(57)【要約】本発明は、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤の同定、このような同定に有用な分析および方法、ならびに、アルツハイマー病を治療するための医薬を製造するためのＳｒｃ阻害剤の使用に関する。
2006503570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Ｓｒｃタンパク質を用意する工程、および、
ｂ）Ｓｒｃ活性に対する化合物の阻害作用を測定する工程を含む、
アルツハイマー病を治療するための治療化合物を同定する方法。
【請求項２】
ａ）Ｓｒｃ発現を調節する配列を用意する工程、および、
ｂ）化合物が、Ｓｒｃタンパク質の発現を阻害するかどうかを測定する工程を含む、
アルツハイマー病を治療するための治療化合物を同定する方法。
【請求項３】
Ｓｒｃは、ヒトＳｒｃまたはマウスＳｒｃである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｓｒｃは、配列番号１、配列番号２または配列番号３の配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｓｒｃは、哺乳動物細胞で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
調節配列は、Ｓｒｃプロモーターである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法を用いることによって治療化合物を同定する工程；
ｂ）同定された化合物を最適化する工程；および、
ｃ）最適化された化合物を製剤化する工程、
を含む、アルツハイマー病を治療するための医薬の製造方法。
【請求項８】
アルツハイマー病を治療するための医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項９】
医薬として使用するためのＰＰ２。
【請求項１０】
アルツハイマー病を治療するための医薬を製造するためのＰＰ２の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｒｃキナーゼの阻害剤の同定、このような同定に有用な分析および方法、ならびに、アルツハイマー病を治療するための医薬を製造するためのＳｒｃ阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、細胞レベルで、大脳辺縁系および大脳皮質でニューロンが大量に損失することに伴う脳の神経変性疾患である。罹患した脳領域において、タンパク質の沈着、いわゆる斑（ｐｌａｑｕｅｓ）を分子レベルで検出することができ、これは、アルツハイマー病の本質的な特徴である。これら斑に最も多く存在するタンパク質は、Ａβ−ペプチドという４０〜４２個のアミノ酸からなるペプチドである。このペプチドは、６９５〜７７０個のアミノ酸からなるより大きいタンパク質、いわゆるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の分解産物である。
【０００３】
ＡＰＰは、まず脂質二重層を貫通する内在性膜貫通タンパク質である。このタンパク質の圧倒的に大きな部分は細胞外に存在し、一方で、より短いＣ末端ドメインは細胞質ゾルに向かっている（図１）。ＡＰＰは３つの異なるプロテアーゼ、すなわちα−セクレターゼ、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼの基質である。ＡＰＰ内で、Ａβ−ペプチドの約３分の２は細胞外ドメイン由来であり、約３分の１は膜貫通ドメイン由来である。
【０００４】
膜結合ＡＰＰ以外に、ＡＰＰの大きい外側のドメインからなるＡＰＰの分泌型を検出することが可能であり、これは、ＡＰＰsec（「分泌型ＡＰＰ」）という。ＡＰＰsecは、α−セクレターゼの作用によるタンパク質分解によってＡＰＰから形成される（図２）。このタンパク質分解は、Ａβ−ペプチドのアミノ酸配列中で起こる（Ａβ−ペプチドのアミノ酸残基１６の後で）。従って、α−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解は、Ａβ−ペプチドを形成させない。
【０００５】
従って、Ａβ−ペプチドは、ＡＰＰから代替のプロセシング経路でのみ形成可能である。２種のプロテアーゼがこのプロセシングに関与し、すなわち、一方のプロテアーゼ（β−セクレターゼという）がＡＰＰのＡβ−ペプチドのＮ末端で切断を行い、第二のプロテアーゼ（γ−セクレターゼという）がＡβ−ペプチドのＣ末端を切り離すと仮定されている（Ｋａｎｇ，Ｊ．等（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ，３２５，７３３（図２））。
【０００６】
Ａβ−ペプチドがアルツハイマー病の発症に重要な因子であるという多くの指摘がある。特に、細胞培養におけるＡβ−原線維（Ａβ−fibrils）の神経毒性が提唱されている（Ｙａｎｋｎｅｒ，Ｂ．Ａ．等（１９９０年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８７，９０２０）。追加の遺伝子コピー中でＡＰＰが生じているダウン症候群の患者においては、アルツハイマー病の神経病理学的な特徴もまた３０歳でも生じる。ここで、ＡＰＰが過剰発現された後に、高いＡβ−ペプチドへの転換が起こると推測される（Ｒｕｍｂｌｅ，Ｂ．等（１９８９年），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２０，１４４６）。
【０００７】
その上、アルツハイマー病におけるＡβ−ペプチドの中心的な役割の最も強い指摘は、家族性の形態の病気であることである。ここで、ＡＰＰ遺伝子のセクレターゼ切断部位領域周辺に、または、２つの他のＡＤ関連遺伝子（プレセニリン）に突然変異が見出されており、これら変異は、細胞培養において、Ａβ生産の顕著な増加をもたらす（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ．Ｄ．等（１９９６年），Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２，８６４）。
【０００８】
まず、ＡＰＰはβ−セクレターゼで切断され、その後、γ−セクレターゼの基質として供されるという多数の指摘がある（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．Ｙ．等（１９９４年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０２，１５１７；Ｅｓｔｕｓ，Ｓ．等（１９９２年），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５５，７２６）。従って、γ−セクレターゼは、Ａβ−ペプチドの形成において重要な役割を有する。習慣的に用いられているγ−セクレターゼ活性の証明は、Ａβ−ペプチドを検出することであるが、しかしながら、しばしば困難であることがわかっている。
【０００９】
その重要な理由は、ほんのわずかなＡＰＰしかＡβ−ペプチドに変換されないことである（Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍ，等，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９６年）１；１６（３）：８９９〜９０８）。その上、Ａβ−ペプチドは、約４ｋＤａの小さい切断フラグメントであり、さらに、その疎水性の特徴により自己凝集する傾向が高く、そのため生理学的条件下で簡単に沈殿してしまう（Ｈｉｌｂｉｃｈ．Ｃ．等（１９９１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１８，１４９）。
【００１０】
短い４７個のアミノ酸からなるＡＰＰのＣ末端テールは、サイトゾルに晒されており、ＰＴＢドメインを含む分子アダプター（Ｆｅ６５、Ｘ１１、ｍ−ｄａｂおよびＪｉｐ１という）との相互作用部位である。これらタンパク質の結合は、ＡＰＰ上のＹＥＮＰＴＹ配列に依存するため、それらの相互作用は同時ではないと考えられている（Ｔ．Ｒｕｓｓｏ等（１９９８年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３４，１〜７；Ｎ．Ｚａｍｂｒａｎｏ等（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，６３９９〜６４０５）。実際に、培養された細胞において、Ｆｅ６５およびＸ１１タンパク質は、ＡＰＰのタンパク質分解プロセシングに逆の作用を有することが示されている（Ｓａｂｏ  Ｓ．等（１９９９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７９５２〜７９５７；Ｂｏｒｇ  Ｊ．Ｐ．等（１９９８年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１４７６１〜１４７６６）。これらの発見への可能な解釈は、異なる組み合わせのタンパク質と、２つのアダプターの他のタンパク質−タンパク質相互作用ドメインとの相互作用に依存する、異なる高分子複合体で、Ｆｅ６５またはＸ１１のいずれかによるＡＰＰのリクルートメントにあるといえる。
【００１１】
ＡＰＰ細胞質ドメインは、様々なセリンおよびスレオニン残基を含み、これらは、インビトロで異なるキナーゼ活性によってリン酸化される。Ｔｈｒ６６８は、インビボにおいてリン酸化の主要な部位であり、ニューロンにおけるニューロン性のサイクリン依存性キナーゼ、Ｃｄｋ５（Ｉｉｊｉｍａ，Ｋ．等（２０００年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５，１０８５〜１０９１）、分裂する細胞におけるｃｄｃ２キナーゼ（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．等（１９９４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３，１１１４〜１１２２；Ｏｉｓｈｉ，Ｍ．等（１９９７年）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３，１１１〜１２３）、ならびに、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ｂ（ＧＳＫ３ｂ）、および、インビトロでのストレス活性化タンパク質キナーゼ１ｂ（ＳＡＰキナーゼ１ｂ）（Ａｐｌｉｎ，Ｅ．Ｅ．等（１９９６年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７，６９９〜７０７；Ｓｔａｎｄｅｎ，Ｃ．Ｌ．等（２００１年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７６，３１６〜３２０）によってリン酸化される。ＡＰＰのリン酸化は、分化するＰＣ−１２細胞で（Ａｎｄｏ，Ｋ．等（１９９９年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，４４２１〜４４２７）、神経突起の伸長を調節することが示されており、同時に分子レベルで、ＡＰＰのリン酸化は、ＰＴＢドメインを含むアダプターへの結合、および、そのプロセシングを調節する可能性もある（Ａｎｄｏ  Ｋ．等（２００１年）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４０３５３〜４０３６１）。
【００１２】
これまでに、ＡＰＰは、Ａｂｌ非受容体型チロシンキナーゼの活性型を発現する細胞において、チロシン６８２でリン酸化されることが実証されていた（Ｚａｍｂｒａｎｏ  Ｎ．等（２００１年）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１９７８７〜９２）；活性Ａｂｌは、ＡＰＰ近隣でＦｅ６５によってリクルートされ、これら２種のタンパク質にそのＷＷドメイン（Ａｂｌ）、および、ＰＴＢ２ドメイン（ＡＰＰ）を介して同時に結合する。ＡＰＰのＴｙｒ−６８２のリン酸化により、ＡｂｌのＳＨ２ドメインのためのドッキング部位が生成し、実際に、ＡＰＰとＡｂｌとの安定な複合体が形成される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
チロシンのリン酸化が、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃの生物学的活性を調節するという仮説を試験するために、ＫｍｉｅｃｉｋおよびＳｈａｌｌｏｗａｙ（１９８７年）Ｃｅｌｌ  ４９，６５〜７３では、Ｔｙｒ５２７とＴｙｒ４１６が別々に、または、同時に、フェニルアラニンに改変されたｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ突然変異体の構築と研究が記載されていた。Ｔｙｒ−Ｐｈｅ５２７突然変異は、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃの形質転換とキナーゼ活性を強く活性化するが、それに対して、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ４１６突然変異を追加で導入すると、これらの活性は抑制された。正常なｐｐ６０ｃ−ｓｒｃのＴｙｒ−Ｐｈｅ４１６突然変異は、その部分的な形質転換活性を除去したが、これは、インビボで安定なリン酸化は観察されなかったとしても、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃの機能には、一時的な、または、その他の制限されたＴｙｒ４１６のリン酸化が重要であることを示す。通常、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃは、インビボで、ｐｐ６０ｖ−ｓｒｃ（その形質転換相同体）では存在しない残基であるチロシン５２７でリン酸化され、インビトロでの自己リン酸化部位であるチロシン４１６ではリン酸化されない。
【００１４】
Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ等（２００２年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２２，１０〜２０）は、Ｔａｕや焦点接着キナーゼ（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ）などのニューロン性タンパク質の、アミロイド−βペプチドへの接触に応じた速いリン酸化、および、Ｓｒｃファミリータンパク質キナーゼの関与を記載した。
【００１５】
Ｓｌａｃｋ，Ｂ．Ｅ．およびＢｅｒｓｅ；Ｂ．（１９９８年）は、ニューロサイエンス学会アブストラクト（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ），２４巻，１〜２号，２０８頁（Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ／Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：第２８回ニューロサイエンス会議（２８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ），第１部，ロサンゼルス，カリフォルニア州，米国，１９９８年１１月７〜１２日，ニューロサイエンス学会（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ），ＩＳＳＮ：０１９０〜５２９５）で、ムスカリン様ｍ３アセチルコリン受容体の作用によるＡＰＰ放出の促進におけるチロシンキナーゼの役割を記載した。彼等は、ムスカリン様受容体によるＡＰＰsec放出の調節におけるＳｒｃチロシンキナーゼの役割を記載した。彼等は、Ｓｒｃ活性型の増加により、ｓｅｃＡＰＰが減少することを実証した。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、アルツハイマー病を治療するための治療剤を同定する方法を提供する。
【００１７】
本発明の一実施形態は、Ｓｒｃ活性阻害剤を同定する方法を提供し、本方法は、
ａ）Ｓｒｃタンパク質（すなわち、発現要素の制御下で、ＳｒｃをコードするＤＮＡ）を用意する工程、および、
ｂ）化合物が、Ｓｒｃの活性を阻害するかどうかを測定する工程、
を含む。
【００１８】
Ｓｒｃタンパク質は、あらゆる哺乳動物のＳｒｃタンパク質が可能であり、好ましくはヒトＳｒｃ（配列番号１（アイソフォーム１）、および、配列番号２（アイソフォーム２））、または、げっ歯動物のＳｒｃ（配列番号３）である。タンパク質は、ヒトＳｒｃまたはげっ歯動物ＳｒｃのｃＤＮＡを発現させることによって、例えば配列番号４または配列番号５の配列を用いることによって、得ることができる。加えて、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１７０３１またはＢＣ０１１５６６で寄託された配列の１つを用いてもよい。
【００１９】
本方法に関して、好ましくは、Ｓｒｃが自然にまたは、細胞／細胞系が遺伝子操作されているために発現されている哺乳動物細胞または細胞系が用いられる。特定の実施形態において、ニューロンの初代培養が用いられる。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、Ｓｒｃ発現を阻害する化合物を同定する方法に関する。本方法は、
ａ）Ｓｒｃ発現を調節する配列を用意する工程（すなわち、Ｓｒｃプロモーター配列）、および、
ｂ）化合物が、Ｓｒｃタンパク質の発現を阻害するかどうかを測定する工程、
を含む。
【００２１】
Ｓｒｃ発現を調節する配列は、好ましくは、レポーター遺伝子またはレポーター遺伝子コンストラクトに連結している。このようなレポーター遺伝子は、化合物がＳｒｃの発現を阻害するかどうかを測定するのに容易に用いることができる。その他に可能性があるのは、Ｓｒｃ遺伝子の使用である。Ｓｒｃ遺伝子を含む第２０染色体の領域は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＬ１３３２９３で寄託されている。
【００２２】
Ｓｒｃ発現を調節する配列として用いることができるハウスキーピングプロモーター、および、肝臓の核因子−１ａで調節される選択的（alternative）プロモーターが記載されている（Ｂｏｎｈａｍ等（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３７６０４）（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ２７２９８２）。
【００２３】
活性化合物、これは、Ｓｒｃ発現を阻害する、または、Ｓｒｃタンパク質活性を阻害する化合物を意味しており、医薬として用いることができる。このような化合物は、アルツハイマー病を治療または予防するための医薬を製造するために用いることができる。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、上述の方法のいずれか１つによって同定されたアルツハイマー病を治療するための医薬を製造するための化合物の使用に関する。
【００２５】
本発明はさらに、アルツハイマー病を治療するための医薬の製造方法に関し、
ａ）上述の方法のいずれか１つを用いることによって治療化合物を同定する工程；
ｂ）同定された化合物を最適化する工程；および、
ｃ）最適化された化合物を製剤化する工程、
を含む。
【００２６】
本発明の他の実施形態は、アルツハイマー病を治療または予防するための医薬を製造するための当業界既知のＳｒｃ阻害剤の使用に関する。本発明は、医薬としてのＰＰ２（４−アミノ−５−（４−クロロフェニル）−７−（ｔ−ブチル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）の使用に関する。本発明はさらに、アルツハイマー病を治療するための医薬を製造するためのＰＰ２の使用に関する。
【００２７】
本発明の他の実施形態は、アルツハイマー病を治療するための医薬を製造するためのＰＰ２の使用に関する。
【００２８】
新たな結果により、ＡＰＰは、Ａｂｌのみによってリン酸化されるのではないことが示される。実際には、Ｓｒｃキナーゼもまた、ＡＰＰのチロシンのリン酸化に関与する。Ａ
ＰＰのチロシンのリン酸化は、その細胞質ドメインの結合特性を変化させ、続いて、結果としてＡＰＰのプロセシングが改変され得ることが予測される。そうであれば、これは、現在利用可能なチロシンキナーゼ阻害剤の使用が有用であることを証明しており、アルツハイマー病の細胞モデルおよび動物モデルにおいてＡＰＰプロセシング産物の放出を薬理学的に調節するための新規の阻害剤を設計することができる。
【００２９】
総合すれば、以下の実施例の結果は、外因性のＳｒｃ活性が、経路の活性化に関与し、高いＡβ分泌をもたらすことができることを示す。これはまた、ＰＰ２は、ＡＤ状態に類似した細胞および動物系においてＡβ分泌を減少させることができる薬物として用いることができることを示す。
【００３０】
従って、安定してＡＰＰ７５１型を過剰発現するＣＨＯ細胞系（Ａβを別のレベルで分泌する）が用いられた。分泌が内因性のＳｒｃ活性に関連するのなら、ＰＰ２は、この細胞系においてもＡβ産生を阻害することができるはずである。これは、図６で示すように、試験された３時点で（１、３および１２時間）、ＰＰ２は用量依存性の様式でＡβの量を減少させるが、ＰＰ３は最高濃度で用いても効果がないことから、実際にいえることである。
【００３１】
これら実験は、Ａβ分泌におけるＳｒｃ活性化の関連性を明確に説明するものであり、ＡＤの治療におけるチロシンキナーゼ阻害剤の薬理学的用途を試すための基礎を構成する。このような阻害剤のスクリーニングおよびそれらの最適化は、可能性のある革新的なアルツハイマー病を治療するための治療剤の開発を可能にすると考えられる。
【実施例】
【００３２】
実施例１
細胞培養、トランスフェクションおよび処理
ヒト胎児腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３）を、１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変最小培地で、３７℃で、５％ＣＯ2雰囲気中で培養した。トランスフェクションのために、細胞を抗生物質非含有培地で１６時間成長させ、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で製造元の説明に従ってトランスフェクトした。ＤＮＡ総量を空のベクターＤＮＡを添加することによって一定に維持した。トランスフェクションの４８時間後、培地を回収し、同時に、細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で回収し、溶解用緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％トリトンＸ−１００，１０％グリセロール，５０ｍＭ  ＮａＦ，１ｍＭバナジウム酸Ｎａ）で、プロテアーゼ阻害剤カクテル（コンプリート，ＥＤＴＡフリー，ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））の存在下で、穏かに溶解した。抽出物を１６，０００×ｇ、４℃での遠心分離で透明化し、タンパク質濃度をバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質分析で製造元の指示書に従って測定した。代謝性標識するために、トランスフェクションの３６時間後、細胞をメチオニンおよびシステイン非含有培地で３０分間インキュベートし、次に、培地を、８０μＣｉ／ｍｌの35Ｓ−メチオニン／システイン混合物（プロミックス（Ｐｒｏｍｉｘ），１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ，アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を含む新鮮培地と交換した。３０分間パルスし、続いて、放射活性培地を完全培地で９０分間かけて交換した。野生型ＡＰＰ７５１を発現するＣＨＯ細胞は、Ｎ．Ｚａｍｂｒａｎｏ等（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，６３９９〜６４０５に記載されている。
【００３３】
免疫沈降反応は、１μｇ／サンプルの６Ｅ１０  モノクローナル抗体（シグネット（Ｓｉｇｎｅｔ））を用いて、培地または細胞溶解産物のいずれかにおいて行った。放射活性サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに溶解し、ストーム（Ｓｔｏｒｍ）８４０ホスホイメージャー（アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を用いて定量した。
【００３４】
ＰＰ２およびＰＰ３（Ｈａｎｋｅ，Ｊ．Ｈ．等（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，６９５〜７０１）を、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から購入し、ＤＭＳＯに溶解した；媒体単独、または、１、５および２０μＭのＰＰ２またはＰＰ３を用いて、トランスフェクトされた細胞を４８時間処理した。ＤＭＳＯの濃度は全サンプルで同じである。ＣＨＯ／ＡＰＰ７５１細胞での処理は、ＤＭＳＯ、または、ＰＰ２（５および２０μＭ）、または、ＰＰ３（２０μＭ）を用いてなされた。
【００３５】
実施例２
ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＰＰ６９５発現ベクターでトランスフェクトした。この細胞系は、細胞が高効率にトランスフェクトされ、ＡＰＰの成熟に必要な一連の全プロセシング活性を示すために用いられた。実際に、ヒトＡＰＰ６９５発現ベクターのトランスフェクションの際に、α−セクレターゼ産物（ＡＰＰsec）と、β−、γ−セクレターゼ産物（Ａβ）はいずれも培地に蓄積された。空のベクター、または、活性型Ａｂｌ（Ａｂｌ−ＰＰ）、または、活性型Ｓｒｃ（ＳｒｃＹＦ）キナーゼのいずれかおよびＡＰＰによりＨＥＫ２９３細胞をコトランスフェクトし、ＡＰＰsecとＡβの分泌を測定した。トランスフェクトされた細胞は、35Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓ混合物を用いて３０分間パルス標識されており、非標識アミノ酸で９０分間チェイスした。培地とタンパク質抽出物はいずれも、放射標識したＡＰＰsecおよび完全長ＡＰＰ（ｈｏｌｏ−ＡＰＰ）それぞれを定量するための免疫沈降実験で用いられた。完全長ＡＰＰの安定性は、Ａｂｌ−ＰＰまたはＳｒｃＹＦ活性型キナーゼいずれかによるコトランスフェクションによる影響は受けないが（図３Ａ）、いずれの場合においても、ＡＰＰsecの相対量（パルス期間中に合成された対応する完全長ＡＰＰを基準とした）の減少を観察した（図３Ｂ）。これは、活性キナーゼとＡＰＰとのコトランスフェクションの際の、α−セクレターゼ経路の活性の減少と解釈することができる。
【００３６】
実施例３
次に、上述の通りにトランスフェクトされた細胞からのＡβの蓄積を調べた。トランスフェクションの４８時間後に、培地上でサンドイッチＥＬＩＳＡ分析によって定量を行った（図４）。この分析により、Ｓｒｃ発現細胞において、分泌されたＡβの量は、コントロールベクターまたはＡｂｌ−ＰＰの存在における場合よりも増加していることが明確に示された。
【００３７】
活性Ｓｒｃがこのような劇的なＡβ分泌の増加を誘発するメカニズムは明らかではない。しかしながら、Ａｂｌ−ＰＰによるＡＰＰのチロシンのリン酸化が、Ａβレベルの増加を引き起こさないことから、ＡＰＰとは異なるその他の数種のタンパク質のリン酸化に依存しているようである。従って、チロシンがグリシンまたはフェニルアラニンのいずれかに置換された様々なＡＰＰ突然変異を用いて類似の挙動が得られた（データは示さず）。
【００３８】
いずれにしても、Ａβの蓄積は、Ｓｒｃファミリーに特異的な阻害剤ＰＰ２での処理に感受性を示すことから、Ａβレベルの上昇は、Ｓｒｃのチロシンキナーゼ活性に依存する。実際に、図５で示すように、トランスフェクトされた細胞を増加する濃度のＰＰ２に４８時間接触させることにより、分泌されたＡβの用量依存性の減少が起った。ＰＰ２の不活性型の類似体であるＰＰ３、または、媒体単独のいずれかでは、ＳｒｃＹＦトランスフェクションによるＡβの上昇に影響を与えない。
【００３９】
総合すれば、これらの観察により、外因性Ｓｒｃ活性は、Ａβ分泌の増加を起こすこれまで同定されていない経路の活性化に関与することが示される。
【００４０】
参考文献
1) T. Russo et al. (1998) FEBS Lett. 434, 1-7.
2) N. Zambrano et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 6399-6405.
3) Sabo S. et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 7952-7957.
4) Borg J.P. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 14761-14766.  
5) Iijima, K. et al. (2000) J. Neurochem. 75, 1085-1091.
6) Suzuki, T. et al. (1994) EMBO J. 13, 1114-1122.
7) Oishi, M. et al. (1997) Mol. Med. 3, 111-123.
8) Aplin, E. E. et al. (1996) J. Neurochem. 67, 699-707.
9) Standen, C. L. et al. (2001) J. Neurochem. 76, 316-320.
10) Ando, K. et al. (1999) J. Neurosci. 19, 4421-4427.
11) Ando K. et al. (2001) J Biol Chem.;276, 40353-40361.
12) Zambrano N. et al. (2001) J Biol Chem 276, 19787-19792.
13) Hanke, J.H. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 695-701. 
【００４１】
【表１】
2006503570.tif 000003
【００４２】
【表２】
2006503570.tif 000004
【００４３】
【表３】
2006503570.tif 000005
【００４４】
【表４】
2006503570.tif 000006
【００４５】
【表５】
2006503570.tif 000007
【００４６】
【表６】
2006503570.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】膜貫通型ＡＰＰの構造および各セクレターゼによる切断位置を示す。
【図２】各セクレターゼによるＡＰＰの分解経路およびその産物を示す。
【図３Ａ】細胞系へのＡＰＰおよび活性キナーゼのコトランスフェクションによる完全長ＡＰＰの相対量（％）の経時変化を示す。
【図３Ｂ】細胞系へのＡＰＰおよび活性キナーゼのコトランスフェクションによる分泌型ＡＰＰの相対量（％）の経時変化を示す。
【図４】ＡＰＰおよび活性キナーゼでコトランスフェクトされた細胞でのＡβの蓄積を示す。
【図５】活性型Ｓｒｃでトランスフェクトした細胞のＡβ産生に対するＰＰ２の阻害実験を示す。
【図６】ＣＨＯ／ＡＰＰ７５１細胞のＡβ産生に対するＰＰ２による阻害実験を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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