(57)【要約】本発明は、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの実用的な酵素的転換のための方法を提供する。これらの方法は、フコシル化オリゴサッカリドの合成において使用される反応物の効率的な合成のために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターであって、該核酸はエピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有する１つのサブユニットの原核生物酵素をコードし、該酵素はＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転換を触媒する、発現ベクター。
【請求項２】
前記核酸が、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＹＥＦ　Ｂポリペプチドと少なくとも６０％同一であるポリペプチドをコードする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記核酸が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記ポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ　ＹＥＦ　Ｂポリペプチドである、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記核酸が、ＹＥＦ　Ｂをコードする核酸に実質的に同一である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ｗｃａＨコード領域を欠く、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記プロモーターが誘導可能プロモーターである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記プロモーターが二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターである、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１１】
前記細胞が原核生物細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記細胞が透過される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１３】
ＧＤＰ−フコースを合成するための反応混合物であって、該反応混合物は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ、ならびにエピメラーゼおよびレダクターゼの両方の活性を有する１つのサブユニットの原核生物酵素を含み、ここで該原核生物酵素はＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転換を触媒し得る、反応混合物。
【請求項１４】
前記原核生物酵素がＥ．ｃｏｌｉ　ＹＥＦ　Ｂと実質的に同一である、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の反応混合物であって、ここで前記ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースが：
ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、およびＮＡＤＰ＋を含む反応混合物を提供する工程；ならびに
少なくとも約９０％の該ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへ転換するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程、
によって形成される、反応混合物。
【請求項１６】
請求項１３に記載の反応混合物であって、ここで前記原核生物酵素は、発現ベクターを含む細胞の溶解物として提供され、該発現ベクターは該原核生物酵素をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモーターを含む、反応混合物。
【請求項１７】
ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素的転換のための方法であって、該方法は以下：
ａ）ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ、およびＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を含む反応混合物を提供する工程であって、ここで該ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼが、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへ転換させる、工程；
ｃ）該ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースをＧＤＰ−フコースに転換するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程；
を包含し、
ここで該方法は、以下の方法：
ｄ）少なくとも約９０％の該ＧＤＰ−マンノースを、ｂ）を行う前に、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換するのに十分な時間、工程ａ）の該反応混合物をインキュベートする工程；または
ｅ）該ＧＤＰ−フコース由来のフコースを、
１）該反応混合物に、フコシルトランスフェラーゼおよびアクセプターサッカリドを添加する工程；および
２）該ＧＤＰ−フコース由来のフコースを、該アクセプターサッカリドに転移させるのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程、
によって該アクセプターサッカリドに転移させる工程、
の１つまたは両方によって、ＧＤＰ−フコースが媒介する該ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼのフィードバック阻害を減少させる工程を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、該方法は、工程ｂ）の反応混合物中に、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋を還元し得る酵素および該酵素の基質を含むことによって、産生されたＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋を、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨへのレダクターゼ活性によってそれぞれ再利用する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
前記酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼであり、そして前記基質がグルコースである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程がそれぞれ同じ反応容器中で行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記フコシルトランスフェラーゼおよび前記アクセプターサッカリドが、実質的にすべての前記ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースがＧＤＰ−フコースに転換される後に、工程ｂ）の産物に添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＤＰ−フコースが、前記フコシルトランスフェラーゼおよび前記アクセプターサッカリドを添加する工程に先立って精製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記フコシルトランスフェラーゼおよび前記アクセプターサッカリドが、工程ｂ）の実行とほぼ同時に、工程ａ）において産生された前記ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１７に記載の方法であって、ここで該方法は、工程ｅ）の前記反応混合物にホスファターゼを添加する工程をさらに含み、そして該ホスファターゼがＧＤＰ由来のリン酸を切断するが、ＮＡＤＰＨ由来のリン酸を切断しない、方法。
【請求項２６】
請求項１７に記載の方法であって、ここで該方法は、工程ｅ）の前記反応混合物にキナーゼおよびキナーゼの基質を添加する工程をさらに含み、そして前記ＧＤＰ−フコース由来のフコースの転移の結果として産生されたＧＤＰがＧＴＰに転換される、方法。
【請求項２７】
前記キナーゼが、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、およびアセチルキナーゼからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記キナーゼがピルビン酸キナーゼであり、そして前記キナーゼの基質がホスホエノールピルビン酸である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１７に記載の方法であって、前記アクセプターサッカリドが、Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−ＲおよびＧａｌβ（１−３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒからなる群から選択され、ここで、
Ｒは、水素、サッカリド、オリゴサッカリド、および少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基からなる群から選択され；そして
Ｒ’は、アセチルおよびアリルオキシカルボニルからなる群から選択される、方法。
【請求項３０】
前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記フコシルトランスフェラーゼが、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−Ｔ　ＩＩＩ）、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、細菌α１，３フコシルトランスフェラーゼ、α１，２フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記α１，３フコシルトランスフェラーゼが、Ｆｕｃ−Ｔ　ＩＶ、Ｆｕｃ−Ｔ　Ｖ、Ｆｕｃ−Ｔ　ＶＩ、およびＦｕｃ−Ｔ　ＶＩＩからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記α１，２フコシルトランスフェラーゼが、Ｆｕｃ−Ｔ　ＩおよびＦｕｃ−Ｔ　ＩＩからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
マンノースから前記ＧＤＰ−マンノースを生成するための酵素系をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法であって、ここでマンノースから前記ＧＤＰ−マンノースを生成するための前記酵素系が、以下：
マンノースをマンノース−６−リン酸へ転換する、ヘキソキナーゼ；
該マンノース−６−リン酸をマンノース−１−リン酸に転換する、ホスホマンノムターゼ；および
該マンノース−１−リン酸をＧＤＰ−マンノースに転換する、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ、
を含む、方法。
【請求項３７】
単一のポリペプチドがＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼ活性およびＧＤＰ−４−ケト−６−ガラクトースレダクターゼ活性の両方を提供する、請求項１７に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが原核生物酵素である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＹＥＦ　Ｂポリペプチドと実質的に同一である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記原核生物酵素がＥ．ｃｏｌｉ由来である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが真核生物由来のＦＸポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１７に記載の方法であって、ここで該方法は、反応の過程で失われた二価カチオンの一部を回復させるために、反応媒体に十分な該二価金属カチオンを添加する工程をさらに含み、それによって該反応媒体中の該二価金属カチオンの濃度を、約１ｍＭと約７５ｍＭとの間で達成するか、またはその濃度を維持し、そして前記酵素的転換の妨害なしで該二価金属カチオンの添加が生じる、方法。
【請求項４４】
フコシル化されたオリゴサッカリドの調製方法であって、該方法は、アクセプターサッカリドをフコシル化反応混合物と接触させる工程を含み、該フコシル化反応混合物は、ＧＤＰ−フコースおよび該ＧＤＰ−フコース由来のフコースを転移させて該フコシル化されたオリゴサッカリドを提供するフコシルトランスフェラーゼを含み、ここでフコシル化の効率は、以下：
１）以下によりＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素的転換によって該ＧＤＰ−フコースを形成する工程：
ａ）ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ、およびＮＡＤＰ＋を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）少なくとも約９０％の該ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへ転換するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程；
ｃ）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース　３，５−エピメラーゼ活性およびＧＤＰ−４−ケト−６−ガラクトースレダクターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを工程ｂ）の産物に添加する工程；ならびに
ｄ）該ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースをＧＤＰ−フコースに転換するのに十分な時間、該反応混合物をインキュベートする工程；
２）キナーゼおよびキナーゼの基質を、該フコシル化反応混合物に添加する工程であって、ここで該ＧＤＰ−フコース由来のフコースの転移の結果として産生されたＧＤＰが、ＧＴＰに転換される、工程；そして
３）可溶性の二価金属カチオンを含む反応媒体中でフコシル化を行う工程であって、ここで該媒体に、該二価金属カチオンの濃度を約２ｍＭと約７５ｍＭとの間に維持するために該可溶性二価金属カチオンを補充する、工程、
からなる群から選択される１つ以上の効率増強工程によって増強される、方法。
【請求項４５】
前記フコシルトランスフェラーゼが、少なくとも約９０％の前記ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースがＧＤＰ−フコースへ転換される後に、前記反応混合物に添加される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記フコシルトランスフェラーゼならびにＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼおよびＧＤＰ−４−ケト−６−ガラクトースレダクターゼを有するポリペプチドが、少なくとも約９０％の前記ＧＤＰ−マンノースがＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換される後に、前記反応混合物に添加される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
それぞれの前記反応工程が同じ反応容器中で行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４４に記載の方法であって、該方法は、工程ｃ）の前記反応混合物中に、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋を還元し得る酵素および該酵素の基質を含むことによって、産生されたＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋を、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨへのレダクターゼ活性によってそれぞれ再利用する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４９】
前記酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼであり、そして前記基質がグルコースである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４４に記載の方法であって、前記アクセプターサッカリドが、Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−ＲおよびＧａｌβ（１−３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒからなる群から選択され、ここで、
Ｒは、水素、サッカリド、オリゴサッカリド、および少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基からなる群から選択され；そして
Ｒ’は、アセチルおよびアリルオキシカルボニルからなる群から選択される、方法。
【請求項５２】
前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、ここで、前記アクセプターサッカリドが、シアル酸が化合物の非還元糖に転移される条件下で、シアル酸のＣＭＰ誘導体の存在下で、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼを使用して、化合物Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲまたはＧａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを、シアリルトランスフェラーゼを用いてシアル酸付加することによって形成される、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、ここで、前記化合物Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲまたはＧａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲが、式ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲまたはＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲの化合物を、前記化合物を形成するのに十分な条件下で、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、それぞれガラクトシル化することによって形成される、方法。
【請求項５５】
前記発現ベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｗｃａＩコード領域を欠く、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５６】
前記反応混合物が、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤ＋をＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨにそれぞれ還元し得る酵素および該酵素の基質をさらに含む、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項５７】
前記酵素がアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項５６に記載の反応混合物。
【請求項５８】
前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼであり、そして前記基質がグルコースである、請求項５７に記載の反応混合物。
【請求項５９】
前記反応混合物が、フコシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼのアクセプターサッカリドをさらに含む、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項６０】
ＧＤＰ由来のリン酸を切断し得るが、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ由来のリン酸を切断し得ないホスファターゼをさらに含む、請求項５９に記載の反応混合物。
【請求項６１】
キナーゼおよびキナーゼの基質をさらに含む、請求項５９に記載の反応混合物。
【請求項６２】
前記キナーゼが、ピルビン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、クレアチンキナーゼ、およびアセチルキナーゼからなる群から選択される、請求項６１に記載の反応混合物。
【請求項６３】
前記キナーゼがピルビン酸キナーゼであり、そして前記キナーゼの基質がホスホエノールピルビン酸である、請求項６２に記載の反応混合物。
【請求項６４】
請求項５９に記載の反応混合物であって、前記アクセプターサッカリドが、Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−ＲおよびＧａｌβ（１−３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒからなる群から選択され、ここで、
Ｒは、水素、サッカリド、オリゴサッカリド、および少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基からなる群から選択され；そして
Ｒ’は、アセチルおよびアリルオキシカルボニルからなる群から選択される、反応混合物。
【請求項６５】
前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項６４に記載の反応混合物。
【請求項６６】
前記アクセプターサッカリドがＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβ（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲからなる群から選択される、請求項６５に記載の反応混合物。
【請求項６７】
前記フコシルトランスフェラーゼが、α１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（Ｆｕｃ−Ｔ　ＩＩＩ）、α１，３フコシルトランスフェラーゼ、およびα１，２フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される、請求項５９に記載の反応混合物。
【請求項６８】
マンノースから前記ＧＤＰ−マンノースを生成するための酵素系をさらに含む、請求項１５に記載の反応混合物。
【請求項６９】
請求項６８に記載の反応混合物であって、ここで前記ＧＤＰ−マンノースを生成するための前記酵素系が、以下：
マンノースをマンノース−６−リン酸へ転換する、ヘキソキナーゼ；
該マンノース−６−リン酸をマンノース−１−リン酸に転換する、ホスホマンノムターゼ；および
該マンノース−１−リン酸をＧＤＰ−マンノースに転換する、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ、
を含む、反応混合物。
【請求項７０】
前記反応混合物が、約１ｍＭと約７５ｍＭとの間の濃度の二価金属カチオンを含む、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項７１】
請求項７０に記載の反応混合物であって、ここで、反応の過程の間に失われた前記二価カチオンの一部を回復させるために、十分な二価金属カチオンが該反応混合物に添加されて、それによって該反応混合物中の該二価金属カチオンの濃度を、約１ｍＭ〜約７５ｍＭの間を達成するか、またはその濃度を維持し、そして二価金属カチオンの添加は、酵素反応の妨害なしで進行する、反応混合物。
【請求項７２】
ａ）の前記反応混合物が、ｂ）を行う前に、少なくとも約９０％の前記ＧＤＰ−マンノースを、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換するのに十分な時間インキュベートされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項７３】
ａ）およびｂ）が同時に行われる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、オリゴサッカリドの合成に関する。特に、これは改善されたＧＤＰ−フコースの酵素合成に関し、これはフコシル化反応において使用され得る。この方法は、容易に利用可能な出発物質を使用して、単一の容器における複合フコシル化オリゴサッカリドの合成を可能にする。
【０００２】
（背景）
細胞表面上の認識エレメントとしての炭水化物の役割の理解の増大は、規定の構造の炭水化物分子を生成することの目的を増加させた。例えば、シアリルルイスリガンド、シアリルルイスｘおよびシアリルルイスａを含む化合物は、レセプター（例えば、ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ　１４０レセプター）と結合する白血球細胞株および非白血球細胞株に存在する。Ｐｏｌｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８８：６２２４（１９９１）およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０：１１３０（１９９０）、またＵＳＳＮ　０８／０６３，１８１を参照のこと。
【０００３】
所望の炭水化物の構造を生成する目的のために、グリコシルトランスフェラーゼおよび炭水化物の酵素触媒合成におけるそれらの役割は、現在広く研究されている。これらの酵素は、高度な特異性を示し、そして規定された配列の炭水化物の構造を形成するのに有用である。従って、グリコシルトランスフェラーゼは、治療目的および他の目的で使用される多くの炭水化物の合成において、酵素の触媒として、ますます使用されている。
【０００４】
合成炭水化物化学の分野への酵素の応用において、炭水化物の酵素的合成のためのグリコシルトランスフェラーゼの使用は、この酵素によって提供される実質的に完全な立体選択性および結合特異性に起因して、化学的方法に対して利点を提供する（Ｉｔｏら、Ｐｕｒｅ　Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，６５：７５３（１９９３）；および米国特許第５，３５２，６７０号および同第５，３７４，５４１号）。しかし、炭水化物化合物の商業的規模での生産は、この炭水化物の酵素的および化学的合成において使用される反応物を入手する際の費用および困難性によって、しばしば複雑である。
【０００５】
炭水化物化合物の酵素的合成のための改善された方法およびこれらの合成において使用される前駆物質は、多くの有益な化合物の生成を促進する。本発明は、これらの必要性および他の必要性を満たす。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、フコシル化オリゴサッカリドの効率的な生産のために有用である方法、発現ベクター、および反応混合物を提供する。本発明は、ヌクレオチド糖（例えば、ＧＤＰ−フコース）が比較的安価で形成され得る方法を提供する。
【０００７】
第１の実施態様において、本発明は、エピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有する原核生物性酵素をコードする核酸に、作動可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターを提供する。これらの２つの活性は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転換を触媒する。
【０００８】
別の実施態様において、本発明は、ＧＤＰ−フコースを合成するための反応混合物を提供する。この反応混合物は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ、およびエピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有する原核生物性酵素を含む。原核生物性酵素は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転換を触媒し得る酵素である。現在好ましい実施態様において、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースは、以下によって形成される：ａ）ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、およびＮＡＤＰ＋を含む反応混合物の提供；ならびにｂ）少なくとも約９０％のＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへ転換するのに十分な時間での反応混合物のインキュベート。
【０００９】
本発明の別の実施態様は、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素的転換のための方法を提供する。これらの方法は、以下：
ａ）ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、およびＮＡＤＰ＋を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）少なくとも約９０％のＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへ転換するのに十分な時間で反応混合物をインキュベートする工程；
ｃ）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼ活性およびＧＤＰ−４−ケト−６−ガラクトースレダクターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドを、反応混合物に添加する工程；ならびに、
ｄ）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースをＧＤＰ−フコースへ転換するのに十分な時間で、反応混合物をインキュベートする工程、を包含する。
【００１０】
フコシル化オリゴサッカリドの酵素的合成のための方法がまた、提供される。これらの方法は、本発明の方法によって生成されるＧＤＰ−フコースからフコースをアクセプターサッカリドへ転移させる工程を包含する。これは、以下のさらなる工程によって達成され得る：ｅ）フコシルトランスフェラーゼおよびアクセプターサッカリドを、工程ｂ）において生成されるＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに添加するか、または工程ｄ）において生成されるＧＤＰ−フコースに添加する工程；ならびにｆ）フコースを、ＧＤＰ−フコースからアクセプターサッカリドへ転移するのに十分な時間で反応混合物をインキュベートする工程。
【００１１】
さらなる実施態様は、マンノースから出発してＧＤＰ−フコースを生成し得る方法を提供する。これらの方法は、マンノースをＧＤＰ−マンノースに転換するための酵素系の使用を含み、次いでこれは、上記の方法を用いてＧＤＰ−フコースに転換される。マンノースのＧＤＰ−マンノースへの転換には、以下の酵素が関与する：ヘキソキナーゼ（これは、マンノースをマンノース−６−リン酸に転換する）；ホスホマンノムターゼ（これは、マンノース−６−リン酸をマンノース−１−リン酸に転換する）；およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ（これは、マンノース−１−リン酸をＧＤＰ−マンノースに転換する）。
【００１２】
本発明はまた、効率を高めた工程が使用される、フコシル化オリゴサッカリドの合成方法を提供する。この方法は、アクセプターサッカリドを、ＧＤＰ−フコースおよびフコシルトランスフェラーゼ（これは、フコースを、ＧＤＰ−フコースから転移させて上記フコシル化オリゴサッカリドを提供する）を含むフコシル化反応混合物に接触させる工程を包含する。ここで、上記フコシル化の効率は、以下からなる群より選択される、効率を高める１つ以上の工程によって高められる：
１）以下のＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素的転換により、上記ＧＤＰ−フコースを形成する工程：
ａ）ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ、およびＮＡＤＰ＋を含む反応混合物の提供；
ｂ）少なくとも約９０％のＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへ転換するのに十分な時間での、反応混合物のインキュベート；
ｃ）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース３，５−エピメラーゼ活性およびＧＤＰ−４−ケト−６−ガラクトースレダクターゼ活性を有する１つ以上のポリペプチドの、工程ｂ）の産物への添加；ならびに、
ｄ）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースをＧＤＰ−フコースへ転換するのに十分な時間での、反応混合物のインキュベート；
２）ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼの基質を、フコシル化反応混合物に添加する工程であって、ここで、ＧＤＰ−フコースからのフコースの転移の結果生成したＧＤＰは、ＧＴＰに転換される、工程；ならびに
３）可溶性の２価の金属陽イオンを含む反応媒体においてフコシル化を行う工程であって、ここで、前記媒体には、前記２価の金属陽イオンの濃度を約２ｍＭと約７５ｍＭとの間で維持するために、前記可溶性の２価の金属陽イオンが補充される、工程。
【００１３】
（詳細な説明）
（定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（１９９４）Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版、Ｊｈｏｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）は、本発明において使用される用語の多くを有する一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書中に記載されるものと類似したまたは同等の、任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を記載する。本発明の目的のために、以下の用語を下のように定義する。
【００１４】
炭水化物化合物に対する以下の略語を、本明細書中で使用する：
Ａｒａ　　　＝アラビノシル；
Ｆｒｕ　　　＝フルクトシル；
Ｆｕｃ　　　＝フコシル；
Ｇａｌ　　　＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ　　　＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；
Ｍａｎ　　　＝マンノシル；および
Ｓｉａ（ＮｅｕＡｃ）＝シアリル（代表的にはＮ−アセチルノイラミニル）。
【００１５】
オリゴサッカリドが、還元末端で実際に還元糖であろうとなかろうと、このオリゴサッカリドは、還元末端および非還元末端を有すると見なされる。認められた命名法に従って、オリゴサッカライドは、本明細書で、左に非還元末端、および右に還元末端というように示される。本明細書中に記載される全てのオリゴサッカリドは、非還元型サッカリドの名前または略語（例えば、Ｇａｌ）、続いて、グリコシド結合（αまたはβ）の立体配置、環の結合、結合に関与する還元型サッカリドの環の位置、次いで、還元型サッカリドの名前または略語（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）で記載される。２つの糖の間の結合は、例えば、２，３、２→３、または（２，３）と、表わされ得る。各サッカリドは、ピラノースである。
【００１６】
用語「シアル酸」とは、炭素が９個の、カルボシキル化された糖のファミリーの任意のメンバーをいう。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸（しばしば、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡとして省略される）である。このファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化された、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーのメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソニック酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９）。９−置換型シアル酸（例えば、９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ１〜Ｃ６アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ）もまた、含まれる。シアル酸ファミリーの概要については、例えば、Ｖａｒｋｉ（１９９２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ　２：２５−４０；Ｓｉａｌｉｃ　Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｔｅｒ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２））を参照のこと。シアリル化手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、国際出願ＷＯ　９２／１６６４０（１９９２年１０月１日に公開）に開示される。
【００１７】
用語「核酸」とは、一本鎖型または二本鎖型のいずれかの状態である、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーをいう。そしてこれは、他に限定されない限り、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式において核酸とハイブリダイズする、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む。他に示されない限り、特定の核酸配列は、それらの相補的配列を含む。
【００１８】
用語「作動可能に連結される」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位の配置）と第２の核酸配列との間の機能的結合をいう。ここで、その発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。
【００１９】
用語「組換え」とは、細胞に関して使用される場合、その細胞が異種の核酸を複製するか、または異種の核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内に見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、天然型の細胞に見出される遺伝子を含み得、ここで、この遺伝子は人工的な手段によって改変され、そして再び細胞に導入される。この用語はまた、細胞から核酸を除去せずに改変されている細胞に対して内因性の核酸を含む細胞も含む；このような改変は、遺伝子の置換、部位特異的変異、および関連技術によって得られたものも含む。「組換えポリペプチド」とは、組換え細胞によって産生されるポリペプチドである。
【００２０】
「組換え発現カセット」または単に「発現カセット」は、組換え的にまたは合成的に生成され、このような制御エレメントに適合する宿主における構造遺伝子の発現をもたらし得る核酸エレメントを有する核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーターを含み、そして必要に応じて、転写終止シグナルを含む。代表的には、組換え発現カセットは、転写される核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびその核酸に作動可能に連結されるプロモーター（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０５２８；国際公開第ＷＯ　９８２０１１１号に記載される、ｔａｃプロモーター成分およびｇａｌプロモーター成分を含むデュアルプロモーター）を含む。発現をもたらすのに必要なまたは有益なさらなる因子はまた、本明細書中に記載されるように使用され得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞から発現されたタンパク質の分泌を指向するシグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。転写終止シグナル、エンハンサー、および遺伝子の発現に影響を与える他の核酸配列もまた、発現カセットに含まれ得る。
【００２１】
本明細書において用いられる「異種の配列」または「異種の核酸」は、特定の宿主細胞に対して外来の供給源から（例えば、異なる種から）もたらされるものであるか、または同じ供給源からの場合は、その元来の形態から改変されている。従って、プロモーターに作動可能に連結された異種の核酸は、このプロモーターが由来するものと異なる供給源からであるか、または同じ供給源からである場合は、その元来の形態から改変されている。例えば、ＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ遺伝子プロモーターは、天然のＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ以外のポリペプチドをコードする構造遺伝子と連結され得る。ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰフコースへの転換に関連する酵素をコードする異種の遺伝子（例えば、原核生物宿主細胞における）は、改変された特定の宿主細胞に内在する遺伝子を含む。異種の核酸の改変は、例えば、プロモーターに作動可能に連結され得るＤＮＡフラグメントを作製するためにＤＮＡを制限酵素で処理することにより起こり得る。部位指向性の変異誘発のような技術はまた、異種の核酸を改変するために有用である。
【００２２】
「サブ配列」は、それぞれ、核酸またはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）のより長い配列の一部を含む核酸またはアミノ酸の配列をいう。
【００２３】
用語「単離された」は、通常、核酸、ポリペプチドまたはその天然の状態において見られるような他の分子を伴う構成成分を、実質的にまたは本質的に有さない物質をいうことを意図する。代表的には、単離された分子は、例えば、銀染色したゲルでのバンド強度または純度を決定するための他の方法により測定された場合、少なくとも約８０％純粋、通常、少なくとも約９０％、そして好ましくは少なくとも約９５％純粋である。タンパク質の純度または同質性は、当該分野で周知の多くの手段（例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに続く染色による可視化）により示され得る。特定の目的のために、高い分解能が必要であり、そしてＨＰＬＣまたは精製のための類似の手段が利用される。
【００２４】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列についての用語「同一な」または「同一性」パーセントは、同じである、または、以下の配列比較アルゴリズムの１つをもちいるかもしくは視覚的検査によって測定した場合に、最大一致について比較し、そして整列させた場合に、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列またはサブ配列をいう。
【００２５】
２つの核酸またはポリペプチドについての句「実質的に同一な」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つをもちいるかもしくは視覚的検査によって測定した場合に、最大一致について比較し、そして整列させた場合に、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列またはサブ配列をいう。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基長、より好ましくは少なくとも約１００残基の領域にわたって、そして最も好ましくは、配列が少なくとも約１５０残基にわたって実質的に同一である配列の領域にわたって存在する。最も好ましい実施態様では、この配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００２６】
配列比較のために、代表的に、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列は、コンピューターにインプットされ、必要ならば、サブ配列の座標が設定され、そして配列アルゴリズムのプログラムパラメーターが設定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、設定されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列と比較して、試験配列についての配列同一性パーセントを算出する。
【００２７】
比較のための配列の最適整列は、例えば、以下によって行われ得る：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性整列アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性方法についての検索（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８））、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、５７５　科学博士、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または視覚的検査（一般には、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．との間の合併事業（１９９５補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）。
【００２８】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｅｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムは、問い合わせ配列における長さＷのショートワードを同定することにより高スコアの配列対（ＨＳＰ）の第１同定を含む。この問い合わせ配列は、データベース配列における同じ長さのワードと整列した場合、いくつかの陽性値の閾値スコアＴに適合するかまたは満足させるかのいずれかである。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを見出す探索を開始するためのシードとして作用する。次いで、このワードヒットは、累積的な整列スコアが増加し得る限りは、それぞれの配列にそって両方の方向へ伸長する。累積的スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（適合残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）およびパラメーターＮ（不適合残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアするマトリックスは、累積的スコアを算出するために用いられる。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合、停止される：累積的整列スコアが、その最大到達値からＸの量まで低下する場合；累積的スコアが、１つ以上の陰性スコアの残基整列の蓄積により、ゼロ以下になる場合；またはそれぞれの配列の末端に達する場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感受性および整列の速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列についての）は、初期値としてワード長（Ｗ）は１１、期待値（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、ワード長（Ｗ）は、３、期待値（Ｅ）は、１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックスを用いる（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。
【００２９】
配列同一性パーセントを算出することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の測定の１つは、最小和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ　ｓｕｍ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ：Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の適合が偶然に生じる確立の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小和確率が約０．１未満、より好ましくは、約０．０１未満、そして最も好ましくは、約０．００１未満の場合、参照配列に類似であるとみなす。
【００３０】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるというさらなる指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、下記のように、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。従って、代表的には、ポリペプチドは実質的に第２のポリペプチド（例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる）と同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子が、下記のように、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【００３１】
句「特異的にハイブリダイズする」は、配列がＤＮＡまたはＲＮＡの複合混合物（例えば、全細胞）に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、特定のヌクレオチド配列に対してのみ分子が結合、２重鎖化、またはハイブリダイズすることをいう。
【００３２】
用語「ストリンジェントな条件」は、プローブがその標的配列にはハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境では異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨで、特定の配列についての融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。（標的配列は、一般的に過剰に存在するので、Ｔｍで、プローブの５０％は、平衡状態で占領される）。代表的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のＮａイオン、代表的には、約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）、ｐＨ７．０〜８．３であり、そして、温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化薬剤の添加でも達成され得る。
【００３３】
抗体に対していう場合の句「タンパク質に特異的に結合する」または「特異的に免疫応答する」は、タンパク質および他の生物製剤の異種の集団の存在下での、タンパク質の存在の限定的な結合反応をいう。従って、指定された免疫アッセイ条件下で、特定化された抗体は、特定のタンパク質に優先的に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に対して有意な量は結合しない。このような条件下でのタンパク質への特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とする。種々の免疫アッセイの形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために用いられ得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質と特異的に免疫応答するモノクローナル抗体を選択するために慣用的に用いられる。特異的な免疫応答性を決定するために用いられ得る免疫アッセイの形式および条件の詳細については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと。
【００３４】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に改変された改変体」は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをいい、またはポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列をいう。遺伝的コードの同義性により、多数の機能的に同一の核酸が任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧコドンは、すべてアミノ酸アルギニンをコードする。従って、アルギニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、このコドンは、コードするポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれとも変更され得る。このような核酸の改変体は、「サイレントな改変体」であり、「保存的に改変された改変体」の１種である。ポリペプチドをコードする、本明細書において記載されたあらゆるポリヌクレオチド配列はまた、他に注記する場合を除いて、あらゆる可能性のあるサイレント改変体を記載する。当業者は、核酸におけるそれぞれのコドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧを除いて）が改変され、標準的な技術によって機能的に同一な分子を生成し得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の「サイレントな改変体」のそれぞれが、それぞれの記載された配列において意図される。
【００３５】
さらに、当業者は、コードされた配列において単一のアミノ酸またはアミノ酸のわずかなパーセンテージ（代表的には、５％未満、より代表的には１％未満）を変化、付加または欠失する、個々の置換、欠失または付加は、変更が化学的に同様のアミノ酸でのアミノ酸置換を生じる場合に、「保存的に改変された改変体」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野において周知である。
【００３６】
当業者は、ＧＤＰ−フコース合成酵素および酵素をコードする核酸の多くの保存的改変体が本質的に同一の産物を産生することを理解する。例えば、遺伝コードの同義性によって、「サイレントな置換」（すなわち、コードされたポリペプチドにおいて変化を生じない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードするあらゆる核酸配列を意味する特徴である。本明細書において記載されたように、配列は、好ましくは酵素を産生するために用いられる特定の宿主細胞（例えば、酵母、ヒトなど）における発現のために最適化される。同様に、アミノ酸配列における１または数個のアミノ酸の「保存的なアミノ酸置換」は、高度に類似の特性を有する異なるアミノ酸で置換され、またこれは、特定のアミノ酸配列または、アミノ酸をコードする特定の核酸配列に高度に類似である場合、容易に確認される。このような保存的に置換された改変体の任意の特定の配列は、本明細書の特徴である。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙもまた参照のこと。さらに、コードされた配列において、単一のアミノ酸またはアミノ酸のわずかなパーセンテージを変化する、負荷するまたは欠失する、個々の置換、欠失または付加もまた、「保存的に改変された改変体」である。
【００３７】
（好ましい実施態様の詳細）
本発明は、フコシル化された炭水化物の化合物の合成において有用であるヌクレオチド糖（例えば、ＧＤＰ−フコース）のような基質の効果的な産生のための方法および反応混合物を提供する。これらの方法において用いられる酵素の産生のための発現ベクターもまた提供される。これらの酵素を用いる方法およびフコシル化されたオリゴ糖を産生するためにヌクレオチド糖を産生するための方法がまた本発明によって提供される。
【００３８】
本発明の方法は、フコシル化のための以前に利用可能な方法を超える有意な利点を提供する。例えば、この方法は、より低コストのＧＤＰ−マンノースから開始するか、またはマンノースから開始してさえ高価な化合物であるＧＤＰ−フコースを作製するための比較的安価な手段を提供する。本発明は、ＧＤＰ−フコース合成の有効性、また引き続くフルコシルトランスフェラーゼ反応の有効性が改善され得る方法を提供する。本発明の方法は、所望のフルコシル化化合物の高い収率を提供する。従って、本発明の方法は、フコシル化化合物の商業的規模の産生のために十分適しており、この化合物には、診断的使用、および治療的使用、食品などのために有用であるものを含む。
【００３９】
（Ａ．ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−フコースへの転換のために有用な酵素をコードする核酸のクローニングおよび発現）
本発明は、第１の実施態様において、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−フコースへの転換のために有用である酵素を産生するための方法を提供する。この生合成経路（図１に図示されている）は、３つの酵素的な活性を含む。第１の酵素、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ（脱水酵素）は、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−４−ケト−６−Ｄ−デオキシマンノースへの転換を触媒する。次いで、この産物は、ＧＤＰ−４−ケト−６−Ｌ−デオキシガラクトースにエピマー化され、次に４’レダクターゼによってＧＤＰ−Ｌ−フコースに還元される。後の２つの酵素活性（エピメラーゼおよびレダクターゼ）は、両方ともヒトＦｘタンパク質に見られる（Ｔｏｎｅｔｔｉら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７２７４〜２７２７９；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５８７６６）。
【００４０】
しかし、商業的規模の酵素合成反応での使用のためには、原核生物で容易に産生される酵素を用いることが好ましい。これは、哺乳動物細胞より大規模で増やすためにかなり容易であり、かつより有効である。哺乳動物の酵素は、しばしば、哺乳動物の酵素のための遺伝子が原核生物の宿主細胞に挿入される場合、高い収率で適切な形態では発現されない。従って、エピマー化および還元を触媒するために原核生物の酵素を獲得することは大きな関心であった。しかし、本発明の前には、ＧＤＰ−フコース合成のための細菌系が、ＧＤＰ−４−ケト−６−Ｄ−デオキシマンノースからＧＤＰ−フコースへのエピマー化および還元を触媒するために１つまたは２つの別のポリペプチドを必要とするのか否かは公知ではなかった。本発明は、１つの酵素がこれらの両方の活性を触媒することを実証するこの不足している情報を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、この酵素は、ＹＥＦ　Ｂと名付けられる。２つの活性を触媒するためにわずか１つの酵素を産生することの必要は、ＧＤＰ−フコース産生の開発および規模の増大を単純化する。
【００４１】
従って、本発明は、ＧＤＰ−フコース産生のために有用である酵素の組換え産生のための方法およびベクターを提供する。ポリペプチドの組換え産生は、一般に、所望のように改変された特定の酵素をコードするＤＮＡ配列の獲得の工程、特定のプロモーターの制御下の発現カセットにＤＮＡを配置する工程、宿主においてタンパク質を発現する工程、発現されたタンパク質を単離する工程、および必要に応じて、タンパク質を再生する工程を含む。複数の酵素が、同じ宿主細胞で（この細胞に存在する同じ発現ベクター上かまたは複数の発現ベクター上のいずれかで）発現され得る。
【００４２】
１つの実施態様では、本発明は、宿主細胞におけるＧＤＰ−フコース合成に関与する酵素を産生するための方法において有用な発現ベクターを提供する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＹＥＦ　Ｂを発現するために有用である発現ベクターが提供される。これは、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのエピマー化および還元の両方を触媒し、ＧＤＰ−フコースを得る。この発現ベクターはまた、関連の酵素、特に、２重のエピメラーゼ／レダクターゼ活性も有する他の原核生物からの酵素を発現し得る。
【００４３】
（１．エピメラーゼ／レダクターゼコード核酸）
本発明の発現ベクターは、ＧＤＰ−４−ケト−６−Ｄ−デオキシマンノースエピメラーゼ活性およびＧＤＰ−４−ケト−６−Ｌ−デオキシガラクトースレダクターゼ活性の両方を有する酵素をコードする核酸を含む。原核生物の酵素は、現在、好ましい実施態様において核酸によりコードされる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉを含む任意の原核生物種由来の原核生物エピメラーゼ／レダクターゼをコードする核酸を用い得る。この酵素は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＹＥＦ　Ｂポリペプチドに実質的に同一であり得る。ある実施態様では、発現ベクターは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するエピメラーゼ／レダクターゼ酵素をコードする核酸を含む。この核酸はまた、Ｅ．ｃｏｌｉのＹＥＦ　Ｂ酵素のような天然のエピメラーゼ／レダクターゼ酵素のアミノ酸配列と比較して保存的なアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードし得る。代表的には、本発明の発現ベクターにおいて用いられる核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３８４７３（ヌクレオチド１０７４８〜１１２３０）に示されるＥ．ｃｏｌｉのＹＥＦ　Ｂコード領域の核酸配列と少なくとも約７５％同一である。より好ましくは、この発現ベクターに用いられる核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉのＹＥＦ　Ｂコード領域と少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは、少なくとも約９５％同一である。代表的には、ＢＬＡＳＴのようなコンピューター化されたアルゴリズムは、好ましくは初期値パラメーターを用いて、比較のために用いられる。これらの同一性パーセンテージは、コード領域全体に対する全般的な値であり得るか、またはコード領域の特定の領域にわたる同一性パーセンテージを指し得る。例えば、現在、好ましい実施態様において、本発明の発現ベクターに用いられる核酸は、対になったＢＬＡＳＴアルゴリズム（以下のパラメーターを用いてＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより実行されるようなＢＬＡＳＴＩＮ２．０．６：マッチ：１；ミスマッチ：−２、ギャップオープン：５；ギャップエクステンション：２、ｘ−ドロップオフ：５０；期待：１０．００；ワードサイズ：１１；フィルタリングなし）を用いて、少なくとも４０ヌクレオチド長の領域にわたるＥ．ｃｏｌｉのＹＥＦ　Ｂコード核酸に少なくとも約８５％同一である。
【００４４】
エピメラーゼ／レダクターゼ酵素をコードする核酸は、当業者に公知の方法を使用して得られ得る。適切な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノム、またはサブ配列（プローブ））はクローン化され得るか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自己持続性配列複製系（ＳＳＲ）のようなインビトロの方法により増幅され得る。広範な種々のクローニングおよびインビトロでの増幅の方法論は、当業者に周知である。多くのクローニングの経験を経た当業者に教示するのに十分な、これらの技術および教示の例は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１５２　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版）第１〜３巻、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）；Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の共同事業（１９９４　補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎら、米国特許第５，０１７，４７８号；およびＣａｒｒ、欧州特許第０，２４６，８６４号に見出される。インビトロでの増幅の方法を経た当業者に教示するのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら、（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２；ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；ＡｒｎｈｅｉｍおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年、１０月１日）Ｃ＆ＥＮ　３６−４７；Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ　ＮＩＨ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７、１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ　Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ　４：５６０；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ　８９：１１７に見出される。インビトロで増幅された核酸をクローニングする改良された方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。
【００４５】
エピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有する酵素をコードする核酸、またはこれらの核酸のサブ配列は、上記に記載されるような任意の適切な方法（例えば、適切な配列のクローニングおよび制限を含む）により調整され得る。例として、１つは、慣用的なクローニング方法によりエピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有するポリペプチドをコードする核酸を獲得し得る。両方の活性を有することが公知の酵素（例えば、ＹＥＦ　Ｂ酵素）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡサンプル中の適切な酵素をコードする遺伝子に、または全ＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ（例えば、サザンブロットまたはノザンブロットにおける）を提供するために使用され得る。適切な配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の配列データベースにおいて提供される。
【００４６】
プローブとしての使用、または本発明の発現ベクターにおける使用のための１つの適切なヌクレオチド配列は、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４８８５−４８９３に記載されるようなＧＤＰ−フコース合成酵素をコードするＥ．ｃｏｌｉ遺伝子クラスター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３８４７３）に見出される。この遺伝子クラスターは、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼのオープンリーディングフレーム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３８４７３におけるヌクレオチド８６５９−９７８０）を含むことが報告されている。出願人は、この遺伝子クラスターがまた、３，５エピマー化活性および４−レダクターゼ活性の両方を有する酵素をコードするオープンリーディングフレームを含み（図１）、従って、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ反応の産物（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース）をＧＤＰ−フコースへ転換し得ることを発見した。このＯＲＦ（ＹＥＦ　Ｂ、ｗｃａＧ、およびｆｃｌと命名された）は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３８４７３のヌクレオチド９７８３−１０７４８に見出される。ＹＥＦ　Ｂが２つの活性を有する酵素をコードするという出願人の発見より前に、原核生物によるＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転換に１つまたは２つの酵素が必要とされるか否かは公知ではなかった。
【００４７】
Ｅ．ｃｏｌｉ由来の遺伝子クラスターは、ｗｃａＨと命名される、さらなるＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３８４７３のヌクレオチド１０７４８−１１２３０）を含む。１５ｋｄのＧＤＰ−マンノースマンノシルヒドロラーゼをコードする、この小さいオープンリーディングフレームは、ＹＥＦ　Ｂコード領域（ｗｃａＧと命名される）のすぐ下流に位置される。各々のこれらの酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−フコースを形成する能力により評価されたように、細菌内で発現された。
【００４８】
標的のエピメラーゼ／レダクターゼの核酸は一旦同定されると、当業者に公知の標準的な方法に従って、それらは単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻：Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００４９】
原核生物エピメラーゼ／レダクターゼをコードする核酸はまた、その発現された産物を物理的、化学的、または免疫学的特性に基づくアッセイにより検出することによってクローン化され得る。例えば、クローン化されたエピメラーゼ／レダクターゼをコードする核酸を、その核酸によりコードされるポリペプチドの、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのＧＤＰ−フコースへの転換を触媒する能力により同定し得る。好ましい方法において、逆相ＨＰＬＣを使用して、種々の反応時間で、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、および必要に応じて、１以上の中間体（例えば、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースおよびＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシガラクトース）の量を決定する。適切なアッセイの条件は、本実施例に記載される。
【００５０】
１つの実施態様において、エピメラーゼ／レダクターゼをコードする核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなＤＮＡ増幅方法を使用してクローン化され得る。従って、例えば、核酸配列またはサブ配列は、１つの制限部位（例えば、ＸｂａＩ）を含むセンスプライマーおよび別の制限部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）を含むアンチセンスプライマーを使用してＰＣＲ増幅される。これは、所望のエピメラーゼ／レダクターゼアミノ酸配列またはサブ配列をコードし、そして末端制限部位を有する核酸を生成する。次いで、この核酸は、第二の分子をコードする核酸を含み、そして適切な対応する制限部位を有するベクター内に容易に連結され得る。適切なＰＣＲプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋまたは他の供給源に提供される配列情報を使用して当業者により決定され得る。適切な制限部位はまた、エピメラーゼ／レダクターゼまたはアミノ酸サブ配列をコードする核酸に、部位特異的変異誘発により付加され得る。エピメラーゼ／レダクターゼをコードするヌクレオチド配列またはサブ配列を含むプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて切断され、次いで、標準的な方法に従って、増幅および／または発現のための適切なベクター内に連結される。
【００５１】
ＧＤＰ−フコース合成酵素の増幅に適切である、適切なプライマーの例は表１に示される；各プライマー対は、５’ＸｂａＩ制限部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を増幅フラグメントに提供するよう設計される。酵素コード配列またはサブ配列を含むプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて切断され、次いで、標準的な方法に従って、増幅および／または発現のための適切なベクター内に連結される。
【００５２】
【表１】
2004512002.tif 000002
エピメラーゼ／レダクターゼをコードする核酸をクローニングする代替的なものとして、適切な核酸は、ＹＥＦ　Ｂポリペプチドまたは、エピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有する関連する酵素をコードする公知の配列から、化学合成され得る。直接的な化学合成方法は、たとえば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９；のホスホトリエステル方法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２のジエチルホスホロアミダイト（ｄｉｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）方法：１８５９−１８６２；および米国特許第４，４５８，０６６の固体支持体方法を含む。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的配列でのハイブリダイゼーションによるか、またはその一本鎖を鋳型として使用するＤＮＡポリメラーゼを用いるポリマー化により、二本鎖ＤＮＡに転換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成が、しばしば、約１００塩基の配列に制限されるが、より長い配列がより短い配列の連結により得られ得ることを認識する。あるいは、サブ配列はクローン化され得、そして適切なサブ配列は、適切な制限酵素を使用して切断され得る。次いで、そのフラグメントは、所望のＤＮＡ配列を生成するために連結され得る。
【００５３】
ＧＤＰ−フコース合成酵素をコードする核酸は、物理的、化学的、または免疫学的特性に基づくアッセイにより検出することによって同定され得る。例えば、クローン化されたＧＤＰ−フコース合成の核酸を、その核酸によりコードされるポリペプチドの、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの転換を触媒する能力により同定し得る。特定の核酸から発現されるポリペプチドの他の物理的特性は、公知のＹＥＦ　Ｂ様ポリペプチドの特性と比較され、エピメラーゼ／レダクターゼをコードする核酸を同定する別の方法を提供し得る。あるいは、推定エピメラーゼ／レダクターゼ遺伝子は、変異され得、そしてＧＤＰ−フコースを生成する能力における変化を検出することにより、エピメラーゼ／レダクターゼとしてのその役割が確証され得る。
【００５４】
いくつかの実施態様において、エピメラーゼ／レダクターゼをコードする核酸の改変が所望され得る。当業者は、所定の核酸構築物における変更を生成する多くの方法を認識する。このような周知の方法は、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅、その核酸を含む細胞の変異原性薬剤または放射線への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、大きい核酸を生成するために連結および／またはクローニングと組合せた）、ならびに他の周知の技術を含む。例えば、ＧｉｌｉｍａｎおよびＳｍｉｔｈ（１９７９）Ｇｅｎｅ　８：８１−９７、Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２８：７３１−７３４を参照のこと。
【００５５】
好ましい実施態様において、本発明の細胞に存在する組換え核酸は、選択された生物体内において核酸の翻訳を増強する好ましいコドンを提供するように改変される（例えば、酵母の好ましいコドンは、酵母における発現のためのコード核酸へ置換される）。
【００５６】
（２．ＧＤＰ−フコース合成に関与する酵素の発現のための発現ベクターおよび方法）
本発明は、発現カセット、およびカセットを含む発現ベクターを提供し、これらはＧＤＰ−フコース合成酵素、特にエピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有するポリペプチドの発現に有用である。これらの発現カセットは、ＧＤＰ−フコース合成酵素をコードする核酸を含み、この核酸は所望の宿主細胞において機能的であるプロモーターに作動可能に連結される。発現カセットはまた、転写、翻訳、およびその酵素の翻訳後修飾に関与する他の配列を含み得る。このような配列は、以下により詳細に記載される。本発明はまた、発現ベクター、および本明細書に記載される組換え核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００５７】
代表的に、糖ヌクレオチド合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞において機能的であるプロモーターの制御下に配置される。非常に広範な種々のプロモーターが周知であり、そして特定の適用に依存して、本発明のベクター内で使用され得る。通常、選択されるプロモーターは、その中でプロモーターが活性であるべき細胞に依存する。リボソーム結合部位、転写終結部位などのような他の発現制御配列もまた、必要に応じて含まれる。特定の宿主細胞における使用に適切である発現制御配列は、しばしばその細胞において発現される遺伝子のクローニングにより得られ得る。
【００５８】
別の実施態様において、本発明は、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの転換における一以上の工程を触媒する酵素の産生に有用である組換え細胞を提供する。組換え細胞は、発現カセットを含み、そのカセットは好ましくは、発現ベクターに含まれる（その発現カセットが、宿主細胞のゲノム内に組み込まれない場合）。本発明の宿主細胞は、例えば、酵母細胞、細菌細胞、または真菌細胞のような、植物細胞または微生物であり得る。適切な細胞の例としては、例えば、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ．（例えば、Ａ．ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ　ｓｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｓｐ．（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｓｐ．他、多くの種が挙げられる。細胞は、以下を含むいくつかの属の任意の細胞であり得る；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃａｎｄｉｄａ（例えば、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、およびＣ．ｈｕｍｉｃｏｌａ）、Ｐｉｃｈｉａ（例えば、Ｐ．ｆａｒｉｎｏｓａおよびＰ．ｏｈｍｅｒｉ）、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ（例えば、Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｉｃａ、Ｔ．ｘｙｌｉｎｕｓ、Ｔ．ｆａｍａｔａ、およびＴ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｄ．ｓｕｂｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｃａｎｔａｒｅｌｌｉｉ、Ｄ．ｇｌｏｂｏｓｕｓ、Ｄ．ｈａｎｓｅｎｉｉ、およびＤ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉおよびＺ．ｂａｉｌｉｉ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（例えば、Ｈ．ａｎｏｍａｌａおよびＨ．ｊａｄｉｎｉｉ）、ならびにＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｂ．ｌａｍｂｉｃｕｓおよびＢ．ａｎｏｍａｌｕｓ）。
【００５９】
プロモーターおよび他の制御シグナルは、研究中の遺伝子に由来し得るか、あるいは異なる遺伝子から、または異なる種から得られる異種プロモーターまたは他のシグナルであり得る。遺伝子の継続的な発現が所望される場合、「構成的」プロモーターを使用し得、それは、一般に、発生または細胞分化のほとんどの環境条件および状態下で活性である。植物における使用のための適切な構成的プロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域および領域ＶＩプロモーター、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡに由来する１’−または２’−プロモーター、ならびに当業者に公知の植物細胞中で活性な他のプロモーターを含む。他の適切なプロモーターは、Ｆｉｇｗｏｒｔモザイクウイルス、アクチンプロモーター、ヒストンプロモーター、チューブリンプロモーター、またはマンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモーター（ＭＡＳ）由来の全長転写物プロモーターを含む。他の構成的な植物プロモーターは、特に、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓに特に由来する種々のユビキチンまたはポリユビキチンプロモーター（ＳｕｎおよびＣａｌｌｉｓ、Ｐｌａｎｔ　Ｊ．１１（５）：１０１７−１０２７（１９９７））、ｍａｓ、Ｍａｃ、またはＤｏｕｂｌｅＭａｃプロモーター（米国特許第５，１０６７３９号およびＣｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３７３−３８１（１９９０）に記載される）、ならびに当業者に公知の種々の植物遺伝子由来の他の転写開始領域を含む。そのような遺伝子は、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来ＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：１２５−１３９（１９９６））、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来Ｃａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４３１４７、Ｚｈｏｎｇら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：１９６−２０３（１９９６））、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ由来ステアロイル−アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ番号Ｘ７４７８２、Ｓｏｌｏｃｏｍｂｅら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：１１６７−１１７６（１９９４））、トウモロコシ由来ＧＰｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ１５５９６、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ　２０８：５５１−５６５（１９８９））、およびトウモロコシ由来Ｇｐｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ４５８５５、Ｍａｎｊｕｎａｔｈら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：９７−１１２（１９９７））を含む。植物についての有用なプロモーターはまた、植物細胞、植物ウイルス、またはそのプロモーターが植物中で機能的であると見出される他の宿主由来のＴｉ−プラスミドあるいはＲｉ−プラスミドから得られるプロモーターを含む。植物中で機能し、従って、本発明の方法における使用に適切である細菌プロモーターは、オクトピンシンセターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびマンノピンシンセターゼプロモーターを含む。適切な内在性植物プロモーターは、リブロース−１，６−ビホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）プロモーター、α−コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモータ���、ＡＤＨプロモーター、および熱ショックプロモーターを含む。
【００６０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける使用のためのプロモーターは、Ｔ７、ｔｒｐ、またはλプロモーターを含む。リボソーム結合部位、および好ましくは、転写終結シグナルもまた提供される。真核生物細胞については、制御配列は、代表的に免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどに由来するエンハンサーを、必要に応じて含むプロモーター、およびポリアデニル化配列を含み、そしてスプライシングドナー配列およびアクセプター配列を含み得る。
【００６１】
酵母において、都合のよいプロモーターは、ＧＡＬ１−１０（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＤａｖｉｅｓ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４４０−１４４８）、ＡＤＨ２（Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４−２６８２）、ＰＨＯ５（ＥＭＢＯ　Ｊ．（１９８２）６：６７５−６８０）、ならびにＭＦα（ＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚおよびＯｓｈｉｍａ（１９８２）Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、Ｊｏｎｅｓ、およびＢｒｏａｃｈ編）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１８１−２０９頁）を含む。酵母における使用のための別の適切なプロモーターは、Ｃｏｕｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅ　６１：２６５−２７５（１９８７）に記載されるような、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターである。例えば、真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの株のような糸状菌（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４，９３５，３４９号）については、有用なプロモーターの例として、ＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ　Ｊ．４：２０９３−２０９９（１９８５））およびｔｐｉＡプロモーターのような、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ解糖遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。適切なターミネーターの例は、ＡＤＨ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら）である。
【００６２】
いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターの制御下に配置される。この誘導性プロモーターは、その発現レベルが、環境的要因または発生的要因（例えば、温度、ｐＨ、嫌気的条件もしくは好気的条件、光、転写因子および化学物質）によって変更可能である遺伝子の発現を指示するプロモーターである。本明細書中において、このようなプロモーターを、「誘導性」プロモーターといい、グリコシルトランスフェラーゼもしくはヌクレオチド糖の合成に関与する酵素の発現時期の制御を可能にする。Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌の宿主細胞については、誘導性プロモーターは当業者に公知である。これらは、例えば、ｌａｃプロモーターを含む。原核細胞における発現のための特に好ましい誘導性プロモーターは、ガラクトース代謝に関与する酵素をコードする遺伝子から得られたプロモーター成分（例えば、ＵＤＰガラクトース４−エピメラーゼ遺伝子（ｇａｌＥ）由来のプロモーター）に連結されたｔａｃプロモーター成分を含む、デュアルプロモーターである。このデュアルｔａｃ−ｇａｌプロモーター（ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０５２８（国際公開第ＷＯ９８２０１１１号に記載される）は、いずれかのプロモーターのみによって提供される発現よりも、より大きな発現レベルを提供する。
【００６３】
植物における使用のための誘導性プロモーターは、当業者に公知である（例えば、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒら（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　３８：２２１に引用された参考文献を参照のこと）。このようなプロモーターとしては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａの１，５−リブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット遺伝子のプロモーター（「ｓｓｕ」プロモーター）が挙げられる。このプロモーターは、光誘導性であり、そして光合成組織、葯特異的プロモーター（ＥＰ３４４０２９）、および種子特異的プロモーター（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ（Ｋｒｅｂｂｅｒｓら（１９８８）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：８５９））においてのみ活性である。
【００６４】
他の生物体のための誘導性プロモーターもまた、当業者に周知である。これらとしては、例えば、アラビノースプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および熱ショックプロモーター、ならびに多数の他のプロモーターが挙げられる。
【００６５】
ポリヌクレオチドの発現を適切な宿主細胞内に配置された場合に駆動する遺伝子発現制御シグナルに作動可能に連結された、目的のポリヌクレオチドを含む構築物を、「発現カセット」という。ヌクレオチド糖合成に関与するＹＥＦ　Ｂおよび／または他の酵素をコードする発現カセットは、しばしば、宿主細胞に導入するための発現ベクター内に配置される。ベクターは、代表的には、発現カセットに加え、１つ以上の選択された宿主細胞において、ベクターを独立して複製し得る核酸配列を含む。一般的に、この配列は、ベクターを宿主染色体ＤＮＡから独立して複製し得、そして複製起点もしくは自律複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌について周知である。例えば、、プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノム相補体に組み込まれるようになり、そして細胞がＤＮＡ複製を受けるにつれて複製されることによって複製し得る。細菌細胞において酵素発現のための好ましい発現ベクターは、ｐＴＧＫであり、これはデュアルｔａｃ−ｇａｌプロモーターを含み、ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０５２８（国際公開第ＷＯ９８２０１１１号）に記載される。
【００６６】
ポリヌクレオチド構築物の構築は、一般に、細菌において複製し得るベクターの使用を必要とする。細菌からプラスミドを精製するための大量のキットが、市販されている。これらの適切な使用については、製造者取扱説明書に従う（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＢｉｏｔｅｃｈからのＥａｓｙＰｒｅｐＪ，ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＪ；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＪ；およびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｑｉａｇｅｎを参照のこと）。次いで、単離され、精製されたプラスミドは、他のプラスミドを生成するようにさらに操作され、そして細胞をトランスフェクトするために使用される。ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓにおけるクローニングもまた可能である。
【００６７】
選択可能マーカーは、本発明の細胞を構築するために使用される発現ベクターに頻繁に組み込まれる。これらの遺伝子は、選択培養培地中で増殖される形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要な遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードし得る。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、この培養培地中で生存しない。代表的な選択遺伝子は、抗生物質もしくは他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロランフェニコール、またはテトラサイクリン）に耐性を与えるタンパク質をコードする。あるいは、選択可能マーカーは、栄養要求性欠失を補足するタンパク質、または複合培地から利用できない必須栄養素を供給するタンパク質をコードし得る（例えば、Ｂａｃｉｌｌｉについては、Ｄ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。しばしば、ベクターは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の細胞において機能的な１つの選択可能マーカーを有する。ここでは、このベクターは、標的細胞への導入に先行して複製される。多数の選択可能マーカーは、当業者に公知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される。細菌細胞における使用に好ましい選択可能マーカーは、カナマイシン耐性マーカーである（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ，Ｇｅｎｅ　１９：２５９（１９８２））。カナマイシン選択の使用は、例えば、アンピシリン選択より優れている。なぜなら、アンピシリンは、培養培地中でβ−ラクトマーゼによって迅速に分解されるため、選択可能な状態が取り除かれ、培養物が、ベクターを含まない細胞を過剰増殖させることを可能にしてしまうからである。
【００６８】
哺乳動物細胞における使用に適切な選択可能マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、または薬物耐性を与える原核生物遺伝子（ｇｐｔ（キサンチン−グアニンホスホリボシルホスホトランスフェラーゼ）、これはマイコフェノール酸で選択され得る；ｎｅｏ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、これはＧ４１８、ハイグロマイシンまたはピューロマイシンで選択され得る；およびＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、これはメトトレキセートで選択され得る（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：２０７２；ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７））が挙げられる。
【００６９】
植物および／または他の真核生物細胞のための選択マーカーは、殺生剤もしくは抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、またはクロラムフェニコール）に対する耐性、あるいは除草剤（例えば、クロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）またはＢａｓｔａ））に対する耐性を頻繁に与える。選択可能マーカーのための適切なコード配列の例は以下である：抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える、酵素ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするｎｅｏ遺伝子（Ｂｅｃｋら（１９８２）Ｇｅｎｅ　１９：３２７）；酵素ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、かつ抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇ遺伝子（ＧｒｉｔｚおよびＤａｖｉｅｓ（１９８３）Ｇｅｎｅ　２５：１７９）；ならびに除草剤化合物ホスフィノスリシンおよびビアラフォス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）に対する耐性を与える、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子（ＥＰ２４２２３６）。
【００７０】
上記に列挙した１つ以上の成分物を含む適切なベクターの構築は、上記に引用される参考文献に記載されるような標準的な連結技術を利用する。単離したプラスミドもしくはＤＮＡフラグメントを切断し、改変し、そして必要とされるプラスミドを生成するために所望される形態で再連結される。構築されたプラスミド中の正確な配列を確認するために、このプラスミドを標準的な技術（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化、および／または公知の方法に従う配列決定）によって分析し得る。これらの目標を達成するための分子クローニング技術は、当該分野で公知である。組換え核酸の構築に適した広範な種々のクローニング方法およびインビトロ増幅方法は、当業者に周知である。これらの技術の例、ならびに多くのクローニング実験に通じる当業者を指示するに十分な解説書は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，との合弁会社（１９９８補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）に見出される。
【００７１】
本発明の発現ベクターの構築の使用に適する種々の通常のベクターは、当該分野で周知である。細菌におけるクローニングのために、通常のベクターとしては、ｐＢＲ３２２に由来するベクター（例えば、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴＴＭ）、およびλ−ファージに由来するベクターが挙げられる。酵母においてベクターとしては、Ｙｅａｓｔ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ　ｐｌａｓｍｉｄ（例えば、ＹＩｐ５）およびＹｅａｓｔ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｐｌａｓｍｉｄ（ＹＲｐ系列のプラスミド）およびｐＧＰＤ−２が挙げられる。哺乳動物細胞における発現は、通常利用される種々のプラスミド（ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩ、およびｐ９１０２３、ならびに溶解性ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびバキュロウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えば、ウシパピローマウイルス）およびレトロウイルスベクター（例えば、マウスレトロウイルス）を含む）を使用して達成され得る。
【００７２】
選択した宿主細胞への発現ベクターの導入に適した適した方法は、当業者に公知である。例えば、発現ベクターは、塩化カルシウム形質転換によって原核生物細胞（Ｅ．ｃｏｌｉを含む）に導入され得、ならびにリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションによって真核生物細胞に導入され得る。他の形質転換方法もまた適している。
【００７３】
いったん発現されると、組換えＧＤＰ−フコース合成酵素は、当該分野の標準的な手順に従って精製され得る。これらの技術としては、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる（一般に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２），Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　第１８２巻；Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと）。少なくとも約９０〜９５％の同質性である実質的に純粋な組成物が好ましく、そして９８〜９９％以上の同質性が最も好ましい。いったん精製（部分的にもしくは所望される場合、均質にまで）がなされると、次いで、このポリぺプチドが使用され得る（例えば、抗体産生のための検疫原として）。
【００７４】
しかし、いくつかの実施態様において、酵素は未精製の状態（例えば、細胞溶解物）で使用される。本発明の組換え細胞を、培養中で増殖させ、所望のスケールの反応での使用に十分な数の細胞を得る。それぞれの宿主細胞の増殖のための方法および培養培地は、当業者に周知である。培養を、例えば、通気した攪拌培養槽または振盪培養槽中で行い、あるいはより好ましくは発酵槽中で行い得る。組換え細胞の増殖が所望の細胞密度に達したら、代表的に、この細胞を本発明の反応混合物および方法における使用のために処理する。例えば、この細胞を、一般的に透過化処理するか、もしくは他の方法で破壊して、可溶性サッカリドアクセプターの細胞への流入を可能にする。細胞によって産生されるＹＥＦ　Ｂまたは他の酵素は、いくつかの状況において、細胞から細胞外液へ拡散し得る。酵素学的活性を有意に低下させないように細胞を透過化処理する方法は、当業者に公知である。細胞を、濃縮、乾燥、凍結乾燥、界面活性剤での処理、超音波処理、機械的な破壊、酵素的処理などに供し得る。
【００７５】
次いで、処理された細胞を、ＧＤＰ−フコース合成酵素の酵素学的活性に必要なもしくは望まれる、当業者に公知のさらなる反応物を含む反応混合物中で使用する。反応混合物中で使用される、処理された細胞の濃度は、代表的には、約０．１％（湿潤ｗｔ／ｖｏｌ）〜４０％（湿潤ｗｔ／ｖｏｌ）、より好ましくは、約１％（湿潤ｗｔ／ｖｏｌ）〜約２０％（湿潤ｗｔ／ｖｏｌ）、そして最も好ましくは、約２％（湿潤ｗｔ／ｖｏｌ）〜約１０％（湿潤ｗｔ／ｖｏｌ）、もしくは乾燥した細胞の対応する量である。
【００７６】
当業者は、化学合成、生物学的発現、または精製後、ＧＤＰ−フコース合成酵素は、天然の構成ポリぺプチドの高次構造と実質的に異なる高次構造を保持し得ることを認識する。この場合、このポリぺプチドを変性および還元し、次いで、このポリぺプチドの好ましい高次構造への再折り畳みを引き起こす必要があり得る。タンパク質を還元および変性し、そして再折り畳みを誘導する方法は、当業者に周知である（Ｄｅｂｉｎｓｋｉら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＰａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；およびＢｕｃｈｎｅｒら（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３−２７０を参照のこと）。Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、例えば、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性および還元を記載する。次いで、このタンパク質を、酸化グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含む酸化還元緩衝液中で再折り畳みする。例えば、本発明の好ましい実施態様に使用されるような、原核生物発現系において原核生物酵素（例えば、ＹＥＦ　Ｂ）を使用することの１つの有意な利点は、変性および再折り畳みを、通常、必要としないことにある。活性な原核生物エピメラーゼ／レダクターゼが、これらのさらなる工程を行わないで多量に得られる。
【００７７】
当業者は、ＧＤＰ−フコース合成酵素に対して、その生物学的活性を縮小しないで改変がなされ得ることを認識する。いくつかの改変が、クローニング、発現、または標的分子の融合タンパク質への組込みを容易にするためになされ得る。このような改変は、当業者に周知であり、例えば、開始部位を提供するためのアミノ末端でのメチオニンの付加、または好都合に位置する制限部位もしくは終結コドンもしくは精製配列を作製するための、いずれかの末端上でのさらなるアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）の配置が挙げられる。
【００７８】
（Ｂ．ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素学的転換）
本発明はまた、ＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに酵素学的に転換するための方法を提供する。この方法は、しばしば、１つ以上のＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ（ＧＭＤ）およびエピメラーゼ／レダクターゼ酵素の使用を包含する。本発明の好ましい実施態様において、この方法は、原核生物ＧＭＤ酵素、ならびにエピメラーゼおよびレダクターゼ活性の両方を有する原核生物酵素を使用する。両方の活性を有する好ましい酵素の例は、Ｅ．ｃｏｌｉのＹＥＦ　Ｂポリぺプチドである。他の実施態様において、真核生物酵素（例えば、ヒトＦｘタンパク質）を使用し得る。本発明の方法は、ＧＤＰ−フコースを、比較的安価な開始材料を使用して、効率的にかつ高い純度で生成し得る手段を提供する。
【００７９】
本発明のいくつかの実施態様は、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの反応効率が、実質的に増加し得る方法を提供する。既知の方法において、酵素学的経路における酵素は、共役反応に使用され、この反応において、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースが生成され、そして同時にエピマー化／還元され、ＧＤＰ−フコースを得る。しかし、ＧＭＤ酵素は、合成経路の初期工程、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへの転換を触媒するが、これは、ＧＤＰ−フコースによって強く阻害される。５０μＭのＧＤＰ−フコースで、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼは、その触媒活性の１０％のみを保持する（Ｂｒｏｓｃｈａｔら（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５３：３９７−４０１）。この産物阻害に起因する収率の減少を避けるために、本発明の方法は、いくつかの実施態様において、この経路の第２の酵素（例えば、エピメラーゼ／レダクターゼ）を加える前に、この経路の第１の段階を、ほぼもしくは完全に完了するまで進行させることを可能にすることを含む。本発明の好ましい実施態様において、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースへの転換は、次の酵素が反応混合物に加えられる時点で、少なくとも約８０％完了、より好ましくは、少なくとも約９０％完了、そしてさらにより好ましくは、少なくとも９５％完了である。ＧＭＤ触媒反応のための反応混合物は、ＮＡＤＰ＋の存在を要求する。別の実施態様において、フコシルトランスフェラーゼおよびアクセプターサッカリドが、エピメラーゼ／レダクターゼと共に、ＧＭＤ反応の産物（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース）に加えられる。エピメラーゼ／レダクターゼによって形成されるＧＤＰ−フコースは、フコシルトランスフェラーゼによって消費されるため、ＧＭＤのフィードバック阻害を妨げる。
【００８０】
本発明はまた、ＧＤＰ−フコースの酵素学的合成のための反応混合物を提供する。いくつかの実施態様において、この反応混合物は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨ、およびエピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性を有する１つ以上のポリぺプチド（例えば、ＹＥＦ　Ｂもしくは適切なアナログ）を含む後者のポリぺプチドは好ましくは原核生物に由来する。エピメラーゼ／レダクターゼポリぺプチドは、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースのエピマー化および還元を触媒し、ＧＤＰ−フコースを形成する。ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースは、好ましくは、上記に記載されるように、ＧＭＤ触媒転換によって、ＧＤＰ−マンノースから得られる。
【００８１】
ＧＤＰ−フコースを得るためのエピメラーゼ／レダクターゼは、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨのいずれかを必要とする。いくつかの実施態様において、酸化電子供与体がＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨに再生成する、再生成系を利用し得る。例えば、反応混合物において、ＮＡＤＰ＋もしくはＮＡＤ＋を利用し、酵素の基質を酸化する酵素を含み得る。その基質もまた反応混合物中に含まれ得る。適切な再循環酵素の例としては、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる（例えば、Ｗｏｎｇら（１９８５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７：４０２８−４０３１を参照のこと）。本発明の好ましい実施態様において、グルコースデヒドロゲナーゼおよびその基質グルコースを使用して、ＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＨを再生成する。
【００８２】
本発明はまた、ＧＤＰ−フコース合成反応がフコシルトランスフェラーゼ反応に共役され、ここでフコース残基が、ＧＤＰ−フコースから適切なサッカリドアクセプターに転移される、方法および反応混合物を提供する。多数の適切なフコシルトランスフェラーゼが当業者に公知である。手短に、フコシルトランスフェラーゼは、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースからアクセプター糖の水酸基位置に転移させる酵素のいずれかを含む。受容可能なアクセプター糖の例は、オリゴサッカリドグリコシドにおけるβＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃ基中のＧｌｃＮＡｃである。そのとき、適切なフコシルトランスフェラーゼは、ヒト乳汁から入手され得る、公知のβＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃ　α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ　Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）（Ｐａｌｃｉｃら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓ．１９０：１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら，Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）を参照のこと）、およびヒト血清に見出される、βＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃ　α（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ，ＦＴＶ，ＦＴＶＩ，およびＦＴＶＩＩ　Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６５）を含む。βＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃ　α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え形態もまた利用可能である（Ｄｕｍａｓら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ　１：４２５−４２８（１９９１）およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら，Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　４：１２８８−１３０３（１９９０）を参照のこと）。他の模範的なフコシルトランスフェラーゼとしては、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．６９）が挙げられ；さらなるフコシルトランスフェラーゼは表２に列挙される。酵素学的フコシル化は、Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９−１７６（１９９０）または米国特許第５，３７４，６５５号に記載される方法によって実行され得る。
【００８３】
本発明はまた、フコースの、ＧＤＰ−フコースからアクセプターサッカリドへのフコシルトランスフェラーゼ媒介転移の効率を改良するための方法を提供する。ＧＤＰ−マンノースがＧＤＰ−フコースに転換され、次いで、ほとんど同時にアクセプターサッカリドに転移される共役反応に伴う１つの問題点は、ＧＤＰがＧＭＤおよびフコシルトランスフェラーゼの両方を阻害することである。従って、１つの実施態様において、本発明の方法は、ＧＤＰ−フコースの酵素学的な合成を、フコシルトランスフェラーゼ反応から分離して行うことによって、フコシル化サッカリドの生成効率を改良することを包含する。遊離のＧＤＰは放出されないため、ＧＭＤは阻害されない。
【００８４】
代替の実施態様において、フコシルトランスフェラーゼ反応に関連して生成されるＧＤＰは、ＧＴＰに転換される。ＧＴＰは、フコシルトランスフェラーゼもしくはＧＭＤを阻害しない。例えば、この反応混合物は、キナーゼおよび対応する基質を含み得る。適切なキナーゼとしては、例えば、ポリリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．４．１．）、ヌクレオシドリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．４．４）、クレアチンキナーゼ（ＥＣ２．７．３．２）；ミオキナーゼ（ＥＣ２．７．４．３）；ミオキナーゼ（ＥＣ２．７．４．３）；アセチルキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．５９）；アセチルリン酸キナーゼ；およびピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）が挙げられる。これらの酵素に適切な基質は、当業者に公知である。この実施態様を組み込む反応スキームを、図９に示す。
【００８５】
好ましい実施態様において、ＧＤＰ−フコース合成酵素を、酵素サイクルにおいて使用する。適切な酵素サイクルは、図１５に示されるような半サイクル（これは、開始物質としてＧＤＰ−マンノースを使用する）および図１６に示されるような完全サイクル（これは、開始物質としてマンノースを使用する）を含む。ＧＤＰ−マンノース半サイクルの例（図１５）は、グルコースデヒドロゲナーゼを使用して、酵素的にＮＡＤＰＨ（エピメラーゼ／レダクターゼポリペプチドに必要とされる補因子）およびフコシルトランスフェラーゼＶを再利用してフコースをＳＬＮに転移し、これにより、シアリル−Ｌｅｗｉｓｘ化合物の形成を生じる。ＧＤＰは、フコシルトランスフェラーゼおよびＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの両方を阻害するので、ＧＤＰを切断し得るが、ＮＡＤＰからリン酸を切断しないホスファターゼを、好ましくは、このサイクルに添加する。ＭｇＣｌ２が、２価のカチオンの供給源として好ましい。なぜなら、ＹＥＦ　Ｂが、ＭｇＣｌ２により阻害されるからである。ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびエピメラーゼ／レダクターゼポリペプチドに加えて、ＧＤＰ−マンノース半フコシルトランスフェラーゼサイクルは、好ましくは以下を含む：ＮＡＤＰＨを再生利用する酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ）、ＮＡＤＰＨ再生酵素のための基質（例えば、グルコースまたはガラクトース）、フコシルトランスフェラーゼ、アクセプターオリゴサッカライドまたはアクセプター複合サッカリド、ＮＡＤＰ、ＧＤＰ−マンノース、および緩衝液系。
【００８６】
あるいは、これらの酵素を、図１６に示されるように、「マンノース完全サイクル」において使用し得る。ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびエピメラーゼ／レダクターゼポリペプチドを、完全な、または「完全」マンノースフコシルトランスフェラーゼサイクルにおいて、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ−ホスホマンノムターゼ、ヘキソキナーゼ、およびピルビン酸キナーゼと組合せて使用し得る。この完全サイクルにより、単にマンノースおよび所望のアクセプターサッカリドを開始物質として使用することが可能である。組換え酵素または天然に存在する酵素のいずれかを、使用し得る。完全サイクル反応に関しては、その反応混合物は、好ましくは、ホスファターゼを含まない。
【００８７】
本発明の反応方法は、その反応混合物中に存在する２価カチオン、反応のｐＨ、温度、および阻害副産物（例えば、ＧＤＰ）の除去により反応キネティクスを促進し得る添加剤（例えば、アルカリホスファターゼ）を変更することにより、最適化し得る。例えば、上記で議論されるように、ＧＤＰは、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびフコシルトランスフェラーゼの両方を阻害することが公知である（Ｂｒｏｓｃｈａｔら（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５３：３９７〜４０１；Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ，Ｅ．（１９９６）ＴＩＧＧ　８：３９１〜４０８）。
【００８８】
フコシル化反応におけるさらなる改良を、その反応混合物中に存在する２価カチオンを、反応が進行する際に補充することにより得ることができる。グリコシルトランスフェラーゼサイクル（米国特許第５，３７４，５４１号およびＷＯ　９４２５６１５　Ａを参照のこと）は、代表的に、形成される産物各モルについて１モル以上の無機ピロリン酸を生成し、そして代表的に、２価金属イオンの存在下で実行される。金属イオンは、このサイクルの各サイクルにおける少なくとも１つの酵素のための補因子である。しかし、この２価の金属カチオンは、このグリコシルトランスフェラーゼサイクルにおいて二重の役割を果たす。特に、この２価の金属イオンは、このグリコシルトランスフェラーゼサイクルにおける種々のプロセスにより生成される無機リン酸または無機ピロリン酸と、非常に溶解性が低い複合体を形成する。その結果、この金属イオンは、この反応からＰｉまたはＰＰｉを沈殿により除去し得る。次ぎに、このことは、溶液中に存在する金属イオンの量の減少、およびこの金属イオン補因子を必要とするこれらの酵素に関する全体の代謝回転速度の対応した減少を生じる。この問題を回避するために、本発明の方法は、十分な２価金属カチオンを反応媒体に添加し、反応の過程で失われた一部の２価カチオンを回復し、それにより反応媒体中の２価金属カチオンの濃度を約１ｍＭと約７５ｍＭとの間にする工程またはこの濃度を維持する工程を含み得る。好ましくは、２価金属カチオンの添加は、上記酵素転換の阻害を伴わずに生じる。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ９６／３２４９１号を参照のこと。
【００８９】
一旦、本発明の反応が、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびエピメラーゼ／レダクターゼ（例えば、ＹＥＦ　Ｂ）に関して最適化されると、これらの他のアナログの酵素活性を、類似のプロセスを使用して試験し得る。例えば、ヒトＦｘをＹＥＦ　Ｂの代わりにし得る。
【００９０】
【表２】
2004512002.tif 000003
グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関して、そのプロセス中で使用される種々の反応物質の濃度または量は、反応条件（例えば、温度およびｐＨ値、ならびにグリコシル化されるアクセプターサッカリドの選択および量）を含む多数の因子に依存する。グリコシル化プロセスにより、触媒作用量の酵素存在下での、活性化しているヌクレオチドの再生、活性化されたドナー糖の再生、および生成されたＰＰｉの除去が可能になるので、このプロセスは、先に議論された化学量論的基質の濃度または量により制限される。本発明の方法に従って使用され得る反応物質の濃度に関する上限を、その反応物質の溶解性により決定する。好ましくは、活性化ヌクレオチド、リン酸ドナー、ドナー糖類、および酵素の濃度を選択して、アクセプターを使い果たすまでグリコシル化が進行し、それにより糖タンパク質上に存在するサッカリド群を完全にシアリル化するようにする。
【００９１】
酵素の量または濃度を活性Ｕｎｉｔで表す。これは、触媒の初期速度の基準である。１活性Ｕｎｉｔは、所定の温度（代表的に３７℃）およびｐＨ値（代表的に７．５）で、１分当たり１μｍｏｌの生成物の形成を触媒する。従って、１０Ｕｎｉｔの酵素は、温度３７℃およびｐＨ値７．５で１分間に、１０μｍｏｌの基質を１０μｍｏｌの生成物に転換する場合の、酵素の触媒作用量である。
【００９２】
上記の成分を、代表的には、水性反応媒体（溶液）中での混合により併用する。そのような媒体は、ｐＨ値約６〜約８．５を有する。この媒体は、酵素補因子（例えば、Ｍｇ＋２またはＭｎ＋２）に結合するキレート剤を欠いている。媒体の選択は、その媒体が所望のレベルのｐＨ値を維持する能力に基づく。従って、いくつかの実施態様においては、媒体を、ｐＨ値約７．５へと、好ましくはＨＥＰＥＳを用いて緩衝化する。緩衝液を使用しない場合、媒体のｐＨを、約６〜８．５、好ましくは約７．２〜７．８に、塩基の添加により維持すべきである。適切な塩基は、ＮａＯＨ、好ましくは６Ｍ　ＮａＯＨである。
【００９３】
反応媒体はまた、可溶化界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎまたはＳＤＳ）および有機溶媒（例えば、メタノールまたはエタノール）を、必要な場合は含み得る。これらの酵素を、溶液中で遊離して使用し得るし、また支持体（例えば、ポリマー）に結合し得る。従って、反応混合物は最初は実質的に均一であるが、反応中にいくらかの沈殿を形成し得る。
【００９４】
上記プロセスを実行する温度は、凝固点のすぐ上から、最も敏感な酵素が変性する温度までに及び得る。その温度範囲は、好ましくは、約０℃から約４５℃まで、また好熱性生物から得られる酵素に関しては１００℃以上まである。非好熱酵素に関する代表的な範囲は、約２０℃〜３７℃である。
【００９５】
このように形成した反応混合物を、所望のパーセンテージのアクセプター糖残基がフコシル化されるのに十分な時間の間維持する。工業規模の調製に関して、この反応はしばしば、約８〜２４０時間進行可能であり、約２４時間と４８時間との間の時間がより代表的である。
【００９６】
（Ｄ．本発明の方法を使用して合成されたＧＤＰ−フコースの使用）
本発明の方法は、ＧＤＰ−フコースの合成に有用である。ＧＤＰ−フコースは、広範で種々の目的の炭水化物化合物の合成における使用が見出される。炭水化物化合物は、糖タンパク質、糖脂質、または遊離分子上で、オリゴサッカリド構造かまたはポリサッカリド構造であり得る。
【００９７】
本発明の方法を使用して生成されたＧＤＰ−フコースを、例えば、広範で種々のフコシル化炭水化物の合成に使用し得る。適切なフコシルトランスフェラーゼ酵素と組み合わせて、以下の炭水化物構造：
【００９８】
【化１】
2004512002.tif 000004
が、ＧＤＰ−フコースを使用して得ることができる構造である。ＧＤＰ−フコースを反応物質として使用して形成し得る生成物の例は、表３に列挙されるものを含むが、これらに限定されない。
【００９９】
【表３】
2004512002.tif 000005
例えば、本発明は、以下の式を有する化合物の反応混合物およびその調製のための方法を提供する：Ｇａｌβ（１−４）（Ｆｕｃα１→３）Ｇｌｃ−Ｒ、Ｇａｌβ（１−３）（Ｆｕｃα１→４）Ｇｌｃ−Ｒ、Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒ、およびＧａｌβ（１→３）（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒ。これらの実施態様において、アクセプターサッカリドはそれぞれ、Ｇａｌβ（１−４）Ｇｌｃ−Ｒ、Ｇａｌβ（１−３）Ｇｌｃ−Ｒ、Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒ、またはＧａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β−Ｒであり、ここで：
Ｒは、水素、サッカリド、オリゴサッカリド、および少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基からなる群から選択され；そして
Ｒ’は、アセチルおよびアリルオキシカルボニルからなる群から選択される。
【０１００】
適切なアクセプターサッカリドはまた、例えば、ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを含む。これらのアクセプターサッカリドは、化合物Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲまたはＧａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを、シアル酸が化合物の非還元糖に転移される条件下で、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼを使用してシアル酸のＣＭＰ誘導体の存在下でシアリルトランスフェラーゼによりシアリル化することにより形成し得る。化合物Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲおよびＧａｌβ（１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲは、それぞれ以下の式の化合物：ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲまたはＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、この化合物が形成するのに十分な条件下で、ガラクトシルトランスフェラーゼによりガラクトシル化することにより形成し得る。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施態様において、ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲまたはＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）（Ｆｕｃα１→４）ＧｌｃＮ（Ｒ’）β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを合成する方法を提供する。これらの式において、Ｒは、水素、サッカリド、オリゴサッカリド、または少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基である。Ｒ’は、アセチルかまたはアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）のいずれかであり得る。用語「少なくとも１つの炭素原子を有するアグリコン基」は、−Ａ−Ｚ基をいい、ここで、Ａは、１〜１８個の炭素原子を、必要に応じてハロゲン、チオール、ヒドロキシ、酸素、硫黄、アミノ、イミノ、またはアルコキシで置換したアルキレン基を表し；そしてＺは、水素、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−Ｎ（Ｒ１）２、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨＲ１、−ＣＯＮ（Ｒ１）２、−ＣＯＮＨＮＨ２、または−ＯＲ１であり、ここで各Ｒ１は、独立して１〜５個の炭素原子のアルキルである。さらに、Ｒは、
【０１０２】
【化２】
2004512002.tif 000006
であり得、ここで、ｎ、ｍ、ｏ＝１〜１８；（ＣＨ２）ｎ−Ｒ２（ｎ＝０〜１８）、ここでＲ２は種々に置換された芳香族環（好ましくはフェニル基）であり、１つ以上のアルコキシ基（好ましくはメトキシまたはＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３、（ｍ＝０〜１８）またはその組み合わせ）で置換されている。
【０１０３】
これらの化合物の合成に関連する工程は以下を含む：
（ａ）式ＧｌｃＮＲ’β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲの化合物を、化合物Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＲ’β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを形成するのに十分な条件下で、ＵＤＰ−ガラクトースの存在下で、ガラクトシルトランスフェラーゼによりガラクトシル化する工程；
（ｂ）（ａ）で形成される化合物を、シアル酸が非還元糖に転移して化合物：ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＲ’β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを形成する条件下で、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼを使用して、シアル酸のＣＭＰ誘導体の存在下で、シアリルトランスフェラーゼによりシアリル化する工程；および
（ｃ）（ｂ）で形成される化合物をフコシル化して、ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮＲ’β（１→３）Ｇａｌβ−ＯＲを提供する工程。
【０１０４】
フコシル化工程を、好ましくは、上記のように、本発明の方法を使用して実行する。いくつかの実施態様において、１つ以上のＧＤＰ−フコース合成酵素を発現する組換え細胞由来の溶解物を、これらの反応中で使用する。グリコシルトランスフェラーゼ反応もまた、組換えグリコシルトランスフェラーゼを産生する細胞の溶解物を使用し得る。いくつかの実施態様において、少なくとも２つの反応工程を、グリコシルトランスフェラーゼか、または他の酵素あるいは他の反応物質を産生する組換え細胞を使用して実行する。異なる酵素が同じ細胞から発現される得るし、異なる組換え細胞で発現し得る。また外因性のグリコシルトランスフェラーゼまたはＧＤＰ−フコース合成酵素遺伝子を含む異なる組換え細胞の各々が、ともに混合され得る。従って、１組の組換え細胞のメンバー（その各々が異なるヌクレオチド糖合成遺伝子、またはグルコシルトランスフェラーゼを含む）を混合および適合させることにより、多くの多工程グリコシル化反応を実行するための自前の反応混合物を容易に作製し得る。
【０１０５】
さらに別の局面において、本発明は、ＷＯ　９４／２６７６０に記載されるような化合物の調製のための方法を提供する。一般に、これらの化合物は、以下の式を有する：
ＮｅｕＡｃα（２→３）Ｇａｌβ（１→４）（Ｆｕｃα１→３）ＧｌｃＮ（Ｒ’’）β−ＯＲ２
この式において、Ｒ’’は１〜１８個の炭素のアルキルまたはアシル、５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフタミド（ｎａｐｈｔｈａｍｉｄｏ）；ベンズアミド；２−ナフタミド；４−アミノベンズアミド；または４−ニトロベンズアミドである。Ｒ２は、上記のＲと同じであってもよいし、Ｇａｌβ−ＯＲ（Ｒは上記と同じである）であってもよい。
【０１０６】
上記において、用語は、一般にその標準の意味に従って使用される。用語「アルキル」は、本明細書中で使用される場合、分枝型または非分枝型の、飽和型かまたは不飽和型の、１価かまたは２価の、１〜２０個の炭素を有する炭水化物ラジカルを意味し、１〜８個の炭素のより低級なアルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ブチル、ｎ−ヘキシルなど）、シクロアルキル（３〜７個の炭素）、シクロアルキルメチル（４〜８個の炭素）、およびアリールアルキルを含む。
【０１０７】
用語「アリール」は、１つの原子の除去により芳香族炭水化物から派生したラジカル（例えば、ベンゼンに由来するフェニル）をいう。芳香族炭水化物は、１つより多くの不飽和炭素環（例えば、ナフチル）を有し得る。用語「アルコキシ」は、酸素によって残りの分子に結合したアルキルラジカル（例えば、エトキシ、メトキシ、またはｎ−プロポキシ）をいう。用語「アルキルチオ」は、硫黄によって残りの分子に結合したアルキルラジカルをいう。
【０１０８】
用語「アシル」は、ヒドロキシル基の除去により有機酸から派生したラジカルをいう。例としては、アセチル、プロピオニル、オレオイル、ミリストイルが挙げられる。
【０１０９】
本発明はまた、セレクチン結合炭水化物部分を含む種々の化合物の合成に有用である。これらのセレクチン結合部分は、以下の一般式を有する：
Ｒ１Ｇａｌβ，ｍ（Ｆｕｃα１，ｎ）ＧｌｃＮＲ０（Ｒ２）ｐ−
ここでＲ０は（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）カルボニル、（Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ）カルボニル、または（Ｃ２〜Ｃ９アルケニルオキシ）カルボニルであり、Ｒ１は、オリゴサッカリドまたは以下の式：
【０１１０】
【化３】
2004512002.tif 000007
を有する基であり、
Ｒ３およびＲ４は、同じであってもよいし、または異なっていてもよく、そして、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、ヒドロキシ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、アリール−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、または（Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ）−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、置換型であってもよいし、また非置換型であってもよい。Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、ヒドロキシ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、アリール−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−アリール、アルキルチオ、α１，２Ｍａｎ、α１，６ＧａｌＮａｃ、β１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、α１，２Ｍａｎ−Ｒ８、α１，６ＧａｌＮａｃ−Ｒ８、およびβ１，３Ｇａｌ−Ｒ８であり得る。Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、ヒドロキシ−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、アリール−（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ８アルキル）−アリールまたはアルキルチオであり得る。この式において、ｍおよびｎは整数であり、そして３または４のいずれかであり得；ｐは０または１であり得る。
【０１１１】
上記で言及した置換基は、ヒドロキシ、ヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）、ポリヒドロキシ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）、アルカノアミド、またはヒドロキシアルカノアミド置換基により置換し得る。好ましい置換基は、ヒドロキシ、ポリヒドロキシ（Ｃ３アルキル）、アセトアミド、およびヒドロキシアセトアミドを含む。置換型ラジカルは、１つより多くの置換を有し得、これは同じであってもよいし、また異なっていてもよい。
【０１１２】
Ｒ１がオリゴサッカリドである実施態様に関して、このオリゴサッカリドは好ましくはトリサッカリドである。好ましいトリサッカリドは、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮａｃβ１，３またはＮｅｕＧｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮａｃβ１，３を含む。
【０１１３】
Ｒ１が以下の式：
【０１１４】
【化４】
2004512002.tif 000008
を有する基である実施態様について、Ｒ３およびＲ４は、好ましくは以下の式：
−Ｒ５−または−（Ｒ６）ｑ−Ｏ−（Ｒ７）ｒ−
を有する単一のラジカルを形成し、ここでＲ５はＣ３〜Ｃ７の２価アルキル（置換型または非置換型）であり、Ｒ６およびＲ７は同一であるかまたは異なり、そしてＣ１〜Ｃ６の２価アルキル（置換型または非置換型）である。この式において、ｑおよびｒは、同じであってもよいしまた異なっていてもよい整数であり、そして０または１のいずれかである。ｑおよびｒの合計は、常に少なくとも１である。
【０１１５】
Ｒ３およびＲ４により形成される単一のラジカルに関する、より好ましい構造は、以下の式：
−（Ｒ６）−Ｏ−
を有し、ここで、Ｒ６はＣ３〜Ｃ４の２価アルキル（置換型または非置換型）である。例えば、Ｒ６は、式−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−（好ましくは置換型）を有し得る。このラジカルは、ヒドロキシ、ポリヒドロキシ（Ｃ３アルキル）、および置換型かまたは非置換型のアルカノアミド基（例えば、アセトアミドまたはヒドロキシアセトアミド）で置換し得る。置換型構造は、代表的には単糖を、好ましくは、シアル酸（例えば、α２，３でＧａｌ残基に結合されたＮｅｕＡｃまたはＮｅｕＧｃ）を形成する。
【０１１６】
上記の一般式において、ｍおよびｎの両方は整数であり、そして３または４のいずれかであり得る。従って、構造の１つのセットにおいて、ＧａｌはＧｌｃＮＡｃに対してβ１，４で連結され、そしてＦｕｃはＧｌｃＮＡｃに対してα１，３で連結される。この式は、ＳＬｅｘテトラサッカリドを含む。ＳＬｅｘは、式、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−、を有する。この構造は、ＬＥＣＣＡＭを保有する細胞によって選択的に認識される。本発明の方法を使用して精製され得るＳＬｅｘ化合物は、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｇａｌ−ＯＥｔ、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１，４Ｇａｌβ１−ＯＥｔ、および国際出願ＷＯ９１／１９５０２に記載される他の化合物を含む。この方法を使用して精製され得る他の化合物は、米国特許第５，６０４，２０７号に記載される、以下の式を有する化合物を含む：
【０１１７】
【化５】
2004512002.tif 000009
ここで、Ｚは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アシルまたは
【０１１８】
【化６】
2004512002.tif 000010
であり；
Ｙは、Ｃ（Ｏ）、ＳＯ２、ＨＮＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）およびＳＣ（Ｏ）からなる群から選択され；
Ｒ１は、アリール、置換アリールおよびフェニルＣ１〜Ｃ３アルキレン基からなる群から選択され、ここで、上記アリール置換基は、ハロ基、トリフルオロメチル基、ニトロ基、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル基、Ｃ１〜Ｃ１８アルコキシ基、アミノ基、モノ−Ｃ１〜Ｃ１８アルキルアミノ基、ジ−Ｃ１〜Ｃ１８アルキルアミノ基、ベンジルアミノ基、Ｃ１〜Ｃ１８アルキルベンジルアミノ基、Ｃ１〜Ｃ１８チオアルキル（ｔｈｉｏａｋｌｙｌ）基およびＣ１〜Ｃ１８アルキルカルボキシアミド基からなる群から選択され、あるいは
Ｒ１Ｙは、アリルオキシカルボニルまたはクロロアセチルであり；
Ｒ２は、モノサッカリド（β１，３Ｇａｌ−ＯＲを含む。ここで、Ｒ＝Ｈ、アルキル、アリールもしくはアシルである）、ジサッカリド、水素、Ｃ１〜Ｃ１８直鎖、分枝鎖もしくは環状ヒドロカルビル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）プロピル、Ｃ１〜Ｃ５アルキレンω−カルボキシレート、ω−三置換シリルＣ２〜Ｃ４アルキレン（ここで、上記ω−三置換シリルは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニルからなる群から独立して選択される、３つの置換基を有するシリル基である）からなる群から選択され、
または、ＯＲ２は一緒になって、Ｃ１〜Ｃ１８直鎖、分枝鎖または環状ヒドロカルビルカルバメートを形成し；
Ｒ３は、水素もしくはＣ１〜Ｃ６アシルであり；
Ｒ４は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはベンジルであり；
Ｒ５は、水素、ベンジル、メトキシベンジル、ジメトキシベンジルおよびＣ１〜Ｃ６アシルからなる群から選択され；
Ｒ７は、メチルもしくはヒドロキシメチルであり；ならびに
Ｘは、Ｃ１〜Ｃ６アシルオキシ、Ｃ２〜Ｃ６ヒドロキシアシルオキシ、ヒドロキシ、ハロおよびアジドからなる群から選択される。
【０１１９】
一般式に含まれる関連するセットの構造は、Ｇａｌがβ１，３で連結され、そしてＦｕｃがα１，４で連結されるものである。例えば、テトラサッカリドであるＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−（本明細書中でＳＬｅａと呼ばれる）は、セレクチン受容体によって認識される。Ｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１４８６９〜１４８７２（１９９１）を参照のこと。特に、Ｂｅｒｇらは、Ｅ−セレクチンｃＤＮＡで形質転換された細胞がＳＬｅａを含むネオ糖タンパク質（ｎｅｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）に選択的に結合することを示した。
【０１２０】
本発明の方法によって生成されたＧＤＰ−フコースを使用して、糖結合体（糖タンパク質および糖脂質を含む）上に存在するオリゴサッカリドを改変し得る。本発明の方法によって改変され得るタンパク質としては、例えば、インスリンのようなホルモン、成長ホルモン（ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、レニン、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子のような凝固因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、血清アルブミン、ホルモンまたは成長因子のための受容体、インターロイキン、コロニー刺激因子、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣポリペプチド、ウイルス抗原、グリコシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。本発明の方法を使用する組換え発現およびそれに続く改変のための目的のポリペプチドとしてはまた、多くの中でもとりわけ、α１−抗トリプシン、エリトロポエチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、抗トロンビンＩＩＩ、インターロイキン６、インターフェロンβ、プロテインＣ、フィブリノーゲンが挙げられる。ポリペプチドのこの列挙は、例示のためであって、排他的ではない。この方法はまた、ＩｇＧのような免疫グロブリン由来の部分を含むキメラタンパク質を含むがこれに限定されない、キメラタンパク質のグリコシル化パターンを改変するために有用である。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明の例示のために提供され、限定するものではない。
【０１２２】
（実施例１）
（ＧＤＰ−フコース合成酵素をコードする核酸のクローニングおよび発現）
この実施例は、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素的な転換、ならびにＧＤＰ−フコースを生成するためのこれらの酵素の使用において有用な酵素をコードする核酸のクローニングおよび発現を記載する。
【０１２３】
（方法）
（Ａ．ＧＤＰ−マンノース　４，６−デヒドラターゼ　オープンリーディングフレームの増幅）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ（ＧＭＤ）オープンリーディングフレームを、ＧＭＤについて公知の配列に基づいたプラーマーを使用して、ＰＣＲによって増幅した（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４８８５〜４８９３；Ｔｏｎｅｔｔｉら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７２７４〜２７２７９）。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２由来のゲノムＤＮＡを、製造者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．製のキットを使用して精製した。ＧＭＤオープンリーディングフレームを増幅するために、以下のプライマーを利用した：５’プライマー：５’−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＡＧＴＣＧＣＴ−３’（配列番号２）；３’プライマー：５’−ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＣＧＣＧＡＴ −３’（配列番号３）。ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼについてのオープンリーディングフレームは、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２のｗｃａ遺伝子クラスターのヌクレオチド８６３３〜９７５４に対応する（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３８４７３中の８６５９〜９７８０）（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、前出）。各プライマーを、５’ＸｂａＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて設計した。１００ｐモルの各プライマー対を、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２由来のゲノムＤＮＡと組み合わせた。３０サイクル（９５℃で４５秒間、６５℃で１分間、７３℃で３分間）を、Ｐｆｕポリメラーゼを使用して行った。この産物を、ゲル精製し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして細菌発現プラスミドｐＴＧＫ（ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０５２８；Ｉｎｔ’ｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＷＯ９８２０１１１）のこれらの部位にサブクローニングした。このプラスミドの配列決定は、ｐＴＧＫにおける発現のために適切に位置付けされたＡＴＧ開始部位を有する、真の（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼを示した。これは、発現プラスミドｐＴＧＫ：ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ（ｐＴＧＫ：ＧＭＤ）を生じた。
【０１２４】
（Ｂ．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１の発現）
標準的な分子生物学のプロトコルを使用した、ｐＴＧＫ：ＧＭＤのＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１への形質転換の後、単離されたコロニーを、ガラクトースを含むＭ９規定培地中で増殖し、オープンリーディングフレームの発現を誘導した。撹拌しながら３７℃で一晩インキュベーションした後、細胞をペレット化し、そして氷上で５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）（ペレット容量の５倍）中に再懸濁した。この細胞を、Ｆｒｅｎｃｈプレスを用いて４℃で溶解した。この細胞の細片および不溶解細胞を、１０分間、遠心分離（３０００ｒｐｍ；Ｂｅｃｋｍａｎフロアトップ（ｆｌｏｏｒｔｏｐ）遠心分離）でペレット化した。得られた上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性アッセイによる分析まで（２時間まで）、氷上で保存した。
【０１２５】
（Ｃ．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼのアッセイ）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ活性をアッセイするために、逆相ＨＰＬＣアッセイを開発した。Ａｑｕｉａｓｉｌ　Ｃ１８逆相カラムを、Ｂｅｃｋｍａｎ　１２６溶媒モニターに一列に取り付けた。このカラムを、１ｍｌ／分の流速で２０分以上、０．５Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４でイソクラティックに（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）溶出した。フォトダイオードアレイ検出装置を使用して、２１０〜３００ｎｍの波長範囲を走査して溶出をモニターした。ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ活性を、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ抽出物と、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１５ｍＭ　ＮＡＤＰ＋（ＮＡＤＰ＋は、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ活性のために、絶対的に必要である）中の４８０ｎｍｏｌｅのＧＤＰ−マンノースを、１００μｌの反応容量で反応させることによって決定した。２０μｌのアッセイ混合物を、Ｃ１８カラム上に注入した。
【０１２６】
２００ｎｍｏｌｅに対応する、無酵素コントロールのピーク領域を比較することによって、ＧＤＰ−マンノースのピーク領域の減少を用いて、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの活性を、以下の式に従って直接測定した：
１．（酵素を有さないピーク領域）−（酵素のピーク領域）＝（消費されたＧＤＰ−マンノースのピーク領域）
２．（消費されたＧＤＰ−マンノースのピーク領域）／（酵素を有さないピーク領域）＝消費された２００ｎモルのＧＤＰ−マンノースのパーセント。
【０１２７】
ＨＰＬＣ注入の際の損失を任意のキャリーオーバーについて制御するために、１０ｎｍｏｌｅのＣＴＰを、分析されるサンプルに添加した。
【０１２８】
（Ｄ．ＹＥＦ　Ｂ、ヒトＦｘおよびｗｃａＨオープンリーディングフレームの増幅）
ＹＥＦ　Ｂ、ｗｃａＨ、およびヒトＦｘのオープンリーディングフレームを含む核酸を、報告されたヌクレオチド配列（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１９９６）前出；Ｔｏｎｅｔｔｉら（１９９６）前出）に基づいて合成されたプライマーを使用して増幅した。Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２由来のゲノムＤＮＡを、製造者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．製のキットを使用して精製した。これらのオープンリーディングフレームを増幅するために、以下のプライマーを利用した：
【０１２９】
【化７】
2004512002.tif 000011
ＹＥＦ　ＢおよびｗｃａＨは、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２のｗｃａ遺伝子クラスターのヌクレオチド９７５７〜１０７２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３８４７３中の９７８３〜１０７４８）および１０７２２〜１１２０４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ３８４７３中の１０７４８〜１１２３０）に対応する（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、前出）。
【０１３０】
各プライマーを、５’ＸｂａＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて設計した。１００ｐｍｏｌｅの各プライマー対を、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２由来のゲノムＤＮＡと、またはヒトＦｘの場合においては、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡと組み合わせた。３０サイクル（９５℃で４５秒間、６５℃で１分間、７３℃で３分間）を、Ｐｆｕポリメラーゼを使用して行った。これらの産物を、ゲル精製し、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして細菌発現プラスミドｐＴＧＫ（ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０５２８；Ｉｎｔ’ｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＷＯ９８２０１１１）のこれらの部位にサブクローニングした。これは、以下の発現プラスミドｐＴＧＫ：ＹＥＦ　Ｂ、ｐＴＧＫ：ヒトＦｘ（ｐＴＧＫ：Ｆｘ）およびｐＴＧＫ：ｗｃａＨを生じた。
【０１３１】
（Ｅ．Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１におけるＹＥＦ　Ｂ（ｗｃａＧ）、ヒトＦｘおよびｗｃａＨの発現）
標準的な分子生物学のプロトコルを使用した、ｐＴＧＫ：ＹＥＦ　Ｂ、ｐＴＧＫ：ＦｘおよびｐＴＧＫ：ｗｃａＨのＥ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１への形質転換の後、単離されたコロニーを、ガラクトースを含むＭ９規定培地中で増殖し、オープンリーディングフレームの発現を誘導した。撹拌しながら３７℃で一晩インキュベーションした後、細胞をペレット化し、そして氷上で５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）（ペレット容量の５倍）中に再懸濁した。この細胞を、Ｆｒｅｎｃｈプレスを用いて４℃で溶解した。この細胞の細片および不溶解細胞を、１０分間、遠心分離（３０００ｒｐｍ；Ｂｅｃｋｍａｎフロアトップ）でペレット化した。得られた上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性アッセイによる分析まで（２時間まで）、氷上で保存した。
【０１３２】
（Ｆ．ＹＥＦ　ＢおよびヒトＦｘについての活性アッセイ）
ＹＥＦ　Ｂ活性をアッセイするために、逆相ＨＰＬＣアッセイを開発した。Ａｑｕｅｓｉｌ　Ｃ１８逆相カラムを、Ｂｅｃｋｍａｎ　１２６溶媒モニターに一列に取り付けた。このカラムを、１ｍｌ／分の流速で２０分以上、０．５Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４でイソクラティックに溶出した。フォトダイオードアレイ検出装置を使用して、２１０〜３００ｎｍの波長範囲を走査して溶出をモニターした。
【０１３３】
結合アッセイを使用して、ＹＥＦ　Ｂ活性をアッセイした。この基質（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース）が不安定であり、そして市販されていないので、このアッセイが必要であった。２０ｍユニットのＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼを以前のような標準的なアッセイ条件下で、２０分間、４８０ｎＭｏｌｅのＧＤＰ−マンノースと反応させた。この時点で、９０％より多いＧＤＰ−マンノースが、ＹＥＦ　Ｂに対する基質であるＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換した。次いで、以下の添加物を作製した：５００ｎｍｏｌｅのグルコース、２０ｍＭまでのＭｇＣｌ２、０．１５ｍＭまでのＮＡＤＰＨ、１０ｍユニットのグルコースデヒドロゲナーゼ、１００ｎｍｏｌｅのＣＴＰ（サンプルがＨＰＬＣに注入される場合に起こり得る損失について標準化するために）、ＹＥＦ　Ｂおよび５０μｌまでの水。この反応を１０分間進行させ、この時点で乾燥氷上で凍結することによって反応を停止した。解凍後、１０μｌのアリコートを逆相ＨＰＬＣ分析によって分析した。形成されたフコースの量を、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの非存在下で分離アッセイ混合を分析することによって計算し、ＧＤＰ−マンノースの吸収ピークについて１００％値を得た。次いで、このピーク領域を、形成されたＧＤＰ−フコースのピーク領域で割り、形成されたＧＤＰ−フコースのパーセンテージを得た。（％ＧＤＰ−フコース）（反応中のｎＭｏｌｅのＧＤＰ−マンノース）＝形成されたｎＭｏｌｅのＧＤＰ−フコース。
【０１３４】
（Ｇ．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　Ｂによって形成される糖ヌクレオチドの特徴付け）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　ＢがＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−フコースに転換することを確認するために、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　Ｂ抽出物を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で、５ｍｇのＧＤＰ−マンノースおよび６ｍｇのＮＡＤＰＨと反応させた。この反応容量は１ｍｌであった。３時間後、９５％のＧＤＰ−マンノースが、ＧＤＰ−フコースとともに移動した吸収ピークへ転換された。この反応を２ｍｌのメタノールでクエンチし、この沈殿物をペレット化し、そしてこの上清を真空下で乾燥した。次いで、得られた糖ヌクレオチドを、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中で２４時間、３７℃で、シアリル　Ｎ−アセチルラクトサミン（ＳＬＮ；シアリル　Ｌｅｗｉｓｘに対する前駆体）、フコシルトランスフェラーゼＶ（２０ｍユニット）、１ｍＭ　ＭｎＣｌ２と反応した。この反応容量は２００μｌであった。この反応は、ＴＬＣによって判断されるように、およそ８０〜８５％完全であった。このオリゴサッカリド生成物を、２０％エタノールで溶離される、１５ｍｌのＰ２カラム上での精製、およびフォトダイオードアレイ検出装置での溶出のモニターによって、ヌクレオチドおよびタンパク質から分離した。次いで、このオリゴサッカリド生成物を、減圧下で乾燥し、プロトンをＤ２Ｏと交換し、そして５００ＭｈｚのプロトンＮＭＲに供した。この分析は、真のシアリル　Ｌｅｗｉｓｘ含有化合物が形成されることを示し、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　ＢがＧＤＰ−フコースを形成するように協力して作用することを示した。
【０１３５】
（Ｈ．０．２ｋＧスケールにおけるＧＤＰ−フコースの合成）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ（ＧＭＤ）を発現する８００グラムの細菌細胞ペレットを、氷冷した４リットルの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に再懸濁した。この細胞を、微小流動器（ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｚｅｒ）に１回通すことによって破壊し、細片を４，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によってペレット化し、そしてこの上清を、デカンテーションによってペレットから分離した。
【０１３６】
２００グラムのＧＤＰ−マンノース（ＨＰＬＣによって８７％純粋）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手し、そして１リットルの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中に溶解した。この溶液に対して、４リットルのＧＭＤ抽出物（２０００ユニット）を、最終濃度が０．１５ｍＭとなるようにＮＡＤＰ＋と共に添加した。ＧＤＰ−マンノースの最終濃度は、６６ｍＭであった。アジ化ナトリウムを、細菌の増殖を阻害するために０．０５％まで添加した。この反応物を、穏やかに撹拌しながら３２℃でインキュベートし、そしてこの反応後ＨＰＬＣを行った。５時間後、９８％のＧＤＰ−マンノースが、その中間体（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース）に転換し、その時点で、ＧＭＤ上清（１５００ユニット）に同様に由来するＹＥＦ　Ｂを発現する、３００グラムの細菌細胞ペレット由来のＹＥＦ　Ｂ上清を、２０ｍｇのＮＡＤＰＨ、０．６６モルのグルコース（ＧＤＰ−マンノースに対して２モル当量）、および１８００ユニットのグルコースデヒドロゲナーゼと共に、反応混合物に添加した。３２℃でのインキュベーションを、穏やかな撹拌を続けながら一晩続けた。翌朝、１００％の中間体（ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース）が、ＨＰＬＣによって決定されるように、ＧＤＰ−フコースに転換された。この物質を、１０ｋＤのＭＷＣ　接線流膜（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｍｅｍｂｒａｎｃｅ）に通して、タンパク質および細菌性のポリサッカリドを含む高分子量物質を除去した。次いで、ＧＤＰ−フコースを含む溶出液を、８０％までのエタノールの添加によって沈澱させた。４℃での保存後、この上清をデカンテーションし、そして沈澱したＧＤＰ−フコースを４５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、ペレット化した。この上清を除去し、そしてこのペレットを水中で再懸濁し、そして凍結乾燥した。２００グラムのＧＤＰ−マンノースから、１４０グラムのＧＤＰ−フコースを、７２％のモル収率で得た。ＧＤＰ−フコースの純度は、ＧＤＰ−マンノースの純度に類似して、およそ８７％であった。
【０１３７】
（Ｉ．酵素的フコシル化を使用する、１００グラムスケールでのシアリルＬｅｗｉｓ　Ｘ抗原の合成）
およそ１２８グラムまたは０．１５モルのＳＬＮ（シアリルＬｅｗｉｓ　Ｘのテトラサッカリド前駆体）を、１１０グラムまたは０．１８モルのＧＤＰ−フコースに添加し、そして２．５リットルの水中に再懸濁した。５ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）を、５０ｍＭの最終濃度まで添加し、そしてＭｇＣｌ２を２０ｍＭ最終濃度まで添加した。Ａ．ｎｉｇｅｒブロスから精製された１．２４ユニット／ｍｌの４４０ｍｌのフコシルトランスフェラーゼＶ（ＦＴＶ）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ製の６００ユニットのアルカリホスファターゼと共に添加した。アジ化ナトリウムを、０．０４％まで添加した。最終容量は３リットルであった。この反応をＴＬＣ、ＨＰＬＣによってモニターし、ＧＤＰ−フコース、ＧＤＰおよびＭｇＣｌ２のレベルを決定した。この反応のｐＨは、ｐＨメータによってモニターした。ＴＬＣ分析に使用される溶媒系は、イソプロパノール：水　４：１であった。ＴＬＣによって、この反応が終了したと判断された後、シアリルＬｅｗｉｓ　Ｘを、限外濾過を使用して精製した。
【０１３８】
（Ｊ．酵素的な半サイクルを使用する、１ｍｇスケールでのシアリルＬｅｗｉｓ　Ｘ抗原の合成）
半サイクルを、以下の条件を用いて行った（全ての濃度は終濃度である）：ＳＬＮ　５ｍＭ；ＧＤＰ−マンノース、１０ｍＭ；グルコース、１８ｍＭ；ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ；Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ；ＮＡＤＰ＋、０．１２ｍＭ；ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ、１．１６ユニット／ｍｌ；ＹＥＦ　Ｂ　７４０ｍユニット／ｍｌ；グルコースデヒドロゲナーゼ、３３０ｍユニット／ｍｌ；ＦＴＶ、４６ｍユニット／ｍｌ；ピルビン酸キナーゼ、１６．５ユニット／ｍｌ；アジ化ナトリウム、０．０４％。最終容量は２２０μｌであった。この反応を、ＴＬＣおよびＨＰＬＣによってモニターした。
【０１３９】
（結果）
（Ａ．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの特徴付け）
（１．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの発現）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を図２、レーン４に示す。大きなバンドが、４２ｋＤ（推定分子量）に存在する；このバンドは、ベクター単独のコントロール（レーン１）またはＹＥＦ　Ｂ（レーン２および３）を発現する細胞には存在しない。
【０１４０】
（２．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの特徴付け）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの酵素活性を特徴付けするために、リニア（ｌｉｎｅａｒ）ＨＰＬＣアッセイが開発された。このアッセイ（これは、ＧＤＰ−マンノースとＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースとＧＤＰフコースとの間の疎水性の差異に基づく）は、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−ガラクトースおよびＧＤＰ−フコースを分離し得る。関連するクロマトグラムを図３に示す。上側のクロマトグラムは、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの存在下、１分後のＧＤＰ−マンノースを示し、そして下側のクロマトグラムは、５５分後の同一の反応を示す。クロマトグラムにより示されるように、ＧＤＰ−マンノースの９８％より多くは、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換されている。この生成物が、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースであることの証明を、ＮＡＤＰＨおよびＹＥＦ　Ｂまたは生成物をＧＤＰフコースに転換するＦｘタンパク質の添加によって実証する。このアッセイの顕著な特徴は、以下である：１）ＧＤＰ−マンノースの減少を付随する、カラムにより分離されるＧＤＰ−マンノース４，６デヒドラターゼ（ＧＤＰ−マンノースの減少が、加水分解活性に起因しないことを実証するために内部標準として作用する）によって形成される中間体の増加が存在すること、および２）定量的な再現性。
【０１４１】
（３．ＧＤＰマンノースデヒドラターゼアッセイの経時的な直線性）
ＧＤＰマンノースデヒドラターゼアッセイの経時的な直線性を実証するために、標準的なアッセイを、単一のエッペンドルフチューブ中で行い、そして１０μｌのアリコートを０〜３０分の時間範囲で取り除き、逆相ＨＰＬＣ分析の前にドライアイスで速やかに凍結した。サンプルを解凍し、そして速やかにアクアシル（ａｑｕａｓｉｌ）逆相ＨＰＬＣカラムに注入した。図４に示されるように、このアッセイは、３０分まで直線である。驚くべきことに、基質の９０％までを消費した場合でさえ、このアッセイは直線のままであった。これは、ＧＤＰマンノースの濃度が、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼのＫｍより上のままであること、およびＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースが酵素を阻害しないことを示す。
【０１４２】
（４．至適ｐＨ）
この酵素の至適ｐＨを決定するために、ｐＨを、緩衝液として５０ｍＭ　ＭＥＳまたはＴｒｉｓを用いてｐＨ６．５〜８．０に変化させ、そして標準的なアッセイを行った。表４は、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼのｐＨプロフィールを示し、そして７．０の至適ｐＨを例示する。ｐＨ７．０より下では、活性はｐＨ７．０の活性の約７０％であり、一方７．０より上のｐＨでは、中程度の活性の減少のみを得る。
【０１４３】
【表４】
2004512002.tif 000012
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼを、エピメラーゼ／レダクターゼおよびフコシルトランスフェラーゼ（この両方とも７．５の至適ｐＨを有する）と共に用いるので、標準的アッセイの作用ｐＨとしてｐＨ７．５を選択した。
【０１４４】
（５．ＮＡＤＰ依存）
ＮＡＤＰ＋の非存在下アッセイした場合、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼは、完全に不活性である。さらに、ＮＡＤ＋は、ＮＡＤＰ＋に置換しない。さらに、アルカリフォスファターゼをこのアッセイに含む場合、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ活性は激しく減弱される。このデータを以下の表５に示す。
【０１４５】
【表５】
2004512002.tif 000013
（６．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼは、２価カチオンに依存しない）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼを、１〜２０ｍＭの濃度範囲のＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２の存在下か、または非存在下において標準的アッセイ条件下でアッセイした場合、本質的に活性に対する効果はまったく観察されなかった。これらの結果を、表６に例示する。
【０１４６】
【表６】
2004512002.tif 000014
（７．ＧＤＰ−フコースによるＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの阻害）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼは、ＧＤＰフコース生合成において最初に関与する工程を表すので、ＧＤＰ−フコースは、この酵素のフィードバックインヒビターである可能性がある。これが真実かどうか決定するために、標準的なアッセイを、漸増量のＧＤＰ−フコースの存在下で行う。図５は、阻害曲線を示す。ＧＤＰ−フコースは、約４０μＭのＩＣ５０を有するこの酵素の強力なインヒビターであることは明らかである。これは、フコシル化オリゴ糖を合成する観点からすると非常に重要である。なぜならば、合成プロセスは、１）フコシルトランスフェラーゼによるオリゴ糖鎖へのフコースの添加と共に生じるＧＤＰ−フコースを反応混合物から取り除くか；２）あるいは全てのＧＤＰ−マンノースを、その中間体（ＧＤＰ−フコースに転換する前のＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース）に転換することを必要とするからである。
【０１４７】
（Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＹＥＦ　Ｂ、ｗｃａＨ、およびヒトＦｘの特徴付け）
（１．ＹＥＦ　Ｂ　発現）
発現について試験するために、これらのプラスミドを保有する細菌を増殖し、溶解し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図２）。これらの溶解物を、ｐＴＧＫベクターのみを保有する細菌溶解物（レーン１）と比較した。２つの別々のＹＥＦ　Ｂクローン（レーン２および３）を保有する溶解物は、ベクターのみを保有する細菌（レーン１）由来の溶解物には存在しない３６．５Ｋｄの高発現タンパク質を示す。ＹＥＦ　Ｂの推定分子量は、３６．５Ｋｄである（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４８８５−４８９３；Ｔｏｎｅｔｔｉら、前出）。
【０１４８】
（２．ｗｃａＨおよびヒトＦｘ発現）
図６に示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥは、それぞれ発現ベクターｐＴＧＫ：ｗｃａＨおよびｐＴＧＫ：ヒトＦｘ（ｐＴＧＫ：Ｆｘ）由来のＥ．ｃｏｌｉにおけるｗｃａＨおよびヒトＦｘの発現を示す。大きなバンドを、ｗｃａＨに関して観察した。幾分予想外なことに、ヒトＦｘタンパク質もまた、この発現系を用いる細菌において有意なレベルで発現した。
【０１４９】
（３．ＹＥＦ　ＢおよびヒトＦｘ活性のアッセイ）
ＹＥＦ　ＢおよびヒトＦｘを、方法に記載されるように疎水性に基づき、ＧＤＰ−４−ケトー６−デオキシマンノース、ＧＤＰ−４−ケトー６−デオキシグルコース、およびＧＤＰ−フコースからＧＤＰ−マンノースを分離するＨＰＬＣ方法を用いてアッセイした。図７Ａは、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの添加５５分後のＨＰＬＣ分析を示す。本質的に全てのＧＤＰ−マンノースは、消費され、そして中間体生成物に転換されている。このアッセイ混合物へのＹＥＦ　ＢおよびＮＡＤＰＨの添加に際して、ピークはＧＤＰ−フコースと同じかつＧＤＰ−フコースと共に移動（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｅ）する吸収スペクトルを有する（図７Ｂ）。無関係な抽出物をＹＥＦ　Ｂ抽出物（ｐＴＧＫプラスミドのみを保有するＪＭ１０１細胞由来の抽出物）の代わりに用いる場合、ＧＤＰ−フコース吸収ピークは出現しない。
【０１５０】
これはＧＤＰマンノースデヒドラターゼが、ＹＥＦ　Ｂと共に作用しＧＤＰ−フコースを形成することを示す。従って、ＹＥＦ　Ｂ（そのヒト相同体であるＦｘに類似する）は、エピメラーゼおよびレダクターゼの両方である。ＹＥＦ　Ｂを、シバクロンブルークロマトグラフィーによって精製する場合、同一の結果が得られ、ＹＥＦ　Ｂが単一の酵素においてエピメラーゼおよびレダクターゼ活性の両方をコードするさらなる証拠を提供する。
【０１５１】
ヒトＦｘタンパク質もまた、ＹＥＦ　Ｂの約１０倍少ないレベルだが、このアッセイにおいて有意な活性を示した。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから推定された発現レベルを反映する。
【０１５２】
（４．至適ｐＨ）
ＭＥＳおよびＴｒｉｓを緩衝液として用いて、このアッセイｐＨを６．５〜８．０に変更した。この標準的なアッセイ混合物は、２０ｍユニットのＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ、４８０ｎｍｏｌｅ　ＧＤＰ−マンノース、５００ｎｍｏｌｅ　グルコース、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１０ｍユニットのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＹＥＦ　Ｂに利用されるＮＡＤＰＨを再循環するため）、適切なｐＨの５０ｍＭ　緩衝液および適切な希釈のＹＥＦ　Ｂを含んだ。この反応を、３７℃で１５分間進行させ、そして速やかにドライアイスで凍結し反応を停止した。１０μｌのアリコートを、解凍後に取り除き、そして逆相ＨＰＬＣによって分析した。表７に示されるように、ＹＥＦ　Ｂは、７．５の至適ｐＨを有する。
【０１５３】
【表７】
2004512002.tif 000015
（５．金属イオン要求性）
金属イオン要求性を研究するために、標準的なアッセイ条件をＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２の濃度を変えて添加して行った。これらの二価カチオンを選択した。なぜならば、ＹＥＦ　Ｂは、フコースサイクルで利用され得、そしてフコシルトランスフェラーゼＶは、活性にＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２のいずれかを必要とするからである。表８にこの結果を示す。これは、フコシルトランスフェラーゼＶ活性に必要とされる濃度のＭｎＣｌ２によって、用量依存様式でＹＥＦ　Ｂを激しく阻害することを示す。対照的にＭｇＣｌ２は、実際、やや刺激性である。従って、フコース「ハーフサイクル」を、ＭｎＣｌ２の存在下ではなくＭｇＣｌ２の存在下で、好ましくは実行する。
【０１５４】
【表８】
2004512002.tif 000016
（６．経時的直線性）
結合したＹＥＦ　Ｂアッセイの直線性を経時的に決定するために、標準的なアッセイ条件を行った。１０μｌのアリコートを、３０分にわたり同じバイアルから取り除いた。ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼを含まない別のチューブを、１００％コントロールとして用いた。図８は、このアッセイの結果を時間に対して示す。このアッセイは、時間に対して直線ではないが、それは活性のすぐれた近似を提供する。直線性の欠落の可能性のある説明としては、エピマー化工程か、還元工程か、またはそれら両方の生成物阻害が挙げられる。とにかく、このアッセイの利用は、２０リットルの発酵が、６００〜７００ユニット／リットル（目的のシアル酸ルイスＸ抗原または他のフコシル化オリゴ糖の数キログラムの合成に十分な量）を生じることを示す。
【０１５５】
（７．ＧＤＰ−マンノースからの０．２ｋＧスケールでのＧＤＰ−フコースの生成）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　Ｂを、ＧＤＰ−フコースをスケールで生成するために使用され得ることを実証するために、２００グラムのＧＤＰ−マンノースを、ＧＤＰ−フコースに転換した。これは、２０００ユニットのＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよび２０００ユニットのＹＥＦ　Ｂを用いて達成した。ＧＤＰ−マンノースのその中間体への完全な転換を達成するために、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース、ＹＥＦ　Ｂおよびグルコースデヒドロゲナーゼを、全てのＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換した後に添加しなければならない。なぜならば、ＧＤＰ−フコース（ＹＥＦ　Ｂの生成物）は、ＧＤＰ−マンノースデヒドロゲナーゼの４０μＭのインヒビターであるからである（図５を参照のこと）。反応混合物中のＧＤＰ−マンノース濃度が約６５ｍＭであるので、一度ＹＥＦ　Ｂを（ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨを再循環するためにグルコースデヒドロゲナーゼと共に）添加すると、ＧＤＰ−マンノースデヒドロゲナーゼによるＧＤＰ−マンノースのその中間体への転換を停止する。従って、この反応を、好ましくは、ＨＰＬＣによって厳密にモニターし、消費したＧＤＰ−マンノースの量および生成したＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースの量を追跡する。
【０１５６】
一度ＧＤＰ−マンノースを、その中間体へ完全に転換すると、２０００ユニットのＹＥＦ　Ｂ、９００ユニットのグルコースデヒドロゲナーゼ、１グラムのＮＡＤＰＨおよび１．２モル等量のグルコース（ＧＤＰ−マンノースに比例して）を、反応混合物に添加し、そして３５℃で一晩インキュベートした。この混合物を、混合物を１０ｋＤ　ＭＷＣタンジェンシャルフロー濾過デバイス（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｄｅｖｉｃｅ）を通過することによって処理し、大部分のタンパク質および多糖類を取り除いた。このＧＤＰ−フコースを精製し、そして限外濾過によって濃縮し、次いで８０％までエタノールを添加することによって沈殿した。この沈殿工程は、限外濾過工程によって取り除かれない遊離単糖（グルコースおよびグルコナート）を効果的に取り除いた。１モル：モル基準で、これは、約６５％の収量に等しい。ＨＰＬＣ分析を、反応が完了したことを確認するために用いた（図９）。
【０１５７】
（８．１００グラムスケールでのシアル酸ルイスＸ抗原前駆体のフコシル化）
シアル酸ルイスＸ抗原および他の生物活性炭水化物の大規模合成に関する、細菌のＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　Ｂの有用性を実証するために、シアル酸ルイスＸ抗原の４糖類前駆体であるＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌ−ＯＲ（ＳＬＮ）をフコシル化し、シアル酸ルイスＸ抗原を形成する１００グラムの反応を行った。ＳＬＮのシアル酸ルイスＸ抗原への転換を、ＨＰＬＣ、ＴＬＣおよびｐＨ電極によるｐＨによってモニターした。このアッセイの結果を、図１０に示す。ここで、シアル酸ルイスＸ抗原の形成を、遊離ＧＤＰ濃度の増加を検出することによってモニターする。この反応混合物のｐＨもまた示す。ＧＤＰを、無機リン酸を遊離するアルカリホスファターゼによって加水分解したので、反応のｐＨは低下した。図１１に示すように、遊離した無機リン酸はまた、マグネシウムイオンと沈殿を形成し、遊離マグネシウムイオンの濃度を減少する。
【０１５８】
ｐＨの低下およびマグネシウムイオンの減少は、以下の２つの理由のため劇的に反応を遅くする：１）ｐＨが低下するので、アルカリホスファターゼの活性は、激しく阻害され、ＧＤＰを生じ、フコシルトランスフェラーゼを阻害するレベルを増強する；および２）フコシルトランスフェラーゼＶは、至適活性のために２０ｍＭの濃度のマグネシウムを必要とする。従って、マグネシウムの濃度が減少するので、フコシルトランスフェラーゼの活性もまた低下する。従って、反応ｐＨおよびマグネシウム濃度を、好ましくは、モニターし、そして反応にＭｇＣｌ２を補充し、ＮａＯＨの添加によってｐＨを８．０に保つ。仔牛腸ホスファターゼは、９．５の至適ｐＨを有し、そしてｐＨ８．０ではその活性の１０％のみを有するので、天然のホスファターゼ（天然のｐＨ活性を有する）は、この反応に最適である。
【０１５９】
反応は、初めは非常に急速に進行することは図１２から明らかであり、次いで劇的に遅くなる。これは、上記に議論されるようにＧＤＰの増強およびマグネシウムの減少に起因した。一度ｐＨが８．０に上がると、このレベルで維持され、そしてこの反応に、アルカリホスファターゼおよびマグネシウムを補充した（この反応の５０時間目に行う）。この反応は、反応を補充するために添加された１５グラムのＧＤＰ−フコースで、完了の９５％より高くまで進行する。
【０１６０】
（９．１００グラムスケールでの最終シアル酸ルイスＸ抗原反応生成物のＮＭＲ分析）
最終反応生成物を、限外濾過によって精製し、ＮＭＲ分析に供し、フコースのＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌ−ＯＲへの添加を確認した。図１３に５００ＭｈｚのプロトンＮＭＲスペクトルおよびフコースについての適切なケミカルシフトを示す。このスペクトルは、標準のシアル酸ルイスＸ抗原と一致し、そしてＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　Ｂの関連した作用か、ＧＤＰ−フコースを形成することを確認する。次いで、この供与体基質を、フコシルトランスフェラーゼによって利用し、フコシル化オリゴ糖（この例において、シアル酸ルイスＸ抗原）を合成し得る。
【０１６１】
（１０．酵素的ハーフサイクルを用いたＳＬＮのシアル酸ルイスＸ抗原への転換）
以前の実験は、アルカリホスファターゼが、その補因子（ＮＡＤＰ）リン酸基の切断によってＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼを不活性化することを実証した（表５を参照のこと）。従って、アルカリホスファターゼを、ＧＤＰのその遊離ヌクレオチドへの加水分解に利用し得ない。ＧＤＰは、フコシルトランスフェラーゼの強力なインヒビターであるので、ＧＤＰの除去が、この反応を完了させるために必要とされる（Ｓｈｉｎｏｄａら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１９９２−３１９９７）。ＧＤＰの除去を達成するために、ＧＤＰのＧＴＰへの転換を試みた。ＧＴＰは、ＧＤＰよりも１０倍弱いフコシルトランスフェラーゼＶの強力なインヒビターである。ＧＤＰのＧＴＰへの転換のために、ＰＥＰおよびピルビン酸キナーゼを反応混合物に用いた。このＧＤＰ−マンノースハーフサイクルフコシルトランスフェラーゼ反応についての概略を図１４に示す。図１５のＴＬＣによって示されるように、５ｍＭ　ＳＬＮおよび１０ｍＭ　ＧＤＰ−マンノースからなるこの反応を、２日後の約９５％の完了まで進行する。ＧＤＰ−マンノース対して１０モル倍過剰のＰＥＰをこの反応の完了に必要とする。
【０１６２】
以下の２つの重要な結果が、この実験から明らかとなる：１）ＧＤＰがＧＴＰへ転換される場合、ＧＤＰ−マンノースハーフサイクルをほぼ完了まで続けることが可能である；および２）ヘキソキナーゼ、ホスホマンノムターゼおよびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼの添加でマンノースから始まる全サイクルは、効果的な反応を生じることの強力な証拠を提供する。完全なフコシルトランスフェラーゼサイクルの例示については図１５を参照のこと、ここでＧＤＰ−フコースはマンノースから合成される。
【０１６３】
本明細書に記載される本実施例および実施態様は、例示的目的のみのためであり、そしてそれらを考慮した種々の改変および変更は、当業者に示唆され、そして本出願の意図および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることを理解される。本明細書で引用される全ての出版物、特許、および特許出願は、全ての目的においてその結果参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素的転換の概略図を示す。
【図２】
図２は、ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素に関する発現プラスミドを保有する細菌細胞からの抽出物の８〜１５％　ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析を示す。分子量スタンダードは、２つの外側のレーンである。抽出物は、発現ベクターｐＴＧＫ、ｐＴＧＫ：ＹＥＦ　Ｂ、ｐＴＧＫ：ｗｃａＨ、およびｐＴＧＫ：ＧＭＤを含む細胞由来である。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１、ｐＴＧＫ溶解産物；レーン２、ｐＴＧＫ：ＹＥＦ　Ｂ１溶解産物；レーン３、ｐＴＧＫ：ＹＥＦ　Ｂ２溶解産物；レーン４、ｐＴＧＫ：ＧＭＤ溶解産物。
【図３】
図３は、発現ベクターｐＴＧＫ：ＧＭＤから発現されたＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼを使用して得られた反応産物の、ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図４】
図４は、ＧＭＤの活性が経時的に直線的であるか否かを試験するために設計したアッセイの結果を示す。
【図５】
図５は、ＧＤＰ−フコースがＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）の強力なインヒビターであることを示す。
【図６】
図６は、ｗｃａＨおよびヒトＦｘがＥ．ｃｏｌｉ中の対応する発現ベクターによって発現されることを示す。この分析は、８〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて還元条件下で行った。
【図７】
図７Ａは、ＹＥＦ　Ｂの活性を決定するための共役アッセイの第１の工程として、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ活性についてのアッセイの結果を示す。図７は、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼ反応の完了後の、反応混合物へのＹＥＦ　Ｂの添加の効果を示す。
【図８】
図８は、共役したＧＭＤ−ＹＥＦ　Ｂアッセイの時間経過の結果を示す。
【図９】
図９は、ＧＭＤおよびＹＥＦ　Ｂを使用した、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの大規模転換の結果を示す。
【図１０】
図１０は、経時的なシアリルルイスＸの形成（ＧＤＰの増加により示される）を示す。また、反応の結果生じる反応混合物のｐＨの減少が示される。
【図１１】
図１１は、シアリルルイスＸの合成の間の経時的な、Ｍｇ２＋の濃度変化を示す。
【図１２】
図１２は、大規模なシアリルルイスＸの合成反応の時間経過を示す。サンプルを反応混合物から得、そしてＴＬＣで分析した。左から右へ、レーンは以下の通りである：レーン１、反応１６０時間；レーン２、１４７時間；レーン３、ＳＬＮ；レーン４、４３時間；レーン５、１時間。
【図１３】
図１３は、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌ−ＯＲを基質として使用した、大規模なフコシル化反応で得られた最終生成物のＮＭＲ分析を示す。
【図１４】
図１４は、ＧＤＰ−マンノース半サイクルのフコシルトランスフェラーゼ反応の概略図を示す。
【図１５】
図１５は、ＧＤＰ−マンノースフコシルトランスフェラーゼ半サイクル反応の生成物のＴＬＣ分析を示す。左から右に：レーン１、ＳＬＮ；レーン２、反応２日め；レーン３、シアリルルイスＸ。
【図１６】
図１６は、マンノースフコシルトランスフェラーゼ全サイクル反応の概略図を示す。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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2004512002.tif 000104
2004512002.tif 000105
【手続補正書】
【提出日】平成12年4月24日(2000.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
【表１】
2004512002.tif 000106
エピメラーゼ／レダクターゼをコードする核酸をクローニングする代替的なものとして、適切な核酸は、ＹＥＦ　Ｂポリペプチドまたは、エピメラーゼ活性およびレダクターゼ活性の両方を有する関連する酵素をコードする公知の配列から、化学合成され得る。直接的な化学合成方法は、たとえば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９；のホスホトリエステル方法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のホスホジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２のジエチルホスホロアミダイト（ｄｉｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）方法：１８５９−１８６２；および米国特許第４，４５８，０６６の固体支持体方法を含む。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的配列でのハイブリダイゼーションによるか、またはその一本鎖を鋳型として使用するＤＮＡポリメラーゼを用いるポリマー化により、二本鎖ＤＮＡに転換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成が、しばしば、約１００塩基の配列に制限されるが、より長い配列がより短い配列の連結により得られ得ることを認識する。あるいは、サブ配列はクローン化され得、そして適切なサブ配列は、適切な制限酵素を使用して切断され得る。次いで、そのフラグメントは、所望のＤＮＡ配列を生成するために連結され得る。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
代替の実施態様において、フコシルトランスフェラーゼ反応に関連して生成されるＧＤＰは、ＧＴＰに転換される。ＧＴＰは、フコシルトランスフェラーゼもしくはＧＭＤを阻害しない。例えば、この反応混合物は、キナーゼおよび対応する基質を含み得る。適切なキナーゼとしては、例えば、ポリリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．４．１．）、ヌクレオシドリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．４．４）、クレアチンキナーゼ（ＥＣ２．７．３．２）；ミオキナーゼ（ＥＣ２．７．４．３）；ミオキナーゼ（ＥＣ２．７．４．３）；アセチルキナーゼ（例えば、ＥＣ２．７．１．５９）；アセチルリン酸キナーゼ；およびピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）が挙げられる。これらの酵素に適切な基質は、当業者に公知である。この実施態様を組み込む反応スキームを、図９に示す。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
好ましい実施態様において、ＧＤＰ−フコース合成酵素を、酵素サイクルにおいて使用する。適切な酵素サイクルは、図７に示されるような半サイクル（これは、開始物質としてＧＤＰ−マンノースを使用する）および図８に示されるような完全サイクル（これは、開始物質としてマンノースを使用する）を含む。ＧＤＰ−マンノース半サイクルの例（図７）は、グルコースデヒドロゲナーゼを使用して、酵素的にＮＡＤＰＨ（エピメラーゼ／レダクターゼポリペプチドに必要とされる補因子）およびフコシルトランスフェラーゼＶを再利用してフコースをＳＬＮに転移し、これにより、シアリル−Ｌｅｗｉｓｘ化合物の形成を生じる。ＧＤＰは、フコシルトランスフェラーゼおよびＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの両方を阻害するので、ＧＤＰを切断し得るがＮＡＤＰからリン酸を切断しないホスファターゼを、好ましくは、このサイクルに添加する。ＭｇＣｌ２が、２価のカチオンの供給源として好ましい。なぜなら、ＹＥＦ　Ｂが、ＭｇＣｌ２により阻害されるからである。ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびエピメラーゼ／レダクターゼポリペプチドに加えて、ＧＤＰ−マンノース半フコシルトランスフェラーゼサイクルは、好ましくは以下を含む：ＮＡＤＰＨを再生利用する酵素（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ）、ＮＡＤＰＨ再生酵素のための基質（例えば、グルコースまたはガラクトース）、フコシルトランスフェラーゼ、アクセプターオリゴサッカリドまたはアクセプター複合糖質、ＮＡＤＰ、ＧＤＰ−マンノース、および緩衝液系。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
あるいは、これらの酵素を、図８に示されるように、「マンノース完全サイクル」において使用し得る。ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびエピメラーゼ／レダクターゼポリペプチドを、完全な、または「完全」マンノースフコシルトランスフェラーゼサイクルにおいて、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ−ホスホマンムターゼ、ヘキソキナーゼ、およびピルベートキナーゼと組合せて使用し得る。この完全サイクルにより、単にマンノースおよび所望のアクセプターサッカリドを開始物質として使用することが可能である。組換え酵素または天然に存在する酵素のいずれかを、使用し得る。完全サイクル反応に関しては、その反応混合物には、好ましくは、ホスファターゼを含まない。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
（結果）
（Ａ．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの特徴付け）
（１．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの発現）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。大きなバンドが、４２ｋＤ（推定分子量）に存在した；このバンドは、ベクター単独のコントロールまたはＹＥＦ　Ｂを発現する細胞には存在しなかった。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
（２．ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの特徴付け）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの酵素活性を特徴付けするために、リニア（ｌｉｎｅａｒ）ＨＰＬＣアッセイが開発された。このアッセイ（これは、ＧＤＰ−マンノースとＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースとＧＤＰフコースとの間の疎水性の差異に基づく）は、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−ガラクトースおよびＧＤＰ−フコースを分離し得る。このアッセイ（これは、ＧＤＰ−マンノースとＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースとＧＤＰフコースとの間の疎水性の差異に基づく）は、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−ガラクトースおよびＧＤＰ−フコースを分離し得る。クロマトグラフィー分析は、ＧＤＰ−マンノースの９８％より多くが、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換されていたことを示した。クロマトグラムにより示されるように、ＧＤＰ−マンノースの９８％より多くは、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換されている。この生成物が、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースであることの証明を、ＮＡＤＰＨおよびＹＥＦ　Ｂまたは生成物をＧＤＰフコースに転換するＦｘタンパク質の添加によって実証する。このアッセイの顕著な特徴は、以下である：１）ＧＤＰ−マンノースの減少を付随する、カラムにより分離されるＧＤＰ−マンノース４，６デヒドラターゼ（ＧＤＰ−マンノースの減少が、加水分解活性に起因しないことを実証するために内部標準として作用する）によって形成される中間体の増加が存在すること、および２）定量的な再現性。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
（３．ＧＤＰマンノースデヒドラターゼアッセイの経時的な直線性）
ＧＤＰマンノースデヒドラターゼアッセイの経時的な直線性を実証するために、標準的なアッセイを、単一のエッペンドルフチューブ中で行い、そして１０μｌのアリコートを０〜３０分の時間範囲で取り除き、逆相ＨＰＬＣ分析の前にドライアイスで速やかに凍結した。サンプルを解凍し、そして速やかにアクアシル（ａｑｕａｓｉｌ）逆相ＨＰＬＣカラムに注入した。図２に示されるように、このアッセイは、３０分まで直線である。驚くべきことに、基質の９０％までを消費した場合でさえ、このアッセイは直線のままであった。これは、ＧＤＰマンノースの濃度が、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼのＫｍより上のままであること、およびＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースが酵素を阻害しないことを示す。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
【表６】
2004512002.tif 000107
（７．ＧＤＰ−フコースによるＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの阻害）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼは、ＧＤＰフコース生合成において最初に関与する工程を表すので、ＧＤＰ−フコースは、この酵素のフィードバックインヒビターである可能性がある。これが真実かどうか決定するために、標準的なアッセイを、漸増量のＧＤＰ−フコースの存在下で行う。図３は、阻害曲線を示す。ＧＤＰ−フコースは、約４０μＭのＩＣ５０を有するこの酵素の強力なインヒビターであることは明らかである。これは、フコシル化オリゴ糖を合成する観点からすると非常に重要である。なぜならば、合成プロセスは、１）フコシルトランスフェラーゼによるオリゴ糖鎖へのフコースの添加と共に生じるＧＤＰ−フコースを反応混合物から取り除くか；２）あるいは全てのＧＤＰ−マンノースを、その中間体（ＧＤＰ−フコースに転換する前のＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース）に転換することを必要とするからである。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
（Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉで発現されるＹＥＦ　Ｂ、ｗｃａＨ、およびヒトＦｘの特徴付け）
（１．ＹＥＦ　Ｂ　発現）
発現について試験するために、これらのプラスミドを保有する細菌を増殖し、溶解し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。これらの溶解物を、ｐＴＧＫベクターのみを保有する細菌溶解物と比較した。２つの別々のＹＥＦ　Ｂクローンを保有する溶解物は、ベクターのみを保有する細菌由来の溶解物には存在しない３６．５Ｋｄの高発現タンパク質を示す。ＹＥＦ　Ｂの推定分子量は、３６．５Ｋｄである（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、（１９９６）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４８８５−４８９３；Ｔｏｎｅｔｔｉら、前出）。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
（２．ｗｃａＨおよびヒトＦｘ発現）
発現ベクターｐＴＧＫ：ｗｃａＨおよびｐＴＧＫ：ヒトＦｘ（ｐＴＧＫ：Ｆｘ）由来のＥ．ｃｏｌｉにおけるｗｃａＨおよびヒトＦｘの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験した。大きなバンドを、ｗｃａＨに関して観察した。幾分予想外なことに、ヒトＦｘタンパク質もまた、この発現系を用いる細菌において有意なレベルで発現した。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
（３．ＹＥＦ　ＢおよびヒトＦｘ活性のアッセイ）
ＹＥＦ　ＢおよびヒトＦｘを、方法に記載されるように疎水性に基づき、ＧＤＰ−４−ケトー６−デオキシマンノース、ＧＤＰ−４−ケトー６−デオキシグルコース、およびＧＤＰ−フコースからＧＤＰ−マンノースを分離するＨＰＬＣ方法を用いてアッセイした。このＨＰＬＣ分析は、ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼの添加５５分後に、本質的に全てのＧＤＰ−マンノースが、消費され、そして中間体生成物に転換されていることを示した。このアッセイ混合物へのＹＥＦ　ＢおよびＮＡＤＰＨの添加に際して、ピークはＧＤＰ−フコースと同じかつＧＤＰ−フコースと共に移動（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｅ）する吸収スペクトルを有する。無関係な抽出物をＹＥＦ　Ｂ抽出物（ｐＴＧＫプラスミドのみを保有するＪＭ１０１細胞由来の抽出物）の代わりに用いる場合、ＧＤＰ−フコース吸収ピークは出現しない。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
【表８】
2004512002.tif 000108
（６．経時的直線性）
結合したＹＥＦ　Ｂアッセイの直線性を経時的に決定するために、標準的なアッセイ条件を行った。１０μｌのアリコートを、３０分にわたり同じバイアルから取り除いた。ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼを含まない別のチューブを、１００％コントロールとして用いた。図４は、このアッセイの結果を時間に対して示す。このアッセイは、時間に対して直線ではないが、それは活性のすぐれた近似を提供する。直線性の欠落の可能性のある説明としては、エピマー化工程か、還元工程か、またはそれら両方の生成物阻害が挙げられる。とにかく、このアッセイの利用は、２０リットルの発酵が、６００〜７００ユニット／リットル（目的のシアル酸ルイスＸ抗原または他のフコシル化オリゴ糖の数キログラムの合成に十分な量）を生じることを示す。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
（７．ＧＤＰ−マンノースからの０．２ｋＧスケールでのＧＤＰ−フコースの生成）
ＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　Ｂを、ＧＤＰ−フコースをスケールで生成するために使用され得ることを実証するために、２００グラムのＧＤＰ−マンノースを、ＧＤＰ−フコースに転換した。これは、２０００ユニットのＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよび２０００ユニットのＹＥＦ　Ｂを用いて達成した。ＧＤＰ−マンノースのその中間体への完全な転換を達成するために、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース、ＹＥＦ　Ｂおよびグルコースデヒドロゲナーゼを、全てのＧＤＰ−マンノースをＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースに転換した後に添加しなければならない。なぜならば、ＧＤＰ−フコース（ＹＥＦ　Ｂの生成物）は、ＧＤＰ−マンノースデヒドロゲナーゼの４０μＭのインヒビターであるからである（図３を参照のこと）。反応混合物中のＧＤＰ−マンノース濃度が約６５ｍＭであるので、一度ＹＥＦ　Ｂを（ＮＡＤＰＨおよびＮＡＤＰＨを再循環するためにグルコースデヒドロゲナーゼと共に）添加すると、ＧＤＰ−マンノースデヒドロゲナーゼによるＧＤＰ−マンノースのその中間体への転換を停止する。従って、この反応を、好ましくは、ＨＰＬＣによって厳密にモニターし、消費したＧＤＰ−マンノースの量および生成したＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースの量を追跡する。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
一度ＧＤＰ−マンノースを、その中間体へ完全に転換すると、２０００ユニットのＹＥＦ　Ｂ、９００ユニットのグルコースデヒドロゲナーゼ、１グラムのＮＡＤＰＨおよび１．２モル等量のグルコース（ＧＤＰ−マンノースに比例して）を、反応混合物に添加し、そして３５℃で一晩インキュベートした。この混合物を、混合物を１０ｋＤ　ＭＷＣタンジェンシャルフロー濾過デバイス（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｄｅｖｉｃｅ）を通過することによって処理し、大部分のタンパク質および多糖類を取り除いた。このＧＤＰ−フコースを精製し、そして限外濾過によって濃縮し、次いで８０％までエタノールを添加することによって沈殿した。この沈殿工程は、限外濾過工程によって取り除かれない遊離単糖（グルコースおよびグルコナート）を効果的に取り除いた。１モル：モル基準で、これは、約６５％の収量に等しい。ＨＰＬＣ分析を、反応が完了したことを確認するために用いた。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
（８．１００グラムスケールでのシアル酸ルイスＸ抗原前駆体のフコシル化）
シアル酸ルイスＸ抗原および他の生物活性炭水化物の大規模合成に関する、細菌のＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　Ｂの有用性を実証するために、、シアル酸ルイスＸ抗原の４糖類前駆体であるＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌ−ＯＲ（ＳＬＮ）をフコシル化し、シアル酸ルイスＸ抗原を形成する１００グラムの反応を行った。ＳＬＮのシアル酸ルイスＸ抗原への転換を、ＨＰＬＣ、ＴＬＣおよびｐＨ電極よるｐＨによってモニターした。このアッセイの結果を、図５に示す。ここで、シアル酸ルイスＸ抗原の形成を、遊離ＧＤＰ濃度の増加を検出することによってモニターする。この反応混合物のｐＨもまた示す。ＧＤＰを、無機リン酸を遊離するアルカリホスファターゼによって加水分解したので、反応のｐＨは低下した。図６に示すように、遊離した無機リン酸はまた、マグネシウムイオンと沈殿を形成し、遊離マグネシウムイオンの濃度を減少する。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
大規模のシアル酸ルイスＸ合成反応の時間経過分析は、この反応が初めは非常に急速に進行し、次いで劇的に遅くなることを示した。これは、上記に議論されるようにＧＤＰの増強およびマグネシウムの減少に起因した。一度ｐＨが８．０に上がると、このレベルで維持され、そしてこの反応に、アルカリホスファターゼおよびマグネシウムを補充した（この反応の５０時間目に行う）。この反応は、反応を補充するために添加された１５グラムのＧＤＰ−フコースで、完了の９５％より高くまで進行する。サンプルを、１、４３、１４７、および１６０時間目に得た。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
（９．１００グラムスケールでの最終シアル酸ルイスＸ抗原反応生成物のＮＭＲ分析）
最終反応生成物を、限外濾過によって精製し、ＮＭＲ分析に供し、フコースのＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌ−ＯＲへの添加を確認した。このスペクトルは、標準のシアル酸ルイスＸ抗原と一致し、そしてＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼおよびＹＥＦ　Ｂの関連した作用か、ＧＤＰ−フコースを形成することを確認する。次いで、この供与体基質を、フコシルトランスフェラーゼによって利用し、フコシル化オリゴ糖（この例において、シアル酸ルイスＸ抗原）を合成し得る。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
（１０．酵素的ハーフサイクルを用いたＳＬＮのシアル酸ルイスＸ抗原への転換）
以前の実験は、アルカリホスファターゼが、その補因子（ＮＡＤＰ）リン酸基の切断によってＧＤＰ−マンノースデヒドラターゼを不活性化することを実証した（表５を参照のこと）。従って、アルカリホスファターゼを、ＧＤＰのその遊離ヌクレオチドへの加水分解に利用し得ない。ＧＤＰは、フコシルトランスフェラーゼの強力なインヒビターであるので、ＧＤＰの除去が、この反応を完了させるために必要とされる（Ｓｈｉｎｏｄａら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３１９９２−３１９９７）。ＧＤＰの除去を達成するために、ＧＤＰのＧＴＰへの転換を試みた。ＧＴＰは、ＧＤＰよりも１０倍弱いフコシルトランスフェラーゼＶの強力なインヒビターである。ＧＤＰのＧＴＰへの転換のために、ＰＥＰおよびピルビン酸キナーゼを反応混合物に用いた。ＧＤＰは、このＧＤＰ−マンノースハーフサイクルフコシルトランスフェラーゼ反応についての概略を図７に示す。ＴＬＣ分析は、５ｍＭ　ＳＬＮおよび１０ｍＭ　ＧＤＰ−マンノースからなるこの反応が、２日後に約９５％の完了まで進行することを実証した。ＧＤＰ−マンノース対して１０モル倍過剰のＰＥＰをこの反応の完了に必要とする。


【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
以下の２つの重要な結果が、この実験から明らかとなる：１）ＧＤＰがＧＴＰへ転換される場合、ＧＤＰ−マンノースハーフサイクルをほぼ完了まで続けることが可能である；および２）ヘキソキナーゼ、ホスホマンノムターゼおよびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼの添加でマンノースから始まる全サイクルは、効果的な反応を生じることの強力な証拠を提供する。完全なフコシルトランスフェラーゼサイクルの例示については図８を参照のこと、ここでＧＤＰ−フコースはマンノースから合成される。


【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＧＤＰ−マンノースのＧＤＰ−フコースへの酵素的転換の概略図を示す。
【図２】
図２は、ＧＭＤの活性が経時的に直線的であるか否かを試験するために設計したアッセイの結果を示す。
【図３】
図３は、ＧＤＰ−フコースがＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）の強力なインヒビターであることを示す。
【図４】
図４は、共役したＧＭＤ−ＹＥＦ　Ｂアッセイの時間経過の結果を示す。
【図５】
図５は、経時的なシアリルルイスＸの形成（ＧＤＰの増加により示される）を示す。また、反応の結果生じる反応混合物のｐＨの減少が示される。
【図６】
図６は、シアリルルイスＸの合成の間の経時的な、Ｍｇ２＋の濃度変化を示す。
【図７】
図７は、ＧＤＰ−マンノース半サイクルのフコシルトランスフェラーゼ反応の概略図を示す。
【図８】
図８は、マンノースフコシルトランスフェラーゼ全サイクル反応の概略図を示す。


【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2004512002.tif 000109
【図２】
2004512002.tif 000110
【図３】
2004512002.tif 000111
【図４】
2004512002.tif 000112
【図５】
2004512002.tif 000113
【図６】
2004512002.tif 000114
【図７】
2004512002.tif 000115
【図８】
2004512002.tif 000116
【国際調査報告】
2004512002.tif 000117
2004512002.tif 000118