(57)【要約】ヒトプロトン感受性イオンチャンネルＢｎａＣ４をコードするＤＮＡをクローン化しかつ特徴づけした。該組換えタンパク質は生物学的に活性のタンパク質を形成することが可能である。該ｃＤＮＡを組換え宿主細胞中で発現させ、それは活性の組換えタンパク質を産生する。該組換えタンパク質をまた、組換え宿主細胞からも精製する。加えて、該組換え宿主細胞を、レセプター活性の調節物質の同定方法を確立するのに利用し、そしてレセプター調節物質を同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドが
（ａ）配列番号８および配列番号９より成る群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して９７％より大きい同一性を有するヒトポリヌクレオチド；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド；ならびに
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドの最低１５の連続する塩基を含んで成るポリヌクレオチド
より成る群から選択されるメンバーを含んで成る、ヒトＢＮａＣ４タンパク質をコードする単離かつ精製された核酸分子。
【請求項２】
ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号６および配列番号７；ならびにそれらの機能的誘導体より成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離かつ精製された核酸分子。
【請求項５】
ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡである、請求項１記載の単離かつ精製されたＤＮＡ分子。
【請求項６】
ヒトＢＮａＣ４タンパク質をコードする組換え遺伝子およびその機能的誘導体を含有する、組換え宿主中でのヒトＢＮａＣ４タンパク質の発現のための発現ベクター。
【請求項７】
発現ベクターが：（配列番号６）；（配列番号７）；およびそれらの機能的誘導体より成る群から選択されるヌクレオチド配列を有するヒトＢＮａＣ４タンパク質をコードするクローン化された遺伝子を含有する、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
発現ベクターが、ヒトＢＮａＣ４タンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含有する、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項９】
ヒトＢＮａＣ４タンパク質もしくはその機能的誘導体をコードする組換え的にクローン化された遺伝子を含有する組換え宿主細胞。
【請求項１０】
遺伝子が：配列番号６および配列番号７；ならびにそれらの機能的誘導体より成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項９記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
クローン化された遺伝子がゲノムＤＮＡである、請求項９記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
ヒトＢＮａＣ４タンパク質として機能する、実質的に純粋な形態のタンパク質。
【請求項１３】
（配列番号８）および（配列番号９）；ならびにそれらの機能的誘導体より成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１０記載のタンパク質。
【請求項１４】
ヒトＢＮａＣ４タンパク質と免疫学的に反応性の単一特異性抗体。
【請求項１５】
抗体がポリペプチドの活性を封鎖する、請求項１２記載の抗体。
【請求項１６】
（ａ）請求項６記載の発現ベクターを適当な宿主細胞に移入すること；および
（ｂ）発現ベクターからのヒトＢＮａＣ４タンパク質の発現を可能にする条件下で段階（ａ）の宿主細胞を培養すること
を含んで成る、組換え宿主細胞中でのヒトＢＮａＣ４タンパク質の発現方法。
【請求項１７】
（ａ）ヒトＢＮａＣ４タンパク質の活性の調節物質をヒトＢＮａＣ４タンパク質と組み合わせること；および
（ｂ）該タンパク質に対する調節物質の影響を測定すること
を含んで成る、ヒトＢＮａＣ４タンパク質の活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項１８】
（ａ）ヒトＢＮａＣ４タンパク質の活性の調節物質をヒトＢＮａＣ４タンパク質と組み合わせること；および
（ｂ）ＢＮａＣ依存性の細胞傷害性に対する該調節物質の影響を測定すること
を含んで成る、ヒトＢＮａＣ４タンパク質の活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項１９】
（ａ）ヒトＢＮａＣ４タンパク質の活性の調節物質をヒトＢＮａＣ４タンパク質と組み合わせること；および
（ｂ）ＢＮａＣ依存性のイオン流入の活性化に対する該調節物質の影響を測定すること
を含んで成る、ヒトＢＮａＣ４タンパク質の活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の方法を使用して試験化合物をスクリーニングすることにより発見された化合物。
【請求項２１】
化合物がＢｎａＣ４タンパク質のイオンチャンネル活性のアゴニストもしくはアンタゴニストである、請求項１７記載の方法で活性の化合物。
【請求項２２】
化合物がＢｎａＣ４タンパク質の発現の調節物質である、請求項１７記載の方法で活性の化合物。
【請求項２３】
請求項１７記載の方法で活性の化合物を含んで成る製薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項１７記載の方法で活性の調節化合物の投与を含んで成る、ヒトＢＮａＣ４により媒介される病状のためのこうした治療が必要な患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
組織アシドーシス（細胞外プロトンの増大された濃度もしくは低下されたｐＨ）は、多数の痛みを伴う生理学的（例えば痙攣）および病理学的（例えば間歇性跛行、炎症、虚血、心筋梗塞）に関連する。細胞外ｐＨは組織アシドーシスの間に２対数単位以上だけ減少することができる（ＲｅｅｈとＳｔｅｅｎ、１９９６）。酸（プロトン）の化学受容は、痙攣、外傷、炎症および低酸素症を包含する多数の病状で起こる侵害受容性のｐＨ不均衡の検出で決定的に重要な役割を演じている（Ｌｉｎｄａｈｌ、１９７４）。局所組織アシドーシス（細胞外Ｈ＋濃度の増大）は、炎症もしくは虚血状態の間の細胞外空隙における変化から生じる（ＷａｌｌとＭｅｌｚａｃｋ、１９９４）。外的な酸性化は、炎症、血腫、心もしくは筋虚血または癌に関連する疼痛における主要因子である。有害な化学的刺激は、知覚神経節（例えば後根、結節および三叉神経節）中の小径知覚ニューロン（侵害受容器）の末梢神経端を興奮させ、そして疼痛として知覚されるシグナルを発する。例えば、疼痛の感覚がｐＨの低下と平行するという証拠が存在する（Ｓｔｅｅｎら、１９９５）。低ｐＨ溶液の持続性の皮内注入は、痛覚過敏もしくは慢性疼痛の間に感じたものと類似である感覚を引き起こす可能性がある。心知覚ニューロン中の酸に惹起された電流は心筋虚血の感覚を媒介することができる（Ｂｅｎｓｏｎら、１９９９）。ｐＨの低下は多様な機構により無数の影響を引き起こすかもしれない一方、プロトンにより直接調節（ｇａｔｅｄ）（活性化）されるイオンチャンネルの存在は、特異的経路を薬理学的に操作するための手段を提供する。知覚および中枢ニューロン中の多数のコンダクタンスが、低いｐＨにより調節されることが示されている（ＢｅｖａｎとＹｅａｔｓ、１９９１；Ｖａｒｍｉｎｇ、１９９９）。異なるｐＨ感受性および動力学をもつプロトン感受性陽イオンチャンネルは、知覚（三叉、心およびＤＲＧ）ニューロン（Ｂｅｎｓｏｎら、１９９９；ＢｅｖａｎとＹｅａｔｓ、１９９１；Ｋｏｖａｌｃｈｕｋら、１９９０；ＫｒｉｓｈｔａｌとＰｉｄｏｐｌｉｃｈｋｏ、１９８１）、中枢神経系のニューロン（ＧｒａｎｔｙｎとＬｕｘ、１９８８；Ｕｅｎｏら、１９９２）ならびに希突起膠細胞（Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒら、１９８９）中で報告された。ＤＲＧ中の本来のプロトンに調節される電流は細胞間で変動するようであり、そして、迅速に不活性化する、不活性化しない、および二相性（迅速に不活性化しそしてその後不活性化しないの双方）電流を包含する。１９９６年以来、多数のプロトン感受性チャンネルがクローン化されており、そしてＶＲ１カプサイシン活性化型受容体（Ｔｏｍｉｎａｇａら、１９９９）、および線虫のデジェネリン（ｄｅｇｅｎｅｒｉｎ）／哺乳動物のアミロリド感受性ナトリウムチャンネル（上皮もしくは脳のＮａチャンネル；ＥＮａＣもしくはＢＮａＣ）に対する相同性を有するレセプターの一ファミリーを包含する。後者の少なくとも４種が知覚神経節中で発現されていることが示されており（表を参照されたい）、観察される電流の多様性に１種の分子が関連していることを示唆する。
【０００２】
クローン化されたプロトン感受性イオンチャンネル（ＡＳＩＣ）は、ケノルハブディティス  エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）のデジェネリンおよび哺乳動物の上皮ナトリウムチャンネルに構造的に関係しており、そして２個の推定の膜貫通ドメインおよび１個の大きな細胞外ドメインより構成される。このスーパーファミリーの最初のメンバーはＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のｄｅｇ−１遺伝子であった。この遺伝子の機能突然変異の獲得（すなわち遺伝子産物が野性型より活性であった）は、ニューロンの腫脹および変性を誘発した（ＣｈａｌｆｉｅとＷｏｌｉｎｓｋｙ、１９９０）。この遺伝子、ならびに関係するタンパク質ＭＥＣ−４をコードする遺伝子（ＤｒｉｓｃｏｌｌとＣｈａｌｆｉｅ、１９９１）は、それらが毒性の形態に変異することができたため「デジェネリン」と呼ばれた。Ｈ＋活性化型（ＡＳＩＣ）、構成的に活性（ＥＮａＣ、上皮Ｎａチャンネル）、カタツムリ中のペプチド調節型（ＦＭＲＦレセプター）からおそらく伸長活性化（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のデジェネリン）まで、このスーパーファミリーのチャンネルの機能の多様性が存在する。しかしながら、これらのファミリーのメンバーの全部がアミロリドに対し感受性であるようであり、Ｎａ＋に対し浸透性であり、そして電圧非感受性である（ＷａｌｄｍａｎｎとＬａｚｄｕｎｓｋｉ、１９９８）。ＡＳＩＣ２ｂを除き、全部のＡＳＩＣサブユニットは、異種発現系中で発現される場合に機能的ホモマー（ｈｏｍｏｍｅｒ）を形成する。
【０００３】
【表１】
2004516804.tif 000002
【０００４】
ホモマーのチャンネルの動力学特性はさまざまである。ＡＳＩＣ１は酸の継続的存在下で活性化かつ脱感作し、そして従って一過性応答のみを誘発する（Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９７）。ＡＳＩＣ２はＡＳＩＣ１よりゆっくりと活性化かつ不活性化する（Ｂａｓｓｉｌａｎａら、１９９７）。ＤＲＡＳＩＣは細胞外の酸性化に対し二相性の応答を生じさせる（Ｂａｂｉｎｓｋｉら、１９９９；Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９７）。酸に対する感受性はサブユニットに依存し（表１を参照されたい）、また、最大の半分の電流を生じさせるｐＨは約６．５から３近くまで変動する。
【０００５】
デジェネリンスーパーファミリーのメンバーはヘテロマー（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒ）を形成する。これはＥＮａＣファミリーではっきりと示されている（Ｃａｎｅｓｓａ、１９９６；ＦｙｆｅとＣａｎｅｓｓａ、１９９８）。ＡＳＩＣサブユニットもまたヘテロマーを形成するようである。ＡＳＩＣサブユニットは共局在するかもしれない。組織レベルでは、ＡＳＩＣ１Ａ、ＡＳＩＣ２ａおよびｂ、ならびにＡＳＩＣ３のｍＲＮＡが脳で発現され、また、ＡＳＩＣ１ＡおよびＢ、ＡＳＩＣ２ｂならびにＡＳＩＣ３のｍＲＮＡはＤＲＧで発現されている（表２）。例えば、ＡＳＩＣ２およびＡＳＩＣ１はマウスおよびヒト脳のほとんど全領域で共発現されている（Ｇａｒｃｉａ  Ａｎｏｖｅｒｏｓら、１９９７）。ラットＡＳＩＣ１に対するポリクローナル抗血清を使用する免疫細胞化学は、脊髄後角浅層、ＤＲＧおよび脊髄の三叉神経核、ならびに末梢神経線維中でＡＳＩＣ１タンパク質を示す（Ｏｌｓｏｎら、１９９８）。複数のＡＳＩＣサブユニットの機能的共発現は、ホモマーのチャンネル（とりわけｐＨ０．５の点で）、相対的イオン浸透性および動力学のいずれかが異なる特性をもつチャンネルを示す（Ｂａｓｓｉｌａｎａら、１９９７）。ＡＳＩＣ２ｂはＡＳＩＣ２ａおよびＤＲＡＳＩＣの動力学および浸透性の特性を改変することが可能である（Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａら、１９９７）。さらに、ＡＳＩＣファミリーのメンバーならびにｈＡＳＩＣ３および構造的に類似のＰ２Ｘ２の共発現（ＳｅｇｕｅｌａとＢａｂｉｎｓｋｉ、１９９９）は、いずれのホモマーとも異なる特性をもつレセプターを生じさせる。本発明をコードするメッセンジャーＲＮＡは、他のＡＳＩＣサブユニットを発現する領域に局在化され、そしてｈＢＮａＣ４が同様にヘテロマーを形成することがありそうであることを示唆する。
【０００６】
アミノリド感受性のＮａチャンネル／デジェネリンファミリーの大部分のメンバーは、Ｎａに対してＫを上回り高度に感受性であるようである（Ｂａｓｓｉｌａｎａら、１９９７；Ｃｈｅｎら、１９９８；Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９７；Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９７）。ＤＲＡＳＩＣの持続性の成分は、Ｎａにより主として媒介されることからＭＤＥＧ２の存在下でより少なくそうであることに変わる（Ｌｉｎｇｕｅｇｌｉａら、１９９７）。第一の膜貫通領域（ＴＭ１）に隣接する推定のＮ末端細胞質領域中のＭＤＥＧ１およびＭＤＥＧ２に示される９アミノ酸のキマー（ｃｈｉｍｅｒ）は、これらのチャンネルのイオン選択性の決定的に重要な決定子である。Ｉｌｅ１９、Ｐｈｅ−２０およびＴｈｒ−２５が、これらの残基での突然変異がＮａとＫとを不十分に識別した（「非選択的」になった）ため、とりわけ重要であるようである（Ｃｏｓｃｏｙら、１９９９）。いくつかのＡＳＩＣサブユニットはＣａ２＋に対してもまた浸透性である（すなわちＡＳＩＣ１Ａ（ＰＮａ／ＰＣａ  〜２．５（Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９７）））。しかしながら、全部のサブユニットが、Ｃａ２＋に対し認めうるほど浸透性であるチャンネルを形成するようであるわけではない（Ｂａｓｓｉｌａｎａら、１９９７；Ｃｈｅｎら、１９９８）。
【０００７】
アミロリド封鎖は、約１０μＭのＫＤから１００μＭでの不完全な封鎖まで、サブユニット間で変動する（表２）。アミロリドが迅速な一過性のＡＳＩＣに媒介される電流を封鎖することは一般に認められているが、ＤＲＡＳＩＣ（ＡＳＩＣ３）の持続性の成分に対するアミロリドの影響に関しては若干の論争が存在する（Ｂａｂｉｎｓｋｉら、１９９９；Ｂａｓｓｉｌａｎａら、１９９７；Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９７）。
【０００８】
【表２】
2004516804.tif 000003
【０００９】
ＡＳＩＣに相同なチャンネルをコードするデジェネリン遺伝子中の突然変異は、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において神経変性を引き起こす（Ｇａｒｃｉａ−Ａｎｏｖｅｒｏｓら、１９９５）。変性過程の間に、細胞は渦状紋（ｗｈｏｒｌ）（膜の同心円の領域）および液胞を蓄積し、それらの元の直径の数倍まで腫脹し、そしてしばしば死ぬ（Ｈａｌｌら、１９９７）。ＭＤＥＧ１およびＡＳＩＣ１に導入される場合の細胞外ループもしくは第二の疎水性ドメインＭＩＩ中の類似の突然変異は、構成的に電流を生じさせ、そしてチャンネルを発現する培養細胞を殺す（Ｂａｓｓｉｌａｎａら、１９９７；Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９６）。
【００１０】
インビボで、プロトン感受性チャンネルの活性化は、チャンネルそれ自身もしくは電圧活性化型カルシウムチャンネルのいずれかにより、細胞の脱分極およびＣａ２＋の流入につながるとみられる。細胞内Ｃａ２＋の蓄積が神経変性につながるかもしれない（ＧｈｏｓｈとＧｒｅｅｎｂｅｒｇ、１９９５；ＫｒｉｓｔｉａｎとＳｉｅｓｊｏｅ、１９９６；ＬｅｉｓｔとＮｉｃｏｔｅｒａ、１９９９；Ｍａｔｔｓｏｎ、１９９８；ＳａｔｔｌｅｒとＴｙｍｉａｎｓｋｉ、１９９８）。組織のアシドーシスは脳虚血の十分に確立した特徴であるとは言え、虚血の神経病理学におけるアシドーシスの役割は理解されていない。以前、プロトンがＮＭＤＡレセプターを阻害するためにそれが保護適役割を演じていると考えられていた（Ｇｉｆｆａｒｄら、１９９０；Ｔａｎｇら、１９９０；Ｖｙｋｌｉｃｋｙら、１９９０）。しかしながら、インビボでのアシドーシスは、ＮＭＤＡレセプターが阻害されている時点でさえ虚血により損傷を悪化させる（ＬｉとＳｉｅｓｊｏ、１９９７；Ｓｉｅｓｊｏら、１９９３）。
【００１１】
本発明は、新規ＡＳＩＣレセプターファミリーメンバーＢＮａＣ４のクローニングおよび機能を記述する。本発明はアミノ酸レベルでラット「ＳＰＡＳＩＣ」（ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＡＪ２４２５５４）に９７％同一であり、そして従ってラット遺伝子のヒト類似物（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）である。ＡＳＩＣファミリーのメンバーは侵害受容に参画していると考えられるが、しかし、それらはとりわけ中枢神経系において他の役割も同様に演じていることがありそうである。
【００１２】
（発明の要約）
ＡＳＩＣ（プロトン感受性イオンチャンネルファミリー）の一メンバーであるヒト脳ナトリウムチャンネルＢＮａＣ４をコードするＤＮＡ分子をクローン化しかつ特徴づけした。該タンパク質の生物学的および構造的特性を、アミノ酸およびヌクレオチド配列がそうであるように開示する。該組換えタンパク質はレセプターＢＮａＣ４の調節物質を同定するのに有用である。ＢＮａＣ４は、神経調節、神経伝達、疼痛、虚血、ならびに限定されるものでないがアルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、小脳性運動失調およびパーキンソン症候群を挙げることができる疾患の根底にある神経変性においてある役割を演じていると考えられている。本明細書で開示されるアッセイで同定された調節物質は治療薬として有用であり、虚血、炎症状態の治療、ならびに、難治性疼痛、複合性局所疼痛症候群、関節炎（例えば慢性関節リウマチおよび骨関節炎）のための鎮痛薬としての使用、ならびに潰瘍、神経変性性疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、過敏性腸症候群および乾癬の候補である。用途は、中枢神経系疾患、腸管の疾患、異常増殖、ならびにとりわけ消化器系および女性生殖器の癌、潰瘍、肝疾患の治療、後根神経節により神経刺激される内臓の制御、またはとりわけヒトＢＮａＣ４ポリペプチドの異常発現に関係したいかなる障害も診断もしくは治療することを包含する。別の局面において、本発明は、本発明により提供される材料を使用しかつヒトＢＮａＣ４不均衡に関連する病状を治療するアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法に関する。該組換えＤＮＡ分子およびそれらの部分は、ＤＮＡ分子の相同物を単離するため、該ＤＮＡ分子のゲノム同等物を同定かつ単離するため、および該ＤＮＡ分子の突然変異体を同定、検出もしくは単離するために有用である。
【００１３】
（詳細な記述）
本発明は、脳ナトリウムチャンネル４（ＡＳＩＣ４、プロトン感受性イオンチャンネル４ともまた称される）についてヒトＢＮａＣ４と命名されたヒトプロトン感受性レセプターに引きつけられる。ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、５３９（図３）アミノ酸をコードする約１６２０（図１）塩基対の単一の大きな読取り枠を示した。ＢＮａＣ４のｃＤＮＡは、図２に示されるとおり、約１６４および約７４４ヌクレオチドの５’および３’非翻訳伸長を有し、ここで５’ＵＴＲは１−１６４であり、コーディング領域は１６５−１７８５であり、そして３’ＵＴＲは１７８６−２５２８である。最初の読み枠中のメチオニンは、約５９，２０３Ｄａの推定される分子量（Ｍｒ）をもつヒトＢＮａＣ４タンパク質を予測する１個の読取り枠の開始コドンと指定された。
【００１４】
予測されるヒトＢＮａＣ４タンパク質は、ヌクレオチドおよびタンパク質データベースと整列され、そしてプロトン感受性イオンチャンネルファミリー（ＢＮａＣ、ＡＳＩＣ）と関係づけられている。チャンネルのこのファミリーで見出される、１個の大きな推定の細胞外ドメイン（約３５４アミノ酸）および２個の予測される膜貫通ドメインを包含するいくつかの保存されたモチーフが存在する。従って、本明細書に記述されるヒトＢＮａＣ４は、ラット「ＳＰＡＳＩＣ」（ＢＮａＣファミリーの新規遺伝子）のヒト相同物である。
ヒトＢＮａＣ４核酸の単離
本発明は、ヒトＢＮａＣ４産生細胞から単離されたヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡに関する。本明細書で使用されるところのヒトＢＮａＣ４は、レセプターとして特異的に機能することができるタンパク質を指す。
【００１５】
ヒトＢＮａＣ４の完全なアミノ酸配列は以前に知られておらず、また、ヒトＢＮａＣ４をコードする完全なヌクレオチド配列も知られていなかった。広範な細胞および細胞型が、記述されるヒトＢＮａＣ４を含有するであろうことが予測される。
【００１６】
他の細胞および細胞系もまた、ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡを単離するための使用に適するかもしれない。適する細胞の選択は、本明細書に記述される細胞抽出物もしくは全細胞のアッセイでのヒトＢＮａＣ４活性についてのスクリーニングにより行ってよい。これらのアッセイのいずれか１つでヒトＢＮａＣ４活性を所有する細胞は、ヒトＢＮａＣ４のＤＮＡもしくはｍＲＮＡの単離に適するかもしれない。
【００１７】
当該技術分野で既知の多様な手順のいずれかを使用して、ヒトＢＮａＣ４のＤＮＡを分子的にクローン化してよい。これらの方法は、限定されるものでないが、適切な発現ベクター系中でのヒトＢＮＡＣ４含有ｃＤＮＡライブラリーの構築後のヒトＢＮＡＣ４遺伝子の直接の機能的発現を挙げることができる。別の方法は、ヒトＢＮＡＣ４のサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒトＢＮａＣ４含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。付加的な一方法は、ヒトＢＮａＣ４タンパク質をコードする部分的ｃＤＮＡを用いて、バクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクター中に構築されたヒトＢＮＡＣ４含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることより成る。この部分的ｃＤＮＡは、精製されたヒトＢＮａＣ４タンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計による、ヒトＢＮａＣ４のＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅により得られる。
【００１８】
別の方法は、ヒトＢＮａＣ４産生細胞からＲＮＡを単離しそして該ＲＮＡをインビトロもしくはインビボ翻訳系を介してタンパク質に翻訳することである。ペプチドタンパク質へのＲＮＡの翻訳は、例えば抗ヒトＢＮａＣ４抗体との免疫学的反応性もしくはヒトＢＮａＣ４タンパク質の生物学的活性により同定することができるヒトＢＮａＣ４タンパク質の少なくとも一部分の産生をもたらすことができる。この方法において、ヒトＢＮａＣ４産生細胞から単離されたＲＮＡのプールを、ヒトＢＮａＣ４タンパク質の少なくとも一部分をコードするＲＮＡの存在について分析することができる。ＲＮＡプールのさらなる分画を行って、非ヒトＢＮａＣ４  ＲＮＡからヒトＢＮａＣ４  ＲＮＡを精製することができる。この方法により製造されるペプチドもしくはタンパク質は、アミノ酸配列を提供するために分析してよく、これを順に、ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡの製造のためのプライマーを提供するのに使用するか、または、翻訳に使用されたＲＮＡを分析して、ヒトＢＮａＣ４をコードするヌクレオチド配列を提供しそしてヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡのこの製造のためのプローブを調製することができる。この方法は当該技術分野で既知でありかつ例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９中、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．に見出すことができる。
【００１９】
他の型のライブラリー、ならびに他の細胞もしくは細胞型から構築されたライブラリーが、ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡを単離するために有用であるかもしれないことが、当業者に容易に明らかである。他の型のライブラリーは、限定されるものでないが、ヒトＢＮａＣ４以外の生物体からの他の細胞由来のｃＤＮＡライブラリー、およびＹＡＣ（酵母の人工的染色体）を包含するゲノムＤＮＡライブラリー、ならびにコスミドライブラリーを挙げることができる。
【００２０】
適するｃＤＮＡライブラリーを、ヒトＢＮａＣ４活性を有する細胞もしくは細胞系から調製してよいことが、当業者に容易に明らかである。ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの調製での使用のための細胞もしくは細胞系の選択は、ヒトＢＮａＣ４に関連する生物学的活性の測定もしくはリガンド結合アッセイを使用して細胞に関連するヒトＢＮＡＣ４活性を最初に測定することにより行ってよい。
【００２１】
ｃＤＮＡライブラリーの調製は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）に見出すことができる。
【００２２】
ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡは適するゲノムＤＮＡライブラリーからもまた単離してよいこともまた、当業者に容易に明らかである。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野で公知の標準的技術により実施することができる。公知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）中、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．に見出すことができる。
【００２３】
上の方法によりヒトＢＮａＣ４遺伝子をクローン化するために、ヒトＢＮａＣ４のアミノ酸配列が必要であるかもしれない。これを達成するために、ヒトＢＮａＣ４タンパク質を精製しそして自動化シークェネーターにより部分的アミノ酸配列を決定してよい。アミノ酸配列全体を決定することは必要でないが、しかし、該タンパク質からの６ないし８アミノ酸の２領域の直鎖状配列を、部分的ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅のためのプライマーの製造のために決定する。
【００２４】
適するアミノ酸配列が同定されれば、それらをコードすることが可能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重であるため、１種以上のコドンが特定の１アミノ酸をコードするのに使用されているかもしれず、そして従って、アミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされる可能性がある。該組の１メンバーのみが、ヒトＢＮａＣ４配列に同一であろうが、しかし、不適正を伴うＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であろう。不適正にされたＤＮＡオリゴヌクレオチドはなおヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡに十分にハイブリダイズすることができ、ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡの同定および単離を可能にする。これらの方法により単離されたＤＮＡを使用して、無脊椎動物および脊椎動物の供給源からの多様な細胞型からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングしかつ相同な遺伝子を単離することができる。
【００２５】
精製された生物学的に活性のヒトＢＮａＣ４はいくつかの異なる物理的形態を有するかもしれない。ヒトＢＮａＣ４は完全長の新生もしくはプロセシングされないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドあるいはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在するかもしれない。完全長の新生ヒトＢＮａＣ４ポリペプチドは、特異的なタンパク質分解的切断事象により翻訳後に修飾されることができ、それは完全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす。１個のフラグメント、もしくはフラグメントの物理的会合物は、ヒトＢＮａＣ４に関連する完全な生物学的活性を有するかもしれないが、しかしながら、ヒトＢＮａＣ４活性の程度は、個々のヒトＢＮａＣ４フラグメントと物理的に会合されたヒトＢＮａＣ４ポリペプチドフラグメントとの間で変動するかもしれない。
【００２６】
遺伝暗号は縮重であるため、１種以上のコドンが特定の１アミノ酸をコードするのに使用されているかもしれず、そして従って、アミノ酸配列は一組の類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードされる可能性がある。該組の１メンバーのみが、ヒトＢＮａＣ４配列に同一であろうが、しかし、適切な条件下で不適正を伴うＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡにハイブリダイズすることが可能であろう。代替の条件下で、不適正にされたＤＮＡオリゴヌクレオチドはヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡになおハイブリダイズして、ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡの同定および単離を可能にするかもしれない。
【００２７】
特定の一生物体からのヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡを使用して、他の生物体からヒトＢＮａＣ４の相同物を単離かつ精製してよい。これを達成するために、第一のヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡを、適切なハイブリダイゼーション条件下でヒトＢＮａＣ４の相同物をコードするＤＮＡを含有するサンプルと混合してよい。ハイブリダイズされたＤＮＡ複合物を単離してよく、そして、相同なＤＮＡをコードするＤＮＡをそれから精製してよい。
機能的誘導体／変異体
特定のアミノ酸をコードする多様なコドンにかなりの量の冗長性が存在することが既知である。従って、本発明はまた、同一のアミノ酸の最終的な翻訳をコードする代替コドンを含有するＤＮＡ配列にも向けられる。この明細の目的上、１個もしくはそれ以上の置き換えられたコドンを担持する配列を縮重変異と定義することができる。発現されたタンパク質の究極的な物理特性を実質的に変えない、ＤＮＡ配列もしくは翻訳されたタンパク質のいずれか中の突然変異もまた、本発明の範囲内に包含される。例えば、脂肪族アミノ酸アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの置換；ヒドロキシル残基セリンおよびトレオニンの交換、酸性残基アスパラギン酸およびグルタミン酸の交換、アミド残基アスパラギンとグルタミンとの間の置換、塩基性残基リシンおよびアルギニンの交換、ならびに芳香族残基フェニルアラニン、チロシンの間の置換は、該ポリペプチドの機能性の変化を引き起こさないかもしれない。こうした置換は公知であり、そして例えばＷａｔｓｏｎらによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ、第４版、ベンガミン  カミングス  パブリッシング  カンパニー（Ｂｅｎｇａｍｉｎ  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）に記述されている。
【００２８】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、天然に存在するペプチドのものと異なる特性を有するペプチドをコードするように変えてよいことが既知である。ＤＮＡ配列を変える方法は、限定されるものでないが部位特異的突然変異誘発、キメラ置換および遺伝子融合を挙げることができる。部位特異的突然変異誘発は１個もしくはそれ以上のＤＮＡ残基を変えるのに使用され、サイレント突然変異、保存的突然変異もしくは非保存的突然変異をもたらすことができる。キメラ遺伝子は、ＢＮａＣ４遺伝子中の類似のドメインを置き換えるように類似のもしくは異なる遺伝子のドメインを交換することにより製造する。同様に、該遺伝子の同定および単離を助長するための親和性標識のようなドメインをＢＮａＣ４遺伝子に付加する融合遺伝子を製造してよい。融合遺伝子は、例えば膜貫通ドメインを除去する、もしくは該タンパク質の正常の輸送を向け直すターゲッティング配列を付加する、またはＢＮａＣ４遺伝子に新たな翻訳後修飾配列を付加することにより該タンパク質の可溶性のバージョンを創製するように、ＢＮａＣ４遺伝子の領域を置き換えるために製造してよい。変えられた特性の例は、限定されるものでないが、基質に対する酵素もしくはリガンドに対するレセプターの親和性の変化を挙げることができる。ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の全部のこうした変化は、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の元の機能が本明細書に記述されるとおり維持される限りは、本発明の有用な変異体として予期される。
【００２９】
当該技術分野で既知のところの同一性もしくは類似性は、配列を比較することにより決定されるような、２種もしくはそれ以上のポリペプチド配列または２種もしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、同一性は、場合によってはこうした配列のひと続きの間の合致により決定されるところの、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の程度もまた意味する。同一性および類似性の双方は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、オックスフォード  ユニバーシティ  プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、ヒューマナ  プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  ストックトン  プレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１）。２種のポリヌクレオチドもしくは２種のポリペプチド配列間の同一性および類似性の多数の測定方法が存在する一方、双方の用語は当業者に公知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  ストックトン  プレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８、１０７３）。配列間の同一性もしくは類似性を決定するのに普遍的に使用される方法は、限定されるものでないがＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８、１０７３に開示されるものを挙げることができる。同一性の好ましい決定方法は、試験される配列間の最大の合致を与えるよう設計されている。同一性および類似性の決定方法は、コンピュータプログラム中に暗号化されている。２種の配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプラグラム方法は、限定されるものでないがＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）、３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３）を挙げることができる。
【００３０】
ポリヌクレオチド（１個もしくは複数）は、一般にいかなるポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドも指し、それらは修飾されないＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい。従って、例えば、本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域もしくは一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含んで成るハイブリッド分子を指す。加えて、本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡ双方を含んで成る三本鎖領域を指す。こうした領域中の鎖は同一の分子もしくは異なる分子からであってよい。該領域は１種もしくはそれ以上の分子の全部を包含してよいが、しかし、より典型的には分子の若干の一領域のみを必要とする。三重らせん領域の分子の１つはしばしばオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドという用語は、１個もしくはそれ以上の修飾された塩基を含有する上述されたところのＤＮＡもしくはＲＮＡを包含する。従って、安定性のためもしくは他の理由から修飾されたバックボーンをもつＤＮＡもしくはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図しているところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、ただ２例を挙げると、イノシンのような普通でない塩基もしくはトリチル化された塩基のような修飾された塩基を含んで成るＤＮＡもしくはＲＮＡは、該用語が本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドである。当業者に既知の多くの有用な目的にかなうＤＮＡおよびＲＮＡに対し多様な修飾がなされていることが認識されるであろう。それが本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドという用語は、こうした化学的、酵素的もしくは代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに、とりわけウイルスならびに単純および複合細胞を包含する細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。ポリヌクレオチドは、しばしばオリゴヌクレオチド（１個もしくは複数）と称される短いポリヌクレオチドを包含する。
【００３１】
本明細書で使用されるところのポリペプチドという用語は、公知でありかつ当該技術分野の無数の教科書および他の刊行物に記述されているポリペプチドの基本的化学構造を指す。この情況において、該用語は、ペプチド結合により直鎖で相互に結合された２個もしくはそれ以上のアミノ酸を含んで成るいかなるペプチドもしくはタンパク質も指すのに本明細書で使用する。本明細書で使用されるところの該用語は、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーともまた当該技術分野で普遍的に称される短鎖、ならびに多くの型が存在する、一般に当該技術分野でタンパク質と称されるより長い鎖の双方を指す。ポリペプチドはしばしば２０種の天然に存在するアミノ酸と普遍的に称される２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有すること、ならびに、末端アミノ酸を包含する多くのアミノ酸が、プロセシングおよび他の翻訳後修飾のような天然の過程、しかしまた当該技術分野で公知である化学修飾技術のいずれかによっても所定のポリペプチド中で修飾されてよいことが認識されるであろう。ポリペプチド中に天然に存在する普遍的修飾でさえ、ここで網羅的に列挙するには多すぎるが、しかし、それらは基礎的教科書およびより詳細に単行書に、ならびに膨大な研究論文で十分に記述されており、そしてそれらは当業者に公知である。本発明のポリペプチド中に存在してよい既知の修飾は、具体的に説明する数例を挙げれば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡに媒介される付加、およびユビキチン化である。こうした修飾は当業者に公知であり、そして学術論文に非常に詳細に記述されている。いくつかのとりわけ普遍的な修飾、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、例えばＰＲＯＴＥＩＮＳ――ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．フリーマン  アンド  カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（１９９３）のような最も基礎的な教科書に記述されている。例えば、ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８３）中、Ｗｏｌｄ，Ｆ．、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１−１２ページ；Ｓ���ｉｆｔｅｒら、（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２、６２６−６４６、およびＲａｔｔａｎら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ”、（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３、４８−６２により提供されるもののような多くの詳述された総論が、この主題に関して入手可能である。ポリペプチドは常に完全に直鎖状であるわけでないことが、公知であるとおり、かつ、上に示されるとおり、認識されるであろう。例えば、ポリペプチドは一般に、天然のプロセシング事象および天然に起こらない人間の操作によりもたらされる事象を包含する翻訳後事象の結果としてであってよい。環状、分枝状および分枝環状のポリペプチドを、同様に非翻訳の天然の過程および完全に合成の方法により合成してもよい。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端を包含するポリペプチド中のいかなる場所でも起こることができる。事実、共有修飾によるポリペプチド中のアミノもしくはカルボキシル基または双方の封鎖は、天然に存在するおよび合成のポリペプチド中で普遍的であり、そしてこうした修飾が同様に本発明のポリペプチド中に存在してもよい。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは他の細胞中で作成されたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解性プロセシング前に、ほとんど常にＮ−ホルミルメチオニンであることができる。ペプチドの翻訳後修飾の間に、ＮＨ置換２（ＮＨ．ｓｕｂ．２）−末端のメチオニン残基が削除されることができる。従って、本発明は、本発明のタンパク質のメチオニンを含有するおよびメチオニンのないアミノ末端変異体の双方の使用を企図している。ポリペプチド中で起こる修飾はしばしばそれが作成される方法の関数であることができる。例えば、クローン化された遺伝子を宿主中で発現することにより作成されるポリペプチドについては、修飾の性質および程度は、大部分、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルにより決定されることができる。例えば、公知であるとおり、グリコシル化は例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主中で起こらない。従って、グリコシル化が望ましい場合、ポリペプチドは、グリコシル化する宿主、一般的には真核生物細胞中で発現させるべきである。昆虫細胞はしばしば哺乳動物細胞と同一の翻訳後グリコシル化を実施し、そして、この理由から、昆虫細胞発現系がとりわけ本来のグリコシル化パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率的に発現させるために開発されている。同様の考慮が他の修飾に当てはまる。同一の型の修飾が所定のポリペプチド中のいくつかの部位に同一もしくは変動する程度で存在してよいことが認識されるであろう。また、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含有してもよい。一般に、本明細書で使用されるところのポリペプチドという用語は、全部のこうした修飾、とりわけ宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現させることにより組換え的に合成されたポリペプチド中に存在するものを包含する。
【００３２】
該用語が本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの変異体（１種もしくは複数）は、それぞれ参照ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドと異なるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に存在する対立遺伝子変異体のような天然に存在する変異体であってよいか、もしくは、それは天然に存在することが知られていない変異体であるかもしれない。（１）別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチド。一般に、差異は、参照および変異体のヌクレオチド配列が全体として緊密に類似かつ多くの領域で同一であるように限定される。下に示されるとおり、変異体のヌクレオチド配列中の変化はサイレントであることができる。すなわち、それらは該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変えないかもしれない。変化がこの型のサイレント変化に限定される場合、変異体は、参照と同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードすることができる。また下に示されるとおり、変異体のヌクレオチド配列中の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変えてもよい。こうしたヌクレオチド変化は、上に論考されたとおり、参照配列によりコードされるポリペプチド中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および短縮をもたらすかもしれない。（２）別の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なるポリペプチド。一般に、差異は、参照および変異体の配列が全体として緊密に類似かつ多くの領域で同一であるように限定される。変異体および参照ポリペプチドは、１個もしくはそれ以上の置換、付加、欠失、融合および短縮（いずれかの組み合わせで存在してよい）によりアミノ酸配列が異なってよい。本明細書で使用されるところのＢＮａＣ４の「機能的誘導体」は、ＢＮａＣ４の生物学的活性に実質的に類似である生物学的活性（機能的もしくは構造的のいずれか）を所有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、ＢＮａＣ４の「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似物」および「相同物」もしくは「化学的誘導体」を包含することを意図している。ポリペプチドの有用な化学的誘導体は当該技術分野で公知であり、かつ、例えば、二次的な化学的部分をもつポリペプチド内に含有される反応性の有機部位の共有修飾を包含する。公知の架橋試薬が、アミノ、カルボキシルもしくはアルデヒド残基と反応させて、例えばビオチン、蛍光色素のような親和性標識を導入するかもしくはポリペプチドを固相表面に結合する（例えば親和性樹脂を創製するため）のに有用である。「フラグメント」という用語はＢＮａＣ４のいずれかのポリペプチドサブセットを指すことを意味している。分子は、双方の分子が実質的に類似の構造を有する場合、もしくは双方の分子が類似の生物学的活性を所有する場合にＢＮａＣ４に「実質的に類似」である。従って、２種の分子が実質的に類似の活性を所有する場合、それらはそれらの分子の一方の構造が他者で見出されない場合でさえ、もしくは２種のアミノ酸配列が同一でない場合でさえ、変異体であるとみなされる。「類似物」という用語は、機能がＢＮａＣ４分子全体もしくはそのフラグメントのいずれかに実質的に類似の分子を指す。いくつかの（ｓｅｖｅｒａｌ）、数個の（ａ  ｆｅｗ）、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１もしくは０個のアミノ酸残基がいずれかの組み合わせで置換、欠失もしくは付加されている、配列番号８もしくは配列番号９のポリペプチドのアミノ酸配列を有する、配列番号６の変異体、類似物、誘導体およびフラグメントをコードするポリヌクレオチド、ならびに該フラグメントの変異体、類似物および誘導体が、この点に関してさらにとりわけ好ましい。配列番号６の遺伝子の特性および活性を変えないサイレントの置換、付加および欠失がこれらのなかでとりわけ好ましい。保存的置換もまたこの点に関してとりわけ好ましい。置換を伴わずに配列番号８もしくは配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが最も高度に好ましい。
【００３３】
本発明のさらなる好ましい態様は、配列番号８もしくは配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこうしたポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチドに、それらの長さ全体にわたって最低７０％同一であるポリヌクレオチドである。あるいは、最低８０％同一である領域を含んで成るポリヌクレオチドが高度に好ましく、最低９０％同一である領域を含んで成るポリヌクレオチドがより高度に好ましく、そしてこれらの好ましいポリヌクレオチドのなかでも最低９５％を伴うものがとりわけ好ましい。さらに、最低９７％の同一性をもつものが最低９５％を伴うもののなかで高度に好ましく、また、これらのなかでも最低９８％および最低９９％を伴うものがとりわけ高度に好ましく、最低９９％が最も好ましい。好ましい一態様において上述されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９の推定されるアミノ酸配列を特徴とするポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドをコードする。さらに、この点で好ましい態様は、配列番号６のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能もしくは活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明はさらに、本明細書に上述された配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点に関して、本発明はとりわけ、ストリンジェントな条件下で本明細書に上述されたポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用されるところの「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間に最低９５％および好ましくは最低９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起こることができることを意味する。
【００３４】
例えば、本発明のポリヌクレオチドアッセイに関して本明細書で付加的に論考されるところの本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６の配列をコードする完全長のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するため、ならびに配列番号６に対する高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして使用してよい。こうしたプローブは、一般に最低１５塩基を含むことができる。好ましくは、こうしたプローブは最低３０塩基を有することができ、そして最低５０塩基を有してよい。とりわけ好ましいプローブは最低３０塩基を有することができ、そして５０塩基もしくはそれ未満を有することができる。例えば、本発明の遺伝子のコーディング領域を、既知のＤＮＡ配列を使用するスクリーニングにより単離して、オリゴヌクレオチドプローブを合成してよい。その後、本発明の遺伝子のものに相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドを使用してｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、該プローブがライブラリーのどのメンバーとハイブリダイズするかを決定する。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、配列番号８もしくは配列番号９のポリペプチド（とりわけ成熟ポリペプチド）、ならびに配列番号８もしくは配列番号９のポリペプチドに対する最低７０％の同一性、好ましくは配列番号８もしくは配列番号９のポリペプチドに対する最低８０％の同一性、そしてより好ましくは配列番号８もしくは配列番号９のポリペプチドに対する最低９０％の類似性（より好ましくは最低９０％の同一性）、そしてなおより好ましくは配列番号８もしくは配列番号９のポリペプチドに対し最低９５％の類似性（なおより好ましくは最低９５％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、かつまたこうしたポリペプチドの部分を包含し、ポリペプチドのこうした部分は、一般に最低３０アミノ酸、およびより好ましくは最低５０アミノ酸を含有する。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例は、例えば、配列番号８もしくは配列番号９の短縮ポリペプチドを包含する。短縮ポリペプチドは、アミノ末端を包含する連続した一連の残基（すなわち連続的な領域、一部もしくは部分）またはカルボキシル末端を包含する連続した一連の残基の欠失、あるいは二重短縮突然変異体でのような、一方がアミノ末端を包含しかつ一方がカルボキシル末端を包含する２個の連続する一連の残基の欠失を除く、配列番号８もしくは配列番号９、またはそれらの変異体もしくは誘導体のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。配列番号８もしくは配列番号９の配列を特徴とするポリペプチドの構造的もしくは機能的属性を特徴とするフラグメントもまた、本発明の本局面において好ましい。この点に関して本発明の好ましい態様は、α−ヘリックスおよびα−ヘリックス形成領域、β−シートおよびβ−シート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α−両親媒性領域、β−両親媒性領域、柔軟性に富む領域、表面形成領域、基質結合領域、本発明のポリペプチドの高抗原指標領域を含んで成るフラグメント、ならびにこうしたフラグメントの組み合わせを包含する。好ましい領域は本発明のポリペプチドの活性を媒介するものである。類似の活性もしくは向上された活性、または低下された望ましくない活性をもつものを包含する、本発明の応答調節体（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）ポリペプチドの化学的、生物学的もしくは他の活性を有するフラグメントが、この点に関して最も高度に好ましい。
ヒトＢＮａＣ４の組換え発現
本明細書に記述される方法により得られたクローン化されたヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡは、適するプロモーターおよび他の適切な転写制御因子を含有する発現ベクター中に分子クローニングすることにより組換え的に発現させてよく、そして、原核生物もしくは真核生物宿主細胞中に移入して組換えヒトＢＮａＣ４タンパク質を産生させてよい。こうした操作の技術はＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、上記に完全に記述されており、そして当該技術分野で公知である。
【００３６】
発現ベクターは、適切な宿主中での遺伝子のクローン化されたコピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と本明細書で定義する。こうしたベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包含する細菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞および動物細胞のような多様な宿主中で真核生物遺伝子を発現させるのに使用することができる。
【００３７】
特別に設計されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞もしくは細菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞中での自律複製のための複製開始点、選択可能なマーカー、限定された数の有用な制限酵素部位、高コピー数の能力、および活性のプロモーターを含有すべきである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合しそしてＲＮＡ合成を開始するよう指図するＤＮＡ配列と定義する。強力なプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。発現ベクターは、限定されるものでないがクローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特別に設計されたプラスミドもしくはウイルスを挙げることができる。
【００３８】
多様な哺乳動物発現ベクターを、哺乳動物細胞中で組換えヒトＢＮａＣ４を発現させるのに使用してよい。組換えヒトＢＮａＣ４発現に適することができる商業的に入手可能な哺乳動物発現ベクターは、限定されるものでないがｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、ｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＸＴ１（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＳＧ５（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）およびＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）を挙げることができる。
【００３９】
多様な細菌発現ベクターを、細菌細胞中で組換えヒトＢＮａＣ４を発現させるのに使用してよい。組換えヒトＢＮａＣ４発現に適することができる商業的に入手可能な細菌発現ベクターは、限定されるものでないがｐＥＴベクター（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））およびｐＱＥベクター（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を挙げることができる。
【００４０】
多様な真菌細胞発現ベクターを、酵母のような真菌細胞中で組換えヒトＢＮａＣ４を発現させるのに使用してよい。組換えヒトＢＮａＣ４発現に適することができる商業的に入手可能な真菌細胞発現ベクターは、限定されるものでないがｐＹＥＳ２（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。多様な昆虫細胞発現ベクターを、昆虫細胞中で組換えヒトＢＮａＣ４を発現させるのに使用してよい。ヒトＢＮａＣ４の組換え発現に適することができる商業的に入手可能な昆虫細胞発現ベクターは、限定されるものでないがｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を挙げることができる。
【００４１】
ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡを、組換え宿主細胞中での発現のため発現ベクター中にクローン化してよい。組換え宿主細胞は、限定されるものでないが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、限定されるものでないがヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞系を挙げることができる哺乳動物細胞、ならびに限定されるものでないがショウジョウバエおよびカイコ由来細胞系を挙げることができる昆虫細胞を挙げることができる、原核生物もしくは真核生物であってよい。適することができかつ商業的に入手可能である哺乳動物種由来の細胞系は、限定されるものでないがＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ−細胞およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）を挙げることができる。
【００４２】
発現ベクターは、限定されるものでないが形質転換、トランスフェクション、原形質融合、リポフェクションおよび電気穿孔法を挙げることができる多数の技術のいずれか１つを介して宿主細胞中に導入してよい。発現ベクター含有細胞をクローン的に繁殖させ、そしてそれらがヒトＢＮａＣ４タンパク質を産生するかどうかを決定するために個別に分析する。ヒトＢＮａＣ４を発現する宿主細胞クローンの同定は、限定されるものでないが抗ヒトＢＮａＣ４抗体との免疫学的反応性および宿主細胞関連のヒトＢＮａＣ４活性の存在を挙げることができるいくつかの手段により行ってよい。
【００４３】
ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡの発現はまた、インビトロで製造された合成ｍＲＮＡを使用して実施してもよい。合成ｍＲＮＡもしくはヒトＢＮａＣ４産生細胞から単離されたｍＲＮＡは、限定されるものでないがコムギ胚芽抽出物および網状赤血球抽出物を挙げることができる多様な細胞を含まない系で効率的に翻訳されることができ、ならびに、限定されるものでないがカエル卵母細胞への微小注入を挙げることができる細胞に基づく系で効率的に翻訳されることができ、カエル卵母細胞中への微小注入が一般に好ましい。
【００４４】
至適レベルのヒトＢＮａＣ４活性および／もしくはヒトＢＮａＣ４タンパク質を生じさせるヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡ配列を決定するために、限定されるものでないが以下すなわち
遺伝子名      開始コドン    終止コドン    総塩基対
ＢＮａＣ４    １６５        １７８５      １６２０
（これらの数字は、最初のメチオニンの最初のヌクレオチドおよび最初の終止コドンの前の最後のヌクレオチドに対応する）を挙げることができるヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡ分子、ならびにヒトＢＮａＣ４タンパク質をコードするｃＤＮＡの部分を含有するいくつかの構築物を構築することができる。全部の構築物は、ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡの５’もしくは３’非翻訳領域を含有しないか、その全部もしくは部分を含有するよう設計することができる。ヒトＢＮａＣ４活性およびタンパク質発現のレベルを、適切な宿主細胞中へのこれらの構築物の単独でおよび組み合わせの双方での導入後に測定することができる。一過性アッセイでの至適の発現を生じさせるヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡカセットの決定後に、このヒトＢＮＡＣ４  ＤＮＡ構築物を、限定されるものでないが哺乳動物細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を挙げることができる宿主細胞中での発現のため、多様な発現ベクターに移す。
ヒトＢＮａＣ４のアッセイ方法
宿主細胞トランスフェクション体および微小注入された卵母細胞を使用して、以下の方法により機能的ヒトＢＮａＣ４活性のレベルおよび総ヒトＢＮａＣ４タンパク質のレベルの双方をアッセイしてよい。組換え宿主細胞の場合、これはヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡをコードする１種もしくはそれ以上のフラグメント、サブユニット、または他の機能的遺伝子を含有する１個またはおそらく２個もしくはそれ以上のプラスミドのコトランスフェクションを必要とする。卵母細胞の場合、これはヒトＢＮａＣ４タンパク質の合成ＲＮＡの共注入を必要とする。発現を見込むための適切な時間の期間の後に、細胞タンパク質を例えば３５Ｓ−メチオニンで２４時間、代謝的に標識し、その後、細胞ライセートおよび細胞培養上清を収穫し、そしてヒトＢＮＡＣ４タンパク質に対し向けられたポリクローナル抗体を用いるの免疫沈降にかける。あるいは、組換えＢＮａＣ４を発現する細胞を電気生理学的分析にかけて、細胞膜を横切るナトリウムイオン（Ｎａ＋）の総流入を、パッチクランプ膜電位技術ならびに膜近位電位感受性色素を包含する当業者により公知かつ本明細書に記述される技術を使用して電位差として測定する。ＢＮａＣ４の適正な機能に影響を及ぼす化合物は、Ｎａチャンネルを開放する能力を増大もしくは減少させるかもしれず、Ｎａ流入の速度を増大もしくは減少させる（従って膜電位の変化に影響を及ぼす）かもしれず、チャンネルの脱感作もしくは再感作の速度を増大もしくは減少させるかもしれない。構成的に機能的な組換えＢＮａＣ４を発現するなおさらなる細胞は細胞の生存率を減少させ、かように試験化合物が該チャンネルの機能に特異的に拮抗するかどうかの生存率に基づく決定方法を形成する。チャンネルに拮抗する化合物は細胞死の速度を低下させることができ、そして従ってより大きな生存率を増進する。ＢＮａＣ４の推測される調節物質に関連して本明細書で使用されるところの「試験化合物」という用語は、ＢＮａＣ４の特異的イオンチャンネル活性を混乱させる潜在能力を有する有機分子を指す。例えば、しかし本発明の範囲を制限するためでなく、化合物は、小型の有機分子、合成もしくは天然のアミノ酸ペプチド、タンパク質、または合成もしくは天然の核酸配列、あるいは前述のもののいかなる化学的誘導体も包含してよい。
【００４５】
宿主細胞中のヒトＢＮａＣ４タンパク質のレベルは免疫親和性および／もしくはリガンド親和性技術により定量する。ヒトＢＮａＣ４特異的親和性ビーズもしくはヒトＢＮａＣ４特異的抗体を使用して、例えば３５Ｓ−メチオニン標識されたもしくは未標識のヒトＢＮａＣ４タンパク質を単離する。標識されたヒトＢＮａＣ４タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。未標識のヒトＢＮａＣ４タンパク質は、ヒトＢＮａＣ４特異的抗体を使用するウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡアッセイにより検出する。
【００４６】
ヒトＢＮａＣ４活性の他の検出方法は、ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた全細胞もしくはヒトＢＮａＣ４  ｍＲＮＡを注入された卵母細胞中でのヒトＢＮａＣ４活性の直接測定を必要とする。ヒトＢＮａＣ４活性は、ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡを発現する宿主細胞の特異的リガンド結合もしくは生物学的特徴により測定する。ヒトＢＮａＣ４を発現する組換え宿主細胞の場合、パッチ膜電位固定技術を使用して、チャンネル活性を測定しかつヒトＢＮａＣ４タンパク質を定量することができる。卵母細胞の場合、パッチクランプならびに二電極膜電位固定技術を使用して、ナトリウムチャンネル活性を測定しかつヒトＢＮａＣ４タンパク質を定量することができる。
細胞に基づくアッセイ
本発明はヒトＢＮａＣ４の化合物調節を検出するための全細胞の方法を提供する。該方法は、段階；
１）試験化合物および機能的ヒトＢＮａＣ４を含有する細胞を接触させること、ならびに
２）試験化合物による改変されたヒトＢＮａＣ４機能に応答しての細胞中の変化を測定すること
を含んで成る。
【００４７】
化合物との細胞の接触に必要な時間の量は、例えば既知のヒトＢＮａＣ４調節物質を用いて時間経過を実施すること、および細胞の変化を時間の関数として測定することにより経験的に決定する。
【００４８】
本発明の方法の測定手段は、ある化合物に曝露されていた細胞を、該化合物に同様に曝露されていなかった同一の細胞と比較することにより、さらに定義することができる。あるいは、２種の細胞（機能的ヒトＢＮａＣ４を含有する一方および第一のものに同一だがしかし機能的ヒトＢＮａＣ４を欠く第二の細胞）を双方とも同一の化合物と接触させかつ該２種の細胞間の差異を比較することができる。この技術はまたこれらのアッセイのバックグラウンドノイズの確立においても有用である。当業者は、これらの制御機構が、機能的ヒトＢＮａＣ４の調節に応答する細胞の変化の容易な選択もまた可能にすることを認識するであろう。
【００４９】
「細胞」という用語は最低１個の細胞を指すが、しかし該検出方法の感度に適切な複数の細胞を包含する。本発明に適する細胞は細菌、酵母もしくは真核生物であってよい。
【００５０】
機能的ヒトＢＮａＣ４の化合物調節を決定するためのアッセイ方法は、慣習的な実験室の形式にあることができるか、もしくは高スループットに適合させることができる。「高スループット」という用語は、複数のサンプルの容易な分析を同時に、およびロボット操作の能力を可能にするアッセイの設計を指す。高スループットアッセイの別の所望の特徴は、試薬の使用を低下させる、もしくは所望の分析を達成するための操作の数を最小限にするよう至適化されているアッセイの設計である。アッセイ形式の例は、９６穴もしくは３８４穴プレート、浮揚液滴、および液体を取り扱う実験に使用される「ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ」マイクロチャンネルチップを包含する。プラスチック型の小型化および液体取扱い装置が進歩したため、もしくは改良されたアッセイ装置が設計されているため、本発明の設計を使用してより多数のサンプルを実施してよいことが、当業者により公知である。
【００５１】
本発明の方法に適する細胞の変化は、ヒトＢＮａＣ４の機能もしくは量の変化を直接測定すること、あるいは例えば二次メッセンジャーの濃度もしくは転写の変化を測定することにより、またはヒトＢＮａＣ４により転写的に影響される遺伝子のタンパク質レベルの変化により、または細胞中の表現型の変化を測定することにより、ヒトＢＮａＣ４機能の下流の影響を測定することによりを含んで成る。好ましい測定手段は、ヒトＢＮａＣ４タンパク質の量の変化、ヒトＢＮａＣ４の機能的活性の変化、ｍＲＮＡの量の変化、細胞内タンパク質の変化、細胞表面タンパク質もしくは分泌型タンパク質の変化、またはＣａ＋２、ｃＡＭＰもしくはＧＴＰ濃度の変化を包含する。ヒトＢＮａＣ４の量もしくは機能的活性の変化を本明細書に記述する。ｍＲＮＡのレベルの変化は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）もしくは示差的遺伝子発現により検出する。免疫親和性、リガンド親和性もしくは酵素測定は、宿主細胞中の特定のタンパク質のレベルのＢＮａＣ４に誘導された変化を定量する。タンパク質が酵素である場合、タンパク質の誘導は蛍光発生性もしくは比色分析の基質の切断によりモニターする。
【００５２】
細胞表面タンパク質のための好ましい検出手段はフローサイトメトリーもしくは統計学的細胞画像化を包含する。双方の技術において、目的のタンパク質は細胞表面に局在化されており、特異的蛍光プローブで標識され、そして細胞の蛍光の程度を介して検出される。フローサイトメトリーにおいては細胞を溶液中で分析する一方、細胞画像化技術においては細胞の野を相対的蛍光について比較する。
【００５３】
本発明はまた、ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現ならびにインビボでのヒトＢＮＡＣ４タンパク質の機能を調節する化合物のスクリーニング方法にも向けられる。化合物は、ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒトＢＮａＣ４タンパク質の機能を増大もしくは減弱することにより調節するかもしれない。ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現またはヒトＢＮａＣ４タンパク質の機能を調節する化合物を、多様なアッセイにより検出してよい。アッセイは、発現もしくは機能に変化が存在するかどうかを決定する単純な「はい／いいえ（ｙｅｓ／ｎｏ）」アッセイであってよい。アッセイは、試験サンプルの発現もしくは機能を標準サンプル中の発現もしくは機能のレベルと比較することにより定量的にしてよい。この方法で同定された調節物質は治療薬として有用であり、そしてヒトＢＮａＣ４。
ヒトＢＮａＣ４タンパク質の精製
組換え宿主細胞中でのヒトＢＮａＣ４の発現後に、ヒトＢＮａＣ４タンパク質を回収して精製されたヒトＢＮａＣ４を提供することができる。組換えヒトＢＮａＣ４は、細胞ライセートおよび抽出物から、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ならびに抗体／リガンド親和性クロマトグラフィーの多様な組み合わせもしくは個々の適用により精製してよい。
【００５４】
組換えヒトＢＮａＣ４は、完全長の新生ヒトＢＮａＣ４、ヒトＢＮａＣ４のポリペプチドフラグメントもしくはヒトＢＮａＣ４のサブユニットに特異的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を用いて作成された免疫親和性カラムの使用により、他の細胞タンパク質から分離することができる。親和性樹脂はその場合、適する緩衝液、例えばリン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、そしてヒトＢＮａＣ４もしくはヒトＢＮａＣ４のサブユニットを含有する細胞培養上清もしくは細胞抽出物を、該カラムをゆっくりと通過させる。その後、光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドに下落するまで、カラムを緩衝液で洗浄し、その後、０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）のような緩衝液を使用してｐＨを低下させることによるような、緩衝液条件を変化させることにより、タンパク質を溶出する。その後、精製されたヒトＢＮＡＣ４タンパク質を、リン酸緩衝生理的食塩水のような適する緩衝液に対して透析する。
ヒトＢＮａＣ４に結合する抗体の産生および使用
ヒトＢＮａＣ４に対する単一特異性抗体は、ヒトＢＮａＣ４に対し反応性の抗体を含有する哺乳動物の抗血清から精製するか、もしくは元はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）により記述された技術を使用してヒトＢＮａＣ４と反応性のモノクローナル抗体として製造する。免疫学的技術は当該技術分野で公知であり、かつ、例えばコールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーにより出版されたＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、ＩＳＢＮ  ０８７９６９３１４２に記述されている。本明細書で使用されるところの単一特異性抗体は、ヒトＢＮａＣ４に対する均質な結合の特徴をもつ単一抗体種もしくは複数の抗体種と定義する。本明細書で使用されるところの均質な結合は、上述されたところのヒトＢＮａＣ４に伴うもののような特異的抗原もしくはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。ヒトＢＮａＣ４特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマなどのような動物（ウサギが好ましい）を、免疫アジュバントを伴いもしくは伴わずのいずれかで適切な濃度のヒトＢＮａＣ４で免疫化することにより生じさせる。
【００５５】
免疫前血清を最初の免疫感作前に収集する。各動物は、許容できる免疫アジュバントを伴う約０．００１ｍｇと約１０００ｍｇとの間のヒトＢＮａＣ４を受領する。こうした許容できるアジュバントは、限定されるものでないがフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、明礬沈殿物、コリネバクテリウム  パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）およびｔＲＮＡを含有する油中水型乳剤を挙げることができる。初期免疫感作は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）もしくは双方のいずれかの複数の部位での好ましくはフロイントの完全アジュバント中のヒトＢＮａＣ４より成る。各動物を一定の間隔で（好ましくは毎週）採血して抗体力価を測定する。動物は、初期免疫感作後に追加抗原注入を受領してももしくはしなくてもよい。追加抗原注入を受領する動物には、一般に、同一経路によりフロイントの不完全アジュバント中の等量の抗原を投与する。追加抗原注入は最大力価が得られるまで約３週間隔で投与する。各追加抗原免疫感作の約７日後、もしくは単一免疫感作後ほぼ毎週、動物を採血し、血清を収集し、そしてアリコートを約−２０℃で保存する。
【００５６】
ヒトＢＮａＣ４と反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウス（好ましくはＢａｌｂ／ｃ）をヒトＢＮａＣ４で免疫化することにより製造する。マウスは、等容量の上で論考されたところの許容できるアジュバント中に組み込まれた約０．１ｍｌの緩衝液もしくは生理的食塩水中の約０．００１ｍｇないし約１．０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇのヒトＢＮａＣ４で、ＩＰもしくはＳＣ経路により免疫化する。フロイントのアジュバントが好ましく、フロイントの完全アジュバントを初期免疫感作に使用し、そしてフロイントの不完全アジュバントをその後使用する。マウスは第０日に初期免疫感作を受領し、そして約２ないし約３０週間休ませる。免疫化されたマウスに、静脈内（ＩＶ）経路により、リン酸緩衝生理的食塩水のような緩衝溶液中の約０．００１ないし約１．０ｍｇのヒトＢＮＡＣ４の１回もしくはそれ以上の追加抗原免疫感作を投与する。抗体陽性マウスからのリンパ球（好ましくは脾リンパ球）を、当該技術分野で既知の標準的手順により免疫化されたマウスから脾を取り出すことにより得る。ハイブリドーマ細胞を、安定なハイブリドーマの形成を可能にすることができる条件下で脾リンパ球を適切な融合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と混合することにより産生させる。融合パートナーは、限定されるものでないが：マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０を挙げることができ、Ｓｐ２／０が一般に好ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞は、約３０％から約５０％までの濃度のポリエチレングリコール（分子量約１０００）中で融合させる。融合されたハイブリドーマ細胞を、当該技術分野で既知の手順によりヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリン補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での増殖により選択する。上清液をほぼ第１４、１８および２１日に増殖陽性のウェルから収集し、そしてヒトＢＮａＣ４を抗原として使用する固相免疫放射アッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイにより抗体産生についてスクリーニングする。培養液は、オークターロニー沈降アッセイでもまた試験して、ｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性のウェルからのハイブリドーマ細胞は、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９７３中のＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅの軟寒天技術のような技術により、もしくは限界希釈の技術によりクローン化する。
【００５７】
モノクローナル抗体は、初回抗原刺激後最低約４日に、約１×１０６ないし約６×１０６個のハイブリドーマ細胞での、プリスタンで初回抗原刺激されたＢａｌｂ／ｃマウスの注入（マウスあたりおよそ０．５ｍｌ）によりインビボで産生させる。腹水を細胞移入後およそ８〜１２日に収集し、そしてモノクローナル抗体を当該技術分野で既知の技術により精製する。
【００５８】
抗ヒトＢＮａＣ４  ｍＡｂのインビトロ産生は、当該技術分野で公知の組織培地中でハイブリドーマを増殖させることにより実施する。高密度のインビトロ細胞培養を実施して、当該技術分野で公知の中空ファイバー培養技術、エアリフト反応器、ローラーボトルもしくは攪拌フラスコ培養技術を使用して、大量の抗ヒトＢＮａＣ４  ｍＡｂを産生させてよい。ｍＡｂは当該技術分野で既知の技術により精製する。
【００５９】
腹水もしくはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、限定されるものでないが沈降法、受動的凝集反応、酵素結合免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）技術およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を挙げることができる多様な血清学的もしくは免疫学的アッセイにより測定する。類似のアッセイを使用して、体液もしくは組織および細胞抽出物中のヒトＢＮａＣ４の存在を検出する。
【００６０】
単一特異性抗体の上述された製造方法は、ヒトＢＮａＣ４ポリペプチドフラグメント、もしくは完全長の新生ヒトＢＮａＣ４ポリペプチド、もしくは個々のヒトＢＮａＣ４のサブユニットに特異的な抗体を製造するのに利用することができることが、当業者に容易に明らかである。とりわけ、ただ１種のヒトＢＮａＣ４のサブユニットもしくは完全に機能性のヒトＢＮａＣ４タンパク質に特異的である単一特異性抗体が生成されるかもしれないことが、当業者に容易に明らかである。ヒトＢＮａＣ４タンパク質の正常な機能を阻害する単一特異性抗体が生成さされるかもしれないこともまた当業者に明らかである。
【００６１】
ヒトＢＮａＣ４抗体親和性カラムは、抗体がゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようなゲル支持体に抗体を付加することにより作成する。好ましい共有結合は、抗体上に含有されるアミン、アルデヒドもしくはスルフヒドリル残基により作成される。抗体上でのアルデヒドもしくは遊離のスルフヒドリル基の生成方法は当該技術分野で公知であり；アミン基は例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応性である。
ヒトＢＮａＣ４特異的試薬を含有するキット組成物
ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ヒトＢＮａＣ４に対する抗体、またはヒトＢＮａＣ４タンパク質を含有するキットを製造してよい。こうしたキットは、ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出するため、またはサンプル中のヒトＢＮａＣ４タンパク質もしくはペプチドフラグメントの存在を検出するために使用する。こうした特徴づけは、限定されるものでないが法廷の分析、診断の応用および疫学的研究を挙げることができる多様な目的上有用である。
【００６２】
本発明は診断試薬としての使用のためのヒトＢＮａＣ４ポリヌクレオチドの使用に関する。機能不全に関連する突然変異された形態のヒトＢＮａＣ４遺伝子の検出は、ヒトＢＮａＣ４の過小発現もしくは過剰発現から生じる疾患もしくはそうした疾患に対する感受性の診断に付加するもしくはそれを定義することができる診断ツールを提供することができる。ヒトＢＮＡＣ４遺伝子中に突然変異を担持する個体を、当該技術分野で公知かつ本明細書に記述される多様な技術によりＤＮＡレベルで検出してよい。
【００６３】
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体を使用して、ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡ、ヒトＢＮａＣ４  ＲＮＡもしくはヒトＢＮａＣ４タンパク質をスクリーニングかつそれらのレベルを測定してよい。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、ヒトＢＮａＣ４の検出および型分類に適するキットの製剤に役立つ。こうしたキットは、最低１個の容器中の緊密な制限中に入れることができるのに適する区画化された担体を含むことができる。担体は、ヒトＢＮａＣ４を検出するのに適する組換えヒトＢＮａＣ４タンパク質もしくは抗ヒトＢＮａＣ４抗体のような試薬をさらに含むことができる。担体はまた、標識された抗原もしくは酵素基質などのような検出のための手段も含有してよい。
遺伝子治療
ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列をアンチセンス療法のため合成することができる。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのようなＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡのようなＲＮＡの安定な誘導体、または他のヒトＢＮａＣ４アンチセンスオリゴヌクレオチド模倣物であってよい。ヒトＢＮａＣ４アンチセンス分子は、微小注入法、リポソーム被包化により、もしくはアンチセンス配列をもつベクターからの発現により細胞中に導入してよい。ヒトＢＮａＣ４アンチセンス療法は、ヒトＢＮａＣ４活性を低下させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。
【００６４】
ヒトＢＮａＣ４遺伝子治療は、標的生物体の細胞中にヒトＢＮａＣ４を導入するのに使用してよい。ヒトＢＮａＣ４遺伝子は、レシピエントの宿主細胞の感染によるヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡの移入を媒介するウイルスベクターに連結することができる。適するウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを包含する。あるいは、ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ複合物もしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合物を使用するレセプターに媒介される標的を定められたＤＮＡ移入、リポフェクション膜融合、または直接微小注入法を包含する非ウイルス技術により、遺伝子治療のため細胞中に移入することができる。これらの手順およびそれらの変形物は、エクスビボならびにインビボのヒトＢＮａＣ４遺伝子治療に適する。ヒトＢＮａＣ４遺伝子治療は、ヒトＢＮａＣ４活性を上昇させることが有益である疾患の治療にとりわけ有用であるかもしれない。ヒトＢＮａＣ４遺伝子とともにの使用に適する遺伝子治療の分子方法論のプロトコルは、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｐａｕｌ  Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓにより編、ヒューマン  プレス（Ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州トタワ、１９９６に記述される。
製薬学的組成物
ヒトＢＮａＣ４  ＤＮＡ、ヒトＢＮａＣ４  ＲＮＡもしくはヒトＢＮａＣ４タンパク質、またはヒトＢＮａＣ４レセプター活性の調節物質を含んで成る製薬学的に有用な組成物を、製薬学的に許容できる担体の混合状態によるような既知の方法に従って処方してよい。こうした担体および処方方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。効果的な投与に適する製薬学的に許容できる組成物を形成するために、こうした組成物は、有効量のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくは調節物質を含有することができる。
【００６５】
本発明の治療用もしくは診断用組成物は、ヒトＢＮａＣ４関連の活性の調節が指示される障害を治療もしくは診断するのに十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の病状、体重、性別および齢のような多様な因子によって変動するかもしれない。他の因子は投与様式を包含する。製薬学的組成物は、皮下、局所、経口および筋肉内のような多様な経路により個体に提供してよい。
【００６６】
「化学的誘導体」という用語は、通常は基本分子の一部でない付加的な化学的部分を含有する分子を記述する。こうした部分は基本分子の溶解性、半減期、吸収などを向上させるかもしれない。あるいは、該部分は、基本分子の望ましくない副作用を減弱させるかもしくは基本分子の毒性を低下させるかもしれない。こうした部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような多様な教科書に記述されている。
【００６７】
本明細書に開示される方法により同定される化合物は、いかなる潜在的な毒性も最小限にしつつ、ヒトＢＮａＣ４レセプターもしくはその活性の至適の阻害を得るために、慣例の試験により定義された適切な投薬量で単独で使用してよい。加えて、他の作用物質の共投与もしくは連続投与が望ましいかもしれない。
【００６８】
本発明はまた、本発明の新規治療方法における使用のための適する局所、経口、全身および非経口の製薬学的製剤を提供することという目的も有する。ヒトＢＮａＣ４の調節における使用のための有効成分として本発明により同定された化合物もしくは調節物質を含有する組成物は、投与のための慣習的なベヒクル中の広範な治療的投薬形態で投与することができる。例えば、該化合物もしくは調節物質は、錠剤、カプセル剤（それぞれ調時性放出および持続性放出製剤を包含する）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁剤、シロップ剤および乳剤のような経口投薬形態で、もしくは注入により投与することができる。同様に、それらはまた、静脈内（ボーラスおよび注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）の双方）、腹腔内、皮下、閉塞を伴うもしくは伴わない局所、または筋肉内の形態で投与してもよく、全部は製薬学的技術の当業者に公知の形態を使用する。有効しかし非毒性の量の所望の化合物は、ヒトＢＮａＣ４調節剤として使用することができる。
【００６９】
生成物の１日投薬量は、患者あたり１日あたり０．０１から１，０００ｍｇまでの幅広い範囲にわたって変動してよい。経口投与のためには、組成物は、治療されるべき患者に対する投薬量の症候的調節のため、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０および５０．０ミリグラムの有効成分を含有する割線付きもしくは割線を付けられない錠剤の形態で好ましく提供される。薬物の有効量は、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重までの投薬量レベルで通常供給される。範囲は、より具体的には、１日あたり約０．００１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重までである。所望の効果を達成するよう組み合わせられる場合に、ヒトＢＮａＣ４レセプター調節物質の投薬量を調節する。他方、これらの多様な作用物質の投薬量は相乗的結果を達成するために独立に至適化しかつ組み合わせてよく、ここで、病状は、いずれかの作用物質を単独で使用した場合にそれがなることができたよりも低減される。
【００７０】
有利には、本発明の化合物もしくは調節物質は単一の１日用量で投与してよいか、または、総１日投薬量を１日２、３もしくは４回の分割された用量で投与してよい。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、適する鼻内ベヒクルの局所使用を介して鼻内の形態で、もしくは当業者に公知の経皮皮膚貼付剤の形態を使用して経皮経路を介して、投与することができる。経皮送達系の形態で投与されるためには、投薬量の投与はもちろん、投薬レジメンを通じて間欠的よりはむしろ継続的であることができる。
【００７１】
有効成分が別個の投薬製剤中にある１種以上の有効成分での組み合わせ治療のためには、有効成分は同時に投与することができるか、もしくはそれらのそれぞれは別個に差をつけられた時間で投与することができる。
【００７２】
本発明の化合物もしくは調節物質を利用する投薬レジメンは、患者の型、種、齢、体重、性別および医学的状態；治療されるべき病状の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；ならびに使用されるその特定の化合物を包含する多様な因子に従って選択する。通常の熟練の医師もしくは獣医師は、該病状の進行を予防、阻止もしくは停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定かつ処方することができる。毒性なしに有効性を生じさせる範囲内の薬物の濃度の達成における至適の精度は、標的部位への薬物の利用可能性の動力学に基づくレジメンを必要とする。これは、薬物の分布、平衡および排泄の考慮を必要とする。
【００７３】
本発明の方法において、本明細書に詳細に記述される化合物もしくは調節物質は、有効成分を形成することができ、そして、意図される投与形態（すなわち経口の錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤など）に関して適して選択されかつ慣習的製薬学的実務と矛盾しない、適する製薬学的希釈剤、賦形剤もしくは担体（集合的に本明細書で「担体」材料と称される）との混合状態で典型的に投与される。
【００７４】
例えば、錠剤もしくはカプセル剤の形態での経口投与のために、有効成分を、エタノール、グリセロール、水などのような経口の非毒性の製薬学的に許容できる不活性担体と組み合わせることができる。さらに、所望のもしくは必要な場合は、適する結合剤、滑沢剤、崩壊剤および着色剤もまた混合物に組み込むことができる。適する結合剤は、制限なしに、デンプン、ゼラチン、ブドウ糖もしくはβ−乳糖のような天然の糖、トウモロコシ甘味料、アアラビアゴム、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウムのような天然および合成のガム、カルボキシメチルルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋などを包含する。これらの投薬形態で使用される滑沢剤は、制限なしに、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどを包含する。崩壊剤は、制限なしに、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどを包含する。
【００７５】
液体の形態については、有効成分は、合成および天然のガム、例えばトラガカント、アラビアゴム、メチルセルロースなどのような適して香味をつけられた懸濁化剤もしくは分散剤を組み合わせることができる。使用してよい他の分散剤はグリセリンなどを包含する。非経口投与のためには滅菌の懸濁剤および溶液が望ましい。適する保存剤を一般に含有する等張の製剤は、静脈内投与が望ましい場合に使用する。
【００７６】
有効成分を含有する局所製剤は、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡおよびＥ油、鉱物油、ＰＰＧ２ミリスチルプロピオネートなどのような当該技術分野で公知の多様な担体材料と混合して、例えばアルコール性溶液、局所浄化剤、浄化用クリーム剤、皮膚ゲル剤、皮膚ローション剤およびクリームもしくはゲル製剤のシャンプー剤を形成することができる。
【００７７】
本発明の化合物もしくは調節物質はまた、小型の単層小胞、大型の単層小胞および多層小胞のようなリポソーム送達系の形態でも投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンもしくはホスファチジルコリンのような多様なリン脂質から形成することができる。
【００７８】
本発明の化合物はまた、化合物分子が結合される個別の担体としてのモノクローナル抗体の使用によっても送達してよい。本発明の化合物もしくは調節物質は、標的を定めることができる薬物担体としての可溶性ポリマーと結合してもまたよい。こうしたポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、もしくはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンを包含することができる。さらに、本発明の化合物もしくは調節物質は、薬物の制御放出の達成において有用な一分類の生物分解可能なポリマー、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋もしくは両親媒性ブロックコポリマーに結合してよい。
【００７９】
経口投与のためには、該化合物もしくは調節物質をカプセル剤、錠剤もしくはボーラスの形態で投与してよいか、あるいは、それらを動物飼料に混合することができる。カプセル剤、錠剤およびボーラスは、デンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウムもしくはリン酸二カルシウムのような適切な担体ベヒクルと組み合わせの有効成分より構成される。これらの単位投与剤形は、均一な混合物が得られるような希釈剤、増量剤、崩壊剤および／もしくは結合剤を包含する適する微細に粉末にされた不活性成分と有効成分を緊密に混合することにより製造する。不活性成分は、化合物もしくは調節物質と反応することができずかつ治療されている動物に対し非毒性であるものである。適する不活性成分は、デンプン、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性ガムおよび油などを包含する。これらの製剤は、治療されるべき動物種の大きさおよび型、ならびに感染の型および重症度のような多数の因子に依存して広範に変動可能な量の有効成分および不活性成分を含有してよい。有効成分はまた、飼料と化合物を単に混合すること、もしくは飼料の表面に化合物を塗布することにより、飼料への添加物として投与してもよい。あるいは、有効成分は不活性担体と混合してよく、そしてその後、生じる組成物を飼料と混合してよいかもしくは動物に直接食べさせてよいかのいずれかである。適する不活性担体は、コーンミール、シトラスミール、醗酵残渣、粗挽きダイズ、乾燥穀類などを包含する。最終組成物が０．００１から５重量％までの有効成分を含有するような細砕、攪拌、微粉砕もしくは混転することにより、有効成分をこれらの不活性担体と緊密に混合する。
【００８０】
該化合物もしくは調節物質は、あるいは、不活性液体担体に溶解された有効成分より成る製剤の注入を介して非経口で投与してよい。注入は筋肉内、第一胃内、気管内もしくは皮下のいずれかであってよい。注入可能な製剤は適切な不活性液体担体と混合された有効成分より成る。許容できる液体担体は、ラッカセイ油、綿実油、ゴマ油などのような植物油、ならびにソルケタール、グリセロールホルマルなどのような有機溶媒を包含する。一代替として、水性の非経口製剤もまた使用してよい。植物油が好ましい液体担体である。該製剤は、最終製剤が０．００５から１０重量％までの有効成分を含有するような液体担体中に有効成分を溶解もしくは懸濁することにより製造する。
【００８１】
該化合物もしくは調節物質の局所適用は、本化合物もしくは調節物質を水性溶液もしくは懸濁液として含有する液体の飲薬もしくはシャンプー剤の使用により可能である。これらの製剤は、一般に、ベントナイトのような懸濁化剤を含有し、そして通常は消泡剤もまた含有することができる。０．００５から１０重量％までの有効成分を含有する製剤が許容できる。好ましい製剤は、０．０１から５重量％までの本化合物もしくは調製物質を含有するものである。
【００８２】
以下の実施例は、しかしながらそれにそれを制限することなしに本発明を具体的に説明する。
実施例１  ヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリーの生成
ｃＤＮＡ合成：
第一鎖の合成：ｃＤＮＡ合成キット（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用してｃＤＮＡを合成するのに、およそ５μｇのヒト胸腺ｍＲＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。２マイクロリットルのＮｏｔ１プライマーアダプターを５μｌのｍＲＮＡに添加し、そして混合物を７０℃に１０分間加熱しかつ氷上に置いた。以下の試薬、すなわち４μｌの５×第一鎖緩衝液（２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ヌクレオチド三リン酸）混合物および１μｌのＤＥＰＣ処理水を、氷上で添加した。反応を４２℃で５分間インキュベートした。最後に、５μｌのスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＲＴ  ＩＩを添加し、そして４２℃でさらに２時間インキュベートした。反応を氷上で終了させた。
第二鎖の合成：第一鎖の産物を水で９３μｌに調節し、そして以下の試薬、すなわち３０μｌの５×第二鎖緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．９）、４５０ｍＭ  ＫＣｌ、２３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）、３μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ヌクレオチド三リン酸）、１μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（１０単位）１μｌのＲＮアーゼＨ（２単位）、４μｌのＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ（１０単位）を氷上で添加した。反応を１６℃で２時間インキュベートした。第二鎖の合成からのＤＮＡをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、そして１６℃に置いてＤＮＡ端を平滑化した。二本鎖ｃＤＮＡを１５０μｌのフェノールおよびクロロホルムの混合物（１：１、ｖ：ｖ）で抽出し、そして０．５容量の７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃおよび２容量の無水エタノールで沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして３７℃で乾燥して残余のエタノールを除去した。二本鎖ＤＮＡペレットを２５μｌの水に再懸濁し、そして、以下の試薬；１０μｌの５×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、１０μｌのＳａｌ１アダプターおよび５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加した。成分を穏やかに混合し、そして１６℃で一夜連結させた。連結混合物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、徹底的にボルテックス攪拌し、そして１４，０００×ｇで室温で５分間遠心分離して層を分離した。水層を新たなチューブに移し、そして水で容量を１００ｍｌに調節した。精製されたＤＮＡを、クロマスピン１０００カラム（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））上で大きさ選択して、より小さいｃＤＮＡ分子を除外した。二本鎖ＤＮＡをＮｏｔ１制限酵素で３７℃で３〜４時間消化した。制限消化物を０．８％低溶融アガロースゲル上で電気泳動した。１〜５ｋｂの範囲のｃＤＮＡを切り出し、そしてゲルザイム（Ｇｅｌｚｙｍｅ）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して精製した。生成物をフェノール：クロロホルムで抽出し、そしてＮＨ４ＯＡｃおよび無水エタノールで沈殿させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄しそして１０ｍｌの水に再懸濁した。
ベクターへのｃＤＮＡの連結：ｃＤＮＡを５本のチューブに分割し（各２μｌ）、そして、４．５μｌの水、２μｌの５×連結緩衝液、１μｌのｐ−ＳｐｏｒｔベクターＤＮＡ（Ｓａｌ−１／Ｎｏｔ１で切断されかつホスファターゼ処理された）および０．５μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加することにより、連結反応を開始した。連結を４０℃で一夜インキュベートした。
電気穿孔法による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）への連結されたｃＤＮＡの導入：
連結反応容量を、水で２０μｌの総容量に調節した。５ミリリットルの酵母ｔＲＮＡ、１２．５ｍｌの７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃおよび７０ｍｌの無水エタノール（−２０℃）を添加した。混合物を徹底的にボルテックス攪拌し、そして直ちに１４０００×ｇで室温で２０分間遠心分離した。ペレットを７０％エタノール中で洗浄し、そして各ペレットを５ｍｌの水に再懸濁した。全５個の連結（２５ｍｌ）を合わせ、そして、１ｍｌのＤＮＡを用いて１００μｌのＤＨ１０Ｂ電気コンピテント細胞（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を電気穿孔し（全体で２０回の電気穿孔）、その後アンピシリンプレート上でプレート培養して、マイクロリットルあたりの組換え体の数（ｃｆｕ）を決定した。ライブラリー全体を２リットルのスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）中に接種し、そして、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマキシ  プレップ（Ｍａｘｉ  Ｐｒｅｐ）キットを使用して大スケール調製物（ｍａｘｉｐｒｅｐ）を作成し、かつ、塩化セシウム勾配上で精製した。
実施例２：ライブラリーのスクリーニング／ヒト胸腺ライブラリー：
ヒト胸腺ライブラリーの１マイクロリットルのアリコートを、エレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂ細胞（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に電気穿孔した。容量をＳＯＣ培地で１ｍｌに調節し、そして振とうしながら３７℃で４５分間インキュベートした。その後、ライブラリーを、ＬＢを含有する１５０ｃｍ２のプレート上で、プレートあたり１０，０００コロニーの密度までプレート培養した。これらの培養物を３７℃で一夜増殖させた。
【００８３】
ヒトＢＮａＣ４プローブは、長さが約４００塩基対の内的フラグメントを生成させたインサイト（Ｉｎｃｙｔｅ）クローン＃４５３２６９２の制限消化物により生成させた。（Ｘｈｏ１／ＢａｍＨ１）。
【００８４】
生じる４００ｂｐのフラグメントを１％アガロースゲル上で泳動し、そしてキアクイック（ＱＵＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を使用して精製した。約１００ｎｇの精製されたプローブを、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのオリゴ標識キットを使用してα３２Ｐで標識し、そして標識されたＤＮＡをＳ−２００カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））で精製した。
【００８５】
ライブラリーのコロニーを、プロトラン（Ｐｒｏｔｒａｎ）ニトロセルロースフィルター（シャイヒャー  アンド  シル（Ｓｃｈｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌ））上に持ち上げ、そしてＤＮＡを１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ中で変性させた。フィルター円盤を、１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１．０Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和し、そしてその後、ＵＶ−ストラタリンカー（ＵＶ−Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して膜にＵＶ架橋した。洗浄溶液（１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；５Ｍ  ＮａＣｌ；０．５Ｍ  ＥＤＴＡ；２０％  ＳＤＳ）中４２℃でフィルターを数回洗浄した。その後、５０％ホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌの剪断サケ精子ＤＮＡ（５’−３’  Ｉｎｃ）を含有する１×サザンプレハイブリダイゼーション緩衝液（５’−３’  Ｉｎｃ）中で、円盤を４２Ｃで６時間インキュベートした。最後に、標識されたプローブ（５×１０５ないし１×１０６ｃｍｐ／ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液）の存在下に５０％ホルムアミド、１００ｎｇの剪断サケ精子ＤＮＡを含有する１×ハイブリダイゼーション緩衝液（５’−３’）中、４２Ｃでハイブリダイゼーションを一夜実施した。
【００８６】
円盤を、２×ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中室温（各２０分）で２回、および０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中５０℃で３０分間１回洗浄した。その後、メンブレンを数枚の濾紙上に置き、サランラップで包み、そして−２０℃で一夜、フィルムに曝露した。
【００８７】
陽性のクローンを同定し、そして元のプレートからコロニーの芯を抜くことにより収集した。コロニーをＬＢ中３７℃で１時間インキュベートした。培養物の希釈物をＬＢ寒天プレート上にプレート培養し、そしてフィルターで持ち上げること（ｆｉｌｔｅｒ−ｌｉｆｔｉｎｇ）、ハイブリダイズすること、洗浄、コロニーを拾うことの手順を反復した。第二のスクリーニングからの個々のクローンを拾い、そしてＳａｌＩ／ＮｏｔＩで消化して挿入物の大きさを決定し、そして挿入物を配列決定した。
【００８８】
完全長のクローンを、鋳型としての１０ｎｇの配列決定されたライブラリークローン、ならびにＥｃｏＲ１（ＦＬ５’オリゴ  配列番号１）およびＮｏｔＩ（ＦＬ３’オリゴ  配列番号２）部位をもつ完全長のオリゴを使用したＰｆｕポリメラーゼを用いるＰＣＲにより生成させた。
ＦＬ５’オリゴ（配列番号１）：
５’ＡＡＣＧＴＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡＴＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＴＧＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴ３’
ＦＬ３’オリゴ：（配列番号２）：
５’ＡＡＣＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＣＡＡＧＣＡＡＡＡＴＣＴＴＣ３’
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１およびＮｏｔＩ酵素で消化し、そしてｐＺｅｏ／ｐＳＶ２発現ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびまたｐＧｅｍ  ＨＥにもクローン化した。ＤＮＡの大スケール調製を、メガ（ＭＥＧＡ）プレップキット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を使用して行った。
実施例３−哺乳動物発現ベクター中へのヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡのクローニング  ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＣＩ  Ｎｅｏにクローン化した。クローン化されたＰＣＲ産物をカラム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＰＣＲ  ＤＮＡ精製キット）上で精製し、そしてＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で消化して付着端を創製した。生成物を低溶融アガロースゲル電気泳動により精製した。ｐＣＩ  ＮｅｏベクターをＮｏｔ１およびＥｃｏＲ１酵素で消化し、そしてその後低溶融アガロースゲル上で精製した。直鎖状のベクターを使用してヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡ挿入物に連結した。ヒトＢＮａＣ４と呼称された組換え体を単離し、そして、エフェクティーン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）リポソーム脂質に基づかないトランスフェクションキット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を使用して哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−７もしくはＣＨＯ−Ｋ１細胞）をトランスフェクトするのに使用した。安定な細胞クローンをゼオシンの存在下での増殖により選択した。単一のゼオシン耐性クローンを単離し、そして無傷のヒトＢＮａＣ４遺伝子を含有することが示された。ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡを含有するクローンを、ｈＢＮａＣ４タンパク質発現について分析した。ヒトＢＮａＣ４をコードするＤＮＡを含有する組換えプラスミドを使用して、哺乳動物のＣＯＳもしくはＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞を形質転換した。
【００８９】
安定にもしくは一過性にヒトＢＮａＣ４を発現する細胞を使用して、電気生理学的および生存率アッセイを使用してヒトＢＮａＣ４の発現について試験した。これらの細胞を使用して、ヒトＢＮａＣ４を調節、阻害もしくは活性化するそれらの能力について他の化合物を同定かつ検査する。
【００９０】
プロモーターに関して正の向きにヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡを含有するカセットを、プロモーターの３’の適切な制限部位に連結し、そして制限部位地図作成および／もしくは配列決定により同定する。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、限定されるものでないが電気穿孔法もしくは化学的手順（陽イオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を挙げることができる標準的方法により、線維芽細胞性の宿主細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ１６５１）およびＣＶ−１  ｔａｔ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５（１９８７）］、２９３、Ｌ（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ６３６２）に導入する。トランスフェクトされた細胞および細胞培養上清を収穫し、そして本明細書に記述されるとおりヒトＢＮａＣ４発現について分析する。
【００９１】
哺乳動物の一過性発現に使用されるベクターの全部を、ヒトＢＮａＣ４を発現する安定な細胞系を樹立するのに使用することができる。発現ベクター中にクローン化された、変えられていないヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡ構築物は、ヒトＢＮａＣ４タンパク質を作成するように宿主細胞をプログラムすると期待される。トランスフェクション宿主細胞は、限定されるものでないがＣＶ−１−Ｐ［Ｓａｃｋｅｖｉｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１５７５（１９８７）］、ｔｋ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒら  Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７）］、ＮＳ／０およびｄＨＦｒ−ＣＨＯ［ＫａｕｆｍａｎとＳｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１、（１９８２）］を挙げることができる。
【００９２】
限定されるものでないがＧ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ヒグロマイシン、ヒグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを挙げることができる薬物選択プラスミドとの、ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡを含有するいずれかのベクターのコトランスフェクションは、安定にトランスフェクトされたクローンの選択を見込むことができる。ヒトＢＮａＣ４のレベルは本明細書に記述されるアッセイにより定量する。
【００９３】
ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡ構築物はまた、最高の可能なレベルのヒトＢＮａＣ４を合成する哺乳動物細胞クローンの産生のための増幅可能な薬物耐性マーカーを含有するベクターにも連結される。細胞中へのこれらの構築物の導入後に、該プラスミドを含有するクローンを適切な作用物質で選択し、そして増大する用量の作用物質中での選択により、高コピー数のプラスミドをもつ過剰発現クローンの単離を達成する。
【００９４】
組換えヒトＢＮａＣ４の発現は、哺乳動物宿主細胞中への完全長のヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡのトランスフェクションにより達成される。
実施例４
ｃＤＮＡライブラリー中のヒトＢＮａＣ４の分布。
【００９５】
ＢＮａＣ４  ｍＲＮＡの組織分布を半定量的ＰＣＲにより測定した。ＢＮａＣ４に特異的なプライマーの組（ＧＣＴＴＣＣＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣ［配列番号３］；ＣＡＧＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧ［配列番号４］）を使用して、構築されたライブラリーからのｃＤＮＡを使用するＰＣＲを介してＢＮａＣ４  ｍＲＮＡの一部分の増幅を完了した（実施例１を参照されたい）。増大された特異性および感受性を獲得するために、オリゴヌクレオチド（ＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＡＣＴＣＧＧＣＣＴＡＣＡ［配列番号５］）を、製造元（アマーシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）により記述されたとおりポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−３２Ｐ−ＡＴＰを使用してリン酸化し、そして変性されたＰＣＲ産物にアニーリングし、かつ６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。その後、その後のゲルを乾燥しかつ画像化した（ホスホルイメジャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）４４５ＳＩ、モレキュラー  ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ））。
【００９６】
図８に示されるとおり、ＰＣＲに基づく組織分布分析は、ＢＮａＣ４  ｍＲＮＡが、ヒト大脳皮質、視床、下垂体、脊髄、海馬、視床下部、小腸、ＤＲＧおよび小脳から構築されたｃＤＮＡライブラリー中で発現されていることを示す。脾、胎盤、心、肝、肺、子宮および骨髄中には検出可能なｃＤＮＡが観察されなかった。
【００９７】
ＡＳＩＣ１、ＡＳＩＣ２およびＡＳＩＣ３を含むｃＤＮＡライブラリー中のｈＢＮａＣ４  ｃＤＮＡの存在に基づく組織分布の重なりが存在し（表２中で強調された組織を参照されたい）、変えられたｐＨ依存性および／もしくは動力学を有するヘテロマーが存在するかもしれないことを示唆する。
実施例５−ゼノプス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中でヒトＢＮａＣ４によりコードされる機能的タンパク質の特徴づけ
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を、以前に記述されかつ当該技術分野で既知の標準的方法（Ｆｒａｓｅｒら、１９９３）を使用して調製しかつ注入した。成体雌性アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）（ナスコ（Ｎａｓｃｏ）、ウィンスコンシン州フォートアトキンソン）からの卵巣小葉を細かく裂き、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節された、８２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有する公称でＣａを含まない生理的食塩水（ＯＲ−２）中で数回すすぎ、そして０．２％コラゲナーゼタイプＩ（ＩＣＮ  バイオメディカルズ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、オハイオ州オーロラ）を含有するＯＲ−２中で２〜５時間穏やかに振とうした。およそ５０％の卵胞層が除去された場合に、ステージＶおよびＶＩの卵母細胞を選択し、そして７５％  ＯＲ−２および２５％  ＮＤ−９６より成る培地中ですすいだ。ＮＤ−９６は：ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節された、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭピルビン酸ナトリウム、ゲンタミシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有した。細胞外Ｃａ＋２が徐々に増大し、そして細胞を、注入前２〜２４時間、ＮＤ−９６中で維持した。インビトロ転写のためには、ヒトＢＮＡＣ４を含有するｐＧＥＭ  ＨＥ（Ｌｉｍａｎら、１９９２）をＮｈｅＩで直鎖状にし、そしてキャップ類似物ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの存在下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて転写した。合成されたｃＲＮＡを酢酸アンモニウムおよびイソプロパノールで沈殿させ、そして５０μｌのヌクレアーゼを含まない水に再懸濁した。ｃＲＮＡを、１、２および５μｌのＲＮＡマーカー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ、０．２４〜９．５Ｋｂ）に対してホルムアルデヒドゲル（１％アガロース、１×ＭＯＰＳ、３％ホルムアルデヒド）を使用して定量した。
【００９８】
卵母細胞に５０ｎｌのヒトＢＮａＣ４  ＲＮＡ（０．００２〜５ｎｇ）を注入した。対照卵母細胞には５０ｎｌの水を注入した。卵母細胞は、ヒトＢＮａＣ４の発現についての分析前にＮＤ−９６中で１〜６日間インキュベートした。インキュベーションおよびコラゲナーゼ消化は室温で実施した。注入された卵母細胞は１８℃で４８穴細胞培養クラスター（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）；マサチューセッツ州ケンブリッジ）中で維持した。全細胞のアゴニスト（プロトン）に誘導された電流を、以前に記述されかつ当該技術分野で既知の標準的方法（Ｄａｓｃａｌ、Ｎａｔｈａｎ（１９８７）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：３１７−３８７）を使用して、慣習的二電極膜電位固定法（ジーンクランプ（ＧｅｎｅＣｌａｍｐ）５００、アクソン  インストゥルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて注入後１〜６日に測定した。微小電極は３Ｍ  ＫＣｌで満たされ、１および２ＭΩの抵抗を有した。細胞は、示されない限り室温で〜１０ｍｌ／分でＮＤ９６を用いて継続的に灌流した。膜電位は示されない限り−７０ｍＶで固定した。
【００９９】
ヒトＢＮａＣ４を注入された卵母細胞は２つの局面で対照と異なった特性を有した。第一に、ＢＮａＣ４  ｃＲＮＡの注入は、注入１〜４日後に、水を注入された姉妹対照卵母細胞に比較して卵母細胞の生存率の劇的な減少を引き起こした（図４）。第二に、ＢＮａＣ４注入は低いｐＨで活性化されるコンダクタンスを生じさせた（図５）。さらに、ＢＮａＣ４（卵母細胞あたり２ｎｇのｃＲＮＡ）を注入された細胞について、−７０ｍＶで膜電位を保持するためのより大きな電流を必要とする傾向が存在した（Ｃａ２＋  ＮＤ−９６中で−１．２＋／−０．４μＡ（ｎ＝１２）対−０．２７＋／−０．０５μＡ（ｎ＝１０）（ｐ＜０．０５）およびＢａ２＋−ＮＤ９６中で−５．９２＋／−０．９６μＡ（ｎ＝５）対−０．４１＋／−０．１０μＡ（ｎ＝３）（ｐ＜０．００５））。保持電流は、０．０２ｎｇのｃＲＮＡを注入された卵母細胞および水を注入された卵母細胞を比較して有意に異ならなかった。
生存率。
【０１００】
ゼノプス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中でのヒトＢＮａＣ４の機能的発現を示す。すなわち、２Ｃａ２＋を含有するＮＤ−９６中で維持された卵母細胞の生存率は、ＢＮａＣ４（１〜５ｎｇ）のｃＲＮＡの注入後１〜４日に有意に減少した（図４）。ＢＮａＣ４および対照の水を注入された卵母細胞のデータは６回の別個の実験で類似であり、そして合わせられた。死亡卵母細胞は、ボシュロム（Ｂａｕｃｈ  ａｎｄ  Ｌｏｍｂ）解剖顕微鏡を３０倍の倍率で使用して視覚的に決定した。ＢＮａＣ４を注入された生存可能な卵母細胞のパーセンテージは、水を注入された対照卵母細胞より有意により低かった。すなわち、ＢＮａＣ４を注入された卵母細胞（ｎ＝２７４）の約１３％のみが、本質的に同一の条件下で維持された姉妹のベヒクルを注入された対照卵母細胞（ｎ＝１６２）の８９％に比較して、注入後１〜４日まで生存した。データはχ２分析を使用して解析し、そして差異が高度に有意であることが見出された（ｐ＝１．７×ｅ−４５）（図４）。卵母細胞の生存率に対するｈＢＮａＣ４  ｃＲＮＡの効果は、０．０２ｎｇの注入が対照の値に類似であったため、用量依存性であった。
低いｐＨの生理的食塩水へのヒトＢＮａＣ４を注入された卵母細胞の応答性。
【０１０１】
ゼノプス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中でのヒトＢＮａＣ４の機能的発現を示す。すなわち、ｐＨ５．５による活性化。図５Ａは、ｐＨ５．５の細胞外生理的食塩水の浴適用により活性化された全細胞電流を示す（黒丸）。卵母細胞は２ｎｇのｈＢＮａＣ  ｃＲＮＡの注入後３日記録した。電流−電圧の関係を、−１２０から＋８０ｍＶまでの電圧傾斜を２秒ごとに０．５ｍＶ／ｍ秒の速度で適用することにより得た。類似の結果が４組の注入された卵母細胞から得られた。卵母細胞は、Ｃａ２＋  ＮＤ−９６  ｐＨ８．３で恒常的に灌流した。図５Ｂにおいて、同一の実験からの水を注入された卵母細胞への低いｐＨの適用は、コンダクタンスのわずかな可逆的低下以外、影響を有しなかった。４回の別個の実験からのデータを合わせた場合に、水を注入された対照に対してｈＢＮａＣ４を注入されたものにおいてｐＨ５．５の生理的食塩水に対する応答性の有意の差異が存在した。＋８０ｍＶで測定された電流の増大は、２〜５ｎｇのｈＢＮａＣ  ｃＲＮＡ対水を注入された卵母細胞について、それぞれ４９８＋／−１９４ｎＡ（平均＋／−ＳＥＭ；ｎ＝７）対１４＋／−１０ｎＡ（ｎ＝１０）であった（ｐ＜０．０５）。試験されたＢＮａＣ４卵母細胞は最低＋６０ｎＡの電流を生じさせた（電圧傾斜プロトコルの終了時に＋８０ｍＶで測定された）（範囲＋６０ないし＋１２４０ｎＡ）。水を注入された卵母細胞の半分はコンダクタンスの迅速な増大を示さなかった。ｐＨ５．５に誘導されるコンダクタンスの迅速な増大は、２００μＭアミロリドの浴適用により４０＋／−１３％（ｎ＝３）だけ封鎖された。応答の動力学の詳細な分析は可能でなかった。二次的効果（通常はコンダクタンスのゆっくりと活性化する減少）が初期応答の分離を妨げたためである。初期応答の逆転電位は６＋／−５ｍＶ（ｎ＝７）であった。類似の実験条件下で、リガンド依存性非選択的陽イオンチャンネルのＶｒｅｖは約−１５ｍＶであり（Ｄｕｂｉｎ，Ａ．Ｅ．（１９９９）ＪＢＣ  ２７４：３０７９９−３０８１０）、Ｎａ＋が卵母細胞中で発現されたｈＢＮａＣホモマーを通るより浸透性の陽イオンであるかもしれないことを示唆する。
実施例６  哺乳動物細胞系中のヒトＢＮａＣ４の特徴づけ
ヒトＨＥＫ２９３細胞をｐＥＧＦＰベクター（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））と一緒にヒトＢＮａＣ４（ｐｈＢＮａＣ４）でトランスフェクトした。１００ｍｍ皿あたり１０６個の細胞あたり１μｇのｐＥＧＦＰと一緒の２μｇのｐｈＢＮＡＣ４の一過性トランスフェクションを、エフェクティーン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）トランスフェクションキット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）；３０１４２５）を使用して実施する。トランスフェクションの２ないし３日後に細胞を１２ｍｍの円形カバーガラス上にプレート培養し、そして成長培地中で一夜維持する。１日後、全細胞膜電位固定法を使用して近接パファーピペット（ｎｅａｒｂｙ  ｐｕｆｆｅｒ  ｐｉｐｅｔｔｅ）からの低いｐＨの適用に対するそれらの全細胞応答についてウェルを試験した。ＧＦＰを発現する細胞を試験した（ＧＦＰ陽性細胞）。ＧＦＰをもつベクター単独でのトランスフェクションを対照として使用した（ＧＦＰ陽性）。
【０１０２】
ヒトＢＮａＣ４を発現する安定な細胞系を構築する。３日後に、細胞をネオマイシン（５００μｇ／ｍｌ）の存在下で選択し、そしておよそ２週間、３回の１０倍希釈継代により増殖させる。個々のコロニーを拾いかつ６穴皿中で増殖させる。ヒトＢＮａＣ４を発現する細胞を、電気生理学的膜電位固定技術および細胞生存率アッセイを使用して低いｐＨに対するそれらの応答性について試験し、そしてクローニングベクター（ｐＣＩＮｅｏ）のみを安定に発現する姉妹細胞から得られた応答と比較する。
【０１０３】
全細胞パッチクランプ技術（Ｈａｍｉｌｌら、１９８１  Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．３９１：８５−１００）を使用して、１２ｍｍカバーガラス上で２日以上維持された、ヒトＢＮａＣ４を一過性に発現するＨＥＫ２９３からのプロトンに誘導される電流を記録した。細胞は、ＤＩＣ  ノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）光学を伴うニコン  ダイアフォト（Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ）３００を使用して可視化した。細胞は、示されるとおりｐＨ７．５もしくは８．２の生理学的生理的食塩水中で継続的に灌流した（〜０．５ｍｌ／分）。標準的な生理学的生理的食塩水（「タイロード液」）は：１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ半Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３、ウェスコー（Ｗｅｓｃｏｒ）５５００蒸気圧（ウェスコー  インク（Ｗｅｓｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ユタ州ローガン）を使用して測定されるところの２９５−３００ｍＯｓｍ）を含有した。記録電極はホウケイ酸キャピラリー管（Ｒ６；ガーナー  グラス（Ｇａｒｎｅｒ  Ｇｌａｓｓ）、カリフォルニア州クレアモント）から加工し、先端は歯科用辺縁蝋（マイルズ  ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、インディアナ州サウスベンド）で被覆し、そして、細胞内生理的食塩水、すなわち１００ｍＭグルコン酸カリウム、２５ｍＭ  ＫＣｌ、０．４８３ｍＭ  ＣａＣｌ２、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ半Ｎａ−ＨＥＰＥＳおよび１ｍＭ  Ｋ４−ＢＡＰＴＡ（１００ｎＭ遊離Ｃａ＋２）；ｐＨ７．４、２９０ｍＯｓｍを達成するために添加されたＤ−ブドウ糖を含む）を含有する場合に１〜２ＭΩの抵抗を有する。液体接合部電位は、標準的ピペット、ならびに経験的におよびコンピュータプログラムＪＰＣａｌｃ（Ｂａｒｒｙ，Ｐ．Ｈ．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５１：１０７−１１６）を使用しての双方で決定されるような浴溶液を使用して−１８ｍＶであった。示された全部の電圧は液体接合部電位について補正した。電流および電圧シグナルを検出し、そしてアクソパッチ（Ａｘｏｐａｔｃｈ）１Ｄパッチクランプ増幅器（アクソン  インストゥルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いて２ｋＨｚでフィルターをかけ（ｆｉｌｔｅｒ）、ＤｉｇｉＤａｔａ  １２００Ｂ実験室インターフェース（アクソン  インストゥルメンツ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））およびＰＣ互換性コンピュータシステムを用いてディジタルで記録し、そしてオフライン分析のため磁気ディスクに記憶させた。データ取得および解析はＰＣｌａｍｐソフトウェアを用いて実施した。
【０１０４】
リガンドに誘導されるコンダクタンス変化の見かけの逆転電位（Ｖｒｅｖ）を、電圧傾斜プロトコル（Ｄｕｂｉｎ，Ａ．Ｅ．ら、（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：１３７１−１３８１）を使用して決定した。電圧傾斜は２秒ごとに適用し、そして生じる全細胞の傾斜に誘導される電流を記録した。通常、電圧は負から正ないし負の値まで傾斜をつけた。細胞を−８８ｍＶで固定するのに必要とされる電流を継続的にモニターした。低いｐＨに誘導されるコンダクタンスを、プロトンの存在および非存在下で電圧傾斜プロトコルにより導き出される全細胞電流から決定した。低いｐＨの前（対照）およびその存在下で測定された電圧傾斜に誘導された電流を比較して、チャンネル電流出力を調節するチャンネルに対する低いｐＨの効果を示した。正味のリガンドに誘導される電流が存在しなかった電圧を決定した（Ｖｒｅｖ）。総膜キャパシタンス（Ｃｍ）を、−６８ｍＶからの３０ｍＶの過分極させる電圧傾斜が１０ｍＶ／ｍ秒の速度で生成した後の最大電流と、最終電位（−９８ｍＶ）での定常状態の電流との間の差異として決定した（Ｄｕｂｉｎ，Ａ．Ｅ．ら、（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：１３７１−１３８１）．
ニコン  ダイアフォト（Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ）３００の表在蛍光（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）付属部品は、ＨＭＸ−４ランプハウス（Ｌａｍｐｈｏｕｓｅ）、Ｃ−ＦＣ  ＥＰＩ−ＦＬ収集レンズ、１００Ｗ水銀ランプおよび電源装置ＨＢＯ−１００Ｗ、ならびにフィルターキューブＥＦ−４  Ｂ−２Ｅ／ＣおよびＥＦ  ４−Ｇ２Ｅを包含した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；ｐＥＧＦＰベクター、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を発現するベクターを、１：２の比でｈＢＮａＣ４とコトランスフェクトした。ＧＦＰ陽性細胞は、１：２の比でトランスフェクトされる場合にＢＮａＣ４とともにトランスフェクトされることもまたありそうであり、そして、トランスフェクション効率の決定およびＢＮａＣ４活性についてアッセイするための細胞の選択の基礎を形成する。
【０１０５】
ｈＢＮａＣ４でのＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションは、対照ベクターのみでトランスフェクトされた細胞に比較して２つの劇的な差異を示した。第一に、ｈＢＮａＣ４でトランスフェクトされた細胞中のＧＦＰ陽性細胞の生存率の低下が存在した。第二に、近接パファーピペットからの低いｐＨの溶液の適用は、ｈＢＮａＣ４でトランスフェクトされた細胞中のコンダクタンスを迅速に増大させ、部分的にＮａ＋により媒介されていることと矛盾しない。この効果はベクターのみとコトランスフェクトされたＧＦＰ陽性細胞中で観察されなかった。
ｈＢＮａＣ４は細胞生存率を低下させた。
【０１０６】
ｈＢＮａＣ４もしくはベクターによりトランスフェクトされることが最もありそうである細胞を、緑色蛍光タンパク質の存在により同定した。ＧＦＰを発現する全部の細胞が第二のベクターでトランスフェクトされることができるわけではない一方、ベクターでトランスフェクトされた細胞がＧＦＰを発現することができることがありそうである。ｈＢＮａＣ４で一過性にトランスフェクトされたＧＦＰ陽性細胞の生存率は３〜６日後に有意に減少した。データは２回の別個の実験から得た。細胞を、ヒトＢＮａＣ４もしくはＧＦＰを発現するベクターでトランスフェクトし、そして、緑色蛍光タンパク質を可視化するための表在蛍光を装備されたノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）の光学を伴うニコン  ダイアフォト（Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ）３００上で可視化する前に、選択なしで３〜４日、５もしくは６日間、成長培地中で維持した。
【０１０７】
ｐｈＢＮａＣ４でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、拡張および培養基への付着を開放し、液胞および泡状突起を獲得し、そして死ぬようである（機能突然変異体のＭＤＥＧ獲得（Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９６）およびＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）におけるデジェネリンに誘発される神経変性（ＣｈａｌｆｉｅとＷｏｌｉｎｓｋｙ、１９９０；ＤｒｉｓｃｏｌｌとＣｈａｌｆｉｅ、１９９１；Ｇａｒｃｉａ−Ａｎｏｖｅｒｏｓら、１９９８；Ｈａｌｌら、１９９７）について報告された細胞死の様式）。図６ａにおいて、ＧＦＰ陽性細胞を２回の別個のトランスフェクションからの３〜６枚のカバーガラスから検査し、そして死亡細胞を視覚的に決定した。データはトランスフェクション後３〜４、５もしくは６日にグループ分けされている。データはχ２分析を使用して解析した。ＢｎａＣ４ベクター（ｐｈＢＮａＣ４）の存在下でのＧＦＰベクターのトランスフェクションの初期トランスフェクション効率（３０％）は、ｐＣＩｎｅｏベクターのみの存在下での効率（１５〜２０％）と同様であった。検討された全部の日で、ｐＣＩｎｅｏでトランスフェクトされた対照に比較して、それらをｐｈＢＮａＣ４とコトランスフェクトした場合に有意により少ない生存ＧＦＰ陽性細胞が存在した。この差異をグラフで（図６ｂ）に提示し、ここでｐＣＩｎｅｏ（黒棒）およびｐｈＢＮａＣ４（斜線をつけられた棒）でトランスフェクトされた生存可能なＧＦＰ陽性細胞のパーセントを示す。
低いｐＨによる膜コンダクタンスの活性化はｈＢＮａＣ４に依存した。
【０１０８】
パッチクランプ技術の全細胞での配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）は、ピペット下で膜の断片を破裂させることにより達成した。細胞を−６８ｍＶで保持し、そして過分極する電圧傾斜で攻撃して、近接パファーピペットからの低いｐＨの生理的食塩水の適用前、その間および後の電流と電圧の関係を得た。ＢＮａＣ４でトランスフェクトされたものにおいて、低いｐＨは１８個の細胞のうち１５個でコンダクタンスの迅速に活性化する増大を惹起したが、しかしベクターのみの対照ではしなかった。電流は、電圧傾斜に誘導される電流の軌跡上で−６８および＋８２ｍＶで測定し、そして活性化されたと初期対照電流との間の差異をこれらの電圧で決定した。電流−電圧曲線全体を図７に示す。増大の閾値は約ｐＨ４．７５であった。攻撃後最初の２〜３秒で−５０および＋１００ｍＶでｐＨ４．５により導き出された電流は細胞間で変動性であり［範囲：−５０ｍＶで−３５ないし−４５００ｐＡ、および＋１００ｍＶで２０ないし２０１５ｐＡ］、そして平均がそれぞれ−７５３＋／−２９７ｐＡ（ｎ＝１６）および４５３＋／−２４８ｐＡ（ｎ＝９）であった。ｐＨ４．５およびへの曝露に際して迅速に増大されたコンダクタンスは主としてＮａ＋に媒介される電流と矛盾しなかった。電流−電圧の関係はその後、非選択的陽イオンにより媒介される二次成分を生じさせる低いｐＨと矛盾せず、より負の電位に移動したようであった。チャンネルのＡＳＩＣファミリーのいくつかのメンバーはＣａ２＋に対し浸透性であり（例えばＡＳＩＣ１Ａ（Ｗａｌｄｍａｎｎら、１９９７））、そして二次的効果がＣａ２＋により活性化されることが可能である。
【０１０９】
ｈＢＮａＣ４でトランスフェクトされかつ低いｐＨに応答する細胞は、ベクターおよびＧＦＰでトランスフェクトされた対照細胞よりも、大電流の活性化直後に細胞死に対しより感受性となった。ｐＨに誘導された効果の可逆性はｐＨ４．７５の刺激を使用して最も容易に観察され、それはｐＨ４．５に対する応答の約５％を生じさせた（−５０および＋１００ｍＶでそれぞれ−４０＋／−１７ｐＡ（ｎ＝３）および＋２０＋／−１０ｐＡ（ｎ＝３））。
【０１１０】
低いｐＨに活性化される電流の逆転電位は＋４２＋／−１０ｍＶ（ｎ＝１５）であった。この値は、異なるＣｌ−濃度をもつ細胞内および細胞外生理的食塩水の使用による接合部電位を考慮に入れている。逆転電位は、１ｍＶ／ｍ秒の傾斜速度で電圧傾斜プロトコルを使用して決定することができた（２００ｍ秒の総時間が必要とされた）。これらの実験で使用された記録条件下で、Ｎａ選択的電流の予測される逆転電位は＋８２ｍＶであるとみられた。従って、該データは、高度に（しかし完全にではない）Ｎａ選択的であるホモマーを形成するヒトＢＮａＣ４と矛盾しない。
【０１１１】
われわれはｐＨ４．５により導き出される電流に対するアミロリドの効果を検討した。アミロリドは広範な効能をもつチャンネルのＡＳＩＣファミリーによる電流の既知の阻害剤である（発明の背景を参照されたい）。細胞を、５００μＭのアミロリドの存在下にｐＨ４．５で攻撃した。同一の細胞をその後、ｐＨ４．５単独に対するそれらの応答について試験した。アミロリドは９８＋／−２％（ｎ＝３）だけｐＨの効果を封鎖した。
【０１１２】
活性化の閾値はｐＨ４．７５近く（ＭＤＥＧ１について観察されたものと同様（Ｂａｓｓｉｌａｎａら、１９９７））であるようであった。
実施例７−ヒトＢＮａＣ４タンパク質の一次構造
本発明はヒトＢＮａＣ４を記述する。ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、５３９アミノ酸をコードする約１６２０塩基対の単一の大きな読取り枠を示した。ＢＮＡＣ４のｃＤＮＡはそれぞれ約１６４および約７４４ヌクレオチドの５’および３’非翻訳伸長を有する。第一の読み枠中のメチオニンが、約５９，２０３Ｄａの推定される分子量（Ｍｒ）をもつヒトＢＮＡＣ４タンパク質を予測する１個の読取り枠の開始コドンと指定された。本発明はラットＳＰＡＳＩＣ（Ａｋｏｐｉａｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ、ＣｈｅｎとＷｏｏｄ（未発表）；ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）ＡＪ２４２５５４）のヒト相同物であるようである。アミノ酸レベルで、ヒトＢＮａＣ４はラットＳＰＡＳＩＣに９７％同一かつ９８．５％類似である。コーディング領域中のヌクレオチドレベルで、ヒトおよびラット配列は約９１％同一である。ヒト遺伝子配列ＡＣ００９９５５（ヒトクローンＮＨ０２５６Ｉ２３）はヒトＢＮａＣ４遺伝子の部分を含有する。
【０１１３】
【表３】
2004516804.tif 000004
【０１１４】
本発明に記述されるｃＤＮＡに比較して、ゲノム配列中にときおり単一塩基の欠失が存在する。
【０１１５】
ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）クローン１５＿Ｊ＿２は本発明の５’ＵＴの１６２ヌクレオチドをコードするようである。
【０１１６】
予測されたヒトＢＮａＣ４タンパク質は、ヌクレオチドおよびタンパク質データベースと整列され、そしてＡＳＩＣファミリーのメンバーに関係づけられることを見出した。２個の予測された膜貫通領域（２０アミノ酸の疎水性領域）および２個の膜貫通セグメントの間の大型の推定の細胞外セグメント（約３５４アミノ酸）を包含する、レセプターのこのファミリーで見出されるいくつかの保存されたモチーフが存在する。一次構造解析および生化学的実験に基づく現在の位相的モデルによれば、〜３５４アミノ酸の１個の大きなドメインが原形質膜の細胞外側に面する（Ｃａｎｅｓｓａら、１９９４；Ｃａｎｅｓｓａら、１９９４）。
【０１１７】
ＡＳＩＣファミリーの他のメンバーとのｈＢＮａＣ４の同一性パーセントは全体として約４８％である。ＢＮａＣ１およびＢＮａＣ２とのＢＮａＣ３の同一性パーセントはそれぞれ４７％および４８％である。従って、本明細書に記述されるヒトＢＮａＣ４は、明らかに、ＡＳＩＣ遺伝子ファミリーの１つの別個の派生物である。
【０１１８】
【表４】
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【０１１９】
ＮおよびＣ末端領域はヒトＡＳＩＣ１、ＡＳＩＣ２およびＡＳＩＣ３の間で最も互いに異なる。これらのファミリーメンバーの間で最も保存された配列は、推定の細胞外ドメイン、すなわちＦＰＡＶＴＬＣＮｘＮｘｘＲ、ＧＫＣＹ、ＧＬｘＩＭＬＤＩＱＱｘＥＹＬＰ、ＦＥｘＧｘｘＶＱＩＨＳＱｘＥＰＰｘＩｘｘＬＧｘＧＶｘＰＧｘＱＴＦＶｘｘＱ、ＣＲＭＶｘＭＰＧ、ならびにＭＩＩドメイン中にある。細胞外ループは、このスーパーファミリーの他のメンバーがそうであるように、高度にシステイン豊富である。３個は、ｈＡＳＩＣ２中で保存されていないシステイン残基Ｃ２８１を包含するヒトＢＮａＣ４の推定の細胞外ループ中の１５個のｃｙｓ残基である。
【０１２０】
ＢＮａＣ４は２個の潜在的ミリストイル化部位、すなわちＭＩとＭＩＩとの間の推定の細胞外ドメイン中の［ＧＶＳＰＧＦ］および［ＧＧＱＭＧＬＦＩＧＡ］を有する。Ｎ１９１およびＮ３７６の２個の推定のＮ結合グリコシル化部位；前者はＤＲＡＳＩＣ中で保存されており、後者はＤＲＡＳＩＣ中の推定のＮ結合グリコシル化部位の２７アミノ酸上流である。推定のリン酸化部位は：推定の細胞外ドメイン中にある１個の潜在的ＰＫＣリン酸化部位（Ｓ３９４）；４個の潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、すなわちＴ２４５、Ｓ２５７、Ｓ２８０およびＴ４５７［しかしながら、最初の３個は推定の細胞外ドメイン中にあり、かつ、最後のものは推定のＭＩＩドメイン中にある］；２個の潜在的乳腺カゼインキナーゼリン酸化部位（ＳｘＥ）すなわちＳ２４６、Ｓ２５７；１個の潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位すなわちＹ３１０［しかしながら、それは推定の細胞外ドメイン中に存在する］を包含する。これらのドメインのリン酸化の機能的影響は、向代謝性（ｍｅｔａｂｏｔｏｒｏｐｉｃ）因子および成長因子により誘導される細胞応答の異種感作の情況で重要であるかもしれない。本発明には推定のＣａＭ結合ドメイン（ＩＱ  ｘｘ  Ｆ／Ｙ  Ｒ／Ｋ  Ｇ／Ｋ  ｘｘ  Ｒ／Ｋ  Ｒ／Ｋ）が存在しない。推定のＰＫＡリン酸化部位が存在しない。
【０１２１】
コーディング配列中に、１０個の独立したｃＤＮＡライブラリークローンの１つ中で一貫して異なった２塩基が存在した。これらのケトおよびピリミジンの差異は、Ｃ末端配列中で１個のＬをＲに、およびＡをＶにならせた。すなわち
．．．Ｓ［Ｌ／Ｒ］ＧＲ［Ａ／Ｖ］ＥＧＧＧＶＳＳＬＬＰＮＨＨＨＰＨＧＰＰＧＧＬＦＥＤＦＡＣ（図３を参照されたい）。
実施例８−ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターへのクローニング
組換えヒトＢＮａＣ４が、限定されるものでないがｐＥＴ系列（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））を挙げることができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター中へのヒトＢＮａＣ４発現カセットの移入後に、大腸菌中（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生される。ｐＥＴベクターはヒトＢＮａＣ４発現をしっかりと調節されるバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に置く。誘導可能なｌａｃプロモーターにより駆動されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体の１コピーを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主へのこの構築物の移入後、ヒトＢＮａＣ４の発現は、適切なｌａｃ基質（ＩＰＴＧ）を培養物に添加する場合に誘導される。発現されたヒトＢＮａＣ４のレベルは本明細書に記述されるアッセイにより測定される。
【０１２２】
ヒトＢＮａＣ４の読取り枠全体をコードするｃＤＮＡを、ｐＥＴ［１６］１１ａのＮｄｅＩ部位に挿入する。正の向きの構築物を配列分析により同定し、そして、発現宿主株ＢＬ２１を形質転換するのに使用する。その後、形質転換体を使用して、ヒトＢＮａＣ４タンパク質の産生のため培養物に接種する。培養物はＭ９もしくはＺＢ培地（その処方は当業者に既知である）中で増殖させてよい。ＯＤ６００＝１．５への増殖後、ヒトＢＮａＣ４の発現を、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて３７℃で３時間誘導する。
実施例９−昆虫細胞中での発現のためのバキュロウイルス発現ベクター中へのヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡのクローニング
ＡｃＮＰＶウイルスのゲノム由来であるバキュロウイルスベクターを、昆虫細胞のＳＦ９系統（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ＃  １７１１）中でｃＤＮＡの高レベル発現を提供するよう設計する。ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡを発現する組換えバキュロウイルスは、以下の標準的方法（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のマックスバック（Ｍａｘｂａｃ）マニュアル）により調製する。すなわち、ヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡ構築物を、ｐＡＣ３６０およびＢｌｕｅＢａｃベクター（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を包含する多様なバキュロウイルス移入ベクター中のポリへドロン遺伝子に連結する。組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞中へのバキュロウイルス移入ベクターおよび直鎖状にされたＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡ［Ｋｉｔｔｓ，Ｐ．Ａ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８：５６６７（１９９０）］のコトランスフェクション後の相同的組換えにより生成させる。組換え体のｐＡＣ３６０ウイルスは、感染した細胞中の封入体の非存在により同定し、また、組換えｐＢｌｕｅＢａｃウイルスはβ−ガラクトシダーゼ発現に基づいて同定する（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．とＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５）。プラーク精製後に、本明細書に記述されるアッセイによりヒトＢＮａＣ４発現を測定する。
【０１２３】
ヒトＢＮａＣ４の読取り枠全体をコードするｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩのＢａｍＨＩ部位に挿入する。正の向きの構築物を配列分析により同定し、そして直鎖状のＡｃＮＰＶの野性型ＤＮＡの存在下でＳｆ９細胞をトランスフェクトするのに使用する。
【０１２４】
真正の活性のヒトＢＮａＣ４が、感染した細胞の細胞質中に見出される。活性のヒトＢＮａＣ４は、感染した細胞から低張もしくは洗剤溶解により抽出する。
実施例１０−酵母発現ベクター中へのヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡのクローニング
組換えヒトＢＮａＣ４は、異種タンパク質の細胞内もしくは細胞外発現を指図するよう設計された発現ベクター中への至適のヒトＢＮａＣ４  ｃＤＮＡシストロンの挿入後に、酵母、ビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で産生される。細胞内発現の場合、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのようなベクターをヒトＢＮａＣ４シストロンに連結する［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５４３−５４５（１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ  Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発現のためには、ヒトＢＮａＣ４シストロンを、ヒトＢＮＡＣ４タンパク質のＮＨ２末端に分泌シグナル（酵母もしくは哺乳動物のペプチド）を融合している酵母発現ベクターに連結する［Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．、Ｇｅｎｅ  ８５：５１１−５１６（１９８９）；Ｒｉｅｔｔ  Ｌ．とＢｅｌｌｏｎ  Ｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９）］。
【０１２５】
これらのベクターは、限定されるものでないが、発現されるｃＤＮＡにヒト血清アルブミンシグナルを融合するｐＡＶＥ１＞６［Ｓｔｅｅｐ  Ｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２−４６（１９９０）］、および発現されるｃＤＮＡにヒトリゾチームシグナルを融合するベクターｐＬ８ＰＬ［Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２７２８−２７３２］を挙げることができる。加えて、ヒトＢＮＡＣ４は、ベクターｐＶＥＰを利用してユビキチンに結合された融合タンパク質として酵母中で発現される［Ｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７１５−７７１９（１９８９）、Ｓａｂｉｎ，Ｅ．Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：７０５−７０９（１９８９）、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  Ｄ．Ｐ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：５５１７−５５２３（１９８９）］。発現されるヒトＢＮａＣ４のレベルを、本明細書に記述されるアッセイにより測定する。
実施例１１−組換えヒトＢＮａＣ４の精製
組換え的に産生されたヒトＢＮａＣ４は抗体親和性クロマトグラフィーにより精製してよい。
【０１２６】
ヒトＢＮａＣ４抗体親和性カラムは、抗ヒトＢＮａＣ４抗体をアフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）−１０（バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））（抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようなＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化されているゲル支持体）に付加することにより作成する。その後、抗体を、スペーサーアームをもつアミド結合を介してゲルに結合する。残存する活性化されたエステルは、その後、１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、いかなる結合されない抗体もしくは付着したタンパク質も除去する。その後、カラムを、リン酸緩衝生理的食塩水（ｐＨ７．３）中で、洗剤のような適切な膜可溶化剤と一緒に平衡化し、そして可溶化されたヒトＢＮａＣ４を含有する細胞培養上清もしくは細胞抽出物を、カラムをゆっくりと通過させる。その後、光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドに下落するまで、カラムを洗剤と一緒にリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、その後、洗剤と一緒に０．２３Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）でタンパク質を溶出する。その後、精製されたヒトＢＮａＣ４タンパク質をリン酸緩衝生理的食塩水に対して透析する。
【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
【表７】
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【０１３０】
【表８】
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【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
【表１０】
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【０１３３】
【表１１】
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【０１３４】
【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、コーディング配列のヒトＢＮａＣ４ヌクレオチド配列（１６２０ｂｐ）。
【図２】
発明にかかる、ヒトＢＮａＣ４のヌクレオチド配列（２５２８ｂｐ）を、１６４ｂｐの５’ＵＴおよび７４４ｂｐの３’ＵＴを包含して示す。
【図３】
発明にかかる、ヒトＢＮａＣ４のコーディング配列（５３９アミノ酸）。潜在的膜貫通ドメインに対応する２０〜３４アミノ酸の２個の伸長に下線をつける。
【図４】
ゼノプス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中でのＢＮａＣ４の機能的発現を示す。すなわち、２Ｃａ２＋を含むＮＤ−９６中で維持された卵母細胞の生存率は、１〜５ｎｇのヒトＢＮａＣ４  ｃＲＮＡの注入後１〜４日に有意に減少した。データは６回の別個の実験から得た。死亡卵母細胞は視覚的に決定した。データはχ２分析を使用して解析した。
【図５】
発明にかかる、卵母細胞中での機能。すなわち、ヒトＢＮａＣ４は低いｐＨにより活性化される。ａ．２ｎｇのｈＢＮａＣ４  ｃＲＮＡの注入後３日に卵母細胞に適用された浴であったｐＨ５．５により活性化された全細胞電流を示す（軌跡を黒丸で印をつけた）。電流−電圧の関係は、２秒ごとに０．５ｍＶ／ｍ秒の速度で−１２０から＋８０ｍＶまでの電圧傾斜を適用することにより得た。類似の結果が、４組の注入された卵母細胞から得られた。卵母細胞はＣａ２＋  ＮＤ−９６  ｐＨ８．３で恒常的に灌流した。類似の応答が、ｐＨ７．３からのｐＨ変化により得られた。ｂ．同一の実験からの水を注入された卵母細胞への低いｐＨの適用は、コンダクタンスのわずかな可逆的減少以外、影響を有しなかった（軌跡を黒丸で印をつけた）。
【図６】
発明にかかる、ＨＥＫ２９３細胞中でのヒトＢＮａＣ４の機能的発現を示す。すなわち、ｈＢＮａＣ４およびＧＦＰで一過性にトランスフェクトされたＧＦＰ陽性細胞の生存率は３〜６日後に有意に減少した。データは２回の別個の実験から得た。細胞を、ヒトＢＮａＣ４およびＧＦＰベクターでトランスフェクトし、そして、緑色蛍光タンパク質の存在を可視化するための表在蛍光でのノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）光学を伴うニコン  ダイアフォト（Ｎｉｋｏｎ  Ｄｉａｐｈｏｔ）３００上で可視化する前３〜４日、５もしくは６日間、選択なしで成長培地中で維持した。死亡細胞は視覚的に決定した（実施例７を参照されたい）。ａ．ＧＦＰ陽性細胞を、２回の別個のトランスフェクションからの３〜６枚のカバーガラス上で検査した。データはトランスフェクション後３〜４、５もしくは６日にグループ分けされている。データはχ２分析を使用して解析した。ｂ．（ａ）に示される各時間点の一番下の列に示されるベクターでトランスフェクトされた（黒棒）およびｈＢＮａＣ４でトランスフェクトされた（斜線をつけられた棒）細胞中の目に見えるＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージのグラフ表示。ｈＢＮａＣ４のトランスフェクションは、対照に比較して目に見える細胞のパーセンテージの有意の低下を生じさせた。ヒトＢＮａＣ４およびベクター対照の初期トランスフェクション効率はそれぞれ３０および１５〜２０％であった。
【図７】
発明にかかる、ヒトＢＮａＣ４を一過性に発現する哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞における機能。すなわち、ｐＨ４．５はコンダクタンスの増大を生じさせ、それはｐｈＢＮａＣ４でトランスフェクトされた細胞中で二相性であるようであった（ａ）。全細胞電流の初期の迅速な増大は、ＥＮａが＋８４ｍＶであると予測されたイオン条件下で＋５４ｍＶの逆転電位を有した。電流の二次的な増大が観察され、それは０ｍＶ近くに逆転した（本実施例において−１４ｍＶ）。示される電圧は−１８ｍＶの接合部電位について補正されている。全細胞電圧傾斜に誘導される電流を２．５秒ごとに測定した。各軌跡の隣の数字は掃引数を指す。部分的な回復が存在し、そしてその後細胞膜は非常に漏出性となった。ベクター対照は、ｈＢＮａＣ４でトランスフェクトされた細胞についてここに示されたものと類似の応答を示さなかった。ｂ．ｐＥＧＦＰ＋ｐＣＩＮｅｏベクター対照でトランスフェクトされたＧＦＰ陽性細胞に適用されたｐＨ４．５は、コンダクタンスの増大を生じさせなかった。
【図８】
発明にかかる、ｃＤＮＡライブラリー中でのヒトＢＮａＣ４の発現。ヒトＢＮａＣ４のＰＣＲに基づく組織分布を示す。レーンは示されるとおり印をつけられる。すなわち、レーン１：脾；レーン２：視床；レーン３：胎盤；レーン４：心；レーン５：肝；レーン６：肺；レーン７  子宮；レーン８：下垂体；レーン９：脊髄；レーン１０：骨髄；レーン１１：海馬；レーン１２：視床下部；レーン１３：小腸；レーン１４：後根神経節；レーン１５：小脳；レーン１６：皮質；レーン１７−２０：陰性対照。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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