(57)【要約】本発明は、切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドと、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする際のそれの使用に関する。切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＨドメインと、キナーゼドメインを構成するアミノ酸までで、それを含まない、少なくとも１つのプロリンに富む領域を含む一部のＴＨドメインを構成する最低限のアミノ酸により切断されているＴｅｃキナーゼアミノ酸配列を有する切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチド。
【請求項２】
Ｔｅｃキナーゼアミノ酸配列が、ＰＨドメインと、ＳＨ２およびキナーゼドメインを構成するアミノ酸までで、それを含まない、少なくとも１つのプロリンに富む領域を含む一部のＴＨドメインを構成する最低限のアミノ酸により切断されているところの、請求項１記載の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチド。
【請求項３】
Ｔｅｃキナーゼアミノ酸配列が、ＰＨドメインと、ＳＨ３、ＳＨ２およびキナーゼドメインを構成するアミノ酸までで、それを含まない、少なくとも１つのプロリンに富む領域を含む一部のＴＨドメインを構成する最低限のアミノ酸により切断されているところの、請求項１記載の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチド。
【請求項４】
全くプロリンに富む領域を含まない、請求項１ないし３のいずれか一項記載の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチド。
【請求項５】
ＴｅｃキナーゼポリペプチドがＩｔｋであるところの、請求項１ないし４のいずれか一項記載の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチド。
【請求項６】
図３に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有する、請求項５記載の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチド。
【請求項７】
ＴｅｃキナーゼポリペプチドがＢｔｋであるところの、請求項１ないし４のいずれか一項記載の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチド。
【請求項８】
図８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有する、請求項７記載の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチド。
【請求項９】
（ａ）請求項１ないし８のいずれか一項に記載の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドをコードするか；
（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的であるか；
（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）と選択的にハイブリダイズするか；または
（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重されている、
単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
（ａ）図３に示される切断型Ｉｔｋポリペプチドをコードするか；
（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的であるか；
（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）と選択的にハイブリダイズするか；または
（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重されている、
請求項９記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
（ａ）図２に示される配列；
（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的な配列；
（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）と選択的にハイブリダイズする配列；または
（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重されている配列
を有する、請求項１０記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
（ａ）図８に示される切断型Ｂｔｋポリペプチドをコードするか；
（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的であるか；
（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）と選択的にハイブリダイズするか；または
（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重されている、
請求項９記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
（ａ）図９に示される配列；
（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的な配列；
（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）と選択的にハイブリダイズする配列；または
（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重されている配列
を有する、請求項１２記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項９ないし１３のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項９ないし１３のいずれか一項記載の切断型Ｔｅｃキナーゼポリヌクレオチドの産生能を有するプライマー。
【請求項１７】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載のポリペプチドの産生方法であって、請求項９ないし１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを、ポリペプチドの発現を得るのに適する条件下で、適当な細胞系に導入することを含む、方法。
【請求項１８】
Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法であって、請求項１ないし８のいずれか一項に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させ、該試験化合物が不存在の場合に起きる活性と比較して、ポリペプチドの活性における亢進または阻害を検出することを含む、方法。
【請求項１９】
目的とする化合物を、請求項１ないし８のいずれか一項に記載のポリペプチドと、標的ポリペプチドの存在下で接触させ、その標的ポリペプチドのリン酸化を観察することを含む、請求項１８記載の化合物の同定方法。
【請求項２０】
請求項１ないし８のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する細胞系を、目的とする化合物と接触させるところの、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
Ｔｅｃキナーゼ活性を調節し、かつ請求項１８ないし２０のいずれか一項に記載の方法で同定可能な化合物。
【請求項２２】
治療に用いるための請求項１８ないし２０のいずれか一項に記載の方法で同定可能な化合物。
【請求項２３】
Ｔｅｃキナーゼ活性を調節し、かつ請求項１８ないし２０のいずれか一項に記載の方法により同定することができる化合物の、Ｔｅｃキナーゼ活性の調節に応答する障害を治療または予防するための医薬の製造における使用。
【請求項２４】
障害が炎症であるところの、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
Ｔｅｃキナーゼ活性の調節に応答する障害を有する対象の治療方法であって、請求項１８ないし２０のいずれか一項に記載の方法によって同定可能な有効量の化合物を患者に投与することを含む、方法。
【請求項２６】
障害が炎症であるところの、請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｔｅｃキナーゼポリペプチド、切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの活性を調節する化合物のスクリーニング方法、および該方法により同定可能な化合物の治療での使用に関する。
【０００２】
（従来技術）
Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマスト細胞上の抗原受容体は、外部のシグナルとの相互作用により活性化される多分子複合体である。そして、これらのシグナルは遺伝子発現と転写後修飾を調節するために伝達される。Ｉｔｋ、Ｔｅｃ、Ｂｔｋ、ＢｍｘおよびＴｘｋチロシンキナーゼを含む「Ｔｅｃキナーゼファミリー」として知られる非−受容体チロシンキナーゼのファミリーは、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマスト細胞のシグナル変換に関与している。Ｔｅｃキナーゼファミリーのメンバーは類似するドメイン構造を共有しており、Ｎ末端プレックストリン相同性（ＰＨ）ドメイン、一つ（Ｉｔｋ、Ｂｍｘ、ＴｘｋおよびＴｅｃ２９）または二つ（ＢｔｋおよびＴｅｃ）のプロリンに富む領域（ＰＲ）を含むＴｅｃ相同性（ＴＨ）ドメイン、Ｓｒｃ相同性３（ＳＨ３）とＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメイン、触媒キナーゼ（ＳＨ１）ドメインを有する。例えば、Ｙａｎｇら（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：３７３−３８２を参考のこと。
治療で用いるための化合物を提供するために、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの調節因子を同定する必要がある。現在では、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドをスクリーニングするのに利用できる方法がない。従って、本発明の目的は、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの活性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供することであり、それゆえ治療に用いる化合物を提供することである。
【０００３】
（発明の開示）
本発明は、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングするためのアッセイにおいて、切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドを用いることができるという知見に基づいている。
従って、本発明は、ＰＨドメインと、キナーゼドメインを構成するアミノ酸までで、それを含まない、少なくとも１つのプロリンに富む領域を含む一部のＴＨドメインを構成する最低限のアミノ酸により切断されているＴｅｃキナーゼアミノ酸配列を有する切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドを提供する。
本発明のもう一つの態様は、（ａ）本発明の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドをコードするか；（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）と相補的であるか；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に選択的にハイブリダイズするか；または（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）由来の縮重物である、単離されたポリヌクレオチドである。
【０００４】
本発明のさらなる態様は、
−本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のポリヌクレオチドを発現できる発現ベクター；
−本発明の発現ベクターを含む宿主細胞；
−本発明のポリヌクレオチドを産生できるプライマー；
−本発明のポリペプチドの産生方法であって、ポリペプチドを発現させるのに適する条件下で、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを、適当な細胞系に導入することを含む方法；
−Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法で、本発明のポリペプチドと試験化合物を接触させ、ポリペプチドの活性において該試験化合物がなかった場合に起きる活性と比較して、亢進または阻害のいずれかを検出することを含む方法；
−Ｔｅｃキナーゼ活性を調節し、かつ上記した方法で同定可能な化合物；
−Ｔｅｃキナーゼ活性の調節に応答する障害の治療や予防のための薬剤製造のための、Ｔｅｃキナーゼ活性を調節し、かつ上記した方法で同定可能な化合物の使用；および
−Ｔｅｃキナーゼ活性の調節に応答する障害を有する対象の治療方法であって、上記した方法によって同定可能な化合物の有効量を該対象に投与することを含む方法である。
【０００５】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明者らは、意外にも、ＰＨドメインと、キナーゼドメインを構成するアミノ酸までで、それを含まない、少なくとも１つのプロリンに富む領域のＴＨドメインを構成する最低限のアミノ酸により切断されている、切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドが、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングするのに適していることを見出した。本発明の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは蛋白質の大部分が切断されているにもかかわらず構造上活性である。
【０００６】
本発明のポリペプチドはリン酸化によって予め活性化させる必要がないため、特にスクリーニングに適していることが見出された。生体内では、Ｔｅｃキナーゼは酵素を活性化するために他のキナーゼによってリン酸化される必要がある（Ｇｉｂｓｏｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１５６：２７１６−２７２２）。例えば、ＬＣＫアッセイがリン酸化工程を含むように（Ｔｒｅｖｉｌｌｙａｎら（１９９９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ　３６４，１９−２９）、アッセイにおいては、リン酸化による予備活性化が一般的に必要とされる一方で、本発明のポリペプチドを予備活性化する必要がなくなることによりアッセイは単純化する。
本発明のさらなる利点は、「強力」なアッセイを提供することにある。本発明者らは、二つの側面からこのアッセイが強力であることを見出した。第一は、長期にわたって安定な多数の切断型酵素を産生することが可能である点である。第二は、このアッセイにより、繰返し試験に基づく比較可能な結果が高頻度で得られることである。
従って、本発明のポリペプチドは、Ｔｅｃキナーゼの作動薬および拮抗薬を含めた、新しい種類の薬剤物質の同定と開発のための有用なスクリーニング標的を提供し、炎症のような障害の治療および／または予防に有用である。
【０００７】
切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチド
本発明は、ＰＨドメインと、キナーゼドメインを構成するアミノ酸までの（それを含まない）少なくとも１つのプロリンに富む領域を含む一部のＴＨドメインを構成する最低限のアミノ酸により切断されているＴｅｃキナーゼアミノ酸配列を有する切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドを提供する。換言すれば、切断点は、ＴＨドメインの最初のプロリンに富む領域（すなわち、ＰＨドメインに最も近いプロリンに富む領域）の後で、キナーゼドメインの前のどこにあってもよい。好ましくは、Ｔｅｃキナーゼアミノ酸配列は、ＰＨドメイン、ならびにＳＨ２およびキナーゼドメインを構成するアミノ酸までの（それを含まない）少なくとも１つのプロリンに富む領域を含む一部のＴＨドメインを構成する最低限のアミノ酸により切断されており、すなわち、その切断点はＴＨドメインの最初のプロリンに富む領域の後で、ＳＨ２ドメインの前のどこにあってもよい。より好ましくは、Ｔｅｃキナーゼアミノ酸配列は、ＰＨドメイン、ならびにＳＨ３、ＳＨ２およびキナーゼドメインを構成するアミノ酸までの（それを含まない）少なくとも１つのプロリンに富む領域を含む一部のＴＨドメインを構成するアミノ酸により切断されており、すなわちその切断点はＴＨドメインの最初のプロリンに富む領域の後で、ＳＨ３ドメインの前のどこにあってもよい。本発明の好ましい態様において、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドが１つ以上のプロリンに富む領域を含有する場合、その切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドはプロリンに富む領域を全く含まない、すなわち、切断点がＴＨドメインのすべてのプロリンに富む領域の後にある。
上記したＴｅｃキナーゼポリペプチドのドメインを図５および６で特定する。図６はＴｅｃキナーゼのドメイン構造の略図である。
本明細書に記載の「ＰＨドメイン」はＴｅｃキナーゼポリペプチドのＮ−末端ドメインである。それはβシート構造からなる。
【０００８】
本明細書に記載の「ＴＨドメイン」とは、ＴｅｃキナーゼポリペプチドのＰＨドメインとＳＨ３ドメインの間に位置しているドメインである。これは、球状核と、一つ（Ｉｔｋ、Ｂｍｘ、Ｔｘｋ、Ｔｅｃ２９）または二つ（Ｔｅｃ、Ｂｔｋ）のプロリンに富む領域のどちらかを含む。
本明細書に記載の「プロリンに富む領域」とは、ＴＨドメインにあるプロリンに富む領域のことである。プロリンに富む領域は６個の連続したアミノ酸の中に少なくとも２つのプロリン残基を、６個の連続したアミノ酸の中に好ましくは少なくとも３つのプロリン残基を、さらに好ましくは６個の連続したアミノ酸の中に少なくとも４つのプロリン残基を含むことが好ましい。
本明細書に記載の「ＳＨ３ドメイン」とは、ＴｅｃキナーゼポリペプチドのＴＨドメインとＳＨ２ドメインの間に位置しているドメインである。これは、互いにおおよそ直角となるように位置する２つのβシート構造を含む。
【０００９】
本明細書に記載の「ＳＨ２ドメイン」とは、ＴｅｃキナーゼポリペプチドのＳＨ３ドメインとキナーゼドメインの間に位置しているドメインである。
本明細書に記載の「キナーゼドメイン」とは、ＴｅｃキナーゼポリペプチドのＣ末端ドメインである。「キナーゼドメイン」はまた、「ＳＨ１」ドメインとしても知られている。
本明細書に記載の「Ｔｅｃキナーゼポリペプチド」は、Ｉｔｋ、Ｔｅｃ、Ｂｔｋ、ＢｍｘおよびＴｘｋチロシンキナーゼを含むＴｅｃキナーゼファミリーのポリペプチドである。
図５は、Ｔｅｃファミリーキナーゼのポリペプチド配列の並びを示したもので、ＰＨ、ＴＨ、ＳＨ３およびＳＨ２ドメインを示している。ＣｌｕｓｔａｌＸ分析プログラムを用いて配列を並べた。（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．、Ｐｌｅｗｎｉａｋ，Ｆ．、Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ，Ｆ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．（１９９７）Ｔｈｅ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ： ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｉｄｅｄ ｂｙ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２４：４８７６−４８８２）。基本設定を用いた。
【００１０】
従って、本発明の好ましい態様において、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは１９９番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＴＨドメインの最初のプロリンに富む領域の最後のアミノ酸）と４５１番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、キナーゼドメインの最初のアミノ酸）の間の位置で切断される。さらに好ましくは、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは１９９番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＴＨドメインの最初のプロリンに富む領域の最後のアミノ酸）と４１７番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＳＨ２ドメインの最後のアミノ酸）の間の位置で切断される。さらに好ましくは、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは１９９番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＴＨドメインの最初のプロリンに富む領域の最後のアミノ酸）と３３３番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＳＨ２ドメインの最初のアミノ酸）の間の位置で切断される。よりさらに好ましくは、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは１９９番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＴＨドメインの最初のプロリンに富む領域の最後のアミノ酸）と２２４番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＳＨ３ドメインの最初のアミノ酸）の間の位置で切断される。
【００１１】
本発明のさらに好ましい態様として、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドが一つ以上のプロリンに富む領域を有する場合、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは２１３番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＴＨドメインの２番目のプロリンに富む領域の最後のアミノ酸）と４５１番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、キナーゼドメインの最初のアミノ酸）の間の位置で切断される。さらに好ましくは、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは２１３番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＴＨドメインの２番目のプロリンに富む領域の最後のアミノ酸）と４１７番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＳＨ２ドメインの最後のアミノ酸）の間の位置で切断される。さらに好ましくは、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは２１３番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＴＨドメインの２番目のプロリンに富む領域の最後のアミノ酸）と３３３番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＳＨ２ドメインの最初のアミノ酸）の間の位置で切断される。よりさらに好ましくは、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは２１３番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＴＨドメインの２番目のプロリンに富む領域の最後のアミノ酸）と２２４番アミノ酸（図５で表されるように配列を並べた場合、ＳＨ３ドメインの最初のアミノ酸）の間の位置で切断される。
【００１２】
本発明の特定の態様においては、ＳＨ３ドメインの始まりはアミノ酸配列：＊Ｘ−Ｘ−Ｖ−［ＶＩＫ］−Ａ−［ＬＭ］−Ｙ−Ｄ−［ＹＦ］で定められ；ＳＨ２ドメインの始まりはアミノ酸配列：［ＩＬ］−［ＥＤ］−Ｘ−Ｙ−Ｅ−＊Ｗ−Ｙで定められ；キナーゼドメインの始まりはアミノ酸配列：Ｇ−［ＬＦ］−［ＧＲＳ］−Ｙ−［ＧＤＥ］−［ＳＫ］−Ｗ−＊で定められる。ここでは、文字は一文字表記のアミノ酸を表し、角括弧は一つのアミノ酸を表し、角括弧内のアミノ酸は代替であり、Ｘはどんなアミノ酸残基でもよく、「＊」はドメインの始まりを示す。
例えば、切断されるＴｅｃキナーゼポリペプチド配列は、Ｂｔｋ（ヒト）−アクセッション番号Ｑ０６１８７（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、Ｂｔｋ（マウス）アクセッション番号Ｐ３５９９１（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、Ｉｔｋ（ヒト）−アクセッション番号Ｑ０８８８１（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ） 、Ｉｔｋ（マウス）−アクセッション番号Ｑ０３５２６（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、Ｔｅｃ（ヒト）−アクセッション番号Ｐ４２６８０（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、Ｔｅｃ（マウス）−アクセッション番号Ｐ２４６０４（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、Ｂｍｘ（ヒト）−アクセッション番号Ｐ５１８１３（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、Ｂｍｘ（マウス）−アクセッション番号Ｐ９７５０４（ＴＲＥＭＢＬ）、Ｔｘｋ（ヒト）−アクセッション番号Ｐ４２６８１（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、Ｔｘｋ（マウス）−アクセッション番号Ｐ４２６８２（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）から選ばれるであろう。
【００１３】
好ましくは、切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドは、切断型Ｉｔｋポリペプチドまたは切断型Ｂｔｋポリペプチドである。好ましくは、切断されるＩｔｋポリペプチドは図４に示される配列（「Ｉｔｋ」配列）またはその相同体または変種を有する。好ましくは、切断型Ｉｔｋポリペプチドは図３に示されるポリペプチド配列またはその相同体または変種を有する。さらに好ましくは、切断型Ｉｔｋポリペプチドは図２に示されるポリヌクレオチド配列によってコード化される配列を有する。好ましくは、切断されるＢｔｋポリペプチドは、Ｂｔｋ（ヒト）アクセッション番号　Ｑ０６１８７（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ．データーベース）またはその相同体または変種の配列を有する。好ましくは、切断型Ｂｔｋポリペプチドは図８に示されるポリペプチド配列またはその相同体または変種を有する。さらに好ましくは、切断型Ｂｔｋポリペプチドは図９に示されるポリヌクレオチド配列によってコード化される配列を有する。
【００１４】
本発明のポリペプチドは単離された形態で与えられる。「単離された」なる語は、意図して、その物質が自然の状態にないということを意味する。つまり、生存動物に存在する自然発生的ポリペプチドは自然の状態にあり、単離されていない。しかし、同じペプチドでも、自然系では共存する物質の幾らかまたは全てから分離されたものは、単離されている。ポリペプチドは、その意図された使用に干渉しないようなキャリアーまたは希釈剤とともに混ぜられ、その時点では依然として単離されていると見なされる。同様に、合成手段、例えば組換え技法により産生されたポリペプチドは、「単離」されている。本発明のポリペプチドはまた、好ましくは、精製された形で与えられ、好ましくは少なくとも５０％の純度、さらに好ましくは７５％の純度、最も好ましくは９０％またはそれ以上、例えば、９５％、９８％の純度まで精製される。本発明に従ってポリペプチドを精製および／または合成するために、常套手段が用いられる。そのような手法は当業者により十分に理解されており、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９（その内容をすべて、出典明示により本明細書の一部とする）に開示されている。
【００１５】
本発明のポリペプチドは、組換え型または合成ポリペプチドである。本発明のポリペプチドはヒトまたは動物の配列（またはそのような配列の相同体）である。そのような動物とは、典型的には、齧歯類（例えばマウス）または霊長類のような哺乳類である。好ましくは、ポリペプチドはヒトの配列である。
ポリペプチド配列の相同体は上記したとおりである。そのような相同体は、典型的には、例えば少なくとも１５、２０、３０、１００またはそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する。相同性はアミノ酸の同一性（時に、「ハードホモロジー」と称される）に基づいて測定される。同一性は汎用のＧＣＧ（ウィスコンシン大学）プログラム一式と、好ましくはディスタンスソフトウェア（修正手法）を用いて測定される。
「変種」なる語は、問題となっている切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドと同じ不可欠な特徴と基本的な生物学的機能を有しているポリペプチドをいう。好ましくは変異ポリペプチドは、切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドと同じリガンドに結合するものである。そのような変種は、対立遺伝子の変種と、ポリペプチド配列内での単一アミノ酸あるいは一群のアミノ酸の欠失、修飾または付加を含み得る。
【００１６】
アミノ酸の置換は、例えば１、２または３個から１０、１５、２０または３０個の置換でなされる。修飾されたポリペプチドは切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドとしての活性を有している。ペプチドのアミノ酸配列における変化は、アミノ酸および他の分子や置換基の中で、電荷密度、疎水性、親水性、大きさ、構造などの物理的特徴における既知の類似点により導かれる。例えば、アミノ酸ＴｈｒはＳｅｒと置き換えることができ、またその逆も可能である。またＬｅｕはＩｌｅと置換することができ、またその逆も可能である。例えば、グリシンまたはセリンのような極性アミノ酸を他の極性アミノ酸と置換してもよく、塩基性アミノ酸を他の塩基性アミノ酸と置換してもよく、酸性アミノ酸を他の酸性アミノ酸と置換してもよく、非極性アミノ酸を他の非極性アミノ酸と置換してもよい。一般的に等価と考えられるアミノ酸のグループは：
（ａ）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）
（ｂ）アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）
（ｃ）ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）
（ｄ）メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）
（ｅ）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
である。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、化学的に修飾されていてもよく、例えば、翻訳後に修飾されていてもよい。例えば、それらはグリコシル化されたり、修飾されたアミノ酸残基を含む。ポリペプチドは、それらの精製を補助するためにヒスチジン残基の付加によって、または他の適当な蛋白質タグによって修飾されていてもよい。例えばＮｉｌｓｓｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　１１：１−１６参照。そのような修飾されたポリペプチドは、本発明の「ポリペプチド」なる語の範囲内にある。
【００１８】
ポリヌクレオチドとプライマー
本発明のさらなる態様は、（ａ）本発明の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドをコードするか；（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的であるか；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）と選択的にハイブリダイズするか；または（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重する、単離ポリペプチドである。好ましい態様は、（ａ）図３に示される切断型Ｉｔｋポリペプチドをコードするか；（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的であるか；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に選択的にハイブリダイズするか；または（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重する、単離ポリペプチドである。さらに好ましい態様は、（ａ）図２に示される配列；（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的である配列；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に選択的にハイブリダイズする配列；または（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重する配列を有する単離ポリヌクレオチドである。本発明のさらなる態様は、（ａ）図８に示される切断型Ｂｔｋポリペプチドをコードするか；（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的であるか；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に選択的にハイブリダイズするか；または（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重する、単離ポリペプチドである。本発明のさらに好ましい態様は、（ａ）図９に示される配列；（ｂ）ポリヌクレオチド（ａ）に相補的である配列；（ｃ）ポリヌクレオチド（ａ）または（ｂ）に選択的にハイブリダイズする配列；または（ｄ）遺伝暗号の結果として、ポリヌクレオチド（ａ）、（ｂ）または（ｃ）から縮重する配列を有する、単離ポリヌクレオチドである。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチド配列はＲＮＡの形態または例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡのようなＤＮＡの形態であってもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド配列はｃＤＮＡである。ＤＮＡは２本鎖または１本鎖で、一つの鎖はコーディング鎖またはノンコーディング（アンチセンス）鎖である。
【００２０】
本明細書で用いる際の、ポリヌクレオチドなる語は、１つまたはそれ以上の修飾（例えばトリチル化）された、または異常な（例えばイノシン）塩基を含む核酸を含む。このように、安定性または他の理由のために修飾されたバックボーンを持つＤＮＡまたはＲＮＡが、該用語を本明細書で用いるところのポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトまたは動物の配列（またはそのような配列の相同体）である。そのような動物とは、典型的には、齧歯類（例えばマウス）または霊長類のような哺乳類である。好ましくは、ポリヌクレオチドはヒトの配列である。
ポリヌクレオチド配列の相同体は、典型的には、例えば少なくとも１５、２０、３０、１００またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する。核酸相同性の測定方法は、当該分野ではよく知られている。例えばＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅは、相同性を測定するために利用されうるＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら１９８４）を提供する。同様に、配列をラインアップするために（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０に記載の）ＰＩＬＥＵＰとＢＬＡＳＴアルゴリズムが用いられうる。
本発明によれば、基本設定を用いることができる。
【００２１】
本明細書で用いる際の、「選択的ハイブリダイゼーション」とは、一般に、ポリヌクレオチドがバックグラウンドよりも有意に高いレベルで遺伝子領域配列にハイブリダイズできることを意味する。本発明のポリヌクレオチドと遺伝子領域配列との間での相互作用によって起きるシグナルレベルは典型的には、他のポリヌクレオチドと遺伝子領域配列の間での相互作用の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍の強度である。相互作用の強度は、例えばポリヌクレオチドを、例えば３２Ｐで放射性同位元素標識して測定される。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、低ストリンジェンシー（約４０℃での０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、中ストリンジェンシー（例えば、約５０℃での０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）または高ストリンジェンシー（例えば、約６０℃での０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．００３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件下で成される。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドのコード配列は、例えば１、２または３個ないし１０、１５、２５、５０または１００個の置換のようなヌクレオチド置換によって修飾され得る。ポリヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の挿入および／または欠失によって、および／または一方か両方の末端の延長によって別途または付加的に修飾される。修飾されたポリヌクレオチドは、切断型Ｔｅｃキナーゼポリヌクレオチドと関連した活性を持つポリペプチドをコードする。例えば、上記したように、修飾された配列が翻訳されるとき、縮重置換がなされるか、および／または置換がなされ、同類アミノ酸置換がもたらされるであろう。
【００２３】
Ｔｅｃキナーゼオリゴヌクレオチドの産生は、例えば関心のあるＴｅｃキナーゼ配列の知識に由来する、またはそれに基づいて組み立てられる適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような当該分野において知られる方法により行われる。例えばＴｅｃキナーゼのポリヌクレオチド配列は、Ｂｔｋ（ヒト）−アクセッション番号Ｘ５８９５７（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｂｔｋ（マウス）アクセッション番号Ｌ０８９６７（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｉｔｋ（ヒト）−アクセッション番号Ｄ１３７２０（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ） 、Ｉｔｋ（マウス）−アクセッション番号Ｌ００６１９（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｔｅｃ（ヒト）−アクセッション番号Ｄ２９７６７（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｔｅｃ（マウス）−アクセッション番号Ｓ５３７１６（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｂｍｘ（ヒト）−アクセッション番号Ｘ８３１０７（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｂｍｘ（マウス）−アクセッション番号Ｕ８８０９１（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｔｘｋ（ヒト）−アクセッション番号Ｌ２７０７１（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）、Ｔｘｋ（マウス）−アクセッション番号Ｕ１６１４５（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ）から選択することができる。
【００２４】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の切断型Ｔｅｃキナーゼポリペプチドをコード化するＴｅｃキナーゼポリヌクレオチドの産生能を有するプライマーが提供される。ＰＣＲ反応のような増幅反応において、一般的に不変プライマーと共に、対立遺伝子特異的プライマーが用いられ、これは特定の配列部位のある対立遺伝子の選択的増幅を介した対立遺伝子間の識別を与える。対立遺伝子特異的プライマーは好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５または２０、例えば少なくとも２５、３０のヌクレオチドの長さである。例えば、切断型Ｉｔｋポリペプチドの産生において、図１で示されるプライマーは対応するポリヌクレオチドを産生するために使われる。切断型Ｂｔｋポリペプチドの産生において、図７で示されるプライマーは対応するポリヌクレオチドを産生するために使われる。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチド配列は単離された形で与えられる。「単離された」なる語は、意図的に、その物質が自然の状態にないということを意味する。つまり、生存動物に存在する自然発生的ポリヌクレオチド配列は自然の状態にあり、単離されていない。しかし、同じポリヌクレオチド配列でも、自然系では共存する物質の幾らかまたは全てから分離されたものは、単離されている。これらは、意図された使用に干渉しないようなキャリアーまたは希釈剤とともに混ぜられ、その時点では依然として単離されていると見なされる。そのようなポリヌクレオチド配列はベクターの一部となりうる。そのようなポリヌクレオチド配列は組成物の一部とすることができ、そのようなベクターまたは組成物が自然環境の一部でないという点で単離されている。本発明のポリヌクレオチド配列はまた、好ましくは、精製された形で与えられ、好ましくは少なくとも５０％の純度、さらに好ましくは７５％の純度、最も好ましくは９０％またはそれ以上つまり９５％、９８％のような純度まで精製される。
【００２６】
Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの産生
本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドの組換え技術による産生のために利用される。このように、例えばヌクレオチド配列は、様々な発現ビヒクルまたはクローニング媒体の全てに、特に蛋白質発現のためのベクターまたはプラスミドに含まれる。
従って、本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。原核生物と真核生物宿主で用いるのに適切なクローニングと発現ベクターは、哺乳類発現ベクター、昆虫発現ベクター、酵母発現ベクター、細菌発現ベクター、ウイルス発現ベクターを含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９）参照。適切なベクターの例は、細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡおよびウイルスＤＮＡの組み合わせから派生するベクターならびにバキュロウイルスの誘導体を含む。好ましいベクターはバキュロウイルスである。
【００２７】
好ましい態様において、ベクターはさらに、例えば、該配列に作動的に連結するプロモーターを含め、ｍＲＮＡ合成を指令するための一つまたはそれ以上の調節配列を含む。適切なプロモーターは、昆虫細胞プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０および原核生物または真核生物細胞またはそれらのウイルス中にて遺伝子発現を調節することが知られている他のプロモーターを包含する。ベクターは、エンハンサー、翻訳開始のためのリボゾーム結合部位および転写ターミネーターを含む。多数の適切なベクターとプロモーター／エンハンサーが当業者に公知であるが、宿主にて複製可能であり、かつ機能する限り、いずれのプラスミドまたはベクター、プロモーター／エンハンサーを用いることもできる。ベクターはまた、発現の選択および／または増幅のための適切な配列を含んでいてもよい。このため、ベクターは表現型の選択／増幅可能なマーカーを一つまたはそれ以上含むであろう。そのようなマーカーはまた当業者によく知られている。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、本発明のベクターを含み、本発明のヌクレオチド配列の発現能を有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば、哺乳類細胞のような高等真核生物細胞または酵母細胞のような下等真核生物細胞または細菌細胞のような原核生物細胞でありうる。形質転換に適切な原核生物宿主は大腸菌を含む。適切な真核生物宿主は、例えばＳＦ９細胞、Ｔｎｉ細胞、Ｈｉ５細胞のような昆虫細胞と、例えばＨＥＫヒーラ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳＯ、３Ｔ３（線維芽細胞系）のような哺乳類細胞を含む。本発明のヌクレオチド配列を発現する細胞は、本発明のポリペプチドを得るため溶解されうる。このポリペプチドは所望により精製されていてもよい。
無細胞翻訳系は、本発明のＤＮＡ構造物から派生するＲＮＡを使って、そのような蛋白質を産生するため利用され得る。
本発明のさらなる発明は、本発明のポリペプチドを産生する方法であり、この方法は、ポリペプチドを発現させるのに適する条件下で、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを、適当な細胞系に導入することよりなる。
【００２９】
スクリーニング法
本発明はさらに、Ｔｅｃキナーゼ活性を調節する化合物の同定方法を提供する。Ｔｅｃキナーゼ活性を調節する化合物は、Ｔｅｃキナーゼポリペプチドの機能を阻害または促進する（例えば、Ｔｅｃキナーゼ蛋白質機能の作動薬または拮抗薬として働く）化合物である。一般的な用語では、そのような化合物のスクリーニングは、本発明のポリペプチドを試験化合物と接触させ、ついで（試験化合物が存在しない下で生じるであろう活性と比較した）結果としてポリペプチド活性の亢進または阻害を検出することを含むであろう。接触することによって、試験化合物と本発明のポリペプチドが、生物学的に相互作用可能であるというような近位性を持つということを示される。本発明のポリペプチドはハイスループットスクリーニングで用いられ、すなわち、多数の化合物の研究を可能にする。
【００３０】
検出される活性は、好ましくはホスホトランスファー活性である。ホスホトランスファーは、ＡＴＰから基質内のチロシン残基へのリン酸基の転移を含む。ホスホトランスファー活性はアッセイ中で標的ポリペプチドを含有することで検出され得る。さらに詳細には、本発明のポリペプチドは、いずれか適当なチロシンキナーゼアッセイ、例えば均質時間溶解蛍光法（ＨＴＲＦ，Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）Ｋｏｌｂら、ＤＤＴ Ｖｏｌ．３，３３３−３４２；比色および発光の読み取りおよび時間分解蛍光を含むインプレート結合アッセイ、例えば、Ｆａｒｌｅｙら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９２）２０３，１５１−１５７、Ｌｅｈｅｌら（１９９７）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４，３４０−３４６、Ｂｒａｕｎｗａｌｄｅｒら（１９９６）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３８，３４０−３４６参照；または、例えば３３Ｐまたは３２Ｐを利用したシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のような放射性同位元素アッセイ、のような時間分解蛍光アッセイにて用いられる。時間分解蛍光アッセイの例は、インプレート時間分解蛍光（ｔｒｆ）アッセイ（Ｄｅｌｉｆａ，Ｗａｌｌａｃ Ｏｙ）である。好ましくは時間分解蛍光アッセイが、最も好ましくは均質時間分解蛍光法が利用される。
好ましい態様において、スクリーニング法を、本発明のポリペプチドを発現する細胞を用い、かかる細胞を、所望によりＴｅｃキナーゼリガンドの存在下で試験化合物と一緒にインキュベートして行う。
【００３１】
治療法
本発明のさらなる態様は、Ｔｅｃキナーゼ活性を調節し、上記したスクリーニング技術で同定可能な化合物である。好ましくは、その化合物は先のスクリーニング技術を用いて同定されている。化合物はＴｅｃキナーゼポリペプチドの作動薬または拮抗薬であるが、好ましくは拮抗薬である。化合物は、例えばアプタマー、ポリペプチド、抗体または小分子である。化合物は、Ｔｅｃキナーゼ活性の調節に応答する障害の治療および／または予防において有用である。例えば、Ｉｔｋ欠損マウスはＴＨ２細胞を確立することができないことがインビボにて明らかにされており、それはＩｔｋがＴＨ２細胞を産生するＩＬ−４の発達を媒介することにおいて一の役割を持っていることを示唆する（Ｆｏｗｅｌｌら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：３９９−４０９）。Ｉｔｋ欠損マウスにおけるこのサイトカインの欠如は、Ｔｅｃキナーゼを調節する化合物が、例えば喘息のような炎症性障害の治療の際に有用であることを示唆する。
本発明の一つの特定の態様は、炎症のようなＴｅｃキナーゼ活性の調節に応答する障害の治療や予防のための薬剤製造のために、Ｔｅｃキナーゼ活性を調節し、本発明のスクリーニング技法で同定可能な化合物を利用することである。
【００３２】
本発明のもう一つの態様は、炎症のようなＴｅｃキナーゼ活性の調節に応答する障害を有する対象の治療方法である。この方法は、本発明のスクリーニング技術によって同定可能な化合物の有効量を患者に投与することよりなる。
例えば、炎症性症状として、喘息、アレルギー性鼻炎、ＵＲＩＤ（上気道炎症障害）、成人呼吸窮迫症候群；リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、変形性関節症のような関節炎の症状；ブドウ膜炎（虹彩炎を含む）、結膜炎のような炎症性の眼の症状；クローン病、潰瘍性大腸炎、遠位直腸炎のような炎症性の腸管の症状；歯周障害；食道炎；乾癬、湿疹、皮膚炎のような炎症性の皮膚の症状が挙げられる。好ましい炎症性症状は、喘息、アレルギー性鼻炎またはＵＲＩＤ（上気道炎症障害）である。
ＴｅｃキナーゼがＢｔｋである場合、障害は好ましくは、（上記した）炎症性症状；Ｂ細胞白血病とＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）のようなＢ細胞成分が関わった障害；血小板機能に関連した障害から選ばれる。
【００３３】
上記したスクリーニング技術に従って同定された物質は、製薬分野では慣用的である、標準的な薬学的に許容されるキャリアーおよび／または賦形剤と共に処方される。処方の正確な種類は、投与される個々の物質と望ましい投与経路を含む幾つかの要素によるであろう。その物質は、口、頬、肛門、肺、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、局所を経るような経腸的または非経口的経路、または他の適切な投与経路で投与される。
このような化合物の治療に効果的な量は、例えば用量反応実験を用いて、当業者によって容易に決定されうる。物質の用量は、様々なパラメータに従って、特に使用された物質；治療される患者の年齢、体重、状態；投与経路および必要とされる投与計画に従って決定される。しかしながら、適切な用量は、体重１ｋｇ当たり１から４０ｍｇのような体重１ｋｇ当たり０．０１から５０ｍｇである。医師は個々の患者に対して必要とされる投与経路および投与量を決定することができるであろう。
【００３４】
実施例
例１Ａ：切断型Ｉｔｋ構築物の産生
活性形態のＩｔｋオリゴヌクレオチドを産生するために、ｃＤＮＡから、結合したＳＨ３、ＳＨ２およびキナーゼドメインに対応するＩｔｋの単一領域を増幅し、構築物をクローニングするための開始メチオニンと制限エンドヌクレアーゼ部位を組み込むようにＰＣＲプライマーを設計した。切断型Ｉｔｋ構築物を産生するために用いられるオリゴヌクレオチド配列を図１に示す。Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートＤＮＡの材料として用いた（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）２５：８５−９２に記載されるライブラリーの生成）。ＰＣＲ産物をクローニングし（図２）、配列決定して用い、標準的な分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９参照）を使用し、ＳＦ９昆虫細胞の感染のための組換えバキュロウイルスを生成した。
【００３５】
実施例１Ｂ：蛋白質発現とアッセイの形成
実施例１Ａに記載の組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞ペレットを、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１ｍＭバナジン酸塩およびプロテアーゼ阻害剤中に均質化させた。１０００００ｇの上澄を−８５℃で貯蔵した。貯蔵溶解産物を氷上で戻し、ＡＴＰとＭｇＣｌ２（０．１ｍＭと１０ｍＭ）を添加した。氷上でのインキュベーションに続けて、そのキナーゼを４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で希釈した。キナーゼ反応混合物は、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ ＡＴＰ、０．０００５ｍＭペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＡＡＥＥＩＹＧＥＩ）を含んだ。ＥＤＴＡ（２５ｍＭ）を加えることで反応を停止させた。ホスホペプチドの量を、Ｋｏｌｂら（１９９８）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ３，３３３−３４２に記載される均質時間分解蛍光法によって定量した。蛍光レベルの上昇はキナーゼ活性の増加を示す。
ＡＴＰとペプチドのＫｍは、各々、０．０３９±０．０１１ｍＭと０．４８０±０．１８３μＭであると測定された。
【００３６】
実施例１Ｃ：Ｉｔｋ活性の調節のためのスクリーニング化合物
下の表は、上記した実施例１Ｂに記載のスクリーニングを用いて同定されたＩｔｋ活性の阻害剤を示す。
キナーゼアッセイでの化合物試験
添加順序：
化合物をウェルへ
酵素をウェルへ
１５分間のプレインキュベーション
基質（ＡＴＰ、ｓｒｃ−ペプチド）の添加
３０分間のインキュベーション
ＥＤＴＡを用いる反応停止
ＨＴＲＦ試薬（ＡＰＣ、Ｅｕ標識抗体（抗ＰＹ抗体））の添加
２０分間の放置
プレートリーダー上でのシグナルの読み取り
【００３７】
【表１】
2004512044.tif 000002
【００３８】
注釈：ＰＩＣ５０は−ｌｏｇ１０ ＩＣ５０モル濃度であり、ＰＩＣ５０が高いほど効能が高いことを示す。
【００３９】
例１Ｄ：Ｉｔｋスクリーニングの実行
次のデータはＩｔｋアッセイの頑健性を証明する。１２／８／９９と２４／２／００の間（バッチ１）と２２／３／００と２５／５／００の間（バッチ２）の期間にわたって上記したアッセイを繰り返すことで：（ｉ）長期間にわたって安定である切断型酵素を大量に産生することが可能であるということ、（ｉｉ）該アッセイは高頻度の反復試験で比較可能な結果を付与すること、が証明される。
【００４０】
【表２】
2004512044.tif 000003
結果を平均値±標準偏差（ｎは８０以上）で示す。
【００４１】
実施例２Ａ：切断型Ｂｔｋ構築物の産生
活性形態のＢｔｋオリゴヌクレオチドを産生するために、ｃＤＮＡから、結合したＳＨ３、ＳＨ２およびキナーゼドメインに対応するＢｔｋの単一領域を増幅し、構築物をクローニングするための開始メチオニンと制限エンドヌクレアーゼ部位を組み込むようにＰＣＲプライマーを設計した。切断型Ｂｔｋ構築物を産生するために用いられるオリゴヌクレオチド配列を図７に示す。ＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定して用い、標準的な分子生物学的技法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９参照）を使用し、ＳＦ９昆虫細胞の感染のための組換えバキュロウイルスを生成した。
【００４２】
実施例２Ｂ：蛋白質発現とアッセイの形成
実施例２Ａに記載の組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞ペレットを、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１ｍＭバナジン酸塩およびプロテアーゼ阻害剤中に均質化させた。１０００００ｇの上澄を−８５℃で貯蔵した。貯蔵溶解産物を氷上で戻し、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中に希釈した。キナーゼ反応混合物は、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、８０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１３００μＭ ＡＴＰ、５００ｎＭペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ−ＡＡＡＥＥＩＹＧＥＩ−ＮＨ２）を含んだ。ＥＤＴＡ（０．１６Ｍ）を加えることで反応を停止させた。ホスホペプチドの量を、Ｋｏｌｂら（１９９８）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ３，３３３−３４２に記載される均質時間分解蛍光法によって定量した。蛍光レベルの上昇はキナーゼ活性の増加を示す。
ＡＴＰのＫｍは１．６９±０．３６ｍＭであると測定された。
【００４３】
実施例２Ｃ：Ｂｔｋ活性の調節のためのスクリーニング化合物
下の表は、上記の実施例２Ｂで記載されたスクリーニングを用いて同定したＢｔｋ活性の阻害剤を示す。
キナーゼアッセイでの化合物試験
添加の順序：
化合物をウェルへ
酵素をウェルへ
１５分間のプレインキュベーション
基質（ＡＴＰ、ｓｒｃ−ペプチド）の添加
３０分間のインキュベーション
ＥＤＴＡを用いる反応停止
ＨＴＲＦ試薬（ＡＰＣ、Ｅｕ標識抗体（抗ＰＹ抗体））の添加
２０分間の放置
プレートリーダー上でのシグナルの読み取り
【００４４】
【化１】
2004512044.tif 000004
ｐＩＣ５０＝６．８３
注釈：ＰＩＣ５０は−ｌｏｇ１０ ＩＣ５０モル濃度であり、ＰＩＣ５０が高いほど、効能が高いことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図２で示される切断型Ｉｔｋ構築物を産生するために用いられるオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図２】切断型Ｉｔｋ構築物のポリヌクレオチド配列（クローニング部位に下線を付す）を示す。
【図３】切断型Ｉｔｋ構築物のポリヌクレオチドおよび翻訳ポリペプチド配列を示す。
【図４】Ｉｔｋ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース、アクセッション番号：Ｑ０８８８１）およびＰＨ、ＳＨ３、ＳＨ２、キナーゼ領域を図示する切断型構造物のポリペプチド配列の並びを示す。ドメインの境界は、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔエントリーＱ０８８８１により定められいるとおりであり：ＰＨは４−１１１；ＳＨ３は１７１−２３１；ＳＨ２は２３９−３３８；キナーゼは３６３−６１５である。注釈：ｔＩｔｋは切断型Ｉｔｋを示す。
【図５】Ｔｅｃファミリーキナーゼのポリペプチド配列の並び（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース）を示す。Ｂｔｋ（ヒト）−アクセッション番号Ｑ０６１８７、Ｂｔｋ（マウス）アクセッション番号Ｐ３５９９１、Ｉｔｋ（ヒト）−アクセッション番号Ｑ０８８８１、Ｉｔｋ（マウス）−アクセッション番号Ｑ０３５２６、Ｔｅｃ（ヒト）−アクセッション番号Ｐ４２６８０、Ｔｅｃ（マウス）−アクセッション番号Ｐ２４６０４、Ｂｍｘ（ヒト）−アクセッション番号Ｐ５１８１３、Ｔｘｋ（ヒト）−アクセッション番号Ｐ４２６８１／Ｑ１４２２０およびＴｘｋ（マウス）−アクセッション番号Ｐ４２６８２。ＰＨドメイン（太文字、イタリック体、囲み）、Ｔｅｃ相同性ドメイン（イタリック体、囲み）、ＳＨ２ドメイン（囲み）を示す。
【図６】Ｔｅｃキナーゼのドメイン構造の略図を示す。
【図７】図９で示される切断型Ｂｔｋ構築物を産生するために用いられるオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図８】切断型Ｂｔｋ構造物の翻訳ポリペプチド配列を示す。
【図９】切断型Ｂｔｋ構造物のポリヌクレオチド配列を示す。全長配列はＧｅｎＥＭＢＬデータベースアクセッション番号Ｘ５８９５７で利用可能である。
【図１】
2004512044.tif 000005
【図４】
2004512044.tif 000006
【図６】
2004512044.tif 000007
【図７】
2004512044.tif 000008
【国際公開パンフレット】
2004512044.tif 000009
2004512044.tif 000010
2004512044.tif 000011
2004512044.tif 000012
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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