(57)【要約】【解決手段】置換基を有するアピシジン誘導体、これの合成方法及びこれを含む抗癌剤組成物。上記の置換基としては、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ヒドラゾン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン、４−メトキシフェニルヒドラゾン、３−メトキシフェニルヒドラゾン、４−ニトロフェニルヒドラゾン、ベンジルヒドラゾン、メタンスルホニルヒドラゾン、ベンゼンスルホニルヒドラゾン、４−メチルベンゼンスルホニルヒドラゾン、ベンゾイルヒドラゾン、４−ニトロベンゾイルヒドラゾン、カルボヒドラゾン、ベンジルオキシムまたはアセトキシム等が好ましい。上記化合物は、ヒストンデアセチラーゼの阻害効果が大きく、デトランスフォーミング活性を有し、癌細胞の成長を特異的に阻害するため、抗癌剤組成物の調製に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１の化合物。
【化１】
2004516328.tif 000007
（式中、Ｒはセミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ヒドラゾン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン、４−メトキシフェニルヒドラゾン、３−メトキシフェニルヒドラゾン、４−ニトロフェニルヒドラゾン、ベンジルヒドラゾン、メタンスルホニルヒドラゾン、ベンゼンスルホニルヒドラゾン、４−メチルベンゼンスルホニルヒドラゾン、ベンゾイルヒドラゾン、４−ニトロベンゾイルヒドラゾン、カルボヒドラゾン、ベンジルオキシムまたはアセトキシムを表す。）
【請求項２】
Ｒがセミカルバゾン、ヒドラゾン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドラゾン、カルボヒドラゾン、ベンジルオキシムまたはアセトキシムである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
塩基または酸の存在下で、下記化学式２のアピシジンとヒドラジン類、カルバジド類またはアミン類とを反応させることを特徴とする請求項１に記載の化合物の製造方法。
【化２】
2004516328.tif 000008
【請求項４】
反応溶媒として、メタノールまたはエタノールを使用する請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
上記塩基がトリエチルアミンまたはピリジンである請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項６】
上記酸が酢酸である請求項３または４に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物を含むヒストンデアセチラーゼ阻害剤。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物を含む抗癌剤組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物の治療上効果的な量を投与することを含む腫瘍の予防または治療方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物の抗癌剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアピシジン誘導体、その製造方法、及び該誘導体を含む抗癌剤組成物に関する。
【０００２】
【従来技術】
ヒストンは真核細胞の核内ＤＮＡと結合している塩基性タンパク質である。ヌクレオソームのコアヒストンは、それらのＮ末端に位置する特定リシン残基のε−アミノ基において可逆的にアセチル化される。ヒストンの可逆的なアセチル化は、遺伝子発現の調節に重要な、クロマチン構造の変化を媒介していると考えられている。
【０００３】
細胞内のヒストンのアセチル化の程度は、二つの特定酵素、即ちヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とヒストンデアセチラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）の活性の平衡により調節される。現在まで様々な種類の構造を有する阻害剤がヒトのヒストンデアセチラーゼを阻害すると報告されている。これらの阻害剤は、構造により以下のように分類される。
【０００４】
１）脂肪酸構造のブチレート［Ｎｅｗｍａｒｋ ＨＬ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ７８， １−５， １９９４参照］
２）ヒドロキサム酸構造のトリコスタチンＡ（ｔｒｉｃｏｓｔａｔｉｎ Ａ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄ， ＳＡＨＡ）及びオキサムプラチン（ｏｘａｍｐｌａｔｉｎ）［１． Ｔｓｕｊｉ Ｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）． ２９， １−６， １９７６， ２． Ｒｉｃｈｏｎ ＶＭ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， ３００３−３００７， １９９８， ３． Ｋｉｍ ＹＢ ｅｔ ａｌ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８， ２４６１−２４７０， １９９９ 参照］
３） ２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシ−デカノイル（ＡＯＥ）を含むサイクリックテトラペプチド構造のトラポキシンＡ  （ｔｒａｐｏｘｉｎ Ａ）［Ｋｉｊｉｍａ Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， ２２４２９−２２４３５， １９９３ 参照］
４） ＡＯＥを含まないサイクリックテトラペプチド構造のＦＲ９０１２２８及びアピシジン［１． Ｎａｋａｊｉｍａ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２４１， １２６−１３３， １９９８， ２． Ｄａｒｋｉｎ−Ｒａｔｔｒａｙ ＳＪ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， １３１４３−１３１４７， １９９６ 参照］
５）ベンズアミド構造のＭＳ−２７−２７５［Ｓａｉｔｏ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， ４５９２−４５９７， １９９９ 参照］ 等がある。
【０００５】
これらの化合物は、ヒト細胞内のヒストンデアセチラーゼ、癌細胞の成長、及び動物モデルで腫瘍の成長を阻害することが知られている。これらの化合物のうち、臨床承認を得て広く使用されているのは、ブチレートのみである。しかし、ブチレート化合物はヒストンデアセチラーゼを阻害するためには高い濃度（ｍＭ 単位）で使用しなければならず、ヒストンデアセチラーゼ以外の酵素も活性化する傾向があるため、理想的な製剤であるとは言えない。従って、低濃度（μＭ 単位）でヒストンデアセチラーゼを選択的に阻害できる別の構造の化合物の臨床研究が活発に行われている。ＦＲ９０１２２８は、現在、臨床試験段階（ｐｈａｓｅ Ｉ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）である。
【０００６】
上記の事実により、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は癌の成長阻害効果を有する薬剤として開発し得る期待の高いものであるが、現在、抗癌剤の調製におけるヒストンデアセチラーゼ阻害剤の使用及びその作用メカニズムはまだ知られていない。
【０００７】
本発明者らは、アピシジンを母核として様々な誘導体を合成し、効果的に癌細胞の成長を阻害できる３つの化合物（ＳＤ９８０１， ＳＤ９８０２， ＳＤ９８０３）を既に特許出願した（韓国出願番号；１９９９−１１８８３号）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
これに本発明者らは、ヒストンデアセチラーゼに関する研究を重ね、低濃度での優れたヒストンデアセチラーゼ阻害効果、デトランスフォーミング活性を有し、正常細胞には毒性をほとんど示さないで癌細胞の成長を特異的に阻害することができるアピシジン誘導体を発見した。本発明はこの発見に基づいて形成される。
従って、本発明の目的は、正常細胞に対して低い毒性を有するアピシジン誘導体， その製造方法及び該誘導体を含む抗癌剤組成物を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記化学式１のアピシジン誘導体に関する。
【００１０】
【化３】
2004516328.tif 000002
（式中、Ｒはセミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ヒドラゾン、ｔｅｒｔ−ブチルヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、２，４−ジニトロフェニルヒドラゾン、４−メトキシフェニルヒドラゾン、３−メトキシフェニルヒドラゾン、４−ニトロフェニルヒドラゾン、ベンジルヒドラゾン、メタンスルホニルヒドラゾン、ベンゼンスルホニルヒドラゾン、４−メチルベンゼンスルホニルヒドラゾン、ベンゾイルヒドラゾン、４−ニトロベンゾイルヒドラゾン、カルボヒドラゾン、ベンジルオキシムまたはアセトキシムを表す。）
【００１１】
また、本発明は塩基または酸の存在下で、下記化学式２で示されるアピシジンとヒドラジン類、カルバジド類、またはアミン類とを反応させることを特徴とする、下記反応スキーム１で表されるアピシジン誘導体の製造方法に関する。
【００１２】
【化４】
2004516328.tif 000003
【００１３】
このとき、上記反応の反応溶媒としてはメタノールまたはエタノール等のアルコール類；ベンゼンまたはトルエン等の芳香族溶媒； テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）；エーテル等が好ましく、このうちメタノール又はエタノールがさらに好ましい。上記反応で使用できる塩基としてはトリエチルアミン、ピリジン、酢酸ナトリウム等が好ましく、このうちトリエチルアミン又はピリジンがさらに好ましい。上記反応に使用される酸としては少量の酢酸、塩酸または硫酸等が好ましく、このうち酢酸がさらに好ましい。反応スキームは、反応混合物を減圧下におき反応溶媒を除去して、一般的な方法でさらに分離する分離工程をさらに含んでもよい。
【００１４】
また、本発明は上記化学式１の化合物を含むヒストンデアセチラーゼ阻害剤を提供する。
さらに、本発明は、上記化学式１の化合物を有効成分として含む抗癌剤組成物を提供する。
【００１５】
このとき、上記化学式１の化合物を有効成分として含む本発明の抗癌剤組成物は、薬剤学的に許容されるキャリヤーと混合し、非経口投与用注射溶液、経口投与、シロップ剤または乳剤等の液剤、錠剤、カプセル剤、粒剤または散剤等の固形剤、軟膏剤等の局所剤の形態で使用可能である。経口投与のためのキャリヤーとしてはでん粉、マンニトール、セルロース、水またはエチルアルコール等が好ましく挙げられる。注射剤用キャリヤーとしては、水、生理食塩水またはブドウ糖溶液等が好ましく挙げられる。本発明の抗癌剤組成物は、キャリヤーと有効成分重量として１：９９から９９：１までの比率で混合してよい。
【００１６】
本発明のさらなる観点からは、化学式１の化合物を治療上効果的な量で投与することを含む腫瘍の治療または予防方法が提供される。
本発明のさらなる観点からは、上記化学式１の化合物の抗癌剤としての使用が提供される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳しく説明するが、これにより本発明が限定されることはない。
【００１８】
【実施例】
実施例１． アピシジンのセミカルバゾン誘導体の合成
１．１  アピシジンの分離
１９９７年に収穫した豆試料をジャガイモ寒天斜面培地で５日間培養した。形成された菌糸体を集めて切断し、その菌糸切片を分離、精製した。得られた菌糸切片を滅菌処理した土壌と一緒に約−１５℃で保存して、本実施例において利用した。
【００１９】
培地として使用する総１．６ ｋｇの小麦を８つの１Ｌ三角フラスコに各２００ｇずつに分割した。三角フラスコに蒸留水１２０ｍｌを添加してこのフラスコを２４時間間隔で２回、１２１℃で１時間、減圧滅菌処理をして培地として使用した。
【００２０】
接種５日後にジャガイモ寒天培地から取りはずした菌糸を、滅菌処理した小麦培地に接種し、２５℃で４週間培養した。培養後、小麦培地をフラスコから取出し、２２から２４℃のフード内で約５日間乾燥させ、細かく粉砕した。粉砕した培地は使用するまで−１５℃で保管した。
【００２１】
総１．６ｋｇの粉砕した小麦培養体を５Ｌフラスコに各５００ｇずつに分割し、１５ Ｌのエチルアセテートで３回抽出し、ワットマン紙（Ｗｈａｔｍａｎ）Ｎｏ． ２ ろ紙でろ過して減圧濃縮した。濃縮された抽出物を２００ ｍｌの蒸留水に溶解し、１ｋｇのアンバーライトＸＡＤ−２が充填されたカラム（内径  ５．５ｃｍ）で分離した。生成物を総６Ｌの蒸留水で洗浄し、６Ｌのメタノールで溶出し、減圧濃縮した。メタノール抽出物をエチルアセテートに溶解し、５００ｇのフロリジルが充填されたカラム（内径  ５ｃｍ）で分離した。このとき使用した溶出溶媒は、エチルアセテートとｎ−ヘキサン（３：１， ｖｏｌ／ｖｏｌ）の混合溶媒である。
【００２２】
サイクリックテトラペプチド（アピシジン）が含まれているＦ２分画を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認し、続けて分離した。Ｆ２分画を少量のクロロホルムに溶解して、これを、蛍光指示剤及び石油結合剤を含んでいる粒子の大きさが２〜２５μｍ のシリカゲル（Ｍｅｒｃｋ）と厚さ２ｍｍのガラスプレートを用いたクロマトトロン（Ｃｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ）で最終分離した。溶出溶媒としてクロロホルム−メタノール（９７：３， ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、流速８ｍｌ／ｍｉｎで使用した。クロマトトロンで分離する間、アピシジンは波長２５４ｎｍの紫外線でモニターした。分離されたアピシジンの純度は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認し、このとき着色剤として、ρ−アニスアルデヒドを使用した。
【００２３】
上記の方法により、約８００ｍｇの純粋なアピシジンが白色粉末で得られた。得られたアピシジンの純度を薄層クロマトグラフィーで確認したところ、ただ一つの紫色スポットが観測され、生成物が非常に純粋なことが分かった。
【００２４】
１．２  アピシジンのセミカルバゾン誘導体の合成
実施例１．１で分離したアピシジン７００ｍｇ（１．１１ｍｍｏｌ）をメタノール３００ｍＬに溶解した。塩酸セミカルバジド４９１ｍｇ（４．４４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ ４４３．８ｍｇ（４．４４ｍｍｏｌ）を加えた後、１２時間還流した。反応溶媒を減圧下で除去した後、残渣をメチレンクロライド５００ｍＬに溶解した。得られた溶液を１Ｎ炭酸水素ナトリウム３００ｍＬ、１Ｎクエン酸３００ｍＬ、食塩水３００ｍＬで順次洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下に濃縮して、カラムクロマトグラフィー（エチルアセテート；ＣＨＣｌ３ ：ＭｅＯＨ ＝ １０：１）で精製した。６５３．８ｍｇ（８５．３％）の純粋な標記化合物を得て、９２．８ｍｇ（１２．１％）の出発物質を回収した。
【００２５】
Ｒｆ  ０．４５ （ ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ １０ ： １）
１Ｈ−ＮＭＲ （ ５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ ）
δ ９．０２ （ｓ， １Ｈ）， ７．８４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．５Ｈｚ）， ７．６０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．０Ｈｚ）， ７．４９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．５Ｈｚ） ７．４１ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ７．２０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝４．０Ｈｚ）， ７．０７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７Ｈｚ）， ６．１６ （ｓ， ２Ｈ）， ６．１２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０．５Ｈｚ）， ５．１６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．５５ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝２０Ｈｚ）， ４．３３ （ｍ， １Ｈ）， ４．１９ （ｍ， １Ｈ）， ４．０１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９７ （ｓ， １Ｈ）， ３．７５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．０Ｈｚ）， ３．０７ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝２３．５Ｈｚ）， ３．０２ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１４．５Ｈｚ）， ２．３９−２．３１ （ｍ， １Ｈ）， １．９５ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝１０．５Ｈｚ）， １．８１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１３．５Ｈｚ）， １．６２−１．４９ （ｍ， ７Ｈ）， １．３５−１．０７ （ｍ， １１Ｈ）， １．０１−０．９８ （ｍ， ３Ｈ）， ０．９４−０．８１ （ｍ， ３Ｈ）
【００２６】
実施例２． アピシジンのヒドラゾン誘導体の合成
実施例１．１で分離したアピシジン１０．０ｍｇ（０．０１６ｍｍｏｌ）をメタノール５．０ｍＬに溶解した。この溶液に二塩酸ヒドラジン５．０ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ ９．８ｍｇ（０．０９６ｍｍｏｌ）を加えた後、５時間還流した。反応溶媒を減圧下で除去した後、残渣をメチレンクロライド１０ｍＬに溶解した。得られた溶液を１ Ｎ炭酸水素ナトリウム５ｍＬ、１ Ｎクエン酸５ｍＬ、食塩水１０ｍＬで順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下に濃縮して、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ ２０ ： １）で精製した。４．５ｍｇ（４４．１％）の純粋な標記化合物を得た。
【００２７】
Ｒｆ  ０．２１ （ ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ ２０ ： １ ）
１Ｈ−ＮＭＲ （ ５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ ）
δ ７．８４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．５Ｈｚ）， ７．６０ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．５Ｈｚ） ７．４１ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ７．２０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝４．０Ｈｚ）， ７．０７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７Ｈｚ）， ６．１６ （ｓ， ２Ｈ）， ６．１２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０．５Ｈｚ）， ５．１６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．５５ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝２０Ｈｚ）， ４．３３ （ｍ， １Ｈ）， ４．１９ （ｍ， １Ｈ）， ４．０１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９７ （ｓ， １Ｈ）， ３．７５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．０Ｈｚ）， ３．０７ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝２３．５Ｈｚ）， ３．０２ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１４．５Ｈｚ）， ２．３９−２．３１ （ｍ， １Ｈ）， １．９５ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝１０．５Ｈｚ）， １．８１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１３．５Ｈｚ）， １．６２−１．４９ （ｍ， ７Ｈ）， １．３５−１．０７ （ｍ， １１Ｈ）， １．０１−０．９８ （ｍ， ３Ｈ）， ０．９４−０．８１ （ｍ， ３Ｈ）
【００２８】
実施例３． アピシジンのｔ−ブチルヒドラゾン誘導体の合成
アピシジン１１．０ ｍｇ（０．０１７６ｍｍｏｌ）をメタノール５．０ｍＬに溶解した。この溶液に塩酸ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン６．６ｍｇ（０．０５２８ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ ５．３ｍｇ（０．０５２８ｍｍｏｌ）を加えた後、６時間還流した。反応溶媒を減圧下で除去した後、残渣をメチレンクロライド１０ｍＬに溶解した。得られた溶液を１ Ｎ炭酸水素ナトリウム５ｍＬ、１ Ｎクエン酸５ｍＬ、食塩水１０ｍＬで順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下に濃縮して、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ ２０ ： １）で精製した。６．８ ｍｇ（５５．７％）の純粋な標記化合物を得た。
【００２９】
Ｒｆ  ０．３１ （ ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ ２０ ： １ ）
１Ｈ−ＮＭＲ （ ５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ ）
δ ７．８４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．５Ｈｚ）， ７．６０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．５Ｈｚ） ７．４１ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ７．２０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝４．０Ｈｚ）， ７．０７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝７Ｈｚ）， ６．１６ （ｓ， ２Ｈ）， ６．１２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０．５Ｈｚ）， ５．１６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．５５ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝２０Ｈｚ）， ４．３３ （ｍ， １Ｈ）， ４．１９ （ｍ， １Ｈ）， ４．０１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９７ （ｓ， １Ｈ）， ３．７５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８．０Ｈｚ）， ３．０７ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝２３．５Ｈｚ）， ３．０２ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１４．５Ｈｚ）， ２．３９−２．３１ （ｍ， １Ｈ）， １．９５ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝１０．５Ｈｚ）， １．８１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１３．５Ｈｚ）， １．６２−１．４９ （ｍ， ７Ｈ）， １．３７−１．３２ （ｍ， ４Ｈ）， １．３１−１．２３ （ｍ， ９Ｈ）， １．１７−１．０３ （ｍ， ６Ｈ）， ０．９７−０．８１ （ｍ， ３Ｈ）
【００３０】
実施例４． アピシジンのカルボヒドラゾン誘導体の合成
アピシジン３０ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ）をメタノール５．０ｍｌに溶解した。この溶液にカルボヒドラジド１３ｍｇ（０．１４４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ ２９ｍｇ（０．２８９ｍｍｏｌ）を加えた後、４時間還流した。反応溶媒を減圧下で除去した後、残渣をメチレンクロライド２０ｍｌに溶解した。得られた溶液を、１ Ｎ炭酸水素ナトリウム１０．０ｍｌ、１ Ｎクエン酸１０．０ ｍｌ、食塩水１０．０ｍｌで順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー（エチルアセテート ； ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ １０ ： １）で精製した。３０．１８ｍｇ（９０．１％）の純粋な標記化合物を白色固体で得た。
【００３１】
Ｒｆ  ０．３２ （ ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ １０ ： １ ）
１Ｈ ＮＭＲ （ ５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ ）
δ ９．４１ （ｓ， １Ｈ）， ９．１９ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１８．５Ｈｚ）， ７．８３ （ｔ． １Ｈ，  Ｊ＝２．５Ｈｚ） ７．６０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ７．５４〜７．４８ （ｍ， １Ｈ）， ７．４３〜７．３８ （ｍ， ３Ｈ）， ７．１９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５ Ｈｚ）， ７．０７ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ） ６．１３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ５．１６ （ｓ， １Ｈ）， ４．５４ （ｓ， １Ｈ）， ４．３２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ），   ４．２３ （ｔ， １Ｈ，  Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．０２ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９９ （ｓ， １Ｈ）， ３．７５ （ｄ， １Ｈ，  Ｊ＝１０Ｈｚ）， ３．０７ （ｔ，１Ｈ，  Ｊ＝１０Ｈｚ）， ３．０２ （ｔ， １Ｈ，  Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ２．２２−２．１４ （ｍ， ５Ｈ）， １．９９〜１．９０ （ｍ， ２Ｈ），１．８０ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝１．５Ｈｚ）， １．５１−１．４７ （ｍ， ４Ｈ）， １．２３−１．１４ （ｍ， １２Ｈ）， １．０４−０．９８ （ｍ， ３Ｈ）， ０．９０−０．８２３ （ｍ， ６Ｈ）
【００３２】
実施例５． アピシジンのベンジルオキシム誘導体の合成
アピシジン２５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍｌに溶解した。この溶液にベンジルオキシアミン塩酸塩７．６６ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ）、ピリジン１５．８ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）を加えた後、４時間室温で攪拌した。反応溶媒を減圧下で除去した後、残渣をメチレンクロライド１５．０ｍｌに溶解した。得られた溶液を１ Ｎ炭酸水素ナトリウム１０．０ｍｌ、１ Ｎクエン酸１０．０ｍｌ、食塩水１０．０ｍｌで順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー（エチルアセテート； ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ １０ ： １）で精製した。２５ｍｇ（８７．４％）の純粋な標記化合物を白色固体で得た。
【００３３】
Ｒｆ  ０．４８ （ ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ １０ ： １ ）
１Ｈ ＮＭＲ （ ５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ ）
δ ７．８２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ７．６１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ７．４８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ７．４０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ７．３３ （ｔ， ５Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ７．１７ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ７．０６ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ６．１２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ５．１６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．９９ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．５４ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ４．３２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．２０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ３．９９ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９７ （ｓ， １Ｈ）， ３．７６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１５Ｈｚ）， ３．１０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ３．０４ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ２．２６−２．０５ （ｍ， １Ｈ）， １．９６ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝１２．５Ｈｚ）， １．８１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１５ Ｈｚ）， １．５１−１．４６ （ｍ， ７Ｈ）， １．３５−１．１５ （ｍ， １１Ｈ）， １．０９−０．９８ （ｍ， ３Ｈ）， ０．８３−０．８２ （ｍ， ３Ｈ）
【００３４】
実施例６． アピシジンのアセトキシム誘導体の合成
６．１  アピシジンのオキシム誘導体の合成
アピシジン２５ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍｌに溶解した。この溶液にヒドロキシルアミン塩酸塩３．３４ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ）、ピリジン１５．８ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）を加えた後、４時間室温で攪拌した。反応溶媒を減圧下で除去した後、残渣をメチレンクロライド１５．０ｍｌに溶解した。得られた溶液を１ Ｎ炭酸水素ナトリウム１０．０ｍｌ、１ Ｎクエン酸１０．０ｍｌ、食塩水１０．０ｍｌで順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮してカラムクロマトグラフィー（エチルアセテート； ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ １０ ： １）で精製した。２５．１ｍｇ（９８％）の純粋な標記化合物を白色固体で得た。
【００３５】
Ｒｆ  ０．１９ （ ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ １０ ： １ ）
１Ｈ ＮＭＲ （ ５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ ）
δ １０．１８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１５Ｈｚ）， ７．８３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ７．６０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０ Ｈｚ）， ７．４９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ７．４０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ７．２１ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ７．０７ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ６．１３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ５．１７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．５４ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ４．３２ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．２２  （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ４．０１ （ｓ， ３Ｈ）， ４．００ （ｓ， １Ｈ）， ３．７５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１５Ｈｚ）， ３．１０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ３．０４ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ２．２０−２．０９ （ｍ，１Ｈ）， １．９４ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝１５Ｈｚ）， １．８１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１５Ｈｚ）， １．５２−１．４８ （ｍ， ７Ｈ）， １．０−０．８５ （ｍ， ３Ｈ）， ０．８８−０．８２（ｍ， ３Ｈ）
【００３６】
６．２ アピシジンのアセトキシム誘導体の合成
上記で合成されたオキシム誘導体１８ｍｇ（０．０２８ｍｍｏｌ）をメチレンクロライド５ｍｌに溶解した。この溶液にＡｃ２Ｏ ３．４５ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）、ピリジン２．６７ｍｇ（０．０３４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ  ３．４５ｍｇ（０．０２８２ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で４時間攪拌した。反応が完結した後、メチレンクロライドを水で抽出し、食塩水２０ｍｌで洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮してカラムクロマトグラフィー （エチルアセテート； ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ １０ ： １）で精製した。１６ｍｇ（８３％）の純粋な標記化合物を白色固体で得た。
【００３７】
Ｒｆ  ０．４１ （ ＣＨＣｌ３ ： ＭｅＯＨ ＝ １０ ： １ ）
１Ｈ ＮＭＲ （ ５００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ ）
δ  ７．８４ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ７．６０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝８Ｈｚ）， ７．４９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ７．４０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝６Ｈｚ）， ７．１９ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ７．０６ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ６．１３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ５．１７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．５３ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ４．３２ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝５Ｈｚ）， ４．２０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ３．７６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ３．１０ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝１０Ｈｚ）， ３．０４ （ｔ， １Ｈ， Ｊ＝７．５Ｈｚ）， ２．３０−２．２０ （ｍ， １Ｈ）， ２．０８ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝１３Ｈｚ）， １．９２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１０ Ｈｚ）， １．８１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１５Ｈｚ）， １．５０−１．４６ （ｍ， ７Ｈ）， １．３４−１．１３ （ｍ， １Ｈ）， １．１０−１．００ （ｍ， ３Ｈ）， ０．８７〜０．８０ （ｍ， ３Ｈ）
【００３８】
試験例１． 細胞成長阻害アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ， ＳＲＢ ａｓｓａｙ）
１．１ 細胞培養
ＨｅＬａ（ヒト子宮頚部癌セルライン）、ｖ−ｒａｓ−形質転換ＮＩＨ３Ｔ３ （マウス繊維母細胞セルライン）、Ｃｏｌｏｎ ３．１−Ｍ２６（マウス大腸癌セルライン）、ＭＧ６３（ヒト骨肉腫セルライン）、ＭＣＦ−７（ヒト乳癌セルライン）は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．製造）で培養した。Ａ２０５８ （ヒト黒色腫セルライン）、ＡＧＳ（ヒト胃腺癌腫セルライン）、ＨＢＬ−１００（ヒト乳癌セルライン）、ＣＣＤ−１８Ｃｏ （ヒト正常大腸セルライン）、ＬＬ８６ （ヒト正常肺セルライン）は、１０％ ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンの存在下でＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．製造）で培養した。
【００３９】
薬物を処置した後、細胞をバッファー（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５）、１２０ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ ｍＭ ＮａＦ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ５ ｍＭ ＥＧＴＡ、１５ ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、３０ ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェート、１ ｍＭ ベンズアミジン、０．１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニルで洗浄し、バッファー（１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０ 含有）で抽出した。タンパク質量は、ＢＳＡを標準にし、ブラドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）方法で測定した。細胞抽出物は、実験前まで液体窒素中に保管した。
【００４０】
１．２ 細胞成長阻害の測定
実施例で製造したアピシジン誘導体のマウスとヒトの癌細胞に対する作用を調べるため、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）タンパク質染色分析を利用した細胞成長阻害アッセイを行った。細胞をウェルに置き、培養中、各々０．０１、０．１、０．５、１、及び ２μｇ／ｍｌのアピシジン、ＳＤ９８０１、ＳＤ９８０２、ＳＤ９８０３、実施例１の化合物、実施例２の化合物及び実施例３の化合物で処置した。４８時間培養後、培養液をウェルプレートから除去した。１ｍｌの１０％トリクロロ酢酸を４℃で加えて細胞を固定させ、これを蒸留水で５回洗浄し、空気中で完全に乾燥させた。ウェルを０．４％ ＳＲＢ溶液で処理し、常温で３０分間染色した。続いて、蒸留水で５回洗浄し、１８時間乾燥させた。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１ｍｌ， １０ｍＭ）を各々のウェル（ｗｅｌｌ）に加えてＳＲＢに結合したタンパク質を溶解した。各ウェルの内容物を除き、その吸光度を４９０ｎｍで測定した。結果を下記の表１に示す（ＥＬ ８０８ ｕｌｔｒａ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ， Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｎｏｏｓｋｉ， ＶＴ）。
【００４１】
【表１】
2004516328.tif 000004
【００４２】
吸光度はウェルに付いた細胞の個数と比例するため、ＳＲＢアッセイの吸光度の結果は本発明の化合物が種々のマウス及びヒトの癌細胞に対する細胞成長阻害効果を有することを示す。
表１から分かるように、細胞成長は非常に低い濃度（μＭ単位）のアピシジン誘導体 （実施例 １、２、３）により有意に阻害された。特に、ＡＧＳ細胞、ＨＢＬ−１００、そしてｖ−ｒａｓによる形質転換ＮＩＨ３Ｔ３細胞に非常に強い阻害（ＩＣ５０， ０．２ μｇ／ｍｌ 以下）を示し、Ａ２０５８ 細胞、ＭＣＦ７ 細胞、ＨｅＬａ 細胞、ＭＧ６３そしてＣｏｌｏｎ ３．１−Ｍ２６ 細胞には、穏やかな阻害を示した（ＩＣ５０， ０．２０−２．０７μｇ ／ｍｌ）。このアピシジン誘導体の癌細胞成長阻害は、母核化合物であるアピシジンの癌細胞成長阻害と同等であった。しかし、これらの誘導体（実施例 １、２、３）は、正常細胞のＣＣＤ−１８Ｃｏ及びＬＬ８６細胞には癌細胞に比べて非常に弱い成長阻害（ＩＣ５０， ４．２７−１８．２５μｇ ／ｍｌ）を示した。即ち、これらの誘導体（実施例 １、２、３）は、アピシジンに比べてヒトの正常大腸細胞であるＣＣＤ−１８Ｃｏの場合は約１．８−５倍、ヒトの正常肺細胞であるＬＬ８６の場合は３．５−４．３倍高い濃度で細胞成長阻害を示した。従って、これら誘導体（実施例 １、２、及び３）は、正常細胞の成長に対して低い阻害作用を示し、癌細胞に対する特異的な成長阻害作用を有する。特に、実施例１の誘導体が正常細胞に対して最も安全なものであった。
【００４３】
従って、本発明によるアピシジン誘導体（実施例 １、２、３）は低濃度で癌細胞に対し強力な細胞成長阻害作用があり、その濃度では正常細胞にほとんど毒性を表さないことが示された。さらに実施例１の化合物は、母核化合物であるアピシジンより約５倍高い正常細胞の成長に対する安全性を示す。一方、既存の化合物であるＳＤ９８０１、ＳＤ９８０２、及びＳＤ９８０３（韓国特許出願番号； １９９９−１１８８３号）は、実施例 １， ２， ３ の化合物と同等の正常細胞の成長に対する阻害作用を示すが、癌細胞成長に対する阻害作用は実施例 １， ２， ３ の化合物と比較してかなり低いものである。
【００４４】
試験例２． ヒストンデアセチラーゼのデトランスフォーミング活性試験
本例は、本発明の新規なアピシジン誘導体が、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤処理によって通常引き起こされるデトランスフォーミング活性を引き起こすか否かを調べるために行われた。ＨｅＬａ細胞を０．０１、 ０．１、 ０．５、１、および２μｇ／ｍｌのアピシジン、ＳＤ９８０１， ＳＤ９８０２， ＳＤ９８０３， 実施例１の化合物、実施例２の化合物、実施例３の化合物、及び実施例４の化合物で２４時間処理した。その後、癌細胞の形態が正常細胞の形態に変わるか否か、即ち、誘導体がジトランスフォーミング活性を有するか否かを決定するため、光学顕微鏡を用いて癌細胞を観察した。
【００４５】
その結果、楕円形または多角形形態を有するＨｅＬａ 細胞が正常細胞の特徴的な形態、すなわちフィラメント状の突起を有する平らな形態に変化することが観察された。結果を下記の表２に示す。
【００４６】
【表２】
2004516328.tif 000005
【００４７】
表２から分かるように、実施例１， ２， ３及び４の誘導体は母核化合物であるアピシジンと同等のデトランスフォーミング活性を示す。しかし、既存の化合物であるＳＤ９８０１、ＳＤ９８０２、及びＳＤ９８０３（韓国特許出願番号； １９９９−１１８８３号）はアピシジン、実施例１， ２， ３及び４の化合物に比べ約２００倍高い濃度でデトランスフォーミング活性を示す。
【００４８】
試験例３． 試験管内におけるヒストンデアセチル化アッセイ
本発明の化合物の高い癌細胞成長に対する阻害作用がヒストンデアセチラーゼの阻害によるものなのかを確認するために、本例において、実施例１、２、３及び４の誘導体のヒストンデアセチラーゼに対する阻害作用の測定が行われた。
【００４９】
ヒストンデアセチラーゼはＨｅＬａ 細胞から精製された。ヒストンデアセチラーゼ活性は、文献公知の方法で測定した。［例えば： Ｉｎｏｕｅ， Ａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． ２０， ３０７−３１６， １９７０参照］。ヒストンジアセチラーゼ活性測定の基質としては、放射性物質で標識された［３Ｈ］アセチル基を有するヒストンを使用した。３７℃で２０分間インキュベートした後、培養液に放出される［３Ｈ］酢酸をエチルアセテートで抽出し、液体放射能測定法で定量した。その結果を下記の表３に示す。
【００５０】
【表３】
2004516328.tif 000006
【００５１】
表３から分かるように、本発明の化合物は濃度依存的にヒストンデアセチラーゼを阻害した。特に、濃度が各々１、及び ３ｎＭである実施例１及び実施例２の化合物が、酵素活性を５０％まで阻害できることを考えると、これらは母核化合物であるアピシジン（ＩＣ５０， ５ ｎＭ）よりかなり強いヒストンデアセチラーゼ活性に対する阻害作用を有することが明らかである。また、既存の化合物であるＳＤ９８０１， ＳＤ９８０２， 及びＳＤ９８０３（韓国特許出願番号； １９９９−１１８８３号）は、アピシジン、実施例１， ２， ３及び４の化合物に比べ約２４〜１０００倍低いヒストンデアセチラーゼ活性に対する阻害作用を示す。
【００５２】
上記の実施例の結果をまとめると、本発明によるアピシジン誘導体（実施例１， ２， ３）は母核化合物であるアピシジンと比較して高いヒストンデアセチラーゼに対する阻害力、デトランスフォーミング活性及び癌細胞に対する阻害作用を有し、正常細胞に対しては低い毒性を有する。本発明の化合物のこのような効果は、生体内のヒストンデアセチラーゼの阻害と密接な関連があり、また、これらの化合物の正常細胞の成長に対する阻害作用は低いことを考慮すると、本発明のアピシジン及び既存の化合物（ＳＤ９８０１， ＳＤ９８０２， ＳＤ９８０３； 韓国特許出願番号； １９９９−１１８８３号）より選択的に癌細胞の成長を阻害できるものと結論付けられる。
【００５３】
【発明の効果】
上述のように、本発明の化合物は低濃度でヒストンデアセチラーゼを強く阻害することができ、デトランスフォーミング活性を有し、癌細胞の成長を特異的に阻害する。また、この化合物は癌細胞の成長阻害に有効な濃度で正常細胞にほとんど毒性を示さない。従って、本発明の化合物はヒストンデアセチラーゼを抑制して癌細胞の成長を阻害できる選択的な阻害剤であり、正常細胞に対する毒性が低い優れた抗癌剤組成物を提供することができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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