(57)【要約】本発明は、美白化効果有効量の子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）由来メラニン分解酵素抽出物を含む局所用の美白化組成物及び当該組成物の調製方法に関する。本発明組成物は皮膚内のメラニンを分解することにより美白化効果を提供し、当該組成物自身は色が暗く変化することはない。上記酵素抽出物は、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）又はサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から得ることができ、本発明組成物に添加される。上記酵素抽出物を含有する本発明組成物は、コウジ酸に比較して皮膚を美白化する効果が２倍である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
美白化効果有効量の子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）由来メラニン分解酵素抽出物と化粧品用又は医薬品用の担体を含む、皮膚に用いる為の局所用の化粧品組成物又は医薬組成物。
【請求項２】
前記酵素抽出物が、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から成る群から選択される属から得られたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）由来酵素抽出物が、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）及びサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から成る群から選択される種である、請求項２に記載の組成物。
【請求項３】
前記酵素が精製された抽出物の溶液である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記酵素抽出物が約０．０５〜５．００重量％の量で存在している、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の酵素抽出物の美白化効果有効量を含む、皮膚に用いる為の局所用の化粧品組成物又は医薬組成物。
【請求項６】
さらに、日焼け止め剤を含有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記酵素抽出物が組成物の約０．０５〜５．００重量％の量で存在している、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵素抽出物の美白化効果有効量を含む、皮膚に用いる為の局所用の化粧品組成物又は医薬組成物。
【請求項９】
さらに、日焼け止め剤を含有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記酵素抽出物が約０．０５〜５．００重量％の量で存在している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）由来メラニン分解酵素抽出物を含有する組成物を皮膚に局所的に適用することを含んで成る、皮膚の美白化方法。
【請求項１２】
前記子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）が、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から成る群から選択される目から得られたものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）が、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）及びサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から成る群から選択される種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素抽出物が組成物の約０．０５〜約５．００重量％の量で存在している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項５に記載された組成物を皮膚に適用することを含んで成る、皮膚中のメラニンを分解する方法。
【請求項１６】
請求項８に記載された組成物を皮膚に適用することを含んで成る、皮膚中のメラニンを分解する方法。
【請求項１７】
前記組成物が組成物の約０．０５〜約５．００重量％の量で存在している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）をベースとする酵素抽出物が、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）及びサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から成る群から選択される属から得られた子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）メラニン分解酵素抽出物の美白化効果有効量を含有する組成物を局所的に適用することを含んで成る、紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）による日焼けを抑制する方法。
【請求項２０】
前記美白化効果有効量が組成物の約０．０５〜約５．００重量％であり、前記酵素抽出物がアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）及びサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から成る群から選択される種から得たものである、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は美白化組成物（ｗｈｉｔｅｎｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）に関する。より詳細には、本発明は、皮膚に局所的に適用された時に、表皮のメラニンを分解する子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）由来酵素抽出物を含有する美白化組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
美は見る人次第である。ある人々にとって皮膚を小麦色にするのが魅力的であるのと同様に、皮膚を白くしたいという願望は別の人々にとってはまさに魅力的であり得る。従って、ある人々にとっては、あざやほくろやそばかすのある皮膚が魅惑的であるかもしれないが、その様な皮膚の茶色の斑点は別の人々にとっては魅力のないものであろう。茶色の斑点は、皮膚のメラニン生成が増加している領域に見られる。メラニンは皮膚の「色」の原因物質であり、紫外線の有害な作用から皮膚を保護する機能を有している。皮膚において、紫外線の刺激に応答して生成されるメラニンは、よく知られている皮膚の日焼けを引き起こし、ある種の民族の皮膚における生まれながらにして多量に生成されるメラニンは、黒っぽい肌の色合いをもたらす。皮膚に茶色の斑点があるのを好まない人や、単に明るい肌の色合いを望む人にとっては、美白化組成物は有用である。
【０００３】
皮膚を美白化するための種々のタイプの美白化剤（ｗｈｉｔｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）が知られている。ヒドロキノン、４−イソプロピルカテコール及びヒドロキノンモノベンジルエーテルは、漂白剤の例である。しかしながら、皮膚の死んだ細胞の最上層は脱離するので、漂白剤は皮膚に繰り返し使用することが必要である。新たに死んだ細胞の層が表面に現れた時に、斑点が再び黒くなるか又は再び現れる。また、漂白剤はその強力な作用により刺激性であり得、場合によっては、後天性斑状皮膚色素脱失（白斑）や発疹（ｒａｓｈｉｎｇ）等の皮膚症状を引き起こし得る。皮膚を美白化する別の方法は、アスコルビン酸、サリチル酸及び乳酸等の美白化剤の使用であり、これらは、死んだ皮膚細胞の最上層の脱離や剥離を引き起こすが、それと同時に、多量に生成されたメラニンに起因する皮膚表面に移動してきた斑点もまた脱離する。しかしながら、この方法では、美白化効果を得るのに約２〜４週間という長い時間が必要であり、また、頻繁に使用する必要がある。
【０００４】
別の公知の美白化剤はコウジ酸等のチロシナーゼ阻害剤であるが、これらは、皮膚内でのメラニンの生成を阻害する。メラニンは皮膚の表皮基底層に存在する細胞であるメラニン形成細胞で合成される。メラニンは多くの前駆体を経由して生成される。例えば、チロシナーゼの作用で媒介されるチロシン、ドーパ、ドーパキノンを経由し、前駆体インドール−５，６−ジヒドロキノンが重合されてメラニンとなる。皮膚内でのメラニンの生成に関与する前駆体のいずれか１つを阻害することにより、メラニンの生成が妨げられ、皮膚の脱色素効果又は「美白化効果」が得られる。
【０００５】
メラニンの生成を阻害することは可能であるが、皮膚を美白化する別の方法ではメラニンを分解する。この方法は、例えば、米国特許第５，５７８，２９６号に記載されており、当該方法では、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属する種又はメラニン分解能を有するいずれかの木材腐朽菌類の培養生成物又は加工生成物を使用する。この方法は、メラニンを分解するので、有害な紫外線から保護するための皮膚内でのメラニンの生成は阻害しない。しかしながら、メラニンを分解するということは皮膚内で新たな斑点が形成されるのを妨げない。従って、この方法も別の美白化方法と同様に繰り返し行うことが必要である。さらに、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）の菌は、窒素が制限された特定培地で予め培養される。担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）の菌の選定に先だって微生物の集中的なスクリーニングがなされたが、不成功に終わった。また、日本国特許出願公開第平０８−１１９８４３号には、活性成分としてアルメニアカエ・セメン（Ａｒｍｅｎｉａｃａｅ Ｓｅｍｅｎ）又はシュードシドニア・シネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｃｙｄｏｎｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｓｃｈｎｅｉｄ．）の抽出物を含有するメラニンの反応抑制物質が記載されており、日本国特許出願公開第平０６−２６９２７８号には、皮膚の上に形成されたメラニンを脱色するための菌株ＭＥＬ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２９９１）が記載されている。
【０００６】
また、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡでコンポスト塊から単離したアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の菌株であるＮＲＲＬ６４６３が、合成チロシン及びドーパ、並びに、単一の炭素源としてタンパク質を除去した毛髪メラニンを利用したことが、Ｌｕｔｈｅｒ及びＬｉｐｋｅにより、「Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｌａｎｉｎ  ｂｙ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ」，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１，ｐｐ．１４５−１５５（Ｊｕｌｙ  １９８０）に記載されている。上記研究論文において記載されているアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）は、メラニンを分解する間に黒い色を発色する。従って、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を美白化剤として皮膚に使用することは記載されていない。さらに、メラニンの構造における多様性は、メラニンの分解に寄与し得る微生物を同定するのに効果的であり得る。メラニンは海生動物と陸生動物の双方において広く存在しているが、メラニンの組成は、イノール性（ｉｎｏｌｉｃ）置換基とフェノール性置換基の比率において変動する。ある特定のクラスのメラニンの化学的組成と物理的性質は、メラニンを形成する環境に大きく依存している。表皮メラニンにはユーメラニン及びフェオメラニンの２つのクラスのメラニンが存在することが知られている。ユーメラニンは特にペプチドコーティングを有している。特定のメラニンポリマーに関して得られた結論を全てのクラスのメラニンに直感的に当てはめることはできない。「Ｍｅｌａｎｉｎ：Ｉｔｓ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ」，Ｚｅｉｓｅ，Ｌ．，ら．Ｅｄｓ．，ｐ．１１−１２（Ｖａｌｄｅｎｍａｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９５）。ＬｕｔｈｅｒとＬｉｐｋｅにより記載された研究論文ではタンパク質除去された毛髪メラニンと合成前駆体を使用しており、当該論文には、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の酵素抽出物を皮膚に局所的に適用した時、当該抽出物が有するメラニンを分解する能力に関しては記載されていない。菌類由来の酵素抽出物が、皮膚の美白
化において、驚くべきことに従来使用されてきたチロシナーゼ阻害剤に比較して２倍も効果的であり得るということも従来技術では知られていない。
【０００７】
また、不完全菌類に属し且つノブリスポリウム（Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ）として分類し直された糸状菌であるアクロスタフィルス（Ａｃｒｏｓｔａｐｈｙｌｕｓ）種のメラニン分解性菌（ｍｅｌａｎｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ）の単離株を用いて、メラニンを加水分解する作用に対する二価金属カチオンの効果が見いだされた。Ｌｉｕ，Ｙｕ−ｔｉｅｎにより「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｅｌａｎｏｌｙｔｉｃ  Ｆｕｎｇｕｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  Ｍｅｌａｎｉｎ」，Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，ｖｏｌ．８７，Ｎｏ．５，ｐｐ．６５１−６５４（１９９５）に開示されている特定の菌株ＮＤＭＣ−１０１を用いた。アクロスタフィルス（Ａｃｒｏｓｔａｐｈｙｌｕｓ）種は木材に腐生し、丸太や切り株、枯れた小枝や木の枝、及び、草本植物の枯れた葉や茎等の植物材を腐朽させる。上記菌株は、適切な量の二価金属イオンを含む培地の中で持続的に増殖するための窒素源としてメラニンを利用することができる。従って、当該菌株は、汚濁水中のメラニンを分解することができる。
【０００８】
驚くべきことに、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）由来酵素抽出物を化粧品組成物又は医薬組成物に含有させて皮膚の美白化剤として使用することができることが見いだされた。従って、本発明により局所用美白化組成物が提供され、当該組成物は、皮膚に使用されることで、不利益な副作用を伴うことなく且つ別の種類の美白化処理と組み合わせる必要もなく、美白化作用を示すことができる。
【０００９】
発明の概要
本発明は、美白化効果有効量の子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）門由来メラナーゼ酵素抽出物を含む、皮膚に用いる為の局所用の化粧品組成物又は医薬組成物に関する。子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）は、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から成る群から得ることができる。特に、上記抽出物は、皮膚を美白化するのに有効な菌（アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））及び酵母（サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の種に由来するメラニン分解酵素を含有する。本発明の組成物を調製する工程には、粗製酵素抽出物を化粧品組成物又は医薬組成物に添加する前に精製する工程も含まれる。
【００１０】
本発明は、さらに、上記子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）由来酵素を含有する組成物を皮膚に局所的に適用することによる、皮膚の美白化方法をも包含する。当該方法は、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）又はサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から酵素を抽出することを含む。メラナーゼ酵素抽出物を化粧品組成物又は医薬組成物に添加して、皮膚に局所的に適用する。本発明組成物を局所的に適用することによる皮膚内メラニン生成物を分解する方法及び紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）による日焼けを抑制する方法もまた本発明に包含される。
【００１１】
図面の説明
図１は、紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）による日焼けに対する、２％コウジ酸及び本発明の１％アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）酵素抽出物の、処理期間中の第７日、第９日、第１２日及び第１４日に測定した、反射率の変化によって示される皮膚の美白化効果を表すグラフである。
【００１２】
図２は、照射を受け且つ２％コウジ酸又は本発明の１％アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）酵素抽出物で処理された皮膚の、第９日と第１４日の間の皮膚の色の減少（％）を示すチャートである。
【００１３】
発明の説明
実際、菌類は、生物の生と死の連続するサイクルにおける重要な部分であると考えられる。特に、菌類は一般に死んだ有機物を再利用して自らの生育に必要な栄養素とする。菌類は、消化器系の一部としての菌糸から周囲の環境に酵素を放出して、有機物を吸収可能な栄養素の形態に分解する。驚くべきことに、大きな門である子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）の菌に由来するメラナーゼ酵素を含有する化粧品組成物又は医薬組成物の局所的な適用が皮膚を美白化するのに有効であることが見いだされた。
【００１４】
子嚢菌としても知られているコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の１つの特定の種は腐生生物であり、殆ど全ての炭素質物質を摂取することができる。好ましいコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）はアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）である。図１に示されているように、約１％のアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）メラナーゼ酵素抽出物により得られる美白化効果は、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）抽出物の２倍の量である２％のコウジ酸を用いて得られる美白化効果よりも大きい。本発明は、有効量のアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）酵素抽出物を皮膚に局所的に適用した時に表皮メラニンを分解することができるという驚くべき発見を包含する。
【００１５】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の分生子は環境中の至る所に存在する。１８ＳｒＤＮＡの系統発生的分析により、子嚢を有する菌（子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ））と担子器を有する菌（担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ））の間の伝統的な分類が支持された。また、担子器の外側で生産され、例えばキノコのかさのようなかさのひだから外へ落下してひだの間の空間内へ短い距離しか放出されない担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）の胞子とは異なり、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の胞子は微細な白い粉塵として空気中に爆発的に放出され得る。子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の最も顕著な特徴の１つは、子嚢胞子を形成し、それらの胞子を子嚢から放出することである。子嚢胞子は、通常、子嚢果からねらいを定めて強制的に噴出される。子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）の嚢内に胞子が密集していることにより、当該門の菌で経験してきた急速な増殖を説明し得る。
【００１６】
コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）には、約１３２の種と１８の変異株が含まれる。アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）種は、植物材、コンポスト、土壌及び食物に天然に見られる。アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の種々の菌株は約２４℃〜約３０℃の範囲の温度でいろいろな寒天培地上で増殖する。アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のコロニーはＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ溶液寒天培地上で約４５℃で急速に増殖する。上記菌はビロードのように滑らかであるものから綿のようなものまであり、色は白であるが、頂部は緑色又は灰色である。菌の下側は無色、黄色、緑色又は茶色である。アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）は、通常は銀／黄色であり、メラニン類やメラノゲン類上で増殖する場合を除いて、暗い色の色素を欠いている。Ｌｕｔｈｅｒら、ｐ．１４６（前掲）を参照されたい。メラナーゼの増加はメラニンに依存し得る。分生子では色素突然変異体も出現し得る。アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の分生子は、ざらざらした膜で覆われているものから殆ど滑らかなものまであり、形状は、球形から楕円形又はほぼ球形のものまであり得る。分生子はまた小さな棘のある、約２．０〜３．５μｍの単一細胞（１−ｃｅｌｌｅｄ）である。分生子を有する分生子柄は薄膜で覆われ、滑らかで緑色をしており、末端は半球状の頂嚢である。アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）は、フィアライドが一列に並んでついているフラスコの形状をした頂嚢、単一の小型柱状体（ｓｉｎｇｌｅ， ｃｏｍｐａｃｔ ｃｏｌｕｍｎ）を産生する。フィアライドは頂嚢の上半分を覆っている。分生子頭もまた単一の小型柱状体を形成する。菌糸壁は２層に見える。１つの層は厚くて半透明の内層であり、残りの層は薄くて不透明な外層である。
【００１７】
本発明のメラニン分解酵素抽出物は、先ず、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから商業的に入手可能な増殖させたアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のコロニーを増殖させることにより調製することができる。好ましい菌株はＡＴＣＣから入手可能なＮＲＲＬ６４６３である。前記菌は、加工処理された試験管の先端に入った状態か又は凍結乾燥した状態で入手可能である。アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）は、麦芽エキス寒天培地、ポテトデキストロース寒天培地、ＹｐＳｓ寒天培地、ＰＹＧ培地又はＣｚａｐｅｋ寒天培地で増殖可能である。好ましくは、前記菌は、１リットルのスピナーフラスコ内のポテトデキストロース寒天培地で、１ｍＬ当たり約１０６〜１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）の極めて高密度に成るまで増殖させる。これらの量は、手引きに従って達成され、必要に応じて微生物学の当業者の一般的な知識に基づいて調節して所望の増殖速度を達成することができる。
【００１８】
上記酵素は、約５００ｍＬの培養物を遠心分離し、それを約１５０ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭのトリスバッファー及び約１％のＮＰ４０界面活性剤に再懸濁させることにより抽出する。得られた再懸濁液を約３０分間超音波処理した後、化粧品組成物又は医薬組成物に、単離された粗製酵素として直接添加することができる。好ましくは、前記酵素は、０．２２μｍのフィルターを通して濾過することにより精製する。精製された酵素抽出物の溶液中の酵素の量は約１％〜約９５％とすることができ、好ましくは、酵素は当該精製溶液の約８０％〜約９５％である。
【００１９】
上記で調製した酵素抽出物の美白化効果有効量を化粧品組成物又は医薬組成物に加える。本明細書で使用される用語「美白化効果有効量」は、ミノルタ色差計（Ｍｉｎｏｌｔａ Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅｒ）を用いて測定した時に、皮膚の色を少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約３０％減じる酵素の量を意味する。好ましくは、美白化効果有効量は、上記組成物中の約０．０５重量％〜約５．００重量％の酵素である。さらに好ましくは、酵素は組成物中に約０．１重量％〜約２．０重量％の量で存在する。
【００２０】
さらに、驚くべきことに、酵母菌由来酵素抽出物を化粧品組成物又は医薬組成物に含有させて皮膚の美白化剤として使用することができることが見いだされた。特定の単細胞酵母菌は、サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（真正酵母菌又はパン酵母としても知られており、例えば、菌株ＡＴＣＣ６０２１９がある）である。酵母菌は、子嚢胞子により減数分裂生殖を行う孤生型出芽細胞により特徴づけられる。酵母菌の核は、別の真核生物の核のように、仁と、核膜に結合した数個の染色体を含んでいる。酵母菌では、子嚢胞子は出芽又は分生子を形成（分裂）して増殖する。単細胞酵母菌は、単に子嚢になり、通常は約４個の胞子を有する。
【００２１】
酵母菌又はパン酵母が皮膚の呼吸を刺激することが報告されていることは公知である。従来技術では、協働作用を有する酵母菌抽出物をペルオキシダーゼ酵素と組み合わせて、ペルオキシダーゼ活性の妨害を防ぐ。しかしながら、欧州特許出願第１００４２８９号においては、当該特許出願に記載された酵母菌抽出物が皮膚内のメラニンを分解する作用を有するということに関しては何ら報告されていない。本発明のために抽出される酵母菌は１０％コロイド状無機物（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｌｓａ，ＯＫ）を含有するＹＭブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｓから入手可能）内で数日間増殖させることができる。前記酵母菌を超音波処理し、濾過し、次いで、酵母菌由来の酵素を、上記で説明した菌の場合と同様に化粧品組成物又は医薬組成物に添加する。
【００２２】
本発明は皮膚を美白化する方法をも包含し、当該方法は、化粧品組成物又は医薬組成物に美白化効果有効量の酵素（上記菌又は酵母菌）を添加し、得られた組成物を皮膚に局所的に適用することから成る。本発明の組成物は、当該組成物自身が暗い色に変色することなく、皮膚の美白化効果を達成する。上記組成物は、例えば、顔、下肢と上肢、及び胴等の、美白化しようとする任意の場所に局所的に適用することができる。本発明の美白化組成物は、皮膚の表面の領域に約２ｍｇ／ｃｍ２の割合ですり込むことにより適用するが、必要に応じて再度適用し、例えば毎日適用する。美白化効果は約５〜１０日で得られる。本発明の組成物の美白化剤としての優位点は、約１０〜１５日の間に観察される。本発明の組成物は常習的に使用することができる。従って、当該美白化組成物は、皮膚へ局所的に適用するための慣用の任意の形態に調製することができる。その様な形態の非限定的な例としては、ゲル、クリーム、コロイド分散液、エマルション（油中水型又は水中油型）、懸濁液、溶液、ローション、フォーム、ムース、及びスプレー等を挙げることができる。
【００２３】
本発明の美白化組成物は、化粧品として及び／又は医薬品として許容される種々の担体と一緒に製剤される。用語「化粧品として及び／又は医薬品として許容される担体」は、意図された標的に活性成分を送達しながらヒト又は当該組成物を適用する他の生物に害を及ぼさない、医薬用途又は化粧品用途の為の賦形剤を指す。本明細書で使用する「医薬」又は「化粧品」は、ヒト用と動物用の医薬及び化粧品の両方とも包含すると理解されたい。有用な担体の例としては、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、及び鉱油等を挙げることができる。選択された担体が本発明の美白化組成物に関して適合性であり且つ比較的不活性でなければならないことは当業者には明らかであろう。組成物を製剤するための方法と成分はよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｉｇｈｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０の中に見いだすことができる。
【００２４】
本発明の美白化組成物は、１種以上の日焼け止め剤と組み合わせてもよい。本明細書で使用される用語「日焼け止め剤」は、約２８０ｎｍ〜約４００ｎｍの波長を有する紫外光を効率よく吸収し、及び／又は、約２８０ｎｍ〜約４００ｎｍの波長を有する紫外光を皮膚の表面から反射させるか若しくは散乱させることにより、その様な波長の紫外光から皮膚を保護することができる任意の物質を指す。これに関して本発明の組成物と組み合わせることができる日焼け止め剤の例としては、二酸化チタン、酸化亜鉛、ベンゾフェノン、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、オクチルジメチルＰＡＢＡ、アミルジメチルＰＡＢＡ、オクチルメトキシシンナメート、２−エトキシｐ−メトキシシンナメート、オキシベンゾン、ホモサレート、サリチル酸フェニル、グリセリルｐ−アミノベンゾエート及びエチル−ｐ−グリコシルイミドベンゾエート等を挙げることができる。製剤において、上記日焼け止め剤は当該日焼け止め剤として通常使用される量で使用され、上記酵素は上記した量で使用される。
【００２５】
本発明の美白化組成物には種々の他の任意成分を含ませてもよい。その様な任意成分としては、非限定的に、芳香剤（ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ）、香料（ｐｅｒｆｕｍｅｓ）、着香剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇｓ）、保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）、皮膚軟化剤、消毒剤（ａｎｔｉｓｅｐｔｉｃｓ）、顔料、染料、着色剤、湿潤剤、噴射剤、防水剤、塗膜形成剤及びビタミン類や、存在させることが化粧品として、薬剤として、医薬として、又は他の点から望ましい別のクラスの物質等を挙げることができる。一般的な例は、ＣＴＦＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９１の中に見いだされる。前記文献の内容は、参照により本明細書に組み入れる。本発明の美白化組成物は、メーキャップ製品の中にも使用し得る。
【００２６】
本発明の美白化組成物は、さらなる有用な活性成分をも含有し得る。その様な活性成分としては、非限定的に、別の公知美白化剤、例えば、チロシナーゼ阻害剤（例えば、コウジ酸）、酸化防止剤、抗菌剤、鎮痛剤、麻酔薬、抗アクネ剤、抗皮膚炎薬（ａｎｔｉｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ａｇｅｎｔｓ）、鎮痒薬、抗炎症薬、抗角化症薬（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｌｙｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、抗乾燥肌薬（ａｎｔｉ−ｄｒｙ ｓｋｉｎ ａｇｅｎｔｓ）、制汗薬、抗乾癬薬、抗脂漏薬、抗老化薬、抗シワ剤、セルフタンニング剤、創傷治療薬、コルチコステロイド、及びホルモン類等を挙げることができる。当該組成物に上記活性成分を入れることができるかについては、本発明の子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）由来メラニン分解酵素と組み合わせた場合のその活性成分の安定性及び／又は溶解性により決定する。しかしながら、追加活性成分の送達方法の選択は、本発明の美白化組成物に対して選択された送達方法には限定されない。
【００２７】
以下に示す非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
【００２８】
実施例
Ｉ．美白化組成物の調製
【表１】
2004518714.tif 000002
相Ｉの成分と相ＩＩの成分を別々の容器で混合し、各混合物を撹拌しながら７０℃まで加熱する。次いで、混合した相Ｉの成分を混合した相ＩＩの成分に撹拌しながら添加する。得られた混合物を撹拌しながら温度を３０℃まで低下させる。相ＩＩＩの成分を混合して相Ｉと相ＩＩの成分に添加して最終的なエマルションを形成させる。アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）酵素抽出物は、ＡＴＣＣから入手したＮＲＲＬ６４６３である。
【００２９】
ＩＩ．アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）酵素抽出物の美白化作用
比較試験を行って、公知のチロシナーゼ阻害剤であるコウジ酸の効力とアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）酵素抽出物の効力とを比較して測定する。３種類のサンプルを調製する。第１のサンプルは美白化剤を含まないローション用の基剤処方を含有する。第２のサンプルは上記と同様の基剤処方に２％コウジ酸を添加したものである。最後に、第３のサンプルは、上記実施例Ｉに記載したように、上記基剤処方中に本発明の美白化剤であるアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）酵素抽出物を１％含有する。
【００３０】
１０人のボランティアパネリストが本研究に参加する。本研究を適切なものとするために、上記パネリストは、皮膚病上の問題を包含する急性疾患及び慢性疾患の兆候を有さない正常な健康状態であることが求められる。パネリストは、肌質タイプＩ−ＩＩの１８歳〜４５歳の範囲の女性である。さらに、日焼けの影響や、発疹、かき傷、又は火傷の痕は試験結果の解析の障害と成り得るので、上記パネリストはこれらの症状を示さない。妊娠中の女性や授乳中の女性も除外される。試験場で試験を実施するにあたり、参加パネリストを調査して、彼女らに過度の疣贅、痣、ほくろ、日焼け（ｓｕｎｂｕｒｎ）、日焼け（ｓｕｎｔａｎ）、瘢痕又は活動性の皮膚障害が無いことを確認する。最後に、パネリストは、試験期間中及び試験開始前２週間は、全身的又は局所的に、レチノイド、抗ヒスタミン剤又は同様の薬品を使用しない。
【００３１】
各パネリストの背中の４つの異なった約４ｃｍ２の領域に印を付ける。４つの領域の内の３ヶ所を、美白化剤を含まない上記ローション、２％コウジ酸を含むローション、及び本発明のアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）酵素抽出物を１％含むローションに対応させる。第４番目の領域を未処理照射対照として用いる。各パネリストは各試験領域に最小有効量（ＭＥＤ）の２倍量の紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）を受ける。試験区域に、フィルター（ｍｍ  ＵＧ−５）の付いたＸｅｎｏｎ  Ａｒｃ  Ｓｏｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ（１５０ワット）を用いて照射して、皮膚を紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）の照射及び紫外線Ａ（ＵＶ−Ａ）の照射に曝す。照射後７日間、日焼けの程度を観察し、皮膚の反射率の差（Ｌ）を測定するミノルタ色差計を用いて基準となる色を測定する。反射率の差の値の変化をΔＬ＊とする。デルタ値を第７日に測定した基準となる皮膚の色値に対して測定する。第７日の色差計による測定の後、試験物質を２ｍｇ／ｃｍ２の割合で各試験区域に適用し、１０分間乾燥させる。試験物質による処理を１日当たり１回の割合で７日間（即ち、試験第８日〜第１４日）続ける。色差計の示す数値を照射後第９日、第１２日及び第１４日に読みとる。皮膚の日焼けの増加を照射後約９日間にわたり色差計を用いて観測する。
【００３２】
結果を図１及び図２に示す。図１において、１％のアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）酵素抽出物（「アスペルギルス抽出物」）の皮膚美白化効果は、当該酵素抽出物の量の２倍の量である２％のコウジ酸よりも大きいことが分かる。当該比較は反射率（ΔＬ＊）に基づいて測定している。当該比較により、本発明の酵素抽出物含有組成物はより低い反射率を有し、従ってより大きな美白化効果を有することが示される。皮膚の日焼けは約第９日まで増加し続けるので、第１２日と第１４日のデータは、第９日のデータの平均値に対して正規化する。図２は、第９日と第１４日の間での、皮膚の色の減少（％）に関する上記３種の処方の比較が示されている。図２のデータから、コウジ酸の量（２％）の半分の量（１％）の酵素抽出物を含有する本発明組成物が皮膚の色をより大きく減少させていることが分かる。
【００３３】
ＩＩＩ．サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵素抽出物の美白化作用
酵母菌を１０％コロイド状無機物を含有するＹＭブロス中で３日間増殖させる。増殖させた酵母菌を水浴ソニケーター内で約３０分間超音波処理し、濾過する。ＰＢＳ中で、１ｍｇ／ｍＬの冷却したｄｌ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）を２５０μＣｉのＣ１４ＤＯＰＡと一緒にインキュベートすることによりメラニンを調製する。１０単位／ｍＬのマッシュルームチロシナーゼで重合を開始させ、暗い色に変わって不溶性メラニン色素が観察されるまで重合を続けさせる。調製したメラニンを４℃で保存する。
【００３４】
約１．０ｍＬの合成メラニンを約１０，０００ｒｐｍで約１５分間遠心分離することを繰り返すことにより、合成メラニンから不溶性の放射性同位体で標識されたＣ１４−メラニンを調製する。遠心分離は３回繰り返す。各遠心分離操作毎に、約１．０ｍＬのメラニンを加え、上澄みを捨てる。プールした不溶性メラニンを約１００μＬのＰＢＳ中に再度懸濁させて、基質として使用する。反応混合物は、１０μＬの放射性標識メラニン、７０μＬのＰＢＳ、約０、２５、５０又は１００μＬの細胞ホモジネートのフラクション（酵母菌抽出物）から成る。反応混合物を振盪しながら３７℃で約１週間インキュベートする。シンチレーション液を添加して反応を停止させ、メラニンをカウントする。処理は３反復で行う。１週間インキュベートした後のメラニンの総カウントの減少を観察する。２５μＬ、５０μＬ及び１００μＬの粗製酵母菌抽出物によって、それぞれ、２４％、２９％及び５４％の量の放射性標識物が減少するのが見いだされる。
【００３５】
ＩＶ．サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵素抽出物の美白化作用
【表２】
2004518714.tif 000003
試験を行って、公知のチロシナーゼ阻害剤であるコウジ酸の効力とサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵素抽出物の効力とを比較して測定する。酵母菌酵素抽出物と２％コウジ酸のサンプルを、別々に、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）ステアレート基剤中で調製する。第１のサンプルは、ローション用の基剤処方とサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵素抽出物１％を含有する。第２のサンプルは、上記と同様の基剤処方に２％コウジ酸を添加したものである。
【００３６】
７人のボランティアパネリストが本研究に参加する。本研究を適切なものとするために、上記パネリストは、皮膚病上の問題を包含する急性疾患及び慢性疾患の兆候を有さない正常な健康状態であることが求められる。パネリストは、肌質タイプＩ−ＩＩの１８歳〜４５歳の範囲の女性である。さらに、日焼けの影響や、発疹、かき傷、又は火傷の痕は試験結果の解析の障害と成り得るので、上記パネリストはこれらの症状を示さない。妊娠中の女性や授乳中の女性も除外される。パネリストは見たところ正常な健康状態であり、皮膚病上の問題を包含する急性疾患及び慢性疾患の兆候を有さない。試験場で試験を実施するにあたり、参加パネリストを調査して、彼女らに過度の疣贅、痣、ほくろ、日焼け（ｓｕｎｂｕｒｎ）、日焼け（ｓｕｎｔａｎ）、瘢痕又は活動性の皮膚障害が無いことを確認する。最後に、パネリストは、試験期間中及び試験開始前２週間は、全身的又は局所的に、レチノイド、抗ヒスタミン剤又は同様の薬品を使用しない。
【００３７】
各々２つのサンプル（即ち、２％コウジ酸を含むローションと本発明のサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵素抽出物を１％含有するローション）を適用するために、各パネリストの背中の異なった約４ｃｍ２の領域に印を付ける。さらに、もう一つの領域に未処理照射対照として印をつける。各パネリストは各試験領域に最小有効量（ＭＥＤ）の２倍量の紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）を受ける。試験区域に、フィルター（ｍｍ  ＵＧ−５）の付いたＸｅｎｏｎ  Ａｒｃ  Ｓｏｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｏｒ（１５０ワット）を用いて照射して、皮膚を紫外線Ｂ（ＵＶ−Ｂ）の照射及び紫外線Ａ（ＵＶ−Ａ）の照射に曝す。照射後５日間、日焼けの程度を観察し、皮膚の反射率の差（Ｌ）を測定するミノルタ色差計（Ｍｉｎｏｌｔａ Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅｒ）を用いて基準となる色を測定する。反射率の差の値の変化をΔＬ＊とする。デルタ値を第７日に測定した基準となる皮膚の色値に対して測定する。第７日の色差計による測定の後、試験物質を２ｍｇ／ｃｍ２の割合で各試験区域に適用し、１０分間乾燥させる。試験物質による処理を１日当たり１回の割合で７日間（即ち、試験第８日〜第１４日）続ける。色差計の示す数値を照射後第９日、第１２日及び第１４日に読みとる。皮膚の日焼けの増加を照射後約９日間にわたり色差計を用いて観測する。結果は、酵母菌酵素抽出物（１％）を含有するサンプルにより皮膚の色が減少したことを示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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