(57)【要約】酸化窒素と結合することができる分子であって、前期分子中の少なくとも一つのレポーター核の分光特性に影響を与える酸化窒素依存性の常磁性を示す分子を提供すること；  前記分子を組織又は流体と接触させて、前記分子を酸化窒素源に暴露すること；そして  前記組織又は流体中の前記酸化窒素に前記分子が暴露した後に、前記分子の常磁性の特性を測定することを含む酸化窒素量の分析方法、及び前記分析方法に用いる造影剤を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化窒素と結合することができる分子であって、前記分子中の少なくとも一つのレポーター核の分光特性に影響を与える酸化窒素依存性の常磁性を示す分子を提供すること；
前記分子を組織又は流体と接触させて、前記分子を酸化窒素源に暴露すること；そして
前記組織又は流体中の前記酸化窒素に前記分子が暴露した後に、前記分子の常磁性の特性を測定すること
を含む、酸化窒素量の分析方法。
【請求項２】
前記分子が金属原子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属が鉄である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記鉄が＋２イオン化状態である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
動物中で前記方法を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記動物が哺乳動物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分子が天然に存在する分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分子が合成物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分子が、少なくとも一つのレポーター核を有するポルフィリンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポルフィリンがヘム基である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヘム基がヘモグロビン分子中に位置する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘム基がミオグロビン分子中に位置する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポルフィリンが合成物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記分子が、少なくとも一つのレポーター核を有するジチオカルバメートである、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ジチオカルバメートが官能基と結合しており、前記官能基が、溶解性、標的組織親和性、又は組織浸透性のいずれか一つを提供する官能基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分子が、式：
【化１】
2006503103.tif 000016
で表されるジチオカルバメート；式：
【化２】
2006503103.tif 000017
で表されるジチオカルバメート；式：
【化３】
2006503103.tif 000018
で表されるジチオカルバメート；及び式
【化４】
2006503103.tif 000019
で表されるジチオカルバメートからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記常磁性の特性の測定を核磁気共鳴により実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記常磁性の特性の測定を核磁気画像化により実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記酸化窒素への暴露が組織中における暴露である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも一つのレポーター核、及び薬剤学的に許容することのできる担体を含み、生体組織中で使用するのに適している核磁気共鳴分光分析用の造影剤であって、前記造影剤が、酸化窒素と結合しないときには第一の分光特性を示し、かつ酸化窒素と結合するときには第二の分光特性を示す、前記造影剤。
【請求項２２】
前記造影剤中に複数のレポーター核が存在する、請求項２１に記載の造影剤。
【請求項２３】
前記レポーター核が、１９Ｆ、１３Ｃ、３１Ｐ、及び重水素からなる群から選択される、請求項２１に記載の造影剤。
【請求項２４】
前記造影剤中で、酸化窒素が金属イオンと錯体を形成する、請求項２１に記載の造影剤。
【請求項２５】
前記金属イオンが鉄原子である、請求項２４に記載の造影剤。
【請求項２６】
前記鉄原子がＦｅ＋２酸化状態である、請求項２５に記載の造影剤。
【請求項２７】
前記造影剤がポルフィリン分子を含む、請求項２４に記載の造影剤。
【請求項２８】
前記生体組織が動物の中にある、請求項２１に記載の造影剤。
【請求項２９】
前記動物が哺乳動物である、請求項２８に記載の造影剤。
【請求項３０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の造影剤。
【請求項３１】
前記造影剤が少なくとも一つのレポーター核を有するジチオカルバメートを含む、請求項２１に記載の造影剤。
【請求項３２】
前記ジチオカルバメートが複数のレポーター核を含む、請求項２１に記載の造影剤。
【請求項３３】
前記造影剤が、式：
【化５】
2006503103.tif 000020
で表されるジチオカルバメート；式：
【化６】
2006503103.tif 000021
で表されるジチオカルバメート；式：
【化７】
2006503103.tif 000022
で表されるジチオカルバメート；及び式
【化８】
2006503103.tif 000023
で表されるジチオカルバメートからなる群から選択される、請求項２１に記載の造影剤。
【請求項３４】
前記造影剤が、少なくとも一つのレポーター核を有するポルフィリンを含む、請求項２１に記載の造影剤。
【請求項３５】
前記ポルフィリンがヘム基である、請求項３４に記載の造影剤。
【請求項３６】
前記ヘム基がヘモグロビン分子中に位置する、請求項３５に記載の造影剤。
【請求項３７】
前記ヘム基がミオグロビン分子中に位置する、請求項３５に記載の造影剤。
【請求項３８】
前記ポルフィリンが合成ポルフィリンである、請求項３４に記載の造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願に対する相互参照）
米国仮特許出願第６０／３９２，７１２号（２００２年６月２８日出願）及び米国仮特許出願第６０／３９２，９６１号（２００２年７月１日出願）に基づいて優先権を主張する。これらの開示は、参照することにより本明細書に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素は、酸化窒素又はＮＯとも称し、免疫系、心臓血管系、及び神経系における重要なメッセンジャーの役割を果たす無電荷の遊離基である。後にＮＯとして同定された酸化窒素の生理活性は、１９８０年代初期に、アセチルコリンによって起こされる血管の弛緩が血管内皮の存在に依存することが発見された際に、最初に発見された。前記血管弛緩を媒介する前記内皮に由来する要素は、内皮由来血管弛緩因子（ＥＤＲＦ）と称され、今では、血管内皮内で、酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）のアイソフォームの一つによって生成されるＮＯであることが分かっている。更に、ＮＯは、公知のニトロ血管拡張剤、例えば亜硝酸アミル、及びトリニトログリセリンから誘導される活性種である。また、酸化窒素は、ｃＧＭＰ生成を刺激する可溶性グアニル酸シクラーゼの内因性刺激物質でもある。Ｎ−モノメチルアルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）によってＮＯＳが阻害される場合には、ｃＧＭＰ形成が完全に妨げられる。ＮＯは、内皮−依存性弛緩の他にも、多くの生物学的作用、例えば、食細胞により媒介される細胞毒性、及び中枢神経系における細胞間コミュニケーションの増強に関連することが知られている。
【０００３】
ＥＤＲＦのＮＯとしての同定は、酵素ＮＯシンターゼによるアミノ酸Ｌ−アルギニンからのＮＯの合成を説明する生化学的経路の発見と同時に行われた。ＮＯシンターゼには、少なくとも以下の３タイプがある：
（ｉ）脳内に位置し、レセプター又は肉体的刺激に応じてＮＯを放出する、構成的な、Ｃａ＋＋／カルモジュリン依存性酵素；
（ii）エンドトキシン及び／又はサイトカインによる、血管平滑筋、マクロファージ、内皮細胞、上皮細胞、神経膠、及び他の多くの細胞の活性化の後に誘導される１３０ｋＤのタンパク質である、Ｃａ＋＋非依存性酵素；及び
（iii）内皮内に存在し、レセプター又は肉体的刺激に応じてＮＯを放出する、構成的な、Ｃａ＋＋／カルモジュリン依存性酵素。
【０００４】
誘導性の酸化窒素シンターゼ（以下、「ｉＮＯＳ」と称する）は、一旦発現したならば、長期にわたって継続的にＮＯを生成する。異常に高い濃度のＮＯは、大きな損傷を与えることがあり、その結果、種々の炎症性の応答及び疾患、例えば、変形性関節炎、慢性関節リウマチ、ガン、脳卒中、及び冠状動脈性心疾患において重大な役割を果たすことがある。従って、人及び動物の組織中の酸化窒素の分布を画像化することによるイン・ビボにおける酸化窒素の検出は、前記疾患及び前記疾患の進行に対する重要なバイオマーカーを提供するであろう。医薬の発見及び試験のために、酸化窒素生成速度の定量、及び組織の種々の領域が酸化窒素を生成する速度に基づく関節軟骨の様な組織の画像化も、必要とされる。
【０００５】
ＮＯは、反応性が高く、従って、超酸化物ラジカルと結合して過酸化亜硝酸を形成するか又は酸素と結合してニトロシレート組織タンパク質を形成する傾向があるために寿命が短いので、ＮＯラジカルの測定は、機器の感度における制約によって制限されてきた。Ｈ３−アルギニンからＨ３−シトルリンへの変換を監視することによって酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）活性を測定することが、現在のところ標準的なＮＯＳ活性に対するアッセイである。ＮＯＳ活性は、市販されているシトルリンアッセイ（ＮＯＳ検出アッセイキット；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州）を用いて、測定することができる。前記キットは、典型的に、放射能標識されたアルギニンを使用し、従って、イン・ビボでの使用に適さない。
【０００６】
鉄の種々の錯体が、酸化窒素と結合し、その結果として、それらが示す常磁性の強さが変化することが知られている。例えば、鉄のジチオカルバメート錯体は、この挙動を示し、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）又は電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光分析による酸化窒素の検出用のスピントラッピング剤として、及びＮＯ活性化磁性共鳴画像法（ＭＲＩ）造影剤として、使用される（「ＬＪ  Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ｖ  Ｋｈｒａｍｔｓｏｖ，Ｆ  Ｈｉｒｏｔａｄａ，及びＴＬ  Ｃｌａｎｔｏｎ，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３０（５）：４８９−４９９：２００１」；「Ｈ  Ｆｕｊｉｉ，Ｘ  Ｗａｎ，Ｊ  Ｚｈｏｎｇ，ＬＪ  Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ４２：２３５−２３９；１９９９」）。
前記文献に記載のジチオカルバメート−鉄−酸化窒素錯体は、ＥＰＲ測定用のスピントラップとしてはうまく作用するが、それらをＭＲＩ造影剤として使用すると、有用なコントラストを生じるには（ミリモルに近い）高濃度が必要となるので、有望でない。
【０００７】
ヘモグロビン中の鉄−ヘム系が酸化窒素に対する良好なスピントラップであること［Ｓ  Ｆｕｊｉｉ及びＴ  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２（４），８７９−９０１（２０００）］、そのうちの或るものは、高い酸化窒素結合定数、長い結合寿命を有することができること、及びそのうちの或るものは、有用なＥＰＲシグナルを生じること［ＳＭ  Ｄｅｃａｔｕｒ，Ｓ  Ｆｒａｎｚｅｎ，ＧＤ  ＤｅＰｈｉｌｌｉｓ，ＲＢ  Ｄｙｅｒ，ＷＨ  Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，及びＳＧ  Ｂｏｘｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５，４９３９−４９４４（１９９６）］が周知である。この効果は、血液中における鉄−ヘム系を用いるＭＲＩ調査に対して使用されてきた［Ｆ  ＤｉＳａｌｌｅ，Ｐ  Ｂａｒｏｎｅ，Ｈ  Ｈａｃｋｅｒ，Ｆ  Ｓｍａｌｔｉｏｎ，及びＭ  ｄ’Ｉｓｃｈｉａ，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ８，４６１−４６４（１９９７）］。これらの化合物は、ＭＲＩ造影剤として、組織水の緩和時間を短縮させることにより作用する。
【０００８】
最後に、クジラミオグロビン（Ｍｂ）のヘムポケット中におけるＮＯ結合の位置を決定するための研究が実施されてきた。この研究は、Ｍｂタンパク質の近位表面及び遠位表面に導入されたシステイン２つを有する突然変異ミオグロビンを使用した。各システインのチオールを、トリフルオロアセチル基で標識した。１９Ｆ  ＮＭＲ  ｏｆ  Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｙｌ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｈ９３Ｇ  Ｃａｖｉｔｙ  Ｍｕｔａｎｔ  ＭＲ  Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  ＳＧ  Ｂｏｘｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０，８５８８−８５９６（２００１）。この突然変異ミオグロビンは、宿主の免疫系によって外来のタンパク質として認識され、前記ミオグロビンに対する抗体が産生される可能性があるので、イン・ビボにおける研究には不適切であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
広義では、本発明は、少なくとも一つのレポーター核（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ）を有しており、生きている組織中で使用するのに適した核磁気共鳴分光分析用の造影剤を、薬剤学的に許容することのできる担体と一緒に使用する酸化窒素の定量方法であって、前記造影剤が、酸化窒素と結合しないときには第一分光特性を示し、及び酸化窒素と結合しているときには第二分光特性を示す、前記酸化窒素の定量方法に関する。或る態様では、造影剤は、酸化窒素と結合しているときには常磁性を示すが、酸化窒素と結合していないときには常磁性を示さない。別の態様では、造影剤は、酸化窒素と結合していないときには常磁性を示すが、酸化窒素と結合しているときには常磁性を示さない。
【００１０】
本発明においては、画像化するための核磁気共鳴信号の発信源として組織水を使用する代わりに、錯化剤自体の中の核からの分光学的信号を、分析に対する根拠として直接的に使用する。
分光学的画像化剤（ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として開示されている化合物を、造影剤の代わりに使用することの利点は、組織中での濃度を高くする必要がないことである。本明細書において提案されるフッ化化合物では、特に前記利点が顕著である。フッ素は、この方法で使用する上で非常に感受性が高い核であり、及び標的組織中に妨害となるフッ素背景が存在しないという別の利点もある。また、このアプローチは、広範な新規で有用な分子を製造するための合成化学を使用する更に多くの機会がある。更に、或る好ましい例の特徴は、常磁性状態のレポーター核の至適Ｔ１値及びＴ２＊値である。
【００１１】
本発明の好ましい例では、前記錯化剤の化学的構造の一部であるフッ素核から信号が来る。別のＮＭＲ活性同位体としては、例えば、重水素、プロトン、１３Ｃ（炭素１３）、及び３１Ｐ（リン３１）などを挙げることができ、これらを単独で又は組み合わせて使用することもできる。得られる信号は、酸化窒素の生成速度が高い組織用の画像化バイオマーカー（ＭＲＩを使用）、及び／又は磁気共鳴分光法（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＭＲＳ）におけるケミカルシフト及び／又は緩和に基づく前記組織の分光学的分析用の画像化バイオマーカーとして使用することができる。最も好ましい態様は、以前から知られている前記ＥＰＲ剤のスピントラッピング機能性を保持するであろう。すなわち、酸化窒素によって誘導される前記錯体の常磁性形態は、酸化窒素それ自体の自由な濃度よりもかなり高い濃度になろう（これは、前記常磁性種が、組織中において、酸化窒素自体よりも長い寿命を有することによる）［Ｓ  Ｐｏｕ，Ｐ  Ｔｓａｉ，Ｓ  Ｐｏｒａｓｕｐｈａｔａｎａ，ＨＪ  Ｈａｌｐｅｒｎ，ＧＶＲ  Ｃｈａｎｄｒａｍｏｕｌｉ，ＥＤ  Ｂａｒｔｈ，ＧＭ  Ｒｏｓｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４２７（１９９９）２１６−２２６］。これにより、分析結果の感受性に対する非常に大きく及び非常に重要な増強が得られる。また、平衡濃度の酸化窒素よりもむしろ、一定期間の間に生成された酸化窒素の総量に関する結果に本発明の焦点を合わせることにも、重要な有利さがある。
【００１２】
本発明の或る態様では、鉄の周囲の配位子場の強さ及び組織の酸化還元電位が、前記鉄が、主にＦｅ（II）酸化状態で及び低スピンの反磁性状態であるような強さ及び電位である。この場合、常磁性が、低いか又は存在しない。前記錯化剤中のフッ素又は他のレポーター核は、長い緩和時間を有する磁気共鳴信号、及びそれらの反磁性値とわずかにしか違わないか又は全く違わないケミカルシフトを提供する。酸化窒素が結合している際には、強い又はより強力な、常磁性状態が形成される。前記状態は、２つの効果を有することができる。第一に、フッ素又は他のレポーター核からの信号の周波数が、（典型的には、超微細シフトメカニズムにより）大きく変化しうる。ケミカルシフトが充分大きく変化するならば、前記変化を、適切に設計されたＭＲＳ／ＭＲＩ測定法によって測定することができ、及び酸化窒素生成速度が速い生物学的サンプル中の領域に特異的な信号の発生に使用することができる。常磁性状態の形成の第二の有用な効果は、フッ素又は他のレポーター核の緩和時間（Ｔ１及び／又はＴ２及び／又はＴ１ロー）を短縮することができることである。また、前記短縮が発生する組織を強調するようにＭＲＳ／ＭＲＩ実験を設計することもできる。更に、短い緩和時間は、ＭＲＳ／ＭＲＩ実験で検出できる別の効果を有することがある。その様な効果としては、コヒーレンス転移（例えば、１９Ｆから１３Ｃへのコヒーレンス転移）の効率、多重量子コヒーレンス形成（例えば、１９Ｆ-１３Ｃ多重量子コヒーレンス）の効率、及び常磁性の系に特異的な核緩和に対する相互相関貢献［ｃｒｏｓｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ］の種々の効果（例えば、１９Ｆ-常磁性相互作用と相互に相関する１９Ｆ-１９Ｆ双極子−双極子相互作用）の効率を挙げることができる。
【００１３】
本発明の別の態様は、鉄錯体が、酸化窒素の不在下で常磁性であり、そして酸化窒素の存在下で反磁性となる態様である。この態様は、組織中で使用するのに特に適している。この状況の例は、例えば、鉄がＦｅ（III）酸化状態（高い又は低いスピン）であり、従って常磁性となるような、配位子場の強さ及び／又は対称性、並びに組織の酸化還元電位である状況であろう。フッ素等のレポーター核は、前記常磁性の効果のいずれかを示す。酸化窒素と結合しているときには、前記錯体が反磁性となり、前記の効果が消え失せる。ＭＲＳ／ＭＲＩ実験を、組織の特定の領域に酸化窒素が存在することによって常磁性が消失したとき又は常磁性が現れた（前出）ときに画像を生成するように、設計及びパラメーター付与することができる。
あるいは、ＭＲＳ／ＭＲＩ実験で検出することが可能なほどの充分独特な磁気特性を有する、Ｆｅ（III）のジニトロキシド錯体を形成する。また、鉄以外の別の金属も、このような効果を発揮することができると予想される。
【００１４】
本発明の特徴は、前記分子又は錯体がその分子又は錯化剤中のレポーター核の分光特性に影響する、酸化窒素依存性の常磁性を示すことであり、それにより、上述した方法の一つにおいて、磁気共鳴分光分析及び／又は核磁気画像化に有用なそれらの核から核磁気共鳴信号を生じる。従って、本発明は、酸化窒素の存在下で所望の効果を生じ、それにより、前記分析を可能にする任意の化合物、並びに特定の化合物の調製に用いられる合成法を包含する。
【００１５】
本発明の別の態様では、酸化窒素と結合することができる分子であって、その分子中のレポーター核少なくとも一つの分光特性に影響を与える酸化窒素依存性の常磁性を示すことができる前記分子を、組織又は流体と接触させて、前記分子を酸化窒素源に暴露し、次いで前記組織又は流体中の前記酸化窒素に前記分子が暴露した後に、前記分子の常磁性の特性を測定する、酸化窒素量の分析方法を提供する。酸化窒素に結合した分子の常磁性の特性を測定する好ましい手段としては、核磁気共鳴及び磁気共鳴画像法を挙げることができる。
本発明の別の態様は、磁気共鳴測定法及び前記分析の実施に用いることのできる装置の提供である。
【００１６】
本発明は、サンプル中の酸化窒素を測定するための改良された造影剤を提供する。前記造影剤は、酸化窒素依存性の常磁性を提供する適切な官能性を有することが好ましい。いくつかの好ましい例では、前期造影剤は鉄と錯体をつくるが、それと同時に、鉄リガンド部位一つ以上を、結合すべき酸化窒素に対して開かれているままにする官能基を、前記造影剤が含む。前記造影剤では、前記官能基の、数、性質、及び対称性を選択して、鉄の酸化能力及び／又は所定の酸化状態に対するスピン状態及び／又は鉄の結合定数、及び／又は分子の残りへの超微細相互作用の伝達、及び／又は鉄の電子緩和時間、及び／又は酸化窒素捕獲効率を、変化させることができる。ジチオカルバメートが、主にＦｅ（II）をその低スピン反磁性状態で保持すること、並びに素早く及び効率的に酸化窒素を捕獲することが知られているので、いくつかの好ましい官能基の例示として、ジチオカルバメートが挙げられる。Ｆｅ（II）−酸化窒素対の形成は、この中心を、常磁性の状態へと切り替える。種々のジチオカルバメート分子及びそれらの製造方法が、文献により公知となっている。例えば、化合物と方法が、２００２年６月１８日に発行されたＬａｉらによるＵＳＰ６，４０７，１３５に開示されている。この文献の開示内容は、参照することにより本明細書に含まれる。
【００１７】
前記錯化剤は、レポーター核の分光学的周波数又はそれらの緩和時間が常磁性状態の鉄／鉄−酸化窒素−錯体によって影響を受けるように鉄中心に対して充分近くに位置する、前記レポーター核少なくとも一つを含む。本発明のいくつかの好ましい例では、レポーター核がフッ素であろう。その様な錯化剤の例として、実際にはＭＧＤ錯化剤の様な公知のフッ化アナログがある。
また、好ましい錯化剤として、錯体全体の物理的特性を制御する成分または態様を挙げることができる。例えば、錯体の全体的な水溶性を増大させる官能基を挙げることができる。
また、好ましい錯化剤は、調査における特別な標的である特定の物理的環境又は特定の組織が優先的に標的となるように、動物中における前記錯体の分散に作用する官能基も含むことができる。例えば、膜内に薬剤を定着させるための余分の炭化水素鎖、又はアテローム性硬化症の斑の様な他の疎水性環境の提供を挙げることができる。
【００１８】
別の例は、錯化剤の残部への、阻害剤又は薬剤候補の結合である。前記錯化剤のこの部分は、次いで、目的の特定の酵素又はレセプターに結合し、そして前記レセプターの濃度が高い領域又は組織に対する酸化窒素分析を標的とする。同様に、目的の標的に対する抗体を、錯化剤の残部に結合させて、前記抗体に対するエピトープを発現する組織における酸化窒素生成を標的とすることができる。更に別の例は、錯体に対して単に実効電荷を加える官能基（これは、レポーター核及び鉄結合部位から、除去することができるか又は充分に除去することができない）である。例えば、錯体がマイナスに荷電したポリマーであるアグリカンを高レベルで含む関節軟骨の領域を標的とすることを助けることがある余分の正電荷、又はアグリカンが枯渇している関節軟骨の標的領域に対する余分の負の電荷を挙げることができる。更に別の標的とする官能性は、骨組織を標的とすることが知られているビスホスホネート薬の要素である。その様な標的要素の付与は、関節炎を伴うことがある骨損傷におけるＮＯの役割を調査するのに役立てることができる。更に別の例は、プトレシン［ｐｕｔｒｅｓｉｎｅ］改変レポーター分子及びベータアミロイド改変レポーター分子の場合における、ＣＮＳ浸透性及び／又はアルツハイマー病プラークへの局所化を増加する基の付与であろう。
【００１９】
レポーター核の緩和変化に基づいて作用する薬剤の場合には、好ましい例が有することのあるいくつかの別の特徴がある。前記特徴は、Ｔ２を過剰に短縮することを避けることができ、好ましい。ＭＲＩ用の信号を生成するための励起は、しばしば、１〜２ミリ秒の時間がかかる。信号の損失を防ぐために、レポーター核のＴ２＊は、この時間よりも長いべきであり、５〜２０倍長いことが好ましい。一方、常磁性錯体中のレポーター核のＴ１値は、信号損失が生じる点までＴ２＊が短縮しないという制限に従う限り、できるだけ短いことが好ましい。短いＴ１値は、同じ時間内におけるＭＲＩ信号を平均化した信号をより大きくすることができ、従って、感受性を大きく増加させることができるであろう。やや類似の考え方を、Ｔ２＊の制限がよりストリンジェントでないことを除いて相当するＭＲＳ法に対して適用する。合成化学を使用して、２つの方法の一つによって、好ましい実施例を構成することができる。第１の方法は、レポーター核を、それらが最適なＴ１及びＴ２＊値に近い値を有するであろうことを実験が示す錯化剤中の位置に配置させることによって、実施することができる。第二の方法は、最適に近い値を有する一つ又は数個のみがＭＲＳ／ＭＲＩ信号の生成において積極的な役割を演じることの実現が、最適なＴ１及びＴ２＊値に近い演繹的な値によって予測される全体的な領域中に、複数のレポーター核を配置することによって、実施することができる。
【実施例】
【００２０】
以下の実施例では、ＭＧＤのＮメチル基をトリフルオロメチル基で置換することにより、新規化合物を製造する。この実施例は、ＭＲＩコントラストを生じることが知られている方法でＦｅ（II）と錯化することが知られているジチオカルバメート基を有する。前記化合物は鉄結合部位に近いフッ素の新たな特徴があるので、それらは、鉄中心における常磁性の変化を感じる良好な機会を有する。前記化合物は、化合物が水溶性に寄与することができるヒドロキシル基多数を含む鎖を有する。本発明のこの特定の実施例は、標的とするために合理的に意図された官能基を有さない。
【化１】
2006503103.tif 000002
【００２１】
前記ジチオカルバメートは、鉄と平面的な錯体を形成し、そして以下に示すように、酸化窒素と結合することができる：
【化２】
2006503103.tif 000003
【００２２】
種々の好ましい実施例が、前記構造中のトリフルオロメチル基の代わりに、フッ素化されたより長い炭素鎖を有することができる。ほとんどの場合において、前記鎖は、多くのフッ素を導入するのに充分な程長く、しかしながら導入されたフッ素原子の全てが強い常磁性効果を被るのに充分な程短いことが最も好ましいであろう。
【００２３】
以下の実施例は、余分の正の電位を有し、前記電位は、高い負のドナン電位を有する領域（例えば、アグリカン含有量の高い関節軟骨）をその錯体が標的とすることを助けることができる。あるいは、ＮＨ３＋の代わりに、負の官能性、例えば、ＳＯ３−を、高い負の電位を有する目的としない組織に、導入することができる。代わりに、疎水性の領域、例えば、膜表面又はアテローム性硬化症の斑を標的とするために、錯化剤は、以下に示す第一アミンに結合する比較的長い炭化水素鎖を有するであろう。
【化３】
2006503103.tif 000004
【００２４】
以下に示す化学式は、有利な要素２つ（水溶性を強化するために官能性中に組み込まれたフッ素レポーター核）が、分子の同じ位置に結合している実施例である。常磁性の中心からの距離がしだいに離れていく複数のレポーター核（この場合フッ素）があるが、全体的な領域において、最適なＴ１値及びＴ２＊値を得る常磁性の効果が予測されるであろう。
【化４】
2006503103.tif 000005
【００２５】
以下に示す化学式は、高レベルのコレステロール結合タンパク質並びに存在することのあるリポタンパク質及びアテローム性硬化症の斑の様な疎水性領域を有する組織を標的とする、コレステロール様標的化機能を有する実施例である。
【化５】
2006503103.tif 000006
【００２６】
当然のことながら、前記分子は、金属イオンと錯化すべきジチオカルバメートの半分である。
【００２７】
本発明の別の態様では、天然の又は合成のポルフィリンが、レポーター核少なくとも一つと一緒に、造影剤の一部を形成する。前記ポルフィリンは、より大きな分子と結合することができ、又は前記ポルフィリンは、一つ以上のレポーター核と単純に結合することができる。
【００２８】
典型的なポルフィリンとしては、ヘム及び合成ポルフィリンを挙げることができる。本発明の別の態様では、前記ヘムが、ヘモグロビン分子中に位置する。本発明の更に別の態様においては、前記ヘムが、ミオグロビン分子中に位置する。状況によっては、内因性のヘムを使用することが可能であろう。ヘム環の周囲のプロトンは、超微細なシフトを非常に多量に示すことがあり、従って、レポーター核として利用することができる。
【００２９】
合成ポルフィリンの製造方法は、当業者に公知であり、例えば、モノピロールの四量体化を挙げることができる。一種類の置換基１タイプのみを含むポルフィリンを合成するには、モノピロールの四量体化を用いることができる。或るアプローチは、橋状メチン（ＣＨ）炭素を供給する、２，５−ジ非置換ピロールとアルデヒドとの間の反応を含む（反応工程式１）。また、この方法は、種々のメソ−テトラアリールポルフィリン、例えば、メソ−テトラフェニルポルフィリンの合成においても使用することができる（反応工程式２）。
【００３０】
モノピロール四量体化の別のアプローチとしては、２−アセトキシメチルピロール又は２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルピロールの自己縮合を挙げることができる（反応工程式３）。最近では、２−ヒドロキシメチルピロールを用いる同様の縮合を行って、種々のポルフィリン、例えば、中心対称的なポルフィリン（別の位置に存在する２タイプの置換基を含む）が合成されている。
【００３１】
【化６】
2006503103.tif 000007
【００３２】
【化７】
2006503103.tif 000008
【００３３】
【化８】
2006503103.tif 000009
【００３４】
好都合に使用することのできる別の合成法は、ジピロリック中間体の縮合である。フィッシャー［Ｆｉｓｃｈｅｒ］により開発された、２００℃以下の温度での有機酸溶融物（例えば、コハク酸）中における１−ブロモ−９−メチルジピロメテンの自己縮合は、良好な収率でポルフィリンを提供する（反応工程式４）。１，９−ジブロモジピロメテンと１，９−ジメチルジピロメテンとを縮合させることによるこの方法は、分子の半分の一方又は両方が対称的であるポルフィリンの合成にも使用することができる（反応工程式５）。この方法の変形として、ギ酸中で１−ブロモ−９−ブロモメチルジピロメテンを反応させて、比較的高い収率でポルフィリンを得る方法がある（反応工程式６）。
【００３５】
フィッシャーの頃から知られていたことであるが、ポルフィリン形成の間のピロール「再分配」により生成物の混合が生じるという問題があるために、前記ジピロメタン経路は広く使用されていなかった。しかしながら、１９６０年にマクドナルド［ＭａｃＤｏｎａｌｄ］が前記反応用のより穏和な条件を開発してから、この経路は一般的になった。前記マクドナルド合成は、酸触媒、例えば、ヨウ化水素又はｐ−トルエンスルホン酸の存在下における、１−非置換−９−ホルミルジピロメタンの自己縮合（反応工程式７）又は１，９−ジ非置換ジピロメタン及び１，９−ジホルミルジピロメタンの縮合（反応工程式８）を含む。また、前記マクドナルド合成に必要なジピロメタンは、しばしば、相当するジピロメテンよりも容易に調製及び精製されることも理由として、現在では、この方法は広く使用されている。
【００３６】
ジピロケトン及びジピロメタンを伴う別の合成経路は、最初に得られる生成物がオキソフロリンであり、これをポルフィリンに変換する必要があるので、前記の２つの方法よりも不便である（反応工程式９）。対称性制限及び反応条件は、ジピロメタンによるマクドナルド合成の対称性制限及び反応条件に従う。また、１，９−ジ非置換ジピロケトンは１，９−ジホルミルジピロメタンと反応するのに充分な求核性を持たないので、前記ジピロケトンは、ジホルミル基を有することも必要となる。
【００３７】
【化９】
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【００３８】
【化１０】
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【００３９】
【化１１】
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【００４０】
【化１２】
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【００４１】
【化１３】
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【００４２】
【化１４】
2006503103.tif 000015
【００４３】
また、例えば、開鎖テトラピロールの環化によってポルフィリンを合成することもできる。
本発明は、酸化窒素量の効果的で及び非侵襲的な分析方法、並びに、不都合で許容することのできない不利な効果を生じることがなく病理学的なＮＯＳ−２（ｉＮＯＳ）発現によって少なくとも部分的に媒介される条件を提供する。
【００４４】
本発明の製剤の適切な投与対象としては、霊長類、ヒト、及びその他の動物、特に、ヒト及び家畜化された動物、例えば、ネコ及びイヌを挙げることができる。
対象における全身的な使用用に、本発明の化合物を、医薬的又は獣医学的な組成物として製剤化することができる。前記化合物は、治療される対象及び投与形態に応じて、それらのパラメータと調和する方法で製剤化する。本発明の組成物は、酸化窒素を画像化するのに有効な投与量を含む。本発明の造影剤は、薬剤学的に許容することのできる担体と組み合わせて用いることが好ましい。
【００４５】
本明細書において、用語「薬剤学的に許容することのできる塩、エステル、アミド、及びプロドラッグ」は、不適切な毒性、刺激、アレルギー応答などなしで患者の組織と接触させて使用するのに（適切な医学診断の範囲内で）適しており、合理的な利益／危険比で釣り合っており、及び意図する用途に対して効果的な、本発明の化合物のカルボキシレート塩、アミノ酸付加塩、エステル、アミド、及びプロドラッグ、並びに存在するのであれば、本発明の化合物の双性イオン形態のことを意味する。
【００４６】
用語「塩」は、本発明の化合物の、比較的無毒な、無機酸付加塩及び有機酸付加塩のことを意味する。これらの塩は、前記化合物の最終的な単離及び精製の間に、ｉｎ ｓｉｔｕで調製するか、あるいは、精製された遊離塩基形態の化合物を、適当な有機酸又は無機酸と別途反応させ、そしてこうして形成される塩を単離することによって、調製することができる。典型的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチレートメシレート、グルコヘプトネート、ラクチオビオネート、及びラウリル硫酸塩などを挙げることができる。これらは、アルカリ金属及びアルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどに基づくカチオン、並びに無毒のアンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオン、例えば、以下に限定されるものでないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むことができる。
【００４７】
本発明の組成物は、ヒト又は動物における酸化窒素の画像化に使用される従来の医薬製剤（例えば、注射溶液）中に含ませることができる。医薬組成物は、皮下注射、静脈内注射、又は筋肉内注射により、あるいは大容量非経口液などとして、投与することができる。本明細書において、用語「非経口」には、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、胸骨内投与、又は注入法が含まれる。
例えば、或る非経口組成物は、造影剤０．１〜９０重量対体積％を含む無菌の等張塩類溶液を含むことができる。
【００４８】
適切な分散剤又は湿潤剤、及び懸濁剤を用いる、公知技術に従って、注射用調製物、例えば、無菌の注射用の水性又は油性懸濁液を製剤化することができる。また、前記の無菌の注射用調製物は、非経口的に許容することのできる希釈剤又は溶媒中の無毒の注射用の溶液又は懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール溶液であってもよい。許容することのできるベヒクル及び溶媒の中で、使用することのできるものは、水、リンガー溶液、及び等張の塩化ナトリウム溶液である。更に、無菌の不揮発性油が、溶媒又は懸濁溶媒として、慣用的に使用される。この目的用に、任意の不揮発性油を用いることができ、例えば、合成モノグリセリド又はジグリセリドを挙げることができる。更に、脂肪酸、例えばオレイン酸は、注射剤の調製における用途が見出されている。
【００４９】
経口投与用の固形投与形態としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、顆粒、及びゲルを挙げることができる。前記固形投与形態においては、前記造影剤を、例えばスクロース、ラクトースまたはデンプンの様な少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合させることができる。また、前記投与形態は、通常の慣行として、不活性な希釈剤以外の別の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムの様な潤滑剤を含んでもよい。カプセル、錠剤、及び丸剤の場合には、前記投与形態は、緩衝剤も含むことができる。錠剤及び丸剤は、更に、腸溶コーティングを用いて調製することができる。
【００５０】
経口投与用の液体投与形態としては、当業界で一般的に使用される水等の不活性な希釈剤、薬剤学的に許容することのできる乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシルを挙げることができる。また、前記組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤、及び懸濁化剤、並びに甘味剤、香味剤、及び芳香剤も含むことができる。
【００５１】
担体材料と組み合わせて単独投与形態を製造することができる造影剤の量は、処理されるホスト及び特定の投与形態に応じて変化するであろう。投与量の選択は、使用される投与形態、分析される条件、及び当業者の決定に従って達成されるべき特定の目的に応じて変化する。
【００５２】
本発明の造影剤を単独及び／又は複数で用いて疾病状態を分析するための投与レジメンは、種々の要因、例えば、タイプ、年齢、体重、性別、食物、及び患者の医学的状態、投与経路、例えば、活性、効力、薬物速度論、及び毒物学的特性の様な使用される特定の化合物の薬理学的検討、医薬デリバリーシステムを用いるか否かに従って選択される。このように、実際に使用される投与レジメンは、広く変化することがあり、従って、前記投与レジメンから逸脱することがある。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、ヒトに投与することが好ましい。しかしながら、これらの薬剤は、ヒトの酸化窒素画像化に対して有用である一方、ペット、外来動物、及び家畜、例えば哺乳類、げっ歯類、鳥類などの獣医学的分析に対する用途に対しても有用である。より好ましい動物としては、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、及びブタを挙げることができる。
【００５４】
本発明によれば、対象組織に対して有効量の活性化合物がデリバリーされるように、前記造影剤又はそれらの混合物を、薬剤学的に許容することのできる担体中に充分な濃度として投与する。前記医薬溶液は、好ましくは、約０．０００１％〜約１０％（重量／体積）、より好ましくは約０．０００５％〜約１％（重量／体積）の濃度範囲内で前記造影剤１種以上を含む。
【００５５】
対象組織、例えば哺乳動物の眼に対して直接的に医薬を投与する任意の方法を使用して、本発明に従って、治療すべき組織に対して投与することができる。適切な投与経路としては、経口又は注射等の全身的投与、局所投与、眼周囲（例えば、サブテノン（ｓｕｂＴｅｎｏｎ））投与、結膜下投与、眼球内投与、網膜下投与、脈絡膜上投与、及び眼球後投与を挙げることができる。用語「直接的に投与する」は、前記造影剤が全身的に提供されることになる一般的な全身性の医薬投与形態、例えば、患者血液中への直接的な注入、経口投与などを意味する。より好ましくは、前記造影剤を、組織に直接注入する。
【００５６】
種々の保存剤を前記医薬調製物中に用いることができる。好ましい保存剤としては、以下に限定されるものでないが、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、及び硝酸フェニル水銀を挙げることができる。
同様に、局所投与において、種々の好ましいベヒクル、例えば、以下に限定されるものでないが、ポリビニルアルコール、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロクサマー、カルボキシメチルセルロース、及びヒドロキシエチルセルロースを用いることができる。
【００５７】
必要であれば又は便利であれば、等張化剤を加えることができる。等張化剤としては、以下に限定されるものでないが、特に、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩類、マンニトール、及びグリセリン、あるいは任意の別の適切な又は許容することのできる等張化剤を挙げることができる。
得られる調製物が薬剤学的に許容することのできる限り、種々の緩衝剤及びｐＨ調節手段を用いることができる。従って、緩衝剤としては、以下に限定されるものでないが、酢酸塩緩衝液、タイトレート［ｔｉｔｒａｔｅ］緩衝液、リン酸塩緩衝液、及びホウ酸塩緩衝液を挙げることができる。所望により、酸又は塩基を用いて、それらの製剤のｐＨを調節することができる。
同様な趣旨で、薬剤学的に許容することのできる抗酸化剤としては、以下に限定されるものでないが、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化水酸化アニソール、及びブチル化水酸化トルエンを挙げることができる。
【００５８】
当業者であれば、本発明において有用な造影剤の適切な投与方法が、利用可能であることが認められよう。個々の造影剤の投与には複数の経路を使用することができるが、或る特定の経路は、別の経路よりも、より即時で及びより効果的な反応を提供することができる。従って、前記の投与経路は、単に例示的なものであり、これらに限定されない。
【００５９】
本発明に従って投与される、動物、特にヒトに対する投与量は、合理的な時間枠の間中前記動物において所望の応答をもたらすのに充分な投与量であることが好ましい。従って、本発明の医薬組成物は、適切な単位投与形態で調製される。当業者であれば、投与量が、種々の要因、例えば、使用される個々の造影剤の強さ、年齢、種、体調、又は疾病状態、及び動物の体重、並びに酸化窒素を発現している組織の量又は存在する酸化窒素の量及び位置に応じて変化するであろうことを認識できるであろう。また、投与量も、投与の経路及びタイミング、並びに特定の造影剤の投与に伴うことのある任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によって決定されるであろう。当業者であれば、種々の体調又は疾病状態、特に慢性的な体調又は疾病状態において、複数回投与を含む、２回以上の酸化窒素の定量を必要とすることがあることが認識できるであろう。
【００６０】
当業者に公知の通常の距離測定法によって、適切な投与量を決定することができる。
前記の実施例は、本発明を説明することを意図するものであり、添付されている「特許請求の範囲」の範囲を制限しない。前記の説明に照らして、多くの変形が当業者に見出されるであろう。
【国際調査報告】
2006503103.tif 000024
2006503103.tif 000025
2006503103.tif 000026
2006503103.tif 000027