(57)【要約】本発明はジベンゾシクロオクタン系リグナン化合物を含有する退行性脳神経系疾患の予防および治療効果を有する薬剤学的製剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）の化合物の退行性脳神経系疾患の予防および治療剤としての用途；
2004511514.tif 000011
式中、
Ｒ１は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキルであって、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜４の低級アルキル基または炭素数１〜４の低級アルコキシ基か、あるいはＲ２とＲ３およびＲ４とＲ５はそれぞれ結合して−ＯＣＨ２Ｏ−基を形成してもよい。
【請求項２】
次の一般式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有し、薬剤学的に許容される賦形剤と混合して通常の薬学的製剤の製造方法で薬学的製剤に製剤化し製造された退行性脳神経系疾患の予防および治療効果を有する薬学的製剤；
2004511514.tif 000012
式中、
Ｒ１は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキルであって、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜４の低級アルキル基または炭素数１〜４の低級アルコキシ基か、あるいはＲ２とＲ３およびＲ４とＲ５はそれぞれ結合して−ＯＣＨ２Ｏ−基を形成してもよい。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は次の一般式（Ｉ）で示されるジベンゾシクロオクタン系リグナン化合物の退行性脳神経系疾患の予防および治療剤としての用途および該構造式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有する薬剤学的製剤に関する。
【０００２】
2004511514.tif 000002
【０００３】
式中、
Ｒ１は水素原子または炭素数１〜４の低級アルキルであって、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ水素原子、ヒドロキシル基、炭素数１〜４の低級アルキル基または炭素数１〜４の低級アルコキシ基か、あるいはＲ２とＲ３およびＲ４とＲ５はそれぞれ結合して−ＯＣＨ２Ｏ−基を形成してもよい。
【０００４】
上記の一般式（Ｉ）の化合物のうち、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がそれぞれメトキシ基の化合物がデオキシシザンドリン（ｄｅｏｘｙｓｈｉｚａｎｄｒｉｎ：化合物１）であって、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２およびＲ３が結合して−ＯＣＨ２Ｏ−基であり、Ｒ４およびＲ５がそれぞれメトキシ基のゴミシンＮ（ｇｏｍｉｓｉｎ Ｎ：化合物２）であり、Ｒ１が水素原子であって、Ｒ２とＲ３およびＲ４とＲ５がそれぞれ結合して−ＯＣＨ２Ｏ−基の化合物がウウェイジス（Ｗｕｗｅｉｚｉｓｕ Ｃ：化合物３）である。
上記の成分は五味子（Ｓｃｈｉｚａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）に含有されている既知の物質である。
【０００５】
背景技術
現代社会の人口分布は高齢化に急変している。これに伴い老化に関わる疾病、たとえば脳卒中や血流不全（ａｒｔｈｙｍｉａ）は退行性脳神経系疾患の発病率も高めている。脳神経系疾患はその死亡率が毎年増加する疾患で韓国の死亡原因を分析してみると癌に続き２番目を示し、世界的にも死亡原因の２〜３番目を示す深刻な疾患である。しかしこれを治療することのできる医薬品や治療方法が未だ提示されていない実状でその社会的、経済的損失は深刻化する一方である。退行性脳神経系疾患は、脳震盪や老化による脳神経細胞の構造的退化、循環器障害など他の成人病に起因する２次的症状として、あるいは交通事故、労働災害、一酸化炭素中毒等の様々な物理的、機械的要因によって脳が損傷を受けることによって引き起こされる。 （Ｒｏｔｈｍａｎ ＳＭ， Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ＪＨ ａｎｄ Ｈａｕｈａｒｔ ＲＥ（１９８７）Ｄｅｌａｙｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２２： １８８４−１８９１； およびＷｅｉｌｏｃｈ， Ｔ． （１９８５）Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄａｍａｇｅ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ａｎ ＮＭＤＡ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： ６８１−６８３）
【０００６】
脳組織が損傷すると脳神経細胞の死滅が進行する。神経細胞死滅のメカニズムは２種類に大別され、一つは脳内に存在する興奮性神経伝達物質のグルタミネート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）によることである。グルタミネートは正常状態では神経伝達物質として作用するが、種々の原因によって過大に分泌すると神経細胞の死滅を招く。かかるグルタミネートによる神経毒性は急性毒性と慢性毒性に分けられる。（Ｃｈｏｉ ＤＷ （１９８８） Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｅｕｒｏｎ １： ６２３−６３４）急性神経毒性は細胞外に存在するＮａおよびＫが細胞内に流入することによって細胞は膨張し結局は死に至る。慢性毒性はグルタミネート受容体のＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ ： ＮＭＤＡ）受容体が活性化してＣａが細胞内に流入し、これによって細胞内カルシウム依存性（ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）酵素が過度に活性化し結局は細胞が死に至ってしまのである。（Ｒｏｔｈｍａｎ ＳＭ， Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ＪＨ およびｈａｕｈａｒｔ ＲＥ （１９８７） Ｄｅｌａｙｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２２： １８８４−１８９１；　Ｓｔｒｉｊｂｏｓ ＰＪＬＭ， Ｌｅａｃｈ ＭＪおよびＧａｒｔｈｗａｉｔｅ Ｊ （１９９６） Ｖｉｃｉｏｕｓ ｃｙｃｌｅ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｎａ＋ ｃｈａｎｎｅｌｓ， ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ＮＭＤＡ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｄｅｌａｙｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １６： ５００４−５０１３；およびＣｏｙｌｅ ＪＴおよびＰｕｒｒｆａｒｃｋｅｎ Ｐ （１９９３） Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ， ｇｌｕｔａｍａｔｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： ６８９−６９５）
【０００７】
もう一つは直接的な酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）による損傷である。脳内は不飽和脂肪酸のしめる比率と酸素の消費量が高く酸素ラジカル（ｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌ）の生成が高いが、他の気管にに比べ相対的に抗酸化酵素の量が少なく酸素ラジカルを含む遊離基（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）による損傷の危険性が高い。このように退行性脳神経系疾患に関わる神経細胞死滅メカニズムに対する多様な角度からの研究が活発に行われている。
【０００８】
（発明が解決しようとする課題）
本実験室の予備的研究では乾燥五味子果実のメタノール抽出物が、Ｌ−グルタミネートで誘発された一次培養ラットの大脳皮質細胞における神経毒性を弱化させることを確認した。かくして本発明者らは五味子のメタノール抽出物の活性成分を分離しようと試みた。本研究において、本発明者らは五つのリグナンが五味子から得られ、それぞれデオキシシザンドリン（ｄｅｏｘｙｓｃｈｉｎｚａｎｄｒｉｎ）、ゴミシンＡ、ゴミシンＮ， シザンドリン（ｓｃｈｉｚａｎｄｒｉｎ）およびウウェイジスＣ（ｗｕｗｅｉｚｉｓｕ Ｃ）であることを確認したことを報告するものである。さらに、デオキシシザンドリン（ｄｅｏｘｙｓｃｈｉｎｚａｎｄｒｉｎ）、ゴミシンＡ、ゴミシンＮ， シザンドリン（ｓｃｈｉｚａｎｄｒｉｎ）およびウウェイジスＣ（ｗｕｗｅｉｚｉｓｕ Ｃ）はマウスの大脳皮質細胞の一次培養液でグルタミネート−誘導された神経毒性に対し脳保護活性を示すことを報告する。古くから民間で強壮や肝臓保護目的で使われてきた五味子はジベンゾシクロオクタンリグナン系成分が主であって、その活性に対しても多くの研究がなされてきた。（Ｎａｋａｊｉｍａ Ｋ， Ｔａｇｕｃｈｉ Ｈ， Ｉｋｅｙａ Ｙ， Ｅｎｄｏ ＹおよびＹｏｓｉｏｋａ Ｉ （１９８３） Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｃｈｉｚａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｂａｉｌｌ． ＸＩＩＩ． Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｇｎａｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔｓ ｏｆ Ｓｃｈｉｚａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｂａｉｌｌ． ｂｙ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｙａｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ １０３： ７４３−７４９； Ｌｉｕ ＧＴ （１９８５） Ｉｎ： Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｃｈａｎｇ ＨＭ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ） ｐｐ．２５７￣２６８， Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）。五味子より分離したジベンゾシクロオクタンリグナン系成分の重要な活性で肝臓保護作用（Ｈｉｋｉｎｏ Ｈ， Ｋｉｓｏ Ｙ， Ｔａｇｕｃｈｉ Ｈ ａｎｄ Ｉｋｅｙａ Ｙ （１９８４） Ａｎｔｉｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｇｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｓｃｈｉｚａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｆｒｕｉｔｓ． Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ． ５０： ２１３−２１８； Ｋｉｓｏ Ｙ， Ｔｏｈｋｉｎ Ｍ， Ｈｉｋｉｎｏ Ｈ， Ｉｋｅｙａ ＹおよびＴａｇｕｃｈｉ Ｈ （１９８５） Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｗｕｗｅｉｚｉｓｕ Ｃ ａｎｄ ｇｏｍｉｓｉｎ Ａ． Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ． ５１： ３３１−３３４； およびＹａｍａｄａ Ｓ， Ｍｕｒａｗａｋｉ ＹおよびＫａｗａｓａｋｉ Ｈ （１９９３） Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｏｍｉｓｉｎ Ａ， ａ ｌｉｇｎａｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ Ｓｃｈｉｚａｎｄｒａ ｆｒｕｉｔｓ， ｏｎ ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｒａｔｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４６： １０８１−１０８５）、他に抗癌（Ｙａｓｕｋａｗａ Ｋ， Ｉｋｅｙａ Ｙ， Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ， Ｉ���ａｓａｋｉ Ｍ， Ａｂｕｒｓｄａ Ｍ， Ｎａｋａｇａｗａ Ｓ， Ｔａｋｅｕｃｈｉ ＭおよびＴａｋｉｄｏ Ｍ （１９９２） Ｇｏｍｉｓｉｎ Ａ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ ｂｙ １２−ｏ−ｔｅｔｒａ−ｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ ｉｎ ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｓｋｉｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ４９： ６８−７１）、抗炎（Ｗａｎｇ ＪＰ， Ｒａｕｎｇ ＳＬ， Ｈｓｕ ＭＦおよびＣｈｅｎ ＣＣ （１９９４） Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｂｙ ｇｏｍｉｓｉｎ Ｃ （ａ ｌｉｇｎａｎ ｆｒｏｍ Ｓｃｈｉｚａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ） ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｂｕｒｓｔ ｏｆ ｒａｔ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ． Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １１３： ９４５−９５３）、抗ウイルス作用（Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ Ｔ， Ｈａｒａ Ｈ， Ｓａｋａｔａ Ｔ， Ｍｏｒｉ Ｋ， Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｈ， Ｔａｎａｋａ Ａ， Ｋａｊｉ ＨおよびＫａｊｉ Ａ （１９９５） Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ （ＨＩＶ） ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ ｇｏｍｉｓｉｎ Ｊ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， ｎｅｗ ｎｏｎｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＨＩＶ ｔｙｐｅ １ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ３９：２０００−２００７）などが報告されている。しかし、これらの化合物が神経系に対する生理活性を有していることは報告していない。
【０００９】
ここに本発明者らは五味子の代表的な成分であるジベンゾシクロオクタンリグナンの神経保護作用およびその作用メカニズムを究明し、ジベンゾシクロオクタンリグナンが神経保護作用を有することを確認した。よって、上記ジベンゾシクロオクタンリグナンを脳卒中や老人性痴呆（アルツハイマー）等の退行性脳神経系疾患の予防及び治療剤の候補物質として提示しようとするものである。
【００１０】
（発明の構成）
次に実施例および実験例で本発明をさらに詳細に説明する。
【００１１】
実施例：ジベンゾシクロオクタン系リグナン化合物の調製
五味子を８０％メタノールで抽出した後、これを濃縮し、総メタノール抽出物を得る。総メタノール抽出物を蒸留水に懸濁した後、ｎ−ヘキサンで抽出してｎ−ヘキサン画分を得た。ｎ−ヘキサン画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒条件：ヘキサン：エチルアセテート＝１００：１〜５０：１〜１０：１）を行い、それぞれの物質を分離した。各分離された化合物を質量分析（ＭＳ）、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ分光学的方法で化合物１、２および３を同定した。また、本発明で用いられたジベンゾシクロオクタン系リグナン化合物は公知方法（Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２８（８） ２４１４−２４２１ （１９８０）； Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２７（６）， １３８３−１３９４ （１９７９）など）により容易に調製することができる。
【００１２】
実験例
実験方法
１．実験動物
ソウル大学動物飼育場から供与されたスピローグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）系マウスをソウル大学薬学大実験動物室で飼育した。飼育場の環境は室内温度を２２±５℃に維持して照明時間を朝７時〜夜７時に固定し、飼料は粗蛋白２３．２％、粗脂肪４．０％、粗繊維６．０％、粗灰分１０．０％、粗カルシウム０．６％、粗リン０．４％などを含有した固形飼料（ソウル、三養社）を用いた。
【００１３】
２．大脳皮質細胞の培養
ニューロンおよびグリア（ｇｌｉａ）を共に含有する混合大脳皮質細胞の一次培養物を先行技術文献開示のラット胎児より製造した。（ Ｋｉｍ ＹＣ， Ｋｉｍ ＳＲ， Ｍａｒｋｅｌｏｎｉｓ ＧＪおよびＯｈ ＴＨ （１９９８） Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅｓ Ｒｂ１ ａｎｄ Ｒｇ３ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ５３： ４２６−４３２）
分離した大脳皮質細胞を１．０×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようコラーゲンを塗布した培養容器に移植した。混合大脳皮質細胞の一次培養物は、熱不活性化された１０％仔牛胎児血清を含有するＤＭＥＭにピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを加えた培養液中、３７℃で湿度を保った空気９５％／ＣＯ２５％の雰囲気下にて２週間培養した後実験に用いた。
【００１４】
３．成分の有効投与量
脳神経細胞保護活性の有無を調べるために、リグナン化合物をＤＭＳＯ中（最終濃度０．１％以内）に溶解し、蒸留水で希釈した。そしてミリポアメンブレイン（０．２２μｍ，　Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）で濾過して無菌状態にした後、濃度が異なるように培養された溶液が脳神経細胞に投与された。
【００１５】
４．グルタミネートによる神経毒性の誘導
マウスの胎児より直接分離した大脳皮質細胞を１４日間培養し、活性を測定しようとする試料を濃度別に培養細胞に処理した後、１時間後に１００μＭのグルタミネートを処理して神経細胞に毒性を誘導した。２４時間後培養細胞に対しＭＴＴ検定法で細胞の生存率を測定することによって試料の神経細胞保護活性を判断した。
【００１６】
５．ＭＴＴ測定
培養中の大脳皮質細胞の培養液にＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を培養液の１０％になるよう加え、続けてさらに３時間培養し生成されたホルマザンをＤＭＳＯで溶解した後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。（Ｍｏｓｍａｎｎ Ｔ （１９８３） Ｒａｐｉｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５： ５５−６１）
【００１７】
６．細胞内Ｃａ２＋濃度測定
一次培養した大脳皮質細胞内のＣａ２＋濃度は活性を測定しようとする化合物を投与し１時間後にグルタミネートで神経毒性を誘導した後、Ｆｕｒａ−２　ＡＭを用いて測定した。（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｇ， Ｐｏｅｎｉｅ ＭおよびＴｓｉｅｎ ＲＹ （１９８５）　Ａ ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０： ３４４０−３４５０）
【００１８】
７．亜硝酸の定量
一次培養した大脳皮質細胞より培養液中に遊離される亜硝酸の量はグリース試薬を用いてドーソンらの方法で測定した。（Ｄａｗｓｏｎ ＶＬ， Ｂｒａｈｂｈａｔｔ ＨＰ， Ｍｏｎｇ ＪＡ ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ ＴＭ （１９９４） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃａｕｓｅｓ ｄｅｌａｙｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎａｌ￣ｇｌｉａｌ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３３： １４２５−１４３０）
【００１９】
８．細胞上澄み液の調製
一次培養した大脳皮質細胞の培養液を除去した後、リン酸カリウムバッファ（ｐＨ　７．４）０．１Ｍを加えて細胞を収集した。収集した細胞を２０秒間音波処理した後、４℃で３，０００ｇを２０分間遠心分離し細胞上澄液を得た。
【００２０】
９．グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ−ｐｘ）の活性測定
試験管にリン酸カリウムバッファ（ｐＨ　７．４）１００ｍＭ、還元したグルタチオン（ＧＳＨ）１ｍＭ、ＮＡＤＰＨ　０．２ｍＭ、Ｈ２Ｏ２　０．５ｍＭおよび１．５単位／ｍｌのＧＳＳＧ−レダクターゼ（ＧＳＳＧ−ｒ）が含まれている反応液１ｍｌを用意した後、細胞上澄液１００μｌを加えて反応させ、３４０ｎｍで１分間吸光度の消失を測定してＧＳＨ−ｐｘの活性を測定した。ＧＳＨ−ｐｘの活性は吸光度係数（６．２２μｍｏｌ−１・ｃｍ−１）を用いて酸化されたＮＡＤＰＨμｍｏｌ／ｍｇ蛋白質／分で示した。（Ｆｌｏｈｅ Ｌ， Ｇｕｎｚｌｅｒ ＷＡ， １９８４， Ａｓｓａｙｓ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １０５： １１４−１２１）
【００２１】
１０．総ＧＳＨ（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）量の測定
試験管にＮＡＤＰＨ０．３ｍＭおよびＤＴＮＢ５ｍＭを含む反応液７０μｌを用意した後、細胞上澄液１００μｌを加えた。さらにＧＳＳＧ−Ｒ最終濃度５ｕｎｉｔｓ／ｍｌを加えて反応させ、１分間で４１２ｎｍの吸光度の増加を測定した。ＧＳＨの量は標準品のＧＳＨでＧＳＨ検量線を求めて換算した。（Ｔｉｅｔｚｅ Ｆ， Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｎｏｇｒａｍ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ａｎｄ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７： ５０２−５２２）
【００２２】
１１．マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）量の測定
細胞上澄液５００μｌに１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）５００μｌを加え、１０分間放置し蛋白質を沈殿させた後、遠心分離器を用いて沈殿されている蛋白質を除去した。上澄み液にチオバルビツール酸を最終濃度０．２％で加え、１ｍｌの反応液を調整した後に１００℃で１時間反応させた。吸光度を５３５ｎｍで測定した後、ＭＤＡ含有量を標準品の１，１，３，３−テトラエトキシプロパンと比較検量して換算した。（Ｙａｇｉ ＫＡ， １９７６， Ｓｉｍｐｌｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｌｉｐｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｅｄ １５： ２１２−２１６）
【００２３】
１２．統計分析
統計的有意性検討は各実験群の数を３にし（ｎ＝３）、対照値よりの変動を“ＡＮＯＶＡデータ”とした。Ｐ値が５％未満の場合、統計的に有意性があると判定した。
【００２４】
１３．結果および考察
五味子の重要なジベンゾシクロオクタンリグナン系成分のデオキシシザンドリン、ゴミシンＮ、シザンドリンおよびウウェイジスＣの脳神経細胞保護活性をグルタミネートで神経毒性を誘発した一次培養したラットの大脳皮質細胞を生存活性の実験系により評価した。その結果を次の表１に示す。
【００２５】
すなわち、ラットの大脳皮質細胞を１４日間培養した後、化合物をそれぞれ濃度別に投与し、１時間後にさらにグルタミネート１００μＭで神経細胞毒性を誘発し、２４時間さらに培養した後、神経細胞保護活性を測定した。化合物の脳神経細胞保護活性は細胞内に存在するコハク酸デヒドロゲナーゼの活性を測定するＭＴＴ検定法で判断した。細胞が毒性になると細胞内ミトコンドリアが損傷を受け、またミトコンドリア内に存在するコハク酸デヒドロゲナーゼの活性も減少し生成されるホルマザンの量が減少するため、これを用いて細胞の生存率を測定することができる。かかる実験系を用いて上記リグナンの脳神経細胞保護活性を測定した結果、一般式（Ｉ）の化合物は顕著な脳神経細胞保護活性を示すことがわかる。すなわち、デオキシシザンドリン、ゴミシンＮおよびウウェイジスＣはそれぞれ１μＭの濃度で投与したとき特に優れた脳神経細胞保護活性を示し、正常状態のときのそれぞれ４６．２％、５１．３％および６３．９％の水準まで脳神経細胞を維持した。
【００２６】
さらに、グルタミネートで誘発した毒性に対し、保護活性を示したデオキシシザンドリン、ゴミシンＮおよびウウェイジスＣのメカニズム究明のために投与時期および投与期間を異にし、グルタミネートで誘発した神経毒性にどのような影響を及ぼすかについて調べた。培養物をグルタミネートに曝し２４時間リグナンで前処理した（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。一部培養液をＤＭＥＭ内で２４時間グルタミネートで曝した（後処理ｐｏｓｔ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。その結果を次の表２に示した。
【００２７】
ウウェイジスＣは前処理したときは顕著な脳神経細胞保護活性を示したが、後処理したときにはその保護活性が著しく減少することが分かる。これはリグナンがグルタミネート毒性の初期段階で作用することを示す。しかし、デオキシシザンドリンは前処理したときよりは後処理したときに一層優れた保護活性を示した。一方、ゴミシンＮは前処理と後処理したとき共にその活性を維持した。したがって、かかる結果よりデオキシシザンドリン、ゴミシンＮおよびウウェイジスＣはそれぞれ相異するメカニズムでグルタミネートによる神経毒性に対し保護活性を示すものと確認された。すなわち、ウウェイジスＣはグルタミネートにより毒性が誘発する初期段階に作用し保護活性を有するものと推定され、デオキシシザンドリンはグルタミネートの受容体の過剰発現後に起こる一連の反応に対して保護活性を示すものと推定することができる。一方、ゴミシンＮはウウェイジスＣとデオキシシザンドリンの脳神経細胞保護メカニズムを共に有するものと推定することができる。
【００２８】
グルタミネートの受容体はＮＭＤＡによって活性化されるＮＭＤＡ受容体とα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾール−プロピオン酸およびカイニン酸（ＫＡ）によって活性化されるｎｏｎ−ＮＭＤＡ受容体に分けられる。
一次培養した大脳皮質細胞に上記の化合物をそれぞれ処理した後、ＮＭＤＡ受容体作用薬ＮＭＤＡまたはｎｏｎ−ＮＭＤＡ受容体作用薬ＫＡを用いて毒性を誘発した後、各化合物の脳神経細胞保護活性を測定した。その結果、ウウェイジスＣはＮＭＤＡで誘発した毒性に対し、またデオキシシザンドリンはＫＡで誘発した毒性に対して相対的に選択的な保護活性を示した。一方、ゴミシンＮはＫＡで誘発した毒性よりはＮＭＤＡで誘発した毒性に対し相対的に優れた保護活性を示したが、その選択性はデオキシシザンドリンやウウェイジスＣより劣ることがわかる。その結果を表３に示した。
【００２９】
グルタミネートによる神経毒性はグルタミネート受容体の過度な活性化によるＣａ２＋の流入が媒介するものと知られ、これは細胞内Ｃａ２＋量の増加、遊離基およびＮＯの蓄積などを伴う。（Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９５； Ｋｒｉｅｇｌｓｔｅｉｎ， １９９７）細胞内Ｃａ２＋は細胞の信号伝達と細胞機能に重要な役割を行う。したがって、Ｃａ２＋の恒常性は体系的に調節され、Ｃａ２＋恒常性の破壊は細胞の死滅を誘導して多様な疾病の原因となっている。神経細胞のＣａ２＋恒常性を破壊する主な原因の一つがグルタミネートによる細胞内Ｃａ２＋の増加である。グルタミネート受容体が活性化するとＣａ２＋が細胞内に流入し細胞内Ｃａ２＋の量の増加はＣａ２＋依存酵素の一酸化窒素（ＮＯＳ）、プロテインキナーゼＣ、ホスホリパーゼおよびプロテアーゼなどを活性化する。（Ｃｈｏｉ， １９８５； Ｌｉｐｔｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， １９９４）かかる酵素が活性化すると一連の反応を通じ多様な毒性を引き起こす。
【００３０】
したがって、デオキシシザンドリン、ゴミシンＮおよびウウェイジスＣがグルタミネートによるＣａ２＋の流入に及ぼす影響を調べた。ゴミシンＮとウウェイジスＣはグルタミネートにより細胞内に流入されるＣａ２＋の濃度を著しくに低下させた。ゴミシンＮとウウェイジスＣはそれぞれ１μＭの濃度で処理したとき、グルタミネートによって増加される細胞内Ｃａ２＋の量をそれぞれ６０．３％および６７．９％まで減少させた。しかしデオキシシザンドリンはＣａ２＋の流入にはあまり顕著なな影響を及ぼさなかった。その結果を次の表４に示した。
【００３１】
前述のように、グルタミネートによる細胞内Ｃａ２＋量の増加はＣａ２＋依存酵素を活性化させる。Ｃａ２＋依存酵素中の一つであるＮＯＳの活性化はＮＯの生成を増加させ毒性を示し、これはグルタミネートの毒性メカニズムの一つとして知られている。（Ｍａｓａｎｏｒｉ ｅｔ ａｌ， １９９８）さらにホスホリパーゼＡ２が活性化するとアラキドン酸が生成され、アラキドン酸の代謝過程で多様な遊離基が生成される。したがって、酸化的ストレスはグルタミネートのさらに異なる毒性メカニズムとして知られている。神経系にはかかる酸化的ストレスに対する防御のための多様な抗酸化メカニズムを有している。代表的な抗酸化メカニズムとしてはグルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼのような抗酸化酵素とグルタチオンに代表される抗酸化物質がある。
【００３２】
一次培養したマウスの大脳皮質細胞にグルタミネートを処理するとＮＯ生成が増加する。ゴミシンＮとウウェイジスＣはグルタミネートによって過多生成されるＮＯの量を顕著に減少させ１μＭの濃度で処理したとき、それぞれ正常状態時の６０．２％および６５．８％水準まで減少した。デオキシシザンドリンも１μＭの濃度で処理したとき、グルタミネートによって増加したＮＯの量を減少させたが、その効果は正常状態時の４０．２％水準でゴミシンＮおよびウウェイジスＣの水準に比べて劣る。その結果を次の表５に示した。
【００３３】
デオキシシザンドリン、ゴミシンＮおよびウウェイジスＣはさらにグルタミネートで毒性を誘発した一次培養大脳皮質細胞に１μＭの濃度で投与したとき、グルタミネートによって減少したＧＳＨ−ｐｘの活性およびグルタチオンの量を正常状態時の約５０％水準まで維持し、抗酸化酵素の活性にも保護活性を示すことが分かった。その結果を表６および表７に示した。
【００３４】
グルタミネートにより過多生成したＮＯとスーパーオキシドアニオンは相互結合してペルオキシ亜硝酸を形成する。（Ａｌｍｅｉｄａ　ｅｔ　ａｌ，　１９９８）かくして生成されたペルオキシ亜硝酸はグルタミネート毒性によって生成された遊離基と共に神経細胞に酸化的ストレスを誘発し、これは結局細胞の脂質過酸化を誘発する。ウウェイジスＣはグルタミネートによる脂質過酸化を６７％まで抑制した。ゴミシンＮとデオキシシザンドリンもグルタミネートによる脂質過酸化を顕著に抑制する効果を示した。その結果を次の表８に示した。
【００３５】
以上の実験結果より本研究では一次培養したマウスの大脳皮質細胞を用い、五味子の３種リグナン、すなわちウウェイジスＣ、デオキシシザンドリンおよびゴミシンＮの脳神経細胞保護活性を初めて究明し、そのメカニズムを提示した。
【００３６】
2004511514.tif 000003
【００３７】
培養されたラットの大脳皮質細胞を１時間前に試料で処理した後、１００μＭグルタミネートに２４時間曝した。細胞生存率はＭＴＴ検定法で測定した。コントロール及びグルタミネート処理群の光学密度（ＯＤ）はそれぞれ１．１８±０．０９および０．７５±０．０７である。生存率は１００×（試料処理群の光学密度−グルタミネート処理群の光学密度）／（コントロールの光学密度−グルタミネート処理群の光学密度）の方法で計算した。得られた値は平均ＳＤ（ｎ＝３）を示す。試料処理群の結果とグルタミネート処理群の差は顕著である；＊：ｐ＜０．０５、＊＊： ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【００３８】
2004511514.tif 000004
【００３９】
培養されたラットの大脳皮質細胞を１時間試料１μＭで処理した後、グルタミネート１００μＭに（１５分間）曝した。さらにＤＭＥＭ中に試料が除去された状態で２４時間曝した（前処理）。また、培養された大脳皮質細胞を１５分間グルタミネートに曝した後、培養液を除去し新たな培養液に試料を加えた後（後処理）、ＤＭＥＭ中に２４時間曝した。細胞生存率はＭＴＴ検定法で測定した。コントロールとグルタミネート処理群の光学密度（ＯＤ）はそれぞれ１．１８±０．０９および０．７５±０．０７である。生存率は表１と同様に計算した。得られた値は平均ＳＤ（ｎ＝３）を示す。試料処理群とグルタミネート処理群の平均値の差は顕著である；＊：ｐ＜０．０５、＊＊： ｐ＜０．０１。
【００４０】
2004511514.tif 000005
【００４１】
培養されたラットの大脳皮質細胞を１時間１μＭ濃度の試料で処理した後、５０μＭ　ＮＭＤＡ及び５０μＭ　ＫＡに培養細胞を２４時間曝し、さらにグルタミネートに２４時間曝した。細胞生存率はＭＴＴ検定法で測定した。コントロール、ＮＭＤＡ処理群およびＫＡ処理群の光学密度（ＯＤ）はそれぞれ１．２０±０．１０、０．７７±０．０５および０．８５±０．０８である。生存率は表１と同様に計算した。得られた値は平均ＳＤ（ｎ＝３）を示す。試料処理群とＮＭＤＡやＫＡ処理群の平均値の差は顕著である；＊：ｐ＜０．０５、＊＊： ｐ＜０．０１。
【００４２】
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培養されたラットの大脳皮質細胞を１時間試料１μＭで処理した後、１００μＭグルタミネートに２４時間曝した。得られた値は平均ＳＤ（ｎ＝３）を示す。試料処理群とグルタミネート処理群の平均値の差は顕著である；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【００４３】
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【００４４】
培養されたラットの大脳皮質細胞を１時間試料１μＭで処理した後、１００μＭグルタミネートに２４時間曝した。与えられ値は平均ＳＤ（ｎ＝３）を示す。試料処理群とグルタミネート処理群の平均値の差は顕著である；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【００４５】
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【００４６】
培養されたラットの大脳皮質細胞にグルタミネートを処理前１時間にわたって試料を処理した後、１００μＭグルタミネートに２４時間曝した。与えられ値は平均ＳＤ（ｎ＝３）を示す。試料処理群とグルタミネート処理群の平均値の差は顕著である；＊：ｐ＜０．０５、＊＊： ｐ＜０．０１。
【００４７】
2004511514.tif 000009
培養されたラットの大脳皮質細胞にグルタミネートを処理前１時間にわたって試料を処理した後、１００μＭグルタミネートに２４時間曝した。与えられ値は平均ＳＤ（ｎ＝３）を示す。試料処理群とグルタミネート処理群の平均値の差は顕著である；＊＊： ｐ＜０．０１。
【００４８】
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【００４９】
培養されたラットの大脳皮質細胞にグルタミネートを処理前１時間にわたって試料を処理した後、１００μＭグルタミネートに２４時間曝した。与えられ値は平均ＳＤ（ｎ＝３）を示す。試料処理群とグルタミネート処理群の平均値の差は顕著である；＊＊： ｐ＜０．０１、＊＊＊： ｐ＜０．００１。
【００５０】
したがって、一般式（Ｉ）の化合物は退行性脳神経系疾患の予防および治療剤として有用に用いることができる。
【００５１】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は１日１ｍｇ〜２００ｍｇを１〜３回投与することができる。本発明の化合物は患者の体重、性別、年齢および疾病の程度によってその使用量を増減することができる。
【００５２】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物は通常薬剤学的に許容される賦形剤と共に注射剤、液剤、シロップ剤、錠剤、カプセル剤などに薬剤学的に通常許容される製法で製剤化することができる。
【００５３】
製剤実施例１
化合物１　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　適量
ｐＨ調節剤　　　　　　　　　　　　　　適量
化合物１を注射用蒸留水に溶解し、ｐＨ調節剤でｐＨ約７．６に調節した後、全体を２ｍｌにした後、２ｍｌ用量のアンプルに充填して滅菌し注射剤を製造する。
【００５４】
製剤実施例２
化合物２　　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
注射用滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　適量
ｐＨ調節剤　　　　　　　　　　　　　　適量
化合物２を注射用蒸留水に溶解し、ｐＨ調節剤でｐＨ約７．２に調節して全体を２ｍｌにした後、２ｍｌ用量のアンプルに充填して滅菌し注射剤を製造する。
【００５５】
製剤実施例３
化合物３　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
澱粉　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　適量
前記の成分を混合し、通常錠剤の製造方法に従って打錠し錠剤を製造する。
【００５６】
製剤実施例４
化合物１　　　　　　　　　　　　　１０ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
澱粉　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　適量
前記の成分を混合し、通常錠剤の製造方法に従って打錠し錠剤を製造する。
【００５７】
製剤実施例５
化合物２　　　　　　　　　　　　　　　５ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
澱粉　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
タルク　　　　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　適量
前記の成分を混合し、通常カプセル剤の製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填しカプセル剤を製造する。
【００５８】
製剤実施例６
化合物１　　　　　　　　　　　　　　　５ｍｇ
乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
澱粉　　　　　　　　　　　　　　　　　９３ｍｇ
タルク　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム　　　　　　　　　適量
前記の成分を混合し、通常カプセル剤の製造方法に従ってゼラチンカプセルに充填しカプセル剤を製造する。
【００５９】
製剤実施例７
化合物３　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ
異性化糖　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ
レモン香　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
精製水　　　　　　　　　　　　全体　１００ｍｌ
前記の成分を通常液剤の製造方法に従って混合し、１００ｍｌの褐色ボトルに充填して滅菌し液剤を製造する。
【００６０】
製剤実施例８
化合物１　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
砂糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ
異性化糖　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｇ
レモン香　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
精製水　　　　　　　　　　　　全体　１００ｍｌ
前記の成分を通常液剤の製造方法に従って混合し、１００ｍｌの褐色ボトルに充填して滅菌し液剤を製造する。
【００６１】
（産業上の利用可能性）
１．一般式（Ｉ）の化合物はＬ−グルタミネートで神経毒性を誘発した一次培養ラットの大脳皮質細胞において顕著な脳神経細胞保護活性を示した。
２．一般式（Ｉ）の化合物はグルタミネートによって細胞内に過剰に流入されたＣａ２＋の濃度を顕著に低下させた。
３．一般式（Ｉ）の化合物はグルタミネートによって減少されたグルタチオンペルオキシダーゼの活性およびグルタチオンの量を顕著に増加させた。さらにグルタミネートによるＮＯの過剰な生成を抑制し、また脂質過酸化も抑制した。
１．以上の実験結果で本発明の一般式（Ｉ）の化合物は脳震盪や老化による脳神経細胞の構造的退化、循環器障害など他の成人病に起因する２次的症状、あるいは交通事故、労働災害、一酸化炭素中毒など、多様な物理的、機械的要因による退行性脳神経系疾患の予防と治療のための医薬製剤として用いることができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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