(57)【要約】炎症の治療及び予防に使用されるアルドステロン遮断薬が開示される。
2004518611.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の炎症関連障害を予防するか又は治療するための方法であって、それの必要な被検者を治療有効量のアルドステロン遮断薬又はその製剤的に許容される塩で治療することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記炎症関連障害が、外傷誘導性炎症、外科手術誘導性炎症、細菌誘導性炎症、及びウイルス誘導性炎症からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
炎症関連障害が心臓血管障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記心臓血管障害が、冠状動脈疾患；動脈瘤；動脈硬化症；アテローム性硬化症；心筋梗塞；塞栓症；卒中；血栓症；狭心症；血管斑（ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｌａｑｕｅ）炎症；血管斑破裂；川崎病；石灰化；及び炎症からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記石灰化が、血管石灰化及び弁石灰化からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
心臓血管障害がアテローム性硬化症である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
心臓血管障害が血栓症である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
心臓血管障害が全体的若しくは部分的に腎臓で起こる、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
心臓血管障害が全体的若しくは部分的に脳で起こる、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
心臓血管障害が全体的若しくは部分的に心臓で起こる、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルドステロン遮断薬がアルドステロン受容体拮抗薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がスピロラクトン型化合物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記スピロラクトン型化合物が、７α−アセチルチオ−３−オキソ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
３−オキソ−７α−プロピオニルチオ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
６β，７β−メチレン−３−オキソ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
１５α，１６α−メチレン−３−オキソ−４，７α−プロピオニルチオ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
６β，７β，１５α，１６α−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
７α−アセチルチオ−１５β，１６β−メチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
１５β，１６β−メチレン−３−オキソ−７β−プロピオニルチオ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；及び、
６β，７β，１５β，１６β−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オンからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がスピロノラクトンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がエポキシ−ステロイド性アルドステロン拮抗薬である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記エポキシ−ステロイド性化合物が、２０−スピロキサン化合物のステロイド核の「Ｃ」環へ縮合したエポキシ部分を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記２０−スピロキサン化合物が、９−α、１１−β置換されたエポキシ部分の存在により特徴づけられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記エポキシ−ステロイド性化合物が：
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、メチルエステル、（７α，１１α，１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、ジメチルエステル、（７α，１１α，１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β，７β，１１α，１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−（１−メチルエチル）エステル、一カリウム塩、（７α，１１α，１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−メチルエステル、一カリウム塩、（７α，１１α，１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−１，４，６−トリエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β，７β，１１α）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、メチルエステル、（６β，７β，１１α，１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、一カリウム塩、（６β，７β，１１α，１７β）−；
３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β，７β，１１α，１７β）−；
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、エチルエステル、（７α，１１α，１７β）−；及び
プレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、１−メチルエチルエステル、（７α，１１α，１７β）−からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がエポキシメクスレノン（ｅｐｏｘｙｍｅｘｒｅｎｏｎｅ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がプレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、ジメチルエステル、（７α，１１α，１７β）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記アルドステロン受容体拮抗薬が３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β，７β，１１α，１７β）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がプレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−（１−メチルエチル）エステル、一カリウム塩、（７α，１１α，１７β）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がプレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、７−メチルエステル、一カリウム塩、（７α，１１α，１７β）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
前記アルドステロン受容体拮抗薬が３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−１，４，６−トリエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β，７β，１１α）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルドステロン受容体拮抗薬が３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、メチルエステル、（６β，７β，１１α，１７β）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルドステロン受容体拮抗薬が３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、一カリウム塩、（６β，７β，１１α，１７β）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルドステロン受容体拮抗薬が３’Ｈ−シクロプロパ［６，７］プレグナ−４，６−ジエン−２１−カルボン酸、９，１１−エポキシ−６，７−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、（６β，７β，１１α，１７β）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２８】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がプレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、エチルエステル、（７α，１１α，１７β）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２９】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がプレグン−４−エン−７，２１−ジカルボン酸、９，１１−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−、γ−ラクトン、エチルエステル、（７α，１１α，１７β）−である、請求項１１に記載の方法。
【請求項３０】
前記アルドステロン受容体拮抗薬がドロスピレノン（ｄｒｏｓｐｉｒｅｎｏｎｅ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項３１】
投与されるエポキシ−ステロイド性化合物の量が１日あたり約０．５ｍｇ〜約５００ｍｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３２】
投与されるエポキシ−ステロイド性化合物の治療有効量が１日あたり約０．５ｍｇ〜約１００ｍｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
投与されるエポキシ−ステロイド性化合物の治療有効量が１日あたり約１０ｍｇ〜約１００ｍｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３４】
投与されるエポキシ−ステロイド性化合物の治療有効量が１日あたり約０．５ｍｇ〜約２５ｍｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３５】
投与されるエポキシ−ステロイド性化合物の治療有効量が１日あたり約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇである、請求項１５に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルドステロン遮断薬が１１β−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３−オン  １７−スピロラクトン、又はその製剤的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記アルドステロン遮断薬がアルドステロン阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記アルドステロン阻害剤が、アロマターゼ阻害剤；１２−リポキシゲナーゼ阻害剤；Ｐ４５０１１β阻害剤；心房性ナトリウム利尿因子；２０−ライゼース（Ｌｙｓａｓｅ）阻害剤；ＰＫＣ阻害剤；ベンゾジアゼピン；カルシウム遮断薬；ジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤；カリウムイオノフォア；電子伝達遮断薬；及びエタノール、又はそれらの製剤的に許容される塩からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記アルドステロン阻害剤がジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤が、１，６−ビス−（シクロヘキシルオキシミノカルボニルアミノ）−ヘキサン、又はその製剤的に許容される塩である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記アルドステロン阻害剤がベンゾジアゼピン化合物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記ジアゼピン化合物がジアゼパム、又はその製剤的に許容される塩である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アルドステロン阻害剤がアロマターゼ阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記アロマターゼ阻害剤が、ファドロゾール（ｆａｄｒｏｚｏｌｅ）、又はその製剤的に許容される塩である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記アルドステロン阻害剤がリポキシゲナーゼ阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
前記リポキシゲナーゼ阻害剤がフェニドン、又はその製剤的に許容される塩である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アルドステロン阻害剤がＰ４５０１１β阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｐ４５０１１β阻害剤が１８−ビニルプロゲステロン、又はその製剤的に許容される塩である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記アルドステロン遮断薬がアルドステロンシンターゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
被検者の炎症関連障害を予防するか又は治療するための方法であって、被検者の炎症の調節に直接的又は間接的に関与している１つ以上の発現産物の発現を変化させるのに十分な治療有効量のアルドステロン遮断薬でその被検者を治療することを含む、前記方法。
【請求項５１】
前記炎症関連障害が前記被検者の組織で起こる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記炎症関連障害が前記被検者の臓器で起こる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記臓器が心臓である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記臓器が脳である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記臓器が腎臓である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
１つ以上の前記発現産物の増加した発現が被検者の炎症の調節に直接的又は間接的に関与している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
１つ以上の前記発現産物の減少した発現が被検者の炎症の調節に直接的又は間接的に関与している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
２つ以上の前記発現産物が同時的に共発現される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
３つ以上の前記発現産物が連続的に共発現される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記発現産物が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＡＮＦ、ａｖβ３、Ｉｎｆ−γ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、スーパーオキシドフリーラジカル、ＴＸＡ２、ｂ−ＦＧＦ、ＣＤ４４、エンドセリン、アンジオテンシンＩＩ受容体、活性ｔ−ＰＡ、不活性ｔ−ＰＡ、ＰＡＩ−１、ＣＲＰ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、トロポニンＴ、ＨＳＰ６５、アミロイド、ホスホリパーゼＡ２、フィブリノーゲン、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、コラーゲン結合インテグリンα１β１、及びコラーゲン結合インテグリンα２β１からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記発現産物が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ＡＮＦ、ａｖβ３、Ｉｎｆ−γ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、スーパーオキシドフリーラジカル、ＴＸＡ２、ｂ−ＦＧＦ、ＣＤ４４、エンドセリン、アンジオテンシンＩＩ受容体、活性ｔ−ＰＡ、不活性ｔ−ＰＡ、及びＰＡＩ−１からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
前記発現産物がシクロオキシゲナーゼ−２を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
前記シクロオキシゲナーゼ−２が、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１からなる群から選択される１つ以上の発現産物とともに共発現される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記発現産物がオステオポンチンを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６５】
前記オステオポンチンが、シクロオキシゲナーゼ−２、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１からなる群から選択される１つ以上の発現産物とともに共発現される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記発現産物がＭＣＰ−１を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＭＣＰ−１が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１からなる群から選択される１つ以上の発現産物とともに共発現される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記発現産物がＩＣＡＭ−１を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＩＣＡＭ−１が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、及びＶＣＡＭ−１からなる群から選択される１つ以上の発現産物とともに共発現される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記発現産物がＶＣＡＭ−１を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＶＣＡＭ−１が、シクロオキシゲナーゼ−２、オステオポンチン、ＩＣＡＭ−１、及びＭＣＰ−１からなる群から選択される１つ以上の発現産物とともに共発現される、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、炎症関連障害、より特定すると、炎症関連心臓血管障害を予防するか又は治療する分野にある。より特別には、本発明は、アテローム硬化症を含む心臓血管障害を予防するか又は治療することにおけるアルドステロン遮断薬療法の使用に関する。
【０００２】
背景技術
プロスタグランジンは炎症プロセスに主要な役割を果たし、プロスタグランジン産生、特にＰＧＧ２、ＰＧＨ２、及びＰＧＥ２の産生の阻害は、抗炎症薬の探索の一般的な標的となってきた。しかしながら、プロスタグランジン誘導性疼痛と炎症プロセスに関連した腫脹を抑制する活性がある一般的な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）はまた、炎症プロセスに関連しない他のプロスタグランジン調節プロセスにも影響を及ぼす活性がある。従って、ほとんどの一般的なＮＳＡＩＤの高用量の使用は、生命を脅かす潰瘍を含め、重篤な副作用を引き起こす可能性があり、その治療潜在性を制限している。ＮＳＡＩＤへの代替手段はコルチコステロイドの使用であるが、これも、特に長期療法に関与する場合、重篤な副作用を引き起こす。
【０００３】
ＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素を含む、ヒトアラキドン酸／プロスタグランジン経路中の諸酵素を阻害することによってプロスタグランジンの産生を予防することが見出されている。炎症に関連した誘導酵素（「シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）」若しくは「プロスタグランジンＧ／ＨシンターゼＩＩ」と呼ばれる）の最近の発見は、炎症をより有効に抑制し、より少なくてより重大でない副作用を引き起こす、実行可能な阻害の標的を提供する。
【０００４】
最近、心臓血管系疾患における炎症の役割がより理解されつつある。Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３６， ９７３−９ （１９９７）） は、心臓血管系疾患における炎症の可能な役割を記載する。Ｊ． Ｂｏｙｌｅ （Ｊ． Ｐａｔｈ．， １８１， ９３−９ （１９９７）） は、斑破裂（ｐｌａｑｕｅ  ｒｕｐｔｕｒｅ）とアテローム硬化性炎症との関連を記載する。
【０００５】
シクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物は、米国特許第５，３８０，７３８、５，３４４，９９１、５，３９３，７９０、５，４３４，１７８、５，４７４，９９５、５，５１０，３６８号、及びＷＯ特許文書、ＷＯ９６／０６８４０、ＷＯ９６／０３３８８、ＷＯ９６／０３３８７、ＷＯ９６／１９４６９、ＷＯ９６／２５４０５、ＷＯ９５／１５３１６、ＷＯ９４／１５９３２、ＷＯ９４／２７９８０、ＷＯ９５／００５０１、ＷＯ９４／１３６３５，ＷＯ９４／２０４８０、及びＷＯ９４／２６７３１号に記載されている。
【０００６】
［ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミドは、シクロオキシゲナーゼ−２の阻害剤として記載され、炎症、関節炎、及び疼痛の治療に有望であり、前臨床及び臨床試験ではほとんど副作用がない。血管系疾患の炎症を治療するためのその使用が米国特許第５，４６６，８２３号に記載されている。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、炎症関連障害の予防若しくは治療へのアルドステロン遮断薬の使用へ向けられる。より特定すると、本発明は、炎症関連心臓血管系疾患の予防におけるアルドステロン遮断薬の使用に関する。
【０００８】
本発明は、心臓血管障害を予防するか又は治療するための方法をそれの必要な被検者に提供する。本発明は、治療有効量のアルドステロン遮断薬又はその誘導体又は製剤的に許容される塩で被検者を治療することを含む。
【０００９】
上記の方法は、限定されないが、心臓、腎臓、及び脳の炎症関連障害を含む、被検者の炎症関連障害、特に血管炎症関連障害を予防するか又は治療するのに、限定されないが、有用であろう。本方法は、冠状動脈疾患、動脈瘤、動脈硬化症、心臓移植アテローム性硬化症を含むアテローム性硬化症、心筋梗塞、塞栓症、卒中、静脈性血栓症を含む血栓症、不安定狭心症を含む狭心症、（血管石灰化及び弁石灰化のような）石灰化、川崎病、及び（冠状斑炎症、クラミジア誘導性炎症を含む細菌誘導性炎症、及びウイルス誘導性炎症のような）炎症の予防若しくは治療に有用であろう。本方法は、炎症を直接的又は間接的に調節する１つ以上の発現産物の発現を変化させることによって病態を治療するか又は予防するのに有用である。炎症関連の心臓血管障害は、増加若しくは減少した発現を受ける可能性がある、１つ以上の発現産物により全体的又は部分的に仲介され得る。前記発現産物には、限定されないが、一緒か又は単独で作用してある効果を直接的又は間接的にもたらす、有機分子、タンパク質、ＤＮＡベース若しくはＲＮＡベースの分子、及びそのような産物のネットワーク若しくは集合体が含まれ得る。前記発現産物の発現のパターンにおける諸変化は連続的又は同時的に起こる場合があり、２つ以上の発現産物が関与する。これらの発現産物は、他の分子又は発現産物により誘導される病理学的効果を誘導するか又は増幅し、被検者の組織若しくは臓器に直接的若しくは間接的な効果を及ぼす場合がある。これらの発現産物は、好（ｐｒｏ−）炎症若しくは抗炎症性の発現産物としてのその機能にそれぞれ依存して、増加した発現又は減少した発現により好炎症効果をもたらす場合がある。
【００１０】
本方法は、シクロオキシゲナーゼ−２及びオステオポンチンを含む、影響される組織に見出される好炎症成分のアップレギュレーションを緩和することによって病気を治療するか又は予防するのに特に有用である。
【００１１】
上記の方法では、心臓血管障害には、限定されないが、炎症成分を有することが知られている障害とアルドステロンにより仲介され得るものが含まれる。上記の方法には、シクロオキシゲナーゼ−２又はオステオポンチンのアップレギュレートされた発現の緩和を必要とする、アルドステロン遮断薬での患者の治療も含まれる。限定されないが、腎臓、心臓、膵臓、及び脳を含む組織では、シクロオキシゲナーゼ−２のアイソフォームが誘導され、この好炎症性酵素のアップレギュレートされた発現をもたらす場合があり、これが軽度〜重篤な組織及び臓器の損傷を引き起こし得る。上記の方法では、アルドステロン遮断薬の投与がアップレギュレートされたシクロオキシゲナーゼ−２の発現を緩和するために使用される。上記の方法は、好炎症性タンパク質のオステオポンチンのアップレギュレートされた発現が誘導され、軽症〜重篤な組織及び臓器の損傷をもたらし得る、限定されないが、腎臓、心臓、及び脳を含む組織において起こり得る病態を予防するか又は治療するのにも有用であろう。上記の方法では、アルドステロン遮断薬の投与がアップレギュレートされたオステオポンチンの発現を緩和するために使用される。
【００１２】
もう１つの態様では、本発明は、好炎症性発現産物のＭＣＰ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＶＣＡＭ−１、及びＩＣＡＭ−１のいずれか１つのアップレギュレートされた発現が起こり、軽症〜重篤な組織及び臓器の損傷をもたらし得る、限定されないが、腎臓、心臓、及び脳を含む組織及び臓器の病態を予防するか又は治療するのに有用であろう。上記の方法では、アルドステロン遮断薬の投与がＭＣＰ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＶＣＡＭ−１、及びＩＣＡＭ−１のいずれか１つのアップレギュレートされた発現を緩和するために使用される。
【００１３】
アルドステロン遮断薬での治療により炎症関連心臓血管系疾患を抑えるためにその発現が緩和され得る、発現産物の非限定的な例は図３４に示され、以下の１つ以上のアップレギュレーションが含まれる：
（ａ）アンジオテンシンＩＩ及びエンドセリンの受容体；
（ｂ）ａｖβ３（接着、増殖、遊走）及びＣＤ４４（遊走）のような単球活性化分子；
（ｃ）インターフェロン−γ（Ｉｎｆ−γ）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子−ａ（ＴＮＦ−ａ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、及びフラクタルカイン（ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ）のような血管炎症のメディエーター；
（ｄ）組織損傷性スーパーオキシドラジカルを産生するＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨオキシダーゼ；及び
（ｅ）活性組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の減少を引き起こす、好血栓性プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）。
【００１４】
本発明のもう１つの態様では、アルドステロン遮断薬での治療により炎症関連心臓血管系疾患を抑えるためにその発現が緩和され得る、発現産物の非限定的な例に以下の１つ以上が含まれる：
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のような急性期反応体、
インターロイキン−６（ＩＬ−６）のような多機能サイトカイン、
可溶性細胞内接着分子−１（ｓＩＣＡＭ−１）である、ＩＬ−１２、
トロポニンＴ若しくはＩ、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、
アミロイド、ホスホリパーゼＡ２、フィブリノーゲン、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達経路、
及び、コラーゲン結合性インテグリンａ１β１（間葉細胞）及びａ２β１（上皮細胞）のような吸着メディエーター。
【００１５】
投与量と治療方式
投与されるアルドステロン遮断薬の量と本発明の方法の投与方式は、被検者の年齢、体重、性別、及び医学的状態、病理効果の重症度、投与の経路及び頻度、利用される特定のアルドステロン遮断薬を含む、多種多様な要因に依存し、従って、多様に変化し得る。被検者へ投与される１日用量は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．００５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重、なおより好ましくは約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、そして最も好ましくは約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重が適正であり得る。ヒト被検者へ投与されるアルドステロン拮抗薬の量は、典型的には、約０．１〜約２００ｍｇの範囲に及ぶ。本発明の１つの態様では、投与量範囲が約０．５〜約５００ｍｇである。本発明のもう１つの態様では、投与量範囲が約０．７５〜約２５０ｍｇである。本発明のさらなる態様では、投与量範囲が約１〜約１００ｍｇである。本発明のもう１つの態様では、投与量範囲が約１０〜約１００ｍｇである。本発明のさらなる態様では、投与量範囲が約２５〜約１００ｍｇである。本発明のもう１つの態様では、投与量範囲が約２５〜約７５ｍｇである。被検者に実質的な利尿及び／又は降圧効果をもたらさないアルドステロン遮断薬の１日用量は、特別に本発明に含まれる。１日用量は１日１〜４回の用量で投与され得る。
【００１６】
アルドステロン遮断薬の投薬は、血圧又は（ナトリウム利尿ペプチド、エンドセリン、及び、以下に論じる他の代替マーカーのような）適正な代替マーカーの測定に基づいて決定され、調整され得る。アルドステロン遮断薬の投与後の血圧及び／又は代替マーカーのレベルをアルドステロン遮断薬の投与に先立つ対応のベースラインレベルと比較し、本発明の効能を決定し、必要に応じて滴定し得る。本方法に有用な代替マーカーの非限定的な例は、腎臓及び心臓血管系の疾患の代替マーカーである。
【００１７】
予防投薬
前記炎症関連心臓血管障害の診断に先立ってアルドステロン遮断薬を予防的に投与し、被検者が炎症関連心臓血管障害に罹患しやすい期間の間アルドステロン遮断薬の投与を継続することは有益である。従って、著明な臨床症状はないが、それでも病理効果を受けやすい個人は、アルドステロン遮断化合物の予防用量で処置され得る。そのようなアルドステロン遮断薬の予防用量は、注目される特定の病理効果を治療するために使用される用量より低くてよいが、低くする必要があるわけではない。
【００１８】
心臓血管系病理への投薬
心臓血管機能の病理を治療するための投薬は、ナトリウム利尿ペプチドの血中濃度の測定に基づいて決定され、調整され得る。ナトリウム利尿ペプチドは、心臓血管、腎臓、及び内分泌系のホメオスタシスにおいて多様な作用を有する、構造的に類似しているが遺伝的には異なるペプチドの群である。心房性ナトリウム利尿ペプチド（「ＡＮＰ」）と脳ナトリウム利尿ペプチド（「ＢＮＰ」）は心筋細胞起源のものであり、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（「ＣＮＰ」）は、内皮起源のものである。ＡＮＰとＢＮＰはナトリウム利尿ペプチド−Ａ受容体（「ＮＰＲ−Ａ」）へ結合し、３’，５’−サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を介して、ナトリウム排泄増加、血管拡張、レニン阻害、抗有糸分裂、及びルシトロピック（ｌｕｓｉｔｒｏｐｉｃ）特性に仲介する。一般に、血中ナトリウム利尿ペプチドレベル、特に血中ＢＮＰレベルの上昇は、血液量の増大と急性心筋梗塞のような血管損傷後の病態の下にある被検者で観察され、梗塞後の延長された期間の間上昇したままである（Ｕｕｓｉｍａａ ｅｔ ａｌ．： Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ １９９９； ６９： ５−１４）。
【００１９】
アルドステロン遮断薬の投与に先立って測定されたベースラインレベルに比較したナトリウム利尿レベルの減少は、アルドステロンの病理効果の減少を明示し、故に、病理効果の阻害との相関性が提供される。
【００２０】
従って、所望されるナトリウム利尿ペプチドレベルの血中レベルを、アルドステロン遮断薬の投与に先立つ対応のベースラインレベルに対して比較し、病理効果を治療することにおける本発明の効能を決定することができる。そのようなナトリウム利尿ペプチドレベルの測定値に基づいて、アルドステロン遮断薬の投薬を調整して、心臓血管系の病理効果を抑制することができる。
【００２１】
同様に、心臓の病理はまた、循環及び尿のｃＧＭＰレベルに基づいて同定され、適正な投薬を決定し得る。血漿ｃＧＭＰレベルの増加は、平均動脈圧の低下に匹敵する。ｃＧＭＰの尿排泄の増加はナトリウム排泄増加に相関する。
【００２２】
心臓の病理はまた、駆出率の低下、又は、心筋梗塞又は心不全又は左心室肥大の存在によって同定され得る。左心室肥大は心エコー図又は磁気共鳴造影により同定され、治療の進展と投薬の適正性をモニターするために使用され得る。
【００２３】
故に、本発明のもう１つの態様では、本発明の方法は、ナトリウム利尿ペプチドレベル、特にＢＮＰレベルを低下させ、それにより関連した心臓血管系の病理を治療することにも使用され得る。
【００２４】
腎臓病理への投薬
腎機能の病理を治療するための投薬は、タンパク尿症、微小アルブミン尿症、減少した糸球体濾過量（ＧＦＲ）、又は減少したクレアチニンクリアランスの測定に基づいて決定され、調整され得る。タンパク尿症は、２４時間採取尿中の０．３ｇより多い尿タンパク質の存在により同定される。微小アルブミン尿症は、イムノアッセイ可能な尿アルブミンの増加により同定される。そのような測定に基づいて、アルドステロン遮断薬の投薬を調整して、腎臓の病理効果を抑制することができる。
【００２５】
神経障害の病理への投薬
神経障害、特に末梢神経障害は、感覚欠損又は運動感覚能力の神経学的検査により同定され、それに基づいて投薬を調整し得る。
【００２６】
網膜障害の病理への投薬
網膜障害は、眼科検査により同定され、それに基づいて投薬を調整し得る。
炎症マーカー
ある種のマーカーは、炎症又はプレ炎症状態の存在を示すか又はその原因になり得る。これらマーカーの測定は、投与されるアルドステロン遮断薬の適正投与量の決定、又は投与後にアルドステロン遮断薬の有効量を決定することに有用であり得る。そのようなマーカーの非限定的な例は：オステオポンチン；Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノーゲン、ＶＩＩＩ因子、血清銅（運搬タンパク質、セルロプラスミン）、血清鉄（運搬タンパク質、フェリチン）、プラスミンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）、及びリポタンパク質（ａ）のような急性期反応体；ナトリウム利尿ペプチド；エンドセリン；ＶＣＡＭ−１；ＩＣＡＭ−１；ＩＬ−１β；ＴＮＦ−α；ＩＬ−６；ＣＯＸ−２；フラクタルカイン；ＭＣＰ−１；及びトリグリセリドである。
【００２７】
組合せ療法
本発明の方法は、アルドステロン遮断薬の投与と組合せた他の有効成分若しくは治療薬の投与を含む場合がある。
【００２８】
例えば、本方法で利用されるアルドステロン遮断薬は、高血圧と心臓血管及び腎臓の病態及び障害の治療に使用される他の活性薬と組合せて被検者へ投与され得る。アルドステロン遮断薬と一緒に投与される活性薬には、例えば、レニン阻害剤、アンジオテンシンＩＩ拮抗薬、ＡＣＥ阻害剤、実質的なアルドステロン遮断効果を有さない利尿剤、及びレチノール酸からなる群から選択される薬物が含まれる。「組合せ療法」（又は「同時療法」）という語句は、薬物の組合せに関して使用される場合、薬物の組合せの有益な効果を提供する処方において連続的なやり方で各薬剤を投与することを含むことを意味し、並びに、実質的に同時のやり方でこれら薬剤を同時投与すること（例えば、一定比のこれら活性薬剤を有する単一のカプセル剤若しくは注射剤、又は各薬剤についての多数の個別カプセル剤若しくは注射剤において）を含むことも意味する。
【００２９】
「アンジオテンシンＩＩ拮抗薬」という語句には、例えば、ＷＯ９６／４０２５７に記載のアンジオテンシンＩＩ拮抗薬が含まれる。
「アンジオテンシン変換酵素阻害剤（「ＡＣＥ阻害剤」）という語句には、デカペプチド形態のアンジオテンシン（「アンジオテンシンＩ」）の、血管収縮性オクタペプチド形態のアンジオテンシン（「アンジオテンシンＩＩ」）への酵素的変換を一部又は完全に遮断する能力を有する薬剤若しくは化合物、又は２つ以上の薬剤若しくは化合物の組合せが含まれる。アンジオテンシンＩＩの形成を遮断することは、アンジオテンシンＩＩの主作用を取り除くことによって、体液及び電解質バランス、血圧、及び血液量の調節に影響を及ぼし得る。このようなアンジオテンシンＩＩの主作用には、副腎皮質によるアルドステロン受容体の合成及び分泌の刺激と細動脈の平滑筋の直接収縮による血圧の上昇が含まれる。
【００３０】
組合せ療法に使用され得るＡＣＥ阻害剤の例には、限定されないが、以下の化合物が含まれる：ＡＢ−１０３、アンコベニン、ベナゼプリラット、ＢＲＬ−３６３７８、ＢＷ−Ａ５７５Ｃ、ＣＧＳ−１３９２８Ｃ、ＣＬ−２４２８１７、ＣＶ−５９７５、エクアテン（Ｅｑｕａｔｅｎ）、ＥＵ−４８６５、ＥＵ−４８６７、ＥＵ−５４７６、フォロキシミチン（ｆｏｒｏｘｙｍｉｔｈｉｎｅ）、ＦＰＬ  ６６５６４、ＦＲ−９００４５６、Ｈｏｅ−０６５、Ｉ５Ｂ２、インドラプリル、ケトメチル尿素、ＫＲＩ−１１７７、ＫＲＩ−１２３０、Ｌ−６８１１７６、リベンザプリル、ＭＣＤ、ＭＤＬ−２７０８８、ＭＤＬ−２７４６７Ａ、モベルチプリル、ＭＳ−４１、ニコチアナミン、ペントプリル、フェナセチン、ピボプリル、レンチアプリル、ＲＧ−５９７５、ＲＧ−６１３４、ＲＧ−６０２７、ＲＧＨ−０３９９、ＲＯＯ−９１１、ＲＳ−１００８５−１９７、ＲＳ−２０３９、ＲＳ  ５１３９、ＲＳ  ８６１２７、ＲＵ−４４４０３、Ｓ−８３０８、ＳＡ−２９１、スピラプリラット、ＳＱ−２６９００、ＳＱ−２８０８４、ＳＱ−２８３７０、ＳＱ−２８９４０、ＳＱ−３１４４０、シネコール（Ｓｙｎｅｃｏｒ）、ウチバプリル、ＷＦ−１０１２９、Ｗｙ−４４２２１、Ｗｙ−４４６５５、Ｙ−２３７８５、Ｙｉｓｓｕｍ  Ｐ−０１５４、ザビシプリル、旭醸造  ＡＢ−４７、アラトリオプリル、ＢＭＳ  １８２６５７、旭化成  Ｃ−１１１、旭化成  Ｃ−１１２、大日本製薬  ＤＵ−１７７７、ミキサンプリル、プレンチル（Ｐｒｅｎｔｙｌ）、ゾフェノプリラット、１−（１−カルボキシ−６−（４−ピペリジニル）へキシル）アミノ−１−オキソプロピル  オクタヒドロ−１Ｈ−インドール−２−カルボン酸、バイオプロジェクト（Ｂｉｏｐｒｏｊｅｃｔ）ＢＰ１．１３７、Ｃｈｉｅｓｉ  ＣＨＦ  １５１４、ファイソンズ  ＦＰＬ−６６５６４、イドラプリル、マリオンメレルダウ  ＭＤＬ−１００２４０、ペリンドプリラット及びセルヴィエＳ−５５９０、アラセプリル、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラット、フォシノプリル、フォシノプリラット、イミダプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、酢酸サララシン、テモカプリル、トランドラプリル、セラナプリル、モエキシプリル、キナプリラット、及びスピラプリル。
【００３１】
特に関心があるＡＣＥ阻害剤の群は、アラセプリル、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラット、フォシノプリル、フォシノプリラット、イミダプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、酢酸サララシン、テモカプリル、トランドラプリル、セラナプリル、モエキシプリル、キナプリラット、及びスピラプリルからなる。
【００３２】
これらＡＣＥ阻害剤の多くが市販されている。例えば、きわめて好ましいＡＣＥ阻害剤であるカプトプリルは、現在ブリストル・マイヤーズ＝スクイブの一部であるＥ．Ｒ．スクイブ・アンド・サンズ社（プリンストン、Ｎ．Ｊ．）により、「ＣＡＰＯＴＥＮ（カポテン）」の商標で、１錠あたり１２．５ｍｇ、５０ｍｇ、及び２００ｍｇの用量の錠剤で販売されている。エナラプリル若しくはマレイン酸エナラプリルとリシノプリルは、メルク社（ウェストポイント、Ｐａ）により販売されている、２つのよりきわめて好ましいＡＣＥ阻害剤である。エナラプリルは、「ＶＡＳＯＴＥＣ（バソテック）」の商標で、１錠あたり２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、及び２０ｍｇの用量の錠剤で販売されている。リシノプリルは、「ＰＲＩＮＩＶＩＬ（プリニビル）」の商標で、１錠あたり５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、及び４０ｍｇの用量の錠剤で販売されている。
【００３３】
利尿剤は、チアジド及び関連スルホンアミド、カリウム節約性利尿剤、ループ利尿剤、及び有機水銀利尿剤のようないくつかの既知クラスから選択され得る。チアジドの非限定的な例は、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、シクロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチルクロチアジド、ポリチアジド、及びトリクロルメチアジドである。チアジドに関連したスルホンアミドの非限定的な例は、クロルサリドン、キネサゾン、及びメトラゾンである。カリウム節約性利尿剤の非限定的な例は、トリアメテレンとアミロリドである。ループ利尿剤（即ち、腎臓のヘンレループの上行脚で作用する利尿剤）の非限定的な例は、フロセミドとエチンアクリル酸である。有機水銀利尿剤の非限定的な例は、メルカプトメリンナトリウム、メレトキシリン、プロカイン、及びメルサリル＋テオフィリンである。
【００３４】
１つの態様では、組合せ療法は、ＡＣＥ阻害剤、アルドステロン受容体拮抗薬であるエポキシ−ステロイド性化合物、及び実質的なアルドステロン拮抗活性を有さないループ利尿剤をヒト被検者へ投与することを含む。
【００３５】
そのような組合せ療法は、例えば、哺乳動物の被検者における炎症関連心臓血管障害を予防するか又は治療するのに有用であろう。実質的なアルドステロン拮抗活性を有さない利尿剤も、ＡＣＥ阻害剤及びエポキシ−ステロイド性化合物と一緒に使用され得る。
【００３６】
他のやり方では、組合せ療法は、炎症関連心臓血管障害を治療するか又は予防するために、治療有効量のＡＣＥ阻害剤、治療有効量のエポキシ−ステロイド性化合物、治療有効量の（実質的なアルドステロン拮抗活性を有さない）ループ利尿剤、及び、治療有効量のジゴキシンをヒト被検者へ投与することを含み得る。
【００３７】
心臓血管障害の予防に使用される、アラキドン酸代謝におけるシクロオキシゲナーゼ経路の阻害剤は、様々な機序により酵素活性を阻害し得る。例を挙げると、本明細書に記載の方法に使用される阻害剤は、その酵素活性の発現を阻害し得る。アルドステロン遮断薬を使用して、炎症性損傷の部位でシクロオキシゲナーゼ−２の発現を遮断することがきわめて有利であるのは、特に長期の予防処置が期待される場合、非選択的ＮＳＡＩＤで生じる胃の副作用がそれにより最少化されるからである。
【００３８】
一般に、本発明の方法で使用されるアルドステロン受容体拮抗薬は、スピロラクトン型のステロイド性化合物である。「スピロラクトン型」という用語は、典型的にはステロイド「Ｄ」環でスピロ結合配置を介してステロイド核へ付いた、ラクトン部分を含んでなる構造を特徴づけることを意味する。スピロラクトン型アルドステロン拮抗化合物のサブクラスは、エプレレノンのようなエポキシ−ステロイド性アルドステロン拮抗化合物からなる。もう１つのスピロラクトン型拮抗化合物のサブクラスは、スピロノラクトンのような、非エポキシステロイド性アルドステロン拮抗化合物からなる。
【００３９】
一般に、本発明の方法に使用されるエポキシ−ステロイド性アルドステロン拮抗化合物は、エポキシ型部分で置換されたステロイド核を有する。「エポキシ型」部分という用語には、２つの炭素原子間のブリッジとして酸素原子を有することで特徴づけられる任意の部分が含まれ、その例には以下の部分が含まれる：
【００４０】
【化１】
2004518611.tif 000003
「エポキシ−ステロイド性」の語句に使用される「ステロイド性」という用語は、慣用的な「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、及び「Ｄ」環を有する、シクロペンテノ−フェナントレン部分により提供される核を意味する。エポキシ型部分は、付加可能か又は置換可能な位置でこのシクロペンテノフェナントレン核へ付く、即ち、ステロイド核の環の１つへ縮合することが可能であるか、又はこの部分は、この環系の環メンバー上で置換され得る。「エポキシ−ステロイド性」という語句には、それに付いた１つ又は複数のエポキシ型部分を有するステロイド核が含まれる。
【００４１】
本発明での使用に適したエポキシ−ステロイド性アルドステロン拮抗薬には、ステロイド核の「Ｃ」環へ縮合したエポキシ部分を有する化合物のファミリーが含まれる。特に好ましいのは、９α，１１α−置換エポキシ部分の存在により特徴づけられる、２０−スピロキサン化合物である。以下の表１の化合物１〜１１は、本発明で使用され得る例示的な９α，１１α−エポキシステロイド性化合物である。これらエポキシステロイドは、Ｇｒｏｂ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，５５９，３３２号に記載の方法により製造され得る。９，１１−エポキシステロイド性化合物とその塩の追加の製造方法は、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９７／２１７２０と Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／２５９４８に開示されている。
【００４２】
【表１】
2004518611.tif 000004
【００４３】
【表２】
2004518611.tif 000005
【００４４】
【表３】
2004518611.tif 000006
【００４５】
【表４】
2004518611.tif 000007
特に興味深いのは、上記に示される化合物１である、エプレレノン（エポキシメクスレノンとしても知られている）化合物である。エプレレノンは、アルドステロン受容体拮抗薬であり、例えばスピロノラクトンよりアルドステロン受容体に対して高い特異性を有する。本方法で、アルドステロン拮抗薬としてエプレレノンを選択することは、より少ない特異性を有するアルドステロン拮抗薬の使用で起こる、女性化乳房のようなある種の副作用を抑えるのに有益であろう。
【００４６】
本発明での使用に適した非エポキシステロイド性アルドステロン拮抗薬には、式ＩＩＩ：
【００４７】
【化２】
2004518611.tif 000008
（ここで、
【００４８】
【化３】
2004518611.tif 000009
は、
【００４９】
【化４】
2004518611.tif 000010
であり、ここでＲは５個までの炭素原子の低級アルキルであって、ここで、
【００５０】
【化５】
2004518611.tif 000011
は、
【００５１】
【化６】
2004518611.tif 000012
である）により定義されるスピロラクトン型化合物のファミリーが含まれる。
【００５２】
低級アルキル残基には、分岐及び非分岐の基、好ましくはメチル、エチル、及びｎ−プロピルが含まれる。
式ＩＩＩの中で興味深い特定の化合物は、以下のものである：
７α−アセチルチオ−３−オキソ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
３−オキソ−７α−プロピオニルチオ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
６β，７β−メチレン−３−オキソ−４，１５−アンドロスタジエン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
１５α，１６α−メチレン−３−オキソ−４，７α−プロピオニルチオ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
６β，７β，１５α，１６α−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
７α−アセチルチオ−１５β，１６β−メチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；
１５β，１６β−メチレン−３−オキソ−７β−プロピオニルチオ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン；及び、
６β，７β，１５β，１６β−ジメチレン−３−オキソ−４−アンドロステン−［１７（β−１’）−スピロ−５’］ペルヒドロフラン−２’−オン。
【００５３】
式ＩＩＩの化合物を製造する方法は、１９７８年１２月１２日に Ｗｉｅｃｈａｒｔ ｅｔ ａｌ． へ発行された、米国特許第４，１２９，５６４号に記載されている。
興味深い非エポキシステロイド性化合物のもう１つのファミリーは、式ＩＩＩ：
【００５４】
【化７】
2004518611.tif 000013
（式中、Ｒ１はＣ１−３アルキル若しくはＣ１−３アシルであり、Ｒ２はＨ若しくはＣ１−３アルキルである）により定義される。
【００５５】
式ＩＩＩの中で興味深い特定の化合物は以下のものである：
１α−アセチルチオ−１５β，１６β−メチレン−７α−メチルチオ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−２１，１７−カルボラクトン；及び
１５β，１６β−メチレン−１α，７α−ジメチルチオ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−２１，１７−カルボラクトン。
【００５６】
式ＩＩＩの化合物を製造する方法は、１９８８年１２月６日に Ｎｉｃｋｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ． へ発行された、米国特許第４，７８９，６６８号に記載されている。
興味深い非エポキシステロイド性化合物のさらにもう１つのファミリーは、式ＩＶ：
【００５７】
【化８】
2004518611.tif 000014
（式中、Ｒは低級アルキルであるが、好ましい低級アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、及びブチルである）により定義される。
【００５８】
興味深い特定の化合物には：
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５，１５−ジエン−１７−カルボン酸  γ−ラクトン；
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグナ−５，１５−ジエン−１７−カルボン酸  γ−ラクトン  ３−アセテート；
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグン−５−エン−１７−カルボン酸  γ−ラクトン；
３β，２１−ジヒドロキシ−１７α−プレグン−５−エン−１７−カルボン酸  γ−ラクトン  ３−アセテート；
２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−１７−カルボン酸  γ−ラクトン；
２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４，６−ジエン−１７−カルボン酸  γ−ラクトン；
２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−１，４−ジエン−１７−カルボン酸  γ−ラクトン；
７α−アシルチオ−２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−１７−カルボン酸  γ−ラクトン；及び
７α−アセチルチオ−２１−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−１７−カルボン酸  γ−ラクトンが含まれる。
【００５９】
式ＩＶの化合物を製造する方法は、１９６６年６月２１日に Ｐａｔｃｈｅｔｔ へ発行された、米国特許第３，２５７，３９０号に記載されている。
興味深い非エポキシステロイド性化合物のさらにもう１つのファミリーは、式Ｖ：
【００６０】
【化９】
2004518611.tif 000015
｛式中、Ｅ’は、エチレン、ビニレン、及び（低級アルカノイル）チオエチレン基からなる群から選択され、Ｅ’’は、エチレン、ビニレン、（低級アルカノイル）チオエチレン、及び（低級アルカノイル）チオプロピレン基からなる群から選択され；Ｒはメチル基であるが、但し、Ｅ’とＥ’’が、それぞれエチレンと（低級アルカノイル）チオエチレン基であるとき、その場合、Ｒは、水素及びメチル基からなる群から選択され；そしてＥ’及びＥ’’の選択は、少なくとも１つの（低級アルカノイル）チオ基が存在するようにする｝により表される。
【００６１】
式ＩＶ中の非エポキシステロイド性化合物の好ましいファミリーは、式ＶＩ：
【００６２】
【化１０】
2004518611.tif 000016
により表される。
【００６３】
より好ましい式ＶＩの化合物は：
１−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３−オン  ラクトンである。
【００６４】
式ＩＶ中の非エポキシステロイド性化合物のもう１つの好ましいファミリーは、式ＶＩＩ：
【００６５】
【化１１】
2004518611.tif 000017
により表される。
【００６６】
式ＶＩＩ中のより好ましい化合物には以下のものが含まれる：
７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３−オン  ラクトン；
７β−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３−オン  ラクトン；
１α，７α−ジアセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４，６−ジエン−３−オン  ラクトン；
７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−アンドロスタ−１，４−ジエン−３−オン  ラクトン；
７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−１９−ノルアンドロスタ−４−エン−３−オン  ラクトン；及び
７α−アセチルチオ−１７α−（２−カルボキシエチル）−１７β−ヒドロキシ−６α−メチルアンドロスタ−４−エン−３−オン  ラクトン。
【００６７】
式ＩＶ〜ＶＩでは、「アルキル」という用語には、１〜約８の炭素を含有する、直鎖及び分岐鎖のアルキル基が含まれる。「（低級アルカノイル）チオ」という用語には、式：低級アルキル−ＣＯ−Ｓの基が含まれる。
【００６８】
特に興味深いのは、以下の構造：
【００６９】
【化１２】
2004518611.tif 000018
と公式名：「スピロノラクトン」：１７−ヒドロキシ−７α−メルカプト−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−２１−カルボン酸  γ−ラクトン  アセテートを有する、スピロノラクトン化合物である。
【００７０】
式Ｖ〜ＶＩＩの化合物を製造する方法は、１９６１年１２月１２日に発行された、Ｃｅｌｌａ ｅｔ ａｌ． への米国特許第３，０１３，０１２号に記載されている。スピロノラクトンは、Ｇ．Ｄ．サール社（スコーキー、イリノイ）により「ＡＬＤＡＣＴＯＮＥ（アルダクトン）」の商標で、１錠あたり２５ｍｇ、５０ｍｇ、及び１００ｍｇの用量の錠剤で販売されている。
【００７１】
本発明で考慮されるもう１つのステロイド性アルドステロン拮抗薬のファミリーは、ドロスピレノン：［６Ｒ−（６α，７α，８β，９α，１０β，１３β，１４α，１５α，１６α，１７β）］−１，３’，４’，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，２０，２１−ヘキサデカヒドロ−１０，１３−ジメチルスピロ［１７Ｈ−ジシクロプロパ［６，７：１５，１６］シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７，２’（５’Ｈ）−フラン］−３，５’（２Ｈ）ジオン、ＣＡＳ登録番号６７３９２−８７−４により代表される。ドロスピレノンを製造及び使用する方法は、特許ＧＢ１５５０５６８（１９７９）、優先ＤＥ２６５２７６１（１９７６）に記載されている。
【００７２】
定義
「治療」若しくは「治療する」という用語には、病理学的な心臓血管系の状態の進展を阻害するか又は逆転させる量のアルドステロン遮断薬を、その必要な人物へ投与することが含まれる。
【００７３】
「予防」若しくは「予防する」という用語には、個体において、臨床的に明らかな心臓血管障害の発症を完全に予防することか、又は前臨床的に明らかな段階の心臓血管障害の発症を予防することのいずれかが含まれる。これには、心臓血管障害を発症するリスクのある個体の予防的処置が含まれる。
【００７４】
「治療的に有効」という語句には、組み合わせて与えられ、有害な副作用を回避する一方で、障害重篤度及び発症頻度の改善の目標を達成する、２つの薬剤の量を適格にすることが含まれる。
【００７５】
治療の目的についての「被検者」という用語には、炎症障害に罹りやすいか又は罹っているヒト若しくは動物の被検者が含まれ、好ましくは、ヒト被検者である。被検者は、例えば、食事、細菌若しくはウイルスへの曝露、存在する共通マーカーを有すること、心臓血管障害への遺伝的素因があること、等によりリスク状態にあり得る。
【００７６】
「アルドステロン」という用語には、アルドステロンと、例えば、アルドステロン−１８−アセテート、アルドステロン−２０−アセテート、及びアルドステロン−２１−アセテートのようなアルドステロンエステルの両方が含まれる。
【００７７】
「アルドステロン遮断薬」という用語は、アルドステロンの生理学的効果を抑制するか又は阻害することが可能な化合物を意味する。アルドステロン遮断薬は、アルドステロン阻害剤、又はアルドステロン受容体拮抗薬であり得る。
【００７８】
本発明のアルドステロン遮断薬は、アルドステロン阻害剤、及びアルドステロン受容体拮抗薬の２つのカテゴリーへ概して分類される。
「アルドステロン阻害剤」という用語は、アルドステロンの合成若しくは活性を直接的又は間接的に抑制するか又は停止させる化合物を意味する。
【００７９】
「アルドステロン拮抗薬」及び「アルドステロン受容体拮抗薬」という用語は、アルドステロンそれ自身のその受容体部位での作用の競合阻害剤として、受容体仲介性のアルドステロン活性をモジュレートするように、アジュバントへ結合することが可能な化合物を意味する。
【００８０】
本発明の代表的なアルドステロン阻害剤には、限定されないが、Ｒ−７６７１３、Ｒ−８３８４２、ＣＧＳ−１６９４９Ａ（ファドロゾール）、ＣＧＳ−２０２６７（レトロゾール）、ＣＧＳ−２０２６７、アミノグルテサミド、ＣＧＳ−４７６４５、ＩＣＩ−Ｄ−１０３３、クロモン及びキサントンの誘導体、及びＹＭ−５１１のようなアロマターゼ阻害剤；ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＢＷ７５５ｃ、フェニドン、バイカライン、アミノグアニジン、ノルジヒドログアイアレチン（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ）酸（ＮＤＧＡ）、シンナミル−３，４−ジヒドロキシ−α−シアノシンナメート（ＣＤＣ）、パナキシノール、ピオグリタゾン、及びｍＲＮＡ切り離しリボザイムのようなリポキシゲナーゼ阻害剤；１８−ビニルプロゲステロン及び１８−エチニルプロゲステロンのようなＰ４５０１１β阻害剤、オレイン酸のような脂肪酸；１８−ビニルデオキシコルチコステロン、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、エトミデート、スピロノラクトン、及び２３−０５８６；ＡＮＰ、ＡＮＦ、及びＡＮＦフラグメントのような心房性ナトリウム利尿因子；ＹＭ−５５２０８及びＹＭ−５３７８９のような１７，２０ライゼース（Ｌｙｓａｓｅ）阻害剤；インドメタシン、メクロフェナメート、アミノグルテサミド、及びアスピリンのようなプロスタグランジン合成阻害剤；スフィンゴシン、レチナール、Ｈ−７、スタウロスポリン、及びトリフルオペラジンのようなＰＫＣ阻害剤；ジアゼパム及びミダゾラムのようなベンゾジアゼピン；アムロジピン及びミベフラジルのようなカルシウム遮断薬；ＲＨＣ−８０２６７［１，６−ビス−（シクロヘキシルオキシミノカルボニルアミノ）−ヘキサン］のようなジアシルグリセロールリパーゼ阻害剤；バリノマイシン及びクロマカリムのようなカリウムイオノフォア；アクチノマイシンＡ、シアニド、ロテノン、及びアミタールのような電子伝達遮断薬（代謝阻害剤）；ドーパミン（プロラクチン阻害ホルモン）、クロルブトール、１８−エチニル−１１−デオキシコルチコステロン（１８−ＥｔＤＯＣ）；及びエタノールが含まれる。
【００８１】
ある種の化合物、例えば、１１β−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−３−オン  １７−スピロラクトンは、アルドステロンシンターゼ阻害剤としてもアルドステロン受容体拮抗薬としても作用する。そのような化合物も本発明で考慮され、「アルドステロン遮断薬」の定義の中に含まれる。
【００８２】
さらに、アンジオテンシンＩＩ阻害剤とアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤もアルドステロンの合成を抑制すること知られている。アンジオテンシンＩＩ阻害剤には、Ｄｅｓ−ａｓｐ１−ｔｈｒ８−アンジオテンシンＩＩ（Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｔｈｒ）、Ｄｅｓ−ａｓｐ１−Ｉｌｅ８−アンジオテンシンＩＩ（Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｉｌｅ）、及びＤｅｓ−ａｓｐ１−ａｌａ８−アンジオテンシンＩＩ（Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｌ−Ｉｌｅ−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｌａ）のようなアンジオテンシンＩＩ類似体；及び、カンデサルタン；エプロサルタン；イブレサルタン；ロサルタン；テルミサルタン；及びバルサルタンのようなアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬が含まれる。
【００８３】
「好炎症」という用語は、体内で産生され、組織若しくは臓器において炎症応答を誘発、活性化、又は亢進させる分子を特徴づける。
「ヒドリド」という用語は、単一の水素原子（Ｈ）を意味する。このヒドリド基は、例えば、酸素原子へ付いてヒドロキシ基を形成し得るか、又は２つのヒドリド基は、炭素原子へ付いてメチレン（−ＣＨ２−）基を形成し得る。単独でか、又は「ハロアルキル」、「アルキルスルホニル」、「アルコキシアルキル」、及び「ヒドロキシアルキル」のような他の用語の中で使用される場合、「アルキル」という用語には、１〜約２０の炭素原子、又は、好ましくは１〜約１２の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖の基が含まれる。より好ましいアルキル基は、１〜約１０の炭素原子を有する「低級アルキル」基である。最も好ましいのは、１〜約６の炭素原子を有する低級アルキル基である。そのような基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル、等が含まれる。「アルケニル」という用語には、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し、２〜約２０の炭素原子、又は好ましくは２〜約１２の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖の基が含まれる。より好ましいアルケニル基は、２〜約６の炭素原子を有する「低級アルケニル」基である。アルケニル基の例には、エテニル、プロペニル、アリル、プロペニル、ブテニル、及び４−メチルブテニルが含まれる。「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、２〜約２０の炭素原子、又は好ましくは２〜約１２の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖の基を意味する。より好ましいアルキニル基は、２〜約１０の炭素原子を有する「低級アルキニル」基である。最も好ましいのは、２〜約６の炭素原子を有する低級アルキニル基である。そのような基の例には、プロパルジル、ブチニル、等が含まれる。「アルケニル」、「低級アルケニル」という用語には、「シス（ｃｉｓ）」及び「トランス（ｔｒａｎｓ）」配向、又は他の言い方では、「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有する基が含まれる。「シクロアルキル」という用語には、３〜１２の炭素原子を有する飽和炭素環式基が含まれる。より好ましいシクロアルキル基は、３〜約８の炭素原子を有する「低級シクロアルキル」基である。そのような基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが含まれる。「シクロアルケニル」という用語には、３〜１２の炭素原子を有する部分的に不飽和な炭素環式基が含まれる。より好ましいシクロアルケニル基は、４〜約８の炭素原子を有する「低級シクロアルケニル」基である。そのような基の例には、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、及びシクロヘキセニルが含まれる。「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素のようなハロゲンを意味する。「ハロアルキル」という用語には、アルキル炭素原子の任意の１つ以上が上記に定義されるようなハロで置換されている基が含まれる。特別に含まれるのは、モノハロアルキル、ジハロアルキル、及びポリハロアルキル基である。１例として、モノハロアルキル基は、その基の内部にヨード、ブロモ、クロロ、又はフルオロ原子のいずれか１つを有する場合がある。ジハロ及びポリハロアルキル基は、２つ以上の同じハロ原子か、又は異なるハロ基の組合せを有する場合がある。「低級ハロアルキル」には、１〜６の炭素原子を有する基が含まれる。ハロアルキル基の例には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル、及びジクロロプロピルが含まれる。「ヒドロキシアルキル」という用語には、１〜約１０の炭素原子を有し、そのいずれか１つが１つ以上のヒドロキシ基で置換され得る、直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基が含まれる。より好ましいヒドロキシアルキル基は、１〜６の炭素原子と１つ以上のヒドロキシ基を有する「低級ヒドロキシアルキル」基である。そのような基の例には、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル、及びヒドロキシヘキシルが含まれる。「アルコキシ」及び「アルキルオキシ」という用語には、１〜約１０の炭素原子のアルキル部分をそれぞれ有する、直鎖若しくは分岐鎖のオキシ含有基が含まれる。より好ましいアルコキシ基は、１〜６の炭素原子を有する「低級アルコキシ」基である。そのような基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、及びｔｅｒｔ−ブトキシが含まれる。「アルコキシアルキル」という用語には、アルキル基へ付いた、即ちモノアルコキシアルキル及びジアルコキシアルキルの基を形成する、１つ以上のアルコキシ基を有するアルキル基が含まれる。「アルコキシ」基は、さらに、フルオロ、クロロ、又はブロモのような１つ以上のハロ原子で置換され、ハロアルコキシ基を提供する場合がある。より好ましいハロアルコキシ基は、１〜６の炭素原子と１つ以上のハロ基を有する「低級ハロアルコキシ」基である。そのような基の例には、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、及びフルオロプロポキシが含まれる。「アリール」という用語は、単独で又は組合せて、１、２、又は３つの環を含有する炭素環式芳香族系を意味し、ここでそのような環は、付帯的なやり方で一緒に付くか、又は縮合され得る。「アリール」という用語には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダン、及びビフェニルのような芳香族基が含まれる。アリール部分はまた、置換可能な位置で、アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アルコキシ、アラルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、ハロ、ニトロ、アルキルアミノ、アシル、シアノ、カルボキシ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、及びアラルコキシカルボニルから独立して選択される１つ以上の置換基で置換され得る。「ヘテロシクリル」という用語には、飽和、部分不飽和、及び不飽和のヘテロ原子含有環状基が含まれ、ここでヘテロ原子は、窒素、イオウ、及び酸素から選択され得る。飽和へテロシクリル基の例には、１〜４の窒素原子を含有する、飽和した３〜６員のへテロ単環式基（例、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジノ、ピペラジニル、等）；１〜２の酸素原子と１〜３の窒素原子を含有する、飽和した３〜６員のへテロ単環式基（例、モルホリニル、等）；１〜２のイオウ原子と１〜３の窒素原子を含有する、飽和した３〜６員のへテロ単環式基（例、チアゾリジニル、等）が含まれる。部分不飽和へテロシクリル基の例には、ジヒドロチオフェン、ジヒドロピラン、ジヒドロフラン、及びジヒドロチアゾールが含まれる。「ヘテロアリール」という用語には、不飽和へテロシクリル基が含まれる。「ヘテロアリール」基とも呼ばれる、不飽和へテロシクリル基の例には、１〜４の窒素原子を含有する、不飽和の３〜６員のへテロ単環式基、例えば、ピロリル、ピロリニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル（例、４Ｈ−１，２，４−トリアゾリル、１Ｈ−１，２，３−トリアゾリル、２Ｈ−１，２，３−トリアゾリル、等）、テトラゾリル（例、１Ｈ−テトラゾリル、２Ｈ−テトラゾリル、等）、等；１〜５の窒素原子を含有する、不飽和の縮合へテロシクリル基、例えば、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、テトラゾロピリダジニル（例、テトラゾロ［１，５−ｂ］ピリダジニル、等）、等；１つの酸素原子を含有する、不飽和の３〜６員のへテロ単環式基、例えば、ピラニル、フリル、等；１つのイオウ原子を含有する、不飽和の３〜６員のへテロ単環式基、例えば、チエニル、等；１〜２の酸素原子と１〜３の窒素原子を含有する、不飽和の３〜６員のへテロ単環式基、例えば、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、等）、等；１〜２の酸素原子と１〜３の窒素原子を含有する、不飽和の縮合へテロシクリル基（例、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、等）；１〜２のイオウ原子と１〜３の窒素原子を含有する、不飽和の３〜６員のへテロ単環式基、例えば、チアゾリル、チアジアゾリル（例、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、等）、等；１〜２のイオウ原子と１〜３の窒素原子を含有する、不飽和の縮合へテロシクリル基（例、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、等）、等が含まれる。この用語にはまた、へテロシクリル基がアリール基と縮合している基が含まれる。そのような縮合した二環式基の例には、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、等が含まれる。前記「へテロシクリル基」は、アルキル、ヒドロキシル、ハロ、アルコキシ、オキソ、アミノ、及びアルキルアミノのような１〜３の置換基を有する場合がある。「アルキルチオ」という用語には、二価イオウ原子へ付いた、１〜約１０の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を含有する基が含まれる。より好ましいアルキルチオ基は、１〜６の炭素原子のアルキル基を有する「低級アルキルチオ」基である。そのような低級アルキルチオ基の例は、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、ブチルチオ、及びヘキシルチオである。「アルキルチオアルキル」という用語には、１〜約１０の炭素原子のアルキル基へ二価イオウ原子を介して付いたアルキルチオ基を含有する基が含まれる。より好ましいアルキルチオアルキル基は、１〜６の炭素原子のアルキル基を有する「低級アルキルチオアルキル」基である。そのような低級アルキルチオアルキル基の例には、メチルチオメチルが含まれる。「アルキルスルフィニル」という用語には、二価の−Ｓ（＝Ｏ）−基へ付いた、１〜１０の炭素原子の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を含有する基が含まれる。より好ましいアルキルスルフィニル基は、１〜６の炭素原子のアルキル基を有する「低級アルキルスルフィニル」基である。そのような低級アルキルスルフィニル基の例には、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ブチルスルフィニル、及びヘキシルスルフィニルが含まれる。「スルホニル」という用語は、単独でか又はアルキルスルホニルのような他の用語へ連結されて使用され、それぞれ二価の−ＳＯ２−基を意味する。「アルキルスルホニル」には、スルホニル基へ付いたアルキル基（ここでアルキルは上記のように定義される）が含まれる。より好ましいアルキルスルホニル基は、１〜６の炭素原子のアルキル基を有する「低級アルキルスルホニル」基である。そのような低級アルキルスルホニル基の例には、メチルスルホニル、エチルスルホニル、及びプロピルスルホニルが含まれる。「アルキルスルホニル」基は、フルオロ、クロロ、又はブロモのような１つ以上のハロ原子でさらに置換され、ハロアルキルスルホニル基を提供する場合がある。「スルファミル」、「アミノスルホニル」、及び「スルホンアミジル」は、ＮＨ２Ｏ２Ｓ−を意味する。「アシル」という用語は、有機酸からヒドロキシの除去後の残基により提供される基を意味する。そのようなアシル基の例には、アルカノイル及びアロイル基が含まれる。そのような低級アルカノイル基の例には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、トリフルオロアセチルが含まれる。「カルボニル」という用語は、単独で又は「アルコキシカルボニル」のような他の用語とともに使用され、−（Ｃ＝Ｏ）−を意味する。
【００８４】
「アロイル」という用語には、上記に定義されるようなカルボニル基の付いたアリール基が含まれる。アロイルの例には、ベンゾイル、ナフトイル、等が含まれ、前記アロイル中のアリールは、追加的に置換され得る。「カルボキシ」若しくは「カルボキシル」という用語は、単独でか又は「カルボキシアルキル」のように他の用語とともに使用され、−ＣＯ２Ｈを意味する。「カルボキシアルキル」という用語には、カルボキシ基で置換されたアルキル基が含まれる。より好ましいのは、上記に定義されるような低級アルキル基を含み、アルキル基でハロにより追加的に置換され得る、「低級カルボキシアルキル」である。そのような低級カルボキシアルキル基の例には、カルボキシメチル、カルボキシエチル、及びカルボキシプロピルが含まれる。「アルコキシカルボニル」という用語は、酸素原子を介してカルボニル基へ付いた、上記に定義されるようなアルコキシ基を含有する基を意味する。より好ましいのは、１〜６の炭素を有するアルキル部分の付いた「低級アルコキシカルボニル」基である。そのような低級アルコキシカルボニル（エステル）基の例には、置換若しくは未置換のメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、及びヘキシルオキシカルボニルが含まれる。「アルキルカルボニル」、「アリールカルボニル」、及び「アラルキルカルボニル」という用語には、カルボニル基へ付いた、上記に定義されるような、アルキル、アリール、及びアラルキル基を有する基が含まれる。そのような基の例には、置換若しくは未置換のメチルカルボニル、エチルカルボニル、フェニルカルボニル、及びベンジルカルボニルが含まれる。「アラルキル」という用語には、ベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチル、及びジフェニルエチルのようなアリール置換アルキル基が含まれる。前記アラルキル中のアリールは、ハロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、及びハロアルコキシで追加的に置換され得る。ベンジルとフェニルメチルという用語は、相互交換可能である。「ヘテロシクリルアルキル」という用語には、飽和及び部分不飽和の、ピロリジニルメチルのようなヘテロシクリル置換アルキル基と、ピリジルメチル、キノリルメチル、チエニルメチル、フリルエチル、及びキノリルエチルのようなヘテロアリール置換アルキル基が含まれる。前記ヘテロアラルキル中のヘテロアリールは、ハロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、及びハロアルコキシで追加的に置換され得る。「アラルコキシ」という用語には、酸素原子を介して他の基へ付いたアラルキル基が含まれる。「アラルコキシアルキル」という用語には、酸素原子を介してアルキル基へ付いたアラルコキシ基が含まれる。「アラルキルチオ」という用語には、イオウ原子へ付いたアラルキル基が含まれる。「アラルキルチオアルキル」という用語には、イオウ原子を介してアルキル基へ付いたアラルキルチオ基が含まれる。「アミノアルキル」という用語には、１つ以上のアミノ基で置換されたアルキル基が含まれる。より好ましいのは、「低級アミノアルキル」基である。そのような基の例には、アミノメチル、アミノエチル、等が含まれる。「アルキルアミノ」という用語は、１又は２つのアルキル基で置換されたアミノ基を意味する。好ましいのは、１〜６の炭素原子を有するアルキル部分を有する「低級Ｎ−アルキルアミノ」基である。好適な低級アルキルアミノは、Ｎ−メチルアミノ、Ｎ−エチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、等のようなモノ若しくはジ−アルキルアミノであり得る。「アリールアミノ」という用語は、Ｎ−フェニルアミノのような、１又は２つのアリール基で置換されたアミノ基を意味する。「アリールアミノ」基は、この基のアリール環部分でさらに置換され得る。「アラルキルアミノ」という用語には、アミノ窒素原子を介して他の基へ付いたアラルキル基が含まれる。「Ｎ−アリールアミノアルキル」及び「Ｎ−アリール−Ｎ−アルキル−アミノアルキル」という用語は、それぞれ、１つのアリール基か、又は１つのアリールと１つのアルキル基で置換され、アルキル基へ付いたアミノ基を有するアミノ基を意味する。そのような基の例には、Ｎ−フェニルアミノメチルとＮ−フェニル−Ｎ−メチルアミノメチルが含まれる。「アミノカルボニル」という用語は、式：−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２のアミド基を意味する。「アルキルアミノカルボニル」という用語は、アミノ窒素原子上で１又は２つのアルキル基に置換されたアミノカルボニル基を意味する。好ましいのは、「Ｎ−アルキルアミノカルボニル」、「Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノカルボニル」基である。より好ましいのは、上記に定義されるような低級アルキル部分を有する「低級Ｎ−アルキルアミノカルボニル」、「低級Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノカルボニル」基である。「アルキルアミノアルキル」という用語には、アミノアルキル基へ付いた１つ以上のアルキル基を有する基が含まれる。「アリールオキシアルキル」という用語には、二価酸素原子を介してアルキル基へ付いたアリール基を有する基が含まれる。「アリールチオアルキル」という用語には、二価イオウ原子を介してアルキル基へ付いたアリール基を有する基が含まれる。
【００８５】
本発明の方法で活用される化合物は、フリー塩基か又はその製剤的に許容される酸付加塩の形態で存在し得る。「製剤的に許容される塩」という用語には、アルカリ金属塩を形成する、及び、フリー酸若しくはフリー塩基の付加塩を形成するのに通常使用される塩が含まれる。塩の性質は、製剤的に許容されるならば、重大ではない。式Ｉの化合物の好適な製剤的に許容される酸付加塩は、無機酸からか又は有機酸から製造され得る。そのような無機酸の例は、塩酸、臭酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸、及びリン酸である。適正な有機酸は、脂肪族、環式脂肪族、芳香族、芳香脂肪族（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、ヘテロ環式、カルボン酸、及びスルホン酸クラスの有機酸から選択される場合があり、その例は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、ｂ−ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸、及びガラクツロン酸である。好適な製剤的に許容される塩基付加塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、及び亜鉛からつくられる金属塩、又は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、及びプロカインからつくられる有機塩が含まれる。上記の塩は、いずれも対応する化合物から、従来の方法により、例えば、適正な酸若しくは塩基をその化合物と反応させることによって製造され得る。
【００８６】
本発明は、治療有効量のアルドステロン遮断薬を少なくとも１つの製剤的に許容される担体、アジュバント、又は希釈剤（本明細書では、「担体」材料と総称する）と、さらに所望されるならば、他の有効成分と一緒に含んでなる、心臓血管障害の予防の医薬組成物を含む。本発明の活性化合物は、当業者に知られた好適な経路により、好ましくはそのような経路に適用される医薬組成物の形態で、意図される治療に有効な用量で投与され得る。活性のある化合物及び組成物は、例えば、血管内、腹腔内、経鼻、気管支内、皮下、筋肉内、又は局所的に（エアゾールを含む）投与され得る。
【００８７】
アルドステロン遮断薬の投与は、経口経路、又は静脈内、筋肉内、又は皮下注射により達成され得る。製剤は、ボーラス剤の形態であるか、又は水性若しくは非水性の等張無菌注射溶液剤若しくは懸濁液剤であり得る。これらの溶液剤及び懸濁液剤は、１つ以上の製剤的に許容される担体若しくは希釈剤を有する無菌の散剤若しくは顆粒剤、又はゼラチン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロースのような結合剤から、１つ以上の潤滑剤、保存剤、界面活性剤、若しくは分散剤と一緒に製造され得る。
【００８８】
経口投与では、医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、懸濁液剤、又は液剤の形態であり得る。医薬組成物は、好ましくは、特定量の有効成分を含有する投与量単位の形態で製造され得る。そのような投与量単位の例は、錠剤又はカプセル剤である。これらは、有利にも、約０．５〜２５０ｍｇ、好ましくは約２５〜１５０ｍｇの各有効成分の量を含有する。哺乳動物に適した１日用量は、患者の状態や他の要因に依存して大きく変動する可能性がある。しかしながら、約０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、特に約１〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の用量が適正であり得る。
【００８９】
有効成分はまた、例えば生理食塩水、デキストロース、又は水が好適な担体として使用され得る組成物として、注射により投与され得る。それぞれの有効成分の好適な１日用量は、治療される疾患に依存して、頻回用量で１日あたり約０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇ体重で注射される。好ましい１日用量は、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であろう。予防療法に適用される化合物は、好ましくは、概して１日につき約０．１ｍｇ〜約１５ｍｇ／体重キログラムの範囲である。より好ましい投与量は、体重キログラムにつき約１ｍｇ〜約１５ｍｇの範囲である。最も好ましいのは、１日につき体重キログラムあたり約１〜約１０ｍｇの範囲の投与量である。好適な用量は、１日あたり頻回の副（ｓｕｂ）用量で投与することができる。これら副用量は単位剤形で投与され得る。典型的には、１つの用量若しくは副用量は、単位剤形につき約１ｍｇ〜約１００ｍｇの活性化合物を含有し得る。より好ましい投与量は、単位剤形につき約２ｍｇ〜約５０ｍｇの活性化合物を含有する。最も好ましいのは、単位用量につき約３ｍｇ〜約２５ｍｇの活性化合物を含有する剤形である。
【００９０】
好ましい組合せ療法では、アルドステロン受容体拮抗薬は、約１０ｍｇ〜約２０ｍｇの範囲の量で存在し得る。
本発明の方法で疾患状態を治療するための投与方式は、患者のタイプ、年齢、体重、性別、及び医学的状態、疾患の重症度、投与の経路、利用される特定の化合物を含む、多種多様な要因に従って選択されるので、大きく変動する可能性がある。
【００９１】
治療目的のために、本発明の有効成分は、通常、適用される投与経路に適した１つ以上のアジュバントと組合せられる。経口で投与される場合、成分は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム及びカルシウム塩、ゼラチン、アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及び／又はポリビニルアルコールと混合してから、簡便な投与のために錠剤化若しくは被包化され得る。そのようなカプセル剤若しくは錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散物に提供され得るように、制御放出製剤を含有する場合がある。非経口投与の製剤は、水性若しくは非水性の等張無菌注射溶液剤若しくは懸濁液剤の形態であり得る。これらの溶液剤及び懸濁液剤は、経口投与用製剤における使用について述べた１つ以上の担体若しくは希釈剤を有する、無菌の散剤若しくは顆粒剤から製造され得る。この成分は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、及び／又は様々な緩衝液に溶かし得る。他のアジュバントと投与の形式については製剤技術の分野で広くよく知られている。
【００９２】
エポキシステロイド性アルドステロン拮抗薬の固体状態形（ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ｆｏｒｍ）
本発明の方法には、治療有効量のエプレレノンを、その任意の固体状態形、つまりエプレレノンそれ自身の１つ以上の固体状態としてか、又は１つ以上の固体状態形のエプレレノンを含んでなる医薬組成物の形態のいずれか一方で投与することが含まれる。これらの新規固体状態形には、限定されないが、溶媒和結晶性エプレレノン、非溶媒和結晶性エプレレノン、及び非結晶性エプレレノンが含まれる。
【００９３】
１つの態様では、本発明の方法に従って投与されるエプレレノンは、以下の表１に示されるＸ線粉末回折パターンを有する非溶媒和結晶形（本明細書では「高融点多型」又は「Ｈ型」と呼ばれる）のエプレレノンである。Ｈ型エプレレノンは国際公開ＷＯ０１／４２２７２号に開示されていて、その開示内容は参照により本明細書に組込まれる。
【００９４】
もう１つの態様では、エプレレノンが医薬組成物の形態で投与され、ここでその組成物に含まれるエプレレノンの全体量は相純粋な（ｐｈａｓｅ ｐｕｒｅ）Ｈ型として存在する。
【００９５】
もう１つの態様では、エプレレノンが医薬組成物の形態で投与され、ここでその組成物に含まれるエプレレノンの全体量は相純粋なＬ型として存在する。Ｌ型エプレレノンは国際公開ＷＯ０１／４１５３５号に開示されていて、その開示内容は参照により本明細書に組込まれる。
【００９６】
もう１つの態様では、エプレレノンが医薬組成物の形態で投与され、ここでその組成物に含まれるエプレレノンの全体量は相純粋な溶媒和結晶性エプレレノンとして存在する。
【００９７】
もう１つの態様では、エプレレノンが医薬組成物の形態で投与され、ここでその組成物に含まれるエプレレノンの全体量は非結晶性エプレレノンとして存在する。
【００９８】
もう１つの態様では、エプレレノンが医薬組成物の形態で投与され、ここでその組成物は、第一の固体状態形のエプレレノンと第二の固体状態形のエプレレノンを含み、この第一及び第二の固体状態形のエプレレノンは、Ｈ型、Ｌ型、溶媒和エプレレノン、及び非結晶性エプレレノンから選択される。一般に、前記第一の固体状態形の、前記第二の固体状態形に対する重量比は、少なくとも約１：９、好ましくは約１：１、より好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは少なくとも約５：１、さらになおより好ましくは少なくとも約９：１である。エプレレノンの製剤は、国際公開ＷＯ００／３３８４７号、及びＷＯ０１／４１７７０号にも開示され、その開示内容は参照により本明細書に組込まれる。
【００９９】
もう１つの態様では、エプレレノンが医薬組成物の形態で投与され、ここでその組成物はＨ型とＬ型の両方を含む。この組成物におけるＬ型のＨ型に対する量の比は、概して、約１：２０〜約２０：１の間である。他の態様では、例えば、この比は、約１０：１〜約１：１０；約５：１〜約１：５；約２：１〜約１：２の間；又は約１：１である。
【０１００】
上記態様のそれぞれは、広範囲のエプレレノン粒径に及ぶ固体状態形のエプレレノンの投与を含み得るが、固体状態形のエプレレノンの選択をエプレレノン粒径の低下と共役させることにより、非製剤化エプレレノンとその固体状態形のエプレレノンを含んでなる医薬組成物のバイオアベイラビリティを改善し得ることが発見された。
【０１０１】
１つのそのような態様では、非製剤化エプレレノン又は医薬組成物において出発材料として使用されるエプレレノンのＤ９０粒径が、概して約４００ミクロン未満、好ましくは約２００ミクロン未満、より好ましくは約１５０ミクロン未満、なおより好ましくは約１００ミクロン未満、そしてなおより好ましくは約９０ミクロン未満である。もう１つの態様では、Ｄ９０粒径が約４０ミクロン〜約１００ミクロンの間にある。もう１つの態様では、Ｄ９０粒径が約３０ミクロン〜約５０ミクロンの間にある。もう１つの態様では、Ｄ９０粒径が約５０ミクロン〜約１５０ミクロンの間にある。もう１つの態様では、Ｄ９０粒径が約７５ミクロン〜約１２５ミクロンの間にある。
【０１０２】
もう１つのそのような態様では、非製剤化エプレレノン又は医薬組成物において出発材料として使用されるエプレレノンのＤ９０粒径が、概して約１５ミクロン未満、好ましくは約１ミクロン未満、より好ましくは約８００ｎｍ未満、なおより好ましくは約６００ｎｍ未満、そしてなおより好ましくは約４００ｎｍ未満である。もう１つの態様では、Ｄ９０粒径が約１０ｎｍ〜約１ミクロンの間にある。もう１つの態様では、Ｄ９０粒径が約１００ｎｍ〜約８００ｎｍの間にある。もう１つの態様では、Ｄ９０粒径が約２００ｎｍ〜約６００ｎｍの間にある。もう１つの態様では、Ｄ９０粒径が約４００ｎｍ〜約８００ｎｍの間にある。
【０１０３】
約１５ミクロン未満の粒径を有する固体状態形のエプレレノンは、当技術分野で知られている適用可能な粒径縮小技術に従って製造され得る。そのような技術には、限定されないが、米国特許第５，１４５，６８４、５，３１８，７６７、５，３８４，１２４、及び５，７４７，００１号に記載されるものが含まれる。米国特許第５，１４５，６８４、５，３１８，７６７、５，３８４，１２４、及び５，７４７，００１号は、詳しく完全に示されるように、特に参照により本明細書に組込まれる。例えば、米国特許第５，１４５，６８４号の方法によれば、エプレレノンを液状の分散媒体に分散させ、その混合物を粉砕媒体の存在下で湿式粉砕化し、その粒子を所望のサイズへ縮小させることによって好適なサイズの粒子が製造される。必要であるか又は有利であるならば、粒子は、表面修飾剤の存在下でサイズを縮小し得る。
【０１０４】
定義
エプレレノンへ適用される「非結晶性」という用語は、エプレレノン分子が無秩序な配置で存在し、明瞭な結晶格子若しくは単位格子を形成しない固体状態を意味する。非結晶性エプレレノンは、Ｘ線粉末回折にかけると、特徴的な結晶性ピークを生じない。
【０１０５】
本出願において物質若しくは溶液の「沸点」へ言及される場合、「沸点」という用語は、適用可能なプロセス条件下での物質若しくは溶液の沸点を意味する。
エプレレノンへ適用される「結晶形」という用語は、エプレレノン分子が（ｉ）明瞭な単位格子を含み、（ｉｉ）Ｘ線照射にかけたときに回折ピークを生じる、明瞭な結晶格子を形成するように配置されている固体状態形を意味する。
【０１０６】
本出願を通して使用される「結晶化」という用語は、エプレレノン出発材料の製造に関連する適用条件に依存した結晶化及び／又は再結晶化を意味し得る。
「蒸解」という用語は、溶媒又は溶媒の混合物中にある固体エプレレノンのスラリーが、適用可能なプロセス条件下で、溶媒又は溶媒の混合物の沸点で加熱される方法を意味する。
【０１０７】
本明細書で使用される「直接結晶化」という用語は、中間的な溶媒和した結晶性固体状態形エプレレノンの形成及び脱溶媒を伴わない、エプレレノンの好適な溶媒からの結晶化を意味する。
【０１０８】
本明細書で使用される「粒径」という用語は、レーザー光散乱、沈降フィールドフロー分画、光子相関分光法、又はディスク遠心分離のような、当技術分野でよく知られている慣用的な粒径測定技術により測定されるような粒径を意味する。「Ｄ９０粒径」という用語は、そのような慣用的な粒径測定技術により測定されるような、粒子の少なくとも９０％の粒径を意味する。
【０１０９】
「純度」という用語は、慣用的なＨＰＬＣアッセイによるエプレレノンの化学純度を意味する。本明細書で使用されるように、「低純度エプレレノン」は、有効量のＨ型成長促進剤及び／又はＬ型成長阻害剤を含有するエプレレノンを概して意味する。本明細書で使用されるように、「高純度エプレレノン」は、Ｈ型成長促進剤及び／又はＬ型成長阻害剤を含有しないか、又はその有効量未満を含有するエプレレノンを概して意味する。
【０１１０】
「相純度」という用語は、本明細書に記載の赤外線分光分析法により決定されるような、特定のエプレレノンの結晶形若しくは非結晶形に関する、エプレレノンの固体状態純度を意味する。
【０１１１】
「ＸＰＲＤ」という用語は、Ｘ線粉末回折を意味する。
「Ｔｍ」という用語は、融ける温度を意味する。
固体状態形の特性決定
１．分子コンホメーション
単結晶Ｘ線分析は、エプレレノン分子のコンホメーションがＨ型とＬ型の間で、特にステロイド環の７位でのエステル基の配向に関して異なることを示す。このエステル基の配向は、Ｃ８−Ｃ７−Ｃ２３−０２ねじれ角により規定され得る。
【０１１２】
Ｈ型結晶格子では、エプレレノン分子は、このエステルのメトキシ基が７位でＣ−Ｈ結合とほぼ一直線に並び、カルボニル基がＢ−ステロイド環のほぼ中心上に位置する配置をとる。このコンホメーションでは、Ｃ８−Ｃ７−Ｃ２３−０２ねじれ角が約−７３°である。この配向では、エステル基（０１）のカルボニル酸素原子が９，１１−エポキシド環（０４）の酸素原子と密に接触している。０１−０４距離は約２．９７Ａ（オングストローム）であり、ファン・デル・ワールスの接触距離の３．０Ａに少し短い（酸素のファン・デル・ワールス半径を１．５Ａと仮定する）。
【０１１３】
Ｌ型結晶格子では、エプレレノン分子は、エステル基がＨ型のそれに比較して約１５０℃回転していて、ほぼ＋７６．９°のＣ８−Ｃ７−Ｃ２３−０２ねじれ角を有するコンホメーションをとる。この配向では、エステルのメトキシ基がＡ−ステロイド環の４，５−アルケン部分の方へ向けられている。この配向では、エステル基のいずれかの酸素原子（０１，０２）と９，１１−エポキシ環の酸素原子との距離が、Ｈ型で決定される距離に比べて増加している。０２−０４距離はほぼ３．０４Ａであり、ファン・デル・ワールスの接触距離より少し長いところに該当する。０１−０４距離は約３．４５Ａである。
【０１１４】
エプレレノン分子は、今日までの単結晶Ｘ線回折により分析される、溶媒和結晶形のＬ型に特徴的なコンホメーションをとるようだ。
２．Ｘ線粉末回折
様々な結晶形のエプレレノンを、ジーメンスＤ５０００粉末回折計か、又はイネル（Ｉｎｅｌ）多目的回折計のいずれかで分析した。ジーメンスＤ５０００粉末回折計では、０．０２０のステップと２秒のステップ周期で、２〜５０の２ｑ値について生データを測定した。イネル多目的回折計では、アルミニウムのサンプルホルダーにサンプルを置き、すべての２θ値で同時に３０分の間、生データを採取した。
【０１１５】
表１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃは、それぞれ、Ｈ型（低純度エプレレノンの蒸解により得られるエタノール溶媒和物の脱溶媒により調製）、Ｌ型（高純度エプレレノンの再結晶化により得られるメチルエチルケトン溶媒和物の脱溶媒により調製）、及びメチルエチルケトン溶媒和物（メチルエチルケトン中の高純度エプレレノンの室温スラリー変換により調製）結晶形エプレレノンについて、主要ピークの重要パラメータを２ｑ値及び強度に関して示した（１．５４０５６オングストロームの波長でのＸ線照射）。
【０１１６】
Ｈ型及びＬ型の回折パターンでは、Ｈ型及びＬ型の製造経路（即ち、溶媒和物の脱溶媒）により、結晶回折面のスペーシングにおける不完全性の結果として、ピーク・ポジショニングにわずかなシフトが存在する場合がある。さらに、Ｈ型は、粗製エプレレノンの蒸解により調製される溶媒和物から単離される。この方法は、全体的により低い化学純度（約９０％）のＨ型をもたらす。最終的に、この溶媒和形のエプレレノンは、結晶格子中の溶媒チャネル内部で溶媒分子の移動が高まるために、回折ピークのポジショニングにいくらかのシフトを示すと予測される。
【０１１７】
【表５】
2004518611.tif 000019
【０１１８】
【表６】
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【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
【表８】
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【０１２１】
【表９】
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【０１２２】
【表１０】
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【０１２３】
【表１１】
2004518611.tif 000025
エプレレノンのＨ型、Ｌ型、及びメチルエチルケトン溶媒和物の結晶形についてのＸ線回折パターンのグラフ例を、それぞれ図１−Ａ、１−Ｂ、及び１−Ｃに示す。Ｈ型は、明瞭なピークを、７．０±０．２、８．３±０．２、及び１２．０±０．２°２θに示す。Ｌ型は、明瞭なピークを、８．０±０．２、１２．４±０．２、１２．８±０．２、及び１３．３±０．２°２θに示す。メチルエチルケトン溶媒和結晶形は、明瞭なピークを、７．６±０．２、７．８±０．２、及び１３．６±０．２°２θに示す。
【０１２４】
３．融解／分解温度
非溶媒和エプレレノン結晶形の融解及び／又は分解の温度を、ＴＡインスツルメンツ  ２９２０示差走査熱量測定計を使用して決定した。各サンプル（１〜２ｍｇ）を、密封又は開封されたアルミニウム皿のいずれかへ入れ、１０℃／分で加熱した。融解／分解吸熱の最大値へ外挿される開始点から、融解／分解の範囲を規定した。
【０１２５】
非溶媒和のエプレレノン結晶形（Ｈ型及びＬ型）の融解は、化学分解と、捕捉された溶媒の結晶格子からの損失に関連していた。融解／分解温度はまた、分析に先立つ固形物の操作により影響を受けた。例えば、適正な溶媒からの直接結晶化か、又は適正な溶媒又は溶媒の混合物中にある高純度エプレレノンの結晶化から得られる溶媒和物の脱溶媒から調製した、非粉砕Ｌ型（約１８０〜４５０ミクロンの近似Ｄ９０粒径）は、概して、約２３７〜２４２℃の融解範囲を有した。粉砕Ｌ型（約８０〜１００ミクロンの近似Ｄ９０粒径）（適正な溶媒又は溶媒の混合物中にある高純度エプレレノンの溶液から溶媒和物を結晶化し、その溶媒和物を脱溶媒してＬ型を産出させ、生じたＬ型を粉砕することによって調製したＬ型）は、概して、約２２３〜２３４℃のより低くてより広い融解／分解範囲を有した。低純度エプレレノンの蒸解により得られる溶媒和物の脱溶媒により調製した、非粉砕Ｈ型（約１８０〜４５０ミクロンの近似Ｄ９０粒径）は、概して、約２４７〜２５１℃のより高い融解／分解範囲を有した。（ａ）メチルエチルケトンから直接結晶化した非粉砕Ｌ型、（ｂ）高純度エプレレノンのメチルエチルケトンからの結晶化により得られる溶媒和物の脱溶媒により調製した非粉砕Ｌ型、（ｃ）高純度エプレレノンのメチルエチルケトンからの結晶化により得られる、脱溶媒した溶媒和物を粉砕することによって調製したＬ型、及び（ｄ）低純度エプレレノンのメチルエチルケトンからの蒸解により得られる溶媒和物の脱溶媒により調製した非粉砕Ｈ型のＤＳＣサーモグラムの例を、それぞれ、図２−Ａ、２−Ｂ、２−Ｃ、及び２−Ｄに示す。
【０１２６】
エプレレノンの溶媒和形のＤＳＣサーモグラムは、パーキンエルマーのＰｙｒｉｓ１示差走査熱量測定計を使用して決定した。各サンプル（１〜１０ｍｇ）を非密閉アルミニウム皿に入れ、１０℃／分で加熱した。より低温での１回以上の吸熱現象は、溶媒和物の結晶格子から溶媒が失われるときに起こるエンタルピー変化に関連していた。最高温度の吸熱は、Ｌ型若しくはＨ型エプレレノンの融解／分解に関連していた。エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和結晶形についてのＤＳＣサーモグラムの例を、図２−Ｅに示す。
【０１２７】
４．赤外吸収分光学
Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＤＲＩＦＴ（乱反射赤外フーリエ変換）Ｍａｇｎａ  システム５５０分光光度計を用いて、エプレレノンの非溶媒和形（Ｈ型及びＬ型）の赤外吸収スペクトルを得た。Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｔｅｃｈコレクターシステムと微量サンプルカップを使用した。サンプル（５％）を臭化カリウム中で分析し、４００〜４０００ｃｍ−１で走査した。Ｂｉｏ−ｒａｄ  ＦＴＳ−４５分光光度計を用いて、希釈（３％）クロロホルム溶液又は溶媒和結晶形におけるエプレレノンの赤外吸収スペクトルを得た。クロロホルム溶液サンプルは、塩化ナトリウム塩プレートの付いた、０．２ｍｍ路程の溶液セルを使用して分析した。溶媒和物のＦＴＩＲスペクトルは、ＩＢＭ  マイクロＭＩＲ（マルティプル内反射）付属品を使用して採取した。サンプルは４００〜４０００ｃｍ−１で走査した。（ａ）Ｈ型、（ｂ）Ｌ型、（ｃ）メチルエチルケトン溶媒和物、及び（ｄ）クロロホルム溶液中にあるエプレレノンの赤外吸収スペクトルの例を、それぞれ、図３−Ａ、３−Ｂ、３−Ｃ、及び３−Ｄに示す。
【０１２８】
表２は、Ｈ型、Ｌ型、及びメチルエチルケトン溶媒和物の結晶形におけるエプレレノンの代表的な吸収バンドを開示する。クロロホルム溶液中のエプレレノンについての代表的なバンドも比較のために開示する。Ｈ型と、Ｌ型又はメチルエチルケトン溶媒和物のいずれか一方との違いが、例えば、スペクトルのカルボニル領域に観察された。Ｈ型が約１７３９ｃｍ−１のエステルカルボニルストレッチを有するのに対し、Ｌ型とメチルエチルケトン溶媒和物の両方は、対応するストレッチをそれぞれ約１７２４ｃｍ−１と約１７２２ｃｍ−１に有する。クロロホルム溶液中のエプレレノンでは、このエステルカルボニルストレッチが約１７２７ｃｍ−１で生じる。エステルカルボニルのストレッチ頻度におけるＨ型及びＬ型の違いは、この２つの結晶形にあるエステル基の配向における変化を反映する。さらに、Ａ−ステロイド環にある共役ケトンのエステルのストレッチは、Ｈ型又はメチルエチルケトン溶媒和物のいずれかの約１６６４〜１６６７ｃｍ−１から、Ｌ型の約１６５５ｃｍ−１へシフトする。希釈溶液では、対応するカルボニルのストレッチが約１６６５ｃｍ−１で生じる。
【０１２９】
Ｈ型とＬ型のもう１つの違いが、Ｃ−Ｈベンディング領域に見られた。Ｈ型は約１３９９ｃｍ−１に吸収を有するが、これは、Ｌ型、メチルエチルケトン溶媒和物、クロロホルム溶液中のエプレレノンでは観察されない。この１３９９ｃｍ−１ストレッチは、カルボニル基に隣接するＣ２及びＣ２１メチレン基のＣＨ２鋏み（ｓｃｉｓｓｏｒｉｎｇ）領域で生じる。
【０１３０】
【表１２】
2004518611.tif 000026
５．核磁気共鳴
１３Ｃ−スペクトルを３１．９４ＭＨｚの磁場で得た。Ｈ型及びＬ型エプレレノンの１３Ｃ−スペクトルを、それぞれ図４及び図５に示す。図４に反映されるデータを得るために分析したＨ型エプレレノンは相純粋ではなく、少量のＬ型エプレレノンが含まれた。Ｈ型は、６４．８ｐｐｍ、２４．７ｐｐｍ、及び１９．２ｐｐｍ付近の炭素共鳴により最も明瞭に識別される。Ｌ型は、６７．１ｐｐｍ及び１６．０ｐｐｍ付近の炭素共鳴により最も明瞭に識別される。
【０１３１】
６．熱重量測定
ＴＡインスツルメンツのＴＧＡ  ２９５０熱重量測定分析機を使用して、溶媒和物の熱重量測定分析を実施した。サンプルを、窒素パージ下の非密封アルミニウム皿に入れた。開始温度は２５℃で、約１０℃／分の割合で温度を上昇させた。メチルエチルケトン溶媒和物についての熱重量測定分析プロフィールの例を図６−Ａに示す。
【０１３２】
７．単位格子変数
以下の表３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃは、Ｈ型、Ｌ型、及びいくつかの溶媒和結晶形について決定された単位格子変数を要約する。
【０１３３】
【表１３】
2004518611.tif 000027
【０１３４】
【表１４】
2004518611.tif 000028
【０１３５】
【表１５】
2004518611.tif 000029
選択したエプレレノンの溶媒和結晶形に関する追加の情報を以下の表４に報告する。メチルエチルケトン溶媒和物について上記表３Ａに報告した単位格子データは、これら追加のエプレレノン結晶性溶媒和物の多くについての単位格子変数を代表するものでもある。試験したエプレレノン結晶性溶媒和物のほとんどは、お互いに実質的に同形である。Ｘ線粉末回折ピークには、溶媒和結晶形ごとに、取込んだ溶媒分子のサイズによりわずかなシフティングが存在する場合があるが、全体的な回折パターンは実質的に同一であり、単位格子変数と分子位置は、試験したほとんどの溶媒和物で実質的に同一である。
【０１３６】
【表１６】
2004518611.tif 000030
溶媒和物の単位格子は、４つのエプレレノン分子から構成される。単位格子中のエプレレノン分子及び溶媒分子の化学量論も、数多くの溶媒和物について上記の表４に報告される。Ｈ型の単位格子は４つのエプレレノン分子から構成される。Ｌ型の単位格子は２つのエプレレノン分子から構成される。溶媒和物の単位格子は、脱溶媒の間に、Ｈ型及び／又はＬ型の単位格子へ変換され、このとき、エプレレノン分子は、転移及び回転を受けて、溶媒分子の残した空間を満たす。表４はまた、数多くの異なる溶媒和物についての脱溶媒温度を報告する。
【０１３７】
８．不純分子の結晶特性
エプレレノン中の選択された不純物は、溶媒和物の脱溶媒の間にＨ型の形成を誘導し得る。特に、以下の２つの不純分子の効果を評価した：７−メチル水素  ４α，５α：９α，１１α−ジエポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナン−７α，２１−ジカルボキシレート、γ−ラクトン（３）（「ジエポキシド」）と７−メチル水素  １１α，１２α−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−７α，２１−ジカルボキシレート、γ−ラクトン（４）（「１１，１２−エポキシド」）。
【０１３８】
【化１３】
2004518611.tif 000031
脱溶媒から生じるエプレレノン結晶形に対するこれら不純分子の影響については、本出願の実施例でより詳しく記載する。
【０１３９】
７−メチル水素  １７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４，９（１１）ジエン−７α，２１−ジカルボキシレート、γ−ラクトン（５）（「９，１１−オレフィン」）及びＨ型の単結晶構造における類似性に鑑みれば、この９，１１−オレフィンも溶媒和物の脱溶媒の間にＨ型の形成を誘導し得ると仮定される。
【０１４０】
【化１４】
2004518611.tif 000032
上記のジエポキシド、１１，１２−エポキシド、及び９，１１−オレフィンは、例えば、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／２５９４８の実施例４７Ｃ、４７Ｂ、及び３７Ｈにそれぞれ示されるように、製造され得る。ジエポキシド、１１，１２−エポキシド、及び９，１１−オレフィンについて単離した結晶形の代表的なＸ線粉末回折パターンを、それぞれ、図９、１０、及び１１に示す。それぞれの不純分子のＸ線粉末回折パターンはＨ型のＸ線粉末回折パターンに類似していて、Ｈ型とこの３つの不純化合物が類似した単結晶構造を有することを示唆する。
【０１４１】
それぞれの不純化合物の単結晶はまた、単離し、Ｘ線構造決定にかけて、これら３つの化合物がＨ型に類似した単結晶構造をとることを証明した。ジエポキシドの単結晶はメチルエチルケトンから単離した。１１，１２−エポキシドの単結晶はイソプロパノールから単離した。９，１１−オレフィンの単結晶は、ｎ−ブタノールから単離した。それぞれの不純化合物の結晶形について決定した結晶構造データを表５に示す。生じた結晶系と格子変数は、Ｈ型、ジエポキシド、１１，１２−エポキシド、及び９，１１−オレフィンの結晶形で実質的に同一であった。
【０１４２】
【表１７】
2004518611.tif 000033
表５に報告される４つの化合物は、同じ空間群へ結晶化し、類似した格子変数を有する（即ち、それらは同形である）。ジエポキシド、１１，１２−エポキシド、及び９，１１−オレフィンはＨ型コンホメーションをとると仮定される。それぞれの不純化合物について（溶液から直接）Ｈ型充填物（パッキング）を単離することが比較的容易であることは、この構造的に類似した化合物の系列についてＨ型格子が安定した充填形式であることを示す。
【０１４３】
エプレレノンの製造
本発明の新規結晶形を調製するのに使用されるエプレレノンの出発材料は、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９７／２１７２０；及び Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／２５９４８に示される方法、特にＷＯ９７／２１７２０及びＷＯ９８／２５９４８に示されるスキーム１を使用して、製造され得る。
【０１４４】
結晶形の調製
１．溶媒和結晶形の調製
エプレレノンの溶媒和結晶形は、好適な溶媒又は好適な溶媒の混合物からのエプレレノンの結晶化により調製され得る。好適な溶媒又は好適な溶媒の混合物は、一般に、有機溶媒か又は有機溶媒の混合物を含み、これは上昇温度でエプレレノンを不純物と一緒に可溶化するが、冷却時には、溶媒和物を選好的に結晶化させる。そのような溶媒又は溶媒の混合物におけるエプレレノンの溶解度は、一般に、室温で約５〜約２００ｍｇ／ｍＬである。溶媒又は溶媒の混合物は、好ましくは、エプレレノン出発材料を製造する方法で以前使用した溶媒、特に、エプレレノン結晶形を含んでなる最終の医薬組成物に含まれても製剤的に許容されるような溶媒から選択される。例えば、塩化メチレンを含んでなる溶媒和物をもたらす塩化メチレンを含む溶媒系は、一般に、望ましくない。
【０１４５】
使用されるそれぞれの溶媒は、好ましくは製剤的に許容される溶媒、特に、『不純物：残留溶媒に関するガイドライン』、ヒト使用医薬品の登録の技術要件に関する国際ハーモナイゼーション会議（ＩＣＨプロセスの第４ステップの採択について、１９９７年７月１７日、ＩＣＨステアリング委員会により推奨）に定義されるクラス２若しくはクラス３の溶媒である。なおより好ましくは、溶媒又は溶媒の混合物は、メチルエチルケトン、１−プロパノール、２−ペンタノン、酢酸、アセトン、酢酸ブチル、クロロホルム、エタノール、イソブタノール、酢酸イソブチル、酢酸メチル、プロピオン酸エチル、ｎ−ブタノール、ｎ−オクタノール、イソプロパノール、酢酸プロピル、プロピレングリコール、ｔ−ブタノール、テトラヒドロフラン、トルエン、メタノール、及び酢酸ｔ−ブチルからなる群から選択される。なおより好ましくは、溶媒は、メチルエチルケトン及びエタノールからなる群から選択される。
【０１４６】
エプレレノンの溶媒和結晶形を調製するには、ある量のエプレレノン出発材料をある量の溶媒に溶かし、結晶が形成するまで冷やす。エプレレノンを溶媒へ加えるときの溶媒温度は、一般に、溶媒又は溶媒の混合物の溶解度曲線に基づいて選択される。例えば、本明細書に記載のほとんどの溶媒では、この溶媒温度は、典型的には、少なくとも約２５℃、好ましくは約３０℃〜溶媒の沸点、そしてより好ましくは、溶媒の沸点未満である約２５℃〜溶媒の沸点である。
【０１４７】
他のやり方では、熱い溶媒をエプレレノンへ加え、この混合物を、結晶が形成するまで冷やすことができる。エプレレノンへ加えるときの溶媒の温度は、一般に、溶媒又は溶媒の混合物の溶解度曲線に基づいて選択される。例えば、本明細書に記載のほとんどの溶媒では、この溶媒温度は、典型的には、少なくとも２５℃、好ましくは約５０℃〜溶媒の沸点、そしてより好ましくは、溶媒の沸点未満である約１５℃〜溶媒の沸点である。
【０１４８】
一定量の溶媒と混合されるエプレレノン出発材料の量も、同様に、溶媒又は溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。典型的には、溶媒へ加えるエプレレノンの量は、室温ではその量の溶媒に完全には溶けない。例えば、本明細書に記載のほとんどの溶媒では、一定量の溶媒と混合されるエプレレノン出発材料の量は、室温でその量の溶媒に溶けるエプレレノンの量の、通常、少なくとも約１．５〜約４．０倍、好ましくは約２．０〜約３．５倍、そしてより好ましくは約２．５倍である。
【０１４９】
エプレレノン出発材料が溶媒に完全に溶けた後で、典型的には、この溶液をゆっくりと冷やし、エプレレノンの溶媒和結晶形を結晶化させる。例えば、本明細書に記載のほとんどの溶媒では、溶液は、約２０℃／分より遅い速度、好ましくは約１０℃／分か又はより遅い速度、より好ましくは約５℃／分か又はより遅い速度、そしてなおより好ましくは約１℃／分か又はより遅い速度で冷やされる。
【０１５０】
溶媒和結晶形が採取される終点温度も溶媒又は溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。例えば、本明細書に記載のほとんどの溶媒では、終点温度は、典型的には約２５℃未満、好ましくは約５℃未満、そしてより好ましくは約−５℃未満である。一般に、終点温度を低下させることは、溶媒和結晶形の形成に有利である。
【０１５１】
他のやり方では、この溶媒和物を調製するために他の技術を使用し得る。そのような技術の例には、限定されないが、（ｉ）エプレレノン出発材料をある溶媒に溶かし、溶媒和物結晶形の結晶化を促進するために助溶媒を加えること、（ｉｉ）溶媒和物の蒸気拡散成長、（ｉｉｉ）回転蒸発のような蒸発による溶媒和物の単離、及び（ｉｖ）スラリー変換が含まれる。
【０１５２】
上記に記載のように調製される溶媒和結晶形の結晶は、濾過又は遠心分離のような、好適な従来手段により溶媒から分離され得る。一般に、結晶化の間に溶媒系の振り混ぜを増やすと、より小さい結晶粒径を生じる。
【０１５３】
２．溶媒和物からのＬ型の調製
Ｌ型エプレレノンは、溶媒和結晶形から脱溶媒により直に調製され得る。脱溶媒は、限定されないが、溶媒和物を加熱すること、溶媒和物の周りの周囲圧を下げること、又はそれらの組合せのような、好適な脱溶媒手段により達成され得る。溶媒和物を、オーヴンなどで加熱して溶媒を除去する場合、この方法の間、溶媒和物の温度は、典型的にはＨ型及びＬ型の互変転移温度を超えない。この温度は、好ましくは、約１５０℃を超えない。
【０１５４】
脱溶媒圧と脱溶媒の時間は狭く限定されない。脱溶媒圧は、好ましくは、約１気圧以下である。しかしながら、脱溶媒圧が低下すると、脱溶媒を行うことができる温度、及び／又は脱溶媒の時間も同様に低下する。より高い脱溶媒温度を有する溶媒和物では特に、真空下で乾燥することによって、より低い乾燥温度の使用が可能になる。脱溶媒の時間は、脱溶媒、即ちＬ型の形成が完了に達することを可能にするだけで十分である。
【０１５５】
実質的にすべてＬ型を含む生成物の調製を確実にするには、エプレレノン出発材料は、典型的には高純度エプレレノン、好ましくは実質的に純粋なエプレレノンである。Ｌ型エプレレノンを調製するために使用されるエプレレノン出発材料は、一般に、少なくとも９０％純粋、好ましくは少なくとも９５％純粋、そしてより好ましくは少なくとも９９％純粋である。本出願の他のところでより詳しく論じるように、エプレレノン出発材料中のある種の不純物は、この方法から得られる生成物の収率及びＬ型含量に不都合に影響を及ぼし得る。
【０１５６】
高純度エプレレノン出発材料からこのやり方で調製される結晶化エプレレノン生成物は、一般に、少なくとも１０％Ｌ型、好ましくは少なくとも５０％Ｌ型、より好ましくは少なくとも７５％Ｌ型、なおより好ましくは少なくとも９０％Ｌ型、なおより好ましくは少なくとも約９５％Ｌ型、そしてなおより好ましくは実質的に相純粋なＬ型を含む。
【０１５７】
３．溶媒和物からのＨ型の調製
Ｈ型を含んでなる生成物は、Ｌ型の調製について上記に示したのと実質的に同じやり方で、（ｉ）高純度エプレレノン出発材料の代わりに低純度エプレレノン出発材料を使用すること、（ｉｉ）溶媒系に相純粋なＨ型結晶の種を入れること、又は（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の組合せによって、調製され得る。
【０１５８】
Ａ．成長促進剤及び阻害剤としての不純物の使用
エプレレノン出発材料中のあらゆる不純物の全量というより、エプレレノン出発材料中の選択された不純物の存在及び量が、溶媒和物の脱溶媒の間のＨ型結晶形成の可能性に影響を及ぼす。選択される不純物は、概して、Ｈ型成長促進剤であるか又はＬ型成長阻害剤である。それは、エプレレノン出発材料中に含まれている、エプレレノン出発材料を加える前に溶媒又は溶媒の混合物に含まれている、及び／又はエプレレノン出発材料を加えた後で溶媒又は溶媒の混合物へ加えられる場合がある。Ｂｏｎａｆｅｄｅ ｅｔ ａｌ．，『分子結晶亜状態のレッジ指向性エピタクシーによる有機多型の選択的核形成及び結晶成長（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ａｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ ｂｙ Ｌｅｄｇｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｐｉｔａｘｙ ｏｎ ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｕｂｓｔａｔｅ）』Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， Ｖｏｌ． １１７， Ｎｏ． ３０ （１９９５年８月２日） は、多型系における成長促進剤及び成長阻害剤の使用について論じるものであり、参照により本明細書に組込まれる。本発明では、不純物は、Ｈ型の単結晶構造と実質的に同一な単結晶構造を有する化合物を含む。不純物は、好ましくは、Ｈ型のＸ線粉末回折パターンと実質的に同一なＸ線粉末回折パターンを有する化合物であり、より好ましくは、ジエポキシド、１１，１２−エポキシド、９，１１−オレフィン、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１５９】
Ｈ型結晶を調製するのに必要とされる不純物の量は、典型的には、溶媒又は溶媒の混合物と、エプレレノンに比較した不純物の溶解度に一部依存し得る。例えば、メチルエチルケトン溶媒からのＨ型の結晶化では、低純度エプレレノン出発材料に対するジエポキシドの重量比は、典型的には少なくとも約１：１００、好ましくは少なくとも約３：１００、より好ましくは約３：１００と約１：５の間、そしてなおより好ましくは約３：１００と約１：１０の間である。１１，１２−エポキシドは、ジエポキシドより高いメチルエチルケトン中での溶解度を有するので、Ｈ型結晶を調製するには、より多量の１１，１２−エポキシドが一般に必要とされる。不純物が１１，１２−エポキシドを含む場合、低純度エプレレノン出発材料に対するジエポキシドの重量比は、典型的には少なくとも約１：５、より好ましくは少なくとも約３：２５、そしてなおより好ましくは約３：２５と約１：５の間である。ジエポキシドと１１，１２−エポキシドの両方の不純物がＨ型結晶の調製に使用される場合、それぞれの不純物のエプレレノン出発材料に対する重量比は、その不純物だけがＨ型結晶の調製に使用されるときの対応比より低い場合がある。
【０１６０】
選択される不純物を含んでなる溶媒和物が脱溶媒されると、Ｈ型及びＬ型の混合物が概して得られる。溶媒和物の最初の脱溶媒から生じる生成物中のＨ型の重量分画は、典型的には約５０％未満である。以下に論じるように、この生成物を結晶化又は蒸解によりさらに処理すると、生成物中のＬ型の重量分画が増加する。
【０１６１】
Ｂ．種入れ（Ｓｅｅｄｉｎｇ）
Ｈ型結晶はまた、エプレレノンの結晶化に先立って、溶媒系に相純粋Ｈ型結晶（又は、上記にすでに論じたようなＨ型成長促進剤、及び／又はＬ型成長阻害剤）を種入れすることによって調製され得る。エプレレノン出発材料は、低純度エプレレノン又は高純度エプレレノンのいずれかであり得る。いずれかの出発材料から調製されて生じた溶媒和物が脱溶媒される場合、この生成物中のＨ型の重量分画は、典型的には、少なくとも約７０％であり、約１００％と同じくらい大きい場合もある。
【０１６２】
溶媒系へ加えられるＨ型種結晶の、溶媒系へ加えられるエプレレノン出発材料に対する重量比は、一般に、少なくとも約０．７５：１００、好ましくは約０．７５：１００〜約１：２０の間、そしてより好ましくは約１：１００〜１：５０の間である。Ｈ型種結晶は、Ｈ型結晶の調製について本出願で論じられるいずれかの方法、特に以下に論じられるような蒸解によるＨ型結晶の調製により、調製され得る。
【０１６３】
Ｈ型種結晶は、一度に、数回の追加で、又はある時間にわたって実質的に連続して、加えてよい。しかしながら、Ｈ型種結晶の追加は、一般に、エプレレノンが溶液から結晶化し始める前に完了される、即ち、種入れは、曇り点（転移可能ゾーンの下端）に達する前に完了される。種入れは、典型的には、溶液温度が曇り点より約０．５℃高いところから曇り点より約１０℃高い範囲、好ましくは、曇り点の約２℃〜約３℃高い範囲内で実施される。種が加えられる曇り点より高い温度が増加するにつれ、一般に、Ｈ型結晶の結晶化に必要とされる種入れの量が増加する。
【０１６４】
種入れは、好ましくは、曇り点より高いところだけでなく、転移可能ゾーンの内部でも起こる。曇り点と転移可能ゾーンは、いずれもエプレレノンの溶解度と、溶媒又は溶媒の混合物中の濃度に依存する。例えば、メチルエチルケトンの１２倍量の希釈では、転移可能ゾーンの上端は、一般に、約７０℃〜約７３℃の間にあり、転移可能ゾーンの下端（即ち、曇り点）は、約５７℃と６３℃の間にある。メチルエチルケトンの８倍量の濃度では、転移可能ゾーンは、溶液が超飽和しているので、ずっと狭くなる。この濃度では、溶液の曇り点は、約７５℃〜約７６℃で起こる。メチルエチルケトンの沸点は周囲条件下で約８０℃であるので、この溶液への種入れは、典型的には、約７６．５℃と沸点の間で起こる。
【０１６５】
Ｈ型の種入れの例示的な非限定例を、以下の実施例７に示す。
Ｈ型成長促進剤又はＬ型成長阻害剤、及び／又はＨ型種入れを使用して得られる結晶化エプレレノン生成物は、概して少なくとも２％のＨ型、好ましくは少なくとも５％のＨ型、より好ましくは少なくとも７％のＨ型、そしてなおより好ましくは少なくとも約１０％のＨ型を含む。残りの結晶化エプレレノン生成物は、概してＬ型である。
【０１６６】
Ｃ．エプレレノンを粉砕することによって調製されるＨ型
さらにもう１つの代替法では、好適なエプレレノンの粉砕により少量のＨ型が調製され得ることが発見された。粉砕されたエプレレノン中のＨ型の濃度は、約３％の高さであると観察された。
【０１６７】
４．低純度エプレレノンから調製される溶媒和物からのＬ型の調製
上記に論じたように、溶媒和物を形成した後にこの溶媒和物を脱溶媒する、低純度エプレレノンの結晶化は、一般に、Ｈ型とＬ型の両方を含んでなる生成物を生じる。より大きいＬ型含量を有する生成物は、溶媒系に相純粋Ｌ型結晶の種入れをすることか、又はＬ型成長促進剤、及び／又はＨ型成長阻害剤を使用することによって、Ｈ型の調製について上記に示したのと実質的に同じやり方で、低純度エプレレノンから調製され得る。種入れのプロトコールと、溶媒系へ加えるＬ型種結晶の量の、溶媒系へ加えるエプレレノン出発材料の量に対する重量比は、相純粋Ｈ型結晶の種入れによるＨ型エプレレノンの調製についてすでに上記で論じた比と同様である。
【０１６８】
このやり方で調製した結晶化エプレレノン生成物は、一般に、少なくとも１０％のＬ型、好ましくは少なくとも５０％のＬ型、より好ましくは少なくとも７５％のＬ型、より好ましくは少なくとも９０％のＬ型、なおより好ましくは少なくとも約９５％のＬ型、そしてなおより好ましくは実質的に相純粋なＬ型を含む。
【０１６９】
本節とＨ型エプレレノンの調製に関連した前節に記載される種入れプロトコールはまた、結晶化エプレレノンの粒径の改善された制御を可能にし得る。
５．Ｌ型を溶液から直に結晶化すること
Ｌ型エプレレノンはまた、好適な溶媒又は溶媒の混合物から、中間溶媒和物の形成と付随する脱溶媒を必要としない、エプレレノンの直接の結晶化により調製され得る。典型的には、（ｉ）溶媒は、溶媒和結晶格子中の利用可能なチャネルスペースと不適合である分子サイズを有し、（ｉｉ）エプレレノンと不純物が上昇温度でこの溶媒に溶け、そして（ｉｉｉ）冷却すると、非溶媒和Ｌ型エプレレノンの結晶化を生じる。溶媒又は溶媒の混合物中でのエプレレノンの溶解度は、一般に室温で約５〜約２００ｍｇ／ｍＬである。この溶媒又は溶媒の混合物は、好ましくは、メタノール、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、アセトニトリル、ニトロベンゼン、水、及びエチルベンゼンからなる群から選択される１つ以上の溶媒を含む。
【０１７０】
Ｌ型エプレレノンを溶液から直接結晶化するには、エプレレノン出発材料のある量をこの溶媒のある量に溶かし、結晶が形成するまで冷やす。エプレレノンを溶媒へ加えるときの溶媒温度は、一般に、溶媒又は溶媒の混合物の溶解度曲線に基づいて選択される。例えば、本明細書に記載されるほとんどの溶媒では、この溶媒温度は、典型的には少なくとも約２５℃、好ましくは約３０℃〜溶媒の沸点、そしてより好ましくは溶媒の沸点の約２５℃未満〜溶媒の沸点である。
【０１７１】
他のやり方では、エプレレノンへ熱い溶媒を加えて、この混合物を結晶が形成するまで冷却し得る。それをエプレレノンへ加えるときの溶媒温度は、一般に、溶媒又は溶媒の混合物の溶解度曲線に基づいて選択される。例えば、本明細書に記載されるほとんどの溶媒では、この溶媒温度は、典型的には少なくとも約２５℃、好ましくは約５０℃〜溶媒の沸点、そしてより好ましくは溶媒の沸点の約１５℃未満〜溶媒の沸点である。
【０１７２】
一定量の溶媒と混合されるエプレレノン出発材料の量も、同様に、溶媒又は溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。典型的には、溶媒へ加えられるエプレレノンの量は、室温では、その量の溶媒に完全には溶けない。例えば、本明細書に記載されるほとんどの溶媒では、一定量の溶媒と混合されるエプレレノン出発材料の量は、通常、室温でその量の溶媒に溶けるエプレレノンの量の、少なくとも約１．５倍〜約４．０倍、好ましくは約２．０〜約３．５倍、そしてより好ましくは約２．５倍である。
【０１７３】
実質的に相純粋Ｌ型を含む生成物の調製を確実にするには、エプレレノン出発材料は、概して高純度エプレレノンである。エプレレノン出発材料は、好ましくは少なくとも６５％純粋、より好ましくは少なくとも９０％純粋、なおより好ましくは少なくとも９８％純粋、そしてなおより好ましくは少なくとも９９％純粋である。
【０１７４】
エプレレノン出発材料が溶媒に完全に溶けた後で、典型的には溶液をゆっくりと冷やし、エプレレノンの溶媒和結晶形を結晶化させる。例えば、本明細書に記載されるほとんどの溶媒では、溶液は、約１．０℃／分より遅い速度、好ましくは約０．２℃／分か又はより遅い速度、そしてより好ましくは約５℃／分と約０．１℃／分の間の速度で冷やされる。
【０１７５】
Ｌ型結晶が採取される終点温度は、溶媒又は溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。例えば、本明細書に記載されるほとんどの溶媒では、終点温度は、典型的には約２５℃未満、好ましくは約５℃未満、そしてより好ましくは約−５℃未満である。
【０１７６】
他のやり方では、他の技術を使用してＬ型結晶を調製し得る。そのような技術の例には、限定されないが、（ｉ）エプレレノン出発材料をある溶媒に溶かし、Ｌ型エプレレノンの結晶化を促進するために助溶媒を加えること、（ｉｉ）Ｌ型エプレレノンの蒸気拡散成長、（ｉｉｉ）回転蒸発のような蒸発によるＬ型エプレレノンの単離、及び（ｉｖ）スラリー変換が含まれる。
【０１７７】
上記に記載のように調製される溶媒和結晶形の結晶は、濾過又は遠心分離のような好適な従来手段により溶媒から分離され得る。
さらに、Ｌ型エプレレノンはまた、高純度エプレレノンのスラリーをメチルエチルケトン中で（以下に記載のように）蒸解し、蒸解したエプレレノンをスラリーの沸点で濾過することによっても調製され得る。
【０１７８】
６．Ｈ型を溶液から直に調製すること
結晶化がＨ型及びＬ型の互変転移温度（Ｔｔ）より高いところで実施され、特にＨ型成長促進剤又はＬ型成長阻害剤が存在するか、又は溶媒に相純粋Ｈ型結晶が種入れされるならば、Ｈ型のほうがこのより高い温度ではより安定であるので、Ｈ型は溶液から直に結晶化するはずであると仮定される。使用される溶媒系は、好ましくは、ニトロベンゼンのような高沸点溶媒を含む。好適なＨ型成長促進剤には、限定されないが、ジエポキシドと１１，１２−オレフィンが含まれる。
【０１７９】
７．溶媒を用いたエプレレノンの蒸解
エプレレノンの溶媒和結晶形、Ｈ型、及びＬ型はまた、好適な溶媒又は溶媒の混合物中でのエプレレノン出発材料の蒸解により調製され得る。蒸解の方法では、エプレレノンのスラリーが溶媒又は溶媒の混合物の沸点で加熱される。例えば、ある量のエプレレノン出発材料をある容量の溶媒又は溶媒の混合物と一緒にし、還流まで加熱し、留出液を除去しながら、この留出液の除去と同時に追加量の溶媒を加える。他のやり方では、この蒸解法の間に留出液を濃縮し、さらなる溶媒を加えずに再利用し得る。典型的には、元の量の溶媒が除去されるか、又は濃縮されて再利用されたなら、スラリーを冷やし、溶媒和結晶を形成させる。溶媒和結晶は、濾過又は遠心分離のような好適な従来手段により溶媒から分離され得る。すでに記載のように溶媒和物を脱溶媒すると、溶媒和結晶中の選択された不純物の存在若しくは不在に依存して、Ｈ型又はＬ型エプレレノンのいずれかが生じる。
【０１８０】
好適な溶媒又は溶媒の混合物は、一般に、本明細書にすでに開示された１つ以上の溶媒を含む。溶媒は、例えば、メチルエチルケトンとエタノールからなる群から選択され得る。
【０１８１】
蒸解法で使用される溶媒へ加えられるエプレレノン出発材料の量は、一般に、溶媒又は溶媒の混合物の沸点でスラリー（即ち、この溶媒又は溶媒和物中でエプレレノンは完全に溶けてはいない）を維持するのに十分である。例示的な数値には、限定されないが、４ｍＬのメチルエチルケトンにつき約１グラムのエプレレノンと８ｍＬのエタノールにつき約１グラムのエプレレノンが含まれる。
【０１８２】
溶液の回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）がエプレレノンの溶媒和結晶形を結晶化するのに十分完了したならば、一般に、溶液をゆっくりと冷やす。例えば、試験した溶媒では、溶液は、約２０℃／分より遅い、好ましくは約１０℃／分又はそれより遅い、より好ましくは約５℃／分又はそれより遅い、そしてなおより好ましくは約１℃／分又はそれより遅い速度で冷やされる。
【０１８３】
溶媒和結晶形が採取される終点温度は、溶媒又は溶媒の混合物の溶解度曲線に依存する。例えば、本明細書に記載されるほとんどの溶媒では、終点温度は、典型的には約２５℃未満、好ましくは約５℃未満、そしてより好ましくは約−５℃未満である。
【０１８４】
主として、又は専らＬ型を含んでなる生成物が所望される場合、典型的には、高純度のエプレレノン出発材料が蒸解される。高純度エプレレノン出発材料は、好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋、そしてなおより好ましくは少なくとも９９．５％純粋である。このやり方で調製される蒸解されたエプレレノン生成物は、一般に、少なくとも１０％のＬ型、好ましくは少なくとも５０％のＬ型、より好ましくは少なくとも７５％のＬ型、より好ましくは少なくとも９０％のＬ型、なおより好ましくは少なくとも約９５％のＬ型、そしてなおより好ましくは実質的に相純粋なＬ型を含む。
【０１８５】
主として、又は専らＨ型を含んでなる生成物が所望される場合、典型的には、低純度のエプレレノン出発材料が蒸解される。低純度エプレレノン出発材料は、一般に、Ｈ型を産生するのに必要とされるだけのＨ型成長促進剤、及び／又はＬ型成長阻害剤だけを含有する。好ましくは、低純度エプレレノン出発材料は、少なくとも６５％純粋、より好ましくは少なくとも７５％純粋、そしてなおより好ましくは少なくとも８０％純粋である。このやり方で調製される蒸解されたエプレレノン生成物は、一般に、少なくとも１０％のＨ型、好ましくは少なくとも５０％のＨ型、より好ましくは少なくとも７５％のＨ型、より好ましくは少なくとも９０％のＨ型、なおより好ましくは少なくとも約９５％のＨ型、そしてなおより好ましくは実質的に相純粋なＨ型を含む。
【０１８６】
８．非結晶性エプレレノンの調製
非結晶性エプレレノンは、破砕、粉砕、及び／又は微小化のような、固形エプレレノンの好適な細分化により少量調製され得る。相純粋非結晶性エプレレノンは、例えば、エプレレノンの溶液、特にエプレレノンの水溶液を凍結乾燥することによって調製され得る。これらの方法は以下の実施例１３及び１４に例示される。
【０１８７】
作業実施例
以下の実施例は、本出願に記載される様々な固体状態のエプレレノンの形態を調製する方法についての詳細な記載を含有する。これらの詳細な記載は本発明の範囲内に含まれ、本発明を例示するのに役立つ。これらの詳細な記載は例示目的のためにのみ提示され、本発明の範囲を制限するものではない。すべての割合は重量によるものであり、温度は、他に明示されなければ、摂氏（℃）である。以下の実施例のそれぞれで使用されるエプレレノン出発材料は、Ｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／２５９４８に示されるスキーム１に従って製造した。
【０１８８】
【実施例】
実施例１：（ａ）高純度エプレレノン出発材料からのメチルエチルケトン溶媒和物と、（ｂ）生じた溶媒和物からのＬ型結晶性エプレレノンの調製
Ａ．メチルエチルケトン溶媒和物の調製：
高純度エプレレノン（４３７ｍｇ；９９％より高い純度で、０．２％未満のジエポキシドと１１，１２−エポキシドが存在する）を、９００ｒｐｍで磁気撹拌しながらホットプレート上で沸騰するまで加熱することによって、１０ｍＬのメチルエチルケトンに溶かした。生じた溶液を連続的に磁気撹拌しながら室温まで冷やした。室温になったら、この溶液を１℃の浴へ移し、撹拌を１時間維持した。１時間後、固形のケチルエチルケトン溶媒和物を真空濾過により採取した。
【０１８９】
Ｂ．Ｌ型結晶性エプレレノンの調製：
上記の工程Ａで調製した固形のメチルエチルケトン溶媒和物を、１００℃のオーヴンで４時間、周囲圧で乾燥させた。乾燥された固形物は、ＤＳＣ及びＸＰＲＤ分析により、純粋なＬ型であると決定された。
【０１９０】
実施例２：高純度エプレレノン出発材料からの追加溶媒和物の調製：
メチルエチルケトンを以下の溶媒：ｎ−プロパノール、２−ペンタノン、酢酸、アセトン、酢酸ブチル、クロロホルム、エタノール、イソブタノール、酢酸イソブチル、イソプロパノール、酢酸メチル、プロピオン酸エチル、ｎ−ブタノール、ｎ−オクタノール、酢酸プロピル、プロピレングリコール、ｔ−ブタノール、テトラヒドロフラン、及びトルエンの１つに置き換え、実施例１の工程Ａに実質的に記載される結晶化を行うことによって、追加の溶媒和結晶形を調製した。Ｌ型エプレレノンは、実施例１の工程Ｂに実質的に記載されるようにして、それぞれの溶媒和物から形成された。
【０１９１】
実施例３：蒸気拡散成長によるメチルエチルケトン溶媒和物の調製
エプレレノン（４００ｍｇ；９９．９％より高い純度）を、ホットプレート上で温めることによって、２０ｍＬのメチルエチルケトンに溶かし、ストック溶液をつくった。このストック溶液の８ｍＬ量を第一の２０ｍＬシンチレーション・バイアルへ移し、メチルエチルケトンで１０ｍＬへ希釈した（８０％）。１０ｍＬ量のストック溶液を第二の２０ｍＬシンチレーション・バイアルへ移し、メチルエチルケトンで１０ｍＬへ希釈した（４０％）。ストック溶液の最後の２ｍＬをメチルエチルケトンで１０ｍＬへ希釈した（２０％）。希釈液を含有する４つのバイアルを、抗溶媒として少量のヘキサンを含有するデシケーター瓶へ移した。デシケーター瓶を密封し、ヘキサン蒸気をメチルエチルケトン溶液へ拡散させた。翌日にはメチルエチルケトン溶媒和物の結晶が８０％希釈サンプル中で成長した。
【０１９２】
実施例４：回転蒸発によるメチルエチルケトン溶媒和物の調製
約４００ｍｇのエプレレノン（９９．９％より高い純度）を２５０ｍＬの丸底フラスコへ秤量して入れる。このフラスコへ溶媒（１５０ｍＬ）を加え、必要ならば、固形物が溶けるまで、溶液を穏やかに加熱する。生じた澄明な溶液をＢｕｃｈｉ回転蒸留器に入れ、約８５℃の浴温に浸し、溶媒を真空下で除去する。約１０ｍＬの溶媒が丸底フラスコに残ったときに溶媒の除去を止める。生じた固形物を、形態の決定に適した方法（ＸＰＲＤ、ＤＳＣ、ＴＧＡ、顕微鏡検査、等）により分析する。
【０１９３】
実施例５：スラリー変換
約１５０ｍｇのＬ型エプレレノンと１５０ｍｇのＨ型エプレレノンを５ｍＬの酢酸エチルへ加えた。生じたスラリーを３００ｒｐｍ（磁気撹拌）で一晩撹拌した。翌日、固形物のサンプルを濾過により採取した。ＸＰＲＤによるサンプルの分析は、サンプルが完全にＬ型エプレレノンからなることを示した。
【０１９４】
実施例６：（ａ）低純度エプレレノン出発材料からの溶媒和物と、（ｂ）生じた溶媒和物からのＨ型結晶性エプレレノンの調製
様々な量の不純物：７−メチル水素  ４α，５α：９α，１１α−ジエポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナン−７α，２１−ジカルボキシレート、γ−ラクトン（「ジエポキシド」）、又は不純物：７−メチル水素  １１α，１２α−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−７α，２１−ジカルボキシレート、γ−ラクトン（「１１，１２−エポキシド」）を含有するサンプルを、１００ｍｇの全サンプル量を提供するのに十分なエプレレノンの量と一緒に７ｍＬのシンチレーション・バイアルへ所望量の不純物を加えることによって調製した。各サンプル中のジエポキシド若しくは１１，１２−エポキシドの重量比を、表Ｘ−６ＡとＸ−６Ｂにそれぞれ示す。１ｍＬのメチルエチルケトンとともに、それぞれのシンチレーション・バイアルへ微小（ｍｉｃｒｏ−ｆｌｅａ）磁気撹拌子を加えた。バイアルにゆるく栓をし、磁気撹拌しながらホットプレート上で還流まで加熱することによって固形物を溶かした。固形物が溶けたならば、ホットプレート上で、溶液を室温まで冷やした。この冷却時間の間も磁気撹拌を維持した。溶液が室温へ達した後で、真空濾過により固形物を採取し、Ｘ線粉末回折（ＸＰＲＤ）により直ちに分析した。次いで、固形物を１００℃のオーヴンへ入れ、周囲圧で１時間乾燥させた。乾燥した固形物について、約１２．１°２θにあるＨ型回折ピークの面積をモニターすることによって、Ｈ型含量をＸＰＲＤにより分析した。Ｉｎｅｌ多目的回折計を使用して、すべてのＸＰＲＤパターンを記録した。
【０１９５】
【表１８】
2004518611.tif 000034
【０１９６】
【表１９】
2004518611.tif 000035
Ａ．ジエポキシドの結果
図１３は、（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）３％、及び（ｄ）５％ジエポキシドでドープ処理したメチルエチルケトン結晶化から得られた湿式ケーク（メチルエチルケトン溶媒和物）のＸ線粉末回折パターンを示す。比較を容易にするために、ピーク強度を正規化した。この回折パターンには、Ｈ型やジエポキシドに特徴的なピークが存在していない。このパターンは、エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物に特徴的である。
【０１９７】
図１４は、（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）３％、及び（ｄ）５％ジエポキシドでドープ処理したメチルエチルケトン結晶化から得られた乾燥固形物のＸ線粉末回折パターンを示す。比較を容易にするために、ピーク強度を正規化した。０及び１％のドーピング・レベルで実施したメチルエチルケトン結晶化に対応する乾燥サンプルでは、Ｈ型が検出されなかった。３及び５％のドーピング・レベルで実施したメチルエチルケトン結晶化に対応する乾燥したサンプルでは、Ｈ型が検出された。約１２．１°２θにあるＨ型回折ピークの面積と各サンプルについての推定Ｈ型含量を以下の表Ｘ−６Ｃに示す。
【０１９８】
【表２０】
2004518611.tif 000036
表Ｘ−６Ｃに報告される結果は、ジエポキシドの存在により、脱溶媒の間にＨ型の形成が影響されることを確認する。これらの結果は、ジエポキシドがメチルエチルケトン溶媒和結晶へ取込まれる、及び／又は吸着されると、Ｈ型エプレレノンの形成を誘導するのに有効であることを示す。
【０１９９】
３％ジエポキシド・ドーピング実験を繰り返して、この調製の経路が、脱溶媒の間に形成されるＨ型の量に及ぼす影響を分析した。この実験では、ドープ処理された結晶化から得られるメチルエチルケトン溶媒和物を２つの部分へ分割した。第一部分を未処理のままにしたのに対し、第二部分は乳鉢及び乳棒で軽く粉砕し、より高いレベルの結晶欠損部分を誘導した。この２つの部分をいずれも周囲圧で１時間、１００℃で乾燥させた。乾燥させた固形物をＸＰＲＤにより分析した。３％ジエポキシドのドープ処理後、（ａ）乾燥前に溶媒和物を粉砕しない、及び（ｂ）乾燥前に溶媒和物を粉砕する、メチルエチルケトン結晶化からの乾燥固形物のＸＰＲＤパターンを図１５に示す。ＸＰＲＤパターンは、非粉砕サンプルに比較して、粉砕サンプルでより多量のＨ型があることを示した。これらの結果は、メチルエチルケトン溶媒和物を単離し、処理する条件が、脱溶媒から生じる結晶形に影響を及ぼし得ることを示唆する。
【０２００】
Ｂ．１１，１２−エポキシドの結果
図１６は、（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）５％、及び（ｄ）１０％  １１，１２−エポキシドでドープ処理したメチルエチルケトン結晶化から得られた湿式ケーク（メチルエチルケトン溶媒和物）のＸ線粉末回折パターンを示す。比較を容易にするために、ピーク強度を正規化した。この回折パターンには、Ｈ型や１１，１２−エポキシドに特徴的なピークが存在していない。このパターンは、エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物に特徴的である。
【０２０１】
図１７は、（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）５％、及び（ｄ）１０％  １１，１２−エポキシドでドープ処理したメチルエチルケトン結晶化から得られた乾燥固形物のＸ線粉末回折パターンを示す。比較を容易にするために、ピーク強度を正規化した。０、１％、及び５％のドーピング・レベルで実施したメチルエチルケトン結晶化に対応する乾燥したサンプルでは、Ｈ型が検出されなかった。１０％のドーピング・レベルで実施したメチルエチルケトン結晶化に対応する乾燥したサンプルでは、Ｈ型が検出された。約１２．１°２θにあるＨ型回折ピークの面積と各サンプルについての推定Ｈ型含量を表Ｘ−６Ｄに示す。
【０２０２】
【表２１】
2004518611.tif 000037
表Ｘ−６Ｄに報告される結果は、１１，１２−エポキシドの存在により、脱溶媒の間にＨ型の形成が影響されることを確認する。Ｈ型エプレレノンの形成を誘導するのに必要とされるメチルエチルケトン結晶化における不純物の比率は、ジエポキシドよりも１１，１２−エポキシドのほうが高いようである。
【０２０３】
実施例７：最終の結晶形に対する結晶化及び乾燥の効果
最終の結晶形に対する結晶化及び乾燥の効果を分析する以下の４つの実験を行なった：（ｉ）エプレレノンのメチルエチルケトン結晶化（２３＋３の統計学的な実験の設計）、（ｉｉ）低品質母液残渣の結晶化、（ｉｉｉ）高純度エプレレノンのＨ型種入れでの結晶化、及び（ｉｖ）低純度エプレレノンのＬ型種入れでの結晶化。実験の設計における変数には、冷却速度、出発材料の純度レベル、及び結晶化の終点温度が含まれた。この実施例のために、高純度エプレレノンを超純粋の粉砕化エプレレノン（ＨＰＬＣ分析はこの材料が１００．８％純粋であることを示した）と定義し、低純度エプレレノンを８９％純粋なエプレレノンと定義した。低純度エプレレノンを調製するには、エプレレノンの製造法に由来するままの母液を分析し、６１．１％エプレレノン、１２．８％ジエポキシド、及び７．６％  １１，１２−エポキシドである材料を生じるように混和した。次いで、この材料を十分量の高純度エプレレノンと混和して、８９％エプレレノンを産生した。
【０２０４】
Ａ．メチルエチルケトン結晶化
メチルエチルケトン結晶化実験では、６０ｇの高純度エプレレノンを使用してすべての作業を実施した。高い終点を４５℃と定義し、低い終点を５℃と定義した。高い冷却速度を３℃／分の冷却と定義し、低い冷却速度を０．１℃／分の冷却と定義した。中位点は、１．５℃／分の冷却、９４．５％純粋なエプレレノン、そして２５℃の終点である。
【０２０５】
ＦＴＩＲでバックグラウンドの読取りをした後で、２５０ｍＬのメチルエチルケトンを１Ｌのメトラー（Ｍｅｔｔｌｅｒ）ＲＣ−１，ＭＰ１０反応器へ入れ、１００ｒｐｍで撹拌した。数回のスキャンの後で、エプレレノンをこの反応器へ入れてから、追加の４７０ｍＬのメチルエチルケトンを入れた。撹拌を５００ｒｐｍへ高めて固形物を懸濁させ、バッチ温度を８０℃へ高めた。バッチ温度を８０℃に保ち、エプレレノンの溶解を確実にした。生じた透明溶液には、黒色又は白色の微小片が概して見られた。次いで、バッチ温度を、所望される終点まで所望される速度で傾斜冷却し、ここで１時間維持してから移載フラスコへ引き入れ、濾過した。反応器を真空にし、次いで、移載フラスコとケークを１２０ｍＬのメチルエチルケトンで洗浄した。洗液をケークに通したならば、中止した。それぞれの湿式ケークの約１０ｇを、窒素を軽く流入する７５℃の名目条件下で、真空オーヴンにおいて乾燥させた。以下に記載の「高い、高い、高い」及び「低い、低い、低い」実験では、高い条件と低い条件の下で、流動床乾燥を操作した。高い流動床乾燥を、１００℃、「４」のブロア（送風機）設定と定義し、低い流動床乾燥を、４０℃、「１」のブロア設定と定義した。
【０２０６】
Ｂ．低品質母液残渣の結晶化
低品質母液残渣実験の結晶化では、６０ｇの６１．１％純粋材料と７２０ｍＬのメチルエチルケトンを１ＬメトラーＲＣ−１，ＭＰ−１反応器へ直に入れた。この６１．１％純粋な材料は、反応器へ入れる前に、高純度エプレレノンと混和しなかった。生じた混合物を８０℃へ加熱すると、その温度で不透明なスラリーになった。結晶化を継続し、この混合物を速い冷却条件下の４５℃で濾過した。
【０２０７】
Ｃ．Ｈ型種入れ
Ｈ型種入れ実験では、６０ｇの純粋（１００．８％）エプレレノンと７２０ｍＬのメチルエチルケトンを１ＬメトラーＲＣ−１，ＭＰ１０反応器へ入れた。この混合物を８０℃へ加熱してから、１．５℃／分の速度で２５℃へ冷やした。溶液が６２℃まで冷えたときに、３ｇの相純粋Ｈ型結晶を種入れし、結晶化を開始させた。Ｈ型種結晶は、以下の実施例９に記載の蒸解法により調製した。
【０２０８】
Ｄ．Ｌ型種入れ
Ｌ型種入れ実験では、６６．６ｇの８９．３％エプレレノン（４８．３ｇの１００％エプレレノンを１８．３ｇの６１．１％エプレレノンと混合することによって調製）と７２０ｍＬのメチルエチルケトンを１ＬメトラーＲＣ−１，ＭＰ１０反応器へ入れた。この混合物を８０℃へ加熱してから、１．５℃／分の速度で２５℃へ冷やした。溶液が６３℃まで冷えたときに、３ｇの相純粋Ｌ型結晶を種入れし、結晶化を開始させた。Ｌ型種結晶は、上記の実施例１に記載の結晶化及び脱溶媒の方法により調製した。
【０２０９】
以上の実験の結果を表Ｘ−７Ａに報告する。ｎ＋１の結晶化実験では、Ｈ型が検出されたのは、低純度エプレレノンを利用して、生成物がジエポキシドを含有する実験においてだけである。より高い冷却速度では、最終生成物中に上昇レベルのジエポキシドも観察された。
【０２１０】
低品質母液残渣実験の結晶化では、Ｘ線粉末結晶回折により分析したときにジエポキシドとＨ型の混合物であると見られる、低品質の材料を生じた。
（高純度エプレレノンにＨ型を種入れした）Ｈ型種入れ実験では、Ｘ線粉末回折分析に基づけば７７％Ｈ型であるが、ＤＳＣに基づけば完全にＨ型である生成物を生じた。しかしながら、Ｘ線粉末回折モデルでは、約１５％を超えるＨ型の直線性が検証されていなかった。この実験は、この実施例の４つの実験で、ジエポキシドの不在下でＨ型が創出された唯一のものであった。
【０２１１】
（低純度エプレレノンにＬ型を種入れした）Ｌ型種入れ実験では、完全にＬ型である生成物を生じた。
エプレレノンの高い流動床乾燥について得られたデータは、真空オーヴン乾燥について得られたデータに対応するようであった。低い流動床乾燥は、真空オーヴン乾燥とは異なる結果を生じた。
【０２１２】
【表２２】
2004518611.tif 000038
Ａ．材料純度
表Ｘ−７Ａに報告されるデータに基づいた、生成物純度、出発材料純度、冷却速度、及び終点温度の立方体プロットを図１８に示す。この立方体プロットは、結晶化のはじめにより高純度の材料を使用するとより高純度の生成物が生じることを示唆する。結晶化の終点温度は、生成物純度にさして影響を及ぼさないようである。しかしながら、冷却速度は、より速い冷却速度からはやや純度の低い生成物を生じるという効果を有するようである。実際、ジエポキシドのレベルは、概して冷却速度が速いほど高かった。
【０２１３】
図１９は、どの変数が、あるとすれば、生成物純度に対して統計的に有意な効果を及ぼすかを決定する、立方体プロットの結果を使用して作成した半正規プロットを示す。出発材料純度が生成物純度に対して最大の統計的に有意な効果を及ぼしたが、冷却速度と冷却速度及び出発材料純度の相互作用も、統計的に有意な効果と見られた。
【０２１４】
図２０は、上記の結果に基づいて、出発材料純度と冷却速度の相互作用が生成物純度に及ぼす効果を示す、相互作用グラフである。高純度エプレレノン（１００．８％のエプレレノン出発材料）では、冷却速度が最終純度に対してほとんど、又はまったく効果を及ぼさないようである。しかしながら、低純度エプレレノン（８９．３％のエプレレノン出発材料）では、冷却速度が増加するに従って生成物純度が減少する。この結果は、より高い冷却速度で実施されるエプレレノン結晶化では、より多くの不純物が結晶化することを示唆する。
【０２１５】
Ｂ．Ｈ型含量
表Ｘ−７Ａに報告されるデータに基づいた、Ｈ型重量分画、出発材料品純度、冷却速度、及び終点温度の立方体プロットを図２１に示す。この立方体プロットは、結晶化のはじめにより高純度のエプレレノンを使用すると、より低い量のＨ型を生じることを示唆する。結晶化の終点温度も最終生成物の形態に影響を及ぼすようである。冷却速度はＨ型の形成にさして影響を及ぼさないようであるが、不純物の存在下での低い終点温度で冷却を速くすると、Ｈ型がいくらか生じる可能性がある。
【０２１６】
図２２は、どの変数が、あるとすれば、最終材料中のＨ型の量に対して統計的に有意な効果を及ぼすかを判定する、立方体プロットの結果を使用して作成した半正規プロットを示す。出発材料純度、結晶化の終点温度、及びこの２つの変数間の相互作用が、統計的に有意な効果と見られた。
【０２１７】
高純度エプレレノン（１００．８％のエプレレノン出発材料）では、終点温度がＨ型含量に対してほとんど効果を及ぼさないようである。純粋なエプレレノンを用いたどの場合もＨ型を生じなかった。しかしながら、低純度エプレレノン（８９．３％のエプレレノン出発材料）では、どの場合もＨ型が存在し、終点温度が高いほどより多くのＨ型が有意に存在した。
【０２１８】
表Ｘ−７Ｂは、流動床（ＬＡＢ−ＬＩＮＥ／Ｐ．Ｒ．Ｌ．高速流動床乾燥機（Ｈｉ−Ｓｐｅｅｄ Ｆｌｕｉｄ Ｂｅｄ Ｄｒｙｅｒ）、Ｌａｂ−Ｌｉｎｅインスツルメンツ社）又は真空オーヴン（バクスター・サイエンティフィック・プロダクツ、真空乾燥オーヴン、モデルＤＰ−３２）のいずれかを用いて乾燥した材料で測定されたＨ型の重量分画を報告する。高速流動床又は真空オーヴンのいずれでも、乾燥された比較可能な材料について、同等のＨ型含量が観察された。しかしながら、真空オーヴンに比べて、低速流動床で乾燥した比較可能な材料では、差異が観察された。
【０２１９】
【表２３】
2004518611.tif 000039
実施例８：（ａ）Ｈ型及びＬ型の混合物をメチルエチルケトンから結晶化して溶媒和物を調製することと（ｂ）この溶媒和物を脱溶媒してＬ型を調製すること
Ｈ型エプレレノン（１０ｇ）を８０ｍＬのメチルエチルケトンと一緒にした。この混合物を還流（７９℃）まで加熱し、この温度で約３０分撹拌した。次いで、生じたスラリーを、６５℃、５０℃、３５℃、及び２５℃で約９０分、それぞれの温度でスラリーを維持することによる、段階的な温度維持（ｈｏｌｄｐｏｉｎｔ）プロトコールで冷やした。スラリーを濾過し、約２０ｍＬのメチルエチルケトンで濯いだ。単離した固形物をはじめはフィルター上で、次いで４０〜５０℃の真空オーヴン中で乾燥させた。９０〜１００℃の真空オーヴン中で乾燥を完了させた。脱溶媒した固形物を８２％の回収で得た。ＸＰＲＤ、ＭＩＲ、及びＤＳＣにより、この固形物がＬ型結晶構造を有することを確認した。
【０２２０】
実施例９：低純度エプレレノン出発材料の溶媒を用いた蒸解によるＨ型の調製
Ａ．エタノール溶媒を用いた蒸解：
低純度エプレレノン（２４．６ｇ；ＨＰＬＣによる重量アッセイでは６４％）を１２６ｍＬのエタノール３Ａと一緒にした。このスラリーを還流まで加熱し、留出液を除去した。１２６ｍＬの溶媒が大気蒸留により除去されるのと同時に追加の１２６ｍｌのエタノール３Ａを加えた。この溶媒回転の完了時に、混合物を２５℃へ冷やし、１時間撹拌した。固形物を濾過し、エタノール３Ａで濯いだ。固形物を空気乾燥させて、エタノール溶媒和物を得た。この溶媒和物を９０〜１００℃の真空オーヴンでさらに６時間乾燥させて、１４．９ｇのＨ型エプレレノンを得た。
【０２２１】
Ｂ．メチルエチルケトン溶媒を用いた蒸解：
他の蒸解方法では、１グラムの低純度エプレレノン（約６５％純粋）を４ｍＬのメチルエチルケトン中で２時間蒸解した。２時間後、混合物を室温まで冷やした。冷えたなら、固形物を真空濾過により採取し、ＸＰＲＤ分析によりメチルエチルケトン溶媒和物であることを決定した。この固形物を１００℃で３０〜６０分乾燥させた。乾燥した固形物は、ＸＰＲＤにより純粋なＨ型であると決定された。
【０２２２】
実施例１０：高純度エプレレノン出発材料の溶媒を用いた蒸解によるＬ型の調製
Ａ．エタノール溶媒を用いた蒸解：
高純度エプレレノン（１グラム）を８ｍＬのエタノール中で約２時間蒸解した。次いで、この溶液を室温へ冷やし、固形物を真空濾過により採取した。濾過直後のＸＰＲＣによる固形物の分析は、この固形物が溶媒和物（おそらくは、エタノール溶媒和物）であることを示した。引き続き、この固形物を大気圧、１００℃で３０分乾燥させた。乾燥した固形物をＸＰＲＤにより分析し、主としてＬ型である（Ｈ型が検出されない）ことを決定した。
【０２２３】
Ｂ．メチルエチルケトン溶媒を用いた蒸解：
高純度エプレレノン（１グラム）を４ｍＬのメチルエチルケトン中で２時間蒸解した。２時間後、この溶液を室温へ冷やし、固形物を真空濾過により採取した。固形物を直ちにＸＰＲＤにより分析し、エプレレノンの溶媒和物（おそらくは、メチルエチルケトン溶媒和物）であることを決定した。引き続き、この溶媒和物を周囲圧、１００℃で３０〜６０分乾燥させた。乾燥した固形物をＸＰＲＤにより分析し、主としてＬ型であり、Ｈ型の回折ピークが存在しないことを決定した。
【０２２４】
実施例１１：Ｌ型を直接溶液から結晶化すること
方法Ａ：エプレレノン（２．５ｇ）を７５℃まで加熱することによって酢酸エチルに溶かした。エプレレノンが溶けたなら、この溶液を７５℃に３０分間保ち、完全な溶解を確実にした。次いで、この溶液を１℃／分で１３℃まで冷やした。１３℃になったなら、スラリーを、オーバーヘッド撹拌子を用いて７５０ｒｐｍで２時間撹拌した。真空濾過により結晶を採取し、４０℃の真空オーヴンで１時間乾燥させた。この固形物のＸＰＲＤパターン及びＤＳＣサーモグラムは、Ｌ型エプレレノンに特徴的であった。固形物の熱重量測定分析（ＴＧＡ）は、２００℃までは固形物からの重量損失がないことを示した。
【０２２５】
方法Ｂ：他の方法では、２ｇのエプレレノンを、ホットプレート上で磁気撹拌しながら加熱することによって、３５０ｍＬの１５／８５％アセトニトリル／水に溶かした。エプレレノンが溶けたなら、この溶液を、一晩磁気撹拌しながら室温へ冷やした。生じた固形物を真空濾過により採取した。この結晶は複屈折であり、三角形のプレート様の結晶習性を有した。この固形物は、Ｌ型エプレレノンに特徴的なＸＰＲＤ及びＤＳＣを有した。ＴＧＡは、２００℃まで重量損失のないことを示した。
【０２２６】
方法Ｃ：他の方法では、６４０ｍｇのエプレレノンを、２０ｍＬのエチルベンゼンの入った５０ｍＬフラスコへ入れた。生じたスラリーを１１６℃まで加熱すると、澄明な溶液になった。この澄明な溶液を３０分にわたり２５℃へ冷やした。この冷却期間の間、８４℃で核形成が始まった。生じた固形物を溶液から濾過し、空気乾燥させて、５３０ｍｇの固形物（８３％の回収）を得た。ホットステージ顕微鏡検査とＸＰＲＤは、この固形物がＬ型結晶であることを確認した。
【０２２７】
方法Ｄ：他の方法では、１．５５ｇのエプレレノンを２．０ｍＬのニトロベンゼンへ加え、２００℃まで加熱した。生じたスラリーを一晩２００℃で撹拌した。この溶液を室温へ冷やし（自然の空気対流）、翌日、固形物を単離した。この固形物は、ＸＰＲＤと偏光顕微鏡検査によりＬ型エプレレノンであると決定された。
【０２２８】
方法Ｅ：他の方法では、５．０ｇのエプレレノン（９９％より高い純度）を８２ｇのメタノール（１０４ｍＬ）へ加えた。撹拌操作（２１０ｒｐｍ）の下で、溶液を６０℃まで加熱し、その温度で２０分保ち、完全な溶解を確実にした。次いで、この溶液を、撹拌しながら０．１６℃／分の速度で−５℃へ冷やした。濾過により結晶を採取し、４０℃の真空オーヴン中で２０時間乾燥させた。乾燥した固形物は、ＤＳＣ及びＸＰＲＤ分析により、純粋なＬ型エプレレノンであると決定された。
【０２２９】
方法Ｆ：他の方法では、６．０ｇのエプレレノン（９％エタノールを含有し、９５．２％の補正純度を有するエタノール溶媒和物）を８２ｇのメタノール（１０４ｍＬ）へ加えた。撹拌操作（２１０ｒｐｍ）の下で、溶液を６０℃まで加熱し、その温度で２０分保ち、完全な溶解を確実にした。次いで、この溶液を、０．１４℃／分の速度で５０℃へ冷やしてから、その温度で約２．５時間維持した。次いで、この溶液を、撹拌しながら０．１３℃／分の速度で−５℃へ冷やした。濾過により結晶を採取し、４０℃の真空オーヴン中で１６時間乾燥させた。乾燥した固形物は、ＤＳＣ及びＸＰＲＤ分析により、純粋なＬ型エプレレノンであると決定された。
【０２３０】
実施例１２：Ｈ型を直接溶液から結晶化すること
１５０．５ｍｇのジエポキシドと２．８５ｇのエプレレノンを１．５ｍＬのニトロベンゼンへ加えた。この混合物を２００℃で数時間磁気撹拌した。次いで、自然の空気対流により、スラリーを室温へ冷やした。このサンプルを乾燥させ、偏光顕微鏡検査とＸＰＲＤにより分析した。ＸＰＲＤは、サンプルがＨ型及びＬ型の混合物であることを示した。この結晶は、顕微鏡検査によれば半透明であり、脱溶媒（及び、Ｈ型又はＬ型のいずれか一方への変換）が起こらないことを示した。
【０２３１】
実施例１３：非結晶性エプレレノンの粉砕による調製
鋼鉄製Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇコンテナーの約半量を約６０ｇのエプレレノン（９９．９％より高い純度）で満たした。鋼鉄のボール及びキャップをサンプルコンテナー上に置き、Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ装置により３０秒撹拌した。Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇコンテナーの表面からエプレレノンを剥ぎ取り、このコンテナーをさらに３０秒振り混ぜた。生じた固形物をＸＰＲＤ及びＤＳＣにより分析し、非結晶性エプレレノン及びＬ型結晶性エプレレノンの混合物であると決定した。
【０２３２】
実施例１４：非結晶性エプレレノンの凍結乾燥による調製
約１００ｍｇの粗製エプレレノンを、４００ｍＬの水を含有するビーカーへ秤量して入れた。この溶液を５分間わずかに加熱してから、音波処理し、撹拌しながらさらに５分間加熱した。この約３５０ｍＬのエプレレノン溶液を、５０ｍＬのＨＰＬＣ用水を含有する１０００ｍＬの丸底フラスコへ濾過して入れた。この溶液を、１〜２分の時間にわたり、ドライアイス／アセトン浴において瞬間凍結させた。このフラスコに Ｌａｂｃｏｎｃｏ Ｆｒｅｅｚｏｎｅ ４．５ 凍結乾燥機を付けて、一晩乾燥させた。フラスコ中の固形物を小さな褐色ボトルへ移した。少量のアリコートを、カージル（ｃａｒｇｉｌｌｅ）油（１．４０４）中１０Ｘ、１．２５Ｘの倍率（ｏｐｔｉｖａｒ）で偏光顕微鏡下で観察し、少なくとも９５％の非結晶性エプレレノンであることを観察した。図２４及び２５は、この非結晶性エプレレノンについて得られたＸＰＲＤパターン及びＤＳＣサーモグラムを示す。図２４の３９°２θで観察されるピークは、アルミニウムのサンプル容器によるものである。
【０２３３】
実施例１５：エプレレノン多型の組成物
２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、及び２００ｍｇ用量のＬ型エプレレノンを含有する錠剤が調製され、以下の組成を有する：
【０２３４】
【表２４】
2004518611.tif 000040
実施例１６：エプレレノン多型の組成物
１００ｍｇ用量のエプレレノンを含有するカプセル剤（硬ゼラチンカプセル、＃０）が調製され、以下の組成を有する：
【０２３５】
【表２５】
2004518611.tif 000041
実施例１７：エプレレノン多型の組成物
２００ｍｇ用量のエプレレノンを含有するカプセル剤（硬ゼラチンカプセル、０号サイズ）が調製され、以下の組成を有する：
【０２３６】
【表２６】
2004518611.tif 000042
実施例１８：粉砕化エプレレノンの調製
はじめに、乾燥メチルエチルケトン溶媒和物を、Ｆｉｔｚｍｉｌｌ の２０メッシュ篩いにこの溶媒和物を通すことによって、脱塊状（ｄｅｌｕｍｐｅｄ）にする。この脱塊状にした固形物を、約２５０キログラム／時間の送り速度の液体窒素冷却下で作動する、Ａｌｐｉｎｅ Ｈｏｓａｋａｗａ 植込みディスクピンミル（ｓｔｕｄ ｄｉｓｋ ｐｉｎ ｍｉｌｌ）を使用して、粒状に粉砕した。粒状粉砕により、約６５〜１００ミクロンのＤ９０粒径を有する粉砕化エプレレノンが生成される。
被検者集団
ある種の集団は、アルドステロンの疾患モジュレート効果を受けやすい。アルドステロンへの感受性があるこれらの集団のメンバーは、典型的には、食塩感受性でもあり、ここで個人の血圧は、一般に、ナトリウム消費量の増加及び減少に伴って、それぞれ上昇及び下降する。本発明がこれら集団への実施に限定されると解釈されてはならないが、これらの被検者集団は、本発明のアルドステロン遮断薬の抗炎症用量を用いた治療に特に適している可能性があると考えられる。
【０２３７】
本発明の態様では、被検者は、好ましくは、全体又は部分的に、日本人の人種集団又は黒人の人種集団である。日本で高血圧症は重大な問題である。ある最近の推計では、約３千万の日本の成人が高血圧症に罹患している（Ｓａｒｕｔａ Ｔ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ Ｍｅｄ １９９７； １３： ４０２４−９）。日本の血圧コントロールの状況は最近改善したが、高血圧症の管理は依然として不十分でなるとみなされている（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ； Ｋ． 日本人の症例（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｓｅｅ）．日本臨床 （Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ Ｊａｐａｎ）， ２０００； ５８ （Ｓｕｐｐｌ．）： ５９３−６）。「日本の血圧と尿ナトリウム及びカリウム排泄の傾向：インターソールト・スタディから８年目の再調査（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎｄ ｕｒｉｎａｒｙ ｓｏｄｉｕｍ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｊａｐａｎ）」Ｎａｋａｇａｗａ Ｈ， ｅｔ ａｌ．： Ｈｕｍ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９９ Ｎｏｖ； １３ （１１）： ７３５−４１ は、日本人の集団が食物カリウムを増やし、食物ナトリウムを減らすことを推奨した。
【０２３８】
しかしながら、日本のナトリウム制限処方は、不良なコンプライアンス（服薬履行性）により失敗している。１日につき５〜８グラムへ食塩量を制限した Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． による日本人の研究も、良好なコンプライアンスを達成することに失敗した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．： Ｊｐｎ Ｃｉｒｃ Ｊ １９８３； ４７： ２６８−７５）。日本の厚生省はナトリウムを１日あたり１０グラム未満へ制限するように奨励した（高齢者の高血圧治療ガイドライン、１９９５年−加齢と健康に関する総合研究プロジェクトの暫定プラン−「高齢者の高血圧治療ガイドライン」研究班メンバー、加齢と健康に関する総合研究プロジェクト、厚生省、日本）．Ｏｇｉｈａｒａ Ｔ， ｅｔ ａｌ．： Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｏｎｅｎ Ｉｇａｋｋａｉ Ｚａｓｓｈｉ． １９９６： ３３（１２）： ９４５−７５）。一般大衆を教育する１０年間のイニシアティブにもかかわらず、日本の正常者及び高血圧者の尿ナトリウムレベルにより測定されるように、依然として高率のノンコンプライアンス（約５０％より高いと推定される）が存在する（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ．： Ｊｐｎ Ｃｉｒｃ Ｊ； ４７（２）： ２６８−７５）。
【０２３９】
さらに、日本人は、食塩感受性と食塩非感受性の２つの大まかな集団を示す（「疫学における予防栄養因子：ナトリウムとカリウムの相互作用」Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｓ， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９９； ２６： ５７３）。多くの日本人の高血圧患者は食塩感受性であると考えられている。従って、食塩感受性、高ナトリウム摂取、及び、ナトリウム消費を自発的に制限し得ないことの組合せを示す日本の人種集団のメンバーは、本発明の治療により特に恩恵を受ける。
【０２４０】
故に、本発明のもう１つの態様では、治療の必要がある被検者は、全体又は部分的に、日本の人種集団のメンバーであり、とりわけ、高血圧症及び／又は心臓血管系疾患、特に、心不全、左心室拡張機能不全、肥大性心筋症、及び拡張期性心不全からなる群の１つ以上のメンバーから選択される心臓血管系疾患を有するか、又はそれに罹患しやすい食塩感受性の個人である。
【０２４１】
黒人の高血圧症も同様に重大な問題である。多くの高血圧及び正常血圧の黒人が食塩感受性である（Ｓｖｅｔｋｅｙ， ＬＰ ｅｔ ａｌ．： Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ． １９９６； ２８： ８５４−８）。蓄積された疫学データは、黒人の高血圧症の罹患率が、ほとんどすべての年齢−及び性別−適合群で白人のそれより高いことを示す。高血圧の黒人は、一般に、高血圧の白人より高い発症率の左心室機能不全、卒中、及び腎障害を有する（但し、虚血性心疾患の発症率はより低い）（Ｅｉｓｎｅｒ， ＧＭ． Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ １９９０； １６ （４ Ｓｕｐｐｌ １）： ３５−４０）。アメリカ黒人の間で高血圧症が流行病ほどの率であることの理由は、主に環境からのものである：高ナトリウム及びアルコール摂取、肥満、運動不足、及び社会心理上のストレスが、いずれも原因とみなされている（Ｆｌａｃｋ， ＪＭ， ｅｔ ａｌ．： Ｊ Ａｓｓｏｃ Ａｃａｄ Ｍｉｎｏｒ Ｐｈｙｓ １９９１； ２： １４３−５０）。
【０２４２】
黒人と白人の集団の両方における問題の原因ははっきりしていないが、ナトリウム処理の違いは、黒人の高血圧者の特殊な血行動態及びホルモンプロフィールの原因となり得るようだ。ナトリウム排泄増加能力を制限する内因性又は高血圧誘導性の腎異常、低下したＮａ＋，Ｋ（＋）ＡＴＰアーゼポンプ活性、他の膜イオン運搬障害、心理学的ストレッサーへの曝露の違い、より高いインスリン抵抗性、及び食事要因（より少ないカルシウム及びカリウム摂取）が、ある役割を担っている可能性があると示唆されている（Ｆｌａｃｋ， ＪＭ ｅｔ ａｌ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ； １９９１； １７ （１ Ｓｕｐｐｌ）： Ｉ１１５−２１）。ある研究によると、黒人の食塩感受性には遺伝子の違いも根底にあるらしい（Ｓｖｅｔｋｅｙ， ＬＰ， ｅｔ ａｌ．： Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １９９６； ２８： ８５４−８）。
【０２４３】
一般に、黒人の高血圧症は、食事中のナトリウム摂取を制限することにより初めは管理される。食事コントロールが不十分であれば、２４時間効力があり、血管の末梢抵抗を低下させ、ナトリウム排泄を促進し、腎臓の血行動態を潜在的に改善する降圧剤の投与が推奨される（Ｅｉｓｎｅｒ， ＧＭ． Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ １９９０； １６ （４ Ｓｕｐｐｌ １）： ３５−４０）。しかしながら、黒人は、一般に、白人に比較すると、降圧剤へ様々に反応する。一般に、β−アドレナリン作動性受容体拮抗薬若しくはＡＣＥ阻害剤の単独療法は、黒人では白人ほど有効でない。黒人男性は、ＡＣＥ阻害剤に対して、黒人女性よりも反応しない傾向さえある（Ｅｉｓｎｅｒ， ＧＭ． Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ １９９０； １６ （４ Ｓｕｐｐｌ １）： ３５−４０）。従って、従って、食塩感受性、高ナトリウム摂取、及び、ナトリウム消費を自発的に制限し得ないことの組合せを示す黒人の人種集団のメンバーは、本発明の治療により特に恩恵を受ける。故に、本発明のもう１つの態様では、治療の必要がある被検者は、全体又は部分的に、黒人の人種集団のメンバーであり、とりわけ、高血圧症及び／又は心臓血管系疾患、特に、心不全、左心室拡張機能不全、肥大性心筋症、及び拡張期性心不全からなる群の１つ以上のメンバーから選択される心臓血管系疾患を有するか、又はそれに罹患しやすい、食塩感受性の個人である。
【０２４４】
調整不能（ｎｏｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）者
調整不能者は、高ナトリウム摂取又はアンジオテンシンＩＩ投与に対して、腎血流速度とアルドステロンの副腎産生において鈍化した陽性反応を示す。そのような調整不能者は、さらに、高められた絶食インスリンレベルとグルコース刺激レベルの高められた増加を示す場合がある（Ｆｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．： Ｄｉａｂｅｔｅｓ １９９９； ４８： １６２３−３０）。インスリン抵抗性も心筋梗塞リスクの増加に関連している。
【０２４５】
従って、本発明のもう１つの態様では、治療の必要がある被検者は、とりわけ、（ｉ）インスリン抵抗性、特にＩ型若しくはＩＩ型糖尿病、及び／又はグルコース抵抗性を有するか、又はそれに罹患しやすい、及び／又は（ｉｉ）心臓血管系疾患を有するか、又はそれに罹患しやすい、食塩感受性で、非調整性の個人である。
【０２４６】
高齢者
食塩感受性の個人では、食物ナトリウム摂取の一定増加への血圧の漸増応答が加齢に伴って増加する。同様に、高齢の個人では、食塩感受性がより頻繁に観察される。さらに、インスリン抵抗性も加齢に伴って同様の増加を示す。
【０２４７】
従って、本発明の１つの態様では、治療の必要な被検者は、少なくとも５５歳の年齢、好ましくは少なくとも約６０歳の年齢、そしてより好ましくは少なくとも約６５歳の年齢であって、とりわけ、インスリン抵抗性、特にＩ型若しくはＩＩ型糖尿病、及び／又はグルコース抵抗性を有するか、又はそれに罹患しやすい、食塩感受性の個人である。
【０２４８】
回復した回復期のアルコール中毒者
回復した回復期のアルコール中毒者も、一般に、食塩感受性である（Ｇｅｎａｒｏ Ｃ ｅｔ ａｌ．： Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２０００： ８６９−８７４）。従って、本発明のもう１つの態様では、治療の必要な被検者は、食塩感受性の個人であって、とりわけ、解毒化したか、回復期にあるアルコール中毒者である。
【０２４９】
肥満
肥満者の人は、一般に食塩感受性である。Ｂｏｎｎｅｒ （ＭＭＷ Ｆｏｒｔｓｃｈｒ Ｍｅｄ １９９９； １４： ３４−６） による研究では、全高血圧患者の４４％が体重過多であり、さらに、食塩感受性、上昇した細胞内カルシウム、ナトリウム貯留、及び高い心拍数に関連していると推定された。さらに、Ｄｉｍｓｄａｌｅ ｅｔ ａｌ． （Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ １９９０； ３： ４２９−３５） は、肥満患者では、食塩負荷に反応してその収縮期血圧がより増加する可能性があると報告した。さらに、食塩感受性の児童もまた、肥満や心臓血管系疾患になる確率が高い（Ｆａｌｋｎｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．： Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９７； ６５： ６１８Ｓ−６２１Ｓ）。正常血圧者でも、ナトリウム感受性の被検者は、ナトリウム抵抗性の被検者より体重が重い傾向がある（Ｒｏｃｃｈｉｎｉ ＡＰ ｅｔ ａｌ．： Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ １９９４； ３０７ Ｓｕｐｐｌ １ Ｓ７５−８０）。従って、本発明のもう１つの態様では、治療の必要な被検者は、食塩感受性の個人であって、とりわけ、肥満である。
【０２５０】
生物学的評価
ヒトの心臓血管障害は複雑な病態であって、血管の高血圧又は心筋梗塞（ＭＩ）によりしばしば開始される。心臓血管障害への療法のあり得る有効性を判定するためには、成分の効力をいくつかのアッセイで判定することが重要である。従って、アッセイ「Ａ」では、アルドステロン拮抗薬のエプレレノン（エポキシメクスレノン）の効能を、アンジオテンシンＩＩ注入を使用して、血管炎症のある高血圧ラットモデルで判定した。アッセイ「Ｂ」では、血管炎症を伴う高血圧をもたらすアルドステロン注入を使用して、ラットモデルにおいて、アルドステロン拮抗薬のエプレレノン（エポキシメクスレノン）の効能を評価する試験が記載される。アッセイ「Ｃ」では、血管炎症を伴う高血圧をもたらすアルドステロン注入を使用して、ラットモデルにおいて、アルドステロン拮抗薬のエプレレノン（エポキシメクスレノン）の効能を評価するさらなる試験が記載される。
【０２５１】
さらに、アルドステロン拮抗薬療法をヒトにおいて評価するために臨床試験が使用され得る。そのような治療試験の数多くの例がすでに公表されていて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ７８， ９０２−９０７ （１９９７） に記載されるＲＡＬＥＳ  ００３試験、又は Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３４１， ７０９−７１７ （１９９９） に記載されるＲＡＬＥＳ  ００４試験の例が含まれる。
【０２５２】
アッセイＡ：ｉｎ ｖｉｖｏ アンジオテンシンＩＩ注入モデル
プロトコール：
方法：
・雄ウィスター系ラット（ｎ＝５０，１０匹／群；ＢＷ＝２００ｇ）
・１％  ＮａＣｌ  飲用
・実験群
１．対照
２．アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ／分、ａｌｚｅｔミニポンプによりｓｃ（皮下注））
３．アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ／分、ｓｃ）＋エプレレノン  １００ｍｐｋ
４．アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ／分、ｓｃ）＋副腎摘出＋デキサメタゾン（１２μｇ／ｋｇ／ｄ，ｓｃ）
５．アンジオテンシンＩＩ（２５ｎｇ／分、ｓｃ）＋副腎摘出＋デキサメタゾン（１２μｇ／ｋｇ／ｄ，ｓｃ）＋アルドステロン（４０ｍｇ／ｋｇ／ｄ，ａｌｚｅｔミニポンプによりｓｃ）
・毎週、尾加圧（ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ）によりＳＢＰ測定
・２４時間の食餌及び飲料摂取、毎日尿量測定
・尿電解質の判定用に、尿サンプルを毎日採取
・４週後、脱苦痛（ｅｘａｎｇｕｉｎａｔｉｏｎ）により屠殺。血液を、血清電解質の決定のために乾燥試験管へ採取し、アルドステロン及びコルチコステロンのレベル測定のためにＥＤＴＡ含有試験管へ採取した。
・心臓をヘマトキシリン及びエオジンで染色し、形態学的異常（即ち、壊死、血管損傷）の判定について分析した。
【０２５３】
結果
血圧．アンジオテンシンＩＩ注入を受けたすべての動物で収縮期血圧が増加した。エプレレノンも副腎摘出も、担体を受けた動物に比較した場合、血圧を低下させなかった。アルドステロン注入は、アンジオテンシンＩＩ／食塩、副腎摘出ラットにおいて血圧を増加させた。図２３は、収縮期血圧におけるこの増加を明示する。
【０２５４】
電解質排泄．１日尿Ｎａ＋排泄量と尿Ｋ＋排泄量の比（Ｕ  Ｎａ＋／Ｋ＋比）をナトリウム排泄増加の指標として使用した。尿Ｎａ＋／Ｋ＋比は、処置の開始前は全群で同様で、高食塩食の開始とともにすべての動物で同じように増加した。尿Ｎａ＋／Ｋ＋比は、アンジオテンシンＩＩの注入を受けている動物で変わらなかったが、１７日目になって、この動物群で、担体注入ラットに比べて、有意に増加した。エプレレノンを受けているアンジオテンシンＩＩ注入動物でも同様の効果が起こったが、これは、注入１４日目から尿Ｎａ＋／Ｋ＋比の増加を示した。しかしながら、どの時点でも、エプレレノン処置ラットは、担体で処置したアンジオテンシンＩＩ注入ラットより高い尿Ｎａ＋／Ｋ＋比を示さなかった。実際、有意な違いが観察されたのは、アンジオテンシンＩＩ注入、担体処置ラットがエプレレノン処置動物より高い尿Ｎａ＋／Ｋ＋比を示した２１日目だけであり、このことは、この実験条件の下ではエプレレノンが有意な利尿若しくはナトリウム排泄増加の効果をもたらさないことを示した。副腎摘出動物は、アルドステロン注入の有無にかかわらず、副腎インタクトな動物よりいつでも高い尿Ｎａ＋／Ｋ＋比を示した。
【０２５５】
心筋損傷．１０匹のアンジオテンシンＩＩ／食塩処置動物のうち７匹が、冠動脈において血管炎症性の変化を発症した。これらの変化は、主にマクロファージによる、血管周囲スペースの白血球浸潤により特徴づけられた。ある動脈では、媒質のフィブリン様壊死も観察された。病巣が広がっているある事例では、周囲の心筋に関連した心筋細胞の壊死が存在した。これらの症例では、心筋壊死の知見に一致して、実質の出血が観察された。エプレレノンを受けた１０匹のアンジオテンシンＩＩ−注入動物では、これらの動物が担体処置アンジオテンシンＩＩ注入ラットと同じくらい高血圧であったにもかかわらず、これらの血管炎症性の病変が観察されたのは１匹だけであった（図２４参照）。同様に、副腎摘出は、心臓での血管炎症病変を防止した。しかしながら、アルドステロン置換は、アンジオテンシンＩＩ注入、副腎インタクト、担体処置動物で観察される重篤な冠血管及び心筋の炎症及び損傷を復帰させた。
【０２５６】
アンジオテンシンＩＩ注入ラット由来の心臓を、シクロオキシゲナーゼ−２特異抗体で免疫染色すると、動脈の周囲の炎症領域、主に単球／マクロファージにこの酵素の存在が同定された。シクロオキシゲナーゼ−２染色はまた、血管周囲スペースに形態学的変化や炎症性の凝集物の証拠がないときでも、冠状動脈の媒質の血管平滑筋細胞に観察された（図２６）。エプレレノン処置は、副腎摘出と同様に、アンジオテンシンＩＩ注入ラット由来の心臓におけるシクロオキシゲナーゼ−２の発現を顕著に低下させたか、又はほとんどの場合、完全に防止した（図２５及び２７を参照のこと）。アンジオテンシンＩＩ、副腎摘出ラットにおけるアルドステロンの置換は、冠状動脈におけるシクロオキシゲナーゼ−２の存在を復帰させた。
【０２５７】
オステオポンチン（早期Ｔ細胞活性化−１、Ｅｔａ−１としても知られている）は、単球の化学誘引、活性化、及び遊走を仲介する、好炎症特性のある分泌糖タンパク質である。アンジオテンシンＩＩ注入、生理食塩水吸飲ラット由来の心臓をオステオポンチン特異抗体で免疫染色すると、冠状動脈の媒質にオステオポンチンの存在が同定された。エプレレノン処置と副腎摘出は、いずれもアンジオテンシンＩＩ注入、生理食塩水吸飲ラットの心臓におけるオステオポンチンの発現を防止した（図２８及び２９）。アルドステロン置換は、副腎摘出動物におけるオステオポンチンの発現を復帰させた。
【０２５８】
アッセイＢ：ｉｎ ｖｉｖｏ アルドステロン注入モデル
プロトコール２：
方法：
・雄スプレーグ・ドーリーラット（ｎ＝３９；ＢＷ＝２５０ｇ）
・１％  ＮａＣｌ  飲用
・ミニポンプの植込みの間に片側腎摘出を実施
・実験群
１．対照
２．アルドステロン（０．７５ｍｇ／時間、ａｌｚｅｔミニポンプによりｓｃ）
３．アルドステロン（０．７５ｍｇ／時間、ａｌｚｅｔミニポンプによりｓｃ）＋エプレレノン１００ｍｐｋ，ｐ．ｏ
４．アルドステロン（０．７５ｍｇ／時間、ａｌｚｅｔミニポンプによりｓｃ）＋０．６％  ＫＣｌ／飲用液
・１、２、及び３群が摂取したのは、０．３％  ＫＣｌ／飲用溶液だけである。
・腹大動脈に挿入したラジオテレメトリープローブによりＳＢＰ測定
・４週後に屠殺．
→心臓を採取し、心室中央の横断面で２つに分割した：上半分をホルマリンへ保存した。下半分は、生化学分析のために液体窒素で瞬間凍結した。
・心臓をヘマトキシリン及びエオジンとコラーゲン特異色素のピクロ−シリウス（ｐｉｃｒｏ−ｓｉｒｉｕｓ）レッドで染色し、間質コラーゲンの量分画と形態学的異常（即ち、壊死、血管損傷）の判定について分析した。
・凍結された心臓中のヒドロキシプロリン濃度を測定した。
・オステオポンチン及びＣＯＸ−２の決定は定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）により実施した。オステオポンチンはまた、免疫組織化学により心臓でも同定した。
【０２５９】
結果
血圧．アルドステロン注入を受けたすべての動物で収縮期血圧が増加した。エプレレノン処置は、血圧を有意に低下させたが、正常化はしなかった。図４３は、これらの結果をグラフで示す。
【０２６０】
心筋損傷
生理食塩水吸飲、片側腎切除ラットは、心筋損傷を有さなかった。間質コラーゲン量分画の組織学的判定によるか、又はヒドロキシプロリン濃度の生化学的判定による、間質コラーゲンの判定は、アルドステロン／食塩処置を受けた動物では心筋線維症がないことを証拠づけた。しかしながら、アルドステロン／食塩処置ラットに由来する心臓のヘマトキシリン−エオジン染色の検査は、重篤な血管炎症性の病変を証拠づけた。これらの病変は、プロトコール１に記載のものと同一であった。エプレレノンの投与は、血圧を正常化しなかったものの、アルドステロン注入、生理食塩水吸飲、片側腎切除ラットにおけるこの血管炎症性の変化を完全に防止した（図３２）。食物カリウムの上昇は、アルドステロン誘発損傷の発症に有意な効果を及ぼさなかった。これらの動物も、担体を受けているアルドステロン／食塩処置ラットと同等レベルの損傷を示したからである。
【０２６１】
２８日目に血清オステオポンチンレベルを決定し、各群（１％  ＮａＣｌ吸飲ラット、１％  ＮａＣｌ吸飲ラット＋アルドステロン、及び１％  ＮａＣｌ吸飲ラット＋アルドステロン及びエプレレノン）について測定した。図４８は、エプレレノン処置ラットにおける循環オステオポンチンレベルの顕著な減少を示す。
【０２６２】
これら動物由来の心臓では、オステオポンチンの免疫染色も実施した。オステオポンチンは、アルドステロンを受けていない、生理食塩水吸飲、片側腎切除の動物では検出されなかった。しかしながら、アルドステロン注入を受けている動物では、冠状動脈の媒質に、オステオポンチンが明瞭に同定された。エプレレノン処置は、アルドステロン注入ラット由来の心臓でのオステオポンチンの発現を防止した（図３０及び４０）。食物カリウムの増加は、オステオポンチン発現を抑制しなかった。定量的ＲＴ−ＰＣＲによるオステオポンチンｍＲＮＡの決定は、担体を受けているアルドステロン／食塩処置ラットの心臓におけるこのサイトカインの顕著な（７倍）アップレギュレーションを示した（相対ｍＲＮＡ発現：１．７±．２に対し、１２．２５±１．７，Ｐ＜．０００１）。この効果は、エプレレノンにより防止された（相対ｍＲＮＡ発現：アルドステロン／食塩＋担体群に対し、２．５±．６，Ｐ＜．０００１）。心臓でのアルドステロン誘導性血管炎症の発症におけるシクロオキシゲナーゼ−２の役割に一致して、アルドステロン／食塩＋担体処置のラットでは、ＣＯＸ−２  ｍＲＮＡの発現が３倍増加していた（相対ｍＲＮＡ発現：１．２±．１２に対し、３．７±．４６，Ｐ＜．０００１）。オステオポンチン発現に対する効果と同じように、エプレレノンは、アルドステロン／食塩処置ラットにおけるＣＯＸ−２発現の増加を防止した（相対ｍＲＮＡ発現：アルドステロン／食塩＋担体群に対し、１．８±．３６，Ｐ＜．０１、図３１及び３９を参照のこと）。
【０２６３】
上記のデータは、アルドステロンが、高血圧ラットの心臓における血管炎症の表現型に仲介することを示唆する。この表現型は、動脈媒質の血管平滑筋細胞にあって、観察される血管周囲炎症と、それによる冠状動脈及び心筋の虚血／壊死損傷に仲介する可能性がある、サイトカインのオステオポンチンと酵素シクロオキシゲナーゼのアップレギュレーションに関連している。理論に束縛されたくはないが、これが、心不全、冠状動脈疾患、自己免疫若しくはウイルス性の心筋炎、結節性動脈周囲炎、卒中、及び腎硬化症のような疾患に観察される血管変化に仲介する機序であると考えられている。図３３は、オステオポンチンとシクロオキシゲナーゼ−２が冠状動脈壁の類似領域で発現されることを明らかにする。本発明では、理論が何の役割も果たさないが、図３４は、このモデルについて提唱される機序を示す。これらの実施例では、エプレレノン処置は、プロトコール＃１に示されるように、副腎切除と同等の程度で、心臓における血管炎症を防止した。このエプレレノンの効果は、プロトコール＃１で示されたように、収縮期血圧の大きな低下とはほとんど無関係であった。アンジオテンシンＩＩ／食塩−高血圧ラットにおけるエプレレノンの利尿若しくはナトリウム排泄増加効果の不足は、選択的アルドステロン拮抗薬の保護効果が、上皮組織に対するその潜在効果とも無関係であったことを示唆する。さらに、食物カリウムの増加がエプレレノンの効果を模倣し得なかったことは、エプレレノンがそのカリウム節約特性により利益を提供するという可能性を反証する。従って、アルドステロンは、上皮組織の電解質ホメオスタシスにおけるこのホルモンの効果やその血圧に対する効果とは無関係に、冠状血管構造において直接的な有害効果を及ぼす可能性があると我々は提唱する。本発明の実験により示唆されるように、エプレレノンのヒトへの投与は、限定されないが心臓、腎臓、及び脳を含む、血管が分布した臓器においてその抗炎症効果により利益を提供する可能性がある。
【０２６４】
アッセイＣ：さらなる ｉｎ ｖｉｖｏ アルドステロン注入試験
アッセイＢの方法をさらなる試験で拡張した。片側腎臓切除したスプレーグ・ドーリーラットに、飲用１％  ＮａＣｌ−０．３％  ＫＣｌと以下の処置の１つを与えた：担体；アルドステロン注入；又はアルドステロン注入とエプレレノン（１００ｍｇ／ｋｇ／日）の組合せ。アルドステロン／食塩処置は、３０日後、ラットに重篤な高血圧症を誘導したが、これはエプレレノンにより有意に抑制された。各処置群の動物からの心筋組織を処置から７、１４、又は３０日後に試験した。組織病理学分析により、１４日目から始まり、周囲の心筋へ広がって病巣の虚血／壊死変化をもたらす血管炎症性の病変が明らかになった。病変には、好炎症性分子の発現と進行性のアップレギュレーションが先行した。好炎症性分子のアップレギュレーションと関連した血管及び心筋の損傷は、エプレレノン処置により顕著に弱められた。これらのデータは、エプレレノンが血圧を下げるのに有効であり、心臓におけるアルドステロン誘導性の血管炎症損傷に対して末端臓器の保護を提供することを示す。
【０２６５】
動物
体重２３０〜２５０ｇの雄スプレーグ・ドーリーラット（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， インディアナポリス、ＩＮ）を、２２±１℃の周囲温度で、１２時間−明／１２時間−暗の１日周期の部屋に収容した（ｎ＝９６）。到着後１週間、動物を馴らし、実験の開始まで、ＴＥＫＬＡＤ  ２２／５齧歯動物食（Ｈａｒｌａｎ ＴＥＫＬＡＤ， マジソン、ＷＩ）と生水を自由摂取させた。
【０２６６】
実験プロトコール
外科処置に先立って、動物を個別に秤量し、以下の群の１つに入れた：（Ｉ）高食塩対照（担体／正常食／１％  ＮａＣｌ＋０．３％  ＫＣｌ、飲料水、ｎ＝３１、３時点の群）、（ＩＩ）アルドステロン対照（アルドステロン／正常食／１％  ＮａＣｌ＋０．３％  ＫＣｌ、飲料水、ｎ＝２８、３時点の群）、（ＩＩＩ）エプレレノン  １００ｍｇ／ｋｇ／日（アルドステロン／エプレレノン食／１％  ＮａＣｌ＋０．３％  ＫＣｌ、飲料水、ｎ＝３０）。生理食塩水溶液へ塩化カリウムの補充を加え、アルドステロン過剰に関連した潜在的な低カリウム血症を防止した。
【０２６７】
処置
外科処置の時点で、担体（９％  エタノール／８７％  プロピレングリコール／４％  Ｈ２Ｏ）又はｄ−アルドステロン（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ）１．０ｍｇ／ｍＬのいずれか一方を含有するＡｌｚｅｔ  ２００２浸透ミニポンプ（アルツァ社、パロアルト、ＣＡ）を頚部の首筋に皮下挿入した。アルドステロンは０．７５ｇ／時間の用量で投与した。エプレレノンは、ＴＥＫＬＡＤ  ２２／５齧歯動物食（Ｈａｒｌａｎ ＴＥＫＬＡＤ， マジソン、ＷＩ）へ、食餌１ｇにつき１ｍｇの濃度（１００ｍｇ／ｋｇ／日をデリバリーすると計算される）で取込ませた。先の分析作業では、エプレレノンがこの食餌中で安定であること、並びに調製後、均質に得られることが示されている。処置から７、１４、又は３０日後に各群の動物（ｎ＝８〜１３）を屠殺した。
【０２６８】
外科処置法
処置から７又は１４日後に屠殺される動物は、片側腎切除し、Ａｌｚｅｔミニポンプを埋め込んだ。３０日後に処置される動物は、以下の方法に従って、片側腎切除し、Ａｌｚｅｔミニポンプを付け、ラジオテレメトリーユニット（モデル番号  ＴＡ１１ＰＡ−Ｃ４０，データサイエンス社、セントポール、ＭＮ）を埋め込んだ。ＶＭＳ麻酔装置（マトリックス・メディカル社、オーチャードパーク、ＮＹ）を使用してＯ２中でデリバリーされる、５％イソフルラン（ソルベイ・アニマル・ヘルス社、メンドータ・ハイツ、ＭＮ）で動物を麻酔した。この外科処置を通して、１〜２％イソフルランで麻酔を維持した。外科部位を結紮し、ノルバサン（ｎｏｌｖａｓａｎ）で洗い落とし、ベタジン（ｂｅｔａｄｉｎｅ）を噴霧した。１１号小刀ブレードを使用して、胸郭の基部から陰部までの皮膚を吻側−尾側切開した。腹壁の筋肉を通して第二の切開をして腹腔を曝露した。尿道、腎動脈、及び左腎静脈を単離し、４−０シルクで縛って血行を止め、腎臓を切除して捨てた。組織開創器を使用して臓器を慎重に転置し、腹大動脈を曝露した。腹大動脈の腸骨動脈への分岐部に対して丁度吻側の１．５ｃｍ切片から過剰な結合組織を除去し、４−０シルクを使用して大動脈に隣接したアンカーをつくった。次いで、きれいにした領域の両端にミクロ血管クリップを置き、過剰な血流を止めた。曲がった２１ゲージ針を使用して、腹大動脈に貫通させた。ラジオテレメトリーユニットのカニューレを挿入し、４−０シルクアンカーを使用して大動脈中に安定化させた。臓器を元の位置に戻し、テレメトリーユニットを臓器上に置いた。４−０シルクを用いた非断続縫合パターンを使用して腹壁を閉じてから、４−０シルクを使用する断続縫合パターンで皮膚を閉じた。縫合部分のあたりで１００μＬの麻酔薬、塩酸メルカイン（サノフィ・ウィンスロップ・ファーマシューティカルズ、ニューヨーク、ＮＹ）を動物に注射し、抗生物質のマンドール（イーライリリー社、インディアナポリス、ＩＮ）の注射（ｉ．ｍ．）をした。術後のケアには、胸骨の横臥が再確立されるまで、麻酔からの回復の間、加熱パッド上で動物をモニターすることが含まれた。
【０２６９】
不安の徴候と外科部位での感染について、動物を毎日モニターした。外科手術後に継続した不快感を示す動物は、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．のブフレノルフィン（Ｂｕｐｈｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ，Ｒｉｃｋｅｔｔ ＆ Ｃｏｌｍａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． リッチモンド、ＶＡ）で処置した。次いで、動物に生水とＴＥＫＬＡＤ  ２２／５齧歯動物食（Ｈａｒｌａｎ ＴＥＫＬＡＤ， マジソン、ＷＩ）を与えた。
【０２７０】
血圧分析
ラジオテレメトリー化した動脈血圧を、ＤＡＴＡＱＵＥＳＴ  Ａ．Ｒ．Ｔバージョン１．１−ゴールド・ソフトウェア（データサイエンス・インターナショナル、セントポール、ＭＮ）を用いて計算した。データ点は、各動物につき、５分ごとに１０秒の読み取りで設定した収集率で、２４時間にわたり収集した。使用した２４時間は、午前６時から午前６時までである。
【０２７１】
屠殺
各実験時点の中止時では、動物をペントバルビタール（６５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．，シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ）で麻酔させ、メトラーＰＭ６０００秤り（メトラー・トレド社、ハイツタウン、ＮＪ）で秤量した。腹腔を開いて腹大動脈を曝露した。１６ゲージ針を腹大動脈へ挿入し、動物を１２ｃｃシリンジで採血した。この血液サンプルを、薬物レベル分析用のガラス製血清採取管（テルモメディカル社、エルクトン、ＭＤ）へ直ちに移した。サンプルは、サンプル採取が完了するまで、湿った氷上に置き、４℃、３０００回転／分で１５分遠心分離させた。
【０２７２】
採血の後で、心臓と腎臓を単離し、除去し、冷リン酸緩衝化生理食塩水で濯ぎ、水分を吸い取って乾燥させた。腎臓は、直ちにレーザーブレードを用いて長軸で分岐させ、１０％中性緩衝化ホルマリン（ＮＢＦ，リチャード−アレン・サイエンティフィック、カラマズー、ＭＩ）に入れた。心臓については、右心室（ＲＶ）を左心室（ＬＶ）から切り離し、両心室をメトラーＡＥ１６３秤り（メトラー・トレド社、ハイツタウン、ＮＪ）で秤量し、ＲＶを１０％  ＮＢＦに入れた。ＬＶ尖の２ｍｍ冠状縫合板（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｌａｂ）を除去し、遺伝子発現の分析のためにドライアイス／イソペンタンで凍結させ、ＬＶの残り部分は、固定化のために１０％  ＮＢＦに入れた。固定化から３〜４日後に最終の湿式トリミングを完了させ、ヒドロキシプロリン分析のために第二の２ｍｍ冠状縫合板を除去し、組織学のために赤道領域から第三の２ｍｍ冠状縫合板を除去した。
【０２７３】
組織の処理及び染色
心臓の赤道領域を、自動組織プロセッサー（Ｈｙｐｅｒｃｅｎｔｅｒ ＸＰ， Ｓｈａｎｄｏｎ／Ｌｉｐｓｈａｗ Ｉｎｃ．， ピッツバーグ、ＰＡ）を用いてパラフィンへ定常的に処理し、尖端側を下にして、新鮮なパラフィンへ埋め込んだ（シャンドン・エンベッディング・センター、シャンドン／リップショー社）。Ｌｅｉｃａ  ＲＭ２０３５回転ミクロトーム（ライカ社、ヒューストン、テキサス）を使用して、それぞれの組織の塊から５〜１０μｍの切片を切出し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ 顕微鏡スライド（フィッシャー・サイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）上に固定した。１０μｍの切片を、コラーゲン特異染色液である、０．１％（ｗ／ｖ）シリウスレッドＦ３ＢＡ（Ｃ．Ｉ．＃３５７８０，Ｐｆａｌｔｚ ＆ Ｂａｕｅｒ， Ｉｎｃ． ウォーターベリー、ＣＮ）（６）含有ピクロシリウスレッドＦ３ＢＡ（飽和ピクリン酸（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ））で染色した。固定化した組織を水で水和した。引き続き、スライドを、０．２％（ｗ／ｖ）ホスホモリブデン酸（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ）を含む蒸留水中で１５分間インキュベートし、０．１％  ピクロシリウスレッドＦ３ＢＡ染色液へ１１０分間移し、９５％エタノールｗ／１％酢酸（ｖ／ｖ）に入れてから、１００％エタノール中での１分間のインキュベーションを２回行い、キシレン中で１分間洗浄した。Ｐｅｒｍｏｕｎｔ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（フィッシャー・サイエンティフィック）を使用して、スライドを１号カバーガラスで覆った。各動物につき、５μｍ切片で固定化した２つのスライドを切り出した。一方のスライドをＨ＆Ｅ染色用に、他方を過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色用に処理した。Ｈ＆ＥとＰＡＳは、心臓の病理学的スコア化のために使用した。
【０２７４】
組織病理学分析
心筋損傷の半定量化は、若干の変更を加えて、すでに記載のように実施した（７）。簡潔に言うと、心筋損傷のレベルを０〜４の尺度を使用してスコア化した。スコア０は「損傷なし」を表した。スコア１は「心筋細胞の損傷を伴わない血管及び血管周囲の炎症性病変の存在」を表した。心筋壊死の明瞭な領域が１つ観察される場合にスコア２を与えた。心筋壊死は、核萎縮若しくは核溶解、細胞質の非収縮性縁波形（ｍａｒｇｉｎａｌ ｗａｖｙ）線維及び過好酸球増加症、又は心筋細胞膜の破壊の明瞭な証拠のような心筋細胞中の壊死変化の存在として定義した。２つ以上の分離した壊死領域（２つの異なる梗塞領域の存在を示唆する）が見出された場合、心臓にスコア３を与えた。左心室の５０％より多くを傷害する広汎な壊死の領域を示す心臓へスコア４を割り当てた。
【０２７５】
映像分析
ピクロシリウスレッドＦ３ＢＡ染色したスライドを使用して、ビデオ測定１５０映像分析システム（Ｏｎｃｏｒ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ， ＭＤ）で間質コラーゲンを定量した。簡潔に言うと、ニコン・オプティフォト（Ｏｐｔｉｐｈｏｔ）顕微鏡（ニコン社）へ付いたニコンＥ  プラン１０／０．２５；１６０／−オブジェクティブ（Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）（ニコン社、ガーデンシティ、ＮＹ）を使用して、映像をとらえた。東芝３  ＣＣＤカラービデオカメラ（モデル＃ＩＫ−Ｔ３０Ｔ，東芝、日本）により、ＲＧＢフォーマットの映像を顕微鏡からＶ１５０ビデオボード付３８６コンピュータへ中継した。Ｖ１５０ビデオボード／Ｖ１５０ソフトウェア・アプリケーション（Ｏｎｃｏｒ Ｉｎｃ．）は、３０５ｘの倍率で、ソニートリニトロンカラービデオモニター（モデル＃ＰＶＭ−１３４２Ｑ，ソニー、東京、日本）のディスプレイ及び分析用ＨＩＳ（色相、明暗度、彩度）フォーマットへＲＧＢ映像を変換した。映像がイメージモニターに表示されると、測定されるピクセルの色相、明暗度、及び彩度を限界化（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）と呼ばれる方法により明確化した。次いで、Ｖ１５０アプリケーションにより、限界化閾値へ入ったピクセルだけを測定した。このシステムをミクロメートルの尺度で較正し（ＥＭサイエンス、ＦＴ．ワシントン、ＰＡ  １９０３４）、ｍｍ２若しくはμｍ２でデータを表現した。それぞれの測定後にデータをＡＳＣＩＩファイル形式で自動的に保存し、最終合計用にマイクロソフト・エクセル・バージョン７．０へ書き換えた。
【０２７６】
免疫組織化学
５μｍの切片をキシレン中で脱パラフィン化し（５〜１０分のインキュベーションを２回）、以下のようなエタノール中での３分間のインキュベーションにより再水和した：１００％エタノール中での２回のインキュベーションに次いで、９５％アルコール中での２回のインキュベーション、さらに７０％アルコール中での１回のインキュベーション。水和したならば、生水中で１分間、蒸留水中で１分間、切片を濯いだ。スライドを３．０％  Ｈ２Ｏ２中に１５分置いてから、蒸留水で５分間濯ぐことにより、内因性過酸化物の活性を阻止した。クエン酸（ｐＨ６．０）を使用して、抗原回復のためにスライドを処理した。スライドを沸騰するまで加熱し、２５℃で２０分冷やし、蒸留水中で濯いだ。ＤＡＫＯ自動染色器（ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ）（ＤＡＫＯコーポレーション、カーピンテリア、ＣＡ）を使用してスライドを染色した。染色に先立って、スライドを濯ぎ、阻止緩衝液中で２０分インキュベートした。阻止緩衝液についてはベクタスタチン（Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ）ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）に記載され、１０ｍＬ  ＴＮＢ（ＮＥＮ  ＴＳＡ  ビオチンシステムキット、カタログ番号：ＮＥＬ７００Ａ，ＮＥＮライフサイエンス・プロダクツ、ボストン、ＭＡ）と３滴の正常血清（二次抗体に相当する）を含有する。
【０２７７】
染色に使用される一次抗体には：１００倍希釈オステオポンチン（マウスモノクローナル、カタログ番号：ＭＰＩＩＩｂ１０、発生研究ハイブリドーマ・バンク、アイオワ大学、アイオワシティ、ＩＡ）；５００倍希釈ＥＤ−１（抗マクロファージ糖タンパク質、マウスモノクローナル、ＭＡＢ１４３５、ケミコン・インターナショナル社、テメキュラ、ＣＡ）；３００倍希釈ＣＤ−３（抗Ｔ細胞、ウサギポリクローナル−アフィニティ精製抗体、Ａ０４５２、ＤＡＫＯコーポレーション、カーピンテリア、ＣＡ）；１００倍希釈ＩＣＡＭ−１（ヤギポリクローナル−アフィニティ精製、Ｍ−１９：ｓｃ−１５１１、サンタクルーズ・バイオテクノロジー、サンタクルーズ、ＣＡ）；１００倍希釈ＶＣＡＭ−１（ヤギポリクローナル−アフィニティ精製、Ｃ−１９：ｓｃ−１５０４、サンタクルーズ・バイオテクノロジー）が含まれた。スライドを一次抗体とともに６０分インキュベートしてから、最終濃度０．５μＬ／ｍＬのビオチニル化抗体と２５℃で３０分インキュベートした。ベクタスタチンＡＢＣ−ＡＰキット（ベクターラボラトリーズ）とジアミノベンチジン染色（ＤＡＫＯコーポレーション、カーピンテリア、ＣＡ）で染色を視覚化した。スライドを水で濯ぎ、ヘマトキシリンで約３０秒間対比染色した。イソタイプ適合ＩｇＧ（シグマケミカル、セントルイス、ＭＯ）を一次抗体の陰性対照として使用した。
【０２７８】
オステオポンチンｍＲＮＡの ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
ラットオステオポンチンの配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号：ＮＭ００８６０８−１）に基づいて、ＲＮＡプローブを産生した。簡潔に言うと、ラットオステオポンチンのｃＤＮＡフラグメントを、以下のプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより産生した：前方プライマー、５‘−ＴＧＧＣＡＣＡＴＴＴＧＴＣＴＴ；逆プライマー、３’−ＡＧＣＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣ。このｃＤＮＡフラグメントを、ＴＡクローニングキット（インビトロゲン・コーポレーション、カールスバッド、ＣＡ）を使用して、ＰＣＲＩＩプラスミドへ挿入した。ｒＲＮａｓｉｎ（２Ｕ）、ＤＮアーゼ（０．５Ｕ）、ＴＥ緩衝液（１Ｘ）、ｒＧＴＰ（１０ｍＭ）、ｒＣＴＰ（１０ｍＭ）、ｒＡＴＰ（１０ｍＭ）、ｒＵＴＰ（１０ｍＭ）（プロメガ、マジソン、ＷＩ）、５μＬ（５０μＣｉ）３３Ｐ−ＵＴＰ（Ｅｌｋｉｎ Ｐｅｌｍｅｒ， ボストン、ＭＡ）及び、適正なＲＮＡポリメラーゼ（Ｓｐ６  ＲＮＡポリメラーゼ（２０Ｕ  Ｌ）；Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（１５Ｕ  Ｌ），プロメガ）を含有する１００μＬの ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写反応液において、３７℃、６０分でプローブを標識化した。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−５０ ミクロ濃縮器（Ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ）（アミコン、ベッドフォード、ＭＡ）を使用して、この反応液からフリーのラベルを除去した。切片をキシレン中で脱パラフィン化し、上記のようにグレード付けしたエタノール溶液で再水和させ、４℃で１０分間、４％パラホルムアルデヒド（ＥＭＳ，Ｆｔ．ワシントン、ＰＡ）で固定化した。次いで、プロテイナーゼＫ（５ｍｇ／ｍＬ；１０分、３７℃、ロッシュ、インディアナポリス、ＩＮ）で組織を消化し、０．５ＸＳＳＣ緩衝液（生理食塩水−クエン酸ナトリウム緩衝液）（１０分）で洗浄した。上記の再水和とは逆の方法で、グレード付けしたエタノールの系列で連続脱水和した後にプレハイブリダイゼーションを実施してから、４２℃で２時間、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％  ホルムアミド、２ＸＳＳＣ、１０％  硫酸デキストラン、ｖ／ｖ）中でインキュベーションをした。ｔＲＮＡ（５０μｇ／ｍＬ，シグマ、セントルイス、ＭＯ）と適正な標識化プローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液を使用して、ハイブリダイゼーションを５５℃で一晩実施した。次いで、ハイブリダイズした組織を、２ＸＳＳＣ緩衝液、０．１ＸＳＳＣ−ＥＤＴＡ緩衝液（０．１ＸＳＳＣ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、及び２ＸＳＳＣ緩衝液で、１時間４０分、連続的に洗浄した。最後に、ＮＨ４ＯＡｃを含有する、上記のようなグレード付けエタノール系列でスライドを脱水和（それぞれ２分間）し、室温で１．５時間、真空乾燥器中で乾燥させた。組織をリンのスクリーンに一晩曝露した。写真用乳剤（コダック、ロチェスター、ＮＹ）でスライドを被覆し、現像に先立って、４℃で３〜５週間、曝露した。現像したスライドをヘマトキシリンとエオジンで対比染色した。
【０２７９】
ＴａｑＭａｎ分析の原理
アプライド・バイオシステムズの７７００配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ）を使用する蛍光産生（フルオロジェニック）５’−ヌクレアーゼアッセイ（Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ）は、ある遺伝子特異的な色素標識化オリゴヌクレオチドプローブの蛍光の増加をモニターすることによって、特定遺伝子のリアルタイム検出／定量化を可能にした。標的及び参照の遺伝子のプローブを、５’末端では６−カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）で、３’末端では６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）消光色素で標識化した。プローブが標的遺伝子へアニールすると、６ＦＡＭの蛍光はＴＡＭＲＡがごく近傍にあるために妨げられた。Ｔａｑポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性は、標的配列からプローブを転置することによってオリゴヌクレオチドプローブからこの色素を遊離させ、存在する標的メッセージの量に正比例した蛍光励起をもたらした。アプライド・バイオシステムズからの配列検出システム・ソフトウェアを使用して、データ分析を実施した。
【０２８０】
ＴａｑＭａｎのプライマー及びプローブ：ＴＧＦ１、ＡＮＰ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ
オリゴプライマー分析ソフトウェア、バージョン５．０（ナショナル・バイオサイエンス社（ＮＢＩ）−Ｗｏｊｃｉｅｃｈ Ｒｙｃｈｌｉｋ， カスケード、ＣＯ）を使用して、プライマーとプローブを設計した。プライマーはライフ・テクノロジーズ（グランドアイランド、ＮＹ）により合成し、プローブはアプライド・バイオシステムズにより合成した。プライマー／プローブのセットは、分析すべきラット遺伝子の既知配列から設計した。すべての標的遺伝子の値（ｖａｌｕｅｓ）を、構成的に発現されるシクロフィリンの参照遺伝子へ正規化した。プライマー／プローブセットの配列は、表８に見出し得る。
【０２８１】
【表２７】
2004518611.tif 000043
ＲＮＡ単離：ＴＧＦ、ＡＮＰ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ
製造業者（Ｌｅｅｄｏ メディカル・ラボラトリーズ社、ヒューストン、テキサス）の指示に従って、１．５ｍＬ  ＲＮＡ−ＳＴＡＴ６０を使用して、凍結（−７０℃）左心室（ＬＶ）組織（約１０〜２０ｍｇ）からＲＮＡを抽出した。簡潔に言うと、５ｍｍプローブの付いた組織ホモジェナイザー（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ Ｔ８ ホモジェナイザー、ＩＫＡワークス社、ウィルミントン、ＮＣ）を使用して、組織をホモジェナイズした。ホモジェナイゼーションの後で、等量の分子グレードクロロホルム（シグマケミカル社、セントルイス、Ｍｏ．）を、室温で１０分間、断続的に混合しながらインキュベートした。サンプルを１２，０００ｇで１０分間遠心分離させ、等量の分子グレードイソプロパノール（シグマケミカル社）を加えることによって上層からＲＮＡを沈殿させてから、−８０℃で一晩インキュベートした。１２，０００ｇでの遠心分離によりＲＮＡをペレット化し、７５％エタノールで洗浄し、ヌクレアーゼフリー水（プロメガ、マジソン、ＷＩ）に溶かした。ＲＮＡを希釈し、濃度及び純度を分光光学的に分析した（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．９〜２．０が、２〜５μｇ  ＲＮＡの平均量）。
【０２８２】
逆転写：ＴＧＦ、ＡＮＰ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ
１５％ヌクレアーゼフリー水（プロメガ、マジソン、ＷＩ）、１Ｘ  ＲＴ緩衝液（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ＮＹ）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（ライフテクノロジーズ）、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ（ＰＥバイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ）、２．５μＭ  オリゴｄ（Ｔ）１５（オリゴ・セラピューティクス社、ウィルソンヴィル、ＯＲ）、４０ユニットのＲＮＡｓｉｎ（プロメガ）、及び２００ユニットの ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）を含有する２０μＬの最終量へ４００ｎｇ  ＲＮＡ（４μＬ）を加えることによって、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。この反応は、正確な反応温度を確実にするために、キャップ付き薄壁反応管において実施した。ＧｅｎｅＡｍｐ  ９６００  熱サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）（アプライド・バイオシステムズ）を使用して、以下のプロトコールに従って、反応を実施した：３７℃で１時間、９５℃で５分間、及び４℃で１０分間。
【０２８３】
ＴａｑＭａｎ分析：ＴＧＦ１、ＡＮＰ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ
各ＰＣＲ反応液は以下を含有した：３８．５％ヌクレアーゼフリー水（プロメガ）、１ＸＰＣＲ緩衝液ＩＩ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５Ｕ／μＬ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＰＣＲコア試薬キット、Ｎ８０８−０２２８、アプライド・バイオシステムズ）、各３００ｎＭの前方及び逆プライマー（ライフテクノロジーズ）、２００ｎＭ  プローブ（アプライド・バイオシステムズ）、及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＣＴＰ（アプライド・バイオシステムズ）を含有する２２．５μＬのＰＣＲ混合物へ２．５μＬ（５０ｎｇ）の各ｃＤＮＡを加える。ＭｉｃｒｏＡｍｐ 光学キャップ付き ＭｉｃｒｏＡｍｐ 光学試験管（アプライド・バイオシステムズ）において単回反応を開始し、７７００配列検出器中へロードした。以下のプロトコールをすべての反応に適用した：９５℃で１０分間（ポリメラーゼ活性化）、９５℃で１０秒を４０サイクル（変性）、及び５７℃で１分間（アニーリング）。
【０２８４】
Ｔａｑｍａｎのプライマー及びプローブ：ＣＯＸ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１
７７００配列検出システムとともに供給されるプライマー・エクスプレス・ソフトウェアを使用してすべてのプライマーとプローブを設計し、アプライド・バイオシステムズにより合成した。全ＲＮＡ（２００ｎｇ〜３２０ｐｇ）の５倍希釈液を使用する標準曲線を作成し、実験サンプルの分析に先立って、ＴａｑＭａｎ反応で設定される各プライマー／プローブの効率を決定した。プライマー／プローブのセットは、分析すべきラット遺伝子の既知配列から設計した。すべての標的遺伝子の値（ｖａｌｕｅｓ）を、構成的に発現されるシクロフィリンの参照遺伝子へ正規化した。プライマー／プローブセットの配列は、表８に見出し得る。
【０２８５】
ＲＮＡ単離：ＣＯＸ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１
全ＲＮＡ単離キット（アンビオン社、オースチン、ＴＸ）を使用して、凍結（−８０℃）ラット心臓組織からＲＮＡを抽出した。−８０℃へ冷やしておいた、ステンレススチールの乳鉢と乳棒を使用して組織を粉砕し、３〜１０ｍＬの冷えた変性緩衝液を含有するｄｏｕｎｃｅホモジェナイザー（Ｋｏｎｔｅｓ， Ｖｉｎｅｌａｎｄ， ＮＬ）へ移した。組織をホモジェナイズし、無菌の１５ｍＬポリプロピレン遠心分離管へ移した。等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、サンプルを１分間激しく振り混ぜ、氷上で少なくとも１５分間インキュベートした。サンプルを１０，０００ｇで３０分遠心分離させた。水相を除去し、１／１０量の酢酸ナトリウム溶液（３．０Ｍ  ＮａＯＡｃ，ｐＨ４．５）を加え、サンプルを１０秒間振り混ぜるか、又はひっくり返し、酸−フェノール（イソアミルアルコールで予め混合した）：クロロホルム（５：１、アンビオン社）を最初のサンプル量に等しい量で加えた。サンプルを１分間激しく振り混ぜ、氷上で１５分間インキュベートし、１０，０００ｇで３０分遠心分離させた。水相を除去し、真新しいポリプロピレン管へ入れた。等量のイソプロパノール（シグマ、セントルイス、ＭＯ）を加え、サンプルを混合し、−２０℃で一晩インキュベートした。サンプルを１０，０００ｇで３０分間遠心分離させ、上澄液を除去し、ＲＮＡペレットをＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリー水に再懸濁した。サンプルを−８０℃で少なくとも２時間凍結し、湿った氷上で融かし、定量のために希釈した。
【０２８６】
ゲノムＤＮＡを除去するＤＮアーゼ消化と炭水化物を除去するＬｉＣｌ沈殿により、全ＲＮＡをさらに精製した。各ＲＮＡ（１００μｇ）を、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液において、１ユニットのＤＮアーゼ（ロッシュ・ジアグノスティクス、インディアナポリス、ＩＮ）と１０ユニットのＲＮアーゼ阻害剤（アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティ、ＣＡ）とともに、３７℃で４５分間インキュベートした。ＲＮＡクリーンアップ用ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉのプロトコール（キアジェン、バレンシア、ＣＡ）を使用して、ＤＮアーゼと緩衝液を除去した。次いで、サンプル量の半分に等しい量の７．５Ｍ  ＬｉＣｌ／５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（アンビオン社、オースチン、ＴＸ）を用いてＲＮＡを沈殿させ、−２０℃で一晩インキュベートし、４℃、１３〜１６，０００ｇで３０分、遠心分離させた。全ＲＮＡを、−８０℃で少なくとも２時間凍結させ、融かし、希釈し、濃度と純度を分光光学的に分析した。
【０２８７】
ＴａｑＭａｎ分析：ＣＯＸ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１
ＴａｑＭａｎ反応を以下のように実施した：１０μＬ（２００ｎｇ）の全ＲＮＡ（ＤＮアーゼ処理し、ＬｉＣｌ沈殿させた）を、１２．５μＬの（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含まない）２Ｘ  ワンステップ（Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ）ＰＣＲマスター・ミックス（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ＋ｄＵＴＰ、受動レファレンス、及び最適化した緩衝液成分を含有する）、０．６２５μＬの４０Ｘ  ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ 及びＲＮアーゼ阻害剤ミックス、０．６２５μＬの２０μＭ  前方プライマー、０．６２５μＬの２０μＭ  逆プライマー、０．５μＬの５μＭ  ＴａｑＭａｎプローブ、及び０．１２５μＬのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリー水を含有するＲＴ−ＰＣＲ反応混合物の１５μＬへ加えた。ＭｉｃｒｏＡｍｐ 光学キャップ若しくは接着カバー（アプライド・バイオシステムズ）が付いた ＭｉｃｒｏＡｍｐ 光学９６ウェル反応プレートに同一２検体で反応を開始し、７７００配列検出器中へロードした。以下のプロトコールをすべての反応に適用した：４８℃で３０分間（逆転写）、９５℃で１０分間（逆転写酵素の不活性化とポリメラーゼ活性化）、９５℃で１５秒を４０サイクル（変性）、及び６０℃で１分間（アニーリング）。
【０２８８】
ヒドロキシプロリンアッセイ
かつて記載された（４）ように、酸化ヒドロキシプロリンとｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドとの反応を定量する比色アッセイにより、心筋のヒドロキシプロリン濃度を測定した。簡潔に言うと、Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ 加熱ブロック（ピアス、ロックフォード、ＩＬ）を使用して、組織（１８０〜２５０ｍｇ）を６０℃で１８時間乾燥させ、秤量した。Ｒｅａｃｔｉ−Ｔｈｅｒｍ 加熱ブロック中で、乾燥させた組織と陽性コラーゲン対照（ウシコラーゲンＩ型、シグマ、セントルイス）を、１５０℃で３時間、２ｍＬ  ６Ｎ  ＨＣｌで加水分解した。窒素ガスの下で酸を蒸発させ、４ｍＬイソプロパノールの存在下、１ｍＬのクエン酸−酢酸緩衝液（０．７Ｍ  ＮａＯＡｃ，０．２Ｍ  クエン酸塩、４５ｍＭ  クエン酸、ｐＨ６．０）中でサンプルを再水和し、０．４５μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ  ＬＣＲフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）に通して濾過した。
【０２８９】
６０μＬの加水分解サンプル若しくはコラーゲン標準品を３５０μＬのクエン酸−酢酸−イソプロパノール緩衝液（４０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを含むクエン酸−酢酸緩衝液）と１００μＬの３００ｍＭ  クロラミンＴ（Ｊ．Ｔ．ベイカー、フィリップスバーグ、ＮＪ）とともに、２５℃で５分間インキュベートすることによって、ヒドロキシプロリン含量を測定した。ヒドロキシプロリンの視覚化及び定量のためにエーリッヒ試薬（１．２５ｍＬ，８０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを含む７０％過塩素酸中、３．５Ｍ  ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド）を加えた。サンプルを６０℃で３０分間インキュベートし、室温へ冷やし、吸光度を５５８ｎｍでモニターした。新たに作成したｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（シグマ、セントルイス、ＭＯ）の標準曲線から、ヒドロキシプロリン含量を測定した。サンプルと標準品はすべて同一２検体で実施した。
【０２９０】
統計分析
データは、片側分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析した。群内の正規性と群間分散の一様性の前提が必ずしも満たされなかったので、生データの順位変換値に基づいて分析を実施した（ノンパラメトリック分析）。平均値間の計画比較にはα＝０．０５レベルの有意性を使用した。群間の計画比較には最小有意差（ＬＳＤ）法を使用した。ＳＡＳ統計ソフトウェア・パッケージ（ＳＡＳ  ＰＣ，バージョン６．１２、ＳＡＳインスティテュート、ケアリー、ＮＣ）のＰＲＯＣ  ＴＴＥＳＴを使用してデータを分析した。データはすべて平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として報告した。
【０２９１】
動物の除外
実験の間に３匹の動物が死亡した：ラット＃１７（アルドステロン＋食塩群、注入２４日目に死亡を確認）、ラット＃６４（アルドステロン＋食塩群、外科手術後に死亡）、及びラット＃５（担体群、外科手術後に死亡）。多数の変数がその割り当てられた処置群を表さない（例えば、その処置群の平均値から３倍以上の標準偏差があること）とみなされた場合、さらに動物を除外した。そのような３匹の動物を試験から除外した：ラット＃５７（７日目のプロトコールから、アルドステロン＋食塩群）、ラット＃９７（１４日目のプロトコールから、アルドステロン＋食塩群）、及びラット＃２４（３０日目のプロトコールから、エプレレノン  １００ｍｇ／ｋｇ／日の群）。上記３匹の動物は、処置群の平均値から３倍以上の標準偏差である炎症マーカー遺伝子（ＣＯＸ−２、オステオポンチン、ＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１）の発現を示した。ラット＃２４はまた、テレメトリーユニットの機能不全の結果としても除外した。これらの動物について作成された数値は、データ表の他の動物のデータとは別に、表９．１０〜表９．１９に示す。
【０２９２】
【表２８】
2004518611.tif 000044
【０２９３】
【表２９】
2004518611.tif 000045
【０２９４】
【表３０】
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【０２９５】
【表３１】
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【０２９６】
【表３２】
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【０２９７】
【表３３】
2004518611.tif 000049
【０２９８】
【表３４】
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【０２９９】
【表３５】
2004518611.tif 000051
【０３００】
【表３６】
2004518611.tif 000052
【０３０１】
【表３７】
2004518611.tif 000053
【０３０２】
【表３８】
2004518611.tif 000054
【０３０３】
【表３９】
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【０３０４】
【表４０】
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【０３０５】
【表４１】
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【０３０６】
【表４２】
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【０３０７】
【表４３】
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【０３０８】
【表４４】
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【０３０９】
【表４５】
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【０３１０】
【表４６】
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【０３１１】
【表４７】
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【０３１２】
【表４８】
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【０３１３】
【表４９】
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【０３１４】
【表５０】
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【０３１５】
【表５１】
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【０３１６】
【表５２】
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【０３１７】
【表５３】
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【０３１８】
【表５４】
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【０３１９】
【表５５】
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【０３２０】
【表５６】
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【０３２１】
【表５７】
2004518611.tif 000073
結果
血圧
血圧は、担体＋食塩対照では、実験を通して正常であった（表１０）。アルドステロン＋食塩は、経時的に血圧の進行増加を誘導した。エプレレノン＋アルドステロン＋食塩を受けた動物では、８〜３０日目で収縮期血圧が有意に低下した。しかしながら、担体＋食塩対照と比較すると、血圧は上昇したままだった。
【０３２２】
【表５８】
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体重、心筋肥大、及びＡＮＰ
アルドステロン＋食塩処置を受けた動物では、担体＋食塩正常血圧対照に比較して、７、１４、及び３０日目に、体重が有意に低かった（表１１〜１３）。アルドステロン＋食塩処置により誘導された体重の減少は、エプレレノンの投与により、３０日目に有意に緩和された（表１１；図４５）。アルドステロン＋食塩処置に反応して、有意な左心室及び右心室の肥大が発生した。左心室肥大はアルドステロン＋食塩処置の７日目から明らかであった（表１１）が、右心室肥大が明らかになったのはアルドステロン＋食塩処置の３０日目以後である（表１３）。エプレレノンは、アルドステロン＋食塩により誘導される、心室の絶対重量や心室重量／脛骨長さの比に影響を及ぼさなかった（表１１〜１３）。アルドステロン＋食塩で処置した動物では、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）ｍＲＮＡレベルの有意な上昇も観察された。このＡＮＰ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションがエプレレノンにより有意に抑制されたのは、処置の３０日目以後であって、１４日目からではない（表１３）。
【０３２３】
【表５９】
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【０３２４】
【表６０】
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【０３２５】
【表６１】
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心筋線維症
間質コラーゲン量分画とヒドロキシプロリンレベルは、実験群間でどの時点でも統計的に差がなかった（表１４〜１６）。アルドステロン＋食塩の処置とアルドステロン＋エプレレノン＋食塩の処置では、担体＋食塩対照と比べて、３０日目にＩ型コラーゲンメッセージのわずかな増加が検出された（表１６）。ＩＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡレベルは、どの時点でも有意に増加しなかった（表１４〜１６）。
【０３２６】
【表６２】
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【０３２７】
【表６３】
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【０３２８】
【表６４】
2004518611.tif 000080
心筋の組織病理学
心筋組織の損傷を、半定量スコアリング・システムを使用して、７、１４、及び３０日の処置後に評価した。担体＋食塩対照由来の心臓は、どの時点でも、組織学的に正常であった。アルドステロン＋食塩を受けたラット由来の心臓では、処置の７日目では、血管又は心筋の病変が同定されなかった（表１４）。対照的に、処置の１４日目からは、動脈及び心筋の病的変化が観察された（表１５及び１６）。アルドステロン＋食塩処置の１４日目と３０日目では、動脈及び心筋の定性的な変化は同様であったが、その頻度と重篤性は、経時的に増加した。図４４に図示されるように、エプレレノンの投与は、どの時点でも心筋損傷を顕著に緩和した（表１４〜１６）。
【０３２９】
炎症性メディエーターの遺伝子発現
多数の好炎症性分子の発現レベルを、定量的Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ分析を使用して評価した（表１７〜１９）。シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）及び単球化学誘引タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の発現レベルは、アルドステロン＋食塩処置により同じようにどの時点でも有意に増加した。オステオポンチンの発現も、アルドステロン＋食塩処置の１４日目（約６倍）と３０日目（約１３倍）から、顕著にアップレギュレートされた（表１８〜１９）。トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）のｍＲＮＡレベルは、検査したどの時点でもアップレギュレートされなかった。細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）のｍＲＮＡ発現は、アルドステロン＋食塩処置の１４及び３０日目でアップレギュレートされたが、増加はわずかであった（表９〜１０）。血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）の遺伝子発現はアルドステロン＋食塩処置の３０日目で２倍増加したが、この増加は統計的有意差に至らなかった（表１９）。すべてのマーカー遺伝子の発現は、アルドステロン＋食塩で処置した動物での遺伝子発現と比べると、エプレレノンにより有意に抑制された（図４６）。
【０３３０】
【表６５】
2004518611.tif 000081
【０３３１】
【表６６】
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【０３３２】
【表６７】
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免疫組織化学
アルドステロン＋食塩で誘導される好炎症反応の分子分析を、免疫組織化学分析を使用してさらに特徴付けた。内皮へ接着し、血管周囲スペースへ浸潤する細胞の大部分は、単球／マクロファージ抗体（ＥＤ−１）でポジティブに、Ｔ細胞抗体（ＣＤ−３）でネガティブに染色された。担体＋食塩対照由来の心臓でのオステオポンチン染色の不在と比較すると、アルドステロン＋食塩処置ラット由来の心臓では有意なオステオポンチンの発現が明らかであった。オステオポンチンの発現は、影響を受けた内側（ｍｅｄｉａｌ）細胞と影響を受けなかった冠状動脈の一部に主に局在化していたが、血管周囲スペース中の一部マクロファージと心筋壊死の領域にも存在した。心筋細胞では、有意なオステオポンチン発現の証拠は見出せなかった。ＩＣＡＭ−１染色は内皮細胞と血管周囲スペースで同定されたが、ＶＣＡＭ−１は、主に内皮細胞で発現していた。エプレレノンの投与は、アルドステロン＋食塩処置で誘導される、評価したすべてのマーカータンパク質についての心筋組織中の染色を顕著に鈍化させた。
【０３３３】
オステオポンチンｍＲＮＡの ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを実施して、心筋組織におけるオステオポンチン発現を位置決定した。オステオポンチンｍＲＮＡの大部分は冠状動脈の内側細胞に見出されたが、オステオポンチンのメッセージは、血管周囲細胞と虚血及び壊死の領域に浸潤している細胞でも同定された。オステオポンチンｍＲＮＡは、心筋細胞や影響を受けていない間質領域では明らかでなかった。
【０３３４】
結論
ラットを、食塩の存在下にアルドステロンで処置すると、血管炎症と心臓組織損傷が誘導された。アルドステロン＋食塩処置により誘導されるこの損傷は、好炎症性分子のアップレギュレーションにより特徴づけられる炎症反応に先行された。エプレレノンは、この初期の血管炎症反応と後続の心筋損傷を顕著に緩和した。
【０３３５】
アテローム性硬化症の予防を含む、心臓血管系の病気の予防の評価に適正である、他のいくつかの動物モデルが利用可能である。Ｓｔｅｈｂｅｎｓ， Ｐｒｏｇ． Ｃａｒｄ． Ｄｉｓ．， ＸＸＩＸ， １００７−２８ （１９８６） と Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５８， ４６８−７１ （１９９２） を参照のこと。
【０３３６】
アテローム硬化病変のＡＰＯｅマウスモデルは、Ｒｏｓｅｌｅａｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ．， １６， １０１３−１８ （１９９６）） により記載された。アルドステロン遮断薬は、アテローム硬化病変を防止する活性があるはずである。
【０３３７】
本発明を特定の態様に関して記載したが、これら態様の詳細は（本発明を）限定するものと解釈されてはならない。
本明細書で参照にされたすべての特許文献は参照により本明細書に組込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１−Ａは、Ｈ型（Ｆｏｒｍ Ｈ）エプレレノンのＸ線粉末回折パターンを示す。
図１−Ｂは、Ｌ型エプレレノンのＸ線粉末回折パターンを示す。
図１−Ｃは、エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図２】
図２−Ａは、メチルエチルケトンから直に結晶化した非粉砕Ｌ型の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す。
図２−Ｂは、高純度エプレレノンのメチルエチルケトンからの結晶化により得られる溶媒和物の脱溶媒により調製された非粉砕Ｌ型の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す。
図２−Ｃは、高純度エプレレノンのメチルエチルケトン溶液から溶媒和物を結晶化させ、その溶媒和物を脱溶媒してＬ型を産生し、生じたＬ型を粉砕することによって調製したＬ型の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す。
図２−Ｄは、適正な溶媒からの低純度エプレレノンの蒸解により得られる溶媒和物の脱溶媒により調製された非粉砕Ｈ型の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）サーモグラムを示す。
図２−Ｅは、メチルエチルケトン溶媒和物のＤＳＣサーモグラムを示す。
【図３】
図３−Ａは、Ｈ型エプレレノンの赤外線スペクトル（乱反射率、ＤＲＩＦＴＳ）を示す。
図３−Ｂは、Ｌ型エプレレノンの赤外線スペクトル（乱反射率、ＤＲＩＦＴＳ）を示す。
図３−Ｃは、エプレレノンのメチルエチルケトン溶媒和物の赤外線スペクトル（乱反射率、ＤＲＩＦＴＳ）を示す。
図３−Ｄは、クロロホルム溶液中のエプレレノンの赤外線スペクトル（乱反射率、ＤＲＩＦＴＳ）を示す。
【図４】
図４は、エプレレノンのＨ型の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】
図５は、エプレレノンのＬ型の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】
図６−Ａは、メチルエチルケトン溶媒和物の熱重量測定分析プロフィールを示す。
【図７】
図７は、メチルエチルケトンから単離した、７−メチル水素４α，５α：９α，１１α−ジエポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナン−７α，２１−ジカルボキシレート、γ−ラクトンの結晶形のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図８】
図８は、イソプロパノールから単離した、７−メチル水素１１α，１２α−エポキシ−１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグン−４−エン−７α，２１−ジカルボキシレート、γ−ラクトンの結晶形のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図９】
図９は、ｎ−ブタノールから単離した、７−メチル水素１７−ヒドロキシ−３−オキソ−１７α−プレグナ−４，９（１１）−ジエン−７α，２１−ジカルボキシレート、γ−ラクトンの結晶形のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図１０】
図１０は、（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）３％、及び（ｄ）５％のジエポキシドでドープ処理した（ｄｏｐｅｄ）メチルエチルケトン結晶化から得られた湿式ケーク（メチルエチルケトン溶媒和物）のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図１１】
図１１は、（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）３％、及び（ｄ）５％のジエポキシドでドープ処理したメチルエチルケトン結晶化から得られた乾燥固形物のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図１２】
図１２は、ジエポキシドの３％ドーピングを用いたメチルエチルケトン結晶化からの（ａ）溶媒和物を乾燥前に粉砕しない、及び（ｂ）溶媒和物を乾燥前に粉砕する、乾燥固形物のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図１３】
図１３は、（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）５％、及び（ｄ）１０％の１１，１２−エポキシドでドープ処理したメチルエチルケトン結晶化から得られた湿ケーク（メチルエチルケトン溶媒和物）のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図１４】
図１４は、（ａ）０％、（ｂ）１％、（ｃ）５％、及び（ｄ）１０％の１１，１２−エポキシドでドープ処理したメチルエチルケトン結晶化から得られた乾燥固形物のＸ線粉末回折パターンを示す。
【図１５】
図１５は、表Ｘ−７Ａに報告されるデータに基づいた、生成物純度、出発材料の純度、冷却速度、及び終点温度の立方体プロットを示す。
【図１６】
図１６は、最終材料純度に対して統計的に有意な効果を及ぼす諸変数を決定する、図１８の立方体プロットを使用して作成した半正規プロットを示す。
【図１７】
図１７は、出発材料純度と冷却速度が最終材料純度に及ぼす相互作用を示す、表Ｘ−７Ａに報告される結果に基づいた相互作用グラフである。
【図１８】
図１８は、表Ｘ−７Ａに報告されるデータに基づいた、Ｈ型重量分画、出発材料純度、冷却速度、及び終点温度の立方体プロットを示す。
【図１９】
図１９は、最終材料の純度に対して統計的に有意な効果を及ぼす諸変数を決定するために図２１の立方体プロットを使用して作成した半正規プロットを示す。
【図２０】
図２０は、出発材料純度と終点温度が最終材料純度に及ぼす相互作用を示す、表Ｘ−７Ａに報告される結果に基づいた相互作用グラフである。
【図２１】
図２１は、非結晶性エプレレノンのＸ線回折パターンを示す。
【図２２】
図２２は、非結晶性エプレレノンのＤＳＣサーモグラムを示す。
【図２３】
図２３は、アンジオテンシンＩＩ注入ラット試験における収縮期血圧の変化を示す。
【図２４】
図２４は、アンジオテンシンＩＩ注入ラットの心臓における血管炎症のエプレレノン（エポキシメクスレノン）による予防を示す。
【図２５】
図２５は、担体注入ラットの心臓におけるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）発現の不足を示す。
【図２６】
図２６は、ＡｎｇＩＩ注入ラットの心臓におけるＣＯＸ−２発現の誘導を示す。
【図２７】
図２７は、ＡｎｇＩＩ注入ラットの心臓におけるＣＯＸ−２発現の誘導のエプレレノンによる予防を示す。
【図２８】
図２８は、担体注入ラットの心臓におけるオステオポンチン発現の不足を示す。
【図２９】
図２９は、アルドステロン注入ラットの心臓におけるオステオポンチン発現の誘導のエプレレノンによる予防を示す。
【図３０】
図３０は、アルドステロン注入ラットの心筋におけるオステオポンチンアップレギュレーションのエプレレノンによる予防を示す。
【図３１】
図３１は、アルドステロン注入ラットの心筋におけるＣＯＸ−２アップレギュレーションのエプレレノンによる予防を示す。
【図３２】
図３２は、アルドステロン注入ラットにおける心筋損傷のエプレレノンによる予防を示す。
【図３３】
図３３は、アルドステロン注入ラットの冠状動脈媒質におけるＣＯＸ−２及びオステオポンチンのアップレギュレートされた共発現を示す。
【図３４】
図３４は、アルドステロン誘導性血管炎症及び損傷の機序のいくつかを示す。
【図３５】
図３５は、アンジオテンシンＩＩを注入し、カプトプリルで処置した易卒中性自然高血圧ラットにおける、増加した尿タンパク排泄のエプレレノン処置による阻害を示す。
【図３６】
図３６は、アンジオテンシンＩＩを注入し、カプトプリルで処置した易卒中性自然高血圧ラットにおける、腎臓損傷の組織病理スコアのエプレレノン処置での低下を示す。
【図３７】
図３７は、易卒中性自然高血圧ラットにおける、エプレレノン処置での生存率の増加と脳損傷の抑制を示す。
【図３８】
図３８は、易卒中性自然高血圧ラットにおける、エプレレノン処置での脳損傷の減少を示す。
【図３９】
図３９は、エプレレノンで処置したアルドステロン注入、高血圧ラットにおける、心筋ＣＯＸ−２の早期経時発現の阻害を示す。
【図４０】
図４０は、エプレレノンで処置したアルドステロン注入、高血圧ラットにおける、心筋オステオポンチンの早期経時発現の阻害を示す。
【図４１】
図４１は、エプレレノンで処置したアルドステロン注入、高血圧ラットにおける、心筋ＭＣＰ−１の早期経時発現の阻害を示す。
【図４２】
図４２は、エプレレノンで処置したアルドステロン注入、高血圧ラットにおける、心筋ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１の早期経時発現の阻害を示す。
【図４３】
図４３は、アルドステロン注入での収縮期血圧の上昇と、アルドステロン注入及びエプレレノン処置でのこの上昇の低下を示す。
【図４４】
図４４は、対照ラット、アルドステロン注入ラット、及びアルドステロン注入及びエプレレノン処置ラットについての２８日目の心筋組織病理スコアと、アルドステロン注入ラットとアルドステロン注入及びエプレレノン処置ラットについての体重に対する心臓重量の比を示す。
【図４５】
図４５は、対照ラット、アルドステロン注入ラット、及びアルドステロン注入及びエプレレノン処置ラットについての２８日目の循環オステオポンチンレベルを示す。
【図４６】
図４６は、対照ラット、アルドステロン注入ラット、及びアルドステロン注入及びエプレレノン処置ラットにおける炎症性サイトカインの２８日目での相対ｍＲＮＡ発現を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【国際公開パンフレット】
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