(57)【要約】核酸配列が、本明細書中に開示される。これらの核酸配列によってコードされるポリペプチド、このポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに上記のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体の誘導体、改変体、変異体またはフラグメントもまた、開示される。本発明はさらに、障害の診断、処置、および予防のための、これらの新規ヒト核酸およびタンパク質のうちのいずれか１つを含む、治療方法、診断方法、および研究方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該成熟形態のアミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該アミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、改変体
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリペプチドであって、前記対立遺伝子改変体が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７からなる群より選択される核酸配列と単一のヌクレオチドで異なる核酸配列の翻訳産物であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
前記改変体のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下：
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該成熟形態のアミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、改変体；
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該アミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、改変体；
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいは該ポリペプチドの改変体の少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該アミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、核酸フラグメント；ならびに
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）の相補体を含む核酸分子からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６】
天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７からなる群より選択される核酸配列と単一のヌクレオチドで異なる、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１以上のヌクレオチドで異なるヌクレオチド配列であって、ただし、２０％未満のヌクレオチドが、該ヌクレオチド配列と異なる、ヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）（ｂ）の核酸フラグメント
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１０】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、以下：
（ａ）第１のヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列をコードするコード配列と１以上のヌクレオチド配列で異なるコード配列を含み、ただし、該第１のヌクレオチド配列のコード配列中の２０％未満のヌクレオチドが、該コード配列と異なる、第１のヌクレオチド配列；
（ｂ）該第１のポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２のポリヌクレオチド；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸フラグメント
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を測定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルに、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を接触させる工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を測定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該サンプルを提供する工程；
（ｂ）該サンプルに、該核酸分子に結合するプローブを接触させる工程；および
（ｃ）該核酸分子に結合する該プローブの存在または量を測定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を測定する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記核酸分子の存在または量が、細胞または組織型のマーカーとして使用される、方法。
【請求項２１】
前記細胞または組織型が癌性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドに、該因子を接触させる工程；および
（ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記因子が細胞レセプターまたは下流のエフェクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞に該因子を接触させる工程、および
（ｃ）該因子が該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程であって、これによって、該ペプチドの発現または活性における変化が、該因子が該ポリペプチドの発現または活性を調節することを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルに、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量の、該ポリペプチドに結合する化合物を接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２６】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、このような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するのに十分な量の、請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記被験体がヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、このような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するのに十分な量の、請求項５に記載の核酸を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記被験体がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、このような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するのに十分な量の、請求項１５に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
前記被験体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３３】
請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３４】
請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項３５】
請求項３２に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３６】
請求項３３に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３７】
請求項３４に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
【請求項３８】
第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプチドのレベルの変化に関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプルにおける該ポリペプチドの発現のレベルを測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該ポリペプチドの量を、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程であって、該第２の哺乳動物被験体は、該疾患を有さないかまたは該疾患に対する素因を有さないことが既知である、工程
を包含し、
ここで、該コントロールサンプルと比較した該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルの変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
【請求項３９】
前記素因が癌に対する素因である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸分子のレベルの変化に関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプルにおける該核酸の量を測定する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量を、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程であって、該第２の哺乳動物被験体は、該疾患を有さないかまたは該疾患に対する素因を有さないことが既知である、工程
を包含し、
ここで、該コントロールサンプルと比較した該第１の被験体における該核酸のレベルの変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、
方法。
【請求項４１】
前記素因が癌に対する素因である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物における病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するのに十分である量のポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドに、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
【請求項４３】
哺乳動物における病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するのに十分な量の請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、核酸およびそれらによってコードされるポリペプチドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般的に、核酸およびそれらによってコードされるポリペプチドに関する。より詳細には、本発明は、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合ポリペプチド、および分泌ポリペプチドをコードする核酸、ならびにこれらの核酸およびポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関する。
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、新規ポリペプチドをコードする核酸配列の発見に一部基づく。この新規核酸および新規ポリペプチドは、本明細書中、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶ１ａ、ＮＯＶ１ｂ、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３、ＮＯＶ４、ＮＯＶ５、ＮＯＶ６ａ、ＮＯＶ６ｂ、ＮＯＶ６ｃ、ＮＯＶ６ｄ、ＮＯＶ７ａ、ＮＯＶ７ｂ、およびＮＯＶ７ｃ核酸およびポリペプチドと称される。これらの核酸およびポリペプチド、ならびにこれらの誘導体、ホモログ、アナログおよびフラグメントは、本明細書の以後、総称して「ＮＯＶＸ」核酸または「ＮＯＶＸ」ポリペプチドという。
【０００４】
１つの局面において、本発明は、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＳ：）１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７に開示される核酸に対して同一性を有する核酸配列を含む、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離されたＮＯＶＸ核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、ＮＯＶＸ核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列のタンパク質コード配列を含む核酸分子に相補的な核酸配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離された核酸、そのフラグメント、ホモログ、アナログ、または誘導体を含む。例えば、核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のアミノ酸配列を含むポリペプチドに、少なくとも８０％同一なポリペプチドをコードし得る。核酸は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のいずれかの核酸配列を含む、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００５】
オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７）の少なくとも６個連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド）または上記オリゴヌクレオチドの相補鎖もまた、本発明に含まれる。
【０００６】
実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８）もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、ＮＯＶＸポリペプチドは、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００７】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチド、またはそのフラグメント、ホモログ、アナログもしくは誘導体に免疫選択的に結合する抗体を特徴とする。
【０００８】
別の局面において、本発明は、治療有効量の治療剤もしくは予防有効量の治療剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物を含む。治療剤は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチドまたはＮＯＶＸポリペプチドに特異的な抗体であり得る。さらなる局面において、本発明は、１つ以上の容器中に、治療有効量の薬学的組成物または予防有効量のこの薬学的組成物を含む。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、ＤＮＡによってコードされるＮＯＶＸポリペプチドの発現を可能にする条件下でＮＯＶＸ核酸を含む細胞を培養することによって、ポリペプチドを産生する方法を含む。所望される場合、ＮＯＶＸポリペプチドは、それから回収され得る。
【００１０】
別の局面において、本発明は、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの存在を検出する方法を含む。この方法において、サンプルは、ポリペプチドと化合物との間の複合体の形成を可能にする条件下で、ポリペプチドに選択的に結合する化合物と接触される。複合体は、存在する場合検出され、それによって、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドを同定する。
【００１１】
本発明はまた、ＮＯＶＸの発現に基づいて特異的な細胞または組織型を同定するための方法を含む。
【００１２】
サンプルをＮＯＶＸ核酸プローブもしくはＮＯＶＸ核酸プライマーと接触させ、そして核酸プローブもしくは核酸プライマーがサンプル中のＮＯＶＸ核酸分子に結合するか否かを検出することによって、サンプル中のＮＯＶＸ核酸分子の存在を検出する方法もまた、本発明によって含まれる。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドを含む細胞サンプルを、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するのに十分な量でＮＯＶＸポリペプチドに結合する化合物と接触させることによって、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するための方法を提供する。この化合物は、例えば、本明細書中にさらに記載されるように、低分子（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機分子（炭素含有）もしくは無機分子）であり得る。
【００１４】
例えば、糖尿病、肥満と関連する代謝性障害、代謝性症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患と関連する消耗病、代謝性障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、または細胞シグナルプロセシングおよび代謝経路調節に関連する他の障害を含む、障害または症候群を処置または予防するための医薬の製造における医薬の使用もまた、本発明の範囲内に含まれる。医薬は、例えば、ＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ特異的抗体、またはそれらの生物学的に活性な誘導体もしくはフラグメントであり得る。
【００１５】
例えば、本発明の組成物は、発達疾患、ＭＨＣＩＩ疾患およびＭＨＣＩＩＩ疾患（免疫疾患）、味覚および嗅覚の検出能力の障害、バーキットリンパ腫、皮質神経疾患、シグナル伝達経路の障害、光受容を含む網膜障害、細胞増殖速度の障害；細胞形態の障害、摂食障害；摂食の制御；過食に起因する潜在的な肥満；飢餓に起因する潜在的な障害（食欲の欠如）、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ１）、細菌感染、真菌感染、原生動物感染およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引起される感染）、疼痛、癌（新生物；腺癌；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌を含むが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、クローン病；多発性硬化症；オルブライト遺伝性骨ジストロフィー、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神異常障害および神経学的障害（不安、精神分裂病症、躁鬱病、譫妄、痴呆、重症の精神遅滞を含む）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、低リン血症性のくる病、常染色体性優性（２）Ａｃｒｏｃａｌｌｏｓａｌ症候群およびジスキネジー（例えば、ハンチントン病またはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群）ならびに／あるいは他の病状および障害などに罹患する患者の処置に効果を有する。
【００１６】
このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＮＯＶＸをコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＮＯＶＸは、それを必要とする被験体に投与された場合に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置に対する効力を有する：細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染）、疼痛、癌（新生物；腺癌；リンパ腫；前立腺癌；子宮癌を含むが、これらに限定されない）、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、残尿、骨粗鬆症、クローン病；多発性硬化症；ならびにオールブライト遺伝性骨形成異常症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、ぜん息、アレルギー、良性前立腺肥大、ならびに精神学的および神経学的障害（不安、精神分裂病、躁鬱、せん妄、痴呆、重篤な精神遅滞およびジスキネジー（例えば、ハンティングトン病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群）を含む）、ならびに／または他の病態および障害の処置。
【００１７】
本発明はさらに、例えば、以下を含む障害または症候群のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を包含する：糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患に関連するるいそう障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン障害、免疫障害および造血障害、または細胞シグナル伝達プロセシングおよび代謝経路調節に関連する他の障害。この方法は、試験化合物をＮＯＶＸポリペプチドと接触させる工程、およびこの試験化合物がこのＮＯＶＸポリペプチドに結合するか否かを決定する工程を包含する。ＮＯＶＸポリペプチドへの試験化合物の結合は、この試験化合物が、前述の障害もしくは症候群の活性のモジュレーター、または前述の障害もしくは症候群に対する潜在性もしくは素因のモジュレーターであることを示す。
【００１８】
また、本発明の範囲には、以下の障害または症候群についての危険性の増大した試験動物に対して、試験化合物を投与することによって、以下を含む障害もしくは症候群の活性のモジュレーター、または以下を含む障害もしくは症候群に対する潜伏もしくは素因のモジュレーターについてスクリーニングする方法が含まれる：例えば、糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患に関連するるいそう障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン障害、免疫障害および造血障害、または、細胞のシグナルプロセシングおよび代謝経路調節に関連した他の障害。試験動物は、ＮＯＶＸ核酸によってコードされる組換えポリペプチドを発現する。次いで、ＮＯＶＸポリペプチドの発現または活性を、この試験動物において測定し、同様に、コントロール動物（これは、ＮＯＶＸポリペプチドを組換え的に発現し、かつ上記の障害についての危険性も上記の症候群についても危険性も増大していない）におけるこのタンパク質の発現または活性を測定する。次いで、試験動物およびコントロール動物の両方におけるＮＯＶＸポリペプチドの発現を比較する。コントロール動物と比較した、試験動物におけるＮＯＶＸポリペプチドの活性における変化は、この試験化合物が、上記の障害または症候群の潜伏のモジュレーターであることを示す。
【００１９】
なお別の局面では、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸またはその両方のレベルの変化に関連した疾患の存在または素因を決定するための方法を含む。この方法は、この被験体由来の試験サンプル中におけるＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程、およびコントロールサンプル中において存在するＮＯＶＸポリペプチドの量に対して、この試験サンプル中におけるこのポリペプチドの量を比較する工程を包含する。コントロールサンプルと比較した場合の試験サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドレベルの変化は、この被験体における疾患の存在または素因を示す。好ましくは、この素因としては、以下の素因が挙げられる：例えば、糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患に関連するるいそう障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン障害、免疫障害および造血障害。また、本発明の新規なポリペプチドの発現レベルは、種々の癌についてスクリーニングする方法および癌の病期を決定する方法において使用され得る。
【００２０】
さらなる局面では、本発明は、病理学的状態を緩和または予防するに十分な量において、被験体（例えば、ヒト被験体）にＮＯＶＸポリペプチド、ＮＯＶＸ核酸、またはＮＯＶＸ特異的抗体を投与することによって、哺乳動物における障害に関連した病理学的状態を処置または予防する方法を包含する。好ましい実施形態では、この障害としては、以下が挙げられる：例えば、糖尿病、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘ、食欲不振、慢性疾患に関連するるいそう障害、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン障害、免疫障害および造血障害。
【００２１】
なお別の局面では、本発明は、当該分野において一般的に使用される多数の技術のうちのいずれか１つによって、本発明の細胞性レセプターおよび下流エフェクターを同定する方法において使用され得る。これらとしては、ツーハイブリッド系、アフィニティ精製、抗体または他の特異的な相互作用分子を用いる共沈が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
他に規定されない限り、本明細書中において使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載された方法および物質と類似または等価な方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および物質を以下に記載する。本明細書中で引用されたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献が、それらの全体において、本明細書中において参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書中が支配する。さらに、物質、方法および例は、例示のみであり、限定されることを意図されない。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規なヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。新規な核酸配列およびそれらのポリペプチドが本発明に含まれる。それらの配列は、集合的に「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と呼ばれ、そして対応するコードされるポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と呼ばれる。他に示されない限り、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示された新規な配列のいずれかをいうことを意味する。表８は、ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドのまとめを提供する。
【００２５】
【表１】
2004501623.tif 000002
【００２６】
ＮＯＶＸ核酸およびそれらがコードするポリペプチドは、種々の応用および内容において有用である。本発明による種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、ドメインの存在および以前に記載されたタンパク質に対する配列関連性に従って、タンパク質ファミリーの新規なメンバーとして有用である。さらに、ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用され得る。
【００２７】
例えば、ＮＯＶ１は、重要な細胞接着分子であり、かつ免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、不規則キアズマＣ最大粗面ファミリー（Ｉｒｒｅｇｕｌａｒ　Ｃｈｉａｓｍ　Ｃ　Ｒｏｕｇｈｅｓｔ　ｆａｍｉｌｙ）のタンパク質のメンバーと相同である。従って、本発明によるＮＯＶ１核酸、ＮＯＶ１ポリペプチド、ＮＯＶ１抗体および関連する化合物は、例えば、細胞の移動、侵襲および腫瘍転移によって特徴付けられる障害（例えば、リンパ増殖性疾患）における治療的応用および診断的応用に有用である。
【００２８】
また、ＮＯＶ２は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター関連タンパク質ファミリーと相同である。従って、ＮＯＶ２は、ＬＤＬレセプターファミリーの他のメンバーと同様に機能し得る。その結果、本発明によるＮＯＶ２核酸、ＮＯＶ２ポリペプチド、ＮＯＶ２抗体および関連化合物は、血清中の高レベルのコレステトールリッチなＬＤＬによって特徴付けられる障害（例えば、家族性高コレステロール血症）において治療的応用および診断的応用に有用である。
【００２９】
さらに、ＮＯＶ３は、ＧＲＯタンパク質およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）を含む誘導性低分子サイトカインタンパク質のファミリーと相同である。従って、本発明によるＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３ポリペプチド、ＮＯＶ３抗体および関連化合物は、ＧＲＯタンパク質、ＩＬ−８および／またはこの同じファミリーの他のメンバーを含む種々の障害の治療応用において有用である。これらの障害の特定の例としては例えば、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性腸炎および種々の型の癌が挙げられる。
【００３０】
また、ＮＯＶ４は、細胞周期の調節および細胞増殖において重要な細胞周期タンパク質および増殖タンパク質と相同である。従って、本発明によるＮＯＶ４核酸、ＮＯＶ４ポリペプチド、ＮＯＶ４抗体および関連化合物は、例えば、種々の免疫障害、発生障害および細胞シグナル伝達障害、ならびに細胞増殖障害（癌を含む）の治療的応用および診断的応用で有用である。
【００３１】
さらに、ＮＯＶ５は、カドヘリンファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明によるＮＯＶ５核酸、ＮＯＶ５ポリペプチド、ＮＯＶ５抗体ならびに関連化合物は、例えば、免疫不全および免疫障害、ウイルス感染、細菌感染および他の感染および細胞増殖障害を含む種々の状態を処置する際に有用である。
【００３２】
さらに、ＮＯＶ６は、リゾチームＣ−１ファミリーのタンパク質と相同である。従って、本発明によるＮＯＶ６核酸、ＮＯＶ６ポリペプチド、ＮＯＶ６抗体および関連化合物は、例えば、細菌感染、真菌感染、原生生物感染およびウイルス感染、アミロイドーシス、血液障害、唾液（ｓａｌｉｖｉｔｏｒｙ）障害、消化障害、経口免疫学的障害、乏しい口腔の健康、炎症プロセス、筋肉障害、骨障害および腱障害、ならびに／または同様の他の病態および障害を含む種々の状態を処置する際に有用である。
【００３３】
最後に、ＮＯＶ７は、重要なプロテアーゼインヒビターおよび癌抗原であるＩｇＧ様タンパク質のメンバーと相同である。従って、本発明によるＮＯＶ７核酸、ＮＯＶ７ポリペプチド、ＮＯＶ７抗体および関連化合物は、プロテアーゼ阻害および癌腫によって特徴付けられる障害（例えば、増殖性障害）の治療的応用および診断的応用で有用である。
【００３４】
ＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドはまた、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害するかまたは高める分子をスクリーニングするために使用され得る。特に、本発明による核酸およびポリペプチドは、例えば、神経発生、細胞分化、細胞増殖、造血、創傷治癒および血管新生を調節するかまたは阻害する低分子の同定のための標的として使用され得る。
【００３５】
本発明によるＮＯＶＸ核酸およびＮＯＶＸポリペプチドについてのさらなる有用性は、本明細書中に記載される。
【００３６】
（ＮＯＶ１）
ＮＯＶ１は、以下に開示される、２つの同様の核酸および２つの同様のタンパク質のファミリーを含む。これらは、ＮＯＶ１内に含まれる同定可能なＩｇドメインの存在によって実証されるように、Ｉｇスーパーファミリーのタンパク質の新たなメンバーである。
【００３７】
（ＮＯＶ１ａ）
３４６４ヌクレオチドの、開示されるＮＯＶ１ａ核酸（２０４２１３３８．０．４４またはＣＧ５１３７３−０２とも呼ばれる）を表１Ａに示す。ＯＲＦは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド２５２４〜２５２６の停止コドンで終わる。終結コドンの下流の推定の非翻訳領域に表１Ａ中で下線を付し、そして開始コドンおよび停止コドンは太字である。
【００３８】
【表２】
2004501623.tif 000003
【００３９】
配列番号２によってコードされるＮＯＶ１ａタンパク質は８４１アミノ酸残基を有し、そして表１Ｂにおいて一文字暗号を用いて提示される。ＮＯＶ１ａに関するＰｓｏｒｔプロファイルは、この配列がシグナルペプチドを有さないようであり、そして０．７０００の確実性で原形質膜に；マイクロボディ（ペルオキシソーム）に（確実性＝０．３６６１）；小胞体（膜）に（確実性＝０．２０００）；およびミトコンドリア内膜に（確実性＝０．１０００）局在するようであることを予測する。同定可能なＩｇドメインが存在するので、ＮＯＶ１ａタンパク質は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。
【００４０】
【表３】
2004501623.tif 000004
【００４１】
ＮＯＶ１ａに関する開示されるアミノ酸配列は、４１０アミノ酸のＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓの不規則キアズマＣ最大粗面タンパク質前駆体（ＡＣＣ：ＢＡＡ９１８５０）（ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１０８４５　ＦＩＳ，Ｃｌｏｎｅ　ＮＴ２ＲＰ４００１３７２）に対して４１０個のうち４１０個（１００％）が同一である（スコア＝２１６１（７６０．７ビット）；Ｅ＝８．３ｅ−２２４）。開示されるＮＯＶ１ａアミノ酸配列もまた、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来の７６４アミノ酸のＡＣＣ：Ａ０８１８０不規則キアズマＣ最大粗面タンパク質前駆体（ＩＲＲＥＣ　ＰＲＯＴＥＩＮ）と、２９１個のうちの８９個（３０％）が同一であり、そして２９１個のうち１３９個（４７％）が陽性であった（スコア＝３５１（１２３．６ビット）；Ｅ＝３．８ｅ−５９）。
【００４２】
最大粗面不規則キアズマＣ（ｒｏｕｇｈｅｓｔ−ｉｒｒｅｇｕｌａｒ　ｃｈｉａｓｍ　Ｃ）タンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるいくつかの重要な発生プロセスに関与する免疫グロブリンスーパーファミリーの膜貫通糖タンパク質である細胞接着分子である。これらとしては、視葉における軸索の経路決定（ａｘｏｎａｌ　ｐａｔｈｆｉｎｄｉｎｇ）ならびに蛹網膜におけるプログラム細胞死および色素細胞分化が挙げられる。Ｍｏｄａら，Ａｎ　Ａｃａｄ　Ｂｒａｓ　Ｃｉｅｎｃ　７２（３）：３８１−８８（２０００）を参照のこと。さらに、このタンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの触覚におけるパターン形成感覚器において役割を果たす。Ｖｅｎｕｇｏｐａｌａ　Ｒｅｄｄｙら，Ｄｅｖ　Ｇｅｎｅｓ　Ｅｖｏｌ　２０９（１０）：５８１−９１（１９９９）を参照のこと。発生中のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ網膜におけるパターン形成は、個眼間の過剰な細胞の除去、ならびに二次色素細胞および三次色素細胞への残りの細胞の分化を含む。Ｒｅｉｔｅｒら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２２（６）：１９３１−４０（１９９６）を参照のこと。不規則キアズマＣ最大粗面タンパク質は、蛹網膜における細胞−細胞接触の適切な選別に必須である。同書を参照のこと。
【００４３】
本明細書中の全てのＢＬＡＳＴアラインメントにおいて、「Ｅ値」または「期待」値は、アラインメントされた配列が、検索されたデータベース内で、偶然のみによってＢＬＡＳＴ問い合わせ配列へのそれらの類似性を達成し得た確率の数値表示である。例えば、ＩＩＴ　ＢＬＡＳＴ分析から検索された対象（「Ｓｂｊｃｔ」）が、問い合わせＩＩＴ配列と純粋に偶然によって一致する確率は、Ｅ値である。期待値（Ｅ）は、特定のサイズのデータベースを検索する場合に単なる偶然によって見られることを「期待」し得る、ヒットの数を記載するパラメーターである。このＥ値は、２つの配列の間の一致に割り当てられたスコア（Ｓ）に伴って指数関数的に減少する。本質的に、Ｅ値は、配列の間での一致について存在する、ランダムなバックグラウンドノイズを記載する。ブラスト実行（ｂｌａｓｔｉｎｇ）は、公開ヌクレオチドデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースおよびＧｅｎｅＳｅｑ特許データベース）に対して行われる。例えば、ＢＬＡＳＴＸ検索は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲを含む、公開タンパク質データベースに対して行われる。
【００４４】
期待値は、結果を報告するための有意な閾値を作製するための便利な手段として用いられる。ブラスト化のために用いられるデフォルト値は代表的に０．０００１に設定される。ＢＬＡＳＴ　２．０では、期待値はまた、Ｐ値（確率）の代わりに用いられて、一致の有意性を報告する。例えば、ヒットに割り当てられた１というＥ値は、現行の大きさのデータベースにおいて、単に偶然によって同様の類似性スコアで１つの一致が見られることを期待し得ることを意味すると解釈され得る。０というＥ値は、単に偶然によって類似のスコアで何らかの一致を見ることも期待しないことを意味する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照のこと。時折、ＸまたはＮの文字列が、ＢＬＡＳＴ検索から得られる。これは、人為産物のヒットを妨げるために行われる低複雑性配列についての問い合わせの自動フィルタリングの結果である。このフィルタは、ヌクレオチド配列中に文字「Ｎ」（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）で、またはタンパク質配列中で文字「Ｘ」（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）で見出される、任意の低複雑性配列を置換する。低複雑性領域は、優位な位置毎のアラインメントというよりも組成の偏りを反映する高スコアをもたらし得る。ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　２６６：５５４−５７１，１９９６。
【００４５】
改変体配列もまた本出願に含まれる。改変体配列は、１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含み得る。ＳＮＰは、いくつかの場合、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡとして始まることを示すために「ｃＳＮＰ」と呼ばれ得る。ＳＮＰは、いくつかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型部位での別のヌクレオチドについての１つのヌクレオチドの置換に起因し得る。このような置換は、トランジションまたはトランスバージョンのいずれかであり得る。ＳＮＰはまた、参照対立遺伝子と比較した、１つのヌクレオチドの欠失または１つのヌクレオチドの挿入から生じ得る。この場合、多型部位は、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子における特定のヌクレオチドに対してギャップを保有する部位である。遺伝子内に生じるＳＮＰは、ＳＮＰの位置で遺伝子によってコードされるアミノ酸の変化を生じ得る。ＳＮＰを含むコドンが、遺伝暗号の冗長性の結果として、同じアミノ酸をコードする場合、遺伝子内ＳＮＰもまたサイレントであり得る。遺伝子領域の外または遺伝子内のイントロンにおいて生じるＳＮＰは、タンパク質のどのアミノ酸配列においても変化をもたらさないが、発現パターンの調節の変化をもたらし得る。例としては、時間的発現、生理学的応答調節、細胞型発現調節、発現強度および転写されたメッセージの安定性における変化が挙げられる。
【００４６】
ＮＯＶ１ａについての可能なＳＮＰは、表１Ｃに見出されるＳＮＰを含む。
【００４７】
【表４】
2004501623.tif 000005
【００４８】
（ＮＯＶ１ｂ）
ＮＯＶ１ｂについてのヌクレオチド配列（２０４２１３３８．０．３０またはＣＧ５１３７３−０１）（１２３０ｂｐ、配列番号３）を表１Ｄに示す。ヌクレオチド１〜３で始まり、そしてヌクレオチド１００３〜１００５で終わる、オープンリーディングフレームが同定された。このオープンリーディングフレームの開始コドンおよび停止コドンは、太字で強調され、そして推定の非翻訳領域に下線を付す。
【００４９】
【表５】
2004501623.tif 000006
【００５０】
コードされるＮＯＶ１ｂタンパク質を表１Ｅに表す。開示されるタンパク質は、３３４アミノ酸長であり、そして配列番号４によって示される。ＮＯＶ１ｂについてのＰｓｏｒｔプロファイルは、この配列がシグナルペプチドを有さないようであり、そして０．４５００の確実性で細胞質に；０．３２３５の確実性でマイクロボディ（ペルオキシソーム）に；０．２０７５の確実性でリソソーム（内腔）に；そして０．１０００の確実性でミトコンドリア基質空間に局在するようであることを予測する。開示されるＮＯＶ１ｂタンパク質は、リンパ節、卵巣および副腎において発現される。開示されるＮＯＶ１ｂタンパク質は、その中に含まれる同定可能なＩｇドメインへのその相同性によって実証される、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。
【００５１】
ＮＯＶ１ｂは、原形質膜１ｂ型膜タンパク質である。ＳＡＧＥ分析は、この遺伝子がＥＧＦｒによってアップレギュレートされることを示す。
【００５２】
【表６】
2004501623.tif 000007
【００５３】
開示されるＮＯＶ１ｂアミノ酸配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来の７６４アミノ酸のＡＣＣ：１８１８０の不規則キアズマＣ最大粗面タンパク質前駆体（ＩＲＲＥＣ　ＰＲＯＴＥＩＮ）と２０５のうち７７（３７％）が同一であり、そして２０５のうち１０６（５１％）である（スコア＝３２６（１１４．８ビット）；Ｅ＝２．３ｅ−２８）。さらに、開示されるＮＯＶ１ｂタンパク質は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の１２４１のアミノ酸ＡＣＣ：Ｏ６０５００のネフリン（Ｎｅｐｈｒｉｎ）と１９９のうち５９（２９％）が同一であり、そして１９９のうち９３（４６％）が陽性である。上記のように、不規則キアズマＣ最大粗面タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーの接着分子である。同様に、ネフリンは、免疫グロブリンの細胞接着分子の推定のメンバーである。Ｋｅｓｔｉｌｉａら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ　１：５７５−８２（１９９８）；ＯＭＩＭ　６０２７１６を参照のこと。ネフリンは、膜貫通ドメイン、８個のＩｇ様モジュールおよび１個のフィブロネクチンＩＩＩ様モジュールを含む。同書を参照のこと。このタンパク質は、腎臓糸球体において特異的に発現されることが示されており、そしてこれは、腎臓濾過関門の発生または機能において重大な役割を果たす。Ｐｕｔａａｌａら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１−８（２００１）は、相同組換えによって胚性幹細胞においてネフリン遺伝子を不活化することによって、先天性腎炎症候群のマウスモデルを作製した。
【００５４】
ＮＯＶ１ｂについての可能なｃＳＮＰを表１Ｆに示す。
【００５５】
【表７】
2004501623.tif 000008
【００５６】
表１Ｇは、ＮＯＶ１ａのタンパク質配列とＮＯＶ１ｂのタンパク質配列との比較を示す。
【００５７】
【表８】
2004501623.tif 000009
【００５８】
他のＢＬＡＳＴの結果は、特許および特許刊行物に公開された配列を含む独自データベースである、Ｐａｔｐデータベース由来の配列を含む。ＮＯＶ１についてのＰａｔｐ結果は、表１Ｈおよび１Ｉに列挙される結果を含む。
【００５９】
ＮＯＶ１ａについてのＰａｔｐの結果は、表１Ｈに列挙される結果を含む。
【００６０】
【表９】
2004501623.tif 000010
【００６１】
ＮＯＶ１ｂに関するＰａｔｐの結果は、表１Ｉに列挙される結果を含む：
【００６２】
【表１０】
2004501623.tif 000011
【００６３】
例えば、ＯＲＦ７８５に対するＢＬＡＳＴ、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の１２６アミノ酸のヒトＯＲＦＸは、ＮＯＶ１ａと１２６／１２６（１００％）の同一性、および１２６／１２６（１００％）陽性（Ｅ＝２．０ｅ−６２）を生じた。ＷＯ００／５８４７３。さらに、ＯＲＦ７８５に対するＢＬＡＳＴによって、ＮＯＶ１ｂと１２６／１２６（１００％）の同一性、および１２６／１２６（１００％）陽性（Ｅ＝１．６ｅ−４５）が得られた。
【００６４】
特にＮＯＶ１ａまたはＮＯＶ１ｂとして注記しない限り、ＮＯＶ１に対する言及はいずれも全ての改変体を包含すると仮定する。本明細書における任意のＮＯＶＸ改変体配列の間の残基の差異は、「１つの」改変体における残基、および「１つの」改変体に関する残基位置を示すように記載されている。個々のＮＯＶ改変体の間で異なる以下の全ての配列におけるＮＯＶ残基を、囲みで強調し、
そして本明細書における全てのアラインメントにおいて改変残基上の（ｏ）記号を用いて印を付ける。
【００６５】
開示されたＮＯＶ１タンパク質は、Ｉｇスーパーファミリー内の多数のタンパク質と良好な同一性を有する。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析のために用いた同一性情報を、表１Ｊに示す。
【００６６】
【表１１】
2004501623.tif 000012
【００６７】
この情報を、関連タンパク質配列をＮＯＶ１を比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析として表１Ｊ（ここで１行目にＮＯＶ１ａを示す）に示す複数の配列アラインメントに図示する。
【００６８】
本明細書における全てのＣｌｕｓｔａｌＷ分析において、黒で輪郭を取ったアミノ酸残基は、保存された配列の領域（すなわち、構造的特徴または機能的特徴を保存するために必要であり得る領域）を示し、一方、強調していないアミノ酸残基は、ほとんど保存されず、そしてタンパク質の構造または機能を変えることなしに、非常に広範な範囲まで潜在的に変異され得る。
表１Ｊ　ＣｌｕｓｔａｌＷタンパク質についての情報
【００６９】
【表１２】
2004501623.tif 000013
2004501623.tif 000014
2004501623.tif 000015
2004501623.tif 000016
【００７０】
ＮＯＶ１は、第１染色体に局在していた。１５４，９９８ｂｐのＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ第１染色体クローンＲＰＩ１１−４４４Ｍ１０（ａｃｃ：ＡＬ１３９０１０．８）に対するＮＯＶ１核酸のＢＬＡＳＴによって、ヌクレオチド１２５６６９〜１２７０８１にわたって、１３７５／１４１４（９７％）同一性および１３７５／１４１４（９７％）陽性（Ｅ＝０．０；鎖＝−／＋）が得られた。同様に、ＮＯＶ１は、この第一染色体クローンのヌクレオチド１６６３２〜１６９０９から、２４９／２７６（９０％）同一および２４９／２７６（９０％）陽性（Ｅ＝１．８ｅ−１９３；鎖＝−／＋）；ヌクレオチド２０１３６〜２０３２４にわたって、１７２／１８９（９１％）同一および１７２／１８９（９１％）陽性（Ｅ＝１．８ｅ−１９３；鎖＝−／＋）；ヌクレオチド１１１３１１〜１１１３４０にわたって、１５９／１６９（９４％）同一および１５９／１６９（９４％）陽性（Ｅ＝１．８ｅ−１９３；鎖＝−／＋）；ヌクレオチド１２７９６３〜１２８１０２にわたって、１４０／１４０（１００％）同一および１４０／１４０（１００％）陽性（Ｅ＝０．０；鎖＝−／＋）；ヌクレオチド１９８３７〜１９９７１にわたって、１３３／１３５（９８％）同一および１３３／１３５（９８％）陽性（Ｅ＝１．８ｅ−１９３；鎖＝−／＋）；ヌクレオチド１３９８９１〜１３９９５８にわたって、１２９／１２９（１００％）同一および１２９／１２９（１００％）陽性（Ｅ＝１．８ｅ−１９３；鎖＝−／＋）；ならびにヌクレオチド２０９４２〜２１０３５にわたって、９４／９５（９８％）同一および９４／９５（９８％）陽性（Ｅ＝１．８ｅ−１９３；鎖＝−／＋）；を有した。さらに、１９５１１５ｂｐのＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ第１染色体クローンＲＰ１１−４０４０１３（ａｃｃ：ＡＬＩ１３８８９９．１０）に対するＮＯＶ１のＢＬＡＳＴによって、この第一染色体クローンのヌクレオチド９０５００〜９０５６４にわたって、６３／６５（９６％）同一および６３／６５（９６％）陽性（Ｅ＝０．００４７；鎖＝＋／＋）；ヌクレオチド１６４１４９〜１６５５６３にわたって、１４０８／１４１５（９９％）同一および１４０８／１４１５（９９％）陽性（Ｅ＝０．０；鎖＝−／＋）；ヌクレオチド１７４８９２〜１７５０５５にわたって、１６２／１６４（９８％）同一および１６２／１６４（９８％）陽性（Ｅ＝０．０；鎖＝−／＋）；ヌクレオチド１７２７２６〜１７２８７７にわたって、１５２／１５２（１００％）同一および１５２／１５２（１００％）陽性（Ｅ＝０．０；鎖＝−／＋）；ヌクレオチド１８３１９３〜１８３３６０にわたって、１５９／１６８（９４％）同一および１５９／１６８（９４％）陽性（Ｅ＝０．０；鎖＝−／＋）；ヌクレオチド１６６４４〜１６６５８２にわたって、１４０／１４０（１００％）同一および１４０／１４０（１００％）陽性（Ｅ＝０．０；鎖＝−／＋）；そしてヌクレオチド１７０５７６〜１７０７０４にわたって、１２９／１２９（１００％）同一および１２９／１２９（１００％）陽性（Ｅ＝０．０；鎖＝−／＋）；を有した。
【００７１】
ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、およびＰｒｉｎｔｓのようなアルゴリズムを用いた検索によって、次いで、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ番号をＩｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）を使用するドメイン適合（または数）に横線を引くことによってＮＯＶ１における同定可能なドメインの存在を決定した。
【００７２】
ＮＯＶ１についてのＤＯＭＡＩＮの結果を、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＢＬＡＳＴを用いて、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴサンプルドメインは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍの収集中に見出す。この結果を表１Ｋに列挙し、これには統計値およびドメインの説明を含む。これらの同定可能なドメインの存在を表１Ｌ−１Ｐに示す。表１Ｌ−１Ｐについて、そして全ての連続的ＤＯＭＡＩＮ配列アラインメントについて、完全保存された単一残基を黒い影によって示し、そして「強い」半保存残基を灰色の影によって示す。この保存されたアミノ酸残基の「強い」群は、以下のアミノ酸の群のいずれか１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【００７３】
【表１３】
2004501623.tif 000017
【００７４】
【表１４】
2004501623.tif 000018
【００７５】
ＮＯＶ１は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーのメンバーは、種々の機能を有するが、全てが細胞認識および細胞挙動の調節において役割を果たすようである。ＯＭＩＭエントリー３００１３７および１４７１００を参照のこと。ヒトＸ染色体のＹＡＣ／ＳＴＳマップを構築しながら、Ｍａｚｚａｒｅｌｌａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４８：１５７〜１６２（１９９８）（ＰｕｂＭｅｄ　ＩＤ：９５２１８６８）は、ヒトとハムスターのゲノム間で高度に保存された領域を同定した。ＰＣＲベースのアプローチを用いて、彼らは、この領域に対応するｃＤＮＡを奇形癌細胞株ライブラリーから単離した。このｃＤＮＡは、Ｃ２型（定常領域２型）の１２のＩｇ様ドメインを含んでいたために、「免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー１」（ＩＧＳＦ１）と名付けられた、推定１，３２７アミノ酸のタンパク質をコードした。さらに、ＩＧＳＦ１は、シグナル配列および潜在的な膜貫通ドメインを有する。ノーザンブロット分析によって、ＩＧＳＦ１が、試験した組織の多くで約４．７ｋｂのｍＲＮＡとして発現され、膵臓、精巣、および胎児肝臓で最高の発現であったことが示された。さらなる２．８ｋｂの転写物および５．５ｋｂの転写物を、それぞれ、心臓および精巣において観察した。独立して、Ｎａｇａｓｅら、ＤＮＡ　Ｒｅｓ．４：１４１〜１５０（１９９７）（ＰｕｂＭｅｄ　ＩＤ：９２０５８４１）は、ＩＧＳＦ１をコードするヒト脳ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　ＧＥＮＢＡＮＫ　ＡＢ００２３６２）を単離した。Ｍａｚｚａｒｅｌｌａら（１９９８）は、ＩＧＳＦ１遺伝子が、Ｘｑ２５においてＨＤＧＦの０．５ｍｂ近位に位置しており、そして動原体（セントロメア）からテロメアに転写されることを報告した。コンピューターマッピングアプローチを用いて、Ｆｒａｔｔｉｎｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　３８：８７〜９１（１９９６）（ＰｕｂＭｅｄ　ＩＤ：８９５４７８５））、Ｆｒａｔｔｉｎｉら（１９９８）は、Ｘｑ２５に対してＩＧＳＦ１遺伝子をマッピングした。Ｆｒａｔｔｉｎｉら、Ｇｅｎｅ　２１４：１〜６（１９９８）（ＰｕｂＭｅｄ　ＩＤ：９７２９１１８）を参照のこと。
【００７６】
さらに、Ｆｒａｔｔｉｎｉら（１９９８）は、免疫グロブリン様ドメイン含有分子スーパーファミリーのメンバーをコードするＩＧＤＣ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ　ＧＥＮＢＡＮＫ　Ｙ１０５２３）を同定した。１，３３６−アミノ酸のＩＧＤＣ１タンパク質は、それぞれ、５および７のモチーフ（この後ろにリンカーセグメントが続く）の２つのクラスター中の１２のＩｇ様ドメイン、ならびに膜貫通ドメインおよび細胞質領域を含む。このＩＧＤＣ１遺伝子は、哺乳動物において保存されており、そして筋肉、心臓、脳、精巣、および膵臓において、異なる長さの転写物として発現され、このことは、この遺伝子が選択的スプライシングに供されることを示唆する。このＩＧＤＣ１遺伝子は、約２０ｋｂにわたって分布した１９のエキソンを含み；各々のＩｇ様ドメインは、反復ゲノム複製の単位を単一または複数のいずれかによって構成する別個のエキソンによってコードされる。この遺伝子の機能は、未知であった。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞阻害性レセプターに対する相同性にかかわらず、Ｆｒａｔｔｉｎｉら（１９９８）は、精製したＮＫの細胞集団または細胞株におけるＩＧＤＣ１のいかなる発現も実証できなかった。この配列類似性は、魅力的であった。なぜなら、ＩＧＤＣ１遺伝子は、ＮＫ細胞機能における欠損を示す、Ｘｑ２５連結したリンパ球増殖性疾患（ＬＹＰ）の病因に関与している可能性があったからである。
【００７７】
ＩＧＤＣ１遺伝子は、ＬＹＰに関与する可能性がある遺伝子の同定を目的とするコンピューターに基づくアプローチ（Ｆｒａｔｔｉｎｉら、１９９６）によって最近同定された；しかしマッピングデータは、この遺伝子がこの障害に罹患している患者において記載された欠失におさまらないことを示唆した。しかし、この遺伝子がＸｑ２５にマッピングされた他の疾患（例えば、汎下垂体機能低下症、またはペティグリュー（Ｐｅｔｔｉｇｒｅｗ）症候群）の病因に関与し得るか否かを確立することが残っていた。
【００７８】
さらに、ＮＯＶ１は、融合に必須である筋芽細胞誘引物質である、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのｄｕｍｂｆｏｕｎｄｅｄタンパク質といくつかの同一性を共有する。管状筋細胞を形成するための筋芽細胞の凝集および融合は、多くの生物体における筋形成に必須である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて、合胞体の管状筋細胞の形成物を創始筋芽細胞として播種する。創始物は、融合にコンピテントな筋芽細胞のクラスターと融合する。ｄｕｍｂｆｏｕｎｄｅｄ（ｄｕｆ）遺伝子は、筋芽細胞の凝集および融合に必要である。Ｄｕｆは、融合コンピテントな筋芽細胞についての誘引物質であるタンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーをコードする。これは創始細胞によって発現され、そして融合によって管状筋細胞が形成する筋芽細胞のクラスターを誘引するように働く。Ｒｕｉｚ−Ｇｏｍｅｚら、Ｃｅｌｌ　１０２（２）：１８９〜９８（２０００）を参照のこと。
【００７９】
ＮＯＶ１ｂは、可能性として腫瘍形成（細胞遊走および侵入、ならびに転移能を含む）に関与する。モノクローナル抗体によるＮＯＶ１ｂの治療標的化は、好ましくは黒色腫における、腫瘍細胞遊走、侵入、および腫瘍転移の程度を制限またはブロックすることが予期される。
【００８０】
ＮＯＶ１の核酸およびタンパク質は、以下にさらに記載している種々の病理的障害に関与する潜在的な治療適用において有用である。例えば、ＮＯＶ１タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そして遺伝子治療の必要な被験体へ投与された場合、有用であり得る。
【００８１】
本発明の核酸およびタンパク質は、種々の疾患および障害の診断および／または処置において適用を有する。例えば、本発明の組成物は、種々の腫瘍および癌、ならびに他の疾患、障害および状態に罹患している患者の処置に有用性を有する。
【００８２】
このポリペプチドは、本発明に特定のタンパク質を生成するための免疫原として、およびワクチンとして用いられ得る。それらはまた、可能性のあるアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物をスクリーニングするために用いられ得る。例えば、ＮＯＶ１タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてレセプター様タンパク質は、遺伝子治療の必要な被験体へ投与された場合、有用であり得る。本発明の新規なＮＯＶ１核酸およびＮＯＶ１タンパク質、またはそのフラグメントはさらに、診断適用において有用であり得る。ここでこの核酸またはこのタンパク質の存在または量を評価する。これらの物質はさらに、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規な物質に対して免疫特異的に結合する抗体の生成において有用である。これらの抗体は、下記の「抗−ＮＯＶＸ抗体」の節に記載のように、疎水性チャートからの予測を用いて、当該分野で公知の方法によって生成され得る。例えば、開示されたＮＯＶ１ｂタンパク質は、複数の親水性領域を有し、その各々が免疫原として用いられ得る。
【００８３】
１実施形態において、意図されるＮＯＶ１ａエピトープは、およそアミノ酸１０〜１１０である。別の実施形態において、ＮＯＶ１ａエピトープは、およそアミノ酸１５０〜２００である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ１ａエピトープは、およそアミノ酸２２０〜２８０、２９０〜３２５、３５０〜４００、４２０〜４３９、４８０〜５１５、５５０〜５６０、６０５〜６５０、およびアミノ酸６６０〜８４１である。同様に、意図されるＮＯＶ１ｂエピトープは、およそアミノ酸２５〜６０である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ１ｂエピトープは、およそ６５〜１１０、１５０〜１９０、２４０〜２７５、および２８０〜３３４である。
【００８４】
この新規なタンパク質はまた、種々のヒト障害の機能的分析のための強力なアッセイシステムの開発において価値があり、これは疾患の病因の理解、および種々の障害の新しい薬物標的の開発において補助する。
【００８５】
ＮＯＶ１の発現データは実施例１に含まれる。
【００８６】
（ＮＯＶ２）
ＮＯＶ２は、新規なＬＤＬレセプター様タンパク質、およびこれをコードする核酸である。
【００８７】
新規なＬＤＬレセプター様タンパク質をコードする３２６４のヌクレオチドの新規な核酸（２１４２４３４４．９．６、配列番号５）を、表２Ａに示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ヌクレオチド５４４〜５４６のＡＴＧ開始コドンで開始し、そしてヌクレオチド２６８３〜２６８５のＴＧＡコドンで終わることが同定された。表２Ａにおいて、開始コドンおよび終止コドンを太文字にしている。
【００８８】
【表１５】
2004501623.tif 000019
【００８９】
配列番号５によってコードされる開示されたＮＯＶ２ポリペプチド（配列番号６）は、７１３アミノ酸残基であり、そして表２Ｂにおける１文字コードを用いて示される。シグナルペプチド予想および細胞局在について、開示されたＮＯＶ２タンパク質の最初の７０アミノ酸を分析した。シグナルＰの結果によって、ＮＯＶ２が配列番号６の１６位置と１７位置の間（すなわち、アミノ酸配列ＡＬＡ−ＨＰにおけるスラッシュ）で切断されることが予想される。Ｐｓｏｒｔおよびヒドロパシー（疎水性親水性指標）のプロフィールによって、またＮＯＶ２がシグナルペプチドを含むこと、そして原形質膜に局在するらしいこと（０．４６００の確実性）が予測される。
【００９０】
【表１６】
2004501623.tif 000020
【００９１】
ＮＯＶ２はもともと、膵臓および甲状腺の組織（これはまたＮＯＶ２の同定可能なＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭフラグメントを発現するためにも用いられる）からクローニングされた。
【００９２】
特許および特許刊行物に公開された配列を含む独自のライブラリーである、Ｐａｔｐデータベースに対する検索によって、いくつかの相同性タンパク質が得られた。ＮＯＶ２の全長アミノ酸配列は、ＰＣＴ特許ＷＯ２０００２６２２７−Ａ１．配列番号４４に見られるように、ＬＤＬレセプター関連タンパク質である７１３アミノ酸残基のヒトＴＡＮＧＯ１３６タンパク質と、７１３アミノ酸残基のうち７１０（９９％）同一、そして７１３残基のうち７１０（９９％）陽性であることが見出された（Ｅ＝０．０）。表２Ｃは、これらの２つのタンパク質のアラインメントを示す。
【００９３】
【表１７】
2004501623.tif 000021
【００９４】
さらに、ＮＯＶ２タンパク質はまた、ＰＣＴ特許ＷＯ２０００２６２２７−Ａ１に見られるように、マウスＴＡＮＧＯ　１３６部分タンパク質に対してかなりの相同性を示す。ＮＯＶ２タンパク質はまた、ＰＣＴ特許ＷＯ９９４１３７５−Ａ２にみられるように、ヒトレセプタータンパク質（Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＨＵＲＰ）７に対してかなりの相同性を有する。さらに、ＮＯＶ２は、ＰＣＴ特許ＷＯ２０００５５１７３−Ａ１に見られるように、ヒトの乳癌および卵巣癌関連抗原タンパク質（Ｂｒｅａｓｔ　ａｎｄ　Ｏｖａｒｉａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して十分な相同性を有する。結局、ＮＯＶ２は、それぞれ、ＷＯ９９４６２８１−Ａ２、ＷＯ２０００５３７５６−Ａ２、およびＷＯ２０００５８４７３にみられるように、３つの理論的ヒトタンパク質：ＰＲＯ７２４、ＰＲＯ７２４（ＵＮＱ３８９）、およびＯＲＦＸＯＲＦ２０１０に対して類似している。
【００９５】
【表１８】
2004501623.tif 000022
【００９６】
公のデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索は、開示されたＮＯＶ２タンパク質（配列番号６）が、表２Ｅにおいて示されるように、ＬＤＬレセプター関連タンパク質のファミリーおよび潜在的な腫瘍サプレッサーと有意な相同性を有することを明らかにした。ＮＯＶ２は、ヒトＬＤＬレセプター関連タンパク質１０５（ＡＣＣ：０７５０７４、Ｅ値＝９．３ｅ−１２３）と、５１０残基のうち２４６残基（４８％）が同一であり、そして５１０残基のうち２９７残基（５８％）がポジティブであることが見出された。さらに、ＮＯＶ２は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の仮定のタンパク質ＤＫＦＺｐ５６４Ｃ１９４０．１（ＰＩＲ−ＩＤ：Ｔ１２４６９、Ｅ値＝７．５ｅ−１６２）と２９６残基のうち２９３残基（９８％）同一であり、そして２９６残基のうち２９３残基（９８％）がポジティブであることが見出された。
【００９７】
【表１９】
2004501623.tif 000023
【００９８】
この情報は、ＮＯＶ２を関連したタンパク質配列と比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析として表２Ｆ（ＮＯＶ２が１行目に示される）において与えられる多重配列整列において図によって示される。
【００９９】
【表２０】
2004501623.tif 000024
2004501623.tif 000025
2004501623.tif 000026
【０１００】
ＮＯＶ２についてのＤＯＭＡＩＮ結果は、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＢＬＡＳＴを用いるＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍｅｉｎ　Ｄａｔａｂｅｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴは、Ｓｍａｒｔ収集およびＰｌａｍ収集において見出したドメインをサンプリングする。ＮＯＶ２タンパク質は、Ｓｍａｒｔ００１９２（ＬＤＬａ、低密度リポタンパク質レセプタードメインクラスＡ、Ｅ＝４ｅ−０９）、Ｐｆａｍ　０００５７（ｌｄｌ　ｒｅｃｅｐｔ　ａ、低密度リポタンパク質レセプタータンパク質クラスＡ、Ｅ＝４ｅ−９）、Ｓｍａｒｔ０００４２（ＣＵＢ、ＣＵＢドメイン、Ｅ＝５ｅ−０８）およびＰｆａｍ００４３１（ＣＵＢ、ＣＵＢドメイン、Ｅ＝５ｅ−０６）と有意な整列を示した。表２Ｇは、ドメイン分析の結果を示す。
【０１０１】
【表２１】
2004501623.tif 000027
【０１０２】
ＮＯＶ２は、２つのＬＤＬレセプターファミリードメインクラスＡ様ドメインを有する。ＬＤＬレセプターファミリードメインクラスＡは、哺乳動物コレステロール機構において中心的な役割を果たすＬＤＬレセプター中のシステインリッチ反復である。このドメインの反復は、リガンド結合に関与すると考えられている（Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９８４）Ｃｅｌｌ　３９：２７−３８；およびＦａｓｓら、（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８８：６９１−６９３）。表２Ｈおよび表２Ｉは、ＮＯＶ２の２つのＬＤＬレセプタークラスＡドメインの各々と、ＬＤＬレセプタークラスＡドメインコンセンサス配列（配列番号５０）との整列を示す。
【０１０３】
【表２２】
2004501623.tif 000028
【０１０４】
【表２３】
2004501623.tif 000029
【０１０５】
ＮＯＶ２は、２つのＣＵＢ様ドメイン（アミノ酸３４〜８８およびアミノ酸１９２〜２４６）を有する。ＣＵＢドメインは、機能的に多様な最も発生的に制御されたタンパク質において見出される約１１０残基の細胞外ドメインである。（ＰＲＯＳＩＴＥ：ＰＤＯＣ００９０８を参照のこと。）例えば、精子付着因子（ｓｐｅｒｍａｄｈｅｓｉｎ）は、このドメインのみを含む。ＮＯＶ２のアミノ酸４〜６３は、１１４残基のＣＵＢドメインのアミノ酸１９２〜２４６と整列する。表２Ｊおよび表２Ｋは、ＮＯＶ２ドメインの２つのＣＵＢ様ドメインの各々と、ＣＵＢドメインコンセンサス配列（配列番号５３）との整列を示す。
【０１０６】
【表２４】
2004501623.tif 000030
【０１０７】
【表２５】
2004501623.tif 000031
【０１０８】
低密度リポタンパク質レセプターファミリードメインクラスＡおよびＣＵＢドメインに対する類似性は、ＮＯＶ２配列が、これらのドメインを含むことが公知である他のタンパク質の特性と類似した特性を有することを示す。
【０１０９】
ＮＯＶ２は、ヒトＬＤＬレセプター関連タンパク質３（ＬＲＰ−３）、マウスＬＤＬレセプター関連タンパク質１０、ラットＬＤＬレセプター関連タンパク質、およびヒトＴＡＮＧＯ　１３６タンパク質を含む、異なる生物由来の複数のＬＤＬレセプター関連タンパク質と広範な相同性を有する。従って、ＮＯＶ２は、ＬＤＬＲ、ＬＲＰ−２、ＬＲＰ−３、ＬＲＰ−５、ＬＲＰ−６、およびＬＲ８Ｂを含む、ＬＤＬレセプターファミリーの新規のメンバーである。このファミリーのメンバーは、循環および細胞外空間由来のリガンドを結合しそして内部移行させるエンドサイトーシスレセプターである。従って、ＮＯＶ２は、これが、低密度リポタンパク質レセプターファミリーの他のメンバーと類似して機能する点で、有用性を有する。
【０１１０】
ＬＤＬレセプターは、それらの表面上にアポリポタンパク質Ｂ−１００（アポＢ−１００）またはアポＥを含む血漿リポタンパク質を結合する。ＬＤＬレセプターは、これらのリポタンパク質の取り込みに重要であり、そしてＬＤＬレセプター中の変異は、家族性高コレステロール血症（血漿中の高いレベルのコレステロールリッチＬＤＬによって特徴付けられる障害）の原因である。家族性高コレステロール血症に罹患する患者における血漿コレステロールレベルの上昇は、アテローム硬化症および心筋梗塞についての増加した危険性を生じる。ＮＯＶ２は、潜在的に、リポタンパク質の代謝および輸送の障害（例えば、アテローム硬化症のような心血管疾患）において役割を果たす。従って、ＮＯＶ２核酸、ＮＯＶ２タンパク質ならびにＮＯＶ２アンタゴニストおよびＮＯＶ２アゴニストは、リポタンパク質の代謝および輸送の障害（例えば、アテローム硬化症のような心血管疾患）の処置に有用である。例えば、ＮＯＶ２タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＮＯＶ２タンパク質は、それが必要な患者に投与される場合に有用であり得る。
【０１１１】
インビトロ研究によって、ＬＲＰ−２が、アポＥを濃縮した非常に低密度のリポタンパク質（Ｗｉｌｌｎｏｗら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２６１７２−２６１８０）、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子およびプラスミノゲン活性化因子インヒビター−１（ｔＰＡ：ＰＡＩ−１）の複合体（Ｗｉｌｌｎｏｗら、前出）、リポタンパク質リパーゼ（Ｗｉｌｌｎｏｗら、前出）、およびラクトフェリンを含む多数の異なるリガンドを結合し得、そしてこれらの細胞内取り込みを媒介し得ることが示された。ＲＡＰ（Ｏｒｌａｎｄｏら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：６６９８−６７０２）として公知のレセプター関連タンパク質は、これらのリガンドのＬＲＰ−２への結合を阻害する。これらのリガンドの全てまたはいくつかは、ＮＯＶ２に結合し得る。従って、ＮＯＶ２核酸、ポリペプチド、アンタゴニストおよびアゴニストは、凝固障害の処置（例えば、凝固形成を阻害するかまたは凝固を溶解する）のために有用である。
【０１１２】
アポリポタンパク質Ｊ（ａｐｏＪ）／クラステリン（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）（Ｋｏｕｎｎａｓら、（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２：１３０７０−１３０７５）およびサイログロブリン（Ｚｈｅｎｇら、（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３９：１４６２−１４６５）を含む、ＬＲＰ−２についての小数の特異的かつ生理学的に関連したリガンドが同定された。ａｐｏＪは、アルツハイマー病の前駆タンパク質のβＡ４ペプチド（サブクラスの高密度リポタンパク質）および補体膜攻撃複合体Ｃ５〜Ｃ９（Ｋｏｕｎｎａｓら、前出）を含む、いくつかのタンパク質に結合することが報告されている。これらおよび他の分子と複合体化したａｐｏＪのクリアランスは、ＬＲＰ−２を介して生じると予想されている。従って、ＬＲＰ−２は、これらの複合体のクリアランスにおいて重要な機能的役割を果たし得る。例えば、ＬＲＰ−２は、クリアランスのためにリポタンパク質を標的するように機能し得るか、またはａｐｏＪ／Ｃ５ｂ−Ｃ９複合体をクリアランスすることによって補体膜Ｃ５ｂ−Ｃ９の細胞溶解性活性の阻害し得る。ＬＲＰ−２は、ａｐｏＪ／アミロイド−β複合体を結合し得るという事実によって、アルツハイマー病の病原性を調節することに関与し得ることが示される。アルツハイマー病におけるＬＲＰ−２の役割は、ＬＲＰ−２が血液−脳−関門を横切ってａｐｏＪ／アミロイドβ複合体を輸送することに関与し得る（Ｚｌｏｋｏｖｉｃら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：４２２９０４２３４）ことを示した別の研究によってさらに支持される。従って、ＮＯＶ２核酸、タンパク質、アゴニストおよびアンタゴニストは、アルツハイマー病および他の神経変性障害（例えば、ハンチントン病およびパーキンソン病）の処置のために有用である。
【０１１３】
ＬＲＰ−２は、甲状腺ホルモンの放出を生じるサイログロブリンのエンドサイトーシスに関係することに関与する（Ｚｈｅｎｇら、（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３９：１４６２−６５）。ＮＯＶ２はまた、甲状腺ホルモンの放出を制御することに関与する。従って、ＮＯＶ２核酸、タンパク質、アゴニスト、およびアンタゴニストは、甲状腺障害（例えば、甲状腺ホルモン放出障害）の処置において有用である。
【０１１４】
ＬＲＰ−２はまた、薬物レセプターとして役割を果たし、そして多塩基薬物（例えば、アプロチニン、アミノグリコシドおよびポリミキシンＢ）の取り込みに関与すると考えられている。多塩基薬物の取り込みは、毒性である（例えば、アミノグリコシドの投与は、しばしば、腎毒性および聴器毒性に関連している）。ＮＯＶ２はまた、多塩基薬物の取り込みを媒介し得、そしてＮＯＶ２核酸、タンパク質、アゴニストおよびタンパク質は、このような薬物の取り込みを調節するために有用である。ＮＯＶ２はまた、このような薬物のより毒性でないバージョンを設計するために使用され得る。
【０１１５】
さらに、ＬＲＰ−２は、ヒト膜性腎症に類似したＨｅｙｍａｎｎ腎炎腎症（ＨＮ）（自己免疫糸球体疾患）の病原性に関与している。ＬＲＰ−２は、主要な病原性抗原であり、そして糸球体基底膜と糸球体の上皮細胞の足突起との間に抗原−抗体複合体を形成すると考えられている。抗原−抗体複合体の存在は、基底膜およびタンパク尿の広範な損傷を生じる（Ｆａｒｑｕｈａｒら、（１９９４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７−１０６）。ＬＲＰ−２と同様に、ＮＯＶ２は、自己免疫糸球体疾患において病原性の役割を果たし得る。従って、ＮＯＶ２核酸、タンパク質、アゴニストおよびアンタゴニストは、自己免疫糸球体疾患の処置のために有用である。
【０１１６】
ＬＲＰ−５およびＬＲＰ−６は、エンドサイトーシスにおいて機能すると考えられている。遺伝的証拠に基づいて、ＬＲＰ−５およびおそらくＬＲＰ−６は、Ｉ型糖尿病の分子病原性において役割を果たすと考えられている（Ｂｒｏｗｎら、（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４８：８７９−８８８）。ＮＯＶ２はまた、Ｉ型糖尿病において役割を果たすようである。従って、ＮＯＶ２核酸、タンパク質、アゴニストおよびアンタゴニストは、Ｉ型糖尿病の処置のために有用である。
【０１１７】
ＬＲ８Ｂは、脳において発現され、そして脳特異的脂質輸送に関与し得る。脳特異的脂質輸送は、ａｐｏＥ４（これは、アルツハイマー病に関連している）に関与し得る。ＮＯＶ２はまた、脳特異的脂質輸送に関与し得、そしてＮＯＶ２核酸、タンパク質、アゴニストおよびアンタゴニストは、アルツハイマー病の処置のために有用である。
【０１１８】
一般に、本発明のＮＯＶ２組成物は、神経学的障害（例えば、神経変性障害および神経精神医学的障害）の処置に効力を有する。神経変性障害の例としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病が挙げられる。神経精神医学的障害としては、精神分裂病、注意欠陥障害、単極性情動（気分）障害（ｕｎｉｐｏｌａｒ　ａｆｆｅｃｔｉｖｅ（ｍｏｏｄ）ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、双極性情動（気分）障害（ｂｉｐｏｌａｒ　ａｆｆｅｃｔｉｖｅ（ｍｏｏｄ）ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（例えば、重篤な双極性情動障害（ＢＰ−Ｉ）ならびに軽躁病および主要なうつ病を有する双極性情動障害（ＢＰ−ＩＩ））、および分裂感情性障害が挙げられる。他のＬＤＬレセプター関連の疾患および障害が、意図される。
【０１１９】
ＬＤＬレセプター関連タンパク質に対する相同性に加えて、ＮＯＶ２タンパク質はまた、（Ｐａｔｐ結果より）乳癌および卵巣癌関連抗原タンパク質に対して、そして（Ｂｌａｓｔ結果より）潜在的なヒト腫瘍サプレッサータンパク質に対して広範な相同性を有する。従って、本発明のＮＯＶ２組成物は、癌、特に乳癌および卵巣癌の処置に効力を有する。
【０１２０】
本発明のＮＯＶ２をコードする新規の核酸、およびＮＯＶ２タンパク質、またはそれらのフラグメントは、診断適用においてさらに有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される。これらの物質は、治療方法または診断方法、ならびに他の疾患、障害および状態などにおける使用のための本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の産生においてさらに有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節において記載されるように、疎水性チャートからの推定を使用して、当業者に公知の方法に従って産生され得る。
【０１２１】
例えば、開示されたＮＯＶ２タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、その各々が免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、意図されたＮＯＶ２エピトープは、およそアミノ酸３１０〜３６０に由来する。別の実施形態において、ＮＯＶ２エピトープは、およそアミノ酸３８０〜４３０に由来する。さらなる実施形態において、ＮＯＶ２エピトープは、およそアミノ酸５２０〜６００に由来する。さらなる実施形態において、ＮＯＶ２エピトープは、およそアミノ酸６００〜６２５に由来する。これらの新規のタンパク質は、機能的分析のためのアッセイ系を開発するために使用され得る。
【０１２２】
（ＮＯＶ３）
ＮＯＶ３は、新規な小さい誘導性サイトカインファミリータンパク質であり、そしてこれをコードする核酸である。
【０１２３】
小さい誘導性サイトカイン様タンパク質をコードする１２６５ヌクレオチドの新規の核酸（Ｂ８０１７３．９．３２、配列番号７）を、表３Ａに示す。ヌクレオチド６１〜６３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド５４４〜５４６のＴＧＡコドンで終わるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、同定された。表３Ａにおいて、開始コドンおよび終止コドンを、太字で示す。
【０１２４】
【表２６】
2004501623.tif 000032
2004501623.tif 000033
【０１２５】
配列番号７によってコードされた開示されたＮＯＶ３ポリペプチド（配列番号８）は、１６１アミノ酸残基であり、そして表３Ｂに１文字コードを使用して示される。開示されたＮＯＶ３タンパク質の最初の７０アミノ酸を、シグナルペプチドの推定および細胞内局在について分析した。ＳｉｇｎａｌＰ結果は、ＮＯＶ３が配列番号８の３４位と３５位との間で（すなわち、アミノ酸配列ＡＡＧ−ＡＳ中のスラッシュにおいて）切断されることを推定する。Ｐｓｏｒｔおよびヒドロパシープロフィールはまた、ＮＯＶ３がシグナルペプチドを含み、そしてミトコンドリア内膜において局在するようであることを推定する（０．７１８２の確実性）。疎水性プロットに基づいて、およそ８〜４０およびおよそ９５〜１１８のＮＯＶ３残基は、膜貫通ドメインであることが推定される。およそ４５〜およそ７５、およそ８３〜およそ９８、およびおよそ１１８〜およそ１４８の残基は、３つの親水性領域を有すると推定される。
【０１２６】
【表２７】
2004501623.tif 000034
【０１２７】
ヒト組織は、ＮＨＦＬＳ、ＨＣＮおよびＨＦＬＳＲＡを含む、ＮＶＯ３の同定可能なＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭフラグメントを発現する。
【０１２８】
ＢＬＡＳＴ検索を、公のタンパク質データベースに対して行なった。本発明の全長タンパク質は、ＧＲＯ１／Ｇｒｏ．α、ＧＲＯ２／Ｇｒｏ．βおよびＧＲＯ３／Ｇｒｏ．γを含むＧＲＯファミリータンパク質と広範な相同性を有することが見出された。ＧＲＯタンパク質は、関連した小さい誘導性サイトカインのスーパーファミリーに属する（ＯＭＩＭ　１５５７３０、１３９１１０および１３９１１１）。例えば、ＮＯＶ３は、１０７アミノ酸残基のヒトＧＲＯ１タンパク質（Ｇｉ｜４５０４１５３｜ｒｅｆ｜ＮＰ　００１５０２．１｜）に対して、１６１残基のうち７９残基（４９％）が同一であり、そして８２／１６１残基（５０％）がポジティブである（Ｅ値＝２ｅ−２３）。ＧＲＯ１はまた、Ｇｒｏ．α、黒色腫増殖刺激活性（ＭＧＳＡ）および好中球活性化タンパク質３（ＮＡＰ−３）として公知である。ＢＬＡＳＴ検索の結果を、表３Ｃに要約する。
【０１２９】
【表２８】
2004501623.tif 000035
【０１３０】
この情報は、ＮＯＶ３を関連したタンパク質配列と比較するＣｌｕｕｓｔａｌＷとして、表３Ｄ（ＮＯＶ３が１行目に示される）において与えられる多重配列整列において表によって示される。興味深いことに、ＣｌｕｓｔａｌＷ整列は、ＮＯＶ３と関連タンパク質との間の相同性が、ＢＬＡＳＴ結果において列挙された相同性の数字（種々のタンパク質について約５０％）よりもより広範であることを明らかにする。ＮＯＶ３タンパク質の７４アミノ酸のＮ末端ストレッチおよび３１アミノ酸のＣ末端ストレッチは、ＮＯＶ３と他の関連タンパク質との間に伸長する２つのおおよそ安定した同一性ブロックによって表によって示されるように、他の関連タンパク質と高レベルの相同性を有する。例えば、Ｎ末端ストレッチにわたって、ＮＯＶ３は、ヒトＧＲＯ１オンコジーンと同一な７４残基のうち７３残基（９９％）、ヒトＧＲＯ２タンパク質と同一な７４残基のうち６８残基（９２％）、ヒトＧＲＯ３タンパク質と同一な７４残基のうち６８残基（９２％）を有する。Ｃ末端ストレッチにわたって、ＮＯＶ３は、ヒトＧＲＯ１オンコジーンと同一な３０残基のうち２９残基（９７％）、ヒトＧＲＯ２タンパク質と同一な３０残基のうち２４残基（８０％）、ヒトＧＲＯ３タンパク質と同一な３０残基のうち２２残基（７３％）を有する。
【０１３１】
【表２９】
2004501623.tif 000036
2004501623.tif 000037
【０１３２】
ＮＯＶ３についてのＤＯＭＡＩＮ結果は、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＢＬＡＳＴを用いるＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍｅｉｎ　Ｄａｔａｂｅｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴは、Ｓｍａｒｔ収集およびＰｆａｍ収集において見出したサンプルドメインをサンプリングする。ＮＯＶ３タンパク質を、両方の収集における多数の関連ドメインと整列した。表３Ｅは、ドメイン分析の結果を示す。
【０１３３】
【表３０】
2004501623.tif 000038
【０１３４】
ＮＯＶ３は、２つのＩＬ−８様ドメイン（アミノ酸３６〜８８およびアミノ酸１３２〜１５４）。表３Ｆは、ＮＯＶ３のＩＬ８コンセンサス配列（配列番号６１）とのＩＬ８様ドメインの整列を示す。
【０１３５】
ＮＯＶ３はまた、ＳＣＹ様ドメイン（アミノ酸１３２〜１５４）である。ＳＣＹドメインは、ｉｎｔｅｒｃｒｉｎｅαファミリー（細胞特異的走化性、細胞増殖、および炎症応答に関与するサイトカインのファミリー）において見出される。表３Ｇは、ＮＯＶ２のＳＣＹ様ドメインとＳＣＹドメインコンセンサス配列（配列番号６２）との整列を示す。
【０１３６】
【表３１】
2004501623.tif 000039
【０１３７】
ＢＬＡＳＴ結果によって示されるように、ＮＯＶ３タンパク質は、ＧＲＯ１／Ｇｒｏ．α、ＧＲＯ２／Ｇｒｏ．βおよびＧＲＯ３／Ｇｒｏ．γを含むＧＲＯタンパク質との良好な相同性を示す。ＮＡＰ−１／ＩＬ−８（以下ＩＬ−８／ＧＲＯ遺伝子ファミリー）（Ｍａｔｕｓｕｓｈｉｍａ，Ｋ．ら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７：１８８３−１８９３；Ｓｃｈｍｉｄ．Ｊ．ら、１９８７、Ｊ．ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：２５０−２５６；Ｐｅｖｅｒｕ，Ｐ．ら、１９８８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７：１５４７−１５５９）を含む関連した小さい誘導性サイトカイン、および血漿塩基性タンパク質（ＰＢＰ）のセットをコードする遺伝子スーパーファミリーに属する。ＰＢＰは、接合性組織活性化タンパク質ＩＩＩ（ＣＴＡＰＩＩＩ）、β−トロンボグロブリン（Ｃａｓｔｏｒ，Ｃ．Ｗ．ら、１９８３、Ｐｒｏｃ．７４：２２５６−２２５８）、血小板因子４（ＰＦ４）（Ｄｅｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．ら、１９７７，Ｐｒｏ．Ｎａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：２２５６−２２５８）、γ−インターフェロン誘導性ペプチド（γＩＰ−１０）（Ｌｕｓｔｅｒ，Ａ．Ｄ．ら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３１５：６７２−６７６）、およびマクロファージ炎症タンパク質２（ＭＩＰ−２）（Ｗｏｌｐｅ，Ｓ．Ｄ．ら、１９８９、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８６：６１２−６１６）の前駆体である。
【０１３８】
ＧＲＯ１は、自発的形質転換されたチャイニーズハムスター線維芽細胞におけるその構成的過剰発現によって最初に同定された（Ａｎｉｓｏｗｉｃｚ，Ａ．ら、１９８７、ＰＮＡＳ，８４：７１８８−７１９２）。関連した遺伝子が、ｖ−ｓｒｃ形質転換ニワトリ細胞において同定された（Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．ら、１９８７、Ｃｅｌｌ，４９：３２１−３２８；Ｂｅｄａｒｄ，Ｐ．Ａ．ら、１９８７、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８４：６７１５−６７１９）。正常な線維芽細胞を用いる発現研究において、Ｇｒｏは、ｃ−ｆｏｓと類似した初期応答速度論を示し、名称Ｇｒｏ（増殖が調節された（ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ））を導いた（Ａｎｉｓｏｗｉｃｚら、１９８７、前出）。その後、黒色腫刺激活性（ＭＧＳＡ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａ．ら、前出）を有するタンパク質は、ＧＲＯ１によってコードされることが示され、そしてマウス初期応答遺伝子ＫＣとの配列同一性が報告された（Ｏｑｕｅｎｄｏ，Ｐ．ら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：４１３３−４１３７）。
【０１３９】
予備的な研究は、Ｇｒｏ　ａｘ遺伝子が、潰瘍活性大腸炎疾患において発現されるが、不活性組織においては発現されないことを示した（Ｉｓａａｃｓ，Ｋ．ら，「Ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｂｏｗｅｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ：ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃ．＆　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｓｓｏｃ．ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｙ　１３−１６，１９９０，Ｔｅｘａｓ（Ａｂｓｔｒａｃｔ））。他方で、Ｇｒｏα遺伝子の発現における不一致は、クローン病由来の不活性組織と対比して、活性組織の場合に低かった。Ｇｒｏα遺伝子の、活動性腸疾患における発現は、これらのサイトカインの、炎症性腸疾患の病理における役割を示唆する。さらに、ＧＲＯ遺伝子は、それらの正常な対応物と比較して、種々の腫瘍細胞において差示的な発現パターンを示す。例えば、Ｇｒｏγは、結腸上皮腫瘍細胞において見出されたが、隣接する正常な上皮細胞においては見出されなかった。Ｇｒｏαが、ＣＨＥＦ／１６細胞、ｓｒｃで形質転換したニワトリ線維芽細胞、およびヒト黒色腫のような、他の腫瘍細胞株において過剰発現されることもまた、観察された。米国特許第５，９９４，０６０号の実施例１を参照のこと。他方で、Ｇｒｏαは、正常な増殖中の乳房細胞において発現されるが、多くの癌腫においては存在しないこともまた、観察された（Ａｎｉｓｏｗｉｃｚ，Ａ．ら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（前出））。従って、問題の細胞型および腫瘍型に依存して、腫瘍の処置レジメンは、細胞にアクセス可能なＧｒｏβまたはＧｒｏγの量を変化させることを包含する。このことは、腫瘍形成がＧＲＯ遺伝子の過剰発現に起因するか過少発現に起因するかに依存して、細胞に対して利用可能なＧＲＯタンパク質の量を増加または減少させることによって、達成され得る。
【０１４０】
ＮＯＶ３タンパク質および本明細書中に開示される核酸に関する類似性情報は、ＮＯＶ３が、ＩＬ８／ＧＲＯタンパク質ファミリーの新規メンバーであることを示唆する。ＮＯＶ３が２つのＩＬ−８様ドメインを含むというドメイン分析の結果は、さらに、ＮＯＶ３がＩＬ８／ＧＲＯタンパク質ファミリーの新規メンバーであることを実証する。その結果、ＮＯＶ３核酸、タンパク質、アゴニストおよびアンタゴニストは、ＩＬ−８／Ｇｒｏファミリー遺伝子が関与する種々の疾患および障害、ならびに／または他の関連する病理において、潜在的な診断用途および治療用途を有し得る。これらとしては、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、および種々の型の癌（特に、結腸癌）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＮＯＶ３タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そしてＮＯＶ３タンパク質は、その必要のある被験体に投与される場合に、有用であり得る。
【０１４１】
さらに、ＩＬ８／ＧＲＯファミリーのタンパク質のいくつかのメンバーは、好中球活性化機能を有することが示された。ＩＬ−８は、強い好中球活性化機能を有すると最初に同定されたものである。Ｗａｌｚ，Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．１４９：７５５（１９８７）、Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３４７４（１９８７）、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：９２３３（１９８７）およびＢａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１０４５（１９８９）。引き続いて、このファミリーの２つの他のタンパク質である、好中球活性化ペプチド２（ＮＡＰ−２）およびＧｒｏαは、ヒト好中級に対して類似の生物学的活性を有することが実証された。Ｗａｌｚ，Ａ．およびＭ．Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９：９６９（１９８９）、Ｗａｌｚ，Ａ．およびＭ．Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：４４９（１９９０）、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａ．ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．７：２０２５（１９８８）、Ｍｏｓｅｒ，Ｂ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１７９７（１９９０）ならびにＳｃｈｒｏｄｅｒ，Ｊ．−Ｍ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１０９１（１９９０）。
【０１４２】
ＮＯＶ３タンパク質とＧＲＯタンパク質との広範な配列類似性に起因して、ＮＯＶ３はまた、好中球活性化の機能を有するようである。従って、ＮＯＶ３の核酸およびタンパク質は、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における種々の好中球欠損の病理学的状態において意図される治療適用において、有用である。より具体的には、ＮＯＶ３は、他の好中球活性化タンパク質と同様に、ＰＭＮ（多型核細胞−好中球）の数または活性化状態の改変によって、局所的にかまたは全身的に、付随されるかまたは引き起こされる状態の処置において、有用である。ＰＭＮの活性化状態の数の増加または増強は、細菌、マイコプラスマ、酵母、真菌、および種々のウイルス感染において、臨床的改善をもたらす。
【０１４３】
非限定的な例によって、ＮＯＶ３核酸およびポリペプチドは、異常に高いかまたは異常に低い好中球計数、および／または全身性の高い／低い好中球レベルを伴う種々の疾患を罹患する患者の処置のための効力を有する。これらの疾患としては、例えば、炎症性疾病、化学療法または放射線治療から生じる造血の欠乏、および上記状態から誘導されて生じる障害が挙げられる。ＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３ポリペプチドはまた、骨髄移植および損傷治癒の焼灼処置の成功を強化する際に有用である。好中球の活性化および障害が関与する他の疾患および障害が、考慮される。
【０１４４】
一般に、ＮＯＶ３核酸およびＮＯＶ３タンパク質は、潜在的な診断適用および治療適用において、ならびに研究ツールとして、有用である。これらとしては、特異的かまたは選択的な、核酸またはタンパク質の、診断および／または予後マーカーとして働くこと（ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）、ならびに以下のような潜在的な治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御武器。これらのポリペプチドはまた、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫原として、およびワクチンとして、使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするために、使用され得る。
【０１４５】
ＮＯＶ３タンパク質をコードする新規核酸、およびそのフラグメントは、さらに、この核酸またはタンパク質の存在または量が評価される、診断適用において有用であり得る。これらの物質は、さらに、治療方法または診断方法において使用するための、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において、有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの推定を使用して、当該分野において公知の方法に従って、生成され得る。例えば、上記のように、開示されるＮＯＶ３タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの領域の各々は、免疫原として使用され得る。新規ＮＯＶ３タンパク質は、種々のヒト障害の機能的分析のためのアッセイ系において使用され得、これは、疾患の病理の理解において、そして種々の障害に対する新規薬物標的の開発において、助けとなる。
【０１４６】
（ＮＯＶ４）
本発明によるＮＯＶ４配列（８３６１４９８４．０．５、配列番号９）は、細胞周期および増殖タンパク質に関連するタンパク質（「ＣＣＹＰＲ」）をコードする６４２ヌクレオチドの核酸配列を含む。表４Ａは、ＮＯＶ４のヌクレオチド配列を示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２０７〜２０９のＡＴＧ開始コドンにおいて開始し、そしてヌクレオチド５３９〜５４１のＴＡＡ終止コドンにおいて終止すると同定された。これらの開始コドンおよび終止コドンは太字である。別の実施形態において、ＮＯＶ４核酸配列は、ヌクレオチド５９４におけるＴヌクレオチドの欠失、および３’末端におけるＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣの追加の配列（配列番号６４）を含む。
【０１４７】
【表３２】
2004501623.tif 000040
【０１４８】
１１１のアミノ酸残基を有する、コードされるタンパク質を、表４Ｂに１文字コードを使用して提示する（配列番号１０）。ＮＯＶ４に対するＰｓｏｒｔプロフィールによって、この配列が、０．４７７６の確実性で、ミトコンドリアマトリックス空間に局在するようであることが予測される。Ｐｓｏｒｔプロフィールによって、ＮＯＶ４が、Ｎ末端シグナル配列を有さないようであることが示唆される。ヒドロパシープロットに基づくと、ＮＯＶ４は、膜貫通ドメインを含まない。
【０１４９】
【表３３】
2004501623.tif 000041
【０１５０】
ＮＯＶ４は、最初、脳、胎児脳、妊娠子宮および胎盤のＪＡＲ細胞からクローニングされた。さらなるヒト組織が、同定可能なＮＯＶ４のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭフラグメントを発現する。これらの組織としては、プールされた副腎、胎盤、プールされた子宮、ＢｅＷｏプールおよび脳が挙げられる。
【０１５１】
Ｐａｔｐデータベース（これは、特許および特許公開公報において公開された配列を含む、占有（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）データベースである）の検索において、ＮＯＶ４は、１１１のアミノ酸残基のうちの１１１（１００％）が、１１１アミノ酸残基のタンパク質であるＣＣＹＰＲ−４８（ヒト細胞周期および増殖タンパク質）（Ｐａｔｐ：ＡＡＢ６０５００）と同一であると同定された（Ｅ値＝０）。表４Ｃは、ＮＯＶ４とＣＣＹＰＲ−４８との間の配列アライメントを示す。
【０１５２】
【表３４】
2004501623.tif 000042
【０１５３】
公共のデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索によれば、開示されるＮＯＶ４タンパク質（配列番号１４）は、１１１の残基のうちの１１１（１００％）が、命名されていないヒトタンパク質（Ｇｉ｜１４３２８０３２｜ｇｂ｜ＡＡＨ０９２３２．１｜ＡＡＨ０９２３２、Ｅ値＝２ｅ−３１）（これは、ヒトＧ抗原８に類似である）と同一であることが明らかである。さらに、ＮＯＶ４はまた、ヒト黒色腫関連抗原ＧＡＧＥ−８（ＡＣＣ：Ｏ７６０８７、１１７ａａ、期待値＝２．７ｅ−１７、スコア＝２１２（７４．６ビット））に対する相同性を有する。
【０１５４】
この情報を、ＮＯＶ４を、Ｇ抗原８と類似の命名されていないヒトとを比較する、ＣｌｕｓｔａｌＷ分析として、表４Ｆに与える複数配列アライメントにおいて、図式的に提示する（ＮＯＶ４を１行目に示す）。
【０１５５】
【表３５】
2004501623.tif 000043
【０１５６】
開示されるＮＯＶ４とＣＣＹＰＲ−４８（ヒト細胞周期および増殖タンパク質）との間の類似性は、ＮＯＶ４が、細胞周期および増殖様タンパク質のメンバーとして機能し得ることを示唆する。
【０１５７】
細胞分裂は、全ての生物が生長し、そして生殖する、基礎的なプロセスである。酵母および細菌のような単細胞生物において、各細胞分裂は、生物の数を２倍にし、一方で多細胞種においては、磨耗およびプログラムされた細胞死によって失われた細胞を修復するために、そして新たな組織または器官を生じるための細胞分化のために、複数回の細胞分裂が必要とされる。従って、適切に調節された細胞分裂周期は、多くの重要な生物学的プロセス（例えば、生殖、分化および増殖、アポトーシスおよび加齢ならびに老化）のために不可欠である。適切な細胞分裂周期における欠損の結果は、欠損の型およびその欠損が位置する細胞の型に依存して、有害である。例えば、多くの組織における非協調的な細胞増殖は、種々の形態の癌の形成を導き得る。驚くべきことではないが、多くの腫瘍タンパク質は、細胞周期の制御に影響を与えることが知られており、そして多くの腫瘍抑制遺伝子もまた、細胞増殖の調節に関与する。別の例として、自己分子と外来分子とを区別できない免疫細胞におけるアポトーシスの誘発における欠損は、自己免疫障害を導き得る。さらに、腫瘍細胞およびウイルスに感染した細胞におけるアポトーシスの誘導の不全は、生物を腫瘍および感染に対して感受性にし得る。
【０１５８】
広範な配列類似性が、ＮＯＶ４とＣＣＹＰＲ−４８（これは、発生中の組織において発現される）との間に存在し、このことは、ＮＯＶ４が、免疫障害、発生障害および細胞シグナル伝達障害、ならびに癌を含む細胞増殖障害において役割を果たし得ることを示唆する。
【０１５９】
さらに、ＮＯＶ４は、ヒト黒色腫関連抗原ＧＡＧＥ−８に相同である。多くのヒト腫瘍は、腫瘍を保有する患者由来の細胞溶解Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によってインビトロで認識される抗原を発現する。ＧＡＧＥ（Ｇ抗原）遺伝子ファミリーのメンバーは、このような抗原をコードする。ＯＭＩＭ６０４１３２を参照のこと。
【０１６０】
まとめると、ＮＯＶ４の核酸およびタンパク質は、種々の免疫障害、発生障害および細胞シグナル伝達障害、ならびに癌を含む細胞増殖障害に関する潜在的な治療適用において、有用であり得る。例えば、細胞周期および増殖様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり得、そして細胞周期および増殖様タンパク質は、遺伝子治療の必要のある患者に投与される場合に、有用であり得る。増加した細胞周期および増殖タンパク質の発現または活性に関連する障害の処置において、ＮＯＶ４の発現または活性を減少させることが所望である。減少した細胞周期および増殖タンパク質の発現または活性に関連する障害の処置において、ＮＯＶ４の発現または活性を増加させることが所望である。従って、本発明の核酸およびタンパク質は、潜在的な診断および治療の適用において、そして研究ツールとして、有用である。これらとしては、特異的かまたは選択的な、核酸またはタンパク質の、診断および／または予後マーカーとして働くこと（ここで、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される）、ならびに以下のような潜在的な治療適用が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療剤、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬物標的／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療に有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）、ならびに（ｖ）インビトロおよびインビボで組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御武器。
【０１６１】
本発明のＮＯＶ４組成物は、例えば、免疫障害、発生障害、細胞シグナル伝達障害、細胞増殖障害、および癌を罹患する患者の処置のために効力を有する。他の病理および障害が、意図される。
【０１６２】
本発明の細胞周期および増殖様タンパク質をコードする新規核酸、および細胞周期および増殖様タンパク質、あるいはそのフラグメントは、さらに、これらの核酸またはタンパク質の存在または量が評価される、診断適用において有用であり得る。これらの物質は、さらに、治療方法または診断方法において、ならびに他の疾患、障害および状態などにおいて使用するために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において、有用である。これらの物質は、さらに、治療方法または診断方法において使用するために、本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の生成において、有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの予測を使用して、当該分野において公知の方法に従って生成され得る。
【０１６３】
例えば、開示されるＮＯＶ４タンパク質は、複数の親水性領域を有し、これらの各々が、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、考慮されるＮＯＶ４エピトープは、アミノ酸約８〜２５由来である。別の実施形態において、ＮＯＶ４エピトープは、アミノ酸約２５〜６５由来である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ４エピトープは、アミノ酸約６５〜１１１由来である。これらの新規タンパク質もまた、機能的分析のためのアッセイ系を開発するために使用され得る。
【０１６４】
（ＮＯＶ５）
本発明によるＮＯＶ５配列は、タンパク質のカドヘリンファミリーに関連するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶ５核酸およびそのコードされるポリペプチドは、表５Ａ〜５Ｂに示される配列を含む。ＮＯＶ５の核酸配列およびアミノ酸配列は、代替的に、クローン３４４０５７９７．０．１５と称される。開示される３６７０ヌクレオチドのＮＯＶ５核酸は、表５Ａに示され、そして配列番号１１として同定される。開示されるＮＯＶ５オープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）は、表１Ａに太字で示すヌクレオチド５０〜５２のＡＴＧ開始コドンで開始する。開示されるＮＯＶ５　ＯＲＦは、ヌクレオチド３４６０〜３４６２のＴＡＧコドンで終止する。表５Ａは、開始コドンの５’側および終止コドンの３’側の推定未翻訳領域を、下線を引いて記し、そして開始コドンおよび終止コドンを太字で記す。
【０１６５】
【表３６】
2004501623.tif 000044
2004501623.tif 000045
【０１６６】
配列番号１２によってコードされるＮＯＶ５タンパク質は、１１３５のアミノ酸残基を有し、そして表５Ｂに１文字コードを使用して提示される。ＮＯＶ５ポリペプチドは、１２６．１５ｋＤａの推定分子量を有する。ＮＯＶ５に対するＰｓｏｒｔプロフィールによって、この配列がシグナルペプチドを有し、そして０．４６００の確実性で、形質膜に局在するようであることが推定される。ＮＯＶ５ペプチドに対する最も起こりそうな切断部位は、ＳｉｇｎａｌＰ推定結果に基づくと、アミノ酸２７とアミノ酸２８との間、すなわち、アミノ酸配列ＶＬＧ−ＫＮのスラッシュの位置においてである（表５Ｂにおいて下線を引く）。ヒドロパシープロット分析に基づいて、ＮＯＶ５の残基６７５〜７１０は、膜貫通ドメインであると推定され、そして残基７１０〜１１３５は、６つのドメインを形成すると推定される。
【０１６７】
【表３７】
2004501623.tif 000046
【０１６８】
ＮＯＶ５は、最初に、胎児腎臓組織からクローニングされた。さらなるヒト組織が、同定可能なＮＯＶ５のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭフラグメントを発現する。これらの組織としては、骨、ＮＨＦＬＳ、ＨＣＮ、ＨＦＬＳＲＡ、腎臓骨髄、ＨＦＤＰＣ、毛包、唾液腺、およびＮＨＭＣ−ＲＭが挙げられる。
【０１６９】
ＮＯＶ５は、カドヘリン様タンパク質である。カドヘリンとは、細胞間相互作用を媒介するカルシウム依存型接着タンパク質である。例えば、Ｏｎｌｉｎｅ　Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍａｎ（「ＯＭＩＭ」）Ｉｄｅｎｔｉｔｙ．Ｎｏ．６０１１２０、ＵＲＬ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭを参照のこと。カドヘリンは、種々の組織において、細胞の構造的および機能的な組織化に関与するレセプターの、次第に拡大するファミリーを構成する。例えば、Ｈｕｂｅｒら，１９９６　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　３２：２１−２８を参照のこと。このファミリーのメンバーとしては、上皮カドヘリン（Ｅ−カドヘリン；ＯＭＩＭ　ＩＤ．１９２０９０）、神経カドヘリン（Ｎ−カドヘリン；ＯＭＩＭ　ＩＤ．１１４０２０）、胎盤カドヘリン（Ｐ−カドヘリン；ＯＭＩＭ　ＩＤ．１１４０２１）、筋肉カドヘリン（Ｍ−カドヘリン；ＯＭＩＭ　ＩＤ．１１４０１９）、および血管内皮カドヘリン（ＶＥ−カドヘリン、すなわちＣＤＨ５）が挙げられる。ファミリーメンバーは、共通のドメイン構造および一次配列相同性を共有する。各カドヘリン型は、独自の組織分布パターンを有する。さらに、複数のカドヘリン型が、特定の細胞の表面において見出され得る。例えば、Ｓａｌｏｍｏｎら，１９９２　Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．１０２：７−１７を参照のこと。
【０１７０】
本発明のタンパク質の全長ＮＯＶ５アミノ酸配列は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の１１３６アミノ酸残基のＫＩＡＡ１５６２タンパク質（ｇｉ｜１００４７１８９｜ｄｂｊ｜ＢＡＢ１３３８８．１（ＡＢ０４６７８２））に対して、１１３５のアミノ酸残基のうちの１１０２（９７％）が同一であり、そして陽性である（Ｅ＝０．０）。さらに、ＮＯＶ５ポリペプチドは、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の７０９アミノ酸残基のＤＫＦＺｐ４３４Ｂ０９２３．１推定タンパク質（ｇｉ｜１１３５９９１０｜ｐｉｒ｜｜Ｔ４６４１３）に対して、７０９アミノ酸残基のうちの６７９（９５％）が同一であり、そして７０９残基のうちの６７６（９５％）が陽性であり（Ｅ＝０．０）；そしてＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の第二の推定タンパク質（ｇｉ｜６８０８０８０｜ｅｍｂ｜ＣＡＢ７０７５５１．１｜（ＡＬ１３７４７１））に対して、２４２アミノ酸残基のうちの７１（２９％）が同一であり、そして２４２残基のうちの１１６（４７％）が陽性である（Ｅ＝２ｅ−２１）。ＮＯＶ５タンパク質は、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の１０４４アミノ酸残基のＯＬ−プロトカドヘリンタンパク質アイソフォーム（ｇｉ｜１４２１０８５１｜ｇｂ｜ＡＡＫ５７１９５．１｜ＡＦ３３４８０１＿１（ＡＦ３３４８０１））に対して、１０４４アミノ酸残基のうちの３９０（３７％）が同一であり、そして１０４４残基のうちの５７７（５４％）が陽性であり（Ｅ＝１ｅ−１８０）、ここで、Ｇａｐ＝１２９／１０４４（１２％）である。ＮＯＶ５タンパク質は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の１０９３アミノ酸残基のＫＩＡＡ１４００タンパク質（ｇｉ｜７２４３１８１｜ｄｂｊ｜ＢＡＡ９２６３８．１（ＡＢ０３７８２１））に対して、１０３８アミノ酸残基のうちの３９０（３７％）が同一であり、そして１０３８残基のうちの５７４（５４％）が陽性であり（Ｅ＝１ｅ−１７９）、ここで、Ｇａｐ＝１２９／１０３８（１２％）である。ＮＯＶ５タンパク質は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の１１３５アミノ酸残基のｑｓ１４＿３タンパク質配列（ＰＣＴ公開ＷＯ２００００９５５２−Ａ１；ｐａｔｐ　ａｃｃｎｏ：ＡＡＹ９４９２３）に対して、１１３５アミノ酸残基のうちの１１３５（１００％）が同一であり、そして陽性である（Ｅ＝０．０）。ＮＯＶ５タンパク質は、Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の４６１アミノ酸残基のｖｃ３５＿１タンパク質（ＰＣＴ公開ＷＯ２０００１１０１５−Ａ１；ｐａｔｐ　ａｃｃｎｏ：ＡＡＹ９４９９１）に対して、４６１アミノ酸残基のうちの４６０（９９％）が同一であり、そして陽性である（Ｅ＝７．０ｅ−２４９）。
【０１７１】
ＮＯＶ５に対する任意の言及は、全ての改変体を含むと仮定される。
【０１７２】
開示されるＮＯＶ５タンパク質は、多数のカドヘリンタンパク質との良好な同一性を有する。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析のために使用される同一性情報を、表５Ｃに提示する。
【０１７３】
【表３８】
2004501623.tif 000047
【０１７４】
この情報を、ＮＯＶ５と関連するタンパク質配列と比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析として、表５Ｄに与える複数の配列アライメントにおいて、図式的に提示する（ＮＯＶ５を１行目に示す）。
【０１７５】
【表３９】
2004501623.tif 000048
2004501623.tif 000049
2004501623.tif 000050
2004501623.tif 000051
【０１７６】
ＮＯＶ５についてのＤＯＭＡＩＮ結果を、Ｒｅｖｅｒｅｓｅ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＢＬＡＳＴを用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｄａｔａｂｅｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍコレクションにおいて見出されたドメインをサンプリングする。ＮＯＶ５についての結果を、統計およびドメインの説明と共に表５Ｅに列挙する。
【０１７７】
アミノ酸残基５９〜６７２のＮＯＶ５タンパク質領域は、６つの「ＣＡ、カドヘリン反復」（配列番号７３、表５Ｆを参照のこと）および相同な５つの「カドヘリンドメイン」領域（配列番号７４、表５Ｇを参照のこと）を含むことが強く予想される（Ｅ＝９ｅ−４〜７ｅ−１７）。以下の表５Ｅに示されるように、ＤＯＭＡＩＮ型（列１）および残基（列２）を、示されるＮＯＶ５残基（列３）、対応するスコア（列４）、およびＥ値（列５）と整列させた。
【０１７８】
【表４０】
2004501623.tif 000052
【０１７９】
カドヘリンは、カルシウム依存的な細胞−細胞接着を担う動物糖タンパク質のファミリーである。例えば、Ｔａｋｅｉｃｈｉ　１９８７　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．３：２１３−２１７；Ｔａｋｅｉｃｈｉ　１９９０　Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：２３７−２５２を参照のこと。カドヘリンは、連結した細胞間で優先的にホモマー複合体を形成し；従って、レセプターおよびリガンドの両方として作用する。いくつかの異なるアイソフォームが、組織特異的な様式で、広範な種々の生物において分布している。異なるカドヘリンを含む細胞は、インビトロで分離する傾向があるが、同一のカドヘリンを含む細胞は、優先的に凝集する傾向がある。この観察は、カドヘリンの発現が、細胞の層への位置的な分離を含む形態変化を引き起こすという発見と結び付けられ、それらが形態発生、組織発生および再生の間の異なる細胞型の仕分けに重要な役割を果たし得ることを示唆する。それらはまた、接着結合および細隙結合の調節、ならびに細胞間スペーシングの制御に関与し得る。カドヘリンは、プラークタンパク質の相互作用に関連する細胞間デスモソーム連結の成分であるデスモグレインと進化的に関連する。
【０１８０】
カドヘリンは、Ｃａ２＋媒介細胞−細胞接着に関与する糖タンパク質である。カドヘリンドメインは、カルシウムと結合した場合に細胞−細胞接触を媒介すると考えられる細胞外領域において反復として生じる。構造的に、カドヘリンは、多くのドメインを含む：これら多くのドメインとして、シグナル配列；約１３０残基のプロペプチド；約６００残基の細胞外ドメイン；単一の膜貫通ドメイン；および約１５０残基の十分に保存されたＣ末端細胞質ドメインが挙げられる。この細胞外ドメインは、しばしば、５つの部分に再分割される。そのうちの４つは、約１１０残基の反復であり、そして５番目の部分は、４つの保存されたシステインを含む。このパターンは、２つの保存されたアスパラギン酸残基および２つのアスパラギンを含むと考えられる。一般的に、ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｃｈにおいて利用可能な、ＰＲＯＳＩＴＥエントリーＰＤＯＣ００２０５、ＰＳ００２３２、ＰＳ５０２６８、ならびにｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏにおいて利用可能なＩｎｔｅｒＰｒｏエントリーＩＰＲ０００２３３およびＩＰＲ００２１２６を参照のこと。カドヘリンのカルシウム結合領域は、細胞外ドメインに位置すると考えられる。
【０１８１】
ＤＳＧ２＿ｈｕｍａｎ：Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ　２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｑ１４１２６）；ＣＡＤＦ＿ｈｕｍａｎ：Ｍｕｓｃｌｅ（Ｍ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤＨ１４）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ５５２９１）；ＣＡＤＤ＿ｈｕｍａｎ：Ｔ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤＨ１３）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ５５２９０）；ＣＡＤ５＿ｈｕｍａｎ：Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤＨ５）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ３３１５１）；ＣＡＤ３＿ｈｕｍａｎ：Ｐｌａｃｅｎｔａｌ（Ｐ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤＨ３）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ２２２２３）；ＤＳＧ３＿ｈｕｍａｎ：Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ　３（Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ａｎｔｉｇｅｎ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ３２９２６）；ＣＡＤＣ＿ｈｕｍａｎ：Ｂｒａｉｎ（ＢＲ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤＨ１２）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ５５２８９）；ＣＡＤＢ＿ｈｕｍａｎ：Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ（ＯＢ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤＨ１１）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ５５２８７）；ＣＡＤ８＿ｈｕｍａｎ：Ｃａｄｈｅｒｉｎ−８（ＣＤＨ８）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ５５２８６）；ＣＡＤ６＿ｈｕｍａｎ：Ｋｉｄｎｅｙ（Ｋ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤＨ６）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ５５２８５）；ＣＡＤ４＿ｈｕｍａｎ：Ｒｅｔｉｎａｌ（Ｒ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤＨ４）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ５５２８３）；ＣＡＤＨ＿ｒａｔ：Ｌｉｖｅｒ−ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（ＬＩ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ５５２８１）；ＣＡＤＦ＿Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ：ＥＰ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ３３１４８）；ＣＡＤ１＿ｈｕｍａｎ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ａ．ｋ．ａ．ｕｖｏｍｏｒｕｌｉｎまたはＬ−ＣＡＭ）（ＣＤＨ１）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ１２８３０）；ＤＳＧ１＿ｈｕｍａｎ：Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ　１（ｄｅｓｍｏｓｏｍａｌ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｑ０２４１３）；およびＣＡＤ２＿ＨＵＭＡＮ：Ｎｅｕｒａｌ（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤＨ２）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　Ｎｏ．Ｐ１９０２２）は、このファミリーに含まれる。
【０１８２】
ＮＯＶ５の核酸およびタンパク質は、生物学的活性を有し、それによりヒトおよび動物における医学的状態を処置、予防、または改善するのに適し；従って、以下にさらに記載される種々の病理的障害に関する潜在的な治療適用において有用である。例えば、カドヘリン様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療において有用であり、そして血管カドヘリン様タンパク質は、それが必要な患者に投与される場合に有用である。ＮＯＶ５ポリヌクレオチドは、このタンパク質が優先的に発現される組織に対するマーカーとして（サザンゲルにおける分子量マーカーとして）使用され得る。本発明のＮＯＶ５核酸配列は、染色体を同定するため、または遺伝子位置を地図化するための染色体マーカーまたはタグとして、ならびに診断用プライマーおよびプローブの供給源として使用され得る。
【０１８３】
本発明の分泌されるＮＯＶ５タンパク質は、部分的にのみ分泌されると考えられるタンパク質、すなわち、膜貫通タンパク質を含む。本発明のタンパク質は、以下から選択される１つ以上の活性を示し得る：サイトカイン活性；細胞増殖活性；抗ウイルス活性；抗菌活性；抗真菌活性；抗炎症活性；皮膚学的活性；抗糖尿病活性；喘息鎮静活性；抗関節炎活性；抗リウマチ活性；殺原虫活性；抗甲状腺活性；腫瘍インヒビター；増殖刺激活性；造血刺激活性；避妊活性；分化活性；免疫調節活性（すなわち、免疫賦活活性；免疫抑制活性）；造血調節活性；組織増殖調節活性；アクチビン／インヒビン活性；走化／ケモキネシス活性；止血および血栓崩壊活性；抗炎症活性；および腫瘍阻害活性。このタンパク質は、ワクチンとして患者に投与され得、そしてヌクレオチドは、遺伝子療法レジームの一部として使用され得る。
【０１８４】
ＮＯＶ５は、免疫不全および障害（例えば、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ならびにウイルス感染、細菌感染、真菌感染、および他の感染）の処置に使用され得る。これらの感染として、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｍａｎｉａ）種、マラリア、およびカンジダ症が挙げられる。ＮＯＶ５タンパク質は、自己免疫障害（例えば、結合組織疾患、多発性硬化、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、自己免疫性肺炎症、ギヤン−バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、対宿主性移植片病、および自己免疫性炎症性眼疾患）を処置するために使用され得る。ＮＯＶ５タンパク質はまた、アレルギー状態（例えば、喘息および貧血）を処置するために使用され得る。ＮＯＶ５タンパク質はさらに、癌；心臓血管障害；血液障害；血友病；神経変性疾患；遺伝的障害；血友病；心臓血管疾患；癌；細菌、真菌、およびウイルス感染（特にＨＩＶ感染）、を処置するために使用され得る。種々のさらなる実施形態において、ＮＯＶ５は、創傷、やけど、潰瘍、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、および筋萎縮側索硬化（「ＡＬＳ」）を処置するために使用され得る。アクチビン／インヒビン活性を有するＮＯＶ５タンパク質はさらに、避妊薬として有用であり得る。
【０１８５】
このポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を作製するための免疫原として、およびワクチンとして使用され得る。それらはまた、潜在的なアゴニストまたはアンタゴニスト化合物についてスクリーニングするために使用され得る。例えば、カドヘリン様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子療法において有用であり得、そしてこのレセプター様タンパク質は、それを必要とする被験体に投与される場合に有用であり得る。カドヘリン様タンパク質、および本発明のカドヘリン様タンパク質、またはそのフラグメントをコードする新規核酸はさらに、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される診断適用において有用であり得る。これらの物質はさらに、治療方法または診断方法において使用されるための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作製に有用であり得る。これらの抗体は、当該分野で公知の方法に従い、以下の節「抗ＮＯＶＸ抗体」に記載されるような疎水性チャートからの予測を用いて作製され得る。例えば、開示されるＮＯＶ５タンパク質は、複数の親水性領域を有し、それらの各々は、免疫原として使用され得る。１つの実施形態において、考え得るＮＯＶ５エピトープは、アミノ酸約１０〜４０由来である。別の実施形態において、ＮＯＶ５エピトープは、アミノ酸約１１０〜１３０由来である。さらなる実施形態において、ＮＯＶ５エピトープは、アミノ酸１５０〜１７５、１９０〜２００、２４０〜２７０由来およびアミノ酸２８０〜３２０由来である。この新規タンパク質はまた、疾患の病理学の理解および種々の障害のための新規薬物標的の開発において役立つ、種々のヒト障害の機能性分析のための強力なアッセイ系の開発において価値を有する。
【０１８６】
ＮＯＶ５についてのＴａｑｍａｎデータは、実施例１に含まれる。
【０１８７】
（ＮＯＶ６）
ＮＯＶ６は、関連するリゾチームＣ−１前駆体様タンパク質のファミリーの新規メンバーを表わす。これらのタンパク質は、グリコシドヒドロラーゼファミリーに関連する。ＮＯＶ６ａ、ＮＯＶ６ｂ、ＮＯＶ６ｃ、およびＮＯＶ６ｄと命名された４つの異なるファミリーのメンバーが、ＮＯＶ６に含まれる。これらの各々は、以下で詳細に議論される。
【０１８８】
（ＮＯＶ６ａ１〜３）
ＮＯＶ６ａ１、ＮＯＶ６ｂ１、およびＮＯＶ６ｃ１と命名された、ＮＯＶ６ファミリーの３つの関連するメンバーが、本明細書中で開示される。これらのＮＯＶ６ａの各々のヌクレオチド配列は異なるが、ＮＯＶ６ａ１、２、および３の各々は、同一のタンパク質をコードする。これらの配列は、以下で詳細に議論される。
【０１８９】
（ＮＯＶ６ａ１）
ＮＯＶ６ａ１を、目的のタンパク質ファミリーとの類似性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列について、ＣｕｒａＧｅｎ’ｓ　Ｈｕｍａｎ　ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを検索することにより、最初に同定した。ＮＯＶ６ａを、本発明の全長ＤＮＡ配列および／もしくはその一部を含むｃＤＮＡフラグメントの研究的クローニングにより、ならびに／または公的なヒト配列データベースからの本発明の全長ＤＮＡ配列および／もしくはその一部のインシリコ予測により獲得した。研究的クローニングを、以下に要約される方法の１つ以上を用いて実施した。
【０１９０】
ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術：ｃＤＮＡを、種々のヒトサンプルから獲得した。このサンプルは、複数の組織型、正常状態および疾患状態、生理的状態、および異なるドナーからの発生学的状態を表す。サンプルを、組織全体、細胞株、初代細胞または組織培養初代細胞および細胞株として獲得した。細胞および細胞株を、遺伝子発現を調節する生物学的または化学的因子（例えば、増殖因子、ケモカイン、またはステロイド）で処理し得た。次いで、このように獲得されたｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎ特許のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を使用して配列決定した。
【０１９１】
ＲＡＣＥ：ポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術（例えば、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ））を使用して、本発明のｃＤＮＡの推定配列を単離または完了した。通常、複数のクローンを、１つ以上のヒトサンプルから配列決定し、フラグメントの配列を獲得した。精巣および胎児脳由来の異なるドナー由来ヒトサンプルを、ＲＡＣＥ反応に使用した。
【０１９２】
配列の追跡（ｔｒａｃｅ）を、手動で評価し、そして適切な場合、訂正のために編集した。フラグメントの配列を、ＲＡＣＥおよびＳｅｑＣａｌｌｉｎｇにより獲得された他のフラグメントと、ならびにバイオインフォマティクスプログラムを使用して公的なＥＳＴと集合させ、そしてＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリのＣｕｒａＧｅｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースに含めた。各アセンブリは、１つ以上のヒトサンプルから獲得された重複する１つ以上のｃＤＮＡ配列を含む。フラグメントおよびＥＳＴを、このアセンブリの別の成分との同一性の程度が、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、アセンブリの成分として含めた。各アセンブリは、遺伝子および／またはその改変体（例えば、スプライス形態および／または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）ならびにそれらの組み合わせ）を表わし得る。
【０１９３】
ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ配列を、ＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲおよび／またはＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲファミリーのメンバーとの類似性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列について、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ’ｓ　Ｈｕｍａｎ　ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを検索することにより、最初に同定した。１４４８６１１５０中の１つ以上のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリを、適切な類似性を有するとして同定した。１つ以上のこれらのアセンブリをさらに分析し、新規の全長タンパク質をコードする任意のオープンリーディングフレームおよびこれらの遺伝子の新規のスプライス形態を同定した。新規ＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ様遺伝子またはそのスプライス形態の１つについて得られるＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、本明細書中で、ＣｕｒａＧｅｎ　Ａｃｃ．Ｎｏ．５６０３２８８．０．２０＿ｄａｌまたはＮＯＶ６ａ１として報告する。
【０１９４】
次いで、全てのアプローチにより規定された領域を手動で組込み、そして、例えば、使用された本来のフラグメントにおける誤った塩基または類似のタンパク質に対する推定の相同性の間の矛盾から生じ得る明らかな不一致について手動で補正し、本明細書中で報告されるＮＯＶ６ａ１の最終配列を獲得した。必要な場合、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ、ＥＳＴ、およびゲノムクローンを同定および分析するためのプロセスを繰り返して、全長配列を獲得した。
【０１９５】
開示される９０７ヌクレオチドの新規ＮＯＶ６ａ１核酸（５６０３２８８．０．２０＿ｄａｌまたはＮＯＶ６ａ１と命名された）を、表６Ａに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３１１〜３１３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド７８８〜７９０のＴＧＡコドンで終了する。
【０１９６】
【表４１】
2004501623.tif 000053
【０１９７】
開示される核酸配列は、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ　ｅｎｔｅｌｌｕｓ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＰＥＬＹＳＯＣ│ａｃｃ：Ｘ６０２３５．１　ｍＲＮＡ（リゾチームＣのＰ．ｅｎｔｅｌｌｕｓ　ｍＲＮＡ）、Ｅ値＝３．５ｅ−１６）由来の６０３塩基対ｍＲＮＡに対する４２０ヌクレオチドのうちの２６３ヌクレオチド（６２％）の同一性を有する。
【０１９８】
配列番号１３によりコードされるＮＯＶ６ａタンパク質は１５９アミノ酸残基を有し、そして表６Ｂに一文字表記を用いて表わす（配列番号１４）。ＮＯＶ６ａについてのＳｉｇｎａｌＰ、Ｐｓｏｒｔ、および／またはヒドロパシープロフィールは、ＮＯＶ６ａが０．６８５０の確実性で細胞外に、または０．６４００の確実性で小胞体に局在する可能性があることを推定する。切断部位を、表６Ｂにおけるアミノ酸２１と２２との間の、ＶＤＡ−ＫＩのスラッシュで示す。ＮＯＶ６ａリゾチーム前駆体様タンパク質のヒドロパシープロフィールは、この配列が、細胞外への局在を支持する強いシグナルペプチドを有することを示唆する。
【０１９９】
【表４２】
2004501623.tif 000054
【０２００】
開示されるＮＯＶ６ａタンパク質の全長アミノ酸配列は、Ａｎａｓ　ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ（アヒル）：ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ００７０５　ＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ　３．２．１．１７）（１，４−ＢＥＴＡ−Ｎ−ＡＣＥＴＹＬＭＵＲＡＭＩＤＡＳＥ　Ｃ）由来の１４７アミノ酸残基タンパク質リゾチームＣ−１前駆体タンパク質に対する、１４７アミノ酸残基のうちの７５アミノ酸残基（５１％）の同一性、および１４７アミノ酸残基のうちの１０３アミノ酸残基（７０％）の類似性を有することが見出された（期待＝５．８ｅ−４０）。
【０２０１】
（ＮＯＶ６ａ２）
ＮＯＶ６ａ２を、目的のタンパク質ファミリーとの類似性を有するタンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列について、ＣｕｒａＧｅｎ’ｓ　Ｈｕｍａｎ　ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを検索することにより、最初に同定した。
【０２０２】
ＮＯＶ６ａ２（ＣＧ５２７５４−０３）配列をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングした：ＡＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＴＣ（配列番号７５）およびＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧ（配列番号７６）。プライマーを、本発明のｃＤＮＡ／タンパク質配列の全長またはいくらかの部分（１つ以上のエキソン）のインシリコ予測に基づき設計した。これらのプライマーを用いて、以下の組織から発現されたヒト配列を含むプールからｃＤＮＡを増幅した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮。
【０２０３】
複数のクローンを配列決定し、そしてこれらのフラグメントを一緒に集め、ときどき公的なヒト配列を含め、バイオインフォマティックプログラムを使用して各アセンブリについてのコンセンサス配列を生成する。各アセンブリをＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースに含める。別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、配列を、アセンブリについての成分として含めた。各アセンブリは遺伝子またはその一部を表し、そして改変体（例えば、スプライス形態、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、および他の配列改変体）の情報を含む。
【０２０４】
エキソン連結により獲得された全オープンリーディングフレームを包含するＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、クローン１２３４９９：：ＧＭＡＣ０４４８４６＿Ａ．６９８４４５．Ｃ１３を提供した。
【０２０５】
新規リゾチームＣ−１前駆体様タンパク質をコードする５０６ヌクレオチドの新規核酸（ＣＧ５２７５４−０３またはＮＯＶ６ａ２と命名された）を、表６Ｃに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド５〜７で始まり、そしてヌクレオチド４８２〜４８４で終了すると同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、表中で太字で強調する。存在する場合、推定非翻訳領域（下線）は、開始コドンの上流および終止コドンの下流で見出される。配列データベースの検索において、例えば、本発明のＮＯＶ６ａ２核酸配列は、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ　ｅｎｔｅｌｌｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＰＥＬＹＳＯＣ│ａｃｃ：Ｘ６０２３５．１　ｍＲＮＡ（リゾチームｃについてのＰ．ｅｎｔｅｌｌｕｓ　ｍＲＮＡ）に対する４２０塩基のうちの２６３塩基（６２％）の同一性を有することが見出された（Ｅ＝３．９ｅ−１６）。
【０２０６】
【表４３】
2004501623.tif 000055
【０２０７】
この核酸配列は、５’末端に３０６個少ないヌクレオチド、ＴからＡへの塩基変化（ＮＯＶ６ａ１の８１２位またはＮＯＶ６ａ２の５０６位）、および３’末端に９５個少ないヌクレオチドを有することにより、ＮＯＶ６ａ１の核酸配列と異なる。コードされるＮＯＶ６ａタンパク質は同一である。
【０２０８】
開示されるリゾチームｃ−１前駆体様遺伝子は、少なくとも以下の組織で発現される：軟骨、脾臓、肺、腎臓、白血球、血漿、唾液、乳汁、および涙。発現情報を、ＣｕｒａＧｅｎ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５２７５４−０３の配列の誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）に含まれる配列の組織供給源から獲得した。
【０２０９】
ＰＳＯＲＴデータは、ＮＯＶ６ａ２リゾチームｃ−１前駆体様タンパク質が、形質膜に局在し得、そしてＣｕｒａＧｅｎ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＧ５２７５４−０３のタンパク質が、リゾチームｃ−１前駆体ファミリー（このファリミーの中のいくらかのメンバーは分泌される）に類似することを示唆する。従って、このタンパク質は、同一の細胞下区画に局在する可能性がある。
【０２１０】
（ＮＯＶ６ａ３）
ＮＯＶ６ａ３を、以前に同定されたクローン３０４１２３０６＿０＿１００＿ｄａｌ（Ｂ）（以下のＮＯＶ６ｄを参照のこと）をエキソン連結プロセスに供し、配列を確認することにより同定した。ＰＣＲプライマーを、正方向プライマーとして利用可能な最も上流の配列および逆方向プライマーとして利用可能な最も下流の配列で開始することによって設計した。各々の場合、配列を、それぞれの末端からコード配列の方へ、特有であるかまたは高度に選択的であるかのいずれかである適切な配列に遭遇するまで（または、逆方向プライマーの場合、終止コドンに達するまで）内側にウォーキングさせることにより試験した。このようなプライマーを、標的配列のＤＮＡまたはタンパク質配列の全長ｃＤＮＡ、一部（１つ以上のエキソン）のインシリコ予測に基づき、または他の種由来の緊密に関連するヒト配列に対する翻訳される推定エキソンの相同性に基づき設計した。次いで、これらのプライマーを用いて、以下のヒトｃＤＮＡのプールに基づくＰＣＲ増幅に使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮。通常、得られるアンプリコンを、高い重複性になるまでゲル精製し、クローニングし、そして配列決定する。全てのクローンから得られる配列を、それら自体、ＧｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースの他のフラグメント、および公的なＥＳＴと共に集める。アセンブリの別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、フラグメントおよびＥＳＴを、アセンブリの成分として含めた。さらに、配列の追跡を手動で評価し、そして適切な場合、訂正のために編集した。これらの手順は、登録番号３０４１２３０６＿０＿１００＿ｄａ１（ＮＯＶ６ａ３）と命名された以下に報告される配列を提供する。
【０２１１】
この配列をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマー：ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＡＴＧ（配列番号７７）およびＴＣＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＴＡＴＣＡＣＡＣＣＣＣ（配列番号７８）を用いた、以下のヒトｃＤＮＡのプール：プール１−副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、および子宮、に対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングした。
【０２１２】
プライマーを、本発明のｃＤＮＡ／タンパク質配列の全長または一部（１つ以上のエキソン）のインシリコ予測に基づき、または他の種由来の緊密に関連するヒト配列に対する翻訳される推定エキソンの相同性に基づき設計した。通常、複数のクローンを配列決定して配列を獲得し、次いでＳｅｑＣａｌｌｉｎｇプロセスと同様に集めた。さらに、配列の追跡を、手動で評価し、そして適切な場合、訂正のために編集した。
【０２１３】
物理的なクローン：エキソン連結により獲得したＰＣＲ産物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。細菌クローン１１８８８５：：３０４１２３０６＿０＿１００＿ｄａｌ．６９８３２４．Ｃ１は、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングされた全オープンリーディングフレームを包含するインサートを有する。
【０２１４】
新規リゾチームＣ−１前駆体様タンパク質をコードする４８７ヌクレオチドの新規核酸（３０４１２３０６＿０＿１００＿ｄａｌまたはＮＯＶ６ａ３と命名された）を、表６Ｄに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１〜３のＡＴＧで始まり、そしてヌクレオチド４７８〜４８０のＴＧＡで終了することが同定された。配列データベースの検索において、例えば、本発明のＮＯＶ６ａ３核酸配列は、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ　ｅｎｔｅｌｌｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＰＥＬＹＳＯＣ│ａｃｃ：Ｘ６０２３５．１　ｍＲＮＡ（リゾチームｃについてのＰ．ｅｎｔｅｌｌｕｓ　ｍＲＮＡ）Ｅ＝３．５ｅ−１６に対する４２０塩基のうちの２６３塩基（６２％）の同一性を有することが見出された。
【０２１５】
【表４４】
2004501623.tif 000056
【０２１６】
この核酸配列は、５’末端に３１０個少ないヌクレオチド、および３’末端に１１０個少ないヌクレオチドを有することにより、ＮＯＶ６ａ１の核酸配列と異なる。コードされるＮＯＶ６ａタンパク質は同一である。
【０２１７】
以下のＳＮＰをＮＯＶ６ａ３について同定した：以下の位置において、このヌクレオチド配列の１つ以上のコンセンサス位置（コンセンサス位置）をＳＮＰとして同定した。「深さ」は、ＳＮＰの領域を包含するクローンの数を表わす。推定の対立遺伝子頻度（推定対立遺伝子頻度）は、ＳＮＰを含むクローン全ての画分である。ダッシュ（「−」）は、示される場合、塩基が存在しないことを意味する。記号「＞」は「〜に変化した」ことを意味する。
【０２１８】
【表４５】
2004501623.tif 000057
【０２１９】
開示されるＮＯＶ６ａ３リゾチームＣ−１前駆体様タンパク質は、少なくとも以下の組織で発現される：軟骨、脾臓、肺、腎臓、白血球、血漿、唾液、乳汁、および涙。この情報を、本発明において含まれる配列の組織供給源（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公的なＥＳＴ供給源、文献的な供給源、および／またはＲＡＣＥ供給源が挙げられるがこれらに限定されない）を決定することにより獲得した。
【０２２０】
（ＮＯＶ６ｂ）
ＮＯＶ６ｂは、タンパク質のリゾチームＣ−１前駆体様ファミリーの新規メンバーであり、グリコシドヒドロラーゼファミリーに関連する。ＮＯＶ６ｂをコードするｃＤＮＡ（５６０３２８８．０．１、ＣＧ５２７５４−０１）配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングした。プライマーを、本発明のｃＤＮＡ／タンパク質配列の全長またはいくらかの部分（１つ以上のエキソン）のインシリコ予測に基づき設計した。これらのプライマーを用いて、胎児脳および腎臓組織に由来する発現されたヒト配列を含むプールからｃＤＮＡを増幅した。
【０２２１】
複数のクローンを配列決定し、これらのフラグメントを、時折公開ヒト配列を含めて、バイオインフォマティクスプログラムを使用して一緒にアセンブリして、各アセンブリについてのコンセンサス配列を生成した。各アセンブリは、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースに含まれる。別の成分との同一性の程度が、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、配列は、このアセンブリの成分として含まれた。各アセンブリは、遺伝子またはその一部を示し、そして、改変体についての情報（例えば、スプライス形態、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失および他の配列バリエーション）を含む。
【０２２２】
エキソン連結プロセスによって生成されるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリを選択し、そして以下の基準を使用して伸長させた。最初の配列または伸長された配列の全てまたは一部に９８％の同一性を有する領域を有するゲノムクローンを、問い合わせヒトゲノムデータベースに対して、関連配列を使用するＢＬＡＳＴＮ検索によって同定した。得られたゲノムクローンを、さらなる分析のために選択した。なぜなら、この同一性は、これらのクローンがこれらのＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリについてのゲノム遺伝子座を含むことを示すからである。これらの配列を、推定コード領域ならびに既知のＤＮＡ配列およびタンパク質配列に対する類似性について分析した。これらの分析のために使用されるプログラムとしては、Ｇｒａｉｌ、Ｇｅｎｓｃａｎ、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ、ＦＡＳＴＡ、Ｈｙｂｒｉｄおよび他の関連のプログラムが挙げられる。
【０２２３】
いくつかのさらなるゲノム領域もまた、選択されたＳｑｅＣａｌｌｉｎｇアセンブリがこれらの領域にマップされるので、同定され得た。このようなＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ配列は、相同性またはエキソン予測によって規定される領域と重複し得た。フラグメントの位置が、元の予測配列に含まれていた、類似性またはエキソン予測によって同定されたゲノム領域の近傍にあったので、これらもまた、含まれ得る。このように同定された配列を手動でアセンブリし、次いでＣｕｒａＧｅｎ　ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースから取った１以上のさらなる配列を使用して伸長し得た。含むことに適切なＳｅｑＣａｌｌｉｎｇフラグメントを、ＣｕｒａＴｏｏｌｓＴＭプログラムＳｅｑＥｘｔｅｎｄによって、または分析されるゲノムクローンの適切な領域にマップされるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇフラグメントを同定することによって、同定した。このような配列を、１以上のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリと重複する領域における同一性の程度が高かった場合にのみ、ＮＯＶ６ｂの誘導物に含めた。同一性の程度は、例えば、約９０％以上、好ましくは約９５％以上、そしてさらにより好ましくは１００％に近いかまたは等しくあり得る。必要な場合、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇフラグメントおよびゲノムクローンを同定および分析するためのプロセスを、全長配列を誘導するために反復した。
【０２２４】
次いで、上記の手順によって規定される領域を、手動で統合し、そして明らかな不一致（例えば、元のフラグメントの誤って呼ばれた塩基、または推定エキソン連結部、ＥＳＴ位置および配列類似性の領域の間の不一致から生じ得た）について補正して、本明細書中に開示される最終配列を誘導した。必要な場合、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリおよびゲノムクローンを同定および分析するためのプロセスを、全長配列を誘導するために反復した。クローンのＳｅｑ　Ｃａｌｌｉｎｇフラグメントを、以下のヒト組織によって提供した：Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ由来の１０種のヒト総ＲＮＡ（脳、胎児脳、肝臓、胎児肝臓、骨格筋、膵臓、腎臓、心臓、肺および胎盤）。
【０２２５】
開示されたリゾチームＣ−１前駆体様遺伝子のＤＮＡ配列は、本明細書中にＣｕｒａＧｅｎ登録番号５６０３２８８．０．１、ＣＧ５２７５４−０１、またはＮＯＶ６ｂとして報告される。６４６ヌクレオチドの開示された新規ＮＯＶ６ｂ核酸（配列番号１７）を、表６Ｆに示す。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド８３で始まり、そしてヌクレオチド５５９で終わる。
【０２２６】
ＮＯＶ６ｂは、以下の点でＮＯＶ６ａ１とは異なる：ＮＯＶ６ｂは、５’ＵＴＲで２２８少ないヌクレオチドを有し、そして３’ＵＴＲで３３少ないヌクレオチドを有し、そして１塩基変化：Ｇ４２９＞Ｔ（ＮＯＶ６ａ１に関する番号付けをした）を有し、１アミノ酸変化：Ｇ４０＞Ｖを生じる。この１アミノ酸変化以外、ＮＯＶ６ａタンパク質とＮＯＶ６ｂタンパク質とは同じである。
【０２２７】
【表４６】
2004501623.tif 000058
【０２２８】
ＮＯＶ６ｂは、表６ＧのＶＤＡ／ＫＩの間のスラッシュによって示されるように、２１位と２２位との間に切断部位を有する可能性が最も高い。
【０２２９】
【表４７】
2004501623.tif 000059
【０２３０】
開示されたＮＯＶ６ｂタンパク質の全長アミノ酸配列は、１４７アミノ酸残基のタンパク質ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ００７０５　ＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ３．２．１．１７）（１，４−ＢＥＴＡ−Ｎ−ＡＣＥＴＹＬＭＵＲＡＭＩＤＡＳＥ　Ｃ）−Ａｎａｓ　ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ（家禽アヒル）に対して、１４７アミノ酸残基のうち７５残基（５１％）同一であり、および１４７アミノ酸残基のうち１０３残基（７０％）がポジティブであることが見出された（Ｅ値＝１．０ｅ−３９）。さらに、ＮＯＶ６ｂは、ベアーフェイストクラッソー（ｂａｒｅ−ｆａｃｅｄ　ｃｒａｓｓｏｗ）リゾチームのアミノ酸配列に類似性を有する：ＰＩＲ−ＩＤ：ＪＥ０１８５リゾチーム（ＥＣ　３．２．１．１７）−ベアーフェイストクラッソーＡに対して、期待値＝２．７ｅ−３９、同一性＝６８／１２９（５２％）；ポジティブ＝９５／１２９（７３％）。
【０２３１】
ヒトタンパク質との高いスコア付け類似性は、以下を含む：１４８アミノ酸のタンパク質ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｏ７５９５１　ＬＹＳＯＺＹＭＥ　ＨＯＭＯＬＯＧ−期待値＝１．４ｅ−３３、同一性＝６２／１４１（４３％）、ポジティブ＝９４／１４１（６６％）。
【０２３２】
（ＮＯＶ６ｃ）
ＮＯＶ６ｃは、グリコシド加水分解酵素ファミリーに関連する、リゾチームＣ−１前駆体様ファミリーのタンパク質の新規のメンバーである。ＮＯＶ６ｃ（ＣＧ５２７５４−０２）配列をコードする配列を、ｃＤＮＡフラグメントの実験室クローニング、配列のインシリコ（ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ）予測によって誘導した。このＤＮＡ配列の全長またはこの配列の一部、あるいはこれら両方のいずれかをカバーするｃＤＮＡフラグメントを、クローニングした。インシリコ予測は、Ｃｕｒａｇｅｎ専有の配列データベースまたは公開ヒト配列データベースにおいて入手可能な配列に基づき、そして全長ＤＮＡ配列またはそのいくつかの部分のいずれかを提供した。
【０２３３】
ＣＧ５２７５４−０２配列をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした：ＴＣＴＧＡＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＣＡＣ（配列番号７９）およびＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＧＣ（配列番号８０）。プライマーを、本発明のｃＤＮＡ配列／タンパク質配列の全長またはいくつかの部分（１以上のエキソン）のインシリコ予測に基づいて設計した。これらのプライマーを使用して、以下の組織由来の発現されたヒト配列を含むプールからｃＤＮＡを増幅した：副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管および子宮。
【０２３４】
複数のクローンを配列決定し、これらのフラグメントを、時折公開ヒト配列を含めて、バイオインフォマティクスプログラムを使用して一緒にアセンブリして、各アセンブリについてのコンセンサス配列生成した。各アセンブリは、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースに含まれる。別の成分との同一性の程度が、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合、配列は、このアセンブリの成分として含まれた。各アセンブリは、遺伝子またはその一部を示し、そして、改変体についての情報（例えば、スプライス形態、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失および他の配列バリエーション）を含む。
【０２３５】
エキソン連結によって誘導される、オープンリーディングフレーム全体をカバーするＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１ベクターにクローニングして、クローン１２１２１０：：ＧＭＡＣ０５５８６１＿Ａ．６９８４２５．Ｃ９を提供した。
【０２３６】
新規のリゾチームｃ−１前駆体様タンパク質をコードする、５０７ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ６ｃ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５２７５４−０２と称される）を、表６Ｈに示す。ヌクレオチド５〜７で始まり、そしてヌクレオチド４４６〜４４８で終わるオープンリーディングフレームが、同定された。オープンリーディングフレームの開始コドンおよび終止コドンを、太字で強調する。存在する場合、推定非翻訳領域（下線部）は、開始コドンの上流および終止コドンの下流に見出される。配列データベースの検索において、例えば、本発明の核酸配列が、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ　ｅｎｔｅｌｌｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＰＥＬＹＳＯＣ｜ａｃｃ：Ｘ６０２３５．１　ｍＲＮＡ（リゾチームｃのＰ．ｅｎｔｅｌｌｕｓ　ｍＲＮＡ）に対して４２０塩基のうち２６６塩基（６３％）が同一性であることが見出された（Ｅ＝３．５ｅ−１６）。
【０２３７】
【表４８】
2004501623.tif 000060
【０２３８】
１４７アミノ酸残基を有する、コードされるＮＯＶ６ｃタンパク質は、表６Ｉにおいて一文字コードを使用して示される。
【０２３９】
【表４９】
2004501623.tif 000061
【０２４０】
ＮＯＶ６ｃは、Ｃ１４７＞Ｖのアミノ酸置換およびＣ末端で１２アミノ酸短いことによって、ＮＯＶ６ａとは異なる。開示されたＮＯＶ６ｃタンパク質の全長アミノ酸配列は、Ａｎａｓ　ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ（家禽アヒル）由来の１４７アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ００７０５タンパク質（ＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ３．２．１．１７）（１，４−ＢＥＴＡ−Ｎ−ＡＣＥＴＹＬＭＵＲＡＭＩＤＡＳＥ　Ｃ））に対して、１４６アミノ酸残基のうち７４残基（５０％）が同一であり、そして１４６アミノ酸残基のうち１０２残基（６９％）が類似であることが見出された（Ｅ＝５．８ｅ−３９）。
【０２４１】
本発明において開示されるＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ様遺伝子は、少なくとも以下の組織において発現される：軟骨、脾臓、肺、腎臓、白血球、血漿、唾液、乳汁および涙。発現情報を、ＣｕｒａＧｅｎ登録番号ＣＧ５２７５４−０２、ＮＯＶ６ｃの配列の誘導物中に含まれる配列の組織供給源から誘導した。
【０２４２】
（ＮＯＶ６ｄ）
ＮＯＶ６ｄは、グリコシド加水分解酵素ファミリーに関連する、リゾチームＣ−１前駆体様ファミリーのタンパク質の新規メンバーである。開示されたＮＯＶ６ｄ（３０４１２３０６＿０＿１００＿ｄａｌ（Ｂ））をコードする配列を、本発明のＤＮＡ配列の全長および／もしくは一部をカバーするｃＤＮＡフラグメントの実験室クローニングによって、ならびに／または公開ヒト配列データベースからの本発明のＤＮＡ配列の全長および／もしくは一部のインシリコ予測によって、誘導した。実験室クローニングを、以下に要約する方法によって実施した：　（ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇＴＭ技術：）ｃＤＮＡを、異なるドナー由来の複数の組織型、正常状態および疾患状態、生理学的状態、ならびに発生状態を示す種々のヒトサンプルから誘導した。サンプルを、組織全体、細胞株、初代細胞または組織培養した初代細胞および細胞株として得た。細胞および細胞株を、遺伝子発現を調節する生物学的薬剤または化学的薬剤（例えば、増殖因子、ケモカイン、ステロイド）を用いて処置し得た。次いで、こうして誘導したｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎ専有のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を使用して、配列決定した。配列トレースを手動で評価し、そして適切な場合、較正のために編集した。全てのサンプル由来のｃＤＮＡ配列を、バイオインフォマティクスプログラムを使用して、これら自体と、および公開ＥＳＴとアセンブリして、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリのＣｕｒａＧｅｎのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースを生成した。各アセンブリは、１以上のヒトサンプルから誘導される１以上の重複するｃＤＮＡ配列を含む。フラグメントおよびＥＳＴを、アセンブリの別の成分との同一性の程度が５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合に、アセンブリの成分として含めた。各アセンブリは、遺伝子および／またはその改変体（例えば、スプライス形態および／または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）ならびにそれらの組み合わせ）を示し得る。
【０２４３】
この配列をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマー：ＴＧＡＣＣＴＴＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＡＴＧ（配列番号８１）およびＴＣＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＴＡＴＣＡＣＡＣＣＣＣ（配列番号８２）を、以下のヒトｃＤＮＡプール：プール１−副腎、骨髄、脳−扁桃、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全体、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮、プール２−癌組織プールおよびプール３−発生プール、に対して使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングした。
【０２４４】
プライマーを、本発明のＤＮＡ配列／タンパク質配列の全長または部分（１以上のエキソン）のインシリコ予測に基づいて、または密接に関連するヒト配列もしくは他種由来の配列に対する推定エキソンの翻訳相同性によって設計した。通常、複数のクローンを配列決定し、次いでＳｅｑＣａｌｌｉｎｇプロセスに類似してアセンブリされる配列を誘導した。さらに、配列トレースを、手動で評価し、適切な場合、較正のために編集した。
【０２４５】
エキソン連結によって同定される配列を、以下の供給源の少なくともいくつか由来の情報を使用してインシリコで伸長した：ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ１４４８６１１５０　１４４８６１１２２　１４４８６１１２７、およびゲノムクローンｇｅｎ：ｇｂ＿ＡＬ３５６７９７　ＨＴＧ　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ｜Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　Ｘ染色体クローンＲＰ１１−４０４Ｐ１６、２８個の順不同の断片、１５８７４９ｂｐのスプライシングゲノム領域３９６１４−３９６０２。
【０２４６】
新規リゾチームＣ−１前駆体様タンパク質をコードする、４６１ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ６ｄ核酸（ＣｕｒａＧｅｎ登録番号３０４１２３０６＿０＿１００＿ｄａｌ（Ｂ）と称される）を、表６Ｊに示す。ヌクレオチド１〜３のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド４５９〜４６１のＴＧＡコドンで終わるオープンリーディングフレームを、同定した。配列データベースの検索において、例えば、本発明の核酸配列が、Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ　ｅｎｔｅｌｌｕｓ由来のｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＰＥＬＹＳＯＣ｜ａｃｃ：Ｘ６０２３５　ｍＲＮＡ（リゾチームｃのＰ．ｅｎｔｅｌｌｕｓ　ｍＲＮＡ）に対して４２０塩基のうち２６３塩基（６２％）が同一であることが見出された（Ｅ＝３．２ｅ−１６）。
【０２４７】
【表５０】
2004501623.tif 000062
【０２４８】
１５３アミノ酸残基を有するコードされるＮＯＶ６ｄタンパク質を、一文字コードを使用して表６Ｋに示す。ＮＯＶ６ｄは、Ｃ末端の６アミノ酸の欠失によって、ＮＯＶ６ａとは異なる。
【０２４９】
【表５１】
2004501623.tif 000063
【０２５０】
本発明のタンパク質の全長アミノ酸配列は、Ａｎａｓ　ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ（家禽アヒル）由来の１４７アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ００７０５タンパク質（ＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ３．２．１．１７））（１，４−ＢＥＴＡ−Ｎ−ＡＣＥＴＹＬＭＵＲＡＭＩＤＡＳＥ　Ｃ）に対して、１４７アミノ酸残基のうち７５残基（５１％）が同一であり、そして１４７アミノ酸残基のうち１０３残基（７０％）がポジティブであることが見出された（Ｅ値＝５．８ｅ−４０）。
【０２５１】
開示されたＮＯＶ６ｄリゾチームＣ−１前駆体様タンパク質は、少なくとも以下の組織において発現される：軟骨、脾臓、肺、腎臓、白血球、血漿、唾液、乳汁および涙。この情報を、参考文献を含む本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって、誘導した。さらに、この配列は、種Ｐｒｅｓｂｙｔｉｓ　ｅｎｔｅｌｌｕｓにおけるリゾチームｃホモログについての密接に関連したＰ．ｅｎｔｅｌｌｕｓ　ｍＲＮＡである、ｇｂ：ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＰＥＬＹＳＯＣ｜ａｃｃ：Ｘ６０２３５の発現パターンに起因して、以下の組織において発現されることが予測される。
【０２５２】
本発明のＮＯＶ６タンパク質は、既知のタンパク質に対する良好な類似性を示す。例えば、１５９アミノ酸のヒト加水分解酵素タンパク質−１（ＨＹＤＲＬ−１）である、ｐａｔｐ：ＡＡＹ７１１０３に対するＢＬＡＳＴは、１５２／１５３（９９％）の同一性および１５３／１５３（９９％）のポジティブを生成した（Ｅ＝２．６ｅ−８４）。ＷＯ００／２８０４５。ＡＡＹ７１１０３は、種々の障害の診断、処置および予防のために有用なヒト加水分解酵素タンパク質として記載され、そしてＣｏｌｏｂｕｓ種およびＮａｓａｌｉｓ　ｌａｒｖａｔｉｓ由来のリゾチーム−ｃ前駆体、ならびにＰａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓ由来のリゾチームに対する相同性を有するとして特徴付けられる。アラインメントを、表６Ｌに示す。
【０２５３】
【表５２】
2004501623.tif 000064
【０２５４】
開示されたＮＯＶ６タンパク質（配列番号１４）は、リゾチーム様タンパク質に対して良好な同一性を有する。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析のために使用される同一性情報を、表６Ｍに示す。
【０２５５】
【表５３】
2004501623.tif 000065
【０２５６】
この情報を、関連のタンパク質配列に対してＮＯＶ６を比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析として、表６Ｎに与えられる複数配列アラインメントにおいて（ＮＯＶ６ａを１列目に示して）図示する。
【０２５７】
【表５４】
2004501623.tif 000066
2004501623.tif 000067
【０２５８】
ＢＬＡＳＴＰ非縮重複合（Ｎｏｎ−Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）データベースからのベストヒットは、以下を含む：Ａｎａｓ　ｐｌａｔｙｒｈｙｎｃｈｏｓ（家禽アヒル）由来の１４７アミノ酸のタンパク質、ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ００７０５　ＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ３．２．１．１７）（１，４−ＢＥＴＡ−Ｎ−ＡＣＥＴＹＬＭＵＲＡＭＩＤＡＳＥ　Ｃ）、期待値＝６．３ｅ−４０、同一性＝７５／１４７（５１％）、ポジティブ＝１０３／１４７（７０％）；ベアーフェイストクラッソー由来の１２９アミノ酸のタンパク質、ｐｔｎｒ：ｐｉｒ−ｉｄ：ＪＥ０１８５リゾチーム（ＥＣ３．２．１．１７）、期待値＝１．７ｅ−３９、同一性＝６８／１２９（５２％）、ポジティブ＝９５／１２９（７３％）；およびＰｈａｓｉａｎｕｓ　ｃｏｌｃｈｉｃｕｓ（コウライキジ）由来の１４７アミノ酸のタンパク質、ｐｔｎｒ：ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ−ＡＣＣ：Ｐ００７０２　ＬＹＳＯＺＹＭＥ　Ｃ−１　ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ（ＥＣ３．２．１．１７）（１，４−ＢＥＴＡ−Ｎ−ＡＣＥＴＹＬＭＵＲＡＭＩＤＡＳＥ　Ｃ）、期待値＝５．６ｅ−３９、同一性＝６６／１４３（４６％）、ポジティブ＝１０１／１４３（７０％）。
【０２５９】
ＮＯＶ６についてのさらなるＢｌａｓｔ　Ｘ情報を、表６Ｏに示す。
【０２６０】
【表５５】
2004501623.tif 000068
【０２６１】
ＮＯＶ６における同定可能なドメインの存在を、アルゴリズム（例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、Ｐｒｉｎｔｓ）を使用する検索によって、次いで、Ｉｎｔｅｒｐｒｏウェブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／）を使用するドメイン一致（または数）を掛け合わせてＩｎｔｅｒｐｒｏ数を決定することによって、決定した。
【０２６２】
ＮＯＶ６についてのＤＯＭＡＩＮ結果を、保存されたドメインデータベース（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｄａｔａｂａｓｅ）（ＣＤＤ）から、逆位特異的（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＢＬＡＳＴを用いて収集した。このＢＬＡＳＴは、Ｓｍａｒｔ収集およびＰｆａｍ収集において見出されるドメインをサンプリングする。この結果を、統計値およびドメインの説明と共に、表６Ｐおよび表６Ｑに列挙する。これらの結果は、このタンパク質が、αラクトアルブミンファミリー由来のリゾチームＣドメインを含むことを示す。ＮＯＶ６ａのアミノ酸２２〜１４７は、ｓｍａｒｔ００２６３ドメインのアミノ酸１〜１２５（表６Ｐにおいて配列番号８９として示される）と整列し、ＮＯＶ６ａのアミノ酸２２〜１４７は、ｐｆａｍ０００６２ドメインのアミノ酸１〜１２２（表６Ｑにおいて配列番号９０として示される）と整列する。
【０２６３】
ＮＯＶ６ａについての良好なＥ値（１ｅ−３４および３ｅ−３３）は、ＮＯＶ６の配列が、このドメインを含むことが既知の他のタンパク質の特性と類似の特性を有することを示す。
【０２６４】
【表５６】
2004501623.tif 000069
【０２６５】
【表５７】
2004501623.tif 000070
【０２６６】
Ｉｎｔｅｒｐｒｏ登録ＩＰＲ００１９１６；Ｌａｃｔａｌｂｍｎ＿ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１７３タンパク質一致）は、グリコシド加水分解酵素ファミリー２２に一致する。特徴的な配列としては、以下が挙げられる：ＰＳ００１２８；ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ＿ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１４９タンパク質）；ＰＲ００１３５；ｌｙｚｌａｃｔ（１４０タンパク質）；ＰＦ０００６２；ｌｙｓ（１７１タンパク質）；ＳＭ００２６３；ＬＹＺ１（１５６タンパク質）；ＩＰＲ０００５４５；Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ（４８タンパク質）；およびＩＰＲ０００９７４；Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（９８タンパク質）。グリコシド加水分解酵素ファミリー２２［ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｈｆ＿２２．ｈｔｍｌ］は、２つの既知の活性を有する酵素を含む；Ｃ型リゾチーム（ＥＣ３．２．１．１７）およびα−ラクトアルブミン。
【０２６７】
上に例示されたドメイン結果はまた、ＮＯＶ６がαラクトアルブミンファミリー由来のリゾチームＣドメインを含むことを実証する。Ｃ型リゾチームおよびα−ラクトアルブミンは、一次配列および一次構造に関して両方とも類似し、そしておそらく、共通の祖先タンパク質から進化した。約３５〜４０％の残基、および各々において４つのジスルフィド結合の位置が両方のタンパク質において保存される。ジスルフィド結合は、システインｎとシステインｎ＋２（例えば、１番目のシステインと３番目のシステイン）の間である。特徴的な配列の図については、Ｐｒｏｓｉｔｅ　ＰＤＯＣ００１１９を参照のこと。
【０２６８】
リゾチームは、細菌細胞壁の多糖類の加水分解を触媒する；これはまた、特定の反芻動物およびオナガザル（ｃｏｌｏｂｉｎｅ　ｍｏｎｋｅｙ）において消化の役割のために補充される（ＩｒｗｉｎおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１１３８７−１１３９３、１９８９）。これら２つの酵素間の別の顕著な差異は、全てのラクトアルブミンが、カルシウムを結合する能力を有する（Ｓｔｕａｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：８４−８７、１９８６）が、この特性が、少数のリゾチームのみに限定されることである（Ｎｉｔｔａら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２２３：４０５−４０８、１９８７）。
【０２６９】
リゾチームは、細菌細胞壁の特定のムコ多糖類の加水分解を触媒する。具体的には、これは、Ｎ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの間の、細菌細胞壁のβ（１−４）グリコシド結合の加水分解を触媒する。これは、脾臓、肺、腎臓、白血球、血漿、唾液、乳汁および涙に見出される。ＦｌｅｍｉｎｇおよびＡｌｌｉｓｏｎ（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．３：２５２−２６０、１９２２）は、実にいずれの組織の中でも最高の、軟骨における異例の高濃度を実証した。軟骨におけるその役割は未知である。Ｎｅｕｆｅｌｄ（私信。Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、１９７２）は、リゾチームの遺伝的欠損が、骨格形成異常症の基礎であり得ることを示唆した。Ｓｐｉｔｚｎａｇｅｌら（（要約）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：９３Ａのみ、１９７２）は、リゾチームレベルの約５０％の減少を生じる、特定の型の好中球顆粒の選択的欠損を有する患者を観察した。この患者は、感染に対する増大した感受性を示した。
【０２７０】
Ｐｒｉｅｕｒら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．７７：２８３−２９６、１９７４）は、ウサギにおける遺伝性リゾチーム欠損を記載した。軟骨の異常も骨の異常も、特に言及されていない（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　３８５：４３５−４３７、１９７５）。年かさの変異ウサギは、感染、特に、皮下の膿瘍に対する増大した感受性を示した（私信。Ｐｕｌｌｍａｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、５／１３／１９７５）。Ｃａｍａｒａら（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３：５４４−５５０、１９９０）は、ウサギリゾチームの２つのアイソザイムを同定し、そしてこれらの分布が組織特異的であることを示した。白血球リゾチームおよび胃腸リゾチームは明らかに識別され、そして電気泳動的およびクロマトグラフィー的には胃腸アイソザイムに類似するが、動力学的には類似しない可能なリンパ上皮アイソザイムを実証した。変異体の、リゾチーム欠損ウサギは、検出可能な白血球アイソザイムを完全に欠いたが、正常ウサギの胃腸リゾチームおよびリンパ上皮リゾチームと識別不可能な胃腸リゾチームおよびリンパ上皮リゾチームを有した。電気泳動方法によって、変異ウサギが、正常ウサギの白血球アイソザイムのタンパク質バンドに対応するタンパク質バンドを欠くことが示された。
【０２７１】
Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５０：７９４−８０１、１９８８）は、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから、ヒトリゾチームをコードするｃＤＮＡを単離した。この１．５ｋｂのｃＤＮＡは、１８アミノ酸からなるシグナルペプチドおよび成熟リゾチームをコードした。ヌクレオチド配列から推測された成熟リゾチームのアミノ酸配列を、公開配列を用いて同定した。ヒトリゾチームは、１３０アミノ酸残基および４つのジスルフィド結合を有する（Ｔａｎｉｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：６４５６−６４６１、１９９１）。Ｐｅｔｅｒｓら（（要約）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ．５１：１０５９のみ、１９８９）は、ヒトリゾチーム遺伝子領域の２５ｋｂを含む２つの重複するゲノムクローンの単離を記載した。彼らはまた、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから、全長ヒトリゾチームｃＤＮＡクローンを単離した。彼らは、構造遺伝子全体およびｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に関して報告した。体細胞ハイブリッドのパネルを使用して、Ｐｅｔｅｒｓら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３８：６４１９−６４２７、１９８９）は、リゾチーム遺伝子を、ヒト第１２染色体に割り当てた。
【０２７２】
Ｃａｎｅｔら（１９９９）は、ストップドフロー蛍光および質量分析に連鎖した水素交換パルス標識によって、ヒトリゾチームおよびこのアミロイド形成的改変体のうち２種（ｉｌｅ５６からｔｈｒおよびａｓｐ６７からｈｉｓ）の非折り畳み特性および再折り畳み特性を研究した。彼らの結果は、リゾチーム改変体のアミロイド形成的性質が、部分的に折り畳まれた中間体と比較してネイティブな折り畳みの安定性の減少を引き起こすことを示唆した。この不安定性の起源は、主に折り畳み比の減少による場合および非折り畳み比の増加による他の場合において生じる、２種の改変体と異なった。両方の場合において、これは、ゆっくりと凝集し得る可溶性の部分的に折り畳まれた種の低集団を生じ、そしてアミロイド原線維を形成する様式を制御した。
【０２７３】
ヒトにおいて、腎アミロイドーシスにおけるＬＹＺ遺伝子の変異は、遺伝的疾患とリゾチームの最初の関連を示した（ＯＭＩＭ１５３４５０、１５３４５０．０００１および１５３４５０．０００２を参照のこと）。一般に、Ｐｒｏｓｉｔｅ　ＰＤＣ００１１９、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ　ｅｎｔｒｉｅｓ　ＩＰＲ００１９１６、ＩＰＲ０００９７４およびＩＰＲ０００５４５を参照のこと。
【０２７４】
開示されるＮＯＶ６リゾチームＣ−１前駆体様タンパク質は、染色体Ｘｐ１１．１−１１．３に位置する。この情報は、ＯＭＩＭ、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって実行される電気的ノザン生物情報ツール、公的ＥＳＴ、公的参考文献および／またはゲノムクローン相同性を使用して割り当てた。これは、本発明に含まれるＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリ、ゲノムクローン、参考文献および／またはＥＳＴ配列の染色体マッピングを駆動するために実行した。
【０２７５】
開示されるＮＯＶ６ａリゾチームＣ−１前駆体様タンパク質は、少なくとも以下の組織において発現される：軟骨、精巣、胎児脳、脾臓、肺、腎臓、白血球、血漿、唾液、乳汁、涙。これらの情報は、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ供給源、公的ＥＳＴ供給源、ゲノムクローン供給源、文献供給源および／またはＲＡＣＥ供給源を含むが、これらに限定されない本発明に含まれる配列の組織供給源を決定することによって駆動された。
【０２７６】
本明細書中に開示されるリゾチームＣ−１前駆体様タンパク質および核酸に関するタンパク質類似性情報、発現パターンおよびマップ位置は、リゾチームＣ−１前駆体がリゾチームＣ−１前駆体ファミリーおよび関連するグリコシド加水分解酵素ファミリーに特徴的な重要な構造的および／または生理的機能を有し得ることを示唆する。従って、本発明の新規な核酸およびＮＯＶ６タンパク質またはそれらのフラグメントは、潜在的な診断用途および治療用途において、ならびに研究ツールとして、有用である。これらとしては、核酸またはタンパク質の存在または量が評価される、特異的または選択的な核酸またはタンパク質の診断マーカーおよび／または予後マーカーとして働くこと、ならびに以下のような潜在的な治療用途が挙げられる：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）低分子薬物標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療的、診断的、薬物標的化／細胞傷害性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療において有用な核酸（遺伝子送達／遺伝子切除）および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防御兵器。
【０２７７】
本発明のＮＯＶ６核酸およびタンパク質は、以下に記載する種々の疾患および障害ならびに／または他の病理に関連する潜在的な診断および治療の用途において、有用である。例えば、本発明の組成物は、以下を罹患する患者の処置のために効力を有する：感染、アシロイドーシスに対する感受性；血友病および凝固能亢進を含む血液障害；唾液障害；消化障害、炎症性プロセス、筋肉、骨および腱障害；特発性血小板減少性紫斑病；免疫欠損；対宿主性移植片病；感染；全身性エリテマトーデス；自己免疫疾患；ぜん息、気腫；強皮症；アレルギー；ＡＲＤＳ；糖尿病；腎動脈狭窄；間質性腎炎；糸球体腎炎；多発性嚢胞腎疾患；尿細管性アシドーシス；ＩｇＡ腎症；高カルシウム血症；レッシュ−ナイハン症候群；腎アミロイドーシス；関節炎；腱炎；生殖障害、精神遅延および異常行動を伴う繊毛アテトーシス；腎細胞癌；乳頭、２；レンペニング症候群−１；肉腫、滑液；関節拘縮症；Ｘ連鎖（萎縮棘筋、乳児性、Ｘ連鎖）精神遅延症候群；Ｘ−連鎖、ｓｉｄｅｒｉｕｓ型精神遅延；Ｘ連鎖１４精神遅延；Ｘ連鎖、非特異的、５０型精神遅延；Ｘ結合、症候群７精神遅延；色素性網膜炎−２；フォン・ヒッペル‐リンダウ（ＶＨＬ）症候群；アルツハイマー病、発作、結節硬化症、高カルシウム血症、パーキンソン病、ハンティングトン病、脳性小児麻痺、てんかん、多発性硬化症、毛細管拡張性運動失調、白質ジストロフィー、行動障害、嗜癖、不安、疼痛および他の疾患、障害ならびに同様の状態など。
【０２７８】
ポリペプチドは、本発明の特異的な抗体を産生するための免疫源およびワクチンとして使用され得る。これらをまた、使用して、潜在的なアゴニストおよびアンタゴニスト化合物をスクリーニングし得る。例えば、リゾチームＣ様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてリゾチームＣ様タンパク質は、それを必要とする被験体に投与する場合、有用であり得る。これらの材料は、さらに、治療的方法または診断的方法における使用のための新規なＮＯＶ６物質に免疫特異的に結合する抗体の産生に有用である。これらの抗体は、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるように、疎水性チャートからの推定を使用して、当該分野で公知の方法に従って、産生され得る。
【０２７９】
ＮＯＶ６ｂは、以下の実施例１の記載されるように組織発現プロフィールについて分析される。
【０２８０】
（ＮＯＶ７）
ＮＯＶ７は、以下に開示される、ＮＯＶ７ａ、ＮＯＶ７ｂおよびＮＯＶ７ｃと命名される、３つの類似の核酸および３つの類似のタンパク質のファミリーを含む。開示される核酸は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質をコードする。
【０２８１】
（ＮＯＶ７ａ）
３４３０ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ７ａ核酸（ＣＧ５１３７３−１０としても称される）を表７Ａに示す。ＯＲＦは、ヌクレオチド３５１〜３５３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド２４９０〜２４９２におけるＴＧＡコドンで終わる。開始コドンから上流および終止コドンから下流の推定非転写領域を表７Ａにおいて下線を引いて示し、そして開始コドンおよび終止コドンを、太文字で示す。ＮＯＶ７ａ遺伝子は、染色体２１ｐ２１に位置する。この割当は、開示された配列と配列同一性を共有するゲノムクローン、公的遺伝子および公的ＥＳＴに関連する情報のマッピングならびにＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの電気的ノザン生物情報ツールを使用してなされる。
【０２８２】
【表５８】
2004501623.tif 000071
2004501623.tif 000072
【０２８３】
配列番号２４によってコードされるＮＯＶ７ａタンパク質は、７１３個のアミノ酸残基を有し、そして表７Ｂ中の一文字コードを使用して表される。ＮＯＶ７ａのＰｓｏｒｔプロフィールは、この配列が０．７０００の確実度を有する形質膜に位置するようであることを示す。
【０２８４】
【表５９】
2004501623.tif 000073
【０２８５】
ＮＯＶ７ａについての開示された核酸配列は、神経細胞接着分子１ラージアイソフォーム前駆体（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＡＫ０２２７０８｜ａｃｃ：ＡＫ０２２７０８．１）にわずかに類似のＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１２６４６　ｆｉｓ　クローンＮＴ２ＲＭ４００１９８７と同一である２６５９塩基のうち２６４９（９９％）を有する。同様に、完全ＮＯＶ７ａアミノ酸配列は、神経細胞接着分子１ラージアイソフォーム前駆体（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｈ９Ｎ１）にわずかに類似のＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ＣＤＮＡ　ＦＬＪ１２６４６　ＦＩＳ　クローンＮＴ２ＲＭ４００１９８７に５７１アミノ酸残基に５７２のうち５６６のアミノ酸残基（９７％）が同一、および５７２アミノ酸残基のうちに５５８のアミノ酸残基に類似（９７％）である。細胞接触分子は、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのサブセットである。
【０２８６】
本明細書に開示されるタンパク質における同定可能なドメインの存在を、Ｐｆａｍ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰｒｏＤｏｍ、ＢｌｏｃｋｓまたはＰｒｉｎｔｓのようなドメインデータベースを使用する検索によって決定し、次いでＩｎｔｅｒｐｒｏドメイン登録番号によって同定する。有意なドメインを表７Ｃに要約した。
【０２８７】
【表６０】
2004501623.tif 000074
【０２８８】
神経細胞接触分子と免疫グロブリン様ドメインとの関連性に基づいて、ＮＯＶ７ａタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質に属する神経細胞接触因子である。
【０２８９】
ＮＯＶ７ａについて可能なｃＳＮＰは、表７Ｄに見出されるｃＳＮＰを含む
【０２９０】
【表６１】
2004501623.tif 000075
【０２９１】
ＮＯＶ７ａ遺伝子は、以下において発現される：副腎、骨髄、脳（扁桃）、脳（小脳）、脳（海馬）、脳（白質）、脳（視床）、脳（全体）、胎児脳、胎児腎臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫（Ｒａｊｉ）、乳腺、膵臓、下垂体、胎盤、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気道および子宮。従って、ＮＯＶ７ａ核酸は、これらの組織型を同定するのに有用である。
【０２９２】
（ＮＯＶ７ｂ）
３３７９ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ７ｂ核酸（２０４２１３３８＿１またはＣＧ５１３７３−０３としても称される）を表７Ｅに示す。ＯＲＦは、ヌクレオチド３５１〜３５３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド２４３９〜２４４１におけるＴＧＡコドンで終わる。
【０２９３】
【表６２】
2004501623.tif 000076
【０２９４】
ＮＯＶ７ｂ遺伝子は、リンパ節、卵巣、胎児肺、胎児腎臓および副腎において発現する。従って、ＮＯＶ７ｂ核酸は、これらの組織型を同定するのに有用である。
【０２９５】
コードされたＮＯＶ７ｂタンパク質を、表７Ｆに示す。開示されるタンパク質は、６９６アミノ酸長であり、そして配列番号２６によって示す。ＮＯＶ７ａと同様に、ＮＯＶ７ｂのＰｓｏｒｔプロフィールは、０．７０００の確実度を有して形質膜に位置するようであることを示す。
【０２９６】
【表６３】
2004501623.tif 000077
【０２９７】
配列データベースの検索において、例えば、ＮＯＶ７ｂポリペプチド配列は、ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来の不規則なキアズマｃ−ｒｏｕｇｈｅｓｔタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＡ９１８５０）に同一な４１０アミノ酸のうち４１０（１００％）を有する。
【０２９８】
ＮＯＶ７ｂについての可能なｃＳＮＰは、表７Ｇに見出されるｃＳＮＰを含む。
【０２９９】
【表６４】
2004501623.tif 000078
【０３００】
（ＮＯＶ７ｃ）
１１４５ヌクレオチドの開示されるＮＯＶ７ｃ核酸（２０４１３３８＿２またはＣＧ５１３７３−０４としても称される）を表７Ｈに示す。ＯＲＦは、ヌクレオチド３５１〜３５３においてＡＴＧ開始コドンで始まり、ヌクレオチド９１８〜９２０におけるＴＧＡコドンで終わる。
【０３０１】
【表６５】
2004501623.tif 000079
【０３０２】
ＮＯＶ７ｃ遺伝子は、リンパ節、卵巣および副腎において発現される。従って、ＮＯＶ７ｃ核酸は、これらの組織型を同定するのに有用である。
【０３０３】
配列番号２８によってコードされるＮＯＶ７ｃタンパク質は、１８９個のアミノ酸残基を有し、そして表７Ｉ中の一文字コードを使用して表される。ＮＯＶ７ｃのＰｓｏｒｔプロフィールは、この配列が０．４５００の確実度を有して形質膜に位置するようであることを示す。
【０３０４】
【表６６】
2004501623.tif 000080
【０３０５】
配列データベースの検索において、例えば、ＮＯＶ７ｃポリペプチド配列は、ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ由来のＦ２２１６２＿１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ９Ｙ４Ａ４）に同一な１３５アミノ酸のうち４５（３３％）を有する。
【０３０６】
ＮＯＶ７ｃについての可能なｃＳＮＰは、表７Ｊに見出されるｃＳＮＰを含む。
【０３０７】
【表６７】
2004501623.tif 000081
【０３０８】
ＮＯＶ７ａ、ＮＯＶ７ｂまたはＮＯＶ７ｃとして具体的にいわない場合、ＮＯＶ７に対する任意の言及は、全ての改変体を含むとみなされる。本明細書中の任意のＮＯＶＸ改変体配列の間で異なる残基は、「１つの（ａ）」改変体中の残基および「ａ」改変体に対する残基位置を示すために書かれる。個々のＮＯＶ７改変体の間で異なる、以下の全ての配列アラインメント中のＮＯＶ７残基を、四角で強調し、そして本明細書中の全てのアラインメントの改変体の残基の上に（ｏ）記号でマークする。例えば、表７Ｌの１行目に示されるタンパク質は、ＮＯＶ７ａについての配列を示し、そしてＮＯＶ７ｂが異なる位置を（ｏ）記号でマークし、そして四角で強調した。
【０３０９】
開示されるＮＯＶ７タンパク質は、多くの免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質に高い同一性を有する。ＣｌｕｓｔａｌＷ分析に使用される相同性の情報を、表７Ｋに示す。
【０３１０】
【表６８】
2004501623.tif 000082
【０３１１】
この情報は、ＮＯＶ７を関連タンパク質配列と比較するＣｌｕｓｔａｌＷ分析のように、表７Ｌに提供する複数配列整列にグラフで表す（ＮＯＶ７ａを１行目に示す）。
【０３１２】
【表６９】
2004501623.tif 000083
2004501623.tif 000084
2004501623.tif 000085
【０３１３】
ＮＯＶ７ａに関するＤＯＭＡＩＮの結果は、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＢＬＡＳＴを用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎ　Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から収集した。このＢＬＡＳＴは、Ｓｍａｒｔ　ａｎｄ　Ｐｆａｍコレクションにおいて見出されるドメインをサンプリングする。ＮＯＶ７ａについての結果を、統計およびドメインの説明と共に表７Ｍに列挙する。
【０３１４】
【表７０】
2004501623.tif 000086
【０３１５】
ｓｍａｒｔ００４０９とのアライメントを、表７Ｎに示す。免疫グロブリンドメインとのＮＯＶ７との類似性は、ＮＯＶ７配列が、このドメインを含むような公知の他のタンパク質の配列と類似の特性を有することを示す。
【０３１６】
【表７１】
2004501623.tif 000087
【０３１７】
他の免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーとの配列相同性およびドメイン情報に基づいて、開示されたＮＯＶ７タンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質−リガンド相互作用に関与するようである。
【０３１８】
ＮＯＶ７の核酸およびタンパク質は、さらに以下に記載される、種々の病理学的障害を含む潜在的な治療的適用に有用である。例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そして免疫グロブリンスーパーファミリー様タンパク質は、それを必要とする被験体に投与する場合、有用であり得る。
【０３１９】
本発明の核酸は、種々の疾患および障害の診断および／または処置において適用を有する。例えば、本発明の組成物は、以下を患う患者の処置に効果を有する：ＣＮＳ疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）、脳梁無発育、遅延、内転した親指、不全対麻痺、脳梁の無発育または発育不全、原発性神経外胚葉腫瘍、ヒト神経奇形癌および他の癌、ヒト２型脳回欠損、再発性発作および海馬硬化症ならびに他の疾患、障害および状態。
【０３２０】
ポリペプチドは、本発明に特異的な抗体を産生するための免疫源およびワクチンとして使用され得る。これらはまた、潜在的なアゴニストおよびアンタゴニスト化合物をスクリーニングするために使用され得る。例えば、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてレセプター様タンパク質は、それを必要とする被験体に投与する場合、有用であり得る。本発明の免疫グロブリンスーパーファミリー様タンパク質をコードする核酸および免疫グロブリンスーパーファミリー様タンパク質またはそれらのフラグメントは、さらに、診断的適用において有用であり得る。この核酸またはタンパク質の存在または量が評価されるべきである。これらの材料は、治療方法または診断方法において使用するための本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の産生において、さらに有用である。これらの抗体は、当該分野で公知の方法に従って、疎水性チャートによる予測を使用して、以下の「抗ＮＯＶＸ抗体」の節に記載されるようにして産生され得る。例えば、開示されるＮＯＶ７タンパク質は、複数の疎水性領域を有し、これらのそれぞれは、免疫源として使用され得る。これらの新規のタンパク質は、様々なヒト障害の機能分析のための強力なアッセイシステムにおいて使用され得、このタンパク質は、疾患の病理学の理解および様々な障害のための新規の薬物標的の開発の際に役立つ。
【０３２１】
ＴａｑＭａｎデータを、実施例１に示す。
【０３２２】
（実施例１．種々の細胞および組織におけるクローンの定量的発現分析）
種々のクローンの定量的発現を、リアルタイム定量ＰＣＴ（ＲＴＱ　ＰＣＲ；ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））種々の正常および病理学由来の細胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含むマイクロタイタープレートを使用して評価した。ＲＴＱ　ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＥ（登録商標）　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍにおいて実施した。サンプルの種々の回収物をプレートに集め、そして以下のように称した：パネル１（正常および癌供給源由来の細胞および細胞株を含む）、パネル２（正常および癌供給源由来の、組織、特に外科的サンプル由来のサンプルを含む）、パネル３（広範な種々の癌供給源由来のサンプルを含む）およびパネル４（正常細胞および炎症状態に関連する細胞由来の細胞および細胞株を含む）。
【０３２３】
第１に、ＲＮＡサンプルをβアクチンおよびＧＡＰＤＨのような構成的に発現される遺伝子に対して正規化した。ＲＮＡ（合計約５０ｎｇまたは約１ｎｇポリＡ＋）を、製造者のプロトコールに従って、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ；カタログ番号Ｎ８０８−０２３４）およびランダムヘキサマーを使用してｃＤＮＡに変換した。反応を、２０μｌで実施し、そして３０分間４８℃でインキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、製造業者のプロトコールに従って、βアクチンおよびＧＡＰＤＨ　ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；それぞれカタログ番号４３１０８８１Ｅおよび４３１０８８４Ｅ）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４４７）を使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、別個のプレートに移した。反応を、以下のパラメータを使用して２５μｌで実施した：５０℃で２分；９５℃で１０分；９５℃で１５秒／６０℃で１分（４０サイクル）。結果を、対数スケールを使用するＣＴ値（所与のサンプルが、蛍光の閾値レベル超えるサイクル）として記録し、所与のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間のＲＮＡ濃度の差は、２のΔＣＴ乗として示した。次いで、相対発現パーセントを、このＲＮＡの差の逆数をとって１００を掛けることにより得る。βアクチンおよびＧＡＰＤＨについて得られたＣＴの平均値は、ＲＮＡサンプルを正規化するために使用した。最も高いＣＴ値を生じるＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要としないが、他の全てのサンプルは、β−アクチン／ＧＡＰＤＨの平均ＣＴ値に従ってこのサンプルと比較して希釈した。
【０３２４】
正規化ＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに転換し、製造者の指示に従って、Ｏｎｅ　Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。プローブおよびプライマーを、インプットとして標的クローンの配列を使用する、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ　ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ　Ｐｏｗｅｒ　ＰＣ用のヴァージョンＩ）または類似のアルゴリズムに従って、各アッセイに対して設定した。デフォルトの設定を、反応条件に対して使用し、そして以下のパラメータを、プライマーを選択する前に設定した：プライマーの濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔｍ）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマーの最適Ｔｍ＝５９℃、プライマーの最大差＝２℃、プローブは、５’Ｇを有さず、プローブＴｍは、プライマーＴｍよりも１０℃高くなければならず、アンプリコンサイズ７５ｂｐ〜１００ｂｐ。選択されるプローブおよびプライマー（以下を参照のこと）は、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成された。プローブを、未反応の色素を除去するために２回ＨＰＬＣ精製し、プローブのそれぞれ５’末端および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを立証するために、質量分析によって評価した。正方向プライマーおよび逆方向プライマーの最終濃度は、各々９００ｎＭであり、そしてプローブの濃度は、２００ｎＭであった。
【０３２５】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化ＲＮＡを、９６ウェルＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウェルにスポットした。２つのプローブ（標的プローブで多重化された標的特異的プローブおよび別の遺伝子特異的プローブ）を含むＰＣＲカクテルを、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７７００の１×ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（１：１：１：２の比））、０．２５Ｕ／ｍｌ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌの逆転写酵素を含む）を用いて設定した。逆転写を、４８℃で３０分間実施し、次いで以下の増幅／ＰＣＲサイクルを実施した：９５℃で１０分、次いで９０℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル。
【０３２６】
パネル１において、以下の略後を使用する。
【０３２７】
ｃａ．＝癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
＊＝転移から定着した（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｆｒｏｍ　ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）
ｍｅｔ＝転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）
ｓ　ｃｅｌｌ　ｖａｒ＝小細胞変異体（ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｖａｒｉａｎｔ）
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ）
ｓｑｕａｍ＝鱗状（ｓｑｕａｍｏｕｓ）
ｐｌ．ｅｆｆ＝胸水（ｐｌｅｕｒａｌ　ｅｆｆｕｓｉｏｎ）
ｇｌｉｏ＝神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）
（パネル２）
パネル２についてのプレートは一般的に、２個のコントロールウェルおよびＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）と密接に協力して研究する外科医によって獲得されるヒト組織から単離されたＲＮＡまたはｃＤＮＡから構成される９４個の試験サンプルを含む。これらの組織は、ヒト悪性腫瘍由来であり、多数の悪性組織を示す場合、その腫瘍に直ぐ隣接した非癌性組織から得られる「一致した辺縁（ｍａｔｃｈｅｄ　ｍａｒｇｉｎ）」を有する。これらは、正常な隣接組織と称され、そして以下の結果において「ＮＡＴ」と示す。この腫瘍組織および「一致した辺縁」は、２人の無関係の病理学者（外科病理学者および再びＮＤＲＩまたはＣＨＴＮでの病理学者による）によって評価される。この分析は、腫瘍の識別グレードの組織病理学的な総合評価を提供する。さらに、ほとんどのサンプルは、患者の臨床病期に関する情報を提供するもとの外科病理学報告を含む。これらの一致した辺縁は、手術の区域に囲まれる（すなわち、直ぐ近接した）組織（正常な隣接組織について、「ＮＡＴ」と称される）から得られる。さらに、ＲＮＡサンプルおよびｃＤＮＡサンプルを、高齢者または突然の死の被害者（事故など）において実施された検死由来の種々のヒト組織から得た。これらの組織を、疾患を含まないことを確認し、そして種々の商業供給源（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ），Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。
【０３２８】
全てのサンプル由来のＲＮＡの完全性は、ガイドとして２８Ｓおよび１８ＳのリボソームＲＮＡ染色強度比（２：１〜２．５：１　２８ｓ：１８ｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動の視覚的評価ならびに分解産物の指標である低分子量のＲＮＡの非存在によって品質について制御される。サンプルは、単一エキソンの全長にわたって増幅するように設計されたプローブおよびプライマーのセットを用いた、逆転写酵素の非存在下でのＲＴＱ　ＰＣＲ反応の実施によってゲノムＤＮＡの混入に対して制御される。
【０３２９】
（パネル３Ｄ）
パネル３Ｄのプレートは、９４個のｃＤＮＡサンプルおよび２個のコントロールサンプルからなる。特に、これらのサンプルのうち９２個は、培養されたヒト癌細胞株、２サンプルのヒト初代小脳組織および２個のコントロール由来である。これらのヒト細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＣＩまたはドイツ腫瘍細胞銀行（Ｇｅｒｍａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｂａｎｋ）から一般的に得られ、以下の組織群に分類される：舌の扁平上皮細胞癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌、肉腫、膀胱癌、膵臓癌、腎臓癌、白血病／リンパ腫、卵巣癌／子宮癌／子宮頸癌、胃癌、結腸癌、肺癌およびＣＮＳ癌の細胞株。さらに、小脳の２つの独立したサンプルが存在する。これらの細胞は、標準的推奨条件下で全て培養され、そしてＲＮＡが標準的手順を用いて抽出される。パネル３Ｄおよびパネル１．３Ｄにおける細胞株は、科学文献において用いられる最も一般的な細胞株である。
【０３３０】
全てのサンプル由来のＲＮＡの完全性は、ガイドとして２８Ｓおよび１８ＳのリボソームＲＮＡ染色強度比（２：１〜２．５：１　２８ｓ：１８ｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動の視覚的評価ならびに分解産物の指標である低分子量のＲＮＡの非存在によって品質について制御される。サンプルは、単一エキソンの全長にわたって増幅するように設計されたプローブおよびプライマーのセットを用いた、逆転写酵素の非存在下でのＲＴＱ　ＰＣＲ反応の実施によってゲノムＤＮＡの混入に対して制御される。
【０３３１】
（パネル４）
パネル４は、種々のヒト細胞株もしくは炎症状態に関連した組織から単離されたＲＮＡ（パネル４ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４ｄ）からなる９６ウェルプレート（２個のコントロールウェル、９４個の試験サンプル）上のサンプルを含む。コントロールの正常組織（例えば、結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））由来の全ＲＮＡを利用した。肝硬変の患者由来の肝臓組織およびループス患者由来の腎臓からの全ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から得た。クローン病および潰瘍性大腸炎を有するとして診断された患者由来のＲＮＡ調製物のための腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から得た。
【０３３２】
星状細胞、肺線維芽細胞、真皮線維芽細胞、冠状動脈平滑筋細胞、小気道上皮、気管支上皮、微小血管真皮内皮細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から全て購入し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによってこれらの細胞型について供給される培地中で増殖させた。これらの初代細胞型を、種々のサイトカインまたはサイトカインの組合せを用いて、示されるように、６時間および／または１２〜１４時間、活性化させた。以下のサイトカインを用いた：約１〜５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦα、約２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、約５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３。内皮細胞を、０．１％の血清を含むＣｌｏｎｅｔｉｃｓによる基礎培地中での培養によって、種々の時間の間、時折飢餓させた。
【０３３３】
単核細胞を、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液からＦｉｃｏｌｌを用いて調製した。ＬＡＫ細胞を、ＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびインターロイキン２）中で４〜６日間培養することによって、これらの細胞から調製した。次いで、細胞を、１０〜２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１〜２μｇ／ｍｌのイオノマイシン、５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２、２０〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγおよび５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８のいずれかを用いて６時間活性化した。いくつかの場合、単核細胞を、約５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）またはＰＷＭ（アメリカヤマゴボウマイトジェン）を有するＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ））中で４〜５日間培養した。サンプルを、ＲＮＡ調製のために２４時間目、４８時間目および７２時間目に得た。ＭＬＲ（混合されたリンパ球の反応物）サンプルを２人のドナー由来の血液を取得することによって得、Ｆｉｃｏｌｌを用いて単核細胞を単離し、そして単離した単核細胞を１：１で、ＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ））中で約２×１０６細胞／ｍｌの最終濃度にて混合した。ＭＬＲを、培養し、そしてサンプルを、ＲＮＡ調製のために１〜７日にわたる間の種々の時点で取得した。
【０３３４】
単球を、製造業者の指示書に従って、ＣＤ１４　Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｅａｄｓ、＋ｖｅ　ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ　Ｍａｇｎｅｔを用いて単核細胞から単離した。単球を、ＤＭＥＭ（５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦおよび５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４）中で、５〜７日間、培養することによって樹状細胞に分化させた。マクロファージを、ＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）および１０％のＡＢ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍまたは約５０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ）中で５〜７日間の単球の培養によって調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）を用いて、６時間および１２〜１４時間刺激した。樹状細胞もまた、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０３３５】
ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞をまた、製造業者の指示書に従って、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ、陽性ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ　Ｍａｇｎｅｔを用いて単核細胞から単離した。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯのＣＤ４リンパ球を、ＣＤ８細胞、ＣＤ５６細胞、ＣＤ１４細胞およびＣＤ１９細胞の単核細胞を、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９のＭｉｌｔｅｎｙｉビーズおよび陽性選択を用いて枯渇させることによって単離した。次いで、ＣＤ４５ＲＯビーズを用いて、ＣＤ４５ＲＯのＣＤ４リンパ球を、ＣＤ４５ＲＡのＣＤ４リンパ球であるままの細胞と共に単離した。ＣＤ４５ＲＡのＣＤ４リンパ球、ＣＤ４５ＲＯのＣＤ４リンパ球およびＣＤ８リンパ球を、ＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ））中に配置し、そしてＰＢＳ中の０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，ＡＴＣＣ）で一晩コートしたＦａｌｃｏｎ　６ウェル組織培養プレート上に１０６細胞／ｍｌでプレートした。６時間後および２４時間後、これらの細胞をＲＮＡ調製物から収集した。慢性的に活性化したＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、単離したＣＤ８リンパ球を、４日間、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３でコートしたプレート上で活性化し、次いで、これらの細胞を収集し、そしてＤＭＥＭ（５％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）ならびにＩＬ−２）中で増殖させた。次いで、増殖させたＣＤ８細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を結合したプレートを用いて、４日間、再び活性化させ、そして既に述べたように、増殖させた。ＲＮＡを、２回目の活性化から６時間後および２４時間後ならびに４日間の２回目の増殖培養の後に単離した。単離したＮＫ細胞を、ＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）ならびにＩＬ−２）中で４〜６日間培養し、その後、ＲＮＡを調製した。
【０３３６】
Ｂ細胞を得るために、扁桃を、ＮＤＲＩから得た。扁桃を、滅菌した解剖鋏を用いて切断し、次いで、ふるいに通した。次いで、扁桃細胞を遠心し、そしてＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ））中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。これらの細胞を活性化させるため、本発明者らは、５μｌｇ／ｍｌのＰＷＭまたは約１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および５〜１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を用いた。細胞を、２４時間目、４８時間目および７２時間目にＲＮＡ調製のために収集した。
【０３３７】
初代および二次のＴｈ１細胞／Ｔｈ２細胞およびＴｒ１細胞を調製するため、６ウェルのＦａｌｃｏｎプレートを、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）で一晩コートし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎ　Ｔｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）ならびにＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ））中で１０５〜１０６細胞／ｍｌで培養した。ＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ４（１μｇ／ｍｌ）を用いて、Ｔｈ１を指向させるが、ＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）を用いて、Ｔｈ２を指向させ、そして５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０を用いて、Ｔｒ１を指向させた。４〜５日後、活性化Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球をＤＭＥＭで１回洗浄し、そしてＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）ならびにＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ））中で４〜７日間培養した。これに続いて、活性化Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を、上記のように抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３およびサイトカインで、５日間再刺激したが、抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）の添加でアポトーシスを阻害した。４〜５日後、Ｔｈ１リンパ球、Ｔｈ２リンパ球およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いで、再びＩＬ−２で４〜７日間増殖させた。活性化Ｔｈ１リンパ球およびＴｈ２リンパ球を最大３サイクル、このように維持した。ＲＮＡを、抗ＣＤ３　ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８　ｍＡｂを結合させたプレートで２回目および３回目の活性化をさせ、そしてインターロイキン２中で４日間、２回目および３回目の増殖培養をさせた６時間後および２４時間後に初代および二次のＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１から調製した。
【０３３８】
以下の白血球細胞株を、ＡＴＣＣから入手した：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ８１２。ＥＯＬ細胞をさらに、０．１ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ中で８日間、５×１０５細胞／ｍｌで培養し、３日毎に培地を交換し、そして細胞濃度を５×１０５細胞／ｍｌに調整することによって分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭまたはＲＰＭＩを使用した（ＡＴＣＣが推奨するように）。ＲＮＡを、静止細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび１μｇ／ｍｌのイオノマイシンで６時間および１４時間活性化させた細胞のいずれかから調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２もまた、ＡＴＣＣから入手した。両方とも、ＤＭＥＭ（５％のＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭの非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ））中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を、約５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βで６時間および１４時間、活性化させたが、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、以下のサイトカインで６時間および１４時間、活性化させた：５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１３および２５ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγ。
【０３３９】
これらの細胞株および血液細胞について、ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いて約１０７細胞／ｍｌを溶解することによって調製した。簡潔には、１／１０容量のブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をこのＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスし、そして室温にて１０分の後、これらのチューブを、Ｓｏｒｖａｌｌ　ＳＳ３４ローター中で１４，０００ｒｐｍにて遠心した。この水相を取り出し、そして１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに配置した。等容量のイソプロパノールを添加し、そして−２０℃にて一晩放置した。この沈殿したＲＮＡを、９，０００ｒｐｍにて１５分間、Ｓｏｒｖａｌｌ　ＳＳ３４のローター中で遠心し、そして７０％のエタノール中で洗浄した。このペレットを、３００μｌのＲＮＡｓｅを含まない水中に再懸濁し、そして３５μｌの緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５μｌのＤＴＴ、７μｌのＲＮＡｓｉｎおよび８μｌのＤＮＡｓｅを添加した。このチューブを、３０分間３７℃にてインキュベートして混入しているゲノムＤＮＡを除去し、フェノールクロロホルムで一回抽出し、そして１／１０容量の３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２容量の１００％のエタノールを用いて再沈殿させた。このＲＮＡを遠心沈殿させ、そしてＲＮＡｓｅを含まない水中に配置した。ＲＮＡを−８０℃にて保存した。
【０３４０】
（ＮＯＶ１ａ）
遺伝子２０４２１３３８．０．４４（ＮＯＶ１ａ）の発現を、このプライマー−プローブセットＡｇ６８９（表Ａに記載される）を用いて評価した。このＲＴＱ−ＰＣＲ実施の結果を、表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、および表Ｅに示す。
【０３４１】
（表Ａ．プローブ名：６８９）
【０３４２】
【表７２】
2004501623.tif 000088
【０３４３】
（表Ｂ．パネル１．２）
【０３４４】
【表７３】
2004501623.tif 000089
2004501623.tif 000090
2004501623.tif 000091
【０３４５】
（表Ｃ．パネル２Ｄ）
【０３４６】
【表７４】
2004501623.tif 000092
2004501623.tif 000093
2004501623.tif 000094
【０３４７】
（表Ｄ．パネル３Ｄ）
【０３４８】
【表７５】
2004501623.tif 000095
2004501623.tif 000096
2004501623.tif 000097
【０３４９】
（表Ｅ．パネル４Ｄ）
【０３５０】
【表７６】
2004501623.tif 000098
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2004501623.tif 000100
2004501623.tif 000101
【０３５１】
（パネル１．２の要約）このパネル中のＮＯＶ１ａの発現は、以下を含む多数の癌細胞株中で最も高い（ＣＴ値＜２９）：卵巣癌、前立腺癌、黒色腫、腎臓癌、およびＣＮＳ癌。この遺伝子の中程度の発現から低い発現は、胎児腎臓における最も高い発現を伴って、ほとんどの正常組織中で検出される（ＣＴ値　２９〜３５）。Ａｇ６８９を用いた２つの別個のＲＴＱ−ＰＣＲ実験から得たこれらの結果は、ほぼ一致する。従って、これらのデータは、この遺伝子が、癌細胞株由来のサンプル中で非常に高く発現し、そして正常組織由来のサンプル中では同様に高くは発現しないことを明らかにする。さらに、正常な腎臓サンプル内で、成人組織と胎児組織との間で一貫性のある差異があるようである。細胞株が、概して組織より増殖性であること、および胎児組織もまた、それらの成人の対応物よりも高い増殖性区画を示すことを考慮すると、この遺伝子が細胞の増殖に関連し得ることが推察される。従って、ＮＯＶ１ａを標的とする抗体または低分子薬物は、増加した細胞増殖性を示す疾患（例えば、癌）の処置に有用であり得る。
【０３５２】
（パネル２Ｄの要約）ＮＯＶ１ａの発現のレベルは、パネル１．２について観察された発現レベルよりもこのパネルではより低いようであった（ＣＴ値　３０〜３５）。Ａｇ６８９を用いた２つの別個のＲＴＱ−ＰＣＲ実験から得たこれらの結果は、ほぼ一致する。パネル２Ｄにおけるデータは、多数のサンプルにわたって広範な発現プロフィールを示す。しかし、詳細には、特定の癌サンプル中のＮＯＶ１ａの発現について、これらの正常な隣接コントロールと比較した場合、優勢であるようである；特定の例としては、胃癌、卵巣癌および２つの結腸癌が挙げられる。従って、ＮＯＶ１ａ遺伝子産物の阻害は、胃癌、卵巣癌および特定の結腸癌の効果的な処置を提供し得る。さらに、この遺伝子は、これらの疾患を診断するためのマーカーとして有用であり得る。
【０３５３】
（パネル３Ｄの要約）パネル３ＤにおけるＮＯＶ１ａの発現は、胃癌細胞株中で最も高かった。パネル１．２Ｄで観察されたことと一致して、この遺伝子の発現は、多数の癌細胞株中で検出された。パネル３Ｄにおけるサンプルの分析は、この遺伝子が特定のセットの癌細胞株によって発現されるが、全ての癌細胞株では発現されないことを示す。詳細には、ＮＯＶ１ａの転写物は、興味深いことには、その広範な発現パターンを示す白血病／リンパ腫細胞株および結腸癌細胞株に存在しないようである。これらの組織におけるＮＯＶ１ａの転写物の欠如は、遺伝子産物がこれらの細胞にとって重要でないことを示し得る。
【０３５４】
最後に、考え合わせると、パネル１．２、パネル２Ｄ、およびパネル３Ｄからのデータは、この遺伝子が細胞の増殖において役割を果たし得ることを示す。従って、この遺伝子の発現または機能の阻害は、癌または細胞増殖に関連する他の疾患の処置のための治療的手段であり得る。
【０３５５】
（パネル４Ｄの要約）
ＮＯＶ１ａ転写物の発現は、線維芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイトおよびＣＤ４５ＲＡ（ナイーブ）Ｔ細胞に限定される。ハエにおいて、この膜貫通糖タンパク質は、細胞接着分子として機能し、そして視葉における軸索開通、プログラム細胞死、およびサナギの網膜における色素細胞分化を含む幾つかの重要な発生プロセスに関連する（Ｒｅｆ．Ａｎ　Ａｃａｄ　Ｂｒａｓ　Ｃｉｅｎｃ．２０００　Ｓｅｐ；７２（３）：３８１−８．ＰＭＩＤ：１１０２８１０２）。この分子を発現する細胞型の接着、アポトーシスおよび分化は、免疫応答および炎症の間に生じる。この転写物によってコードされるタンパク質によって設計される抗体治療剤は、白血球と内皮との間の接着相互作用をブロックすることによって炎症を低減および除去し得た。同様に、拮抗可溶性タンパク質治療剤は、このリガンドに結合することによって機能し、そしてリガンドがＮＯＶ１ａと相互作用することを防ぐ。ＮＯＶ１ａタンパク質で設計されるタンパク質治療剤および抗体治療剤はまた、この分子の活性化によって誘導されるアポトーシスをブロックし得る。これらの治療剤は、乾癬、アレルギー、遅延型過敏症、気腫、および喘息の処置において重要であ得る。
【０３５６】
（ＮＯＶ１Ｂ）
ＮＯＶ１ｂ遺伝子の発現は、表Ｆに記載のプライマー−プローブセットＡｇ２７１を使用することによって評価された。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を表Ｇに示す。
【０３５７】
【表７７】
2004501623.tif 000102
2004501623.tif 000103
2004501623.tif 000104
【０３５８】
（パネル１の要約）
このパネルにおけるＮＯＶ１ｂの発現は、正常コントロールと比較した場合、膵臓癌、前立腺癌、黒色腫、腎癌腫およびＣＮＳ癌を含む相当数の癌細胞株で最も高い。この遺伝子の発現はまた、脂肪における発現が最も高く、多くの正常組織で検出される。Ａｇ２７１を使用する２つの別個のＲＴＱ−ＰＣＲ実験から得られた結果は、大まかに一致している。パネル１．２に提示されるデータは、この遺伝子が癌細胞株由来のサンプルにおいて極めて高く発現され、そして正常組織由来のサンプルにおいて高く発現しないことを示している。さらに、正常な腎臓サンプルにおいて、成人組織と胎児組織との間に相反しない差が存在するようである。細胞株が、全体として組織より増殖性であり、そして、胎児の組織はまた、成人の対応物より高く増殖性の区分を示すことも考慮にいれると、この遺伝子が細胞増殖に関与し得ることが推測される。従って、これらを合わせて、パネル１．２、パネル２Ｄおよびパネル３Ｄからのデータは、この遺伝子が細胞増殖で役割を果たし得ることを示している。ＮＯＶ１ｂ遺伝子はまた、細胞移動および浸潤ならびに転移能力において役割を果たし得る。従って、この遺伝子の発現または機能の阻害は、癌または細胞増殖を含む他の疾患の処置の治療的手段であ得る。さらに、モノクローナル抗体を用いたＮＯＶ１ｂの治療的標的化は、特に、黒色腫、前立腺癌、腎臓細胞癌腫およびＣＮＳ癌における腫瘍細胞移動および浸潤ならびに腫瘍転移の程度を制限するかまたはブロックすることが期待される。脂肪における発現は、この遺伝子が正常な代謝機能において役割を果たしており、そして肥満および糖尿病を含む代謝病を処置するための重要な標的であり得ることを示唆し得る。
【０３５９】
（ＮＯＶ７ａ）
ＮＯＶ７ａの発現は、表Ｈに記載のプライマー−プローブセットＡｇ２７１ｂを使用して評価された。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果は、表Ｉに示されている。この発現はまた、表Ａおよび表Ｆに記載のプライマー−プローブセットＡｇ６８９およびＡｇ２７１を使用して評価された；このＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果は、表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、表Ｅおよび表Ｇに提示されており、そして上記のように要約される。
【０３６０】
【表７８】
2004501623.tif 000105
2004501623.tif 000106
2004501623.tif 000107
【０３６１】
（パネル１の要約）
このパネルにおける遺伝子ＮＯＶ７ａの発現は、正常コントロールと比較した場合、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、黒色腫、腎癌腫、およびＣＮＳ癌を含む相当数の癌細胞において最も高い。この遺伝子の発現はまた、多くの組織において低レベルで検出され、乳腺における発現が最も高い。パネル１に提示されるデータは、この遺伝子が癌細胞株由来のサンプルにおいて極めて高く発現され、そして正常組織由来のサンプルにおいて高く発現しないことを示している。さらに、正常な腎臓サンプルにおいて、成人組織と胎児組織との間に相反しない差が存在するようである。その細胞株が、全体として、組織より増殖性であり、そして胎児の組織はまた、成人の対応物より高く増殖性の区分であることを考慮すると、この遺伝子が細胞増殖に関与し得ることが推測される。従って、この遺伝子の発現または機能の阻害は、癌または細胞増殖を含む疾患の処置の治療的手段であり得る。さらに、モノクローナル抗体を使用するＮＯＶ７ａの治療的標的化は、特に、黒色腫、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、腎細胞癌腫およびＣＮＳ癌における腫瘍細胞移動および浸潤ならびに腫瘍転移の程度を制限またはブロックすることが期待される。この遺伝子はまた、種々の癌の診断および検出についての有効なマーカーであり得る。
【０３６２】
（ＮＯＶ２）
遺伝子ＮＯＶ２の発現は、表Ｊ、表Ｋ、表Ｌ、および表Ｍに記載のプライマー−プローブセットのＡｇ９９５、Ａｇ９８、Ａｇ８８３、およびＡｇ２７４９を使用して評価される。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行の結果が、表Ｎ、表Ｏ、表Ｐ、表Ｑ、表Ｒ、および表Ｓにおいて示される。
【０３６３】
【表７９】
2004501623.tif 000108
2004501623.tif 000109
2004501623.tif 000110
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【０３６４】
（パネル１の要約）
ＮＯＶ２遺伝子は、サンプルが正常な組織に由来したかまたは癌細胞株に由来したに関係なく、このパネル上のほとんどの組織において高度に発現するようである。発現は、気管において最も高かった。これらの結果は、ＮＯＶ２遺伝子の機能が種々の組織について重要であり得ることを示唆している。
【０３６５】
（パネル１．２の要約）
３つの別個のＲＴＱ　ＰＣＲ実験を実行し、ＮＯＶ２遺伝子の発現を調べた；２つが良好に一致し、これは、この遺伝子の真の発現パターンを反映していると推定される。このＮＯＶ２遺伝子は、サンプルが正常な組織に由来したかまたは癌細胞株に由来したかに関係なく、パネル上の組織のほとんどにおいて高度に発現されているようである。発現が、卵巣癌腫細胞株で最も高く；これは、ＮＯＶ２遺伝子が卵巣癌の部分集合において役割を果たしてことを示唆し得る。このパネルからなる結果は、ＮＯＶ２遺伝子の機能が種々の組織において重要であり得ることを示唆している。
【０３６６】
（パネル１．３Ｄの要約）
異なるプローブとプライマーとのセットを使用する２つの別個のＲＴＱ　ＰＣＲ実験を実行して、ＮＯＶ２遺伝子の発現を調べた；この結果は、いくつかの軽微な差異を伴うが理に適って一致した。一般に、ＮＯＶ２遺伝子は、サンプルが正常な組織に由来したかまたは癌細胞株に由来したかに関係なく、パネル上の組織のほとんどにおいて高度に発現されているようである。発現は、胎児骨格で最も高かった。脳におけるＮＯＶ２遺伝子の発現は、海馬および扁桃において最も高かった。このＬＤＬレセプター関連タンパク質（ＬＲＰ）は、幾つかの独立した研究の株を通してアルツハイマー病と関連する。ＬＲＰは、ａｐｏＥに対するレセプターであり、そしてこの３つ共通の対立遺伝子は（ａｐｏＥ　ε４）のうちの１つは、遅発型アルツハイマー病の危険性を増大することを示した。ａｐｏＥはアミロイドβ（アルツハイマー病の原発性の病状の原因となるタンパク質；老人斑）に結合するので、これは、Ａ−βクリアランスが、ＬＲＰを介してａｐｏＥ媒介取り込みを通して生じることが示唆されている。さらに、ＬＲＰにおける変異は、ＡＤの危険性を増大し得る。従って、このタンパク質は、Ａ−βクリアランスをアップレギュレートすることによるアルツハイマーの処置において有用である。ＬＲＰはまた、脳内のコレステロール輸送に関与し、そして（疎水性膜成分の輸送において特異的である）代償性のシナプス生成（ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）関与する。従って、神経の死滅が起こる任意の神経変性疾患／脳障害において、このタンパク質は、選択的な代償性シナプス生成の増大について、損傷に応答して有用であり得る。
【０３６７】
（パネル２Ｄの要約）
異なるプローブとプライマーとのセットを使用する２つの別個のＲＴＱ　ＰＣＲ実験を実行し、パネル２ＤにおけるＮＯＶ２遺伝子の発現を調べた。両方の場合において、ＮＯＶ２遺伝子の発現は、サンプルが正常な組織に由来したかまたは腫瘍に由来したかに関係なく、ほとんどの組織において高度である。しかし、不明瞭な理由によって、これらの２つの実験からの結果の間にいくつかの不一致もまた存在する；１つの可能性は、異なった発現をするこれらのタンパク質のスプライス改変体が存在することである。１つの実験において、ＮＯＶ２遺伝子発現は、正常な腎臓サンプルにおいて最も高かったが、他方において、これは正常な前立腺において最も高かった。
【０３６８】
（パネル３Ｄの要約）
ＮＯＶ２遺伝子の遍在的な高度な発現を、このパネル上の癌細胞株サンプルの全てにおいて検出し、膵管腺癌において発現が最も高かった。これらの結果は、他方のパネルにおいて見られたものと一致し、そしてさらに、この遺伝子が主要な細胞型の機能において役割を果たすとういう考えに対する支持を提供する。
【０３６９】
（パネル４Ｄの要約）
Ａｇ９９５について、ほとんどの組織における処置に関わらず、この転写物の高度な発現が存在した。例外は、炎症性腸疾患に罹患する患者由来の結腸である。正常な結腸は、高レベルを発現するが、炎症を起こした腸は、相対的に低いレベルのこの転写物を発現する。従って、この抗原に対する作動性タンパク質治療剤は、ＩＢＤの間の炎症プロセスを、低減するかまたはブロックし得る。Ａｇ２７４９に関する知見は、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βで処理した肺微小血管内皮細胞による転写物の発現の例外はあるが、Ａｇ９９５についての知見と一致する。これらの内皮細胞による高度の転写物の発現は、増幅プロットに基づく、ＰＣＲの人工産物のようである。
【０３７０】
（ＮＯＶ４Ａ）
ＮＯＶ４ａの発現は、表Ｔおよび表Ｕに記載される、プライマー−プローブセットＡｇ２６５０およびＡｇ１０７２を使用して評価された。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表Ｖ、Ｗ、ＸおよびＹに示す。
【０３７１】
【表８０】
2004501623.tif 000122
2004501623.tif 000123
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【０３７２】
（パネル１．２の要約）
３つの別々のＲＴＱ　ＰＣＲ実験を、ＮＯＶ４ａ遺伝子を発現を見るために実行した：２回は、良好な一致であり、そしてこの遺伝子の真の発現パターンを反映していると推定される。パネル１．２において、組織にまたがるこの遺伝子の発現によって、その発現が、胎盤組織に大部分限定されることが明らかになる。従って、この遺伝子は、胎盤においてほとんど独占的に発現し、そして他の組織からこれらの組織を同定／区別するために使用され得る。
【０３７３】
（パネル１．３Ｄの要約）
パネル１．３Ｄにおける組織にまたがるこの遺伝子の発現によって、その発現が、パネル１．２について観察された結果と一致して、胎盤に大部分限定されていることを明らかにする。従って、この遺伝子は、胎盤においてほとんど独占的に発現し、そして他の組織からこれらの組織を同定／区別するために使用され得る。
【０３７４】
（パネル２Ｄの要約）
パネル２ＤにおけるＮＯＶ４ａ遺伝子の発現によって、その発現が、肺癌組織と比較した場合、隣接する正常な肺組織に限定されていることが実証される。これは、パネル２Ｄからの４対の組織サンプルのうち４つにおいて明らかである。これらを一緒にまとめると、このデータは、この遺伝子の発現が胎盤組織および肺組織に関連することを示唆する。両方の組織が、窒素および／または可溶性の気体の交換に関することを考えると、この遺伝子は、この機能に関連するプロセスに潜在的に関連し得る。従って、この遺伝子の使用は、このようなプロセスの障害において有利である。さらに、肺癌と隣接する正常な肺組織との間のこの遺伝子の発現において相違があるようであるので、この遺伝子はまた、肺癌の処置において用途を有し得る。
【０３７５】
（パネル４Ｄの要約）
異なるプローブおよびプライマーセットを使用した２つの別々のＲＴＱ　ＰＣＲ実験を、ＮＯＶ４ａ遺伝子の発現を見るために実行し、そしてその結果は、当然の一致である。この転写産物の発現は、正常な肺およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞に限定されている。この転写産物の発現パターンによって、これが、肺の中の杯状細胞を同定するための診断ツールとして有用であり得ることが示唆される。さらに、この転写産物によってコードされるタンパク質を用いて設計されたタンパク質治療物は、喘息、気腫、もしくはアレルギーに起因する炎症または粘液産生を、減少またはブロックするのに有用であり得る。
【０３７６】
（ＮＯＶ５）
ＮＯＶ５の発現を、表Ｚに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ１０７８を使用して評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ実行の結果を、表ＡＡ、ＢＢおよびＣＣに示す。
【０３７７】
【表８１】
2004501623.tif 000130
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【０３７８】
（パネル１．２の要約）
Ａｇ１０７８を使用する２つの別々のＲＴＱ−ＰＣＲ実験から得られた結果は、おおむね一致である。このパネルにおけるＮＯＶ５遺伝子の発現は、正常な組織および２つの黒色腫細胞株に大部分限定される。このパターンは、特に黒色腫細胞株を含むことに関して興味深い。なぜなら、本発明者らの実験において、これは、内皮細胞によって発現される遺伝子にいくらか特徴的であるからである。これらの観察は、血管内皮カドヘリンである内皮細胞接着分子は、安定でかつ十分に機能的な血管の形成において必須の役割を果たすという公開された報告と一致している（Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖ　２０００；１９：１〜５）。さらに、血管内皮カドヘリンに対するモノクローナル抗体は、新脈管形成、腫瘍増殖、および転移の強力なインヒビターであることが示されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２０００；６０：６８０５〜１０）。従って、ＮＯＶ５遺伝子の治療的調節は、新脈管形成の欠如もしくは過剰のそれぞれに関する疾患プロセスを増強または干渉するために、同様に使用され得る。このような疾患としては、癌、心血管疾患および異常な損傷の治癒が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７９】
（パネル２．２の要約）
ＮＯＶ５遺伝子の発現は、その癌性の対応物と比較した場合、正常組織に関係するようである。このことは、パネル１．２のデータと組み合わせた場合、この遺伝子が休止期または非活性期の内皮において発現されることを示し得る。従って、この遺伝子の治療的調節を使用して、内皮細胞の欠如もしくは過剰のそれぞれに関する疾患プロセスを増強または干渉し得る。このような疾患としては、癌、心血管疾患および異常な損傷の治癒が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、血管腫は、内皮の良性腫瘍である。血管種におけるこの遺伝子の標的化は、この疾患を無効にし得る。腫瘍はＮＯＶ５転写産物を欠くようであるので、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、腫瘍抑制物として作用し得る。従って、アゴニスト性のＮＯＶ５タンパク質治療剤を使用して、種々のヒト腫瘍を処置し、そして転移を予防し得る。
【０３８０】
（パネル４Ｄの要約）
ＮＯＶ５転写産物の発現は、線維芽細胞に限定される。この転写産物の発現は、ＩＬ−４またはγ−インターフェロン処置によって影響されないか、またはわずかにそれによって上昇し、そして、ＩＬ−１またはＴＮＦ−α処置によって減少される。この転写産物によってコードされるタンパク質は、線維芽細胞についてのマーカーとして役立ち得る。さらに、このタンパク質で設計されたアゴニスト性のタンパク質治療剤は、アレルギー、喘息、気腫および細菌感染に起因する炎症を減少し得る。なぜなら、これらの全ての状態は、ＴＮＦα／ＩＬ−１βの発現を誘導するからである。
【０３８１】
（ＮＯＶ６Ｂ）
遺伝子ＮＯＶ６ｂの発現は、表ＤＤ、ＥＥおよびＦＦに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２１７５、Ａｇ２９７８、Ａｇ２９３９、およびＡｇ６５４を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲの実行の結果は、表ＧＧおよびＨＨに示す。
【０３８２】
【表８２】
2004501623.tif 000138
2004501623.tif 000139
2004501623.tif 000140
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2004501623.tif 000145
【０３８３】
パネル１．３Ｄ　要約：異なるプローブおよびプライマーセットを用いた３つの別々のＲＴＱ−ＰＣＲ実験から得た結果は、おおよそ一致する。ＮＯＶ６ｂ遺伝子の発現は、主として精巣に制限されるようであり、従ってこの遺伝子は、精巣を同定／精巣を他の組織と区別するために使用され得る。非常に低いレベルのＮＯＶ６ｂ転写物もまた、胸腺および脳で検出され、パネル４Ｄで得た結果と一致する。
【０３８４】
パネル２．２　要約：パネル２．２におけるＮＯＶ６ｂ遺伝子の発現は、全サンプルにおいて、低く／検出不可能であった（Ｃｔ値＞３５）。
【０３８５】
パネル４Ｄ　要約：Ａｇ６５４に関して、ＮＯＶ６ｂ転写物の有意な発現が、胸腺、初代休止Ｔｒ１／Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ならびにＣＤ４０およびＩＬ−４で処理したＢ細胞中で検出される。ＩＢＤ大腸炎１における発現は、おそらく、ゲノムのコンタミネーションに起因する。この分子は、胸腺のＴ細胞発達、Ｔ細胞およびＢ細胞の分化、ならびにＢ細胞アイソタイプのスイッチングに重要であり得る。低分子治療剤によるこの分子の調節は、免疫を調節するために機能し、そして組織移植、ワクチン開発および自己免疫疾患の処置に重要であり得る。Ａｇ２９３９に関して、全サンプルが、ＣＴ値＞３５を有した；しかし、最も高い発現レベルが、胸腺において再び観察された。
【０３８６】
（ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド）
本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸に関する。ＮＯＶＸコード核酸（例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての使用のためのフラグメントもまた、本発明に含まれる。本明細書中に使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて作製されたＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログ、ならびに、これらの誘導体、フラグメント、およびホモログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０３８７】
ＮＯＶＸ核酸は、成熟形態のＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書中に使用される場合、本発明に開示される「成熟」形態のポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質としては、非限定的な例として、対応する遺伝子によってコードされる全長遺伝子産物が挙げられる。あるいは、これは、本明細書中に記載されるＯＲＦによってコードされる、ポリペプチド、前駆体、またはプロタンパク質として定義され得る。産物の「成熟」形態は、再び非限定的な例として、一つ以上の天然に存在するプロセシング工程の結果として生じる。なぜなら、このプロセシング工程は、遺伝子産物を生じる細胞（すなわち、宿主細胞）内で起こり得るからである。「成熟」形態のポリペプチドまたはタンパク質を導くそのようなプロセシング工程の例としては、ＯＲＦの開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解切断が挙げられる。従って、残基１〜Ｎ（ここで、残基１は、Ｎ末端メチオニンである）を有する、前駆体ポリペプチドまたは前駆体タンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に、残存する残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎ（ここで、残基１〜残基ＭのＮ末端シグナル配列が、切断される）を有する、前駆体ポリペプチドまたは前駆体タンパク質から生じる成熟形態は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎの残基を有する。さらに、本明細書中に使用される場合、「成熟」形態のポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質分解切断事象以外の翻訳後修飾の工程から生じ得る。このようなさらなるプロセスとしては、非限定的な例として、グリコシル化、ミリスチル化またはリン酸化が挙げられる。一般的に、成熟ポリペプチドまたは成熟タンパク質は、これらのプロセスのちの１つのみの操作、またはこれらのいずれかの組み合わせの作用から生じ得る。
【０３８８】
用語「プローブ」とは、本明細書中で使用される場合、種々の長さの核酸配列をいい、好ましくは、特定の使用に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔほどの大きさの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてより短い長さのオリゴマープローブよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、メンブレンベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を有するように設計される。
【０３８９】
用語「単離された」核酸分子は、本明細書中で使用される場合、この核酸の天然の供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されているものである。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、この核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓など）のゲノムＤＮＡ中でこの核酸分子に天然で隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合、その他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合、化学的前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０３９０】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、２７のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列の任意の相補体は、標準的な分子生物学的技法および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、２７の核酸配列の全部または一部を使用して、ＮＯＶＸ分子は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＹ　ＭＡＮＵＡＬ　第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるように）を用いて単離され得る。
【０３９１】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【０３９２】
本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられ得るのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれから設計され得、そして特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ長、５０ｎｔ長、または１００ｎｔ長、好ましくは約１５ｎｔ〜３０ｎｔ長を有する核酸配列の部分を含む。本発明の１つの実施形態では、１００ｎｔ長より短い核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７の少なくとも６個連続するヌクレオチド、またはその相補体を含む。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてプローブとして用いられ得る。
【０３９３】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７に示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部分（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメント、あるいはＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）の相補体である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、または２７に示されるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、または２７に示されるヌクレオチド配列に十分相補的である核酸分子であり、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７に示されるヌクレオチド配列に対しミスマッチがほとんどまたは全くなく水素結合し得、それによって安定な二本鎖を形成する。
【０３９４】
本明細書で用いる用語場合、「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成をいい、そして、用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまたは化合物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス性、疎水性相互作用などを含む。物理的相互作用は直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物を介するか、またはその効果に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物を介してかまたはその効果に起因して生じないが、その代わりその他の実質的な化学的中間体を伴わない相互作用をいう。
【０３９５】
本明細書中に提供されるフラグメントは、少なくとも６個の（連続する）核酸または少なくとも４個の（連続する）アミノ酸の配列（それぞれ、核酸の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを可能にし、またはアミノ酸の場合には、エピトープの特異的な認識を可能にするのに十分な長さ）として規定され、そして全長配列未満のせいぜいいくらかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配列またはアミノ酸配列の任意の連続する部分に由来し得る。誘導体は、直接的にかまたは改変もしくは部分的置換によってかのいずれかでネイティブな化合物から形成される核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブな化合物に類似する（しかし、同一ではない）構造を有するが、特定の成分または側鎖に関してそれとは異なる核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成物であり得るか、または異なる進化的起源に由来し得、そして野生型と比較して、類似の代謝活性または反対の代謝活性を有し得る。ホモログは、異なる種由来の特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【０３９６】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列に比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、もしくは９５％の同一性（好ましい同一性は、８０〜９５％）で実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。
【０３９７】
用語「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の生物の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（脊椎動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列としてはまた、天然に存在する対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同的ヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同核酸配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７における保存的アミノ酸置換（以下を参照のこと）、およびＮＯＶＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性は以下に記載されている。
【０３９８】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディグフレーム（「ＯＲＦ」）によってコードされる。ＯＲＦは、潜在的にポリペプチドに翻訳され得るヌクレオチド配列に対応する。ＯＲＦを含む核酸のストレッチは、終止コドンにより中断されない。完全タンパク質のコード配列を示すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、そして３つの「停止」コドン、すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡの１つで停止する。本発明の目的のために、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方をともなうか、またはそれらのないコード配列の任意の部分であり得る。本物の細胞タンパク質をコードするための良好な候補と考えられるＯＲＦについて、最小サイズ要件（例えば、５０アミノ酸またはそれ以上のタンパク質をコードするＤＮＡのストレッチ）がしばしば設定される。　【０３９９】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の細胞型（例えば、他の組織由来）におけるＮＯＶＸホモログ、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸホモログを同定および／またはクローニングする際の使用のために設計されるプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、または２７の、少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個以上の連続するセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、または２７の少なくとも約１２個、約２５個、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個または約４００個以上の連続するアンチセンス鎖ヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域；あるいは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、または２７の天然に存在する変異体を含む。
【０４００】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じまたは相同なタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態において、このプローブはさらに、プローブに付着した標識基を含み、例えば、この標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、ＮＯＶＸタンパク質を誤って発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞のサンプル中のＮＯＶＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異しているかまたは欠失しているかを決定すること）によって使用され得る。
【０４０１】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」とは、本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドをいい、用量依存性の有無に関わらず、特定の生物学的アッセイにおいて測定されるような成熟形態を含む。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸの生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は、以下に要約される）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、または２７の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードされた部分を発現させ（例えば、インビトロでの組換え発現によって）、そしてＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価することによって調製され得る。
【０４０２】
（ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドの改変体）
本発明はさらに、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含し、従って、これらの核酸は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同じＮＯＶＸタンパク質をコードし得る。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０４０３】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７に示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＮＯＶＸ遺伝子中のこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の分散を生じ得る。天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＮＯＶＸポリペプチドの機能的活性を変化させない、ＮＯＶＸポリペプチド内の任意および全てのこのようなヌクレオチドのバリエーションならびに得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であると意図される。
【０４０４】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードし、従って、ヒトの配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、または２７とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。本発明のＮＯＶＸのｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示されるヒトＮＯＶＸ核酸に対するその相同性に基づいて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて単離され得る。
【０４０５】
従って、別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００または２０００以上のヌクレオチド長である。なお別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書中で用いられる場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関して、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである条件を記載することを意図する。
【０４０６】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ（ｐａｒａｌｏｇｓ））は、特定のヒト配列の全てまたは一部をプローブとして用い、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングに関して当該分野で周知の方法を使用して、低い、中程度の、または高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションによって得られ得る。
【０４０７】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）であり、そして温度が短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化剤の添加で達成され得る。
【０４０８】
ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、互いに少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％相同な配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％　ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中での６５℃でのハイブリダイゼーション、続く０．２×ＳＳＣ、０．０１％　ＢＳＡ中での５０℃での１回以上の洗浄である。ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７の配列にハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【０４０９】
第２の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のヌクレオチド配列を含む核酸分子またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体に、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃での６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％　ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、続いて１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中での３７℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。
【０４１０】
第３の実施形態では、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体に、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％　ＰＶＰ、０．０２％　Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％　ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）デキストラン硫酸中での４０℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％　ＳＤＳ中での５０℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知である（例えば、種交差ハイブリダイゼーションについて用いられるように）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），１９９３，ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹならびにＫｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０，ＧＥＮＥ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＡＮＤ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０４１１】
（保存的変異）
集団中に存在し得る、ＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のヌクレオチド配列への変異によって変化が導入され得、それによって、コードされたＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を変更することなく、このコードされたＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされることをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基にてアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８の配列において行われ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく、ＮＯＶＸタンパク質の野生型配列から、変更され得る残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、このような生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変更を受け入れ難いと予測される。保存的置換が行われ得るアミノ酸は、当該分野で周知である。
【０４１２】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基における変化を含む、ＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、アミノ酸配列において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、または２８とは異なるが、生物学的活性をなお保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のアミノ酸配列に対して少なくとも約４５％の相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に少なくとも約６０％相同であり、より好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に少なくとも約７０％相同であり、なおより好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に少なくとも約８０％相同であり、なおより好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に少なくとも約９０％相同であり、そしてそして最も好ましくは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に少なくとも約９５％相同である。
【０４１３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のタンパク質に相同なＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより作製され得、その結果、１以上のアミノ酸の置換，付加または欠失が、コードされるタンパク質に導入される。
【０４１４】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸタンパク質中の推定非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０４１５】
アミノ酸ファミリーの関連性はまた、側鎖の相互作用に基づいて決定され得る。置換されたアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基または完全に保存された「弱い」残基であり得る。この保存されたアミノ酸残基の「強い」基は、以下の群のうちの１つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。ここで、１文字アミノ酸コードは、互いに置換され得るアミノ酸によって分類される。同様に、保存された残基の「弱い」群は、以下のうちの任意の１つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＡＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＶＬＩＭ、ＨＦＹ。ここで、各群内の文字は、１文字アミノ酸コードを表す。
【０４１６】
１つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（ｉ）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（ｉｉ）変異ＮＯＶＸタンパク質とＮＯＶＸリガンドとの間の複合体形成；（ｉｉｉ）変異ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）。
【０４１７】
なお別の実施形態において、変異ＮＯＶＸタンパク質は、特定の生物学的機能（例えば、インスリン放出の調節）を調節する能力についてアッセイされ得る。
【０４１８】
（アンチセンス核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体に、ハイブリダイズし得るかまたは相補的である単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的であるヌクレオチド配列（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に相補的である）を含む。特定の局面では、ＮＯＶＸコード鎖の少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドまたはＮＯＶＸコード鎖全体に相補的、またはその一部分にのみ相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のＮＯＶＸ核酸分子に相補的なアンチセンス核酸が、さらに提供される。
【０４１９】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する５’および３’配列をいう（すなわち、５’および３’非翻訳領域ともいう）。
【０４２０】
本明細書に開示されるＮＯＶＸをコードするコード鎖配列が与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の規則に従って設計され得る。このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部分に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いる化学的合成または酵素的連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大するため、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を増大するために設計された種々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換されたヌクレオチドが用いられ得る）を用いて化学的に合成され得る。
【０４２１】
アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例は：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ヴィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に産生され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下のサブセクションでさらに記載されるように、目的の標的核酸に対してアンチセンス配向である）。
【０４２２】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって）。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんのメジャーグルーブ（ｍａｊｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る（例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって）。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ　ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０４２３】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに平行に走行する（例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：６６２５〜６６４１を参照のこと）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：６１３１〜６１４８を参照のこと）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（例えば、Ｉｎｏｕｅら，１９８７，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０を参照のこと）を含み得る。
【０４２４】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
核酸の改変としては、非制限的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０４２５】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ　１９８８．Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５〜５９１に記載されるハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＮＯＶＸ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈらの米国特許第４，９８７，０７１号およびＣｅｃｈらの米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡをまた使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０４２６】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域（例えば、ＮＯＶＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら．１９９２．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；Ｍａｈｅｒ，１９９２．Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４：８０７〜１５を参照のこと。
【０４２７】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（例えば、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１４６７０〜１４６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０４２８】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐら，１９９６．前出を参照のこと）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら，１９９６，前出を参照のこと）、使用され得る。
【０４２９】
別の実施形態において、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに脂溶性基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ　ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向を考慮して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出を参照のこと）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐら，１９９６，前出およびＦｉｎｎら，１９９６，Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２４：３３５７〜３３６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホラミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら，１９８９，Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１７：５９７３〜５９８８を参照のこと）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（例えば、Ｆｉｎｎら，１９９６，前出を参照のこと）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，１９７５，）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０４３０】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０４３１】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に提供されるＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明はまた、なおそのＮＯＶＸ活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントをコードするが、その任意の残基が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に示される対応する残基から変化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。
【０４３２】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するＮＯＶＸ改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換される任意の改変体を含み、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠失が、本発明に包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。
【０４３３】
本発明の１つの局面は、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびそれらの生物学的に活性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに関する。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用のために適切なポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームによって、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わるものとして、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。
【０４３４】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質あるいはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、ＮＯＶＸタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、ＮＯＶＸタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、調製物はまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、ＮＯＶＸタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満を示す。
【０４３５】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体または非ＮＯＶＸの化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０４３６】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含み、そしてＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に示されるアミノ酸配列）に十分に相同なアミノ酸配列、またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。
【０４３７】
さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＮＯＶＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０４３８】
１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８に実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子の改変または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０４３９】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップは、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸または核酸配列に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０４４０】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ　ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０４４１】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：この比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を、比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０４４２】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」またはＮＯＶＸ「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なり、かつ同一でかまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態においてＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０４４３】
１つの実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０４４４】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、Ｎ末端に異種シグナル配列を含むＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０４４５】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここで、ＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ、そして被験体に投与されて、細胞の表面上でＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボのＮＯＶＸ媒介信号伝達を抑制し得る。このＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸ同族リガンドの生体利用性に影響を与え得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害の両方の処置、ならびに細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することに、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として用いられ得、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイで用いられ得る。
【０４４６】
本発明のＮＯＶＸキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑末端または粘着（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて粘着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端のフィルイン、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を採用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニールおよび再増幅され得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的オーバハングを生じるアンカープライマーを用いて実施し得る（例えば、Ａｕｓｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合成分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、この融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０４４７】
（ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体（例えば、ＮＯＶＸタンパク質の離散した点変異または短縮型）が、変異誘発により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の１つ以上の活性を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特異的生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して被験体におけるより少ない副作用を有する。
【０４４８】
ＮＯＶＸアゴニスト（すなわち、模倣物）として、またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはＮＯＶＸタンパク質アンタゴニスト活性のためのＮＯＶＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，１９８３．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら，１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６；Ｉｋｅら，１９８３．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと。
【０４４９】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみのニックが生じる条件下、ヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法により、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０４５０】
点変異または短縮により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための種々の技術が当該分野で公知である。このような技法を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技法であるリクルーシブエンセブル変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る。例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：７８１１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら，１９９３．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６：３２７〜３３１を参照のこと。
【０４５１】
（抗ＮＯＶＸ抗体）
本発明は、本発明の任意のＮＯＶＸポリペプチドに免疫特異的に結合する、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２のような抗体または抗体フラグメントを包含する。
【０４５２】
単離されたＮＯＶＸタンパク質、またはその部分もしくはフラグメントは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を用いて、ＮＯＶＸポリペプチドに結合する抗体を産生するための免疫原として用いられ得る。完全長のＮＯＶＸタンパク質が用いられ得るが、あるいは、本発明は、免疫原としての使用のためのＮＯＶＸタンパク質の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＮＯＶＸの抗原性ペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８で示されるアミノ酸配列の少なくとも４アミノ酸残基を含み、そしてこのペプチドに対して惹起された抗体がＮＯＶＸと特異的な免疫複合体を形成するような、ＮＯＶＸのエピトープを含む。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも６、８、１０、１５、２０、または３０個のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドが、用途に依存して、そして当業者に周知の方法に従い、より短い抗原性ペプチドよりもしばしば好適である。
【０４５３】
本発明の特定の実施形態では、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸの領域、例えば、親水性領域である。抗体産生を標的にする手段として、親水性および疎水性の領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を伴うかまたは伴わない、Ｋｙｔｅ　ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ　Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、それらの全体が本明細書に参考として援用される、例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：３８２４〜３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１４２を参照のこと。
【０４５４】
本明細書で開示されるように、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のＮＯＶＸタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として利用し得る。本明細書で用いる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＮＯＶＸのような抗原に特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含む分子をいう。このような抗体は、制限されずに、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーを含む。特定の実施形態では、ヒトＮＯＶＸタンパク質に対する抗体が開示される。当該分野で公知の種々の手順が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１８、２０、２２、２４、２６、および２８のＮＯＶＸタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生のために用いられ得る。これらのタンパク質のいくつかを以下で論議する。
【０４５５】
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）が、ネイティプタンパク質、もしくはその合成改変体、または前述の誘導体での注射により免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えにより発現されたＮＯＶＸタンパク質または化学的に合成されたＮＯＶＸポリペプチドを含有し得る。この調製物は、アジュバントをさらに含み得る。免疫学的応答を増大するために用いられる種々のアジュバントは、制限されずに、フロイントの完全および不完全アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍのようなヒトアジュバント、または類似の免疫刺激剤を含む。所望であれば、ＮＯＶＸに対して惹起された抗体分子は、哺乳動物（例えば、血液）から単離され、そしてさらに、ＩｇＧ画分を得るために、プロテインＡクロマトグラフィーのような、周知の技術により精製され得る。
【０４５６】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ＮＯＶＸの特定のエピトープと免疫反応し得る、１種類の抗原結合部位のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、代表的には、モノクローナル抗体組成物は、それと免疫反応する特定のＮＯＶＸタンパク質に対し、単一の結合親和性を示す。特定のＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対して特異的なモノクローナル抗体の調製には、継続的な細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術は、制限されずに、ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５〜４９７を参照のこと）；トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Ｃｏｌｅら、１９８５　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７〜９６頁を参照のこと）を含む。ヒトモノクローナル抗体を、本発明の実施において利用し得、そしてヒトハイブリドーマを用いることによるか（例えば、Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：２０２６〜２０３０を参照のこと）、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイルスで形質転換することにより（例えば、Ｃｏｌｅら、１９８５　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．７７〜９６頁を参照のこと）産生し得る。上記の引用の各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０４５７】
本発明によれば、技術は、ＮＯＶＸタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために適合されて（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと）、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能にし得る。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技術により「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。ＮＯＶＸタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントを、当該分野で公知の技術により産生し得、これには、制限されないで：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより産生されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）抗体分子のパパインおよび還元剤での処理により産生されるＦａｂフラグメント；ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメントが含まれる。
【０４５８】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような、組換え抗ＮＯＶＸ抗体（これらは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により産生され得る。この技術は例えば、以下に記載の方法を用いる：国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７号；欧州特許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３，４９４；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ　８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；欧州特許出願番号１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３〜４０６０。上記引用の各々は、それらの全体において参考として本明細書中に援用される。
【０４５９】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は、当該分野内で公知の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術を含むが、これに限定されない。特定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選抜は、このようなドメインを所有しているＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。従って、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログ内の所望のドメインについて特異的である抗体がまた、本明細書において提供される。
【０４６０】
抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的なサンプル中のＮＯＶＸタンパク質のレベルを測定する使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログについての抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物（本明細書中、以降において「治療剤」）として利用される。
【０４６１】
抗ＮＯＶＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準的技術（例えばアフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために用いられ得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、細胞からの天然のＮＯＶＸポリペプチド、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＮＯＶＸ抗体が、（例えば、細胞の溶解産物または細胞上清における）ＮＯＶＸタンパク質を検出するために用いられて、ＮＯＶＸタンパク質の発現のアバンダンスおよびパターンを評価し得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に結合する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易にされ得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０４６２】
（ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログをコードする核酸を含む、ベクター、好ましくは、発現ベクターに関する。本明細書において使用する場合、用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」である。これはさらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。他の型のベクターは、ウイルス性ベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、ベクターが導入される宿主細胞中で自律複製し得る（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そして、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示し得る。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるので、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、このような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０４６３】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結する」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合は、宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。
【０４６４】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者には明白である。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０４６５】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）にさらに考察されている。あるいは、組換え型発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０４６６】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉにおいて実施される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性を増加させるため；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助するため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との結合部に導入されて、融合タンパク質の精製の後に融合部分から組換えタンパク質を分離することを可能とする。このような酵素、およびその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０４６７】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ　６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ　１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０４６８】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を欠損した宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるコドンであるように発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０４６９】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ　３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ　５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０４７０】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９）が挙げられる。
【０４７１】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のために適切な他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０４７２】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指示し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーターにおいて（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ　Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリンの特定のプロモーターにおいて（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：９１２−９１６）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発達的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）。
【０４７３】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の持続的な発現を指示する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列（例えば、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー）が選択され得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞特異的発現を指示する調節配列が、選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０４７４】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をもいうことが理解される。変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において生じ得るので、このような子孫は、実際には、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用される場合のこの用語の範囲内に含まれる。
【０４７５】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０４７６】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するために当該分野で容認されている種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０４７７】
安定な哺乳動物細胞のトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの要素を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート）に対する耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０４７８】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、本発明の方法はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離する工程を包含する。
【０４７９】
（トランスジェニックＮＯＶＸ動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸタンパク質コード配列が導入された、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、外因性のＮＯＶＸ配列がゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のＮＯＶＸ配列が変更された相同組換え動物を作製するために使用され得る。このような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性を研究するため、ならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類であり、ここでは、その動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、細胞（この細胞からトランスジェニック動物を発生させた）のゲノムに組み込まれかつ成熟動物のゲノムに残存し、それによって、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する、外因性のＤＮＡである。本明細書中で使用される場合、「相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスであり、ここでは内因性のＮＯＶＸ遺伝子は、内因性の遺伝子と、その動物の発生の前にその動物の細胞（例えば、その動物の胚細胞）に導入された外因性のＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている。
【０４８０】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核に導入すること、およびその卵母細胞を偽妊娠雌性養育動物（ｆｏｓｔｅｒ　ａｎｉｍａｌ）中で発達させることを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のヒトのＮＯＶＸ　ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスのＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトのＮＯＶＸ　ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（上記にさらに記載された）、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ得、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指示するように、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣習的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ　１９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ　ＴＨＥ　ＭＯＵＳＥ　ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織もしくは細胞中のＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を育種するために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に交雑され得る。
【０４８１】
相同組換え動物を作製するために、ＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。ここで、この遺伝子は、欠失、付加、または置換が導入され、それによってそのＮＯＶＸ遺伝子が変更されている（例えば、機能的に破壊されている）。ＮＯＶＸ遺伝子はヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のｃＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトのＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７のヒトのＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおける内因性のＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、その内因性のＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊されるように設計される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）。
【０４８２】
あるいは、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、あるいはさもなければ、変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように、設計され得る（例えば、上流の調節領域が変更され、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子の変更された部分は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接されることにより、相同組換えが、ベクターによって保有される外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの説明についてＴｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ　５１：５０３を参照のこと。次いで、このベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）胚性幹細胞株に導入され、そして導入されたＮＯＶＸ遺伝子が内因性ＮＯＶＸ遺伝子と相同組換えした細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ　６９：９１５を参照のこと）。
【０４８３】
次いで、選択された細胞が、動物（例えば、マウス）の未分化胚芽細胞へ注入され、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ、１１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、キメラ胚が、適切な偽妊娠雌性養育動物に移植され得、そしてその胚は分娩に到る。その生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを保有する子孫が、動物を育種するために使用され得、ここでこの動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって、相同組換えされたＤＮＡを含む。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ／９３／０４１６９。
【０４８４】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−１３５５を参照のこと）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、２つのトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０４８５】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖サイクル（ｇｒｏｗｔｈ　ｃｙｃｌｅ）から出て、Ｇ０期に入るように誘導され得る。次いで、静止性細胞が、例えば、電気パルスの使用により、その静止性細胞が単離されたのと同種の動物から摘出された卵母細胞へ融合され得る。次いで、この再構築された卵母細胞は培養され、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性養育動物に移される。この雌性養育動物から産まれた子孫は、その細胞（例えば、その体細胞）が単離された動物のクローンである。
【０４８６】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（これはまた、本明細書中で、「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合可能な、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（当該分野の標準的参考文献であって、本明細書中に参考として援用される）の最新版に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０４８７】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合可能であるように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（すなわち、局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような、滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような、抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような、抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような、キレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような、緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような、張度の調整のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０４８８】
注入用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（ここでは、水溶解性）または分散媒（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）、および滅菌注入可能溶液または分散媒の即座の調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与において、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染行為に対して保護されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散媒であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散媒の場合には、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、砂糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール）、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の吸収期間の延長は、組成物に吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含ませることによってもたらされ得る。
【０４８９】
滅菌注射可能溶液は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体））を、適切な溶媒中で、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、必要な場合、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散媒は、活性化合物を、基本（ｂａｓｉｃ）の分散媒と上記で列挙される成分から必要とされる他の成分とを含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能液剤の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０４９０】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして音を立てられ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０４９１】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０４９２】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透される障壁に適切な浸透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０４９３】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または貯留（ｒｅｎｔｅｎｔｉｏｎ）浣腸の形態で調製され得る。
【０４９４】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの物質はまた、Ａｌｚａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｎｏｖａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０４９５】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体に対する単位投薬量として適切な物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して所望の治療的効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特徴、および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためのこのような活性化合物を調合する分野に固有の制限によって決定されるか、あるいはこれらに直接依存する。
【０４９６】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によって、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得るか、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる除放性マトリックスが挙げられ得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞からインタクトで産生され得（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０４９７】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書と共に、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０４９８】
（スクリーニング方法および検出方法）
本発明の単離された核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質を発現するために（例えば、遺伝子治療適用の際に宿主細胞における組み換え発現ベクターを介して）使用され、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおける）またはＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的病変を検出し得、かつ以下にさらに記載されるようなＮＯＶＸ活性を調節し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分かもしくは過剰な産生またはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少したかまたは異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生によって特徴付けられる障害を処置するために使用され得る（例えば、糖尿病（インスリン放出の調節）；肥満（脂質の結合および輸送）；肥満に関連する代謝障害；代謝症候群Ｘならびに慢性疾患および種々の癌に関連する食欲不振および消耗障害、ならびに感染性疾患（抗菌活性の保有）ならびに種々の異脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ））。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離し、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。なおさらなる局面において、本発明は、ポジティブおよびネガティブの両方の様式で、欲求、養分の吸収、および代謝物質の処分に影響を与えるための方法において使用され得る。
【０４９９】
本発明は、さらに、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤および上記される処置のためのそれらの使用に関する。
【０５００】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸタンパク質発現またはＮＯＶＸタンパク質活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補化合物または候補薬剤、あるいは試験化合物または試験薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。本発明はまた、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を含む。
【０５０１】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分の膜結合形態に結合するか、またはそれら膜結合形態の活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数のアプローチを使用して得られ得、これらのライブラリーには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　１２：１４５を参照のこと）。
【０５０２】
本明細書中で使用される場合、「低分子」とは、約５ｋＤ未満の分子量、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうように意味される。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であり得る。化学的および／または生物学的混合物（例えば、真菌、細菌または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、そして本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０５０３】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら、１９９４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０５０４】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ　米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２３３，４０９号）において示され得る。
【０５０５】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせて、その結果、この試験化合物のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０５０６】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＮＯＶＸタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸ相互作用タンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞間タンパク質、または下流シグナル伝達分子のＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０５０７】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動的に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０５０８】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸを結合する公知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０５０９】
さらに別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０５１０】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する公知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０５１１】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質の、可溶性の形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、ＮＯＶＸタンパク質の膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｅｔｈｅｒ）ｎ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０５１２】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸタンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１実施形態において、そのタンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および吸着されない標的タンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０５１３】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術がまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンで被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸタンパク質、または標的分子と反応性であるがＮＯＶＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸタンパク質が、抗体の結合によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質、または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０５１４】
別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（すなわち、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０５１５】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ　７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ　ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＮＯＶＸ（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナル伝達に関与するようである。
【０５１６】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーは、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０５１７】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤の使用に関する。
【０５１８】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部分またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば（限定はされない）、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上のそのそれぞれの遺伝子をマッピングし得る；そして従って、遺伝的疾患に関連する遺伝子領域を位置付け得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得る。これらの適用のうちのいくつかは、以下の節において記載される。
【０５１９】
（染色体マッピング）
一旦遺伝子の配列（または配列の一部分）が単離されると、この配列を用いて染色体上の遺伝子の位置をマッピングし得る。このプロセスは、染色体マッピングとよばれる。従って、ＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、および２７、あるいはそのフラグメントまたはその誘導体）は、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をマッピングするために、それぞれ使用され得る。ＮＯＶＸ配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列と、疾患と関連する遺伝子とを相関付ける際の重要な第一歩である。
【０５２０】
簡潔には、ＮＯＶＸ遺伝子は、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー（好ましくは、１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することにより染色体にマッピングされ得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡにおける１つを超えるエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し得、従って、増幅プロセスを複雑にし得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用され得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを生じる。
【０５２１】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞（例えば、ヒトおよびマウス細胞）を融合することにより調製される。ヒトおよびマウスのハイブリッドが増殖および分裂するにつれ、それらは、無作為な順序で徐々にヒト染色体を失うが、マウス染色体を維持する。マウス細胞は増殖できない（なぜなら、それらは特定の酵素を欠損している）が、ヒト細胞は増殖できる培地を使用することにより、必要な酵素をコードする遺伝子を含む１つのヒト染色体が維持される。種々の培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネルが確立され得る。パネルにおける各細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、およびマウス染色体の完全なセットを含み、これにより、個々の遺伝子を特定のヒト染色体にマッピングすることが容易に可能になる。Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏら、１９８３．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２０：９１９−９２４を参照のこと。ヒト染色体のフラグメントのみを含む体細胞ハイブリッドはまた、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用することにより生成され得る。
【０５２２】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体に特定の配列を割り当てるための迅速な手順である。１つのサーマルサイクラーを用いて、一日に３つ以上の配列が割り当てられ得る。ＮＯＶＸ配列を使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを設計すると、下位位置決定（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて達成され得る。
【０５２３】
中期染色体スプレッドに対するＤＮＡ配列の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、一工程で正確な染色体位置を提供するためにさらに使用され得る。染色体スプレッドは、コルセミド（染色体紡錘体を破壊する）のような化学物質により分裂が中期においてブロックされた細胞を使用して行われ得る。この染色体は、トリプシンで短時間処理され得、次いで、ギムザ染色され得る。薄いバンドおよび濃いバンドのパターンが各染色体で発生し、その結果、この染色体は、個々に同定され得る。ＦＩＳＨ技術は、５００または６００塩基ほどの短さのＤＮＡ配列と共に使用され得る。しかし、１，０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で、独特の染色体位置に結合する可能性がより高い。好ましくは、１，０００塩基、そしてより好ましくは、２，０００塩基が妥当な時間量で良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、ＨＵＭＡＮ　ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥＳ：Ａ　ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＢＡＳＩＣ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８８）を参照のこと。
【０５２４】
染色体マッピングの試薬が、単一の染色体またはその染色体上の単一部位を印付けするために個々に使用され得るか、または試薬のパネルが、複数部位および／または複数染色体を印付けするために使用され得る。遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、実際に、マッピング目的のために好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存され、これにより染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションの機会が増大する可能性が高い。
【０５２５】
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、その配列の染色体上の物理的位置は、遺伝子マップデータと相関し得る。このようなデータは、例えば、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，ＭＥＮＤＥＬＩＡＮ　ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥ　ＩＮ　ＭＡＮ（Ｊｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｗｅｌｃｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙを介してオンラインで入手可能）において見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係は、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄら、１９８７．Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載される連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を介して同定され得る。
【０５２６】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子と関連する疾患に罹患した個体と、この疾患に罹患していない個体との間のＤＮＡ配列における差異が決定され得る。罹患した個体のいくらかまたは全てにおいて変異が認められるが、非罹患個体のいずれにおいても認められない場合、この変異は特定の疾患の原因である因子である可能性が高い。罹患個体と非罹患個体の比較は、一般に、染色体における構造的変化（例えば、染色体スプレッドから可視であるか、またはそのＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲを用いて検出可能な欠失または転座）を最初に探すことを包含する。最終的に、いくらかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定を行って、変異の存在を確認し、かつ多型に由来する変異を区別する。
【０５２７】
（組織型決定（ｔｉｓｓｕｅ　ｔｙｐｉｎｇ））
本発明のＮＯＶＸ配列はまた、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限フラグメント長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０５２８】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０５２９】
このように調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、唯一の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域においてある程度生じ、そして非コード領域においてより大きな程度に生じる。個々のヒト間での対立遺伝子変異は、各５００塩基につき約１回の頻度で生じると見積もられる。対立遺伝子変異の多さは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０５３０】
本明細書中で記載の配列の各々は、ある程度、標準（これに対して個体からのＤＮＡが識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５および２７における配列）が使用される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０５３１】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の関連で決定し、これによって、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に関連する代謝障害、代謝症候群Ｘならびに慢性疾患および種々の癌に関連する消耗障害が挙げられる。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸ遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または生物学的活性によって特徴付けられるかまたはそれに関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置する。
【０５３２】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性を決定するための方法を提供し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的因子（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の因子に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいた、個体の治療的または予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０５３３】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬剤、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０５３４】
これらおよび他の因子は、以下の節でさらに詳細に記載される。
【０５３５】
（診断アッセイ）
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長のＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５および２７またはその部分の核酸（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、そしてストリンジェントな条件下でＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分であるオリゴヌクレオチド））であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書中に記載される。
【０５３６】
ＮＯＶＸタンパク質を検出するための１つの薬剤は、ＮＯＶＸと結合し得る抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによって、そのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によって、そのプローブもしくは抗体を間接的に標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにビオチンを用いるＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、生物学的サンプル中のＮＯＶＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸ　ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。この被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０５３７】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０５３８】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または薬剤と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０５３９】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物または薬剤；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおけるＮＯＶＸの量を標準と比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内にパッケージングされ得る。このキットは、さらに、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための説明書を備え得る。
【０５４０】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するかまたはその発症の危険にある被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を有するかまたはその発症の危険にある被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険にある被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険にある被験体についての診断指標である。本明細書において使用される「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０５４１】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体が薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）が投与されてＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置し得るか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を用いて、被験体が障害について薬剤を用いて有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害について、薬剤を用いて被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害を処置するための薬剤が投与され得る被験体についての診断指標である）。
【０５４２】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸの遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が異常な細胞増殖および／または分化によって特徴付けられる障害についての危険にあるか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、本発明の方法は、その被験体由来の細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える変更の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的損傷、あるいはＮＯＶＸの遺伝子の誤発現の存在または非存在を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（ｉ）ＮＯＶＸの遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（ｉｉ）ＮＯＶＸの遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸの遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）ＮＯＶＸの遺伝子の染色体再配置；（ｖ）ＮＯＶＸの遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（ｖｉ）ＮＯＶＸの遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（ｖｉｉ）ＮＯＶＸの遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）ＮＯＶＸのタンパク質の非野生型レベル、（ｉｘ）ＮＯＶＸの遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（ｘ）ＮＯＶＸのタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、多数の公知のアッセイ技術が存在し、これらは、ＮＯＶＸの遺伝子における損傷を検出するために使用され得る。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０５４３】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ　ＰＣＲ）あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸの遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら、１９９５、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸの遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物の大きさを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに、予備的増幅工程として使用されるために望ましくあり得ることが予想される。
【０５４４】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１８７４−１８７８を参照のこと）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１１７３−１１７７を参照のこと）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１１９７を参照のこと）、または他の任意の核酸増幅方法、それに続いて、当業者に周知の技術を用いる増幅された分子の検出。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に少数で存在する場合、核酸分子の検出のために特に有用である。
【０５４５】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＮＯＶＸの遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差違は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０５４６】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝的変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（例えば、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９を参照のこと）。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（上記）に記載のように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、第一のプローブハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロールにおける長いストレッチのＤＮＡを通じて走査して、連続的に重複するプローブの線形アレイを作製することによってその配列の間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に続いて、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによって、特定の変異の特徴付けを可能にする第二のハイブリダイゼーションアレイがある。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補的である並行プローブセットから構成される。
【０５４７】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルのＮＯＶＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（例えば、Ｎａｅｖｅら、（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９：４４８を参照のこと）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ　９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０５４８】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断薬剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２を参照のこと）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化することに対して、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。次いで、そのミスマッチ領域の消化後、得られた材料を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさで分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０５４９】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸ　ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（例えば、Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　１５：１６５７〜１６６２を参照のこと）。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０５５０】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖配座多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（例えば、Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化さえも検出し得る。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、二次構造が、配列中の変化に対してより感受的である、（ＤＮＡではなく）ＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する（例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．７：５を参照のこと）。
【０５５１】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる（例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４９５を参照のこと）。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される（例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３を参照のこと）。
【０５５２】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる（例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：６２３０を参照のこと）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異体にハイブリダイズされる。
【０５５３】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において目的の変異を保有し得る（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（例えば、Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８を参照のこと）か、あるいは適切な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げ得るかまたは減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（例えば、Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ．１１：２３８を参照のこと）。さらに、変異の領域に新規な制限部位を導入することは、切断に基づく検出を行うために望ましくあり得る（例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　６：１を参照のこと）。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される（例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１８９を参照のこと）。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位で既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０５５４】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子に関与する疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において簡便に使用され得る。
【０５５５】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０５５６】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、障害を処置（予防的または治療的に）するために固体に投与され得る（この障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａｓ）、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　Ｘ）、および慢性疾患と関連する消耗障害、および種々の癌が挙げられる）。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を可能にする。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０５５７】
薬理ゲノム学は、罹患した人において変更された薬物の性質および異常な作用に起因する、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，１９９６，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２３：９８３〜９８５；Ｌｉｎｄｅｒ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。遺伝的状態は、薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達されるか（変更された薬物作用）、または遺伝的状態は、身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【０５５８】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないか、または薬物の標準的かつ安全な用量を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で発現される。ＰＭの罹患率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０５５９】
従って、ＮＯＶＸのタンパク質の活性、ＮＯＶＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸの遺伝子の変異量が決定されて、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸのモジュレーター（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定されるモジュレーター）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０５６０】
（臨床試験の間の効果のモニタリング）
ＮＯＶＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的なスクリーニングにおいてのみならず、臨床試験においてもまた適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される薬剤が、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加する効力、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートする効力を、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートされたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターし得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される薬剤が、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少する効力、またはＮＯＶＸの活性をダウンレギュレートする効力を、増加したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートされたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターし得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸおよび好ましくは、例えば、細胞性増殖障害または免疫障害に関与した他の遺伝子の発現または活性が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ　ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の免疫応答のマーカーとして使用され得る。
【０５６１】
例えば、限定の目的ではないが、ＮＯＶＸ遺伝子を含む遺伝子（これは、ＮＯＶＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される活性）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が、同定され得る。従って、細胞性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０５６２】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を増加するために（すなわち、この薬剤の効力を増加するために）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を減少するために（すなわち、この薬剤の効力を減少するために）望ましくあり得る。
【０５６３】
（処置の方法）
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連する障害の危険性（または感受性）があるか、またはこの障害を有する被験体を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。この障害としては、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心臓欠損症、大動脈狭窄症、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室性（Ａ−Ｖ）管欠陥、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈下部弁狭窄症、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、移植、副腎脳白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固症、突発性血小板減少性紫斑、免疫欠損、対宿主性移植片病、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、オールブライト遺伝性骨ジストロフィーの処置、ならびに他の疾患、障害および状態などが挙げられる。
【０５６４】
これらの処置方法は、以下にさらに十分に議論される。
【０５６５】
（疾患および障害）
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）上記ペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによって上記ペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、上記ペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）上記ペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させるモジュレーター（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０５６６】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０５６７】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（または上記ペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０５６８】
（予防的方法）
１つの局面において、本発明は、被験体における異常なＮＯＶＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸの発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する疾患の危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＮＯＶＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト薬剤またはＮＯＶＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。本発明の予防方法は、以下の節でさらに議論される。
【０５６９】
（治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためのＮＯＶＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、１つ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、１つ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子の異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子を、減少したかまたは異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０５７０】
ＮＯＶＸ活性の刺激は、ＮＯＶＸが異常にダウンレギュレートされている状況、および／またはＮＯＶＸ活性の増加が有益な効果を有するようである状況において、望ましい。このような状況の１つの例は、被験体が、異常な細胞増殖および／または細胞分化によって特徴付けられる障害（例えば、癌または免疫関連疾患）を有する場合である。このような状況の別の例は、被験体が妊娠疾患（例えば、子かん前症（ｐｒｅｃｌａｍｐｓｉａ））を有する場合である。
【０５７１】
（治療の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態では、適切なインビトロまたはインビボアッセイを行い、特定の治療効果を決定し、かつその投与が罹患した組織の処置について示されるか否かを決定する。
【０５７２】
種々の特定の実施形態では、インビトロアッセイは、所定の治療が、細胞型に所望の効果を発揮するかどうかを決定するために、患者の疾患に関与する代表的な細胞型で行なわれ得る。治療において使用される化合物は、ヒト患者で試験する前に、適切な動物モデル系で試験され得、それらの適切な動物モデル系としては、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むがそれに限定されない。同様に、インビボ試験のために、当該分野で公知の動物モデル系のいずれかが、ヒト患者に投与する前に使用され得る。
【０５７３】
（本発明の組成物の予防的使用および治療的使用）
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、種々の障害（代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、ならびに種々の異脂血症、肥満に関連する代謝障害、Ｘ代謝症候群、および慢性疾患と関連する消耗障害、および種々の癌が挙げられるが、これらに限定されない）に関係する潜在的な予防的適用および治療的適用において有用である。
【０５７４】
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてこのタンパク質は、それらを必要とする被験体に投与された場合、有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、以下に罹患している患者の処置についての有効性を有する：代謝障害、糖尿病、肥満症、感染症、食欲不振、癌関連悪液質、癌、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異脂血症。
【０５７５】
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規の核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、診断適用に有用であり得、ここで核酸またはタンパク質の存在または量が、評価される。さらなる用途は、抗菌性分子としてであり得る（すなわち、いくつかのペプチドは、抗菌特性を有することが見出された）。これらの物質は、治療方法または診断方法における使用のための、本発明の新規の物質に免疫特異的に結合する抗体の産生において、さらに有用である。
【０５７６】
（等価物）
特定の実施形態が、本明細書中に詳細に開示されているが、これは、例示のみの目的で例として成されており、そして上記の添付の特許請求の範囲に関して限定することを意図しない。特に、本発明者らによって、種々の置換、変更および改変が、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱せずに、本発明に対してなされ得ることが意図される。核酸出発物質、挿入物のクローン、またはライブラリー型の選択は、本明細書中に記載される実施形態の知識を用いて当業者にとって慣用的な事項であると考えられる。他の局面、利点および改変は、上記の特許請求の範囲内であるとみなされる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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