(57)【要約】放射標識されたアネキシンを用いた生体内におけるアポトーシスの画像化の方法を開示する。腫瘍の放射線療法の方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用放射性同位体と結合させたアネキシンを含む組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、当該組成物において前記治療用放射性同位体が103Pd、186Re、188Re、90Y、153Sm、159Gd、および166Hoからなるグループから選択される、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、当該組成物において前記アネキシンがアネキシンVまたはその断片である、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、当該組成物において前記アネキシンおよび前記治療用放射性同位体が、１：１乃至１：２の比で結合している、組成物。
【請求項５】
腫瘍を有する哺乳類対象に、治療用放射性同位体と結合させたアネキシンを含む組成物を、腫瘍を減少させるのに有効な量投与するステップを含む、腫瘍の放射線療法の方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、全身照射、または標的化外部照射とともに使用する方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、標的化内部照射とともに使用する方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、少なくとも１種類の化学療法剤を用いた処理とともに使用する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、当該方法において前記化学療法剤が、ジメチルブスルファン、シクロホスファミド、ビスクロロエチルニトロソウレア、シトシンアラビノシド、および6-チオグアニンからなるグループから選択される、方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の方法であって、全身照射および少なくとも１種類の化学療法剤を用いた処理とともに用いる、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、当該方法において前記化学療法剤が、ジメチルブスルファン、シクロホスファミド、ビスクロロエチルニトロソウレア、シトシンアラビノシド、および6-チオグアニンからなるグループから選択される、方法。
【請求項１２】
請求項５に記載の方法であって、TNF、TRAILおよびFasからなるグループから選択されるアポトーシス誘導物質とともに使用する、方法。
【請求項１３】
請求項５に記載の方法であって、TNF結合抗体、TRAIL結合抗体、およびFas結合抗体からなるグループから選択されるアポトーシス誘導物質とともに用いる、方法。
【請求項１４】
請求項５に記載の方法であって、前記治療用放射性同位体が103Pd、186Re、188Re、90Y、153Sm、159Gd、および166Hoからなるグループから選択される、方法。
【請求項１５】
請求項５に記載の方法であって、前記アネキシンがアネキシンVまたはその断片である、方法。
【請求項１６】
腫瘍の放射線療法の方法であって、腫瘍を有する対象を化学療法剤で処理するステップと、処理した対象に治療用放射性同位体と結合させたアネキシンを含む組成物を腫瘍を減少させるのに有効な量投与するステップと、を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記化学療法剤が、ジメチルブスルファン、シクロホスファミド、ビスクロロエチルニトロソウレア、シトシンアラビノシド、および6-チオグアニンからなるグループから選択される、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記対象にTNF、TRAILおよびFasからなるグループから選択されるアポトーシス誘導物質を投与するステップをさらに含む、方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、前記対象にTNF結合抗体、TRAIL結合抗体、およびFas結合抗体からなるグループから選択されるアポトーシス誘導物質を投与するステップをさらに含む、方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記治療用放射性同位体が103Pd、186Re、188Re、90Y、153Sm、159Gd、および166Hoからなるグループから選択される、 方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、当該方法において前記アネキシンがアネキシンVまたはその断片である、方法。
【請求項２２】
毒素と結合させたアネキシンを含む、組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、前記毒素が、E.コリ、サルモネラSp.、リステリアSp.、シガトキシン、および関連する海産ポリエーテル、ならびにアフラトキシンからなるグループから選択される毒素である、組成物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の組成物であって、当該組成物において前記アネキシンがアネキシンVまたはその断片である、組成物。
【請求項２５】
請求項２２に記載の組成物であって、前記アネキシンおよび前記毒素が１：１乃至１：４の比で結合している、組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連事項】
【０００１】
本願研究は部分的にNIH助成金HL-47151の支援を受けた。従って、アメリカ合衆国政府は本願発明についていくらかの権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、引用をもって内容全体を本出願に援用するものとする2001年4月3日に出願された米国特許仮出願第60/281,352号の優先権を主張する。
【０００３】
発明の分野
本願発明は生体内における細胞死の画像化の方法に関連する。特に、本願発明はガンマ線画像法を用いた哺乳類における細胞死の画像領域への、放射標識されたアネキシンの使用に関連する。
【０００４】
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【０００５】
発明の背景
アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死は、発達ならびに多数の恒常性維持プロセスおよび疾患プロセスに重要な役割を果たしている(Thompson, 1995)。したがって、さまざまな疾患の新規の治療戦略が、アポトーシス的な細胞死の調節によって可能となりうる。アポトーシス的な細胞死を促進または阻害する新規の薬理学的物質の研究は、生体内におけるアポトーシス的な細胞死を検出または監視する非侵襲的な方法がないために、妨げられてきた。
【０００６】
脂質の水素核磁気共鳴分光法（1H NMRS）は、リンパ芽球の原形質膜およびアポトーシス的な細胞死を迎えているその他の細胞の組成および／または流動性の特異的な変化を検出する上で、有用であることが明になっている(Blankenberg, et al., 1996)。アポトーシスを研究するために脂質の1H NMRSを臨床的に使用することは、多くの組織および器官において天然に認められる複雑な局所的磁気微小環境によって、現在は制約されている。
【０００７】
発明の概要
ある局面では、本願発明には生体内における哺乳類対象のある領域における細胞死（たとえばアポトーシスまたは壊死による細胞死）の画像化の方法が含まれる。本願方法には、（a）直接または間接的に生物適合性の放射性核種に結合させたアネキシンを前記対象に投与するステップ、（b）前記の標識されたアネキシンが前記対象内に局在化しうる時間の経過後に、放射線検出装置の検出フィールド内に前記対象を配置するステップと、（c）対象内に局在化した放射性核種からの放射線放出を放射線検出装置で測定し、放射線放出の画像であって当該画像が前記哺乳類対象の前記領域内における細胞死を表す画像を作成するステップが含まれる。ある実施態様では、前記方法には（d）前記の標識されたアネキシンの、腎における非特異的な局在化など、非特異的な局在化によって発生したシグナルを前記画像から差し引く処理を行うステップがさらに含まれる。
【０００８】
前記方法に有用な放射性核種には、ヨウ素123、ヨウ素131、ガリウム67、インジウム111、フッ素18、およびテクネチウム99m(Tc99m)が含まれる。フッ素18は陽電子放射体であり、そのため陽電子放出断層撮影（PET）には有用であることは理解されよう。ヨウ素123、ヨウ素131、ガリウム67、インジウム111およびテクネチウム99mは標準のガンマ線検出法に有用である。Tc99mは本発明の方法での使用に好適な放射性核種である。好ましい実施態様では、ヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）を介してTc99mとアネキシンを連結する。Tc99m標識されたアネキシンは典型的には、約5乃至約20mCiの線量を投与する。
【０００９】
本願発明のある一般的な実施態様では、放射線検出装置はガンマ線検出装置であって、測定される放射線放出はガンマ線放出である。別の一般的な実施態様では、前記放射線検出装置は陽電子放出検出装置であって、測定される放射線放出は陽電子放出である。
【００１０】
さらに別の一般的な実施態様では、前記方法にはさらに、特定の間隔をあけた（b）および（c）のステップの繰り返しであって、当該繰り返しが、前記領域の放射線放出（たとえばガンマ線または陽電子放出）の強度の変化を経時的に追跡するために有効であって、細胞死を迎えている細胞の数の変化が反映される、繰り返しが含まれる。
【００１１】
さらに別の一般的な実施態様には、特定の間隔をあけた（b）および（c）のステップの繰り返しであって、当該繰り返しが前記領域のガンマ線放出の局在化の変化を経時的に追跡するために有効であって、細胞死を迎えている細胞の位置の変化が反映される、繰り返しが含まれる。
【００１２】
前記放射線検出装置は、たとえば、アンガーガンマ線シンチレーションカメラまたは３次元画像化カメラであってよい。
【００１３】
本願発明に使用される好ましいアネキシンはアネキシンVである。典型的には、用量がタンパク質約300μg/kg未満、好ましくはタンパク質約1乃至10μg/kgを投与する。投与経路は静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、鞘内、および胸腔内投与を含むいくつかの経路が可能である。
【００１４】
画像の作成のためのガンマ線放出の測定は、典型的には、標識されたアネキシンの投与後、約5分間乃至約2時間後に行う。ある実施態様では、画像の作成のためのガンマ線放出の測定は、標識されたアネキシンの投与から約1時間後に行う。
【００１５】
本願明細書に開示される方法を用いて、前記対象のさまざまな部分を画像化してよい。たとえば、前記領域には、実質的には対象全体、または頭部もしくはその部分、心臓もしくはその部分、および肝臓もしくはその部分などの対象の一部分を含んでよい。
【００１６】
本願発明はまた、生体内における細胞死の画像化のためのキットも提供する。前記キットには、（i）たとえば材料および方法（A）に記載のとおり調製された、HYNIC標識アネキシンを含有する密封バイアルと、（ii）たとえば材料および方法（B）に記載のとおり調製されN2下で維持された、Sn-トリシン溶液を含有する密封バイアルと、（iii）（I）および（ii）の構成要素およびTc-99mを用いたTc-99m標識されたアネキシンの生成の説明書と、（iv）生体内における細胞死の領域を画像化するためのTc-99mアネキシンの投与の説明書とが含まれる。ある実施態様では、前記キットは-70℃で維持し、ドライアイスで輸送する。別の実施態様では、HYNIC標識アネキシンを凍結乾燥する。
【００１７】
別の局面では、本願発明は、たとえば103Pd、186Re、188Re、90Y、153Sm、159Gd、または166Hoなどの治療用の放射性同位体とたとえば直接的または間接的に結合させた、たとえばアネキシンVなどのアネキシンを含む組成物を提供する。治療用の放射性同位体および前記アネキシンは、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、または2:1の割合（治療用の放射性同位体：アネキシン）で結合させてよい。任意の上述の値を上限および／または下限として組み合わせて用いる値の範囲も本願発明に含まれることを意図する。ある実施態様では、前記アネキシンは、たとえばデキストランまたはその変種などのポリマー構造物を介して治療用の放射性同位体と結合させる。
【００１８】
さらなる局面では、本願発明は、腫瘍を有する哺乳類対象に、たとえば直接または間接的に治療用の放射性同位体を結合させたアネキシンを含む組成物を腫瘍を減少させるのに効果的な量投与することによる腫瘍の放射線療法の方法を提供する。前記の方法は、全身照射、または標的化外部照射、または内部照射療法、および／または少なくとも１種類の化学療法剤（たとえばジメチルブスルファン、シクロホスファミド、ビスクロロエチルニトロソウレア、シトシンアラビノシド、または6-チオグアニン）を用いた治療法と組み合わせて用いてもよい。さらに、本願方法は生物学的に活性な抗癌剤およびTNF、TRAIL、もしくはFasなどのアポトーシス誘導物質、またはこの受容体に結合してアポトーシスを誘導する抗体、小分子、もしくはファルマコフォアとともに用いてもよい。
【００１９】
別の局面では、本願発明は、腫瘍を有する対象を化学療法剤で処理するステップと、それに続いて治療用の放射性同位体を結合させたアネキシンを含む組成物を腫瘍を減少させるのに効果的な量投与するステップを含む、腫瘍の放射線療法の方法を特徴とする。
【００２０】
治療用の物質と結合させたアネキシンの投与のタイミングは、治療介入の有効性を左右する。修飾したアネキシンは、標的組織のアポトーシスまたは壊死の時点でのバイオアベイラビリティを確保できる時点に投与されるべきである。放射標識されたアネキシンVを用いた診断用の画像化研究によると、治療用に修飾したアネキシンの投与は、損傷を受けた腫瘍におけるアネキシンの局在化の有用度を最適にするために、好ましくは複数の代謝拮抗薬（いわゆるCHOPまたはMOPP療法）を用いたリンパ腫の化学療法の経過が完了してから24時間以内に行うべきであるということを示唆している。投与に最適な時間は、患者における画像化研究によって示されたとおり、乳癌、肺癌、または肉腫などの充実性腫瘍の化学療法による治療から36、48、60、または72時間以内であってよい。アポトーシスの程度を決定するための放射標識されたアネキシンなどの診断用の画像化剤の使用は、治療用に修飾されたアネキシンの投与に適した患者の選定、および治療用に修飾されたアネキシンの最適な投与量を決定するために用いてよい。
【００２１】
別の局面では、本願発明は、たとえばE.コリ、サルモネラSp、リステリアSp、シガトキシンおよび海産ポリエーテル、ならびにアフラトキシンなどの毒素を結合（直接または間接的に）させた、たとえばアネキシンVなどのアネキシンまたはその断片を含む組成物を提供する。
【００２２】
これらおよびその他の物質、ならびに本願発明の特性は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面とともに読めば、さらに詳細に明らかになるであろう。
【００２３】
発明の詳細な説明
I.  定義
本願明細書に用いられる「細胞死」という用語には、哺乳類細胞を死滅させるプロセスが含まれる。このようなプロセスには、アポトーシス（可逆的および非可逆的の両方）およびアポトーシスに関与すると考えられるプロセス（たとえば細胞の老化）、ならびに壊死が含まれる。本願明細書で用いられる「細胞死」は、有核細胞（たとえばニューロン、心筋細胞、および肝細胞など）の死または切迫した死、または無核細胞（たとえば赤血球、および血小板など）の死または切迫した死を意味する。典型的には、原形質膜の外側の小葉上にPSが露出することによって細胞死が顕在化する。
【００２４】
本願明細書に記載の「対象」には、温血動物であって、好ましくはヒトを含む哺乳類が含まれる。好ましい実施態様では、前記対象は霊長類である。さらに好ましい実施態様では、前記対象はヒトである。細胞死は、たとえば対象の器官（たとえば脳、心、肝、肺、膵、大腸）またはその部分、または対象の腺（たとえば前立腺、下垂体、または乳腺）もしくはその部分において、画像化または検出されることがある。
【００２５】
本願明細書に用いられる対象に「投与する」という用語には、非経口または経口経路のいずれか、筋肉内注射、皮下／皮内注射、静脈内注射、舌下投与、経皮送達、および直腸、結腸、膣、鼻内、または呼吸管経路による投与を含む、対象における望ましい位置への本願発明の組成物送達のために、前記組成物を任意の好適な経路によって対象に投与、送達、または適用するステップが含まれる。
【００２６】
本願発明の組成物は、望ましい結果を達成するために有効な量を、必要な投与量および期間、対象に投与してよい。本願発明の組成物の有効な量は、対象のたとえば腫瘍期などの病期、年齢、および体重、ならびに組成物が前記対象において望ましい応答を発現する能力などの因子によって変化してもよい。有効な量はまた、前記組成物の任意の有毒または有害な作用（たとえば副作用）を治療上または診断上の有益な作用が上回る量である。本願発明の組成物はたとえばタンパク質1乃至1000 μg/kg、タンパク質1乃至900 μg/kg、タンパク質1乃至800 μg/kg、タンパク質1乃至700 μg/kg、タンパク質1乃至600 μg/kg、タンパク質1乃至500 μg/kg、タンパク質1乃至400 μg/kg、タンパク質1乃至300 μg/kg、タンパク質1乃至200 μg/kg、タンパク質1乃至100 μg/kg、タンパク質10乃至100 μg/kg、タンパク質10乃至80 μg/kg、タンパク質10乃至60 μg/kg、タンパク質10乃至40 μg/kg、またはタンパク質10乃至20 μg/kgの濃度で投与してよい。
【００２７】
「生体適合性放射性核種」または「生体適合性放射性同位体」とは、核医療用に患者に注射するために有用であると認められている同位体である。生体適合性放射性核種の例には、ヨウ素123、ヨウ素131、ガリウム67、インジウム111、フッ素18、およびテクネチウム99mが含まれる。
【００２８】
II.  細胞死――アポトーシスおよび壊死
アポトーシスとは、細胞が「細胞の自殺」プログラムを実行する「プログラムされた細胞死」を意味する。アポトーシスプログラムは、実質的にすべての多細胞生物および特定の生物のすべての細胞に、進化の過程を通して保存されていると考えられている。さらに、多くの場合、アポトーシスは、健全に生き延びている細胞において積極的に阻害されなければならない「デフォルト」のプログラムであるとも考えられている。
【００２９】
細胞がアポトーシスに従うと決定するには、さまざまな調節刺激および環境因子が影響すると考えられる（Tompson, 1995）。アポトーシスの生理学的なアクチベータには、腫瘍壊死因子（TNF）、Fasリガンド、トランスフォーミング成長因子β、神経伝達物質グルタミン酸塩、ドーパミン、N-メチル-D-アスパル酸塩、成長因子の消退、基質結合の消失、カルシウムおよびグルココルチコイドが含まれる。損傷に関連するアポトーシスの誘導因子には、熱ショック、ウイルス感染、細菌毒素、発癌性myc、relおよびE1A、腫瘍抑制因子p53、細胞溶解性T細胞、酸化物質、フリーラジカル、および栄養欠損（代謝拮抗物質）が含まれる。治療に関連するアポトーシス誘導因子には、ガンマ線、紫外線、ならびにシスプラチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、窒素マスタード、メトトレキセート、およびビンクリスチンを含むさまざまな化学療法薬が含まれる。毒素に関連する誘導因子またはアポトーシスには、エタノールおよびd-アミロイドペプチドが含まれる。アポトーシスは、ニューロンなどの通常は再生しない細胞中に病理学的に生じる場合、特に壊滅的な結果をもたらすことがある。このような細胞は死滅しても置換されないために、罹患した器官を衰弱させ、時に致命的な機能不全を引き起こすこともある。このような機能不全は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、網膜色素変性症、および小脳変性症を含む、大量のアポトーシスに伴う数々の神経変性疾患に明らかである。
【００３０】
望ましくないアポトーシスがもたらす結果は、心筋梗塞、再灌流障害、および脳卒中などの場合に典型的に生じる虚血性障害を含むそのほかの病変にも同様に壊滅的である可能性がある。特に、アポトーシスは、軽度の病巣虚血後、長時間経過してから生じる梗塞の中心的な役割を果たしていると考えられている（Du, et al. 1996）。大量のアポトーシスに随伴するさらなる疾患には、AIDS、再生不良性貧血などの骨髄異形成症候群、および過剰なアルコール摂取に起因する損傷を含む肝疾患を引き起こす毒素が、それらに限定されずに含まれる。
【００３１】
壊死は、アポトーシス以外（つまり細胞に固有の自殺プログラムの実行以外）の原因による細胞または組織の局所的な死滅である。壊死は外傷性損傷、細菌感染、および急性低酸素症などによって生じることがある。これら2種類の細胞死にはいくらかの重複があり、損傷の重症度によって、いくらかの刺激が壊死もしくはアポトーシスのいずれか、または部分的に両方ともを生じることがある。
【００３２】
III.  生物学的な膜の非対称性
一般に、生物学的な膜は特異的膜リン脂質に関して非対称であると考えられている。特に、真核細胞の細胞膜の外層は主にスフィンゴミエリンおよびホスファチジルコリン（PC）などのコリンリン脂質で形成されているが、内層は主にホスファチジルセリン（PS）およびホスファチジルエタノールアミン（PE）などのアミノリン脂質で形成されている。この非対称性は、二重の層の間をPEとPSを選択的に輸送するアデノシン３リン酸（ATP）依存性アミノリン脂質トランスロカーゼの活性によって維持されていると考えられている（Seigneuret and Devaux, 1984）。層間のリン脂質の輸送に関与すると考えられているそのほかの酵素には、ATP依存性フロッパーゼ（Connor, et al., 1992）および脂質スクランブラーゼ（Zwaal, et al., 1993）が含まれる。
【００３３】
正常な細胞にとっては非対称性が標準のようであるが、このような非対称性の消失はいくつかの生理学的および病理学的なプロセスに関連する。たとえば、細胞の外層の小葉上へのPSの出現（「PS露出」）として検出される膜の非対称性は、DNAの断片化、細胞膜の水疱化、および膜の統合性の消失に先立つ、アポトーシスの最も初期の徴候の１つであると認識されている(Martin, et al., 1995; Fadok, et al., 1992)。
【００３４】
同様の再配向は、鎌形赤血球病(Lane, et al., 1994)、「B-サラセミア」(Borenstain-Ben Yashar, et al., 1993)、血小板活性化、およびPS輸送に障害があるいくつかの突然変異腫瘍細胞株に認められる。外層へのPSの漸次的な出現も、老化した赤血球に生じることが観察されている(Tait and Gibson, 1994)。このような細胞上へのPSの露出が閾値に達すると、その細胞はマクロファージによって循環から除外される(Pak and Fidler, 1991)。上述の症状すべてにおいて、大半が罹患細胞（すなわち顕著なPS露出を伴う細胞）の死滅に終わる。
【００３５】
PS露出はアポトーシスおよび壊死の両方の構成要素であると理解されよう。アポトーシスの初期段階でのその役割は上に要約されている。アポトーシス細胞がアポトーシスの最終段階に達すれば、両層の中にあるPSが細胞外環境に「露出」されるものと理解されよう。壊死による細胞死にも同様の状況が存在し、その場合には膜の統合性の消失は、壊死細胞の死滅プロセスの開始要因となるか、または壊死細胞の死滅プロセスの初期に生じる。したがって、このような壊死細胞も、原形質膜の両層が「露出」しており、「露出した」PSを有する。
【００３６】
IV.  アネキシン
タンパク質のアネキシンファミリーは本願発明の実施に有用である。アネキシンVは、通常、胎座、リンパ球、単球、胆管および腎尿細管（皮層）上皮を含む、多数の細胞の細胞質に大量に認められる。アネキシンの生理学的な機能は完全に解明されているわけではないが、アネキシンのいくつかの特性のために、アネキシンは診断および／または治療物質として有用である。特に、アネキシンは、ホスファチジルセリン（PS）が露出した表面を有する膜層など、アニオン性のリン脂質の表面に非常に高い親和性があることが明らかになっている。
【００３７】
V.  実験結果の概要
本願発明を支持する実験を行い、放射標識されたアネキシンの投与を生体内における細胞死の画像化に使用できることが示されている。たとえば、例１の実験では、精製したJo2抗体のマウスへの注射に応答した、Fasが媒介した肝細胞の死滅の画像化および定量化を説明している(Ogasawara, et al., 1993)。これらの実験の結果は（たとえば図１参照）、放射標識されたアネキシンVの肝への取り込みが、１時間経過時点では２倍、２時間経過時点では４倍増加していることを示した。これは、具体的にはJo2抗体注射後のFasを媒介した肝細胞死のためである。脾への取り込みは、処理直後に一時的に２倍増加し、その後対象値に減少していることも認められている。この脾からのシグナルの減少は、処理後におきた、Fasが媒介したアポトーシスの急増に応じた循環および脾リンパ細胞からの急速なクリアランスによると考えられる。
【００３８】
アネキシンの結合は腎でも認められた。しかし、この結合は任意のアポトーシス誘導刺激の欠如下において存在し、実際、肝細胞シグナルが増加すると減少した。抗Fas Ab投与後に、時間とともに腎活性が漸進的に減少し、同期間中に肝への取り込みが増加したことは、アネキシンVがアポトーシスに関連しない腎に示す親和性はアポトーシス組織に示す親和性よりも低いことを示唆している。注射されたアネキシンVの腎皮質結合は、部分的には、腎尿細管リン脂質とのアネキシンの交差反応のためかもしれない。
【００３９】
標識されたアネキシンの腎からの排出は少なく、放射標識（この場合Tc99m）が実験の期間中、アネキシンに連結したままだったことが示唆される。さらに、注射されたTc99m標識されたアネキシンは、急速に血流から排出され、血清半減期は約3乃至7分であった。これらの因子により、放射性医薬品の投与後１乃至２時間の時点における放射性医薬品のシグナルの画像化が可能になった。
【００４０】
上述の特性は、放射標識されたアネキシンVの注射の時点における目的の組織または機器官を用いた、アポトーシス活性のスナップショットである、連日（または１日おき）の画像化研究を可能にする。
【００４１】
VI.  生体内における細胞死の画像化
ある局面では、本願発明には生体内における哺乳類対象の領域の細胞死（たとえばアポトーシスまたは壊死による）の画像化の方法が含まれる。この方法では、放射標識アネキシン（たとえばテクネチウム99mで標識されたアネキシンV）を前記対象に投与する。前記複合体が前記対象において局在化を達成することができる時間が経過した後、前記対象をガンマ線検出装置の検出フィールドの中に配置する。前記ガンマ線検出装置を用いて前記テクネチウム99mからのガンマ線放出を測定している間、前記対象を実質的に固定した状態に維持する。測定後、ガンマ線放出の画像を作成する。次に、そのように作成された画像は、前記哺乳類対象の細胞死の領域、または前記哺乳類対象の分析される領域の地図または局在化を担当医に提供するために用いる。
【００４２】
上述の方法を用いて入手した画像の解釈を容易にするために、前記画像をデジタル処理して背景ノイズおよび／またはアネキシン/Tc99m複合体の非特異的局在（たとえば腎の局在）を除去してもよい。
【００４３】
上述の方法の利点は、ガンマ線放出を測定し特定の間隔で画像を形成することによって、前記方法を用いて、細胞死を迎えている細胞の数の変化を反映する前記対象からのガンマ線放出の強度の変化を経時的に追跡することができる。このようなアプローチを用いて、細胞死を迎える細胞の分布の変化を反映する前記対象からのガンマ線放出の局在の変化を追跡してもよい。
【００４４】
A.  放射標識されたアネキシンの合成
本願発明は、精製された野生型、組換え、または合成的に調製したアネキシンを用いて実施することができる。たとえばアネキシンVは、ヒト胎座から便利に精製することができる(Funakoshi, et al., 1987)。しかし、組換えアネキシンには、調製の容易さや経済的な効率を含むいくつかの利点がある。数多くのさまざまなアネキシンがヒトおよびそのほかの生物からクローニングされている。その配列は、GenBankを含む配列データベースで入手することができる。
【００４５】
本願発明は、いくつかの理由により、アネキシンVを用いて実施することが好ましい。第１に、アネキシンVは最も豊富なアネキシンの１種である、（ii）天然または組換え供給源から産生するのが簡単である、および（iii）リン脂質膜への親和性が高い（Tait, et al., 1988）。ヒトアネキシンVは、分子量が36kdであって、ホスファチジルセリン（PS）への親和性が高い（kd=7 nmol/L）。ヒトアネキシンVの配列はGenBankから登録番号U05760-U05770として入手することができる。
【００４６】
本願発明で使用するためのアネキシンを作製するために好適な例示的な発現系は、材料および方法の欄に記載する。そこでは、E.coliのpET12a発現ベクター（ノバジェン社、ウイスコンシン州マジソン）を用いる。
【００４７】
その他の細菌発現ベクターも使用してよい。それらには、たとえばプラスミドpGEX（Smith, et al. (1988) Gene 67:31）およびその誘導体（たとえばファルマシアバイオテック社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）のpGEXシリーズ）が含まれる。これらのベクターは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼとインフレームで融合したクローニングされたインサートのポリペプチド配列を発現する。組換えpGEXプラスミドは、適当な株にトランスフォームすることができ、融合タンパク質の産生はIPTG（イソプロピル-チオガラクトピラノシド）の添加によって誘導することができる。可溶化した組換え融合タンパク質を、標準の方法（Ausubel, et al.）に従って、グルタチオンアガロースアフィニティクロマトグラフィを用いて、誘導した培養液の細胞ライセートから精製することができる。そのほかの市販の発現系には、インビトロジェン社（カリフォルニア州サンディエゴ）のPichia発現キットなどの酵母発現系、バキュロウイルス発現系（Reilly, et al.、Beames, et al.：クローンテック社、カリフォルニア州パロアルト）、および哺乳類細胞発現系（クローンテック社、カリフォルニア州パロアルト、ギブコ-BRL社、メリーランド州ガイザーズバーグ）が含まれる。
【００４８】
培養培地への発現した配列の分泌を促進するリーダー配列など、多数の特性を発現ベクターに組み込むことができる。組換え的に産生されたポリペプチドは、典型的には溶解細胞または培養培地から単離する。
【００４９】
上述の通り産生した単離された組換えポリペプチドは、ディファレンシャル沈降、分子ふるいクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、等電点分離法、ゲル電気泳動法、およびアフィニティクロマトグラフィを含む、標準のタンパク質精製手順によって精製してよい。タンパク質調製物も、たとえば濾過によって濃縮することができる（アミコン社、マサチューセッツ州ダンバーズ）。
【００５０】
上述の通り産生したアネキシンは、次いで特定の放射性核種で標識する。選択される特定の同位体は本願明細書が請求する方法の特定の用途によって異なるだろう。
【００５１】
本願発明は、現在入手可能な多様な放射性核種の任意の１種を用いて実施してもよい。好適な放射性核種を選択する場合、施行者は典型的には本願発明の特定の用途とともに一般に核画像化に共通する因子を考慮するだろう。このような因子には、（i）最小の粒子放出、（ii）一次光子エネルギーが約50乃至500 kEv、（iii）投与する物質の調製に必要な時間よりも長い物理学的な半減期、（iv）検査時間よりも長い有効半減期、好適な化学形態および反応性、低い毒性、およびその放射性同位体で標識したアネキシンの安定または安定に近い状態が含まれる。
【００５２】
例示的な放射性核種は半減期が６時間であるTc99mであって、アネキシンを高い比放射能に標識するために用いることができる。Tc99mは上述の条件をほとんど満たしており、80%を超える核医療用画像法に用いられている。使用してもよいその他の同位体には、ヨウ素123（半減期〜13.2時間）、ヨウ素131（半減期〜8日間）、ガリウム67（半減期〜78時間）、およびインジウム111（半減期〜2.8日間）が含まれる。
【００５３】
前記同位体のアネキシンへの連結は、既知の技術を用いて行うことができる。たとえば、Tc99mは、後述の材料および方法のセクションに記載の通り、たとえばカナダ、ブリティッシュコロンビア州ラングレイのAnorMED社から入手できるヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）基を経由して、アネキシンと連結することができる。ガリウム67およびインジウム111は、たとえば、引用により本願明細書に援用するHnatowich, et al. 1983に記載の方法を用いて、タンパク質を放射標識するために使用することができる。
【００５４】
その他にも放射性核種でタンパク質を標識する方法が知られている。たとえば、1996年9月03日に発行された米国特許第5,552,525号（Dean）は、テクネチウム99m（Tc99m）で標識されたペプチドの作製を教示する。Tc-99mを用いたペプチドおよびポリペプチドの標識の方法は、米国特許第5,443,815号および5,508,020号にも開示されている。Lind et al.,（1990）は、Tc-99mで標識されたモノクローナル抗体を教示する。LaMuraglia, et al., (1989) は111In標識 非特異的ヒト免疫グロブリンを教示し、Fischman, et al., (1991) は化学走化性ホルミルペプチド (fMLF)--111In-標識DTPA 複合体を教示する。
【００５５】
B.  放射標識されたアネキシンの投与
放射標識されたアネキシンは、放射標識された化合物の投与の標準的なプロトコルを用いて投与してよい。投与量は主に２つの点を考慮することによって変化する。つまり（i）注射された放射性核種の量および種類、（ii）注射されたアネキシンタンパク質の量である。
【００５６】
テクネチウム99mはヒト成人に最高約20mCiまでの線量を投与することができる。Tc99mの単回投与に好ましい線量は、約5乃至20mCiである。
【００５７】
アネキシンVは、約300μg/kgを超える投与量で薬理学的な作用（抗凝固作用）を有し始める。したがって、本願発明の診断方法（標識されたアネキシンの薬理学的な作用を避けるための）は、好ましくは300μg/kg未満、典型的には50μg/kg、の投与量で実施する。このようなより微量な投与量（たとえば10μg/kg乃至50μg/kg）では、動物またはヒト対象において薬理学的または有毒な副作用は報告されていない。
【００５８】
放射標識されたアネキシンは典型的には滅菌食塩水などの好適な輸送媒体に懸濁させている。この媒体は、当業に認識される安定化物質、担体、賦形剤、安定化剤、および乳化剤なども含有してよい。
【００５９】
放射標識されたアネキシンは、核医療画像化用の放射標識されたタンパク質の投与に効果的であると知られているいくつかの経路のいずれかによって投与することもできる。投与の好ましい方法は、静脈内注射（i.v.）である。この方法は、十分に血管新生している、心、肝、および脾などの体内器官の画像化に特に好適である。放射性医薬品の静脈注射の方法が知られている。たとえば、放射標識された医薬品は典型的には、オルデンドルフ／止血器法または静脈内プッシュ法(たとえば Mettler and Guierbteau, (1985)参照)を用いたボーラス注射として投与することが認識されている。
【００６０】
脳を画像化するために、前記の標識されたアネキシンを鞘内に投与することもできる。鞘内投与は、脳脊髄液（CSF）を含有するくも膜下腔に直接化合物を送達する。脊髄領域への送達はまた、くも膜外の脊髄領域への硬膜外注射によって行うこともできる。
【００６１】
気管支鏡検査に使用するには、本願発明のアネキシン化合物は、吸入によって投与してよい。たとえば、前記アネキシン化合物は、たとえば二酸化炭素などの気体など好適な推進剤を入れた加圧容器もしくはディスペンサ、またはネブライザからエアロゾルスプレー状で送達してもよい。
【００６２】
その他の投与形態には、腹腔内（たとえば腎臓透析患者のための）および胸腔内投与が含まれる。特定の用途のために、本願発明は、筋肉内注射、皮下、リンパ管内、吸入法、および経口、膣内および／または直腸投与を含むさらなる送達形態を意図する。
【００６３】
上述の投与形態を実施する方法は当業に既知である。
【００６４】
C.  放射標識されたアネキシンの局在化
前記の標識されたアネキシンを投与後、それを標的組織または器官に局在化させる。この文脈における局在化とは、対象の体内において結合状態の「局在化」した標識されたアネキシンと非結合状態の「遊離」した標識されたアネキシンとの間の平衡状態または疑似安定状態の関係性のいずれかが達成された場合の状態を意味する。このような局在化に要する時間は、典型的には数分間から数十分間である。前記の標識されたアネキシンの血清半減期によって推定することもできる。局在化時間はまた、前記の標識されたアネキシンの標的組織への到達性にも依存する。これは、当業に認識されるとおり、投与形態に依存する。
【００６５】
画像化は好ましくは、前記の標識されたアネキシンの大半がその標的に局在化した後に開始する。Tc99m-標識されたアネキシンVを静脈内投与する場合、半減期の数倍の時間の経過後にこの状態になる。半減期の約10倍の時間（アネキシン／Tc99m複合体の場合は約30乃至240分）が、基本的に完全な局在化が達成されるのに十分な時間だと考えられる。しかし当業者は、上述の〜10倍の半減期の時間よりも短い、または長い時間が経過した時点で、画像化を行うことが望ましいこともあることを理解するだろう。たとえば、血管損傷による細胞死を画像化する場合、標的組織への到達性は非常に高く、特に低用量の標識されたアネキシンを徐々に投与して循環する標識からのシグナルを最小にする場合には、数分で標的部位から強いシグナルを得ることができる。
【００６６】
上述のすべての場合において、当業者は局在化が達成される時間を妥当に推測することができる。さらに、局在化を時間の関数で表した後で、本願発明の方法に従って、標識されたアネキシンからのガンマ線シグナルを画像化してもよい。
【００６７】
D.  ガンマ線検出装置
ガンマ線画像化装置は、対象から放出されたガンマ線から生じるシグナルを長時間蓄積することによって機能する。最も広く用いられているガンマ線検出方法の１つがアンガーガンマ線シンチレーションカメラである(Mettler and Guiberteau, 1985)。この方法は、放射性核種によって放出されたガンマ線を光子に変換し（通常NaI(TI)結晶を使用）、それからその光子を光電子倍増管（PMT）で増幅して電圧信号に変換し、画像を作成するために使用することによって作動する。アンガーシンチレーションカメラの構成要素には、コリメータ、シンチレーション結晶、PMTアレイ、波高分析器、ブラウン管（CRT）、およびコントロールコンソールが典型的に含まれる。前記カメラシステムには、典型的にはコンピュータも含まれる。PMとディスプレイ（たとえばCRT）の間の処理は、アナログかまたはデジタルのいずれかであってよい。アンガーガンマ線の理論および操作の詳細な記述
【００６８】
E.  ガンマ線検出装置のフィールドへの対象の配置
1.  装置の検出フィールド  前記装置の検出はガンマ線の定常的で確実な測定が得られる領域として定義される。ECTを用いて前記画像を作成する場合、前記装置の検出は、ガンマ線放出が確実に測定できる空間全体か、またはECTシステムがスキャンに含まれるようにプログラムされているような空間の一部である。この空間は典型的にはシグナル、非ECTカメラの検出フィールドよりも実質的に大きい。
【００６９】
動物または対象全体がガンマ線検出装置の検出フィールドに、必ずしも入っている必要はないことは理解されよう。たとえば、もし特定の器官からのシグナルの解析に興味がある場合、望ましい情報を得るには、その器官を含む領域のみと周辺の「暗黒」領域からの十分なシグナルを測定する必要がある。
【００７０】
2.  対象の配置：固定
画像を作成するために使用するシグナルを収集するために、前記対象を、画像を作成するために用いられるであろうガンマ線を測定する時間、光検出装置の検出フィールドに配置する。シグナルが十分に強力で、約20ミリ秒未満のうちに測定されたγ線放出から画像を作成できる、および／または前記対象が実質的に画像が劣化するほど画像化平面に対して動くことがなければ、固定のための特別な注意は典型的には必要ない。必要なのは、前記対象が測定時間の間、検出装置のフィールド内に配置されることである。
【００７１】
しかしその一方で、ガンマ線放出測定が約20ミリ秒を超え、前記対象が激しく動く場合には、前記対象の動きの程度に合わせて、ガンマ線放出測定の間、前記対象の固定を確実に行うための注意を考慮し、作成された画像の空間情報を保護すべきである。たとえば、前記対象がヒトであって、光子放出の測定時間がおよそ数秒である場合は、単に前記対象にガンマ線放出測定（画像化）の間、できるだけ静止したままでいるように要求するだけでよい。その一方で、前記対象がマウスなどの動物である場合、前記対象はたとえば麻酔または機械的な拘束器具を用いて固定することができる。
【００７２】
さまざまな拘束器具を作製してよい。たとえば、マウスを数十秒から数分間固定するために効果的な拘束器具は、発泡体のクッション上にガンマ線を透過するシートを固定することによって作製してよい。前記クッションは、一端に動物の頭をのせるくぼみを有する。前記動物の頭がくぼみ上にのるように前記シートの下に配置し、呼吸は自由にできるがその体の動きを発泡体のクッションが拘束するようにする。
【００７３】
画像化する領域には、細胞死を診断する、または監視するために必要である、前記対象の実質的な全体か、または前記対象の一部分を含んでよいことは理解されよう。たとえば、前記領域には  付属肢もしくはそのような付属肢の一部、頭部、中枢神経系、または胸腔もしくは腹膜腔などの内臓腔のみが含まれてよい。特定の実施態様では、前記領域には特定の器官またはその部分のみが含まれてよい。たとえば、前記方法は、中枢神経系、脳、心、肝、脾、肺、骨髄、または上述の任意の器官の部分のみの細胞死の解析に適用してよい。さらに、解析される前記領域は、たとえば腫瘍に細胞死を引き起こすようにデザインされた治療を受けている癌患者などの腫瘍に限定してよい。
【００７４】
F.  ガンマ線放出画像の作成：画像処理
最も好適なカメラでは、ガンマ線放出の測定によって電圧シグナルが生じ、そのシグナルはCRTに表示されるか、または保存されるか、および／または数の配列としてコンピュータで解析することができる。これらの数を用いて標準の画像化法による画像を作成する。たとえば、前記画像は典型的には、ガンマ線の計数を正規化して（前もって選択した固定値に対してか、または任意のピクセルで検出された最大値に対して）、正規化した数値をモニターに表示される輝度（グレースケール）または色彩（疑似色彩）に変換することによって、解析する。疑似色彩で表示する場合、典型的な色彩の割り当ては以下の通りである。計数ゼロのピクセルは黒色に割り当て、計数が小さい場合には青色に、そして計数の増加とともに波長も大きくなり、最大のガンマ線計数値は赤色に割り当てる。モニター上の色彩の位置はガンマ線放出の分布を表し、したがって、細胞死の領域の位置を表す。
【００７５】
局在化および／またはシグナルを経時的に追跡し、たとえば細胞死の分布および／または局在化に処理が与える効果を記録することが望ましい場合には、ガンマ線放出の測定または画像化を特定の時間間隔で繰り返し、一連の画像を作成することができる。その間隔は最低でも分単位であり、最高で日、週、月または年の単位であってよい。
【００７６】
本願発明の方法によって作成した画像は、様々な方法によって解析してよい。そのような方法には、単純な目視検査、心理的な評価および／またはハードコピーの印刷から、高度なデジタル画像解析まである。
【００７７】
VII.  用途
放射標識されたアネキシンVの主な用途には、たとえば狼瘡、移植片拒絶反応などの免疫疾患などの疾患状態、または重度の虚血に陥った細胞における発生すべきではない不適切なアポトーシスの検出、およびたとえば腫瘍またはウイルスに感染している細胞など、発生すべき時に不十分なアポトーシスの検出が含まれる。
【００７８】
本願明細書に記載の結果から、放射標識されたアネキシンは、臓器および骨髄移植拒絶反応または損傷、感染性および非感染性炎症性疾患、自己免疫性疾患、脳および心筋梗塞ならびに虚血、心筋症、アテローム性疾患、神経および神経筋変性疾患、鎌状赤血球病、β-サラセミア、癌療法、AIDS、骨髄異形成症候群、および毒素誘導肝疾患などこれらに限定せずに、アポトーシスおよび／または壊死細胞死に監視が必要な、さまざまな臨床背景に用いることができることを示唆する。放射標識されたアネキシンは、正常な免疫系、発生工学的な発達、ならびに免疫寛容およびアレルギーを研究するための臨床研究用ツールとしても有用であろう。
【００７９】
放射標識されたアネキシンVは、たとえば、処理を受けている正常および悪性組織中のアポトーシス細胞死を画像化および定量化するために用いることができる。放射標識されたアネキシンVの一連の画像化研究に用いられるアポトーシスの監視は、さまざまな疾患の新薬および療法の迅速な試験および開発に使用することができる。さらに、本願方法は処理の進行の監視、疾患の進行の監視、またはそれらの両方を行うために用いてよい。さらに、本願方法はいくつかの疾患の早期検出を促進するために用いてよい。
【００８０】
本願発明の組成物および方法はまた、たとえば網膜疾患または緑内障などの眼疾患を罹患する対象の診断および／または処理に用いてもよい。
【００８１】
要約すると、本願発明の組成物および方法は、臨床上および診断上の利点を数多く提供する。たとえば、本願発明の方法を用いて、確立した抗癌治療計画に対する個々の患者の応答を、効率よく適時に評価することもでき、新規の抗癌薬の抗新生物活性を評価することもでき、新規の抗癌薬の最適な用量および投薬計画を特定することもでき、および既存の抗癌薬および薬物の組み合わせの最適な用量および投与計画を特定することもできると考えられる。さらに、本願発明の方法を用いて、臨床試験中の癌患者を、治療計画に応答を示すか示さないかについて効率的に分類してもよい。
【００８２】
本願発明の方法は、とりわけ、個々の患者の腫瘍が化学療法に対して初期に示す応答を評価するための非侵襲的な技術を提供する。これにより、副作用が、期待される効果と均衡がとれていない可能性がある、非効率的な処理の迅速な判別を可能にすることによって、効率的な処理の選択を容易にする。
【００８３】
本願発明は、以下の実施例によってさらに具体化されるが、それらは本願発明を制限するものと解釈されてはならない。本願明細書全体に引用されたすべての参考文献、係属中の特許出願、公開された特許出願、および図は、引用によりここに明白に援用される。
【実施例】
【００８４】
材料および方法
A.  HYNIC標識されたアネキシンVの調製
ヒトアネキシンVを、E.coli中でpET12a-PAPI プラスミドから発現させることによって産生し、既述の通り精製した (Wood, et al., 1996, ここにおいて引用により援用される)。ヒドラジノニコチンアミドのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル（HYNIC：カナダ、ブリティッシュコロンビア州ラングレイ、AnorMED社から入手：引用により本願明細書に援用するBabich, et al., 1993）の30 mM のストック溶液 (「HYNIC エステルストック」) を、スクシンイミジル6-ヒドラジノニコチナートヒドロクロリド（SHNH）220μgをN,N-ジメチルホルムアミド18.5pLに懸濁させて調製した。バッファA（20 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCI）893pLに5mgのアネキシンVを溶解し、引用により本願明細書に援用するSchwartz, et a/., 1991に記載の方法に従って、室温で光を遮断した状態で、３時間穏やかに撹拌しながらHYNICエステルストックと反応させた。この反応を500pLの 500mMグリシンpH5.3で停止させて、4°C で20 mM クエン酸ナトリウムpH 5.2、100 mM NaCIに対して透析 した。10分間、1500 xg で遠心分離して沈殿物を除去した。HYNIC-アネキシンVを100 μL (100μg)のアリコートに分けて -70°Cで保存した。
【００８５】
B. HYNIC-アネキシンVの放射標識
80 μL のSnC12(50 mg/ml の0.1 N HCI 溶液をN2ガスで２時間パージした)を50 mlの20 mM トリシン溶液 (pH 7.1, N2ガスで１時間パージしたトリシン =N - [トリス (ヒドロキシメチル) メチルグリシン]に加えた。200 μL の Sn-トリシン溶液を、Larson, et al., 1995が既述した方法に従って、アネキシンVの100 μLアリコート１つと混合したTc99m (放射能は4 - 8 mCi) （上述の通り調製した）に加えた。
【００８６】
放射標識されたアネキシンの比放射能を、食塩水を溶媒として即時薄層クロマトグラフィ（ITLC）で測定したところ、タンパク質1μg当たり20 - 200 μCi (望ましい放射能に応じて) で、放射能純度は92 % - 97 % だった。HYNIC-アネキシンVおよび崩壊したTc99m HYNIC アネキシン Vの膜結合活性を、5 nM FITC-アネキシンVをI125アネキシンに置換した改変競合アッセイ法で測定した(Wood, et al., 1996)。室温で15分後、そのサンプルを遠心分離し、ペレット状の細胞を結合させたFITC-アネキシンVをEDTAに遊離させ、遊離したFITC-アネキシンVを蛍光光度分析法で測定した。このアッセイシステムでは、無修飾アネキシン、HYNIC アネキシン、およびTc99m HYNICアネキシンVは、それぞれ8 nM、10.5 nM、および12.3 nMの競合阻害（FITC-アネキシンVの結合を50%阻害する濃度） を有した。HYNICのアネキシンVへの取り込みはアネキシンV 1molにつき0.9molであることがわかった。
【００８７】
C. 画像化および体内分布研究
ITLC食塩水を溶媒として用いて遊離Tc99m対結合Tc99mを測定後、50乃至150 μCiの Tc99m-HYNIC アネキシン(タンパク質0.125乃至0.25μg) をマウスに注射した。放射性薬物を注射後１乃至２時間経過してから、マウスを腹位で画像化した。画像は、高感度平行孔コリメータおよび128x128画像化マトリックスを用いた低エネルギーモバイル（LEM）シンチレーションカメラ(シーメンス社、イリノイ州デスプレインズ)を用いて、15分間で得た。同様のプロトコルを処理前および処理後のすべてのスキャンにおいて使用した。
【００８８】
体内分布研究は、頸部節／唾液腺、脳、胸腺、心、肺、肝、脾、胃、消化管、腎、骨格筋、脂肪、血液、および屠殺体の残部の試料を収集後に行った。試料はパッカードコブラII自動ガンマ線シンチレーションカウンター（パッカードインスツルメント社、イリノイ州ダウナーズグローブ）で計数し、同位体崩壊および背景放射能を１分間当たりの修正計数として表した。
【００８９】
D. 結合したヒトアネキシンVおよびアポトーシス核の免疫染色
ホルマリン固定したパラフィン包埋組織をヘマトキシリン／エオジン染色などの技術用に5μmに薄切した。結合したヒトアネキシンVの免疫染色を、ヒト胎座アネキシンVに対して産生したウサギ抗血清を用いて行い、Affi-Gel (バイオ-ラド社)に結合させた組換えアネキシンVで親和性を精製した。その後、ビオチン標識ヤギ抗ウサギ抗体およびアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体を用いた連続インキュベーションによって、免疫組織化学的な検出を完成させ(Jackson Immuno Research)、Bindl and Warnke (引用により本願明細書に援用するBindl, J.M. & Warnke, R.A., 1986)による記述の通り3,3'-ジアミノベンジジンと反応させた。
【００９０】
アポトーシス核の検出のために、Gavrieli et al. (引用により本願明細書に援用するGavrieli, et al., 1992)により記述された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介UTP末端標識（TUNEL）法の改変法を用いて、切片を染色した。内因性のペルオキシダーゼを阻害した後、切片を脱パラフィン化し、プロテイナーゼK(20 μg/ml)で15分間室温で消化させた。その後、切片をλエキソヌクレアーゼ（ライフテクノロジーズ社、メリーランド州ガイザーバーグ）5 ユニット/ml とともに、37℃で30分間インキュベートし、その後、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応バッファ(0.2 M カコジル酸カリウム、25 mM TrisHCL、0.25 mg/ml BSA、1.5 mM Cac12、20 mg/ml ポリビニルピロリドン、および20 mg/ml フィコール) および5 μM dATPで平衡化した。その後、最終濃度が75 ユニット/mlの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび100μMの1,N-6-エテノールl-dATP (シグマ社)を含有する末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応バッファ中で、末端標識反応を行った。37℃における60分間のインキュベーション後、その反応物を1 x SSC (標準クエン酸食塩水)で洗浄して失活させた。その後、切片を、エテノアデニン基を認識する1G4 mAbマウス (コロンビア大学 Regina Santella提供)とともにインキュベートした(引用により本願明細書に援用するYoung, T.L. & Santella, R.M., 1988)。その後、免疫化学組織学的検出を、ビオチン標識ヤギ抗マウス抗体を用いて、上述の通り行った。
【００９１】
例１
Fas媒介アポトーシスの生体内における画像化
マウスの肝のアポトーシスは抗Fas抗体を注射して誘導した。この抗体は１乃至２時間以内に広範囲の肝アポトーシスを引き起こし、３時間経過時点で処理した動物の90%が死亡する（Ogasawara）。
【００９２】
５乃至６週齢の18乃至24gのメスBalb/c マウスに、精製したハムスターモノクローナル抗Fas抗体（Jo2、10μg／動物、ファーミンゲン社、カリフォルニア州サンディエゴ）を静脈注射した。抗Fas抗体を注射後、その動物に、約90μCiのテクネチウム99m（Tc99m）ヒドラジノニコチンアミド（HYNIC）放射標識アネキシンVを、それぞれ３つの別々の実験において抗体投与後0、1、および2時間経過時点に静脈注射した。その結果を図１に示す。
【００９３】
１および２時間経過時点における放射標識されたアネキシンVの肝への取り込みが顕著に進行的に増加しているのが認められ、図１に具体化された目的領域（ROI）画像解析によって測定したところ、それぞれ対照値と比較して148%および372%であった。一次的な脾への取り込みは処理後１時間経過時点では対照値の140%まで上昇し、２時間経過時点では110%まで低下した。腎への取り込みは処理後１および２時間経過時点で40%に減少した。
【００９４】
もう１つののマウス群（対照）に、Jo2抗体処理後０、１、および２時間経過時点で90μCiのTc99mHYNICオバルブミン（MW=43kd；タンパク質2μg）を注射した。図２に示すように、これらの動物では、抗Fas抗体処理後1時間経過時点で肝への取り込みの初期増加（127%）が認められ、２時間経過時点ではそのまま変化がなかった（131%）。放射標識されたオバルブミンの脾への取り込みは処理後も対照値から変化がなかった。放射標識されたオバルブミンの腎への取り込みは、処理後１時間では対照値の138%まで増加し、２時間経過時点では131%と変化がなかった。
【００９５】
第３のマウス群は、上述のように処理され、Tc99m標識されたアネキシンVおよびI125標識されたヒト血清アルブミン（HAS）を、それぞれ３つの別々のの実験において抗体投与後0、1、および2時間経過時点に同時に注射した。別々の実験における動物を、対応する各時点において屠殺し、体内分布研究を行った。組織1gあたりのパーセント注射用量（%ID/g）を、以下の表１に示す。そのデータは、放射標識アネキシンVおよびHASの両方について、ROI画像解析によって得られたデータに比例した。
【００９６】
【表１】
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【００９７】
例２
心同種移植拒絶反応の生体内における画像化
99mTc HYNIC-アネキシンVを上述の通り実質的に調製した。画像化および体内分布研究は、ほかに指定のない限り上述の通り行った。
【００９８】
Ono and Lindsey（引用により本願明細書に援用するWoodley, et. al., 1993）の技術を改変した方法に従って、成体オスACIラット（250-350g）に、PVGドナー（ハーラン・スプラーグ・ドーリー社から入手）からの異所性心同種移植片を移植し、宿主の腹部大動脈および大静脈に吻合した。ACIドナーから得た心臓の同系移植片も、宿主ACIラットの腹部に移植した。上述のモデルを用いたACIレシピエントのPVG心同種移植片では、移植から４乃至５日経過後に拒絶反応が始まり、その拒絶反応は脈の減少や動悸として評価される。移植から５日後、その動物すべてに尾部から700乃至900μCiの99mTc HYNIC-アネキシンV（タンパク質10乃至20μg/kg）を投与し、１時間後に画像化した。それから動物を屠殺し、生来の心および移植心についてシンチレーション計数および組織病理学的研究でを行った。
【００９９】
PVG心同種移植片（n=4）のすべてを、移植から５日後に99mTc HYNIC-アネキシンVで容易に画像化した。ACIの心同系移植片（n=3）は、99mTc HYNIC-アネキシンの注射後、シンチレーションウエルカウンタ法によって確認された生来の心の放射能と同量の放射性薬物を取り込んでも、目視で確認できる放射能はなかった。ROI画像解析によって決定したところ、PVG同種移植片の全身放射能の割合は、ACI同系移植片の放射能よりも213%上（P＜0.005; 両側スチューデントt検定を使用）であった。シンチレーションウエルカウンタ法により、PVG同種移植片への99mTc HYNIC-アネキシンVの取り込みは生来の心の放射能と比較して11倍超も増加したことを明らかにした。移植から５日間後のPVG心同種移植片の切片は、罹患動物において顕著な単核炎症性細胞浸潤が認められたが、同系または生来の心臓においては浸潤は認められなかった。浸潤は心筋の損傷領域を囲んでおり、心筋血管の血栓症を随伴した。これらの領域の中心部には、明らかな壊死が存在し、ヘマトキシリンでは染色されないが、周辺部位ではTUNEL染色で確認されるアポトーシスの変化を伴う核が存在した。99mTc HYNIC-アネキシンVの免疫染色は、炎症領域と壊死領域の境界部分の心筋細胞に顆粒状に認められた。抗アネキシンV染色は、TUNELと比較して、陽性の心筋細胞数および強度に関してはるかに広範囲であった。抗アネキシン染色は濃色で予想どおり明白な壊死領域に凝集していたが特異的であり、同種もしくは生来の心、または一次抗体を除外した同種移植心では染色は認められなかった。
【０１００】
別個であるが同様のセットの実験では、ACIラット（各群ともn=6）にPVGドナーからの異所性心同種移植片を移植した。ACIドナー（各群ともn=3）からの同系心移植片を宿主ACIラットに移植した。いずれの群も移植片拒絶反応についての処理は受けなかった。
【０１０１】
レシピエントラットの群には、移植後第１、２、３、４、５、６、および７日に核スキャンを行った。1.0 nCiの99mTc HYNIC-アネキシンVを核スキャンの１時間前に注射した。PVGの心同種移植片は、移植から４日後に99mTc HYNIC-アネキシンVで容易に可視化することができた。ACI心同系移植片は、99mTc HYNIC-アネキシンの注射後も目視で確認できる放射能はなかった。
【０１０２】
99mTc HYNIC-アネキシンVの取り込みを定量化するために、関心領域の解析を用いた。移植心による取り込みを、全身取り込み率として計算した。その結果を図３に示す。
【０１０３】
核スキャン後ただちに、動物を安楽死させた。移植した心臓を解析のために収集した。急性拒絶反応の組織学的な等級付けを、標準ヘマトキシリンおよびエオジン染色断片上で行った。等級付けスキームを、以下の表２に示す。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
市販のペルオキシダーゼキット（APOPTAG（登録商標）；オンコー社、メリーランド州ガイザーズバーグ）を用いて、核DNA切断のTUNEL染色によって組織学的な断片中にあるアポトーシス核を同定した。表３のデータに示されるように、アポトーシスは心同種移植片拒絶反応中に心筋細胞および炎症細胞に生じるように見える。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
例３
処理したマウスリンパ腫の生体内における画像化
99mTc HYNIC-アネキシンVを、実質的に上述の通り調製した。画像化および体内分布研究は、他に指定がない限り上述の通り行った。
【０１０９】
38C13マウスB細胞リンパ腫（Maloney, et al., 1985）を、C3H.HeNマウス（ハーランブリーダーズ社、インディアナポリス）で成長させ、その後200μlのRPMI培地1640（無血清）に懸濁させた腫瘍細胞400個を左側腹に皮下注射した。移植から１４日後、マウスを100mg/kgのシクロホスファミドを腹腔内注射して処理した。シクロホスファミド投与から20時間後、25乃至50μgの99mTc HYNIC-アネキシンV（100乃至150μCi/動物）を筋肉内注射した。その後、動物を画像化してから、シンチレーション計数および組織病理学的研究のため、腫瘍の除去後、放射性薬物を注射してから１時間後に屠殺した。
【０１１０】
未処理の側腹腫瘍移植片（n=8）は、シンチレーションカメラによる画像化法によって容易に見ることができ、ROI画像解析法によって示されたように、アネキシンVの取り込みは正常の軟組織の放射能よりも365%上であった。処理した側腹腫瘍（n=6）では、99mTc HYNIC-アネキシンVの放射能は、腫瘍1g当たりの全身放射能として表される対照値よりも78%増加しており（P＜0.05、有意性は両側スチューデントt検定を使用）、容易に可視化できる増加を示した。この結果をシンチレーションウエルカウンタ法によって確認した。処理した腫瘍は、対照と比較して、腫瘍1gあたりの注射線量率として表したアネキシンV取り込みが132%の増加（P＜0.05）を示し、体重は58%の減少（＜0.05）を示した。ROI画像解析法によって観察した腫瘍1gあたりの全身放射能は、体内分布研究によって決定した腫瘍1gあたりの注射用量の割合と直線的に相関していた（r2=0.831）。組織学的な解析では、処理した腫瘍におけるすべてのリンパ芽球が事実上完全な（95%を超える）アポトーシスを示したのに対し、対照ではアポトーシス細胞は5%未満であった。
【０１１１】
例４
赤血球への放射標識されたアネキシンVの結合
この実験では、Hynic-アネキシンをTc-99mで放射標識してTc-99m Hynic-アネキシン調製物とするか、Re-188で放射標識してRe-188 Hynic-アネキシン調製物とした。いずれの調製物も赤血球への結合能の検査用である。
【０１１２】
２種類の調製物を得るための放射標識は、以下の通り行った。
【０１１３】
調製物1：Hynic-アネキシン100μgを含有するHynic-アネキシンリサーチグレードロット番号60-027 JLV032202を過テクネチウム酸塩0.2mL 7.63mCiで再構築した。亜スズ酸トリシンバイアルを食塩水0.5mLで再構築し、0.1mLをその調製物に加えた。15分後、食塩水0.5mLを加えた。
【０１１４】
調製物2：Re-188 過レニウム酸塩0.5mLを亜スズ酸トリシン凍結乾燥キットに加えた。そのRe-188を室温で5分間インキュベートしてから、この溶液0.3mLを、Hynic-アネキシン100μgを含有するHynic-アネキシンリサーチグレードロット番号60-027 JLV032202のバイアルに移した。
【０１１５】
クロマトグラフィを用いた放射標識生成物の解析では、Hynic-アネキシンの放射標識はTc-99mおよびRe-188の両方とも成功したことを示唆した。
【０１１６】
赤血球（RBC）アッセイのために、上述の通り放射標識したアネキシンをカルシウムの存在下において赤血球とともにインキュベートする（その内容を引用により本願明細書に援用するJ.F. Tait et al. (2000) Bioconjugate Chem., 11:918-25に記載の通り）。簡単に説明すると、10nmol/Lの濃度の放射標識したタンパク質調製物を、最終体積が250μLになるように２本の同じ試験管に入れる。次に、コールター4Cプラス赤血球正常対照（12.5乃至50μL、細胞5x107乃至2x108個に相当）を、その試験管に加える。それから、CaCl2溶液（2.5 mM乃至10mM）および／またはEDTA 50mMを加える。最後に、10 mM Hepes pH 7.4、136 mM NaCl、2.7 mM KCl、2 mM MgCl2、1 mM NaH2PO4,、5 mM グルコース および1 mg/mL ウシ血清アルブミンを、合計体積が250μL（典型的には180 乃至 225μL）に達するまで加える。37℃で15分間インキュベーションした後、その試験管を11,000rpmで5分間遠心分離する。その上清50μLの放射能を測定する。
【０１１７】
細胞に結合した放射能の割合を、２段階の解析を用いて計算する。第１に、特異的な結合量を以下の通り求める：
[(EDTAの存在下における上清のカウント数) - (EDTAの不在下における上清)].
それから、結合％を以下のように求める：
特異的な結合/( EDTAの存在下における上清のカウント数) x 100。
【０１１８】
結合%が約70%超であれば、生理活性放射標識アネキシンを示す。
【０１１９】
例５
アネキシンへのMAG3の結合
アネキシンへのMAG3の結合は、たとえばZ. Zhu et al. (2001) Nucl Med Biol. 28:703-8 and Hnatowich DJ et al. (1998) J. Nucl. Med. 39:56-64に記述の通り行う。簡単に説明すると、新たに調製したNHS-MAG3溶液を、乾燥DMFに入れて10乃至50mg/mLの濃度に調製する。次に、この溶液を、アネキシンの濃度が1乃至5mg/mLの0.1M HEPESバッファ溶液pH8に滴下して加え、MAG3とアネキシンの最終的なモル比が約5:1になるように調整する。DMFの体積は、常に、全体積の10%未満にするべきである。その反応混合物を室温で30乃至60分間インキュベートしてから、セファデックスG25カラムで20mMクエン酸バッファpH5.5を溶出液として用いて精製する。ピーク画分を収集し、280nmで吸光度を定量化し、さらに使用するまで-20℃で保存する。
【０１２０】
MAG3-アネキシンのTc-99m標識のために、以下の手順を用いる。MAG3-アネキシンは典型的に、クエン酸バッファ中における濃度が300乃至500μLで使用する。0.5M重炭酸塩に入れた一定分量の酒石酸ナトリウムを最終濃度7μg/μLおよびpH9.2に達するまで加える。次いで、アネキシン1μgに対して10乃至50μCiのTc-99m過テクネチウム酸塩を加え、新たに調製した4μLの塩化第一スズ二水和物（0.01M HCl中で1mg/mL）を、Tc99m 10μLごとに加える。この溶液を室温で30乃至60分間インキュベートする。最終pHは約7.5で、標識されたアネキシンは、セファデックスG25で0.05M PBSを溶出液として用いて精製することができる。
【０１２１】
MAG3-アネキシンのRe-188標識のために、以下の手順を用いる。20mg/mLのクエン酸溶液を調製し、100μLのクエン酸溶液に対してRe-188過レニウム酸塩を10μL加える。次いで、この溶液をMAG3-アネキシンに加える。これは、典型的にはクエン酸バッファにおける濃度が300乃至500μg/mLで使用する。室温で30乃至60分間インキュベーションした後、標識したアネキシンを、セファデックス25Gで0.05M PBS/アスコルビン酸塩を溶出液として用いて精製することができる。
【０１２２】
等価物
当業者であれば、ごく普通の実験を用いるのみで、ここに説明した本願発明の特定の実施態様の等価物を数多く認識し、または確認できることであろう。このような等価物は、以下の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】Tc99m HYNIC-アネキシンVで検出した、Fas媒介劇症肝アポトーシスを示す、コンピュータで作成した画像である。
【図２】Fas媒介劇症肝アポトーシスの間に、Tc99m HYNIC-オバルブミンから出たシグナルを示す、コンピュータで作成した画像である。
【図３】同種または同系の移植心によるアネキシンVの取り込みを示すグラフである。
【図４】急性心同種移植片拒絶反応の組織学的な等級付けに対する、移植心によるアネキシンVの取り込みを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529922.tif 000044
【国際調査報告】
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