(57)【要約】Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．のマメ抽出物から濃縮した多糖を重量比で０．０１〜９９％含有する栄養補給用組成物。Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．のマメ粉砕物から多糖を濃縮する方法；α‐（１，６）‐結合したグルコース残基の骨格と、１つまたは複数の該グルコース残基のＣ３もしくはＣ４位に（１，３）‐もしくは（１，４）‐結合により結合した１つまたは複数のガラクトースまたはマンノース残基とを有する多糖；ならびに、そのような多糖を用いて血液細胞数を増加させるべく対象者を治療する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）のマメ抽出物から濃縮された多糖を重量比で０．０１〜９９％含む栄養補給用組成物。
【請求項２】
０．０１〜１％の多糖を含むことを特徴とする請求項１に記載の栄養補給用組成物。
【請求項３】
１〜９９％の多糖を含むことを特徴とする請求項１に記載の栄養補給用組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの多糖がタンパク質と結合していることを特徴とする請求項１に記載の栄養補給用組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの多糖がタンパク質と結合していることを特徴とする請求項２に記載の栄養補給用組成物。
【請求項６】
少なくとも１つの多糖がタンパク質と結合していることを特徴とする請求項３に記載の栄養補給用組成物。
【請求項７】
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）のマメ粉砕物から多糖を濃縮する方法であって、
マメ粉砕物を水または有機溶媒と水との混合物に浸して多糖を溶解させる工程と、
沈殿促進剤を添加することにより脂肪酸およびタンパク質を沈殿させる工程と、
上清を回収する工程と
からなる方法。
【請求項８】
回収工程の後に、８０ＫＤａｌより小さい分子量を有する化合物を除去する工程からさらになる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
除去工程は、同時に上清の容量を低減するために圧力透析または限外濾過により実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上清を回収する工程の後に、エタノールを用いて該上清から多糖を選択的に沈殿させる工程からさらになる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）のマメ粉砕物から多糖を濃縮する方法であって、
マメ粉砕物を水または有機溶媒と水との混合物に浸して多糖を溶解させる工程と、
上清を回収する工程と、
上清から８０ＫＤａｌより小さい分子量を有する化合物を除去する工程と
からなる方法。
【請求項１２】
除去工程は、同時に上清の容量を低減するために圧力透析または限外濾過により実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象者の血液細胞数を増加させる方法であって、治療を必要とする対象者を、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）のマメ抽出物から調製した多糖を用いて治療する方法。
【請求項１４】
血液細胞が骨髄系の細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
骨髄系の細胞が白血球であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
白血球が好中球または単球であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
多糖が対象者に投与されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
血液細胞が骨髄系の細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
骨髄細胞または末梢血液細胞が対象者から採取され、培地中で多糖とともにインキュベートされ、そして該対象者へ戻されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
α‐（１，６）‐結合したＤ‐グルコース残基の骨格、および１つまたは複数のガラクトース、マンノース、またはグルコース残基を備えた側鎖からなる多糖。
【請求項２１】
前記側鎖は、１つまたは複数の骨格グルコース残基のＣ３もしくはＣ４位に（１，３）‐もしくは（１，４）‐結合により結合していることを特徴とする、請求項２０に記載の多糖。
【請求項２２】
グルコース残基／ガラクトース残基／マンノース残基の比率が８９／５／６であることを特徴とする、請求項２０に記載の多糖。
【請求項２３】
請求項２０に記載の多糖と医薬として許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２４】
多糖は請求項２１に記載の多糖である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
グルコース残基／ガラクトース残基／マンノース残基の比率が８９／５／６であることを特徴とする、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
対象者の血液細胞数を増加させる方法であって、治療を必要とする対象者を、請求項２０に記載の多糖を用いて治療する方法。
【請求項２７】
多糖は請求項２１に記載の多糖である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
グルコース残基／ガラクトース残基／マンノース残基の比率が８９／５／６であることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
血液細胞が骨髄系の細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
骨髄系の細胞が白血球であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
骨髄系の白血球が好中球または単球であることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
多糖が対象者に投与されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
血液細胞が骨髄系の細胞であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
骨髄細胞または末梢血液細胞が対象者から採取され、培地中で多糖とともにインキュベートされ、そして該対象者へ戻されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
対象者のがんを予防または治療する方法であって、投与を必要とする対象者に、ダイズ
（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）のマメ抽出物から調製した多糖を投与することからなる方法。
【請求項３６】
がんが白血病であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
がんが固形腫瘍であることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
対象者のがんを予防する方法であって、投与を必要とする対象者に請求項２０に記載の多糖を投与することからなる方法。
【請求項３９】
がんが白血病であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
がんが固形腫瘍であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にダイズから、特に黒ダイズから精製された多糖が有用な生物学的活性を有するという発見に基づくものである。
【背景技術】
【０００２】
最近の報告によれば、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）由来の成分は、免疫応答を調節し、発がんを予防し、腫瘍の成長を阻害する効力を有している。例えば、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ、第２９巻、２４‐２８ページ、１９９７年；チョウ（Ｚｈｏｕ）ら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、第１２９巻、１６２８‐６３５ページ、１９９９年；ベンジャミン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ）ら、Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．、第３０巻、８７３‐８８１ページ、１９９７年；ラオ（Ｒａｏ）ら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．、第１２５巻（増刊第３号）、Ｓ７１７‐Ｓ７２４ページ、１９９５年；メイダーニ（Ｍｅｙｄａｎｉ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌｅ．Ｎｕｔｒ．、第１０巻、４０６‐４２８ページ、１９９１年を参照のこと。
【０００３】
黒ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）は黒い種皮をもつダイズの品種である。黒ダイズは少なくとも数百年間、漢方において用いられてきた。
黒ダイズおよびその他の薬草を含む薬草処方薬が、白血球減少状態の患者において白血球を増加させることも報告されている。ワン（Ｗａｎｇ）、Ｔｒａｄ．Ｃｈｉ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．、第５巻、３５‐３６ページ、１９９２年を参照のこと。しかしながら、黒ダイズの中のいかなる化合物または化合物群がその治療効果の全てまたは一部を担っているかについては、明らかではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、黒ダイズの多糖を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一般にダイズから、特に黒ダイズから精製された多糖が有用な生物学的活性を有するという発見に基づくものである。
従って、本発明の一態様は栄養補給用組成物に関し、該組成物はソフトドリンク、ミルク、棒状の軽食、ジュース、栄養補助食品、または植物性薬品でありうる。該栄養補給用組成物は、ダイズまたは黒ダイズの抽出物から濃縮した多糖を重量比で０．０１〜９９％（たとえば、ソフトドリンクもしくはミルク中に０．０１〜１％、または栄養補助食品もしくは植物性薬品中に１〜９９％）含有する。組成物中の多糖の含量（すなわち重量比で０．０１〜９９％）は、当技術分野でよく知られた方法により測定可能である。このような多糖は血液細胞数を増大させ、サイトカイン産生を刺激し、免疫を強化する能力を有する。言い換えれば、多糖を濃縮したダイズ（特に黒ダイズ）抽出物は、本発明の栄養補給用組成物における活性成分として使用される。該多糖はタンパク質を含有しないものでもタンパク質と結合しているものでもよい。
【０００６】
本発明の別の態様は、α‐（１，６）‐結合したグルコース残基の骨格と、１つまたは複数の該グルコース残基のＣ３もしくはＣ４位に（１，３）‐もしくは（１，４）‐結合により結合した１つまたは複数（例えば４または５）のグルコース、ガラクトース、またはマンノース残基、例えば骨格グルコース残基のＣ４位の一部に結合した１つまたは複数の残基、および／または、同一もしくは別の骨格グルコース残基のＣ３位に結合した１つまたは複数の残基、とを有する多糖に関する。残基のモル数の比率は５％ガラクトース、６％マンノース、および８９％グルコース（±２０％）であってよい。該多糖の分子量は８０ｋＤａｌよりも大きく、例えば３００〜６００ｋＤａｌの範囲にある。
【０００７】
本発明のさらなる態様は、ダイズまたは黒ダイズ由来の多糖を濃縮する方法に関する。これらの多糖は一般に分子量が大きく、すなわち８０ｋＤａｌよりも大きい（例えば３００〜６００ｋＤａｌ）。該方法は、（粉砕したマメを有機溶媒に浸すか、または機械的圧力により、極性の低い含有物を予め除去するかまたは除去せずに）水または水と有機溶媒（例えばエタノール）との混合物に粉砕したマメを浸して多糖を溶解する工程と、フィルター濾過または遠心分離および上清の回収により不溶性含有物を除去する工程とを含む。上清に含まれる多糖は、蒸発により、または十分な量のエタノールで沈殿させてからフィルター濾過もしくは遠心分離することにより、上清の溶液を濃縮して得られる。任意選択で、不溶性含有物を除去する前に、脂質およびタンパク質の含有物の大半を沈殿させるために十分な量の沈殿促進剤を溶液に添加することも可能である。沈殿促進剤は、溶解成分の沈殿を誘発し得る１つまたは複数の化合物である。脂質やタンパク質の沈殿促進剤の例としては、酸（例えば酢酸および塩酸）、ナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）、カルシウム塩（例えば硫酸カルシウムおよび塩化カルシウム）、マグネシウム塩（例えば塩化マグネシウム）、ならびにアンモニウム塩（例えば硫酸アンモニウム）がある。上清を任意選択で透析し（例えば圧力透析もしくは限外濾過により）、かつ同時に濃縮して、多糖の回収に先立ち多糖より小さい化合物を除去することも可能である。代替例として、上清にエタノールを段階的に添加して容積比率で１０〜８０％（例えば１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、または５０〜６０％）とし、高分子量の多糖を沈殿させることも可能である。
【０００８】
高度に濃縮された高分子量の多糖をプロテアーゼで処理した後に、プロテアーゼとペプチドを除去するべく再度透析またはエタノールで沈殿させることも可能である。
本明細書の開示全体を通して使用される「高分子量の多糖」という用語は、ダイズまたは黒ダイズから抽出可能な、８０ｋＤａｌよりも大きい（例えば３００〜６００ｋＤａｌの）分子量を有する多糖を指す。そのような多糖は、例えば超音波による断片化または酵素的消化を用いて変化させてその分子量を低減させることができる。
【０００９】
本発明は、対象者において血液細胞、すなわち赤血球、巨核球、および特に白血球（例えば好中球、単球、顆粒球および好酸球等の骨髄系の白血球など）の数を増加させる方法をも含む。より具体的には、粉砕したダイズまたは黒ダイズの抽出物から調製（すなわち濃縮または精製）した多糖で対象者を治療する。多糖は高分子量（すなわち８０ｋＤａｌを超え、例えば３００〜６００ｋＤａｌ）でも低分子量（すなわち８０ｋＤａｌ未満）でもよく、または高分子量のものと低分子量のものとの組合せでもよい。多糖は対象者に直接投与することができる。代替例として、次のようなｅｘ  ｖｉｖｏの手法も可能である。すなわち、末梢血細胞（成熟した血球細胞、および幹細胞を含む前駆細胞から構成される）、骨髄細胞、またはそれらの組合せを対象者から採取し、培地中で多糖と共にインキュベートした後に対象者へ戻すことが可能である。
【００１０】
ダイズまたは黒ダイズから調製された多糖を用いてＴＮＦαおよびその他のサイトカインのレベルを上げることにより細胞性免疫を活性化させることも可能であり、がんの予防または治療において対象者の免疫を強化することも可能である。また、血液細胞数を増加させ免疫系を高めることにより、ＨＩＶなど疾患の原因となる物質に感染した患者の健康を改善するために使用することも可能である。
【００１１】
サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＮＦγ、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン１７、顆粒球コロニー刺激因子、単球コロニー刺激因子、または顆粒球・単球コロニー刺激因子など）を得る方法も本発明の範囲内にある。該方法には、ダイズまたは黒ダイズから調製された多糖の使用が含まれる。例えば、哺乳動物から採取したサイトカイン産生細胞を、ダイズまたは黒ダイズから調製された多糖を含む培地中でインキュベートしてサイトカインを産生させることができる。次いでそのようにして得られたサイトカインを培地から単離する。代替例として、該多糖を哺乳動物に投与してサイトカインの産生を刺激することができる。次いで該動物の血液からサイトカインを単離することができる。
【００１２】
本発明はさらに、対象者のがんを予防または治療する方法に関する。該方法は、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）のマメ抽出物から調製された多糖、またはα‐（１，６）‐結合したＤ‐グルコース残基の骨格と、１つ以上のガラクトース残基、マンノース残基、もしくはグルコース残基を有する側鎖とを備えた多糖を、投与を必要とする対象者に投与することを含む。前記がんは、白血病または固形腫瘍のいずれかでありうる。
【００１３】
同様に、多糖と医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物、該医薬組成物を用いてｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｅｘ  ｖｉｖｏで対象者を治療することにより該対象者の血液細胞数を増加させる方法、ならびにがんもしくは感染症を予防または治療する際に該医薬組成物を用いて対象者の免疫を高める方法も本発明の範囲内にあると考えられる。該組成物に含まれる多糖は、ダイズもしくは黒ダイズから濃縮され、８０ｋＤａｌよりも大きい（例えば３００〜６００ｋＤａｌ）もしくは８０ｋＤａｌ未満の分子量を有する多糖、またはα‐（１，６）‐結合したＤ‐グルコース残基の骨格と、１つ以上のガラクトース残基、マンノース残基、もしくはグルコース残基を有する側鎖とを備えた多糖でありうる。
【００１４】
本発明のその他の特徴、目的および有利な点は、以降の説明および請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の種々の実施形態は、ダイズまたは黒ダイズから精製された多糖がサイトカインの産生を刺激し、血球細胞数を増加させ、免疫を強化するという知見に基づくものである。
【００１６】
該多糖は、以下の方法により、種々の供給源の粉砕黒ダイズから抽出し濃縮することが可能である。粉砕された黒ダイズを任意選択で有機溶媒（例えばエタノール）に浸すか、または機械的圧力を加えて、脂肪酸のような極性の低い含有物を除去する。次いで有機溶媒不溶性画分を、高温で適切な長さの時間（例えば１００℃で１０分間または６０℃で８時間）水または水溶液に浸して多糖を抽出する。抽出物を（例えばフィルター濾過により）回収し、任意選択で硫酸カルシウムなどの試薬で処理して極性の低い含有物およびタンパク質を沈殿させる。この後沈殿物を遠心分離またはフィルター濾過により除去可能である。次いで多糖の溶液を任意選択で（例えば圧力透析もしくは限外濾過により、または例えば容積で１０〜８０％の量のエタノールで多糖を沈殿させることにより）濃縮および凝縮させ、そして次に、任意選択で、乾燥（または凍結乾燥）させて多糖調製物を得る。凝縮抽出物をプロテアーゼ（例えばプロテアーゼＫ）で処理した後に、再度透析または沈殿させてプロテアーゼと小さなペプチドとを除去することが可能である。必要に応じて、該多糖調製物をさらに濃縮するか、ゲル濾過または他の好適な方法により精製することも可能である。血液細胞の増殖刺激および宿主の免疫系強化において強力な多糖または多糖混合物の平均分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィによる測定では約４８０ＫＤａｌである。これら多糖のうちの１成分は、α‐（１，６）‐結合したグルコース残基の骨格と、１つまたは複数の該グルコース残基のＣ３もしくはＣ４位に（１，３）‐もしくは（１，４）‐結合により結合した１つまたは複数（例えば４または５）のグルコース、ガラクトース、またはマンノース残基、例えば骨格グルコース残基のＣ４位の一部に結合した１つまたは複数の残基、および／または、同一もしくは別の骨格グルコース残基のＣ３位に結合した１つまたは複数の残基とを有する多糖である。残基のモル数の比率は５％ガラクトース、６％マンノース、および８９％グルコース（±２０％）であってよい。
【００１７】
多糖の量は、フェノール硫酸法による総炭水化物測定アッセイ、または任意の類似の方法により測定される。例えば、フォックス（Ｆｏｘ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１９５巻、９３‐９６ページ、１９９１年、を参照のこと。例えば、多糖とフェノールとの混合物をマイクロタイタープレートのウェルに入れて低速で振とうし、氷で冷却する。次いで濃硫酸を各ウェルに添加する。プレートを再度低速で振とうし、高温でインキュベートし、そして冷却する。マルトースまたはＤ‐グルコースを標準品として使用し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定して（多糖の加水分解により生じた）単糖の量を決定する。
【００１８】
こうして得た多糖調製物を用いて、例えば化学療法後のがん患者など、サイトカインのレベルが低い、または血液細胞数（特に白血球数）が少ないことが関連する障害を治療する（予防または該疾患の症状を緩和することを含む）ための栄養補給用組成物を作製可能である。該栄養補給用組成物は、栄養補助食品（例えばカプセル剤もしくは錠剤、または小型バッグに入れた状態で）、食品（例えばソフトドリンク、ミルク、ジュースもしくは菓子、またはハーブティーのティーバッグに含めた状態で）、あるいは植物性薬品でありうる。植物性薬品は経口で使用するのに好適な形態、例えば錠剤、硬カプセル剤もしくは軟カプセル剤、水溶液、またはシロップ剤の形態で、あるいは非経口で使用するのに好適な形態、例えばプロピレングリコール水溶液または緩衝水溶液の形態でありうる。該栄養補給用組成物中の活性成分の量は、対象者の個々の必要性によって大きく変わる。この量は、当業者には理解されるように、投与経路、および同様にサイトカイン産生を刺激または血液細胞数を増加させうる他の物質との間の共用の可能性によっても変わるであろう。
【００１９】
部分的にまたは高度に精製された有効な量の多糖を、医薬として許容可能な担体と共に製剤化し、上記障害を治療するための医薬組成物とすることができる。「有効な量」とは、治療を受ける対象者に治療効果をもたらすのに必要な量の多糖を指す。有効な用量は、当業者には認識されるように、投与経路、賦形剤の使用、および任意選択の他の治療処置との共用によって変わる。医薬として許容可能な担体の例としては、コロイド状の二酸化シリコン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウムおよび黄色２０３号（Ｄ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．１０）がある。
【００２０】
従来の方法を用いて、多糖を様々な投与経路のための投与形態に製剤化可能である。例えば、経口投与のためのカプセル剤、ゲル封入剤、または錠剤に製剤化することが可能である。カプセル剤には、ゼラチンやセルロースなどの医薬として許容可能な標準的な材料を含めてもよい。錠剤を、多糖の混合物を固体の担体および潤滑剤と共に圧縮することにより従来の手順に従って製剤化してもよい。好適な固体の担体の例には、デンプンおよびシュガーベントナイトがある。多糖を、例えばラクトースもしくはマンニトールなどの結合剤、従来の充填剤、および錠剤化剤を含むハードシェルタブレットまたはカプセル剤の形態で投与することも可能である。該医薬組成物を、例えば局所、腹腔内、および静脈内などの非経口経路により投与してもよい。非経口の投与形態の例には、活性物質の水溶液、等張生理食塩水の溶液もしくは５％グルコースの溶液、またはその他のよく知られた医薬として許容可能な賦形剤がある。シクロデキストリン、または当業者によく知られた他の可溶化剤を、治療用化合物の送達のための医薬賦形剤として使用することが可能である。
【００２１】
黒ダイズから調製された多糖を、上記障害の治療のため、またはその障害の治療用薬剤の製造のために使用することも、本発明の範囲内にある。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、本発明の栄養補給用組成物または医薬組成物がサイトカイン産生を刺激する効果を（例えばエライザ法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）により）評価し、または血液前駆細胞の数を増加させる効果を（例えば顆粒球・単球コロニー形成単位（ＣＦＵ‐ＧＭ）アッセイにより）評価することが可能である。例をあげれば、サイトカイン産生を上昇させるために、サイトカイン産生細胞（例えば脾臓細胞または単核球）を本発明の組成物の存在下培地中でインキュベートしてもよい。このようにして培地中に産生されたサイトカインの量を次に（例えばＥＬＩＳＡキットにより）測定することができる。サイトカインを含む脾臓細胞の培地を骨髄細胞と共にインキュベートして血液細胞を増加させることも可能である。前駆細胞数の増加は、ＣＦＵアッセイにおいてコロニーの総数を計数することにより測定可能である。
【００２２】
事前にスクリーニング（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）された本発明の組成物の有効性を、ｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイにより確認することができる。例えば、マウスに多糖を含有する組成物を給餌しつつ、その血液細胞数またはサイトカインレベルを間を置いて測定することができる。様々な用量および投与について試験可能である。結果に基づき、適切な用量の範囲と投与経路とを決定することができる。動物モデルから得た情報に基づいて臨床試験の計画を策定することができる。
【００２３】
さらに詳述するまでもなく、当業者には本明細書の記載に基づいて本発明を十分に利用することが可能と考えられる。従って、黒ダイズ由来の多糖の調製と試験とについて説明する以下の特定の実施例は、単なる例示として解釈されるべきであり、本開示の残りの部分を如何様にも限定するものではない。従って、下記の実施例では黒ダイズの１品種から調製された多糖の単離と利用とについて述べるが、他品種の黒ダイズまたはダイズから調製された多糖（以下の実施例１に記載の構造と多少異なる構造を有する可能性がある）およびその利用は、本発明の範囲内にある。本明細書中で言及した全ての出版物は、引用によりその全体を本明細書に組み込む。
【実施例１】
【００２４】
（黒ダイズ由来多糖の単離および構造解析）
ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．）のある品種のマメ（中華民国台湾に所在の台南地域農業改善本部（Ｔａｉｎａｎ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ）より入手した暗紫色の種皮と緑色の子葉のもの）を粉砕し、有機溶媒に浸して極性の低い含有物を除去した。次いで粉砕されたマメを水に浸した。遠心分離の後、水抽出物すなわち上清を、液体クロマトグラフィ、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ＬＨ‐２０カラム（英国バッキンガムシャー州リトルチャルフォント（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ）所在のアマシャムファルマシアバイオテク社）およびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＳＫ  ＨＷ‐５５Ｆカラム（ドイツ連邦共和国ダルムシュタート（Ｄａｒｍｓｔａｄ）所在のメルク社）を用いて精製した。精製された水抽出物をプロテアーゼＫ（５０ｍｇ／ｍｌ；米国ミズーリ州セントルイスに所在のシグマ社）により３７℃で１時間処理した。最後に、プロテアーゼ処理した水抽出物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ‐４００カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いたゲル濾過によりさらに精製し、凍結乾燥して多糖を得た。Ｓ‐４００カラムの結果から、主な多糖は約４８０ＫＤａｌの分子量を有することが示唆された。
【００２５】
多糖の分子量を、較正用に標準デキストラン（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて測定した。例えばリャオ（Ｌｉａｏ）ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ、第１２巻第１０号、８４１‐８４６ページ、２００１年；ハラ（Ｈａｒａ）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第１１０巻、７７‐８７ページ、１９８２年；ウカイ（Ｕｋａｉ）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第１０１巻、１０９‐１１６ページ、１９８２年を参照のこと。総炭水化物の測定は、標準としてグルコースを使用したフェノール硫酸比色アッセイにより実施した。フォックス（Ｆｏｘ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１９５巻、９３‐９６ページ、１９９１年、を参照のこと。２．０Ｎのトリフルオロ酢酸により１００℃で６時間加水分解した後、単糖の組成を測定し、次いでｃａｒｂｏＰａｃ（登録商標）ＭＡ‐１カラムを備えたＤｉｏｎｅｘ（登録商標）ＤＸ‐５００クロマトグラフィシステムを用いたイオン交換により精製した。例えばハーディ（Ｈａｒｄｙ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１７０巻、５４‐６２ページ、１９８８年を参照のこと。主な多糖の組成と多糖間の結合は、１Ｈ‐もしくは１３Ｃ‐ＮＭＲ分光法またはＨＰ６８９０シリーズＧＣシステムを備えたＨＰ５９７３ＭＳＤ（米国デラウェア州ウィルミントン所在のＨＰカンパニー）によるガス液体クロマトグラフィ‐質量分析（ｍａｓｓ）を用いても測定した。該多糖の比旋光度は、ＪＡＳＣＯ  ＤＩＰ‐３７０デジタル偏光計（日本国所在の日本分光株式会社（ＪＡＳＣＯ  Ｃｏｒｐ．））により５８９ｎｍのナトリウムランプを用いて２４℃の水中で測定可能である。
【００２６】
主な多糖の比旋光度は水中で［α］Ｄ＋１２２．２°、ｃ＝０．４５であった。スペクトルの結果から、該多糖が、（１，３）‐または（１，４）‐結合の分岐によりＣ３またはＣ４位がガラクトース、マンノース、またはグルコース残基で置換された、α‐（１，６）‐結合したＤ‐グルコース残基の骨格から基本的に構成されていることが示唆される。残基のモル数の比率は５％ガラクトース、６％マンノース、および８９％グルコース（±２０％）である。
【００２７】
このようにして得られた、または類似の方法を用いて得られた多糖（その主な構成要素として上記の多糖を有する）を保存し、以下の実施例に記載の実験に使用した。
【実施例２】
【００２８】
（サイトカイン産生に対する多糖の効果）
特定病原体不在条件で飼育したＩＣＲマウス（８〜１０週齢、２０〜２５ｇ）から脾臓を摘出し、単一細胞になるまでホモジナイズし、１ｍｍの金属製ふるいを用いて分散させて懸濁液とした。次いで、該脾臓細胞（１×１０７個／ｍＬ）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で、プロテアーゼ処理しＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ‐４００カラムで精製した種々の濃度（例えば０，１２．５，２５，５０および１００μｇ／ｍｌ）の多糖とともに、大気中５％ＣＯ２の全体に湿潤な雰囲気中３７℃でインキュベートした。７２時間後、脾臓細胞馴化培地（ＳＣＭ）を回収し、滅菌し、次いで１ｍＬずつのアリコートとして使用するまで−７０℃で保存した。
【００２９】
ＳＣＭ中に産生されたサイトカイン（すなわちインターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン１７、顆粒球コロニー刺激因子、単球コロニー刺激因子、または顆粒球・単球コロニー刺激因子）の測定は、対照として非処理の脾臓細胞を含むＳＣＭを用いてＥＬＩＳＡキット（米国ミネソタ州ミネアポリス所在のＲ＆Ｄシステムズ）により実施した。例えば、リャオ（Ｌｉａｏ）ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ、第１２巻第１０号、８４１‐８４６ページ、２００１年、および「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１１章、アカデミックプレス、ジョンワイリーアンドサンズ社、１９９８年を参照のこと。
【００３０】
刺激の３日後、ＰＳＢＳ‐ＳＣＭ中のＩＬ‐１７、ＧＭ‐ＣＳＦ、Ｇ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐６の量が劇的に増加した。
【実施例３】
【００３１】
（コロニー形成単位に対する多糖の効果）
ａ）顆粒球・マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ‐ＧＭ）に対する効果
軟寒天培養法を用いたＣＦＵ‐ＧＭアッセイを、ワン( Ｗａｎｇ) ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、第２４巻、４３７ページ、１９９６年に記載されているように実施した。ＩＣＲマウスから採取した骨髄細胞を、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、加湿状態の５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で９０分間培養した。次いで非付着性の該骨髄細胞（１×１０５個／ｍＬ）を、１５％ＦＣＳ、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミンＣならびにピルビン酸ナトリウムを添加したマッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙｓ’５Ａ  ｍｅｄｉｕｍ）に０．３％寒天（シグマ社）を含めて１ｍＬの層にしたものに蒔いた。種々の２０％（容量比）ＳＣＭまたは多糖のみを添加して、細胞の終濃度が同一となるように蒔いた。７日間インキュベートした後、各プレート上のコロニー数を倒立顕微鏡（米国ニューヨーク州メルビル所在のオリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）社）を用いて計数した。５％グルタルアルデヒドで固定し、メタノールで脱水し、ハリス・ヘマトキシリンで染色した後にｉｎ  ｓｉｔｕでコロニーの形態を測定した。例えばワン( Ｗａｎｇ) ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、第２０巻、５５２ページ、１９９２年を参照のこと。
【００３２】
結果から、多糖処理により、処理群のＳＣＭ中における培養骨髄細胞のコロニー形成が著しく増大した。形態学的解析から、４つのタイプのコロニー、すなわち顆粒球、単球・マクロファージ、顆粒球・単球、および好酸球が多糖処理により誘導されたことが示された。
【００３３】
ｂ）多能性コロニー形成単位（ＣＦＵ‐ＧＥＭＭ）および赤血球コロニー形成単位（ＢＦＵ‐Ｅ）に対する効果
ＣＦＵ‐ＧＥＭＭおよびＢＦＵ‐Ｅについてのコロニーアッセイを、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、米国ヒューストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ）：ＡＡＣＰ、シェ（Ｈｓｉｅｈ）編、１９９０年（Ｓ１）、１０ページ、におけるワン( Ｗａｎｇ) らの記載、および、ワン( Ｗａｎｇ) ら、Ｂｌｏｏｄ、第６５巻、１１８１ページ、１９８５年に記載されている手順に従って実施した。具体的には、５×１０４個の骨髄細胞を、イスコフ改変ダルベッコ培地（カナダ国バンクーバー所在のステムセルテクノロジーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に含めた１％メチルセルロース、３０％ＦＣＳ、１％ウシ血清アルブミン、１０−４Ｍの２‐メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ‐グルタミン、１ユニットのエリスロポエチン（ＥＰＯ；カナダ国オンタリオ州ウィロウデール（Ｗｉｌｌｏｗｄａｌｅ）所在のコンノートラボラトリーズ社（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）、および種々の２０％ＳＣＭの１ｍＬ混合物の入った３５ｍｍ培養用ディッシュに蒔いた。該ディッシュを、大気中５％ＣＯ２で満たした湿潤な雰囲気中３７℃で７日間インキュベートした。インキュベーション後、コロニーを特定し倒立顕微鏡で評価した。ＣＦＵ‐ＧＥＭＭは、顆粒球（Ｇ）、赤血球（Ｅ）、単球・マクロファージ（Ｍ）および巨核球（Ｍ）を含む混合コロニーを示し、ＢＦＵ‐Ｅは赤色またはピンク色の多中心性（ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ）（バースト）赤血球系コロニーを示した。
【００３４】
これらの結果から、多糖処理により、ＳＣＭ中におけるＣＦＵ‐ＧＥＭＭおよびＢＦＵ‐Ｅのコロニー形成が用量依存的に著明に増加することが示された。
【実施例４】
【００３５】
（マウスの骨髄造血に対する多糖の効果）
放射線照射マウスに対する多糖の効果を調査するため、２０匹のＩＣＲマウスを次の４群、すなわち対照群、多糖単独の処理群、全身放射線照射（ＴＢＩ）のみの処理群、およびＴＢＩと多糖投与とによる処理群、に分けた（各群マウス５匹）。第０日に、線形加速装置（Ｃｌｉｎａｃ（登録商標）１８００、米国カリフォルニア州所在のバリアンアソシエーツ社（Ｖａｒｉａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、線量率２．４Ｇｙ／分）を用いて各マウスの全身に８Ｇｙ（６ＭＶの光子線）の単回照射を実施した。多糖の経口投与（４００ｍｇ／ｋｇ）をＴＢＩの６時間後に開始し第０日から第４日まで実施した。対照群では、マウスに通常の生理食塩水を経口摂取させた。第０、２、４、６、８、１０、１２、１４および１６日に末梢血液を眼窩採血し、コールターカウンターを用いて白血球を計数した。さらに、実験期間中１日おきにマウスの体重を測定した。第１７日にマウスを屠殺し、コロニー形成アッセイのために骨塩量（ＢＭＣ）を取り出した。骨髄系のコロニー形成（ＣＦＵ‐ＧＭ）を上述の方法により評価した。
【００３６】
ＩＣＲマウスに５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）を単回で１５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。６時間後、４００ｍｇ／ｋｇの多糖を連続５日間経口投与した。同マウスを第１１日に屠殺し、コロニー形成アッセイのためにＢＭＣを採取した。結果から、これら２つのｉｎ  ｖｉｖｏのプロトコールにおいて、非処理の対照群と多糖処理群におけるＩＣＲマウスの白血球数のベースラインは同じであった。放射線照射および５‐ＦＵによる処理は明らかな骨髄抑制を引き起こした。白血球数はＴＢＩおよび５‐ＦＵ処理後に著しく減少した。多糖の５日間（第０〜４日）連続投与はＴＢＩおよび５‐ＦＵによる白血球減少症の程度を軽減しただけでなく、白血球数の回復期間を短縮した。ＴＢＩおよび５‐ＦＵ処理後、ＣＦＵ‐ＧＭコロニー数は著しく減少した（それぞれ３３±６および４１±５コロニー）。多糖の投与により、放射線照射および５‐ＦＵで処理されたマウスの骨髄造血の再生が可能となり、ＣＦＵ‐ＧＭの数値はＴＢＩおよび５‐ＦＵ単独の処理群に比べて約２．０倍（ＴＢＩ）および１．８倍（５‐ＦＵ）に増加した。
【実施例５】
【００３７】
（白血病細胞株Ｕ９３７に対する多糖の効果）
多糖の抗がん特性を示すために、本研究では米国基準菌株保存機構（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国メリーランド州ロックビル所在）から入手したヒト骨髄性白血病細胞株Ｕ９３７を使用した。１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地でＵ９３７細胞を培養し、加湿された５％ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で維持した。１×１０５個／ｍｌの細胞を、３０％（容量比）の正常ＭＮＣ‐ＣＭ（Ｎ‐ＭＮＣ‐ＣＭ）、ＰＳＢＳ（２５〜４００μｇ／ｍｌ）‐ＭＮＣ‐ＣＭまたはＰＳＢＳ単独（２５〜４００μｇ／ｍｌ）、の存在下または非存在下で培養した。５日間インキュベートした後、ラバーポリスマン（ｒｕｂｂｅｒ  ｐｏｌｉｃｅｍａｎ（商品名）、米国ニュージャージー州バインランド（Ｖｉｎｅｌａｎｄ）ベルコ・グラス（Ｂｅｌｌｃｏ  Ｇｌａｓｓ））を用いてディッシュを静かにこすることにより細胞を回収し、生細胞数をトリパンブルー色素排除テストにより計数した。
【００３８】
その結果、Ｕ９３７細胞の増殖はＰＳＢＳ‐ＭＮＣ‐ＣＭにより著しく阻害された。しかし、正常ＭＮＣ‐ＣＭまたはＰＳＢＳ単独（最大４００μｇ／ｍｌ）においては有意な阻害は観察されなかった。
【００３９】
種々の処理の５日後、細胞を回収してＣｙｔｏｓｐｉｎ（登録商標、シャントン・サザン・インスツルメント社（Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．））を用いて顕微鏡用スライド上で細胞遠心分離し、ライト染色し、倒立顕微鏡（オリンパス）で倍率×１０００で観察した。細胞の形態を３段階、すなわち未成熟な芽球、中間の細胞、成熟した単球またはマクロファージ、に分類した。
【００４０】
結果から、ＰＳＢＳ‐ＭＮＣ‐ＣＭの誘発により未成熟な芽球細胞が成熟した単球およびマクロファージに分化することが示された。芽球細胞の割合は９８．７±０．９％（非処理の対照群）から２．３±１．５％（４００μｇ／ｍｌのＰＳＢＳとともに調製されたＭＮＣ‐ＣＭ）へと劇的に減少した。これに対し、単球＋マクロファージの割合は０±０．０％（非処理の対照群）から８３．０±４．０％（ＰＳＢＳ‐ＭＮＣ‐ＣＭ）へと増加した。
【実施例６】
【００４１】
（骨髄造血活性の促進に対する多糖の効果）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜１０週齢、２０±５ｇ）を入手し、温度および湿度が制御された特定病原体不在条件下で、１２時間の明／暗サイクルで、餌と水を自由摂取できる状態に維持した。全ての実験を、ＮＩＨの「実験動物の飼育と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）」（ＤＨＨＳ発行番号ＮＩＨ８５‐２３、１９９６年改訂）に規定されたガイドラインに従って実施した。マウスの大腸腺がんでありＢＡＬＢ／ｃに同系のＣＴ２６を、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（米国ユタ州ローガン（Ｌｏｇａｎ）所在のハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ））および２ｍＭのＬ‐グルタミン（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（米国ニューヨーク州グランドアイランド所在のライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））中に維持し、５％ＣＯ２を含む浸潤な雰囲気中で３７℃で培養した。これらの細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの左横腹へ皮下移植した。
【００４２】
腫瘍を移植しない実験として、第０日目に５‐ＦＵ（体重１ｋｇあたり１５０ｍｇ）をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ（ｉ．ｐ．）注射し、ＰＳＢＳ（体重１ｋｇあたり１００または４００ｍｇ）を５‐ＦＵの注射後６時間から１日１回連続５日間、経口投与または腹腔内投与した。対照群のマウスには同じ時間に通常の生理食塩水を与えた。腫瘍移植モデルでは、マウス１匹あたりＰＢＳに含めた１×１０６個のＣＴ２６腫瘍細胞をマウス左横腹へ皮下注射した。１０日後、腫瘍は大きさ約０．５ｃｍ２まで成長し、次にマウスを対照群、５‐ＦＵ単独（１５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）処理群、および５‐ＦＵと多糖（４００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）の処理群の３群に分けた（１群マウス５匹）。次に、薬物処理の手順は先の腫瘍を用いない実験の方法と同じとした。
【００４３】
結果から、腫瘍を移植された、または移植されていないマウスの白血球数は５‐ＦＵ処理により著しく減少したことが示されている。ＰＳＢＳと組み合わせた５日間の処理により、５‐ＦＵの骨髄抑制を原因とする白血球数の底値の際の厳しさが緩和されただけでなく、底値となった後の白血球数の回復速度も増大した。多糖による処理は、腫瘍移植および５‐ＦＵ処理を受けたマウスのサイトカインの量も増大させた。
【実施例７】
【００４４】
（腫瘍成長の低減における多糖の効果）
マウス１匹あたり約１×１０６個のＰＢＳに含めたＣＴ２６腫瘍細胞を、第０日目にＢＡＬＢ／ｃマウスの左横腹へ皮下注射した。これらのマウスを次の４群に分けて処理した。（１）対照群、第１日目に開始して１週間に４日間ＰＢＳ投与；（２）多糖のみ、第１日目に開始して１週間に４日間、４００ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．投与；（３）５‐ＦＵのみ、第１１日目に開始して１週間に１回、１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与；（４）第１日目に開始の多糖と第１１日目に開始の５‐ＦＵの組合せ。末梢血液を眼窩採血し、ヘパリン処理したキャピラリー管とコールターカウンターとを用いて白血球を計数した。マウスの体重と腫瘍の大きさとを実験期間中１週間に２度測定したが、腫瘍の大きさは測径器で測定し、式：（長さ／２）（幅／２）πを用いて計算した。例えばワン（Ｗａｎｇ）ら、Ａｎｔｉ‐Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．、第１３巻、７７９ページ、１９９８年を参照のこと。
【００４５】
結果から、多糖を用いた処理により腫瘍の大きさが著しく縮小したことが示されている。１１日目の後では、（２）群の腫瘍の大きさを測定すると（１）群の腫瘍の大きさよりも有意に小さく、２０日目の後では、（４）群の腫瘍の大きさを測定すると（３）群の腫瘍の大きさよりも有意に小さかった。
【００４６】
（その他の実施形態）
以上の説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に特定することができ、また本発明の思想および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適合する本発明の種々の変更形態および修正形態を作製することができる。従って、他の実施形態も請求の範囲の範囲内にある。
【国際公開パンフレット】
2004531574.tif 000002
2004531574.tif 000003
2004531574.tif 000004
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2004531574.tif 000018
2004531574.tif 000019
2004531574.tif 000020
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004531574.tif 000021
【国際調査報告】
2004531574.tif 000022