(57)【要約】本発明は、変異ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）分離株に関し、特に、ウイルスゲノムの前初期（ＩＥ）遺伝子に変異を有するＥＨＶ−１分離株に関する。ＥＨＶ−１変異株のパネルについて記載されている。好適なＥＨＶ−１分離株は、複製能を有し、かつ非病原性の分離株である。本発明に係る変異ＥＨＶ−１分離株は、ウマのＥＨＶ−１感染症を予防及び治療するためのワクチン組成物を調製する上で有用である。さらに、本発明は、本発明に係る非病原性ＥＨＶ−１分離株で予め免疫されたウマ被験個体に存在するＥＨＶ−１分離株の病原性を判定する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１から選択される変異を含むＥＨＶ−１分離株。
【請求項２】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ１、Ａｂ４、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＭ、またはＲａｃＨから選択された株である、請求項１に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項３】
ＫｙＡΔＳＲＴ１、ＫｙＡΔＳＲＴ２、ＫｙＡｄ１７８／６２７、ＫｙＡ５５２／８９７、ＫｙＡ６４４／８２４、ＫｙＡｎ６２７、ＫｙＡｎ９５１、ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡｉｎ６２８、ＫｙＡｉｎ１４１１、ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙＡＬ１２Ｐ、ＫｙｎＬ１２Ｅ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、及びＫｙＡＥ３４Ｑからなる群より選択されるＥＨＶ−１分離株。
【請求項４】
ＩＥ遺伝子に変異を含む、複製能を有するＥＨＶ−１分離株。
【請求項５】
変異が、アミノ酸番号１〜８９、１８１〜２２０、４２２〜５９７、または９６３〜９７０の中でのアミノ酸残基の置換である、請求項４に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項６】
置換が、Ｄ２０Ｎ、Ｄ２４Ｎ、Ｌ１２Ｅ、Ｆ１５Ｄ、またはＥ３４Ｑから選択される、請求項５に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項７】
変異が、アミノ酸番号９０〜１８０、２２１〜４２１、５９８〜９６２、または９６３〜１４８７の中における約３以上のアミノ酸残基の欠失または挿入である、請求項４に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項８】
変異が、ｄ６４４／８２４、ｎ６２７、ｎ１０２９、ｎ１４１１、ｉｎ６２８、またはｉｎ１４１１から選択される、請求項７に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項９】
ＥＨＶ−１分離株が非病原性である、請求項４に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項１０】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ１、Ａｂ４、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＭ、またはＲａｃＨから選択された株である、請求項９に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項１１】
ＥＨＶ−１分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号１〜８９、１８１〜２２０、４２２〜５９７、または９６３〜９７０の中でのアミノ酸残基の置換である、請求項１０に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項１２】
変異が、Ｄ２０Ｎ、Ｄ２４Ｎ、Ｌ１２Ｅ、Ｆ１５Ｄ、またはＥ３４Ｑから選択される、請求項１１に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項１３】
ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙＡＬ１２Ｅ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、またはＫｙＡＥ３４Ｑから選択される、請求項１２に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項１４】
ＥＨＶ−１分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号９０〜１８０、２２１〜４２１、５９８〜９６２、または９６３〜１４８７の中における約３以上のアミノ酸残基の欠失または挿入である、請求項１０に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項１５】
分離株が、ｄ６４４／８２４、ｎ６２７、ｎ１０２９、ｎ１４１１、ｉｎ６２８、またはｉｎ１４１１から選択される、請求項１４に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項１６】
ＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ６２７、ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡｉｎ６２８、またはＫｙＡｉｎ１４１１から選択される、請求項１５に記載のＥＨＶ−１分離株。
【請求項１７】
医薬適合性の担体、及び非病原性で複製能を有するＥＨＶ−１分離株を含む免疫原性組成物であって、該ＥＨＶ−１分離株がＩＥ遺伝子に変異を含むものである免疫原性組成物。
【請求項１８】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ１、Ａｂ４、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＭ、またはＲａｃＨから選択された非病原性株である、請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号１〜８９、１８１〜２２０、４２２〜５９７、または９６３〜９７０の中でのアミノ酸残基の置換である、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
変異が、Ｄ２０Ｎ、Ｄ２４Ｎ、Ｌ１２Ｅ、Ｆ１５Ｄ、またはＥ３４Ｑのうちの一つである、請求項１９に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙｎＬ１２Ｅ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、またはＫｙＡＥ３４Ｑから選択される、請求項２０に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号９０〜１８０、２２１〜４２１、５９８〜９６２、または９６３〜１４８７の中における約３以上のアミノ酸残基の欠失または挿入である、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
変異が、ｄ６４４／８２４、ｎ６２７、ｎ１０２９、ｎ１４１１、ｉｎ６２８、またはｉｎ１４１１から選択される、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
分離株が、ＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ６２７、ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡｉｎ６２８、またはＫｙＡｉｎ１４１１から選択される、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
ウマ被験個体において、ＥＨＶ−１に対する免疫応答を促進する方法であって、該被験個体に有効量の非病原性で複製能を有するＥＨＶ−１分離株であって、ＩＥ遺伝子に変異を含むＥＨＶ−１分離株を投与することを含む方法。
【請求項２６】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ１、Ａｂ４、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＭ、またはＲａｃＨから選択された非病原性株である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号１〜８９、１８１〜２２０、４２２〜５９７、または９６３〜９７０の中でのアミノ酸残基の置換である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
変異が、Ｄ２０Ｎ、Ｄ２４Ｎ、Ｌ１２Ｅ、Ｆ１５Ｄ、またはＥ３４Ｑのうちの一つである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙｎＬ１２Ｅ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、またはＫｙＡＥ３４Ｑから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号９０〜１８０、２２１〜４２１、５９８〜９６２、または９６３〜１４８７の中における約３以上のアミノ酸残基の欠失または挿入である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
変異が、ｄ６４４／８２４、ｎ６２７、ｎ１０２９、ｎ１４１１、ｉｎ６２８、またはｉｎ１４１１から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
分離株が、ＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ６２７、ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡｉｎ６２８、またはＫｙＡｉｎ１４１１から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
免疫応答が、細胞媒介性免疫応答または体液性免疫応答である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
医薬適合性の担体、及び非病原性で複製能を有するＥＨＶ−１分離株を含むワクチン組成物であって、該ＥＨＶ−１分離株がＩＥ遺伝子に変異を含むものであるワクチン組成物。
【請求項３５】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ１、Ａｂ４、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＭ、またはＲａｃＨから選択された非病原性株である、請求項３４に記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号１〜８９、１８１〜２２０、４２２〜５９７、または９６３〜９７０の中でのアミノ酸残基の置換である、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
変異が、Ｄ２０Ｎ、Ｄ２４Ｎ、Ｌ１２Ｅ、Ｆ１５Ｄ、またはＥ３４Ｑのうちの一つである、請求項３６に記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙｎＬ１２Ｅ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、またはＫｙＡＥ３４Ｑから選択される、請求項３７に記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号９０〜１８０、２２１〜４２１、５９８〜９６２、または９６３〜１４８７の中における約３以上のアミノ酸残基の欠失または挿入である、請求項３５に記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
変異が、ｄ６４４／８２４、ｎ６２７、ｎ１０２９、ｎ１４１１、ｉｎ６２８、またはｉｎ１４１１から選択される、請求項３９に記載のワクチン組成物。
【請求項４１】
分離株が、ＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ６２７、ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡｉｎ６２８、またはＫｙＡｉｎ１４１１から選択される、請求項４０に記載のワクチン組成物。
【請求項４２】
ウマ被験個体においてＥＨＶ−１感染を予防または阻害する方法であって、該被験個体に治療上有効な量の非病原性で複製能を有するＥＨＶ−１分離株であって、ＩＥ遺伝子に変異を含むＥＨＶ−１分離株を投与することを含む方法。
【請求項４３】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ１、Ａｂ４、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＭ、またはＲａｃＨから選択された非病原性株である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号１〜８９、１８１〜２２０、４２２〜５９７、または９６３〜９７０の中でのアミノ酸残基の置換である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
変異が、Ｄ２０Ｎ、Ｄ２４Ｎ、Ｌ１２Ｅ、Ｆ１５Ｄ、またはＥ３４Ｑのうちの一つである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＥＨＶ−１分離株が、ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙｎＬ１２Ｅ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、またはＫｙＡＥ３４Ｑから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
分離株のＩＥ遺伝子における変異が、アミノ酸番号９０〜１８０、２２１〜４２１、５９８〜９６２、または９６３〜１４８７の中における約３以上のアミノ酸残基の欠失または挿入である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
変異が、ｄ６４４／８２４、ｎ６２７、ｎ１０２９、ｎ１４１１、ｉｎ６２８、またはｉｎ１４１１から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
分離株が、ＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ６２７、ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡｉｎ６２８、またはＫｙＡｉｎ１４１１から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
非病原性ＥＨＶ−１分離株を予め投与されたウマ被験個体に存在するＥＨＶ−１ウイルスの非病原性を判定する方法であって、該ＥＨＶ−１分離株がＩＥ遺伝子に変異を含み、該方法が、該ウイルスを該被験個体から分離すること、該ウイルスの中に該非病原性分離株の変異ＩＥタンパク質が存在し、野生型ＩＥタンパク質が存在しないことを検出し、それによって、該ウイルスが非病原性であると判定することを含む方法。
【請求項５１】
変異ＩＥタンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、野生型ＩＥタンパク質の移動度とは異なる移動度をもつ、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
変異ＩＥタンパク質が、アミノ酸残基の欠失または挿入を含み、ＩＥタンパク質の検出が、欠失または挿入が起きたアミノ酸残基に特異的な抗体に基づいている請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
非病原性ＥＨＶ−１分離株を予め投与されたウマ被験個体に存在するＥＨＶ−１ウイルスの非病原性を判定する方法であって、該ＥＨＶ−１分離株がＩＥ遺伝子に欠失を含み、該方法が、ＩＥタンパク質の欠失部位に特異的な抗体が、該被験個体の血清に存在しないことを検出し、それによって、該ウイルスが非病原性であると判定することを含む方法。
【請求項５４】
非病原性ＥＨＶ−１分離株を予め投与されたウマ被験個体に存在するＥＨＶ−１ウイルスの非病原性を判定する方法であって、該ＥＨＶ−１分離株がＩＥ遺伝子に変異を含み、該方法が、該ウイルスを該被験個体から分離すること、野生型ＩＥの塩基配列が存在しないこと、及び変異ＩＥの塩基配列が存在すること検出し、それによって、該ウイルスが非病原性であると判定することを含む方法。
【請求項５５】
非病原性ＥＨＶ−１分離株を予め投与されたウマ被験個体に存在するＥＨＶ−１ウイルスの非病原性を判定する方法であって、該ＥＨＶ−１分離株がＩＥ遺伝子に変異を含み、該方法が、該ウイルスを該被験個体から分離すること、該ウイルスの温度感受性が、非病原性ＥＨＶ−１分離株の温度感受性と同じであると判定し、それによって、該ウイルスが非病原性であると判定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、変異ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）の分離株、特に、ウイルスゲノムの前初期（ＩＥ）遺伝子のみに変異を有するＥＨＶ−１分離株に関する。さらに、本発明は、ワクチン組成物、及びＥＨＶ−１感染症の治療法に関する。ＥＨＶ−１ウイルスの病原性を判定する方法も提供する。
【０００２】
ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）は、ウマの主要な病原体である。感染動物では、通常、上気道感染症を伴うが、神経後遺症をもたらすこともある。妊娠した雌ウマがＥＨＶ−１に感染すると流産性疾患を引き起こすため、世界中のウマ産業に重大な経済的打撃を与える。
【０００３】
ウマは、ウマヘルペスウイルスの自然宿主であるが、さまざまな動物や組織培養系を用いて、このウイルスを増殖させることができる。ＥＨＶ−１の実験動物には、ゴールデン・ハムスター、ベビー・ハムスター、ニワトリ胚、生まれたばかり又は成長したマウス、仔ネコなどがある。ＥＨＶ−１を増殖させるために使用される初代組織培養系には、胎仔の肺、真皮、脾臓及び腎臓など、さまざまなウマ組織由来の細胞や、飼育用のネコ、イヌ、ハムスター、ウサギ、マウス、ヒツジ、及びブタに由来する細胞などがある。研究室において、ＥＨＶ−１を培養するために広く用いられている永久培養系には、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ−１細胞、ウサギ腎（ＲＫ）細胞、マウスＬ−Ｍ細胞、及びウマＥｄｍｉｎ３３７細胞などがある。
【０００４】
ウマの呼吸器へのＥＨＶ−１の自然感染は、短期間の体液性反応をもたらすだけで、その後の感染に対する長期間の防御をもたらすことはない。ＥＨＶ−１感染症を治療するためのワクチンが数多く開発されているが、その中には、主にＥＨＶ−１及びＥＨＶ−４の両者を含む不活化ワクチン（Ｐｎｅｕｍａｂｏｒｔ　Ｋ（商標）、Ｒｅｓｅｑｕｉｎ（商標）、Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（商標）、またはＤｕｖａｘｙｎ（商標））、改変生ワクチン（Ｒｈｉｎｏｍｕｎｅ（商標）またはＰｒｅｖａｃｃｉｏｎｏｌ（商標））、及びサブユニットワクチン（Ｃａｖａｌｏｎ　ＩＲ（商標））がある。
【０００５】
しかしながら、ＥＨＶワクチンには、望ましくない副作用をもたらすものがあり、また、それらの殆どは、許容できるほどの防御レベルに達していない。ＥＨＶ−１感染症に対する安全かつ有効なワクチンに対する需要がある。
【０００６】
本発明は、ウイルスゲノムの前初期（ＩＥ）遺伝子に一個以上の変異を有するＥＨＶ−１分離株を目的とする。
【０００７】
特に、本発明は、ウイルスゲノムのＩＥ遺伝子に、表１に列挙した一個以上の変異を有するＥＨＶ−１分離株を提供する。
【０００８】
好ましい実施形態において、本発明は、複製能をもつＥＨＶ−１分離株であって、ＩＥ遺伝子に一個以上の変異を有する分離株を提供する。
【０００９】
特に、ＩＥ遺伝子における変異は、ＩＥタンパク質の４つのドメインであって、ウイルス複製に必須のドメインＴＡＤ（１〜８９番アミノ酸（ａａ））、ＳＲＴ（ａａ１８１〜２２０）、ＤＢＤ（ａａ４２２〜５９７）、及びＮＬＳ（ａａ９６３〜９７０）のいずれの構造及び／または機能を大きく阻害することはない。
【００１０】
この実施形態において、本発明は、複製能をもつＥＨＶ−１分離株であって、ＴＡＤ、ＳＲＴ、ＤＢＤ、またはＮＬＳの中のアミノ酸残基が置換されているＩＥ遺伝子変異をもつ分離株を提供する。好ましくは、この置換は、交換基グループ内、すなわち、タンパク質の構造に与える全体的な影響に関して類似したアミノ酸の間でアミノ酸を交換することを含む。より好ましくは、この置換は、Ｄ２４Ｎ、Ｄ２０Ｎ、Ｆ１５Ｄ、Ｌ１２Ｅ、またはＥ３４Ｑである。
【００１１】
特に好ましい変異は、９０〜１８０番目、２２１〜４２１番目、５９８〜９６２番目、または９７１〜１４８７番目のアミノ酸の範囲内において、１個または２個、好ましくは３個以上、より好ましくは５個以上のアミノ酸残基の挿入または欠失を含む。最も好適な変異は、ｄ６４４／８２４（６４４〜８２４番アミノ酸の欠失）、ｎ１０２９（１０２９番アミノ酸におけるナンセンス変異及び１０３０〜１４８７番アミノ酸の欠失）、ｎ１４１１（１４１１番アミノ酸におけるナンセンス変異及び１４１１〜１４８７番アミノ酸の欠失）、ｉｎ６２８（１４１１番アミノ酸における挿入）、及びｉｎ１４１１（１４１１番アミノ酸における挿入）などである。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明は、ＩＥ遺伝子に一個以上の変異をもち、複製能を有するＥＨＶ−１分離株であって、本明細書において「非病原性」ＥＨＶ−１分離株とも称される、病原力が低下しているか、病原力をもたない分離株を提供する。
【００１３】
非病原性であって複製能を有するＥＨＶ−１分離株は、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ４、Ａｂ１、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＨ、及びＲａｃＭなどのＥＨＶ−１株であって、一個以上の変異がウイルスゲノムのＩＥ遺伝子の中に導入されているＥＨＶ−１分離株であろう。好適な変異ＥＨＶ−１分離株はＫｙＡ変異株である。
【００１４】
さらに、本発明は、本明細書に記載された非病原性であって複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株を一種類以上含む免疫原性組成物を目的としている。
【００１５】
さらに、本発明は、本発明に係る免疫原性組成物を被験ウマに投与することによって、該ウマにおいてＥＨＶ−１に対する免疫反応を促進する方法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、本明細書に記載された非病原性であって複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株を一種類以上含む弱毒化生ワクチン組成物を目的としている。
【００１７】
さらに、本発明は、本発明に係る非病原性で複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株を治療上有効な量、ウマ被験個体に投与することによって、該ウマにおけるＥＨＶ−１感染症を治療する方法も提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、本発明に係る非病原性ＥＨＶ−１分離株を以前ワクチン接種した被験動物に存在するＥＨＶ−１分離株の病原性を判定する方法も提供する。この判定は、野生型ＥＨＶ−１と、以前に被験動物に投与された非病原性ＥＨＶ−１分離株とを区別するアッセイ法を行なって実施する。
【００１９】
本発明の一側面は、ウイルスゲノムの前初期（ＩＥ）遺伝子に一個以上の変異を有する新規変異ウマヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）分離株を目的とするものである。
【００２０】
ＥＨＶ−１は、直鎖状の二本鎖ＤＮＡゲノムをもち、長短の独自配列（それぞれＵＳ及びＵＬ）と、短い独自配列に隣接する逆方向反復配列を特徴とする。ＥＨＶ−１、Ａｂ４株の全ゲノム配列を決定したところ、サイズが１５０，２３３ｂｐであり、８０個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在しうることが明らかになった。
【００２１】
ＩＥ遺伝子は、ＥＨＶ−１に唯一の前初期遺伝子で、ウイルスゲノムの逆方向反復配列の両方に存在している。ＩＥ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号：１）は、構造的にも抗原としても関連するタンパク質分子種を生じさせる６．０−ｋｂにスプライシングされたｍＲＮＡへと転写される（Ｃａｕｇｈｍａｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６３：５６３−５７１，１９８８）。１，４８７アミノ酸（配列番号：２）からなる主なＩＥタンパク質分子種は、分散した機能ドメインからなる（図１）。強力な転写活性ドメイン（ＴＡＤ）が、最初の８９アミノ酸の中に位置している。セリンに富む領域（ＳＲＴ；ａａ１８１〜２２０）は、リン酸化部位を含んでいる可能性がある。ＤＮＡ結合機能は、４２２〜５９７番目のアミノ酸残基の中にある。９６３〜９７０番目までのアミノ酸（ＮＬＳ）は、タンパク質の核移行に必須である。
【００２２】
ＩＥタンパク質は、培養細胞の中でウイルスを増殖させるのに必須であり、増殖性感染過程における初期遺伝子及び後期遺伝子が発現するに必要とされる（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：９３６−９４５，１９９２）。ＩＥポリペプチド合成後に、約４５種類の初期転写物を検出することができる。これら初期タンパク質のうち３種類が調節タンパク質として働き、ＥＩＣＰ２２、ＥＩＣＰ２７、及びＥＩＣＰ０と名付けられている。初期遺伝子発現の後、約２９種類の後期転写物が産生され、ウイルス複製が行なわれ、その後、成熟ウイルス粒子が生成される。
【００２３】
ここで、「変異」という用語は、ＩＥタンパク質の一個以上のアミノ酸残基の置換、欠失、または挿入をもたらす、ＩＥをコードする配列の一塩基対以上の置換、欠失、または挿入を含む。
【００２４】
本発明によって、ＩＥ遺伝子に変異を有するＥＨＶ−１分離株を、本明細書で提供されている組換え系によって作出することができる。このような系に基づいて、例えば、分子クロニーングの最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）（Ａｕｓｕｂｅｌら、ニューヨーク、ジョンワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ））に記載されている多種多様な組換えクロニーング技術のいずれかを用いて、ＩＥ遺伝子に変異を生じさせることができる。そして、一個以上の変異をもつ変異ＩＥの塩基配列を、形質移入するのに適した組換えベクター上に配置し、例えば、ＲＫ−１３細胞など、適当な宿主細胞に形質移入する。そして、形質移入された宿主細胞にＩＥ遺伝子を欠失した無発現ＥＨＶ−１ウイルスを感染させる。このようにして、無発現ウイルスのゲノムと、変異ＩＥ遺伝子を含む組換えベクターとの間における相同的組換えにより、変異ウイルスを作出する。この組換え系において使用する無発現ＥＨＶ−１ウイルスは、例えば、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ４、Ａｂ１、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＨ、及びＲａｃＭなどのＥＨＶ−１株を用いて作出することができる。ＥＨＶ−１のＫｙＡ株を、２０００年７月２０日にバージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス、ユニバーシティＢｌｖｄ．１０８０１（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９）にあるアメリカン・ティシュー・タイプ・カルチャー（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）に寄託した（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２２５３）。ＫｙＡ株の無発現ウイルス、すなわちＫｙＡΔＩＥは、Ｇａｒｋｏ−Ｂｕｃｚｙｎｓｋｉら、（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２４８：８３−９４，１９９８）に記載された通りにして作成されている。この組換え系によって、ＩＥ遺伝子の２つのコピーに同一または異なった変異を有する変異ＥＨＶ−１分離株を作出することもできる。好ましくは、本発明に係る変異ＥＨＶ−１分離株は、ウイルスゲノムのＩＥ遺伝子の２つのコピーに同一の変異を有する。
【００２５】
本発明の一実施形態は、ウイルスゲノムのＩＥ遺伝子中に、表１に記載した変異を少なくとも一つもつＥＨＶ−１分離株を提供する。
【００２６】
【表１】
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好ましい実施形態において、本発明は、複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株を提供する。
【００２７】
ここで「複製能」という用語は、宿主細胞において、トランス（ｉｎ　ｔｒａｎｓ）に発現された補完ＩＥタンパク質の不在下でウイルス分離株が増殖できることを意味する。
【００２８】
本発明に従い、例えば、非補完細胞（ＩＥタンパク質を発現しない細胞）を用いたプラークアッセイ法など、いくつかのアッセイ法によって変異ウイルス分離株の複製能を判定することができる。このアッセイ法では、単層となった細胞に、目的とする変異分離株を感染させた後、２％アガロースを適当な増殖培地と１：１の割合で混合したもので覆う。この目的に用いることのできる宿主細胞は、さまざまなウマ組織、例えば、胎仔の肺、真皮、脾臓、腎臓などに由来する細胞、また、飼育用のネコ、イヌ、ハムスター、ウサギ、マウス、ヒツジ、ブタなどに由来する細胞などである。一般的には、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ−１細胞、ウサギ腎（ＲＫ）細胞、マウスＬ−Ｍ細胞、及びウマＥｄｍｉｎ３３７細胞など、通常、組織培養でＥＨＶ−１を培養するために用いられている細胞が使用される。好ましくは、本アッセイ法においてはＲＫ−１３細胞が使用される。
【００２９】
変異ウイルス分離株が非補完細胞上でプラークを形成することができれば、たとえ、そのプラークが、野生型ＥＨＶ−１が形成するプラークよりも小さいものであっても、そのような細胞は「複製能を有する」。複製能をもたない細胞は、例えば、ＩＥ１３．１細胞のように、ＩＥタンパク質をトランスで発現している補完細胞の中でプラークを形成できるにすぎない。
【００３０】
本発明によれば、ＩＥタンパク質の４つのドメイン、すなわち、ＴＡＤ（ａａ１〜８９）、ＳＲＴ（ａａ１８１〜２２０）、ＤＢＤ（ａａ４２２〜５９７）、及びＮＬＳ（ａａ９６３〜９７０）がウイルス複製には必須である。従って、これら４つのドメインの構造及び／または機能を有意に阻害するＩＥ遺伝子変異は、複製能を持たないウイルス分離株を生じさせる可能性が高い。例えば、ＩＥタンパク質のこれら４つのドメインのいずれかで５個以上のアミノ酸残基を連続して欠失させると、そのドメインの機能を破壊する可能性が高く、その結果生じた変異ウイルスは複製能を持たない可能性が高い。しかし、一個以上のアミノ酸残基を、サイズ及び／または疎水性が同じような残基に置換した場合には、それぞれのドメインの構造及び／または機能を破壊する程度は少なくなり、その結果生じた変異ウイルスは、依然複製能を有するものであろう。
【００３１】
したがって、本発明の一実施形態は、ＩＥ遺伝子に一個以上の変異を有する、複製能をもつＥＨＶ−１分離株であって、該変異が、ＴＡＤ（ａａ１〜８９）、ＳＲＴ（ａａ１８１〜２２０）、ＤＢＤ（ａａ４２２〜５９７）、またはＮＬＳ（ａａ９６３〜９７０）の内部のいずれかにある残基における置換であり、また、該変異によって、ウイルス複製におけるＩＥタンパク質の機能が実質的に破壊されていない分離株を提供する。
【００３２】
特定の公式には限定されないが、本発明に係る好適な置換は、一つの交換基グループ内のアミノ酸同士、すなわち、タンパク質構造に対する全体的な影響が互いに似ているアミノ酸同士の置換であろう。例えば、芳香族のＰｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐは一つの交換基グループを形成し、正に荷電した残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓも、一つの交換基グループを形成し、大きな脂肪族非極性残基であるＶａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅが、僅かに極性を帯びるＭｅｔ及びＣｙｓも包含する一つの交換基グループを形成する。この他の低分子残基Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、及びＰｒｏとともにすべて一つの交換基グループに含まれる。
【００３３】
より好ましくは、置換は、Ｄ２４Ｎ、Ｄ２０Ｎ、Ｆ１５Ｄ、Ｌ１２Ｅ、またはＥ３４Ｑである。さらに好ましくは、これらの置換を一つ以上もつ変異ＥＨＶ−１分離株は、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ１、Ａｂ４、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＭ、またはＲａｃＨから選択された株である。特に好適な変異ＥＨＶ−１分離株は、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、ＫｙＡＬ１２Ｅ、及びＫｙＡＥ３４Ｑである。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態において、複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株は、上記の４つのドメイン外に位置する変異であって、ＴＡＤ（ａａ１−８９）、ＳＲＴ（ａａ１８１−２２０）、ＤＢＤ（ａａ４２２−５９７）、及びＮＬＳ（ａａ９６３−９７０）ドメインのいずれの中にも置換、欠失、または挿入を生じさせない変異を持つ。
【００３５】
特に好適な変異は、アミノ酸番号９０〜１８０、２２１〜４２１、５９８〜９６２、または９７１〜１４８７の領域内のアミノ酸残基一個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは５個以上の挿入または欠失などである。
【００３６】
最も好適な変異は、ｄ６４４／８２４（６４４〜８２４番アミノ酸の欠失）、ｎ１０２９（１０２９番アミノ酸におけるナンセンス変異及び１０３０〜１４８７番アミノ酸の欠失）、ｎ１４１１（１４１１番アミノ酸におけるナンセンス変異、従って１４１１〜１４８７番アミノ酸の欠失）、ｉｎ６２８（１４１１番アミノ酸における挿入）、及びｉｎ１４１１（１４１１番アミノ酸における挿入）などである。これらの変異を一つ以上もつ変異ＥＨＶ−１分離株は、好ましくは、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ１、Ａｂ４、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＭ、またはＲａｃＨから選択された株である。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明は、病原性が低下しているか、非病原性であり、複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株であって、本明細書において「非病原性」ＥＨＶ−１分離株または「弱毒化」ＥＨＶ−１分離株と称される分離株を提供する。
【００３８】
ここで「病原力」または「病原性」という用語は、ウマにおいて、例えば、気道感染症、自然流産、また、神経疾患などのＥＨＶ−１関連疾患を惹き起こすＥＨＶ−１株の能力を意味する。病原性ＥＨＶ−１が原因となる感染症は、一般的に、発熱、大量の鼻水、及び鼻粘膜のうっ血という特徴をもつ。したがって、ここで、ＥＨＶ−１の「非病原性」または「弱毒化」株、または、「病原力が低下した」ＥＨＶ−１株とは、病原性のＥＨＶ−１に較べて、ＥＨＶ関連臨床疾患の発生を惹起する能力が実質的に低下している株のことである。
【００３９】
本発明によれば、ＥＨＶ−１分離株の病原性は、マウスモデルで適宜判定することができる。マウスにおけるＥＨＶ−１感染症の臨床症状には、例えば、Ｃｏｌｌｅら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．４３：１１１−１２４（１９９６）、及びＺｈａｎｇら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．５６：１１−２４（１９９８）に記載されているように、例えば、毛の逆立ち、体重減少、強制呼吸、嗜眠、及び群居などがある。また、下記する実施例に記載されているように、感染マウスの肺からウイルスを分離し、そのウイルスをＲＫ−１３細胞の単層上で培養し、形成されたプラーク数を測定することによって、感染症の程度を測定することもできる。
【００４０】
本発明に係る非病原性変異ＥＨＶ−１分離株は、本明細書に記載した組換え系によって、変異ＩＥ遺伝子を非病原性ＥＨＶ−１株の無発現ウイルスに導入することによって作成することができる。このような天然の非病原性ＥＨＶ−１株、または、実験処理によって非病原性にしたＥＨＶ−１株のいずれかを用いて、例えば、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ４、Ａｂ１、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＨ、及びＲａｃＭなどの無発現ウイルスを作出することができる。これら非病原性ＥＨＶ−１株の無発現ウイルスは、例えば、Ｇａｒｋｏ−Ｂｕｃｚｙｎｓｋｉら、（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２４８：８３−９４，１９９８）に記載された手順に従って作出することができる。
【００４１】
本発明に係る変異株を作出するときに使用するのに適したＥＨＶ−１株はＥＨＶ−１のＫｙＡ株であり、その寄託は、２０００年７月２０日にバージニア州２０１１０−２２０９、マナッサス、ユニバーシティＢｌｖｄ．１０８０１（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９）にあるアメリカン・ティシュー・タイプ・カルチャー（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ）に行われている（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−２２５３）。
【００４２】
したがって、本発明に係る、好適な非病原性で複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株は、ＩＥ遺伝子に一個以上の変異を有するＫｙＡ分離株であって、その変異が、ＴＡＤ（ａａ１−８９）、ＳＲＴ（ａａ１８１−２２０）、ＤＢＤ（ａａ４２２−５９７）、またはＮＬＳ（ａａ９６３−９７０）の内部のいずれかの残基の置換であって、その変異が、ウイルス複製におけるＩＥタンパク質の機能を実質的に破壊することのないＫｙＡ分離株である。このような変異ＥＨＶ−１分離株の例は、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、ＫｙＡＬ１２Ｅ、及びＫｙＡＥ３４Ｑである。
【００４３】
本発明に係る、別の好適な非病原性で複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株は、ＩＥ遺伝子に一個以上の変異を有するＫｙＡ分離株であって、その変異が、上記の４つのドメイン外に位置する変異であって、ＴＡＤ（ａａ１−８９）、ＳＲＴ（ａａ１８１−２２０）、ＤＢＤ（ａａ４２２−５９７）、及びＮＬＳ（ａａ９６３−９７０）ドメインのいずれの中にも置換、欠失、または挿入を生じさせない変異をもつＫｙＡ分離株である。このような変異ＥＨＶ−１分離株の例は、ＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡｉｎ６２８、及びＫｙＡｉｎ１４１１などである。
【００４４】
さらなる本発明の側面において、本明細書において上記したような、本発明に係る、非病原性で複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株は、免疫原性組成物に含まれる。
【００４５】
「免疫原性」とは、主に細胞傷害性Ｔ細胞によってもたらされる細胞性免疫応答、または、抗体産生をもたらすＢ細胞を順次活性化するヘルパーＴ細胞によって主に媒介される体液性免疫応答のいずれかの免疫応答をウマ被験個体において誘発するＥＨＶ−１分離株の能力を意味する。
【００４６】
本発明に係る免疫原性組成物は、少なくとも一種類の、すなわち一種類以上の上記した非病原性で複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株を含む。免疫原性組成物に含まれるべき好適な変異ＥＨＶ−１分離株には、例えば、ＩＥ遺伝子中にＤ２４Ｎ、Ｄ２０Ｎ、Ｆ１５Ｄ、Ｌ１２Ｅ、またはＥ３４Ｑの一個以上の変異を有するＥＨＶ−１分離株、または、ＩＥタンパク質のアミノ酸番号９０〜１８０、２２１〜４２１、５９８〜９６２、または９７１〜１４８７の中に一個以上の変異を有するＥＨＶ−１分離株などがある。好ましくは、本発明に係る免疫原性組成物において使用される変異ＥＨＶ−１分離株は、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ４、Ａｂ１、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＨ、及びＲａｃＭなどの非病原性ＥＨＶ−１株である。免疫原性組成物において使用される特に好適な変異ＥＨＶ−１分離株は、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、ＫｙＡＬ１２Ｅ、ＫｙＡＥ３４Ｑ、ＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ１４１１、及びＫｙＡｉｎ１４１１などである。
【００４７】
また、本発明に係る免疫原性組成物は、例えば、米国特許第５，７０７，６２９号に記載された免疫原性組成物（「ウマヘルペスウイルス１型に対する免疫原性組成物」）、及び米国特許第５，７９５，５７８号に記載された免疫原性組成物（「ウマヘルペスウイルス１型に対するワクチン」）、またはＥＨＶ−４に対する他の免疫原性組成物など、ＥＨＶ−１に対する他の免疫原性組成物などの付加的な有効成分を含むこともできる。
【００４８】
さらに、本発明に係る免疫原性組成物は、一種類以上の医薬適合性の担体を含むこともできる。
【００４９】
ここで「医薬適合性の担体」には、溶媒、分散媒、被覆剤、アジュバント、ワクチン安定化剤、抗細菌剤及び抗菌剤、砂糖及び塩化ナトリウムなどの等張剤、吸収遅延剤などのいずれかまたはすべてがある。このような媒質及び薬剤を薬学的有効物質として使用することは当技術分野においてよく知られている。通常の媒質または薬剤が有効成分と非親和的である場合以外は、これらを免疫原性組成物において使用することが考えられる。補助的な有効成分も、該組成物の中に取り込むことができる。
【００５０】
本発明に係る免疫原性組成物は、例えば、滅菌水溶液または分散液の状態など、注射に用いるのに適した状態にすることができ、または、真空乾燥及び凍結乾燥の技術を用いて、凍結乾燥状態にすることもできる。凍結乾燥させたワクチン組成物は、一般的には、約４℃で保持され、例えば、アジュバントを含むか含まない生理食塩水及び／またはＨＥＰＥＳなどの安定化溶液の中で再構成させることができる。すべての場合において、免疫原性組成物は滅菌状態になければならない。
【００５１】
本発明に係る免疫原性組成物は、ウマに投与して、ＥＨＶ−１に対する免疫応答を誘導することができる。したがって、本発明の別の実施形態は、上記した本発明に係る免疫原性組成物のいずれかを有効量投与することによって、ウマ被験個体において、ＥＨＶ−１に対する免疫応答を促進する方法を提供する。
【００５２】
免疫応答を誘導するのに「有効」となる、投与すべき免疫原性組成物の量は、該免疫原性組成物に使用されるそれぞれのＥＨＶ−１分離株の免疫原性によって異なる可能性がある。本発明によれば、ＥＨＶ−１分離株の免疫原性、すなわち、ウイルス分離株によって誘導される免疫応答の種類と程度は、ウマ被験個体の代わりとなるモデルとして一般的に認知されているマウスにおいて適宜測定することができる。さまざまな技術を、ウイルス分離株によってマウスの中で起きる免疫応答を解析するために用いることができる。例えば、当業者は、例えば、マウスの脾臓または他のリンパ性組織に応答するＣＴＬが存在するか否かを検出することによって、あるウイルス分離株が細胞媒介性免疫応答を誘導するか否かを判定することができる。または、当業者は、例えば、血清中のＥＨＶ−１特異的抗体の中和力価、または血清における抗体分泌細胞の存在を検出することによって、あるウイルス分離株が、液性免疫応答を促進するか否かを容易に判定することができる。これらの技術は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、「免疫学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．）（１９９４）など、当技術分野において十分に記述されている。
【００５３】
免疫応答を引き起こすために、本発明に係る免疫原性組成物を、静脈、腹腔、筋肉内、もしくは粘膜内（例えば、点鼻または呼吸器用のスプレーまたは注射）という経路、または別の非経口投与方法によって、対象となるウマに投与することができる。また、免疫原性組成物は、インプラントまたは経口経路によって投与することもできる。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、生の弱毒化ワクチン組成物を目的とする。
【００５５】
具体的には、本発明に係るワクチン組成物は、上記したような非病原性であって複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株を一種類以上含む。
【００５６】
ＥＨＶ−１の病原性株が細胞に感染すると、感染した対象の中で病原性ウイルス粒子が産生され、ＥＨＶ−１関連疾患が生じる。これに対し、本発明に係る非病原性ＥＨＶ−１株は、一般的に、病原力をもつまたは病原性のＥＨＶ−１株による感染に対して、対象個体を十分に防御できる程度まで複製する。
【００５７】
ここで「ワクチン」という用語は、感染リスクを防止または低下する組成物、または、感染症の症状を緩和する組成物を意味する。病原体に対するワクチン組成物の防御効果は、通常、対象個体において、細胞媒介性または体液性の免疫応答の一方または両方を含みうる免疫応答を刺激することによって発揮される。ワクチン組成物に含ませるＥＨＶ−１分離株の量を決定するときや、ワクチン接種計画を立てるときに、そのような分離株によって誘導される免疫応答の強さ及び存続期間を考慮することができる。一般的に言えば、ＥＨＶ−１感染症の発生が消失または減少すること、症状の緩和、または、感染した被験個体からウイルスの消失が迅速になることは、ワクチン組成物の防御効果の指標となる。
【００５８】
好適な非病原性で複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株であって、ワクチン組成物に使用することができる分離株は、例えば、ＩＥ遺伝子の中にＤ２４Ｎ、Ｄ２０Ｎ、Ｆ１５Ｄ、Ｌ１２Ｅ、またはＥ３４Ｑを一つ以上有するＥＨＶ−１分離株などである。好ましくは、ワクチン組成物に使用される変異ＥＨＶ−１分離株は、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ４、Ａｂ１、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＨ、及びＲａｃＭなどの非病原性ＥＨＶ−１株である。ワクチン組成物に使用される、特に好適なＥＨＶ−１分離株は、ＫｙＡＤ２４Ｎ、ＫｙＡＤ２０Ｎ、ＫｙＡＦ１５Ｄ、ＫｙＡＬ１２Ｅ、及びＫｙＡＥ３４Ｑを含む。
【００５９】
他の好適な非病原性で複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株であって、ワクチン組成物に使用することができる分離株は、ＩＥタンパク質のアミノ酸番号９０〜１８０、２２１〜４２１、５９８〜９６２、または９７１〜１４８７の範囲内に一個以上の変異、例えば、ｄ６４４〜８２４、ｎ１４１１、及びｉｎ１４１１を有するＥＨＶ−１分離株などである。このワクチン組成物に使用することができる変異ＥＨＶ−１分離株は、ＫｙＡ、ＫｙＤ、Ａｂ４、Ａｂ１、ＲａｃＬ１１、ＲａｃＨ、及びＲａｃＭなどの非病原性ＥＨＶ−１株である。ワクチン組成物に使用することができる、特に好適なＥＨＶ−１分離株は、ＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ１４１１、及びＫｙＡｉｎ１４１１などである。
【００６０】
また、本発明に係るワクチン組成物は、例えば、米国特許第５，７０７，６２９号に記載された免疫原性組成物（「ウマヘルペスウイルス１型に対する免疫原性組成物」）、及び米国特許第５，７９５，５７８号に記載された免疫原性組成物（「ウマヘルペスウイルス１型に対するワクチン」）、またはＥＨＶ−４に対する他の免疫原性組成物など、ＥＨＶ−１に対する他の免疫原性組成物などの付加的な有効成分を含むこともできる。
【００６１】
さらに、本発明に係るワクチン組成物は、上記した医薬適合性の担体を一種類以上含むことができる。
【００６２】
本発明に係るワクチン組成物は、例えば、滅菌水溶液または分散液の状態など、注射に用いるのに適した状態にすることができ、または、真空乾燥及び凍結乾燥の技術を用いて、凍結乾燥状態にすることもできる。凍結乾燥させたワクチン組成物は、一般的には、約４℃で保持され、例えば、アジュバントを含むか含まない生理食塩水及び／またはＨＥＰＥＳなどの安定化溶液の中で再構成させることができる。すべての場合において、ワクチン組成物は滅菌状態になければならない。
【００６３】
本発明の別の実施形態において、上記本発明に係るワクチン組成物は、ＥＨＶ−１感染症を治療するときに使用することができる。したがって、本発明は、本発明に係る非病原性ＥＨＶ−１分離株を治療上有効な量、ウマ被験個体に投与することによって、ウマにおけるＥＨＶ−１感染症を治療する方法を提供する。
【００６４】
「治療する」とは、ＥＨＶ−１の病原性株による感染の危険を防止または低下させること、ＥＨＶ−１感染症の症状を改善させること、または、ＥＨＶ−１感染症からの回復を促進させることを意味する。
【００６５】
治療上有効な非病原性ＥＨＶ−１分離株の量は、分離株の性質、ウマの症状、及び／または感染の程度によって決めることができ、獣医師が決定することができる。
【００６６】
本方法を実施する際に、本発明に係るワクチン組成物を、静脈、腹腔、筋肉内、もしくは粘膜内（例えば、点鼻または呼吸器用のスプレーまたは注射）という経路、または別の非経口投与方法によって、対象となるウマに投与することができる。また、ワクチン組成物は、インプラントまたは経口経路によって投与することもできる。追加免疫措置が必要になることもあり、また、投薬計画を調整して、最適な免疫を提供することもできる。交配させる前に雌ウマにワクチン接種し、妊娠中に再びワクチン接種すると、ＥＨＶ−１が原因で起こる流産を防ぐことができる。または、別のウマには、例えば、年に約一回ワクチンを接種することもできる。仔ウマには、誕生後間もない時にワクチンを接種することができる。
【００６７】
また、本発明に係る非病原性で複製能を有する変異ＥＨＶ−１分離株は、ウマヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ−４）が原因で起こる感染症に対して免疫防御効果を示すこともある。したがって、ＥＨＶ−４感染症を予防または阻害するために本発明に係る変異ＥＨＶ−１分離株を免疫原性組成物またはワクチン組成物に使用することも、本発明が想定するところである。
【００６８】
本発明に係るワクチン組成物は、それに含まれる非病原性ＥＨＶ−１分離株が、通常、発現されるＩＥタンパク質の組成及びサイズに関して、または、温度に対する増殖感度に関して、野生型ＥＨＶ−１株から識別可能であるという、さらなる特徴を有する。この特徴は、例えば、ある臨床試験において陽性であると検査された個体が、病原性ＥＨＶ−１を有するのか、それとも、以前接種された非病原性ＥＨＶ−１を有するかを判定する上で有用である。
【００６９】
従って、別の実施形態において、本発明は、事前に本発明に係る非病原性ＥＨＶ−１分離株をワクチン接種した被験個体中に存在するＥＨＶ−１分離株の病原性を判定する方法を提供する。
【００７０】
この方法は、野生型ＥＨＶ−１と、その前に被験個体に投与された非病原性ＥＨＶ−１分離株とを区別することを前提としているため、区別をつけるための測定法の選択は、非病原性ＥＨＶ−１分離株の変異の性質によって決まる。
【００７１】
事前に被験個体に投与された非病原性ウイルス分離株が、ＩＥ遺伝子に欠失を持つ場合、すなわち、ｄ６４４／８２４、ｎ１０２９、またはｎ１４１１をもつＥＨＶ−１である場合、ＩＥタンパク質、または、ＩＥタンパク質に対する血清中の抗体を検出する測定法を用いることができる。例えば、感染した細胞または組織を被験個体から分離することができる。そのような細胞または組織から細胞内抽出物を作成し、例えば、下記する実施例に記載されているようなウエスタンブロット解析を行なうことができる。低分子量のＩＥタンパク質が観察されれば、被験個体内に存在するＥＨＶ−１株の非病原性が示される。または、アミノ酸残基の欠失部位に特異的な抗体をウエスタンブロットで使用して、ＩＥタンパク質のバンドが出現しなければ、被験個体内に存在するＥＨＶ−１株の非病原性が示される。さらに、ＩＥタンパク質の欠失または削除部位に対する抗体が血清中に存在しなければ、これも、被験個体内に存在するＥＨＶ−１株の非病原性を示す。被験個体の血清における抗体の有無は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴなど、適当な免疫測定法において、欠失部位に対応するペプチドを使用することによって判定することができる。
【００７２】
以前ワクチン接種に用いられた非病原性ウイルス分離株が、野生型ＥＨＶ−１に較べ、温度に対する感受性が異なっているとき、下記する実施例に記載されているような温度変化測定法を用いることもできる。例えば、このような測定法は、例えば、ｄ６４４／８２４、ｎ１０２９、ｎ１４１１、ｉｎ１４１１、Ｄ２４Ｎ、Ｌ１２Ｅ、Ｆ１５Ｄ、またはＥ３４ＱをもつＥＨＶ分離株、特に、ｎ１０２９及びｎ１４１１をもつＥＨＶ分離株から野生型ＥＨＶ−１を区別するときに利用することができる。野生型ＫｙＡとは異なり、ＫｙＡｎ１４１１及びＫｙＡ１０２９は、３９℃では増殖することができない。ｄ６４４／８２４、ｉｎ１４１１、Ｄ２４Ｎ、Ｌ１２Ｅ、Ｆ１５Ｄ、またはＥ３４ＱをもつＫｙＡは、野生型ＫｙＡに較べると、増殖能力が劣っている。
【００７３】
病原性の判定は、被験個体から分離したウイルスのＩＥ遺伝子における変異をスクリーニングするための、核酸を利用する測定法によって行うこともできる。これらの測定法には、サザンブロットまたはノザンブロット解析法、ＰＣＲ、及び配列決定法などがある。
【００７４】
ＩＥ遺伝子の変異によって、例えば、ＥＩＣＰ０またはｇＤなど、別のＥＨＶ−１タンパク質の発現低下がもたらされることがある。例えば、ｎ１０２９は、ＥＩＣＰ０とｇＤ両方のｍＲＮＡ量を有意に低下させる。この場合、このような別のタンパク質の発現低下を、ｍＲＮＡ量またはタンパク質量で検出することによって、被験個体内に存在するウイルスの非病原性が示される。
【００７５】
上記測定法を改変したものも本発明に包含される。
【００７６】
本発明を、以下の実施例によってさらに具体的に説明する。
【００７７】
（実施例１）
材料と方法
マウスＬＭ細胞を、０．１２％メチルセルロース−１２、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＹＥＬＰ培地（酵母抽出物、ラクトアルブミン加水分解物、ペプトンを添加したイーグルの最小必須培地［ＥＭＥＭ］）による懸濁培養で増殖させた。
【００７８】
ウサギ腎細胞（ＲＫ−１３）を、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、非必須アミノ酸、及び５％ＦＢＳを添加した完全ＥＭＥＭの中で維持した。Ｐｅｒｄｕｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５９：２０１−２１６（１９７４）に記載されたようなプラークアッセイ法によって、感染性ウイルスを測定した。
【００７９】
ＩＥ１３．１細胞は、ＩＥタンパク質をトランスで発現し、ウイルスゲノム上のＩＥ遺伝子のコピーは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＬａｃＺによって置換されている。ＩＥ１３．１細胞の作出法と特徴、及び、ＩＥノックアウトウイルスＫｙＡΔＩＥについては、Ｇａｒｋｏ−Ｂｕｃｚｙｎｓｋｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２４８：８３−９４（１９９８）に記載されていた。
【００８０】
（実施例２）
変異ウイルスの作出
プラスミド
ＫｙＡΔＩＥウイルスのゲノムと、プラスミドｐＢＲ３２２ＩＥに由来するさまざまな組換えベクターとの相同組換えによって、変異ウイルスのパネルを作成するために、組換え系を確立した（図１〜２）。
【００８１】
最初の組換えベクターｐＢＲ３２２ＩＥを作出するために、ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＶ及びＰｖｕＩＩで制限酵素消化し、得られた断片を再び連結させてプラスミドｐＢＲ３２２Ｅ／Ｐを作成した。ＩＥ遺伝子の塩基番号−２１５から＋８１４０までのＩＥの全ＯＲＦを含む８．０−ｋｂのＮｄｅＩ断片（Ｇｒｕｎｄｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７２：２２３−２３６，１９８９）をｐＢＲ３２２Ｅ／Ｐに一つしかないＮｄｅＩ部位にクロニーングしてｐＢＲ３２２ＩＥを得た。第二のベクターであるｐＩＥＣａｓｓｅｔｔｅは、塩基番号−２５７から＋１２６６までのＩＥのＯＲＦを含むＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ断片を、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ部位にクロニーングして作出した。
【００８２】
「ドメイン交換」法を用いて、ナンセンス変異、挿入変異、点変異、または欠失変異をもつ変異ＩＥ型を含む組換えプラスミドを作成した。組換えプラスミドｐＢＲ３２２ｎ１４１１、ｐＢＲ３２２ｄ６４４／８２４、ｐＢＲ３２２Ｉｎ６２８、及びｐＢＲ３２２ｎ１０２９は、ｐＢＲ３２２ＩＥをＢａｍＨＩ及びＰｖｕＩＩで制限酵素消化し、この断片を、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３８５７−３８９２（１９９５）に記載された変異体から得られた変異誘発されたＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ切断ＩＥ　ＯＲＦの配列と置き換えて作成した。プラスミドｐＢＲ３２２ｄ１７８／６２７及びｐＢＲ３２２ｄ５５２／８９７は、ｐＢＲ３２２ＩＥをＮｃｏＩ及びＰｖｕＩＩで制限酵素消化し、この断片を、Ｂｕｃｚｙｎｓｋｉら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．　６５：１３１−１４０（１９９５）、及びＣａｕｇｈｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３０２４−３０３２（１９９５）に記載された変異体から得られた変異誘発されたＮｃｏＩ−ＰｖｕＩＩ切断ＩＥ　ＯＲＦの配列と置き換えて作成した。組換えプラスミドｐＢＲ３２２ΔＳＲＴ１は、ｐＳＶＩＥをＢｓｐＥＩで制限酵素消化し（塩基番号１５２３〜１７３３）、クレノウによってフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）して平滑末端を作出し、１０重合体のＥｃｏＲＩリンカーをインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で挿入して作成した。ｐＢＲ３２２ＩＥΔＳＲＴ２ベクターを構築するために、まず、プラスミドｐＳＶＩＥをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで制限酵素消化し、得られたＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＵＣ１０のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクロニーングして、プラスミドｐＵＩＥを作成した。ｐＵＩＥをＮａｅＩで制限酵素消化し、セルフライゲーションさせてプラスミドｐＵＩＥΔＳＲＴ２を作成した。プラスミドｐＵＩＥΔＳＲＴ２をＮｃｏＩで制限酵素消化し、得られた断片をｐＢＲ３２２ＩＥのＮｃｏＩ部位にクロニーングした。ＩＥのトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）の中に点変異を含む変異体を作出するために、選択された変異を含むプライマーを利用して、ＰＣＲによる変異誘発法（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を行なった（オレゴン州ウィルソンビルにあるＯｌｉｇｏ’ｓ　Ｅｔｃ．社；アイオワ州コーラルビルにあるＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。変異誘発されたＴＡＤは、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（カリフォルニア州カールスバッドにあるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングされ、要求される変異の存在を確認するため、全体の配列解析を行った。変異誘発されたＴＡＤを、ｐＩＥＣａｓｓｅｔｔｅベクターに唯一のＮｃｏＩ−ＮａｅＩ部位の中にクロニーングした。次に、さまざまな変異を起こしたＴＡＤを含むＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで切断した断片を、ｐＢＲ３２２ＩＥベクターのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ部位にクロニーングし、それによって、選択した変異を有する、再構築されたＩＥのＯＲＦを作出した。ＩＥ遺伝子にナンセンス変異、挿入変異、点変異、または欠失変異を含む組換えベクターを用いて、ウイルス複製に必須なＩＥタンパク質のドメインの同定を可能にする変異ウイルスを作成した。
【００８３】
ＤＮＡ形質移入及び変異ウイルスの作出
ＲＫ−１３細胞を、変異ＩＥ遺伝子を含むさまざまな組換えベクターで形質転換した後、無発現ウイルスＫｙＡΔＩＥを感染させた。ＫｙＡΔＩＥウイルスのゲノムと、変異ＩＥ遺伝子を含む、さまざまな組換えベクターとの間の相同的組換えによって、変異ウイルスを作出した。
【００８４】
以下の通りにして、選択した組換えベクターをＲＫ−１３細胞に形質移入した。ＲＫ−１３細胞を、完全ＥＭＥＭに２５ｃｍ２当たり２．５×１０６の密度で播種し、５％ＣＯ２下３７℃で一晩付着させた。翌日、ＲＫ−１３の単層に対し、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）試薬（ニューヨーク州グランドアイランドにあるライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を用い、製造業者の指示に従って、リポソームによるＤＮＡトランスフェクションを行なった。具体的には、２０μｌのリポフェクチン試薬を２３０μｌの無血清ＥＭＥＭと混合し、混合液を室温で４５分間インキュベートして、リポソームを調製した。２５０μｌの無血清ＥＭＥＭを含む別のチューブで調製した最大１０μｇまでのＤＮＡを、予め作成しておいたリポソーム溶液の中に入れてゆっくりと混合した。リポソーム−ＤＮＡ混合液を室温でさらに１５分間インキュベートして、ＲＫ−１３細胞の単層を無血清ＥＭＥＭで３回洗浄した。このリポソーム−ＤＮＡ混合液を一滴ずつ、１ｍｌの無血清ＥＭＥＭを含む各ＲＫ−１３細胞単層に加えた。細胞を５％ＣＯ２下３７℃で５時間インキュベートした。５時間後、５％ＦＢＳを添加した５〜１０ｍｌのＥＭＥＭを形質転換した細胞に加え、細胞を、さらに、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。
【００８５】
形質転換してから約２４時間後、ＫｙＡΔＩＥをＭＯＩ１０で細胞に多重感染させた。細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、推定組換えウイルスを含む培養上清を１０倍に希釈して、コンフルエントになったＩＥ１３．１細胞の上に蒔いた。２％アガロースを、６％ＦＢＳ、及び、白色プラークと青色プラークとを区別するために１ｍＭのＢｌｕｏＧａｌ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とを添加した２×ＥＭＥＭと１：１の割合で混合したもので、ＩＥ１３．１細胞を覆った。白色プラークを選び出して、ＩＥ１３．１細胞でプラーク精製を５回行って、残留するＫｙＡΔＩＥを確実に除去した。
【００８６】
ウイルス分離株のＰＣＲ解析
プラーク精製した保存液から単離した変異ウイルスに対し、各変異ウイルスのＩＥのＯＲＦが所望の変異を有していることを確認するため、ＬａｃＺまたはＩＥに特異的なを用いてＰＣＲ解析とＤＮＡ配列解析を行った。
【００８７】
ＳＷ５０．１ローター中、２８，０００ｒｐｍで２時間、４℃で超遠心して、培養上清からウイルスを単離した。上清を吸引し、残ったペレットを５０μｌのＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，５０ｍＭトリス塩酸［ｐＨ８．０］、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸、１％ＮＰ４０）に再懸濁し、ときどき混合しながら、室温で１時間インキュベートした。再懸濁したペレットは、ＰＣＲ解析の鋳型として用いられた。ＩＥフォワードプライマー（５’ＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＴＣＧＧＴＣＴＴ３’（配列番号：３）；塩基番号９１３〜９３０）及びＩＥリバースプライマー（５’ＣＴＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＣＡＴＧＴＴ３’（配列番号：４）；塩基番号１１５５〜１１３８）を用いて、ＩＥに特異的なＤＮＡ断片を増幅した。ＩＥフォワードプライマー（上記）及び大腸菌のＬａｃＺ遺伝子の５’側コード領域から得られたＬａｃＺ特異的プライマー（５’ＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴ３’（配列番号：５））を用いて、ＬａｃＺに特異的なＤＮＡ断片を増幅した。プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｆｍｏｌシークエンシング装置（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列解析によって変異を確認した。
【００８８】
変異ウイルスの場合、親ウイルスであるＫｙＡΔＩＥのバクテリア由来のＬａｃＺ　ＯＲＦの両コピーとも、組換えベクター由来の変異ＩＥ　ＯＲＦで置き換えられていることが分かった。
【００８９】
（実施例３）
感染細胞におけるＩＥタンパク質の発現
ウエスタンブロット解析を行って、感染細胞の中でＩＥタンパク質が産生され、それが予測されたサイズをもつことを確認した。これらの解析は、ＩＥ遺伝子に大きな欠失をもつ変異ウイルスにとって特に重要であった。これらの欠失によって、非常に不安定なＩＥタンパク質合成がもたらされることがあるからである。
【００９０】
Ｇａｒｋｏ−Ｂｕｃｚｙｎｓｋｉら、（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２４８：８３−９４，１９９８）に記載されたプロトコールに従って、感染細胞抽出物を調製した。
【００９１】
Ｐａｔｅｒｓｏｎら、（Ｎｕｃ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．１６：１１００５−１１０２５，１９８８）に記載された方法を修正した方法によって、ＥＨＶ−１感染細胞の核抽出物を調製した。野生型ＥＨＶ−１または変異型ＥＨＶ−１をＭＯＩ１０でＲＫ−１３細胞に感染させた。感染させてから６時間後に細胞を掻き取ってＰＢＳに入れ、沈殿させて、４倍量の緩衝液Ａ（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．０］，１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＫＣｌ，０．５ｍＭ　ＤＴＴ，０．５％ＮＰ４０、及び０．５ｍＭ　ＴＰＣＫ）に再懸濁した。細胞を氷上で１０分間保温した後、核を微量遠心機中１４，０００ｒｐｍで５分間沈殿させた。上清を捨て、核を２倍量の緩衝液Ｂ（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．９］，２５％グリセロール、０．４２Ｍ　ＮａＣｌ２、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＫＣｌ，０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ、及び０．５ｍＭ　ＴＰＣＫ）に再懸濁して、氷上で３０分間保温した。核の細片を、微量遠心機中１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することにより沈殿させ、上清を−８０℃で保存した。
【００９２】
細胞または核抽出物中の全タンパク質を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質測定試薬（イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にあるピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））を使用して測定した。感染細胞抽出物のタンパク質試料を等量の２×レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプル緩衝液（１０％２−メルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、０．００１％ブロモフェノールブルー）とともに５分間沸騰させた。４％スタッキングゲル及び８％分離ゲルによりタンパク質を分離し、４℃、１００Ｖで１時間、電気泳動によってニトロセルロース膜（ニューハンプシャー州キーン（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）にあるシュライヒャー・アンド・シュネル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．））に転写した。転写後、この膜を、１％のゼラチン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を含むＴＢＳＴ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、０．９％ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）に入れて、室温で１時間ブロッキングした。そして、このニトロセルロース膜を抗ＩＥペプチド特異的ポリクローナル抗血清（希釈率１：１０００）とともにインキュベートした後、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ；希釈率１：３０，０００）とともにインキュベートした。この抗ＩＥペプチド抗体は、ＩＥタンパク質のアミノ酸番号４２５〜４４５の範囲のペプチドに対して作製されたもので、免疫蛍光検査法（ＩＦ）及びウエスタンブロット解析法において、ＩＥタンパク質に対して非常に反応性が高いことが示されている（Ｓｍｉｔｈら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０２：７６０−７７０，１９９４）。各抗体を０．１％のゼラチンを含むＴＢＳＴの中で、振とうしながら２時間インキュベートした後、０．１％のゼラチンを含むＴＢＳＴの中で１５分間振とうしながら３回洗浄した。ＮＢＴ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．５］、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．３３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム［ＮＢＴ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ］、及び０．１６５ｍｇ／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート［ＢＣＩＰ］Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の中で膜をインキュベートして、反応したタンパク質を可視化した。
【００９３】
１７種類のＩＥ変異ウイルスすべての場合に、感染ＲＫ−１３細胞において、変異ＩＥタンパク質が合成された。これらのＩＥ変異ウイルスのうち４種類に関する代表的データを図３に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約１９０〜２００ｋＤａのバンドとして移動する野生型ＩＥタンパク質とは対照的に、ＫｙＡｄ６４４／８２４は、約１８０ｋＤａのところに移動するＩＥタンパク質を産生した。変異ＫｙＡ１０２９は、４５８個のカルボキシル末端側の残基をコードする配列を欠いたＩＥのＯＲＦをもつため、そのＩＥ遺伝子産物は、約１３８ｋＤａのところに移動する。ＫｙＡΔＳＲＴ２を唯一の例外とし、その他１６種類のウイルスは、それぞれ、予測された分子量の位置に移動した。ＫｙＡΔＳＲＴ２のＩＥのＯＲＦは、アミノ酸番号８８〜２４３をコードする配列を持たないため、その推定ＩＥタンパク質は、およそ１７９ｋＤａのところに移動するはずであった。このサイズのＩＥ遺伝子産物を検出することができたが、非常に少ない量しか検出されなかった。このことは、この変異体は非常に低濃度でしか得られなかったことを示している。または、ＫｙＡΔＳＲＴ２ウイルスによってコードされるＩＥタンパク質は、非常に不安定なのかもしれない。
【００９４】
（実施例４）
ＲＫ−１３細胞における変異ウイルスの増殖
変異ウイルスを、さまざまな希釈度でＲＫ−１３細胞及びＩＥ１３．１細胞に感染させた。６％ＦＢＳを添加した２×ＥＭＥＭと１：１の割合で混合した２％アガロースで感染細胞を覆った。プラーク形成を観察した。
【００９５】
ＲＫ−１３細胞、及び補完ＩＥ１３．１細胞株における１７種類の変異ウイルスの増殖解析結果をまとめたものを表２に示す。重要なのは、すべての変異ウイルスが、ＩＥ１３．１補完細胞株において複製することができたということである。アミノ酸番号３〜８９の中に位置する最小ＩＥ　ＴＡＤ内に点変異を含む６種類のウイルスは、ＲＫ−１３細胞においても増殖することができた。ロイシン１２やフェニルアラニン１５など、ＩＥ　ＴＡＤの中にある高度に保存された残基に点変異をもつウイルスは、ＲＫ−１３細胞において増殖することができた。同様に、アミノ酸番号１２に、ＩＥ　ＴＡＤの二次構造を大きく変えると考えられる、ロイシンからプロリンへの置換を有するＫｙＡＬ１２Ｐも、ＲＫ−１３細胞において増殖することができた。ＩＥのＯＲＦ内部に欠失を含む変異ウイルスのうち、ＫｙＡΔＳＲＴ１、ＫｙＡΔＳＲＴ２、ＫｙＡ１７８／６２７、及びＫｙＡ５５２／８９７は、ＩＥ１３．１細胞株によって産生される野生型ＩＥタンパク質が存在しないと増殖することができなかった。ＫｙＡΔＳＲＴ１及びＫｙＡΔＳＲＴ２はともにＩＥタンパク質の全ＳＲＴ領域を欠失しているが、ＫｙＡΔＳＲＴ２のＩＥのＯＲＦにおける欠失（８８〜２４３番目の残基）は、ＩＥ　ＴＡＤの非常に近接した位置にあるので、この重要なドメインの機能及び／または立体構造に影響するかもしれない。ＫｙＡｄ６４４／８２４は、ＩＥタンパク質の領域３に欠失をもつが、ＲＫ−１３細胞における増殖に欠陥がないことが実証されたが、このことは、この領域が、ウイルス複製に必要な初期遺伝子をトランス活性化する、ＩＥタンパク質にとって必須のドメインを含んでいないことを示している。上記の４種類の欠失変異体以外に、６２７番アミノ酸及び９５１番アミノ酸にナンセンス変異を含む変異ＥＨＶ−１は、ＲＫ−１３細胞上では複製することができなかった（これらの変異体はいずれも核移行シグナルを持たない）。ナンセンス変異が１１４１番アミノ酸にあるもの（ＫｙＡｎ１４１１）も、１０２９番アミノ酸にあるもの（ＫｙＡｎ１０２９）も、非補完細胞におけるこれらのウイルスの増殖に影響を与えなかった。しかし、ＫｙＡｎ１０２９が形成したプラークは、野生型ＫｙＡによって形成されるプラークよりも大きく、ＫｙＡｎ１０２９が形成したプラークの出現は、野生型ＫｙＡウイルスに較べて遅かった。最後に、ＫｙＡＩｎ６２８及びＫｙＡＩｎ１４１１のＩＥ　ＯＲＦにおける挿入変異は、これら変異体のＲＫ−１３細胞における増殖または表現型に有害な影響を与えなかった。
【００９６】
増殖曲線解析を行って、変異ウイルスがＲＫ−１３細胞内で増殖でき、また、野生型ＥＨＶ−１に見られるウイルス力価に匹敵する力価を得ることができたかを判定した。野生型ＥＨＶ−１または変異型ウイルスのいずれかをＭＯＩ１でＲＫ−１３細胞に感染させた。感染後さまざまな時点で培養上清の等量液を取り出し、ＲＫ−１３細胞上でのプラーク測定法によって解析を行った。図４に示すように、ＫｙＡＩｎ１４１１、ＫｙＡＩｎ６２８、及びＫｙＡｄ６４４／８２４は、野生型ＥＨＶ−１と同程度に増殖した。しかし、ＫｙＡｎ１４１１及びＫｙＡｎ１０２９の力価は、野生型ウイルスの力価よりも有意に低かった。このことは、ＩＥ　ＯＲＦ内におけるこれらの欠失が、ＩＥの機能を損ない、最終的にウイルス増殖を低下させたことを示している。この観察結果は、ＩＥタンパク質のカルボキシル末端にある配列が、ＩＥタンパク質が最大のトランス活性化作用を示すために必須であるとの最近の知見（Ｂｕｃｚｙｎｓｋｉら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．６５：１３１−１４０，１９９９）と一致する。
【００９７】
【表２】
2004512826.tif 000003
（実施例５）
変異ウイルスの温度感受性
温度を上昇させたり、低下させたりしたときに、ＩＥ　ＯＲＦ内における変異がウイルス増殖に影響するか否かを判定するために、温度変化実験を行なった。野生型ＥＨＶ−１、または変異型ウイルスを段階希釈して、ＲＫ−１３細胞上に、３回反復して播種した。プレートを３３℃、３７℃、または３９℃で５日間インキュベートしてから、１０％緩衝ホルマリン（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にあるシグマ社）を用いて固定した。メチレンブルーで染色した後、プラークの数を数えて、さまざまな温度における培養効率を測定した。
【００９８】
野生型ＥＨＶ−１は、３３℃でも３７℃でも効率的に複製したが、３９℃では、ウイルス収率が約７０％低下した。さらに、野生型ＥＨＶ−１のプラークの大きさは、３９℃で有意に減少し、プラークが小さすぎて、培養効率を算定するのが困難になるほどであった。しかし、ＲＫ−１３細胞上における、野生型ＥＨＶ−１と変異型ウイルスの増殖における違いを確認することができた。変異型ウイルスは、３９℃における増殖能力の有無によって、２つのグループに分けられた（表３）。ウイルスＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡＩｎ６２８、ＫｙＡｎ１４１１、及びＫｙＡΔＳＲＴ２は、３９℃でのＲＫ−１３細胞における増殖が、野生型ＫｙＡで見られる増殖と較べて、激しく損なわれることから、グループ１に分類された。ＫｙＡｎ１０２９とＫｙＡｎ１４１１は両方とも、３７℃（図４）と３９℃（表３）において増殖阻害を示した。グループ２に分類されたウイルス（表３）は、ＫｙＡＩｎ１４１１以外は、いくらかの増殖阻害は見られたものの３９℃で増殖した。ＫｙＡＩｎ１４１１は、３３℃、３７℃、及び３９℃で、野生型ＥＨＶ−１と外見上同程度に増殖することができた。
【００９９】
【表３】
2004512826.tif 000004
（実施例６）
選抜されたウイルス変異株の分子的表現型
ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡΔＳＲＴ２、及びＫｙＡｄ６４４／８２４という、いくつかのウイルス変異株を選抜して、それらの分子的表現型を特定するための実験を開始した。
【０１００】
これらの変異型ウイルスの欠損を遺伝子発現のレベルで特徴づけるため、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法（ＲＰＡ）を行なった。ＲＰＡの感度なら、ＩＥ遺伝子、ＥＩＣＰ０遺伝子（後期遺伝子の発現において重要な初期補助制御因子の遺伝子）、及びグリコプロテインＤ（ｇＤ）遺伝子（ウイルス複製に必須の重要な後期遺伝子）の発現レベルの違いを識別できるはずである。ＲＫ−１３細胞を疑似感染させるか、野生型ＥＨＶ−１、ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡΔＳＲＴ２、またはＫｙＡｄ６４４／８２４をＭＯＩ１０で感染させた。感染後、所定の時間（３、５、９時間後など）に細胞を回収し、製造業者のプロトコール通りにトリゾール試薬（ＴＲＩＺＯＬ　ＲＥＡＧＥＮＴ）（ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、全ＲＮＡを単離した。ＲＰＡを行なうには、製造業者の指示通りにＲＩＢＯＱＵＡＮＴ　ＲＮＡＳＥ保護アッセイ装置（ＲＩＢＯＱＵＡＮＴ　ＲＮＡＳＥ　ＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ　ＡＳＳＡＹ　ＳＹＳＴＥＭ）（カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にあるファルミンゲン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を利用した。各ＲＰＡ反応につき、全ＲＮＡの約２０μｇを用いた。ＲＰＡ解析用プローブは、プロメガ社（ウィスコンシン州マディソン）のリボプローブ・インビトロ転写装置（ＲＩＢＯＰＲＯＢＥ　ＩＮ　ＶＩＴＲＯ　ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ　ＳＹＳＴＥＭ）を用いて作成した。ＩＥプローブ用には、プラスミドｐＧ３ＩＥをＢａｍＨＩで制限酵素消化して、ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写物を作成した。プラスミドｐＧ３ＩＥは、４，７７３−塩基対のＩＥ　ＯＲＦ全部を含むＮｈｅＩ／ＤｒａＩ断片を、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＸｂａＩ／ＳｍａＩ部位にクロニーングして構築された。制限酵素消化されたｐＧ３ＩＥプラスミドをフェノール−クロロフォルム抽出法及びエタノール沈殿法によって精製し、約１μｇのプラスミドを用い、製造業者の指示に従って、リボプローブを作成した。ＥＩＣＰ０特異的プローブには、プラスミドｐＧＥＭＩＣＰ０Ｋ（Ｂｏｗｌｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４９０４−４９１４，１９９７；Ｂｏｗｌｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１２００−１２０８，２０００）をＮｈｅＩで制限酵素消化し、ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写物を作成し、上記の通り精製した。グリコプロテインＤ特異的プローブには、プロメガのリボプローブ・インビトロ転写装置を用いて、プラスミドｐ７２Ｄ３９２（Ｚｈａｎｇら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．５６：１１−２４，１９９８）を直接転写した。モレキュラーダイナミクス社（カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））の分子動力学ホスフォイメージ装置（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＤＹＮＡＭＩＣＳ　ＰＨＯＳＰＨＯＩＭＡＧＥＲＹ　ＳＹＳＴＥＭ）を用いて、ｍＲＮＡ量を定量した。
【０１０１】
遺伝子発現レベルを表４にまとめた。ＲＰＡによるＫｙＡｄ６４４／８２４の解析結果は、その遺伝子発現が、すべての時点において、野生型ＥＨＶ−１のレベルと同程度であることを示した。これらのデータは、ＫｙＡｄ６４４／８２４の力価が、野生型ＥＨＶ−１の力価と同程度であるとの、増殖曲線解析から得られた結果と一致する。しかし、ＫｙＡｎ１０２９、ＫｙＡｎ１４１１、及びＫｙＡΔＳＲＴ２を感染させたＲＫ−１３細胞におけるこれらの代表遺伝子の発現を調べたところ、これらのウイルス転写産物量が、特に感染後期の時点で減少することが明らかになった。ＫｙＡｎ１０２９に感染した細胞におけるＩＥ遺伝子の発現は、感染してから３時間後と５時間後で変化しないのに対し、感染９時間後のＩＥ　ｍＲＮＡ量は、ほぼ３倍減少した。さらに、ＫｙＡｎ１０２９感染細胞においては、調査したすべての時点でＥＩＰＣ０ｍＲＮＡの合成が低下し、ここでも、ＩＥタンパク質のカルボキシル末端が、この制御タンパク質の完全な活性に重要であることを示唆していた。また、ｇＤ　ｍＲＮＡ合成が感染の後期に３倍以上低下したことからも明らかなように、ＥＩＣＰ０遺伝子発現の低下は、後期遺伝子の発現に大きな影響を与えた。ＲＰＡによるＫｙＡΔＳＲＴ２の遺伝子発現解析結果は、ＳＲＴ領域の欠失が、ＩＥ遺伝子の発現には影響しないことを明確に示したが、ＥＩＣＰ０及びｇＤ遺伝子とも、感染９時間後には、ほとんど検出できない程度にまで発現が低下した。初期遺伝子及び後期遺伝子の両方の発現に欠陥があると、ウイルスに回復不能な障害を与えるため、ＫｙＡΔＳＲＴ２ウイルスは、ＲＫ−１３細胞の中で増殖できなくなった。
【０１０２】
【表４】
2004512826.tif 000005
（実施例７）
マウスにおける変異型ウイルスの試験
変異型ウイルスＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡｉｎ１４１１、及びＫｙＡＥ３４Ｑをマウスで試験した。
【０１０３】
３〜６週齢のメスのＣＢＡ（Ｈ−２ｋ）マウスをインディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）にあるハーラン・スプレーグ・ドーリー社（Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ）、またはメイン州バーハーバー（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）にあるジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手した。マウスは、シュリーブポート（Ｓｈｒｅｖｅｐｏｒｔ）にあるルイジアナ州立大学メディカル・センターの動物資源施設（Ａｎｉｍａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｏｕｉｓｉａｎａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ）において、上部がフィルターになったケージの中で飼育された。マウスはすべて、使用前最低一週間は静置した。
【０１０４】
マウスをハロタン（ミズーリ州セントルイスにあるシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．））で麻酔して、２×１０６ＰＦＵのＥＨＶ−１　ＫｙＡまたは変異型ウイルスを５０μｌ鼻腔内（ｉ．ｎ．）接種した。対照マウスには、５０μｌの培地のみを投与した。
【０１０５】
弱毒化
免疫したマウスを毎日観察して、例えば、Ｃｏｌｌｅら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．４３：１１１−１２４（１９９６）、及びＺｈａｎｇら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．５６：１１−２４（１９９８）に記載されているような、例えば、毛の逆立ち、体重減少、強制呼吸、嗜眠、及び群居など、ＥＨＶ−１感染症の臨床症状が見られないかを調べた。試験した４種類の変異型ウイルスのいずれに感染したマウスも、何ら臨床疾患を示さなかった。
【０１０６】
また、接種後２日、５日、８日目に、ＲＫ−１３細胞単層上のプラーク密度によって、肺に存在するウイルス量を測定した。Ｃｏｌｌｅら（１９９６）、及びＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５３６６−５３７２（１９９８）に記載された通りに、ウイルスを肺から単離した。
【０１０７】
ＣＴＬ反応
主要なＣＴＬ反応を測定するために、接種後５日目に、縦隔リンパ節（ＭＬＮ）からリンパ球を単離し、また、６０ゲージのワイヤーメッシュ網でリンパ組織を圧迫して、単細胞の懸濁液を得た。リンパ球を洗浄して、１２ウェル平底プレート（ニューヨーク州コーニングにあるコーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．）中、５％ＦＣＳ、２０μＭメルカプトエタノール、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、及び抗生物質を含む完全ＲＰＭＩ　１６４０（Ｓｉｇｍａ）培地で５％ＣＯ２下３７℃で３日間培養した（１ウェル当たり１０７細胞）。９６ウェルのＶ底プレート（デンマークにあるヌンク社（Ｎｕｎｃ））の中で、１０４個の５１Ｃｒ−標的した、感染または非感染の標的ＬＭ細胞に対して、さまざまなエフェクター対標的の割合で、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイ法により細胞溶解活性を測定した。
【０１０８】
図５Ａ〜５Ｃに示されている通り、調査した４種類の変異型ウイルス、ＫｙＡｄ６４４／８２４、ＫｙＡｎ１４１１、ＫｙＡｉｎ１４１１、及びＫｙＡＥ３４Ｑはすべて、親株であるＫｙＡウイルスによって誘導されるのと同程度のＣＴＬ反応を誘導した。
【０１０９】
メモリーＣＴＬ反応を測定するために、上記した通りにマウスを感染させて、２〜２６週間飼育した。脾臓組織を６０ゲージのワイヤーメッシュ網で圧迫し、３７℃でトリス緩衝０．８３ＮＨ４Ｃｌに短時間曝露して、赤血球を溶解させた。次に、得られたリンパ球を、Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：２３４−２５２（１９９１）に記載されているようにして、マイトマイシンＣで処理した３×１０５の刺激細胞存在下、１２ウェル平底プレート中で５日間、５％ＣＯ２下３７℃で完全ＲＰＭＩ　１６４０培地において培養した（１ウェル当たり１０７細胞）。刺激細胞は、後期ウイルス遺伝子産物を発現させるためにＥＨＶ−１　ＫｙＡを感染効率１０で１８時間感染させたＬ−Ｍマウス線維芽細胞である。１０４個の５１Ｃｒ−標的した、感染または非感染の標的ＬＭ細胞に対する、標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイ法により、９６ウェルのＶ底プレート（デンマークにあるヌンク社（Ｎｕｎｃ））の中で細胞溶解活性を測定した。
【０１１０】
免疫したマウスの血清中のＥＨＶ−１特異的抗体
免疫した対照マウスから血清試料を採取して、中和抗体（ｎＡｂ）の存在量を測定した。簡単に説明すると、血清を５６℃で１時間加熱して補体を不活性化した後、連続的に２倍希釈した血清（１：２０から１：１０２８）を３×１０３ｐｆｕのＥＨＶ−１　ＫｙＡとともに３７℃で１時間インキュベートした。ＲＫ−１３細胞単層上でプラークアッセイ法によって、感染性ウイルスについて、各試料を３回反復して測定した。ｐｆｕの５０％低下をもたらす血清の希釈度で最も高いものの逆数としてｎＡｂの力価を測定した。免疫前の血清を対照として用いた。
【０１１１】
ＥＨＶ−１特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）
抗原投与後所定の日にマウスを殺し、肺、ＭＬＮ、及びＣＬＮを取り出して、ＥＬＩＳＰＯＴ測定法によってＡＳＣの分布範囲を測定した。肺組織から単細胞懸濁液を作成するには、はさみで組織を切り刻んでから、６０ゲージの網で圧迫した。遠心分離後、１０ｍｌのコラゲナーゼ型Ｌ／デオキシリボヌクレアーゼＬ溶液（２５０：５０Ｕ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に細胞を懸濁し、振とう器に入れて３７℃で９０分間インキュベートした。そして、トリス緩衝した０．８３％のＮＨ４Ｃｌ溶液３ｍｌによって３７℃で５分間処理して、血液細胞を溶解させた。細胞は、５％仔ウシ血清と抗生物質を添加したダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ−５）に再懸濁した。ＭＬＮ及びＣＬＮから単細胞懸濁液を作成するには、余計な処理を行なうことなく、６０ゲージの網で組織を圧迫した。脾臓から単細胞懸濁液を作成するには、脾臓組織を６０ゲージの網で圧迫して、前記したように、トリス−ＮＨ４Ｃｌで処理した。
【０１１２】
ＥＬＩＳＰＯＴ測定法
簡単に説明すると、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＥＨＶ−１　ＫｙＡ感染細胞溶解液（１０〜２００μｇ／ｍｌ）で、ニトロセルロース製の９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ−ＨＡ；マサチューセッツ州ベドフォードにあるミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を被覆し、加湿チャンバー内において４℃で一晩インキュベートするか、３７℃で２時間インキュベートした。被覆されたプレートは、使用時まで４℃で保存した。各実験測定ごとに、コーティング用緩衝液（ＰＢＳ）を捨て、プレートをＰＢＳで濯いで３回洗浄した。残った結合部位の可能性がある部位を、ＰＢＳ中５％ウシ胎児血清、またはＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（（ミズーリ州セントルイスにあるシグマケミカル社）によって、３７℃で３０分間飽和させた。さらに洗浄した後、ＤＭＥＭ−５の中で適当な濃度（１０３〜１０６細胞／ウェル）になるようリンパ球を希釈してから、被覆プレートに加えた。Ｂ細胞の非特異的活性化因子として、リポポリサッカライド（ＬＰＳ、５μｇ／ｗｅｌｌ；カリフォルニア州ラホヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にあるカルバイオケム−ノババイオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を加えた。また、この測定法では、非感染細胞の対照用プレートも使用し、ＥＨＶ−１感染細胞のプレートと同じように処理した。
【０１１３】
細胞は、５％ＣＯ２下３７℃で３〜４時間インキュベートした後、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで洗浄して廃棄した。１００ｍｌのアルカリホスファターゼ結合抗体を各ウェルに加えてから、プレートを加湿チャンバー内で室温下２〜３時間インキュベートした。徹底的に洗浄した後、製造業者の指示に従って、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、及びニトロブルー・塩化テトラゾリウム（ＮＢＴ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を基質として加えて、青色になるまで５〜３０分間置いて、ＥＨＶ−１特異的ＡＳＣに対応するスポットを可視化した。ニトロセルロース膜を水で数秒間洗浄して、反応を停止した。２〜２４時間後に、光学顕微鏡下低倍率（１０〜３０倍）でＥＨＶ−１特異的ＡＳＣの数を数えた。
【０１１４】
防御免疫の誘導
免疫したマウスをハロタン（ニュージャージー州リバーエッジ（Ｒｉｖｅｒ　Ｅｄｇｅ，ＮＪ）にあるハロカーボン・ラボラトリーズ社（Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で軽く麻酔してから、ＰＢＳで２×１０６ｐｆｕに希釈した病原性ＥＨＶ−１株（全量５０μｌ／マウス）を鼻腔内に接種した。
【０１１５】
マウスを毎日観察して、毛の逆立ち、体重減少、強制呼吸、嗜眠、及び群居など、ＥＨＶ−１感染症の臨床症状が発生していないかを調べた。
【０１１６】
さらに、ウイルス投与したマウスの肺におけるウイルス量を測定した。投与後２日目、５日目、及び１０日目にウイルスを投与した動物から肺を分離した。以前、Ａｗａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１１３１−１１４０（１９９０）によって記載されているとおりに、マウス肺組織からウイルスを回収した。２ｍｌのホイートン社ドウンス型（Ｗｈｅａｔｏｎ　Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーを用いて、１ｍｌのイーグル最小必須培地の中で組織をホモジナイズした。次に、超音波処理装置（ニューヨーク州ファーミンデール（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）にあるヒートシステムズ−ウルトラソニックス社（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）の中で各試料を１分間超音波破砕してから、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞残滓を取り除いた。ＲＫ細胞上でプラーク測定法によってウイルスを定量するまで、試料は−７０℃で保存した。ＳｉｇｍａＳｔａｔソフトウエア（カリフォルニア州サンラファエル（Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）にあるジャンデル社（Ｊａｎｄｅｌ，Ｃｏｒｐ．））を用いて、統計解析を行なった。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＥＨＶ−１ゲノムの構造と前初期遺伝子の位置を示す。ＥＨＶ−１ゲノムの概略を上図に示す。図の下部にＩＥタンパク質（１，４８７アミノ酸）の機能的ドメインを示す：トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ、ａａ３〜８９）、セリンリッチドメイン（ＳＲＴ、ａａ１８１〜２２０）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ、ａａ４２２〜５９７）、核移行シグナル（ＮＬＳ、ａａ９６３〜９７０）。
【図２】
図２はＩＥ遺伝子に変異を生じさせるための組換え系を示す。左図：コンストラクトｐＩＥカセットは、ＩＥ遺伝子の５’側部位を含んでいる。一箇所しかないＮｃｏＩ及びＮａｅＩ制限酵素部位によって、３〜８９番目のアミノ酸を含む変異ＴＡＤをコードする配列のクロニーングが容易になる。右図：コンストラクトｐＢＲ３２２ＩＥは、ＩＥのＯＲＦ全域を含む。変異ＴＡＤを含む、さまざまなｐＩＥカセットコンストラクトから得られたＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ断片を簡単にｐＢＲ３２２ＩＥにクロニーングして、ＩＥタンパク質の変異型をコードするＯＲＦを再構築した。または、野生型配列をさまざまな変異配列で置き換えて、さまざまなドメインを交換した。このベクターを用いて、組換えウイルスを作出した。組換えプラスミドをＩＥ１３．１細胞に形質移入し、移入してから２４時間後にＫｙＡΔＩＥを重感染させた。上清をＲＫ−１３細胞上でスクリーニングして、補完ＩＥタンパク質不在下で増殖可能なウイルスを調べた。
【図３】
図３はＥＨＶ−１変異株のウエスタン解析結果を示す。図Ａ、感染効率（ＭＯＩ）１０でＥＨＶ−１のＫｙＡ（レーン１）、ＫｙＡｄ６４４／８２４（レーン２）、ＫｙＡｎ１４１１（レーン３）、またはＫｙＡＩｎ１４１１（レーン４）に感染したＲＫ−１３細胞から得られた感染細胞抽出物（ＩＣＥ）。ＩＣＥにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク質をニトロセルロース上にブロットし、ポリクローナル抗ＩＥペプチド抗体で染色した。レーン１、３、及び４では、ＩＥタンパク質に相当する２００−ｋＤａのバンドがはっきりと検出された。ＫｙＡｄ６４４／８２４に感染した細胞から得られた１７５−ｋＤａのバンドがレーン２に見える。図Ｂ：レーン１は、ＥＨＶ−１　ＫｙＡに感染したＲＫ−１３細胞の核抽出物において検出された２００−ｋＤａのＩＥタンパク質のバンドを示している。レーン２は、ＫｙＡｎ１０２９に感染したＲＫ−１３細胞の核抽出物で検出された１３８−ｋＤａのＩＥタンパク質のバンドを示している。
【図４】
図４は選択されたＩＥ変異ウイルスの増殖解析結果を示す。ＲＫ−１３細胞に野生型ＥＨＶ−１　ＫｙＡまたは選ばれたＥＨＶ−１　ＩＥ変異ウイルスを感染効率１で感染させ、ウイルスを付着させるため、５％ＣＯ２中３７℃で１時間インキュベートした。付着後、ＦＢＳ無添加のイーグル培地で細胞を３回洗浄して、付着しなかったウイルスを除去し、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。付着期間後所定の時間に、ＲＫ−１３細胞を用いたプラークアッセイ法によって、培養上清中のウイルス力価を測定した。
【図５】
図５Ａ〜５Ｃは、野生型ＥＨＶ−１、またはＩＥ遺伝子に変異をもつＥＨＶ−１によって免疫されたＣＢＡマウスから単離したリンパ球のＣＴＬ活性を解析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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