(57)【要約】本発明は、インスリン誘導体およびその合成に関する。特に、インスリンは、ペプチド結合を介してチロイドホルモンにフリーのアミン基を接合させることにより、Ｂ１残基（フェニルアラニン）を介して接合される。特に、Ｂ１残基のαアミン基に、３，３’，５，５’−テトラヨード−Ｄ−チロニル基（ＤＴ４ｙｌ）が共有結合したインスリンまたはその機能的等価物からなる化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ１残基のαアミン基に、３，３’，５，５’−テトラヨード−Ｄ−チロニル基（ＤＴ４ｙｌ）が共有結合したインスリンまたはその機能的等価物からなる化合物。
【請求項２】
ＤＴ４ｙｌ基がリンカーを介して結合している、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｂ１残基のαアミン基に、Ｎ−Ｃ１−４−アルカノイル−ヨードチロニル基が共有結合したインスリンまたはその機能的等価物からなる化合物。
【請求項４】
ヨードチロニル基が、Ｎ−アルカノイル−３，３’，５，５’−テトラヨードチロニル基である、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
ヨードチロニル基が、Ｎ−アルカノイル−３，３’，５，５’−テトラヨード−Ｄ−チロニル基である、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｃ１−４アルカノイル基がアセチルである、請求項３記載の化合物。
【請求項７】
Ｎ−アルカノイル−ヨードチロニル基が、リンカーを介してＢ１残基のαアミン基に連結される、請求項３記載の化合物。
【請求項８】
一般式：−ＯＣ−（ＣＲ２）ｎ−ＮＲ１−［式中、−ＯＣ−はインスリンに連結され、ＮＲ１−はチロイドホルモンに連結され、各Ｒは独立にＨおよびＣ１−４アルキルから選択され、ｎは少なくとも１１の整数であり、Ｒ１はＨ、Ｃ１−４−アルキル、またはＣ１−４−アルカノイルである］を有するリンカーを介して、チロイドホルモンが共有結合した、インスリンまたはその機能的等価物からなる化合物。
【請求項９】
リンカーの−ＯＣ基が、インスリンまたはその機能的等価物のＢ１残基のαアミン基に連結した、請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
チロイドホルモンが３，３’，５，５’−テトラヨードチロニンである、請求項８記載の化合物。
【請求項１１】
リンカーが−ＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＮＨ−である、請求項８記載の化合物。
【請求項１２】
リンカーが−ＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＮＨ−である、請求項１０記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の化合物とキャリアーとを含む組成物。
【請求項１４】
請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の化合物と薬学的賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項１５】
治療または診断によるヒトまたは動物の治療方法における使用のための、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
治療または診断によるヒトまたは動物の治療方法における使用のための組成物の製造における、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１７】
治療方法がインスリン置換療法である、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
ヒトまたは動物が糖尿病である、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
ペプチドのフリーのアミン基を、以下の工程：
ａ）ｉ）一般式Ｉのチロニル試薬：
【化１】
2004502784.tif 000012
［式中、各基Ｘ３、Ｘ３’、Ｘ５およびＸ５’はＨおよびＩから選択され、ただし少なくとも２つの基がＩを示し；
Ｒ２はアミン保護基であり；かつ
Ｒ３はカルボキシル活性化基である］
を、ｉｉ）アミン化合物ｍ（Ｒ４Ｎ）Ｒ５（ＮＨ２）ｐ
［式中、Ｒ５は（ｍ＋ｐ）官能性有機基であり；
Ｒ４はＲ２以外のアミン保護基であり；
ｍは０または１０までの整数であり；
ｐは少なくとも１の整数である］
と反応させる工程；
ｂ）保護基Ｒ２が除かれるがいずれのＲ４基も取り除かれないような条件下での選択的アミン脱保護化工程において保護化中間体を処理して、脱保護化された中間体を生じる工程；および
ｃ）脱保護化された中間体の脱保護化されたアミン基をアルカノイレーション工程でＣ１−４アルカノイル基によりアシル化して、Ｎ−アルカノイル化化合物を生じる工程；
を含む方法によりチロニル化する方法。
【請求項２０】
Ｒ２がｔｅｒｔ−ブトキシ−カルボニル基である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｒ４がメチルスルホニルエトキシカルボニルである、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ１−４アルカノイル基がアセチル基である、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
ｍが少なくとも１であり、かつ、工程ｃ）が前記保護基Ｒ４が取り除かれる第二のアミン脱保護化工程において処理される、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
不斉炭素原子Ｃ＊がＬ−立体配置をとる、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
不斉炭素原子Ｃ＊がＤ−立体配置をとる、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インスリン誘導体およびその合成に関する。特に、インスリンは、ペプチド結合を介してチロイドホルモンにフリーのアミン基を接合させることにより、Ｂ１残基（フェニルアラニン）を介して接合される。
【０００２】
【従来の技術】
ＷＯ−Ａ−９５／０５１８７には、循環性結合タンパクに親和性を有する分子部分を結合したインスリン誘導体が記載されている。その明細書に特に記載および例示されている分子部分は、チロイドホルモン、特にＬ−チロキシン（３，３’，５，５’−テトラヨード−Ｌ−チロニン）である。チロニン化合物のインスリンへの共有的接合は、インスリンのＢ１残基のフリーのαアミノ基と、チロニン化合物のカルボキシル基との間のペプチド結合形成を介するものである。インスリンのＬ−チロキシン誘導体が、特定の血漿タンパク、特にチロイド結合グロブリンおよびトランスチレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）に親和性を有することが示されている。チロニン部分の結合はインスリンの変更された分布をもたらし、特に、インスリンを肝選択性（ｈｅｐａｔｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）にすると考えられる。
【０００３】
しかしながら、Ｌ−チロキシン誘導体（ＬＴ４−Ｉｎｓ）は、血漿タンパクに対して非常に高い親和性を有し、制限された代謝回転を示すことが観察された。結合タンパクに対してより低い親和性を有する誘導体は、ＷＯ−Ａ−９９／６５９４１に記載されており；さらなるインスリンのチロイド誘導体、すなわち３，３’，５’−トリヨードチロニン、リバースＴ３−インスリン（ｒＴ３−Ｉｎｓ）が記載されている。
【０００４】
ＷＯ−Ａ−９５／０７９３１では、インスリンが、Ｂ２９リシン部分のエプシロン−アミノ基を、Ｌ−チロキシンおよびＤ−チロキシンと、任意にＣ１０スペーサーを伴って、反応させることによって誘導化される。一部の例では、チロニン部分のアミノ基は、インスリンとＴ４試薬との接合前にアセチル化される。
【０００５】
内因性循環タンパクへのチロイドホルモンの結合は、Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．ら Ｔｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ （ｅｄ Ｈｅｎｎｅｍａｎｎ，Ｇ．） １９８６，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＣ，ＵＳＡ，３−３８に要約されている。ＬＴ４、Ｔ３（３，３’，５−トリヨードチロニン）、ｒＴ３、３’，５’−ジヨードチロニン（３’，５’Ｔ２）、ＤＴ４、Ｎ−アセチル化ＬＴ４、Ｎ−アセチル化Ｔ３、および他のアルカノアート化（ａｌｋａｎｏａｔｅｄ）化合物の、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、プレアルブミン（トランスチレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）としても知られる）、およびアルブミンのようなチロイドホルモン結合タンパク（ＴＨＢＰＳ）に対する親和性を含む、種々のチロイドホルモンの相対的な結合親和性が議論されている。
【０００６】
身体内でのインスリンの最適な分布、代謝利用能を達成し、かつ、チロイドホルモン部分の活性による副作用を最小化するために、インスリン接合物におけるチロイドホルモン部分、およびそのインスリンへの接合形式を最適化することが望ましい。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様によれば、インスリンのＢ１残基のαアミン基に、３，３’，５，５’−テトラヨード−Ｄ−チロニル基が共有結合した、インスリンまたはその機能的等価物からなる新規の化合物を提供する。
【０００８】
以下ＤＴ４−ｙｌ基として知られるチロキシル基は、Ｔ４分子のカルボキシル基とペプチド結合を介してαアミン基に直接結合してもよい。あるいは、アミン基とカルボキシル基との間にリンカーがあってもよい。好ましくは、リンカーは、各端においてペプチド結合を介してそれぞれの部分に連結され、かつ、例えば二つのペプチド結合の間に少なくとも１１の炭素原子の長さのアルカン−ジイル基を有する。あるいは、より短いリンカーを用いてもよい。利用性（ａｃｃｅｓｓａｂｉｌｉｔｙ）、循環系における安定性、標的組織における活性などを最適化するために、ＤＴ４−ｙｌおよびアミン基へのリンカーの他の接合手段が選択されてもよい。
【０００９】
本発明の第二の態様によれば、Ｂ１残基のαアミン基にＮ−Ｃ１−４−アルカノイル−（ジ−、トリ−またはテトラ−）ヨードチロニル基が共有結合した、インスリンまたはその機能的等価物からなる新規化合物を提供する。
【００１０】
この発明の態様では、チロニル基は、リンカーを介してＢ１残基に接合してもよい。リンカーについては上述のものであってもよい。
【００１１】
本発明のこの態様では、チロニル基は、好ましくは３，３’，５，５’−テトラヨード−Ｄ−チロニル基、好ましくはＤＴ４である。
【００１２】
チロニルアミン基のＣ１−４アルカノイル基は、好ましくはアセチルであり、またはプロパノイルであってもよい。
【００１３】
本発明の第三の態様では、一般式：−ＯＣ−（ＣＲ２）ｎ−ＮＲ１−［式中、−ＯＣ−はインスリンに連結され、ＮＲ１−はチロイドホルモンに連結され、各Ｒは独立にＨおよびＣ１−４アルキルから選択され、ｎは少なくとも１１の整数であり、かつ、Ｒ１はＨ、Ｃ１−４−アルキル、またはＣ１−４−アルカノイルである］を有するリンカーを介して、チロイドホルモンが共有結合した、インスリンまたはその機能的等価物からなる新規の化合物を提供する。
【００１４】
かかる本発明の第三の態様では、リンカーの−ＯＣ基は、インスリンまたはインスリンの機能的等価物のＢ１残基のαアミン基に連結される。あるいは、リンカーは、インスリン分子の別のフリーのアミン基、例えばＢ２９リシン残基のエプシロン−アミノ基に連結されてもよい。かかるインスリンとの接合体は、インスリンの内因的代謝効果を保持するように、インスリンにとって有効なインスリンの活性部位を残すべきである。
【００１５】
本発明のこの第三の態様では、チロイドホルモンは、好ましくはＬＴ４またはＤＴ４である。
好ましくは、リンカーは−ＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＮＨ−である。
【００１６】
本発明の第四の態様では、新規のＮ−アルカノアート化（ａｌｋａｎｏａｔｅｄ）誘導体または他のＮ−アルカノイル化（ａｌｋａｎｏｙｌａｔｅｄ）化合物が形成される新規の方法を提供し、この方法は以下の工程：
ａ）ｉ）一般式Ｉのチロニル試薬：
【化２】
2004502784.tif 000002
［式中、各基Ｘ３、Ｘ３’、Ｘ５およびＸ５’はＨおよびＩから選択され、ただし少なくとも２つの基がＩを示し；
Ｒ２はアミン保護基であり；かつ
Ｒ３はカルボキシル活性化基（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）である］
を、ｉｉ）アミン化合物ｍ（Ｒ４Ｎ）Ｒ５（ＮＨ２）ｐ
［式中、Ｒ５は（ｍ＋ｐ）官能性有機基であり；
Ｒ４はＲ２以外のアミン保護基であり；
ｍは０または１０までの整数であり；
ｐは少なくとも１の整数である］
と反応させて、保護化中間体を生成する工程；
ｂ）保護基Ｒ２が除かれるが、いずれのＲ４基も取り除かれないような条件下で、選択的アミン脱保護化工程において保護化中間体を処理して、脱保護化された中間体を生成する工程；および
ｃ）脱保護化された中間体の脱保護化されたアミン基をアルカノイレーション（ａｌｋａｎｏｙｌａｔｉｏｎ）工程でＣ１−４アルカノイル基によりアシル化して、Ｎ−アルカノイル化化合物を生成する工程；
を含む。
【００１７】
本発明のこの態様では、アミン化合物はインスリンまたはその機能的等価物であってもよい。上記方法は、チロニル試薬によるアシル化のためのフリーのアミン基を備えたインスリン以外のオリゴ−またはポリ−ペプチド活性体に適用されてもよい。好ましくは、この技術はインスリンに適用され、最も好ましくはインスリンのＢ１残基のαアミノ基に適用される。
【００１８】
保護基Ｒ２およびＲ４は、この方法の工程ｂにおいて選択的脱保護化を可能にするように選択される。好ましくはＲ２はＢｏｃ基（第三級ブトキシカルボニル）である。脱保護化は、好ましくは、塩酸／酢酸混合物を用いて、または好ましくはトリフルオロ酢酸を用いて、慣用的な脱保護化方法を用いて実施される。
【００１９】
Ｒ４保護基は、選択的脱保護化工程ｂによって除かれないように選択される。Ｍｓｃ基（メチルスルホニルエトキシカルボニル）が好都合である。かかる基は、工程ａにおいて形成された結合、またはアルカノイレーション工程で形成された結合を切断しない条件下で除くことができる。後の非選択的脱保護化工程に適した条件は、例えば水酸化ナトリウムを使用したアルカリである。
【００２０】
この新規の方法は、チロニル基の不斉炭素原子（Ｃ＊）のラセミ化を最小限に抑える。不斉炭素原子がＬ−立体配置をとることが適切だが、Ｄ−立体異性体を用いることができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明を、実施例を用いて例示する。
略号：Ｍｓｃ＝メチルスルホニルエチルオキシカルボニル
Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ｍｐ＝融点
ＯＮＳｕ＝Ｎ−オキシスクシンイミドエステル
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＮＭＭ＝Ｎ−メチルモルホリン
ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
【００２２】
【実施例】
参考実施例１−Ｍｓｃ−Ｌ−チロキシン（１）
２ｍｌのジメチルスルホキシド中の７７６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＬ−チロキシンを、室温で１８時間、１３９μｌ（１ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンの存在下で、５３０ｍｇ（２ｍｍｏｌ）のＭｓｃ−ＯＮＳｕと反応させた。次いでこの溶液を、２０ｍｌの氷冷ＨＣｌ溶液（ｐＨ２）にピペットで移した。沈殿を遠心により単離し、水性ＨＣｌ溶液で３回洗浄し、ｉｎ ｖａｃｕｏで乾燥させた。
収量：８４３ｍｇ（理論値の９１％）
ＲＰ−ＫＰＬＣ純度：９９．１％
【００２３】
参考実施例２
合成を、出発物質としてＤ−チロキシンを用いて、（１）と同様に実施した。
収量：８１９ｍｇ（理論値の８８％）
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度：９８．４％
【００２４】
参考実施例３−Ｂｏｃ−Ｌ−チロキシン（３）
７７６．０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のＬ−チロキシンを、５ｍｌのジメチルスルホキシドに溶かした。この溶液のｐＨを、Ｎａ２ＣＯ３を添加して９に調節した。この溶液を０℃に冷却した後に、攪拌しながら、２７５．０ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボナート（固形）を添加した。０℃で４時間攪拌した後に、この溶液を氷冷した水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ２）にピペットで移した。遠心後に、沈殿を水性ＨＣｌ溶液で２回洗浄し、ｉｎ ｖａｃｕｏで乾燥させた。
収量：７２１ｍｇ（理論値の８２％）
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度：９８．４％
【００２５】
参考実施例４−Ｎ−Ｂｏｃ−１２−アミノラウリン酸（４）（Ｎ−Ｂｏｃ−１２−アミノドデカン酸）
４５ｍｌの１，４−ジオキサン／水（２／１；ｖ／ｖ）中の２．７４ｇ（１２．７ｍｍｏｌ）の１２−アミノラウリン酸の溶液を０℃に冷却し、１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨ９に調節した。１０ｍｌの１，４−ジオキサン中に溶解された４．８０ｇ（２２．０ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボナートを添加した後に、必要に応じて１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを９に一定に保ちながら４時間攪拌した。有機溶媒をｉｎ ｖａｃｕｏで蒸発させた。水性部を１０％の水性ＫＨＳＯ４溶液でｐＨ２に調節し、酢酸エチルエステルで３回抽出した。これらを合わせた有機相を、１０ｍｌの冷却した飽和ＮａＣｌ溶液で１回、水で２回洗浄し、乾燥させ、濾過し、沈降が始まるまで濃縮した。＋４℃に１８時間維持した後に、この産物を濾過により単離し、ｉｎ ｖａｃｕｏで乾燥させた。
収量：３．７ｇ（理論値の９２％）
【００２６】
参考実施例５−Ｎ−Ｍｓｃ−Ｄ−チロキシン−Ｎ−オキシスクシンイミドエステル（５）
２ｍｌのＴＨＦ中の２００．０ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）の（２）および２５．３ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液に、０．４２ｍｌのＴＨＦ中の４５．３ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを、０℃で攪拌しながら加えた。３時間後に、ジシクロヘキシル尿素を濾過により除いた。この溶液を濃縮して、＋４℃に１８時間維持した。この産物を濾過により単離し、ｉｎ ｖａｃｕｏで乾燥させた。
収量：１７６ｍｇ（理論値の７９％）
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度：７６．６％
【００２７】
参考実施例６−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−チロキシン−Ｎ−オキシスクシニミジルエステル（６）
合成を、出発物質として（３）を用いて（５）と同様に実施した。
収量：１９１２ｍｇ（理論値の８７％）
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度：８２．８％
【００２８】
実施例１−Ｂ１−Ｄ−チロキシル−インスリン（ヒト）（７）
２ｍｌのＤＭＦ中の１００．０ｍｇ（約０．０１６ｍｍｏｌ）のＡ１，Ｂ２９−Ｍｓｃ２−インスリン（Ｓｃｈｕｔｔｌｅｒ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ， Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６０，１７２１−１７２５（１９７９）に従って調製）および１８．０μｌ（０．１６ｍｍｏｌ）のＮ−メチル−Ｌ−モルホリン（ＮＭＭ）の溶液に、０．２ｍｌのＤＭＦ中の９３．１ｍｇの２を加えた。室温で６時間攪拌した後に、インスリン誘導体をエーテルで沈殿させて、遠心して単離し、エーテルで３回洗浄し、ｉｎ ｖａｃｕｏで乾燥させた。Ｍｓｃ基を０℃でＮａＯＨ／ジオキサン／水で処理して除き、１７を記載通り（Ｇｅｉｇｅｒら，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１０８，２７５８−２７６３（１９７５））Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ ｆｉｎｅでゲル濾過して最初に精製し、凍結乾燥させ、次いでＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
収量：３４．９ｍｇ（理論値の３３．３％）
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度：９９．６％
【００２９】
参考実施例７−Ｂ１−Ｌ−チロキシル−インスリン（ヒト）（７ａ）
合成を、１００．０ｍｇのＡ１，Ｂ２９−Ｍｓｃ２−インスリンおよび（１）から（７）と同様に実施したところ、Ｍｓｃ基の除去後に８８．９％の純度で７４ｍｇ（理論値の７０．４％）の（７ａ）を得て、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製の後に３７．２ｍｇ（理論値の３５．４％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ純度は９９．８％であった。
【００３０】
実施例２
２．１　Ｂ１−（Ｔ４−アミノラウロイル）−インスリン（ヒト）の合成
１２−アミノラウリン酸　ｎ＝１１
最初に、Ａ１，Ｂ２９−Ｍｓｃ２−インスリンを、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＤＣＣ／ＨＯＢｔ）（Ｋｏｎｉｇ ＆ Ｇｅｉｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１０３，７８８−７９８）を用いて１時間０℃および１時間室温で予備活性化した６等量の（４）と反応させた。室温で７０分後、反応が完了し、タンパク質が沈殿した。次いで、Ｂｏｃ基を選択的にＴＦＡで取り除いた。
中間体（Ｂ１−（１２−アミノドデカノイル）−Ａ１，Ｂ２９−Ｍｓｃ２−インスリン）を、８０％の収率および５９％の純度で単離した。
【００３１】
２．２　Ｂ１−Ｌ−チロキシル−（１２−アミノラウリル）−インスリン（ヒト）（８）
２ｍｌのＤＭＦ中の１０３．４ｍｇのＢ１−アミノラウロイル−Ａ１，Ｂ２９−Ｍｓｃ２−インスリンおよび１８．０μｌのＮ−メチル−Ｌ−モルホリンの溶液に、０．２ｍｌのＤＭＦ中の１３４ｍｇのＩを加えた。室温で６時間攪拌した後に、インスリン誘導体をエーテルで沈殿させて、遠心により単離し、エーテルで洗浄し、ｉｎ ｖａｃｕｏで乾燥させた。保護基を０℃でＮａＯＨ／ジオキサン／水で処理して除いた。ＶＩＩＩを最初にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ ｆｉｎｅでゲル濾過して、次いで半調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
収量：２９．５ｍｇ（理論値の２７．３％）
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度：９７．６％
【００３２】
２．３　Ｂ１−Ｄ−チロキシル−（１２−アミノラウリル）−インスリン（ヒト）（９）
出発物質として（５）を用いて（８）と同様に合成した。
収量：２６．７ｍｇ（理論値の２５％）
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度：９８％
【００３３】
実施例３
αアミノ基がアセチル化された変性チロイド部を有する二つのアナログを合成し、特徴決定した。
ＬＴ４のアセチル化を４０℃で酢酸無水物中で定量した。Ｎ−アセチル−ＬＴ４を、ＤＣＣ／ＮＨＳで活性化し、上記方法に従って、ａ）部分的に保護されたインスリン（Ａ１，Ｂ２９（ＭＳｃ）２インスリン）、およびｂ）Ｂ１−１２−アミノドデカノイル（Ｍｓｃ）２−インスリンに直接的にカップリングさせた。
しかしながら、非ブロック化後は、ＲＰ−ＨＰＬＣは、産物の明らかな不均質性を示した。
分離された個々のピーク並びに混合物のＭＳ分析は、Ｂ１−Ｎ−アセチル−Ｌ−Ｔ４−インスリンについて計算された６６０９の質量を全てのケースで与えた。これはラセミ化アニュイティー合成（ｒａｃｅｍｉｓａｔｉｏｎ ａｎｎｕｉｔｙ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を示すと考えられる。
【００３４】
実施例４
実施例３においてカバーされていないラセミ化を避けるために、直交保護基手段を介してＢ１−Ｎ−アセチル−ＬＴ４−インスリンの立体保存的合成を設計した。
【００３５】
４．１　Ｎ−アセチル−Ｌ−チロキシル−インスリン（ヒト）（１０）
２ｍｌのＤＭＦ中の１００．０ｍｇのＡ１，Ｂ２９−Ｍｓｃ２−インスリンおよび１８．０μｌのＮ−メチル−Ｌ−モルホリンの溶液に、０．２ｍｌのＤＭＦ中の１３４ｍｇの３を加えた。室温で６時間攪拌した後に、インスリン誘導体を氷冷エーテルで沈殿させて、遠心して単離し、エーテルで３回洗浄し、最後にｉｎ ｖａｃｕｏで乾燥させた。Ｂｏｃ基をＴＦＡで処理して除き、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０ ｆｉｎｅでゲル濾過して精製し、凍結乾燥させた。チロキシ部のアミノ基をアセチル化するために、５０．０ｍｇのＢ１−Ｌ−チロキシル−Ａ１，Ｂ２９−Ｍｓｃ２−インスリンを１ｍｌのＤＭＦに溶解し、２２．９ｍｇの酢酸スクシンイミドエステルと２時間室温で反応させた。このタンパク質を氷冷エーテル中に沈殿させて単離した。Ｍｓｃ基の最終的な除去を上述したようにＮａＯＨ中で行った。最終的な精製を、半調製用ＲＰ−ＨＰＬＣで行った。
収量：３８．３ｍｇ（理論値の３６％）
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度：９９．４％
【００３６】
４．２　Ｂ１−（（Ｎ−アセチル−Ｌ−チロキシル）−（１２−アミノラウリル））−インスリン（ヒト）（１１）
中間体としてＢ１−アミノラウロイル−Ａ１，Ｂ２９−Ｍｓｃ２−インスリンを用いて、１０に記載の方法に従って合成した。最初に、Ｂｏｃ−ＬＴ４をカップリングした。Ｂｏｃ基の切断後に、酢酸スクシンイミドエステルを用いた選択的アセチル化を行った。Ｍｓｃ基の除去および半調製用ＲＰ−ＨＰＬＣが１１を与えた。
収量：２３．５ｍｇ（理論値の２１％）
ＲＰ−ＨＰＬＣ純度：９８．２％
【００３７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを適用して、チロイド−インスリン−接合物の分子量を調べた。測定中、チロイド部の部分的非ヨウ素化が全ての接合物で観察された。表１では、実測および算出した質量がスペクトル質量（ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｓｓｅｓ）について比較されている。
【表１】
2004502784.tif 000003
【００３８】
実施例６
インスリンレセプターに対するチロイド−インスリン−接合物の結合特性
チロイド−インスリン接合物は、チロイド特性とインスリン特性を一つの分子に併せ持つ。
インスリン特性として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのインスリンレセプターに対する結合を調べた。レセプター結合は、培養したＩＭ−９リンパ球で｛Ｔｙｒ−（１２５Ｉ）Ａ１４｝−インスリンを用いた競合アッセイで調べた。血清アルブミンに対する代替インスリン接合物の計画される親和性のために、ＢＳＡの標準１％溶液を１％のγ−グロブリンに置換した（非特異的結合の抑制）。
相対的な結合を、非線形曲線適合を介してプログラムＰｒｉｓｍを用いて算出した。
レセプター親和性を表２にまとめた。
【００３９】
【表２】
2004502784.tif 000004
【００４０】
ＬＴ４を立体異性体ＤＴ４で置き換えることにより、約５０から１２．３％へと親和性が顕著に低減する。Ｌ−チロキシンのアミノ基のアセチル化は、Ｃ１２親和性を３０％まで低減する。スペーサーのアームを導入することにより、３つ全てのケースで親和性が顕著に損失した。
【００４１】
実施例７
血漿タンパクＴＢＧへの結合の調査
光学バイオセンサーＩＡｓｙｓは、リアルタイムでの生体分子の相互作用を記録すること、かくして速度論的研究を可能にする。チロイド−インスリン接合物であるＢ１−ＬＴ４−インスリン（参照）、Ｂ１−ＤＴ４−インスリン、およびＢ１−Ｎ−アセチル−ＬＴ４−インスリンの、血漿タンパク質であるチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）に対する結合を調べた。
キュベットの表面を、血漿タンパクＴＢＧを固定するカルボキシメチル化デキストランマトリックス（ＣＭＤ）で被覆した。
カルボキシメチル化マトリックスへのＴＢＧの固定化は、共鳴角度の変化を介して検出した。
【００４２】
速度論的研究のために、チロイド−インスリン接合物を、２５℃で、ＨＢＳ／Ｔｗｅｅｎバッファーに２００、３００、４００および５００μｇ／ｍｌという一連の希釈率となるようにマイクロキュベットに注入した。再現性を調べるために、全ての測定を３回繰り返した。
コントロールとして、天然インスリンを高濃度で注入した（５００μｇ／ｍｌ）。注入はバッファー−ジャンプに至るが、結合は観測されなかった。インスリン溶液の除去とブランクのバッファーの注入により別のバッファー−ジャンプが引き起こされたが、解離の徴候はなかった。かくして、固定された血漿タンパクに対するインスリンの非特異的結合が排除できる。さらなる測定のために、マイクロキュベットの表面をバッファーで数回濯いだ。
【００４３】
種々のリガンド濃度ＣＬにおける“オン・レート（ｏｎ−ｒａｔｅ）”定数ｋｏｎの測定は、ｋｏｎを式（４）に従ってＣＬに対してプロットされることを可能にする。これは傾きから結合速度定数ｋＡ、およびＣ２＝０のところで解離速度定数ｋＤを与える。しかしながら、ｋＤ＜０．０１ｓ−１のときにｋＤのエラーが非常に大きくなることを考慮する必要がある（ＩＡｓｙｓ， ＭＥＴＨＯＤＳ ＧＵＩＤＥ）。
ｋｏｎ＝ｋＤ＋ｋＡ・ｃＬ　　　　（４）
【００４４】
チロイド−インスリン−接合物を用いた固定されたＴＢＧへの結合の研究では、個々の測定の良好な再現性が注意される必要がある。
表３に示された３つのチロイド−インスリン−接合物の結合および解離曲線は、プログラムＦａｓｔ−ｆｉｔを用いて分析された。結合の定量については、二相適合の値がより大きな変動を示したことから、単一相曲線適合を選択した。
【００４５】
接合物の結合速度定数を表３に記載する。
【表３】
2004502784.tif 000005
【００４６】
Ｂ１−ＬＴ４−インスリンのｋＡは、Ｂ１−ＤＴ４−インスリンのｋＡよりも顕著に大きかった。リガンド濃度に対してＢ１−Ｎ−アセチル−ＬＴ４−インスリンのｋｏｎ値をプロッティングすると、大きな分散を示し、定量的評価はできなかった。しかしながら、個々の曲線は、Ｂ１−ＤＴ４−インスリンに非常によく類似していた。
【００４７】
解離の評価も、上記と同じ理由から、単一相曲線適合を介して行った。調査対象であるチロイド−インスリン−接合物の解離定数ｋＤは、表４にまとめられている。
【表４】
2004502784.tif 000006
【００４８】
Ｂ１−ＬＴ４−インスリンのｋＤは、Ｂ１−Ｎ−アセチル−ＬＴ４−インスリンのｋＤよりも約２０％大きかった。種々の濃度範囲内で良好な再現性があったにもかかわらず、観察された変動により、Ｂ１−ＤＴ４−インスリンのｋＤを算出できなかった。
【００４９】
実施例８
チロイド−インスリン−接合物の構造的特徴
アナログであるＢ１−ＬＴ４−インスリンおよびＢ１−ＬＴ４（１２−アミノドデカノイル）−インスリンを、ＣＤ分光法により分析した。
Ｂ１−ＬＴ４−インスリンを、０．０１７、０．１７、および０．８８ｇ／ｌの濃度で、またさらに０．４等量の亜鉛イオンの存在下で０．８８ｇ／ｌの濃度で調査した。いずれの条件下でも、同じスペクトルが記録された。濃度の増加、並びに亜鉛の存在のいずれも、楕円率に変化をもたらさなかった。１９５ｎｍにおけるインスリン特異的最大値も常に観察された。
【００５０】
近ＵＶでは、楕円率の濃度依存性は小さかった。天然インスリンとは対称的に、２５２ｎｍにポジティブなバンドがあった。これは、しかしながら、亜鉛の添加によってインスリンに共通なレベルまで低減した。２７５ｎｍでは、インスリンに典型的なプロフィールが観察された。しかしながら、スペクトルは、２Ｚｎ−ヘキサマーに典型的な値には到達しなかった（＝−３０５ｇｒａｄ・ｃｍ２ｘｄｍｏｌ−１）。
【００５１】
天然インスリンでは、フェノールの添加はＴ→Ｒ遷移を誘導し、ここでＢ鎖の伸長されたＮ末端がαヘリックス構造へと変わる。近ＵＶでは、約４００の値まで、２５１ｎｍにおけるネガティブ楕円率の増加を伴う。Ｂ１−ＬＴ４−インスリンの場合、この方向に小さい徴候のみが存在する。
【００５２】
Ｂ１−ＬＴ４−（１２−アミノドデカノイル）インスリンは、０．０２、０．２０、および０．６８ｇ／ｌの濃度で遠ＵＶで分析した。さらに、０．６８ｇ／ｌでの測定を、０．３３等量の亜鉛の存在下で行った。Ｂ１−ＬＴ４−（１２−アミノドデカノイル）インスリンは、１９５ｎｍでインスリンに典型的な最大を示した。濃度の増加および亜鉛の添加は、スペクトルを変化させなかった。
【００５３】
近ＵＶでは、ハイブリッドであるＢ１−ＬＴ４−（１２−アミノドデカノイル）インスリンを、０．０２および０．６８ｇ／ｌの濃度で調べた（図３７）。Ｂ１−ＬＴ４−インスリンとは対称的に、Ｂ１−ＬＴ４−（１２−アミノドデカノイル）インスリンは、２５５ｎｍにおいてポジティブなバンドを全く示さなかった。２７５ｎｍにおいて、ｔｈ４スペクトルはインスリンと類似していた。楕円率は、−２００以下に低減したが、インスリンの値（−３０５）までは到達しなかった。
【００５４】
実施例９
肝臓形質膜に対する結合の研究
９．１　ラット肝臓形質膜（ＬＰＭ）の単離
インスリンレセプターのソースとして平衡結合アッセイで用いるように、ラットの肝臓形質膜（ＬＰＭ）を単離した。ＬＰＭは、実際に、形質膜だけではなく、核、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体およびリソソームの膜も含む。細胞膜を断片化する際に、再び封じて（ｒｅｓｅａｌ）、小さな、閉じたベシクル、すなわちミクロソームを形成する。それゆえ、ＬＰＭは、核とミクロソーム成分に分離されうる。各成分は軽いおよび重いフラクションに分離される。次いでこれは、さらなるサブフラクションへと分離されうる。インスリンレセプターが存在する形質膜は軽いフラクションに観察されるが、本件での目的は、核の軽いフラクションが結合アッセイにおいて可変性の結果を通常生じることから、ミクロソームの軽いフラクションのみを得ることである。最初にＮｅｖｉｌｌｅ（１９６０）によって記載された方法を用いて、形質膜画分を新鮮なラット肝臓から単離した。
【００５５】
９．２．１　高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）
チロイドホルモン結合タンパク（ＴＨＢＰ）へのインスリンまたはアナログの結合を確かめるために、これらを４℃で一晩インキュベートした。結合および非結合種をＦＰＬＣで分子量により分離した。表１に示されているように、正常ヒト血清、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）、およびＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）に対するＨ−Ｉｎｓ、ＬＴ４−Ｉｎｓ、ＤＴ４−Ｉｎｓ、およびＬＴ４−（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓ（実施例２に従って合成）の結合を調べた。使用したＴＨＢＰ濃度は、コストの理由から、ＴＢＧを除いて、生理学的なものであった。
【００５６】
【表５】
2004502784.tif 000007
【００５７】
９．２．２　ＴＨＢＰの希釈とアナログとのインキュベーション
ＴＨＢＰの溶液（０．５ｍｌ）を以下のようにＦＰＬＣバッファーに調製し、ボルテックスした。
・正常ヒト血清　−　希釈せずに使用
・ＨＳＡ（５％ ｗ／ｖ）　−　ＨＳＡ（２０％ ｗ／ｖ）から１：４に希釈
・ＴＢＧ　−　１０μｌのストックＴＢＧ（０．１ｍｇ／０．１３ｍｌ）を０．５ｍｌのバッファーに加えた。ＦＰＬＣ／Ｂａｒｂｉｔｏｎｅ／ＨＳＡバッファー中のＨＳＡ（０．２％）の量があまりに小さかったので、アナログに対するＴＢＧの結合は有意に変化しなかった。
【００５８】
Ｈ−Ｉｎｓ（０．２７６μＭの１００μｌ）またはアナログをＴＨＢＰ溶液に加えた。これをボルテックスして、４℃で〜１６時間または一晩インキュベートした。ＦＰＬＣの前に、再度ボルテックスし、孔径０．２μｍのシリンジフィルターを介して濾過して（Ｇｅｌｍａｎ，ＵＫのＡｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）ＬＣ１３ ＰＶＤＦ）、細菌および血清沈殿を除いた。
【００５９】
９．２．３　フラクションをカラムから回収する
フラクションチューブ（ＬＰ３チューブ）を、アナログがチューブの内面に吸着することを避けるために５０μｌの３％（ｗ／ｖ）ＨＳＡで被覆した。フラクションサイズを０．５０ｍｌとしてプログラムした。各フラクションの免疫反応性インスリンを、同日にラジオイムノアッセイでアッセイした。
【００６０】
９．２．４　インスリンのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
二重抗体ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を行って、各ＦＰＬＣフラクションにおけるＨ−Ｉｎｓまたはインスリンアナログの濃度をインスリン特異的抗体を用いて調べた。
このアッセイを、インスリンスタンダードを用いて換算した。インスリンスタンダードおよびＦＰＬＣフラクションがアッセイされうる前に、Ｂａｒｂｉｔｏｎｅ／ＨＳＡ（０．２％ ｗ／ｖ）バッファーおよびＦＰＬＣ／Ｂａｒｂｉｔｏｎｅ／ＨＳＡバッファーを用いて希釈することにより、それらのＨＳＡ濃度を標準化した。ダブルディスペンサー（Ｄｉｌｕｔｒｅｎｄ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｌｏｎｄｏｎ Ｌｔｄ）を用いて、適切な量のバッファーおよび標準またはＦＰＬＣフラクションを、ラベル下ＬＰ３チューブに加えた。各チューブの全体量は５００μｌであった。さらに、標準化したＨＳＡ濃度を含むＮＳＢ（非特異的結合）の３つのチューブを、Ｂａｒｂｉｔｏｎｅ／ＨＳＡ（０．２％ ｗ／ｖ）およびＦＰＬＣ／Ｂａｒｂｉｔｏｎｅ／ＨＳＡバッファーを用いて調製した。表２は、標準およびＦＰＬＣフラクションの希釈、並びにＴＣおよびＮＳＢチューブの調製をまとめたものである。
【００６１】
【表６】
2004502784.tif 000008
【００６２】
９．２．５　［１２５Ｉ］インスリントレーサーの添加
［１２５Ｉ］インスリントレーサーのアリコートを、適当な量（チューブあたり１００μｌ）のＢａｒｂｉｔｏｎｅ／ＨＳＡ（０．２％ｗ／ｖ）に加えた。１００μｌの得られたトレーサー溶液の放射活性をγカウンターで計測し、一分間当たりのカウント（ｃｐｍ）を３０００−５０００ｃｐｍの間である。ＴＨＢＰはアッセイされるべきインスリン部分を保護し得るから、ＡＮＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）をこの溶液に溶解させ、これはアナログのＴ４部分をＴＨＢＰから置換するように機能した。最後に、１００μｌのこの溶液を各チューブに加えた。
【００６３】
９．２．６　一次抗体（Ｗ１２）の添加およびインキュベーション
一次抗体Ｗ１２は、ポリクローナルのモルモット抗インスリン抗体である。これはインスリン分子のＢ１残基から離れたエピトープを認識するので、Ｂ１残基に結合したＴ４部は結合するＷ１２を妨げないであろう。これは、Ｂａｒｂｉｔｏｎｅ／ＨＳＡ（０．２％ｗ／ｖ）バッファーに１：４５０００に希釈され、１００μｌをＴＣとＮＳＢチューブを除く各チューブに加えた。最終的に、このチューブをマルチボルテクサー（Ｍｏｄｅｌ ２６０１， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， ＵＳＡ）でボルテックスし、室温で約１６時間インキュベートした。
【００６４】
９．２．７　二次抗体（Ｓａｃ−Ｃｅｌ）の添加
二次抗体Ｓａｃ−Ｃｅｌ（ＩＤＳ Ｌｔｄ．，ＡＡ−ＳＡＣ３）は、抗体被覆セルロースを含む、ｐＨ７．４の固相懸濁液である。これをＢａｒｂｉｔｏｎｅ／ＨＳＡ（０．２％ｗ／ｖ）で１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、１００μｌを全てのチューブ（ＴＣを除く）に添加し、ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。遠心する前に１ｍｌの蒸留水をチューブに加え、溶液を希釈し、これによって非特異的結合を最小とした。
【００６５】
９．２．８　フリーおよび結合種の分離
フリーおよび抗体結合種を分離するために、チューブを、４℃に設定した冷却遠心機（ＩＥＣ ＤＰＲ−６０００ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）において２５００ｒｐｍで２０分まで遠心した。このチューブを、デカンティングラックに移した。回収タブ上でトレイを素早く転倒させることにより、フリーの種を含む上清をデカントした。ペレットが滑り落ちないように注意し、チューブを拭いて上清の残りを取り除いた。合わせた上清は、後で、実験室の安全ガイドラインに従ってスルースで処理した。最後に、サンプルを、ＴＣおよびＮＳＢチューブと共に、ＲＩＡのプログラムを用いてγカウンターでカウントした（ＲｉａＣａｌｃ）。
【００６６】
９．３　平衡結合アッセイ
この平衡結合アッセイは、ＴＨＢＰの存在下および不在下の両方における、ＬＰＭのインスリンレセプターに対して親和性のアナログを調べる。要約すると、固定された量の［１２５Ｉ］インスリントレーサーを、固定された量のＬＰＭと共に、異なる濃度のアナログとインキュベートして、トレーサーがインスリンレセプターに結合するのをアナログが阻害するようにする。遠心により結合およびフリーの種を分離した後に、結合したトレーサーの量をγカウンターで計測した。この結果を使用してＥＤ５０（実効半減量）を算出し、また、結合力を、Ｈ−Ｉｎｓに対して、あるいは添加したＴＨＢＰの効果を調べるアッセイでは、ＴＨＢＰ不在下におけるアナログに対して評価した。
【００６７】
９．４　結果
９．４．１　ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
二重抗体ＲＩＡを用いて、ＦＰＬＣフラクションにおける免疫反応性インスリン（ＩＲＩ）を定量した。抗体結合挙動が未知である新規アナログを定量するためにＲＩＡを用いることの妥当性を、Ｈ−Ｉｎｓ、ＤＴ４−Ｉｎｓ、ＬＴ４−Ｉｎｓ、およびＬＴ４（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓの標準液をアッセイすることにより確認した。図１は、Ｈ−Ｉｎｓおよびアナログによる一次抗体Ｗ１２に対する［１２５Ｉ］インスリンの結合の阻害を示す。それらのＥＤ５０は、１０６５ｐＭ（Ｈ−Ｉｎｓ）、４１７．３ｐＭ（ＬＴ４−Ｉｎｓ）、８１８．３ｐＭ（ＤＴ４−ｉｎｓ）、および８５５．９ｐＭ（ＬＴ４−（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓ）であった。Ｈ−Ｉｎｓ、ＤＴ４−ＩｎｓおよびＬＴ４（ＣＨ２）１２−ＩｎｓのＥＤ５０は、類似しているように見えたので（サイズが小さいために統計学的分析は行っていない）、Ｈ−Ｉｎｓと比べて新規アナログのインスリン部分の抗体認識に主な差異は無いと考えることができる。しかしながら、ＬＴ４−Ｉｎｓの標準曲線は、他の曲線の左にシフトしており、これはＷ１２に対するより低い結合を意味しうる。
【００６８】
９．４．２　高速タンパク液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）
ＦＰＬＣを用いて、ＴＨＢＰ（正常ヒト血清、ＨＳＡ ５％ｗ／ｖ、ＴＢＧ ０．２３８μＭ）に対するインスリンおよびアナログの結合を調べた。各フラクションのＩＲＩ含量をＲＩＡによりアッセイした。
ａ）ＴＨＢＰの非特異的結合
ＲＩＡにおける抗体に対するＴＨＢＰの非特異的結合を、ＴＨＢＰのみを溶出することにより測定し、フラクションをＩＲＩについてアッセイした。これらは全て無視できる量のＩＲＩを示した。
ｂ）溶出プロフィール
図２ａ−ｄは、それぞれ正常ヒト血清を用いて一晩インキュベーションした後の、Ｈ−Ｉｎｓ、ＬＴ４−Ｉｎｓ、ＤＴ４−ＩｎｓおよびＬＴ４（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓの溶出プロフィールを示す。図３ａ−ｄは、５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で一晩インキュベーションした後の接合体の溶出プロフィールを示す。図４ａ−ｄは、それぞれ、０．２３８μＭのＴＢＧで一晩インキュベーションした後の、Ｈ−ＩｎｓおよびＬＴ４−Ｉｎｓの溶出プロフィールを示す。算出した％結合および％フリーの値は表３に含まれている。最初のクロマトグラム（アナログを検出するほど敏感ではない）でＵＶ吸光度により検出されるＴＨＢＰの出現も、溶出プロフィールにおいて矢印として示されている。影付きのボックスは結合フラクションを示し、クリアなボックスはフリーのフラクションを示す。
【００６９】
Ｈ−Ｉｎｓ
各ＴＨＢＰに対するＨ−Ｉｎｓの算出した％結合は、同じＴＨＢＰに対するＬＴ４−Ｉｎｓの％結合よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。それにもかかわらず、結合Ｈ−Ｉｎｓの％は、完全には無視できるものではなかった。ＨＳＡに対して９．０２％およびＴＢＧに対して９．８５％のバックグラウンドの結合を観察した（図３Ａ、４Ａ）。
【００７０】
ＬＴ４−Ｉｎｓ、ＤＴ４−Ｉｎｓ、およびＬＴ４（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓ
チロキシル連結アナログは全て、ＴＨＢＰに対する実質的な結合（＞６０％）を示した（表１）。正常ヒト血清については、ＤＴ４−Ｉｎｓに対する％結合は、ＬＴ４−Ｉｎｓに対するものよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ＨＳＡ（５％ｗ／ｖ）については、ＬＴ４（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓに対する％結合は、ＬＴ４−Ｉｎｓに対するものよりも有意に高かった（ｐ，０．０５）。ＴＢＧ（０．２３８μＭ）については、ＤＴ４−Ｉｎｓに対する％結合は、ＬＴ４−ＩｎｓおよびＬＴ４（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓの両方に対するものよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【００７１】
９．４．３　平衡結合アッセイ
ＬＰＭのインスリンレセプターに対する平衡結合アッセイを、Ｈ−Ｉｎｓ、ＬＴ４−Ｉｎｓ、ＤＴ４−ＩｎｓおよびＬＴ４（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓについて実施した。さらに、添加したＴＨＢＰ（正常ヒト血清 ４５％、ＨＳＡ ５％ｗ／ｖ、ＴＢＧ ０．１３μＭ）の二つの新規アナログに対する効果も調べた。
Ｈ−ＩｎｓとアナログによるＬＰＭに対する［１２５Ｉ］インスリン結合の阻害を示す平衡結合曲線を、図５ａおよびｂ並びに６から１１に示した。各曲線は、いくつかのアッセイの平均の結果を示し、このアッセイの平均ＥＤ５０を表４に示す。
アナログの相対的能力評価（ＲＰＥ）を表５にまとめた。この値は微々たる異分散を示したが（Ｂａｒｌｅｔｔ Ｘ２テスト、ｐ＜０．０５）、一部は有意の非平行（ｎｏｎ−ｐａｒａｌｌｅｌｉｓｍ）を示した（Ｆ＜０．０５）。
【００７２】
ＴＨＢＰの不在下における結合
図５ａおよび５ｂは、Ｈ−Ｉｎｓおよび接合物による、ＬＰＭに対する１２５Ｉ−インスリン結合の阻害を示す。
ＬＴ４−Ｉｎｓ、ＤＴ４−ＩｎｓおよびＬＴ４（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓの結合曲線は全て、Ｈ−Ｉｎｓ曲線の右にシフトし（図５ａおよびｂ）、かつ、そのＥＤ５０は全てＨ−Ｉｎｓ’よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。二つの新規アナログＤＴ４−ＩｎｓおよびＬＴ４（ＣＨ２）１２−ＩｎｓのＥＤ５０は、いずれもＬＴ４−Ｉｎｓ’よりも高かったが（ｐ＜０．０５）、互いには有意に異ならなかった。
【００７３】
Ｈ−Ｉｎｓに対する３つのアナログのＲＰＥは、いずれも１００％であった。ＬＴ４−Ｉｎｓは６３．５％（４０．５−９６．７％）、ＤＴ４−Ｉｎｓは４５．４％（２７．９−７０．０％）、およびＬＴ４（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓは２２．６％（１４．１−３３．８％）で最も低い能力であった。
ＴＨＢＰの存在下で行った結合アッセイでは、結合曲線のシフト、並びにＥＤ５０およびＲＰＥの変化は、ＴＨＢＰの不在下における、同一のアナログの結合に対して記載されている。
【００７４】
正常ヒト血清（４５％ｖ／ｖ）
図６は、正常ヒト血清の存在下および不在下における、ＬＰＭに対する１２５Ｉ−Ｉｎｓの結合のＤＴ４−Ｉｎｓによる阻害を示す。図７は、ＬＴ４（ＣＨ２）１２Ｉｎｓの対応する曲線を示す。
正常ヒト血清（４５％ｖ／ｖ）を加えた場合（図６、７）、ＤＴ４−ＩｎｓおよびＬＴ４（ＣＨ２）１２Ｉｎｓの結合曲線はＴＨＢＰの不在下における結合よりも有意に高く（ｐ＜０．０５）、またそのＲＰＥは僅かに２１．０％（１１．３〜３４．５％）であった。ＤＴ４−Ｉｎｓでは、しかしながら、結合曲線の直線部の傾きは有意に大きく、シフトは非平行であった。そのＥＤ５０およびＲＰＥは、それゆえ、ＴＨＢＰ不在下でのその結合と比較して妥当とは言えない。また、〜５ｎＭまで［１２５Ｉ］の置換がないこと、および〜１１０ｎＭにおいて二つの曲線のクロスオーバーがあることが興味深い。
【００７５】
ＨＳＡ（５％ｗ／ｖ）
図８は、５％ＨＳＡの存在下および不在下における、ＬＰＭに対する１２５Ｉ−Ｉｎｓの結合のＤＴ４−Ｉｎｓによる阻害を示す。図９は、ＬＴ４（ＣＨ２）１２Ｉｎｓの対応する曲線を示す。
ＨＳＡ（５％ｗ／ｖ）の存在下では、ＤＴ４−ＩｎｓおよびＬＴ４（ＣＨ２）１２Ｉｎｓの両方の結合曲線は右にシフトしたが、ＬＴ４（ＣＨ２）１２ＩｎｓのＥＤ５０のみはＴＨＢＰの不在下における結合よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。ＨＳＡ存在下のＤＴ４−ＩｎｓのＲＰＥは６７．３％（３７．８−１１５．０％）であり、ＨＳＡ存在下のＬＴ４（ＣＨ２）１２ＩｎｓのＲＰＥは９２．８％（６６．６−１２９．２％）であった。
【００７６】
ＴＢＧ（０．１３５μＭ、０．２７μＭ）
図１０は、二つの異なる濃度のＴＢＧの存在下または不在下における、ＬＰＭに対する１２５Ｉ−Ｉｎｓの結合のＤＴ４−Ｉｎｓによる阻害を示す。図１１は、ＬＴ４（ＣＨ２）１２Ｉｎｓの対応する曲線を示す。
ＴＢＧについては、ＤＴ４−Ｉｎｓに０．１３５μＭ（半分の生理学的濃度）で添加すると、正常ヒト血清を添加したのと同じように、結合曲線の非平衡シフトが引き起こされた。それゆえ、そのＥＤ５０およびＲＰＥは、ＴＨＢＰの不在下におけるものと比較できない。〜５ｎＭまでのＤＴ４−Ｉｎｓで［１２５Ｉ］の置換がなく、かつ、〜１１０ｎＭにおいて二つの曲線が交差した。０．２７μＭのＴＢＧを添加した場合、曲線は、ＴＨＢＰの不在下におけるＤＴ４−Ｉｎｓの曲線に平行となるように戻った。ＥＤ５０は、ＴＢＧの不在下でＤＴ４−Ｉｎｓより有意に高く（ｐ＜０．０５）、また、ＲＰＥは２５．４％（１５．９−３７．９％）であった。
ＬＴ４（ＣＨ２）１２Ｉｎｓを添加した場合、０．１３５μＭのＴＢＧは、曲線の右への有意の非平行シフトをもたらし（図１５）、かくしてＥＤ５０およびＲＰＥは妥当な比較ではなかった。０．２７μＭのＴＢＧを加えた場合、曲線は平行に右にシフトした。そのＥＤ５０はＴＨＢＰの不在下での結合より有意に高く（＜ｐ０．０５）、そのＲＰＥは２３．５％（１４．２−３６．１％）であった。
【００７７】
【表７】
2004502784.tif 000009
【００７８】
【表８】
2004502784.tif 000010
【００７９】
【表９】
2004502784.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｈ−Ｉｎｓおよびアナログによる一次抗体Ｗ１２に対する［１２５Ｉ］インスリンの結合の阻害を示す。
【図２】正常ヒト血清を用いて一晩インキュベーションした後の、Ｈ−Ｉｎｓ、ＬＴ４−Ｉｎｓ、ＤＴ４−ＩｎｓおよびＬＴ４（ＣＨ２）１２−Ｉｎｓの溶出プロフィールをそれぞれ示す。
【図３】５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で一晩インキュベーションした後の接合体の溶出プロフィールを示す。
【図４】０．２３８μＭのＴＢＧで一晩インキュベーションした後の、Ｈ−ＩｎｓおよびＬＴ４−Ｉｎｓの溶出プロフィールを示す。
【図５】Ｈ−Ｉｎｓおよび接合物による、ＬＰＭに対する１２５Ｉ−インスリン結合の阻害を示す。
【図６】正常ヒト血清の存在下および不在下における、ＬＰＭに対する１２５Ｉ−Ｉｎｓの結合のＤＴ４−Ｉｎｓによる阻害を示す。
【図７】ＬＴ４（ＣＨ２）１２Ｉｎｓの対応する曲線を示す。
【図８】５％ＨＳＡの存在下および不在下における、ＬＰＭに対する１２５Ｉ−Ｉｎｓの結合のＤＴ４−Ｉｎｓによる阻害を示す。
【図９】ＬＴ４（ＣＨ２）１２Ｉｎｓの対応する曲線を示す。
【図１０】二つの異なる濃度のＴＢＧの存在下または不在下における、ＬＰＭに対する１２５Ｉ−Ｉｎｓの結合のＤＴ４−Ｉｎｓによる阻害を示す。
【図１１】ＬＴ４（ＣＨ２）１２Ｉｎｓの対応する曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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