(57)【要約】本発明は、６−ヒドロキシ−３−（４−［２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ］フェノキシ）−２−（４−メトキシフェニル）ベンゾ［ｂ］チオフェン塩酸塩の新規な非溶媒和型無水結晶形、ならびに心血管疾患、高脂血症および骨粗鬆症を含むエストロゲン欠乏に関連する疾患状態の阻止；ならびに他の病理的状態（例えば、子宮内膜症、子宮繊維症、エストロゲン依存性のガン（乳ガンおよび子宮ガンを含む）、前立腺ガン、良性前立腺過形成、アルツハイマー疾患を含むＣＮＳ障害）の阻止、乳癌の予防およびＣｈＡＴのアップレギュレートを含む、その使用に関する。
2004512333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のピークの少なくとも１つを含むＸ線回折パターンを有する、結晶性６−ヒドロキシ−３−（４−［２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ］フェノキシ）−２−（４−メトキシフェニル）ベンゾ［ｂ］チオフェン塩酸塩水和物（Ｆ−Ｖ）：
２θ＝７．３±０．２、１５．５±０．２、１５．９±０．２および１７．６±０．２（銅放射線源から得た場合）。
【請求項２】
Ｘ線回折パターンがさらに、以下のピークの少なくとも１つを有する、請求項１に記載の結晶性Ｆ−Ｖ：
２θ＝１７．９±０．２、１８．２±０．２、１８．９±０．２および２１．５±０．２（銅放射線源から得た場合）。
【請求項３】
請求項１に記載の結晶性化合物、１つ以上の製薬的キャリア、希釈剤または賦形剤、および場合によりメチオニン、アセチルシステイン、システインまたはシステイン塩酸塩から選択される安定化剤、および場合によりエストロゲン、場合によりプロゲスチン、場合によりアロマターゼインヒビター、場合によりＬＨＲＨアナログ、および場合によりアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）インヒビターを含む医薬製剤。
【請求項４】
請求項１に記載の結晶性化合物、１つ以上の製薬的キャリア、希釈剤または賦形剤、およびエストロゲンを含む請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項５】
エストロゲンがＰｒｅｍａｒｉｎ（登録商標）である、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項６】
請求項１に記載の結晶性化合物、１つ以上の製薬的キャリア、希釈剤または賦形剤、およびプロゲスチンを含む請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項７】
プロゲスチンが、ノルエチルノドレルおよびノルエチンドロンからなる群から選択される請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
請求項１に記載の結晶性化合物、１つ以上の製薬的キャリア、希釈剤または賦形剤、およびＡＣｈＥインヒビターを含む請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項９】
ＡＣｈＥインヒビターがサリチル酸フィソスチグミン、タクリン塩酸塩およびドネペジル塩酸塩からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
請求項１に記載の結晶性化合物、１つまたはそれ以上の製薬的キャリア、希釈剤または賦形剤、エストロゲン、およびプロゲスチンを含む請求項３に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
子宮繊維症、子宮内膜症、大動脈平滑筋細胞増殖、再狭窄、乳癌、子宮癌、前立腺癌、良性前立腺過形成、骨喪失、骨粗鬆症、心血管疾患、高脂血症、ＣＮＳ障害およびアルツハイマー疾患からなる群から選択される病理的状態を阻止するための方法であって、その必要性を有する哺乳動物に請求項１に記載の化合物を有効量で投与することを含む方法。
【請求項１２】
病理的状態が乳癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
阻止の態様が予防的である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
病理的状態が卵巣癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
病理的状態が子宮内膜癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
病理的状態が骨粗鬆症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）のアップレギュレート方法であって、その必要を有する哺乳動物に、有効量の請求項１に記載の化合物および場合によりアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）インヒビターを投与することを含む方法。
【請求項１８】
６−ヒドロキシ−３−（４−［２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ］フェノキシ）−２−（４−メトキシフェニル）ベンゾ［ｂ］チオフェン塩酸塩を、メタノールまたは水性メタノール、エタノールまたはイソプロパノールからなる群から選択される結晶化溶媒から結晶化させること、続いて得られた固体を一定重量まで乾燥させることを含む、請求項１に記載の化合物の製造方法。
【請求項１９】
溶媒が水性メタノールである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
水のメタノールに対する比（ｖ：ｖ）が２０％〜５％の間である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記比が１５％である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
子宮繊維症、子宮内膜症、大動脈平滑筋細胞増殖、再狭窄、乳癌、子宮癌、前立腺癌、良性前立腺過形成、骨喪失、骨粗鬆症、心血管疾患、高脂血症、ＣＮＳ障害およびアルツハイマー疾患からなる群から選択される病理的状態を阻止するための請求項１に記載の化合物。
【請求項２３】
乳癌を阻止するための請求２２に記載の化合物。
【請求項２４】
前記阻止の態様が予防的である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
卵巣癌を阻止するための請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
子宮内膜癌を阻止するための請求項２２に記載の化合物。
【請求項２７】
骨粗鬆症を阻止するための請求項２２に記載の化合物。
【請求項２８】
哺乳動物におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をアップレギュレートするための請求項１に記載の化合物。
【請求項２９】
子宮繊維症、子宮内膜症、大動脈平滑筋細胞増殖、再狭窄、乳癌、子宮癌、前立腺癌、良性前立腺過形成、骨喪失、骨粗鬆症、心血管疾患、高脂血症、ＣＮＳ障害およびアルツハイマー疾患からなる群から選択される病理的状態を阻止するための医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項３０】
前記医薬が乳癌を阻止するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記阻止の態様が予防的である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記医薬が卵巣癌を阻止するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
前記医薬が子宮内膜癌を阻止するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３４】
前記医薬が骨粗鬆症を阻止するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３５】
哺乳動物においてコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をアップレギュレートするための医薬を製造するための請求項１に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
６−ヒドロキシ−３−（４−［２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ］フェノキシ）−２−（４−メトキシフェニル）ベンゾ［ｂ］チオフェン塩酸塩（アルゾキシフェン（ａｒｚｏｘｉｆｅｎｅ））は、最初に米国特許第５，５１０，３５７に包括的に記載され、具体的には米国特許第５，７２３，４７４（’４７４）号および欧州特許出願０７２９９５６号に開示された。アルゾキシフェンは、非ステロイド性混合エストロゲン（ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ　ｍｉｘｅｄ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ）アンタゴニスト／アゴニストであり、とりわけ、血清コレステロールの低下に有用であり、ならびに高脂血症、骨粗鬆症、エストロゲン依存性の癌（乳癌および子宮癌を含む）、子宮内膜症、ＣＮＳ障害（アルツハイマー病を含む）、大動脈平滑筋細胞増殖、ならびに再狭窄の阻止に有用である。
【０００２】
具体的には、アルゾキシフェンは、レセプター陽性（ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ）転移性乳癌；レセプター陽性患者の適切な全身治療または局所治療に続いてのアジュバント処置の治療；浸潤性および非浸潤性乳癌の再発の減少；浸潤性乳癌および非浸潤乳管癌（ｄｕｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｉｎ　ｓｉｔｕ「ＤＣＩＳ」）の発病率の減少に有用であり、また、臨床評価を受けている。また、アルゾキシフェンは、放射線療法、アロマターゼインヒビター、ＬＨＲＨアナログ、およびアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）インヒビターとの併用で有用である。
【０００３】
’４７４に教示されている手法によって単離された大量の（バルク）アルゾキシフェンのＸ線粉末回折（ＸＲＤ）、熱重量分析（ＴＧＡ）、プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）およびカールフィッシャー（ＫＦ）分析は、後にこの物質が水和されており、結晶性に乏しく、その格子内に可変量の有機揮発性物質（酢酸エチル）を含んでいることを示していた。
【０００４】
一般的に、結晶性の悪い物質および／または非晶質物質は結晶性のよい物質よりも製剤処理に関して望ましくない。非晶質化合物は顕著な量の水を吸収する傾向があるので、化学的および物理的に安定性が低い。例えば、ゼラチンカプセル中の非晶質物質による水分の吸収は、カプセル剤から非晶質成分へと水分が移動するのでカプセルの収縮またはゆがみを引き起こすかもしれない。さらに、非晶質化合物は、それらを含有する液体から析出する傾向がある。非晶質の薬物物質が送達溶液から析出すると、薬物の溶解およびバイオアベイラビリティー特性は負の影響を受けるかもしれない。
【０００５】
さらに、実質的な量の有機溶媒（例えば、酢酸エチル）を含有する製剤を処方することは、患者に対しての溶媒毒性の可能性および製剤の効力の溶媒の関数としての変化という点で、通常、望ましくない。さらに、製造という観点からは、製造方法がろ過による最終生成物の回収工程を含むかぎり、非結晶質の物質を製造することは望ましくない。回収した物質が非結晶性である場合には、このようなろ過は、しばしば、実行がより困難になる。さらに、典型的に、水和のレベルは、その医薬が製造され、保存されている相対湿度の関数となるので、製造的な観点より、実質的な量の水を含有する医薬（水和物）を処方することは、一般的にあまり望ましくない。いいかえると、典型的に、変化しやすいという可能性は無水形態と比較して水和物でより問題となる。
【０００６】
’４７４に教示される方法により製造したアルゾキシフェンは医薬として用いることができるが、商業規模で再現性よく、そして効率的に製造され得る、その結晶格子の中に水も有機溶媒もいずれも含有しない、より結晶性の良い形態のアルゾキシフェンを見出すことが非常に望ましく、そして好都合である。
【０００７】
発明の要旨
本発明は、以下のピークの少なくとも１つを含むＸ線回折パターンを有する、６−ヒドロキシ−３−（４−［２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ］フェノキシ）−２−（４−メトキシフェニル）ベンゾ［ｂ］チオフェン塩酸塩（Ｆ−Ｖ）の非溶媒和型無水結晶形に関する：
２θ＝７．３±０．２、１５．５±０．２、１５．９±０．２および１７．６±０．２°（銅放射線源から得た場合）。
【０００８】
さらに本発明は、Ｆ−Ｖ、１つ以上の製薬的キャリア、希釈剤、または賦形剤、および場合によりメチオニン、アセチルシステイン、システインまたはシステイン塩酸塩から選択される安定化剤、および場合により、エストロゲン、場合によりプロゲスチン、場合によりアロマターゼインヒビター、場合によりＬＨＲＨアナログ、および場合よりアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）インヒビターを含む医薬製剤に関する。
【０００９】
さらに本発明は、Ｆ−Ｖを用いて、子宮繊維症、子宮内膜症、大動脈平滑筋細胞増殖、再狭窄、乳癌、子宮癌、前立腺癌、良性前立腺過形成、骨喪失、骨粗鬆症、心臓血管疾患、高脂血症、ＣＮＳ障害およびアルツハイマー病のような病理的状態を阻止する方法および、Ｆ−Ｖを用いてこれらを阻止する医薬を製造する方法に関する。
【００１０】
本発明はさらに、Ｆ−Ｖを用いて、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）をアップレギュレートする方法および、Ｆ−Ｖを用いて、これをアップレギュレートする医薬を製造する方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、Ｆ−Ｖを製造する方法に関し、この方法は６−ヒドロキシ−３−（４−［２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ］フェノキシ）−２−（４−メトキシフェニル）ベンゾ［ｂ］チオフェン塩酸塩を、メタノールまたは水性メタノール、エタノールまたはイソプロパノールからなる群から選択される結晶化溶媒から結晶化すること、続いて、得られた固体を一定重量まで乾燥させることを含む。
【００１２】
発明の詳細な説明
Ｆ−Ｖは、周囲温度またはやや高い温度のいずれかでの乾燥により製造することができ、結晶固体は、周囲温度で、メタノール、エタノールまたはイソプロパノールもしくはメタノールの水性混合物からアルゾキシフェン（またはその任意の非晶質／溶媒和物）を結晶化することにより単離することができる。エタノールまたはイソプロパノールを用いる場合、この溶媒中の水含量は、好ましくは、０．２％未満（Ａ．Ｃ．Ｓ．分光光度計グレード）である。好ましくは、メタノール中の水性組成物は３０容量％未満の水を含有する。さらに好ましくは、Ｆ−Ｖは、周囲温度またはわずかに高温のいずれかでの乾燥により製造され、固体は、２０容量％から５容量％の間の水が存在する水性メタノールからの結晶化により単離される。最も好ましくは、Ｆ−Ｖは、減圧下、５０〜７０℃で乾燥することにより製造され、固体は、周囲温度で、水含量が１５容量％である水性メタノールからのアルゾキシフェン（またはその任意の非晶質／溶媒和物）の結晶化から単離される。
【００１３】
典型的には、アルゾキシフェンはメタノールに溶解することができ（約１ｇ溶質／２０ｍｌ溶媒）、アルゾキシフェン出発物質を溶解させるために加熱しても良い。一旦、溶解が達成されれば、例えば、蒸留により、溶液を約１ｇ溶質／５ｍｌ溶媒まで濃縮してから溶液をゆっくり室温まで冷却してもよい。一旦室温にした後、（氷浴または冷蔵庫を用いて）溶液をさらに冷却（０〜５℃）してもよい。結晶化させるのに十分な時間が経過した後、Ｆ−Ｖ結晶を減圧ろ過により回収してもよく、冷却（約０℃）メタノールを用いて洗浄したのち、一定重量まで減圧下で乾燥させてもよい。窒素パージ存在下でわずかに高温の乾燥温度（約５０℃で１２〜４８時間）が好ましい。商業規模でのＦ−Ｖの合成には、Ｆ−Ｖの種晶添加が有益であるかもしれない。
【００１４】
上記の結晶化に適したアルゾキシフェン出発物質には、Ｓ−ＩＩ、Ｆ−Ｉ、Ｆ−ＩＩＩ（ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１６３３２およびＰＣＴ／ＵＳ００／１６３３３に記載されている、アルゾキシフェンの溶媒和型および非化学量論的水和型結晶形態。これらの教示を参照して本明細書中に組み込む）、’４７４に教示されている手法によって製造されたアルゾキシフェンまたはそのいずれかの混合物が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中に記載の手法にしたがって無水メタノールから結晶化するとＦ−Ｖ結晶が生じるので、いずれの形態のアルゾキシフェンで出発するかは重要ではない。
【００１５】
Ｆ−Ｖの特徴付け
示差走査熱量分析／熱量分析（ＤＳＣ／ＴＧＡ）、水分吸着および脱着、およびＸ線粉末回折（ＸＲＤ）法を用いて、Ｆ−Ｖを特徴付けした。ＴＧＡは熱により引き起こされた物質の重量喪失の温度の関数としての指標である。これは、脱溶媒和プロセスを調べるため、そして固体の全揮発含量を定量的に測定するために最も一般的に用いられる。物質の物理的変化が生じる温度は、通常、その物質に特徴的であるので、ＤＳＣは、多形性に関して化合物をスクリーニングするために頻繁に使用される技術である。水分吸着等温線は、所定の物質に関する含水量の程度の評価、非水和物及び水和物の特徴付けを提供する。最後に、ＸＲＤは結晶性物質中の長距離秩序（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ ｏｒｄｅｒ）を検出する技術である。
【００１６】
Ｆ−Ｖの代表的なＴＧＡトレースを図１に記載する。Ｆ−Ｖの熱重量分析は重量の喪失を示さず、これは非溶媒和型結晶形態の単離を示す。Ｆ−ＶのＤＳＣ分析は、図２に示すように、１７４−１７５℃でのシャープな溶融時の吸熱を示し、これはＦ−ＩＩＩについて観察されるものよりも有意に高かった。
【００１７】
Ｆ−Ｖに関して得られた水分吸着／脱着等温線は、０−９５％ＲＨの範囲にわたり０．１１％の重量増加を示し、これは水分を吸着する性質または水和型アルゾキシフェン形態に変換する性質がほとんどない安定な無水結晶形態を示す。
【００１８】
Ｆ−ＶのＸＲＤパターンは鋭いピークおよびフラットなベースラインを描き、これは結晶性の良い物質であることを示す。Ｆ−Ｖに対する最も長いピークの１０％以上の強度を有する全てのピークに関して、２θでの角ピーク位置および対応するＩ／Ｉ０データを表１に示す。表１中の全てのデータは±０．２％の精度で表されている。多数の強い反射が、Ｓ−ＩＩ、Ｆ−ＩおよびＦ−ＩＩＩに関して報告されたものと概ね同様の回折角に存在するが、各形態は、Ｓ−ＩＩ、Ｆ−Ｉ、Ｆ−ＩＩＩおよびＦ−Ｖ間ではっきり区別される異なった粉末パターンを生じる。
【００１９】
Ｆ−Ｖの種々の温度のＸ線粉末回折分析は、１２５℃までは回折パターンの顕著な変化を示さず、これは安定な結晶形態を示すＤＳＣプロフィールと一致した。
【００２０】
結晶技術分野では、任意の所定の結晶形態に関し、回折ピークの相対強度が、結晶形態学および晶癖のような要因から生じる好ましい（優先的な）配向に起因して変動し得ることが周知である。選択的配向の影響が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形体の特徴的なピーク位置は変動しない。例えば、米国薬局方＃２３， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ＃１８， ページ １８４３−１８４４， １９９５ を参照のこと。さらに、結晶技術分野では、任意の所定の結晶形態に関し、角ピーク位置がわずかに変動し得ることも周知である。例えば、サンプルを分析する温度の変動、サンプルの置換、または内部標準の存在または非存在に起因して、ピーク位置がシフトし得る。本発明の場合、２θ＝±０．２のピーク位置の変動についてはこれらの変化の可能性を考慮に入れており、Ｆ−Ｖの明白な同定は阻害されない。
【００２１】
文献周知でありかつ容認された化学結晶形態の探索法は、「フィンク（Ｆｉｎｋ）」法である。フィンク法は初期探索に４つの最も強いラインを使用し、続いて次に最も強い４本のラインを使用する。フィンク法に従ったピーク強度およびピーク位置に基づき、銅放射線源からパターンを得た場合、２θ＝７．３±０．２、１５．５±０．２、１５．９±０．２および１７．６±０．２°のピークの存在により、Ｆ−Ｖを同定することができる。さらに、銅放射線源からパターンを得た場合、２θ＝１７．９±０．２、１８．２±０．２、１８．９±０．２および２１．５±０．２°のピークによりＦ−Ｖの存在を検証することができる。
表１
【表１】
2004512333.tif 000003
【００２２】
Ｆ−Ｖは’４７４に記載の先行技術のアルゾキシフェン形態、ならびに前記で参照して組込んだＰＣＴ出願に記載されているＦ−ＩおよびＦ−ＩＩＩを超える利点をいくつか有する。’４７４に教示される手順により作製されたアルゾキシフェンと比較して、Ｆ−Ｖは周囲温度でより安定であり、それゆえ、より製薬的な開発、すなわち、投薬用製剤の開発に使用しやすい。さらに、’４７４に開示される形態とは異なり、Ｆ−Ｖは非常に結晶性が良い。一般的に、結晶性物質は非晶質物質よりも吸湿性が低く、より安定（すなわち、化学的に分解する傾向が少なく、一定の効力を維持する）であり、それゆえ製剤処理により望ましい。さらに、’４７４に教示される手順により作製されるアロゾキフェン形態（これはその格子中に酢酸エチルおよび水を含有していた）とは異なり、Ｆ−Ｖはいずれも含有しない。
【００２３】
Ｓ−ＩＩ、Ｆ−ＩおよびＦ−ＩＩＩとは異なり、Ｆ−Ｖは、相対湿度の変化に際して水を吸着する傾向を示さない、まさしく無水形態のアルゾキシフェンである。さらに、Ｆ−Ｖの結晶格子は融点温度まで安定である。さらに、Ｆ−ＶはＦ−ＩＩＩと比較しておよそ１０％高い水溶性を有し、熱力学的に最も安定な公知の形態のアルゾキシフェンである。
【００２４】
特徴付け方法
ＤＳＣ分析は、自動サンプラーおよび冷蔵冷却デバイスを備えたＴＡ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　２９２０を用いて行った。サンプルは波形アルミニウムパンに包み、空の基準パンに対して分析した。３０℃で平衡化した後に熱流量を測定した。加熱速度は３００℃までは５℃／分であった。熱流量対温度のグラフを積分して任意の吸熱または発熱事象を同定した。
【００２５】
ＴＧＡ分析は、自動サンプラーを備えたＴＡ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　２９５０を用いて行った。サンプルをタールを塗った（ｔａｒｅｄ）アルミニウムパンにロードし、１０℃／分の速度で周囲温度から３００℃へと徐々に温度を上げた。重量パーセント対温度のグラフを積分して損失割合を決定した。
【００２６】
ＶＴＩ　ＳＧＡ−１００フロー装置を用いて水分吸着等温線を作製した。吸着に関しては２５℃で０〜９５％の相対湿度（ＲＨ）で、脱着に関しては９５〜５％ＲＨで、５％ＲＨのステップで、サンプルを分析した。吸着および脱着等温線を、重量変化％　対　％ＲＨのグラフとして作製した。
【００２７】
粉末Ｘ線回折パターンは、ＣｕＫα源（λ＝１．５４０５６）およびＫｅｖｅｘ固相状態検出器を備えたＳｉｅｍｅｎｓ　Ｄ５０００粉末Ｘ線回折装置を、５０ｋＶおよび４０ｍＡで操作して得た。サンプルを２θ＝４°〜３５°の間で、０．０４°のステップサイズあたり２．５秒で走査した。凹型頂点ローディングサンプルホルダーに乾燥粉末をパックし、ガラススライドを用いて表面を平滑にした。
【００２８】
種々の温度の粉末Ｘ線回折パターンを、ＣｕＫα供給源（λ＝１．５４０５６）、シンチレーション検出器およびニッケルフィルターを備えたＳｉｅｍｅｎｓ　Ｄ５０００粉末Ｘ線回折装置を５０ｋＶおよび４０ｍＡで操作して得た。粉末を頂点ローディング型の凹型温度制御ホルダーにパックし、回折のために表面を平滑にした。サンプルを２℃から３５℃の間で、２θ＝０．０４°のステップサイズあたり２．５秒で走査した。これは５分間の平衡化時間の後に２５℃で開始した。続く走査を、２５℃から最高１２５℃までの上昇温度増分で行った。
【００２９】
以下の実施例は、Ｆ−Ｖの製造方法をさらに例示する。これらの例はいかなる点においてもこれらの方法の範囲を限定することは意図しておらず、またそのように解釈されるべきでない。
【００３０】
実施例
実施例１
メタノールからの濃縮無しでの結晶化
アルゾキシフェンのサンプル２０．００ｇを、無水メタノール（ＨＰＬＣグレード）５００ｍｌと混合し、加熱還流する。固体全てを溶解して均一な淡黄色の溶液を得る。溶液を還流温度未満まで冷却し、さらにアルゾキシフェン５．００ｇを添加する。溶液を再び加熱還流して全固体を溶解する。溶液を、攪拌しながらゆっくりと冷却する。５０℃で、予め製造しておいたＦ−Ｖの塩を溶液に数ｍｇ播種する。結晶スラリーを５０℃から３０℃まで、１．２５時間かけて冷却する。この時点では大量の白色固体が存在する。攪拌スラリーを氷浴に浸し、さらに３時間攪拌する。Ｗｈａｔｍａｎ＃１フィルター紙を用いてスラリーをろ過し、白色の固体を予め０℃に冷却したメタノー５０ｍｌで洗浄する。ウェットケークを５０℃で約４８時間、真空下で、わずかにＮ２でパージして乾燥させる。収量１５．９４ｇ（収率６３．８％）。ＨＰＬＣ効力８９．４％（遊離の塩基として）、全関連物質（ＴＲＳ）０．２８％。乾燥前と後との生成物の重量の比較は、最初のウェットケークが６５％の溶媒を含有していたことを示した。
【００３１】
実施例２
メタノールから濃縮有りでの結晶化
アルゾキシフェン２５．００ｇのサンプルを無水メタノール（ＨＰＬＣグレード）５００ｍｌと合わせ、加熱還流する。固体全てを溶解して均一な淡黄色の溶液を得る。溶液を、大気蒸留で蒸留液を３７５ｍｌ取り除くことにより濃縮する。この時点で、反応混合物は清澄な均一の黄色液体である。還流を停止し、予め製造しておいたＦ−Ｖを溶液に数ｍｇ播種する。播種後、混合物を周囲温度までゆっくりと攪拌しながら１時間かけて冷却する。この間に、大量の白色の析出物が形成する。スラリーを氷浴に浸し、さらに３時間攪拌する。Ｗｈａｔｍａｎ＃１フィルター紙を用いてスラリーをろ過し、白色の固体を予め０℃に冷却したメタノール５０ｍｌで洗浄する。ウェットケークを５０℃で約４８時間、真空下で、わずかにＮ２でパージして乾燥させる。収量２２．４４ｇ（収率８９．８％）。ＨＰＬＣ効力９１．３％（遊離の塩基として）、ＴＲＳ　０．２６％。乾燥前と後との生成物の重量の比較は、最初のウェットケークが３１．５％の溶媒を含有していたことを示した。
【００３２】
実施例３
メタノールからの３０ガロンスケールの再結晶化
アルゾキシフェンのサンプル３．０８ｋｇを無水メタノール（ＨＰＬＣグレード）６０Ｌと合わせ、加熱還流する。固体全てを溶解して均一な淡黄色の溶液を得た。溶液を、大気蒸留で蒸留液を４０Ｌ取り除くことにより濃縮する。この時点で、反応混合物は清澄な均一の黄色液体である。反応系を冷却して還流を停止し、結晶化をチェックするために約４０℃で小さい孔（ｍａｎｗａｙ）を開ける。結晶が観察されれば、１２℃／時間の速度で最終温度０℃まで冷却を継続する。結晶スラリーを一晩０℃で攪拌し、次いでシングルプレートフィルタープレスでろ過する。結晶タンクから全ての生成物を取り出すために、母液をタンク洗浄液として使用してプレスに注ぐ。次いで、ウェットケークを、予め０℃に冷却した無水メタノール１１．３Ｌで洗浄する。プレスを減圧に付し、プレスのジャケットに５０℃の水を流すことによりウェットケークを乾燥させる。約２４時間後にわずかにＮ２パージを行う。全乾燥時間は約３６時間である。収量は２．５８８ｋｇ（８６．２７％）；ＨＰＬＣ効力９２．７（遊離塩基として）；ＴＲＳ　０．３９％。
【００３３】
実施例４
エタノールからの結晶化
１００％エタノール（ｐｕｎｃｔｉｌｉｏｕｓ　ｅｔｈａｎｏｌ）（２５０ｍｌ）およびアルゾキシフェン（１０．０ｇ）を合わせ、加熱還流して溶解した。溶液を３時間かけて周囲温度まで冷却し、この間に白色の結晶析出物が形成した。固体をろ過により単離し、５０℃で一晩、わずかにＮ２でパージして真空乾燥した。収量５．５０ｇ、ｍ．ｐ．１７３℃（ＤＳＣ）。このサンプルの粉末Ｘ線回折スペクトルを得、これは図３に開示のＦ−Ｖパターンと実質的に同一であった。
【００３４】
実施例５
イソプロパノールからの結晶化
無水イソプロパノール（２５０ｍｌ）およびアルゾキシフェン（１０．０ｇ）を合わせ、加熱還流して溶解した。加熱を停止し、数ｍｇのＦ−Ｖを溶液に播種した。反応混合物を周囲温度まで冷却し、一晩攪拌すると、この間に白色の析出物が形成された。固体をろ過により単離してウェットケークを１２．１１ｇ得た。ウェットケークのサンプル４．０１ｇを６０℃で一晩、真空下でわずかにＮ２でパージして乾燥させた。収量２．７２ｇ；ｍ．ｐ．１７１．５℃（ＤＳＣ）。このサンプルの粉末Ｘ線回折スペクトルを得、これは図３に開示のＦ−Ｖパターンと実質的に同一であった。
【００３５】
実施例６
アルゾキシフェン遊離塩基からの製造
アルゾキシフェン遊離塩基（５．０７ｇ）をメタノール（６５．０ｍｌ）中でスラリー化した。濃塩酸（１．４１ｍｌ）および水（１０．０ｍｌ）の溶液を反応混合物に加えた。反応混合物を５５℃まで１５分間加熱して溶解した。反応混合物を３０℃まで冷却し、Ｆ−Ｖを５０ｍｇ播種した。反応混合物を１０℃まで１℃／時間の速度で冷却し、その温度で８時間攪拌した。固体をろ過により単離し、予め１０℃まで冷却したメタノールで洗浄し、５０℃で一晩、軽くＮ２パージして真空乾燥した。収量４．４２ｇ（収率８７．７％）、効力（ＨＰＬＣ）９９．７％；ＴＲＳ　０．３２％。このサンプルの粉末Ｘ線回折スペクトルを得、これは図３に開示のＦ−Ｖパターンと実質的に同一であった。
【００３６】
用途
本明細書中で使用する用語「有効量」とは、本明細書中に記載の状態またはその有害な結果を阻止し得るＦ−Ｖの量を意味する。Ｆ−Ｖがエストロゲン、プロゲスチン、アロマターゼインヒビター、ＬＨＲＨアナログ、またはＡＣｈＥインヒビターと同時投与される場合、用語「有効量」は、意図する効果を生じ得る薬剤の量を意味する。
【００３７】
用語「阻止（阻害）する」および「阻止（阻害）」は、一般的に受け入れられている意味、すなわち、本明細書中に記載の病理的状態の進行または重篤度、あるいはそれらの後遺症の予防、妨害、抑止、緩和、改善、遅延、静止または逆転を包含する。
【００３８】
用語「予防する」、「〜の予防」、「予防（防御）」、「予防（防御）の」および「妨害」は、本明細書中において相互交換可能に使用され、Ｆ−Ｖのレシピエントが、本明細書中に記載の病理的状態またはその後遺症を受けるまたは発症する可能性を減少させることを意味する。
【００３９】
用語「エストロゲンが枯渇した」および「エストロゲン枯渇」とは、自然発生的な、または臨床的に誘発されたいずれかの状態を意味し、この場合、女性はエストロゲン依存性の機能、例えば、月経、骨重量の恒常性、神経機能、心血管状態などを維持するために充分な内因性エストロゲンホルモンを産生できない。このようなエストロゲン枯渇状況は、以下に限定するわけではないが、閉経、外科的または化学的卵巣切除（ｏｖａｒｅｃｔｏｍｙ）（機能的に等価な、例えば、アロマターゼインヒビター、ＧｎＲＨアゴニストまたはアンタゴニスト、ＩＣＩ　１８２７８０での薬物療法などを含む）などから生じる。エストロゲン枯渇状態と関連した疾患状態としては、骨喪失、骨粗鬆症、心血管疾患および高脂血症が挙げられるが、これらに限定するわけではない。
【００４０】
本明細書中で用いられる用語「エストロゲン」には、エストロゲン性活性を有するステロイド化合物、例えば、１７β−エストラジオール、エストロン、結合型エストロゲン（Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標））、ウマエストロゲン１７β−エチニルエストラジオールなどが含まれる。好ましいエストロゲンに基づく化合物は Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標）およびノルエチルノドレル（ｎｏｒｅｔｈｙｌｎｏｄｒｅｌ）である。
【００４１】
本明細書中で用いられる用語「プロゲスチン」には、プロゲステロン性活性を有する化合物、例えばプロゲステロン、ノルエチルノドレル、ノンゲストレル（ｎｏｎｇｅｓｔｒｅｌ）、酢酸メゲストロール、ノルエチンドロンなどが含まれる。ノルエチンドロンは好ましいプロゲスチンベースの薬剤である。
【００４２】
本明細書中で用いられる用語「アロマターゼインヒビター」には、アロマターゼを阻害し得る化合物、例えば市販のインヒビター、例えばアミノグルテミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｍｉｄｅ，ＣＹＴＡＮＤＲＥＮ（登録商標））、Ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、Ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、Ｆｏｒｍｅｓｔａｎｅ（ＬＥＮＡＴＲＯＮ（登録商標））、Ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））などが含まれる。
【００４３】
本明細書中で用いられる用語「ＬＨＲＨアナログ」とは、月経閉止前の女性のエストロゲン生産を阻害するホルモンを放出する黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）のアナログを意味し、これにはゴセレリン（ｇｏｓｅｒｌｉｎ，ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標））、ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標））などが含まれる。
【００４４】
本明細書中で用いられる用語「ＡＣｈＥインヒビター」には、アセチルコリンエステラーゼを阻害する化合物、例えばサリチル酸フィソスチグミン、タクリン塩酸塩（ｔａｃｒｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ドネベジル塩酸塩（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ） などが含まれる。
【００４５】
用語「ＣｈＡＴのアップレギュレート」とは、ＣｈＡＴの酵素活性を増加させること、すなわち、コリンのアセチルコリンへの変換の促進を意味する。この促進には、ＣｈＡＴおよびコリンの反応の効率および／または速度の増加、および／または作用部位に存在するＣｈＡＴ量の増加が含まれる。この存在する酵素量の増加は、遺伝子調節または酵素形成の他の合成工程および／または酵素の脱活性化および代謝の減少に起因し得る。
【００４６】
選択された試験手順
一般的ラット調製手順：（特記しないかぎり）７５日齢の雌性 Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ラット（重量範囲２００〜２２５ｇ）を Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｐｏｒｔａｇｅ， ＭＩ） から得る。この動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ で両卵巣切除（ＯＶＸ）するか、あるいはＳｈａｍ（シャム） 外科手術を行い、１週間後に輸送されている。到着時に、それらを金属の吊り下げ籠中、餌（カルシウム含量約０．５％）および水は自由に摂取できるようにして、１籠あたり３または４匹の群で１週間飼育する。室温を２２．２°±１．７℃に維持し、最小相対湿度を４０％とする。室内の光周期を１２時間の明および１２時間の暗とした。
【００４７】
投与レジメ組織収集：一週間の新環境順応期間後（したがって、ＯＶＸの二週間後）、Ｆ−Ｖの毎日の投与を開始する。特記しないかぎり、１％カルボキシメチルセルロース中の懸濁液または２０％シクロデキストリンに溶解して１７α−エチニルエストラジオールまたはＦ−Ｖを経口投与する。動物に４日間毎日投与する。投与レジメが終了後、動物の体重を量り、ケタミン：Ｘｙｌａｚｉｎｅ（２：１、ｖ：ｖ）の混合物で麻酔し、心臓に穴をあけて血液サンプルを収集する。次いでこの動物をＣＯ２での窒息により屠殺し、正中切開によって子宮を取り出し、子宮湿重量を測定する。１７α−エチニルエストラジオールは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ から得る。
【００４８】
心血管疾患／高脂血症
上記の血液サンプルを室温で２時間凝固させ、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して血清を得る。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ 高性能コレステロールアッセイ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｓｓａｙ）を用いて血清コレステロールを測定する。簡単に、コレステロールをコレスト−４−エン−３−オンおよび過酸化水素に酸化する。次いでペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素をフェノールおよび４−アミノフェナゾンと反応させ、ｐ−キノンイミン色素を生じさせ、これを分光光度計において５００ｎｍで読み取る。次いで標準曲線に対しコレステロール濃度を計算する。Ｂｉｏｍｅｋ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ を用いて全アッセイを自動化する。
【００４９】
子宮エオシン好性白血球（好酸球）ペルオキシダーゼ（ＥＰＯ）アッセイ
上記の子宮を酵素分析時まで４℃で維持する。次いで０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ−８．０）５０容量中で子宮をホモジナイズする。トリス緩衝液中０．０１％過酸化水素および１０ｍＭ Ｏ−フェニレンジアミン（最終濃度）を加えた時点で、４５０ｎｍで１分間、吸光度の増加をモニターする。子宮内のエオシン好性白血球の存在により、化合物のエストロゲン性活性が示される。反応曲線の初期直線部分にわたって、１５秒間隔の最大速度を測定する。
【００５０】
骨喪失（骨粗鬆症）の阻止試験手順
上記の一般的調製手順にしたがって、ラットを３５日間にわたって毎日処置（処置群あたりラット６匹）し、３６日目に二酸化炭素で窒息させて屠殺する。３５日間の期間は、本明細書中に記載のようにして測定される骨密度を最大に減少させるに十分である。屠殺した時点で、子宮を取り出し、異質組織を含まないように解剖し、流動性内容物を排出した後、完全な卵巣切除に関連するエストロゲン欠損を確認するために湿重量を測定する。子宮重量は卵巣切除に応答して一般に約７５％減少する。次いでこの子宮を、次の組織学分析用に、１０％中性緩衝化ホルマリンに入れる。
【００５１】
右大腿骨を摘出し、デジタル化Ｘ線（ｄｉｇｉｔｉｌｉｚｅｄ Ｘ−ｒａｙ）を作製し、遠位骨幹端（ｔｈｅ ｄｉｓｔａｌ ｍｅｔａｐｈｙｓｉｓ）でのイメージ分析プログラム（ＮＩＨイメージ）によって分析する。また、これらの動物由来の脛骨の近位面を定量的コンピューターＸ線断層撮影によってスキャンする。上記の手順によって、２０％ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン中のＦ−Ｖまたはエチニルエストラジオール（ＥＥ２）を試験動物に経口投与する。また、Ｆ−Ｖはエストロゲンまたはプロゲスチンと組み合わせても有用である。
【００５２】
ＭＣＦ−７増殖アッセイ
ＭＣＦ−７胸部癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ ２２）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ｖ／ｖ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ｛（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］１０ｍＭ｝、非必須アミノ酸およびウシインシュリン（１μｇ／ｍＬ）を補ったＭＥＭ（フェノールレッドを含まない最小必須培地、Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）（維持培地）中で維持する。分析の１０日前に、１０％ＦＢＳの代わりに１０％デキシトランコーティングチャコールストリップド（ｄｅｘｔｒａｎ ｃｏａｔｅｄ ｃｈａｒｃｏａｌ ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ウシ胎仔血清（ＤＣＣ−ＦＢＳ）を補った維持培地（アッセイ培地）にＭＣＦ−７細胞を移し、ステロイドの内部貯蔵を涸渇させる。細胞解離培地（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを補ったＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＨＢＳＳ（フェノールレッドを含まない））を用いてＭＣＦ−７細胞を維持フラスコから取り出す。細胞をアッセイ培地で２回洗浄し、８０，０００細胞／ｍＬに調節する。約１００ｍＬ（８，０００細胞）を平底マイクロ培養ウェル（Ｃｏｓｔａｒ ３５９６）に加え、５％ＣＯ２給湿インキュベーター中、３７℃で４８時間インキュベートし、移転後の細胞を付着させ、平衡化する。薬物または、希釈物対照としてのＤＭＳＯの系列希釈物をアッセイ培地中で調製し、５０ｍＬをマイクロ培養物に３連で移し、次いでアッセイ培地５０ｍＬを移して、最終容量２００ｍＬにする。５％ＣＯ２給湿インキュベーター中、３７℃でさらに４８時間後、マイクロ培養物にトリチウム化チミジン（ｔｒｉｔｉａｔｅｄ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（１μＣｉ／ウェル）を４時間適用する。培養を−７０℃で２４時間凍結して終結させた後、解凍し、Ｓｋａｔｒｏｎ 半自動細胞回収装置を用いてマイクロ培養物を回収する。Ｗａｌｌａｃ ＢｅｔａＰｌａｃｅ β カウンターを用いる液体シンチレーションによってサンプルをカウントする。
【００５３】
ＤＭＢＡ誘導性の乳房腫瘍阻止
Ｈａｒｌａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄｉａｎａ から購入した雌性 Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ラットにエストロゲン依存性の乳房腫瘍を生じさせる。約５５日齢のラットに、７，１２−ジメチルベンゾ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）２０ｍｇを一回経口投与する。ＤＭＢＡ投与から約６週間後、乳腺を、腫瘍の存在について一週間間隔で触診する。１個以上の腫瘍が存在した時は、メートル測径器で各腫瘍の最長および最短の直径を測定し、この測定値を記録し、この動物を実験用に選択する。処置群およびコントロール群に種々のサイズの腫瘍が一様に分配されるように試み、平均サイズの腫瘍が試験群間に等しく分配されるようにする。各実験についてのコントロール群および試験群には５〜９頭が含まれる。
【００５４】
Ｆ−Ｖは、２％アカシア中で腹膜内注射によって、あるいは経口で投与する。経口投与される化合物はトウモロコシ油０．２ｍＬに溶解あるいは懸濁されている。アカシアおよびトウモロコシ油でのコントロール処置を含む各処置は、各試験動物に１日一回投与される。初期腫瘍測定および試験動物選択後、上記方法によって腫瘍を毎週測定する。動物の処置および測定を３〜５週間継続し、この時点で腫瘍の最終領域を測定する。各化合物処置およびコントロール処置に関して、平均腫瘍領域の変化を測定する。
【００５５】
子宮繊維症試験手順
試験１：子宮繊維症の女性３〜２０人にＦ−Ｖを投与する。投与する化合物量は０．１〜１０００ｍｇ／日であり、投与期間は３ヶ月である。投与期間中および投与停止後３月まで、子宮繊維症に対する効果について女性を観察する。
試験２：投与期間が６月であることを除いて、試験１と同じ方法を用いる。
試験３：投与期間が１年であることを除いて、試験１と同じ方法を用いる。
試験４：長期エストロゲン刺激を用いて、性的に成熟した雌性モルモットの平滑筋腫（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔａ）を誘発させる。１週あたり３〜５回、２〜４月間あるいは腫瘍が生じるまでエストラジオールを動物に注射により投与する。Ｆ−Ｖまたはビヒクルからなる処置を３〜１６週間毎日投与した後、動物を屠殺し、子宮を取り出し、腫瘍退行に関して分析する。
試験５：ヒト平滑筋腫由来の組織を、性的に成熟した卵巣除去した雌性ヌードマウスの腹膜腔および／または子宮筋層内に移植する。外来性エストロゲンを補って、外移植組織の成長を誘導する。いくつかのケースでは、取り出した腫瘍細胞を移植前にインビトロで培養する。３〜１６週間、基本的には毎日、胃洗浄によってＦ−Ｖまたはビヒクルからなる処置を供給し、移植片を取り出し、成長または退行に関して測定する。屠殺の時点で、子宮を取り出し、器官の状態を評価する。
試験６：ヒト子宮筋腫由来の組織を取り出し、初代非形質転換培養物としてインビトロで維持する。外科標本を滅菌メッシュまたはふるいに押し通し、あるいは周りの組織を除いて細かく切断し、単細胞懸濁液を製造する。細胞を１０％血清および抗生物質を含む培地に維持する。エストロゲンの存在および非存在下での増殖速度を測定する。補体成分Ｃ３を製造する能力および、成長因子および成長ホルモンに対する応答に関して細胞をアッセイする。プロゲスチン、ＧｎＲＨ、Ｆ−Ｖおよびビヒクルでの処置後の増殖応答に関してインビトロ培養物を評価する。ステロイドホルモンレセプターのレベルを毎週評価し、重要な細胞の特徴がインビトロで維持されるか否かを決定する。患者５〜２５人の組織を用いる。
試験７：Ｆｕｃｈｓ−Ｙｏｕｎｇら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｌｅｉｏｍｙｏｍａｓ ｂｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ」， Ｍｏｌ． Ｃａｒ．， １７（３）：１５１−１５９ （１９９６） に記載（この教示を本明細書中に参照して組み込む）のように、平滑筋腫由来ＥＬＴ細胞株のエストロゲン刺激性増殖を阻止するＦ−Ｖの能力を実質的に測定する。
【００５６】
子宮内膜症試験方法
試験１：成体ＣＤ系統雌性ラット１２〜３０匹を試験動物として用いる。これらを同数の３群に分ける。すべての動物の発情サイクルをモニターする。発情前期の日、各雌に手術を施す。各群の雌の左子宮角を取り出し、細かく切断し、腸間膜血流に近接した種々の部位で各片をゆるく縫合する。さらに、第２群の雌の卵巣を除去する。手術の翌日、第１群および第２群の動物には、１４日間、水を腹膜内注射し、一方第３群の動物にはＦ−Ｖを１．０ｍｇ／体重ｋｇを同期間、腹膜内注射する。１４日間の処置後、各雌を屠殺し、適切な子宮内膜外植片、副腎、残留子宮および卵巣を取り出し、組織学試験用に調製する。卵巣および副腎の重さを量る。
試験２：成体ＣＤ系統雌性ラット１２〜３０匹を試験動物として用いる。これらを同数の二群に分ける。すべての動物の発情サイクルをモニターする。発情前期の日に、各雌に手術を施す。各群の雌の左子宮角を取り出し、細かく切断し、腸間膜血流に近接した種々の部位で各片をゆるく縫合する。手術の約５０日後に、第１群に分配した動物には、２１日間、水を腹膜内注射し、一方第２群の動物にはＦ−Ｖを１．０ｍｇ／体重ｋｇを同期間、腹膜内注射する。２１日間の処置後、各雌を屠殺し、子宮内膜外植片および副腎を取り出し、重さを量る。この外植片を成長の指標として測定する。発情サイクルをモニターする。
試験３：子宮内膜組織の自家移植（ａｕｔｏｇｒａｐｈｓ）を用いて、ラットおよび／またはウサギの子宮内膜症を誘導する。生殖的成熟時の雌性動物に両卵巣摘出手術を行い、外部からエストロゲンを供給し、これにより特定の一定量のホルモンを提供する。自己子宮内膜組織を動物５〜１５０匹の腹膜に移植し、エストロゲンを供給して外植片組織の成長を誘導する。３〜１６週間基本的に毎日、胃洗浄により本発明の化合物からなる処置を供給し、移植片を取り出して、成長または退行に関して測定する。屠殺の時点で、無傷の子宮角を取り出し、子宮内膜の状態を評価する。
試験４：ヒト子宮内膜病変由来の組織を、性的に成熟した、卵巣切除雌性ヌードマウスの腹膜内に移植する。外来性エストロゲンを供給し、外植片組織の成長を誘導する。いくつかの場合には、回収した子宮内膜細胞を、移植前にインビトロで培養する。３〜１６週間、基本的に毎日、胃洗浄によってＦ−Ｖを含む処置を供給し、移植片をとりだし、成長または退行を測定する。屠殺の時点で、子宮を取り出し、無傷の子宮内膜の状態を評価する。
試験５：ヒト子宮内膜病変由来の組織を取り出し、初代非形質転換培養物としてインビトロで維持する。外科標本を滅菌メッシュまたはふるいに押し通すか、あるいは周りの組織を除いて細かく切断し、単細胞懸濁液を調製する。１０％血清および抗生物質を含む培地中に細胞を維持する。エストロゲンの存在下および非存在下での成長速度を測定する。補体成分Ｃ３を製造する能力および成長因子および成長ホルモンに対する応答に関して細胞をアッセイする。インビトロ培養物をプロゲスチン、ＧｎＲＨ、Ｆ−Ｖおよびビヒクルで処置した後の増殖応答に関して評価する。ステロイドホルモンレセプターの量を毎週評価し、細胞の重要な特徴がインビトロで維持されるか否かを決定する。患者５〜２５人からの組織を用いる。
【００５７】
アルツハイマー疾患を含むＣＮＳ障害
エストロゲン、例えば１７β−エストラジオールは、特定の細胞集団の細胞質に存在するエストロゲンレセプター（ＥＲ）と結合することによって遺伝子の転写を調節する。ＥＲのリガンド活性化は、１３塩基対パリンドロームＤＮＡコンセンサス配列（エストロゲン応答因子、またはＥＲＥ）と結合して転写装置の会合を開始し、適当な標的遺伝子の活性化を生じさせるための複合体核輸送の前提条件である。エストロゲンによって調節される種々の遺伝子が同定されている。これらには、細胞骨格タンパク質、神経伝達生合成および代謝の酵素およびレセプター、ならびに他のホルモンおよび神経ペプチドが含まれる。ＥＲＥ類は、ビテロゲニン（ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）、ｃ−ｆｏｓ、プロラクチンおよび黄体形成ホルモンを含む多くのエストロゲン応答遺伝子において同定されている。
【００５８】
中枢神経系において重要なことは、ｐ７５ｎｇｒおよびｔｒｋＡ中でＥＲＥ様配列が同定されたことであり、これらは両方とも、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＧＦ）およびニューロトロフィン−３に対するシグナル伝達分子として働く。
【００５９】
ＢＤＮＦならびにＮＧＦは培養物中でコリン作動性ニューロンの生存を促進することが示された。ニューロトロフィンおよびエストロゲン間の相互作用が基底前脳ニューロン（これはアルツハイマー病では変性している）の発達および生存に重要であるならば、（月経閉止後のような）エストロゲン欠損が生じている臨床症状はこれらのニューロンの喪失に関与しているかもしれないことが仮定される。
【００６０】
（上記のように調製した）卵巣切除されたラットにおいて以下の実験を行い、種々の脳領域における遺伝子発現に影響する際のＦ−Ｖとエストロゲン間の類似点および／または相違点を決定する。６週齢のラットに、エストラジオールベンゾエート（０．０３ｍｇ／ｋｇ）、Ｆ−Ｖまたはビヒクル（コントロール）を皮下注射により毎日投与する。処置５週間後、動物を屠殺し、その脳を取り出し、顕微解剖によって海馬を収集する。この海馬を液体窒素中で急速凍結し、−７０℃で保存する。適切な処置群およびコントロール群から集めた組織から全ＲＮＡを調製し、特定のｍＲＮＡ（ポリ−Ａ＋）集団に関して選択されている３’オリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転写する。ランダム５’オリゴヌクレオチド（１０塩基対長；合計１５０）、反応緩衝液、Ｔａｑポリメラーゼおよび３２ＰｄＴＣＰからなる混合物中でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。
【００６１】
４０ラウンドの増幅後、反応産物を６％ＴＢＥ−尿素ゲルでサイズ分画し、乾燥させ、Ｘ線フィルムに暴露する。得られたｍＲＮＡディスプレイパターンを処置群間で比較する。
【００６２】
エストロゲンと組み合わせたＦ−Ｖの使用
月経閉止が近い女性および月経閉止後の女性は循環内因性エストロゲンの低下に関連するネガティブな結果と闘うため、例えば一過性熱感を処置するために、しばしばホルモン置換治療（ＨＲＴ）を受ける。しかしＨＲＴは、子宮癌および乳癌を含む特定の癌の危険性の増加を伴う。Ｆ−ＶをＨＲＴとともに用いてこれらの危険性を防止することができるかもしれない。
【００６３】
アロマターゼ阻害剤と組み合わせたＦ−Ｖの使用
定義では、月経閉止後の女性の卵巣は機能していない。彼女の唯一のエストロゲン供給源は、酵素アロマターゼによる副腎アンドロゲンのエストロゲンへの変換を介するものであり、これは（脂肪、筋肉および乳房腫瘍自身を含む）末梢組織において見られる。したがって、アロマターゼを阻害する薬物（アロマターゼインヒビター）は月経閉止後の女性の循環エストロゲンを涸渇させる。アロマターゼ阻害によるエストロゲン欠乏は、転移性乳癌の患者に対する重要な治療選択肢である。アロマターゼインヒビターでの治療の間に、循環エストロゲンの欠乏は、ネガティブな意図しない副作用（例えば血清脂質レベルに対するもの）を引き起こし得る。Ｆ−Ｖを用いてこれらのネガティブな作用を阻止しうる。
【００６４】
ＬＨＲＨアナログと組み合わせたＦ−Ｖの使用
ＬＨＲＨ（黄体形成ホルモン放出ホルモン）アナログに連続的に暴露することにより、下垂体腺の感受性が減少し、月経閉止前の女性のエストロゲン産生が阻害され、その後、もはや卵巣はエストロゲンを産生するようには刺激されない。この臨床作用は「医用卵巣摘出手術」であり、ＬＨＲＨアナログの中止時には回復する。ＬＨＲＨアナログでの治療中、循環エストロゲンが欠乏すると、例えば血清脂質レベルに対する、ネガティブな意図しない副作用が生じ得る。Ｆ−Ｖを用いてこれらのネガティブな効果を阻止しうる。
【００６５】
アセチルコリンのレベルの増加
アルツハイマー病に罹患した患者は、海馬に、アルツハイマー病ではない同等者より著しく少量のコリン作動性ニューロンしか有さないことが知られている。これらのコリン作動性ニューロンの進行性喪失は、これらの患者における記憶および認知機能の進行性喪失を反映するものであると思われる。これらのニューロンの減退の理由の１つは、神経伝達物質であるアセチルコリンの機能の喪失または減少であると考えられる。
【００６６】
ニューロンにおけるアセチルコリンレベルは基本的に、生合成および生分解の間の平衡の位置によって決定される。酵素コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）は主に合成に関与し、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は分解に関与する。
【００６７】
ＣｈＡＴ量に対するＦ−Ｖの効果を測定するため、以下の実験を行う。上記の一般的なラット調製手順に従い、１０％シクロデキストリンを含むビヒクル中で３ｍｇ／ｋｇ／日のＦ−Ｖ、０．０３または０．３ｍｇ／ｋｇ／日のエストラジオールベンゾエート、またはビヒクルコントロールを、毎日、皮下注射あるいは経口胃管栄養法により４０匹のラットに投与する。動物を３または１０日間処置する。各投薬レジメについて動物２０匹を用いる。適当な時間間隔で、動物を屠殺し、その脳を解剖する。脳の特定の部分をホモジナイズし、アッセイする。海馬および前頭皮質由来のホモジネート物を処理し、アセチルコリン生合成の放射能ラベルアッセイによってＣｈＡＴ活性の測定を行う。この方法は、Ｓｃｈｏｅｐｐら、Ｊ． Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓ．， ７８：１８３−１９３， １９８９（この教示は本明細書中に組み込む）中に見出し得る。
【００６８】
予想されるように、ＯＶＸ動物では、偽（ｓｈａｍ）操作されたコントロールと比較してＣｈＡＴレベルが＞５０％（ｐ＜０．００１）減少する。
【００６９】
本発明の別の態様では、Ｆ−ＶをＡＣｈＥインヒビターと組み合わせて用いる。ＡＣｈＥインヒビターの使用は、ＡＣｈＥの阻害を介してアセチルコリンの分解をブロックすることによりアセチルコリンのレベルを上昇させる。
【００７０】
良性前立腺過形成（ＢＰＨ）
エストロゲン作用とＢＰＨおよび前立腺癌の処置の間の関連に対する背景に関しては、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９８／０７２７４号（国際公開日：１９９８年１０月１５日）を参照のこと。
【００７１】
以下に記載の実験では、種々のヒト前立腺癌細胞株における、Ｆ−Ｖのエストロゲンレセプターでの結合能を評価する。
【００７２】
５０ｎＭ トリス・ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）、１．５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．４Ｍ ＫＣｌ、１０％ グリセロール、０．５ｍＭ ２−ＭＥおよび１０ｍＭ モリブデン酸ナトリウムを含み、さらにプロテアーゼインヒビターであるペプスタチン（１ｍｇ／ｍＬ）、ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）（２ｍｇ／ｍＬ）、アプロチニン（５ｍｇ／ｍＬ）およびフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ、０．１ｍＭ）を含むＴＥＧ培地（ＴＥＧＰ）中で、ＬＮＣａＰ、ＤＵ−４５およびＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞株の溶解物を調製する。
【００７３】
この細胞溶解物を遠心分離し、ペレットを冷ＴＥＧＰに再懸濁（ＴＥＧＰ １ｍＬ／ペレット １００ｍｇ）し、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｍｏｄｅｌ ４５０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ で３０秒間、超音波破砕（衝撃係数（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ））７０％、出力１．８）する。溶解物を１０，０００×Ｇで４℃で１５分間遠心分離することによってペレット化した後、上清を回収し、すぐに用いるか、あるいは−７０℃で保存する。
【００７４】
競合的結合アッセイ：結合緩衝液は、０．４Ｍ ＫＣｌを５０ｍＭ ＮａＣｌで置換し、オボアルブミン１ｍｇ／ｍＬをさらに加えているＴＥＧである（ＴＥＧＯ）。ＴＥＧＯ中、Ｆ−Ｖを２０ｎＭまで希釈し、これから３倍系列希釈物を調製する。アッセイは、丸底ポリプロリレンマイクロプレート中で３連のマイクロウェルで行う。各ウェルにトリチウム化１７β−エストラジオール（０．５ｎＭ、比活性６０．１ Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＤｕＰｏｎｔ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）３５ｍＬおよび冷却拮抗試験化合物（０．１ｎＭ−５ｍＭ）またはＴＥＧＯ３５ｍＬを入れ、振とうしながら４℃で５分間インキュベートした後、ＭＣＦ−７細胞株溶解物７０ｍＬを入れる。
【００７５】
プレートを４℃で２４時間インキュベートした後、デキストランコーティング炭（ＤＣＣ）７０ｍＬを各ウェルに加え、４℃で８分間激しく攪拌する。次いでこのプレートを１５００×Ｇで１０分間、４℃で遠心分離する。Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｏｂｅｔａ Ｍｏｄｅｌ １４５０ カウンターでのシンチレーションカウント用の柔軟ポリスチレンマイクロプレートに各ウェルから上清を回収する。カウント効率（３５〜４０％）およびバックグラウンドに関して補正した後、放射能を１分あたりの放射能分解（壊変）（ＤＰＭ）として記載する。さらなるコントロールは全カウントおよび全カウント＋ＤＣＣであり、ＤＣＣ抽出可能カウント（ＤＣＣ ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ ｃｏｕｎｔｓ）の下限を規定する。これらの競合的結合アッセイの結果を式：
【数１】
2004512333.tif 000004
を用いて平均結合パーセント（結合％）＋／−標準偏差として表す。
【００７６】
乳癌の予防
本発明はまた、デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）乳癌を発症する危険性のある患者へのＦ−Ｖの投与に関する。本明細書中で用いる用語「デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）」は、正常な乳房細胞の、癌細胞または悪性細胞への形質転換、あるいは変性が、最初の段階では無いことを意味する。このような形質転換は、進化的過程を介して同一細胞あるいは娘細胞の段階で生じるかもしれず、あるいは１回の重要な事象（ｓｉｎｇｌｅ， ｐｉｖｏｔａｌ ｅｖｅｎｔ）において生じるかもしれない。このデノボプロセスは、すでに形質転換した、または悪性細胞の、最初の腫瘍部位から新規な位置への転移、コロニー形成または播種とは対照的なものである。
【００７７】
乳癌を発症する特定の危険性を有さない人は、デノボ乳癌を発症するかもしれず、上記の、該疾患の通常の危険性を有する証拠または疑いを有さず、該疾患を有すると診断されたこともない人である。乳癌の発症に寄与する最も大きな危険因子は、該疾患に罹患したという個人的履歴または、以前の疾患の存在であり、仮にその存在についての証拠がなく、鎮静した場合もあてはまる。別の危険因子は該疾患の家族履歴である。
【００７８】
発癌物質であるＮ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレアの投与によるラットでの乳房腫瘍の誘発は、乳癌の研究に関して非常によく承認されている動物モデルであり、化学的予防薬剤の効果の分析に適切であると見出されている。
【００７９】
２つの別の実験において、５５日齢雌性 Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ラットに、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア５０ｍｇ／体重ｋｇを静脈内投与（研究１）または腹膜内投与（研究２）し、一週間後に種々の量のＦ−Ｖ、（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン塩基（タモキシフェン塩基）またはコントロールを混合した餌を自由摂取させる。
【００８０】
研究１では、６０ｍｇ／食餌１Ｋｇおよび２０ｍｇ／食餌１Ｋｇの食餌投薬を、３および１ｍｇ／試験動物の体重１Ｋｇにおよそ匹敵する投薬であると解釈する。
【００８１】
研究２では、２０、６、２および０．６ｍｇ／食餌１Ｋｇの食餌投薬を、１、０．３、０．１および０．０３ｍｇ／試験動物の体重１Ｋｇにおよそ匹敵する投薬であると解釈する。
【００８２】
週に１度、ラットを毒性の形跡について観察し、体重を測定し、腫瘍形成に関して触診した。１３週間後（研究１）、または１８週間後（研究２）に動物を屠殺し、解剖時に腫瘍を確認し、秤量する。
【００８３】
製剤化
本明細書中で形容詞として用いる用語「医薬（製薬）的（上）」とは、レシピエント哺乳動物に対して実質的に無害であることを意味する。「医薬製剤」とは、キャリア、希釈剤、賦形剤および活性成分が製剤の他の成分と融和性でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならないことを意味する。
【００８４】
好ましくは、Ｆ−Ｖは投与前に製剤化する。製剤の選択は担当医師により、有効量の決定に関与するものと同じ要因を考慮に入れて決定されるべきである。
【００８５】
このような製剤中の活性成分の合計は、製剤の０．１重量％〜９９．９重量％を構成する。好ましくは、製剤中には２種以下の活性成分が含まれる。すなわち、Ｆ−Ｖは、エストロゲン、プロゲスチン、アロマターゼインヒビター、ＬＨＲＨアナログおよびＡＣｈＥインヒビターから選択される第２の活性成分とともに製剤化することが好ましい。最も好ましい製剤は、Ｆ−Ｖが単独の活性成分である製剤である。
【００８６】
周知の、容易に入手可能な成分を用いる当分野に既知の手法により、本発明の医薬製剤を製造する。例えば、単独あるいはエストロゲン、プロゲスチン、アロマターゼインヒビター、ＬＨＲＨアナログまたはＡＣｈＥインヒビター化合物と組み合わせたかのいずれかで、Ｆ−Ｖを一般的な賦形剤、希釈剤またはキャリアと共に製剤化し、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、溶液剤、注射剤、エアロゾル剤、散剤などに成形する。
【００８７】
非経口投与用の本発明の医薬組成物は、滅菌した水性または非水性の液剤、分散剤、懸濁剤または乳剤、および滅菌した散剤を含有し、これは使用直前に滅菌溶液または懸濁液中で再構成される。適切な滅菌した水性および非水性のキャリア、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例には、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール）など）およびそれらの適当な混合物、植物油（例えばオリーブ油）および注射用有機エステル（例えばエチルオレエート）が挙げられる。例えばレシチンのようなコーティング物質を使用することによって、分散液および懸濁液の場合には、適当な粒子サイズを維持することにより、ならびに界面活性剤を用いることにより、適当な流動性を維持する。
【００８８】
また、非経口組成物は、保存剤、湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、乳化剤および分散剤のようなアジュバントを含有していてもよい。抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含ませることにより微生物の作用を確実に予防する。また、等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含ませることも望ましいかもしれない。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより注射用製剤の吸収を延長させてもよい。
【００８９】
いくつかの例では、薬物の効果を延長させるため、皮下または筋肉内注射後の薬物の吸収を遅延させるのが望ましい。これは、水溶性の低い結晶性物質の液状懸濁物の使用、あるいは薬物を油状ビヒクルに溶解あるいは懸濁することによってこれを達成してもよい。水溶性の低い形態の薬物を含む懸濁液の皮下注射または筋肉内注射の場合、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存する。
【００９０】
ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー（共重合体）、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）、当分野に記載されている物質のような生分解性ポリマー中に薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより、Ｆ−Ｖの注射用「デポー（ｄｅｐｏｔ）」製剤を製造する。薬物対ポリマーの比、および特定の用いるポリマーの特徴に依存して、薬物放出の速度を制御することができる。
【００９１】
注射用製剤を、製造時、あるいは（二重チャンバシリンジパッケージ（ｄｕａｌ ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｒｉｎｇｅ ｐａｃｋａｇｅ）の例のように）投与直前の時点のいずれかで、例えば細菌保持フィルターを介してろ過することによって、あるいは混合物の成分を、混合前にあらかじめ滅菌しておくことによって、滅菌する。
【００９２】
経口投与用の固形投薬形態としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が挙げられる。このような固形投薬形態では、Ｆ−Ｖを少なくとも１種の不活性な製薬キャリア（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム）および／または（ａ）充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトースおよびグルコースを含む糖、マンニトールおよびケイ酸、（ｂ）結合剤（例えば、カルボキシメチル−セルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギナート、ゼラチン、ポリ（ビニルピロリジン）、スクロースおよびアカシア）、（ｃ）保湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）（例えば、グリセロール）、（ｄ）崩壊剤（例えば、寒天−寒天、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、ポテトまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩および炭酸ナトリウム）、（ｅ）湿潤化剤（例えば、グリセロール）、（ｆ）溶液遅延剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフィン）、（ｇ）吸収促進剤（例えば、第四アンモニウム化合物）、（ｈ）湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセリン）、（ｉ）吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト土）および（ｊ）滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリ（エチレングリコール）、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物）と混合する。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、投与形態としては、また、緩衝剤を含有し得る。
【００９３】
また、同様のタイプの固形組成物は、ラクトースおよび高分子量ポリ（エチレングリコール）などのような賦形剤を用いてゼラチン軟または硬カプセル剤中に充填物を含ませてもよい。
【００９４】
また、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤のような固形投与剤型は、腸溶性コーティングまたは医薬製剤分野で周知の他のコーティングのようなコーティングあるいは外皮を施して製造することができる。このコーティングには、不透明化物質、または活性成分を消化管の特定の部分で放出させる薬剤、例えば活性成分を胃で放出させるための酸溶解性コーティング、または活性成分を腸管で放出させるための塩基溶解性コーティングが含まれ得る。
【００９５】
また、活性成分を持続放出コーティング内でマイクロカプセル化し、マイクロカプセルをカプセル製剤の丸剤の一部としてもよい。
【００９６】
Ｆ−Ｖの経口投与用液体投薬形態には、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性成分に加えて、液体製剤には、当該分野で一般的に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の製薬的溶媒、溶解剤および乳化剤、例えばエタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油状物（特に、綿実油、アメリカホドイモ（ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ）油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリ（エチレングリコール）、ソルビトールの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物を含有することができる。
【００９７】
不活性希釈剤の他に、また、液体経口製剤は、湿潤化剤、乳化剤および懸濁化剤、ならびに甘味料、矯味矯臭剤、および香料のような添加物を含有してもよい。
【００９８】
液体懸濁剤は、活性成分に加えて、懸濁化剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト土、寒天−寒天およびトラガカントならびにこれらの混合物を含有し得る。
【００９９】
経直腸投与または膣内投与のための組成物は、Ｆ−Ｖを適切な非刺激性賦形剤（例えば、ココア脂、ポリエチレングリコールまたは、室温では固体であるが、体温では液体であり、それゆえ、直腸または膣腔中で溶解して活性成分を放出する、任意の坐薬用ワックス）と混合することにより製造する。化合物を融解したワックスに溶解し、所望の形に成形し、最終坐剤製剤へと固化させる。
【０１００】
また、Ｆ−Ｖはリポソームの形態で投与することができる。当該分野において公知であるように、通常、リポソームはリン脂質または他の脂質基質に由来する。リポソーム製剤は、水性媒体中に分散した単層または多層状の水和型液状結晶によって形成される。任意の非毒性の製薬的で代謝可能な、リポソームを形成し得る脂質を用いることができる。リポソーム形態の本発明の組成物は、Ｆ−Ｖに加えて、安定化剤、賦形剤、保存剤などを含有し得る。好ましい脂質は、天然および合成のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。
【０１０１】
リポソームを形成させる方法は、例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ＸＩＶ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ． （１９７６）、３３頁参照、に記載されている。
【０１０２】
以下の製剤例は単なる例示であり、本発明の範囲を制限することは意図しない。
【０１０３】
製剤例１：
約１０および５０ｍｇのＦ−Ｖを含む各錠剤を以下のように調製することができる：
【表２】
2004512333.tif 000005
成分を混合し、錠剤へと圧縮成形する。
【０１０４】
別法として、Ｆ−Ｖを２．５〜１０００ｍｇ含む各錠剤を以下のように製造する：
製剤２：錠剤
【表３】
2004512333.tif 000006
【０１０５】
Ｆ−Ｖ、デンプンおよびセルロースをＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通し、徹底的に混合する。ポリビニルピロリドンの溶液を得られた散剤と混合し、次いでこれをＮｏ．１４メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。このように製造した顆粒を５０°〜６０℃で乾燥し、Ｎｏ．１８メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通す。次いで、予めＮｏ．６０Ｕ．Ｓ．ふるいに通したカルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクを顆粒に加え、混合後、打錠機で圧縮して錠剤を得る。
【０１０６】
５ｍｌ用量あたり医薬を０．１〜１０００ｍｇ含む各懸濁剤を以下のように製造する。
製剤例３：懸濁剤
【表４】
2004512333.tif 000007
【０１０７】
医薬をＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．ふるいに通し、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびシロップと混合して滑らかなペーストを形成する。安息香酸溶液、香料および着色料を、攪拌しながらいくらかの水を加えて希釈する。次いで十分な水を加えて、必要体積を製造する。
【０１０８】
製剤例４：静脈内液剤
【表５】
2004512333.tif 000008
上記成分の溶液を１分当たり約１ｍＬの速度で患者に静脈内投与する。
【０１０９】
製剤５：システイン塩酸塩を含有する錠剤
重さ約２５０ｍｇであり、約１０ｍｇまたは２０ｍｇのＦ−Ｖを含有するコア錠剤を、通常は以下のようにして製造する。Ｆ−Ｖ、水溶性希釈剤（ラクトース一水和物および無水ラクトース）、および崩壊剤（クロスポビドン）の一部を高剪断造粒機中で混合する。ついで、この混合物を高剪断造粒機中でポビドンおよびポリソルベート８０の水溶液とともに湿潤塊にする。また、システイン塩酸塩を造粒溶液中に溶解し、造粒溶液を介して湿潤塊工程の間に加える。一定の錠剤充填重量を維持するために、ラクトース（ラクトース一水和物および無水ラクトース）の量を、加えたシステイン塩酸塩の量に一致するように減少させる。回転翼粉砕機を用いてのサイズ画分工程の後、顆粒を流動層乾燥機を用いて乾燥させる。乾燥した顆粒を回転翼粉砕機を用いて適切なサイズまで減少させる。残りの成分（微結晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウム、および残りのクロスポビドン）を乾燥した顆粒に加え、ブレンドする。次いで、この混合物を、従来的な回転錠剤プレスを用いて丸型錠剤に圧縮する。これらの各ロットの単位製剤を表２にまとめる。これは各事例で用いた賦形剤の量（ｍｇ／錠剤）およびタイプを示す。表からわかるように、ロットＣおよびＤの錠剤のコアは、市販のエアハンドリングユニットに取り付けた横通風口コーティングパン中での水性分散を介して塗布されるフィルムコーティングの適用を含む。
【０１１０】
表２：錠剤単位処方（ｍｇ／錠剤）
【表６】
2004512333.tif 000009
【０１１１】
製剤例６：メチオニンを含有する錠剤
重さ約２５０ｍｇであり、約１ｍｇのＦ−Ｖを含有するコア錠剤を、通常は以下のようにして製造する。Ｆ−Ｖ、水溶性希釈剤（ラクトース一水和物および無水ラクトース）、および崩壊剤（クロスポビドン）の一部を高剪断造粒機中で混合する。ついで、この混合物を高剪断造粒機中でポビドンおよびポリソルベート８０の水溶液とともに湿潤塊にする。メチオニンもまた、造粒溶液中に溶解し、湿潤塊工程の間に造粒溶液を介して加える。一定の錠剤充填重量を保持するために、ラクトース（ラクトース一水和物および無水ラクトース）の量を、加えた安定化剤の量に一致するように減少させる。回転翼粉砕機を用いての湿潤サイズ画分工程の後、顆粒を流動層乾燥機を用いて乾燥させる。乾燥した顆粒を回転翼粉砕機を用いて適切なサイズまで減少させる。残りの成分（微結晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウム、および残りのクロスポビドン）を乾燥した顆粒に加え、ブレンドする。次いで、この混合物を、従来的な回転錠剤プレスを用いて丸型錠剤に圧縮する。これらの各ロットの単位処方を表３にまとめる。これは各事例で用いた賦形剤の量（ｍｇ／錠剤）およびタイプを示す。
【０１１２】
表３：錠剤単位処方（ｍｇ／錠剤）
【表７】
2004512333.tif 000010
【０１１３】
用量
本発明にしたがって投与するＦ−Ｖの具体的用量は、それぞれの症状を取り巻く具体的な状況によって決定される。これらの状況には、投与経路、患者の以前の病歴、処置される病状または症状、処置される病状／症状の重篤度、ならびに患者の年齢および性別が挙げられる。
【０１１４】
一般に、Ｆ−Ｖの１日当たりの最小有効用量は約１、５、１０、１５または２０ｍｇである。代表的には、最大有効用量は約８００、１００、６０、５０または４０ｍｇである。最も代表的には、投薬量は１５ｍｇから６０ｍｇの範囲にわたる。患者に対する「用量力価判定」の医療分野における標準的実施にしたがい、すなわち、最初に低用量の化合物を投与し、所望の治療効果が観察されるまで用量を徐々に増加させることによって、正確な用量を決定することができる。
【０１１５】
上記の併用治療に関して、患者の用量を力価判定を行うことが必要であるかもしれないが、Ｆ−Ｖ以外の活性成分の代表的な用量は以下の通りである：エチニルエストロゲン（０．０１〜０．０３ｍｇ／日）、メストラノール（０．０５〜０．１５ｍｇ／日）、結合型エストロゲン性ホルモン（例えば、Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標）， Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ； ０．３〜２．５ｍｇ／日）、メドロキシプロゲステロン（２．５〜１０ｍｇ／日）、ノルエチルノドレル（１．０〜１０．０ｍｇ／日）、ノンエチンドロン（ｎｏｎｅｔｈｉｎｄｒｏｎｅ）（０．５〜２．０ｍｇ／日）、アミノグルテミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｍｉｄｅ）（２５０〜１２５０ｍｇ／日、好ましくは１日４回２５０ｍｇ）、アナストラゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）（１〜５ｍｇ／日、好ましくは１日１回１ｍｇ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）（２．５〜１０ｍｇ／日、好ましくは１日１回２．５ｍｇ）、フォルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｅ）（２５０〜１２５０ｍｇ／週、好ましくは週２回２５０ｍｇ）、エクセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）（２５〜１００ｍｇ／日、好ましくは１日１回２５ｍｇ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｌｉｎ）（３〜１５ｍｇ／３月、好ましくは３月ごとに１回３．６〜７．２ｍｇ）およびロイプロリド（３〜１５ｍｇ／月、好ましくは毎月１回３．７５から７．５ｍｇ）。
【０１１６】
投与経路
Ｆ−Ｖは、経口、経直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内および鼻腔内を含む種々の経路によって投与することができる。エストロゲンおよびプロゲスチンベースの各薬剤の投与方法は、当分野に既知であるものと一致している。一般的に、Ｆ−Ｖは、単独、あるいはエストロゲン、プロゲスチンまたはＡＣｈＥインヒビターと組み合わせて、都合のよい製剤中で投与する。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、ヒトおよび他の哺乳動物（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ブタなど）に、経口、経直腸、膣内、非経口、局所、口腔内または舌下または鼻腔内投与してもよい。本明細書中、用語「非経口投与」とは、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内（ｉｎｓｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、皮下または関節内への注射または注入を含む投与様式を意味する。
【０１１８】
投与様式／期間
本発明の方法の多くに関して、Ｆ−Ｖを、連続して、１日１〜３回、あるいは患者に有効量のＦ−Ｖを送達するために必要とされる頻度で投与する。周期的な治療は、特に、子宮内膜症の治療に有用であるかもしれないし、または疾患の痛みを伴う発作時に緊急で使用してもよい。再狭窄の場合には、血管形成術のような医療処置の後、治療を短い（１〜６月）間隔に制限されるかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＦ−Ｖの代表的なＴＧＡトレースである。
【図２】図２はＦ−Ｖの代表的なＤＳＣトレースである。
【図３】図３はＶ型の代表的なＸＲＤパターンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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