(57)【要約】本発明は、改善された生物学的特性を有する分子の進化のための方法に関する。詳細には、本発明は、これらのタンパク質の作用と、改善された生物学的特性を有する分子の選択との間の関係を確立するための、ＤＮＡ基質を改変するタンパク質を使用する方法に関する。全てのこれらの機構の一様な特徴は、進化させられるコード領域が同じ遺伝的エレメント中にあるか、またはＤＮＡ改変タンパク質の標的部位と同じＤＮＡ分子上にあることである。従って、ＤＮＡ改変タンパク質の活性（または不活性）は、その核酸基質の配列を評価することによって試験され得る。この様式では、多数の種々の型の化合物が選択され、これには、改善されたＤＮＡ改変タンパク質、ＤＮＡ改変タンパク質についての改善された基質、改善されたリガンド−レセプター相互作用、改善された補因子および調節タンパク質活性、改善されたＤＮＡ結合タンパク質などが挙げられる。
2004518419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する、核酸基質に対して所望される活性を有しているＤＮＡ改変タンパク質をコードする核酸の選択方法：
ａ）遺伝的エレメントのライブラリーを提供する工程であって、それぞれの遺伝的エレメントはその中に以下を含有する、工程：
ｉ）ＤＮＡ改変タンパク質をコードする核酸配列；および
ｉｉ）該核酸基質；
ｂ）そのＤＮＡ改変タンパク質の発現および活性に適切な条件下で該ライブラリーをインキュベートする工程；ならびに
ｃ）該核酸基質が改変されているかまたは改変されていないかのいずれかである遺伝的エレメントの同定によって、該所望される活性を有しているＤＮＡ改変タンパク質をコードする核酸を選択する、工程。
【請求項２】
以下の工程を包含する、所望される活性を有しているかまたは所望される活性を有している候補分子の合成を指向する能力を有している、候補分子をコードする１つ以上の遺伝的エレメントの選択方法：
ａ）遺伝的エレメントのライブラリーを提供する工程であって、それぞれの遺伝的エレメントはその中に以下を含有する、工程：
ｉ）所望される生物学的活性の保持のために候補分子をコードしているか、または所望される活性を有している候補分子の合成を指向する能力を有している、核酸配列；
ｉｉ）ＤＮＡ改変タンパク質の基質を構成する核酸配列；および
ｉｉｉ）ＤＮＡ改変活性を有しているタンパク質；
ここで、該ＤＮＡ改変タンパク質の活性は、該候補分子の活性によって調節され、その結果、核酸基質の改変は、該核酸配列が所望される活性を有している候補分子をコードするかまたはその合成を指向する事象においてのみ生じる；
ｂ）該ライブラリーと該タンパク質とを、そのＤＮＡ改変活性に適切な条件下でＤＮＡ改変活性とともにインキュベートする工程；ならびに
ｃ）該核酸基質が改変されているかまたは改変されていないかのいずれかである遺伝的エレメントの同定によって、該所望される活性を有している候補分子をコードする核酸を選択する、工程。
【請求項３】
以下の工程を包含する、標的リガンドについて親和性を有しているレセプター分子をコードする核酸の選択方法：
ａ）遺伝的エレメントのライブラリーを提供する工程であって、それぞれの遺伝的エレメントはその中に以下を含有する、工程：
ｉ）リガンドをコードする核酸配列；
ｉｉ）候補レセプター分子に融合されたＤＮＡ改変タンパク質を含有している融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ここで、該タンパク質のＤＮＡ改変活性は、該レセプター分子へのリガンド結合が生じない場合には低く、そしてレセプターへのリガンドの結合によって誘導されるか、抑制されるか、または変更される；ならびに
ｂ）そのＤＮＡ改変タンパク質の活性に適切な条件下で該ライブラリーをインキュベートする工程；ならびに
ｃ）核酸基質が改変されているかまたは改変されていないかのいずれかである遺伝的エレメントの同定によって、該所望される活性を有しているレセプターをコードする核酸を選択する、工程。
【請求項４】
以下の工程を包含する、標的レセプターについて親和性を有しているリガンドをコードする核酸の選択方法：
ａ）遺伝的エレメントのライブラリーを提供する工程であって、それぞれの遺伝的エレメントはその中に以下を含有する、工程：
ｉ）候補のリガンドをコードする核酸配列；
ｉｉ）該標的レセプターに融合されたＤＮＡ改変タンパク質を含有している融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ここで、該タンパク質のＤＮＡ改変活性は、該レセプター分子へのリガンド結合が生じない場合には低く、そしてレセプターへのリガンドの結合によって誘導されるか、抑制されるか、または変更される；ならびに
ｂ）そのＤＮＡ改変タンパク質の活性に適切な条件下で該ライブラリーをインキュベートする工程；ならびに
ｃ）核酸基質が改変されているかまたは改変されていないかのいずれかである、遺伝的エレメントの同定によって、所望される活性を有しているリガンドをコードする核酸を選択する工程。
【請求項５】
以下の工程をさらに包含する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法：
ｄ）第２のライブラリーを作成するために、工程（ｃ）で単離した１つ以上の遺伝的エレメントを変異誘発させる工程；
ｅ）前記所望される活性を有している分子を選択するために、工程ａ）からｃ）を繰り返す工程。
【請求項６】
工程ｃ）において、配列が改変されているかまたは改変されていないかのいずれかである核酸が選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ改変タンパク質がリコンビナーゼタンパク質であるかまたはリコンビナーゼ複合体の成分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記リコンビナーゼが部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記リコンビナーゼが、インテグラーゼ、またはレソルバーゼ／インベルターゼのクラスのリコンビナーゼ、および例えば、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉプラスミドｐＳＲ１由来のＲリコンビナーゼ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｉｕｍプラスミドｐＫＤ１由来のＡリコンビナーゼ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗａｌｔｉｉプラスミドｐＫＷ１由来のリコンビナーゼ、λＩｎｔ組換えシステムの任意の成分、またはＧｉｎ組換えシステムの任意の成分のような、イントロンによってコードされるエンドヌクレアーゼから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リコンビナーゼが相同リコンビナーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記レセプターが核レセプターである、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核レセプターがホルモンレセプターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ホルモンレセプターがステロイドホルモンレセプターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ステロイドホルモンレセプターが脊椎動物のグルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、またはアンドロゲンレセプターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リコンビナーゼタンパク質またはリコンビナーゼ複合体の成分が、遺伝的融合体によって、レセプターまたはそのリガンド結合ドメインに融合される、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記基質がリコンビナーゼ標的部位を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記融合タンパク質が、ｆｌｐリコンビナーゼおよびエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメインを含む、請求項３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの工程が自動化される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＮＡ改変タンパク質と核酸基質との間で共有結合が形成されない、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１、または請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法に従って単離されたＤＮＡ改変タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸によってコードされる、ＤＮＡ改変タンパク質。
【請求項２２】
本明細書中に記載されている変異体ＦｒｅまたはＣｒｅリコンビナーゼである、請求項２１に記載のＤＮＡ改変タンパク質。
【請求項２３】
本明細書中に記載されているＦｒｅ３、５、または２０である、請求項２２に記載のＦｒｅリコンビナーゼ。
【請求項２４】
請求項２、または請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法に従って単離された、所望される活性を有している候補分子をコードする、遺伝的エレメント。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸によってコードされる、候補分子。
【請求項２６】
請求項３、または請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法に従って単離された、リガンドについて親和性を有しているレセプターをコードする、核酸。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸によってコードされる、レセプター。
【請求項２８】
請求項４、または請求項５〜１９のいずれか１項に記載の方法に従って単離された、標的レセプターについて親和性を有しているリガンドをコードする、核酸。
【請求項２９】
請求項２８に記載の核酸によってコードされる、リガンド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された生物学的特性を有する分子の進化のための方法に関する。詳細には、本発明は、ＤＮＡに作用するタンパク質を使用して、それらのタンパク質の作用と、改良された生物学的特性を有する分子の選択との間の関係を確立する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中で引用されている全ての文献は、本明細書中で参照として援用される。
【０００３】
指向性のインビトロでの進化は、所望の生物学的特性を保有している分子の作製のための有力な方法である。この方法では、ダーウィン進化（すなわち、ランダム変異誘発、組換え、および選択）の重要なプロセスが、インビトロで模倣されて、新規のまたは改良された生物学的特性を有するように分子を進化させる。
【０００４】
新しい、改変された、または改良された生物学的活性を有する新規のポリペプチドを作製するために、多数の異なるアプローチが慣習的に行われている。構造が知られている分子については、これらの方法には、分子の特定領域の残基の特異的変更（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）が含まれる（Ｗｉｎｔｅｒら、１９８２）。構造情報が存在しない場合は、指向性のタンパク質の進化についての遺伝的多様性は主に、点変異誘発、組み合わせカセット変異誘発（Ｂｌａｃｋら、１９９６）によって、またはＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９４）によって作製されている。新規の分子はまた、ファージディスプレイによっても作製されている（Ｍａｒｋｓら、１９９４）。
【０００５】
連続的なランダム変異誘発を利用する任意の方法による進化の模倣に付随する１つの問題点は、有用な変異と同時に有害な変異が生じ、そして固定されることであり、その結果、この方法の進化能力が限界を迎える。さらに、多くの有用な変異が選択工程で切り捨てられてしまう。なぜなら、次の世代の親となるように選択された変異のみが保たれるからである。
【０００６】
さらに、所望される生物学的活性を有する分子をコードする遺伝的エレメントが、選択されたのと同じ分子中にはコードされないという事実は、遺伝暗号の回収が困難でありそして時間のかかる作業であるということを意味する。タンパク質の進化の問題点は、情報成分と機能成分との分離に関係している。好ましい変異（単数または複数）をコードする情報分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、それ自体は改良された生物学的特性を伝達せず、むしろ、その特性は、コードされる情報から翻訳される対応するタンパク質によって伝達される。
【０００７】
従って、タンパク質の進化の方法論は、好ましい変異（単数または複数）と改良された特性との間の物理的な関係を維持する必然性によって束縛される。通常は、これは、宿主細胞またはファージ（ここでは、好ましいタンパク質をコードする遺伝子とタンパク質自体の両方がともに捕捉されている）によって提供される画分内での関係によって達成されている。結果として、今日までに行われたほとんどのタンパク質の進化実験は、情報分子の回収前に好結果を生じる候補を単離する工程を通して、改良された生物学的特性について、スクリーニングの間に宿主の完全性を維持することを必要とする。この要件は、サイクルの速度および大きさの両方に関して、使用される進化サイクルに制限を課する。
【０００８】
種々の方法において情報成分と機能成分とを関係付ける、２つの別の分子進化アプローチが記載されている。両方ともが分子の進化サイクルの局面を単純にし、そして速度と大きさに関して利点を与える。特定のインビトロでのＲＮＡまたはＤＮＡの進化実験においては、情報成分と機能成分とが同じ分子によって運ばれ；従って、区画による関連付けは不要である（ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ（１９９２）２５７：６３５−６４１；ＬｅｈｍａｎおよびＪｏｙｃｅ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８２−１８５；ＷｒｉｇｈｔおよびＪｏｙｃｅ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：６１４−６１７；ＢｒｅａｋｅｒおよびＪｏｙｃｅ（１９９４）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １：２２３−２２９）。
【０００９】
リボザイムに基づく分子の進化の特定の場合には、同じＲＮＡ分子が酵素をコードする鋳型、酵素自体、および酵素が作用する基質を提供する。それにより、改良された酵素活性についての選択は、改良された酵素をコードする分子を同時に送達する。これらの例には、タンパク質の分子進化は含まれない。なぜなら、酵素は核酸分子のみであり得るからである。
【００１０】
第２のアプローチには、タンパク質をコードするＲＮＡ分子中への抗生物質ピューロマイシンの取り込みが関係している（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９７）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２）。翻訳後、タンパク質とＲＮＡ分子はピューロマイシン部分を通じて共有結合される。それにより、情報成分と機能成分とが物理的に連結され、そして区画化は不要である。このアプローチは、区画化によるいくらかの不都合から開放するが、さらなる工程が、増幅のために情報分子をＲＮＡからＤＮＡへ転換に必要である。
【００１１】
酵素の選択については多数の障害が存在し、このことは新規または改良された酵素の作製が困難であると立証されていることを意味している。主な障害は選択方法が少数であることによって生じる；触媒活性について選択することは簡単であるが、遺伝暗号自体の選択は困難である。なぜなら、今日までに提起された方法においては、表現型と遺伝子型との間には直接的な相関が存在しないからである。
【００１２】
自然界の進化プロセスを模倣することにより酵素特性を改良するための最初の試みでは変異体生物が使用され、増殖の利点によって増大した酵素活性について選択された（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ、１９８７）。より最近では、ファージが提示する触媒分子が、タンパク質に不可逆的に結合する自殺インヒビター（Ｓｕｉｃｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）への結合によって、富化させられている（Ｓｏｕｍｉｌｌｉｏｎら、１９９４）。しかし、自殺インヒビターまたは遷移状態アナログは、一般的には、全ての目的の反応については利用することができない。所望される触媒活性についての直接的な選択によって、より優れた結果が得られる。
【００１３】
改良された結合特性を有する分子を作製するために、ほとんどの従来の方法は、変異誘発とスクリーニングとの反復工程に頼っており、これによって所望される特性を保有している分子は、標的に対するそれらの親和性によって選択される。上記に加えて、分子設計の当該分野での特別な問題点は、選択プロセスの効率が、標的に対して高い親和性を有している分子を生じさせる際に、その効率を制限することである。さらに、ライブラリーの大きさの制限が、スクリーニングすることができる変異の見込み数を減少させる。
【００１４】
今日までに記載されているタンパク質の分子進化のほとんどの場合では、目的のタンパク質をコードする遺伝子が、候補分子のライブラリーを作製するようにランダムに変異させられている。しかし、任意の所定のタンパク質の変異体バリエーションについての理論上の数は膨大であり、そして変異体のライブラリーをスクリーニングするための現在のアプローチによって課される実質的な限界をはるかに上回る。（ｉ）現在の方法論では極めて大きな変異体ライブラリーの作製が可能であり、そして（ｉｉ）ライブラリーが好ましい変異体の組み合わせを含む偶然はライブラリーの大きさとともに増大するが、変異体ライブラリーをスクリーニングするための現在のアプローチによって課される事実上の限界が、その実施を制限する。従って、より大きなライブラリーをスクリーニングすることができるようにこれらの事実上の限界に取り組む任意のアプローチによって、現行技術は改良される。
【００１５】
ライブラリーのスクリーニングについての事実上の限界は、分子進化の適用に対してさらに２つの制限を課す。現行のアプローチは、適用される選択基準下で明らかに好ましい変異体候補の選択に頼る。これらの好ましい変異体は、次いで、次回のライブラリーの構築および選択に因子を提供するために使用される。このサイクルでの重要な要素は、選択基準の性質である。ライブラリーのスクリーニングに関する労働集約的な局面に起因して、今日までの好結果を生じた分子の進化実験のほとんどは、好結果を生じない候補から好結果を生じる候補を分離するために、簡単な厳密な基準に頼っている。結果として、分子の進化の可能性は、選択のための簡単な厳密な基準を設計することの必要性によって制限される。
【００１６】
さらに、これらの方法においては、所望される特性においてわずかな改良のみを示す変異体候補は、そのような変異体が、後に別のわずかにまたは十分に改良された変異体と混合されると、所望される特性において有意な改良を生じ得る可能性があるにもかかわらず、排除され得る。この分野のこれらの限界の両方に、ライブラリーのスクリーニングの作業を単純にする任意の進歩によって取り組むことができる。
【００１７】
ライブラリーのスクリーニング工程に含まれる作業を単純化する任意の利点は、微妙なあまり厳格ではないスクリーニング規準に基づく選択プロトコールを含み、そしてさらにわずかに改良された変異体候補をも保持し得るように、分子進化適応の範囲を増大させる効果を有する。
【００１８】
従って、触媒機能または結合親和性のいずれかを有している分子の選択を可能にする改良された生物学的活性を有する分子の選択のためのインビトロでの進化の改良方法が、当該分野で著しく必要とされている。適切な方法は、種々の変異を含有している多数の分子の高処理量でのスクリーニングを可能にする。この方法には、改良された機能を有する分子の容易な同定を可能にする選択プロセス、およびそれに続くコードされた遺伝的エレメントの分離が伴う。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は、所望される活性を有している化合物を選択し得る広範囲の種々の可能性のある機構を含む。全てのこれらの機構の統一的な特徴は、進化させられるコード領域が同じ遺伝的エレメント中にあるか、またはＤＮＡ改変タンパク質の標的部位と同じＤＮＡ分子上にあることである。従って、ＤＮＡ改変タンパク質の活性（または不活性）は、その核酸基質の配列を評価することによって試験され得る。この様式では、多数の種々のタイプの化合物が選択され得、これには、改良されたＤＮＡ改変タンパク質、ＤＮＡ改変タンパク質についての改良された基質、改良されたリガンド−レセプター相互作用、改良された補因子および調節タンパク質活性、改良されたＤＮＡ結合タンパク質などが含まれる。本発明の方法は、本明細書中で、基質連結型指向性進化（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＳＬｉＤＥ））と呼ばれる。
【００２０】
本発明の第１の局面に従うと、以下の工程を包含する、核酸基質に対して所望される活性を有するＤＮＡ改変タンパク質をコードする核酸の選択方法が提供される：
ａ）遺伝的エレメントのライブラリーを提供する工程であって、それぞれの遺伝的エレメントは以下を含有する、工程：
ｉ）ＤＮＡ改変タンパク質をコードする核酸配列、および
ｉｉ）上記の核酸基質；
ｂ）そのＤＮＡ改変タンパク質の発現および活性に適切な条件下で上記のライブラリーをインキュベートする工程；ならびに
ｃ）核酸基質が、改変されているかまたは改変されていないかのいずれかである遺伝的エレメントを同定することにより、所望される活性を有しているＤＮＡ改変タンパク質をコードする核酸を選択する工程。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様においては、配列が改変されているかまたは改変されていないかのいずれかである核酸が選択される。
【００２２】
従って、本発明のこの局面の方法は、新規のまたは改良された機能を有するＤＮＡ改変タンパク質の進化に適切である。
【００２３】
このシステムは、所望される表現型を有しているＤＮＡ改変タンパク質が、そのＤＮＡ改変タンパク質がコードされた遺伝的エレメント中で変化を生じるように設定される。これによって、変更された核酸基質の選択によって次の工程でこの遺伝的エレメントについて富化させることを可能にする。従って、所望される遺伝子が選択的に富化させられる。この方法は、変異と選択の反復工程において繰り返され得、その結果、所望される分子は、サイクルの各選択工程において富化させられる。目的の分子をコードする遺伝的エレメントが選択されて、次の世代の親となる。
【００２４】
従って、本発明は、遺伝的エレメントのライブラリーの使用に依存する。ここでは、それぞれの遺伝的エレメントは、ＤＮＡ改変タンパク質およびそのＤＮＡ改変タンパク質の基質の両方をコードする。従って、基質は、遺伝的エレメントが、その特定の基質を認識する活性なＤＮＡ改変タンパク質をコードするという場合にのみ、変更される。ＤＮＡ改変タンパク質の核酸基質は遺伝的エレメント自体の中にまたはその上に存在するので、基質が変更されると、変更された核酸基質の選択によって、目的の活性なＤＮＡ改変タンパク質についてのコード情報を同時に単離することが可能である。
【００２５】
コードされる遺伝情報とそれによって生じる選択された表現型との間での関係付けを確実にするために、いくつかの形態の区画化が必要とされる。遺伝情報が区画の間で交換され得ないことを保障する、任意の区画化方法が、本発明での使用に適切である。
【００２６】
従って、用語「遺伝的エレメント」は、本明細書中で使用される場合には、遺伝情報を含むかまたはそれをコードし、そしてそのコードされる遺伝情報とＤＮＡ改変タンパク質の基質との関係付けを可能にする、任意の物体を含むように意味される。遺伝的エレメントが内部で変更されている（または、当然、未変更のまま維持されている）核酸基質に基づいて選択される場合には、その核酸基質の変更された状態または未変更の状態が同じ遺伝的エレメント（同じ区画）中のＤＮＡ改変タンパク質の活性の明確な結果であることを確実にし得るために、この関係付けは不可欠である。基質核酸が核酸を産生するように転換されているそれらの遺伝的エレメントの同定によって、同時に、活性なまたは活性化されたＤＮＡ改変タンパク質をコードする遺伝情報を同定する。もちろん、不活性なまたは不活化されたＤＮＡ改変タンパク質について選択する場合には、逆もまた真である。本発明の方法では、ＤＮＡ改変タンパク質と核酸基質との間に、共有結合は形成されない。
【００２７】
従って、本明細書中で使用される場合には、用語「遺伝的エレメント」は原核生物または真核生物の細胞、バクテリオファージあるいはウイルスのような微生物であり得る。国際特許出願番号第ＷＯ９９／０２６７１号に最近公開された１つのインビトロシステムは、区画化するための水中油乳濁物を使用して作製されたマイクロカプセルの使用を報告し、そのようにして翻訳系の成分を単離する。このようなマイクロカプセルは、本発明に従う遺伝的エレメントを表し得る。
【００２８】
目的の反応の構成成分は全て、何らかの方法で反応を行うことができるように、それぞれの遺伝的エレメントに提供されなければならない。この方法の１つの不可欠な局面は、その特性について選択されるタンパク質をコードする核酸分子が、ＤＮＡ改変タンパク質の核酸基質と同じ遺伝的エレメント中に含まれることである；他の成分は、所望される場合には、外因的に添加され得る。当業者は、全ての構成成分が存在するように構成成分がシステムに導入され得る、可能な方法が多数存在することを認識している。例えば、特定の細胞性生物によって提供される遺伝的エレメント物体の場合には、反応成分の一部または全てが、その生物のゲノムから発現され得る。別の実施態様においては、反応の構成成分の一部または全てが、プラスミド、エピソーム、人工染色体などのような染色体外エレメントから発現され得る。これらの可能な取り合せにより、当然、複数の成分のいくつかがその生物のゲノムから発現され、そしていくつかが染色体外エレメントから発現されるように組み合わせられ得る。
【００２９】
目的のＤＮＡ改変タンパク質が十分な活性のために他のタンパク質の存在を必要とする場合には、これらのタンパク質もまた反応物中に含まれるべきであり、そして細胞の染色体によって、またはプラスミド中でコードされ得る。タンパク質は目的のＤＮＡ改変タンパク質をコードするのと同じ遺伝的エレメントによって、例えば同じプラスミド上にコードされ得る。
【００３０】
ＤＮＡ改変タンパク質の基質およびＤＮＡ改変タンパク質をコードする核酸は、同じ遺伝的エレメント中にまたはその上にコードされるべきであるが、これらの物体は、同じ核酸分子によってコードされることは必ずしも必要ではない。例えば、細菌細胞のライブラリーの場合には、ＤＮＡ改変タンパク質はそれぞれの細胞中に存在するプラスミド上にコードされ得、一方、基質は細菌染色体上に位置してもよい。あるいは、基質がプラスミド上に位置し得、そしてＤＮＡ改変タンパク質が、同じ細胞内のいずれかほかの場所（例えば、ゲノム中）でコードされてもよい。両方の場合において、分子進化実験の目的である遺伝子は、基質に隣接して配置される。細菌はその中に特定のシステムの成分を効果的に拘束し、そしてライブラリーの他の細胞中でコードされるタンパク質を締め出すので、試験される表現型と原因となる遺伝子型との間の関連が維持される。
【００３１】
遺伝的エレメントのライブラリーは複数の形質転換された細胞を含み得、そのそれぞれの細胞は種々のＤＮＡ改変タンパク質を発現する。種々の「遺伝子型」が、ライブラリーの生物のゲノム中での差異から生じ得る。しかし、より一般的には、ベクターのライブラリー（例えば、プラスミド、エピソーム、バクテリオファージ、またはウイルスのベクターライブラリー）、あるいは人工染色体ライブラリーを用いて細胞の調製物を形質転換することによって、細胞のライブラリーを作製することはより簡便である。１つのタイプの遺伝的エレメントのみがライブラリーのそれぞれの細胞中で発現されることを確実にするために、適切な条件下で、プラスミド、エピソーム、またはバクテリオファージでの形質転換が行われ得る。
【００３２】
細胞のライブラリーは、平均して１つのタイプの核酸のみがそれぞれの細胞中に形質転換されるように作製されるべきである。これによって、同じ細胞中の核酸から発現される全てのタンパク質を拘束し、そして目的の分子をコードしている核酸選択を容易にする。それぞれの細胞が複数の核酸分子を含む場合には、細胞の単離の際には、どの核酸分子が所望される効果を生じるタンパク質をコードするかは明らかではない。従って、本発明に従うと、活性なＤＮＡ改変タンパク質の存在の結果としての基質核酸の任意の変更は、その同じ細胞中のタンパク質の活性の直接的な結果である。このように、変更された核酸基質の選択によって、活性なまたは活性化されたＤＮＡ改変タンパク質をコードする細胞を選択する。
【００３３】
バクテリオファージもまた、本発明の方法での使用のための遺伝的エレメントとして適切である。なぜなら、細菌感染の工程は、１つのタイプのバクテリオファージのみがそれぞれの細菌細胞中で維持されるのに適切な条件下で設計され得るからである。このことは、核酸基質がバクテリオファージ中で変更される場合には、これが活性なまたは活性化されたＤＮＡ改変タンパク質の存在の結果でなければならないことを意味する。
【００３４】
所望される機能を有しているＤＮＡ改変タンパク質の選択を容易にするためには、それぞれが異なるＤＮＡ改変タンパク質をコードしている多様な種々の遺伝的エレメントを含有しているライブラリーからの選択が所望される。これは、ライブラリーが所望される特性を有している少なくとも１つの分子を含有している可能性を増大させる。
【００３５】
ライブラリーの作製方法は当該分野で周知である。例えば、ｃＤＮＡライブラリーが、生物または細胞中に存在しているｍＲＮＡの逆転写によって、任意の生物または細胞型から単離され得る。極めて多種のｃＤＮＡライブラリーを、現在は市販によってもまた入手することができる。ライブラリーは、当該分野の標準的な方法を使用して、適切なプラスミド、ファージ、またはウイルスベクター中にクローン化することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｊ．Ｍ．およびＨｏｅｆｆｌｅｒ  Ｊ．Ｐ．編（１９９８）Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のことのこと）。
【００３６】
別の実施態様においては、多様な数の種々の化合物をコードするのではなく、ライブラリーは、単一のタイプのタンパク質の多数の変異体を含み得る。例えば、特定のＤＮＡ改変タンパク質の特性を改良または変更することが所望される場合には、ライブラリーは、このタンパク質をコードする遺伝子の変異誘発によって、またはこのタンパク質をコードする遺伝子に直接関係する部分の合理的な変異誘発によって、作製され得る。
【００３７】
用語「ＤＮＡ改変タンパク質」は、本明細書中で使用される場合には、ＤＮＡ分子の配列または構造に変化を生じるように、その活性が核酸の配列または構造に変化を生じさせる任意のタンパク質を含むように意味される。ＤＮＡ分子の配列または構造の変化は、それを有していないものから変更させられている分子を区別するために使用され得る。この方法では、ＤＮＡ改変タンパク質の活性が評価され得る。
【００３８】
ＤＮＡ改変タンパク質は、基質核酸の変更を唯一担い得る。方法のこの最も簡単な実施態様においては、他のタンパク質は基質転換プロセスには関係していない。
【００３９】
しかし、当業者が理解しているように、ＤＮＡ改変タンパク質は、目的のＤＮＡ改変タンパク質が存在しない場合は不活性である、多タンパク質複合体の一部を形成し得る。例えば、一部のＤＮＡ改変タンパク質は、実際には、個々の構成要素であるタンパク質から構成されるホロタンパク質である。本発明のこの実施態様においては、複合体は、ホロタンパク質の個々の構成要素であるタンパク質の全てが同じ細胞中に存在する場合にのみ、活性化される。
【００４０】
本発明の方法を使用する進化に適切なＤＮＡ改変タンパク質の例には、部位特異的リコンビナーゼ（ＳＳＲ）、相同組換え（ＨＲ）に関係しているタンパク質、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、トランスポザーゼ、およびレソルバーゼが含まれる。これらの分子の全てが、生化学的または分子生物学的技術を使用して追跡することができる、ＤＮＡ分子の構造変化を生じる。それぞれのタンパク質のタイプの適切な例が、当業者に明らかである。
【００４１】
例えば、本発明の方法のこの局面は、相同組換え（ＨＲ）のプロセスに関係している任意のタンパク質に対して適用され得る。ＨＲには、特定のＨＲタンパク質によって開始される、２つの同一またはほぼ同一の配列間でのＤＮＡの再配置が含まれる。これらのタンパク質は、組み立てられると活性となって、ＤＮＡ構造を変更する、リコンビナーゼ複合体を形成する。適切なタンパク質の例には、ＲｅｃＡ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＴ、Ｒｅｄα、Ｒｅｄβ、真核生物のＲａｄ５１、真核生物のＲａｄ５２、Ｔ４ファージＵｖｓＸ、Ｔ７ファージ遺伝子６、Ｔ７ファージ遺伝子２５、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓｅｐ１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｄｐａ１、およびＨＳＶ  ＩＣＰ８が含まれる。他の適切な例が、当業者には明らかである。所望される機能のＨＲタンパク質の存在は、ＨＲ事象により再配置されている遺伝的エレメントの単離によって選択され得る。
【００４２】
制限エンドヌクレアーゼもまた、本発明のこの局面の方法において使用され得る。これらのタンパク質は、ＤＮＡ分子上の特定の部位にホモ二量体として結合する。核酸がそのような酵素のコンセンサスな認識部位に制限されている細胞の選択によって、目的の特性を有している制限エンドヌクレアーゼをコードする細胞の選択が可能である。従って、これらの細胞は、活性な制限エンドヌクレアーゼをコードしない細胞から識別され得る。
【００４３】
ＤＮＡメチラーゼもまた、本発明のこの局面の方法において使用され得る。この実施態様においては、ＤＮＡメチラーゼは、それ自体が「目的の遺伝子」である（すなわち、目的のＤＮＡメチラーゼについて次いでスクリーニングされ得るライブラリーを作製するために、そのコード遺伝子が変異させられている）であるか、またはＤＮＡメチラーゼは、その遺伝子がライブラリーを作製するために変異させられている異種タンパク質の活性を報告し得るかのいずれかである。この後者の例では、この外部のタンパク質は、ＤＮＡメチラーゼを調節する。ＤＮＡメチラーゼは、目的の遺伝子に近い核酸上の基質部位をメチル化するかまたはしないかのいずれかである。ライブラリーは、計画に適切であるようにメチル化された場合またはメチル化されていない場合に基質部位をもまた認識する制限酵素を用いて、インビトロで検索され、そして切断される。（ａ）変異させられた遺伝子および（ｂ）メチラーゼ基質部位のいずれかの側に配置されたＰＣＲプライマーの使用によって、制限酵素によっては切断されなかった分子のみが増幅される。これらの分子には、好結果を生じる候補核酸が含まれる。次いで、これらは、次の回のスクリーニングおよび選択のための、新規のライブラリー中へのクローン化に使用され得る。
【００４４】
好ましくは、ＤＮＡ改変タンパク質は、ＳＳＲまたはＨＲタンパク質、より好ましくは、ＳＳＲタンパク質のような、組換えに関係しているタンパク質である。ＳＳＲは、リコンビナーゼ標的（ＲＴ）と呼ばれる特定のＤＮＡ配列を認識しそして結合する酵素であり、そして２つのＲＴの間での組換えを媒介する。これによって、組換えられていない標的からの組換えられた標的の識別を可能にする、ＤＮＡ配列中の変化を生じる。
【００４５】
従って、用語「ＳＳＲ」は、インテグラーゼ、またはレソルバーゼ／インベルターゼのクラスのＳＳＲを含む特異的ＤＮＡ遺伝子座でのＤＮＡの再配置を媒介する、任意の組換えシステム（Ａｂｒｅｍｓｋｉ，Ｋ．Ｅ．およびＨｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ５、８７−９１；Ｋｈａｎら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：８５１−８６０；Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６：３９１−４０６；ＴｈｏｒｐｅおよびＳｍｉｔｈ（１９９８）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ  ＵＳＡ  ９５：５５０５−１０）、およびイントロンによってコードされるエンドヌクレアーゼによって媒介される部位特異的組換え（Ｐｅｒｒｉｎら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２９３９−２９４７）の任意のタンパク質成分をいう。
【００４６】
好ましいＳＳＲタンパク質は、以下からなる群より選択される：ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉプラスミドｐＳＲ１由来のＲリコンビナーゼ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｉｕｍプラスミドｐＫＤ１由来のＡリコンビナーゼ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗａｌｔｉｉプラスミドｐＫＷ１由来のリコンビナーゼ、ＢａｃｉｌｌｕｓトランスポゾンＴｎ４４３０由来のＴｎｐＩ、λＩｎｔ組換えシステムの任意の成分、またはチロシンリコンビナーゼの任意の他のメンバー；ｐｈｉＣ３１、あるいは大きなセリンリコンビナーゼの任意の他のメンバー；ＧｉｎまたはＨｉｎ組換えシステムの任意の成分、レソルバーゼまたはセリンリコンビナーゼの任意の他のメンバー、ＶＤＪ組換えシステムのＲａｇ１、Ｒａｇ２、または任意の他の成分、あるいはそれらの変異体、ｐｈｉＣ３１、Ｇｉｎ組換えシステムの任意の成分、あるいはそれらの変異体。用語「変異体」はこの文脈では、アミノ酸の欠失、置換、および／または付加によって上記のタンパク質から誘導され、そしてこれは、それらが由来するタンパク質に固有の機能の一部または全てを保持しているタンパク質をいう。詳細には、変異体は、リコンビナーゼとして作用する能力を保持し得るか、またはこれは組換え反応に、もしくは組換え反応の調節に重要なタンパク質／タンパク質またはタンパク質／ＤＮＡ相互作用を保持し得る。
【００４７】
リコンビナーゼタンパク質は、それ自体は組換え酵素としては活性でなくてもよいが、例えば、λＩｎｔまたはＧｉｎ組換えシステムの成分のような、リコンビナーゼ複合体の成分を形成してもよい。本発明のこの実施形態では、リコンビナーゼ複合体の残りの成分は、リコンビナーゼ成分が発現されると組換え事象が生じ得るように、細胞中に存在するべきである。
【００４８】
選択される特性は、改善された触媒効率、または増大した基質の代謝回転速度であり得る。従って、選択は、ストリンジェンシーを増大させた条件下で、例えば、より短いインキュベーション時間を使用し得、その結果、最も効率のよいＤＮＡ改変タンパク質のみが許された時間の間に核酸基質を変更する。
【００４９】
別の選択肢では、この方法は、特定のヌクレオチドコンセンサス配列を認識する新規のＤＮＡ改変タンパク質を選択するために使用され得る。これには、ＤＮＡ改変タンパク質をコードするライブラリーで形質転換された候補の細胞のライブラリーを用いる形質転換された細胞のスクリーニングが含まれる。選択は、ライブラリーの個々のメンバーの中に必要な配列の核酸基質を含むこと、そしてその中の核酸基質（そしてさらに詳細には、核酸基質の配列）が変更されている（または未変更の）そのような細胞を単離することによる。この起こり得る事象では、ライブラリーの個々のメンバーは、ＲＴとして、新規のＤＮＡ改変タンパク質がそれに結合するはずである適切な配列の核酸の２つの部分を含むはずである。これらの配列間で再配置を生じることができるＳＳＲタンパク質の存在は、組換えが生じたそのような細胞の選択によって試験され得る。
【００５０】
さらなる実施例においては、この方法は、特異的ヌクレオチド配列を認識する新規の制限酵素の選択に使用され得る。これには、例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子とともに候補の制限酵素をコードする遺伝子のライブラリーを含むプラスミドのような、遺伝的エレメントの構築が含まれる。この例の１つの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子のコード領域は、それが抗生物質耐性を発現しないように破壊され得る。候補の制限酵素部位は、切断部位に配置され得る。切断部位のいずれかの側で、抗生物質耐性遺伝子のコード領域の断片（例えば、少なくとも６塩基対）が繰り返され得る。候補の制限酵素がその部位を切断すると、抗生物質耐性遺伝子は反復された断片による二本鎖の切断の修復によって再構成され、このことは、この表現型を示す細胞を抗生物質に対する耐性によって選択することができることを意味している。この特定の実施例は、宿主細胞が二本鎖の切断を修復できることを必要とする。このような機能は、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ、Ｒｅｃα／ＲｅｃβまたはＲｅｃＡによって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で提供され得る。
【００５１】
他の所望される選択特性は、当業者に明らかである。
【００５２】
所望されるＤＮＡ改変タンパク質活性の選択の成功の可能性を改善するために、この方法の選択工程では、ライブラリーは、ＤＮＡ改変タンパク質の活性に適切な条件下でインキュベートされるべきである。従って、それらのコード遺伝子からのこれらのタンパク質の発現を可能にするために適切な転写および翻訳機構が、このシステムには存在するはずである。この機構は、ほとんどの場合では、ライブラリーの細胞に由来する。
【００５３】
ＤＮＡ改変タンパク質の発現を可能にし、そしてその活性に最適である条件もまた、使用されるべきである。このような条件には、適切な温度、必要な濃度の補因子、溶液イオンなどの含有が含まれる。適切な条件は、当業者に明らかである。
【００５４】
ＤＮＡ改変タンパク質の適切な核酸基質の設計は、使用される特定のＤＮＡ改変タンパク質に依存する。例えば、ＳＳＲ酵素の場合は、基質は、その構成要素の配列がＳＳＲ酵素によって認識される２つのリコンビナーゼ標的（ＲＴ）を含む。細胞中での活性なＳＳＲタンパク質の存在は、ＲＴの間での遺伝的エレメントの再配置を引き起こし、それによって基質とは区別され得る生成物を生じる。
【００５５】
一旦活性なＤＮＡ改変タンパク質によって変更されると、核酸基質は、未変更の基質からのその識別を可能にするいくつかの点で異ならなければならない。この方法では、その中で好結果を生じる反応が起こる（従って、所望される特性を有している候補化合物をコードする）細胞が同定され得る。変更された核酸鋳型の選択に適切な方法は当業者に明らかであり、そして当然、利用されるＤＮＡ改変タンパク質の特性に依存する。従って、変更されたＤＮＡ配列または構造の同定を可能にする任意の方法が適切である。例として、制限分析、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）分析、制限フラグメント長多型分析（ＲＦＬＰ）、ＰＣＲに基づく方法、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられる。当業者が認識しているように、ＳＳＣＰおよびＰＣＲのさらに正確な技術によって、１つのヌクレオチドのみによって異なる核酸分子の区別が可能である。従って、核酸生成物は、わずかに１つのヌクレオチド置換、欠失、または挿入によって核酸基質とは異なり得る。当業者が認識しているように、制限分析および特定の化合物についての感受性は、単一またはそれ以上のヌクレオチドでの共有結合的化学的改変（例えば、メチル化）の存在または非存在を識別するために使用することができる。
【００５６】
本発明の主題である方法の全てに共通であるのは、ＤＮＡ改変タンパク質と核酸基質との間で共有結合が形成されないことである。全ての場合において変更された（または未変更の）核酸基質の選択は、核酸自体の配列または構造（好ましくは、配列）の変化によるのであって、核酸基質に共有結合する化合物の単離によるのではない。
【００５７】
ＤＮＡ改変タンパク質としてリコンビナーゼを利用する方法に関して、リコンビナーゼ活性を決定する方法には、ＤＮＡ標的部位の間での組換え、または組換え率の変化の直接的または間接的のいずれかでの検出が含まれる。標的部位の物理的配置の直接的な測定には、ＤＮＡ分子のゲル電気泳動、サザンブロッティング、またはＰＣＲに基づく方法のような技術が利用され得る。間接的な測定は、組換え前または組換え後にリコンビナーゼ標的部位を保有しているＤＮＡの領域によってコードされる特性を評価することによって行われ得る。例えば、組換えは、リコンビナーゼをコードする遺伝的エレメントから細胞毒性遺伝子を切り取ることができ、従って、組換えは、毒素に対する宿主細胞の抵抗性に関して測定され得る。
【００５８】
ほとんどの場合には、改変されたまたは未改変の核酸配列の試験のためのより便利でありそして順応性のある技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく技術である。この技術により、変更されたＤＮＡ鋳型だけに結合しそして未変更のＤＮＡ鋳型には結合しないか、または結合後に変更されたＤＮＡ鋳型についてのＰＣＲ産物だけを作製することができるが未変更のＤＮＡ鋳型については作製できないかのいずれかであるプライマーを使用して、変更されたＤＮＡ鋳型の特異的増幅が可能である。後者の場合には、ＰＣＲの前のさらなる処理工程（例えば、制限酵素切断）が有用であり得る。次いで、増幅された鋳型が精製され、そして好結果を生じる候補遺伝子が、選択プロセスでの次の世代の親として使用され得る適切な遺伝的エレメント中にクローン化して戻される。
【００５９】
多くの例では、好結果を生じる候補をコードする核酸配列の選択は、ＤＮＡ改変タンパク質の活性に起因して、基質中での変化によって引き起こされる遺伝子発現の変化に基づいて行われ得る。例えば、基質の適切な設計を用いると、ＤＮＡ改変タンパク質によって課された変化により、抗生物質耐性遺伝子の発現を活性化することができ、それによって好結果を生じる候補についての抗生物質を用いる選択を可能にするか、あるいは、緑色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子のような表現型マーカー遺伝子の発現を活性化し、それによってＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）のような物理的富化方法を可能にする。全ての分子進化実験が、他の可能性の膨大な数のバックグラウンドの中の稀な事象（またはより多くの場合には、稀な事象の組み合わせ）の検索であるので、好結果を生じる事象の同定のために膨大な数の候補を徹底的にスクリーニングするために行われ得る全ての改良が、有用である。従って、上記のスクリーニング手順の１つを超える組み合わせ（例えば、ＦＡＣＳ工程、それに続くＰＣＲ工程）によって、次いで次回に親として提供され得る有利な候補の同定を容易にする。
【００６０】
選択は、変更された核酸基質または未変更の核酸基質のいずれかについてであり得る。
【００６１】
今日までに記載された全てのインビトロでの進化方法を用いる場合には、選択されるＤＮＡ改変タンパク質の特性を最適にするために、一般的には１回を超える選択工程が必要である。結果として、核酸基質の好結果を生じる（または好結果を生じない）改変に基づいて選択された候補が、選択されて次世代の候補の親とされ、そしてこのプロセスが繰り返される。
【００６２】
本発明の一部を構成する改良された選択技術は、可能性のある候補の大きなプールが繰り返しの連続によって行われ得るように、反復的な分子進化のサイクルの簡単な使用を可能にする。最初のサイクルでは、このようなプールは、好結果を生じない候補と支配的に混合されている。しかし、サイクルの繰り返しに際して、プールの内容物は、好結果を生じる（「より適切な」）変異体候補により徐々に占有されるようになる。従って、容易でありそして繰り返して適用することが可能であるようにライブラリーのスクリーニングの労働集約的な作業を簡単にすることによって、本発明の方法は、厳格ではない選択基準が使用されることを可能にし、その結果、微妙な改良を生じる変異体が保たれ得る。一連の反復サイクルの後、好結果を生じる候補のプールが、さらにストリンジェントな選択基準下で新たな一連の反復サイクルを開始するために使用される新規のライブラリーを作製するために、採取される。
【００６３】
選択された分子を選択工程の間で「進化させる」ために、選択された候補は配列中に変異を導入し、そして次回の選択での試験のための新規の候補ライブラリーを作製するように、変異誘発され得る。例えば、所望される特性と同様の特性を有するタンパク質をコードする、１つの特定のＤＮＡ改変タンパク質配列を用いて開始することが、好ましい場合がある。変異体タンパク質のライブラリーの作製のためにこのタンパク質型の配列を変異させることによって、そこから選択プロセスを開始する有力な点を提供する偏りのあるライブラリーが得られる。次いで、選択プロセスは、多数回の反復サイクルにおいて行われ得る；各回の選択のストリンジェンシーを増大させることによって、遺伝子のプールは、所望される特性を有しているタンパク質について段階的に富化される。
【００６４】
適切な変異誘発の方法は当業者に公知であり、そしてこれには点変異誘発（エラー−プローンＰＣＲ、化学的変異誘発、特異的変異誘発遺伝子宿主株の使用）、復帰変異誘発（ＤｅｌａｇｒａｖｅおよびＹｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１５４８−１５５２）、コンビナトリアルカセット変異誘発（Ｂｌａｃｋら、１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９４）が含まれるか、またはコドン置換変異誘発による。インビトロでの組換えのためのプロセスにおける最近の改良の概要については、ＧｉｖｅｒおよびＡｒｎｏｌｄ、１９９８（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、２（３）：３３５−３３８）を参照のこと。
【００６５】
例えば、選択される分子の特定の領域またはドメインに対して変異を標的化させるためには、候補の変異誘発を方向付けることが好ましい場合がある。これは、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用して、または例えば、核酸のコード領域中の特定のヌクレオチド配列に結合する縮重オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって、ほぼ適切に行うことができる。
【００６６】
好ましくは、変異誘発と選択の少なくとも２回のサイクルが行われるが、自動化の可能性によっては、必要な場合には１０００回以上のサイクルの使用が可能であり得る。
【００６７】
本発明のこの局面のなおさらなる実施形態に従うと、上記に記載されている本発明の実施形態のいずれかに従って同定されたＤＮＡ改変タンパク質をコードする核酸分子が、提供される。本発明はまた、そのような核酸分子によってコードされるＤＮＡ改変タンパク質を提供する。これらの方法を使用して選択され得るＤＮＡ改変タンパク質のタイプの例には、部位特異的リコンビナーゼ、相同組換えに関与している酵素、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ、トランスポザーゼ、およびレソルバーゼが含まれる。特定の例として、本明細書中に含まれる実施例に記載されている変異体ＣｒｅおよびＦｒｅリコンビナーゼ（特に、Ｆｒｅ３、５、および２０）が挙げられる。
【００６８】
本発明の第２の局面においては、ＤＮＡ改変タンパク質の活性を調節、調整、妨害、または増強する（本明細書中では以後、用語「調節する」、「調節される」、および「調節」に含まれる）分子が、上記の基質に連結するように指向させた進化の方法を使用して選択され得る。全ての場合において、ＤＮＡ改変タンパク質は、指向させた進化の実験において選択される分子のコード領域に対して物理的に連結された部位に作用する。特異的なＤＮＡ配列に対するＤＮＡ改変タンパク質の作用は、ＤＮＡ改変タンパク質を調節する分子の活性を反映する。好結果を生じる候補分子は、好結果を生じる候補をコードするヌクレオチド配列に対して物理的に連結される基質中での変化、または変化がないことによって同定される。本発明のこの第２の局面においては、ＤＮＡ改変タンパク質をコードする核酸配列は、基質に対して物理的に連結される必要がなく、およびその分子をコードする核酸配列が選択されることに注目すべきである。１つの例外は、ＤＮＡ改変タンパク質のコード領域が、２つの分子間で融合分子を生じるように選択される分子のコード領域に融合される１つの場合である。
【００６９】
本発明のこの局面に従うと、以下の工程を包含する、所望される活性を有している候補分子をコードするか、または所望される活性を有している候補分子の合成を指向する能力を有している、１つ以上の遺伝的エレメントの選択方法が、提供される：
ａ）遺伝的エレメントのライブラリーを提供する工程であって、それぞれの遺伝的エレメントはその中に以下を含有する：
ｉ）所望される生物学的活性の保持のために候補分子をコードしているか、または所望される活性を有している候補分子の合成を指向する能力を有している、核酸配列；および
ｉｉ）ＤＮＡ改変タンパク質の基質を構成する、核酸配列；
ｉｉｉ）ＤＮＡ改変活性を有している、タンパク質；
ここで、上記のＤＮＡ改変タンパク質の活性は、上記の候補分子の活性によって調節され、その結果、核酸基質の改変は、核酸配列が所望される活性を有している候補分子をコードするかまたはその合成を指向する事象においてのみ生じる；
ｂ）上記のライブラリーと上記のタンパク質とを、そのＤＮＡ改変活性に適切な条件下でＤＮＡ改変活性とともにインキュベートする工程；ならびに
ｃ）核酸基質が改変されているかまたは改変されていない遺伝的エレメントを同定することによって、所望される活性を有する候補分子をコードする核酸を選択する、工程。
【００７０】
このシステムは、所望される活性を有している分子が、それがコードされる特定の遺伝的エレメント中に変化を生じるように整えられる。好ましくは、この変化は、遺伝的エレメントの配列中にもたらされる。これによって、その中に変化が作製される遺伝的エレメントの選択によって、続く工程において、この分子をコードする核酸について富化させることを可能にする。このようにして所望される遺伝子が選択的に富化される。多くのインビトロでの進化方法を用いる場合と同様に、この方法は、所望される分子がサイクルのそれぞれの選択工程において富化されるように、変異と選択の反復工程において繰り返され得る。それぞれの工程では、目的の分子をコードする遺伝的エレメントが選択されて、次世代の親とされる。
【００７１】
本発明は、所望される活性の所有についての候補であるか、または所望される活性を有している分子を産生する代謝経路に関係している分子をコードしている核酸配列と、ＤＮＡ改変タンパク質の基質を構成する核酸配列の両方を含む遺伝的エレメントの使用に頼る。候補分子と核酸基質は、同じシステム中に閉じ込められる。このシステムは、候補分子とその標的との間での好結果を生じる相互作用がＤＮＡ改変活性を有しているタンパク質の活性の変更によって反映されるように設計される。従って、核酸基質は、システムが核酸基質を認識する活性化されたＤＮＡ改変タンパク質を含む事象においてのみ変更される。このことによって、所望される特性を有している分子をコードする核酸を含む遺伝的エレメントの同定を可能にする。これらの遺伝的エレメントの選択は、目的の分子についてのコード情報の同時の単離を可能にする。
【００７２】
例えば、変更された核酸基質の選択は、いくつかの分子事象によって活性化されているＤＮＡ改変タンパク質についてのコード情報の単離を可能にする。未変更の基質の選択によって、不活性なＤＮＡ改変タンパク質を選択し、従ってＤＮＡ改変タンパク質のインヒビター、またはＤＮＡ改変タンパク質によるその基質への結合およびその基質の変更を妨げるＤＮＡ結合タンパク質の単離に有用である。
【００７３】
候補分子とその標的との間での好結果を生じる分子相互作用の発生は、相互作用に必須のそれぞれの成分の発現および活性に適切な条件下で遺伝的エレメントをインキュベートし、次いで変更された核酸基質の存在または非存在についてその遺伝的エレメントを分析することによって、評価され得る。所望される反応がその中で生じるそのような遺伝的エレメントの同定によって、相互作用にうまく関与している分子をコードする遺伝情報の単離を可能にする。
【００７４】
この実施例の１つの実施形態においては、ＤＮＡ改変タンパク質は、特異的な分子機構によってそれが阻害されるために基質に作用することができないか、または特異的な分子機構によってそれが阻害されない限りは基質に作用するかのいずれかの形態で発現される。
【００７５】
特異的な分子機構は、ＤＮＡ改変タンパク質自体、タンパク質としてのその活性、またはタンパク質としてのその活性に必要な任意の成分に対して指向され得る。あるいは、特異的な分子機構は、ＤＮＡ改変タンパク質の基質に対して指向され得る。
【００７６】
阻害を緩和するかまたは阻害を強要する、候補の核酸分子をコードする核酸配列、または補因子（脂質、糖、ステロイド、ペプチド、および阻害を緩和するかまたは阻害を課す代謝経路の任意の他の産物を含む）の合成に関係している分子をコードする核酸配列が、基質のすぐ隣に配置された候補分子のライブラリーから同定され得る。
【００７７】
本発明のこの局面の別の実施形態においては、ＤＮＡ改変タンパク質は、補因子を伴わずには基質に作用しないか、または補因子がそれを妨害しない限りは基質に作用するかのいずれかの形態で、発現される。候補の補因子の一部または全てをコードするか、または補因子（脂質、糖、ステロイド、ペプチド、および補因子の一部または全てとして作用する代謝経路の任意の他の産物を含む）の合成に関係している分子をコードする核酸配列が、この方法を使用して候補のライブラリーから同定され得る。
【００７８】
本発明のこの局面においては、ＤＮＡ改変タンパク質は、核酸基質および候補分子をコードする核酸と同じ遺伝的エレメント中でコードされ得る。従って、ＤＮＡ改変タンパク質は、例えば、細胞のゲノム中でコードされてもよいし、これは、染色体外エレメントによってコードされてもよい。後者の場合には、ＤＮＡ改変タンパク質は、核酸基質および／または候補分子をコードする核酸と同じ染色体外エレメント上にコードされ得る。当業者が認識しているように、ＤＮＡ改変反応の３つの成分が同じ区画の中に拘束されている限り、他の遺伝的エレメント中にコードされる反応成分の排除のために、遺伝子型と表現型との間の必要な関係が保たれる。
【００７９】
本発明のこの局面においては、ＤＮＡ改変タンパク質の活性は、目的の候補分子の活性と関係しているはずである。これによって、候補分子が、一部の方法では、ＤＮＡ改変タンパク質の活性に影響を与えなければならず、その結果、ＤＮＡ改変タンパク質の活性は、候補分子の所望される特性の結果として、特異的に上昇されるかまたは低下されるかのいずれかであることが意味される。この様式では、候補分子が所望される活性を有する場合には、同じ候補分子をコードする特定の細胞が、ＤＮＡ改変タンパク質の核酸基質の配列に基づいて単離され得る。
【００８０】
当業者に明らかであるように、候補分子の活性がＤＮＡ改変タンパク質の活性と関係付けられ得る多数の方法が存在している。例えば、ＤＮＡ改変タンパク質は、所望される活性の候補分子が存在しない場合は不活であり得る。分子は、ＤＮＡ改変タンパク質に直接または間接的に結合する場合があり、それによってその活性を生じる。このような相互作用の一例は、ＤＮＡ改変タンパク質との補因子の相互作用、またはその活性がＤＮＡ改変タンパク質の適切な機能に不可欠である任意の他のタンパク質タイプの相互作用であり得る。
【００８１】
候補分子は、中間のエフェクター分子を通じてＤＮＡ改変タンパク質と相互作用し得る。例えば、ＤＮＡ改変タンパク質は、同種リガンドが存在しない場合には、ＤＮＡ改変タンパク質の活性を示す調節ドメインと結合し得る。従って、本発明のこの局面では、選択される候補分子は、調節ドメインについて新規のまたは改良された親和性を有するリガンドであり得る。この局面では、融合タンパク質（特に、欧州特許第０  ７０７  ５９９号に開示されている特性を有する融合タンパク質）の使用に関する以下の議論が、特に直接関係している。選択は、変更された核酸基質について、または未変更の核酸基質についてのいずれかであり得る。例えば、ＤＮＡ改変タンパク質に対して阻害活性を有しているインヒビター分子の選択の場合には、最も有効なインヒビターの選択には、その中でＤＮＡ改変タンパク質が不活化されており、従って、その中で核酸基質が未変更のまま保たれているそのような細胞の選択が含まれる。しかし、ほとんどの状況では、選択は、その核酸基質が変更されている細胞についてである。
【００８２】
本発明のこの局面のなおさらなる実施形態に従うと、上記に記載されている本発明のいずれか１つの方法に従って選択された候補分子をコードする核酸が提供される。本発明はまた、そのような核酸分子によってコードされる候補分子を提供する。詳細には、このような分子には、小さな薬物分子、リガンド、レセプター、ＤＮＡ結合タンパク質、インヒビター、補因子、およびＤＮＡ改変タンパク質の活性化因子が含まれる。
【００８３】
本発明の第３の局面においては、新規のまたは改変された特性を有しているリガンドまたはレセプター分子が選択され得る。
【００８４】
この局面の好ましい実施形態においては、以下の工程を包含する、標的リガンドに対する親和性を有しているレセプター分子をコードする核酸の選択方法が提供される：
ａ）遺伝的エレメントのライブラリーを提供する工程であって、それぞれの遺伝的エレメントはその中に以下を含有する：
ｉ）ＤＮＡ改変タンパク質の基質を構成する核酸配列；
ｉｉ）候補レセプター分子に対して融合されたＤＮＡ改変タンパク質を含有している融合タンパク質をコードする核酸配列であって、ここでは、タンパク質のＤＮＡ改変活性は、上記のレセプター分子へのリガンド結合がない場合には低いかまたは高く、そしてレセプターへのリガンドの結合によって誘導されるか、抑制されるか、または変更される；
ｂ）そのＤＮＡ改変タンパク質の活性に適切な条件下で上記のライブラリーをインキュベートする工程；
ｃ）リガンドに対して、または種々のリガンドの混合物に対して、上記のライブラリーを曝す工程；
ｄ）遺伝的エレメントを同定することによって、所望されるリガンド結合活性を有しているレセプターをコードする核酸を選択する工程であって、ここで、核酸基質は、改変されているかまたは改変されていないかのいずれかである、工程。
【００８５】
この局面の別の好ましい実施態様においては、以下の工程を包含している、標的レセプターについて親和性を有しているリガンドをコードする核酸分子の選択方法が提供される：
ａ）遺伝的エレメントのライブラリーを提供する工程であって、それぞれの遺伝的エレメントはその中に以下を含有する：
ｉ）ＤＮＡ改変タンパク質の基質を構成する核酸配列；
ｉｉ）候補のリガンドをコードする核酸配列；
ｂ）そのＤＮＡ改変タンパク質の活性に適切な条件下で上記のライブラリーをインキュベートする工程；および
ｃ）標的レセプターに融合されたＤＮＡ改変タンパク質を含有している融合タンパク質に対して、上記のライブラリーを曝す工程であって、ここでは、タンパク質のＤＮＡ改変活性は、上記のレセプターへのリガンド結合が生じない場合には低いかまたは高く、そしてレセプターへのリガンドの結合によって、誘導されるか、抑制されるか、または変更される、工程；
ｄ）核酸基質が改変されているかまたは改変されていないかのいずれかである遺伝的エレメントを同定することによって、所望される活性を有しているリガンドをコードする核酸を選択する工程。
【００８６】
本発明の両方のこれらの局面においては、好ましくは、その配列が改変されているかまたは改変されていないかのいずれかの核酸が選択される。
【００８７】
ＤＮＡ改変タンパク質と標的レセプターとを含有している融合タンパク質は、パートａ）の遺伝的エレメントによってコードされ得る。
【００８８】
従って、本発明のこれらの実施態様は、所望される結合相互作用のいずれかの成分の選択を提供する。上記の本発明の第１の局面と同様に、細胞のライブラリーが使用され、そのそれぞれは、ＤＮＡ改変タンパク質の核酸基質を含む。しかし、本発明のこの実施態様においては、それぞれの細胞が、リガンドについて親和性を示すレセプター分子の一部または全てに対して融合させられた、ＤＮＡ改変タンパク質を含む融合タンパク質をコードする。融合タンパク質は、ＤＮＡ改変タンパク質の活性がレセプターへのリガンド結合が生じない場合には阻害され、そしてレセプターへのリガンドの結合によって誘導されるかまたは変更されるか、あるいはレセプターへのリガンドの結合が生じない場合には活性であり、そしてレセプターへのリガンドの結合によって阻害されるかまたは変更されるように、設計される。リガンドがその標的レセプターに対して高い親和性を示す場合にのみ、発現されたリガンドがＤＮＡ改変タンパク質に結合し、そしてＤＮＡ改変タンパク質を活性化または阻害する。結果として、リガンドとレセプターとの間での好結果を生じる結合相互作用の発生によってのみ、遺伝的エレメント中の基質核酸の変更を生じる。必要とされる結合親和性を有するリガンドが存在しない場合は、基質は未変化のままであるか、あるいはリガンドがＤＮＡ改変タンパク質の活性を抑制するかまたは誘導するかどうかに依存して変化される。
【００８９】
従って、産生反応が生じない細胞は、さらなる回の選択のためには選択されない。
【００９０】
好ましくは、融合タンパク質のＤＮＡ改変タンパク質部分の活性は、少なくとも１０倍、より好ましくは２０倍、そして最も好ましくは少なくとも４０倍、レセプタードメインに対するリガンドの結合によって変更させられる。
【００９１】
本発明の第１の局面の方法を用いる場合と同様に、産生反応を生じるリガンドが、核酸基質の改変が生じた同じ細胞によってコードされることを確実にするためには、反応は閉じられた（区画化された）系の中で行われなければならない。これによって、表現型と遺伝子型との間の関係の忠実度が保存されることを確実にする。重ねて、本発明の方法に従うと、ＤＮＡ改変タンパク質と核酸基質との間では共有結合は形成されないことが繰り返されるべきである。
【００９２】
用語「リガンド」によって、標的レセプターについて親和性を示す任意のペプチドまたはポリペプチドリガンドが意味される。この用語は、標的について結合親和性を有するエピトープを形成するペプチドを含むように意味される。適切なエピトープの例は当業者に明らかであり、そして特に、抗体について、レセプターについて、生体リガンド（例えば、ビオチンおよびアビジン）について、別個のタンパク質ドメイン（例えば、ＳＨ３ドメイン）について、他のペプチドエピトープについて、タンパク質分子中のコンセンサス配列（例えば、キナーゼ認識部位）について、または特異的な細胞型（例えば、リンパ球）について結合親和性を有する分子が含まれる。他の例は当業者に明らかである。
【００９３】
ポリペプチドリガンドには、別のタンパク質と特異的に相互作用する任意のポリペプチドが含まれ、そして例えば、レセプタードメイン、抗体ドメイン、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、エフェクタードメイン、プロテアーゼドメイン、および転写因子が含まれる。
【００９４】
用語「リガンド」はまた、本明細書中で使用される場合は、リガンドとして作用することができる任意の合成分子または生合成経路の産物を含むように意図される。合成分子の場合には、これは、ＤＮＡ改変タンパク質がその基質に作用し得る前にＤＮＡ改変タンパク質の活性に影響を与えるように、記載されている方法において有効濃度でそして１つの段階で添加されなければならない。生合成経路の産物であるリガンドの場合には、リガンド活性が現れる前に、生合成経路は、ＤＮＡ改変タンパク質が存在する区画内で作動可能でなければならない。
【００９５】
用語「レセプター」は、この用語が上記で定義されているようなリガンドに対して結合する能力を有している、任意の分子（好ましくは、ポリペプチド分子）を含むように意味される。従って、この用語には、抗体、膜レセプター、核レセプター（例えば、ホルモンレセプター）、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、タンパク質ドメイン（例えば、ＳＨ３ドメイン）、転写因子などの全てまたは一部が含まれる。
【００９６】
多数の種々のタイプのＤＮＡ改変タンパク質が、本発明の第１の局面について上記で議論されているように、本発明のこの局面で使用され得る。本発明のこの局面の方法は、組換えに関係しているＤＮＡ改変タンパク質（特に、部位特異的リコンビナーゼ）を用いる用途に特に十分に適切である。好ましい実施態様においては、融合タンパク質のレセプター部分へのリガンドの結合が成功すると、リコンビナーゼタンパク質が活性化され、細胞のＤＮＡ中に存在するその認識配列（基質）に結合し、そしてこれらの配列間での組換えを媒介する。これによって、組換えられた鋳型を組換えられていない鋳型から識別することを可能にする、細胞内でのＤＮＡ配列の変化を生じる。
【００９７】
好ましい実施態様においては、融合タンパク質は、そのＤＮＡ改変活性がレセプターへのリガンド結合が生じない場合に阻害され、そしてレセプターへのリガンドの結合によって誘導されるかまたは変更されるように設計される場合がある。発現されたリガンドは、リガンドがその標的レセプターについて高い親和性を示す場合にのみ、ＤＮＡ改変タンパク質に結合し、そしてこれを活性化する。結果として、リガンドとレセプターとの間での好結果を生じる結合相互作用の発生は、活性化されたＤＮＡ改変タンパク質による基質核酸の変更を生じる。
【００９８】
好ましい実施態様においては、融合タンパク質は、レセプターのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）のアミノ酸配列に対して物理的に連結された、ＤＮＡ改変タンパク質またはその活性なフラグメントのアミノ酸配列を含むはずである。「活性なフラグメント」によって、核酸基質を改変する能力を保持しているＤＮＡ改変タンパク質の任意のフラグメントが意味される。
【００９９】
好ましくは、融合タンパク質のレセプター部分は、リガンドに結合する能力を有している、核レセプターであるかまたは核レセプターのＬＢＤであり、これは、グリコシル化され得るかまたはグリコシル化されない場合もある任意の分子を意味している。詳細には、この用語は、リガンド結合に関して、レセプタータンパク質によって提示される機能的特性または生化学的特性と同様の、機能的特性または生化学的特性を示すタンパク質をいう（Ｗｈｉｔｅｌａｗら、１９９３）。リガンドへの結合により、核レセプターは、活性なまたは変更された転写因子になる。
【０１００】
より詳細には、核レセプターは、ステロイドホルモンレセプター（例えば、ステロイド、ビタミン、または関連するリガンドによって認識されるレセプター）のＬＢＤに対して、それらのアミノ酸配列によって関係している場合がある。適切な核レセプターの例は、Ｌａｕｄｅｔら、１９９２（これは、本明細書中で参考として援用されている）に列挙されている。好ましくは、核レセプターは、ステロイドホルモンレセプターであり、より好ましくは、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、またはアンドロゲンレセプターである。Ｌａｕｄｅｔらによって記載されている方法を使用して関連しているとして同定することができるような、核レセプターアミノ酸配列に対して十分な関係を保持している変異体レセプター誘導体が、この用語に含まれる。
【０１０１】
好ましくは、ＤＮＡ改変タンパク質は、遺伝子融合によって、レセプターまたはそのリガンド結合ドメインに融合させられる。従って、融合タンパク質は、単一の核酸分子によってコードされる直鎖状の遺伝的融合体である場合がある。しかし、融合タンパク質は、レセプタードメインとＤＮＡ改変タンパク質ドメインの両方に対して共有結合される他の手段により（例えば、反応性基（例えば、スルフヒドリル基）を有しているスペーサー分子を介して）連結される場合がある。
【０１０２】
遺伝的融合体の場合には、レセプターとＤＮＡ改変タンパク質成分との連結は、ＤＮＡ改変タンパク質をコードするＤＮＡと同じリーディングフレーム中（好ましくは、ＤＮＡ改変タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれか）に配置されたレセプタードメインをコードするＤＮＡとともに、融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする組換えＤＮＡ構築物を使用して達成される場合がある。より好ましくは、レセプタードメインは、ＤＮＡ改変タンパク質のＣ末端に融合される。本発明のこの局面の１つの特に好ましい実施態様においては、レセプターは、主に親水性の酸から構成され、そして好ましくは４個と２０個の間のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを介して、ＤＮＡ改変タンパク質に融合させられる。
【０１０３】
当業者に明らかであるように、完全なレセプターが存在する必要はない。リガンドに結合するアミノ酸がＤＮＡ改変タンパク質に融合させられることが、十分である。例えば、レセプターのＬＢＤがタンパク質の残りから分離されて、ＤＮＡ改変タンパク質に融合され、これによって得られる融合タンパク質にリガンド調節を与えることが知られている。グルココルチコイドおよびエストロゲンのレセプターについては、リガンドに結合するドメインは、他の転写因子に、そして腫瘍タンパク質にもまた融合されており、これによって融合タンパク質を、それらの活性について関連するリガンドに依存するようにする（Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９８８；Ｋｕｍａｒら、１９８７：Ｐｉｃａｒｄら、１９８８；Ｅｉｌｉｅｒｓら、１９８９；Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａら、１９９１；ＢｕｒｋおよびＫｌｅｍｐｅｎａｕｅｒ、１９９１；Ｂｏｅｈｍｅｌｔら、１９９２）。
【０１０４】
核レセプター部分とＳＳＲ部分とを含む適切な融合タンパク質の特定の例が、以下の参考文献（これらの内容は、それらの全体において本明細書中で参考として援用されている）に記載されている：欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０  ７０７  ５９９号；Ｓｃｈｗｅｎｋら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６、１４２７−３２；Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４．１４０４−１４１１；Ｎｉｃｈｏｌｓら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１、９５０−９６１；Ｎｉｃｈｏｌｓら（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．１７、７６５−７７３；Ｌｏｇｉｅら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２、１１２０−１１３２；Ｆｅｉｌ  Ｒら（１９９６）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ、９３、１０８８７−９０；Ｂｒｏｃａｒｄら（１９９７）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９４：１４５５９−１４５６３。
【０１０５】
第ＥＰ−Ｂ−０  ７０７  ５９９号には、融合タンパク質のレセプター部分に対するリガンドの結合が、分子のリコンビナーゼ部分の活性化を可能にすることが実証されている。この開示は、ＳＳＲ−ＬＢＤ融合タンパク質が、組換えを生じることなく標的部位と共在し得ることをもまた実証している。なぜなら、これらのタンパク質は、リコンビナーゼ活性のためにＬＢＤへのリガンド結合を必要とするからである。関連するリガンドが存在しない場合は、記載されているＳＳＲ−ＬＢＤ融合タンパク質のリコンビナーゼ活性は、野生型のリコンビナーゼ活性よりも少なくとも１／２００小さい活性である。関連するリガンドとともにＳＳＲ−ＬＢＤ融合タンパク質が存在する場合は、リコンビナーゼ活性は、野生型の２０％より高くにまで誘導される。すなわち、４０倍以上の誘導である。このことは、組換えを、関連するリガンドの存在によって、任意の経験的に操作することができる微生物中で調節することができることを意味する。
【０１０６】
第ＥＰ−Ｂ−０  ７０７  ５９９号に記載されている系と同等の例として、リガンド媒介性二量体化ドメイン（Ｓｐｅｎｃｅｒら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２  １０１９−２４）、原核生物由来のリガンド結合因子（例えば、テトラサイクリンリプレッサー（Ｇｏｓｓｅｎら（１９９４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５：５１６−２０））、抗体のリガンド結合ドメイン、膜レセプター、核レセプター（例えば、ホルモンレセプター）、酵素、ＤＮＡ結合ドメイン、特定のタンパク質ドメイン（例えば、ＳＨ３ドメイン）および転写因子が挙げられ、そしてこれらが使用される場合がある。同種リガンドが知られているＬＢＤの他の例が、当業者に明らかである。
【０１０７】
好ましくは、融合タンパク質のＬＢＤ部分は、リガンドに結合する能力を有している、核レセプターであるか、または核レセプターのＬＢＤであり、これは、グリコシル化され得るかまたはグリコシル化されない場合もある任意の分子を意味している。詳細には、ＬＢＤは、リガンド結合に関して、レセプタータンパク質によって提示される機能的特性または生化学的特性と同様の、機能的特性または生化学的特性を示す任意のタンパク質であり得る（Ｗｈｉｔｅｌａｗら、１９９３）。リガンドへの結合により、核レセプターは、活性なまたは変更された転写因子となる。
【０１０８】
ＬＢＤは、ステロイドホルモンレセプター（例えば、ステロイド、ビタミン、または関連するリガンドによって認識されるレセプター）のＬＢＤに対してそれらのアミノ酸配列によって関係している場合がある。適切なホルモンレセプターの例は、ＧｒｏｎｅｍｅｙｅｒおよびＬａｕｄｅｔ（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅ、２：１１７３−３０８；Ａｓｈｏｋら（１９９８）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９５：２７６１−６）；Ｈａｈｎら、（１９９７）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９４：１３７４３−８の中で列挙されている。
【０１０９】
好ましくは、ＬＢＤは、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、ミネラルコルチコイド、エクジソン、またはアンドロゲンレセプター荷由来する。Ｌａｕｄｅｔら（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１００３−１０１３によって記載されている方法を使用して、関係しているとして同定することができるような、核レセプターアミノ酸配列への十分な関係性を保持している、変異体レセプター誘導体は、用語ＬＢＤに含まれる。
【０１１０】
特に好ましい実施態様においては、ＦｌｐまたはＣｒｅリコンビナーゼは、エストロゲン、グルココルチコイド、プロゲステロン、またはアンドロゲンのレセプターのＬＢＤに融合させられる（ＧｒｏｎｅｍｅｙｅｒおよびＬａｕｄｅｔ（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅ、２：１１７３−３０８；また、Ｂｅａｔｏ、１９８９）。他の好ましい実施態様には、これらのＬＢＤへの、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｉｕｍもしくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗａｌｔｉｉ由来のＦｌｐリコンビナーゼ、ＴｒｐＩリコンビナーゼ、Ｒリコンビナーゼ、またはＳＳＲの融合が含まれる。
【０１１１】
別の好ましい実施態様には、これらのＬＢＤに対するＳＳＲ複合体の１つ以上の成分（特に、λＩｎｔまたはＧｉｎ組換え系の成分）の調節が含まれる。しかし、本発明は、既知のリコンビナーゼおよび組換え複合体、ならびに／または既知の核レセプターＬＢＤに限定されるようには意図されない。むしろ、本発明のこの実施態様のストラテジー（ＬＢＤまたは核レセプターへのリコンビナーゼまたは組換え複合体の成分の融合を含む）を、一部の当業者が過度の実験を行うことなく容易に同定することができる所望される特性を示すこれらのタンパク質の任意の融合組合わせに対して適用することが可能である。
【０１１２】
本発明の第１の局面のこの方法について議論されているように、用語「遺伝的エレメント」は、本明細書中で使用される場合は、遺伝情報を含むかまたはそれをコードし、そしてＤＮＡ改変タンパク質の基質とのそのコードされる遺伝情報の関係付けを可能にする、任意の実体を含むように意味される。特に、適切な遺伝的エレメントには、原核生物もしくは真核生物細胞、バクテリオファージ、またはウイルスの染色体または複数の染色体のうちの１つ、あるいは原核生物または真核生物細胞中で維持され得るエピソームまたは染色体外エレメント、あるいは原核生物または真核生物細胞中で維持され得る任意のＤＮＡまたはＲＮＡエレメントあるいは合成の区画が含まれる。原核生物、真核生物、または合成の区画中でのＤＮＡまたはＲＮＡ分子の染色体外での維持を指向するベクターが、特に適切である。それぞれの場合において、本発明の必須の部分は、ＤＮＡ改変タンパク質の基質部位と、その特性が選択される分子をコードする核酸配列との間での物理的な連結である。好ましい実施態様においては、それぞれの個々の細胞中で、１つのタイプのリガンドのみが発現され、これは生物自体中のＤＮＡ（例えば、細菌染色体）によってコードされる。これに続く、核酸基質がリガンド−レセプター結合事象によってそれ自体が活性化されるＤＮＡ改変タンパク質によって変更されている細胞の単離は、活性なリガンドまたはレセプターをコードする遺伝情報の単離を可能にする。
【０１１３】
本発明のこれらの局面のなおさらなる実施態様に従うと、上記に記載されている本発明の実施態様のいずれかに従って同定されたレセプターまたはリガンドをコードする核酸分子が提供される。本発明はまた、このような核酸分子によってコードされるレセプターまたはリガンドを提供する。
【０１１４】
上記で議論した分子進化のアプローチは、循環型のプロセスであり、そしてそれぞれのサイクルの局面は自動化することが可能である。好ましい実施態様においては、上記に記載されている本発明の局面の全てについて、反復サイクルによるライブラリーのスクリーニングに関する現在の激しい労力を伴う作業を、自動化することができる。
【０１１５】
本発明の種々の局面および実施態様は、特に、新規のＤＮＡ結合タンパク質の単離に関して、実施例によってさらに詳細に本明細書中に記載される。細部の改変が本発明の範囲を逸脱することなく行われ得ることは明らかである。
【０１１６】
（実施例）
（方法）
（進化ベクター）：ｐＥＶＯベクターシリーズは、プラスミドｐＢＡＤ−３３（Ｇｕｚｍａｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７：４１２１−３０（１９９５））に基づく。ｐＥＶＯ−ｌｏｘＰ２、ｐＥＶＯ−３、ｐＥＶＯ−６、およびｐＥＶＯ−１０は、リコンビナーゼの認識標的部位を除いて同一である（図３もまた参照のこと）。ｐＥＶＯ−ｌｏｘＰ２は、それらがバクテリオファージＰ１中に存在する場合と同様に、６９０ｂｐ隔ててタンデム縦列反復した２つのｌｏｘＰ部位を含む。ｐＥＶＯ−３は、ハーフサイト（ｈａｌｆｓｉｔｅ）にあたり３ヌクレオチドがｌｏｘＰ部位とは異なる２つの認識標的部位を含む。ｐＥＶＯ−３中のスペーサーは、バクテリオファージＰ１由来のｌｏｘＰ部位に見られるものと同一である。ｐＥＶＯ−６の認識標的部位（ｌｏｘＨ）は、ｐＥＶＯ−３中に存在する３つのヌクレオチド変化に加えて、８つの位置全てで変更されたスペーサー配列を有する。ｐＥＶＯ−１０は、２つのｌｏｘＨ部位と２つのｌｏｘＰ部位を含む。これらは相互に絡み合っている（ｉｎｔｅｒｗｉｎｅｄ）。リコンビナーゼの発現レベルは、培地に添加されるＬ−アラビノースの量によって滴定することができる。
【０１１７】
変異誘発およびＤＮＡシャッフリング：ランダム変異を、記載されているエラープルーンＰＣＲ（Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６、３９１−４０６（１９９８））によって、そしてミューテーター株ＸＬ１−ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の利用によって、Ｃｒｅリコンビナーゼのコード配列中に配置した。ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−９１（１９９４））およびＳｔＥＰ（Ｚｈａｏら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６、２５８−６１（１９９８））ＰＣＲを、記載されているように（若干変更して）行った。ＤＮＡシャッフリングのために、プラスミドライブラリー全体を、穏やかな超音波処理によって１００〜５００ｂｐのフラグメントに断片化し、そしてプライマーを添加することなく再度アセンブルした。バクテリオファージＰ７由来リコンビナーゼのコード領域を、ＤＮＡシャッフリング実験に含ませた。プライマーＥＶＯ−５’（５’−ＴＴＴＡＴＣＧＣＡＡＣＴＣＴＣＴＡＣＴＧ−３’）およびＥＶＯ−３’（５’−ＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴ−３’）（図３）を、リコンビナーゼの再アセンブルしたコード領域を増幅するために使用した。
【０１１８】
ライブラリーの作成：増幅したフラグメントをＢｓｒＧＩとＸｂａＩで消化し、そして同じ制限酵素で切断した適切なｐＥＶＯ−ベクター中にクローン化した。ライブラリーをＸＬ１−ｂｌｕｅコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にトランスフェクトし、液体培地に移し、そして２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび種々の濃度のＬ−アラビノース中で増殖させた。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉプレップキットを用いてＤＮＡを抽出した。平均のライブラリーのサイズは、１．２００．０００であった。ｐＥＶＯ−３およびｐＥＶＯ−６シリーズについては各１０世代を増殖させ、そしてｐＥＶＯ−１０については１５世代を増殖させた。
【０１１９】
リコンビナーゼの育種：ライブラリーから単離したＤＮＡをＮｄｅＩで消化した。ＮｄｅＩは非組換えクローン（ｐＥＶＯ−３およびｐＥＶＯ−６）、および非組換えクローン、またはｌｏｘＰ組換えクローン（ｐＥＶＯ−１０）を切断するが、ｌｏｘＨ部位を介して組換えられたプラスミドは切断しない。消化したライブラリーから単離したプラスミドＤＮＡを、続いて、プライマーＥＶＯ−５’およびＥＶＯ−３’の存在下での３５サイクルのＰＣＲ反応（９４℃、１分；５６℃、１分；７２℃、１．５分）において使用した。３世代毎に、ライブラリーを、ＤＮＡシャッフリングまたはＳｔＥＰ−ＰＣＲのいずれかによって組換えた。各世代において、リコンビナーゼの発現レベルは、各ベクターシリーズ（２０μｇ／ｍｌのＬ−アラビノースから始まりＬ−アラビノースなし（非常に低い発現）まで）について、２０％減少した。
【０１２０】
細胞培養：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用してプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。３６時間後に粗細胞抽出物を調製し、そして細胞抽出物のルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイシステムを用いて決定した。相対的なβ−ガラクトシダーゼ活性を、ＴｒｏｐｉｘのＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔキットを用いて測定した。Ｃｒｅ組換えレポータープラスミドｐＳＶｐａＸは、以前に記載されている（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：４２５６−６２（１９９６））。ｐＳＶｐａＨは、ｌｏｘＰ部位がｌｏｘＨ部位で交換されていることを除いて、ｐＳＶｐａＸと同一である。組換え形態のレポータープラスミド（ｐＳＶｐａＸΔまたはｐＳＶｐａＨΔ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＣｒｅまたはＦｒｅ３を発現する低コピープラスミドの存在下で、ｐＳＶｐａＸまたはｐＳＶｐａＨを同時培養することによって得た。組換え効率を、測定したβ−ガラクトシダーゼ活性から計算し、ルシフェラーゼ測定値によってアッセイした形質転換効率によって補正した。
【０１２１】
本発明の方法の特定の模式図を、図１、２、および９〜１３に示す。
【０１２２】
図１のパネルＡでは、発現され得る目的の遺伝子（矢印の先端で示す）を含有している遺伝的エレメントを楕円形の線で示す。この遺伝子は、ＤＮＡ改変酵素の基質部位に、物理的に連結されている。多くの適用では、目的の遺伝子は、候補のライブラリーの一部を形成する。
【０１２３】
パネルＢは、目的の遺伝子が、基質部位に作用し得るＤＮＡ改変酵素をコードする場合に適用する、簡単な模式図を示す。目的の遺伝子が候補のＤＮＡ改変酵素のライブラリーである場合は、２つの結果が可能であり、候補のＤＮＡ改変酵素が基質部位に対してそれを化学的に変更するように作用するか、またはそのようには作用せずに基質を未変化のままにするかのいずれかである。変化された基質、およびそれにより好結果を生じる候補のＤＮＡ改変酵素は、基質部位での変化の使用によって遺伝的エレメントのプールから回収される。好結果を生じる候補はほとんどの分子進化の実験において稀にしか見いだされないので、この模式図は、大部分の未変更の遺伝的エレメントの中の稀なメンバーとして、変更された遺伝的エレメント（波状線）を示す。この模式図は、基質が変化されたことに起因して好結果を生じる事象が同定される場合を示すが、逆もまた可能である。
【０１２４】
パネルＣは、目的の遺伝子が基質部位に作用し得るＤＮＡ改変酵素の活性に影響を与えるタンパク質をコードする場合に適用する簡単な模式図を示す。ここでは、目的の遺伝子（または目的のライブラリー）は、ＤＮＡ改変酵素をコードしないが、その活性を促進する（＋）かまたは阻害するかのいずれかであるＤＮＡ改変酵素を調節する分子をコードする。従って、基質中での変化、または変化がないことは、目的の遺伝子産物の活性を反映する。
【０１２５】
パネルＤは、目的の遺伝子のコード領域が基質部位に作用し得るＤＮＡ改変酵素のコード領域に融合されている場合に適用する簡単な模式図を示す。ここでは、ＤＮＡ改変酵素の遺伝子と目的の遺伝子とが、その発現産物がＤＮＡ改変酵素と目的の遺伝子（または目的のライブラリー）との間での融合体であるように、融合される。従って、ＤＮＡ改変タンパク質に対する目的の遺伝子の作用は、分子内作用であり得る。
【０１２６】
（実施例１）
図２では、部位特異的リコンビナーゼのＤＮＡ配列特異性を変更する一例を示す。工程１。部位特異的リコンビナーゼ（この場合には、Ｃｒｅリコンビナーゼ）のコード領域を、意図される基質を有しているベクター中にそれがクローン化されているライブラリーを作製するために、変異させる。ＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰと呼ばれる３４ｂｐの配列を認識し、そして２つのｌｏｘＰ部位の間で組換えを行う。正確なｌｏｘＰコンセンサス部位を示さない３４ｂｐの配列間で組換えを行う変異体Ｃｒｅリコンビナーゼを選択するために、変更されｌｏｘ部位（白色の三角で示す）を、変異体Ｃｒｅライブラリーがその中にクローン化されるベクター中に組み込む。
【０１２７】
工程２。次いで、ライブラリーを、変異させたＣｒｅリコンビナーゼがその中で発現され、そしてライブラリーの各メンバーがライブラリーの全ての他のメンバーから区画化される区画（好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ）中に導入する。変更されたｌｏｘ部位を認識して組換えを行う変異体は、２つの変更されたｌｏｘ部位の間での組換えによってそれらのコード領域に近接しているＤＮＡ配列を変化させる。（ここでは、２つのｌｏｘ部位の間のＤＮＡ領域の欠失として示すが、２つの部位間のＤＮＡ領域の逆位、または１つの部位でのＤＮＡの挿入、または１つの部位と別の分子中に存在する部位との間でのＤＮＡの転座を使用するストラテジーもまた可能である。それぞれの場合において、好結果を生じる変異体Ｃｒｅの活性は、そのコード領域に対して物理的に連結させたＤＮＡ配列中の変化によって示される。）野生型または好結果を生じない変異体Ｃｒｅリコンビナーゼは変化を触媒せず、結果として、好結果を生じる変異体Ｃｒｅリコンビナーゼのコード領域は、連結された変化によって示され、そして変化を同定するために、単一の方法または複数の方法によってライブラリーから回収することができる。
【０１２８】
工程３。変化を、その発現によって区画を表現型的に変更する遺伝子の導入または除去によって、同定することができる。表現型の変化は任意の手段によって同定することが可能であるが、以下のいずれかが好ましい：（ｉ）好結果を生じる変異体の区画が好結果を生じない変異体の区画よりも豊富であるように、区画別残存物を変更させる；または（ｉｉ）好結果を生じる変異体を含有している区画を、好結果を生じない変異体を含有している区画から迅速に分類することができる。１つのこのような選別方法はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）技術を使用する。
【０１２９】
変化を、変更させた分子を物理的に区別するための任意の手段によって、しかし好結果を生じる変異体にはよらずに同定するもまた可能である。好ましくは、変更を、好結果を生じる変異体遺伝子についての変更と関連したコード領域とを増幅するためのＰＣＲによって同定する。
【０１３０】
さらに好ましい実施態様は、表現型上の規準による同定を、物理的アプローチを使用する同定と組み合わせる。いずれかのスクリーニングアプローチのみでも、好結果を生じない候補の大きなバックグラウンドから好結果を生じる変異体を同定することができるが、この組み合わせによって、なおさらに多数の候補のスクリーニングが可能である。これらのアプローチにより、タンパク質指向性進化における主要な限界（すなわち、タンパク質コード領域のランダムな変異誘発によって提示される可能性のある膨大なバックグラウンドの中から、所定の特性について指向されたタンパク質機能を改善する好結果を生じる変異体の同定）に着手する。本明細書中に示す全ての実施例（例えば、以下に示す実施例）においては、この第１の実施例について詳細に記載した局面を、他に適応する。
【０１３１】
工程４。それぞれのタンパク質の進化サイクルの共通の目的は、好結果を生じる遺伝子の同定および増幅であり、好ましくはＰＣＲによる。図２に示す場合では、好結果を生じる変異体Ｃｒｅリコンビナーゼを、好結果を生じる遺伝子のコード領域に、次回のさらに改良したバリエーションのスクリーニングのための新しいライブラリーを作製するために新規の変異体のバリエーションが混入するように、ｓｌｏｐｐｙ  ＰＣＲによって増幅した。好結果を生じる変異体によってコードされるタンパク質を変更するための他の方法（例えば、ＤＮＡシャッフリング）もまた、より複雑なライブラリーを作製するためにこの工程に含むことができる。前回で同定した好結果を生じる候補に基づき、そして新規の変異および変異の組み合わせを導入するための任意の手段によって変更させた新規のライブラリーを、変異体ｌｏｘ部位を含有しているベクター中に再度クローニングし、そしてこのサイクルを繰り返す。
【０１３２】
Ｃｒｅリコンビナーゼについてのこのアプローチの詳細な適用は、実施例２に続く。
【０１３３】
（実施例２）
ここでは、ゲノム中に本来存在する配列を特異的に組換えるリコンビナーゼがが生じ得たかどうかを試験した。ヒトゲノムをスキャンし、そしパリンドローム配列を第２２染色体上で同定した。これは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される３４塩基対のｌｏｘＰ部位のうちの１４個が異なる（図３ａ）。そのヒトに起源することに基づいて、この配列は「ｌｏｘＨ」部位と称されている。Ｅ．ｃｏｌｉ中でのｌｏｘＨ部位を用いた最初の組換え実験は、Ｃｒｅリコンビナーゼが測定可能な頻度ではこの部位を組換えないことを示した（データは示さず）。
【０１３４】
本発明の方法を試験するために、Ｃｒｅリコンビナーゼを最初に、ベクターｐＥＶＯ−ｌｏｘＰ２中にクローン化した。ｐＥＶＯ−ｌｏｘＰ２は、切断基質として指向された２つのｌｏｘＰ部位を含む。Ｃｒｅがアラビノースプロモーターによって発現させられると、ＣｒｅはプラスミドｐＥＶＯ−ｌｏｘＰ２を効率よく組換える。組換えは、より速く移動するバンドの出現により、非常に低い発現レベルでもなお明らかであった（図４ａ、レーン１）。ＣｒｅはｌｏｘＨ部位に対しては組換え活性を示さなかったので、３つの工程による指向性分子進化ストラテジーを、進化するリコンビナーゼにおける斬新的変化が生じるのを可能にするように定めた。第１の工程として、ｌｏｘＨのハーフサイトで異なる３個のヌクレオチドを導入した（ｐＥＶＯ−３）。Ｃｒｅは、低い発現レベルではこのプラスミドを組換えなかった（図４ａ、レーン２）。しかし、より高い発現レベルでは、組換えが観察された（図４ａ、レーン４）。変異させたリコンビナーゼのライブラリーをｐＥＶＯ３中にクローン化し、そして低いリコンビナーゼ発現レベルでスクリーニングした。この部位が組換えられたクローンをひとまとめにして増幅し、そして複数の方法において概略を述べたように再度スクリーニングしたかまたはシャッフルした。１０世代後には、かなりの量のプラスミドが、低いリコンビナーゼ発現レベルで組換えを示した（図４ａ、レーン６）。
【０１３５】
このライブラリーを第２の工程の出発点として使用し、そしてｐＥＶＯ−６中にクローン化した。ｐＥＶＯ−６は、ハーフサイトあたり３個のヌクレオチド変化に加えて、全部で８個のヌクレオチドの変更されたスペーサーを含む（図３ａ）。Ｃｒｅは、スペーサー配列中の変化に敏感であり（Ｌｅｅ，Ｇ．およびＳａｉｔｏ，Ｉ．，Ｇｅｎｅ  ２１６、５５−６５（１９９８））、そしてリコンビナーゼがアラビノースで誘導されてもなお、ｐＥＶＯ−６中にクローン化された場合には組換えを示さなかった（図４ａ、レーン５）。ｐＥＶＯ−６中のｌｏｘＨ部位を組換えたリコンビナーゼを、さらなる世代において進化させた。これは、図４ｂ、レーン７の組換えバンドにより明らかである。
【０１３６】
１０世代後に、１２個の別々のクローンを、それらの組換えの性質を評価するために調査した。１２個の全てのクローンが、種々の程度でｌｏｘＨ部位を組換えた。しかし、１２個の全てのクローンはまた、それらをｐＥＶＯ−ｌｏｘＰ２中にクローン化した場合に同様またはそれよりも高い組換え効率を示した。このことは、これらのリコンビナーゼが緩やかな特異性を有したことを示している（図４ｃのクローンＦｒｅ２０、および未公開データを参照のこと）。
【０１３７】
ｌｏｘＨ部位を特異的に組換えるリコンビナーゼを同定するために、ｐＥＶＯ１０を構築した。ｐＥＶＯ１０は、２つのｌｏｘＰ部位が絡み合わされている２つのｌｏｘＨ部位を含む（図３ｂ）。ｐＥＶＯ−１０を有している細胞中で発現されたリコンビナーゼは、ｌｏｘＨ部位を組換えてＮｄｅＩ制限部位の除去を生じるか、またはｌｏｘＰ部位を組換えてプライマーＥＶＯ−３’の結合部位を除去するかのいずれかが可能である。ｌｏｘＰとのｌｏｘＨの組換えは不可能である。なぜならこれらは異なるスペーサー配列を含み、そして相同性は、インテグラーゼファミリーの部位特異的リコンビナーゼの組換えに決して欠くことができないからである（Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４、２２８７−３００（１９８６）；Ｎｕｎｅｓ−Ｄｕｂｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２６、３９１−４０６（１９９８））。
【０１３８】
ＰＣＲ増幅工程で示される鋳型のより多量の提示に起因して、ｌｏｘＨ部位を優先的に組換えるリコンビナーゼがそれぞれの世代で蓄積した。１５世代後には、調査されたほとんどのリコンビナーゼが、ｌｏｘＨ部位の組換えに対する優先性を示した。４個のリコンビナーゼがｌｏｘＨ部位の組換えに対して強い優先性を示した（図６ｂ）。１つのリコンビナーゼ（Ｆｒｅ３と呼ぶ）は、３回のアッセイで特異性の完全な逆転を示し（図４ｂ、図４ｃ）、そしてｌｏｘＨ部位のみを組換えた。
【０１３９】
Ｆｒｅ１とＦｒｅ３の組換え特性を、レポータープラスミドおよびリコンビナーゼ発現プラスミドを用いて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を同時トランスフェクトすることによって、哺乳動物細胞中で評価した（図６ａ）。ｐＳＶｐａＸまたはｐＳＶｐａＨのみでトランスフェクトした細胞は、低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示したが、レポータープラスミドの組換え形態（ｐＳＶｐａＸΔまたはｐＳＶｐａＨΔ）でトランスフェクトした細胞は、全てのレポータープラスミドの完全な組換えから予想されるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。ｐＳＶｐａＸのｐＮＰＫ−Ｃｒｅとの同時トランスフェクションから測定したβ−ガラクトシダーゼ活性は、レポーターの約７５％が３６時間以内に組換えられたことを示した。対照的に、プラスミドｐＳＶｐａＨの組換えがほとんどないことを、Ｃｒｅを発現するプラスミドと同時トランスフェクトした場合に観察した。Ｅ．ｃｏｌｉアッセイと同様に、Ｆｒｅ２０は緩やかな特異性を示し、そしてｐＳＶｐａＸとｐＳＶｐａＨの両方を組換えた。Ｆｒｅ１とＦｒｅ３は、ｐＳＶｐａＨのみを組換え、このことは、これらのリコンビナーゼが哺乳動物細胞中のｌｏｘＨ部位を特異的に組換えることを示している。Ｆｒｅ１とＦｒｅ３は、Ｃｒｅと比較した場合には、これらのアッセイにおいて活性の低下を示した（図６ｂ）。それにもかかわらず、それらの活性は、マウスにおいて高い忠実度で作用することが最近示された（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５、１３９−４０（２０００））改良されたＦＬＰｅリコンビナーゼ（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６、６５７−６２（１９９８））の活性に類似しているか、またはそれよりも良好であった。高い酵素活性の選択は、本発明者らの分子育種ストラテジーには含まなかった。しかし、高い忠実度でｌｏｘＨ部位を特異的に組換えるリコンビナーゼは、高い酵素活性を標的とするアッセイにおいては迅速に進化する場合がある。
【０１４０】
種々の世代サイクル後の個々のクローンのＤＮＡ配列は、進化によるタンパク質設計アプローチの能力を明らかにし、そして進化の流れを示した（図７）。このデータは、重要なアミノ酸変化の同定およびそれらの機能の予測をもまた導いた。例えば、アミノ酸２６２が、ｐＥＶＯ３中での１０世代後に配列決定した１０個のクローンのうちの４個において、ＥからＱに変異させられていたことを見出した。このアミノ酸変化が、ｐＥＶＯ３中での１０世代後の最も顕著な変化であること、そしてこれがさらなる世代において保存されていたという事実（図７）は、この変化がハーフサイトにおいて変化した３個のヌクレオチドを含むｌｏｘ部位の組換え効率を促進すると予想する。この仮説と一致して、Ｃｒｅ結晶構造へのＥ２６２のマッピングは、これがｌｏｘＨのハーフサイト１０での変化に極めて近接していることを示す（Ｇｕｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９、４０−６（１９９７））（図８）。
【０１４１】
ｐＥＶ０６中での１０世代、およびｐＥＶＯ１０中での１５世代後の１４個のクローンの配列決定によって、アミノ酸変化がクラスター形成した３個の顕著な領域を同定した（図７）。アミノ酸Ｅ１７６、Ｎ３１７、Ｎ３１９およびＩ３２０は、複雑なシナプス中のスペーサー配列の露出されているヌクレオチドに面している（図８）。アミノ酸Ｍ３０、Ｖ８５、Ｋ８６、Ｑ９４、Ｒ１０１、Ｓ１０８、およびＥ１２９は、同じ構造中のスペーサー配列周辺のＤＮＡの切断されていない上部を覆う。
【０１４２】
ｐＥＶＯ３中での選択後のこれらのアミノ酸変化の出現およびスペーサー領域に対するそれらの非常な近接に基づいて、本発明者らは、これらの２つのクラスター中のアミノ酸変化が、ｌｏｘＨスペーサー配列の認識を可能し、これはおそらく、挿入されたスペーサー配列が切断のための正確な立体構造を生じることによると予想した。興味深いことに、アミノ酸Ｋ８６、Ｑ９４、Ｒ１０１、Ｓ１０８、Ｎ３１７、およびＩ３２０は、予め切断された複合体中での切断のためのｌｏｘＰスペーサー配列の配置に関係していることが示されている（Ｇｕｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９６、７１４３−８（１９９９））。第３のクラスターは、アミノ酸Ｅ１５０、Ｎ１５１、Ｄ１５３、およびＧ２１６を含む。このクラスターでは、負電荷の欠失または正電荷の獲得のいずれかを生じる変化が選択されるようである。さらに、Ｎ末端およびＣ末端は、これらの中でそのタンパク質中の最速の変化位置であった。このことは、これらの領域がタンパク質の機能には重要ではなく、従って、これらの領域での変化が十分に許容されることを示唆し得る。しかし、いくつかの最も持続的な変化（Ｖ７Ｌおよび２個または１６個のアミノ酸によりＣ末端を延長するヌクレオチド欠失）をこれらの領域中で見出した。このことは、これらの領域がまだなお同定されていない機能を含む場合があることを示している。
【０１４３】
Ｆｒｅ１、Ｆｒｅ３、Ｆｒｅ５、およびＦｒｅ６がｌｏｘＨ部位について特異性を示す理由に関する説明は現在提供され得ない。ライブラリーがｐＥＶＯ６からｐＥＶＯ１０に進んだ５世代後には、アミノ酸変化の明らかなクラスターは生じなかった（図７）。ｐＥＶＯ１０中のさらなる世代および／またはこれらのリコンビナーゼの構造情報は、特異性の発生が生じる方法の理解を手助けし得る。
【０１４４】
（実施例３）
図９では、エンドヌクレアーゼのＤＮＡ配列特異性が変更させられる。
【０１４５】
工程１では、部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、稀な切断エンドヌクレアーゼＩ−Ｓｃｅ１）のコード領域を、意図される基質（ここでは、変更したＩ−Ｓｃｅ１切断部位）（白色の三角で示す）を保有しているベクター中にクローン化されるライブラリーを作成するために、変異させる。Ｉ−Ｓｃｅ１は、約２０ｂｐの配列を認識し、そしてこの部位を切断する。新しい認識部位を切断する変異体Ｉ−Ｓｃｅ１の選択のために、変更したＩ−Ｓｃｅ１認識部位（単数または複数）を、その中に変異体Ｉ−Ｓｃｅ１ライブラリーがクローン化されるベクター中にクローン化する。図１中の実施例Ａに記載するように、次いで、ライブラリーを、発現および区画化のためにＥ．ｃｏｌｉ細胞に導入し、そしてさらなる処理工程もまた、エンドヌクレアーゼによる切断が、好結果を生じる変異体Ｉ−Ｓｃｅ１をコードするＤＮＡ分子中に変化を生じるために部位特異的組換えではなくむしろ相同組換えを促進することを除いて、同様であった。この相同組換え事象は、変異体Ｉ−Ｓｃｅ１エンドヌクレアーゼ切断によって促進され、そして導入された変異体Ｉ−Ｓｃｅ１部位（太い黒線で示す）のいずれかの側に予め配置された短い直接のＤＮＡ反復にそって生じる。そしてこれは、二本鎖の切断  修復を促進するタンパク質（詳細には、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ、またはＲｅｄα／Ｒｅｄβ）の同時に生じる発現によって媒介され、その結果、意図される相同組換えは、変異体Ｉ−Ｓｃｅ１部位は、変異体Ｉ−Ｓｃｅ１の切断が生じない場合には有意な頻度では生じない。分子内組換えの直接の反復は８ｂｐ程度の短さであり得るが、より長い反復はより大きな効率を導く。これらの直接の反復が非常に長い（例えば、１２０ｂｐ以上）場合には、変異体Ｉ−Ｓｃｅ１の切断が生じない場合に生じる分子内相同組換えのバックグラウンドが発生し、そして意図される変異体Ｉ−Ｓｃｅ１切断によって促進される事象の同定を混乱させるかまたは妨げる場合がある。
【０１４６】
工程３。それにより、変異体Ｉ−Ｓｃｅ１部位を良好に切断する変異体Ｉ−Ｓｃｅ１遺伝子を保有しているベクターは、好結果を生じないベクターとは物理的に異なる。これらを、本明細書中に記載されている物理的方法によって同定することができる。さらに、記載する表現型の識別方法はまた、相同組換えを促進する短い直接の反復が変異体Ｉ−Ｓｃｅ１部位とその発現が便利な表現型に関する差異を提示する遺伝子の両方のいずれかの側に間隔があいている場合にも、含まれ得る場合がある。直接の反復による相同組換えは、表現型に関する遺伝子を欠失させ、従って、単離およびさらなるサイクルのために好結果を生じる変異体Ｉ−Ｓｃｅ１遺伝子を記録するための、表現型の変化および物理的な変化の両方を示す。
【０１４７】
工程４。それぞれのタンパク質進化のサイクルの共通の目的は、好結果を生じる遺伝子の同定および増幅であり、好ましくはＰＣＲによる。図９に示す場合には、好結果を生じる変異体Ｉ−Ｓｃｅ１リコンビナーゼを、好結果を生じる遺伝子のコード領域が次回のさらに改良されたバリエーションのスクリーニングのための新しいライブラリーを作成するための新規の変異体のバリエーションと混合されるように、ｓｌｏｐｐｙ  ＰＣＲによって増幅した。好結果を生じる変異体によってコードされるタンパク質を変更するための他の方法（例えば、ＤＮＡシャッフリング）もまた、より複雑なライブラリーを作成するためのこの工程に含むことができる。前回で同定し、そして新規の変異および変異の組み合わせを導入するための任意の手段によって変更した好結果を生じる候補に基づく新規のライブラリーを、変異体ｌｏｘ部位を含有しているベクター中に再度クローン化し、そしてサイクルを繰り返す。
【０１４８】
（実施例４）
図１０の工程１では、ＤＮＡ修復に関係しているタンパク質（単数または複数）（例えば、ＭＳＨ２、ＭＳＨ４、ＭＳＨ６、またはＥ．ｃｏｌｉのファージタンパク質、ＲｅｃＴもしくはＲｅｄβ）（ここでは、ＲｅｃＴ）のコード領域（単数または複数）を、意図される基質を有しているベクター中にクローン化されるライブラリーを作成するために、変異させる。意図される基質は、その変異していない形態で容易に同定することができる表現型の変化を示すタンパク質を発現することができる、微妙に変異した遺伝子であり得る。例えば、本明細書中で示すようには、基質は、１個から４個またはそれ以上のｂｐの欠失、１個から４個またはそれ以上の塩基対の付加によって変異させられたか、あるいはそれが不活性なタンパク質を発現するように点変異させられた、抗生物質耐性（例えば、選択マーカーについてはｓｍと記載する）、ＧＦＴ、またはｌｏｃＺ遺伝子であり得る。
【０１４９】
工程２。活性なタンパク質を発現するためのＤＮＡ修復によるオープンリーディングフレームの回復は、好結果を生じる候補を同定するための表現型による方法をもたらす。ＤＮＡ修復によって導入された同時に生じる物理的変化はまた、例えば、変更されたベクター配列と未変更のベクター配列との間を識別するＰＣＲ増幅条件を使用して、未変更のベクターからそれが物理的に識別され得るように、ベクターを変更する。あるいは、ＤＮＡ修復による変更されたベクター配列と未変更のベクター配列との間での識別は、表現型マーカーの発現の回復を単にバイパスし得る場合があり、そしてこれは、物理的方法による識別のみに頼る。
【０１５０】
この場合は、ＤＮＡ修復タンパク質の活性は、修復されたＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子（ここでは、「修復オリゴヌクレオチド」と記載する）によって、ベクター上の基質部位に向けられる。ＤＮＡ修復によって、この配列を、ベクターを変更するために変異させられた領域に再度配置する。
【０１５１】
工程３。一旦修復されると、変更されたベクターによって、工程４での次回のライブラリーの構築、および好結果を生じる候補のさらなる同定のための材料を供給する変異体ライブラリーから好結果を生じる候補遺伝子を同定する。
【０１５２】
上記の実施例１および２とは対照的に、候補のライブラリー中の好結果を生じる変異体の同定は、もとのタンパク質には含まれない特性の獲得による場合には、実施例３に記載されている場合は、もとのタンパク質によって提示されるものを上回る改良された特性を示す変異体タンパク質の同定による。このアッセイでは、もとのタンパク質、およびもとのタンパク質の有害ではない変異体のバリエーションもまた、好結果を生じる。しかし、反復スクリーニングのサイクルの際には、元のタンパク質を上回る改良された効率を示す変異体のバリエーションは、以後の回のライブラリーのクローニングおよびスクリーニングを行うために使用される変更されたベクター分子のプールを徐々に占有する。結果として、複数回の好結果を生じる候補の単離、再分類、再クローニング、および試験によるスクリーニングプロセスによって、改良された候補が出現する。
【０１５３】
（実施例５）
図１１では、相同組換えを媒介するタンパク質の効率を改善する。
【０１５４】
工程１。相同組換えに関与するタンパク質（単数または複数）（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのファージタンパク質、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＴ、Ｒｅｄα、Ｒｅｄβ、ＵｖｓＸ、ファージＰ２２タンパク質、またはＥ．ｃｏｌｉタンパク質、ＲｅｃＢ、ＲｅｃＣ、ＲｅｃＤ、ＲｅｃＦ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ、またはＲｅｃＡファミリーの任意のメンバー（ＲｅｃＡおよび真核生物のＲＡＤ５１ｓを含む）、またはＲＡＤ５２ファミリーの任意のメンバー、あるいは相同組換えに関与する任意の他のタンパク質（ここでは、ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴと示す））の、コード領域（単数または複数）を、意図される基質を有しているベクター中にクローン化されるライブラリーを作成するために変異させる。この意図される基質は、容易に同定することができる表現型の変化を示すタンパク質を発現することができる遺伝子であり得る。例えば、この基質は、変異体または野生型の抗生物質耐性、ＧＦＰ、またはｌａｃＺ遺伝子であり得る。工程２。相同組換えタンパク質の作用を、表現型の変化（ここでは、「ｓｍ」−選択マーカー−遺伝子の導入と示す）を示すように基質遺伝子が相同領域（太い黒線によって示す）を通じた相同組換えによって交換されるように、基質遺伝子の変異された領域を置き換えるＤＮＡ分子（太い黒点線によって示す）の導入によって、基質に対して指向させる。同時に生じる基質中での物理的変化もまた、連結した好結果を生じる相同組換え遺伝子を回収するための物理的方法の基準として役立ち得る。あるいは、この基質は、導入されたライブラリーのクローニング部位に物理的に連結された任意のＤＮＡ領域であり得、そして好結果を生じる遺伝子は、物理的方法のみの使用によって回収される。
【０１５５】
上記の実施例３と同様に、このアプローチは、改良された変異体のバリエーションが、変更されたクローニングベクターのプールを徐々に占有するようにさせるための、反復スクリーニングサイクルに頼る。
【０１５６】
図１２では、模式図は、目的の遺伝子がプロテアーゼである場合を示すが、この原理を、ＤＮＡ改変酵素の活性を調節する任意の分子機構に対して適応する。
【０１５７】
工程１。プロテアーゼ（例えば、ＴＥＶまたはトロンビンプロテアーゼ）をコードする遺伝子の変異体ライブラリーを、ＤＮＡ改変タンパク質の基質の近くのベクター中にクローン化する。
【０１５８】
工程２。示した場合では、ＤＮＡ改変タンパク質は部位特異的リコンビナーゼ（ここでは、Ｃｒｅ）であり、そしてこの基質は、２つの同種の部位特異的組換え標的部位（ここでは、白三角で示すｌｏｘＰ部位）を含む。部位特異的リコンビナーゼが作用しない場合は、これは、２つの同種の部位間での部位特異的組換えによってベクターを再配置する。２つの部位特異的組換え標的部位の間のＤＮＡ領域は、その発現によって抗生物質耐性遺伝子のような表現型上の差異を示す遺伝子が、部位特異的組換え事象までは発現されないか、または部位特異的組換え事象によってその発現が削除されるまで発現されるかのいずれかであるように、ＤＮＡエレメントを含むことができる。部位特異的リコンビナーゼの発現は、それが不活性な形態で全ての区画中で発現されるように形成される。記載する場合では、これを、部位特異的リコンビナーゼの酵素活性を阻害する連結されたタンパク質ドメインとの融合タンパク質として発現させる。融合タンパク質のこのような一つの例は、核レセプターのリガンド結合ドメインに融合された部位特異的リコンビナーゼの発現の場合である。融合タンパク質を、候補のプロテアーゼ切断部位が、阻害ドメインに対して部位特異的リコンビナーゼを連結するアミノ酸領域中に含まれるように設計する。候補のプロテアーゼ認識部位での好結果を生じる変異体プロテアーゼによる切断は、部位特異的リコンビナーゼ由来の阻害ドメインを提供し、従ってリコンビナーゼは、基質に対する作用がなくなる。工程３。従って、好結果を生じる変異体プロテアーゼを、そのコード領域の付近のベクター中での物理的変化との関連によって回収することができる。
【０１５９】
図１３に示す例では、ＤＮＡ改変酵素（ここでは、部位特異的リコンビナーゼＦＬＰ）のコード領域を、ＦＬＰが目的のタンパク質の変異されたバリエーションを有する融合タンパク質として発現されるように、目的の遺伝子に融合する。記載する例では、目的の遺伝子は核レセプターのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）をコードする。工程２。区画（ここでは、好ましくは、真核生物細胞によって提供される区画）中への導入およびその中での発現の際には、誘導した部位特異的リコンビナーゼ／リガンド結合ドメイン（ＦＬＰ−ＬＢＤ）融合タンパク質は、リガンド結合ドメインによる同種リガンドの結合が生じない場合には不活性である（Ｌｏｇｉｅ，Ｃ．およびＳｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．，ＰＮＡＳ，１９９５）。基質の組換えが全く生じないかまたはほとんど生じないように、同種リガンドが融合タンパク質が発現される区画中に導入される前に、リガンド結合ドメインは、部位特異的リコンビナーゼの酵素活性を抑制する。リガンド結合ドメインによるリガンド結合の際に、抑制が解消され、そして組換えが生じる。それによって、この例では、本発明の方法を、候補のリガンドに結合する好結果を生じる変異体のバリエーションについて、変異させたリガンド結合ドメインのライブラリーをスクリーニングするために適応することができる。候補のリガンドは単一の分子であり得るか、または分子の混合物であり得る。好結果を生じる変異体リガンド結合ドメイン／候補のリガンド結合事象は、部位特異的リコンビナーゼの酵素活性を脱抑制し、そして基質が組換えられる。工程３。本明細書中に記載する全ての交換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）に関して、基質中での物理的変化は、好結果を生じる変異体遺伝子のコード領域に対して連結され、そしてこれを記録する。これは、表現型的または物理的方法、あるいは両方の組み合わせによって、本明細書の別の場所に記載するように、好結果を生じない候補の大きなバックグラウンドから回収することができる。
【０１６０】
（実施例６：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのこの方法（ＳＬｉＤＥ）の適応）
その機能成分を標識付けしたプラスミド２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１を図１４に示す。このプラスミドは、酵母／Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターに基づき、結果として、Ｅ．ｃｏｌｉ中での増殖のためのＣｏｌＥ１起点（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）およびアンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰ）と、酵母中での増殖のためのＣＮ４複製起点（ＣＥＮ４）およびトリプトファン生合成遺伝子（ＴＲＰ）とを含む。
【０１６１】
ＳＬｉＤＥのこの適応での使用のためのＤＮＡ改変タンパク質はＦＬＰリコンビナーゼ（ＦＬＰ）であり、これは、核ホルモンレセプター由来のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）との融合タンパク質としてＧＡＬプロモーターから発現される。
【０１６２】
この模式図および以下の配列（Ｂ）では、ＬＢＤは、ヒトのエストロゲンレセプター由来であり、これはヒトエストロゲンレセプターのアミノ酸２５１で開始するＦＬＰの極めてＣ末端に融合される。融合点を、これらのタンパク質のコード領域の間に示す。このプラスミドの他の誘導体中では、特有のＢａｍＨＩとＳａｃ１部位（示す）を使用して、エストロゲンレセプター配列を他の核ホルモンレセプター由来のＬＢＤ配列と交換するか、または２２−ＧＦＰ／ＦＬＰを作成するためにＦＬＰが融合タンパク質としては発現されないように全てのＬＢＤを除去する。ＦＬＰ−ＬＢＤ融合コード領域には、示すようにＡＲＯ４ターミネーターが続く。
【０１６３】
ＦＬＰの組換えのための基質には、ＴＥＦ１プロモーターから発現されるＵＲＡ３遺伝子が含まれる。ＵＲＡ３遺伝子は２つのＦＬＰ組換え標的部位（ＦＲＴ、示す）に隣接される。ＦＬＰによって媒介される組換えによって、２つのＦＲＴの間のＤＮＡ領域を欠失させ、それによってＵＲＡ３遺伝子を欠失させる。
【０１６４】
下流には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する遺伝子が存在する。組換えの前にはＧＦＰは発現されない。なぜなら、プロモーターを有さないからである。組換え後は、ＧＦＰ遺伝子は、ＴＥＦ１プロモーターに隣接し、そして発現される。従って、このＳＬｉＤＥ基質中では、好結果を生じるＦＬＰ組換え事象により、ＤＮＡ改変酵素（ここでは、ＦＬＰ−ＬＢＤ）のコード領域に隣接している基質プラスミドに対する物理的変化と、また表現型マーカー遺伝子の発現における変化（ここでは、ＵＲＡ３の欠失および／またはＧＦＰ発現の獲得）との両方を生じる。
【０１６５】
以前に示され（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｍ．，Ｒｉｅｎｔｊｅｓ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．，Ｌｏｇｉｅ，Ｃ．およびＳｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｆ．（１９９７）「Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ／ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ａｇｏｎｉｓｔｓ」Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１、９５０−９６１）、そして図１３に図解するように、ＦＬＰに融合されたＬＢＤの存在は、ＦＬＰリコンビナーゼ活性を阻害し、そして阻害はＬＢＤの同種リガンドの投与により開放することができる（図１６もまた参照のこと）。
【０１６６】
プラスミド２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１のＤＮＡ配列を、図１４Ｂに示す。
【０１６７】
対照実験を、２２−ＧＦＰ／ＦＬＰを用いて行い、ＦＬＰの組換えが、ＳＬｉＤＥの最初の表現型のスクリーニングとして次いでＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）において使用することができるＧＦＰの発現を誘導することを確認した。
【０１６８】
図１５は、４個のパネルを示す。上段では、２２−ＧＦＰ／ＦＬＰの誘導体を有している酵母細胞（この実験のために、その中の２つのＦＲＴの間の領域を酵母への導入の前に欠失させた）を、最大のＧＦＰの発現についてのポジティブコントロールとして示す。
【０１６９】
第２のパネルでは、２２−ＧＦＰ／ＦＬＰの誘導体を有している酵母細胞（これは、ＦＲＴの間の領域全体をなおも保有しているが、ＦＬＰリコンビナーゼ遺伝子を有していない）を、ＧＦＰを発現がないことについてのコントロールとして示す。
【０１７０】
第３のパネルでは、２２−ＧＦＰ／ＦＬＰを有している酵母細胞をグルコース培地中で培養した。その結果、ＧＡＬプロモーターが抑制され、そしてＦＬＰリコンビナーゼは発現されないはずである。予想したように、ＦＬＰの組換えないことの指標である、ＧＦＰの発現がないことを観察した。
【０１７１】
第４のパネルでは、２２−ＧＦＰ／ＦＬＰを有している酵母細胞を、ガラクトース培地中で培養して、ＧＡＬプロモーターを誘導しそれによりＦＬＰリコンビナーゼの発現を誘導した。予想通り、ＧＦＰの発現が誘導され、これはＦＬＰの組換えの指標である。
【０１７２】
結果として、４個のパネルに示したようなＭ１／Ｍ２の境界でのＦＡＣＳのゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）によって、ＧＦＰを発現しない酵母細胞からＧＦＰを発現する酵母細胞を分離し、従って、不活性を用いて活性なＦＬＰリコンビナーゼを有するそのような細胞を分離する。このように、この識別は、ＳＬｉＤＥによる分子進化のための最初の表現型上の規準として役立ち得る。
【０１７３】
種々の核レセプターＬＢＤを、ＦＬＰの抑制について酵母中で試験した。これらの実験結果を、図１６においてサザンブロットの形態で示す。試験した全てのＬＢＤを、２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１について記載したようにＦＬＰに融合した。試験したＬＢＤは以下であった：ＥＲ（上記のＥＲ２５１）；ＡＲ（ヒトのアンドロゲンレセプターのＬＢＤ）；ＶＤＲ（ヒトのビタミンＤレセプターのＬＢＤ）；およびＴＲ（ヒトの甲状腺ホルモンレセプターのＬＢＤ）。さらに、ＬＢＤを連結していないＦＬＰをもまた試験した（レーンＦＬＰ）。
【０１７４】
これらのタンパク質を、２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１中の場合にはＧＡＬプロモーターから発現させ、そして発現を抑制するためにはグルコース（ＦＬＰについて「ｇｌ」で示す第１のレーンのみ）、または発現を誘導するためにはガラクトース（全ての他のレーン）のいずれかの中で培養した。ガラクトースの添加の時点で、同種リガンド（ここでは、「ホルモン」と示す）を添加したか（＋）または添加しなかった（−）。ホルモンは全て、左に示した時間に１μＭで添加し、そして以下であった；ＥＲ（エストラジオール）；ＡＲ（ミボレロン（ｍｉｂｏｌｅｒｏｎｅ））；ＶＤＲ（１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）；ＴＲ（トリヨードチロシン）、その後、細胞を回収し、ＤＮＡを精製し、そしてＦＬＰ組換え事象を試験するために示したサザンブロットを行った。
【０１７５】
組換えの前には、ＤＮＡバンドは大きく（ｕｎｒｅｃ）、そして組換えによってＵＲＡ３遺伝子を欠失してＤＮＡバンドは短くなる（ｒｅｃ）。観察されるように、さらなるＬＢＤを有していないＦＬＰ遺伝子を有している細胞中では、ＦＬＰの組換えが起こらないことが、グルコース中で増殖させた細胞において明らかである（レーン１）が、組換えは実質的には、グルコースでの誘導の１０時間以内に完了する（レーン２、１１、および１２）。全てのＦＬＰ−ＬＢＤの場合には、ごくわずかな組換えが、リガンドを添加していない場合の２２．５時間の時点でもなお明らかになった。
【０１７６】
全てのＦＬＰ−ＬＢＤの場合において、組換えは、同種リガンドの添加によって効率よく誘導された。このことは、ＦＬＰ−ＬＢＤタンパク質が発現され、そして同種リガンドが存在していない場合には組換えが生じないことが、融合されたＬＢＤによる抑制に起因することを示している。従って、ＦＬＰ−ＬＢＤ融合タンパク質は、図１３で概略を述べたＳＬｉＤＥストラテジーについての適切な出発点を明確に示し、２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１中で進化される。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の模式図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の模式図を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の模式図を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明の模式図を示す。
【図２】図２は、部位特異的リコンビナーゼのＤＮＡ配列特異性の変更を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＨ部位のヌクレオチド配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ベクターｐＥＶＯ１０を用いた進化ストラテジーの模式図を示す。ＰＣＲ反応で使用した関連する制限部位およびプライマーを示す。灰色の三角は、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識標的部位（ｌｏｘＰ）を示す。白色の三角は、ｌｏｘＨ部位を示す。タンパク質のコード配列および複製起点を示す。細胞中でのリコンビナーゼの発現は、２つのｌｏｘＰ部位による組換え、２つのｌｏｘＨ部位による組換え、または組換えが起こらないこと（示さず）のいずれかを生じる。２つのｌｏｘＨ部位を組換えたリコンビナーゼを、単離したプラスミドＤＮＡの制限酵素ＮｄｅＩでの消化、それに続く示したプライマーでのＰＣＲ増幅によって、リコンビナーゼのプールから同定することができる。増幅したフラグメントをシャッフルし、そして次世代を開始するためにもとのｐＥＶＯ１０ベクター中にクローン化して戻した。
【図４】図４は、以下を示す：ａ）ｐＥＶＯベクターシリーズのＣｒｅによる組換え、および種々の世代のサイクルでのライブラリー。プラスミドＤＮＡを細菌から抽出し、そして０．７％のアガロースゲル上で泳動した。２つの矢印を有する線は、組換えられていない状態のプラスミドを示し、一方、１つの矢印を有する線は、リコンビナーゼによって媒介される組換え後のプラスミドを示す。Ｍ＝１ｋｂのマーカー、ｌ＝ＬＢ中で増殖させたｐＥＶＯ−ｌｏｘＰ２−Ｃｒｅ、２＝ＬＢ中で増殖させたｐＥＶＯ−３−Ｃｒｅ、３＝ＬＢ中で増殖させたｐＥＶＯ−６−Ｃｒｅ、４＝５・ｇ／ｍｌのＬ−アラビノース中で増殖させたｐＥＶＯ−３−Ｃｒｅ、５＝５・ｇ／ｍｌのＬ−アラビノース中で増殖させたｐＥＶＯ−６−Ｃｒｅ、６＝ＬＢ中で増殖させたｐＥＶＯ−３−Ｌｉｂ１０、７＝ＬＢ中で増殖させたｐＥＶＯ−６−Ｌｉｂ１０、８＝ｐＥＶＯ−ｌｏｘＰ２、９＝ｐＥＶＯ−３、１０＝ｐＥＶＯ−６。ｂ）ｌａｃＺ組換えレポーターアッセイを利用して説明されるＦｒｅ３の変化した組換え特異性。示したレポータープラスミド（ｐＳＶ−ｐａＸ、またはｐＳＶ−ｐａＨ）およびｐＢＡＤ３３−Ｃｒｅ（Ｃｒｅ）、またはｐＢＡＤ３３−Ｆｒｅ３（Ｆｒｅ３）を有しているＤＨ５・細胞を、５０・ｇ／ｍｌのＬ−アラビノース中で増殖させた。細胞を、Ｘ−ｇａｌを含有しているプレート上にプレートした。組換えによってＬａｃＺを駆動するプロモーターを除去し、白色の細胞得た。ｃ）ｐＥＶＯ−１０中にクローン化し、そして２５μｇ／ｍｌのＬ−アラビノースで増殖させた組換え体Ｃｒｅ、Ｆｒｅ２０、Ｆｒｅ１、およびＦｒｅ３のサザンブロット。回収したプラスミドＤＮＡを、ＢｓｒＧＩとＮｄｅＩで消化し、そしてベクター特異的プローブとハイブリダイズさせた（図４Ｂをもまたを参照のこと）。ｌｏｘＨ部位による組換えを受けたプラスミド（ｌｏｘＨ、５３２１ｂｐ）、ｌｏｘＰ部位による組換えを受けたプラスミド（ｌｏｘＰ、３３９０ｂｐ）、および組換えられていないＤＮＡ（ｕｎｒｅｃ．、４３２１ｂｐ）を示す。リン酸画像（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）分析によって決定した量を、画像の下に示す。
【図５Ａ】図５Ａは、リコンビナーゼによって媒介される組込みアッセイを示す。ｐＥＶＯ−Ｆｒｅ３へのプラスミドＰＩＲａｔｅ−ｌｏｘＨの部位特異的組込みの模式図を示す。タンパク質のコード配列と複製起点を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、リコンビナーゼによって媒介される組込みアッセイを示す。示したプラスミド混合物を用いてカナマイシンプレート上で得られたコロニーを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、リコンビナーゼによって媒介される組込みアッセイを示す。示したｐＥＶＯ１０−リコンビナーゼベクター中へのｐＩＲａｔｅ−ｌｏｘＨ（白）またはｐＩＲａｔｅ−ｌｏｘＰ（黒）の組込み効率を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、哺乳動物細胞中でアッセイしたリコンビナーゼを示す。ＰＧＫプロモーターから示したリコンビナーゼを発現しているプラスミドを、組換えレポータープラスミドｐＳＶｐａＸ（ｌｏｘＰ部位）またはｐＳＶｐａＨ（ｌｏｘＨ部位）を用いてＣＨＯ細胞中に同時トランスフェクトした。プラスミドｐＳＶｐａＸ、ｐＳＶｐａＨ、およびｐＳＶｐａＺの説明を示す。白色の三角はｌｏｘＨ部位を示し、灰色の三角はｌｏｘＰ部位を示し、そして黒色の三角はＦＲＴ部位を示す。ＳＶ４０＝ＳＶ４０初期プロモーター；ｐａｃ＝ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ。コントロール１は、レポータープラスミドｐＳＶｐａＸのみ、またはｐＳＶｐａＨのみでトランスフェクトした細胞を示す。コントロール２は、レポータープラスミドの組換え形態ｐＳＶｐａＸΔまたはｐＳＶｐａＨΔでトランスフェクトした細胞を示す（１００％の組換え）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、哺乳動物細胞中でアッセイしたリコンビナーゼを示す。ＣＨＯ細胞中での示したリコンビナーゼおよびレポータープラスミドの組換え効率を示す。
【図７】図７は、選択した変異体の配列比較を示す。提示された変異体中で見出されるアミノ酸変化を太字で示す。ｘ線構造中で見出される二次構造エレメントを、柱（α−へリックスＡ〜Ｎ）と矢印（β−シート１〜５）で示す。結晶構造中でＤＮＡとの接触を示したアミノ酸を、アスタリスクでマークする。
【図８】図８は、Ｃｒｅ結晶構造へのＦｒｅ３変異のマッピングを示す。
【図９】図９は、エンドヌクレアーゼのＤＮＡ配列特異性の変更を示す。
【図１０】図１０は、ＤＮＡ修復を媒介するタンパク質の効率の改良を示す。
【図１１】図１１は、相同組換えを媒介するタンパク質の効率の改良を示す。
【図１２】図１２は、ＤＮＡ改変酵素ではなく、むしろＤＮＡ改変酵素の活性に影響を与える、目的の遺伝子に対する本発明の方法の適応の模式図を示す。
【図１３】図１３は、目的の遺伝子がＤＮＡ改変酵素ではなく、むしろＤＮＡ改変酵素に対して融合された場合にＤＮＡ改変酵素の活性に影響を与える場合への、本発明の方法の適応の模式図を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの、本発明の方法（ＳＬｉＤＥ）の適応のためのプラスミドベクターの構造を示す。
【図１４Ｂ−１】図１４Ｂ−１は、２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１のＤＮＡ配列を示す。
【図１４Ｂ−２】図１４Ｂ−２は、２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１のＤＮＡ配列を示す。
【図１４Ｂ−３】図１４Ｂ−３は、２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１のＤＮＡ配列を示す。
【図１４Ｂ−４】図１４Ｂ−４は、２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１のＤＮＡ配列を示す。
【図１４Ｂ−５】図１４Ｂ−５は、２２−ＧＦＰ／ＥＲ２５１のＤＮＡ配列を示す。
【図１５】図１５は、ＦＬＰ組換え体がＧＦＰの発現を誘導することを確立するための、２２−ＧＦＰ／ＦＬＰを用いた対照実験を示す。ＧＦＰの発現は、次いで、本発明の方法（ＳＬｉＤＥ）のための最初の表現型スクリーニングとして、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）において使用することができる。
【図１６】図１６は、種々の核レセプターＬＢＤを、ＦＬＰの抑制のために酵母中で試験した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ−１】
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【図１４Ｂ−２】
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【図１４Ｂ−３】
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【図１４Ｂ−４】
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【図１４Ｂ−５】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004518419.tif 000101
2004518419.tif 000102
【国際調査報告】
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2004518419.tif 000104
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