(57)【要約】本発明は、エストロゲン受容体遺伝子／タンパクの、エストロゲン受容体β遺伝子の遺伝子構造と新規な多型を定義する、ヒト染色体６とｃＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列に基づく。このような多型は、ガンへの感受性、骨粗鬆症、心臓血管疾患等の、変異エストロゲン受容体によって媒介／変調される、様々な異常を引き起こす可能性がある。この配列アプローチに基づき、本発明は、エストロゲンβ遺伝子のゲノムヌクレオチド配列、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列、及び配列多型、サンプル中のこれらの配列／多型を検出する方法、変異エストロゲン受容体により媒介される異常を持つ又は発現する危険性を測定する方法、及び変異エストロゲン受容体により媒介される異常を治療するために用いられる化合物をスクリーニングする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離ペプチド。
（ａ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列。
（ｂ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸を含むフラグメント。
【請求項２】
下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
（ａ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列。
（ｂ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸を含むフラグメント。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸分子。
（ａ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
（ｂ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列。
（ｃ）（ａ）−（ｂ）の核酸分子の補体である核酸分子。
【請求項５】
下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（ａ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
（ｂ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列。
（ｃ）（ａ）−（ｂ）の核酸分子の補体である核酸分子。
【請求項６】
請求項４記載の核酸配列を含む核酸ベクター。
【請求項７】
請求項５記載の核酸配列を含む核酸ベクター。
【請求項８】
請求項６記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項７記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１記載の何れかのペプチドの生産方法であって、（ａ）−（ｂ）のペプチド配列の何れかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、その核酸配列からタンパクを発現する条件下で該宿主細胞を培養することを含む、ペプチドの生産方法。
【請求項１１】
請求項２記載の何れかのペプチドの生産方法であって、（ａ）−（ｂ）のペプチド配列の何れかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、その核酸配列からタンパクを発現する条件下で該宿主細胞を培養することを含む、ペプチドの生産方法。
【請求項１２】
サンプル中における請求項１記載の何れかのペプチドの存在の検出方法であって、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出可能な作用物質とサンプルを接触させ、その後該ペプチドの存在を検出することを含む検出方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法に使用するための試薬を含むキットであって、該試薬が前記ペプチドに特異的に結合する作用物質を含むキット。
【請求項１４】
サンプル中における請求項４記載の核酸配列の存在の検出方法であって、ストリンジェント条件下で該核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにサンプルを接触させ、該サンプル中の該核酸配列に該オリゴヌクレオチドが結合するか否かを決定することを含む検出方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法に使用するための試薬を含むキットであって、該試薬がストリンジェント条件下で前記核酸分子の何れかにハイブリダイズする化合物を含むキット。
【請求項１６】
請求項１記載の何れかのペプチドに結合する作用物質の同定方法であて、該ペプチドを物質に接触させ、その接触混合物を分析して前記物質がペプチドに結合してコンプレックスを形成するか否かを決定することを含む同定方法。
【請求項１７】
変異エストロゲン受容体により媒介される疾患を有する、あるいは発症する危険があるヒトを同定する方法であって、エストロゲン受容体遺伝子配列の変更に関してそのヒトから単離した核酸分子を分析し、図２で与えられる変異体からなる群から選択される前記エストロゲン受容体遺伝子における変更を、前記骨疾患を有する、あるいは発症する危険があると同定することを含む同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は疾病の発見と治療方法の分野に関する。本発明は、特に、従来未知のエストロゲン受容体β遺伝子（ＥＳＲ−β）における核酸／アミノ酸多型、及びエストロゲン受容体により媒介／変調される疾病や障害の診断方法、治療方法に用いるための、同遺伝子の遺伝子配列を提供するものである。
【０００２】
背景技術
エストロゲン受容体
ヒトエストロゲン受容体βは、核ホルモン受容体のファミリーに属する。核ホルモン受容体は、特定のホルモン応答因子を含む遺伝子の転写を開始又は増大することのできるホルモン活性転写因子のファミリーである。
【０００３】
ＥＲタンパクは、５９５個のアミノ酸からなり、６６ｋＤａの分子量、８つの翻訳されたエキソン、６つの異なる機能を持つドメインを有する。これらのドメインのうちの２つでは、核ホルモン受容体スーパーファミリーの初期の配列が高く保持されている。このドメインのうちの１つ、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、受容体のホルモン応答遺伝子促進剤中のホルモン応答因子への結合を媒介する２つの亜鉛を含んでいる。Ｃ末端領域では、ホルモン結合ドメイン（ＨＢＤ）は他のホルモン受容体と配列の相同性を有する２つのドメインを含み、ホルモン特性と選択性を与えている。ヒトエストロゲン受容体α遺伝子は、染色体６ｑ．２５．１に位置している。
【０００４】
エストロゲン受容体、及びこれと類似した他のステロイド受容体は、ステロイド（エストラジオール）又はタモキシフェンのようなステロイド類似体と結合し、活性化される転写因子である。活性化に際して、受容体はエストロゲン活性化遺伝子のプロモーター領域に位置するエストロゲン受容体成分（ＥＲＥｓ）と結合してホモ二量体又はヘテロ二量体を形成し、ホストの補活性化因子との相互作用による転写を調整する。
【０００５】
心臓血管疾患におけるエストロゲンの役割
心臓病は、女性の主な死亡原因であり、実際このことは女性や医師達によって認識されている。４５歳から６５歳の女性の９人に一人は何らかの心臓血管疾患を有しており、６５歳以上になると３人に１人に増加する。毎年、全米で２４０，０００人が心臓病により亡くなっており、このうち、発作で亡くなった人は約９０，０００人である。さらに、１年間に全体の約４４％が心臓発作で亡くなっており、これと比べて男性の場合は２６％である（Ｗａｒｒｅｎ ＭＰ ａｎｄ Ｋｕｌａｋ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓ Ｇｙｎ １９９８ ４１（４）：９７６−９８７）。
【０００６】
エストロゲンは、多種多様な細胞タイプに対して、広範囲にわたり生理的な影響を及ぼす。例えば、それらは細胞の成長とアポトーシスを調節し、無数の機能が再生に関連している。エストロゲン受容体には、αとβの２つのタイプがある。血管と骨にはβ受容体が含まれ、肝臓ではα受容体を有する。そして、中枢神経系ではα及びβ受容体の両方が発見される。これらの異なる受容体部位の相互作用は、エストロゲンと、例えばラロキシフェンのような、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭｓ）の生物学的な効果に影響する。結合パターンは、エストロゲンであるかＳＥＲＭであるかどうかに関係なく、エストロゲンアゴニスト又はアンタゴニストとして作用するように命令する（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ＭＥ ａｎｄ Ｋａｒａｓ ＲＨ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９９， ３４０（２３）：１８０１−１８１１；Ｇｒｅｓｅ ＴＡ ａｎｄ Ｄｏｄｇｅ ＪＡ Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓｉｇｎ １９９８， ４：７１−９２）。ＳＥＲＭｓと受容体結合部位との間に、組織に特有の関係が存在する。エストロゲンは、高比重リポタンパク・コレステロールレベルを増大し、低比重リポタンパクコレステロールを減少させ、プラスミノーゲン活性抑制因子レベルを減少させる（Ｍｅｉｓｌｅｒ ＪＧ Ｊｏｕｒ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ １９９９， ８（１）：５１−５７）。全てのエストロゲンは、それらを発現するために細胞受容体を必要とする。一般に、エストロゲン受容体は、ホルモンの結合の後に、目的の遺伝子の発現を調節するリガンド誘導性の転写因子である（Ｆａｕｓｔｉｎｉ−Ｆｕｓｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ １９９９， １４０：１１１−１２９）。エストロゲンは、血管壁にも重要な影響を及ぼしているかもしれない。エストラジオールとプロゲステロン受容体は、動脈の内皮および平滑筋細胞で確認されている（Ｃａｍｐｉｓｉ Ｄ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓ Ｒｅａｃｔ １９８７， ＩＸ（５）：３９３−３９８）。エストロゲンは、血管平滑筋を緩和するために、血管抵抗を減少させる動脈の壁の上で作用する。この機構は、緩和因子と硝酸塩に由来する内皮の刺激を通して現れる（Ｗａｒｒｅｎ ＭＰ ａｎｄ Ｋｕｌａｋ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓ Ｇｙｎ １９９８ ４１（４）：９７６−９８７）。１７Ｂ−エストラジオールによって誘導される緩和は、冠状動脈状態の調節において重要な役割を果たすかもしれず、これにより閉経後の女性における心臓血管疾患の危険性を減らすことができる。エストロゲン受容体が抗エストロゲン薬によりブロックされた際に一酸化窒素の産生が抑制されることから、一酸化窒素の産生はエストロゲン受容体によって媒介されている。
【０００７】
いくつかの研究においては、エストロゲンによる療法が最高で５０％心臓病の危険性を減らすことが示されている（ｍｏｓｔ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｂｙ Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ＭＥ ａｎｄ Ｋａｒａｓ ＲＨ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９９， ３４０（２３）：１８０１−１８１１；Ｒｉｃｈ−Ｅｄｗａｒｄｓ ＪＷ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， １９９５， ３３２：１７５８−１７６５； Ｇｅｒｈａｒｄ Ｍ， Ｇａｎｚ Ｐ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １９９５， ９２：５−８； Ｇｒｏｄｓｔｅｉｎ Ｆ， ｅｔ ａｌ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９７， ３３６：１７６９−７５； Ｃｈａｓｅｎ−Ｔａｂｅｒ Ｌ ａｎｄ Ｓｔａｍｐｆｅｒ ＭＪ Ａｎｎ ｏｆ Ｉｎｔ Ｍｅｄ， １９９８， １２８：４６７−４７７； Ｗａｒｒｅｎ ＭＰ ａｎｄ Ｋｕｌａｋ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎ １９９８， ４１（４）：９７６−９８７）。エストロゲンの低下は、女性における心血管系の病気の発展における最も重要な要因のうちの１つであるかもしれない。
【０００８】
エストロゲンがアテローム発生を防止するといった直接の証拠がない間にも、エストロゲンが心臓血管疾患を減少させるために有効であることを示唆する多くの疫学的証拠が存在していた；（１）全ての年齢層において、女性の心臓血管疾患の発病率は男性より低い；（２）エストロゲンを摂取せずに早期的な閉経を経験した女性においては、心臓血管疾患を有する人が、同年代の閉経前のコントロールの女性の２倍であった；（３）エストロゲンを使う閉経後の女性はそうしない人々と比較して、心臓血管疾患の発病率がかなり低いこと；（４）血管造影法によって発見された心臓血管疾患の女性は、エストロゲンを用いた場合、生存率がより高い。
【０００９】
近年、エストロゲン療法による心臓血管疾患の発病率及び死亡率に対する良好な結果の報告によって、閉経後の女性に対するエストロゲンの使用が、広範囲にわたって注目されるに至った（Ｍｅｉｎｅｒｔｚ Ｔ Ｈｅｒｚ １９９７， ２２： １５１−１５７）。米国の医科大学により刊行されたエストロゲン治療のためのガイドラインによると、「冠状動脈性心臓病を持つ女性に対して、ホルモン療法が有効である」と述べられている。
【００１０】
３０以上の予見的な研究と１３の管理された研究により、エストロゲン代替療法の心臓血管疾患の発生率又は流行、及び全ての死亡原因に対する影響についての調査が行われた（Ｓｔａｍｐｆｅｒ ＭＪ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９１， ３２５：７５６−６２； Ｇｒａｄｙ Ｄ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １９９２， １１７：１０１６−３７）。これらの研究のほとんどで、閉経後のエストロゲン使用者の冠状動脈性心臓病の発生率及び死亡率は、非使用者のそれと比べてより低いものであった。具体的には、エストロゲン使用者で冠状動脈性の疾病を示したのは、エストロゲン非使用者のおよそ５０％であった。全体的には、この証拠の大部分はエストロゲンによる保護の効果について、０．５６の相対的な危険性を伴って強固に支持している（９５％　信頼区間　０．５０−０．６１）。しかしながら、これらの研究において健康な女性の選択の偏向は、結果を混乱させるかもしれない（エストロゲン使用者は、エストロゲン非使用者と比較し、より良い体重管理が行われ、運動が多く、喫煙が少ない）。さらに、エストロゲン使用者がより高い教育を受け、より高い収入を有している等といった偏向もこれらの疫学研究を混乱させている（Ａｂｒａｍｓ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９８， ２１：２１８−２２２）。
【００１１】
以前の観測の試みでは、ランダム化がなされていなかったために、これらの種々の方法論的な偏向から、５０％の危険性の減少について２５％が信頼されていた（Ｇｒｏｄｓｔｅｉｎ Ｆ ａｎｄ Ｓｔａｍｐｆｅｒ ＭＪ Ｐｒｏｇ Ｃａｒｄｉｏｌ Ｄｉｓ １９９５， ３８： １９９−２１０； Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｃｏｎｎｅｒ Ｅ ａｎｄ Ｇｒａｄｙ Ｄ １９９８， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ １９：５５−７２）。最近、２つのメタ分析では、エストロゲン使用による冠状動脈性心臓病の減少は３５から４４％の範囲であると見積もられた。最近の研究では、無傷の子宮を有するエストロゲン単独使用者において、子宮ガンの危険性が向上するとの報告があったことから、エストロゲンの是否の問題についての調査が行われている。新しい証拠として、エストロゲンに加えてプロゲスチン（通常メドロキシプロゲスチンアセテート）を摂取すると、エストロゲンを単独で摂取している女性と比較して、心臓を保護する効果を受けることがないことが示唆されている（Ｈｕｌｌｅｙ Ｓ ｅｔ ａｌ １９９８ ＪＡＭＡ ２８０：６０５−６１３； Ａｂｒａｍｓ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９８， ２１：２１８−２２２）。
【００１２】
閉経期におけるエストロゲンの低下は、ＨＤＬコレステロール濃度の６％の低下と、ＬＤＬコレステロールの５％の増加に関連しており、これは閉経後の女性が閉経前の女性と比較して、より高い心臓血管疾患発病率を有することの説明となるかもしれない。エストロゲンを使用する閉経後の女性の心臓血管疾患の発病率が低いことは、ＬＤＬコレステロールレベルが１５％から１９％に減少することと、ＨＤＬコレステロール・レベルが１６％から１８％に増加するという結果によって部分的に説明できるかもしれない（ＪＡＭＡ １９９５， ２７３：１９９−２０８）。ＰＥＰＩ（Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ／Ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）、ランダム化された二重盲式偽薬対照試験では、単独でエストロゲンを使用する女性のＨＤＬコレステロールレベルが、エストロゲンを組み合わせて使用した女性のそれと比較して著しく増大すること示した（ＪＡＭＡ １９９５、２７３：１９９−２０８）。最近、人間以外の霊長類の研究によりこれらの調査結果が立証された（Ｃｌａｒｋｓｏｎ ＴＢ Ｌａｂ Ａｎ Ｓｃｉ １９９８， ４８（６）：５６９−７２）。エストロゲンの脂質側面上の影響についての統計モデルでは、エストロゲンの介在によるＨＤＬ−コレステロールの良好な変化による２５から５０％の明らかな心臓保護効果が示された（Ｂｕｓｈ ＴＬ ｅｔ ａｌ． １９８７ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ７５：１１０２−９； Ｇｒｕｃｈｏｗ ＨＷ ｅｔ ａｌ． １９８８ Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ １１５：９５４−６３）。
【００１３】
エストロゲン代替療法は危険を伴わない訳ではない。長年にわたって、経口避妊薬の使用者は非使用者と比較して、静脈の血栓塞栓症（ＶＴＥ）の危険性が３から４倍増大することが示されていた（Ｗｅｉｓｓ Ｇ Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １９９９ １８０：Ｓ２９５−３０１）。ある研究により、固有の凝固因子が経口避妊薬に関連するＶＴＥにおいて重要な役割を果たしていることが示された（Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ ＪＰ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ １９９４ ３４４：１４５３−７； Ｒｏｓｉｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９９７， ９７：２３３−２３８）。ライデン突然変異の第５因子は、非使用者においてはＶＴＥの危険性を５から１０倍増大するが、第三世代の経口避妊薬使用者においては３０倍である。混合されたエストロゲンは、体内の自然な血液凝固阻止システム（ＡＰＣ）に対する抵抗を引き起こす。経口避妊薬の使用者におけるライデン突然変異第５因子による異型接合体は、同型接合の女性と同等のＡＰＣ抵抗に発展する。
【００１４】
エストロゲンは子宮内膜ガンの危険性を約６倍増大するが、ほとんどの場合、プロゲスチンを加えることによりこの影響は除かれる（Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｃｏｎｎｅｒ Ｅ ａｎｄ Ｇｒａｄｙ Ｄ １９９８， Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ １９：５５−７２）。エストロゲン代替が乳ガンの危険性を増大するかどうかという議論は続けられているが、いくつかの研究により危険性が３０％程度に減少することが示されている（Ｇｒｅｅｎｄａｌｅ ＧＡ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ １９９９， ３５３：５７１−８０）。
【００１５】
エストロゲン代替療法が女性の心臓血管疾患の危険性を減少するかどうか、そして、それが乳ガンの危険性を増大するかどうかについて立証するべく、ランダム化された多くの研究が進められている。最近完了したある試験（ＨＥＲＳ − Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ／ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｓｔｕｄｙ）においては、心臓血管疾患を有する２７００人の女性において、連続的に結合エストロゲン及びメドロキシプロゲステロンアセテートとを処方した場合と、偽薬を処方した場合との比較を行った（Ｈｕｌｌｙ Ｓ ｅｔ ａｌ． １９９８ ＪＡＭＡ ２８０（７）：６０５−１３）。コントロールと比較して、介入したグループは１年間の試験では心臓病の発病は著しく多かったが、４から５年の試験では著しく少なかった。さらに、ホルモンを摂取している女性の研究においては、初期の段階で血栓塞栓症の発病率の著しい増加が起こった。これらの結果に基づくと、ホルモン代替療法は心臓病の二次的な予防に勧めることはできない。
【００１６】
エストロゲンを用いた心血管系の病気の一時的な予防に関して、他の２つの大きな臨床研究が現在行われている。２００５年に英国で完了することになっているＴｈｅ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ、及び２０１０年に完了されることになっているＷＩＳ−ＤＯＭと呼ばれる研究では、エストロゲンの心臓血管疾患に対する保護効果についての新しい光を投じるであろう（Ｍｅｉｓｌｅｒ ＪＧ Ｊｏｕｒ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ １９９９， ８（１）：５１−５）。
【００１７】
まとめると、特に最近明らかにされたデザイナーエストロゲンまたはＳＥＲＭｓに関連する、現在進行中のエストロゲン代替療法の研究においては、胸と子宮内膜組織に対する悪影響を起こさずに、骨と同様に、心血管系に有効な影響を及ぼすかもしれないことを示唆している。それでもなお、慎重に観察される必要がある。エストロゲンを摂取する女性は、平均して、より教育され、より健康で、より高い収入を持っていて、より良い健康管理を行っている。エストロゲンよりもむしろ、これらの違いが心臓病の危険性の低下の良い説明となるかもしれない。
【００１８】
病気を持たない閉経後の女性においては、エストロゲン代替療法は、重要性、一貫性、データの生物学的なもっともらしさを考慮した場合、有用な影響を持つように見える。病気を持っている女性においては、安全性と、外因性のエストロゲンの心臓血管疾患に対する保護医薬としての有効性に関し、問題が残っている。
【００１９】
エストロゲンと自己免疫性疾患
Ａ．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
エストロゲンが全身エリテマトーデスに対して効果があるという見解が、以下のことから広く知られている：
１．子供を出産した女性は、男性の９倍全身エリテマトーデスに発展する可能性が高い。思春期より前では、女性における発生率は男性の３倍以上であるが、閉経期後の女性はＳＬＥに発展する機会は、同世代の男性と同程度である。多くの研究により、これらの性による違いの理由は、おそらくエストロゲンに関係があるであろうことが示された（Ｌａｈｉｔａ Ｒ．Ｇ．， １９８６： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９， ３０５−３１４； Ｋｒａｍｍｅｒ， Ｇ．Ｍ． ａｎｄ Ｔｓｏｋｏｓ， Ｇ．Ｃ． ， １９９８ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８９： １９２−１９５； Ｒｉｄｅｒ ａｔ ａｌ．， １９９８ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８９： １７１−１８０）。
【００２０】
ＳＬＥでのエストロゲンの役割の糸口は、経口避妊薬がこの病状に不利な影響を及ぼすと結論した研究から得られた（Ｂｕｔｏｎ， Ｊ．Ｐ．， １９９６ Ａｎｎ． Ｍｅｄ． Ｉｎｔｅｒｎｅ， １４７：２５９−２６４； Ｊｕｌｋｕｎｅｎ， １９９１： Ｓｃａｎ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２０：４２７−４３３）。
【００２１】
２．ＳＬＥとともにＫｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ症候群（ＸＸＹ）を有する患者が報告された（Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９７７： Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２０：１８−２２）。
【００２２】
３．ＳＬＥ患者は、抗エストロゲン抗体を持つ（Ｆｅｌｄｍａｎ， １９８７： Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４５：１３４２−１３４８： Ｂｕｃａｌａ ｅｔ ａｌ．， １９８７： Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６７：１６７−１７５）。
【００２３】
過去には、経口避妊薬がＳＬＥを突発的に引き起こすことが示されており、産児制限錠剤の少量の服用がＳＬＥ患者にとって安全であると考えられるに至るまでの間、これらの使用はＳＬＥを有する女性において賛同されていなかった（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ ＨＡ Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９９１；２０（６）：４２７−３３）。また同様に、ホルモン代替療法もＳＬＥ患者にとって安全であると考えられている（Ｍｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９９８；２７（５）：３４２−６： Ｋｒｅｉｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９９７ Ｎｏｖ；２４（１１）：２１４９−５２）。
【００２４】
４．エストロゲンアンタゴニストであるタモキシフェンは、病気の進行を改善するようである（Ｓｔｈｏｅｇｅｒ， １９９７， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９７ Ａｐｒ ５；８１５：３６７−８： Ｓｔｈｏｅｇｅｒ， １９９４， Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９９４ Ｄｅｃ；２１（１２）：２２３１−８）。
【００２５】
Ｂ．エストロゲン、リウマチ関節炎（ＲＡ）及び骨関節炎
慢性関節リウマチにおけるエストロゲンに関連する文献は、骨関節炎の場合と比べて明らかでない。疫学研究においては、経口避妊薬はＲＡの発病を遅らせるが、エストロゲン単独ではＲＡの症状を軽減することがないことから、ＲＡが女性ホルモンンにより影響を受けることを示唆している（Ｂｉｊｌｓｍａ Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２ Ｏｃｔ−Ｄｅｃ；２８（３−４）：２３１−４）。エストロゲン補助剤の処方は、ＲＡをもつ閉経後の女性の骨無機質密度を増大し、しばしばＲＡと併発することのある骨粗しょう症に対して保護となるかもしれない（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｉｎｋ： Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ １９９３ Ａｐｒ；５２（４）：３０２−５）。上述したようにエストロゲンがＲＡの症状を軽減しないことを示すとは言え、他の研究ではエストロゲン補助剤療法でさえも症状を改善しないと結論づけた。ＲＡの発病と関連しているエストロゲン受容体が、１つの多型として報告されている（Ｕｓｈｉｙａｍａ Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ １９９９ Ｊａｎ；５８（１）：７−１０）。
【００２６】
骨関節炎の他に、閉経期後の女性がエストロゲン代替療法（ＥＲＴ）を受けることは一般的に行われていない。
【００２７】
Ｃ．エストロゲンと骨粗しょう症
骨粗しょう症は、骨の脆化とそれに伴う破砕の危険に至る骨の代謝の病気である。骨粗しょう症を有する閉経期後の女性の治療には、ホルモン、特にエストロゲンの代替を含んでいる。エストロゲンは、骨損失及び破砕の発生率を減少させる効果を示す（Ｗｅｉｓｓ　ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８０ Ｎｏｖ ２０；３０３（２１）：１１９５−８ ：Ｐａｇａｎｉｎｉ−Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １９８１ Ｊｕｌ；９５（１）：２８−３１： Ｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １９８５ Ｍａｒ；１０２（３）：３１９−２４）。
【００２８】
さらに、エストロゲン受容体における多型は、ヒトとマウスの両方において骨損失と関係していた．（ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １９９６ Ｍａｒ；１１（３）：３０６−１１ ： Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １９９９ Ｍａｙ；１８０（５）：１１１５−２０； Ｄｅｎｇ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９８ Ｎｏｖ；１０３（５）：５７６−８５ ）。
【００２９】
エストロゲンと認識機能
男性と比較して、女性はアルツハイマー病になる危険性が高い。いくつかの研究によって、閉経期後の女性がエストロゲンを使用することにより、アルツハイマー病の発病率を低く抑えることが示されている。アルツハイマー病の女性においても、エストロゲンを使用することにより、深刻な症状を抑え、知能の低下を遅らせる。長期間使用（１０年以上）している女性においては、危険性が最も低い。しかし、短期間、エストロゲンを使用した女性においても効果が得られた。
【００３０】
エストロゲンと乳ガン
乳ガンの発病の主な危険因子は、性、年齢、家族の乳ガンの病歴、初潮の年代、最初の満期産の年代と閉経の年代である。家族史を除くこれらの要因の全てでは、エストロゲンの暴露寿命と直接関係していることが示され、ホルモン露出の増大が乳ガンになる危険性の増大と関連している。増大するガンの危険性は、乳房の上皮の細胞の増殖的な反応がエストロゲン受容体に介在されることに起因すると考えられている。
【００３１】
エストロゲン受容体アンタゴニストであるタモキシフェンは、乳ガンの防止と治療の両方に効果を示す医薬となることが示された。免疫組織化学方法を使用することにより、組織に発現するエストロゲン受容体タンパク質の量によって、胸腫瘍がエストロゲン受容体陽性であるか又は陰性であるかを分類することが可能である。エストロゲン受容体陽性の腫瘍は、エストロゲン受容体陰性の腫瘍より、タモキシフェンによる治療により好適に応答する。閉経前の女性は、閉経後の女性より、エストロゲン受容体陰性の乳ガンに発展することが多い。
【００３２】
エストロゲン受容体の構造と機能の突然変異は、初期の胸腫瘍または乳ガン細胞系において説明されている。しかしながら、これらの変化が初期（発ガンに至る過程を含む）か、第二期（ガン組織の中の遺伝子の不安定性の結果）かどうかは明らかでない。さらに、これらの身体の突然変異に加えて、いくつかの研究で、遺伝によるＤＮＡ配列の変化と乳ガンの発達との関係の可能性を指摘しているが、これらについても議論の余地がある。
【００３３】
そしてさらに、最近、乳ガンにおけるエストロゲン受容体の役割を示す証拠として、乳ガンの発達の素因を作る変異体として遺伝する遺伝子ＢＲＣＡ１がエストロゲン受容体の信号を抑制することが発見された。
【００３４】
エストロゲンと子宮内膜ガン
子宮内膜ガンは女性における最も一般的な骨盤の悪性腫瘍であるが、約７５％の場合には診断の時点で子宮内で確認されるので、通常は子宮摘出によって治癒することができる。エストロゲンへの子宮内膜細胞における無抵抗の暴露は劇的に子宮ガン細胞の発達する機会が劇的に増大し、そして、それはエストロゲン単独のホルモン代替療法が無傷の子宮を有する女性になされてはならないということの理由となる。プロゲステロンの周期的又は連続的投与は、子宮内膜細胞の過度の増殖を防ぐのに役立ち、また、ホルモン代替治療養生法の一部としてエストロゲンを処方されている閉経後の女性において、子宮内膜ガンの危険性を減らす。
【００３５】
子宮内膜ガンの多くの場合では、エストロゲン受容体が発現しており、一般的には、エストロゲン応答性の腫瘍は好適に予測することできる。後天的な（身体の）突然変異は、最大８．５％の場合が述べられているが、子宮内膜ガンの発達、進行における突然変異の役割は、現在はっきりしていない。
【００３６】
いくぶん議論の余地があるとは言え、研究により、タモキシフェンの使用が子宮内膜ガンに発展する機会を増大しているかもしれないことが示唆されている。これは、さらにエストロゲン受容体封鎖での役割に加えて、タモキシフェンが部分的な受容体アゴニスト活性を有し、子宮内膜増殖を誘発するエストロゲン応答性遺伝子の低級での誘発に影響していることを示す。
【００３７】
種々の病気への媒介／変調にエストロゲン受容体を用い、エストロゲン受容体中の配列多型の同定とこれらと病気の状態、治療効果等とを互いに関連づけることが重要である。本発明は、従来未知であった種々のＥＳＲ−αタンパク質の多型を提供することにより、これらの技術を進歩させるものである。
【００３８】
ＳＮＰｓ
全ての有機体のゲノムは、それらの進化、すなわち、始原配列からの変異形態の生成過程において、自然発生的な突然変異を受ける（Ｇｕｓｅｌｌａ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５５， ８３１−８５４ （１９８６））。変異した形態は始原形態と比べ、進化の点で有利、又は不利であるかもしれず、また、関係ないかもしれない。例えば、変異体が致命的な不利を受けた場合は、後の世代に引き継がれることができない。他方、変異形態が種の進化にとって有利であった場合には、結局、その種の多く又はほとんどのＤＮＡに組み込まれ、効果的に始原形態となる。加えて、変異形態の影響は有益かつ有害であるかもしれず、それは環境によることになる。例えば、異型接合的鎌状赤血球突然変異はマラリアに対しての抵抗を持つが、同型接合的な鎌状赤血球突然変異は通常致命的である。多くの例では、始原形態と変異形態は、種の中で共存している。多種の形態での共存は、多型、例えばＳＮＰｓを引き起こす。
【００３９】
ここでいう対立形態とは任意に示されているものであり、例えば、種の個体数の中で最も多い形態、又は最初に確認される対立形態であるかもしれず、他方の対立形態は択一、変異、多型対立遺伝子として示される。選ばれた集団の中で最も頻繁に起こる対立形態は、野生型の形態と呼ばれている。
【００４０】
ヒトゲノム中の全ての多型のうち、約９０％が単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）である。ＳＮＰの位置又は部位は、通常、高度に保護された対立遺伝子（個体数の１／１００又は１／１０００以下が変化する配列）に従う。個体のそれぞれのＳＮＰ位置での対立遺伝子は同型接合又は異型接合であるかもしれない。本発明で確認されたように、ＳＮＰ位置での最小頻度の対立遺伝子は、より高頻度の対立遺伝子よりは少なく１％以下の頻度である。例えば、アミノ酸配列でコード付けされたＳＮＰを含むヌクレオチド配列を示すＳＮＰは、ｃＳＮＰと呼ばれる。
【００４１】
ＳＮＰｓは、多型部位の一つのヌクレオチドが他のものに置換されることによって起こる。置換は転移又は転換により起こる。転移とはプリンヌクレオチドが他のプリンヌクレオチドに、又はピリミジンヌクレオチドが他のピリミジンヌクレオチドに置き換わることである。転換とはピリミジンによりプリンが置き換えられること、又はその逆である。ＳＮＰｓはまた、１つの塩基が挿入又は削除された変異形態（インデルと呼ばれる）であるかもしれない。コドンコーディングにおいてアミノ酸を他のアミノ酸とする置換は、非同義コドン変異またはミスセンス突然変異と呼ばれる。同義コドン変異またはサイレント突然変異は、遺伝コードの変質のためにアミノ酸の変異が起こらないものである。ナンセンス突然変異は、終止コドンを形成する非同義コドン変異に分類されるものであり、それによってポリペプチド鎖が早期終結し不完全なタンパクへと導かれる。
【００４２】
ＳＮＰｓは、原則的には、ｂｉ−、ｔｒｉ−、ｔｅｔｒａ−の対立遺伝子となることができる。しかしながら、ｔｒｉ−、ｔｅｔｒａ−は極めて珍しく、ほとんど存在しない（Ｂｒｏｏｋｅｓ， Ｇｅｎｅ ２３４ （１９９９） １７７−１８６）。このために、ＳＮＰは、しばしば、“ｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ”又は “ｄｉ−ａｌｌｅｌｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ”と呼ばれることがある。
【００４３】
原因ＳＮＰｓは、遺伝子発現、または遺伝子生成物の機能発現の変化を生じるＳＮＰｓであり、ほとんどの場合で臨床表現型の予測が可能である。これらの種の一つは、ポリペプチド生成物をコード化している遺伝子領域に入っているＳＮＰ、すなわち、ｃＳＮＰｓを含んでいる。これらのＳＮＰｓは、ポリペプチド生成物のアミノ酸配列の変更（すなわち非同義コドン変異）の結果生じ、不完全、又は変異タンパク質の発現を引き起こすかもしれない。さらに、ナンセンス突然変異の場合では、ＳＮＰはポリペプチド生成物の早期終結に至るかもしれない。このような変異生成物は、疾病状態、例えば遺伝子病を生じる可能性がある。コード配列内の多型を有する遺伝子が遺伝子病を引き起こすものとして、鎌状赤血球性貧血と嚢胞性線維症も含まれる。原因ＳＮＰｓは、必ずしもコード領域で起こる必要があるわけでなく、原因ＳＮＰｓは、最終的に核酸によってコード化されるタンパクの発現や活動に影響を及ぼし得る何れの領域でも起こりうる。これらの遺伝子領域には、プロモーター領域のＳＮＰｓのような転写を含む遺伝子領域、不完全な接合を引き起こすかもしれないイントロン−エクソン境界のＳＮＰｓ、又はポリアデニル化信号領域のような信号配列を処理するｍＲＮＡ中のＳＮＰｓのような転写過程に関連する遺伝子領域が含まれている。例えば、ＳＮＰｓはイントロンの接合を抑制し、その結果、ｍＲＮＡは早期終止コドンを含み、不完全なタンパクに至るかもしれない。したがって、調節領域のＳＮＰｓは発現に大きく影響を与えることとなる。
【００４４】
いくつかのＳＮＰｓは、病気を引き起こす配列と密接に関連しており、共に分離されるにも関わらず、原因ＳＮＰｓではない。この場合、ＳＮＰの存在が、病気の存在、又は感染と相関している。これらのＳＮＰｓは、診断学や病気感染スクリーニングにとって非常に有用である。
【００４５】
臨床試験では、患者の医薬での治療に対する反応がしばしば異質であることが示されている。したがって、治療のための医薬の設計の試みを向上させることが必要であるといえる。ＳＮＰｓは、患者の治療に用いるために最も適した特定の医薬を決定するために用いることができる（これは、しばしば生薬学と呼ばれる）。生薬学は薬学研究における医薬の選択プロセスにも用いることができる。（Ｌｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４３， ２５４； Ｍａｒｓｈａｌｌ （１９９７）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １５， １２４９； Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９７／４０４６２， Ｓｐｅｃｔｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ； ａｎｄ Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ３．）
【００４６】
集団研究
集団遺伝学とは、メンデルの法則と他の遺伝子の原理が、全体に適用されるかどうかという研究である。このような研究は進化を適切に理解するために必要不可欠である。なぜなら、基本的に進化とは集団の遺伝子構成の革新的な変化の結果生じるものであるからである。集団遺伝学とは、同時代における分離、組換え、突然変異といった遺伝子現象の影響を理解又は予測するものであり、したがって、集団遺伝学では個体数、交接パターン、個体の地勢分布、移動、自然淘汰といった生態学的又は進化論的な因子も考慮に入れなければいけない。
【００４７】
理想的には、集団遺伝子の構成がどのようにしてなるかを解明し、自然淘汰又は人工的な淘汰の結果生じる集団の変化を予測するため、どのように集団遺伝子のタイプと頻度を論じるかを理解することが望まれる。
【００４８】
それらの多くの問題について説明するためには、連鎖と呼ばれる位置との関係を理解することが重要である
【００４９】
連鎖は、同一染色体上の近接位置であることから、２つ以上の非対立性遺伝子が共に遺伝しているものであり、減数分裂の後、非連鎖遺伝子と予測される５０％より多くが対合して残されている。減数分裂の間に物理的な交差がある場合は、生殖細胞生成の際に個々の染色分体間で、母、父の遺伝寄与の物理的な交換が起こっていることは明らかである。この交換では、それぞれの親と近接する染色体領域の遺伝子は必然的に分離され、残った配列が混錬した結果、組み換え体が生じる。そして、減数分裂の交差を経た組み換え体生成過程は、遺伝子特性の再配列における重要な特徴であり、遺伝子伝達に関する理解の中核をなしている。
【００５０】
組み換えは、一般的に遺伝子の大きなセグメントの間で起こる。これは隣接するＤＮＡの伸張と遺伝子とが連動していることを意味している。逆に、染色体中で互いに遠く離れたＤＮＡ領域は、交差の過程の間も離れているようである。
【００５１】
減数分裂の間に起こる組換え現象を明らかにするために、分子マーカーを用いることができる。いくつかのマーカーは、ヒトＤＮＡの至る所に存在する、異なる長さの（ＣＡ）ｎの繰り返しで、それらの長さにはわずかな選択圧力があり、位置マーカーと、染色体にそった位置確認特性として用いられる。これらのマーカーは、母方由来の遺伝子領域から、父方由来のものを区別するのに用いることができる。
【００５２】
他のマーカーは一つのヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。それらはｂｉａｌｌｅｌｉｃなマーカーであり、これらのマーカーの子孫への伝達についての分析にも用いることができる。
【００５３】
染色体に沿った１組のマーカーのパターンはハプロタイプと呼ばれる。そして、同一の小さな染色体セグメント上の対立遺伝子は、系統を妨げて伝達されるという傾向がある。ハプロタイプ既知の親から子孫への系列のハプロタイプを分析することにより、染色体中の親の部分がどれだけ子に伝えられたかを確認するのが可能となった。組み換えによって壊れていない場合、ハプロタイプは単独で高度に多形化した位置での対立遺伝子としてのマッピング目的のために用いることができる。
【００５４】
連鎖マーカーの特定の対立遺伝子と関連する病原性遺伝子が優先的に生成することを連鎖不平衡（ＬＤ）と呼ぶ。この種の不平衡は、一般的に、ほとんどの病性染色体が同一の突然変異を伝えること、テストされたマーカーが病原性遺伝子に非常に近いことを意味している。例えば、多くの連鎖不平衡がＨＬＡの位置全体を横切っている。Ａ３対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ１４対立遺伝子と共にＬＤ中にあり、その結果、Ｂ７とＢ１４は血色素沈着症と高い関連性を有する。このように、ＨＬＡの分類は、例え他のファミリーが正式な連鎖解析に利用できないとしても、単独で血色素沈着症の危険の推定を大幅に改めることができる。結果として、遺伝子推定位置周辺のいくつかのマーカーの組合せを用いることにより、ファミリーに影響する、又は影響しないように、ハプロタイプの決定を行うことができる。
【００５５】
ＳＮＰに基づくアソシエーション解析と連鎖不平衡マッピング
ＳＮＰｓは、特定のＳＮＰｓ、又は例えば乳ガンのような病的状態と関連する他の多型を同定するためのアソシエーション研究に有用である。アソシエーション研究は、一般的な個体数の範囲内で実行されるかもしれず、影響を受けるファミリーの個体に関連して行われる研究（連鎖研究）に限られるものではない。ＳＮＰｓを用いたアソシエーション研究においては、重要な障害（例えば乳ガン）を有する多くの患者において、同様に類似した年齢、経歴をコントロールとして、ＳＮＰ対立遺伝子の頻度を決定することを必要とする。患者とコントロールの適切な選択は、ＳＮＰアソシエーション研究の成功にとって重要である。したがって、よく特徴づけられた表現型をもつ個人の集合が、極めて望ましい。例えば、高血圧の個人において、特定のＳＮＰ遺伝子型と既知の表現型との間で関連が認められる生理学的パラメータのある場合は、血圧と心拍数を個人のＳＮＰパターンと相関させることができる。特定のＳＮＰｓ又はＳＮＰハプロタイプと表現型的性質との間の有意の関連は、標準の統計方法によって決定することができる。アソシエーション解析は、直接、またはＬＤに基づいて行うことができる。直接のアソシエーション解析においては、病原性配列の候補である原因ＳＮＰの試験を行う。
【００５６】
ＬＤに基づいたＳＮＰアソシエーション解析において、ランダムなＳＮＰｓが広いゲノム領域、あるいはゲノム全体で試験され、真の病原性の配列または病原性ＳＮＰとともに、ＬＤ中のＳＮＰが発見される。この研究のためには、連鎖不平衡中の未知の病原性位置とランダムＳＮＰｓを十分に近づけて関連を発見するために、高密度のＳＮＰマップが必要とされる。ＳＮＰｓは高頻度で起こる傾向があって、ゲノムを通じて均一に間隔が空けられる。ＳＮＰｓの頻度と均一性は、縦列繰り返し多型のような他のタイプの多型と比較して、病原性の遺伝子位置の近接で見つかる可能性がより高いことを意味する。また、ＳＮＰｓは、例えばＶＮＴＲｓのような縦列繰り返し多型よりも突然変異に対して安定である。ＬＤに基づくアソシエーション研究では、何の遺伝子がどこにあるといった予備知識なしに、病原性の遺伝子を発見することが可能である。
【００５７】
しかしながら、現在、全てのヒトゲノムにおいて実行可能なＳＮＰアソシエーション研究はなく、したがって、乳ガンと関係する候補遺伝子がＳＮＰ同定及びアソシエーション解析におけるターゲットとされている。候補遺伝子の研究では、直接疾病の発達に影響すると仮定される遺伝子を確認するために、疾病原因についての先見的な知識が用いられる。候補遺伝子の研究では、障害の治療に用いられる薬により直接のターゲットとされる遺伝子に焦点が当てられるかもしれない。乳ガンの感染性の増大に関連するＳＮＰｓを発見するために、候補遺伝子は疾病の経路に生理的に関係するシステムから選ばれることができる。これらの遺伝子から発見されたＳＮＰｓは、病気にかかっている個人と適切なコントロールとの統計的な関連を見るために試験される。候補遺伝子の研究では、広範囲、又は完全なゲノム領域でのランダムＳＮＰｓのＬＤに基づいたアソシエーション研究との比較、及び分類を行う必要のある個体の数と、候補ＳＮＰｓの数を徹底的に減らすことができるといった長所を持つ。さらに、候補遺伝子研究ではゲノムの特定領域を含むＬＤの範囲を予測する必要もない。
【００５８】
適度に間隔を空けられた十分な情報を有するＳＮＰマーカーの高密度マップとを組み合わせて用いると、連鎖不平衡に基づくゲノムワイドアソシエーション研究を含むアソシエーション研究において、心臓血管疾患、ガン等の複雑な疾病に関わるほとんどの遺伝子を同定することが可能となる。これは特定の疾病と関連する原因ＳＮＰｓを含む候補遺伝子の選択性を向上させるものである。本発明に開示されている全てのＳＮＰｓは、ゲノムワイドアソシエーション研究、又は候補遺伝子アソシエーション研究に部分的に用いることができる。
【００５９】
本発明は、先端技術を進歩させるとともに、エストロゲン受容体遺伝子における従来未知のＳＮＰｓを提供する商業的に有用なものである。
【００６０】
発明の要約
本発明は、エストロゲン受容体ベータ遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子／タンパクの新規な多型のゲノム構造を定義するための、ヒトの第６番染色体及びｃＤＮＡからのゲノムＤＮＡの配列決定に基づく。このような多型は、変異エストロゲン受容体により媒介／変調される、癌に対する感受性、骨粗しょう症、心血管疾患などの様々な病気へと導き得る。この配列決定による手法に基づき、本発明はゲノムヌクレオチド配列、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列、ＥＳＲ−ベータ遺伝子中の配列多型、試料中のこれらの配列／多型を検知する方法、変異エストロゲン受容体により媒介される病気になるか或いは進展する危険性を決定する方法、及び変異エストロゲン受容体により媒介される病気を治療するために使用される化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００６１】
発明の詳述
概論
本発明は、エストロゲン受容体ベータ遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子／タンパクの新規な多型のゲノム構造を定義するための、ヒトの第６番染色体及びｃＤＮＡからのゲノムＤＮＡの配列決定に基づく。このような多型は、変異エストロゲン受容体により媒介／変調される、癌に対する感受性、骨粗しょう症、心血管疾患などの様々な病気へと導き得る。この配列決定による手法に基づき、本発明はゲノムヌクレオチド配列、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列、ＥＳＲ−ベータ遺伝子中の配列多型、試料中のこれらの配列／多型を検知する方法、変異エストロゲン受容体により媒介される病気になるか或いは進展する危険性を決定する方法、及び変異エストロゲン受容体により媒介される病気を治療するために使用される化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００６２】
単離ＳＮＰ含有核酸分子
本発明は一種又はそれ以上の本発明が開示するＳＮＰを含む単離核酸分子を提供する。本発明はさらに、変異タンパクをコード化する単離核酸分子を提供する。このような核酸分子は、一種又はそれ以上の本発明に係るＳＮＰからなるか、実質的にこれらからなるか、又はこれらを含む。核酸分子は追加の核酸残基を有し得る。このような核酸残基は、例えば天然にその核酸分子と連なるものであるか又は異種のヌクレオチド配列である。
【００６３】
ここで、“単離”ＳＮＰ含有核酸分子は本発明のＳＮＰを含むものであり、核酸の天然源に存在する他の核酸から分離されたものである。概して、ここにおける単離ＳＮＰ含有核酸には、そのいずれかの側において側部ヌクレオチド配列を伴う、本発明が開示するＳＮＰ位置が一種又はそれ以上含まれる。この側部配列は、検知試薬のためには好ましくは概ね３００塩基まで、１００塩基まで、５０塩基まで、３０塩基まで、１５塩基まで、１０塩基まで、又は４塩基までを、或いは図面に開示されたコーディング変異体を含むタンパクを生成するために使用するならば、全体のタンパクコード化配列だけの長さを、ＳＮＰ位置のいずれかの側に有する。重要な点は、核酸は遠隔の、及び重要でない側部配列から単離されることであり、そして組み替え発現、ＳＮＰ位置のためのプローブ及びプライマーの調製、及びＳＮＰ含有核酸配列に特有な他の使用のような、ここに開示される特有の操作又は使用をし得るような適切な長さであることである。
【００６４】
さらに、本発明のＳＮＰ位置を含むｃＤＮＡ分子のような“単離”核酸分子は、組み替え技術、化学前駆体、又は化学的に合成する場合における他の化学物質により生産する場合には、他の細胞物質、又は培養媒体から実質的に解放されたものであり得る。しかしながら、核酸分子は他のコーディング又は調節配列と融合し得、この場合もなお単離したものとみなされる。例えば、ベクターに含まれる組み替えＤＮＡ分子は単離したものとみなされる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異型宿主細胞に保持された組み替えＤＮＡ分子、或いは溶液中の精製（部分的に又は実質的な）ＤＮＡ分子が含まれる。単離ＲＮＡ分子には、本発明の単離ＳＮＰ含有ＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのＲＮＡ転写体が含まれる。本発明に係る単離核酸分子には、さらに合成的に生産された分子が含まれる。
【００６５】
単離ＳＮＰ含有核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形で、又はＤＮＡの形であり得る。このＤＮＡには、クローニングにより得られるか、化学合成技術により生産されるか、又はこれらの組み合わせにより生産されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが含まれる。核酸、特にＤＮＡは、二本鎖或いは一本鎖であり得る。一本鎖の核酸はコーディング鎖（センス鎖）、又は非コーディング鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【００６６】
本発明はさらに、ストリンジェント条件下でここに開示される核酸分子にハイブリダイズした関連核酸分子を提供する。ここで、“ストリンジェント条件下でハイブリダイズする”なる表現は、少なくとも６０−７０％が互いに同種であるペプチド配列をコード化するヌクレオチド配列が通常、互いになおハイブリダイズしているような、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を記述することを意図している。この条件は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれ以上が互いに同種である配列が通常なお互いにハイブリダイズしているようなものであり得る。そのようなストリンジェント条件は当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）， ６．３．１−６．３．６に見出すことができる。ストリンジェント条件の一例としては、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中での約４５℃におけるハイブリダイゼーションに続いて、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での５０−６５℃における１回又はそれ以上の洗浄をする。穏やかな乃至低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は従来よく知られている。
【００６７】
特別な態様
ペプチド分子
本発明はエストロゲン受容体の変異体をコード化する核酸配列を提供する。これらの変異体分子／配列は、ここにおいて本発明のエストロゲン受容体変異体、本発明のエストロゲン受容体タンパク、又は本発明のペプチド／タンパクを指すものとする。
【００６８】
本発明は、ここに開示されるエストロゲン受容体変異タンパクのアミノ酸配列からなるか、実質的にそれからなるか、或いはそれを含む単離エストロゲン受容体タンパク分子を提供する。
【００６９】
ここで、タンパク又はペプチドは、それが細胞物質から実質的に解放されているか、又は化学前駆体や他の化学物質から実質的に解放されている場合に、“単離”又は“精製”されたという。本発明のペプチドは均一に、或いはある程度の純度に精製され得る。精製のレベルは使用意図に基づく。その臨界的な特徴は、相当量の他成分が存在したとしても、調製物がペプチドの所望の機能を許容することである。
【００７０】
ここで、“細胞物質から実質的に解放されている”とは、少なくとも約３０％（乾燥重量）以下の他のタンパク（即ち汚染タンパク）、２０％以下の他のタンパク、１０％以下の他のタンパク、又は５％以下の他のタンパクを有するペプチドの調製を含む。ペプチドが組み替えにより生産される場合、実質的に培養媒体からも解放され得る。即ち、培養媒体はタンパク調製物の量の約２０％以下存在する。
【００７１】
“化学前駆体又は他の化学物質から実質的に解放されている”なる語は、ペプチドがその合成時において含まれる化学前駆体又は他の化学物質から単離される該ペプチドの調製を含む。ある態様では、“化学前駆体又は他の化学物質から実質的に解放されている”なる語は、少なくとも約３０％（乾燥重量）以下の化学前駆体又は他の化学物質、２０％以下の化学前駆体又は他の化学物質、１０％以下の化学前駆体又は他の化学物質、又は５％以下の化学前駆体又は他の化学物質を有するエストロゲン受容体タンパクの調製を含む。
【００７２】
単離エストロゲン受容体タンパクは、天然にそれを発現する細胞から精製することができ、それを発現するように改変された細胞（組み替え）から精製することができ、或いは知られているタンパク合成手法を用いて合成され得る。例えば、エストロゲン受容体タンパクをコード化している核酸分子は発現ベクターへクローンされ、該発現ベクターは宿主細胞へ導入され、そしてタンパクが該宿主細胞で発現する。該タンパクはその後、標準のタンパク精製技術を用いて適当な精製過程により細胞から単離され得る。これらの技術の多くは以下に記述される。
【００７３】
したがって、本発明は、一種又はそれ以上の図２に与えられる配列多型を含む、図１及び図３で与えられたＥＳＲ−ベータコード化核酸配列からなるＥＳＲ−ベータ遺伝子によりコード化されたタンパクを提供する。タンパクは、アミノ酸配列がそのタンパクの最終的なアミノ酸配列である場合、そのアミノ酸配列からなる。
【００７４】
本発明はさらに、一種又はそれ以上の図２に与えられる配列多型を含む、実質的に図１及び図３で与えられたＥＳＲ−ベータコード化核酸配列からなるＥＳＲ−ベータ遺伝子によりコード化されたタンパクを提供する。タンパクは、最終的なタンパクにおいてこのアミノ酸配列が僅かな追加のアミノ酸残基と共に存在する場合、実質的にそのアミノ酸配列からなる。
【００７５】
本発明はさらに、一種又はそれ以上の図２に与えられる配列多型を含む、図１及び図３で与えられたＥＳＲ−ベータコード化核酸配列を含むＥＳＲ−ベータ遺伝子によりコード化されたを提供する。。タンパクは、このアミノ酸配列が該タンパクの最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部分である場合、アミノ酸配列を含む。同じく、このタンパクは該ペプチドのみであり得、又は天然にそのタンパクに連なるか又は異型のアミノ酸残基／ペプチド配列であるアミノ酸残基（隣接するコード化配列）のような、追加のアミノ酸配列も持ち得る。このようなタンパクは、数個の追加アミノ酸残基を持ち得、または数百或いはそれ以上の追加アミノ酸を含むことができる。いかに様々なタイプのこれらのタンパクを生産／単離し得るかについて、以下に簡潔に記述する。
【００７６】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、キメラ又は融合タンパクを形成するために異型配列と接合し得る。このようなキメラ又は融合タンパクは、実質的にそのエストロゲン受容体タンパクとは同種でないアミノ酸配列を有する異型タンパクへ作用的に結合されたエストロゲン受容体タンパクを含む。“作用的に結合された”とは、エストロゲン受容体タンパクと異型タンパクがフレーム内に融合することを示す。異型タンパクは、エストロゲン受容体タンパクのＮ末端又はＣ末端に融合され得る。
【００７７】
ここで、融合タンパクはエストロゲン受容体タンパクの活性に本質的に影響しない。例えば、融合タンパクは、酵素融合タンパク、例えばベータガラクトシダーゼ融合体、イーストツーハイブリッドＧＡＬ融合体、ポリ−Ｈｉｓ融合体、ＭＹＣ標識、ＨＩ標識、Ｉｇ融合体を含むがこれらに限定されない。このような融合タンパクは、特にポリ−Ｈｉｓ融合体は、組み替えエストロゲン受容体タンパクの精製を容易にすることができる。ある宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）では、タンパクの発現及び／又は分泌は、異型の信号配列の使用により増加され得る。
【００７８】
キメラ又は融合タンパクは、標準の組み替えＤＮＡ技術により生産され得る。例えば、異なるタンパク配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来技術により互いにフレーム内に括られる。他の態様では、融合遺伝子は自動ＤＮＡシンセサイザを含む従来技術により合成され得る。代わりに、二つの連続した遺伝子フラグメントの間の相補的な突出を生じるアンカープライマーを用い、続いてアニール及び再増幅してキメラ遺伝子配列を生成して遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２を参照）。さらに、融合半部をすでにコード化してある多くの発現ベクターが商業的に入手可能である（例えばＧＳＴタンパクが挙げられる）。エストロゲン受容体タンパクをコード化した核酸は、融合半部をエストロゲン受容体タンパクにフレーム内で連結させることで発現ベクターなどへクローニングし得る。
【００７９】
ポリペプチドは、２０天然由来アミノ酸と通常呼ばれる２０のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含む。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、天然の過程、加工や翻訳後修飾、又は従来技術としてよく知られている化学修飾技術により修飾される。ポリペプチドに天然に起こる典型的な修飾は基本テキスト、詳細な専攻論文、及び研究文献に記述されており、当業者によく知られている。したがって、このポリペプチドは、置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりエンコードされたものではない誘導体又は類推体を包含し、置換基が含まれる誘導体又は類推体を包含し、成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半寿命を増加する化合物のような、他の化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合した誘導体又は類推体を包含し、リーダー又は分泌配列、又は成熟ポリペプチドの精製のための配列、又はプロタンパク配列のような追加のアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合した誘導体又は類推体を包含する。
【００８０】
知られている修正は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、フラビンの共有結合、ヘム半部の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミンの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水和化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解加工、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパクへの転移ＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化を含むがこれに限定されない。
【００８１】
このような修飾は当業者によく知られており、科学文献に大いに詳細に記述されている。いくつかの汎用されている修飾として、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、水和化、及びＡＤＰリボシル化がほとんどの基本書に記述されている。このような基本書としては、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄＥｄ．， Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）が挙げられる。この主題についての多くの詳細なレビューが入手でき、例えば Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６（１９９０）） ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２（１９９２））が挙げられる。
【００８２】
本発明はさらに、本発明のエストロゲン受容体タンパクのフラグメントを含み、それらのフラグメントからなるタンパク及びペプチドに加えて、それらのフラグメントを提供する。本発明が属するそのフラグメントは、しかしながら、本発明に先立ち公に開示されたであろうフラグメントを包含するようには解釈されない。
【００８３】
ここで、フラグメントはエストロゲン受容体タンパクからの隣接する８個又はそれ以上のアミノ酸残基を含む。このようなフラグメントはエストロゲン受容体タンパクの一種又はそれ以上の生物学的活性を保持する能力に基づき選択することができ、又は機能、例えば免疫原としての作用を果たし得る能力のために選択することができる。特に重要なフラグメントは生物学的に活性なフラグメント、ペプチドであり、これらは例えば長さにして約８個又はそれ以上のアミノ酸であり、変異アミノ酸残基（図２）を含む。このようなフラグメントは通常、本発明のエストロゲン受容体タンパクのドメイン又はモチーフ、例えば活性サイト、リガンド結合ドメイン、又はＤＮＡ結合ドメインを含む。さらに、可能なフラグメントとして、これに限定されないが、ドメイン又はモチーフを含有するフラグメント、溶解性ペプチドフラグメント、及び免疫原性構造を含有するフラグメントを含む。予言されるドメイン及び機能性サイトは、当業者によく知られ直ちに入手可能なコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ ａｎａｌｙｓｉｓ）により直ちに同定し得る。
【００８４】
タンパク／ペプチドの使用
本発明のタンパクは、高スループットのスクリーニングのための多要素タンパクのパネルを含む、該タンパクの生物的活性を決定するためのアッセイとして、そして；抗体を増やし、又は他の免疫応答を引き出すため；生物学的流体中のタンパク（又はその結合パートナー或いは受容体）のレベルを定量的に決定するためにデザインされたアッセイにおける試薬（ラベル試薬を含む）として；そして対応するタンパクが好適に発現する組織（形成的に、又は組織分化乃至発達の特別な段階での、或いは病気の状態における）のマーカとしての、アッセイに使用できる。いずれかの、又は全てのこれらの研究用ユティリティは、研究用製品としての商用化のための試薬グレード又はキットフォーマットへと発展させることができる。上記の使用を達成するための方法は、当業者によく知られている。このような方法を開示するリファレンスには、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．， １９８９， ａｎｄ “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ． ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌｓ ｅｄｓ．， １９８７が含まれる。
【００８５】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは生物学的アッセイとして有用である。このようなアッセイは、エストロゲン受容体に関連した状態の診断及び治療に有用な、どのような知られているエストロゲン受容体の機能、活性、又は性質をも伴う。
【００８６】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、細胞ベース、又は無細胞のシステムでのドラッグスクリーニングアッセイにも有用である。細胞ベースのシステムは、ネイティブ、即ち通常該受容体タンパクを発現する細胞でもよく、生検としてでもよく、又は細胞培養へ拡張し得る。ある態様において、しかしながら、細胞ベースのアッセイは、受容体タンパクを発現する組み替え宿主細胞を含む。
【００８７】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、受容体の活性を変調する化合物を同定するために使用することができる。本発明のエストロゲン受容体タンパク及び適当なフラグメントの双方は、受容体の活性を束縛及び／又は変調するための能力についての候補化合物を検査するための高スループットのスクリーンとして使用できる。これらの化合物は、化合物の受容体活性に対する効果を決定するために、機能性受容体に対してさらにスクリーンすることができる。さらに、これらの化合物は、活性／効果を決定するために動物又は無脊椎動物のシステムでテストすることができる。受容体を所望の程度に活性化し（作用物質）、又は不活性化する（拮抗物質）化合物が同定される。このような化合物は、一種又はそれ以上の、本発明に係る変異エストロゲン受容体タンパクに作用する能力のために選択される。
【００８８】
さらに、受容体ポリペプチドは、受容体タンパクと、通常は受容体タンパク、例えばエストロゲンと相互作用するターゲット分子との間の相互作用を刺激又は阻害する能力のための化合物をスクリーンするために使用することができる。該ターゲットは、受容体タンパクが通常相互作用するリガンド又は結合パートナー（例えばエストロゲンリガンド又はＤＮＡ配列）であり得る。このようなアッセイは通常、受容体タンパク又はフラグメントが該ターゲット分子と相互作用する条件下で、受容体タンパクを候補化合物と結合させ、そしてタンパクとターゲットの間のコンプレックス生成を検知するか、又はタンパクとターゲットの間の相互作用の生物学的結果を検知するステップを含む。
【００８９】
候補化合物としては、例えば次のものを含む。１）Ｉｇ−テール融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリのメンバー（例えばＬａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８４−８６（１９９１）を参照）及び、Ｄ及び／又はＬ配置アミノ酸から作られるコンビナトリアルケミストリーからの分子ライブラリを含む溶解性ペプチド等のペプチド；２）ホスホペプチド（例えばランダムな、及び部分的に縮退したメンバー、直線状のホスホペプチドライブラリ、例えばＳｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８（１９９３）を参照）；３）抗体（例えばポリクロナール、モノクロナール、ヒト化、抗イジオタイプ、キメラ、そして、Ｆａｂ、Ｆ（ａ’ｂ）２、Ｆａｂ発現ライブラリフラグメント、及び抗体のエピトープ結合フラグメントと同様の一本鎖抗体）；４）小型の有機、無機分子（例えばコンビナトリアル及び天然生産物ライブラリから得られる分子）。
【００９０】
一つの候補化合物としては、リガンド結合と競合する受容体の溶解性フラグメントが挙げられる。他の候補化合物としては、受容体の機能に影響し、リガンドと競合する変種受容体又は適当なフラグメントを含む突然変異体が含まれる。したがって、例えば高い親和性でリガンドと競合するフラグメント、又はリガンドと結合して離れないフラグメントが本発明に包含される。
【００９１】
本発明はさらに、受容体の活性を変調（刺激又は阻害）する化合物を同定するための他のエンドポイントアッセイ（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ ａｓｓａｙ）を含む。このアッセイは通常、受容体活性を表す信号伝達経路における事象のアッセイを含む。例えば、受容体タンパクに依存する信号カスケードに応答して上下に調整される遺伝子の発現がアッセイできる。ある態様において、このような遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼのような容易に検知できるマーカへ作用的に結合することができる。代わりに、受容体タンパク又は受容体タンパクターゲットのホスホリル化も測定できる。受容体により媒介される生物学的又は生化学的な機能の何れもがエンドポイントアッセイとして使用できる。これらは、ここに記述された、ここに引用されたリファレンスにおける、これらのエンドポイントアッセイターゲットのためのリファレンスにより取り入れた、全ての生化学的又は生化学／生物学的事象と、当業者に知られている他の機能を含む。
【００９２】
受容体ポリペプチドは、受容体と相互作用する化合物を発見するためにデザインされた方法における競合結合アッセイとしても有用である。化合物は該化合物がポリペプチドと結合又は他の相互作用をする条件下で受容体ポリペプチドにさらされる。受容体へのリガンドもその混合物へ加えられる。テスト化合物が受容体又はリガンドと相互作用する場合、形成されるコンプレックスの量又は受容体ターゲットからの活性を減少させる。このタイプのアッセイは、受容体の特別な領域と相互作用する化合物を探す場合に特に有用である。
【００９３】
無細胞のドラッグスクリーニングアッセイを行うには、アッセイの自動化の便宜を図ると同時に、一つ又は両方のタンパクの非コンプレックス型からの、コンプレックスの分離を容易にするため、受容体タンパクか、フラグメントか、又はそのターゲット分子を固定化することが望ましいこともある。
【００９４】
マトリックスにタンパクを固定化する技術がドラッグスクリーニングアッセイに使用できる。ある態様において、タンパクがマトリックスへ束縛されるドメインを加えた融合タンパクが提供される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパクは、グルタチオンセファローゼビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅｓ）に吸着され得る。これはその後、細胞溶菌液（例えば３５Ｓでラベルした）及び候補化合物と結合され、この混合物はコンプレックス形成へと導く条件下（例えば塩とｐＨの生理学的条件）で培養される。培養に続き、未束縛のラベルを除くためにビーズを洗浄し、マトリックス固定化がなされ、放射性ラベルが直接、又はコンプレックスが解離した後の上澄みで決定される。代わりに、コンプレックスはマトリックスから解離することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ビーズフラクション中に見いだされる受容体束縛タンパクのレベルは標準の電気泳動技術を用いゲルから定量される。例えば、ポリペプチド又はそのターゲット分子は、従来よく知られている技術を用いてビオチンとステプタビジンの共役を利用して固定化し得る。代わりに、タンパクと反応性であるがタンパクのターゲット分子への結合を妨害しない抗体が、プレートのくぼみへ誘導体化され得、タンパクは抗体の共役によりくぼみにトラップされる。受容体結合タンパクと候補化合物の調製物は、受容体タンパクが存在するくぼみで培養され、くぼみにトラップされたコンプレックスは定量され得る。このようなコンプレックスを検知する方法としては、ＧＳＴ固定化コンプレックスのために上述したものに加えて、ターゲット分子に関連した酵素活性を検知することによる酵素結合アッセイと同様に、受容体タンパクターゲット分子と反応性の、又は受容体タンパクと反応性でありターゲット分子と競合する抗体を用いたコンプレックスの免疫検知を含む。
【００９５】
本発明のタンパクを変調する試薬は、上記の一種又はそれ以上のアッセイを単独又は組み合わせて用いることにより同定できる。細胞ベース或いは無細胞のシステムを初めに使用し、その後動物又は他のモデルシステムで活性を確認するのが一般的には好ましい。このようなモデルシステムは従来よく知られており、この状況において直ちに用いることができる。これらのドラッグスクリーニングアッセイにより同定される受容体タンパクのモジュレータは、エストロゲン受容体タンパクを発現する細胞を治療することにより、受容体経路で媒介される病気をもつ患者を治療するのに用いることができる。これらの治療の方法は、ここに開示されたように医薬組成物中のタンパク活性のモジュレータを、そのような治療の必要に応じて患者へ投与するステップを含む。
【００９６】
本発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイにより同定される新規な試薬に属する。したがって、適当な動物モデルにおいて、ここに開示されたように同定された試薬をさらに使用することは本発明の範囲内に属する。例えば、ここに開示されたように同定された試薬（例えばエストロゲン受容体変調試薬、アンチセンスエストロゲン受容体核酸分子、エストロゲン受容体特異抗体、又はエストロゲン受容体結合パートナー）が、このような試薬による治療の効率、毒性、副作用を決定するために動物モデルにおいて使用できる。代わりに、ここに開示されたように同定された試薬は、このような試薬の作用のメカニズムを決定するために動物モデルにおいて使用できる。さらに、本発明はここに開示されたような治療のために上述のスクリーニングアッセイにより同定された新規な試薬の使用に関係する。
【００９７】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、エストロゲン受容体により媒介される病気又は病気へのかかりやすさを診断するためのターゲットを提供するのにも有用である。したがって、本発明は細胞中、組織中、又は有機体中における、本発明のエストロゲン受容体変異体（又はエンコーディングｍＲＮＡ）の存在、又はそのレベルを検知するための方法を提供する。この方法は、生物学的試料を、受容体タンパク（又は受容体をコード化する遺伝子、ｍＲＮＡ）と相互作用が可能な化合物に、相互作用が検知されるように接触させることを含む。
【００９８】
試料中のタンパクを検知する一つの試薬は、エストロゲン受容体タンパクの変異型に選択的に結合することができる抗体である。このような試料は、患者の体内に存在する組織、細胞、及び生物学的流体と同時に、患者から分離された組織、細胞、及び生物学的流体を含む。核酸ベースのプローブ、プライマー、及びアレイのような他の試薬が以下に記述される。
【００９９】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、変異エストロゲン受容体をもつ患者の進行中の病気、病気へのかかりやすさを診断するためのターゲットも提供する。ここでの病気は特に骨粗しょう症、自己免疫疾患、細胞分化などのようなエストロゲン経由のものを含む（従来技術欄を参照）。例えば、受容体は生物学的試料から単離され、異常型の受容体活性を生じる遺伝子突然変異の存在をアッセイすることができる。これは、アミノ酸置換、削除、挿入、再配列（異常型のスプライシング事象の結果として）、そして図２に与えられる適当な後翻訳修正を含む。分析手法は、変更電気伝導度、変更トリプシン消化、細胞ベース又は無細胞のアッセイにおける変更受容体活性、リガンド又は抗体結合パターンにおける変更、変更等電点、直接アミノ酸配列決定、そしてタンパク中の突然変異を検知するために有用な知られている他のアッセイ技術を含む。特に有用なのは図２に与えられるバリエーションである。
【０１００】
ペプチドを検知するためのＩｎ ｖｉｔｒｏの技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ）、免疫沈降、及び免疫蛍光を含む。代わりに、ペプチドは、患者にラベルした抗ペプチド抗体を導入することにより、Ｉｎ ｖｉｖｏで患者内で検知できる。例えば、抗体は、患者内におけるその存在と位置が標準のイメージング技術により検知できる放射性マーカでラベルされ得る。特に有用なのは、患者内で発現する、ここに開示されるエストロゲン受容体の特異なアレル変異体を検知する方法及び、試料中のペプチドのフラグメントを検知する方法である。
【０１０１】
該ペプチドは、薬理ゲノミクス分析にも有用である。薬理ゲノミクスは、薬処理過程の改変及び患者における異常な作用により、薬への応答に対し臨床的に有意である遺伝的変異を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５（１９９６））や、Ｌｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６（１９９７））を参照。これらの変異の臨床結果は、物質代謝における個人の変異の結果として、ある個人においては治療薬が激しい毒性となるという結果となり、またある個人においては薬による治療の失敗に終わるという結果となる。このように、個人の遺伝子型が、治療化合物が体に作用する道筋を、或いは体が化合物を代謝する道筋を決定し得るのである。さらに、薬代謝酵素の活性は、薬作用の強さ及び長さの両方に影響を与える。このように、個人の薬理ゲノミクスは効果的な化合物及び、個人の遺伝子型に基づいた予防的又は治療的な扱いのための化合物の、効果的な投薬を選択する機会を与える。幾つかの薬代謝酵素における遺伝子多型の発見は、なぜ幾らかの患者において期待したドラッグ効果が得られず、過度のドラッグ効果を示し、又は標準的なドラッグ投与から深刻な毒性を経験するのかを説明する。多型は、正常以上の代謝を有する人の表現型にも、代謝の遅い人にも発現し得る。したがって、遺伝子多型は受容体タンパクのアレルタンパク変異を導き、この場合一の個体群における一又はそれ以上の受容体の機能は、他の個体群とは異なる。したがって、ペプチドによりターゲットの治療法に影響を与え得る遺伝子的素質を確かめることができる。例えば、リガンドベースの治療において、多型はアミノ末端の細胞外ドメイン及び／又はリガンド結合が幾らか活性である他のリガンド結合領域を引き起こし、そして受容体の活性化を引き起こす。したがって、リガンドの服用量は当然に、ある多型／ハプロタイプを含む与えられた個体群において治療効果が最大となるように調節される。遺伝子型に代えて、特異的な多型ペプチドが同定し得る。
【０１０２】
抗体
本発明はまた、本発明のエストロゲン受容体タンパクに、そのフラグメントと同じく選択的に結合する抗体を与える。ここで、抗体は、ターゲットタンパクと結合する場合、選択的にそれと結合し、関連しないタンパクとは有意に結合しない。抗体は、それがターゲットタンパクと実質的に同種ではない他のタンパクとも結合する場合であっても、そのようなタンパクが抗体のターゲットタンパクのフラグメント又はドメインと同一性を共有する限りにおいて、なお選択的にタンパクと結合するとみなされる。この場合、そのタンパクに結合している抗体は、ある程度の妨害的な再反応性にもかかわらず、なお選択的であることが理解される。
【０１０３】
ここで、抗体は、その技術において認識されるものと同一性を有する用語で定義される：それらは、抗原の攻撃に応答して哺乳類生物により生産された、マルチサブユニットタンパクである。本発明の抗体は、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体、そしてこのような抗体のフラグメントも同様に含み、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメントを含むがこれに限定されない。
【０１０４】
与えられたターゲットに対する抗体を生成及び／又は同定する多くの方法が知られている。幾つかのそのような方法は、Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記述されている。概して、抗体を生成するために、単離ペプチドが免疫原として使用され、これがラット、ラビット、又はマウスのような哺乳類生物へ投与される。全長のタンパク、抗原性ペプチド、又は融合タンパクを使用することができる。
【０１０５】
抗体は、好ましくはエストロゲン受容体タンパクの領域又は離散的なフラグメントから調製される。抗体は、ここに開示されるペプチドのいかなる領域においても調製され得る。しかしながら、好ましい領域は機能／活性、及び／又は受容体／結合パートナー相互作用を伴う領域を含む。抗原性ペプチドは通常、少なくとも１０個の隣接アミノ酸残基を含む。該抗原性ペプチドは、しかしながら、少なくとも１２、１４、２０又はそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。このようなフラグメントは、例えば疎水性領域のようなタンパクの表面に位置する領域に相当するフラグメントのような、物理的性質により選択され得る。
【０１０６】
本発明の抗体の検知は抗体を検知可能な物質へカップリング（即ち、物理的な結合）させることにより容易にすることができる。検知可能な物質の例としては、様々な酵素、補綴基、蛍光物質、発光物質、バイオ発光物質、及び放射性物質が含まれる。適当な酵素の例としては、ホルセラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる；適当な補綴基コンプレックスの例としては、ストレプタビジン／ビオチン、及びアビジン／ビオチンが含まれる；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナーゼ、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリスリンが含まれる；発光物質の例としては、ルミノールが含まれる；バイオ発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びアエクオリンが含まれ、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが含まれる。
【０１０７】
抗体の使用
抗体は、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準的な技術により、本発明のエストロゲン受容体タンパクを単離するために使用することができる。該抗体は、細胞及び、宿主細胞で発現し組み替え的に生産されたタンパクからの天然タンパクの精製を容易にすることができる。加えて、この抗体は、生物の様々な組織間における、そして通常の発達の進行に渡って、本発明のエストロゲン受容体タンパクの発現のパターンを決定するために、細胞又は組織中における該タンパクの存在を検知するために有用である。さらにこの抗体は、発現の豊富さ及びパターンを評価するために、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又は細胞溶解液或いは上澄み中におけるタンパクを検知するために使用することができる。また、この抗体は、発達中における異常な組織分布又は異常な発現を評価するために使用することができる。全長のエストロゲン受容体タンパクの循環フラグメントの抗体検知は、循環率を同定するために使用することができる。
【０１０８】
さらに、この抗体は、病気の活性段階における、又はタンパクの機能に関連する病気、特に骨粗しょう症、自己免疫疾患など（従来技術欄を参照）を伴う病気を起こす素質がある個人における発現を評価するために使用することができる。変調が不適切な組織分布、成長的な発現、タンパクの発現レベル、又は発現／加工された型により引き起こされる場合、抗体は、通常のタンパクに対して調製することができる。もし変調がタンパクの特異的な突然変異により特徴付けられる場合には、この突然変異タンパクに特異的な抗体を、特異的な突然変異タンパクの存在をアッセイするために使用することができる。
【０１０９】
この抗体は、生物の様々な組織中の細胞の、通常及び異常型の遺伝子局在を評価するためにも使用することができる。診断的な使用は、遺伝子試験だけでなく、治療法をモニタするためにも適用できる。したがって、治療が終局的に発現レベル、又は異常型配列の存在及び異常型組織分布、又は成長的な発現を直すことを意図している場合には、そのタンパク又は関連するフラグメントに対して向けられた抗体を、治療効率をモニタするために使用することができる。
【０１１０】
加えて、抗体は薬理ゲノム分析に有用である。例えば、多型タンパクに対して調製された抗体は、修正した治療法が求められる個人を同定するために使用することができる。この抗体は、電気伝導度、等電点、トリプシンペプチド消化、そして従来技術において知られている他の物理的アッセイにより分析される異常型エストロゲン受容体タンパクのための免疫的マーカとしての診断ツールとしても有用である。
【０１１１】
この抗体は、タンパク機能の阻害、例えば、エストロゲン受容体タンパク質の、リガンドのような結合パートナーへの結合のブロックのためにも有用である。これらの使用は、治療がタンパクの機能を阻害することを伴う治療状況にも適用することができる。抗体は、例えば結合をブロックし、これによりタンパクの活性を変調（作用又は拮抗）するために使用することができる。抗体は、機能が要求されるサイトを含む特別なフラグメントに対して、又は細胞或いは細胞膜と関連しているそのままのタンパクに対して調製することができる。
【０１１２】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパクの存在を検知するための抗体を使用するためのキットも包含する。このキットは、ラベル化又はラベル可能な抗体のような抗体及び、生物学的サンプル中のエストロゲン受容体タンパクを検知するための化合物又は試薬；該サンプル中のタンパクの量を決定する手段；該サンプル中のエストロゲン受容体タンパクの量を基準と比較する手段；及び使用のためのインストラクションを含むことができる。
【０１１３】
核酸分子
本発明はさらに、本発明にかかるエストロゲン受容体タンパクをコード化する単離核酸分子を提供する。該核酸分子は、本発明のエストロゲン受容体タンパクの一つをコード化するヌクレオチド配列からなる、本質的に該ヌクレオチド配列からなる、又は該ヌクレオチド配列を含む。
【０１１４】
ここでいう「単離」核酸分子とは、核酸の天然源に存在する他の核酸から区別されたものである。好ましくは「単離」核酸は、本来核酸が誘導された有機体のゲノムＤＮＡ中で核酸を側面に配置する配列（すなわち、核酸の５´又は３´末端に位置する配列）ではない。しかしながら、いくらか側面に配置するヌクレオチド配列を含むことができ、その例としては約５ＫＢ，４ＫＢ，３ＫＢ，２ＫＢ，又は１ＫＢ以下であり、特に連続的にペプチドをコード化する配列及び同一遺伝子内でペプチドをコード化する配列であるが、ゲノム配列のイントロンから離れた配列である。重要な点は、核酸が離れた重要でない隣接配列から単離されたことであり、ここで述べる組換えの発現、プローブ及びプライマーの調製、及び核酸配列に特異的な他の用途等の特殊な操作の対象となるということである。
【０１１５】
さらに、ｃＤＮＡ分子等の「単離」核酸分子は、他の細胞材料、又は組換え技術で製造された場合には培地、化学合成された場合には化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、核酸分子は他のコード化又は調節配列と融合することができ、これも単離したと考えられる。
【０１１６】
例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は単離されていると考えられる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、非相同な宿主細胞中に維持された組換えＤＮＡ分子、または溶液中の精製（部分的に又は実質的に）されたＤＮＡ分子があげられる。単離ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明の単離ＤＮＡ分子のＲＮＡ転写を含む。さらに本発明にかかる単離核酸分子は合成的に製造された分子を含む。
【０１１７】
従って、本発明は、図１及び３で示されるエストロゲンβコード化ヌクレオチド配列よりなる、図２で提供される一つ以上の配列多型を含む核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列が核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるので、核酸分子はヌクレオチド配列からなっている。
【０１１８】
本発明はさらに、図１及び３で示されるエストロゲンβコード化ヌクレオチド配列より実質的になる、図２で提供される一つ以上の配列多型を含む核酸分子を提供する。核酸分子は実質的に、最終的な核酸分子中に幾つかの付加的核酸残基が存在するヌクレオチド配列よりなる。
【０１１９】
本発明はさらに、図１及び３で示されるエストロゲンβコード化ヌクレオチド配列を含む、図２で提供される一つ以上の配列多型を含む核酸分子を提供する。核酸分子は、該ヌクレオチド配列が核酸分子の最終的なヌクレオチド配列の一部である核酸配列の場合、該ヌクレオチド配列を含む。このように、核酸分子はヌクレオチド配列のみ、又は付加的核酸残基を有することができ、核酸残基はヌクレオチド配列又は非相同性ヌクレオチド配列と自然に関連したものである。このような核酸分子はわずかな付加的ヌクレオチドを有する、あるいは数百又はそれ以上の付加的ヌクレオチドを含む。これら様々なタイプの核酸分子がどのようにして作られ／単離されたかの簡単な説明を以下に提供する。
【０１２０】
単離核酸分子は、成熟タンパクと付加的アミノ酸又はカルボキシル末端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸（例えば成熟形態が一つ以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することがある。このような配列はタンパクが前駆体から成熟体へ成長する際、タンパク搬送の促進、タンパク半減期の延長又は短縮、又はアッセイ又は製造の際のタンパク操作の効率化、又は他の事由に役割を果たす。一般にｉｎ ｓｉｔｕの場合、付加的アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパクから切り離される。
【０１２１】
上記のように、単離核酸分子は、エストロゲン受容体タンパクのみをコード化する配列、主又は副配列（例えばｐｒｅ−ｐｒｏ 又はｐｒｏ−タンパク配列）等の、成熟ペプチド及び付加的コード配列をコード化する配列、付加的コード配列を有し又は有さない成熟ペプチドをコード化する配列、プロモーターなどのゲノム調節配列に加えて、例えばイントロン及び非コード化５´及び３´配列のような転写はされるが翻訳はされず、転写、ｍＲＮＡ処理（スプライシング及びポリアデニル化信号を含む）、リボゾーム結合及びｍＲＮＡの安定化に役割を果たす付加的非コード配列を含むが、これに制限されない。さらに、核酸分子は、例えば精製に有用なペプチドなどをコード化するマーカー配列に融合されたものでもよい。
【０１２２】
単離核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡ形態、あるいはｃＤＮＡ及びクローニング又は化学合成技術、又はこれらの組み合わせで得られたゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ形態でありえる。核酸、特にＤＮＡは二重鎖又は一重鎖である。一重鎖はコード鎖（センス鎖）又は非コード鎖（アンチセンス鎖）でありえる。
【０１２３】
フラグメントは、１２又はそれ以上のヌクレオチドの連続的ヌクレオチド配列を含む。さらにフラグメントは、少なくとも３０，４０，５０，１００，２５０，又は５００のヌクレオチド長であることができる。フラグメントの長さは使用目的に依存する。例えば、フラグメントはペプチドのエピトープ挙動部分をコード化し、又はＤＮＡプローブ又はプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成する公知のヌクレオチド配列を用い、単離することができる。標識されたプローブは、コード化部分に対応する核酸を単離するため、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡをスクリーニングするために用いることができる。さらに、プライマーは、遺伝子の特定部分をクローンするためＰＣＲ反応を用いることができる。
【０１２４】
プローブ／プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約１２，２０，２５，４０，５０又はそれ以上の連続的なヌクレオチドとなるように、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列部分を含む。好ましいプローブ／プライマーセットは、図２において識別された変異塩基をカバー／スパンする。
【０１２５】
ここで「ストリンジェント条件下でのハイブリダイズ」とは、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列が互いに少なくとも５０−５５％の相同性を有するまでハイブリダイズ及び洗浄を行うことを意味する。前記条件は、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、互いに配列が少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％以上相同性を有する。このようなストリンジェント条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントハイブリダイズ条件の一例は、６Ｘ　塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃でハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ　５０−６５℃で一回以上洗浄するという条件である。
【０１２６】
核酸分子の利用
本発明の核酸分子はプローブ、プライマー、化学的中間体、および生物学的アッセイに有用である。プローブは図２に示した一つ以上の配列多型を含む、図１及び３のヌクレオチド配列よりなる核酸分子の全長にわたっていずれかの配列にかかるものでありえる。従って、それは５´非コード化部分、コード化部分、及び３´非コード化部分から誘導できる。しかしながら、前述したように、フラグメントは、本発明以前に公開されたフラグメントを含むものではない。
【０１２７】
核酸分子は、ＰＣＲによる核酸分子のいずれかの与えられた部分の増幅に有用であり、また、望ましい長さ及び配列の反増感分子の合成に有用である。
【０１２８】
核酸分子はまた、組換ベクターを構成するのにも有用である。このようなベクターはペプチド配列の一部分又はすべてを発現する発現ベクターを含む。ベクターは挿入ベクターを含み、他の核酸分子配列に融合して使用され、例えば細胞ゲノム中に、遺伝子及び／又は遺伝子生成物の発現状態を変えるために用いられる。例えば、内生コード化配列を、そのすべて又はその一部について一以上の特に変異を引き起こすコード化部分に相同的に組換えることができる。
【０１２９】
核酸分子はまた、タンパクの抗原部分を示すのにも有用である。
核酸分子また、ここに記述された核酸分子から、全長又は一部のｍＲＮＡに対応するリボザイムを設計するのに有用である。
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部またはすべてを発現する宿主細胞を構築するのに有用である。
【０１３０】
核酸分子はまた、前記核酸分子及びペプチドのすべて又は一部を発現する遺伝子組換動物を構築するのに有用である。
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現するベクターを作るのに有用である。
【０１３１】
核酸分子はまた、核酸分子の発現の存在、レベル、形態及び分布を決定するハイブリダイズプローブとして有用である。従って、プローブは、細胞、組織及び有機体における特定核酸分子の存在を検知し、又はレベルを決定するために用いられ得る。核酸のレベルはＤＮＡ又はＲＮＡで決定される。従って、ここに記述されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、又は有機体で，発現及び／又は遺伝子複製数の評価に用いることができる。これらを使用することは、正常状態に比較し、エストロゲン受容タンパクの発現が増加又は減少することに関連した異常の診断に等価である。
【０１３２】
ｍＲＮＡの検出のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、ノーザンハイブリダイズ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズを含む。ＤＮＡ検出のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、サウザンハイブリダイズ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズを含む。
【０１３３】
プローブは、エストロゲン受容体タンパクを発現する細胞又は組織を特定するための診断検査キット、又は核酸配列フォーマットの一部として用いることができ、それは対象からの細胞のサンプル中の受容体コード化核酸、例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのレベルを測定すること、又はエストロゲン受容体遺伝子が変異していないかを検出することで行われる。
【０１３４】
核酸発現アッセイは、エストロゲン受容体核酸発現を変調する化合物を特定するスクリーニング試薬として有用である。
【０１３５】
従って本発明により、エストロゲン受容体遺伝子の核酸発現に関連した異常を処置するために用い得る化合物の特定のための方法が提供される。この方法は、典型的にはエストロゲン受容体核酸の発現を変調する化合物の能力をアッセイし、望ましくないエストロゲン受容体核酸発現により特徴づけられる異常の処置にその物質が使用し得るかを判定する。これらのアッセイは細胞ベース系及び細胞フリー系で行うことができる。細胞ベースのアッセイは、エストロゲン受容体核酸を自然に発現している細胞、又は特定の核酸配列を発現するように遺伝的に設計された組換え細胞を含む。
【０１３６】
エストロゲン受容体核酸発現のアッセイは、ｍＲＮＡレベルなどの核酸レベルの直接的アッセイ、又は信号経路に関連する二次的な化合物により行われる。さらにエストロゲン受容タンパク信号経路に対する遺伝子発現の上昇又は減少制御がアッセイされる。この具体例では、これらの遺伝子の調節部分はルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子と結合されることができる。
【０１３７】
そして、エストロゲン受容体遺伝子発現の変調剤は、細胞が候補化合物と接触し、ｍＲＮＡの発現が検出されることで特定される。候補化合物の存在下でのエストロゲン受容体ｍＲＮＡの発現レベルが、候補化合物不存在下でのエストロゲン受容体ｍＲＮＡの発現レベルと比較される。候補化合物は、この比較に基づき核酸発現の変調剤として判定され、例えば異常な核酸発現に特徴づけられる異常の処置に使用される。ｍＲＮＡの発現が候補化合物の存在下で、不存在下に比較して統計的に著しく大きい場合には、その候補化合物は核酸発現の刺激剤として特定される。ｍＲＮＡの発現が候補化合物の存在下で、不存在下に比較して統計的に著しく小さい場合には、その候補化合物は核酸発現の阻害剤として特定される。
【０１３８】
本発明は、核酸を標的として、エストロゲン受容体を発現する細胞又は組織にエストロゲン受容体核酸発現の変調を行う遺伝子変調剤とした薬剤スクリーニングを通して特定された化合物を用いた処置方法を提供する。変調は、向上調整（例えば活性化又はアゴニスト化）又は低下調整（抑制又はアンタゴニスト化）の両方の調節、または核酸発現を含む。
【０１３９】
あるいは、エストロゲン受容体核酸発現の変調剤は、その薬剤又は小分子がそのタンパクが発現している細胞又は組織中でエストロゲン受容体核酸発現を阻害するものである限り、ここに記述されたスクリーニングアッセイを用いて特定された小分子又は薬剤である。
【０１４０】
核酸分子は、臨床試験又は処理管理において、エストロゲン受容体遺伝子の発現又は活性に対する変調化合物の有効性のモニターに有効である。遺伝子発現パターンは化合物により処理の連続的効果のバロメーターとなり、特に患者が耐性を示す化合物に有効である。遺伝子発現パターンは化合物に影響された細胞の生理的反応を示すマーカーとしてもまた有用である。従って、このようなモニターは化合物の投与量の増加又は患者が耐性を示さない別の化合物の投与を許可する。同様に、核酸発現のレベルが好ましいレベル以下に落ちたら、化合物の投与を比例して減少させることができる。
【０１４１】
核酸分子はまた、エストロゲン受容体核酸発現の質的変化に対する診断アッセイに有用であり、特に病状に質的変化を導き出す。核酸分子はエストロゲン受容体遺伝子及びｍＲＮＡのような遺伝子発現生成物の変異を検出するのに用いることができる。核酸分子はエストロゲン受容体遺伝子中で自然に生じた遺伝子変異を検出するハイブリダイズプローブとして用いることができ、そして変異を有する対象が変異により生じる異常の危険性があるか否かを判定することができる。変異は、遺伝子中の一以上のヌクレオチド、特に図２で識別されるようなヌクレオチドの欠如、付加、置換；転置又は転移のような染色体再配置；異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの変化、増幅のような遺伝子複写数の変化等を含む。逆機能に関連したエストロゲン受容体遺伝子の変異形態の検出は、活性診断、又は疾患がエストロゲン受容体タンパクの過剰発現、過小発現、又は変異発現の結果である場合には疾患に対する感受性の診断方法となる。
【０１４２】
エストロゲン受容体遺伝子に変異を有する個体は、各種技術により遺伝子レベルで検出することができる。ゲノムＤＮＡは直接に分析し、又は分析に先立ちＰＣＲを用いて増幅することもできる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡは同様に用いることができる。サンプルは、１つの変異を一度に試験するために使用されるか、または単一の実験について多くの変異を試験するために、核酸配列を使ってマルチプレックスされる。ある用途では、変異の検出は、アンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ　ＰＣＲのように、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２）におけるプローブ／プライマーの使用に関連し、又は異なるものではリゲーション鎖反応（ＬＣＲ）（Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）；及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４（１９９４）参照）に関連し、後者は特に遺伝子のポイント変異の検出に特に有効である（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５）参照）。この方法は、患者から細胞サンプルを収集する工程、サンプルの細胞から核酸（例えばゲノム，ｍＲＮＡ又は両者）を単離する工程、核酸サンプルを遺伝子（もし存在すれば）のハイブリダイズ及び増幅が生じる条件下で、遺伝子に特にハイブリダイズした一以上のプライマーと接触させる工程、増幅生成物の存在又は不存在を検出し、又は増幅生成物の大きさを検出しコントロールサンプルの長さと対比する工程を含む。欠如及び挿入は増幅生成物を正常ゲノタイプと比較することにより、大きさの変化で検出することができる。ポイント変異は、増幅ＤＮＡを正常ＲＮＡ、又は不増感ＤＮＡとハイブリダイズすることで特定することができる。
【０１４３】
あるいは、エストロゲン受容体遺伝子の変異は直接に、例えば変形された限定酵素消化パターンをゲル電気泳動で決定することで特定することができる。
さらに、配列−特定リボザイム（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４９８，５３１）を、リボザイム分裂サイトの成長又は減少により特定変異の存在をスコア化することができる。完全に一致した配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ又は融点の相違により、一致しない配列から区別することができる。
【０１４４】
特定位置の配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ又は化学開裂法により評価することができる。さらに、変異エストロゲン受容体遺伝子と野性型遺伝子との間の配列の相違を、直接ＤＮＡ配列化により決定する。自動配列化手段の各種は、診断アッセイを実行するときに有効であり（Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．，（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）、マススペクトルによる配列化を含む（ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；及びＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８；１４７−１５９（１９９３）参照）。
【０１４５】
遺伝子の変異を検出する他の方法は、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の不適合塩基を検出するため、開裂試薬から保護する方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０；１２４２（１９８５））；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、変異及び野性型核酸の電気泳動量を比較するもの（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８６；２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；及びＨａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））、及び変性グラジェントゲル電気泳動を用い、変性剤の傾斜濃度を含むポリアクリルアミドゲル中で変異又は野性型フラグメントの移動をアッセイするもの（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５（１９８５））が含まれる。ポイント変異を検出する他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイズ、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【０１４６】
核酸分子はまた、疾患を不要に起こさせず、治療様相に影響を与えるゲノタイプの個体を試験するためにも有用である。そして、核酸分子は個体の遺伝子型と、治療のために用いられた化合物に対する個体の反応との間の相関を研究するのに用いることができる（薬理ゲノム相関）。従って、ここに記述された核酸分子は、好ましい化合物及び治療のための投与量を選択するため、ある個体のエストロゲン受容体遺伝子の変異量を評価するために用いることができる。
【０１４７】
そして、治療に影響を与える遺伝子変異を示す核酸分子は、個体に対するテーラー治療に用いることのできる診断標的を提供する。従って、これらの多型／ハプロタイプを有する組換細胞及び動物の製造は、薬剤及び投与量の効果的な臨床設計を可能とする。
【０１４８】
核酸分子は、細胞、組織及び生体中でのエストロゲン受容体遺伝子発現の調整を行うため、不増感性の形成に有用である。ＤＮＡ不増感核酸分子は、転写及びその後のエストロゲン受容体タンパクの製造を阻止するため、転写に関連する遺伝子の部分に相補的に設計される。不増感ＲＮＡ又はＤＮＡ核酸分子は、ｍＲＮＡにハイブリダイズされ、ｍＲＮＡのエストロゲン受容体タンパクへの翻訳を阻止する。
【０１４９】
あるいは、不増感分子の一種は、エストロゲン受容体核酸の発現を減少させるためｍＲＮＡを不活性化するために用いられる。従って、これらの分子は、異常又は望ましくないエストロゲン受容体核酸発現により特徴づけられる異常を処置することができる。この技術は、ｍＲＮＡが翻訳される能力を減じる核酸配列を相補的にｍＲＮＡの一以上の部分に含ませたリボチームによる開裂に関する。可能な部分は、コード化部分及び特に基質結合部分のような、エストロゲン受容体タンパクの触媒及び他の機能的活性に関連したコード化部分である。
【０１５０】
核酸分子はさらに、エストロゲン受容体遺伝子発現に異常を有する細胞を含む患者の遺伝子治療のベクターを提供する。そして、ｅｘ ｖｉｖｏで変調され、患者に戻された患者の細胞を含む組換細胞を、個人の処置のため、患者の細胞が望ましいエストロゲン受容体タンパクを生成する位置に導入するものである。
【０１５１】
本発明はまた、生物的サンプル中のエストロゲン受容体核酸の存在を検知するキットを含む。例えば、このキットは、標識された或いは標識できる核酸又は生物的サンプル中のエストロゲン受容体核酸を検知することのできる薬剤；、サンプル中のエストロゲン受容体核酸の量を決定できる手段；及びサンプル中のエストロゲン受容体核酸量を標準と比較する手段を含む。化合物又は薬剤は適当な容器に封入される。このキットはさらにエストロゲン受容体タンパクｍＲＮＡ又はＤＮＡを検出するキットの使用に関する説明書を含む。
【０１５２】
ＳＮＰ含有核酸検出方法の設計
本発明のＳＮＰ核酸分子はプローブ、プライマー、化学的中間体、およびＳＮＰの生物学的アッセイに有用である。プローブ／プライマーは図１〜３、８、９に示した一つ以上のＳＮＰと一致しているか、または５´及び／又は３´と一致している。しかしながら、前述したように、フラグメントは、本発明のＳＮＰと関連しないフラグメント、又はＳＮＰ検出の技術において知られているフラグメントを含むものではない。ここで提供されたＳＮＰ含有核酸分子と情報は、ＰＣＲが、本発明において提供されたＳＮＰを増幅し、フォーマットされたＳＮＰ検出試薬／キットを設計するＰＣＲプライマーを設計するのにまた有用である。
【０１５３】
プローブ／プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約１２，２０，２５，４０，５０又はそれ以上の連続的なヌクレオチドとなるように、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列部分を含む。特定の条件に基づいて、連続的なヌクレオチドは標的ＳＮＰ位置を含むことができ、又は、所望のアッセイを実行するＳＮＰ位置である近接５´及び／又は３´ＳＮＰに十分近い特定部分になることもできる。
【０１５４】
好ましいプライマーとプローブ配列は、図１〜３、８、及び９において提供された配列を使ってすぐに決定できる。それは当技術者には明白であり、そのようなプライマーとプローブは、本発明のＳＮＰをゲノタイピングする診断プローブや増幅プライマーとして有効であり、キット型に組み入れることができる。
【０１５５】
ＳＮＰを分析するために、ＳＮＰ対立遺伝子（「対立遺伝子特定オリゴヌクレオチド」、「対立遺伝子特定プローブ」、または「対立遺伝子特定プライマー」として表される）に特有なオリゴヌクレオチドを使うことが適切である。多型を分析するための対立遺伝子特定プローブの設計と用途は、例えばＳａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２４， １６３−１６６ （１９８６）； Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ， ＥＰ ２３５，７２６， Ｓａｉｋｉ， ＷＯ ８９／１１５４８に説明されている。
【０１５６】
ハイブリダイズベースのアッセイにおいて、対立遺伝子特有プローブは、１人のヒト由来の標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、異なる多型が存在する別のヒト由来のセグメントにはハイブリダイズしないよう設計される。ハイブリダイズ条件は、対立遺伝子間のハイブリダイズ強度に重要な差異、好ましくは重要な二元性応答があるため、十分ストリンジェントであるべきであり、それによってプローブが対立遺伝子の一つだけにハイブリダイズする。いくつかのプローブが、標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするように設計されるので、多型部分はプローブの中心位置（例えば７位の１５量体、８又は９位の１６量体）に配列する。プローブの設計により、異なる対立遺伝子間のハイブリダイズが、よく識別できるようになる。
【０１５７】
対立遺伝子特定プローブはしばしば対で使われ、「対」は、ＳＮＰ位置での対立遺伝子の変異を表す一つのヌクレオチド不一致を除いて同一である。対の一方は標的配列と完全に一致し、他方は変異型と完全に一致している。配列において、数対のプローブは、同じ標的配列内の複数の多型を同時分析する同じ担体に固定することができる。
【０１５８】
あるタイプのＰＣＲベースのアッセイにおいては、対立遺伝子特定プライマーがＳＮＰ位置と重複している標的ＤＮＡ部分にハイブリダイズし、プライマーが完全な相補性を表す対立遺伝子型のプライマーだけが増幅する。（Ｇｉｂｂｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １７ ２４２７−２４４８ （１９８９）参照）。このプライマーは、末端部分でハイブリダイズする２番目のプライマーと共役して使われる。増幅は、２つのプライマーから生じ、特定の対立遺伝子型の存在を示すことのできる生成物を生じる。コントロールは、通常プライマーの２つの対により実行される。１対は多型部分の単一塩基が不一致であり、もう１対は末梢部分へ完全に相補性を表す。単一塩基不一致は増幅を阻止し、生成物は全く成形されない。この方法は、不一致が多型に配列したオリゴヌクレオチドの３´−ｍｏｓｔ位に含まれている時、最もよく機能する。それは、この位置がプライマーから伸張し最も不安定であるためである（例えばＷＯ ９３／２２４５６参照）。このＰＣＲベースのアッセイはＴａｑＭａｎアッセイの一部として利用され、下記のように説明される。
【０１５９】
ＳＮＰ検出キット、核酸配列、及び組み込みシステム
本発明にはさらに、図１〜３、８、及び９において提供されたＳＮＰに基づく、核酸分子の配列又はマイクロ配列、プローブ／プライマーセットなどのＳＮＰ検出キットを提供する。
【０１６０】
本発明の１具体例において、ここで明らかにされた一つ以上のＳＮＰを検出する１回以上のアッセイを実行するために、必要な試薬を含むキットを提供する。本発明は、本発明おけるＳＮＰを分析するマルチ成分組み込みシステムも提供する。
【０１６１】
ＳＮＰ検出キットは一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ、または対のプローブを含むことができ、それは個々のＳＮＰ位置、またはその位置の近くでハイブリダイズする。本発明のＳＮＰのうちの少なくとも一つのＳＮＰを含む多数のＳＮＰを試験するために、複数対の対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドをキットに同時に含むことができる。配列などのいくつかのキットにおいて、対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドが提供され、基質に固定される。例えば、同じ基質は、少なくとも１；１０；１００；１０００；１００００；１０００００；３０００００、又は図１〜３、８、及び９において示された多型のうちのほぼすべてを検出するための対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。
【０１６２】
特に本発明は、小さく仕切られ、一以上の容器を有するもので、（ａ） 核酸プローブの一つ、例えばここに記述されるＳＮＰ含有ヒトゲノムのフラグメントを結合することのできる対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドを含む第一の容器；及び（ｂ）洗浄剤、又は結合プローブの存在を検出することのできる試薬の一つ以上を含むことのできる一以上の容器を含むコンパートメント化されたキットを提供する。
【０１６３】
詳細には、コンパートメント化されたキットは、複数の試薬が入れられる隔離された容器を各キットが有する。そのような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器、プラスチックのストライプ、ガラス又は紙、又はシリカのような配列化材料を含む。このような容器は、一つのコンパートメントから他のコンパートメントに試薬を効率的に移行させ、サンプル及び試薬は相互汚染せず、各容器の試薬又は溶液は一の容器から他の容器へ定量的に添加される。このような容器は、被検サンプルを入れる容器、核酸プローブを入れる容器、洗浄液（リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液など）を入れる容器、結合プローブを検出する試薬を入れる容器を含む。さらにキットは、ＰＣＲ又は他の酵素反応のための試薬、及びキットを使用する使用説明書を含むことができる。当業者は、本発明の未特定ＳＮＰを識別し、ここに記述された配列を用い、定型的に特定することができ、これを周知のキット形式に折り込んで用いることができる。
【０１６４】
さらに本発明により、図２の変異態のうちの一つ以上を含む、図１、３の配列情報に基づく核酸分子の配列またはマイクロ配列が提供される。
【０１６５】
ここで用いる「配列」又は「マイクロ配列」とは、基板上に合成された別個のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの配列を表し、基板は紙、ナイロン又は他種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス又は他の適当な固形担体である。一つの具体例において、マイクロ配列はＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ５，８３７，８３２，Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ 出願 ＷＯ９５／１１９９５（Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．），Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５−１６８０）及びＳｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４−１０６１９）に記載された方法にしたがって調製され且つ使用され、これらは参考としてここに折り込まれる。他の具体例では、このような配列はＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８０７，５２２に記載される方法により製造される。配列またはマイクロ配列は、一般的に、「ＤＮＡチップ」と表される。
【０１６６】
異なるＳＮＰ位置と一致している個々のプローブまたは対のプローブにおいて、対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドなどの多数のオリゴヌクレオチドプローブが配列される。オリヌクレオチドは、基板の特定領域に、光照射化学処理により合成される。基板は、紙、ナイロン又は他種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス、又は他の適当な固体担体である。
【０１６７】
オリゴヌクレオチド配列に基づくハイブリダイズアッセイは、短いオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズ安定度において、完全に一致する及び不一致である標的配列変異における相違に依存している。多型情報は、選ばれた位置で固体の担体（例えばチップ）に取り付けられたオリゴヌクレオチドプローブの高密度配列を含む基本的な構造によって、効率的に得られる。個々のＤＮＡチップは、格子状に並び、ダイムサイズへ小型化され、個々の特定ＳＮＰ位置又は対立遺伝子変異と一致し、数千から数百万のＤＮＡプローブを含む。好ましくは、プローブは、アドレス可能な配列において、固体の担体に結び付けられる。
【０１６８】
配列／チップテクノロジーはすでに多くのケースにおいて成功し適用されている。例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子、ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異菌株、及びＨＩＶ−Ｉウイルスのプロテアーゼ遺伝子（Ｈａｃｉａ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ； Ｋｏｚａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６） において変異のスクリーニングが行われた。ＳＮＰ検出にて使う変異形チップがカスタマイズされた基質上に製造できる。
【０１６９】
ＳＮＰを検出するのに有用な配列ベースのタイリング計画は、ＥＰ ７８５２８０において説明される。すなわち配列は一般に多くの特定多型に「タイリングされる」。 「タイリング」とは、前に選ばれた配列変異態だけでなく、標的配列に相補的な配列により構成されているオリゴヌクレオチドプローブの定義された合成、例えば一つ以上のモノマーベースの一つ以上の与えられた位置の置換、すなわちヌクレオチドを表す。タイリング計画はＰＣＴ 出願 Ｎｏ．ＷＯ ９５／１１９９５でさらに説明されている。特定の面において、配列は多くの特定ＳＮＰにタイリングされる。特に、配列は、各検出ブロックが特定ＳＮＰまたはＳＮＰセットに特有の多くの検出ブロックを含むようタイリングされる。例えば、特定ＳＮＰを含む配列セグメントを測定する多くのプローブを含むように、検出ブロックがタイリングされる。個々の対立遺伝子に相補性を表すプローブを得るために、プローブは、ＳＮＰ位置で異なる対において合成される。ＳＮＰ位置で異なるプローブだけでなく、一置換体プローブもまた、一般に検出ブロック内でタイリングされる。この方法は、ここに記述されたＳＮＰ情報にすぐ適用できる。
【０１７０】
これらの一置換体プローブは、ヌクレオチド残基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及びＵから選ばれる）によって置換された多型からの一定数の塩基をどちらの方向にも持つ。一般に、タイリングされた検出ブロックのプローブは、ＳＮＰから５塩基離れた配列位置の置換を含む。一置換体プローブは、実際のハイブリダイズを人為的交雑ハイブリダイズと区別するために、内的コントロールをタイリング配列に行う。標的配列及び配列の洗浄を持つハイブリダイズの完成において、配列は、標的配列がハイブリダイズする配列における位置を決定するよう考察される。走査された配列からのハイブリダイズデーターは、サンプル内の対立遺伝子又はＳＮＰの対立遺伝子の存在を識別するために分析される。ハイブリダイズと走査は、ＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ ９２／１００９２、ＷＯ ９５／１１９９５とＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５４２４１８６における説明のように行われる。
【０１７１】
従って、いくつかの具体例において、チップは長さ約１５ヌクレオチドのフラグメントの核酸配列を含む。他の具体例では、チップは、図１〜３、８、及び９に記述されているグループから選ばれる少なくとも一つの配列、相補的な配列、フラグメント、少なくとも８つ以上、好ましくは１０、１５、２０、より好ましくは２５、３０、４０、４７、又は５０の連続的なヌクレオチドと多型塩基を含むフラグメントを含む。いくつかの具体例では、多型塩基は、ポリヌクレオチドの中央から、５、４、３、２、又は１のヌクレオチド内にあり、より好ましくは該ポリヌクレオチドの中央にある。他の具体例では、チップは、本発明のポリヌクレオチドをいくつか持つ配列を含む。
【０１７２】
オリゴヌクレオチドは基板上に化学結合処理及びインクジェット処理装置により合成され、これはＰＣＴ 出願 ＷＯ９５／２５１１１６（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）に記載されており、そのすべては参考としてここに折り込まれる。他の例では、「格子化」配列はドット（又はスロット）がｃＤＮＡフラグメント又はオリゴヌクレオチドを、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合処理により基板の表面に配置及び結合する。上記のような配列は、手作業又は適当な機械（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（適当な固体担体のいずれか）及び機械（ロボット化設備）、及び８，２４，９６，３８４，１５３６，６１４４又はそれ以上のオリゴヌクレオチド、又は商業的に用いられる設備の効率的使用となるオリゴヌクレオチドにより製造される。
【０１７３】
このような配列を用い、本発明は、本発明にかかるＳＮＰを特定する方法を提供する。詳細には、このような方法は被検サンプルを一以上の核酸分子と共にインキュベートし、被検サンプル中の成分に核酸分子が結合することをアッセイする。このアッセイは、多くの遺伝子、少なくとも本発明にかかるＳＮＰ及び／又は本発明にかかるＳＮＰの対立遺伝子の一つを含む配列を含む。
【０１７４】
被検サンプルと核酸分子のインキュベーション条件は変化する。インキュベーション条件はアッセイに用いられた形態、採用された検出方法、及びアッセイに用いられた核酸分子の型及び性質に依存する。当業者は、ここに記述されたヒトゲノムの新規なＳＮＰを用いるのに適したように、一般的な適用されるハイブリダイゼーション、増幅、又は配列アッセイ形態を調製することができる。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に記載されている。
【０１７５】
本発明のテストサンプルは、タンパク、核酸抽出物、体液（血、尿、唾液、痰、胃液等）から得られる細胞膜抽出物、培養細胞、生検材料、または他の組織調製物から得ることができるが、これら限定されない。上記の方法により使われたテストサンプルは、アッセイフォーマット、検出方法の性質、およびサンプルとして使用された組織、細胞、抽出物に基づき変異する。核酸、タンパク、または細胞抽出物を用意する方法は、当業者によく知られており、利用された系と互換のサンプルを得るために、すぐに適応できる。
【０１７６】
マルチ成分組み込みシステムは、また、ＳＮＰ分析に使用できる。そのような系は、単一の機能的な装置において、ＰＣＲなどの製法及び毛管状の電気泳動法反応を小型化し、コンパートメント化する。このような技術の例はＵＳ ｐａｔｅｎｔ ５，５８９，１３６に記述されており、ＰＣＲ増幅及びチップの毛管状の電気泳動法を説明している。
【０１７７】
組み込みシステムは主に、マイクロ流体系が使われる時に考察できる。これらの系は、ガラス、ケイ素、石英、またはプラスチック製のウェハーの上に設計されたマイクロチップに含まれるマイクロチャンネル型を含む。サンプルの動きは、動作部なしで機能的な微視的なバルブとポンプを作成するためにマイクロチップの種々の区域に適用された電気、電気浸透、または流体静力によりコントロールされる。電圧を変えることにより、マイクロ機械加工されたチャンネル間の交差における液状の流量をコントロールし、マイクロチップの種々の断面を横切るポンピングの液体流率を変更する。
【０１７８】
ＳＮＰをゲノタイピングするために、マイクロ流体系は、例えば、核酸増幅、小型配列プライマー延長、毛管状の電気泳動法、及びレーザーを引き起こすけい光検出等の検出方法を合成する。
【０１７９】
最初のステップにおいて、ＤＮＡサンプルは増幅され、好ましくはＰＣＲにより増幅される。そして、増幅生成物は、達成目標とされた多型塩基のすぐ上流にハイブリダイズするｄｄＮＴＰ（個々のｄｄＮＴＰのための特定けい光）、及び適切なオリゴヌクレオチド小型配列プライマーを使って自動化された小型配列反応に従っている。いったん３´末端の延長が完成されたら、プライマーは、未包含である蛍光性のｄｄＮＴＰから毛管状の電気泳動法により単離される。毛管状の電気泳動法で使われる単離媒体は例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはデキストランとすることができる。単一のヌクレオチドプライマー延長生成物に含まれるｄｄＮＴＰは、レーザー誘導けい光検出により識別される。このマイクロチップは少なくとも９６から３８４またはそれ以上のサンプルを並行して処理するために使用できる。
【０１８０】
ベクター／宿主細胞
本発明は、ここに記載の核酸分子を含むベクターも提供する。”ベクター”という用語は、核酸分子を輸送するビヒクル、好ましくは核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子である場合、その核酸分子は共有結合でベクターの核酸と結合されている。本発明のこの見地から、ベクターはプラスミド、１本鎖又は２本鎖のファージ、１本鎖又は２本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベクター、あるいは人工染色体を含み、例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＭＡＣなどが挙げられる。
ベクターは、染色体外成分として宿主細胞中で維持可能であり、そこで核酸分子の別のコピーを複製、生産する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込み、宿主細胞が複製する際に核酸分子の別のコピーを生産してもよい。
【０１８１】
本発明は、維持のためのベクター（クローニングベクター）あるいは核酸分子発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞、あるいはその両者において機能することができる（シャトルベクター）。
発現ベクターは、シス作用性調節領域を含み、該領域は、核酸分子の転写が宿主細胞中でできるように、ベクター中で核酸分子に作動可能に結合されている。核酸分子は、転写に作用することが可能な別の核酸分子と共に宿主細胞に導入することができる。従って、この第２の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写ができるように、シス調節コントロール領域と相互作用するトランス作用性因子を与えてもよい。あるいは、トランス作用性因子は、宿主細胞により供給されてもよい。また、トランス作用性因子は、ベクターそれ自体から生産することもできる。しかしながら、いくつかの実験において、核酸分子の転写及び／又は翻訳は無細胞系で起こり得ることが理解される。
【０１８２】
ここに記載の核酸分子が作動可能に結合している調節配列は、ｍＲＮＡ転写を指示するプロモーターを含む。これは、これらに限定されないが、バクテリオファージλから残ったプロモーター、大腸菌からのｌａｃ、ＴＲＰ、及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、ＣＭＶ即時型プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長末端反復を含む。
転写を促進するコントロール部位の他に、発現ベクターは、レプレッサー結合部位やエンハンサーなどの転写調節部位も含んでよい。例として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサーを含む。
【０１８３】
転写の開始及びコントロールのための部位を含む他、発現ベクターは、転写終止に必要な配列を含むことが可能であり、また転写される部位においては、翻訳のためのリボソーム結合部位を含むことも可能である。発現のための他の調節コントロール要素は、ポリアデニル化シグナルと共に、開始及び終止コドンも含む。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調節配列を知っているであろう。このような調節配列は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ， ＮＹ（１９８９）に記載されている。
【０１８４】
多様な発現ベクターを核酸分子の発現に用いることができる。このような発現ベクターは、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクターを含み、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母人工染色体を含む酵母染色体要素由来、バクロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスなどのウイルス由来のベクターが挙げられる。ベクターはプラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素、例えば、コスミド、ファージミドなどに由来するようなこれら起源の組み合わせに由来してもよい。原核及び真核宿主のための適当なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ， ＮＹ（１９８９）に記載されている。
【０１８５】
調節配列は１つ以上の宿主細胞における構成性発現を与えてもよく（すなわち、組織特異的）、あるいは、温度、栄養添加剤、又はホルモンや別のリガンドのような外因性因子によるような一つ以上の細胞型での誘導性発現を与えてもよい。原核及び真核宿主における構成性発現及び誘導性発現を与える様々なベクターは当業者に良く知られている。
【０１８６】
核酸分子は、周知の方法論により、ベクターの核酸に挿入することができる。一般に、最終的に発現するＤＮＡ配列は、一つ以上の制限酵素によりＤＮＡ配列と発現ベクターを切断し、その後そのフラグメントが互いに連結することにより発現ベクターに結合する。制限酵素の消化及び連結反応の手順は、当業者に良く知られている。
適当な核酸分子を含むベクターは、周知の技術を用い、増殖あるいは発現に適当な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞は、大腸菌、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｕｉｍ）を含むが、これらに限定されない。真核細胞は、酵母、ショウジョウバエなどの昆虫細胞、ＣＯＳやＣＨＯ細胞などの動物細胞、及び植物細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１８７】
ここに記載のように、融合タンパクとしてペプチドを発現することが望ましいかもしれない。従って、本発明は、ペプチドが生産できる融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組み換えタンパクの発現を増強し、組み換えタンパクの溶解度を向上させ、そして例えばアフィニティー精製のためのリガンドとして作用することによりタンパク精製を助けることができる。タンパク加水分解の切断部位は、融合部分の接合点に導入してもよく、その結果、所望のペプチドを最終的に融合部分から分離することができる。タンパク加水分解酵素は、Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。代表的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８））、 ｐＭＡＬ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）、及び目的とする組み換えタンパクに対してグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク、あるいはプロテインＡとそれぞれ融合するｐＲＩＴ５ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を含む。
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ （Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５ （１９８８）） 及び ｐＥＴ １１ｄ （Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９ （１９９０））を含む。
【０１８８】
組み換えタンパクの発現は、宿主細胞の組み換えタンパクをタンパク加水分解的に切断する能力が減じられている遺伝的バックグラウンドを与えることにより、宿主細菌において最大化することができる（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。あるいは、関心のある核酸分子の配列は、大腸菌などの特定の宿主細胞のための優先的コドンの使用（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を提供するように変更することができる（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８ （１９９２））。
【０１８９】
核酸分子は、酵母において作用する発現ベクターにより発現することも可能である。酵母、例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２２９−２３４ （１９８７））、 ｐＭＦａ （Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、 ｐＪＲＹ８８ （Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３ （１９８７））、 及び ｐＹＥＳ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含む。
【０１９０】
核酸分子は、また、例えばバクロウイルス発現ベクターを用い、昆虫細胞中で発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ ９ 細胞）中でのタンパク発現に有用なバクロウイルスベクターは、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５ （１９８３）） 及び ｐＶＬ系（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９８９））を含む。
本発明のある実施例においては、ここに記載の核酸分子は、ほ乳類の発現ベクターを用い、ほ乳類細胞においてする。ほ乳類発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７）） 及び ｐＭＴ２ＰＣ （Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５ （１９８７））を含む。
【０１９１】
ここに挙げた発現ベクターは、核酸分子を発現するのに有用で当業者が利用可能な周知のベクターのうち、単なる例として提供するものである。当業者は、ここに記載の核酸分子の維持、増殖あるいは発現に適した他のベクターについて知っているであろう。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に認められる。
【０１９２】
本発明は、ここに記載の核酸配列が逆向き（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）にベクター中にクローン化されてはいるが、アンチセンスＲＮＡの転写を許可する調節配列に作用可能に結合されているベクターも含む。従って、アンチセンス転写物は、コーディング領域及び非コーディング領域の両方を含む、ここに記載の核酸分子配列の全てあるいは一部に対して生産することができる。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関する上記各パラメータに従う（調節配列、構成性又は誘導性発現、組織特異的発現）。
【０１９３】
本発明は、また、ここに記載のベクターを含む組み換え宿主細胞にも関する。宿主細胞は、従って、原核細胞、酵母のような下等真核細胞、昆虫細胞のような他の真核細胞、及びほ乳類細胞のような高等真核細胞を含む。
組み換え宿主細胞は、ここに記載のベクター構成物を当業者が容易に使用可能な技術により細胞に導入することにより作製される。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）に認められるような他の技術を含むが、これらに限定されない。
【０１９４】
宿主細胞は、一つのベクター以上を含むことができる。従って、異なるヌクレオチド配列を同じ細胞の異なるベクター上に導入することができる。同様に、核酸分子を単独で、あるいは、発現ベクターのためのトランス作用性因子を提供する核酸分子に無関係な他の核酸分子とともに導入することもできる。一つのベクター以上を細胞に導入する場合、ベクターは独立して導入するか、共に導入するか、あるいは核酸分子ベクターに結合することができる。
【０１９５】
バクテリオファージ及びウイルス性ベクターの場合、これらは感染及び形質導入の標準的な方法によりパッケージ化ウイルスあるいはカプセル化ウイルスとして細胞内に導入することができる。ウイルスベクターは、複製能コンピテント（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）あるいは複製能欠損（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）であることが可能である。ウイルス複製が欠損している場合、複製は欠損を補足する機能を発揮する宿主細胞において起こる。
【０１９６】
ベクターは、一般的に、組み換えベクター構成物を含む細胞亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ）が選択できる選択可能マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載の核酸分子を含む同一のベクター中に含まれていてもよく、あるいは別のベクター上にあってもよい。マーカーは、原核宿主細胞に関するテトラサイクリン抵抗性又はアンピシリン抵抗性遺伝子、及び真核宿主細胞に関するジヒドロ葉酸レダクターゼ抵抗性又はネオマイシン抵抗性を含む。しかしながら、表現型形質（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｔｒａｉｔ）を選択する何れのマーカーも効果的であろう。
【０１９７】
成熟タンパクは細菌、酵母、ほ乳類細胞、および他の細胞において適当な調節配列のコントロール下に生産可能であるが、無細胞転写及び翻訳系をここに記載のＤＮＡ構成物に由来するＲＮＡを用いてこれらタンパクを生産するのに使用することも可能である。
ペプチドの分泌が必要な場合には、それはエストロゲンレセプターのようなタンパクを含むマルチトランスメンブランドメインで実行することは難しいが、適当な分泌シグナルをベクター中に加える。シグナル配列は、ペプチドに対して内因性であるか、あるいはこれらのペプチドに対して異型であることができる。
【０１９８】
そのペプチドを媒体中に分泌しない場合、それはエストロゲンレセプターの代表的なケースであるが、そのタンパクは凍結解凍、音波処理、機械的破砕、溶菌剤の使用等を含む標準的な破砕方法により宿主細胞から単離することができる。ペプチドは、その後、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、あるいは高速液体クロマトグラフィー等の周知の精製方法により回収、精製することができる。
【０１９９】
ここに記載のペプチドの組み換え生産における宿主細胞に依存して、ペプチドは、細胞によっては細菌中で生産する場合のようにグリコシル化されないかもしれないが、様々なグリコシル化パターンを有する可能性があることも理解される。さらに、宿主を媒介したプロセスの結果のような場合には、ペプチドは初期修飾メチオニンを含むかもしれない。
【０２００】
ベクター及び宿主細胞の使用
ここに記載のペプチドを発現する組み換え宿主細胞は、様々な用途を有する。まず、その細胞は、エストロゲン受容体タンパクの生産、あるいは、さらに精製して所望量のエストロゲン受容体タンパクやフラグメントを生産することができるペプチドの生産に有用である。従って、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチド生産に有用である。
【０２０１】
宿主細胞は、また、当該分野で公知のフォーマットと共に前記のようなエストロゲン受容体タンパクあるいはエストロゲン受容体タンパクフラグメントに関連する細胞ベースアッセイにも有用である。従って、ネイティブエストロゲン受容体タンパクを発現する組み換え宿主細胞は、エストロゲン受容体タンパク機能を刺激あるいは抑制する物質アッセイに有用である。
宿主細胞はまた、その機能に影響があるエストロゲン受容体タンパク突然変異体の同定にも有用である。その突然変異体が自然に発生し、病理を起こすのであれば、その突然変異を含む宿主細胞は、ネイティブエストロゲン受容体タンパクに対しては示さないかもしれない効果であって、エストロゲン受容体タンパク突然変異体に対しては望ましい効果（例えば、刺激機能や抑制機能）を有する化合物の分析に有用である。
【０２０２】
遺伝子工学宿主細胞は、さらに非ヒト形質転換動物の生産に使用することができる。形質転換動物は、好ましくはほ乳類、例えば、ラットやマウスなどの齧歯類であり、その動物の細胞の一つ以上が導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含むものである。導入遺伝子は、形質転換動物が発育した細胞のゲノム中に組み込まれ、その形質転換動物の一つ以上の細胞型あるいは組織中の成熟動物のゲノム中に残存する外因性ＤＮＡである。これらの動物は、エストロゲン受容体タンパクの機能の研究、ならびにエストロゲン受容体タンパク活性のモジュレーターの同定及び評価に有用である。形質転換動物の他の例として、非ヒト霊長目動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類を含む。
【０２０３】
形質転換動物は、受精卵母細胞の雄前核中に核酸を導入することにより生産することができる。例えばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染、卵母細胞の疑似妊娠雌養育動物中での発育などにより生産できる。エストロゲン受容体タンパクヌクレオチド配列は何れも、マウスのような非ヒト動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。
発現ベクターにおいて有用な調節配列あるいは他の配列は何れも、形質転換配列の部分を形成することができる。これは、既に含まれていない場合には、イントロン配列及びポリアデニル化シグナルを含む。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作用可能に結合し、特定の細胞に対してエストロゲン受容体タンパクの発現を指示する。
【０２０４】
胚操作（ｅｍｂｒｙｏ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）及びマイクロインジェクションによる形質転換動物の創出方法は、特にマウスのような動物では、当該技術分野において通常行われており、例えば、米国特許公報第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号（共にＬｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許公報第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、ならびにＨｏｇａｎ， Ｂ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）等に記載されている。同様の方法は、他の形質転換動物の生産にも使用される。形質転換の基礎動物（ｆｏｕｎｄｅｒ ａｎｉｍａｌ）は、そのゲノム中の導入遺伝子及び／又はその動物の組織あるいは細胞中の形質転換ｍＲＮＡの発現の存在に基づき同定することができる。形質転換動物は、その後、導入遺伝子を保有する別の動物を生むのに用いることができる。また、導入遺伝子を保有する形質転換動物は、さらに別の導入遺伝子を保有する別の形質転換動物に改良することができる。形質転換動物はまた、ここに記載の相同組み換え宿主細胞を用いて完全な動物あるいはその動物の組織を生産する動物も含む。
【０２０５】
別の実施例において、形質転換非ヒト動物は、導入遺伝子発現調節ができる選択システムを含み生産することができる。そのようなシステムの一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムに関しては、例えば、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６ （１９９２）を参照。リコンビナーゼシステムの別の例はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＦＬＰリコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５ （１９９１））。ｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムを導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択タンパクの両方をコード化する導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、”複”形質転換動物の構築を通じて、例えば、２つの形質転換動物、すなわち、一つは選択タンパクをコード化する導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコード化する導入遺伝子を含む２つの形質転換動物を交配することにより、得ることができる。
【０２０６】
ここに記載の非ヒト形質転換動物のクローンは、また、Ｗｉｌｍｕｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ （１９９７）ならびにＰＣＴ国際公開公報 ＷＯ ９７／０７６６８及びＷＯ ９７／０７６６９に記載の方法により生産することもできる。簡単に説明すれば、細胞、例えば、体細胞は、成長サイクルからの脱してＧ０期に入るように、形質転換動物から単離、誘導することができる。
休止細胞（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ）は、その後、例えばその休止細胞を単離したのと同種の動物からの無核卵母細胞に対して電気パルスを使用することにより、融合（ｆｕｓｅ）することができる。この再構築卵母細胞は、その後、培養して桑実胚（ｍｏｒｕｌａ）又は尾胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に発達し、疑似妊娠雌養育動物にトランスファーする。この雌養育動物の子は、その細胞、例えば体細胞を単離した動物からのクローンであろう。
【０２０７】
ここに記載のペプチドを発現する組み換え細胞を含む形質転換動物は、ここに記載のアッセイをｉｎ ｖｉｖｏ状況下で行うのに有用である。ｉｎ ｖｉｖｏ で存在し、リガンド結合（ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）、エストロゲン受容体タンパク活性化、及び
シグナル形質導入（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を果たすことができる様々な生理的因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ の無細胞分析あるいは細胞ベース分析から明らかでないかもしれない。従って、非ヒト形質転換動物の提供は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるエストロゲン受容体タンパク機能、例えば、リガンド相互作用、エストロゲン受容体タンパク機能に対する特異的突然変異エストロゲン受容体タンパクの影響、ならびにキメラエストロゲン受容体タンパクの影響を含む機能の分析に有用である。また、ヌル突然変異（ｎｕｌｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）、すなわち、実質的にあるいは完全に一つ以上のエストロゲン受容体タンパク機能を除去する突然変異の影響を評価することもできる。
【０２０８】
【実施例】
ＳＮＰの同定及び評価
ＥＳＲ−β中のＳＮＰの同定に用いた方法は、下記表に挙げたプライマーにより増幅したオーバーラッピングＥＳＲ−β ＰＣＲ生産物の配列決定であった。４８名の乳ガン（ＢＣ）患者及びコリエール多様性パネルの血液及び腫瘍から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ＥＳＲ２のエキソン−７〜−９と、約１００塩基の各フランキングイントロン（ｆｌａｎｋｉｎｇ ｉｎｒｔｏｎ）を増幅した。ＰＣＲ生産物は、配列決定した。エキソン−７から−２の配列は、ＡＢ０６５８９及び“アセンブルド” ＢＡＣ ＡＬ１６１７５６からｃＤＮＡを比較した。エキソン−１から９ （図 ２）は、ＥＳＲ２の１０１ ｋｂにあるＢＡＣ 配列（我々が知っている最も多くの５’ 及び ３’エキソン以外の全て）と比較し、コンティグ６４とし（図１）、単一ヌクレオチド多型性（（ＳＮＰ）を見いだした。エキソン１０の配列はＥＲ２の全てに存在するアセンブルドＢＡＣ配列に比較し、ＥＲ２ ＢＡＣとした。ＰｏｌｙＰｈｒｅｄ バージョン２．０ （Ｄ． Ａ． Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｓ． Ｔａｙｌｏｒ， Ｎ． Ｋｏｌｋｅｒ， Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， １９９８） を配列に関して（デフォルトセッティングで）実行し、ポテンシャル異型接合体を可視化した。標識部位は、多型性を確認するために、品質試験を行った。２１のＳＮＰは２より大きな頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）であり、臨床サンプルに特有な４及びコリエールサンプルに特有の４とを有することが判明した。これらの６のＳＮＰはＥＳＲ２ ｃＤＮＡ中に見られ、４７名（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からの前立腺のｍＲＮＡのプールから単離した。１６ ＳＮＰの１５は、異型接合性における少なくとも一つの変化を示し、ＳＮＰの５は、異型接合性における少なくとも一つの欠損の例を示した。臨床サンプルに特有の３つのサンプルのうち、一つは腫瘍に観察された。
【０２０９】
【表１】
２より大きな頻度と２０より大きな品質スコアを有する、臨床サンプル中で判明したＳＮＰの要約
2004512816.tif 000002
【０２１０】
【表２】
臨床サンプルにおける異型接合性の変化の要約：ＳＮＰ は２より大きな頻度と２０より大きな品質スコアを有した（図８参照）。
2004512816.tif 000003
【０２１１】
同定されたＳＮＰの要約は、図２（ａ）で与えられる。ＳＮＰは４８名の乳ガン患者で見いだされた。ゲノムＤＮＡは血液から単離し（Ｂ； ９６ 染色体）、腫瘍組織とマッチさせた （Ｔ； ９６ 染色体）．
図２（ｂ）はプールコリエール多様性パネル中のＳＮＰを示す。ＳＮＰ部位のいくつかは、５コリエールヒト多様性パネルで試験した。エキソンは、３又は４名のプールからＰＣＲ増幅した。微量対立遺伝子（ｍｉｎｏｒ ａｌｌｅｌｅ）を保有する染色体のパーセントはピークの高さから計算し、各多様性パネルについて報告したが、それは２０の染色体を表した（Ｎ． Ｅｕｒ，　北欧人； Ｃｈｉ， 中国人； Ｉｎ−Ｐａｋ， インド−パキスタン人； Ａｆ−Ａｍ， アフリカ系アメリカ人； ＳＷ−ＮＡ， 南西部ネイティブアメリカン）。参考として、リバプールＢＣサンプル中で見られるこれらのＳＮＰの頻度を示した。
【０２１２】
図２（ｃ）は非プールコリエール多様性パネルのＳＮＰを示す：ＳＮＰ部位はそれぞれ１０名の５コリエールヒト多様性パネルで試験した。
図２（ｄ）はＣＥＰＨ ファミリーのＳＮＰを示す。臨床サンプル中のＳＮＰは３ ＣＥＰＨ ファミリー、すなわち、コーカサス人、アフリカ系アメリカ人（Ａｆ−Ａｍ）及びアジア人の２番目の参考群で確認した。それぞれのファミリーは、４名あるいは８染色体を表す。微量対立遺伝子（ＳＮＰ 対立遺伝子）を保有する染色体のパーセントも示した。
【０２１３】
図２ （ｅ） 及び （ｆ）はオーバーラッピングＰＣＲ及びクローン配列決定に使用したプライマーのセット及びＭ１３ プライマーを示す。図２（ｅ）はｉｘ− （イントロン−エキソン）ＰＣＲ生産物を生じるように使用したプライマーを示す。エキソン−７から８ はＰＣＲ プライマーに付随したＭ１３であった。全配列決定は、ＰＣＲプライマーを配列決定に用いたエキソン９以外、Ｍ１３で前方及び逆に行った。図２（ｆ）は、エキソン１０の配列決定に用いたプライマーを示す。
【０２１４】
図５は、ＥＳＲβタンパクのドメイン構造及びここに記載のＳＮＰの多くの位置を示す。図６ａ、６ｂ及び７は、ＥＳＲβのイントロン／エキソンのグラフ図である。
図８（ａ）は、北欧州人、中国人、インド−パキスタン人（Ｉｎｄｏ−Ｐａｋｉｓｔａｎｉ）、アフリカ系アメリカ人（Ａｆｒｉｃａ Ａｍｅｒｉｃａｎ）、及び南西部ネイティブアメリカン（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｎａｔｉｖｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ）の少数民族グループから集めたコリエールサンプル中のＳＮＰ及び発生頻度を示す。結果は、特定の少数民族グループの間で検出目的のために使用可能である。図８（ｂ）は、血液サンプル及び乳ガンサンプルのグループから選択したリバプールサンプルにおけるＳＮＰ及び発生頻度を示す。
【０２１５】
２．ＥＳＲ２ゲノム配列決定−エストロゲン受容体βの完全ゲノム構造
エストロゲン受容体（ＥＲ）は、核ホルモン受容体遺伝子スーパーファミリー（ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）の一つである。この遺伝子のファミリーは、３つの別個のドメイン、すなわち、変異（Ｎ）−末端ドメイン、高度保存ＤＮＡ結合ドメイン（ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）及び保存（Ｃ）−末端ドメインのモジュラー構造を特徴とする（参考文献１，２参照）。機能的には、（Ｎ）−末端ドメインはトランス活性化を、ＤＮＡ結合ドメインは二量化（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）及びＤＮＡ結合を、（Ｃ）−末端ドメインはトランス活性化、二量化、リガンド結合、核トランスロケーション（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）、及び熱ショックタンパク結合（Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）をそれぞれ調節する。核ホルモン遺伝子スーパーファミリーの各ドメインの機能は、それらが見出される受容体に無関係で、ドメインは異なる異型タンパク中に置かれた場合であっても、その機能を保有する（参考文献３，４，５参照）。これら遺伝子の主なサブファミリーは、進化の初期に単純な遺伝子複写（ｓｉｍｐｌｅ ｇｅｎｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を通じて進化したので、核ホルモン受容体遺伝子スーパーファミリーのドメインモジュール性が存在する（参考文献６）。核ホルモン受容体遺伝子ファミリーは、２つの異なる分類スキームに従って分離することができる。一方はホルモン結合に基づくものであり、他方は二量化と、いかにして受容体がそれらのそれぞれのＤＮＡ応答エレメントに結合するかに基づくものである（参考文献２参照）。
【０２１６】
ＥＲαのｃＤＮＡは、まず、ＭＣＦ−７乳ガン細胞系列からクローン化及び配列決定し、ｖ−ｅｒｂ−Ａ 遺伝子に対して２７％の同一性と４１％の保存性を有することが判明した（参考文献７）。ＥＲαは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ （ＦＩＳＨ））及び染色体結合を用いて染色体６ｑ２５．１にマップした（参考文献８）。１９９６年に、新規なエストロゲン受容体（ＥＲβ）が縮退ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ）により同定され（参考文献９）、ＦＩＳＨにより１４ｑ２２−２４にマップされた（参考文献１０）。ＥＲα及び ＥＲβは、ＤＮＡ結合ドメイン中９６％の配列同一性と、リガンド結合ドメイン中５８％の同一性を有し、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）（ドメインＤ）と同様に５’及び３’末端においては同一性は低いことが示された。様々なＥＲα及び ＥＲβ変異体は、これまで単一及び複数のエキソン失欠（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）、切断転写物、及び挿入物（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ）を含む転写物を含め記載されてきた（参考文献１１，１２，１３）。これらの変異体は、正常組織、腫瘍組織及び細胞系列を含む様々な起源から単離された。乳ガン患者の腫瘍のＥＲ状態は、内分泌療法に対する応答のインジケータとして用いられ（参考文献１４，１５）、多くの研究により乳ガン腫瘍の進行、ＥＲ−ネガティブ状態、及びホルモンアンタゴニスト抵抗性におけるＥＲの役割が検討されてきた（完全には、参考文献１６参照）。
【０２１７】
ＥＲ遺伝子の重要性から、我々はその全体をクローン化し、その完全な構造を決定しようとした。初めに、標準細菌人工染色体（ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ （ＢＡＣ））配列決定を用いて遺伝子のコーディング領域の配列情報を発生させた。セレラのヒトゲノム配列決定が進行したとき、ＥＲの残存領域はセレラリージョナルアッセンブリーズ（Ｃｅｌｅｒａ ｒｅｇｉｏｎａｌ ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）を用いて埋められた。２５ｋｂより小さな領域は、公知のＢＡＣ（Ａｌ３５３６１１．６， ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ １，４９７−２５，９４１）を用いてＥＲα上に埋められた。
【０２１８】
材料及び方法
１） ＢＡＣ スクリーニング
適当なマーカーをＥＲα ａｎｄ ＥＲβ エキソンのために設計し、リサーチジェネティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）から市販のＢＡＣクローンを得るために用いた。いくつかのポジティブＢＡＣを選び、それぞれのクローンを確認のために再スクリーニングした。
【０２１９】
２） ＤＮＡの単離及びライブラリーの作製
ＢＡＣのＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮカラム（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ） を用い、メーカー仕様書に従って、確認したクローンから単離した。ショットガンライブラリーは、標準プロトコルに従い作製した（参考文献１７）。簡単に説明すると、単離したＢＡＣのＤＮＡを音波処理、ポリッシュ、及びサイズ分画した。サイズを選択したＤＮＡフラグメントは、その後標準の連結反応技術を用いてｐＵＣ１９中にサブクローン化した。連結したＤＮＡは、エレクトロコンピテント細胞（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）中にトランスフォームし、一晩成長させた。
【０２２０】
３） ＤＮＡ 配列決定及び注釈
配列決定反応は、ビッグダイターミネーターケミストリー（Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて実行し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡアナライザー （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。Ｐｈｒｅｄ （参考文献１８）， Ｐｈｒａｐ 及び Ｃｏｎｓｅｄ （参考文献１９）は塩基呼び出し（ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ）、組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）及び仕上げ（ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ）にぞれぞれ使用した。エキソン位置は、クロスマッチ（Ｃｒｏｓｓ＿Ｍａｔｃｈ）を用いて決定し、公表された遺伝子配列をゲノムのコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）と比較した。
【０２２１】
結果
１． エストロゲン受容体α
ＥＲαのゲノム配列及びＥＲαの公表されたｍＲＮＡ配列のアライメント（Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、その遺伝子が１４エキソンからなり、４４６，２９６ ｂｐのゲノム配列をカバーすることを示す。
【０２２２】
２． エストロゲン受容体β
ＥＲβのゲノム配列及びＥＲβの公表されたｍＲＮＡ配列のアライメントは、その遺伝子が１７エキソンからなり、２５３，７４８ ｂｐのゲノム配列をカバーすることを示す（図 ５， 表３）。セレラゲノムブラウザ（Ｃｅｌｅｒａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）での分析により、我々は遺伝子、ヒトシナプス核発現遺伝子（ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅ ２， ｓｙｎｅ−２， ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０１５１８０．１）、を同定することができた。それは、反対の鎖上でＥＲβのイントロン９内に完全に含まれる。ｓｙｎｅ−２遺伝子のさらなる分析により、それは２１エキソンからなり、５１，４７１ ｂｐのゲノム配列をカバーすることが示された。
【０２２３】
考察
完全なＥＲαゲノム配列と様々なＥＲβ転写物のアライメントは、遺伝子が４４６，２９６ ｂｐのゲノム配列をカバーし、１４エキソンからなることを示す。エキソン１Ｅ （ＡＪ００２５６１） （参考文献２０）の公表配列とＥＲαゲノム配列のアライメントは、エキソン１Ｅが実際には２つの別のエキソンからなることを明らかにした。新しく示されたエキソンは、これまでに確立された命名規約に従い、ここではエキソン１Ｇという。エキソン１Ｇは、エキソン１Ｅの約４５ ｋｂ上流に位置し、ＧＴ／ＡＧ スプラス部位共通配列に一致する。
【０２２４】
完全なＥＲβゲノム配列に対する様々なＥＲβ転写物のアライメントは、これまで受け入れられていたよりも複雑な体制（ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を示す（参考文献１３）。ＥＲβｃｘ変異体（ＡＢ００６５８９）の５’ＵＴＲは実際には７つの非翻訳エキソン（ここではエキソン−１〜−７という）からなり、これらは全て、ＧＴ／ＡＧ スプライス部位共通配列に一致する（図５， 表３）。ＥＲβ変異体 ＡＦ０６１０５５ 及び ＡＦ０６１０５４ （参考文献１２）の配列アライメントは、これらの転写物が両方ともイントロン配列を含み、おそらく部分的に成熟した転写物であることを示した。これらの部分的成熟転写物は両方ともエキソン７と、エキソン９の一部を含むが、イントロン配列が存在する部位のスプライス部位共通配列には一致していない。
【０２２５】
セレラゲノムブラウザを用いてＥＲゲノム配列を調べることにより、我々は、ＥＲβのイントロン９内に完全に含まれた分離遺伝子を同定することができた。この遺伝子は、ヒトシナプス核発現遺伝子２（ｓｙｎｅ−２）であり、５０ Ｋｂのゲノム配列をカバーし、２１のエキソンからなることが示された。これらは全てＧＴ／ＡＧスプライス共通配列に一致する（図５及び表４）。 ｓｙｎｅ−２遺伝子は、ＥＲβのアンチセンス鎖上に位置する。
ＥＲα及びＥＲβの配列及び構造の完成は、これらの重要な受容体のさらなる理解と特徴づけに寄与する。
【０２２６】
【表３】
ヒトエストロゲン受容体におけるエキソン−イントロン境界及び位置：
エキソン配列は大文字、イントロン配列は小文字、スプライス部位は太字で示す。
2004512816.tif 000004
【０２２７】
【表４】
ヒトシナプス核発現遺伝子２におけるエキソン−イントロン境界及び位置：
エキソン配列は大文字、イントロン配列は小文字、スプライス部位は太字で示す。
2004512816.tif 000005
【０２２８】
参考文献
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８． Ｍｅｎａｓｃｅ ＬＰ， Ｗｈｉｔｅ ＧＲ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＣＪ， Ｂｏｙｌｅ ＪＭ．　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｏｃｕｓ （ＥＳＲ） ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ６ｑ２５．１ ｂｙ ＦＩＳＨ ａｎｄ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｐｏｓｔ−ＦＩＳＨ ｂａｎｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９３ Ｊｕｌ；１７（１）：２６３−５．
９． Ｍｏｓｓｅｌｍａｎ Ｓ， Ｐｏｌｍａｎ Ｊ， Ｄｉｊｋｅｍａ Ｒ． ＥＲ ｂｅｔａ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．　ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９６ Ａｕｇ １９；３９２（１）：４９−５３．
１０． Ｅｎｍａｒｋ Ｅ， Ｐｅｌｔｏ−Ｈｕｉｋｋｏ Ｍ， Ｇｒａｎｄｉｅｎ Ｋ， Ｌａｇｅｒｃｒａｎｔｚ Ｓ， Ｌａｇｅｒｃｒａｎｔｚ Ｊ， Ｆｒｉｅｄ Ｇ， Ｎｏｒｄｅｎｓｋｊｏｌｄ Ｍ， Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ＪＡ．　Ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ−ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ．　Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ． １９９７ Ｄｅｃ；８２（１２）：４２５８−６５．
【０２３０】
１１． Ｍｕｒｐｈｙ ＬＣ， Ｄｏｔｚｌａｗ Ｈ， Ｌｅｙｇｕｅ Ｅ， Ｄｏｕｇｌａｓ Ｄ， Ｃｏｕｔｔｓ Ａ， Ｗａｔｓｏｎ ＰＨ． Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．　Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９７ Ａｕｇ；６２（５−６）：３６３−７２．
１２． Ｍｏｏｒｅ ＪＴ， ＭｃＫｅｅ ＤＤ， Ｓｌｅｎｔｚ−Ｋｅｓｌｅｒ Ｋ， Ｍｏｏｒｅ ＬＢ， Ｊｏｎｅｓ ＳＡ， Ｈｏｒｎｅ ＥＬ， Ｓｕ ＪＬ， Ｋｌｉｅｗｅｒ ＳＡ， Ｌｅｈｍａｎｎ ＪＭ， Ｗｉｌｌｓｏｎ ＴＭ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ｉｓｏｆｏｒｍｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． １９９８ Ｊｕｎ ９；２４７（１）：７５−８．
１３． Ｏｇａｗａ Ｓ， Ｉｎｏｕｅ Ｓ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ， Ｏｒｉｍｏ Ａ， Ｈｏｓｏｉ Ｔ， Ｏｕｃｈｉ Ｙ， Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｍ．　 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａｃｘ： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８ Ａｕｇ １；２６（１５）：３５０５−１２．
１４． Ｏｓｂｏｒｎｅ ＣＫ， Ｙｏｃｈｍｏｗｉｔｚ ＭＧ， Ｋｎｉｇｈｔ ＷＡ ３ｄ， ＭｃＧｕｉｒｅ ＷＬ． Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ １９８０ Ｄｅｃ １５；４６（１２ Ｓｕｐｐｌ）：２８８４−８．
１５． ＤｅＳｏｍｂｒｅ ＥＲ， Ｃａｒｂｏｎｅ ＰＰ， Ｊｅｎｓｅｎ ＥＶ， ＭｃＧｕｉｒｅ ＷＬ， Ｗｅｌｌｓ ＳＡ Ｊｒ， Ｗｉｔｔｌｉｆｆ ＪＬ， Ｌｉｐｓｅｔｔ Ｍ Ｓｐｅｃｉａｌ ｒｅｐｏｒｔ． Ｓｔｅｒｉｏｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９７９ Ｎｏｖ １；３０１（１８）：１０１１−２．
【０２３１】
１６． Ｐａｒｌ， Ｆｒｉｔｚ Ｆ．， Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ， Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ａｎｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ． ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， ２０００．
１７． Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ， Ｇｒｅｅｎ ＥＤ， Ｋｌａｐｈｏｌｚ Ｓ， Ｍｙｅｒｓ， Ｒ， Ｒｉｅｔｈｍａｎ Ｈ， Ｒｏｓｋａｍｓ Ｊ， （ｅｄｓ．） （１９９７）， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．
１８． Ｅｗｉｎｇ Ｂ， Ｈｉｌｌｉｅｒ Ｌ， Ｗｅｎｄｌ ＭＣ， Ｇｒｅｅｎ Ｐ． Ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｔｒａｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈｒｅｄ． Ｉ． Ａｃｃｕｒａｃｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９８ Ｍａｒ；８（３）：１７５−８５．
１９． Ｇｏｒｄｏｎ Ｄ， Ａｂａｊｉａｎ Ｃ， Ｇｒｅｅｎ Ｐ． Ｃｏｎｓｅｄ： ａ ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９８ Ｍａｒ；８（３）：１９５−２０２．
２０． Ｆｌｏｕｒｉｏｔ Ｇ， Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｃ， Ｋｅｎｅａｌｙ Ｍ， Ｓｏｎｎｔａｇ−Ｂｕｃｋ Ｖ， Ｇａｎｎｏｎ Ｆ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｇｅｎｅ ａｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｕｓａｇｅ．　Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９８ Ｄｅｃ；１２（１２）：１９３９−５４．
【０２３２】
上記明細書に記載の全ての出版物及び特許はここに織り込まれるものである。本発明に記載の方法及びシステムの様々な修飾及び変更は本発明の範囲ならびに精神を外れない範囲で当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい実施例に関連して記載しているが、クレームしたように本発明はそのような特定の実施例に不当に限定されないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学及び関連する分野の当業者に自明な、前記本発明の実施態様の様々な修飾はクレームの範囲内であることを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】エストロゲン受容体−ベータ遺伝子の完全ゲノム配列を示す。
【図２】ＥＳＲ−ベータゲノムＤＮＡに見出される配列多型（ヌクレオチドの位置は図１及び図３で与えられる配列に基づく）を示す。
ａ）リバプール臨床組織サンプル中のＳＮＰ。
ｂ）プールコリエール多様性パネル中のＳＮＰ。
ｃ）非プールコリエール多様性パネル中のＳＮＰ。
ｄ）ＣＥＰＨファミリー中のＳＮＰ。
ｅ）ＰＣＲプライマー。
ｆ）シークエンシングプライマー。
【図３】ＥＳＲ−ベータ遺伝子をカバーするｃＤＮＡの核酸配列を示す。
【図４】エストロゲン受容体−ベータタンパクのアミノ酸配列。
【図５】ヒトＥＳＲ２遺伝子座のグラフ表現。
（ａ）ＥＲβのイントロン９内に含まれるヒトシナプス核発現遺伝子２（ｓｙｎｅ−２）の完全構造。エキソンは塗りつぶした四角で、イントロンは水平線で表す。遺伝子はＥＲβとして逆の鎖にあることに注意。
（ｂ）ヒトエストロゲン受容体βの完全構造。エキソンは塗りつぶした四角で、イントロンは水平線で表す。
（ｃ）ゲノム配列を完成するために使用されたコンティグの順番と名前。ＧＡナンバーはセレラコンティグナンバーを表す。リサーチジェネティクスＢＡＣクローンは基準プレート及び詳細番号で表される。
【図６】ゲノムＥＳＲベータ遺伝子のエキソン。
【図７】ＥＳＲベータ遺伝子中の本発明に係るＳＮＰの分布及び頻度。
【図８】ＥＳＲ−ベータＳＮＰ：ａ）コリエールサンプル中、ｂ）リバプールサンプル中（Ｔ＝腫瘍サンプル、Ｂ＝血液サンプル）。
【図９】ＳＮＰを有するＥＳＲ−ベータエキソン（ “Ｎ”、“Ｃ”、“Ｉ”、“Ａ”、“Ｓ”の表現については図２を参照）。下線の配列はプライマー配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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