(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする単離された核酸、精製されたヒトＭＣＨ１受容体、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする単離された核酸を備えたベクター、このようなベクターを含む細胞、ヒトＭＣＨ１受容体に対して誘導された抗体、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を検出するのに有用な核酸プローブ、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸のユニークな配列に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、正常なヒトＭＣＨ１受容体又は変異したヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現するヒト以外のトランスジェニック動物、ヒトＭＣＨ１受容体を単離する方法、ヒトＭＣＨ１受容体の活性に関連する異常を治療する方法、並びに哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合する化合物を決定する方法を提供する。本発明は、患者の摂食行動を改変する方法であって、前記患者の体重を減少させ、及び／又は前記患者による食物の消費を減少させるのに有効な量のＭＣＨ１アンタゴニストを前記患者に投与することを備えた方法を提供する。本発明は、さらに、鬱病及び／又は不安を患った患者を治療する方法であって、前記患者の鬱病及び／又は不安を治療するのに有効な量のＭＣＨ１アンタゴニストを前記患者に投与することを備えた方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体をコードする単離された核酸。
【請求項２】
前記核酸がＤＮＡである請求項１の核酸。
【請求項３】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項２のＤＮＡ。
【請求項４】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項２のＤＮＡ。
【請求項５】
前記核酸がＲＮＡである請求項１の核酸。
【請求項６】
前記ヒトＭＣＨ１受容体が、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）によってコ−ドされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する請求項１の核酸。
【請求項７】
ヒトＭＣＨ１受容体が、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）を備えた請求項１の核酸。
【請求項８】
前記変異体ヒトＭＣＨ１受容体が、図１３に示されているアミノ酸配列（配列番号２６）を含む請求項１の核酸。
【請求項９】
前記変異体ヒトＭＣＨ１受容体が、図１４に示されているアミノ酸配列（配列番号２７）を含む請求項１の核酸。
【請求項１０】
前記変異体ヒトＭＣＨ１受容体が、図１５に示されているアミノ酸配列（配列番号２８）を含む請求項１の核酸。
【請求項１１】
精製されたヒトＭＣＨ１受容体タンパク質。
【請求項１２】
請求項１の核酸を備えたベクタ−。
【請求項１３】
前記受容体をコ−ドする前記核酸に作用可能に連結され、その発現を可能とする前記細胞での前記核酸の発現に必要な制御因子を備えた、細胞での発現に適合された請求項１２のベクタ−であって、前記細胞が、細菌、両生類、酵母、昆虫、又は哺乳類細胞であるベクタ−。
【請求項１４】
前記ベクタ−がバキュロウイルスである請求項１３のベクタ−。
【請求項１５】
前記ベクタ−がプラスミドである請求項１２のベクタ−。
【請求項１６】
ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）という名称の請求項１５のプラスミド。
【請求項１７】
請求項１３のベクタ−を有する細胞。
【請求項１８】
前記細胞が非哺乳類細胞である請求項１７の細胞。
【請求項１９】
前記非哺乳類細胞がアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の卵母細胞又はアフリカツメガエルのメラニン保有細胞である請求項１８の細胞。
【請求項２０】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項１７の細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウスＹ１細胞、又はＣＨＯ細胞である請求項２０の哺乳類細胞。
【請求項２２】
請求項１３のベクターを有する昆虫細胞。
【請求項２３】
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、又はトリコプルシアｎｉ５Ｂ−４細胞である請求項２２の昆虫細胞。
【請求項２４】
請求項１７の細胞から単離された膜調製物。
【請求項２５】
少なくとも１５のヌクレオチドを有する核酸プロ−ブであって、ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸と特異的にハイブリダイズし、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）の中に存在するヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸の２本鎖のうちの１本中に存在する配列に対応するユニ−クな配列を有する核酸プロ−ブ。
【請求項２６】
少なくとも１５のヌクレオチドを有する核酸プロ−ブであって、ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸と特異的にハイブリダイズし、（ａ）図１に示されている核酸配列（配列番号１）、又は（ｂ）これと相補的な核酸配列中に存在する配列に対応するユニ−クな配列を有する核酸プロ−ブ。
【請求項２７】
前記核酸がＤＮＡである請求項２５又は２６の核酸プローブ。
【請求項２８】
前記核酸がＲＮＡである請求項２５又は２６の核酸プローブ。
【請求項２９】
請求項５のＲＮＡに特異的にハイブリダイズして、該ＲＮＡの翻訳を妨げ得る配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項４のゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし得る配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが化学的に修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体を含む請求項２９又は３０のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項１の核酸によってコ−ドされるヒトＭＣＨ１受容体に結合し得る抗体。
【請求項３３】
ヒトＭＣＨ１受容体への請求項３２の抗体の結合を拮抗的に阻害し得る物質。
【請求項３４】
前記抗体がモノクロ−ナル抗体又は抗血清である請求項３２の抗体。
【請求項３５】
（ａ）細胞膜を通過することができ、ヒトＭＣＨ１受容体の発現を減少せしめるのに有効な量の請求項２９のオリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記細胞膜を通過することができる薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３６】
前記オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡを不活化する物質に結合されている請求項３５の薬学的組成物。
【請求項３７】
ｍＲＮＡを不活化する前記物質がリボザイムである請求項３６の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記薬学的に許容される担体が、細胞上のヒトＭＣＨ１受容体に結合する構造物であって、該構造物への結合後に細胞によって取り込まれ得る構造物を備えた請求項３５の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記薬学的に許容される担体が、選択した細胞種に対して特異的であるヒトＭＣＨ１受容体に結合することができる請求項３５の薬学的組成物。
【請求項４０】
ヒトＭＣＨ１受容体へのリガンドの結合を遮断するのに有効な量の請求項３２の抗体と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項１のヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡを発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４２】
天然のヒトＭＣＨ１受容体が相同的組換えによってノックアウトされたヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４３】
ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、
そのゲノムが、請求項１のヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡに対して相補的であるアンチセンスＤＮＡを有し、
該アンチセンスＤＮＡが、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡに対して相補的であり、且つヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスｍＲＮＡに転写されるように前記ゲノム中に配置されていることによって、その翻訳を減少させるヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４４】
前記ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする前記ＤＮＡが、さらに誘導性プロモ−タ−を備えた請求項４１又は４２のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４５】
前記ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡが、さらに組織特異的な制御因子を備えた請求項４１又は４２のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４６】
前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物がマウスである請求項４１、４２、又は４３のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４７】
哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定する方法であって、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡを含有し、該受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞（該細胞は、哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない）に、結合に適した条件下で前記化合物を接触させることと、
前記化学的化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への特異的な結合を検出することとを備え、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが、（ａ）低ストリンジェンシー条件下で、図１に示されている所定の配列（配列番号１）を有する核酸、又はこれに相補的な配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こすことができることをさらに特徴とし、
前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する方法。
【請求項４８】
哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定する方法であって、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡを含有し、該受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞（該細胞は、哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない）から得た膜調製物を、結合に適した条件下で前記化合物と接触させることと、
前記化学的化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への特異的な結合を検出することとを備え、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが、（ａ）低ストリンジェンシー条件下で、図１に示されている所定の配列（配列番号１）を有する核酸、又はこれに相補的な配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こし得ることを、さらに特徴とし、
前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する方法。
【請求項４９】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体である請求項４７又は４８の方法。
【請求項５０】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である請求項４７又は４８の方法。
【請求項５１】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）によってコ−ドされるヒトＭＣＨ１受容体の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項４７又は４８の方法。
【請求項５２】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）と実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項４７又は４８の方法。
【請求項５３】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）を有する請求項４７又は４８の方法。
【請求項５４】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、図１３に示されているアミノ酸配列（配列番号２６）を有する請求項４７又は４８の方法。
【請求項５５】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、図１４に示されているアミノ酸配列（配列番号２７）を有する請求項４７又は４８の方法。
【請求項５６】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、図１５に示されているアミノ酸配列（配列番号２８）を有する請求項４７又は４８の方法。
【請求項５７】
前記化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが以前には知られていない請求項４７又は４８の方法。
【請求項５８】
請求項５７の方法によって同定された化合物。
【請求項５９】
前記細胞が昆虫細胞である請求項４７又は４８の方法。
【請求項６０】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項４７又は４８の方法。
【請求項６１】
前記細胞が非神経細胞由来である請求項６０の方法。
【請求項６２】
前記非神経細胞が、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である請求項６１の方法。
【請求項６３】
前記化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが以前には知られていない化合物である請求項６０の方法。
【請求項６４】
請求項６３の方法によって同定された化合物。
【請求項６５】
哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定するための拮抗的結合を含んだ方法であって、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的な結合を検出することとを備え、
前記化学的化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することの指標となり、
前記細胞は哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが、（ａ）低ストリンジェンシー条件下で、図１に示されている所定の配列（配列番号１）を有する核酸、又はこれに相補的な配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こすことができることをさらに特徴とし、
前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する方法。
【請求項６６】
哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定するための拮抗的結合を含んだ方法であって、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞から得た膜調製物を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的な結合を検出することとを備え、
前記化学的化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することの指標となり、
前記細胞は哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが、（ａ）低ストリンジェンシー条件下で、図１に示されている所定の配列（配列番号１）を有する核酸、又はこれに相補的な配列にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こすことができることを、さらに特徴とし、
前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する方法。
【請求項６７】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である請求項６５又は６６の方法。
【請求項６８】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である請求項６５又は６６の方法。
【請求項６９】
前記細胞が昆虫細胞である請求項６５又は６６の方法。
【請求項７０】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項６５又は６６の方法。
【請求項７１】
前記細胞が非神経細胞由来である請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記非神経細胞が、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である請求項７１の方法。
【請求項７３】
前記化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが以前には知られていない請求項７０の方法。
【請求項７４】
請求項７３の方法によって同定された化合物。
【請求項７５】
哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングする方法であって、
（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られている化合物が結合可能な条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが知られていない複数の化合物に接触させることと；
（ｂ）前記複数の化合物に含まれる化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られている前記化合物の結合が、前記複数の化合物の不存在下における前記化合物の結合に比べて減少しているかどうかを測定することと；もし減少していれば、
（ｃ）前記複数の化合物に含まれる化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への結合を各別に測定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することとを備えた方法。
【請求項７６】
哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングする方法であって、
（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞から得た膜調製物を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られている化合物の結合が可能な条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが知られていない前記複数の化合物に接触させることと、
（ｂ）前記複数の化合物に含まれる化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られている化合物の結合が、前記複数の化合物の不存在下における前記化合物の結合に比べて減少しているかどうかを測定することと、もし減少していれば、
（ｃ）前記複数の化合物に含まれる化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への結合を各別に測定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することとを備えた方法。
【請求項７７】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である請求項７５又は７６の方法。
【請求項７８】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である請求項７５又は７６の方法。
【請求項７９】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項７５又は７６の方法。
【請求項８０】
前記哺乳類細胞が非神経細胞由来である請求項７９の方法。
【請求項８１】
前記非神経細胞が、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＹ１細胞、又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞である請求項８０の方法。
【請求項８２】
哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするｍＲＮＡの存在を検出することによって、哺乳類ＭＣＨ１受容体の発現を検出する方法であって、
細胞から全ｍＲＮＡを得ることと、
このようにして得た前記ｍＲＮＡを、ハイブリダイズ条件下で、請求項２５、２６、２７、又は２８の何れかの核酸プロ−ブと接触させることと、
前記プロ−ブにハイブリダイズしているｍＲＮＡの存在を検出することにより、前記細胞による前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の発現を検出することとを備えた方法。
【請求項８３】
細胞の表面上の哺乳類ＭＣＨ１受容体の存在を検出する方法であって、
抗体が前記受容体に結合できる条件下で、前記細胞を請求項３２の抗体と接触させることと、
前記細胞に結合した前記抗体の存在を検出することにより、前記細胞の表面上の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の存在を検出することとを備えた方法。
【請求項８４】
様々なレベルの哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性の生理的な影響を測定する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体の発現を制御する誘導性プロモ−タ−の使用によって、ヒトＭＣＨ１受容体活性のレベルが変化した請求項４４のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作成することを備えた方法。
【請求項８５】
様々なレベルのヒトＭＣＨ１受容体の活性の生理的な影響を測定する方法であって、各々が異なる量のヒトＭＣＨ１受容体を発現している一群の請求項４４のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作成することを備えた方法。
【請求項８６】
ヒトＭＣＨ１受容体の活性を減少することによって緩和される異常を緩和することができるアンタゴニストを同定する方法であって、
請求項４１、４４、４５、又は４６のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与することと、
ヒトＭＣＨ１受容体の過剰活性の結果として、前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に表れた身体及び／又は行動上の異常を、前記化合物が緩和するかどうかを決定することとを備え、
前記異常が緩和されれば、前記化合物をアンタゴニストとして同定する方法。
【請求項８７】
請求項８６の方法によって同定されたアンタゴニスト。
【請求項８８】
請求項８７のアンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項８９】
ヒトＭＣＨ１受容体の活性を減少することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、有効量の請求項８８の薬学的組成物を前記患者に投与することによって、前記異常を治療することを備えた方法。
【請求項９０】
ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加することによって緩和される患者の異常を緩和し得るアゴニストを同定する方法であって、
請求項４１、４４、４５、又は４６のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与することと、
前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に表れた物理的及び行動上の異常を、前記化合物が緩和するかどうかを決定することとを備え、
前記異常が緩和されれば、前記化合物をアゴニストとして同定する方法。
【請求項９１】
請求項９０の方法によって同定されたアゴニスト。
【請求項９２】
請求項９１のアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項９３】
ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、有効量の請求項９２の薬学的組成物を前記患者に投与することによって、前記異常を治療することを備えた方法。
【請求項９４】
特定の哺乳類の対立遺伝子の活性が関与する疾患に対する素因を診断する方法であって、
（ａ）前記疾患に罹患した患者のＤＮＡを得ることと、
（ｂ）一群の制限酵素によって前記ＤＮＡの制限消化を行うことと、
（ｃ）得られたＤＮＡ断片をサイジングゲル上で、電気泳動により分離することと、
（ｄ）得られたゲルを、ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸分子の配列内に含まれるユニ−クな配列と特異的にハイブリダイズすることができ、検出可能なマ−カ−で標識された核酸プロ−ブと接触させることと、
（ｅ）前記疾患に罹患している患者の前記ＤＮＡに特異的なユニ−クなバンドパタ−ンを作出するために、検出可能なマーカーで標識された請求項１のヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡにハイブリダイズした標識されたバンドを検出することと、
（ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）によって診断用に取得したＤＮＡを準備することと、
（ｇ）工程（ｅ）で得られた前記疾患に罹患している患者のＤＮＡに特異的なユニ−クなバンドパタ−ンと、工程（ｆ）で得られた診断用に取得した前記ＤＮＡとを比較して、該パタ−ンが同一であるか、あるいは異なるかどうかを決定し、前記パタ−ンが同一であれば、それによって、前記疾患に対する素因を診断することとを備えた方法。
【請求項９５】
特定の哺乳類の対立遺伝子の活性が関与する疾患が診断される請求項９４の方法。
【請求項９６】
請求項１１の精製されたヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法であって、
（ａ）前記ヒトＭＣＨ１受容体を発現するように細胞を誘導することと、
（ｂ）前記誘導された細胞から前記ヒトＭＣＨ１受容体を回収することと、
（ｃ）このように回収した前記ヒトＭＣＨ１受容体を精製することと
を備えた方法。
【請求項９７】
請求項１１の精製されたヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法であって、
（ａ）ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸を適切な発現ベクタ−に挿入することと、
（ｂ）得られたベクタ−を適切な宿主細胞中に導入することと、
（ｃ）単離されたヒトＭＣＨ１受容体を産生できる適切な条件に、得られた細胞を置くことと、
（ｄ）前記得られた細胞によって産生されたヒトＭＣＨ１受容体を回収することと、必要に応じて、
（ｅ）このように回収したヒトＭＣＨ１受容体を精製することとを備えた方法。
【請求項９８】
ある化学的化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかどうかを決定する方法であって、
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を可能とする条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、
哺乳類ＭＣＨ１受容体活性の増加を検出することにより、前記化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法。
【請求項９９】
ある化学的化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を可能とする条件下で、公知の哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、前記ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、
哺乳類ＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法。
【請求項１００】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である請求項９８又は９９の方法。
【請求項１０１】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である請求項９８又は９９の方法。
【請求項１０２】
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効な量の請求項９８の方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１０３】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストが、以前には知られていない請求項１０２の薬学的組成物。
【請求項１０４】
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効な量の請求項９９の方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１０５】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストが、以前には知られていない請求項１０４の薬学的組成物。
【請求項１０６】
ある化学的化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、活性化するかどうかを決定する方法であって、
セカンドメッセンジャ−応答を生じ、それらの細胞表面上に前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を発現する細胞であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない細胞を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で、前記化学的化合物と接触させることと、
前記化学的化合物の存在下と不存在下で、前記セカンドメッセンジャ−応答を測定することとを備え、
前記化学的化合物の存在下で前記セカンドメッセンジャ−応答が変化することが、前記化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することの指標である方法。
【請求項１０７】
前記セカンドメッセンジャ−応答が、塩素イオンチャンネルの活性化を含み、セカンドメッセンジャ−の変化が内向き塩素イオン電流のレベルの増加である請求項１０６の方法。
【請求項１０８】
ある化学的化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、その活性化を阻害するかどうかを決定する方法であって、
セカンドメッセンジャ−応答を生じ、それらの細胞表面上に前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を発現する細胞であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない細胞を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で、前記化学的化合物及び前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと各別に接触させることと、
前記第二の化学的化合物のみの存在下での前記セカンドメッセンジャ−応答と、前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下での前記セカンドメッセンジャ−応答とを測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下よりも、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下での前記セカンドメッセンジャ−応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となる方法。
【請求項１０９】
前記セカンドメッセンジャ−応答が、塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下での内向き塩素イオン電流のレベルの増加が小さいことが、前記セカンドメッセンジャ−応答の変化である請求項１０８の方法。
【請求項１１０】
哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である請求項１０６、１０７、１０８、又は１０９の何れかの方法。
【請求項１１１】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である請求項１０６、１０７、１０８、１０９、又は１１０の何れか１項の方法。
【請求項１１２】
前記細胞が昆虫細胞である請求項１０６、１０７、１０８、１０９、又は１１０の何れか１項の方法。
【請求項１１３】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項１０６、１０７、１０８、１０９、又は１１０の何れか１項の方法。
【請求項１１４】
前記哺乳類細胞が非神経細胞由来である請求項１１３の方法。
【請求項１１５】
前記非神経細胞が、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である請求項１１４の方法。
【請求項１１６】
前記化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが以前は知られていなかった化合物である請求項１０６、１０７、１０８、又は１０９の何れか１項の方法。
【請求項１１７】
請求項１１６の方法によって決定された化合物。
【請求項１１８】
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効な量の請求項１０６又は１０７の方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１１９】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストが、以前には知られていない請求項１１８の薬学的組成物。
【請求項１２０】
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効な量の請求項１０８又は１０９の方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１２１】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストが、以前には知られていない請求項１２０の薬学的組成物。
【請求項１２２】
哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングして、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、
（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、該受容体を発現している細胞を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することが知られていない前記複数の化合物と接触させることと、
（ｂ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性が、前記化合物の存在下で増加するかどうかを測定することと、もし増加すれば、
（ｃ）前記複数の化合物に含まれる各化合物によって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が増加するかどうかを各別に決定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物を同定することとを備えた方法。
【請求項１２３】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である請求項１２２の方法。
【請求項１２４】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である請求項１２２の方法。
【請求項１２５】
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングして、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下で、公知の哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、該受容体を発現している細胞を前記複数の化合物と接触させることと、
（ｂ）前記複数の化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が、前記複数の化合物の不存在下での活性化比べて、減少しているかどうかを測定することと、もし減少していれば、
（ｃ）前記複数の化合物に含まれる各化合物について、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化の阻害を各別に決定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定することとを備えた方法。
【請求項１２６】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である請求項１２５の方法。
【請求項１２７】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である請求項１２５の方法。
【請求項１２８】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項１２３、１２４、１２５、１２６、又は１２７の何れか１項の方法。
【請求項１２９】
前記哺乳類細胞が非神経細胞由来である請求項１２８の方法。
【請求項１３０】
前記非神経細胞が、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞である請求項１２９の方法。
【請求項１３１】
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効な請求項１２３又は１２４の方法によって同定された化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１３２】
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効な請求項１２５又は１２６の方法によって同定された化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１３３】
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、前記異常を治療するのに有効な量の哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストである化合物を前記患者に投与することを備えた方法。
【請求項１３４】
前記異常が、ステロイド若しくは下垂体ホルモンの調節異常、エピネフリン放出の異常、胃腸疾患、心血管疾患、電解質バランスの異常、高血圧、糖尿病、呼吸器疾患、喘息、生殖機能疾患、免疫疾患、内分泌疾患、筋骨格疾患、神経内分泌疾患、認知障害、記憶障害、知覚の調節及び伝達障害、運動同調性疾患、知覚統合障害、運動統合障害、ドーパミン機能の異常、知覚伝達障害、嗅覚障害、交感神経支配の異常、痛み、精神異常の行動、モルヒネ耐性、鎮痛剤中毒、情動障害、ストレス関連疾患、液体バランス異常、発作疾患、又は偏頭痛である請求項１３３の方法。
【請求項１３５】
哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、前記異常を治療するのに有効な量の哺乳類ＭＣＨ１アンタゴニストである化合物を前記患者に投与することを備えた方法。
【請求項１３６】
前記異常が、ステロイド若しくは下垂体ホルモンの調節異常、エピネフリン放出の異常、胃腸疾患、心血管疾患、電解質バランスの異常、高血圧、糖尿病、呼吸器疾患、喘息、生殖機能疾患、免疫疾患、内分泌疾患、筋骨格疾患、神経内分泌疾患、認知障害、記憶障害、知覚の調節及び伝達障害、運動同調性疾患、知覚統合障害、運動統合障害、ドーパミン機能の異常、知覚伝達障害、嗅覚障害、交感神経支配の異常、痛み、精神異常の行動、モルヒネ耐性、鎮痛剤中毒、情動障害、ストレス関連疾患、液体バランス異常、発作疾患、又は偏頭痛である請求項１３５の方法。
【請求項１３７】
哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、請求項４７、４８、６５、６６、７５又は７６の何れか１項の方法を用いて化学的化合物を同定した後、該化学的化合物、又はその新規な構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備えた方法。
【請求項１３８】
哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、請求項９８、１０６、又は１２２の何れか１項の方法を用いて化学的化合物を同定した後、該化学的化合物、又はその新規な構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備えた方法。
【請求項１３９】
哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、請求項９９、１０８、又は１２５の何れか１項の方法を用いて化学的化合物を同定した後、該化学的化合物、又はその新規な構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備えた方法。
【請求項１４０】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である請求項１３７、１３８、又は１３９の何れ１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がヒトＭＣＨ１受容体である請求項１３７、１３８、又は１３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
組成物を調製する方法であって、薬学的に許容される担体と、請求項４７、４８、６５、６６、７５又は７６の何れか１項の方法によって同定された治療的に有効な量の化学的化合物又はその新規な構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備えた方法。
【請求項１４３】
組成物を調製する方法であって、薬学的に許容される担体と、請求項９８、１０６、又は１２２の何れか１項の方法によって同定された治療的に有効な量の化学的化合物又はその新規な構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備えた方法。
【請求項１４４】
組成物を調製する方法であって、薬学的に許容される担体と、請求項９９、１０８、又は１２５の何れか１項の方法によって同定された治療的に有効な量の化学的化合物又はその新規な構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備えた方法。
【請求項１４５】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である請求項１４２、１４３、又は１４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がラットＭＣＨ１受容体である請求項１４２、１４３、又は１４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
ある化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、
ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を可能とする条件下で、公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、前記ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、
ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含み、前記公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体であり、前記細胞が、ＭＣＨ１受容体をトランスフェクトする前には該受容体を発現していない方法。
【請求項１４８】
ある化学的化合物が、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、その活性化を阻害するかどうかを決定する方法であって、
それらの細胞表面上に前記ヒトＭＣＨ１受容体を発現しており、且つヒトＭＣＨ１受容体の活性化に際してセカンドメッセンジャー応答を生じる細胞を、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で、前記化学的化合物とヒトＭＣＨ１受容体を活性化させることが知られている第二の化学的化合物の両者と、及び前記第二の化学的化合物のみと各別に接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする前記ＤＮＡは図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ　ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む）、
前記第二の化学的化合物のみの存在下で、及び前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下で前記セカンドメッセンジャー応答を測定することとを備え、
前記第二の化学的化合物のみの存在下に比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下での前記セカンドメッセンジャー応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となり、
前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である方法。
【請求項１４９】
前記セカンドメッセンジャー応答が塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における内向き塩素イオン電流のレベルの増加が前記第二の化学的化合物のみの存在下における増加と比べて小さい増加であることが前記セカンドメッセンジャー応答の変化である請求項１４８の方法。
【請求項１５０】
ヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物をスクリーニングして、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下で、前記ヒトＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、前記ヒトＭＣＨ１受容体を発現している細胞を、
公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記複数の化合物と接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする前記ＤＮＡは図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含み、前記公知のＭＣＨ１受容体アゴニストは、ＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）、
（ｂ）前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が、前記複数の化合物の不存在下での前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化と比べて、前記複数の化合物の存在下で減少するかどうかを測定することと、もし減少すれば、
（ｃ）前記複数の化合物に含まれる各化合物について、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化の阻害の程度を各別に決定することにより、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定することとを備えた方法。
【請求項１５１】
前記細胞が昆虫細胞である請求項１４７、１４８、又は１５０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項１４７、１４８、又は１５０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記哺細胞が非神経細胞由来の哺乳類細胞である１４７、１４８、又は１５０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記細胞が、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞、である１４７、１４８、又は１５０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５５】
ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物を又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標である、拮抗的結合を含む方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することが同定される方法（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体が、図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）。
【請求項１５６】
ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物を又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞から得られた膜調製物を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標でなる、拮抗的結合を含む方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することが同定される方法（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体が、図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）。
【請求項１５７】
ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである物質の組成物を製造する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、
公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化させ得る条件下で、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法によって、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストとして同定される方法（ここで、前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストはＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）。
【請求項１５８】
ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体の活性化を阻害する物質の組成物を製造する方法であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体の活性化を阻害する化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化したときにセカンドメッセンジャー応答を生じる細胞を、前記化学的化合物及び前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で各別に接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされる）、前記第二の化学的化合物のみの存在下で、及び前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下で、前記セカンドメッセンジャ−応答を測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における前記セカンドメッセンジャー応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となり、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合し、該受容体の活性化を阻害すると同定される方法。
【請求項１５９】
前記セカンドメッセンジャー応答が塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における内向き塩素イオン電流のレベルの増加が前記第二の化学的化合物のみの存在下における増加と比べて小さいことが前記セカンドメッセンジャー応答の変化である請求項１５８の方法。
【請求項１６０】
組成物を調製する方法であって、
ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標となる拮抗的結合を含んだ方法（ここで、前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合とが同定される方法。
【請求項１６１】
組成物を調製する方法であって、
ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞から得た膜調製物を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標となる拮抗的結合を含んだ方法（ここで、前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することが同定される方法。
【請求項１６２】
組成物を調製する方法であって、
ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、
公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化させ得る条件下で、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法によって（ここで、前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストはＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストとして同定される方法。
【請求項１６３】
組成物を調製する方法であって、
ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体の活性化を阻害する化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化したときにセカンドメッセンジャー応答を生じる細胞を、前記化学的化合物及び前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で各別に接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされる）、前記第二の化学的化合物のみの存在下で、及び前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下で、前記セカンドメッセンジャ−応答を測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における前記セカンドメッセンジャー応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となり、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合し、該受容体の活性化を阻害すると同定される方法。
【請求項１６４】
前記セカンドメッセンジャー応答が塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における内向き塩素イオン電流のレベルの増加が前記第二の化学的化合物のみの存在下における増加と比べて小さいことが前記セカンドメッセンジャー応答の変化である請求項１６３の方法。
【請求項１６５】
前記細胞が昆虫細胞である請求項１５５、１５６、１５７、１５８、１６０、１６１、１６２、又は１６３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項１５５、１５６、１５７、１５８、１６０、１６１、１６２、又は１６３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記哺乳類細胞が非神経細胞由来である請求項１６６の方法。
【請求項１６８】
前記非神経細胞が、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である請求項１６７の方法。
【請求項１６９】
患者の摂食障害又は肥満を治療する方法であって、治療的有効量の、ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害するＭＣＨ１アンタゴニストを前記患者に投与することを備えた方法。
【請求項１７０】
ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々の活性化を阻害するときのアンタゴニスト効力より、少なくとも３０倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する請求項１６９の方法。
【請求項１７１】
ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々の活性化を阻害するときのアンタゴニスト効力より、少なくとも１０倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する請求項１７０の方法。
【請求項１７２】
ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々の活性化を阻害するときのアンタゴニスト効力より、少なくとも１００倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する請求項１７０の方法。
【請求項１７３】
ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々の活性化を阻害するときのアンタゴニスト効力より、少なくとも１００倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する請求項１７２の方法。
【請求項１７４】
ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも３０倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する請求項１６９の方法。
【請求項１７５】
ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する請求項１７４の方法。
【請求項１７６】
ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する請求項１７４の方法。
【請求項１７７】
ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍より大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する請求項１７６の方法。
【請求項１７８】
ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも３０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１７９】
ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１７８の方法。
【請求項１８０】
ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍より大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１７８の方法。
【請求項１８１】
ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１８０の方法。
【請求項１８２】
ＭＣＨ１アンタゴニストがドーパミンＤ２受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも３０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１８３】
ＭＣＨ１アンタゴニストがヒスタミンＨ１受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも３０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１８４】
ＭＣＨ１アンタゴニストがドーパミンＤ２受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが、さらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１８５】
ＭＣＨ１アンタゴニストがヒスタミンＨ１受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１８６】
ＭＣＨ１アンタゴニストがドーパミンＤ２受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも２００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１８７】
ＭＣＨ１アンタゴニストがヒスタミンＨ１受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも２００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１８８】
ＭＣＨ１アンタゴニストがα１Ａアドレナリン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１８９】
ＭＣＨ１アンタゴニストがα１Ａアドレナリン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１９０】
ＭＣＨ１アンタゴニストがＭＣＨ１受容体に結合するときの結合親和性より、１０倍超にすぎない結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが、さらにα１Ａアドレナリン受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１９１】
ＭＣＨ１アンタゴニストがＭＣＨ１受容体に結合する結合親和性より、１００倍超にすぎない結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにα１Ａアドレナリン受容体に結合する請求項１６９の方法。
【請求項１９２】
患者の摂食障害を治療する方法であって、治療的有効量の、前記ＭＣＨ１受容体を活性化するＭＣＨ１アゴニストを前記患者に投与することを備えた方法。
【請求項１９３】
ＭＣＨ１アゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体を夫々活性化するときのアゴニスト効力より、少なくとも３０倍より大きなアゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アゴニストがさらにＭＣＨ１受容体を活性化する請求項１９２の方法。
【請求項１９４】
ＭＣＨ１アゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体を夫々活性化するときのアゴニスト効力より、少なくとも１０倍大きなアゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アゴニストがさらにＭＣＨ１受容体を活性化する請求項１９３の方法。
【請求項１９５】
ＭＣＨ１アゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体を夫々活性化するときのアゴニスト効力より、少なくとも１００倍大きなアゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アゴニストがさらにＭＣＨ１受容体を活性化する請求項１９３の方法。
【請求項１９６】
ＭＣＨ１アゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体を夫々活性化するときのアゴニスト効力より、少なくとも１００倍大きなアゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アゴニストがさらにＭＣＨ１受容体を活性化する請求項１９５の方法。
【請求項１９７】
前記摂食障害が神経性拒食症である請求項１９２、１９３、１９４、１９５、又は１９６の何れか一項の方法。
【請求項１９８】
患者の鬱病及び／又は不安を治療する方法であって、
薬学的に許容される担体と治療的有効量のＭＣＨ１アンタゴニストとを含む組成物を前記患者に投与することを備え、
（ａ）（１）前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、１０ｍＭの濃度で、中枢モノアミンオキシダーゼＡの活性を、５０パーセントを超えて阻害せず、且つ
（２）前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、１０ｍＭの濃度で、中枢モノアミンオキシダーゼＢの活性を、５０パーセントを超えて阻害せず、
（ｂ）以下のトランスポーター：セロトニントランスポーター、ノルエピネフリントランスポーター、及びドーパミントランスポーターの夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが前記ＭＣＨ１受容体に結合する方法。
【請求項１９９】
ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒト５ＨＴ１Ａ、ヒト５ＨＴ１Ｂ、ヒト５ＨＴ１Ｄ、ヒト５ＨＴ１Ｅ、ヒト５ＨＴ１Ｆ、ヒト５ＨＴ２Ａ、ラット５ＨＴ２Ｃ、ヒト５ＨＴ４、ヒト５ＨＴ６、及びヒト５ＨＴ７受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが前記ＭＣＨ１受容体にも結合する請求項１９７の方法。
【請求項２００】
ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒトヒスタミンＨ１、及びヒトヒスタミンＨ２受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが前記ＭＣＨ１受容体にも結合する請求項１９７の方法。
【請求項２０１】
ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒトドーパミンＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、及びＤ５受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが前記ＭＣＨ１受容体にも結合する請求項１９７の方法。
【請求項２０２】
ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒトα１Ａアドレナリン受容体、ヒトα１Ｂアドレナリン受容体、ヒトα１Ｄアドレナリン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが前記ＭＣＨ１受容体にも結合する請求項１９７の方法。
【請求項２０３】
ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒトα２Ａアドレナリン受容体、ヒトα２Ｂアドレナリン受容体、及びヒトα２ｃアドレナリン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが前記ＭＣＨ１受容体にも結合する請求項１９７の方法。
【請求項２０４】
前記ＭＣＨ１アンタゴニストが、中枢モノアミンオキシダーゼＡの活性を、６０％を超えて阻害しない請求項１９７の方法。
【請求項２０５】
前記ＭＣＨ１アンタゴニストが、中枢モノアミンオキシダーゼＢの活性を、６０％を超えて阻害しない請求項１９７の方法。
【請求項２０６】
前記ＭＣＨ１アンタゴニストが、中枢モノアミンオキシダーゼＡの活性を、７０％を超えて阻害しない請求項１９７の方法。
【請求項２０７】
前記ＭＣＨ１アンタゴニストが、中枢モノアミンオキシダーゼＢの活性を、７０％を超えて阻害しない請求項１９７の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
本出願を通じて、様々な文献が括弧内に著者及び年次によって参照されている。該参考文献の完全な引用は、本明細書の末尾の配列表の直前にある。本発明が属する分野の技術水準をより完全に記述するために、前記文献の開示内容の全体は、参考文献として本出願に援用される。
【０００２】
神経制御因子は、神経系におけるコミュニケーションを補助又は調節する多様なグループの天然産物から構成される。該制御因子には、神経ペプチド、アミノ酸、生体アミン、脂質、脂質代謝産物、及びその他の代謝副産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの神経制御因子物質の多くは、細胞の外側から内側へとシグナルを伝達する特異的な細胞表面受容体と相互作用する。Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、多くの神経伝達物質が相互作用してそれらの効果を媒介する細胞表面受容体の主要なクラスを成す。ＧＰＣＲは７回膜貫通ドメインを有すると予測されており、受容体の活性化と後続する細胞内の生化学的な反応（例えば、アデニル酸シクラーゼの刺激）とをつなぐＧタンパク質を介してそれらのエフェクターに共役している。
【０００３】
メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）は、サケ科（硬骨魚類）の下垂体から最初に単離された環状ペプチドである（Ｋａｗａｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８３）。魚類では、１７アミノ酸ペプチドがメラニン保有細胞内でメラニンの凝集を引き起こし、ＡＣＴＨの放出を阻害し、α−ＭＳＨの機能的なアンタゴニストとして作用する。哺乳類ＭＣＨ（１９アミノ酸）は、ラット、マウス、及びヒトの間でよく保存されており、１００％のアミノ酸相同性を示すが、その生理学的な役割は魚類におけるほど明確ではない。ＭＣＨは、摂食、水分の平衡、エネルギー代謝、通常の覚醒状態／注意状態、記憶及び認知機能、並びに精神病を含む様々なプロセスに関わっていることが報告されている（総説として、Ｂａｋｅｒ，１９９１；Ｂａｋｅｒ，１９９４；Ｎａｈｏｎ，１９９４；Ｋｎｉｇｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６を参照）。ｏｂ｜ｏｂマウスの視床下部では、ｏｂ｜＋マウスと比較してＭＣＨが過剰発現していること、及び極度の絶食をさせると、絶食中に、肥満マウス及び正常マウスの両者でＭＣＨ　ｍＲＮＡが増加することを実証する最近のＮａｔｕｒｅの文献により、摂食又は体重制御においてＭＣＨが役割を担うということが支持されている（Ｑｕ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）。ＭＣＨは、側脳室に注入すると、正常なラットにおける摂食も刺激した（Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）。ＭＣＨは、α−ＭＳＨの行動上の効果を機能的に拮抗することも報告されている（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３；Ｇｏｎｚａｌｅｚ　ｅｔ　ａｌ，１９９６；Ｓａｎｃｈｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。更に、ストレスがＰＯＭＣ　ｍＲＮＡのレベルを上昇させるのに対して、ＭＣＨの前駆体であるプレプロＭＣＨ（ｐｐＭＣＨ）ｍＲＮＡのレベルは減少させることが示されている（Ｐｒｅｓｓｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２）。従って、ＭＣＨはストレスに対する反応、並びに摂食及び性行動の制御に関わる統合的神経ペプチドとして機能し得る（Ｂａｋｅｒ，１９９１；Ｋｎｉｇｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。
【０００４】
前記ＭＣＨ前駆体（ｐｐＭＣＨ）をコードする遺伝子がクローニングされ、該遺伝子は、さらに２つのペプチド（神経ペプチドＥＩ（１３ＡＡ）及び神経ペプチドＧＥ（１９ＡＡ）（これらのペプチドも生物活性を有するかもしれない）をコードする（Ｎａｈｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８９）。ＭＣＨペプチドは、多くの脳の領域及び下垂体に分散して投射する視床下部の神経細胞（不確帯及び視床下部外側部）中で主に合成される（Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２）。ＮＥＩも外植された視床下部の神経由来の培地中で同定された（Ｐａｒｋｅｓ　ａｎｄ　Ｖａｌｅ，　１９９３）。前記ｍＲＮＡの分布に関する研究により、ＭＣＨは末梢（精巣及び消化管；Ｈｅｒｖｉｅｕ　ａｎｄ　Ｎａｈｏｎ，１９９５）にも存在することが示されているが、最も濃度が高いのは視床下部である。哺乳類でｐｒｏＭＣＨの組織依存的な異なるプロセッシングが行われている証拠も存在する。選択的スプライシングにより生じるものと思われる、さらに短いＭＣＨ遺伝子転写産物が脳のいくつかの領域及び末梢組織で検出されたが、末梢では異なるペプチドの形態も見出された（Ｖｉａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）。ヒトでは、標準のＭＣＨをコードする遺伝子は第１２番染色体上に存在するが、２つの変種遺伝子（切断型）コピーは第５番染色体上に存在する（Ｂｒｅｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３）、前記変種の機能的な意義は、仮に存在するとしても、未だ明らかになっていない。最後に、ラットＭＣＨ遺伝子は、異なる読み枠で更なるペプチド候補をコードしているかもしれない（Ｔｏｕｍａｎｉａｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）。
【０００５】
ＭＣＨの生物学的な効果は特定の受容体を介していると信じられているが、ＭＣＨの結合部位は未だ十分に記述されていない。トリチウム化されたリガンド（［３Ｈ］−ＭＣＨ）は、脳の膜に特異的に結合することが報告されているが、飽和分析法には使用できないので、親和性とＢｍａｘは何れも決定されなかった（Ｄｒｏｚｄｚ　ａｎｄ　Ｅｂｅｒｌｅ，　１９９５）。１３番目のチロシンを放射性ヨウ素で標識すると生物活性が劇的に低下したリガンドとなった（Ｄｒｏｚｄｚ　ａｎｄ　Ｅｂｅｒｌｅ，　１９９５参照）。これに対して、ＭＣＨ類縁体［Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ１９］−ＭＣＨの放射性ヨウ素標識は、うまく機能した（Ｄｒｏｚｄｚ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５）。前記リガンドは生物活性を維持しており、マウスのメラノーマ（Ｂ１６−Ｆ１、Ｇ４Ｆ、及びＧ４Ｆ−７）、ＰＣ１２、及びＣＯＳ細胞を含む様々な株細胞に対して特異的な結合を示した。Ｇ４Ｆ−７細胞では、ＫＤ＝０．１１８ｎＭ、Ｂｍａｘ＝〜１１００部位／細胞である。重要なことに、前記結合はα−ＭＳＨによって阻害されなかったが、ラットＡＮＦによって僅かに阻害された（天然のＭＣＨに対して、Ｋｉ＝１１６ｎＭ　ｖｓ．１２ｎＭ）（Ｄｒｏｚｄｚ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９５）。さらに最近になって、形質転換したケラチノサイト（Ｂｕｒｇａｕｄ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）及びメラノーマ細胞（Ｄｒｏｚｄｚ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）における特異的なＭＣＨの結合が報告されており、光架橋の研究により、前記受容体は見かけの分子量が４５−５０キロダルトンの膜タンパク質であり、ＧＰＣＲ受容体スーパーファミリーの分子量の範囲に適合することが示唆されている。ラジオオートグラフィーによる、該リガンドを用いたＭＣＨ受容体の局在性に関する研究はまだ報告されていない。
【０００６】
ＭＣＨ受容体のシグナル伝達機構はなお明らかとなっていない。哺乳類でのＧタンパク質の共役を裏付ける直接的な証拠は存在しないが、硬骨魚類では、Ｇαｑ及び／又はＧαｉ型の共役に関する証拠が不十分ながら２つ存在する。すなわち、１）硬骨魚類のメラニン保有細胞においてフォスフォリパーゼＣを介して作用するＭＣＨに対する間接的な証拠が存在する（フォスフォリパーゼＣの阻害剤及びプロテインキナーゼＣの阻害剤は、ＭＣＨ用量応答曲線を右側へシフトさせ、ＴＰＡは少量の投与ではＭＣＨと似た作用を示す（Ａｂｒａｏ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９１））。２）魚類のメラニン保有細胞においてＭＣＨにより誘導された色素の凝集は基底ｃＡＭＰレベルの減少と関係しており、ノルエピネフリンを用いたときに観察される現象と類似している（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）。Ｇタンパク質共役と相容れないのは、ＭＣＨとＡＮＦに一般的な構造上の相同性があることであり、ＡＮＦの受容体はＧＰＣＲスーパーファミリーに属していない。最近、ＭＣＨの作用は、チロシンキナーゼの典型的であるフォスファチジルイノシトール−３−キナーゼ経路及びサイトカイン受容体の活性化を介していることが報告された（Ｑｕ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。しかしながら、複数のシグナル経路（受容体間のクロストーク）が該メディエーターを産生し得るので、哺乳類系においてはＭＣＨシグナル伝達経路に関して結論に到達し得ない。
【０００７】
ＭＣＨペプチドの局在及び生物活性は、ＭＣＨ受容体活性の調節が多数の治療的用途において有用であり得ることを示唆する。摂食におけるＭＣＨの役割は、可能な臨床的用途の中で、最も明らかにされている。ＭＣＨは、視床下部外側野（のどの渇き、及び空腹感の制御に関わる脳の領域）において発現されている（Ｇｒｉｌｌｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）。最近、強力な食欲促進剤であるオレキシンＡ及びＢが視床下部外側野においてＭＣＨと極めて類似した局在性を示すことが示された（Ｓａｋｕｒａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。該脳領域におけるＭＣＨ　ｍＲＮＡレベルは絶食から２４時間後のラットにおいて増加する（Ｈｅｒｖｅ　ａｎｄ　Ｆｅｌｌｍａｎ，１９９７）。インスリンを注射すると、ＭＣＨ　ｍＲＮＡレベルの著しい増加とともに、ＭＣＨ免疫反応性の神経細胞体及び繊維の量及び染色強度の著しい増加が観察された（Ｂａｈｊａｏｕｉ−Ｂｏｕｈａｄｄｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）。ＭＣＨがラットにおいて摂食を刺激することができるのと一致して（Ｒｏｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）、ＭＣＨ　ｍＲＮＡレベルが肥満ｏｂ／ｏｂマウスの視床下部でアップレギュレートされ（Ｑｕ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）、レプチン処理されたラットの視床下部では減少し、食物摂取及び体重増加も減少する（Ｓａｈｕ，　１９９８）ことが観察される。ＭＣＨは、食物摂取及びＨＰＡ（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｏｐｉｔｕｉｔａｒｙ／ａｄｒｅｎａｌ　ａｘｉｓ）内でのホルモン分泌への作用において、メラノコルチン系の機能的アンタゴニストとして作用すると考えられる（Ｌｕｄｗｉｇ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。摂食行動の制御においてＭＣＨが関与しているという更なる証拠が、ＭＣＨペプチドをコードする遺伝子を欠失させたマウスでの研究から得られた（Ｓｈｉｍａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。これらのマウスでは、ＭＣＨの遺伝的な欠失により、体重の減少、体脂肪含量の低下、代謝率の増加を特徴とする表現型がもたらされた。より最近になって、異なる系統のマウスで、ＭＣＨをコードする遺伝子を過剰発現させるとグルコース恒常性及びインスリン耐性の二次的な機能障害を伴う、又は伴わない肥満の表現型をもたらし得ることが示された（Ｔｒｉｔｏｓ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）。
【０００８】
これらのデータを綜合すると、エネルギーバランスの調節及びストレス応答における内在性ＭＣＨの役割が示唆され、肥満及びストレスに関連した疾患の治療に利用するためにＭＣＨ受容体に作用する特定の化合物を開発するための理論的根拠を与える。
【０００９】
これまでに研究された全ての生物種において、ＭＣＨ細胞群の大部分の神経細胞は、視床下部外側野及び視床腹部（該神経細胞が存在し、いくつかの所謂「錐体外路」運動回路の一部であり得る）の領域内に、かなり一定の位置を占めている。これらには、視床及び大脳皮質、視床下部領域、及び視床下核との相互接続、黒質、及び中脳中心を含む線条体−及び淡蒼球下行性（ｐａｌｌｉｄｏｆｕｇａｌ）経路の相当部分が含まれる（Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２）。それらの部位では、ＭＣＨ細胞群は適切且つ同調した自発運動を伴う視床下部による内臓の活動を行うための橋渡し又は機序を与える。錐体外路の回路が関わっていることが知られているパーキンソン病及びハンチントン舞踏病のような運動障害に該ＭＣＨ系が関わっていることを考慮することは臨床的にいくらかの価値があり得る。
【００１０】
ヒトに対する遺伝連鎖研究により、標準のｈＭＣＨの遺伝子座が第１２番染色体上（１２ｑ２３−２４）に位置すること、及びその変種ｈＭＣＨの遺伝子座は第５番染色体上（５ｑ１２−１３）に位置することが判明した（Ｐｅｄｅｕｔｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）。１２ｑ２３−２４遺伝子座は、常染色体優性の小脳性運動失調タイプＩＩ（ＳＣＡ２）がマップされた遺伝子座と一致する（Ａｕｂｕｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２；　Ｔｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９２）。該疾患は、オリーブ橋小脳萎縮症を含む神経変性障害を有する。更に、ダリエ病の遺伝子が１２ｑ２３−２４遺伝子座にマッピングされた（Ｃｒａｄｄｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３）。ダリエ病は、いくつかの家族におけるＩケラチノサイト接着の異常及び精神障害により特徴付けられる。ラット及びヒトの脳におけるＭＣＨ神経系の機能的及び神経解剖学的なパターンの観点から、ＭＣＨ遺伝子はＳＣＡ２又はダリエ病の適当な候補であり得る。興味深いことに、強い社会的影響を与える疾患は該遺伝子座にマップされている。実際に、慢性型又は急性型の脊髄筋萎縮症の原因遺伝子は遺伝連鎖分析を用いて染色体５ｑ１２−１３に割り当てられた（Ｍｅｌｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０；Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）。更に、独立に得られた一連の証拠から、主要な精神分裂病遺伝子座が染色体５ｑ１１．２−１３．３に割り当てられることが支持されている（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８；Ｂａｓｓｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８；Ｇｉｌｌｉａｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）。上記の研究は、ＭＣＨが神経変性疾患及び情動障害において役割を担い得ることを示唆する。
【００１１】
ＭＣＨに関連する化合物の更なる治療上の応用が、他の生物学的な系において観察されるＭＣＨの効果により示唆される。例えば、ＭＣＨは雄及び雌のラットにおける性機能を制御し得る。ＭＣＨの転写産物及びＭＣＨペプチドは成体ラットの精巣中の生殖細胞内に検出され、ＭＣＨが幹細胞の再生及び／又は初期の精母細胞の分化に関与しているかもしれないということを示唆する（Ｈｅｒｖｉｅｗ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）。内側視索前野（ＭＰＯＡ）又は腹内側核（ＶＭＮ）に直接注入されたＭＣＨは、雌のラットの性活動を刺激した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６）。エストラジオールで初回刺激を受けた卵巣切除ラットでは、ＭＣＨは黄体形成ホルモン（ＬＨ）の放出を刺激したのに対して、抗ＭＣＨ抗血清はＬＨ放出を阻害した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）。ＭＣＨ細胞体の大きな集団を含有する不確帯は排卵前のＬＨ波動を制御する部位として以前に同定された（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９８４）。ＭＣＨは、ＡＣＴＨ及びオキシトシンを含む下垂体ホルモンの放出に影響を与えることが報告されている。ＭＣＨ類似体も癲癇の治療に有用であり得る。ＰＴＺ癲癇発作モデルでは、ラット及びモルモットの両者において、癲癇発作の誘導前にＭＣＨを注入すると発作性活動が阻止された。このことは、ＭＣＨを含有する神経細胞がＰＴＺによって誘導される癲癇発作の基礎を成す神経回路に関与しているかもしれないということを示唆する（Ｋｎｉｇｇｅ　ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ，　１９９７）。ＭＣＨは、認知機能の行動相関に影響を与えることも観察されている。ＭＣＨ処理をすると、ラットにおける受動的回避反応の消滅が早められる（ＭｃＢｒｉｄｅ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）。このことは、ＭＣＨ受容体のアンタゴニストが記憶の保存及び／又は保持にとって有益であり得るという可能性を提起する。痛みの調節又は知覚においてＭＣＨが担い得る役割は、ＭＣＨ陽性繊維により中脳水道周囲の灰白質（ＰＡＧ）が高密度に神経支配されていることにより支持される。最後に、ＭＣＨは水分摂取量の制御に関与しているかもしれない。意識のあるヒツジの脳室内へＭＣＨを注入すると、血漿量の増加に応じて利尿量、ナトリウム排泄量、及びカリウム排泄量の変化が引き起こされた（Ｐａｒｋｅｓ，　１９９６）。脳の液体制御領域中にＭＣＨが存在することを報告する解剖学的なデータと合わせると、前記結果は、ＭＣＨが哺乳類における液体の恒常性の中心的な調節に関わる重要なペプチドであり得ることを示している。
【００１２】
本明細書で後に記述されているように、ＭＣＨ１がラット中枢神経系の辺縁系領域全体にわたって分布していることに照らして、選択的なＭＣＨ１受容体アンタゴニストの抗鬱病及び不安解消特性を評価するために、一連のインビボ行動実験が行われた。鬱病及び不安を治療するために選択的なＭＣＨ１受容体アンタゴニストを使用することを評価するために、ラット強制水泳試験（Ｆｏｒｃｅｄ　Ｓｗｉｍ　Ｔｅｓｔ）及びラット社会的相互関係試験（Ｓｏｃｉａｌ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ｔｅｓｔ）が行われた。これらのモデルは、当該分野の専門家によって、鬱病及び不安を治療する薬剤の能力を反映するものと考えられている。
【００１３】
ラット強制水泳試験（ＦＳＴ）
ラット強制水泳試験（ＦＳＴ）は、抗鬱性効果について化合物をスクリーニングするために用いられる行動学的試験である（Ｐｏｒｓｏｌｔ　ｅｔ　ａｌ．，　１９７７，　１９７８；　Ｐｏｒｓｏｌｔ，　１９８１）。該試験は、研究室が異なっても信頼性があり、比較的容易に実行でき、且つＴＣＡ及びＭＡＯＩ、並びに様々な非定型的抗鬱剤を含む抗鬱剤のいくつかの主要なクラスの抗欝剤の効果に鋭敏であるために広く用いられている。更に、ほとんどの向精神薬はＦＳＴにおいて同様の行動的な作用を引き起こさないため、該試験は比較的抗鬱剤に対して選択的である。
【００１４】
ラットＦＳＴでは、水柱の中に動物を長期間にわたって置き、動物はここから逃がれることはできない。典型的には、動物は、不動、よじ登る、泳ぐ、及び飛び込むという幅広い行動を示し、水に数分つかった後は、動かなくなることが最も多い。それ故、過去の多くの研究は、被検薬剤を投与した後の不動性を測定又は記録するにすぎないものであった。不運にも、この方法によっては、抗鬱剤の候補により引き起こされ得る他のいかなる活動的な行動も記録されない。それ故、ＦＳＴ試験の際に、特定のクラスの抗鬱剤が不動性に対してはほとんど影響を与えないが、特徴的な行動は引き起こすことができるとしても、これらの行動は記録されずに、問題の化合物は抗鬱作用を持たないと結論されてしまうであろう。
【００１５】
しかしながら、最近になって、ＦＳＴにおいて不動の他に、泳ぐ、よじ登る、及び飛び込むという活動的な行動を記録するために、サンプリングの技術が開発された（Ｄｅｔｋｅ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９５；Ｌｕｃｋｉ，１９９７；Ｐａｇｅ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９９；Ｒｅｎｅｒｉｃ　ａｎｄ　Ｌｕｃｋｉ，１９９８）。該改変されたサンプリング技術によって、フルオキセチン、パロキセチン、及びセルトラリンのようなＳＳＲＩが著しく不動時間を減少させ、且つ水泳時間を増加させることが示された（Ｄｅｔｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５；Ｐａｇｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）。これに対して、選択的なノルエピネフリン（ＮＥ）の再取り込み阻害剤は、よじ登り行動を増加させるが水泳時間は変化させない（Ｄｅｔｋｅ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９５；Ｐｅｇｅ，　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。
【００１６】
ラット社会的相互作用試験（ＳＩＴ）
化合物が抗不安作用を有するかどうかを決定するために用いられたパラダイムが多数存在する。これらの試験の多くは、食物又は水の剥奪、罰則、又は摂取行動の測定を含む（総説として、Ｆｉｌｅ，　ｅｔ　ａｌ．，１９８０，Ｆｉｌｅ，１９８５，Ｒｏｄｇｅｒｓ，ｅｔ　ａｌ．，１９９７　ａｎｄ　Ｔｒｅｉｔ，１９８５を参照）。更に、これらのモデルでは、事前の条件付けのために不安感又は不安が減少してしまう。一般的には、このような試験は動物行動的な妥当性に欠ける。
【００１７】
罰則又は剥奪を含まない無条件の反応に基づいたモデルの１つが、社会的相互作用試験（ＳＩＴ）である（Ｆｉｌｅ　ａｎｄ　Ｈｙｄｅ，１９７８，１９７９）。このモデルでは、体重をマッチさせた新たなパートナーと共に、慣れた薄明かりの試験場の中に、事前に１匹で飼育したラットを入れる。これらの条件下で不安を生み出す主な刺激はパートナーの新規性であり、潜在的な脅威に対する条件付けられていない反応が含まれる。薬理学的な処理をした後、以下の行動を活動的社会的相互作用（毛づくろい、匂いをかぐ、噛む、取り囲む、もみ合う、追いかける、お互いに乗りあう）として記録する。広範囲の向精神薬がこのパラダイムで調査され、社会的相互作用試験は抗不安薬を抗鬱剤、抗精神病薬、興奮薬、及び鎮静薬と区別し得ることが示された（Ｆｉｌｅ，　１９８５；Ｇｕｙ　ａｎｄ　Ｇａｒｄｎｅｒ，１９８５）。該試験は、パロキセチン及びその他のＳＳＲＩを含む非ベンゾジアゼピン類に加えて（Ｌｉｇｈｔｏｗｌｅｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９９４）、ベンゾジアゼピンのような抗不安薬を検出し得る（Ｆｉｌｅ　ａｎｄ　Ｈｙｄｅ，１９７８；Ｆｉｌｅ　ａｎｄ　Ｈｙｄｅ，１９７９；Ｆｉｌｅ，１９８０）。最後に、社会的相互作用試験は、逆性ベンゾジアゼピン受容体アゴニストを含む不安誘発剤を検出し得る（Ｆｉｌｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９８２，　Ｆｉｌｅ　ａｎｄ　Ｐｅｌｌｏｗ，　１９８３；　Ｆｉｌｅ　ａｎｄ　Ｐｅｌｌｏｗ，　１９８４，　Ｆｉｌｅ，　１９８５）。
【００１８】
本明細書で後に記述されている結合及び機能的活性に関する情報から、思いがけず、予想ＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化合物が肥満、鬱、及び不安の動物モデルにおいて有効であることが発見され、このことからヒトにおける効果が予測される。それ故、我々はＭＣＨ１受容体アンタゴニストが肥満を治療する新たな方法を提供することを実証する。更に、我々はＭＣＨ１受容体アンタゴニストが鬱及び／又は不安を治療する新たな方法を提供することを実証する。
【００１９】
【発明の概要】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体をコードする単離された核酸を提供する。
【００２０】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸であって、低ストリンジェンシー条件下で、（ａ）図１に示されている所定の配列（配列番号１）、又はこれと相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こすことができることをさらに特徴し、前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する核酸を提供する。
【００２１】
本発明は、精製されたヒトＭＣＨ１受容体タンパク質を提供する。
【００２２】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を備えたベクター、とりわけ、哺乳類又は非哺乳類細胞でのヒトＭＣＨ１受容体の発現に適合されたベクターを提供する。このようなベクターの１つは、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするヌクレオチド配列を備えたｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）という名称のプラスミドである。
【００２３】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を備えたベクターを含む細胞、並びにこのような細胞から単離された膜調製物も提供する。
【００２４】
本発明は、さらに、少なくとも１５のヌクレオチドを有する核酸プロ−ブであって、哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸と特異的にハイブリダイズし、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸又はその相補物内に存在する配列と対応するユニークな配列を有し、それらが何れもプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）の中に存在する核酸プローブを提供する。
【００２５】
本発明は、さらに、少なくとも１５のヌクレオチドを有する核酸プロ−ブであって、哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸と特異的にハイブリダイズし、（ａ）図１に示されている核酸配列（配列番号１）、又は（ｂ）これと相補的な核酸配列内に存在する配列に対応するユニ−クを有する核酸プロ−ブを提供する。
【００２６】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＲＮＡに特異的にハイブリダイズして、該ＲＮＡの翻訳を妨げ得る配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びヒトＭＣＨ１受容体をコードするゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし得る配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供する。
【００２７】
本発明は、さらに、ヒトＭＣＨ１受容体に結合し得る抗体、並びにヒトＭＣＨ１受容体への該抗体の結合を拮抗的に阻害し得る物質を提供する。
【００２８】
本発明は、（ａ）細胞膜を通過することができ、ヒトＭＣＨ１受容体の発現を減少せしめるのに有効な量の上記オリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記細胞膜を通過することができる薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２９】
さらに、本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡを発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。本発明は、天然の（ｎａｔｉｖｅ）ヒトＭＣＨ１受容体が相同的組換えによってノックアウトされたヒト以外のトランスジェニック哺乳動物も提供する。本発明は、さらに、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、そのゲノムが、ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡに対して相補的であるアンチセンスＤＮＡを有し、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡに相補的であり、且つヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスｍＲＮＡに転写されるように前記アンチセンスＤＮＡが、前記ゲノム中に配置されていることによって、その翻訳を減少させるヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。
【００３０】
ある態様では、本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定する方法であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡを含有し、該受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない細胞に、結合に適した条件下で前記化合物を接触させることと、前記化学的化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への特異的な結合を検出することとを備えた方法を提供する。
【００３１】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定する方法であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞（このような細胞は、哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない）から得た膜調製物を、結合に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化学的化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への特異的な結合を検出することとを備えた方法を提供する。
【００３２】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定するための拮抗的結合を含んだ方法であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞（このような細胞は、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない）を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の前記受容体への結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的な結合を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することの指標となる方法を提供する。
【００３３】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定するための拮抗的結合を含んだ方法であって、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞（このような細胞は、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない）の細胞抽出物から得た膜画分を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的な結合を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することの指標となる方法を提供する。
【００３４】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングする方法であって、（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが知られている化合物と接触させることと、（ｂ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を結合することが知られている化合物が結合可能な条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが知られていない複数の化合物に、工程（ａ）の調製物を接触させることと、（ｃ）前記複数の化合物に含まれる化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られている前記化合物の結合が、前記複数の化合物の不存在下における前記化合物の結合と比べて減少しているかどうかを測定することと、もし減少していれば、（ｄ）前記複数の化合物に含まれる化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への結合を各別に測定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することとを備えた方法を提供する。
【００３５】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングする方法であって、（ａ）哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞から得た膜調製物を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが知られている化合物と接触させることと、（ｂ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を結合することが知られている化合物が結合可能な条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが知られていない複数の化合物に、工程（ａ）の調製物を接触させることと、（ｃ）前記複数の化合物に含まれる化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られている前記化合物の結合が、前記複数の化合物の不存在下における前記化合物の結合と比べて減少しているかどうかを測定することと、もし減少していれば、（ｄ）前記複数の化合物に含まれる化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への結合を各別に測定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することとを備えた方法を提供する。
【００３６】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするｍＲＮＡの存在を検出することによって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の発現を検出する方法であって、細胞から全ｍＲＮＡを得ることと、このようにして得た前記ｍＲＮＡを、ハイブリダイズ条件下で、核酸プロ−ブと接触させることと、前記プロ−ブにハイブリダイズしているｍＲＮＡの存在を検出することにより、前記細胞による前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の発現を検出することとを備えた方法を提供する。
【００３７】
本発明は、細胞の表面上の哺乳類ＭＣＨ１受容体の存在を検出する方法であって、抗体が前記受容体に結合できる条件下で、前記細胞を抗体と接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を検出することにより、前記細胞の表面上の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の存在を検出することとを備えた方法を提供する。
【００３８】
本発明は、様々なレベルのヒトＭＣＨ１受容体の活性の生理的な影響を測定する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体の発現を制御する誘導性プロモ−タ−の使用によって、ヒトＭＣＨ１受容体活性のレベルが変化したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作成することを備えた方法を提供する。
【００３９】
本発明は、様々なレベルのヒトＭＣＨ１受容体の活性の生理的な影響を測定する方法であって、各々が異なる量のヒトＭＣＨ１受容体を発現している一群のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作成することを備えた方法を提供する。
【００４０】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を減少することによって緩和される異常を緩和することができるアンタゴニストを同定する方法であって、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与することと、ヒトＭＣＨ１受容体の過剰活性の結果として、前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に表れた身体及び行動上の異常を、前記化合物が緩和するかどうかを決定することとを備え、前記異常が緩和されれば、前記化合物をアンタゴニストとして同定する方法を提供する。本発明は、該方法によって同定されたアンタゴニストも提供する。本発明は、さらに、該方法によって同定されたアンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００４１】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を減少することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、有効量の該薬学的組成物を前記患者に投与することによって、前記異常を治療することを備えた方法を提供する。
【００４２】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加することによって緩和される患者の異常を緩和することができるアゴニストを同定する方法であって、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与することと、前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に表れた身体及び／又は行動上の異常を、前記化合物が緩和するかどうかを決定することとを備え、前記異常が緩和されれば、前記化合物をアゴニストとして同定する方法を提供する。本発明は、該方法によって同定されたアゴニストも提供する。本発明は、さらに、該方法によって同定されたアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、有効量の該薬学的組成物を前記患者に投与することによって、前記異常を治療することを備えた方法を提供する。
【００４３】
本発明は、特定の哺乳類の対立遺伝子の活性が関与する疾患に対する素因を診断する方法であって、（ａ）前記疾患に罹患した患者のＤＮＡを得ることと、（ｂ）一群の制限酵素によって前記ＤＮＡの制限消化を行うことと、（ｃ）得られたＤＮＡ断片をサイジングゲル上で、電気泳動により分離することと、（ｄ）得られたゲルを、ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸分子の配列内に含まれるユニ−クな配列と特異的にハイブリダイズすることができ、検出可能なマ−カ−で標識された核酸プロ−ブと接触させることと、（ｅ）前記疾患に罹患している患者の前記ＤＮＡに特異的なユニ−クなバンドパタ−ンを作出するために、検出可能なマーカーで標識されたヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする前記ＤＮＡにハイブリダイズした標識されたバンドを検出することと、（ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）によって診断用に取得したＤＮＡを準備することと、（ｇ）工程（ｅ）で得られた前記疾患に罹患している患者のＤＮＡ及び工程（ｆ）から診断用に取得したＤＮＡに特異的なバンドパタ−ンとを比較して、該パタ−ンが同一であるか、あるいは異なるかどうかを決定し、前記パタ−ンが同一であれば、前記疾患に対する素因を診断することとを備えた方法を提供する。
【００４４】
本発明は、精製されたヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法であって、（ａ）前記ヒトＭＣＨ１受容体を発現する細胞を誘導することと、（ｂ）前記誘導された細胞から前記ヒトＭＣＨ１受容体を回収することと、（ｃ）このように回収した前記ヒトＭＣＨ１受容体を精製することとを備えた方法を提供する。
【００４５】
本発明は、精製されたヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法であって、（ａ）ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸を適切な発現ベクタ−に挿入することと、（ｂ）得られたベクタ−を適切な宿主細胞中に導入することと、（ｃ）単離されたヒトＭＣＨ１受容体を産生できる適切な条件に、得られた細胞を置くことと、（ｄ）前記得られた細胞によって産生されたヒトＭＣＨ１受容体を回収することと、（ｅ）このように回収したヒトＭＣＨ１受容体を精製することとを備えた方法を提供する。
【００４６】
本発明は、ある化学的化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかどうかを決定する方法であって、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を可能とする条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、哺乳類ＭＣＨ１受容体活性の増加を検出することにより、前記化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法を提供する。本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効な量の該方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【００４７】
本発明は、ある化学的化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を可能とする条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を、公知の哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記化合物と接触させることと、哺乳類ＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法を提供する。本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効な量の該方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【００４８】
本発明は、ある化学的化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、活性化するかどうかを決定する方法であって、セカンドメッセンジャ−応答を生じ、それらの細胞表面上に前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を発現する細胞（このような細胞は、哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない）を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で、前記化学的化合物と接触させることと、前記化学的化合物の存在下と不存在下で、前記セカンドメッセンジャ−応答を測定することとを備え、前記化学的化合物の存在下で前記セカンドメッセンジャ−応答が変化することが、前記化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することの指標である方法を提供する。本発明は、該方法によって決定された化合物も提供する。本発明は、さらに、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効な量の該方法によって決定された前記化合物（ＭＣＨ１受容体アゴニスト）と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【００４９】
本発明は、ある化学的化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、その活性化を阻害するかどうかを決定する方法であって、セカンドメッセンジャ−応答を生じ、それらの細胞表面上に前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を発現する細胞（このような細胞は、哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない）を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で、前記化学的化合物及び前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと各別に接触させることと、前記第二の化学的化合物のみの存在下での前記セカンドメッセンジャ−応答と、前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下での前記セカンドメッセンジャ−応答とを測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下よりも、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下での前記セカンドメッセンジャ−応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となる方法を提供する。本発明は、該方法によって決定された化合物も提供する。本発明は、さらに、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効な量の該方法によって決定された前記化合物（ＭＣＨ１受容体アンタゴニスト）と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【００５０】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングして、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、該受容体を発現している細胞を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することが知られていない前記複数の化合物と接触させることと、（ｂ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性が、前記化合物の存在下で増加するかどうかを測定することと；もし増加すれば、（ｃ）前記複数の化合物に含まれる各化合物によって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が増加するかどうかを各別に決定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物を同定することとを備えた方法を提供する。本発明は、該方法によって決定された化合物も提供する。本発明は、さらに、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効な量の該方法によって同定された前記化合物（哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニスト）と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００５１】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングして、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下で、公知の哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、該受容体を発現している細胞を前記複数の化合物と接触させることと、（ｂ）前記複数の化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が、前記複数の化合物の不存在下での前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化と比べて減少しているかどうかを測定することと、もし減少していれば、（ｃ）前記複数の化合物に含まれる各化合物について、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害するかどうかを各別に決定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定することを備えた方法を提供する。本発明は、該方法によって同定された化合物も提供する。本発明は、さらに、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効な量の該方法によって同定された前記化合物（哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニスト）と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【００５２】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、前記異常を治療するのに有効な量の哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストである化合物を前記患者に投与することを備えた方法を提供する。
【００５３】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、前記異常を治療するのに有効な量の哺乳類ＭＣＨ１アンタゴニストである化合物を前記患者に投与することを備えた方法を提供する。
【００５４】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合し、及び／又は該受容体を活性化し、若しくはその活性化を阻害する化合物を同定するために、本明細書に記載の何れかの方法を用いて化学的化合物を同定した後、該化学的化合物、又はその新規な構造的及び機能的類縁体又は相同体を合成することとを備えた方法を提供する。本発明は、さらに、薬学的組成物を調製する方法であって、薬学的に許容される担体と、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合し、及び／又は該受容体を活性化し、若しくはその活性化を阻害する化合物を同定するために本明細書に記載された何れかの方法によって同定された薬学的に許容される量の化学的化合物、又はその新規な構造的及び機能的類縁体又は相同体を投与することを備えた方法を提供する。
【００５５】
本発明は、ある化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を可能とする条件下で、公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、前記ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備え、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含み、前記公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体であり、前記細胞が、ＭＣＨ１受容体をトランスフェクトする前には該受容体を発現していない方法を提供する。
【００５６】
本発明は、ある化合物が、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、その活性化を阻害するかどうかを決定する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に際してセカンドメッセンジャー応答を生じ、且つそれらの細胞表面上に前記ヒトＭＣＨ１受容体を発現している細胞を、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で、前記化学的化合物とヒトＭＣＨ１受容体を活性化させることが知られている第二の化学的化合物の両者と、及び前記第二の化学的化合物のみと各別に接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする前記ＤＮＡは図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む）、前記第二の化学的化合物のみの存在下で、及び前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下で前記セカンドメッセンジャー応答を測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下に比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下での前記セカンドメッセンジャー応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となり、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である方法も提供する。
【００５７】
本発明は、さらに、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的化合物をスクリーニングして、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下で、前記ヒトＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、前記ヒトＭＣＨ１受容体を発現している細胞を、公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記複数の化合物と接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする前記ＤＮＡは図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含み、前記公知のＭＣＨ１受容体アゴニストは、ＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）、
（ｂ）前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が、前記複数の化合物の不存在下での前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化と比べて、前記複数の化合物の存在下で減少するかどうかを測定することと、もし減少すれば、
（ｃ）前記複数の化合物に含まれる各化合物について、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化の阻害の程度を各別に決定することにより、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定することとを備えた方法を提供する。
【００５８】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標である、拮抗的結合を含む方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが同定される方法（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）を提供する。
【００５９】
本発明は、さらに、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞から得られた膜調製物を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標である、拮抗的結合を含む方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することが同定される方法（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）を提供する。
【００６０】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである物質の組成物を製造する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化させ得る条件下で、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法によって、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストとして同定される方法（ここで、前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストはＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）を提供する。
【００６１】
本発明は、さらに、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体の活性化を阻害する物質の組成物を製造する方法であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体の活性化を阻害する化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化したときにセカンドメッセンジャー応答を生じる細胞を、前記化学的化合物及び前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で各別に接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされる）、前記第二の化学的化合物のみの存在下で、及び前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下で、前記セカンドメッセンジャ−応答を測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における前記セカンドメッセンジャー応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となり、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合し、該受容体の活性化を阻害すると同定される方法を提供する。
【００６２】
本発明は、組成物を調製する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標となる拮抗的結合を含んだ方法（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することが同定される方法を提供する。
【００６３】
本発明は、さらに、組成物を調製する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞から得た膜調製物を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標となる拮抗的結合を含んだ方法（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することが同定される方法を提供する。
【００６４】
本発明は、組成物を調製する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化させ得る条件下で、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法によって（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストとして同定される方法も提供する。
【００６５】
本発明は、さらに、組成物を調製する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体の活性化を阻害する化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化したときにセカンドメッセンジャー応答を生じる細胞を、前記化学的化合物及び前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で各別に接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされる）、前記第二の化学的化合物のみの存在下で、及び前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下で、前記セカンドメッセンジャ−応答を測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における前記セカンドメッセンジャー応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となり、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合し、該受容体の活性化を阻害すると同定される方法を提供する。
【００６６】
本発明は、患者の摂食障害又は肥満を治療する方法であって、治療的有効量の、ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害するＭＣＨ１アンタゴニストを前記患者に投与することを備えた方法を提供する。
【００６７】
本発明は、患者の体重を減少させる方法であって、前記患者の体重を減少させるのに有効な量のＭＣＨ１アンタゴニストを前記患者に投与することを備えた方法を提供する。
【００６８】
本発明は、さらに、患者の摂食障害を治療する方法であって、治療的有効量の、ＭＣＨ１受容体を活性化するＭＣＨ１アゴニストを前記患者に投与することを備えた方法を提供する。
【００６９】
本発明は、患者の鬱病及び／又は不安を治療する方法であって、
薬学的に許容される担体と治療的有効量のＭＣＨ１受容体アンタゴニストとを含む組成物を前記患者に投与することを備え、
（ａ）（１）前記ＭＣＨ１受容体アンタゴニストは、１０ｍＭの濃度で、中枢モノアミンオキシダーゼＡの活性を、５０パーセントを超えて阻害せず、且つ
（２）前記ＭＣＨ１受容体アンタゴニストは、１０ｍＭの濃度で、中枢モノアミンオキシダーゼＢの活性を、５０パーセントを超えて阻害せず、
（ｂ）前記ＭＣＨ受容体１アンタゴニストが、以下のトランスポーター：セロトニントランスポーター、ノルエピネフリントランスポーター、及びドーパミントランスポーターの夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で前記ＭＣＨ１アンタゴニストがヒトＭＣＨ１受容体に結合する方法を提供する。
【００７０】
【発明の詳細な記述】
本出願を通じて、特定のヌクレオチド塩基を表記するために以下の標準的な略号を使用する。
【００７１】
Ａ＝アデニン
Ｇ＝グアニン
Ｃ＝シトシン
Ｔ＝チミン
Ｕ＝ウラシル
Ｍ＝アデニン又はシトシン
Ｒ＝アデニン又はグアニン
Ｗ＝アデニン、チミン、又はウラシル
Ｓ＝シトシン又はグアニン
Ｙ＝シトシン、チミン、又はウラシル
Ｋ＝グアニン、チミン、又はウラシル
Ｖ＝アデニン、シトシン、又はグアニン（チミン又はウラシル以外）
Ｈ＝アデニン、シトシン、チミン又はウラシル（グアニン以外）
Ｄ＝アデニン、グアニン、チミン、又はウラシル（シトシン以外）
Ｂ＝シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル（アデニン以外）
Ｎ＝アデニン、シトシン、グアニン、チミン、又はウラシル
（又はイノシンのような他の修飾された塩基）
Ｉ＝イノシン
さらに、本出願を通じて、「アゴニスト」という用語は、本発明の何れかのポリペプチドの活性を増加させる任意のペプチド又は非ペプチド化合物を示すために使用する。本出願を通じて、「アンタゴニスト」という用語は、本発明の何れかのポリペプチドの活性を減少させる任意のペプチド又は非ペプチド化合物を示すために使用する。「哺乳類」という用語は、本発明を通じて、ヒトＭＣＨ１受容体の変異型を含むものとして使用される。
【００７２】
本明細書に開示されているポリペプチドのようなＧタンパク質共役型受容体の活性は、その受容体の活性化が、アデニレートサイクレース、カルシウムの動因、アラキドン酸の放出、イオンチャンネルの活性、イノシトールリン脂質の加水分解、又はグアニリルサイクレースを含む（これらに限定されない）あるセカンドメッセンジャー系のレベルに観察可能な変化をもたらす任意の様々な機能的アッセイを用いて測定し得る。本発明の核酸を発現するために適切な宿主細胞を用いる異種発現系は、所望のセカンドメッセンジャー共役を得るために使用される。受容体の活性は、卵母細胞発現系でもアッセイし得る。
【００７３】
アゴニストの不存在下で受容体が活性を有している場合には（構成的受容体活性）、アンタゴニストは、中性的アンタゴニストではなく、逆性アゴニスト又はアロステリック調節物質として作用し、アゴニストとは独立に受容体のシグナル伝達を抑制してもよい（Ｌｕｔｚ　ａｎｄ　Ｋｅｎａｋｉｎ，１９９４）。従って、「アンタゴニスト化合物」の範疇には、１）中性的アンタゴニスト（アゴニストの作用を遮断するが、構成的活性には影響を与えない）、２）逆性アゴニスト（アゴニスト作用のみならず、不活性な受容体のコンフォメーションを安定化させることによって、構成的活性を遮断する）、３）アロステリック調節物質（限られた程度で、アゴニストの作用を遮断し、アロステリック制御を通じて構成的活性も遮断し得る）が含まれることが理解されるであろう。アンタゴニストが中性的であり、従って「効力がゼロ」である確率は、受容体の異なる三次構造に対して同一の親和性がこれに必要とされると仮定すれば、比較的低い。このため、Ｋｅｎａｋｉｎは、１９９６年に、「逆性拮抗作用を検出するための感度のよい検査系が開発されれば、多くの薬剤が再分類されることになり、これまで中性的アンタゴニストに分類されてきた数多くのアンタゴニストが、逆性アゴニストであり得ることが観察されるかもしれない」ということを提起した（Ｋｅｎａｋｉｎ，１９９６）。実際に、とりわけヒスタミン、５ＨＴ１Ａ、５ＨＴ２Ｃ、カンナビノイド、ドーパミン、カルシトニン、及びヒトホルミルペプチド受容体を含む多数の受容体に対する逆性アゴニストが存在することを裏付ける、公知の薬理学的物質を用いた研究から得られた新しい証拠が存在する（ｄｅ　Ｌｉｇｔ，　ｅｔ　ａｌ，２０００；Ｈｅｒｒｉｃｋ−Ｄａｖｉｓ，　ｅｔ　ａｌ，２０００；Ｂａｋｋｅｒ，　ｅｔ　ａｌ，２０００）。５−ＨＴ２Ｃ受容体の場合には、セルチンドール、クロザピン、オランザピン、ジプラシドン、リスペリドン、ゾテピン、チオスピロン、フルペルラピン、及びテニラピンのような臨床的に有効である非典型的抗精神病薬は強力な逆性活性を示したのに対して、クロルプロマジン、チオリダジン、スピペロン、及びチオチキセンのような典型的抗精神病薬は、中性的アンタゴニストとして分類された（Ｈｅｒｒｉｃｋ−Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ，２０００）。ヒスタミンＨ１受容体の場合には、治療に用いられている抗アレルギー薬であるセチリジン、ロラタジン、及びエピナスチンは逆性アゴニストであることが見出された。これらの知見は、さらに、構成的に活性な受容体システムで調べれば、これまで中性的アンタゴニストと考えられてきた多くの化合物が、逆性アゴニストとして再分類されるであろうという見解を敷衍する（ｄｅ　Ｌｉｇｔ　ｅｔ　ａｌ，２０００）。
【００７４】
ヒトＭＣＨ１受容体の遺伝子はイントロンを含んでもよく、さらに、コード領域又は非コード領域には、さらなるイントロンが存在する可能性もある。さらに、スプライス型のｍＲＮＡは、現時点で確定されている開始メチオニンの上流か、又はコード領域内の何れかに、さらなるアミノ酸をコードしているかもしれない。さらに、選択的エキソン（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｅｘｏｎ）の存在と使用も可能であり、これにより、ｍＲＮＡは、エキソンを含む領域中の異なるアミノ酸をコードし得る。さらに、ＲＮＡエディッティングの機構を介して、発現されたタンパク質のアミノ酸配列が、元の遺伝子によってコードされるものとは異なるように、単一のアミノ酸の置換が生じてもよい（Ｂｕｒｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；Ｃｈｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。このような変種は、元の遺伝子によってコードされるポリペプチドとは異なる薬理学的な特性を示すかもしれない。
【００７５】
本発明は、本明細書に開示されたヒトＭＣＨ１受容体のスプライス変種を提供する。本発明は、さらに、選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）翻訳開始部位、及び本発明のヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸の選択的スプライシング又はエディッティングされた変異形を提供する。
【００７６】
本発明の核酸には、前記ヒトＭＣＨ１受容体遺伝子が図１に示されている核酸配列、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含まれる核酸配列を含む、ヒトＭＣＨ１受容体遺伝子の核酸類縁体も含まれる。ヒトＭＣＨ１受容体遺伝子の核酸類縁体は、１以上の核酸塩基の同一性又は位置が、本明細書に記載されたヒトＭＣＨ１受容体遺伝子と異なり、図１に示された全ての核酸塩基、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１中に含まれる全ての核酸塩基よりも少ない核酸塩基を含有する欠失類縁体、図１に示された、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれる１以上の核酸塩基が、他の核酸塩基によって置換されている置換類縁体、及び１以上の核酸塩基が前記核酸配列の末端又は中間部に付加されている付加類縁体）、図１に示された核酸配列、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれる核酸配列によってコードされるタンパク質の特性のうちの幾つか、又は全てを共有するタンパク質をコードする。本発明のある態様では、前記核酸類縁体は、図２に示されたアミノ配列を含むタンパク質、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれる核酸配列によってコードされるタンパク質をコードする。別の態様では、前記核酸類縁体は、図２Ｃに示されたアミノ酸配列、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれる核酸によってコードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。さらなる態様では、前記核酸類縁体によってコードされるタンパク質は、図２に示されたアミノ酸配列を有する受容体タンパク質の機能と同一の機能を有する。別の態様では、前記核酸類縁体によってコードされるタンパク質の機能は、図２に示されたアミノ酸配列を有する受容体タンパク質の機能とは異なる。別の態様では、核酸配列の変異は、タンパク質の膜貫通（ＴＭ）領域中に起こる。さらなる態様では、核酸配列の変異は、ＴＭ領域の外側に起こる。
【００７７】
本発明は、前記核酸がＤＮＡである上記単離された核酸を提供する。ある態様では、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。別の態様では、前記ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。さらに別の態様では、前記核酸はＲＮＡである。核酸分子の製造方法及び取扱い方法は、本分野において周知である。
【００７８】
本発明は、さらに、本明細書に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡに対して縮退した核酸を提供する。ある態様では、前記核酸は、図１に示されたヌクレオチド配列（配列番号２）、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれるヌクレオチド配列に対して縮退したヌクレオチド配列、すなわち、同一のアミノ酸配列に翻訳されるヌクレオチド配列を備える。
【００７９】
本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列をコードするが、表現型の変化を生じさせてはならないＤＮＡ及びｃＤＮＡも包含する。あるいは、本発明は、本発明のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＲＮＡも包含する。ハイブリダイゼーション法は、当業者に周知である。
【００８０】
本発明の核酸には、１以上のアミノ酸残基の同一性又は位置が、天然型と異なり、天然型の特性のうちの幾つか又は全てを共有する抗原性ポリペプチドのポリペプチド類縁体、断片又は誘導体をコードする核酸分子も含まれる（記載されている前記タンパク質の全残基よりも少ない残基を含有する欠失類縁体、記載された残基のうちの１以上が他の残基によって置換されている置換類縁体、及び１以上のアミノ酸残基が、ポリペプチドの末端又は中間部に付加されている付加類縁体）。これらの分子には、選択した非哺乳類宿主によって発現するのに「好適な」コドンが組み込まれ、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断部位が与えられ、迅速発現ベクターの構築を容易にする先頭、末端、又は中間部の付加的ＤＮＡ配列が与えられる。ポリペプチド類縁体の作成は、当業者に周知である（Ｒ．Ｆ．　Ｓｐｕｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）；Ｆｏｎｇ，Ｔ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，（１９９５）；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ　Ｄ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）；Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｍ．Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）；Ｇｕａｍ　Ｘ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，（１９９５））。
【００８１】
本発明の修飾ポリペプチドは、その例が本明細書に開示されている本分野で周知の方法を用いて、一過性に又は安定的に細胞中にトランスフェクトされ得る。本発明は、前記修飾ポリペプチドを用いた結合アッセイであって、前記ポリペプチドが、一過性に又は安定的に細胞株中で発現されるアッセイも提供する。本発明は、さらに、修飾ポリペプチドを用いて、本明細書に記載した結合アッセイのような結合アッセイで同定された化合物を提供する。
【００８２】
本明細書の本文及び請求項に記載された核酸は、そのポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報が有用であり、様々な組換え手法によって、ポリペプチドを大規模に合成するための産物として有用である。核酸分子は、新しいクローニングベクター及び発現ベクター、形質転換及びトランスフェクトされた原核及び真核宿主細胞、並びにポリペプチド及び関連産物を発現することができるこのような宿主細胞を培養増殖する新規且つ有用な方法を作成するのに有用である。
【００８３】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体をコードする単離された核酸を提供する。ある態様では、前記核酸はＤＮＡである。別の態様では、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。別の態様では、前記ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである。別の態様では、前記核酸はＲＮＡである。
【００８４】
本発明は、図１に示されている核酸配列によってコードされる（配列番号１）、又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）によってコ−ドされるＭＣＨ１受容体の種相同体をコードする単離された核酸を使用する方法も提供する。ある態様では、前記核酸は、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によってコードされるＭＣＨ１受容体が有するアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する哺乳類のＭＣＨ１受容体の相同体をコードする。別の態様では、前記核酸は、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によってコードされるＭＣＨ１受容体と６５％以上のアミノ酸同一性を有する哺乳類ＭＣＨ１受容体相同物をコードする。好ましくは、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によってコードされるＭＣＨ１受容体と７５％以上のアミノ酸同一性を有する。より好ましくは、前記核酸は、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によってコードされるＭＣＨ１受容体と８５％以上のアミノ酸同一性を有する。最も好ましくは、前記核酸は、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によってコードされるヒトＭＣＨ１受容体と９５％以上のアミノ酸同一性を有する。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体相同体は、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれるＭＣＨ１受容体遺伝子と７０％以上の核酸同一性を有する。好ましくは、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれるＭＣＨ１受容体遺伝子と８０％以上の核酸同一性を有する。さらに好ましくは、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１に含まれるＭＣＨ１受容体遺伝子と９０％以上の核酸同一性を有する。種相同物を単離し、精製する方法の例は、他の文献（例えば、米国特許第５，６０２，０２４号、ＷＯ９４／１４９５７、ＷＯ９７／２６８５３、ＷＯ９８／１５５７０）に記載されている。
【００８５】
本発明の別の態様では、前記核酸は、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によってコードされるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するＭＣＨ１受容体をコードする。さらなる態様では、前記ＭＣＨ１受容体は、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）と実質的に同一の配列を有する。別の態様では、前記ＭＣＨ１受容体は、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）を有する。
【００８６】
ある態様では、前記変異ヒトＭＣＨ１受容体は、図１３に示されているアミノ酸配列（配列番号２６）を有する。別の態様では、前記変異ヒトＭＣＨ１受容体は、図１４に示されているアミノ酸配列（配列番号２７）を有する。さらに別の態様では、前記変異ヒトＭＣＨ１受容体は、図１５に示されているアミノ酸配列（配列番号２８）を有する。
【００８７】
別の態様では、前記ヒトＭＣＨ１受容体は、表記されている３つの開始（ＡＴＧ）コドンの何れかから始まり、図１に示されている核酸配列によってコードされる。
【００８８】
本発明は、第三細胞内ドメイン中にアミノ酸の欠失、置換、又は付加を有する点で、ヒトＭＣＨ１受容体と異なる、修飾ＭＣＨ１受容体をコードする単離された核酸を提供する。
【００８９】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸であって、（ａ）低ストリンジェンシー条件下で、図１に示されている所定の配列（配列番号１）又はこれに相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こすことができることをさらに特徴とし、前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する核酸を提供する。低ストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、２５％ホルムアミド、５×ＳＣＣ、７ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、２５μｌ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション緩衝液中において、４０℃で行われる。０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中において、４０℃で洗浄する。ｐＨの変化は、受容体によって媒介された細胞外酸性化速度のマイクロフィジオメーターによる測定を通じて測定される。細胞の代謝は、（多様なメッセンジャー経路の受容体による活性化を含む）幅広い細胞現象に、複雑に関与しているので、ミクロフィジオメーターによる（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｒｉｃ）細胞代謝の測定を使用すれば、原理的には、受容体の信号伝達経路の詳細に関わらず、任意の受容体の活性化から生じる細胞活性の一般的なアッセイ法が得られる。一過性の受容体発現、細胞の調製、及びミクロフィジオメーターによる記録の一般的なガイドラインは、他の文献（Ｓａｌｏｎ，Ｊ．Ａ．　ａｎｄ　Ｏｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ａ．，１９９６）に記載されている。製造業者の推奨（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従い、リポソームにより媒介されるトランスフェクションによって、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で、受容体及び／又は制御ベクターを一過性に発現し、ＨａｍのＦ−１２完全培地（１０％血清）中に維持する。トランスフェクションの２４時間前に分割され、トランスフェクションの時点で７０〜８０％集密であると判定された各７５ｃｍ２のフラスコをトランスフェクトするために、総量１０μｇのＤＮＡを使用する。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を回収し、ミクロフィジオメーターのカプセルに、３ｘ１０５の細胞を播種する。さらに２４時間、該カプセルの膜に細胞を付着させる（最後の１６時間には、各種の血清因子によって引き起こされる不完全な代謝の刺激を最小限に抑えるために、細胞を無血清Ｆ−１２完全培地と交換する）。実験日に、細胞カプセルをミクロフィジオメーターに移し、記録培地（０．１％の無脂肪酸ＢＳＡを含有する、低緩衝液　ＲＰＭＩ　１６４０、重炭酸塩なし、無血清（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））中で平衡化させ、この間に、基礎代謝活性のベースライン測定を確立する。標準的な記録のプロトコールでは、３０秒にわたって流れを中断する（この間に、酸性化速度を測定する）ことを含む２分の総ポンプサイクルで、１００μＬ／分の流速とする。リガンドへの暴露は、暴露後初めて速度を測定する直前に、１分２０秒間サンプルに暴露することに引き続き、合計５分２０秒間サンプルを暴露するためのさらに２回のポンプサイクルを含む。典型的には、一次スクリーニング中の薬物は、１０μＭの最終濃度で細胞に与えられる。続いて、リガンドサンプルを洗い出し、表示された酸性化速度を、暴露直前に観察されたベースライン速度に対するピーク応答のパーセント増加率として表す。ＭＣＨリガンドの例には、内在性ＭＣＨペプチドが含まれるが、これに限定されない。
【００９０】
本発明は、精製されたヒトＭＣＨ１受容体タンパク質を提供する。
【００９１】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を備えたベクターを提供する。ある態様では、前記ベクターは、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする前記核酸に作用可能に連結され、その発現を可能とする前記細胞での前記核酸の発現に必要な制御因子を備えた、細胞での発現に適合されている。別の態様では、前記細胞は、細菌細胞、両生類細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳類細胞である。別の態様では、前記ベクターはバキュロウイルスである。ある態様では、前記ベクターはプラスミドである。
【００９２】
本発明は、ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１と命名されたプラスミド（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）を提供する。該プラスミドは、ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡに作用可能に連結され、その発現を可能とする、哺乳類細胞でのＤＮＡの発現に必要な制御因子を備える。
【００９３】
該プラスミド（ｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１）は、１９９８年９月１７日、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２、Ｕ．Ｓ．Ａ．に該プラスミド（ＭＣＨ１）を寄託し、ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７が与えられた。
【００９４】
本発明は、さらに、所望の宿主細胞での発現に、又は結合アッセイ若しくは機能的アッセイで使用するのに有用な修飾された未翻訳の配列を備えた任意のベクター又はプラスミドを提供する。例えば、様々な長さの未翻訳配列を有するベクター又はプラスミドは、使用する宿主細胞に応じて、異なる量のポリペプチドを発現し得る。ある態様では、前記ベクター又はプラスミドは、前記ポリペプチドのコード配列と宿主細胞中での発現に必要な制御要素とを備える。
【００９５】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を備えたベクターを含む細胞を提供する。ある態様では、前記細胞は、非哺乳類細胞である。さらなる態様では、前記非哺乳類細胞は、アフリカツメガエルの卵母細胞又はアフリカツメガエルのメラニン保有細胞である。別の態様では、前記細胞は、哺乳類細胞である。さらなる態様では、前記哺乳類細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、マウスＹ１細胞、又はＣＨＯ細胞である。
【００９６】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸を備えた昆虫細胞中での発現に適合されたベクターを含む昆虫細胞を提供する。別の態様では、前記昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、又はトリコプルシア　ｎｉ　５Ｂ１−４（ＨｉｇｈＦｉｖｅ）細胞である。
【００９７】
本発明は、上述した細胞の何れか１つから単離した膜調製物を提供する。
【００９８】
本発明は、少なくとも１５のヌクレオチドを有し、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする核酸プローブであって、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１中に存在するヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸の２つの鎖のうちの１つの中に存在する配列に対応するユニークな配列を有する核酸プローブを提供する。本発明は、少なくとも１５のヌクレオチドを有し、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸と特異的にハイブリダイズする核酸プローブであって、（ａ）図１に示された核酸配列（配列番号１）、又は（ｂ）その反対側相補鎖中に存在する配列に対応するユニークな配列を有する核酸プローブも提供する。ある態様では、前記核酸はＤＮＡである。別の態様では、前記核酸はＲＮＡである。
【００９９】
本明細書で使用する「特異的にハイブリダイズする」という語は、核酸分子が、自身と相補的な核酸配列を認識して、相補的な塩基対間の水素結合を介して二重螺旋セグメントを形成し得ることを意味する。
【０１００】
核酸プローブ技術は、当業者に周知であり、当業者であれば、このようなプローブの長さは著しく異なってもよく、プローブの検出を促進するために放射性アイソトープ又は蛍光色素のような検出可能な標識で標識し得ることを容易に理解できるであろう。ＤＮＡプローブ分子は、本分野で周知の方法を用いて、プラスミド又はバクテリオファージのような適切なベクターの中に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を挿入した後、適切な細菌宿主細胞中に形質転換し、形質転換した前記細菌宿主細胞中で複製し、ＤＮＡプローブを採集することによって作成し得る。あるいは、プローブは、ＤＮＡ合成機によって、化学的に作成してもよい。
【０１０１】
ＲＮＡプローブは、Ｔ３、Ｔ７、又はＳＰ６のようなバクテリオファージのプロモーターの下流に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を挿入することによって作成し得る。大量のＲＮＡプローブは、適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下で、上流のプロモーターを含有する直鎖化された断片とともに、標識したヌクレオチドをインキュベートすることによって作成し得る。
【０１０２】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＲＮＡに特異的にハイブリダイズして、ＲＮＡの翻訳を妨げることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし得る配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供する。ある態様では、前記オリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されたヌクレオチド又はヌクレオチド類縁体を含む。
【０１０３】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする核酸によってコードされるヒトＭＣＨ１受容体に結合し得る抗体を提供する。本発明は、抗体のヒトＭＣＨ１受容体への結合を拮抗的に阻害し得る物質も提供する。ある態様では、前記抗体は、モノクローナル抗体又は抗血清である。
【０１０４】
本発明は、（ａ）細胞膜を通過することができ、ヒトＭＣＨ１受容体の発現を減少させるのに有効な量のオリゴヌクレオチドと、（ｂ）前記細胞膜を通過できる薬学的に許容される担体とを備えた薬学的組成物を提供する。ある態様では、前記オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活化する物質に結合されている。さらなる態様では、ｍＲＮＡを不活化する前記物質は、リボザイムである。別の態様では、前記薬学的に許容される担体は、細胞上に存在するヒトＭＣＨ１受容体に結合する構造を備え、該構造への結合後に、前記細胞によって取り込まれ得る。さらなる態様では、前記薬学的に許容される担体は、選択した細胞のタイプに特異的であるヒトＭＣＨ１受容体に結合することができる。
【０１０５】
本発明は、リガンドのヒトＭＣＨ１受容体への結合を遮断するのに有効な量の抗体と薬学的に許容される担体とを備えた薬学的組成物を提供する。
【０１０６】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」という用語は、任意の標準的な薬学的に許容される担体を意味し、薬学的組成物を処方する上で有用であるとして当業者に公知の任意の薬学的担体である。例としては、リン酸で緩衝化した生理的食塩水、生理的食塩水、水、及びｏ／ｗエマルジョンのようなエマルジョンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
１９９７年１２月２４日に、米国保健社会福祉省の健康食品医薬品局から、「Ｑ３Ｃ　Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ：Ｒｅｓｉｄｕａｌ　Ｓｏｌｖｅｎｔ」と題されたガイダンスが発行された。該ガイダンスは、患者の安全のために、薬品の中に許容され得る量の溶媒が残留することを推奨しており、且つ薬剤物質及び投薬形態の製造において、より毒性の低い溶媒を使用することを推薦している。該ガイダンスの表１は、「クラス１溶媒」を列記している。次いで、該ガイダンスは、それらの使用が、リスク−有益性評価において強度に正当化されない限り、薬剤物質、賦形剤、又は薬剤製品の製造において、クラス１溶媒を使用することは避けるべきであると述べている。さらに、該ガイダンスは、生じ得る副作用から患者を保護するために、クラス２溶媒は制限すべきであると述べている。該ガイダンスは以下の溶媒、ベンゼン、四塩化炭素、１、２−ジクロロエタン、１、１−ジクロロエテン、及び１、１、１−トリクロロエタンをクラス１溶媒としている。該ガイダンスは、以下の溶媒、アセトニトリル、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、１、２−ジクロロエテン、ジクロロメタン、１、２−ジメトキシエタン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、１、４−ジオキサン、２−エトキシエタノール、エチレングリコール、ホルムアミド、ヘキサン、メタノール、２−メトキシエタノール、メチルブチルケトン、メチルシクロヘキサン、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ピリジン、スルフォラン、テトラリン、トルエン、１、１、２−トリクロロエテン、及びキシレンをクラス２溶媒としている。本発明で使用する「薬学的に許容される担体」という用語には、クラス１又はクラス２溶媒は含まないものとする。
【０１０８】
本発明のある態様では、前記薬学的担体は液体であり得、前記薬学的組成物は溶液の形態であろう。別の態様では、前記薬学的に許容される担体は固体であり、前記組成物は粉末又は錠剤の形態である。さらなる態様では、前記薬学的担体はゲルであり、前記組成物は座剤又はクリームの形態である。さらなる態様では、前記化合物は、薬学的に許容される経皮貼付薬の一部として調剤してもよい。さらなる態様では、前記化合物は、スプレー又は吸入によって、前記患者に供給される。
【０１０９】
固体担体は、内在性担体（例えば、栄養素又は微量元素担体）香料、減摩剤、可溶化剤、懸濁剤、賦形剤、潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、圧縮補助剤、結合剤、又は錠剤崩壊剤としても作用し得る１以上の物質を含むことができる。それは、カプセル化物質でもあり得る。粉末では、前記担体は、細かく分割された活性成分と混合される細かく分割された固体である。錠剤では、活性成分は、必要な圧縮特性を有する担体と適切な比率で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。粉末及び錠剤は、好ましくは、９９％を超えない活性成分を含有する。適切な固体担体には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低溶融蝋、及びイオン交換樹脂が含まれる。
【０１１０】
液体担体は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤、及び加圧された組成物を調製するのに使用される。活性成分は、水、有機溶媒、両者の混合物、又は薬学的に許容される油若しくは脂肪のような薬学的に許容される液体担体中に溶解、又は懸濁され得る。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味料、香料、懸濁剤、濃縮剤、着色料、粘度調整剤、安定化剤、又は浸透圧調整剤のような他の適切な薬学的添加物を含有することができる。経口及び非経口投与のための適切な液体担体の例には、水（上記の添加物、例えば、セルロース誘導体、好ましくは、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を一部含有する）、（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む）アルコール及びそれらの誘導体、並びに油（例えば、ヤシ油、及びラッカセイ油）が含まれる。非経口投与のためには、担体は、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルのような油状エステルでもあり得る。無菌液体担体は、非経口投与用の無菌液体型組成物において有用である。加圧組成物用の液体担体は、ハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。
【０１１１】
無菌溶液又は懸濁液である液体薬学的組成物は、例えば、筋肉内、莢膜内、硬膜外、腹腔内、又は皮下注射によって使用することができる。無菌溶液は、静脈内投与してもよい。前記化合物は、無菌水、生理的食塩水、又は他の適切な無菌の注射可能な溶媒を用いて、投与時に、溶解又は懸濁させ得る無菌固体組成物として調製し得る。担体は、必要な不活性結合剤、懸濁剤、減摩剤、香料、甘味料、防腐剤、色素、及びコーティングを含むことが予定されている。
【０１１２】
ＭＣＨ１アンタゴニストは、他の溶質又は懸濁剤、例えば、溶液を等張にするのに十分な生理的食塩水又はグルコース、胆汁酸塩、アラビアゴム、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステル、及びエチレンオキサイドと共重合したその無水物）等を含有する無菌溶液又は懸濁液の形態で経口投与できる。
【０１１３】
ＭＣＨ１アンタゴニストは、液体又は固体組成物のうちの何れかの形態で、経口投与することもできる。経口投与に適した組成物は、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、及び粉末のような固体形態、並びに溶液、シロップ、エリキシル、及び懸濁液のような液体形態を含む。非経口投与に有用な形態には、無菌溶液、エマルジョン、及び懸濁液が含まれる。
【０１１４】
投与すべき至適投薬量は、当業者によって決定し得、使用する具体的な化合物、調製物の効力、投与様式、及び病状の進行に応じて変動するであろう。患者の年齢、体重、性別、食餌、及び投与の時間を含む治療を受ける患者に応じたさらなる要素は、投薬量を調整する必要をもたらすであろう。
【０１１５】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡを発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。本発明は、天然のヒトＭＣＨ１受容体が相同的組換えによってノックアウトされたヒト以外のトランスジェニック哺乳動物も提供する。本発明は、さらに、そのゲノムが、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡと相補的なアンチセンスＤＮＡであって、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡと相補的であるアンチセンスｍＲＮＡに転写されるように前記ゲノム中に配置され、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズすることによって、その翻訳を減少せしめるアンチセンスＤＮＡを具備するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。ある態様では、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする前記ＤＮＡは、さらに誘導性プロモーターを備えている。別の態様では、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡは、さらに、組織特異的制御要素を備える。さらなる態様では、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物はマウスである。
【０１１６】
本発明のポリペプチドの生理的役割及び行動上の役割を明らかにする動物モデル系は、様々な技術により、該ポリペプチドの活性が増加若しくは減少しているか、又は発現されたポリペプチドのアミノ酸配列が変化しているトランスジェニック動物を作出することによって与えられる。これらの技術の例には、１）マイクロインジェクション、エレクトロポーレイション、レトロウイルスのトランスフェクション、又は当業者に周知の他の手段によって、適切な受精した胚の中に、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡの正常型又は変異型を挿入して、トランスジェニック動物を作成すること、又は２）トランスジェニック動物中に存在する本来の遺伝子座を、変異した又は正常な、これらの遺伝子に対応するヒト又は動物の遺伝子で相同的に組換えて、これらのポリペプチド配列の発現又は構造の制御を変化させることが含まれるが、これらに限定されない。相同的組換えの技術は、本分野において周知である。相同的組換えは、元の遺伝子を挿入遺伝子と置き換えるので、元のポリペプチドを発現できないが、例えば、（組換えによって動物のゲノム中に存在した元のポリペプチドを置換している）挿入された変異型ポリペプチドを発現しているために、トランスポーターの発現が低下している動物を作成するのに有用である。マイクロインジェクションは、ゲノムに遺伝子を加えるが、それらを除去しないので、それ自身のポリペプチドと加えたポリペプチドとを発現し、ポリペプチドが過剰発現している動物を作成するのに有用である。
【０１１７】
一例としてマウスを用いて、トランスジェニック動物を作成するのに利用できる手段の１つは、以下のとおりである。雌のマウスを交配し、それらの卵管から生じた受精卵を取り出す。Ｍ２培地のような適切な培地の中に、前記卵を保存する。本分野で周知の方法によって、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡをベクターから精製する。誘導性プロモーターをＤＮＡのコード領域と融合すれば、導入遺伝子の発現を制御するための実験的な手段が得られ得る。これに代えて、又はこれに加えて、導入遺伝子の組織特異的な発現を可能とするために、コード領域に組織特異的な制御要素を融合してもよい。適切に緩衝化した溶液中で、マイクロインジェクション針（ピペットガラス電極作成器を用いて、キャピラリーチューブから作製し得る）の中にＤＮＡを入れ、凹型スライドの中に、注入すべき卵を置く。卵の前核に針を入れ、ＤＮＡ溶液を注入する。その後、注入された卵は、偽妊娠したマウス（妊娠を維持するための適切なホルモンで刺激されているが、実際には妊娠していないマウス）の卵管中に移動し、マウスの体内で、卵は子宮まで進み、着床し、出産日まで成長する。上述のように、マイクロインジェクションが、卵細胞の中にＤＮＡを挿入する唯一の方法ではなく、ここでは、例示のために使用されているにすぎない。
【０１１８】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定する方法であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡを含有し、該受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞に、結合に適した条件下で前記化合物を接触させることと、前記化学的化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への特異的な結合を検出することとを備え、前記細胞は哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、
前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが、（ａ）低ストリンジェンシー条件下で、図１に示されている所定の配列（配列番号１）又はこれに相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こすことができることをさらに特徴とし、前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する方法を提供する。本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定する方法であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡを含有し、該受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞から得た膜調製物を、結合に適した条件下で前記化合物と接触させることと、前記化学的化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への特異的な結合を検出することとを備え、前記細胞は哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが、（ａ）低ストリンジェンシー条件下で、図１に示されている所定の配列（配列番号１）を有する核酸又はこれに相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こすことができることをさらに特徴とし、前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する方法も提供する。ある態様では、前記ＭＣＨ１受容体はヒトＭＣＨ１受容体である。別の態様では、前記ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容体である。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によってコ−ドされるヒトＭＣＨ１受容体と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。さらなる態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、図２に示されているアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列（配列番号２）を有する。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）を有する。異なる態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、図１３に示されているアミノ酸配列（配列番号２６）を有する。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、図１４に示されているアミノ酸配列（配列番号２７）を有する。さらに別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、図１５に示されているアミノ酸配列（配列番号２８）を有する。ある態様では、前記化合物は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが以前には知られていない。本発明は、さらに、上述の方法によって同定された化合物を提供する。
【０１１９】
上記方法のある態様では、前記細胞は昆虫細胞である。別の態様では、前記細胞は哺乳類細胞である。さらなる態様では、前記細胞は非神経細胞由来である。さらなる態様では、前記非神経細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である。
【０１２０】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定するための拮抗的結合を含んだ方法であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的な結合を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することの指標となり、前記細胞は哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが、（ａ）低ストリンジェンシー条件下で、図１に示されている所定の配列（配列番号１）又はこれに相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こすことができることをさらに特徴とし、前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する方法を提供する。
【０１２１】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定するための拮抗的結合を含んだ方法であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞から得た膜調製物を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的な結合を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することの指標となり、前記細胞は哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが、（ａ）低ストリンジェンシー条件下で、図１に示されている所定の配列（配列番号１）又はこれに相補的な配列を有する核酸にハイブリダイズし、且つ（ｂ）ＭＣＨ１リガンドを培養物に加えたときに、ＣＨＯ細胞の培養物のｐＨに変化を引き起こすことができることをさらに特徴とし、前記ＣＨＯ細胞が、前記所定の配列を有する核酸又はその相補物にハイブリダイズした核酸を含有する方法も提供する。
【０１２２】
ある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容体である。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によってコ−ドされるヒトＭＣＨ１受容体と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。さらなる態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）を有する。
【０１２３】
ある態様では、前記細胞は昆虫細胞である。別の態様では、前記細胞は哺乳類細胞である。さらなる態様では、前記細胞は非神経細胞由来である。別の態様では、前記非神経細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である。ある態様では、前記化合物は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが以前には知られていない。本発明は、上述の方法によって同定された化合物を提供する。
【０１２４】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングする方法であって、（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を結合することが知られている化合物が結合可能な条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが知られていない前記複数の化合物に接触させることと、（ｂ）前記複数の化合物に含まれる化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られている化合物の結合が、前記複数の化合物の不存在下における前記化合物の結合に比べて減少しているかどうかを測定することと、もし減少していれば、（ｃ）前記複数の化合物に含まれる化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への結合を各別に測定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することとを備えた方法を提供する。
【０１２５】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングする方法であって、（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、該受容体を発現している細胞から得た膜調製物を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られている化合物の結合が可能な条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが知られていない前記複数の化合物に接触させることと、（ｂ）前記複数の化合物に含まれる化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが知られている化合物の結合が、前記複数の化合物の不存在下における前記化合物の結合に比べて減少しているかどうかを測定することと、もし減少していれば、（ｃ）前記複数の化合物に含まれる化合物の前記哺乳類ＭＣＨ１受容体への結合を各別に測定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化合物を同定することとを備えた方法を提供する。
【０１２６】
上述の方法のある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、ラットＭＣＨ１受容体である。別の態様では、前記細胞は哺乳類細胞である。さらなる態様では、前記哺乳類細胞は非神経細胞由来である。別の態様では、前記非神経細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＹ１細胞、又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
【０１２７】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするｍＲＮＡの存在を検出することによって、哺乳類ＭＣＨ１受容体の発現を検出する方法であって、細胞から全ｍＲＮＡを得ることと、このようにして得た前記ｍＲＮＡを、ハイブリダイズ条件下で、前記核酸プロ−ブと接触させることと、前記プロ−ブにハイブリダイズしているｍＲＮＡの存在を検出することにより、前記細胞による前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の発現を検出することとを備えた方法も提供する。
【０１２８】
本発明は、さらに、細胞の表面上の哺乳類ＭＣＨ１受容体の存在を検出する方法であって、抗体が前記受容体に結合できる条件下で、前記細胞を前記抗体と接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を検出することにより、前記細胞の表面上にある前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の存在を検出することとを備えた方法を提供する。
【０１２９】
本発明は、様々なレベルのヒトＭＣＨ１受容体の活性の生理的な影響を測定する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体の発現を制御する誘導性プロモ−タ−の使用によって、ヒトＭＣＨ１受容体活性のレベルが変化したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作成することを備えた方法を提供する。
【０１３０】
本発明は、様々なレベルのヒトＭＣＨ１受容体の活性の生理的な影響を測定する方法であって、各々が異なる量のヒトＭＣＨ１受容体を発現している一群のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作成することを備えた方法も提供する。
【０１３１】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を減少することによって緩和される異常を緩和することができるアンタゴニストを同定する方法であって、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与することと、ヒトＭＣＨ１受容体の過剰活性の結果として、前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に表れた身体及び／又は行動上の異常を、前記化合物が緩和するかどうかを決定することとを備え、前記異常が緩和されれば、前記化合物をアンタゴニストとして同定する方法を提供する。本発明は、上述の方法によって同定されたアンタゴニストも提供する。本発明は、さらに、上述の方法によって同定されたアンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を減少することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、有効量の該薬学的組成物を前記患者に投与することによって、前記異常を治療することを備えた方法を提供する。
【０１３２】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加することによって緩和される患者の異常を緩和し得るアゴニストを同定する方法であって、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与することと、前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に表れた身体及び行動上の異常を、前記化合物が緩和するかどうかを決定することとを備え、前記異常が緩和されれば、前記化合物をアゴニストとして同定する方法を提供する。本発明は、上述の方法によって同定されたアゴニストも提供する。本発明は、さらに、上述の方法によって同定されたアゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、さらに、ヒトＭＣＨ１受容体の活性を増加することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、有効量の該薬学的組成物を前記患者に投与することによって、前記異常を治療することを備えた方法を提供する。
【０１３３】
本発明は、特定の哺乳類の対立遺伝子の活性が関与する疾患に対する素因を診断する方法であって、（ａ）前記疾患に罹患した患者のＤＮＡを得ることと、（ｂ）一群の制限酵素によって前記ＤＮＡの制限消化を行うことと、（ｃ）得られたＤＮＡ断片をサイジングゲル上で、電気泳動により分離することと、（ｄ）得られたゲルを、ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸分子の配列内に含まれるユニ−クな配列と特異的にハイブリダイズすることができ、検出可能なマ−カ−で標識された核酸プロ−ブと接触させることと、（ｅ）前記疾患に罹患している患者の前記ＤＮＡに特異的なユニ−クなバンドパタ−ンを作出するために、ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする検出可能なマーカーで標識されたＤＮＡにハイブリダイズした標識されたバンドを検出することと、（ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）によって診断用に取得したＤＮＡを準備することと、（ｇ）工程（ｅ）で得られた前記疾患に罹患している患者のＤＮＡに特異的なユニ−クなバンドパタ−ンと、工程（ｆ）から診断用に得られたＤＮＡに特異的なユニークなバンドパターンとを比較して、該パタ−ンが同一であるか、あるいは異なるかどうかを決定し、前記パタ−ンが同一であれば、それによって、前記疾患に対する素因を診断することとを備えた方法を提供する。ある態様では、特定の哺乳類の対立遺伝子の活性が関与する疾患が診断される。
【０１３４】
本発明は、前記精製されたヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法であって、（ａ）前記ヒトＭＣＨ１受容体を発現するように細胞を誘導することと、（ｂ）前記誘導された細胞から前記ヒトＭＣＨ１受容体を回収することと、（ｃ）このように回収した前記ヒトＭＣＨ１受容体を精製することとを備えた方法を提供する。
【０１３５】
本発明は、精製されたヒトＭＣＨ１受容体を調製する方法であって、（ａ）ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドする核酸を適切な発現ベクタ−に挿入することと、（ｂ）得られたベクタ−を適切な宿主細胞中に導入することと、（ｃ）単離されたヒトＭＣＨ１受容体を産生できる適切な条件に、得られた宿主細胞を置くことと、（ｄ）前記得られた細胞によって産生されたヒトＭＣＨ１受容体を回収することと、（ｅ）このように回収したヒトＭＣＨ１受容体を精製することとを備えた方法を提供する。
【０１３６】
本発明は、ある化学的化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかどうかを決定する方法であって、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を可能とする条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、哺乳類ＭＣＨ１受容体活性の増加を検出することにより、前記化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法を提供する。本発明は、ある化学的化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を可能とする条件下で、公知の哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、前記ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、哺乳類ＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物が哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法も提供する。ある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である。
【０１３７】
本発明は、さらに、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効な量の上述の方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。ある態様では、哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストは、以前には知られていない。
【０１３８】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効な量の上述の方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。ある態様では、哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストは、以前には知られていない。
【０１３９】
本発明は、ある化学的化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体を活性化させるどうかを決定する方法であって、セカンドメッセンジャ−応答を生じ、それらの細胞表面上に前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を発現する細胞であって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない細胞を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で、前記化学的化合物と接触させることと、前記化学的化合物の存在下と不存在下で、前記セカンドメッセンジャ−応答を測定することとを備え、前記化学的化合物の存在下で前記セカンドメッセンジャ−応答が変化することが、前記化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することの指標である方法を提供する。ある態様では、前記セカンドメッセンジャ−応答は、塩素イオンチャンネルの活性化を含み、セカンドメッセンジャ−の変化が内向き塩素イオン電流のレベルの増加である。
【０１４０】
本発明は、ある化学的化合物が、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、その活性化を阻害するかどうかを決定する方法であって、セカンドメッセンジャ−応答を生じ、それらの細胞表面上に前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を発現する細胞（このような細胞は、哺乳類ＭＣＨ１受容体を本来発現していない）を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で、前記化学的化合物及び前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと各別に接触させることと、前記第二の化学的化合物のみの存在下での前記セカンドメッセンジャ−応答と、前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下での前記セカンドメッセンジャ−応答とを測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下よりも、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下での前記セカンドメッセンジャ−応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物が前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となる方法も提供する。ある態様では、前記セカンドメッセンジャ−応答が、塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下での内向き塩素イオン電流のレベルの増加が小さいことが、前記セカンドメッセンジャ−応答の変化である。本発明は、セカンドメッセンジャー応答を生じ、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、該受容体を発現している細胞から得た膜調製物を用いて行う上述の方法も提供する。
【０１４１】
上述の方法のある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容体である。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、プラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１によってコードされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する。さらなる態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）と実質的に同一の配列を有する。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、図２に示されているアミノ酸配列（配列番号２）を有する。ある態様では、前記細胞は昆虫細胞である。さらなる態様では、前記細胞は別の態様では、前記細胞は哺乳類細胞である。さらなる態様では、前記哺乳類細胞は非神経細胞由来である。別の態様では、前記非神経細胞は、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である。ある態様では、前記化合物は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合することが以前には知られていない。本発明は、上述の方法によって決定された化合物も提供する。
【０１４２】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効な量の上述の方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。ある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストは、以前は知られていない。
【０１４３】
本発明は、さらに、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効な量の上述の方法によって決定された哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。ある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体アンタゴニストは、以前は知られていない。
【０１４４】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングして、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化する化合物を同定する方法であって、（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下で、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、該受容体を発現している細胞を、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化することが知られていない前記複数の化合物と接触させることと、（ｂ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性が、前記化合物の存在下で増加するかどうかを測定することと、もし増加すれば、（ｃ）前記複数の化合物に含まれる各化合物によって、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が増加するかどうかを各別に決定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体を活性化する各化合物を同定することとを備えた方法を提供する。ある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、ラットＭＣＨ１受容体である。
【０１４５】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的化合物をスクリ−ニングして、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下で、公知の哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、該受容体を発現している細胞を前記複数の化合物と接触させることと、（ｂ）前記複数の化合物の存在下において、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化が、前記複数の化合物の不存在下での前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化と比較して減少しているかどうかを測定することと、もし減少していれば、（ｃ）前記複数の化合物に含まれる各化合物について、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害するかどうかを各別に決定することにより、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定することとを備えた方法を提供する。ある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体が、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、ラットＭＣＨ１受容体である。
【０１４６】
上述の方法のある態様では、前記細胞は哺乳類細胞である。別の態様では、前記哺乳類細胞が非神経細胞由来である。さらなる態様では、前記非神経細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、又はＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。
【０１４７】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加させるのに有効な上述の方法によって同定された化合物と薬学的に担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【０１４８】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少させるのに有効な上述の方法によって同定された化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【０１４９】
本発明は、さらに、アフリカツメガエル卵母細胞発現系のような卵母細胞発現系又はメラニン保有細胞の中で、受容体の活性化を測定する方法を提供する。ある態様では、受容体の活性化は、イオンチャンネル活性の測定によって決定される。別の態様では、受容体の活性化は、エコーリン発光によって測定される。
【０１５０】
アフリカツメガエル卵母細胞中での遺伝子の発現は、本分野で周知であり（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ａ．，１９８４；Ｍａｓｕ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，１９９４）、カエルの卵母細胞への、固有のｍＲＮＡ又はインビトロで合成したｍＲＮＡのマイクロインジェクションを用いて行われる。インビトロで合成されたｍＲＮＡの調製は、Ｔ７ポリメラーゼとｍＣＡＰ　ＲＮＡマッピングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いることを含む様々な標準的手法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　ｅｔ　ａｌ．，１９８９）によって行うことができる。
【０１５１】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を増加することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、前記異常を治療するのに有効な量の哺乳類ＭＣＨ１受容体アゴニストである化合物を前記患者に投与することを備えた方法を提供する。別の態様では、前記異常は、ステロイド若しくは下垂体ホルモンの調節異常、エピネフリン放出の異常、胃腸疾患、心血管疾患、電解質バランスの異常、高血圧、糖尿病、呼吸器疾患、喘息、生殖機能疾患、免疫疾患、内分泌疾患、筋骨格疾患、神経内分泌疾患、認知障害、アルツハイマー病のような記憶障害、知覚の調節及び伝達障害、運動同調性疾患、知覚統合障害、運動統合障害、パーキンソン病のようなドーパミン機能の異常、知覚伝達障害、嗅覚障害、交感神経支配の異常、鬱病のような情動障害、ストレス関連疾患、液体バランス異常、尿失禁のような尿疾患、発作疾患、痛み、精神分裂病のような精神異常の行動、モルヒネ耐性、鎮痛剤中毒、又は偏頭痛である。
【０１５２】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体の活性を減少することによって緩和される患者の異常を治療する方法であって、前記異常を治療するのに有効な量の哺乳類ＭＣＨ１アンタゴニストである化合物を前記患者に投与することを備えた方法を提供する。別の態様では、前記異常は、ステロイド若しくは下垂体ホルモンの調節異常、エピネフリン放出の異常、胃腸疾患、心血管疾患、電解質バランスの異常、高血圧、糖尿病、呼吸器疾患、喘息、生殖機能疾患、免疫疾患、内分泌疾患、筋骨格疾患、神経内分泌疾患、認知障害、アルツハイマー病のような記憶障害、知覚の調節及び伝達障害、運動同調性疾患、知覚統合障害、運動統合障害、パーキンソン病のようなドーパミン機能の異常、知覚伝達障害、嗅覚障害、交感神経支配の異常、鬱病のような情動障害、ストレス関連疾患、液体バランス異常、尿失禁のような尿疾患、発作疾患、痛み、精神分裂病のような精神異常の行動、モルヒネ耐性、鎮痛剤中毒、又は偏頭痛である。
【０１５３】
本発明は、哺乳類ＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、哺乳類ＭＣＨ１受容体に結合し、及び／又は該受容体を活性化し、若しくはその活性化を阻害する化合物を同定するために本明細書に記載された方法の何れかを用いて、化学的化合物を同定した後、該化学的化合物、又はその新規な構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備えた方法を提供する。ある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である。別の態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容体である。
【０１５４】
本発明は、さらに、組成物を調製する方法であって、薬学的に許容される担体と、哺乳類ＭＣＨ１受容体又はその新規な構造的及び機能的類縁体若しくは相同体に結合し、及び／又はこれらを活性化し、若しくはその活性化を阻害する化合物を同定するために、本明細書に記載された何れかの方法によって同定された治療的有効量の化学的化合物とを混合することを備えた方法を提供する。ある態様では、前記哺乳類ＭＣＨ１受容体は、ヒトＭＣＨ１受容体若しくはＭＣＨによって活性化されるこのようなヒトＭＣＨ１受容体の変異体、又はそれらの類縁体若しくは相同体である。別の態様では、哺乳類ＭＣＨ１受容体はラットＭＣＨ１受容体である。
【０１５５】
本発明は、ある化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を可能とする条件下で、公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコ−ドするＤＮＡがトランスフェクトされ、前記ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備え、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含み、前記公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストがＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体であり、前記細胞が、ＭＣＨ１受容体をトランスフェクトする前にはＭＣＨ１受容体を発現していない方法を提供する。
【０１５６】
本発明は、ある化合物が、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、その活性化を阻害するかどうかを決定する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に際してセカンドメッセンジャー応答を生じ、且つそれらの細胞表面上に前記ヒトＭＣＨ１受容体を発現している細胞を、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で、前記化学的化合物及びヒトＭＣＨ１受容体を活性化させることが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと各別に接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする前記ＤＮＡは図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ　ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む）、前記第二の化学的化合物のみの存在下で、及び前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下で前記セカンドメッセンジャー応答を測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下に比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下での前記セカンドメッセンジャー応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となり、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である方法を提供する。ある態様では、前記セカンドメッセンジャー応答は塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における内向き塩素イオン電流のレベルの増加が前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて小さいことが前記セカンドメッセンジャー応答の変化である。
【０１５７】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的化合物をスクリーニングして、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が可能な条件下で、前記ヒトＭＣＨ１受容体がトランスフェクトされ、前記ヒトＭＣＨ１受容体を発現している細胞を、公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下で、前記複数の化合物と接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、ヒトＭＣＨ１受容体をコードする前記ＤＮＡは図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む）、
（ｂ）前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化が、前記複数の化合物の不存在下での前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化と比べて、前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを測定することと、もし減少すれば、
（ｃ）前記複数の化合物に含まれる各化合物について、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化の阻害の程度を各別に決定することにより、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する化合物を同定することと
を備えた方法を提供する。上記方法のある態様では、前記細胞は昆虫細胞である。別の態様では、前記細胞は哺乳類細胞である。さらに別の態様では、前記細胞は非神経細胞由来の哺乳類細胞である。さらなる態様では、前記細胞は、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である。
【０１５８】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物を又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することがこのような化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標である、拮抗的結合を含む方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが同定される（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）方法を提供する。
【０１５９】
本発明は、さらに、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する物質の組成物を製造する方法であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物を又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞から得られた膜調製物を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標である、拮抗的結合を含む方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合することが同定される方法（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）を提供する。
【０１６０】
本発明は、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである物質の組成物を製造する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化させ得る条件下で、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法によって、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストとして同定される方法（前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストはＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）も提供する。
【０１６１】
本発明は、さらに、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体の活性化を阻害する物質の組成物を製造する方法であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体の活性化を阻害する化学的化合物を同定した後、前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体を合成することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化したときにセカンドメッセンジャー応答を生じる細胞を、前記化学的化合物及び前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で各別に接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされる）、前記第二の化学的化合物のみの存在下で、及び前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下で、前記セカンドメッセンジャ−応答を測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における前記セカンドメッセンジャー応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となり、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合し、該受容体の活性化を阻害すると同定される方法を提供する。ある態様では、本発明は、前記セカンドメッセンジャー応答は塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における内向き塩素イオン電流のレベルの増加が前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて小さいことがセカンドメッセンジャー応答の変化である。
【０１６２】
本発明は、組成物を調製する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標となる拮抗的結合を含んだ方法（ここで、前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合とが同定される方法を提供する。
【０１６３】
本発明は、さらに、組成物を調製する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合する化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞から得た膜調製物を、前記化学的化合物及び前記受容体に結合することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、両化合物の結合に適した条件下で各別に接触させることと、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記化学的化合物の特異的結合の程度を検出することとを備え、前記化学的化合物の存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体への前記第二の化学的化合物の結合が減少することが、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することの指標となる拮抗的結合を含んだ方法（ここで、前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合することが同定される方法を提供する。
【０１６４】
本発明は、組成物を調製する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストである化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、
公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストの存在下において、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化させ得る条件下で、前記ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現している細胞を前記化合物と接触させることと、ヒトＭＣＨ１受容体活性の減少を検出することにより、前記化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストであるかどうかを決定することとを備えた方法によって（ここで、前記細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされ、前記公知のヒトＭＣＨ１受容体アゴニストはＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である）、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体アンタゴニストとして同定される方法も提供する。
【０１６５】
本発明は、さらに、組成物を調製する方法であって、ヒトＭＣＨ１受容体に特異的に結合して、該受容体の活性化を阻害する化学的化合物を同定した後、担体と前記化学的化合物又はその構造的及び機能的類縁体若しくは相同体とを混合することを備え、
前記ヒトＭＣＨ１受容体をそれらの細胞表面上に発現している細胞であって、前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化したときにセカンドメッセンジャー応答を生じる細胞を、前記化学的化合物及び前記ヒトＭＣＨ１受容体を活性化することが知られている第二の化学的化合物の両者と、並びに前記第二の化学的化合物のみと、前記ヒトＭＣＨ１受容体の活性化に適した条件下で各別に接触させることと（このような細胞は前記ヒトＭＣＨ１受容体を本来発現しておらず、前記ヒトＭＣＨ１受容体は図１に示された配列（配列番号１）又はプラスミドｐＥＸＪ．ＨＲ−ＴＬ２３１（ＡＴＣＣ受託番号２０３１９７）に含有された配列を含む核酸によってコードされる）、前記第二の化学的化合物のみの存在下で、及び前記第二の化学的化合物と前記化学的化合物の両者の存在下で、前記セカンドメッセンジャ−応答を測定することとを備え、前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における前記セカンドメッセンジャー応答の変化が小さいことが、前記化学的化合物がヒトＭＣＨ１受容体の活性化を阻害することの指標となり、前記第二の化学的化合物がＭＣＨ又はＭＣＨの相同体若しくは類縁体である方法によって、前記化学的化合物が前記ヒトＭＣＨ１受容体に結合し、該受容体の活性化を阻害すると同定される方法を提供する。ある態様では、前記セカンドメッセンジャー応答が塩素イオンチャンネルの活性化を含み、前記化学的化合物と前記第二の化学的化合物の両者の存在下における内向き塩素イオン電流のレベルの増加が前記第二の化学的化合物のみの存在下と比べて小さいことが前記セカンドメッセンジャー応答の変化である。
【０１６６】
上記方法のある態様では、前記細胞は昆虫細胞である。別の態様では、前記細胞は哺乳類細胞である。別の態様では、前記哺乳類細胞は非神経細胞由来である。さらなる態様では、前記非神経細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胚性腎臓細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、マウスＹ１細胞、又はＬＭ（ｔｋ−）細胞である。
【０１６７】
本発明において、「アンタゴニスト効力」は、アンタゴニスト−受容体複合体の平衡解離定数として定義されるＫＢとして測定される。
【０１６８】
本発明において、「アゴニスト効力」は、機能的アッセイにおいて、最大応答の５０％を惹起するのに必要とされる濃度として定義されるＥＣ５０として測定される。
【０１６９】
本発明を通じて、「結合親和性」という用語は、放射性リガンドの結合によって検出することが可能である、受容体集団中の半分の結合部位を占有するのに必要とされる化合物の濃度を指す。結合親和性濃度は、阻害定数Ｋｉ、又は解離定数ＫＤとして表すことができる。
【０１７０】
「結合親和性の選択性」という用語は、ある化学的化合物が、ある受容体を別の受容体と識別することができることを指す。例えば、受容体Ｂに比べて、受容体Ａへの選択性を示す化合物は、受容体Ｂを結合するために必要とされる濃度より低い濃度で、受容体Ａを結合するであろう。
【０１７１】
それ故、特定の受容体「に比べて、少なくとも１０倍高い結合親和性でＭＣＨ１受容体に結合する」という形式の記載は、ＭＣＨ１受容体への結合親和性が、特定の受容体に対する結合親和性より、少なくとも１０倍大きく、化合物に対する結合親和性の測定値（すなわち、Ｋｉ又はＫＤ）が、少なくとも数値的に１０倍低いことを示す。
【０１７２】
本発明は、患者の摂食障害又は肥満を治療する方法であって、治療的有効量の、ＭＣＨ１受容体の活性化を阻害するＭＣＨ１アンタゴニストを前記患者に投与することを備えた方法を提供する。ある態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々の活性化を阻害するときのアンタゴニスト効力より、少なくとも３０倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する。
【０１７３】
さらなる態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々の活性化を阻害するときのアンタゴニスト効力より、少なくとも１０倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する。別の態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々の活性化を阻害するときのアンタゴニスト効力より、少なくとも１００倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する。
【０１７４】
さらなる態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々の活性化を阻害するときのアンタゴニスト効力より、少なくとも１００倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する。ある態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも３０倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する。
【０１７５】
別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する。さらなる態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体の活性化を阻害する。
【０１７６】
さらなる態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きなアンタゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する。さらに別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも３０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体に結合する。さらに別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体に結合する。
【０１７７】
さらなる態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体に結合する。さらなる態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する。
【０１７８】
別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがドーパミンＤ２受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも３０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体に結合する。別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがヒスタミンＨ１受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも３０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体に結合する。
【０１７９】
さらに他の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがドーパミンＤ２受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体に結合する。別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがＨ１ヒスタミン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する。
【０１８０】
別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがドーパミンＤ２受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも２００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストがさらにＭＣＨ１受容体に結合する。さらに別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがＨ１ヒスタミン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも２００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体に結合する。
【０１８１】
さらなる態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがα１Ａアドレナリン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体に結合する。別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがα１Ａアドレナリン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１００倍大きな結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体に結合する。
【０１８２】
他の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがＭＣＨ１受容体に結合するときの結合親和性より、１０倍超にすぎない結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにα１Ａアドレナリン受容体に結合する。さらに別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストがＭＣＨ１受容体に結合する結合親和性より、１００倍超にすぎない結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、さらにα１Ａアドレナリン受容体に結合する。
【０１８３】
本発明の前記態様の何れにおいても、前記食物摂取又は摂食障害は、過食症、肥満、又は神経性過食症である。ある態様では、前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒト又はイヌである。別の態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、食物とともに投与される。
【０１８４】
本発明は、患者の摂食障害を治療する方法であって、治療的有効量の、前記ＭＣＨ１受容体を活性化するＭＣＨ１アゴニストを前記患者に投与することを備えた方法も提供する。ある態様では、ＭＣＨ１アゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体を夫々活性化するときのアゴニスト効力より、少なくとも３０倍大きなアゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体を活性化する。
【０１８５】
別の態様では、ＭＣＨ１アゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体を夫々活性化するときのアゴニスト効力より、少なくとも１０倍大きなアゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体を活性化する。さらなる態様では、ＭＣＨ１アゴニストが５−ＨＴ２Ｃ及びＭＣ−４受容体を夫々活性化するときのアゴニスト効力より、少なくとも１００倍大きなアゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アゴニストがさらにＭＣＨ１受容体を活性化する。
【０１８６】
さらに別の態様では、ＭＣＨ１アゴニストがＮＰＹ１、ＮＰＹ５、ＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２、及びＧＡＬＲ３受容体を夫々活性化するときのアゴニスト効力より、少なくとも１００倍より大きなアゴニスト効力で、前記ＭＣＨ１アゴニストは、さらにＭＣＨ１受容体を活性化する。さらなる態様では、前記摂食障害は神経性拒食症である。別の態様では、前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒト又はイヌである。別の態様では、前記ＭＣＨ１アゴニストは、食事とともに投与される。最後の態様では、前記ＭＣＨ１アゴニストは、食物とともに投与される。
【０１８７】
本発明において、「治療的に有効な量」とは、化合物が有効である疾病に罹患している患者に投与したときに、疾病の抑制、軽減、又は回復をもたらす化合物の任意の量である。本出願において、「患者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、脊椎動物、哺乳動物、ヒト又はイヌである。
【０１８８】
本発明は、さらに、患者の摂食行動を改変する方法であって、前記患者による食物の摂取を減少させ、及び／又は前記患者の体重を減少させるのに有効な量の本発明の化合物を、前記患者に投与することを備えた方法を提供する。ある態様では、前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒト又はイヌである。別の態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、食事とともに投与される。
【０１８９】
本発明の化合物のプロドラッグも、本発明の範疇に属する。一般的には、このようなプロドラッグは、本発明の化合物の機能的な誘導体であって、インビボにおいて、必要な化合物に即座に転換され得る誘導体であろう。従って、本発明において、「投与する」という用語は、具体的に開示されているＭＣＨ１アンタゴニストを用いて、又は具体的には開示されていないかもしれないが、患者に投与した後に、インビボで、明記されているＭＣＨ１アンタゴニストに転換される化合物を用いて、既述の様々な症状を治療することを包含する。適切なプロドラッグ誘導体を選択及び調製する慣用的な操作は、例えば、Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，　ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載されている。
【０１９０】
本発明は、患者の鬱病及び／又は不安を治療する方法であって、
薬学的に許容される担体と治療的有効量のＭＣＨ１アンタゴニストとを含む組成物を前記患者に投与することを備え、
（ａ）（１）前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、１０ｍＭの濃度で、中枢モノアミンオキシダーゼＡの活性を、５０パーセントを超えて阻害せず、且つ
（２）前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、１０ｍＭの濃度で、中枢モノアミンオキシダーゼＢの活性を、５０パーセントを超えて阻害せず、
（ｂ）ＭＣＨ１アンタゴニストが、以下のトランスポーター：セロトニントランスポーター、ノルエピネフリントランスポーター、及びドーパミントランスポーターの夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で前記ＭＣＨ１アンタゴニストが前記ＭＣＨ１受容体に結合する方法を提供する。
【０１９１】
本発明において、「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書において既に定義されている。
【０１９２】
他の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒト５ＨＴ１Ａ、ヒト５ＨＴ１Ｂ、ヒト５ＨＴ１Ｄ、ヒト５ＨＴ１Ｅ、ヒト５ＨＴ１Ｆ、ヒト５ＨＴ２Ａ、ラット５ＨＴ２Ｃ、ヒト５ＨＴ４、ヒト５ＨＴ６、及びヒト５ＨＴ７受容体の夫々に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは前記ＭＣＨ１受容体にも結合する。
【０１９３】
さらに別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒトヒスタミンＨ１、及びヒトヒスタミンＨ２受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは前記ＭＣＨ１受容体にも結合する。
【０１９４】
さらに別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒトドーパミンＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、及びＤ５受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは前記ＭＣＨ１受容体にも結合する。
【０１９５】
さらなる態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒトα１Ａアドレナリン受容体、ヒトα１Ｂアドレナリン受容体、ヒトα１Ｄアドレナリン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが前記ＭＣＨ１受容体にも結合する。
【０１９６】
別の態様では、ＭＣＨ１アンタゴニストが、ヒトα２Ａアドレナリン受容体、ヒトα２Ｂアドレナリン受容体、及びヒトα２ｃアドレナリン受容体に結合するときの結合親和性より、少なくとも１０倍高い結合親和性で、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが前記ＭＣＨ１受容体にも結合する。
【０１９７】
幾つかの態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、中枢モノアミンオキシダーゼＡの活性を、６０％を超えて阻害しない。さらなる態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、中枢モノアミンオキシダーゼＢの活性を、６０％を超えて阻害しない。他の態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、中枢モノアミンオキシダーゼＡの活性を、７０％を超えて阻害しない。さらに別の態様では、さらなる態様では、前記ＭＣＨ１アンタゴニストは、中枢モノアミンオキシダーゼＢの活性を、７０％を超えて阻害しない。
【０１９８】
様々な受容体への化合物の結合特性は、目的とする受容体を選択的に発現する培養細胞株を用いて決定された。細胞株は、本明細書において、以下の実験の詳細にさらに記載されているように、クローニングされたｃＤＮＡ、又はクローニングされたゲノムＤＮＡ、又は前記受容体をコードするゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両者を含有する構築物をトランスフェクトすることによって調製された。さらに、様々なトランスポーター及び酵素への化合物の結合相互作用は、本分野で周知である組織調製物及び特異的なアッセイを用いて決定することができる。
【０１９９】
本発明に関連して、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、及びこれに代えて、本明細書で論述されている数多くのクローン化された受容体が、安定にトランスフェクトされた細胞株として、作成され、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ　２０１１０−２２０９に寄託されている。具体的には、これらの寄託物には、以下のようなＡＴＣＣ受託番号が与えられた。
【０２００】
【表Ａ】
2004502423.tif 000002
以下の受容体配列は、国立バイオテクノロジーセンター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）によって管理されているＧｅｎＢａｎｋ　ＤＮＡデータベースに寄託されている。
【０２０１】
【表Ｂ】
2004502423.tif 000003
このように、標的の受容体サブタイプに対する遺伝子をクローニングして、これをレシピエント細胞の中に入れると、その表面上に標的の受容体サブタイプを発現する。その後、標的のヒト受容体サブタイプの単一集団を発現する該細胞を増殖させて、細胞株を確立させる。該細胞株（薬剤伝達系（ＤＤＳ）を構成する）は、２つの異なるタイプのアッセイ、すなわち結合アッセイと機能的アッセイに用いられる。結合アッセイでは、ある薬剤伝達計画の標的となる受容体サブタイプと、副作用に関連している可能性がある別の受容体サブタイプの両者に対する化合物の親和性を測定する。これらの測定により、前記化合物が、他の受容体サブタイプに比して、標的となるべき受容体サブタイプに対して有する選択性の程度と、化合物の効力とを予測することが可能となる。結合アッセイから得られたデータによれば、化学者は、最適な治療効果を得るために、適切なものとして、１以上の関連するサブタイプに向かう、又は該サブタイプから離れる化合物をデザインすることが可能となる。機能的アッセイでは、前記受容体サブタイプの前記化合物に対する応答の性質が測定される。機能的アッセイから得られたデータは、前記化合物が、前記受容体サブタイプの活性を阻害又は増強するように作用するかどうかを示すので、薬理学者は、それらの最終的な標的であるヒトの受容体サブタイプに於いて、化合物を素早く評価することが可能となり、化学者は、既存の薬物に比べて、より有効で、且つより少ない、又は実質的により軽い副作用を有する薬物を論理的にデザインすることができる。
【０２０２】
受容体のサブタイプに選択的な化合物をデザインし、合成するためのアプローチは周知であり、伝統的な医薬品化学、及びより新しいコンビナトリアル化学の手法が含まれ、何れも、コンピューターによって補助された分子モデリングによって支援される。このようなアプローチを用いて、化学者や薬理学者は、これらの受容体サブタイプにおいて活性を有すると思われる構造物をデザインし、合成するために、標的受容体サブタイプの構造に関する、及び受容体サブタイプに結合し、及び／又はこれを活性化若しくはその活性化を阻害すると決定された化合物に関する知識を使用する。
【０２０３】
コンビナトリアル化学には、異なる組み合わせの化学的構築ブロックを用いてそれらを集合させることにより、様々な新規化合物を自動合成することが含まれる。コンビナトリアル化学の使用は、化合物を作成する工程を著しく加速させる。得られた化合物の群は、ライブラリーと呼ばれ、対象の受容体において、十分なレベルの活性を示す化合物（「リード化合物」）をスクリーニングするために使用される。コンビナトリアル化学を用いれば、対象となる受容体標的に対して大きな指向性を有すると予測される化合物の「集中型」ライブラリーを合成することが可能となる。
【０２０４】
一旦リード化合物が同定されれば、コンビナトリアル化学、あるいは伝統的な医薬品化学又はその他の方法を使用すると否とにかかわらず、化学構造と生物学的又は機能的活性との相関についての理解を早めるために、様々な相同体及び類縁体が調製される。これらの研究によって、構造活性相関が明らかとなり、次いでこれを用いて、効力、選択性、及び薬物動態学的特性が改良された薬剤がデザインされるリード最適化のための様々な構造物を迅速に作成するために、コンビナトリアル化学も使用される。さらなる改善を行い、自動手法を適用し得ない化合物を作成するために、一度に一個の化合物を合成する伝統的な医薬品化学も使用される。このような薬剤が得られたら、製薬及び化学業界で広く用いられている標準的な化学的製造法を用いて、製造をスケールアップする。
【０２０５】
本発明は、以下の実験の詳細によって、さらによく理解されるであろう。しかしながら、当業者であれば、論述されている具体的な方法及び結果は、その後に記載されている特許請求の範囲に、より完全な形で記載されている本発明の方法を例示するものにすぎないことを容易に理解できるであろう。
【０２０６】
【実験の詳細】
物質と方法
ヒトＭＣＨ１受容体のクローニング
ＧＥＮＥＭＢＬにおける、ＦＢ４１ａと相同な発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）Ｆ０７２２８の発見
Ｓｙｎａｐｔｉｃ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社所有の配列ＦＢ４１ａを照会として使用し、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてＧＥＮＥＭＢＬのＢＬＡＳＴ検索を行った。これにより、ＦＢ４１ａ及びソマトスタチン、アヘン及びガラニン受容体に対して高度の相同性を有するＥＳＴ（受託番号Ｆ０７２２８）が同定された。
【０２０７】
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーの構築及びスクリーニング
ＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）を用いて、ヒト海馬ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からポリＡ＋　ＲＮＡを精製した。ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎ（１９８３）に若干の変更を加えて、ポリＡ＋　ＲＮＡからＤＳ−ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡをＢｓｔＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐ．）に連結し、排除カラムクロマトグラフィーによって、過剰なアダプターを除去した。サイズ選別したｄｓ−ｃＤＮＡの高分子量の画分をｐＥＸＪ．ＢＳ（ｐｃＥＸＶから修飾したＯｋａｙａｍａとＢｅｒｇの発現ベクター、Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｇｅｒｍａｉｎ，１９８６）に連結し、ＢｓｔＸＩと他の更なる制限部位を含有させた。平均挿入サイズ３．０ｋｂを有する合計２．２×１０６の独立したクローンが作製された。該ライブラリーを寒天プレート（アンピシリン選択）上に播種し、５０００個の独立クローン４５０プール用のグリセロール保存液を調製した。スーパープールを作るために、一次グリセロール保存液も約１０のグループになるようにまとめた。
【０２０８】
ＭＣＨ１の完全長配列のクローニング
Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）と以下のＰＣＲプロトコール（９４℃で５分間維持、９４℃２分、６８℃４分を４０サイクル、６８℃に７分固定、試料をゲルにかけるまで４℃に維持）を使用して、Ｆ０７２２８特異的プライマーＴ５７９及びＴ５８０を用いたＰＣＲによって、スーパープール及びヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからの一次プールのグリセロール保存液をスクリーニングした。１つの陽性一次プール４９０を連続的にサブプールに分割し、ＬＢ培地中で一晩増幅させ、プライマーＴ５７９とＴ５８０を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。１つの陽性サブプール４９０−４−１０−２３を寒天プレート（アンピシリン選択）上に播種し、コロニーをニトロセルロース膜に転写した（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）。Ｆ０７２２８ＥＳＴ配列に対して設計された、１０６ｃｐｍ／ｍｌの３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブＴ５８１を用いて、高ストリンジェンシー条件下で、フィルターを２日間ハイブリダイズさせた。フィルターを洗浄し、Ｂｉｏｍａｘ　ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ）に接触させた。７つの陽性コロニーを取り出し、ＬＢ−ＡＭＰプレート上に画線し、一晩増殖させた。元の７つの各々から得た２つの各コロニーを取り出し、以下のプライマー対：Ｔ９５、Ｔ５８０及びＴ９４、Ｔ５７９を用いて、ベクター固着ＰＣＲにかけた。ＴＢ中で、１つの陽性コロニーＧ１を一晩増幅し、プラスミド精製用に加工した。該プラスミドをＴＬ２３０と命名し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅキット（ＵＳ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を用いて、両鎖に対して配列決定を行った。ＧＣＧプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、ヌクレオチド及びペプチド配列分析を行った。哺乳類の発現ベクターｐＥＸＪ中に、ＴＬ２３０のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片をサブクローニングし、ＴＬ２３１と名付けた。
【０２０９】
プライマーとプローブ：
ＴＬ５７９：５’−ＧＧＧＡＡＣＴＣＣＡＣＧＧＴＣＡＴＣＴＴＣＧＣＧＧＴ−３’（配列番号５）
ＴＬ５８０：５’−ＴＡＧＣＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＡＧ−３’（配列番号６）
ＴＬ５８１；５’−ＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＧ−３’（配列番号７）
ＴＬ９４：５’−ＣＴＴＣＴＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＧＧＡＡＧＴＧＴＴＡ−３’（配列番号８）
ＴＬ９５：５’−ＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号９）
ＴＬ２３１の種相同体（ヒトＭＣＨ１）の断片の単離
ＴＬ２３１の種相同体の断片を取得するために、ＴＬ２３１のＴＭ領域の１つに対応するフォワードＰＣＲプライマーと、ＴＬ２３１の別のＴＭ領域に対応するリバースプライマーを用いて、種ゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を増幅し得る。Ｅｘｐａｎｄ　Ｌｏｎｇ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用い、例えば以下の条件下（９４℃で３０秒、５０℃で１．５分、６８℃で１．５分を４０サイクル、それぞれ９４℃で５分及び６８℃で７分のプレ及びポストインキュベーションを行う）で、ＰＣＲを行い得る。バンドを単離し、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、バンドをサブクローニングし、配列決定した。該配列を走行させ、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７　ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上で分析した。該配列に対してフォワード及びリバースプライマーを設計し、例えば、以下の条件（９４℃で３０秒、６８℃で１．５分を３５サイクル、それぞれ９４℃で５分及び６８℃で５分のプレ及びポストインキュベーションを行う）を用いて、ゲノムＤＮＡからバンドを増幅するために使用した。ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲ産物をサブクローニングする。形質転換体のＭｉｎｉｐｒｅｐ培養物を調製し、上述のように配列決定した。
【０２１０】
ＴＬ２３１の完全長種相同体（ヒトＭＣＨ１）の単離
以下に簡潔に記されているような、標準的な分子生物学の手法とアプローチを用いて、ＭＣＨ１受容体をコードする核酸配列を単離し得る。
【０２１１】
アプローチ＃１：完全長のＭＣＨ１受容体を得るために、３２Ｐ標識されたオリゴヌクレオチドプローブでコスミドライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０２１２】
完全長の配列は、さらに配列決定用プライマーを用いて、該コスミドクローンを配列決定することによって取得し得る。該遺伝子中にはイントロンが１つ存在するので、標準的な分子生物学的手法を用いて、ｃＤＮＡからイントロンのない完全長の遺伝子を取得し得るかもしれない。例えば、５’ＵＴ中に設計されたフォワードＰＣＲプライマーと３’ＵＴ中に設計されたリバースＰＣＲプライマーは、ｃＤＮＡからイントロンが存在しない完全長の遺伝子を増幅するために使用し得る。標準的な分子生物学的手法を使用して、該遺伝子を哺乳類の発現ベクター中にサブクローニングすることができる。
【０２１３】
アプローチ＃２：３２Ｐ標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、高ストリンジェンシー下でのハイブリダイゼーションを行うことにより、市販のｃＤＮＡファージライブラリーをスクリーニングするために、標準的な分子生物学的技術を用いることができる。λライブラリーからプラーク精製されたクローンを取得し、次いで、該クローンを直接ＤＮＡシークエンシングに供することによって、完全長のＭＣＨ１受容体を単離し得る。あるいは、ＭＣＨ１配列に対するプライマーを使用して、ライブラリープールをＰＣＲ増幅することによって、自家ｃＤＮＡプラスミドライブラリーをスクリーニングするために、標準的な分子生物学的手法を用いることができるかもしれない。３２Ｐ標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、陽性プールのコロニーリフトにサザンハイブリダイゼーションを行うことによって、完全長のクローンを単離し得るかもしれない。
【０２１４】
アプローチ＃３：別の代替法として、ｃＤＮＡから、ＭＣＨ１の別の配列を含有するＭＣＨ１を発現するＰＣＲ産物を作製するために３’―ＲＡＣＥ及び５’−ＲＡＣＥを利用することができる。これらのＲＡＣＥ　ＰＣＲ産物は、続いて、失われた配列を決定するために配列決定し得る。該新しい配列は、続いて、５’−ＵＴ中のフォワードＰＣＲプライマーと３’−ＵＴ中のリバースプライマーをデザインするために使用することができる。次いで、これらのプライマーは、ｃＤＮＡから、完全長のＭＣＨ１クローンを増幅するために使用することができる。
【０２１５】
ヒトＭＣＨ１変異体の構築
プラスミドＴＬ２３１は、フレーム中に３つのメチオニン残基（何れも、ＭＣＨ１受容体の翻訳を開始する可能性を有している）をコードしている。これらの残基が、異種発現系において機能する能力は、１以上の下流のメチオニン残基がアラニンに変異されたＴＬ２３１の変異体を構築することによって調べた。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ位置指定突然変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、突然変異導入を行った。各５０μｌのＰＣＲ反応液は、１０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、０．１ｍｇ／ｍｌ無ヌクレアーゼＢＳＡ、それぞれ１１４ｎｇの２つの変異導入プライマー（下記参照）、５０ｎｇのプラスミドＤＮＡテンプレート（下記参照）、２．５ユニットのＰｆｕＴｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼ、及び１μｌのキット付属の専売ｄＮＴＰ混合物を含有していた。以下のサイクリングパラメーター（９５℃３０秒間を１サイクル、９５℃３０秒間、５５℃１分間、６８℃２．５分を１８サイクル、最後に４℃に維持）を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　９７００装置を用いて、サーモサイクリングを行った。次に、前記変異導入反応物に１μｌ（１０ユニット）のＤｐｎＩ制限酵素を添加した後、３７℃で１時間インキュベーションを行った。該消化物の分取試料２μｌを使用して、変異導入キットとともに供与された５０μｌのＥ．Ｃｏｌｉ　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレート上において、３７℃で増殖する能力に基づいて、形質転換体を選択した。該プレートを一晩インキュベートすることによって得られた単一のコロニーを用いて、２ｍｌのＬＢ−アンピシリンの培養物を接種し、揺動させながら、３７℃で一晩増殖させた。Ｑｉａｇｅｎ　ｍｉｎｉｐｒｅｐシステムを用いて、これらの培養物からＭｉｎｉｐｒｅｐ　ＤＮＡを調製し、自動配列分析にかけた。これにより、所望の変異と残りのＭＣＨ１コード配列の完全性の両者を確認することができた。正しく変異を受けたクローンを同定した後、Ｑｉａｇｅｎメガプレップカラムを用いて大規模なＤＮＡプレップを調製した。
【０２１６】
Ｍ７０Ａ変異のみをコードしているクローンを作製するために、前記テンプレートＤＮＡはＴＬ２３１であり、前記変異導入プライマーはＲＰ１９２及びＲＰ１９３であった。該クローンは、Ｒ１０６と命名され（配列番号１６）、最初の二つの開始コドンの候補のみをコードする（図１２参照）。Ｍ６ＡとＭ７０Ａ変異をともにコードするクローンを作製するために、前記テンプレートＤＮＡはＲ１０６であり、前記変異導入プライマーはＲＰ１９０とＲＰ１９１であった。得られたクローンは、Ｒ１１４と命名され（配列番号１７）、最初の開始コドンのみをコードする（図１２参照）。
【０２１７】
所望であれば、別の組合せの利用可能なメチオニン残基をコードするさらなるＭＣＨ１変異体を構築するために、同じ変異導入技術を利用することができる。変異Ｍ１Ａは、プライマーＸ１とＸ２を用いて構築することができる。このような変化は、第一のメチオニンを除去するが、２つの下流の残基は保持するであろう。同様に、二重変異Ｍ１Ａ、Ｍ７０Ａは、順次プライマー対Ｘ１／Ｘ２及びＲＰ１９２／ＲＰ１９３を用いることによって構築することができる。これにより、第二のメチオニンのみがそのままの状態で保存された遺伝子が作られるであろう。
【０２１８】
ｈＭＣＨ１変異受容体構築物の作成に使用したプライマー：
変異体　　　 プライマー　　 プライマー配列
Ｒ１０６　　　　 ＲＰ１９２　　　　　５’ ＣＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧ ３’
（配列番号１８）
Ｍ７０Ａ）　　　　 ＲＰ１９３　　　　　５’ ＣＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＧ ３’
（配列番号１９）
Ｒ１１４　　　　　ＲＰ１９０　　　　　 ５’ ＡＴＧＴＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＧＧＧ ３’
（配列番号２０）
（Ｍ６Ａ， Ｍ７０Ａ）　 ＲＰ１９１　　　　　 ５’ ＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＡＴ ３’
（配列番号２１）
（Ｍ１Ａ）　　　　 Ｘ１　　　　　　　５’ ＴＡＡＴＧＴＧＴＣＴＡＧＧＴＧＧＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＧ ３’
（配列番号２２）
Ｘ２　　　　　　　 ５’ＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＧＣＣＡＣＣＴＡＧＡＣＡＣＡＴＴＡ ３’
（配列番号２３）。
【０２１９】
短縮型のヒトＭＣＨ１受容体の構築
３つの開始メチオニンの候補のうち最下流のみを発現する短縮型のヒトＭＣＨ１受容体を以下のように作製した。ＢＢ１１２２（ＴＬ２３１中に存在する第三番目のメチオニンより１０ヌクレオチド上流から開始し、さらにＨｉｎｄＩＩＩを取り込む部位フォワードプライマー）とＢＢ１１２３（第二膜貫通ドメイン中のリバースプライマー）を用いてＴＬ２３１を増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇｌＩＩＡを用いて、生じた産物を消化した。Ｅｘｐａｎｄ　Ｌｏｎｇ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用い、以下の条件下（９４℃で２０秒、６８℃で１分を４０サイクル、それぞれ９４℃で５分及び６８℃で７分のプレ及びポストインキュベーションを行う）で、ＰＣＲを行った。２７０ｂｐの産物をゲルで精製し、ＴＬ２３１からの４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩ制限断片に連結した。得られた構築物をＢＯ１２０と名付けた。
【０２２０】
末端切断されたヒトＭＣＨ１受容体の構築に使用したプライマー：
ＢＢ１１２２　５’−ＴＧＡＣＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号２４）
ＢＢ１１２３　５’−ＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号２５）
宿主細胞
異種的に発現されたタンパク質を研究するために幅広い宿主細胞を広く使用することができる。これらの細胞には、Ｃｏｓ−７、ＣＨＯ、ＬＭ（ｔｋ−）、ＨＥＫ２９３等のような多彩な哺乳類株、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等のような昆虫細胞株、アフリカツメガエル卵母細胞のような両生類細胞、及びその他が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２１】
ＣＯＳ−７細胞は、１５０ｍｍプレート上で、補充物を加えたＤＭＥＭ（１０％仔ウシ血清、４ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍＬペニシリン／１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）中において、３７℃、５％ＣＯ２下で成育させる。ＣＯＳ−７細胞の原プレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：６に分割する。
【０２２２】
ヒト胚性腎臓２９３細胞は、１５０ｍｍプレート上で、補充物（１０％仔ウシ血清、４ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン／１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を加えたＤＭＥＭ中において、３７℃、５％ＣＯ２下で成育させる。２９３細胞の原プレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：６に分割する。
【０２２３】
マウス繊維芽ＬＭ（ｔｋ−）細胞は、１５０ｍｍプレート上で、補充物を加えたＤ−ＭＥＭ（１０％仔ウシ血清、４ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン／１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）中において、３７℃、５％ＣＯ２下で成育させる。ＬＭ（ｔｋ−）細胞の原プレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：１０に分割する。
【０２２４】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、１５０ｍｍプレート上で、補充物（１０％仔ウシ血清、４ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン／１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を含むＨＡＭのＦ−１２培地中において、３７℃、５％ＣＯ２下で成育させる。ＣＨＯ細胞の原プレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：８に分割する。
【０２２５】
マウス胚性繊維芽ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、１５０ｍｍプレート上で、補充物（１０％仔ウシ血清、４ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍＬのペニシリン／１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＥＭＥ）中において、３７℃、５％ＣＯ２下で成育させる。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の原プレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：１５に分割する。
【０２２６】
Ｓｆ９及びＳｆ２１細胞は、１５０ｍｍ組織培養皿上で、１０％ウシ胎児血清を補充したＴＭＮ−ＦＨ培地中において、２７℃、無ＣＯ２下で単層に成育させる。Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ昆虫細胞は、１５０ｍｍ組織培養皿上で、Ｌ−グルタミンを補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ　４００ＴＭ培地中において、２７℃、無ＣＯ２下で成育させる。
【０２２７】
ある場合には、接着性の単一層として増殖する細胞株は、細胞収率を増加させ、慣用的な受容体スクリーニング計画用の均一なアッセイ材料の大きなバッチを与えるために、懸濁培地に換えることができる。
【０２２８】
アフリカツメガエル卵母細胞も、異種タンパク質を一過性に発現させるための宿主系として使用することができる。それらの飼養及び用法は、以下の電気生理的方法の部に記載されている。
【０２２９】
一過性発現
調査すべきタンパク質をコードするＤＮＡは、様々な哺乳類、昆虫、両生類、及び他の細胞株の中で、リン酸カルシウムを介した、ＤＥＡＥ−デキストランを介した、リポソームを介した、ウイルスを介した、電気穿孔を介した、及びマイクロインジェクションによる送達を含む（これらに限定されない）幾つかの方法によって、一過性に発現させることができる。これらの方法は、それぞれ、その後に使用すべきＤＮＡ、細胞株、アッセイの種類に応じて、種々の実験的パラメーターを至適化することが必要であるかもしれない。
【０２３０】
ＬＭ（ｔｋ−）細胞に適用する場合のリン酸カルシウム法の典型的なプロトコールは以下に記載されているとおりである。トランスフェクションの約２４時間前に接着性細胞を採集し、１００ｍｍ組織培養皿の中に、１〜２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で再播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートさせる。ＣａＣｌ２とＤＮＡ（２５０ｍＭ　ＣａＣｌ２中２０μｇのＤＮＡ）の混合物２５０μｌを５ｍｌのプラスチック管に加え、穏やかに混合しながら、２５０μｌの２×ＨＳＢ（２５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭ　デキストロース、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ）をゆっくりと加える。該混合物を室温で２０分間インキュベートして、ＤＮＡ沈殿物を形成させる。続いて、完全培地で細胞を洗浄し、１０ｍｌの培地を各プレートに加えた後、前記ＤＮＡ沈殿物を加える。次いで、３７℃、５％ＣＯ２で、２４〜４８時間細胞をインキュベートする。
【０２３１】
Ｃｏｓ−７細胞に適用する場合のＤＥＡＥ−デキストラン法の典型的なプロトコールは以下に記載されているとおりである。トランスフェクションの２４時間前に、トランスフェクションに使用すべき細胞を分裂させて、トランスフェクションの時点で、フラスコを７０〜８０％の集密状態にする。要約すれば、９ｍｌの完全ＤＭＥＭ＋ＤＥＡＥ−デキストラン混合物（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ）に、８μｇの受容体ＤＮＡ＋８μｇの必要とされる他の任意のＤＮＡ（例えば、Ｇαタンパク質発現ベクター、レポーター構築物、抗生物質耐性マーカー、偽ベクターなど）を添加する。ＰＢＳを用いて、（準集密状態の）Ｔ２２５フラスコ中に播種されたＣｏｓ−７細胞を一度洗浄し、各フラスコに前記ＤＮＡ混合物を加える。３７℃、５％ＣＯ２で３０分間細胞をインキュベートさせる。インキュベーション後に、８０μＭのクロロキンを加えた完全ＤＥＭＥ３６ｍｌを各フラスコに加え、さらに３時間インキュベートさせる。続いて、培地を吸引し、１０％ＤＭＳＯを含有する２４ｍｌの完全培地を正確に２分間、その後吸引する。次いで、ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、３０ｍｌの完全ＤＥＭＥを各フラスコに加える。続いて、細胞を一晩インキュベートする。翌日、トリプシン処理によって細胞を採集し、実施すべきアッセイの種類に応じて、必要であれば再度播種する。
【０２３２】
ＣＨＯ細胞に適用する場合のリポソームを介したトランスフェクションの典型的なプロトコールは以下に記載されているとおりである。トランスフェクションの２４時間前に、トランスフェクションに使用すべき細胞を分裂させて、トランスフェクションの時点で、フラスコを７０〜８０％の集密状態にする。受容体ＤＮＡに加えて、様々な比率で、必要な他の任意のＤＮＡを含み得る計１０μｇのＤＮＡ（例えば、Ｇαタンパク質発現ベクター、レポーター構築物、抗生物質耐性マーカー、偽ベクターなど）を用いて、細胞の各７５ｃｍ２フラスコをトランスフェクトする。リポソームを介したトランスフェクションは、製造者（ＬｉｐｏｆｅｔＡＭＩＮＥ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）の推奨に従って実施する。トランスフェクションから２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を採集し、使用すべきアッセイにおける必要性に従って、そのまま使用するか、又は再度播種する。
【０２３３】
Ｃｏｓ−７細胞に適用する場合の電気穿孔法の典型的なプロトコールは以下に記載されているとおりである。トランスフェクションの２４時間前に、トランスフェクションに使用すべき細胞を分裂させて、トランスフェクションの時点で、フラスコを準集密状態にする。トリプシン処理によって細胞を採集し、それらの増殖培地中に再懸濁し、計数した。３００μｌのＤＭＥＭ中に４×１０６細胞を懸濁し、電気穿孔キュベット中に置く。８μｇの受容体ＤＮＡ＋８μｇの必要とされる他の任意のＤＮＡ（例えば、Ｇαタンパク質発現ベクター、レポーター構築物、抗生物質耐性マーカー、偽ベクターなど）を細胞懸濁液に加え、前記キュベットをＢｉｏＲａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ中に置き、電気パルス（Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒの設定：電圧０．２５ｋＶ，電気容量９５０μＦ）をかける。パルスをかけた後、８００μｌの完全ＤＭＥＭを各キュベットに加え、懸濁液を滅菌チューブに移す。各チューブに完全培地を加えて、最終の細胞濃度を１×１０細胞／１００μｌにする。続いて、実施すべきアッセイの種類に応じて、必要であれば細胞を播種する。
【０２３４】
ウイルスを介して異種タンパク質を発現させるための典型的なプロトコールは、昆虫Ｓｆ９細胞をバキュロウイルスに感染させる場合、以下に記載するとおりである。既存の制限部位に、又はポリペプチドのコード領域の５’又は３’側の配列中に設けた制限部位に、本明細書に開示された受容体をコードするＤＮＡのコード領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＩの中にサブクローニングし得る。バキュロウイルスを作製するために、２×１０６のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫Ｓｆ９細胞中に、（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍａｎｕａｌの中で）Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎによって概説されているように、リン酸カルシウム共沈殿法によって、０．５μｇのウイルスＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏｇＧｏｌｄ）及びポリペプチドをコードする３μｇのＤＮＡ構築物を同時トランスフェクトし得る。続いて、細胞を２７℃で５日間インキュベートする。遠心により前記共トランスフェクションプレートの上清を集めて、組換えウイルスをプラーク精製し得る。ウイルスの株を調製するため、及びウイルス株の力価を決定するために、細胞にウイルスを感染させる操作は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎのマニュアルに記載されているとおりである。レトロウイルス、シムリキ森林ウイルス、及びアデノ、ヘルペス、及びワクシニアウイルス等のような二本鎖ＤＮＡウイルスを介した哺乳類細胞発現にも、概ね同様の原理が当てはまるであろう。
【０２３５】
目的タンパク質をコードするｃＲＮＡのマイクロインジェクションは、アフリカツメガエル卵母細胞及び培養哺乳類細胞中でタンパク質機能を研究するのに有用である。ｃＲＮＡを調製し、アフリカツメガエル卵母細胞中に注入するための典型的なプロトコールは、以下の電気生理学の部に記載されている。
【０２３６】
安定発現
異種ＤＮＡは宿主細胞中に安定に取り込ませて、該細胞が永続的に外来タンパク質を発現するようにさせることができる。ＤＮＡを細胞中に輸送するための方法は、一過性発現について上記したものと同様であるが、標的とされる宿主細胞に薬物耐性を与えるために、補助遺伝子を同時トランスフェクトすることが必要となる。得られた薬物耐性は、異種ＤＮＡを取り込んだ細胞を選択して、維持するために使用することができる。ネオマイシン、カナマイシン、及びハイグロマイシンを含む種々の耐性遺伝子を使用することができるが、これらに限定されるものではない。受容体研究のために、異種受容体タンパク質の安定発現は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＬＭ（ｔｋ−）等を含む哺乳類細胞中で実施されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０２３７】
細胞膜の調製
結合アッセイ用に、氷冷した緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ，５ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）の中にトランスフェクトされた細胞の沈殿物を懸濁し、音波処理によって７秒間ホモゲナイズする。細胞溶解物を２００×ｇ、４℃で５分間遠心する。続いて、４０，０００×ｇ、４℃で２０分間、前記上清を遠心する。得られた沈降物をホモゲナイゼーション緩衝液中で一度洗浄し、結合緩衝液（放射性リガンド結合の方法を参照）中に懸濁する。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法によって測定する。結合アッセイは通常直ちに実施するが、膜を大量に調製して、将来使用するために液体窒素中に凍結保存することも可能である。
【０２３８】
放射性リガンド結合アッセイ
放射性リガンドの結合により、内在性ヒト受容体の存在について、細胞をスクリーニングし得る（以下に詳述されている）。本明細書に開示された内在性ヒト受容体が全く存在しないか、又は低レベルで存在する細胞には、外在性受容体をトランスフェクトしてもよい。
【０２３９】
トランスフェクトされた細胞からの膜（２０〜４０μｇの膜タンパク質）を用いたＭＣＨ１結合実験は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．４、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２μｇ／ｍｌアプロトニン（ａｐｒｏｔｏｎｉｎ）、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ、及び５０μｇ／ｍｌバシトラシンからなるインキュベーション緩衝液を使用し、０．１ｎＭ［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３−Ｔｙｒ１９−ＭＣＨ（ＮＥＮに注文して標識）を用いて行う。結合は、２５℃で１時間行う。０．０１％　ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．４を洗浄用緩衝液として用いて、予め５％ＰＥＩに浸したＧＦ／Ｃガラスファイバーフィルター上での急速な真空濾過により、インキュベーションを停止させる。全ての実験で、１０μＭの未標識ＭＣＨを用いて、非特異的な結合を測定する。
【０２４０】
機能的アッセイ
機能的アッセイ（以下で詳述されている）を用いて、内在性の哺乳類の受容体の存在について、細胞をスクリーニングし得る。内在性受容体が全く存在しない、又は低レベルの内在性受容体が存在する細胞には、以下の機能的アッセイで使用するために、外在性受容体をトランスフェクトしてもよい。
【０２４１】
受容体の活性化をスクリーニングするためには、広範なアッセイを使用することができる。これらは、例えば、ホスファチジルイノシトール、ｃＡＭＰ、Ｃａ＋＋、及びＫ＋の伝統的な測定から、これらと同じセカンドメッセンジャーの測定系であるが、より情報量が多く、より一般的で、且つ感度がより高くなるように修飾又は適合された測定系；例えば、代謝の変化、分化、及び細胞分裂／増殖のような受容体の活性化により生じる、より一般的な細胞現象を知らせる細胞をベースとしたプラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）、並びに、例えば、心臓血管、鎮痛、食欲増進、抗不安、及び鎮静効果を含む受容体の活性化が関連すると考えられている、複雑な生理的な変化又は行動上の変化をモニターする高レベルの生物アッセイにまでわたる。
【０２４２】
サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成アッセイ
受容体を介したサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成の刺激又は阻害は、哺乳類の受容体を発現する細胞の中でアッセイし得る。９６ウェルのプレートに細胞を播種し、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ　イソブチルメチルキサンチンを加えたＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中で、３７℃で２０分間、５％ＣＯ２下においてインキュベートする。被験化合物を添加し、１０μＭのフォルスコリンを加えて、又は加えずに、さらに１０分間、３７℃でインキュベートする。その後、培地を吸引し、１００ｍＭ　ＨＣｌを添加することによって、反応を停止する。４℃で１５分間、プレートを保存し、ラジオイムノアッセイによって、停止溶液中のｃＡＭＰ含量を測定する。放射能は、データ整理ソフトウェアを装備したガンマ計数器を用いて定量し得る。
【０２４３】
アラキドン酸放出アッセイ
９６ウェルのプレートに、哺乳類の受容体を発現している細胞を播種し、補充物を加えたＨＡＭ’ｓ　Ｆ−１２中で３日間成育させる。各ウェルに１００μＬのアリコートとして、［３Ｈ］−アラキドン酸（比活性＝０．７５μＣｉ／ｍＬ）を与え、３７℃、５％ＣＯ２下で１８時間、サンプルをインキュベートした。標識された細胞は、２００μＬのＨＡＭ’ｓ　Ｆ−１２で３回洗浄する。次に、ウェルを培地（２００μＬ）で満たし、ペプチド又は緩衝液（２２μＬ）を添加して、アッセイを開始する。３７℃、５％ＣＯ２下で３０分間、細胞をインキュベートする。上清をマイクロタイタープレートに移し、真空オーブンの中で、７５℃で蒸発させて乾燥させる。続いて、サンプルを溶解し、２５μＬの蒸留水で再懸濁する。シンチレーション物質（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（３００μＬ）を各ウェルに添加し、Ｔｒｉｌｕｘプレートリーダーの中で、サンプルの３Ｈを計測する。データは、非線形回帰とＧｒａｐｈＰＡＤ　Ｐｒｉｓｍ　ｐａｃｋａｇｅ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で利用できる統計手法を用いて分析する。
【０２４４】
細胞内カルシウム動員アッセイ
細胞内の遊離カルシウム濃度は、顕微分光蛍光定量法（ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｆｌｏｕｒｏｍｅｔｒｙ）によって、蛍光指示色素Ｆｕｒａ−２／ＡＭ（Ｂｕｓｈ　ｅｔ　ａｌ，１９９１）を用いて測定され得る。カバーガラスが挿入された３５ｍｍ培養皿上に細胞を播種し、ＨＢＳで細胞を洗浄した後、２０〜４０分の間、１００μＬのＦｕｒａ−２／ＡＭ（１０μＭ）を与える。Ｆｕｒａ−２／ＡＭ溶液を除去するためにＨＢＳで洗浄した後、ＨＢＳ中で、１０〜２０分間、細胞をＨＢＳ中で平衡化させる。続いて、Ｌｅｉｔｚ　Ｆｌｕｏｖｅｒｔ　ＦＳ顕微鏡の４０倍の対物レンズ下で、細胞を可視化し、３４０ｎＭと３８０ｎＭの間を行き来する励起波長を用いて、５１０ｎＭの蛍光放射を測定する。生の蛍光データは、標準カルシウム濃度曲線とソフトウェア分析技術を用いて、カルシウム濃度に変換する。
【０２４５】
イノシトールリン酸アッセイ
細胞の調製、及びセカンドメッセンジャーイノシトールリン酸（ＩＰ）のアッセイについてのガイドラインが、一過性にトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞を含む典型的なプロトコールに関して以下に記載されている。９６ウェルマイクロプレートフォーマットアッセイでは、ウェル当たり７０，０００細胞を播種し、トランスフェクション操作から２４時間後にインキュベートする。続いて、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、マイクロウェル当たり０．５μＣｉ［３Ｈ］ｍｙｏ−イノシトールにより、細胞を標識する。アッセイの直前に培地を取り除き、１０ｍＭ　ＬｉＣｌを含有する９０μＬのＰＢＳに置き換える。続いて、３７℃、５％ＣＯ２で、１５分間、プレートをインキュベートする。インキュベーション後に、形質転換体に、３７℃、５％ＣＯ２で、アゴニスト（１０μｌ／ウェル、１０×濃度）を３０分間暴露する。暴露を終結し、１００μｌの非放射性５％　ｖ／ｖトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えることによって細胞を溶解した後、３０分を超える間、４℃でインキュベーションを行う。イオン交換クロマトグラフィーによって、溶解物から総ＩＰを単離する。簡潔に述べれば、１００μｌのＤｏｗｅｘ　ＡＧ１−Ｘ８懸濁液を含有する（５０％ｖ／ｖ，水：レジン）（２００〜４００メッシュ、蟻酸塩型）Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ　ＨＶフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、ウェルの溶解含有物を移す。レジンベッドを洗浄又は溶出するために、真空マニホールド上に、フィルタープレートを置く。各ウェルは、まず２００μＬの５ｍＭ　ミオイノシトールで２回洗浄する。７５μｌの１．２Ｍ　蟻酸アンモニウム／０．１Ｍ　蟻酸を用いて、Ｗａｌｌａｃ９６ウェルプレート中に総［３Ｈ］ＩＰを溶出させる。２００μｌのＳｕｐｅｒＭｉｘシンチレーションカクテルを各ウェルに加えて、ウェルを混合し、平衡化させＭｉｃｒｏ　Ｂｅｔａ　Ｔｒｉｌｕｘシンチレーションカウンターで計数する。（注：試薬の用量を単に調整することにより、アッセイを２４ウェルのフォーマットにスケールダウンし、各クロマトグラフィーカラムを用いてもよい。）
ＧＴＰγＳ機能的アッセイ
０．２％ＢＳＡと１０μＭ　ＧＤＰを補充したアッセイ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）に、哺乳類の受容体をトランスフェクトした細胞の膜を懸濁する。膜を、氷上で２０分間インキュベーションし、９６ウェルのＭｉｌｌｉｐｏｒｅマイクロタイターＧＦ／Ｃフィルタープレートに移し、ＧＴＰγＳ（最終濃度＝１００μＭ）を加えた、又は加えないＧＴＰγ３５Ｓ（例えば、２５０，０００ｃｐｍ／サンプル、比活性約１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を混合する。最終膜タンパク質濃度は、約９０μｇ／ｍＬである。ＭＣＨ（最終濃度＝１μＭ）の存在下又は不存在下において、３０分間、室温でサンプルをインキュベートした後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ真空マニホールド上で濾過し、コールドのアッセイ緩衝液で３回洗浄する。フィルタープレート中に採集したサンプルを、シンチレーション物質で処理し、Ｔｒｉｌｕｘ（Ｗａｌｌａｃ）液体シンチレーションカウンターで３５Ｓを計測する。哺乳類受容体の膜調製物が、適切に工作された異種発現系、すなわち、高レベルの哺乳類受容体の発現をもたらす、及び／又は、高いターンオーバー速度（ＧＤＰのＧＴＰへの交換）を有するＧタンパク質を発現する発現系由来であるときに、最適な結果が得られると思われる。ＧＴＰγＳアッセイは、本分野において周知であり、当業者であれば、例えば、Ｔｉａｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）又はＬａｚａｒｅｎｏ　ａｎｄ　Ｂｉｒｄｓａｌｌ（１９９３）によって記載されているような上述した方法の変法を使用し得るであろう。
【０２４６】
転写アッセイ
細胞の調製、及び９６マイクロウェルフォーマットにおいて、ＤＥＡＥ−デキストラン法によって一過性にトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞の受容体を介した転写のアッセイに関するガイドラインは以下のとおりである。これらの研究に使用されるｃ−ｆｏｓ−β−ｇａｌプロモーター／レポーター構築物は、βガラクトシダーゼのｃＤＮＡを含有する発現ベクターｐＮＡＳＳβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の上流に挿入されたｃｆｏｓプロモーター領域（−３８４〜＋１９）（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　１９９１，Ｙａｌｋｉｎｏｇｌｕ　ｅｔ　ａｌ，１９９５）からなる。転写活性は、比色アッセイで検出されるように、β−ガラクトシダーゼ酵素活性のアッセイによって測定される。一過性トランスフェクションから４８時間後に、溶媒を除去し、典型的には、１０μＭの濃度で薬物（例えば、ＭＣＨ）を含有する培地と置き換える。３７℃、５ＣＯ２で、少なくとも１８時間、前記細胞をインキュベートさせた後、溶媒を吸引し、２００μｌのＰＢＳ／ウェルで細胞を洗浄する。続いて、１００μｌのＡＢ緩衝液（１００ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ　ＭｎＣｌ２）により、室温で１０分間、前記細胞を溶解させる。次いで、１００μｌのＡＢ／Ｔｘ／β−メルカプトエタノール（０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、４０ｍＭ　β−メルカプトエタノール）を各ウェルに加え、室温でさらに１０分、溶解物をインキュベートさせる。基質であるＯＮＰＧ／ＡＢ（ＡＢ緩衝液中の４ｍｇ／ｍｌのＯ−ニトロフェニル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド）を添加することによって、酵素的な発色反応を開始させる。３０分間、又は黄色が現れるまで反応を進行させる。光学密度の測定は、Ｄｙｎａｔｅｃｈマイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍで行う。
【０２４７】
ＭＡＰキナーゼアッセイ
ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）は、受容体の活性化を評価するためにモニターし得る。ＭＡＰキナーゼは、細胞中の複数の経路によって活性化される。最も重要な活性化の様式には、ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＥＫ／ＭＡＰキナーゼ経路が含まれる。成長因子（チロシンキナーゼ）受容体は、ＳＨＣ／Ｇｒｂ−２／ＳＯＳ／ｒａｓを介してこの経路に入る。Ｇｉ共役型受容体もｒａｓを活性化し、続いて、ＭＡＰキナーゼの活性化を生じせしめることが知られている。フォスフォリパーゼＣ（Ｇｑ及びＧ１１）を活性化する受容体は、ホスファチジルイノシトールの加水分解の結果として、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を産生する。ＤＡＧは、次にＭＡＰキナーゼをリン酸化するタンパク質キナーゼＣを活性化する。
【０２４８】
ＭＡＰキナーゼの活性化は、いくつかのアプローチによって検出できる。１つのアプローチは、（非リン酸化（不活性型）又はリン酸化（活性型）の何れであるかという）リン酸化状態の評価に基づくものである。リン酸化されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で、より遅い移動度を有するので、ウェスタンブロッティングを用いて、刺激されていないタンパク質と比較することができる。あるいは、リン酸化されたタンパク質に対して特異的な抗体を使用することができ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、それは、リン酸化されたキナーゼの増加を検出するために使用し得る。何れの方法においても、マイトジェンで細胞を刺激した後、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で抽出する。可溶性画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライし、電気泳動によって、ニトロセルロース又はＩｍｍｏｂｉｌｏｎにタンパク質を転写する。免疫反応性のバンドを、標準的なウェスタンブロッティング法によって検出する。可視シグナル又は化学発光シグナルは、フィルム上に記録され、デンシトメトリーで定量し得る。
【０２４９】
別のアプローチは、リン酸化アッセイを介したＭＡＰキナーゼ活性の評価に基づくものである。細胞をマイトジェンで刺激し、可溶性抽出物を調製する。該抽出物を、３０℃で１０分間、γ３２−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系、及び（インスリンによって制御される、リン酸化された熱及び酸に対して安定なタンパク質、すなわちＰＨＡＳ−Ｉのような）ＭＡＰキナーゼに特異的な基質とともにインキュベートする。Ｈ３ＰＯ４を添加して反応を終結させ、サンプルを氷に移す。Ｗｈａｔｍａｎ　Ｐ８１クロマトグラフィー紙（リン酸化されたタンパク質を保持する）上に、アリコートを滴下する。クロマトグラフィー紙を洗浄し、液体シンチレーションカウンターによって３２Ｐを計数する。あるいは、前記細胞抽出物を、γ３２−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系、及びストレプトアビジンによってフィルター支持体に結合されたビオチン化されたミエリン塩基性タンパク質とともにインキュベートする。ミエリン塩基性タンパク質は、活性化されたＭＡＰキナーゼの基質である。リン酸化反応は、３０℃で１０分間行う。続いて、抽出物は、リン酸化されたミエリン塩基性タンパク質を保持している前記フィルターを通して、吸引することができる。前記フィルターを洗浄し、液体シンチレーションカウンターによって３２Ｐを計数する。
【０２５０】
細胞増殖アッセイ
Ｇタンパク質共役型受容体を活性化することによって、分裂促進反応又は増殖反応（これらは３Ｈ−チミジンの取り込みによってモニターされ得る）を導き得る。［３Ｈ］−チミジンとともに培養細胞をインキュベートすると、チミジンは、核に移行し、そこで、リン酸化されてチミジン三リン酸になる。ヌクレオチド三リン酸は、その後、細胞増殖速度に比例する速度で細胞のＤＮＡに取り込まれる。典型的には、１〜３日間、培地中で細胞を増殖させる。２４時間血清を除去することによって、細胞を休止状態にさせる。続いて、マイトジェン物質を培地に添加する。２４時間後、１〜１０μＣｉ／ｍＬの間の比活性の［３Ｈ］−チミジンとともに、２〜６時間、細胞をインキュベートする。回収方法には、トリプシン処理すること、及び（可溶性チミジンを抽出するためにＴＣＡ中で予めインキュベートし、又はインキュベートせずに）ＧＦ／Ｃフィルター上で濾過することによって細胞を捕捉することが含まれ得る。シンチレーション物質で前記フィルターを処理し、液体シンチレーションカウンターによって３Ｈを計数する。あるいは、ＭｅＯＨ又はＴＣＡ中で接着細胞を固定し、水で洗浄し、０．０５％デオキシコール酸／０．１Ｎ　ＮａＯＨで可溶化する。可溶性の抽出物をシンチレーションバイアルに移し、液体シンチレーションカウンターによって３Ｈを計数する。
【０２５１】
アフリカツメガエル卵母細胞中で電流を記録する方法
０．２％のトリケイン（３−アミノ安息香酸エチルエステル、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．）中で、雌のアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ−１、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）に麻酔を施し、無菌技術（Ｑｕｉｃｋ　ａｎｄ　Ｌｅｓｔｅｒ，１９９４）を用いて、卵巣の一部を摘出する。８７．５ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、及び５ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含有するｐＨ７．５の溶液中の２ｍｇ／ｍＬ　コラーゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）を用いて、卵母細胞の濾胞を除去する。卵母細胞には、哺乳類のｍＲＮＡを注入し得る（Ｎａｎｏｊｅｃｔ，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｏｏｍａｌｌ，ＰＡ）。他の卵母細胞には、哺乳類のｍＲＮＡとＧタンパク質によって活性化される内向き整流分子の遺伝子をコードするｍＲＮＡとの混合物を注入し得る（ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４、米国特許第５，７３４，０２１号及び第５，７２８，５３５号）。Ｋ＋チャンネル１及び４を内向きに整流するＧタンパク質（ＧＩＲＫ；Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｗａｒｄｌｙ　ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ　Ｋ＋）（ＧＩＲＫ１及びＧＩＲＫ４）をコードする遺伝子は、適切な５’及び３’プライマーを得るために、公表されている配列（Ｋｕｂｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３；Ｄａｓｃａｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３；Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５　ａｎｄ　１９９５ｂ）を用いたＰＣＲによって得られる。
【０２５２】
ＧＩＲＫ１については、プライマー５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＧ−３’（配列番号１０）及び５’−ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号）、ＧＩＲＫ４については、５’−ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＡＧＧＡＡＴＧ−３’配列番号１２）及び５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＣＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１３）とともに、ヒト心臓ｃＤＮＡをテンプレートとして使用した。
【０２５３】
ＰＣＲ産物のｐｃＤＮＡ１−Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へのクローニングを促進するために、各プライマー対において、上流プライマーはＢａｍＨＩ部位を含有することができ、下流プライマーはＥｃｏＲＩ部位をすることができる。哺乳類の受容体のための転写テンプレートも、同様に取得し得る。ｍＲＮＡは、哺乳類受容体ＧＩＲＫ１とＧＩＲＫ４の完全なコード領域を含有する別個のＤＮＡプラスミドから調製される。プラスミドは、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｍｅｓｓａｇｅ　Ｍａｃｈｉｎｅ，Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、直鎖化し、転写される。あるいは、ｍＲＮＡは、Ｔ７プロモーターとポリＡ＋テールを組み込んで、ＰＣＲによって作成されたテンプレートから翻訳してもよい。各卵母細胞には、２５ｎｇの哺乳類受容体のｍＲＮＡとともに、それぞれ２ｎｇのＧＩＲＫ１とＧＩＲＫ４のｍＲＮＡが与えられる。ｍＲＮＡを注入した後、回転する台の上で、３〜８日間、１６℃で卵母細胞をインキュベートする。双極電位固定（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ，Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、１〜３ＭΩの抵抗を有する３Ｍ　ＫＣｌを満たしたガラス微小電極を用いて行う。特に断らなければ、卵母細胞は、−８０ｍＶの固定電位で電位固定する。記録している間、９６ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、及び５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（ＮＤ９６）を含有する連続的に流れている（２〜５ｍＬ／分）培地中か、又は、ＧＩＲＫ１とＧＩＲＫ４を発現している卵母細胞の場合には、増加したＫ＋を含有する９６ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、及び５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（ｈＫ）を含有する連続的に流れている（２〜５ｍＬ／分）培地中に、卵母細胞を浸漬する。薬物は、重力を付与した一連の灌流線からスイッチングすることによって与える。
【０２５４】
アフリカツメガエルの卵母細胞中でのＧＰＣＲの異種性発現は、アゴニスト刺激によって活性化されるシグナル伝達経路の正体を決定するために広く使用されてきた（Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８３；Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７）。フォスフォリパーゼＣ（ＰＬＣ）経路の活性化は、予め、哺乳類受容体のｍＲＮＡが注入された卵母細胞にＮＤ９６溶液中の被検化合物を与え、−８０ｍＶの固定電位で内向き電流を観察することによってアッセイされる。−２５ｍＶで逆転し、Ｃａ＋＋によって活性化されるＣｌ−（塩素イオン）チャンネルの他の特性を示す電流の出現は、哺乳類の受容体によるＰＬＣの活性化、及びＩＰ３と細胞内Ｃａ＋＋の放出の指標である。このような活性は、Ｇｑと共役するＧＰＣＲによって表される。
【０２５５】
内向き整流Ｋ＋（カリウム）チャンネル（ＧＩＲＫ）の活性の測定は、哺乳類の受容体ＧＩＲＫ１とＧＩＲＫ４をコードするｍＲＮＡを同時注入した卵母細胞中でモニターする。２つのＧＩＲＫ遺伝子の産物は、互いに集合して、Ｇｉ又はＧｏに共役する多数のＧＰＣＲによって活性化される（すなわち、刺激される）ことが知られているＧタンパク質によって活性化されるカリウムチャンネルを形成する（Ｋｕｂｏ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３；Ｄａｓｃａｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３）。Ｋ＋が増加した溶液（ｈＫ）中でＫ＋電流を測定することによって、被検化合物に対する、哺乳類の受容体と２つのＧＩＲＫサブユニットを発現する卵母細胞の応答性について検査する。３００μＭのＢａ＋＋に対して感受性がある内向き整流電流の活性化は、卵母細胞中で、哺乳類の受容体がＧｉ又はＧｏ経路に共役していることを意味している。
【０２５６】
受容体／Ｇタンパク質の同時トランスフェクション実験
ＭＣＨ１が、選択したＧタンパク質に優先的に共役し得るかどうかを決定する戦略は、ＭＣＨ１受容体のｃＤＮＡをＧタンパク質αサブユニットのｃＤＮＡと共に宿主細胞の中に同時トランスフェクトすることを含む。Ｇαサブユニットの例には、Ｇαｉ／Ｇαｏクラス（Ｇαｔ２及びＧαｚを含む）、Ｇαｑクラス、Ｇαｓクラス、及びＧα１２／１３クラスのメンバーが含まれる。典型的な操作には、ＣＯＳ−７のような宿主細胞への一過性のトランスフェクションを含む。他の宿主細胞を使用してもよい。特に考慮しなければならないのは、調べているＧタンパク質を介した機能的反応を補完する下流のエフェクター（例えば、ある種のアデニレートシクラーゼ、フォスフォリパーゼＣ、又はチャンネルのアイソフォーム）を、細胞が有しているどうかということである。Ｇタンパク質βγサブユニットが、本来細胞に存在しているものであれば、前記Ｇタンパク質ヘテロ三量体が完成されると推測される。もし、完成しなければ、特定のβ及びγサブユニットも同時トランスフェクトしてよい。さらに、受容体によって媒介された機能的シグナルを最適化するために、α、β、又はγサブユニットの何れかを個別に、又はα、β、及びγサブユニットを任意の組合せで、同時トランスフェクションしてもよい。
【０２５７】
受容体／Ｇαを同時トランスフェクトした細胞は、結合アッセイ（この場合、放射性リガンドの結合は、最適なＧタンパク質の共役の存在によって増強され得る）、又は、受容体／Ｇタンパク質仮説を試験するためにデザインされた機能的アッセイにおいて評価される。ある例では、ＭＣＨ１受容体は、Ｇαｉ／ＧαｏクラスのＧαサブユニットとの共役を通じて、ｃＡＭＰの蓄積を阻害すると仮定し得る。ＭＣＨ１受容体及び適切なＧαサブユニットのｃＤＮＡを同時トランスフェクションした宿主細胞を、ｃＡＭＰ法において上述したようにフォルスコリン＋／−ＭＣＨ１アゴニストで刺激する。ラジオイムノアッセイによる分析のために、細胞内ｃＡＭＰを抽出する。ｃＡＭＰ阻害は、ＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイ及びイノシトールリン酸加水分解アッセイを含む他のアッセイと置き換えてもよい。Ｇαを除いたＭＣＨ１又はＭＣＨ１を除いたＧαをトランスフェクトした宿主細胞を、ネガティブコントロールとして同時に試験してもよいだろう。トランスフェクトとされた細胞でのＭＣＨ１受容体の発現は、トランスフェクトされた細胞から得た膜を用いた放射性リガンドのタンパク質結合実験において確認され得る。トランスフェクトされた細胞でのＧαの発現は、対象のＧタンパク質に特異的な抗体を用いて、トランスフェクトした細胞から得た膜をウェスタンブロット分析することによって確認され得る。
【０２５８】
一過性のトランスフェクション操作の効率は、刺激アッセイの場合より、阻害アッセイの場合のほうが、Ｓ／Ｎに対するずっと重要な要素となる。全ての細胞に存在する（フォスルコリンで刺激されたｃＡＭＰの蓄積のような）陽性シグナルが、受容体とＧαが首尾よくトランスフェクトされた細胞の画分だけで阻害されるのであれば、Ｓ／Ｎ比は良くないであろう。Ｓ／Ｎ比を向上させる１つの方法は、１００％の細胞が受容体とＧαサブユニットの両者を発現する安定にトランスフェクトされた細胞株を作出することである。他の方法としては、阻害すべきシグナルをプラス方向に制御するＧタンパク質共役型受容体の第３ｃＤＮＡとの一過性同時トランスフェクションがある。同時トランスフェクトされた細胞が、刺激性の受容体、阻害性の受容体、及び阻害性の受容体に必須なＧタンパク質を同時に発現していれば、陽性シグナルは、受容体特異的なアゴニストを用いて、トランスフェクトされた細胞内で選択的に上昇させ得る。例には、５−ＨＴ４受容体、ＭＣＨ１受容体、及びＧαサブユニットによってＣＯＳ−７細胞を同時トランスフェクトすることが含まれる。トランスフェクトされた細胞は、５−ＨＴ４アゴニスト＋／−ＭＣＨ１タンパク質によって刺激される。サイクリックＡＭＰは、ＭＣＨ１とこのＧαサブユニットも発現する細胞の中だけで上昇すると思われ、向上したＳ／Ｎ比で、ＭＣＨ１依存性の阻害を測定し得るであろう。
【０２５９】
本明細書で記載した細胞株は、単に、本発明の哺乳類受容体の結合と機能を評価するために使用される方法の一例にすぎず、本明細書に記載したアッセイには、他の適切な細胞を使用し得ることを理解しなければならない。
【０２６０】
交雑セカンドメッセンジャーアッセイ
種々雑多な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇαサブユニットを使用することによって、様々な機能的クラスの受容体に、予め選択した経路を通じてシグナルを伝達させることが可能である。例えば、細胞をベースとする受容体アッセイ系に、Ｇα１６、又はＧαＺｑのようなキメラＧαサブユニット等の外部から供給される種々雑多なＧαサブユニットを与えることによって、本来的には、（例えば、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ０等の）特定のシグナル伝達経路を介した共役を好むかもしれないＧＰＣＲを、前記種々雑多なＧαサブユニットによって規定される経路を介して共役せしめ、アゴニストによる活性化によって、当該サブユニットの経路に付随するセカンドメッセンジャーを生成させることができる。Ｇα１６及び／又はＧαｑＺの場合、これには、Ｇｑ経路の活性化とセカンドメッセンジャーであるイノシトールリン酸の産生が含まれるであろう。同様の戦略とツールを使用すれば、例えば、Ｃａ＋＋、ｃＡＭＰ、及びＫ＋電流のような他のセカンドメッセンジャーを産生する経路を介するように、受容体のシグナル伝達がを偏向させることが可能となる。
【０２６１】
ミクロフィジオメーターによるアッセイ
細胞の代謝は、（多様なメッセンジャー経路の受容体による活性化を含む）広範な細胞現象に、複雑に関与し、実行されているので、ミクロフィジオメーターによる（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｒｉｃ）細胞代謝の測定を使用すれば、原理的には、受容体の直近信号伝達経路の詳細に関わらず、任意の受容体の活性化から生じる細胞活性の一般的なアッセイ法が得られる。
【０２６２】
細胞の調製及びミクロフィジオメーターによる記録に関する一般的なガイドラインは、これまでに報告されている（Ｓａｌｏｎ，Ｊ．Ａ．　ａｎｄ　Ｏｗｉｃｋｉ，Ｊ．Ａ．，１９９６）に記載されている。一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を利用する典型的なプロトコールは以下のとおりである。記録する２４時間前に、トランスフェクト細胞を採集し、計数する。３×１０５細胞を細胞培養カプセル（Ｃｏｓｔａｒ）中に播種し、カプセル膜に接着させる。１０時間後（記録から１４時間前）に、細胞培地を無血清Ｆ−１２完全培地に交換して、様々な血清因子によって引き起こされる有害な代謝刺激を最小化する。
【０２６３】
実験日に、細胞カプセルをミクロフィジオメーター（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に移し、記録培地（低緩衝液　ＲＰＭＩ　１６４０、重炭酸塩なし、無血清）の中で、０．１％ＢＳＡ（実質的に脂肪酸を含まない）と平衡化させ、この間に、基礎代謝活性のベースライン測定を確立する。記録のプロトコールでは、３０秒にわたって流れを中断する（この間に、速度測定を行う）ことを含む２分のポンプサイクルで、１００μＬ／分の流速からなる。リガンドへの暴露は、暴露後速度の最初の測定の直前に、１分２０秒薬物に暴露することに引き続き、合計５分２０秒、薬物に暴露するため、さらに２回のポンプサイクルを含む。続いて、薬物を洗い出し、速度を基底状態に戻す。表示された細胞外酸性化速度を、暴露直前に観察されたベースライン速度に対するピーク応答のパーセント増加率として表す。
【０２６４】
ＧＰＣＲリガンドのライブラリー
ＭＣＨ１のような新規受容体の機能的アッセイには、全ての既知のＧＣＰＲに対する代表的なアゴニストのみならず、ＧＰＣＲ候補のアゴニスト又は、ＧＰＣＲの近傍で関与する標的のエフェクターであり得るその他の化合物を含有する化合物の小さなライブラリーを予備的に調べることが含まれる。本研究で使用される集団には、現在のところ、公表されている４５を超えるクラスのＧＰＣＲ（セロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリン、オピオイドなど）に対する、（小分子、ホルモン、プレプロホルモン、及びペプチドなどを含む）約１８０の化合物が含まれる。さらには、ＧＰＣＲであることが知られているか、又はＧＰＣＲファミリーではないかと考えられているが、必ずしも薬理学的に性質決定がなされておらず、又はクローニングされていない（ＭＣＨ１のような）ＧＰＣＲファミリーに対するリガンドも含まれる。
【０２６５】
ＧＰＣＲのサブタイプに特異的なアゴニスト及びアンタゴニスト化合物、コンビナトリアルペプチド及び／又は小分子のライブラリー、天然産物の集合体なども含まれるように、ライブラリーの多様性を拡張してもよい。機械による扱いを容易にするために、分割された、又はプールされた化合物の濃縮物として９６ウェルのプレートの中に物質を分配し、試薬プレートをそのまま使用できるように、凍結して保存される。
【０２６６】
ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡの分布
ＭＣＨ１に対するプローブの開発：放射線標識されたアンチセンスＲＮＡプローブの作製を容易にするために、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含有するプラスミドベクター中に、ラットＭＣＨ１をコードする遺伝子の断片がサブクローニングされるであろう。Ｐｓｔ１でラットＭＣＨ１をコードする完全長のｃＤＮＡ（ヌクレオチド９０５〜１１９４）が消化され、該２８９ヌクレオチドの断片が、ｓｐ６とＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位をともに含有するｐＧＥＭ　３ｚのＰｓｔＩ部位にクローニングされるであろう。配列の完全性と方向性を確認するために、該構築物が配列決定されるであろう。ＲＮＡのアンチセンス鎖を合成するために、（方向に応じて）ＨｉｎｄＩＩＩ又はＥｃｏＲＩを用いて該構築物が直鎖化され、以下に記載のように、放射標識されたヌクレオチドを取り込むためにＴ７又はｓｐ６　ＲＮＡポリメラーゼが使用されるであろう。
【０２６７】
ラットグリセルアルデヒド　３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子（構成的に発現されるタンパク質）をコードするプローブを同時に使用した。ＧＡＰＤＨは、多くの組織中に、比較的一定のレベルで発現されており、異なる領域でのラットＭＣＨ１受容体遺伝子の発現レベルを比較するためにその検出が使用される。
【０２６８】
プローブの合成：放射線標識されたリボプローブを合成するために、ファージポリメラーゼのプロモーター配列が先行するＭＣＨ１とＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡ配列が使用されるであろう。リボプローブの合成条件は、０．２５〜１．０μｇの直鎖化されたＤＮＡプラスミドテンプレート、１．５μＬのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（それぞれ１０ｍＭ）、３μＬのジチオスレイトール（０．１Ｍ）、３０ユニットのＲＮＡｓｉｎ　ＲＮＡｓｅ阻害剤、０．５〜１．０μＬ（１５〜２０ユニット／μＬ）のＲＮＡポリメラーゼ、７．０μＬの転写用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．）、及び１２．５μＬのα３２−ＣＴＰ（比活性３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）であった。反応液中に、０．１ｍＭ　のＣＴＰ（０．０２〜１．０μＬ）を加え、ＤＥＰＣ処理した水で、容量が３５μＬに調整されるであろう。３７℃で６０分間、標識反応をインキュベートした後、３ユニットのＲＱ１　無ＲＮＡｓｅ　ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．）を加えて、テンプレートを消化するであろう。Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ　Ｓ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、取り込まれなかったヌクレオチドからリボプローブを分離するであろう。ＴＣＡ沈殿と液体シンチレーション分光法を用いて、プローブに取りこまれた標識の量を測定するであろう。０．２５ｍｍ厚の７Ｍ　尿素、４．５％アクリルアミドシークエンシングゲル上で、合成された全リボプローブの画分をサイズ分画するであろう。これらのゲルを保存リン光体スクリーンに並べ、リン光体撮像装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて得られたオートラジオグラフをスキャンし、合成されたプローブが完全長であり、分解されていないことを確認する。
【０２６９】
溶液ハイブリダイゼーション／リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）：溶液ハイブリダイゼーションのために、組織から単離した２．０μｇのｍＲＮＡをが使用されるであろう。ネガティブコントロールは、３０μｇの転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）又は組織なしのブランクから成っていた。全てのｍＲＮＡサンプルを、１．５ｍＬのミクロフュージチューブの中に入れ、真空乾燥されるであろう。０．２５〜２．０Ｅ６カウントの各プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液（８０％ホルムアミド中、４０μＬの４００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．４、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）が各チューブに加えられるであろう。９５℃で１５分間サンプルを加熱した後、ハイブリダイゼーションのために、温度は５５℃に下げられるであろう。
【０２７０】
１４〜１８時間ハイブリダイゼーションを行った後、ＲＮＡｓｅ　Ａ（Ｓｉｇｍａ）とＲＮＡｓｅ　Ｔ１（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、ＲＮＡ／プローブ混合物が消化されるであろう。３３０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）及び５ｍＭ　ＥＤＴＡ（４００μＬ）を含有する緩衝液中の２．０μｇのＲＮＡｓｅ　Ａと１０００ユニットのＲＮＡｓｅＴ１との混合物を各サンプルに加え、室温で９０分間インキュベートされるであろう。ＲＮＡｓｅで消化した後、２０μＬの１０％ＳＤＳと５０μｇのプロテイナーゼＫが各チューブに加えられ、３７℃で、１５分間インキュベートされるであろう。フェノール／クロロホルム：イソアミルアルコールを用いてサンプルが抽出され、１時間、−７０℃で２倍容量のエタノール中に沈殿されるであろう。各チューブに、沈殿を促進させるための担体としてＰｅｌｌｅｔ　Ｐａｉｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）が加えられるであろう（２．０μｇ）。沈殿後、サンプルを遠心し、冷たい７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥されるであろう。ホルムアミド添加緩衝液中にサンプルを溶かし、尿素／アクリルアミドシークエンシングゲル（Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ中の７．０Ｍ尿素、４．５％アクリルアミド）上でサイズ分画がなされるであろう。ゲルを乾燥させ、保存リン光体スクリーンに並べ、リン光体撮像装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｄａｌｅ，ＣＡ）を用いてスキャンされるであろう。
【０２７１】
ＲＴ−ＰＣＲ：ヒトＭＣＨ１をコードするＲＮＡを検出するために、ヒト組織から抽出したｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＥｚｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いて、５０ｍＬの容量で、逆転写とＰＣＲ反応を行った。以下の配列を有するプライマー：
フォワードプライマー：（ＲＡ　ＳＬＣ１ａ／ＭＣＨ　Ｆ）；　ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＣＧＧ　ＴＴＧ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　ＣＡ（配列番号１４）
リバースプライマー：（ＲＡ／ＳＬＣ１ａ　ＭＣＨ　Ｂ）；　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＣＡＣ　ＧＡＣ　（配列番号１５）
を使用した。
【０２７２】
これらのプライマーは、ヌクレオチド１６９〜４１７から得られる２４８塩基対の断片を増幅するであろう。
【０２７３】
各反応は、０．１μｇのｍＲＮＡと０．３μＭの各プライマーを含有していた。各反応中の試薬の濃度は、それぞれ３００μＭのＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；２．５ｍＭ　Ｍｎ（ＯＡｃ）２；５０ｍＭ　Ｂｉｃｉｎｅ；１１５ｍＭ　酢酸カリウム、８％　グリセロール、及び５ユニットのＥｚｒＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼであった。（ｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドプライマーを除く）全てのＰＣＲ用試薬は、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒから購入した。反応は、以下の条件：６５℃６０分；９４℃２分；（９４℃１分；６５℃１分）３５サイクル、７２℃１０分で行った。１０％ポリアクリルアミドを用いたゲル電気泳動によって、ＰＣＲ反応をサイズ分画した。ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ　ＯＲ）でＤＮＡを染色して、４５０ｎＭでの青色蛍光モードにおいて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ　ＣＡ）　Ｓｔｏｒｍ　８６０上でスキャンした。
【０２７４】
ＰＣＲ反応のポジティブコントロールは、プラスミド構築物からの標的配列の増幅の他に、公知の配列の逆転写と増幅から成った。ネガティブコントロールは、ｍＲＮＡのブランクとプライマー及びｍＲＮＡのブランクから成った。ｍＲＮＡにゲノムＲＮＡが混入していないことを確認するために、逆転写の前に、ＲＮＡｓｅでサンプルを消化した。ＲＮＡの完全性は、ＧＡＤＰＨをコードする、ｍＲＮＡの増幅によって評価した。
【０２７５】
ラット中枢神経系中のＭＣＨ１受容体の分布を調べるための受容体オートラジオグラフ実験
動物
ＣＯ２を用いて、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を安楽死させ、断頭し、それらの脳を素早く摘出し、砕いたドライアイス上で凍結させた。クリオスタットを用いて、２０μｍの冠状切片を切り出し、ゼラチンで被覆されたスライド上に融解状態で載置した後、使用するまで−２０℃で保存した。
【０２７６】
放射性リガンドの結合実験
放射性リガンド結合アッセイでは、０．１ｎＭの［３Ｈ］化合物１０（比活性５６Ｃｉ／ｍｍｏｌ（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用した。ドーパミン、プラゾシン、及びフェナントロリンはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。
【０２７７】
インビトロオートラジオグラフィー
１時間、組織切片を室温に平衡化させた。１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１６ｍＭ　ＰＭＳＦ、０．３ｍＭ　フェナントロリン、０．２％　ウシ血清アルブミン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、１００μＭ　ドーパミン、１μＭ　プラゾシン、及び０．０１ｎＭ［３Ｈ］化合物１０を含有する５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ　７．４の中で、１．５時間、２５℃で切片をインキュベートした。インキュベーション緩衝液中で１０μＭの未標識化合物１０を含ませることによって、非特異的結合を測定した。インキュベーション後に、それぞれ、４℃の５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ　７．４の中で５分間、前記切片を二度洗浄した後、塩を除去するために、氷冷した蒸留水中に素早く浸した。冷たい気流の下で組織を乾燥させ、３Ｈプラスチック標準スケールとともに、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−３Ｈ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に６週間並置した。Ｋｏｄａｋ感光装置―Ｄ１９とＲａｐｉｄ　Ｆｉｘｅｒ（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いてフィルムを感光させた。適切な置換剤の存在下で、ラット脳の様々な脳領域中のオートラジオグラム上に存在する残存光学密度を観察することによって、ＭＣＨ１受容体への特異的な［３Ｈ］化合物１０の結合を解釈した。
【０２７８】
化学的な合成方法
一般的な方法：全ての反応（パラレル合成反応アレイによる反応は除く）はアルゴン雰囲気下で実施し、試薬はそのまま、または適当な溶媒中でシリンジおよびカニューレによって反応容器に移した。パラレル合成反応アレイはＪ−ＫＥＭ加熱シェーカー（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いてバイアル中（不活性雰囲気は用いない）で実施した。無水溶媒はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙより購入し、入手した状態で使用した。この特許に記載の実施例（１〜３７）は、ＡＣＤ／Ｎａｍｅプログラム（バージョン２．５１、Ａａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．， Ｔｏｒｏｎｔｏ． Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｍ５Ｈ２Ｌ３， Ｃａｎａｄａ）を用いて命名した。特に断りのない限り、溶媒としてはＣＤＣｌ３、また内部標準としてはテトラメチルシランを用い、１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを３００および７５ＭＨｚ（ＱＥ Ｐｌｕｓ）で記録した。ｓ＝シングレット；ｄ＝ダブレット；ｔ＝トリプレット；ｑ＝カルテット；ｐ＝ペンテット；セクステット；セプテット；ｂｒ＝ブロード；Ｍ＝マルチプレット。元素分析はＲｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｌｉｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．で実施した。特に断りのない限り、質量スペクトルは低分解エレクトロスプレー法（ＥＳＭＳ）を用いて得、ＭＨ＋を報告した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はシリカゲル６０ Ｆ２５４（０．２５ｍｍ、ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｔｅｃｈ．）でプレコートしたガラスプレートで行った。分取薄層クロマトグラフィーはシリカゲルＧＦ（２ｍｍ、Ａｎａｌｔｅｃｈ）でプレコートしたガラスシートで行った。フラッシュカラムクロマトグラフィーはＭｅｒｃｋシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）で行った。融点（ｍｐ）はＭｅｌ−Ｔｅｍｐ装置上のオープンキャピラリーチューブで測定し、補正はしていない。
【０２７９】
ジヒドロピリミジン中間体の合成手順
５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−ピリミジン：
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の、４−メトキシアセト酢酸メチル（５０．０ｇ，０．３４２ｍｏｌ）、３，４−ジフルオロベンズ−アルデヒド（５１．４ｇ，０．３６２ｍｏｌ）、および尿素（３１．６ｇ，０．５２７モル）の撹拌した混合物に、室温にて酸化銅（Ｉ）（５．０６ｇ，０．０３５モル）および酢酸（２．０５ｍＬ）を連続的に添加し、続いてボロントリフルオライドジエチルエーテル化合物（５６．０ｍＬ，０．４４２モル）を滴下添加した。この混合物を撹拌し、８時間還流させた時点で、ＴＬＣ（１／１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）分析は反応が完全であることを示した。反応混合物を冷却し、氷および炭酸水素ナトリウム（１００ｇ）の混合物中に注ぎ、得られた混合物をセライトを用いて濾過した。このセライトパッドをジクロロメタン（４００ｍＬ）で洗浄した。有機層をろ液から分離し、水層をさらなるジクロロメタン（３×３００ｍＬ）で抽出した。合体した有機抽出物を乾燥させ（硫酸ソーダ）、溶媒を蒸発させた。粗成物をフラッシュカラム（酢酸エチル／ヘキサン、１／１；次いで酢酸エチル）により精製し、生成物を薄い黄色の泡状物で得、これをヘキサンで粉砕すると白色の粉末になった（１０３ｇ，９７％）。１Ｈ ＮＭＲ ｄ ３．４８（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ），５．３９（ｓ，１Ｈ），６．６０（ｂｒ ｓ，１Ｈ， ＮＨ），７．００−７．２０（ｍ，３Ｈ），７．７２（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。
【０２８０】
（＋）−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−ピリミジン：
ラセミ中間体５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジンを、キラルＨＰＬＣ［キラルセルＯＤ ２０×２５０ｍｍ ＃３６９−７０３−３０６０４；ラムダ２５４ｎｍ；ヘキサン／エタノール ９０／１０；注入ごとに８５ｍｇ；所望のエナンチオマーの保持時間：１６．９４分，最初のエナンチオマーピークが溶出するまで］により分割し、（＋）−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−ピリミジン（４０−４２重量％ ラセミ酸塩からの所望のエナンチオマーの分離）；［α］Ｄ＝＋８３．８（ｃ＝０．５，クロロホルム）。（−）−異性体もまた、キラルクロマトグラフィカラムから後に溶出する分画として分離される。
【０２８１】
（＋）−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：
無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の、（＋）−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−ピリミジン（１．９８ｇ，６．３４ｍｍｏｌ）の溶液に、−７８℃でアルゴン雰囲気下にて、ＴＨＦ（１Ｍ，１８．０ｍＬ，１８．０ｍｍｏｌ）中のリチウムヘキサメチルジシラジドの溶液を２〜３分にわたり添加し、混合物を１０分撹拌した。この溶液を、カニューラを介してＴＨＦ（２０ｍＬ）中のクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（４．４７ｇ，２２．２ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に−７８℃で６分にわたり添加した。撹拌を１０分続け、混合物を氷（５０ｇ）中に注ぎ、クロロホルム（２×５０ｍＬ）で抽出した。合体した抽出物を乾燥させ（硫酸ソーダ）、溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン／酢酸，４／１から３．５／１を溶離剤として）にり精製した。生成物を黄色のシロップで得、これをヘキサンを用いて粉砕すると白色の粉末になった（２．４０ｇ，７９％）：１Ｈ ＮＭＲ ｄ ３．５２（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），４．６５−４．８０（ｑ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），６．３２（ｓ，１Ｈ），７．１０−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ），８．２７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ）。
【０２８２】
３−［（３，４−ジフルオロフェニル）メチレン］−４−オキソペンタン酸ベンジル：
プロピオニル酢酸ベンジル（３６．３ｇ，１７６ｍｍｏｌ）、３，４−ジフルオロベンズアルデヒド（２５．０ｇ，１７６ｍｍｏｌ）、ピペリジン（０．８６ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）および酢酸（０．４９ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を用いて水を除去しながら５時間還流させた。溶媒を真空下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解させた。反応混合物を水（１００ｍＬ）、続いて塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水ＥｔＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させ、薄い黄色のシロップを得た（６０．２ｇ）。生成物をさらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０２８３】
５−（ベンジルオキシカルボニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−４−エチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジン：
ＤＭＦ（１９０ｍＬ）中の、３−［（３，４−ジフルオロフェニル）メチレン］−４−オキソペンタン酸ベンジル（１６．０ｇ，４８．０ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルイソウレア硫化水素（１６．７ｇ，９７．０ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（１６．３ｇ，１３０ｍｍｏｌ）の懸濁液を７０℃で２０時間撹拌した。室温にまで冷却した後、混合物を濾過し、ろ液をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、次いで水（４×１００ｍＬ）、塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を除去した後、残渣をカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／７）により精製し、標題化合物を無色の油状物で得た（１０．６ｇ，５８％）。ＮＭＲ分析によれば、これはアミン／イミン互変体の混合物であり、次なる工程に用いた。
【０２８４】
５−（ベンジルオキシカルボニル）−４−エチル−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ（３，４−ジ−フルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：
ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中の５−（ベンジルオキシカルボニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−４−エチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジン（１７．０ｇ，４４．０ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（７．００ｇ，５７．３ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、粉末のクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（１１．５ｇ，５７．１ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を１２時間撹拌した後、溶媒を真空下で除去した。残渣をクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／７）により精製し、５−（ベンジルオキシカルボニル）−４−エチル−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジンを無色の粘性のある油状物で得た（１２．６ｇ，５０％）。１Ｈ ＮＭＲ ｄ １．２４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．８１−２．９８（ｍ，３Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），５．１４（ＡＢｑ，Ａ＝５．０８，Ｂ＝５．２０，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），６．２８（ｓ，３Ｈ），７．０３−７．２９（ｍ，８Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）。
【０２８５】
５−（ベンジルオキシカルボニル）−４−エチル−１，６−ジヒドロ−１−｛Ｎ−［１−フェニルエチル］｝−カルボキシアミド−２−メトキシ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジン：
ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の５−（ベンジルオキシカルボニル）−４−エチル−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン（１２．６ｇ，２２．９ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、Ｒ−（＋）−α−メチルベンジルアミン（３．５３ｍＬ，２７．１ｍｍｏｌ）の溶液を室温にて添加した。撹拌を１２時間続け、溶媒を真空下で除去した。黄色の残渣をクロロホルム（２００ｍＬ）中に溶解させ、Ｋ２ＣＯ４ １０％溶液（２×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去した。得られたジアステレオマーの混合物をカラムクロマトグラフィ（石油エーテル／エーテル，９／１から４／１）により分離した。溶出する第１の主要な生成物は（＋）−５−（ベンジルオキシカルボニル）−４−エチル−１，６−ジヒドロ−１−｛Ｎ−［１−フェニル）−エチル］｝カルボキシアミド−２−メトキシ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジンであった。無色の油状物；Ｒｆ＝０．３１（石油エーテル／エーテル，４／１）；収量：３．８ｇ（３１％）；［α］Ｄ＝＋２６７．０５（ｃ＝０．７６，ＣＨＣｌ２）；１Ｈ ＮＭＲ ｄ １．２２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．５２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），２．８８（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｓ，３Ｈ），４．９９（ｍ，１Ｈ），５．０９（ＡＢｑ，Ａ＝５．００，Ｂ＝５．１９，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，２Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），６．９９−７．３６（ｍ，１３Ｈ）。溶出する第２の主要な生成物は（−）−５−（ベンジルオキシカルボニル）−４−エチル−１，６−ジヒドロ−１−｛Ｎ−［２−フェニル）エチル］｝カルボキシアミド−２−メトキシ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジンであった。無色の油状物；Ｒｆ＝０．２２（石油エーテル／エーテル，４／１）；収量：３．２０ｇ（２６％）；［α］Ｄ＝−１４６．８９（ｃ＝０．３８，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ ＮＭＲ δ１．２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．４９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），２．８８（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），５．０３（ｍ，１Ｈ），５．１１（ＡＢｑ，Ａ＝５．０２，Ｂ＝５．１９，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，２Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．９１−７．３４（ｍ，１３Ｈ）。
【０２８６】
（＋）−５−（ベンジルオキシカルボニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−４−エチル−６−（３，４−ジ−フルオロフェニル）ピリミジン：
トルエン（１０ｍＬ）中の（＋）−５−（ベンジルオキシカルボニル）−４−エチル−１，６−ジヒドロ−１−｛Ｎ−［２−フェニル）エチル］カルボキシ−アミド−２−メトキシ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジン（１．００ｇ，１．８３ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−ｕｎｄｅｃ−７−エン（０．１２０ｍＬ，０．８１０ｍｍｏｌ）を室温にて添加し、得られた溶液を還流温度で５時間加熱し、次いで１２時間室温にて撹拌した。溶媒を、残渣をフラッシュカラム（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１１３）により精製し、（＋）−５−（ベンジルオキシカルボニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−４−エチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジン（０．５６０ｇ，７７％）を得た。
【０２８７】
（＋）−５−（ベンジルオキシカルボニル）−４−エチル−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−６−（３，４−ジ−フルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：
ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中の（＋）−５−（ベンジルオキシカルボニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−４−エチル（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジン（１７．０ｇ，４４．０ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（６．９９ｇ，５７．３ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、クロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（１１．６ｇ，５７．３ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を１２時間撹拌した後、溶媒を真空下で除去した。残渣をクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／７）により精製し、（＋）−５−（ベンジルオキシカルボニル）−４−エチル−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジンを粘性のある無色の油状物で得た（１９．３ｇ，７６％）。
【０２８８】
５−メチルベンズフロキサン：
４−メチル−２−トロアニリン（１００ｇ，０．６５０ｍｏｌ）を、水酸化ナトリウム飽和メタノール溶液（１．５０Ｌ）中に懸濁した。この懸濁液を冷却し（５℃）、次亜塩素酸ナトリウム水溶液を、赤色が消えるまで冷却した。得られた綿毛状の黄色の沈殿物を濾過し、冷水で洗浄し、エタノールから再結晶化させ、５−メチルベンズフロキサン（８８．２ｇ，８９％収率）を薄い黄色の固体で得た：１Ｈ ＮＭＲ ｄ ２．３９（ｓ，３Ｈ），６．９０−７．４０（ｂｒ ｍ，３Ｈ）。
【０２８９】
５−メチルベンゾフラザン：
還流しているＥｔＯＨ（７５ｍＬ）中の５−メチルベンズフロキサン（８８．２ｇ，０．５９０ｍｏｌ）にＰ（ＯＥｔ）３（１５０ｍＬ）を滴下添加した。還流温度で１時間加熱を続けた。溶媒を真空下で除去し、残渣を水（２００ｍＬ）とともに振とうし、一晩（０〜５℃で）放置した。得られた茶色の固体を濾過し、水で洗浄した。粗成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し、５−メチルベンゾフラザン（７０．０ｇ，８７％）を白色の針状物で得た；１Ｈ ＮＭＲδ ２．４１（ｓ，１Ｈ），７．１９（ｄｄ，Ｊ＝９．３，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ）。
【０２９０】
５−ジブロモメチルベンゾフラザン：
四塩化炭素（１．５Ｌ）中の、５−メチルベンゾフラザン（７０．０ｇ，０．５２０ｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスク心アミド（３２５ｇ）、および過酸化ベンゾイル（０．５０ｇ）の溶液を還流温度で撹拌しながら３０時間加熱した。反応混合物を水（２×５００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＮａＳＯ４）、溶媒を真空下で除去した。残渣をクロマトグラフィにかけ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／１５０）、１２２ｇ（８０％）の標題化合物を白色の固体で得た：１Ｈ ＮＭＲ ｄ ６．６９（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ）。
【０２９１】
５−ホルミルベンゾフラザン：
２Ｌの水中のＡｇＮＯ３（１６３ｇ）を、ＥｔＯＨ（１Ｌ）中のジブロモメチルベンゾフラザン（１２２ｇ，４１８ｍｍｏｌ）の還流している混合物に添加した。還流温度での加熱を２時間続けた。混合物を冷却し、沈殿したＡｇＢｒをセライトに通す濾過により除去し、溶媒を濃縮した。得られた溶液をトルエン（１０×１００ｍＬ）で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ溶媒を真空下で除去した。残渣をクロマトグラフィにかけ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／１２５）、標題のアルデヒド（４８．２ｇ，７８％）を白色の固体で得た：１Ｈ ＮＭＲδ ７．９２（ｍ，２Ｈ），８．３９（ｓ，１Ｈ），１０．１０（ｓ，１Ｈ）。
【０２９２】
２−［（ベンゾフラン−５−イル）メチレン］−３−オキソ酪酸メチル：
ベンゼン（３０ｍＬ）中の５−ホルミルベンゾフラザン（０．６０ｇ，４．１ｍｍｏｌ）、アセト酢酸メチル（０．５２ｇ，４．５ｍｍｏｌ）、ピペリジン（０．０１９ｇ，０．２３ｍｍｏｌ）、および酢酸（０．０１４ｇ，０．２３ｍｍｏｌ）の混合物を還流温度で８時間加熱した（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを装備）。ベンゼンを真空下で蒸発させ、残渣を酢酸エチル（８０ｍＬ）中に溶解させ、塩水（５０ｍＬ）、二硫酸カリウム飽和溶液（５０ｍＬ）、および炭酸水素ナトリウム飽和溶液で洗浄した。酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／２０）により精製した。所望の生成物を油中物で得（０．９８ｇ，９８％）、さらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０２９３】
６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチルピリミジン：
ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の２−［（ベンゾフラン−５−イル）メチレン］−３−オキソ酪酸メチル（１．０２ｇ，４．１０ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルイソウレア硫化水素（１．０６ｇ，６．２０ｍｍｏｌ）、およびＮａＨＣＯ３（１．３０ｇ，１６．４ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌し、７０℃で１６時間加熱した。混合物を冷却し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、水（５×５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗成物をフラッシュクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から１／５）により精製し、所望の生成物を油状物で得た（０．５２０ｇ，４３％）。１Ｈ ＮＭＲδ ２．３８ ａｎｄ ２．４２（２ ｓ，３Ｈ），３．６０ ａｎｄ ３．６６（２ ｓ，３Ｈ），３．７４ ａｎｄ ３．８２（２ ｓ，３Ｈ），５．５３ ａｎｄ ５．６８（２ ｓ，１Ｈ），６．３１ ａｎｄ ６．３２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．０−７．８（ｍ，３Ｈ）。
【０２９４】
６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：
ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の６−（ベンゾフラン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチルピリミジン（０．４８５ｇ，１．６ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（０．２００ｇ，１．６４ｍｍｏｌ）の溶液に、０〜５℃でクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（０．３０７ｇ，１．５２ｍｍｏｌ）を添加した。次いで混合物を室温にまで加温した。１２時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／２０）により精製し、所望の生成物を白色の結晶で得た（０．６６５ｇ，８９％）；ｍ．ｐ．１８０−１８３℃；１Ｈ ＮＭＲδ ２．５４（ｓ，３Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），６．３７（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３２（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）。
【０２９５】
（＋）および（−）（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−１−［Ｎ−（Ｓ）−１−（１−フェニルエチル）］−４−メチルピリミジン：
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル（４−ニトロフェノキシ）カルボニルピリミジン（８００ｍｇ，１．７１ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−（−）−ａ−メチルベンジルアミン（２６９ｍｇ，２．２２ｍｍｏｌ）の溶液を室温にて１２時間撹拌した。ＴＨＦを真空下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３１０％水溶液（３×５０ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を除去した後、残渣をクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／２０から３／２０）により精製し、２つのジアステレオマーを分離させた。６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−１−［Ｎ−（Ｓ）−１−（１−フェニルエチル）］−４−メチルピリミジンの異性体を無色の油状物で得た。第１の異性体（３６７ｍｇ，４７．７％）：［α］Ｄ＝＋２７８（ｃ＝０．５０，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ ＮＭＲδ １．５４（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），３．９９（ｓ，３Ｈ），５．０２（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｓ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２−７．９（ｍ，８Ｈ）。第２の異性体（２０５ｍｇ，２６．６％）：［α］Ｄ＝−８１（ｃ＝０．４３，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ ＮＭＲδ １．５２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），２．４８（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），５．００（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７４（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２−７．９（ｍ，８Ｈ）。
【０２９６】
６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチルピリミジン：
トルエン（５０ｍＬ）中の第１の異性体６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−１−［Ｎ−（Ｓ）−１−（１−フェニルエチル）］−４−メチルピリミジン（９６０ｍｇ，２．１４ｍｍｏｌ）および１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］ｕｎｄｅｃ−７−エン（１０７ｍｇ，０．７０５ｍｍｏｌ）の溶液を１００℃で５時間撹拌した。室温にまで冷却した後、トルエンを真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／７）により精製した。６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチルピリミジンを無色の油状物で得た（６３５ｍｇ，９８．３％）。１Ｈ ＮＭＲδ ２．３８（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），５．６８（ｓ，１Ｈ），６．３２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．０−７．８（ｍ，３Ｈ）。
【０２９７】
６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルピリミジン：
ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の、６−（ベンゾフラン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチルピリミジン（０．４８５ｇ，１．６０ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノ−ピリジン（０．２００ｇ，１．６０ｍｍｏｌ）の溶液に、０〜５℃で、クロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（０．３０７ｇ，１．５２ｍｍｏｌ）を添加した。添加の後、混合物を室温にまで加温した。１２時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／２０）、所望の生成物を白色の結晶で得た（０．６６５ｇ，８９％）：ｍ．ｐ．１８０−１８３℃；１Ｈ ＮＭＲδ ２．５４（ｓ，３Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．９８（ｓ，３Ｈ），６．３７（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３２（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ）；［α］Ｄ＝＋２６６（ｃ＝２．７０，ＣＨ２Ｃｌ２）。
【０２９８】
２−［（３，４−ジフルオロフェニル）メチレン］−３−オキソ酪酸メチル：
ベンゼン（１５０ｍＬ）中の３，４−ジフルオロベンズアルデヒド（１４．２ｇ，０．１００ｍｏｌ）、アセト酢酸メチル（１２．２ｇ，０．１０５ｍｏｌ）、ピペリジン（０．４３０ｇ，５ｍｍｏｌ）、および酢酸（０．３０ｇ，５ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌し還流温度で８時間加熱した（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを装備）。ベンゼンを蒸発させ、残渣を酢酸（２００ｍＬ）中に溶解させた。得られた溶液を、塩水（５０ｍＬ）、二硫酸カリウム飽和溶液（５０ｍＬ）、および炭酸水素ナトリウム飽和溶液で洗浄した。酢酸溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／２０）により精製し、所望の生成物を黄色の油状物で得（９．８０ｇ，４１％）、これをさらに特徴付けることなく後続する工程に用いた。
【０２９９】
６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチルピリミジン：
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の２−［（３，４−ジフルオロフェニル）−メチレン］−３−オキソ酪酸メチル（８．８０ｇ，３６．３ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルイソウレア硫化水素（９．４０ｇ，５４６ｍｍｏｌ）、およびＮａＨＣＯ３（１２．３ｇ，１４６ｍｏｌ）の混合物を７０℃で撹拌しながら１６時間加熱した。混合物を冷却し、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、水（５×３００ｍＬ）、塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗成物をフラッシュクロマトグラフィ（勾配溶離剤としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／７）により精製し所望の生成物を油状物で得た（３．８２ｇ，３５％）。
【０３００】
６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：
クロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（１．８２ｇ，９．０４ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチルピリミジン（２．８２ｇ，９．４６ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（１．１６ｇ，９．５２ｍｍｏｌ）の溶液を０〜５℃で添加し、次いで混合物を室温にまで加温した。１２時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から３／２０）、所望の生成物を白色の結晶で得た（３．７２，８５％）：ｍ．ｐ．１７２−１７４℃。
【０３０１】
６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソメトキシカルボン−イル−４−メチル−１−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルピリミジン：
６Ｎ 塩酸水溶液（１０ｍＬ）を、ＴＨＦ（２００ｍＬ）中の６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１（４−ニトロフェノキシ）カルボニルピリミジン（１０．０ｇ）の過溶液に添加した。撹拌を３時間続けた。溶媒を蒸発させ、残渣を真空下で乾燥させ、所望の生成物を白色の粉末で得た（９．７０ｇ，１００％）：ｍ．ｐ．１８５−１８６℃。
【０３０２】
（＋）−１−（３−ブロモ−プロピルカルバモイル）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−メチル−２−オキソ−１，６−ジヒドロ−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：
ＨＣｌ（５ｍＬ）の１０％水溶液を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の（＋）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）−カルボニル］ピリミジン（４．１０ｇ，９．１０ｍｍｏｌ）の撹拌中の溶液に室温にて添加し、得られた溶液を一晩撹拌した。ＴＨＦを真空下で除去し、得られた残渣をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出し、塩水（１０ｍＬ）で洗浄した後、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、（＋）−６−（３，４−ジ−フルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−オキソ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジンを粘性のある油状物で得た（３．８ｇ，８．５ｍｍｏｌ）。この油状物をＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解させ、３−ブロモ−プロピルアミン臭化水素酸塩（２．３３ｇ，１０．８ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３（１．８１ｇ，２１．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた懸濁液を室温にて一晩撹拌した。ＴＨＦを真空下で除去し、得られた残渣を水（１０ｍＬ）中に溶解させた後、ＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を合体させ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去し、（＋）−１−（３−ブロモ−プロピルカルバモイル）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−メチル−２−オキソ−１，６−ジヒドロピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル（３．２８ｇ，８３％）を得た：１Ｈ ＮＭＲδ ２．０５−２．１５（ｍ，２Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），３．４０−３．５６（ｍ，４Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），７．０８−７．２７（ｍ，３Ｈ），７．５７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．８４（ｂｒ ｔ，１Ｈ）。Ｃ１７Ｈ１８Ｎ３Ｏ４Ｆ２Ｂｒに対する分析：計算値Ｃ，４５．７６；Ｈ，４．０７；Ｎ，９．４２。実測値Ｃ，４５．７０；Ｈ，３．９９；Ｎ，９．１６。
【０３０３】
３−［（３，４，５−トリフルオロフェニル）メチレン］−２，４−ペンタンジオン：
ベンゼン（１５０ｍＬ）中の３，４，５−トリフルオロベンズアルデヒド（４．２０ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）、２，４−ペンタンジオン（２．６２ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）、ピペリジン（０．４３０ｇ，５．００ｍｍｏｌ）の撹拌混合物を還流温度で８時間加熱（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを装備）した。ベンゼンを蒸発させ、黄色がかった残渣、２−［（３，４，５−トリフルオロフェニル）メチレン］−２，４−ペンタンジオンを得、さらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０３０４】
６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−アセチル−４−メチルピリミジン：
ＥｔＯＨ（４００ｍＬ）中の２−［（３，４，５−トリフルオロフェニル）メチレン］−２，４−ペンタンジオン（２６．２ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルイソウレア硫化水素（３．２２ｇ，３９．３ｍｍｏｌ）、およびＮａＨＣＯ３（６．６ｇ，７８．６ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌し、９５−１００℃で６時間撹拌した。混合物を濾過し、固体の残渣をエタノール（１００ｍＬ）で洗浄した。合体したろ液から溶媒を蒸発させ、粗成物をフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から１／４）、所望の生成物を油状物で得た（２．８０ｇ，３６％）。
【０３０５】
６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−アセチル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：
クロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（１．８９ｇ，９．３８ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中の６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−アセチル−４−メチルピリミジン（２．８０ｇ，９．３８ｍｍｏｌ）およびピリジン（１０ｍＬ）の溶液に０〜５℃で添加し、得られた混合物を室温にまで加温した。１２時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ジクロロ−メタン／ＥｔＯＡｃ，１／９から３／２０）、所望の生成物を白色の粉末で得た（４．００ｇ，９２％）。
【０３０６】
６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−５−アセチル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：
６Ｎ ＨＣｌ水溶液（４ｍＬ）を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−アセチル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン（４．００ｇ，８．６３ｍｍｏｌ）の撹拌中の溶液に０〜５℃で添加し、混合物を室温にまで加温した。２時間後、溶媒を蒸発させ、生成物を真空下で乾燥させた。生成物を純粋な単一成分で得、さらに精製することなく次なる工程に用いた（３．８８ｇ，１００％）。
【０３０７】
ピペリジン中間体の合成手順
（ビニルトリフレートと、ホウ酸又はトリブチル錫試薬のＰｄ結合のための一般的手順についての参照：Ｗｕｓｔｏｎ，Ｗｉｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９１），９９３を参照されたい）。
【０３０８】
ピペリジン側鎖中間体
４−（［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボキシレートピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ｎ−ブチルリチウム（１７．６ｍＬ，４４．２ｍｍｏｌ，２．５Ｍ ヘキサン中）を、４０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中のジイソソプロピルアミン（９６．２ｍＬ，４４．２ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で添加し、２０分間撹拌した。反応混合物を−７８℃にまで冷却し、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の４−オキソ−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，４０．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に滴下添加し、３０分間撹拌した。ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のＴｆ２ＮＰＨ（４２．０ｍｍｏｌ，１５．０ｇ）を反応混合物に滴下添加し、　℃で一晩撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ（９：１）中に再び溶解させ、アルミナのプラグを通過させ、このアルミナプラグをヘキサン：ＥｔＯＡｃ（９：１）で洗浄した。合体した抽出物を濃縮し、出発物質Ｔｆ２ＮＰＨがいくらか混ざった所望の生成物を１６．５ｇ得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．７７（ｓ，１Ｈ），４．０５（ｄｍ，２Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），３．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．４５（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）。
【０３０９】
４−［３−（アミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ジメトキシエタン（５ｍＬ）中の２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３水溶液（４．２ｍＬ）、４−［［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジン−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．５００ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）、３−アミノフェニルホウ酸ヘミサルフェート（０．３９３ｇ，２．１１ｍｍｏｌ）、塩化リチウム（０．１９１ｇ，４．５０ｍｍｏｌ）、およびテトラキス−トリフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．０８０ｇ，０．０７５ｍｍｏｌ）の混合物を、還流温度で３時間、不活性雰囲気下で加熱した（トリフェニルホスフィン酸化物の形成を避けるために、混合物を最初に脱ガスすることが勧められる）。冷却した反応混合物の有機相を分離し、水層を酢酸（３Ｘ）で洗浄した。合体した有機抽出物を乾燥させ、真空下で濃縮した。粗成物をクロマトグラフィにかけ（シリカ，ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ジクロロメタン（６：１：１），ＢＯＣ群を加水分解から保護するためにイソプロピルアミンを１％添加）、０．３３０ｇの所望の生成物を８１％収率で得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ），６．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２，８．０Ｈｚ），６．０１（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．４０Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．５２−２．４６（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：２７５．２（Ｍ＋Ｈ）＋。Ｃ１６Ｈ２４Ｎ２Ｏ２に対する分析：計算値Ｃ，７０．０４；Ｈ，８．０８；Ｎ，１０．２１。実測値Ｃ，６９．７８；Ｈ，７．８０；Ｎ，９．９２。
【０３１０】
４−［３−（アミノ）フェニル］−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
２００ｍＬのエタノール中の３．１０ｇの４−（３−アミノフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１１．３ｍｍｏｌ）および１．０ｇの１０％ Ｐｄ／Ｃの混合物を、室温にてバルーン法を用いて２日間水素化した。反応混合物を濾過し、エタノールで洗浄した。合体したエタノール抽出物を真空下で濃縮し、残渣をシリカ上のクロマトグラフィにかけ（ジクロロメタン：メタノール ９５：５、ＢＯＣ群を加水分解から保護するために、イソプロピルアミンを１％添加）、２．６３ｇの所望の生成物（８４％）を得た。
【０３１１】
４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＣｌ３）δ ８．２３（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．５１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．２０（ｍ，１Ｈ），４．１７−４．０８（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．６１−２．５２（ｍ，２Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：２４９．１（Ｍ＋Ｈ−Ｃ４Ｈ８）＋。
【０３１２】
１，２，３，６−テトラヒドロ−４−（３−ニトロフェニル）ピリジン：
１００ｍＬの１，４−ジオキサン中の、５．００ｇ（１６．０ｍｍｏｌ）の１，２，３，６−テトラヒドロ−４−（３−ニトロフェニル）ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルの撹拌した溶液中に０℃で、ＨＣｌガスを１０分間バブリングした。反応混合物を室温にまで加温し、ＨＣｌガスのバブリングをさらに１時間続けた。溶媒を真空下で除去し、残渣を５０ｍＬの水中に溶解させ、ＫＯＨペレットを添加することにより中和した。水溶液を３×８０ｍＬのジクロロメタンを用いて抽出し、合体した有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９：１ ジクロロメタン メタノール＋１％イソプロピルアミン）、２．８５ｇ（８７．５％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２４（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．３５−６．２５（ｍ，１Ｈ），３．５８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑ，２Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），３．１４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．５４−２．４６（ｍ，２Ｈ）。
【０３１３】
３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
２５０ｍＬの１，４−ジオキサン中の２．８０ｇ（１４．０ｍｍｏｌ）の１，２，３，６−テトラヒドロ−４−（３−ニトロフェニル）ピリジン、３．６０ｇ（１５．０ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル、１１．６ｇ（８４．０ｍｍｏｌ）のＫ２ＣＯ３、１４．６ｍＬ（８４．０ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミン、および０．７８ｇ（２．００ｍｍｏｌ）のヨウ化テトラブチルアンモニウムの混合物を還流温度で１４時間加熱した。反応混合物を濾過し、ろ液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９：１，ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）、４．３５ｇ（８５．７％ 収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ），８．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９，８．０Ｈｚ），７．７０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．２３（ｍ，１Ｈ），３．２９−３．１８（ｍ，４Ｈ），２．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．６４−２．５４（ｍ，４Ｈ），１．８２−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３６２．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０３１４】
３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）−１−プロパンアミン：
１００ｍＬの１，４−ジオキサン中の、４．３５（１２．０ｍｍｏｌ）の３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの撹拌した溶液中に、０℃で、ＨＣｌガスを１０分間バブリングした。反応混合物を室温にまで加温し、バブリングをさらに１時間続けた。溶媒を真空下で除去し、残渣を５０ｍＬの水中に溶解させ、ＫＯＨペレットの添加により中和した。水溶液を３×８０ｍＬのジクロロメタンで抽出し、合体した有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９：１，ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）、３．０５ｇ（９７．０％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，８．２Ｈｚ），７．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，８．２Ｈｚ），７．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．２４（ｍ，１Ｈ），３．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），２．８４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），２．６４−２．５４（ｍ，４Ｈ），１．７６（ｍ，２Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：２６２．２（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ１４Ｈ１９Ｎ３Ｏ２（０．０６ ＣＨＣｌ３）に対する分析：計算値Ｃ，６２．９０；Ｈ，７．１６；Ｎ，１５．６５．。実測値Ｃ，６３．２０；Ｈ，７．１６；Ｎ，１５．６５。実測値Ｃ，６３．２０；Ｈ，７．１６；Ｎ，１５．６５。
【０３１５】
（４Ｓ）−３−［（｛３−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］プロピル｝アミノ）カルボニル］−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：
２００ｍＬのジクロロメタン（アルゴン下）中の、３．０２ｇ（６．３３ｍｍｏｌ）、１−（４−ニトロフェニル）（６Ｓ）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−（メトキシメチル）−２−オキソ−３，６−ジヒドロ−１，５（２Ｈ）−ピリミジンジカルボン酸５−メチル、１．５０ｇ（５．８０ｍｍｏｌ）の３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）−１−プロパンアミン、７．９４ｇ（７５．５ｍｍｏｌ）のＫ２ＣＯ３および１．００ｍＬのメタノールからなる混合物を室温にて１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、真空下で濃縮した。残渣を１００ｍＬの酢酸エチル中に溶解させ、３×５０ｍＬのＮａＯＨ ５％水溶液で洗浄し、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣を、０．５０ｇの １０％ Ｐｄ／Ｃを含んだ１００ｍＬの無水エタノール中に溶解させ、反応混合物を水素バルーン下で２４時間撹拌した。反応混合物を、セライト５４５濾過物質のカラムに通し、エタノールで洗浄し、ろ液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９．５：０．５，ジクロロメタン：メタノール　＋１％，イソプロピルアミン）、１．６５ｇ（５２．０％収率）の所望の生成物を得た。
【０３１６】
４−［３−（イソブチリールアミノ）フェニル］−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
１００ｍＬ ジクロロメタン中の４．００ｇ（１６．０ｍｍｏｌ）の４−（３−アミノフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルおよび５．６０ｍＬ（３２．０ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミンの溶液中に、１．９０ｍＬ（１９．０ｍｍｏｌ）の塩化イソブチルをゆっくりと添加した。反応混合物を室温にて２時間撹拌し、水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，５０：４６：３：１，ヘキサン：ジクロロメタン：メタノール：イソプロピルアミン）、２．９０ｇ（５２．０％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．６９（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．０４（ｓ，１Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），３．６２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ），２．５１（ｍ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３４５．５（Ｍ＋Ｈ）＋。Ｃ２０Ｈ２８Ｎ２Ｏ３＋０．１７５ ＣＨＣｌ３に対する分析：計算値Ｃ，６６．３３；Ｈ，７．７７；Ｎ，７．６７。実測値Ｃ，６６．２０；Ｈ，７．４１；Ｎ，７．８８。
【０３１７】
４−［３−（イソブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
１００ｍＬのエタノール中の２．９０ｇ（８．４０ｍｍｏｌ）の４−［３−（イソブチリールアミノ）フェニル］−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルおよび０．８０ｇの１０％収率 Ｐｄ／Ｃの混合物を水素バルーン下で２４時間撹拌した。反応混合物をセライト５４５のカラム濾過試薬に通し、ろ液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９．５：０．５，ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）、２．４０ｇ（８４．０％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４９−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．２０−４．１０（ｍ，２Ｈ），２．８６−２．４５（ｍ，４Ｈ），１．８６−１．７５（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．２４（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３４５．２（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２０Ｈ３０Ｎ９Ｏ３＋０．３Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，６８．２７；Ｈ，８．７７；Ｎ，７．９６。実測値Ｃ，６８．２５；Ｈ，８．５４；Ｎ，７．８４。
【０３１８】
２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド：
１００ｍＬの１，４−ジオキサン中の、２．２０（６．５０ｍｍｏｌ）の４−［３−（イソブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルの撹拌した溶液中に、０℃でＨＣｌガスを１０分間バブリングさせた。反応混合物を室温にまで加温し、ＨＣｌガスのバブリングを１時間続けた。溶媒を真空下で除去し、残渣を５０ｍＬの水中に溶解させ、ＫＯＨペレットの添加により中和した。水溶液を３×８０ｍＬのジクロロメタンで抽出し、合体した有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９：１，ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）、０．７０６ｇ（４６．０％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４７（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），３．２３−３．１４（ｍ，５Ｈ），２．８２−２．５７（ｍ，４Ｈ），１．２０（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：２４７．２（Ｍ＋Ｈ）＋；塩酸塩の塩を燃焼分析に用いた：Ｃ１５Ｈ２２Ｎ２Ｏ＋ＨＣｌ＋０．１５ＣＨＣｌ３に対する分析：計算値Ｃ，６０．５１；Ｈ，７．７６；Ｎ，９．３２。実測値Ｃ，６０．５７；Ｈ，７．８３；Ｎ，８．８８。
【０３１９】
３−（４−ピペリジニル）アニリン：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．０１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．６２−６．５４（ｍ，３Ｈ），３．１６（ｂｒ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），２．７５（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．３Ｈｚ），２．５６（ｔｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，１２．３Ｈｚ），１．８１（ｂｒ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），１．６５（ｄｑ，２Ｈ，Ｊ＝４．０，１２．３Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：１７７．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０３２０】
４−（４−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
コンデンサーに備えられた２５ｍＬ丸底フラスコに、４−｛［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ｝−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．０ｇ）、４−ニトロフェニルホウ酸（０．７１ｇ）、炭酸ナトリウム（０．４３０ｍＬの２Ｍ溶液）、塩化リチウム（０．３８２ｇ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０）（０．１７３ｇ）、およびエチレングリコールジメチルエーテル（１０ｍＬ）を加えた。反応混合物をアルゴンで３回フラッシュした後、反応混合物を１００℃にまで３時間加熱した。室温にまで冷却した後、反応混合物を塩化メチレン（３０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）で希釈し、有機層を分離した。水層を塩化メチレン（３×２０ｍＬ）で抽出し、合体した有機抽出物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィにより精製し（６：１＝ヘキサン：酢酸エチル、１％ ＮＨ３を添加）、生成物（０．５５ｇ，５９．９％）を黄色の油状物で得た。該化合物は室温では安定しないため、実際上可能な限り迅速に使用した：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．２４（ｍ，１Ｈ），４．１３（ｍ，２Ｈ），３．６７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），２．５５（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）。
【０３２１】
４−（４−ニトロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン：
４−（４−ニトロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンを、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミドの調製に用いた手法と同様の手法にて、ＨＣｌガスおよびジオキサン（５．０ｍＬ）中の４−（４−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１３０ｍｇ）を室温で用いて調製した。反応混合物を真空下で濃縮し、粗成物（６９．８ｍｇ）を得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０３２２】
ジヒドロピリミジン中間体
３−（３，４，５−トリフルオロベンジリデン）−２，４−ペンタンジオン：
ベンゼン（１５０ｍＬ）中の、３，４，５−トリフルオロベンズアルデヒド（４．２０ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）、２，４−ペンタンジオン（２．６２ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）、ピペリジン（０．４３０ｇ，５．００ｍｍｏｌ）の撹拌混合物を、還流温度でＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置にて８時間加熱した。ベンゼンを蒸発させ、黄色の油状の残渣をさらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０３２３】
１−［２−メトキシ−４−メチル−６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジニル］エタノン：
ＥｔＯＨ（４００ｍＬ）中の３−（３，４，５−トリフルオロベンジリデン）−２，４−ペンタンジオン（２６．２ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルイソウレア硫化水素（３．２２ｇ，３９．３ｍｍｏｌ）、およびＮａＨＣＯ３（６．６ｇ，７８．６ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌し、９５−１００℃で６時間加熱した。混合物を濾過し、固形のフィルターケーキをエタノール（１００ｍＬ）で洗浄した。合体したろ液から溶媒を蒸発させ、粗成物をフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／９から１／４）、所望の生成物を油状物で得た（２．８０ｇ，３６％）。
【０３２４】
５−アセチル−２−メトキシ−４−メチル−６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１（６Ｈ）−ピリミジンカルボン酸 ４−ニトロフェニル：
クロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（１．８９ｇ，９．３８ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中の１−［２−メトキシ−４−メチル−６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジニル］エタノン（２．８０ｇ，９．３８ｍｍｏｌ）およびピリジン（１０ｍＬ）の溶液に０〜５℃で添加し、得られた混合物を室温にまで加温した。１２時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ジクロロメタン／ＥｔＯＡｃ，１／９から３／２０）、所望の生成物を白色の粉末で得た（４．００ｇ，９２％）。
【０３２５】
５−アセチル−４−メチル−２−オキソ−６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）ピリミジンカルボン酸 ４−ニトロフェニル：
６Ｎ ＨＣｌ水溶液（４ｍＬ）を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の５−アセチル−２−メトキシ−４−メチル−６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１（６Ｈ）−ピリミジンカルボン酸 ４−ニトロフェニル（４．００ｇ，８．６３ｍｍｏｌ）のよく撹拌した溶液に０〜５℃で添加し、混合物を室温にまで加温した。２時間後、溶媒を蒸発させ、生成物を真空下で乾燥させた。生成物を純粋な単一成分で得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた（３．８８ｇ，１００％）：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ １０．２９（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），７．５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），７．１５−７．０７（ｍ，２Ｈ），６．１８（ｓ，１Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４５０．２（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２０Ｈ１４Ｆ３Ｎ３Ｏ６に対する分析：計算値Ｃ，５３．４６；Ｈ，３．１４；Ｎ，９．３５。実測値Ｃ，５３．２６；Ｈ，３．２１；Ｎ，９．３５。
【０３２６】
２−プロピオニル−３−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−２−プロパン酸ベンジル：
プロピオニル酢酸ベンジル（３６．３ｇ，１７６ｍｍｏｌ）、３，４−ジフルオロベンズアルデヒド（２５．０ｇ，１７６ｍｍｏｌ）、ピペリジン（０．８６ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）および酢酸（０．４９ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）の溶液を還流温度で、水を除去しながらＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を用いて５時間加熱した。溶媒を真空下で除去し、残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解させた。有機層を水（１００ｍＬ）、続いて塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を蒸発させて、薄い黄色のシロップを得（６０．２ｇ）、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０３２７】
６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジル：
ＤＭＦ（１９０ｍＬ）中の、２−プロピオニル−６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−２−プロパン酸ベンジル（１６．０ｇ，４８．０ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルイソウレア硫化水素（１６．６５ｇ，９７．０２ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（１６．３ｇ，１３０．２ｍｍｏｌ）の懸濁液を７０℃で２０時間撹拌した。室温にまで冷却した後、反応混合物を濾過し、ろ液をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で希釈し、次いで水（４ｘ１０００ｍＬ）、塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を除去した後、残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（ＳｉＯ２，ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１０％−３０％）、６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジルを無色の油状物で得た（１０．６ｇ，５８％収率）。この生成物が１Ｈ ＮＭＲ 分光学によりアミン／イミン互変体の混合物であることを示した後、この生成物を直接次なる工程に用いた。
【０３２８】
１−（４−ニトロフェニル）６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，５（６Ｈ）−ピリミジンジカルボン酸５−ベンジル：
ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）中の、６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジル（２７．５ｇ，６８．７５ｍｍｏｌ）およびピリミジン（９．２ｍＬ）のよく撹拌した溶液に、クロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（１４．４９ｇ，８２．５ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を４時間撹拌した後、ＫＯＨ １０％水溶液（２×１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、残渣をさらに精製することなく次なる工程に用いた：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．２４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），２．８１−２．９８（ｍ，３Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），５．１４（ＡＢｑ，２Ｈ），６．２８（ｓ，３Ｈ），７．０３−７．２９（ｍ，８Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ）。
【０３２９】
６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１−（｛［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ］カルボニル）−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジル：
ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の１−（４−ニトロフェニル）６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，５（６Ｈ）−ピリミジンジカルボン酸５−ベンジル（１２．６ｇ，２２．８６ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液中に、Ｒ−（＋）−α−メチルベンジルアミン（３．５３ｍＬ，２７．４４ｍｍｏｌ）の溶液を室温にて添加した。撹拌を１２時間続け、溶媒を真空下で除去した。黄色の残渣をクロロホルム（２００ｍＬ）中に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３ １０％溶液（２×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去した。得られたジアステレオマーの混合物を、シリカゲル上での、９：１ 石油エーテル：エーテルから４：１ 石油エーテル：エーテルのクロマトグラフィにより分離した。溶出する第１の主要な生成物は（＋）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１−（｛［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ｝カルボニル）−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジルであった：無色の油状物；Ｒｆ＝０．３１（４：１，石油エーテル：エーテル）；重量＝３．８ｇ（６０％収率）；［α］Ｄ＝＋２６７．０５（ｃ＝０．７６，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．２２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．５２（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），２．８８（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｓ，３Ｈ），４．９９（ｍ，１Ｈ），５．０９（ＡＢｑ，２Ｈ），６．６６（ｓ，１Ｈ），６．９９−７．３６（ｍ，１３Ｈ）；溶出する第２の主要な生成物は（−）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ（｛［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ｝カルボニル）−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジルであった：無色の油状物；Ｒｆ＝０．２２（４：１ 石油エーテル：エーテル）；重量＝３．２ｇ（５１．２％収率）；［α］Ｄ＝８９（ｃ＝０．３８，ＣＨＣｌ３）；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．４９（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），２．８８（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），５．０３（ｍ，１Ｈ），５．１１（ＡＢｑ，２Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．９１−７．３４（ｍ，１３Ｈ）。
【０３３０】
（＋）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジル：
ＣＨ２Ｃｌ２中の、（＋）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１−（｛［（１Ｒ）−１−フェニルエチル］アミノ｝カルボニル）−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジル（１７．１ｍｍｏｌ，９．３５ｇ）撹拌した溶液に、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−ｕｎｄｅｃ−エン（１７．１ｍｍｏｌ，２．５６ｍＬ）を添加し、撹拌を１６時間室温にて続けた。溶媒を蒸発させ、残渣を、３：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを溶出系とするシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製した。５．２７ｇの（＋）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジルを得た（７７％収率）。
【０３３１】
（＋）１−（４−ニトロフェニル）６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，５（６Ｈ）−ピリミジンジカルボン酸５−ベンジル：
ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）中の（＋）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジル（６．４ｇ，１６．０ｍｍｏｌ） およびピリジン（１．５ｍＬ）のよく撹拌した溶液に、クロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（３．４１ｇ，１９．２ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を４時間撹拌した後、ＫＯＨ １０％水溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離しＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去した。残渣である（＋）−１−（４−ニトロフェニル）６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−エチル−２−メトキシ−１，５（６Ｈ）−ピリミジンジカルボン酸５−ベンジルをさらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０３３２】
ａ．２−（４−メトキシベンジル）−２−チオプソイドウレア塩酸塩：
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のチオ尿素（７．６ｇ，０．１ｍｏｌ）のよく撹拌した懸濁液に、０℃で、４−塩化メトキシベンジル（１６ｇ，０．１ｍｏｌ）を１０分で添加し、反応混合物を室温にまで加温した。２時間後、反応混合物を６５℃にまで加熱し、室温に５時間保った。反応混合物を室温にまで冷却し、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）で希釈した。形成された白色の沈殿物を濾過し、乾燥させた（２２．５ｇ，９６％収率）；ｍ．ｐ．１６１−１６３℃。
【０３３３】
ｂ．２−｛［４−ニトロフェニル）メチレン｝オキソ酢酸メチル：
２−プロパノール（４００ｍＬ）中の４−ニトロベンズアルデヒド（１５．１ｇ，０．１ｍｏｌ）、アセト酢酸メチル（１２．７７３ｇ，０．１１ｍｏｌ）、ピペリジン（０．４１ｇ，４．８０ｍｍｏｌ）、および酢酸（０．２８８ｇ，４．８ｍｍｏｌ）の混合物を室温にて４８時間撹拌した。得られた白色の固体である２−［（４−ニトロフェニル）メチレン］−３−オキソ酪酸メチルを濾過し、２−プロパノール（２×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（２１．８ｇ，９３％収率）。
【０３３４】
ｃ．１，６−ジヒドロ−５−メトキシカルボニル−２−［｛（４−メトキシフェニル）メチル｝チオ］−４−メチル−６−（４−ニトロフェニル）ピリミジン：
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の、２−［（４−ニトロフェニル）メチレン］−３−オキソ酪酸メチル（８．９６ｇ，０．０４ｍｏｌ）、２−（４−メトキシベンジル）−２−チオプソイドウレア塩酸塩（９．２８ｇ，０．０４ｍｏｌ）、およびＮａＯＡｃ（３．２８ｇ，０．０４ｍｏｌ）の混合物を撹拌し、７０−７５℃で４．５時間加熱した。反応混合物を室温にまで冷却し、氷水（３００ｍＬ）中に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２×４００ｍＬ）で抽出した。合体したＥｔＯＡｃ抽出物をＮａＨＣＯ３ １０％溶液（２×６０ｍＬ）、塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させた（ＭｇＳＯ４）。溶媒を蒸発させ、粗成物を、ヘキサン中に１０％から３０％のＥｔＯＡｃを勾配溶離剤として用いたシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製し、これをＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いて粉砕し、黄色の固体（１１．４ｇ，６６．７％収率）を得、これは１Ｈ ＮＭＲによればの混合物互変体であった：ｍ．ｐ．１３８−１３９℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ２．１５（ｓ，３Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），４．０５ ａｎｄ ５．７８（ｓ ａｎｄ ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ），４．０８，４．２０（ＡＢ ｑ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，２Ｈ），４．２１ ａｎｄ ６．４０（ｓ ａｎｄ ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（２ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．０８（２ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（２ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），８．７（２ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）；Ｃ２１Ｈ２１Ｎ３Ｏ５Ｓに対する分析：計算値Ｃ，５９．００；Ｈ，４．９５；Ｎ，９．７７。実測値Ｃ，５９．０２；Ｈ，４．９３；Ｎ，９．７７。
【０３３５】
ｄ．１，６−ジヒドロ−５−メトキシカルボニル−２−［｛（４−メトキシフェニル）メチル｝チオ］−４−メチル−６−（４−ニトロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：
１，６−ジヒドロ−５−メトキシカルボニル−２−［｛（４−メトキシフェニル）メチル｝チオ］−４−メチル−６−（４−ニトロフェニル）ピリミジン（４．５０ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（３．６９ｇ，０．０４４ｍｏｌ）、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）、および水（５０ｍＬ）のよく撹拌した混合物に、０〜５℃で、クロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（２．４０ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）を５分間にわたり添加し、反応混合物を室温にまで加温した。１０時間後、反応混合物のＴＬＣ分析によれば、少量の出発ピリミジンが存在したため、さらなるクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（０．６５ｇ，０．００３２ｍｏｌ）を添加し、撹拌をさらに４時間続けた。２つの層を分離し、ＣＨ２Ｃｌ２層をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３×５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒を蒸発させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２およびヘキサンから再結晶化させ、生成物を白色の結晶で得た（５．５０ｇ，８８．４％収率）：ｍ．ｐ．１５６−１５７℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ２．５３（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），４．０６，４．３６（ＡＢｑ，Ｊ＝１３．５Ｈｚ，２Ｈ），６．３０（ｓ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）；Ｃ２８Ｈ２４Ｎ４Ｏ９Ｓに対する分析：計算値Ｃ，５６．７５；Ｈ，４．０８；Ｎ，９．４５。実測値Ｃ，５６．４９；Ｈ，４．２８；Ｎ，９．２５。
【０３３６】
ａ．６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−オキソ−５−メトキシカルボニル−４−ブロモメチル−１−［（４−ニトロフェニル−オキシ）カルボニル］ピリミジン：
１．５ｍＬのクロロホルム中の６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニル−オキシ）カルボニル］ピリミジン（０．３１０ｍｍｏｌ，０．１４０ｇ）のよく撹拌した溶液に、１．５ｍＬのクロロホルム中の臭素（０．３１０ｍｍｏｌ，０．０２０ｍＬ）の溶液を０℃で添加し、溶液を１．５時間にわたり室温にした。溶媒を真空下で除去し、残渣を再びＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中に溶解させ、塩水で洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去し、０．１５ｇ（８８％収率）の６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−オキソ−５−メトキシカルボニル−４−ブロモメチル−１−［（４−ニトロフェニル−オキシ）カルボニル］ピリミジンを黄色の泡状物で得た。粗成物をさらに精製することなく次なる工程に用いた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ３．７９（ｓ，３Ｈ），４．７２（ＡＢｑ，２Ｈ），６．４７（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ）。
【０３３７】
ｃ．４−（２，１，３−ベンゾキサジアゾール−５−イル）−２，５−ジオキソ−１，２，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３（４Ｈ）−カルボン酸 ４−ニトロフェニル：
６−（３，４−ベンゾフラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−オキソ−５−メトキシカルボニル−４−ブロモメチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン（０．２７ｍｍｏｌ，０．１５ｇ）を油浴で３時間加熱した（浴温度１３０℃）。これにより得られた茶色がかった黄色の残渣をＣＨＣｌ３で洗浄し、４−（２，１，３−ベンゾキサジアゾール−５−イル）−２，５−ジオキソ−１，２，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３（４Ｈ）−カルボン酸 ４−ニトロフェニルをオフホワイトの白色の固体で得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた（粗成物重量０．１１ｇ，９３％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ８．３８−７．５６（ｍ，７Ｈ），６．３３（ｓ，１Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ）；Ｃ１９Ｈ１１Ｎ５Ｏ８＋２．３Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，４７．８５；Ｈ，３．２８；Ｎ，１４．６３。実測値Ｃ，４７．７３；Ｈ，２．５１；Ｎ，１４．７７。
【０３３８】
１−（４−ニトロフェニル）４−（ブロモメチル）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−３，６−ジヒドロ−１，５（２Ｈ）−ピリミジンジカルボン酸５−メチル：
５ｍＬのクロロホルム中の６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン（１．５ｍｍｏｌ，０．６６ｇ）のよく撹拌した溶液に、３ｍＬのクロロホルム中の臭素（１．５ｍｍｏｌ，０．０９ｍＬ）の溶液を０℃で添加し、溶液を１．５時間にわたって室温にした。溶媒を真空下で除去し、残渣を再びＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）中に溶解させ、塩水で洗浄した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去し、所望の生成物を黄色の泡状物で得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた。１Ｈ ＮＭＲδ ３．７５（ｓ，３Ｈ），４．６７（ＡＢｑ，２Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），７．０９−７．１９（ｍ，４Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），８．２７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ）。
【０３３９】
４−（３，４−ジフルオロフェニル）−２，５−ジオキソ−１，２，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３（４Ｈ）−カルボン酸 ４−ニトロフェニル：
１−（４−ニトロフェニル）４−（ブロモメチル）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−３，６−ジヒドロ−１，５（２Ｈ）−ピリミジンジカルボン酸５−メチル（１．５ｍｍｏｌ，０．８１ｇ）を油浴で３時間加熱した（浴温度１３０℃）。これにより得られた茶色がかった黄色の残渣をＣＨＣｌ３で洗浄し、所望の生成物を薄い茶色の固体で得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた（粗成物重量０．５１ｇ）：１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ４．９４（ｂｒ ｓ，２Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），７．２０−７．４３（ｍ，４Ｈ），８．３５（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，２Ｈ）。
【０３４０】
４−（１−ベンゾジオキソール−５−イル）−２，５ ジオキソヘキサヒドロフロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３（４Ｈ）−カルボン酸 ４−ニトロフェニル：
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ １１．３５（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），７．３２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），６．８１−６．６５（ｍ，３Ｈ），５．８８（ｓ，１Ｈ），４．８５（ＡＢｑ，２Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４４０．１（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２０Ｈ１５Ｎ３Ｏ９＋１．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５１．２９；Ｈ，３．８７；Ｎ，８．９７。実測値Ｃ，５１．３８；Ｈ，２．８５；Ｎ，８．７３。
【０３４１】
１−（４−ニトロフェニル）（６Ｓ）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−メチル−２−オキソ−３，６−ジヒドロ−１，５（２Ｈ）−ピリミジンジカルボン酸５−メチル：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），７．３６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．２５−７．１１（ｍ，３Ｈ），６．３７（ｓ，１Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），２．４６（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４４８．１（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２０Ｈ１５Ｆ２Ｎ３Ｏ７に対する分析：計算値Ｃ，５３．７０；Ｈ，３．３８；Ｎ，９．３９。実測値Ｃ，５３．３５；Ｈ，３．３６；Ｎ，９．２７。
【０３４２】
ピリミジン−３−カルボン酸−４−ニトロフェニルエステルのアミンとの反応のための一般的手順：
１０ｍＬの無水ＴＨＦ中の置換されたピリミジン−３−カルボン酸−４−ニトロフェニルエステル（０．２９ｍｍｏｌ）および置換された４−フェニル−１−（３−プロピルアミノピペリジン（０．３０ｍｍｏｌ）の溶液を一晩室温にて撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィにより精製した。
【０３４３】
４−｛［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ］−１，２，３，６−テトラ−ヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ｎ−ブチルリチウム（１７．６ｍＬ，４４．２ｍｍｏｌ，２．５Ｍ ヘキサン中）を、４０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中のジイソソプロピルアミン（９６．２ｍＬ，４４．２ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で添加し、２０分間添加した。反応混合物を−７８℃にまで冷却し、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の４−オキソ−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（４０．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に滴下添加し、３０分間撹拌した。ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のＴｆ２ＮＰＨ（１５．０ｇ，４２．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に滴下添加し、混合物を０℃で一晩撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（９／１）中に溶解させ、アルミナのプラグを通過させ、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（９／１）で洗浄した。合体した抽出物を濃縮して１６．５ｇの所望の生成物を得た。これには少量のＴｆ２ＮｐＨが混じっていた。１Ｈ ＮＭＲδ ５．７７（ｓ，１Ｈ），４．０５（ｄｍ，２Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），３．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．４５．（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）。
【０３４４】
４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
Ｎａ２ＣＯ３飽和水溶液（２５ｍＬ）、４−｛［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ｝−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジン−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２０ｍｍｏｌ）、３−アセト−アミドフェニルホウ酸（３０ｍｍｏｌ）、およびテトラキス−トリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１．１５ｇ）、ならびにジメトキシエタン（４０ｍＬ）の混合物を、還流温度で一晩加熱した。冷却した反応混合物の有機層を分離させ、水層を酢酸（３Ｘ）で洗浄した。合体した有機抽出物を乾燥させ、真空下で濃縮した。粗成物をクロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲδ ８．１１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．５７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４１（ｂｒ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．０８（ｂｒ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．９９（ｂｓ，１Ｈ），４．０３（ｂｒ ｍ，Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），３．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．４６（ｍ，２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）。
【０３４５】
Ｎ１−［３−（１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル）フェニル］アセタミド：
ジオキサン（１０ｍＬ）中の４Ｍ ＨＣｌの溶液を、ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８．２５ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を室温にて一晩撹拌し、真空下で濃縮し、所望の生成物を塩酸塩の塩で得た（２．１ｇ）。１Ｈ ＮＭＲδ ７．４１−７．００（ｍ，４Ｈ），６．１０（ｂｒ，１Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．４４（ｍ，２Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ）。
【０３４６】
Ｎ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ジクロロメタン中で塩基の存在下にて３−ブロモプロピルアミン臭化水素酸塩およびＢＯＣ２Ｏから調製した：１Ｈ ＮＭＲδ ５．０７（ｂｒ，１Ｈ），３．３１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．１２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｂｒ ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．９２（ｐ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．３０（ｓ，９Ｈ）。
【０３４７】
Ｎ１−［３−（１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル）フェニル］アセタミドのＮ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルとの反応
Ｎ−（３−［４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジニル］プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
乾燥ジオキサン（３０ｍＬ）中のＮ１−［３−（１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル）フェニル］アセタミド塩酸塩（８．２４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル、および炭酸カリウム（３３ｍｍｏｌ）の溶液を還流温度で一晩加熱した。固体を濾過により除去し、溶液を真空下で濃縮し、生成物をクロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た（１１０ｍｇ）。１Ｈ ＮＭＲδ ７．６５（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．０２（ｓ，１Ｈ），５．２３（ｂ，１Ｈ），３．４０（ｂ，２Ｈ），３．３０−１．８０（ｍ，１０Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０３４８】
ＢＯＣの脱保護：
Ｎ１−｛３−［１−（３−アミノプロピル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル］フェニル｝アセタミド：
ＴＦＡ：ＣＨ２Ｃｌ２の１：１溶液（５ｍＬ）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中のＮ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジニル］プロペル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルに添加した。得られた溶液を室温にて１〜３日間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ＞６にし、有機層を分離し、真空下で乾燥させ、所望の生成物（４５ｍｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ ７．６８（ｂｒ，１Ｈ），７．３５（ｄｍ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１５（ｄｍ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．１２（ｍ，１Ｈ），３．２２（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），２．７０−２．５０（ｍ，４Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｐ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。
【０３４９】
４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラ−ヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（７１０ｍｇ）および５％ Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）の混合物を、室温にて一晩水素化した（バルーン技術）。反応混合物をセライト５４５のパッドに通し、このセライトのパッドをエタノールで洗浄した。合体したエタノール抽出物を濃縮し、クロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た（６６０ｍｇ）。１Ｈ ＮＭＲδ ７．８０（ｓ，１Ｈ），７．４１−７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），４．２１（ｍ，２Ｈ），２．７５（ｍ，２Ｈ），２．６２（ｍ，１Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．７８（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）。
【０３５０】
Ｎ１−［３−（４−ピペリジル）フェニル］アセタミド：
ジオキサン（４Ｎ，５ｍＬ）中のＨＣｌの溶液を、乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６６０ｍｇ）に添加した。反応混合物を室温にて一晩撹拌し、真空下で濃縮し、所望の生成物（５５０ｍｇ）を得た：ｍ．ｐ．１０２−１０４℃；１Ｈ ＮＭＲδ ２．０２（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ），２．１１−２．４５（ｍ，５Ｈ），２．６７−２．７７（ｍ，１Ｈ），３．００−３．１０（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２０−７．４６（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｓ，１Ｈ）。
【０３５１】
Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］ピペリジノ｝プロピル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ジオキサン（２０ｍＬ）中のＮ１−［３−（４−ピペリジル）フェニル］アセタミド（５５０ｍｇ，０．２１０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ブロモプロピル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５５０ｍｇ，０．２３０ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１．１０ｇ，０．８９０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．５０ｍＬ）、および微量のＫＩの結晶の溶液を還流温度で２日間加熱した。沈殿した塩を濾過により除去し、真空下で濃縮し、粗成物をクロマトグラフィにかけ、所望の生成物（３４０ｍｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲδ ８．１５（ｓ，１Ｈ），７．４７−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．５３（ｂ，１Ｈ），３．２３（ｂ，６Ｈ），２．８０−１．６０（ｍ，９Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０３５２】
Ｎ１−｛３−［１−（３−アミノプロピル）−４−ピペリジル］フェニル｝アセタミド：
ＴＦＡ（１．０ｍＬ）を、乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のＮ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］ピペリジノ｝プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３４０ｍｇ）の溶液に添加し、室温にて５時間撹拌した。この反応混合物にＫＯＨの１０％水溶液を添加してｐＨ＞６にした後、ジクロロメタンを真空下で除去した。水層を凍結させ、凍結乾燥させた後、得られた固体をメタノールを用いて抽出した。メタノールを除去して所望の生成物（１２０ｍｇ）を油状物で得た。１Ｈ ＮＭＲδ ８．５６−８．４６（ｓ，１Ｈ），７．４３−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．２３−７．１６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．９５−６．９２（ｍ，１Ｈ），３．０３−２．９９（ｍ，２Ｈ），２．７７−２．７３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．５０−１．６０（ｍ，１０Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ）。
【０３５３】
１−ベンジル−４−ヒドロキシ−４−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）ピペリジン：１Ｈ ＮＭＲ δ７．４０−７．２６（ｍ，５Ｈ），６．９１−６．７６（ｍ，３Ｈ），３．５７（ｓ，２Ｈ），２．８３−２．７２（ｍ，２Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），２．５８−２．４３（ｍ，２Ｈ），２．２３−２．１２（ｍ，２Ｈ）。
【０３５４】
１−ベンジル−４−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン：１Ｈ ＮＭＲδ ７．４１−７．２６（ｍ，５Ｈ），７．０５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．０，８．１Ｈｚ），６．８７−６．８０（ｍ，２Ｈ），５．５２−５．５０（ｍ，２Ｈ），３．６５（ｓ，２Ｈ），３．１３（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），２．６９−２．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），２．３５−２．３１（ｍ，２Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ）。
【０３５５】
４−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）ピペリジン：１Ｈ ＮＭＲδ ７．１７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．８３−６．８０（ｍ，２Ｈ），３．２２（ｍ，２Ｈ），２．８１−２．７３（ｍ，２Ｈ），２．６６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），２．３３（ｓ，３Ｈ），１．８０−１．６０（ｍ，４Ｈ）。
【０３５６】
１−ベンジル−４−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリン：１Ｈ ＮＭＲδ ７．５０−７．２０（ｍ，７Ｈ），５．６７（ｍ，１Ｈ），３．６９（ｓ，２Ｈ），３．１９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑ，２Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），２．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．３４（ｍ，２Ｈ）。
【０３５７】
４−（３，４，５−トリフルオロフェニル）ピペリジン：ｍ．ｐ．１９７−１９９℃；１Ｈ ＮＭＲδ ２．０５（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ），），２．３３（ｄｄ，Ｊ＝２５．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，２Ｈ），３．０６−３．２３（ｍ，３Ｈ），３．７３（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９４−７．０４（ｍ，２Ｈ）。
【０３５８】
４−（３，４，５−トリフルオロフェニル）ピペリジン：１Ｈ ＮＭＲδ ７．２０−６．８０（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｍ，２Ｈ），３．１４（ｍ，３Ｈ），２．３３（ｍ，２Ｈ），２．０５（ｍ，２Ｈ）。
【０３５９】
Ｎ−３−［４−（３，４，５−トリフルオロフェニル）ピペリジノ］プロピル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：１Ｈ ＮＭＲδ ６．９１（ｍ，２Ｈ），５．６２（ｂ，１Ｈ），４．３１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．６３（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．１，６．０Ｈｚ），３．４０−２．７０（ｍ，７Ｈ），２．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．１０−１．６０（ｍ，４Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０３６０】
３−［４−（３，４，５−トリフルオロフェニル）ピペリジノ］プロパンアミン：１Ｈ ＮＭＲδ ６．９３（ｍ，２Ｈ），４．３０（ｂ，１Ｈ），３．３６（ｂ，１Ｈ），３．０６（ｍ，２Ｈ），２．７７（ｍ，２Ｈ），２．４３（ｍ，２Ｈ），２．２０−１．４０（ｍ，９Ｈ）。
【０３６１】
１−ベンジル（５−フルオロ−２−メトキシフェニル）−４−ピペリジノール：１Ｈ ＮＭＲδ ７．４０−６．８０（ｍ，８Ｈ），３．９４ ａｎｄ ３．８５（ｓ，３Ｈ），３．６１ ａｎｄ ３．５８（ｓ，２Ｈ），２．８０−１．９０（ｍ，８Ｈ）。
【０３６２】
１−ベンジル−４−（５−フルオロ−２−メトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン：１Ｈ ＮＭＲδ ７．４０−６．７０（ｍ，８Ｈ），５．８４（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．６４（ｓ，２Ｈ），３．１７（ｍ，２Ｈ），２．６８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．５４（ｍ，２Ｈ）。
【０３６３】
４−（５−フルオロ−２−メトキシ）フェニルピペリジン：ｍ．ｐ．２５４−２５８℃；１Ｈ ＮＭＲδ １．５３−１．６８（ｍ，２Ｈ），１．７９（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，２Ｈ），２．１２（ｄｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．７７（ｄｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），２．９０−３．０５（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．２２（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｓ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），６．７２−６．９３（ｍ，３Ｈ）。Ｃ１２Ｈ１７ＮＯＦＣｌ＋０．１４ＣＨ２Ｃｌ２に対する分析：計算値Ｃ，５６．６０；Ｈ，６．７６；Ｎ，５．４４。実測値Ｃ，５６．６０；Ｈ，６．９２；Ｎ，５．２８。
【０３６４】
Ｎ−３−［４−（５−フルオロ−２−メトキシフェニル）ピペリジノ］プロピル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：１Ｈ ＮＭＲδ ６．７０（ｍ，３Ｈ），５．７６（ｂ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．６８（ｍ，１Ｈ），３．４０−２．９０（ｍ，４Ｈ），２．４５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．２０−１．６０（ｍ，９Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０３６５】
３−［４−（５−フルオロ−２−メトキシフェニル）ピペリジノ］−１−プロパンアミン：１Ｈ ＮＭＲδ ７．００−６．８０（ｍ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），２．７６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．４３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．０５（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．４，１１．７Ｈｚ），１．９０−１．２０（ｍ，１０Ｈ）。
【０３６６】
４−（１−ナフチル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：１Ｈ ＮＭＲδ ８．００−７．８０（ｍ，２Ｈ），７．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．５０−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．２７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．７６（ｂｒ，１Ｈ），４．１４（ｍ，２Ｈ），４ ＯＲ ３．２９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．５２（ｂｒ ｍ，２Ｈ），１．５３（ｓ，９Ｈ）。
【０３６７】
４−（１−ナフチル）ピペリジン：ＨＣｌ塩；ｍ．ｐ．３３０−３３２℃；１Ｈ ＮＭＲ δ１．６６−１．７０（ｍ，２Ｈ），２．２０−２．２６（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．４３（ｍ，２Ｈ），２．７２−２．８４（ｍ，１Ｈ），３．１５−３．２６（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．５６（ｍ，４Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）。Ｃ１５Ｈ１８ＮＯＣｌ＋０．２０ＣＨ２Ｃｌ２に対する分析：計算値Ｃ，６８．９６；Ｈ，７．００；Ｎ，５．２９。実測値Ｃ，６８．６４；Ｈ，７．０４；Ｎ，５．２４。
【０３６８】
Ｎ−３−［４−（１−ナフチル）ピペリジノ］プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：１Ｈ ＮＭＲδ ８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．８６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，７．５Ｈｚ），７．７１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，６．９Ｈｚ），７．６０−７．３０（ｍ，４Ｈ），６．３１（ｂｒ，１Ｈ），５．７５（ｂｒ，１Ｈ），４．２６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．４０−３．００（ｍ，６Ｈ），２．５４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．２４（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝３．０，１１．４Ｈｚ），２．００−１．６０（ｍ，６Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０３６９】
４−（３−メチル−２−ピペリジン）−４−ピペリジノール：１Ｈ ＮＭＲδ ８．２１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，４．５Ｈｚ），７．３６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，７．８Ｈｚ），７．０２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，７．５Ｈｚ），３．０７（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．３Ｈｚ），２．８９（ｍ，２Ｈ），２．４６（ｓ，３Ｈ），２．２２（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．８，１２．３Ｈｚ），１．３９（ｄｍ，２Ｈ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ）。
【０３７０】
４−（３−メチル−２−ピリジル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：１Ｈ ＮＭＲδ ８．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，３．３Ｈｚ），７．５１（ｄｍ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，７．５Ｈｚ），５．７３（ｂｒ，１Ｈ），４．０１（ｍ，２Ｈ），３．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．４０（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）。
【０３７１】
Ｎ−３−［４−（３−メチル−２−ピリジル）ピペリジノ］プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：１Ｈ ＮＭＲδ ８．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２，４．８Ｈｚ），７．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２，７．５Ｈｚ），７．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５，７．５Ｈｚ），６．７３（ｂｒ，１Ｈ），３．２６（ｍ，４Ｈ），３．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ），２．８０−２．４０（ｍ，４Ｈ），２．６１（ｓ，３Ｈ），１．８２（ｐ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ）。
【０３７２】
４−（３−メトキシフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：１Ｈ ＮＭＲδ ７．２３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），６．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，８．１Ｈｚ），６．０２（ｂｒ，１Ｈ），４．２０−４．００（ｍ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．６２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．５１（ｂｒ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）。
【０３７３】
１−ベンジル−４−メチル−ピペリジン−４−オル：
メチルリチウム（Ｅｔ２Ｏ ５４．０ｍＬ中に１．４Ｍ，）を、無水エーテル中の１−ベンジル−４−ピペリドン（５．００ｍＬ，２７．０ｍｍｏｌ）の溶液に−７８℃でアルゴン下て添加した。撹拌を−７８℃で１．５時間続けた。エーテル（２００ｍＬ）および水（４０ｍＬ）を添加し、２つの相を分離した。水溶液をＥｔ２Ｏ（３×５０ｍＬ）で抽出し、合体した有機溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣をクロマトグラフィにかけ（ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ ９／１）、４．８１ｇ（８７％）の所望の生成物を無色の油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ δ１．２１（ｓ，３Ｈ），１．５６（ｄｔ，Ｊ＝１３，３Ｈｚ，２Ｈ），１．６５（ｔｄ，Ｊ＝１０，４Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｔｄ，Ｊ＝１０，３Ｈｚ，２Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｍ，１Ｈ），７．２９（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲδ ３０．４４，３９．３７，５０．３９，６３．８０，６８．５０，１２７．５６１，１２８．８０，１２９．８０，１３９．１７。
【０３７４】
１−ベンジル−４−メチル−４−フェニルピペリジン：
１−ベンジル−４−メチル−４−ピペリジン−４−オル（４．８１ｇ，２３．４ｍｍｏｌ）を、ベンゼン（１００ｍＬ）中のＡｌＣｌ３（１５．６２ｇ，１１７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温にてアルゴン下で添加した。混合物を還流で２４時間撹拌した後、冷却し、氷水（１００ｇの氷，５０ｍＬの水）中に慎重に注いだ。６Ｎ ＮａＯＨ水溶液を０℃で添加することにより水相をｐＨ１１〜１２に調整し、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）を用いて抽出した。合体した有機溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣をクロマトグラフィにかけ（ヘキサン−Ｅｔ２Ｏ １９／１から９／１，続いてヘキサン−ＥｔＯＡｃ ３／１）、所望の生成物（３．２３ｇ，５２％）を茶色の油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲδ １．２５（ｓ，３Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），２．１７（ｍ，２Ｈ），２．４４（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｍ，２Ｈ），３．５０（ｓ，２Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），７．３５（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲδ ３６．８２，３７．６５，５０．９５，５４．９３，６４．０８，１２６．１９，１２６．５１，１２７．５９，１２８．８３，１２８．９５，１２９．０５，１２９．８９，１３９．２４。
【０３７５】
４−メチル−４−フェニルピペリジン：調製したばかりの蟻酸メタノール溶液（重量で４．４％，７０ｍＬ）を、１−ベンジル−４−メチル−４−フェニルピペリジン（３．２３ｇ，１２．２ｍｍｏｌ）に添加した。得られた溶液に、炭素上の１０％ パラジウム（２．００ｇ）を添加した。混合物を室温にて２４時間撹拌した。固体を濾過して取り出し、ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１５ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）、およびＭｅＯＨ（１５ｍＬ）で洗浄した。合体したろ液および洗浄液を濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１０ｍＬ）中に溶解させた。１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を添加することにより水相をｐＨ１１に調整した。有機相を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣の油状物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＭｅＯＨ中でＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／２Ｎ ＮＨ，１００／４／０から１００／２０／１０）、１−ベンジル−４−メチル−４−フェニルピペリジン（１．２０ｇ）および１．１０ｇ（５１％，８２％ 消費した出発物質に基づく）の４−メチル−４−フェニルピペリジンを得た：１Ｈ ＮＭＲδ １．２４（ｓ，３Ｈ），１．７１（ｍ，２Ｈ），２．０６（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｍ，３Ｈ），２．９４（ｍ，２Ｈ），７．１９（ｍ，１Ｈ），７．３２（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲδ ３７．２２，３８．５４，４３．４４，４７．７４，１２６．３１，１２７．４３，１２９．０１，１４９．７３。
【０３７６】
３−アミノプロピル−４−メチル−４−フェニルピペリジン：
還流しているジオキサン（２０ｍＬ）中の、４−メチル−４−フェニルピペリジン（１．００ｇ，５．７０ｍｍｏｌ）、３−ブロモ−プロピルアミン臭化水素酸塩（１．８７ｇ，８．５５ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（１．９７ｇ，１４．２ｍｍｏｌ）の溶液を３６時間撹拌した。溶媒を除去した後、水（５０ｍＬ）を添加し、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を添加することによりｐＨを１１〜１２に調整した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ＋３×１００ｍＬ）を用いて抽出した。合体した有機溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＭｅＯＨ中にＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／２Ｎ ＮＨ３，１００／２０／１０）、所望の生成物を無色の油状物で得た（２４１ｍｇ，１８％）：１Ｈ ＮＭＲδ １．１８（ｓ，３Ｈ），１．６１（ｐ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．７５（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｍ，２Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．４０（ｍ，２Ｈ），２．４５（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），３．０２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．１４（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ ８３０．２８，３６．７８，３７．６４，４１．５１，５０．９６，５７．５１，１２６．１６，１２６．４０，１２８．９１，１４９．２０。
【０３７７】
３−［４−（４−フルオロフェニル）ピペリジン−１−イル］プロピルアミンの調製
４−（４−フルオロフェニル）ピペリジン塩酸塩：
メタノール（２００ｍＬ）中の４−（４−フルオロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン塩酸塩（１０ｇ）の溶液に、木炭上の１０％ パラジウム（０．５ｇ）を添加し、混合物を５０ｐｓｉで３時間水素化した。触媒を濾過により除去し、溶媒を蒸発させ、生成物（１０．０ｇ）を白色の粉末で得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた。ＮＭＲおよびＴＬＣ分析に基づき生成物は純粋であると見られた。１Ｈ ＮＭＲδ １．９５−２．０３（ｂｒ ｄ，２Ｈ），２．１４−２．２９（ｍ，２Ｈ），２．７０−２．８０（ｍ，１Ｈ），２．９１−３．０７（ｂｒ ｑ，２Ｈ），３．６０−３．６４（ｂｒ ｄ，２Ｈ），６．９６−７．０３（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．２２（ｍ，２Ｈ），９．６０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．７１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。
【０３７８】
４−（４−フルオロフェニル）ピペリジン：ｍ．ｐ．　℃；１Ｈ ＮＭＲ １．５１−１．６６（ｍ，２Ｈ），１．８０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．５３−２．６４（ｍ，１Ｈ），２．６７−２．７７（ｍ，２Ｈ），３．１７（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，２Ｈ），６．９４−７．０３（ｍ，２Ｈ），７．１３−７．２１（ｍ，２Ｈ）。Ｃ１１Ｈ１４ＮＦ＋Ｃ４Ｈ４Ｏ４に対する分析：計算値Ｃ，５８．７０；Ｈ，５．８３；Ｎ，４．１８。実測値Ｃ，５８．７２；Ｈ，５．８４；Ｎ，３．９８。
【０３７９】
３−［４−（４−フルオロフェニル）ピペリジン−１−イル］プロピルフタルイミド：
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の４−（４−フルオロフェニル）ピペリジン塩酸塩（５．０８ｇ，２３．２ｍｍｏｌ）、３−ブロモプロピルフタルイミド（６．２２ｇ，２３．２ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（１５ｇ）の混合物を、９５〜１００℃で１２時間撹拌した。減圧下で約８０％の溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸（２００ｍＬ）で希釈し、塩水（３×１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を酢酸溶液から蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（１／１ ヘキサン−酢酸エチルから１００％酢酸エチル）、粗成物を得た（７．５０ｇ，８８％）。この粗成物をイソプロパノールから再結晶化させ、白色の結晶の固体を得た（４．５０ｇ，第１の産物）。この物質を次なる工程に用いた。母液の濃縮と冷却とを経て、第２の産物である所望の生成物を得た（１．０ｇ）。１Ｈ ＮＭＲδ １．４３−１．５２（ｍ，２Ｈ），１．６７−１．７５（ｍ，２Ｈ），１．８０−１．９６（ｍ，４Ｈ），２．３３−２．４６（ｍ，３Ｈ），２．９４−２．９９（ｂｒ ｄ，２Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），６．９０−７．０４（ｍ，４Ｈ），７．７０−７．７４（ｍ，２Ｈ），７．８４−７．８７（ｍ，２Ｈ）。
【０３８０】
３−［４−（４−フルオロフェニル）ピペリジン−１−イル］プロピルアミン：
ヒドラジン（４ｍＬ）を、メタノール（２００ｍＬ）中の３−［４−（４−フルオロフェニル）ピペリジン−１−イル］プロピルフタルイミド（４．５０ｇ，１２．３ｍｍｏｌ）の溶液中に添加し、混合物を還流で８時間撹拌した。溶液を室温にまで冷却し、形成されて得られた白色の固体を濾過し、メタノール（２０ｍＬ）で洗浄した。ろ液から溶媒を蒸発させ、残渣を真空下で４時間乾燥させた。粗成物を５０ｍＬのクロロホルム中に溶解させ、１時間撹拌し、濾過した。白色の固体をさらなるクロロホルム（２０ｍＬ）で洗浄し、合体したろ液から溶媒を蒸発させ、粗成物を油状物で得た。カラムクロマトグラフィにより精製し（メタノール中にジクロロメタン／メタノール／２Ｍ アンモニア，１０／３／１）、所望の生成物を得た（２．７０ｇ，９３％）。１Ｈ ＮＭＲδ １．６０−１．８３（ｍ，６Ｈ），１．９６−２．０７（ｍ，４Ｈ），２．４０−２．５５（ｍ，３Ｈ），２．７０−２．８５（ｂｒ ｔ，２Ｈ），３．０３−３．０７（ｂｒ ｄ，２Ｈ），６．９３−７．００（ｍ，２Ｈ），７．１４−７．２０（ｍ，２Ｈ）。
【０３８１】
４−（４−メチル−４−（３，５−ジメチルフェニル）ピペリジン：吸湿性あり；１Ｈ ＮＭＲδ １．２０（ｓ，３Ｈ），１．７４−１．８０（ｍ，２Ｈ），２．０８−２．１６（ｍ，２Ｈ），２．３０（ｓ，６Ｈ），２．５０−２．５６（ｍ，２Ｈ），２．６４−２．６８（ｍ，２Ｈ），２．９７−３．０４（ｍ，１Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），６．９４（ｓ，２Ｈ）。
【０３８２】
４−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］メチル｝−シクロヘキシルカルバミン酸ベンジル：
塩化オキサリル（１．１当量）を、トルエン中の４−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］メチル｝−シクロヘキサンカルボン酸（１当量，Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ）の混合物中に滴下添加した。反応混合物を室温にて２〜６時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をアセトン中に溶解させ、得られた混合物をアジ化ナトリウム水溶液（１．２当量）に、温度１０〜１５℃を保つような速さで滴下添加した。反応が完了した後、反応混合物を酢酸エチルを用いて抽出し、合体した抽出物を乾燥させ、真空下で濃縮した。残渣をアセトン中に溶解させ、高温の（６０℃）ベンゼンにゆっくりと添加した。反応が完了した後、反応混合物にベンジルアルコールを添加し、２日間撹拌し、所望の生成物を分離した（典型的な参照文献として、Ｇ． Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ Ｂｅｒ． １９０９，４２，３３５６；ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，Ｃ．Ｆ．Ｈ．；Ｂｅｌｌ，Ａ． Ｏｒｇ． Ｓｙｎ． Ｃｏｌｌ． Ｖｏｌ． ３．（１９５５） ８４６．を参照されたい）。
【０３８３】
１０％ Ｐｄ／Ｃを含んだＭｅＯＨ中の、４−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］メチル｝−シクロヘキシルカルバミン酸ベンジルの溶液を、５０ｐｓｉで一晩水素化した。反応混合物をセライト５４５を介して濾過し、このセライト５４５をメタノールで洗浄した。合体したメタノール抽出物を真空下で濃縮し、４−アミノシクロヘキシルメチルカルバミン酸ｔｒａｎｓ−ｔｅｒｔ−ブチル（９５％）を得た。
【０３８４】
Ｎ−［４−（アミノメチル）シクロヘキシル］カルバミン酸９Ｈ−９−フルオレニルメチル：１Ｈ ＮＭＲδ ８．０２（ｂｒ，１Ｈ），７．３３（ｍ，５Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，１Ｈ），３．４０（ｂｒ ｍ，１Ｈ），２．８０（ｂｒ ｍ，２Ｈ），１．９４（ＡＢｑ，４Ｈ），１．６８（ｂｒ，１Ｈ），１．３０−１．００（ｍ，５Ｈ）。
【０３８５】
Ｎ１−［４−（アミノメチル）シクロヘキシル］−１−ナフタミド：
ジオキサン（１０ｍＬ，４Ｎ）中のＨＣｌを、ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の［４−（１−ナフトイル−アミノ）シクロヘキシル］メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．３５０ｇ）の溶液に添加し、一晩撹拌し、真空下で濃縮し、所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ δ８．２４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，８．７Ｈｚ），７．８５（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．７，９．７Ｈｚ），７．６０−７．３０（ｍ，４Ｈ），５．９８（ｍ，１Ｈ），４．０２（ｍ，１Ｈ），３．８０−３．４０（ｍ，４Ｈ），２．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），２．０２（ＡＢｑ，４Ｈ），１．３１−１．９０（ｍ，４Ｈ）。
【０３８６】
Ｎ−（４−［（１−ナフチルカルボニル）アミノ］シクロヘキシルメチル）−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の１−ナフトエ酸（１．００ｍｍｏｌ，０．１７２ｇ）、ＤＭＡＰ（２．００ｍｍｏｌ，０．２５０ｇ）、およびＥＣＤ（０．３８３ｇ，２．００ｍｍｏｌ）の混合物を室温にて０．５時間撹拌し、続いて（４−アミノ）シクロヘキシル）メチル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルアミン（１．０９ｍｍｏｌ，０．２５０ｇ）を添加した。反応混合物を室温にて一晩撹拌し、フラッシュクロマトグラフィにより精製し、所望の生成物を白色の固体で得た（０．１６０ｇ）：１Ｈ ＮＭＲδ ８．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，９．１Ｈｚ），７．８９（ｍ，２Ｈ），７．６０−７．４０（ｍ，４Ｈ），５．８５（ｂｒ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．６５（ｍ，１Ｈ），４．０４（ｍ，１Ｈ），３．０２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．０５（ＡＢｑ，４ Ｈ），１．６２（ｍ，２Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．４０−１．１０（ｍ，４Ｈ）。
【０３８７】
４−アセチル−１−（３−アミノプロピル）−４−フェニルピペリジン：
４−アセチル−４−フェニルピペリジン（７，１．５３ｇ，７．５０ｍｍｏｌ）、３−ブロモ−プロピルアミン臭化水素酸塩（１．６４ｇ，７．５０ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（１．２４ｇ，９．００ｍｍｏｌ）の溶液を、還流している１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）に１２時間添加した。ジオキサンを除去した後、水（５０ｍＬ）を添加し、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を添加することによりｐＨを１１〜１２に調整した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ＋３×５０ｍＬ）を用いて抽出した。合体した有機溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ−ＭｅＯＨ−Ｅｔ３Ｎ １００／４０／２０）、所望の生成物を無色の油状物で得た（７８０ｍｇ，４０％）：１Ｈ ＮＭＲδ １．５６（ｐ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），１．８４（ｓ，３Ｈ），１．９８（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｂｒ ｔ，Ｊ＝１２Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，２Ｈ），２．６６（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，４Ｈ），７．１８−７．３０（ｍ，５Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲδ ２６．２８，３１．１１，３３．４３，４１．４７，５１．６２，５５．３１，５７．１９，７７．３２，７７．７４，７８．１７，１２６．９５，１２７．６９，１２９．４４，１４２．２５，２１０．１５。
【０３８８】
ベンゾ−４’，５’［Ｈ］フランピペリジンの調製については、Ｗ．Ｅ．Ｐａｒｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｉｎ．（１９７６） ４１， ２２６８を参照されたい。
【０３８９】
ｔｅｒｔ−ブトキシ｛［３−（ベンゾ−４’，５’［Ｈ］フランピペリジン−１−イル）プロピル］アミノ｝メタノール：
ジオキサン（２０ｍＬ）中のＮ−［４−（ベンゾ−４’，５’［Ｈ］フランピペリジン（０．５６６ｇ，３．２７ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３−ブロモプロピルアミン（０．７７２ｇ，３．２７ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（０．９０４ｇ，６．５４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を２４時間還流させた。反応混合物を室温にまで冷却し、濃縮し、クロロホルム（４０ｍＬ）および水（５ｍＬ）の間で分配した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をカラムクロマトグラフィにより精製し（酢酸／メタノール，４．５／０．５）、所望の生成物を無色の油状物で得た（０．８５６ｇ，７９％）；１Ｈ ＮＭＲ（１．４５（ｓ，９Ｈ），１．６３−２．０４（ｍ，６Ｈ），２．３３−２．５２（ｍ，４Ｈ），２．８７（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），５．６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．１３−７．２８（ｍ，４Ｈ）。
【０３９０】
３−（４−メチル−４−フェニル−１−ピペリジニル）プロピルアミン：
トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブトキシ｛［３−（４−メチル−４−フェニル−１−ピペリジニル）プロピル］アミノ｝メタノール（０．５００ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を室温にて１時間撹拌した。溶液を濃縮し、ＫＯＨ １０％溶液で中和させ、ジクロロメタン（２５ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、０．３４０ｇ（９８％）の３−（４−メチル−４−フェニル−１−ピペリジニル）プロピルアミンを得、これをさらに精製することなく後続する工程に用いた。
【０３９１】
アミン側鎖のカルバミン酸ｐ−ニトロフェニル中間体との反応手順：
一般的手順：
ジクロロメタン中の、３−（４−メチル−４−フェニル−１−ピペリジニル）プロピルアミンのようなアミン側鎖、および５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェン−イルオキシ）カルボニル］ピリミジンのようなｐ−ニトロフェニルカルバミン酸塩中間体、ならびに１〜２当量のジイソプロピルエチルアミンのような塩基からなる等モル溶液を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィにより精製し、所望の生成物を得た。２−メトキシ中間体の場合、オキソ誘導体への変換は、２−メトキシ生成物をジオキサン中のＨＣｌを用いて処理することにより達成される。
【０３９２】
２−オキソ−３−｛スピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］プロピルアミン（０．０３１９ｇ，０．１２３ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の、（±）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−エチル−１−（４−ニトロフェノキシ）カルボニル−ピリミジン（０．０５２ｇ，０．１１２ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を室温にて２４時間撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ（２ｍＬ）を添加した後、反応混合物をさらに１時間撹拌した。ＫＯＨ １０％水溶液を用いて中和した後、反応混合物をジクロロメタン（３×１０ｍＬ）中に抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，４．５／０．５）、所望の生成物（０．０４０ｇ）をシロップで得た。
【０３９３】
エーテル（５ｍＬ）中の１Ｎ ＨＣｌをジクロロメタン（４ｍＬ）中の遊離塩基（０．０４０ｇ，０．０７２ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を減圧下で濃縮した。粗成物をエーテルから再結晶化させ、所望の化合物（０．０４２ｇ，９９％）を薄い黄色の固体で得た；ｍ．ｐ．１７８−１８２℃；Ｃ２９Ｈ３４Ｎ４Ｏ５Ｃｌ２＋０．６Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５７．８７；Ｈ，５．７３，Ｎ，９．３１。実測値Ｃ，５８．１１；Ｈ，５．９０；Ｎ，８．９５。
【０３９４】
ピペリジンおよびピペラジンの、１−（３−ブロモ−プロピルカルバモイル）−６−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−４−メチル−２−オキソ−１，６−ジヒドロ−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステルとの反応についての一般的手順
アミン（０．１５ｍｍｏｌ）を、無水アセトン（１０ｍＬ）中の１−（３−ブロモ−プロピルカルバモイル）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−メチル−２−オキソ−１，６−ジ−ヒドロピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル（４３．０ｍｇ，０．１００ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、続いてＮａＨＣＯ３（４１ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）およびＫＩ（１６ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）に添加した。得られた懸濁液を加熱して１０時間還流させ、次いで室温にまで冷却した。溶媒を真空下で除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製した（ＥｔＯＡｃ，続いてＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，９／１）。次いで生成物を２ｍＬのクロロホルム、アセトン、又はＥｔＯＡｃ中に溶解させ、Ｅｔ２Ｏ中のＨＣｌ（０．５ｍＬ，１Ｍ）を室温にて添加した。溶媒を真空下で除去し、所望の化合物をＨＣｌ塩として得た。
【０３９５】
例１　（　）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（３，−アセタミド）−フェニル−ピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−４−メトキシメチル−６−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−２−オキソピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：ＥＳＭＳ，６１２．２５（Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲδ １．７６−１．８７（ｍ，６Ｈ），２．０３−２．１３（ｍ，２Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．４９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），３．１０（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，２Ｈ），３．３０−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０４−７．１１（ｍ，２Ｈ），７．１６−７．２６（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｓ，１Ｈ），８．９８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０３９６】
例２　３−［（３−４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジニルプロピル）アミノ］カルボニル−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシ−メチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：１Ｈ ＮＭＲδ ８．９０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），７．７５（ｓ，１Ｈ），７．５０−７．００（ｍ，８Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．０３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．６７（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），３．３８（ＡＢｍ，２Ｈ），３．１６（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），２．５６（ｍ，４Ｈ），２．３５−１．９０（ｂｒ，２Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），１．８２（ｐ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；ＥＳＭＳ，６１２．２５（Ｍ＋１）。
【０３９７】
例３　（１）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［３−（４−Ｏ−アセチル）−４−フェニルピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソピリミジン：
４−アセチル−１−（３−アミノプロピル）−４−フェニルピペリジン（１９０ｍｇ，０．６８７ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（３ｍＬ）およびＴＨＦ（４ｍＬ）中の５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラ−ヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボン−イル］ピリミジン（２８１ｍｇ，０．５７３ｍｍｏｌ）の撹拌中の溶液に添加した。反応混合物を室温にて１２時間撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ水溶液を用いて反応を止めた。反応混合物を濃縮して体積を減らし、ジクロロメタンおよび水（各１００ｍＬ）の間で分配し、混合物をＮａ２ＣＯ３の添加によりｐＨ８に調整し、相を分離させ、水層をジクロロメタン（３×３０ｍＬ）を用いて抽出した。合体した有機抽出物を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、生成物をクロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た。エーテル中の１Ｎ ＨＣｌをＣＨ２Ｃｌ２の生成物の溶液に添加することによりＨＣｌ塩を調製した。沈殿した塩を濾過し、エーテルで洗浄し、真空下で乾燥させ、（１）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［３−（４−Ｏ−アセチル）−４−フェニルピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソピリミジン（１７０ｍｇ，４７％）を塩酸塩の塩で得た：（Ｃ３１Ｈ３６Ｎ４Ｆ２Ｏ７＋ＨＣｌ＋０．６ＣＨ２Ｃｌ２）；ｍ．ｐ．８２−８４℃。
【０３９８】
例４　例４の生成物の生成物へのベンジルエステル前駆体ｚ：
（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（ベンゾ−４’，５’（Ｈ）フラン）ピペリジン−１−イル］プロピル｝−カルボキシアミド−４−エチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−ピリミジン−５−カルボン酸フェニルメチルエステル：１Ｈ ＮＭＲδ ７．６０−７．００（ｍ，１２Ｈ），６．８５（ｂｒ，１Ｈ），６．６２（ｓ，１Ｈ），５．１０（ＡＢｑ，２Ｈ），５．６７（ｓ，２Ｈ），４．０３（ｂｒ，１Ｈ），４．０１（ｓ，３Ｈ），３．４０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．２０−１．６０（ｍ，１２Ｈ），２．８６（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝２．５Ｈｚ），１．１９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）。
【０３９９】
（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（ベンゾ−４’，５’（Ｈ）フラン）ピペリジン−１−イル］プロピル｝−カルボキシアミド−４−エチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−ピリミジン−５−カルボン酸塩酸塩：１Ｈ ＮＭＲ δ８．９５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．２２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７ ６．９５（ｍ，７Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），６．６３（ｓ，１Ｈ），５．１０−４．９５（ｍ，２Ｈ），３．４０−３．２０（ｍ，４Ｈ），３．１０−２．８０（ｍ，４Ｈ），２．５５−２．２０（ｍ，１Ｈ），２．１５（ｍ，１Ｈ），１．８５（ｍ，２Ｈ），１．５５−１．３０（ｍ，４Ｈ），１．２０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）；Ｃ２９Ｈ３２Ｎ４Ｏ５Ｆ２＋ＨＣｌ＋１．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５６．３６；Ｈ，５．８７；Ｎ，８．０６。実測値Ｃ，５６．７２；Ｈ，６．１１；Ｎ，７．６１。
【０４００】
例５　１，２，３，４−テトラヒドロ−１−オキソ−２−ナフト酢酸メチルエステル：
アルゴン下で、乾燥ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のα−テトラロン（５．００ｇ，３４．２ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ中のＬＤＡ（２Ｍ，１８．８ｍＬ）を用いて−７８℃で処理した。溶液を−７８℃で１時間撹拌した。次いでブロモ酢酸メチル（１５．７ｇ，０．１０３モル）を溶液に添加し、混合物を一晩撹拌し、室温にまで加温した。溶媒を蒸発させ、残渣をＣＨＣｌ３（３００ｍＬ）中に溶解させ、水および飽和塩水で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を濾過および除去し、残渣を真空で蒸留した。無色の油状物である生成物（７．２１ｇ，９６．５％）を１８０℃／１ｍｍＨｇで回収した；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）δ １．９８（ｍ，１Ｈ），２．２５（ｍ，１Ｈ），２．４４（ｍ，１Ｈ），２．９０−３．２０（ｍ，４Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），７．１０−８．１０（ｍ，４Ｈ）；ｍ／ｚでのＥＩ マススペクトルＭ＋ ２１８。
【０４０１】
１−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン：
ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の１，２，３，４−テトラヒドロ−１−オキソ−ナフト酢酸メチルエステル（６．１５ｇ，２８．２ｍｍｏｌ）の溶液を、ＬｉＡｌＨ４（２．８２ｇ，７０．５ｍｍｏｌ）を用いて処理し、次いで反応混合物を還流温度で５時間加熱した。懸濁液を０℃にまで冷却し、固体のＮａ２ＳＯ４・１０Ｈ２Ｏを添加することによりクエンチした。混合物を室温で４時間撹拌した。固体を濾過により除去し、ろ液を真空下で濃縮して黄色の油状物を得た（５．３３ｇ，９８．３％）；１Ｈ ＮＭＲ は、異性体の混合物の形成を示した。ｍ／ｚでのＥＩマススペクトルＭ＋ １９２。この混合物をさらに精製することなく次なる工程に直接用いた。
【０４０２】
２−（２−ヒドロキシエチル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１−オキソ−ナフタレン：
ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の、１−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシエチル）−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンの異性体の混合物（３．００ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）の溶液を、ＭｎＯ２（２０．４ｇ，０．２３４モル）を用いて処理した。懸濁液を室温にて１６時間撹拌し、固体を濾過により除去した。ろ液を真空下で濃縮することにより茶色の油状物を得、これをさらにフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３，５／９５）、黄色の油状物を得た（２．００ｇ，６７．４％）：１Ｈ ＮＭＲδ １．７６（ｍ，１Ｈ），１．９８（ｍ，１Ｈ），２．２１（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｂｒ，１Ｈ），２．７０（ｍ，２Ｈ），３．２０（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｍ，２Ｈ），７．００−８．２０（ｍ，４Ｈ）；ｍ／ｚでのＣＩ マススペクトル（Ｍ＋１）＋ １９１。
【０４０３】
２−（２−ブロモエチル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１−オキソ−ナフタレン：
ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の２−（２−ヒドロキシエチル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１−オキソ−ナフタレン（２．００ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）の溶液をＰＢｒ３（９４８ｍｇ，３．５０ｍｍｏｌ）を用いて０℃で処理した。混合物を室温にて７２時間撹拌し、次いで１００ｇの氷中に注いだ。有機層を分離し、Ｋ２ＣＯ３１０％水溶液、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を濾過および除去し、残渣をクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１／１０）、黄色の油状物を得た（１．１８ｇ，４４．４％）；１Ｈ ＮＭＲδ １．４９（ｍ，２Ｈ），２．２４（ｍ，１Ｈ），２．６０（ｍ，１Ｈ），２．７５（ｍ，１Ｈ），３．０３（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｍ，２Ｈ），７．１０−８．１０（ｍ，４Ｈ）；ＥＩＭＳ Ｍ＋ ｍ／ｚ ２２３，Ｍ／Ｍ＋２＝１：１。
【０４０４】
２−［２−（４−ベンズアミノ−１−ピペリジル）エチル］−１，２，３，４−テトラヒドロ−１−オキソ−ナフタレン：
アセトン（２００ｍＬ）中の２−（２−ブロモエチル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１−オキソ−ナフタレン（１．１８ｇ，４．６６ｍｍｏｌ）、４−ベンズアミドピペリジン（９５２ｍｇ，４．６６ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１．２９ｇ，９．３２ｍｍｏｌ）の混合物を室温にて４８時間撹拌した。固体を濾過により除去した。ろ液を真空下で濃縮して黄色の固体を得、これをクロマトグラフィにより精製し（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３，５／９５）、生成物をＥｔＯＡｃ／ヘキサン混合物から再結晶化させ、白色の粉末を得た（２６８ｍｇ，１５．３％）；ｍ．ｐ．１５８−１５９℃；１Ｈ ＮＭＲδ １．５３（ｍ，２Ｈ），１．６７（ｍ，１Ｈ），１．９１（ｍ，１Ｈ），２．０２（ｍ，２Ｈ），２．２１（ｍ，４Ｈ），２．５０（ｍ，３Ｈ），２．９５（ｍ，４Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），５．９５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．２０−８．１０（ｍ，９Ｈ）；ＣＩ ＭＳ（Ｍ＋１） ＋ｍ／ｚ ３７７；Ｃ２４Ｈ２８Ｎ２Ｏ２に対する分析：計算値Ｃ，７６．５５；Ｈ，７．５１；Ｎ，７．４４。実測値Ｃ，７６．２８；Ｈ，７．４６；Ｎ，７．３７。
【０４０５】
例６　４−（２，１，３−ベンゾキサジアゾール−５−イル）−３−［（１−［４−（ジブチルアミノ）−ベンジル］−４−ピペリジルメチル）アミノ］カルボニル−６−メチル−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：１Ｈ ＮＭＲδ ７．７２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．６，９．６Ｈｚ），７．７０−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．１１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．５９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），５．９０（ｓ，１Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｓ，２Ｈ），３．２４（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．８０（ｍ，２Ｈ），２．４９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），２．３８（ｓ，３Ｈ），２．９０−１．００（ｍ，５Ｈ），１．５４（ｐ，４Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），１．３５（ｓｅｘｔｅｔ，４Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），０．９４（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）。
【０４０６】
例７　（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（Ｎ’−エチル）−Ｎ−ベンズイミダゾリール−ピペリジン−１イル］プロピル｝カルボキシアミド−４−メチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソピリミジン塩酸塩：１Ｈ ＮＭＲ δ８．９５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），７．６１（ｂｒ １Ｈ），７．６０−６．９５（ｍ，７Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），４．３６（ｍ，１Ｈ），３．９４（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．４２（ＡＢｍ，４Ｈ），３．３０（ｍ，２Ｈ，４．７６（ｍ，４Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｍ，２Ｈ），１．７７（ｍ，４Ｈ），１．３３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。
【０４０７】
例８　６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−２−オキソ［Ｎ−［３−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロピル］｝カルボキシアミド−ピリミジン：
ＭｅＯＨ中の６−（ベンゾ−フラザン−５−イル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−｛Ｎ−［３−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロピル］｝カルボキシアミドピリミジンの溶液を６Ｎ ＨＣｌを用いて０℃で処理した。溶液を室温にて２時間撹拌し、ＭｅＯＨを真空下で除去した。６−（ベンゾフラザン−５−イル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−２−オキソ−１−｛Ｎ−［３−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロピル］｝カルボキシアミドピリミジン塩酸塩を白色の粉末で得た：ｍ．ｐ．１３４−１３７℃。
【０４０８】
例９　４−（３−メトキシ）−フェニルピペリジン：
ＨＣｌ塩；ｍ．ｐ．１５０−１５４℃；１Ｈ ＮＭＲδ ２．０４（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），２．２５（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），２．８０（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），３．０９（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），３．６６（ｓ，２Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），６．７９（ｓ，ｂｒ，３Ｈ），７．２３（ｓ，１Ｈ），９．４１（ｓ，ｂｒ，１Ｈ）。Ｃ１２Ｈ１８ＮＯＣｌ＋０．３０ＣＨ２Ｃｌ２に対する分析：計算値Ｃ，５８．３４；Ｈ，７．４０；Ｎ，５．５３。実測値Ｃ，５８．３０；Ｈ，７．７１；Ｎ，５．３５。
【０４０９】
（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−Ｎ−［４−（３−メトキシ）−フェニル］−ピペリジン−１−イル］−プロピル−カルボキシアミド−４−メトキシメチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：ｍ．ｐ．８０−８４℃；［α］Ｄ＝＋９４．７，（ｃ＝０．２５，ＭｅＯＨ）；１Ｈ ＮＭＲδ １．７４−１．８４（ｍ，６Ｈ），１．９９−２．０９（ｍ，２Ｈ），２．３８−２．５１（ｍ，３Ｈ），３．０３（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，２Ｈ），３．２３−３．４３（ｍ，２Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），４．７２（ｓ，２Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．７２−６．８４（ｍ，３Ｈ），７．０５−７．１１（ｍ，２Ｈ），７．１５−７．２７（ｍ，２Ｈ），７．７２（ｓ，１Ｈ），８．８４（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）。Ｃ３０Ｈ３７Ｎ４Ｏ６Ｆ２Ｃｌに対する分析：計算値Ｃ，５７．８；Ｈ，６．０；Ｎ，９．０。実測値Ｃ，５７．６１；Ｈ，６．５７；Ｎ，６．９７。
【０４１０】
例１０　（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（３，−アセタミド）−フェニル−ピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−４−メトキシメチル−６−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−２−オキソピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：ｍ．ｐ．１３５−１３８℃；［α］Ｄ＝＋１０５．５，（ｃ＝０．１１，ＭｅＯＨ）；ＥＳＭＳ，６１４．２５（Ｍ＋１）；１Ｈ ＮＭＲδ １．７６−１．８７（ｍ，６Ｈ），２．０３−２．１３（ｍ，２Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．４９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），３．１０（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，２Ｈ），３．３０−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．４６（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．０４−７．１１（ｍ，２Ｈ），７．１６−７．２６（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｓ，１Ｈ），８．９７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）；ＥＳＭＳ，Ｍ＋１　６１４．２５。
【０４１１】
例１０の化合物もまた例２の化合物の水素化（Ｈ２バルーン法，メタノール，Ｐｄ／Ｃ，一晩）により調製し得る。後の方のルート（スキーム１１）に類似した合成経路を用いてトリチウム化した類似物を調製し、次にこれを薬理学的アッセイにおいて放射リガンドとして用いた。
【０４１２】
例１１　３−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロピオニトリル：アクリロニトリル（３．１ｍＬ，４４ｍｍｏｌ，２．５当量）を、ＥｔＯＨ（４０ｍＬ）中の４−フェニルピペリジン（３．００ｇ，１８．０ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、混合物を室温にて１．５時間撹拌した。揮発成分を除去し、３．８０ｇの所望の生成物（茶色の油状物，９９％）を得た。
【０４１３】
３−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロピルアミン：ＴＨＦ中のＢＨの溶液（１．０Ｍ，８３．０ｍＬ，８３．０ｍｍｏｌ，３．５当量）を、無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の３−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロピオニトリル（５．１０ｇ，２４．０ｍｍｏｌ）撹拌中の溶液にアルゴン下で室温にて添加した。混合物を還流温度で４．５時間加熱した後、室温にまで冷却した。６Ｎ ＨＣｌ水溶液（１３０ｍＬ）を添加し、撹拌を２時間５０〜７０℃で続けた。６Ｎ ＮａＯＨ水溶液を添加することにより、混合物をｐＨ９にまで塩基性にし、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（３×１００ｍＬ）で抽出した。合体した有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中に溶解させ、エーテル（１．０Ｍ，５０ｍＬ）中のＨＣｌを用いて処理した。溶媒を除去し、エーテル（２５０ｍＬ）を添加し、混合物を濾過し、フィルターケーキをエーテルで洗浄した。水（６０ｍＬ）を得られた白色の固体に添加し、１Ｎ ＮａＯＨをｐＨ１０〜１１に達するまで添加した後、水相をＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）を用いて抽出し、合体した抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させ、所望の生成物を得た（４．５０ｇ，８７％）。
【０４１４】
６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−２−オキソ−１−｛Ｎ−［３−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロピル］｝カルボキシアミド−ピリミジン：ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の、６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−｛Ｎ−［３−（４−フェニル−ピペリジン−１−イル）プロピル］｝カルボキシアミドピリミジン（１００ｍｇ，０．１８５ｍｍｏｌ，ｍｐ＝４３−４５℃で）の溶液を６Ｎ ＨＣｌ水溶液（１．５ｍＬ）を用いて０℃で処理した。溶液を室温にて２時間撹拌し、ＭｅＯＨを真空下で除去した。６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−２−オキソ−１−｛Ｎ−［３−（４−フェニルピペリジン−１−イル）プロピル］｝カルボキシアミドピリミジン塩酸塩を白色の粉末で得た（８９ｍｇ，８６％）。ｍ．ｐ．１３３−１３６℃。
【０４１５】
例１２　３−［（３，４，５−トリフルオロフェニル）メチレン］−２，４−ペンタンジオン：ベンゼン（１５０ｍＬ）中の、３，４，５−トリフルオロベンズアルデヒド（４．２ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）、２，４−ペンタンジオン（２．６２ｇ，２６．２ｍｍｏｌ）、ピペリジン（０．４３０ｇ，５ｍｍｏｌ）の撹拌混合物を、還流温度で８時間加熱した（Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを装備）。ベンゼンを蒸発させ、黄色の油状の残渣，２−［（３，４，５−トリフルオロフェニル）−メチレン］−２，４−ペンタンジオンをさらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０４１６】
６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−アセチルメチルピリミジン：ＥｔＯＨ（４００ｍＬ）中の２−［（３，４，５−トリフルオロ−フェニル）メチレン］−２，４−ペンタンジオン（２６．２ｍｍｏｌ）、Ｏ−メチルイソウレア硫化水素（３．２２ｇ，３９．３ ｎｕｎＯｌ）、およびＮａＨＣＯ３（６．６０ｇ，７８．６ｍｍｏｌ）の撹拌混合物を９５−１００℃で６時間加熱した。混合物を濾過し、固体の残渣をエタノール（１００ｍＬ）で洗浄した。溶媒を合体したろ液から蒸発させ、粗成物をフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、９／１から４／１）、所望の生成物を油状物で得た（２．８０ｇ，３６％）。
【０４１７】
６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−アセチル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：クロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（１．８８６ｇ，９．３８ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中の６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−アセチル−４−メチルピリミジン（２．８０ｇ，９．３８ｍｍｏｌ）、およびピリジン（１０ｍＬ）の溶液に０〜５℃で添加し、次いで混合物を室温にまで加温した。１２時間後、溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ，９／１から２０／３）、所望の生成物を白色の粉末で得た（４．０ｇ，９２％）。
【０４１８】
６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−５−アセチル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：６Ｎ ＨＣｌ水溶液（４ｍＬ）を、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の６−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−アセチル−４−メチル−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン（４．０ｇ，８．６３ｍｍｏｌ）の撹拌中の溶液に０〜５℃で添加し、混合物を室温にまで加温した。２時間後、溶媒を蒸発させ、生成物を真空下で乾燥させ、所望の生成物を純粋な単一成分で得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた（３．８８ｇ，１００％）。
【０４１９】
（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（４−フルオロフェニル）ピペリジン−１−イル］−プロピル｝カルボキシアミド−５−アセチル−２−オキソ−６−（３，４−５−トリフルオロ−２−フェニル）−４−メチルピリミジン塩酸塩：１Ｈ ＮＭＲδ ７．２０−６．８６（ｍ，６Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），５．５６（ｓ，１Ｈ），３．７０−３．８０（ｍ，２Ｈ），３．４３−３．３５（ｍ，２Ｈ），３．１９−２．９８（ｍ，２Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），２．２８（ｓ，３Ｈ），２．５０−１．６０（ｍ，８Ｈ）。
【０４２０】
例１３　Ｎ１−［４−（［４−（ジブチルアミノ）ベンジル］アミノメチル）シクロヘキシル］−１−ナフト−アミド：
１Ｈ ＮＭＲδ ８．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１，７．２Ｈｚ），７．８７（ｍ，２Ｈ），７．５１（ｍ，２Ｈ），７．４０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．６１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），５．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８，１Ｈｚ），４．０４（ｍ，１Ｈ），３．７６（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ ａｖｅｒａｇｅ），２．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），２．１０，ＡＢｍ，４Ｈ），１．５５（ｐ，４Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ ａｖｅｒａｇｅ），１．３４（ｓｅｐｔ，４Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ ａｖｅｒａｇｅ），１．１７（ｍ，４Ｈ），０．９５（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ ａｖｅｒａｇｅ）。
【０４２１】
例１４　（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（１−ナフチル）−ピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−４−メトキシメチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：ｍ．ｐ．１６８−１７２℃；［α］Ｄ＝＋９４．７，（ｃ＝０．２５，ＭｅＯＨ）；１Ｈ ＮＭＲδ １．７５−１．８４（ｍ，２Ｈ），１．８７−２．０１（ｍ，４Ｈ），２．１４−２．２８（ｍ，２Ｈ），２．４７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．１０（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，２Ｈ），３．２８−３．４５（ｍ，３Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ），６．７０（ｓ，１Ｈ），７．０５−７．１２（ｍ，２Ｈ），７．１６−７．２４（ｍ，１Ｈ），７．４２−７．５４（ｍ，４Ｈ），７．６９−７．７５（ｍ，２Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ），８．９１（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４２２】
例１５　４−（５−フルオロ−２−メトキシ）フェニル−１−ピペリジン：ｍ．ｐ．２５４−２５８℃；１Ｈ ＮＭＲδ １．５３−１．６８（ｍ，２Ｈ），１．７９（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，２Ｈ），２．１２（ｄｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．７７（ｄｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），２．９０−３．０５（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．２２（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｓ，１Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），６．７２−６．９３（ｍ，３Ｈ）。Ｃ１２Ｈ１７ＮＯＦＣｌ＋０．１４ＣＨ２Ｃｌ２に対する分析：計算値Ｃ，５６．６０；Ｈ，６．７６；Ｎ，５．４４．。実測値Ｃ，５６．６０；Ｈ，６．９２；Ｎ，５．２８。
【０４２３】
（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（５−フルオロ−２−メトキシ）フェニルピペリ−ジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−４−メトキシメチル−６−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−２−オキソピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：１Ｈ ＮＭＲδ ８．９３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），７．７６（ｂｒ，１Ｈ），７．３０−６．６９（ｍ，７Ｈ），４．６９（ｓ，２Ｈ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｍ，２Ｈ），３．１０−２．８０（ｍ，３Ｈ），２．４２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．０７（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝３．０，８．４Ｈｚ），２．００−１．６０（ｍ，６Ｈ）。
【０４２４】
例１６　（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−ヒドロキシ−４−（２−ピリジル）−ピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−４−メトキシメチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：ｍ．ｐ．１３２−１３５℃；［α］Ｄ＝＋９４．７，（ｃ＝０．２５，ＭｅＯＨ）；１Ｈ ＮＭＲ δ１．４７（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，２Ｈ），１．７４−１．８５（ｍ，２Ｈ），２．４３−２．６３（ｍ，９Ｈ），２．８７（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，２Ｈ），３．３０−３．４７（ｍ，２Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），４．６９（ｓ，２Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），７．０４−７．２１（ｍ，４Ｈ），７．４９（ｄｄ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），８．３６（ｄｄ，Ｊ＝１．２，４．８Ｈｚ，１Ｈ），８．８９（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４２５】
例１７　１−（３−アミノプロピル）−４−［２−ピリジル］ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩：
ＤＭＦ（６０ｍＬ）中の２，４’−ジピリジル（２５．０ｇ，１６０ｍｍｏｌ）および３−ブロモプロピル−アミン臭化水素酸塩（３５．０ｇ，１６０ｍｍｏｌ）の溶液を、９０−９５℃で１０時間加熱した。室温にまで冷却した後、無水エーテル（５００ｍＬ）を混合物に添加し、得られた白色の固体を濾過し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、乾燥させ、１−（３−アミノプロピル）−４−［２−ピリジル］ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩（６０ｇ，１００％））を得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ ２．３５−２．４４（ｍ，２Ｈ），３．０８−３．１３（ｍ，２Ｈ），４．７６−４．８１（ｍ，２Ｈ），７．５８（ｄｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．７７−８．８１（ｍ，３Ｈ），９．１２（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）。Ｃ１３Ｈ１６Ｎ３Ｂｒ＋ＨＢｒ＋０．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，４０．６５；Ｈ，４．７２；Ｎ，１０．９４。実測値Ｃ，４０．８３；Ｈ，４．３７；Ｎ，１１．０５。
【０４２６】
３−（３’，６’−ジヒドロ−２’−Ｈ−［２，４’］ビピリジニル−１’−イル）−プロピルアミン：ＮａＢＨ４（２ｇ，５３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）中の１−（３−アミノプロピル）−４−［２−ピリジル］ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩（６ｇ，１６ｍｍｏｌ）の溶液に０〜５℃で２時間にわたり少量ずつ添加した。反応混合物を一晩室温にて撹拌し、次いで溶媒を蒸発させた。残渣をエーテル（２００ｍＬ）中に懸濁し、ＮａＯＨ ５０％水溶液（１００ｍＬ）を用いて処理した。エーテル層を分離し、水層をさらなるエーテル（２×５０ｍＬ）で抽出した。合体したエーテル抽出物を炭酸カリウム上で乾燥させ、溶媒を除去して３−（３’，６’−ジヒドロ−２’−Ｈ−［２，４’］ビピリジニル−１’−イル）−プロピルアミン（３．４８ｇ）を油状物で得た。粗成物をさらに精製することなく、直ちに次なる工程に用いた。
【０４２７】
３−アミノプロピル−４−（２−ピリジル）ピペリジン：ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中の３−（３’，６’−ジヒドロ−２’−Ｈ−［２，４’］ビピリジニル−１’−イル）−プロピルアミン（３．４８ｇ 粗製，１５．９ｍｍｏｌ）およびＰｅａｒｌｍａｎ触媒（１．０ｇ）の懸濁液を１２０ｐｓｉで１０時間水素化した後、反応混合物をセライトのパッドに通し、溶媒を除去した。残渣をシリカゲル（３０ｇ）上のカラムクロマトグラフィ（ＭｅＯＨ中にＣＨ２Ｃｌ２／メタノール／２Ｍ ＮＨ３，９０／８／４から９０／４０／４０）により精製した［注：シリカゲルを過剰に多量に用いた場合、生成物の回収は極めて少ない］。生成物を黄色の油状物で得た（３．２１ｇ，９１％）。１Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤ３ＯＤ） １．５０−１．９９（ｍ，１０Ｈ），２．０２−２．０６（ｍ，２Ｈ），２．３７−２．７５（ｍ，３Ｈ），３．０２−３．０６（ｂｒ ｍ，２Ｈ），７．０５−７．０９（ｍ，４Ｈ），７．１６（ｄｔ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．４８（ｄｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４２８】
パートＩＩ
（＋）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−｛Ｎ−［４−（２−ピリジル）ピペリジン−１−イル］−プロピル］｝カルボキシアミド−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−２−オキソ−１，２，３，６−テトラヒドロ−５−塩化ピリミジンジヒドロ
５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−ピリミジン：酸化銅（Ｉ）（５．０６ｇ，０．０３５モル）および酢酸（２．０５ｍＬ）を、ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の４−メトキシアセト酢酸メチル（５０．０ｇ，０．３５１ｍｏｌ）、３，４−ジフルオロベンズアルデヒド（５１．４ｇ，０．３５１ｍｍｏｌ）、および尿素（３１．６ｇ，０．５２７モル）の撹拌中の溶液に、室温で連続して添加し、続いてボロントリフルオライドジエチルエーテル化合物（５６．０ｍＬ，０．４５６モル）を滴下添加した。混合物を還流温度で８時間撹拌した時点で、ＴＬＣ（１／１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）は反応が完了したことを示した。反応混合物を冷却し、氷および炭酸水素ナトリウム（１００ｇ）の混合物中に注ぎ、得られた混合物をセライトを介して濾過した。セライトパッドをジクロロメタン（４００ｍＬ）で洗浄した。有機層をろ液から分離し、水層をさらなるジクロロメタン（３×３００ｍＬ）を用いて抽出した。合体した有機抽出物を乾燥させ（硫酸ソーダ）、溶媒を蒸発させた。粗成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（酢酸／ヘキサン、１／１；次いで酢酸）、所望の生成物を薄い黄色の泡状物で得た。この泡状物をヘキサンを用いて粉砕し、白色の粉末を得た（１０３．３ｇ，９４％）。１Ｈ ＮＭＲδ ３．４７６（ｓ，３Ｈ），３．６５１（ｓ，３Ｈ），４．６５３（ｓ，２Ｈ），５．３９（ｓ，１Ｈ），６．６０（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．００−７．２０（ｍ，３Ｈ），７．７２（ｂｒ ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。
【０４２９】
（＋）−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−ピリミジン：ラセミ中間体５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジンを、キラルＨＰＬＣ［キラルセルＯＤ ２０×２５０ ｍｍ ＃３６９ ３０６０４；ラムダ２５４ ｎｍ；ヘキサン／エタノール ９０／１０；注入毎に８５ｍｇ；所望のエナンチオマーの保持時間：１６．９４分，最初のエナンチオマーピークが溶出するまで］により分割した。（＋）−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−ピリミジンを得た（ラセミ酸塩から所望のエナンチオマーを４０〜４２重量％分離）；［α］Ｄ＝＋８３．８（ｃ＝０．５，クロロホルム）。
【０４３０】
（＋）−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン：
ＴＨＦ中のリチウムヘキサメチルジシラジドの溶液（１Ｍ，１８．０ｍＬ，１８．０ｍｍｏｌ）を２〜３分にわたり、無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の（＋）−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−ピリミジン（１．９８ｇ，６．３４ｍｍｏｌ）の溶液に−７８℃でアルゴン雰囲気下で添加し、混合物を１０分撹拌し、得られた溶液を６分にわたりカニューレを介して、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（４．４７ｇ，２２．２ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に−７８℃で添加した。混合物をさらに１０分撹拌し、混合物を氷（５０ｇ）中に注ぎ、クロロホルム（２×５０ｍＬ）で抽出した。合体した抽出物を乾燥させ（硫酸ソーダ）、溶媒を蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ヘキサン／酢酸，４／１から３．５／１）、生成物を黄色のシロップで得、これをヘキサンを用いて粉砕し、白色の粉末を得た（２．４０ｇ，７９％） １Ｈ ＮＭＲδ ３．５２（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），４．７６−４．８０（ｑ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），６．３２（ｓ，１Ｈ），７．１０−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ），８．２７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ）。
【０４３１】
（＋）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−｛Ｎ−［４−（２−ピリジル）ピペリジン−１−イル］−プロピル］｝カルボキシアミド−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−２−オキソ−１，２，３，６−テトラヒドロ−５−塩化ピリミジンジヒドロ：ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の（＋）−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−１，２，３，６−テトラヒドロ−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［（４−ニトロフェニルオキシ）カルボニル］ピリミジン（２．３８ｇ，５ｍｍｏｌ）、３−アミノプロピル（２−ピリジル）ピペリジン（１．２１ｇ，５．５ｍｍｏｌ）の溶液を室温にて１２時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）中に再び溶解させた。得られた溶液を氷冷した１Ｎ ＮａＯＨ（４×５０ｍＬ）、塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、炭酸カリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＭｅＯＨ中にジクロロメタン／ＭｅＯＨ／２Ｍ アンモニア，９８０／１０／１０ から ９４０／３０／３０）、所望の生成物の純粋な泡状の分画（２．４５ｇ，８８％）、および僅かに不純な分画（０．３０ｇ，１０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ δ１．６０−２．００（ｍ，６Ｈ），２．０５−２．１５（ｍ，２Ｈ），２．３８−２．４３（ｂｒ ｔ，２Ｈ），２．６５−２．８０（ｍ，１Ｈ），３．０５−３．０６（ｂｒ ｄ，２Ｈ），３．３０−３．４５（ｍ，２Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），３．７０４（ｓ，３Ｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），７．０５−７．２０（ｍ，５Ｈ），７．５８−７．６３（ｄｔ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．５０−８．５２（ｄｄ，１Ｈ），８．８８（ｂｒ ｔ，１Ｈ）。
【０４３２】
ＨＣｌ塩を、エーテル中の遊離塩基の溶液をエーテル中の１Ｎ ＨＣｌを用いて処理することにより調製した。白色の粉末を得、これを減圧下で乾燥させた：１Ｈ ＮＭＲδ ２．０５−２．２０（ｍ，４Ｈ），２．７７−２．８８（ｍ，２Ｈ），３．００−３．２０（ｍ，４Ｈ），３．３５−３．４７（ｍ，２Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），３．６４−３．７０（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），４．０５（ｂｒ ｔ，１Ｈ），４．６７（ｓ，２Ｈ），６．５９（ｓ，１Ｈ），７．０５−７．２０（ｍ，３Ｈ），７．７９（ｔ，１Ｈ），８．００（ｄ，１Ｈ），８．４３（ｄｔ，１Ｈ），８．９６（ｂｒ ｔ，１Ｈ，ＮＨ），１２．４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）。ｍ．ｐ．１８８−１９１℃；［α］Ｄ＝＋１４１．１３（ｃ＝０．２６５，ＭｅＯＨ）；Ｃ Ｈ３４Ｎ５Ｏ５Ｆ２Ｃｌ＋０．６Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５２．３６；Ｈ，５．８４；Ｎ，１０．９０。実測値Ｃ，５２．２４；Ｈ，５．９６；Ｎ，１０．８０（注：該生成物のＮＭＲ分析によれば水分は全く存在しなかった。しかし元素分析を実施した実験室は、この試料が大気から水分を吸収することにより作業中に重量が増えることを記している）。
【０４３３】
例１８　（１）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（イソベンゾフラン）ピペリジン−１−イル］−プロピル｝カルボキシアミド−５−メトキシカルボニル−２−オキソ−６−（３，４−ベンゾフラザン）−４−メチルピリミジン塩酸塩
４−（３，４−ベンゾフラザン）−６−メチル−２−オキソ−３｛［３−（４−スピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］プロピル｝−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：１−（３−アミノプロピル）−４−スピロ［イソ−ベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］（０．０２８ｇ，０．１１０ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（±）−６−（ベンゾフラザン）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルピリミジン（０．０４７ｇ，０．１００ ＭＭ０１）に添加し、溶液を室温にて２４時間撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ水溶液（２ｍＬ）を反応混合物に添加し、さらに１時間撹拌した。反応混合物をＫＯＨ １０％水溶液を用いて塩基性にし（ｐＨ＝９）、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）中に抽出させた。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，４．５／０．５）、所望の生成物（４１．０ｍｇ，７３％）をシロップで得た：１Ｈ ＮＭＲδ １．７６−１．８１（ｍ，７Ｈ），１．９４−２．０４（ｍ，６Ｈ），２．３２−２．４８（ｍ，１Ｈ），２．８３（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３６−３．４３（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），７．０７−７．２７（ｍ，４Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，１Ｈ），８．８５（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４３４】
エーテル中のＨＣｌ（１Ｎ，５ｍＬ）を、ジクロロメタン（４ｍＬ）中の遊離塩基（０．０４１ｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を減圧下で濃縮した。生成物をエーテルから再結晶化させ、塩酸塩の塩を薄い黄色の固体で得た（４２．０ｍｇ，９６％）；ｍ．ｐ．１８０−１８２℃；Ｃ２９Ｈ３４Ｎ６Ｏ６Ｃｌ＋０．５モルＨ２Ｏに対する分析：計算値ＣＩ ５７．４７；Ｈ，５．６５；Ｎ，１３．８７。実測値Ｃ，５７．４２；Ｈ，５．７１；Ｎ，１３．７０。
【０４３５】
例１９　２−（３，４−ジフルオロフェニル）４，５−ジヒドロイミダゾール−１−カルボン酸｛３−［４−フェニル−４−（４−ブロモ−５−メチルチオフェン−２−イル）］−プロピル｝アミド：　Ｃ３０Ｈ３０Ｎ４Ｏ５ＣｌＦ３＋ＨＣｌ＋１．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５５．２６；Ｈ，６．０３；Ｎ，８．５９。実測値Ｃ，５５．２９；Ｈ，５．９５；Ｎ，８．３９。
【０４３６】
例２０　４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−｛［３−（４−スピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］プロピル｝−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル
例２０の化合物びエーテルピペリジン前駆体の調製については、Ｗ．Ｅ．Ｐａｒｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．（１９７６） ４１，２２６８．を参照されたい。
【０４３７】
１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（４−スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］）プロピルアミン：Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３−ブロモ−プロピルアミン（０．７７２ｇ，３．２７ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（０．９０４ｇ，６．５４ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（２０ｍＬ）中のアミン（０．５６６ｇ，３．２７ｍｍｏｌ）の撹拌中の溶液に添加し、反応混合物を還流温度で２４時間加熱した。反応混合物を室温にまで冷却し、濃縮し、クロロホルム（４０ｍＬ）および水（５ｍＬ）の間で分配した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をカラムクロマトグラフィにより精製し（酢酸／メタノール，４．５／０．５）、所望の生成物（０．８５６ｇ，７９％）を無色の油状物で得た；１Ｈ ＮＭＲδ １．４５（ｓ，９Ｈ），１．６３−２．０４（ｍ，６Ｈ），２．３３−２．５２（ｍ，４Ｈ），２．８７（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，２Ｈ），３．２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），５．６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．１３−７．２８（ｍ，４Ｈ）。
【０４３８】
３−（４−スピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］）プロピルアミン：
トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル３−（４−スピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］）プロピルアミン（０．５００ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を室温にて１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＫＯＨ １０％溶液を用いて中和し、ジクロロメタン（２５ｍＬ）中に抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、所望のアミン（０．３４０ｇ，９８％）を得、これをさらに精製することなく後続する工程に用いた。
【０４３９】
４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−３｛［３−（４−スピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］プロピル｝−１，２，３，４テトラヒドロ−５−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：３−（４−スピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］）プロピルアミン（０．０３１９ｇ，０．１２３ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（±）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルピリミジン（０．０５２ｇ，０．１１２ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を室温にて２４時間撹拌した。６Ｎ ＨＣｌ水溶液（２ｍＬ）を添加し、反応混合物をさらに１時間撹拌した。ＫＯＨ １０％水溶液を用いて中和した後、反応混合物をジクロロメタン（３×１０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，４．５／０．５）、所望の生成物（０．０４０ｇ，６４％）をシロップで得た；１Ｈ−ＮＭＲδ １．７３−１．７８（ｍ，７Ｈ），１．９３−２．０４（ｍ，２Ｈ），２．３３−２．４８（ｍ，６Ｈ），２．８３（ｄ，Ｊ＝１１．８Ｈｚ，２Ｈ），３．３５−３．４１（ｍ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），６．７５（ｓ，１Ｈ），７．０４−７．２６（ｍ，７Ｈ），８．８２（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４４０】
エーテル（５ｍＬ）中の１Ｎ ＨＣｌの溶液を、ジクロロメタン（４ｍＬ）中の遊離塩基（０．０４０ｇ，０．０７２ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を真空下で濃縮した。生成物をエーテルから再結晶化させ、ジヒドロクロライドを薄い黄色の固体で得た（０．０４２ｇ，９９％）；ｍ．ｐ．１７８−１８２℃；Ｃ２９Ｈ３４Ｆ２Ｎ４Ｏ５Ｃｌ２＋０．６Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５７．８７；Ｈ，５．１３，Ｎ，９．３１。実測値Ｃ，５８．１１；Ｈ，５．９０；Ｎ，８．９５。
【０４４１】
例２１　１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（ジヒドロインデン）−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−５−メトキシカルボニル−２−オキソ−６−（３，４−ベンゾフラザン）−４−メチルピリミド−イン
例２１の化合物のインダンピペリジン前駆体の調製については、Ｍ．Ｓ．Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９２） ３５， ２０３３．を参照されたい。
【０４４２】
Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）３−（４−スピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］）プロピルアミン（１．１０ｇ，４．６４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１．１７ｇ，８．４４ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（２０ｍＬ）中のアミン（０．７９０ｇ，４．２２ｍｍｏｌ）の撹拌中の溶液に添加し、得られた溶液を還流温度で２４時間加熱した。反応混合物を室温にまで冷却し、濃縮し、クロロホルム（４０ｍＬ）および水（５ｍＬ）の間で分配した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をカラムクロマトグラフィにより精製し（酢酸／メタノール，４．５／０．５）、所望の生成物（０．８８６ｇ，６１％）を無色の油状物で得た；１Ｈ ＮＭＲ δ１．４６（ｓ，９Ｈ），１．５５（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６９（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８８−２．４７（ｍ，６Ｈ），２．４７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，４Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），５．８５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．１８（ｓ，４Ｈ）。
【０４４３】
トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中の１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−（４−スピロ［イソベンゾ−フラン−１（３Ｈ），４’−ピペリジン］｝プロピルアミン（０．１８０ｇ，０．５２ｍｍｏｌ）に添加し、得られた溶液を室温にて１時間撹拌し、溶液を濃縮し、ＫＯＨ １０％溶液を用いて中和し、ジクロロメタン（２５ｍＬ）中に抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、プロピルアミンを得（０．１５６ｇ，１００％）、これをさらに精製することなく後続する工程に用いた。
【０４４４】
（±）−４−（３，４−ベンゾフラザン）−６−メチル−２−オキソ−３−｛スピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］プロピル｝−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル塩酸塩：
乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（±）−４−（３，４−ベンゾフラザン）−１，６−ジヒドロメトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−（４−ニトロフェノキシ）−カルボニルピリミジン（０．０５９ｇ，０．１２６ｍｍｏｌ）に、１−（３−アミノプロピル）スピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］（０．０６２ｇ，０．２５２ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温にて２４時間撹拌した。反応混合物に２ｍＬの６Ｎ ＨＣｌを添加した後さらに１時間撹拌した。反応混合物をＫＯＨ １０％水溶液を用いて塩基性にし（ｐＨ＝９）、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）を用いて抽出した。合体した有機抽出物を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ． ４．５／０．５）、０．０７０ｇ（１００％）の所望の生成物をシロップで得た：１Ｈ ＮＭＲδ １．５１（ｄ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ，２Ｈ），１．７６−２．０８（ｍ，４Ｈ），２．１２（ｔ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４５（ｓ，５Ｈ），２．８６−２．９１（ｍ，４Ｈ），３．３０−３．４５（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），７．０２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．０（ｍ，４Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．８４（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４４５】
４ｍＬのジクロロメタン中の遊離塩基（０．０７０ｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）に、エーテル中の１Ｎ ＨＣｌ ５ｍＬを添加し、溶液を減圧下で濃縮した。エーテルからの再結晶化を経て０．０８８ｇ（１００％）の（±）−４−（３，４−ベンゾフラザン）−６−メチル−２−オキソ−３−｛スピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］プロピル｝−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル塩酸塩を白色の固体で得た：ｍ．ｐ．１５５−１５７℃；Ｃ３０Ｈ３６Ｎ６Ｏ５Ｃｌに対する分析：計算値Ｃ，５７．１２；Ｈ，５．７６；Ｎ，１３．３３。実測値Ｃ，５７．４０；Ｈ，５．９６；Ｎ，１３．０２。
【０４４６】
例２２　（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（ベンゾ−４’，５’（Ｈ）フラン）ピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−４−エチル−６−（３−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−ピリミジン−５−カルボキシアミド塩酸塩：
ＤＭＡＰ・ＥＣＤ（０．２５０ｍｍｏｌ，０．０５０ｇ）を、乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の（＋）−１，２，３，６−テトラ−ヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（ベンゾ−４１，５１（Ｈ）フラン）ピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシ−アミド−４−エチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−ピリジミン−５−カルボン酸塩酸塩（０．１００ｍｍｏｌ，０．０５５ｇ）およびＮ−メチルモルホリン（０．３３０ｍＬ）の撹拌した混合物に添加した。得られた混合物を室温にて１時間撹拌し、ＮＨ３を用いてクエンチした。反応混合物を室温にて一晩撹拌し、濃縮し、クロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た。エーテル中のＨＣｌをジクロロメタン中の生成物の溶液に添加し、続いて溶媒を蒸発させることによりＨＣｌ塩を調製した。Ｃ２９Ｈ３３Ｎ５Ｏ４Ｆ２＋ＨＣｌ＋０．７ＣＨＣｌ３に対する分析：計算値Ｃ，５２．９６；Ｈ，５．２９；Ｎ，９．４０。実測値Ｃ，５２．８１；Ｈ，５．６９；Ｎ，８．９７。
【０４４７】
例２３　（１）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（３，４−ジヒド−２−ロオキソスピロ−ナフタレン−１（２Ｈ））−ピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−５−メトキシカルボニル−２−オキソ−６−（３，４−ベンゾフラザン）−４−メチルピリミジン塩酸塩
１−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）スピロ［イソクロマン−３，４−’ピペリジン］−１−オン：ジオキサン（２０ｍＬ）中の、スピロ［ピペリジン−４，１’−テトラリン］、スピロ［イソクロマン−３，４’−ピペリジン］−１−オン（Ｋ．Ｈａｓｈｉｇａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８４） ３２， ３５６８．）（０．５８７ｇ，２．５８ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３−ブロモプロピルアミン（０．６１５ｇ，２．８４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（０．７１４ｇ，５．１７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を２４時間還流させた。反応混合物を室温にまで冷却し、濃縮し、４０ｍＬ クロロホルムおよび５ｍＬ 水の間で分配した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をカラムクロマトグラフィにより精製し（酢酸／メタノール，４．５／０．５）、０．４６５ｇ（４７％）の所望の生成物を無色の油状物で得た；１Ｈ ＮＭＲδ １．４５（ｓ，９Ｈ），１．６４−２．１８（ｍ，７Ｈ），２．４５−２．８４（ｍ，６Ｈ），３．１９−３．９５（ｍ，４Ｈ），６．０１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．１３−７．２６（ｍ，３Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈ）。
【０４４８】
工程Ｂ．１−（３−アミノプロピル）スピロ［イソクロマン−３，４’ピペリジン］−１−オン：
５ｍＬのジクロロメタン中の１−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）スピロ［イソクロマン−３，４’−ピペリジン］−１−オン（０．１４４ｇ，０．３７５ｍｍｏｌ）に、１ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加し、溶液を室温にて１時間撹拌した。溶液を濃縮し、ＫＯＨ １０％溶液を用いて中和し、２５ｍＬのジクロロメタン中に抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、０．１１０ｇ（１００％）の生成物を得、これを後続する工程に用いた。
【０４４９】
（±）−４−（３，４−ベンゾフラザン）−４−メチル−２−オキソ−３−｛（スピロ［イソクロマン−３，４−ピペリジン］−１−オン）プロピル｝−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：
１０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の（±）−４−（３，４−ベンゾフラザン）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−（４−ニトロフェノキシ）−カルボニルピリミジン（４０．０ｍｇ，０．０８６５ｍｍｏｌ）に、スピロ［イソクロマン−３，４’ピペリジン］−１−オン（４４．０ｍｇ，０．１７３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温にて２４時間撹拌した。２ｍＬの６Ｎ ＨＣｌを添加した後、反応混合物をさらに１時間撹拌した。反応混合物をＫＯＨ １０％水溶液を用いて塩基性にし（ＰＨ＝９）、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）中に抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，４．５／０．５）、５０．０ｍｇ（１００％）の所望の生成物をシロップで得た：１Ｈ ＮＭＲ δ１．６７−２．１３（ｍ，８Ｈ），２．４５（ｍ，５Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．７２−２．７５（ｍ，２Ｈ），３．１９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．３４−３．４５（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），６．８２（ｓ，１Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），７．４４（ｍ，３Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１３−７．４３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），８．８７（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４５０】
４ｍＬのジクロロメタン中の遊離塩基（５０．０ｍｇ，０．０８４ｍｍｏｌ）に、エーテル中の５ｍＬの１Ｎ ＨＣｌを添加し、溶液を減圧下で濃縮した。エーテルからの再結晶化を経て３０．０ｍｇ（８６％）の生成物を白色の固体で得た：ｍ．ｐ．１６５−１６７℃；Ｃ３１Ｈ３６Ｎ６Ｏ６Ｃｌ＋１．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５７．８１；Ｈ，５７．８１；Ｈ，５．９５。実測値Ｃ，５７．７５；Ｈ，５．９１。
【０４５１】
例２４　（１）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（３，４−ジヒド−２−ロオキソスピロ ナフタレン−１（２Ｈ））−ピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−５−メトキシ−カルボニル−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−メチルピリミジン
（±）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−３−［（スピロ［イソクロマン−３，４’ピペリジン］−１−オン）プロピル｝−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：１０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の（±）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルピリミジン（４０．０ｍｇ，０．０８６５ｍｍｏｌ）に、スピロ［イソクロマン−３，４’ピペリジン］−１−オン（４４．０ｍｇ，０．１７３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温にて２４時間撹拌した。２ｍＬの６Ｎ ＨＣｌを添加した後反応混合物をさらに１時間撹拌した。反応混合物をＫＯＨ １０％水溶液を用いて塩基性にし（ｐＨ＝９）、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）中に抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，４．５／０．５）、４５．０ｍｇ（９０％）の（±）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−３−｛（スピロ［イソクロマン−３，４’ピペリジン］−１−オン）プロピル｝−１，２，３，４−テトラヒドロピリジミ−ジン−５−カルボン酸メチルエステルをシロップで得た；１Ｈ ＮＭＲδ １．７５−１．９４（ｍ，９Ｈ），２．０５−２．１３（ｍ，４Ｈ），２．３６−２．４１（ｍ，５Ｈ），２．７０（ｔ，Ｊ＝７．３５Ｈｚ，２Ｈ），２．７７（ｍ，２Ｈ），３．１９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９３−３．４３（ｍ，２Ｈ），６．６９（ｓ，１Ｈ），７．０４−７．４５（ｍ，８Ｈ），８．８２（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４５２】
４ｍＬのジクロロメタン中の遊離塩基（４５．０ｇ，０．０７７ｍｍｏｌ）に、エーテル中の５ｍＬの１Ｎ ＨＣｌを添加し、溶液を真空下で濃縮した。エーテルからの再結晶化を経て０．０５０ｇ（１００％）の（±）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−３−｛（スピロ−［イソクロマン−３，４’ピペリジン］−１−オン）プロピル｝−１，２，３，４−テトラヒドロ−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル塩酸塩を白色の固体で得た：ｍ．ｐ．１５０−１５２℃；Ｃ３１Ｈ３８Ｆ２Ｎ４ＯＣｌ＋２Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５６．４９；Ｈ，５．９６。実測値Ｃ，５６．４０；Ｈ，５．９５。
【０４５３】
例２５　５−［（Ｚ）−１−（１−エチル−２，２，４−トリメチル−１，２−ジヒドロ−６−キノリニル）−メチリデン］−２−チオキソ−１，３−チアゾラン−１−オン
例２６　１−［ビス（４−フルオロフェニル）メチル］−４−（３−フェニル−２−プロペニル）ピペラジン
例２７　４−［（４−イミダゾ［１，２−Ａ］ピリジン−２−イルフェニル）イミノ］メチル−５−メチル−１，３−ベンゼンジオール
例２８　１−［３−（４−クロロベンゾイル）］プロピル−４−ベンズアミドピペリジン
１−［３−（４−クロロベンゾイル）プロピル］−４−ベンズアミドピペリジンの調製
１−［３−（４−クロロベンゾイル）プロピル］−４−ベンズアミドピペリジン：５０ｍＬのアセトン中の３−（４−クロロベンゾル）プロピル臭化物（６４０ｍｇ，２．４５ｍｍｏｌ）、４−ベンズアミドピペリジン（５００ｍｇ，２．４５ｍｍｏｌ）、およびＫ２ＣＯ３（１．０１ｇ，７．３４ｍｍｏｌ）の混合物を還流温度で４８時間加熱した。冷却した反応混合物を濾過して固体を除去し、真空下で濃縮し、黄色の固体を得、これをクロマトグラフィにより精製した（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３，５／９５）。生成物（３２０ｍｇ，３３．９％）を白色の粉末で分離した：１Ｈ ＮＭＲδ １．４６（ｄｑ，Ｊ１＝１．０Ｈｚ，Ｊ２＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９０−２．１０（ｍ，４Ｈ），２．１６（ｍ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．８０−２．９０（ｍ，２Ｈ），２．９７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．９７（ｍ，１Ｈ），５．９２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ），７．４０−８．００（ｍ，９Ｈ）。生成物をＨＣｌ塩に変換し、ＭｅＯＨ／Ｅｔ２Ｏから結晶化した。ｍ．ｐ．２４３−２４４℃；Ｃ２２Ｈ２５ＣｌＮ２Ｏ２＋ＨＣｌ＋Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，６０．１５；Ｈ，６．３７；Ｎ，６．３７；実測値Ｃ，６０．１８；Ｈ，６．３４；Ｎ，６．２９。
【０４５４】
例２９　４−［４−（４−クロロフェニル）−４−ヒドロキシ−１−ピペリジニル］−１−（４−クロロフェン−１−イル）−１−ブタノン
例３０　Ｎ−メチル−８−［４−（４−フルオロフェニル）−４−オキソブチル］−１−フェニル−１，３，８−トリ−アザスピロ−［４．５］デカン−４−オン
例３１　１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イル（２−ニトロフェニル）スルフォン
例３２　（１）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（ジヒドロインデン）−１−イル］プロピル｝−カルボキシアミド−５−メトキシカルボニル−２−オキソ−６−（３，４−ジフルオロ）−４−メチル−ピリミジン
１−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）スピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］：ジオキサン（２０ｍＬ）中のスピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］（Ｍ．Ｓ．Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９２） ３５， ２０３３．）（０．７９０ｇ，４．２２ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル）−３−ブロモプロピルアミン（１．１ｇ，４．６４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１．１７ｇ，８．４４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を還流温度で２４時間加熱した。反応混合物を室温にまで冷却し、濃縮し、４０ｍＬのクロロホルムおよび５ｍＬの水の間で分配した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をカラムクロマトグラフィにより精製し（酢酸／メタノール，４．５／０．５）、０．８８６ｇ（６１％）の所望の生成物を無色の油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ δ１．４６（ｓ，９Ｈ），１．５５（ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，２Ｈ），１．６９（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８８ ４７（ｍ，６Ｈ），２．４７（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，４Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），５．８５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．１８（ｓ，４Ｈ）。
【０４５５】
１−（３−アミノプロピル）スピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］：５ｍＬのジクロロメタン中の１−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノプロピル）スピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］（０．１８０ｇ，０．５２ｍｍｏｌ）に１ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加し、溶液を室温にて１時間撹拌した。溶液を濃縮し、ＫＯＨ １０％溶液を用いて中和し、２５ｍＬのジクロロメタン中に抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、０．１５６ｇ（１００％）の生成物を得、これを後続する工程に用いた。
【０４５６】
（±）−４−（３，４−ジフルオロ）−６−メチル−２−オキソ−３−｛スピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］プロピル｝−１，２，３，４−テトラヒドロピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：１０ｍＬの乾燥ジクロロメタン中の（±）−４−（３，４−ジフルオロ）１，６−ジヒドロ−２−メトキシ−５−メトキシカルボニル−４−メチル−１−（４−ニトロフェノキシ）カルボニルピリミジン（５０．０ｇ，０．１０８ｍｍｏｌ）に、１−（３−アミノプロピル）スピロ［１Ｈ−インダン−１，４’−ピペリジン］（５３．０ｍｇ，０．２１６ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温にて２４時間撹拌した。２ｍＬの６Ｎ ＨＣｌを添加した後、反応混合物をさらに１時間撹拌した。反応混合物をＫＯＨ １０％水溶液を用いて塩基性にし（ｐＨ＝９）、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）中に抽出した。有機層を硫酸ソーダ上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗成物をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，４．５／０．５）、６０．０ｍｇ（１００％）の生成物をシロップで得た：１Ｈ ＮＭＲδ １．５２（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７０−２．０７（ｍ，８Ｈ），２．１２（ｔ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（ｓ，４Ｈ），２．８６−２．９１（ｍ，３Ｈ），３．３２−３．４３（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），６．７１（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．０４−７．１９（ｍ，７Ｈ），８．８２（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４５７】
４ｍＬのジクロロメタン中の遊離塩基（０．０６０ｇ，０．１０８ｍｍｏｌ）に、エーテル中の１Ｎ ＨＣｌ ５ｍＬを添加し、溶液を減圧下で濃縮した。エーテルからの再結晶化を経て０．０７０ｇ（１００％）の生成物を白色の固体で得た；ｍ．ｐ．１５０−１５３℃；Ｃ３０Ｈ３６Ｆ２Ｎ４Ｏ６Ｃｌに対する分析：計算値Ｃ，５４．８６；Ｈ，５．５３；Ｎ，８．５４。実測値Ｃ，５４．９６；Ｈ，５．５７；Ｎ，８．２７。
【０４５８】
例３３　（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（３，４，５−トリフルオロ）−フェニル−ピペリジン−１−イル］プロピル｝カルボキシアミド−４−メトキシメチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル：ｍ．ｐ．　℃；［α］Ｄ＝＋１２３．０，（ｃ＝０．１５，ＭｅＯＨ）；１Ｈ ＮＭＲδ １．７０−１．８２（ｍ，６Ｈ），１．９７−２．０８（ｍ，２Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．７４−２．８７（ｍ，１Ｈ），３．０１（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，２Ｈ），３．２９−３．４０（ｍ，２Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），４．６９（ｓ，２Ｈ），６．６８（ｓ，１Ｈ），６．８８−６．９５（ｍ，２Ｈ），７．０５−７．１１（ｍ，２Ｈ），７．１５−７．２２（ｍ，１Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），８．９０（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４５９】
例３４　（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［２−（Ｓ）−メチル）−４−（２−ニトロフェニ）−ピペラジン−１イル］プロピル｝−カルボキシアミド−４−メチル−６−（３，４−ジフルオロフェン−イル）−２−オキソ−ピリミジン
（Ｓ）−（＋）−３−メチル−１−（２−ニトロフェニル）−ピペラジン：
１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）中の２−ブロモニトロベンゼン（０．６００ｇ，３．００ｍｍｏｌ）の溶液に、（Ｓ）−（＋）−２−メチルピペラジン（０．５００ｇ，０．５００ｍｍｏｌ）および粉末のＫ２ＣＯ３（１５．０ｍｍｏｌ，１．５０ｇ）を添加し、得られた懸濁液を還流で１０時間加熱した。懸濁液を冷却した後、焼結ガラス漏斗を介して濾過し、溶媒を真空下で除去した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（１／１ ヘキサン／ＥｔＯＡｅ 続いて４／１ ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）、（Ｓ）−（＋）−３−メチル−１−（２−ニトロフェニル）−ピペラジンをオレンジ色の油状物で得た（０．５３ｇ，８０％）。
【０４６０】
（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［２−（Ｓ）−メチル）−４−（２−ニトロフェニル）ピペラジン−１−イル］プロピル｝−カルボキシアミド−４−メチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−ピリミジン：２０ｍＬの無水アセトン中の、（＋）−１−（３−ブロモ−プロピルカルバモイル）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−３−メチル−２−オキソ−１，６−ジヒドロ−ピリミジン−５−カルボン酸メチルエステル（０．２００ｇ，０．５００ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−（＋）−３−メチル−１−（２−ニトロフェニル）−ピペラジン（０．１７０ｇ，０．７５０ｍｍｏｌ）の溶液に、粉末Ｋ２ＣＯ３（０．３４ｇ，３．５ｍｍｏｌ）およびＫＩ（０．０７ｇ，０．５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた懸濁液を還流温度で１０時間加熱した。ＴＬＣは、新たな生成物（Ｒｆ＝０．３，３／０．５　ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）が存在し、大部分は出発物質であることを示した。懸濁液を冷却し、濾過し、溶媒を蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィにより精製した（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ，５／１）。（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［２−（Ｓ）−メチル）−４−（２−ニトロフェニル）ピペラジン−１−イル］−プロピル｝−カルボキシアミド−４−メチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−ピリミジンを黄色の油状物で得た（０．０３０ｇ，１０％収率）。エーテル中のＨＣｌをジクロロメタン中の溶液生成物に添加し、続いて溶媒を蒸発させることによりＨＣｌ塩を調製した。；ｍ．ｐ．１５０−１５３℃；［α］Ｄ＝５８．３（ｃ＝０．３，ＭｅＯＨ）；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ １．０４（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），１．７１−１．７８（ｍ，２Ｈ），２．３３−２．４９（ｍ，３Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．５５−２．９２（ｍ，５Ｈ），３．００−３．１０（ｍ，３Ｈ），３．３４−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），６．７１（ｓ，１Ｈ），７．０１−７．３２（ｍ，６Ｈ），７．４６（ｄｔ，Ｊ＝０．７Ｈｚ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄｄ，Ｊ＝１．５，８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．８２（ｔ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ）。Ｃ２８Ｈ３３Ｎ６Ｆ２Ｏ６＋０．２０ＣＨ２Ｃｌ２に対する分析：計算値Ｃ，５２．９２；Ｈ，５．２６；Ｎ，１３．１３。実測値Ｃ，５２．８４；Ｈ，５．６８；Ｎ，１２．９４。
【０４６１】
例３５　１，２，３，６−テトラヒドロ−１−｛Ｎ−［４−（２’−メチル−フェニル）ピペラジン−１−イル］−プロピル｝−カルボキシアミド−４−メチル−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−ピリミジン：
用いたアミンは４−（２’−メチル−フェニル）−ピペラジンであった。１Ｈ ＮＭＲδ １．７５−１．８０（ｍ，２Ｈ），２．２９（ｓ，３Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．４１−２．４８（ｍ，２Ｈ），２．５８−２．６２（ｍ，４Ｈ），２．９７（ｍ，４Ｈ），３．３５−３．４２（ｍ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），６．７１（ｓ，１Ｈ），６．９７−７．２６（ｍ，８Ｈ），８．８１（ｔ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，１Ｈ）。
【０４６２】
生成物をエーテル中に溶解させ、エーテル中の１Ｎ ＨＣｌを添加した。エーテルを蒸発させ、塩化ジヒドロの塩を得た；ｍ．ｐ．６６−７１℃。Ｃ　Ｈ３５Ｎ５Ｆ２Ｏ４Ｃｌ２＋１．７５アセトンに対する分析：計算値Ｃ，５５．７３；Ｈ，６．４０；Ｎ，９．７８。実測値Ｃ，５６．１６；Ｈ，６．２９；Ｎ，１０．０６。
【０４６３】
例３６　（＋）−１，２，３，６−テトラヒドロ−５−メトキシカルボニル−４−メトキシメチル−２−オキソ−１−｛Ｎ−［３−（４−メチル−４−フェニルピペリジン−１−イル］プロピル｝−６−（３，４−ジフルオロフェニル）ピリミジン：吸湿性あり；［α］Ｄ＝＋８２．１（ｃ＝０．３１，ＭｅＯＨ）；１Ｈ ＮＭＲδ １．１４（ｓ，３Ｈ），１．６１−１．７２（ｍ，Ｈ），２．０３−２．０８（ｍ，２Ｈ），２．２５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３０−２．４２（ｍ，４Ｈ），３．１９−３．３１（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），３．６３（ｓ，３Ｈ），４．６０（ｓ，２Ｈ），６．６０（ｓ，１Ｈ），６．９７−７．２９（ｍ，８Ｈ），７．６３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．７８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）。Ｃ３０Ｈ３７Ｎ４Ｏ５Ｆ２Ｃｌ＋ＣＨ２Ｃｌ２に対する分析：計算値Ｃ，５３．８０；Ｈ，５．６８；Ｎ，８．１０。実測値Ｃ，５３．７９；Ｈ，６．０３；Ｎ，７．８３。
【０４６４】
例３７　５−（５−ブチル−２−チエニール）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２，４，７（１Ｈ，３Ｈ，８Ｈ）−
例３８　（４Ｓ）−３−［（｛３−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］プロピル｝アミノ）カルボニル］−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８０（ｓ，１Ｈ），７．２２−７．０２（ｍ，２Ｈ），６．９５（ｔｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．６３−６．４４（ｍ，４Ｈ），４．５６（ＡＢｑ，２Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．３２（ｍ，４Ｈ），２．９６（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．１１−１．９４（ｍ，３Ｈ），１．８１−６４（ｍ，４Ｈ），ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５７２．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４６５】
例３９　例４０に記載の方法に従って生成物を得た。
【０４６６】
（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−３−（｛［３−（４−｛３−［（メトキシアセチル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル｝アミノ］カルボニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：１５．６ｍｇ（６９％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ９．０１（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．３０−７．０５（ｍ，５Ｈ），７．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．７１（ｓ，１Ｈ），４．７０（ｓ，２Ｈ），４．０３（ｓ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．５３（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｓ，３Ｈ），３．４２−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．０８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．４９（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．２０（ｓ，２Ｈ），２．０７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１．９７−１．７５（ｍ，４Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：６４４．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４６７】
例４０　（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−３−（｛［３−（４−｛３−［（３，３−ジメチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル｝アミノ］カルボニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル　２０ｍＬバイアルに、（４Ｓ）−３−［（｛３−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］プロピル｝アミノ）カルボニル］−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル（０．０３５ｍｍｏｌ）、酸塩化物又は塩化スルホニル（１．５当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５当量）およびジクロロメタン（２ｍＬ）を室温にて添加した。反応混合物を室温にて２４時間撹拌し、この時点でＴＬＣ分析は反応が完了したことを示した。反応混合物を濃縮して体積を少なくし、分取用ＴＬＣにより精製し（シリカ，２０００ミクロン，９５：５，ジクロロメタン：メタノール，１％のイソプロピルアミンを添加）、５．６ｍｇの（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−３−（｛［３−（４−｛３−［（３，３−ジメチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル］アミノ｝カルボニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチルを得た：２４．６％収率；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．５０（ｓ，１Ｈ），７．２６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．１５−７．０２（ｍ，５Ｈ），６．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．５５（ｓ，１Ｈ），４．５６（ＡＢｑ，２Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），２．９９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），２．４９−２．３７（ｍ，３Ｈ），２．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），１．７８−１．６５（ｍ，１４Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：６７０．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４６８】
例４１　（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−３−（｛［３−（４−｛３−［（３，３−ジメチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル｝アミノ］カルボニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチルに記載された方法に従って生成物を得た。
【０４６９】
（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−３−｛［（３−｛４−［３−（プロピオニルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）アミノ］カルボニル｝−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：９．９ｍｇ（４５％収率）δ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３６（ｓ，１Ｈ），７．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．１６−７．０２（ｍ，５Ｈ），６．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．５４（ｓ，１Ｈ），４．５６（ＡＢｑ，２Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），３．２７−３．１９（ｍ，４Ｈ），２．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０．３．Ｈｚ），２．４１（ｍ，１Ｈ），２．３４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），２．２８（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．０１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），１．７３−１．６４（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：６２８．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４７０】
例４２　（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−３−（｛［３−（４−｛３−［（３，３−ジメチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル｝アミノ］カルボニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチルに記載の方法に従って、生成物を得た：
（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−３−（｛［３−（４−｛３−［（３−メチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル］アミノ｝カルボニル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：１０．４ｍｇ（４５％収率） １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３６（ｓ，１Ｈ），７．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．１６−７．０３（ｍ，５Ｈ），６．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），６．５６（ｓ，１Ｈ），４．５６（ＡＢｑ，２Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），２．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），２．４３（ｍ，１Ｈ），２．３８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），１．１３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．１０−２．０１（ｍ，２Ｈ），１．７５−１．６４（ｍ，６Ｈ），０．９１（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：６５６．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４７１】
例４３　（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−３−（｛［３−（４−｛３−［（３，３−ジメチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル］アミノ｝カルボニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチルに記載の方法に従って、生成物を得た：
（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−３−｛［（３−｛４−［３（イソブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）アミノ］カルボニル｝−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：１６．４ｍｇ（７３％収率） δ１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３７（ｓ，１Ｈ），７．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．１６−７．０１（ｍ，５Ｈ），６．８８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．５４（ｓ，１Ｈ），４．５６（ＡＢｑ，２Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．３２（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．２３−３．１８（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ），２．５７−２．４８（ｍ，１Ｈ），２．４３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），２．１４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），１．８−１．６５（ｍ，５Ｈ），１．０９（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：６４２．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４７２】
例４４　（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−３−（｛［３−（４−｛３−［（３，３−ジメチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル｝アミノ］カルボニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチルに記載の方法に従って、生成物を得た：
（４Ｓ）−３−｛［（３−｛４−［３−（ブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）アミノ］カルボニル｝−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：１４．７ｍｇ（６５．５％収率）δ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３８（ｓ，１Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），７．１７−６．９９（ｍ，５Ｈ），６．８７（ｓ，１Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ，４．５６（ＡＢｑ，２Ｈ），３．６３（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．２８−３．１７（ｍ，６Ｈ），３．０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．５１−２．３６（ｍ，３Ｈ），２．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ），２．１０（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．８−１．５６（ｍ，６Ｈ），０．９０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝５．０Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：６４２．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４７３】
例４５　（４Ｒ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（ブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド
方法：
（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸：
Ｈ２Ｏ−ＴＨＦ（２：１，３００ｍＬ）中の、１モル当量の（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル（１０．０ｇ，３２．０ｍｍｏｌ）および水酸化リチウム（２当量，１．５３ｇ，６４．０ｍｏｌ）の撹拌した混合物を、還流温度で１時間加熱した。反応混合物を濃縮し、水中に溶解させ、酢酸で洗浄し、酸性にして（１Ｎ ＨＣｌ）ｐＨ３〜４（ｐＨ紙）にした。沈殿した生成物を回収し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させ、所望の生成物を９０％収率で得た。
【０４７４】
（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−Ｎ−［３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）プロピル｝−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド：
ジクロロメタン中の（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸（１．２当量）、ＥＤＣ（１．５当量）、Ｎ−メチルモルホリン（２．０当量）の溶液を室温にて１５分間撹拌し、続いてこの反応混合物に３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）−１−プロパンアミン（１．０当量）を添加した。得られた溶液を１８時間撹拌し、濃縮し、シリカ上のクロマトグラフィにかけ、（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−Ｎ−［３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）プロピル］−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミドを得た。
【０４７５】
（４Ｒ）−Ｎ−｛３−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］プロピル｝−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド：
エタノール中の、（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−Ｎ−［３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）プロピル］−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド、１０％ Ｐｄ／Ｃの混合物を２日間水素化した（バルーン法）。反応混合物をセライト５４５を介して濾過し、エタノールで洗浄し、濃縮し、所望の生成物を得た。
【０４７６】
（４Ｒ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（ブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド：
２０ｍＬバイアル中に、２．０ｍＬのジクロロメタン中の（４Ｒ）−Ｎ−｛３−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］プロピル｝−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド（０．０４０ｍｍｏｌ）、酸塩化物（１．５当量）、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．０当量）を室温にて添加した。２４時間後、反応混合物を真空下で濃縮し、分取用ＴＬＣで精製し（シリカ，２０００ミクロン，９５：５＝ジクロロメタン：メタノール，１％のイソプロピルアミンを添加）、９．２ｍｇ（４５％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．４９（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２０−７．０２（ｍ，５Ｈ），６．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），５．２９（ｓ，１Ｈ），４．２４（ＡＢｑ，２Ｈ），３．３０ ａｎｄ ３．２４（ｔｗｏ ｓ，３Ｈ），３．４６−３．１２（ｍ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｓ，４Ｈ），２．７４（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．２５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），２．０４−１．６９（ｍ，７Ｈ），１．６３（ｓｅｘｔｅｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），０．９１（ｔ，３Ｈ，７．４Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５８４．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４７７】
例４６　（４Ｒ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（ブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミドに記載の方法に従って、生成物を得た。
【０４７８】
（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−Ｎ−（３−｛４−［３−（プロピオニルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル］プロピル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド：
５．６ｍｇ（２４．６％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．５６（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），７．３−７．０３（ｍ，４Ｈ），７．１７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ．＝７０Ｈｚ），５．４５（ｓ，１Ｈ），４．３３（ＡＢｑ，２Ｈ），３．４１（ｓ，３Ｈ），３．３７−３．２３（ｍ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，４Ｈ），２．８（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．３９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），２．１４−１．７８（ｍ，７Ｈ），１．２１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５７０．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４７９】
例４７　（４Ｒ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（ブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミドに記載の方法に従って、生成物を得た。
【０４８０】
（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−Ｎ−［３−（４−｛３−［（３−メチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル｝−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド：
１１．１ｍｇ（４６％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．６（ｓ，１Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３１−７．１７（ｍ，３Ｈ），７．０１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），６．６４−６．６１（ｍ，１Ｈ），５．４５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．３２（ＡＢｑ ２Ｈ），３．９４ ａｎｄ ３．８７（ｔｗｏ ｓ，３Ｈ），３．４２−３．１２（ｍ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ），３．１（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），２．７９−２．５７（ｍ，４Ｈ），２．２７−１．７３（ｍ，８Ｈ），１．１９ ａｎｄ １．０１（ｔｗｏ ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５９８．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４８１】
例４８　（４Ｒ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（ブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミドに記載の方法に従って、生成物を得た。
【０４８２】
（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−Ｎ−［３−（４−｛３−［（２−メチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル｝−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド：
６．７ｍｇ（２８％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．５９（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３−７．２（ｍ，３Ｈ），７．１７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），５．４５（ｓ，１Ｈ），４．３３（ＡＢｑ，２Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．２９（ｍ，２Ｈ），２．８４（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．４２（ｍ，１Ｈ），２．１４−１．７８（ｍ，９Ｈ），１．７（ｍ，１Ｈ），１．４９（ｍ，１Ｈ），１．２０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），０．９５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５９８．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４８３】
例４９　（４Ｒ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（ブチリールアミノ）フェニル］−ｌ ピペリジニル］プロピル）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミドに記載の方法に従って、生成物を得た。
【０４８４】
（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−Ｎ−［３−（４−｛３−［（３，３−ジメチルブタノイル）アミノ］フェニル｝−１−ピペリジニル）プロピル］−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド：
１．１ｍｇ（４．４％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．６−６．９１（ｍ，７Ｈ），５．４３（ｓ，１Ｈ），４．３１（ＡＢｑ，２Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），３．２７−１．２６（ｍ，１７Ｈ），１．０９（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：６１２．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４８５】
例５０　（４Ｒ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（ブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミドに記載の方法に従って、生成物を得た。
【０４８６】
（４Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−Ｎ−（３−｛４−［３（イソブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル］プロピル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボキシアミド：
１２．７ｍｇ（５４％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．５９（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．３１−７．０７（ｍ，４Ｈ），７．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），５．３９（ｓ，１Ｈ），４．３４（ＡＢｑ，２Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），３．３３−３．１９（ｍ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ），３．０８−２．７２（ｍ，４Ｈ），２．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．１４−１．８２（ｍ，８Ｈ），１．１９（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５８４．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４８７】
例５１　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成のために記載された方法と同様である。
【０４８８】
５−アセチル−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−メチル−２−オキソ−６−（３，４，５トリフルオロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリミジンカルボキシアミド：
１４．５ｍｇ（４６％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ９．５６（ｓ，１Ｈ），９．２０（ｓ，１Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．１８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．０７−６．７５（ｍ，５Ｈ），３．５９−３．３７（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．３８（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．５７−２．３９（ｍ，５Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．１９−１．５９（ｍ，９Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５８６．３（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ３０Ｈ３４Ｆ３Ｎ５Ｏ４＋０．１ＣＨＣｌ３に対する分析：計算値Ｃ，６０．５０；Ｈ，５．７５；Ｎ，１１．７２。実測値Ｃ，６０．５９；Ｈ，５．４０；Ｎ，１１．７３。
【０４８９】
例５２　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成のための記載と同様である。
【０４９０】
３−｛［（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）アミノ］カルボニル｝−４−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−エチル−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸ベンジル：１４．８ｍｇ（４１％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ９．０５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｓ，１Ｈ），７．３７−７．２１（ｍ，８Ｈ），７．１８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），６．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），６．７−６．６２（ｍ，３Ｈ），５．０９（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝１７．８Ｈｚ），３．４８−３．２４（ｍ，２Ｈ），３．０４（Ａａｑ，２Ｈ），２．８８−２．７１（ｍ，２Ｈ），２．５２−２．３９（ｍ，２Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．１７−１．８８（ｍ，３Ｈ），１．７７−１．５８（ｍ，３Ｈ），１．１９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：６７４．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４９１】
例５３　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成のための記載と同様である。
【０４９２】
Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−２，５−ジオキソ−１，２，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３（４Ｈ）−カルボキシアミド：８．７５ｍｇ（２８％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ９．８１（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｓ，１Ｈ），７．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．９１−６．７（ｍ，４Ｈ），６．４２（ｓ，１Ｈ），５．９（ｓ，２Ｈ），４．７５（ｓ，２Ｈ），３．６１−３．５（ｍ，１Ｈ），３．３７−３．２７（ｍ，１Ｈ），３．０８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．５６−２．４０（ｍ，３Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．１６−１．８５（ｍ，４Ｈ），１．７８−１．６（ｍ，５Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５７６．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４９３】
例５４　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成のための記載と同様である。
【０４９４】
１−｛［（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）アミノ］カルボニル｝−２−［（４メトキシベンジル）スルファニル］−４−メチル−６−（４−ニトロフェニル）−１，６−ジヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：１０．１ｍｇ（２６％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．５３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４４７．２７（ｍ，６Ｈ），７．１４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．２（ｓ，１Ｈ），４．２３（ＡＢｑ，２Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．７（ｓ，３Ｈ），３．５８−３．４８（ｍ，１Ｈ），３．３７−３．２６（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｍ，２Ｈ），２．６１−２．４３（ｍ，３Ｈ），２．４１（ｓ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．１５−１．６４（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：７２９．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４９５】
例５５　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成のための記載と同様である。
【０４９６】
Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（２，１，３−ベンゾキサジアゾール−５−イル）−２，５−ジオキソ−１，２，５，７−テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３（４Ｈ）−カルボキシアミド：７．７ｍｇ（１２％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９７−６．８３（ｍ，７Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ），５．５１（ｓ，１Ｈ），３．４３−２．０２（ｍ，１７Ｈ），１．８２（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５７４．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０４９７】
例５６　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成のための記載と同様である。
【０４９８】
（４Ｓ）−３−｛［（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）アミノ］カルボニル｝−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−メチル−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：１６．６ｍｇ（５２％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ９．５５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），９．０７（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｓ，１Ｈ），７．５４（ｓ，１Ｈ），７．２５−６．９８（ｍ，４Ｈ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．６９（ｓ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．５７−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），２．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．１８−１．６１（ｍ，９Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５８４．３（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ３０Ｈ３５Ｆ２Ｎ５Ｏ＋０．２５ＣＨＣｌ３に対する分析：計算値Ｃ，５９．２３；Ｈ，５．７９；Ｎ，１１．４２。実測値． Ｃ，５９．６１；Ｈ，５．３１；Ｎ，１１．４８。
【０４９９】
ペプチド合成：
略語：Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルオキシカルボニル−；トリチル＝トリフェニルメチル−；ｔＢｕ−＝第三ブチルエステル；ＯｔＢｕ−＝第三ブチルエーテル；Ｎｇ＝Ｎ−グアニジニール；Ｎｉｎ＝Ｎ−インドール；ＭＢＨＡ＝メチルベンジルジアミン；ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリジノン；ＤＩＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン；ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸。
【０５００】
小規模のペプチド合成は、溶媒および試薬を除去するためにアルゴン圧を用いる焼結ガラスカラム、又はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ ３９６−９０００自動ペプチド合成器（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）のいずれかを使用することにより手動で行った。大規模なペプチド合成はＣＳ Ｂｉｏ ５３６（ＣＳ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）で行った。Ｆｍｏｃ−アラニン−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−システイン（トリチル）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−アスパラギン酸（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−グルタミン酸（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−フェニルアラニン−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−グリシン−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ヒスチジン（トリチル）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−イソロイシン−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−リシン（ＢＯＣ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ロイシン−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−メチオニン−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−アスパラギン（トリチル）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−プロリン−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−グルタミン（トリチル）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−アルギニン（Ｎｇ−２，２，４，６，７−メチルブタノイルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−セリン（ＯｔＢｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−トレオニン（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−バリン−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−トリプトファン（ＮｉｎＢＯＣ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−チロシン（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−シクロヘキシルアラニン−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−ノルロイシン、Ｆｍｏｃ−Ｏ−ベンジル−ホスホチロシンを保護されたアミノ酸として用いた。Ｎｇ−２，２，５，７，８−メチルブタノイルクロマン−６−スルホニル保護グループを有するＦｍｏｃ−Ｄ−アルギニンを除いて、対応するＤ−アミノ酸は全て同一の側鎖保護基を有していた。
【０５０１】
Ｃ末端アミドを有するペプチドを、連結アミド−ＭＢＨＡ 樹脂を用いて固相上で合成した。連結 アミド ＭＢＨＡ 樹脂のＦｍｏｃグループを、ＤＭＦ中の３０％ピペリジンを用いて５分および３０分それぞれ処理することにより除去した。ＤＭＦ（３回）、メタノール（２回）、およびＤＭＦ／ＮＭＰ（３回）で洗浄した後、適切なＦｍｏｃ−保護化されたアミノ酸（４当量）を、活性化試薬としてのＨＢＴＵ又はＨＡＴＵ（４当量）、および塩基としてのＤＩＥＡ（８当量）を用いて２時間結合させた。手動による合成において、アミノ酸の完全な結合を試験するためにニンヒドリン試験を用いた。Ｆｍｏｃグループを、ＤＭＦ中の３０％ ピペリジンで５分および３０分間それぞれ処理することにより除去した。ＤＭＦ（３回）、メタノール（２回）、およびＤＭＦ／ＮＭＰ（３回）で洗浄した後、次なるＦｍｏｃ保護されたアミノ酸（４当量）を、活性化試薬としてのＨＢＴＵ又はＨＡＴＵ（４当量）、および塩基としてのＤＩＥＡ（８当量）を用いて２時間結合させた。この結合手順およびＦｍｏｃグループの脱保護を、所望のペプチドが樹脂上に構成されるまで続けた。Ｎ−末端Ｆｍｏｃグループを、ＤＭＦ中の３０％ ピペリジンンで５分および３０分間それぞれ処理することにより除去した。ＤＭＦ（３回）、メタノール（２回）で洗浄した後、樹脂を真空下で２時間乾燥させた。樹脂上のペプチドの開裂、および側鎖保護化グループの除去を、ＴＦＡ：エタンジチオール：チオアニソール：ｍ−クレゾール：水：トリイソプロピルシラン：フェノール，７８／５／３／３／３／５／３（１００ ｍｇ 樹脂ごとに５ｍＬ）を用いて２．５〜３時間処理することにより達成した。ペプチドを含んだ開裂カクテルを丸底フラスコ中に濾過し、揮発成分液を回転蒸発により３０−４０℃で除去した。無水エーテルを用いてペプチドを沈殿させ、真空濾過により中程度の孔を有する焼結ガラス漏斗上に回収し、エーテルで洗浄し、真空乾燥させた。
【０５０２】
Ｃ末端の酸を有するペプチドを、２−塩化クロロトリチル樹脂を用いて合成した。０．６〜１．２当量の上記適切なＦｍｏｃ−保護されたアミノ酸中をジクロロメタン中に溶解することにより（必要ならば、溶解を促進させるために最小限量のＤＭＦを添加する）、第１のアミノ酸を樹脂に結合した。これにＤＩＥＡ（４当量。Ｆｍｏｃ−アミノ酸に比例）を添加し、この溶液を樹脂に添加し、３０−１２０分間振とうした。溶媒および過剰な試薬を排出し、樹脂をジクロロメタン／メタノール／ＤＩＥＡ（１７／２／１）（３回）、ジクロロメタン（３回）、ＤＭＦ（２回）、ジクロロメタン（２回）で洗浄し、真空乾燥させた。所望の、完全に保護されたペプチドを樹脂上に構成するまで、Ｆｍｏｃグループの脱保護および適切なＦｍｏｃ−保護されたアミノ酸の結合の手順を、上記に述べたとおりに続けた。最後のＦｍｏｃグループの除去、ならびにペプチドの開裂および脱保護の手順は、Ｃ末端アミド酸を有するペプチドについて上述した手順と同様である。ペプチドの精製は、水（０．１％ ＴＦＡ）中のアセトニトリル（０．１％ ＴＦＡ）勾配を有する逆相Ｃ−１８カラム（２５×２５０ｍｍ）（Ｐｒｉｍｅｓｓｐｈｅｒｅ又はＶｙｄａｃ）を用いた分取用高性能カラムクロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により行った。一般的な勾配は水中で、４０分間に亘って０％−９０％のアセトニトリルであった。ＨＰＬＣトレース上の各ピークに対応する分画を回収し、凍結乾燥させ、電子スプレー質量分析法により分析した。次いで必要ならば、所望のペプチドに対応した質量分析データを有する分画を、アミノ酸分析により分析した。精製した全てのペプチドについて、２．５ｘ２５０ｍｍ分析カラムを用いた以外は上述した条件と同一の条件を用いてＨＰＬＣにより均一性を試験し、一般的には＞９５％の純度を有することが分かった。
【０５０３】
参照文献
テンプレートおよびピペリジンの合成のための参照文献として、刊行された我々のジヒドロピリミジノンおよびオキサゾリジノ特許を参照されたい。また、アミノプロピルピペリジンおよびテンプレートについては以下を参照されたい。
【０５０４】
【参照文献１】
2004502423.tif 000004
2004502423.tif 000005
2004502423.tif 000006
【化１】
2004502423.tif 000007
【化２】
2004502423.tif 000008
【化３】
2004502423.tif 000009
【化４】
2004502423.tif 000010
【化５】
2004502423.tif 000011
【化６】
2004502423.tif 000012
【化７】
2004502423.tif 000013
【化８】
2004502423.tif 000014
【化９】
2004502423.tif 000015
【化１０】
2004502423.tif 000016
【化１１】
2004502423.tif 000017
【化１２】
2004502423.tif 000018
【化１３】
2004502423.tif 000019
【化１４】
2004502423.tif 000020
【０５０５】
【表Ｃ−１】
2004502423.tif 000021
2004502423.tif 000022
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一般的な方法：全ての反応（パラレル合成反応アレイによる反応は除く）はアルゴン雰囲気下で実施し、試薬はそのまま、または適当な溶媒中でシリンジおよびカニューレによって反応容器に移した。パラレル合成反応アレイはＪ−ＫＥＭ加熱シェーカー（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いてバイアル中（不活性雰囲気は用いない）で実施した。無水溶媒はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙより購入し、入手した状態で使用した。本特許に記載の例はＡＣＤ／Ｎａｍｅプログラム（バージョン２．５１、Ａａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．， Ｔｏｒｏｎｔｏ． Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｍ５Ｈ２Ｌ３， Ｃａｎａｄａ）を用いて命名した。特に断りのない限り、１Ｈを３００および４００ＭＨｚ（それぞれＱＥ ＰｌｕｓおよびＢｒｕｋｅｒ）にて、内部標準としてテトラメチルシランを用い、記録した。ｓ＝シングレット；ｄ＝ダブレット；ｔ＝トリプレット；ｑ＝カルテット；ｐ＝ペンテット；セクステット；セプテット；ｂｒ＝ブロード；Ｍ＝マルチプレット。元素分析はＲｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｌｉｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．で実施した。特に断りのない限り、質量スペクトルは低分解エレクトロスプレー法（ＥＳＭＳ）を用いて得、ＭＨ＋を報告した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はシリカゲル６０ Ｆ２５４（０．２５ｍｍ、ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｔｅｃｈ．）でプレコートしたガラスプレートで行った。分取薄層クロマトグラフィーはシリカゲルＧＦ（２ｍｍ、Ａｎａｌｔｅｃｈ）でプレコートしたガラスシートで行った。フラッシュカラムクロマトグラフィーはＭｅｒｃｋシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）で行った。融点（ｍｐ）はＭｅｌ−Ｔｅｍｐ装置上のオープンキャピラリーチューブで測定し、補正はしていない。
【０５０６】
ピペリジン側鎖の中間体
４−｛［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ｝−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ｎ−ブチルリチウム（１７．６ｍＬ，４４．２ｍｍｏｌ，２．５Ｍ ヘキサン中）を、４０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中のジイソプロピルアミン（９６．２ｍＬ，４４．２ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で添加し、２０分撹拌した。反応混合物を−７８℃にまで冷却し、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中の４−オキソピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，４０．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に滴下添加し、３０分撹拌した。ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のＴｆ２ＮＰＨ（４２．０ｍｍｏｌ，１５．０ｇ）を反応混合物に　℃で一晩滴下添加した。反応混合物を真空下で濃縮し、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ（９：１）中に溶解させ、アルミナのプラグに通過させ、このアルミナプラグをヘキサン：ＥｔＯＡｃ（９：１）で洗浄した。合体した抽出物を濃縮して、出発物質のＴｆ２ＮＰＨがいくらか混じった１６．５ｇの所望の生成物を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ５．７７（ｓ，１Ｈ），４．０５（ｄｍ，２Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），３．６３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．４５（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｓ，９Ｈ）。
【０５０７】
４−［３−（アミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ジメトキシエタン（５ｍＬ）中の、２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３水溶液（４．２ｍＬ）、４−［［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ］−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（０．５００ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）、３−アミノフェニルホウ酸ヘミサルフェート（０．３９３ｇ，２．１１ｍｍｏｌ）、塩化リチウム（０．１９１ｇ，４．５０ｍｍｏｌ）およびテトラキス−トリフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．０８０ｇ，０．０７５ｍｍｏｌ）の混合物を還流温度で３時間、不活性雰囲気下で加熱した（トリフェニルホスフィン酸化物の形成を避けるために、混合物を最初に脱ガスすることが勧められる）。冷却した反応混合物の有機層を分離し、水層を酢酸エチル（３Ｘ）で洗浄した。合体した有機抽出物を乾燥させ、真空下で濃縮した。粗成物をクロマトグラフィにかけ（シリカ，ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：ジクロロメタン（６：１：１）、ＢＯＣ群を加水分解から保護するために、イソプロピルアミンを１％添加）、０．３３０ｇの所望の生成物を８１％収率で得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ），６．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ），６．５９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２，８．０Ｈｚ），６．０１（ｍ，１Ｈ）。４．１０−４．０１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．５２−２．４６（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：２７５．２（Ｍ＋Ｈ）＋。Ｃ１６Ｈ２４Ｎ２Ｏ２に対する分析：計算値Ｃ，７０．０４；Ｈ，８．０８；Ｎ，１０．２１。実測値Ｃ，６９．７８；Ｈ，７．８０；Ｎ，９．９２。
【０５０８】
４−［３−（アミノ）フェニル］ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
２００ｍＬのエタノール中の、３．１０ｇの４−（３−アミノフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１１．３ｍｍｏｌ）および１．０ｇの１０％ Ｐｄ／Ｃの混合物を、室温でバルーン法を用いて２日間水素化した。反応混合物を濾過し、エタノールで洗浄した。合体したエタノール抽出物を真空下で濃縮し、残渣をシリカ上のクロマトグラフィにかけ（ジクロロメタン：メタノール９５：５、加水分解からＢＯＣ群を保護するために、イソロピルアミンを１％添加した）、２．６３ｇの所望の生成物を得た（８４％）。
【０５０９】
４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
Ｎａ２ＣＯ３の飽和水溶液（２５ｍＬ）、４−［［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジン−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（２０ｍｍｏｌ）、３−アセタミドフェニルホウ酸（３０ｍｍｏｌ）およびテトラキス−トリフェニルホスフィンパラジウム（０）（１．１５ｇ）およびジメトキシエタン（４０ｍＬ）の混合物を、還流温度で一晩加熱した。冷却した反応混合物の有機相を分離し、水層を酢酸エチル（３Ｘ）で洗浄した。合体した有機抽出物を乾燥させ、真空下で濃縮した。粗成物をクロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．１１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．５７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４１（ｂｒ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．０８（ｂｒ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．９９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．０３（ｂｒ ｍ，２Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），３．５９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．４６（ｍ，２Ｈ，），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）。
【０５１０】
Ｎ１−［３−（１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジニル）フェニル］アセタミド：
ジオキサン（１０ｍＬ）中の４Ｍ ＨＣｌの溶液を、ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８．２５ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、真空下で濃縮し、所望の生成物を塩酸塩の塩として得た（２．１ｇ）：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．４１−７．００（ｍ，４Ｈ），６．１０（ｂｒ，１Ｈ），３．５５（ｍ，２Ｈ），３．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．４４（ｍ，２Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ）。
【０５１１】
Ｎ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ジクロロメタン中で塩基の存在下にて３−ブロモプロピルアミン臭化水素酸塩およびＢＯＣ２Ｏから調製し、９．８９ｍｍｏｌ：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ５．０７（ｂｒ，１Ｈ），３．３１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．１２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｂｒ ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），１．９２（ｐ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．３０（ｓ，９Ｈ）。
【０５１２】
Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジニル｝プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
乾燥ジオキサン（３０ｍＬ）中の、Ｎ１−［３−（１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル）フェニル］アセタミド、ＨＣｌ（８．２４ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルおよび炭酸カリウム（３３ｍｍｏｌ）の溶液を、還流温度で一晩加熱した。固体を濾過により除去し、溶液を真空下で濃縮し、生成物クロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た（１１０ｍｇ）。
【０５１３】
Ｎ−（３−４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジニルプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．６５（ｓ，１Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．０２（ｓ，１Ｈ），５．２３（ｂ，１Ｈ），３．４０（ｂ，２Ｈ），３．３０−１．８０（ｍ，１０Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０５１４】
Ｎ１−｛３−［１−（３−アミノプロピル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル］フェニル｝アセタミド：
ＴＦＡ：ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）の１：１溶液を、ジクロロメタン（５ｍＬ）中のＮ−（３−｛４−［３（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジニル｝プロペル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルに添加した。得られた溶液を室温で１〜３日間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ＞６にし、有機層を分離し、真空下で乾燥させ、所望の生成物を得た（４５ｍｇ）。
【０５１５】
Ｎ１−｛３−［１−（３−アミノプロピル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル］フェニル｝アセタミド：
Ｎ１−｛３−［１−（３−アミノプロピル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル］フェニル｝アセタミドおよび酸（ＴＦＡ又はＨＣｌ）から、得られた塩の塩基性化に次いで：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．６８（ｂｒ，１Ｈ），７．３５（ｄｍ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），１５（ｄＲｎ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．１２（ｍ，１Ｈ），３．２２（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），２．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），２．７０−２．５０（ｍ，４Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），１．８７（ｐ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）。
【０５１６】
４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の、４−［３（アセチルアミノ）フェニル］−１，２，３，６−テトラヒドロ−１−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（７．１０ｍｇ）および５％ Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）の混合物を室温で一晩水素化した（バルーン技術）。反応混合物をセライト５４５のパッドに通過させ、このセライトのパッドをエタノールで洗浄した。合体したエタノール抽出物を濃縮し、クロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た（６６０ｍｇ）：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．８０（ｓ，１Ｈ），７．４１−７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），４．２１（ｍ，２Ｈ），２．７５（ｍ，２Ｈ），２．６２（ｍ，１Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．７８（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ）。
【０５１７】
Ｎ１−［３−（４−ピペリジル）フェニル］アセタミド：
ジオキサン（４Ｎ，５ｍＬ）中のＨＣｌの溶液を、乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の４−［３（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（６６０ｍｇ）に添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、真空下で濃縮し、所望の生成物を得た（５５０ｍｇ）：ｍ．ｐ．１０２−１０４℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ２．０２（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，２Ｈ），２．１１−２．４５（ｍ，５Ｈ），２．６７−２．７７（ｍ，１Ｈ），３．００−３．１０（ｍ，２Ｈ），３．５１（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，２Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２０−７．４６（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｓ，１Ｈ）；Ｃ１３Ｈ１９Ｎ２ＯＣｌ＋０．８６ＣＨ２Ｃｌ２に対する分析：計算値Ｃ，５０．７８；Ｈ，６．３７；Ｎ，８．５５。実測値Ｃ，５０．８０；Ｈ，７．５５；Ｎ，７．０１。
【０５１８】
Ｎ−（３−｛４−［３（アセチルアミノ）フェニル］ピペリジノ｝プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
ジオキサン（２０ｍＬ）中の、Ｎ１−［３−（４−ピペリジル）フェニル］アセタミド（５５０ｍｇ，０．２１０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５５０ｍｇ，０．２３０ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（１．１０ｇ，０．８９０ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．５０ｍＬ）、およびわずかなＫＩの結晶の溶液を還流温度で２日間加熱した。沈殿した塩を濾過により除去し、真空下で濃縮し、粗成物をクロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た（３４０ｍｇ）：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．１５（ｓ，１Ｈ），７．４７−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．５３（ｂｒ，１Ｈ），３．２３（ｂ，６Ｈ），２．８０−１．６０（ｍ，９Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），１．４５（ｓ，９Ｈ）。
【０５１９】
Ｎ１−｛３−［１−（３−アミノプロピル）−４−ピペリジル］フェニル｝アセタミド：
ＴＦＡ（１．０ｍＬ）を、乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のＮ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］ピペリジノ｝プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（３４０ｍｇ）の溶液に添加し、室温で５時間撹拌した。ＫＯＨ １０％水溶液を反応混合物にｐＨ＞６になるまで添加し、次いでジクロロメタンを真空下で除去した。水層を凍結し、凍結乾燥させて固体を得、これをメタノールを用いて抽出した。溶媒を除去し、所望の生成物（１２０ｍｇ）を油状物で得た。：Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．２３−７．１６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．９５−６．９２（ｍ，１Ｈ），３．０３−３．９９（ｍ，２Ｈ），２．７７−２．７３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．５０−１．６０（ｍ，１０Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ）。
【０５２０】
４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２３（ｓ，１Ｈ），８．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．５１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．２０（ｍ，１Ｈ），４．１７−４．０８（ｍ，２Ｈ），３．６７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．６１−２．５２（ｍ，−２Ｈ），１．５０（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ ２４９．１（Ｍ＋Ｈ−Ｃ４Ｈ８）＋。
【０５２１】
１，２，３，６−テトラヒドロ−４−（３−ニトロフェニル）ピリジン：
１００ｍＬの１，４−ジオキサン中の、５．００ｇ（１６．０ｍｍｏｌ）の１，２，３，６−テトラヒドロ−４−（３−ニトロフェニル）ピリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルの撹拌した溶液に、０℃でＨＣｌガスを１０分間バブリングさせた。反応混合物を室温にまで加温し、ＨＣｌガスのバブリングをさらに１時間続けた。溶媒を真空下で除去し、残渣を５０ｍＬの水中に溶解させ、ＫＯＨペレットを添加して中和した。水溶液を３×８０ｍＬのジクロロメタンを用いて抽出し、合体した有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９：１，ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）、２．８５ｇ（８７．５％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２４（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．３５−６．２５（ｍ，１Ｈ），３．５８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑ，２Ｈ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），３．１４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．５４−２．４６（ｍ，２Ｈ）。
【０５２２】
３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
２５０ｍＬの１，４−ジオキサン中の、２．８０ｇ（１４．０ｍｍｏｌ）の１，２，３，６−テトラヒドロ−４−（３−ニトロフェニル）ピリジン、３．６０ｇ（１５．０ｍｍｏｌ）のＮ−（３−ブロモプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル、１１．６ｇ（８４．０ｍｍｏｌ）のＫ２ＣＯ３、１４．６ｍＬ（８４．０ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミン、および０．７８ｇ（２．００ｍｍｏｌ）のヨウ化テトラブチルアンモニウムの混合物を還流温度で１４時間加熱した。反応混合物を濾過し、ろ液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９：１，ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）、４．３５ｇ（８５．７％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ），８．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９，８．０Ｈｚ），７．７０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．２３（ｍ，１Ｈ），３．２９−３．１８（ｍ，４Ｈ），２．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．６４−２．５４（ｍ，４Ｈ），１．８２−１．７０（ｍ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３６２．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５２３】
３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）−１−プロパンアミン：
１００ｍＬの１，４−ジオキサン中の、４．３５（１２．０ｍｍｏｌ）の３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルの撹拌した溶液中に、０℃でＨＣｌガスを１０分バブリングさせた。反応混合物を室温にまで加温し、バブリングをさらに１時間続けた。溶媒を真空下で除去し、残渣を５０ｍＬの水中に溶解させ、ＫＯＨペレットを添加して中和した。水溶液を３×８０ｍＬのジクロロメタンを用いて抽出し、合体した有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９：１　ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）、３．０５ｇ（９７．０％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），８．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，８．２Ｈｚ），７．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８，８．２Ｈｚ），７．４８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．２４（ｍ，１Ｈ），３．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），２．８４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．７５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），２．６４−２．５４（ｍ，４Ｈ），１．７６（ｍ，２Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：２６２．２（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ１４Ｈ１９Ｎ３Ｏ２（０．０６ ＣＨＣｌ３）に対する分析：計算値Ｃ，６２．９０；Ｈ，７．１６；Ｎ，１５．６５。実測値Ｃ，６３．２０；Ｈ，７．１６；Ｎ，１５．６５。
【０５２４】
（４Ｓ）［｛［３−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］プロピル｝アミノ）カルボニル］−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−６−（メトキシメチル）−２−オキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−５−ピリミジンカルボン酸メチル：
２００ｍＬ ジクロロメタン中の、３．０２ｇ（６．３３ｍｍｏｌ）、１−（４−ニトロフェニル）（６Ｓ）−６−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−（メトキシメチル）−２−オキソ−３，６−ジヒドロ−１，５（２Ｈ）−ピリミジンジカルボン酸５−メチル、１．５０ｇ（５．８０ｍｍｏｌ）の３−（４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジニル）−１−プロパンアミン、７．９４ｇ（７５．５ｍｍｏｌ）のＫ２ＣＯ３、および１．００ｍＬのメタノールの混合物（アルゴン下で）を、室温で１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、真空下で濃縮した。残渣を１００ｍＬの酢酸エチル中に溶解させ、３×５０ｍＬのＮａＯＨ ５％水溶液で洗浄し、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣を、０．５０ｇの １０％ Ｐｄ／Ｃを含んだ１００ｍＬの無水エタノール中に溶解させ、反応混合物を水素バルーン下で２４時間撹拌した。反応混合物をセライト５４５濾過試薬のカラムに通し、エタノールで洗浄し、ろ液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９．５：０．５ジクロロメタン：メタノール＋ １％イソプロピルアミン）、１．６５ｇ（５２．０％収率）の所望の生成物を得た。
【０５２５】
４−［３−（イソブチリールアミノ）フェニル］−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
１００ｍＬ−ジクロロメタンの４．００ｇ（１６．０ｍｍｏｌ）の４−（３−アミノフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル、および５．６０ｍＬ（３２．０ｍｍｏｌ）のジイソプロピルエチルアミンの溶液中に、１．９０ｍＬ（１９．０ｍｍｏｌ）の塩化イソブチルをゆっくりと添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，５０：４６：３：１，ヘキサン：ジクロロメタン：メタノール：イソプロピルアミン）、２．９０ｇ（５２．０％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．６９（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．０４（ｓ，１Ｈ），４．０５（ｓ，２Ｈ），３．６２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ．，２．５１（ｍ，３Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３４５．５（Ｍ＋Ｈ）＋。Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ３＋０．１７５ＣＨＣｌ３に対する分析：計算値Ｃ，６６．３３；Ｈ，７．７７；Ｎ，７．９６。実測値Ｃ，６６．２０；Ｈ，７．４１；Ｎ，７．８８。
【０５２６】
４−［３−（イソブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
１００ｍＬのエタノール中の２．９０ｇ（８．４０ｍｍｏｌ）の４−［３−（イソブチリールアミノ）フェニル］−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルおよび１０％収率 Ｐｄ／Ｃ の混合物０．８０ｇを、水素バルーンの下で２４時間撹拌した。反応混合物をセライト５４５濾過試薬のカラムに通し、ろ液を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９．５：０．５ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）、２．４０ｇ（８４．０％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４９−７．４４（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．２０−４．１０（ｍ，２Ｈ），２．８６−２．４５（ｍ，４Ｈ），１．８６−１．７５（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｓ，９Ｈ），１．２４（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ ３４５．２（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ３＋０．３Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，６８．２７；Ｈ，８．７７；Ｎ，７．９６。実測値Ｃ，６８．２５；Ｈ，８．５４；Ｎ，７．８４。
【０５２７】
２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド：
１００ｍＬの１，４−ジオキサン中の、２．２０（６．５０ｍｍｏｌ）の４−［３（イソブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルの撹拌した溶液中に、０℃でＨＣｌガスを１０分バブリングさせた。反応混合物を室温にまで加温し、ＨＣｌガスのバブリングを１時間続けた。溶媒を真空下で除去し、残渣を５０ｍＬの水中に溶解させ、ＫＯＨペレットを添加して中和した。水溶液を３×８０ｍＬのジクロロメタンを用いて抽出し、合体した有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、真空下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィにより精製し（シリカ，９：１ ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）、０．７００ｇ（４６．０％収率）の所望の生成物を得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４７（ｓ，１Ｈ），７．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．００（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），３．２３−３．１４（ｍ，５Ｈ），２．８２−２．５７（ｍ，４Ｈ），１．２０（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：２４７．２（Ｍ＋Ｈ）＋；塩酸塩の塩を燃焼分析に用いた：Ｃ１５Ｈ２２Ｎ２Ｏ＋ＨＣｌ＋０．１５ＣＨＣｌ３に対する分析：計算値Ｃ，６０．５１；Ｈ，７．７６；Ｎ，９．３２。実測値Ｃ，６０．５７；Ｈ，７．８３；Ｎ，８．８８。
【０５２８】
３−（４−ピペリジニル）アニリン：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．０１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．６２−６．５４（ｍ，３Ｈ），３．１６（ｂｒ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ），２．７５（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．７，１２．３Ｈｚ），２．５６（ｔｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，１２．３Ｈｚ），１．８１（ｂｒ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ），１．６５（ｄｑ，２Ｈ，Ｊ＝４．０，１２．３Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：１７７．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５２９】
４−（４−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル：
コンデンサーに備えられた２５ｍＬ丸底フラスコに、４−｛［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ｝−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１．０ｇ）、４−ニトロフェニルホウ酸（０．７１ｇ）、炭酸ナトリウム（０．４３０ｍＬの２Ｍ溶液）、塩化リチウム（０．３８２ｇ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０）（０．１７３ｇ）およびエチレングリコールジメチルエーテル（１０ｍＬ）を添加した。反応混合物をアルゴンを用いて３回フラッシュした後、反応混合物を１００℃にまで３時間加熱した。室温にまで冷却した後、反応混合物塩化メチレン（３０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）で希釈し、有機層を分離した。水層を塩化メチレン（３×２０ｍＬ）で抽出し、合体した有機抽出物を飽和ＮＨ４Ｃｌ（２０ｍＬ）および塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィにより精製し（６：１＝ヘキサン：酢酸エチル，１％ ＮＨ３を添加）、生成物（０．５５ｇ，５９．９％）を黄色の油状物で得た。この化合物は室温では安定しないので実際上可能な限り迅速に使用する：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．２４（ｍ，１Ｈ），４．１３（ｍ，２Ｈ），３．６７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），２．５５（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｓ，９Ｈ）。
【０５３０】
４−（４−ニトロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン：
４−（４−ニトロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンを、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミドの調製に用いた手順と同様の手順にて、ＨＣｌガス、およびジオキサン（５．０ｍＬ）中の４−（４−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ピリジンカルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（１３０ｍｇ）を室温で用いて調製した。反応混合物を真空下で濃縮し、粗成物（６９．８ｍｇ）を得、これをさらに精製することなく次なる反応に用いた。
【０５３１】
オキサゾリジノン中間体：
アミノ−（３，５−ジフルオロフェニル）−アセトニトリル：
丸底フラスコ内でＭｅＯＨ（５００ｍＬ）中の３，５−ジフルオロベンズアルデヒド（２５．０ｇ，０．１７６ｍｏｌ）の溶液中に、アンモニアガスを２時間室温でバブリングした。その後フラスコを０℃にまで冷却し、シアン化トリメチルシリルをゆっくりと添加した。反応混合物を２時間撹拌した時点で、ＴＬＣ分析によれば反応は完全であった（Ｒｆ＝０．３５，３：２ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）。溶媒を真空下で除去し、残渣をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た。
【０５３２】
アミノ−（３，５−ジフルオロフェニル）−酢酸メチルエステル
アミノ−（３，５−ジフルオロフェニル）−アセトニトリル（２２．０ｇ，０．１３０ｍｏｌ）のよく撹拌した溶液に、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中のＨＣｌの溶液室温でを添加した。得られた黄色の溶液を室温で１０時間撹拌し、還流温度で１．５時間加熱した。冷却後、溶媒を真空下で除去し、得られた黄色の固体を水（２００ｍＬ）中に溶解させた。水溶液を次いでＮａＯＨ ２０％溶液を用いて、ｐＨ９にまで慎重に塩基性にした。水層をＣＨ２Ｃｌ２（３×１００ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去し、所望の生成物を得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０５３３】
２−アミノ−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−エタノール：
コンデンサーおよび滴下用漏斗に取り付けられた三首の丸底フラスコ内のＴＨＦ（１２０ｍＬ）中のＬｉＡｌＨ４（４．７ｇ，０．１２５ｍｏｌ）のよく撹拌した懸濁液に、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のアミノ−（３，５−ジフルオロフェニル）−酢酸メチルエステル（１０．０ｇ，０．０５ｍｏｌ）の溶液を０℃で滴下添加した。得られた緑がかった茶色の懸濁液を還流温度で２時間加熱した。反応混合物を０℃にまで冷却した後、５ｍＬの水、５ｍＬの３Ｎ ＮａＯＨ、続いて１５ｍＬの水で連続的に慎重に反応を止めた。得られた懸濁液をフリットされたガラス製の漏斗を介して濾過した。フィルターケーキに１００ｍＬ Ｅｔ２Ｏを添加し、懸濁液を還流温度で２０分加熱した。懸濁液を濾過し、合体したろ液をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去した。２−アミノ−２−（３，５−ジフルオロフェニル）−エタノールを黄色のガラス状のシロップで得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０５３４】
［１−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシ−エチル］−カルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル：
ＣＨＣｌ３（１５０ｍＬ）中の２−アミノ（３，４−ジフルオロフェニル） エタノール（８．６ｇ，４９．７ｍｍｏｌ）の溶液中に、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）中のジカーボネート−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１１．４ｇ，５２．０ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で一度に添加し、得られた溶液を一晩室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィ（２：１ ヘキサン−ＥｔＯＡｃ 続いてＥｔＯＡｃ）にかけ、［１−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシ−エチル］−カルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを白色の固体で得た（１０．０ｇ，７４％収率）。
【０５３５】
（＋）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−オキサゾリジン−２−オン：
室温のＴＨＦ（４０ｍＬ）中のＮａＨ（１．１ｇ，４５．８ｍｍｏｌ）のよく撹拌した懸濁液に、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の［１−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシ−エチル］−カルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５．０ｇ，１８．３ｍｍｏｌ）の溶液を、滴下漏斗を介して室温で添加した。得られた懸濁液を３時間撹拌した後、１０ｍＬの水を用いて慎重に急冷した。二層の混合物を１００ｍＬのＥｔ２Ｏを用いて抽出し、塩水で洗浄し、濾過し、溶媒を真空下で除去した。これにより得たガム状の残渣をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィにより精製し（Ｒｆ＝０．１５，３：２ ヘキサン ＥｔＯＡｃ）、４−（３，５−ジフルオロフェニル）−オキサゾリジン−２−オンを白色のフレーク状の固体で得た（２．８ｇ，７７％収率）。ｍ．ｐ．８１−８３℃；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ４．１３（ｄｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．７３（ｔ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．９４（ｄｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．０３−７．２３（ｍ，３Ｈ）。エナンチオマーを、１２．０ｍＬ／分（Ｕ．Ｖ． ２５４ ｎｍ）で８０％ヘキサン／２０％イソプロピルアルコールを溶出系として用いたキラルセルＯＤ（２０×２５０ｍｍ）で分離した。２つの異性体の反応時間は、それぞれ１６．１９分および２０．０８分であった。
【０５３６】
（４Ｓ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボン酸 ４−ニトロフェニル：
アルゴン下の２０ｍＬの無水ＴＨＦ中のＮａＨ（０．１４ｇ，５．３０ｍｍｏｌ）の懸濁液中に、ＴＨＦ中の（＋）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−オキサゾリジン−２−オン（０．８８ｇ，４．４２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加した（滴下漏斗）。得られた懸濁液を室温で３０分撹拌した。次いでこの懸濁液をカニューレを介して、ＴＨＦ中のクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（１．１１ｇ，５．３０ｍｍｏｌ）の溶液を含んだ他の丸底フラスコに滴下添加し、−７８℃で１５分に亘って冷却した。撹拌を２時間続け、次いで溶媒を除去し、残渣を、１：１ ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２続いてＣＨ２Ｃｌ２（Ｒｆ＝０．４，ＣＨ２Ｃｌ２）を用いたシリカゲル上のカラムクロマトグラフィにより精製し、所望の生成物を白色の固体で得た（１．５５ｇ，８６％収率）。
【０５３７】
同様に上記の手法に従って、４−（３，５−トリフルオロフェニル）−２−オキソ−オキサゾリジン−３−カルボン酸−４−ニトロフェニルエステルおよび４−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−２−オキソ−オキサゾリジン−３−カルボン酸−４−ニトロ−フェニルエステルを得た。オキサゾリジノンエナンチオマーをキラルセルＯＤカラム（先に例示したもの）で分割し、４−ニトロ−フェニルエステルをクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニルを用いて調製した。
【０５３８】
（４Ｓ）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボン酸 ４−ニトロフェニル：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．３３−６．８１（ｍ，５Ｈ），５．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，８．７Ｈｚ），４．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），４．３３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，９．３Ｈｚ）；Ｃ１６Ｈ１０Ｆ２Ｎ２Ｏ６＋０．２ＥｔＯＡｃに対する分析：計算値Ｃ，５２．８４；Ｈ，３．０６；Ｎ，７．３４。実測値Ｃ，５３．２６；Ｈ，２．８３；Ｎ，７．７３。
【０５３９】
（４Ｓ）−２−オキソ−４−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，３−オキサゾリジン−３−カルボン酸 ４−ニトロフェニル：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．１１−７．０２（ｍ，２Ｈ），５．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，９．０Ｈｚ），４．８１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），４．３３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，９．０Ｈｚ）；Ｃ１６Ｈ９Ｆ３Ｎ２Ｏ６に対する分析：計算値Ｃ，５０．２７；Ｈ，２．３７；Ｎ，７．３３。実測値Ｃ，５０．５６；Ｈ，２．５０；Ｎ，７．４９。
【０５４０】
１−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−２−ヒドロキシプロピルアミン：
無水エーテル（２００ｍＬ）中の２−アミノ−２−（３，４−ジフルオロフェニル）酢酸メチル（１０．５ｇ，５２．１９ｍｍｏｌ）のよく撹拌した溶液に、エーテル中の臭化メチルマグネシウム（３Ｍ，８７ｍＬ，２６１ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で１０分にわたり添加した。反応混合物を０℃で２．５時間撹拌し、室温にまで加温した。１２時間後、反応混合物を氷（３００ｇ）および塩化アンモニウム飽和水（５０ｇ）の混合物中に慎重に注いだ。エーテル層を分離し、水層をさらなるエーテル（４×２００ｍＬ）を用いて抽出した。合体した抽出物を硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、溶媒を蒸発させた。粗成物を、メタノール中のクロロホルム／メタノール／２Ｍ アンモニア（１０００：２０：１０，１０００：４０：２０，１０００：８０：４０）を溶離剤として用いたシリカゲル上のカラムクロマトグラフィにより精製し、生成物を油状物で得た（６．５ｇ，６２％収率）。１Ｈ ＮＭＲおよびＭＳによりこれが所望の生成物であることを確認した。
【０５４１】
４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５，５−ジメチル−２−オキソ−オキサゾリジン：
ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中の、１−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−メチル−２−ヒドロキシプロピルアミン（３．００ｇ，１４．９ｍｍｏｌ）およびカルボニルジイミダゾール（２．４１８ｇ，１４．９ｍｍｏｌ）の混合物を還流温度で３６時間加熱し、溶媒を蒸発させた。残渣を、クロロホルム／酢酸（９：１）を用いたシリカゲル上のカラムクロマトグラフィにより精製し、生成物を粘性のある油状物で得、静置して凝固させた（１．８０ｇ，５０％収率）。
【０５４２】
４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５，５−ジメチル−２−オキソ−３−（４−ニトロフェニルオキシカルボニル）オキサゾリジン
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（パラフィン２０３ｍｇ中に６０％ 懸濁，１．４当量）の撹拌した懸濁液中に、ＴＨＦ（５ｍＬ）中の４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５，５−ジメチル−２−オキソ−オキサゾリジン−３−（８７０ｍｇ，３．６２２ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で添加し、続いて３０分撹拌した。この懸濁液を、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（９５０ｍｇ，４．７１ｍｍｏｌ）溶液に、−７８℃でアルゴン下にて添加し、撹拌を２時間続けた。ゆっくりと室温にまで加温し、４時間後、溶媒を蒸発させた。残渣をジクロロメタン（１５０ｍＬ）と混合し、０．０５Ｎ 水酸化ナトリウム（３×１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（硫酸ソーダ）。溶媒を蒸発させ、残渣を、クロロホルム／酢酸エチル（９：１）を溶離剤として用いたシリカゲル上のカラムクロマトグラフィにより精製し、生成物を白色の粉末で得た（８６０ｍｇ，５９％収率）。
【０５４３】
４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５，５−ジメチル−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボン酸 ４−ニトロフェニル：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），７．２９−６．９７（ｍ，５Ｈ），５．０４（ｓ，１Ｈ），１．０９（ｓ，６Ｈ）；Ｃ１８Ｈ１４Ｆ２Ｎ２Ｏ６＋０．２％Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５４．６１；Ｈ，３．６７；Ｎ，７，０８。実測値Ｃ，５４．８９；Ｈ，３．５９；Ｎ，７．４１。
【０５４４】
ａ．ベンズヒドリルインデン−（３，４−ジフルオロ−ベンジル）−アミン
トルエン（２００ｍＬ）中の３，４−ジフルオロベンジルアミン（９．８ｇ，６９ｍｍｏｌ）およびベンゾフェノン（１３．０ｇ，７１．０ｍｍｏｌ）の溶液中に、触媒量のＢＦ３・ＯＥｔ２を添加し、得られた溶液を還流温度で１２時間加熱した。反応混合物を真空下で濃縮し、油状物を得（２１ｇ，＞９５％）、これをＮＭＲ分析により特徴付け、さらに精製することなく後続する反応に供した。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ４．５７（ｓ，２Ｈ），７．８０−６．８０（ｍ，１３Ｈ）。
【０５４５】
ｂ．１−（ベンズヒドリリデン−アミノ）−１−（３，４−ジフルオロ−フェニル）プロパン−２−オル
２５０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中のベンズヒドリルインデン−（３，４−ジフルオロ−ベンジル）−アミン（２１ｇ，６９ｍｍｏｌ）の溶液中に、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム（１．７Ｍ，６０ｍＬ）を滴下添加し、得られた溶液を−７８℃で０．５時間撹拌した。溶液に、１００ｍＬのＴＨＦ中のアセトアルデヒド（１０ｍＬ，１８０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を−７８℃で２時間、２５℃で１時間撹拌した。塩水を添加することにより反応混合物の反応を停止させた。反応混合物を５００ｍＬのＥｔ２Ｏで希釈し、塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、真空下で濃縮し、油状物を得、これをさらに精製することなく次なる工程に用いた。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．０４（ｄ，３Ｈ），２．７７（ｂｒｏａｄ ｓ，１Ｈ），４．０８（ｍ，１Ｈ），４．１５（ｄ，１Ｈ），７．８０−６．８０（ｍ，１３Ｈ）。
【０５４６】
ｃ．１−アミノ−１−（３，４−ジフルオロ−フェニル）−プロパン−２−オル
先の手順からの生成物およびＭｅＯＮＨ２・ＨＣｌ（１０ｇ，１２０ｍｍｏｌ）の溶液を２００ｍＬのＭｅＯＨ中に希釈し、１２時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、油状の残渣を得、これを２００ｍＬのＥｔＯＡｃ中に溶解させ、塩水で洗浄した。有機層真空下で濃縮して油状の混合物を生成し、これをカラムクロマトグラフィ（５％ ＮＨ３ 飽和ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）に供し、所望の生成物を（３，４−ジフルオロベンジルアミンから８．８ｇ，６８％収率）、ジアステレオマーの混合物で得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）（〜４：１ ジアステレオマーの混合物）δ １．０２−２．７７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），１．０４（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，３Ｈ），２．１０（ｂｒ，６Ｈ），３．５６−３．６９（ｍ，２Ｈ），３．８８−３．９２（ｍ，２Ｈ），７．０２−７．１７（ｍ，６Ｈ）。
【０５４７】
ｄ．［１−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシ−プロピル］−カルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル
ＣＨＣｌ３（１５０ｍＬ）中の１−アミノ−１−（３，４−ジフルオロフェニル）−プロパン−２−オル（１３．１ｇ，７０．１ｍｍｏｌ）の溶液中に、ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）中のジカーボネートジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１９．３ｇ，８７．６ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で一度に添加し、得られた溶液を一晩室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を、シリカゲル（２：１ ヘキサン−ＥｔＯＡｃ 続いてＥｔＯＡｃ）上のカラムクロマトグラフィに供し、［１−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシ−プロピル］−カルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステルを粘性のある油状物を得た（１８．４ｇ，９１％収率）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）（〜４：１ ジアステレオマーの混合物） δ１．０５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），１．２５（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），１．４１（ｂｒ，２０Ｈ），３．９２−４．１９（ｂｒ，２Ｈ），４．４５−４．６０（ｍ，２Ｈ），５．４１−５．４９（ｂｒ，２Ｈ），７．０２−７．１７（ｍ，６Ｈ）。
【０５４８】
ｅ．４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５−メチル−オキサゾリジン−２−オン
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の［１−（３，４−ジフルオロフェニル）−２−ヒドロキシ−プロピル］−カルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．４３ｇ，１．５ｍｍｏｌ）のよく撹拌した溶液に９５％ＮａＨ（０．０９ｇ，３．８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応を大規模（＞５ｇ）に行い、１．０当量のＫＨおよび１．５当量のＮａＨを塩基として用いた。得られた懸濁液を３時間約３５℃（温水浴）で撹拌し、次いで氷で慎重に急冷した。二相の混合物を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出し、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去した。２つのジアステレオマーをシリカゲル上のカラムクロマトグラフィにより分離した（第１の異性体：０．１６ｇ，Ｒｆ＝０．６，３：１ ヘキサン−ＥｔＯＡｃ；第２の異性体：０．１８ｇ，Ｒｆ＝０．５，３：１ ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）。ＮＯＥ試験は、第１のジアステレオマーがメチルおよびｔｒａｎｓ配置のアリール群を有する一方、第２のジアステレオマーは２つのグループ間でｃｉｓ配置を有することを示した。
【０５４９】
ｔｒａｎｓ−ジアステレオマーに対する１Ｈ ＮＭＲ スペクトルは次の通りである。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ １．４９（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，３Ｈ），４．３７（ｄｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７ ７．２８（ｍ，３Ｈ）。
【０５５０】
ｃｉｓ−ジアステレオマーに対する１Ｈ ＮＭＲ スペクトルは次の通りである。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ０．９６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），４．９１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．９９（ｄｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．０８−７．２８（ｍ，３Ｈ）。
【０５５１】
ジアステレオマーのエナンチオマーを、アイソクラチック条件（Ｕ．Ｖ． ２５４ ｎＭ）下で８０％ヘキサン／２０％イソプロピルアルコール／０．１％ジエチルアミンを溶出系（１２ｍＬ／分）として用いたキラルセルＯＤ カラム（２０×２５０ ｍｍ）を用いることによるＨＰＬＣにより分離した。
【０５５２】
ｆ．４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５−メチル−２−オキソ−オキサゾリジン−３−カルボン酸−４−ニトロ−フェニルエステル
６０ｍＬ ＴＨＦ中の４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５−メチル−オキサゾリジン−２−オン（０．９７ｇ，４．５５ｍｍｏｌ）の溶液中に、ヘキサン中（３．０６ｍｍｏｌ，４．９ｍｍｏｌ）のｎ−ブチルリチウムの溶液を、シリンジを介してアルゴン雰囲気下にて−７８℃で添加した。得られた黄色の溶液を−７８℃で４０分撹拌した。次いでこの溶液を、カニューレを介して、ＴＨＦ中のクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（１．０３ｇ，５．１ｍｍｏｌ）の溶液を含んだ他の丸底フラスコ中に滴下添加し、−７８℃で１５分間にわたり冷却した。５分後、フラスコを冷却槽から取り出し、撹拌を１時間続けた。氷を添加することにより反応混合物を急冷し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物を塩水で洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過後、溶媒を除去し、残渣を、１：１ ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２ 続いてＣＨ２Ｃｌ２（Ｒｆ＝０．４，ＣＨ２Ｃｌ２）を用いたシリカゲル上のカラムクロマトグラフィにより精製し、所望の生成物を得た。
【０５５３】
ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ 異性体の相対配置を、各々のｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル誘導体の１Ｈ ＮＭＲ分析に基づいて指定した。ｔｒａｎｓ 異性体については、Ｃ−５メチルグループのプロトンおよびＣ−４のプロトンの間でＮＯＥが観察された。Ｃ−４でのプロトンおよびＣ−５の位置の異性体の間ではＮＯＥは観察されなかった。したがってこの異性体を、ｔｒａｎｓ 立体化学を指定した。ｃｉｓ異性体については、Ｃ−５ メチルグループのプロトンおよびＣ−４でのプロトンの間でＮＯＥは観察されなかった。しかし、Ｃ−４でのプロトンおよびＣ−５の位置の間ではＮＯＥが観察され、この異性体をｃｉｓ立体化学に指定した。ｃｉｓ（Ｊ＝７．８Ｈｚ）およびｔｒａｎｓ（Ｊ＝５．１Ｈｚ）のＣ−４ プロトンのビシナル結合定数もまた、同一のオキサゾリジンについて報告された値に一致し、また立体化学アサインメント（Ｄｏｎｄｏｎ，Ａ．；Ｐｅｒｒｏｎｅ，Ｄ．；Ｓｅｍｏｌａ，Ｔ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９５，１８１）を行うのに有用であった。
【０５５４】
オキサゾリジノン環のステレオジェン中心での絶対配置を指定するために、新規の合成ルートを設計した。この合成ルートは、キラルプールから派生した得念チオマー的に純粋な基質物質を採用する。商業的に入手可能な（Ｓ）−（＋）−乳酸メチルを、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．；Ｐａｓｃｕａｌ，Ｏ．；Ｒｏｍｅａ，Ｐ．；Ｒｏｖｉｒａ，Ｒ．；Ｕｒｐｉ，Ｆ．；Ｖｉｌａｒｒａｓａ，Ｊ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９９７，３８，１６３３）の方法にしたがってピロリジンアミドに変換した。（２Ｓ）−１−オキソ−１−（１−ピロリジニル）−２−プロパノールのＴＢＤＭＳグループへの保護化にしたがい、（１Ｓ）−１−メチル−２−オキソ−２−（１−ピロリジニル）エチルエーテルｔｅｒｔブチル（ジメチル）シリルを３，４−ジフルオロフェニルリチウムを用いて処理し、（２Ｓ）−２−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−１−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−プロパノンを唯一の生成物として得た。次いでこれを（２Ｓ）−２−｛［ｔｅｒｔ ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−１−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−プロパノンオキシムに変換した。（２Ｓ）−２−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−１−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−プロパノンオキシムのＬｉＡｌＨ４による還元、Ｎ−アシル化、および塩基により誘発された環化により、オキサゾリジノン−ジアステレオマーを得、これらをフラッシュカラムクロマトグラフィにより分離した。これらの異性体のエナンチオマー純度は、キラルＨＰＬＣ分析により確認され、またそれらの相対配置は、それらの１Ｈ ＮＭＲスペクトルとラセミ異性体との比較により指定された。乳酸から誘導されたオキサゾリジノンのＣ−５における絶対配置が（Ｓ）であるため、ｔｒａｎｓ化合物のＣ−４中心もまた（Ｓ）配置を有する。よって、ｃｉｓ化合物における立体中心の絶対配置は（４Ｒ，５Ｓ）に指定される。
【０５５５】
（４Ｓ，５Ｒ）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５−メチル−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボン酸 ４−ニトロフェニル：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．３０−６．９９（ｍ，５Ｈ），５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），５．０７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑｕｉｎｔｅｔ，１Ｈ），１．１７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）；Ｃ１７Ｈ１２Ｆ２Ｎ２Ｏ６＋０．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５２．７２；Ｈ，３．３８；Ｎ，７．２３。実測値Ｃ，５３．０９；Ｈ，３．１９；Ｎ，７．５０。
【０５５６】
（＋）−２−アミノ−３−（３，４−ジフルオロ）−フェニル−プロパン−１−オル：
０℃で、（＋）−３，４−ジフルオロフェニルアラニン（１．０ｇ，５．０ｍｍｏｌ）にＴＨＦ（３０ｍＬ）中のＬｉＡ１Ｈ４（０．４８０ｇ，１２．５ｍｍｏｌ）の撹拌中の懸濁液を徐々に加えた。その後、得られた懸濁液を２時間、還流下にて加熱した。反応混合物を０℃で冷却し、その後、水（０．５ｍＬ）、３Ｎ ＮａＯＨ（０．５ｍＬ）、ふたたび水（１．５０ｍＬ）で慎重に連続的に冷却した。得られた懸濁液をフリットされたガラス製の漏斗を通して濾過した。ろ液にエーテル（５０ｍＬ）を注ぎ、２０分間還流温度で懸濁液を加熱した。懸濁液を濾過し、先のろ液に合体させた。合体した有機物質をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、溶媒を真空下で除去した。２−アミノ−３−（３，４−ジフルオロ）−フェニル−プロパン−１−オルが白色粉末（０．５００ｇ，１００％）として得た。生成物をさらに精製することなく次なる工程に用いた。
【０５５７】
（＋）−［１−（３，４−ジフルオロベンジル）−２−ヒドロキシ−エチル］−カルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル：
０℃で、ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中のジカルボネート−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（０．６４０ｇ，２．９０ｍｍｏｌ）溶液をＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）中の（＋）−２−アミノ−３−（３，４−ジフルオロ）−フェニル−プロパン−１−オル（０．５００ｇ，２．６２ｍｍｏｌ）溶液に添加して、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣をクロマトグラフィにかけ（２：１ ヘキサン−ＥｔＯＡｃ，続いて ＥｔＯＡｃ）、（＋）−［１−（３，４−ジフルオロベンジル）−２−ヒドロキシ−エチル］−カルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（０．６４０ｇ，９９％）を白色粉末として得た。
【０５５８】
（＋）−４−（３，４−ジフルオロ−ベンゾイル）−オキサゾリジン−２−オン：
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の（＋）−［１−（３，４−ジフルオロベンジル）−２−ヒドロキシ−エチル］−カルバミン酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．００ｇ，４．００ｍｍｏｌ）溶液を、漏斗をつたわせながら、室温下で、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の９５％ ＮａＨ（０．１２ｇ，５．０ｍｍｏｌ）の撹拌中の懸濁液に加えた。得られた懸濁液を３時間撹拌し、その後、慎重に水（１０ｍＬ）で冷却した。二相の混合物をＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）で抽出し、塩水で洗浄し、濾過した。そして残渣を真空下で除去した。得られた粘着性の残渣をカラムクロマトグラフィ（Ｒｆ＝０．２５，３：２ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）に通して精製し、所望の生成物を白色粉末（０．３２０ｇ，７６％）として得た。
【０５５９】
（＋）−４−（３，４−ジフルオロ−ベンゾイル）−オキサゾリジン−２−オン−３−カルボン酸−４−ニトロ−フェニルエステル：
アルゴン下にてＴＨＦ（１０ｍＬ）中の（＋）−４−（３，４−ジフルオロ−ベンゾイル）−オキサゾリジン−２−オン（０．２１０ｇ，１．０ｍｍｏｌ）溶液を、漏斗をつたわせながら、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮａＨ（３０．０ｍｇ，１．３０ｍｍｏｌ）の撹拌中懸濁液に添加した。得られた懸濁液を３０分間、室温で撹拌した。その後、この懸濁液を−７８℃で１５分以上、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のクロロ蟻酸 ４−ニトロフェニル（０．３００ｇ，１．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、カニューレを通して滴下添加した。残渣を除去し、残余物質をカラムクロマトグラフィ（１：１ ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２，続いてＣＨ２Ｃｌ２；Ｒｆ＝０．４，ＣＨ２Ｃｌ２）を通して精製した後、さらに２時間撹拌し続け、所望の黄色の粉末（０．３５０ｇ，８２％）を得た。同様に、対応するｐ−フルオロフェニルアラニンから、４−（４−フルオロベンジル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボン酸 ４−ニトロフェニルを得た。
【０５６０】
４−（４−フルオロベンジル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボン酸 ４−ニトロフェニル：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），７．４２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．２４−６．９９，（ｍ，４Ｈ），４．６９−４．５９（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），４．２３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，９．３Ｈｚ），３．３７（ｄｄ，ＩＨ，Ｊ＝３．８，１３．６Ｈｚ），２．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３，１３．６Ｈｚ）；Ｃ１７ＨＩ３ＦＮ２Ｏ６に対する分析：計算値Ｃ，５６．６７；Ｈ，３．６４；Ｎ，７．７７。実測値Ｃ，５６．９４；Ｈ，３．７６；Ｎ，７．７１。
【０５６１】
２−［６−（４−フェニル−１−ピペリジニル）ヘキシル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン：
４−フェニルピペリジンヒドロクロライド（５ｇ，２５ｍｍｏｌ）、Ｎ−（６ブロモヘキシル）フタルイミド（１５．５ｇ，５０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２１．８ｍｌ，１２５ｍｍｏｌ）、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（０．２ｇ）、ジオキサン（２５０ｍｌ）を室温下で５００ｍＬの丸底フラスコに加えた。反応混合物を１００℃で７２時間撹拌した。残渣を真空下で除去し、天然の生成物をフラッシュクロマトグラフィ（９８：２＝クロロホルム：２Ｎメタノール中のアンモニア）で精製し、７．６７ｇの所望の生成物（７７％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７８−７．７９（ｍ，２Ｈ），７．７４−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．３２−７．１４（ｍ，５Ｈ），３．６９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３５Ｈｚ），３．０６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），２．４９（ｑｕｉｎｔｅｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．３６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１２．５Ｈｚ），１．８２（ｂｒ ｓ，４Ｈ），１．６９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．５４（ｂｒ ｓ，２Ｈ），１．３７（ｂｒ ｓ，４Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３９１．３（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２５Ｈ３０Ｎ２Ｏ２＋０．２Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，７６．１９；Ｈ，７．７７；Ｎ，７．１１。実測値Ｃ，７６．１４；Ｈ，７．３８；Ｎ，７．１３。
【０５６２】
置換された４−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペニリジニル］−１−（フェニル）−１−ブタノンの調製についての一般的手順：
４−（３−アミノフェニル）ピペリジン（２．０ｍｍｏｌ）、２．４ｍｍｏｌの適切に置換されたフェニルブチリルクロライド、３．０ｍｍｏｌのＫ２ＣＯ３、５ｍＬのトルエン中の１０ｍｇの１８−クラウン−６の混合物を２．５日間、１１０℃で加熱した。反応混合液を濃縮し、シリカ（ジクロロメタン中の５％メタノール）上でクロマトグラフィにかけ、所望の化合物を得た。
【０５６３】
４−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］−１−（４−フェノキシフェニル）−１−ブタノン：３０５ｍｇ；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４１５．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５６４】
４−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］−１−（４−クロロフェニル）−１−ブタノン：５００ｍｇ；Ｃ２１Ｈ２５ＣｌＮ２Ｏ＋０．３Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，６９．６２；Ｈ，７．１２；Ｎ，７．７３。実測値Ｃ，６９．６３；Ｈ，７．３４；Ｎ，７．６０；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３５７．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５６５】
４−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］−１−フェニル−１−ブタノン：２５０ｍｇ；Ｃ２１Ｈ２６Ｎ２Ｏ＋０．２Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，７７．３６；Ｈ，８．１６；Ｎ，８．５９。実測値Ｃ，７７．５５；Ｈ，８．１２；Ｎ，８．７５；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３２３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５６６】
４−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］−１−（２，４−ジメトキシフェニル）−１−ブタノン：３３０ｍｇ；Ｃ２３Ｈ３０Ｎ２Ｏ３＋０．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，７０．５６；Ｈ，７．９８；Ｎ，７．１６。実測値Ｃ，７０．６９；Ｈ，７．８７；Ｎ，６．９９；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３８３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５６７】
置換された４−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］−１−（４−フェニル）−１−ブタノンのアシル化またはスルホニル化の一般的手順：
ジクロロメタン中で１当量の置換された４−［４−（３−アミノフェニル）−１−ピペリジニル］−１−（４−フェニル）−１−ブタノン、１．５当量の酸塩化物もしくは塩化スルホニル、５当量のジイソプロピルエチルアミンの混合物を室温で２日間撹拌した。反応混合物を分取用ＴＬＣプレートに加え、ジクロロメタン：メタノール（１５：１，１％のイソプロピルアミンを含有する）で抽出し、所望の生成物を得た。
【０５６８】
置換された４−Ｎ−（３−｛１−［４−（フェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）アセトアミドの調製についての一般的手順：
ジオキサン（０．５から１．０Ｍ）中のＮ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］アセトアミド（１．０当量）およびアリール基で置換されたクロロブチロフェノン（２．０当量）、Ｋ２ＣＯ３（５．０当量）、ジイソプロピルエチルアミン（３．０当量）、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（ｃａｔ． ５−１０％）の混合物を１６時間還流温度で加熱した。反応混合物を濾過し、真空下で濃縮した。粗成物をシリカＴＬＣ（クロロホルム：０．５％のイソプロピルアミンを含有するメタノール）を使用してクロマトグラフィにかけ、所望の生成物を得た。
【０５６９】
例５７　Ｎ−（３−｛１−［４−（３，４−ジメチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）アセトアミド：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．７５（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．３５（ｓ，１Ｈ），７．２６−７．２２（ｍ，２Ｈ），６．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．２４−３．２１（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．６７−２．６３（ｍ，２Ｈ），２．５９−２．４８（ｍ，１Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），２．３０−２．２７（ｍ，２Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．１４−２．０６（ｍ，２Ｈ），２．００−１．８０（ｍ，４Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３９３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７０】
例５８　Ｎ−（３−｛１−［４−（３，４−ジメチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
５ｍＬのＤＭＦ中の０．０５００ｇ（０．２００ｍｍｏｌ）の２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド、０．１００ｇ（０．４８０ｍｍｏｌ）の４−クロロ−３’，４’−ジメチルブチロフェノン、０．０８０ｇ（０．６００ｍｍｏｌ）のＫ２ＣＯ３、０．０９０ｇ（０．６００ｍｍｏｌ）のＮａＩの混合物を１８時間、還流温度で加熱した。反応混合物を濾過し、ろ液を５ｍＬの水に注ぎ、３×５ｍＬの酢酸エチルで洗浄した。合体した有機物質を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空下で濃縮し、分取用ＴＬＣ（シリカ；９．５：０．５，ジクロロメタン：メタノール　＋１％イソプロピルアミン）で精製し、０．０６７ｇ（８０．０％収率）の所望の生成物を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．４４（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２３−７．２０（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．１３−３．１１（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．５６−２．４０（ｍ，４Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），２．１７−２．１５（ｍ，２Ｈ），２．０４−１．７８（ｍ，６Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４２１．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７１】
例５９　Ｎ−（３−｛１−［４−（３，４−ジメチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）シクロヘキサンカルボキシアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８０−６．８１（ｍ，７Ｈ），３．４１−３．００（ｍ，４Ｈ），２．９５−２．４１（ｍ，４Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），２．２２−１．０５（ｍ，１８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４６１．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７２】
例６０　Ｎ−（３−｛１−［４−（３，４−ジメチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−フェニルアセトアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８５−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．４５−６．９２（ｍ，１０Ｈ），３．７６（ｓ，２Ｈ），３．１０−２．９０（ｍ． ４Ｈ），２．５０−２．３５（ｍ，３Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），２．１０−１．８５（ｍ，４Ｈ），１．８０−１．６０（ｍ，４Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４６９．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７３】
例６１　Ｎ−（３−｛１−［４−（３，４−ジメチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−（３−メトキシフェニル）アセトアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７６−７．６５（ｍ，２Ｈ），７．３８−７．１２（ｍ，６Ｈ），６．９５−６．８０（ｍ，３Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，２Ｈ），３．１０−２．９０（ｍ，４Ｈ），２．５０−２．３８（ｍ，３Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），２．１０−１．８５（ｍ，４Ｈ），１．８０−１．６０（ｍ，４Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９９．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７４】
例６２　Ｎ−（３−｛１−［４−（３，４−ジメチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メトキシアセトアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８０−７．７５（ｍ，２Ｈ），７．５０−７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３４−６．９０（ｍ，３Ｈ），４．００（ｓ，２Ｈ），３．５１（ｓ，３Ｈ），３．３０−２．９５（ｍ，４Ｈ），２．７０−２．５０（ｍ，３Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），２．１５−１．８０（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４２３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７５】
例６３　Ｎ−（３−｛１−［４−（３，４−ジメチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）メタンスルホンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８２−７．１０（ｍ，７Ｈ），３．４１（ｓ，３Ｈ），３．４０−２．８５（ｍ，４Ｈ），２．８２−２．３５（ｍ，５Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），２．２２−１．８０（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４２９．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７６】
例６４　Ｎ−（３−｛１−［４−（３，４−ジメチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）エタンスルホンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．７５（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３０−７．０９（ｍ，４Ｈ），７．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．３６−３．０５（ｍ，６Ｈ），２．７７−２．５２（ｍ，３Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），２．１５−１．８２（ｍ，８Ｈ），１．３７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４４３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７７】
例６５　１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−（４−ニトロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジンアセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５５−７．４０（ｍ，３Ｈ），７．３５（ｓ，１Ｈ），７．２２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），３．３０−３．２７（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｔ，２ａ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．７６−２．３９（ｍ，５Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．１７−１．８５（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３９９．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７８】
例６６　１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−（４−ニトロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン−２−メチルプロパンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），３．２１−３．１８（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．６４−２．５１（ｍ，４Ｈ），２．２８−１．８６（ｍ，８Ｈ），１．２６（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４２７．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５７９】
例６７　Ｎ−（３−｛１−［４−（４−クロロフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）シクロヘキサンカルボキシアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．５５−７．１９（ｍ，５Ｈ），６．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．２５−３．００（ｍ，４Ｈ），２．６５−２．４５（ｍ，４Ｈ），２．３０−１．５０（ｍ，１８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４６７．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８０】
例６８　Ｎ−（３−｛１−［４−（４−クロロフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−フェニルアセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４６−７．２６（ｍ，９Ｈ），７．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．７５（ｓ，２Ｈ），３．１５−３．１３（ｍ，２Ｈ），３．０３（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．６４−２．４６（ｍ，３Ｈ），２．２２−１．６０（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８１】
例６９　Ｎ−（３−｛１−［４−（４−クロロフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−（３−メトキシフェニル）アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．３８（ｓ，１Ｈ），７．３５−７．２５（ｍ，３Ｈ），７．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９４−６．８６（ｍ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，２Ｈ），３．１２−３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．５７−２．４４（ｍ，３Ｈ），２．２０−１．６０（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５０５．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８２】
例７０　Ｎ−（３−｛１−［４−（４−クロロフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メトキシアセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７ ７．２５（ｍ，５Ｈ），６．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），４．０１（ｓ，２Ｈ），３．５７（ｓ，３Ｈ），３．３０−３．１５（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．７０−２．５０（ｍ，３Ｈ），２．３５−１．８０（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４２９．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８３】
例７１　Ｎ−（３−｛１−［４−（４−クロロフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）メタンスルホンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９５−６．９６（ｍ，８Ｈ），３．４８（ｓ，３Ｈ），３．２８−２．９０（ｍ，６Ｈ），２．８０−２．５７（ｍ，３Ｈ），２．３８−１．８６（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ ４３５．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８４】
例７２　Ｎ−（３−｛１−［４−（４−クロロフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）エタンスルホンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．３０−７．０８（ｍ，３Ｈ），６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．２６−３．０２（ｍ，６Ｈ），２．６９−２．４５（ｍ，３Ｈ），２．３２−１．７５（ｍ，８Ｈ），１．３６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４４９．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８５】
例７３　Ｎ−［３−｛１−（４−オキソ−４−フェニルブチル）−４−ピペリジニル］フェニル｝アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ６．８０（ｍ，９Ｈ），３．４０−２．９５（ｍ，４Ｈ），２．８５−２．２０（ｍ，３Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．１５−１．７０（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３６５．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８６】
例７４　２−メチル−Ｎ−｛３−［１−（４−オキソ−４−フェニルブチル）−４−ピペリジニル］フェニル｝プロパンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） ７．９９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．５７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．４８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），７．４５−７．２０（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．９４（ｄ，１Ｈ，８．０Ｈｚ），３．２４−３．２１（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．５７−２．２５（ｍ，４Ｈ），２．３１−１．８４（ｍ，８Ｈ），１．２６（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３９３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８７】
例７５　Ｎ−｛３−［１−（４−オキソ−４−フェニルブチル）−４−ピペリジニル］フェニル｝−２−フェニルアセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．６５−７．１５（ｍ，１１Ｈ），６．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３．７４（ｓ，２Ｈ），３．２０−２．９５（ｍ，４Ｈ），２．６５−２．４０（ｍ，３Ｈ），２．２５−１．７０（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４４１．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８８】
例７６　２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−｛３−［１−（４−オキソ−４−フェニルブチル）−４−ピペリジニル］フェニル｝アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．５６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６２Ｈｚ），７．４６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４０（ｓ，１Ｈ），７．３７−７．２６（ｍ，２Ｈ），７．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９４−６．８６（ｍ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），３．１２−３．０３（ｍ，４Ｈ），２．５７−２．４４（ｍ，３Ｈ），２．１６−１．７７（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４７１．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５８９】
例７７　Ｎ−（３−｛１−［４−（２，４−ジメトキシフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３３（ｓ，１Ｈ），７．２２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．４６（ｓ，１Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．４８−３．２７（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．９０−２．６８（ｍ，２Ｈ），２．６５−２．３８（ｍ，３Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．１８−１．８０（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４２５．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９０】
例７８　Ｎ−（３−｛１−［４−（２，４−ジメトキシフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．４１−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．４６（ｓ，１Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．１１−３．０８（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．５３−２．４６（ｍ，４Ｈ），２．１３−１．７９（ｍ，８Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ ４５３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９１】
例７９　Ｎ−（３−｛１−［４−（２，４−ジメトキシフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−フェニルアセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８５（ｍ，１２Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，２Ｈ），３．２２−２．９０（ｍ，４Ｈ），２．６４−２．４０（ｍ，３Ｈ），２．２５−１．７０（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５０１．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９２】
例８０　Ｎ−（３−｛１−［４−（２，４−ジメトキシフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−（３−メトキシフェニル）アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４８−７．１５（ｍ，５Ｈ），６．９５−６．８０（ｍ，３Ｈ），６．５８−６．４５（ｍ，２Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），３．８６（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７２（ｓ，２Ｈ），３．２５−２．９５（ｍ，４Ｈ），２．６５−２．４０（ｍ，３Ｈ），２．３０−１．９５（ｍ，４Ｈ），１．９３−１．７２（ｍ，４Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５３１．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９３】
例８１　Ｎ−（３−｛１−［４−オキソ−４−（４−フェノキシフェニル）ブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ６．７５（ｍ，１３Ｈ），３．３０−２．８０（ｍ，４Ｈ），２．７５−２．１０（ｍ，５Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．００−１．６０（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４５７．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９４】
例８２　２−メチル−Ｎ−（３−｛１−［４−オキソ−４−（４−フェノキシフェニル）ブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）プロパンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４３−７．１５（ｍ，６Ｈ），７．１０−６．９３（ｍ，５Ｈ），３．４２−２．９５（ｍ，４Ｈ），２．８０−２．４５（ｍ，４Ｈ），２．８０−１．８０（ｍ，８Ｈ），１．１４（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４８５．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９５】
例８３　２−（３−メトキシフェニル）−Ｎ−（３−｛１−［４−オキソ−４−（４−フェノキシフェニル）ブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４１−７．１８（ｍ，７Ｈ），７．０８−６．９９（ｍ，５Ｈ），６．９４−６．８７（ｍ，３Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，２Ｈ），３．１０−２．９５（ｍ，４Ｈ），２．５５−２．４０（ｍ，３Ｈ），２．１５−１．９５（ｍ，４Ｈ），１．８１−１．７０（ｍ，４Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５６３．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９６】
例８４　Ｎ’−（３−｛１−［４−（４−クロロフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．２７（ｓ，１Ｈ），７．２５−７．１０（ｍ，２Ｈ），６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．３０−３．１０（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．８３（ｓ，６Ｈ），２．６８−２．４５（ｍ，３Ｈ），２．３０−１．７５（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ ４６４．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９７】
例８５　Ｎ−（３−｛１−［４−オキソ−４−（２−チエニル）ブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９０−６．７８（ｍ，７Ｈ），３．２２−２．８８（ｍ，４Ｈ），２．６９−２．２５（ｍ，５Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），２．００−１．６４（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３７１．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９８】
例８６　Ｎ−（３−｛１−［４−（４−イソプロピルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．００−６．７８（ｍ，８Ｈ），３．１５−２．９８（ｍ，４Ｈ），２．７７−２．１５（ｍ，４Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），２．００−１．６２（ｍ，８Ｈ），０．９２７（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４０７．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０５９９】
例８７　Ｎ−（３−｛１−［４−（４−メチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９０−６．８０（ｍ，８Ｈ），３．１０−２．４５（ｍ，７Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），２．０１−１．６８（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３７９．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６００】
例８８　Ｎ−（３−｛１−［４−（４−ブロモフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）アセタミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９０−６．８０（ｍ，８Ｈ），３．３０−３．０５（ｍ，４Ｈ），２．７０−２．４５（ｍ，３Ｈ），２．０５（ｓ，３Ｈ），１．９８−１．６５（ｍ，８Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４４４．０（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６０１】
例８９　Ｎ−（３−｛１−［４−（３，４−ジメチルフェニル）−４−オキソブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−プロパンスルホンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．７５（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２７−７．００（ｍ，５Ｈ），３．３２−３．２４（ｍ，３Ｈ），３．１０−３．０２（ｍ，２Ｈ），２．７８−２．５０（ｍ，３Ｈ），２．３２（ｓ，６Ｈ），２．１９−１．８４（ｍ，８Ｈ），１．３９（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４５７．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６０２】
例９０　Ｎ−（３−｛１−［４−オキソ（４−フェノキシフェニル）ブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−プロパンスルホンアミド：
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．９７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．４４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２７−７．００（ｍ，９Ｈ），３．３５−２．９６（ｍ，５Ｈ），２．６９−２．４５（ｍ，３Ｈ），２．１４−１．７９（ｍ，８Ｈ），１．３９（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ ５２１．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６０３】
例９１　Ｎ−（３−｛１−［３−（４−クロロフェニル）−２−メトキシプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
ジオキサン（２．０ｍＬ）中の、３−メトキシ−３−（ｐ−クロロフェニル）−１−クロロプロパン（２７．４ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（２８．３ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５０ｍＬ）、および触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウムを、９０℃で７２時間撹拌した。反応混合物を濃縮して体積を小さくし、分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィにかけ、Ｎ−（３−｛１−［３−（４−クロロフェニル）−２−メトキシプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（３９．５ｍｇ，７３．８％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲδ ７．４８（ｓ，１Ｈ），７．３４−７．３（ｍ，２Ｈ），７．２５（ｍ，４Ｈ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．２０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，７．６Ｈｚ），３．２（ｓ，３Ｈ），３．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），２．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），２．４９（Ｈ，４Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．２０−２．１０（ｍ，４Ｈ），１．８２（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４２９．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６０４】
例９２　Ｎ−（３−｛１−［６−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ヘキシル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
合成方法は、２−［６−（４−フェニル−１−ピペリジニル）ヘキシル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオンについて記載した方法と同様である。Ｎ−（３−｛１−［６−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ヘキシル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：５０６ｍｇ（５６％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８６−７．８０（ｍ，２Ｈ），７．７３−７．６８（ｍ，２Ｈ），７．４４（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），３．６９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．０１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），２．５８−２．４０（ｍ，２Ｈ），２．３３（ｍ，２Ｈ），１．９８（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝３．２，１１．３Ｈｚ），１．８４−１．６４（ｍ，４Ｈ），１．５１（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．４３−１．３０（ｍ，６Ｈ），１．２４（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４７６．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６０５】
例９３　Ｎ−｛３−［１−（３−メトキシ−３−フェニルプロピル）−４−ピペリジニル］フェニル｝−２−メチルプロパンアミド：
ジオキサン（２．０ｍＬ）中の、３−メトキシ−３−フェニル−１−クロロプロパン（２３．１ｍｇ，０．１２６ｍｍｏｌ）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（２８．３ｍｇ，０．１２６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５０ｍＬ）、および触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウムの混合物を、９０℃で７２時間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、Ｎ−｛３−［１−（３−メトキシ−３−フェニルプロピル）−４−ピペリジニル］フェニル｝−２−メチルプロパンアミド（４５．４ｍｇ，９１．２％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４５（ｓ，１Ｈ），７．３４−７．２５（ｍ，５Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．２０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．９，７．６Ｈｚ），３．２（ｓ，３Ｈ），３．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），２．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），２．４９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，４Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．３−２．１（ｍ，４Ｈ），１．８２（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３９５．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６０６】
例９４　Ｎ−（３−｛１−［４−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
合成方法は、２−［６−（４−フェニル−１−ピペリジニル）ヘキシル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオンについて記載された方法と同じである。Ｎ−（３−｛１−［４−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：６６４ｍｇ（７４％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８７−７．７８（ｍ，２Ｈ），７．７６−７．６４（ｍ，２Ｈ），７．４７（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），６．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．３７−３．２２（ｍ，２Ｈ），３．０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），２．７５（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．６４−２．３３（ｍ，４Ｈ），１．９９（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．６，１１．７Ｈｚ），１．８６−１．６５（ｍ，２Ｈ），１．６３−１．５０（ｍ，２Ｈ），１．２３ ａｎｄ １．２１（ｔｗｏ ｄ，６Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４４８．４（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２７Ｈ３４Ｎ３ＣｌＯ３＋０．４Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，６．０２；Ｈ，７．１４；Ｎ，８．５５。実測値Ｃ，６６．０７；Ｈ，６．７８；Ｎ，８．６５。
【０６０７】
例９５　Ｎ−（３−｛１−［４−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
合成方法は、２−［６−（４−フェニル−１−ピペリジニル）ヘキシル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオンについて記載された方法と同じである。Ｎ−（３−｛１−［５−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）ペンチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：６１４ｍｇ（６４％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８７−７．８（ｍ，２Ｈ），７．７６−７．６８（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．６９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．３９−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．０２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ），２．７８（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．６４−２．５２（ｍ，１Ｈ），２．５２−２．４０（ｍ，１Ｈ），２．４０−２．３１（ｍ，２Ｈ），２．０１（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝３．７，１１．１Ｈｚ），１．８５−１．６４（ｍ，２Ｈ），１．５８（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．４５−１．３２（ｍ，２Ｈ），１．２３（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４６２．４（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２８Ｈ３６Ｎ３ＣｌＯ３に対する分析：計算値Ｃ，６７．５２；Ｈ，７．２９；Ｎ，８．４４。実測値Ｃ，６７．０４；Ｈ，７．０６；Ｎ，８．３８。
【０６０８】
例９６　２−メチル−Ｎ−｛３−［１−（４−フェニルブチル）−４−ピペリジニル］フェニル｝プロパンアミド
２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（２８．３ｍｇ，０．１００ｍｍｏｌ）、４−フェニル−１−クロロブタン（２１．１ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５０ｍＬ）、触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウム、およびジオキサン（２．０ｍＬ）の混合物を還流温度で３日間加熱した。反応混合物濃縮し、分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いてクロマトグラフィにかけ、生成物２−メチル−Ｎ−｛３−［１−（４−フェニルブチル）−４−ピペリジニル］フェニル｝プロパンアミド（９．５０ｍｇ，２５．１％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲδ ７．３７（ｓ，１Ｈ），７．２９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），７．１８（ｍ，３Ｈ），７．１１（ｍ，３Ｈ），６．９０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），３．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．４１（ｍ，４Ｈ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ），２．０１（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５７（ｍ，４Ｈ），１．１８（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３７９．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６０９】
例９７　Ｎ−（３−｛１−［３−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）プロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
合成方法は、２−［６−（４−フェニル−１−ピペリジニル）ヘキシル］−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオンについて記載された方法と同じである。
【０６１０】
Ｎ−（３−｛１−［３−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）プロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：８１０ｍｇ（９３％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８７−７．８２（ｍ，２Ｈ），７．７３−７．６８（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．１８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．０６（ｑｕｉｎｔｅｔ，２Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），２．９５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ），２．５８−２．３１（ｍ，４Ｈ），１．９６−１．８３（ｍ，２Ｈ），１．７０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ），１．５２（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝３．５，１２．５Ｈｚ），１．０３（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４３４．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６１１】
例９８　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
（Ｓ）−（−）−３−クロロ−１−フェニル−１−プロパノール（０．４２６ｇ，２．５０ｍｍｏｌ，９９％ｅｅ）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（０．５６５ｇ，２．００ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．２９ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）、ジオキサン（５．０ｍＬ）、および触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウムの混合物を９０℃で７２時間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て所望の生成物（３０６ｍｇ，３９．３％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４６（ｓ，１Ｈ），７．４２（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．３５（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．２３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），７．１２（ｓ，１Ｈ），６．９６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．３Ｈｚ），３．１８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５，１２．５Ｈｚ），２．７４（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），２．３−２．１（ｍ，６Ｈ），１．８（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３８９．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６１２】
例９９　Ｎ−（３−｛１−［３−メトキシ−３−（４−メチルフェニル）プロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
ジオキサン（２．０ｍＬ）中の、３−メトキシ−３−（ｐ−トリール）−１−クロロプロパン（２４．９ｍｇ，０．１２６ｍｍｏｌ）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（２８．３ｍｇ，０．１２６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５０ｍＬ）、および触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウムの混合物を、９０℃で７２時間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て所望の生成物（１０．９ｍｇ，２１．２％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００，ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４４（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｍ，１Ｈ），７．３−７．１（ｍ，５Ｈ），６．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），４．１８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．６，７．９Ｈｚ），３．２４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），３．２（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ），２．４９（ｍ，４Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．３−２．１（ｍ，３Ｈ），１．９２（ｄ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４０９．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６１３】
例１００　Ｎ−｛３−［１−（３−イソプロポキシ−３−フェニルプロピル）−４−ピペリジニル］フェニル｝−２−メチルプロパンアミド
ジオキサン（２．０ｍＬ）中の３−イソプロピル−３’−フェニル−１−クロロプロパン（２６．６ｍｇ，０．１２６ｍｍｏｌ）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（２８．３ｍｇ，０．１２６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５０ｍＬ）、および触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウムの混合物を９０℃で７２時間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て所望の生成物（１４．１ｍｇ，２６．５％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４６（ｓ，１Ｈ），７．４３−７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｍ，３Ｈ），７．２３（ｍ，２Ｈ），６．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），４．４６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，８．３Ｈｚ），３．４９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．１０（ｓ，２Ｈ），２．７０（ｍ，２Ｈ），２．５２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，４Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，２Ｈ），１．９０−１．８０（ｄ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），１．１５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．０８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４２３．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６１４】
例１０１　Ｎ−（３−｛１−［４，４−ビス（４−フルオロフェニル）ブチル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ジオキサン（２．０ｍＬ）中の、４，４−ビス（４−フルオロ−フェニル）−１−クロロ−ブタン（３９．０ｍｇ，Ｏ．，１２６ｍｍｏｌ）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（２８．３ｍｇ，０．１２６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５０ｍＬ）、および触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウムの混合物を、９０℃で７２時間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（１５．９ｍｇ，２５．２％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０２（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｓ，１Ｈ），７．３−７．１５（ｍ，４Ｈ），７．１０（ｍ，３Ｈ），６．８９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，５Ｈ），３．８１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），３．３０（ｓ，１Ｈ），２．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２，５Ｈｚ），２．８０（ｍ，１Ｈ），２．４０（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），１．９３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑ，３Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），１．７２（ｍ，３Ｈ），１．４０（ｍ，２Ｈ），１．２０（ｍ，２Ｈ），１．１５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９１．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６１５】
例１０２　Ｎ−｛３−［１−（３−メトキシベンジル）−３−ピペリジニル］フェニル｝−２−メチルプロパンアミド
２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（２８．３ｍｇ，０．１００ｍｍｏｌ）、３−メトキシベンジル塩化物（１９．６ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５０ｍＬ）、触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウム、およびジオキサン（２．０ｍＬ）の混合物。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（１０．２ｍｇ，２７．９％収率）を黄色の固体で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４６（ｓ，１Ｈ），７．３５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２７−７．２１（ｍ，２Ｈ），６．９５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），６．８２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，８．３Ｈｚ），３．８４（ｍ，３Ｈ），３．５６（ｓ，２Ｈ），３．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ），２．５１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，４Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．１３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，２Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３６７．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６１６】
例１０３　Ｎ−（３−｛１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンジル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（２８．３ｍｇ，０．１００ｍｍｏｌ）、３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンジル臭化物（３８．４ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５０ｍＬ）、触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウム、およびジオキサン（２．０ｍＬ）の混合物。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（１２．２ｍｇ，２５．８％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８３（ｓ，２Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），７．５３（ｓ，１Ｈ），７．３０−７．２１（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），６．９８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．６２（ｓ，２Ｈ），２．９４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ），２．５１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．１４（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４７３．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６１７】
例１０４　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−４−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル｝−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
方法Ａ
４−｛［（１Ｒ）−３−クロロ−１−フェニルプロピル］オキシ｝−１，２−ジメトキシベンゼン：
ＴＨＦ（１１０ｍＬ）中の、３，４−ジメトキシフェノール（４．０７ｇ，２６．４ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−（−）−３−クロロ−フェニル−１−プロパノール（４．５０ｇ，２６．４ｍｍｏｌ，９９％ｅｅ，Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、トリフェニルホスフィン（６．９２ｇ，２６．４ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（４．５９ｇ，２６．４ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で２４時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮した。この時点で残渣を（×３）で洗浄することができ、合体したペンタン抽出物を濃縮し、クロマトグラフィにかけ（シリカ，溶離剤としてヘキサン−ＥｔＯＡｃ ８：１）、所望の生成物を得た（Ｓｒｅｂｎｉｋ，Ｍ．；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｐ．Ｖ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９８８，５３，２９１６−２９２０により一般的手順として記載の通り）。この手順をより小規模に行い、生成物を４０％のみの収率で得た。代替的に、大規模の場合（２６．４ｍｍｏｌ）、粗成物を少量のジクロロメタンで粉砕し、沈殿した酸化トリフェニルホスフィンを濾過した。ろ液を濃縮し、粗成物をクロマトグラフィにかけ、所望の生成物を黄色の薄い油状物で得た（７．３０ｇ，８８．９％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３９−７．３２（ｍ，４Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），６．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ），６．３０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．７，８．７Ｈｚ），５．２７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５，８．７Ｈｚ），３．７９（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．６１（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｍ，１Ｈ），１．８０（Ｓ，１Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３０７．１１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６１８】
Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル｝−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
ＤＭＦ（５．０ｍＬ）中の、炭酸カリウム（３２１ｍｇ，２．３２ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（５２２ｍｇ，３．４８ｍｍｏｌ）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（５７０ｍｇ，２．３２ｍｍｏｌ）、および４−｛［（１Ｒ）−３−クロロ−１−フェニルプロピル｝オキシ］−１，２−ジメトキシベンゼン（７１２ｍｇ，２．３２ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃で３時間撹拌し、この時点でＴＬＣは反応が完全であることを示した。反応混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、水層を塩化メチレン（３×３０ｍＬ）で抽出した。合体した有機抽出物を塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗成物を分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］により精製し、生成物（９７０ｍｇ，９０．１％）を濃い油状物で得た。
【０６１９】
方法Ｂ
２５ｍＬ丸底フラスコ中に、トリフェニルホスフィン（９．８０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、アゾジカルボン酸ジエチル（５．２２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル｝−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、３，４−ジメトキシフェノール（７．７０ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、およびＴＨＦ（１．０ｍＬ）を室温で添加した。反応混合物を室温で一晩（１６時間）撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中の２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］により精製し、所望の生成物（４．４ｍｇ，３４．１％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４６（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｍ，３Ｈ），６．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），６．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），６．２９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６，９．１Ｈｚ），５．２０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．５Ｈｚ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｍ，２Ｈ），２．７７（ｍ，２Ｈ），２．５（ｍ，２Ｈ），２．３−２．１（ｍ，６Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５１７．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６２０】
例１０５　２−メチル−Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−フェノキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）プロパンアミド
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル｝−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、フェノール（４．７０ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（９．８０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、アゾジカルボン酸ジエチル（５．２２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（２．７ｍｇ，２３．６％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲδ ７．４６（ｓ，２Ｈ），７．４０−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｍ，３Ｈ），７．２０（ｍ，２Ｈ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），６．８９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔｔ，１Ｈ，Ｊ＝０．８，７．６Ｈｚ），６．８４（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝０．８，８．０Ｈｚ），５．２０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．５Ｈｚ），３．３５（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｍ，２Ｈ），２．６０（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．９６（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４５７．４（Ｍ＋Ｈ）＋；。
【０６２１】
例１０６　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（４−メトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、４−メトキシフェノール（６．２０ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（９．８０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（５．２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（４．６ｍｇ，３７．９％収率）を濃い油状物で得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３８−７．１４（Ｒｎ，８Ｈ），６．９０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．７２−６．４６（ｍ，４Ｈ），５．０９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，８．１Ｈｚ），３．６４（ｓ，３Ｈ），３．１８（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），２．３７−１．７２（ｍ，８Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４８７．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６２２】
例１０７　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（３−クロロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、３−クロロフェノール（６．４０ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（９．８０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（５．２２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（４．９ｍｇ，４０．０％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３９（ｓ，１Ｈ），７．３５−７．１０（ｍ，７Ｈ），７．０２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．８４−６．７５（ｍ，２Ｈ），６．６５（ｍ，１Ｈ），５．０９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９９，１Ｈｚ），３．１０（ｍ，２Ｈ），２．６０（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），２．３０−１．７０（ｍ，８Ｈ），１．１８（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９１．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６２３】
例１０８　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（４−クロロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、４−クロロフェノール（６．４０ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（９．８０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（５．２２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（３．３ｍｇ，２６．９％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲδ ７．３６（ｓ，１Ｈ），７．３５−７．２２（ｍ，７Ｈ），７．１２（ｍ，２Ｈ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．７７（ｍ，２Ｈ），５．２３（ｍ，１Ｈ），３．１８（ｍ，２Ｈ），２．７０（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），２．４０−１．８０（ｍ，８Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９１．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６２４】
例１０９　２−メチル−Ｎ−［３−（１−｛（３Ｓ）−３−フェニル−３−［４−（トリフルオロメチル）フェノキシ］プロピル｝−４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、４−トリフルオロメチルフェノール（８．１００ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（９．８ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（５．２２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（５．１０ｍｇ，３８．９％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ δ８．０６（ｓ，１Ｈ），７．４９（ｓ，１Ｈ），７．４４（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝．６Ｈｚ），７．３８−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．３０−７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７Ｈｚ），６．９１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），５．３４（ｍ，１Ｈ），３．１９（ｍ，２Ｈ），２．７２（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），２．４０−１．８０（ｍ，８Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５２５．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６２５】
例１１０　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−（２，５−ジフルオロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、２，５−ジフルオロフェノール（６．５０ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（９．８０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（５．２２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（３．６０ｍｇ，２９．３％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲδ ７．４６（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．３２（ｍ，４Ｈ），７．３１−７．２０（ｍ，２Ｈ），７．１７（ｓ，１Ｈ），７．０１−６．９２（ｍ，２Ｈ），６．６５−６．４２（ｍ，２Ｈ），５．２７（ｍ，１Ｈ），３．１３（ｍ，２Ｈ），２．６４（ｍ，２Ｈ），２．５１（ｍ，２Ｈ），２．２８−１．８０（ｍ，８Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９３．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６２６】
例１１１　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジクロロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル｝］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、３，４−ジクロロフェノール（８．２０ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（９．８０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（５．２２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（５．２０ｍｇ，３９．７％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲδ７．７０−７．６３（ｍ，２Ｈ），７．５５（ｍ，１Ｈ），７．４７−７．４３（ｍ，３Ｈ），７．４０−７．１９（ｍ，３Ｈ），７．００−６．５０（ｍ，２Ｈ），６．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２，８．８Ｈｚ），５．２５（ｍ，１Ｈ），３．２０（ｍ，２Ｈ），２．７０（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），２．４０−２．１０（ｍ，４Ｈ），２．１０−１．８０（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５２５．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６２７】
例１１２　２−メチル−Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−フェノキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）プロパンアミド
ＴＨＦ（１．０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、フェノール（４．７０ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（９．８０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（５．２２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（４．１ｍｇ，３６．０％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ７．４５（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．１５（ｍ，１０Ｈ），６．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．８８−６．８２（ｍ，２Ｈ），５．２６（ｍ，１Ｈ），３．１８（ｍ，２Ｈ），２．７５（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），２．４０−２．１０（ｍ，４Ｈ），２．１０−１．８０（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４５７．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６２８】
例１１３　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
方法Ａ
２５ｍＬ丸底フラスコ中に、（Ｒ）−（＋）−３−クロロ−１−フェニル−１−プロパノール（０．５４５ｇ，３．１９ｍｍｏｌ，９９％ｅｅ，Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（０．７４８ｇ，３．０４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．４２０ｇ，３．０４ｍｍｏｌ）、およびヨウ化ナトリウム（０．６８４ｇ，４．５６ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（６．０ｍＬ）を室温で添加した。１００℃で３時間撹拌した後、ＴＬＣは反応が完全であることを示した。反応混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、水層を塩化メチレン（３×２０ｍＬ）で抽出した。合体した有機抽出物を塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィにより精製し（１：１＝ヘキサン：酢酸エチル，１％イソプロピルアミンを添加）、所望の生成物（１．０９ｇ，９４．３％収率）を薄い黄色の固体で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．１０（ｓ，１Ｈ），７．４６−７．３５（ｍ，６Ｈ），７．２７（ｍ，２Ｈ），６．９８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），５．０２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．１Ｈｚ），３．１８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．５，１２．５Ｈｚ），２．７４（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：３８１．２（Ｍ＋Ｈ）＋。ジクロロメタン中の遊離塩基の溶液にエーテル（１．２当量）中の１Ｎ ＨＣｌをわずかに過剰に添加することにより、塩化水素塩を調製した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥させた。Ｃ２４Ｈ３２Ｎ２Ｏ２＋ＨＣｌ＋０．８Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，６６．８２；Ｈ，８．０８；Ｎ，６．４９；Ｃｌ，８．２２。実測値Ｃ，６６．９０；Ｈ，７．７８；Ｎ，６．６３；Ｃｌ，８．５２。
【０６２９】
方法Ｂ
２５ｍＬ丸底フラスコ中に、（Ｒ）−（＋）−３−クロロ−１−フェニル−１−プロパノール（０．４２６ｇ，２．５０ｍｍｏｌ）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（０．５６５ｇ，２．００ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．２９ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）、ジオキサン（５．０ｍＬ）、および触媒量のヨウ化テトラブチルアンモニウムを室温で添加した。９０℃で７２時間撹拌した後、反応混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、水層を塩化メチレン（３×２０ｍＬ）で抽出した。合体した有機抽出物を塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を分取用ＴＬＣプレート（１：５：１００＝イソプロピルアミン：メタノール：酢酸エチル）により精製し、所望の生成物（０．２６０ｇ，３４．２％収率）を薄い黄色の固体で得た。
【０６３０】
例１１４　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（４−シアノフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、４−シアノフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（４．７０ｍｇ，７１．３％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５４（ｍ，２Ｈ），７．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７ ７．２０（ｍ，３Ｈ），７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．９２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），５．３６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９，７．６Ｈｚ），３．１２（ｍ，２Ｈ），２．６１（ｍ，２Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４８２．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６３１】
例１１５　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（４−フルオロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、４−フルオロフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィにかけ、所望の生成物（４．２０ｍｇ，６４．７％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４０（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．２０（ｍ，５Ｈ），７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．８７（ｍ，１Ｈ），６．７６（ｍ，１Ｈ），５．２６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０，８．１Ｈｚ），３．０９（ｍ，２Ｈ），２．６６（ｍ，２Ｈ），２．５１（ｍ，２Ｈ），２．３−２．１（ｍ，６Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４７５．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６３２】
例１１６　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（４−ブロモフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、４−ブロモフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（０．７０ｍｇ，９．６％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０６（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．２０（ｍ，５Ｈ），７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．７３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），５．２２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．９，７．８Ｈｚ），３．１５（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｍ，２Ｈ），２．５１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５３５．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６３３】
例１１７　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（３−メトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、３−メトキシフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（３．１ｍｇ，４６．６％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），７．４２（ｓ，１Ｈ），７．３−７．２０（ｍ，３Ｈ），７．２０（ｍ，３Ｈ），７．０７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），６．４０（ｍ，３Ｈ），５．２７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．３，８．０Ｈｚ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｍ，２Ｈ），２．６１（ｓ，１Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈｚ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４８７．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６３４】
例１１８　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（４−シアノ−２−メトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中のＮ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２−メトキシ−４−シアノフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（５．５０ｍｇ，７６．５％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５１（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），７．２０（ｍ，４Ｈ），７．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），７．０８（ｓ，１Ｈ），６．９９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．７６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），５．４３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１，８．０Ｈｚ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．３４（ｍ，２Ｈ），２．６３（ｍ，２Ｈ），２．６３（ｓ，１Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．２８（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５１２．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６３５】
例１１９　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（５−アセチル−２−メトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２−メトキシ−５−アセチルフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（１．６０ｍｇ，２２．２％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．５２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），７．３−７．２（ｍ，５Ｈ），７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），６．６９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），５．４７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３，７．８Ｈｚ），３．９５（ｓ，３Ｈ），３．３８（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｍ，１Ｈ，２Ｈ），２．６１（ｓ，１Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．５０（ｓ，３Ｈ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５２９．６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６３６】
例１２０　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−（２−アセチルフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル｝−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２−アセチルフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（１．７０ｍｇ，２４．９％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．６５（ｍ，１Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ），７．３０−７．２０（ｍ，５Ｈ），７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９７（ｍ，２Ｈ），６．７６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ），５．４９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３，８．０Ｈｚ），３．３８（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｓ，１Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９８．８（Ｍ＋）。
【０６３７】
例１２１　Ｎ−［３−（１−｛（３Ｒ）−３−［２−フルオロ−５−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−３−フェニルプロピル｝−４−ピペリジニル）フェニル］−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２−フルオロ−２−トリフルオロメチルフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（２．５０ｍｇ，３３．７％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０７（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｍ，１Ｈ），７．４５（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．１０（ｍ，６Ｈ），７．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），５．３７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，８．５Ｈｚ），３．４（ｍ，２Ｈ），２．８（ｍ，２Ｈ），２．６（ｓ，１Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５４２．６（Ｍ＋），５４３．５４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６３８】
例１２２　Ｎ−［３−（１−｛（３Ｓ）−３−［２−フルオロ−５−（トリフルオロメチル）フェノキシ］−３−フェニルプロピル｝−４−ピペリジニル）フェニル］−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２−フルオロ−２−トリフルオロメチルフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（３．００ｍｇ，４０．４％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０６（ｓ，１Ｈ），７．６７（ｍ，２Ｈ），７．５５（ｍ，２Ｈ），７．５０−７．４０（ｍ，３Ｈ），７．３０−７．１０（ｍ，３Ｈ），７．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．０７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．３７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２，８．１Ｈｚ），３．３７（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｍ，２Ｈ），２．６３（ｓ，１Ｈ），２．５０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８５（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５４２．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６３９】
例１２３　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（２，５−ジフルオロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２，５−ジフルオロフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（２．７０ｍｇ，４０．１％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４６（ｓ，１Ｈ），７．５０−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．２０（ｍ，２Ｈ），７．１７（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｍ，２Ｈ），６．５８（ｍ，１Ｈ），６．５１（ｍ，１Ｈ），５．２７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１，８．２Ｈｚ），３．１３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，２Ｈ），２．６４（ｍ，２Ｈ），２．５１（ｍ，２Ｈ），２．３４（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），２．１７（ｍ，３Ｈ），１．９０−１．８０（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９３．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６４０】
例１２４　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−（３−クロロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中のＮ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、３−クロロフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（２．４ｍｇ，３５．８％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３０（ｍ，２Ｈ），７ ７．２０（ｍ，３Ｈ），７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．７１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），６．６９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），６．６７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），６．６５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），５．０９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，８．１Ｈｚ），３．１８（ｍ，２Ｈ），２．７３（ｍ，２Ｈ），２．５０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８９（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９１．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６４１】
例１２５　（１Ｓ）−３−｛４−［３−（イソブチリールアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝−１−　２５ｍＬ丸底フラスコ中に、ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中のＮ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、１−ナフタレンカルボニル塩化物（１００ｍｇ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．３０ｍＬ）を室温で添加した。１６時間室温で撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］により精製し、所望の生成物（４．７０ｍｇ，７１．３％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），８．２８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，７．２Ｈｚ），８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．８８（ｄｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．６０−７．４８（ｍ，７Ｈ），７．４０−７．３２（ｍ，３Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），６．９０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），６．１８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．７，７．８Ｈｚ），３．４２（ｍ，２Ｈ），２．８４（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），２．４４（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，４Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，２Ｈ），１．８２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５３５．６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６４２】
例１２６　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（３−アセチルフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中のＮ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２−アセチルフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（１．５０ｍｇ，２２．０％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．６５（ｍ，１Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ），７．３０−７．２０（ｍ，５Ｈ），７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９７（ｍ，２Ｈ），６．７６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ），５．４９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３，８．０Ｈｚ），３．３８（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｍ，２Ｈ），２．７５（ｓ，３Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．９２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９８．８１（Ｍ＋），４９９．６（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６４３】
例１２７　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（２−フルオロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中のＮ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２−フルオロフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（３．５ｍｇ，５３．９％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０７（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），７．４１（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．１０（ｍ，５Ｈ），７．０５（ｍ，２Ｈ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．８６（ｍ，２Ｈ），６．７９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，９Ｈｚ），５．３１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５，８．０Ｈｚ），３．３９（ｍ，２Ｈ），２．９７（ｍ，２Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．３−２．１（ｍ，６Ｈ），１．９２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４７５．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６４４】
例１２８　（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミド
方法：
２０ｍＬバイアル内に、Ｎ１−｛３−［１−（アミノプロピル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル］フェニル｝アセタミド（１５ｍｇ，０．０５４ｍｍｏｌ）、４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−オキサゾリジン−３−カルボン酸−４−ニトロ−フェニルエステル（３９．３ｍｇ，１．０８ｍｍｏｌ，２当量）、および０．６％のメタノールを含んだジクロロメタン（３ｍＬ）を室温で添加した。室温で３時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、分取用シリカＴＬＣ（１９：１＝クロロホルム：メタノール）により精製し、所望の生成物（１８．３ｍｇ，６８％収率）を得た；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３６−７．２８（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．９９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），６．８６−６．８２（ｍ，２Ｈ），５．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，９．０Ｈｚ），４．７２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），４．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９，９．１Ｈｚ），３．４２−３．２９（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ），２．５２−２．３８（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０８−１．９８（ｍ，２Ｈ），１．８６−１．７０（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５０１．２（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２６Ｈ３０Ｆ２Ｎ４Ｏ４＋０．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，６０．６４；Ｈ，６．１８；Ｎ，１０．８８。実測値Ｃ，６０．６７；Ｈ，５．７９；Ｎ，１０．８６。
【０６４５】
例１２９　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成について記載された方法と同様である。
【０６４６】
（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−２−オキソ−４−（３，４，５−トリフルオロフェニル）−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミド：１８．８ｍｇ（６７％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４１−７．２０（ｍ，３Ｈ），７．０２−６．９１（ｍ，３Ｈ），５．３７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．８，８．９Ｈｚ），４．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９Ｈｚ），４．２１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４，９．３Ｈｚ），３．４３−３．２７（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），２．５３−２．３７（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０８−１．９７（ｍ，２Ｈ），１．８５−１．６９（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５１９．２（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２６Ｈ２９Ｆ３Ｎ４Ｏ４＋０．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，５９．２０；Ｈ，５．７３；Ｎ，１０．６２。実測値Ｃ，５９．４０；Ｈ，５．３５；Ｎ，１０．６５。
【０６４７】
例１３０　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成について記載された方法と同様である。
【０６４８】
Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５，５−ジメチル−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミド：１９．６ｍｇ（６８％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．１８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），７．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．３３（ｓ，１Ｈ），７．２７−７．１４（ｍ，２Ｈ），７．０２−６．８８（ｍ，３Ｈ），５．０４（ｓ，１Ｈ），３．３４（ｑｍ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．０２（ｄｍ，２Ｈ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），２．５３−２．３８（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０７−１．９６（ｍ，２Ｈ），１．８７−１．６９（ｍ，６Ｈ），１．６２（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５２９．３（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２８Ｈ３４Ｆ２Ｎ４Ｏ４に対する分析Ｃ，６３．６２；Ｈ，６．４８；Ｎ，１０．６０。実測値Ｃ，６３．１５；Ｈ，６．２７；Ｎ，１０．４８。
【０６４９】
例１３１　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成について記載された方法と同様である。
【０６５０】
（４Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，４−ジフルオロフェニル）−５−メチル−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミド：２０．５ｍｇ（７４％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．１４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３７−６．８９（ｍ，６Ｈ），５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），５．０２−４．９３（ｍ，１Ｈ），３．４１−３．２５（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ），２．５３−２．３７（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｍ，２Ｈ），１．８９−１．６８（ｍ，６Ｈ），１．０４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５１５．３（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２７Ｈ３２Ｆ２Ｎ４Ｏ４＋０．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，６１．９４；Ｈ，６．３５；Ｎ，１０．７０。実測値Ｃ，６１．９０；Ｈ，６．１３；Ｎ，１０．６４。
【０６５１】
例１３２　合成方法は、（４Ｓ）−Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（３，５−ジフルオロフェニル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミドの合成について記載された方法と同様である。
【０６５２】
Ｎ−（３−｛４−［３−（アセチルアミノ）フェニル］−１−ピペリジニル｝プロピル）−４−（４−フルオロベンジル）−２−オキソ−１，３−オキサゾリジン−３−カルボキシアミド：１７．４ｍｇ（６５％収率）；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），７．４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．３４（ｓ，１Ｈ），７．２８−７．１４（ｍ，３Ｈ），７．０５−６．９５（ｍ，３Ｈ），４．６９−４．６０（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２，９Ｈｚ），３．４３（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），３．３（ｄｍ １Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），３．０４（ｄｍ，２Ｈ，Ｊ＝１１Ｈｚ），２．８７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．３，１４．４Ｈｚ），２．５３−２．４２（ｍ，３Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），２．０９−１．９９（ｍ，２Ｈ），１．８７−１．６５（ｍ，６Ｈ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９７．３（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ２７Ｈ３３ＦＮ４Ｏ４＋０．５Ｈ２Ｏに対する分析：計算値Ｃ，６４．１４；Ｈ，６．７８；Ｎ，１１．０８。実測値Ｃ，６４．２６；Ｈ，６．３９；Ｎ，１１．１２。
【０６５３】
例１３３　２−メチル−Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−（２−ニトロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）プロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２−ニトロフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（２．３７ｍｇ，３４．５％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８４（ｄ，１Ｈ），７．９０（ｍ，１Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．２０（ｍ，５Ｈ），７．２０（ｍ，２Ｈ），６．９８（ｍ，２Ｈ），６．８９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），５．６２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，８．９Ｈｚ），３．１０（ｍ，２Ｈ），２．６０（ｍ，２Ｈ），２．５３（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５０２．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６５４】
例１３４　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルオキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中のＮ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、４−フェニルフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（３．００ｍｇ，４１．２％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０６（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．３０（ｍ，８Ｈ），７．３０−７．２５（ｍ，４Ｈ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．９１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），５．３４（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．０Ｈｚ），３．４０（ｍ，２Ｈ），２．９８（ｍ，２Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），２．４４（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．９３（ｄ，２Ｈ），１．２６（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５３３．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６５５】
例１３５　２−メチル−Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−（３−ニトロフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）プロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中のＮ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、３−ニトロフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（２．８０ｍｇ，４０．８％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．７６（ｄｍ，１Ｈ），７．７１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ），７．５０−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．２５（ｍ，７Ｈ），７．１７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４，８．２），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），５．４５（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．０，８．１Ｈｚ），３．４５（ｍ，２Ｈ），２．８９（ｍ，２Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．９２（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５０２．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６５６】
例１３６　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（２−エトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中の、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、２−エトキシフェノール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４−ｍｇＲ ０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を、室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（１．１６ｍｇ，１５．５％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０６（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．３３（ｍ，４Ｈ），７．３０−７．２０（ｍ，３Ｈ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），６．８８（ｍ，２Ｈ），６．６８（ｍ，２Ｈ），５．２１（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．３７（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｍ，２Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８９（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５０１．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６５７】
例１３７　２−メチル−Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（１−ナフチルオキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）プロパンアミド
ＴＨＦ（０．５０ｍＬ）中のＮ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（５．２０ｍｇ，０．０１３７ｍｍｏｌ）、１−ナフトール（１００ｍｇ）、トリフェニルホスフィン（３０．０ｍｇ，０．１１５ｍｍｏｌ）、およびアゾジカルボン酸ジエチル（７．４２ｍｇ，０．０４２６ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３日間撹拌した。シリカ分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィを経て、所望の生成物（４．３０ｍｇ，６６．２％収率）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．０６（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．５（ｍ，２Ｈ），７．４５−７．３０（ｍ，６Ｈ），７．２５（ｍ，３Ｈ），７．１７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６，９．０Ｈｚ），７．０１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），６．９７（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），５．４６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５ｆ ８．１Ｈｚ），３．１２（ｍ，２Ｈ），２．６１（ｍ，２Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５０７．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６５８】
例１３８　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
工程１：２−［（１Ｓ）−３−クロロ−１−フェニルプロピル｝−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン
５．０ｍＬのＴＨＦ中の、フタルイミド（０．１４７ｇ，１．０ｍｍｏｌ）、（Ｒ）−（＋）−３−クロロ−フェニル−１−プロパノール（０．１７１ｇ，１．０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（０．２６２ｇ，１．０ｍｍｏｌ）、アゾジカルボン酸ジエチル（０．１７４ｇ，１．０ｍｍｏｌ）の混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をペンタン（×３）で洗浄し、合体したペンタン抽出物を濃縮し、クロマトグラフィにかけ（シリカ，および溶離剤としてヘキサン−ＥｔＯＡｃ ８：１）、所望の生成物を得（一般的手順としてＳｒｅｂｎｉｋ，Ｍ．；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｐ．Ｖ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９８８，５３，２９１６−２９２０による記載の通り）、所望の生成物（０．１２１ｇ，５０．２％）を黄色の固体で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），７．７０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），７．５６（ｍ，２Ｈ），７ ７．２７（ｍ，３Ｈ），５．６４（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０，９．２Ｈｚ），３．５７（ｍ，２Ｈ），３．０５（ｍ，１Ｈ），２．８２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ ３００．１３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６５９】
工程２：Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
ＤＭＦ（５．０ｍＬ）中の、炭酸カリウム（２９．２ｍｇ，０．２１１ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（４７．５ｍｇ，０．３１７ｍｍｏｌ）、２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（５１．８ｍｇ，０．２１１ｍｍｏｌ）、２−［（１Ｓ）−３−クロロ−１−フェニルプロピル｝−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（６３．１ｍｇ，０．２１１ｍｍｏｌ）の混合物を、１００℃で３時間撹拌し、この時点でＴＬＣは反応が完全であることを示した。反応混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、水層を塩化メチレン（３×３０ｍＬ）を用いて抽出した。合体した有機抽出物を塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗成物を分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］により精製し、所望の生成物（７４．１ｍｇ，７７．１％）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．８３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），７．６９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），７．５６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，３Ｈ，Ｊ＝２．９，７．３Ｈｚ），７．３３（ｍ，４Ｈ），７．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．０９（ｓ，１Ｈ），６．８１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．４９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．５，９．５Ｈｚ），２．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），２．８７（ｍ，２Ｈ），２．５０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），２．４０−２．３５（ｍ，４Ｈ），１．９４（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．５０（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５１０．３７（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６６０】
例１３９　２−メチル−Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（４−フェノキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）プロパンアミド
工程１：４−｛［（１Ｓ）−３−クロロ−１−フェニルプロピル］オキシ｝−（４−フェノキシ）ベンゼン：
５．０ｍＬのＴＨＦ中の、４−フェノキシフェノール（１．８６ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−（−）−３−クロロ−フェニル−１−プロパノール（１．７０ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２．６２ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）、アゾジカルボン酸ジエチル（１．５７ｍＬ，１０．０ｍｍｏｌ）の混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をペンタン（×３）で洗浄し、合体したペンタン抽出物を濃縮し、クロマトグラフィにかけ（シリカ、溶離剤としてヘキサン−ＥｔＯＡｃ ９７：３）（一般的手順としてＳｒｅｂｎｉｋ，Ｍ．；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｐ．Ｖ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９８８，５３，２９１６−２９２０による記載の通り）、所望の生成物を濃い油状物で得、静置して固化させた。（２．５１ｇ，７５．７％）：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４−７．２３（ｍ，７Ｈ），７．０３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），６．９１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑ，４Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），５．３１（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．５，８．６Ｈｚ），３．８２（ｍ，１Ｈ），３．６２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｑｕｉｎｔｅｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．４７（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｍ，１Ｈ）。
【０６６１】
工程２：２−メチル−Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（４−フェノキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）プロパンアミド：
ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の２−メチル−Ｎ−［３−（４−ピペリジニル）フェニル］プロパンアミド（６５．５ｍｇ，０．２６６ｍｍｏｌ）、４−｛［（１Ｓ）−３−クロロ−１−フェニルプロピル］キシ｝−（４−フェノキシ）ベンゼン（０．１００ｍｇ，０．２９６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４０．９ｍｇ，０．２９６ｍｍｏｌ）、およびヨウ化ナトリウム（６７．０ｍｇ，０．４４４ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃で３時間撹拌した。反応混合物を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、水層を塩化メチレン（３×３０ｍＬ）で抽出した。合体した有機抽出物を塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗成物を分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］により精製し、所望の生成物（０．１０９ｇ，７４．６％）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４８（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．２０−７．１０（ｍ，６Ｈ），７．０９（ｓ，１Ｈ），６．９９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９８（ａｐｐａｒｅｎｔ ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），６．９３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．８４（ｍ，２Ｈ），５．２０（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．５Ｈｚ），３．０３（ｍ，２Ｈ），２．５１（ｍ，４Ｈ），２．２４（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），２．２０−２．１０（ｍ，３Ｈ），１．９０（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５４９．４１（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｃ３６Ｈ４０Ｎ２Ｏ３に対する分析：計算値Ｃ，７８．８０；Ｈ，７．３５；Ｎ，５．１１。実測値Ｃ，７８．５８；Ｈ，７．４８；Ｎ，５．０９。
【０６６２】
例１４０　Ｎ−（４−｛１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド
工程１：１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−（４−ニトロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン：
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の、炭酸カリウム（２４．０ｍｇ，０．１７４ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（３９．０ｍｇ，０．２６０ｍｍｏｌ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（３５．４ｍｇ，０．１７４ｍｍｏｌ）、および４−｛［（１Ｒ）−３−クロロ−１−フェニルプロピル］オキシ｝−１，２−ジメトキシベンゼン（５３．４ｍｇ，０．１７４ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃で３時間撹拌した。この時点でＴＬＣは反応が完全であることを示した。反応混合物を水（５．０ｍＬ）中に注ぎ、水層を塩化メチレン（３×３０ｍＬ）で抽出した。合体した有機抽出物を塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗成物を分取用ＴＬＣプレート［１：１＝ヘキサン：酢酸エチル、および１％ ＮＨ３］により精製し、生成物（６３．１ｍｇ，７６．６％）を黄色の油状物で得た。生成物をさらに精製することなく次の反応に用いた。
【０６６３】
工程２：４−｛１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝アニリン：
水素を充填したバルーンに取り付けられた２５ｍＬ丸底フラスコに、１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−（４−ニトロフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（６３．０ｍｇ，０．１３３ｍｍｏｌ）、炭素上のパラジウム（５．０ｍｏｌ−ｅｑ％，０．００６６５ｍｍｏｌ，７．０４ｍｇ）、およびエタノール（２．０ｍＬ）を室温で注入した。１時間後、反応混合物をセライト５４５のプラグを介して濾過し、減圧下で濃縮した。粗成物（５４．１ｍｇ，８９．４％）をさらに精製することなく次の反応に用いた。
【０６６４】
工程３：Ｎ−（４−［１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
塩化メチレン（１．０ｍＬ）中の４−｛１−［（３Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝アニリン（５．３１ｍｇ，０．０１１９ｍｍｏｌ）、塩化イソブチル（２．０８ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．４０ｍｇ，０．０６５０ｍｍｏｌ）の混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］を用いたクロマトグラフィにかけ、生成物（３．５ｍｇ，５６．５％）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．３０−７．２０（ｍ，４Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．１１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．５７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），６．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６，８．３Ｈｚ），５．０９（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．１Ｈｚ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．０８（ｍ，２Ｈ），２．５７（ｍ，２Ｈ），２．４３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８０（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝７．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：５１７．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６６５】
例１４１　Ｎ−（３−｛１−［（３Ｓ）−３−（３−アセチルフェノキシ）−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド：
２５ｍＬ丸底フラスコ中に、トリフェニルホスフィン（９．８０ｍｇ，０．０３７５ｍｍｏｌ）、アゾジカルボン酸ジエチル（５．２２ｍｇ，０．０３００ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−｛１−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル］−４−ピペリジニル｝フェニル）−２−メチルプロパンアミド（９．５３ｍｇ，０．０２５０ｍｍｏｌ）、３−ヒドロキシアセトフェノン（１００ｍｇ）、およびＴＨＦ（１．０ｍＬ）を室温で添加した。反応混合物を室温で一晩（１６時間）撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を分取用ＴＬＣプレート［ＣＨＣｌ３中に２．５％のＮＨ３（メタノール中に２．０Ｍ）］により精製し、所望の生成物（２．７３ｍｇ，３９．９％）を濃い油状物で得た：１Ｈ ＮＭＲδ ７．７０−７．６４（ｍ，２Ｈ），７．５４（ｍ，２Ｈ），７．４９−７．４４（ｍ，６Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），７．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．９６（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），５．３４（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８，８．２Ｈｚ），３．１５（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｍ，２Ｈ），２．５２（ｓ，３Ｈ），２．５３（ａｐｐａｒｅｎｔ ｓｅｐｔ，ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｈｉｄｄｅｎ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．３０−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．８９（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；ＥＳＭＳ ｍ／ｅ：４９９．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【０６６６】
【化１５】
2004502423.tif 000028
【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【化２１】
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【化２２】
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【化２３】
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【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【化２７】
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【化２８】
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【化２９】
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【０６６７】
【表Ｃ−２】
2004502423.tif 000043
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インビボモデル
物質と方法
１．ＭＣＨ刺激による食物摂取に対する効果
ＭＣＨ１アンタゴニストがＭＣＨ刺激による食物摂取を減弱させ得るかどうかを決定するため、脳室内に投与したＭＨＣによってもたらされた食物摂取に対する化合物１０の腹腔内投与の効果を計測した。
【０６６８】
動物
オスの成体白色種ウイスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ社，ニューヨーク州）を個別に収容し、１２時間ごとの明暗サイクルを維持して、Ｐｕｒｉｎａ社のラット用飼料及び水を自由摂取できるようにした。ラットにクロルプロマジン（腹腔内に３ｍｇ／ｋｇ）を前処理し、ケタミンＨＣｌ（筋肉内へ１２０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。定位固定器（Ｋｏｐｆ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｔｕｊｕｎｄａ、ＣＡ）を用いて、下記の座標を使用して、第三脳室を標的とし、ステンレス鋼のカニューレ（２２ゲージ（ｇａｇｅ）、Ｐｌａｓｔｉｃｓ　Ｏｎｅ、Ｒｏａｎｏｋｅ、ＶＡ）を埋入した。座標は、インサイザー（ｉｎｃｉｓｏｒ）バー（＋５ｍｍ）、十字縫合の後方３．０ｍｍ、矢状縫合の方向に１．５ｍｍ外側、角度１０度、及び頭蓋頂端から９ｍｍである。カニューレは歯科用アクリルを用いて４つの固定ねじにより頭蓋に定置した。動物は検査を開始する前に１０日間回復させた。
【０６６９】
検査パラダイム
食餌用のビンを飼育用ケージから取り除き、ラットを数日間検査パラダイムに慣らし、明サイクルに入ってから３〜６時間の時点で、予め秤量した固形飼料を動物ケージの床に置いた。２日後に、動物が最小限の食物摂取（２時間を超える間に１ｇ未満）というベースラインの基準に合致すると考えた。その後、ラットに、ポリエチレンチューブを使用してハミルトンマイクロシリンジに結合したステンレス鋼の内部カニューレ（２８ゲージ、プラスチックワン社）を介して、ビークル（人工脳脊髄液、５μｌ、１μｌ／１５秒）を第三脳室に投与した。注入後直ちに、食物を前記ケージの床に置き、３０分、６０分、１２０分後に摂取を評定した。ビークルの投与後に摂取レベルが低いことを確認した後、ＭＣＨ（３ｎｍｏｌ、５μｌ）を第三脳室にマイクロインジェクションされ、食物摂取を上記のように検証した。その後、各注入条件の間には最低４日間おいて、釣り合いを取らせた順序で、以下の組み合わせの注入により、これらのラットの群の一部を検査した。前記組み合わせは、ａ）ＤＭＳＯ（１％で腹腔内）ＭＣＨの投与の１０分前（第三脳室、３ｎｍｏｌ、５μｌ、ｎ＝１１）、ｂ）化合物１０（１ｍｇ／ｋｇで腹腔内）ＭＣＨの１０分前（第三脳室、３ｎｍｏｌ、５μｌ、ｎ＝８）ｃ）化合物１０（１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内）ＭＣＨの１０分前（第三脳室、３ｎｍｏｌ、５μｌ、ｎ＝６）であった。二回目の注入直後に上述のように食物を与え、摂取を上述のように評価した。
【０６７０】
２．体重に対するＭＣＨ１アンタゴニストの効果
食物と水を自由に摂取できる状態で、１２時間ごとの明暗サイクルの下、４匹のグループ（腹腔内注入）で、又は対にして（浸透圧性ミニポンプ実験）、実験の当初に１８０〜２００ｇの体重を有する雄のロングエバンスラット（Ｌｏｎｇ　Ｅｖａｎｓ　ｒａｔ）（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ社）を飼育した。
【０６７１】
浸透圧性ミニポンプに関連する研究では、イソフルラン（Ａｅｒｒａｎｅ、Ｂａｘｔｅｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）でラットを麻酔し、ビークル（２０％ＤＭＳＯ）、化合物１０（２０％ＤＭＳＯ中、１９．２ｍｇ／ｍｌ）又はｄ−フェンフルラミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ、２０％ＤＭＳＯ中、１１．５ｍｇ／ｍｌ）のうちいずれかで満たした浸透圧性ミニポンプ（モデル２ＭＬ２，Ａｌｚｅｔ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）を頭皮中央部の皮下に埋入した。これらの濃度で、１０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１０又は６ｍｇ／ｋｇ／日のｄ−フェンフルラミンをラットに継続的に注入した。
【０６７２】
腹腔内注入に関連する研究では、日に二度（暗サイクルの１時間前に一度、照明がついてから二時間後に一度）薬物を投与した。朝の注入後に、全てのラットの体重を毎日計量した。二元配置分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）で全結果は解析し、各時点のデータに対しては、多重比較のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定に従って一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）で解析した。
【０６７３】
３．甘味付きコンデンスミルクの消費に対するＭＣＨ１アンタゴニストの効果
食物と水を自由に摂取できる状態におき、１２時間ごとの明／暗サイクル下、実験を開始する際に１８０〜２００ｇの体重であった雄のＳｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ社）を４匹のグループで収容した。７日間、ラットの体重を計量し、個別のケージに入れ、明サイクルに入って２〜５時間後に２０分間、甘味付きコンデンスミルク（ネッスル（Ｎｅｓｔｌｅ）社、水で１：３に希釈）を飲み得るようにした。各飲水行動の前後にミルクボトルの重量を計量することによって、消費されたミルクの量を決定した。検査日には、ラットにミルクを与える３０分前に化合物１０（０．０１％乳酸に３、１０、又は３０ｍｇ／ｋｇ）、又はｄ−フェンフルアミン（０．０１％乳酸に３ｍｇ／ｋｇ）のビークル（０．０１％乳酸）を腹腔内注射した。検査日に消費されたミルクの量（ｍｌｓミルク／ｋｇ体重）を、３日前に決定した各ラットのベースラインの消費と比較した。データは対応のない両側ｔ検定を用いて解析した。
【０６７４】
４．強制水泳試験（ＦＳＴ）
水深（本操作では３０ｃｍ）以外の点では、本研究で使用した方法は、以前述べた（Ｐｏｒｓｏｌｔ，ｅｔ　ａｌ．，１９７８）方法と同様であった。本実験では、水深をこれより深くすると、ラットがシリンダーの底に足を付けて自らを支えることができなくなった。
【０６７５】
水泳の部は、３０ｃｍの深さまで２３〜２５度の水を含有する（プレキシガラスの各シリンダー（４６ｃｍ長×直径２０ｃｍ）にラットを入れることにより行ったＰｏｒｓｏｌｔらは僅か１５ｃｍの深さを使用した。Ｄｅｔｋｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５も参照）。１２００時間〜１８００時間の間に常に二つの水泳試験を実行した。最初の１５分のプレテストから２４時間後に、５分の検査を行った。５分間の検査の３０分前に、薬物処理を施した。全ての他の検査期間は、１３００時間〜１７００時間の間に行った。全ての水泳の部に続いて、ラットをシリンダーから取り出し、ペーパータオルで乾燥させ、１５分間、温熱ケージに置いてから飼育用ケージに戻した。検査の全期間を通じ、後にスコアリングするために、パナソニックのカラービデオカメラとビデオレコーダーを使用してビデオテープに収録した。
【０６７６】
動物
全ての実験で、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍｓ、ＮＹ）を使用した。ラットはペアで収容し、１２時間：１２時間の明暗サイクルを維持した。行動検査に先立ち、５日間毎日、５分間ラットを取り扱った。
【０６７７】
行動のスコアリング
５分間の検査の間、５秒ごとに、ラットの行動に対して、以下のうちの何れか１つの採点を与えた。
【０６７８】
１．不動−ラットが暴れずに、水に浮遊した状態に留まっており、頭を水上に上げておくのに必要な動きしかしなかった。
【０６７９】
２．登上−ラットが、通常壁に向かって前肢を水から出し入れし、活発に活動する。
【０６８０】
３．水泳−頭を単に水の上に上げ続けるのに必要な限度を超えて、ラットが活発に泳ぐ動作をしていた。例、シリンダー内を周回した。
【０６８１】
４．潜水−ラットの体全体が沈んだ。
【０６８２】
全ての行動のスコアリングは、処理条件を知らされていない単一の査定者によって行われた。
【０６８３】
薬物投与
動物を無作為的に割り振って、５分間の検査期間が開始する３０分前に、化合物１０（３、１０、又は３０ｍｇ／ｋｇ、５％乳酸中に溶解）、フルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、蒸留水中に溶解）、又はビ−クル（５％乳酸と蒸留水の等量混合物）を腹腔内に単回投与した。全ての注入は２６　３／８ゲージの針（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＶＷＲ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ、ＮＪ）に合う１ｃｃのツベルクリンシリンジを使用して行った。注入容量は１ｍｌ／ｋｇである。１０ｍｇ／ｋｇのフルオキセチンの効果はポジティブコントロールとしてＦＳＴで利用した。
【０６８４】
データ解析
強制水泳試験のデータ（不動、登上、水泳、潜水）を、無作為化した一元配置分散分析及びＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を使用して実施する無作為化した多重比較検定にかけた。前記データはＧＢＳＴＡＴプログラム、バージョン６．５（Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、メリーランド州Ｓｉｌｖｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇ，１９９７）を使用して解析した。全てのデータは平均値±標準誤差として表されている。
【０６８５】
５．社会的相互作用試験（ＳＩＴ；Ｓｏｃｉａｌ　ＩｎｔｅｒｒａｃｔｉｏｎＴｅｓｔ）
ラットを５日間、動物看護施設に順応させ、検査前の５日間には、単独で収容した。動物は１日に５分間取り扱った。社会的相互作用試験の設定と手順は、以前にＫｅｎｎｅｔｔ等（１９９７）によって記述されたようにして実行した。検査の日に、体重を合わせた（±５％）互いになじみのないラットの対に同一の処置を施し、元の飼育用ケージに戻した。動物を、無作為に１群当たり５つのペアからなる５つの処理群に分割し、以下の腹腔内処理：化合物１０（３、１０、又は３０ｍｇ／ｋｇ）、ビークル（１ｍｌ／ｋｇ）、又はクロルジアゼポキシド（ｃｈｌｏｒｄｉａｚｅｐｏｘｉｄｅ）（５ｍｇ／ｋｇのうちの一つを施した。投与は、検査の一時間前に行った。その後、床面が２４個の等大の正方形に分割された白のパースペックス（ｐｅｒｓｐｅｘ）の検査箱又は検査アリーナ（５４×３７×２６ｃｍ）にラットを１５分間入れた。空気清浄機を使用してバックグラウンドのノイズを発生させ、部屋を華氏約７４度に維持した。全てのセッションはＪＶＣのポータブルビデオカメラ（モデルＧＲ−ＳＺ１、Ｅｌｍｗｏｏｄ　ｐａｒｋ、ＮＪ）を使用し、ＴＤＫ（ＨＧの最高級ブランド）のビデオカセット又はソニーの３０分用ビデオカセットの一方を用いてビデオテープに収録した。全てのセッションは午後１時〜午後４時半の間に行った。毛づくろい、臭い嗅ぎ行動、噛み付き、殴り合い、格闘、追走、相手に覆い被さり、又は潜り込む行動と定義された活発な社会的相互作用を、ストップウォッチ（スポーツライン　モデル番号２２６、分解能１／１００秒）を用いて、スコアリングした。起立行動（動物が後肢で自分の体を完全に立ち上げる）、毛づくろい（体を舐め、噛み、引っかく）、洗顔行動（すなわち、手を繰り返し顔に運ぶ）の事象数及び正方形の横断数をスコアリングした。受動的な社会的相互作用（動物が互いの横に並ぶか、又は相手の上に乗る）はスコアリングしなかった。全ての行動は各ペアの処理について知らされていない観察者によって、後に評定した。各検査の最後には、濡れたペーパータオルで、前記の箱を徹底的に拭浄した。
【０６８６】
動物
飼料と水を自由摂取できる状態で、オスの白色種Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ　Ｆａｒｍｓ、ニューヨーク州）を１２時間ごとの明暗サイクル（午前７時に照明を点灯した）下にて、ペアで収容した。
【０６８７】
薬物投与
化合物１０を５％乳酸に溶解させて薬物投与した。クロルジアゼポキシド（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入）は蒸留水に溶解させた。５％乳酸と蒸留水の等量混合物をビークルとした。全ての薬物の溶液は注入の１０分前に調製し、前記溶液を投与した。
【０６８８】
データ解析
社会的相互作用データ（相互作用の時間、起立行動、横断した正方形）を、無作為化した一元配置分散分析とＳｔｕｄｅｎｔ　Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を用いて行う無作為化したｐｏｓｔ　ｈｏｃ検定とにかけた。前記データは正規性の検定（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定）に掛けた。前記データは、ＧＢＳＴＡＴプログラム、バージョン６．５（Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ　Ｉｎｃ．、ＭＤ、１９９７）を使用して、解析した。全てのデータは平均値±標準誤差として表されている。
【０６８９】
結果と考察
クローニングとシークエンシング
ＧＥＮＥＭＬにおける、ＦＢ４１ａに相同な発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）Ｆ０７２２８の発見
Ｓｙｎａｐｔｉｃ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが専有権を有する配列ＦＢ４１ａを用いて、ＧＥＮＥＭＢＬのＢＬＡＳＴ検索を行った結果、ＦＢ４１ａ並びにソマトスタチン受容体、オピエート受容体及びガラニン受容体に高い相同性を有するＥＳＴ（受託番号Ｆ０７２２８）が同定された。
【０６９０】
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーの構築とスクリーニング
平均挿入サイズが３．０ｋｂである総計２．２×１０６の独立のクローンを含有するヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターｐＥＸＪ．ＢＳ中に調製した。前記ライブラリーを寒天プレートに蒔き（アンピシリンセレクション）、５０００の独立なクローンの４５０プール用にグリセロールのストックを調製する。スーパープールを作成するために、一次グリセロール保存液も約１０のグループになるようにまとめた。
【０６９１】
ＭＣＨ１の完全長配列のクローニング
Ｆ０７２２８に特異的なプライマーであるＴ５７９及びＴ５８０を用いたＰＣＲによって、前記ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリ−から得たスーパープールや初代プールのグリセロールストックをスクリーニングした。引き続いて、ある陽性初代プール４９０をサブプールに分割し、ＬＢ培地中で一晩増殖させ、プライマーＴ５７９及びＴ５８０を使用して、ＰＣＲによりスクリーニングした。ある陽性サブプールである４９０−４−１０−２３を寒天プレートに蒔き（アンピシリンセレクション）、コロニーをニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｅｒｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅｌｌ社、Ｋｅｅｎｅ、ＮＹ）に転写した。１０６ｃｐｍ／ｍｌのＴ５８１（Ｆ０７２２８ＥＳＴ配列に対して設計した３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブ）を用いて、高ストリンジェンシー条件下で二日間、フィルターにハイブリダイズをした。フィルターを洗浄し、Ｂｉｏｍａｘ　ＭＳフィルム（コダック社）を重積した。７つの陽性反応コロニーを選択し、ＬＢ−ＡＭＰプレート上に画線して一晩増殖させた。元の７つの各コロニーから個別に２つのコロニーを選択し、以下のプライマー対、Ｔ９５とＴ５８０、及びＴ９４とＴ５７９を用いたベクター連関型ＰＣＲにかけた。ある陽性反応コロニーＧ１をＴＢの中で一晩増殖させ、プラスミド精製を行った。本プラスミドをＴＬ２３０と命名し、両鎖の配列を決定した。ヌクレオチド配列とペプチド配列の分析は、ＧＣＧプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて行った。ＴＬ２３０のＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ断片を哺乳類発現ベクターｐＥＸＪにサブクローニングして、ＴＬ２３１と命名した。本構築物における最大のオープンリーディングフレームは１２６６ヌクレオチドを含有し（図１）、４２２アミノ酸からなるタンパク質（図２）をコードするものと予測される。４２２、４１７又は３５３アミノ酸のタンパク質をもたらし得る、アミノ末端に存在するインフレームのメチオニンが３つ存在する。前記タンパク質のハイドロパシー分析は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーの指標となる７回膜貫通ドメインの推定構造と合致している（図３）。ＴＬ２３１はＭＣＨ１と命名された。
【０６９２】
ＭＣＨ１配列のデータベース解析によって、ＭＣＨ１はソマトスタチン受容体に最も類似することが明らかとなった。さらに、データベース分析によって、ＴＬ２３１のラット相同遺伝子であると思われるＧｅｎｂａｎｋ寄託物（受託番号ＡＦ００８６５０、１９９７年８月１日に寄託）が明らかとなった。ＡＦ００８６５０はＭＣＨ１よりも５’端が６９残基短く、開始メチオニンが異なるものと思われる。図４及び図５に、それぞれ、ラットＭＣＨ１受容体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が図示されている
ＭＣＨ１をトランスフェクした細胞のイノシトールリン酸の応答
Ｇα１６サブユニットを含有する発現ベクター（ｐＥＸＪ）と共に、エレクトロポーレイションによって、ＭＣＨ１ｃＤＮＡを含有する前記発現ベクター（ｐＥＸＪ）をＣｏｓ−７細胞にトランスフェクトした。播種及び［３Ｈ］−ｍｙｏ−イノシトールによる標識の後、とりわけメラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）（最終濃度１０μＭ）を含有するリガンドライブラリーを用いて前記トランスフェクタントを調べ、その後イノシトールリン酸（ＩＰ）の形成をアッセイした。ＭＣＨを用いて調べると、（Ｇα１６とともに）ＭＣＨ１をトランスフェクトした細胞は、７つのスクリーンのうち５つにおいて、Ｇα１６のみをトランスフェクトした細胞と比べて、ＩＰ産生が約１．４倍増加していた。
【０６９３】
その後の実験により、１０μＭのＭＣＨでは、ＭＣＨ１のみをトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞における基底レベルと比べて、ＩＰ放出を３．４倍刺激し得ることが実証され、本受容体がＧｑのシグナル経路と共役していることが示唆された。前記ＩＰ反応はＭＣＨの用量に依存的であり、ＥＣ５０の値は９．３±１．７ｎＭ（ｎ＝２）、Ｅｍａｘは基底値の約４００％（４０４±７２）であった（図６）。
【０６９４】
さらにいくつかの化合物につき、ＭＣＨ１を活性化し得るかどうかを検査した。ソマトスタチン、ハロペリドール、又はダイノルフィンＡ１−１３を試みた際には、ＭＣＨ１をトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞において、イノシトールリン酸形成の用量応答性は検出することができず、ＭＣＨ１がソマトスタチン様、オピオイド様、又はシグマ様ＧＰＣＲサブタイプをコードしているという可能性は減少した（図７）。
【０６９５】
ＭＣＨ１トランスフェクト細胞のＭＣＨに対するミクロフィジオメーター応答
リポフェクション媒体を使用して、ＣＨＯ細胞にＭＣＨ１を一過的にトランスフェクトし、徐々に増加する濃度のＭＣＨ又はフェニルアラニン１３、チロシン１９−ＭＣＨ濃度を与えて、細胞外酸性化速度の変化を連続的にモニターした。両リガンドは酸性化速度の用量依存的な増加を引き起こし、ＭＣＨに対するＥＣ５０値が８．６ｎＭ、フェニルアラニン１３、チロシン１９−ＭＣＨに対するＥＣ５０値が５１．８ｎＭであった。天然のＣＨＯ細胞及び偽（ｐＥＸＪ）トランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、何れもＭＣＨ又はフェニルアラニン１３、チロシン１９−ＭＣＨに暴露しても、酸性化速度の変化を示さなかった（図８）。
【０６９６】
ＭＣＨ１をトランスフェクトした細胞の転写応答
ＤＥＡＥ−デキストラン法によって、ＭＣＨ１及びｃ−ｆｏｓ−β−ｇａｌレポーター構築物をＣｏｓ−７細胞に一過的に感染させた。ＭＣＨを含む多様な薬剤を前記細胞に与え、β−ガラクトシダーゼタンパク質の発現の比色アッセイによって、転写活性を測定した。１０μＭの濃度のＭＣＨを初回単回投与すると、ｃ−ｆｏｓで制御された転写活性が刺激されて、培地のみの細胞よりも転写活性が約３．９倍になった。ｃ−ｆｏｓ−β−ｇａｌ構築物のみをトランスフェクトした細胞ではＭＣＨに対して全く反応を示さなかった。後の実験によって、ＥＣ５０値が１１６ｎＭであるＭＣＨに対して用量依存的な転写活性化応答が示された（図９）。
【０６９７】
ＭＣＨ１トランスフェクト細胞における、［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３−Ｔｙｒ１９−ＭＣＨの結合
ＤＥＡＥ−デキストラン法によって、ＭＣＨ１をトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞から採取した膜は、０．１ｎＭの放射性リガンド濃度で、［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３−Ｔｙｒ１９−ＭＣＨに対し、偽トランスフェクト細胞（約２０ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質）よりも特異的な結合を示した（約８０ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質）。特異的な［１２５Ｉ］Ｐｈｅ１３−Ｔｙｒ１９−ＭＣＨの結合は、０．１ｎＭの放射性リガンド濃度における総結合の約７０％であった（図１０）。
【０６９８】
ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡの局在
ＭＣＨ１受容体をコードするメッセージの存在を調べるために、様々なヒトの組織から単離されたｍＲＮＡサンプルにＲＴ−ＰＣＲを使用した（表１、図１１）。増幅後、１０％ポリアクリルアミドゲル上でＰＣＲ反応物をサイズ分画し、ＳＹＢＲグリーンＩで染色を行った。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｓｔｏｒｍ　８６０ワークステーションを用いて画像解析を行った。ＭＣＨ１受容体に対応する増幅されたバンド（４９０塩基）が示されている（矢印）。ＲＴ−ＰＣＲ解析により、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするｍＲＮＡは、中枢神経系組織及び末梢器官の両者を含むアッセイを行った全ての組織に広く分散していることが示される。このように広く分散していることは神経系及び内分泌機構を含む広範な制御機能を示唆している。
【０６９９】
【表１】
2004502423.tif 000056
ヒトＭＣＨ１受容体をコードする遺伝子のクローニングにより、薬理学的な特性、及び該ｍＲＮＡ分布のノーザン及びｉｎ　ｓｉｔｕマッピングによる該遺伝子の生理学的な役割を調べる手段が得られた。更に、ヒトＭＣＨ１受容体をコードするＤＮＡが利用可能であることは、インビボでの該遺伝子産物の機能を決定するのに有用である抗体及びアンチセンス技術の開発に役立つであろう。ｍＲＮＡ分子を標的としてインビボで該遺伝子産物の転写を選択的に遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって、単一遺伝子の発現と発現に続く機能とを関連付けることに成功している。従って、該受容体遺伝子のクローニングは神経系及びその他の任意の組織において生理学的な役割を調べる手段を提供し、それによってＧＰＣＲスーパーファミリーにおける構造／機能相関を明らかに役立ち得る。
【０７００】
ＴＬ２３１のｃＤＮＡ配列中に３つの異なる開始コドンの候補が存在するということは、何れの転写産物が活性なＭＣＨ受容体を産生するのかという疑問を提起する。ＴＬ２３１の第一及び第二の開始コドンの転写産物が機能的ヒトＭＣＨ受容体をコードするかどうかを確定するために、ＴＬ２３１の６及び７０位のメチオニンをアラニンに変異した（構築物Ｒ１１４；図１２参照）。７０位の第三メチオニンもアラニンに置換した（構築物Ｒ１０６；図１２参照）。ＴＬ２３１、Ｒ１０６、又はＲ１１４をＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトすると、カルシウム色素であるｆｌｕｏ−３（ＦＬＩＰＲ、　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を与えした細胞中で、蛍光強度プレートリーダーによって測定したところによれば、全てのトランスフェクト細胞で、ＭＣＨを介した細胞内カルシウムの増加が生じた。表２に示されているように、ＴＬ２３１、Ｒ１０６、Ｒ１１４及びＢＯ１２０をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、徐々に増加する濃度のＭＣＨに暴露すると、同様の最大応答及びＥＣ５０値で、用量依存的な細胞内カルシウムの動員を示した。これらのデータは、ＴＬ２３１の第一及び／又は第二及び第三のメチオニンから始まる転写産物が機能的なヒトＭＣＨ受容体をコードすることを実証している。
【０７０１】
【表２】
2004502423.tif 000057
ＭＣＨ１受容体アンタゴニストの発見
ＭＣＨ１受容体アンタゴニストを同定するためのアッセイとして、ＭＣＨ１をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞におけるＭＣＨに対する細胞内カルシウム応答を用いた。化学構造が既知である化合物を１ｍＭの濃度で、カルシウム指示薬であるｆｌｕｏ−３を負荷したＭＣＨ１を発現するＣＯＳ−７細胞に添加し、５００ｎＭのＭＣＨの存在下及び非存在下で蛍光強度を測定した。ＭＣＨ１アンタゴニスト化合物はＭＣＨにより誘導される応答の阻害能によって同定された。次いで、５００ｎＭのＭＣＨの応答を５０％阻害する投与量（ＩＣ５０）を決定するために同定された前記化合物を１２種類の濃度でテストした（１ｅ−４〜３ｅ−１０Ｍ）。ＩＣ５０値から、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｓｏｆ補正を用いてアンタゴニスト効力（Ｋｂ）を導いた（Ｌａｚａｒｅｎｏ　ａｎｄ　Ｂｉｒｄｓａｌｌ、　１９９３）。表３に５００ｎＭよりも低いｋｂを有することが見出された化合物を例示した。
【０７０２】
テストされた化合物の中で、化合物１０がヒトＭＣＨ１受容体の最も効力のあるアンタゴニストとして同定された。ヒトＭＣＨ１受容体をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞におけるイノシトールリン酸応答を用いて、化合物１０による拮抗を更に特性決定した。図１６に示されているように、１、３、及び１０ｎＭの化合物１０の存在下で、ＭＣＨに対する用量応答曲線の平行移動が観察され、拮抗的アンタゴニストの存在が示唆された。前記用量応答のＳｃｈｉｌｄ解析によって、ほぼ１の傾きでｐＡ２＝９．２４が得られた。この値は細胞内カルシウム動員アッセイを用いて決定されたＫｂ＝０．３ｎＭと密接に相関関係がある。
【０７０３】
化合物１０のＭＣＨ１受容体に対する高い親和性を考慮して、該化合物のトリチウム化した類似体を合成した。ヒトＭＣＨ１受容体を発現する細胞の膜調製物への［３Ｈ］化合物１０の結合能をテストした。図１７に示されているように、化合物１０の非存在下（合計）及び１０ｍＭの化合物１０の存在下（非特異的）で［３Ｈ］化合物１０の濃度を徐々に増加させて加えると、ＭＣＨ１をトランスエフェクトしたＣｏｓ−７細胞の膜調製物への飽和し得る特異的結合が生じた。該結合データのＳｃａｔｃｈａｒｄ解析によって、［３Ｈ］化合物１０に対するＫｄ＝０．１８　ｎＭと結合部位の最大数（Ｂｍａｘ）＝８７０　ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質と（図１７の挿入図を参照）が概算された。ＭＣＨ１をトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞の膜調製物を用いた競合的結合アッセイでは、化合物１０及びＭＣＨは、それぞれ０．３３及び５１１ｎＭのＩＣ５０値で、［３Ｈ］化合物１０の特異的な結合を完全に置換した（図１８）。非トランスフェクトＣｏｓ−７細胞では、［３Ｈ］化合物１０の結合は、ＭＣＨ又は標識されていない化合物１０と１０ｍＭまで置き換わらなかった。これらのデータを綜合すると、［３Ｈ］化合物１０がＭＣＨ１受容体に対する特異的且つ高親和性の放射性リガンドであることを実証している。
【０７０４】
発明の背景に記述されているように、受容体に対するＭＣＨの効果を遮断する化合物は摂食障害及び肥満の治療に利用できる可能性がある。体重及び食物摂取制御に関する研究は、レプチンのようなエネルギー恒常性中の循環する代謝シグナルと共に視床下部回路及びその神経伝達物質の重要な役割を指向している（Ｅｌｍｑｕｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９９）。食欲誘導性の（食欲促進の）効果を媒介する視床下部神経細胞には、伝達物質として神経ペプチドＹ、ＭＣＨ、ガラニン、及びオレキシンを利用する細胞が含まれる。逆に、食欲促進シグナルを媒介する神経要素には、とりわけ、伝達物質としてセロトニン（５ＨＴ）、α−ＭＳＨ、及びＣＡＲＴ（ｃｏｃａｉｎｅ　ａｎｄ　ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を用いるものが含まれる。それらの薬理学的特性の決定とともに、幾つかの該伝達物質分子に対する受容体の分子クローニングにおける近年の進歩により、治療を行うための多数のターゲット候補を同定することが可能となった。ＮＰＹの場合、ＮＹＰ１とＮＰＹ５受容体の両方がＮＰＹの食欲促進効果の媒介に関わっていることが示唆する証拠がある（Ｉｎｕｉ，１９９９）。α−ＭＳＨの抗食欲促進効果はＭＣ４受容体により媒介される（Ｆａｎ　ｅｔ　ａｌ，１９９７）。更に、５ＨＴ２Ｃ受容体遺伝子をターゲット欠失させたマウスの肥満表現型によって、セロトニン作動性アゴニストの抗食欲促進効果に対する重要な役割が示唆された（Ｎｏｎｏｇａｋｉ，　１９９８）。しかし、視床下部における食欲促進及び抗食欲促進経路間の相互作用は、他の生物学的制御機構に典型的なかなりの代理機能性を示す（Ｋａｌｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９）。この複雑性は、複数の食欲促進性受容体を標的とする薬剤の開発の設計が、肥満をもたらすエネルギー恒常性のアンバランスを回復させ得る有効な治療法をもたらし得ることを示唆する。このようなアプローチの１つには、ＮＰＹ１、ＮＰＹ５、又はガラニン受容体アンタゴニストと共に、上述されたようなＭＣＨ１受容体のアンタゴニストの組合せを投与することが含まれ得る。別のアプローチは、１以上のＭＣＨ１、ＮＰＹ１、ＮＰＹ５、又はガラニン受容体への結合によって、１以上のＭＣＨ、ＮＰＹ、及びガラニンの食欲促進効果を拮抗する単一の分子を設計することである。しかしながら、何れの場合にも、前記化合物はＭＣ−４又は５ＨＴ２Ｃ受容体に対するアンタゴニスト活性を有するべきではない。なぜならこれらの受容体を拮抗すると食物摂取の増加及び肥満にもたらすからである（Ｆａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）。そのような化合物の設計は、組換え体ＭＣＨ１、ＮＰＹ１、ＮＰＹ２、Ｇａｌ１、Ｇａｌ２、Ｇａｌ３、５ＨＴ２Ｃ、及びＭＣ−４受容体へのそれらの結合親和性を決定することにより最適化され得る。前記受容体のｃＤＮＡを取得し、前記受容体を異種の系で発現させ、結合親和性を決定するアッセイを実行するための方法は、以下の出版物に記載されている：ヒトＮＰＹ１（Ｌａｒｈａｍｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２）、ヒトＮＰＹ５（米国特許第５，６０２，０２４号、その開示内容の全体は参考文献として本明細書に援用される）、ヒトＧａｌ１（Ｈａｂ��ｒｔ−Ｏｒｔｏｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４）、ヒトＧａｌ２（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．、１９９７）、ヒトＧａｌ３（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）、ラット５ＨＴ２Ｃ（Ｊｕｌｉｕｓ　ｅｔ　ａｌ．、　１９９８）、及びヒトＭＣ−４（Ｇａｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ．、　１９９３）。さらに、副作用が生じ得るので、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが以下の受容体に結合することは望ましくない：ヒトＨ１ヒスタミン受容体、ヒトＨ２ヒスタミン受容体、ヒトα−１Ａアドレナリン作動性受容体、ヒトα−１Ｄアドレナリン作動性受容体、ヒトα−２Ａ受容体、ヒトα−２Ｂアドレナリン作動性受容体、ヒトα−２Ｃアドレナリン作動性受容体、ヒトドーパミンＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ５受容体及びβ−アドレナリン受容体。β−アドレナリン受容体に対する結合の研究は、Ｒｉｖａ及びＣｒｅｅｓｅ、１９８９年の方法に従って行い得る。残りの受容体に関する結合アッセイは米国特許第５，７８０，４８５（その開示内容の全体は参考文献として本明細書に援用される）に記述されている手順に従って実行し得る。
【０７０５】
発明の背景に更に記述されているように、ＭＣＨ１受容体に対するＭＣＨの影響を遮断する化合物は鬱及び不安の治療に使用され得る可能性がある。神経シグナルを媒介する生体アミン伝達物質分子は現在では本分野において公知であり、とりわけ、セロトニン（５ＨＴ）、ノルエピネフリン（ＮＥ）、及びドーパミン（ＤＡ）が含まれる。近年、それらの薬理学的な性質の決定と合わせ、該伝達物質分子の機構の分子研究が進歩したことによって、治療的介入に対する多数の標的の候補を同定することが可能となった。５ＨＴ、ＮＥ及びＤＡトランスポーター系の阻害剤、及び酵素、モノアミンオキシダーゼの阻害剤は広く研究されており、生体アミン神経伝達物質の作用を高めることが知られている。得られた臨床的に有効な抗鬱剤は、今日ではＴＣＡ、ＳＳＲＩ、及びＭＡＯＩとして知られている（Ｔａｔｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７；　Ｉｖｅｒｓｅｎ，　２０００）。
【０７０６】
ＭＣＨの場合、本発明に示される証拠は、ＭＣＨ１受容体に結合してこれを拮抗する、ＧＰＣＲをターゲットとする分子は鬱病及び／又は不安障害の治療に使用し得ることを示唆する。しかしながら、ＭＣＨ１アンタゴニストは５ＨＴ、ＮＥ及びＤＡトランスポーターに対する活性を有するべきではない。更に、ＭＣＨ１アンタゴニストは脳に存在するモノアミンオキシダーゼＡ（ＭＡＯＡ）又はモノアミンオキシダーゼＢ（ＭＡＯＢ）（すなわち、中枢ＭＡＯ）の酵素活性を阻害すべきではない。このような化合物の設計は組織アッセイにおいて５ＨＴ、ＮＥ及びＤＡトランスポーターに対するそれらの結合親和性を決定することにより最適化され得る。このような化合物の設計は、更に中枢ＭＡＯＡ及び中枢ＭＡＯＢとのそれらの相互作用を決定することにより最適化することができる。
【０７０７】
更に、副作用が生じ得るので、前記ＭＣＨ１アンタゴニストが以下の受容体に結合することは望ましくない：ヒトＨ１ヒスタミン受容体；ヒトＨ２ヒスタミン受容体；ヒトα１Ａアドレナリン作動性受容体、ヒトα１Ｂアドレナリン作動性受容体、ヒトα１Ｄアドレナリン作動性受容体、及びヒトα２Ａアドレナリン作動性受容体、ヒトα２Ｂアドレナリン作動性受容体、ヒトα２Ｃアドレナリン作動性受容体；ヒトドーパミンＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５受容体；並びにヒト５ＨＴ１Ａ受容体、ヒト５ＨＴ１Ｂ受容体、ヒト５ＨＴ１Ｄ受容体、ヒト５ＨＴ１Ａ受容体、ヒト５ＨＴ１Ｂ受容体、ヒト５ＨＴ１Ｄ受容体、ヒト５ＨＴ１Ｅ受容体、ヒト５ＨＴ１Ｆ受容体、ヒト５ＨＴ２Ａ受容体、ラット５ＨＴ２Ｃ受容体、ヒト５ＨＴ４受容体、ヒト５ＨＴ６受容体、及びヒト５ＨＴ７受容体。
【０７０８】
放射性リガンド結合アッセイ及び酵素アッセイ
前記受容体のｃＤＮＡを取得し、異種の系において前記受容体を発現させ、結合親和性を決定するアッセイを実行するための方法は後述されている。
【０７０９】
ヒト５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ、５ＨＴ１Ｅ、５ＨＴ１Ｆ、及び５ＨＴ７受容体：これらの各５ＨＴ受容体サブタイプをコードする遺伝子が安定してトランスフェクトされたＬＭ（ｔｋ）クローン株細胞溶解液を上記のように調製した。１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０　Ｍ　パージリン、及び０．１％　アスコルビン酸を含有する５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ　７．４　３７℃）中に細胞膜を懸濁した。化合物の親和性を平衡競合結合アッセイにおいて５ｎＭの［３Ｈ］セロトニン存在下で３７℃、３０分間インキュベートすることによって決定した。非特異的結合は１０μＭのセロトニン存在下で決定した。結合した放射性リガンドは細胞回収機を用いてＧＦ／Ｂフィルターを通した濾過により分離した。
【０７１０】
ヒト５ＨＴ２Ａ受容体：ヒト５ＨＴ２Ａ受容体のコーディング配列をヒト大脳皮質のｃＤＮＡライブラリーから取得し、ｐＣＥＸＶ３真核細胞発現ベクターのクローニングサイトにクローニングした。ＤＥＡＥデキストラン法（Ｃｕｌｌｅｎ，　１９８７）によって、該構築物をＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。７２時間後に細胞を回収し、５ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ　７．５中で超音波破砕することにより溶解させた。前記細胞溶解液を１０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心し、上清を３０，０００×ｇ、２０分間、４℃で遠心した。ペレットを１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び０．１％アスコルビン酸を含有する５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌバッファー（ｐＨ　７．７、室温）中に懸濁した。化合物の５ＨＴ２Ａ受容体おける親和性を［３Ｈ］ケタンセリン（１ｎＭ）を用いた平衡競合結合アッセイにおいて決定した。非特異的結合は１０μＭのミアンセリンを加えることによって決定した。結合した放射性リガンドは細胞回収機を用いてＧＦ／Ｂフィルターを通した濾過により分離した。
【０７１１】
５ＨＴ１Ａ受容体：５ＨＴ１Ａ受容体のオープンリーディングフレーム及び様々な非コーディング５’及び３’領域に対応するｃＤＮＡを真核細胞発現ベクターｐＣＥＸＶ３にクローニングした。ＤＥＡＥデキストラン法（Ｃｕｌｌｅｎ，　１９８９）によって、該構築物をＣＯＳ７細胞に一過的にトランスフェクトさせ、７２時間後に回収した。３Ｈ８ＯＨＤＰＡＴを放射性リガンドとして使用し、１０μＭのミアンセリンを加えることによって非特異的結合を決定したことを除いて、５ＨＴ２Ａ受容体に対して放射性リガンド結合アッセイ法を上述のように実行した。
【０７１２】
他の５ＨＴ受容体：他のセロトニン受容体結合アッセイは文献に記載されている方法に従って行われた：ラット５ＨＴ２Ｃ受容体（Ｊｕｌｉｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８８）；及び５ＨＴ６（Ｍｏｎｓｍａ，　ｅｔ　ａｌ．，　１９９３）。５ＨＴ４受容体を用いた結合アッセイは、米国特許第５，７６６，８７９（その開示内容の全体は、参考文献として本明細書に援用される）に記載されている手順に従って行われた。
【０７１３】
他の受容体：ヒトドーパミンＤ１、Ｄ２、Ｄ４、及びラットＤ３受容体を発現している細胞膜をＢｉｏＳｉｇｎａｌ，　Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，　Ｃａｎａｄａ）から購入した。ヒスタミンＨ１受容体；ドーパミン受容体；並びにα１Ａ、α１Ｂ、及びα２アドレナリン作動性受容体を用いた結合アッセイは、米国特許第５，７８０，４８５号（その開示内容の全体は、参考文献として本明細書に援用される）に記述される手順に従って行われ得る。ドーパミンＤ５受容体を用いた結合アッセイは米国特許第５，８８２，８５５号（その開示内容の全体は、参考文献として本明細書に援用される）に記述されている手順に従って行われ得る。ヒトα１Ｄアドレナリン作動性受容体に対する結合アッセイは、米国特許第６，１５６，５１８号（その開示内容の全体は、参考文献として本明細書に援用される）に記述されている手順に従って行われ得る。
【０７１４】
天然のトランスポーターでの結合親和性を決定する方法は、以下の出版物に記述されている：５ＨＴトランスポーター及びＮＥトランスポーター（Ｏｗｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７）、及びＤＡトランスポーター（Ｊａｖｉｔｃｈ　ｅｔ　ａｌ，　１９８４）。
【０７１５】
モノアミンオキシダーゼ酵素（例えば、中枢ＭＡＯＡ及びＭＡＯＢ）での活性を決定する方法はＯｔｓｕｋａ及びＫｏｂａｙａｓｈｉ，１９６４年に記述されている。
【０７１６】
【表３ａ】
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【０７１７】
【表３ｂ】
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【０７１８】
【表３ｃ】
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【０７１９】
【表３ｄ】
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【０７２０】
【表３ｅ】
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ラット中枢神経系におけるＭＣＨ１結合部位分布のオートラジオグラフィー
終脳
大脳皮質では低密度のＭＣＨ１受容体結合部位が検出されており、表層でわずかに結合が増加している。同様に、中隔核（図２０Ａ、Ｃ）、前障（Ｃ１）（図２０Ａ、Ｂ）、対角帯の腹側脚や水平脚、及び梨状皮質（Ｐｉｒ）は低密度のＭＣＨ１受容体結合部位を含んでいた（図２０Ａ、Ａ〜Ｆ；図２０Ｂ、Ｇ及びＨ）。
【０７２１】
ラット中枢神経系では、基底核や嗅結節（Ｔｕ）において最も強いＭＣＨ１受容体の結合がいくつか認められた。尾状核−被殻（ＣＰｕ）及び側坐核（ＡｃｂＣ）ではＭＣＨ１受容体の標識が密集していることが示され、側坐核の殻（Ａｃｂｓｈ）では非常に強い標識が存在していた（図２０Ａ、Ｂ）。淡蒼球（ＧＰ）は標識されなかった。視床下核（ＳＴｈ）、基底核周辺部分は中等度に標識された（図２０Ａ、Ｆ）。
【０７２２】
扁桃体及び扁桃体延長領域では中等度に低い標識が示され、分界条床核（ＢＳＴＭ）（図２０Ａ、Ｃ）、外側基底扁桃核（ＢＬＡ）及び外側扁桃核（図２０Ａ、Ｄ及びＦ）において若干多い放射リガンドの結合が認められた。
【０７２３】
間脳
一般に、間脳ではＭＣＨ１受容体の結合は全体的に弱かった。視床では、室傍核（ＰＶＡ）、視床中内側核、及び視床前背核（ＡＤ）において結合強度のわずかな増加が認められた（図２０Ａ、Ｄ）。視床上部では、内側手綱核（ＭＨｂ）がＭＨＣ１受容体結合部位を含んでいた（図２０Ｂ、Ｇ）。視床下部全体では、均一な弱い結合シグナルが認められた（図２０Ａ、Ｃ〜Ｈ；２０Ｂ、Ｇ及びＨ）。視床下部腹内側部（ＶＭＨ）及び内側乳頭核（ＭＭ）においてＭＨＣ１の結合強度がわずかに増加していた（図２０Ａ、Ｅ；２０Ｂ　Ｈ）。
【０７２４】
ＭＨＣ１受容体の結合は、灰白層（ＩＧ）（図２０Ａ、Ｂ）及び海馬形成のアンモン角（ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３）（図２０Ａ、Ｅ及びＦ）では中等度であった。ＭＨＣ１結合部位は、ＣＡ１領域の上昇層（ｓｏ）及び放射状層（ｓｒ）、並びにＣＡ３領域の上昇層に存在した。中等度の結合が、歯状回の分子層及び前／傍海馬台に認められた（図２０Ａ、Ｅ及びＨ）。
【０７２５】
中脳
全体的に見て、中脳におけるＭＣＨ１受容体の結合は非常に弱かった。水道周囲灰白質（ＰＡＧ）及び橋核（Ｐｎ）ではわずかに結合強度が増加することが明らかに示された（図２０Ｂ、Ｉ及びＪ）。中等度の結合が上丘（ＳＣ）及び背側縫線核（ＤＲ）で認められた（図２０Ｂ、Ｉ及びＪ）。
【０７２６】
菱脳（橋／髄質）
菱脳では、青斑核（ＬＣ）においてＭＨＣ１受容体結合部位が最も高密度に見られた（図２０Ｂ、Ｌ）。橋及び髄質全体を通してＭＣＨ１受容体の結合は一貫して低かった（図２０Ｂ、Ｋ及びＬ）。わずかに強い結合が、下丘（ＩＣ）、背側被蓋核（ＤＴＮ）及び傍小脳脚核（ＰＢ）（図２０Ｂ、Ｋ）及び上外側オリーブ核（ＬＳＯ）で検出された（図２０Ｂ、Ｌ）。
【０７２７】
脊髄
ＭＣＨ１受容体結合部位は、脊髄の後角と前角全体に均一に分布しているようである（図２０Ｂ、Ｍ）。結合密度は後角表層部でわずかに増加していた。
【０７２８】
【表４】
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考察
ラット中枢神経系におけるＭＣＨ１受容体の解剖学的分布を、ドーパミン１００μＭ及びプラゾシン１μＭの存在下で［３Ｈ］化合物１０を０．１ｎＭ使用した受容体オートラジオグラフィーによって測定し、受容体を直接視覚化した（図１９Ａ）。非特異的結合は、インキュベーション緩衝液に非標識化合物１０を１０μＭ含めることによって測定した。［３Ｈ］化合物１０の特異的結合は約９５％であった（図１９Ｂ）。
【０７２９】
この結果から、ＭＨＣ１受容体はラット中枢神経系に広く分布していることが示唆される。ＭＣＨ１受容体は、基底核では豊富に発現し、海馬や青斑では中等度に発現している。弱いＭＣＨ１の発現が、間脳、中脳及び菱脳で観察された。脊髄では、後角、前角ともＭＣＨ１受容体の発現が低いことが示された。
【０７３０】
ＭＣＨ様免疫反応性（ＭＣＨ−ＬＩ）は、ラット中枢神経系で報告されている（Ｓｋｏｆｉｔｓｃｈ、Ｇ．ｅｔ　ａｌ．１９８５；Ｚａｍｉｒ、ｅｔ　ａｌ．、１９８６；Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ　ｅｔ　ａｌ．１９９２）。ＭＣＨ−ＬＩは、新皮質、線条、扁桃体、海馬、間脳、中脳及び髄脳を含めた脳全体で検出された。小脳皮質だけがＭＣＨ−ＬＩを含んでいなかった。ＭＣＨ細胞体は視床下部、前扁桃野に尾部が広がった嗅球、及び傍正中橋網様体の領域に局在していた。間脳は最も高濃度のＭＣＨ陽性細胞体と広範囲にわたる繊維ネットワークを含んでいた。終脳領域は、ＭＣＨ免疫反応性繊維ネットワークを受容していた。新皮質、海馬、嗅結節、尾状核−被殻、側座核、視床、並びに髄質及び脊髄ではＭＣＨ陽性繊維の散在が認められた。
【０７３１】
近年、ＭＣＨ１受容体（ＳＬＣ−１）のクローニングによって（Ｓａｉｔｏ、ｅｔ　ａｌ．、１９９９；Ｃｈａｍｂｅｒｓ、ｅｔ　ａｌ．、１９９９）、ＭＣＨ１　ｍＲＮＡの組織での局在が明らかになった。ＭＣＨ１　ｍＲＮＡは、嗅覚領、海馬、基底核、視床下部、扁桃体、及び青斑を含む様々な脳領域に局在していた。行動強化に関与する側坐核では特に活発にｍＲＮＡが発現していた。次に、受容体選択的な抗体を使用すると、ＭＣＨ−１（ＳＬＣ−１）受容体タンパク質の分布がラット中枢神経系におけるＭＣＨ１ｍＲＮＡの分布と一致することが発見された（Ｈｅｒｖｉｅｕ、ｅｔ　ａｌ．、２０００）。本明細書では、［３Ｈ］化合物１０を使用したＭＣＨ１結合部位の分布が、受容体ｍＲＮＡとタンパク質発現の両者の分布と類似することを報告した。外側視床下部及び不確帯のＭＣＨ細胞は脳全体に広く投射しているので、ラット中枢神経系全体に広範囲にＭＣＨ１受容体結合部位が分布していることは驚くことではない。
【０７３２】
応用への可能性
ＭＣＨは食物摂取や摂食行動の制御（Ｑｕ、ｅｔ　ａｌ．、１９９６；Ｒｏｓｓｉ、ｅｔ　ａｌ．、１９９７；Ｓｈｉｍａｄａ、ｅｔ　ａｌ．、１９９８）、目標定位行動、一般的な覚醒またはストレス反応の制御（Ｊｅｚｏｖａ、ｅｔ　ａｌ．、１９９２）及び流体の恒常性の調節に関与している（総説、Ｂｅｒｎａｒｄｉｓ、ｅｔ　ａｌ．、１９９３）。
【０７３３】
ＭＣＨ１受容体結合部位の解剖学的分布は、食物摂取、口渇感及び摂食行動の強化におけるＭＣＨ受容体の役割と一致している。ＭＨＣ１受容体結合部位は、食物摂取に関与することが認識されている腹内側核、背内側核、及び弓状核にはっきりと表れており、ＭＣＨ１受容体がＭＣＨの食欲促進効果を媒介していることが示唆された。ＭＣＨ１結合部位は、流体の恒常性の調節に関与する領域、外側視床下部及び不確帯に存在していた。
【０７３４】
既に述べたように、ＭＣＨ１結合部位は脳全体に広く分布している。新皮質及び外側視床下部にＭＣＨ１受容体が集中して局在していることは、一般的覚醒においてＭＣＨ１受容体が機能的な役割を果たすことを裏付けている。
【０７３５】
ＭＣＨは、インビボでのＡＣＴＨ放出を増加させ、視床下部−脳下垂体−副腎系（ＨＰＡ）への刺激効果を有することが示された。ＭＣＨ１の作用部位は現在では知られていないが、視床下部全体及び分界条の床核に局在するＣＲＦニューロンが標的の１つである可能性がある。ＭＣＨ１受容体は、これらの領域に局在しており、したがってＭＣＨ１受容体がストレス反応において役割を果たしている可能性が示唆される。
【０７３６】
ＭＣＨ１受容体は、いくつかの辺縁系関連構造、すなわち、海馬、中隔、側坐核、対角帯核、分界条の床核、及び扁桃体に存在する。この局在に基づいて、ＭＣＨ１受容体は、学習及び記憶並びに感情状態の調節に関与する可能性がある。抑鬱及び不安の治療において有効な薬剤は、主として脳のセロトニン作動系及び非アドレナリン作動系に作用することが立証された。ＭＣＨ１受容体は、中脳縫線核からの投射を受容するいくつかの前脳領域、セロトニン作動経路の始点、並びに非アドレナリン作動系の始点である青斑に局在していた。扁桃体、海馬、視床下部、側坐核及び新皮質のＭＣＨ１受容体は、情動障害の治療の標的となり得る。
【０７３７】
ラット中枢神経系の中で最も強く放射リガンドが結合するのは、基底核内、特に尾状核−被殻及び側坐殻で、中等度に結合するのは視床下核であった。運動皮質及び網様体、歩行能力に関与する領域全体にＭＣＨ１受容体が局在していることを考え合わせると、ＭＣＨ１受容体は運動行動の制御におけるＭＣＨの役割を媒介する能力を秘めており、従ってパーキンソン病やハンチントン舞踏病の治療において治療目標の候補となり得るだろう。しかし、ＭＣＨ−／−マウスに行ったオープンフィールド歩行試験では歩行に欠陥がなかったことは注目すべきことである。
【０７３８】
腹側線条体にＭＣＨ１受容体が局在していることはかなり興味深く、ドーパミン作動性神経伝達を調節する、薬物嗜癖及び精神病の治療において、ＭＣＨ１受容体が治療標的となり得ることを示唆している。側坐殻は摂食行動の正の強化の媒介に関与し、報酬系で役割を果たしている。腹側被蓋野から抗精神病薬の作用部位である側坐核へドーパミン作動性の投射が密集している。
【０７３９】
感覚情報の調節におけるＭＣＨ１受容体の役割は、いくつかの感覚経路に中継核が存在することによって示されるかもしれない。ＭＣＨ１受容体は視覚系の調節に関与しているようである。ＭＣＨ１受容体結合部位は、網膜からの求心神経を受容する上丘に局在している。聴覚系では、ＭＣＨ１受容体は内側膝状核、下丘核、及び蝸牛神経核及び前庭神経内側核に存在している。
【０７４０】
青斑にＭＣＨ１が局在することは、非アドレナリン神経伝達において調節的に作用して、睡眠、注意及び覚醒に影響を及ぼす可能性があることを意味する。
【０７４１】
痛みの知覚の調節においてＭＣＨ１受容体が役割を果たしている可能性は、水道周囲灰白質、背側縫線核及び脊髄の灰白質にＭＣＨ１受容体結合部位が局在していることによって示唆される。ＭＣＨ１受容体は上行、及び下行する感覚情報、さらには脊髄での運動反射を調節することができる。
【０７４２】
ｉｎ ｖｉｖｏモデル
結果
１．ＭＣＨ刺激による食物摂取に対する影響
ＭＣＨの第３脳室への投与は、媒体投与の対照実験に比較して、測定された全ての時点で食物摂取を有意に増加させた（図２１）。食物摂取における条件の違いによる有意差が３０分後［Ｆ（４， ４４）＝７．０７， ｐ ＜ ０．０００２　一方向反復測定、ＡＮＯＶＡ］、６０分後［（Ｆ（４， ４４）＝６．３１， ｐ ＜ ０．０００４］、および１２０分後［Ｆ（４， ４４）＝９．８４， ｐ＜０．０００１］に観察された。ＭＣＨ投与前の系統的なＤＭＳＯ処理は、ＭＣＨ刺激による食物摂取を有意には変えなかった（図１）。１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０による前処理は、３０分および１２０分後のＭＣＨ誘導食欲を有意に減少させ、６０分時点におけるＭＣＨ誘導食欲の発生を防いだ（図２１）。１ｍｇ／ｋｇの化合物１０の前処理は全ての時点におけるＭＣＨ誘導食欲の発生を防いだ（図２１）。これらの結果は、化合物１０の末梢投与はＭＣＨの中枢投与によって誘導される食物摂取の刺激を有意に減少させることを示す。
【０７４３】
２．ＭＣＨ１アンタゴニストの体重に対する効果
化合物１０の体重制御に対する影響を調べるために、１０ ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１０または６ｍｇ／ｋｇ／日のｄ−フェンフルラミン、または媒体の何れかを放出する浸透圧ミニポンプを体内に移植したラットの体重変化をモニターした。化合物１０またはｄ−フェンフルラミンで処理したラットは、媒体処理に比して有意に体重を減少させた［２方向ＡＮＯＶＡ測定で、Ｆ（２，３６０） ＝ ８１．６９， ｐ＜０．０００１］。化合物１０で処理したラットは、１−１３日において、媒体処理に比して有意に体重を減少させた（図２２）。ｄ−フェンフルラミンで処理したラットは、１−６日において媒体処理に比して有意に体重を減少させた（図２２）。研究の全期間にわたって、化合物１０またはｄ−フェンフルラミンで処理したラットは、対照に比してそれぞれ１６％および１０％体重を減少させた。
【０７４４】
化合物１０の体重制御に対する影響は、次に７日間１日に２回の腹腔内注射によって調べられた。図２３に示すように、この実験期間を通して全ての対照ラットが体重を増加させたのに対して、１０ ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１０で処理したラットは、媒体処理ラットに比して有意に体重を減少させた（処理効果は２方向ＡＮＯＶＡ検定でＦ（３， ２１４）＝ ６０．５９， ｐ ＜ ０．０００１））。１０ ｍｇ／ｋｇ／日の化合物１０で処理したラットは、媒体処理ラットに比して２６％体重を減少させた。１または３ｍｇ／ｋｇの化合物１０の投与によっては、体重に対する有意な影響は観察されなかった。
【０７４５】
化合物９４および化合物９５を１日２回、３日間の腹腔内注射で投与することの体重への影響が調べられた。２方向ＡＮＯＶＡ検定によって、体重増加に対する処置の有意な効果があった［Ｆ（６， １６０）＝３１．２１， ｐ ＜ ０．０００１，図 ２４、２５］．
図２４に示すように、３０ｍｇ／ｋｇの化合物９４で処理されたラットは、媒体処理ラットに比して、１日、２日および３日目において体重を減少させ、一方３または１０ ｍｇ／ｋｇの化合物９４で処理したラットは、対照群と同様に体重を増加させた。同様に図２５に示したように、３０ ｍｇ／ｋｇの化合物９５で処理されたラットは、媒体処理ラットに比して、１日、２日および３日目において体重を減少させ、３または１０ ｍｇ／ｋｇの化合物９５で処理したラットは、対照群と同様に体重を増加させた。研究の全期間にわたって化合物９４または化合物９５で処理したラットは、対照に比して、それぞれ４０ ％および８２ ％体重を減少させた。総合してみると、これらの発見は、ＭＣＨ１受容体のアンタゴニストである３つの化合物は、若い成長期のラットの体重増加を抑制することを示している。
【０７４６】
３．ＭＣＨ１アンタゴニストによる甘味付け濃縮ミルクの消費に対する影響
ラットは、明サイクルの初期において、一日７回２０分間だけ甘味付けした濃縮ミルクを飲むように訓練された。各々のラットの飲料ベースラインは、試験の最後の３日間の平均値として決定された。次いで、ラットは３０分間だけ甘味付け濃縮ミルクを与えられ、それに続いて媒体、あるいは３、１０または３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０、あるいは３ｍｇ／ｋｇのｄ−フェンフルラミンが腹腔内注射で投与された。図２６は、各々のラットのベースライン飲料に対する％で表されたミルクの消費量を示している。３、１０または３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０あるいは３ ｍｇ／ｋｇのｄ−フェンフルラミン処理をしたラットは、対照に比して有意に飲料が減少した（それぞれ８７， ５９， ４１ および０．０３％）。これらの結果は、化合物１０が食欲減退薬として作用し、口に合う食物の消費を減少させる能力をもつことを示す。
【０７４７】
４．強制水泳試験
媒体、フルオキセチンおよび化合物１０の不動性、登上、および水泳試験に対する効果
不動性
不動性に対しての統計処理は有意の薬効が不動性に対してみられることを示した（（Ｆ（４， ２４）＝ ６．３６、 ｐ ＝ ０．００１８）。それに続くｐｏｓｔ ｈｏｃ分析は、１０ ｍｇ／ｋｇ のフルオキセチンの腹腔内シングル投与のよって、媒体処理の対照群に比して不動性が２３．０± １．０ （Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ値は２０．５２、ｐ ＜ ０．０１）に減少することを明らかにした（表５）。それに加えて、３、１０および３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０の腹腔内単回投与は、媒体処理の対照群の値３５±１．９（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓはそれぞれ、１３．４５、１５．０８、１１．９１、表５）に比して、不動性を有意に減少させた（各投与量において、それぞれ２５±２．７、２５ ± １．９および２６± １．９ カウント）。
【０７４８】
登上
登上についての統計処理は、有意な薬効がみられることを示した（Ｆ（４， ２４）＝５．１８、 ｐ＝０．００５）。事後分析は、１０ ｍｇ／ｋｇ のフルオキセチンの腹腔内シングル投与が、媒体処理の対照群に比して有意には登上カウントを変えないことを示した（表５）。対照的に、３ｍｇ／ｋｇの化合物１０の単回投与は、登上カウント（１９ ± １．７）を媒体処理の対照群（１２ ±１．２）に比して有意に増加させた（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ値 ＝ ９．４２、ｐ ＜ ０．０５）。１０および３０ ｍｇ／ｋｇのドースにおいて、化合物１０は登上を有意には変えなかった。
【０７４９】
水泳
水泳データの統計処理は、不動性に対して有意な薬効がみられることを示した［（Ｆ（４， ２４）＝ １６．４、 ｐ ＜ ０．０００１］（表５）。事後分析の結果、１０ ｍｇ／ｋｇ のフルオキセチンの腹腔内シングル投与は、水泳カウントが媒体処理の対照群（１２±１．０、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ値は５０．４８、ｐ ＜ ０．０１）に比して有意な増加（２６± １．６）を生み出すことが示された。同様に、３、１０および３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０の腹腔内単回投与は、水泳カウントを有意に増加させた（それぞれ１６±１．１、２０±１．７、２３±１．０、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓはそれぞれ、４．３７， ｐ ＜ ０．０５、１９．２６， ｐ ＜ ０．０１、３４．２、ｐ ＜ ０．０１、表５）．
潜水
この行動は媒体シングル投与では観察されず、フルオキセチン（５匹のうち１匹が２回潜水）、３ｍｇ／ｋｇ化合物１０（５匹のうち２匹が一回ずつ潜水）、１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０（５匹のうち４匹が、１、４、１、３回の潜水）または３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０（５匹のうち２匹が１および４回の潜水）ではわずかに観察された。
【０７５０】
【表５】
2004502423.tif 000071
各々の値は平均値±平均偏差を示す。５匹全ての動物がそれぞれの処置群に対して検査された；
ａ３ｍｇ／ｋｇの化合物１０（ｐ＜０．０５）および１０と３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０およびフルオキセチンよりの有意に低い、ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ検定；
ｂ媒体（ｐ ＜ ０．０１）および１０と３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０ （ｐ ＜ ０．０１）よりも有意に高い、ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ検定；
ｃ３、１０および３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０およびフルオキセチン （ｐ ＜ ０．０１）よりも有意に高い、ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ検定。
【０７５１】
強制水泳試験の結果は、Ｐｏｒｓｏｌｔ強制水泳試験の変更試験を用いて、１０ｍｇ／ｋｇのフルオキセチンの腹腔内シングル注射による投与がオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄｏｗｌｅｙラットの不動性を減少させ、水泳を増加させることを示した。これはＬｕｃｋｉ変法を用いた以前の結果（Ｄｅｔｋｅら、１９９５；Ｋｉｒｂｙ とＬｕｃｋｉ、１９９７；Ｌｕｃｋｉ， １９９７； ｐａｇｅら、１９９９；　ＲｅｎｅｒｉｃとＬｕｃｋｉ、１９９８）と一致している。それに加えて、フルオキセチンを用いて得られた結果は他のＳＳＲＩを用いた結果と一致している（Ｄｅｔｋｅら、１９９５）。このように、Ｐｏｒｓｏｌｔ強制水泳試験の変法はフルオキセチンノようなＳＳＲＩの抗鬱薬作用を一貫して検出可能である。
【０７５２】
媒体処理動物に比較して、化合物１０は、３、１０および３０ ｍｇ／ｋｇのドースで有意に不動性を減少させ、水泳を増加させること、並びに３ｍｇ／ｋｇのドースでは有意に水泳を増加させることを示した。このように、強制水泳試験の過去の解釈に基づけば、我々の結果は、化合物１０が抗鬱剤のような性質をもつことを示唆している。
【０７５３】
５．社会的相互作用試験
化合物１０およびクロロジアゼポキサイドのラット社会的相互作用試験における行動への影響
３、１０または３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０の腹腔内単回投与は、社会的相互作用（ｓｏｃｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を、ベンゾジアゼピンアンキオリティックおよびクロロジアゼポキシド（５８．８のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ値）と同様に、媒体処置の動物（ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４， ４０）＝ ２０．６、ｐ ＜ ０．０００１、図６）に比して有意に増加させた（それぞれ４８．７、４３．７および１７．１のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ値）。３０ｍｇ／ｋｇの化合物１０の腹腔内単回投与により生じた社会的相互作用（ｓｏｃｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の度合いは、３および１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０および５ｍｇ／ｋｇのクロロジアゼポキシドのそれらに比して有意に低い（それぞれ８．０６、８．１２および１４．１６のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ値）。３および１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０およびクロロジアゼポキシドの腹腔内投与の間には、社会的相互作用の持続期間に関して有意差はなかった。
【０７５４】
【表６】
2004502423.tif 000072
各々の値は平均の社会的相互作用時間（秒）±平均偏差を示す。７−１０匹全ての動物がそれぞれの処置群に対して検査された；
ａ媒体よりも有意に高い、ｐ ＜ ０．０１、 ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ検定；
ｂクロロジアゼポキシドおよび３ｍｇ／ｋｇの化合物１０ （ｐ ＜ ０．０１）および１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０（ｐ ＜ ０．０５）よりも有意に低い、ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ検定。
【０７５５】
化合物１０およびクロルジアゼポキシドのラットの社会的相互作用試験における起立挙動、歩行運動および毛繕いへの影響
統計解析は処置の養育行動に対する有意な効果を示した（ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４， ４０）＝ ３．０３、ｐ ＝ ０．０２１、表７）。３または１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０の腹腔内単回投与は、媒体処置および１０および３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０で処置した動物に比して、顕在する起立回数（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｅａｒｉｎｇ）を有意に低下させる（それぞれ４．５５、５．３４および８．０９のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ値）。それに加えて、５ｍｇ／ｋｇクロロジアゼポキシドの腹腔内投与によって生じる起立回数は、３０ ｍｇ／ｋｇドースの化合物１０のそれよりも有意に低い（表７）。
【０７５６】
統計解析は処置のグルーミング行動に対する有意な効果を示した（ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４， ４０）＝ １２．００、 ｐ ＜ ０．０００１、表７）。３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０の腹腔内単回投与は、媒体処置、３および１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０、並びに５ｍｇ／ｋｇクロロジアゼポキシドの腹腔内投与で処置した動物に比して、毛繕い発作（Ｇｒｏｏｍｉｎｇ ｂｏｕｔｓ）、顕在する起立回数（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｅａｒｉｎｇ）を有意に増加させる（それぞれ１６．９、２５．１および２７．９および３６．６のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ値）。３および１０ ｍｇ／ｋｇドースのＳＮＥＣ−３およびクロロジアゼポキシドの腹腔内投与のあいだには毛繕い発作に関して有意差はなかった。
【０７５７】
統計的解析は、処置の運動能力に対する有意差のある効果を示した（ＡＮＯＶＡ、Ｆ（４， ４０）＝ ３．８３、 ｐ ＝ ０．００８８）。ｐｏｓｔ ｈｏｃ分析により、３ｍｇ／ｋｇドースの化合物１０での処理は、媒体処理あるいは１０または３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０を投与した動物に比して通過した区画の数が有意に低下することが示された（それぞれ８．４、６．５および８．９６のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ値、図７）。５ｍｇ／ｋｇドースのクロロジアゼポキシドのシングル投与動物とその他の処理をした動物との間には、通過した区画の数に関して有意差はなかった。
【０７５８】
【表７】
2004502423.tif 000073
各々の値は平均±平均偏差を示す。７−１０匹全ての動物がそれぞれの処置群に対して検査された；
ａ媒体、１０および３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０よりも有意に低い、ｐ ＜ ０．０５、 ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ検定；
ｂクロロジアゼポキシド（ｐ ＜ ０．０５） および３ｍｇ／ｋｇの化合物１０ （ｐ ＜ ０．０１））よりも有意に大きい、ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ検定；
Ｃ媒体、３および３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０よりも有意に低い（ｐ ＜ ０．０５）、 ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ検定；
ｄその他のすべての処理群よりもよりも有意に大きい、ｐ ＜ ０．０１、ＡＮＯＶＡおよびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ検定。
【０７５９】
３、１０または３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０の腹腔内投与は、ラットの社会的相互作用（ｓｏｃｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）時間を媒体処置の動物に比して有意に増加させた。それから、ａｎｘｉｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔ （５ ｍｇ／ｋｇのクロロジアゼポキシド腹腔内投与）は媒体処理した動物に比して、社会的相互作用時間の有意な増加を生み出した。３または１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０によって起こされた反応は、ポジティブコントロールであるクロロジアゼポキシドのそれに匹敵した。３０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０の腹腔内単回投与により生じた社会的相互作用の度合いは、３および１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０の場合に比して有意に低かった。このより高いドースの化合物１０は、毛繕い行動の有意な増加をもたらすので、それが社会的相互作用時間に匹敵する行動をひき起こす可能性がある。
【０７６０】
３ ｍｇ／ｋｇの化合物１０の腹腔内単回投与は、ラットの通過する区画と飼育の数を、媒体処置または１０または３０ ｍｇ．ｋｇの化合物１０で処理した動物に比して有意に減少させた。この発見の行動学的意味は不明である。しかしながら、３ ｍｇ．ｋｇドースの化合物１０で処理した動物は、如何なる明白なカタレプシーあるいは鎮静の兆候も示さなかった。それに加えて、このドースにおける社会的相互作用のレベルは、１０ ｍｇ／ｋｇの化合物１０または５ｍｇ／ｋｇのクロルジアゼポキシドのそれとは有意には違わなかった。
【０７６１】
以前、社会的相互作用試験において、アンフェタミンおよびカフェインなどの強壮剤は社会的相互作用時間および運動能力を増加させ、一方、不安緩解剤は交接時間を増加させるが運動能力を減退させる（Ｆｉｌｅ， １９８５；　Ｆｉｌｅ ａｎｄ Ｈｙｄｅ， １９７９； Ｇｕｙ ａｎｄ ｇａｒｄｎｅｒ， １９８）。しかしながら、化合物１０の如何なるドースも、ラットの飼育行動および通過した区画の数を、媒体で処理した動物に比して有意に増加させなかった。実際、上述のように、３ｍｇ／ｋｇドースでの化合物１０の腹腔内投与により、ラットの通過する区画と飼育行動は、媒体処理した動物に比して有意に減少した。従って、化合物１０が非特異的効果を生み出すことはありそうもない。
【０７６２】
結論として、この研究の結果は、３、１０および３０ ｍｇ／ｋｇのドースでは、化合物１０はラットの通過する区画あるいは毛繕い行動を増やすことなく、社会的相互作用時間を有意に増加させている。全体として、化合物１０は社会的相互作用試験において不安緩解剤のプロファイルをもっているように見える。
【０７６３】
【参照文献２】
2004502423.tif 000074
2004502423.tif 000075
2004502423.tif 000076
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2004502423.tif 000091
【０７６４】
【配列表】
2004502423.tif 000092
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2004502423.tif 000094
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトＭＣＨ１受容体（ＭＣＨ１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）。３つの開始（ＡＴＧ）コドンの候補と停止（ＴＧＡ）コドンの候補に下線が付してある。
【図２】
図１に示されたヌクレオチド配列（配列番号１）によってコードされるヒトＭＣＨ１受容体の推定アミノ酸配列（配列番号２）。
【図３】
ヒトＭＣＨ１の推定アミノ酸配列（配列番号２）。７つの推定膜貫通（ＴＭ）領域に下線を付してある。
【図４】
ラットＭＣＨ１のヌクレオチド配列（配列番号３）。一つの開始（ＡＴＧ）コドンと停止コドン（ＴＧＡ）に下線が付してある。
【図５】
ラットＭＣＨ１に対する推定アミノ酸配列（配列番号４）。
【図６】
ＭＣＨ１に媒介された、ＰＩのＭＣＨ１に対する用量応答性。
【図７】
対象となるいくつかの化合物を用いたＭＣＨ１の誘発。
【図８】
ＭＣＨ及びフェニルアラニン１３、チロシン１７−ＭＣＨに対する、ＭＣＨ１に媒介された細胞外の酸性化応答。結果は、同じ形式で行った独立な二つの実験の平均として報告されている。
【図９】
ＭＣＨ１をトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞のＭＣＨ１に対する転写反応。
【図１０】
ＭＣＨをトランスフェクトしたＣｏｓ−７細胞膜への［１２５Ｉ］フェニルアラニン１３、チロシン１７−ＭＣＨの結合。結果は、３回繰り返しの測定による平均値±標準誤差（縦線）である。
【図１１】
ヒトｍＲＮＡサンプルにおけるＭＣＨ１受容体ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる検出。
【図１２】
様々なプラスミドがコードするＭＣＨ１受容体のＮ末端領域のアミノ酸を並列させた図。Ｒ１０６（配列番号１６）とＲ１１４（配列番号１７）に存在する変異が下段枠内に示されている。開始メチオニンの候補が太字で示されている。１００位より下流のアミノ酸配列は４つのプラスミドで全て同一である。
【図１３】
プラスミドＲ１０６によってコードされるヒトＭＣＨ１受容体変異体のアミノ酸配列（配列番号２６）。
【図１４】
プラスミドＲ１１４によってコードされるヒトＭＣＨ１受容体変異体のアミノ酸配列（配列番号２７）。
【図１５】
プラスミドＢＯ１２０によってコードされるヒトＭＣＨ１受容体変異体のアミノ酸配列（配列番号２８）。
【図１６】
ＭＣＨによって誘導されるホスファチジルイノシトール反応によって示された、ＭＣＨ１がトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞における化合物１０の拮抗作用。挿入図：シルド（Ｓｃｈｉｌｄ）プロット、ｙ軸＝（（ＥＣ５０ＭＣＨ＋Ｃｍｐｄ１０／ＥＣ５０ＭＣＨ）−１）；ｘ軸＝Ｌｏｇ（Ｃｍｐｄ１０）［Ｍ］。線形回帰分析による分析によって、ｐＡ２（ｘ切片）＝９．２４、傾き＝０．９７±０．２及びｒ２＝０．９４と見積もられた。
【図１７】
ヒトＭＣＨ１受容体に対する［３Ｈ］化合物１０の飽和平衡結合。室温で９０分間、０．２５０ｍｌの体積で、ＭＣＨ１がトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞の膜調製物を様々な濃度の［３Ｈ］化合物１０（ＳＡ：５６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともにインキュベートした。ＧＦ／Ｃフィルターの濾過により反応を停止させ、放射能をシンチレーションのカウントにより測定した。非特異的結合は、未標識の化合物１０の存在（１０ｍＭ）下で、反応混合物をインキュベートした後にフィルター中に維持されている放射能として定義した。
【図１８】
ヒトＭＣＨ１受容体に対する［３Ｈ］化合物１０の拮抗的結合。９０分間室温で、様々な濃度のＭＣＨ（１Ｅ−１１Ｍ〜１Ｅ−６Ｍ）の存在下で、又は未標識の化合物１０（１Ｅ−１０Ｍ〜１Ｅ−５Ｍ）の存在下で、０．４ｎＭの［３Ｈ］化合物とともに、ＭＣＨ１がトランスフェクトされたＣｏｓ−７細胞の膜調製物をインキュベートした。ＧＦ／Ｃフィルターの濾過により反応を停止させ、シンチレーションカウントにより、膜に結合した放射能を決定した。
【図１９】
ラット間脳中のＭＣＨ１受容体結合部位のオートラジオグラフィーによる局在。Ａ、１μＭ　プラゾシンと１００μＭ　ドーパミンの存在下で、０．１ｎＭ［３Ｈ］化合物１０を用いて得られた全ＭＣＨ１受容体の結合。Ｂ．１μＭの非放射性化合物１０の存在下で観察された非特異的結合。
【図２０Ａ】
１μＭパラゾシンと１００μＭドーパミン存在下で［３Ｈ］化合物１０を用いた、ラット中枢神経系中のＭＣＨ１結合部位のオートラジオグラフィーを吻尾方向に示した。前頭皮質（Ａ）、前脳／大脳基底核（Ｂ）、大脳基底核（Ｃ）、間脳（Ｄ−Ｈ）、中脳（Ｉ−Ｊ）、脳幹（Ｋ−Ｌ）のレベルでのラット脳の冠状切片及び腰髄の横断面（Ｍ）である。尾状核−被核（ＣＰｕ）や側坐核（ＡｃｂＳｈとＡｃｂＣ）（Ｂ）のようないくつかの脳の部位に濃い標識があることに注意されたい。海馬（Ｅ−Ｈ）、視床下核（Ｆ）及び青斑核（Ｌ）には中程度の標識が観察されたが、視床と視床下部（Ｄ−Ｈ）には、これより弱い標識が見られる。
略語の一覧
ＡＡＶ　　　前扁桃野、腹側
ＡｃｂＣ　　側坐核、中心部
ＡｃｂＳｈ　側坐核、中心部
ＡＣｏ　　　前皮質扁桃核
ＡＤ　　　　前視床背側核
ＡＨ　　　　視床下部前部
ＡＩ　　　　無顆粒型島皮質
Ａｒｃ　　　視床下部弓状核
ＡＯＮ　　　前嗅核
ＡＵ　　　　聴覚皮質
ＡＶ　　　　視床下部前腹側核
ＢＬＡ　　　扁桃体基底外側核
ＢＳＴＭ　　分界条の底核、内側部
ＣＡ１、２、３　海馬のＣＡ１、２または３野
Ｃｇ　　　　帯状皮質
ＣＬ　　　　前障
ＣＰＵ　　　尾状核−被殻
ＤＬＧ　　　背側外側膝状体
ＤＭ　　　　視床下部背内側核
ＤＲ　　　　背側縫線核
ＤＴＮ　　　背側被蓋核
Ｅｎｔ　　　内嗅皮質
ＧＰ　　　　淡蒼球
ＩＡＭ　　　視床前内側中間核（ｉｎｔｅｒａｎｔｅｒｏｍｅｄｉａｌ　ｔｈａｌａｍｉｃ　ｎｕｃｌｅｕｓ）
ＩＣ　　　　下丘
ＩＣｊＭ　　カレハ（Ｃａｌｌｅｊａ）島、島の主要部
ＩＧ　　　　灰白層
Ｌａ　　　　外側扁桃核
ＬＣ　　　　青斑核
ＬＤ　　　　視床外背側核
ＬＨ　　　　外側視床下部
ＬＯ　　　　外側視索前野
ＬＳＤ　　　外側中隔核、背側
ＬＳＯ　　　上オリーブ外側核
ｍｉ　　　　一次運動領皮質
Ｍｅ　　　　内側扁桃核
ＭＧ　　　　内側膝状核
ＭＨｂ　　　内側手綱核
ＭＭ　　　　内側乳頭体核
ＭＰＯ　　　内側視索前野
ＯＣ　　　　後頭皮質
ＰＡＧ　　　中脳水道周囲灰白質
ＰＢ　　　　傍小脳脚核
ＰＦ　　　　視床束傍核
ＰＨ　　　　後視床下部領域
Ｐｉｒ　　　梨状皮質
ＰｍＣＯ　　後内側扁桃核
Ｐｎ　　　　橋核
Ｐｏ　　　　後視床核群
ＰＶＡ　　　視床室傍核
ＰＶＰ　　　視床室傍核、後部
ＲＳＧ　　　顆粒型脳梁膨大後方皮質（ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ　ｇｒａｎｕｌａｒ　ｃｏｒｔｅｘ）
ＳＣ　　　　上丘
ＳＮＲ　　　黒質、毛様部
ＳＴｈ　　　視床下核
ｓｉ　　　　一次体性感覚皮質
ｓｏ　　　　ＣＡ１野の多形細胞層
ｓｒ　　　　ＣＡ１野の放射状層
Ｔｕ　　　　嗅結節
Ｖ２　　　　二次視覚領皮質
ＶＬ　　　　視床外腹外側核
ＶＭＨ　　　視床下部腹内側核
ＶＰ　　　　視床後腹側核
【図２０Ｂ】
１μＭパラゾシンと１００μＭドーパミン存在下で［３Ｈ］化合物１０を用いた、ラット中枢神経系中のＭＣＨ１結合部位のオートラジオグラフィーを吻尾方向に示した。前頭皮質（Ａ）、前脳／大脳基底核（Ｂ）、大脳基底核（Ｃ）、間脳（Ｄ−Ｈ）、中脳（Ｉ−Ｊ）、脳幹（Ｋ−Ｌ）のレベルでのラット脳の冠状切片及び腰髄の横断面（Ｍ）である。尾状核−被核（ＣＰｕ）や側坐核（ＡｃｂＳｈとＡｃｂＣ）（Ｂ）のようないくつかの脳の部位に濃い標識があることに注意されたい。海馬（Ｅ−Ｈ）、視床下核（Ｆ）及び青斑核（Ｌ）には中程度の標識が観察されたが、視床と視床下部（Ｄ−Ｈ）には、これより弱い標識が見られる。
略語の一覧
ＡＡＶ　　　前扁桃野、腹側
ＡｃｂＣ　　側坐核、中心部
ＡｃｂＳｈ　側坐核、中心部
ＡＣｏ　　　前皮質扁桃核
ＡＤ　　　　前視床背側核
ＡＨ　　　　視床下部前部
ＡＩ　　　　無顆粒型島皮質
Ａｒｃ　　　視床下部弓状核
ＡＯＮ　　　前嗅核
ＡＵ　　　　聴覚皮質
ＡＶ　　　　視床下部前腹側核
ＢＬＡ　　　扁桃体基底外側核
ＢＳＴＭ　　分界条の底核、内側部
ＣＡ１、２、３　海馬のＣＡ１、２または３野
Ｃｇ　　　　帯状皮質
ＣＬ　　　　前障
ＣＰＵ　　　尾状核−被殻
ＤＬＧ　　　背側外側膝状体
ＤＭ　　　　視床下部背内側核
ＤＲ　　　　背側縫線核
ＤＴＮ　　　背側被蓋核
Ｅｎｔ　　　内嗅皮質
ＧＰ　　　　淡蒼球
ＩＡＭ　　　視床前内側中間核（ｉｎｔｅｒａｎｔｅｒｏｍｅｄｉａｌ　ｔｈａｌａｍｉｃ　ｎｕｃｌｅｕｓ）
ＩＣ　　　　下丘
ＩＣｊＭ　　カレハ（Ｃａｌｌｅｊａ）島、島の主要部
ＩＧ　　　　灰白層
Ｌａ　　　　外側扁桃核
ＬＣ　　　　青斑核
ＬＤ　　　　視床外背側核
ＬＨ　　　　外側視床下部
ＬＯ　　　　外側視索前野
ＬＳＤ　　　外側中隔核、背側
ＬＳＯ　　　上オリーブ外側核
ｍｉ　　　　一次運動領皮質
Ｍｅ　　　　内側扁桃核
ＭＧ　　　　内側膝状核
ＭＨｂ　　　内側手綱核
ＭＭ　　　　内側乳頭体核
ＭＰＯ　　　内側視索前野
ＯＣ　　　　後頭皮質
ＰＡＧ　　　中脳水道周囲灰白質
ＰＢ　　　　傍小脳脚核
ＰＦ　　　　視床束傍核
ＰＨ　　　　後視床下部領域
Ｐｉｒ　　　梨状皮質
ＰｍＣＯ　　後内側扁桃核
Ｐｎ　　　　橋核
Ｐｏ　　　　後視床核群
ＰＶＡ　　　視床室傍核
ＰＶＰ　　　視床室傍核、後部
ＲＳＧ　　　顆粒型脳梁膨大後方皮質（ｒｅｔｒｏｓｐｌｅｎｉａｌ　ｇｒａｎｕｌａｒ　ｃｏｒｔｅｘ）
ＳＣ　　　　上丘
ＳＮＲ　　　黒質、毛様部
ＳＴｈ　　　視床下核
ｓｉ　　　　一次体性感覚皮質
ｓｏ　　　　ＣＡ１野の多形細胞層
ｓｒ　　　　ＣＡ１野の放射状層
Ｔｕ　　　　嗅結節
Ｖ２　　　　二次視覚領皮質
ＶＬ　　　　視床外腹外側核
ＶＭＨ　　　視床下部腹内側核
ＶＰ　　　　視床後腹側核
【図２１】
ＭＣＨによって誘導されたラットにおける食物摂取の刺激に対する化合物１０の効果。ＭＣＨ（３ｎｍｏｌ）又はビークルを第３脳室に投与し、３０分、６０分、１２０分後に食物摂取を測定した。幾匹かのラットには、側脳室内注射の２０分前に、腹腔内にビークル又は化合物１０（１又は１０ｍｇ／ｋｇ）を前処理した。
＊ビークルより有意に大きい、＋ピークル／ＭＣＨより有意に小さい。
【図２２】
成長途上の幼若ラットの体重増加に対する化合物１０の効果。化合物１０（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、フェンフルラミン（ｆｅｎｆｌｕｒａｍｉｎｅ）（６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、又はビークルを、１４日間、皮下に埋入した浸透圧性のミニポンプを介してラットに投与した。ＡＮＯＶＡ及びニューマン−コイルス（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）検定により測定した、ビークルとの有意差が、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０１、ｘＰ＜０．０５でによって表されている。
【図２３】
成長途上の幼若ラットの体重増加に対する化合物１０の効果。化合物１０（１、３又は１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、又はビークル（直線）を日に二度、腹腔内注射によりラットに投与した。ＡＮＯＶＡ及びニューマン−コイルス検定により測定した、ビークルとの有意差が、＊＊Ｐ＜０．００１、＊Ｐ＜０．０１によって表されている。
【図２４】
成長途上の幼若ラットの体重増加に対する化合物９４の効果。化合物９４（３、１０、又は３０ｍｇ／ｋｇ）又はビークルを日に二度、腹腔内注射によりラットに投与した。ＡＮＯＶＡ及びニューマン−コイルス検定により測定した、ビークルとの有意差が、＋Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１によって表されている。
【図２５】
成長途上の幼若ラットの体重増加に対する化合物９５の効果。化合物６７１７３（３、１０または３０ｍｇ／ｋｇ）又はビークルを日に二度、腹腔内注射によってラットに投与した。ＡＮＯＶＡ及びニューマン−コイルス検定により測定した、ビークルとの有意差が、＊Ｐ＜０．００１であることを意味する。
【図２６】
ラットの甘味付きコンデンスミルクの消費に対する化合物１０の効果。日に２０分間、甘味付きコンデンスミルクを飲むようにラットを訓練した。実験日に、ミルクを与える３０分前に腹腔内に化合物１０（３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇ）、フェンフルラミン（ｆｅｎｆｌｕｒａｍｉｎｅ）（３ｍｇ／ｋｇ）、又はビークルを投与した。両側ｔ検定により測定した、ビークルからの有意差が＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１によって表されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502423.tif 000660
【国際調査報告】
2004502423.tif 000661
2004502423.tif 000662
2004502423.tif 000663
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2004502423.tif 000665