(57)【要約】式Ｒ1−Ｙ1−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を製造するための方法が提供される。その方法は、式ＰＸ3の化合物を式ＨＮＲ2Ｒ3の化合物と反応させて式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を形成すること、及び、炭化水素溶媒の存在下、前記式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの化合物と反応させて式Ｒ1−Ｙ1−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を形成すること、を含む。Ｒ1はリン保護基を表し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立にアルキル基（好ましくはＣ1-6アルキル基）を表すか、又は、Ｒ2とＲ3が連結し、それらが結合している窒素と共に５−７員環を形成してもよく、Ｙ1はＯまたはＳ（好ましくはＯ）を表し、そして、Ｘはハロゲン（好ましくはＣｌ）を表す。好ましい溶媒はトルエンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）式ＰＸ3の化合物を式ＨＮＲ2Ｒ3の化合物と反応させて式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を形成すること、及び、
ｂ）溶媒の存在下、前記式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの化合物と反応させて式Ｒ1−Ｙ1−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を形成すること、
を含む式Ｒ1−Ｙ1−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を製造するための方法であって、前記ｂ）の反応に使用される前記溶媒が炭化水素溶媒であることを特徴とする方法［ここで、Ｒ1はリン保護基を表し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立にアルキル基を表すか、又は、Ｒ2とＲ3が連結し、それらが結合している窒素と共に５−７員環を形成してもよく、Ｙ1はＯまたはＳを表し、そして、Ｘはハロゲンを表す］。
【請求項２】
前記ａ）工程の式ＰＸ3の化合物と式ＨＮＲ2Ｒ3の化合物との反応が、前記ｂ）工程の式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物と式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの化合物との反応において使用される溶媒と同じ溶媒の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ1がメチル基、式−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5の基、式−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3の基、式−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2の基、式−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮの基、フェニル基、４−クロロフェニル基、２−クロロフェニル基、２−ニトロフェニル基又は４−ニトロフェニル基を表す、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ1が式−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮの基を表し、Ｙ1がＯを表す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ2及びＲ3がそれぞれ独立にＣ1-6アルキル基を表す、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ2及びＲ3がイソプロピル基を表す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｙ1がＯを表す、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＸがＣｌを表す、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記炭化水素溶媒がトルエンである、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｂ）工程の式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物と式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの化合物との反応が塩基の存在下に行われる、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記塩基がトリ（Ｃ1-4アルキル）アミンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）トルエン中で、ＰＣｌ3と［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ−Ｈとを反応させて｛［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ｝2−Ｐ−Ｃｌを形成すること、及び、
ｂ）トルエン中で、｛［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ｝2−Ｐ−ＣｌとＨＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮとを反応させて｛［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ｝2−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮを形成すること、
を含む、｛［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ｝2−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮを製造するための方法。
【請求項１３】
実質的に無水の反応条件が使用される、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
溶媒の存在下、式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの化合物と反応させて式Ｒ1−Ｙ1−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を形成すること、を含む式Ｒ1−Ｙ1−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を製造するための方法であって、前記溶媒が炭化水素溶媒であることを特徴とする方法［ここで、Ｒ1はリン保護基を表し、Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立にアルキル基を表すか、又は、Ｒ2とＲ3が連結し、それらが結合している窒素と共に５−７員環を形成してもよく、Ｙ1はＯまたはＳを表し、そして、Ｘはハロゲンを表す］。
【請求項１５】
Ｒ1がＮＣＣＨ2ＣＨ2−を表し、Ｙ1がＯを表し、Ｒ2及びＲ3がそれぞれイソプロピルを表し、Ｘがクロロであり、そして、前記炭化水素溶媒がトルエンである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ホスフィチル化剤を製造するための方法に関する。
合成オリゴヌクレオチドは、遺伝的疾患及びウイルス性疾患の検出のための重要な診断手段である。さらに、オリゴヌクレオチド及び修飾されたオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現又はタンパク質機能を阻害する治療的候補としての興味が持たれている。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の治療のためのオリゴヌクレオチド類縁体に対するＦＤＡの承認があったこと、及び他のいくつかのオリゴヌクレオチド類縁体が臨床試験中であることから、治療的候補として使用するためにオリゴヌクレオチドの大量合成が益々重要になってきている。一つの臨床試験には、キログラム量の精製オリゴヌクレオチド類縁体が必要である。
【０００２】
オリゴヌクレオチドの製造のために現在使用されている基本的な方法は、ホスホロアミダイト法である。大量のオリゴヌクレオチドに対する需要の増大は、対応して、ホスホロアミダイト化合物の需要を増加させている。ホスホロアミダイト化合物は、一般に、活性化剤の存在下、ホスフィチル化剤によるヌクレオシドのホスフィチル化によって製造される。従って、ホスフィチル化剤に対する需要も、対応して増加してきている。それゆえ、ホスフィチル化剤の製造のための改良法又は別法が望まれている。
【０００３】
本発明によって、式Ｒ1−Ｙ1−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を製造するための方法が提供される。その方法は、
ａ）式ＰＸ3の化合物を式ＨＮＲ2Ｒ3の化合物と反応させて式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を形成すること、及び、
ｂ）溶媒の存在下、前記式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの化合物と反応させて式Ｒ1−Ｙ1−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物を形成すること、
を含み、そして、前記ｂ）の反応に使用される溶媒が炭化水素溶媒であることを特徴とする。ここで、Ｒ1はリン保護基を表す。Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくはＣ1-6アルキル基、を表すか、又は、Ｒ2とＲ3が連結し、それらが結合している窒素と共に５−７員環を形成してもよい。Ｙ1はＯ又はＳ、好ましくはＯ、を表し、そして、Ｘはハロゲン、好ましくはＣｌ、を表す。
【０００４】
Ｒ1で表されるリン保護基は、通例、オリゴヌクレオチド合成に使用される開裂可能なリン保護基であり、例えば、メチル基、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ6Ｈ5、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ（Ｏ）2−ＣＨ2ＣＨ3、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2等の置換又は非置換の脂肪族基であり、好ましくは式−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮの基である。また、リン保護基は、例えば、フェニル基又は置換フェニル基（例えば、４−クロロフェニル基、２−クロロフェニル基、２−ニトロフェニル基又は４−ニトロフェニル基等）等の置換又は非置換の芳香族基である。
【０００５】
式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの化合物は、製造することを望む化合物の性質に基づいて、好適に選択される。式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの好ましい化合物は２−シアノエタノールである。
本発明の方法によって製造された化合物において、Ｒ2とＲ3は同じであることが好ましい。Ｒ2とＲ3が共に−ＣＨ（ＣＨ3）2である場合が特に好ましい。特に好ましくは、Ｙ1はＯであり、そして、Ｒ1は−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮである。
【０００６】
本発明の方法によって製造することができる化合物の例は、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（一般に“テトラホス（ｔｅｔｒａｐｈｏｓ）”として知られている）、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダイト、Ｏ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルホスホロジアミダイト、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−メチルトリフルオロアセチルアミノ−エトキシホスフィン、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−ジフェニルメチルシリルエトキシホスフィン、及びＯ−β−シアノエチル−ビス（Ｎ−モルホリノ）ホスホロジアミダイトを含む。
【０００７】
本発明の方法に使用することができる炭化水素溶媒は、脂肪族炭化水素及び芳香族炭化水素を含む。脂肪族炭化水素の例は、ペンタン、ヘキサン及び石油エーテルを含む。芳香族炭化水素の例は、ベンゼン、トルエン、キシレン及びメシチレンを含む。トルエンが最も好ましい溶媒である。
【０００８】
多くの好ましい実施態様において、反応ａ）は反応ｂ）と同じ溶媒の存在下で実施され、好適にはトルエンの存在下で実施される。
式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物と式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの化合物の反応は、好ましくは、塩基の存在下で行われる。使用することができる塩基は、炭酸ナトリウム等の無機塩基、及び有機塩基を含む。有機塩基が好ましい。有機塩基の例は、ピリジン等の芳香族アミン、及び、アルキルアミン、好ましくはトリ（Ｃ1-4アルキル）アミン、特に好ましくはトリエチルアミン、等のトリアルキルアミン等の無機アミンを含む。
【０００９】
工程ａ）において、式ＰＸ3の化合物と式ＨＮＲ2Ｒ3の化合物のモル比は、通例、約１：１乃至約１０：１の範囲から、好ましくは約３：１乃至約６：１の範囲から選択される。
【００１０】
工程ｂ）において、式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物と式Ｒ1−Ｙ1−Ｈの化合物のモル比は、通例、約１：１乃至約５：１の範囲から選択される。１：１乃至１．５：１の範囲のモル比が特に好ましい。
【００１１】
塩基が使用される場合、塩基と式Ｘ−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の化合物のモル比は、約０．７５：１乃至２：１、好ましくは約１：１乃至１．３：１の範囲から選択される。
本発明の方法の工程ａ）は、通例、室温（例えば、約１５℃乃至約３０℃）から使用される溶媒の還流温度（例えば、約５０℃乃至約１２０℃）までの範囲の温度において実施される。
【００１２】
本発明の方法の工程ｂ）は、通例、約−２５℃乃至室温（例えば約１５℃乃至約３０℃）の範囲、例えば約−２０℃乃至約０℃の範囲の温度において実施される。−２０℃乃至−１０℃の範囲の温度が特に好ましい。
【００１３】
実質的に無水の反応条件が使用されるのが好都合である。
多くの実施態様において、本発明の方法は、窒素又はアルゴン雰囲気下等の不活性雰囲気下で実施される。
【００１４】
式Ｒ1−Ｙ1−Ｐ（ＮＲ2Ｒ3）2の生成化合物は、好適には、蒸留によって反応混合物から分離される。特に好ましくは、ワイプド−フィルム（ｗｉｐｅｄ−ｆｉｌｍ）蒸留によって反応混合物から分離される。
【００１５】
本発明の特に好ましい実施態様は、｛［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ｝2−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮを製造するための方法を含む。その方法は、ａ）トルエン中で、ＰＣｌ3と［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ−Ｈとを反応させて｛［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ｝2−Ｐ−Ｃｌを形成すること、及び、ｂ）トルエン中で、｛［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ｝2−Ｐ−ＣｌとＨＯ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮとを反応させて｛［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ｝2−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮを形成すること、を含む。
【００１６】
本発明は、以下の実施例によって説明されるが、それに限定されるものではない。
［実施例］
工程ａ）
マグネチックスターラー及び窒素バブラーに連結されたコールドフィンガー蒸留ヘッド（ｃｏｌｄ−ｆｉｎｇｅｒ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｈｅａｄ）装着し、窒素を流した、２Ｌ丸底フラスコにジイソプロピルアミン（３８３ｇ）、トルエン（１０８７ｇ）及び水素化カルシウム（１０ｇ）を加えた。そして、その混合物を２時間、還流下で加熱（９８℃）して痕跡量の水分をすべて除去した。そうして乾燥したアミン／トルエン混合物を、メカニカルスターラー、１００ｍＬの均圧（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｅｑｕａｌｉｚｉｎｇ）滴下漏斗、熱ウエル（ｔｈｅｒｍｏｗｅｌｌ）及び窒素バブラーに連結された冷却器が装着された、オーブンで乾燥し、窒素を流した、３Ｌの４口丸底フラスコに蒸留し、そして、室温（約１７℃）まで冷却した。三塩化リン（９９．９９９％、１００ｇ）を、滴下漏斗より約３０分で加えた。混合物の温度が約２５℃に上がるのが観測された。混合物を還流下加熱し（１００−１１０℃）、２４時間撹拌した。この間に、その混合物は、沈澱したジイソプロピルアミン塩酸塩で粘稠となった。混合物を室温に冷却し、そして、窒素下で加圧濾過（ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）によりアミン塩を除いた。なお、すべての器具はオーブンで乾燥後に使用した。濾過ケーキを２１７ｇのトルエンで洗浄した。濾過液と洗浄液を合わせ、減圧下で大部分のトルエンを蒸留で除去した。この間、固体が沈澱し、混合物はドロドロとなった。トルエンの蒸留がなくなってから、窒素により減圧を解き、蒸留容器を、冷却トラップを経由して、真空ポンプに直接連結した。固体生成物、｛［（ＣＨ3）2ＣＨ］2Ｎ｝2−Ｐ−Ｃｌ、が一定の質量になるまで、残留トルエンをポンプで除いた。31ＰＮＭＲで９６−９７面積％を示したこの物質を、それ以上精製することなく工程ｂ）に使用した。
工程ｂ）
マグネチックスターラー及び窒素バブラーに連結されたコールドフィンガー蒸留ヘッドを装着し、窒素を流した、１Ｌ丸底フラスコにトリエチルアミン（４９．４ｇ）、トルエン（６４９．５ｇ）及び水素化カルシウム（５ｇ）を加えた。そして、その混合物を２時間、還流下で加熱（９８℃）して痕跡量の水分を除去した。そうして乾燥した混合物を、メカニカルスターラー、熱ウエル、及び窒素バブラーに連結された５０ｍＬの均圧滴下漏斗が装着され、ジャケットで覆った（ｊａｃｋｅｔｅｄ）、オーブンで乾燥し、窒素を流した、２Ｌの３口丸底フラスコに蒸留した。その混合物を、循環冷却器を使い、反応容器のジャケットにエチレングリコール／水をポンプで通して、−１５℃以下に冷却した。そして、そこに工程ａ）の生成物（１３０．３ｇ）を加えた。温度を−１０℃以下に保ちながら、約３０分で滴下漏斗より２−シアノエタノール（３９．９ｇ）をそのまま（ｎｅａｔ）で加えた。その混合物を、窒素雰囲気下、−１５℃から−１８℃で１８時間撹拌して反応を完結させた。混合物を室温まで昇温後、窒素下で加圧濾過によりトリエチルアミン塩酸塩を除いた。なお、すべての器具はオーブンで乾燥後に使用された。トルエンをロータリーエバポレーター（浴温約５０℃）により除いた。窒素により減圧を解き、蒸留容器を、冷却トラップを経由して、真空ポンプに直接連結した。残留トルエンをポンプで除き、１３９．５ｇの粗生成物を得た。ワイプド−フィルム（ｗｉｐｅｄ−ｆｉｌｍ）エバポレーター（加熱域（ｈｅａｔｅｄ  ｚｏｎｅ）７０℃、圧力０．００８ｍｍＨｇ）により、１．５時間で、粗生成物を蒸留して１１５．９ｇの生成物を得た。
【００１７】
所望であれば、フラッシュクロマトグラフィー（例えば、ペンタンと乾燥塩基性アルミナを使用）及び、追加のワイプド−フィルム（ｗｉｐｅｄ−ｆｉｌｍ）蒸留によって、生成物をさらに精製することができる。
【国際調査報告】
2006509813.tif 000002
2006509813.tif 000003
2006509813.tif 000004
2006509813.tif 000005