(57)【要約】【構成】本発明は、一般式ＡＢ（Ｔ）の免疫活性組成物に関する。なお、ＡＢは上皮標的細胞、特に脈絡叢細胞上のレセプター部位に結合する抗原、成長因子などであり、そしてＴは、標的細胞の活性に作用する部位、例えば毒素または薬剤であり、一つかそれ以上の化学的結合によって部位ＡＢに付着する。この免疫活性物質は上皮細胞に選択的に付着し、この細胞によって次に部位Ｔが吸収されるため、他の細胞に作用する恐れは小さい。本発明はまた、ＣＳＦ循環系に注入またはインフュージョンによって免疫活性物質を投与し、免疫活性物質の投与および作用を局在化することによって、水頭症の治療時に上皮細胞、特に脈絡叢細胞からのＣＳＦ生成を調節するこれら細胞を治療する方法を提供する。本免疫活性物質は、他の上皮細胞の治療、例えば脳下垂体細胞、腎細胞および眼細胞の治療にも適用することができる。
2004529128.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫活性物質の活性成分として使用するのに好適な組成物で、次の一般式で表されることを特徴とする組成物。
ＡＢ（Ｔ）
ここでＡＢは上皮脈絡叢細胞の表面に発現されたエピトープに結合できる抗体、インターロイキンまたは成長因子、あるいはこれらのフラグメントであり、Ｔはこの細胞によって吸収され、かつこの細胞の活性に作用する部位であり、そして（）は部位ＡＢおよび部位Ｔとの間の付着を示す。
【請求項２】
上記部位ＡＢが次のエピトープＩｇＧ、ＧＦＡＰ、ＨＭＦＧ１、ＴＴＲ、ＺＯ−１、サイトケラチン、カドヘリンファミリー、カテニンファミリー、ビメンチンファミリー、ＳＶ４０、ＥＭＡ、ＧＡ７３３−２Ｅ、ガレクチンファミリー、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥＧＰ４０、ムチンファミリー、ＣＤ４４、クラウジンファミリー、レクチンファミリー、Ｆａｓ、カルボヒドレートＡｇファミリー（ＣＡ１９−９、Ｌｅ（Ｙ））、Ｎａ／ＫＡＴＰアーゼ、Ｓｐａｎ−１、ＫＭＯ−１、ヒト乳脂肪グロブリン、分泌成分、ＢｅｒＥＰ４、ＨＥＡ１２５、上皮糖タンパク−２（ＥＧＰ−２）、ＥＧＦ、Ｔｈｙ１．１、神経細胞接着分子、神経芽細胞成長因子、表皮成長因子、神経栄養性成長因子、ｅｒｂＢ２、インターロイキンまたはＭＤＲのうち１種かそれ以上に対する抗体または成長因子である請求項１の組成物。
【請求項３】
上記抗体が次のエピトープＥＭＡ、Ｎａ／ＫＡＴＰアーゼ、ＨＭＧＧ１、Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、ＥＧＦおよび/またはＭＤＲに対する抗体である請求項１の組成物。
【請求項４】
上記抗体部位ＡＢをそのフラグメント化形態として使用する請求項１または３の組成物。
【請求項５】
上記部位ＡＢのフラグメント化形態がＦａｂおよび/またはＦａｂ´である請求項４の組成物。
【請求項６】
上記部位Ｔについて、上皮細胞に対する毒素、放射性ヌクレオチド、または上皮細胞の活性を一時的に変異させる薬剤から選択する請求項１〜５のいずれか１項の組成物。
【請求項７】
上記部位Ｔが、ウイルス、アセタゾルアミド、ベラパミル、カルシウムアゴニスト、カルシウムアンタゴニスト、チクラセル、全リシン、Ａ鎖リシン、ボツリヌス、シュードモナス外毒素、抗ＣＤ２２−Ａ、サポリン、あるいはこれらの混合体、前駆体または誘導体である請求項６の組成物。
【請求項８】
上記（）が、部位ＡＢと部位Ｔとの間の化学的結合を表す請求項１〜７のいずれか１項の組成物。
【請求項９】
上記結合が、チオエーテル結合による結合である請求項８の組成物。
【請求項１０】
上記付着が、中間架橋成分による付着である請求項１〜９のいずれか１項の組成物。
【請求項１１】
上記中間成分が、ＳＳＰｙ、ＳＰＤＰまたはＳＭＴＰである請求項１０の組成物。
【請求項１２】
上記部位ＡＢとＴとが、０．５：１〜２：１のモル比で存在する請求項１〜１１のいずれか１項の組成物。
【請求項１３】
実質的に実施例に記載したものからなる請求項１の組成物。
【請求項１４】
注入またはインフュージョンによって哺乳類に投与できる水性組成物として調製した請求項１の組成物。
【請求項１５】
部位ＡＢと部位Ｔとを反応させ、これら両部位間にスルフィド結合またはチオエーテル結合を形成する請求項１〜１４のいずれか１項の組成物を製造する方法。
【請求項１６】
ＳＭＴＰを使用して上記部位ＡＢを誘導し、ＤＤＴを使用して上記部位Ｔを還元し、生成物を反応させて、これら部位ＡＢおよびＴを結合するジスルフィド結合を形成する請求項１５の方法。
【請求項１７】
チオール基がすでに存在していない場合に上記部位ＡＢにこのチオール基を導入し、上記部位Ｔをアルキル化し、生成物を反応させて、これら部位ＡＢおよびＴを結合するチオエーテル結合を形成する請求項１５の方法。
【請求項１８】
実質的に実施例に記載した方法からなる請求項１５の方法。
【請求項１９】
特異的なエピトープを発現する標的上皮細胞の作用が関与する哺乳類の疾病疾患を治療する方法において、
（ｃ）薬理学的に有効な量の免疫活性物質を標的細胞に投与し、
（ｄ）この免疫活性物質が標的細胞の活性に作用する成分を含有し、そしてこの成分自体が、標的細胞が発現するエピトープに付着する抗体、インターロイキンまたは成長因子であるか、あるいはこの成分が上記抗体、インターロイキンまたは成長因子に付着したものであり、これによって、上記免疫活性物質を標的細胞に選択的に付着させ、かつ上記成分を標的細胞に吸収させることを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
上記標的細胞が、上皮脈絡叢細胞で、そして上記免疫活性物質が、この細胞からのＣＳＦの生成を一時的に変更するように作用する請求項１９の治療方法。
【請求項２１】
上記免疫活性物質が、標的細胞に対する毒素、放射性ヌクレオチドおよび/または薬剤またはこれらの混合体を含有する請求項１９または２０の治療方法。
【請求項２２】
上皮細胞に特異的なエピトープを一つかそれ以上発現するこの上皮細胞が関与する哺乳類における疾病疾患を治療する方法において、
哺乳類に、薬理学上有効な量の、抗体、成長因子またはこれらのフラグメントからなる免疫毒素を投与し、上皮細胞に対する毒素をこの免疫毒素に付着させ、この付着毒素を、上皮細胞の表面に発現する上記エピトープに選択的に付着させることを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
上記免疫活性物質が、請求項１〜１４のいずれか１項の組成物である請求項１９または２２の治療方法。
【請求項２４】
上皮脈絡叢細胞からのＣＳＦ生成を調節する治療である請求項１９〜２３のいずれか１項の治療方法。
【請求項２５】
上記免疫活性物質を水性組成物として調製し、患者のＣＳＦの循環系に注入またはインフュージョンによって投与する請求項１９〜２３のいずれか１項の治療方法。
【請求項２６】
上記標的細胞が、脳下垂体細胞である請求項１９〜２５のいずれか１項の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は方法および組成物に関し、特に哺乳動物の脳における疾病疾患を治療する方法、およびこの方法に使用する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
人や他の哺乳動物の脳は、脳脊髄液（ＣＳＦ）に包まれている。このＣＳＦは大部分が脳室（側脳室、第３脳室および第４脳室）内に位置する脈絡叢によって生成される。既に確立している理論によれば、ＣＳＦは脳室系を循環してから、第４脳室から脊髄管を通って頭蓋に再流入する。次に、ＣＳＦはくも膜下スペース内の脳表面上を通り、静脈系に吸収される。
【０００３】
研究によれば、成人は１時間にほぼ２０ｍｌｓのＣＳＦを生成する。健康な状態では、ＣＳＦの生成と吸収とはバランス（ＣＳＦ動力学）がとれているため、頭蓋内圧力は正常の範囲内に維持される。
【０００４】
脳はリンパ系がなく、ＣＳＦの脈絡叢外生成の多くは、ＣＳＦ流路内に排出される細胞外流体による。ヒトの場合、この脈絡叢外生成は、脳周囲に循環しているＣＳＦの10〜30％を構成していると考えられている。
【０００５】
ＣＳＦ動力学が変化する多くの原因があり、代表的な原因は脳水腫(水頭症)である。脳水腫の場合、ＣＳＦが蓄積する結果、脳室系が膨張するため、頭蓋内圧が高くなる。現在、脳室系からＣＳＦを身体の末端にある部位、通常は腹部にＣＳＦを排出する皮下管であるＣＳＦシャント装置を使用して、過剰なＣＳＦを排液し、頭蓋内圧を解放している。この装置が出現する前は、脳水腫は致命的な疾病で、予後がよくても、通常重い障害が残っていた。
【０００６】
シャント装置の使用は脳水腫の治療に革命をもたらしたが、新しくシャントを挿入した場合、そのうちの３０〜４０％は挿入第１年目に見直しが必要であり、また５〜１０％は感染により外す必要がある。米国では、毎年約１２５，０００人のシャント患者が発生し、コストは１億ドルである。従って、脳水腫を治療するために、このようなコストが高く、結果がそれ程思わしいものではない方法の非外科的代替治療法が求められている。
【０００７】
本発明者は、シャント装置に代わり得る非外科的治療を提供できる方法および組成物を発明した。
【０００８】
脈絡叢は、上皮性質をもち、従って上皮細胞を呈する脳下垂体を別にすれば、脳柔組織の他の細胞とは異なるものであることが知られている。このような細胞は、特異的な抗原またはレセプター部位、例えば成長因子、あるいは脳下垂体ホルモンの場合には、レセプター部位を細胞表面に発現する。以下便宜上、このような抗原およびレセプター部位を一括してエピトープと呼ぶことにする。これらエピトープは、脳内において他の細胞によって発現されるエピトープとは異なっているが、これら事実は、脳水腫の治療には現在のところ利用されていない。本発明では、これらエピトープに選択的に結合する抗体または成長因子を利用して、この抗体または成長因子に付着する毒素やその他の成分を結合する。なお、上記の他の成分は次に標的細胞によって吸収され、この細胞の機能を変える。このように、上記成分は標的脈絡叢細胞に選択的に作用する。本発明者は、染色試験によって、上皮細胞に結合する抗体として上皮膜抗原（ＥＭＡ）に対する抗体を使用した場合、脳柔組織のどこにも染色がほとんど見られないことを確認し、さらに抗体結合の選択性を確認した。これにより、脳内の上記他の成分と他の細胞との間の副反応が発生する恐れが少なくなる。さらに、上記他の成分をＣＳＦ循環系内に直接投与できるため、脈絡叢細胞領域において毒素または他の成分を局在化できる。従って、毒素やその他の成分の活性を局在化し、その作用を身体全体に分散させない。さらに、ＣＳＦに免疫毒素を投与するため、毒素などが肝臓に達することはほとんどなく、所望の位置にとどまり、免疫毒素を静脈投与した場合と異なり、分解することもなく、また排泄されることもない。
【０００９】
例えば、ｔｈｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｙ  Ｖｉｔｅｔｔａ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ  ｉｎＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２、１９９１、ｐｐ４７−５８に記載されているように、毒素を抗体または成長因子に付着させ、ガン細胞が発現するエピトープに抗体または成長因子を付着させることによってガン腫瘍細胞治療用毒素を生成することが提案されている。ところが、このような治療には、毒素を担持する抗体または成長因子が目的の標的細胞以外の細胞に付着することが多い問題があり、また静脈投与された免疫毒素が血流によって肝臓に運ばれ、ガン細胞に作用する前に、分解し、排泄される問題もある。さらに、肝臓に運ばれている間に、毒素が広範囲にわたる細胞に作用し、望ましくない副作用を起こす恐れもある。加えて、このような免疫毒素を繰り返し投与すると、患者に免疫反応が生じる問題もある。
【００１０】
本発明では、脳内の他の細胞に対する特異性とは逆の、上皮脈絡叢細胞が発現するエピトープに対する抗体または成長因子の特異性を利用して、抗体または成長因子が担持する成分を選択的に付着させ、標的細胞の作用を一時的に変える。
【００１１】
上皮脈絡叢細胞は、細胞表面に特異的なエピトープ、特にＥＭＡ、Ｎａ／ＫＡＴＰアーゼおよびＭＤＲを発現する。これらエピトープは他の脳組織には発現しない。脳下垂体の場合、特異的エピトープはホルモンエピトープである。
【００１２】
このように、エピトープにより脈絡叢細胞および脳下垂体の上皮細胞をユニークかつ特異的に外部から確認でき、従って脈絡叢細胞を他の脳組織から判別できる。細胞表面でこれらエピトープを特性化すると、これらエピトープを介して脈絡細胞に優先的に結合する抗体、インターロイキンまたは成長因子の型を同定できる。本発明者は、このようなエピトープに結合する一部の抗体、特にＭＤＲが脈絡叢細胞の活性に直接作用することを見出した。さらに、ある毒素を抗体、インターロイキンまたは成長因子に付着させ、免疫毒素を生成すると、これが、脈絡叢細胞を選択的に死滅させるか無力化し、ＣＳＦの生成を抑えることも見出した。脈絡叢細胞の表面に選択的かつ特異的に付着される免疫毒素を例えば脊髄内投与（すなわち、脳室または腰椎ＣＳＦ投与）、血管内投与または経口投与による脳水腫治療方法は、免疫毒素の投与に必要な手術を別にすれば、外科的治療を無用にするものである。
【００１３】
この治療方法は、治療薬などを上皮脈絡叢細胞に付着させ、例えばアルツハイマー患者のＣＳＦ生成が低下したときにＣＳＦ生成を刺激するためにも使用できると考えられる。このように、本発明は、広範囲にわたる疾病疾患におけるＣＳＦ生成を管理する方法を提供するものである。さらに、本発明は、脳以外に存在する他の上皮細胞にも適用可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
すなわち、本発明は、特異的エピトープを発現する標的上皮細胞の作用が関与する哺乳類における疾病疾患を治療する方法、特に哺乳類におけるＣＳＦの生成を調節する方法において、
ａ）標的細胞に薬理学的に有効な量の免疫活性物質を投与することから成り、
ｂ）上記免疫活性物質が、標的細胞の活性に作用する成分を含有し、この成分として、標的細胞が発現するエピトープに付着する抗体、インターロイキンまたは成長因子それ自体を使用するか、あるいはこの成分を上記抗体、インターロイキンまたは成長因子に付着させたものを使用することによって、上記免疫活性物質を標的細胞に選択的に付着させるとともに、上記成分を標的細胞に吸収させることを特徴とする治療方法を提供するものである。
【００１５】
標的細胞としては、上皮脈絡叢細胞が好ましく、また抗体、インターロイキンまたは成長因子に付着させる成分としては、標的細胞に対する毒素、放射性ヌクレチオドまたは医薬品が好ましい。
【００１６】
なお、免疫活性物質とは、一つかそれ以上の抗体、インターロイキンまたは成長因子、あるいはこれらの活性フラグメントを含有する物質を意味する。免疫活性物質は、標的上皮細胞が発現するエピトープに付着し、この細胞の活性に作用する成分を付着するものである。すなわち、免疫活性物質としては、例えば、上皮細胞の活性に対して調節作用をもち、かつ標的細胞を死滅あるいは無力化できるカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤がある。いくつかの形態の抗体、特にＭＤＲはそれ自体標的細胞の活性に所望の作用を示すが、使用する抗体または成長因子には、標的細胞に所望の作用を与えるか、この作用を強化する成分を担持するのが好ましい。このような成分としては、細胞を無力化あるいは死滅させるＡ鎖リシンおよび/または全リシン（ＩＴ−Ｒ）などの毒素が好ましい。以下便宜的に、このような毒素を付着させた抗体からなる免疫毒素を使用することを前提として本発明を説明する。
【００１７】
また、本発明は、上皮細胞に特異的なエピトープを一つかそれ以上発現するこの上皮細胞が関与する哺乳類における疾病疾患を治療する方法において、
哺乳類に、薬理学上有効な量の、抗体、成長因子またはこれらのフラグメントからなる免疫毒素を投与し、上皮細胞に対する毒素をこの免疫毒素に付着させ、この付着毒素を、上皮細胞の表面に発現する上記エピトープに選択的に付着させる方法を提供するものでもある。
【００１８】
上述したように、本発明の方法は、上皮細胞の作用が関与する広範な疾病疾患に適用することができる。治療適用例をあげれば、眼液生成細胞のナトリウム/カリウムポンプ作用の無力化による眼病、特に緑内障の治療；頭部負傷や良性頭蓋内高血圧の場合におけるＣＳＦ生成の低下；原発性脈絡叢腫瘍および類皮嚢腫や類表皮腫などの他の腫瘍の治療；髄膜腫、奇形腫、生殖細胞腫、頭蓋咽頭腫や中枢神経系に対する転移癌の治療である。下垂体腫瘍は上皮細胞をもち、そして本発明方法に使用するエピトープとして作用するホルモンレセプターをもつことも多い。ＭＤＲ抗原を発現する上衣細胞腫も、本発明方法を使用して治療することができる。本発明は、また、腎臓組織、例えば腎臓腫瘍の治療にも適用することができるが、本発明の重要な適用用途は、上皮脈絡叢細胞の活性によってＣＳＦ生成を加減し、これによってＣＳＦを調節する用途である。というのは、免疫活性物質の好適なＣＳＦ循環系投与方法は、この用途において特に有効であるからである。この好適な投与方法を前提にして、以下、本発明を説明する。
【００１９】
本発明に使用する免疫活性物質は新規物質と考えられる。従って、本発明は、本発明方法に免疫活性物質として使用するのに好適な組成物であって、以下の一般式で表される組成物を提供するものでもある。
ＡＢ（Ｔ）
ここでＡＢは上皮脈絡叢細胞の表面に発現されたエピトープに結合できる抗体、インターロイキンまたは成長因子、あるいはこれらのフラグメントであり、Ｔはこの細胞によって吸収され、かつこの細胞の活性に作用する部位であり、そして（）は部位ＡＢおよび部位Ｔとの間の付着を示す。
【００２０】
上述したように、脈絡叢細胞は、上皮細胞に対して特異的な表面に特異的なエピトープを発現する細胞である。これらエピトープには、ＩｇＧ、ＧＦＡＰ、ＨＭＦＧ１、ＴＴＲ、ＺＯ−１、サイトケラチン、カドヘリンファミリー、カテニンファミリー、ビメンチンファミリー、ＳＶ４０、ＥＭＡ、ＧＡ７３３−２Ｅ、ガレクチンファミリー、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥＧＰ４０、ムチンファミリー、ＣＤ４４、クラウジンファミリー、レクチンファミリー、Ｆａｓ、カルボヒドレートＡｇファミリー（ＣＡ１９−９、Ｌｅ（Ｙ））、Ｓｐａｎ−１、ＫＭＯ−１、ヒト乳脂肪グロブリン、分泌成分、ＢｅｒＥＰ４、ＨＥＡ１２５、上皮糖タンパク−２（ＥＧＰ−２）、Ｔｈｙ１．１抗原、神経細胞接着分子などの抗原および成長因子レセプター部位；および神経芽細胞成長因子、表皮成長因子レセプター、神経栄養性成長因子/レセプター、ｅｒｂＢ２−レセプターなどの成長因子レセプター部位がある。エピトープとしては、インターロイキンレセプターであってもよい。
【００２１】
病的状態では、一部の異型エピトープが発現したり、あるいは上皮細胞表面に発現した典型エピトープの相対的割合が正常な状態とは異なる場合がある。この場合には、このような異型発現を特性化し、そのペプチド鎖上の反応性部位の特性を同定し、これによって本発明方法においてこれらに結合する抗体の型を同定することが望ましい。エピトープの特性化は、適当な任意の方法を利用して行なうことができる。例えば、通常利用されているバイオプシーによって、あるいは脳室系のＣＦＳをサンプリングし、サンプルの反応性部位を適当な方法によって、例えば細胞培養液のサンプルまたはその抽出物をクロマトグラフィーカラムで処理するなどによって検定し、これによって患者から脈絡叢細胞のサンプルを採取すればよい。
【００２２】
以下便宜上、上皮脈絡叢細胞が単一発現エピトープをもち、このエピトープに単一の免疫活性物質が付着することを前提として本発明を説明する。特に、免疫物質が付着するレセプター部位としてエピトープＩｇＧ、ＥＭＡ、Ｎａ／ＫＡＴＰアーゼおよび/またはＭＤＲを使用するのが好ましい。
【００２３】
本発明では、抗体および/または成長因子および/またはインターロイキン部位ＡＢを使用し、部位Ｔを上皮細胞のエピトープに付着する。ＡＢ部位は、適当な任意の抗体から選択するが、部位ＡＢは例えばＥＭＡ、ＨＭＧＧ１、Ｅ−カドヘリン、βカテニンまたはＥＧＦに対する抗体を有するものである。本発明において特に好適な部位ＡＢは、ＥＭＡ抗原に対する抗体である。
【００２４】
所望ならば、部位ＡＢとして抗体または成長因子のフラグメントを使用することができる。このようなフラグメントは、そのサイズが小さいため、免疫毒素の作用を強化することが既に知られているからである。本発明に使用できる代表的なフラグメントには、Ｆａｂ´またはＦ（ａｂ´）がある。
【００２５】
所望ならば、部位ＡＢの混合体を使用することができ、またこのような部位の薬理学的に許容できる誘導体または前駆体を使用することもできる。この結果、例えば、免疫活性化合物の生成時に、その場で目的の部位ＡＢを生成することができる。
【００２６】
部位ＡＢとして好適に使用できる多くの抗体、インターロイキンまたは成長因子はいずれも天然、合成を問わず市販され、本発明に市販品の形態でそのまま使用できる。
【００２７】
免疫活性物質の部位Ｔは、例えば免疫活性物質の部位Ｔ部分を標的細胞の表面に発現する糖タンパク質または糖脂質と結合し、細胞壁を介して部位Ｔまたはその活性成分を吸収することによって、細胞に吸収される広範囲の物質から選択できる。上述したように、部位Ｔは細胞を無力化または死滅すればよく、例えばウイルス、全リシンまたはＡ鎖リシンであればよい。あるいは、細胞のＣＳＦ生成を増強するか、または細胞内のイオンチャンネル、例えばＮＡ／Ｋチャンネルまたは関連チャンネル、塩化物チャンネルまたは各種のカルシウムチャンネルを妨害する薬物でもよい。このような薬物には、限定はしないが、アセタゾルアミド、ベラパミル、カルシウムアゴニスト、カルシウムアンタゴニストなどがある。また、部位Ｔは、他の手段によって、例えば放射性ヌクレオチドを部位Ｔとして使用する場合などのように細胞照射によって細胞の活性に作用する物質でもよいが、脈絡叢細胞を死滅または無力化する物質、例えば毒素であるリシン、ボツリヌス、シュードモナス外毒素、抗ＣＤ２２−Ａまたはサポリン、あるいは化学的抗癌剤またはチクラセルを使用するのが特に好ましい。このような毒素は天然毒素または合成毒素でもよく、その活性を増強するために、遺伝子的に修飾あるいはその他の手段で処理してもよい。
【００２８】
部位ＡＢおよび部位Ｔの代表例は、ペプチド分子またはその残基である。ペプチドの鎖が化学的結合またはその他の結合が生じる部位になる。部位ＡＢおよび部位Ｔは、任意の適当な方法によって相互に付着できる。従って、リシンの場合には、通常、付着は、例えば全リシンのＢ鎖を取りはずすことによって活性化しておくことができる全リシンのＡ鎖およびＢ鎖を結合するジスルフィド結合を介して行なう。このような方法はよく知られている方法であり、例えば、ＳＭＴＰを使用して部位ＡＢを誘導し、ＤＤＴを使用して部位Ｔを還元してから、これらを反応させて、これらを結合する鎖間結合を形成し、存在していない場合には、部位ＡＢにチオール基を導入するとともに、毒素部位Ｔにアルキル化機能を導入し、次にこれらを反応させてチオエーテル結合を形成する方法である。あるいは、部位ＡＢの遊離システイン残基、特にフラグメントＦａｂ／Ｆａｂ´を使用してもよく、この場合にはエルマン試薬を使用して部位Ｔに、ジスルフィド結合とのチオエーテル結合を形成すればよい。
【００２９】
なお、エピトープおよび/または部位ＡＢおよび/または部位Ｔが、直接相互に付着する反応性部位をもっていない場合には、不和合性物質を結合する架橋成分として作用するさらに別な物質を使用する必要が出てくることもある。このような架橋成分、例えばＳＳｐｙ、ＳＰＤＰ、ＳＭＴＰなどのヘテロ２官能基およびこれらの作用モードは既知であり、通常と同様に使用適用すればよい。
【００３０】
免疫活性物質を示す上記一般式の（）が意味する“付着”は、部位Ｔがエピトープによって担持され、そして部位ＡＢがエピトープによって担持されることを意味するが、いずれの場合も、この担持は相互反応性のある部位を介するか、あるいは中間架橋部位Ｌを介する化学的結合による担持である。なお、中間架橋部位Ｌは、部位ＡＢ、Ｔおよび/またはエピトープに適当な反応性部位がもともと存在していない部位を結合する好適な反応性部位になるものである。
【００３１】
免疫活性物質を生成する最適な方法および条件は、個々の部位の特性およびこれら部位間に形成する付着の特性に依存するもので、簡単な試行錯誤試験を行なってから、使用するのに最適な形態の部位を同定することによって簡単に決定できる。
【００３２】
免疫活性物質の代表的な部位ＡＢ／Ｔモル比は、０．５：１〜２：１、好ましくは約１：１であり、通常は、部位Ｔをモル比において過剰に、例えば１０〜１００％過剰で使用して、免疫活性物質を生成する。生成した免疫活性物質の過剰な部位Ｔについては、任意の適当な方法によって除去することができる。
【００３３】
生成した免疫活性物質は、媒体からた単離されていない形態で使用することができるが、任意の適当な方法によって免疫活性物質を単離精製するのが望ましい。これら方法のうち代表的なのは、遊離部位ＡＢを除去するブルーセファロースを使用するアフィニティークロマトグラフィーおよび高分子量物質および遊離毒素を除去するセファクリルＳ−２００ＨＲのゲルろ過である。
【００３４】
以下便宜上、媒体中で免疫活性物質を生成し、この媒体を免疫活性物質の患者への投与方法に好適な水性媒体その他の媒体中として調製し、この媒体から単離した免疫活性物質を前提として本発明を説明する。所望ならば、例えば凍結乾燥やトレハロース存在下での乾燥によって単離免疫活性物質を乾燥し、保存に好適で、患者に所定濃度で投与する水溶液または懸濁液として再構成するのに好適な乾燥製品を生成することができる。
【００３５】
所望ならば、免疫活性物質を含有する組成物に、免疫物質の性能を強化する他の成分を配合することもできる。例えば、免疫活性物質を、塩化アンモニウムやクロロキンなどのリソソーム向性アミンあるいはカルボン酸イオノホアと併用してもよい。
【００３６】
免疫活性物質を含有する好適な量の水性組成物を循環ＣＳＦ液に、例えば脳室または脊髄ＣＳＦに注入することによって、免疫活性物質を含有する組成物を患者に投与できる。あるいは、免疫活性物質は、経口投与、静脈投与、あるいは動脈間投与によって投与してもよいが、免疫活性物質の投与を治療すべき細胞付近に局在化するためには、ＣＦＳ循環系に直接注入することによって免疫活性物質を投与するのが好ましい。
【００３７】
各症状に応じて、最適な投与方法および投与量を容易に決定できる。なお、本発明者の知見によれば、通常、免疫活性物質の効果は投与量に直接関係している。投与量については、患者から良好な結果が得られるレベルまで、あるいは患者が免疫毒素に対して有害な副作用を示すレベルに達しないレベルまで漸増すればよい。長期投与を目的として免疫毒素含有組成物をインフュージョンによって投与することも本発明の範囲である。これは、移植した装置によって、あるいは外部のポンプ装置または移植したポンプ装置を介してＣＳＦに定期的に直接注入することによって実現することができ、免疫毒素を長期投与することができる。免疫毒素を投与する最良の方法は、各症状の特徴に依存するもので、通常利用されている方法を使用する簡単な試験によって決定することができる。
【００３８】
以下、ＣＳＦ生成/吸収/動力学の平衡が崩れる水頭症やその他の症状の治療を前提として本発明を説明するが、本発明は他の疾患にも適用可能である。これら他の疾患には、水頭症のすべての形態、良性の頭蓋内高血圧症や、頭部負傷などの頭蓋内圧力上昇を引き起こす疾患がある。また、本発明は、原発性脈絡叢腫などの悪性細胞や上衣細胞腫などの他の脳室内腫瘍および髄膜腫の死滅に、また脳下垂体の腫瘍の治療にも適用することができる。腎臓組織および眼の部分は、脈絡叢にみられる細胞に似た細胞をもつ領域をもつため、本発明は、腎臓腫瘍などの腎臓疾患や、緑内障などの眼疾患にも有用である。
【００３９】
以下、例示のみを目的として、以下の実施例に示す本発明の好適な実施態様について本発明を説明する。なお、特に断らない限り、部および％は重量基準である。添付図面について説明すると、図１はラットの脳における上皮脈絡叢細胞に対する抗体ＥＭＡの付着選択性を示す図である。図２は、脈絡叢細胞上のレセプター部位に付着する本発明の免疫活性物質を示す概略図である。図３は、細胞上の免疫活性物質の効果を検定するプロトコールを示す図である。図４は、脈絡叢細胞に適用した免疫活性物質について所定の間隔をおいて撮影した、免疫活性物質としてＭＤＲを使用した図３の検定結果の一つを示す一連の写真である。これら写真は、本発明免疫活性物質が細胞死滅に迅速な作用をもつことを明らかに示す写真である。図５は、異なる投与量で免疫活性物質を使用した、図３の検定結果の一つを示す一連の写真である。これら写真は、本発明免疫活性物質の作用が投与量に依存することを明確に示す写真である。
【００４０】
以下の抗原に対する抗体として３種類の市販エピトープ抗体ペプチドフラグメントを選択した。
【００４１】
１．βサブユニットのエクトドメインに存在する（ほぼaa６２−３０４）Ｎａ−ＫＡＴＰアーゼβ１サブユニット（アメリカ、ニュージャージー州フランダースのＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社の製品）。この抗原については、脈絡叢細胞がＮａ−ＫＡＴＰアーゼを豊富に含有していることが知られているため選択した。これは、緑内障の治療に有効である。
【００４２】
２．Ｐ−糖タンパク質０１７０またはＭＤＲ１として知られている多種薬剤輸送タンパク質。この細胞膜結合タンパク質は細胞質ドメインと細胞外ドメインの両方をもつ。この抗原については、細胞外成分を特異的に認識できるため選択した。入手先は、英国、オックスフォードシャー、アビンドンのＩｍｍｕｎｏＫｏｎｔａｃｔ、ＡＭＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社である。
【００４３】
３．ＥＭＡ（上皮膜抗原）。これは、よく認識されている上皮抗原である。ラットの脳に関する本発明者の準備研究によれば、この抗原は、脈絡叢に特異的な吸収を示すが、脳柔組織には吸収を示さない。図１を参照。
【００４４】
なお、上述したように、脈絡叢細胞表面に発現する抗原を特性化し、これら抗原に対する抗体を合成することによって他の好適な抗原/ペプチドフラグメントも得ることができた。
【００４５】
使用した毒素は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｈａｒａｍｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の製品であるＳ−ＭＢＳおよびＳＤＰＤを使用して抗体のペプチド鎖に結合したリシンＡ鎖であった。
【００４６】
免疫毒素の製造
本実施例では、毒素として、タンパク質合成の潜在的な抑制因子である植物誘導剤のリシンを使用した。なお、細胞を死滅させるか、あるいは細胞機能を妨害するその他多くの剤も使用できるものである。リシンは、ターゲティング（Ｂ−鎖）サブユニットと毒素（Ａ−鎖）サブユニットとからなるグリコシル化ホロ毒素である。Ｂ−鎖が存在しない場合、リシンＡ−鎖の毒性は、糖部位の除去によって消滅する。というのは、標的細胞に侵入できないからである。リシン系免疫毒素は、一般に、特異的な抗体に結合するリシンＡ−鎖からなり、この抗体がリシンＢ−鎖のターゲティング作用をもつ。抗体（Ｎａ／ＫＡＴＰアーゼ、ＭＤＲ１、ＥＭＡ、ＩｇＧ）をリシンの脱グリコシル化Ａ−鎖（ＲＣＡ）に接合し、標準プロトコールを使用して、未接合毒素から精製する。このように、２官能性架橋試薬ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル（ＭＢＳ）エステル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社の製品）でＲＣＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社の製品）を培養してから、部分還元モノクロナール抗体の新たな生成物と混合する。活性化されたＲＣＡが還元された抗体と反応し、これに結合し、特異的免疫毒素（ＩＴＸ）を生成する。未接合毒素を除去するために、サイズ排除カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の製品）を使用して、反応生成物をＦＰＬＣにかけ、（見掛け分子量によって判定して）ＩＴＸのみを含有する分画を分取する。所望ならば、ＩＴＸを固定化Ｄ−ガラクトースアフィニティーカラム（Ｐｉｅｒｃｅ社の製品）に結合し、このカラムをＰＢＳでフラッシュ処理してから、ＩＴＸをラクトース溶液で溶離処理することによって未接合抗体を除去してもよい。
【００４７】
ヒツジの脈絡叢細胞株およびヒトの脈絡叢癌細胞株を使用して、試験管細胞培養を行なった。初期培養により、脈絡叢細胞上にＥＭＡ、Ｎａ−ＫＡＴＰアーゼおよびＭＤＲ１が選択的に存在していることを確認した。実験では、上記のようにして生成した免疫毒素を細胞上に１時間置き、子ウシ血清で洗浄除去した。免疫毒素および免疫毒素の使用量に応じて次の２４時間〜１週間で細胞の死滅を観察した。細胞死滅は、ＩｇＧ免疫毒素の場合に見られるように部分的から、ＥＭＡ、Ｎａ／ＫＡＴＰアーゼおよびＭＤＲ１免疫毒素の場合にみられるようにほぼ完全までの範囲にあった。所望ならば、リソソームｐＨを高くし、免疫毒素における毒素の作用を強くするクロロキンなどの補助剤を脈絡叢細胞に適用する免疫毒素と併用してもよい。
【発明の効果】
【００４８】
これら試験では細胞死滅数が多く、図４および図５に示すように、免疫毒素が脈略叢細胞の選択的死滅または選択的無力化に対して有効であり、またそのＣＳＦ生成抑制能力が高いことを実証している。これは、ヒツジの脈絡叢細胞上のＲＣＡに付着せずに抗体を投与し、細胞がほとんど死滅しなかった対照試験とは対照的である。
【００４９】
さらに研究した結果、この細胞の死滅は投与量に依存し、図５に示すように、脈絡叢細胞に対して特異的である。この結果から、ＣＳＦ生成を十分に抑制し、すべての脈絡叢を死滅させずに症状をコントロールできるレベルまで生体内に輸送される免疫毒素の量を“滴定”できることがわかる。
【００５０】
別な試験では、ＭＤＲ１抗体をＲＣＡに付着せずに使用した。脈絡叢細胞に適用した場合、ＭＤＲ１抗体単独でも細胞死滅は十分であった。この試験の結果は、図４および図５に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ラットの脳における上皮脈絡叢細胞に対する抗体ＥＭＡの付着選択性を示す図である。
【図２】脈絡叢細胞上のレセプター部位に付着する本発明の免疫活性物質を示す概略図である。
【図３】細胞上の免疫活性物質の効果を検定するプロトコールを示す図である。
【図４】脈絡叢細胞に適用した免疫活性物質について所定の間隔をおいて撮影した、免疫活性物質としてＭＤＲを使用した図３の検定結果の一つを示す一連の写真である。これら写真は、本発明免疫活性物質が細胞死滅に迅速な作用をもつことを明らかに示す写真である。
【図５】異なる投与量で免疫活性物質を使用した、図３の検定結果の一つを示す一連の写真である。これら写真は、本発明免疫活性物質の作用が投与量に依存することを明確に示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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