(57)【要約】本発明は、α−平滑筋アクチン遺伝子（α−ＳＭＡ遺伝子）の特異的、調節配列領域、及び前記調節配列領域が作動的に他の機能塩基配列に結合してなる融合構造に関する。本発明はまた、細胞種特異的及び分化特異的レポーター発現、細胞種特異的及び分化特異的遺伝子変化（改変、変異）、並びに細胞及び生物内での遺伝子発現変化のために前記調節配列領域を使用することに関する。
2004502448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）α−ＳＭＡ遺伝子のヌクレオチド−６９８〜＋１８からなるα平滑筋アクチン遺伝子（α−ＳＭＡ遺伝子）の調節配列領域からの１つ以上の機能領域（番号付けは、図５Ａ及び７Ａに示されるｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの配列を意味する）と、
（ｉｉ）天然α−ＳＭＡをコードせず、配列（ｉ）と作動的に連結している少なくとも１つの追加の機能核酸配列と、を含む核酸配列の、
筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞のＳＭＡ陽性細胞の遺伝子発現及び／又は一時的又は活性化後の細胞機能を操作するための医薬組成物を調製するための使用。
【請求項２】
前記α−ＳＭＡ遺伝子の前記調節配列領域の前記核酸配列が、
前記α−ＳＭＡ遺伝子のヌクレオチド−６９８〜＋１８からの少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０の連続した塩基を有する、及び／又は
哺乳動物、特に霊長類、齧歯類、又は鳥類に由来し、特に好ましくはラット、マウス、ヒト、又はニワトリに由来する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記調節配列領域がラットに由来し、前記核酸配列が好ましくは、図５Ａに示される配列（配列番号１）、特に図７Ａに示される配列（配列番号５）の１つ以上の機能領域を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記機能領域が、
（ｉ）転写活性化核酸配列であり、特に、図７Ｃに示される配列（配列番号７）に由来し、好ましくは、前記転写活性化配列は、図７Ｃに示される配列の少なくとも１０、好ましくは少なくとも４０、特に好ましくは少なくとも６０の連続した塩基を有し、特に好ましくは図７Ｂ又は７Ｃに示される配列（配列番号６又は７）を含むか、あるいは
（ｉｉ）細胞種特異的核酸配列であり、特に、図７Ａの配列−６９８〜−１９０（配列番号５のヌクレオチド１〜５０９）に由来し、特に好ましくは図７Ａの配列−６９８〜−２１５（配列番号５のヌクレオチド１〜４８４）又は図７Ｉに示される配列（配列番号１３）に由来し、好ましくは前記細胞特異的配列は、図７Ａの配列−６９８〜−１９０からの少なくとも２５、好ましくは少なくとも３５の連続した塩基を有し、特に好ましくは図７Ｉ又は７Ｍに示される配列（配列番号１３又は１７）を含む、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記核酸配列が、転写活性化及び細胞種特異的核酸配列を含む、及び／又は配列番号５〜１７に示される配列の中の１つを有する、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
前記調節配列領域がマウスに由来し、好ましくは前記核酸配列図５Ｂに示される配列（配列番号２）が１つ以上の機能領域を有し、特に配列番号１８に示される配列を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記機能領域が、
（ａ）転写活性化核酸配列であり、特に配列番号１８のヌクレオチド４９０〜６９７に由来する、及び／又は
（ｂ）細胞種特異的核酸配列であり、特に配列番号１８に示される配列のヌクレオチド１〜４８９に由来する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記調節配列領域がヒトに由来し、前記核酸配列が好ましくは図５Ｃに示される配列（配列番号３）、特に配列番号１９に示される配列の１つ以上の機能領域を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
前記機能領域が、
（ａ）転写活性化核酸配列であり、特に配列番号１９に示される配列のヌクレオチド５１３〜７１５に由来する、及び／又は
（ｂ）細胞種特異的核酸配列であり、特に配列番号１９に示される配列のヌクレオチド１〜５１２に由来する、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記調節配列領域がニワトリに由来し、前記核酸配列が好ましくは図５Ｄに示される配列（配列番号４）、特に配列番号２０の配列の１つ以上の機能領域を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
前記機能領域が、
（ａ）転写活性化核酸配列であり、特に配列番号２０に示される配列のヌクレオチド４９７〜６９９に由来する、及び／又は
（ｂ）細胞種特異的核酸配列であり、特に配列番号２０に示される配列のヌクレオチド１〜４９６に由来する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記追加の機能核酸配列が、ペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、特にレポーター遺伝子、薬理学的活性タンパク質をコードする配列、及び調節ＤＮＡ配列から選択されるか、あるいは機能ＲＮＡ、特にリボザイムをコードする配列である請求項１から１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１〜１２に定義される核酸配列、又はベクターを導入することを含み、前記核酸配列が生物又は器官に導入される、生物及び器官の筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞の遺伝子発現及び／又は細胞機能を操作する方法。
【請求項１４】
ｉｎ　ｖｉｖｏ法又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ法であって、特に
（ｉ）前記生物又は器官への導入が、トランスジェニックノックアウト／ノックイン技術を利用して行われるか、あるいは
（ｉｉ）　前記方法が、遺伝子治療融合ベクターの利用である、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）α−ＳＭＡ遺伝子のヌクレオチド−６９８〜＋１８からなるα平滑筋アクチン遺伝子（α−ＳＭＡ遺伝子）の調節配列領域の１つ以上の機能領域（番号付けは、図５Ａ及び７Ａに示されるｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの配列を意味する）と、
（ｉｉ）配列（ｉ）と作動的に連結し、天然α−ＳＭＡをコードせず、薬理学的活性タンパク質をコードするＤＮＡ配列、調節配列、又は機能ＲＮＡをコードする配列から選択される少なくとも１つの追加の機能核酸配列と、
を含む、核酸配列。
【請求項１６】
請求項２から１１に定義される請求項１５に記載の核酸配列。
【請求項１７】
請求項４、７、９、又は１１に定義される転写活性化核酸配列又は細胞種特異的核酸配列。
【請求項１８】
請求項１７に定義される核酸配列を含む、又は請求項１５若しくは１６に定義される核酸配列が挿入されるベクター。
【請求項１９】
請求項１５、１６、又は１７に定義される核酸配列、又は請求項１８に定義されるベクターに、一過的又は安定的にトランスフェクト、トランスフォーム、又は感染され、好ましくは
（ｉ）前記α−ＳＭＡ遺伝子の前記調節配列の調節下でレポーターを発現するか、あるいは、
（ｉｉ）α−ＳＭＡ遺伝子の調節下で薬理学的活性タンパク質、調節ＤＮＡ配列、又は機能ＲＮＡ配列の発現又は含有が起こる、
真核細胞又は生物。
【請求項２０】
請求項１５、１６、又は１７に定義される核酸配列、又は請求項１８に定義されるベクターで、親細胞を、トランスフェクト、トランスフォーム、又は感染させること含む、請求項１９に定義の真核細胞の作製方法。
【請求項２１】
請求項１５、１６、又は１７に定義される核酸配列、又は請求項１８に定義されるベクターを有するＥＳ細胞を、生物の胚盤胞に注入するステップと、代理母に着床させるステップとを含む、請求項１９に定義の生物の作製方法。
【請求項２２】
請求項１５、１６、又は１７に定義される核酸配列、又は請求項１８に定義されるベクターを生物又は器官に導入することを含み、
（ｉ）前記生物又は器官への導入が、好ましくはトランスジェニックノックアウト／ノックイン技術を利用して行われるか、あるいは
（ｉｉ）前記方法が、好ましくは遺伝子治療融合ベクターの利用である、
生物又は器官の平滑筋細胞又は筋線維芽細胞の遺伝子発現及び／又は細胞機能を操作する方法。
【請求項２３】
請求項１から１２又は１５から１６に定義される核酸配列、あるいは請求項１８に定義されるベクターを含み、好ましくは、生物又は器官の平滑筋細胞又は筋線維芽細胞の遺伝子発現及び／又は細胞機能の操作に好適である医薬組成物。
【請求項２４】
筋線維芽細胞性及び分化依存性レポーター発現のため、又は筋線維芽細胞性及び分化依存性遺伝子操作のための前記α−ＳＭＡ遺伝子の前記調節配列領域の機能領域の使用であって、前記α−ＳＭＡ遺伝子の前記機能領域が好ましくは
（ｉ）請求項１７に定義される核酸配列である、
（ｉｉ）請求項１から１２又は１５〜１６に定義される核酸配列である、及び／又は
（ｉｉｉ）請求項１８に定義されるベクター中に存在する、
方法。
【請求項２５】
細胞混合物、細胞集団、細胞集合体、又は生物から筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞の一時的又は活性化後のＳＭＡ陽性細胞を単離又はスクリーニングする方法であって、
真核細胞又は生物のレポーター遺伝子の発現を、請求項１から１２又は１５から１６に定義されるα−ＳＭＡ遺伝子の調節配列の調節下でレポーターを使用して行うステップと、
前記レポーターを検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２６】
細胞混合物、細胞集団、細胞集合体、又は生物から筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞の一過的又は活性化後のＳＭＡ陽性細胞を単離又はスクリーニングするための診断薬の製造のための請求項１から１２又は１５から１６に定義されるα−ＳＭＡ遺伝子の調節配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明が属する技術分野
本発明は、α平滑筋アクチン遺伝子（α−ＳＭＡ遺伝子）の特異的調節配列領域と、α−ＳＭＡ遺伝子の前記調節配列領域が他の機能核酸配列に作動的に連結している融合コンストラクトと、細胞種及び分化に特異的なレポーター発現（特に、筋線維芽細胞中及び筋線維芽細胞様細胞中において）、細胞種及び分化に特異的な遺伝子変化（改変、変異）、及び細胞と生物における遺伝子発現変化のための前記調節配列領域の使用とに関する。
【０００２】
詳細には、本発明は、α−ＳＭＡ遺伝子の５’末端領域内にある配列から実質的になる前記特異的配列領域が、さらに別の機能核酸配列、好ましくはペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列、調節ＤＮＡ−配列、又は機能ＲＮＡをコードする配列と作動的に連結している融合コンストラクトに関し、前記融合コンストラクトをベクターに作動的に挿入し、そのベクターコンストラクトを真核細胞に導入する方法に関し、前記細胞をレポーターコンストラクトで一時的又は持続的にトランスフェクト、トランスフォーム、又は感染させ、α−ＳＭＡ遺伝子の前記調節配列の調節下でレポーターを発現させ、細胞混合物、細胞集団、細胞集合体、又は生物から、肺細胞又は一時的にα−ＳＭＡ陽性の細胞、特に、筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞を単離又はスクリーニングするためにそのレポーター発現を後に使用する方法に関し、前記融合コンストラクト（α−ＳＭＡ遺伝子の調節配列、ならびにペプチド又はタンパク質をコードする配列、及びＲＮＡをコードする配列をそれぞれ含む）によって、生物又は器官のα−ＳＭＡ陽性細胞、特に筋線維芽細胞及び筋線維芽細胞様細胞の細胞機能のそれぞれの遺伝子発現を、トランスジェニック若しくはノックアウト／ノックイン技術の使用、又は遺伝子治療融合ベクターの利用によって操作する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
α−ＳＭＡ遺伝子は、細胞骨格アクチンの種々のアイソフォームをコードするアクチン多重遺伝子ファミリーに含まれる。種々のアクチンの発現は、細胞種特異性が高く、分化に依存して調節される。成体では、骨格α−アクチンは骨格筋で発現され、心臓α−アクチンは心筋で発現され、α−ＳＭＡは平滑筋で発現される。α−ＳＭＡ遺伝子の転写調節は、５’領域における正及び負に作動する調節要素の相互作用によって行われる（Ｂｌａｎｋ， Ｒ． Ｓ．ら、Ｊ ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９８４−９８９ （１９９２）、 Ｃａｒｒｏｌ， Ｓ． Ｌ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１：８９５５−８９７６ （１９８６）、 Ｃａｒｒｏｌ， Ｓ． Ｌ．ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：２４１−２５０ （１９８８）、 Ｎａｋａｎｏ， Ｙ．ら、Ｇｅｎｅ． ９９：２７５−２８９ （１９９１）、 Ｍｉｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１６６６７−１６６７５ （１９９０））。α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域は、別々に保存されたシスエレメント様の２つのＣＡｒＧ−エレメント（ＣＡｒＧ−Ａ及びＢ）を含む（Ｃａｒｒｏｌ， Ｓ． Ｌ．ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：２４１−２５０ （１９８８）、 及びＢｌａｎｋ， Ｒ． Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９８４−９８９（１９９２））。ＣＡｒＧモチーフは、ＣＣ／ＧＧが隣接するＡ／Ｔ繰り返しからなり、筋肉特異的な遺伝子調節の重要な要素として現在議論されている（Ｃｈｏｗ， Ｋ． Ｌ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｒ． Ｊ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０，５２８−５３８ （１９９０）、及びＳｏｂｕｃ， Ｋ．ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９０：１０５−１１８ （１９９９））。トランスジェニックマウスにおけるレポーターの研究から、α−ＳＭＡ遺伝子の第１イントロンの別のＣＡｒＧボックス（０）が、平滑筋細胞におけるα−ＳＭＡのｉｎ　ｖｉｖｏ発現に必要であることが示された（Ｍａｃｋ， Ｃ． Ｐ．， Ｏｗｅｎｓ， Ｇ． Ｋ．， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， ８４：８５２−８６１ （１９９９））。
【０００４】
さらにα−ＳＭＡ遺伝子の５’領域は、基本的なへリックス−ループ−へリックス転写因子の潜在的な結合部位である２つのＥ−ボックスコンセンサス配列（ＣＡ ＮＮ ＴＧ） （Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ａ． Ｄ．， Ｏｗｅｎｓ， Ｇ． Ｋ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２７６，Ｃ１４２０−Ｃ１４３１ （１９９９））と、機能がまだ分かっていない別のコンセンサス配列（Ｈａｕｔｍａｎｎ， Ｍ． Ｂ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：１０９４８−１０９５６ （１９９７）、及びＭｃＮａｍａｒａ， Ｃ． Ａ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６８：Ｃ１２５９−Ｃ１２６６ （１９９５））を含む。
【０００５】
α−ＳＭＡ遺伝子は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）で細胞種特異的に発現される（Ｖａｎｄｅｒｋｅｒｃｋｈｏｖｅ Ｊ． ａｎｄ Ｗｅｂｅｒ Ｋ．， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １４：１２３−１３３ （１９７９）、Ｓｋａｌｌｉ， Ｏ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０３：２７８７−２７９６ （１９８６）、及び同上、Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．， ３７：３１５−３２１ （１９８９））。ＷＯ００／２４２５４号には、ＳＭＣにおける外来遺伝子の発現のために、５’領域の調節配列及びα−ＳＭＡの第１イントロンを使用する方法が開示されている。この刊行物には、ＳＭＣの関与する組織再構成のスクリーニング、ＳＭＣの関連する組織再構成のアゴニスト及びアンタゴニストの推定のスクリーニング、ならびにＳＭＣの関連する組織再構成の治療薬のスクリーニングのためのベクター中へのこれらの配列の使用も開示されている。詳細には、ＷＯ００／２４２５４号には、α−ＳＭＡ遺伝子の全配列（配列番号１：ラットα−ＳＭＡ遺伝子の−２５５８ｂｐ〜＋２７８４ｂｐ、すなわち、−２５５８ｂｐの５’領域、ならびに第１エクソン及びイントロンの＋１〜＋２７８４ｂｐ領域）、ＳＭＣのｉｎ　ｖｉｖｏ発現に必要な第１イントロンの配列領域（＋７７３〜＋１０９８、配列番号２参照）が開示されている。
【０００６】
ＳＭＣの細胞特異的発現以外に、α−ＳＭＡ遺伝子は、骨格筋細胞及び心筋細胞の分化中に胚形成でも一時的に発現され（Ｒｕｚｉｃｋａ， Ｄ． Ｌ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １０７：２５７７５−２５７８６ （１９８８）、Ｗｏｏｄｃｏｃｋ−Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｊ．， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｊ． Ｊ．， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３９：１６１−１６６ （１９８８））、慢性的な器官の損傷後の瘢痕及び組織再構成中の異なる細胞種の創傷治癒中及び筋線維芽細胞性変化後の筋線維芽細胞でも一時的に発現される（Ｄｅｓｍｏｕｌｉ＆ｅｇｒａｖｅ；ｒｅ Ａ．ら、Ｅｘｐ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． ３：１３４−１３９ （１９９５）、Ｇａｂｂｉａｎｉ Ｇ．， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３８：５４５−５４８ （１９９８）、同上のＰａｔｈｏｌ． Ｒｅｓ． Ｐｒａｃｔ． １９０：８５１−８５３ （１９９４）、同上のＡｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ８３：４５７−４７４ （１９７６））。
【０００７】
筋線維芽細胞は、中胚葉起源の細胞種であり、顕著なマトリックス形成、デスミン又はビメンチンとは異なる中間径フィラメントパターンを特徴とし、α−ＳＭＡ発現によって収縮することができる（Ｄｅｓｍｏｕｌｉ＆ｅｇｒａｖｅ；ｒｅ， Ａ．ら、Ｅｘｐ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． ３：１３４−１３９ （１９９５）、Ｇａｂｂｉａｎｉ， Ｇ．， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３８：５４５−５４８ （１９９８）、同上、Ｐａｔｈｏｌ． Ｒｅｓ． Ｐｒａｃｔ． １９０：８５１−８５３ （１９９４）、同上、 Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ８３：４５７−４７４ （１９７６））。これらは創傷治癒中に一時的に発生するが、永存性の筋線維芽細胞は慢性瘢痕プロセス及び結合組織又は器官の再構成に関与している。例えば、肝炎、糸球体腎炎、骨髄線維症、又は肺線維症などの慢性的臓器障害が原因である種々の線維疾患では、筋線維芽細胞が主要マトリックス形成細胞である（Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｓ． Ｌ．， Ｎｅｗ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８：１８２８−３５ （１９９３）、Ｇｒｅｓｓｎｅｒ， Ａ． Ｍ．， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ４９：３９−４５ （１９９６）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ． Ｒ．ら、Ｈｕｍ． Ｐａｔｈｏｌ．， ２４：７１０−７１６ （１９９３）、Ａｌｐｅｒｓ， Ｃ． Ｅ．ら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ４１：１１３４−１１４２ （１９９２）、Ｔｈｉｅｌｅ Ｊ．ら、Ｊ． Ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃ． Ｃｙｔｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． ２３（１）：１０９−２１（１９９１）、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｒ． Ｊ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８７：８４７−８５８ （１９９１）、Ｋａｐａｎｃｉ， Ｙ．ら、Ｍｏｄ． Ｐａｔｈｏｌ． １０：１１３４−４２ （１９９７））。したがって、筋線維芽細胞は調節された線維芽細胞としてもしられているが、それらの前駆細胞は器官の種類によって大きく異なる。慢性的な腎臓障害は、メサンギウム細胞から筋線維芽細胞への分化転換の原因となる（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｒ． Ｊ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８７：８４７−８５８ （１９９１）、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ Ｂ． Ｒ．ら、Ｈｕｍ． Ｐａｔｈｏｌ． ２４：７１０−７１６ （１９９３））。肝臓の慢性障害は、肝星細胞（ＨＳＣ）の筋線維芽細胞への分化転換が起こる肝線維症の原因となり（Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｓ． Ｌ．， Ｎｅｗ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８：１８２８−３５ （１９９３）； Ｇｒｅｓｓｎｅｒ Ａ． Ｍ．， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ４９：３９−４５ （１９９６）； Ｒａｍａｄｏｒｉ Ｇ．ら、Ｖｉｒｃｈ． Ａｒｃｈ． ［Ｂ］５９：３４９−３５７ （１９９０））、この障害が、慢性アルコール中毒、ウイルス性Ｂ型若しくはＣ型肝炎への感染、又は他の慢性障害により引き起こされたかどうかには無関係である。肝星細胞は周細胞的性質を有し、休止期細胞は内因性ビタミンＡの８０％を貯蔵する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｓ． Ｌ．， Ｎｅｗ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８：１８２８−３５ （１９９３））。マトリックス形成、α−ＳＭＡ発現に誘導される収縮能力、増殖開始、ビタミンＡ減少、及び変更された増殖因子の性質を特徴とする筋線維芽細胞性分化転換の後、それらの細胞は肝線維症の維持及び悪化に大きく関与する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｓ． Ｌ．， Ｎｅｗ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８：１８２８−３５ （１９９３）、Ｇｒｅｓｓｎｅｒ， Ａ． Ｍ．， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ４９：３９−４５ （１９９６））。気管支喘息疾患及び肺線維症の場合、筋線維芽細胞が主要なマトリックス形成細胞である（Ｔｒｅｍｂｌａｙ， Ｇ． Ｍ．ら、Ｃａｎ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ５（１）：５９−６１ （１９９８）、Ｇｉｚｙｃｋｉ， Ｍ． Ｊ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６（６）：６６４−７３（１９９７）、Ｇａｂｂｒｉｅｌｌｉ， Ｓ．ら、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ． ８６（２）：１５７−６０） （１９９４））。ｉｎ　ｓｉｔｕ癌から浸潤癌に進行する間に、筋線維芽細胞に、誘発された細胞外マトリックス形成及び収縮能力の特徴的性質が現れる（Ｔｒｅｍｂｌａｙ， Ｇ． Ｍ．ら、Ｃａｎ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． ５（１）：５９−６１ （１９９８）、Ｇｉｚｙｃｋｉ， Ｍ． Ｊ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６（６）：６６４−７３ （１９９７）、Ｇａｂｂｒｉｅｌｌｉ， Ｓ．ら、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ． ８６（２）：１５７−６０） （１９９４））。多くの癌では、ストローマ細胞は筋線維芽細胞であり（Ｔｅｒａｄａ， Ｔ．ら、Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ． ２４：７０６−１２ （１９９６）、Ｆａｏｕｚｉ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ． ３０（２）：２７５−８４ （１９９９）、Ｋｏｓｍｅｈｌ， Ｈ．ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ８１（６）：１０７１−９ （１９９９）、Ｐｕｊｕｇｕｅｔ， Ｐ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４８：５７９−９２ （１９９６）、Ｃｈｏｍｅｔｔｅ， Ｇ．ら、Ｐａｔｈｏｌ． Ｒｅｓ． Ｐｒａｃｔ． １８６（１）：７０−９ （１９９０）、Ｒｏｎｎｏｖ−Ｊｅｓｓｅｎ， Ｌ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５（２）：８５９−７３ （１９９５））、これらはパラクリンに依存して腫瘍増殖に影響を与える（Ｎｅａｕｄ， Ｖ．ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６：１４５８−６６ （１９９７）、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ Ｊ．ら、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５（１１）：３５１６−２２ （１９９９））。しかし、例えば、種々の器官の筋線維芽細胞腫及び筋線維線維肉腫の場合のように、腫瘍細胞自体は筋線維芽細胞の子孫である場合もある（Ｇｏｃｈｔ， Ａ．ら、Ｐａｔｈｏｌ． Ｒｅｓ Ｐｒａｃｔ． １９５（１）；１−１０ （１９９９）、Ｕｎｄｅｎ， Ａ． Ｂ．ら、Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０７（２）：１４７−５３ （１９９６）、Ａｕｇｅｒ， Ｍ．ら、Ａｒｃｈ． Ｐａｔｈｏｌ． Ｌａｂ． Ｍｅｄ． １１３（１１）：１２３１−５ （１９８９））。
【０００８】
遺伝子治療では、慢性的な線維症及び腫瘍に取り組んでいる。筋線維芽細胞は多くの硬化性疾患及び腫瘍の中心的細胞種であるので、これらは遺伝子治療を含めた治療における理想的な標的細胞である。
（ａ）例えば細胞内シグナル伝達物質をコードする遺伝子（Ｗａｌｔｈｅｒ， Ｗ．， Ｓｔｅｉｎ， Ｕ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １３（１）：２１−２８ （１９９９））、又は
（ｂ）結合によって特定の遺伝子の転写又は翻訳に影響するＲＮＡをコードする配列領域（Ｂａｉ， Ｊ．ら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １（３）：２４４−２５４ （２０００））、又は
（ｃ）ｆｌｏｘＰが隣接する遺伝子領域を修飾する環状組み換え（ＣＲＥ）の酵素（Ｓａｕｅｒ， Ｂ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １４：３８１−３９２ （２９９８））、の細胞種特異的及び分化依存的な発現調節によって、特定の標的細胞の治療が可能となる。ウイルス性ベシクル様アデノウイルス又はレトロウイルス派生物（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎ． Ｗｈｅｌａｎ， Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ８，８０３−８１５、Ｍｏｕｎｔａｉｎ， Ａ．， Ｔｉｂｔｅｃｈ． １８：１１９−１２８ （２０００）、 Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒ， Ｇ．ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １８，１８０−１８３ （１９９８）、Ｐａｒｒ， Ｍ． Ｊ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３，１１４５−１１４９ （１９９７）、Ｏｒｙ， Ｄ． Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１１４００−１１４０６ （１９９６）、Ｆｅｎｇ， Ｍ．ら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：８６６−８７０ （１９９７））がベクターとして使用されることが多い。しかしプラスミドコンストラクトのＤＮＡも単独、あるいはリポソーム又はポリマー体との凝集物として投与してもよい（Ｈｅｎｇｇｅ， Ｕ．ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １０：１６１−１６６ （１９９５）、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ， Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：３４１０−３４１４ （１９９０）、Ｗａｇｎｅｒ， Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７：３４１０−３４１４ （１９９０））。筋線維芽細胞機能の遺伝子治療法及び修飾のためには、好適な調節配列又はプロモーターが必要であり、これらによって筋線維芽細胞の細胞機能及び発現を適切な変化に向けることができるが、必要な条件はこれだけではない、調節配列をプロモーター中に使用することによってのみ、（ａ）改変された遺伝子発現、（ｂ）タンパク質合成の調節、又は（ｃ）ゲノム改変によって筋線維芽細胞による細胞機能の性質に向かい、それによって細胞は遺伝子治療に応答しうる。
【０００９】
本発明の要約
α−ＳＭＡ遺伝子の調節配列領域（以下、α−ＳＭＡ−５’領域と呼ぶ）の特性決定中に、驚くべきことに、α−ＳＭＡ−５’配列領域内の１つの領域すなわち−６９８〜＋１８領域（他に明記しない限り、番号付けは図７Ａに示されるｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのα−ＳＭＡ遺伝子に基づいている）は、領域全体の活性とは異なる活性を示すことを発見した。例えば、α−ＳＭＡ遺伝子の−１８９〜＋１８の領域は転写を活性化させ、一方、−６９８から−１９０の領域は細胞種特異的及び分化以前性の調節特性を示し、すなわち、この領域はコア領域（−１８９〜＋１８）とともに細胞種特異的調節に応答する。ある領域によって、遺伝子発現を調節可能であり、筋線維芽細胞、筋線維芽細胞様細胞、及び胚性、一時的、又は誘発されたＳＭＡ発現細胞の機能も調節可能であるという発見に基づいて、筋線維芽細胞性調節制御システムを開発した。したがって、本発明は、
（１）（ｉ）α平滑筋アクチン遺伝子（α−ＳＭＡ遺伝子）の調節配列領域からの１つ以上の機能領域と、
（ｉｉ）配列（ｉ）と作動的に連結している少なくとも１つの追加の機能核酸配列と、
を含み、前記調節配列領域は好ましくは前記α−ＳＭＡ遺伝子のヌクレオチド−６９８〜＋１８（番号付けは、図５Ａ及び７Ａに示されるｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの配列を意味する）からなり、前記追加の機能核酸配列は前記α−ＳＭＡ遺伝子をコードしない核酸配列、
（２）（１）に定義される核酸配列の好ましい実施態様であって、前記調節配列領域がラットに由来し、前記核酸配列が好ましくは、図５Ａに示される配列（配列番号１）、特に図７Ａに示される配列（配列番号５）の１つ以上の機能領域を含む、
（３）（２）に定義される核酸配列の好ましい実施態様であって、前記機能領域が転写活性化核酸配列であり、特に図７Ａに示される配列の配列−１８９〜＋１８（すなわち配列７Ｃ、配列番号７）に由来する、
（４）（２）に定義される核酸配列の好ましい実施態様であって、前記機能領域が細胞種特異的核酸配列であり、特に図７Ａで定義される配列−６９８〜−１９０に由来し、特に好ましくは配列−６９８〜−２１５に由来する、
（５）（１）に定義される核酸配列の好ましい実施態様であって、前記調節配列領域がマウスに由来し、前記核酸配列は好ましくは図５Ｂ（配列番号２）示される配列、特に配列番号１８の領域の１つ以上の機能領域に由来する、
（６）（５）に定義される核酸配列の好ましい実施態様であって、前記機能領域が、
（ａ）転写活性化核酸配列であり、特に配列番号１８に示される配列のヌクレオチド４９０〜６９７に由来する、及び／又は
（ｂ）細胞種特異的核酸配列であり、特に、配列番号１８に示される配列のヌクレオチド１〜４８９に由来する、
（７）（１）に定義される核酸配列の好ましい実施態様であって、前記調節配列領域がヒトに由来し、前記核酸配列が好ましくは図５Ｃに示される配列（配列番号３）、特に配列番号１９に示される配列の１つ以上の機能領域を含む、
（８）（７）に定義される核酸配列の好ましい実施態様であって、前記機能領域が、
（ａ）転写活性化核酸配列であり、特に配列番号１９に示される配列のヌクレオチド５１３〜７１５に由来する、及び／又は
（ｂ）細胞種特異的核酸配列であり、特に配列番号１９に示される配列のヌクレオチド１〜５１３に由来する、
（９）（１）に定義される核酸配列の好ましい実施態様であって、前記調節配列領域がニワトリに由来し、前記核酸配列が好ましくは図５Ｄに示される配列、特に配列番号２０の配列の１つ以上の機能領域を含む、
（１０）前記機能領域が、
（ａ）転写活性化核酸配列であり、特に配列番号２０に示される配列のヌクレオチド４９７〜６９９に由来する、及び／又は
（ｂ）細胞種特異的核酸配列であり、特に配列番号２０に示される配列のヌクレオチド１〜４９６に由来する、（９）に定義される核酸配列の好ましい実施態様、
（１１）（３）、（６）、（８）、又は（１０）に定義される転写活性化核酸配列、
（１２）（４）、（６）、（８）、又は（１０）に定義される細胞種特異的核酸配列、
（１３）（１１）及び／又は（１２）に定義される核酸配列を含むベクター、
（１４）（１）〜（１０）に定義される核酸配列が挿入されるベクター、
（１５）（１）〜（１０）に定義される核酸配列、又は（１３）若しくは（１４）に定義されるベクターを一時的又は持続的にトランスフェクト、トランスフォーム、又は感染させた真核細胞又は生物、
（１６）（１）〜（１０）に定義される核酸配列、又は（１３）若しくは（１４）に定義されるベクターを親細胞にトランスフェクト、トランスフォーム、又は感染させることを含む、（１５）に定義される真核細胞を発生させる方法、
（１７）（１５）に定義される生物を発生させる方法であって、（１）〜（１０）に定義される核酸配列、又は（１３）若しくは（１４）に定義されるベクターをトランスフェクトしたＥＳ細胞を、生物の胚盤胞に注入するステップと、代理母に着床させるステップとを含む、
（１８）（１５）に定義される真核細胞又は生物内でレポーター遺伝子を発現させることを含む、細胞混合物、細胞集団、細胞集合体、又は生物から平滑筋細胞、筋線維芽細胞、又は筋線維芽細胞様細胞を単離又はスクリーニングする方法、
（１９）（１）〜（１０）に定義される核酸配列、又は（１４）に定義されるベクターを器官又は生物に導入することを含む、生物及び／又は器官の平滑筋細胞又は筋線維芽細胞の遺伝子発現及び／又は細胞機能を操作する方法、
（２０）（１）〜（１０）、（１１）ないし（１２）に定義される核酸配列、又は（１４）に定義されるベクターを含む医薬組成物、ならびに
（２１）特に、ＳＭＡが一時的に要請の胚性細胞内、筋線維芽細胞内、及び筋線維芽細胞様細胞内における、細胞種及び分化特異的なレポーター発現、細胞種及び分化に特異的な遺伝子改変、ならびに遺伝子発現及び／又は細胞機能の操作のための医薬組成物の細胞のために、（１）〜（１２）に定義されるα−ＳＭＡ遺伝子の調節配列領域の機能領域の使用すること、に関する。
以下では、添付の図面及び実施例によって本発明を具体的に説明する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、α−ＳＭＡ遺伝子の特定の調節配列、特に、図７のＡ〜Ｍ（配列番号５〜１７）に示される１つ又は２つの配列を含む調節配列が、筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞において作動的に連結した機能核酸配列、例えばレポーター遺伝子又は別の機能遺伝子の機能核酸配列の遺伝子発現、を調節可能であるという驚くべき発見に基づいている。
【００１１】
本発明の実施態様（１）の核酸配列は、α−ＳＭＡ遺伝子の調節配列領域由来の１つ以上の機能領域を含む。この調節配列領域は、哺乳動物、特に霊長類、齧歯類、又は鳥類、特に好ましくは、ラット、マウス、ヒト、又はニワトリに由来しうる（Ｂｌａｎｋ， Ｒ． Ｓ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７（２）：９８４−９８９ （１９９２）、Ｍｉｎ， Ｂ． Ｈ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１６６６７−１６６７５ （１９９０）、Ｒｅｄｄｙ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５（３）：１６８３−１６８７ （１９９０）、Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｓ． Ｌ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１（１９）：８９６５−８９７６ （１９８６））。
【００１２】
好ましい実施態様（２）では、前述したように本発明の調節配列領域はラットに由来する（Ｂｌａｎｋ， Ｒ． Ｓ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９８４−９８９ （１９９２））。その中で特に好ましいものは前記機能領域が転写活性化核酸配列を含み、特に好ましくは図７Ｃに示される配列に由来する。ここで、図７Ｃに示される配列の少なくとも１０、好ましくは少なくとも４０、特に好ましくは少なくとも６０の連続した塩基を有する転写活性化配列が好ましく、特に好ましくは図７Ｂ及びＣに示される配列（配列番号６又は７）を含む。あるいは、又はこれに加えて、前記機能領域は細胞種特異的又は分化依存的に調節される核酸配列であってよく、好ましくは図７Ａの配列−６９８〜−１９０（配列番号５のヌクレオチド１〜５０９）に由来する領域であり、特に好ましくは図７Ａの配列−６９８〜−２１５に由来する領域である。ここで、図７Ａの配列−６９８〜−１９０から少なくとも２５、好ましくは少なくとも３５の連続した塩基を有する細胞種特異的配列が好ましく、特に好ましくは図７Ｉ又は７Ｍに示される配列を含む。
【００１３】
好ましい実施態様（５）〜（１０）によると、別の選択として、本発明の調節配列領域は、あるいはマウス、ヒト、又はニワトリに由来し（Ｍｉｎ， Ｂ． Ｈ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１６６６７−１６６７５ （１９９０）、Ｒｅｄｄｙ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５（３）：１６８３−１６８７ （１９９０）、Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｓ． Ｌ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１（１９）：８９６５−８９７６ （１９８６））、本発明の機能領域は前出の（５）〜（１０）で定義されている。本発明によると、特に好ましくは前記転写活性化核酸配列は、（６）、（８）、又は（１０）に記載の転写活性化配列からの少なくとも１０、好ましくは少なくとも４０、特に好ましくは少なくとも６０の連続した塩基と、（６）、（８）、又は（１０）に定義される細胞種特異的配列からの少なくとも２５、好ましくは少なくとも３５の連続した塩基とをそれぞれ含む。配列番号１８、１９、及び２０に記載の部分的配列（ラットの配列７Ａ〜Ｍ（図６のアラインメントによる）に対応する）が特に好ましい。
【００１４】
本発明の実施態様（１）によるもう１つの機能核酸配列は、ペプチド若しくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列（レポーター遺伝子、薬理学的活性タンパク質をコードする配列、及び調節ＤＮＡ−配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない）、又は機能ＲＮＡをコードする配列（リボザイムが挙げられるが、これに限定されるものではない）となりうる。
【００１５】
従来の研究によってα−ＳＭＡ遺伝子フラグメントのレポーター遺伝子との連結が示されている（特に、Ｎａｋａｎｏ， Ｙ．ら、Ｇｅｎｅ ９９（２）：２８５−９ （１９９１）、Ｂｌａｎｋ， Ｒ． Ｓ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １５，２６７（２）：９８４−９ （１９９２）、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ａ． Ｄ． ｕｎｄ Ｏｗｅｎｓ， Ｇ． Ｋ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７６：Ｃ１４２０−３１ （１９９９）、Ｈａｕｔｍａｎｎ， Ｍ． Ｂ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７２（１６）：１０９４８−５６， （１９９７）、Ｓｉｍｏｎｓｏｎ， Ｍ． Ｓ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６８ （４ Ｐｔ ２）：Ｆ７６０−９ （１９９５）、Ｋｉｍ， Ｊ． Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９０（３）：１１１５−２１ （１９９３）、ＭｃＮａｍａｒａ， Ｃ． Ａ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６８：Ｃ１２５９−６６ （１９９５）、ならびにＷＯ００／２４２５４号及び米国特許第５，８８５，７６９号）。　筋線維芽細胞性調節のための好適なレポーター遺伝子は、例えば、表１に記載の遺伝子である。本発明による別の機能遺伝子は、例えば、薬理学的活性タンパク質又はペプチド、及び調節ＤＮＡ又はＲＮＡ配列をコードする遺伝子である。
表１：使用可能なレポーター遺伝子の例であって、これらはα−ＳＭＡ−５’−配列によって発現を調節可能である。
【００１６】
【表１】
2004502448.tif 000003
１ＳＥＡＰ：分泌アルカリホスファターゼ
２ＢＣＩＰ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート
３ＮＢＴ：ニトロブルーテトラゾリウム
４ＣＡＴ：クロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ
５ｈＧＨ：ヒト成長ホルモン
６ＤＡＢ：３，３’−ジアミノベンジジン
７ＡＥＣ：３−アミノ−９−エチルカルバゾール
【００１７】
実施態様（１３）によるベクターは、従来のトランスフェクションベクター及び遺伝的伝達に好適なベクターを含む。
【００１８】
本発明の実施態様（１５）による真核細胞又は生物は、親細胞のトランスフェクション、トランスフォーメーション、又は感染、及び生物の胚盤胞へのＥＳ細胞の感染及びそれらの代理母への着床のための方法を使用して発生され得、それぞれの方法は当業者には公知である。
【００１９】
現在まで、休止細胞から筋線維芽細胞への移行に特異的な調節配列領域が発見されていなかったため、レポーターを使用した筋線維芽細胞性活性化のスクリーニングは可能でなかった。−６９８〜＋１８の配列領域（配列番号５）をレポーター遺伝子（表１参照）と融合させて移入ベクターに挿入することによって、筋線維芽細胞性活性化のトランスフェクションスクリーニングが可能となる（図１）。従来の筋線維芽細胞性活性化のスクリーニング方法では、免疫細胞学的又は免疫組織学的手順が選択され、これらの方法は細胞の固定、抗原の阻害、抗体のインキュベーション、及び検出などのいくつかのステップを含む（Ｆ． Ｈｏｆｍａｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔ． ５． ８： Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； Ｅｄｓ． Ｊ． Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ＵＳＡ （１９９６））。通常、筋線維芽細胞の免疫細胞学的又は免疫組織学的検出は、α−ＳＭＡタンパク質の免疫化学染色によって行われた。しかし、例えば毒性試薬による活性化の定量的測定は不可能であった。本発明では、好ましくは発光レポータータンパク質が筋線維芽細胞性トランスフォーメーションのα−ＳＭＡ−５’−配列調節レポーターとして選択され、細胞の活性化は照度計（ダイネックス・テクノロジーズ（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、米国シャンティリー（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ）製ＭＬＸ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で定量的かつ高感度に測定された（図１）。定量的レポーターアッセイでは、定量的毒性学的及び薬理学的研究が本発明によって初めて可能となり、物質の筋線維芽細胞性活性化能力の評価が可能となり、それによって、慢性的な関連器官障害の可能性の検出が可能となる。
【００２０】
α−ＳＭＡ−５’−配列レポーター融合コンストラクトを保持するベクターを含む細胞の筋線維芽細胞性移行の分析によって、治療薬組成物のスクリーニングが可能になると考えられ、本発明では例えば、毒素又はトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）のような線維形成性増殖因子による低下などの筋線維芽細胞性活性の低下を、α−ＳＭＡ−５’−配列調節レポーターによって読みとることができる。
【００２１】
α−ＳＭＡ−５’配列領域（−６９８〜＋１８）がレポーターの調節に使用される本発明により提供される方法は、筋線維芽細胞性活性のスクリーニング以外に、α−ＳＭＡ−５’で調節されるレポーター発現によってある種の細胞を単離することを含む。この方法では、α−ＳＭＡ−５’配列領域を蛍光性レポーター（例えば、表１のＧＦＰ参照）と作動的に連結することによって実施されることが好ましく、それによって、ベクターコンストラクトを生物又は細胞集団に導入した後、一過性の胚性ＳＭＡ陽性細胞又は筋線維芽細胞性誘導細胞を、細胞混合物又は集合体から、蛍光を利用したＦＡＣＳソーター（ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞ソート処理）によって単離することができる。あるいは、α−ＳＭＡ−５’配列領域を別のレポーターと連結することで、光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡の制御下での顕微解剖によって、筋線維芽細胞と筋線維芽細胞様細胞の領域を分離することができる。
【００２２】
本発明は、胚様体の胚性心筋細胞、平滑筋細胞、又は骨格筋細胞への分化が可能な胚性幹細胞（ＥＳ）における特異的遺伝子発現のためのα−ＳＭＡ遺伝子の配列領域−６９８〜＋１８の役割も含む（Ｅｖａｎｓ， Ｍ． Ｊ．， Ｋａｕｆｍａｎｎ， Ｍ． Ｈ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９２， １５４−１５６ （１９８１））。α−ＳＭＡ−５’配列領域の異なるドメインを有するコンストラクトを安定にトランスフェクトしたＥＳを比較すると、胚性細胞集合体からの心筋細胞、骨格筋細胞、及び平滑筋細胞の選択に関して、−１８９〜＋１８の配列領域（図７Ｃ、ＳＭＡ−１９０）で調節されるレポーターは不十分であり、α−ＳＭＡ遺伝子の−６９８〜−１９０（図７の配列Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、及びＭ）内の追加の５’位置ドメインが必要である（図２）。
【００２３】
同様に、本発明は、α−ＳＭＡ−５’配列領域又はその配列の部分領域（図７の配列Ａ〜Ｍ）と、発現に影響する別の核酸配列の作動的連結に関する。例としては、β−グロブリン又はニワトリβ−アクチン遺伝子のイントロン配列（図８Ａ及びＢ、配列番号３０及び３１参照）が挙げられるが、図３に示されるベクター内のウイルスＣＭＶなどの他のエンハンサー配列も挙げられる。しかし、本明細書では挙げなかった他の発現に影響を与える配列を、α−ＳＭＡ−５’−配列又はそのドメイン（図７の配列Ａ〜Ｍ）に作動的に連結することもできる。
【００２４】
レポーター遺伝子ではなく別のペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子領域がα−ＳＭＡ−５’配列領域（配列番号５〜１７）と連結される場合、作動的に連結した遺伝子領域がα−ＳＭＡ−５’の調節によって発現される。本発明の好ましい実施態様では、目的の遺伝子領域の発現の調節に図７の配列Ａが使用される。図１又は図３は図７の配列Ａの転写調節の分化依存性を示している。配列Ａによる転写調節で、筋芽細胞又は休止筋線維芽細胞性前駆体での発現は阻害されるが、筋管細胞の分化又は筋線維芽細胞性分化転換の後では、連結した遺伝子領域の発現が起こる。図７の配列Ｃが標的遺伝子と連結すると、線維芽細胞などの多くの細胞種で発現が起こり、図７の配列Ａ、Ｆ、Ｇが連結すると、筋線維芽細胞又はＳＭＣの子孫で発現が起こる。α−ＳＭＡ−５’配列領域（図７のＡ〜Ｍ）によって転写調節される遺伝子領域は、さらに別の配列ドメインと連結させることができる。リーディングフレームに関して、ある種のタグ又はレポータードメインをコードする配列（図３ｂ）と連結することによって、α−ＳＭＡ配列によって転写調節される遺伝子領域の遺伝子発現の監視、又はその領域がコードするタンパク質又はペプチドの精製が可能となる。
【００２５】
α−ＳＭＡ−５’配列領域（図７の配列Ａ〜Ｍ）を、シグナル伝達物質のＲＮＡをコードするＤＮＡ又は遺伝子領域を含む配列と作動的に連結させると、筋線維芽細胞の表現型を機能的に妨害することができる。このようなコンストラクトを、遺伝子治療に好適なベクター（例えば、様々な世代のアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター及びそれらの派生物（Ｏｒｙ， Ｄ． Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１１４００−１１４０６ （１９９６）、 Ｆｅｎｇ， Ｍ．ら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５：８６６−８７０ （１９９７））及びプラスミドベクターに、それぞれ、そのまま又は荷電ポリマー又はリポソーム（Ｈｅｎｇｇｅ， Ｕ．ら、Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １０：１６１−１６６ （１９９５）、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ， Ｓ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：４４８−４５７（１９９６））と組み合わせた集合体のいずれかで挿入した後、筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞の遺伝子治療法の予備的要求に適合させると、それを、硬化性疾患に使用することができる（Ｄｅｓｍｏｕｌｉｅｒｅ， Ａ．ら、Ｅｘｐ． Ｎｅｐｈｒｏｌ． ３：１３４−１３９ （１９９５）、Ｇａｂｂｉａｎｉ， Ｇ．， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３８：５４５−５４８ （１９９８）、同上、Ｐａｔｈｏｌ． Ｒｅｓ． Ｐｒａｃｔ． １９０：８５１−８５３、同上、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ８３：４５７−４７４ （１９７６））、又は腫瘍疾患（Ｔｅｒａｄａ， Ｔら、Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ． ２４：７０６−１２ （１９９６）、Ｆａｏｕｚｉ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌ． ３０（２）：２７５−８４ （１９９９）、Ｋｏｓｍｅｈｌ， Ｈ．ら、Ｂｒ．， Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ８１（６）：１０７１−９ （１９９９）、Ｐｕｊｕｇｕｅｔ， Ｐ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４８：５７９−９２ （１９９６）、Ｃｈｏｍｅｔｔｅ， Ｇ．ら、Ｐａｔｈｏｌ． Ｒｅｓ． Ｐｒａｃｔ． １８６（１）：７０−９ （１９９０）、Ｒｏｎｎｏｖ−Ｊｅｓｓｅｎ， Ｌ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５（２）：８５９−７３ （１９９５）、Ｇｏｃｈｔ， Ａら、Ｐａｔｈｏｌ． Ｒｅｓ． Ｐｒａｃｔ． １９５（１）：１−１０ （１９９９））。
【００２６】
図７の配列Ａ〜Ｍの領域（本発明では好ましくは図７の配列Ａが使用される）を、環状組み換え（Ｃｒｅ）のための酵素（配列番号３２）と作動的に連結することによって、筋線維芽細胞が分化した細胞中でｆｏｘＰ−配列（図８Ｃ、配列番号３３）の隣接する遺伝子領域の新しい組み換えが可能となる。Ｃｒｅ酵素の機能及びｆｌｏｘＰ配列の向き次第で、選択された調節α−ＳＭＡ−５’配列領域の調節下でｆｌｏｘｅｄ遺伝子領域の逆転、切り出し、組み込み、又は移動が起こりうる。本発明によるベクターから選ばれた使用可能なコンストラクトを図４に示す。
【００２７】
本発明による方法（１７）では、トランスフェクトさせたＥＳ細胞を宿主生物の胚盤胞に注入して、さらに代理母に着床させる（Ｖ． Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ， Ｒ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ． Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｅｄ． Ａ． Ｌ： Ｊｏｙｎｅｒ， Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ （１９９３）、Ｔ． Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｓ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ （１９９４））。生まれて成体まで成長したトランスジェニックキメラ動物の戻し交雑の後、同型接合の動物に試験すべき毒素を注入して、導入遺伝子の発現をスクリーニングした。あるいは、方法（１７）において、ベクター骨格のないコンストラクトにマイクロインジェクションによって前核に導入することで、トランスジェニック生物を得ることができる（Ｊ． Ｗ． Ｇｏｒｄｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０１：４１１−３３ （１９８３）、Ｂ． Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｇｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９９４））。本発明の実施態様（１５）及び（１７）による生物としては、霊長類、齧歯類、及び有蹄類などの哺乳動物が挙げられるがこれらに限定されるものではない（ここでヒトの場合に関連の国内又は地域の法令によって特許を受けることができない場合には哺乳動物は非ヒト生物のみが考慮される）。実施態様（１５）による真核細胞としては、上述の哺乳動物のすべての可能な細胞及び細胞系が挙げられる。
【００２８】
本発明の実施態様（２０）及び（２１）による「医薬組成物」（課題、用途、追加の機能核酸配列の種類などによっては診断薬となりうる）は、使用形態に依存して、本発明の核酸配列／ベクター以外に、市販の添加剤、希釈剤、及びそれらと類似のものを含んでもよい。本発明の医薬組成物は、筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞の遺伝子発現及び／又は細胞機能の操作に好適であり、これは、本発明の医薬組成物を（発明の背景で詳細に述べたように）慢性的な臓器の損傷が原因の線維症（例えば、肝炎、糸球体腎炎、骨髄線維症、又は肺線維症）及び腫瘍を含めた多数の疾患の治療及び診断に使用できることを意味する。
以下の非限定的な例を用いて本発明を説明する。
【００２９】
実施例
材料及び方法
表２：使用したプライマー
【表２】
2004502448.tif 000004
【００３０】
この実験では以下の市販のベクターを使用した：
共通クローニングベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ＋（クロンテック、ハイデルベルグ）及びｐＧＥＭ３Ｚ（プロメガ、マンハイム）を使用した。α−ＳＭＡプロモーターの領域を、プロモーターのないルシフェラーゼベクターｐＲＬ−ｎｕｌｌ（プロメガ、マンハイム）にサブクローン化した。形成されたコンストラクトの活性を比較できるようにするために、さらに別のベクター、ｐＲＬ−ＳＶ４０やｐＲＬ−ＣＭＶなどのｐＲＬファミリー、及びｐＧＬ３ファミリーのベクター（プロメガ、ハイデルベルク）を使用した。
【００３１】
実施例１：α−ＳＭＡ−５’−配列の作製
単離したラットＤＮＡから、α−ＳＭＡ遺伝子の５’−プロモーター領域の長さ７３６ｂｐのフラグメントを増幅し、クローン化した。最初にこれを、配列中にそれぞれ制限酵素認識部位を含むプライマーＳＭＡ−７１０Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）及びＳＭＡ−３０Ｒ（ＥｃｏＲＩ）を使用して、ラットゲノムＤＮＡから−７０８〜＋２８の領域のＰＣＲ増幅によって行った。制限酵素を使用した後、得られたフラグメント（−６９８〜＋１８）をｐＲＬ−ｎｕｌｌに連結することによって挿入し、真核細胞の実験用に得られたベクターｐＲＬ−ＳＭＡ−７００をＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２株で増殖させた（図７Ａの配列を参照）。
【００３２】
実施例２：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域の調節下のレポーター発現による筋線維芽細胞性分化のスクリーニング
Ａ．α−ＳＭＡ−５’配列領域で調節されるレポーターベクターの調製：α−ＳＭＡ−５’領域レポーターコンストラクトを調製するために、α−ＳＭＡの異なる様々なα−ＳＭＡ−５’領域をそれぞれレポーターベクターに挿入した。ラットゲノムＤＮＡ（上記参照）からプライマーＳＭＡ−７１０−Ｆ及びＳＭＡ−３０−Ｒで増幅された産物を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＢＳＳＫ＋（ストラタゲン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ））にクローン化して、ｐＢ−ＳＭＡ−７００を作製した。α−ＳＭＡ遺伝子のα−ＳＭＡ−５’領域中の制限酵素認識部位を使用し、ＥｃｏＲＩ及び特異的制限酵素を使用してｐＢ−ＳＭＡ−７００から切断しフラグメントＳＭＡ−４８０（ＰｓｔＩ）、ＳＭＡ−２１５（ＰｖｕＩＩ）、及びＳＭＡ−１２５（ＤｒａＩＩ）を作製し、最初にｐＧＥＭ（プロメガ）又はｐＢ−ＳＫ（ストラタゲン）にサブクローン化した。これによってｐＧＥＭ−ＳＭＡ−４８０、ｐＧＥＭ−ＳＭＡ−２１５、及びｐＢ−ＳＭＡ−１２５のプラスミドを得た。センスプライマーとしてプライマーＳＭＡ−２４５Ｆ（ＰｓｔＩ）又はＳＭＡ−１９０Ｆ（ＨｉｎｄＩＩＩ）を使用し、アンチセンスプライマーとしてＳＭＡ−３０Ｒを使用して、特異的フラグメントを作製し、次にそれらのプライマーに関連する制限酵素認識部位でクローン化して、ｐＧＥＭ−ＳＭＡ−２４５及びｐＢ−ＳＭＡ１９０を得た。
【００３３】
α−ＳＭＡプロモーターのすべてのプロモーターフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ又はＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩによってｐＲＬ−ｎｕｌｌにサブクローン化し、それによってＳＭＡ−７００〜ＳＭＡ−１２５の長さの異なる６つの欠失コンストラクトを作製した。
【００３４】
Ｂ．一過性トランスフェクション：トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、マンハイム）を使用してトランスフェクションを行った。１．２μｇのｐＲＬ−７００及び０．３μｇのｐＧＬ３コントロールプラスミドで構成される１．５μｇのプラスミドＤＮＡを各実験で使用した（ＤＮＡ試薬比１：３に相当）。トランスフェクションのために、酵素的肝臓潅流及び密度勾遠心法でラット肝臓から単離した休止肝星細胞（ＨＳＣ）（Ｋｎｏｃｋ， Ｄ． Ｓ．， ｄｅ Ｌｅｅｕｗ， Ａ． Ｍ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ．， １３９，４６８ ４７１ （１９８２））、及びプラスチック皿で培養後筋線維芽細胞に分化させた分化ＨＳＣ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））（Ｇｅｅｒｔｓ， Ａ．ら、Ｊ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ９，５９−６８ （１９８９））を使用した。
【００３５】
Ｃ．配列Ａの調節下での休止ＨＳＣ及び筋線維芽細胞性ＨＳＣにおけるレポーター活性の測定：二重ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（ＤＬＲ（登録商標）、プロメガ、マンハイム）を使用して活性を測定した。一過性トランスフェクションでは、筋線維芽細胞のみがｐＲＬ−７００レポーターコンストラクトの明らかな活性を示した。α−ＳＭＡ陰性細胞は、相対的活性の１％未満のレポーター活性を示した。筋線維芽細胞では、レポーターが１４倍に誘発された。休止細胞は活性を示さなかった（＞１％）（図１）。したがって、このコンストラクトを筋線維芽細胞性の分化のスクリーニングに使用することができる。
【００３６】
実施例３：安定的にトランスフェクトさせた生物及び細胞のα−ＳＭＡ−５’−配列調節下でのレポーター
Ａ．α−ＳＭＡ調節下となるレポーターベクターの構成：ニワトリβ−アクチン−プロモーター、及びニワトリβ−アクチンの第１イントロン（配列番号３１）のフラグメントを有する修飾ＧＦＰ−発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ）（Ｉｋａｗａ， Ｍ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ３７：４５５−４５９（１９９５））から、制限酵素ＳｎａＢＩ及びＡｐａＩで消化することで心筋プロモーターを切り取り、ｐＲＬ−７００又はｐＲＬ−１９０をＸｈｏｌ及びＥｃｏＲＩで消化した後のそれぞれのα−ＳＭＡ−５’配列領域（配列番号５又は配列番号７）で置き換えた。アガロースゲルによるバンドの精製後、「平滑末端」クローニングができるように突出末端を満たした。さらに、ベクターの再連結を防止するために、ベクターの５’末端の脱リン酸を行った。連結反応とＥ．ｃｏｌｉへのトランスフォーメーションの後、陽性クローンを単離し、それらのプラスミドＤＮＡを精製し、正しい方向にα−ＳＭＡ−５’配列領域が挿入されているかを確認するために配列決定を行った。配列決定は、α−ＳＭＡ−プロモーターの領域−１００で結合する標識プライマーＳＭＡ−１００（ＴＭ＝６３℃）を使用して行った。得られたコンストラクトを図２ｂに示す。
【００３７】
Ｂ．α−ＳＭＡ−５’−配列（図７Ａ及び７Ｃの配列）で調節されるレポーター活性を使用した持続的トランスフェクタントのスクリーニング及び単離：安定的ＥＳ−トランスフェクタントを作製するために、２つのＧＦＰ−レポーターコンストラクトｐＳＭＡ−ＧＦＰ−７００及び−１９０（図２ｂ）を作製し、マウス胚性Ｄ３−幹細胞にトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトされたクローンを、ＧＦＰコンストラクトに含まれるネオマイシン（Ｇ４１８）耐性を使用して選択した。この目的のために、トランスフェクションの２４時間後に５０μｇ／ｍｌのネオマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）を加えた。
【００３８】
幹細胞を分化させるため、これらの培養を、支持細胞を使用せず、ＬＩＦを添加していないＤＭＥＭ（４４０ｍｇのＤ−グルコース、１１０ｍｇのピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、シグマ）、２０％ＦＣＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＭＤ）、１×の非必須アミノ酸（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、１×ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、及び０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を使用して行った。胚様体（ＥＢ）を形成させるために、２．２５×１０５細胞及び４．２５×１０５細胞のそれぞれを１ｍｌの培地に希釈した。それぞれの細胞浮遊液２０μｌ（４５０細胞又は８００細胞）を懸滴培養した（Ｄｒａｂ， Ｍ．ら、ＦＡＳＥＢ， １１：９０５−９１１ （１９９７）、及びＫｏｌｏｓｓｏｖ， Ｅ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １４３：２０４５−２０５６ （１９９８））。
【００３９】
ｐＳＭＡ−ＧＦＰ−１９０プロモーターフラグメントをトランスフェクトさせたＥＢの免疫組織学的観察から、ＧＦＰ陽性細胞領域が常にα−ＳＭＡを発現するわけではなく、すべてのα−ＳＭＡ陽性細胞がＧＦＰを発現するわけではないことが分かった。ＧＦＰ陽性細胞は、アクチンを発現する心筋又は骨格筋細胞種であることが分かった。カルデスモン陽性平滑筋細胞ではＧＦＰ発現が見られなかった。
【００４０】
対照的に、ｐＳＭＡ−ＧＦＰ−７００コンストラクトは、特異的なＧＦＰ発現を示し、これは心筋及び骨格筋領域ならびにカルデスモン陽性平滑筋細胞で見ることができた。α−ＳＭＡ遺伝子の図５の配列Ａの調節下で観察されるレポーターのパターンは、胚形成中の分化ＥＳ細胞に対応する。したがって、ＳＭＡ−７００フラグメント（配列番号５）は、胚性及び一過的ＳＭＡ陽性細胞の機能調節配列である。
【００４１】
レポーター活性によって、細胞をトリプシン処理後に分離して（図２ａ）、別々に分析することができる。
【００４２】
実施例４：筋線維芽細胞で導入遺伝子を発現するマウスの作製
Ａ．図２ｂ／３に示されるコンストラクトのＥＳ細胞への安定的トランスフェクション：安定的にトランスフェクトされた胚性幹細胞を作製するために、α−ＳＭＡ遺伝子導入ベクターを、アンピシリン遺伝子内の部位を使用して制限酵素消化することによって線状化し、精製後に水に溶解した（１μｇ／μｌ）。その後、エレクトロポレーションを実施した。このために、５×１０６個のＥＳ細胞を０．７ｍｌのＰＢＳに再浮遊させ、キュベットに移した。線状化プラスミドＤＮＡ３０μｇ（体積１００μｌ）を各エレクトロポレーションで使用した。ＤＮＡをキュベットに加えた後、氷上で１０分間インキュベートし、取り出して、プレ複合体を形成させた。その後、Ｂｉｏｒａｄ（ミュンヘン）製のエレクトロポレータを使用して、５００μＦ及び０．２４Ｖのインパルスを発生させた。その後、氷上で細胞を２０分間インキュベートして再生させた後、ネオマイシン耐性支持細胞上に播種した。
【００４３】
上記ＥＳ細胞を宿主マウスの胚盤胞に注入し、代理母に着床させた（Ｖ． Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ， Ｒ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ． Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｅｄ． Ａ． Ｌ： Ｊｏｙｎｅｒ， Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ （１９９３）、Ｔ． Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｓ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ （１９９４））。生まれて成体まで成長したトランスジェニックキメラ動物の戻し交雑の後、得られた同型接合の動物に試験すべき毒素を注入して、導入遺伝子の発現をスクリーニングした。
【００４４】
あるいは、ベクター骨格のないコンストラクト（図２ｂ参照）をマイクロインジェクションによって前核に導入することで、トランスジェニックマウスを得ることができる（Ｊ． Ｗ． Ｇｏｒｄｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０１：４１１−３３ （１９８３）、Ｂ． Ｈｏｇａｎら、ｉｎ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ． Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． Ｇｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９９４））。
【００４５】
Ｂ．毒素注入による慢性肝臓障害及び筋線維芽細胞のスクリーニング
慢性肝臓障害を誘発するために、マウスへ２週間ごとに４％四塩化炭素の鉱油溶液（６ｍｌ／ｋｇ体重）の腹腔内注入を２週間、４週間、６週間、又は８週間行った。これらのマウスについて、肺炎及び腎炎、ならびに肺又は腎臓における筋線維芽細胞の発生を調べた。四塩化炭素は主に肝炎の原因となるので、筋線維芽細胞の活性化が、トランスジェニックＧＦＰマウスの肝臓において観察された。
【００４６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐＲＬ−７００−レポーターコンストラクトの調節下での休止状態及び筋線維芽細胞で活性化された肝星細胞（ＨＳＣ）のルシフェラーゼレポーター活性の測定。
【図２ａ】
分化したＥＢから分離した後に培養した単細胞の免疫細胞学的解析。ｐＳＭＡ−ＧＦＰ−１９０をトランスフェクトした細胞では、α−ＳＭＡ陰性細胞（１Ｃ）でさえもＧＦＰ−発現（１Ｂ）を示した。ｐＳＭＡ−ＧＦＰ−７００をトランスフェクトした細胞では、ＧＦＰ−発現（２Ｂ）はα−ＳＭＡ発現細胞（２Ｃ）に限定された。
【図２ｂ】
胚性幹細胞又はトランスジェニックマウスモデルで安定にトランスフェクトさせるためのＳＭＡ−ＧＦＰ−７００及びＳＭＡ−ＧＦＰ−１９０レポーターベクターの設計。外来の調節配列として、ニワトリβ−アクチンの第１イントロンを、ＧＦＰ−レポーター（ＥＧＦＰ変異体）と、α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域の７１６ｂｐ（配列番号５）又は２０７ｂｐ（配列番号７）の間となるようにコンストラクトにクローン化する。安定なトランスフェクタントを選択するため、コンストラクトはアンピシリン耐性だけでなくネオマイシン耐性も有し、これによって真核細胞からＧ４１８を選択できる。
【図３ａ】
細胞株Ｌ６の胚性筋管細胞及び筋芽細胞の一過性トランスフェクション後に測定した異なる長さのＳＭＡコンストラクト（ＳＭＡ−１２５〜ＳＭＡ−７００、図７参照）のルシフェラーゼレポーター活性。血清欠乏後にα−ＳＭＡ発現筋管細胞に分化したＬ６細胞は、前駆Ｌ６筋芽細胞と比較すると全コンストラクトの導入が４〜５倍となったことを示している。ＳＭＡ−１９０コンストラクトは強くトランス活性化するが、ＳＭＡ−７００コンストラクトは分化依存的レポーター発現を制御する。ＳＭＡコンストラクトの活性は、ＳＶ４０プロモーター活性（１００％）に対して標準化した。各２回繰り返す３つの独立したアッセイを行った。
【図３ｂ】
α−ＳＭＡ遺伝子の７１６ｂｐ−５’−配列（配列番号５）の調節下で目的のペプチド又はポリペプチドを発現させるためのプラスミドコンストラクト。発現を検出するため、ストレプトアビジンをコードする配列（配列番号３４）、及び／又は抗体（９Ｅ１０）によって認識されるエピトープ様ｍｙｃをコードする配列（配列番号３５）、及び／又は精製が可能となる１〜５個のヒスチジンをコードする配列（配列番号３６）などの１つ以上のタグをインフレームで加えることによってオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を補うことができる。ペプチドならびに連結されるタグの配列は、細胞種特異的及び分化依存的なα−ＳＭＡ遺伝子調節配列領域の調節下にある。
【図４】
α−ＳＭＡ−５’−遺伝子領域の調節下でのＬｏｘＰの媒介するＣｒｅ組み換え：
ａ．α−ＳＭＡ−５’−配列領域の５’領域（配列番号５）とβ−アクチンの第１イントロン（配列番号３１）の併用によるＣｒｅ遺伝子（配列番号３２）の転写調節によって、筋線維芽細胞性分化後の筋線維芽細胞でのＣｒｅ遺伝子の発現（１）、ｌｏｘＰと隣接するネオマイシン遺伝子（ｎｅｏ）のＣｒｅの媒介による切り出し（２）、及びそれに続く目的遺伝子の発現（３）が行われる。
ｂ．α−ＳＭＡ−５’−配列領域の５’領域（配列番号５）とβ−アクチンの第１イントロン（配列番号３１）の併用によるＣｒｅ遺伝子（配列番号３２）の転写調節によって、筋線維芽細胞性分化後の筋線維芽細胞でのＣｒｅ遺伝子の発現（１）、ｌｏｘＰと隣接する対象遺伝子のＣｒｅの媒介による切り出し（２）が起こり、それによって目的遺伝子の発現が中断される（３）。
ｃ．α−ＳＭＡ−５’−配列領域の５’領域（配列番号５）とβ−アクチンの第１イントロン（配列番号３１）の併用によるＣｒｅ−ＥＲ融合遺伝子（配列番号３２＋ＥＲ （登録商標）、Ｄａｎｉｅｌｉａｎ ＰＳら、Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ７：２３２−２４０， １９９３）の転写調節によって、筋線維芽細胞性分化後の筋線維芽細胞でのＣｒｅ−ＥＲ融合遺伝子の発現（１）が起こる。０．１〜２ｍｇの４−ＯＨＴの添加又は注入後、ＥＲ−ペプチドはリガンドと結合できるようになり、Ｃｒｅ−ＥＲ／４−ＯＨＴ複合体が形成される。続いて、この複合体は核に移され、図４ａ及びｂに示されるＣｒｅ媒介ステップ（２及び３）が行われる。
ｎＳ：核シグナルペプチド配列、斜線枠：イントロン配列、ＬＰ：リンカーペプチド配列、ＥＲ（登録商標）：内因性１７−β−エスタドリオールとは結合せず合成リガンドの４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）との親和性が高い改変エストロゲン受容体の配列、β−Ａ：β−アクチン−イントロン（配列番号３１）、及びｂ４−ＯＨＴ：４−ヒドロキシタモキシフェン。
【図５】
複数の種のα−ＳＭＡの５’−上流領域及びエクソン１の開始部分（領域−７１３〜＋５２、番号付けは配列Ａを基準にしている）
Ａ：ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ； 配列番号１； Ａｃｃ． Ｎｏ Ｓ７６０１１； Ｂｌａｎｋ， Ｒ． Ｓ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７（２）：９８４−９８９ （１９９２））。
Ｂ：マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ； 配列番号２； Ａｃｃ． Ｎｏ． Ｍ５７４０９ Ｍ３５１９４； Ｍｉｎ， Ｂ． Ｈ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１６６６７−１６６７５ （１９９０））。
Ｃ：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ； 配列番号３； Ａｃｃ． Ｎｏ． Ｊ０５１９３； Ｒｅｄｄｙ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５（３）：１６８３−１６８７ （１９９０））。
Ｄ：ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ； 配列番号４； Ａｃｃ． Ｍ１３７５６ Ｄ０００４１ Ｎ０００４１； Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｓ． Ｌ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１（１９）：８９６５−８９７６ （１９８６））。
【図６】
図５に示される配列のアライメント。
【図７】
ラット（Ｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来の本発明の好ましいα−ＳＭＡ−配列を示す（配列番号）
Ａ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−６９８〜＋１８（５）
Ｂ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−１２４〜＋１８（６）
Ｃ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−１８９〜＋１８（７）
Ｄ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−２１４〜＋１８（８）
Ｅ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−２４４〜＋１８（９）
Ｆ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−４８４〜＋１８（１０）
Ｇ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−５２１〜＋１８（１１）
Ｈ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−１８９〜−１２５（１２）
Ｉ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−２１４〜−１９０（１３）
Ｊ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−２４４〜−２１５（１４）
Ｋ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−４８４〜−２４５（１５）
Ｌ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−５２１〜−４８５（１６）
Ｍ：α−ＳＭＡ遺伝子の５’領域：−６９８〜−５２２（１７）
【図８ａ】
Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ　ｃｕｎｉｃｕｌｕｓのβ−１−グロビン遺伝子；イントロンＩＩ／エクソンＩＩＩ移行部位；Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｖ００８８２：配列１２５０〜１３４３　（配列番号３０）。
【図８ｂ】
Ｇａｌｌｕｓ　ｇａｌｌｕｓの細胞質β−アクチン遺伝子；Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｘ００１８２、イントロンＩ（５４４〜１５４２）；配列５５０ｂｐ〜１５０３ｂｐで示される（配列番号３１）。
【図８ｃ】
ｆｌｏｘＰ部位の配置：ＦｌｏｘＰ−配列（配列番号３３）は、Ｃｒｅ（垂直矢印）によって２つの部位に切断される８ｂｐ非対称コア領域に隣接する１３ｂｐの逆方向リピート（水平矢印）からなる。
【図１】
2004502448.tif 000029
【図２ａ】
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【図２ｂ】
2004502448.tif 000031
【図３ａ】
2004502448.tif 000032
【図３ｂ】
2004502448.tif 000033
【図４】
2004502448.tif 000034
2004502448.tif 000035
2004502448.tif 000036
【図５】
2004502448.tif 000037
【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502448.tif 000105
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【手続補正書】
【提出日】平成14年8月31日(2002.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）（ｉ）α−ＳＭＡ遺伝子のヌクレオチド−６９８〜＋１８からなるα平滑筋アクチン遺伝子（α−ＳＭＡ遺伝子）の調節配列領域からの１つ以上の機能領域（番号付けは、図５Ａ及び７Ａに示されるｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの配列を意味する）と、
（ｉｉ）天然α−ＳＭＡをコードせず、配列（ｉ）と作動的に連結している少なくとも１つの追加の機能核酸配列と、を含む核酸配列の、
筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞の遺伝子発現及び／又は細胞機能を操作するための医薬組成物を調製するための使用。
【請求項２】
前記α−ＳＭＡ遺伝子の前記調節配列領域の前記核酸配列が、
前記α−ＳＭＡ遺伝子のヌクレオチド−６９８〜＋１８からの少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０の連続した塩基を有する、及び／又は
哺乳動物、特に霊長類若しくは齧歯類、又は鳥類に由来し、特に好ましくはラット、マウス、ヒト、又はニワトリに由来する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記調節配列領域がラットに由来し、前記核酸配列が好ましくは、図５Ａに示される配列（配列番号１）、特に図７Ａに示される配列（配列番号５）の１つ以上の機能領域を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記機能領域が、
（ｉ）転写活性化核酸配列であり、特に、図７Ｃに示される配列（配列番号７）に由来し、好ましくは、前記転写活性化配列は、図７Ｃに示される配列の少なくとも１０、好ましくは少なくとも４０、特に好ましくは少なくとも６０の連続した塩基を有し、特に好ましくは図７Ｂ又は７Ｃに示される配列（配列番号６又は７）を含むか、あるいは
（ｉｉ）細胞種特異的核酸配列であり、特に、図７Ａの配列−６９８〜−１９０（配列番号５のヌクレオチド１〜５０９）に由来し、特に好ましくは図７Ａの配列−６９８〜−２１５（配列番号５のヌクレオチド１〜４８４）又は図７Ｉに示される配列（配列番号１３）に由来し、好ましくは前記細胞特異的配列は、図７Ａの配列−６９８〜−１９０からの少なくとも２５、好ましくは少なくとも３５の連続した塩基を有し、特に好ましくは図７Ｉ又は７Ｍに示される配列（配列番号１３又は１７）を含む、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記核酸配列が、転写活性化及び細胞種特異的核酸配列を含む、及び／又は配列番号５〜１７に示される配列の中の１つを有する、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
前記調節配列領域がマウスに由来し、好ましくは前記核酸配列図５Ｂに示される配列（配列番号２）が１つ以上の機能領域を有し、特に配列番号１８に示される配列を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記機能領域が、
（ａ）転写活性化核酸配列であり、特に配列番号１８に示されるヌクレオチド４９０〜６９７に由来する、及び／又は
（ｂ）細胞種特異的核酸配列であり、特に配列番号１８に示される配列のヌクレオチド１〜４８９に由来する、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記調節配列領域がヒトに由来し、前記核酸配列が好ましくは図５Ｃに示される配列（配列番号３）、特に配列番号１９に示される配列の１つ以上の機能領域を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
前記機能領域が、
（ａ）転写活性化核酸配列であり、特に配列番号１９に示される配列のヌクレオチド５１３〜７１５に由来する、及び／又は
（ｂ）細胞種特異的核酸配列であり、特に配列番号１９に示される配列のヌクレオチド１〜５１２に由来する、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記調節配列領域がニワトリに由来し、前記核酸配列が好ましくは図５Ｄに示される配列（配列番号４）、特に配列番号２０の配列の１つ以上の機能領域を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
前記機能領域が、
（ａ）転写活性化核酸配列であり、特に配列番号２０に示される配列のヌクレオチド４９７〜６９９に由来する、及び／又は
（ｂ）細胞種特異的核酸配列であり、特に配列番号２０に示される配列のヌクレオチド１〜４９６に由来する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記追加の機能核酸配列が、ペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、特にレポーター遺伝子、薬理学的活性タンパク質をコードする配列、及び調節ＤＮＡ配列から選択されるか、あるいは機能ＲＮＡ、特にリボザイムをコードする配列である請求項１から１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１〜１２に定義される核酸配列、又はベクターを導入することを含み、前記核酸配列が生物又は器官に導入される、生物及び器官の筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞の遺伝子発現及び／又は細胞機能を操作する方法。
【請求項１４】
ｉｎ　ｖｉｖｏ法又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ法であって、特に
（ｉ）前記生物又は器官への導入が、トランスジェニックノックアウト／ノックイン技術を利用して行われるか、あるいは
（ｉｉ）　前記方法が、遺伝子治療融合ベクターの利用である、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）α−ＳＭＡ遺伝子のヌクレオチド−６９８〜＋１８の少なくとも１０の連続した塩基からなるヒトα平滑筋アクチン遺伝子（α−ＳＭＡ遺伝子）の図５Ｃ（配列番号３）に示される調節配列領域の１つ以上の機能領域（番号付けは、図５Ａ及び７Ａに示されるｒａｔｔｕｓ　ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓの配列を意味する）と、
（ｉｉ）配列（ｉ）と作動的に連結し、天然α−ＳＭＡをコードせず、薬理学的活性タンパク質をコードするＤＮＡ配列、調節配列、又は機能ＲＮＡをコードする配列から選択される少なくとも１つの追加の機能核酸配列と、
を含む、核酸配列。
【請求項１６】
前記調節配列領域が、前記ヌクレオチド−６９８〜＋１８の少なくとも２０の連続した塩基を有する、及び／又は配列番号１９に由来する、及び／又は請求項９に定義される、請求項１５に記載の核酸配列。
【請求項１７】
請求項９に定義される転写活性化核酸配列又は細胞種特異的核酸配列。
【請求項１８】
請求項１７に定義される核酸配列を含む、又は請求項１５若しくは１６に定義される核酸配列が挿入されるベクター。
【請求項１９】
請求項１５、１６、又は１７に定義される核酸配列、又は請求項１８に定義されるベクターに、一過的又は安定的にトランスフェクト、トランスフォーム、又は感染され、好ましくは
（ｉ）前記α−ＳＭＡ遺伝子の前記調節配列の調節下でレポーターを発現するか、あるいは、
（ｉｉ）α−ＳＭＡ遺伝子の調節下で薬理学的活性タンパク質、調節ＤＮＡ配列、又は機能ＲＮＡ配列の発現又は含有が起こる、
真核細胞又は生物。
【請求項２０】
請求項１５、１６、又は１７に定義される核酸配列、又は請求項１８に定義されるベクターで、親細胞を、トランスフェクト、トランスフォーム、又は感染させること含む、請求項１９に定義の真核細胞の作製方法。
【請求項２１】
請求項１５、１６、又は１７に定義される核酸配列、又は請求項１８に定義されるベクターを有するＥＳ細胞を、生物の胚盤胞に注入するステップと、代理母に着床させるステップとを含む、請求項１９に定義の生物の作製方法。
【請求項２２】
請求項１５、１６、又は１７に定義される核酸配列、又は請求項１８に定義されるベクターを生物又は器官に導入することを含み、
（ｉ）前記生物又は器官への導入が、好ましくはトランスジェニックノックアウト／ノックイン技術を利用して行われるか、あるいは
（ｉｉ）前記方法が、好ましくは遺伝子治療融合ベクターの利用である、
生物又は器官の平滑筋細胞又は筋線維芽細胞の遺伝子発現及び／又は細胞機能を操作する方法。
【請求項２３】
請求項１５、１６、又は１７に定義される核酸配列、あるいは請求項１８に定義されるベクターを含み、好ましくは、生物又は器官の平滑筋細胞又は筋線維芽細胞の遺伝子発現及び／又は細胞機能の操作に好適である医薬組成物。
【請求項２４】
前記α−ＳＭＡ遺伝子の前記調節配列領域の機能領域の、筋線維芽細胞性及び分化依存性レポーター発現のため、又は筋線維芽細胞性及び分化依存性遺伝子操作のための使用であって、前記α−ＳＭＡ遺伝子の前記機能領域が好ましくは
（ｉ）請求項１５〜１７に定義される核酸配列である、
（ｉｉ）請求項１８に定義されるベクター中に存在する、
方法。
【請求項２５】
細胞混合物、細胞集団、細胞集合体、又は生物から筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞を単離又はスクリーニングする方法であって、
真核細胞又は生物のレポーター遺伝子の発現を、請求項１から１２又は１５から１６に定義されるα−ＳＭＡ遺伝子の調節配列の調節下でレポーターを発現させて行うステップと、
前記レポーターを検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２６】
細胞混合物、細胞集団、細胞集合体、又は生物から筋線維芽細胞又は筋線維芽細胞様細胞を単離又はスクリーニングするための診断薬の製造のための請求項１から１２又は１５から１６に定義されるα−ＳＭＡ遺伝子の調節配列の使用。
【国際調査報告】
2004502448.tif 000107
2004502448.tif 000108
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