(57)【要約】本発明は、癌を治療するための薬剤を製造するためのＥＳＭ−１タンパク質の化合物アンタゴニストの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を治療するための薬剤を製造するためのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物の使用。
【請求項２】
請求項１記載の使用であって、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が、タンパク質ＥＳＭ−１に特異的に結合する抗体を含んでなることを特徴とする使用。
【請求項３】
請求項２記載の使用であって、該抗体タイプのアンタゴニスト化合物が、タンパク質ＥＳＭ−１の抗原決定基ＡｇＤ１、ＡｇＤ２又はＡｇＤ３の１つに特異的に結合することを特徴とする使用。
【請求項４】
請求項２又は３の１項に記載の使用であって、該抗体タイプのアンタゴニスト化合物が、次のハイブリドーマ株：
受託番号Ｉ−１９４４のもとパスツール研究所のコレクション・ナショナーレ・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオルガニズムズ（ＣＮＣＭ）へ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマＭＥＰ２１；
受託番号Ｉ−１９４２のもとＣＮＣＭへ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマＭＥＰ１４；
受託番号Ｉ−１９４３のもとＣＮＣＭへ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマＭＥＰ１９；
受託番号Ｉ−１９４１のもとＣＮＣＭへ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマＭＥＰ０８
によって分泌されるモノクローナル抗体の中から選ばれることを特徴とする使用。
【請求項５】
請求項２記載の使用であって、該抗体タイプのアンタゴニスト化合物が、受託番号Ｉ−２５７２のもとＣＮＣＭへ２０００年１０月１７日に寄託されたハイブリドーマ株ＭＥＣ１５によって産生される抗体であることを特徴とする使用。
【請求項６】
請求項１記載の使用であって、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が、配列番号１のうちの少なくとも１０の連続するアミノ酸の長さを有し、配列番号１の位置１１９におけるアミノ酸から位置１３９におけるアミノ酸に及ぶアミノ酸の配列を含有し、そして対応する配列番号１の配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の置換を含有するポリペプチドであることを特徴とする使用。
【請求項７】
請求項６記載の使用であって、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が、該配列番号１中に見出される芳香族環を含有するアミノ酸の、芳香族環を含有しないアミノ酸による１又はそれを超える置換を含有することを特徴とする使用。
【請求項８】
請求項６又は７の１項に記載の使用であって、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が、該配列番号１と比較して、配列番号１の位置１３４及び１３５におけるフェニルアラニン残基の、芳香族環を含有しない２つの同一か又は異なるアミノ酸残基による置換を含有することを特徴とする使用。
【請求項９】
請求項１記載の使用であって、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなることを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項９記載の使用であって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドタイプのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が、配列番号２のＥＳＭ−１のｃＤＮＡのうちの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含んでなることを特徴とする使用。
【請求項１１】
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物であって、受託番号Ｉ−２５７２のもと２０００年１０月１７日にＣＮＣＭへ寄託されたハイブリドーマ株ＭＥＣ１５によって産生されるモノクローナル抗体を含んでなることを特徴とするアンタゴニスト化合物。
【請求項１２】
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を選択する方法であって、次の段階：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１の存在下で腫瘍を形成することができる細胞であって、タンパク質ＥＳＭ−１をｉｎｖｉｖｏで発現することのできる核酸によって形質移入又は形質転換されている細胞をある動物中に注射する段階；
ｂ）この動物にタンパク質ＥＳＭ−１の候補アンタゴニスト化合物を投与する段階；
ｃ）段階ｂ）の終わりにおいて得られたような第一動物における腫瘍の形成と、段階ａ）の終わりにおいて得られたような第二動物における腫瘍の形成を比較する段階；及び
ｄ）該第一動物における腫瘍の形成を阻害又は遮断することができる候補化合物を選択する段階
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１３】
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を選択する方法であって、次の段階：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質のペプチド断片を含んでなるポリペプチドを得る段階；
ｂ）前記ポリペプチドを、試験される候補化合物と接触させる段階；
ｃ）前記ポリペプリドと該候補化合物の間に形成される複合体を検出する段階；
ｄ）タンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質の断片を含んでなる該ポリペプチド上に固定されている候補化合物を選択する段階
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１４】
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を選択する方法であって、次の段階：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１又はそれのペプチド断片を：
（ｉ）タンパク質ＥＳＭ−１上に固定されているタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物；及び
（ｉｉ）試験される候補化合物
と接触させる段階；
ｂ）段階ａ）と別であるが場合によってそれと同時に行われる段階において、タンパク質ＥＳＭ−１又はそれのペプチド断片を、タンパク質ＥＳＭ−１上に固定されているタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物と接触させる段階；
ｃ）段階ａ）及びｂ）の各々の後に固定されたタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物のそれぞれの量を検出する段階；及び
ｄ）タンパク質ＥＳＭ−１上での固定について該アンタゴニスト化合物と競合する候補化合物を選択する段階
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１５】
候補化合物からタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を選択する方法であって、次の段階：
ａ）該候補化合物の中から、タンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質のペプチド断片上に固定されている化合物を選択する段階；
ｂ）段階ａ）において選択された化合物を動物へ投与して、タンパク質ＥＳＭ−１によって誘発された腫瘍の発達をこの化合物がこの動物中で阻害する能力を確認する段階；
ｃ）段階ｂ）において確認された腫瘍の発達を阻害する化合物をタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物として選択する段階
を含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１６】
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含有する、癌を治療及び／又は予防するための医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１６記載の医薬組成物であって、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が、タンパク質ＥＳＭ−１に特異的に結合する抗体であることを特徴とする組成物。
【請求項１８】
請求項１７記載の医薬組成物であって、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が、受託番号Ｉ−１９４１のもと１９９７年１１月１９日にＣＮＣＭへ寄託されたハイブリドーマ株ＭＥＰ０８によって産生される抗体、又は受託番号Ｉ−２５７２のもと２０００年１０月１７日にＣＮＣＭへ寄託されたハイブリドーマ株ＭＥＣ１５によって産生される抗体であることを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１６記載の医薬組成物であって、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が、配列番号１のタンパク質ＥＳＭ−１のうちの少なくとも１０の連続するアミノ酸を含んでなり、配列番号１の位置１１９におけるアミノ酸から位置１３９におけるアミノ酸に及ぶアミノ酸の配列を含有し、そして該配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸の置換を含有するポリペプチドであることを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１６記載の医薬組成物であって、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が、アンチセンスポリヌクレオチドからなることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予防及び／又は治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
莫大な財政的及び人的投資にも関わらず、癌は死亡の主要な原因の１つのままである。
癌は、多くの場合、細胞内情報伝達の系における欠陥と関連する疾患である。正常細胞は、増殖、分化、又はより一般的にはそれらの代謝活性の変化によって、多数の細胞外信号に応答する。このような信号は細胞の表面上で受けとられ、信号変換タンパク質の系によって、細胞により認識されるメッセージに変換される。このメッセージは、その後の細胞調節現象の一因となる。
転移とは、初期の腫瘍から離れた部位における二次的腫瘍コロニーの形成である。これは、腫瘍侵襲が早期の事象である多段階過程に相当する。腫瘍細胞は、上皮の基底膜のようなバリアー組織を局部的に横切って回避し、間質性基質に達し、そこから、その後の転移の前に血管又はリンパ管へ接近する。血管壁の内皮層を侵襲した後、その循環性腫瘍細胞は血液循環によって周辺に運ばれ、内皮細胞の管腔表面へ接着することによって標的器官の前毛細血管細静脈中で停止するか、若しくは基底膜に曝される。腫瘍細胞は、血管壁を去り、そして器官の実質組織中に入る。最終的に、腫瘍細胞は、血管外遊出の後それが生じた組織とは異なる組織中で増殖する。
【０００３】
いくつかの癌は、信号の変換の一因になる遺伝子に関連した欠陥によって引き起こされることが示されている。このような遺伝子は、発癌遺伝子と呼ばれている。これら発癌遺伝子は、１又はそれを超える信号変換タンパク質の過剰発現をもたらし、異常な細胞増殖を誘発しうる。この欠陥信号は、種々のメカニズムと関連付している。
いくつかの抗癌治療は、ＭＡＰキナーゼファミリーのタンパク質、又はｃ−ｍｙｃのような一定の発癌遺伝子の産生物のような、癌細胞の増殖の一因となる発癌性タンパク質の発現又は生物学的利用能を阻害することを目指すものである。
タンパク質ＥＳＭ−１は、内皮細胞によって分泌される１８４アミノ酸のポリペプチドであり、それは、ＬＡＳＳＡＬＬＥｅｔａｌ．（１９９６）によって初めて記載された。タンパク質ＥＳＭ−１をコードするメッセンジャーＲＮＡは、主に、内皮細胞、肺及び腎組織において見出される。ＥＳＭ−１をコードする遺伝子の発現は、サイトカインによって調節される。ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βは、ヒト臍静脈の内皮細胞中のＥＳＭ−１遺伝子の発現の増大を誘発する一方で、γ−インターフェロンはそれの発現を減少させる。
高いレベルの循環性タンパク質ＥＳＭ−１は、敗血症ショックのような全身性炎症症候群を示している患者において見出される（ＢＥＣＨＡＲＤｅｔａｌ．，２０００）。
癌のための最新の病院治療は、放射線及び／又はビンブラスチン又はアドリアマイシンのような化学療法剤を使用するのが主流である。しかしながら、そのような治療の広く知られている望ましくない効果は、患者がこれら戦略を支持することを非常に難しいものとする。
本発明の目的は、技術の現状における癌の治療的処置の方法の欠点を克服する抗癌化合物を供給することである。
【発明の要旨】
【０００４】
本発明の第一の目的は、癌を治療するための薬剤を製造するための、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物の使用からなる。
第一の態様によれば、本発明のアンタゴニスト化合物は、タンパク質ＥＳＭ−１に特異的に結合する抗体である。
第二の態様によれば、本発明の範囲において用いられるアンタゴニスト化合物は、修飾されたタンパク質ＥＳＭ−１のうちの少なくとも１０アミノ酸のペプチドであり、そしてそれは、アミノ酸グループＡｌａ（１３４）−Ａｌａ（１３５）を含有する。
第三の態様によれば、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、ＥＳＭ−１をコードするｃＤＮＡとハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる。
本発明の更なる目的は、上で定義されたアンタゴニスト化合物の中から選ばれる、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物からなる。
本発明は、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含んでなる、癌を治療することを意図された医薬組成物にも関する。
本発明の別の目的は、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が投与される段階を含んでなる、癌を予防するための方法からなる。
本発明は、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物が投与される段階を含んでなる、癌を治療するための方法にも関する。
【発明の詳しい説明】
【０００５】
本発明によって、タンパク質ＥＳＭ−１はヒトにおいてコンドロイチン／デルマタン硫酸タイプのプロテオグリカンの形態で分泌されること、及びその分泌されたタンパク質ＥＳＭ−１は因子ＨＧＦ／ＳＦ（肝細胞増殖因子／散乱因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ／ｓｃａｔｔｅｒｆａｃｔｏｒ））の分裂促進活性をｉｎｖｉｔｒｏで刺激できることが、初めて示された。
ＨＧＦ／ＳＦは、腎臓多嚢胞性異形成症の出現及び尿細管の過剰増殖の出現における重要な因子であり、乳房、腎臓及び肺の癌の発達にも、そして悪性黒色腫の発達にも関連している。
本発明によって、タンパク質ＥＳＭ−１を発現する形質移入ヒト腎上皮細胞は強い腫瘍潜在性を有し、そしてマウスにおいてｉｎｖｉｖｏで腎臓癌の出現を引き起こすことも示された。タンパク質ＥＳＭ−１に対して向けられた抗体は腎腫瘍の発達をｉｎｖｉｖｏで阻害できること、及びタンパク質ＥＳＭ−１のペプチドアンタゴニストは同じ抗腫瘍活性を有することも示された。
更に、本発明によって、気管支−肺癌を有する患者においてタンパク質ＥＳＭ−１の血清レベルが増大していることが示された。
従って、本発明の第一の目的は、癌を予防及び／又は治療するための薬剤を製造するためのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物の使用からなる。
【０００６】
一般定義
本発明の文脈における表現“タンパク質ＥＳＭ−１”又は“ＥＳＭ−１のポリペプチド”は、配列表中の配列番号１として参照される１８４アミノ酸のポリペプチド、及び、シグナルペプチドに対応するＮ末端の１９アミノ酸が欠けている配列番号１のポリペプチドと同一の１６５アミノ酸のポリペプチドであって、配列番号１のポリペプチドの分泌された形態を含んでなるポリペプチドをも包含する。“タンパク質ＥＳＭ−１”及び“ＥＳＭ−１のポリペプチド”の定義には、それぞれ配列番号１の１８４アミノ酸のグリコペプチド、及び位置１３７におけるセリン残基がＯ−グリコシル化によって修飾された配列番号１の位置２０におけるアミノ酸から位置１８４におけるアミノ酸に及ぶ配列に対応する１６５アミノ酸のポリペプチドも包含される。このタンパク質ＥＳＭ−１のＯ−グリコシル化形態も、本明細書において“グリコペプチド”と呼ばれる。そのＥＳＭ−１グリコペプチドは、好ましくは、コンドロイチン／デルマタン硫酸基によってＯ−グリコシル化された位置１３７におけるセリン残基を有する。
【０００７】
本発明によれば、タンパク質ＥＳＭ−１の“アンタゴニスト化合物”によって、タンパク質ＥＳＭ−１が本来その上に固定される標的分子と比較して、タンパク質ＥＳＭ−１の生物学的利用能を有意に減少させることのできる化合物が意味されると理解されるべきである。タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、生物の標的分子であって、その上にタンパク質ＥＳＭ−１が本来固定される標的分子へのタンパク質ＥＳＭ−１の結合の可能性をを減少させることによって、これらタンパク質の生物学的利用能を減少させることができる。本発明によるアンタゴニスト化合物は、ＥＳＭ−１をコードする遺伝子の転写を阻害又は遮断すること、その対応するメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害又は遮断すること、タンパク質ＥＳＭ−１の細胞内成熟の修飾、例えば、それのグリコシル化をもたらす酵素過程を害すること、又は成熟タンパク質ＥＳＭ−１の分泌を阻害又は遮断することによって、タンパク質ＥＳＭ−１の生物学的利用能を減少させることができる。
本発明の第一の目的は、癌を治療するための薬剤を製造するためのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物の使用からなる。
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、標的分子であって、タンパク質ＥＳＭ−１の生物学的利用能をこのタンパク質が固定される分子と比較して減少させるあらゆるタイプのもの、即ち、ポリペプチド、糖類又はあらゆる有機若しくは無機化合物であってよい。
【０００８】
抗体タイプのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物
本発明による第一ファミリーの好ましいＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、タンパク質ＥＳＭ−１に特異的に結合する抗体から構成される。
本発明によると、タンパク質ＥＳＭ−１に対して特異的に向けられた抗体は、このタンパク質の腫瘍発生力を阻害又は遮断できることが示された。従って、抗ＥＳＭ−１抗体は、大きな治療的価値を有するアンタゴニスト化合物を構成する。
本発明の文脈における“抗体”によって、特に、ポリクローナル若しくはモノクローナル抗体、又はタンパク質ＥＳＭ−１を認識する初期の抗体のドメインを含有するそれらの断片（例えば、断片Ｆａｂ又はＦ（ａｂ）’２）若しくはあらゆるポリペプチドが意味されることが理解されるべきである。
モノクローナル抗体は、ＫＯＨＬＥＲ及びＭＩＥＬＳＴＥＩＮ（１９７５）によって記載された技術に従って、ハイブリドーマから調製されうる。
【０００９】
それらは、ＫＯＺＢＯＲｅｔａｌ．（１９８３）によって記載されたトリオーマ技術又はハイブリドーマ技術によって生成される、ＥＳＭ−１又はこのタンパク質の断片に対して向けられる抗体であってもよい。
それらは、米国特許第４，９４７６，７７８号中又はＭＡＲＴＩＮＥＡＵｅｔａｌ．（１９９８）によって開示されたもののような、単一鎖Ｆｖ抗体断片（ＳｃＦｖ）であってもよい。
本発明による抗ＥＳＭ−１抗体は、ＲＩＤＤＥＲｅｔａｌ．（１９９５）によって記載されたようなファージバンクを使用して得られる抗体の断片、又はＲＥＩＮＭＡＮＮｅｔａｌ．（１９９７）若しくはＬＥＧＥＲＯＪ，ｅｔａｌ．，１９９７によって記載されたようなヒト抗体の断片をも含んでなる。
それらは、ＢＥＣＨＡＲＤｅｔａｌ．（２０００）によって記載された技術に従って生成される抗ＥＳＭ−１抗体であってもよい。ＢＥＣＨＡＲＤｅｔａｌ．（２０００）によって記載されたそれら抗体は、大腸菌中で産生されたＥＳＭ−１の分子量１４ｋＤａのＣ末端断片に対して予め免疫化されたマウス脾臓細胞から調製されるハイブリドーマ株によって分泌されるモノクローナル抗体、換言すれば、タンパク質ＥＳＭ−１の非グリコシル化断片である。ＢＥＣＨＡＲＤｅｔａｌ．（２０００）は、エピトープマッピングをすることによって、異なるハイブリドーマ株によって産生されたモノクローナル抗体を、それらによって認識されるタンパク質ＥＳＭ−１の領域に従って分類することができた。
【００１０】
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含んでなる本発明による第一の好ましいファミリーの抗体は、配列番号１の位置７９におけるプロリン残基から位置９９におけるシステイン残基に及ぶ領域を特異的に認識するモノクローナル抗体であり、この領域は抗原決定基Ｄ１に相当する。それらは、好ましくは、受託番号Ｉ−１９４４のもとパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）研究所のコレクション・ナショナーレ・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオルガニズムズ（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏ―ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ））へ寄託されハイブリドーマ株によって産生されるモノクローナル抗体であって、抗体ＭＥＰ２１とも命名された抗体である。
他の好ましいモノクローナル抗体は、配列番号１の位置１５９におけるグリシン残基と位置１８４におけるアルギニン残基の間に含有される抗原決定基Ｄ３を含んでなる領域であるタンパク質ＥＳＭ−１の部分であって、に特異的に結合するものである。抗原決定基Ｄ３の格別に好ましいモノクローナル抗体は、パスツール研究所のコレクション・ナショナーレ・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオルガニズムズ（ＣＮＣＭ）へ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマ株Ｉ−１９４３（ＭＥＰ１９）から得られうる。
【００１１】
本発明による他の好ましいモノクローナル抗体は、配列番号１のタンパク質ＥＳＭ−１の位置１１９におけるセリン残基と位置１３９におけるバリン残基の間に含有される領域に特異的に結合するモノクローナル抗体であり、この領域はタンパク質ＥＳＭ−１の抗原決定基Ｄ２と定義される。ＥＳＭ−１の抗原決定基Ｄ２に特異的に結合する好ましいモノクローナル抗体は、受託番号Ｉ−１９４１のもとパスツール研究所のコレクション・ナショナーレ・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオルガニズムズ（ＣＮＣＭ）へ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマ株ＭＥＰ０８から得られうる。
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を構成する興味の対象となる本発明の範囲内にある他のモノクローナル抗体は、タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端部分に対して特異的に向けられるモノクローナル抗体である。タンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端部分に対して向けられた好ましいモノクローナル抗体は、受託番号Ｉ−２５７２のもと２０００年１０月１７日にパスツール研究所のコレクション・ナショナーレ・デ・カルチャーズ・デ・マイクロオルガニズムズ（ＣＮＣＭ）へ寄託されたハイブリドーマ株ＭＥＣ１５から得られうる。
【００１２】
好ましい態様によれば、ＥＳＭ−１に対して最も良いアンタゴニスト活性を有する抗ＥＳＭ−１抗体は、位置１１５におけるフェニルアラニン残基の周囲の領域に局在化されたエピト−プを特異的に認識する抗体の中から選ばれる。それらは、特に、上に記載されたモノクローナル抗体ＭＥＰ０８のように、配列番号１のタンパク質ＥＳＭ−１の位置１１９におけるセリン残基と位置１３９におけるバリン残基の間に含有される領域に特異的に結合する抗体である。
本発明によって、モノクローナル抗体ＭＥＰ０８は、マウスにおいて腎由来のヒト細胞の増殖によって引き起こされる腫瘍の形成にへのタンパク質ＥＳＭ−１の前腫瘍活性を阻害できることが示された。
【００１３】
タンパク質ＥＳＭ−１のポリペプチドアンタゴニスト
本発明によって、タンパク質ＥＳＭ−１の抗原決定基Ｄ２を含有する領域はタンパク質ＥＳＭ−１の前腫瘍活性のために重要であることが示された。
特に、発明者らは、配列番号１の位置１３４及び位置１３５におけるフェニルアラニン残基、換言すれば、分泌されたタンパク質ＥＳＭ−１の位置１１５及び１１６の残基が、２つのアラニン残基によって置換されたタンパク質ＥＳＭ−１から誘導化されたポリペプチドを合成した。発明者らは、この修飾ポリペプチドがマウスにおいて腫瘍を誘発できないことを示した。かくして、このような修飾ポリペプチドは、癌患者において高いレベルで産生されたタンパク質ＥＳＭ−１と、ＨＧＦ／ＳＦのような増殖因子又は増殖因子ＦＧＦ−２及びＦＧＦ−７でのそれの強化作用について、競合することができたのである。
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、配列番号１の位置１１９におけるアミノ酸から位置１３９におけるアミノ酸に及ぶアミノ酸の配列を包含する、配列番号１のうちの少なくとも１０の連続するアミノ酸の長さを有するポリペプチドを包含し、そのようなＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、タンパク質ＥＳＭ−１に対応する配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の置換を含有する。
【００１４】
上で定義されたようなタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドは、好ましくは、配列番号１のうちの多くても１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５又は５０の連続するアミノ酸を有し、そして配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸の置換を有する。
上で定義されたようなタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドは、配列番号１と比較して、多くても１、２、３、４、５，６、７、８、９又は１０のアミノ酸の置換を含有する。このアミノ酸の置換の数はそのポリペプチドの長さに相関して適合化される。本発明によるアンタゴニストポリペプチドにおける配列番号１と比較したアミノ酸の置換の数は、このアンタゴニストポリペプチドの配列中に含有されるアミノ酸の多くても２５％であり、好ましくは多くても２０％、１５％、そしてより好ましくはＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドの配列に含有されるアミノ酸の数の多くても１０％であることが理解される。
【００１５】
本発明によるアンタゴニストポリペプチド中の配列番号１と比較したアミノ酸の置換は、好ましくは“非保存的”置換である。“非保存的”置換によって、異なるクラスのアミノ酸によるアミノ酸残基の置換が意味されることが理解されるべきである。
アミノ酸は、慣用的に、次のクラス：
・非極性アミノ酸（疎水性）：アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニン；
・芳香族環を含有するアミノ酸：フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン；
・中極性のアミノ酸：グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン；
・正に荷電したアミノ酸（塩基性である）：アルギニン、リジン及びヒスチジン；
・負に荷電したアミノ酸（酸性である）：アスパラギン酸及びグルタミン酸
のクラスに従って分類される。
本発明によるタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドを調製するための好ましいタイプのアミノ酸の置換は、芳香族環を含有するアミノ酸の、芳香族環を含有しないアミノ酸による置換である。
本発明によるタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドは、好ましくは配列番号１の位置１３４及び１３５におけるフェニルアラニン残基の、芳香族環を含有しない２つの同一か又は異なるアミノ酸残基による置換を含有する。
そのような好ましいタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドは、上で定義されたように位置１３４及び１３５におけるフェニルアラニン残基が２つのアラニン残基によって置き換えられた、配列番号１のうちの少なくとも１０の連続するアミノ酸のポリペプチドである。
【００１６】
第一の態様によれば、本発明によるタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドは、慣用的な化学合成技術によって、均一溶液中又は固相中のいずれにおいても調製されうる。
例示として、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドは、ＨＯＵＢＥＮＷＥＩＬ（１９７４）によって記載されている均一溶液技術、又はＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ（１９６５ａ；１９６５ｂ）及びＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ（１９６５ｂ）によって記載されている固相合成技術によって調製されうる。
本発明によるタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドは、遺伝子組み替えによっても調製されうる。
上で定義されたようなタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドを生成するために：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸を適切な発現ベクター中へ挿入する段階；
ｂ）段階ａ）の組み換え発現ベクターで予め形質転換又は形質移入された宿主細胞を適正な培地中で培養する段階；
ｃ）その培地を回収し、又は宿主細胞を例えば超音波処理又は浸透圧衝撃によって溶解する段階；
ｄ）段階ｃ）において得られた前記培養培地又は細胞溶解産物から前記アンタゴニストポリペプチドを分離して精製する段階；
ｅ）適切であれば、このように生成された組み換えアンタゴニストポリペプチドを特性決定する段階
を含んでなる方法が用いられうる。
本発明によるアンタゴニストポリペプチドは、免疫親和性クロマトグラフィーカラムであって、その上にこのポリペプチド又はそれの断片に対して向けられた抗体が予め不動化されたカラム上に固定されることによって特性決定されうる。
別の態様によれば、ＥＳＭ−１のアンタゴニストポリペプチドは、当業者に公知で、例えば、ＡＵＳＵＢＥＬＦ．ｅｔａｌ．（１９８９）によって記載されている方法に従って、適切な一連のクロマトグラフィーカラムに通すことによって精製されうる。
【００１７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドタイプのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物
危険な状態の患者又は既に発達した腫瘍を有する患者において分泌されているタンパク質ＥＳＭ−１の生物学的利用能を減少させることを目指す、別の好ましいファミリーのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、ヒトにおけるＥＳＭ−１をコードする遺伝子の発現を阻害又は遮断することのできる化合物である。
そのようなタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、アンチセンスポリヌクレオチドでありうる。
従って、本発明によるタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、タンパク質ＥＳＭ−１をコードする遺伝子の所与の領域に特異的にハイブリダイズすることでき、それの転写及び／又は翻訳を阻害又は遮断することができるアンチセンスポリヌクレオチドを包含する。
ヒトＥＳＭ−１遺伝子の配列は、データベースＧｅｎｂａｎｋにおいて受託番号ＡＪ４０１  １０９１及びＡＪ４０１  １０９２のもと参照される。
本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドは、好ましくは、ＥＳＭ−１遺伝子のＤＮＡの５’末端の領域中に局在化した配列に相補的な配列を、そしてより好ましくは、ＥＳＭ−１遺伝子の転写の開始コドン（ＡＴＧ）に近接した配列を含有する。
第二の好ましい態様によれば、本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドは、ＥＳＭ−１遺伝子のエキソン／イントロン接合点に局在化した配列の１つに、そして好ましくはスプライシング部位に対応する配列に相補的な配列を含有する。
本発明による好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、ＥＳＭ−１をコードするヌクレオチド配列番号２を有するｃＤＮＡのうちの少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含有する。
【００１８】
本発明の目的のためには、第一ポリヌクレオチドは、その第一ヌクレオチドの各々の塩基が、その方向が逆になった第二ポリヌクレオチドの相補的な塩基と対合する場合に、第二ポリヌクレオチドに“相補的である”と考えられた。その相補的塩基は、ＡとＴ（又はＡとＵ）及びＣとＧである。
一般に、本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドは、ＥＳＭ−１の配列番号２のｃＤＮＡのうちの少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００又は２０００の連続するヌクレオチドを有する。
例示として、本発明による好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、ＥＳＭ−１の配列番号２のｃＤＮＡの核酸に相補的な配列の核酸からなる。
本発明によるタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含んでなるアンチセンスポリヌクレオチドは、クローニング及び制限酵素の作用を包含する当業者にとって周知のあらゆる適する方法によって、又は、ＮＡＲＡＮＧｅｔａｌ．（１９７９）若しくはＢＲＯＷＮｅｔａｌ．（１９７９）のホスホジエステル法、ＢＥＡＵＣＡＧＥｅｔａｌ．（１９８０）のジエチルホスホルアミダイト法、又は欧州特許第ＥＰ−０，７０７，５９２号中に開示されている固体支持体技術のような技術に従う化学合成によって調製されうる。
【００１９】
一般に、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＥＳＭ−１のｍＲＮＡの発現を阻害するために十分な安定性を有する細胞内二重鎖ハイブリッドを形成できるよう十分な長さ及び融点を有さなければならない。アンチセンスポリヌクレオチドを構築するための戦略は、特にＧＲＥＥＮｅｔａｌ．（１９８６）、及び、ＩＺＮＡＴ及びＷＥＩＮＴＲＡＵＢ（１９８４）よって記載されている。
アンチセンスポリヌクレオチドを構築するための方法は、ＲＯＳＳＩｅｔａｌ（１９９１）、及びＰＣＴ出願のＷＯ９４７／２３，０３６、ＷＯ９５／０４１４１、ＷＯ／９２Ｌ１８，５２２、及び欧州特許出願ＥＰ０５７２２８７によっても記載されている。
アンチセンスポリヌクレオチドの使用のための他の方法は、例えば、ＳＣＺＡＫＩＥＬｅｔａｌ．（１９９５）によって記載されているもの、又はＰＣＴ出願のＷＯ９５／２４，２２３中に開示されているものがある。
当業者は、ｒａｓ遺伝子を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している米国特許第５，５８２，９８６号中に開示されている技術、腫瘍形成遺伝子ｃ−ｍｙｂのメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載しているＨＯＬＴｅｔａｌ．（１９８８）によって記載されている技術、又は遺伝子ｃ−ｍｙｃのメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載しているＷＩＣＫＳＴＲＯＮｅｔａｌ．（１９８８）によって記載されている技術のような、癌の発達に関連する遺伝子の発現を阻害又は遮断するアンチセンスポリヌクレオチドの生成及び使用の方法を有利に参照することができる。
当業者によって用いられうるアンチセンスポリヌクレオチドを使用するための他の技術は、ＳＡＬＥｅｔａｌ．（１９９５）のもの及びＧＡＯｅｔａｌ．（１９９６）のものである。
【００２０】
タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を選択するための方法
本発明によるタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、それがタンパク質ＥＳＭ−１によって誘発された腫瘍の発達をｉｎｖｉｖｏで阻害する能力のために、当業者によって選択されるうる。
第一の態様によれば、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を選択する方法は、次の段階：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１の存在下で腫瘍を形成することができる細胞であって、タンパク質ＥＳＭ−１をｉｎｖｉｖｏで発現することのできる核酸によって形質移入又は形質転換されている細胞をある動物中に注射する段階；
ｂ）この動物にタンパク質ＥＳＭ−１の候補アンタゴニスト化合物を投与する段階；
ｃ）段階ｂ）の後に得られたような第一動物における腫瘍の形成と、段階ａ）の後に得られたような第二動物における腫瘍の形成を比較する段階；及び
ｄ）該第一動物における腫瘍の形成を阻害又は遮断することができる候補化合物を選択する段階
を含んでなる。
【００２１】
上の選択方法に使用される動物は、好ましくは非ヒト哺乳類、有利にはげっ歯類、そしてより好ましくはラット、モルモット又はマウスである。
本方法の特定的な態様においては、これは、第一及び第二動物を犠牲にすることからなる段階ｅ）を包含する。
有利には、タンパク質ＥＳＭ−１の存在下で動物中に腫瘍を形成することができる細胞株は、株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）である。
更なる態様によれば、本発明によるタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、タンパク質ＥＳＭ−１上への候補化合物の固定を証明することを使用する方法によって選択されうる。タンパク質ＥＳＭ−１の候補アンタゴニスト化合物のそのような選択の方法は、次の段階：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質のペプチド断片からなるポリペプチドを供給する段階；
ｂ）前記ポリペプチドを、試験される候補化合物と接触させる段階；
ｃ）前記ポリペプリドと該候補化合物の間に形成される複合体を検出する段階；
ｄ）タンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質の断片からなるポリペプチド上に固定される該候補化合物を選択する段階
を含んでなる。
【００２２】
タンパク質ＥＳＭ−１の“断片”によって、配列番号１のポリペプチドＥＳＭ−１のうちの少なくとも２０、好ましくは、少なくとも３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０の連続するアミノ酸を含有し、そして配列番号１の位置１３３におけるプロリン残基から位置１３８におけるバリン残基に及ぶ配列を含有するポリペプチドが意味されることが理解されるべきである。
本発明は、タンパク質ＥＳＭ−１の候補アンタゴニスト化合物を選択するためのキットであって：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質の断片からなるポリペプチドの精製された調製物；
ｂ）適切であれば、該ポリペプチドと試験される候補化合物との間に形成される複合体を検出する手段
を含んでなるキットにも関する。
タンパク質ＥＳＭ−１から誘導されたポリペプチドとその候補化合物との間に形成される複合体を検出する方法は、ＷＡＮＧｅｔａｌ．（１９９７）によって記載された、ＨＰＬＣ法と組み合わせられたミクロ透析法、又はＢＯＵＳＨｅｔａｌ．（１９９７）によって記載された親和性キャピラリ電気泳動のような、種々の技術によって行われうる。
候補化合物は、あらゆるタイプのものであることができ、そして特にコンビナトリアル化学法の最終生成物であることができる。
【００２３】
Ａ．ペプチドバンクから得られた候補化合物
タンパク質ＥＳＭ−１の候補アンタゴニスト化合物は、上の方法に従って、ＰＡＲＭＬＥＹ及びＳＭＩＴＨ（１９８８）により記載された技術に従ってファージベクター中に含有されたＤＮＡ挿入物の発現産物として選択されうる。このタイプのペプチドバンクにおいては、ＯＬＤＥＮＢＵＲＧＫＲｅｔａｌ．（１９９２）、ＶＡＬＡＤＯＮＰｅｔａｌ．（１９９６）、ＬＵＣＡＳＡＨ（１９９４）、ＷＥＳＴＥＲＩＮＫ（１９９５）、ＦＥＬＩＣＩｅｔａｌ．（１９９１）によって記載されているように、そのＤＮＡ挿入物は長さ８〜２０アミノ酸のペプチドをコードする。
この特定的な態様によれば、タンパク質ＥＳＭ−１またはそれの断片からなるポリペプチド上に固定されることができるタンパク質を発現する組み換えファージが保持され、そしてタンパク質ＥＳＭ−１又はそれの断片とその組み換えファージの間に形成される複合体が抗ＥＳＭ−１モノクローナル又はポリクローナル抗体によって、その後に免疫沈降されうる。
【００２４】
Ｂ．競合実験によって得られた候補化合物
タンパク質ＥＳＭ−１の候補アンタゴニスト化合物は、それらが、上に記載された抗ＥＳＭ−１抗体の１つ、そして特に、受託番号Ｉ−１９４１のもとＣＮＣＭへ１９９７年１１月１９日に寄託されたハイブリドーマ株ＭＥＰ０８によって分泌されるモノクローナル抗体のような、タンパク質ＥＳＭ−１の予め選択されたアンタゴニスト化合物と競合して、タンパク質ＥＳＭ−１上又はそれのポリペプチド断片上に固定されるという事実によっても選択されうる。
そのような競合実験は、例えば、ＢＥＣＨＡＲＤｅｔａｌ．（２０００）による論文中に記載されている。
【００２５】
Ｃ．親和性クロマトグラフィーによって選択されるタンパク質ＥＳＭ−１の候補アンタゴニスト化合物
タンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質のポリペプチド断片上に固定されることができるタンパク質又はあらゆるタイプの他の分子は、タンパク質ＥＳＭ−１又はそれの断片が、例えば、タンパク質ＥＳＭ−１又はそれの断片のアガロース又はＡｆｆｉＧｅｌ（登録商標）のような親和性カラムのマトリックスとの化学的カップリングを包含する、慣用的な技術によって予め不動化された親和性カラムを使用して選択されうる。試験される候補化合物を含有する溶液が、タンパク質ＥＳＭ−１又はそれのペプチド断片が不動化されたクロマトグラフィーの保持体と接触させられた。その親和性カラム上に保持された化合物は、明確に選択された。
【００２６】
Ｄ．光学的バイオキャプター（ＢＩＯＣＡＰＴＯＲ）技術によって選択される候補化合物
タンパク質ＥＳＭ−１の候補アンタゴニスト化合物は、ＥＤＷＡＲＤＳ及びＬＥＡＴＨＥＢＡＲＲＯＷ（１９９７）によって記載されているような光学的バイオキャプターを使用することによっても選択されうる。この技術によって、市販の分子の使用を必要とすることなしに分子間の相互作用をリアルタイムで検出できる。この技術は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴ＳｕｒｆａｃｅＰｌａｓｍｏｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ）に基づく。簡単に説明すると、試験される候補化合物が、カルボキシメチルデキストランマトリックスのような表面上に固定される。光線が、試験される試料を含有しない表面の部分上に向けられ、そしてこの表面によって反射される。ＳＰＲ現象は、反射光の角度とその光線の波長との間の格別な関係で反射光の強度の減少を引き起こす。候補化合物の固定は、表面の屈折率の変化を引き起こし、その屈折率の変化がＳＰＲ信号の僅かな変化として検出される。
光学バイオキャプターによるそのような検出方法は、タンパク質ＥＳＭ−１又はそれのペプチド断片上での固定について別のリガンドと競合する候補化合物の選択をも可能とする。
例えば、タンパク質ＥＳＭ−１の候補アンタゴニスト化合物は、抗ＥＳＭ−１抗体のタンパク質ＥＳＭ−１上への固定を阻害することができ、因子ＨＧＦ−ＳＦ又は因子ＦＧＦ−２及びＦＧＦ−７のタンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質のペプチド断片上への固定を阻害することができる化合物を包含する。
【００２７】
従って、更なる態様によれば、本発明は、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を選択する方法であって、次の段階：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１又はそれのペプチド断片を：
（ｉ）タンパク質ＥＳＭ−１上に固定されているタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物；及び
（ｉｉ）試験される候補化合物
と接触させる段階；
ｂ）段階ａ）と別であるが場合によってそれと同時に行われる段階において、タンパク質ＥＳＭ−１又はそれのペプチド断片を、タンパク質ＥＳＭ−１上に固定されているタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物と接触させる段階；
ｃ）段階ａ）及びｂ）の各々の後に固定されたタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物のそれぞれの量を検出する段階；及び
ｄ）タンパク質ＥＳＭ−１上での固定について該アンタゴニスト化合物と競合する候補化合物を選択する段階
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
上の選択法を使用するためのＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物は、好ましくは本明細書において上で定義されたような抗ＥＳＭ−１抗体又はペプチドアンタゴニスト化合物である。
【００２８】
ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を候補化合物から選択するための方法の第一の態様においては、前記方法は、次の段階：
１）該候補化合物の中から、タンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質のペプチド断片上に固定される化合物を選択する段階；
２）段階１）において選択された化合物をある動物へ投与して、タンパク質ＥＳＭ−１によって誘発された腫瘍の発達をこの動物中で阻害するこの化合物の能力を確認する段階；
３）段階２）において確認された、腫瘍の発達を阻害する化合物をタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物として選択する段階
を含んでなる。
段階１）は、好ましくは、本明細書において詳述された方法の中から選ばれる、タンパク質ＥＳＭ−１又はこのタンパク質のペプチド断片上に固定されている候補化合物を選択する方法の使用からなる。
段階２）は、好ましくは、本明細書において詳述されたような、候補化合物をｉｎｖｉｖｏで選択する方法の使用からなる。
本方法の特定的な態様においては、これは、動物を犠牲にすることからなる段階４）をも含有する。
【００２９】
本発明の医薬組成物
本発明の更なる目的は、タンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含有する癌を治療及び／又は予防するための医薬組成物である。
本発明による抗体タイプ又はペプチドタイプのアンタゴニスト化合物を含有する医薬組成物
第一の態様によれば、本発明による医薬組成物は、治療的に有効な量の抗ＥＳＭ−１抗体又はＥＳＭ−１から誘導されたペプチドアンタゴニスト化合物を、１又はそれを超える薬学的に適合性のビヒクルと組み合わせて含有する。本発明による医薬組成物には、局所、経口、経皮、経直腸、点鼻又は非経口（筋肉内、皮下及び静脈内を包含する）投与に適するもの、又は吸入又は注入による投与に適する形態のものが含まれる。本発明による医薬組成物は、単位剤形の形態で与えられ、そして医薬の分野の当業者に周知のあらゆる方法によって調製されうる。全ての方法は、組成物の活性成分を含んでなるアンタゴニスト化合物を液体ビヒクル又は微細に分割された固体ビヒクルと組み合わせ、そして、必要であれば、その生成物を例えば錠剤又はカプセル剤の形態に作り上げることからなる段階を包含する。
【００３０】
経口投与するために、本発明による医薬組成物は、好ましくは、錠剤、カプセル剤又はハードカプセル剤のような単位剤形の形態で与えられる。加圧容器中に含有された形態で与えられる時には、その医薬組成物は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガスのような噴射剤を含有しうる。加圧エアロゾル剤の場合には、その投与単位は所与の量の医薬組成物を供給することができるバルブと共に提供されうる。
別の態様によれば、本発明による医薬組成物は、吸入又は注入による投与のためのドライパウダー組成物の形態、例えば、アンタゴニスト化合物の粉末とラクトースやデンプンのような適する基礎粉末の混合物の形態であってもよい。その散剤組成物は、投与単位、例えば、カプセル剤、又は吸入若しくは注入装置を使用してそこから粉末が投与されうる分与器の形態で与えられうる。
【００３１】
本発明による医薬組成物に適合性の薬学的に許容できる固体ビヒクルには、着香料、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、充填剤、圧縮補助剤、結合剤又は分散剤並びにカプセル化剤のような物質が含まれる。散剤においては、ビヒクルは微細に分割された固体であり、それは、やはり微細に分割された形態のＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物との混合物とされる。錠剤においては、活性成分であるＥＳＭ−１のアンタゴニストが適する圧縮特性を有するビヒクルと混合され、望まれる形態及びサイズに固められる。散剤と錠剤は、好ましくは９９％未満の活性成分を含有する。好ましい固体ビヒクルは、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン及びイオン交換樹脂である。
【００３２】
液体ビヒクルは、本発明による医薬組成物を溶液剤、懸濁液剤、乳液剤、シロップ剤、エリキシル剤及び加圧製剤の形態で調製するために使用される。活性成分であるタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニストは、水、有機溶媒、又はこれら２つ若しくは薬学的に許容できる油脂の混合物のような、薬学的に許容できるビヒクル中に溶解又は懸濁されうる。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味料、着香料、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤又は浸透圧調整剤のような他の薬学的に許容できる添加剤を含有してもよい。経口及び非経口投与のための液体ビヒクルの例には、水、アルコール類（一価アルコール及びグリコール類のような多価アルコールを包含する）、ヤシ油又は分画されたラッカセイ油のような油類が含まれる。非経口投与のためには、そのビヒクルは、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルのようなエステルであることもできる。
滅菌溶液剤又は懸濁液剤の形態の液体医薬組成物は、筋肉内、腹腔内又は皮下注射のために用いられうる。
本発明による医薬組成物は、投与単位当たり１〜１０００ｍｇのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を、好ましくは投与単位当たり１０〜５００ｍｇのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含有する。
本発明は、癌を治療及び／又は予防する方法であって、そのような治療を必要とする患者に上で定義されたような医薬組成物が投与される段階を含んでなる方法にも関する。
【００３３】
アンチセンスポリヌクレオチドタイプのタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含有する医薬組成物
本明細書において定義されたアンチセンスポリヌクレオチドタイプの治療的に有効な量のタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含有する医薬組成物も、癌を治療及び／又は予防する方法であって、そのような治療を必要とする患者に上で定義されたようなアンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬組成物を投与することを含んでなる方法に加えて、本発明の一部を形成する。
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、局所や全身のどのような手段によっても投与されうる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの例えば腫瘍中への局所投与は、直接腫瘍の中に又は腫瘍を囲んでいる組織中にアンチセンスポリヌクレオチドをへ投与して、そのオリゴヌクレオチドが腫瘍細胞中に拡散できるようにすることによって行われうる。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドは、シリンジを使用して注射されうる。その注射は、筋肉内、静脈内、腹腔内又は皮下のものでありうる。アンチセンスポリヌクレオチドは、肝門脈を介して肝臓に投与されうる。同様に、アンチセンスポリヌクレオチドは、吸入装置を用いて肺に投与されうる。
【００３４】
アンチセンスポリヌクレオチドの他の投与の手段も用いられうる。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドは、発現ベクター中にそれらが挿入された後に全身投与されうる。用語“発現ベクター”には、アンチセンスポリヌクレオチドの発現を確実にするプラスミド、ウイルス又は技術の現状において公知のあらゆる他のビヒクルが含まれる。
アンチセンスポリヌクレオチドの組み換え体の発現に適するベクターを使用するために、当業者は、ＬＥＥ及びＮＡＴＨＡＮＳ（１９８８）によって記載されているベクターｐＭＳＸＮＤ、ＧＬＵＺＭＡＮ（１９８２）によって記載されているもののような真核性ウイルスベクター、米国特許第５，１７３，４１４号及び第５，３５４，６７８号中に記載されているもののようなアアデノウイルス及びアデノ関連ウイルス、又はＭＯＸＨＡＭｅｔａｌ．（１９９３）によって記載されている発現ベクターを包含する発現系を有利に用いることができる。
その発現ベクターは、好ましくは、ポリヘドリンプロモーターのような、動物、好ましくは哺乳類、そして、好ましくはヒトにおいてアンチセンスポリヌクレオチドを産生できるようにするプロモーターを含有する。
発現ベクターは、例えば、アンチセンスポリヌクレオチドをコードする核酸を上皮細胞または内皮細胞のような一定の細胞に特異的なプロモーターの制御下に置くことによって、腫瘍の部位におけるアンチセンスポリヌクレオチドの目標とされる発現に適するものとなりうる。そのようなプロモーターの例は、乳がんの治療において格別に有用であるＮｕＮＴＶと命名されたウイルスプロモーターである。そのような具体的なプロモーターの他の例は、βラクトグロブリン、αカゼイン及びβカゼインのような乳タンパク質プロモーターである。
【００３５】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドの治療的に有効な量は、全身又は局所レベルのタンパク質ＥＳＭ−１の翻訳を有意に減少させるために必要な量として決定されうる。
アンチセンスポリヌクレオチドの治療学的に有効な濃度は、投与の様式の選択に伴なって変動することが、当業者には明確であろう。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドが注射によって哺乳類に投与されると、その投与単位は、有効な量のアンチセンスポリヌクレオチドを含有するシリンジを含んでなることとなる。全身投与のためのアンチセンスポリペプチドの有効な量は、一日あたり一回又は二回投与される０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。医薬組成物中に包含される本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドの治療的に有効な量は、一般に、投与当たり１０４〜１０１１分子のアンチセンスポリヌクレオチドであり、好ましくは、投与当たり１０５〜１０１０分子のＤＮＡである。
しかしながら、（ｉ）アンチセンスポリヌクレオチドの、タンパク質ＥＳＭ−１の発現を阻害する個々の能力、（ｉｉ）疾患の重さ又は程度、又は（ｉｉｉ）使用されるアンチセンスポリヌクレオチドの薬物動態学的挙動に従って、異なる投与プロトコールが用いられうる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、薬学的に許容できるビヒクル又は賦形剤と組み合わされうる。賦形剤の例には、投与のタイプ及び投与の形態に従って、充填剤、結合剤、分散剤、滑沢剤が含まれる。好ましい投与の形態には、溶液剤、有利にはＨＡＮＫ´ｓ又はＲＩＮＧＥＲ溶液のように生物学的に適合性の緩衝液が含まれる。さらに、本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドは、固体形態に製剤され、次いで、使用直前に再溶解又は再懸濁されることができる。これには、そのようなアンチセンスポリヌクレオチドを含有する凍結乾燥形態及びリポソームが含まれる。
【００３６】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、経粘膜、経皮、又は経口経路によって全身投与されることもできる。経粘膜又は経皮経路の投与のために、胆汁酸塩又はフシジン酸の誘導体のような浸透剤が製剤中で用いられうる。
本発明は、癌を治療及び／又は予防する方法であって、そのような治療を必要とする患者にアンチセンスポリヌクレオチドタイプのＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含有する上で定義されたような医薬組成物を投与する段階を含んでなる方法にも関する。
一般に、上で定義されたような医薬組成物であって、治療学的に有効な量のタンパク質ＥＳＭ−１のアンタゴニスト化合物を含有する本発明の組成物のいずれも、癌の予防及び／又は治療に有用である。
非限定的な例示として、本発明による医薬組成物は、気道癌、気管支−肺癌、乳癌、結腸癌、及び腎臓癌、並びに消化器系の癌のような癌を予防及び／又は治療するために有用である。
本発明は、次の実施例と図によって更に例示されるが、いかなるやり方によっても限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１
タンパク質ＥＳＭ−１の分泌型の翻訳後修飾
Ａ．材料及び方法
Ａ．１  細胞培養及び材料
ＣＨＯ細胞は、１０％ウシ胎児血清を補った培地ＭＡＭα（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）中で培養した。ウイルスＳＶ４０で形質移入したヒト内皮細胞、即ち、ＬＡＳＳＡＬＬＥｅｔａｌ（１９９２）に記載されるＳＶ１細胞は、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ヒト胚腎臓細胞、株２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清を含む、ダルベッコのＤＭＥＭ培地中で培養した。増殖試験に用いるヒト胚腎臓細胞、即ち、株２９３の細胞は、１０ｍｇ／ｍｌのインスリン及び１０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリンを補った、ダルベッコの修飾ＥＡＧＬＥ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で培養した。プロテイナーゼ及びコンドロイチナーゼＡＢＣは、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍより商業的に入手可能であった。コンドロイチナーゼＢ、ＡＣ及びＣは、Ｓｉｇｍａにより販売されている。ヒト因子ＨＧＦ／ＳＦはＲ＆Ｄに、そしてデコリンはＳｉｇｍａにより販売されている。抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体は、ＢＥＣＨＡＲＤｅｔａｌ（２０００）に記載されるように産生し、そして精製した。
【００３８】
Ａ．２  ＥＳＭ−１を発現する細胞株の発達
ＥＳＭ−１をコードする完全ｃＤＮＡを振り向け、精製し、そして発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが販売）のＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入した。このベクター構築物を、リポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）の存在下で、細胞株ＣＨＯ及び２９３に形質移入し、その後、Ｇ４１８上で選択した（ＣＨＯ株に関しては１０００μｇ／ｍｌ、そして２９３株に関しては３００μｇ／ｍｌ）。安定に形質移入されている細胞株を限界希釈によって得て、そしてこうして選択した細胞を、それぞれ、ＣＨＯ−ＥＳＭ及び２９３６−ＥＳＭと名づけた。
【００３９】
Ａ．３  突然変異解析によるＥＳＭ−１のＯ−グリコシル化の部位の決定
ソフトウェア、ＮＥＴ  Ｏ  ｇｌｙｃ：０予測サーバーを用いて、Ｏ−グリコシル化の２つの潜在的な部位を予測しておいた。
１３７位のセリン残基（配列番号１）及び１２０位のスレオニン（配列番号１）は、アラニン残基で置換した。Ｏ−グリコシル化突然変異体は、製造者の推奨にしたがって、突然変異誘発キット、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたＰＣＲによって産生した。
突然変異体ｃＤＮＡは、配列決定（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの配列決定装置ＡＢＩプリズム３７７）によって確認した。その後、突然変異体ｃＤＮＡが挿入されているベクターで２９３細胞を形質移入し、一過的な及び安定な形質移入体、それぞれ２９３−ＥＳＭ／Ｓ  １３７Ａ及び２９３−ＥＳＭ／Ｔ  １２０Ａを得た。
【００４０】
Ａ．４  プロテオグリカンＥＳＭ−１コンドロイチン／デルマタン硫酸の精製
細胞培養上清をｐＨ８に調整し、その後、ＤＥＡＥ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通過させ、Ｔｒｉｓ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ８）、０．２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄してから、緩衝液Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ（ｐＨ８）、０．８Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。
溶出液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．５Ｍ  ＮａＣｌに調整し、そして親和性カラムを通過させた。親和性カラムは、製造者の推奨にしたがって、Ａｆｆｉｇｅｌ  Ｈｚヒドラジドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上に固定した抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体（ハイブリドーマ株ＭＥＣ４が産生）で構成された。
Ｔｒｉｓ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ８）、０．５Ｍ  ＮａＣｌでの洗浄工程後、タンパク質ＥＳＭ−１は、３ＭＭｇＣｌ２溶液で溶出し、濃縮し、そしてウルトラフリー３０装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で同緩衝液に対して透析した。
その後、溶出した材料を抗ＥＳＭ−１抗体での免疫検出によって定量化し、そしてクマシーブルー又はアルシアンブルーでの呈色を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認した。
ヒト血漿からのタンパク質ＥＳＭ−１の精製は、以下のプロトコルにしたがって行った。
輸血局（フランス・リール）により供給された８００ｍｌの血漿を６０％硫酸アンモニウム溶液で沈殿させ、そしてＴｒｉｓ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ８）、０．５Ｍ  ＮａＣｌに対して透析した。その後、沈殿しそして透析した血漿抽出物を、抗ＥＳＭ−１免疫親和性カラムに通過させる前に、Ａｆｆｇｅｌ型の５０ｍｌプレカラム（Ｂｉｏｒａｄ）に通過させた。免疫親和性カラムに固定したタンパク質ＥＳＭ−１は、以下に記載するように回収した。
ＥＳＭ−１の非グリコシル化型（ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ）は、クロマトグラフィー及び免疫親和性による単一工程で精製した。グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）及びセリン１３７で交換した非グリコシル化タンパク質（ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ）の純度は、ＦＰＬＣによって確認した。精製材料は、カブトガニ（ｌｉｍｕｌｕｓ）アメーバ様細胞溶解物試験（ＢＩＯｗｈｉｔａｋｅｒ）の結果によって立証するように、内毒素不含であった。
【００４１】
Ａ．５  免疫沈降、免疫ブロット及び配列決定
ＥＳＭ−１の異なる型のサイズは、細胞培養上清及び細胞溶解物からの免疫沈降及び免疫ブロットによって決定した。細胞は、ＰＢＳ中、０．５％のＮＰ４０、抗プロテイナーゼカクテル（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する緩衝液に、４℃で３０分間攪拌しながら溶解した。
その後、溶解物は、清澄にした細胞溶解物を得るため、１０．０００ｇで１５分間遠心分離した。
培養上清は、孔直径０．４５ｍｍを有するフィルターでろ過した。
ハイブリドーマ株ＭＥＰ１９に産生されたＥＳＭ−１モノクローナル抗体１μｇ、又は１μｇ抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体（クローン１６４Ｂ）を、清澄にした溶解物又は細胞培養上清に添加し、そして４℃で一晩、攪拌しながらインキュベーションした。
アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）にコンジュゲート化した抗マウス免疫グロブリン５０μｌを、４℃で９０分間に渡って添加し、その後、遠心分離し、そして溶解緩衝液で洗浄し、そしてＰＢＳ中で洗浄した。
ビーズは、２０及び４０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液に５分間再懸濁し、遠心分離して上清を解析した。
【００４２】
試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動に供し、その後、標準法を用いてニトロセルロース膜上に移した。
ブロッキング工程後、ハイブリドーマ株ＭＥＰ１４に産生されたＥＳＭ−１モノクローナル抗体１μｌと、膜を１時間インキュベーションし、洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａが販売）とコンジュゲート化した抗Ｆｃマウス二次抗体と、１時間インキュベーションした。数回洗浄した後、Ａｍｅｒｓｈａｍが販売するＥＣＬ検出キットを用いて、顕色を行った。
アミノ酸配列解析のため、精製タンパク質ＥＳＭ−１をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の電気泳動に供し、その後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅが販売するポリフッ化ビニリデン（ＰＤＶＦ）膜上に電気トランスファーし、その後、０．１％クマシーブルーを用いて発色させた。５０ｋＤのタンパク質バンドを膜から切り取り、そしてＡＢＩ４７３Ａ型のタンパク質配列決定装置上で、エドマン分解によってＮ末端配列を決定した。
【００４３】
Ａ．６  プロテイナーゼＫによるＥＳＭ−１のペプチド部分の消化
グリコサミノグリカンのサイズを決定するため、０．１％ＳＤＳの存在下又は非存在下、Ｔｒｉｓ緩衝液１０ｍＭ、ｐＨ８中、酵素：ＥＳＭ−１比１：５０（ｗ／ｗ）で、精製タンパク質ＥＳＭ−１を、プロテイナーゼＫで、５６℃で３時間消化した。完全な分解を確証するため、プロテイナーゼＫによって、タンパク質ＥＳＭ−１のものの１０倍多い量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を消化した。試料を、１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で解析し、その後、クマシーブルー及びアルシアンブルーで発色させた。
【００４４】
Ａ．７  コンドロイチナーゼＡＢＣ、Ｂ、ＡＣ及びＣによるＥＳＭ−１の消化
グリコサミノグリカンの置換の性質を解析するため、精製タンパク質ＥＳＭ−１を、いくつかのコンドロイチナーゼで消化した：コンドロイチナーゼＡＢＣ（０．５単位／ｍｇ、緩衝液１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８、３０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２中、３７℃で４５分間）、コンドロイチナーゼＢ（２００単位／ｍｇ、緩衝液２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ、ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％ＢＳＡ、ｐＨ７．５中、２５℃で２時間）、コンドロイチナーゼＡＣ（ｍｌあたり１単位、緩衝液２５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、７５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．３中、３７℃で２時間）、コンドロイチナーゼＣ（８０−１２０単位／ｍｌ、緩衝液５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８中、２５℃で３時間）。試料は、免疫ブロットによって解析した。
【００４５】
Ａ．８  抗凝血活性
コントロールである低血小板血漿（ＰＰＰ）は、抗凝血剤、クエン酸ナトリウム（３０ｍＭ）の存在下、２５００ｇで１５分間遠心分離することによって、血液から調製した。すべての試薬は、ＳＴＡＧＯＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（フランス）によって販売された。低血小板血漿に、タンパク質ＥＳＭ−１、緩衝液又はヘパリンを添加することによって、３つのパラメーターを評価した。
ａ）ＡＰＴＴ（部分的トロンボプラスチン活性化時間）：このパラメーターは、凝血の内因性の経路を調べる（ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ）。これらの因子の１つの欠損又は阻害は、ＰＰＰ試薬、セファリン、活性化因子、ＣａＣｌ２の混合物の凝血時間を増加させる。
ｂ）ＴＣＴ（トロンビン凝血時間）：このパラメーターは、トロンビンの存在下、低血小板血漿（ＰＰＰ）の混合物に対して解析する。トロンビンの標準濃度では、血漿の凝血時間は一定である。フィブリン形成欠損は、凝血時間の増加を誘発する。
ｃ）抗Ｘａ活性：ヘパリン、又は因子ＦＸａに作用する他の阻害剤の抗Ｘａ活性は、競合試験によって検出する。検討した試料（ＰＰＰ＋ＥＳＭ−１＋緩衝液又は＋ヘパリン）を因子ＦＸａ及び因子ＦＸａの特異的色素生産基質と混合する。最終呈色は、阻害剤濃度に逆比例する。
【００４６】
Ａ．９  トロンビン生成試験
この高感度包括的試験は、トロンビン生成の遅延又は減少を誘発する、血漿又は血小板中の欠損を検出可能である。高血小板血漿（ＰＲＰ）は、クエン酸ナトリウムの存在下、１５０ｇで１０分間遠心分離することによって、血液から調製した。各被験者に関して、ＥＳＭ−１の非存在下の試料、非分画ヘパリン化カルシウム（抗Ｘａ  ０．５ＵＩ／ｍｌ）を含む試料、又は、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌのＥＳＭ−１（最終濃度）を含む試料において、トロンビン生成試験を行った。
タンパク質ＥＳＭ−１は、試験１０分前に添加した。
３７℃で、１ｍｌの血漿を、１ｍｌのＣａＣｌ２と混合し、そしてクロノメーターを開始した。０．１ｍｌのアリコット分画を、１分ごとに、反応混合物から採取した。
反応混合物中に形成された血餅を定期的に除去した。アリコット分画を０．２ｍｌのフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ、Ｏｗｒｅｎ緩衝液中４／１０００）と３７℃で混合し、そして各アリコット分画に関して凝血時間を測定した。
反応混合物中に形成されたトロンビンは、形成因子（ｆｏｒｍｉｎｏｇｅｎ）として働き、フィブリンの形成を誘発した。凝血活性は、４から８分間の間に最大であり、その後、抗トロンビンによるトロンビンの中和のため、減少した。
【００４７】
Ａ．１０  ゲルろ過による分析クロマトグラフィー
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中の精製グリコシル化ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）及び精製非グリコシル化ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ）５０μｇは、クロマトグラフィー系、ＢｉｏｒａｄＢｉｏｌｏｇｉｃＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ系を用いて、流速１ｍｌ／分で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ販売のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＥＳＭ／ＷＴ用）又はＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ用）上の液体クロマトグラフィーによって分離した。
標準として、以下の高及び低分子量（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）の較正キットを用いた：リボヌクレアーゼＡ（ウシ膵臓、１３．７ｋＤ）、オボアルブミン（４３ｋＤ）、アルブミン（ウシ血清、６７ｋＤ）、アルドラーゼ（ウサギ筋肉、１５８ｋＤ）、フェリチン（ウシ脾臓、４４０ｋＤ）、チログロブリン（ウシ甲状腺、６６９ｋＤ）。
分子量標準は、タンパク質ＥＳＭ−１に用いたものと同一の緩衝液を用いて分離し、そして分離は、タンパク質ＥＳＭ／ＷＴ及びＥＳＭ／Ｓ１３７Ａの分離の直後に行った。それぞれ、タンパク質ＥＳＭ／ＷＴ及びＥＳＭ／Ｓ１３７Ａの見かけの分子量を決定するため、標準タンパク質の溶出時間を用いて、標準線形曲線、Ｋａｖ＝ｆ（ｌｏｇ  ＭＲ）を引いた。
１ｍｌの画分を収集し、特異的免疫酵素試験（ＥＬＩＳＡ）を用いて、タンパク質ＥＳＭ−１を検出した。
【００４８】
Ｂ．結果
Ｂ．１  内皮細胞及び樹立細胞株により産生されたタンパク質ＥＳＭ−１の分泌型の翻訳後修飾
シグナルペプチドと予測されるＮ末端アミノ酸配列の存在に示唆されるように、ＥＳＭ−１が分泌分子として成熟しているかどうかを決定するため、細胞株２９３−ＥＳＭからタンパク質ＥＳＭ−１を精製した。
５０ｋＤ型のＮ末端配列によって、１９アミノ酸のシグナルペプチドが予測される部位で切断され、配列番号１の２０位のトリプトファン残基で始まる１６５アミノ酸のＥＳＭ−１の成熟ポリペプチドが生じ、Ｎ末端配列がＷＳＮＮＹＡＶＤ−Ｐであることが示された。
ＥＳＭ−１は、ＨＵＶＥＣ、ＳＶ１、２９３−ＥＳＭ及びＣＨＯ−ＥＳＭ細胞の培養上清から免疫沈降し、その後、免疫ブロットによって解析した。
ＨＵＶＥＣ細胞上清において、ＥＳＭ−１は、５０ｋＤ周囲の拡散したバンドの形で移動することが、先に示されていた。
類似のサイズのバンドが、ＳＶ１、２９３−ＥＳＭ及びＣＨＯ−ＥＳＭ細胞の上清でも観察された（図１Ａ）。
見出された分子量は、予測された分子量より大きかった。この結果は、ＥＳＭ−１の分泌型が、翻訳後修飾を経たことを示唆した。精製タンパク質ＥＳＭ−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上、クマシーブルーよりアルシアンブルーでよく発色し、この事実は、還元状態がＥＳＭ−１の見かけの分子量を変更しないため、ＥＳＭ−１は、ジスルフィド架橋を通じてオリゴマー化されているのではなく、グリコシル化されていることを示唆した（図１Ｂ、１Ｃ）。
【００４９】
Ｂ．２  １３７位のセリン残基（配列番号１）は、ＥＳＭ−１のＯ−グリコシル化の部位である
潜在的なグリコシル化部位のコンピュータ解析によって、それぞれ、１６位のセリン、１２０位のスレオニン及び１２７位のセリン上に、３つの推定上のＯ−グリコシル化部位が同定されたが、Ｎ−グリコシル化部位は同定されなかった。
１２０位のスレオニン残基及び１３７位のセリン残基を、アラニン残基で交換した。
これらの突然変異体を２９３細胞で一過的に発現した。
その後、タンパク質ＥＳＭ−１を細胞溶解物及び培養上清から免疫沈降し、そして免疫ブロットによって解析した。
タンパク質ＥＳＭ／Ｔ１２０Ａは、図２Ａに示すように、５０ｋＤに移動し、これはＥＳＭ−１の野生型（ＥＳＭ／ＷＴ）の見かけの分子量と類似の位置であった。
対照的に、タンパク質ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａは、ＥＳＭ−１の細胞内型に対応する２２ｋＤに移動し（図２Ａ）、これはＥＳＭ−１の予測される分子量と矛盾しない分子量であった。
一過的形質移入ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞から行った免疫沈降は同一の結果を生じ、検討したすべての細胞モデルで、１３７位のセリン残基のみがグリココンジュゲート化の部位を構成することを示した。
ＥＳＭ−１のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の長さを決定するため、ＥＳＭ−１のペプチド部分をプロテイナーゼＫによって完全に消化した。
プロテイナーゼＫによる処理は、５０ｋＤから２５−３０ｋＤへの分子量変化を引き起こした（図２Ｂ）。これらの結果は、５０ｋＤの見かけの分子量のバンドが、２２ｋＤのポリペプチドの存在と矛盾せず、２２ｋＤのポリペプチドが、平均サイズ２５−３０ｋＤのＧＡＧ鎖によって、１３７位のセリンでグリココンジュゲート化されていることを示す。
【００５０】
Ｂ．３  ＥＳＭ−１のＧＡＧ鎖は、コンドロイチナーゼＡＢＣに感受性である
ＥＳＭ−１のＧＡＧ鎖を性質決定するため、タンパク質ＥＳＭ−１をまず、コンドロイチナーゼＡＢＣで消化した。コンドロイチナーゼＡＢＣによる処理は、分泌タンパク質ＥＳＭ−１の分子量を２２ｋＤに減少させ（図３Ａ）、これは、ＥＳＭ−１の炭水化物が、コンドロイチン型の鎖であることを示唆した。
このプロフィールは、２９３−ＥＳＭ細胞及びヒト内皮細胞株ＳＶ１から精製したタンパク質ＥＳＭ−１と類似している。タンパク質ＥＳＭ−１は、血中で循環するため、我々はまた、ヒト血漿から精製したタンパク質ＥＳＭ−１の挙動も検討した。検討した他の細胞株すべてに関して、結果は、５０ｋＤの単一の主なバンドを示し、このバンドは、コンドロイチナーゼＡＢＣでの処理後、２２ｋＤの分子量を有した（図３Ａ）。こうしたタンパク質ＥＳＭ−１は、単一コンドロイチン硫酸鎖を含有する可溶性プロテオグリカンである。
【００５１】
Ｂ．４  ＥＳＭ−１のＧＡＧ鎖は、不均一コンドロイチン／デルマタン硫酸鎖である
ＥＳＭ−１のＧＡＧ鎖を構成する糖単位の型をよりよく決定するため、コンドロイチナーゼＢ、ＡＣ及びＣなどのいくつかの特異的酵素を用いた。
コンドロイチナーゼＢでの処理は、見かけの分子量を５０ｋＤから２２ｋＤに減少させた（図３Ｂ）。
ＥＳＭ−１をコンドロイチナーゼＡＣ及びＣによって処理した後も同様のプロフィールが観察された（図３Ｃ、Ｄ）。
これらの異なる酵素処理は、ＥＳＭ−１のＧＡＧ鎖が、異なって硫酸化されたイズロン酸又はグルクロン酸にカップリングした、アミノ糖の一種、Ｎ−アセチルガラクトサミンを含む、異なる構成要素単位を含有することを示した。
これらの異なる単位は鎖に交互に現れ、そしてコンドロイチナーゼでの処理すべてが、同じ２２ｋＤの減少した見かけの分子量を導くため、コンドロイチナーゼによる消化後にタンパク質部分に残る、鎖の初めの部分、Ｎ末端二硫酸化二糖近くに存在した。
【００５２】
Ｂ．５．  凝血への可溶性ＥＳＭ−１プロテオグリカンの生物学的活性
タンパク質ＥＳＭ−１は、内皮細胞によってコンドロイチン／デルマタン硫酸型のプロテオグリカンとして分泌され、そしてデルマタン硫酸は、ｉｎｖｉｔｒｏでトロンビン生成に（ＤＥＬＯＲＭＥｅｔａｌ（１９９６））、そして凝血に、影響を示すため、ＥＳＭ−１の抗凝血潜在能力を、パラメーターＡＰＴＴ、ＴＣＴ、抗Ｘａ活性を用いて、そしてトロンビン生成に対して検証した。
結果は以下の表１に示す。
【００５３】
【表１】
2004518638.tif 000002
【００５４】
表１の結果は、０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌまでの異なる有意な用量のタンパク質ＥＳＭ−１が、試験した異なるパラメーターを変化させなかったことを示す。
パラメーターＡＰＴＴ、ＴＣＴ及び抗Ｘｚ活性は、緩衝液を含む又はタンパク質ＥＳＭ−１を含む低血小板血漿（ＰＰＰ）に関して類似していた。
陽性コントロールにおいて、ＡＰＴＴ、ＴＣＴ及び抗Ｘａ活性は、ヘパリンの存在下でＰＰＰに関してより高かった。
さらに、タンパク質ＥＳＭ−１は、トロンビン生成試験に対して阻害効果を持たなかった；コントロール緩衝液に比較して、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌのＥＳＭ−１濃度に応じて、相違はまったく観察されず、一方、ヘパリンは、トロンビン形成に遅延を誘発した（図４）。
【００５５】
実施例２
因子ＨＧＦ／ＳＦの分裂促進活性へのタンパク質ＥＳＭ−１の影響
Ａ．材料及び方法
増殖刺激活性は、２９３細胞による３Ｈチミジンの取り込みを測定することによって決定した。
２９３細胞は、ＴＰＰ型の９６ウェルマイクロプレートにおいて、ウェルあたり１ｘ１０４細胞の濃度で蒔き、そしてトランスフェリン及びインスリンを補ったＤＭＥＭ培地中、２４時間維持した。
ヒト組換えＨＧＦ／ＳＦは、０．１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳで希釈し、そして最終濃度５０ｎｇ／ｍｌを得るため、水中で、３つの同一のウェルに添加した。
組換えタンパク質ＥＳＭ／ＷＴ、ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ、ＥＳＭ−１由来の精製ＧＡＧ鎖及びデコリンは、単独で、又は１ｎｇ／ｍｌから２．５μｇ／ｍｌの用量の因子ＨＧＦ／ＳＦと組み合わせて、ＨＧＦ／ＳＦの添加と同時に、添加した。
培養９６時間後、細胞をウェルあたり０．５μＣｉの３Ｈチミジンとインキュベーションし、そして３Ｈチミジンの取り込みを、Ｔｏｐｃｏｕｎｔマイクロプレート・シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）型のシンチレーションカウンターを用いて決定した。
試験は３つの同一ウェルのバッチに対して行った。
細胞生存性は、ＭＴＴ還元試験を用いて測定した。
【００５６】
Ｂ．結果
因子ＨＧＦ／ＳＦの活性に対するタンパク質ＥＳＭ−１の影響を検討した。
２９３細胞による３Ｈ−チミジンの取り込みを、５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦ単独、又は異なる量のＥＳＭ／ＷＴと組み合わせた存在下で測定した。
実験の最初のバッチにおいて、５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦ単独では、血清によって誘発される増殖の約４５％に等しいレベルで、２９３細胞の増殖が誘発されたが、タンパク質ＥＳＭ／ＷＴ単独では、２９３細胞の増殖が刺激されなかったことを観察した。
対照的に、因子ＨＧＦ／ＳＦと組み合わせると、タンパク質ＥＳＭ／ＷＴは、２．５μｇ／ｍｌの濃度で試験した際、ＨＧＦ／ＳＦによって誘発される２９３細胞の増殖を、１６２．３％の増加で、大幅に増加させた（図５）。
ＨＧＦ／ＳＦ活性に対するタンパク質ＥＳＭ−１のこの増加効果は、ＥＳＭ−１の用量に依存し、そして１０ｎｇ／ｍｌの用量で、有意になり始めた（図６）。
さらに、因子ＨＧＦ／ＳＦの分裂促進活性へのタンパク質ＥＳＭ／ＷＴの影響を、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸型の別のプロテオグリカン、デコリンの影響に比較した。タンパク質ＥＳＭ／ＷＴと対照的に、デコリンは、因子ＨＧＦ／ＳＦによって誘発される２９３細胞の増殖を増加させる活性をまったく示さなかった（図５、６）。
これらの結果は、タンパク質ＥＳＭ−１が、因子ＨＧＦ／ＳＦの分裂促進活性に対して特異的影響を有することを示した。
【００５７】
分裂促進効果を増加させる活性に対する、ＥＳＭ−１のタンパク質部分及びＧＡＧ鎖のそれぞれの関与を調べるため、異なる濃度の非グリコシル化ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ及びＥＳＭ−１由来のＧＡＧ鎖を補ったＨＧＦ／ＳＦの存在下で、２９３細胞による３Ｈ−チミジンの取り込みを測定した。
ＥＳＭ−１の非グリコシル化型は、因子ＨＧＦＳＦの存在下又は非存在下いずれかで、２９３細胞の増殖を誘発不能であり（図５）、該因子を高濃度で用いた場合でさえ、不能であった。
対照的に、ＥＳＭ−１から精製したＧＡＧ鎖は、因子ＨＧＦ／ＳＦ単独に比較して、９６．６％に近い増加係数で、因子ＨＧＦ／ＳＦによって誘発される２９３細胞の増殖を大幅に増加させた（図５）。ＧＡＧ鎖の分裂促進効果は、タンパク質ＥＳＭ−１の野生型で観察されるものより小さかったが、それにもかかわらず、この効果は、添加したＧＡＧ鎖の用量に依存した（図６）。
【００５８】
上に示した結果は、タンパク質ＥＳＭ／ＷＴが、因子ＨＧＦ／ＳＦによって誘発される２９３細胞の増殖を増加させ、そしてこの分裂促進活性がＥＳＭ−１のコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸型のＧＡＧ鎖に特異的であり、そして該鎖によるものであることを明らかに示す。
一般的に、因子ＨＧＦ／ＳＦは、妊娠６から１３週のヒト器官形成の重要な初期中に発現される。ＨＧＦ／ＳＦ遺伝子を発現する器官は、特に、肝臓、後腎、腸及び肺であり、これらの器官は各々、間葉及び上皮間の誘発性相互作用によって発達する。さらに、因子ＨＧＦ／ＳＦは、ヒト腎臓多嚢胞性異形成症（ＴＡＫＡＹＡＭＡｅｔａｌ１９９７）の、そして尿細管の奇形及び過剰増殖出現の重要な要因である。上に示す結果は、タンパク質ＥＳＭ−１が、ＨＧＦ／ＳＦの存在下で、胚性腎臓の細胞増殖を有意に増加させるが、タンパク質ＥＳＭ−１の非グリコシル化型がまったく影響を持たないことを示す。さらに、タンパク質ＥＳＭ−１から単離したＧＡＧ鎖は、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ／ＷＴの効果を模倣することが可能である。これらの結果は、因子ＨＧＦ／ＳＦの機能に対するＥＳＭ−１の生物学的活性が、そのＧＡＧ鎖によって主に仲介されることを明らかに示す。内皮細胞によって分泌されるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸型の別のプロテオグリカンであり、そして因子ＨＧＦ／ＳＦ上に固定可能であるデコリン（ＣＥＬＬＡｅｔａｌ，１９９２）が、ＨＧＦＳＦの活性に、まったく影響を持たないことに注目することが可能である。これらの比較は、小さなロイシンリッチ反復を持つプロテオグリカンファミリーに属するプロテオグリカンのＧＡＧ鎖と異なるＧＡＧ鎖の組成を必要とする、因子ＨＧＦ／ＳＦの活性に対する、タンパク質ＥＳＭ−１の作用の特異性を示す。
【００５９】
腎臓において、タンパク質ＥＳＭ−１は、遠位尿細管を選択的に検出するが、これは、ヒト腎多嚢胞性異形成症の状況で、ネフロンの同一部分に因子ＨＧＦ／ＳＦが優先的に局在するという観察と関連する可能性がある結果である（ＷＥＩＤＮＥＲｅｔａｌ，１９９３）。これらの結果は、乳癌（ＲＡＨＩＭＩｅｔａｌ，１９９８）、腎臓癌（ＮＡＴＡＬＩｅｔａｌ（１９９６））、及び肺癌（ＯＴＳＵＫＡｅｔａｌ，１９９８）の発達にも、そしてまた悪性黒色腫（ＳＩＥＧＦＲＩＥＤｅｔａｌ，１９９８）においても関連することが示されている因子ＨＧＦ／ＳＦに依存する病理学的障害における、タンパク質ＥＳＭ−１の適用を示唆する。このように、因子ＨＧＦ／ＳＦは、過形成の拡大を支持し、そして侵襲性の表現型を持つ細胞を生成する可能性がある。タンパク質ＥＳＭ−１は、因子ＨＧＦ／ＳＦの制御解除された分裂促進活性のこれらの現象に関与する可能性がある。
【００６０】
実施例３
抗体タイプのタンパク質ＥＳＭ−１アンタゴニスト化合物の調製
システイン残基が豊富なタンパク質ＥＳＭ−１のＮ末端領域に対して向けられる抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体を得るため、タンパク質ＥＳＭ−１をコードするＤＮＡ挿入物を含有する発現ベクターで形質移入したＣＨＯ細胞株が産生する天然型のタンパク質ＥＳＭ−１を精製した。
ＥＳＭ−１のｃＤＮＡを真核発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、その後、製造者の推奨にしたがって、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ）でＣＨＯ細胞に形質移入した。形質移入４８時間後、１０００マイクログラム／ｍｌの用量の選択剤（Ｇ４１８、Ｇｉｂｃｏ）の存在下、細胞を移植した。選択２週間後、Ｇ４１８に耐性であるＣＨＯ細胞を限界希釈によってクローニングした。その後、ＥＳＭ−１を発現しているクローンを選択し、そしてＣＨＯ−ＥＳＭと名づけた（ＣＮＣＭに寄託）。
産生のため、ＣＨＯ−ＥＳＭ細胞を、ウシ胎児血清を含まない培地（培地ＣＨＯ  ＳＦＭ  ＩＩ、Ｇｉｂｃｏ）中の懸濁で培養した。上清をｐＨ８に調整し、そしてＤＥＡＥ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通過させた。カラムを緩衝液５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄した。緩衝液５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１Ｍ  ＮａＣｌでＥＳＭ−１分子を溶出した。その後、溶出物を、緩衝液５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８中で１：４に希釈し、そしてアガロース（Ｂｉｏｒａｄ）上に固定した抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体（ＭＥＣ４）の存在下でインキュベーションした。攪拌しながら４℃で一晩インキュベーションした後、緩衝液５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．２Ｍ  ＮａＣｌでアガロースビーズを洗浄した。ＥＳＭ−１は、３Ｍ  ＭｇＣｌ２で溶出した。溶出物を濃縮し、そして緩衝液５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中で透析し、そして−７０℃で保存した。
【００６１】
標準的免疫プロトコルにしたがって、フロイントのアジュバントの存在下、マウスあたり１０μｍの精製組換えタンパク質ＥＳＭ−１の注射によって、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを免疫した。
ＢＥＣＨＡＲＤら（２０００）に記載される技術にしたがって、融合、スクリーニング及びサブクローニングによって、抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体を分泌しているハイブリドーマ細胞を得た。
５つのハイブリドーマ細胞クローンを得て、そして総称的にＭＥＣ（ＣＨＯ細胞によって産生される、ＥＳＭ−１に対するマウスモノクローナル抗体）と名づけた。
選択したハイブリドーマのうち４つは、アイソタイプＩｇＧ１、ｋであり、それぞれのハイブリドーマをＭＥＣ４、ＭＥＣ５、ＭＥＣ１５及びＭＥＣ３６と名づけた。
ハイブリドーマの１つはアイソタイプＩｇＭ、ｋのハイブリドーマＭＥＣ１１であった。
ハイブリドーマ細胞クローンは、血清の非存在下、培地中で培養し、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ（スウェーデン・ウプサラ）販売のプロテインＧ−セファロースカラム上でのクロマトグラフィーによって、抗ＥＳＭ−１抗体を精製した。
【００６２】
実施例４
ポリペプチドタイプのタンパク質ＥＳＭ−１アンタゴニスト化合物の調製
製造者の推奨にしたがって用いる、部位特異的迅速突然変異誘発キットの参考資料を元に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ販売のキットを用いて、定方向突然変異誘発を行った。
簡単に説明すると、厳密に相補的な配列の順方向及び逆方向プライマー対であって、突然変異アミノ酸（類）をコードするヌクレオチド、又は相補的ヌクレオチドを含んでなり、これらのヌクレオチドがプライマー配列の中央に位置し、プライマーがまた、中央ヌクレオチドの５’及び３’側両方に、増幅しようとする配列に相補的な、約１０から１５の連続ヌクレオチドも含んでなる、前記プライマーを合成した。
ＰＣＲによる増幅後、突然変異タンパク質ＥＳＭ−１をコードする増幅ポリヌクレオチドをベクターｐＣＤＮＡ３に挿入した。
プライマーの以下の対、各々を用いた：
ａ）タンパク質ＥＳＭ−１  Ｆ１１５Ａ用
順方向プライマー：５’−ＧＣＣ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＣＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＣＡＧ−３’（配列番号３）
逆方向プライマー：５’−ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＣＧＧ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧＣ−３’（配列番号４）
ｂ）タンパク質ＥＳＭ−１  Ｆ１１６Ａ用
順方向プライマー：５’−ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＣＣＣ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＣＣＡ  ＡＴＡ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＡＡＣ  Ｃ−３’（配列番号５）
逆方向プライマー：５’−ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＣＧＣ  ＧＡＡ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＧＴ  Ｇ−３’（配列番号６）
ｃ）タンパク質ＥＳＭ−１  Ｆ１１５  Ｆ１１６Ａ用
順方向プライマー：５’−ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＡＴＴ  ＣＣＣ  ＣＧＣ  ＣＧＣ  ＣＣＡ  ＡＴＡ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＡＡＣ  Ｃ−３’（配列番号７）
逆方向プライマー：５’−ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  Ｇ−３’−（配列番号８）
【００６３】
実施例５
グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１の腫瘍発生活性
Ａ．材料及び方法
Ａ．１．  細胞株：ＨＥＫ  Ｔ、ＨＥＫ  ＥＳＭ／ＷＴ、ＨＥＫ  ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ、ＨＥＫ  ＥＳＭ／６９、ＨＥＫ  ＥＳＭ／７１、ＨＥＫ  ＥＳＭ／７３
ＥＳＭ−１の野生型（ＥＳＭ／ＷＴ）をコードするｃＤＮＡで安定に形質移入した細胞株ＨＥＫ  ＥＳＭ／ＷＴを用いた。４つの他の細胞株は、野生型の定方向突然変異誘発によって得たＥＳＭ−１の精製形態をコードするｃＤＮＡで形質移入することによって得た。ＨＥＫ  ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａと称する、これらの最初のものは、Ｏ−グリコシル化の主要部位であるセリン１３７がアラニンで交換されている、突然変異体非グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１を発現した。３つの他の株は、タンパク質部分が突然変異しているＥＳＭ−１のグリコシル化型を発現した。これらは、株ＨＥＫ  ＥＳＭ／Ｆ１１５Ａ（１３４位でフェニルアラニンを交換）、ＨＥＫ  ＥＳＭ／７１（１３５位でフェニルアラニンを交換）及びＨＥＫ  ＥＳＭ／Ｆ１１５Ａ、Ｆ１１６Ａ（１３４−１３５位の二重欠失／交換）であった。
こうして、ＥＳＭ−１の異なる型を産生する６つの細胞株を用いた：
−コントロールＨＥＫ、ＥＳＭ−１を分泌しない；
−ＥＳＭ−１の野生型：ＨＥＫ  ＥＳＭ／ＷＴ；
−ＥＳＭ−１の脱グリコシル化型：ＨＥＫ  ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ；
−タンパク質部分が１１５−１１６領域で突然変異しているグリコシル化型：ＨＥＫ−ＥＳＭ／６９、ＨＥＫ−ＥＳＭ／７１、ＨＥＫ  ＥＳＭ／７３。
【００６４】
Ａ２．  異種間腫瘍のマウスモデル
用いたマウスはＳＣＩＤ型（重症複合免疫不全）のものであった。これらは、より正確には、リールのパスツール研究所の動物施設に供給されるマウス、Ｃ．Ｂ．１７  Ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄであった。これらのマウスは、組換え系に劣性常染色体突然変異を有した（Ｂｌｕｎｔ、１９９５）。この突然変異は、非機能的免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴｃＲ）及びＢ  ５ＢｃＲの産生を引き起こす。その結果、これらは機能するＴ及びＢリンパ球を持たない；したがって、これらのマウスは非自己を許容し、そして異種間腫瘍の発達に選択されるモデルを代表する。用いたＳＣＩＤマウスは、３から５週齢の若いオスマウスであった。これらの各々に関して、抗アシアロＧＭ−１抗体の腹腔内注射（２００μｌのＲＰＭＩで希釈したものをマウスあたり１００μｇ）は、異なる細胞株の注射２４時間前に行った。これらは、ＮＫ細胞に発現されるアシアロＧＭ−１抗原に対して特異的に向けられる、ウサギポリクローナル抗体（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ）であった。先の検討によって、これらの抗体をマウスモデルで使用すると、ＮＫ細胞の細胞傷害性効果が中和され、そして腫瘍移植が促進されることが示されている（ＭａｔｈｅｒＧｅｔａｌ（１９９４））。
その後、エーテル麻酔したマウス４バッチ（グループあたり１０から１５匹のマウス）の背中に、皮下注射した。各マウスに、２００μｌのＲＰＭＩに希釈した１００万の細胞を投与した。これらの細胞の注射は、実験の最初の日を定義した（Ｄ０）。各マウスに関して、ありうる腫瘍の外見を観察するための注射点の巨視的検査と共に、体重測定を毎週行った。ＥＬＩＳＡ試験（ＢＥＣＨＡＲＤ  Ｄら、２０００）によってＥＳＭ−１の血清レベルを決定するため、５週目以降、血液試料（マウスあたり約５００μｌ）を毎週採取した。解剖病理学的検査を各マウスに行った。
【００６５】
Ｂ．結果
Ｂ．１．  グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１によるマウスにおける腫瘍の誘発
ＨＥＫ細胞は、ＥＳＭ／ＷＴと称する、グリコシル化野生型タンパク質ＥＳＭ−１コードｃＤＮＡを含有する挿入物を持つベクターで形質移入した。ＨＥＫ細胞は、５週齢のＳＣＩＤマウスに皮下注射した。各マウスは、先に、抗アシアロＧＮ−１抗体を腹腔内注射で投与されていた。
形質移入ＨＥＫ細胞の注射８週後、マウスで観察される、１ｃｍ３より大きい体積を有する腫瘍の割合を解析した。
結果を図７に示す。
図７Ａでは、コントロールＨＥＫ細胞の注射が、マウスにおいて腫瘍出現を誘発しなかったことが観察可能である。対照的に、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１をコードするＤＮＡで形質移入したＨＥＫ細胞は、巨視的に可視である多くの腫瘍を誘発し、このうち約９５％が、１ｃｍ３より大きい腫瘍体積を有した。
図７Ｂは、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１をコードするＤＮＡで形質移入した形質移入ＨＥＫ細胞を投与しておいたマウスにおける、腫瘍出現の動態を例示する。ｃｍ３で表す平均腫瘍体積が、形質移入ＨＥＫ細胞注射４週後から連続して増加したことが観察可能である。
【００６６】
図７に提示する実験結果は、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１が腫瘍促進活性を有することを明らかに示す。
タンパク質ＥＳＭ−１の血清レベルもまた、コントロールＨＥＫ細胞を投与しておいたマウス及びタンパク質ＥＳＭ−１をコードするｃＤＮＡで形質移入したＨＥＫ細胞を投与しておいたマウスで測定した。
結果を図８に示す。
図８Ａに例示する結果は、タンパク質ＥＳＭ−１がコントロールＨＥＫ細胞を投与しておいたマウスの血清には見られなかったことを示す。対照的に、細胞注入８週後、タンパク質ＥＳＭ−１をコードするｃＤＮＡで形質移入したＨＥＫ細胞を投与しておいたマウスでは、ｍｌあたり４０から５０ナノグラムの血清レベルが見出された。
グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）を発現している形質移入ＨＥＫ細胞を投与しておいたマウスにおいて、ＥＳＭ−１の血清レベルの動態もまた、解析した。
結果を図８Ｂに示す。
タンパク質ＥＳＭ−１の検出可能量が細胞注射５週後からマウス血清に見られ、そして血清レベルが、細胞注射５週後から１２週後まで、迅速にそして連続して増加したことが観察可能である。
図８に例示する実験結果は、形質移入ＨＥＫ細胞を投与しておいたマウスで発達する腫瘍が、タンパク質ＥＳＭ−１を生じることを示す。さらに、循環中で産生されるタンパク質ＥＳＭ−１の量は、マウスにおける腫瘍発達の動態にしたがう。
【００６７】
実施例６
タンパク質ＥＳＭ−１の異なる型の腫瘍生成促進活性
Ａ．材料及び方法
この実施例で用いた材料及び方法は、実施例５に記載したものと同一である。
Ｂ．結果
ＨＥＫ細胞は、それぞれ、非グリコシル化野生型ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）、非グリコシル化型ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ）、並びに１３４位及び１３５位のフェニルアラニン残基で突然変異して、アラニン残基に交換されている、グリコシル化型ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／７３）をコードするＤＮＡ挿入物を所持するベクターによって形質移入した。５週齢であり、そして先に、抗アシアロＧＭ−１抗体を投与しておいたＳＣＩＤマウスに、異なる形質移入細胞を皮下注射した。
異なるバッチのマウスにおいて、１ｃｍ３より大きい腫瘍体積を有する、巨視的に可視である腫瘍の割合を解析した。結果を図９Ａに示す。
図９Ａの結果は、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１のみがマウスにおいて腫瘍を誘発可能であることを示す。非グリコシル化ＥＳＭ−１、又は１３４位及び１３５位のフェニルアラニン残基で突然変異したグリコシル化ＥＳＭ−１のいずれも、ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍発達を誘発しなかった。
異なるバッチのマウスにおいて、循環中のタンパク質ＥＳＭ−１の血清レベルもまた測定した。結果を図９Ｂに示す。
【００６８】
図９Ｂの結果は、細胞注射８週後、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）を発現しているＨＥＫ細胞を投与しておいたマウスでのみ、検出可能なレベルの血清タンパク質ＥＳＭ−１が測定可能であったことを示す。
非グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ）を発現している細胞を注射したマウス、又はグリコシル化及び突然変異タンパク質ＥＳＭ−１であるＨＥＫ−ＥＳＭ／Ｆ１１５Ａ、Ｆ１１６Ａを投与しておいたマウスのいずれも、タンパク質ＥＳＭ−１を産生しなかった。
この実施例に示す全体の結果は、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１の腫瘍生成促進活性を確認する。
結果はまた、タンパク質ＥＳＭ−１の非グリコシル化型又はタンパク質ＥＳＭ−１の突然変異型が、このタンパク質のアンタゴニストとして挙動し、そして癌性病理に関して予防的及び／又は治癒的能力を持つことが可能であることも示す。
【００６９】
実施例７
異なる発達段階の気管支−肺癌を患う患者における循環タンパク質ＥＳＭ−１の測定
Ａ．材料及び方法
免疫検出試験は、一般的な特徴が、ＢＥＣＨＡＲＤｅｔａｌ（２０００）に記載されるものと同一である「サンドイッチ」型の免疫酵素試験からなった。
ハイブリドーマ株ＭＥＰ１４（ＣＮＣＭ第Ｉ−１９４２号）に産生される抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体は、炭酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ９．５中、５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、そして９６ウェルプレート上に、＋４℃で一晩吸着させた（プレートＥ．Ｉ．Ａ．／Ｒ．Ｉ．Ａ．、Ｃｏｓｔａｒ、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。
プレートは、２００μｌ／ウェルの体積の、０．１％ウシ血清アルブミン及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ緩衝液を用いて、実験室温度で１時間飽和させ、その後、ＥＬＩＳＡ緩衝液（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を補った上記ＰＢＳ緩衝液）で２回洗浄した。
較正は、ＢＥＣＨＡＲＤら（２０００）に記載される技術にしたがって精製したタンパク質ＥＳＭ−１で行った。
【００７０】
血液試料は、ＥＬＩＳＡ緩衝液中で連続希釈し（１：２から１：１２８）、そしてＥＬＩＳＡプレート上、実験室温度で１時間インキュベーションした。
ウェルは、ＥＬＩＳＡ緩衝液で３回洗浄し、その後、ウェルあたり１００μｌの緩衝液中、０．１μｇ／ｍｌの濃度の、ＥＳＭ−１に対して向けられる二次モノクローナル抗体、抗体ＭＥＣ１５（ＣＮＣＭ第Ｉ−２５７２号）と、実験室温度で１時間インキュベーションした。
３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡ緩衝液中で希釈した、マウスＩｇＧ１に対して向けられるビオチン化ラットモノクローナル抗体（ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮ販売）を添加し、そして放置して、この二次抗体と１時間インキュベーションした。
ＥＬＩＳＡ緩衝液中で３回洗浄した後、ウェルを、１：１０．０００ｖ／ｖの希釈でストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ・コンジュゲート（ＺＹＭＥＤ販売）とインキュベーションした。
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ・コンジュゲートとのインキュベーション３０分後、各ウェルをＥＬＩＳＡ緩衝液で３回洗浄し、その後、ＰＢＳ緩衝液中で２回洗浄した。
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ・コンジュゲートは、２５５μｌのＨ２Ｏ２の存在下、Ｓｉｇｍａ（米国ミズーリ州セントルイス）販売の基質ＴＭＢで３０秒間顕色した。
顕色反応は、１００μｌ体積の２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止した。
プレートは、４０５ナノメートルの波長で分光光度計（ａｎｔｈｏｓｌａｂｔｅｃＬＰ４０，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて読み取った。
タンパク質ＥＳＭ−１の血漿又は血清濃度は、光学密度測定値から計算し、そしてｍｌあたりのナノグラムとして表した。
【００７１】
Ｂ．結果
以下に定義する国際分類ＴＮＭにしたがった、異なる発達段階、それぞれＩ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ及びＩＶ期の気管支肺癌を患う、異なる患者の血清における循環タンパク質ＥＳＭ−１の濃度：
Ｔ＝腫瘍サイズ（Ｔ１：＜１ｃｍ；Ｔ２：１及び３ｃｍの間；Ｔ３：＞３ｃｍ）。
Ｎ＝神経節モジュール（侵襲されていなければＮＯ；侵襲されていればＮ１）。
Ｍ＝遠距離での転移（転移がなければＭＯ；転移があればＭ）。
Ｉ期の癌を患う患者は、１．４３±０．７６ナノグラム／ｍｌのタンパク質ＥＳＭ−１血清濃度を有した（ｎ＝３）。
ＩＩ期の気管支肺癌を患う患者は、０．７２±０．３９ナノグラム／ｍｌのタンパク質ＥＳＭ−１血清濃度を有した（ｎ＝３）。
ＩＩＩＡ期の気管支肺癌を患う患者は、０．９±０．５３ナノグラム／ｍｌの循環タンパク質ＥＳＭ−１濃度を有した（ｎ＝２）。
ＩＩＩＢ期の気管支肺癌を患う患者は、３．１±２．１７ナノグラム／ｍｌの循環タンパク質ＥＳＭ−１濃度を有した（ｎ＝３）。
ＩＶ期の気管支肺癌を患う患者は、３．１±１．９１ナノグラム／ｍｌの循環タンパク質ＥＳＭ−１濃度を有した（ｎ＝１１）。
上に示す結果は、タンパク質ＥＳＭ−１の血清レベルが、癌発達段階の関数として増加することを示す。こうして、患者における血液循環中のタンパク質ＥＳＭ−１の産生レベル及び癌の重症度の間に、明らかな相関が立証される。
【００７２】
実施例８
抗体タイプのＥＳＭ−１アンタゴニスト化合物の抗腫瘍活性
Ａ．材料及び方法
ＭＥＰ−０８モノクローナル抗体は、ＨＥＫ／ＥＳＭ−ＷＴ細胞の接種後、２回目から、４００μｇの用量で腹腔内注射した。注射は毎週１２週間繰り返した。コントロール抗体、ＭＥＰ−１４は、同一条件下で用いた。マウスは、腫瘍体積が６ｃｍ３より大きくなったとき屠殺した（各グループにｎ＞８のマウス）。図は、各グループで生存したマウスの割合を示す。
Ｂ．結果
１１５位のフェニルアラニンが、腫瘍発達に必要となる範囲内で、該残基は新規療法標的を含んでなる。このため、第Ｉ−１９４１号でＣＮＣＭに寄託されるハイブリドーマ株ＭＥＰ−０８に産生され、この領域に対して特異的に向けられる、抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体ＭＥＰ−０８を産生し、そしてＨＥＫ−ＥＳＭ／ＷＴマウスのグループに注射した。目的は、腫瘍発達におけるＥＳＭ−１のペプチドの役割を検討し、そしてありうる療法効果を評価することであった。抗体のＦｃ断片に依存する抗腫瘍効果（ＡＤＣＣの反応）を除去するため、同一アイソタイプであるが、異なるエピトープを認識するコントロール抗体を、平行して、そして同一条件下で用いた。
図１０は、ＭＥＰ−０８抗体の初期注射が、６０％近くまで、マウスの生存を有意に増加させたが、ＭＥＰ−１４抗体がまったく影響を持たなかったことを示す。これらの最初の結果は、これが１１５位のフェニルアラニンに対して特異的に向けられる抗体のＦａｂ断片に関連する特異的作用であることを示し、そして腫瘍増殖における該ペプチドの関与を確認する。驚くべきことに、生存に対するこの効果は、抗体を後に投与した際には減少することが観察される。
注射開始が何週目であっても、抗体は、腫瘍増殖を遅延又は予防可能である。この抗腫瘍効果は、抗体をより早く用いた場合は、より顕著でありつづける。
【００７３】
参考文献
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・ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤＲＢ１９６５ｂＳｃｉｅｎｃｅ，Ｖ０１．１５０（６９３：１７８―１８５）．
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・ＮＡＲＡＮＧＳＡ，ＨＳＩＵＮＧＨＮ，ＢＲＯＵＳＳＥＡＵＲ，ｅｔａｌ．１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓｅｎｚｙｍｏｌ，ｖｏｌ．６８，９０―９８．
・ＮＡＴＡＬＩＰＧｅｔａｌ．，１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．６９：２１２―２１７．
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・ＲＡＨＩＭＩＮｅｔａｌ．（１９９８），Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７３：３３．７１４―３３．７２１．
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【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、ウェスタンブロット免疫ブロッティングゲル及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のＥＳＭ−１の呈色を示している。
各々の免疫ブロッティングゲルは、抗ＥＳＭ−１モノクローナル抗体ＭＥＰ１４で明らかにされた。ホースラーディシュペルオキシダーゼで標識された第二抗マウス抗体は、親和性によって精製され、単独で用いられた時には陰性結果を与えた。
図１Ａ．このタンパク質を発現する異なる細胞タイプからのタンパク質ＥＳＭ−１の免疫ブロッティングゲル  細胞培地上澄み液ＳＶＩ（１）、２９３−ＥＳＭ（２）及びＣＨＯ−ＥＳＭ（３）からのＥＳＭ−１の免疫沈降が、これが示されるときには抗体ＭＥＰ１９で行われ、さもなくばコントロール抗体で行われた。矢印はＥＳＭ−１に特異的なバンドを示している。ＥＳＭ−１の天然形態は、５０ｋＤａ周辺の拡散したバンドによって表されている。
図１Ｂ．クーマシーブルーでの精製タンパク質ＥＳＭ−１の検出の不存在  ＳＶＩ細胞から精製された５μｇのタンパク質ＥＳＭ−１がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１５％で充填され、その分子のペプチド部分を検出するためにクーマシーブルーで呈色された。矢印は、ＥＳＭ−１の検出の不存在を示している。
図１Ｃ．アルシアンブルーでの精製タンパク質ＥＳＭ−１の検出  ＳＶＩ細胞から精製された５μｇのタンパク質ＥＳＭ−１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１５％で充填され、その分子のグリカン部分を検出するためにアルシアンブルーで明らかにされた。矢印は、タンパク質ＥＳＭ−１を示している。
【図２】図２は、ＥＳＭ−１のペプチド及びグリカン部分の見かけ分子量を示している。
図２Ａ．Ｏ−グリコシル化の固定の部位の突然変異による分析  ２つの予測されるＯ−グリコシル化部位（トレオニン１２０及びセリン１３７）が定方向突然変異誘発によりアラニン残基によって置換された。野生型タンパク質ＥＳＭ−１（ＷＴ）、ＥＳＭ−１  Ｔ１２０Ａ及びＳ１３７Ａ突然変異体、及び陰性コントロール（ＭＯＣＫ）が２９３細胞中に形質移入され、そしてその細胞培地上澄み液及び細胞溶解産物が、モノクローナル抗体ＭＥＰ１４を使用する免疫ブロッティング（ウェスタンブロット）によって分析された。矢印は、特異的なバンドを示している。
図２Ｂ．ＥＳＭ−１のプロテイナーゼＫでの処理の効果  ＳＶＩ（１）及び２９３−ＥＳＭ細胞（２）から精製されたタンパク質ＥＳＭ−１は、プロテイナーゼＫによって消化され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１５％で充填された。上方の矢印は野生型の未処理タンパク質ＥＳＭ−１を示し、下方の矢印はプロテイナーゼＫによって消化されたタンパク質ＥＳＭ−１を示している。
【図３】図３は、特異的なコンドロイチナーゼのＥＳＭ−１への効果を示している。
図３Ａ．精製野生型タンパク質ＥＳＭ−１のコンドロイチナーゼＡＢＣでの処理  分泌されたタンパク質ＥＳＭ−１は、ＳＶＩ（１）、２９３−ＥＳＭ（２）の細胞培地上澄み液、及びヒト血漿（３）から、イオン交換クロマトフラフィー、それに続く免疫親和性クロマトフラフィーによって精製され、次いで、コンドロイチナーゼＡＢＣによって消化されるか、又はされなかった。５０ｎｇの消化されたタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１５％で充填され、次いで、免疫ブロッティング（ウェスタンブロット）によって分析された。上方の矢印はＥＳＭ−１の未消化形態を示し、下方の矢印はＥＳＭ−１の消化形態を示している。
図３Ｂ．精製された野生型タンパク質ＥＳＭ−１のコンドロイチナーゼＢでの処理  ＳＶＩ（１）及び２９３−ＥＳＭ細胞（２）の細胞培地上澄み液から精製されたタンパク質ＥＳＭ−１がコンドロイチナーゼによって消化されるか、又はされなかった。そのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１５％で充填された。上方の矢印は５０ｋＤａ周辺の異なる未消化形態のＥＳＭ−１を示し、下方の矢印は２２ｋＤａ周辺の異なる形態の消化されたＥＳＭ−１を示している。
図３Ｃ．精製された野生型タンパク質ＥＳＭ−１のコンドロイチナーゼＡＣでの処理  ＨＵＶＥＣ（１）及び２９３−ＥＳＭ細胞（２）の細胞培地上澄み液から精製されたタンパク質ＥＳＭ−１がコンドロイチナーゼＡＣによって消化され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１５％で充填された。上方の矢印は５０２ｋＤａ周辺の異なる未消化形態のＥＳＭ−１を示し、下方の矢印は２２ｋＤａ周辺の異なる形態の消化されたＥＳＭ−１を示している。
図３Ｄ．精製された野生型タンパク質ＥＳＭ−１のコンドロイチナーゼＣでの処理  ＨＵＶＥＣ（１）及び２９３−ＥＳＭ細胞（２）の細胞培地上澄み液から精製されたタンパク質ＥＳＭ−１がコンドロイチナーゼＣによって消化されるか又はされないで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に１５％で充填された。上方の矢印は、５０ｋＤａ周辺の異なる未消化形態のＥＳＭ−１を示し、下方の矢印は２２ｋＤａ周辺の異なる形態の消化されたＥＳＭ−１を示している。
【図４】図４は、精製された野生型タンパク質ＥＳＭ−１の、トロンビン存在下での凝固時間への効果を示している。トロンビン産生の遅延及び減少がヘパリン添加された血漿において見られ、そして他の４つの曲線（血小板又はＰＲＰに富む血漿：白抜きの菱形；血小板に富む血漿＋０．２ｍｇ／ｍｌのＥＳＭ−１：黒塗りの四角；血小板に富む血漿＋０．５ｍｇ／ｍｌのＥＳＭ−１：黒塗りの三角；血小板に富む血漿＋１ｍｇ／ｍｌのＥＳＭ−１：黒塗りの丸；血小板に富む血漿＋ヘパリン：白抜きの丸）においても見られる。
【図５】図５は、因子ＨＧＦ／ＳＦによって誘発された２９３細胞の増殖へのプレテオグリカンＥＳＭ−１の生物学的活性を示している。２９３細胞による因子ＨＧＦ／ＳＦによって誘発される３Ｈ−チミジンの取り込みの刺激が検討された。細胞は、ＤＭＥＭ培地中にウェルあたり１×１０４個まかれて、トランスフェリンとインスリンと５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦが追加され、その後に異なる分子が添加された。棒グラフは、示された添加物の、血清、２．５ｍｇ／ｍｌの異なる形態のＥＳＭ−１及び２．５ｍｇ／ｍｌのデコリンの存在下での、３Ｈ−チミジン取り込みにおける％増加率（代表的実験の三重試料の平均値±標準偏差）を表している。ＨＧＦ／ＳＦの存在下での３Ｈ−チミジン取り込みのバックグラウンドノイズレベルは、一般にウェルあたり７，０００〜８，０００ｃｐｍであった。表されている結果は、他の３つの異なる実験において得られたものと類似している。
【図６】図６は、因子ＨＧＦ／ＳＦによって誘発された分裂促進活性への、異なる形態のＥＳＭ−１及びデコリンの１２の反応の検討を示す。２９３細胞によるＤＮＡ合成の刺激は、５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ／ＳＦ単独の存在下、又は、異なる濃度の野生型タンパク質ＥＳＭ−１／ＷＴ（白抜きの四角）、突然変異非グリコシル化タンパク質ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ（黒塗りの丸）、タンパク質ＥＳＭ／ＷＴから誘導されたＧＡＧ鎖（黒塗りの四角）又はデコリン（白塗りの丸）の存在下で検討された。３つの独立した実験の内の１つの実験において得られた３Ｈ−チミジン取り込みの三重測定の平均値が、図６に示されている。その結果はｃｐｍで表現されている。標準偏差はおよそ１０％であった。
【図７】図７は、タンパク質ＥＳＭ−１の腫瘍発生力を示している。２バッチの１０を上回るマウスが、コントロールＨＥＫ細胞若しくは野生型タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）のｃＤＮＡをコードするベクターで形質移入された細胞を入れられた。図７Ａ上には、８週目に注射点において顕微鏡で見ることができ、かつその腫瘍容量が１ｃｍ３を上回った腫瘍のパーセンテージが、縦座標として示されている。図７Ｂは、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）を発現する形質移入ＨＥＫが入れられたマウスにおける腫瘍の出現の動態を示す。細胞の注射後の週の数が、横座標上に示されている。
【図８】図８は、マウスにおいて誘発された腫瘍によるＥＳＭ−１の産生を示している。
図８Ａは、細胞の注射後８週目において２バッチのマウス中に見出されたタンパク質ＥＳＭ−１の血清レベルを表している。横座標は、コントロールＨＥＫ細胞を入れられたマウスのバッチ及びグリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）を発現するＨＥＫ細胞を入れられたマウスのバッチをそれぞれ示している。ｎｇ／ｍｌで表現された、見出されたＥＳＭ−１の血清レベルが、縦座標上に示されている。
図８Ｂは、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）をコードするＤＮＡで形質移入されたＨＥＫ細胞を入れられたバッチのマウスについての、ＥＬＩＳＡによって測定されたＥＳＭ−１の血清レベルの動態を示している。横座標は、形質移入された細胞の注射の後の週の数を示している。ｎｇ／ｍｌで表現されたタンパク質ＥＳＭ−１の血清レベルが、縦座標上に示されている。
【図９】図９は、異なる形態のタンパク質ＥＳＭ−１の腫瘍発生活性を示している。
図９Ａは、異なるバッチのマウス、即ち、コントロールＨＥＫ細胞、グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／ＷＴ）をコードするｃＤＮＡで形質移入されたＨＥＫ細胞、非グリコシル化タンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／Ｓ１３７Ａ）で形質移入された細胞、及び位置１３４及び１３５において置き換えられたタンパク質ＥＳＭ−１（ＥＳＭ／Ｆ１１５Ａ，Ｆ１１６Ａ）をコードするｃＤＮＡで形質移入されたＨＥＫ細胞をそれぞれに入れられたマウスにおける腫瘍の出現を示す。縦座標は、８週目に注射点において顕微鏡で見ることができ、かつその腫瘍容量が１ｃｍ３を上回った腫瘍のパーセンテージを示している。
図９Ｂは、異なる同一バッチのマウスにおけるＥＳＭ−１の血清レベルを示している。ｎｇ／ｍｌで表現されたＥＳＭ−１の血清レベルが縦座標上に示されている。
【図１０】図１０は、タンパク質ＥＳＭ−１の前腫瘍活性へのモノクローナル抗体ＭＥＰ０８の阻害作用を示している。
ＭＥＰ−０８抗体の注射は、ＨＥＫ  ＥＳＭ／ＷＴグループからのマウスの生存率を増大させた。モノクローナル抗体ＭＥＰ−０８は、ＨＥＫ／ＥＳＭ−ＷＴ細胞の接種の後の２回目から、４００μｇの量で腹腔内注射された。その注射は、１２週間毎週繰り返された。コントロール抗体、即ち、ＭＥＰ−１４が同じ条件下で用いられた。マウスはそれらの腫瘍容量が６ｃｍ３を上回った時に犠牲にされた（各々のグループにおいてｎ＞８のマウス）。図は、各々のグループにおける生存しているマウスのパーセンテージを示している。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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