(57)【要約】微生物を利用するＬ−スレオニンの製造方法を提供する。この方法において、微生物の染色体ＤＮＡの特定部位に、元来存在するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子およびスレオニンオペロンに加え、ｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンの各々１若しくは複数のコピーが組み込まれている。したがって、２以上のコピーのｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンが染色体ＤＮＡに組み込まれることによって、ホスホエノールピルビン酸からスレオニン生合成の前駆体であるオキザロ酢酸に転換する酵素をエンコードするｐｐｃ遺伝子およびオキザロ酢酸からスレオニンを合成する経路に関わる酵素をエンコードする遺伝子（ｔｈｒＡ：ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅＩ−ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｔｈｒＢ：ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ｔｈｒＣ：ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現量を増加させることができ、Ｌ−スレオニンの生産性を飛躍的に向上させることができる。
2004518439.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を利用するＬ−スレオニンの製造方法であって、該微生物の染色体ＤＮＡの特定部位に元来存在するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子およびスレオニンオペロンに加え、ｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンの各々１若しくは複数コピーが挿入された、Ｌ−スレオニンの製造方法。
【請求項２】
該微生物が大腸菌であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
挿入されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子およびスレオニンオペロンは、スレオニン類似体、リジン類似体、イソロイシン類似体およびメチオニン類似体に対して耐性の微生物に由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
挿入されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子およびスレオニンオペロンの挿入部位が、染色体ＤＮＡ中のｌａｃＺ部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｌ−スレオニン生産菌株である、受託番号ＫＦＣＣ１０７１８の大腸菌ＴＦ４０７６の染色体からポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって得たホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子および該大腸菌株からクローニングされたスレオニンオペロンが、母菌株であるＴＦ４０７６の染色体に挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該微生物が図２に示された組換えプラスミドｐＧｍＴＮ−ＰＰＣにより構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｌ−スレオニンを生産できる、受託番号ＫＣＣＭ１０２３６の大腸菌ｐＧｍＴＮ−ＰＰＣ１２。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は微生物を利用するＬ−スレオニンの製造方法に関する。より詳細には、該微生物の染色体ＤＮＡの特定部位に、元来存在するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子およびスレオニンオペロンに加え、ｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンの各々１若しくは複数のコピーを挿入することによって、ホスホエノールピルビン酸からスレオニン生合成の前駆体であるオキザロ酢酸に転換する酵素をエンコードするｐｐｃ遺伝子およびオキザロ酢酸からスレオニンを合成する経路に関わる酵素をエンコードする遺伝子（ｔｈｒＡ：ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅＩ−ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ｔｈｒＢ：ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ｔｈｒＣ：ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の発現量を増加させ、Ｌ−スレオニンを高収率で得る、Ｌ−スレオニンの製造方法に関する。
【０００２】
従来技術
Ｌ−スレオニンは必須アミノ酸の一種として飼料及び食品の添加剤として広く使われ、医薬用には水液剤あるいは医薬品の合成原料として用いられる。Ｌ−スレオニンは醗酵法で製造するが、大腸菌、コリネバクテリウム、セラチア、プロビデンシア菌株の野生株由来の人工変異株が使用されている。このような変異株としては、アミノ酸類似体耐性および薬剤耐性の変異株にジアミノピメリン酸、メチオニン、リジン、イソロイシン栄養要求性を付与した人工変異株が知られている（特公平２−２１９５８２号、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９．５５０−５５３（１９８８），韓国特許公告第９２−８３６５号）。
【０００３】
一般に、特定遺伝子の発現量を高める方法としては、プラスミドを使用し、微生物あたりのコピー数を増加させることで、ある微生物が有する遺伝子の数を増加させるという方法が用いられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２版，１９８９，１．３〜１．５）。プラスミドに所望の遺伝子を挿入し、このような組換えプラスミドを再び微生物に形質転換することによって、１つの微生物当りそのプラスミドのコピー数だけ遺伝子を増やす効果を期待できる。この方法でスレオニンの生産性向上を試みて部分的に成功したという報告がある（米国特許５，５３８，８７３号）。
【０００４】
しかしながら、このようなプラスミドを利用した技術は、大部分の場合において特定遺伝子だけを過度に発現させることによって宿主微生物に大きな負担として作用し、組換え菌株の培養中にプラスミドを消失するなどプラスミドの安定性に問題が生じる。
【０００５】
この問題を解決するために、培養液中に抗生物質を添加するか、発現調節プラスミドを使用する方法が開発された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，２版、１９８９，１．５〜１．６，１．９〜１．１１）。発現調節プラスミドを使用する方法では、増殖期には遺伝子が発現しない条件で培養して宿主微生物への負担を減らし、微生物が十分に増殖した後に一時的に発現を誘導することによって目的物を得ることができる。しかし、このような発現調節プラスミドを使用する方法の大部分は蛋白質が最終目的物である。目的物が１次代謝産物である場合には、微生物の増殖と密接な関連があるため、増殖期に目的遺伝子を発現させずに１次代謝産物の収率を増加させることは困難である。１次代謝産物の一種であるスレオニンの場合も同様である。
【０００６】
このような短所を補完するため、スレオニン製造のためにスレオニン生合成関連遺伝子を染色体ＤＮＡ中に挿入する方法が利用された（米国特許５，９３９，３０７号）。しかし、この場合はプロモーターを誘導プロモーターに交換した遺伝子を染色体中に存在する同じ遺伝子と置換する方法を利用しているために、スレオニンオペロン遺伝子の画期的な発現量の増加を期待できなかった。
【０００７】
本発明者らは、従来の置換方法とは異なり、宿主微生物の染色体の中に元来存在する遺伝子に加えてｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンを染色体ＤＮＡ中の特定部位（ｌａｃＺ遺伝子部位）に挿入することによって、元来宿主微生物が有している遺伝子の作用に加え、染色体に挿入されたｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンの遺伝子の作用を活用できるという利点を発見し、本発明を完成するに至った。従来の遺伝子工学的な方法によるスレオニン収率を向上させるための研究は、主にオキザロ酢酸からスレオニンまでの生合成経路にだけ集中していた。しかし、本発明ではそれらの酵素に加え、その前段階に作用してオキザロ酢酸を誘導する酵素であるｐｐｃ酵素までも含めることによって、ホスホエノールピルビン酸からの炭素の流れを故意にオキザロ酢酸経路へと誘導している。また本発明は、必要であれば２以上の遺伝子の挿入も可能である。
【０００８】
発明の開示
前記課題を解決するために、本発明の目的は、プラスミドを使用した遺伝子組換え菌株の短所として指摘されているプラスミドの不安定性及び菌株の生育の阻害を解決すると同時に、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子およびスレオニンオペロン遺伝子の発現を増加させることを特徴とする、高収率のＬ−スレオニンの製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の目的は、微生物を利用するＬ−スレオニンの製造方法であって、該微生物の染色体ＤＮＡの特定部位に、元来存在するｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンに加え、ｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンの各々１若しくは複数のコピーを挿入された、Ｌ−スレオニンの製造方法により達成される。
【００１０】
本発明によれば、２以上のコピーのｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンを染色体ＤＮＡに組み込むことによって、ホスホエノールピルビン酸からスレオニン生合成の前駆体であるオキザロ酢酸に転換する酵素をエンコードするｐｐｃ遺伝子およびオキザロ酢酸からスレオニンを合成する経路に関わる酵素、ｔｈｒＡ（ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅＩ−ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｔｈｒＢ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、ｔｈｒＣ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の遺伝子の発現量を増加させ、Ｌ−スレオニンを高収率で得ることができる。
【００１１】
本発明によれば、大腸菌、コリネバクテリウム、セラチア、プロビデンシア菌株のようにＬ−スレオニンを生産できるいかなる菌株も用いることが可能であるが、大腸菌であることがより好ましい。
【００１２】
微生物に追加で挿入されるｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンは、スレオニン類似体、リジン類似体、イソロイシン類似体およびメチオニン類似体に対して耐性の微生物（人工変異株）由来のものであることが好ましい。
【００１３】
本発明によれば、ｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンは、染色体ＤＮＡ中の、元来のスレオニンオペロン以外のいかなる部位にも追加で挿入されうるが、ｌａｃＺ部位に挿入されることが好ましい。
【００１４】
本発明に係るＬ−スレオニンの製造方法においては、Ｌ−スレオニン生産菌株である、大腸菌ＴＦ４０７６（受託番号：ＫＦＣＣ１０７１８）の染色体から、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって得たｐｐｃ遺伝子、および該染色体からクローニングされたスレオニンオペロンが、母菌株である大腸菌ＴＦ４０７６の染色体に挿入されることが好ましい。
【００１５】
１．スレオニンオペロンおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子
スレオニンオペロンおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子は、ＴＦ４０７５（受託番号Ｋ：ＦＣＣ１０７１８、大韓民国特許出願第９０−２２９６５号）の染色体からクローニングされたものを使用した。この菌株はメチオニン要求性およびスレオニン類似体（ＡＨＶ：α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸）、リジン類似体（ＡＥＣ：Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン）、イソロイシン類似体（α−アミノ酪酸）およびメチオニン類似体（エチオニン）に対する耐性を有している。
【００１６】
２．組み込み用ベクター
染色体組み込みのためのプラスミドベクターにはｐＢＲＩＮＴ−ＴｓＧｍを使用した（Ｓｙｌｖｉｅ Ｌｅ Ｂｅａｔｒｉｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），ｐＢＲＩＮＴ−Ｔｓ：ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃｏｎ，ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｌａｃＺ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．，Ｇｅｎｅ．，２２３，２１３−２１９．）。このベクターは温度感受性を有しており、３７℃で培養すればプラスミドにクローニングされた遺伝子が染色体ＤＮＡのｌａｃＺ遺伝子部位に組み込まれ、温度を４４℃に上げると細胞質中に残留しているプラスミドは消失する。
【００１７】
３．組換えベクター
ＴＦ４０７６の染色体からポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によって得たｐｐｃ遺伝子と、スレオニンオペロンでクローニングされたベクターｐＡＴ９４（韓国特許出願９２−２４７３２号）由来のスレオニンオペロンとをｐＢＲＩＮＴ−ＴｓＧｍのＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位にクローニングして組換えプラスミドベクターｐＧｍＴＮ−ＰＰＣを作製した。このプラスミドベクターを用いてＴＦ４０７６系を形質転換させた後、３７℃で培養し、クローニングされたｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンが染色体ＤＮＡのｌａｃＺ遺伝子部位へ組み込まれるのを誘導した。その後、宿主母菌株中に残留しているプラスミドを除去するために、４４℃で培養を継続した。
【００１８】
４．選別方法
ゲンタマイシンに対する耐性およびカルベニシリンに対する感受性を有し、さらにＸ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含む固体培地上で青色ではなく白色のコロニーを、組換え菌株として選別した。この選別方法は、染色体ＤＮＡのｌａｃＺ遺伝子にｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンが挿入されると、ｌａｃＺ遺伝子が不活性化され、発色剤であるＸ−ｇａｌを分解する能力を失ってしまうという原理に基づいている。
【００１９】
このようにして選別された組換え株のスレオニンの生産性を母菌株と比較した。その結果、母菌株は４８時間に２０ｇ／Ｌを生産したのに対し、染色体ＤＮＡにｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンが組み込まれた組換え菌株の一つである菌株ｐＧｍＴＮ−ＰＰＣ（受託番号：ＫＣＣＭ−１０２３６）では、収率が約３５％で２７．０ｇ／Ｌと最も高いスレオニン生産性を示した（実施例４参照）。またこの菌株は、５−Ｌ醗酵槽での醗酵では１０２ｇ／Ｌのスレオニンを生産し、母菌株と比較して３５．４％と高い収率を示した（実施例５参照）。
【００２０】
発明を実施するための最良の態様
以下、実施例をあげて本発明をより具体的に説明する。以下の実施例は例示することが目的であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２１】
実施例１：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子のクローニング過程を図１に示す。このｐｐｃ遺伝子はスレオニン生産菌株であるＴＦ４０７６から得た。染色体ＤＮＡを分離して制限酵素ＳａｌＩで切断した後、電気泳動して４−５ｋｂのＤＮＡ断片を選択的に単離した。単離したＤＮＡ断片をテンプレートとして、プライマー１（５’−ａｇｇａａｔｔｃｔｔｃｃｇｃａｇｃａｔｔｔｇａｃｇｔｃａｃ−３’）およびプライマー２（５’−ａｇｇａａｇｃｔｔｔｔａｇｃｃｇｇｔａｔｔａｃｇｃａｔａｃｃ−３’）を用いてｐｐｃ遺伝子を増幅した。増幅産物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して、再び電気泳動により最終的に２．８ｋｂのｐｐｃ遺伝子断片を単離した。クローニングには、メキシコ国立大学より入手したｐＢＲＩＮＴ−Ｔｓ系列のベクターである、７．６ｋｂのｐＢＲＩＮＴ−ＴｓＧｍを使用した（Ｓｙｌｖｉｅ Ｌｅ Ｂｅａｔｒｉｚ等（１９９８），ｐＢＲＩＮＴ−Ｔｓ：ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃｏｎ，ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｌａｃＺ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．，Ｇｅｎｅ．，２２３，２１３−２１９．）。ｐＢＲＩＮＴ−ＴｓＧｍも同じ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより二重切断し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて単離したＤＮＡと接合した。このＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５αを電場衝撃法により形質転換し、抗生物質としてカルベニシリンを５０ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシンを５ｍｇ／Ｌになるように含んだＬＢ固体培地（酵母エキス５ｇ／Ｌ、バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、バクトアガー１．７％、ｐＨ７．０）で培養した。次いで単一コロニーを回収した。この単一コロニーを同じ抗生物質を含むＬＢ培地で培養し、増殖した菌株からプラスミドを単離した。これらのプラスミドのサイズをまず確認し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて二重切断し、２．８ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を用いて、ｐｐｃ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＧｍＰＰＣ（１０．７ｋｂ）を完成させた。
【００２２】
実施例２：スレオニンオペロンおよびｐｐｃ遺伝子を含有した染色体ＤＮＡ組み込み用ベクター
スレオニンオペロンにはＴＦ４０７６の染色体ＤＮＡからクローニングにより作製された組換えプラスミドベクターｐＡＴ９４（韓国特許出願第９２−２４７３２号）を使用し、また、ｐｐｃ遺伝子には実施例１の組換えプラスミドｐＧｍＰＰＣを使用した。染色体ＤＮＡ組み込み用ベクターにはメキシコ国立大学より入手したｐＢＲＩＮＴ−Ｔｓ系列のベクターであるｐＢＲＩＮＴ−ＴｓＧｍを使用した（Ｓｙｌｖｉｅ Ｌｅ Ｂｅａｔｒｉｚ等（１９９８），ｐＢＲＩＮＴ−Ｔｓ：ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈ ａ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｐｌｉｃｏｎ，ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｌａｃＺ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｇｅｎｅ．２２３，２１３−２１９．）。組換えプラスミドの作製過程を図２に示す。ｐＡＴ９４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで二重切断し、この二重切断によって分離された６．４ｋｂのスレオニンオペロンＤＮＡ断片を電気泳動により単離した。ｐＧｍＰＰＣをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで二重切断して２．８ｋｂのｐｐｃ遺伝子断片を単離した。ｐＢＲＩＮＴ−ＴｓＧｍプラスミドベクターをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、完全に切断されたＤＮＡ断片を同様の方法で単離した。切断されたプラスミドベクター、単離されたスレオニンオペロンＤＮＡ断片およびｐｐｃ遺伝子断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて接合した。大腸菌株ＤＨ５αをこの接合産物を用いて電場衝撃法により形質転換し、抗生物質としてカルベニシリンを５０ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシンを５ｍｇ／Ｌになるように含んだＬＢ固体培地（酵母エキス５ｇ／Ｌ、バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、バクトアガー１．７％、ｐＨ７．０）で培養した。次いで単一コロニーを単離した。単離した単一コロニーを同じ抗生物質を含むＬＢ培地で培養し、増殖した菌株からプラスミドを回収した。これらのプラスミドのサイズをまず確認し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて二重切断して、９．２ｋｂおよび７．９ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を用いて、スレオニンオペロンおよびｐｐｃ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＧｍＴＮ−ＰＰＣ（１７．１ｋｂ）を完成させた。
【００２３】
実施例３：組換えプラスミドの染色体組み込み菌株の選別
大腸菌株ＤＨ５αから回収した組換えプラスミドｐＧｍＴＮ−ＰＰＣを用いて、スレオニン生産菌株であるＴＦ４０７６を形質転換し、５ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含むＬＢ固体培地（酵母エキス５ｇ／Ｌ、バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、バクトアガー１．７％、ｐＨ７．０）において３０℃で６０時間培養した。単一コロニーを０．５ｍＬのＬＢ培地に接種して３０℃で４時間培養した。培養液の一部を１０ｍＬのＬＢ培地に移して３０℃で６時間培養した後、３７℃で一晩培養した。この培養液を１０−３〜１０−６に希釈して５ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含むＬＢ固体培地に塗抹した。同時に、ＩＰＴＧ（０．１Ｍ）１２（ｌおよびＸ−ｇａｌ（２％）６０（ｌもＬＢ固体培地に塗抹した。４４℃で２４時間培養した後、１５ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含むＬＢ固体培地で増殖できない、カルベニシリン感受性の白いコロニーを組換え菌株として選別した。選別された組換え菌株には所望のプラスミドが含まれていること、各菌株の染色体ＤＮＡのｌａｃＺ遺伝子部位にはｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンが組み込まれていることを確認した。
【００２４】
実施例４：フラスコ培養における組換え菌株のスレオニン生産性の比較
組換えプラスミドが染色体に組み込まれた組換え菌株の単一コロニー３０株を選別し、スレオニン力価培地を用いて、三角フラスコ中でスレオニンの生産性を比較した。ここで用いたスレオニン力価培地の組成を表１に示す。各コロニーはＬＢ固体培地上３２℃培養器で一晩培養した。２０ｍＬの力価培地にそれぞれの培養液を１ループずつ接種し、３２℃、２５０ｒｐｍで４８時間培養した。この試験結果を表２に示す。母菌株のＴＦ３０７６は２０ｇ／Ｌのスレオニンを生産したのと比較して、組換え菌株は３０コロニー全てが良好な生産性を示し、８コロニーは２６ｇ／Ｌ以上のスレオニンを生産した。最も高い生産性を示した組換え菌株は、母菌株と比較して約３５％高い収率で２７ｇ／Ｌのスレオニンを生産し、この菌株をｐＧｍＴＮ−ＰＰＣ１２と命名した。この菌株ｐＧｍＴＮ−ＰＰＣ１２を２００１年１月５日付で韓国微生物保存センターに寄託して寄託番号第ＫＣＣＭ−１０２３６号を受けた。
【００２５】
【表１】
2004518439.tif 000003
【００２６】
【表２】
2004518439.tif 000004
【００２７】
実施例５：醗酵槽を用いたスレオニン生産性の比較
実施例４で最も高いスレオニン生産力価を示したことから選別された組換え菌株ｐＧｍＴＮ−ＰＰＣ１２と、母菌株ＴＦ４０７６との間で、醗酵槽におけるスレオニンの生産性を比較した。ここで用いた初期の培地組成を表３に示す。種菌培養には、グルコース１０ｇ／ＬおよびＬ−メチオニン０．１ｇ／Ｌをさらに添加したＬＢ培地を使用し、醗酵槽への初期接種体積は初期培養体積の３−５％と決定した。グルコースは最終濃度が５質量％になるように計６回にわたって添加し、ＫＨ２ＰＯ４を１質量％になるように同時に添加した。ここで、グルコースを添加するのはグルコースが枯渇した時点であった。初期培養体積は１．５Ｌで、最終培養体積は３．０Ｌであった。醗酵中に添加されたグルコースの総濃度は２５０ｇ／Ｌであった。醗酵中、培地は７００−１０００ｒｐｍで攪拌し、温度は３２℃に保ち、ｐＨは２５−２８％のアンモニア水を使用して７．０に調節した。通気量は０．１ｖｖｍに調整した。この試験結果を表４に示す。表４にも示されているように、母菌株ＴＦ４０７６は７５．３ｇ／Ｌのスレオニンを生産し、消費グルコースに対して３０．１％の収率を示した。一方、組換え菌株ｐＧｍＴＮ−ＰＰＣ１２は１０２ｇ／Ｌのスレオニンを生産し、４０．８％の収率を示して、母菌株と比較して３５．４％の収率の向上を示した。
【００２８】
さらに、組換え菌株にしばしば現れる生育阻害現象によるグルコース消費の低下も見られず、母菌株と同様の醗酵状態が確認された。
【００２９】
【表３】
2004518439.tif 000005
【００３０】
【表４】
2004518439.tif 000006
【００３１】
以上説明したように、本発明によれば、２以上のコピーのｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンが染色体ＤＮＡに組み込まれることによって、ホスホエノールピルビン酸からスレオニン生合成の前駆体であるオキザロ酢酸に転換する酵素をエンコードするｐｐｃ遺伝子およびオキザロ酢酸からスレオニンを合成する経路に関わる酵素、ｔｈｒＡ（ａｓｐａｒｔｏｋｉｎａｓｅＩ−ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ｔｈｒＢ（ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、ｔｈｒＣ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をエンコードする遺伝子の発現量を増加させることができる。本発明によれば、母菌株と比較して３５％高いというように、Ｌ−スレオニンの生産性を飛躍的に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子のクローニング過程を示した図である。
【図２】図２は、ｐｐｃ遺伝子およびスレオニンオペロンがクローニングされた組換えプラスミドｐＧｍＴＮ−ＰＰＣの作製を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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