(57)【要約】本発明は、対象におけるSARS関連コロナウィルス粒子の濃度を減らすために有効な量のインターフェロン・ポリペプチドを対象に投与することで、前記対象を治療するステップを含む、重症急性呼吸器症候群（SARS）に罹患した対象を治療する方法を提供するものである。本発明は、更に、インターフェロン・ポリペプチドを対象に投与するステップを含む、特定のウィルスに感染した対象を治療する方法や、対象のウィルス感染のリスクを減らす方法も提供する。本発明は、更に、インターフェロン・ポリペプチドを対象に投与するステップを含む、インフルエンザに罹患した対象を治療する、又は、対象のインフルエンザウィルス感染のリスクを減らす、方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィルスに感染した対象を治療する、又は、対象のウィルス感染のリスクを減らす、方法であって、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、68、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84 又は 86のうちの一つに対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、天然で生じるインターフェロン対立遺伝子ではない、インターフェロン・ポリペプチドを対象に投与するステップであって、前記ウィルスが、重症急性呼吸器症候群に関連するコロナウィルス、インフルエンザ、コロナウィルス、天然痘ウィルス、牛痘ウィルス、西ナイルウィルス、ワクシニアウィルス、呼吸系発疹ウィルス、ライノウィルス、アルテリウィルス、フィロウィルス、ピコルナウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、パポヴァウィルス、疱疹ウィルス、ポックスウィルス、ヘパドナウィルス、アストロウィルス、コクサッキーウィルス、パラミキソウィルス、オルトミキソウィルス、エコーウィルス、エンテロウィルス、カルジオウィルス、トガウィルス、ラブドウィルス、ブンヤウィルス、アレナウィルス、ボルナウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、及びフラビウィルスから成る群より選択され、それにより、ウィルスに感染した対象を治療する、又は、対象のウィルス感染のリスクを減らす、ステップを含む、方法。
【請求項２】
前記インターフェロン・ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、68、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84 及び 86から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インターフェロン・ポリペプチドが核酸にコードされており、前記核酸が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83 及び 85から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記インターフェロン・ポリペプチドが、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83 及び 85から成る群より選択される配列を含む核酸に高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする核酸にコードされている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記インターフェロン・ポリペプチドが、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83 及び 85から成る群より選択される配列に相補的な核酸に高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする核酸にコードされている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、ヒト、ヒト以外の霊長類、ネコ、イヌ、又は家畜である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記インターフェロンが、注射、吸入、点眼剤、軟膏、座薬、制御放出パッチ、輸注、又は吸入により、鼻孔、口腔、非経口、局所、直腸を通じて投与される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記インターフェロンが、対象の鼻咽頭粘膜又は肺上皮に投与される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
投与されるインターフェロン・ポリペプチドの量が、対象におけるウィルス粒子の濃度を低下させて、対象を治療するために有効な量である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
投与されるインターフェロン・ポリペプチドの量が、対象におけるウィルス粒子の濃度の増加を妨げる又は減らして、対象を予防的に治療するために有効な量である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
インターフェロン組成物を、前記組成物を対象に投与する際の指示と一緒に含む医薬梱包物であって、（ｉ）前記指示が、ウィルスに感染した対象を治療する、又は、対象のウィルス感染のリスクを減らす、ためであり、前記ウィルスが、重症急性呼吸器症候群に関連するコロナウィルス; インフルエンザ、コロナウィルス、天然痘ウィルス、牛痘ウィルス、西ナイルウィルス、ワクシニアウィルス、呼吸系発疹ウィルス、ライノウィルス、アルテリウィルス、フィロウィルス、ピコルナウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、パポヴァウィルス、疱疹ウィルス、ポックスウィルス、ヘパドナウィルス、アストロウィルス、コクサッキーウィルス、パラミキソウィルス、オルトミキソウィルス、エコーウィルス、エンテロウィルス、カルジオウィルス、トガウィルス、ラブドウィルス、ブンヤウィルス、アレナウィルス、ボルナウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、及びフラビウィルスから成る群より選択され、そして（ｉｉ）前記インターフェロン・ポリペプチドが、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、68、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84 又は 86のうちの一つに少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、医薬梱包物。
【請求項１２】
前記インターフェロン組成物が、配列番号 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、68、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84 又は 86から成る群より選択されるインターフェロンを含む、請求項１１に記載の医薬梱包物。 
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本出願は、引用をもってその内容を本出願のここに援用することとする、２００３年５月２３日に提出された米国仮出願No. 60/473,134号に基づく優先権を主張するものである。 
【０００２】
多様な参考文献を本出願全体を通じて引用するが、これらの参考文献のそれぞれの内容を、引用をもって本出願に援用することとする。
【０００３】
発明の背景
インターフェロン（IFN）、は、様々な真核細胞が様々な刺激に曝露したときに分泌するよく知られたファミリのサイトカインである（Zoon KC: Human Interferons: Structure and Function. p. 1-12. In:
Interferon 8. Academic Press, London, 1987;  Walter et al., Cancer Biotherm Radiopharm 1998 June; 13(3）、:143-54; Pestka, S., Biopolymers 2000; 55(4）、:254-287; Pestka, S., Methods in Enzymology,
78, 1981; Pestka, S., Methods in Enzymology, 79, 1981; Pestka, S., Methods in
Enzymology, 119, 1986）。インターフェロンはそれらの化学的及び生物学的特徴により分類されてきた。インターフェロンは、タイプＩ及びタイプＩＩインターフェロンと呼ばれる２つのグループに分かれる（Pestka, S.; Langer; J.A.; Zoon, K.C.; Samuel, C.E. Ann Rev Biochem
1987, 56, 727-777; Pestka, S., Biopolymers 2000; 55(4）、:254-287）。IFN-γは、免疫インターフェロンとしても公知であり、唯一のタイプＩＩインターフェロンであるが、他方、タイプＩヒトインターフェロンはIFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-κ、及びIFN-τ、という５つのクラスから成る。 ヒトIFN-β及びヒトIFN-ωは一つしかないが、複数のIFN-α種の一ファミリがある。IFN-τは有蹄動物のみに見られ、ヒトIFN-τはない。IFNは抗ウィルス活性、免疫調節活性及び抗増殖活性を示す。インターフェロンの臨床上の可能性が認識されている。
【０００４】
インターフェロンはアイザック及びリンデンマンにより発見された（Proc. Royal Soc. London, Ser B 147, 258, 1957）。ヒト白血球インターフェロンを精製及び特徴付けしようとする試みにより、正常及び白血病性（慢性骨髄性白血病又は「CML」）ドナー白血球を由来とする均質な白血球インターフェロン（今ではIFN-αと呼ばれる）、が調製された（Pestka,
S., Biopolymers 2000; 55(4）、:254-287; Rubinstein, M.; Levy, W.P.; Moschera, J.A.; Lai, C.-Y.; Hershberg,
R.D.; Bartlett, R.T.; Pestka, S. Arch Biochem Biophys 1981, 210, 307-318.）。均質な線維芽細胞インターフェロン（今ではIFN-βと呼ばれる）も均質になるまで精製された（Friesen, H.-J.; Stein, S.; Evinger, M.; Familletti, P.C.; Moschera,
J.; Meienhofer, J.; Shively, J.; Pestka, S. Arch Biochem Biophys 1981, 206,
432-450）。これらのインターフェロンはウィルス耐性状態をそれらの標的細胞にもたらす強力な能力を特徴とする一ファミリーのタンパク質である。加えて、インターフェロンは細胞増殖を阻害し、免疫応答を調節し、タンパク質の発現を変化させることができる。
これらの特性があるために、ウィルス感染及び悪性腫瘍の治療用の治療薬としての白血球インターフェロンの臨床上の使用に拍車がかかっている。
【０００５】
過去数十年の間に、数多くのヒト及び動物のインターフェロンが生産され、同定され、精製及びクローニングされてきた。このインターフェロン製剤のうちのいくつかは、粗な形のままと、精製済みの形の両方で臨床治験に向けて調製された。いくつか個別の組換えインターフェロン-α種がクローニング及び発現させられている。こうして、そのタンパク質は様々な手法により精製され、様々な処方で臨床上の使用に向けて調合されてきた。臨床での使用に、世界中で多様な法的機関により認可されたインターフェロンの大半は、ヒトαインターフェロン（Hu-IFN-α）、の混合物又は個別の種である。国によっては、Hu-IFN-β及びγも臨床治験が認められており、場合によっては治療上の使用も認められている。これらのインターフェロンの臨床上の使用の基礎にある主な理論は、これらが正常な個体により産生される天然分子であるという点であった。実際、その具体的な理論は、臨床上の使用に調製されるインターフェロンはすべて、天然又は組換えにより作製された産物であるに関係なく、正常なヒトにより天然で産生されたインターフェロンであったという点である。このことは、数多くのインターフェロンだけでなく、作製されてきた特定の成長因子、リンホカイン、サイトカイン、ホルモン、凝固因子及び他のタンパク質にとって真実である。
【０００６】
発明の概要
本発明は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86又はその一断片のうちの少なくとも１つに示されるアミノ酸配列を含むインターフェロン・ポリペプチドの少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチド、を含む核酸を提供するものである。このように、本発明の一局面は、（ａ）これらの配列番号の少なくとも一つのアミノ酸配列を含むインターフェロン・ポリペプチドをコードするヌクレオチド、配列；（ｂ）これらの配列番号のうちの少なくとも一つに示されたポリペプチドの生物学的活性断片をコードするヌクレオチド、配列；及び（ｃ）上記の（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれか少なくとも１つに対して相補的なヌクレオチド配列：から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、を提供するものである。本発明の更なる実施態様には、上記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに少なくとも95% 同一、そしてより好ましくは少なくとも96%同一、そして更により好ましくは少なくとも 97%同一、そして更により好ましくは少なくとも98%同一、そして更により好ましくは 少なくとも 99.25%同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは、上記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のポリヌクレオチドに、そして好ましくは配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83 又は85のうちの少なくとも１つに示されたポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、を含む核酸がある。前記断片には、インターフェロン・ポリペプチドの生物学的活性断片が含まれる。配列番号1-26 はネコ・インターフェロンの配列である。配列番号27-36はアカゲザル・インターフェロンの配列である。配列番号37-86 はヒト・インターフェロンの配列である。
【０００７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」にはストリンジェントな洗浄条件が含まれるものと意図されており、当業者であれば、低塩及び高温など、このような高い条件を判断できよう。低塩の一例は0.1 X SSCである。高温の一例は６５−６８℃である。ある実施態様は、50% ホルムアミド、5 x SSC （150 mM NaCl、15 mM クエン酸三ナトリウム）、50
mM リン酸ナトリウム (pH 7.6）、5 x デンハーツ溶液、10% 硫酸デキストラン、及び20
ug/ml 変性剪断サケ精子DNA：を含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーションをした後、フィルタを６５℃の0.1 x
SSC中で洗浄するステップを包含する。ここで用いられる場合、「高ストリンジェンシー」とは、（ｉ）、ハイブリダイゼーション後の洗浄に低イオン強度及び高温、例えば５０℃の0.1倍のSSC及び0.1% (w/v） SDS 、を用いる；又は（ｉｉ）、ハイブリダイゼーション条件中に、例えばハイブリダイゼーション温度が、ハイブリダイズさせようとするポリヌクレオチドの二重鎖溶解温度よりも低い２５℃であり、例えば65℃の1.5倍のSSPE、10% (w/v）、 ポリエチレングリコール 6000、7% (w/v）、 SDS、0.25 mg/ml 断片化ニシン精子DNAを用いる； 又は（ｉｉｉ）例えば70℃の0.5M リン酸ナトリウム、pH 7.2、5 mM EDTA、7% (w/v）、 SDS (28）、 及び0.5% (w/v）、 BLOTTOを用いる；又は（ｉｖ）、ハイブリダイゼーション中にホルムアミド、例えば50% (v/v） ホルムアミド、などの変性剤を、42℃の５倍のSSC、50 mM リン酸ナトリウム（pH 6.5）、及び５倍のデンハーツ溶液と一緒に用いる；又は（ｖ）例えば42℃の50% (v/v）、 ホルムアミド、５倍のSSC、50 mM リン酸ナトリウム（pH 6.8）、0.1% (w/v）、ピロリン酸ナトリウム、５倍のデンハーツ溶液、音波破砕したサケ精子DNA (50 .mu.g/ml）、 及び10% 硫酸デキストラン、を用いる条件も言う。
【０００８】
ポリペプチド、ペプチド及びタンパク質断片に関しては、これらは生物学的活性断片であってもよく、またここで提供する配列同定要素に記載した配列の完全長よりも短いいずれの長さのものであってもよい。ある実施態様では、当該断片は、少なくとも 10アミノ酸長である。別の実施態様では、当該断片は少なくとも 20 アミノ酸長である。他の実施態様では、当該断片は少なくとも 30、40、50、60、70、80、90 又は100 アミノ酸長であってよい。更なる実施態様では、当該断片は少なくとも 110、120、130、140、150、160、又は170アミノ酸長であってよい。
【０００９】
核酸断片に関しては、これらには、ここで論じる通りの診断用プローブ及びプライマとして有用であろうものが含まれる。このような配列は、ここで解説されたインターフェロン・ヌクレオチド配列を特異的に特定するものであってよい。そしてそれらはいかなる長さのものであってもよい。例えば、それらには、少なくとも約15ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド、更により好ましくは 少なくとも約30ヌクレオチド、そして更により好ましくは少なくとも約40ヌクレオチド、長のものが含まれる。もちろん、50-300ヌクレオチド長のものなどのより大きな断片も、ここで提供した配列番号のうちの少なくとも一つに示されたヌクレオチド配列の全部でないにしても大半に相当する断片と同様に、本発明に従って有用である。断片とは、例えば、ここで提供した配列番号のうちの少なくとも一つに示したとおりのヌクレオチド配列の少なくとも一つからの20個以上の連続した塩基を含む少なくとも20ヌクレオチド長が、意図された断片である。50-300ヌクレオチド長の断片には、例えば、約50、60、70、80、90又は100塩基長であるものが含まれる。これらには、更に、約110、120、130、140、150、160、170、180、190 又は200 塩基長である断片も含まれよう。これらには、更に、約210、220、230、240、250、260、270、280、290 又は300 塩基長である断片も含まれよう。
【００１０】
あるポリヌクレオチドの一「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドには、いずれの中間の長さ（例えば50塩基）も含め、基準ポリヌクレオチドのうちの少なくとも約15ヌクレオチド、そしてより好ましくは 少なくとも 約 20 ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも 約 30 ヌクレオチド、そして更により好ましくは 約 30-70ヌクレオチド、にハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNA又はRNAのいずれか）、が含まれる。これらは、上に論じたように、そして以下に詳述するように、診断用プローブ及びプライマとして有用である。
【００１１】
別の局面では、本発明は、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、又はその一断片の少なくとも１つに示されたアミノ酸配列を含む、ネコ・インターフェロン・ポリペプチドの少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供するものである。このように、本発明の一局面は、：（ａ）これらの配列番号のうちの少なくとも一つのアミノ酸配列を含むネコ・インターフェロン・ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）これらの配列番号のうちの少なくとも一つに示されたポリペプチドの生物学的活性断片をコードするヌクレオチド配列；及び（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列の少なくともいずれか一つに相補的なヌクレオチド配列、から成る群より選択されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供するものである。本発明の更なる実施態様には、ここで解説されたヌクレオチド配列のいずれかに少なくとも95%同一、そしてより好ましくは 少なくとも 96%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 97%同一、そして更により好ましくは少なくとも 98%同一、そして更により好ましくは少なくとも 99.25%同一、なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは、ここで解説されたポリヌクレオチド配列に、そして好ましくは
配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23 又は25.のうちの少なくとも１つに示されたポリヌクレオチド配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、を含む核酸がある。
【００１２】
本発明は、更に、配列番号28、30、32、34、36 又はその一断片のうちの少なくとも１つに示されたアミノ酸配列を含むアカゲザル・インターフェロン・ポリペプチドの少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供するものである。
このように、本発明の一局面は、（ａ）これらの配列番号のうちの少なくとも一つのアミノ酸配列を含むアカゲザル・インターフェロン・ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）これらの配列番号のうちの少なくとも一つに示されたポリペプチドの生物学的活性断片をコードするヌクレオチド配列；及び（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供するものである。更なる実施態様には、上記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに少なくとも 95%同一、そしてより好ましくは少なくとも 96%同一、そして更により好ましくは 少なくとも 97%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 98%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 99.25%同一、なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のヌクレオチドに、そして好ましくは配列番号27、29、31、33 又は35の少なくとも１つに示されたポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、を含む核酸がある。
【００１３】
更に本発明は、配列番号38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86 又はその一断片のうちの少なくとも１つに示されたアミノ酸配列を含むヒト・インターフェロン・ポリペプチドの少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチドを含む核酸も提供するものである。このように、本発明の一局面は、（ａ）これらの配列番号のうちの少なくとも一つのアミノ酸配列を含むヒトインターフェロン・ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）これらの配列番号のうちの少なくとも１つに示されたポリペプチドの生物学的活性断片をコードするヌクレオチド配列；及び（ｃ）上記（ａ）又は（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供するものである。本発明の更なる実施態様には、上記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも 95%同一、そしてより好ましくは 少なくとも 96%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 97%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 98%同一、そして更により好ましくは少なくとも 99.25%同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは、上記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のポリヌクレオチドに、そして好ましくは配列番号37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83 又は85のうちの少なくとも１つに示されたポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、を含む単離された核酸がある。
【００１４】
別の局面では、インターフェロン・ポリペプチドをコードする本発明の核酸のいずれかに、限定はしないが、それのみで完全なポリペプチドのアミノ酸配列をコードするもの；そして、完全なポリペプチドのコーディング配列や、例えばプレ-、又はプロ-又はプレプロ-タンパク質配列などの付加的な分泌リーダ配列をコードするものなどの付加的な配列が含まれていてもよい。
【００１５】
更に、限定はしないが、例えばイントロン及び非コーディング5’側及び3’側配列や、例えば、mRNAのリボゾーム結合及び安定性など、スプライシング及びポリアデニレーション・シグナルを含む転写、mRNAプロセッシングにおいて役割を果たし、転写はされるが翻訳されない配列；及び、付加的な機能性を提供するものなどの付加的なアミノ酸をコードする付加的なコーディング配列を含め、付加的な非コーディング配列と一緒のここで解説された核酸も提供される。
【００１６】
このように、当該ポリペプチドをコードする配列を、例えば融合させたポリペプチドの精製が容易に行えるようにするペプチドをコードする配列など、マーカ配列に融合させてもよい。本発明のこの局面のいくつかの好適な実施態様では、前記マーカ・アミノ酸配列は、中でもとりわけ、その多くが市販されているpQE ベクタ（カリフォルニア州91311、チャッツワース、イートン・アベニュー9259、キアジェン社）、に提供されたタグなど、ヘキサ-ヒスチジン・ペプチドである。例えば、Gentz らが解説するヘキサ-ヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製に役立つ（Gentz et al. (1989）、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824）。「HA」タグは精製のために有用な別のペプチドであり、インフルエンザ・ヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに相当する（Wilson et al. (1984） Cell 37: 767）。融合タグの他の例には以下：（１）MBPタグはマルトース結合タンパク質の一部分である（ベクタはロシュTM社から入手可能（例としてのベクタの指定：pIVEX MBP）、ニュー・イングランド・バイオロジカル（例としてのベクタの指定：pMAL-p2X）、；（２）HA タグは、ヒト・インフルエンザ・ウィルスのヘマグルチニンの一部分である（ベクタはロシュ社から入手可能（例としてのベクタの指定：pIVEX HA-タグ）、BD バイオサイエンセズ社（pCMV-HA）、；（３）FLAGは特殊な８アミノ酸エピトープである（ベクタはシグマ・ケミカル社から、例としてのベクタの指定：gWiz/GFP）、；（４）CBP タグは、カルモジュリン結合タンパク質の一部分である（ベクタはストラタジーン社から入手可能：例としてのベクタの指定：pDual）、；及び（５）GFP は緑色蛍光タンパク質の一部分である（ベクタはストラタジーン社から入手可能：例としてのベクタの指定pDual）、がある。融合タンパク質を作製するための他のよくあるエピトープ・タグ：c-myc、GST、AU1、AU5、DDDDK、E エピトープ、E2 タグ、Glu-Glu、S1、KT-3、T7 エピトープ・タグ、V5 エピトープ・タグ、VSV-G、BFP、CFY、YFP。以下に論じるように、他のこのような融合タンパク質には、Ｎ又はＣ末端でFcに融合させたインターフェロンがある。
【００１７】
更に本発明は、本発明の核酸を含む組換えベクタや、該組換えベクタを含有するホスト細胞、並びに、このようなベクタ及びホスト細胞を作製する方法や、組換え技術によりインターフェロン・ポリペプチド又はペプチドを作製するためのそれらの使用法も提供するものである。
【００１８】
更に本発明は、（ａ）配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84 又は86のうちの少なくとも１つに示された酸配列を含むインターフェロン・ポリペプチドのアミノ酸配列；及び（ｂ）これらの配列番号のうちの少なくとも１つに示されたポリペプチドの生物学的活性断片のアミノ酸配列、から選択されるアミノ酸配列を含むインターフェロン・ポリペプチドを提供するものである。更に本発明は、ここで解説されたポリペプチドに対して少なくとも95%同一、そしてより好ましくは 少なくとも 96%同一、そして更により好ましくは
少なくとも97%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 98%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 99.25%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。また、ここで解説されたものに対して少なくとも 95%の類似性、より好ましくは少なくとも96%の類似性、そして更により好ましくは 97% の類似性、そして更により好ましくは少なくとも 98% の類似性、そして更により好ましくは少なくとも99.25%の類似性のあるアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。また、ここで解説されたものに少なくとも 95%、96%、97%、98% 又は99.25% の相同性のあるアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。
【００１９】
本発明のこの局面の付加的な実施態様は、ここで解説されたアミノ酸配列を有するインターフェロン・ポリペプチドのエピトープ担持部分のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドに関する。本発明のインターフェロン・ポリペプチドのエピトープ担持部分のアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドには、少なくとも６個又は７個、好ましくは少なくとも９個、そしてより好ましくは少なくとも約３０個のアミノ酸乃至約５０個のアミノ酸から成るこのようなポリペプチドの部分が含まれるが、上に解説した本発明のポリペプチドの全アミノ酸配列を最高として含むいずれの長さのエピトープ担持ポリペプチドも、本発明に含まれる。
【００２０】
別の実施態様では、本発明は、ここで解説されたアミノ酸配列を有するインターフェロン・ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。このような抗体はモノクローナル抗体であってもよい。更にそれはFab又はFab’断片などの抗原結合断片であってもよい。該抗体は、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体であってもよい。該抗体はネコ抗体又はアカゲザル抗体であってもよい。更に本発明は、ここで解説されたアミノ酸配列を有するインターフェロン・ポリペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法も提供する。このような抗体は、以下に解説するように治療上、有用である。
【００２１】
別の局面では、本発明は更に、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 又は26のうちの少なくとも１つに示されたアミノ酸配列を含むインターフェロン・ポリペプチドのアミノ酸配列；及び（ｂ）、これらの配列番号のうちの少なくとも一つに示されたポリペプチドの生物学的活性断片のアミノ酸配列：から選択されるアミノ酸配列を含むネコ・インターフェロン・ポリペプチドを提供するものである。また本発明は、ここで解説されたポリペプチドに少なくとも95%同一、そしてより好ましくは少なくとも96%同一、そして更により好ましくは 少なくとも 97%同一、そして更により好ましくは少なくとも 98%同一、そして更により好ましくは 少なくとも 99.25%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。更に、ここで解説されたものに少なくとも 95% の類似性、より好ましくは 少なくとも 96% の類似性、そして更により好ましくは 97% の類似性、そして更により好ましくは少なくとも98% の類似性、そして更により好ましくは少なくとも99.25%の類似性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。更に、ここで解説されたものに少なくとも 95%、96%、97%、98% 又は 99.25% の相同性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。
【００２２】
別の局面では、本発明は、（ａ）配列番号28、30、32、34 又は 36のうちの少なくとも一つに示された酸配列を含むインターフェロン・ポリペプチドのアミノ酸配列；及び（ｂ）、
これらの配列番号のうちの少なくとも一つに示されたポリペプチドの生物学的活性断片のアミノ酸配列：から選択されるアミノ酸配列を含むアカゲザル・インターフェロン・ポリペプチドも提供する。更に本発明は、ここで解説されたポリペプチドに少なくとも 95%同一、そしてより好ましくは 少なくとも96%同一、そして更により好ましくは少なくとも 97%同一、そして更により好ましくは少なくとも 98%同一、そして更により好ましくは 少なくとも 99.25%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。更に、ここで解説されたものに少なくとも 95% の類似性、より好ましくは少なくとも 96% の類似性、そして更により好ましくは 97% の類似性、そして更により好ましくは 少なくとも98% の類似性、そして更により好ましくは少なくとも 99.25% の類似性のあるアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。更に、ここで解説されたものに少なくとも95%、96%、97%、98% 又は 99.25% の相同性のあるアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。
【００２３】
別の局面では、本発明は、更に、（ａ）、配列番号38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84 又は 86のうちの少なくとも一つに示された酸配列を含むインターフェロン・ポリペプチドのアミノ酸配列；及び（ｂ）、これらの配列番号に示されたポリペプチドのうちの少なくとも一つの生物学的活性断片のアミノ酸配列：から選択されるアミノ酸配列を含むヒト・インターフェロン・ポリペプチドも提供する。更に本発明は、ここに解説されたポリペプチドに少なくとも 95%同一、そしてより好ましくは 少なくとも 96%同一、そして更により好ましくは少なくとも 97%同一、そして更により好ましくは少なくとも 98%同一、そして更により好ましくは少なくとも 99.25%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含する。 更に、ここで解説されたものに、少なくとも 95% の類似性、より好ましくは少なくとも 96%の類似性、そして更により好ましくは 97% の類似性、そして更により好ましくは 少なくとも 98% の類似性、そして更により好ましくは 少なくとも 99.25% の類似性のあるアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。更に、ここで解説されたものに少なくとも 95%、96%、97%、98% 又は 99.25% の相同性のあるアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。
【００２４】
別の局面では、本発明は更に、in vitroの細胞に、ex vivoの細胞に、そしてin vivoの細胞に、あるいは多細胞生物に投与するための、ここで解説されたインターフェロン・ポリヌクレオチド又はインターフェロン・ポリペプチドのいずれかを含む組成物も提供する。本発明のこの局面のいくつか特に好適な実施態様では、該組成物は、疾患を治療しようとするホスト生物においてインターフェロン・ポリペプチドを発現させるためのインターフェロン・ポリヌクレオチドを含む。この関係で特に好適なものは、内因性インターフェロンの活性の喪失又は不足に関連する機能不全を治療するためのヒトの患者における発現である。
【００２５】
更に本発明は、例えばウィルス感染、寄生生物感染、細菌感染、癌、自己免疫疾患、多発性硬化症、リンパ腫及びアレルギなどの免疫系関連異常を治療又は防止するためなどに用いてもよいインターフェロン・ポリペプチドを含む医薬組成物及び方法を提供するものである。インターフェロン・ポリペプチドを必要とする個体を治療する方法も提供される。いくつかの好適な実施態様では、当該の医薬組成物は、非ヒト動物、好ましくは非ヒト霊長類に投与するための獣医用組成物である。インターフェロンによる治療の可能な状態の例には、ウィルス感染があるがこれに限らない。限定はしないが、インターフェロンによる治療を、インターフェロン感受性ウィルスの複製を阻害すると有益であろう状態を治療するために用いてもよい。本発明に従って治療できると思われるウィルス感染には、重症急性呼吸器症候群（SARS）、天然痘ウィルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、西ナイルウィルス、ワクシニア、コロナウィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、他の非Ａ型／非Ｂ型肝炎、疱疹ウィルス、エプスタイン-バーウィルス（EBV）、サイトメガロウィルス（CMV）、単純疱疹、６型ヒト疱疹ウィルス（HHV-6）、乳頭腫ウィルス、ポックスウィルス、ピコルナウィルス、アデノウィルス、ライノウィルス、１型及び２型ヒトＴリンパ球好性ウィルス（HTLV-1/-2）、ヒトロタウィルス、狂犬病、ヒト免疫不全ウィルス（HIV）、を含むレトロウィルス、脳炎、アルテリウィルス、フィロウィルス、レオウィルス、パポバウィルス、ヘパドナウィルス、アストロウィルス、コクサッキーウィルス、オルトミキソウィルス属（インフルエンザウィルス）、パラミキソウィルス属、エコーウィルス、エンテロウィルス及び呼吸器発疹ウィルス、がある。特に関係するのは、SARS関連コロナウィルスと命名された新しいコロナウィルスにより引き起こされると考えられているSARSの治療である（Peiris et
al., Lancet, April 19, 2003; 361(9366）:1319-25; Ksiazek et al., New England Journal of Medicine, April
30, 2003 under PubMed ID#12690092; Drosten et al., New England Journal of Medicine, April 10, 2003, under PubMed
ID#12690091; Marra et al., Science,
epublication on May 1, 2003 with PubMed ID#12730501。PubMedの記事は http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi? CMD=Search&DB=PubMed）、でＩＤ番号によりアクセスすることができる。
【００２６】
更に本発明の方法は、多様な免疫応答を修飾するためにも用いることができる。ここで解説されたインターフェロン・ポリペプチドは、SARSや、ここで解説されたウィルスにより引き起こされるウィルス感染を治療するために用いられよう。また、これらのインターフェロン・ポリペプチドを、例えば感染を防止したり、あるいは、感染に関連する症状を対象が示さないように妨げるなど、予防的な態様で用いてもよい。このような予防的治療が有益であろう対象には、例えばウィルスに曝露してしまった対象や、あるいは、ウィルスに感染した又はウィルスに曝露した個体など、感染のリスクの高いものがある。
【００２７】
ある実施態様では、インターフェロンを抗ウィルス薬として用いることができる。インターフェロンは、後天性免疫異常、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎を含むウィルス性肝炎、乳頭腫ウィルス、疱疹、ウィルス性脳炎の治療に、そして鼻炎及び呼吸器感染の予防に、臨床上、用いられてきた。
【００２８】
別の実施態様では、インターフェロンを抗寄生生物薬として用いることができる。インターフェロンを、例えばクリプトスポリジウム-パルブム（原語： Cryptosporidium
parvum）感染を治療するためなどに用いてよい。更に別の実施態様では、インターフェロンを抗菌剤として用いることができる。インターフェロンは臨床上、抗菌治療に用いられてきた。例えば、インターフェロンを多剤耐性肺結核の治療に用いることができる。
【００２９】
更に別の実施態様では、インターフェロンを免疫療法プロトコルの一部として用いることができる。本発明のインターフェロンを、免疫療法、又はより具体的には例えば移植片対宿主拒絶を防ぐためや、あるいは、関節炎、多発性硬化症、又は糖尿病などの自己免疫疾患の進行を抑えるためなど、臨床で用いてよい。
【００３０】
別の実施態様では、インターフェロンをアレルギ治療のプログラムの一部として用いることができる。更に別の実施態様では、インターフェロンをワクチン・アジュバントとして用いることができる。インターフェロンを、予防的又は治療的ワクチン接種の場合に免疫応答を亢進又は刺激するためのアジュバント又はコアジュバントとして用いてもよい。
【００３１】
一般的な動物の治療に加え、本発明は特に、獣医学プロトコルの一部としての霊長類の治療用のインターフェロンの使用も考察する。ある実施態様では、当該のインターフェロンはアカゲザル・インターフェロンである。更に本発明は、具体的には、獣医学プロトコルの一部としてネコの治療のためのインターフェロンの使用も考察する。ある実施態様では、当該のインターフェロンはネコ・インターフェロンである。
【００３２】
いくつかの実施態様では、インターフェロンを用いてウィルス感染についてネコを治療する。例えば、ネコ免疫不全ウィルス（FIV）を持つネコは、正常な健康を保つためには支援療法を必要とする。FIVに感染したネコの治療の一部としてインターフェロンを用いることができる。同様に、ネコ白血病ウィルス（FeLV）に感染したネコの治療の一部としてインターフェロンを用いることができる。ネコ白血病ウィルス（FeLV）は、今日、アメリカの家ネコの大半の重要な複合致死性感染性疾患の原因である。
【００３３】
ネコ汎白血球減少症を治療するためにインターフェロンを用いることができる。ネコ感染性腸炎、ネコ「ジステンパー」及びネコ運動失調又は協調運動不能とも呼ばれるネコ汎白血球減少症は、その突然の発症、熱、食欲不振（食欲の喪失）、脱水、うつ、嘔吐、血中白血球数の減少（白血球減少）、そしてしばしば高い死亡率を特徴とする、ネコの感染性の高いウィルス疾患である。（子宮内部の）子宮内感染の結果、流産、死産、新生児初期の死亡、及び、２乃至３週齢で始まる仔猫の協調運動不能（運動失調）、として現れる小脳低形成（小脳の発育不全）、が起きる場合がある。ネコ科（ネコ科）の仲間はすべて、アライグマ科のアライグマ、ハナグマ、及びカコミスルと同様に、ネコ汎白血球減少症（FPV）感染に罹る可能性がある。
【００３４】
インターフェロンを、ネコ感染性腹膜炎に感染したネコを治療するために用いることができる。インターフェロンを、狂犬病に感染したネコを治療するために用いることができる。ネコの治療に関する他の実施態様では、インターフェロンを炎症性気道疾患（IAD）を治療する際に用いることができる。更に別の実施態様では、インターフェロンを、イヌ又は他の家庭用ペットを治療するために用いることができる
(de Mari K, Maynard L, Eun HM,
Lebreux B. Vet Rec. (2003） 152:105-8）。更に別の実施態様では、インターフェロンを、家畜を治療するために用いることができる。更に別の実施態様では、インターフェロンを、ヒトを治療するために用いることができる。本発明は、重症急性呼吸器症候群に罹患した対象を治療する方法であって、対象内のSARS関連コロナウィルス粒子の濃度を減らすのに有効量のインターフェロン・ポリペプチドを対象に投与することで、この対象を治療するステップを含む方法を提供するものである。
【００３５】
本発明は、コロナウィルス、天然痘ウィルス、牛痘ウィルス、サル痘ウィルス、西ナイルウィルス、ワクシニアウィルス、呼吸系発疹ウィルス、ライノウィルス、アルテリウィルス、フィロウィルス、ピコルナウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、パポヴァウィルス、疱疹ウィルス、ポックスウィルス、ヘパドナウィルス、アストロウィルス、コクサッキーウィルス、パラミキソウィルス属、オルトミキソウィルス属、エコーウィルス、エンテロウィルス、カルジオウィルス、トガウィルス、ラブドウィルス、バンヤウィルス、アレナウィルス、ボルナウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、及びフラビウィルスから成る群より選択されるウィルスに感染した対象を治療する方法であって、対象内のウィルス粒子の濃度を減らすのに有効量のインターフェロン・ポリペプチドを対象に投与することで、この対象を治療するステップを含む方法を提供するものである。
【００３６】
本発明は、ここで解説された治療法のいずれかを、更に、罹患又は感染から対象を妨げる方法とする、あるいは、対象の罹患又は感染のリスクを減らす方法とする、あるいは、ある特定のウィルスに関連する異常／状態から対象を保護する方法とする、あるいは、ウィルス感染に関連する症状を示すことから対象を妨げる方法とする、ことも考察する。例えば、ウィルスに感染した対象を治療するための上記の方法を、更に、対象のウィルス感染を妨げるために、あるいは、対象のウィルス感染のリスクを減らすために、用いてもよい。
【００３７】
本発明は、対象にインターフェロン・ポリペプチドを投与するステップを含む、対象のウィルス感染のリスクを減らす方法を提供するものである。ある実施態様では、この方法は、対象をウィルス感染から妨げるステップを含む。ある実施態様では、この方法は、ウィルス感染に関連する症状を示すことから対象を妨げるステップを含む。ある実施態様では、この方法は、特定のウィルスに関係する異常／状態から対象を保護するステップを含む。この保護は、感染を原因とする異常／状態の重篤度を妨げる又は軽減することにより、提供されてもよい。別の実施態様では、該保護は、患者において感染を原因とする異常／状態の重篤度を軽減することにより、他者への感染の広がりを減らすことにより、提供されてもよい。別の実施態様では、該保護又はリスクの低下は、対象の細胞の、感染に対する易罹患性を小さくすることにより、なされる。ここで解説された方法及び実施態様は、必ずしも相互に排他的ではない。ウィルス感染には、限定はしないが、コロナウィルス、天然痘ウィルス、牛痘ウィルス、サル痘ウィルス、西ナイルウィルス、ワクシニアウィルス、呼吸系発疹ウィルス、ライノウィルス、アルテリウィルス、フィロウィルス、ピコルナウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、パポヴァウィルス、疱疹ウィルス、ポックスウィルス、ヘパドナウィルス、アストロウィルス、コクサッキーウィルス、パラミキソウィルス属、オルトミキソウィルス属、エコーウィルス、エンテロウィルス、カルジオウィルス、トガウィルス、ラブドウィルス、ブンヤウィルス、アレナウィルス、ボルナウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、及びフラビウィルス、により引き起こされるものが含まれる。
【００３８】
本発明は、インフルエンザ（オルトミキソウィルス）、に罹患した対象を治療する方法であって、対象内のインフルエンザウィルス粒子の濃度を下げるために有効な量のインターフェロン・ポリペプチドを対象に投与するステップを含む方法を提供するものであり、この場合、該インターフェロン・ポリペプチドは、ここで解説された配列番号のうちの少なくとも１つに少なくとも 95%同一、そしてより好ましくは 少なくとも 96%同一、そして更により好ましくは 少なくとも 97%同一、そして更により好ましくは 少なくとも 98%同一、そして更により好ましくは 少なくとも 99.25%同一なアミノ酸配列を含み、こうして該対象が治療される。
【００３９】
例えば治療及び／又は防止の関係でなど、ここで言うインターフェロン・ポリペプチドには、限定はしないが、IFN-αポリペプチド、IFN-βポリペプチド、IFN-γポリペプチド、及びIFN-ωポリペプチドが含まれる（Zoon KC:
Human Interferons: Structure and Function. p. 1-12. In: Interferon 8. Academic
Press, London, 1987;  Walter et
al., Cancer Biotherm Radiopharm 1998 June; 13(3）、:143-54; Pestka, S., Biopolymers 2000; 55(4）、:254-287; Biopolymers 2000; 55(4）、:254-287; Pestka, S., Methods in Enzymology,
78, 1981; Pestka, S., Methods in Enzymology, 79, 1981; Pestka, S., Methods in
Enzymology, 119, 1986; Pestka, S., Langer; J.A.,  Zoon, K.C., Samuel, C.E. Ann
Rev Biochem 1987, 56, 727-777）。これらには、更に、限定はしないがヒトIFN、マウスIFN、ネコIFN及びアカゲザルIFNが含まれる。
【００４０】
ここで解説されたインターフェロン・ポリペプチドのある実施態様では、該インターフェロン・ポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、68、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84 又は 86のうちの一つに少なくとも少なくとも95%同一、そしてより好ましくは 少なくとも 96%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 97%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 98%同一、そして更により好ましくは
少なくとも 99.25%同一なアミノ酸配列を含む。更に、上記のものに少なくとも 95% の類似性, より好ましくは 少なくとも 96% の類似性、そして更により好ましくは 97% の類似性、そして更により好ましくは少なくとも 98% の類似性、そして更により好ましくは少なくとも 99.25%の類似性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。更に、ここで解説されたものに少なくとも 95%、96%、97%、98% 又は 99.25% の相同性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドも提供される。
【００４１】
ここで解説されたインターフェロン・ポリペプチドのある実施態様では、該インターフェロン・ポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、68、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84 及び 86から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。ここで解説されたインターフェロン・ポリペプチドのある実施態様では、該インターフェロン・ポリペプチドは核酸にコードされているが、この核酸は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83 及び 85から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む。ここで解説されたインターフェロン・ポリペプチドのある実施態様では、該インターフェロン・ポリペプチドは、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83 及び 85から成る群より選択される配列を含む核酸に高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする核酸にコードされている。ここで解説されたインターフェロン・ポリペプチドのある実施態様では、該インターフェロン・ポリペプチドは、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83 及び 85から成る群より選択される配列に相補的な核酸に高ストリンジェンシー下でハイブリダイズする核酸にコードされている。
【００４２】
本発明は、対象にインターフェロン・ポリペプチドを投与するステップを含む、該対象が重症急性呼吸器症候群に罹患することを妨げる方法を提供する。本方法は、対象にインターフェロン・ポリペプチドを投与するステップを含む、該対象が重症急性呼吸器症候群に罹患するリスクを減らす方法を提供する。
【００４３】
更に本発明は、ある量のインターフェロンポリペプチドを対象に投与するステップを含む、該対象がコロナウィルス、天然痘ウィルス、牛痘ウィルス、サル痘ウィルス, 西ナイルウィルス、ワクシニアウィルス、呼吸系発疹ウィルス、ライノウィルス、アルテリウィルス、フィロウィルス、ピコルナウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、パポヴァウィルス、疱疹ウィルス、ポックスウィルス、ヘパドナウィルス、アストロウィルス、コクサッキーウィルス、パラミキソウィルス属、オルトミキソウィルス属、エコーウィルス、エンテロウィルス、カルジオウィルス、トガウィルス、ラブドウィルス、ブンヤウィルス、アレナウィルス、ボルナウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、及びフラビウィルスから成る群より選択されるウィルスにより引き起こされる症候群に罹患することを妨げる方法も提供する。
【００４４】
本発明は、ここで解説されたインターフェロン・ポリペプチドをある量、対象に投与するステップを含む、対象がインフルエンザに罹患することを妨げる方法を提供する。本発明は、ここで解説されたインターフェロン・ポリペプチドをある量、対象に投与するステップを含む、対象がインフルエンザに罹患するリスクを減らす方法を提供する。ここで解説された方法のある実施態様では、対象はヒトである。該対象には、限定はしないが、イヌ、ネコ、サル、及び家畜が含まれる。
【００４５】
本発明は、治療、防止、予防、及びここで解説されたリスクの低下の方法のいずれかのための医薬の調製に向けた、ここで解説されたインターフェロン・ポリペプチドの使用を提供する。
【００４６】
本発明は、インターフェロン組成物を、対象に本組成物を投与するための指示と共に含む医薬梱包物を提供する。該指示には書面及び／又は図面での指示が含まれよう。該指示は、治療、防止、予防、及びここで解説されたリスクの低下の方法のいずれのためであってもよい。
【００４７】
更に本発明は、例えば一つ以上のアミノ酸残基が野生型インターフェロンとは異なり、当該野生型インターフェロンの一つ以上の生物学的活性を阻害するような機能的アンタゴニストも考察する。このようなアンタゴニストは、内因性インターフェロンの異常な過発現又は他の活性化を原因とする異常を治療するために用いることができる。該機能的アンタゴニストを医薬製剤に調合してもよい。
【００４８】
更に本発明は、インターフェロン・ポリペプチドの生物学的活性を亢進又は阻害することのできる化合物を同定するスクリーニング法も提供するものであり、該スクリーニング法は、インターフェロン・ポリペプチドにより亢進する受容体を、候補化合物に、インターフェロン・ポリペプチドの存在下で接触させるステップと、前記候補化合物及びインターフェロン・ポリペプチドの存在下における抗ウィルス活性などを検定するステップと、前記活性を、標準レベルの活性と比較するステップであって、前記標準が、前記化合物の非存在下で前記受容体とインターフェロンとを接触させたときに検定される、ステップと、を含む。この検定では、前記標準に比べたときの活性の増加は、前記候補化合物が、インターフェロン活性のアゴニストであることを示し、そして前記標準に比べたときの活性の減少は、前記化合物がインターフェロン活性のアンタゴニストであることを示すものである。
【００４９】
本発明の更なる局面は、身体内のインターフェロン活性レベルを上昇させる必要のある動物を治療する方法に関係し、該方法は、このような動物に、本発明の単離されたインターフェロン・ポリペプチド又はそのアゴニストを治療上有効量、含む組成物を投与するステップを含む。
【００５０】
本発明の更なる局面は、身体内のインターフェロン活性レベルを低下させる必要のある動物を治療する方法であり、該方法は、このような動物に、インターフェロン・アンタゴニストを治療上有効量、含む組成物を投与するステップを含む。本発明で用いるために好適なアンタゴニストは、インターフェロン特異抗体である。
【００５１】
上記の投薬量の投与は一日おきでもよいが、好ましくは１週間に１回又は２回であるとよい。用量は通常、少なくとも２４週間にわたって注射によって投与される。
【００５２】
該用量の投与は、静脈内、皮下、筋肉内、又はいずれか他の許容可能な全身法であってよい。担当医の判断に基づき、投与される薬物量や、用いる治療計画は、もちろん、治療しようとする患者の年齢、性別及び医療暦、好中球数（例えば好中球減少症）の重篤度）、局部的な毒性や全身の副作用を証左とする、特定の疾患状態の重篤度や治療に対する患者のトレランスに依拠するであろう。投薬量及び頻度を、好中球数の最初のスクリーニングの間に判定してもよい。
【００５３】
従来の医薬調合物を、本発明のインターフェロン組成物を用いて調製することもできる。当該の調合物は、治療上有効量のインターフェロン・ポリペプチドを、薬学的に許容可能な担体と一緒に含む。例えば、必要であればアジュバント、希釈剤、保存剤及び／又は可溶化剤を本発明の実施に用いてもよい。本発明のものを含むインターフェロンの医薬組成物には、ある範囲のｐＨ及びイオン強度を有する多様な緩衝剤（例えばTris-HCl、酢酸塩、リン酸塩）の希釈剤、担体（例えばヒト血清アルブミン）、可溶化剤（例えばポリオキシエチレン・ソルビタン又はTWEENTMポリソルベート）、及び保存剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）を含めてもよい。例えば米国特許第4,496,537号を参照されたい。
【００５４】
上記の状態を治療するために投与されるインターフェロン組成物の治療的量は、当該組成物のインターフェロン活性に基づく。それは、正の臨床応答に有意に影響するのに有効な量である。ウィルス感染の治療の場合、正の臨床応答は、対象におけるウィルス粒子の濃度の減少や、あるいはより一般的には感染の症状の減少によって示されるであろう。予防的治療の場合、正の臨床応答は、例えば、対象内のウィルス粒子の非存在、対象内のウィルス粒子濃度の減少、あるいは、対象内のウィルス濃度を、ウィルス感染の症状を対象が示す閾値濃度よりも低く維持することで示されるであろう。ここで用いられる場合の、予防的治療には、対象が、ウィルスにより引き起こされる異常に罹患しないように妨げることが含まれる。
【００５５】
臨床上の用量により患者の中にはある程度の副作用が起きることがあるであろうが、ヒトを含む哺乳動物にとっての最大の用量は、手に負えない程臨床上重大な副作用が起きないような最高の用量である。本発明の目的のためには、このような臨床上重大な副作用とは、重篤な感冒様症状、中枢神経系の抑制、重篤な胃腸管の異常、脱毛、重篤な掻痒又は発疹を原因とする治療中止を必要とするものである。実質的な白血球及び／又は赤血球及び／又は肝酵素の異常又は貧血様の状態によっても、用量は制限を受ける。
【００５６】
当然ながら、インターフェロンの投薬量は、選択された処方によっては幾分、異なるであろう。しかしながら、一般的には、インターフェロン組成物は、当該哺乳動物の状態に基づき、
一日当たり約 100,000 乃至約数百万 IU/m2の範囲の量、投与される。上記の範囲は例示的であり、当業者であれば、臨床経験及び治療指標に基づいて、選択されたインターフェロンの最適な投薬量を決定することであろう。
【００５７】
本医薬組成物は、当業で公知の方法に従って調製された、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、凍結乾燥粉末等の形であってよい。更に、このような組成物の投与は、主に非経口投与によるであろうが、当業者のニーズに応じては経口又は吸入経路も用いてよいと考えられる。
【００５８】
DNA又はRNAなどの核酸に関してここで用いられる用語「単離された」とは、当該巨大分子の天然源に存在する、それぞれ他のDNA又はRNAから分離された分子を言う。単離されたという用語は、更に、組換えDNA技術により作製された場合には細胞物質又は培地を、あるいは化学合成された場合には化学的前駆体又は他の化学物質を、実質的に伴わない核酸又はペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を言う。更に、「単離された核酸」には、断片としては天然で生じず、かつ天然状態で見られないであろう核酸断片が含まれるものと、意図されている。
【００５９】
クエリー配列と対象の配列との間の最良の全体的な対合を判定する好適な方法は、グローバル配列アライメントとも言及され、FASTDBコンピュータ・プログラムをBrutlag
et al. （Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990））のアルゴリズムに基づいて用いて判定することができる。用語「配列」には、ヌクレオチド及びアミノ酸配列が含まれる。配列アライメントにおいて、クエリー配列及び対象配列は、両者がヌクレオチドであるか、あるいは両者がアミノ酸配列である。前記のグローバル配列アライメントの結果は、パーセント同一性として提示される。パーセント同一性を計算するためにDNA配列のFASTDB検索で用いられる好適なパラメータは： Matrix＝Unitary、k-tuple=4、ミス対合ペナルティ＝1、ジョイニング・ペナルティ＝30、ランダム化グループ・レングス＝0、及びカットオフ・スコア＝1、ギャップ・ペナルティ＝5、ギャップ・サイズ・ペナルティ0.05、及びウィンドウ・サイズ＝500
又はヌクレオチド塩基でのクエリー配列長のいずれか短い方、である。パーセント同一性や、アミノ酸アライメントの類似性を計算するために用いられる好適なパラメータは：Matrix=PAM 150、k-tuple=2、ミス対合ペナルティ＝1、ジョイニング・ペナルティ＝20、ランダム化グループ・レングス＝0、カットオフ・スコア＝1、ギャップ・ペナルティ＝5、ギャップ・サイズ・ペナルティ＝0.05、及びウィンドウ・サイズ＝500又はアミノ酸残基でのクエリー配列長のいずれか短い方、である。
【００６０】
タンパク質及び／又は核酸配列の相同性を、当業で公知の多種の配列比較アルゴリズム及びプログラムのいずれかを用いて評価してもよい。このようなアルゴリズム及びプログラムには、決して限定はしないが、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、及びCLUSTALW がある（Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85(8）:2444-2448;
Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3）:403-410; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(2）:4673-4680; Higgins et al., 1996, Methods
Enzymol. 266:383-402; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3）:403-410; Altschul et al., 1993, Nature
Genetics 3:266-272）。
【００６１】
ある特に好適な実施態様では、タンパク質及び核酸配列の相同性を、当業で公知のベーシック・ローカル・アライメント・サーチ・ツール（「BLAST」）、を用いて評価する（例えばKarlin
and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:2267-2268; Altschul et al.,
1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics
3:266-272; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402を参照されたい）。特に、五つの具体的なBLAST プログラムを用いて以下のタスクを行う：
（１）BLASTP 及びBLAST3 で、アミノ酸クエリー配列をタンパク質配列データベースに比較する；
（２）BLASTNで、ヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチド配列データベースに比較する；
（３）BLASTX で、クエリーヌクレオチド配列（両方の鎖）、の６フレーム仮説翻訳産物をタンパク質配列データベースに比較する；
（４）TBLASTNで、クエリータンパク質配列を、６つの読み枠全てで翻訳された（両方の鎖）、ヌクレオチド配列データベースに比較する；そして
（５）TBLASTX で、ヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳を、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳に比較する。
【００６２】
BLASTプログラムは、クエリーアミノ酸又は核酸配列と、好ましくはタンパク質又は核酸配列データベースから得られる検査配列との間の「高スコアセグメント・ペア」とここで言及される類似のセグメントを特定することにより、相同配列を特定する。高スコアセグメント・ペアは、好ましくは、その多くが当業で公知の採点マトリックスにより特定される（即ちアライメントされる）とよい。好ましくは、用いられる該採点マトリックスがBLOSUM62 マトリックス（Gonnet et
al., 1992, Science 256:1443-1445; Henikoff and Henikoff, 1993, Proteins
17:49-61）であるとよい。 次に好ましくは、PAM 又はPAM250マトリックスを用いてもよい（例えば Schwartz and Dayhoff, eds.,
1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence
and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundationを参照されたい）。
【００６３】
BLAST プログラムは、特定された高スコアセグメント・ペアの全ての統計学的有意性を評価するが、好ましくは、例えばユーザが特定したパーセント相同性など、ユーザが特定する有意性の閾値を満たすようなセグメントが選択されるとよい。好ましくは、高スコアセグメント・ペアの統計学的有意性をKarlin （例えばKarlin and
Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2267-2268を参照されたい）の統計学的有意性の公式を用いて評価するとよい。
【００６４】
上記のアルゴリズムで用いられるパラメータを、研究される配列の長さや相同性の程度に応じて適合させてもよい。いくつかの実施態様では、該パラメータは、ユーザからの指示のないときにアルゴリズムが用いるデフォルト・パラメータであってもよい。
【００６５】
いくつかの実施態様では、Brutlag et
al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990で解説されたFASTDBアルゴリズムを用いる。このような分析では、該パラメータを以下の通りに選択してもよい：Matrix=Unitary、k-tuple＝4、ミス対合ペナルティ＝1、ジョイニング・ペナルティ＝30、ランダム化グループ・レングス＝0、カットオフ・スコア＝1、ギャップ・ペナルティ＝5、ギャップ・サイズ・ペナルティ＝0.05、ウィンドウ・サイズ＝500又はプローブにハイブリダイズする配列の長さのいずれか短い方。
【００６６】
FASTAなど、上記の方法及びアルゴリズムを、研究される配列の長さ及び相同性の程度に応じたパラメータ、例えばユーザからの指示がないときにアルゴリズムが用いるデフォルト・パラメータなど、と一緒に用いて、ある核酸にコードされたタンパク質に少なくとも 99.25%、少なくとも 98%、少なくとも 97%、 少なくとも 96%、 少なくとも 95%、 少なくとも 90%、少なくとも 85%、少なくとも 80% 又は少なくとも 75% の相同性を有するタンパク質をコードする核酸を得ることができる。いくつかの実施態様では、相同性レベルを、「デフォルト」オープニング・ペナルティ及び「デフォルト」ギャップ・ペナルティと、PAM250などのスコアリング・マトリックス（標準的スコアリング・マトリックス；Dayhoff et al., in: Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5,
Supp. 3 (1978）を参照されたい）とを用いて決定することができる。
【００６７】
代替的には、ポリペプチドの相同性のレベルを、Brutlag
et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990に解説されたFASTDBアルゴリズムを用いて判定してもよい。このような解析では、該パラメータを以下の通りに選択してもよい：Matrix=PAM 0、k-tuple=2、ミス対合・ペナルティ=1、ジョイニング・ペナルティ=20、ランダム化グループ・レングス=0、カットオフ・スコア=1、ウィンドウ・サイズ=配列長、ギャップ・ペナルティ=5、ギャップ・サイズ・ペナルティ=0.05、ウィンドウ・サイズ=500又は相同配列の長さのいずれか短い方。
【００６８】
更に本発明は、ここで解説されたものより低い同一性の程度を有するが、同じ機能のうちの一つ以上を行うためには充分な類似性を有するような配列も包含する。類似性は、保存的アミノ酸置換により決定される。このような置換は、あるポリペプチドの中のあるアミノ酸を、同様な特徴の別のアミノ酸へ置換するものである。保存的置換は表現型上サイレントである可能性が高い。典型的に保存的置換として見られるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、及びIleの中の一つのものが別のものに替わる置換、ヒドロキシル残基Ser 及びThr同士の置換、酸性残基Asp 及びGluの交換、アミド残基Asn 及びGln間の置換、 塩基性残基Lys 及び Argの交換、そして芳香族残基Phe、Tyr間の置換である。どのアミノ酸変化が表現型上サイレントになる可能性が高いかに関する指針はBowie et al., Science 247:1306-1310 (1990）に見られる。
【００６９】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するためには、当該の配列を最適な比較を目的としてアライメントする（例えば、最適なアライメントのためにギャップを第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入することができ、相同でない配列は、比較を目的とした場合には無視することができる）。ある好適な実施態様では、ある基準配列の長さのうちの少なくとも 30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は 90%以上を、比較を目的としてアライメントする。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある位置が、第二の配列の対応する位置にあるのと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められていれば、それら分子はその位置において同一ということになる（ここで用いられるアミノ酸又は核酸の「同一性」はアミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間のパーセント同一性は、これら２つの配列を最適にアライメントするために導入する必要のあるギャップの数や、各ギャップの長さを考慮に入れたときの、これら配列に共通の同一位置の数の関数である。
【００７０】
２つの配列間の配列の比較や、パーセント同一性及び類似性の決定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができる（Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University
Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.
W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data,
Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey,
1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press,
1987; and Sequence Analysis primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M
Stockton Press, New York, 1991）。ある好適な実施態様では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を、GCGソフトウェア・パッケージ（http://www.gcg.comで入手できる）のGAPプログラムに組み込まれたニードルマン及びワンシュ（J. Mol. Biol. (48）:444-453 (1970））のアルゴリズムを用い、Blossum 62 マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれかを用いて、ギャップ・ウェイトを16、14、12、10、8、6、又は4にし、レングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6 にして、決定する。更に別の好適な実施態様では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、GCG ソフトウェア・パッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1）:387 (1984））、（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMP マトリックスを用いて、ギャップ・ウェイトを40、50、60、70、又は80にし、そしてレングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は 6にして判定する。別の実施態様では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれたE.マイヤース及び W. ミラー（CABIOS, 4:11-17 (1989））のアルゴリズムを用い、PAM120 ウェイト残基表、12のギャップ・レングス・ペナルティ及び4のギャップ・ペナルティを用いて判定する。
【００７１】
本発明の核酸及びタンパク質配列を更に「クエリー配列」として用いて、他のファミリ・メンバ又は関連する配列を特定するなどのために配列データベースに対して検索を行うことができる。このような検索は、Altschul, et al. （J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990））のNBLAST 及びXBLAST プログラム（バージョン2.0）を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラムで、スコア=100、ワードレングス=12として行って、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、 XBLASTプログラムで、スコア=50、ワードレングス=3として行うと、本発明のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップのあるアライメントをするには、ギャップドBLAST をAltschul et al. （Nucleic Acids Res. 25(17）:3389-3402 (1997））に解説された通りに用いることができる。BLAST及びギャップドBLASTプログラムを用いる場合は、各プログラム（例えばXBLAST 及びNBLAST）、のデフォルト・パラメータを用いることができる。本発明の実施にあたっては、そうでないと明示しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の、当業者に公知の従来技術を用いることになるであろう。このような技術は文献に解説されている。例えば
Molecular Cloning A
Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook,
Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989）; DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985）; Oligonucleotide, synthesis (M. J. Gait ed., 1984）; Mullis et al. U.S. Patent No:
4,683,195; Nucleic Acid Hybridization
(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984）; Transcription And
Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984）; Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987）; Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986）; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984）; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press,
Inc., N.Y.）; Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells
(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory）; Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.）Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987）; Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and
C. C. Blackwell, eds., 1986）; Manipulating the Mouse
Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,
1986）、を参照されたい。
【００７２】
配列表内でここに解説されたヌクレオチド及びアミノ酸配列において、ヌクレオチド配列に関して「n」又は「x」はいずれかのヌクレオチドを言う場合があり、他方、タンパク質配列に関しては、「n」又は「x」はいずれかのアミノ酸を言う場合がある。
【００７３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求の範囲から明白であろう。
【００７４】
発明の詳細な説明
Ｉ．  製剤例
別の局面では、本発明は、インターフェロン、インターフェロン・アゴニスト又はインターフェロン・アンタゴニストを含む医薬製剤を提供するものである。本方法で用いるための該インターフェロン、インターフェロン・アゴニスト及び／又はインターフェロン・アンタゴニストは、例えば水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、又はこれらの適した混合物など、生物学的に許容可能な媒質と一緒に、投与に向けて適宜、調合できよう。選択された媒質中の活性成分の最適な濃度は、医学化学者に公知の手法に従い、経験的に決定することができる。ここで用いられる場合の「生物学的に許容可能な媒質」には、医薬製剤の所望の投与経路にとって適しているであろうあらゆる溶媒、分散媒等が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質の使用は当業で公知である。従来のいずれかの媒質及び作用物質が本発明の組成物の活性にとって不適合である場合を除き、本発明の医薬製剤中へのその使用は考察されている。他のタンパク質を含む適した伝播体及びそれらの処方は、例えば書籍レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンセズ（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,
Easton, Pa., USA 1985）などに解説されている。これらの伝播体には、注射可能な「デポー調合物」が含まれる。
【００７５】
本発明の医薬調合物には、更に、例えば家畜、ヒト以外の霊長類、又はイヌ及びネコなどのペットの治療用など、例えば獣医学用途に適した本発明の組成物の医薬製剤などの獣医用組成物も含めることができる。
【００７６】
再充填可能又は生分解性の器具を導入方法としてもよい。近年、タンパク質様バイオ医薬を含め、薬物の制御送達のために多様な遅延放出ポリマ器具が開発されており、in vivoでテストされている。生分解性及び非分解性ポリマの両方を含め、多種の生分解性ポリマ（ヒドロゲルを含む）を用いて、特定の標的部位での持続放出用のインプラントを形成することができる。
【００７７】
本発明の製剤を経口、非経口、局所、鞘内／脳室内（ICV）、頭蓋内、中枢神経系に直接（腔内）又は直腸経由で投与してもよい。これらはもちろん、各投与経路に適した形で投与される。例えばこれらは錠剤又はカプセル型で、注射、吸入、点眼剤、軟膏、座薬、制御放出パッチ等により、注射、輸注又は吸入による投与；点眼剤又は軟膏による局所；及び座薬による直腸で投与される。いくつかの実施態様では、経口及び局所投与が好ましいであろう。ある実施態様では、当該のインターフェロンを鼻咽頭粘膜に直接、送達する。ある実施態様では、当該のインターフェロンを肺上皮に直接、送達する。これにより、これらの組織を全身送達のための伝播体として用いるのではなく、これらの細胞は、ウィルスに対して耐性となるであろう。この場合、全身のインターフェロンが最小限となり、その結果副作用は最小限となるか、あるいは無くなるであろう。
【００７８】
ここで用いる場合の文言「非経口投与」及び「非経口投与する」とは、通常は注射による、腸管内及び局所投与以外の投与形態を意味し、その中には、限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、角皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、及び胸骨内注射及び輸注がある。
【００７９】
ここで用いる場合の文言「全身投与」、「全身投与する」、「末梢投与」及び「末梢投与する」は、例えば皮下投与など、それが患者の全身に進入し、こうして代謝及び他の同様のプロセスを受けるような、中枢神経系、膀胱又は身体の他の区画へ直接する以外の化合物、薬物又は他の物質の投与を意味する。
【００８０】
これらの化合物を、経口、スプレーなどによる鼻孔、直腸、経膣、非経口、槽内及び粉末、軟膏又は、口腔内及び舌下を含むドロップによる局所を含め、いずれかの適した投与経路により、治療のためにヒト及び他の動物に投与してよい。
【００８１】
選択された投与経路に関係なく、適した水和化型で用いてもよい本発明の化合物、及び／又は、本発明の医薬組成物は、以下に解説するような、あるいは、当業で公知の他の従来の方法により、薬学的に許容可能な剤形に調合される。
【００８２】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、患者にとって毒性となることなく、特定の患者、組成物及び投与形態にとって、所望の治療的応答を達成するために有効な活性成分量が得られるように変更してもよい。
【００８３】
選択された投薬レベルは、用いる本発明の特定の化合物、あるいはそのエステル、塩又はアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排出速度、治療の期間、用いる特定の組成物と組み合わせて用いる他の薬物、化合物及び／又は物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び以前の医療暦等、医業で公知の因子を含む多種の因子に依存するであろう。
【００８４】
当業で通常の技術を有する医師又は獣医であれば、必要となる医薬組成物の有効量を容易に決定でき、また処方することができる。例えば、該医師又は獣医は、当該医薬組成物中に用いる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要な量より少ないレベルで開始し、所望の効果が達成されるまでこの投薬量を次第に増加させていってもよいであろう。
【００８５】
一般的には、本発明の化合物の適した一日当たりの用量は、治療効果を生むために有効な最低の用量である化合物量であろう。このような有効な用量は、一般的には上に解説した因子に依存するであろう。
【００８６】
必要であれば、活性化合物の有効な一日当たりの用量を、全日にわたって、選択的には単位剤形で、適当な間隔をおきながら２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上の回数に小分けした用量にして別々に投与してもよい。
【００８７】
用語「治療」は、予防、療法、治癒、及び感染の広がりの防止も包含するものとして意図されている。
【００８８】
この治療を受ける患者は、霊長類、特にヒト、及び他の哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ブタ、げっ歯類及びヒツジ；並びに一般的な家禽類及びペットを含め、必要なあらゆる動物又は動物ベクタ（ウィルス源）である。
【００８９】
本発明の化合物は、それ単独で、あるいは、薬学的に許容可能な及び／又は無菌の担体との混合物として投与することができ、そして他の薬剤と併せて投与することもできる。このような薬剤の非限定的な例には、ペニシリン、セファロスポリン、アミノグリコシド、及びグリコペプチドなどの抗菌剤がある。従って、併用療法には、最初に投与されるものの治療効果が、次のものが投与されるときには完全には消えていないようなな態様で、活性化合物を順次、同時及び別々に投与することが含まれる。
【００９０】
ＩＩ．医薬組成物
本発明の化合物を単独で投与することも可能であるが、本化合物を医薬調合物（組成物）、として投与することが好ましい。本発明の組成物は、ヒトの医療又は獣医学的医療での使用に向けて、いずれかの便利な方法での投与用に調合できよう。いくつかの実施態様では、本医薬製剤に含有させる化合物は、それ自体で活性であっても、あるいは、例えば生理条件下で活性な化合物に転化し得るなど、プロドラッグであってもよい。
【００９１】
このように、本発明の別の局面は、治療上有効量の一種以上の上記の化合物を、一種以上の薬学的に許容可能な担体（添加剤）、及び／又は希釈剤と一緒に調合して含む、薬学的に許容可能な組成物を提供するものである。以下に詳述するように、本発明の医薬組成物を、以下：（１）経口投与、例えば飲薬（水性又は非水性の溶液又は懸濁液）、錠剤、巨丸剤、粉末、顆粒、舌への塗布用のペースト；（２）無菌の溶液又は懸濁液などとしての、皮下、筋肉内又は静脈内注射などによる非経口投与；（３）皮膚に塗布するクリーム、軟膏又はスプレーなどとしての局所投与；又は（４）ペッサリ、クリーム又はフォームなどとしての膣内又は直腸内、に適合させたものを含め、固体又は液体形での投与に特に調合してもよい。しかしながら、いくつかの実施態様では、本化合物を、単に無菌水に溶解又は懸濁させるだけでもよい。
いくつかの実施態様では、本医薬製剤は無発熱源であり、即ち、患者の体温を上昇させない。
【００９２】
文言「治療上有効量」とは、ここで用いられる場合、本発明のある化合物、物質、又は、本発明の化合物を含む組成物の量であって、いずれの医学的治療にも適用できる妥当な利益／リスク比で、動物の細胞の少なくとも一下位集団において何らかの所望の治療効果を生み、ひいては、治療された細胞中でその経路の生物学的結果を遮断するために有効な量を意味する。
【００９３】
文言「医学的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内にあり、過剰な毒性、刺激、アレルギ反応、又は他の問題又は合併症なく、妥当な利益／リスク比でヒト及び動物の組織と接触させて用いるために適した、化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を言うためにここで用いられている。
【００９４】
ここで用いる場合の文言「薬学的に許容可能な担体」は、当該のアゴニストを、一臓器又は身体部分から別の臓器又は身体部分に運ぶ又は輸送することに関与する、液体又は固体の充填剤、希釈剤、医薬品添加物、溶媒又は封入剤などの薬学的に許容可能な物質、組成物又は伝播体を意味する。各担体は、調合物の他の成分に対して適合性であり、かつ、患者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容可能な担体として役立てることのできる物質のいくつかの例には：（１）乳糖、ブドウ糖及びショ糖などの糖類；（２）コーンスターチ及びいもでんぷんなどのでんぷん；（３）例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバター及び座薬用ろうなどの医薬品添加物；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油脂類；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）無発熱源水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；及び（２１）医薬調合に用いられる他の非毒性適合性物質、がある。
【００９５】
ＩＩＩ．  処方例
本発明のインターフェロンを、取り込み、分布及び／又は吸収を助けるために、例えばリポソーム、ポリマ、受容体標的化分子、経口、直腸、局所もしくは他の調合物などとして、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と混合、封入、結合又は他の方法で結び付けてもよい。本インターフェロンを、浸透促進剤、担体化合物及び／又はトランスフェクション剤も含む処方にして提供することもできる。
【００９６】
更に本発明の組成物は、ヒトを含む動物に投与されたときに、生物学的に活性な代謝産物又はその残渣を（直接又は間接的に）提供することのできる、いずれかの薬学的に許容可能な塩、エステル又はこのようなエステルの塩、あるいはいずれか他の化合物も包含する。従って、例えば、本開示は、薬学的に許容可能な塩及び他の生物学的均等物にも関する。
【００９７】
薬学的に許容可能な塩基添加塩は、例えばアルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミンなど、金属又はアミンと一緒に形成される。カチオンとして用いられる金属の例はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等である。適したアミンの例は、N,NI-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N-メチルグルカミン、及びプロカイン（例えばBerge et al., "Pharmaceutical Salts," J. of Pharma Sci.,
1977, 66,1-19を参照されたい）である。前記酸性化合物の塩基添加塩は、従来の態様でその遊離酸型を、充分な量の所望の塩基に接触させて塩を形成させることにより、調製される。遊離酸型は、従来の態様でその塩型を酸に接触させ、遊離酸を単離することによって再生できよう。遊離酸型はそれらの各塩型とは、極性溶媒中での可溶性など、いくつかの物理的特性の点で幾分、異なるが、他の点では、塩は、本発明の目的のために、それらの各遊離酸型に均等である。ここで用いられる、「医薬添加塩」には、本発明の組成物の成分のうちの一つの酸型の薬学的に許容可能な塩が含まれる。これらには、アミンの有機又は無機酸塩が含まれる。好適な酸塩は塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。他の適した薬学的に許容可能な塩が当業者に公知であり、その中には多様な無機及び有機酸の塩基性塩が含まれる。
【００９８】
Ａ．  超分子複合体
いくつかの実施態様では、 本調合物は「超分子複合体」の一部である。更に実例を挙げると、本インターフェロンを少なくとも一種のポリマに接触させてコンポジット（原語：composite）、を形成させ、その後このコンポジットのポリマを、本インターフェロンと多次元ポリマ・ネットワークとを含有する超分子複合体を形成するために充分な条件下で処理することができる。該ポリマ分子は直線状でも、又は分枝状であってもよい。従って、二種以上のポリマ分子の一群が、直線状でも、分枝状でも、あるいは直線状及び分枝状ポリマの混合物であってもよい。該コンポジットを、当業で公知のいずれの適した手段により調製してもよい。例えば、単に本インターフェロンをポリマに接触、混合又は分散させることにより、該コンポジットを形成してもよい。コンポジットは、発現コンストラクトの存在下で直線状又は分枝状ポリマを形成することのできる、同じでも、又は異なっていてもよい単量体を重合化させることによっても調製できよう。該コンポジットを、更に、発現コンストラクトの細胞内取り込みを命令するか、あるいは、in vivoで発現コンストラクトの 組織又は細胞内分布を行わせるためなど、少なくとも１つのリガンドで改変してもよい。該コンポジットはいずれの適した形を採ってもよいが、好ましくは粒子の形であるとよい。
【００９９】
いくつかの好適な実施態様では、本インターフェロンを陽イオンポリマと一緒に調合する。陽イオン・ポリマの例には、ポリ（L）、リジン（PLL）、及びポリエチレンイミン（PEI）、がある。いくつかの好適な実施態様では、当該の発現コンストラクトを、β-シクロデキストリン含有ポリマ（βCD-ポリマ）、と一緒に調合する。βCD-ポリマは核酸とポリプレックス（原語：polyplex）、を形成して、培養細胞にトランスフェクトすることができる。βCD-ポリマは、例えばジアミノ-シクロデキストリン単量体Ａをジイミデート共単量体Ｂと縮合させることにより、合成することができる。シクロデキストリンは天然で生じるD(＋）、-グルコピラノース単位をα-（1,4）、結合に含有する環状の多糖である。最もよくあるシクロデキストリンは、それぞれ６個、７個又は８個のグルコピラノース単位を含有するα-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン及びγ-シクロデキストリンである。本インターフェロンの送達に容易に適合させることのできるシクロデキストリン送達系の例は、例えば、Gonzalez et al のPCT 出願 WO00/01734 及びDavisのPCT出願 WO00/33885に解説されている。
【０１００】
いくつかの実施態様では、超分子複合体を凝集させて、例えば20乃至5000ナノメータ（nm）の間の平均直径を有する粒子の調合物などの粒子にする。別の実施態様では、該粒子は、20乃至200nmの間の平均直径を有する。別の実施態様では、該粒子は、2乃至10ミクロンの間の平均直径を有する。2乃至10ミクロンの間の粒子サイズの使用を、例えば肺への送達などに用いてよい。
【０１０１】
Ｂ．他の陽イオン性、非脂質調合物
いくつかの実施態様では、本インターフェロンを、陽イオン性の非脂質伝播体中に提供し、呼吸管を通じたエーロゾル送達で用いるために調合する。dsRNA 及びdsRNA-コーディング・プラスミドなどのポリ（エチレンイミン）及び巨大分子を用いた調合物により、肺のトランスフェクション・レベルを高くし、噴霧療法中の安定性を高めることができる。PEI-核酸調合物も、肺への高い特異性を示すことができる。
【０１０２】
インターフェロンをPEIと一緒に調合することに加え、本発明は更に、シクロデキストリン-改変ポリ（エチレンイミン）などのシクロデキストリン-改変ポリマの使用も考察する。いくつかの実施態様では、本ポリマは式：
【０１０３】
【化１】
2006526022.tif 000002
【０１０４】
の構造を有し、但し式中、Rはそれぞれ個別にH、低級アルキル、シクロデキストリン部分、又は
【０１０５】
【化２】
2006526022.tif 000003
【０１０６】
を表し；そして
mは、それぞれ個別に、2乃至10,000、好ましくは10乃至5,000、又は100乃至1,000の整数を表す。
【０１０７】
いくつかの実施態様では、R
は、シクロデキストリン部分を別にして第一級アミン（即ちHを表すRを２つ持つ）であろう窒素原子の少なくとも 約 1%、より好ましくは 少なくとも 約 2%、又は少なくとも 約 3%、そして最高約 5% 又は更に10%のシクロデキストリンを表す。
【０１０８】
いくつかの実施態様では、該シクロデキストリン部分は、重量で当該のシクロデキストリン-改変ポリマの少なくとも重量で約 2%、3% 又は4%、最高5%、7%、又は更に10% を成す。
【０１０９】
いくつかの実施態様では、当該ポリマ中のエチレンイミン・サブユニットの少なくとも
重量で約 2%、3% 又は4%、最高で5%、7%、又は更に10% が、シクロデキストリン部分で改変されている。
【０１１０】
シクロデキストリン部分による誘導体化を受けやすい求核性アミノ置換基を持つポリ（エチレンイミン）のコポリマも、本発明の範囲内のシクロデキストリン-改変ポリマを調製するために用いることができる。
【０１１１】
シクロデキストリン部分の例には、例えばシクロデキストリン及び酸化シクロデキストリンなど、7乃至9個の糖部分から基本的に成る環状構造がある。シクロデキストリン部分は、選択的には、環状構造と、好ましくはジカルボン酸誘導体（例えばグルタール酸誘導体、コハク酸誘導体等）、などのアルキル鎖や、オリゴエチレングリコール鎖などのヘテロアルキル鎖など、1乃至20個の原子を鎖に有するようなポリマ骨格との間に共有結合を形成するリンカ部分を含む。
【０１１２】
Ｃ．リポソーム調合物
いくつかの実施態様では、本発明は、リポソームに封入された又は結合させたインターフェロンを含む組成物を提供する。リポソームとは、ここで用いる場合、水性の内部を封入する一つ以上の脂質二重層上に典型的に形成された外側の脂質の殻を有する脂質のベシクルを言う。ある好適な実施態様では、該リポソームは、約20乃至80モルパーセントの陽イオン性のベシクル形成脂質と、残りの中性のベシクル形成脂質及び／又は他の成分とから構成された陽イオン性リポソームである。ここで用いられる場合の「ベシクル形成脂質」とは、例としてはホスホリピドなど、疎水性かつ極性の頭基部分を有すると共に、水中でそれ自体に自発的に二重層ベシクルを形成することができる両親媒性の脂質を言う。好適なベシクル形成脂質は、例えばホスホリピドなど、そのアシル鎖が典型的に約14乃至22個の炭素原子長を有し、様々な程度、不飽和になっているようなジアシル鎖脂質である。
【０１１３】
陽イオン性のベシクル形成脂質とは、その極性の頭基が、ｐＨ４乃至９など、作業を行うｐＨにおいて正味で正の電荷を持つものである。典型的な例には、ホスホリピド、例えばホスファチジルエタノールアミンなど、その極性の頭基をリジンなどの正の部分で誘導体化させたもの、例えばL-リジンで誘導体化させた脂質DOPE（LYS-DOPE）、がある（Guo, et al., 1993）。更にこのクラスには、陽イオン性の極性の頭の基を有するセレブロシド及びガングリオシドなどのグリコリピドが含まれる。
【０１１４】
用いてもよい別の陽イオン性ベシクル形成脂質はコレステロールアミン及び関連する陽イオン性ステロールである。陽イオン性脂質の例には、1,2-ジオレオイルオキシ-3-（トリメチルアミノ）プロパン (DOTAP）；N-[1-（2,3,-ジテトラデシルオキシ）プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド (DMRIE）；N-[1-（2,3,-ジオレイルオキシ）プロピル]-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド (DORIE）；N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ） プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド (DOTMA）；3β［N-（N',N'-ジメチルアミノエタン）カルバモイル] コレステロール (DC-Chol）；及びジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB）、がある。
【０１１５】
当該リポソームの残りは、中性のベシクル形成脂質、即ち、正味の電荷を持たないか、あるいは、極性の頭の基に負の電荷を有する脂質を少ないパーセンテージ、含有していてもよいことを意味するベシクル形成脂質、から形成される。このクラスの脂質に含まれるのは、ホスファチジルコリン（PC）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ホスファチジルイノシトール（PI）、及びスフィンゴミエリン（SM）、などのホスホリピドや、コレステロール、コレステロール誘導体、及び他の無電荷のステロール類である。
【０１１６】
上記の脂質は市販のものを得ることも、あるいは、公開された方法に従って調製することもできる。本発明に含めることのできる他の脂質はセレブロシド及びガングリオシドなどのグリコリピドである。
【０１１７】
本発明の一実施態様では、該インターフェロン-リポソームの複合体には、プラスミド／リポソーム複合体の血中循環時間を延ばすために有効な、親水性のポリマ鎖の表面被覆を有するリポソームがある。適した親水性ポリマには、シクロデキストリン（CD）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニル-ピロリド-オン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、及び誘導体化セルロース、例えばヒドロキシメチルセルロース又はヒドロキシエチル-セルロースがある。好適な親水性ポリマ鎖はポリエチレングリコール（PEG）であり、好ましくは500乃至10,000ダルトン、より好ましくは1,000乃至5,000ダルトンの分子量を有するPEG鎖としてである。当該の親水性ポリマは、水やクロロホルムなどの非水性溶媒中で可溶性を有しているであろう。
【０１１８】
被覆は、好ましくは、ベシクル形成脂質に、その頭の基でポリマ鎖で誘導体化させたホスホリピド又は他のジアシル鎖脂質を含有させることにより、調製されるとよい。このような脂質を調製する方法や、ポリマで被覆されたリポソームをこのような脂質で形成する方法は、引用をもってその内容をここに援用することとする米国特許第5,013,556号及び第5,395,619号に解説されている。
【０１１９】
前記の親水性ポリマを脂質に安定に結合させたり、あるいは、血流を循環する間、又は、標的部位への局在後に、当該のポリマで被覆されたプラスミド-リポソーム複合体に、その親水性ポリマ・コーティングを離脱させる又は「遊離させる」ような不安定な結合を介して結合させることもできることは理解されよう。刺激に応答してポリマ鎖を遊離させるために有効な結合を介した、親水性ポリマ、特にポリエチレングリコール（PEG）、のベシクル形成脂質への付着は、例えば、引用をもってここに援用することとするWO 98/16202、WO 98/16201やKirpotin, D. et a. (FEBS Letters, 388:115-118 (1996）などに解説されている。
【０１２０】
ある実施態様では、前記の遊離可能な結合は、適した遊離剤の投与により切断される、あるいは、酵素もしくは還元剤の存在下など、選択的生理条件下で切断される、化学的に遊離可能な結合である。例えばエステル及びペプチド結合はエステラーゼ又はペプチダーゼ酵素により切断される。ジスルフィド結合は、グルタチオン又はアスコルビン酸塩などの還元剤の投与や、あるいは、血漿中及び細胞内に存在するシステインなど、in vivoで存在する還元剤により、切断される。
【０１２１】
他の遊離可能な結合には、ｐＨ感受性結合や、グルコース、光又は熱への曝露時に切断される結合がある。一例を挙げると、当該の親水性ポリマ鎖をリポソームにｐＨ感受性結合により付着させると、そのプラスミド-リポソーム複合体に、この結合を切断して該親水性の鎖を遊離させるために有効なｐＨを有する、腫瘍領域などの部位を標的とさせることができる。ｐＨ感受性結合の例には、アシルオキシアルキルエーテル、アセタール及びケタール結合がある。別の例は、前記の切断可能な結合は、含硫結合を言うものとここでは広く意図されているジスルフィド結合である。含硫結合は、選択された程度の不安定性を達成するために合成することができ、その中には、ジスルフィド結合、混合スルフィド−スルホン結合及びスルフィド−スルホキシド結合がある。これら３つの結合のうちで、ジスルフィド結合はチオリシスを最も起こしにくく、スルフィド−スルホキシド結合は最も起こしやすい。
【０１２２】
このような遊離可能な結合は、親水性ポリマ部分のリポソーム複合体からの遊離速度を調節するために有用である。例えば、大変不安定なジスルフィド結合を、血球又は内皮細胞の標的決定のために用いることができる。なぜなら、これらの細胞は容易に到達可能であり、リポソームの血中循環寿命が短くても充分だからである。反対の場面では、複合体を所望の標的に到達させるのに、リポソームの血中循環寿命を長くする必要が概してあるような腫瘍組織又は他の臓器が標的である場合には、より長時間持続する又は丈夫なジスルフィド結合を用いることができる。
【０１２３】
親水性ポリマ鎖をリポソームに付着させている遊離可能な結合は、in vivoでは、典型的には、例えば腫瘍組織の一領域や、あるいは低酸素性の腫瘍などの還元条件のある部位など、僅かにｐＨが低い特定の部位にリポソームが到達したときなど、環境変化の結果として切断される。in  vivoでの還元条件はまた、例えばアスコルビン酸塩、システイン又はグルタチオンなどの還元剤の投与によっても起こさせることができる。切断可能な結合はまた、光又は熱などの外部刺激に応答して破壊されることもある。
【０１２４】
別の実施態様では、該リポソーム複合体が、治療を目的とする標的細胞に特異的に結合するために有効な親和性部分又は標的決定リガンドを含む。このような部分は、リポソームの表面に付着させることも、あるいは、親水性ポリマ鎖の遠位端に付着させることもできる。部分の例には、PCT 出願WO US94/03103、WO 98/16202 及び WO 98/16201などに解説されているように、抗体、標的細胞表面受容体に特異的に結合するリガンド等がある。該部分は、更に、当該複合体の標的細胞との融合を容易にする疎水性部分であってもよい。
【０１２５】
インターフェロンを縮合させるために用いられるポリカチオン性縮合剤は、多重荷電カチオン性ポリマであってよく、好ましくはスペルミジン、スペルミン、ポリリジン、プロタミン、全ヒストン、H1、H2、H3、H4などの特定のヒストン画分、及び他のポリカチオン性ポリペプチドなどの生体高分子であるとよいが、ポリミキシンBなどの生体適合性ポリマも含まれよう。これらのポリカチオン性縮合剤は、例えば硫酸プロタミン及び臭化水素酸ポリリジンなど、遊離塩基又は塩型で用いることができることは理解されよう。ある好適な実施態様では、ポリカチオン性縮合剤は、ここでは全ヒストン又は特定のヒストン画分を含むと言及されたヒストンである。
【０１２６】
いくつかの実施態様では、ポリマ-脂質結合体中の疎水性部分は疎水性ポリペプチド配列である。好ましくは、当該のポリペプチド配列は約 5-80, より好ましくは 10-50個、最も好ましくは20-30個の、非極性及び／又は脂肪族／芳香族のアミノ酸残基から成るとよい。これらの配列は、特定のエンベロープのあるウィルスのホスト細胞への融合を惹起する上で活性であり、その中にはパラインフルエンザ・ウィルス、例えばセンダイ、シミアン・ウィルス-5 (SV5）、はしかウィルス、ニューキャッスル病ウィルス (NDV）、 及び呼吸系発疹ウィルス(RSV）、がある。他の例には、ヒトレトロウィルス、例えばウィルス・エンベロープの、ホスト細胞の細胞膜への融合により細胞に感染する、AIDSの原因物質であるヒト免疫不全ウィルス-1（HIV-1）などがある。融合は生理的（即ち中性）、ｐＨで起き、それに続いて、ホスト細胞の細胞質内区画へのウィルス遺伝物質（ヌクレオカプシド）の注入が起きる。
【０１２７】
D.  リガンドで指向させた調合物
いくつかの実施態様では、本発明による、超分子複合体などのポリマ複合体やリポソームを、標的細胞上の特異的細胞表面タンパク質又はマトリックスに結合させるために有効な一つ以上のリガンドに結び付けることで、複合体の標的細胞への指向を容易にし、そして場合によってはこの細胞によるインターフェロンの取り込みを促すことができる。単に実例を挙げるだけであるが、本発明の超分子複合体及びリポソームを特定の細胞種に標的決定するための使用に適したリガンドの例を下の表１に挙げる。
【０１２８】
【表１】
2006526022.tif 000004
【０１２９】
更に本発明は、複合体の経細胞輸送を促進するリガンドによる、当該のポリマ及びリポソーム複合体の誘導体化も考察する。更に実例を挙げると、インターフェロンの細胞内局在を促すために、超分子複合体などのポリマ複合体を、複合体の細胞膜を透過した転位を惹起する内部移行性ペプチドに共有結合させることができる。この場合、内部移行性ペプチド自体が、比較的高速で経細胞輸送などにより細胞膜を横切ることができる。内部移行性ペプチドは、例えば共有結合による側基などとしてポリマに結合させる。
【０１３０】
ある実施態様では、内部移行性ペプチドをドゥロソフィラ・アンテペネペディア（原語：Drosophila antepennepedia）タンパク質又はその相同体から得る。該ホメオタンパク質アンテペネペディアの６０個のアミノ酸ホメオドメインは、生体膜を透過して転位することが実証されており、それが結合する相手である異種ポリペプチドの転位を促すことができる。例えば Derossi et al. (1994） J Biol Chem 269:10444-10450; and Perez et al. (1992） J Cell Sci 102:717-722を参照されたい。最近、このタンパク質のうちで１６個という少ない数のアミノ酸から成る断片があれば内部移行を誘導するには充分であることが実証された。Derossi et al. (1996） J Biol Chem 271:18188-18193を参照されたい。本発明は、修飾された複合体の膜透過輸送を、未修飾の複合体に比較して統計的に有意な量、増加させるために充分な、アンテペネペディアタンパク質（又はその相同体）のうちの少なくとも一部分で修飾されたインターフェロン複合体を考察するものである。
【０１３１】
内部移行性ペプチドのもう一つの例は、HIVトランスアクチベータ (TAT）、 タンパク質である。このタンパク質は４つのドメインに分割されるようである（Kuppuswamy
et al. (1989） Nucl. Acids
Res. 17:3551-3561）。精製されたTATタンパク質は、組織培養物内の細胞に取り込まれ（Frankel and Pabo, (1989） Cell 55:1189-1193）、TATの残基37-62に相当する断片などのペプチドは、in vitroの細胞に高速で取り込まれる（Green and Loewenstein, (1989） Cell 55:1179-1188）。この高塩基性領域は、内部移行部分の、核への内部移行及び標的決定を媒介する（Ruben et al., (1989） J. Virol. 63:1-8）。CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSなどの前記の高塩基性領域に存在する配列を含むペプチド又は類似体を、本ポリマに結合させて、このような複合体の、細胞内ミリューへの内部移行及び標的決定に役立てる。
【０１３２】
別の経細胞ポリペプチドの例は、インターフェロン複合体の膜透過輸送を増加させるためにマストパランの充分な部分を含むように作製することができる（T. Higashijima et al., (1990） J. Biol. Chem. 265:14176）。
【０１３３】
他の適した内部移行性ペプチドは、例えばヒストン、インシュリン、トランスフェリン、塩基性アルブミン、プロラクチン及びインシュリン様成長因子I（IGF-I）、インシュリン様成長因子II（IGF-II）、又は他の成長因子などの全部又は一部分を用いて作製することができる。例えば、毛管細胞上のインシュリン受容体に対して親和性を示すある一インシュリン断片であって、血糖減少においてはインシュリンよりも有効性の小さい断片が、
受容体媒介性経細胞輸送による膜透過輸送を行うことができ、従って当該の経細胞ポリペプチドの内部移行性ペプチドとして役立つことが見出されている。好適な成長因子由来内部移行性ペプチドには、EGF （上皮成長因子）由来ペプチド、例えばCMHIESLDSYTC及びCMYIEALDKYAC； TGF-ベータ（トランスフォーミング成長因子ベータ）由来ペプチド；PDGF（血小板由来成長因子）、又はPDGF-2を由来とするペプチド；IGF-1（インシュリン様成長因子）、又はIGF-IIを由来とするペプチド；及びFGF（線維芽細胞成長因子）由来ペプチド、がある。
【０１３４】
もう一つのクラスの転位／内部移行性ペプチドは、ｐＨ依存的膜結合を示すものである。酸性ｐＨでヘリックス型のコンホメーションを採る内部移行性ペプチドの場合、内部移行していくペプチドは、両親媒性を獲得し、例えばそれは疎水性界面と親水性界面の両方を有する。より具体的には、ほぼ5.0-5.5のｐＨ範囲内では、内部移行中のペプチドは、この部分の標的膜への挿入が容易となる両親媒性構造であるアルファ・ヘリックスを形成する。アルファ・ヘリックス誘導性の酸性ｐＨ環境は、例えば細胞エンドソーム内に存在する低ｐＨ環境で見られよう。このような内部移行性ペプチドを、エンドサイトーシス機序により取り込まれたインターフェロン-複合体の、エンドソーム区画から細胞質への輸送を促すために用いることができる。
【０１３５】
更に他の好適な内部移行性ペプチドには、アポリポタンパク質A-1及びBのペプチド；ペプチド毒素、例えばメリチン、ボンボリチン、デルタヘモリシン及びパルダキシン；抗生のペプチド、例えばアラメチシン；ペプチドホルモン、例えばカルシトニン、コルチコトロフィン放出因子、ベータエンドルフィン、グルカゴン、副甲状腺ホルモン、膵臓ポリペプチド；及び数多くの分泌型タンパク質のシグナル配列に相当するペプチド、がある。加えて、例示する内部移行性ペプチドを、酸性ｐＨでこの内部移行性ペプチドのアルファ・ヘリックス性を高める置換基を付着させることで改変してもよい。
【０１３６】
本発明内での使用に適した更に別のクラスの内部移行性ペプチドには、生理的ｐＨでは「隠され」ているが、標的細胞エンドソームの低ｐＨ環境では露出するような疎水性ドメインがある。ｐＨで誘導される変性が起き、この疎水性ドメインが露出すると、この部分は脂質二重層に結合して、共有結合した複合体の細胞質への転位を実行する。このような内部移行性ペプチドは、例えばシュードモナス・エキソトキシンＡ、クラスリン、又はジフテリア毒素などで同定された配列に倣ってモデリングできよう。
【０１３７】
ポアを形成するタンパク質又はペプチドも、ここで内部移行性ペプチドとして役立つであろう。ポアを形成するタンパク質又はペプチドは、例えばC9補体タンパク質、細胞溶解性T細胞分子又はNK細胞分子などから得たり、又は由来としてもよい。これらの部分は、膜内でリング様の構造を形成することで、付着した複合体を膜を透過させて細胞内部へ輸送する。
【０１３８】
内部移行性ペプチドの単なる膜挿入があるだけでも、複合体に細胞膜を透過して転位させるために充分である場合もある。しかし、内部移行性ペプチドを、細胞内酵素の基質（即ち補助ペプチド」）に付着させると転位は向上するであろう。内部移行性ペプチドのうちで、細胞膜から細胞質側の面に突出する部分に補助ペプチドを付着させることが好ましい。この補助ペプチドを、転位／内部移行部分又はアンカー・ペプチドの一方の末端に付着させると有利であろう。本発明の補助部分は、一個以上のアミノ酸残基を含有していてもよい。ある実施態様では、補助部分は、細胞内リン酸化のための基質となるものでもよい（例えば、補助部分がチロシン残基を含有していてもよい）。
【０１３９】
この点で例示的な補助部分は、GNAAAARRなど、N-ミリストイルトランスフェラーゼのペプチド基質であろう（Eubanks et al., in: Peptides. Chemistry and Biology, Garland
Marshall (ed.）ESCOM, Leiden, 1988, pp. 566-69）。このコンストラクトにおいては、内部移行性ペプチドを補助ペプチドのＣ末端に付着させることになるであろう。なぜなら、Ｎ末端のグリシンは、補助部分の活性にとって重要だからである。このハイブリッド・ペプチドは、ポリマ複合体に付着させるとN-ミリスチル化して、更に標的細胞膜に繋ぎ止められ、例えばそれは、細胞膜でのその複合体の局部的濃度を高める働きなどをする。
【０１４０】
適した補助ペプチドには、キナーゼ基質であるペプチド、一個の性の電荷を持つペプチド、膜結合型グリコトランスフェラーゼにより糖付加される配列を含有するペプチド、がある。膜結合型グリコトランスフェラーゼにより糖付加される補助ペプチドには、配列x-NLT-xが含まれ、但しこの場合「x」は別のペプチド、アミノ酸、カップリング剤又は疎水性分子などであってよい。この疎水性のトリペプチドをミクロソーム・ベシクルと一緒にインキュベートするとそれはベシクルの膜を透過し、管腔側で糖付加され、その親水性のためにベシクル内に捕獲される（C. Hirschberg et al., (1987）
Ann. Rev. Biochem. 56:63-8）。このように配列x-NLT-xを含有する補助ペプチドは、対応する複合体の標的細胞保持を高めるであろう。
【０１４１】
上述したように、内部移行性ペプチド及び補助ペプチドはそれぞれ個別に、インターフェロン複合体又はリポソームに、化学的架橋や、又は非共有結合的相互作用（例えばストレプトアビジン-ビオチン結合体、His6-Ni相互作用等の使用）を通じて加えることができる。特定の場合には、構造化していないポリペプチド・リンカを、ペプチド部分と、ポリマ複合体又はリポソームとの間に含めることができる。
【０１４２】
更に、このような内部移行性ペプチド及び補助ペプチドを、例えば当該タンパク質の骨格上の水酸基への共有結合などを通じて、インターフェロンに直接、結び付けることができることも考えられる。いくつかの実施態様では、前記の結合は、エステラーゼへの曝露又は簡単な加水分解反応など、生理条件下で切断しやすい。このような組成物を単独で用いることも、あるいは、ポリマ複合体又はリポソームに調合することもできる。
【０１４３】
Ｅ．  呼吸用インターフェロン
本発明の別の局面は、呼吸管へインターフェロンを送達するエーロゾルを提供する。該呼吸管には、中咽頭及び喉頭を含む上気道と、それに続く、分岐部により気管支及び細気管支に続く気管を含む下気道が含まれる。上気道及び下気道は誘導気管支と呼ばれる。こうして末端の細気管支は呼吸細気管支に分かれ、次にこの呼吸細気管支が、最終的な呼吸域である気胞、即ち深肺へとつながる。
【０１４４】
ここで、吸入による投与は経口及び／又は鼻孔、気管内（経吻合部又は気管切開チューブを通じて）、あるいは、人工呼吸器などの呼吸補助具を通じてであってよい。エーロゾル送達のための薬剤器具の例には、定用量吸入器（MDI）、乾燥粉末吸入器（DPI）、及び空気噴射ネブライザがある。当該のインターフェロンの送達に容易に適合させることのできる吸入による送達系の例は、例えば米国特許第5,756,353号；第5,858,784号；及びPCT出願 WO98/31346； WO98/10796； WO00/27359； WO01/54664；WO02/060412に解説されている。インターフェロンを送達するために用いてもよい他のエーロゾル調合物は、米国特許第6,294,153号；第6,344,194号；第6,071,497号、及びPCT 出願 WO02/066078； WO02/053190； WO01/60420；WO00/66206に解説されている。
【０１４５】
ヒトの肺は、数分から数時間の間に、加水分解可能な沈着したエーロゾルを取り除くか、又は急速に分解することができる。上気道では、線毛上皮が、粒子が気道から口に向かって掃き出される「粘液線毛除去」に寄与する。Pavia, D., "LungMucociliary Clearance," in Aerosols and
the Lung: Clinical and Experimental Aspects, Clarke, S. W. and Pavia, D.,
Eds., Butterworths, London, 1984。深肺においては、肺胞マクロファージは、粒子が沈着した直後にそれを貪食することができる。Warheit et al. Microscopy Res. Tech., 26: 412-422 (1993）; and Brain, J. D.,
"Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages," in The
Reticuloendothelial System, S. M. Reichard and J. Filkins, Eds., Plenum,
New. York, pp. 315-327, 1985。深肺、又は肺胞は、インターフェロンを全身送達するための、吸入された治療用エーロゾルの重要なターゲットである。
【０１４６】
好適な実施態様では、特にインターフェロンの全身投薬をしたい場合には、当該のエーロゾル化インターフェロンをマイクロ粒子として調合する。0.5乃至10ミクロンの間の直径を有するマイクロ粒子は肺を貫通でき、天然の障壁の大半を通過することができる。１０ミクロン未満の直径が、喉を迂回するには必要であり；0.5ミクロン以上の直径が呼気から掃き出されることを避けるために必要である。
【０１４７】
いくつかの好適な実施態様では、当該のインターフェロンを、0.5乃至10ミクロンの直径を有し、凝集して0.5乃至10ミクロンの直径を有する粒子になることのできる、上述したような超分子複合体に調合する。
【０１４８】
他の実施態様では、当該のインターフェロンを、肺送達に向けて適宜（例えば上述したように）調合されたリポソーム又は超分子複合体に入れて提供する。
【０１４９】
（ｉ）  マイクロ粒子を形成するためのポリマ
上述した超分子複合体に加え、数多くの他のポリマを用いてマイクロ粒子を形成することができる。ここで用いられるように、用語「マイクロ粒子」は、マイクロスフィア（均一なスフィア）、マイクロカプセル（コアと、ポリマによる外側層とを有する）、及び非定型な形状の粒子を包含する。
【０１５０】
ポリマは、好ましくは、インターフェロンを遊離させたい期間にわたって、あるいは、比較的にその直後、一般的には１年、より典型的には数ヶ月、更に典型的には数日乃至数週間の範囲で生分解性であるとよい。生分解は、マイクロ粒子の分解、即ち、マイクロ粒子を形成しているポリマの解離、及び／又は、ポリマ自体の分解、のいずれかであると言うことができる。これが起きるのは、ジケトピペラジンの場合のように、粒子を含有させてある担体から、遊離部位のｐＨへのｐＨ変化の結果であったり、ポリ（ヒドロキシ酸）の場合のように加水分解の結果であったり、アルギン酸塩などのポリマのイオン結合により形成されるマイクロ粒子の場合のように、マイクロ粒子からのカルシウムなどのイオンの拡散の結果であったり、そして多くの多糖及びタンパク質の場合のように、酵素作用の結果であったりする。場合によっては線形の遊離が最も有用なこともあり、他方、パルス型遊離又は「バルク遊離」がより有効な結果をもたらすこともある。
【０１５１】
代表的な合成物質は：ジケトピペラジン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、及びこれらのコポリマなどのポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステルなどのポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアセテート、及び塩化ポリビニルなどのポリビニル化合物、
ポリスチレン、ポリシロキサン、 ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチル
メタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリウレタン及びこれらのコポリマを含むアクリル酸及びメタクリル酸のポリマ、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシエチルセルロース、セルローストリアセテート、及びセルローススルフェートナトリウム塩を含むセルロース、ポリ（ブチック酸）（原語：poly(butic acid）、ポリ（吉草酸）、及びポリ（ラクチド-コ-カプロラクトン）、である。
【０１５２】
天然ポリマには、デキストラン及びセルロース、コラーゲン、アルブミン及び他の親水性タンパク質、ゼイン及び他のプロラミン及び疎水性タンパク質、これらのコポリマ及び混合物を含むアルギン酸塩及び他の多糖がある。ここで用いられる場合、これらの化学的誘導体とは、例えばアルキル、アルキレンなどの化学基の置換、追加、ヒドロキシル化、酸化、及び、当業者が通常行う他の修飾を言う。
【０１５３】
生体接着性ポリマには、H.
S. Sawhney, C. P. Pathak and J .A. Hubell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587に解説された生体侵食性ヒドロゲル、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、及びポリアクリレートがある。
【０１５４】
更に実例を挙げると、マトリックスは、溶媒蒸発、スプレー乾燥、溶媒抽出、及び当業で公知の他の方法により、ポリマから形成することができる。薬物送達用のマイクロスフィアを作製するために開発された方法は、Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release 5, 13-22 (1987）; Mathiowitz, et al., Reactive
Polymers 6, 275-283 (1987）; 及び Mathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci. 35, 755-774 (1988）などに解説されているように、文献に解説されている。方法の選択は、例えばMathiowitz,
et al., Scanning Microscopy 4,329-340 (1990）; Mathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci. 45, 125-134 (1992）; 及び Benita, et al., J. Pharm. Sci. 73, 1721-1724 (1984）に解説されているように、ポリマの選択、所望のサイズ、外部の形態、及び結晶度に依存する。
【０１５５】
Mathiowitz,
et al., (1990）, Benita, 及びJaffeの米国特許第4,272,398号などに解説された溶媒抽出法では、ポリマを揮発性の有機溶媒に溶解させる。可溶性型か、又は、微細な粒子として分散させたインターフェロンを該ポリマ溶液に加え、この混合物をポリ（ビニルアルコール）などの界面活性剤を含有する水相に懸濁させる。その結果できた乳濁液を、有機溶媒の大半が蒸発して固体のマイクロスフィアが残るまで攪拌する。
【０１５６】
一般的には、ポリマを塩化メチレンに溶解させることができる。例えば0.05乃至0.20g/mlの間など、いくつかの異なるポリマ濃度を用いることができる。溶液に薬物を加えた後、この溶液を1%（w/v）のポリ（ビニルアルコール）（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社）を含有する200mlのよく攪拌中の蒸留水に懸濁させる。４時間攪拌した後は、有機溶媒はポリマから蒸発してしまっており、できたマイクロスフィアを水で洗浄し、凍結乾燥器で一晩、乾燥させることになるであろう。
【０１５７】
様々なサイズ（1-1000
ミクロン、但しエーロゾル用途の場合10ミクロン未満）及び形態のマイクロスフィアを、ポリエステル及びポリスチレンなどの比較的に安定なポリマに有用なこの方法により得ることができる。しかし、ポリ無水物などの不安定なポリマは、水への曝露により分解するであろう。これらのポリマの場合、ホットメルト封入及び溶媒除去が好ましいであろう。
【０１５８】
ホットメルト封入では、ポリマをまず溶解させ、次に、好ましくは適当な大きさにふるいをかけた固形のインターフェロン粒子と混合する。この混合物をシリコン油などの非混和性溶媒中に懸濁させ、攪拌を続けながら、ポリマの溶解点より高い５℃まで加熱する。この乳濁液が安定したら、ポリマ粒子が固化するまでそれを冷却する。その結果得られるマイクロスフィアを、石油エーテルによる傾瀉で洗浄して、さらさらした粉末を得る。1乃至1000ミクロンの直径を持つマイクロスフィアをこの方法で得ることができる。この技術で調製されたスフィアの外部表面は通常、滑らかで密である。この手法は、水不安定なポリマで有用であるが、分子量が1000乃至50000のポリマでの使用に限定される。
【０１５９】
スプレー乾燥においては、当該ポリマを塩化メチレン（0.04g/ml）などの有機溶媒に溶解させる。既知の量のインターフェロンを、このポリマ溶液に懸濁させる（不溶性の場合）か、又は同時溶解させる（可溶性の場合）。次に、この溶液又は分散液をスプレー乾燥させる。直径で1乃至10ミクロンの範囲のマイクロスフィアを、ポリマの選択に応じた形態で得ることができる。
【０１６０】
アルギン酸塩又はポリホスファジン又は他のジカルボン酸ポリマなどのゲル型ポリマから成るヒドロゲル・マイクロスフィアは、当該ポリマを水溶液に溶解させ、混合物に取り入れようとする物質を懸濁させ、窒素ガスジェットを備えたマイクロ液滴形成装置を通じてこのポリマ混合物を押し出すことにより、調製することができる。Salib, et al., Pharmazeutische Industrie 40-111A, 1230 (1978）などに解説されたように、できたマイクロスフィアは、ゆっくりと攪拌中のイオン硬化槽に落ちる。この系の利点は、Lim, et al., J. Pharm. Sci. 70, 351-354 (1981）などに解説された通りに、製造後に、マイクロスフィアの表面をポリリジンなどのポリカチオン性ポリマで被覆することで更に改変できるという可能性である。例えばアルギン酸塩の場合、アルギン酸塩をカルシウムイオンでイオン的に架橋し、次に、製造後にマイクロ粒子の外側表面をポリリジンなどのポリカチオンで架橋することにより、ヒドロゲルを形成することができる。マイクロスフィアの粒子サイズは、多様なサイズの押出器、ポリマ流速及びガス流速を用いて制御されるであろう。
【０１６１】
キトサン・マイクロスフィアは、ポリマを酸性溶液に溶解させ、トリポリホスフェートと架橋することにより、調製することができる。例えば、カルボキシメチルセルロース (CMC）マイクロスフィアは、ポリマを酸溶液に溶解させ、このマイクロスフィアを鉛イオンで沈殿させることにより、調製される。アルギン酸塩／ポリエチレンイミン（PEI）は、アルギン酸塩マイクロカプセル上のカルボキシル基の量を減らすために調製することができる。
【０１６２】
（ｉｉ）医薬組成物
マイクロ粒子を、患者への投与に向けて、生理食塩水などの適した医薬担体中に懸濁させることができる。最も好適な実施態様では、マイクロ粒子を、投与の直前まで、乾燥又は凍結乾燥型で保存することになるであろう。こうしてこれらを、エーロゾルとしての投与に向けた水溶液など、充分な溶液中に懸濁させるか、あるいは、乾燥粉末として投与することができる。
【０１６３】
（ｉｉｉ）標的決定された投与
本マイクロ粒子を特定の細胞、特に貪食細胞及び臓器に送達することができる。パイエル板内の貪食細胞は、経口投与されたマイクロ粒子を選択的に取り込むようである。細網内皮系組織系の貪食細胞もまた、静脈内投与された場合のマイクロ粒子を取り込む。肺内のマクロファージによるマイクロ粒子のエンドサイトーシスを利用して、本マイクロ粒子を脾臓、骨髄、肝臓及びリンパ節に標的決定することができる。
【０１６４】
マイクロ粒子は、特定の標的に特異的又は非特異的に結合する、上述したものなどのリガンドの付着によっても標的決定することができる。このようなリガンドの例には、可変領域を含む抗体及び断片、レクチン及びホルモン、又は、標的細胞表面上に受容体を有する他の有機分子、がある。
【０１６５】
（ｉｖ）マイクロ粒子の保存
好適な実施態様では、マイクロ粒子を凍結乾燥した状態で保存する。投薬量は、封入されたインターフェロンの量、肺系内の遊離速度、及び当該化合物の薬物動態により、決定される。
【０１６６】
（ｖ）マイクロ粒子の送達
マイクロ粒子は、粒子のいくらかが肺系に達するような鼻孔通路への直接の投与から、粉末点滴注入器具の使用、肺の管へ達するカテーテル又はチューブの使用に至る幅広い方法を用いて送達することができる。乾燥粉末吸入器が市販されているが、炭化水素推進剤を用いるものはもはや使われておらず、患者による呼吸の取り込みに依拠するもので多様な用量にすることができる。適した推進薬の例には、例えば1,1,1,2-テトラフルオロエタン (CF3CH2F） (HFA-134a）、及び1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロ-n-プロパン (CF3CHFCF3） (HFA-227）、ペルフルオロエタン、モノクロロイフルオロメタン、1,1 ジフルオロエタン、及びこれらの組合せなどのヒドロフルオロアルカン推進剤がある。
【０１６７】
Ｆ．  インターフェロンの遊離のための医療器具コーティング
本発明の別の局面はコーティングされた医療器具に関する。例えば、いくつかの実施態様では、本発明は、コーティングを少なくとも一方の表面に接着させて有する医療器具であって、この場合、前記コーティングが本ポリマ・マトリックス及びインターフェロンを含む、医療器具を提供する。このようなコーティングを、ねじ、プレート、洗浄器、縫合糸、プロテーゼ・アンカ、鋲、ステープル、電気リード線、弁、メンブレンなどの外科器具に施すことができる。該器具はカテーテル、移植可能な血管到達ポート、血液保存バッグ、血液管材料、中心静脈カテーテル、動脈カテーテル、血管移植体、大動脈内バルーン・ポンプ、心臓弁、心臓血管縫合糸、
人工心臓、ペースメーカ、心室支援ポンプ、体外器具、血液フィルタ、血液透析装置、吸着型血液浄化用装置、血漿瀉血装置、及び血管内に装着するように適合されたフィルタ、であってよい。
【０１６８】
本発明に従ったいくつかの実施態様では、ポリマを形成するための単量体をインターフェロンと配合し、混合して、インターフェロンを単量体溶液中に均一に分散させる。次にこの分散液を従来のコーティング法に従ってステント又は他の器具に施し、その後、紫外線などの従来の開始物質により、架橋プロセスを開始させる。本発明に従った他の実施態様では、ポリマ組成物をインターフェロンと配合して分散液を形成する。次に、この分散液を医療器具の表面に施し、ポリマを架橋させて固体のコーティングを形成させる。本発明に従った他の実施態様では、ポリマ及びインターフェロンを適した溶媒に配合して分散液を形成し、次にこの分散液を従来の態様でステントに施す。次に熱蒸発などの従来プロセスにより溶媒を取り除き、その結果、ポリマ及びインターフェロン（共に持続放出薬物送達系を形成する）はコーティングとしてステント上に残る。インターフェロンをポリマ組成物中に溶解させた場合にも同様なプロセスを用いてよい。
【０１６９】
本発明に従ったいくつかの実施態様では、当該の系は、比較的に硬質のポリマを含む。他の実施態様では、当該の系は、軟質かつ展性のポリマを含む。更に他の実施態様では、当該の系は、接着性を有するポリマを含む。ポリマの硬度、弾性、接着性及び他の特徴は、以下に更に詳述するように、当該の系の特定の最終的物理形状に応じて幅広く多様にすることができる。
【０１７０】
本発明に従った系の実施態様は数多くの様々な形を採る。いくつかの実施態様では、当該の系は、インターフェロンをポリマ中に懸濁又は分散させたものから成る。いくつか他の実施態様では、当該の系は、インターフェロンと、注射筒を関して体内に注射されるように適合された半固体又はゲル状のポリマから成る。本発明に従った他の実施態様では、当該の系は、インターフェロンと、適した外科的方法により体内に挿入又は移植されるように適合された軟質の可撓性ポリマとから成る。本発明に従った更なる実施態様では、当該の系は、適した外科的方法により体内に挿入又は移植されるように適合された硬質の固体ポリマから成る。更なる実施態様では、当該の系は、インターフェロンを中に懸濁又は分散させて有するポリマを含み、この場合、前記のインターフェロン及びポリマの混合物は、例えばねじ、ステント、ペースメーカ等の外科用器具上のコーティングを形成する。本発明に従った具体的な実施態様では、当該の器具は、外科用ねじ、プレート、ステント等の外科用器具又はその何らかの部品の形に成形された硬質の固体ポリマである。本発明に従った他の実施態様では、当該の系は、インターフェロンを中に分散又は懸濁させて有する縫合糸の形のポリマを含む。
【０１７１】
本発明に従ったいくつかの実施態様では、外部表面などの表面と、前記外部表面上のコーティングとを有する基板を含む医療器具が提供される。前記のコーティングは、ポリマと、前記ポリマ中に分散したインターフェロンとを含み、この場合、当該のポリマは、インターフェロンを浸透させることができるか、あるいは生分解してインターフェロンを遊離させる。本発明に従ったいくつかの実施態様では、該器具は、インターフェロンを適したポリマ内に懸濁又は分散させて含み、この場合、前記インターフェロン及びポリマは、外科用器具などの基板全体にコーティングされる。このようなコーティングは、スプレー・コーティング又は浸漬コーティングなどにより達成できよう。
【０１７２】
本発明に従った他の実施態様では、本器具は、インターフェロン及びポリマ懸濁液又は分散液を含み、この場合、当該のポリマは剛性であり、そして体内に挿入又は移植しようとする器具の一構成部分を成す。例えば、本発明に従った特定の実施態様では、当該の器具は、ポリマ中に懸濁又は分散させたインターフェロンでコーティングされた外科用ねじ、ステント、ペースメーカ等である。本発明に従った他のいくつかの実施態様では、インターフェロンを中に懸濁させるポリマは外科用ねじの先端又は頭部、あるいはその一部分を成す。本発明に従った他の実施態様では、インターフェロンを中に懸濁又は分散させるポリマを、外科用管材料（例えば結腸フィステル形成術、腹膜透析、カテーテル、及び静脈内管材料など）などの外科用器具上にコーティングする。本発明に従った更なる実施態様では、当該の器具は、ポリマ及びインターフェロンを上にコーティングして有する静脈内用針である。
【０１７３】
上に論じたように、本発明に従ったコーティングは、生侵食性又は非生侵食性のポリマを含む。
生侵食性、対、非生侵食性のポリマの選択は、当該の系又は器具の意図された最終用途に基づいてなされる。本発明に従ったいくつかの実施態様では、当該ポリマは生侵食性であると有利である。例えば、当該の系が、ねじ、ステント、ペースメーカ等の外科的に移植可能な器具上のコーティングである場合、当該のポリマが生侵食性であると有利である。当該のポリマが有利にも生侵食性である、本発明に従った他の実施態様には、インターフェロンのポリマ中への移植可能、吸入可能、又は注射可能な懸濁液又は分散液である器具であり、この場合、更なる要素（例えばねじ又はアンカ）は用いられない。
【０１７４】
当該のポリマの浸透性及び生侵食性が乏しいような、本発明に従ったいくつかの実施態様では、インターフェロンが遊離した後でも実質的な時間、ポリマが定位置に残るが、最終的には生侵食され、周囲組織に再吸収されるように、ポリマの生侵食の速度が、インターフェロン遊離の速度よりも充分に遅いと有利である。例えば、本器具が、インターフェロンを生侵食性ポリマに懸濁又は分散させて含む生侵食性縫合糸である場合、このポリマの生侵食の速度は、インターフェロンが約３乃至約１４日間にわたって線形に遊離するが、縫合糸は約３週間乃至約６ヶ月間、存続するように、充分に遅いと有利である。本発明に従った同様な器具には、インターフェロンを生侵食性ポリマに懸濁又は分散させて含む外科用ステープルがある。
【０１７５】
本発明に従った他の実施態様では、ポリマの生侵食速度は、インターフェロン遊離の速度と同じ状態であると有利である。例えば、当該の系が、インターフェロンを、整形外科用ねじ、ステント、ペースメーカ、又は非生侵食性の縫合糸など外科用器具の上にコーティングされたポリマ中に懸濁又は分散させて含む場合、該ポリマが、周囲身体組織に直接曝露するインターフェロンの表面積が、ある期間にわたって実質的に一定であるような速度で、生侵食すると有利である。
【０１７６】
本発明に従った他の実施態様では、該ポリマ伝播体は、例えば血漿中など、周囲組織中の水にとって浸透性である。このような場合、水溶液がこのポリマに浸透してインターフェロンに接触するであろう。溶解の速度は、例えばポリマの浸透性、インターフェロンの可溶性、生理的流体のｐＨ、イオン強度、及びタンパク質の組成等の複雑な組合せの変数によって支配されるであろう。
【０１７７】
本発明に従ったいくつかの実施態様では、当該のポリマは非生侵食性である。非生侵食性のポリマは、当該の系が、体内に永久に又は半永久に挿入又は移植されるように適合された外科用器具上にコーティングされるか、又は同外科用器具の一構成部分を成すように意図されたポリマを含む。当該のポリマが、有利にも外科用器具上に永久的なコーティングを成すような器具の例には、整形外科用ねじ、ステント、人工関節、人工弁、永久縫合糸、ペースメーカ等がある。
【０１７８】
経皮経管血管形成術後に用いてもよい様々な複数のステントがある。いずれの数のステントを本発明に従って用いてもよいが、平易となるよう、限られた数のステントを、本発明の実施例では解説することとする。当業者であれば、いずれの数のステントを本発明の関係で用いてもよいことは認識されよう。加えて、上述したように、他の医療器具を用いてもよい。
【０１７９】
ステントは通常、閉塞を軽くするために導管の内腔内に残される管状構造として用いられる。通常は、ステントは、内腔内に非拡張型で挿入された後に、自律的に拡張させるか、あるいは、in situの第二の器具の助けを受けて拡張させる。拡張の典型的な方法は、血管の壁面成分に伴う閉塞を剪断及び破壊し、内腔を拡大するために狭窄した血管又は体内痛徐内で膨張させる、カテーテルに取り付けられた血管形成バルーンの使用を通じて行われる。
【０１８０】
本発明のステントは、いずれの数の方法を用いても製造できよう。例えば、ステントを、レーザ、放電粉砕、化学的食刻又は他の手段を用いて機械加工してもよい中空又は成形ステンレス鋼管から製造してもよい。該ステントを体内に挿入し、拡張されていない形で所望の部位に配置する。ある例示的な実施態様では、バルーン・カテーテルにより拡張を血管内で行わせてもよく、この場合、このステントの最終的な直径は、用いるバルーン・カテーテルの直径の関数である。
【０１８１】
本発明に従ったステントは、例えばニッケル及びチタンの適した合金又はステンレス鋼などを含め、形状記憶物質で実施してもよいことは理解されねばならない。
【０１８２】
ステンレス鋼から形成された構造は、該ステンレス鋼を、例えばそれを編組形状に捻るなどにより、所定の態様で構成することにより、自己拡張性に形成できよう。この実施態様では、ステントを成形後、挿入手段によりそれを血管内又は他の組織内に挿入できるように充分小さな空間を占めるように圧縮してもよく、この場合の前記の挿入手段には、適したカテーテル、又は可撓性のロッドが含まれる。
【０１８３】
カテーテルから脱出する際に拡張して所望の形状になるようにステントを形成してもよく、この場合の拡張は、自動であるか、あるいは、圧力、温度又は電気的刺激の変化により惹起される。
【０１８４】
ステントのデザインに関係なく、有効な投薬量を病変域に提供するには、
充分な特異性及び充分な濃度を持つインターフェロンを施すことが好ましい。この関係で、コーティングの「レザバ・サイズ」は、好ましくは、当該のインターフェロンを所望の位置及び所望の量、適切に施す大きさとするとよい。
【０１８５】
代替的な実施態様では、ステントの内側及び外側の全表面を、治療的な投薬量のインターフェロンでコーティングしてもよい。しかし、コーティング技術は当該のインターフェロンに応じて様々であろうことに留意することが重要である。また、コーティング技術は、当該のステント又は他の内腔内医療器具を含む材料に応じても様々であろう。
【０１８６】
前記の内腔内医療器具は、持続放出薬物送達コーティングを含む。インターフェロンによるコーティングを、例えば含浸コーティング、スプレー・コーティング又は浸漬コーティングなどの従来のコーティング・プロセスに従ってステントに施してよい。
【０１８７】
ある実施態様では、内腔内医療器具は、長手方向のステント軸に沿って延びる内側内腔表面及び対向する外側表面を有する、長寸の半径方向に拡張可能な管状ステントを含む。該ステントには、永久的な、移植可能なステント、移植可能な移植用ステント、又は一時的ステントが含まれるであろうが、前記の一時的ステントは、血管内で拡張可能であり、かつ、その後血管から後退させることができるステントであると、定義しておく。当該のステントの形状は、コイル・ステント、記憶コイル・ステント、ニチノール・ステント、メッシュ・ステント、スカフォード・ステント、スリーブ・ステント、浸透性のステント、温度センサを有するステント、多孔質のステント等が含まれよう。更にステントを、例えば膨張可能なバルーン・カテーテル、自己装着機構（カテーテルからの解放後）あるいは他の適した手段など、従来の方法に従って装着してもよい。前記の長寸の半径方向に拡張可能な管状ステントは、移植用ステントであってもよく、この場合、この移植用ステントは、移植体の内側又は外側にステントを有する複合器具である。該移植体は、例えばePTFE移植体、生物学的移植体、又は織物状移植体など、血管移植体であってもよい。
【０１８８】
インターフェロンは、数多くの方法でステントに取り入れたり、あるいは固定してよい。例示的な実施態様では、インターフェロンをポリマー・マトリックスに直接取り入れ、ステントの外側表面にスプレーする。このインターフェロンはこのポリマ・マトリックスから時間と共に溶出し、周囲組織に進入する。当該のインターフェロンは、好ましくは、少なくとも３日間からほぼ６ヶ月間、そしてより好ましくは７乃至３０日の間、ステント上に留まるとよい。
【０１８９】
いくつかの実施態様では、本発明によるポリマは、インターフェロンが浸透でき、また、当該のポリマからのインターフェロンの遊離速度の主要な速度決定因子でないような浸透性を有する、生物学的に寛容なポリマを含む。
【０１９０】
本発明に従ったいくつかの実施態様では、当該のポリマは非生侵食性である。本発明で有用な非生侵食性ポリマの例には、ポリ（エチレン-コ-ビニルアセテート） (EVA）、ポリビニルアルコール及びポリウレタン、例えばポリカーボネートベースのポリウレタン、がある。本発明の他の実施態様では、当該のポリマは生侵食性である。本発明で有用な生侵食性ポリマの例には、ポリ無水物、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリアルキルシアノアクリレート、又はこれらの誘導体及びコポリマがある。当業者であれば、ポリマの生侵食性及び非生侵食性の選択は、以下にさらに詳述するように、当該の系の最終的な物理的形に依存することを認識されよう。他の例示的なポリマには、ポリシリコーンや、ヒアルロン酸から誘導されたポリマがある。当業者であれば、本発明に従ったポリマは、当該のポリマからのインターフェロンの遊離において主要な速度決定因子でないような浸透性を持たせるのに適した条件下で調製されることは、理解されよう。
【０１９１】
更に、適したポリマには、体液及び哺乳動物組織に対して生物学的に適合性があり、当該のポリマが接触することになる体液には基本的に不溶性である天然（コラーゲン、ヒアルロン酸等）又は合成の物質が含まれる。加えて、適したポリマは、基本的に、ポリマ中に分散／懸濁させたインターフェロンと、体液中のタンパク質様成分との間の相互作用を妨げるものである。急速に溶解するポリマや、又は、体液中での溶解性の高いポリマ、あるいは、インターフェロンとタンパク質様成分との間の相互作用を許容するものの使用は、いくつかの場合で避けねばならない。なぜなら、ポリマの溶解、又は、タンパク質様成分との相互作用は、薬物放出の定常性に影響しかねないからである。
【０１９２】
他の適したポリマには、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリエチレンビニルアセテート（PVA又はEVA）、酸化ポリエチレン（PEO）、酸化ポリプロピレン、ポリカルボン酸、ポリアルキルアクリレート、セルロースエーテル、シリコーン、ポリ（dl-ラクチド-コ  グリコリド）、多様なユードラグリット（原語：Eudragrits ）（例えばNE30D、RS PO 及び RL PO）、ポリアルキル-アルキアクリレートコポリマ、ポリエステル-ポリウレタン・ブロック・コポリマ、ポリエーテル-ポリウレタン・ブロック・コポリマ、ポリジオキサノン、ポリ（β-ヒドロキシブチレート）、ポリ乳酸 (PLA）、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、及びPEO-PLAコポリマ、がある。
【０１９３】
本発明のコーティングは、一種以上の適した単量体及び適したインターフェロンを混合した後、前記単量体を重合体化してポリマ系を形成することにより、形成できよう。この方法で、インターフェロンをポリマ中に溶解又は分散させる。他の実施態様では、インターフェロンを液体ポリマ又はポリマ分散液に混合した後、このポリマを更に加工して、本発明のコーティングを形成する。適した更なる加工には、適した架橋性インターフェロンとの架橋、液体ポリマ又はポリマ分散液の更なる重合体化、適した単量体とのコポリマ化、適したポリマブロックとのブロック・コポリマ化等が含まれよう。
更なる加工は、インターフェロンをポリマ伝播体中に懸濁又は分散させるように、インターフェロンをポリマ中に捕獲するものである。
【０１９４】
いずれの数の非侵食性ポリマを当該インターフェロンと共に用いてもよい。この用途でコーティングに用いることのできるフィルム形成性ポリマは、吸収性でも、又は非吸収性でもよいが、血管壁への刺激を抑えるために生体適合性でなくてはならない。当該のポリマは所望の遊離速度又は所望の程度のポリマ安定性に応じて、生体安定性でも、あるいは生体吸収性でもよいが、生体吸収性のポリマが好ましいであろう。なぜなら、生体安定性のポリマとは異なり、それは移植後長期に渡って存在せず、有害な慢性の局部的応答を引き起こすことがないからである。更に、生体吸収性のポリマは、長期後には、生物学的環境のストレスによりステントとコーティングとの間の接着が失われて、コーティングが外れ、ステントが組織中に封入された後でも更なる問題を引き起こすというリスクをもたらさない。
【０１９５】
使用できると思われる適したフィルム形成性生体吸収性ポリマには、脂肪族ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル-エステル）、ポリアルキレンオキサレート、ポリアミド、ポリ（イミノカルボネート）、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミド基を含有するポリオキサエステル、ポリ（無水物）、ポリホスファゼン、生体分子及びこれらの混合物、から成る群より選択されるポリマがある。本発明の目的のために、脂肪族ポリエステルには、（乳酸d-、l-及びメソラクチドを含む）ラクチドのホモポリマ及びコポリマ、ε-カプロラクトン、（グリコール酸を含む）グリコリド、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシヴァレレート、パラ-ジオキサノン、トリメチレンカーボネート（及びそのアルキル誘導体）、1,4-ジオキセパン-2-オン、1,5-ジオキセパン-2-オン、6,6-ジメチル-1,4-ジオキサン-2-オン及びこれらのポリマ混合物がある。本発明の目的のためのポリ（イミノカーボネート）には、Kemnitzer and Kohn, in the Handbook of Biodegradable Polymers,
edited by Domb, Kost and Wisemen, Hardwood Academic Press, 1997, pages 251-272に解説されたようにある。本発明の目的のためのコポリ（エーテル-エステル）には、Journal of Biomaterials Research,
Vol. 22, pages 993-1009, 1988 by Cohn and Younes and Cohn, Polymer Preprints
(ACS Division of Polymer Chemistry）, Vol. 30(1）, page 498, 1989 (e.g. PEO/PLA）に解説されたコポリエステル-エーテルがある。本発明の目的のためのポリアルキレンオキサレートには、（引用をもってここに援用する）米国特許第4,208,511号；第4,141,087号；第4,130,639号；第4,140,678号；第4,105,034号；及び第4,205,399号がある。（引用をもってここに援用することとする）Allcock in The Encyclopedia of Polymer Science, Vol. 13, pages
31-41, Wiley Intersciences, John Wiley & Sons, 1988 and by Vandorpe,
Schacht, Dejardin and Lemmouchi in the Handbook of Biodegradable Polymers,
edited by Domb, Kost and Wisemen, Hardwood Academic Press, 1997, pages 161-182に解説されたものなど、L-ラクチド、D,L-ラクチド、乳酸、グリコリド、グリコール酸、パラ-ジオキサノン、トリメチレンカーボネート及びε-カプロラクトンから作製されるポリホスファゼン、co-、ter- 及びより高次の混合単量体ベースのポリマ。型 HOOC−C6H4-O-(CH2）m-O-C6H4-COOH の二酸から誘導されるポリ無水物（但し式中、 m は２乃至８の整数である及び最高12個までの炭素から成る脂肪族アルファ-オメガ二酸とのそのコポリマ）。ポリオキサエステルポリオキサアミド、及び、アミン及び／又はアミド基を含有するポリオキサエステルは、（引用をもってここに援用する）以下米国特許第5,464,929号；第5,595,751号；第5,597,579号；第5,607,687号；第5,618,552号；第5,620,698号；第5,645,850号；第5,648,088号；第5,698,213号及び第5,700,583号のうちの一つ以上に解説されている。（引用をもってここに援用する）Heller in Handbook of Biodegradable Polymers, edited by Domb, Kost
and Wisemen, Hardwood Academic Press, 1997, pages 99-118が解説したものなどのポリオルトエステル。本発明の目的のためのフィルム形成性ポリマ生体分子には、 人体で酵素により分解するか、あるいは人体内では加水分解的に不安定な、天然で生じる物質、例えばフィブリン、フィブリノーゲン、コラーゲン、エラスチン、及び吸収性生体適合性多糖、例えばキトサン、でんぷん、脂肪酸（及びそのエステル）グルコーソ−グリカン及びヒアルロン酸、がある。
【０１９６】
慢性組織応答が比較的に低い適したフィルム形成性生体安定性ポリマ、例えばポリウレタン、シリコーン、ポリ（meth）、アクリレート、ポリエステル、ポリアルキルオキシド（酸化ポリエチレン）、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリビニルピロリドンや、ヒドロゲル、例えば架橋されたポリビニルピロリドン及びポリエステルから形成されるものなど、も用いることができるであろう。ステント上で溶解、硬化又は重合体化することができれば、他のポリマも用いることができよう。これらには、ポリオレフィン、ポリイソブチレン及びエチレン-アルファオレフィン・コポリマ；アクリルポリマ（メタクリレートを含む）及びコポリマ、ハロゲン化ビニルポリマ及びコポリマ、例えば塩かポリビニル；ポリビニルエーテル、例えばポリビニルメチルエーテル；ハロゲン化ポリビニリデン、例えばフッ化ポリビニリデン及び塩化ポリビニリデン；ポリアクリロニトリル、ポリビニルケトン；ポリビニル芳香族、例えばポリスチレン；ポリビニルエステル、例えば酢酸ポリビニル；ビニル単量体の相互とオレフィンとのコポリマ、例えばエチレン-メチルメタクリレートコポリマ、アクリロニトリル-スチレンコポリマ、ABS 樹脂及びエチレン-酢酸ビニルコポリマ；ポリアミド、例えばナイロン66 及びポリカプロラクタム；アルキド樹脂；ポリカーボネート；ポリオキシメチレン；ポリイミド；ポリエーテル；エポキシ樹脂、ポリウレタン；レイヨン；レイヨン-トリアセテート、セルロース、セルロースアセテート、セルロースアセテートブチレート；セロファン；セルロースニトレート；セルロースプロピオネート；セルロースエーテル（即ちカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース）及びこれらの組合せ、がある。本出願の目的のためのポリアミドは、型-NH-(CH2）n-CO- 及びNH-(CH2）x-NH-CO-(CH2）y-CO（但し式中、n は好ましくは6乃至13の整数である；xは6乃至12の範囲の整数である；そしてyは4乃至16の範囲の整数である）のポリアミドも含むであろう。上記のリストは例示的なものであり、限定的なものではない。
【０１９７】
コーティングに用いるポリマは、ろう様になったり、あるいは粘着性になったりしないように充分高い分子量を有するフィルム形成性ポリマであってよい。当該のポリマはまた、ステントに接着しなければならず、ステント上に蒸着された後は、血流力学的ストレスによって変位させられる程、容易に変形可能であってはならない。当該のポリマの分子量は、ステントの操作又は装着中にポリマが擦り取られないように充分な強度を提供するように充分高い分子量であり、また、ステントの拡張中に裂けてはならない。いくつかの実施態様では、当該のポリマは、４０℃より高い、好ましくは約４５℃より高い、より好ましくは約５０℃より高い、そして最も好ましくは約５５℃より高い融解温度を有する。
【０１９８】
コーティングは、治療用インターフェロンのうちの一つ以上をコーティング・ポリマとコーティング混合液中で混合することにより、調合できよう。該インターフェロンは液体、微細に分割された固体、又はいずれか他の適した物理学的形で存在してよい。選択的には、該混合液は、希釈剤、単体、医薬品添加物、安定化剤等の非毒性補助物質など、一種以上の添加物を含んでいてもよい。他の適した添加物を、ポリマ及びインターフェロンと一緒に調合してもよい。例えば、前に解説した生体適合性フィルム形成性ポリマのリストから選択された親水性ポリマを、生体適合性の疎水性コーティングに加えて、遊離プロファイルを変更してもよい（あるいは、疎水性ポリマを親水性コーティングに加えて遊離プロファイルを変更してもよい）。一例は、酸化ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース及びこれらの組合せから成る群より選択される親水性ポリマを脂肪族ポリエステル・コーティングに加えて、遊離プロファイルを変更することであろう。適した相対的量は、治療用インターフェロンのin vitro及び／又はin vivo遊離プロファイルを観察することにより、決定することができる。
【０１９９】
コーティングの厚さは、マトリックスからインターフェロンが溶出する速度を決定することができる。基本的には、インターフェロンは、ポリマ・マトリックスを通じた拡散により、マトリックスから溶出する。ポリマは浸透性であるため、固体、液体及び気体はそこから逃げることができる。ポリマ・マトリックスの合計の厚さは、約１ミクロン乃至約２０ミクロンの範囲内又はそれ以上である。プライマ層及び金属表面処理を、ポリマ・マトリックスを医療器具に固定する前に用いてよいことに留意することが重要である。例えば、酸洗浄、アルカリ（塩基）洗浄、塩処理及びパリレン析出を、解説した全体的プロセスの一部として用いてもよい。
【０２００】
更に実例を挙げると、ポリ（エチレン-コ-ビニルアセテート）、ポリブチルメタクリレート及びインターフェロン溶液を、数多くの方法でステント中又はステント上に取り入れてよい。例えば、溶液をステント上に噴霧するか、あるいは、ステントを溶液中に浸漬してもよい。他の方法には、スピン・コーティング及びRFプラズマ重合体化がある。ある例示的な実施態様では、溶液をステント上に噴霧した後、乾燥させる。別の例示的な実施態様では、溶液を一方の極性に帯電させ、ステントを反対の極性に帯電させる。この方法で、溶液及びステントを互いに誘引されるであろう。この種類の噴霧プロセスを用いると、廃棄物が減り、被膜の厚さをより精確に制御できるであろう。
【０２０１】
別の例示的な実施態様では、インターフェロンを、ある量の、重合体化フッ化ビニリデン及び重合体化テトラフルオロエチレンから成る群より選択される第一部分と、ある量の、前記第一部分以外の、第一部分と共重合体化させる第二部分とを含むフィルム形成性ポリフルオロコポリマに取り入れることで、ポリフルオロコポリマを作製してよく、この場合、前記第二部分は、当該のポリフルオロコポリマに靱性又は弾性を提供することができ、
また前記第一部分及び第二部分の相対量は、コーティングと、それから生じたフィルムとに、移植可能な医療器具を処理する際の使用に有効な特性をもたらすものである。
【０２０２】
本発明に従ったある実施態様では、本発明の内腔内医療器具の拡張可能な管状ステントの外側表面は、本発明に従ったコーティングを含む。コーティングを有するステントのこの外側表面は組織接触表面であり、生体適合性である。「持続放出インターフェロン送達系でコーティングされた表面」は、「コーティングされた表面」と同義であり、この表面は、本発明に従った持続放出インターフェロン送達系によりコーティングされるか、覆われるか、又は含浸されている。送達系の例（制御放出、持続放出、遅延放出）は、引用をもってその内容を本出願に援用することとする、本出願人のUS2003/0017169として公開された米国一連番号 10/193,654、及びWO02/053174として公開された PCT/US01/50355に解説されている。
【０２０３】
代替的な実施態様では、本発明の内腔内医療器具の長寸の半径方向に拡張可能な管状ステントの内側内腔表面又は全表面（即ち内側及び外側表面）はコーティングされた表面を有する。本発明の持続放出インターフェロン送達系コーティングを有する内側内腔表面も、流体接触表面であり、生体適合性かつ血液適合性である。
【０２０４】
ＩＶ．  異型インターフェロン・ポリペプチド
本発明のインターフェロン・ポリペプチドの特定の変異型（又は異型）はアゴニスト又はアンタゴニストとして作用するであろうと予測される。いずれの特定の理論に縛られることを望む訳ではないが、変異型のタンパク質シグナル伝達因子はその適した受容体に結合できるが、それでもこの受容体を活性化することはできないことが公知である。このような変異タンパク質は野生型タンパク質を変位させて正常な受容体活性化を遮断することでアンタゴニストとして作用する。加えて、数多くのタンパク質には、野生型の当該タンパク質に比較してそれらの活性を高めるために、一箇所以上のアミノ酸置換を作ることができることが公知である。このようなアゴニストは、例えば、野生型タンパク質に比較して増加した半減期、結合親和性、安定性、又は活性を有するであろう。所望の活性を持つ変異型（又は異型）を得るには数多くの公知の方法がある。
【０２０５】
変異型／異型タンパク質の大きなプールを作製する方法は当業で公知である。ある実施態様では、本発明は、コンビナトリアル変異誘発により作製されたインターフェロン・ポリペプチドを用いることを考察する。このような方法は、当業で公知のように、点変異型及び切断変異型の両方を作るために便利であり、特に、検定で機能的な潜在的異型配列（例えば相同体）を特定するために有用であろう。このようなコンビナトリアル・ライブラリをスクリーニングする目的は、例えば、アゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとして作用できるインターフェロン異型又は相同体などを作製することである。このように、コンビナトリアルで得られた異型は、天然で生じる型のタンパク質に比較して向上した効力を有するように作製することができる。同様に、他の細胞外マトリックス成分（例えば受容体）への結合などは模倣できるが、それでも尚、何ら生物学的応答を誘導せず、従ってインターフェロン・ポリペプチド又はインターフェロン・アゴニストの作用を阻害することができる点でアンタゴニストとして作用するように、インターフェロン異型を作製することが、このコンビナトリアル法で可能である。更に、本方法によるインターフェロンのいくつかのドメインを操作することで、特定の有用な特性を有すると実証されたドメインなど、融合又はキメラタンパク質で用いるのにより適したドメインを提供することができる。
【０２０６】
コンビナトリアル変異誘発法の技術水準を更に実例を挙げると、Gallop et al. (1994）、 J
Med Chem 37:1233 のレビュー文献が、１９９０年代初頭の時点でコンビナトリアル・ライブラリの一般的技術水準を解説していることに注目されたい。具体的には、Gallopらは１２３９ページで、「類似ライブラリをスクリーニングすると、活性な配列の最小の大きさを決定し、結合にとって重要であり、置換には耐えられないような残基を特定する上で助けとなる」と述べている。加えて、Ladner らのPCT 公報
WO90/02809、Goeddel らの米国特許第5,223,408号、及び Markland らのPCT
公報 WO92/15679 は、特定の活性を持つ異型／断片を特定するために高速でスクリーニングすることのできる異型のライブラリを作製するために、当業者が利用できると思われる具体的な技術を解説している。これらの技術は当業にとって例示的なものであり、関連する異型／切断型の大型ライブラリを作製し、検定すれば、不要な実験を行わずに特定の異型を単離することができることを実証している。Gustin et al. (1993）
Virology 193:653、及びBass et al. (1990） Proteins: Structure,
Function and Genetics 8:309-314 も、本発明のインターフェロン・ポリペプチドの変異誘発異型を作製する手段として適合させることのできる、当業の他の例示的な技術を解説している。
【０２０７】
実際、どの残基が生物学的機能にとって重要であるかの予備知識がなくとも、インターフェロンタンパク質の大規模な変異誘発を行えば、均等な生物学的活性を有する異型の幅広いアレイを作製できることは、コンビナトリアル変異誘発技術から明白である。代替的には、このような方法を用いて、より高い活性又はアンタゴニスト活性を有する異型の幅広いアレイを作製することができる。実際、重要な残基を前もって理解又は知っておく必要をなくす高スループットの解析により、数十億の様々な異型をスクリーニングできるというのが、コンビナトリアル技術の能力である。
【０２０８】
Ｖ．  抗体アンタゴニスト
いくつかの抗体はインターフェロン・アンタゴニストとして働くことができると予測される。抗体は特定のエピトープに対して驚くべき親和性及び特異性を有することがある。抗体の、あるタンパク質上のそのエピトープへの結合は、適正な機能を果たすために必要な、そのタンパク質の他のタンパク質との相互作用を、競合的又は非競合的に阻害することにより、そのタンパク質の機能に拮抗するであろう。
【０２０９】
インターフェロン・アンタゴニスト活性を持つ抗体は、他のインターフェロン・アンタゴニストとほとんど同じ方法で特定することができる。例えば、候補抗体を、レポータ遺伝子を発現している細胞に投与することができ、こうしてレポータ遺伝子の発現減少を引き起こす抗体は、アンタゴニストである。
【０２１０】
ある変形例では、本発明の抗体は、ポリペプチド・リンカで連結された可変抗原結合ドメインを含む一本鎖抗体（scFv）であってよい。一本鎖抗体は一個のポリペプチド鎖として発現するが、細菌内で、そしてファージ・ディスプレイ・ライブラリの一部として発現させることができる。この方法では、適したscFvを発現するファージが、インターフェロン・アンタゴニスト活性を有するであろう。次に、一本鎖抗体をコードする核酸をこのファージから回収し、大量のscFvを作製するために用いることができる。scFvライブラリの構築及びスクリーニングは、多様な公開文献に広汎に解説されている（米国特許第5,258,498号；第5,482,858号；第5,091,513号；第4,946,778号；第5,969,108号；第5,871,907号；第5,223,409号；第5,225,539号）。
【０２１１】
Ｇ．  ヒトIFN-α対立遺伝子及びタンパク質産物
下の表２は、ヒトインターフェロンαファミリの遺伝子／タンパク質の共通の対立遺伝子を示し、Pestka, S. (1983） Arch Biochem Biophys 221:1-37; Diaz, M.O., Pomykala, H.M.,
Bohlander, S.K., Maltepe, E., Malik, K., Brownstein, B., and Olopade, O.I.  (1994） Genomics 22:540-52; 及び Pestka, S. (1986） Meth. Enzymol 119:3-14に基づいて構築され、Krause, C.D., Lunn, C.A., Izotova, L.S., Mirochnitchenko, O.,
Kotenko, S.V., Lundell, D.J., Narula, S.K., and Pestka, S.  (2000)J Biol Chem. 275:22995-3004でレビューされた。 
【０２１２】
【表２】
2006526022.tif 000005
【０２１３】
ヒトインターフェロン-α遺伝子の対立遺伝子異型及びインターフェロン-α変異型は以下の出願で報告されている： WO 2002/095067; WO
02/079249; WO 02/101048; WO 02/095067; WO 02/083733; WO
02/086156; WO 2002/083733; WO 03/000896; WO 02/101048; WO 02/079249; WO
03/000896; WO 2004/022593; WO 2004/022747; WO 03/023032;
WO 2004/022593。以下の公開文献も参照されたい： (1） Kim et al, Cancer Lett. 2003 Jan 28;189(2）:183-8; (2）  Hussain et al., J Interferon Cytokine Res. 2000 Sep;20(9）:763-8; (3） Hussain et al., J Interferon
Cytokine Res. 1998 Jul;18(7）:469-77; (4） Nyman et al., Biochem J. 1998 Jan 15;329 ( Pt 2）:295-302; (5）Golovleva et al, J Interferon
Cytokine Res. 1997 Oct;17(10）:637-45; (6）Hussain et al, J Interferon Cytokine Res. 1997 Sep;17(9）:559-66; (7）Golovleva, I., Saha, N., Beckman,
L.  Hum Hered. 1997 Jul-Aug;47(4）:185-8; (8） Golovleva et al, 1997 Apr;18(4）:645-7; (9）Kita et al, J Interferon Cytokine
Res. 1997 Mar;17(3）:135-40; (10）Golovleva et al, Am J Hum Genet. 1996 Sep;59(3）:570-8; (11）Hussain et al, J Interferon Cytokine
Res. 1996 Jul;16(7）:523-9 ; (12） Linge et al, Biochim Biophys Acta. 1995 Dec 27;1264(3）:363-8 ; (13）Gewert et al, J Interferon Cytokine
Res. 1995 May;15(5）:403-6; (14） Lee et al, J Interferon Cytokine Res. 1995 Apr;15(4）:341-9; (15） Kaluz et al, Acta Virol. 1994
Apr;38(2）:101-4; (16） Emanuel et al, J Interferon Res.
1993 Jun;13(3）:227-31; (17） Kaluz et al,  Acta
Virol. 1993 Feb;37(1）:97-100; (18）Shekhter et al, Dokl Akad Nauk SSSR. 1990;314:998-1001; (19) Li et
al, Sci China B. 1992 Feb;35(2):200-6。
【０２１４】
実施例
本発明を概略的に解説したところで、以下の実施例を参照されればそれを容易に理解されようが、以下の実施例は単に本発明の特定の局面及び実施例の描写を目的として含まれたのであり、本発明を限定することは意図していない。
【０２１５】
実施例１：  ネコIFNαクローンの単離
ネコIFNαクローンを、標準的方法を用いた、ネコ肺細胞株（AKD）由来のゲノムDNAのPCR増幅により単離した。９つの個別の配列が単離され、Fe-IFN-αA （配列番号９）、Fe-IFN-αB（配列番号１１）、Fe-IFN-αC（配列番号１３）、Fe-IFN-αD（配列番号１５）、Fe-IFN-αE（配列番号１７）、Fe-IFN-αF（配列番号１９）、Fe-IFN-αG（配列番号２１）、Fe-IFN-αH（配列番号２３）、及びFe-IFN-αI（配列番号２５）と指定された。これらの各々に対応するアミノ酸配列も提供されている：Fe-IFN-αA（配列番号１０）、Fe-IFN-αB（配列番号１２）、Fe-IFN-αC（配列番号１４）、Fe-IFN-αD（配列番号１６）、Fe-IFN-αE （配列番号１８）、Fe-IFN-αF（配列番号２０）、Fe-IFN-αG（配列番号２２）、Fe-IFN-αH（配列番号２４）、及びFe-IFN-αI（配列番号２６）。
【０２１６】
PCRを標準的な手法を用いて行った。ゲノムDNAの増幅を２回、行った。ネコ配列を増幅するために用いられたフランキング・プライマは：
5’ プライマ:     5’-CTCTTCCTTCTTGGTGGCCCTG-3’
3’ プライマ:     5’-GTGATGAGTCAGTGAGAATCATTTC-3’
である。
【０２１７】
実施例２：  ネコIFNα種の抗ウィルス活性
当該のインターフェロン種の抗ウィルス活性を、細胞変性効果検定（CPE）を用いて測定した。簡単に説明すると、インターフェロンの連続希釈液を検査細胞と一緒に１乃至４時間、３７℃でインキュベートした。次にウィルスをこの細胞に加え、１６時間、３７℃でインキュベートした。生存している細胞をクリスタル・バイオレット染料の取り込みで可視化し、細胞のほぼ５０％が、ウィルス感染後も生存するインターフェロンの希釈度を判定した。
【０２１８】
図１は、CPEで測定したときにネコIFN-αA、IFN-αB、IFN-αC、IFN-αD、IFN-αE、IFN-αF、IFN-αG、及びIFN-αIがそれぞれ、抗ウィルス活性を持つことを実証するこれらの実験の結果を要約したものである。
ネコIFN-αHの活性はこの検定では判定されなかった。この具体的な実験では、検査細胞はAKDネコ肺細胞であり、ウィルスは水疱性口内炎ウィルス（VSV）であった。
【０２１９】
実施例３：  アカゲザルIFNαクローンの単離
アカゲザルIFNαクローンを、アカゲザル腎細胞株（LLCMK-2）由来のゲノムDNAから標準的な方法を用いたPCR増幅により単離した。２つの別々のプライマ・ペアを用いて配列を増幅した。一番目のプライマ・ペアを用いて、一つの配列を単離し、Rh-IFN-α4b（配列番号２９）と指定した。Rh-IFN-α4b核酸配列に対応するアミノ酸配列を配列番号３０と指定した。PCRを標準的手法を用いて行った。ゲノムDNAからの増幅を２回、行った。このアカゲザル配列を増幅するために用いられたフランキング・プライマは：
5’ プライマ:     5’-CTTCAGAGAACCTGGAGCC-3’
3’
プライマ:     5’-AATCATTTCCATGTTGAACCAG-3’
である。
【０２２０】
３つの更なるアカゲザルIFNαクローンを、標準的な方法及び第二のプライマ・ペア：Rh-IFN-αD1（配列番号３１）、Rh-IFN-αD2 （配列番号３３）、及びRh-IFN-αD3（配列番号３５）を用いて、アカゲザル腎細胞株（LLCMK-2）由来のゲノムDNAのPCR増幅により、単離した。これらのそれぞれに対応するアミノ酸配列も提供されている：Rh-IFN-αD1 （配列番号３２）、Rh-IFN-αD2（配列番号３４）、及びRh-IFN-αD3（配列番号３６）。
【０２２１】
PCRを標準的手法を用いて行った。ゲノムDNAからの増幅を２回、行った。これらのアカゲザル配列を増幅するために用いられたフランキング・プライマは：
5’ プライマ:     5’-AGAAGCATCTGCCTGCAATATC-3’
3’
プライマ:     5’-GCTATGACCATGATTACGAATTC-3’
である。
【０２２２】
実施例４：  アカゲザルIFNα種の抗ウィルス活性
当該のインターフェロン種の抗ウィルス活性を細胞変性効果検定（CPE）を用いて測定した。簡単に説明すると、インターフェロンの連続希釈液を検査細胞と一緒に１乃至４時間、３７℃でインキュベートした。次にウィルスをこの細胞に加え、３７℃で１６時間、インキュベートした。生存している細胞をクリスタル・バイオレット染料の取り込みで可視化し、細胞のほご５０％がウィルス感染後も生き延びるインターフェロンの希釈度を判定した。
【０２２３】
図２は、抗ウィルス活性検定（CPE）で測定したときにアカゲザルIFN-α4bが抗ウィルス活性を持つことを実証する実験の結果を要約したものである。アカゲザルIFN-αD1、IFN-αD2、及びIFN-αD3の活性はこの検定では判定されなかった。この検定は、検査細胞として、VSVに感染したMadin-Darby ウシ腎内皮細胞（MDBK）又はアフリカミドリザル腎細胞（Vero）のいずれかを用いて行われた。
【０２２４】
実施例５：  ヒトIFNαクローンの単離
１８個のヒトインターフェロン-α種を米国特許第5,789,551号、第5,869,293号及び第6,001,589号に解説された手法に従って単離した。簡単に説明すると、ヒトゲノムDNAを標準的な方法を用いたPCRにより解析した。この解析で用いられたプライマを図３及び４で解説する。
【０２２５】
このアプローチを用いて同定された１８個のヒトインターフェロン-α種は：hu-IFN-α001 （配列番号３７）、hu-IFN-α002 （配列番号３９）、hu-IFN-α003 （配列番号４１）、hu-IFN-α004 （配列番号４３）、hu-IFN-α005 （配列番号４５）、hu-IFN-α006 （配列番号４７）、hu-IFN-α007（配列番号４９）、hu-IFN-α008 （配列番号５１）、hu-IFN-α009 （配列番号５３）、hu-IFN-α010 （配列番号５５）、hu-IFN-α011 （配列番号５７）hu-IFN-α012 （配列番号５９）、hu-IFN-α013 （配列番号６１）、hu-IFN-α014 （配列番号６３）、hu-IFN-α015 （配列番号６５）、hu-IFN-α016 （配列番号:６７）、hu-IFN-α017 （配列番号６９）、hu-IFN-α018 （配列番号７１）である。これらのそれぞれに対応するアミノ酸配列も提供されている：IFN-α001 （配列番号３８）、hu-IFN-α002 （配列番号４０）、hu-IFN-α003（配列番号４２）、hu-IFN-α004（配列番号４４）、hu-IFN-α005（配列番号４６）、hu-IFN-α006（配列番号４８）、hu-IFN-α007（配列番号５０）、hu-IFN-α008（配列番号５２）、hu-IFN-α009（配列番号５４）、hu-IFN-α010（配列番号５６）、hu-IFN-α011（配列番号５８）、hu-IFN-α012（配列番号６０）、hu-IFN-α013（配列番号６２）、hu-IFN-α014（配列番号６４）、hu-IFN-α015（配列番号６６）、hu-IFN-α016（配列番号６８）、hu-IFN-α017（配列番号７０）、hu-IFN-α018（配列番号７２）。
【０２２６】
更に、hu-IFN-α001及びhu-IFN-α012を、至適 E. coliコドンを用いて戻し翻訳し、hu-IFN-α001-BT （配列番号７３）及びhu-IFN-α012-BT （配列番号７５）と指定した。これらのそれぞれに対応するアミノ酸配列も提供されている：hu-IFN-α001-BT （配列番号７４）及びhu-IFN-α012-BT （配列番号７６）。
【０２２７】
実施例６：  ヒトIFNα異型の単離
上に詳述したヒトIFNα種を含有する発現ベクタを構築中に、変異を含有する以下のクローンを作製した。これらのIFNα異型を、活性について検査することができる。IFNα異型に、サイレントな置換を含めることで、野生型IFNα種と同一の活性を有させることができる。代替的には、異型に、当該ポリペプチドの活性を変える置換を含めてもよい。前記の置換は、当該の活性を増す、高める又は強めるものであってよく、こうしてIFNαアゴニストであってよい。加えて、該置換は当該の活性を減らす又は干渉するものかも知れず、こうしてIFNαアンタゴニストであってもよい。
【０２２８】
異型種の核酸配列を提供する：hu-IFN-α019 （配列番号７７）、hu-IFN-α020 （配列番号７９）、hu-IFN-α021（配列番号８１）、hu-IFN-α022（配列番号８３）、及びhu-IFN-α023（配列番号８５）。これらのそれぞれに対応するアミノ酸配列も提供されている：hu-IFN-α019 （配列番号７８）、hu-IFN-α020（配列番号８０）、hu-IFN-α021（配列番号８２）、hu-IFN-α022（配列番号８４）、及びhu-IFN-α023（配列番号８６）。
【０２２９】
実施例７：  ヒトIFNα種の抗ウィルス活性
ヒトIFNα種の抗ウィルス活性も、上に詳しく概略したようにCPE検定を用いて判定した。この検定は以下の検査細胞及びウィルスの組合せを用いて行われた：VSVを持つMDBK検査細胞；VSVを持つヒト上皮扁平（HEP-2）細胞；EMCを持つマウス結合組織線維芽細胞（L929）；VSVを持つヒト肺扁平（H226）細胞；及びインフルエンザウィルスを持つヒト肺線維芽細胞。
【０２３０】
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説された本発明の具体的な実施例の均等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような均等物は、以下の請求項に包含されるものと、意図されている。多様な公開文献が本出願全体を通じて引用されている。これらの公開文献の内容を、引用をもって本出願のここに援用することとする。より詳細な事項については、図１０及び実施例１３を参照されたい。
【０２３１】
実施例８：  SARSコロナウィルス細胞変性効果のインターフェロンによる阻害
材料及び方法：  インターフェロンの抗SARS-CoV活性を評価するために、10%ウシ胎児血清（FBS、インビトロジェン社）を添加したMEM培地に入れたFRhk-4 細胞（１ウェル当たり5×103個） を９６ウェル細胞培養プレートに播種し、一晩、培養した。次に、細胞を、100μlのMEM培地に溶解した様々な濃度の様々な形のインターフェロンと一緒に１時間、インキュベートした。次にこれらをSARS-CoV （GZ50 株）に感染させ、培養した。SARS-CoV 感染から２４時間後に、SARS-CoV ウィルス細胞変性効果に対して細胞にもたらされた保護の程度を、位相差顕微鏡で細胞形態を観察及び記録することで判定した。各実験は三重にして行われ、少なくとも３回、繰り返された。非感染細胞は平らになったが、SARS-CoV感染細胞は光屈折性となり、丸くなった。SARS-CoVで誘導された細胞変性効果の程度を、0 （CPEなし）；±1（弱いCPE）；±2（中程度の CPE）；±3（強いCPE、保護剤の添加なし）までで等級付けした。
【０２３２】
感染から１６時間前に細胞を９６ウェル皿に播種した。感染細胞の調整培地を１０倍連続に1%のFBSを加えたMEMで希釈し、細胞を感染させるために用いた。１０個のウェルを各希釈に用い、２個のウェルをウィルス感染のないコントロールとして用いた。CPEを位相差顕微鏡下で感染後２４時間目で記録し、感染性のウィルス力価を標準的なプロトコル（50%の組織培養物感染性用量）に従って計算した。
【０２３３】
結果：  図５を参照されたい。IFN α2a及び新規なインターフェロンの有効性を、in  vitroで、FRhk-4サル腎細胞に対するSAR CoVの単離株GZ50の細胞変性効果の阻害を測定する検定で検査した。図Ｘに見られるように、20 ng/ml の濃度のIFNアルファ 2b は、SARS コロナウィルスのこれらの培養細胞に対する致死能を、完全には阻害しない。IFN α012は、これらの細胞を保護する上ではより活性であり、20 ng/ml で完全に保護が起き、IC50は 0.8 乃至 0.16 ng/mlの間である。IFN α023は更により効力があり、4 ng/ml で完全な保護が起き、IC50は 0.8 乃至0.16 ng/mlの間である。
【０２３４】
実施例９：  インターフェロンによるSARS Cov複製の阻害
材料及び方法：  細胞及びウィルス：  アフリカミドリサル腎細胞（Vero 76）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC；米国ヴァージニア州マナサス）から得た。この細胞を、5%熱不活化ウシ胎児血清（FBS；米国ユタ州ローガン、ハイクローン・ラボラトリズ社）を添加した最小基本培地（MEM）中で慣例の通りに成長させた。抗ウィルス検定については、血清を2% まで希釈し、ゲンタマイシンを培地に最終濃度50μg/mlになるように加えた。
【０２３５】
重症急性呼吸器症候群コロナウィルス（SARS CoV）である株Urbani (200300592)をCDCから得、Vero 76 細胞内で慣例通りに継代させた。
【０２３６】
細胞変性効果（CPE）阻害検定法。Barnard et al. 2001 (Barnard,
D.L., Stowell, V.D., Seley,K.L., Hegde, V.R., Das, S.R., Rajappan, V.P.,
Schneller, S.W., Smee, D.F., & Sidwell, R.W. 2001, Antiviral Chemistry
& Chemotherapy 12:221-230）のプロトコルを用いた。化合物を様々な濃度（４つの単一log10 又は７つの 1/2 log10 希釈度）で１回乃至２回、この検定で検査し、次に細胞生存率を、同じプレート上でニュートラルレッド（NR）取り込み検定 により分光法で確認した（下記参照）。ウィルス（感染多重度［MOI］＝0.001）及び化合物を等容にして、96ウェル組織培養プレートに入れた80-90% コンフルエント細胞の単層に添加した。インターフェロンを評価するウェルでは、これらの細胞をインターフェロンでウィルス曝露前の２４時間、予備処理した。用いたMOIは、ウィルス・コントロール中の細胞の100%が細胞変性効果（CPE）を３乃至５日間以内に示すものだった。ウィルス・コントロール・ウェル中の細胞が光学顕微鏡で観察したときに完全なウィルス性CPEを示すまで、このプレートを３７℃でインキュベートした。薬物の各濃度は、ウィルス性CPEの阻害については三重にして、そして細胞毒性については二重にして、検定された。マイクロプレート一個当たり６つのウェルを、未感染の非処理細胞コントロールとして横に置いておき、６つのウェルには、１マイクロプレート当たりウィルスを培地のみに入れて投与し、ウィルス複製に関するコントロールとした。
検査された各組の化合物についてアルフェロンを陽性コントロール薬物として含めた。全てのCPEベースの検定について、インターフェロンの50%有効濃度（IC50）を、各濃度に関する非処理の未感染コントロールのパーセンテージで表されたCPE等級の中間値の線形回帰分析で計算した。
【０２３７】
CPE阻害及び化合物細胞毒性のニュートラル・レッド（NR）取り込み検定。この検定は、視覚的観察で観察された阻害活性及び細胞毒性を確認するために、上述した同じCPE阻害検査プレート上で行われた。我々が有する視覚的検定及びNR検定間の通常の相関は、95% を越えていた（Barnard, D.L., Stowell, V.D., Seley, K.L., Hegde, V.R., Das, S.R.,
Rajappan, V.P., Schneller, S.W., Smee, D.F., & Sidwell, R.W. 2001,
Antiviral Chemistry & Chemotherapy 12:221-230）。このNR検定は、Barnard et al. (Barnard, D.L., Sidwell, R.W., Xiao, W., Player,
M.R., Adah, S. & Torrence, P.F. (1999） Antiviral Research 41:119-134）に解説された通りに、Cavenaugh et al. (Cavenaugh, P.R. Jr., Moskwa,, P.S., Donish, W.H.,
Pera, P.J., Richardson, D. & Andrese, A.P. (1990） Investigational New Drugs
8:347-354)の改良された方法を用いて行われた。
【０２３８】
簡単に説明すると、培地を一枚のプレートの各ウェルから取り出し、このプレートの各ウェルに0.034%のNRを加え、このプレートを２時間、３７℃で暗室内でインキュベートした。該NR溶液をウェルから取り出し、すすぎ、残った染料を、ソレンソンのクエン酸緩衝液で緩衝させたエタノールを用いて抽出した。540 nm/450 nm での吸光度をマイクロプレート・リーダ（Bio-Tek EL 1309; ヴァーモント州ウィヌースキ、バイオ-テック・インスツルメンツ社）で読み取った。吸光度値を、非処理のコントロールのパーセンテージで表し、IC50値を、上述したように計算した。
【０２３９】
結果：  図６を参照されたい。 IFN α2a及び新規なインターフェロンのSARS CoV を阻害する上での有効性を、SARS CoV 阻害の別の検定でin vitroで検査した。これらの実験では、異なるウィルス株であるUrbani及び細胞株アフリカミドリザル細胞（Vero 76）を用いた。ニュートラル・レッドの取り込みで測定すると、IFN α012のみがIFNα 2aよりも細胞を保護する上でより有効だった。視覚的測定では、示した新規なIFN（IFNα003、α023及びα012）の３つすべてが、IFN α2aよりも有効であり、やはりIFN α012が最高の抗ウィルス活性を示した。
【０２４０】
実施例１０：  呼吸系発疹ウィルスの複製のインターフェロンによる阻害
材料及び方法：  ヒト胚性二倍体線維芽細胞を、5%ウシ胎児血清（FBS）を取り入れたイーグルMEMを入れた平底９６ウェル・プレート内でコンフルエントになるまで成長させた。次に、細胞単層をRSVの様々な臨床単離株に低MOI（約0.01）で感染させ、ウィルスを１時間、室温で吸着させた。ウィルスを取り除き、単層をPBSで洗浄し、薬物なしのコントロールも含む多様なインターフェロンの連続希釈液を含有する、2% FBSを加えたMEMに取り替えた。３６℃で３日間、インキュベートした後、細胞を0.05% グルタルアルデヒド／PBS 中に固定し、5% BSA/PBS で１時間、遮断した。洗浄後、単層に、希釈したマウスモノクローナル抗体（Ａ＆Ｂサブタイプと交差反応性）を投与し、３６℃で１時間、インキュベートした。洗浄後、単層を、推奨された濃度のプロテイン-Ａ-HRP結合体と一緒に１時間、３６℃でインキュベートした。洗浄後、基質を加え、希硫酸を加えて反応を停止させた。吸光度値を450nmで測定した。データを表にし、50% エンドポイントを判定した。
【０２４１】
結果：  図７を参照されたい。IFN α2a及び新規なインターフェロンの有効性を、呼吸系発疹ウィルス（RSV）感染のin vitroモデルで検査した。単離株の大半について、IFN α012は、IFNα2aよりも効力があり、但しVS1511は例外であり、この場合IFN α023は検査されたすべての株に対して絶対的により効力があった。IFN α003及びα001は、この検定系ではあまり効力がなかった。
【０２４２】
実施例１１：  ヒト肺線維芽細胞をインフルエンザウィルス感染から保護する上でのインターフェロンの有効性
材料及び方法：  本検定で用いるべき適したウィルス力価を決定するために、ウィルス感受性検定を行った。二重の列にした100μlの細胞を、９６ウェル微量定量プレートに、2.0E＋5のヒト肺線維芽細胞（HLF）細胞/mlの濃度になるようにプレートする。この微量定量プレートを5.0%のCO2と一緒に一晩、３７℃下におく。２日目に、インフルエンザを別の微量定量プレート上で力価測定する。１：２の連続希釈をプレート全体に行って、合計２４個の希釈液とする。次に、これらのウィルス希釈液のうちの50μlを細胞の微量定量プレートに加え、インキュベータ内に一晩、配置する。３日目にプレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。本検定で実際に用いるべきウィルスの希釈液を得るために、細胞の１００％の致死が起きる最後のウェルの右側３つ目のウェルのエンドポイントを用いる。この場合、我々の用いたウィルス・ストックの１：２０のインフルエンザ希釈液を最良の希釈液と判定した。
【０２４３】
インターフェロン力価を見出すには、インターフェロンをまず、ほぼ8000U/mlになるように、90% DMEM, 10% FBSで希釈する。次に、この溶液のうちの10μlを９６ウェル微量定量プレート上の190μlの培地に加える。２倍の希釈をプレート全体に行って、合計１２のインターフェロン希釈液を作る。既知の濃度のヒトIFN アルファA 実験用標準も、最初のウェルで１：２０に希釈し、プレート全体にわたって連続希釈する。HLF 細胞を計数し、2.0E＋5細胞／mlの濃度まで希釈する。次に、これらの細胞のうちの100μlを各ウェルに加える。次に、微量定量プレートをプラットホーム・ロッカ上に置き、１０分間、揺らす。次にこのプレートをインキュベータ内（３７℃、5.0% CO2）に一晩、配置する。
２日目にインフルエンザを所定の濃度、ここでは１：２０に希釈して、50μlを各ウェルに加える。再度、このプレートをインキュベータ内に一晩、配置する。次にプレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。インターフェロン力価を判定するために、50%の致死が起きたエンドポイントを判定する。その後このエンドポイントをヒトIFNアルファＡ実験標準のエンドポイントと比較する。
【０２４４】
結果：  図８を参照されたい。新規なインターフェロンの有効性をin vitroで、ウィルス(H1N1）のWSN/A 株 及び正常ヒト肺線維芽細胞（HLF）を用いたインフルエンザモデルで検査した。
ウィルス細胞変性効果の50%を阻害するのに必要なIFN濃度を判定し、相対的効力で表す。この検定では、IFN α003は、IFN α2aに均等であったが、IFN α001の効力はそれより低かった。IFNα012は、IFNα2aの効力よりも２０倍を越えて、高かった。
【０２４５】
実施例１２：  黄熱病ウィルス感染から肝細胞を保護する上でのインターフェロンの有効性
材料及び方法：  PBSに40に1に希釈した0.1%コラーゲン・タイプ1でコーティングされた平底９６ウェル微量定量プレートにHepG2 細胞を播種した。この細胞をサブコンフルエントな単層になるまで成長させた後、推定上の抗ウィルス剤を加えた。化合物は６つの複製にしてウェルB2乃至G2に加えられ、３倍の希釈液をプレート全体にわたって（B2 乃至B10、C2 乃至C10等）調製した。カラム１１には化合物を加えなかった。
【０２４６】
化合物を細胞の存在下で２７時間、インキュベートした。黄熱病ウィルス株17D （ストック 6）を、列B、C 及びDの細胞に、１ウェル当たり50μlにして加え、500 pfu/ウェルとした。ウィルス感染細胞で充分な致死が起きたときに、１ウェル当たり25μlのXTT及びPMSを各ウェルに加えることで生存細胞を測定し、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。プレートを室温まで１０分間かけて冷ましてから、プレート・シーラを施し、プレートを450nmで分光吸光度について分析した。
【０２４７】
結果：  図９を参照されたい。新規なインターフェロンの、HepG2肝細胞を黄熱病ウィルスによる致死から保護する上での有効性を、IFN α2aに比較した。IFN α012は、IFN α2aよりも僅かに有効であったが、IFN α003及びα023はIFN α2aよりも著しく有効であった。YFVはＣ型肝炎ウィルスに密接に関係しているため、これはＣ型肝炎治療のモデルとして役立つであろう。
【０２４８】
実施例１３：  様々なウィルスに感染した多様な細胞種におけるIFN α2a及び新規なIFNの比較
材料及び方法：  抗ウィルス検定プロトコル：
HEp-2 細胞／VSV
検定で用いるべき適したウィルス力価を判定するために、ウィルス感受性検定をまず行った。二重の列の100μlの細胞を９６ウェル微量定量プレートに3.0E＋5 HEp-2 細胞／mlの濃度になるようにプレートする。この微量定量プレートを5.0%のCO2と一緒に３７℃に一晩、置く。２日目にVSVを別の微量定量プレート上で力価測定する。１：２の連続希釈をプレート全体に行って合計２４の希釈液を作る。次に、これらのウィルス希釈液のうちの50μlを細胞の微量定量プレートに加え、インキュベータ内に一晩、置く。３日目に、これらのプレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。この検定で用いるべきウィルスの実際の希釈度を得るために、細胞の100%の致死が起きる最後のウェルから右側に３番目のウェルのエンドポイントを用いる。この場合、我々のウィルス作業ストックからのVSVの1:150の希釈度を、最良の希釈度として判定した。
【０２４９】
インターフェロンIC50を判定するためには、インターフェロンをまず、ほぼ 8000 U/mlになるように90% DMEM、10% FBSで希釈する。次に、この溶液のうちの10μlを９６ウェル微量定量プレート上で190μlの培地に加える。２倍の希釈をプレート全体に行って、合計１２個のインターフェロン希釈液とする。既知の濃度のヒトIFNアルファA実験用標準も、１：２０になるように一番目のウェルで希釈し、プレート全体にわたって連続希釈する。HEP-2細胞を計数し、希釈して3.0E＋5細胞/mlの濃度にする。次に、100μlのこれらの細胞を各ウェルに加える。その後、微量定量プレートをプラットフォーム・ロッカに起き、１０分間、揺らす。次にプレートをインキュベータ（３７℃、5.0% CO2）内に一晩、置く。２日目にVSVを所定の濃度、ここでは1:150まで希釈し、50μlを各ウェルに加える。再度、プレートをインキュベータ内に一晩、置く。その後プレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。インターフェロン力価を判定するために、50%の致死が起きたエンドポイントを判定する。その後このエンドポイントを、ヒトIFNアルファＡ実験標準のエンドポイントと比較する。
【０２５０】
H226細胞／VSV
本検定で用いるべき適したウィルス力価を判定するために、ウィルス感受性検定をまず行った。二重の列にした100μlの細胞を９６ウェル微量定量プレートに2.5E＋5 H226 細胞／mlの濃度になるようにプレートする。この微量定量プレートを３７℃に、5.0%のCO2と一緒に一晩、置く。２日目にVSV を別の微量定量プレート上で力価測定する。１：２の連続希釈をプレート全体に行って合計２４の希釈液とする。次に、これらのウィルス希釈液のうちの50μlを細胞の微量定量プレートに加え、インキュベータ内に一晩、置く。３日目にプレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。本検定で用いるべきウィルスの実際の希釈度を得るために、細胞の100%の致死が起きる最後のウェルから右側に３番目のウェルのエンドポイントを用いる。この場合、我々のウィルス作業ストックからのVSVの1:1000の希釈度を、最良の希釈度として判定した。
【０２５１】
インターフェロンIC50を判定するためには、インターフェロンをまず、ほぼ 8000 U/mlになるように90% RPMI、10% FBSで希釈する。次に、この溶液のうちの10μlを９６ウェル微量定量プレート上で190μlの培地に加える。２倍の希釈をプレート全体に行って、合計１２個のインターフェロン希釈液とする。既知の濃度のヒトIFNアルファA実験用標準も、１：２０になるように一番目のウェルで希釈し、プレート全体にわたって連続希釈する。H226細胞を計数し、希釈して2.5E＋5細胞/mlの濃度にする。次に、100μlのこれらの細胞を各ウェルに加える。その後、微量定量プレートをプラットフォーム・ロッカに起き、１０分間、揺らす。次にプレートをインキュベータ（３７℃、5.0% CO2）内に一晩、置く。２日目にインフルエンザを所定の濃度、ここでは1:1000まで希釈し、50μlを各ウェルに加える。再度、プレートをインキュベータ内に一晩、置く。その後プレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。インターフェロン力価を判定するために、50%の致死が起きたエンドポイントを判定する。その後このエンドポイントを、ヒトIFNアルファＡ実験標準のエンドポイントと比較する。
【０２５２】
HLF細胞／インフルエンザ
本検定で用いるべき適したウィルス力価を判定するために、ウィルス感受性検定をまず行った。二重の列にした100μlの細胞を９６ウェル微量定量プレートに2.0E＋5 HLF 細胞／mlの濃度になるようにプレートする。この微量定量プレートを３７℃に、5.0%のCO2と一緒に一晩、置く。２日目にインフルエンザ
を別の微量定量プレート上で力価測定する。１：２の連続希釈をプレート全体に行って合計２４の希釈液とする。次に、これらのウィルス希釈液のうちの50μlを細胞の微量定量プレートに加え、インキュベータ内に一晩、置く。３日目にプレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。本検定で用いるべきウィルスの実際の希釈度を得るために、細胞の100%の致死が起きる最後のウェルから右側に３番目のウェルのエンドポイントを用いる。この場合、我々のウィルス作業ストックからのインフルエンザの1:20の希釈度を、最良の希釈度として判定した。
【０２５３】
インターフェロンIC50を判定するためには、インターフェロンをまず、ほぼ 8000 U/mlになるように90% DMEM、10% FBSで希釈する。次に、この溶液のうちの10μlを９６ウェル微量定量プレート上で190μlの培地に加える。２倍の希釈をプレート全体に行って、合計１２個のインターフェロン希釈液とする。既知の濃度のヒトIFNアルファA実験用標準も、１：２０になるように一番目のウェルで希釈し、プレート全体にわたって連続希釈する。HLF細胞を計数し、希釈して2.0E＋5細胞/mlの濃度にする。次に、100μlのこれらの細胞を各ウェルに加える。その後、微量定量プレートをプラットフォーム・ロッカに起き、１０分間、揺らす。次にプレートをインキュベータ（３７℃、5.0% CO2）内に一晩、置く。２日目にインフルエンザを所定の濃度、ここでは1:20まで希釈し、50μlを各ウェルに加える。再度、プレートをインキュベータ内に一晩、置く。その後プレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。インターフェロン力価を判定するために、50%の致死が起きたエンドポイントを判定する。その後このエンドポイントを、ヒトIFNアルファＡ実験標準のエンドポイントと比較する。
【０２５４】
Ｌ細胞／EMCV
本検定で用いるべき適したウィルス力価を判定するために、ウィルス感受性検定をまず行った。二重の列にした100μlの細胞を９６ウェル微量定量プレートに3.0E＋5 Ｌ 細胞／mlの濃度になるようにプレートする。この微量定量プレートを３７℃に、5.0%のCO2と一緒に一晩、置く。２日目にEMCV を別の微量定量プレート上で力価測定する。１：２の連続希釈をプレート全体に行って合計２４の希釈液とする。次に、これらのウィルス希釈液のうちの50μlを細胞の微量定量プレートに加え、インキュベータ内に一晩、置く。３日目にプレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。本検定で用いるべきウィルスの実際の希釈度を得るために、細胞の100%の致死が起きる最後のウェルから右側に３番目のウェルのエンドポイントを用いる。この場合、我々のウィルス作業ストックからのEMCVの1:2000の希釈度を、最良の希釈度として判定した。
【０２５５】
インターフェロンIC50を判定するためには、インターフェロンをまず、ほぼ 8000 U/mlになるように90% MEM、10% FBSで希釈する。次に、この溶液のうちの10μlを９６ウェル微量定量プレート上で190μlの培地に加える。２倍の希釈をプレート全体に行って、合計１２個のインターフェロン希釈液とする。既知の濃度のヒトIFNアルファA実験用標準も、１：２０になるように一番目のウェルで希釈し、プレート全体にわたって連続希釈する。HEP-2細胞を計数し、希釈して3.0E＋5細胞/mlの濃度にする。次に、100μlのこれらの細胞を各ウェルに加える。その後、微量定量プレートをプラットフォーム・ロッカに起き、１０分間、揺らす。次にプレートをインキュベータ（３７℃、5.0% CO2）内に一晩、置く。２日目にEMCVを所定の濃度、ここでは1:2000まで希釈し、50μlを各ウェルに加える。再度、プレートをインキュベータ内に一晩、置く。その後プレートをクリスタル・バイオレットで染色し、乾燥させる。インターフェロン力価を判定するために、50%の致死が起きたエンドポイントを判定する。その後このエンドポイントを、ヒトIFNアルファＡ実験標準のエンドポイントと比較する。
【０２５６】
結果：  図１０を参照されたい。数多くの細胞株をウィルス感染から保護する上での新規なインターフェロンの有効性を判定した。該細胞株はウシ株MDBK、マウス株L細胞、及び３つのヒト株HEP-2、H226 及びHLFだった。IFN α12及びα023は、IFN α2aよりも 検査したすべてのヒト株で良好だった（IFN α023は HLF/Flu 検定では検査されなかった）。加えて、IFN α012は、IFN α2aがほとんど効果を有さなかったマウス細胞で著しい活性（IFN α2aよりも〜７０倍の効力がある）を示した。これにより、他のものよりもこのIFNを用いた方が、より容易に感染のマウスモデルを行える可能性が出てくる。
【０２５７】
様々なウィルス／細胞のペアにおけるこれらのIFNの相対的効験の違いは、選択されたIFN、又は、選択されたIFNの組合せが、特定のウィルス感染の治療にとって好適であろうことを示唆している。例えば、IFN α003は、VSV感染からHEP-2細胞を保護する上でIFN α2aよりも著しく強力であり、 他方、IFN α003は、HLF/Flu ウィルス検定においてIFN α2aのそれと類似の効力を有する。
【０２５８】
更に、IFN α021及びIFN α018は、ここで紹介した検定では強力な抗ウィルス活性を示さなかったが、別のウィルス／細胞の組合せがこれらのIFNにとって応答性が高いであろうことは明白であることに留意されたい。選択的には、これらのIFNは、内因性IFN活性の調節が保証される特定の条件下では、IFNアンタゴニストとして有用であろうと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１】図１は、ネコIFNα種の抗ウィルス活性を示す。
【図２】図２は、アカゲザルIFNα種の抗ウィルス活性を示す。
【図３】図３は、ヒトIFNα種を増幅するために用いられたPCRプライマの配列を示す。
【図４】図４は、ヒトIFNα種のそれぞれを同定するために用いられたプライマ・ペア（図３に詳述する）を示す。
【図５】図５は、SARSコロナウィルス細胞変性効果のインターフェロンによる阻害を示す。インターフェロンは、SARSCoV の細胞変性効果を用量依存的に阻害する。 この検定は、サル腎FRhk-4細胞をSARS 臨床単離株（GZ50）に感染させることにより、行われた。３点は、ウィルスによる細胞の完全なウィルス性致死（従ってインターフェロンによる保護無し）を示し、０点はウィルスによる細胞致死無し（インターフェロンによる完全な保護）を示す。実施例８を参照されたい。
【図６】図６は、インターフェロンによるSARSCoV複製の阻害を示す。アフリカミドリザル細胞（Vero76）に対するSARS CoV （Urbani）細胞変性効果を阻害する上でのIFN α2a及び新規なインターフェロンの有効性。ウィルス阻害に関するIC50は、肝細胞の直接の視覚的評価か、あるいは、肝細胞のニュートラル・レッド染色により、判定された。実施例９を参照されたい。
【図７】図７は、呼吸系発疹ウィルス複製のインターフェロンによる阻害を示す。IFNが、Ｂ群呼吸系発疹ウィルス（RSV）の２つの臨床単離株、及び、Ａ群RSVの２つの臨床単離株の複製を阻害する能力を、in vitroで検査した。IC50は、IFNの連続希釈により判定され、ウィルス複製が５０％阻害された濃度は、ウィルス性タンパク質に関するイムノアッセイで判定された。棒がグラフの上端まで延びる試料については、IC50は、2500pg/mlを越えると計算され、この検定で容易には判定できなかった。実施例１０を参照されたい。
【図８】図８は、ヒト肺線維芽細胞をインフルエンザ・ウィルス感染から保護する上でのインターフェロンの有効性を示す。in vitroのヒト肺線維芽細胞でインフルエンザの成長を阻害する上でのインターフェロンの有効性。各インターフェロンに関するIC50を判定し、IFN α2aについて得られたIC50値を１に設定した。IC50 新規IFNα／IC50 IFN α2aの比を判定した。このグラフでは、より高い数は、インターフェロンがIFN α2aよりもより効力があることを示す。実施例１１を参照されたい。
【図９】図９は、黄熱病ウィルス感染からの肝細胞の保護を示す： Ｃ型肝炎治療のモデルとしてのYFV感染から肝細胞を保護する上でのインターフェロンの有効性を、HepG2肝細胞を用いて判定した。IC50は比色法により判定された。２つの個別の判定がなされた。実施例１２を参照されたい。
【図１０】図１０は、様々なウィルスに感染した多様な細胞種におけるIFN α2a及び新規なIFNの比較を示す。IFN α2a及び新規なインターフェロンの有効性を、５つの異なる細胞種及び３つの異なるウィルスで検査した。いずれの場合でも、IFN α2の活性を１と設定し、IFNがより効力がある場合には、この数値は、１よりも大きく、効力が小さい場合には１未満である。実施例７及び１３を参照されたい。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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