(57)【要約】本発明は、生物キシレラ・ファスチジオーサ（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）由来のオペロンの単離および特徴づけに関する。ＸｆＧＵＭ オペロンと呼ばれるこのオペロンは９ 個の遺伝子を含み、キサンタンガム様の性質を持つ化合物の産生に関与する。本オペロンおよび遺伝子の発現産物ならびにそれらの様々な用途も、本発明の一部である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に記載のアミノ酸配列を持つ少なくとも１ つのタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも７０％の類似性を持つヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９に記載のアミノ酸配列を持つタンパク質の全てをコードするヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも７０％の類似性を持つヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号１ 、２ 、３ 、４ 、５ 、６ 、７ 、８ または９ に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１ つまたはそれに対して少なくとも７０％の類似性を持つヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号１０のヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも７０％の類似性を持つヌクレオチド配列を含む請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
プロモーターに作動可能な形で結合した請求項１に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項６】
プロモーターに作動可能な形で結合した請求項２に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項８】
請求項２に記載の単離された核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項９】
請求項５に記載の発現ベクターを含む組換え細胞。
【請求項１０】
請求項６に記載の発現ベクターを含む組換え細胞。
【請求項１１】
配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９に記載のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項１２】
請求項１１に記載の単離されたタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
式：
［ グルコース− グルコース− マンノース− グルクロン酸］ ｎ
（式中、ｎ は１ 〜約５０００の整数である）
の化合物。
【請求項１４】
式：
［ グルコース− グルコース− マンノース− グルクロン酸］ ｎ
（式中、ｎ は１ 〜約５０００の整数である）
の化合物の製造方法であって、請求項２に記載の単離された核酸分子を含む細胞を培養すること、および前記細胞による前記化合物の産生後に、前記化合物を単離することを含む方法。
【請求項１５】
前記細胞がキシレラ・ファスチジオーサ（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が組換え細胞である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ＸｆＧＵＭ オペロンのメンバーに対する物質の効果を決定する方法であって、請求項２に記載の単離された核酸分子を含む細胞を前記物質と接触させること、および式：
［ グルコース− グルコース− マンノース− グルクロン酸］ ｎ
（式中、ｎ は１ 〜約５０００の整数である）
の化合物の産生に対する前記物質の効果を決定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＦＡＰＥＳＰの援助を受けて行われた。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、微生物キシレラ・ファスチジオーサ（Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）のオペロンの単離に関する。より具体的には、本発明は、以下の説明で「ｘｆｇｕｍＢ、Ｃ 、Ｄ 、Ｅ 、Ｆ 、Ｈ 、Ｊ 、Ｋ およびＭ 」と呼ぶ９ 個の遺伝子を含む上記オペロンの単離に関する。また、これら９ 個の独立した遺伝子のそれぞれに相当する単離された核酸分子も、本発明の一部である。さらに、プロモーターに作動可能な形で結合した上記オペロンまたはその成分遺伝子の１ もしくは複数を含む発現ベクター、上記オペロンまたは上記遺伝子の１ もしくは複数を含む組換え細胞、それら遺伝子の発現産物、およびそれらの様々な用途も、本発明の一部である。
【０００３】
（背景および従来技術）
キサンタンガムは、植物病原性細菌キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）が産生するエキソポリサッカリド（以下「ＥＰＳ 」という）である（Ｉｅｌｐｉ ら，１９８１，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１３０：２５３−２５６ ）。Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓにおけるこの細胞外多糖の生合成は、１２個の遺伝子ｇｕｍＢ〜ｇｕｍＭからなるクラスターによって指示される（Ｂｅｃｋｅｒら，１９９８，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，５０：１４５−１５２；Ｖｏｊｎｏｖら，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４４：４８７−４９３）。これは、ポリプレノールリン酸運搬体にグルコース−１− リン酸、グルコース、マンノース、グルクロン酸およびマンノースが順次付加することによって組立てられる五糖繰返し単位の重合体からなっている（Ｉｅｌｐｉ ら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：２４９０−２５００ ）。また、この五糖繰返し単位は、様々な程度にＯ−アセチル化およびピルビル化される（Ｉｅｌｐｉ ら，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：２４９０−２５００ ）。
【０００４】
ｇｕｍＢおよびｇｕｍＣを含む遺伝子クラスターを使った形質転換によって、欠損突然変異体におけるキサンタン産生が回復したことから、ｇｕｍＢとｇｕｍＣはどちらも細菌膜を横切るキサンタンの移行に関与することが示唆される（Ｖｏｊｎｏｖら，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４４：４８７−４９３）。
【０００５】
キサンタン生合成には、２ つの遺伝子群が関与している。すなわち、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルクロン酸およびＧＤＰ−マンノースの合成をそれぞれ担っている遺伝子ｘｐｓＩＩＩ、ｘｐｓＩＶ およびｘｐｓＶＩ （Ｈａｒｄｉｎｇ ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６９：２８５４−２８６１（１９８７）；Ｈａｒｄｉｎｇ ら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｍｉｃｏｂｉｏｌ １３９：４４７−４５７（１９９３） ；Ｈｏｅｔｔｅら，１９９９ ；Ｋｏｅｐｌｉｎ ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７４：１９１−１９９（１９９２），１９９２ ）と、ポリプレノールリン酸に結合した五糖の重合およびＥＰＳ の細胞外環境への分泌に関与する酵素をコードする遺伝子ｇｕｍ またはｘｐｓＩ（Ｉｅｌｐｉ ら，１９９２（前掲） ；Ｉｅｌｐｉ ら，１９９３（前掲） ）である。
【０００６】
Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｇｕｍ遺伝子はｇｕｍＢ、Ｃ 、Ｄ 、Ｅ 、Ｆ 、Ｇ 、Ｈ 、Ｉ 、Ｊ 、Ｋ 、Ｌ およびＭ と呼ばれる１２個の遺伝子を含む長さ約１６ｋｂのオペロン（ＧＵＭ オペロン）にまとめられている。ｇｕｍＤ遺伝子は、ポリプレノールリン酸運搬体へのＵＤＰ−グルコースのグルコース−１− リン酸基の転移による脂質− 単糖の形成を担う酵素、グルコシルトランスフェラーゼＩ をコードしている。ｇｕｍＭは、第２ グルコース残基の付加による脂質− 二糖の形成を触媒する酵素、グルコシルトランスフェラーゼＩＩをコードしている。ｇｕｍＨは、第１ マンノース残基の付加による脂質− 三糖の形成を触媒する酵素、グルコシルトランスフェラーゼＩＩＩ をコードしている。ｇｕｍＫは、グルクロン酸残基の付加による脂質− 四糖の形成を触媒する酵素、グルコシルトランスフェラーゼＩＶをコードしている。ｇｕｍＩは、第２ マンノース残基の付加による脂質− 五糖の形成を触媒する酵素、グルコシルトランスフェラーゼＶ をコードしている。ｇｕｍＦは、内部マンノース残基のアセチル化を触媒する酵素、アセチルトランスフェラーゼＩ をコードしている。ｇｕｍＧは、外側マンノース残基のアセチル化を触媒する酵素、アセチルトランスフェラーゼＩＩをコードしている。そしてｇｕｍＬは、外側マンノース残基のピルビル化を触媒する酵素、ピルビン酸ケタールトランスフェラーゼをコードしている。ｇｕｍＢ、Ｃ およびＥ は細菌膜を通したＥＰＳ の重合および分泌に関与しており、ｇｕｍＪは並行して起こるＥＰＳ の重合および分泌段階に関与すると考えられている（Ｉｅｌｐｉ ら，１９９２（前掲） ；Ｉｅｌｐｉ ら，１９９３（前掲） ）。
【０００７】
キサンタンは、水性溶液の増粘剤として商業的に広く応用されている。キサンタンは食品工業でも非食品工業でも使用され、懸濁液、エマルションおよびフォームの安定剤としても使用されている。キサンタン生合成経路に欠陥を持つＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 突然変異株は、様々な構造、類似するレオロジー的性質および異なる粘度を持つキサンタン類を合成し重合することが明らかにされている（Ｈａｓｓｌｅｒ およびＤｏｈｅｒｔｙ，１９９０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｐｒｏｇ ６：１８２−１８７）。アセチル化およびピルビル化は、キサンタンの粘度特性に影響を及ぼすことができる。ピルビン酸が存在すると粘度が増大するのに対して、酢酸は粘度を低下させる（Ｈａｓｓｌｅｒ およびＤｏｈｅｒｔｙ，前掲）。キサンタン側鎖からの糖残基の除去も、粘度に影響する。末端マンノースを欠くポリマー（ポリ四量体）は、野生型キサンタンと比較すると、増粘剤としては劣っている。これに対し、末端のマンノース残基とグルクロン酸残基を両方とも欠いているポリマー（ポリ三量体）は優れた増粘剤である（Ｈａｓｓｌｅｒ およびＤｏｈｅｒｔｙ，前掲）。非アセチル化四量体とアセチル化四量体（どちらも側鎖末端マンノース残基を欠き、前者は内部マンノース残基上の酢酸基を欠く）は、野生型細菌と比較して高い粘度（前者）および低い粘度（後者）を示した（Ｌｅｖｙら，１９９６，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３８：２５１−２７２）。高粘度型と低粘度型の間にみられるコンフォメーション上の主な相違は、高粘度型における開螺旋（ｏｐｅｎ ｈｅｌｉｃａｌ）主鎖量の増加および側鎖可撓性の増大である（Ｌｅｖｙら，１９９６，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３８：２５１−２７２）。
【０００８】
キサンタンは薬物安定剤として、薬物吸収を改善するため、薬物放出を遅らせるためにも使用されており、また制御放出製剤に使用することもできる（Ｔａｌｕｋｄａｒら，１９９６，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １８５：５３７−５４０ ）。α− シクロデキストリンをキサンタンガムと併用すると、直腸粘膜および肝臓でのモルヒネの初回通過代謝が減少し、このオピオイドの見かけの直腸バイオアベイラビリティーが約４ 倍向上することが示された（Ｋｏｎｄｏ ら，１９９６，Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ １９：２８０−２８６）。キサンタン− アルギナートは、酵素のカプセル化に使用されている。キサンタンアルギナート球は、至適条件で２０回反復使用した後でさえ最大ウレアーゼ活性の７５％を示した（Ｅｌｃｉｎ，１９９５，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １６：１１５７−１１６１）。
【０００９】
水溶性食物繊維、キサンタンガムおよびローカストビーンガムを使って製造された徐放性ヒドロゲル坐剤は、市販の坐剤よりはるかに長時間にわたって薬物放出を持続させることが明らかにされている。平均滞留時間は長くなり、血漿濃度対時間曲線下面積の低下も起こらなかった。組織病理学的研究により、上記ヒドロゲル坐剤は直腸粘膜に対して良好な生物学的安全性を持つことが明らかになった。これらの結果から、キサンタンガムおよびローカストビーンガムを使って製造されるＩＭＣ ヒドロゲル坐剤は作用時間が長く副作用も少ない実用的な直腸製剤であることが示唆された（Ｗａｔａｎａｂｅら，１９９３，Ｂｉｏ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ １６：３９１−３９４ ）。
【００１０】
キサンタンを使って製造されたヒドロゲルからのプレドニソロンの見かけの放出速度は、ガム濃度が増加するにつれて減少したことから、薬物分子の拡散は主にマトリックス内の三次元網目構造の密度によって制御されることが示唆された。これらの結果から、薬物放出は網目構造の密度だけでなく、ヒドロゲルの微視的粘度によっても制御されるらしいことがわかった（Ｗａｔａｎａｂｅら，１９９２，Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ４０：４５９−４６２）。
【００１１】
ネオマイシン− フラゾリドン− キサンタン複合体は、ネオマイシンの抗微生物活性を増大させることが明らかにされている（Ｄｕｍｉｔｒｉｕら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ ７：２５６−２７６）。
【００１２】
キサンタンガムは、糖尿病を軽減することも明らかにされている。糖尿病患者にキサンタンガムを投与すると、空腹時および負荷後血清グルコース値が低下し、総血漿コレステロールの空腹時レベルが減少した。またキサンタンガムは、ガストリンおよび胃酸分泌抑制ポリペプチド（ＧＩＰ ）の空腹時および負荷後レベルを低下させ、総トリグリセリドおよびＶＬＤＬトリグリセリドならびにＶＬＤＬおよびＬＤＬ フラクション中のコレステロールの空腹時レベルを低下させる傾向も示した。被験者はキサンタンマフィンの摂取後に膨満感を訴えたが、重篤な消化器症状の報告はなかった（Ｏｓｉｌｅｓｉ ら，１９８５，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ４２：５９７−６０３ ）。
【００１３】
特異的な植物− 病原体相互作用を媒介する因子と共に、細胞外酵素の産生、エキソポリサッカリドの産生、毒素および植物ホルモンの産生を含むいくつかの因子が、植物病原性細菌の病原性と関連づけられている（Ａｇｒｉｏｓ，１９８８，Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，第３ 版，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ；Ａｌｉｐｐｉ，１９９２，Ａｇｒｏｎｏｍｉｅ １２：１１５−１２２）。いくつかの細菌の病原性にＥＰＳ が果たす役割はよく知られている。それらは（ｉ ）木部導管の閉塞による細胞死、（ｉｉ）ムコイド病斑（ｍｕｃｏｉｄ ｌｅｓｉｏｎｓ）ならびに（ｉｉｉ ）植物／ 病原体相互作用および植物組織における細菌増殖の促進と関係している。
【００１４】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 病原性におけるキサンタンの役割は、いくつかのグループが研究している。キサンタンガムは病原性にとって不可欠であると長い間考えられていたが、多くの著者は、このＥＰＳ と病原性との直接的つながりを証明することができなかった（ＫａｍｏｕｎおよびＫａｄｏ，１９９０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７２：５１６５−５１７２ ）。最近になって、ｇｕｍＤの欠失（Ｃｈｏｕら，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ ２３３：２６５−２６９）またはキサンタン生合成の後期段階における変化（Ｋａｔｚｅｎら，１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８０：１６０７−１６１７ ）は、ブロッコリにおいて黒斑病を引き起すビルレンスを低下させ、植物に対するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ の病原力を減少させることが証明された。オレンジの木のＸ．ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ感染の症状は、例えば葉のクロロシス、栄養不足症状、果実サイズの減少など、よく知られているが（ＤｅＮｅｇｒｉ，１９９０，Ｃｏｍ．Ｔｅｃ．Ｎｏ．８２，Ｅｘｔ．Ｒｕｒａｌ，Ｃａｔｓ，Ｃｏｍｐｉｎａｓ：Ｍａｌａｖｏｌｔａ ら，１９９０，Ｃｏｒｄｅｉｒｏｐｏｌｉｓ，ｖ．１１，ｎ．１，ｐ．１５−１８）、この細菌が病害を引き起す機序はわかっていない。細菌感染はオンコメトピア・ファシアリス（Ｏｎｃｏｍｅｔｏｐｉａ ｆａｃｉａｌｉｓ）、アクロゴニア・テルミナリス（Ａｃｒｏｇｏｎｉａ ｔｅｒｍｉｎａｌｉｓ）およびディロボプテルス・コスタリマイ（Ｄｉｌｏｂｏｐｔｅｒｕｓ ｃｏｓｔａｌｉｍａｉ ）などの媒介昆虫に依存する（「Ｃｌｏｒｏｓｅ Ｖａｒｉｅｇａｄａ ｄｏ Ｃｉｔｒｏｓ 」（１９９７）のＧｒａｖｅｎａ ら「Ｏｓ ｖｅｔｏｒｅｓ ｄｅ Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ」）。これらの昆虫が木部栄養分を食べると細菌が導管に導入され、細菌はそこで偏好的に生育する（Ｌｏｐｅｓ ら，１９９６，”Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ”， Ｆｉｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｎ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ，Ｂｒａｓｉｌｉａ ｖ．２１，Ｓｕｐｌｅｍｅｎｔｏ ｐ．３４３；Ｒｏｂｅｒｔｏ ら，１９９６，Ｆｉｔｏｐａｔｏｌｏｇｉａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ，Ｂｒａｓｉｌｉａ ｖ．２１，ｎ．４，ｐ．５１７−１８ ）。本発明の特徴であるＸｆＧＵＭ オペロンによって合成されたＥＰＳ は、オレンジの木において柑橘斑入りクロロシス（Ｃｉｔｒｕｓ Ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ Ｃｌｏｒｏｓｉｓ）を、またコーヒーおよびブドウなどの植物において他の病害を引き起す病原性に、直接関与しているのかもしれない。
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、その一側面として、ｘｆｇｕｍＢ、ｘｆｇｕｍＣ、ｘｆｇｕｍＤ、ｘｆｇｕｍＥ、ｘｆｇｕｍＦ、ｘｆｇｕｍＨ、ｘｆｇｕｍＪ、ｘｆｇｕｍＫおよびｘｆｇｕｍＭの遺伝子を含むＸｆＧＵＭ オペロンのメンバーをコードする約１２７１０ ヌクレオチドの核酸分子および前記オペロンの用途ならびにそれによってコードされるタンパク質に関する。これらは、例えば柑橘斑入りクロロシス（Ｃｉｔｒｕｓ Ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ Ｃｌｏｒｏｓｉｓ（ＣＶＣ ））などのオレンジの木の病害の防除、および上記細菌が他の植物で引き起す病害の防除などに使用することができる。ＸｆＧＵＭ オペロンによってコードされる酵素が産生するＥＰＳ は、木部導管を閉塞させることによって、または細菌感染、付着および伝播の機構に関与することによって病害を引き起すのだろう。ただし、本出願人らは一つの作用理論にこだわるわけではない。また本発明は、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａまたは他の細菌を宿主とするエキソポリサッカリドの製造、この新しいガムおよびガム構造変異体の有用な産業的および／ または医学的応用に、ＸｆＧＵＭ オペロンの成分を使用することに関する。
【００１６】
本発明は、多くの思いがけない驚くべき発見に基づいている。その一つは、１２７１０ ヌクレオチドのＤＮＡ 配列を植物病原性細菌Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａのゲノムに発見したことである。キサンタンＧＵＭ オペロンは、今までＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓにしか見いだされていなかった。もう一つの発見は、ＸｆＧＵＭ オペロンに酵素グルコシルトランスフェラーゼＶ 、アセチルトランスフェラーゼＩＩおよびピルビン酸ケタールトランスフェラーゼをそれぞれコードする遺伝子ｇｕｍＩ、ｇｕｍＧおよびｇｕｍＬが存在しないことである。これらの遺伝子が存在しないことから、ＸｆＧＵＭ オペロンは、グルコース、グルコース、マンノースおよびグルクロン酸からなる四量体単位から構成されるエキソポリサッカリドを合成するのに必要な酵素をコードしていること、そしてアセチルトランスフェラーゼＩＩおよびピルビン酸ケタールトランスフェラーゼをコードする遺伝子が存在しないことから考えて、結果として生じる四糖は全くピルビル化されず、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ に関して証明されているように、そのマンノースはおそらく一部しかアセチル化されないことがわかる。これらの知見は、新しいレオロジー的性質および化学的性質を持つ新しいガムを産生する酵素群をＸｆＧＵＭ がコードしていることを示している。
【００１７】
本発明は、特に（ａ ）酵素グリコシルトランスフェラーゼＩ 、グリコシルトランスフェラーゼＩＩ、グリコシルトランスフェラーゼＩＩＩ 、グリコシルトランスフェラーゼＩＶおよびアセチルトランスフェラーゼＩ ならびに以下ＧＵＭＢ、ＧＵＭＣ、ＧＵＭＥおよびＧＵＭＪと呼ぶタンパク質をコードするＸｆＧＵＭ オペロンの構造領域および調節領域を含むヌクレオチド配列、（ｂ ）細胞における前記ヌクレオチド配列の発現、（ｃ ）単離された酵素、タンパク質およびその活性型、ならびに突然変異体、断片および融合タンパク質、（ｄ ）Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａおよび／ または近縁の生物が引き起す病害を防除するのに有効な化合物を同定するためのスクリーニグ法における、ＧＵＭ 様オペロンがコードする酵素および／ またはタンパク質の使用、（ｅ ）ＸｆＧＵＭ によってコードされる酵素および／ またはタンパク質を発現するように細菌宿主を改変すること、および（ｆ ）ＸｆＧＵＭ によってコードされる酵素および／ またはタンパク質を発現させる改変宿主を使って、産業用および／ または医学用ならびにヒトを含む動物用のエキソポリサッカリドを製造することを包含する。
【００１８】
（好ましい態様の詳細な説明）
本発明は、遺伝子ｘｆｇｕｍＢ、ｘｆｇｕｍＣ、ｘｆｇｕｍＤ、ｘｆｇｕｍＥ、ｘｆｇｕｍＦ、ｘｆｇｕｍＨ、ｘｆｇｕｍＪ、ｘｆｇｕｍＫおよびｘｆｇｕｍＭを含むオペロンＸｆＧＵＭ をコードするＸｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａゲノムの約１２７１０ ヌクレオチドの核酸分子に関する。また本発明は、オレンジの木の病害である柑橘斑入りクロシス（ＣＶＣ ）の防除または上記細菌が他の植物（オークおよびブドウなど）で引き起す類縁の病害の防除に、前記オペロンをＤＮＡ として、ならびにそれがコードするタンパク質として使用することに関する。
【００１９】
本願明細書および特許請求の範囲で使用する用語の趣旨または範囲に関して不明確な点が残らないように、以下の定義を行う。
【００２０】
本明細書にいう「類似性」とはヌクレオチド配列の同一性を指す。大域アラインメント後に小さい方の配列のヌクレオチドの７０％が他方の配列の対応するヌクレオチドと同一である場合、その配列はもう一つの配列と７０％類似しているという。大域アラインメントは動的計画法によって行われる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ ら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，４８７６−４８８２；参考文献として本明細書に一部を構成）。これにより、全てのヌクレオチド間での一致および不一致に値を割り当て、様々な長さの挿入または欠失にペナルティーを割り当てる数学的に最適なアラインメントが保証される。典型的な数値は、一致に１．９ のスコア、不一致に０ 、ギャップ開始に１５、およびギャップ伸張に６．６６である。
【００２１】
実施例１
Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａの全ＤＮＡ から、制限酵素ＢａｍＨＩ によるＤＮＡ の消化を含む標準的な技術を使って、コスミドライブラリーを作製した。約３５〜４５キロ塩基の範囲の断片を最も妥当な断片として選択した。ハイブリダイゼーション地図を作成し、それを調べて、オーバーラップしていないコスミドを選択した。選択後に、非オーバーラップコスミドを、当技術分野で知られるショットガン法によって配列決定した。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 属の配列との類似性を考慮して、一つのコスミドを選択した。約１２７１０ ヌクレオチドの断片を単離し、さらなる検討を行った。
【００２２】
実施例２
上記実施例１ で述べたさらなる検討には、上記１２７１０ ヌクレオチド断片とＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの既知のＧＵＭ オペロンとの比較を含めた。既知のオペロンは１２個の遺伝子を含むと記載されている。しかし、本明細書に開示するオペロンは９ 個の遺伝子しか含んでいないようである。すなわち本明細書に開示するオペロンはｇｕｍＢ、Ｃ 、Ｄ 、Ｅ 、Ｆ 、Ｈ 、Ｊ 、Ｋ およびＭ にいくらか相同な遺伝子を含むが、ｇｕｍＧ、Ｉ またはＬ に相同な配列は認められない。
【００２３】
上記二組の遺伝子を区別するために、本発明の一部である遺伝子群を以下の説明では「ｘｆｇｕｍ 」遺伝子と記載し、オペロンを「ＸｆＧＵＭ 」と呼ぶことにする。
【００２４】
ｘｆｇｕｍＢ、Ｃ 、Ｄ 、Ｅ 、Ｆ 、Ｈ 、Ｊ 、Ｋ およびＭ のヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１ 〜９ に示す。全ＸｆＧＵＭ オペロンを配列番号１０に示す。
【００２５】
参照ｘｆｇｕｍ 遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を配列番号１１〜１９に示す。これらをＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの相当する配列と比較した。ホモロジー解析の結果を、本発明のタンパク質には「ＧＵＭＢＸｆ」「ＧＵＭＣＸｆ」などの略号を、またＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓタンパク質には「ＧＵＭＢＸｃ」「ＧＵＭＣＸｃ」などの略号を使って、図１Ａ〜１Ｉに示す。
【００２６】
実施例３
Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ由来の配列のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ配列に対するホモロジーから、コードされているタンパク質の機能に関する結論と、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａが産生するキサンタン様物質の提案合成機構とが導かれた。これを図２ に示す。具体的には、ｘｆｇｕｍＤは、ＵＤＰ−グルコースからイソプレノールリン酸運搬体へのグルコース−１− リン酸の転移による第１ グルコース残基の付加（結果として脂質単糖が生成）に関与するグリコシルトランスフェラーゼＩ ホモログをコードする。次の合成段階では、ｘｆｇｕｍＭがコードするグリコシルトランスフェラーゼＩＩホモログにより、第２ グルコース残基が付加されて脂質二糖が生成する。これに続いて、ｘｆｇｕｍＨによってコードされるグリコシルトランスフェラーゼＩＩＩ ホモログがマンノース残基を付加して三糖を生成すると考えられ、その後、ｘｆｇｕｍＫによってコードされるグリコシルトランスフェラーゼＩＶホモログがグルクロン酸残基を付加して四糖を生成する。ｘｆｇｕｍＦ遺伝子は、上記マンノース残基のアセチル化を触媒するアセチルトランスフェラーゼＩ ホモログをコードする。ｘｆｇｕｍＢ、Ｃ およびＥ によってコードされるタンパク質は、キサンタン様ＥＰＳ の細菌膜を通した分泌に関与するようである。一方、ｘｆｇｕｍＪによってコードされるタンパク質は、キサンタン様ＥＰＳ の重合および分泌に関与するようである。
【００２７】
上述のようにＸｆＧＵＭ オペロンは、アセチルトランスフェラーゼＩＩ、グルコシルトランスフェラーゼＶ およびピルビン酸トランスフェラーゼをコードするＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ 属の遺伝子ＧＵＭＧ、Ｉ およびＬ に相当する成分を欠いている。これは、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａによって産生されるＥＰＳ がグルコース− グルコース− マンノース− グルクロン酸の四量体単位からなり、これらの四量体はピルビル化されず、全部または一部がアセチル化されることを示唆している。
【００２８】
Ｈａｓｓｌｅｒ ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｊ．６：１８２−１８７（１９９０）と、Ｌｅｖｙら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３８：２５１−２７２（１９９６） は、どちらも、キサンタン生合成経路の１ または複数段階に欠陥を持つＸａｎｔｈａｎｏｍａｓ の突然変異株が、互いに相違しかつ標準的キサンタンとも相違する化学的性質を持つキサンタンの構造変異体を合成することを示している。アセチル化およびピルビル化は、どちらもキサンタンの粘度特性に影響を及ぼす過程として知られている。ピルビン酸は粘度を増大させ、酢酸は粘度を低下させる。さらに、末端マンノースがないと粘度が低下する。側鎖末端マンノースを欠く非アセチル化四量体は、高い粘度を持つ。従来知られていたこれらの知見から、本明細書に記載のＥＰＳ は今までに同定されたキサンタンとは異なる性質を持つことが示唆される。
【００２９】
実施例を含む上記の記載は、本発明の特徴を説明している。本発明の特徴には、ＧＵＭｘｆＢ、Ｃ 、Ｄ 、Ｅ 、Ｆ 、Ｈ 、Ｊ 、Ｋ およびＭ を含む本明細書に記載のｘｆｇｕｍ タンパク質の全てをコードする単離された核酸分子ならびにタンパク質そのものが包含される。配列番号１ 〜９ のヌクレオチド配列を含むまたは同ヌクレオチドからなる単離された核酸分子、およびそれらとは異なるが遺伝コードの縮重ゆえに配列番号１１〜１９に記載のアミノ酸配列を持つタンパク質を依然としてコードしている核酸分子は、特に好ましい。
【００３０】
本発明の単離された核酸分子は、核酸分子がプロモーターに作動可能な形で結合するように、発現ベクターに含めることができる。本発明のこの特徴では、本明細書に記載しクレームする核酸分子の２ つ以上を、発現ベクターに含めてもよい。本明細書には９ つの核酸分子ファミリーを記載する。これらは自由に組合わせて上記発現ベクターの一部にすることができる。言い換えると、本核酸分子のうち２ 、３ 、４ 、５ 、６ 、７ および８ 個を組み合わせて上記ベクターの一部とすることができ、また発現ベクターは９ 個全部または１ 個だけを含んでもよい。
【００３１】
本発明の単離された核酸分子または組換え発現ベクターの１ または複数で形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞、例えば組換え原核細胞株および組換え真核細胞系なども本発明の一部である。
【００３２】
単離されたＸｆＧＵＭ オペロンも本願発明の一部を構成する。好ましい態様は配列番号１０に記載の態様であるが、遺伝コードの縮重に関する上記の記載がここにも当てはまることは理解されるだろう。さらに、本オペロンならびに本明細書に記載の全ての核酸分子に関して、核酸分子を細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用する場合は、好ましいコドン使用頻度の原則が適用される。
【００３３】
上述のように、上記単離された核酸分子によってコードされるタンパク質も本発明の特徴である。本明細書で説明するように、これらのタンパク質は酵素活性を持つ。さらに、これらのタンパク質を免疫原として使用して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製し、それらの抗体を後述するように使用することもできる。さらに、これらのタンパク質は融合タンパク質を含む種々の組換え型として、または当該タンパク質の全アミノ酸配列より短い配列からなる活性型などとして製造することもできる。例えば、酵素が１ または複数の活性部位を含む様々な構造ドメインから構成されることはよく知られている。そのような活性部位は本発明の一部であり、当該タンパク質の全アミノ酸配列より短い配列を含む。
【００３４】
上述のように、本発明のタンパク質はキサンタン様分子、例えば図２ に図解するもの、すなわち
［ グルコース− グルコース− マンノース− グルクロン酸］ ｎ
（ここにｎ は１ 〜約５０００、好ましくは約３００ 〜約５０００、最も好ましくは約１５００〜３０００の整数である）
を製造するために使用することができる。この構造はアセチル化されていてもよいが、上述のように、本発明の一部である酵素の使用を含む製造方法によって製造する場合、結果として得られる四糖構造は完全にはアセチル化またはピルビル化されない点で既知のキサンタンとは相違する。上記の化合物は細胞内または細胞外過程によって重合されうる。
【００３５】
本ＸｆＧＵＭ オペロンの単離および特徴づけにより、当業者は、どの物質がこのオペロン全体またはこのオペロンの個々のメンバーの阻害剤または活性化剤として作用するかを決定することができるようになる。上述のように、本発明のキサンタン様産物には様々な産業上の用途があり、活性化剤および／ またはアゴニストの決定により、当業者は、例えばＸｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａの実験室培養、またはキサンタン様化合物を産生する形質転換細胞もしくはトランスフェクト細胞など、適切な条件下で、本物質の産生量を増大させることができる。Ｘ．ｆａｓｔｉｄｉｏｓａを阻害または拮抗することが望ましい「分野」では、本発明のオペロンおよび単離された核酸分子により、当業者は、上記生物の抑制に役立つ物質を同定することができる。
【００３６】
本発明の他の側面は当業者には明らかであり、ここに詳述する必要はないだろう。
【００３７】
本明細書で使用した用途および表現は限定ではなく説明を目的とするものであり、かかる用語および表現の使用に、本明細書に示し説明した特徴またはその一部の均等物を排除する意図はなく、本発明の範囲内で様々な変更態様が可能であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のタンパク質の推定アミノ酸配列をＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓの相同タンパク質と比較した図
【図２】本発明の成分を使った提案生合成経路の説明図
【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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