(57)【要約】本発明は、炎症プロセスに関与するキナーゼ及び炎症性疾患に陽性の影響を与えるように該キナーゼの機能を調節することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質が、タンパク質の機能の活性剤であるかまたは阻害剤であるかを測定するための方法であって、
該タンパク質が、ＤＨＡＭ−キナーゼであるかまたは対応するＤＨＡＭ−キナーゼの機能を有するＤＨＡＭ−キナーゼの変異体、突然変異体またはフラグメントであり、
該方法が、ＤＨＡＭ−キナーゼまたはＤＨＡＭ−キナーゼの機能を有するＤＨＡＭ−キナーゼの変異体、突然変異体またはフラグメントと、ＤＨＡＭ−キナーゼの所望の機能の阻害剤であるか又は活性剤であるかを試験するための該物質とを接触させ、及び所望の機能が阻害剤であるか又は活性剤であるかを測定することを含む前記方法。
【請求項２】
所望の機能が阻害されているかまたは活性化されているかを直接測定する請求項１記載の方法。
【請求項３】
所望の機能が阻害されているかまたは活性化されているかを間接的に測定する請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＤＨＡＭ−キナーゼが哺乳類のＤＨＡＭ−キナーゼである請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＤＨＡＭ−キナーゼがヒトＤＨＡＭ−キナーゼである請求項４記載の方法。
【請求項６】
分析を、細胞系を使用して行う請求項１記載の方法。
【請求項７】
分析を、無細胞系を使用して行う請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＨＡＭ−キナーゼが、ＰＡＫ２（配列番号４）、ＰＲＫ２（配列番号１０）及びＧＵＫ１（配列番号１２）からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＰＡＫ２（配列番号４）又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＰＲＫ２（配列番号１０）又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
ＧＵＫ１（配列番号１２）又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
該機能が、キナーゼ活性である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該機能が、基質結合である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
機能が、基質を特異的にリン酸化することである請求項１２の方法。
【請求項１５】
マクロファージで発現するＤＨＡＭ−キナーゼのレベルを測定することを含む、ＤＨＡＭ−キナーゼの発現レベルを測定する方法。
【請求項１６】
前記マクロファージが哺乳動物マクロファージである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記マクロファージがヒトマクロファージである請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＨＡＭ−キナーゼが、ＰＡＫ２（配列番号４）； ＰＲＫ２（配列番号１０）及びＧＵＫ１（配列番号１２）からなる群から選ばれる請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
ＰＡＫ２（配列番号４）又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＰＲＫ２（配列番号１０）又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ＧＵＫ１（配列番号１２）又は同じ機能を有する変異体、突然変異体またはそれらのフラグメントを使用する、請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
慢性炎症性気道疾患を診断または監視するための請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
慢性炎症性気道疾患が、慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
分析が、炎症の部位から得られるマクロファージまたはそれらの部分を使用して行われる請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
物質が、あるタンパク質の機能の活性剤であるかまたは阻害剤であるかを測定するための試験系であって、該タンパク質が、ＤＨＡＭ−キナーゼであるかまたは対応するＤＨＡＭ−キナーゼの機能を有するＤＨＡＭ−キナーゼの変異体、突然変異体またはフラグメントである前記試験系。
【請求項２６】
前記ＤＨＡＭ−キナーゼが、ＰＡＫ２（配列番号４）； ＰＲＫ２（配列番号１０）；及びＧＵＫ１（配列番号１２）からなる群から選ばれる請求項２５記載の試験系。
【請求項２７】
ＤＨＡＭ−キナーゼを発現する細胞を含む請求項２５記載の試験系。
【請求項２８】
ＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であると測定された物質。
【請求項２９】
ＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤または阻害剤である、ある疾患を治療するための物質。
【請求項３０】
前記疾患が慢性炎症性気道疾患である請求項２９記載の物質。
【請求項３１】
前記慢性炎症性気道疾患が慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる請求項３０記載の物質。
【請求項３２】
ＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であるかと測定された少なくとも１種の物質を含む医薬組成物。
【請求項３３】
慢性炎症性気道疾患を治療するための医薬組成物を製造するための、ＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であると測定された物質の使用。
【請求項３４】
慢性炎症性気道疾患が慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる請求項３３記載の物質の使用。
【請求項３５】
ＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であると測定された少なくとも１種の物質を含む医薬組成物を、慢性炎症性気道疾患の治療が必要な生物に適当量投与することを含む慢性炎症性気道疾患を治療するための方法。
【請求項３６】
哺乳類を治療するための請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ヒトを治療するための請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる慢性炎症性気道疾患を治療するための請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
ＡＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるかまたは阻害剤であると測定された物質を投与することを含む、マクロファージ中でＤＨＡＭ−キナーゼを選択的に調整するための方法。
【請求項４０】
マクロファージが、慢性炎症性気道疾患に関与する請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
慢性炎症性気道疾患が、慢性気管支炎及びＣＯＰＤからなる群から選ばれる請求項４０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序論
本発明は、炎症過程、特に、マクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の調節の分野に関する。炎症過程は、本発明により炎症過程に関与することが確認されているキナーゼの生物活性に影響を及ぼすことにより調節することができる。
マクロファージが重要な役割を果たす慢性炎症性気道疾患の例は、慢性気管支炎（ＣＢ）である。ＣＢは、気流が制限されているか否かに関わらずに起こり得、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。ＣＢは、以下のいくつかの疾患の症状を含む複雑な疾患である：咳及び粘質過分泌を特徴とする慢性気管支炎、炎症及び気管支周囲線維症を含む末梢気道病変、気腫及び気流制限。ＣＢは、肺機能が加速度的かつ不可逆的に減退することを特徴とする。ＣＢ発症の主要危険因子は、連続的にタバコを喫煙することである。全ての喫煙者の約２０％だけがＣＢに苦しめられるので、遺伝的素因もまた疾患の一因となっていると思われる。
【０００２】
ＣＢの初期段階において最初に起こるのは炎症であり、小気道及び大気道に影響を与える。タバコを喫煙することに引き起こされる刺激が、マクロファージ及び好中球を誘引する。喫煙者の痰ではこれらの数が増加している。絶え間なく喫煙すると、傷害部位に炎症細胞を補充するマクロファージ、好中球及び上皮細胞から媒介物が放出されることにより、肺における進行性炎症性反応となる。これまで、ＣＢの経過を戻すのに利用できる治療がなかった。禁煙により、肺機能の減退を減らすことができる。
現在までに、患者の症状を幾分軽減する薬剤がわずかに知られている。持続性β２−アゴニスト及び抗コリン作用剤を適用すると、一時的に気管支が拡張する。ＬＴＢ４−阻害剤のような炎症性現象に用いるための様々なアンタゴニストが研究されている。
慢性炎症性気道疾患を治療するための薬剤を提供することが常に必要とされている。慢性炎症性気道疾患の原因は、活性化された炎症性免疫細胞、例えばマクロファージにあると考えることができる。それ故、炎症過程の原因を除くよう、マクロファージの機能を調節する薬剤が必要である。
【０００３】
発明の説明
本発明において、炎症過程に関与するマクロファージ、特に慢性炎症性気道疾患に関与するマクロファージ、更に特に慢性気管支炎またはＣＯＰＤに関与するマクロファージが、差別的に発現した核酸配列及びタンパク質発現のパターンを示すことが分かり、これは、健康なドナーまたは炎症を起こしたドナー由来のマクロファージの遺伝子発現のパターンとは異なるものであり、ここで、後者は、活性化状態のマクロファージを含有する。それ故、マクロファージは種々の炎症状態において種々の活性レベルを示す。例えば、本発明において、ＣＯＰＤ喫煙者の炎症過程に含まれるマクロファージは、健康な喫煙者由来のマクロファージとは異なる遺伝子発現パターンを示すことが、つまり、ＣＯＰＤ喫煙者におけるマクロファージが、以下に「活性化過剰」状態と称した、異なる状態を示すことが分かった。本発明により、活性化過剰を維持するか又は活性化過剰に関与するキナーゼを調節する物質を同定することにより、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又は活性化過剰を阻害する可能性を提供する。
【０００４】
本明細書において、用語「慢性炎症性気道疾患」は、例えば、慢性気管支炎（ＣＢ）及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。用語「慢性炎症性気道疾患」がＣＢ及びＣＯＰＤを意味するのが好ましく、ＣＢまたはＣＯＰＤを意味するのがより好ましい。
本発明は、活性化過剰でないマクロファージと比べて活性化過剰マクロファージにおいて差別的に発現する核酸配列の同定に基づく。そのような核酸配列は、炎症過程、好ましくは慢性炎症性気道疾患に関与するマクロファージの活性化過剰状態を維持するか又は活性化過剰状態に関与するキナーゼをコードする。そのような差別的に発現する核酸配列又は該核酸配列にコードされるタンパク質はまた、以下に、それぞれ本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質と命名した。特に、本発明は、差別的に発現する核酸配列及びタンパク質発現パターンに起因する、マクロファージにおける表現型の変化と、炎症過程にマクロファージが関与することとの関連を教示するものであり、従って、種々の用途の根拠（ｂａｓｉｓ）を提供する。例えば、本発明は、本発明のマクロファージタンパク質又は本発明の差別的に発現する核酸配列の発現レベルを測定するための方法及び試験系を提供し、それにより、例えば、哺乳類、好ましくはヒト、特に好ましくは炎症過程に罹っているヒト、特に慢性炎症性気道疾患、特に好ましくは慢性気管支炎又はＣＯＰＤに罹っているヒトにおいて活性化過剰マクロファージに関連する炎症過程の診断又は監視方法を提供する。本発明はまた、本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質により物質を同定する方法であって、該物質が調節をする前記方法に関する。ここで、該物質が調節をするとは、該物質が、本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質に阻害剤又は活性剤として作用し、それによりマクロファージの活性化過剰を阻害するかマクロファージの活性化過剰状態を軽減して慢性炎症過程に陽性の影響を与えることをいう。それにより哺乳類、好ましくは前記疾患に罹っているヒトの治療をすることができる。本発明はまた、マクロファージにおいて本発明の差別的に発現する核酸配列又はタンパク質を選択的に調節する方法であって、該タンパク質又は差別的に発現する核酸配列のモジュレータであると測定された物質を投与することを含む前記方法に関する。本発明は、炎症過程の治療が必要な患者を治療するために前記物質を使用することを含む。
【０００５】
本発明の第一段階において、本発明の差別的に発現する核酸配列は、活性化過剰でないマクロファージと比べて活性化過剰マクロファージにおいて異なる発現パターンを有するものと確認された。簡単のため、特にＣＯＰＤに関与するマクロファージの調査について説明するが、他の慢性炎症性気道疾患、例えば、他の慢性気管支炎症状に罹っている被験者由来のサンプルから同等の結果を得ることができる。異なる発現パターンを調査することにより、以下の実施例で例証するように、炎症過程に関与すマクロファージの活性化状態に応じて発現する、一連の差別的に発現する核酸配列を同定することになる。
【０００６】
簡単に言えば、そのような本発明の差別的に発現する核酸配列は、活性化過剰マクロファージ由来の細胞抽出物又は細胞を使用する、比較発現プロファイリング実験により同定する。すなわち、例えば、ＣＯＰＤにおける炎症部位由来のものと、該疾患に罹っていないが、タバコの煙にさらされているような同様の炎症を起こしている状態にあるコントロールの対応する部位とを比較する。
【０００７】
第二段階において、本発明のタンパク質は、差別的に発現する核酸配列によりコードされるものと確認される。すなわち、活性化過剰を媒介する役割を果たすか又は活性化過剰状態を維持する役割を果たすタンパク質である。本発明の差別的に発現する核酸配列のクラスは、活性化過剰されていないマクロファージにおけるコントロールレベルよりも、低いレベルか又は高いレベルにおいて、本発明により活性化過剰されているマクロファージにおいて発現することを特徴とする、キナーゼのクラスをコードするものであると確認することが出来る。そのような本発明のキナーゼを、以下、ＤＨＡＭ−キナーゼ（“活性化過剰マクロファージにおいて調節解除された（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）”−キナーゼ）と称する。本発明のＤＨＡＭ−キナーゼの好ましい例としては、配列表に記載した、グアニレートキナーゼ１（ＧＵＫ１）、セリン−スレオニン−キナーゼＰＡＫ２、又はセリン−スレオニン−キナーゼＰＲＫ２があげられる。
【０００８】
本発明のＤＨＡＭ−キナーゼの生物学的活性、すなわち、本発明の炎症過程においてマクロファージの関与を媒介することは、例えば、基質リン酸化及び／又は基質認識キナーゼ及び／又は基質結合等の他のＤＨＡＭ−キナーゼ機能に依存する。
本発明はまた、ＤＨＡＭ−キナーゼ、特に既述の好ましいキナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）及びフラグメントに関する。本明細書において、「機能的（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）」とは、それぞれ対応するＤＨＡＭ−キナーゼの、生物学的活性に関与する機能、例えば、基質リン酸化、基質認識及び／又は基質結合を有することを意味する。
【０００９】
本発明により、コントロールレベルよりも低いレベルにおいて発現するＤＨＡＭ−キナーゼの生物学的活性を、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又は活性化過剰を阻害するよう活性化するのが好ましく、コントロールレベルよりも高いレベルで発現するＤＨＡＭ−キナーゼの生物学的活性を、マクロファージの活性化過剰状態を軽減するか又は活性化過剰を阻害するよう阻害するのが好ましい。
本発明の一態様において、本発明は、物質がＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定する試験方法に関する。ＤＨＡＭ−キナーゼは慢性炎症性気道疾患に関与しており、炎症を媒介する役割を果たすので、ＤＨＡＭ−キナーゼの生物学的活性を調節する物質は、慢性炎症性気道疾患を治療するのに使用することもできるし、物質の機能を最適化し、最適化された物質が慢性炎症性気道疾患を治療するのに適当であるようにするためのリード化合物として使用することもできる。本発明の方法を行うために、本発明の試験系を使用することができる。
【００１０】
本発明はまた、物質がＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するための試験系に関する。本発明の方法を行うのに有用な試験系は、細胞系又は無細胞系を含む。例えば、本発明の一態様は、例えば、測定可能な読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）として、レポーター遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子等の発現を使用する、差別的に発現する核酸配列の発現レベルに作用する物質を試験できるように設計された試験系に関する。本発明の別の態様は、天然の又は人工的なものであるが適当なＤＨＡＭ−キナーゼ活性剤により、例えば適当なキナーゼ等により、例えばＤＨＡＭ−キナーゼの酵素活性等の活性化を干渉する物質、又は、例えばＤＨＡＭ−キナーゼの酵素活性等の機能と直接相互作用する物質を試験できるように設計された試験系に関する。
【００１１】
本発明の試験系は、ＤＨＡＭ−キナーゼ又はＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、該タンパク質をコードする核酸又はＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント及び／又は制御要素をコードする核酸を含み、ここでＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント；ＤＨＡＭ−キナーゼをコードする核酸若しくはＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸は、試験する物質と相互作用することができ、直接相互作用することにより、測定可能な読み出しがＤＨＡＭ−キナーゼのそれぞれの生物学的活性の変化を示すか、及び／又はＤＨＡＭ−キナーゼの発現の変化を示す。
【００１２】
本発明の試験系は、例えば、当業界で周知の要素を含む。例えば、無細胞系は、例えば、ＤＨＡＭ−キナーゼ又はＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、ＤＨＡＭ−キナーゼをコードする核酸又はＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸を、溶解形態又は結合形態で、又は細胞区画又は小胞内に含むことができる。適当な細胞系としては、例えば、適当な原核細胞又は真核細胞、例えば、ＤＨＡＭ−キナーゼ又はＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメント、ＤＨＡＭ−キナーゼをコードする核酸又はＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントをコードする核酸を含む原核細胞又は真核細胞があげられる。本発明の前記試験系に使用するのに適当な細胞は、組換え技術により、例えば、所望のＤＨＡＭ−キナーゼ又はＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントを発現するのに適当な組換えベクターで形質転換するか又は形質移入した後に得ることができる。或いは、そのような適当な細胞は、所望のＤＨＡＭ−キナーゼ又はＤＨＡＭ−キナーゼの機能的同等物、誘導体、変異体、突然変異体又はフラグメントを発現する天然原料から単離される細胞又は細胞系であり得る。本発明の試験系は、対象の物質がＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを試験するのが望まれているか又は必要であるとき、ＤＨＡＭ−キナーゼの天然又は人工のリガンドを含むことができる。
【００１３】
本発明の試験方法は、例えば、細胞系を細胞系の表現型を監視するのに使用するとき、読み出しを測定すること、例えば試験系における表現型の変化を測定することを含む。そのような変化は、例えば以下の実施例に詳細に説明するように、ＤＨＡＭ−キナーゼ活性又は阻害に対して起こる細胞の、天然の応答又は人工的な応答における変化であり得る。
本発明の試験方法は、一方では物質が本発明の活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するのに適当な高速処理（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）試験に有用であり得る。また、例えば、高速処理試験において確認されたヒット化合物又はリード化合物の二次試験又は確認にも有用であり得る。
【００１４】
本発明はまた、本発明の方法において本発明のＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤又は阻害剤であると確認された物質に関する。本発明の物質は、本発明のＤＨＡＭ−キナーゼの機能を活性化又は阻害することができる、好ましくは阻害することができる、あらゆる化合物である。ＤＨＡＭ−キナーゼの機能を活性化又は阻害する方法の別の例としては、ＤＨＡＭ−キナーゼの発現レベルに影響を与えることである。ＤＨＡＭ−キナーゼの機能を活性化又は阻害する方法の別の例としては、適用した物質の性質に応じて可逆的又は不可逆的に行うことができる物質をＤＨＡＭ−キナーゼに直接結合させ、それによってＤＨＡＭ−キナーゼの機能的ドメインを活性化するか又は阻止することである。
従って、ＤＨＡＭ−キナーゼの生物学的活性を活性化するか又は阻害するのに有用な物質としては、差別的に発現する核酸配列の発現に作用する物質、例えば、対応する遺伝子又は調節配列とハイブリダイズし、それにより遺伝子発現に影響する核酸フラグメント、又はＤＨＡＭ−キナーゼ自体又は他の天然に発生する細胞成分により活性化又は阻害するのに作用する物質、例えば、本発明のタンパク質に酵素学的に作用する他のタンパク質、例えば、タンパク質キナーゼがあげられる。
【００１５】
それ故、本発明は、例えば、ＤＨＡＭ−キナーゼの遺伝子をコードする核酸配列、又は該核酸配列のフラグメント、誘導体、突然変異体又は変異体である物質であって、該核酸配列又はそのフラグメント、誘導体、突然変異体又は変異体が、遺伝子発現レベルに影響を与えることができる前記物質、例えば、アンチセンス核酸、リボザイムとして適当な核酸分子、又は三重らせん形成に適当な核酸分子に関する。
本発明はまた、例えば、ＤＨＡＭ−キナーゼに直接結合しているか又はＤＨＡＭ−キナーゼの活性化と相互作用し、それによりその生物学的活性に影響を与える有機若しくは無機化合物又は抗体である物質に関する。
【００１６】
更なる観点において、本発明は、ＤＨＡＭ−キナーゼをコードする核酸、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ、又は細胞、好ましくはマクロファージ、より好ましくは炎症部位から単離したマクロファージ、さらにより好ましくは慢性炎症性気道疾患に罹っている被験者の炎症部位から単離したマクロファージにおける本発明のタンパク質自身の発現レベルを測定するための方法に関する。そのような方法は、例えば、物質が本発明の活性剤であるか又は阻害剤であるか測定するための上に概要を示した方法において、差別的に発現する核酸配列発現レベルに物質が影響を与えることができるかどうか試験するのに使用することができる。しかしながら、本発明の発現レベルを測定するための方法はまた、マクロファージの活性化状態を試験するのに、例えば、活性化過剰マクロファージにより引き起こされる疾患の治療の結果を調査するか又は診断するために使用することができる。前記マクロファージは、哺乳類であるのが好ましく、ヒト細胞であるのがより好ましい。従って、本発明のマクロファージは、哺乳類の炎症部位、より好ましくはヒトの炎症部位から得るのが好ましい。従って、本発明はまた、慢性炎症性疾患の診断方法、又は該疾患の監視方法、例えば、マクロファージにおいてＤＨＡＭ−キナーゼをコードする核酸、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ、又はＤＨＡＭ−キナーゼ自身の発現レベルを測定することを含む、慢性炎症性疾患の治療が必要な患者の治療結果を監視する方法に関する。
【００１７】
本発明のタンパク質をコードする核酸、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ、又は本発明のタンパク質自身の発現レベルを測定する方法は、発現レベルの測定目的に応じ、ルシフェラーゼアッセイ等のレポーター遺伝子駆動アッセイを介するか又はハイブリダイゼーション技術を介する各ＲＮＡ転写物の濃度を測定するといった公知の方法により、又はそれぞれの抗体を使用する本発明のタンパク質のタンパク質濃度を測定することにより行うことができる。
本発明はまた、慢性炎症性気道疾患を治療するための本発明の物質の使用に関する。本発明の別の態様は、活性剤又は阻害剤であると測定された本発明の物質の少なくとも１種を含有する医薬組成物に関する。本発明の組成物は、それ自体公知の方法により、例えば、慣用の混合、溶解、粉砕、ドラジェ製造、微粒子化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、粉末化、乳化、カプセル化、包括化（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）又は凍結乾燥方法により製造することができる。
【００１８】
本発明の活性化するか又は阻害する物質を慢性炎症性気道疾患を治療するための薬剤として使用するために、該物質を動物モデルで、例えば、炎症性気道疾患に罹っている動物又は本発明のＤＨＡＭ−キナーゼを発現するトランスジェニック動物で試験することができる。
本発明の物質の毒性及び治療効果は、細胞培養及び動物実験をしてＩＣ５０、ＬＤ５０及びＥＤ５０を測定することを含む、標準的な医薬的方法により測定することができる。得られたデータは、動物、より好ましくはヒトの投与量範囲を見積もるのに使用する。投与量範囲はまた投与形態（錠剤、カプセル、エアゾールスプレー、アンプル等）及び投与ルート（例えば、経皮、経口、口内（ｂｕｃｃａｌ）、点鼻、非経口、吸入、気管内又は直腸）にもまた依存する。
【００１９】
有効成分として本発明の物質の少なくとも１種を含有する医薬組成物は、慣用の方法により処方することができる。そのような組成物の製造方法は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ”に記載されている。本発明の物質の少なくとも１種を処方するのに有用な成分の例は、国際公開公報第９９／１８１９３号パンフレットに記載されている。この文献は本明細書に含まれるものとする。
更なる観点において、本発明は、本発明の慢性炎症性気道疾患を治療する方法に関する。該方法は、慢性炎症性気道疾患の治療が必要な生物、好ましくはヒトに、ＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であるかを測定するための本発明の方法により活性剤であるか又は阻害剤であると測定された少なくとも１種の物質を含有する医薬組成物の適当な量を投与することを含む。
【００２０】
他の態様において、本発明は、本発明のＤＨＡＭ−キナーゼの活性剤であるか又は阻害剤であると測定された物質を投与することを含む、マクロファージにおけるＤＨＡＭ−キナーゼ濃度を選択的に調節する方法に関する。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、限定的に解釈すべきではない。しかしながら、以下の実施例は本発明の最も好ましい態様を示すものである。
【００２１】
実施例
実施例１：比較発現プロファイリング
以下は、本発明のＤＨＡＭ−キナーゼを同定するために、どのようにしたら比較発現プロファイリングを行うことが出来るかを具体的に示すものである。
１．１．  被験者の選択
３群の被験者について研究した：健康な非喫煙者、健康な喫煙者及びＣＯＰＤ患者。
肺機能を評価するために、被験者は肺活量を測定しなければならない。年齢及び身長に基づく簡単な計算を使用して結果を特徴付けた。ＣＯＰＤ患者については、その予測ＦＥＶ１％が＜７０％の者について研究した。健康な喫煙者は、ＣＯＰＤ患者と年齢及び喫煙暦を合わせたが正常な肺機能を有する者である。健康な非喫煙者は、正常な肺機能を有し、これまで喫煙したことがない。健康な非喫煙者の群は、喘息を除外するためメタコリン挑戦（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を有する。この方法は、各投与間で肺活量を測定することにより、被験者に投与するメタコリン量を増やすことを必要とする。ＦＥＶ１が２０％低下したとき、試験を中止し、ＰＣ２０を計算する。これがＦＥＶ１を２０％低下させるメタコリンの投与量に相当する。喘息が存在しない証拠として、３２より大きい値を必要とする。全被験者は通常のアレルゲンに対する皮膚プリックテストをし、陰性の結果を有することを必要とする。これによりアトピー性の個体を除く。被験者の病歴を監視し、付随する（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）疾患を除外した。
【００２２】
１．２． ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ））方法
ＢＡＬ前にミダゾラムを投与して被験者を落ち着かせた。局所麻酔スプレーを使用して咽頭の裏に麻酔をした。７ｍｍ オリンパス気管支鏡を使用した。洗浄領域は右側中央部の突出部（ｌｏｂｅ）である。２５０ｍｌの滅菌生理食塩水を点滴し（ｉｎｓｔｉｌｌ）、直ぐに吸引した。得られた吸引液はマクロファージを含有した。
１．３． ＢＡＬ処理
滅菌ガーゼを通してＢＡＬを濾過し、細片を除去した。該細胞をＨＢＳＳ中で２回洗浄し、１ｍｌ ＨＢＳＳ （Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に再懸濁し、計測した。マクロファージを引き出して、１５ ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ ｂｌｕｅ−ｃａｐ ポリプロピレンを使用してペレットにし、１０，０００，０００細胞当たり１ ｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ試薬濃度においてＴｒｉｚｏｌ 試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、次いで、−７０℃において凍結した。
【００２３】
１．４．  差別的（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）遺伝子発現分析
全ＲＮＡを、実施例１．３により得たマクロファージサンプルから抽出した。ピペットを通してＴｒｉｚｏｌ中細胞懸濁液をホモジナイズし、室温で５分間インキュベートした。Ｔｒｉｚｏｌ １ｍＬ当たり２００μＬのクロロホルムを添加し、該混合物を注意深く１５秒間混合し、室温で３分以上インキュベートした。サンプルを４℃において、１５分間１００００ｇでスピンした。上相を新しい反応チューブに移し、室温で１０分間、Ｔｒｉｚｏｌ １ｍＬ当たり０．５ ｍｌのイソプロパノールを添加することによりＲＮＡを沈殿させた。次いで、４℃において１００００ｇで１０分間ミクロ遠心分離器を使用することにより該沈殿物をペレット状にし、該ペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、風乾し、及びＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏに再懸濁した。
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）によりＲＮＡの洗浄を行い、ＲＮＡの純度を上げた。ＲＮＡの純度は、アガロースゲル電気泳動により測定し、濃度は２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収により測定した。
【００２４】
５μｇの各ＲＮＡをｃＤＮＡ合成に使用した。第一及び第二ストランド合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ ｓｙｓｔｅｍ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により行った。総体積１１μＬのＲＮＡ及び１μＬの１００μＭ Ｔ７−（ｄｔ）２４プライマー中で、配列番号１に記載の配列を７０℃まで１０分間加熱し、氷上で２分間冷却した。最終濃度の１倍（１×）にするための第一ストランド溶液、濃度１０ ｍＭにするためのＤＴＴ及び最終濃度０．５ｍＭにするためのｄＮＴＰ混合物を、総体積１８μＬに添加した。該反応混合物を４２℃において２分間インキュベートし、２μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ 逆転写酵素（２００ Ｕ／μＬ）を添加した。第二ストランドを合成するため、１．１５ｘ第二ストランド溶液、２３０μＭ ｄＮＴＰｓ、１０Ｕ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ リガーゼ（１０Ｕ／μＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ポリメラーゼ（１０ Ｕ／μＬ）， ＲＮａｓｅ Ｈ （２Ｕ／μＬ）を含有する１３０μＬの混合物を、第一ストランド合成の反応に加え、ピペットで注意深く混合した。１６℃において２時間第二ストランド合成を行い、次いで２μＬのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）を添加し、１６℃で５分間インキュベートし、１０μＬの０．５ Ｍ ＥＤＴＡを添加することにより、反応を停止した。
【００２５】
ｃＲＮＡ合成の前に、二本鎖ｃＤＮＡを精製した。該ｃＤＮＡを等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）と混合し、未結合のヌクレオチドからｃＤＮＡを分離するために、ミクロ遠心分離中で相ロック（ｌｏｃｋ）ゲル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のゲルマトリックスによりスピンした。水相を酢酸アンモニウム及びエタノールで沈殿させた。続いて、ｃＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に使用した。製造業者（ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の手順に従いＥＮＺＯ ＢｉｏＡｒｒａｙ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔを使用してｃＲＮＡ合成を行った。簡単に説明すると、ｃＤＮＡを、総体積４０μＬの１ｘ ＨＹ 反応溶液、１×ビオチンラベルしたリボヌクレオチド、１ｘ ＤＴＴ、１ｘ Ｒｎａｓｅ阻害剤混合物及び１ｘ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと共に３７℃で５時間インキュベートした。次いで、該反応混合物をＲｎｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を通して精製し、酢酸アンモニウム及びエタノールでｃＲＮＡを沈殿させ、最後にＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。２６０ｎｍにおいてＵＶ分光器により濃度を測定した。残りのｃＤＮＡを１ｘ 断片化緩衝液（５ｘ断片化緩衝液：２００ｍＭ 酢酸トリス、ｐＨ ８．１、 ５００ ｍＭ ＫＯＡｃ、１５０ ｍＭ ＭｇＯＡｃ）と共に９４℃において３５分間インキュベートした。
【００２６】
ＤＮＡチップをハイブリダイズするために、１５μｇのｃＲＮＡを使用し、総体積３００μＬの５０ｐＭビオチンラベルしたコントロールＢ２ オリゴヌクレオチド、配列番号２に示した配列、１ｘ ｃＲＮＡカクテル、０．１ｍｇ／ｍｌ ｈｅｒｒｉｎｇ 精子ＤＮＡ、０．５ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、１ｘ ＭＥＳ （２−［Ｎ−モルホリノ］−エタンスルホン酸）ハイブリダイゼーション溶液と混合した。該ハイブリダイゼーション混合物を９９℃まで５分間混合し、４５℃に１０分間で冷却し、２００μＬの混合物を使用してプローブ配列に満たした。４５℃において６０ｒｐｍで１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、チップ上のハイブリダイゼーション混合物を、３００μＬの非ストリンジェント洗浄液（１００ ｍＭ ＭＥＳ， １００ ｍＭ ＮａＣｌ， ０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）と置換した。このチップをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｆｌｕｉｄｉｃｓステーションに挿入し、ＥｕｋＧＥ−ＷＳ２手順により洗浄及び染色した。チップ当たりの染色溶液は、６００μＬの１ｘ 染色液（１００ ｍＭ ＭＥＳ， １ Ｍ ＮａＣｌ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌ ＳＡＰＥ （ストレプトアビジンフィコエリトリン） （Ｄｉａｎｏｖａ）を含有し、抗体溶液は、１ｘ染色液、２ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ ｍｇ／ｍｌ ヤギＩｇＧ， ３μｇ／ｍｌ ビオチニル化抗体を含有した。洗浄及び染色処理後、チップをＨＰ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ （Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）でスキャンした。
【００２７】
データ分析は、ＣＯＰＤ喫煙者から単離したＲＮＡでハイブリダイズしたチップと、健康な喫煙者から単離したＲＮＡでハイブリダイズしたチップとの比較により行った。
以下に、差別的に発現した遺伝子及び本発明の方法により確認したその機能を具体的に示す。
【００２８】
実施例２： ＰＡＫ２
ＣＯＰＤ患者において下方制御していると一貫して確認されている遺伝子は、ＰＡＫ２ （配列番号３， ４）をコードする。ＰＡＫ２は、活性化Ｃｄｃ４２及びＲａｃと優先的に相互作用するが、Ｒｈｏとは相互作用しないセリン／スレオニンキナーゼである。この組合せ（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により、ＰＡＫ２の自己リン酸化及びそのキナーゼ活性の活性化を引き起こす。ＰＡＫ２は、ミオシンＩＩ、ＭＬＣＫ （ミオシン軽鎖キナーゼ）、ｐ４７ｐｈｏｘ （ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）、及びＲａｆ−１をリン酸化することができる。ＰＡＫ２は、アクチン再編成（ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）及び細胞運動に関与する（Ｋｎａｕｓ ｅｔ ａｌ． １９９５， Ｆｒｏｓｔ ｅｔ ａｌ． １９９６， Ｇｏｅｃｋｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０００， Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０００）。
ＰＡＫ２は、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者では、一貫して下方制御であることが分かった（４７％）。これを、“ａｖｇ ｄｉｆｆ”値（表１）及び“倍（ｆｏｌｄ）変化”値（表２）に示した。ＣＯＰＤ喫煙者と健康な喫煙者を含む２つの別々の群のｐ値は０．００１及び０．００４であった。
【００２９】
【表１】
2004516837.tif 000002
【００３０】
【表２】
2004516837.tif 000003
２．１． ＰＡＫ２のクローニング
健康なボランティアから単離したヒトＰＭＮｓ （多形核好中球）から抽出した全ＲＮＡから、ＰＡＫ２をクローン化した。５μｇ ＲＮＡを、オリゴ（ｄｔ）１８プライマー、１ｘ第一ストランド緩衝液、１０ ｍＭ ＤＴＴ、０．５ ｍＭ ｄＮＴＰｓ及び２Ｕ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により４２℃において５０分間ｃＤＮＡに逆転写した。次いで、７０℃、１５分間で該反応を終了し、ｃＤＮＡ濃度をＵＶ分光光度計で測定した。ＰＡＫ２を増幅させるために、ＰＡＫ２用の配列特異性プライマー（配列番号５の前（ｆｏｒｗａｒｄ）プライマー及び配列番号６の逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー）１０ｐｍｏｌｅｓ及びｃＤＮＡ１００ｎｇをＰＣＲに使用した。反応条件は以下の通りである：９４℃で２分間、９４℃で３０秒間を３５サイクル、５３℃で３０秒、７２℃で９０秒、次いでＴａｑ ＤＮＡ−ポリメラーゼにより７２℃で７分間。反応混合物を２％アガロースゲルで分離し、約１０００ｂｐのバンドを切断し、ＱＩＡＥＸ ＩＩ 抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。精製したバンドの濃度を測定し、約１２０ｎｇを、３００ｎｇのｐＤＯＮＲ２０１、Ｇａｔｅｗａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のドナーベクター、１ｘ ＢＰクローナーゼ（ｃｌｏｎａｓｅ）反応緩衝液、Ｂｐクローナーゼ酵素混合物（総体積２０μＬ）と共に、２５℃で６０分間インキュベートした。次いで、反応物を２μＬのプロテイナーゼＫと共にインキュベートし、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、該反応混合物をコンピテントＤＢ３．１細胞に電気穿孔し、カナマイシン含有プレートで培養した。配列決定によりクローンを確認した。データベースに入れた配列と同じ配列（ａｃｃ． Ｕ２４１５３）を有する、ｐＤＯＮＲ−ＰＡＫ２と命名したクローンを次の実験に使用した。
【００３１】
２．２ ＰＡＫ２発現ベクター
上述したＰＡＫ２含有ベクターを使用して、ＣＭＶプロモータの制御下でＰＡＫ２が発現する、Ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の“ａｔｔＲ１”及び“ａｔｔＲ２”組換え部位を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ａｔｔＲにＰＡＫ２用ｃＤＮＡを移した。１５０ｎｇの“エントリーベクター”ｐＤＯＮＲ−ＰＡＫ２を、ＴＥ（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）で２０μＬにした、１５０ｎｇの“目的（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）ベクター”ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ａｔｔＲ、４μＬのＬＲ クローナーゼ酵素混合物及び４μＬのＬＲ クローナーゼ反応緩衝液と共に混合し、２５℃で６０分間インキュベートした。次いで、２μＬのプロテイナーゼＫ溶液を添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。氷上で３０分間、ＤＮＡと共に細胞をインキュベートした後、４２℃で３０秒間熱ショックを与えることにより、１μＬの反応混合物を５０μＬのＤＨ５αに形質転換した。細胞に熱ショックを与えた後、４５０μＬのＳ．Ｏ．Ｃ．を添加し、３７℃で６０分間細胞をインキュベートした。細胞（１００μＬ）を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、一晩インキュベートした。
【００３２】
挿入物としてＰＡＫ２と共にｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ａｔｔＲを含有するコロニーをｐｃＤＮＡ／ＰＡＫ２と命名し、形質移入研究に使用した。
ＰＡＫ２の恒常的に活性な突然変異体で同様のクローニング反応を行った。この突然変異体は、ヌクレオチドＡＣＣ（コード領域の位置１４２０−１４２２）とＧＡＡとを置換することにより生成した。それにより、４６１位におけるアミノ酸スレオニンを、グルタミン酸と置換した。該クローンをｐｃＤＮＡ／ＰＡＫ２Ｔ４６１Ｅと呼ぶ。
【００３３】
２．３． ＰＡＫ２用のＭｙｃで標識した（ｔａｇｇｅｄ）発現ベクター
ＰＡＫ２のＣ末端をＭｙｃで標識したものを生成するために、停止コドンを欠くＰＡＫ２のコード配列を、配列番号７の前プライマー及び配列番号８の逆プライマーで、上述した反応条件によりＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、１％アガロースゲルで分離し、切断し、及びＱＩＡＥＸ ＩＩ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。次いで、該生成物をフレーム内でｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローン化し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化した。同様に、ＰＡＫ２の恒常的に活性な突然変異体のクローニング配列を、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓにクローン化した。
【００３４】
２．４．Ｍｙｃで標識化したＰＡＫ２の精製
Ｍｙｃで標識化したＰＡＫ２を免疫沈降するために、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ （Ｄｙｎａｌ）に結合している抗ｍｙｃマウスモノクローナル抗体（９Ｅ１０） （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。緩衝液Ａ （２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ８、０．２ ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ ｍＭ ＫＣｌ）中、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡの存在下、１０分間、ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を予備インキュベートした。ビーズを２回洗浄し、インキュベート前と同体積の緩衝液Ａ中に再懸濁した。５μｇの抗ｍｙｃ抗体及び５０μＬのダイナビーズＭ−２８０と共に室温で２時間クローニングを行った。次いで、５００μＬのＲＩＰＡ緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ８、１４０ ｍＭ ＮａＣｌ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ、１％デオキシコーレート）で３回洗浄し、次いで緩衝液Ａで２回洗浄した。更に、４℃で２時間、Ｍｙｃで標識化したＰＡＫ２を含有する３００μＬの細胞内可溶質（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）抽出物と共にビーズをインキュベートした。磁気装置でビーズを集め、氷冷したキナーゼ緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、１ ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ ｍＭ β−メルカプトエタノール、脱リン酸酵素阻害剤（５０ ｍＭ ＮａＦ、５ ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７、２ ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０ ｎＭ オカダ酸）及びタンパク質分解酵素阻害剤（４０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、４０μｇ／ｍｌペプスタイン、４０μｇ／ｍｌ アプロチニン、５００μＭ ＰＭＳＦ （フェニルメチルスルホニルフルオライド）で４回洗浄した。
【００３５】
２．５． ＰＡＫ２構築物によるＴＨＰ−１細胞の形質移入
５％ ＣＯ２で加湿した雰囲気中、３７℃において、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ ｍＭ グルタミン及び１ｘ 非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンを入れた１０％ ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中でＴＨＰ−１細胞を増殖させた。ＴＨＰ−１細胞を新しく継代培養した２−５ｘ１０５細胞を３５ｍｍペトリ皿に培養体積２ｍＬで接種した。
６μＬ ＦｕＧｅｎｅ６ （Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を１００μＬの血清無含有培地に添加し、室温で５分間平衡させた。次いで、２μｇの精製したｐｃＤＮＡ／ＰＡＫ２又はｐｃＤＮＡ／ＰＡＫ２Ｔ４６１Ｅを、予め希釈したＦｕＧｅｎｅ６溶液に添加し、穏やかに混合し、さらに室温で１５分間インキュベートした。次いで、ＦｕＧｅｎｅ６／ＤＮＡ溶液を細胞に滴下し、培地を撹拌することにより均等に分配した。２４時間後、該培地を２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含有する培地と交換した。
【００３６】
ＰＡＫ２又はＰＡＫ２Ｔ４６１Ｅを発現する安定なクローンを生成するために、４８時間後、室温で５分間５００×ｇで細胞をスピンした。該培地を吸引し、ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳ、２ ｍＭ グルタミン、１００ Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン及び２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８と交換した。その後５日間毎日交換し、死細胞及び細片を洗浄した。３９４ウェルプレートに有限的に希釈することにより単一コロニーを単離した。単一クローンを拡大させ、幾つかのクローンにおいてＰＡＫ２特異性抗体（クローンＶ−１９， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によりＰＡＫ２の発現を試験した。
【００３７】
２．６． ＰＡＫ２の自己リン酸化
活性化Ｃｄｃ４２によりＰＡＫ２の自己リン酸化を誘発した。それ故、５００ｎｇのＣｄｃ４２を１８０μＭ ＧＴＰγＳ （Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で１０分間３０℃で予備的に負荷をかけた（ｐｒｅｌｏａｄ）。自己リン酸化のため、５００ｎｇのｍｙｃで標識化したＰＡＫ２又はＰＡＫ２Ｔ４６１Ｅを、反応容積２０μＬで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ （１０００ ｃｐｍ／ｐｍｏｌ） （Ａｍｅｒｓｈａｍ）中でインキュベートした。濃度範囲０．５〜３００ｎＭの本発明の物質及び５００ｎｇのＧＴＰγＳ−負荷Ｃｄｃ４２を添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。１０ｍｌのトリクロロ酢酸（３０％）を添加することにより該反応を停止し、Ｐａｃｋａｒｄ細胞ハーベスター上、ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）で濾過した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭβ−メルカプトエタノールで２回洗浄した。３０μＬのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔカクテル（Ｐａｃｋａｒｄ）を添加した後、フィルター結合放射能を、マイクロプレートシンチレーションカウンターで計測した。
【００３８】
２．７．  ヒストンｈ４のリン酸化
ＰＡＫ２を活性化するために、ＰＡＫ２を活性化Ｃｄｃ４２で誘発した。それ故、５００ｎｇのＣｄｃ４２を、１８０μＭ ＧＴＰγＳ （Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）により３０℃において１０分間予備的に負荷をかけた。自己リン酸化のため、５００ｎｇのｍｙｃで標識化したＰＡＫ２又はＰＡＫ２Ｔ４６１Ｅを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ （１０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ） （Ａｍｅｒｓｈａｍ）中、反応容積２０μＬでインキュベートした。５００ｎｇのＧＴＰγＳで負荷をかけたＣｄｃ４２、２０ｍｇヒストンｈ４（Ｓｉｇｍａ）及び本発明の物質を０．５〜３００ｎＭの範囲の濃度で添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。２ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加することにより反応を停止し、該反応混合物を１２％ ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル （Ｂｉｏｒａｄ）上で分離した。ヒストンｈ４に導入した放射能を、蛍光物質イメージング（Ｓｔｏｒｍ ８６０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により測定した。
【００３９】
２．８．  キナーゼ活性についてのＳＰＡアッセイ（シンチレーション近接アッセイ（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ａｓｓａｙ））
３８４ウェルプレート（Ｐａｃｋａｒｄ Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ， 白色， 平底， 製造番号． ６００５２１４）でＳＰＡアッセイを行った。Ｎ末端にビオチンを有するヒストンを組換えＰＡＫ２の基質として使用した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ ０．１ ｍＭ ＥＧＴＡ ／ ０．１％ ２−メルカプトエタノール／ １０ｍＭ ステアリン酸マグネシウム／０．１ｍＭ ＡＴＰ／ｐＨ ７．５中で酵素ストックを、−８０℃においてアリコートで保存した。
方法：
３８４ウェルプレートにおいて、脱塩水中１０μＬの試験化合物（５％ ＤＭＳＯ含有、最終濃度１％）を、１５μＬのＰＡＫ２（１ Ｕ／ｍｌ μＭ； ｆ．ｃ． ０．３ Ｕ／ｍｌ）と酵素希釈緩衝液（１ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ／ ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ ０．１ ｍＭ ＥＧＴＡ／ ０．１％ ２−メルカプトエタノール／ ｐＨ ７．５）中で混合し、室温で１５分間インキュベートした。“陰性”コントロール（１００％ ＣＴＬ、酵素活性を阻害していないもの）として、試験化合物を上述の混合物から除いた。“陽性”コントロール（０％ ＣＴＬ、完全に酵素活性を阻害したもの）として、試験化合物をスタウロスポリン（１００μＭ， ｆ．ｃ． ２０ μＭ）と置換した。ビオチニル化ヒストン（１．５μＭ， ｆ．ｃ． ０．７５μＭ）及びγ３３ＰでラベルしたＡＴＰ （０．１７μＣｉ／ウェル）を２５μＬの２×キナーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ １０ｍＭ β−グリセロホスフェート／４ｍＭ ジチオスレイトール／２００μＭバナジン酸ナトリウム／２０ｍＭ ＭｇＣｌ２／ｐＨ７．５）に添加した。次いで、該プレートを室温で２時間インキュベートした。インキュベート時間終了後、０．１ｍｇ／ウェルのＬＥＡＤシーカーストレプトアビジンで被覆したポリスチレンビーズを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ ｍＭ ＥＤＴＡ／１００μＭ 冷ＡＴＰを含有する３０μＬの溶液に添加した。室温で１時間インキュベーション後、該プレートを５００ｇで１分間遠心分離にかけた。各アッセイミクロ滴定プレートは、上述した“陰性”及び“陽性”コントロールを含むウェルを含有した。データ分析は、“陽性”コントロールを減じた後、“陰性”コントロールのシンチレーションと比較した、試験化合物中に存在するシンチレーションのパーセンテージを計算することにより行った：
％ＣＴＬ＝（シンチレーション（サンプル）−シンチレーション（“陽性”コントロール））×１００／（シンチレーション（“陰性”コントロール）−シンチレーション（“陽性”コントロール）
ＰＡＫ２酵素の阻害剤では、１００ ％ＣＴＬ （阻害せず）と０ ％ＣＴＬ （完全に阻害）の間の値が得られると思われる。１００ ％ＣＴＬより大きい値は通常、アロステリック制御等の化合物特異性物理化学的性質又は間接的生化学的性質と関連する。
【００４０】
２．９． ＰＡＫ２による表現型効果／細胞効果
以下のアッセイは、ＰＡＫ２又はＰＡＫ２／Ｔ４６１Ｅで過渡的に又は安定的に形質移入されている細胞系ＴＨＰ−１ （Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．， １９８０）又はＭｏｎｏＭａｃ ６ （Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８８）で行い、読出した情報を、形質移入したようにみせかけた細胞と比較した。また、ＰＡＫ２の活性を刺激する本発明の物質を添加した。
サイトカインの製造及び放出
単球／マクロファージ細胞系を、２．５〜５ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度で、１０ｎＭ ＰＭＡ、２０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、２０μｇ／ｍｌ ＬＰＳ （サルモネラミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｓｏｔａ）Ｒｅ５９５由来）等、種々の刺激で刺激した。０、１、３、６、１２、２４、４８及び７２時間後に細胞を捕集し、更に研究するために上澄みを凍結し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１４３ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む４００μＬのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）中に再懸濁し、ＤＮＡを２０ｇの針で少なくとも５回切断し、−７０℃で保存した。
【００４１】
煙リッチ培地により、タバコの煙による細胞刺激を行った。サプリメント無含有１００ｍＬ ＲＰＭＩ培地を、２本のタバコの煙で灌流した。タバコの煙を５０ｍＬシリンジ中に引き（タバコ１本当たり５０ｍＬ体積の約２０体積）、次いで培地中に灌流した。その後、培地のｐＨを７．４に調整し、０．２μｍフィルタを通して培地を濾過滅菌（ｆｉｌｔｅｒｓｔｅｒｉｌｉｚｅ）した。細胞を煙リッチ培地に再懸濁し、１ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度で、３７℃で１０分間インキュベートした。次いで細胞をＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、上述した時間でフラスコ又は２４ウェルプレート（ＭｏｎｏＭａｃ６）に播種した。
全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）により、製造業者の手順に従い単離した。精製したＲＮＡをＴａｑＭａｎ分析に使用した。サイトカインＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−８及びＩＬ−６の発現レベルを測定した。
【００４２】
分泌したサイトカインの検出
培養及び刺激した細胞の上澄み中のタンパク質を、最終濃度が１０％になるまで三塩素酸（ＴＣＡ）を添加することにより沈殿させた。沈殿物を８０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁した。ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定し、各サンプル５０μｇを１２％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにかけた。ゲルをＰＶＤＦ膜上にブロットし、ＴＢＳＴ中５％ＢＳＡ中で１時間ブロックし、商業的に入手可能な、ヒトＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−８及びＩＬ−６に対する抗体と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで洗浄後、セイヨウワサビパーオキシダーゼに結合している抗ヒトＩｇＧと共にブロットをインキュベートし、再度洗浄し、ＥＣＬ化学ルミネッセンスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で展開した。バンドの強度をＢｉｏＭａｘ Ｘ線フィルム（コダック）で可視化し、濃度計で定量した。
【００４３】
分泌したマトリックス金属プロテアーゼ及び他のプロテアーゼの検出
サイトカインについて使用した方法と同じ方法を使用した。ウエスタンブロットに使用した抗体は、ヒトＭＭＰ−１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−１２にあわない。
分泌したマトリックス金属プロテアーゼの活性
蛍光物質を使用してプロテアーゼ活性を測定した。刺激した細胞と未刺激の細胞とから単離した上澄み（既述のもの）を、総体積５０μＬで、１μＭの基質（Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ （ＥＤＡＮＳ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ２ （Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ））と共に５分間室温でインキュベートした。反応当たり１２５ｎｇの精製したＭＭＰ−１２で陽性コントロールを行った。励起３２０ｎｍ及び発光４０５ｎｍにおいて蛍光光度分析によりプロテアーゼ活性を測定した。
【００４４】
タンパク質分解活性及び細胞遊走を測定するための別のアッセイにおいて、走化性（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバを使用した。チャンバの上方部分のウェルにおいて、細胞（ウェル当たり１０５細胞）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の８μｍ層で被覆したフィルター上に置いた。区画の下方部分で、ＭＣＰ−１ （１０ｎｇ／ｍｌ）、ロイコトリエンＢ４ （１０ｎｇ／ｍｌ）等の化学遊走物質を培地に添加した。５日後フィルターを除き、Ｍａｔｒｉｇｅｌを通り抜けてきた、下面の細胞を、メタノールで固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色キット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）で染色し、光学顕微鏡により高性能視野（４００ｘ）で３回（ｉｎ ｔｈｒｅｅ）カウントした。
【００４５】
走化性アッセイ
走化性を測定するために、４８ウェルの走化性（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバ（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）を使用した。細胞を、２４時間、ＦＣＳ無含有ＲＰＭＩ培地中で飢えさせた。化学遊走物質（５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−８、１０ｎｇ／ｍｌ ＭＣＰ−１、１０ｎＭ ｌｉｐｏｘｉｎ Ａ４）及び本発明の物質を、ＦＣＳ無含有ＲＰＭＩ培地中で希釈し、３０μＬを下方区画のウェルと置換した。ポリカーボネートフィルター（孔径８μｍ）で上方区画を下方区画から離した。５０μＬの細胞懸濁液（５ ｘ１０４）を上方区画のウェルに置いた。該チャンバを、５％ＣＯ２で加湿した雰囲気中、３７℃で５時間インキュベートした。次いで、フィルターを除き、上面の細胞をこすり落とし、下面の細胞をメタノール中で５分間固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色セット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）で染色した。遊走した細胞を光学顕微鏡により高性能視野（４００ｘ）で３回カウントした。
【００４６】
粘着アッセイ
細胞を捕集し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ及び１μＭ ＢＣＥＣＦ（（２’−７’−ビス−（カルボキシエチル）−５（６’）−カルボキシフルオレセインアセトキシメチル）エステル、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に再懸濁し（４ｘ１０６／ｍｌ）、３７℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、０．１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に再懸濁した（３．３ｘ １０６／ｍｌ）。３ｘ１０５ 細胞（９０μＬ）を、ラミニン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で被覆した９６ウェルの平底プレートの各ウェルに添加し、１０分間放置した。本発明の物質を添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、３７℃で２０分間プレートをインキュベートした。０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、粘着細胞を１００μＬの０．０２５Ｍ ＮａＯＨ及び０．１％ ＳＤＳで可溶化した。蛍光測定により定量した。
【００４７】
食作用
細胞懸濁液（２．５ｘ１０４ 細胞／ｍｌ）を、５ｍｌのＵ９３７又はＴＨＰ−１と共に６ウェルプレートに播種するか、又は２ｍｌのＭｏｎｏＭａｃ６と共に２４ウェルプレートに播種し、本発明の物質の存在下、５％ＣＯ２で加湿した雰囲気中、３７℃で１時間インキュベートした。熱により不活性化したＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ （２０酵母／細胞）の分散懸濁溶液４０μＬを各ウェルに添加した。細胞を３時間より長くインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞遠心分離した（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）。サイトスピン調製物をＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、食菌した粒子を光学顕微鏡によりカウントした。
【００４８】
実施例３：ＰＡＫ２
同定した別の遺伝子によりＰＡＫ２（配列番号９，１０）をコードした。ＰＡＫ２は、プロテインキナーゼのＰＫＣクラスに関連するセリン／スレオニンキナーゼである。ＰＡＫ２は小さいＧＴＰａｓｅｓ Ｒａｃ及びＲｈｏＡの下流エフェクターであり、細胞運動の過程に関与すると思われる（Ｖｉｎｃｅｎｔ ａｎｄ Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ １９９７）。
ＰＡＫ２は、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者において一貫して下方制御（５４．８％）であることが分かった。これは、“ａｖｇ ｄｉｆｆ”値（表３）に示した。ＣＯＰＤ喫煙者と健康な喫煙者との間で比較したｐ値は０．０２である。
【００４９】
【表３】
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【００５０】
実施例２．９と類似の方法で、ＰＡＫ２の代わりにＰＲＫ２でアッセイした。
実施例４：ＧＵＫ１
同定した別の遺伝子は、グアニレートキナーゼ１（ＧＵＫ１；配列番号１１，１２）である。グアニレートキナーゼ１は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）又はｄＧＭＰへリン酸塩が移行するのを触媒する。この酵素はｃＧＭＰの回収において機能し、それ故、シグナル伝達経路へのグアニンヌクレオチドの供給を制御すると考えられる（Ｂｒａｄｙ ｅｔ ａｌ． １９９６）。
ＧＵＫ１は、健康な喫煙者と比較してＣＯＰＤ喫煙者において一貫して上方制御（５２％）であることが分かった。これは、“倍変化”（ＦＣ）値（表４）に示した。ＣＯＰＤ喫煙者と健康な喫煙者とを比較した２つの別々の群のｐ値は０．０２と０．１７であった。
【００５１】
【表４】
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実施例２．９と類似の方法で、ＰＡＫ２の代わりにＧＵＫ１でアッセイした。
Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ：
ＰＡＫ２
Ｋｎａｕｓ， Ｕ．Ｇ．， Ｍｏｒｒｉｓ， Ｓ．， Ｄｏｎｇ， Ｈ．−Ｊ．， Ｃｈｅｒｎｏｆｆ， Ｊ．， ａｎｄ Ｂｏｋｏｃｈ， Ｇ．Ｍ． （１９９５）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９， ２２１−２２３．
Ｆｒｏｓｔ， Ｊ．Ａ．， Ｘｕ， Ｓ．， Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ， Ｍ．Ｒ．， Ｍａｒｃｕｓ， Ｓ．， ａｎｄ Ｃｏｂｂ， Ｍ．Ｈ． （１９９６）． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６， ３７０７−３７１３．
Ｇｏｅｃｋｅｌｅｒ， Ｚ．Ｍ．， Ｍａｓａｒａｃｃｈｉａ， Ｒ．Ａ．， Ｚｅｎｇ， Ｑ．， Ｃｈｅｗ， Ｔ．−Ｌ．， Ｇａｌｌａｇｈｅｒ， Ｐ．， ａｎｄ Ｗｙｓｏｌｍｅｒｓｋｉ， Ｒ．Ｂ． （２０００）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， １８３６６−１８３７４．
Ｚｅｎｇ， Ｑ．， Ｌａｇｕｎｏｆｆ， Ｄ．， Ｍａｓａｒａｃｃｈｉａ， Ｒ．， Ｇｏｅｃｋｅｌｅｒ， Ｚ．， Ｃｏｔｅ， Ｇ．， ａｎｄ Ｗｙｓｏｌｍｅｒｓｋｉ， Ｒ． （２０００）． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １１３， ４７１−４８２．
ＰＲＫ２
Ｖｉｎｃｅｎｔ， Ｓ．， ａｎｄ Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ， Ｊ． （１９９７）． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７， ２２４７−２２５６．
ＧＵＫ１
Ｂｒａｄｙ， Ｗ．Ａ．， Ｋｏｋｏｒｉｓ， Ｍ．Ｓ．， Ｆｉｔｚｇｉｂｂｏｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｂｌａｃｋ， Ｍ．Ｅ． （１９９６）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １６７３４−１６７４０．
Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ
Ｔｓｕｃｈｉｙａ， Ｓ．， Ｙａｍａｂｅ， Ｍ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｙ．， Ｋｏｎｎｏ， Ｔ．， ａｎｄ Ｔａｄａ， Ｋ． （１９８０） Ｉｎｔ．Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２６， １７１−１７６．
Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ， Ｈ．Ｗ．， Ｔｈｉｅｌ， Ｅ．， Ｆｕｔｔｅｒｅｒ， Ａ．， Ｈｅｒｚｏｇ， Ｖ．， Ｗｉｒｔｚ， Ａ．， ａｎｄ Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ， Ｇ． （１９８８） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１， ４５６−４６１
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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