(57)【要約】本発明は、カロテノイド過剰生産細菌に関する。本発明の細菌宿主における、イソプレノイド経路の遺伝子は、ある遺伝子が、上方制御されるかまたは下方制御され、結果として未修飾宿主で見られるより高いレベルでカロテノイド化合物を産生するように操作されている。上方制御されてもよい遺伝子は、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＢ、ｌｙｔＢおよびｙｇｂＢＰ遺伝子を包含する。さらに、ｙｊｅＲ遺伝子の部分的破壊は、カロテノイド産生を増強する効果を有することも分かった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｄｘｓ、ｉｄｉおよびｙｇｂＢＰ遺伝子は、過剰発現され、ｙｊｅＲ遺伝子は、下方制御される、機能的カロテノイド酵素的生合成経路をコードする遺伝子を含んでなる、カロテノイド過剰生産細菌。
【請求項２】
前記ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢＰおよびｉｓｐＢ遺伝子は、過剰発現される、機能的カロテノイド酵素的生合成経路をコードする遺伝子を含んでなるカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項３】
前記ｌｙｔＢおよびｄｘｒ遺伝子は、場合により過剰発現される、請求項１または２に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項４】
前記カロテノイド酵素的生合成経路は、遺伝子ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｙｇｐＰ、ｙｃｈＢ、ｙｇｂＢ、ｌｙｔＢ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡ、ｉｓｐＢ  ｃｒｔＥ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＹからなる、請求項１または２に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項５】
前記カロテノイド酵素的生合成経路は、場合によりｃｒｔＺおよびｃｒｔＷ遺伝子をさらに含んでなる、請求項４に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項６】
前記細菌は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項７】
前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項６に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項８】
前記ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｙｇｐＰ、ｙｃｈＢ、ｙｇｂＢ、ｌｙｔＢ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡ、ｉｓｐＢは、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）ｓｐ．に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項９】
前記ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＢおよびｙｇｂＢＰ遺伝子は、強力プロモーターの制御下
にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項１０】
前記強力プロモーターは、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λＰＬ、λＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ＰＴ５、およびｔｒｃよりなる群から選択される、請求項９に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項１１】
前記ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＢおよびｙｇｂＢＰ遺伝子は、細菌染色体にマルチコピーで組み込まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項１２】
前記ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＢおよびｙｇｂＢＰ遺伝子は、細菌中の１つもしくはそれ以上のプラスミド上にマルチコピーで存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項１３】
前記ｙｊｅＲ遺伝子は、遺伝子破壊により下方制御される、請求項７に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項１４】
前記破壊されたｙｊｅＲ遺伝子は、配列番号６３に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項１３に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項１５】
前記ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＢ  ｙｇｂＢＰおよびｌｙｔＢ遺伝子は、宿主細胞ゲノム内に、染色体組込みされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカロテノイド過剰生産細菌。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ同定番号ＰＴＡ−４８０７を有する菌株、およびＡＴＣＣ同定番号ＰＴＡ−４８２３を有する菌株よりなる群から選択される、カロテノイド過剰生産細菌。
【請求項１７】
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のカロテノイド過剰生産細菌であって、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢＰ、ｉｓｐＢ、ｌｙｔＢ、ｄｘｒよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を過剰発現し、ｙｊｅＲは、場合により下方制御される細菌をカロテノイドを産生するために十分な時間増殖させ、
ｂ）場合により、ステップ（ａ）のカロテノイド過剰生産細菌から前記カロテノイドを回収することを含んでなる、カロテノイドの産生方法。
【請求項１８】
前記カロテノイドは、アンテラキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、キャプソルブリン（ｃａｐｓｏｒｕｂｒｉｎ）、β−クリプトキサンチン、ジデヒドロリコペン、β−カロテン、ζ−カロテン、δ−カロテン、γ−カロテン、ケト−γ−カロテン、ψ−カロテン、ε−カロテン、β，ψ−カロテン、トルレン、エキネノン、α−クリプトキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクテュカキサンチン（ｌａｃｔｕｃａｘａｎｔｈｉｎ）、ルテイン、リコペン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリディニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、ウリオライド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ）、酢酸ウリオライド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、およびＣ３０−カロテノイドよりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記カロテノイドは、乾燥細胞重量１ｇ当たり少なくとも約６ｍｇのレベルで産生される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）よりなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢＰ、ｉｓｐＢおよびｌｙｔＢ遺伝子は、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λＰＬ、λＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ＰＴ５、およびｔｒｃよりなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＢ、ｙｇｂＢＰおよびｌｙｔＢ遺伝子は、細菌染色体にマルチコピーで組み込まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＢ、ｙｇｂＢＰおよびｌｙｔＢ遺伝子は、細菌中の１つもしくはそれ以上のプラスミド上のマルチコピーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｙｊｅＲ遺伝子は、遺伝子破壊により下方制御される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記破壊されたｙｊｅＲ遺伝子は、配列番号６３に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＢ、ｙｇｂＢＰおよびｌｙｔＢ遺伝子は、宿主細胞ゲノム内に、染色体組込みされる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は、２００２年１２月１９日出願の米国仮出願第６０／４３４，６１８号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、微生物学の分野である。さらに具体的には、本発明は、カロテノイド過剰生産細菌株に関する。
【背景技術】
【０００３】
カロテノイド類は、自然界全体のいたる所に存在し、また全ての酸素発生光合成生物、および一部の従属栄養的生育細菌および菌・カビ類で合成される色素である。カロテノイド類の工業的用途としては、数例を挙げると、医薬、栄養補助食品、電気光学用途、動物飼料添加物、および化粧品の着色料などがある。動物は、カロテノイド類を新規に合成することができないため、食餌という方法によってカロテノイド類を得なければならない。したがって、植物または細菌におけるカロテノイド産生および組成物の操作によって、カロテノイド類の新規なまたは改良されたソースを提供することができる。
【０００４】
カロテノイド類は、多くの異なる形態また化学構造で提供される。ほとんどの天然カロテノイド類は、８個のＣ５イソプレン単位（イソペンテニルピロリン酸、ＩＰＰ）の逐次縮合により誘導されるＣ４０メチル分枝炭化水素主鎖を含有する疎水性テトラテルペノイド類である。さらに、より長いまたはより短い主鎖を有する新規なカロテノイド類が、非光合成細菌の幾つかの種に存在する。
【０００５】
カロテノイド色素生合成の遺伝学は周知である（非特許文献１、非特許文献２）。この経路は、以前はエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）として知られていた、パンテア属（ｇｅｎｅｒａ  Ｐａｎｔｏｅａ）のグラム陰性、色素細菌で、非常によく研究されている。Ｅ．ハービコーラ（Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＥＨＯ−１０（ＡＴＣＣ  ３９３６８）でもＥ．ウレドボラ（Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）２０Ｄ３（ＡＴＣＣ  １９３２１）でも、ｃｒｔ遺伝子は、２つのオペロン、ｃｒｔＺおよびｃｒｔＥＸＹＩＢにクラスター化されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。
【０００６】
イソプレノイド類は、自然界で、最大級の天然物を構成し、また、ステロール類（真核膜安定剤）、ジベレリン類およびアブシジン酸（植物ホルモン類）、メナキノン、プラストキノン類、およびユビキノン（電子輸送担体として使用される）、テトラピロール類の前駆物質、ならびにカロテノイド類、およびクロロフィル（光合成用色素）のフィトール側鎖の役割をする。全てのイソプレノイド類は、共通の代謝前駆物質、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を経て、合成される。最近まで、ＩＰＰの生合成は、一般に、アセチル−ＣｏＡから古典的なメバロン酸経路を経て排他的に進行すると推定されていた。しかし、真正細菌および緑藻類では、ＩＰＰ形成のための、代替メバロン酸非依存的経路の存在が特徴づけられている。
【０００７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、イソプレノイド生合成のメバロン酸非依存的経路の酵素をコードする遺伝子を含む（図１）。この経路において、イソプレノイド生合成は、ピルビン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）との縮合で始まり、ｄｘｓ遺伝子によりコードされる酵素によって、デオキシ−Ｄ−キシルロースを形成する。次いで、さらなる酵素の宿主を次の逐次反応で使用して、デオキシ−Ｄ−キシルロースを、最終的なＣ５イソプレン産物である、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に変換する。ＩＰＰは、ｉ
ｄｉ遺伝子にコードされる酵素によって、異性体ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換される。ＩＰＰは、ＤＭＡＰＰと縮合されて、Ｃ１０ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を生じ、次いでＣ１５ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）に伸長される。
【０００８】
ＦＰＰ合成は、カロテン産生性（ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ）および非カロテン産生性細菌（ｎｏｎ−ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の両者に共通である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は通常は、ＦＰＰをβ−カロテンに変換するために必要な遺伝子を含まない（図１）。次のカロテノイド経路における酵素は、ＦＰＰ前駆物質からカロテノイド色素を生じさせ、カロテン主鎖合成酵素およびその後の修飾酵素という、２種類に分けられる。該主鎖合成酵素としては、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＣｒｔＥ）、フィトエンシンターゼ（ＣｒｔＢ）、フィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣｒｔＩ）およびリコペンサイクラーゼ（ＣｒｔＹ／Ｌ）等々がある。該修飾酵素としては、ケトラーゼ、ヒドロキシラーゼ、デヒドラターゼ、グリコシラーゼ等々がある。
【０００９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、異種カロテノイド産生に便利な宿主である。細菌、菌・カビ類および高等植物由来のカロテン産生性遺伝子の多くは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で機能的に発現させることができる（非特許文献３）。さらに、大規模バイオプロセスにしばしば使用される産生宿主である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での使用に、多くの遺伝学的ツールが利用できる。
【００１０】
カロテノイド産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）操作は、以前は、マルチコピープラスミドからの、重要なイソプレノイド経路遺伝子の過剰発現に集中していた。非カロテン産生性宿主（ｎｏｎ−ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ  ｈｏｓｔ）で産生されるカロテノイド総量は、テルペノイド前駆物質の可用性によって制限されると仮定されてきた（非特許文献４）。幾つかの研究は、様々なソース由来のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ｉｄｉ）、デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）シンターゼ（ｄｘｓ）、ＤＸＰレダクトイソメラーゼ（ｄｘｒ）をコードするプラスミドのクローニングおよび形質転換によって、このような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）系におけるカロテノイド生成の１．５〜５０倍の増加を報告した（非特許文献５）（非特許文献６）（非特許文献７）（非特許文献８）（非特許文献９）（非特許文献１０）。加えて、イソプレノイド前駆物質濃度の上昇は、致命的であると報告されていた（非特許文献３）。
【００１１】
これまでに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生されたカロテノイドの最高レベルは、およそ１．５７ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）である。それにひきかえ、カンジダ・アティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）の操作された菌株は、乾燥細胞重量１ｇ当たり７．８ｍｇのリコペンを産生する（非特許文献３）。非カロテン産生性宿主、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるカロテノイド産生の限界は、膜機能性を崩壊する膜のカロテノイド過負荷のため、およそ１．５ｍｇ／ｇ  ＤＣＷのレベルで到達すると推測されてきた。このため、高レベルのカロテノイド産生のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）操作の今後の焦点は、さらなる膜の形成に合わせるべきであると提案されてきた（非特許文献４）。
【００１２】
イソプレノイドの代謝工学におけるこれまでの研究の多くは、カラースクリーニングが容易なため、カロテノイドを主として使用して行われてきた。カロテノイドの産生増加のためには、イソプレノイド前駆物質の供給増加技術が必要である。カロテノイド生合成における律速段階は、ＩＰＰのＤＭＡＰＰへの異性化であることが証明されている（非特許文献１１）。ＦＰＰからＧＧＰＰへの変換が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるカロテノイド産生の第１の機能的律速段階であることも分かった（非特許文献１２）。ｄｘｓ、ｄｘｒ、およびｉｄｉ遺伝子を過剰発現させるための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換は、カロテノイド産生を３．５倍に増加した（非特許文献４）。他の経路からの競合を避け、また律速段階を緩和するために、アーキアグロバス・ファルジダス（Ａｒｃｈａｒｏｇ
ｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来のＧＧＰＰシンターゼ（ｇｐｓ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｄｉ遺伝子とともに、マルチコピー発現ベクターでクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で過剰発現させた（非特許文献１２）。これらの例は、カロテノイドの産生のために、マルチコピー発現ベクターが代謝工学に広く使用されてきたことを示す。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，６５６，４７２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５４５，８１６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５３０，１８９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，５３０，１８８号明細書
【特許文献５】米国特許第５，４２９，９３９号明細書
【非特許文献１】アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７６：４７９５−４８０２（１９９４年）
【非特許文献２】アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５１：６２９−６５９（１９９７年）
【非特許文献３】サンドマン（Ｓａｎｄｍａｎｎ），Ｇ．著、植物科学における傾向（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、６：１４−１７（２００１年）
【非特許文献４】アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２１：７９１−７９５（１９９９年）
【非特許文献５】キム（Ｋｉｍ），Ｓ．およびキースリング（Ｋｅａｓｌｉｎｇ），Ｊ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７２：４０８−４１５（２００１年）
【非特許文献６】マシューズ（Ｍａｔｈｅｗｓ），Ｐ．およびワーゼル（Ｗｕｒｔｚｅｌ），Ｅ．、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５３：３９６−４００（２０００年）
【非特許文献７】ハーカー（Ｈａｒｋｅｒ），Ｍ．およびブラムリー（Ｂｒａｍｌｅｙ），Ｐ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ．、４４８：１１５−１１９（１９９９年）
【非特許文献８】ミサワ（Ｍｉｓａｗａ），Ｎ．およびシマダ（Ｓｈｉｍａｄａ）Ｈ．Ｊ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５９：１６９−１８１（１９９８年）
【非特許文献９】リヤオ（Ｌｉａｏ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、６２：２３５−２４１（１９９９年）
【非特許文献１０】ミサワ（Ｍｉｓａｗａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３２４：４２１−４２６（１９９７年）。
【非特許文献１１】カジワラ（Ｋａｊｉｗａｒａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、４２３：４２１−４２６（１９９７年）
【非特許文献１２】ワング（Ｗａｎｇ）ら、Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、６２：２３５−２４１（１９９９年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、解決すべき問題は、上昇したレベルのカロテノイドを産生することができる微生物宿主を操作して提供することである。出願人は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に修飾を施し、致死作用なしで、β−カロテン産生を乾燥細胞重量１ｇ当たり６ｍｇ（６０００ＰＰＭ）（初期レベルより３０倍の増加）まで増加させることにより、記載の問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、機能的カロテノイド酵素的生合成経路をコードする遺伝子を含んでなり、ｄｘｓ、ｉｄｉおよびｙｇｂＢＰ遺伝子は過剰発現され、ｙｊｅＲ遺伝子は下方制御される、カロテノイド過剰生産細菌を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、機能的カロテノイド酵素的生合成経路をコードする遺伝子を含んで
なり、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢＰおよびｉｓｐＢ遺伝子が過剰発現される、カロテノイド過剰生産細菌を提供する。カロテノイド産生をさらに増加させるために、場合により、ｌｙｔＢ遺伝子も過剰発現させてもよい。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ同定番号ＰＴＡ−４８０７を有する菌株およびＡＴＣＣ同定番号ＰＴＡ−４８２３を有する菌株よりなる群から選択される、カロテノイド過剰生産細菌を提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、
ａ）本発明のカロテノイド過剰生産細菌であって、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢＰ、ｉｓｐＢ、ｌｙｔＢ、ｄｘｒよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を過剰発現し、ｙｊｅＲは、場合により下方制御される細菌を、カロテノイドを産生するのに十分な時間、増殖させ、
ｂ）場合により、該カロテノイドを、ステップ（ａ）の該カロテノイド過剰生産細菌から回収することを含んでなる、カロテノイドの産生方法を提供する。
【００１９】
本発明は、本出願の一部を形成する、下記の詳細な説明および添付の配列記述から、さらに十分に理解することができる。
【００２０】
下記の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の必要条件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」に従い、また、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ））基準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴ（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、および実施細則の２０８条および付則Ｃ）の配列リスト必要条件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される符号および書式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の法則に従う。
【００２１】
【表１】
2006515174.tif 000002
【００２２】
配列番号１９〜２０は、該カロテノイド生合成遺伝子をＰ．スチュワーティ（Ｐ．ｓｔ
ｅｗａｒｔｉｉ）から増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２３】
配列番号２１〜３２は、本発明において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）イソプレノイド遺伝子から上流のＴ５強力プロモーター（ＰＴ５）の染色体組込みを引き起こすために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２４】
配列番号３３は、ｐＳＵＨ５を作るために、ｐＫＤ４に挿入されたＰＴ５プロモーター配列のヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号３４〜４５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体において、ｄｘｓ（１６ａ）、ｄｘｒ（１６ａ）、およびｌｙｔＢ（１６ａ）遺伝子挿入を引き起こすためのオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２６】
配列番号４６〜６２は、本発明において、染色体組込みの正確な挿入を確認するためのスクリーニングに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【００２７】
配列番号６３は、ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５突然変異遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号６４は、プラスミドｐＰＣＢ１５のヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号６５は、プラスミドｐＫＤ４６のヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号６６は、プラスミドｐＳＵＨ５のヌクレオチド配列である。
【００３１】
生物学的寄託の簡単な説明
下記の生物学的寄託は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約の条項に従って行われてきた。
【００３２】
【表２】
2006515174.tif 000003
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「ＡＴＣＣ」は、米国２０１１０−２２０９  バージニア州マナッサス・ユニバーシティ・ブルーバード１０８０１（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ）のＡＴＣＣにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション国際寄託機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）を指す。「国際寄託名称（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ」は、ＡＴＣＣに寄託した際の該培養への受入番号である。
【００３４】
リストに記載されている寄託物は、表示された国際寄託機関で少なくとも３０年間維持
され、それを開示する特許が付与された時に、一般に公開される。政府の措置によって付与される特許権の特例で、寄託物の利用可能性は、主題の発明を実施する許諾の構成要素とならない。
【００３５】
本開示では、多数の用語および略語が使用される。下記の定義を提供する。
【００３６】
「オープン・リーディング・フレーム」は、ＯＲＦと省略される。
【００３７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと省略される。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、「単離された核酸断片」は、合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を場合により含んでもよい、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形の、単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントで構成されていてもよい。
【００３９】
用語「イソプレノイド」または「テルペノイド」は、１０炭素テルペノイド類およびそれらの誘導体、たとえばカロテノイド類およびキサントフィル類を含む、イソプレノイド経路に由来する化合物およびあらゆる分子を指す。
【００４０】
「カロテン」は、炭化水素カロテノイドを指す。ヒドロキシ−、メトキシ−、オキソ−、エポキシ−、カルボキシ−、またはアルデヒド官能基の形で、あるいは、グリコシド、グリコシドエステル、またはサルフェートの中に、１つもしくはそれ以上の酸素原子を含むカロテン誘導体は、「キサントフィル類」として集合的に知られている。カロテノイドは、炭化水素主鎖の両末端が、環化されて脂肪族または環状の環構造を生じるかどうかによって、非環式、単環式、または二環式としてさらに記述されている（Ｇ．アームストロング（Ｇ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、（１９９９年）、総括的天然産物化学（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、エルゼビア・プレス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ）、第２巻、３２１〜３５２ページ）。
【００４１】
用語「λ−Ｒｅｄ組換えシステム」、「λ−Ｒｅｄシステム」および「λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ」は、バクテリオファージλ遺伝子ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍによりコードされる酵素群を記述するために同義的に使用される。特に、線状組込みカセットを使用するとき、該３遺伝子にコードされる酵素は一緒に働いて、比較的低率の相同的組換えを有すると一般に考えられる生物である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における相同的組換えの率を高める。該λ−Ｒｅｄシステムは、線状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片の両側に位置する短い相同領域（１０〜５０ｂｐ）を相同的組換えに使用できる能力を助長する。本方法では、該λ−Ｒｅｄ遺伝子は、ヘルパープラスミドｐＫＤ４６上に発現される（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、ＰＮＡＳ、９７：６６４０−６６４５（２０００年）；配列番号６５）。
【００４２】
用語「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ菌株」および「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ」は、同義的に使用され、唯一の炭素源およびエネルギー源としてメタンを利用できる能力という点で独特である、メチロトローフとして知られる生理学的細菌群の細菌（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４０２）を指す。
【００４３】
用語「ｙｊｅＲ」は、オリゴ−リボヌクレアーゼ遺伝子座を指す。
【００４４】
用語「Ｄｘｓ」は、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸との、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＯＸＰ）への縮合を触媒する、ｄｘｓ遺伝子によりコ
ードされる酵素Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸を指す。
【００４５】
用語「Ｄｘｒ」または「ＩｓｐＣ」は、ＤＯＸＰの、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸への同時還元および異性化を触媒する、ｄｘｒまたはｉｓｐＣ遺伝子によりコードされる酵素ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼを指す。遺伝子の名称、ｄｘｒまたはｉｓｐＣは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称、ＤｘｒまたはＩｓｐＣは、本願では同義的に使用される。
【００４６】
用語「ＹｇｂＰ」または「ＩｓｐＤ」は、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸の、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールへのＣＴＰ依存的シチジル化を触媒する、ｙｇｂＢまたはｉｓｐＤ遺伝子によりコードされる酵素を指す。遺伝子の名称、ｙｇｂＰまたはｉｓｐＤは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称、ＹｇｂＰまたはＩｓｐＤは、本願では同義的に使用される。
【００４７】
用語「ＹｃｈＢ」または「ＩｓｐＥ」は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸へのＡＴＰ依存的リン酸化を触媒する、ｙｃｈＢまたはｉｓｐＥ遺伝子によりコードされる酵素を指す。遺伝子の名称ｙｃｈＢまたはｉｓｐＥは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称ＹｃｈＢまたはＩｓｐＥは、本願では同義的に使用される。
【００４８】
用語「ＹｇｂＢ」または「ＩｓｐＦ」は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸へ、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロジホスフェートへの、ＣＭＰ損失を伴う環化を触媒する、ｙｂｇＢまたはｉｓｐＦ遺伝子によりコードされる酵素を指す。遺伝子の名称ｙｇｂＢまたはｉｓｐＦは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称ＹｇｂＢまたはＩｓｐＦは、本願では同義的に使用される。
【００４９】
用語「ＧｃｐＥ」または「ＩｓｐＧ」は、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロジホスフェートの、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸への変換に関与する、ｇｃｐＥまたはｉｓｐＧ遺伝子によりコードされる酵素を指す。遺伝子の名称ｇｃｐＥまたはｉｓｐＧは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称ＧｃｐＥまたはＩｓｐＧは、本願では同義的に使用される。
【００５０】
用語「ＬｙｔＢ」または「ＩｓｐＨ」は、ｌｙｔＢまたはｉｓｐＨ遺伝子によりコードされ、また１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸の、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）への変換に関与する、酵素を指す。遺伝子の名称ｌｙｔＢまたはｉｓｐＨは、本願では同義的に使用される。遺伝子産物の名称ＬｙｔＢまたはＩｓｐＨは、本願では同義的に使用される。
【００５１】
用語「Ｉｄｉ」は、イソペンテニル二リン酸をジメチルアリル二リンに変換する、ｉｄｉ遺伝子によりコードされる酵素イソペンテニル二リン酸イソメラーゼを指す。
【００５２】
用語「ＩｓｐＡ」は、ｉｓｐＡ遺伝子によりコードされる酵素ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）シンターゼを指す。
【００５３】
用語「ＩｓｐＢ」は、ｉｓｐＢ遺伝子によりコードされる、イソプレノイドキノン類の側鎖の前駆物質を供給する、酵素オクタプレニル二リン酸シンターゼを指す。
【００５４】
用語「ｐＰＣＢ１５」は、本方法によって遺伝子操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるβ−カロテン産生をモニターするためのレポータープラスミドとして使用する、β
−カロテン合成遺伝子パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）ｃｒｔＥＸＹＩＢを含む、プラスミド（図７；配列番号６４）を指す。
【００５５】
用語「ｐＫＤ４６」は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＹ０４８７４６を有するプラスミド（配列番号６５；ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）を指す。プラスミドｐＫＤ４６は、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムの成分を発現する。
【００５６】
用語「ｐＳＵＨ５」は、ファージＴ５プロモーター（ＰＴ５）領域を、ｐＫＤ４（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）のＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングすることにより構築された、プラスミド（図６；配列番号６６）を指す。これを、融合されたカナマイシン選択可能マーカー／ファージＴ５プロモーター線状ＤＮＡヌクレオチドのＰＣＲ増幅用鋳型プラスミドとして使用した。
【００５７】
本発明において、用語「三重相同的組換え（ｔｒｉｐｌｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、結果として、標的染色体に２つの線状核酸断片が染色体組込みされる、相同な配列による、２つの線状（ＰＣＲ−生成）ＤＮＡ断片と標的染色体との間の遺伝子組換えを指す。
【００５８】
用語「ホモロジーアーム」は、２つの異なる核酸のある特定の領域に、実質的に同じヌクレオチド配列を有する２つの核酸間の相同的組換えを可能にするヌクレオチド配列を指す。該ホモロジーアームのヌクレオチド配列の好ましいサイズ範囲は、約１０〜約１００ヌクレオチドである。
【００５９】
用語「部位特異的リコンビナーゼ」は、特定のヌクレオチド配列（組換え標的部位）を認識し、組換え標的部位間の組換えを触媒する、１つもしくはそれ以上の酵素からなる系を記述するために、本発明で使用される。部位特異的組換えは、外因性ＤＮＡを、再配列、除去、または導入する方法を提供する。部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの関連組換え標的部位の例を以下に挙げる。Ｃｒｅ−ｌｏｘ、ＦＬＰ／ＦＲＴ、Ｒ／ＲＳ、Ｇｉｎ／ｇｉｘ、Ｘｅｒ／ｄｉｆ、Ｉｎｔ／ａｔｔ、ｐＳＲ１システム、ｃｅｒシステム、およびｆｉｍシステム。本発明は、選択可能マーカーを除去するための、部位特異的リコンビナーゼの使用を説明する。ＦＲＴ組換え標的部位が両側にある、抗生物質耐性マーカーは、ＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼの発現により除去される。
【００６０】
用語「スタッキング」、「組合せスタッキング」、「染色体スタッキング」、および「形質スタッキング」は同義的に使用され、選択マーカーを除去するための該部位特異的リコンビナーゼシステムと組み合わせてバクテリオファージＰ１形質導入を使用して、多数の遺伝形質を１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に並列でスタッキングする反復処理を指す（図１２）。
【００６１】
用語「並列組合せ様式」は、多数の遺伝形質が、並列で受容細胞を移動させることができるように、様々なドナー細胞から作られた、Ｐ１溶解産物混合物を用いたＰ１形質導入を指す。
【００６２】
用語「組込みカセット」および「組換え因子」は、組換え堪能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）細菌宿主の形質転換に有用な線状核酸構築物を指す。本発明の組換え因子は、様々な遺伝因子たとえば選択可能マーカー、発現ＤＮＡ断片、および細菌染色体上または他の組換え因子上の領域と相同性を有する組換え領域を含んでもよい。発現ＤＮＡ断片は、所望の表現型の変化を与えるために、組換えに際して、組換え因子に特に操作が加えられた、プロモーター、コード配列、遺伝子、および他の制御因子を
含んでもよい。
【００６３】
用語「発現ＤＮＡ断片」は、宿主細胞における表現型の変化に影響するあらゆるＤＮＡを意味する。「発現ＤＮＡ断片」は、たとえば、制御因子、単離プロモーター、オープン・リーディング・フレーム、コード配列、遺伝子、またはそれらの組合せを含んでなるＤＮＡを含んでもよい。
【００６４】
用語「ｐＤＣＱ１０８」は、本方法によって遺伝子操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるβ−カロテン産生をモニターするためのレポータープラスミドとして使用される、β−カロテン合成遺伝子パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）ｃｒｔＥＸＹＩＢを含むプラスミドを指す（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８２３）。
【００６５】
用語「ＰＴ５プロモーター」および「ファージＴ５プロモーター」は、同義的に使用され、またファージＴ５由来の−１０および−３５コンセンサス配列、乳糖オペレーター（ｌａｃＯ）、およびリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるヌクレオチド配列を指す（配列番号３３）。
【００６６】
用語「ヘルパープラスミド」は、λ−ＲｅｄリコンビナーゼをコードするｐＫＤ４６またはＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼをコードするｐＣＰ２０（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４５５；ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲；およびチェレパノフ（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ）およびワッケルナーゲル（Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ）、Ｇｅｎｅ、１５８：９−１４（１９９５））のいずれかを指す。
【００６７】
用語「カロテノイド過剰生産細菌」は、様々な遺伝子の上方制御または下方制御によって、野生型または非操作宿主より高レベルのカロテノイド化合物を産生するように遺伝子操作されている本発明の細菌を指す。
【００６８】
用語「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）」は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株Ｋ−１２誘導体、たとえばＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６）およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ  ５３３３８）を指す。
【００６９】
用語「パンテア・スチュワーティ亜種スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）」は、「パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）」と略され、エルウィニア・スチュワーティ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）と同義的に使用される（マーガート（Ｍｅｒｇａｅｒｔ）ら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、４３：１６２−１７３（１９９３年））。
【００７０】
用語「パンテア・アナタス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔａｓ）」は、エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）と同義的に使用される（マーガート（Ｍｅｒｇａｅｒｔ）ら、上掲）。
【００７１】
用語「パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）ｃｒｔＥＸＹＩＢ群」は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）ＡＴＣＣ  ８１９９から増幅されたカロテノイド合成遺伝子ｃｒｔＥＸＹＩＢを含む遺伝子群を指す。該遺伝子群は、遺伝子ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、およびｃｒｔＢを含む。該遺伝子群はまた、反対方向に、かつｃｒｔＢ遺伝子に隣接して配列されたｃｒｔＺ遺伝子も含む。
【００７２】
用語「ＣｒｔＥ」は、トランス−トランス−ファルネシル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸を、ピロリン酸＋ゲラニルゲラニル二リン酸に変換する、ｃｒｔＥ遺伝子によりコ
ードされるゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ酵素を指す。
【００７３】
用語「ＣｒｔＹ」は、リコペンをβ−カロテンに変換する、ｃｒｔＹ遺伝子によりコードされるリコペンサイクラーゼ酵素を指す。
【００７４】
用語「ＣｒｔＩ」は、４つの二重結合を導入することにより、フィトエンを、フィトフルエン、ζ−カロテンおよびニューロスポレンという中間体を経てリコペンに変換する、ｃｒｔＩ遺伝子によりコードされるフィトエンデヒドロゲナーゼ酵素を指す。
【００７５】
用語「ＣｒｔＢ」は、プレフィトエン二リン酸（ゲラニルゲラニルピロリン酸）からフィトエンへの反応を触媒する、ｃｒｔＢ遺伝子によりコードされるフィトエンシンターゼ酵素を指す。
【００７６】
用語「ＣｒｔＸ」は、ゼアキサンチンをゼアキサンチン−β−ジグルコシドに変換する、ｃｒｔＸ遺伝子によりコードされるゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素を指す。
【００７７】
用語「ＣｒｔＺ」は、β−カロテンからゼアキサンチンへのヒドロキシル化反応を触媒する、ｃｒｔＺ遺伝子によりコードされるβ−カロテンヒドロキシラーゼ酵素を指す。
【００７８】
用語「カロテノイド生合成経路」は、図１に示されているような、本発明の上方および／または下方イソプレノイド経路のメンバーを含んでなる遺伝子を指す。本発明において、用語「上方イソプレノイド経路」および「上方経路」は、同義的に使用され、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸の、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）への変換に関与する酵素を指す。これらの酵素は、Ｄｘｓ、Ｄｘｒ（ＩｓｐＣ）、ＹｇｐＰ（ＩｓｐＤ）、ＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）、ＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）、ＧｃｐＥ（ＩｓｐＧ）、ＬｙｔＢ（ＩｓｐＨ）、Ｉｄｉ、ＩｓｐＡ、および場合によりＩｓｐＢを含むが、この限りではない。本発明において、用語「下方カロテノイド経路」および「下方経路」は、同義的に使用され、ＦＰＰをカロテノイド類、殊にβ−カロテンに変換する酵素を指す（図１）。この経路における酵素は、ＣｒｔＥ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＸ、およびＣｒｔＺを含むが、この限りではない。本発明において、「下方経路」遺伝子は、レポータープラスミドｐＰＣＢ１５またはｐＤＣＱ１０８上に発現される。
【００７９】
用語「カロテノイド生合成酵素」は、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）ｃｒｔＥＸＹＩＢ群によりコードされるありとあらゆる酵素を指す総称である。該酵素は、ＣｒｔＥ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、およびＣｒｔＸを包含する。
【００８０】
用語「Ｐ１ドナー細胞」および「ドナー細胞」は、本発明で同義的に使用され、バクテリオファージまたはウイルスに感染しやすい細菌株を指し、また形質導入性粒子内にパッケージされた核酸断片のソースの役割をする。一般に、ドナー細胞の遺伝子構造は、「受容細胞」と類似しているかまたは全く同じであり、ドナー細胞により産生される、形質導入性粒子またはウイルスを含むＰ１溶解産物を受け入れるのに役立つ。
【００８１】
用語「Ｐ１受容細胞」および「受容細胞」は、本発明で同義的に使用され、バクテリオファージまたはウイルスに感染しやすい細菌株を指し、ドナー細胞により産生される、形質導入性粒子またはウイルスを含む溶解産物を受け入れるのに役立つ。
【００８２】
「合成遺伝子」は、当業者に周知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から組み立てることができる。これらの構成単位を連結し、アニールして、遺伝子セグメントを形成し、次いで酵素的に組み立てて、遺伝子全体を構築する。「化学
的に合成された」は、ＤＮＡの配列に関連しているとき、構成要素であるヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられたことを意味する。人力を要するＤＮＡの化学合成は、確立した手順を使用して、人力を要するＤＮＡの化学合成を行ってもよく、または多数の販売されている機械の１つを使用して、自動化化学合成を実施してもよい。したがって、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて、該遺伝子を、最適の遺伝子発現に合わせ、宿主細胞のコドンバイアスを反映することができる。コドン使用が、宿主に好まれるコドンに偏っている場合、当業者は、成功する遺伝子発現の可能性を正しく評価することができる。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能な宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
【００８３】
「遺伝子」は、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）および後続する制御配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」は、独自の制御配列と共に自然界で見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界で一緒に見られない制御配列およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子ではない遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来する制御配列およびコード配列を含んでなってもよく、または同一ソースに由来するが、自然界で見られるのとは異なる方法で配列されている、制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムの、その自然の位置にある、天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、通常は、宿主生物に見られないが、遺伝子導入により宿主生物に導入される、遺伝子を指す。外来遺伝子は、非生来の生物に挿入された天然遺伝子、すなわちキメラ遺伝子を含んでなってもよい。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入された遺伝子である。
【００８４】
用語「遺伝子最終産物」は、遺伝子産物の働きの結果として産生される、物質、化学物質または材料（すなわちイソプレノイド類、カロテノイド類）を意味する。一般に、遺伝子産物は、酵素であり、遺伝子最終産物は、特定の基質に対するその酵素活性の産物である。遺伝子最終産物は、単一の酵素活性の結果であってもよく、または生合成経路で見られるような多数の連関活性（幾つかの酵素活性）の結果であってもよい。
【００８５】
細菌ＤＮＡにおける、「オペロン」は、多シストロン性ｍＲＮＡを生じさせる１つのプロモーターから転写される一群の隣接遺伝子群である。
【００８６】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適当な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００８７】
「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般的に、コード配列は、３’からプロモーター配列までに位置する。プロモーターは、全体として天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されてもよく、たとえ合成のＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型における、または発生の異なる段階における、または異なる環境条件もしくは生理学的条件に反応して、遺伝子の発現を指令する可能性があることは、当業者に理解されている（「誘導プロモーター」）。ほとんどの時に、ほとんどの細胞型で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。プロモーターは、それらの使用により確認される発現の相対的強さ（すなわち弱い、中程度、または強い）によって、さらに分類することができる。さらに、ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に確定さ
れてはいないため、異なる長さのＤＮＡ断片が、全く同じプロモーター活性を有する可能性があることが認められている。
【００８８】
「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ｍＲＮＡプロセッシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる制御シグナルを含む。
【００８９】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列の、ＲＮＡポリメラーゼ触媒転写に起因する産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーであるとき、該ＲＮＡ転写物は一次転写物と呼ばれ、またはＲＮＡ転写物は該一次転写物の転写後プロセッシングに由来するＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンがなく、かつ細胞によりタンパク質に翻訳され得る、ＲＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、したがって細胞によりタンパク質に翻訳され得る、ＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、かつ標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、該特定の遺伝子転写物のいずれの部分とであってもよい、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列であってもよい。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されていないが細胞処理に影響を及ぼす他のＲＮＡを指す。
【００９０】
用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方により影響を受ける、単一の核酸断片上の核酸配列の関連性を指す。たとえば、プロモーターが、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、該コード配列が、該プロモーターの転写調節下にある）とき、プロモーターは、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向に、制御配列に作動可能に連結することができる。
【００９１】
用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、本発明の核酸断片に由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指すことがある。
【００９２】
「形質転換」は、遺伝学的に安定な遺伝に帰着する、核酸断片の、宿主生物のゲノムへの移動を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」、「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【００９３】
用語「形質導入」および「普遍形質導入」は、同義的に使用され、また細菌ＤＮＡを含むファージ粒子によって、細菌ＤＮＡが、一方の細菌細胞（ドナー）から他方（受容体）に移動される現象を指す（図１２）。ドナー由来の細菌ＤＮＡ断片は、受容細胞の染色体との相同的組換えを受け、ドナー細胞のＤＮＡ断片を受容体の染色体にしっかり組み込むことができる。
【００９４】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、多くの場合、細胞の中枢代謝の部分ではなく、通常は円形の二本鎖ＤＮＡ断片の形をしている遺伝子を担持する染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、多数のヌクレオチド配列が連結されているか、プロモーター断片および選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列とともに細胞に導入することができる独特の構築物に組換えられている、任意のソースに由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、線状または円形の、自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよい。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、かつ該外来遺伝子に加えて、ある特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する、特異的ベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、かつ外来遺伝子に加えて、異質の宿主におけるその遺伝子の発現を
増強することが可能なエレメントを有する特異的なベクターを指す。
【００９５】
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用なコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販されていることもあり、または独立に開発されていることもある。代表的な配列分析ソフトウェアは、ＧＣＧプログラム一式（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ウィスコンシン州マディソンのジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０年））、およびＤＮＡスター（ＤＮＡＳＴＡＲ）（米国  ５３７１５  ウィスコンシン州セイント・マディソン  Ｓ．パーク  １２２８の、ＤＮＡスター・インク（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）（１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ））、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み込んだファスタ（ＦＡＳＴＡ）プログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会議日程１９９２年、１１１−２０、編集者：スハーイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）、発行者：ニューヨーク州ニューヨークのプレナム（Ｐｌｅｎｕｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ））を含むが、この限りではない。配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、特に明記されていない限り、分析の結果は、参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことは、本願の脈略の中で、理解されるであろう。本明細書で使用されるとき、「デフォルト値」は、最初に初期化するときに、該ソフトウェアを最初にロードする任意の組の値またはパラメーターを意味する。
【００９６】
本発明は、カロテノイド過剰生産細菌に関する。本発明の細菌宿主におけるイソプレノイド経路の遺伝子は、ある特定の遺伝子が、上方制御されるかまたは下方制御され、その結果として、非操作宿主でみられるより高いレベルでカロテノイド化合物が産生されるように操作されている。制御される遺伝子は、カロテノイド生合成経路に直接関与している場合もある。関与する遺伝子は、カロテノイド生合成経路とは分かっている関係がない染色体遺伝子の場合もある。
【００９７】
カロテノイド生合成遺伝子のある特定の組合せの過剰発現は、予想外に高レベルのカロテノイド産生を与えることが分かっている。カロテノイド生合成経路の一部であるこの方法で有用な遺伝子の例は、ｄｘｓ遺伝子、（ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸の、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸への縮合を触媒する）、ｉｄｉ遺伝子（イソペンテニル二リン酸を、ジメチルアリル二リン酸に変換する）、ｙｇｂＢ（ｉｓｐＦ）遺伝子（４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸への、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロジホスフェートへの、ＣＭＰ損失を伴う環化を触媒する）、ｙｇｂＰ（ｉｓｐＤ）遺伝子（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸の、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールへの、ＣＴＰ依存的シチジル化を触媒する）および一緒にしてｙｇｂＢＰ遺伝子と呼ばれる、ｌｙｔＢ（ｉｓｐＨ）遺伝子（２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロジホスフェートの、ジメチルアリル二リン酸およびイソペンテニル二リン酸への変換に関与する）、および酵素オクタプレニルジホスフェートシンターゼをコードするｉｓｐＢ遺伝子である。強力プロモーターの制御下で、これらの遺伝子が選択的に過剰発現されるとき、予想外に高レベルのカロテノイドが産生される結果となる。所望の作用を与えることが証明されているのは、これらの遺伝子の過剰発現の組合せであることに注目することが重要である。
【００９８】
あるいは、ある種の必須染色体遺伝子は、変異したとき、カロテノイド生合成経路の生産量を変えることも分かっている。１つのこのような遺伝子は、ｙｊｅＲ遺伝子（オリゴ−リボヌクレアーゼ遺伝子座を確定する）である。この遺伝子の部分的突然変異は、カロテノイド生合成ができる宿主細胞で、カロテノイド産生を予想外に増加することが分かっている。
【００９９】
カロテノイド産生に関与する遺伝子
カロテノイド類の生合成に関与する酵素経路は、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸を、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）に変換する上方イソプレノイド経路、ならびにフィトエンおよびその後産生される全てのカロテノイド類を合成する下方カロテノイド生合成経路という、２つの部分で、便利に考えることができる。上方経路は、多くの非カロテン産生性微生物に遍在し、これらの場合、所望のカロテノイドを生合成するための下方経路を含んでなる遺伝子を導入しさえすればよい。２つの経路の主要な区分は、ファルネシルピロリン酸の合成に関する。ＦＰＰが本来存在する場合、下方カロテノイド経路のエレメントのみが必要である。しかし、カロテノイドの産生に有効な下方経路カロテノイド遺伝子にとって、宿主細胞が、適当なレベルのＦＰＰを該細胞内に有することが必要なことは、十分に理解されるであろう。宿主細胞によりＦＰＰが合成されない場合、ＦＰＰの産生に必要な遺伝子を導入することが必要であろう。これらの各経路を、以下で詳細に検討する。
【０１００】
上方イソプレノイド経路
イソプレノイド生合成は、共通のＣ５イソプレンサブユニット、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を生成する、２経路のいずれかによって起こる。第一に、周知の酢酸／メバロン酸経路によって、ＩＰＰを合成することが可能である。しかし、最近の研究は、該メバロン酸依存的経路は、全ての生物で機能するとは限らないことを証明した。ＩＰＰ生合成のための代わりのメバロン酸非依存的経路は、細菌、ならびに緑藻類および高等植物で、特性決定されている（ホルバッハ（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１１１：１３５−１４０（１９９３年）；ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９５：５１７−５２４（１９９３年）；シュベンデル（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３１６：７３−８０（１９９６年）；およびアイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：６４３１−６４３６（１９９６年））。
【０１０１】
メバロン酸非依存的イソプレノイド経路における多くの工程は、公知である（図１）。たとえば、ＩＰＰの産生につながる代替経路の初期段階は、コール（Ｃｏｌｅ）ら（Ｎａｔｕｒｅ、３９３：５３７−５４４（１９９８年））により、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）で研究されている。該経路の第１工程は、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸として知られる５炭素化合物を生じるための、２つの３炭素分子（ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸）の縮合を含む。この反応は、ｄｘｓ遺伝子によりコードされる、ＤＸＳ酵素によって引き起こされる。次に、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の異性化および還元により、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を生じる。該異性化および還元工程に関与する酵素の１つは、遺伝子ｄｘｒ（ＩｓｐＣ）によりコードされる、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）である。２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸は、次に、非存在注釈付き遺伝子ｙｇｂＰによりコードされる酵素によるＣＴＰ依存的反応で、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールに変換される。しかし、最近、該ｙｇｂＰ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子群の一部として、ｉｓｐＤと改名された（スイスプロテイン受入番号（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃）Ｑ４６８９３）。
【０１０２】
次に、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの第２位ヒドロキシ基は、ｙｃｈＢ遺伝子によりコードされる酵素によるＡＴＰ依存的反応で、リン酸化することができる。ＹｃｈＢは、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールをリン酸化し、その結果として４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸を生じる。該ｙｃｈＢ遺伝子は、やはりｉｓｐ遺伝子群の一部として、ｉｓｐＥと改名された（スイスプロテイン受入番号（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃）Ｐ２４２０９）。ＹｇｂＢは、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸を、ＣＴＰ依存的方法で、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロジホスフェートに変換する。この遺伝子もまた、最近改名され、ｉｓｐ遺伝子群に属する。具体的には、ｙｇｂＢ遺伝子の新しい名称は、ｉｓｐＦである（スイスプロテイン受入番号（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃）Ｐ３６６６３）。
【０１０３】
ｇｃｐＥ（ｉｓｐＧ）およびｌｙｔＢ（ｉｓｐＨ）遺伝子（およびおそらくその他）によりコードされる酵素は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の形成につながる反応に関与すると考えられる。ＩＰＰは、ｉｄｉ遺伝子によりコードされる、ＩＰＰイソメラーゼによりＤＭＡＰＰに異性化される可能性がある。しかし、この酵素は、生き残るために不可欠ではなく、また２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）経路を使用する一部の細菌で、欠けていることがある。最近の証拠から、ＭＥＰ経路はＩＰＰの前に分岐し、ｌｙｔＢ遺伝子産物を介して、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを別々に産生することが示唆される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合、ｌｙｔＢノックアウト突然変異は、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの両者を加えた培地以外では致命的である。
【０１０４】
ＦＰＰの合成は、ＩＰＰの、ジメチルアリルピロリン酸への異性化を介して起こる。この反応の後に、ｉｓｐＡにより触媒される、一連の、２つのプレニルトランスフェラーゼ反応が続き、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ；１０炭素分子）およびファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ；１５炭素分子）の生成につながる。
【０１０５】
表１に示す通り、上方経路のエレメントをコードする遺伝子は、様々な植物、動物、および細菌起源から知られている。
【０１０６】
【表３】
2006515174.tif 000004
【０１０７】
【表４】
2006515174.tif 000005
【０１０８】
【表５】
2006515174.tif 000006
【０１０９】
本発明における上方イソプレン経路に最も好ましい遺伝子源は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４０２）に由来する。メタン資化性菌は、生来、ピンクの色素を有し、３０炭素カロテノイドを産生するため、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａは、本発明に特に適する。したがって、該生物は、上方イソプレン経路の遺伝子を有する。これらの好ましい遺伝子の配列を、下記の配列番号として示す。ｄｘｓ（１６ａ）遺伝子（配列番号１３）、ｄｘｒ（１６ａ）遺伝子（配列番号１７）、およびｌｙｔＢ（１６ａ）遺伝子（配列番号１５）。
【０１１０】
下方カロテノイド生合成経路
上方イソプレノイド経路と下方カロテノイド経路との間の区分は、幾らか主観的である。ＦＰＰ合成は、カロテン産生性細菌（ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）および非カロテン産生性細菌の両者に共通であるため、下方カロテノイド生合成経路の第１工程は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）をゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）に変換するプレニルトランスフェラーゼ反応から始まると考えられる。ＧＧＰＰシンセターゼをコードする、遺伝子ｃｒｔＥは、ＩＰＰをＦＰＰに付加して、２０炭素分子ＧＧＰＰを産生する、このプレニルトランスフェラーゼ反応に関与する。ＧＧＰＰ  ２分子の縮合反応が起こり、下方カロテノイド生合成経路の最初の４０炭素分子である、フィトエン（ＰＰＰＰ）が生じる。この酵素反応は、フィトエンシンターゼをコードする、ｃｒｔＢにより触媒される。
【０１１１】
「赤色」のスペクトルを与える、リコペンは、フィトエンから、遺伝子ｃｒｔＩ（フィトエンデサチュラーゼをコードする）により触媒されて８個の水素原子が除去されることによる４つの逐次的脱水素反応を経て、産生される。この反応における中間体は、フィト
フルエン、ζ−カロテン、およびニューロスポレンである。
【０１１２】
リコペンサイクラーゼ（ｃｒｔＹ）は、リコペンをβ−カロテンに変換する。本発明では、遺伝子最終産物としてβ−カロテンを産生するレポータープラスミドが使用される。しかし、さらなる遺伝子を使用して、様々な他のカロテノイド類を生じさせることが可能である。たとえば、β−カロテンは、β−カロテンヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ遺伝子によりコードされる）の活性により生じるヒドロキシル化反応を介して、ゼアキサンチンに変換される。β−クリプトキサンチンは、この反応における中間体である。
【０１１３】
β−カロテンは、ｃｒｔＷ遺伝子またはｃｒｔＯ遺伝子のいずれかによりコードされるβ−カロテンケトラーゼにより、カンタキサンチンに変換される。エキネノンは、この反応における中間体である。次いで、カンタキサンチンは、ｃｒｔＺ遺伝子またはｃｒｔＲ遺伝子によりコードされるβ−カロテンヒドロキシラーゼによって、アスタキサンチンに変換することができる。アドンビルブリン（ａｄｏｎｂｉｒｕｂｒｉｎ）は、この反応における中間体である。
【０１１４】
ゼアキサンチンは、ゼアキサンチン−β−ジグルコシドに変換することができる。この反応は、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ（ｃｒｔＸ）により触媒される。
【０１１５】
ゼアキサンチンは、ｃｒｔＷ、ｃｒｔＯまたはｂｋｔによりコードされるβ−カロテンケトラーゼによって、アスタキサンチンに変換することができる。ＢＫＴ／ＣｒｔＷ酵素は、β−カロテンおよび４−ケトゼアキサンチンから、エキネノンを経て、カンタキサンチンを合成した。アドニキサンチンは、この反応における中間体である。
【０１１６】
スフェロイデンは、ｃｒｔＡによりコードされるスフェロイデンモノオキシゲナーゼにより、スフェロイデノンに変換することができる。
【０１１７】
ニューロスポレンは、スフェロイデンに変換することができ、リコペンは、それぞれ、ｃｒｔＣ遺伝子、ｃｒｔＤ遺伝子およびｃｒｔＦ遺伝子によりコードされる、ヒドロキシニューロスポレンシンターゼ、メトキシニューロスポレンデサチュラーゼおよびヒドロキシニューロスポレン−Ｏ−メチルトランスフェラーゼの逐次作用により、スピリロキサンチンに変換することができる。
【０１１８】
β−カロテンは、ｃｒｔＵによりコードされるβ−カロテンデサチュラーゼにより、イソレニエラテンに変換される。
【０１１９】
表２に示す通り、下方カロテノイド生合成経路のエレメントをコードする遺伝子は、様々な植物、動物、および細菌起源から知られている。
【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
【表７】
2006515174.tif 000008
【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
【表９】
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【０１２４】
【表１０】
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【０１２５】
ｃｒｔ遺伝子の最も好ましい起源は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）に由来する。これらの好ましい遺伝子の配列は、下記の配列番号として示される。ｃｒｔＥ遺伝子（配列番号１）、ｃｒｔＸ遺伝子（配列番号３）、ｃｒｔＹ（配列番号５）、ｃｒｔＩ遺伝子（配列番号７）、ｃｒｔＢ遺伝子（配列番号９）およびｃｒｔＺ遺伝子（配列番号１１）。
【０１２６】
宿主生物で、十分なＦＰＰ源が利用できるのであれば、表２に示されている遺伝子および本発明の好ましい遺伝子の様々な組合せを使用することにより、本発明の方法を使用し
て無数の異なるカロテノイド類およびカロテノイド誘導体を作ることが可能である。たとえば、遺伝子群ｃｒｔＥＸＹＩＢは、β−カロテンの産生を可能にする。ｃｒｔＺをｃｒｔＥＸＹＩＢに付加することにより、ゼアキサンチンの産生が可能になる。
【０１２７】
本発明の有用な産物は、アンテラキサンチン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、キャプソルブリン（ｃａｐｓｏｒｕｂｒｉｎ）、β−クリプトキサンチン、ジデヒドロリコペン、β−カロテン、ζ−カロテン、δ−カロテン、γ−カロテン、ケト−γ−カロテン、ψ−カロテン、ε−カロテン、β，ψ−カロテン、トルレン、エキネノン、ガンマ−カロテン、ゼータ−カロテン、α−クリプトキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクテュカキサンチン（ｌａｃｔｕｃａｘａｎｔｈｉｎ）、ルテイン、リコペン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリディニン、フィトエン、ロドピン、ロドピングルコシド、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、ウリオライド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ）、酢酸ウリオライド（ｕｒｉｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、およびＣ３０−カロテノイド類等を含むが、この限りではない、本明細書で定義されているあらゆるカロテノイド化合物を包含することが想定される。
【０１２８】
カロテノイド生合成経路を最適化する方法
代謝工学は、一般に、新規な代謝活性を宿主生物に導入すること、または変更操作たとえば遺伝因子の、付加、除去、または修飾による既存の方法の改良を含む（スタファノプーロス（Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ）、Ｇ．、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．、１：１−１１（１９９９年））。１つのこのような修飾は、代謝経路における関連遺伝子の発現に対する、遺伝子工学的調節である。
【０１２９】
遺伝子発現を調節するための、様々な方法がある。微生物代謝工学は、一般に、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターの制御下で当該遺伝子を発現させるために、マルチコピーベクターを使用することを含む。工業的使用のための代謝工学のこの方法は、幾つかの欠点を有する。分離不安定性（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）のため、該ベクターを維持することが困難な場合がある。ベクター負荷（ｖｅｃｔｏｒ  ｂｕｒｄｅｎ）に起因する、細胞の生存能力および増殖に対する悪影響がしばしば認められる。ベクター上の所望の遺伝子の最適発現レベルを調節することもまた困難である。マルチコピーベクターを使用することの望ましくない影響を回避するために、バクテリオファージλ、トランスポゾン、または当該遺伝子を含む他の適当なベクターの単挿入による、相同的組換えを使用する染色体組込み手法が使用されてきた。しかし、この方法もまた、組換えの前に、当該遺伝子を適当なベクターに入れるために、多数のクローニング工程を必要とする等の欠点を有する。もう１つの欠点は、挿入された遺伝子と関連した不安定性であり、これは、切除により失くすことができる。最後に、これらの方法には、可能な挿入の数および染色体上の挿入部位の位置を制御できないこと関連した制限がある。
【０１３０】
幾つかの方法が、遺伝子発現の制御に含まれる。主な工程は、（１）転写の開始、（２）転写の終結、（３）転写物のプロセッシング、および（４）翻訳である。これらの中で、転写開始が、遺伝子発現を調節するための主要な工程である。転写開始は、１つもしくはそれ以上の転写因子のための可能性がある結合部位と一緒にＲＮＡポリメラーゼのための結合部位を含むプロモーター領域の配列により決定される。
【０１３１】
強力プロモーターは、代謝経路における重要な遺伝子の構成的過剰発現に広く使用される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に有用な強いプロモーターおよびどちらかと言えば強いプロモーターとしては、ｌａｃ、ｔｒｐ、λＰＬ、λＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、Ｔ５
（ＰＴ５）、およびｔｒｃなどがある。タンパク質発現の量およびタイミングを制御する従来の方法は、誘導プロモーターを使用することである。誘導プロモーターは、構成的プロモーターのように、常に活性であるとは限らない（たとえばウイルスのプロモーター）。誘導プロモーターは通常、ある環境的刺激または化学的刺激に反応して活性化される（すなわち、数例を挙げると、熱ショックプロモーター、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）反応性プロモーター、およびテトラサイクリン（ｔｅｔ）反応性プロモーター）。
【０１３２】
ストレス条件下および静止期の開始時に活性である静止期σＳレギュロンのプロモーターは、様々なストレスに対する細胞の保護に関与する約１００遺伝子の発現を調節する。代謝産物が細胞成長を阻害するとき、σＳレギュロン遺伝子のプロモーターはまた、所望の遺伝子の発現に有用である。該σＳ依存的静止期プロモーターとしては、数例を挙げると、ｒｐｏＳ、ｂｏｌＡ、ａｐｐＹ、ｄｐｓ、ｃｙｘＡＢ−ａｐｐＡ、ｃｓｇＡ、ｔｒｅＡ、ｏｓｍＢ、ｋａｔＥ、ｘｔｈＡ、ｏｔｓＢＡ、ｇｌｇＳ、ｏｓｍＹ、ｐｅｘ、およびｍｃｃなどがある。
【０１３３】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子に由来してもよい。場合により、終結部位は不必要なこともあるが、含まれていれば、最も好ましい。
【０１３４】
あるいは、標的経路、またはエネルギーまたは炭素の競合シンクの役割をすることが可能な競合経路における、ある種の遺伝子の発現を減少または排除することが必要なこともある。この目的のために遺伝子を下方調節する方法が探求されてきた。破壊される遺伝子の配列が分かっている場合、遺伝子下方制御の最も効果的な方法は、転写を破壊するために外来ＤＮＡを構造遺伝子内に挿入する方法である、標的遺伝子破壊である。これは、破壊される遺伝子の一部と相同性が高い配列に挟まれた、挿入されるＤＮＡ（多くの場合、遺伝子マーカー）を含んでなる遺伝子カセットを創出することにより行うことができる。該カセットを宿主細胞内に導入することは、細胞の生来のＤＮＡ複製機構を介して、または本発明で使用されるλ−Ｒｅｄ組換えシステムによって、外来ＤＮＡを構造遺伝子に挿入する結果となる。（たとえばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１：４６１７−４６２２（１９８９年）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、Ｇｅｎｅ、１３６：２１１−２１３（１９９３年）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２４：２５１９−２５２４（１９９６年）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．、５：２７０−２７７（１９９６年））。
【０１３５】
アンチセンス技術は、標的遺伝子の配列が分かっている場合に、遺伝子を下方制御する別法である。これを行うためには、所望の遺伝子由来の核酸セグメントをクローン化し、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに作動可能に連結する。次いで、この構築物を宿主細胞に導入し、該ＲＮＡのアンチセンス鎖を産生させる。アンチセンスＲＮＡは、当該タンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨げることにより、遺伝子発現を阻害する。当業者は、特定の遺伝子の発現を減少させるためには、特別の配慮がアンチセンス技術の使用と関係していることが分かるであろう。たとえば、アンチセンス遺伝子の適切なレベルの発現は、当業者に周知の異なる制御因子を利用する、異なるキメラ遺伝子の使用を必要とする。
【０１３６】
該配列が分かっている場合、標的遺伝子破壊およびアンチセンス技術は、遺伝子を下方制御する効果的な方法を提供するが、配列に基づかない、他の特異性が低い方法が開発されている。たとえば、細胞をＵＶ放射線に暴露し、次いで所望の表現型についてスクリーニングする。化学薬品による突然変異誘発もまた、突然変異体を生じさせるために有効であり、よく使用される物質としては、非複製ＤＮＡに影響する化学薬品たとえばＨＮＯ２
およびＮＨ２ＯＨ、ならびにフレームシフト突然変異を引き起こすことで著名な、複製ＤＮＡに影響する化学薬品たとえばアクリジン色素などがある。放射線または化学薬品を使用して突然変異体を創出する特異的な方法は、当該技術分野で十分に文書に記録されている。たとえばトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、バイオテクノロジー：工業微生物学教科書（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版（１９８９年）マサチュセッツ州サンダーランドのシナウワー・アソシエーツ・インク（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．）、またはデシュパンデ・ムクンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７、（１９９２年）を参照されたい。
【０１３７】
遺伝子破壊の別の非特異的方法は、転移性因子すなわちトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡにランダムに挿入するが、どの場所で挿入が起こったかを決定するために、その後の配列に基づいて検索することができる、遺伝因子である。ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも、転位方法は公知である。両方法はともに、トランスポザーゼ酵素と組合せて、転移性因子を使用する。トランスポザーゼの存在下で、該転移性因子すなわちトランスポゾンを核酸断片と接触させるとき、該転移性因子は、該核酸断片にランダムに入る。該転移性因子の配列に基づいて、破壊された遺伝子を同定することが可能なため、該技術は、ランダム突然変異誘発および遺伝子単離に有用である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転位向けのキットが販売されている（たとえばニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）から販売されている、酵母Ｔｙ１因子に基づいた、ザ・プライマー・アイランド・トランスポジション・キット（Ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）；マサチュセッツ州ベバリーのニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から販売されている、細菌のトランスポゾンＴｎ７に基づいた、ザ・ゲノム・プライミング・システム（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ
Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）；およびウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から販売されている、Ｔｎ５細菌転移性因子に基づいた、ＥＺ：：ＴＮトランスポゾン・インサーション・システムズ（Ｔｈｅ  ＥＺ：：ＴＮ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を参照されたい）。酵素または他のタンパク質、アミノ酸、またはアルコール類を含む小さい有機分子を含むかなり多数の所望の産物の産生増強を含むかなり多数の用途向けに、突然変異体を単離するために、染色体におけるトランスポゾン仲介ランダム挿入を使用することができる。
【０１３８】
本発明は、様々な必須遺伝子で突然変異を引き起こすために、この最後の経路調節方法を使用し、カロテノイド生合成経路の生産量に何らかの影響があるかどうかをテストする。トランスポゾン突然変異誘発を使用して、ｙｊｅＲ遺伝子に部分的破壊を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突然変異体を創出する。突然変異した遺伝子の正確な配列を、配列番号６３として示す。このｙｊｅＲ突然変異（ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５）は、カロテノイド産生性プラスミド（ｐＰＣＢ１５またはｐＤＣＷ１０８）のプラスミドコピー数の増加を介して、β−カロテン産生増加をもたらした。プラスミドに対するこの遺伝子座の突然変異の効果は斬新であり、既知の研究から予測することはできなかった。イソプレノイド遺伝子の上流の、非内因性プロモーターの染色体操作によって作られた、操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に、ｙｊｅＲ突然変異（ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５）をスタッキングすること、および非内因性イソプレノイド経路遺伝子を染色体に組み込むことにより、β−カロテン産生のさらなる増加が可能になった。
【０１３９】
経路調節のための本明細書に記載の一般法は、有用であり、また熟練者が本発明を実行
することを可能にする。実行者が、イソプレノイド経路における必要な改良を加えることができるであろう、他の、さほど伝統的ではない方法が考えられることは、十分に理解されるであろう。バクテリオファージ形質導入システムを使用する染色体のプロモーター置換を含む１つのこのような方法をここで使用して好結果を得たので、以下に記載する。
【０１４０】
バクテリオファージ形質導入による、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるカロテノイド産生の最適化
本方法は、（組換え堪能（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）宿主における）相同的組換えによるプロモーター置換と、バクテリオファージ形質導入システムを併用する。該方法を使用すれば、遺伝子発現増強に望ましい因子の上流に、強力プロモーターを迅速に挿入することができる。該方法はまた、発現遺伝因子のどの組合せが、所望の遺伝子最終産物の産生を最適化するかを評価するためのライブラリーの作成を容易にする（図１２）。このように、特定の生合成経路と通常は関係がない、所望の遺伝子最終産物の産生に、予想外に顕著な影響をもたらす遺伝子を同定することが可能である。
【０１４１】
組込みカセット
該プロモーター置換方法の一態様は、組込みカセットの使用である。本発明で使用されるとき、「組込みカセット」は、図２に示されているように、２つのＰＣＲで生成された断片または１つのＰＣＲで生成された断片を使用することにより、相同的組換えで染色体に組み込まれる線状二本鎖ＤＮＡ断片である。該組込みカセットは、発現ＤＮＡ断片、および部位特異的リコンビナーゼによく反応する特異的リコンビナーゼ部位により結合された選択可能マーカー、ならびに宿主細胞の染色体の異なる部分と相同性を有するホモロジーアームを含む核酸組込み断片を含んでなる。一般的に、該組込みカセットは、一般構造：５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−Ｙ−ＲＲ２−３’を有し、ここで、
（ｉ）ＲＲ１は、第１のホモロジーアームであり；
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼによく反応する組換え部位であり；
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択可能マーカーをコードするＤＮＡ断片であり；
（ｉｖ）Ｙは、第１の発現ＤＮＡ断片であり；そして
（ｖ）ＲＲ２は、第２のホモロジーアームである。
【０１４２】
本発明の発現ＤＮＡ断片は、生合成経路の遺伝学的操作で有用なものである。たとえば、本発明の発現ＤＮＡ断片は、ある経路で、生来のプロモーターの代わりに強力プロモーターを操作するために有用な可能性がある。ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、λＰＬ、λＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、ＰＴ５、およびｔｒｃ（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）ならびにａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター、およびたとえばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用な様々なファージプロモーターを含むがこの限りではない、実質的にあらゆるプロモーターが、本発明に適する。
【０１４３】
あるいは、既存の生来のプロモーターの下流に、異なるコード領域を導入してもよい。このようにして、宿主細胞に既存の経路を完成するかまたは強化する、生合成経路を含んでなる新しいコード領域を、導入することができる。これらのコード領域は、それらの生来のプロモーターを保持する遺伝子であってもよく、または標的生合成経路における遺伝子の発現増加のために、誘導可能な強力プロモーターまたは構成的強力プロモーターに作動可能に連結されたキメラ遺伝子であってもよい。本発明で好ましいのは、イソプレノイド／カロテノイド生合成経路の遺伝子であり、上に定義され、また図１に示されているような、ｄｘｓ、ｄｘｒ、ｙｇｂＰ、ｙｃｈＢ、ｙｇｂＢ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡ、ｌｙｔＢ、ｇｃｐＥ、ｉｓｐＢ、ｇｐｓ、ｃｒｔＥ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、ｃｒｔＸ、およびｃｒｔＺを包含する。本発明では、該発現ＤＮＡ断片が、プロモーターか、または生合成経路の調節に有用なコード領域であれば、好ましい。本発明で例証されるのは、組換
え堪能大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主におけるイソプレノイド生合成経路の調節に使用されるファージＴ５強力プロモーターである。該経路のある因子を下方制御することが望ましい場合、時として、発現ＤＮＡ断片は、アンチセンス方向であってもよい。
【０１４４】
一般に、該ホモロジーアームの好ましい長さは、約１０〜約１００塩基対の長さである。相同的組換えのために本発明で使用される比較的短い長さのホモロジーアームを考えれば、能率的な組換えのためには、好ましくは相同的組換えの標的とされるものと全く同じ配列を使用して、許容し得る不適正配列のレベルを最低限に保つべきであると考えるであろう。２０〜４０塩基対の相同性により、相同的組換えの能率は、４桁上昇する（ユー（Ｙｕ）ら、ＰＮＡＳ．、９７：５９７８−５９８３（２０００年））。したがって、ホモロジーアーム内の多数の不適正は、相同的組換えの能率を低下させる可能性がある。しかし、当業者は、不適正の許容し得るレベルを容易に確認することができる。
【０１４５】
本発明は、２つの組換え因子（組込みカセット）の一方の上の選択可能マーカーを使用する。抗生物質耐性マーカーたとえばアンピシリン耐性、カナマイシン耐性、およびテトラサイクリン耐性を含むがこの限りではない選択可能マーカーは、当該技術分野で公知である。選択可能マーカーはまた、アミノ酸生合成酵素（通常は、外的に供給された当該アミノ酸を必要とする栄養要求体を選択するため）および目に見える外見の変化を触媒する酵素、たとえばｌａｃ−細菌におけるβ−ガラクトシダーゼも含んでもよい。本明細書で使用されるとき、該マーカーは、部位特異的リコンビナーゼ認識配列により挟まれている。選択および構築物検証の後、部位特異的リコンビナーゼを使用して、該マーカーを除去する。次いで、さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ染色体修飾のために、本発明の工程を繰り返すことができる。染色体修飾を操作するために使用される組込みカセットは、プロモーターおよび／または遺伝子、および部位特異的リコンビナーゼ配列に挟まれた選択マーカーを包含する。部位特異的リコンビナーゼ、たとえば本発明におけるフリッパーゼ（ＦＬＰ）リコンビナーゼの使用は、特異的組換え配列（すなわちＦＲＴ配列）を認識して、選択可能マーカーの除去を可能にする。本発明のこの態様は、多重染色体修飾のための、本方法を反復使用を可能にする。数例の部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの関連した特異的認識配列が当該技術分野で知られているように、本発明は、ＦＬＰ−ＦＲＴリコンビナーゼシステムに限定されない。他の適当な部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの対応する認識配列の例は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、Ｒ／ＲＳ、Ｇｉｎ／ｇｉｘ、Ｘｅｒ／ｄｉｆ、Ｉｎｔ／ａｔｔ、ｐＳＲ１システム、ｃｅｒシステム、およびｆｉｍシステムを包含する。
【０１４６】
組換え堪能（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）宿主細胞
本発明は、組込みカセットと宿主細胞染色体との間の能率的な相同的組換えを仲介することができる組換え堪能宿主細胞を使用する。相同的組換えを非常に効果的に仲介する生物（たとえば酵母）もあるが、遺伝学的介入を必要とする生物もある。たとえば、本来、相同的組換えにより能率的な形質転換を受けないものと一般に考えらる宿主である、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を変えて、組換え堪能宿主にすることが可能である。λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムを含有するヘルパープラスミドを用いた形質転換は、相同的組換え率を数倍上昇させる（マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、Ｇｅｎｅ、２４６：３２１−３３０（２０００年）；マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ），Ｋ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８０：２０６３−２０７１；ポティート（Ｐｏｔｅｅｔｅ）およびフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８２：２３３６−２３４０（２０００年）；ポティート（Ｐｏｔｅｅｔｅ），Ａ．、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．、２０１：９−１４（２００１年）；ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲；ユー（Ｙｕ）ら、上掲；シャベロッシュ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８：ｅ９７：１−６（２０００年）；米国特許第６，３５５，４１２号明細書；米国特許第６，５０９，１５６号明細書；および米国特許出願第６０／４３４６０２号明細書）。該λ−Ｒｅｄシステムはまた、宿
主に染色体的に組み込むことができる。該λ−Ｒｅｄシステムは、通常は組換え欠損大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、組換え堪能宿主に変える３遺伝子（ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍ）を含む。
【０１４７】
通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、そのＲｅｃＢＣＤエンドヌクレアーゼにより線状二本鎖ＤＮＡを能率的に分解し、結果として染色体操作に有用ではない形質転換効率に帰着する。ｇａｍ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＢＣＤ複合体に結合して、エンドヌクレアーゼ活性を阻害する、タンパク質をコードする。ｅｘｏ遺伝子は、二本鎖ＤＮＡの５’末端鎖を前進的に分解し、３’一本鎖オーバーハングを創出する、λ−エクソヌクレアーゼをコードする。ｂｅｔによりコードされるタンパク質は、λ−エクソヌクレアーゼと複合体を形成し、また一本鎖ＤＮＡオーバーハングに結合して相補鎖の再生を促進し、交換反応を仲介することができる。λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムは、相同的組換えにより形質転換することが困難と通常考えられている宿主、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｉｎ  ｖｉｖｏ染色体操作のツールとしての、相同的組換えの使用を可能にする。λ−Ｒｅｄシステムは、他の細菌でも機能する（ポティート（Ｐｏｔｅｅｔｅ），Ａ．、上掲、２００１年）。λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムの使用は、工業生産に一般的に使用される他の宿主に適用できるはずである。これらのさらなる宿主は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）含むが、この限りではない。好ましい宿主は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される。
【０１４８】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステム
本発明で使用されるλ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムは、ヘルパープラスミド（ｐＫＤ４６）上に含まれ、３つの必須遺伝子、ｅｘｏ、ｂｅｔ、およびｇａｍで構成される（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）。該ｅｘｏ遺伝子は、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの５’末端鎖を前進的に分解し、３’一本鎖オーバーハングを創出する、λ−エクソヌクレアーゼをコードする。Ｂｅｔは、λ−エクソヌクレアーゼと複合体を形成し、一本鎖ＤＮＡに結合して相補鎖の再生を促進し、交換反応を仲介することができる、タンパク質をコードする。Ｇａｍは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＲｅｃＢＣＤ複合体に結合して該複合体のエンドヌクレアーゼ活性を阻害する、タンパク質をコードする。
【０１４９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における相同的組換えは非常に低い頻度で起こり、また通常、広範囲に及ぶ相同領域を必要とするため、λ−Ｒｅｄシステムが、本発明で使用される。該λ−Ｒｅｄシステムは、線状ｄｓＤＮＡ断片の両側に位置する短い相同領域（１０〜１００ｂｐ）を相同的組換えに使用できる能力を助長する。さらに、通常、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されるＲｅｃＢＣＤ複合体は、そのエクソヌクレアーゼ活性が、線状ｄｓＤＮＡを能率的に分解するため、形質転換のための線状ｄｓＤＮＡの使用が妨げられる。ｇａｍによる、ＲｅｃＢＣＤ複合体のエンドヌクレアーゼ活性の阻害は、線状ｄｓＤＮＡ断片を使用する能率的な相同的組換えに不可欠である。
【０１５０】
組合せＰ１形質導入システム
形質導入は、細菌ＤＮＡを含有するファージ粒子によって、細菌ＤＮＡが、１つの細菌細胞（ドナー）から別の細菌細胞（受容体）に移動される現象である。ドナー細菌の集団がファージに感染すると、ファージ溶菌サイクルの事象が開始される可能性がある。溶菌感染の間に、ウイルスＤＮＡのバクテリオファージ内へのパッケージに関与する酵素は、時には宿主ＤＮＡをパッケージすることがある。結果として生じる粒子は、形質導入性粒子と呼ばれる。該細胞が溶解されると、形質導入性粒子と正常なビリオンの混合物（「Ｐ１溶解産物」）が放出される。この溶解産物を使用して、受容細胞の集団を感染させるとき、該細胞の大部分は、正常なウイルスに感染する。しかし、該集団のごく一部は、前の宿主細菌から受け取ったＤＮＡを注入する形質導入性粒子を受け取る。このＤＮＡは、他の宿主のＤＮＡとの遺伝子組換えを遂げることができる。従来のＰ１形質導入は、一度にただ１つの遺伝形質（すなわち遺伝子）を（ドナー細胞から受容細胞に）移動させることができる。
【０１５１】
公知の形質導入ファージを有するもの、たとえばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロジーナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオ（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）を含むがこの限りではない多数の宿主システムを、本発明の目的のために使用できることは十分に理解されるであろう。本方法での使用に好適なファージは、Ｐ１、Ｐ２、λ、φ８０、φ３５３８、Ｔ１、Ｔ４、Ｐ２２、Ｐ２２誘導体、ＥＳ１８、Ｆｅｌｉｘ「ｏ」、Ｐ１−ＣｍＣｓ、Ｆｆｍ、ＰＹ２０、Ｍｘ４、Ｍｘ８、ＰＢＳ−１、ＰＭＢ−１、およびＰＢＴ−１を包含することが可能であるが、この限りではない。
【０１５２】
本方法は、選択マーカーを除去するための部位特異的リコンビナーゼシステムと組合せてバクテリオファージＰ１混合物を使用して、並列組合せ様式で、多数の遺伝形質を１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に移動させるためのシステムを提供する（図１２）。様々なドナー細胞から作られたＰ１溶解産物混合物によるＰ１形質導入後、形質導入された受容細胞を、抗生物質耐性についてスクリーニングし、所望の遺伝子最終産物の産生増加について分析する。最適化された形質導入体を選択した後、抗生物質耐性マーカーを部位特異的リコンビナーゼで除去する。選択された形質導入体は、多数の染色体修飾を操作し、所望の遺伝子最終産物の産生を最適化するために、Ｐ１形質導入のさらなるラウンドで、受容細胞として再度使用することができる。本組合せＰ１形質導入方法は、所望の遺伝子最終産物の最適産生のための、迅速かつ容易な染色体の形質スタッキングを可能にする。
【０１５３】
上述の方法を使用すれば、イソプレノイド経路に関与する律速酵素をコードする重要なイソプレノイド遺伝子のプロモーターが操作される。内因性プロモーターの、強力プロモーター（ＰＴ５）との置換は、β−カロテン産生を増加する結果となった。
【０１５４】
プロモーター置換の本方法の利点は、宿主細胞内の多数の染色体修飾を可能にすることである。該システムは、選択マーカーを除去するための部位特異的リコンビナーゼと組合せてバクテリオファージＰ１形質導入を使用して、多重遺伝形質を１つの宿主細胞に移動させる手段である（図２および１２）。
【０１５５】
プロモーター置換のための本組合せＰ１形質導入方法は、ｉｓｐＢ遺伝子の単離および同定、ならびに強力プロモーターの制御下に置かれたとき、β−カロテンの産生増加に対するその効果を可能にした。β−カロテンの産生増加に対するｉｓｐＢの効果は予想外であり、自明ではない結果であった。イソプレノイドキノン類の側鎖の前駆物質を合成する、ＩｓｐＢ（オクタプレニルジホスフェートシンターゼ）は、カロテノイド生合成経路からＦＰＰ基質を取り除く（図１）。ファージＴ５強力プロモーターの制御下にある、ｉｓｐＢ遺伝子の過剰発現がいかにしてβ−カロテン産生を増加するかというメカニズムは、まだ明白ではない。しかし、結果から、ＩｓｐＢは、カロテノイド生合成経路のフラックスを増加できることが示唆される。強力プロモーターの制御下で、ｉｓｐＢ遺伝子を、操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の染色体内にスタッキングすることにより、β−カロテン産生のさらなる増加が促進される（図１１）。
【０１５６】
カロテノイド最終産物の測定
所望の遺伝子最終産物が有色産物であれば、そのときは、有色コロニーに基づいて形質転換体を選択することができ、また該産物の特徴的なλｍａｘピークで、ＵＶ／可視分光測定法により該産物を定量化することができる。ＨＰＬＣ、ＣＥ、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳを含むがこの限りではない、代替分析方法も使用することができる。
【０１５７】
本発明では、β−カロテンは、β−カロテンの特徴的なλｍａｘピークである４２５、４５０および４７８ｎｍで、ＵＶ／可視分光測定法により測定した。カロテノイドは、細胞ペレットからアセトンで抽出した。宿主菌株は、β−カロテンの合成に関与する遺伝子を発現するための、レポータープラスミドを含んでいた。該レポータープラスミド（ｐＰＣＢ１５またはｐＤＣＱ１０８）は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）ｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子群を担持していた。該遺伝子群は、β−カロテンの産生を助長した。したがって、イソプレノイド上方経路を通る炭素フラックスの増加は、産生されるβ−カロテンの量が増加する結果となり；イソプレノイド遺伝子の操作された上流にＴ５プロモーターを持たない菌株と比較するとき、寒天プレート上に、より強烈な色を有するコロニーを生じる結果となる。産生されるカロテノイドの量は、ＨＰＬＣ分析で測定した。β−カロテンの検出は、特定の溶媒条件でＨＰＬＣを使用し、それぞれの保持時間に、４５０ｎｍにおける吸収により測定した。β−カロテンのピーク面積を、
既知のβ−カロテン標準と比較することにより、定量分析を実施した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５８】
増強されたβ−カロテン産生ができる幾つかの菌株を創出するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、遺伝学的に改良されてきた。該菌株の１つは、乾燥細胞重量１ｇ当たり最高６ｍｇのβ−カロテンを産生することが示されている。
【０１５９】
プロモーター置換は、宿主細胞におけるカロテノイド産生を増加させるために、２つの線状（ＰＣＲで生成された）ＤＮＡ断片を使用する細菌のｉｎ  ｖｉｖｏ染色体操作の、容易な一工程方法を使用して実施した。該断片と、宿主（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））染色体上の標的部位との間に、短いフランキング相同領域を含むように、該断片はデザインされていた。２つのＰＣＲで生成されたＤＮＡ断片と宿主細胞の染色体との間の、制御可能かつ能率的なｉｎ  ｖｉｖｏ三重相同的組換え用の、アラビノース誘導性プロモーターの制御下で、ヘルパープラスミドを用いて、ファージλ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムを発現させた。組換え中に使用された２つの線状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片の少なくとも一方は、部位特異的リコンビナーゼ配列（ＦＲＴ）で挟まれた選択的マーカー（カナマイシン）を含むようにデザインされていた（実施例１）。該選択可能マーカーは、所望の組換え事象を受けた細胞の同定および選択を可能にした。選択された組換え体の構築物は、配列分析により確認した。該選択的マーカーは、λファージのＰＲプロモーターの制御下にある部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む第２のヘルパープラスミド（ｐＣＰ２０）で切除した（実施例６〜１２および１７）。
【０１６０】
強力プロモーター（ファージＰＴ５）は、２つの（ＰＣＲで生成された）線状ｄｓＤＮＡ断片および標的染色体ＤＮＡを使用する三重相同的組換えにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）標的遺伝子ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢｙｇｂＰ、ｉｓｐＢ、ｉｓｐＡｄｘｓの上流に配置した（実施例１）（図２）。各実施例で、２つの断片の一方は、部位特異的ＦＲＴリコンビナーゼ配列に挟まれたカナマイシン耐性マーカーを含んでいた。部位特異的リコンビナーゼ配列の両側にあったのは、短い（およそ１０〜５０ｂｐ）相同領域を含むホモロジーアームであった。第１の組換え領域（ホモロジーアーム＃１）は、第１の断片の５’末端に連結されていた。第２の組換え領域（ホモロジーアーム＃２）は、第１の断片の３’末端に連結されていた。第２のＰＣＲで生成された線状ｄｓＤＮＡ断片は、ＰＴ５強力プロモーターを含んでいた。第３の組換え領域（ホモロジーアーム＃３）は、第２の断片の３’末端に連結されていた。第１の組換え領域（ホモロジーアーム＃１）は、置換の標的となる、生来の細菌染色体のプロモーターの上流部分と相同性を有していた。第２の組換え領域（第１の断片の３’末端に位置するホモロジーアーム＃２）は、第２の断片の５’末端部分と相同性を有していた。第３の組換え領域（ホモロジーアーム＃３）は、置換の標的となる、生来の細菌染色体のプロモーターの下流部分と相同性を有していた（図２）。
【０１６１】
組換え堪能大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主（ヘルパープラスミドｐＫＤ４６上にλ−Ｒｅｄ組換えシステムを含む）は、２つのＰＣＲで生成された断片で形質転換され、その結果として、標的とされる生来のプロモーターと、第１の断片のカナマイシン選択可能マーカーおよび第２の断片のＰＴ５強力プロモーターを含む構築物との、染色体置換を招いた（実施例１および６〜１２、図２）。該プロモーター置換は、導入された非自然プロモーターに作動可能に連結された、増強された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体遺伝子（ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢｙｇｂＰ、ｉｓｐＢまたはｉｓｐＡｄｘｓ遺伝子のいずれか）を形成する結果となった。選択可能マーカーの発現および選択された培地でそれらが増殖できる能力に従って、所望の組換え事象を受けた細菌宿主細胞を選択した。次いで、選択された組換え体を、選択可能マーカーを切除するフリッパーゼ（Ｆｌｐ）部位特異的リコンビナーゼを発現させる、第２のヘルパープラスミド、ｐＣＰ２０（チェレパノフ（Ｃｈｅｒｅｐ
ａｎｏｖ）およびワッケルナーゲル（Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ）、上掲）で形質転換した（実施例６〜１２）。該構築物は、ＰＣＲ断片分析で確認した（図３〜５）。次いで、該増強されたイソプレノイド遺伝子（ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢｙｇｂＰ、ｉｓｐＢまたはｉｓｐＡｄｘｓ）および該カロテノイドレポータープラスミド（ｐＰＣＢ１５）を含む組換え細菌宿主細胞を、β−カロテンの産生増加についてテストした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢｙｇｂＰ、ｉｓｐＢまたはｉｓｐＡｄｘｓ遺伝子（通常は、非常に低いレベルで発現される）の１つもしくはそれ以上を強いＰＴ５プロモーターの制御下に置くことは、結果としてβ−カロテン産生の顕著な増加を招いた（実施例１８〜１９、図１１）。
【０１６２】
別の実施形態では、該方法を使用して、外来遺伝子およびプロモーターを同時に付加した。２つのＰＣＲで生成された断片の第１は、選択可能マーカー（カナマイシン）およびプロモーター（ＰＴ５）の融合産物を含むようにデザインされていた（実施例２、図２）。第２のＰＣＲで生成された断片は、選択可能マーカー（ｋａｎ−ＰＴ５）およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｄｘｓ  （１６ａ）（配列番号１３）、ｄｘｒ（１６ａ）（配列番号１７）またはｌｙｔＢ（１６ａ）（配列番号１５）遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とは無関係である）の融合産物を含んでいた。またしても、ホモロジーアームは、宿主細菌の染色体内に正確に組み込むことができるようにデザインされていた。所望の組換え体は、既述の方法で選択した。次いで、既述の通りに、部位特異的リコンビナーゼで選択可能マーカーを除去した。該組換え構築物は、ＰＣＲ断片分析で確認した。形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）レポーター菌株におけるβ−カロテン産生は、既述の通りに測定した。ＰＴ５プロモーターの制御下にあるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｄｘｓ（１６ａ）および／またはｌｙｔＢ（１６ａ）遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｄｘｓおよびｌｙｔＢ遺伝子と相同）を含む細胞は、β−カロテン産生の増加を示した（図１１）。本方法は、外来プロモーターおよび遺伝子の同時付加に有用であった。必要に応じて、所望の産物の産生を増加させるために、本方法を繰り返して細菌の生合成経路を操作することができるように、その後の選択可能マーカーの除去が必要であった。
【０１６３】
別の実施形態では、所望の最終産物の産生効率が上昇するように、多数のプロモーターおよび遺伝子付加または置換を含む、多数の染色体修飾を含むように、該細菌宿主菌株を操作した。好ましい実施形態では、組み込まれた、または増強された、染色体遺伝子は、カロテノイド産生に有用な酵素をコードする。
【０１６４】
別の好ましい実施形態では、イソプレノイド遺伝子の上流の非内因性プロモーターの染色体操作によって作られた構築物、および非内因性イソプレノイド経路遺伝子を宿主染色体内に組み込むことによって作られた構築物を、１つの菌株に合体させる。ファージＴ５強力プロモーター（ＰＴ５）−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ、ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）、ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）、ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）ＰＴ５−ｉｄｉ、ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ、ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢｙｇｂＰ、ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ
ＰＴ５−ｙｇｂＢｙｇｂＰ  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）、ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢｙｇｂＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５、およびＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢｙｇｂＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢを、組合せスタッキングで構築した。組合せ方式におけるこれらの構築物のスタッキングは、顕著に増加したカロテノイド産生能力がある、操作された宿主菌株の開発を容易にした。
【０１６５】
別の実施形態では、カロテノイド産生を増加できる能力を与えるトランスポゾン挿入物を担持する遺伝子座を、宿主染色体内に操作した。Ｔｎ５トランスポゾン挿入配列（ｙｊ
ｅＲ：：Ｔｎ５；配列番号６３）を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｊｅＲ遺伝子を、ＰＴ５−ｄｘｓ、ＰＴ５−ｉｄｉおよびＰＴ５−ｙｇｂＢｙｇｂＰと組合せてスタッキングし、１９倍高いレベルのβ−カロテンを産生する菌株（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８０７）を創出した。
【０１６６】
別の実施形態では、β−カロテン産生を分析するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）レポーター菌株を構築した。簡単に記載すると、該レポーター菌株は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）由来の遺伝子群ｃｒｔＥＸＹＩＢを、レポータープラスミド（ｐＰＣＢ１５）にクローニングし、次にこれを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を形質転換することにより、創出した（図７）。該遺伝子群は、カロテノイドの合成に必要な遺伝子の多くを含み、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でβ−カロテンを産生した。ｃｒｔＺ遺伝子（β−カロテンヒドロキシラーゼ）が該遺伝子群に含まれていたことに注目すべきである。しかし、ｃｒｔＺ遺伝子（反対方向にかつｃｒｔＢ遺伝子に隣接して構築されている）を発現させるためのプロモーターは存在せず、ゼアキサンチンは産生されなかった。ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素（該遺伝子群内に位置するｃｒｔＸ遺伝子によりコードされる）には、その反応のための基質がなかった。β−カロテン産生の増加は、対照株産生と比較した増加として報告された（図１１）。
【０１６７】
別の実施形態では、新しいレポータープラスミドが創出された。実験の多くに使用された、レポータープラスミドｐＰＣＢ１５は、低コピー数プラスミドと考えられる。パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）ｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子群も含む、新しい中コピー数レポータープラスミド、（ｐＤＣＱ１０８）が作成された（実施例１９）。次いで、プラスミドｐＤＣＱ１０８を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢｙｇｂＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢにおけるレポータープラスミドとして使用して、対照株と比較したとき、β−カロテン産生のおよそ３０倍増加に導いた（図１１；実施例２０および２１；表９）。
【０１６８】
非カロテン産生性宿主たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるカロテノイド産生の限界は、膜の過負荷および膜機能性の妨害のため、およそ１．５ｍｇ／ｇ細胞乾燥重量（１，５００ｐｐｍ）のレベルで到達すると推測されてきた（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら、上掲）。本方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に修飾を施し、致死作用なしに、β−カロテン産生を乾燥細胞重量１ｇ当たり６ｍｇ（６，０００ＰＰＭ）（初期レベルより３０倍の増加；致死作用がない）まで増加させることにより、記載の問題を解決した。６，０００ｐｐｍのカロテノイドという細菌の産生は、細菌におけるカロテノイド産生の最大許容限度（１，６００ｐｐｍ）よりはるかに高い。
【０１６９】
本方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のほかにも様々な宿主に適用できることを、当業者は理解するであろう。他の宿主における本方法の使用は、１）該イソプレノイド経路は、細菌に共通であること、２）該λ−Ｒｅｄシステムは、様々な宿主で機能することが報告されていること、および３）ファージ形質導入は、多くの宿主で起こることが知られていること、により支持される。
【実施例】
【０１７０】
以下の実施例で、本発明をさらに明確にする。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、当然のことながら、実例として示すに過ぎない。上の論考およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の必須特性を確認することができ、また本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修飾を加えて、様々な使用および条件に適合させることができる。
【０１７１】
一般法
実施例で使用された標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．分子クローニング：研究所マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）；コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、（１９８９年）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））ならびにＴ．Ｊ．シルヘイビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）、遺伝子融合を用いた実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）、ならびにアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら、分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエーション（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）発行（１９８７年）により記述されている。
【０１７２】
細菌培養の維持および増殖に適当な材料および方法は、当該技術分野で周知である。以下の実施例での使用に適当な技術は、一般細菌学のための方法のマニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（フィリップ・ジェラール（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ（Ｒａｌｐｈ）Ｎ．コスチロー（Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）Ｗ．ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス（Ｗｉｌｌｉｓ）Ａ．ウッド（Ｗｏｏｄ）、ノエル（Ｎｏｅｌ）Ｒ．クリーグ（Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４年））に、またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、バイオテクノロジー：工業微生物学教科書（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第２版（１９８９年）マサチュセッツ州サンダーランドのシナウワー・アソシエーツ・インク（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．）により、明確に記載されている。細菌細胞の増殖および維持に使用された全ての試薬、制限酵素および材料は、特に明記されていない限り、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）／ＢＲＬ（メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ））から入手した。
【０１７３】
遺伝子配列の操作は、ジェネティクス・コンピューター・グループ・インク（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）から販売されているプログラム一式（ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ウィスコンシン州マディソンのジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して行った。該ＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」を使用する場合、ギャップ・クリエーション・デフォルト値１２、およびギャップ・エクステンション・
デフォルト値４を使用した。ＣＧＣ「ギャップ（Ｇａｐ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムを使用する場合、デフォルト・ギャップ・クリエーション・ペナルティ５０およびデフォルト・ギャップ・エクステンション・ペナルティ３を使用した。スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み込んだファスタ（ＦＡＳＴＡ）プログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会議日程１９９２年、１１１−１２０、編集者：スハーイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）、発行者：ニューヨーク州ニューヨークのプレナム（Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を使用して、多数のアラインメントを作成した。これらのプログラムまたは他のプログラムで、プログラムパラメーターが指示されていないいずれの場合にも、デフォルト値を使用した。
【０１７４】
略語の意味は以下の通りである。「ｈ」は、時間を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は、日を意味し、「μＬ」は、マイクロリットルを意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「ｒｐｍ」は、１分当たりの回転数を意味する。
【０１７５】
実施例１
イソプレノイド遺伝子の上流に、染色体に組み込まれたファージＰＴ５プロモーターを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築（プロモーター置換）
図２に記載の通りに、２つのＰＣＲ断片染色体組込み方法を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）イソプレノイド遺伝子ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢｙｇｂＰ、ｉｓｐＢ、およびｉｓｐＡｄｘｓの生来のプロモーター（図１）を、（ＰＴ５）プロモーターと置換した。該置換方法は、ヘルパープラスミド上にコードされているλ−Ｒｅｄリコンビナーゼによる、相同的組換えに基づく。組換えは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体と、ＰＣＲ断片の両端に２０〜５０ｂｐの相同パッチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｐａｔｃｈ）を含む２つのＰＣＲ断片との間で起こる（図２）。これらの遺伝子の上流にＰＴ５プロモーターを組み込むために、２つのＰＣＲ断片法を使用した。この方法では、２つの線状断片は、部位特異的リコンビナーゼ標的配列（ＦＲＴ）に挟まれたカナマイシン選択可能マーカー（ｋａｎ）を含むＤＮＡ断片（１４８９ｂｐ）ならびに−１０および−３５共通プロモーター配列、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、およびリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるファージＴ５プロモーター（ＰＴ５）を含むＤＮＡ断片（１５４ｂｐ）を含んでいた。
【０１７６】
２つのＰＣＲ断片法を使用することにより、該カナマイシン選択可能マーカーおよびＰＴ５プロモーター（ｋａｎ−ＰＴ５）を、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢＰ、ｉｓｐＢ、およびｉｓｐＡｄｘｓ遺伝子の上流に組込み、ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ、ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉ、ｋａｎ−ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ、ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＢ、およびｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓを生じた。カナマイシン選択可能マーカーを含む線状ＤＮＡ断片（１４８９ｂｐ）は、下記の通り、表３のプライマー対を用いて、プラスミドｐＫＤ４（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）からＰＣＲで合成した。
【０１７７】
【表１１】
2006515174.tif 000012
【０１７８】
該ＰＴ５プロモーターを含む第２の線状ＤＮＡ断片（１５４ｂｐ）は、下記の通り、表４のプライマー対を用いて、ｐＱＥ３０（カリフォルニア州バレンシアのキアジェン・インク（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からＰＣＲで合成した。
【０１７９】
【表１２】
2006515174.tif 000013
【０１８０】
融合したカナマイシン選択可能マーカー−ファージＴ５プロモーターを含む線状ＤＮＡ断片（１，６４７ｂｐ）は、下記の通り、表５のプライマー対を用いて、ｐＳＵＨ５からＰＣＲで合成される。該ｐＳＵＨ５プラスミド（図６；配列番号６６）は、ファージＴ５プロモーター（ＰＴ５）領域（配列番号３３）を、ｐＫＤ４（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）のＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングすることにより構築した。
【０１８１】
【表１３】
2006515174.tif 000014
【０１８２】
下記の通り、標準ＰＣＲ条件を使用して、アンプリタク・ゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｑ
Ｇｏｌｄ）（登録商標）ポリメラーゼ（カリフォルニア州フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で、該線状ＤＮＡ断片を増幅した。
【０１８３】
【表１４】
2006515174.tif 000015
【０１８４】
ＰＣＲ反応の完了後、各ＰＣＲ反応混合物５０μＬを、１％アガロースゲル上を移動させ、製造業者の説明書に従ってキアクイック・ゲル・エクストラクション・キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（商標）（カタログ番号２８７０４、カリフォルニア州バレンシアのキアジェン・インク（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用して、該ＰＣＲ産物を精製した。該ＰＣＲ産物を、蒸留水１０μＬで溶出させた。製造業者の説明書に従って、ＤＮＡクリーン・アンド・コンセントレーター（ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（商標）キット（カリフォルニア州オレンジのザイモ・リサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））を使用して、該ＰＣＲ産物断片をさらに精製した。該ＰＣＲ産物を、蒸留水６〜８μＬで、０．５〜１．０μｇ／μＬの濃度まで溶離させた。
【０１８５】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドｐＫＤ４６（ａｍｐＲ）（配列番号６５）を担持する、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１菌株を、ＰＣＲ断片の染色体組込みのための宿主菌株として使用した。該菌株は、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミド、ｐＫＤ４６（ａｍｐＲ）を用いた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＣ１０６１の形質転換によって構築した。形質転換体は、３０℃の１００μｇ／ｍＬアンピシリンＬＢプレートで選択した。
【０１８６】
形質転換のために、カナマイシンマーカーおよびＰＴ５プロモーターを担持する精製ＰＣＲ産物１〜５μｇを使用して、エレクトロポレーションを実施した。抗生物質耐性形質転換体を選択するために、形質転換された細胞のおよそ半分を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレート上に塗布した。該プレートを３７℃で一晩インキュベートした後、抗生物質耐性形質転換体が下記の通りに選択された。ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ  １０コロニー、ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉ  １２コロニー、ｋａｎ−ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  １０コロニー、ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＢ  ３コロニー、およびｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＡ
１９コロニー。
【０１８７】
ＰＣＲ分析を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上の正確な位置における、カナマイシン選択可能マーカーおよびＰＴ５プロモーターの両者の組込みを確認した。ＰＣＲのために、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５Ｕ  アンプリタク（ＡｍｐｌｉＴａｑ）（商標）（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ））、およ
び０．４μＭ  特異的プライマー対を含有するＰＣＲ反応混合物５０μＬ中に、コロニーを再懸濁させた。テストプライマーは、カナマイシン（５’−プライマー）および各イソプレノイド遺伝子の初期コード領域（３’−プライマー）に位置する領域の配列と適合するように選択した（図３）。これらのプライマーの配列は、上表３、４、および５に記載されており、ＰＣＲ反応は、上述の通りに実施された。結果として得られた、染色体上に各ｋａｎ−ＰＴ５−イソプレノイド遺伝子融合を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、染色体上に多数のｋａｎ−ＰＴ５−イソプレノイド遺伝子融合物をスタッキングするために使用して、実施例６〜１２および１７に記載のβ−カロテン産生を増加させるための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を構築した。
【０１８８】
実施例２
染色体に組み込まれたメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｄｘｓ（１６Ａ）、ｄｘｒ（１６Ａ）およびｌｙｔＢ（１６Ａ）遺伝子を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の構築
ｄｘｓ（「ｄｘｓ（１６ａ）」として表示され、また配列番号１３として記述される）、ｄｘｒ（「ｄｘｒ（１６ａ）」として表示され、また配列番号１７として記述される）、およびｌｙｔＢ（「ｌｙｔＢ（１６ａ）」として表示され、また配列番号１５として記述される）を有する、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４０２）イソプレノイド遺伝子ｄｘｓ、ｄｘｒおよびｌｙｔＢ（国際公開第０２／２０７３３  Ａ２号パンフレット）、ならびに融合したｋａｎ−ＰＴ５プロモーターを、図２に記載の２つのＰＣＲ−断片染色体組込み方法を使用して、それぞれ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の３０．９、７８．６および１８．１分に位置するオペロン間領域に共組込みした。外来遺伝子の染色体組込みの原理は、実施例１に記載のものと同じである。
【０１８９】
融合されたカナマイシン選択可能マーカー−ＰＴ５プロモーターを含む線状ＤＮＡ断片（１，６４７ｂｐ）は、下記の通り、表６のプライマー対を用いて、ＰＣＲによりｐＳＵＨ５から合成した。該ｐＳＵＨ５プラスミド（図６）は、ＰＴ５プロモーター領域（配列番号３３）を、ｐＫＤ４（ダツセンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）のＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングすることにより構築した。
【０１９０】
【表１５】
2006515174.tif 000016
【０１９１】
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｄｘｓ、ｄｘｒまたはｌｙｔＢ遺伝子を含む線状ＤＮＡ断片は、下記の通り、表７のプライマー対を用いて、ＰＣＲによりメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−２４０２）ゲノムＤＮＡから合成した。
【０１９２】
【表１６】
2006515174.tif 000017
【０１９３】
ＰＣＲ反応、精製およびエレクトロ・トランスフォーメーションを、実施例１に記載の通りに実施した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ７コロニー、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｒ（１６ａ）  ３コロニー、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）  １２コロニーを含む、カナマイシン耐性形質転換体を選択した。これらの中で、ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）、ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｒ（１６ａ）またはｋａｎ−ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の標的部位への正確な組込みを有するコロニーを、ＰＣＲ分析で選択した（図３、４、および５）。
【０１９４】
実施例３
パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）由来のβ−カロテン産生遺伝子のクローニング
ｃｒｔ遺伝子を含む断片をＰＣＲで増幅するために、エルウィニア・ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）由来の配列を使用して、プライマーをデザインした。これらの配列は、５’〜３’下記を含んでいた。
【０１９５】
【表１７】
2006515174.tif 000018
【０１９６】
染色体ＤＮＡは、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ８１９９）から精製し、Ｐｆｕターボ（Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ）ポリメラーゼ（カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ））を、下記の条件で、ＰＣＲ増幅反応で使用した。９４℃、５分；２５サイクルの９４℃（１分）−６０℃（１分）−７２℃（１０分）、および７２℃  １０分間。ゲル電気泳動後、およそ６．５ｋｂの一産物が確認された。Ｔａｑポリメラーゼ（カリフォルニア州フォスター・シティのパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））を１０分間  ７２℃の反応で使用して、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にＴＯＰＯクローニングするための断片に、３’アデノシンヌクレオチドをさらに付加し、プラスミドｐＰＣＢ１３を創出した。エレクトロポレーションにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））に形質転換後、数コロニーが、鮮黄色に見え、カロテノイド化合物を産生していることを示した。製造業者に指示された通りに、キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））ミニプレップキットを使用して、プラスミドを単離した後、ＧＰＳ−１ゲノム・プライミング・システム・キット（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）キット（マサチュセッツ州ベバリーのニューイングランド・バイオラブズ・インク（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））を使用して、該６．５ｋｂの増幅された断片を含むプラスミドを、ｐＧＰＳ１．１と入れ替えた。多数の、これらの転位したプラスミドを、トランスポゾンの各末端から配列決定した。トランスポゾン特異的プライマーを使用し、ダイターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；ＥＰ２７２００７号）を使用して、ＡＢＩオートマティック・シークエンサー（ＡＢＩ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）で、配列を作成した。シーケンチャー・プログラム（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ）（ミシガン州アナーバーのジーン・コーズ・コープ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））を用いて、配列アセンブリを実施した。
【０１９７】
実施例４
細菌遺伝子の同定および特性決定
ｃｒｔＥ、Ｘ、Ｙ、Ｉ、Ｂ、およびＺをコードする遺伝子は、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘイブン・プロテイン・データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）、スイス・プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースから導かれる配列を含んでなる）に含まれている配列との類似性を検索するブラスト（ＢＬＡＳＴ）（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９３年））を実施することにより同定した。実施例３で得られた配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ））により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、該「ｎｒ」データベースに含まれている全ての公的に入手可能なＤＮＡ配列との類似性について分析した。ＤＮＡ配列を、全てのリーディングフレームで翻訳し、ＮＣＢＩより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ（Ｇｉｓｈ），Ｗ．およびステイツ（Ｓｔａｔｅｓ），Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３：２６６−２７２（１９９３年））を使用して、該「ｎｒ」データベースに含まれている全ての公的に入手可能なタンパク質配列との類似性について比較した。
【０１９８】
全ての比較は、ＢＬＡＳＴＮｎｒまたはＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムのいずれかを使用して行った。ＢＬＡＳＴ比較の結果は、最高の類似性有する配列をまとめてある表７に示す。表７は、ＢＬＡＳＴＸｎｒアルゴリズムに基づいたデータを、期待値で報告される値とともに示す。期待値は、一致の統計学的有意性を予測し、全く偶然に、このサイズの
データベースの検索で予測される、一致の数を、所定の点数で、明確に示す。
【０１９９】
【表１８】
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【０２００】
実施例５
トランスポゾン突然変異誘発による遺伝子機能の分析
ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ、およびｃｒｔＺを含む各コード領域内に挿入されたトランスポゾンを担持する幾つかのプラスミドを、実施例３で作成された配列データを使用して選択した。これらのプラスミド変異体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５に形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンの存在下、ルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）ブロス１００ｍＬで増殖させた。培養を、２６℃で１８時間増殖させ、細胞を遠心分離で回収した。アセトン１０ｍＬを使用して、カロテノイドを細胞ペレットから抽出した。アセトンを窒素下で乾燥させ、ＨＰＬＣ分析のために、カロテノイドをメタノール１ｍＬ中に再懸濁させた。ベックマン・ゴールド・ヌーヴォー・ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｎｏｕｖｅａｕ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（メリーランド州コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ））を用いたベックマン・システム・ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）（登録商標）ＨＰＬＣを試験に使用した。粗抽出液（０．１ｍＬ）を、対応する保護カラムが付いた１２５×４ｍｍのＲＰ８（５μｍ粒子）カラム（カリフォルニア州サンフェルナンドのヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ））に添加した。流速は１ｍＬ／分であり、使用した溶媒プログラムは、０〜１１．５分  水４０％／メタノール６０％；１１．５〜２０分  メタノール１００％；２０〜３０分  水４０％／メタノール６０％であった。スペクトルデータは、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）光ダイオードアレイ検出器（モデル１６８）で収集した。
【０２０１】
野生型ｃｒｔＥＸＹＩＢＺを有するクローンでは、カロテノイドは、保持時間１５．８分および吸収スペクトル４５０ｎｍ、４７５ｎｍを有することが分かった。これは、β−カロテン標準と比較して確認されたものと同じ値であった。このことから、反対方向に構築されたｃｒｔＺ遺伝子は、この構築物で発現されないことが示唆される。ｃｒｔＺにおけるトランスポゾン挿入は、予想通り、全く影響しなかった（データ示さず）。
【０２０２】
ＨＰＬＣスペクトル分析はまた、ｃｒｔＸにトランスポゾン挿入を有するクローンも、β−カロテンを産生することを示した。このことは、β−カロテンの合成に続く、カロテノイド経路の後期工程における、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするｃｒｔＸの、提唱された機能と一致する。
【０２０３】
ｃｒｔＹにおけるトランスポゾン挿入により、β−カロテンは産生されなかった。カロテノイドの溶出時間（１５．２分）および吸収スペクトル（４４３ｎｍ、４６９ｎｍ、５００ｎｍ）は、リコペン標準のそれらと一致する。リコペンがｃｒｔＹ突然変異体に蓄積したことにより、リコペンサイクラーゼコード化遺伝子としてのｃｒｔＹの役割が裏付けられた。
【０２０４】
ｃｒｔＩ抽出液は、２８６ｎｍでモニターしたとき、保持時間１６．３分および吸収スペクトル２７６ｎｍ、２８６ｎｍ、２９７ｎｍを有するピークを示し、フィトエンに関して報告されたスペクトルと一致する。フィトエンがｃｒｔＩ突然変異体で検出されたことにより、フィトエンデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子としての、ｃｒｔＩ遺伝子の機能が裏付けられた。
【０２０５】
ｃｒｔＥ突然変異体またはｃｒｔＢ突然変異体から抽出されたアセトンは、透明であった。これらの突然変異体における有色カロテノイドの喪失は、ｃｒｔＥ遺伝子およびｃｒｔＢ遺伝子の両者が、カロテノイド合成に不可欠であることを示す。いずれの突然変異体でもカロテノイドは全く確認されず、このことは、プレフィトエンピロリン酸シンターゼをコードするｃｒｔＢおよびゲラニルゲラニルピロリン酸シンセターゼをコードするｃｒ
ｔＥの、提唱された機能と一致する。両酵素は、β−カロテン合成に必要である。
【０２０６】
トランスポゾン突然変異誘発実験の結果を、下表９に示す。遺伝子群ｃｒｔＥＸＹＩＢ内へのトランスポゾン挿入部位を、ＬＢプレートで観察された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーの色、（ＨＰＬＣスペクトル分析で決定される）カロテノイド化合物の同一性、および各遺伝子の実験的に割り当てられた機能と共に記録する。
【０２０７】
【表１９】
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【０２０８】
実施例６
β−カロテン産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｉｄｉ菌株の構築
イソプレノイド遺伝子の最前部におけるＰＴ５プロモーターの染色体組込みが、β−カロテン産生に及ぼす影響を特性化するために、ｉｓｐＡｄｘｓおよびｉｄｉ遺伝子から上流に、染色体に組み込まれたＰＴ５プロモーターを含み、かつβ−カロテンを産生することができる、菌株（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ）を構築した。
【０２０９】
第１に、増殖中の細菌培養をＰ１ファージに感染させ、該細胞を溶解させることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ菌株のＰ１溶解産物を作った。Ｐ１感染のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ菌株を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地４ｍＬに接種し、３７℃で一晩増殖させ、次いで、一晩培養の１：１００希釈物を、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＬＢ培地１０ｍＬで継代培養した。３７℃で２０〜３０分間増殖させた後、１０７個のＰ１ｖｉｒファージを加えた。該細胞−ファージ混合物に３７℃で２〜３時間、溶解するまで通気し、クロロホルム数滴を加え、該混合物を３０秒間渦巻攪拌し、室温でさらに３０分間インキュベートした。次いで、該混合物を４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄を新しい試験管に移し、クロロホルム数滴を加えた。
【０２１０】
第２に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ菌株で作られたＰ１溶解産物を用いて、受容株である、β−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）（図６）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５に形質導入した。プラスミ
ドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ８１９９）由来のカロテノイド生合成遺伝子群（ｃｒｔＥＸＹＩＢ）をコードする。ｐＰＣＢ１５プラスミドを、ＳｍａＩ消化ｐＳＵ１８（バルトロメ（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ）ら、Ｇｅｎｅ、１０２：７５−７８（１９９１年））ベクターと、ｐＰＣＢ１３（実施例３）由来のｃｒｔＥＸＹＩＢを担持する平滑末端化ＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ断片とのライゲーションにより構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５  ｐＰＣＢ１５受容細胞を、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地４ｍＬで、３７℃にて、中対数期（１〜２×１０８細胞／ｍｌ）まで増殖させた。細胞を、４５００ｒｐｍで１０分間遠沈し、２ｍＬの１０ｍＭＭｇＳＯ４および５ｍＭＣａＣｌ２に再懸濁した。受容細胞（１００μＬ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ菌株から作られたＰ１溶解産物貯蔵液（１０７ｐｆｕ／μＬ）、１μＬ、１０μＬ、または１００μＬと混合し、３０℃で３０分間インキュベートした。受容細胞−溶解産物混合物を、６５００ｒｐｍで３０秒間遠沈し、１０ｍＭクエン酸ナトリムを含むＬＢ培地１００μＬに再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。抗生物質耐性形質導入体を選択するために、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールの両者を含むＬＢプレート上に細胞をプレーティングし、３７℃で、１日または２日間インキュベートした。６つのカナマイシン耐性形質導入体を選択した。
【０２１１】
カナマイシン選択可能マーカーを染色体から除去するために、熱感受性複製起点を有する、ＦＬＰリコンビナーゼ発現プラスミドｐＣＰ２０（ａｍｐＲ）（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４５５）（チェレパノフ（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ）およびワッケルナーゲル（Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ）、上掲）を、エレクトロポレーションにより、カナマイシン耐性形質導入体の１つに一時的に形質転換させた。細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天および２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールＬＢプレート上に塗布し、３０℃で１日増殖させた。コロニーを採取して、アンピシリン抗生物質を含まない２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールＬＢプレート上に画線し、４３℃で一晩インキュベートした。プラスミドｐＣＰ２０は、熱感受性複製起点を有し、そのため、細胞を４３℃で培養することにより、宿主細胞から取り除いた。コロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンＬＢプレートまたは２５μｇ／ｍＬカナマイシンＬＢプレート上に画線することにより、該コロニーを、アンピシリンおよびカナマイシン感受性についてテストし、ｐＣＰ２０およびカナマイシン選択可能マーカーの喪失をテストした。このようにして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ菌株を構築した。
【０２１２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓの染色体上にｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉをさらにスタッキングするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉ菌株で作られたＰ１溶解産物を、上述の通りに、受容株である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓに形質導入した。およそ８５の形質導入体を選択した。形質導入後、上述の通りに、カナマイシン選択可能マーカーを染色体から除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｉｄｉ菌株を得た。
【０２１３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｉｄｉ菌株について、ｉｓｐＡｄｘｓおよびｉｄｉ遺伝子の最前部におけるＰＴ５プロモーターの正確な組込み、およびカナマイシン選択可能マーカーの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からの除去は、ＰＣＲ分析で確認された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｉｄｉ菌株のコロニーを、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５Ｕアンプリタク（ＡｍｐｌｉＴａｑ）（商標）（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ））、および０．４μＭの特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−ｋａｎ（５’−ＡＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＡＴ  ＣＴＧＣＴＣ−３’；配列番号４６）およびＢ−ｉｓｐＡ（５’−ＣＣＴＡＡＴＡＡＴＧＣＧＣＣＡＴＡＣＴＧＣＡＴＧＧ−３’；配列番号４７）、Ｔ−Ｔ５（５’−ＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣ
Ｃ−３’；配列番号４８）およびＢ−ｉｓｐＡ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｄｉ（５’−ＣＡＧＣＣＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＣＧＡＧＡＴＧＴ−３’；配列番号４９）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｄｉを含むＰＣＲ反応混合物５０μＬ中に再懸濁した。テストプライマーは、カナマイシンマーカーまたはＰＴ５プロモーターのいずれかおよびｉｓｐＡｄｘｓまたはｉｄｉ遺伝子の初期領域に位置する領域を増幅するように選択した（図３）。ＰＣＲ反応は、実施例１に記載の通りに実施した。ＰＣＲの結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体から、カナマイシン選択可能マーカーが除去されていることを示した（図３、レーン２および４）。ｉｓｐＡｄｘｓおよびｉｄｉ遺伝子の上流のＰＴ５プロモーター断片の染色体組込みは、予想されるＰＣＲ産物のサイズである、それぞれ、２８５ｂｐおよび２７４ｂｐに基づいて確認した（図３、レーン１および３）。
【０２１４】
実施例７
β−カロテン産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）菌株の構築
ｉｓｐＡｄｘｓ遺伝子およびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｄｘｓ（ｄｘｓ（１６ａ））から上流に染色体に組み込まれたＰＴ５プロモーターを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）菌株を構築するために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）菌株から作られたＰ１溶解産物を、受容株である、実施例３に記載の、β−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓに形質導入した。７８のカナマイシン耐性形質導入体を選択した。実施例３に記載のようなＦＬＰリコンビナーゼ発現システムを使用して、カナマイシン選択可能マーカーを、形質導入体の染色体から除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）菌株を得た。
【０２１５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）菌株では、ｉｓｐＡｄｘｓ遺伝子の最前部におけるファージＴ５プロモーター、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上の３０．９分に位置するオペロン間領域におけるＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）の正確な組込み、ならびにカナマイシン選択可能マーカーの除去を、ＰＣＲ分析で確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）菌株のコロニーを、特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｓｐＡ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｓｐＡ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｄｘｓ（１６ａ）（５’−ＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＡ−３’；配列番号５０）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｄｘｓ（１６ａ）を用いたＰＣＲでテストした。テストプライマーは、カナマイシン耐性遺伝子またはＰＴ５プロモーターのいずれかに位置する領域、および染色体組込み部位の下流領域を増幅するように選択した（図３）。ＰＣＲ反応は、実施例１に記載の通りに実施した。ＰＣＲの結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体から、カナマイシン選択可能マーカーが除去されていることを示した（図３、レーン６および８）。ｉｓｐＡｄｘｓ遺伝子の上流の、ＰＴ５プロモーター断片の染色体組込み、およびオペロン間領域におけるＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）遺伝子の組込みは、予想されるＰＣＲ産物のサイズである、それぞれ、２８５ｂｐおよび２１８４ｂｐに基づいて、確認された（図３、レーン５および７）。
【０２１６】
実施例８
β−カロテン産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株の構築
増加したカロテノイド産生が可能な細菌株を創出するために、ＦＬＰ組換えシステムを組合せたＰ１形質導入により、ＰＴ５プロモーターの制御下にある、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｌｙｔＢ（ｌｙｔＢ（１６ａ））遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）菌株にさらにスタッキン
グした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株から作られたＰ１溶解産物を、受容株である、β−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）に形質導入した。４２のカナマイシン耐性形質導入体を選択した。実施例６に記載のようなＦＬＰリコンビナーゼ発現システムを使用して、カナマイシン選択可能マーカーを、形質導入体の染色体から除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）を得た。
【０２１７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株について、ｉｓｐＡｄｘｓ遺伝子の上流のＰＴ５プロモーターの正確な組込み、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上の、それぞれ３０．９分および１８．１分に位置するオペロン間領域におけるＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）およびＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）遺伝子の付加、ならびにカナマイシン選択可能マーカーの除去を、ＰＣＲ分析で確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株のコロニーは、特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｓｐＡ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｓｐＡ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｄｘｓ（１６ａ）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｄｘｓ（１６ａ）、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｌｙｔＢ（１６ａ）（５’−ＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＧＣＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＣＡＧ−３’；配列番号５１）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｌｙｔＢ（１６ａ）を用いたＰＣＲでテストした。テストプライマーは、カナマイシン耐性遺伝子またはＰＴ５プロモーターのいずれかに位置する領域、および染色体組込み部位の下流領域を増幅するように選択した（図３）。実施例１に記載の通りに、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からカナマイシン選択可能マーカーが除去されていることを示した（図３、レーン１０、１２および１４）。ｉｓｐＡｄｘｓ遺伝子の上流のＰＴ５プロモーター断片の染色体組込み、ならびにオペロン間領域におけるＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）およびＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）遺伝子の組込みは、予想されるＰＣＲ産物のサイズである、それぞれ、２８５ｂｐ、２１８４ｂｐ、および１２８２ｂｐ、に基づいて確認された（図３、レーン９、１１および１３）。
【０２１８】
実施例９
β−カロテン産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）  ＰＴ５−ｉｄｉ菌株の構築
増加したカロテノイド産生が可能な細菌株を創出するために、ＦＬＰ組換えシステムと組合せたＰ１形質導入により、ＰＴ５−ｉｄｉ遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株にさらにスタッキングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉ菌株から作られたＰ１溶解産物を、受容株である、β−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）に形質導入した。およそ４５０のカナマイシン耐性形質導入体を選択した。実施例６に記載のようなＦＬＰリコンビナーゼ発現システムを使用して、カナマイシン選択可能マーカーを形質導入体の染色体から除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）  ＰＴ５−ｉｄｉを得た。
【０２１９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）  ＰＴ５−ｉｄｉ菌株について、ｉｓｐＡｄｘｓおよびｉｄｉ遺伝子上流のＰＴ５プロモーターの正確な組込み、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上の、それぞれ３０．９分および１８．１分に位置するオペロン間領域における、ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）およびＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）遺伝子の組込み、ならびにカナマイシン選択可能マーカーの除去を、ＰＣＲ分析で確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−
ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）  ＰＴ５−ｉｄｉ菌株のコロニーを、特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｓｐＡ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｓｐＡ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｄｘｓ（１６ａ）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｄｘｓ（１６ａ）、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｌｙｔＢ（１６ａ）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｌｙｔＢ（１６ａ）、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｄｉを用いたＰＣＲでテストした。テストプライマーは、カナマイシン耐性遺伝子またはＰＴ５プロモーターのいずれかに位置する領域、および染色体組込み部位の下流領域を増幅するように選択した（図３）。実施例１に記載の通りに、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からカナマイシン選択可能マーカーが除去されていることを示した（図４、レーン１６、１８、２０、および２２）。ｉｓｐＡｄｘｓおよびｉｄｉ遺伝子の上流のＰＴ５プロモーター断片の染色体組込み、ならびにオペロン間領域におけるＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）およびＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）構築物の組込みは、予想されるＰＣＲ産物のサイズである、それぞれ２８５ｂｐ、２７４ｂｐ、２１８４ｂｐ、および１２８２ｂｐに基づいて確認した（図４、レーン１５、１７、１９および２１）。
【０２２０】
実施例１０
β−カロテン産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ菌株の構築
ｄｘｓおよびｉｄｉ遺伝子の最前部におけるＰＴ５強力プロモーターの染色体組込みが、β−カロテン産生に及ぼす影響を特性化するために、β−カロテンを産生することができる、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉを構築した。
【０２２１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ菌株を用いて作られたＰ１溶解産物を、受容株である、実施例６に記載の、β−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５に形質導入した。１６のカナマイシン耐性形質導入体を選択した。ＦＬＰリコンビナーゼ発現システムを使用して、カナマイシン選択可能マーカーを形質導入体の染色体から除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ菌株を得た。
【０２２２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓの染色体上にｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉをスタッキングするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉ菌株から作られたＰ１溶解産物を用いて、受容株である、上述の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓに形質導入した。およそ４５０のカナマイシン耐性形質導入体を選択した。形質導入後、上述の通りにカナマイシン選択可能マーカーを染色体から除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ菌株を得た。
【０２２３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ菌株について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上のｄｘｓおよびｉｄｉ遺伝子の上流の、ファージＰＴ５プロモーターの正確な組込み、およびカナマイシン選択可能マーカーの除去を、ＰＣＲ分析で確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ菌株のコロニーを、特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｄｘｓ（５’−ＴＧＧＣＡＡＣＡ  ＧＴＣＧＴＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧ−３’；配列番号５２）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｄｘｓ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｄｉを用いたＰＣＲにより、テストした。テストプライマーは、カナマイシンまたはＰＴ５プロモーターの位置する領域、および染色体組込み部位の下流領域を増幅するように選択した（図３）。実施例１に記載の通りに、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からカナマイシン選択可能マーカーが除去されていることを示した（図４、レーン２４および２６）。ｄｘｓおよびｉｄｉ遺伝子の上流の、ＰＴ５プロモーター断片の染色体組込みは、予想されるＰＣＲ産物のサイズである、それぞれ、２２９ｂｐおよび２７４ｂｐに基
づいて確認した（図４、レーン２３および２５）。
【０２２４】
実施例１１
β−カロテン産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ
ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ菌株の構築
増加したカロテノイド産生が可能な細菌株を創出するために、ＦＬＰ組換えシステムと組合せたＰ１形質導入により、ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ菌株にさらにスタッキングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ菌株を用いたＰ１溶解産物で、受容株である、上述のβ−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ  ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉに形質導入した。２１のカナマイシン耐性形質導入体を選択した。ＦＬＰリコンビナーゼ発現システムを使用して、カナマイシン選択可能マーカーを形質導入体の染色体から除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ菌株を得た。
【０２２５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ菌株について、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上のｄｘｓ、ｉｄｉおよびｙｇｂＢＰ遺伝子の上流の、ＰＴ５プロモーターの正確な組込み、およびカナマイシン選択可能マーカーの除去を、ＰＣＲ分析で確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ菌株のコロニーを、特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｄｘｓ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｄｘｓ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｙｇｂ（５’−ＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＣＣＧＡＧＴＧＴＴＣ−３’）（配列番号５３）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｙｇｂを用いたＰＣＲでテストした。テストプライマーは、カナマイシン耐性マーカーまたはＰＴ５プロモーターのいずれかに位置する領域および染色体組込み部位の下流領域を増幅するように選択した（図３）。実施例１に記載の通りにＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からカナマイシン選択可能マーカーが除去されていることを示した（図４、レーン２８、３０および３２）。ｄｘｓ、ｉｄｉおよびｙｇｂＢＰ遺伝子の上流の、ＰＴ５プロモーター断片の染色体組込みは、予想されるＰＣＲ産物のサイズである、それぞれ、２２９ｂｐ、２７４ｂｐ、および２９６ｂｐに基づいて確認した（図４、レーン２７、２９、および３１）。
【０２２６】
実施例１２
β−カロテン産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ＤＸＳ  ＰＴ５−ＩＤＩ
ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株の構築
増加したカロテノイド産生が可能な細菌株を創出するために、ＦＬＰ組換えシステムと組合せたＰ１形質導入により、ＰＴ５プロモーターの制御下にあるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）１６ａ  ｌｙｔＢ（ｌｙｔＢ（１６ａ））遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ菌株に、さらにスタッキングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株を用いたＰ１溶解産物で、受容株である、既述のβ−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）を含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ  ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰに形質導入した。およそ３００のカナマイシン耐性形質導入体を選択した。ＦＬＰリコンビナーゼ発現システムを使用して、カナマイシン選択可能マーカーを形質導入体の染色体から除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株を得た。
【０２２７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株について、ｄｘｓ、ｉｄｉおよびｙｇｂＢＰ遺伝子の上流のＰＴ５プロモーターの正確な組込み、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上の１８．１
分に位置するオペロン間領域におけるＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）遺伝子の組込み、ならびにカナマイシン選択可能マーカーの除去を、ＰＣＲ分析で確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）菌株のコロニーを、特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｄｘｓ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｄｘｓ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｙｇｂ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｙｇｂ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｌｙｔＢ（１６ａ）、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｌｙｔＢ（１６ａ）を用いたＰＣＲでテストした。テストプライマーは、カナマイシン耐性マーカーまたはファージＰＴ５プロモーターのいずれかに位置する領域および染色体組込み部位の下流領域を増幅するように選択した（図３）。実施例１に記載の通りにＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からカナマイシン選択可能マーカーが除去されていることを示した（図４、レーン３４、３６、３８および４０）。ｄｘｓ、ｉｄｉおよびｙｇｂＢＰ遺伝子の上流のＰＴ５プロモーター断片の染色体組込み、およびＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）遺伝子の組込みは、予想されるＰＣＲ産物のサイズである、それぞれ、２２９ｂｐ、２７４ｂｐ、２９６ｂｐ、および１２８２ｂｐに基づいて確認した（図４、レーン３３、３５、３７、および３９）。
【０２２８】
実施例１３
カロテノイド産生を増加させる染色体突然変異の単離
野生型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、非カロテン産生性であり、カロテノイドのファルネシルピロリン酸前駆物質のみを合成する。パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）由来のｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子群を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入するとき、β−カロテンが合成され、また該細胞は、β−カロテンに特有の黄色を示す。カロテノイド産生を増加させる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体突然変異は、結果として、より激しく着色したすなわちより濃い黄色を有するコロニーを生じるはずである（図８）。
【０２２９】
プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）は、パンテア・スチュワーティ（Ｐａｎｔｏｅａ
ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ８１９９）由来のカロテノイド生合成遺伝子群（ｃｒｔＥＸＹＩＢ）をコードする。ｐＰＣＢ１５プラスミドは、ＳｍａＩ消化ｐＳＵ１８（バルトロメ（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ）ら、Ｇｅｎｅ、１０２：７５−７８（１９９１年））ベクターと、ｐＰＣＢ１３由来のｃｒｔＥＸＹＩＢを担持する平滑末端化ＰｍｅＩ／ＮｏｔＩ断片とのライゲーションによって構築した（実施例３）。ｐＰＣＢ１５で形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５を、トランスポゾン突然変異誘発に使用した。突然変異誘発は、製造業者の説明書に従い、ＥＺ：ＴＮ（商標）＜ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ  トランスポゾーム（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ）（商標）キット（ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して実施した。トランスポゾン（１μＬ）を、極めてエレクトロコンピテントなＭＧ１６５５（ｐＰＣＢ１５）細胞５０μＬにエレクトロポレートした。突然変異体細胞を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢノーブル（ＬＢ−Ｎｏｂｌｅ）寒天（ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））プレート上に塗布し、３７℃で一晩増殖させた。より濃い黄色が現れることによって評価されるような、上昇したレベルのβ−カロテンの産生について、数万個の突然変異体コロニーを視覚的に検査した。候補の突然変異体を、用時調製したＬＢノーブル（ＬＢ−Ｎｏｂｌｅ）寒天プレートに再度画線し、さらなる特性決定のために、グリセロール凍結貯蔵液を作った。
【０２３０】
実施例１４
カロテノイド産生の定量化
実施例１３におけるより濃い黄色コロニーの視覚的スクリーニングによって、β−カロテン産生増加のために選択された突然変異体が、より多いβ−カロテンを実際に産生したことを確認するために、各突然変異体菌株から増殖させた培養からカロテノイドを抽出し、分光光度法で定量化した。各候補の突然変異体菌株を、２５０ｒｐｍで振盪している５０ｍＬフラスコ内の、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１０ｍＬで一晩培養した。ＭＧ１６５５（ｐＰＣＢ１５）を対照として使用した。カロテノイドを、各細胞ペレットから１５分間、アセトン１ｍＬに抽出し、産生されたβ−カロテンの量を、４５５ｎｍで測定した。細胞密度を６００ｎｍで測定した。ＯＤ４５５／ＯＤ６００比を使用して、異なる培養のβ−カロテン産生を標準化した。β−カロテン産生はまた、ＨＰＬＣでも確認した。試験した突然変異体クローンの中で、８つがβ−カロテン産生増加を示した（図９）。３つの独立した測定値の平均値と算出された標準偏差を示し、また標準偏差バーとして示した図８から分かるように、突然変異体Ｙ１５は、ほぼ２倍のβ−カロテン産生増加を示した。
【０２３１】
実施例１５
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上のトランスポゾン挿入のマッピング
各突然変異体におけるトランスポゾン挿入部位は、ＰＣＲおよび突然変異体菌株の染色体ＤＮＡからの直接配列決定により同定した。改良型１プライマーＰＣＲ方法（カーリーシェフ（Ｋａｒｌｙｓｈｅｖ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２８：１０７８−８２、２０００年）を使用した。この方法のために、体積１００μＬの一晩培養を、ＰＣＲ機械内で、９９℃にて１０分間加熱した。細胞片を、４０００ｇで１０分間の遠心分離により除去した。体積１μＬの上澄を、Ｔｎ５ＰＣＲＦ（５’−ＧＣＴＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＡＴＣ−３’；配列番号５４）プライマーまたはＴｎ５ＰＣＲＲ（５’−ＣＧＡＧＣＡＡＧＡＣＧＴＴＴＣＣＣＧＴＴＧ−３’；配列番号５５）プライマーのいずれかを使用する５０μＬ  ＰＣＲ反応で使用した。ＰＣＲは、下記の通りに実行した。９５℃で５分；２０サイクルの、９２℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３分；３０サイクルの、９２℃で３０秒、４０℃で３０秒、７２℃で２分；３０サイクルの、９２℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分。体積１０−μＬの各ＰＣＲ産物を、アガロースゲル上を電気泳動させ、産物の長さを評価した。キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットを使用して、体積４０μＬの各ＰＣＲ産物を精製し、ＥＺ：ＴＮ（商標）＜ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐトランスポゾーム（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ）（商標）キットにより提供される配列決定プライマーＫａｎ−２ＦＰ−１（５’−ＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣ−３’；配列番号５６）またはＫａｎ−２ＲＰ−１（５’−ＧＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＧ−３’；配列番号５７）を使用して配列決定した。各突然変異体から得られた配列を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５ゲノムの配列と配列比較することにより、トランスポゾンの染色体挿入部位は、Ｔｎ５トランスポゾンとＭＧ１６５５染色体ＤＮＡとの間の接合部として同定された。突然変異体Ｙ１５は、ｙｊｅＲにＴｎ５挿入を担持していた（ゴーシュ（Ｇｈｏｓｈ），Ｓ．、ＰＮＡＳ、９６：４３７２−４３７７（１９９９年））。Ｔｎ５カセットは、該遺伝子のカルボキシ末端の非常に近くに位置しており（図１０）、結果として、機能的であるが切断されたタンパク質産物を生じる公算が高い。
【０２３２】
実施例１６
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体におけるトランスポゾン挿入の確認
実施例１５におけるトランスポゾン挿入部位を確認するために、各突然変異体のトランスポゾン挿入部位から４００−８００ｂｐ上流および下流に、染色体特異的プライマーをデザインした。プライマーＹ１５＿Ｆ（５’−ＧＧＡＴＣＧＡＴＣＴＴＧＡＧＡＴＧＡＣＣ−３’；配列番号５８）およびＹ１５＿Ｒ（５’−ＧＣＴＴＴＣＧＴＡＡＴＴＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＧ−３’；配列番号５９）を使用して、Ｙ１５突然変異体をスクリーニングした。各突然変異体について、３組のＰＣＲ反応を実施した。第１組（ＰＣＲ１と名づ
けられた）は、染色体特異的上流プライマーと染色体特異的下流プライマーを使用する。第２組（ＰＣＲ２）は、染色体特異的上流プライマーとトランスポゾン特異的プライマー（染色体におけるトランスポゾンの向きによって、Ｋａｎ−２ＦＰ−１またはＫａｎ−２ＲＰ−１のいずれか）を使用する。第３組（ＰＣＲ３）は、染色体特異的下流プライマーとトランスポゾン特異的プライマーを使用する。ＰＣＲ条件は、下記の通りである。９５℃で５分；３０サイクルの、９２℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分；次いで、７２℃で５分。野生型ＭＧ１６５５（ｐＰＣＢ１５）細胞は、対照細胞の役割をした。対照細胞では、予想される野生型バンドがＰＣＲ１で検出され、突然変異体バンドは、ＰＣＲ２またはＰＣＲ３で検出されなかった。全て８つの突然変異体では、野生型バンドはＰＣＲ１で検出されず、予想される突然変異体バンドがＰＣＲ２およびＰＣＲ３の両者で検出された。ＰＣＲ２およびＰＣＲ３における生成物のサイズは、各特異的遺伝子における挿入部位と相関関係があった。したがって、実施例１５で示される通り、突然変異体は、トランスポゾン挿入を含んでいた。
【０２３３】
実施例１７
β−カロテン産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ
ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５菌株の構築
増加したカロテノイド産生が可能な細菌株を創出するために、実施例１３〜１６で略述した実験により発見された、トランスポゾン（Ｔｎ５）（ｋａｎＲ）により部分的にノックアウトされる遺伝子、ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５（配列番号６３）を、Ｐ１形質導入により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ菌株にさらにスタッキングした。小さいオリゴリボヌクレオチドに対して３’から５’へのエキソリボヌクレアーゼ活性を有するオリゴリボヌクレアーゼをコードするｙｊｅＲ遺伝子は、β−カロテン産生を増加するためのランダムトランスポゾン（Ｔｎ５）−挿入突然変異誘発により単離されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５菌株で作られたＰ１溶解産物で、受容株である、既述のβ−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰに形質導入した。６つのカナマイシン耐性形質導入体を選択した。
【０２３４】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５菌株について、ｄｘｓ、ｉｄｉおよびｙｇｂＢＰ遺伝子の上流のＰＴ５プロモーターの正確な組込み、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体上のｙｊｅＲ：：Ｔｎ５遺伝子組込みを、ＰＣＲ断片分析で確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ
ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５菌株のコロニーを、特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｄｘｓ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｄｘｓ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｙｇｂ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｙｇｂ、Ｔ−Ｔｎ５ｙｊｅＲ（５’−ＧＣＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＧ−３’；配列番号６０）およびＢ−ｙｊｅＲ（５’−ＧＣＴＴＴＣＧＴＡＡＴＴＴＴＣＧＣＡＴＴＴＣＴＧ−３’；配列番号６１）を用いたＰＣＲでテストした。テストプライマーは、カナマイシン選択マーカーまたはＰＴ５プロモーターのいずれかに位置する領域および染色体組込み部位の下流領域を増幅するように選択した（図３）。実施例１に記載の通りにＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からカナマイシン選択可能マーカーが除去されていることを示した（図４、レーン４２、４４、および４６）。ｄｘｓ、ｉｄｉおよびｙｇｂＢＰ遺伝子の上流のＰＴ５プロモーター断片の染色体組込み、およびトランスポゾン（Ｔｎ５）のｙｊｅＲ遺伝子（ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５）への組込みは、予想されるＰＣＲ産物のサイズである、それぞれ、２２９ｂｐ、２７４ｂｐ、２９６ｂｐ、および２８５ｂｐに基づいて確認した（図４、レーン４１、４３、４５、および４７）。
【０２３５】
実施例１８
β−カロテン産生増加のための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ
ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株の構築
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株を、マーカー除去のためのＦｌｐ部位特異的リコンビナーゼと組合せたＰ１形質導入によって構築した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株から作られたＰ１溶解産物で、受容株である、β−カロテン生合成発現プラスミドｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰに形質導入した。３６のカナマイシン耐性形質導入体を選択した。実施例６に記載の通り、カナマイシン選択可能マーカーを、染色体から除去し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢを得た。
【０２３６】
ＰＴ５強力プロモーターの制御下にあるｉｓｐＢ遺伝子のスタッキングは、予想外に、β−カロテン産生を増加させた。イソプレノイドキノン類の側鎖の前駆物質を供給する、ＩｓｐＢ（オクタプレニルジホスフェートシンターゼ）は、カロテノイド生合成経路からＦＰＰ基質を取り除く（図１）ため、このことは、自明ではない結果であった。ＰＴ５プロモーターの制御下にあるｉｓｐＢ遺伝子の過剰発現が、いかにしてβ−カロテン産生を増加するかというメカニズムは、まだ明白ではない。しかし、結果から、ＩｓｐＢは、カロテノイド生合成経路のフラックスを増加できることが示唆される。
【０２３７】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株について、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢＰ、およびｉｓｐＢ遺伝子の最前部におけるファージＰＴ５プロモーターの正確な組込み、およびカナマイシン選択可能マーカーの除去は、ＰＣＲ分析で確認した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢのコロニーを、特異的プライマー対の異なる組合せ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｄｘｓ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｄｘｓ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｉｄｉ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｙｇｂ、Ｔ−ｋａｎおよびＢ−ｙｇｂ、Ｔ−Ｔ５およびＢ−ｉｓｐＢ（５’−ＡＧＴＡＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＣＧＧＡＣＧＡＡＴＡＣＧ−３’；配列番号６２）、ならびにＴ−ｋａｎおよびＢ−ｉｓｐＢを用いたＰＣＲでテストした。テストプライマーは、カナマイシン選択可能マーカーまたはＰＴ５プロモーターのいずれかに位置する領域および染色体組込み部位の下流領域を増幅するように選択した（図３）。実施例１に記載の通りにＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体からカナマイシン選択可能マーカーが除去されていることを示した（図５、レーン４９、５１、５３、および５５）。ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｙｇｂＢＰおよびｉｓｐＢ遺伝子の上流のＰＴ５プロモーターの染色体組込みは、予想されるＰＣＲ産物のサイズである、それぞれ、２２９ｂｐ、２７４ｂｐ、２９６ｂｐ、および３１８ｂｐに基づいて確認した（図５、レーン４８、５０、５２、および５４）。
【０２３８】
実施例１９
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ＩｓｐＢ菌株へのｐＤＣＱ１０８の形質転換
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢにおけるβ−カロテン産生をモニターするためのレポータープラスミドとして使用された低コピー数プラスミドｐＰＣＢ１５（β−カロテン合成遺伝子パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）ｃｒｔＥＸＹＩＢを含む）を、β−カロテン合成遺伝子パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）ｃｒｔＥＸＹＩＢを含む中コピー数プラスミドｐＤＣＱ１０８（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８２３）と置換した。ＬＢプレート上に画線し、３７℃で２日間インキュベートし、白色コロニーを採取することによって、プラスミドｐＰＣＢ１５を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株から除去した。
【０２３９】
プラスミドｐＤＣＱ１０８（ｔｅｔＲ）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株に形質転換した（カロテノイドレポータープラスミドを欠く白色コロニー）。実施例１に記載の通りに、エレクトロ・トランスフォーメーションを実施した。３７℃の、２５μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンＬＢプレートで、形質転換体を選択した。結果として得られた形質転換体は、ｐＤＣＱ１０８を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株であった。
【０２４０】
実施例２０
染色体組込みを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるβ−カロテン産生の測定
９つの、染色体操作した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５
ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）  ＰＴ５−ｉｄｉ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＤＣＱ１０８  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢのβ−カロテン産生を、下記の分光光度法で定量化した。β−カロテン産生の定量分析は、４２５、４５０および４７８ｎｍにおけるβ−カロテンの特徴的なλｍａｘピークのスペクトルを測定することによって実施した。８つの染色体操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照株を、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ  ５ｍＬで、３７℃にて２４時間増殖させ、次いで、４０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により回収した。細胞ペレットを、１分間渦巻攪拌し、次いでサンプルを室温で１時間揺り動かながら、アセトン１ｍＬに再懸濁することにより、β−カロテン色素を抽出した。４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、β−カロテンを含むアセトン層の吸収スペクトルを、ウルトロスペック（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ）３０００分光光度計（ニュージャージー州ピスキャタウェイのアマーシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、４５０ｎｍで測定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）におけるβ−カロテンの産生は、対照株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５のそれより、それぞれおよそ３．５倍および４．３倍高かった（図１１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｉｓｐＡｄｘｓ  ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）  ＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）  ＰＴ５−ｉｄｉにおけるＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）およびＰＴ５−ｉｄｉのさらなるスタッキングは、β−カロテンの産生を顕著に増加しなかった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉでのβ−カロテンの産生は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５対照株のそれよりおよそ４．４倍高かった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰにおけるＰＴ５−ｙｇｂＢＰおよびＰＴ５−ｌｙｔＢ（１６ａ）のさらなるスタッキングは、β−カロテンの産生を、��腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉのそれに比べて、それぞれ４１％および４５％増加した（図１１）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄ
ｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５におけるβ−カロテンの産生は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５対照株のそれよりおよそ１９倍高かった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＤＣＱ１０８  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５対照株よりおよそ３０倍高い、最高のβ−カロテン産生価を示した。
【０２４１】
実施例２１
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢにおけるβ−カロテン含量の測定
実施例２０は、本発明における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ
ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８０７）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＤＣＱ１０８  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ
ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４８２３）菌株が、高レベルのβ−カロテンを産生し、ＬＢプレート上に濃いオレンジ色のコロニーを示すことを証明した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＤＣＱ１０８  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株におけるβ−カロテンを、ＨＰＬＣ分析で定量化した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５対照大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＣＰＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＤＣＱ１０８  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株を、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ  ５０ｍＬ中で、２５０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃にて２４時間増殖させた。９５℃の炉で２４時間乾燥させた後、予め重量を測定した直径３７ｍｍのセルロースフィルター（０．２μｍ）（マサチュセッツ州ベッドフォードのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で、培養細胞２０ｍＬを濾過した。滅菌水１０ｍＬで洗浄した後、予め重量を測定したフィルター上の細胞を、その重量が変化しなくなるまで、９５℃の炉で２４時間完全に乾燥させた。乾燥細胞重量は、フィルターそれ自身の重量を、総重量から減算することによって決定した。
【０２４２】
カロテノイド抽出および分析のため、培養細胞２０ｍＬを、４０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して回収した。実施例２０に記載の通りに、β−カロテン色素を抽出した。得られたカロテン抽出液は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により、β−カロテン含量について分析した。１２５×４ｍｍのＲＰ８（５μｍ粒子）カラム（カリフォルニア州サンフェルナンドのヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ））を、β−カロテンのＨＰＬＣ分析に使用した。流速は、１ｍＬ／分であり、溶媒プログラムは、下記の通りであった。０〜１１．５分  水４０％／メタノール６０％から１００％メタノールまでの線状勾配、１１．５〜２０分  １００％メタノール、２０〜３０分  水４０％／メタノール６０％。β−カロテンの検出は、４５０ｎｍにおける吸収により測定し、また定量分析は、β−カロテンのピークの面積を、既知のβ−カロテン標準（ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））と比較することによって実施した。
【０２４３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＤＣＱ１０８  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株は、それぞれ、乾燥細胞重量１ｇ当たり３．８ｍｇのβ−カロテン（３，８００ｐｐｍ）および６．０ｍｇのβ−カロテン／ｇ乾燥細胞重量（６，０００ｐｐｍ）を産生したが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５対照株は、０．２ｍｇのβ−カロテン／ｇ乾燥細胞重量（２００ｐｐｍ）を産生する（表１０）。β−カロテン含量に関するＨＰＬＣ分析もまた、染色体操作
した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＰＣＢ１５  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＤＣＱ１０８  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢ菌株は、対照株より、それぞれ１９倍および３０倍高いβ−カロテンを産生することを示した。
【０２４４】
非カロテン産生性宿主、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、カロテノイド産生の限界は、膜の過負荷および膜機能性の崩壊のため、およそ１．５ｍｇ／ｇ  細胞乾燥重量（１，５００ｐｐｍ）のレベルで到達すると推測されてきた（アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら、上掲）。本方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に修飾を施し、β−カロテン産生を乾燥細胞重量１ｇ当たり６ｍｇ（６０００ＰＰＭ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｐＤＣＱ１０８  ＰＴ５−ｄｘｓ  ＰＴ５−ｉｄｉ  ＰＴ５−ｙｇｂＢＰ  ＰＴ５−ｉｓｐＢにおける初期レベルより３０倍の増加）に増加させることにより、記載の問題を解決した。
【０２４５】
【表２０】
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【図面の簡単な説明】
【０２４６】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるβ−カロテンの産生に使用される、イソプレノイドおよびカロテノイド生合成経路を略述する図である。
【図２】プロモーターまたは全遺伝子配列の染色体組込み、および強力プロモーター−イソプレノイド遺伝子融合体のスタッキングのための方策を示す図である。
【図３】染色体挿入物のＰＣＲ分析を示す図である。
【図４】染色体挿入物のＰＣＲ分析を示す図である。
【図５】染色体挿入物のＰＣＲ分析を示す図である。
【図６】ｐＳＵＨ５のプラスミド地図を示す図である。
【図７】ｐＰＣＢ１５のプラスミド地図を示す図である。
【図８】増加したカロテノイド産生を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｎ５突然変異体を創出するための方策を示す図である。
【図９】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｎ５突然変異体からの増加したβ−カロテン産生を示す図である。
【図１０】Ｙ１５；ｙｊｅＲ：：Ｔｎ５突然変異におけるＴｎ５の挿入部位を示す図である。
【図１１】本発明の操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株によるβ−カロテン産生を示す図である。
【図１２】β−カロテン産生の最適化に使用される、バクテリオファージＰ１仲介形質導入および並列組合せスタッキングを示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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