(57)【要約】本発明はプロテインキナーゼ活性の測定方法を提供する。この方法は、（ａ）ＡＴＰおよび試験されるプロテインキナーゼを含む第１の溶液と、試験される前記キナーゼの非存在下でＡＴＰを含む第２の溶液とを提供すること、（ｂ）試験されるプロテインキナーゼによってリン酸化され得る基質をステップ（ａ）の第１の溶液および第２の溶液に加えること、（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された反応混合物のそれぞれにおけるＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度あるいはその経時的変化速度を、生物発光反応を使用して測定すること、そして（ｄ）ＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度に関する情報を使用して、試験されるプロテインキナーゼの活性を決定することを含む。本発明の方法およびキットの１つの具体的な利点は、一般的なプロテインキナーゼ活性試験、すなわち、１つのプロテインキナーゼまたはその基質に対して特異的でない試験が提供されるということである。
2004518422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインキナーゼ活性を測定するための方法であって、
（ａ）ＡＴＰおよび試験されるプロテインキナーゼを含む第１の溶液と、試験される前記キナーゼの非存在下でＡＴＰを含む第２の溶液とを提供すること、
（ｂ）試験されるプロテインキナーゼによってリン酸化され得る基質をステップ（ａ）の第１の溶液および第２の溶液に加えること、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された反応混合物のそれぞれにおけるＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度あるいはその経時的変化速度を、生物発光反応を使用して測定すること、そして
（ｄ）ＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度に関する情報を使用して、試験されるプロテインキナーゼの活性を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
プロテインキナーゼの活性を調節する化合物を識別するための方法であって、
（ａ）ＡＴＰ、プロテインキナーゼおよび試験される化合物を含む第１の溶液と、試験される前記化合物の非存在下でＡＴＰおよびプロテインキナーゼを含む第２の溶液とを提供すること、
（ｂ）プロテインキナーゼによってリン酸化され得る基質をステップ（ａ）の第１の溶液および第２の溶液に加えること、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された反応混合物のそれぞれにおけるＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度あるいはその経時的変化速度を、生物発光反応を使用して測定すること、
（ｄ）ＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度に関する情報を使用して、第１の溶液および第２の溶液におけるプロテインキナーゼの活性を決定すること、
（ｅ）プロテインキナーゼを調節する化合物を識別するために、第１の溶液におけるプロテインキナーゼの活性を第２の溶液におけるプロテインキナーゼの活性と比較し、それにより、第１の溶液におけるプロテインキナーゼの活性が第２の溶液におけるプロテインキナーゼの活性と異なる場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの調節因子として識別されること
を含む方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）の第１の溶液および第２の溶液が実質的に細胞を含まない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性よりも低い場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの阻害剤として識別される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性の５０％未満である場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの阻害剤として識別される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性よりも大きい場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの活性化剤として識別される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性よりも少なくとも５０％大きい場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの活性化剤として識別される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）からステップ（ｄ）までを、異なるキナーゼおよびその対応する基質を毎回使用して１回またはそれ以上繰り返すことをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
キナーゼがステップ（ａ）に先立って活性化される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）の第１の溶液および第２の溶液が緩衝液を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
緩衝液がＨｅｐｅｓ緩衝液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）〜ステップ（ｃ）が連続して行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）において基質が加えられた後、反応混合物が、ステップ（ｃ）の前に、室温において１時間反応させられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）において形成された反応混合物に、キナーゼと基質との反応を停止させる試薬を加える追加のステップ（ｂ´）が、ステップ（ｂ）の後であってステップ（ｃ）の前に行われることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
停止試薬が、リン酸、ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ´）において形成された混合物のｐＨをｐＨ７．０に調節する追加のステップ（ｂ¨）が、ステップ（ｂ´）の後であってステップ（ｃ）の前に行われることを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ¨）が、Ｈｅｐｅｓ緩衝液を加えることを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）が同時に行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）が、
（ｉ）ルシフェリンまたはその誘導体およびルシフェラーゼを含む生物発光試薬を前記反応混合物に加えること（ただし、前記ルシフェリンまたはその誘導体はＡＴＰ存在下のルシフェラーゼとの生物発光反応で光を発する）、ならびに
（ｉｉ）生じた生物発光反応によって放射される光の強度またはその経時的変化をＡＴＰ濃度を基準として測定すること、
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｃ）が、ステップ（ｉｉ）において測定される光の強度が実質的に一定のレベルに達した後に行われる下記のステップ：
（ｉｉｉ）ＡＤＰをＡＴＰに変換する試薬を加えること、
（ｉｖ）ルシフェリンまたはその誘導体およびルシフェラーゼを含む生物発光試薬をステップ（ｉｉｉ）の前記反応混合物に加えること、および
（ｖ）生じる生物発光反応によって放射される光の強度を測定すること、
をさらに含み、
ステップ（ｖ）における光の強度とステップ（ｉｉ）における光の定常状態での強度との差がステップ（ｉｉ）の反応混合物におけるＡＤＰ濃度の測定値である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
キナーゼがＪＮＫ−１であり、基質がＧＳＴ−ｃ−ｊｕｎである、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
キナーゼがＭＡＰキナーゼ−１（ＥＲＫ−１）であり、基質がミエリン塩基性タンパク質である、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
キナーゼがＭＡＰキナーゼ−２（ＥＲＫ−２）であり、基質がミエリン塩基性タンパク質である、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
キナーゼがＰＫＡであり、基質がＫｅｍｐｔｉｄｅである、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
キナーゼがＪＮＫ−２であり、基質がＧＳＴ−ｃ−ｊｕｎである、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
キナーゼがＭＥＫ−１であり、基質が不活性型ＭＡＰキナーゼ−２（ＥＲＫ−２）である、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
キナーゼがＪＮＫ２α２であり、基質がＡＴＦ−２である、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
キナーゼがＪＮＫ２α２であり、基質がｃ−ｊｕｎである、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
キナーゼがＳＡＰＫ−３であり、基質がミエリン塩基性タンパク質である、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
キナーゼがＳＡＰＫ−４であり、基質がミエリン塩基性タンパク質である、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
キナーゼがｒａｆ−１であり、基質が不活性型ＭＥＫ−１である、請求項２から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２から３１のいずれか一項に記載の方法を使用して識別される化合物。
【請求項３３】
（ａ）ルシフェリンまたはその誘導体およびルシフェラーゼを含む生物発光試薬であって、前記のルシフェリンまたはその誘導体がＡＴＰ存在下のルシフェラーゼとの生物発光反応で光を発する生物発光試薬、
（ｂ）キナーゼ、
（ｃ）前記キナーゼによってリン酸化され得る基質、および
（ｄ）ＡＴＰ
を含む、請求項２に記載の方法において使用されるキット。
【請求項３４】
生物発光試薬、キナーゼ、基質および／またはＡＴＰを再構成または希釈または溶解するための１つまたは２つ以上の緩衝液をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記キナーゼと前記基質との反応を停止させることができる試薬をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
ＡＤＰをＡＴＰに変換する１つまたは２つ以上の試薬をさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３７】
ＡＤＰをＡＴＰに変換する試薬がピルビン酸キナーゼおよびホスホエノールピルビン酸を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
２つ以上の異なるキナーゼおよびそれらの基質をさらに含む、請求項３３から３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
１つまたは複数の試薬が凍結乾燥形態で提供される、請求項３３から３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
マルチウエル・マイクロタイター・プレートをさらに含む、請求項３３から３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
マルチウエル・マイクロタイター・プレートが９６個以上のウエルを含有する、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
実施例１から１３を参照して実質的には本明細書中に記載されるような、無細胞系においてプロテインキナーゼ活性を測定するための方法。
【請求項４３】
実施例１４を参照して実質的には本明細書中に記載されるような、プロテインキナーゼの活性を調節する化合物を識別するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼ活性を検出するための方法およびそのような方法を行うためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、広範囲の様々な細胞事象の調節において非常に重要な役割を果たしている。これらの酵素は、リン酸残基を細胞内ポリペプチドにおける特定のアミノ酸に転移することによって作用して、これらのタンパク質基質の活性化をもたらし、そして細胞の増殖および分化および分裂を含む一連の活性化制御事象を始動させる。様々なプロテインキナーゼが腫瘍生物学の分野で広範囲に研究されている。細胞内のキナーゼの活性が制御されないことにより、腫瘍の形成がもたらされると考えられている。製薬業界は、広範囲の様々な腫瘍の処置を助けるために、これらのキナーゼを標的とする薬物の探索を絶えず行っている。少なくとも１２００個のプロテインキナーゼが細胞機能の調節に関与している。それらは膜酵素および細胞質ゾル酵素として存在し、セリン、トレオニンおよびチロシンのアミノ酸残基をリン酸化する。これらの基質特異性に基づいて、キナーゼは、セリン／トレオニンキナーゼおよびチロシンキナーゼの２つのグループに分けられる。これにより、リン酸基を受け取り、それをタンパク質／ペプチドに結合させるこれらのタンパク質の能力に注目する多数の技術が開発されている。
【０００３】
非常に広く使用されている技術の１つが、３２Ｐまたは３３Ｐのいずれかのγ−リン酸を利用する放射性同位体法である。活性なキナーゼが存在する場合、標識されたリン酸はＡＴＰからタンパク質基質またはペプチド基質に転移される。これらのアッセイは、高比活性に標識されたＡＴＰの存在下で行う必要がある。これは、非標識ＡＴＰの濃度をマイクロモーラーの濃度範囲内に保つことから生じる。また、必要とされる感度を達成するためにも、ペプチド基質は高濃度（５μＭ〜２０μＭ）で使用されなければならない。得られるリンタンパク質における増大した放射能を、その後、ホスホセルロース紙に捕捉した後、シンチレーション・カウンターを使用して検出することができる。
【０００４】
他の方法には、様々な免疫沈殿法が含まれる。これらのアッセイを行っているとき、キナーゼと、ＡＴＰと、基質との反応が進行させられ、その後、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液などの緩衝液を使用して停止させられる。その後、タンパク質が、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動を使用して泳動される。その後、ゲルはニトロセルロース膜にブロットされ、そして選ばれたリン酸化アミノ酸に対する抗体を使用して、リン酸化された基質に対してプローブされる。リン酸化されたバンドの存在を、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化された二次抗体を使用し、その後、化学発光検出システムを使用し、そして写真フィルムへの感光によって可視化することができる。しかし、放射性同位体アッセイの代替として提案されてきた方法の多くの場合のように、上記のウエスタン・ブロッティング技術は感度がなく、極めて手間がかかる。
【０００５】
生物発光または化学発光のいずれかによる発光検出の使用により、非常に高感度な検出システムが可能になる。Ｌｅｈｅｌ他（１９９７、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４４、３４０〜３４６）は、プロテインキナーゼ活性を検出するために化学発光によるマイクロタイター・プレート・アッセイの使用を報告した。このアッセイは、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートに捕捉されるビオチン化基質ペプチドをモノクローナル抗体とともに使用することに基づいている。著者らは、アッセイを開発するためにプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を選んだが、選ばれたプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ、受容体相互作用タンパク質およびｓｒｃの活性に関する結果も信頼できることを見出した。これらのアッセイは、阻害剤の存在下および非存在下、２０μＭのＡＴＰおよび目的のキナーゼの存在下で行われた。キナーゼ反応は、完了するまで行われた。次いで、プレートは洗浄され、その後、抗体との結合、そして西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化された二次抗体による化学発光検出が行われ、化学発光が、Ｔｒｏｐｉｘ（登録商標）（米国）化学発光基質キットを使用して測定された。このアッセイは、依然として、特異的な基質が利用できることに頼っており、そしてまた生じたリンタンパク質に対する抗体にも頼っている。
【０００６】
利用されている別の方法は、マイクロチップに基づく技術を採用することである。Ｃｏｈｅｎ他（１９９９、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７３、８９〜９７）は、フォトリソグラフィー技術に基づくＰＫＡ用アッセイを報告した。蛍光標識されたペプチド基質および生成物のチップ上での電気泳動分離を行うことにより、リン酸基のＡＴＰからヘプタペプチド（Ｋｅｍｐｔｉｄｅ）のセリン残基への移動を測定することができる。この技術は、ＰＫＡ活性を検出するために開発されていた。
【０００７】
Ｅｕ他（１９９９、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７１、１６８〜１７６）は、生物発光によるＡＴＰの測定が、尿試料中に存在する基質（ガラクトース）の量に関連する方法を記載する。
【０００８】
Ｓａｌａ−ＮｅｗｂｙおよびＣａｍｐｂｅｌｌ（１９９２、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３０７、２４１〜２４４）は、プロテインキナーゼＡ認識部位ＲＲＦＳを含有し、かつ天然ルシフェラーゼのＣ末端ペルオキシソーム・シグナルを含まないように操作されたホタル・ルシフェラーゼの使用を記載する。この変異ルシフェラーゼは、ＣＯＳ細胞において発現させられ、それらの細胞における環状ＡＭＰによるプロテインキナーゼＡの活性化を検出および定量するために使用された。
【０００９】
上記の方法は、環状ＡＭＰによるプロテインキナーゼＡの活性化についてだけ有用であるので、極めて特異的であることが理解される。従って、この方法は、特異的な酵素およびそれが反応する基質に基づく上記に記載されたプロテインキナーゼ検出システムと同じ問題に悩まされる。
【００１０】
キナーゼ・ファミリーまたはリン酸化されるアミノ酸残基にかかわりなくキナーゼ活性を測定することができるアッセイは存在しない。これは、現在利用可能な方法はすべて、特異的な酵素および関与する基質に注目しているという事実のためである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ある１つのプロテインキナーゼに対して特異的でなく、むしろ、広範囲のプロテインキナーゼの活性を測定する一般的な手段として使用することができる、プロテインキナーゼ活性の測定方法を提供しようとするものである。
【００１２】
本発明により、プロテインキナーゼ活性を測定するための方法で、
（ａ）ＡＴＰおよび試験されるプロテインキナーゼを含む第１の溶液と、試験される前記プロテインキナーゼの非存在下でＡＴＰを含む第２の溶液とを提供すること、
（ｂ）試験されるプロテインキナーゼによってリン酸化され得る基質をステップ（ａ）の第１の溶液および第２の溶液に加えること、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された反応混合物のそれぞれにおけるＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度あるいはその経時的変化速度を、生物発光反応を使用して測定すること、そして
（ｄ）ＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度に関する情報を使用して、試験されるプロテインキナーゼの活性を決定すること
を含む方法が提供される。
【００１３】
キナーゼは、好ましくは、リン酸化によってステップ（ａ）に先立って活性化される。キナーゼは、非常に複雑な細胞内シグナル変換カスケードに関与している。アゴニストが細胞膜の受容体に結合したとき、多数のリン酸化事象が非常に迅速に開始される。休止細胞では、多数のキナーゼがその不活性型の形態にあり、したがって、これらの酵素がそれらの基質をリン酸化することができるためには、リン酸化されることが必要である。ドミノ様の作用によって、経路の成分の１つが活性化されると、シグナルの大きな増幅がもたらされることがある。例えば、Ｒａｆは、ＭＥＫ（ＭＡＰＫキナーゼ）をリン酸化および活性化するセリン／トレオニンキナーゼである。一方、ＭＥＫは、チロシン残基およびトレオニン残基をリン酸化することによってＭＡＰＫ（Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２）を活性化する二重チロシン／トレオニンキナーゼである。これらのＭＡＰＫは、次に、その基質（すなわち、ミエリン塩基性タンパク質）をリン酸化することができるように活性化される。
【００１４】
市販のキナーゼは、（供給者によって既にリン酸化された）その活性型形態で、またはその不活性型形態で得ることができる。後者は、シグナル伝達経路内のそれよりも上流に位置する別のキナーゼによるリン酸化を必要とする。
【００１５】
本発明の方法は、特定タイプのキナーゼ（すなわち、セリン／トレオニン対チロシン）に対して選択的ではないので、例えば、ＭＥＫがＥｒｋ−１をリン酸化し、その後、Ｅｒｋ−１がミエリン塩基性タンパク質をリン酸化するときに見られるＡＴＰの減少を測定することによって、特定の経路におけるすべてのキナーゼの段階毎の活性化をモニターするために使用することができる。
【００１６】
本発明の第２の態様により、プロテインキナーゼの活性を調節する化合物を識別するための方法で、
（ａ）ＡＴＰおよびプロテインキナーゼおよび試験される化合物を含む第１の溶液と、試験される前記化合物の非存在下でＡＴＰおよびプロテインキナーゼを含む第２の溶液とを提供すること、
（ｂ）プロテインキナーゼによってリン酸化され得る基質をステップ（ａ）の第１の溶液および第２の溶液に加えること、
（ｃ）ステップ（ｂ）において形成された反応混合物のそれぞれにおけるＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度あるいはその経時的変化速度を、生物発光反応を使用して測定すること、
（ｄ）ＡＴＰおよび／またはＡＤＰの濃度に関する情報を使用して、第１の溶液および第２の溶液におけるプロテインキナーゼの活性を決定すること、
（ｅ）プロテインキナーゼの活性を調節する化合物を識別するために、第１の溶液におけるプロテインキナーゼの活性を第２の溶液におけるプロテインキナーゼの活性と比較し、それにより、第１の溶液におけるプロテインキナーゼの活性が第２の溶液におけるプロテインキナーゼの活性と異なる場合、試験される化合物がプロテインキナーゼの調節因子として識別されること
を含む方法が提供される。
【００１７】
本発明の方法において使用される例示的なキナーゼ／基質の組合せには、ＪＮＫ−１／ｃ−ｊｕｎ、ＪＮＫ−２／ｃ−ｊｕｎ、ＭＡＰキナーゼ−１（ＥＲＫ−１）／ミエリン塩基性タンパク、ＭＡＰキナーゼ−２（ＥＲＫ−２）／ミエリン塩基性タンパク、ＰＫＡ／Ｋｅｍｐｔｉｄｅ、ＭＥＫ−１／不活性型ＭＡＰキナーゼ−２（ＥＲＫ−２）、ＪＮＫ２α２／ＡＴＦ−２、ＪＮＫ２α２／ｃ−ｊｕｎ、ＳＡＰＫ−３／ミエリン塩基性タンパク質、ＳＡＰＫ−４／ミエリン塩基性タンパク質、およびｒａｆ−１／不活性型ＭＥＫ−１が含まれる。
【００１８】
「調節する」によって、プロテインキナーゼの活性が試験化合物の存在下で増大または低下または妨害／阻害されるという意味が包含される。従って、本発明の方法は、化合物がプロテインキナーゼの阻害剤または活性化剤であるかどうかを決定するために使用することができる。
【００１９】
試験される化合物は、第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性よりも低い場合、プロテインキナーゼの阻害剤として識別される。好ましくは、試験される化合物は、第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性の９０％未満である場合、プロテインキナーゼの阻害剤として識別される。より好ましくは、試験される化合物は、第１の溶液におけるキナーゼの活性が、第２の溶液におけるキナーゼの活性の８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満または１０％未満である場合、プロテインキナーゼの阻害剤として識別される。最も好ましくは、試験される化合物は、第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性の５０％未満である場合、プロテインキナーゼの阻害剤として識別される。
【００２０】
同様に、試験される化合物は、第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性よりも大きい場合、プロテインキナーゼの活性化剤として識別される。好ましくは、試験される化合物は、第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性よりも１０％より大きい場合、プロテインキナーゼの活性化剤として識別される。より好ましくは、試験される化合物は、第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性よりも２０％より大きい場合、または３０％より大きい場合、または４０％より大きい場合、または５０％より大きい場合、または７５％より大きい場合、または１００％より大きい場合、または２００％より大きい場合、プロテインキナーゼの活性化剤として識別される。最も好ましくは、試験される化合物は、第１の溶液におけるキナーゼの活性が第２の溶液におけるキナーゼの活性よりも少なくとも５０％大きい場合、プロテインキナーゼの活性化剤として識別される。
【００２１】
好都合には、本発明の方法のステップ（ａ）の第１の溶液および第２の溶液は実質的に細胞を含まない。
【００２２】
本発明の第２の態様による方法のステップ（ａ）〜ステップ（ｄ）は、異なるキナーゼおよびその対応する基質を毎回使用して１回またはそれ以上繰り返すことができる。
【００２３】
プロテインキナーゼの活性を増大させる化合物は、医学において、特にガンの研究において有用性を見出すことでき、そして治療剤として有用であり得る。プロテインキナーゼの活性を低下または妨害／阻害する化合物もまた、そのような適用において有用性を見出すことができる。
【００２４】
好ましくは、ステップ（ａ）の第１の溶液および第２の溶液は緩衝液を含み、好都合にはＨｅｐｅｓ緩衝液を含む。
【００２５】
好都合には、ステップ（ａ）〜ステップ（ｃ）は連続して行われる。
【００２６】
ステップ（ｂ）において基質が加えられた後、反応は、ステップ（ｃ）に先立って、様々な期間および様々な温度で行わせることができることが当業者によって理解される。好都合には、ステップ（ｂ）において基質が加えられた後、反応混合物は、ステップ（ｃ）に先立って、３０℃で１０分間反応させられる。便宜的には、ステップ（ｂ）において基質が加えられた後、反応混合物は、ステップ（ｃ）に先立って、３０℃で１０分間または室温で１時間反応させられる。
【００２７】
好ましくは、本発明の方法のステップ（ｃ）は、
（ｉ）ルシフェリンまたはその誘導体およびルシフェラーゼを含む生物発光試薬を前記反応混合物に加えること（ただし、前記のルシフェリンまたはその誘導体はＡＴＰの存在下でのルシフェラーゼとの生物発光反応において光を発する）、そして
（ｉｉ）生じる生物発光反応によって放射される光の強度またはその経時的変化をＡＴＰ濃度の測定値として測定すること、
を含む。
【００２８】
ステップ（ｃ）の生物発光試薬はルシフェリン／ルシフェラーゼの一般的なタイプのいずれでも可能である。活性な基質はＤ−ルシフェリンまたはその誘導体である。米国特許第５，３７４，５３４号には、本発明の方法においてルシフェラーゼとともに使用され得るＤ−ルシフェリン誘導体が開示される。任意の他の誘導体を使用することができる。
【００２９】
ルシフェラーゼ酵素は、好ましくは、天然物から、特にホタルから、最も具体的にはＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（ホタル）から得られる。しかし、ルシフェラーゼの供給源は、生物発酵反応においてルシフェリン（またはその誘導体）およびＡＴＰと反応する限り、重要ではない。例には、Ｌｕｃｉｃｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ（ゲンジボタル）、Ｄｉｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．およびＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ  ｓｐｐ．から得られるルシフェラーゼがある。
【００３０】
合成ルシフェラーゼ（例えば、組換えルシフェラーゼ）を本発明において使用することができる。これは、Ｄｅｖｉｎｅ他（１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１１７３、１２１〜１３２）によって記載され、そして欧州特許第０３０１５４１号および米国特許第５，５８３，０２４号において記載される。
【００３１】
変異ルシフェラーゼもまた本発明の方法において使用することができる（下記参照）。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、ステップ（ｂ）において形成された反応混合物に、キナーゼと基質との反応を停止させる試薬を加えるさらなるステップ（ｂ´）が、ステップ（ｂ）の後、ステップ（ｃ）の前に行われることを含む。
【００３３】
多数の酸が、停止試薬としての使用に好適であり、例えば、リン酸などの、実験室で広く使用されている酸が好適である。あるいは、高濃度のＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを用いることができる。ルシフェラーゼは、ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡの作用に対する抵抗性が他の酵素よりも大きく、高濃度のこれらの塩のもとでの反応効率は、変異ルシフェラーゼ酵素の使用によって増大する。さらに、酵素反応を停止させるための他の知られている緩衝液はどれも使用することができる。
【００３４】
停止試薬は、好ましくは、リン酸、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡである。
【００３５】
停止試薬の使用は、非常に多数の試料を試験に先立って作製し、貯蔵することができるので、特に好都合である。この特徴は、本発明の方法のハイ・スループット適用（下記参照）のためには特に望ましい。
【００３６】
この好ましい実施形態の方法は、好都合には、ステップ（ｂ´）において形成された混合物のｐＨを、ルシフェラーゼ酵素が活性であるｐＨに、通常的にはｐＨ７．０に調節するさらなるステップ（ｂ¨）が、ステップ（ｂ´）の後、ステップ（ｃ）の前に行われることを含む。好ましくは、ステップ（ｂ¨）は、Ｈｅｐｅｓ緩衝液を加えることを含む。
【００３７】
ｐＨを調節するステップは、停止試薬を加えた後の溶液のｐＨで、必要とする活性を保持する変異ルシフェラーゼの使用によって回避することができる。２５℃以上ではあまり活性でない野生型ルシフェラーゼではなく、３０℃で活性であるルシフェラーゼを用いることもまた有用である。熱安定性のルシフェラーゼ変異体を使用することのさらなる利点は、高い温度に対するその耐性に加えて、酵素内の重要なアミノ酸が、低いｐＨおよび高塩溶液に対する耐性を含む、酵素の性能を高める他の有利な性質をもたらすように変異され得るということである。従って、これらの性質は、停止液が使用される場合、有益である。
【００３８】
好適な変異ルシフェラーゼをＫｉｋｋｏｍａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（キッコーマン（株）バイオケミカル事業部、日本）から得ることができる。
【００３９】
本発明の方法における使用に好適な他の例示的な変異ルシフェラーゼが、Ｗｈｉｔｅ他（１９９６）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、３１９、３４３〜３５０；Ｓｑｕｉｒｒｅｌ他（１９９７）、Ｊ．  Ｄｅｆｅｎｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２、２９２〜２９７；ＫａｒｐおよびＯｋｅｒ−Ｂｌｏｍ（１９９９）、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１６、１０１〜１０４；Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ他（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８、１３２２３〜１３２３０；Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ他（２０００）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９、５４３３〜５４４０；Ｔａｔｓｕｍｉ他（１９９６）、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２４３、１７６〜１８０；国際特許出願公開ＷＯ９８／４６７２９、同ＷＯ９６／２２３７６、同ＷＯ９９／０２６９７、欧州特許ＥＰ０４４９６２１Ｂ、米国特許第５，３３０，９０６号、米国特許第６，０７４，８５９号および国際特許出願公開ＷＯ９５／１８８５３に開示されている。
【００４０】
好都合には、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｉｉ）において測定される光の強度が実質的に一定のレベルに達した後に行われる下記のステップ：
（ｉｉｉ）ＡＤＰをＡＴＰに変換する試薬を加えること、
（ｉｖ）ルシフェリンまたはその誘導体およびルシフェラーゼを含む生物発光試薬をステップ（ｉｉｉ）の前記反応混合物に加えること、そして
（ｖ）生じる生物発光反応によって放射される光の強度を測定すること、
をさらに含み、この場合、ステップ（ｖ）における光の強度とステップ（ｉｉ）における光の定常状態での強度との差がステップ（ｉｉ）の反応混合物におけるＡＤＰ濃度の測定値である。
【００４１】
「実質的に一定の」により、光の強度が、光強度の測定を行うために要されるのと同じ時間で大きく変化しないという意味が包含される。非限定的な例として、この用語は、放射された光の強度の変化割合が１分あたり５％未満であり、好ましくは１分あたり３％未満であるという意味を包含することが意図される。いずれの場合においても、当業者は、ＡＴＰベースラインにおける何らかの小さい変化によって大きく影響を受けないＡＤＰ変換試薬を添加することによって産生されるＡＴＰの有効な読み取り値を得ることができるようにレベルが十分に一定しているかどうかを評価することができる。
【００４２】
代わりの好ましい実施形態において、ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）は同時に行われる。
【００４３】
さらなる態様により、本発明は、本発明の方法を使用して識別される化合物を提供する。
【００４４】
本発明の方法は、ハイ・スループット・スクリーニングを行うために、すなわち、薬学的製造物に対するリード物質を得るために非常に多数の化学合成物および天然由来産物をスクリーニングするために好適であることが当業者によって理解される。そのようなスクリーニング・アッセイにおいて、化合物は、マイクロタイター・プレート技術を使用するスクリーニングのためにグループ化することができる。
【００４５】
従って、本発明の方法は、９６ウエル・プレート形式に加えて、３８４ウエル・プレートおよび１５３６ウエル・プレートと一緒に小容量で行うことができる。実験室ロボットが使用されるこれらの状況のもとでは、アッセイは非常に多数のプレートにおいて調製される。その後、アッセイは、注入器を伴うルミノメーターの中にプレートを移すためにロボットを使用して行うことができ、そしてアッセイを上記のように行うことができる。
【００４６】
別の選択肢が、生物発光反応から生じる光の「輝き」の半減期が長いことによりもたらされる。反応がプラトー状態に達すると、放射光の強度は実質的に一定の状態になる。これにより、生物発光試薬を回分様式でプレートに加えることができ、したがって、プレートは、試薬を添加した３時間後〜４時間後でさえ読み取ることができる。
【００４７】
本発明はさらに、本発明の第２の態様の方法において使用されるキットを提供する。このキットは、
（ａ）ルシフェリンまたはその誘導体およびルシフェラーゼを含む生物発光試薬で、前記のルシフェリンまたはその誘導体がＡＴＰの存在下でのルシフェラーゼとの生物発光反応において光を発する生物発光試薬、
（ｂ）キナーゼ、
（ｃ）前記キナーゼによってリン酸化され得る基質、および
（ｄ）ＡＴＰ
を含む。
【００４８】
キットは、好都合には、生物発光試薬、キナーゼ、基質および／またはＡＴＰを再構成または希釈または溶解するための１つまたは２つ以上の緩衝液をさらに含む。
【００４９】
キットはまた、前記キナーゼと前記基質との反応を停止させることができる試薬（例えば、リン酸）をさらに含むことができる。
【００５０】
本発明によるキットは、ピルビン酸キナーゼおよびホスホエノールピルビン酸を含む試薬などの、ＡＤＰをＡＴＰに変換する１つまたは２つ以上の試薬をさらに含むことができる。
【００５１】
好ましい実施形態において、本発明のキットは、２つ以上の異なるキナーゼおよびそれらの基質を含む。したがって、化合物がキナーゼ活性を調節するかどうかを明らかにするために、そしてそのような阻害の特異性を明らかにするために、試験される化合物を、複数の異なるキナーゼに対してスクリーニングするために好適なキットが考えられる。
【００５２】
本発明によるキットはマルチウエル・マイクロタイター・プレートをさらに含むことができる。この用語は、プレートの形態で一緒に連結された複数の反応器または反応ウエルを含む器具を包含することが意図される。それぞれのウエルは小さい容量を有し、通常、９６ウエル・プレートでは２５０μｌ〜３００μｌの容量を、３８４ウエル・プレートでは６０μｌ〜７０μｌの容量を、そして１５３６ウエル・プレートでは６μｌ〜８μｌの容量を有する。現在、最も一般的なプレートは９６個のウエルを有しているが、３８４個のウエルおよび１５３６個のウエルを有するプレートが知られており、これらは本発明により有用である。好ましくは、キットは、９６個以上のウエルを含有するマルチウエルのマイクロタイター・プレートを含む。
【００５３】
好都合には、本発明のキットにおける１つまたは２つ以上の試薬は凍結乾燥形態で提供される。
【００５４】
次に、本発明の特定の態様を包含する様々な実施例が、下記の図を参照する非限定的な例示として記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
（実施例）
本発明者らは、無細胞系におけるプロテインキナーゼ活性の影響を示すために一連の実験を行った。すべてのプロテインキナーゼおよび基質はＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ＵＢＩ；Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、米国）によって供給された。多数の異なる配合物で使用された他の試薬はどれも、付属１に示される。
【００５６】
実施例１  −  ＪＮＫ−１の活性の測定
最初の実験組は、ＪＮＫ−１の活性を、２つの他のキナーゼ（ＭＥＫＫ１およびＭＫＫ４）による本酵素の活性化の後で測定することであった。これらの酵素を活性化するために使用されたアッセイ緩衝液は１０倍ストック液として作製された（配合は付属１に示される）。アッセイは下記のように行われたが、ＪＮＫを活性化するためのプレミックスが最初に調製された。
【００５７】
ＪＮＫ酵素は１．２３４ｍｇ／ｍｌのストック濃度で使用され、ＭＥＫＫ１は１ｍｇ／ｍｌで、そしてＭＫＫ４は０．２８ｍｇ／ｍｌで使用された。活性化混合物を、８．７μｌのＪＮＫ、２．５μｌのＭＥＫＫ１、８．４μｌのＭＫＫ４、１μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、英国）、１μｌのジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ、英国）、５μｌの１０Ｘアッセイ緩衝液および２３．４μｌの蒸留水とともにポリエチレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に加えた。これを室温で一晩インキュベーションした。実際のアッセイを行うために、５０μｌの活性化された濃縮物を作業濃度の９ｍｌのＪＮＫアッセイ緩衝液で希釈した（すなわち、１：１０で希釈した）。使用された基質は、８．６１ｍｇ／ｍｌの濃度でのＧＳＴ−ｃ−ｊｕｎであった。簡単に記載すると、１２μｌのＧＳＴ−ｃ−ｊｕｎを１５４５μｌの作業濃度のアッセイ希釈緩衝液で希釈した。それぞれのアッセイ点を白色の不透明な９６ウエル・マイクロタイター・プレート（Ｄｙｎｅｘ）の三連ウエルで行った。それぞれのウエルには、１５μｌの基質混合物が加えられ、続いて３０μｌの活性化されたＪＮＫ酵素が加えられた。その後、反応を室温で１時間行った。その後、反応を、２０μｌの２％（ｖ／ｖ）リン酸（Ｓｉｇｍａ、英国）の添加によって停止させた。三連ウエルの１つの組には１３５μｌのＴｒｉｓ酢酸緩衝液（ｐＨ７．７５、配合については付属１を参照のこと）を加え、三連ウエルの別の組には１３５μｌの２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．７５、配合については付属１を参照のこと）を加えた。この後、２０μｌのＡＴＰモニタリング試薬（配合については付属１を参照のこと）をそれぞれのウエルに加えた。その後、プレートをＭｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）Ｊｅｔルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に直ちに入れ、光出力を１秒間の積算で求めた。図１には、キナーゼの存在下で見られる光出力の低下が示される。
【００５８】
停止液
これらの実験は、キナーゼ反応を設定された時点で停止させるために２％リン酸を用いて行われた。停止液を使用することのある種の利点、すなわち、キナーゼと、キナーゼがリン酸化する基質との反応を停止させることができる任意の試薬を使用することのある種の利点は、本発明の方法での試験に先立って、非常に多数の試料を作製し、貯蔵することができるということである。この特徴は、ハイ・スループット・スクリーニング適用のためには特に有利な点である。停止液に関する問題の１つは、ｐＨの低下がルシフェラーゼ酵素に有害な影響を及ぼすということであり、従って、十分な緩衝化能が、ＡＴＰが測定されるときには存在しなければならない。この最初の一連の実験では、Ｈｅｐｅｓが、リン酸の影響を中和するために、はるかに良好な緩衝液であることが証明された。実験が、Ｈｅｐｅｓの濃度を増大させながら行われ、この実験により、２００ｍＭの緩衝液はウエル内のｐＨをｐＨ７．０に戻し、これにより、キナーゼを再活性化することなく、ルシフェラーゼ−ルシフェリンの反応を進行させることができたことが示された。Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液はあまり効率的ではなく、しかしながら、検出されたＲＬＵ値の差がキナーゼ酵素の存在下において依然として存在したが、その差はＨｅｐｅｓの場合ほど顕著ではなかった。Ｈｅｐｅｓを用いた結果は、用いない場合よりも低いＲＬＵ値を示したが、この方法では、キナーゼ活性を、ルシフェラーゼ−ルシフェリンの反応を使用して検出される前に抑えることができた。この結果として、下記の実験のほとんどは、別途示されない限り、希釈緩衝液として２００ｍＭのＨｅｐｅｓを用いて行われた。図２には、２つの異なる実験から得られたデータが示され、リン酸停止液およびＨｅｐｅｓ緩衝液の両方の効果が明らかにされている。
【００５９】
当業者は、停止液を加えた後における緩衝液の使用が、ｐＨおよび塩に対して安定である変異ルシフェラーゼを使用することによって避けられ得ることを理解する。２５℃以上であまり活性でない野生型ルシフェラーゼではなく、３０℃において熱安定性である変異ルシフェラーゼを使用することもまた望ましい。好適な変異体は様々な供給源から入手することができる。例えば、ｐＨおよび塩に対して安定な熱安定性の変異体をＫｉｋｋｏｍａｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（キッコーマン（株）バイオケミカル事業部、日本）から得ることができる（上記参照）。
【００６０】
実施例２  −  ＭＡＰＫ−１／ＥＲＫ−１の活性の測定
本発明の上記方法によるキナーゼ活性のモニタリングが、ＡＴＰからリン酸を切断する他の酵素を用いて行われることを確認するために、本発明者らは、シグナル伝達において重要であり、そして薬物発見における標的として使用される多数の他のキナーゼを調べた。
【００６１】
ＭＡＰキナーゼ−１／ＥＲＫ−１活性を、ホスホ・アクセプターとしてのミエリン塩基性タンパク質の存在下で調べた。この酵素は、２５０μｌにおける２５μｇのストック濃度でＵＢＩから活性型形態で供給された。簡単に記載すると、１０μｌのアッセイ希釈緩衝液（ＵＢＩ、配合については付属１を参照のこと）を白色壁の９６ウエル・マイクロタイター・プレート（Ｄｙｎｅｘ）の三連ウエルに加えた。これに、１０μｌのＭＡＰＫ１および１０μｌのミエリン塩基性タンパク質（ＵＢＩ、２ｍｇ／ｍｌ）、そして１０μｌのＡＴＰカクテル（ＵＢＩ、配合については付属１を参照のこと）を加えた。プレートをシールして、反応を３０℃で１０分間行った。この後、１１０μｌのアッセイ希釈緩衝液またはＨｅｐｅｓ緩衝液のいずれかをウエルに加え、その後、２００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液で再構成された２０μｌのＡＴＰモニタリング試薬を加えた。結果は、この酵素をその基質の存在下で用いることによる光出力の低下を示した。ＵＢＩ緩衝液の場合、ＲＬＵ値が７７３６７から３５５７８に低下したが、Ｈｅｐｅｓ緩衝液の場合、９１２５６から７３４２４への低下であった。
【００６２】
ＡＤＰの増大に基づく検出
この実験を用いて、本発明者らはまた、ピルビン酸キナーゼを含有する２０μｌのＡＤＰ変換試薬（配合については付属１を参照のこと）を加えることによりＡＤＰをＡＴＰに変換することによってＡＤＰの何らかの生じた増大を検出することが可能であるかどうかを明らかにした。ＡＤＰの量を測定するために、読み取りが、最初のＡＴＰ光シグナルを１０分間減衰させた後に行われた。その後、変換試薬が加えられ、さらなる読み取りが５分後に行われた。これらの読み取り値はすべて、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（登録商標）Ｊｅｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して１秒後に得られた積算値であった。ＡＤＰの存在量は、最初の光読み取り値と、変換試薬の添加前に得られた読み取り値との光出力の差と相関した。データは、図３に示されるように、ＡＤＰの増大を測定することは可能であることを示した。
【００６３】
実施例３  −  ＭＡＰＫ−２／ＥＲＫ−２の活性の測定
上記のプロトコルはまた、同じ基質（ミエリン塩基性タンパク質）の存在下におけるＭＡＰＫ−２／ＥＲＫ−２の影響を明らかにするために使用された。ＭＡＰＫ−２は、２５μｌの緩衝液（配合については付属１を参照のこと）において２．５μｇの酵素の濃度でＵＢＩによって供給され、比活性は６６２．５Ｕ／ｍｇであった（１Ｕ＝１ｎｍｏｌｅのリン酸がミエリン塩基性タンパク質に取り込まれる）。この酵素を、５０μｌにおいて１２．５μｇの濃度でＵＢＩによって同様に供給される不活性型形態と比較した。両方の酵素は、１０μｌにおいて２５ｎｇのタンパク質がそれぞれのウエルに添加され得るようにＵＢＩのアッセイ希釈緩衝液で希釈された。ミエリン塩基性タンパク質を上記の実施例に記載されるように加え、そして２００ｍＭのＨｅｐｅｓが、ＡＴＰモニタリング試薬の添加前にウエルに添加される緩衝液として使用された。アッセイは三連ウエルで行われ、不活性型酵素について１００７５±３３９のＲＬＵ値を示した。これは、酵素非添加対照からの光出力（１１４４０±１３７２）と非常に類似していた。活性型酵素に対するＲＬＵ値は、１０分のインキュベーションの後、７００８±４３０へのＡＴＰの低下を示した。不活性型酵素の場合の４４１と比較して、５２７２の活性な試料におけるＡＤＰ変換試薬の添加後のＲＬＵ値の増大を検出することもまた可能であった。
【００６４】
実施例４  −  ＡＴＰの減少に対するキナーゼ濃度の影響
ＡＴＰの減少に対するキナーゼ活性の濃度依存的な影響が存在するかどうかを明らかにするために、ＭＡＰＫ−１を、最大濃度からの連続した２倍希釈物を用いて１．５６ｎｇ／１０μｌから１００ｎｇ／１０μｌの範囲の濃度で使用した。使用されたミエリン塩基性タンパク質の濃度は前の実験の場合と同じであった。アッセイは、前の２つの実験の場合のように、すなわち、ＵＢＩの試薬を使用して行われたが、１１０μｌの２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液がＡＴＰ読み取り値の測定の前に添加された。結果は、検出されるＡＴＰレベルがＭＡＰＫ−１の濃度の増大とともに濃度依存的に減少することを示した。１．５６ｎｇが各ウエルに添加されたとき、酵素の影響は認められなかったが、３．１３ｎｇ以上の濃度では著しい影響が認められた（図４を参照のこと）。
【００６５】
実施例５  −  光の減衰に対するＡＴＰ濃度の影響：緩衝液タイプの影響
ルシフェラーゼ酵素自体は、ＡＴＰをＡＭＰおよび無機リン酸に変換するＡＴＰａｓｅである。ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の結果としての光出力が最初に増大した後、光シグナルは時間とともに減衰し始める。本発明者らは、２００μＭまで増大するＡＴＰ濃度を上記の実験において使用して光の減衰を調べた。ＡＴＰ標準物（Ｓｉｇｍａ、英国）を、各ウエルに添加される１０μｌあたり２００μＭから３．１２５μＭまでの連続した２倍希釈で希釈した。標準物は、ＵＢＩから得られるアッセイ希釈緩衝液、Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液（ｐＨ７．７５）および２００ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．７）の３つの異なる緩衝液で希釈された。１０μｌの標準物、およびＡＴＰ非添加緩衝液対照を、不透明な白色の９６ウエル・マイクロタイター・プレートの三連ウエルに加えた。実験は２枚のプレートを用いて行われた。一方のプレートでは、１４０μｌのＴｒｉｓ酢酸緩衝液がすべてのウエルに加えられ、もう一方では、同じ容量の２００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液が加えられた。これらの試薬を加えた直後に、２０μｌのＡＴＰモニタリング試薬をすべてのウエルに加えた。その後、プレートをＢｅｒｔｈｏｌｄ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＰＬ２ルミノメーターに入れ、プログラムを、２分毎にそれぞれのウエルについて１秒間の積算読み取り値が得られるように設定した。図５のグラフには、（時間０における）初期の光出力と、異なる緩衝液条件および２００μＭのストックＡＴＰ（ウエルにおける１２μＭの最終濃度）を用いて観測された光シグナルの減衰とが示される。
【００６６】
実施例６  −  キナーゼアッセイに対するルシフェリン−ルシフェラーゼ（ＡＭＲ）試薬の影響：光シグナルの低下としてのキナーゼ活性の検出
実験はまた、キナーゼアッセイをルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬（ＡＭＲ）の存在下で行ったときの影響、およびシグナル減衰速度に対するその影響を調べるために行われた。使用された酵素は、各ウエルに添加される１０μｌあたり１μｇでのＪＮＫ−２（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、米国）であり、ｃ−ｊｕｎ（１−１６９）−ＧＳＴ基質（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、米国）もまた同じ濃度で加えられた。それぞれのウエルには、１０μｌの２００μＭ  ＡＴＰ標準物および１０μｌのＨｅｐｅｓ緩衝液（２００ｍＭ）が加えられた。対照のウエルには、１０μｌの酵素が１０μｌのＨｅｐｅｓ緩衝液で置き換えられ、活性な試薬のすべてがウエル内に存在し、さらに１２０μｌのＨｅｐｅｓ希釈緩衝液が加えられると、その後、２０μｌのＡＭＲが加えられ、シグナルの減衰が、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＰＬ２ルミノメーターを使用して２分間の期間について２０秒毎にモニターされた。１秒間の積算読み取り値がそれぞれの時点で得られた。データは、図６に示されるように、シグナル減衰速度がＪＮＫ−２酵素の存在下において増大することを示した。このことは、キナーゼ活性はまた、停止液が存在しない場合、光シグナルの加速された低下として検出され得ることを示している。
【００６７】
実施例７  −  キナーゼの活性型形態および不活性型形態の比較
本発明者らはまた、ＭＡＰＫ−１およびＭＡＰＫ−２の活性化形態および不活性型形態を比較し、これらの酵素の不活性型形態による低下したキナーゼ活性を示した。場合により、ある量の自己リン酸化が存在するようであったが、これは、酵素非添加対照とは大きく異なってはいなかった。不活性型ＭＡＰＫ−１対活性化形態に対する濃度曲線により、酵素のキナーゼ活性がＡＴＰ量を減少させる様子、従って、シグナル減衰を増大させる様子が明瞭に示された。実験は、実施例３に詳しく記載されるように行われたが、この場合には、反応の速度論が反応の最初の６分間について調べられた。図７から、１０μｌあたり１００ｎｇのＭＡＰＫ−１（５８８ｎｇ／ｍｌの最終濃度）では、シグナル減衰率（％）の著しい増大が６分までもたらされたことを理解することができる。アッセイは、３つの異なる実験において三連で行われた。ＡＭＲが添加されるとすぐに、プレートは、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（登録商標）ルミノメーターを使用して６分間にわたり１分毎に１秒の積算値を求めるために読み取りが行われた。
【００６８】
類似した影響が、ＭＥＫ−１によるＭＡＰＫ−２のリン酸化の場合にも認められた。この実験シリーズでは、ＭＥＫ−１は、５Ｕ／５０μｌのストック酵素の１μｌ〜５μｌを添加することによって７５μｇ／ｍｌから３７５μｇ／ｍｌまでのウエル内最終濃度で使用された。Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃから引用された活性は７８５０Ｕ／ｍｇであった（１ユニットは、最大、１ユニットの不活性型ＭＡＰＫ−２を活性化する）。不活性型ＭＡＰＫ−２は、５．８８μｇ／ｍｌの最終濃度が得られるように、１０μｌでそれぞれのウエルに加えられた。再度ではあるが、２００μＭのＡＴＰおよびＨｅｐｅｓ緩衝液が存在する場合、シグナルの減衰は、対照における１４％から、使用された最大濃度に対する３６％まで濃度依存的に増大した。
【００６９】
実施例８  −  異なるキナーゼ緩衝液の影響
文献には、多数の異なる反応緩衝液が、キナーゼアッセイを行うために使用されているので、本発明者らは、アッセイが緩衝液の構成成分にかかわりなく行えることを確保するために、これらの緩衝液を用いてＡＴＰ検出試薬を試験することに決めた。これらの緩衝液が使用される理由は、ＡＴＰおよびタンパク質／ペプチド基質の存在下でのキナーゼ反応に対して最適な条件を与えるものであるからである。図８には、プロテインキナーゼのアッセイにおいて一般的に使用されている１３個の異なる緩衝液の影響が示される。緩衝液の構成成分は表１に示される。
【００７０】
【表１】
2004518422.tif 000003
【００７１】
ＡＴＰをそれぞれの緩衝液で希釈して、１００μｌを９６ウエル・マイクロタイター・プレートの各ウエルに加え、２０μｌのＡＴＰ検出試薬をウエルに加え、そして光出力を、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｒｉｏｎルミノメーターを使用する１秒の積算読み取りの後に検出した。
【００７２】
図８の結果は、緩衝液０および緩衝液９が光出力を弱めているが、アッセイ感度は影響を受けなかったことを示している。これらのアッセイは、通常、数十マイクロモルから数百マイクロモルのＡＴＰ濃度を用いて、すなわち、著しい光出力が、シグナルを減少させる緩衝液を用いても依然として検出可能である、本実施例において使用される１μＭの濃度よりも大きい濃度で行われる。
【００７３】
実施例９  −  生物発光アッセイにおけるＴｒｉｓ酢酸緩衝液の使用
本発明者らは、Ｔｒｉｓ緩衝液ならびにＨｅｐｅｓにおける生物発光アッセイの成績を比較した。本発明者らは、ｐＨ７．７５のＴｒｉｓ酢酸緩衝液においてＡＴＰ検出試薬を再構成することが可能であることを示している。しかし、酸停止液（例えば、リン酸）を使用するとき、上記に記載されるＨｅｐｅｓ緩衝液再構成システムを使用することが好ましい。
【００７４】
アッセイが、多数の異なるキナーゼおよび基質を使用して行われた。この実験は、Ｈｅｐｅｓ緩衝液について記載される方法に類似する方法を使用して行われた。アッセイは９６ウエル・マイクロタイター・プレートのウエルにおいて１００μｌの容量で行われ、適切な濃度の酵素および基質のそれぞれが、その酵素について最も好適な反応緩衝液においてウエルに加えられた。その後、反応が、ＡＴＰを適切な濃度で添加することによって開始され、反応を３０℃で１０分間行い、その後、２０μｌのＡＴＰ検出試薬（Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液において再構成されたもの）を加えて、光出力を１秒間の積算により検出した。下記の実施例では、ＡＴＰ検出試薬は、Ｈｅｐｅｓではなく、Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液（ｐＨ７．７５）において再構成された。
【００７５】
基質としてのＡＴＦ−２およびｃ−Ｊｕｎを用いたＪＮＫ２α２
この酵素を、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから得られるＡＴＦ−２基質ペプチドおよびｃ−Ｊｕｎ基質ペプチドの両方を用いて試験した。
【００７６】
アッセイ緩衝液：１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４
２０ｍＭジチオスレイトール
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０％グリセロール
０．００４％  Ｂｒｉｊ−３５
【００７７】
経時変化実験を透明なプラスチック試験管において１００μｌ（または２００μｌ）の容量で行った。反応を３０℃の水浴またはインキュベーターのいずれかで行った。
【００７８】
Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙは、アッセイ点あたり５μｇでのＡＴＦ−２基質およびアッセイ点あたり２０ｍＵでのＪＮＫ２α２の使用を推奨した。
【００７９】
ストックＡＴＦ−２（ＬＢ０１８ＬＦｐ１０７）は１０μｌずつの分量で４．３ｍｇ／ｍｌ（１０μｌ中４３μｇ）である。基質をストック液から１：８に希釈して、１０μｌをチューブに加え、反応混合物において５．３８μｇの最終濃度にした。
【００８０】
ストックＪＮＫ２α２（ＬＢ０２１ＳＤｐ８１）は７７Ｕ／ｍｇ（１００Ｕ／ｍｌ）すなわち１．３ｍｇ／ｍｌであり、１０μｌ量（１Ｕ）に小分けする。濃度曲線を、酵素ストック原液の５μｌ（５０ｍＵ）、１：２液の５μｌ（２５ｍＵ）、１：４液の５μｌ（１２．５ｍＵ）および１：８液の５μｌ（６．２５ｍＵ）を１００μｌの最終反応容量あたり加えることによって作製した。
【００８１】
ストックＡＴＰは１０μｌ量において１Ｍである。ＡＴＰを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（３９０μｌの添加）で１：４０に希釈し、その後、さらに１：１００に希釈して、２５０μＭの作業用溶液を得た。その後、１０μｌを１００μｌの最終反応容量のそれぞれに加えた。これにより、チューブにおいて２５μＭの最終濃度が得られた。
【００８２】
従って、チューブには、
１０μｌの基質
５μｌの酵素
１０μｌのＡＴＰ
７５μｌのアッセイ緩衝液
が含まれた。
【００８３】
キナーゼ活性を測定するために、２０μｌの試料を５分間隔でチューブから取り出し、９６ウエルの白色不透明なマイクロタイター・プレートのウエルに加えた。その後、Ｔｒｉｓ−Ａｃ緩衝液において再構成された２０μｌのＡＭＲをウエルに加えて、プレートを１秒間の積算でルミノメーターで読み取った。
【００８４】
再現性を確認するために、より大きい容量を調整して、三連の試料を短い時点について採取した。
【００８５】
図９には、基質のみの対照と比較して、酵素および基質の存在下における光出力の経時的な低下が示される。
【００８６】
図９にはまた、ＡＴＰ検出試薬を用いた検出のために、キナーゼ活性の結果として形成されたＡＤＰをＡＴＰに戻すＡＤＰ変換試薬（２０μｌ）を添加したときの影響が示される。ＡＤＰ変換試薬をピペットで加えた後の光シグナルの低下は、ウエル内のｐＨが添加後に低下したためであった。図９は、酵素非添加対照と比較して、酵素および基質の存在下における光出力の顕著な低下を明瞭に示している。
【００８７】
上記の方法において記載されるように、アッセイを、同じＡＴＰ濃度およびペプチド濃度に対して、ＪＮＫ２α２の濃度を低下させながら繰り返した。図１０には、ＪＮＫ２α２を２．５５μＭ（５０ｍＵ）から３２０ｎＭに低下させることによって得られたデータが示される。
【００８８】
ＡＴＦ−２に加えて、本発明者らはまた、別のＪＮＫ基質、すなわち、ｃ−Ｊｕｎペプチドを調べた。ｃ−ＪｕｎペプチドとのＪＮＫ２α２活性を測定するために、実験が、上記と同じプロトコルを使用して行われたが、ＡＴＦ−２ではなく、１０μｌのｃ−Ｊｕｎが添加された。
【００８９】
ストックｃ−Ｊｕｎ（ＬＢ０２３ＪＴｐ７２）は、８０５μｌにおいて４．８３ｍｇ／ｍｌで、１０μｌ＝４８．３μｇであり、ＡＴＦ−２とほぼ同じ量のペプチドを使用するために、再び１：９に希釈され、その後、チューブあたり１０μｌが加えられる。
【００９０】
図１１では、２つの異なる基質が比較されたとき、キナーゼ活性の結果としてのＡＴＰの低下が比較される。データにより、ＡＴＦ−２がＪＮＫ２α２活性についてはｃ−Ｊｕｎよりも効率的な基質であるという、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから受け取った情報が確認された。
【００９１】
ＳＡＰＫ−３およびミエリン塩基性タンパク質
ＳＡＰＫ３は、様々な細胞外アゴニストによって活性化され得るマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーのメンバーである。これらのストレス感受性タンパク質キナーゼは、キナーゼ反応におけるリン受容体としてミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を利用することができる。本発明者らは、このキナーゼ活性が、Ｈｅｐｅｓ緩衝液に加えて、Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液（ｐＨ７．７５）において再構成されたＡＤＰ検出試薬を用いて測定され得ることを示している。アッセイは下記の通りに行われた。
【００９２】
このアッセイは、３０℃でのインキュベーションを用いて、ＭＡＰＫ−２／ＥＲＫ−２の場合と同じ緩衝液を使用して行われた。ＡＴＰは、ＪＮＫ２α２の場合と同じ濃度で使用された。
【００９３】
アッセイ緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５
１０ｍＭ  酢酸Ｍｇ
０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ
【００９４】
前記酵素の場合のように、アッセイは、経時変化を行うためにチューブにおいて組み立てられた。キナーゼ反応が完了した後、２０μｌの反応混合物を９６ウエルの不透明な白色のマイクロターター・プレートのウエルに入れ、その後、２０μｌのＡＴＰ検出試薬を加えた。光出力を１秒間の積算で再び測定した。
【００９５】
チューブには、１０μｌの酵素、１０μｌの基質、１０μｌのＡＴＰおよび７０μｌのアッセイ緩衝液が含まれた。
【００９６】
ＳＡＰＫ３ストック液（ＬＢ０１２ＳＤｐ１７４、２２０μｌ）は１．５５ｍｇ／ｍｌの濃度および８７．３Ｕ／ｍｇで提供された。酵素を１０μｌ量（１５．５μｇ）に小分けした。その後、酵素を１：３に希釈した（＝５．１７μｇ／１０μｌ）。酵素濃度曲線のために、酵素を１：５（１．０３μｇ）および１：１０（０．５２μｇ）にさらに希釈した。アッセイは、１００μｌの最終反応容量あたり１０μｌを加えることによって行われた。最終的な酵素濃度は、０μｇ／ｍｌ、０．５１７μｇ／ｍｌ、１．０３μｇ／ｍｌおよび５．１７μｇ／ｍｌであった（それぞれ、０ｎＭ、７２．８ｎＭ、１４５．６ｎＭおよび７２８．０ｎＭのナノモル濃度に対応する；図１２の凡例を参照のこと）。
【００９７】
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから得られるＭＢＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ）は、１００μｌの最終反応容量あたり１０μｌのストック原液が使用された（２．７２μＭの最終濃度）。
【００９８】
ＳＡＰＫ３／ＭＢＰ実験の結果が図１２に示される。図１２において、（光出力によって測定されたとき）ＡＴＰの濃度依存的な低下が明らかである。
【００９９】
ＳＡＰＫ４およびミエリン塩基性タンパク質
上記の実験はまた、ＳＡＰＫ４およびＭＢＰを用いて繰り返された。これらのアッセイは、ＭＡＰＫ２／ＥＲＫ−２およびＳＡＰＫ３の場合と同じアッセイ緩衝液を使用して行われた。
【０１００】
ストックＳＡＰＫ４（ＬＢ０１２ＳＤｐ１７６）は、１２７μｌにおいて、１．６４ｍｇ／ｍｌで、１４４．１Ｕ／ｍｇである。これを５μｌの試料に小分けした（８．２μｇ／小分け物）。作業用ストックを作製するために、酵素を１：４（２．０５μｇ／５μｌ）に希釈し、次いで１：５（４１０ｎｇ／５μｌ）および１：１０（２０５ｎｇ／５μｌ）にさらに希釈した。その後、５μｌをそれぞれのチューブに加え、これにより、１００μｌの反応容量について、０μｇ／ｍｌ、０．１０３μｇ／ｍｌ、０．２０５μｇ／ｍｌおよび１．２５μｇ／ｍｌのチューブ内の最終濃度が得られた（対応するナノモル濃度は図１３に示される）。
【０１０１】
ストックＭＢＰ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は２．５ｍｇ／ｍｌである。１０μｌが１００μｌの最終反応容量のそれぞれに加えられた（２５０μｇ／ｍｌすなわち１３．６μＭ）。
【０１０２】
ＭＢＰの濃度が大きくなると、時間０における光シグナルの急速な減少が示された。これは、実際には、試薬を添加した約２分後であった。試料をチューブから取り出し、それらをプレートに入れ、そしてＡＴＰ検出試薬を加えるためにこのような長い時間を要したからであった（図１３参照）。
【０１０３】
ＳＡＰキナーゼを用いて行われた研究により、多数の異なる供給者から得られるＭＢＰを使用することが可能であることもまた示された（しかし、アッセイの成績は、供給されたタンパク質の性状に依存することが見出された）。
【０１０４】
これらのデータにより、Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液が、以前に記載されたＨｅｐｅｓ緩衝液と同様に、ＡＴＰ検出試薬を再構成するために使用できることが確認される。
【０１０５】
実施例１０  −  ＡＴＰ濃度の影響
上記の実験はすべて、ＡＴＰが２５μＭの最終濃度で行われた。本発明者らは、生物発光システムにより、より大きいＡＴＰ濃度およびより低いＡＴＰ濃度でキナーゼ活性が検出され得るかどうかを調べることにした。アッセイは、上記に記載されるのと同じ緩衝液を用いて、そして同じ容量を用いて行われた。しかし、下記の実施例では、実験は、チューブにおいてではなく、白色壁の９６ウエル・マイクロタイター・プレートのウエルにおいて行われた。３０℃で３０分後、プレートをインキュベーターから取り出して、２０μｌのＡＴＰ検出試薬をそれぞれのウエルに加え、光出力を１秒間の積算で読み取った。
【０１０６】
ＪＮＫ２α２
図１４には、１μＭ、１０μＭおよび１００μＭの３つの異なる最終濃度のＡＴＰで得られた結果が示される（結果は三連ウエルの平均値±ＳＤとして示される）。使用された基質は２．１１μＭの最終濃度でのＡＴＦ−２であり、酵素は１．２５μＭであった。アッセイ緩衝液は、上記のＪＮＫ２α２について記載される緩衝液と同じであった。
【０１０７】
ＳＡＰＫ３
ＡＴＰ濃度曲線実験を、ＳＡＰＫ３および基質としてのＭＢＰを用いて繰り返した。図１５には、光出力の変化に対する種々のＡＴＰ濃度の影響が示される（結果は三連ウエルの平均値±ＳＤとして示される）。ＳＡＰＫ３は７２８ｎＭの濃度で使用され、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）はウエルにおいて２．７２μＭの最終濃度であった。１００μＭにおいて、基質の存在下における酵素の影響が認められた。この場合、光シグナルは、５，２６７，９００±１３３，６８８から４，５７４，６６６±２８３，２０４への６９３，２３４のＲＬＵの低下があった。これは、ＲＬＵ値における有意な減少であり、そしてこの高濃度のＡＴＰでは、酵素および基質の量が制限因子であることを示していた。
【０１０８】
ＲＬＵ値の差はＡＴＰ濃度と直接相関しており、光出力のこの低下は、ＳＡＰＫ３によって脱リン酸化されたＡＴＰの量に関連する。このことは、ＲＬＵ値の差が示される図１６においてさらに明らかにされる。図１６は、１０μＭの場合と同じ量のＡＴＰが１００μＭのＡＴＰで消費されたことを示している。
【０１０９】
図１６から明らかではないが、使用されたＡＴＰの最少濃度に関してＲＬＵ値の差もまた有意であった。この場合、ＲＬＵ値は８１８±１８から３００±１７（平均値±ＳＤ）に低下した。
【０１１０】
実施例１１  −  ３８４ウエル・マイクロタイター・プレートにおけるアッセイ成績
上記に記載される経時変化実験により、アッセイをより大きい容量でチューブにおいて行い、その後、それぞれの時点において、白色不透明なマイクロタイター・プレート（９６ウエル）に添加するための２０μｌの試料で行うことが可能であることが確認された（この場合、光出力が２０μｌのＡＴＰ検出試薬の添加後に測定される）。本発明者らはまた、アッセイを９６ウエル・プレートのウエルにおいて１００μｌの容量で行うことが可能であることを示している。
【０１１１】
図１７には、より大きい反応容量からの２０μｌを使用したとき、およびアッセイが３８４ウエル・マイクロタイター・プレートのウエルにおいて直接行われたときのアッセイ成績の比較が示される。３８４ウエルでは、キナーゼ反応は２０μｌの容量で行われ、２０μｌのＡＴＰ検出試薬が加えられる。データは、チューブ（１００μｌ）または３８４ウエル・プレート（２０μｌ）で行われたとき、アッセイの成績に差がないことを示している。
【０１１２】
実施例１２  −  キナーゼカスケードの研究
キナーゼの活性化は、シグナル伝達経路内の上流の他のキナーゼによるリン酸化の結果であることが非常に多い。この１つの例が、ＭＥＫ−１によるＭＡＰＫ−２の活性化、その後、ＭＢＰをリン酸化するＭＡＰＫ−２の能力である。本発明者らはこのシステムを使用して、ＭＡＰＫ−２がＭＥＫ−１によってリン酸化および活性化されることを確認した。このタンパク質が活性化されていた場合、ＭＡＰＫ−２が続いてＡＴＰの存在下においてＭＢＰにさらされたとき、ＡＴＰの減少が見られる。このアッセイは１００μｌの容量でチューブにおいて行われ、不活性型ＭＡＰＫ２の最初の活性化が、１０μＭのＡＴＰを用いて３０℃で行われた。アッセイ緩衝液には、２５ｍＭのＴｒｉｓ酢酸（ｐＨ７．７５）が０．１ｍＭのＥＧＴＡおよび１０ｍＭの酢酸マグネシウムとともに含まれた。ＭＥＫ−１は１１４ｎＭの最終濃度で使用され、不活性型ＭＡＰＫ−２は５１６ｎＭの最終濃度であった。
【０１１３】
キナーゼ活性を測定するために、その後、２０μｌが９６ウエル・プレートの二連ウエルに加えられ、そして２０μｌのＡＴＰ検出試薬を加えて、光シグナルが１秒間の積算で測定された。
【０１１４】
０．２５ｍｇ／ｍｌのＭＢＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の１０μｌ、１０μＭのＡＴＰの１０μｌおよびアッセイ緩衝液の６０μｌを含む三連ウエルを含有する別のプレートを準備し、これに、チューブからの２０μｌのＭＥＫ−１／ＭＡＰＫ２反応混合物を加えて、反応をインキュベーターにおいて３０℃で３０分間行った。この時間の後、２０μｌのＡＴＰ検出試薬をウエルに加えて、光出力を測定した。
【０１１５】
結果が下記の図１８に示される。図１８には、基質のみの対照におけるＲＬＵ値の増大が認められ、この増大は、元のＭＥＫ−１／ＭＡＰＫ−２反応混合物からのＡＴＰの添加に関連する。データは、ＭＡＰＫ−２がリン酸化され、従って、ＭＢＰの存在下においてキナーゼ活性そのものを示すことができたことを明瞭に示している。さらなる対照を、不活性型ＭＡＰＫ−２およびＭＢＰを用いて行ったが、これは、光シグナルの低下を示さなかった。
【０１１６】
実施例１３  −  基質リン酸化のウエスタン・ブロッティング研究
本発明者らは、キナーゼの機能的活性を誘導し、そして生物発光アッセイを使用してこの活性を検出することができることを示すことに加えて、光出力の低下がペプチド／タンパク質基質におけるアミノ酸のリン酸化と関連することをウエスタン・ブロッティングによって確認した。
【０１１７】
方法
試料調製：キナーゼ反応を１００μｌの容量で完了させた後、２０μｌの反応混合物を２０μｌの２ｘＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｓ、英国）に加え、１００℃で４分間加熱し、ただちに氷上に置き、その後、使用した。
【０１１８】
分子量ＨＲＰタンパク質マーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、１０μｌのマーカーを１０μｌのウエスタン・ブロッティング試料緩衝液に加えることによって調製した。
【０１１９】
ゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）および転写ブロット：それぞれの調製された試料の２０μｌ（１０μｌのキナーゼ反応混合物に等しい）を１２％のＳＤＳレディー・ゲル（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｔｓ、英国）のレーン・ウエル内に加えて、標準的なＴｒｉｓグリシン泳動緩衝液を用いて１８０Ｖで４５分間泳動した。
【０１２０】
ゲルを標準的なＴｒｉｓ−グリシン−メタノール転写緩衝液中、室温で５分間平衡化させ、その後、ＢｉｏＲａｄミニ・ブロット装置を１００Ｖで６０分間使用してニトロセルロース膜に転写した。
【０１２１】
膜のプローブ処理：その膜を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）（ＩＬ、米国）ブロッキング緩衝液中で室温で１時間阻止処理をした。使用された一次抗体は、ＭＡＰＫ、ｐ３８およびＪＮＫについてはＰｒｏｍｅｇａ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）により供給され、抗リン酸化ＭＢＰについてはＵＢＩにより供給された。抗体希釈物は、蒸留水で１０倍に希釈されたＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（登録商標）中で作製された。一次抗体は１：１００００で使用され、そして適する場合、二次抗体は１：２００００で使用された。ＨＲＰコンジュゲート化検出試薬が、ＨＲＰタンパク質マーカーを検出するために１：１００００で使用された。
【０１２２】
化学発光検出：プローブ処理された膜を、１０ｍｌのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ、米国）と、軽く振とうしながらを２分間インキュベーションした。その後、プローブ処理されたブロットをＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｓ、英国）に２０秒間感光させた。リン酸化された目的物を、識別のために分子量マーカーに対して比較した。
【０１２３】
結果
図１９には、３０℃で３０分後のＭＢＰに対するＳＡＰＫ３活性の影響が示される。この実験では、アッセイは、前記に記載されたようにチューブにおいて行われた。ＡＴＰレベルを測定するために、２０μｌ量の試料が９６ウエル発光適合プレートの二連ウエル内に取り出され、そして残りがウエスタン・ブロッティング分析のために使用された。ブロットは、リン酸化ＭＢＰに対する抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用してプローブ処理された。
【０１２４】
上記の実験を、ＳＡＰＫ４と、ＭＢＰの多数の異なる供給物とを使用して繰り返した。結果が図２０に示され、そして、結果より、いくつかのタンパク質は、同じ濃度で使用されたときでさえ、生物発光アッセイおよびウエスタン・ブロッティングの両方に関して異なる結果をもたらしたことが強調される。ブロットは、同じ抗リン酸化ＭＢＰで再びプローブ処理された。結果が示すように、使用されたＭＢＰのバッチの１つ（ＣＢ）は、いずれの検出アッセイにおいても影響がなかった。Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得られるＭＢＰの２つの異なる試料が使用された。１つは脱リン酸化形態（ＤｅＰｈｏｓ）であり、もう１つは標準的なＭＢＰ（ＵＢＩ）であった。生物発光データにより、同じ量のタンパク質が使用された場合（２．７２μＭ）、脱リン酸化形態がＳＡＰＫ４アッセイにおいてより効率的であることが示唆された。これは免疫ブロッティングから明らかにすることができず、これにより、生物発光はキナーゼ活性に対してより高感度かつより定量的なアッセイであることが確認される。
【０１２５】
まとめ
上記の実施例１〜実施例１３に記載される研究により、本発明の方法およびキットの万能性が明らかにされる。
【０１２６】
具体的には、本発明の方法は、多数の異なるプロテインキナーゼ／基質の組合せを研究するために使用することができる。上記の実施例において使用されたプロテインキナーゼ酵素には、下記が含まれた：
（ｉ）ペプチドが基質としてのｃ−ｊｕｎの存在下におけるＪＮＫ−１およびＪＮＫ−２；
（ｉｉ）基質としてミエリン塩基性タンパク質を用いたＭＡＰＫ−１／ＥＲＫ−１およびＭＡＰＫ−２／ＥＲＫ−２；
（ｉｉｉ）基質として不活性型ＭＡＰＫ２を用いたＭＥＫ−１；
（ｉｖ）基質としてＡＴＦ−２およびｃ−ｊｕｎを用いたＪＮＫ２α２；
（ｖ）基質としてミエリン塩基性タンパク質を用いたＳＡＰＫ−３；そして
（ｖｉ）基質としてミエリン塩基性タンパク質を用いたＳＡＰＫ−４。
【０１２７】
さらに、様々な比較が、ミエリン塩基性タンパク質の存在下においてＭＡＰＫ−１／ＥＲＫ−１およびＭＡＰＫ−２／ＥＲＫ−２の両方の活性化形態と不活性型形態との間で行われた。
【０１２８】
これらの実験から得られた結果は、検出可能なＡＴＰの減少、測定されたＡＤＰの増大、そしてまたルシフェラーゼの存在下における加速されたシグナル減衰によって、キナーゼ活性をＡＴＰおよび適切な酵素基質の存在下において検出することが可能であったことを示している。
【０１２９】
本発明のアッセイの利点のいくつかが下記の点でまとめられる。
・本発明のアッセイは、ＡＴＰからリン酸を切断する任意のプロテインキナーゼに適用することができる。
・プロテインキナーゼ活性を、ＡＴＰおよび／またはＡＤＰの検出に先立って、完了させることができる。
・アッセイをＡＴＰモニタリング試薬の存在下で行うことができ、この場合、プロテインキナーゼ活性は、シグナル減衰の増大と一緒に、光出力の低下として測定される。
・アデニル酸ヌクレオチドの変化は、酵素、基質およびＡＴＰ濃度の変動に関して濃度依存的な影響を示した。
・光シグナルの低下はタンパク質のリン酸化と相関する。
・本発明の方法は、プロテインキナーゼの阻害剤を検出および研究するために使用することができる。
・本発明の方法は、プロテインキナーゼのカスケード系を研究するために使用することができる。
・本発明のアッセイは室温または３０℃で行うことができる。
・アデニル酸ヌクレオチドの変化を停止液の存在下または非存在下で検出することができ、これにより、試料の大量スクリーニングが可能になる。適切な緩衝液（例えば、Ｈｅｐｅｓ）を使用することによって、２％リン酸でプロテインキナーゼ反応を停止させ、プロテインキナーゼ活性の結果としてのＡＴＰの減少量を検出することもまた可能であった。
・本発明の方法は多数の異なるプロテインキナーゼ緩衝液とともに使用することができる。
・ＡＴＰ検出試薬はＴｒｉｓ酢酸緩衝液またはＨｅｐｅｓ緩衝液のいずれでも使用することができる。
・本発明のアッセイはキットとして供給することができる。種々のキットを、停止試薬の使用とともに、または停止試薬を使用することなく、ＡＴＰの低下を測定するために供給することができる。キットはまた、プロテインキナーゼ活性の結果としてのＡＤＰの増加を検出するために、（付属１に概略されるような）ＡＤＰ変換試薬を含有することができる。
【０１３０】
本発明の方法の適用
本発明の方法およびアッセイは、上記の実施例に記載されるように、無細胞系におけるキナーゼ活性の測定として使用することができる。このことは、これにより、本発明の方法およびアッセイが、例えば、キナーゼの調節因子（特に、阻害剤）として作用し得る薬物を識別するために、ハイ・スループット・スクリーニング実験室において使用することができるので、製薬産業では特に重要である。この適用のために、アッセイは、上記の実施例に記載されるようにまさに行うことができる。
【０１３１】
本発明の方法およびアッセイはまた、細胞抽出物におけるキナーゼ活性を測定するために、そして細胞キナーゼ活性の調節因子の作用を測定するために使用することができる。これらの実験を行うために、上記の実施例における知られているキナーゼを細胞抽出物／上清に置き換えることができる。基質は、記載されるように加えられ、そして阻害剤／活性化剤で処理された細胞におけるキナーゼ活性の何らかの変化を検出することができる。
【０１３２】
ますます多くのプロテインキナーゼが、新しい腫瘍治療剤を開発するために標的化されている。このリストが大きくなるに従い、それぞれのキナーゼに対して特異的な試験を使用することは実用的ではなくなり、そして極めて費用のかかるものになる。本発明のアッセイおよびキットにより、広範囲のキナーゼを検出することができ、そして共通した終点検出システムがすべてのキナーゼに提供される。これにより、より容易な使用が、目的とするすべての検出試薬ならびに様々なキナーゼおよび阻害剤を用いて、そして不透明な白色（または黒色）のルミノメーター用マイクロタイター・プレートを用いてロボットが組み立てられ得る場合には、特にハイ・スループット・スクリーニング実験室において可能になる。
【０１３３】
さらに、停止液の使用により、非常に多数のプレートを、ＡＴＰおよび／またはＡＤＰのレベルを分析する前にバッチ処理（すなわち、停止処理）することができる。
【０１３４】
実施例１４  −  キナーゼ阻害剤の研究
スタウロスポリン
本発明者者らは、最初に、作用範囲が広いキナーゼ阻害剤のスタウロスポリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を調べることを選んだ。最初、本発明者らは、この阻害剤がルシフェラーゼ−ルシフェリン反応に影響を及ぼさないことを確保するために、ＡＴＰ検出試薬に対する（ＤＭＳＯ中での）阻害剤を試験した。
【０１３５】
図２１には、生物発光検出システムに対するスタウロスポリンの影響が示される。結果は三連ウエルの平均値±ＳＤとして示される。
【０１３６】
データは、阻害剤の濃度が最大のときでさえ、光出力に対する影響が大きくなかったことを示している。実験は、９６ウエル・プレートにおいて１００μｌの容量で１０μＭのＡＴＰを使用し、２０μｌのＡＴＰ検出試薬を添加して行われた。
【０１３７】
スタウロスポリンの影響を、基質としてＡＴＦ−２を用いたＪＮＫ２α２酵素について試験した。下記の図が示すように、予想された阻害活性を、生物発光によるプロテインキナーゼアッセイ系を使用して検出することができた。
【０１３８】
図２２には、ＪＮＫ２α２活性に対する２つの異なるスタウロスポリン濃度の影響が示される。低い方の濃度ではほとんど影響がなかったが、５μＭでは約５０％の阻害が３０℃で３０分後にもたらされた。
【０１３９】
上記のアッセイは、３０℃の水浴で、プラスチック・チューブにおいて２００μｌの容量で行われた。それぞれの時点で、２０μｌの試料がチューブから取り出され、９６ウエル・プレートのウエルに加えられ、その後、２０μｌのＡＴＰ検出試薬が添加された。使用されたＡＴＰの最終濃度は１２．５μＭであり、ＪＮＫ２α２は１．２５μＭであり、ＡＴＦ−２は２．５５μＭであった。
【０１４０】
ゲニステイン
本発明者らはまた、基質としてＭＢＰを用いたＭＡＰＫ−１活性に対するゲニステイン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の影響を調べた。
【０１４１】
使用されたアッセイ緩衝液は、ＳＡＰキナーゼの場合と同じであった（下記参照）。アッセイは、３０℃で３０分間、９６ウエル・マイクロタイター・プレートにおいて１００μｌの容量で行われた。ＭＢＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、前記に記載されたのと同じ濃度（２．７２μＭ）で使用され、活性化されたＭＡＰＫ１／ＥＲＫ１（ＵＢＩ）が１００μｌの反応容量あたり２．５Ｕの最終濃度で使用された。阻害剤は、１０μｌが０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯにおいてウエルあたり添加されることにより、０μＭ、０．１μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭおよび１．０μＭの濃度で添加された。
【０１４２】
完全にするために、ＤＭＳＯ添加およびＤＭＳＯ無添加の対照試料（それぞれ、０＋ＤＭＳＯおよび０−ＤＭＳＯ）もまた、アッセイ成績に対するＤＭＳＯの影響がないことを確認するために分析された。
【０１４３】
図２３には、基質としてＭＢＰを用いたＭＡＰＫ−１活性に対するゲニステインの濃度（μＭ単位）を増大させたときの影響が示される（結果は二連ウエルの平均値±ＳＤとして表される）。具体的には、データは、ゲニステインの影響が５００ｎＭにおいて存在することを示し、増大した阻害活性が１μＭで見られた。
【０１４４】
ＰＤ０９８０５９
本発明者らはまた、不活性型ＭＥＫ−１のｒａｆ−１活性化に対する選択的阻害剤ＰＤ０９８０５９の影響を調べた。
【０１４５】
ＰＤ０９８０５９に関して、阻害剤の存在下における光出力の濃度依存的な増大が認められた。このことはキナーゼ活性の低下を示している。
【０１４６】
図２４には、ｒａｆ−１活性に対するＰＤ０９８０５９の２つの異なる濃度の影響が示される（結果は三連ウエルの平均値±ＳＤである）。これらのデータにより、本発明のアッセイは、キナーゼの阻害活性を測定するために好適であることが確認された。
【０１４７】
この実験によりまた、別のキナーゼ／基質系（すなわち、ｒａｆ−１／不活性型ＭＥＫ−１）の活性を検出することが可能であったので、本発明の方法およびアッセイが万能であることが証明される。
【０１４８】
付属１
ＡＴＰモニタリング試薬（ＡＭＲ）配合
再構成されたＡＭＲ
酢酸マグネシウム          ２０ｍＭ          Ｓｉｇｍａ
ピロリン酸四ナトリウム    ８μＭ          Ｓｉｇｍａ
ウシ血清アルブミン        ０．３２％ｗ／ｖ      Ｓｉｇｍａ
Ｄ−ルシフェリン            ７１２μＭ        ＣｏｎＣｅｌｌ
Ｌ−ルシフェリン            １７．８μＭ        ＣｏｎＣｅｌｌ
ルシフェラーゼ            １７ｎＭ          Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ
デキストラン              ３ｍｇｍｌ−１        Ｓｉｇｍａ
Ｔｒｉｓ                      ４０ｍＭ          Ｓｉｇｍａ
ＥＤＴＡ                    ８００μＭ          Ｓｉｇｍａ
最終反応濃度
酢酸マグネシウム          ２．３６ｍＭ
ピロリン酸四ナトリウム    ２３６ｎＭ
ウシ血清アルブミン        ０．００９％ｗ／ｖ
Ｄ−ルシフェリン            ２１μＭ
Ｌ−ルシフェリン            ５２５ｎＭ
ルシフェラーゼ            ５００ｐＭ
デキストラン              ８８．５ｇｍｌ−１
Ｔｒｉｓ                      １．１８ｍＭ
ＥＤＴＡ                      ２３．６μＭ
【０１４９】
Ｔｒｉｓ酢酸（ＴＡ）緩衝液（１リットルに対する必要量）
Ｔｒｉｓ                      １２．１ｇ      Ｓｉｇｍａ
ＥＤＴＡ                    ０．７４４ｇ        Ｓｉｇｍａ
０．１ＭのＴｒｉｓ／２ｍＭのＥＤＴＡを氷酢酸でｐＨ７．７５に調節する。
【０１５０】
Ｈｅｐｅｓ緩衝液、２００ｍＭ（１リットルに対する必要量）
ＥＤＴＡ                      ０．７４４ｇ        Ｓｉｇｍａ
Ｈｅｐｅｓ                    ４７．６ｇ          Ｓｉｇｍａ
氷酢酸でｐＨ７．７５に調節する。
【０１５１】
ＵＢＩ緩衝液（ＵＢＩのデータ・シートの通り）
２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．２
２５ｍＭ  β−グリセロリン酸
５ｍＭ  ＥＧＴＡ
１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム
１ｍＭジチオスレイトール
【０１５２】
ＪＮＫアッセイ緩衝液（ｘ１０濃縮物に対する配合）
２５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５                Ｓｉｇｍａ
１．５Ｍ  塩化ナトリウム              Ｓｉｇｍａ
２００ｍＭ塩化マグネシウム            Ｓｉｇｍａ
０．０１％ツイーン２０                  Ｓｉｇｍａ
使用時に２０ｍＭのジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ）および１５０μＭのＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を添加する。
【０１５３】
ＡＤＰ変換試薬（６００ｍｌに対する必要量）
ピルビン酸キナーゼ（５００００ユニット）              ２０ｍｌ      Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
１Ｍホスホエノールピルビン酸（モノナトリウム塩）  １０ｍｌ      Ｓｉｇｍａ
２Ｍ酢酸カリウム                                １００ｍｌ      Ｓｉｇｍａ
Ｔｒｉｓ酢酸緩衝液、ｐＨ７．７５                        ４７０ｍｌ
最終濃度
ストック        反応混合物
ＰＫ              ７．６Ｕ／ｍｌ          ０．８Ｕ／ｍｌ
ＰＥＰ              １．６７ｍＭ          １７５ｎＭ
酢酸カリウム    ３３ｍＭ            ３．５ｍＭ
【０１５４】
付属２：供給者
Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ        Ｄｙｎｅｘ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ
Ｂｌｅｉｃｈｓｔｒａｓｓｅ  ５６−５８                    Ａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｒｔ
Ｄ−７５１７３  Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ                      Ａｓｈｆｏｒｄ  Ｒｏａｄ
Ｇｅｒｍａｎｙ                                Ａｓｈｆｏｒｄ
Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ  ＴＷｌ５  １ＸＢ
Ｂｉｏｔｒａｃｅ  Ｌｔｄ                            Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｏｙ
Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ                        Ｓｏｒｖａａｊａｎｋａｔｕ  １５
Ｂｒｉｄｇｅｎｄ                                Ｈｅｌｓｉｎｋｉ
ＣＦ３ｌ  ３ＮＡ                                Ｆｉｎｌａｎｄ
００８１０
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  （ＵＫ）  Ｌｔｄ        Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐａｒｋ              Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｏｕｓｅ
Ｐａｄｇｅ  Ｒｏａｄ                              ２０４  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐａｒｋ
Ｂｅｅｓｔｏｎ                                  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＣＢ４  ＯＧＺ
Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ＮＧ９  ２ＪＲ
ＣｏｎＣｅｌｌ  ＢＶ                              Ｓａｒｓｔｅｄｔ
Ｗｅｖｅｌｉｎｇｈｏｖｅｎ  ２６                        ６８  Ｂｏｓｔｏｎ  Ｒｏａｄ
Ｎｅｔｔｅｔａｌ                                Ｂｅａｕｍｏｎｔ  Ｌｅｙｓ
Ｄ−４１３３４                                  Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ  ＬＥ４  ｌＡＷ
Ｇｅｒｍａｎｙ
Ｅｕｒｏｐａ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ                  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ  Ｌｔｄ
Ｅｕｒｏｐａ  Ｈｏｕｓｅ                            Ｆａｎｃｙ  Ｒｏａｄ
１５−１７  Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｗｉｃｋｅｎ              Ｐｏｏｌｅ
Ｅｌｙ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ                          Ｄｏｒｓｅｔ  ＢＨＩ２  ４ＱＨ
ＣＢ７  ５ＸＷ
Ｆａｈｒｅｎｈｅｉｔ  Ｌａｂ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ                Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．  （ＵＢＩ）
Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ  Ｒｏａｄ                        １９９  Ｓａｒａｎａｃ  Ａｖｅｎｕｅ
Ｒｏｔｈｅｒｈａｍ                              Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ
Ｓｏｕｔｈ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ  Ｓ６０  １ＲＲ                ＮＹ  １２９４６
ＳＡ
Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ              Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ
１  Ａｃｏｒｎ  Ｈｏｕｓｅ                          Ｐ０  Ｂｏｘ  １０
Ｔｈｅ  Ｂｒｏｙｌｅ                              Ｔｕｒｋｕ
Ｒｉｎｇｍｅｒ                                ＦＩ−２０１０１
Ｅａｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ  ＢＮ８  ５ＮＷ                    Ｆｉｎｌａｎｄ
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】プロテインキナーゼＪＮＫ−１に関連するＡＴＰ光出力（相対的光ユニット；ＲＬＵ）の低下を示す図である。３つの異なる実験の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が示される。これらは、２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓの存在下で得られたデータからの結果である。
【図２】活性化されたＪＮＫの存在下および非存在下で得られる光出力（ＲＬＵ）に対するＨｅｐｅｓおよび停止液の影響を示す図である。結果は、三連で行われた２つの異なる実験の平均値±標準偏差（ＳＤ）として表される。対照として、２０μｌの蒸留水が停止液の代わりに添加された。
【図３】ＡＤＰの増大に対するＭＡＰＫ−１／ＥＲＫ−１の影響を示す図である。データは、変換試薬の添加前および添加後のＲＬＵ差として示される。結果は、それぞれの条件について６つの異なる二連実験の平均値±ＳＤを表す。
【図４】光出力の低下に対するＭＡＰＫ−１の濃度を増大させたときの影響を示す図である。結果は、三連で行われた３つの異なる実験の平均値±ＳＥＭとして表される。
【図５】種々の緩衝化条件におけるＡＴＰモニタリング試薬および１２μＭのＡＴＰを用いて観測される初期の光出力およびその後のシグナル減衰を示す図である。示される結果は１つの代表的な実験からのものである。
【図６】ＡＴＰモニタリング試薬の存在下で最初の２分間について測定されるシグナル減衰に対するＪＮＫ−２活性の影響を示す図である。結果は、３つの実験を代表する１つの実験から得られたものである。アッセイは９６ウエル・マイクロタイター・プレートの三連ウエルで行われた。
【図７】光シグナルの減衰に対するＭＡＰＫ−１の濃度を増大させたときの影響を示す図である。この実験ではまた、不活性型形態に対する酵素の活性化形態の影響が比較された。結果は三連の実験の平均値±ＳＤとして表される。
【図８】１μＭのＡＴＰを用いた光出力（ＲＬＵ）に対する種々のキナーゼ緩衝液の影響を示す図である。データは６つの二連ウエルの平均値±ＳＤとして示される。緩衝液の詳細については表１を参照のこと。
【図９】基質としてＡＴＦ−２を用いたＪＮＫ２α２キナーゼ活性の結果としての光出力の減少に対する経時的変化を示す図である。ＡＤＰの検出は、ＡＴＰからのリン酸基の切断を確認する対照として作用するように行われた。ＪＮＫ２α２は５０ｍＵで使用され、ＡＴＦ−２は５．３８μｇで使用された。
【図１０】キナーゼ活性を指標とする、３０℃におけるＡＴＰの減少の経時的なＪＮＫ２α２濃度曲線を示す図である。ＡＤＰ変換試薬は、反応混合物におけるＡＤＰの存在を確認するために添加された。
【図１１】基質としてのｃ−ＪｕｎおよびＡＴＦ−２とともにＪＮＫ２α２を使用する光シグナルの低下の比較を示す図である。
【図１２】光シグナルの濃度依存的低下を伴うＳＡＰＫ３濃度曲線を示す図である。ＳＡＰＫ３濃度はナノモル濃度として示される。
【図１３】（ＭＢＰ基質を用いた）低下した光出力に対するＳＡＰＫ４の濃度依存的影響を示す図である。ＳＡＰＫ４濃度はナノモル濃度として示される。
【図１４】基質としてのＡＴＦ−２の存在下におけるＪＮＫ２α２活性のＡＴＰ検出濃度を増大させたときの影響を示す図である。結果は三連ウエルの平均値±ＳＤである。
【図１５】基質としてのＭＢＰの存在下におけるＳＡＰＫ３活性に対するＡＴＰ濃度を増大したときの影響を示す図である。結果は三連ウエルの平均値±ＳＤとして示される。
【図１６】ＳＡＰＫ３およびＭＢＰの増大する濃度のＡＴＰの存在下におけるＲＬＵの減少を示す図である。ＳＡＰＫ３は７２８ｎＭで使用され、ＭＢＰは１００μｇ／ｍｌの最終濃度で使用された。
【図１７】より大きい反応容量からの２０μｌを使用したとき、およびアッセイが３８４ウエル・マイクロタイター・プレートのウエル内において直接行われたときのキナーゼアッセイの成績の比較を示す図である。
【図１８】ＭＥＫ−１によるＭＡＰＫ２の活性化、その後の、事前に活性化されたＭＡＰＫ−２によるＭＢＰのリン酸化を示す図である。
【図１９】ウエスタン・ブロッティングによるリン酸化ＭＢＰの免疫染色を用いた光シグナルの低下の相関を示す図である。ブロットの左レーンはＭＢＰ非添加対照との相関であり、右レーンは、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＢＩ）のＭＢＰに対するＳＡＰＫ３活性の影響を示す。
【図２０】キナーゼ活性の生物発光アッセイとウエスタン・ブロッティングの結果との比較を示す図である。
【図２１】生物発光検出システムに対するスタウロスポリンの影響を示す図である。結果は三連ウエルの平均値±ＳＤとして表される。
【図２２】（基質としてＡＴＦ−２を用いた）ＪＮＫ２α２活性に対する２つの異なるスタウロスポリン濃度の影響を示す図である。
【図２３】（基質としてＭＢＰを用いた）ＭＡＰＫ−１活性に対するゲニステインの濃度を増大させたときの影響を示す図である。
【図２４】（基質として不活性型ＭＥＫ−１を用いた）ｒａｆ−１活性に対するＰＤ０９８０５９の２つの異なる濃度の影響を示す図である。結果は三連ウエルの平均値±ＳＤである。
【図１】
2004518422.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2004518422.tif 000020
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2004518422.tif 000023
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004518422.tif 000109
【国際調査報告】
2004518422.tif 000110
2004518422.tif 000111
2004518422.tif 000112
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