(57)【要約】HIV-1含有検体、特にグループM型ウイルスのグループB亜型を分析するために設計されたプライマー配列を使用して遺伝子型同定することができなかった検体、の遺伝子型同定のためのプライマー配列及びその配列を使用する方法が提供された。例えば、少なくとも一種のフォワードプライマー及び少なくとも一種のリバースプライマー［ここでフォワードプライマーは縮重配列：RARRARGGGCTGYTGGARATGTS  （Seq. ID No.9）で示すことができそしてリバースプライマーは縮重配列：AGTCARATYTAYBCWGGGATYAARGTRADGV  （Seq. ID No.10）またはGTCARATYTAYBCWGGGATYAARGTRADGV  （Seq. ID No.12）で示すことができる］を含むプライマーの混合物を適切に使用する。各グループから一つ以上選択されたプライマーを逆転写、増幅及び配列分析に使用することができ、また遺伝子型同定用キット中に適当に収納される。そのキットはプライマーに加えて、RNA分解酵素阻害剤、逆転写酵素、ポリメラーゼ、及び/またはdNTP及びddNTP原料のような試薬を含むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
縮重配列RARRARGGGCTGYTGGARATGTS  （Seq. ID No.9）
により示される配列を含むプライマーの中から選択されるフォワードHIV-1プライマーの少なくとも一つと、
縮重配列AGTCARATYTAYBCWGGGATYAARGTRADGV  （Seq. ID No.10）または
GTCARATYTAYBCWGGGATYAARGTRADGV  （Seq. ID No.12）
により示される配列を含むプライマーの中から選択されたリバースHIV-1プライマーの少なくとも一つとを、単一溶液中に含む、プライマー混合物。
【請求項２】
該フォワードプライマーの少なくとも一つが、
2004537278.tif 000011
からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載のプライマー混合物。
【請求項３】
該リバースプライマーの少なくとも一つが、
2004537278.tif 000012
からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載のプライマー混合物。
【請求項４】
該フォワードプライマーの少なくとも一つが、
2004537278.tif 000013
からなる群から選択された配列を含む、請求項3に記載のプライマー混合物。
【請求項５】
該フォワードプライマー及び該リバースプライマーが、該縮重フォワードプライマーセット及び該縮重リバースプライマーセットの一員であり、かつ該プライマー混合物が、少なくとも2種の縮重フォワードプライマー及び少なくとも2種の縮重リバースプライマーを含む、請求項4に記載のプライマー混合物。
【請求項６】
該フォワードプライマー及び該リバースプライマーが、それぞれ、Seq. ID No.1及び7で記述される配列を含む、請求項5に記載のプライマー混合物。
【請求項７】
該フォワードプライマーが、
配列GGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGYG  （Seq. ID No.:1）
を含む該縮重プライマーセットの一員である、請求項5に記載のプライマー混合物。
【請求項８】
該フォワードプライマーが、Seq. ID No.15及び16で記述される配列を持つ、請求項7に記載のプライマー混合物。
【請求項９】
該リバースプライマーが、
配列GYCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGC（Seq. ID No.7）
を含む縮重プライマーセットの一員である、請求項7に記載のプライマー混合物。
【請求項１０】
該リバースプライマーが、Seq. ID No.13及び14で記述される配列を持つ、請求項9に記載のプライマー混合物。
【請求項１１】
該リバースプライマーが、
配列GYCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGC（Seq. ID No.7）
を含む縮重プライマーのセットの一員である、請求項5に記載のプライマー混合物。
【請求項１２】
該リバースプライマーが、Seq. ID No.13及び14で記述される配列を持つ、請求項11に記載のプライマー混合物。
【請求項１３】
該フォワードプライマーまたは該リバースプライマーが、検出用標識で標識されている、請求項1-12のいずれかに記載のプライマー混合物。
【請求項１４】
該検出用標識が蛍光標識である、請求項13に記載のプライマー混合物。
【請求項１５】
縮重配列RARRARGGGCTGYTGGARATGTS  （Seq. ID No.9）
により示される配列を含むプライマーの中から選択されたフォワードHIV-1プライマーの少なくとも一つと、
縮重配列AGTCARATYTAYBCWGGGATYAARGTRADGV  （Seq. ID No.10）または
GTCARATYTAYBCWGGGATYAARGTRADGV  （Seq. ID No.12）
により示される配列を含むプライマーの中から選択されたリバースHIV-1プライマーの少なくとも一つとを含む、遺伝子型同定キット。
【請求項１６】
該少なくとも一つのフォワードプライマーが、
2004537278.tif 000014
からなる群から選択される、請求項15に記載のキット。
【請求項１７】
該少なくとも一つのリバースプライマーが、
2004537278.tif 000015
からなる群から選択される、請求項15に記載のキット。
【請求項１８】
該少なくとも一つのフォワードプライマーが、
2004537278.tif 000016
からなる群から選択される、請求項17に記載のキット。
【請求項１９】
該フォワードプライマー及び該リバースプライマーが、該縮重フォワードプライマーセット及び該リバースプライマーセットの一員であり、かつ該プライマー混合物が、少なくとも2種の縮重フォワードプライマー及び少なくとも2種の縮重リバースプライマーを含む、請求項15に記載のキット。
【請求項２０】
該フォワードプライマーが、
配列GGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGYG  （Seq. ID No.:1）
を含む該縮重プライマーセットの一員である、請求項19に記載のキット。
【請求項２１】
該フォワードプライマーが、Seq. ID No.15及び16で記述される配列を持つ、請求項20に記載のキット。
【請求項２２】
該リバースプライマーが、
配列GYCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGC（Seq. ID No.7）
を含む縮重プライマーのセットの一員である、請求項20に記載のキット。
【請求項２３】
該フォワードプライマーが、Seq. ID No.15及び16で記述される配列を持つ、請求項22に記載のキット。
【請求項２４】
該リバースプライマーが、Seq. ID No.13及び14で記述される配列を持つ、請求項23に記載のキット。
【請求項２５】
該リバースプライマーが、
配列GYCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGC（Seq. ID No.7）
を含む縮重プライマーのセットの一員である、請求項19に記載のキット。
【請求項２６】
該リバースプライマーが、Seq. ID No.13及び14で記述される配列を持つ、請求項25に記載のキット。
【請求項２７】
該フォワードプライマーまたは該リバースプライマーが、検出用標識で標識されている、請求項15-26のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
該検出用標識が蛍光標識である、請求項27に記載のキット。
【請求項２９】
該キットが、さらにRNA分解酵素阻害剤、逆転写酵素、ポリメラーゼ、並びにdNTP及びddNTPの原料からなる群から選択された1またはそれ以上の試薬を含む、請求項15-26のいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
該フォワードプライマーまたは該リバースプライマーが、検出用標識で標識されている、請求項29に記載のキット。
【請求項３１】
該検出用標識が蛍光標識である、請求項30に記載のキット。
【請求項３２】
ウイルスの型を判定するために非BグループM HIV-1ウイルスまたはグループO HIV-1ウイルスを含むと推測される検体を分析する方法であって、
該検体を処理してウイルスRNAを取出し、
該取出したウイルスRNAを逆転写し、
該逆転写による生成物の配列を分析し、
該配列分析段階の情報を使用して、被検ウイルスの遺伝子型を確定する段階を含み、
該逆転写段階及び該配列分析段階の少なくとも一つを、請求項1-12のいずれかに記載のプライマー混合物を使用して行なう、上記方法。
【請求項３３】
さらに、B亜型ウイルスを確認するために設計された遺伝子型同定方法を平行して実施する段階を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
該検体が、B亜型ウイルスを確認するために設計された遺伝子型同定方法を使用して以前に遺伝子型同定できなかった検体である、請求項32に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）における突然変異を判定するための方法及びプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルスは、後天性免疫不全症候群（AIDS）、あるいはAIDS関連症候群（ARC）の主原因物質である。AIDSは全身的な免疫低下、複合日和見感染、及び神経障害によって特徴づけられる感染症である。HIVは、AIDSの主原因物質と見なされているが、複合感染するウイルス及び細菌病原体は、AIDS患者に認められる一連の臨床症状の原因である。
【０００３】
HIV感染症の臨床経過は、患者によって非常に異なっている。臨床的所見として、日和見感染及びカポジ肉腫のような稀な癌、AIDS随伴痴呆に至る神経障害、及び全身的な免疫不全に罹患し易くなることが認められる。
【０００４】
HIV-1ウイルスは、レトロウイルス科レンチウイルス亜科に属している。他の全てのレトロウイルスと同様に、HIV-1ウイルスはRNAゲノムを持っており、これが、ウイルス逆転写酵素によってDNAプロウイルスに複製され、宿主細胞ゲノム中に組み込まれる。
【０００５】
種々の薬物が、HIVを治療するために現在利用されており、それらは以下の3種類に分類される。
ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NRTI）：ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、ラミブジン、スタブジン、アバカビル、テノフォビル、ホスカルネット等；
非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（NNRTI）：ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ等；及び
タンパク分解酵素阻害剤（PI）：サキナビル、インジナビル、リトナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、及びロピナビルのリトナビルとの併用等。
これらの薬物の中には同じ作用様式を持つものがあるが、ある薬物に対する耐性を生じたからと言って他の薬物にも耐性が生じるとは限らない。
【０００６】
AIDS治療のために現在使用されている抗レトロウイルス薬は、それぞれ、CD4細胞数に対する一過性の影響、ウイルス複製の不完全阻害、処方用量における副作用、及び耐性型ウイスルの出現など、何らかの欠点を持っている。その結果、患者の治療としては併用治療が行なわれている。いくつかのインビトロ試験により、2以上の抗HIV薬の併用はそれぞれの薬物を単独で使用するよりも有効にHIV複製を阻害することが示されている。この数年の間に、標準的な患者の治療方法は、日常的に3剤併用治療がHIV患者に施されるに至っている。
【０００７】
併用療法はHIVによる罹患率及び死亡率を著しく低下させた。しかし、多数の患者は、併用療法によっても完全なウイルス抑制を達成または維持することができていない。薬物耐性はこの不完全なウイルス抑制の結果である。HIVウイルスの非常に高い突然変異率（ウイルス逆転写酵素のエラーを起こし易い性質による）及びウイルスの遺伝的可変性のために、薬物感受性を減じた多くのHIV変異体を生じる。
【０００８】
HIV-1複製はウイルスがコードしている酵素、即ち1本鎖ウイルスRNAゲノムを2本鎖DNA/RNAハイブリッドにコピーする逆転写酵素（RT）、に依存している。HIV-1 RT酵素は、通常はエラーを修復するポリメラーゼの「校正」機能を補助する3'エキソヌクレアーゼ活性を持っていない。HIV-1は9200塩基ゲノムを持っており、RTは、平均してコピーした10,000塩基の転写毎に少なくとも1エラーを生じる。したがって、作られたウイルス子孫は、その親とは若干異なっている可能性がある。RTの不正確さにより、組込まれた塩基当たり推定3 x 10-5のインビボ正突然変異率となる（Mansky LM. Virology. 1996; 222:391-400）。
【０００９】
HIV-1ゲノムに導入された突然変異の多くはウイルスの感染性に悪影響を与えると思われるが、一部のものはウイルス感染性に影響しない。患者において、HIV-1の遺伝的変異体が検出される頻度は、各変異体の複製力（適合性）と感染した患者の中でのその群に働く選択的な抵抗力の特性との関数である（Volberding PA, et al., Antiretroviral therapy for HIV infection: promises and problems, JAMA, 1998;279:1343-4）。 HIV-1感染患者に存在する選択的な抵抗力としては、抗HIV免疫反応、種々の組織におけるウイルス感染を受け易い宿主細胞の利用、及び抗レトロウイルス薬治療などがある。
【００１０】
ウイルスの突然変異誘発性は、この病気の治療の著しい障壁となっている。さらに、このウイルスの突然変異誘発性は、ウイルスの遺伝子変化の検査を非常に困難なものにしている。DNA配列の変化を調べるには、標的核酸分子の完全な配列分析によって行なうことができるが、しかし当業者の多くがその試験は日常的に行なうには余りにも高価であると考えている。
【００１１】
ウイルス抑制の達成または維持の失敗が、ますます注目されてきている。薬物治療の失敗には、治療に関する指示を患者が守らないこと、薬物の効力、薬物動態上の問題（抗レトロウイルス薬の吸収、代謝、排泄及び薬物‐薬物相互作用に関する）及び薬物耐性を含む、いくつかの原因がある（Vella S, et al., Aids. 1998; 12: S147-8.b）。抗レトロウイルス薬の多剤併用は、HIV-1を、HIV-1 RNA検出レベル以下に抑制するが、このことはウイルスが「聖域」区画において複製していないことを意味しない。ある治療法はHIV-1 RNAを検出レベル以下に減少させることができるが、数ヶ月以内にHIV-1ウイルス量は再び増加する。HIV-1が複製している場合には、治療に対する耐性が発生している可能性がある。
【００１２】
HIV-1複製は速やかに生じるので、抗レトロウイルス薬に対して減少した感受性を示すウイルスを含む多数のウイルス変異体を生じる。抗レトロウイルス薬に対する耐性を賦与する突然変異は、既に治療を受けた患者からの伝染または自然発生的な突然変異により、抗レトロウイルス治療を開始する前にHIV-1感染患者に存在し得る。一度薬物治療が開始されると、選択的優位性のために既に存在する薬物耐性ウイルス群が急速に優勢となり得る。ラミブジンまたはネビラピン（及びその他のNNRTI）のような薬物に対して、HIV-1 RT遺伝子の1ヌクレオチドの変異は、100から1,000倍の薬物感受性減少を生じ得る（Schinazi RF, et al., Int Antiviral News. 1997; 5: 129-42）。これらの薬物が単独で使用された場合のインビボ抗レトロウイルス活性は薬物耐性変異体の急速な生成のために治療開始から4週間以内にほとんど失われる（Richman DD, et al. Nevirapine resistance mutations of human immunodeficiency virus type 1 selected during therapy. J Virol. 1994; 68: 1660-6）。抗レトロウイルス薬により選択される一部の突然変異は、直接、ウイルスの酵素に作用して、薬物結合を減少させて耐性を生じるが、他方その他には間接的に作用するものもある（Condra JH, et al. J Virol. 1996; 70: 8270-6,及びHarrigan PR, et al. J Vrol. 1996; 70: 5930-4）。異なる抗レトロウイルス薬による治療は、同一の、または関連する、突然変異を持つHIV-1変異体を選択することがあり得る。治療により、未だ患者が曝露されていない薬物に対して耐性であるHIV-1変異体の生成を選択してしまうこともあり得る（交差耐性）。
【００１３】
突然変異は、Orita et al., Genomics 5: 874-879 (1989)により記述されている「1本鎖立体配座多型」（SSCP）と呼ばれる技術、またはその変法であるSarkar et al., Genomics 13: 441-443 (1992)により記述されているジデオキシ‐フィンガープリンティング法（「ddF」）と呼ばれる方法により検出することができる。SSCP及びddFはいずれもDNAフラグメントが非変性電気泳動ゲル上で電気泳動により分離して生じるバンドパターンを分析する。このパターンはフラグメントの大きさと変性していない3次元立体配座の組み合わせに依存している。その結果、フラグメントバンドの理論的な間隔は均等ではないので、配列分析には使用することができない。
【００１４】
その他にプローブによる分析によりウイルスの遺伝子状態を調べる試みがなされ、その方法では特異的ハイブリダイゼーション条件下に探索プローブがウイルス核酸とハイブリダイズするか否かにより特異的ウイルス突然変異の存在を調べる。例えば、Stuyver et al. (PCT国際特許公報番号WO 99/67428)は、逆ハイブリダイゼーション検定における核酸プローブパネルの使用を記述し、またGingeras et al. は突然変異の対を検出するプローブの使用を記述している（PCT国際特許公報番号WO 92/16180）。それらの検定は、新しいウイルス変異体を検出することができないことを含めていくつかの欠点を持っており、また領域内における複雑な多数の突然変異に対処するのに充分な感度がない。
【００１５】
その他の方法は、患者由来のウイルスと宿主細胞との培養に、耐性検査ベクターを使用することである。このベクターは、試験量の抗HIV薬を細胞培養に加えた時に、細胞培養系におけるその薬物に対するクローン化ウイルスの耐性を測定するための指標遺伝子を含んでいる（Parkin et al, USPN 5,837,464）。
【００１６】
患者のウイルスの遺伝子的合成に関するもっとも直接的情報は、何と言ってもウイルスの配列を直接分析することである（遺伝子型同定）。遺伝子型同定の臨床的有用性は、遺伝子型同定抗レトロウイルス薬耐性試験（GART）等の研究に基づき、制御された既知の及び予見される介入により立証されている（Baxter JD, et al. A randomized study of antiretroviral management based on plasma genotypic antiretroviral resistance testing in patients failing therapy. AIDS; 2000; 14: F83-F93及びVIRADAPT試験、Durant J, et al. Drug-resistance genotyping in HIV-1 therapy: the VIRADAPT randomised controlled trial, Lancet. 1999; 353: 2195-9 and Lancet 1999 Sep 25; 354 (9184): 1128）。治療を受けている患者において、標準的治療に付随して特異的な抗レトロウイルス薬に対する耐性の原因となる突然変異の同定を行なったところ、ウイルス量の著しい減少により、治療方法選択の指針としての遺伝子型同定の付随的使用が、臨床上有用性であることが立証された。
【００１７】
遺伝子型同定の困難の一つは、ウイルス固有の変動性と不均一性である。ウイルスは、ウイルスに対する宿主の免役系の反応性、並びにELISA、抗体依存性細胞障害検定（ADCC）、及びCD4不活化法に基づいて、血清学的に異なることが認められている。ウイルスの広範な血清学的不均一性はウイルスの遺伝子配列にも反映されている。結果として、ウイルスDNA配列を使用した系統発生的再構成に基いて、HIV-1ウイルスは二つの遺伝子グループに分類されてきた。グループ０（アウトライアー）は、ごく一部のHIV-1を表し、西アフリカ、多分カメルーン起源と考えられる。
【００１８】
臨床上問題となるAIDSと関係する大多数のHIV-1の配列は、グループM（メジャー）型である。Mグループの中には、種々の亜型（単系統群とも呼ばれる）が存在し、以下に示すように地域的に異なる分布をしている。
【００１９】
HIV-1グループM亜型      主として分布する地域
A（A1及びA2を含む）     中央アフリカ
B                       ヨーロッパ、北及び南アメリカ、オーストラリア、及びアジア
C                       東及び南アフリカ、インド
D                       中央アフリカ
E                       東南アジア（タイ）
F（F1及びF2を含む）     南アメリカ（ブラジル）及び東ヨーロッパ（ルーマニア）
G                       中央アフリカ、ロシア、及びポルトガル
H                       中央アフリカ及び台湾
I                       キプロス
J                       中央アフリカ及びヨーロッパ
K
N
O
【００２０】
各亜型は、相互にウイルスエンベロープ領域においては、少なくとも20%のアミノ酸組成が異なっており、ウイルスgag領域においては、少なくとも15%のアミノ酸組成が異なっている。各亜型の中では、envにおける相違は10%まではあり得、その一方gagにおける相違は8%まであり得る。ウイルスの逆転写酵素およびタンパク分解酵素の遺伝子は、薬物耐性に関係することが知られている部位であり、ウイルスpol転写物上に認められている。亜型間のHIV-1 polのアミノ酸同一性は75%に過ぎないと推定されている。核酸配列レベルにおける変動はさらに大きい。
【００２１】
レトロウイルスは、関連するレトロウイルスと組換えを行なう傾向がある。もし一つの細胞が複数のウイルスに感染すると、組換えが起こって組換え亜型を生じ、その後、これが他人に感染することがある。既知の多数の亜型に加えて、組換え亜型の流布が認められており、例えばA/E（中央アフリカ）、A/G（西及び中央アフリカ）、A/B（カリングラード）、A/G/H/K（キプロス/ギリシャ）並びにD/F及びB/D組換え体がある。
【００２２】
今日まで、北アメリカ及び西ヨーロッパにおける臨床研究の多くは、グループM亜型Bが他のグループM亜型よりも比較的流布していたために、当該グループM亜型Bに向けられてきた。しかし、AIDS流行が拡大するにしたがって、北アメリカ及びヨーロッパにおいて、非B亜型の発生頻度が増加してきている。ある場合、非Bに感染した最初の患者は局地的集団の感染中心となることがあり、そのような場合には、例えば、ある北アメリカの都市（そこでは未だ主として亜型Bが存在する）において、非B亜型に感染した患者の完全な局在化を生じ得る。例えば、グループO及びグループMの亜型Gが、最近アフリカから米国に来たAIDS患者に認められた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
（発明の要約）
本発明は、プライマー配列、及びそれを使用してHIV-1含有検体、特にグループMウイルスのB亜型を検出するために設計されたプライマー配列を使用して遺伝子型同定することができない検体、の遺伝子型同定方法を提供する。したがって、本発明の第一の態様は、少なくとも1種のフォワードプライマー及び少なくとも1種のリバースプライマーを含むプライマーの組合せである。
【００２４】
フォワードプライマーは次の縮重配列によって示すことができる。
RARRARGGGCTGYTGGARATGTS  （Seq ID No.9）
【００２５】
任意に一端または両端にGを追加でき、配列中の標準でない記号（A，C，G及びT以外の記号）は後記するように通常の命名による塩基の選択を示す。この配列により総計128の可能な配列が示される。これらの配列の変異体も使用することができる。例えば、Seq. ID No. 11, 15及び16は、Gが追加されたプライマーを示す。
【００２６】
同様にリバースプライマーは次の縮重配列によって示すことができる。
AGTCARATYTAYBCWGGGATYAARGTRADGV（Seq. ID No.10）
GTCARATYTAYBCWGGGATYAARGTRADGV  （Seq. ID No.12）
【００２７】
前者の場合に、この定義の範囲内に合計3456種類の可能なプライマーがある。後者の場合にも、この縮重配列は最初のAのみが異なる3456の可能なプライマーを示している。各グループの一つまたはそれ以上の選択されたプライマーは、逆転写、増幅及び配列分析のプライマーとして使用することができる。
【００２８】
プライマーは遺伝子型同定キットの中に適切に組込まれる。そのキットにはプライマーに加えて、RNA分解酵素阻害剤、逆転写酵素、ポリメラーゼ、及び/またはdNTP及びddNTPの原料のような試薬が含まれる。
【００２９】
プライマーは本発明の方法において適切に使用される。本方法に従って、非BグループM  HIV-1ウイルスまたはグループO  HIV-1ウイルスを含むと推測される検体を処理してウイルスRNAを取出す。取出したウイルスRNAをDNAに逆転写し、その配列を本発明のプライマーを使用して分析する。得られた配列情報を使用して被検ウイルスの遺伝子型同定を行なう、すなわち、検体中のウイルスがどの亜型に属するか確定する。本発明の方法は、B亜型ウイルスを同定するために設計された遺伝子型同定方法と平行して実施することができる。また、B亜型ウイルスを同定するために設計された遺伝子型同定方法を使用してそれまでに遺伝子型同定することができなかった検体について本発明の方法を実施する。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
本願で使用されている用語は、この技術分野において標準的なものであるが、明確さを確保するために一部の用語について定義を示す。
【００３１】
本明細書において使用される用語「アレル」は、多型性遺伝子座における特定のヌクレオチド配列を意味する。
【００３２】
本明細書において使用される用語「多型性部位」は、集団内で変動する遺伝子座における所定のヌクレオチド位置を意味する。
【００３３】
本明細書において使用される用語「遺伝子」または「遺伝子座」は、所定のゲノム内の特定のヌクレオチド配列を意味する。
【００３４】
遺伝子座におけるヌクレオチドの「場所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）」または「位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、一般的には遺伝子のゲノム配列であるcDNA配列から得られる、遺伝子中のヌクレオチドに対して指定された数字を意味する。
【００３５】
ヌクレオチドアデノシン、シトシン、グアニン及びチミンは、一文字コードA，C，G及びTでそれぞれ表示される。縮重プライマーの表示において、記号RはGまたはAを示し、記号YはT/UまたはCを示し、記号MはAまたはCを示し、記号KはGまたはT/Uを示し、記号SはGまたはCを示し、記号WはAまたはT/Uを示し、記号Bは「非A」を示し、記号Dは「非C」を示し、記号Hは「非G」を示し、記号Vは「非T/U」を示し、そして記号Nはいずれのヌクレオチドでもよいことを示す。本出願の明細書及び特許請求の範囲において、縮重プライマーは、塩基選択の組み合わせのいずれかまたは全て、あるいはDNAまたは対応するRNA配列（すなわち、TをUに置換）のいずれかである。したがって、縮重プライマーは1種、または選択の範囲内にある2種の混合物、または選択の範囲内にある3種の混合物、さらに可能な組合せを全て含む混合物までを示すことができる。
【００３６】
本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチドプライマー」は、3を超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子のことである。その正確な長さは、温度、プライマーの起源及び使用する方法を含めて、オリゴヌクレオチドプライマーの最終的な機能及び用途に関係する多くの因子に依存している。オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成を誘導する条件下に置いた時に合成の開始点として働くことができる。条件としては、適切な温度とpHにおける、ヌクレオチド及びDNAポリメラーゼのような誘導剤の存在が含まれる。望ましい態様において、プライマーは、誘導剤の存在下に特定の配列から伸長生成物の合成を開始するのに充分な長さのSSオリゴデオキシリボヌクレオチドである。望ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは少なくとも18ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドプライマーの感度及び特異性は、プライマーの長さ及び鋳型核酸である特定の試料中における配列の独自性により決まる。例えば、非常に短いプライマーは、広範囲で変化している配列に対して非特異的な結合性を示す。
【００３７】
本発明の第一の態様は、Seq ID No.9の縮重配列、例えばSeq. ID. No.11, 15または16で示される配列を含むプライマーの中から、望ましくは正確にこれらの配列を持つプライマーの中から選択された少なくとも一つのフォワードHIV-1プライマーと、Seq ID No.10または12の縮重配列、例えばSeq. ID. No.13または14で示される配列を含むプライマーの中から、望ましくは正確にこれらの配列を持つプライマーの中から選択された少なくとも一つのリバースHIV-1プライマーとを単一溶液中に含むプライマーの混合物である。プライマーが配列分析プライマーとして使用される場合には、フォワードプライマーかあるいはリバースプライマを検出標識で標識する。最も一般的な配列分析装置には、蛍光標識が望ましいが、着色、発色、蛍光（化学発光を含む）及び放射能による標識も使用し得る。プライマー混合物は逆転写、増幅または配列分析に使用する他の試薬を含むことができ、勿論分析用のHIV-1遺伝物質を含むことができる。
【００３８】
本発明のプライマー混合物に使用するための特異的フォワードプライマーは、
2004537278.tif 000002
であり、非限定的に、以下の非縮重プライマー配列を含んでいる。
2004537278.tif 000003
【００３９】
本発明のプライマー混合物に使用するための特異的リバースプライマーは、
2004537278.tif 000004
であり、非限定的に、以下の非縮重プライマー配列を含んでいる。
2004537278.tif 000005
【００４０】
上記のプライマー混合物は、本発明による方法において、非BグループM HIV-1ウイルスまたはグループO  HIV-1ウイルスを含むと推測される検体についてウイルスの亜型及び遺伝子型を調べるために使用することができる。この方法は、ウイルスRNAを取出すために検体を処理し；取出したウイルスRNAを逆転写し；逆転写生成物の配列を分析し；配列分析段階の結果を使用して被検ウイルスの遺伝子型を確定する、段階を含んでいる。この方法においては、逆転写段階及び配列分析段階のいずれかあるいは両方を上記のプライマー混合物を使用して行なう。本発明の方法は、B亜型ウイルスを同定するために設計された遺伝子型同定方法を平行して行なう段階を含むことができる。その他には、本発明の方法は、B亜型ウイルスのために設計された遺伝子型同定方法を使用して遺伝子型同定できなかった検体に使用することができる。この代替法は現在では一般的となったB亜型であることが立証されている検体について不必要な試験を行なわずに済むと言う利点がある。
【実施例】
【００４１】
（実施例１）
配列  GGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGYG  （Seq. ID. No.1）
のフォワードプライマー及び
配列  GYCAGATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGC（Seq. ID. No.7）
のリバースプライマーの縮重混合物を、他のプライマーを使用して遺伝子型同定できなかった検体中の非B亜型を回収するために使用した。TRUGENE  HIV-1遺伝子型同定キット（Visible Genetics Inc., Toronto, Canada）を、HIV-1ウイルスのある非B亜型の遺伝子型同定を行なうために使用した。RNAを、患者血漿検体からウイルスRNA用のTRUPREP抽出キットの説明書に従って抽出した。RNAの17μlを増幅用混合母液に添加する。混合母液は、（反応当たり）0.2 μlのSEQ ID No.1 (30 pmole/μl)、0.4μlのSEQ ID No.7 (30 pmole/μl)、6.4μlの水、1.75μlのdNTP、1.165μlのDTT及び0.58μlのRNA分解酵素阻害剤を含む。反応はPerkin-Elmer 9700 thermocyclerを使用して加熱サイクルを行ない、下記の温度/時間サイクルプログラムを使用する。
【００４２】
【表１】
2004537278.tif 000006
【００４３】
増幅用混合母液及びRNAを、一緒に、5分間50℃でインキュベートした後、14μlの第二混合母液を加え、RT-PCRサイクルプログラムを継続する。第二混合母液は、10μlのRT-PCR緩衝液、5μlのRNA分解酵素阻害剤、1μlの逆転写酵素（Superscript, Invitrogen Corporation ）、及び17.5μlのDNAポリメラーゼを含む。PCRサイクルプログラムが完了した後、検体の配列分析をTRUGENE HIV-1説明書（Visible Genetics Inc.）のプロトコールに従って行なった。
【００４４】
下記の検体について増幅及び配列分析することができた。ウイルス量は患者血漿ミリリットル当たりのウイルスRNAコピー数として示してある。「起源」は血漿を採取した時の患者の住所のことである。
【００４５】
【表２−１】
2004537278.tif 000007
【００４６】
【表２−２】
2004537278.tif 000008
【００４７】
【表２−３】
2004537278.tif 000009
【００４８】
（実施例2）
本発明によるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、TRUGENE HIV-1遺伝子型同定キットを使用して遺伝子型同定することができなかった非B亜型の何パーセントを遺伝子型同定できるか試験した。これらの検体の74%を遺伝子型同定することができた。同様に、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、非B検体と判明している全検体の95%以上を遺伝子型同定することができた。陽性対照としてpLAIを使用して、非B亜型ウイルスのパネルを作製した。各検体のウイルス量を測定した（Roche Amplicor or Organon Teknika NASBA）後、連続希釈法を使用して、逆転写反応当たり25コピーまで、検体を希釈した。全ての場合に、塩基の読み取り及び突然変異の検出を行なうことができた。
【００４９】
（実施例3）
本発明のプライマーを使用して、グループM（種々の亜型及び組換え体）及びグループOの両者のHIV-1ウイルスの増幅及び配列分析を行なうことができた。
【００５０】
【表３】
2004537278.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004537278.tif 000017
2004537278.tif 000018
2004537278.tif 000019
2004537278.tif 000020
2004537278.tif 000021
2004537278.tif 000022
2004537278.tif 000023
2004537278.tif 000024
2004537278.tif 000025
2004537278.tif 000026
2004537278.tif 000027
2004537278.tif 000028
2004537278.tif 000029
2004537278.tif 000030
2004537278.tif 000031
2004537278.tif 000032
2004537278.tif 000033
2004537278.tif 000034
2004537278.tif 000035
2004537278.tif 000036
2004537278.tif 000037
2004537278.tif 000038
2004537278.tif 000039
2004537278.tif 000040
2004537278.tif 000041
2004537278.tif 000042
2004537278.tif 000043
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537278.tif 000044
【国際調査報告】
2004537278.tif 000045
2004537278.tif 000046