリウムを用いて、室温でＢａｃｉｔｒａｃｉｎカラムから溶出した。
【０１９２】
Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ精製段階からのプロテアーゼ活性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カルシウムを含む、ｐＨ６．５に調節された緩衝液により平衡化された７５０ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（５ｃｍの直径）に適用した。
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムからのタンパク質加水分解活性を有する画分を組合し、そして０．０１Ｍのジメチルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．００２Ｍの塩化カルシウムを含む、ｐＨ６．５に調節された緩衝液により平衡化された１５０ｍｌのＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ ６Ｂカチオン交換カラム（５ｃｍの直径）に適用した。
【０１９３】
プロテアーゼを、同じ緩衝液（スブチリシン１４７の場合、０−０．２Ｍの塩化ナトリウム）２Ｌ中、０〜０．１Ｍの塩化ナトリウムの線状グラジエントを用いて溶出した。
最終精製段階においては、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからのプロテアーゼ含有画分を組合し、そしてＧＲ８１ＰＰ膜（Ｄａｎｉｓｈ Ｓｕｇａｒ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． からの）を備えたＡｍｉｃｏｎ超濾過セルにおいて濃縮した。
【０１９４】
構成及び発酵について例１の技法及び上記単離方法を用いることによって、次のスブチリシン３０９を、生成し、そして単離した：
Ｌ４２ＬＮ＋Ｐ１２９ＰＡ
Ｓ９９ＳＤ＋Ｌ４２ＬＮ
Ｌ４２ＬＮ＋Ｌ２１７ＬＰ
Ｌ４２ＬＮ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｐ１２９ＰＡ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｎ１５５ＮＡ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｎ１５５ＮＡ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｎ１５５ＮＤ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｎ１５５ＮＤ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｎ１５５ＮＲ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｎ１５５ＮＲ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｎ１５５ＮＦ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｎ１５５ＮＦ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ１８８ＳＥ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｓ１８８ＳＥ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ１８８ＳＤ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｓ１８８ＳＤ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ１８８ＳＫ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｓ１８８ＳＫ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ１８８ＳＬ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｓ１８８ＳＬ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ１８８ＳＡ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｓ１８８ＳＡ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ２１６ＳＰ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｓ２１６ＳＰ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ２１６ＳＤＰ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｓ２１６ＳＤＰ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｓ２１６ＳＰＤ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｓ２１６ＳＰＤ
【０１９５】
Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｓ２１６ＳＤ
Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｓ２１６ＳＥ
Ｌ２１７ＬＰ
Ｌ２１７ＬＡ
Ｌ２１７ＬＤＰ
Ｓ９９ＳＤ＋Ｌ２１７ＬＰ
Ｐ１２９ＰＡ＋Ｌ２１７ＬＰ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｌ２１７ＬＰ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｌ２１７ＬＰ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｌ２１７ＬＤＰ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｌ２１７ＬＤＰ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｌ２１７ＬＰＤ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｌ２１７ＬＰＤ
Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７ＬＤ
Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１６０Ｓ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７ＬＥ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｎ２１８ＮＰ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｎ２１８ＮＰ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｎ２１８ＮＤＰ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｎ２１８ＮＤＰ
Ｓ９９Ａ＋Ｓ９９ＳＤ＋Ｎ２１８ＮＰＤ＝Ｓ９９ＡＤ＋Ｎ２１８ＮＰＤ
【０１９６】
例３．“モデル洗剤洗浄性能試験”
標準の洗剤組成物におけるサブチラーゼの洗浄性能を評価するために、標準の洗浄実験を、下記実験条件を用いて行うことができる：
洗剤：　　　　　　　　　モデル洗剤
洗剤用量：　　　　　　　４．０ｇ／ｌ
ｐＨ：　　　　　　　　　　　１０．１ｇ
洗浄時間：　　　　　　　　２０分
温度：　　　　　　　　　　３０分
水の硬度：　　　　　　　　１５°ｄＨ
酵素濃度：　　　　　　　　１０ｎｍ（洗剤溶液における）
試験システム：　　 撹拌棒を有する１０ｍｌのビーカー
布／体積　　 ５個の布片（φ２．５ｃｍ）／５０ｍｌの洗剤溶液
試験材料： ＷＦＫ１０Ｎ（卵のしみ）
【０１９７】
モデル洗剤の組成は次の通りである：
６．２％のＬＡＳ（Ｎａｎｓａ ８０Ｓ）；
２％のＣ１６−Ｃ１８脂肪酸のナトリウム塩；
４％の非イオン性界面活性剤（Ｐｌｕｒａｆａｘ ＬＦ４０４）；
２２％のゼオライトＰ；
１０．５％のＮａ２ＣＯ３；
４％のＮａ２Ｓｉ２Ｏ５；
２％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）；
６．８％のアクリレート液体ＣＰ５ ４０％；
２０％の過硼酸ナトリウム（実験式ＮａＢＯ２・Ｈ２Ｏ）；
０．２％のＥＤＴＡ；
２１％のＮａ２ＳＯ４及び
水（残余）。
【０１９８】
洗剤溶液のｐＨを、ＨＣｌ又はＮａＯＨの添加により１０．１に調節する。水の硬度を、試験システムへのＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２（Ｃａ２＋：Ｍｇ２＋＝４：１）の添加により１５°ｄＨに調節する。洗浄の後、布片を水道水によりフラッシュし、そして空気乾燥した。
試験材料に対する反射率（Ｒｖａｒｉａｎｔ）の測定を、Ｍａｃｂｅｔｈ ＣｏｌｏｒＥｙｅ ７０００分光計（Ｍａｃｂｅｔｈ， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｋｏｌｌｍｏｒｇｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、４６０ｎｍで行う。測定は、製造業者のプロトコールに従って行なわれる。
【０１９９】
ブランク値を決定するために、類似する洗浄実験を、酵素の添加を伴なわないで行う。反射率（Ｒｂｌａｎｋ）の続く測定を、上記に記載のようにして行う。
次に、対照実験を上記のようにして行い、ここで親酵素の洗浄性能が試験される。反射率（Ｒｐａｒｅｎｔ）の続く測定を、上記のようにして行う。
洗浄性能を、下記式に従って定義される性能因子（Ｐ）により評価する：
Ｐ＝（Ｒｖａｒｉａｎｔ−Ｒｂｌａｎｋ）−（Ｒｐａｒｅｎｔ−Ｒｂｌａｎｋ）
＝Ｒｖａｒｉａｎｔ−Ｒｐａｒｅｎｔ 。
【０２００】
例４．“卵−阻害アッセイ”
下記阻害アッセイは、試験されるサブチラーゼ変異体がペプチド−ｐＮＡ結合の加水分解を触媒し、それにより、便利には４０５ｎｍで追跡される黄色ｐＮＡを開放する原理に基づかれている。所定の期間の後、開放されるｐＮＡの量は、サブチラーゼ活性の直接的な尺度である。それぞれ、インヒビターを伴なって及びそれを伴なわないでそのような加水分解実験を行うことによって、一定のサブチラーゼ変異体が阻害される程度についての定量的尺度を得ることが可能である。
【０２０１】
反応条件：
酵素濃度：　 ０．０００３ｍｇ／ｍｌ
トリプシンインヒビタータイプＩＶ−０の濃度：０．００１５ｍｇ／ｍｌ
初期基質濃度：　　　 ０．８１ｍＭ
反応時間：　 １１分
アッセイ濃度 ２５℃
アッセイｐＨ　 ８．６
測定される吸光度　　 ４０５ｎｍ
【０２０２】
アッセイ溶液：
基質溶液（２ｍＭ）：５００ｍｇのＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡを、４ｍｌのＤＭＳＯ（２００ｍＭ）に溶解する。この溶液を、下記緩衝溶液により４倍に稀釈する。得られる基質溶液における基質の濃度は２ｍＭである。
インヒビター溶液（０．００５ｍｇ／ｍｌ）：５ｍｇのトリプシンインヒビタータイプＩＶ−０（Ｓｉｇｍａ Ｔ−１８８６）を水１０ｍｌに溶解する。この溶液を、下記緩衝溶液により１００倍に溶解する。得られるインヒビター溶液におけるインヒビターの濃度は０．００１ｍｇ／ｍｌである。
【０２０３】
緩衝溶液（ｐＨ８．６）：１５．７ｍｇのトリスを、適切な量の水に溶解し、そして０．７５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）のＢＲＩＪ（ＢＲＩＪ３５ポリオキシエチレンラウリルエーテル、３０％（ｗ／ｖ）、ＳｉｇｍａカタログＮｏ．４３０ＡＧ−６）を添加する。ｐＨを、４ＭのＮａＯＨにより８．６に調節し、そしてその溶液を水により１Ｌに稀釈した。
インヒビターを用いてのアッセイ：
１体積単位（例えば、８０μｌ）のインヒビター溶液を、適切な反応溶液（例えば、分光形セル又はマイクロタイタープレート）において、１体積単位（例えば、８０μｌ）の酵素溶液と共に混合し、そして２５℃で１５分間、平衡化した。１．３７５体積単位（例えば、１１０μｌ）の基質溶液を、反応容器に添加し、この後、４０５ｎｍでの吸光度を１１分間、追跡する（例えば、１０又は３０秒ごとに測定することにより）。吸光度曲線の傾斜を、線状回帰分析を用いて計算する。吸光度曲線の傾斜は、αｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして示される。
【０２０４】
インヒビターを用いないでのアッセイ：
１体積単位（例えば、８０μｌ）の緩衝液溶液を、適切な反応溶液（例えば、分光形セル又はマイクロタイタープレート）において、１体積単位（例えば、８０μｌ）の酵素溶液と共に混合し、そして２５℃で１５分間、平衡化した。１．３７５体積単位（例えば、１１０μｌ）の基質溶液を、反応容器に添加し、この後、４０５ｎｍでの吸光度を１１分間、追跡する（例えば、１０又は３０秒ごとに測定することにより）。吸光度曲線の傾斜を、線状回帰分析を用いて計算する。吸光度曲線の傾斜は、αとして示される。
【０２０５】
ブランク：
１体積単位（例えば、８０μｌ）のインヒビター溶液を、適切な反応溶液（例えば、分光形セル又はマイクロタイタープレート）において、１体積単位（例えば、８０μｌ）の酵素溶液と共に混合し、そして２５℃で１５分間、平衡化した。１．３７５体積単位（例えば、１１０μｌ）の基質溶液を、反応容器に添加し、この後、４０５ｎｍでの吸光度を１５分間、追跡する。それらの測定値は、計算には使用されないが、しかし酵素が緩衝液及び／又は基質溶液に添加されていない対照として単に作用する。
【０２０６】
残留活性（ＲＡ）の計算：
残留酵素活性（ＲＡ）を、下記式に従って計算する：
ＲＡ＝（αｉｎｈｉｂｉｔｏｒ／α）×１００％
上記試験を用いて、次の結果を得た：
【０２０７】
【表１７】
2004511228.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、上記ＧＡＰルーチンを用いてのスブチリシンＢＰＮ’（ａ）とＳａｖｉｎａｓｅ（商標）（ｂ） との間の一列整列を示す。
【国際公開パンフレット】
2004511228.tif 000021
2004511228.tif 000022
2004511228.tif 000023
2004511228.tif 000024
2004511228.tif 000025
2004511228.tif 000026
2004511228.tif 000027
2004511228.tif 000028
2004511228.tif 000029
2004511228.tif 000030
2004511228.tif 000031
2004511228.tif 000032
2004511228.tif 000033
2004511228.tif 000034
2004511228.tif 000035
2004511228.tif 000036
2004511228.tif 000037
2004511228.tif 000038
2004511228.tif 000039
2004511228.tif 000040
2004511228.tif 000041
2004511228.tif 000042
2004511228.tif 000043
2004511228.tif 000044
2004511228.tif 000045
2004511228.tif 000046
2004511228.tif 000047
2004511228.tif 000048
2004511228.tif 000049
2004511228.tif 000050
2004511228.tif 000051
2004511228.tif 000052
2004511228.tif 000053
2004511228.tif 000054
2004511228.tif 000055
2004511228.tif 000056
2004511228.tif 000057
2004511228.tif 000058
2004511228.tif 000059
2004511228.tif 000060
2004511228.tif 000061
2004511228.tif 000062
2004511228.tif 000063
2004511228.tif 000064
2004511228.tif 000065
2004511228.tif 000066
2004511228.tif 000067
2004511228.tif 000068
2004511228.tif 000069
2004511228.tif 000070
2004511228.tif 000071
2004511228.tif 000072
2004511228.tif 000073
2004511228.tif 000074
2004511228.tif 000075
2004511228.tif 000076
2004511228.tif 000077
2004511228.tif 000078
2004511228.tif 000079
2004511228.tif 000080
2004511228.tif 000081
2004511228.tif 000082
2004511228.tif 000083
2004511228.tif 000084
2004511228.tif 000085
2004511228.tif 000086
2004511228.tif 000087
2004511228.tif 000088
2004511228.tif 000089
2004511228.tif 000090
2004511228.tif 000091
2004511228.tif 000092
2004511228.tif 000093
2004511228.tif 000094
2004511228.tif 000095
2004511228.tif 000096
2004511228.tif 000097
2004511228.tif 000098
2004511228.tif 000099
2004511228.tif 000100
2004511228.tif 000101
2004511228.tif 000102
2004511228.tif 000103
2004511228.tif 000104
2004511228.tif 000105
2004511228.tif 000106
2004511228.tif 000107
2004511228.tif 000108
2004511228.tif 000109
【国際調査報告】
2004511228.tif 000110
2004511228.tif 000111
2004511228.tif 000112
2004511228.tif 000113