(57)【要約】本発明は、特別に規定された媒体における該細胞の培養によって幹細胞をインスリン産生細胞に分化し、好ましくは、β細胞の分化に関与する1 つ以上の遺伝子を活性化する新規方法に関するものである。本発明はさらに、本発明の方法から直接的に発生する医療分野(特に糖尿病)分野における応用に関するものである。加えて、本発明は、本発明の方法から直接的に発生する、治療効果または毒性効果を備えた化合物を同定および特徴つけるための適用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法において、好適な培地における幹細胞を培養し、β細胞分化に関与する少なくとも 1 つの遺伝子を活性化することを特徴とする、幹細胞をインスリン産生細胞に分化する方法。
【請求項２】
胚様体を形成するために当該培養幹細胞を凝集し、当該胚様体を分化培地で培養し、β細胞分化を促進し、同定し、および随意的にインスリン産生細胞を選択する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該幹細胞が胚幹細胞、成体幹細胞、体細胞幹細胞および原始生殖細胞から選択される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
当該幹細胞がヒト由来である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
β細胞分化に関与する遺伝子が、Pdx1、Pax4、Pax6、ngn3、Nkx6.1、Nkx6.2、Nkx2.2、HB9、β 2、NeuroD、IsI1、HNF1-alpha、HNF1-β 、HNF3、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
インスリン遺伝子が Pdx1、Pax4、Pax6、ngn3、およびその組み合わせから選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
遺伝子がヒト由来である、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
遺伝子の活性化が膵臓遺伝子の幹細胞への送達から成る、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
当該遺伝子送達が、転写の開始を可能にするため、少なくとも 1 つの膵臓遺伝子の cDNA で調節領域の制御下にて行われる幹細胞の形質転換を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
当該遺伝子送達が、ウィルス送達システムを用いる DNA 伝達を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子活性化が、膵臓遺伝子のタンパク質生成物の幹細胞への送達を含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
当該胚様体が懸滴方法によって形成される、請求項２から１１でのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
当該分化培地が、イスコーブ変法ダルベッコ培地に基づき、子ウシの胎児血清、L グルタミン、非必須アミノ酸、および随意的に EGF を含む α-モノチオグリセリン 、bFGF、プロゲステロン、成長ホルモン、フリスタチンおよび／またはアクチビンで補足される、請求項２から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
当該分化培地がさらに、細胞外のマトリックスタンパク質、コラーゲンおよび／または成長因子および細胞外のマトリックスタンパク質の混合物を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも 20% のインスリン産生細胞が、15 日間の分化時間後に得られる、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも 40% のインスリン産生細胞が得られる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ネスチン陽性細胞の選択を含む、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
インスリン産生細胞が薬学目的に使用される、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
膵臓疾患、血糖値異常を伴なう代謝症候群および代謝障害、例えば糖尿病、高血糖および／または糖耐性障害の治療に対する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
3000〜100000 に相当する分化済インスリン産生細胞が体重 1 キログラム当たりに投与される、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法によって入手可能なインスリン産生細胞を含む細胞組成物。
【請求項２２】
15 日間の分化時間後に、少なくとも 20% のインスリン産生細胞を含む、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも 40% のインスリン産生細胞を含む、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも２：１のインスリン産生細胞とグルカゴン産生細胞との比を有する、請求項２１から２３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
少なくとも 5 :1 の比を有する、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
27.7 mM グルコースを用いて 15 分間刺激作用を加えた後に、少なくとも 2 倍のインシュリン分泌量の増加を示す、請求項２１から２５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
医薬品組成物である、請求項２１から２６までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
膵臓疾患、血糖値異常を伴なう代謝症候群および代謝障害、例えば糖尿病、高血糖および／または糖耐性障害の治療に対する、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
移植によって投与または医療器具に使用される、請求項２１または２６に記載の組成物。
【請求項３０】
幹細胞のインスリン産生細胞への分化を調節する能力のある組成物を同定および／または特性決定する方法において、幹細胞がインスリン産生細胞に分化される能力を持ち、化合物の分化過程におよぼす効果を確定する能力を持つという条件下で、テストされる化合物に幹細胞を用いて接触することを特徴とする、幹細胞のインスリン産生細胞への分化を調節する能力のある組成物を同定および／または特性決定する方法。
【請求項３１】
幹細胞を、β細胞の分化に関与する調節制御下の遺伝子のレポーター遺伝子を含み、当該形質転換済細胞にテストされ、レポーター遺伝子の活性を確定する化合物を用いて接触する DNA 構成物で形質転換を行うことを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
分化培地で培養される胚様体に接触し、テストされインスリン産生細胞への分化を確定する化合物を用いてβ細胞の分化を促進する、請求項３０または３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、特別に規定された培地における該細胞の培養によって幹細胞をインスリン産生細胞に分化し、好ましくは、β細胞の分化に関与する1 つ以上の遺伝子を活性化する方法に関するものである。本発明は、当該インスリン産生細胞を糖尿病動物および糖尿病患者に移植することによって、膵臓疾患、代謝症候群、および血糖値異常による代謝障害、例えば、これらに限定するものではないが、真性糖尿病、高血糖および糖耐性障害の治療のための手段を提供する。さらに、本方法を用いて、細胞分化、インシュリン分泌またはグルコース応答性を促がす化合物の同定および特徴付けのための細胞を生成することもできる。さらに、分化されたインスリン産生細胞を用いて、外来性化合物の毒性およびその他の作用のβ細胞機能への影響を研究することもできる。
【０００２】
［発明の背景］
糖尿病、高血糖および糖耐性障害は、炭水化物、タンパク質、および脂質の代謝に影響を及ぼし、血液中の異常な血糖値を結果としてもたらす、インシュリンの不適切な産生または使用を特徴とする内分泌障害である。糖尿病は不均一な疾病であり、1 型糖尿病(インスリン依存型糖尿病、IDDM、I 型、若年性糖尿病としても知られている) および2 型糖尿病(非インスリン依存型糖尿病、NIDDM、II 型、成人発症型糖尿病)の2 通りの主要グループに分類される。
【０００３】
膵臓の内分泌機能単位は、膵臓の外分泌部に分散し、4 つの細胞型: α細胞、β細胞、δ 細胞、およびPP 細胞から構成されているランゲルハンス島である。β細胞は、インシュリンを産生し、内分泌細胞の大部分に相当し、ランゲルハンス島の中心を形成する一方、α細胞はグルカゴンを分泌し、ランゲルハンス島の外周部に位置している。δ 細胞およびPP 細胞は比較的に数が少なく、それぞれソマトスタチンおよび膵臓ポリペプチドを分泌する。インシュリンおよびグルカゴンは血糖値の重要な制御因子である。インシュリンは細胞の取り込みおよびグリコーゲンへの変換を増加することによって血糖値を低下する。グルカゴンは肝臓グリコーゲンの分解に介入することによって血糖値高める。1 型糖尿病は、インスリン産生β細胞の自己免疫破壊を特徴とする。2 型糖尿病は、インシュリンの効果的な使用またはβ細胞による適切な量での産生が行われないような、インシュリン耐性および糖耐性障害を特徴とする。以上の点から、2 型患者は多くの場合、血糖値を調節するために追加のインシュリンを必要とする。その結果、1 型糖尿病患者と2 型糖尿病患者との間のインシュリン投与量には治療上の差異がほとんどない。(Fajans in Diabetes Milletus fifth editions; Porte and Sherwin, ed; Appleton & Lange pub. 1997, 1423pp を参照)。糖尿病に悩む個人は、インシュリンを最大で1 日に6 回自分自身で注入する必要がある。
【０００４】
インシュリン注入にもかかわらず、糖尿病患者は合併症を起こし、脳卒中、失明、切断、腎臓および心血管疾患の可能性が大きく増加する一方、寿命は短縮される(Nathan (1993) N. Engl. J. Med. 328:1676-1685; Group、T. D. C. a. C. T. R. (1993) N. Engl. J. Med. 329:977-986)。 ランゲルハンス膵島またはインスリン産生細胞の移植によるインスリン産生細胞不在の代替は有望な治療オプションである(Luzi らの(1996) J. Clin. Invest. 97:2611-2618; Bretzel らの(1996) Ther. Umsch. 53:889-901)。しかし、移植のためのヒトのドナー組織の利用能は非常に限定されている。代替オプションとしてはブタの動物組織の使用があげられるが、重大な技術的問題、例えば長期的免疫抑制およびブタ内在性レトロウイルスのようなブタ病原体がヒト集団に移入する危険などを解決する必要がある(Butler らの(1998) Nature 391:320-324; Bach らの(1998) Nature Med. 4:141-144; Shapiro らの(2000) N. Engl. J. Med. 343:230-238)。この問題に対する一つの解決策としては、欠損または機能不全のβ細胞の機能を担う能力のあるヒト「代理細胞」を生成することがあげられる。以上の点から、糖尿病患者に移植するための無限量の代理インスリン産生細胞を産生する必要性が存在する。本発明は、幹細胞の機能的なインスリン産生細胞への分化を誘導するための容易な方法を提供することによってこの要求を満たす。
【０００５】
幹細胞とは、さまざまな個別細胞を作り出すことができる未分化細胞または未熟細胞のことである。ひとたび分化または分化誘導された幹細胞は、損傷器官および機能不全器官を修復するために用いることができる。幹細胞は胚または成人に由来する細胞である。成人幹細胞または体細胞の幹細胞は、筋肉、骨髄、肝臓、および脳などの幾多の異なる組織で同定されている ((Vescovi and Snyder (1999) Brain Pathol., 9:569-598; Seale and Rudnicki (2000) Dev. Biol.、218:115-124)。膵臓には、幹細胞が成人組織内にも存在していることが示唆されている (Gu および Sarvetnick (1993) Development、118:33-46; Bouwens (1998) Microsc Res Tech、43:332-336; Bonner-Weir (2000) J. Mol. Endocr.、24:297-302)。ところが、この集団は境界が明確でなく、膵臓における細胞の極めて小さな部分しか占めていない。
【０００６】
胚幹細胞は、着床前胚(ES 細胞)の内部細胞塊または着床後胚 (EG 細胞)の生殖隆起に見出される原始生殖細胞から分離される。攪拌培養または懸滴培養などの特別な培養条件で成長するとき、ES 細胞およびEG 細胞は両方とも、凝集して胚様体(EB)を形成する。EBs(胚様体)は、胚形成期間中に存在する細胞に類似した、さまざまなタイプの細胞から構成されている。適切な培地で培養されると、EB を用いて、胚体外の内胚葉、造血細胞、神経細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、および血管細胞などの生体外で分化された表現型を生成することができる。これまでは、EB を効果的にインスリン産生細胞に分化できるような方法は、記載されていない。
【０００７】
Soria とその同僚は、細胞捕獲装置を用いて、ES 細胞からインスリン分泌細胞のクローンを選択するための方法を記載している。この方法においては、細胞をプラスミドで形質転換し、ヒトインシュリン遺伝子の調節領域の制御下で、ネオマイシン耐性遺伝子の発現を可能にしている。インスリン分泌細胞クローンからの細胞が糖尿病マウスの脾臓に移植された。移植された細胞は、治療を受ける動物の血糖値を正常化し、体重を復元することができる(Soria らの(2000) Diabetes 49:157-162)。ただし、この選択方法の欠点は、その低効率である。
【０００８】
Lumelsky とその同僚 (Lumelsky らの(May 2001)、Science 292: 1389-1394)は、マウスの ES 細胞からインスリン発現細胞を生成した。ES 細胞を、支持細胞なしで、LIF の存在下で、ゼラチン被覆組織培養表面上で膨張させる。次に、ES 細胞培地の懸濁液中、LIF の不在下で、胚様体を生成する。その後の段階で、無血清培地 (ITSFn)中、組織培養表面上でネスチン陽性細胞を選択する。結果として得られた 膵臓の内分泌前駆細胞を膨張させ、インスリン分泌膵島クラスタの分化と形態形成を誘導する。ところが、インスリン分泌膵島クラスタを糖尿病マウスに移植しても、正常な血糖値を復元しなかった。
【０００９】
Assady らの(August 2001)、Diabetes、50:1-7) は、ヒト多能性胚性幹細胞のインスリン産生細胞の特性を備えた細胞への自然発生的な生体外分化を記載している。インシュリンの培地への分泌が、分化依存的な様態で、その他のβ細胞マーカーの出現と関連して観察された。ところが、分化の効率は、インシュリンに対して陽性反応を示した分化細胞はわずか 1 〜 3 % と低かった。
【００１０】
本発明は、特定の遺伝子のインスリン産生細胞への活性化によって ES 細胞の分化を誘導することを目的としているので、該細胞の選択を目的とする従来の技術の方法とは異なっている。
【００１１】
近年、いくつかの遺伝子が、胚形成中における膵臓の内分泌細胞の生成にとって必須であることが照明されている (Edlund (1998) Diabetes、47:1817-1823; St-Onge らの(1999) Curr. Opin. Genet. Dev.、9:295-300)。膵臓の発生には、周辺の中胚葉組織から発散する一連の誘導信号および膵臓の上皮組織で発現された転写因子が関与する。転写因子 Pdx1 (Idx1, STF1, IPF1 とも呼ばれる)を含むホメオボックスは、その発生・成長中に膵臓膵芽のすべての細胞で発現し、成獣の β細胞に限られるようになる。Pdx1 突然変異マウスは、外分泌組織や内分泌組織を発生せず、膵臓を持たない(Jonsson らの(1994) Nature、371:606-609; Ahlgren らの(1996) Development、122:1409-1416; Offield らの(1996) Development、122:983-995)。基本ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子 neurogenin3 (ngn3)は、膵臓の上皮組織における初期の内分泌前駆物質の特異化に必要とされ、ひとたび内分泌分化が始まると下方制御される(Apelqvist らの(1999) Nature、400:877-881; Jensen らの(2000) Diabetes、49:163-176; Gradwohl らの(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、97:1607-1611)。Pax 遺伝子系の 2 つのメンバーである、Pax4およびPax6 は、膵臓における内分泌細胞の適切な分化にとって必須である(Sosa-Pineda らの(1997) Nature、386:399-402; St-Onge らの(1997) Nature、397:406-409; Sanders らの(1997) 遺伝子 Dev.、11:1662-1673)。その両方の Pax 遺伝子は、膵臓の上皮組織の内分泌前駆物質細胞サブセット内で、成熟ホルモン産生細胞の分化の前に、成長の初期に発現する。Pax4 に欠けるマウスはβ細胞を発現せず、糖尿病となる一方、α細胞集団は Pax6 突然変異マウスに存在しない。Nkx2.2、Nkx6.1、Nkx6.2、Isl1、および NeuroD はまた、β細胞の適切な分化および機能(作用)に必要な必須転写因子でもある。
【００１２】
β細胞再生のための実験動物は、成体生物体で β細胞分化に関与するメカニズムが、胚形成中に β細胞分化に関与するメカニズム類似していることを示唆している。Gu および Savernick は、膵臓の膵島で発現したインターフェロンγ (IFN-γ)遺伝子を有する遺伝子組換えマウスにおける膵臓の膵島および β細胞再生の研究のためのモデル系をを確定した。このモデル系においては、新規の膵島細胞(すなわち、 β 、α 、δ およびPP 細胞)が、膵臓の管細胞(Gu および Savernick (1993) Development、118:33-46)から連続的に形成される。それらのモデル系は、管細胞増殖およびIFN-γ 遺伝子組換えマウスにおける管関連の膵島形成が、その発生・成長中に膵島形成を再利用し、Pax4 遺伝子、Pax6 遺伝子およびPdx1 遺伝子の発現を必要にすることを明らかにしている。成獣の膵島再生に関与する遺伝子と、胚形成中の β細胞分化との間にはリンクが存在するが、幹細胞中の該遺伝子の活性化がインスリン産生細胞への分化を誘引できることは従来の技術では明らかにされていない。
【００１３】
本発明の要旨
本発明は、特別に規定された媒体における該細胞の培養によって幹細胞をインスリン産生細胞に分化し、好ましくは、β細胞の分化に関与する1 つ以上の遺伝子を活性化する新規方法に関するものである。本発明はさらに、本発明の方法から直接的に発生する医療分野および糖尿病分野における応用に関するものである。加えて、本発明は、本発明の方法から直接的に発生する、治療効果または毒性効果を備えた化合物を同定および特徴つけるための適用に関するものである。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
本方法について以下に説明するが、説明した特定の装置、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載する方法および材料に類似または 等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料をここに記載した。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連し得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００１５】
本発明の根底にある技術的問題は、例えば、限定するものではないが、高血糖、糖耐性障害、妊娠性糖尿病、および真性糖尿病などの膵臓疾患に悩む患者に移植するためのインスリン産生細胞を生成するための方法を提供することである。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられた実施例によって達成する。
【００１６】
従って本発明は、幹細胞をインスリン産生細胞に分化する下記から成る方法に関するものである。
(a)１つ以上の膵臓遺伝子を幹細胞で活性化する。
(b)胚様体を形成するために当該細胞を凝集する。
(c)特定の分化培地で胚様体を培養し、β細胞分化を促進する。
(d)インスリン産生細胞と膵臓細胞の同定および選択を行う。
【００１７】
本発明に関連しては、用語「幹細胞」は、未分化細胞または未熟胚細胞、さまざまなタイプの固有細胞を作り出せることができる成体細胞または体細胞の細胞を示す。用語「幹細胞」には、胚幹細胞(ES)および原始生殖細胞(EG) ヒト細胞または動物細胞が含まれる。該細胞の分離および培養は、当業者であれば公知である (Thomson らの(1998) Science 282:1145-1147; Shamblott らの(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726-13731; US 6,090,622; US 5,914,268; WO 0027995; Notarianni らの(1990) J. Reprod. Fert. 41:51-56; Vassilieva らの(2000) Exp. Cell. Res. 258:361-373)。用語「幹細胞」には、胚、胎児または成体神経組織からの神経前駆細胞も含まれ得る。該細胞の分離および培養は、当業者であれば公知である(Rao (Ed.), Stem Cells and CNS Development, Humana Press Inc., New Jersey (2001); Fedoroff and Richardson (Eds.), Protocols for Neural Cell Culture, Humana Press Inc., 3rd edition, New Jersey, (2001))。
【００１８】
用語「インスリン産生細胞」とは、インシュリンを発現、産生、および分泌する能力を持つ細胞を意味する。
【００１９】
用語「培養培地」とは、幹細胞、望ましくは ES 細胞および EG 細胞の成長および分化をサポートする能力を持つ好適な培地を意味する。本発明の実施するにあたって好適な培養培地の実施例は、ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Life Technologies 社) をベースに調整し、15% 熱不活性子ウシ胎児血清 (FCS、Gibco)、添加物、例えば、2 mM L グルタミン(Gibco)、5 x 10−６M  β−メルカプトエタノール(Serva)および 1:100 非必須アミノ酸 (Gibco)などで補足する。別の実施例では、培養培地はイスコーブ変法ダルベッコ培地(IMDM、Gibco)をベースに調整し、20% FCS、2 mM L グルタミン(Gibco)、1:100 非必須アミノ酸(Gibco)および 450 μM α-モノチオグリセリン (Sigma)で補足する。日常的な培養の場合、ES 細胞を 100 μg/ml のマイトマイシン C で3 時間処理することによって不活化した胚繊維芽細胞の支持層上で成長させる。
用語「分化培地」は、幹細胞のインスリン産生細胞への分化を誘導することを意味する。本発明の実施するにあたって好適な培養培地の実施例は、イスコーブ変法ダルベッコ培地(IMDM、Gibco)をベースに調整し、20% 子ウシ胎児の血清(FCS)、2mM L グルタミン、1:100 非必須アミノ酸および 450 μM α-モノチオグリセリン (Sigma)で補足する。加えて、該培地には、1 ng/ml〜100 μg/ml の、望ましくは 10 ng/ml の上皮成長因子(EGF); 1ng/ml 〜100 μg/ml の、望ましくは 2 ng/ml の基本線維芽細胞成長因子(bFGF); 1 nM〜1 mM の、望ましくは 20 nM のプロゲステロン; 10 ng/ml〜100 μg/ml の、望ましくは 100 ng/ml の成長ホルモン; 1 nM〜100 μM、望ましくは 5 nM フリスタチン (R&D);または 1〜100 nM、望ましくは 2nM のアクチビン (R&D)が含まれる。本発明を実施するにあたって別の好適な培養培地の実施例は、ダルベッコ変法イーグル培地: 栄養素混合物 F-12 (DMEM/F12、Life Technologies) をベースに調整し、100 ng/ml〜100 μg/ml の、望ましくは 5 μg/ml のインシュリン; 1 nM〜100 nM の、望ましくは 30 nM のナトリウム亜セレン酸塩; 100 ng/ml〜500 μg/ml の、望ましくは 50 μg/ml のトランスフェリン; 100 ng/ml〜100 μg/ml の、望ましくは 5 μg/ml のフィブロネクチンで補足する。本発明を実施するにあたって、また別の好適な培養培地の実施例は、ダルベッコ変法イーグル培地: 栄養素混合物 F-12 (DMEM/F12、Life テクノロジ) をベースに調整し、100 ng/ml〜100 μg/ml の、望ましくは 25 μg/ml のインシュリン; 1 nM〜100 nM、望ましくは 30 nM ナトリウム 亜セレン酸塩; 100 ng/ml〜500 μg/ml の、望ましくは 50 μg/ml のトランスフェリン; 100 ng/ml〜100 μg/ml の、望ましくは 5 μg/ml のフィブロネクチン; 500 ng/ml〜100 μg/ml の、望ましくは 1 μg ラミニン; 10 μM〜500 μM、望ましくは 100 μM プトレシン; 1 nM〜1 μM 望ましくは 20 nM プロゲステロン; 100 μM〜100 mM、望ましくは 10 mM ニコチンアミドで補足する。
【００２０】
加えて、細胞外のマトリックス(ECM)タンパク質、例えば、ラミニン(0.5〜100 μg/ml の、望ましくは 1 μg/ml、SIGMA)、または コラーゲン、または成長因子の複合体混合物および基底薄膜 (Matrigel R、Collaborative Research/Becton Dickinson、1:3 比率で希釈 = 保存溶液、培養の最終濃度 = 1: 10)のECM タンパク質が、膵臓の細胞数を増進するほかに、それらの分化状態を促進するために含まれる。
【００２１】
用語「末端分化培地」は、インスリン産生細胞の末端分化のための好適な培地を意味する。本発明を実施するにあたって好適な培養培地の実施例は、イスコーブ変法ダルベッコ培地(IMDM、Gibco)をベースに調整し、20% FCS、2mM L のグルタミン、1:100 非必須アミノ酸および 450 μM の α-モノチオグリセリン (Sigma)で補足する。加えて、該培地には 1 nM〜100 μM の、望ましくは 2 nM のアクチビン A; 1nM〜100 μM の、望ましくは 1 nM の β cellulin; 1 ng/ml〜100 μg/ml の、望ましくは 10 ng/ml のヒト成長因子(HGF); 1nM〜100 μM の、望ましくは 10 nM の Niacinamid および 1 ng/ml〜100μg/ml の、望ましくは 2 ng/ml の形質転換成長因子2 β  (TGF 2β )を含むことができる。
【００２２】
用語「膵臓遺伝子」は、膵臓の発生・成長、より望ましくは β細胞分化に関連し、必要とされる、遺伝子またはそのタンパク質生成物を意味する。該遺伝子の実施例には、ヒト遺伝子または動物遺伝子の Pdx1 (GenBank アクセッション番号 AH005712)、Pax4 (GenBank アクセッション番号 XM004974、NM006193)、Pax6 (GenBank アクセッション番号 M93650)、ngn3 (GenBank アクセッション番号 XM005744、NM020999、AJ133776)、Nkx6.1 (GenBank アクセッション番号 AH007313)、Nkx6.2、Nkx2.2 (GenBank アクセッション番号 AF019415)、HB9 (GenBank アクセッション番号 XM049383、AF107457)、β 2/NeuroD (GenBank アクセッション番号 NM002500、XM002573)、Isl1 (GenBank アクセッション番号 NM002202)、HNF1-α、HNF1-β  (GenBank アクセッション番号 X71346)、およびHNF3 (GenBank アクセッション番号 AF176112、AF176111)があげられる。好適な遺伝子は Pdx1、Pax4、Pax6、およびngn3 である。特に 好適な遺伝子は Pdx1、Pax4、およびPax6 である。各遺伝子は、独立または組み合わせで使用することができる。
【００２３】
用語「1 つ以上の膵臓遺伝子活性化する」とは、当該膵臓遺伝子またはタンパク質を幹細胞に送達および導入することを意味する。
【００２４】
好適な実施例では、1 つ以上の膵臓遺伝子の cDNAは、調節領域の制御下に置かれ、例えば電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウム法間接比較、DEAE デキストランなどの形質転換の方法により、細胞への転写や導入を開始することが可能になる。該方法および装置は、当分野で詳細に記載されており、必要以上の実験無しに実施できるものである。例えば、Joyner、"Gene Targeting: A Practical Approach", Oxford University Press, New York, 1993; Mansouri "Gene Targeting by Homologous Recombination in Embryonic Stem Cell", Cell Biology: A Laboratory Handbook, second ed., Academic Press, 1998 などを参照。膵臓遺伝子の遺伝子発現は、構成型プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス プロモーター/エンハンサー領域など、または誘導型プロモーター、例えばテトラサイクリン誘導型プロモータなどによって保証される。発現ベクターには、選択薬剤、例えばネオマイシン、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン耐性遺伝子なども含み得る。該遺伝子発現ベクターの作成は、当分野で周知である。Sambrook らの "Molecular Cloning, A laboratory Manual" third ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 2000; Gossen and Bujard, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551)を参照。DNA 伝達はまた、ウィルス送達システム、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連 ウイルスおよびレンチウイルス ベクターなどを用いても達成することができる。
【００２５】
さらに好適な実施例では、膵臓遺伝子のタンパク質生成物は、直接的に幹細胞に送達できる。例えば、タンパク質の送達は、ポリカチオン リポソーム(Sells らの(1995) Biotechniques 19:72-76)、Tat（ウイルス発現促進因子）媒介 タンパク質伝達 (Fawell らの(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:664-668)によって達成でき、タンパク質を B 型肝炎ウィルスのプレ S2 ドメインからの細胞透過性モチーフに融合することによっても達成できる(Oess and Hildt (2000) Gene Ther. 7:750-758)。細菌、酵母菌または原核細胞からの該タンパク質の調製(調合)、産生および精製は、当業者に公知のものである。
【００２６】
本発明の追加実施例は、胚様体を形成するために幹細胞、望ましくは ES 細胞および EG 細胞を凝集する方法に関するものである。胚様体は懸滴方法によって生成できる。例えば、400〜800 の ES 細胞、望ましくは 600 の ES 細胞は、20 μl のイスコーブ変法ダルベッコ培地(IMDM、Gibco)の液滴を利用し、リン酸基緩衝生理食塩水(PBS)を満たしたペトリ皿の蓋に配置した20% FCS、L-グルタミン、非必須アミノ酸および α-モノチオグリセリンで補足して培養する。胚様体は、2 日間 37 ℃で 5% の二酸化炭素で懸滴して培養した後に、細菌培養ペトリ皿(Greiner、Germany)に移し、懸濁培養液中でさらに3 日間インキュベートする。5 日間後、胚様体をゼラチン被覆した 24 個のウェルプレート、ペトリ皿またはその他の好適な培養容器上にプレーティングし、さらに 15〜35 日間 37℃で、5% の二酸化炭素を用いて培養する。. 胚様体はまた、攪拌培養によっても産生することができる。例えば、粘着性の幹細胞は、0,2% トリプシンおよび PBS 内の 0,05% EDTA (Life Technologies)を用いて、酵素的に解離し、密度 107 細胞/ml で、100 の培養培地を含んだ 250 ml のシリコン処理した攪拌フラスコ(Life テクノロジ)に播種する。24 時間後、150 ml 培養培地を最終容量 250 に加える。攪拌フラスコは、攪拌装置(Integra Biosciences)を用いて20 rpm にて攪拌する。該方法は当分野で周知あり、必要以上の実験無しに、工業製造用にスケールアップすることができるものである。
【００２７】
本発明の別の実施例では、胚様体を分化培地を含んでいるペトリ皿にプレーティングし、インスリン産生細胞に分化させるため、15〜50 日間、望ましくは 20〜25 日間分化させる(使用する細胞株による; R1 野生型の細胞は、Pdx-1+またはPax4+ 細胞に比べて、インシュリンまたはグルカゴン陽性を示す細胞を生成するためには、より長い分化期間を必要とする)。本発明の方法においては、インスリン産生細胞が高い比率で取得できる。15 日間の分化期間後、インスリン産生細胞の比率は、望ましくは 少なくとも 20%、より望ましくは少なくとも 40% および最も望ましくは 少なくとも 50% である。
【００２８】
インスリン産生細胞の比率は、ネスチン陽性細胞を選択することによってさらに増加することが可能である。この選択には、望ましくは胚様体、例えば懸滴方法による取得された胚様体の、懸濁培養液への伝達が含まれ、それに引き続く、好適な培地、例えばポリ L オリニチン/ラミニン被覆のプレート上へのプレーティングおよび(または)再プレーティングも含まれる。ネスチン選択手順を使用すると、インスリン産生細胞の比率を、例えば 70% 以上の比率に、さらに高めることが可能である。
【００２９】
本発明の別の実施例では、プラスミドで細胞を形質転換することによる、ES 細胞からインシュリン分泌細胞クローンを選択するための方法を用いて、分化されたインスリン産生細胞を分離および精製し、ヒトインシュリン遺伝子の調節領域の制御下で、ネオマイシン、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン耐性遺伝子の発現を可能にしている。細胞はまた、ヘキスト社製の 33342 色素で染色した後には、蛍光細胞分析分離装置(FACS)を用いてソートすることもできる(Goodell らの(1996) J. Exp. Med. 183:1797-1806)。本発明の上記の実施例のさらなる修飾は、本開示による必要以上の実験無しに、当業者によって容易に行われることができる。
【００３０】
本発明の追加実施例は、糖尿病を治療するための方法に関するものであり、その方法では、体重 1 キログラム当たりに 3000〜100,000 に相当する分化済インスリン産生細胞を、経皮的/経肝臓的なアプローチを介し、局所麻酔を用いて、糖尿病患者の門脈内に導入する。そのような外科的な技術は当分野で周知であり、のおよび必要以上の実験無しに実施できるものである。Pyzdrowski らの、"Preserved insulin secretion and insulin independence in recipients of islet autografts"  New England J. Medicine 327:220-226, 1992; Hering らの、"New protocol toward prevention of early human islet allograft failure" Transplantation Proc. 26:570-571, 1993; Shapiroらの」"Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen"、New England J. Medicine 343:230-238、2000 を参照。さらには、カプセル化技術もまた、Lanza らの "Encapsulated cell technology", Nature Biotech  14:1107-1111、1996 に記載されたように、分化されたインスリン産生細胞を移植するために使用することができる。
【００３１】
さらに、 本発明は、インシュリン産生、例えば上記の方法によって取得できるインスリン産生細胞株を示す、分化された幹細胞から成る細胞組成に関するものである。インスリン産生細胞は、β細胞の分化、特に上記の遺伝子に関与する上記の少なくとも 1 個の遺伝子の安定または一過性の発現を示すことが可能である。細胞は望ましくは、ヒト幹細胞からのヒト細胞であるほうがよい。治療用途の場合、患者の成体幹細胞からのヒト自家細胞の生成が特に好適である。
【００３２】
本発明のインスリン産生細胞は、天然β細胞に非常に似た特性を示す。特に、インスリン産生細胞対グルカゴン産生細胞の比は高い。15 日間の分化後、この比は、望ましくは少なくとも 2:1 とし、より望ましくは、少なくとも 5:1 とする。さらに、本発明の細胞は、グルコースに対して迅速な応答をする能力を持つ。27.7 mM のグルコースを追加後には、本発明の細胞においてインシュリン産生量が少なくとも 2 因数、望ましくは少なくとも 3 因数だけ促進する。さらに、本発明の細胞は、マウスへの移植後に血糖値を正常化する能力を持つ。
【００３３】
本発明の細胞組成は、望ましくは医薬的受容が可能な担体、希釈液 および(または) 補助剤と共に医薬組成物から成る。本医薬品組成物は、望ましくは糖尿病の治療に使用する。投与方法は望ましくは上記の移植法による。
【００３４】
さらなる実施例では、本発明は、β細胞の分化、インシュリン分泌またはグルコース応答性を促がす化合物を同定 および(または)特徴づけるために細胞の生成を可能にする。この方法は、診断目的、薬剤開発またはスクリーニングのための生体内試験に対して特に好適である。対象化合物を、適切な培養系、例えば 96 ウェルプレートや 384 ウェルプレートなどで発生・成長した分化済および未分化のインスリン産生細胞に加える。治療を受ける細胞におけるインシュリンのレベルは、酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)または放射免疫測定(RIA)によって定量化できる。この方法を使用して多数の化合物をスクリーニングすることができ、β細胞の分化を誘引し、インシュリン分泌を高める化合物を容易に同定できる。
【００３５】
ハイスループット スクリーニングの検証方法と培地量の検証方法に対する好適な実施例を図に記載した。 11. ハイスループット スクリーニング法における細胞の形質転換は、β細胞分化、例えば上記の遺伝子のプロモーター、望ましくは Pax4 プロモーターに関与する遺伝子のプロモーターの調節制御下で、DNA 構成物、例えば lacZ 遺伝子または GFP 遺伝子のようなレポーター遺伝子を含むウィルスベクターまたは非ウイルス性のベクターを用いて行う。形質転換した細胞は、アリコートに分割し、各アリコートは試験物質、例えば候補 1、候補 2 および候補 3 と接触せしめる。レポーター遺伝子の活性は、β細胞分化を誘引する試験化合物能力に対応する。
【００３６】
さらなる実施例では (この実施例は上記のハイスループット スクリーニングと合体し得る)、培地量の検証を実行した。その検証では、試験化合物を培養幹細胞に加え、インシュリン産生量を確定した。初期のハイスループット アッセイ、例えば上記に概説した細胞ベースのアッセイ(例: Pax4 プロモーターが β細胞再生のマーカーとして使用される場合)に続いて、β細胞分化を誘引する候補分子の活性を、胚様体の培養培地に当該化合物を加えたものから成る検証アッセイでテストした。次に、インスリン産生細胞への分化を、化合物の有効性を査定するために、例えば野生型および(または) Pax4 発現 ES 細胞に比較して、評価した。
【００３７】
実施例
本発明のより良い理解およびその多くのメリットは、図示によって示された次の実施例から明らかであろう。
【００３８】
実施例 1: Pdx1 遺伝子または Pax6 遺伝子を発現する ES 細胞の生成
マウス R1 ES 細胞(Nagy らの(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 90:8424-8) を、CMV プロモーター 制御下で(図１を参照)、Pax6 または Pdx1 遺伝子を用いて電気穿孔し、またホスホグリセリン酸 キナーゼ I プロモーター(pGK-1)の制御下で、ネオマイシン耐性遺伝子を用いて電気穿孔した。ES 細胞は、4.5 g/l グルコース、10−４M β−メルカプトエタノール、2nM グルタミン、1% 非必須アミノ酸、1 nM ピルビン酸ナトリウム、15% FCSおよび500 U/ml 白血病抑制因子(LIF)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Life Technologies)で培養する 。つまり、およそ 107 の ES 細胞25 μg/ml の直線化された発現ベクターを含む 0.8 ml リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中において再懸濁し、電気穿孔遺伝子導入装置(BioRad)を用いて、1 パルスの 500 μF および250 ボルトで室温にて電気穿孔する。電気穿孔の 5 分後、ES 細胞を、3 時間の100 μg/ml マイトマイシン C による処理で先に不活化した線維芽細胞の支持細胞 を含む 8.5 cm ペトリ皿にプレーティングする。電気穿孔の1 日後、培養培地は 450 μg/ml G418 を含む培地に変化する。耐性クローンを個別に分離し、選択培地に適用後、14 日間培養する。細胞は、常に 37℃de、5% の二酸化炭素を用いて培養する。
【００３９】
実施例 2: ES 細胞のインスリン産生細胞への分化
発現Pdx1 (Pdx1+)を構成的に発現する ES 細胞株 R1 (野生型、wt)およびES 細胞を、胚様体(EB; EBs)として、懸滴方法 (図２)によって培養した。つまり、およそ 600 個の細胞を、イスコーブ変法ダルベッコ培地 (IMDM、Gibco)から構成されている 20 μl 培地の液滴を利用し、20% FCS、L グルタミン、非必須アミノ酸および α モノチオグリセリン (Sigma、Steinheim、Germany; 最終濃度 450 μM)で補足した。液滴をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)で満たしたペトリ皿の蓋上に落とした。EBs を懸滴培養中で 2 日間形成せしめた後、細菌培養用のペトリ皿(Greiner、Germany)中の懸濁培養液に移し 3 日間移植した。5 日目に、EBs を、ゼラチン被覆した 24 個のウェルプレート上に個別にプレーティングした。 ここでの当該ウェルプレートには、イスコーブ変法ダルベッコ培地 (IMDM、Gibco)をベースに調整して、20% FCS、2mM L グルタミン、1:100 非必須アミノ酸、450 μM α−モノチオグリセリン (Sigma)、10 ng/ml 上皮成長因子 (EGF、R&D Research)、2 ng/ml (基本)線維芽細胞成長因子(bFGF、R&D Research)、20 nM プロゲステロン (R&D Research)、100 ng/ml ヒト成長ホルモン (HGH、R&D Systems)および 5 nM フリスタチン (R&D Systems) および(または) 2nM ヒト アクチビン A (R& D Systems)で補足した分化培地が含まれる。細胞を15〜40 日間、分化培地中で培養した。分化能力を促進するには、EB プレーティング後 5〜20 日間の段階で、末端分化培地を適用する。
【００４０】
実施例 3分化済 ES 細胞におけるホルモン発現
インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチンおよび膵臓ポリペプチド(PP)の発現は、分化された野生型細胞およびPdx1+ ES 細胞において、蛍光抗体法によって検証した。蛍光抗体法は、標準 プロトコル(Wobus らの: In Vitro Differentiation of Embryonic Stem Cells and Analysis of Cellular Phenotypes, In: Tymms, M.J. and Kola, I. (Eds.) Gene Knockout Protocols, vol. 158, Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2001 を参照)に従って実施した。つまり、分化された野生型細胞またはPdx1+ ES 細胞は、カバーガラス上で成長し、PBS で 2 回リンスし、メタノール 7、アセトン 3 の比率で、-20℃ にて10 分間固定する。次の抗体を使用した: マウスの抗インスリン(Sigma-Aldrich Co.)、ウサギの抗グルカゴン(Dako Corporation)、ウサギの抗ソマトスタチン(Dako Corporation)、ウサギの抗PP(Dako Corporation)は一次抗体として使用する一方、フルオレッセイン(DTAF)抱合型ヤギ抗マウス IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)およびCy3TM抱合型ヤギ抗ウサギ IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)は第二抗体として使用した。この試験では、免疫二重染色を実施し、次の抗体ペアを使用した: 抗インスリンおよび抗グルカゴン; 抗インスリンおよび抗ソマトスタチン; 抗インスリンおよび抗PP。細胞は、蛍光顕微鏡 Optiphot-2(Nikon)および共焦点レーザー顕微鏡(CLSM) LSM-410(Carl Zeiss)を用いて分析した。分化された野生型 ES 細胞はインシュリン、グルカゴン、PP、およびソマトスタチンを共発現し、細胞が単一ホルモン産生細胞に成熟にしていないことを示している。ところが、分化された Pdx1+ 細胞は、個別にインシュリンまたはグルカゴンのいずれかを発現するが、両方のホルモンを同一細胞で発現するのは稀であり、該細胞が単一ホルモン産生細胞への成熟を達成することを実証している。Pdx1+ ES 細胞を分化培地(図３を参照)で培養する場合は、ホルモン産生細胞の数がより多く、膵臓の発生調節遺伝子が幹細胞(例えばES)において発現する場合、および該細胞を分化培地において培養する場合には、インスリン産生細胞への分化がより効率的であることを示している。
【００４１】
実施例 4: ES 細胞のインスリン産生細胞への分化後の膵臓特定遺伝子の発現
膵臓特定遺伝子の発現レベルを半定量的 RT-PCR分析によって測定した。分化された野生型細胞、Pdx-1+ 細胞およびPax4+ 細胞を胚様体(5d)形成後収集し、プレーティングの 2、7、10、15、21および24 日間(5+2d、+7d、+10d、+15d、+21d、+ 24d)後、溶解緩衝液(4 M guanidinium thiocyanate(チオシアン酸グアニジニアム)、25 mM クエン酸ナトリウム、pH 7; 0.5% サルコシル、0.1 M β メルカプトエタノール)において懸濁した。全 RNA を ChomczynskiおよびSacchi によって記載された一段階抽出法によって分離した(Chomczynski および Sacchi(1987) Anal. Biochem. 162: 156-159)。mRNA は、PolyT テイル プライマー オリゴ d(T)16(PerkinElmer)を用いて逆転写し、結果として得られた cDNA はオリゴヌクレオチド プライマーを用いて増幅した。当該プライマーは、下記の遺伝子の転写物に相補的および同一である: GLUT2(配列識別番号 9 および10; アニーリング温度 60℃、40 サイクル、期待断片サイズ 556 bp)、インシュリン(配列識別番号 11 および 12; アニーリング温度: 60℃、40 サイクル、期待断片サイズ 340 bp)、ngn-3 (配列識別番号 13 および 14; アニーリング温度: 60℃、40 サイクル、期待断片サイズ 514 bp)、Pdx-1 (配列識別番号 15 および 16; アニーリング温度: 60℃、45 サイクル、期待断片サイズ 230 bp)および Isl1 (配列識別番号 17 および 18; アニーリング温度: 60℃、40 サイクル、期待断片サイズ 514 bp)。ハウスキーピング遺伝子 β チューブリン(配列識別番号 19 および 20、アニーリング温度: 60℃、28 サイクル、期待断片サイズ 317 bp)を内部標準として使用した。逆転写(RT)は、MuLV 逆転写酵素(Perkin Elmer)を用いて実施した。多発性 PCRsは、AmpliTaq DNA ポリメラーゼ(Perkin Elmer)を用いてWobus ら、1997 に記載されたように実行した。つまり、RT 反応(20 μl) をMuLV 逆転写酵素を用いて実施した。分析遺伝子のプライマーまたはハウスキーピング遺伝子 β チューブリンのプライマーを使用する個別の PCRs を、RT 生成物の 3 μl を用いて実行した。
【００４２】
Pax4 およびインシュリンをコードする遺伝子の mRNA レベルは、Dynalbeads mRNA DIRECT micro kit(Dynal)を製造者の指示に従って用いて分析した。
【００４３】
各 PCR 法反応の三分の一を、電気泳動によって、 0.35 μg/ml の臭化エチジウムを含む 2% アガロース(電気泳動担体) ゲル上で分離した。ゲルを UV 光で照射し、ゲルの臭化エチジウム蛍光シグナルを E.A.S.Y. システム(Herolab)によって保管し、TINA2.08e ソフトウェア(Raytest Isotopenmessgeraete GmbH)によって分析した。臭化エチジウム蛍光シグナルの強度は、各ピークの曲線下にある領域から決定し、標的遺伝子のデータを、ハウスキーピング遺伝子 β チューブリンの発現に関連したパーセントの変化としてプロットした。
【００４４】
結果は、β細胞分化機能(作用)のためのマーカーが、Pdx1＋およびPax4＋分化済 ES 細胞においては、分化済の野生型 ES 細胞における場合よりも、より高いレベルで発現したことを示し、that of a 膵臓の発生調節遺伝子の活性化が、野生型 ES 細胞に対する場合と比べて、より効率的に分化を与えることを実証している(図４)。分化された幹細胞における GLUT2 の発現は、ホルモン産生細胞がグルコースに応答する能力のあることを示す。加えて、初期の内胚葉/膵臓前駆物質細胞の特異化、例えば、ngn3 および Isl1 などに関与する遺伝子は、生体内データと一致するように Pdx-1＋および Pax4＋ES 細胞内で下方制御しており、該細胞が単一ホルモン産生細胞に成熟していることを示す。
【００４５】
実施例 5: Pdx1 および Pax4 を発現する分化済 ES 細胞のホルモン発現
生体外 β細胞分化を誘引する膵臓の発生調節の潜在能力を研究するため、本発明者らは、サイトメガロウイルス(CMV) 初期 プロモーター/エンハンサー 領域の制御下で、Pax4 または Pdx1 遺伝子を発現する、安定したマウス胚幹(ES)細胞を生成した(図１の a、b を参照)。CMV-Pax4 および CMV-Pdx1 導入遺伝子は、電気穿孔法によってES 細胞 に導入した。本方法は当分野で公知であり、例えば Joyner の、"Gene Targeting: A Practical Approach", Oxford University Press, New York, 1993; Mansouri "Gene Targeting by Homologous Recombination in Embryonic Stem Cell", Cell Biology: A Laboratory Handbook, second ed., Academic Press, 1998 を参照。次に、Pax4、Pdx1 および野生型 ES 細胞を、その形成が可能となるように、懸滴または攪拌培養胚様体を用いて培養した。引き続いて、胚様体をプレーティングして、さまざまな成長因子を含む分化培地において培養した。該条件下では、 プレーティングの 6 日後に細胞 を発現する Pdx1 および Pax4 においてインスリン産生細胞を検出することができる(図５)。比較すると、野生型 ES 細胞には、同一段階でインスリン産生細胞が含まれていなかった。プレーティングの 10 日後、細胞を発現する Pdx1 および Pax4 の 12% がインシュリンに対して陽性反応を示した一方、最初のインスリン産生細胞は、野生型 ES 細胞において観察された。プレーティング 15 日目で、最大で 60% の Pax4 ES 細胞がインシュリンに対して陽性反応を示した。それと比較して、Pdx1 ES 細胞の場合は 22%、および野生型 ES 細胞の場合は 6% であった。これらのデータは、Pax4、そしてある程度までは Pdx1 が、ES 細胞のインスリン産生細胞への分化を、野生型 ES 細胞と比較して、有意に促進および増強することを実証する。
【００４６】
Pax4 の発現はまた、インスリン産生細胞の分化状態に影響する。. 胚形成中には、成長する膵臓に発生する最初のホルモン産生細胞は、インシュリンおよびグルカゴンの両方を共発現する。これらの細胞は引き続いて分化し、単一ホルモン産生細胞に成熟する。類似の様式で、野生型 ES 細胞からのすべてのインスリン産生細胞は、グルカゴンを共発現し、分化細胞が早期の段階で抑止されることを示唆している(図６)。インシュリンおよびグルカゴンは、生物体の血糖値に逆の効果を有していることから、該細胞には治療学的な価値はほとんどない可能性が高いといえる。ところが Pax4 ES 細胞においては、単一インスリン産生細胞が相当量で生成される(図６)。細胞を共発現するインスリン・グルカゴンは少量で検出され、培養内で分化過程が進行中で可能性が高いことを示す。この観察は、Pax4 が、野生型 ES 細胞で観察される細胞よりもより成熟しているインスリン産生細胞の分化を誘発し、促進することを実証している。
【００４７】
実施例 6: 分化されたインスリン産生細胞の機能的特徴づけ
β細胞の重要な特質の 1 つは、グルコース インシュリン分泌応答である。Pax4 からのインスリン産生細胞が、このグルコース応答特質を備えているかどうかをテストするため、生体外グルコース応答アッセイを分化細胞上で実施した。つまり、10〜14 の胚様体を、上記の分化培地が含まれる 3 cm ペトリ皿で培養した。アッセイ日に、分化培地を除去し、細胞を 3 回、クレブスリンガー重炭酸塩バッファー(KRBH; 118 mM NaCl、4.7 KCl、2.5 mM CaCl２、1,2 mM KH２PO４、1.2 mM MgSO４、24.6 NaHCO３、10 mM Hepes、2 mg/ml BSA)を用いて洗浄した。次には、細胞を 750 μl KRBH 中で 45 分間 37℃でインキュベートした。KRBH は次に、基礎インスリン分泌の測定のために保持し、27.7 mM グルコースを含む 750 μl KRBHを細胞に加えた。15分間の 37℃ でのインキュベーション後、KRBH を、グルコース刺激インシュリン分泌の測定のため、細胞から除去したインシュリンのレベルの、マウスのインシュリン(Mercodia)用の酵素免疫測定(吸着)法(ELISA)による確定は、製造者の推奨に従って実施した。適切なインシュリン開放のための代替培地は、1 g/l(Gibco)のグルコース濃度を用い、非必須アミノ酸(Gibco 社、保存溶液 1:100)および上述した追加要素で補足したDMEM に基づいた培地である。該培地は、細胞を使用する 1〜6 日間前に適用することができる。
【００４８】
野生型および Pax4 ES の両方からのインスリン産生細胞をグルコース不在で培養する場合には、基本インシュリン分泌が認められる(図７)。ところが、Pax4 ES からのインスリン産生細胞のみが、グルコース刺激作用に応答するグルコースの存在下では、Pax4 ES からのインスリン産生細胞において、5 倍のインシュリン分泌増加が見られた。野生型 ES からのインスリン産生細胞はグルコースに応答しない。
【００４９】
実施例 7: STZ 糖尿病マウスにおける Pax4 ES からのインスリン産生細胞の移植
糖尿病を改善および治療するための Pax4 ES からのインスリン産生細胞の治療の可能性を、ストレプトゾトシン誘導の糖尿病マウスに該細胞を移植することによって検討した。ストレプトゾトシンは、ある投与量で投与された場合、β細胞にとって細胞毒性の抗生物質である。(Rodrigues らの: Streptozotocin-induced diabetes, in McNeill (ed) Experimental Models of Diabetes, CRC Press LLC, 1999 を参照)。その効果は急速であり、48 時間以内に重度な糖尿病を動物に与える。
【００５０】
非絶食のオス C マウスを 170 mg/体重 Kg  STZ で治療した。該条件下では、17 匹の制御マウスが STZ 治療の 6 日後に高血糖を発生した。マウスが 3 日間連続で 10 mMol/l 以上の血糖値を有する場合には、糖尿病と考慮する。1 匹のマウスは STZ 治療に応答しなかった。高血糖値は、各動物と各日によって著しく変化した。該動物はその血糖を調節をできないので、これは糖尿病の示唆であるといえる。細胞は、動物の腎臓嚢下の脾臓に移植した。つまり、マウスは、15 μl/体重 g の アバチン(2,5% の3-ボロモエチル アルコール:三級アミル アルコール)の腹腔内注入によって麻酔した。腎臓および脾臓を腰部切開によって露出し、細胞は鈍い 30G 針を用いて各組織形質転換した。
【００５１】
細胞の腎臓嚢下の脾臓への移植を、STZ 治療の 24〜48 時間後に実施した。8 動物に、1 x 10６〜 5 x 10６Pax4 ES からのインスリン産生細胞を移植した。移植動物 8 匹のうち 4 匹が、外科手術の手順のために死んだ。生存した 4 匹の動物は、STZ 治療を受けた制御動物と比べて、いずれも糖尿病を発生しなかった(図８)。インスリン産生細胞の存在は、移植組織の免疫組織学的分析によって確認した。これらの結果は、移植細胞が糖尿病動物における血糖を正常化することを実証するものである。
【００５２】
実施例 8: ネスチン陽性細胞形成を支持する培養条件を用いた ES 細胞のインスリン産生細胞への分化
ネスチン陽性細胞の分化のため、胚様体(EBs; 図１０)を形成するために、マウス ES 細胞を 2 日間、懸滴(一滴当たり 100、200、または 400 細胞)で培養した。EBs を次に、細菌培養用のペトリ皿(Greiner、Germany)形質転換し、20% FCS を含む DMEM(IMDM; Gibco)のイスコーブ変法でさらに2 日間培養し、(Rohwedel らの(1998)、Dev. Biol. 201(2):167-184)に記載されたように補足したが、β メルカプトエタノールは 450 mM α モノチオグリセリン(Sigma、Steinheim、Germany)で置換した。4 日目に、20〜30 のEBs を組織培養皿(直径 6 cm)上にプレーティングし、20% FCS で補足した IMDM で 24 時間培養した。ネスチン陽性細胞の選択を、Okabe とその同僚(Okabe らの1996、Mech. Dev. 59:89-102)によって記載された方法に従って実行したが、次の修正を加えた: EBs の添加後(4+1 日目)、培地をダルベッコ変法イーグル培地ベースで調整した B1 培地と交換し: 栄養素混合物 F-12 (DMEM/F12、Life Technologies)を 5 mg/ml インシュリン、30 nM 亜セレン酸塩ナトリウム(両方とも Sigma 社より)、50 mg/ml トランスフェリン、および 5 mg/ml フィブロネクチン(両方とも Gibco 社より)で補足した。B1 培養培地は、48 時間毎に補充した。ネスチン陽性細胞は、7 日間(= 4+7d)の培養後に選択した。4+8 日目には、EBs を0.1% トリプシン(Gibco)/0.08% EDTA(Sigma)を用いて、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(1:1)で1 分間解離し、遠心分離によって収集し、ポリ-L-オルニチン/ラミニン被覆組織培養皿上で再プレーティングした。B2 培地を含み、DMEM/F12 ベースで調製し、10% FCS; 20 nM プロゲステロン; 100 mM プトレシン; 1 mg/ml ラミニン(すべて Sigma 社より); 25 mg/ml インシュリン; 50 mg/ml トランスフェリン; 30 nM 亜セレン酸塩ナトリウム; B27 補足; および 10 mM ニコチンアミドで補足した。この培地は 24 時間後に FCS に欠ける B2 培地で 置換した。プレーティング 30 日目で; 最大で 75% の Pax4 ES 細胞がインシュリンに対して陽性反応を示した。それと比較して、野生型 ES 細胞の場合は 6% であった。(図１１)。
【００５３】
本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことながら共通認識とする。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Pdx1、Pax4、Pax6、および ngn3 遺伝子を含む発現ベクターを示す略図。
【００５５】
Pdx1、Pax4、Pax6、および ngn3 (配列認識番号 1、2、3、4) cDNA を、Becker らによって先に記載された発現 ベクター pACCMV.pLpA に挿入した (Becker らの (1994) Meth. Cell Biol. 43:161-189)。つまり、サイトメガロウイルス(CMVp) プロモーターの制御下でPdx1 遺伝子を配置して、Pdx1 cDNA (配列認識番号1)を含んだ Kpn I-Bam HI 断片を pACCMV.pLpA の KpnI-BamHI 部位に導入した。同様に、CMV プロモーターの制御下で Pax4 遺伝子を配置して、Pax4 cDNA (配列識別番号 2) を含んだ Bam HI-Hind III 断片を pACCMV.pLpA の Bam HI-Hind III 部位に導入し; CMV プロモーターの制御下で、Pax6 遺伝子を配置して、Pax6 cDNA (配列識別番号3) を含む Bam HI-Hind III 断片を pACCMV.pLpA の Bam HI-Hind III 部位に導入し; およびCMV プロモーターの制御下で ngn3 遺伝子を配置して、ngn3 cDNA (配列認識番号 4) を含む Bam HI-Xba I を pACCMV.pLpA の Bam HI-Xba I 部位に導入した。略語: B は Bam HI; H は Hind III; K は Kpn I; X は Xba I; Ad 5 はアデノウイルス 5 型。
【００５６】
【図２】ＥS 細胞のインスリン産生細胞への分化を示す略図。
【００５７】
胚幹(ES)を発現する野生型細胞および Pdx1 細胞を、胚様体(EB; EBs)として懸滴方法によって培養した。分化および末端分化培地は、EBs をプレーティングする時点で加えた。
【００５８】
【図３】Pdx1+ 分化済 ES 細胞におけるホルモン産生細胞の量を示す線図。
【００５９】
正常な培養培地および分化培地において培養した Pdx1+ 胚様体のプレーティング後のインシュリン、グルカゴン、膵臓のポリペプチド(PP)およびソマトスタチン陽性を示す細胞の蛍光抗体法による観察。結果は、時間がたてば、ホルモン産生細胞の平均数を示す自由裁量の単位で、培養皿の領域を決定することを明らかにした。ホルモン産生細胞(インシュリン、グルカゴン、PP、およびソマトスタチン)の数は、胚様体が分化および末端分化培地で培養するときには、より多くなる。
【００６０】
【図４】野生型、Pdx1+、およびPax4+ ES 細胞のインスリン産生細胞への分化後の膵臓特定の遺伝子の発現を示す線図。
【００６１】
分化培地における懸滴方法およびプレーティングによる胚様体の形成後の膵臓特定の遺伝子の mRNA レベルインシュリンレベルと Glut2 レベルは、Pdx1+ 細胞および Pax4+ ES 細胞においては野生型 ES 細胞における場合よりも高く、膵臓の発生調節遺伝子が活性化されているときには、分化がより効率的であることを示している。
【００６２】
【図５】マウス ES 細胞のインスリン産生細胞への分化を示す線図。
【００６３】
インスリン産生細胞の比率は、プレーティング後 5、6、10、および15 日後に、野生型細胞(R1)、および Pdx1 発現細胞および Pax4 発現細胞において決定した。
【００６４】
【図６】インスリン産生細胞 対 グルカゴン産生細胞を示す線図。
【００６５】
野生型 ES 細胞、Pdx1 発現細胞および Pax4 発現細胞におけるインシュリンおよびグルカゴンの発現は、プレーティング後 5、10 または15 日後に決定した。
【００６６】
【図７】Pax4 ES 細胞からのインシュリン細胞のグルコース応答を示す線図。
【００６７】
野生型(R1)および Pax4 ES からのインスリン産生細胞のインシュリン分泌は、グルコースの不在下で、27.7 mM グルコースを用いた 15 分間の刺激作用後に決定した。
【００６８】
【図８】糖尿病マウスにおける血糖値の調節を示す線図。
【００６９】
糖尿病制御マウス(STZ 制御)および Pax4 ES 細胞からのインスリン産生細胞の移植を受けた糖尿病マウスの血糖値を決定した。
【００７０】
【図９】薬剤スクリーニング方法を示す略図。
【００７１】
3 つの試験化合物に対するハイスループット スクリーニングおよび培地量の検証方法を示した。最初のハイスループット スクリーニングは、細胞アッセイにおいて、β細胞分化に対するレポーターとしてPax プロモーターを用いて実施する。陽性を示した候補化合物は次に培地量アッセイにおいて胚様体を用いて検証する。化合物は、培養過程の異なる段階でインスリン産生細胞の形成誘引する潜在能力をテストする。
【００７２】
【図１０】ネスチン陽性細胞形成を支持する培養条件を用いた ES 細胞のインスリン産生細胞への分化方法を示す略図。
【００７３】
【図１１】ネスチン陽性マウス ES 細胞のインスリン産生細胞への分化を示す略図。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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