(57)【要約】逆標識法と呼ばれる比較プロテオミクスについての新規タンパク質標識実行方法が、マーカーまたは標的タンパク質の迅速な同定を目的として提供される。この方法により、対照試料と比較される病気または薬剤処理試料のタンパク質発現を評価するため、２つの変換共同標識実験を並行して行う。一実験では、（病気または薬剤処理による）摂動試料を重同位体標識し、第二実験では対照を重同位体標識する。差次的比較を行うためその非標識または軽同位体対応物質と混合および分析すると、特徴的な逆標識パターンが、評価できるレベルまで差次的発現されたタンパク質についての２つの並行分析間で観察される。特に有用な実例にでは、タンパク質標識は、１８Ｏ−水中で行なわれたタンパク質分解の結果としてペプチドへのタンパク質分解的１８Ｏ−取込み、タンパク質への１５Ｎ（または１３Ｃおよび２Ｈ）の代謝的取込み、および同位体コードタグ試薬、例えば同位体コードアフィニティータグ試薬によるタンパク質の化学的標識法により達成される。
2004516486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の集団を含む２つの異なる試料における差次的発現タンパク質の同定方法であって、
ａ）レファレンス試料および実験試料の各々から２つの等しいタンパク質プールを準備し、
ｂ）タンパク質用の実質的に化学的には同一であって同位体が異なるタンパク質標識試薬によりタンパク質プールを標識し、ただしこの場合、レファレンスおよび実験プールの各々からの一プールを重同位体タンパク質標識試薬で標識することにより重同位体標識レファレンスプールおよび重同位体標識実験プールを準備し、そして残りのレファレンスおよび実験プールを軽同位体タンパク質標識試薬で標識することにより、軽同位体標識レファレンスプールおよび軽同位体標識実験プールを準備するものとし、
ｃ）軽同位体標識レファレンスプールを、重同位体標識実験プールと合わせて、第一タンパク質混合物を準備し、
ｄ）重同位体標識レファレンスプールを、軽同位体標識実験プールと合わせて、第二タンパク質混合物を準備し、
ｅ）２つの混合物の各々から標識タンパク質を検出し、そして
ｆ）第一および第二混合物で標識タンパク質について得られた標識パターンを比較するが、ここで、第一混合物におけるタンパク質の標識パターンと比較されている第二混合物におけるタンパク質の逆標識パターンは、２つの異なる試料における差次的発現タンパク質を示すものとする
工程を含む方法。
【請求項２】
さらに、第一および第二混合物において標識タンパク質を酵素的または化学的に開裂することにより、工程（ｅ）の前にペプチド混合物を供給することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
さらに、ペプチドの一つを配列決定することにより、ペプチドの起点となった差次的発現タンパク質を同定することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ペプチドの配列決定が、タンデム質量分析またはポストソース分解（ＰＳＤ）を用いて遂行される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
さらに、差次的発現タンパク質の配列決定によりタンパク質を同定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
差次的発現タンパク質の配列決定が、タンデム質量分析またはＰＳＤを用いて遂行される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
さらに、工程（ｅ）の前に第一および第二混合物の各々から標識タンパク質を分離することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
２つの混合物からの標識タンパク質の分離工程が、硫酸アンモニウム沈澱、等電点電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過、免疫沈降およびそれらの組合わせから成る群から選択される技術を用いて実施される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
さらに、工程（ｅ）前に第一および第二混合物の各々から標識ペプチドを分離する工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
２つの混合物から標識ペプチドを分離する工程が、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降およびそれらの組合わせから成る群から選択される技術を用いて実施される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標識タンパク質が質量分析法により検出される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
標識ペプチドが質量分析法により検出される、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
さらに、試料を少なくとも１種の分画技術にかけることにより、工程（ａ）の前に試料中のタンパク質のコンプレキシティーを低減化させる工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
さらに、第一および第二混合物の同位体標識タンパク質を少なくとも１種の分画技術にかけることにより、第一および第二混合物における標識タンパク質開裂前に第一および第二混合物のタンパク質のコンプレキシティーを低減化させる工程を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１５】
分画技術が、硫酸アンモニウム沈澱、等電点電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過、免疫沈降およびそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
２つの試料が、細胞型、組織型、生理学的状態、病状、発達段階、環境条件、栄養状態、化学的刺激因子または物理的刺激因子の点で異なる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
重同位体タンパク質標識試薬が、２Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏおよび３４Ｓから成る群から選択される安定した重同位体を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
軽同位体タンパク質標識試薬が、Ｈ、１２Ｃ、１４Ｎ、１６Ｏおよび３２Ｓから成る群から選択される安定した軽同位体を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
重同位体タンパク質標識試薬が１８Ｏを含み、軽同位体タンパク質標識試薬が１６Ｏを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質標識試薬がアフィニティータグ含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
試料が、細胞ホモジネート、細胞画分、組織ホモジネート、生物学的流体、涙液、糞、唾液および洗浄液から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
差次的発現タンパク質が、細胞表面タンパク質、膜タンパク質、細胞質ゾルタンパク質およびオルガネラタンパク質から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質の集団を含有する２つの異なる試料において差次的発現タンパク質を同定する方法であって、
ａ）レファレンス試料および実験試料の各々から２つの等しいタンパク質プールを準備し、
ｂ）同位体標識水によるタンパク質プールの各々の標識中に各タンパク質プールをタンパク質加水分解し、ただしこの場合、レファレンスおよび実験プールの各々からの一プールを１８Ｏ−水で標識して１８Ｏ−標識レファレンスプールおよび１８Ｏ−標識実験プールを得、そして残りのレファレンスおよび実験プールを１６Ｏ−水で標識することにより、１６Ｏ−標識レファレンスプールおよび１６Ｏ−標識実験プールを得るものとし、
ｃ）１６Ｏ−標識レファレンスプールを１８Ｏ−標識実験プールと合わせることにより、１６Ｏ−および１８Ｏ−標識ペプチドを含む第一混合物を準備し、
ｄ）１８Ｏ標識レファレンスプールを１６Ｏ−標識実験プールと合わせることにより、１８Ｏ−および１６Ｏ−標識ペプチドを含む第二混合物を準備し、
ｅ）２つの混合物の各々から標識ペプチドを検出し、そして
ｆ）第一および第二混合物で標識ペプチドについて得られた標識パターンを比較するが、ここで、第一混合物におけるペプチドについて得られた標識パターンと比較されている第二混合物におけるペプチドについて得られた逆標識パターンは、ペプチドが起点とする差次的発現タンパク質を示すものとする
工程を含む方法。
【請求項２４】
さらに、工程（ｅ）の前に２つの混合物における標識ペプチドを分離する工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
２つの混合物における標識ペプチドの分離工程が、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降およびそれらの組合わせから成る群から選択される技術を用いて実施される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
標識ペプチドの検出が質量分析法により実施される、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
さらに、ペプチドの一つを配列決定することにより、ペプチドが起点とする差次的発現タンパク質を同定する工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
ペプチドの配列決定が、タンデム質量分析法またはＰＳＤを用いて遂行される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
さらに、試料を少なくとも一種の分画技術にかけることにより、工程（ａ）の前に試料中のタンパク質のコンプレキシティーを低減化させる工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
さらに、第一および第二混合物の標識ペプチドを少なくとも一種の分画技術にかけることにより、工程（ｅ）の前に第一および第二混合物から望ましくないペプチドを分離する工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
分画技術が、硫酸アンモニウム沈澱、等電点電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過、免疫沈降およびそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
試料が、細胞ホモジネート、細胞画分、組織ホモジネート、生物学的流体、涙液、糞、唾液および洗浄液から成る群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項３３】
差次的発現タンパク質が、細胞表面タンパク質、膜タンパク質、細胞質ゾルタンパク質およびオルガネラタンパク質から成る群から選択される、請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
２つの試料が、細胞型、組織型、生理学的状態、病状、発達段階、生理学的状態、環境条件、栄養状態、化学的刺激因子または物理的刺激因子の点で異なる、請求項２３記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質の集団を含有する２つの異なる試料において差次的発現タンパク質を同定する方法であって、
ａ）レファレンス試料および実験試料の各々から２つの等しいタンパク質プールを準備し、
ｂ）タンパク質プールの各々におけるタンパク質をタンパク質分解することによりペプチドプールを得、
ｃ）各ペプチドプールを同位体標識水で標識し、ここでレファレンスおよび実験プールの各々からの一ペプチドプールを１８Ｏ−水で標識して１８Ｏ−標識レファレンスペプチドプールおよび１８Ｏ−標識実験ペプチドプールを得、そして残りのレファレンスおよび実験ペプチドプールを１６Ｏ−水で標識することにより、１６Ｏ−標識レファレンスペプチドプールおよび１６Ｏ−標識実験ペプチドプールを得るものとし、
ｄ）１６Ｏ−標識レファレンスプールを１８Ｏ−標識実験プールと合わせることにより、１６Ｏ−および１８Ｏ−標識ペプチドを含む第一混合物を得、
ｅ）１８Ｏ標識レファレンスプールを１６Ｏ−標識実験プールと合わせることにより、１８Ｏ−および１６Ｏ−標識ペプチドを含む第二混合物を得、
ｆ）２つの混合物の各々から標識ペプチドを検出し、そして
ｇ）第一および第二混合物で標識ペプチドについて得られた標識パターンを比較するが、ここで、第一混合物におけるペプチドについて得られた標識パターンと比較されている第二混合物におけるペプチドについて得られた逆標識パターンは、ペプチドが起点とした差次的発現タンパク質を示すものとする
工程を含む方法。
【請求項３６】
さらに、工程（ｆ）の前に第一および第二混合物から標識ペプチドを分離する工程を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
２つの混合物からの標識ペプチドの分離工程が、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降およびそれらの組合わせから成る群から選択される技術を用いて実施される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
標識ペプチドの検出が質量分析法により実施される、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
さらに、ペプチドの一つを配列決定することにより、ペプチドが起点とした差次的発現タンパク質を同定する工程を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
ペプチドの配列決定が、タンデム質量分析またはＰＳＤを用いて遂行される、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
さらに、試料を少なくとも１種の分画技術にかけることにより、工程（ａ）の前に試料中のタンパク質のコンプレキシティーを低減化する工程を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４２】
さらに、第一および第二混合物の標識ペプチドを少なくとも１種の分画技術にかけることにより、工程（ｅ）の前に第一および第二混合物から望ましくないペプチドを分離する工程を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項４３】
分画技術が、硫酸アンモニウム沈澱、等電点電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過、免疫沈降およびそれらの組合わせから成る群から選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
試料が、細胞ホモジネート、細胞画分、組織ホモジネート、生物学的流体、涙液、糞、唾液および洗浄液から成る群から選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項４５】
差次的発現タンパク質が、細胞表面タンパク質、膜タンパク質、細胞質ゾルタンパク質およびオルガネラタンパク質から成る群から選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項４６】
２つの試料が、細胞型、組織型、生理学的状態、病状、発達段階、生理学的状態、環境条件、栄養状態、化学的刺激因子または物理的刺激因子の点で異なる、請求項３５記載の方法。
【請求項４７】
タンパク質の集団を含む２つの異なる試料における差次的発現タンパク質の同定方法であって、
ａ）レファレンス試料および実験試料の各々から２つの等しいタンパク質プールを準備し、ただしこの場合、レファレンスおよび実験プールの各々からの一プールを、重同位体標識同化性供給源を含む培地中での培養により製造して重同位体標識レファレンスプールおよび重同位体標識実験プールを準備し、そして残りのレファレンスおよび実験プールを、軽同位体標識同化性供給源を含有する培地中での培養により製造して軽同位体標識レファレンスプールおよび軽同位体標識実験プールを準備するものとし、
ｂ）軽同位体標識レファレンスプールを、重同位体標識実験プールと合わせて、第一タンパク質混合物を準備し、
ｃ）重同位体標識レファレンスプールを、軽同位体標識実験プールと合わせて、第二タンパク質混合物を準備し、
ｄ）２つの混合物の各々から標識タンパク質を検出し、そして
ｅ）第一および第二混合物で標識タンパク質について得られた標識パターンを比較するが、ここで、第一混合物におけるタンパク質の標識パターンと比較されている第二混合物におけるタンパク質の逆標識パターンは、２つの異なる試料における差次的発現タンパク質を示すものとする
工程を含む方法。
【請求項４８】
さらに、第一および第二混合物中の標識タンパク質を酵素的または化学的に開裂することにより、工程（ｄ）の前にペプチド混合物を供給する工程を含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
同化性供給源が、アンモニウム塩類、グルコース、水およびアミノ酸から成る群から選択される、請求項４７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、複合タンパク質混合物における特異的タンパク質の同定方法に関するものである。特に、本発明方法は、質量分析法を用いる、２つの異なる試料、例えば異なる組織、異なる細胞型または異なる細胞状態からの差次的発現タンパク質の迅速な同定に関するものである。
【０００２】
２．関連技術の記載
ほとんどの病気の経過および病気の処置がタンパク質レベルで明らかにされていることについては、充分に確立されている。実際に、市販されている医薬の大部分についての作用機序は、タンパク質により仲介されるものである。薬剤処置を施す場合または施さない場合における、正常および疾患状態からのタンパク質プロフィールの比較分析により、生物学系または疾患に関与するタンパク質の系統的試験が簡便となるため、病気の機序に関する新たな洞察が明らかにされ、新規標的が同定され、薬剤作用機序および毒性に関する情報が提供され、代用マーカーが同定され得る。プロテオーム試験により、病気の機序に関する重要な新規洞察が導かれ、新規治療薬を発見するための薬剤発見戦略が改良されると考えられる。
【０００３】
現在までのプロテオーム試験に関する最も一般的な技術プラットホームは、例えばＱｕａｄｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、２０：６６４−６７７で報告されている通り、タンパク質プロファイリングを目的とする二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動およびタンパク質分析および同定を目的とする質量分析の統合的使用である。正常または疾患状態の細胞または組織に由来するタンパク質混合物を、２Ｄ ＰＡＧＥで分離し、染色により視覚化する。示されたタンパク質の画像をコンピューターへデジタル走査後、画像の定量比較が行なわれ得る。次いで、独特なものであるスポットまたは差次的発現されているスポットが同定される。スポットの切除およびイン シチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）消化後、様々な質量分析技術を用いることにより、ペプチドフィンガープリントおよびペプチド配列情報が得られ、これらはタンパク質を同定するための配列データベースの検索に使用され得る。これらのタンパク質は疾患特異的であるため、各々が潜在的に薬剤発見のための新規標的となり得るかまたは病気マーカーとして使用され得る。
【０００４】
現時点で、２Ｄ−ＰＡＧＥは、依然として最も包括的なタンパク質呈示方法である。一次元目の分離用に固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップが導入されたため、２Ｄゲルは再現性が高いことが示されている。それは、数千のタンパク質を分離し得、銀または蛍光染料で染色すると、タンパク質発現の高感度定量方法が提供される。それにもかかわらず、この技術にはある種の欠点が依然として存在する。中でも主たる欠点は、それが全タンパク質成分、例えば膜タンパク質、極端なｐＩを有するタンパク質および低コピー数のタンパク質を呈示できないことである。不適当な分離能は、この技術に伴う別の落とし穴である。全スポットの２０〜４０％に至るものは、複数のタンパク質を含み得るため、タンパク質発現の定量的比較および実験結果の解釈を非常に難しくしている。過去数年にわたって大きく前進してきたが、２Ｄゲルを用いるプロテオミクスは、自動化およびスループットの点で依然として困難な技術として見なされている。２Ｄゲル電気泳動、染色、および画像分析は、プロセスが真に高スループットと呼ばれ得る以前の、完全自動化されずに残されている幾つかの工程に相当する。この技術に代わるもの、特に２Ｄゲルの使用に代わるものが、より優れたスループットおよびより高感度の達成を期待して探求されている。
【０００５】
２Ｄゲルを省く一方法では、多次元液相分離技術、例えばクロマトグラフィーおよび／または液中等電点電気泳動を使用することにより、タンパク質の混合物またはそれらの消化ペプチド産物を部分的に分離する（例えば、Ｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９４、５：９７６−９８９、ＭｃＣｏｒｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７、６９：７６７−７７６、Ｏｐｉｔｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７、６９：２２８３−２２９１、Ｏｐｉｔｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７、６９：１５１８−１５２４、Ｏｐｉｔｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９８、２５８：３４９−３６１、Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． １９８２、２３９：５６５−５７０、Ｉｓｏｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． １９９１、５８８：１１５−１２３、Ｗａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ２０００、７２：１０９９−１１１１、Ｊｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９９、７１：２０７６−２０８４、および Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９９、１２１：７９４９−７９５０に記載）。追加的分離能をもつ質量分析計（ＭＳ）は、単純化された混合物の同定に使用される。分離は液相で行なわれるため、自動化ポテンシャルはゲルに基く方針の場合よりかなり高い。分取的規模で進めると、試料ローディングは２Ｄ ＰＡＧＥで達成され得るものより著しく大きい。さらに、この方法は、最終分離タンパク質／ペプチドが溶解状態なので、２Ｄ−ゲル技術に伴うタンパク質／ペプチド回収損失を低減化させる。負の一局面は、２Ｄ−ゲル造影から得られる定量的情報がこれらの方法論ではまだ達成され得ないことである。
【０００６】
同位体希釈は、長い間生物学的物質における薬剤の定量分析に使用されてきた。構造が同位体の点で異なる内部標準を試料に加えることにより、特定化合物の正確な定量を達成する。内部標準であるため、変動事象、例えば試料調製中における試料損失、マトリックス効果、検出妨害などは、もはや正確な定量についての問題点ではない。同じ原理を相対タンパク質定量に適用するために、タンパク質標識または同位体標識方法の開発に向けての努力が為されてきた。タンパク質のプールの標識は、代謝的または化学的に実施され得る。タンパク質の差次的発現を評価するとき、一方は（重同位体により）標識され、他方はされていない（すなわち、天然、軽同位体による）、タンパク質の２つのプール（例、正常対疾患状態）を混合し、タンパク質分解し、分析する。
【０００７】
標識した場合およびしていない場合の、ペプチドシグナルの各対は、互いに内部標準となり、タンパク質差次的発現の定量比較を可能にする。ＭＳ分析から得られたペプチドフィンガープリントおよびペプチド配列情報はタンパク質の同定方法を提供しており、標識は２つの集団を区別し、あらゆるタンパク質について正確な定量を遂行する手段を提供する。したがって、タンパク質プロファイリング、定量、および同定が単一工程で遂行される。Ｏｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ１９９９、９６：６５９１−６５９６は、タンパク質を、１５Ｎ強化培養培地における細胞培養中に代謝的に標識する方法を立証している。また、同様の戦略が、例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２０００、７２：１１３４−１１４３の記載にしたがって細胞培養中に代謝的に達成されるタンパク質のアミノ酸特異的標識を介して適用され得る。Ｇｙｇｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９９９、１７：９９４−９９９は、同位体コードアフィニティータグ（ＩＣＡＴ）と呼ばれる化学的誘導体化スキームを開発することにより、全システイン含有タンパク質における標識を実施した。この方法により、相対タンパク質定量は、２つの同位体が異なる軽および重タグの使用により達成される。この方法は若干の細胞系で有効に適用されており、タンパク質発現の定量比較が達成された。標識におけるビルトイン式アフィニティータグは、システイン含有ペプチドのみを選択的に強化することによりペプチド混合物コンプレキシティーの低減化を可能としている。しかしながら、それはまた、非システイン含有タンパク質に関する情報およびタンパク質翻訳後修飾に関する情報を失う危険を有する。
【０００８】
データ分析は、これらの方法の場合単調で退屈なものであり得る。サブトラクティブ（消去式）分析の遂行により発現で大部分を変更しているタンパク質へ迅速に収束し得るビルトイン機構は存在しない。むしろ、軽および重タグの各ペプチド対を同定し、ランク付けを達成するためには先に相対定量を全タンパク質について遂行しなければならない。ダイナミックレンジはこれらの方法に伴う別の制限因子である。軽および重同位体の両タグによるペプチドからのシグナルは、タンパク質発現の正確な定量を達成するために定量的に検出されなければならない。対の一シグナルのみが検出される極端な状況では、シグナルは、化学的バックグラウンドとしてまたは高度に差次的発現されたタンパク質からではなく非システイン含有ペプチドからのものとして混同され得る。さらに、ここで述べられている標識方法は全て、特殊な試薬（注文製造の化学物質または同位体強化培養培地）および標識を導入するための余分な労力を必要とするもので、タンパク質分析実験室またはＭＳ実験室を容易に利用できない場合もあり得る。
【０００９】
上記方法は、複合タンパク質混合物における差次的発現タンパク質の同定および定量を可能にするが、これらの方法は、速度／スループット、感度、全タンパク質を包括する能力または発現の極端な変化またはタンパク質共有結合の変化を同定する能力に欠陥を有する。したがって、複合タンパク質混合物における様々な種類の差次的発現タンパク質を同定する方法であって、迅速で高スループット、高感度であり、タンパク質発現のあらゆる変化（定量的または定性的）を明白に同定し得る方法の提供が要望されている。
【００１０】
発明の要約
本発明は、複合タンパク質混合物内の差次的発現タンパク質の同定に使用される逆標識法と呼ばれる比較プロテオミクスに用いられる新規タンパク質標識実施方法に関するものである。特に、本発明方法は、２つの異なる試料、例えば異なる組織または細胞型、疾患または発達段階における差次的発現タンパク質の同定を可能にする。
【００１１】
下記に記載されている方法は、様々な種類の差次的発現タンパク質の迅速で、高スループット、高感度で信頼性があり、明白な同定法を提供するという点で現行方法固有の不利な点を克服する。
【００１２】
一態様では、タンパク質の集団を含む２つの異なる試料における差次的発現タンパク質の同定方法であって、
ａ）レファレンス試料および実験試料の各々から２つの等しいタンパク質プールを準備し、ｂ）タンパク質用の実質的に化学的には同一であって同位体が異なるタンパク質標識試薬によりタンパク質プールを標識し、ただしこの場合、レファレンスおよび実験プールの各々からの一プールを重同位体タンパク質標識試薬で標識することにより重同位体標識レファレンスプールおよび重同位体標識実験プールを準備し、そして残りのレファレンスおよび実験プールを軽同位体タンパク質標識試薬で標識することにより、軽同位体標識レファレンスプールおよび軽同位体標識実験プールを準備するものとし、ｃ）軽同位体標識レファレンスプールを、重同位体標識実験プールと合わせて、第一混合物を準備し、ｄ）重同位体標識レファレンスプールを、軽同位体標識実験プールと合わせて、第二混合物を準備し、ｅ）２つの混合物の各々から標識タンパク質を検出し、そしてｆ）第一および第二混合物で標識タンパク質について得られた標識パターンを比較するが、ここで、第一混合物におけるタンパク質の標識パターンと比較されている第二混合物におけるタンパク質の逆標識パターンは、２つの異なる試料における差次的発現タンパク質を示すものとする工程を含む方法が提供される。
【００１３】
別の態様では、タンパク質の集団を含有する２つの異なる試料において差次的発現タンパク質を同定する方法であって、ａ）レファレンス試料および実験試料の各々から２つの等しいタンパク質プールを準備し、ｂ）同位体標識水によるタンパク質プールの各々の標識中に各タンパク質プールをタンパク質分解し、ただしこの場合、レファレンスおよび実験プールの各々からの一プールを１８Ｏ−水で標識して１８Ｏ−標識レファレンスプールおよび１８Ｏ−標識実験プールを得、そして残りのレファレンスおよび実験プールを１６Ｏ−水で標識することにより、１６Ｏ−標識レファレンスプールおよび１６Ｏ−標識実験プールを得るものとし、ｃ）１６Ｏ−標識レファレンスプールを１８Ｏ−標識実験プールと合わせることにより、１６Ｏ−および１８Ｏ−標識ペプチドを含む第一混合物を準備し、ｄ）１８Ｏ標識レファレンスプールを１６Ｏ−標識実験プールと合わせることにより、１８Ｏ−および１６Ｏ−標識ペプチドを含む第二混合物を準備し、ｅ）２つの混合物の各々から標識ペプチドを検出し、そしてｆ）第一および第二混合物で標識ペプチドについて得られた標識パターンを比較するが、ここで、第一混合物におけるペプチドについて得られた標識パターンと比較されている第二混合物におけるペプチドについて得られた逆標識パターンは、ペプチドが起点とした差次的発現タンパク質を示すものとする工程を含む方法が提供される。
【００１４】
別の態様では、タンパク質の集団を含有する２つの異なる試料において差次的発現タンパク質を同定する方法であって、ａ）レファレンス試料および実験試料の各々から２つの等しいタンパク質プールを準備し、ｂ）タンパク質プールの各々におけるタンパク質をタンパク質分解することによりペプチドプールを準備し、ｃ）各ペプチドプールを同位体標識水で標識し、ここでレファレンスおよび実験プールの各々からの一ペプチドプールを１８Ｏ−水で標識して１８Ｏ−標識レファレンスペプチドプールおよび１８Ｏ−標識実験ペプチドプールを準備し、そして残りのレファレンスおよび実験ペプチドプールを１６Ｏ−水で標識することにより、１６Ｏ−標識レファレンスペプチドプールおよび１６Ｏ−標識実験ペプチドプールを得るものとし、ｄ）１６Ｏ−標識レファレンスプールを１８Ｏ−標識実験プールと合わせることにより、１６Ｏ−および１８Ｏ−標識ペプチドを含む第一混合物を得、ｅ）１８Ｏ標識レファレンスプールを１６Ｏ−標識実験プールと合わせることにより、１８Ｏ−および１６Ｏ−標識ペプチドを含む第二混合物を得、ｆ）２つの混合物の各々から標識ペプチドを検出し、そしてｇ）第一および第二混合物で標識ペプチドについて得られた標識パターンを比較するが、ここで、第一混合物におけるペプチドについて得られた標識パターンと比較されている第二混合物におけるペプチドについて得られた逆標識パターンは、ペプチドが起点とした差次的発現タンパク質を示すものとする工程を含む方法が提供される。
【００１５】
さらに別の態様では、タンパク質の集団を含む２つの異なる試料における差次的発現タンパク質の同定方法であって、ａ）レファレンス試料および実験試料の各々から２つの等しいタンパク質プールを準備し、ただしこの場合、レファレンスおよび実験プールの各々からの一プールを、重同位体標識同化性供給源を含む培養培地中での培養により製造して重同位体標識レファレンスプールおよび重同位体標識実験プールを準備し、そして残りのレファレンスおよび実験プールを、軽同位体標識同化性供給源を含有する培養培地中での培養により製造して軽同位体標識レファレンスプールおよび軽同位体標識実験プールを準備するものとし、ｂ）軽同位体標識レファレンスプールを、重同位体標識実験プールと合わせて、第一タンパク質混合物を準備し、ｃ）重同位体標識レファレンスプールを、軽同位体標識実験プールと合わせて、第二タンパク質混合物を準備し、ｄ）２つの混合物の各々から標識タンパク質を検出し、そしてｅ）第一および第二混合物で標識タンパク質について得られた標識パターンを比較するが、ここで、第一混合物におけるタンパク質の標識パターンと比較されている第二混合物におけるタンパク質の逆標識パターンは、２つの異なる試料における差次的発現タンパク質を示すものとする工程を含む方法が提供される。
【００１６】
図面の簡単な記載
図１．マーカー／標的タンパク質を迅速に同定するための逆標識方法。説明を目的とするため、２つのタンパク質プールで未変化のまま残るタンパク質が等しい存在量で示されている。（実際に、それらは必ずしも等しい存在量で存在するとは限らない。むしろ、それらは１ではない一定比で存在し得る）（タンパク質の）タンパク質分解的１８Ｏ標識法は、説明を目的としてこの概略図では使用されている。
【００１７】
図２．逆１８Ｏ標識ＢＳＡトリプシンペプチドの液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）検出法。（Ａ）：１６Ｏ−対照−１８Ｏ−「処理」試料のＭＳ、（Ｂ）：１８Ｏ−対照−１６Ｏ−「処理」試料のＭＳ、（Ｃ）：（Ａ）におけるペプチドのＭＳ／ＭＳ、および（Ｄ）：（Ｂ）におけるペプチドのＭＳ／ＭＳ。最も豊富な同位体イオンについての（Ａ）および（Ｂ）間の２−Ｄａ質量シフトは、タンパク質の顕著な差次的発現を示す。さらに質量シフトは、全Ｙイオンの２−ＤａシフトによりＭＳ／ＭＳスペクトル（Ｃ）および（Ｄ）で証明／確認されており、これはまたＹイオンおよびＢイオンの同定に役立つため、スペクトルの解釈においても助けとなる。ＢＳＡタンパク質は、Ｙイオンを用いたデータベース検索から独占的に同定される（２−Ｄａシフトを伴うもの）。
【００１８】
図３．逆１８Ｏ−標識アルドラーゼトリプシンペプチドのＬＣ／ＭＳ検出法。（Ａ）：１６Ｏ−対照−１８Ｏ−「処理」試料のＭＳ、（Ｂ）：１８Ｏ−対照−１６Ｏ−「処理」試料のＭＳ、（Ｃ）：（Ａ）におけるペプチドのＭＳ／ＭＳ、および（Ｄ）：（Ｂ）におけるペプチドのＭＳ／ＭＳ。最も豊富な同位体イオンについての（Ａ）および（Ｂ）間の４−Ｄａ質量シフトは、タンパク質の顕著な差次的発現を示す。さらに質量シフトは、全Ｙイオンの４−ＤａシフトによりＭＳ／ＭＳスペクトル（Ｃ）および（Ｄ）で実証／確認されており、これはまたＹイオンおよびＢイオンの同定に役立つため、スペクトルの解釈においても助けとなる。アルドラーゼタンパク質は、Ｙイオンを用いたデータベース検索から独占的に同定される（４−Ｄａシフトを伴うもの）。
【００１９】
図４．８−タンパク質混合物の逆 １８Ｏ−標識トリプシン消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ検出。（Ａ）：１６Ｏ−対照−１８Ｏ−「処理」試料、（Ｂ）：１８Ｏ−対照−１６Ｏ−「処理」試料、（Ｃ）：（Ａ）（上方）および（Ｂ）（下方）におけるＢＳＡペプチドＭＨ＋１５６７．９の一同位体パターン、および（Ｄ）：（Ａ）（上方）および（Ｂ）（下方）におけるアルドラーゼペプチドＭＨ＋２１０７．３の一同位体パターン。質量シフトまたは１６Ｏ−／１８Ｏ−強度比の逆転は、タンパク質の差次的発現：ＢＳＡの「ダウンレギュレーション」およびアルドラーゼの「アップレギュレーション」を示す。
【００２０】
図５．逆 １８Ｏ−標識アルドラーゼトリプシンペプチドＭＨ＋２１０７．３のＭＡＬＤＩ ＰＳＤスペクトル。（Ａ）：１６Ｏ−対照−１８Ｏ−「処理」試料の場合、および（Ｂ）：１８Ｏ−対照−１６Ｏ−「処理」試料の場合。図４（Ｄ）において分子イオンで観察された４−Ｄａ質量シフトは、全Ｙイオンの４−ＤａシフトによりＰＳＤスペクトルでさらに実証／確認される。これはまた、ＹイオンおよびＢイオンを同定するのに役立つことから、ＰＳＤスペクトルの解釈においても助けとなる。アルドラーゼタンパク質は、Ｙイオンを用いるデータベース検索から独占的に同定される（４−Ｄａシフトを伴うもの）。
【００２１】
図６．ＰＴＰ（プロテインチロシンホスファターゼ）−１ＢによりスパイクしたＣＨＯ細胞ライゼートからのＰＴＰトリプシンペプチドのＬＣ／ＭＣ検出。（Ａ）：１６Ｏ−ＰＴＰ１０−１８Ｏ−ＰＴＰ３０試料のＭＳ、（Ｂ）：１８Ｏ−ＰＴＰ１０−１６Ｏ−ＰＴＰ３０試料のＭＳ、（Ｃ）：挿入図（Ａ）におけるペプチドのＭＳ／ＭＳ、および（Ｄ）：挿入図（Ｂ）におけるペプチドのＭＳ／ＭＳ、ただし、ＰＴＰ１０は、１０ｐｍｏｌのＰＴＰ−１Ｂによりスパイクされた０．２５ｍｇのＣＨＯ細胞ライゼートであり、ＰＴＰ３０は、３０ｐｍｏｌのＰＴＰ−１Ｂでスパイクされた０．２５ｍｇＣＨＯ細胞ライゼートである。スパイク後、タンパク質混合物をタンパク質分解し、それに続いて逆１８Ｏ−標識し、２つの混合物ＡおよびＢを形成させる。最も豊富な同位体イオンについての（Ａ）および（Ｂ）（挿入図）間の４−Ｄａ質量シフトは、タンパク質の顕著な「差次的発現」を示している。さらに質量シフトは、全Ｙイオンの４−ＤａシフトによりＭＳ／ＭＳスペクトルで実証／確認されており、これはまたＹイオンおよびＢイオンの同定に役立つため、ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈においても助けとなる。ＰＴＰ−１Ｂタンパク質は、Ｙイオンを用いたデータベース検索から独占的に同定される（４−Ｄａシフトを伴うもの）。
【００２２】
図７．逆１５Ｎ−標識２−タンパク質系のトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ検出であり、ＰＴＰタンパク質は「処理」試料で３倍アップレギュレーションされている。（Ａ）：１４Ｎ−対照−１５Ｎ−「処理」試料、（Ｂ）：１５Ｎ−対照−１４Ｎ−「処理」試料。下方パネルは選択的ズームインｍ／ｚ領域である。
【００２３】
図８．逆１５Ｎ−標識２−タンパク質系のトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ検出であり、ＰＴＰタンパク質は「処理」試料で１００倍ダウンレギュレーションされている。（Ａ）：１４Ｎ−対照−１５Ｎ−「処理」試料、（Ｂ）：１５Ｎ−対照−１４Ｎ−「処理」試料。下方パネルは選択的ズームインｍ／ｚ領域である。
【００２４】
図９．逆１５Ｎ−標識２−タンパク質系のトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ−ＭＳ／ＭＳ検出であり、ＰＴＰタンパク質は「処理」試料で３倍ダウンレギュレーションされている。（Ａ）：１４Ｎ−対照−１５Ｎ−「処理」試料のＭＳ、（Ｂ）：１５Ｎ−対照−１４Ｎ−「処理」試料のＭＳ、（ａ）２つのＬＣ／ＭＳ−ＭＳ−ＭＳラン（実行）の基準ピークイオンクロマトグラム、（ｂ）逆標識パターン（質量シフト）を示す（ａ）におけるペプチドのＭＳスペクトル、および（ｃ）（ｂ）（二重荷電イオンで）におけるペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル。ＰＴＰタンパク質は、１４Ｎ−ペプチドのＭＳ／ＭＳデータ（上方（ｃ））を用いたデータベース検索から独占的に同定される。
【００２５】
図１０．ＰＴＰタンパク質でスパイクした逆１５Ｎ−標識藻類細胞ライゼートのトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ−ＭＳ／ＭＳ検出であり、ＰＴＰは「処理」試料で３倍ダウンレギュレーションされている。（Ａ）：１４Ｎ−対照−１５Ｎ−「処理」試料のＭＳ、３分ＬＣ／ＭＳウインドーにおいて平均化したスペクトル、（Ｂ）：１５Ｎ−対照−１４Ｎ−「処理」試料のＭＳ、３分ウインドーにおいて平均化したスペクトル、（Ｃ）：（Ａ）ｍ／ｚ６２３．５におけるペプチドのＭＳ／ＭＳ、および（Ｄ）：（Ｂ）ｍ／ｚ６３１．３におけるペプチドのＭＳ／ＭＳ、ただし、１４Ｎ−対照は、１０ｐｍｏｌのＰＴＰ−１Ｂでスパイクした０．０５ｍｇ１３Ｃ−藻類タンパク質であり、１５Ｎ−対照は、１０ｐｍｏｌの１５Ｎ−ＰＴＰでスパイクした０．０５ｍｇ１３Ｃ−１５Ｎ−藻類タンパク質であり、１４Ｎ−「処理」は、０．３ｐｍｏｌのＰＴＰ−１Ｂでスパイクした０．０５ｍｇ１３Ｃ−藻類タンパク質であり、１５Ｎ−「処理」は、０．３ｐｍｏｌの１５Ｎ−ＰＴＰでスパイクした０．０５ｍｇ１３Ｃ−１５Ｎ−藻類タンパク質である。（Ａ）および（Ｂ）間の質量シフトまたは逆標識パターンは、印を付けたイオン（＊）で観察された。逆標識または差次的発現は、それらの類似フラグメント化パターンによりＭＳ／ＭＳスペクトルでさらに実証／確認されている。ＰＴＰ−１Ｂタンパク質は、１４Ｎ−ペプチドのＭＳ／ＭＳデータ（Ｃ）を用いるデータベース検索から独占的に同定されている。
【００２６】
図１１．逆ＩＣＡＴ標識６−タンパク質系のトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ検出。（Ａ）：Ｄ０−対照−Ｄ８−「処理」試料、（Ｂ）：Ｄ８−対照−Ｄ０−「処理」試料。下方パネルは、選択的ズームインｍ／ｚ領域である。質量シフトまたはＤ０−／Ｄ８−強度比逆転は、タンパク質の差次的発現を示す。
【００２７】
図１２．逆ＩＣＡＴ標識６−タンパク質系のトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ検出。（Ａ）：Ｄ０−対照−Ｄ８−「処理」試料の基準ピークイオンクロマトグラム、（Ｂ）：Ｄ８−対照−Ｄ０−「処理」試料の基準ピークイオンクロマトグラム。質量シフトの特徴的な逆標識パターンのシグナルが明確に検出されている。差次的発現タンパク質は、それらのＭＳデータを用いて迅速に同定される。
【００２８】
発明の記載
ここに引用されている全ての特許出願、特許および参考文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００２９】
タンパク質（複数を含む）に関する「差次的（に）発現された」の語は、発現レベルの定量的変化および定性的変化、例えば共有結合変化、例えば翻訳後修飾、例えばタンパク質リン酸化、タンパク質グリコシル化、タンパク質アセチル化およびタンパク質のＣ−またはＮ−末端のタンパク質プロセッシングをいう。
【００３０】
本明細書で使用されている「試料」の語は、その最も広い意味で使用されている。適切な試料には、細胞ホモジネート、細胞分画、組織ホモジネート、生物学的流体、例えば血液、尿、および髄液、涙液、糞、唾液および洗浄液、例えば肺または腹膜洗浄液があるが、これらに限定されるわけではない。
【００３１】
「安定同位体」の語は、元素の非放射性同位体形態をいう。
【００３２】
「放射性同位元素」の語は、放射能、すなわちガンマ線または原子より小さい粒子（例、アルファおよびベータ線）を自然放射する複数の核の特性を呈する元素の同位体形態をいう。
【００３３】
「軽同位体タンパク質標識試薬」の語は、軽い元素形態、例えばＨ、１２Ｃ、１４Ｎ、１６Ｏまたは３２Ｓを取込んだタンパク質標識試薬をいう。
【００３４】
「重同位体タンパク質標識試薬」の語は、重い元素形態、例えば２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏまたは３４Ｓを取込んだタンパク質標識試薬をいう。軽同位体および重同位体タンパク質標識試薬はまた、それぞれ非標識および標識試薬として本明細書では称されている。
【００３５】
「逆標識パターン」の語は、定性的質量シフトまたは同位体ピーク強度比逆転、すなわち２つの逆標識混合物間において、重標識シグナルがより強い状態から、軽標識シグナルがより強い状態へ（またはその逆）のシフトが検出されることを意味する。
【００３６】
本発明はまた、逆標識法として知られる比較プロテオミクスのための新規タンパク質標識実行方法に関するものであり、例えば病状または薬剤処置、潜在的毒性物質との接触、または環境（例、栄養レベル、温度、時間経過）の変化の結果としての、マーカーまたは標的タンパク質、摂動時に発現レベルが顕著に変化したものまたは摂動時に共有結合変化が生じたものの迅速な同定を可能にする。差次的発現タンパク質の迅速な同定法は、新たな疾患機序の暴露、薬剤作用機序の解明および薬剤毒性試験に向けて適用され得る。この方法は、各々タンパク質の集団を含む２つの異なる試料について２つの逆変換共同標識実験を並行して遂行する工程を含む。これら２つの異なる試料をレファレンスおよび実験試料と称す。これらの試料は、細胞型、組織型、オルガネラ型、生理学的状態、病状、発達段階、環境または栄養状態、化学的または物理的刺激因子または時間経過が異なり得る。例えば、レファレンスおよび実験試料は、正常細胞および癌細胞、薬剤を用いない処置および薬剤による処置などのそれぞれ典型となり得る。
【００３７】
本方法は、レファレンスおよび実験試料の各々から２つの等しいタンパク質プールを準備する工程を含む。次いで、各タンパク質プールをタンパク質標識試薬で標識するが、これは、重または軽同位元素を取込むことにより質量で区別されるという点以外、実質的には化学的に同一である。同位体は、安定同位体または放射性同位元素であり得る。安定同位体は時間が経過しても安定しているため取り扱いによる変化を最小限にすることから、より正確な定量的測定結果を提供し、放射性同位元素よりも環境的に安全であるため、タンパク質標識試薬へ安定同位体を取込ませるのが好ましい。
【００３８】
タンパク質プールの標識に関して、レファレンスおよび実験試料の各々からの一タンパク質プールを、重同位体タンパク質標識試薬で標識することにより、重同位体標識レファレンスプールおよび重同位体標識実験プールを準備する。レファレンスおよび実験試料の各々からの残りのプールを、軽同位体タンパク質標識試薬で標識することにより、軽同位体標識レファレンスプールおよび軽同位体標識実験プールを準備する。
【００３９】
タンパク質標識試薬は、タンパク質の標識に使用されるのに適切なものであればいかなる試薬でもよい。同位体は試薬に含まれるため、タンパク質中に取込まれる。標識は、化学的、代謝的、タンパク質分解的または同位体をタンパク質へ取込ませるのに適切な他の手段により達成され得る。
【００４０】
一態様において、タンパク質標識試薬は、タンパク質の特定官能基、すなわちタンパク質の化学的標識と反応する基を含む試薬であり得る。タンパク質標識試薬の反応基の例には、スルフヒドリル基、アミノ基、カルボン酸基、エステル基、燐酸基、アルデヒドおよびケトン基などと反応するものがある。チオール反応基の例には、ニトリル、スルホン化アルキルまたはアリールチオール、マレイミド、エポキシドおよびアルファハロアシル基があるが、限定されるわけではない。アミノ反応基の例には、イソシアネート、イソチオシアネート、活性エステル類、例えばテトラフルオロフェニルエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホニルハライド、酸無水物および酸ハライドがあるが、限定されるわけではない。カルボン酸反応基の例には、カップリング剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下におけるアミンまたはアルコール類、または２，３，５，６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートがあるが、限定されるわけではない。エステル反応基の例には、ホモセリンまたはラクトンと反応するアミン類があるが、これらに限定はされない。リン酸反応基の例には、金属、例えばＦｅ（ＩＩＩ）またはＧａ（ＩＩＩ）がニトロトリ酢酸またはイミノジ酢酸にキレート化されているキレート化金属があるが、限定されるわけではない。アルデヒドまたはケトン反応基には、アミン類およびＮａＢＨ４またはＮａＣＮＢＨ４、例えばＲ．ＬｕｎｄｂａｌｄによるＣｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）に記載されたものがあるが、これらに限定はされない。
【００４１】
特に有用なタイプの一タンパク質標識試薬は、アフィニティータグ含有試薬である。特定種類のタンパク質、例えばリン酸基を含むものがアフィニティー精製にかけられ得、それで望ましくないタンパク質を排除し得ることにより、タンパク質プールのコンプレキシティーを低減化させ、さらに特定種類のタンパク質を濃化し得るという点で、アフィニティータグ含有試薬の使用は特に有利である。さらに、上記アフィニティータグ含有試薬はまた、不和合性であるかまたは質量分析法による特異タンパク質の同定を遮蔽する望ましくない汚染物質を排除し得る。例えば、上記タンパク質プールは、重同位体および軽同位体ビオチン含有タンパク質標識試薬によりビオチニル化され得る。次いで、タンパク質プールに存在するビオチニル化標識タンパク質は、ビオチン−アビジンクロマトグラフィーにより精製され得る。同じ原理を標識タンパク質混合物のタンパク質分解後のペプチドに適用することにより、特定種類のペプチドを濃化するかまたは混合物コンプレキシティー、すなわち質量分析法による特異タンパク質の同定に対する潜在的干渉を低減化し得る。
【００４２】
タンパク質標識剤で修飾されたタンパク質またはペプチドの選択的分離用アフィニティータグは、同位体取込みと同時に、またはタンパク質同位体標識前または後の別の反応で導入され得る。Ｇｙｇｉ ｅｔ ａｌ（前出）により報告された同位体コートアフィニティータグ（ＩＣＡＴ）試薬として知られている特異的アフィニティータグ試薬の場合、ビオチンアフィニティータグは、タンパク質標識試薬の一部であるため、同位体標識と同時に導入される。Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌおよび Ｓｈａｌｅｒ ｅｔ ａｌ、２００１、第４９回ＡＳＭＳコンファレンス・オン・マス・スペクトロメトリー・アンド・アライド・トピックス（シカゴ、イリノイ）によると、両方ともアミノ酸特異的化学作用による同位体標識前に導入されるアフィニティータグについて報告している。例えばＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ、前出で報告されている通り開裂可能なタグを使用する場合、タグ含有タンパク質／ペプチドのアフィニティー濃化後、同位体標識が、一般的修飾スキーム、例えばＮ−末端アシル化、Ｃ−末端エステル化、またはシステイン化学作用を通して導入され得る。アフィニティータグ付けはまた、同位体標識後に行われ得る。上記例には、一般的標識手順、例えばＮ−末端アシル化、Ｃ−末端エステル化、または他の非化学的標識方法、例えばＣｏｎｒａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１、７３：２１３２−２１３９に記載された例えば代謝的１５Ｎ−標識法を行った後、システイン特異的ビオチニル化試薬を用いてシステイン含有タンパク質／ペプチドを反応およびプールアウトさせる工程が含まれる。
【００４３】
タンパク質差次的発現を試験するため異なる試料に由来するタンパク質を標識するのに使用されてきた特異的アフィニティータグ含有タンパク質標識試薬の一例は、例えばＧｙｇｉ ｅｔ ａｌ．，前出、およびＷＯ００／１１２０８で報告されているＩＣＡＴ試薬である。ＩＣＡＴ試薬の構造は、３つの基本的エレメント：１）ビオチンアフィニティータグ、２）Ｈまたは２Ｈを取込んだリンカーおよび３）タンパク質反応基、例えばスルフヒドリル反応基により構成される。ＩＣＡＴ方法では、還元タンパク質試料における、アミノ酸残基、例えばシステイニル残基の側鎖を、ＩＣＡＴ試薬の軽同位体形態で修飾する。第２タンパク質試料における同基をＩＣＡＴ試薬の重同位体形態で修飾する。２標識タンパク質試料を合わせ、次いでタンパク質分解してペプチドフラグメントを得、その幾つかを標識する。標識（システイン含有）ペプチドをアビジンアフィニティークロマトグラフィーにより単離し、次いで、分離し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する。ＩＣＡＴ試薬の一例は、例えばＷＯ００／１１２０８で報告されているアフィニティー精製用のビオチン基、マススペクトル分析用に安定同位体で同位体標識され得る化学的不活性スペーサーおよびタンパク質のスルフヒドリル基との反応用のヨードアセトアミジル基から成るビオチニル−ヨードアセチルアミジル−４，７，１０トリオキサトリデカンジアミンである。同様の戦略は、タンパク質についての異なる反応基を含む他の試薬の使用に適用され得る。
【００４４】
別の態様において、タンパク質標識試薬は、例えばタンパク質プールの代謝的標識により、タンパク質に取込まれ得る試薬であり得る。例えば、レファレンスおよび実験試料からのタンパク質プールは、限定されるわけではないが、アンモニウム塩類（例、塩化アンモニウム）、グルコース、または水を含む重または軽同位体標識同化性供給源、または１個またはそれ以上の重または軽同位体標識アミノ酸、例えばシステイン、メチオニン、リシン等を含有する培養培地での培養により、重または軽同位体、例えばそれぞれ１５Ｎおよび１４Ｎ、１３Ｃおよび１２Ｃ、２ＨおよびＨ、または３５Ｓおよび３２Ｓを取込んだ標識タンパク質を提供する異なる細胞型を表し得る。
【００４５】
特に有用な態様では、例えば Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９８３、２１５：２７３−２７７、および Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９８８、２５０：２５３−２５９に報告され、下記で詳述されている通り、タンパク質標識試薬、１８Ｏ−および１６Ｏ−標識水により行なわれるタンパク質分解の直接結果としてタンパク質が標識される。
【００４６】
プールの標識が一旦完了すると、軽同位体レファレンスプールを、重同位体標識実験プールと合わせることにより、第一混合物を準備する。次いで、重同位体標識レファレンスプールを軽同位体標識実験プールと合わせることにより、第二混合物を準備する。したがって、第一混合物では、重同位体標識タンパク質は実験プールに由来し、第二混合物では、重同位体標識タンパク質はレファレンスプールに由来する。同位体標識を通して、レファレンスおよび実験試料における同一タンパク質が質量で区別され、適切な技術、例えば質量分析技術によりそれらの独立した検出および２試料間の定量的比較が可能となる。
【００４７】
第一および第二混合物におけるタンパク質は、好ましくは、プロテアーゼ類、例えばトリプシン、化学物質、例えば臭化シアン、または希酸、例えば塩化水素を用いることにより酵素的または化学的にペプチドへ開裂される。好ましくは、標識タンパク質をトリプシンで消化する。各タンパク質溶液に加えられる典型的なトリプシン：タンパク質比（ｗｔ：ｗｔ）は、約１：２００〜約１：２０の範囲である。消化は、約３７℃で約２〜約３０時間続行され得る。タンパク質からペプチドへの消化はまた、下記でさらに詳述されているようにレファレンスおよび実験試料のタンパク質プールの各々の標識前または間に実施され得る。小タンパク質を分析する場合には、消化工程は除かれ得る。
【００４８】
次いで、第一および第二混合物から消化された標識ペプチドまたは標識タンパク質は、レファレンスおよび実験試料から誘導された同位体標識ペプチドまたは標識タンパク質間における質量の差異を検出し得る適切な技術により検出される。好ましくは、下記の公知分画技術を当業界では公知であるＭＳ技術と結び付けることにより消化された標識ペプチドまたは標識タンパク質を分離し、それに続いて分析する。若干のＭＳおよびタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）技術が利用可能であり、ペプチドの検出に使用され得るが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化ＭＳ（ＭＡＬＤＩ／ＭＳ）およびエレクトロスプレーイオン化ＭＳが好ましい。分離標識ペプチドまたは分離標識タンパク質の定量的比較は、重および軽同位体標識タンパク質試薬で標識されている同一配列を有するペプチドまたはタンパク質イオンについての相対シグナル強度により反映される。化学的に同一のペプチドまたはタンパク質対は、クロマトグラフィーにより共溶離または接近して溶離し、質量が異なるため、それらは質量分析走査中に容易に視覚化される。タンパク質の発現がアップまたはダウンレギュレーションされた場合、すなわち軽同位体および重同位体のシグナル強度における真のシフトが第一混合物で観察される場合、逆標識故に第二混合物の分析においては当然逆が観察される。タンパク質の発現が摂動後に未変化のままである場合、第一および第二混合物間の標識パターンに顕著な差異は無い。したがって、逆標識法によると、差次的発現タンパク質同定についての先行技術の同位体標識方法で実施されるようにあらゆるペプチドについて軽同位体対重同位体シグナルの比を定量的に計算するのではなく、２つのデータセットは容易に比較され、差次的発現タンパク質を示す上記定性的変化のペプチドが迅速に同定される。
【００４９】
選択的質量分析検出法はまた、一般的標識スキーム後、例えばＷｉｌｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． １９９６、６８：５２７に記載されたホスホペプチドまたはグリコペプチドの検出についての前駆イオン走査により、ペプチドの特定基を選択的に検出するのに使用され得る。
【００５０】
１個またはそれ以上の標識小タンパク質または標識ペプチドの配列は、標準的技術、例えばタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）またはポストソース分解（ＰＳＤ）により決定される。差次的発現タンパク質から誘導されたペプチド配列の少なくとも一つは、そのタンパク質およびレファレンスおよび実験試料におけるその存在を示している。さらに、ペプチドフラグメントデータはＭＳにより生成され得る。それに続いて、ペプチドフィンガープリントまたはペプチド配列情報のＭＳにより生成されたデータを用いることにより、タンパク質同定のためのタンパク質データベースが検索され得る。
【００５１】
下記で例証されている本方法の特に好ましい態様では、レファレンスおよび実験試料のタンパク質プールを、１８Ｏ−および１６Ｏ−水で標識する前またはそれと同時にトリプシンを用いてタンパク質分解する。一１８Ｏ−原子および一１６Ｏ−原子が、タンパク質分解中の加水分解の結果として新たに形成されたカルボキシ末端に取込まれる。追加の１８Ｏおよび１６Ｏは、例えば Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８、前出で記載されているプロテアーゼ触媒交換機構を通して末端カルボキシ基に取込まれ得る。すなわち、トリプシンによる消化後、Ｃ−末端にＬｙｓまたはＡｒｇを欠くＣ−末端ペプチド以外の生成したペプチドは全て、Ｃ−末端が１個または２個の１８Ｏ−および１６Ｏ−原子で標識される（交換に充分な時間がとれる場合はたいてい２個）。主に高価な１８Ｏ−水を節約して使用するため、１８Ｏ−標識のタンパク質分解中およびタンパク質分解後の両取込みについて調査した。先の試験によると、１８Ｏ−標識は、プロテアーゼ触媒交換を通してペプチドのＣ−末端カルボキシ基に取込まれ得る。（例えば、Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ、１９８８、前出、および Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９６、１７：９４５−９５３参照）これは、タンパク質を１８Ｏ−水中で消化したとき非Ｃ−末端ペプチドの大多数に複数の１８Ｏ原子が取込まれたことが見出される観察結果により確認される。タンパク質分解（トリプシンを追加または追加せず）後完全乾燥ペプチド混合物にごく小量の１８Ｏ−水（〜１０μｌ）を加え、室温で５〜１２時間交換させることにより、同レベルの１８Ｏ−取込みがタンパク質分解中標識の取込みとして達成される。
【００５２】
体積の減少が問題となるタンパク質またはタンパク質混合物を扱う場合、タンパク質分解後標識は非常に有利であり得る。タンパク質分解後標識をすることにより、消化は、通常の方法で標準水緩衝液、細胞ライゼートまたは膜タンパク質において実施され得、濃縮中におけるタンパク質沈澱や標識のため圧倒的１８Ｏ−環境に到達させるための大量の高価な１８Ｏ−水の使用について心配することがない。一旦タンパク質がペプチドにタンパク質分解されると、濃縮および沈澱は通常大した問題ではなくなり、プロテアーゼ触媒交換を介した標識プロセスはごく小量の１８Ｏ−水を用いて実施され得る。タンパク質分解後標識が非常に有用であることが立証され得る別の領域は、ゲル中消化によるゲル分離タンパク質で１８Ｏ−標識実験を行う場合である。タンパク質分解後１８Ｏ−標識を実施することにより、標識が乾燥した抽出ペプチドで行なわれるため、必要とされる１８Ｏ−水の量は実質的に低減化される。対照的に、タンパク質分解中標識するためのゲルで標識を遂行するが、その場合膨張したゲル片を全て覆うのに充分な１８Ｏ−水を使用しなければならない。
【００５３】
大きさが３０００Ｄａ以下のペプチドに関する理論的計算値は、２実験間のペプチドについての特徴的な１６Ｏ−／１８Ｏ−強度逆転または質量シフトの明白で信頼できる観察結果を得るためには、タンパク質発現における２．５倍またはそれより高率の変化が要求され得ることを示している。したがって、下記で例証されている２つのモデル系では、３倍の値が使用に選択されている。両場合とも、特徴的な逆標識パターンのペプチドが明白に検出され、データにより、予測されたタンパク質はデータベースから独占的に同定されている。現実に、典型的には発現レベルの２倍またはそれより高率の差異を伴うタンパク質差次的発現は、統計的に有意であるとみなされる。例えば、Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １９９９、４：５５−６２に記載されている通り、罹患および正常哺乳類材料に関連する典型的なプロテオミクス分析では、５０〜３００の上記特有または差次的発現タンパク質が同定され得る。タンパク質変化における例えば５倍またはそれ以上のカットオフ値は、最重要タンパク質に焦点を絞る場合に適用され得る。
【００５４】
タンパク質またはペプチドレベルでの追加的分画スキームは、レファレンスおよび実験試料におけるタンパク質のコンプレキシティーを低減化するために必要とされ得、そして質量分析計にかけられるタンパク質混合物またはペプチド混合物のコンプレキシティーを低減化することにより、分離ペプチドおよび小タンパク質の干渉の機会が低減化され、すなわち逆標識パターンの明白な検出およびタンパク質の同定が達成され得る。タンパク質混合物のコンプレキシティーを低減化させる慣用的分画技術には、硫酸アンモニウム沈澱、等電点電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、限外濾過、免疫沈降およびそれらの組合わせがあるが、これらに限定はされない。ペプチド混合物のコンプレキシティーを低減化させる慣用的分画技術には、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降およびそれらの組合わせがあるが、これらに限定はされない。例えば、一般的標識スキーム後に包括的アフィニティー手順を適用することにより、特定種類のペプチドを単離し得る。例えばＣｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，および Ｒｅｇｎｉｅｒ、２００１、Ｔｈｅ ４９ｔｈ ＡＳＭＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｔｏｐｉｃｓ（シカゴ、イリノイ）で報告されている通り、上記例には、ホスホペプチドを濃化するための固定化金属アフィニティーカラム（ＩＭＡＣ）の使用、およびグリコシル化ペプチドを単離するためのＣｏｎＡビーズの使用がある。
【００５５】
逆標識方法は、図１の概略図に示されている。この方法では、差次的比較されるべき２つのタンパク質プール（例、対照対罹患状態）の各々を、２つの等しい分量に分ける。２つのプールの各々からの一分量を、上記方法により例えば重同位体、例えば１８Ｏ含有試薬で標識し、残りの分量については標識せず、すなわち軽同位体、例えば１６Ｏで標識する（図１）。次いで、第一実験では標識タンパク質が摂動プールから誘導され、第二実験では標識タンパク質が対照プールから誘導されるように、対照からの分量および摂動したものからの分量を合わせる。タンパク質の発現が摂動により顕著にアップまたはダウンレギュレーションされた（すなわち、１６Ｏおよび１８Ｏのシグナル強度の真のシフトが一分析で観察される）場合、逆標識故に他の試料分析でも当然逆転が観察される。
【００５６】
図１で描かれているところによると、差次的発現タンパク質の迅速な同定は、特徴的な逆標識パターンを呈するタンパク質に由来するペプチドの迅速な同定により達成される。たいていのタンパク質の場合、それらの発現レベルは摂動後も未変化のままであり、それはプール１およびプール２の類似存在量プロフィールにより反映されている。したがって、２つの逆標識実験間の標識パターンに顕著な差異は無く（すなわち、両実験における１６Ｏ−および１８Ｏ−シグナルの存在量は類似している）、これらのシグナルは、原則として、２つのデータセットの比較分析によりサブトラクションされ得る。１８Ｏ−標識を伴わないＣ−末端ペプチドも同様にサブトラクションされる。発現レベルが摂動により顕著にアップまたはダウンレギュレーションされたタンパク質の場合、１６Ｏ−および１８Ｏ−シグナル強度の変化が観察される。
【００５７】
対照が標識されておらず、摂動された方が１８Ｏ−標識されているとき、タンパク質がアップレギュレーションされていれば、１８Ｏ−シグナルはより大きな強度を有する。逆に、ダウンレギュレーションが行なわれた場合、１６Ｏ−シグナルがより強くなる。標識が逆にされている第二分析ではその逆が観察される。２分析間の強度比逆転の方向により、タンパク質差次的発現の方向（すなわち、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）が決定され得る。例えば、タンパク質が、対照プール１と比べプール２における罹患状態により実質的にアップレギュレーションされている場合、そして罹患試料が１８Ｏ−標識されているとき、Ｃ−末端ペプチド以外のこのタンパク質からのペプチド全てについて１８Ｏ−シグナルのより高い強度が観察される。対照プールが１８Ｏ−標識され、罹患プールが標識されていない第二実験で標識が逆にされているとき、１６Ｏ−シグナルは、それらのペプチドについてはさらに強くなる。
【００５８】
すなわち、２つの逆標識実験間にはさらに強い同位体イオンの２／４Ｄａ下方質量シフト（すなわち、第一実験における１８Ｏ−シグナルから第二実験における１６Ｏ−シグナルへ）が存在する。実際に、質量の高い（例、１３００Ｄａまたはそれより大）ペプチドの場合、最強イオンに関する２分析間の質量シフトは、タンパク質差次的発現が１３Ｃ−効果を省けるほどには顕著でないとき１３Ｃ−干渉故に２／４Ｄａではなく１／３Ｄａとして検出され得る。ここで最も強い同位体イオンの質量シフトは、強度比逆転を反映している。この手順により、あらゆるペプチドについての１６Ｏ−対１８Ｏ−シグナルの比を定量的に計算するのではなく、２つのデータセットを比較し、特徴的な質量シフトのペプチドを同定するだけでよく、これは迅速かつおそらくは自動的に達成され得る。シフトの方向は、実施されたタンパク質のアップ−またはダウン−レギュレーションに影響を与える。
【００５９】
差次的発現タンパク質の同定において、適切な標識方法を用いる逆標識方法により、下記の通り質量分析法を用いる他の先行技術方法固有の問題点が克服される。
【００６０】
タンパク質発現レベルの統計的に有意な変化は、逆標識実験では当然逆標識パターンを示す。代謝的１５Ｎ−標識の場合、標識時の質量増加は、ペプチドの配列により異なる変数である（約１．２％で平均化したペプチドＭＷの約１．０〜１．５％の範囲である）。変動し得るかまたは予測できない質量差異により、スペクトルが非常に複雑な場合、慣用的質量分析計を用いてペプチド同位体対の相関関係を明らかにするのは非常に難しくなる。超高分解能ＦＴ ＩＣＲ（フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）ＭＳの使用が高精度測定に提案されており、ピーク間の正確な質量差異が得られるため、高い信頼性でペプチド同位体対が代入される。
【００６１】
別の可能ではあるが、非実践的な解決策は、タンデムＭＳの使用によるものである。ペプチドの同位体対は、当然類似フラグメント化パターンを有するため、それらのＭＳ／ＭＳデータを用いて相関関係が明らかにされ得る。逆標識方法の適用において、求められることは、同位体パターンでも、正確な質量シフトでもなく、定性的質量シフトである。したがってＭＳ器具の分解能に関する厳密な必要条件は無い。同位体ピークは、単位分解能の標準質量分析計を用いても高荷電状態のペプチドイオンについて充分には分解され得ないが、質量シフトは容易に認められる。この観察／結論は、さらにＭＳ／ＭＳデータの類似フラグメント化パターンにより裏付けされており、これはタンパク質同定の達成プロセスにおける論理的後続工程のために得られる。多重シグナル対の正確な質量差異を測定して最良の適合対を選択するか、または全シグナルについてＭＳ／ＭＳを行うことによる、他の解決策を用いた余分な作業を実施し、フラグメント化パターンの類似性に基いて相関関係を示す対を見出さなければならない。同位体対の相関関係を明らかにするためにＭＳ／ＭＳフラグメント化パターンを用いる方法は、データを得るために莫大な長さの計器操作時間を必要とするだけでなく、データの取扱いに多大な労力を要する（手で行うのは不可能である）。
【００６２】
同位体シグナルが弱すぎて正確な質量測定または有用なＭＳ／ＭＳデータの入手ができないときに困難は常に存在する。逆標識が遂行されない場合、対を成さない（同位体）シグナルがタンパク質共有結合変化または発現の極端な変化の場合に検出されるとき、不明確さが実際の関心事である。検出された対を成さないシグナルは、非標識ペプチド／タンパク質または化学的バックグラウンドとして混同され得る。真の変化が定量的または定性的にタンパク質に生じた場合、逆標識に伴って定性的質量シフトが観察される。逆標識方法により、標準的単位分解能を有するあらゆる質量分析計が使用され得、最小限の必須データを得るだけで不明確さを伴わない差次的発現タンパク質マーカー／標的の迅速な同定が達成され得る。その後所望ならば、同じく差次的発現タンパク質（または興味の対象であるタンパク質）でのみ発現レベルの相対定量が遂行され得る。
【００６３】
以下の実施例は本発明を説明する役割を果たすものであり、いかなる意味にせよ、その範囲を制限するものではない。
【００６４】
実施例
材料
１８Ｏ−水（９５％原子）は、アイソテック・インコーポレイテッド（マイアミバーグ、オハイオ）から購入される。
【００６５】
１３Ｃ−藻類タンパク質抽出物および１３Ｃ−１５Ｎ−藻類タンパク質抽出物は、アイソテック・インコーポレイテッド（マイアミバーグ、オハイオ）から購入される。
【００６６】
ＩＣＡＴ試薬（軽Ｄ０および重Ｄ８の両方）は、アプライド・バイオシステムズ（ケンブリッジ、マサチューセッツ）から購入される。
【００６７】
実施例１
８−タンパク質モデル系を用いる逆１８Ｏ−標識法
市販タンパク質のＢＳＡ、アルドラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、β−カゼイン、ニワトリアルブミン、アポ−トランスフェリン、β−ラクトグロブリンおよびシトクロムＣ（シグマ）は、それ以上精製せずに使用される。８種のタンパク質を「対照」については１：１：１：１：１：１：１：１および「処理」プールについては０．３：３：１：１：１：１：１：１のモル比で混合する。未変化成分の各々１０ｐｍｏｌを含有する２つの同一アリコートを各プールから採取し、スピードバックを用いて乾燥する。１８Ｏ−標識を、タンパク質分解中およびタンパク質分解後に２つの手順を用いて行う。タンパク質分解標識を行う場合、乾燥アリコートの一方を２０μｌの通常水で、および他方を２０μｌの１８Ｏ−水で再構成するが、ただし両方とも５０ｍＭの重炭酸アンモニウムを含むものとする。１：１００のトリプシン対タンパク質比（ｗｔ：ｗｔ）でトリプシン（モディファイド、プロメガ）を各溶液に加え、消化を３７℃で〜２０時間続行させる。タンパク質分解後標識を行う場合、全トリプシン消化を、同じトリプシン対タンパク質比で〜１２時間通常水−重炭酸アンモニウム緩衝液中において行う。次いで、生成したペプチド混合物をスピードバックにより完全乾燥状態にする。タンパク質分解後１８Ｏ−標識を行うため、１０μｌの１８Ｏまたは通常水をそれぞれ乾燥ペプチド混合物に加える。室温で〜１２時間、このプロセスを続行させる。分析前、タンパク質分解中およびタンパク質分解後の両標識を行う場合、１６Ｏ−対照試料を１８Ｏ−「処理」試料と混合し、１８Ｏ−対照試料を１６Ｏ−「処理」試料と混合する。同じＭＳ分析を両混合物について行う。
【００６８】
実施例２
ＰＴＰ（プロテインチロシンホスファターゼ）でスパイクした全細胞ライゼートを用いる逆１８Ｏ−標識
採取した約５×１０７ＣＨＯ細胞を、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含む緩衝液を用いて機械的に溶解（冷凍／解凍）させる。０．４ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度で生成した細胞ライゼート２．５ｍｌを４アリコートに分割する。２つを１０ｐｍｏｌのＰＴＰ−１Ｂタンパク質（内部発現、残基１−２９８）（ＰＴＰ１０）で、他の２つを３０ｐｍｏｌのＰＴＰ−１Ｂ（ＰＴＰ３０）でスパイクする。トリプシンを１：１００（ｗｔ：ｗｔ）トリプシン対全タンパク質比で各溶液に加えることにより、消化を開始させる。タンパク質分解を３７℃で〜１２時間続行させる。生成した溶液を遠心分離にかけ、固体を廃棄する。次いで、溶液をスピードバックにより完全乾燥状態にする。ＰＴＰ１０およびＰＴＰ３０の両方については、２つの同一アリコートの一方を１０μｌの１８Ｏ−水で、他方を１０μｌの通常水で再構成する。タンパク質分解後１８Ｏ−取込みを〜１２時間室温で続行させる。分析前、１６Ｏ−ＰＴＰ１０および１８Ｏ−ＰＴＰ３０試料を混合し、そして１８Ｏ−ＰＴＰ１０および１６Ｏ−ＰＴＰ３０試料も同じく混合する。各混合物を１００μｌの移動相Ａ（０．１％蟻酸−０．０１％ＴＦＡ、水中）で希釈し、０．４μｍミクロコン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）フィルターで濾過する。濾液を分析するためＬＣ／ＭＳに注入する。
【００６９】
実施例３
逆１８Ｏ−標識ペプチド混合物のＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳペプチド分析
逆１８Ｏ−標識ペプチド混合物のＭＳ分析を、フィニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＬＣＱイオントラップ質量分析計を用いるＬＣ−ＥＳＩ ＭＳを通して実施する。１．０×１５０ｍｍのヴァイダックＣ１８カラムを、０−２−１０−６５−６６−７０分で２−２−２０−４５−９８−９８％Ｂの勾配でのオンラインペプチド分離に使用する。移動相Ａは０．１％蟻酸−０．０１％ＴＦＡ（水中）であり、Ｂは０．１％蟻酸−０．０１％ＴＦＡ（アセトニトリル中）である。流速は５０μｌ／分である。ＬＣカラム後、流れが９：１に分離され、約５μｌ／分がＭＳに入り、４５μｌ／分が後で使用するために集められる。シグナル強度が前以って調節した閾値を越えたとき各走査の最強度イオンでＭＳ／ＭＳを自動的に遂行するデータ依存方式で、ＬＣＱイオントラップ質量分析計を作動させる。必要時には、集めた試料を濃縮し、再分析して、興味の対象であるペプチドについて第一作業で自動的には集められなかったＭＳ／ＭＳデータを入手する。相対衝突エネルギーを４５％に設定する。この条件下において、ほとんどのペプチドは我々の経験では有効に分解する。前駆イオン選択については８−Ｄａウインドウを使用する。
【００７０】
実施例４
逆１８Ｏ−標識ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳペプチド分析
混合物試料を、ＭＡＬＤＩマトリックス溶液（飽和α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡ中）を用いて１：３〜１：５に単純希釈し、〜１μｌの最終溶液（８タンパク質系についての未変化成分に基き各々約５００ｆｍｏｌを含有）を分析用にＭＡＬＤＩ標的へローディングする。遅延イオン引き出しによるリフレクトロン方式で稼動するブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）のリフレックスＩＩＩ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析計で分析を行う。適用可能な場合、ポストソース分解（ＰＳＤ）についても興味の対象であるペプチドイオンにおいて行う。
【００７１】
実施例５
逆１８Ｏ−標識ペプチドのデータベース検索
検索ソフトウェアＰＲＯＷＬ（プロテオメトリクス、ニューヨーク、ニューヨーク）およびＭＡＳＣＯＴ（マトリックス・サイエンス、ロンドン、英国）を用いてタンパク質データベースを検索することにより、ペプチドフィンガープリント、ＭＳ／ＭＳフラグメント、および処理されたＰＳＤスペクトルを用いてタンパク質を同定する。ペプチドフィンガープリント情報を用いて検索を行う場合、２つの逆標識実験間で最も多く存在する同位体イオンについての２または４Ｄａの逆標識パターンまたは質量シフトを呈するペプチドイオンを、質量シフトの方向（アップまたはダウン）に基いて選別する。各リストを別々に用いてデータベース検索を行い、タンパク質を同定する。ペプチド配列情報を用いて検索を行う場合、２つの逆標識実験からのペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを比較すると、２または４Ｄａの質量シフトを伴うＹイオンが同定される。これらのイオンを単独またはＢイオンと組合わせて使用してタンパク質データベースを検索することにより、タンパク質の同定を達成する。ペプチド地図およびＭＳ／ＭＳのデータを合わせる反復検索も行われる。地図で明確な逆標識パターンを示し、ＭＳ／ＭＳデータにおけるフラグメントイオンの質量シフトにより確認されるイオンであれば、それらのＭＳ／ＭＳフラグメント／配列タグを用いて最初に同定される。次いで、同定されたタンパク質に伴うペプチドをリストから除き、残るペプチドの質量を用いて第２ラウンド検索を開始する。納得のゆく結論が全く得られなかったイオンについては、集めた試料を用いて第二分析を行うことにより、それらに関するＭＳ／ＭＳデータを入手する。得られたデータを同様に用いることにより、タンパク質同定のためにデータベースを検索する。
【００７２】
実施例６
８−タンパク質モデル系を用いる逆１８Ｏ−標識方法のＭＳ分析
ＢＳＡが３倍「ダウンレギュレーション」され、アルドラーゼが３倍「アップレギュレーション」されている８−タンパク質モデル系について図１に示された要領と同様にして、逆１８Ｏ−標識およびＭＳ分析を遂行する。オンラインＲＰＬＣを伴うＬＣＱを用いて分析するとき、明確な逆標識パターンまたは２／４Ｄａ質量シフトが若干のペプチドについて観察される（図２−３（Ａ、Ｂ））。データ分析後、質量シフトの方向に基くペプチド質量の２つのリストが迅速に作成される。各々を別々に用いてデータベースを検索すると、タンパク質発現のアップレギュレーションに対応する、２／４Ｄａ下方シフトのリストを用いてアルドラーゼが独占的に同定され、タンパク質発現のダウンレギュレーションに対応する、上方質量シフトのリストを用いてＢＳＡが同定される。少数のペプチドについてデータ依存的方式で、ＭＳ／ＭＳスペクトルが自動的に得られる。
【００７３】
また、シフトの方向とは関係無く、シフトしたもの全ての質量リストを合わせたものを用いて、反復検索スキームを適用する。質量リストまたはＭＳ／ＭＳスペクトルにより、一旦高い信頼性でタンパク質（この場合アルドラーゼ）が同定されると、タンパク質の関連ペプチドを質量リストから外す。次いで、残りのリストについて第二検索を行うことにより、二番目に顕著なタンパク質（この場合ＢＳＡ）が同定される。逆標識の結果として、非常に豊富な情報がＭＳ／ＭＳデータには埋封されている。第一に、標識は各ペプチドのＣ−末端に取込まているため、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるＹイオンは、標識をもつフラグメントであり、差次的発現されたタンパク質についての特徴的な逆標識パターンを呈する。図２−３（Ｃ、Ｄ）で示されている通り、その「発現レベル」が「摂動」によって顕著に改変されているタンパク質の場合、逆標識パターンまたはペプチドにおいて分子イオンレベルで観察される２／４Ｄａ質量シフトは、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるＹイオンへ移される。さらにＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるフラグメントイオンについての特徴的逆標識パターンの観察結果は、タンパク質差次的発現の実証および確証を提供する。
【００７４】
ほとんどのペプチドフラグメントは親分子より電荷の数が少ないため（この書面に示された図面ではほとんど単電荷である）、質量シフトはより顕著であり、そのためそれらの多価前駆イオンからの場合と比べて認識されやすい。第二に、ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいてＹイオンで反映される逆標識パターンもまた、ＭＳ／ＭＳスペクトルの解釈にとって非常に好都合なＹイオンおよびＢイオンの同定方法を提供する。質量シフトを伴うフラグメントはＹおよびＹ関連イオンであり、質量シフトを伴わないものはＢまたはＢ関連イオンである。ＭＳ／ＭＳデータを用いてデータベースを検索するのに解釈は必要とされないが、特異性が追加されれば、データベース検索によるタンパク質同定の効率および正確さを向上させる助けとなる。ＢＳＡおよびアルドラーゼは両方とも、ＭＳ／ＭＳデータおよびＹ／Ｂイオンアサインメント（割当て）（図２−３）を用いることにより明確に同定される。事実、予測されたタンパク質は全て、ＭＳ／ＭＳデータおよびＹ／Ｂイオンアサインメント（図２−３および５−６）を用いて同定される。
【００７５】
新たに配列決定が必要とされる新規タンパク質に取り組むとき、これらの利点はより重要となる。ＹおよびＢイオンをアサインメントできると、ＭＳ／ＭＳスペクトルからの配列の「読み出し」が大きく簡便化される。タンパク質発現の正確な定量は本方法の意図された用途ではないが、タスク（すなわち、天然１３Ｃ−同位体コントリビューションの補正後における１６Ｏ〜１８Ｏのシグナル強度）の遂行が望まれる場合、情報はＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータの両方で入手できる。全く分離を伴わずに混合物においてＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳを直接遂行すると、かなりの重複を示すペプチド−地図スペクトルが作成され、データの解釈が困難となる（図４（Ａ、Ｂ））。それにもかかわらず、逆標識パターンは依然として若干のイオンについて観察され得る（図４（Ｃ、Ｄ））。ＰＳＤを少数のイオンについて実施し、タンパク質はこのＰＳＤデータを用いて同定され得る（図５）。
【００７６】
実施例７
ＰＴＰスパイク細胞ライゼート系を用いる逆１８Ｏ−標識のＭＳ分析
ＰＴＰ−１Ｂタンパク質が、複合タンパク質混合物系を模倣する強度により２つの異なるレベルでスパイクされている全細胞ライゼート系においては、良好なシグナル強度を有する多くのペプチドシグナルが検出される（データは示さず）。オンラインＬＣ分離による場合でも、深刻な重複が予測され、事実観察されている。それにもかかわらず、逆標識からの２セットのデータを分析および比較すると、特徴的な逆標識パターン、主として４Ｄａシフトを伴う少数のイオンが同定される（図６（Ａ、Ｂ））。脱離および採集された試料を第２ラウンドの分析にかけることにより、それらのＭＳ／ＭＳデータを得る。さらに、Ｙイオンが２つの並行実験間において４Ｄａシフトの逆標識パターンを呈するＭＳ／ＭＳデータは、前駆ペプチドで観察される質量シフト、すなわちタンパク質の差次的発現を立証／確認するものである（図６（Ｃ、Ｄ））。質量シフトの容易に認識されるＹイオンを用いるデータベース検索により、タンパク質がヒトＰＴＰ−１Ｂとして決定的に同定される。全細胞ライゼートによるこの特定の場合では、予想通り、ＭＡＬＤＩ ＭＳペプチドマッピングはペプチドシグナルの深刻な重複故にあまり有用な情報を提供しない（データは示さず）。
【００７７】
細胞培養中におけるタンパク質の代謝的標識とは異なり（１３Ｃ／１５Ｎ／２Ｈ）、この方法は特殊な技術および／または設備を全く必要とはしない。また、組織タンパク質の分析および組織からのマーカー／標的タンパク質の同定は容易に実施され得る。化学的標識とは異なり、この方法は追加的反応／後処理工程を必要とはしない。すなわち、それによって追加工程に伴う可能性のある試料損失が回避される。残基特異的化学標識に伴う別の落とし穴、すなわち高い確率で起こり得る翻訳後修飾情報の喪失もまた回避される。２つの共同分析は逆標識方法により遂行されるため、発現レベルの極度の変化およびＭＳ検出の劇的な範囲制限またはタンパク質の共有結合修飾故に同位体対応物質非検出のシグナルが明確に同定され得る。
【００７８】
実施例８
２−タンパク質モデル系を用いる逆１５Ｎ−標識
通常および１５Ｎ−標識ＰＴＰタンパク質（１−２９８）並びに通常および１５Ｎ−標識ＨｔｒＡタンパク質（１６１−３７３）は標準培養条件を用いて内部製造され、この場合１５Ｎ−標識物質は１５Ｎ−濃化培養培地での醗酵により製造される。タンパク質の信憑性および同位体取込みのレベルを最終タンパク質生成物に関するＭＳにより評価する。標識収率は、ＭＳ結果によると両タンパク質とも９０％より高い。２種の個々のタンパク質ＰＴＰおよびＨｔｒＡを一緒に混合することにより、２−タンパク質モデル系を作製するが、ただし通常１４Ｎ−混合物は２種の１４Ｎ−タンパク質の混合物であり、１５Ｎ−混合物は２種の１５Ｎ−標識タンパク質の混合物である。「対照」は、モル比１：１での２タンパク質の混合物である。「処理」または「改変状態」物質は、ＰＴＰタンパク質に関する４つの異なるレベルの「タンパク質差次的発現」を模倣するように生成され、ＨｔｒＡの「発現」レベルは未変化のままである。４「処理」混合物についてのＰＴＰ：ＨｔｒＡのモル比は、３：１、１００：１、０．３：１、０．０１：１であり、３倍および１００倍アップレギュレーションおよび３倍および１００倍ダウンレギュレーションをそれぞれ模倣する。通常１４Ｎ−混合物および標識１５Ｎ−混合物を同様に製造する。逆標識実験を遂行するため、１４Ｎ−対照のアリコートを１５Ｎ−「処理」のアリコートと混合し（各々同量のＨｔｒＡタンパク質を含有する）、逆標識は同じ方法で１５Ｎ−対照を１４Ｎ−「処理」と合わせることにより達成される。（すなわち、２種の逆標識混合物を各比較プロテオミクス実験用に製造する。）同じ手順を４種の「差次的」レベル全てについても実施する。後続のトリプシン消化を、３７℃で〜７時間５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液中において１：５０トリプシン対タンパク質比（ｗｔ：ｗｔ）の全混合物（プロメガからのモディファイドトリプシン、シーケンシング品質）について実施する（２タンパク質は、事前に還元およびアルキル化をしなくてもこの条件下で容易に消化することが知られている）。ＭＡＬＤＩおよびエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳを両方とも用いるＭＳ分析を全ペプチド混合物について実施する。各々１０ｐｍｏｌのＨｔｒＡペプチドを含有するアリコートをＬＣ／ＭＳ分析に用いる。
【００７９】
実施例９
ＰＴＰタンパク質でスパイクした藻類細胞ライゼートを用いる逆１５Ｎ−標識  ６ＭのグアニジンＨＣｌ−５０ｍＭのトリス−５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含む１ｍｌ溶液を、１３Ｃ−藻類タンパク質抽出物および１３Ｃ−１５Ｎ−藻類タンパク質抽出物の各々１０ｍｇに加える。混合物を渦状に攪拌し、４０分間音波処理することにより、タンパク質を可溶化する。２００００ＲＰＭで２０分間遠心分離後、上清をさらなる使用に供するため取っておく。大量の不溶性物質を廃棄する。１０ｍＭのＤＴＴを溶液に加え、還元反応を５０℃で１時間続行させる。４０ｍＭヨード酢酸ナトリウム塩を加えた後暗所中室温で１時間振り混ぜることにより、システインアルキル化を実施する。それに続いて１ｋＤａ ＭＷカットオフのセントリコンフィルターを用いて、過剰の試薬を除去し、緩衝液を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムに交換する。標準ブラッドフォード方法を用いて抽出物のタンパク質濃度を測定する。１０ｐｍｏｌの通常ＰＴＰタンパク質を、約０．０５ｍｇの全タンパク質を含有する１３Ｃ−藻類タンパク質抽出物のアリコートへスパイクすることにより、１４Ｎ−「対照」を形成し、１０ｐｍｏｌの１５Ｎ−ＰＴＰを、１５Ｎ−「対照」として約０．０５ｍｇの全タンパク質を含有する１３Ｃ−１５Ｎ−藻類タンパク質抽出物のアリコートへスパイクする。「処理」物質については、３ｐｍｏｌのＰＴＰを同一アリコートの藻類抽出物へスパイクすることにより、３倍ダウンレギュレーションを作成し、そして藻類抽出物の別の等しいアリコートへ０．１ｐｍｏｌのＰＴＰをスパイクすることにより、１００倍ダウンレギュレーションを作成する。１４Ｎ−物質は、１４Ｎ−ＰＴＰが１３Ｃ−藻類抽出物のアリコートへスパイクされた結果であり、１５Ｎ−物質は、１３Ｃ−１５Ｎ−藻類抽出物のアリコートへ１５Ｎ−ＰＴＰをスパイクすることにより生成される。逆標識実験は、同様にして１５Ｎ−「処理」と１４Ｎ−対照、および１４Ｎ−「処理」と１５Ｎ−対照のアリコートを合わせることにより行なわれる。生成した４種の逆標識混合物（２種の差次的レベルについて）におけるトリプシン消化を、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液中３７℃で〜１６時間１：１００トリプシン対タンパク質比（ｗｔ：ｗｔ）で行う。エレクトロスプレーＬＣ／ＭＳにより、全消化物を分析する。
【００８０】
実施例１０
逆１５Ｎ−標識ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳペプチド分析
２−タンパク質モデル系の全消化混合物を、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより分析する。混合物試料をＭＡＬＤＩマトリックス溶液（飽和α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、５０％アセトニトリル−０．１％ＴＦＡ中）を用いて１：５に希釈し、最終溶液（約ｆｍｏｌのＨｔｒＡペプチドを含有）各々〜１μｌを分析するためＭＡＬＤＩ標的にローディングする。遅延イオン引き出しを伴うリフレクトロン方式で稼動されるブルカーＲＥＦＲＥＸ ＩＩＩ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析計で分析を行う。
【００８１】
実施例１１
逆１５Ｎ−標識ペプチド混合物のＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳペプチド分析
２−タンパク質モデル系の全消化混合物および藻類スパイキング系からの同混合物をＬＣ／ＭＳ−ＭＳ／ＭＳにより分析する。フィニガンＬＣＱイオントラップ質量分析計を用いてエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳにより分析を実施する。１．０×１５０ｍｍヴァイダックＣ１８カラムをオンラインペプチド分離に使用する。０−１０−６５−６６−７０分で２−２０−４５−９８−８９％Ｂの勾配プログラムを使用する。移動相Ａは水中０．２５％の蟻酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．２５％の蟻酸である。流速は５０μｌ／分である。ＬＣカラムからの溶離後、流れは９：１に分離され、約５μｌ／分はＭＳへ入り、４５μｌ／分は後で使用するため集められる。シグナル強度が予め設定した閾値を越えるとき、各走査の各最高強度イオンで自動的にＭＳ／ＭＳを遂行する、データ依存的モードでＬＣＱイオントラップ質量分析計を稼動させる。必要時、集めた試料を濃縮および再分析して、興味の対象であるペプチドについての１回目の実行で自動収集されていないＭＳ／ＭＳデータを得る。ほとんどのペプチドが有効にフラグメント化する４５％に相対衝突エネルギーを設定する。前駆イオン選別用の５−Ｄａウインドウを使用する。
【００８２】
実施例１２
逆１５Ｎ−標識ペプチドのデータベース検索
検索ソフトウェアＰＲＯＷＬ（プロテオメトリクス、ニューヨーク、ニューヨーク）およびＭＡＳＣＯＴ（マトリックス・サイエンス、ロンドン、英国）を用いてタンパク質データベースを検索することにより、ペプチドフィンガープリントおよびＭＳ／ＭＳフラグメントを用いてタンパク質を同定する。ペプチドフィンガープリント情報を用いる検索の場合、２つの逆標識実験間において逆標識パターンを呈するペプチドイオンを、質量シフトの方向（増加または減少）に基いて選別する。各リストをデータベース検索に別々に使用することにより、タンパク質を同定する。ペプチド配列情報を用いる検索の場合、２つの逆標識実験からのペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを比較し、それらの類似フラグメント化パターンによりそれらの相関関係をさらに実証／確認する。Ｎ１４−ペプチド（質量が低い方）のＭＳ／ＭＳスペクトルを用いて、タンパク質を同定するためデータベースを検索する。
【００８３】
実施例１３
２−タンパク質モデル系を用いる逆１５Ｎ−標識方法のＭＳ分析
２−タンパク質モデル系の混合物については直接ＭＡＬＤＩ分析が有効に実施される。複合タンパク質混合物（例、全細胞ライゼート）の消化物におけるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳによる分離のオフラインカップリングの場合、各フラクションがここで立証された状況と類似し得る。逆標識方法とは対照的に、単一実験方法を適用すると、タンパク質差次的発現がそれほど徹底したものではないため両同位体対が明白には検出されない場合でさえ（例、３倍変化、図７（Ａ））、同位体対の相関関係が、例えば１５５０〜１６００のｍ／ｚ範囲で示されるものに達するのは依然として困難であり得る。しかしながら、逆標識実験からの２つのＭＡＬＤＩスペクトルをサブトラクティブ比較することにより（図７−８（Ａ、Ｂ））、差次的発現が顕著ではないタンパク質からのシグナル対が除かれ（例えば横軸に沿った矢印で印を付したもの）、相関関係を明らかにし易いかなり単純化したスペクトルが得られる。タンパク質差次的発現があまり徹底したものではなく（例、１０００倍またはそれ未満）、両方の同位体シグナルが検出されるとき、シグナル強度比の逆転が容易に認識され、相関関係が確認される（図７（Ａ、Ｂ））。逆標識を使用しない場合、より劇的な差次的発現が行なわれたためＭＳ検出におけるダイナミックレンジの制限故に弱い方の同位体シグナルが検出されないとき、同位体対の相関関係を明らかにする際に誤りが生じやすくなる。同じ範ちゅうに分類されるのは、摂動の結果としてのタンパク質の共有結合変化であり、その場合タンパク質の共有結合修飾、例えば末端でのタンパク質プロセッシングまたは翻訳後修飾が行なわれる。修飾は制御状態では存在しないため、共有結合変化を担うペプチドは同位体対応物質無しで検出される。逆標識はこれらの問題に容易な解答を提供する。１００倍のダウンレギュレーションは、弱い方の同位体シグナルが完全に検出を逃れ得るほどには強烈なものではないが、この方法の利点を証明する良い例である。
【００８４】
図８（Ａ、Ｂ）に示されている通り、差次的発現が顕著なものではないタンパク質からのシグナルのサブトラクティブ除去後に逆標識パターンは容易に認識される。（ただし、一ペプチド配列当たりの窒素原子の範囲は通常ペプチド分子量の１％より大、かつペプチドＭＷの１．５％より小であり、平均約１．２％ＭＷであるものとする。）また、２−タンパク質モデル系からの消化混合物をエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳにより分析する（図９（ａ−ｃ））。データは、同位体対が逆相クロマトグラフィーによる顕著な分離を全く見せないことを示唆している。逆標識実験からの２つの基準ピークイオンクロマトグラムを迅速に比較することにより（図９（ａ））、差次的発現タンパク質から逆標識パターン（質量シフト）の基準ピークペプチドが速やかに同定される。確かに、低い存在量であり、存在量の多いペプチドと共溶離している逆標識パターンの他のペプチドを同定するためには、ＭＳデータを処理しなければならない。一旦逆標識パターンを伴うペプチドシグナルが同定されると、データ依存的稼動方式で自動的に得られたＭＳ／ＭＳデータを分析する。それらの類似フラグメント化パターンは、同位体対の相関関係、すなわちタンパク質差次的発現についての正しい結論を証明／確認する。
【００８５】
次いで、データを用いて、タンパク質同定のためにタンパク質データベースを検索する（図９（ｃ））。この場合、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質は、データベースから容易に同定される。実際、複合タンパク質系を扱うとき、ペプチド地図からの逆標識パターンを伴うイオンのデータとＭＳ／ＭＳを合わせる反復検索スキームが遂行され得る。地図において明白な逆標識パターンを示したイオンで、さらにＭＳ／ＭＳデータの類似フラグメント化パターンにより確認されるものは、それらの（１４Ｎ−イオンまたは低質量の）ＭＳ／ＭＳデータを用いて最初に同定される。次いで、同定されたタンパク質に伴うペプチドはペプチドリストから外され得、逆標識パターンの残りのペプチドのＭＳ／ＭＳデータを用いて第二ラウンド検索を開始する。自動的に得られるＭＳ／ＭＳデータが無いイオンについては、集めた試料を用いて２回目の分析を行うことにより、それらのＭＳ／ＭＳデータを得る。次いで、同様にデータを用いて、タンパク質同定のためにデータベースを検索する。
【００８６】
実施例１４
スパイクされた藻類細胞ライゼート系を用いる逆１５Ｎ−標識方法のＭＳ分析  さらに複雑な混合物における本方法の適用性を立証するため、非標識および１５Ｎ−標識の両方のＰＴＰ−１Ｂタンパク質を、異なるレベル（３倍および１００倍ダウンレギュレーション）で藻類細胞ライゼート−１３Ｃおよび−１３Ｃ／１５Ｎへそれぞれスパイクすることにより、タンパク質差次的発現を模倣する。次いで、逆標識実験を行い、混合物をＬＣ／ＭＳ−ＭＳ／ＭＳにより分析する。各逆標識実験から得られた２セットのデータを比較すると、特徴的な逆標識質量シフトを有する若干のイオンが引き出される（図１０（Ａ、Ｂ））。脱離および採集した試料を２回目の分析にかけることにより、逆標識パターンを呈するイオンに関するＭＳ／ＭＳを得る。それらの類似フラグメント化パターンは、前駆ペプチドで観察される質量シフトまたは逆標識パターン、すなわち前駆タンパク質の差次的発現を明白に実証する（図１０（Ｃ、Ｄ））。１４Ｎ−ペプチドのＭＳ／ＭＳデータを用いるデータベース検索により、ヒトＰＴＰ−１Ｂタンパク質が独占的に同定される。
【００８７】
実施例１５
６−タンパク質モデル系を用いる逆ＩＣＡＴ標識
市販タンパク質のＢＳＡ、アルドラーゼ、β−カゼイン、アポ−トランスフェリン、β−ラクトグロブリンおよびシトクロムＣ（シグマ）をそれ以上精製せずに使用する。６タンパク質を、「対照」については１：１：１：１：１：１および「処理」プールについては０．３：３：１：１：１：１のモル比で混合する。推奨されたプロトコルに従う。まず、対照および「処理」のタンパク質混合物を還元および変性させる。次いで、ＩＣＡＴ誘導体化を逆標識法で行い（図１）、各混合物の半分をＤ０−ＩＣＡＴ試薬と反応させ、残りの半分をＤ８−ＩＣＡＴ試薬と反応させる。Ｄ０−対照をＤ８−「処理」と、およびＤ８−対照をＤ０−「処理」と混合することにより、逆標識を続行させる。次いで、トリプシン消化を３７℃で〜１６時間１：５０（ｗｔ：ｗｔ）のトリプシン対タンパク質比で両両混合物において行う。生成したペプチド混合物を、まず過剰の試薬、変性剤、および還元剤等を除去するためのカチオン交換工程にかける。次いで、標識（システイン含有）ペプチドの親和性強化のためそれらをアビジンカラムに通す。未変化成分各々１０ｐｍｏｌを含有するアリコートを各プールから採取し、スピードバックを用いて乾燥する。ＬＣ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ分析前にそれらを移動相Ａにより再構成する。
【００８８】
実施例１６
逆ＩＣＡＴ標識ペプチド混合物のＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳペプチド分析
ＩＣＡＴ標識ペプチド混合物のＭＳ分析（実施例１５参照）を、前駆イオン選別用に５−Ｄａウインドウを使用すること以外、実施例３に記載した方法と同様にして実施する。
【００８９】
実施例１７
逆ＩＣＡＴ−標識ペプチド混合物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳペプチド分析
実施例１５からのスピードバック乾燥混合物試料のアリコートを、実施例４記載の手順と同様の手順にかける。
【００９０】
実施例１８
逆ＩＣＡＴ−標識ペプチドのデータベース検索
検索ソフトウェアＰＲＯＷＬ（プロテオメトリクス、ニューヨーク、ニューヨーク）およびＭＡＳＣＯＴ（マトリックス・サイエンス、ロンドン、英国）をタンパク質データベースの検索に用いることにより、ペプチドフィンガープリントおよびＭＳ／ＭＳフラグメントを用いてタンパク質が同定される。ペプチドフィンガープリント情報を用いた検索の場合、２つの逆標識実験間において質量シフトの逆標識パターンを呈するペプチドイオンを、質量シフトの方向（増加または減少）に基いて選別する。各リストを別々に使用してデータベース検索を行い、タンパク質を同定する。また、ペプチド地図からの逆標識パターンを伴うイオンのデータおよびＭＳ／ＭＳを合わせる反復検索を行う。地図において明白な逆標識パターンを示し、さらにＭＳ／ＭＳデータで質量シフト随伴および非随伴であるそれらの類似フラグメント化パターンおよびフラグメントにより確認されるイオンが、それらのＭＳ／ＭＳフラグメントを用いて最初に同定される。次いで、同定されたタンパク質に伴うペプチドをリストから外し、逆標識パターンの残りのペプチドの質量を用いて第二ラウンド検索を開始する。納得のゆく結論に達し得ないイオンについては、集めた試料を用いて２回目の分析を行うことにより、ＭＳ／ＭＳデータを得る。得られたデータを同じ方法で使用することにより、タンパク質同定についてデータベースを検索する。
【００９１】
実施例１９
６−タンパク質モデル系を用いる逆ＩＣＡＴ標識方法のＭＳ分析
ＢＳＡが３倍「ダウンレギュレーション」され、アルドラーゼが３倍「アップレギュレーション」されている６−タンパク質モデル系について図１に示された方法と同様にして逆標識およびＭＳ分析を行う。全く分離を伴わない混合物において直接遂行されるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳは、かなりの程度のシグナル重複を示すが、如何に逆標識戦略が差次的発現タンパク質から誘導されたペプチドシグナルの迅速な同定を助けるかを依然として明白に立証している。逆標識戦略を用いない場合、各々全てのペプチドについての±８／１６／２４−Ｄａ対を捜し、定量を行いながら単一スペクトルを評価しなければならない（例、図１１（Ａ））。逆標識戦略を用いる場合、２つのスペクトルをオーバーレイし（図１１（Ａ、Ｂ））、「ズームおよびピック」（サイズ変更および選択）を行うだけで、２つのスペクトル間において特徴的な質量シフトを示すピークが同定される。この定性的比較実行後非常に迅速に（この場合数分で）、特徴的な逆標識パターンのピークが同定される（例、質量標識ピーク）。逆標識を適用した場合、２データセットの迅速な定性的比較により、興味の対象であるペプチドが迅速に同定され得ることは明らかである。
【００９２】
次いで、タンパク質を同定するための定量およびＰＳＤまたはＭＳ／ＭＳ分析が、それらのペプチドについて実施され得る。同じ試料を、オンラインＲＰＬＣと共にＬＣＱを用いて分析すると、質量シフトの特徴的な逆標識パターンはまた若干のペプチドにおいても明白に観察される（図１２（Ａ、Ｂ））。質量シフトは、配列におけるシステインの数および検出されているペプチドの荷電状態により変化する。データ分析後、ペプチド質量の２つのリストを質量シフトの方向に基いて迅速に作成する。これら２つのリストを用いてデータベースを検索する。アルドラーゼは、タンパク質発現のアップレギュレーションに対応する、質量シフト減少のリストを用いて独占的に同定される。ＢＳＡは、タンパク質発現のダウンレギュレーションに対応する、質量シフト増加のリストを用いて同定される。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、若干のペプチドについてはデータ依存的方式で自動的に得られる。多重タンパク質がアップまたはダウンレギュレーションされ得る広域スペクトル状況をエミュレートするために、また反復検索スキームが適用される。この場合、我々は、シフトの方向とは関係無く、質量シフトを示す全ペプチドの質量リストを合わせたものを使用する。一タンパク質が質量リストまたはＭＳ／ＭＳスペクトルを用いることにより高い信頼度でもって同定された後（我々の系ではアルドラーゼ）、そのタンパク質から誘導された全ペプチドを質量リストから外す。次いで、このプロセスを反復することにより、質量シフトを示す次のタンパク質が同定される（この場合ＢＳＡ）。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータには追加的情報が埋封されていることは強調されるべきである。質量シフトは、如何に多くのシステインが配列に存在するかを示している。データベース検索用に使用するとき、この追加された特異性が、候補リストを絞り、検索結果の有効性および正確さを高めるのに役立つ。
【００９３】
様々な修飾が本明細書に開示されている態様および／または実例に加えられ得ることは理解できるはずである。すなわち、上記の記載は、制限を意図したものではなく、好ましい態様の典型的な具体例に過ぎないものとみなされるべきである。当業者であれば、本明細書に記載された「請求の範囲」の範囲および精神から逸脱することなく他の修飾を想到できるはずである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１．マーカー／標的タンパク質を迅速に同定するための逆標識方法。
【図２】図２．逆１８Ｏ−標識ＢＳＡトリプシンペプチドの液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）検出法。
【図３】図３．逆１８Ｏ−標識アルドラーゼトリプシンペプチドのＬＣ／ＭＳ検出法。
【図４】図４．８−タンパク質混合物の逆 １８Ｏ−標識トリプシン消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ検出。
【図５】図５．逆 １８Ｏ−標識アルドラーゼトリプシンペプチドＭＨ＋２１０７．３のＭＡＬＤＩ ＰＳＤスペクトル。
【図６】図６．ＰＴＰ（プロテインチロシンホスファターゼ）−１ＢによりスパイクしたＣＨＯ細胞ライゼートからのＰＴＰトリプシンペプチドのＬＣ／ＭＣ検出。
【図７】図７．逆１５Ｎ−標識２−タンパク質系のトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ検出であり、ＰＴＰタンパク質は「処理」試料で３倍アップレギュレーションされている。
【図８】図８．逆１５Ｎ−標識２−タンパク質系のトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ検出であり、ＰＴＰタンパク質は「処理」試料で１００倍ダウンレギュレーションされている。
【図９】図９．逆１５Ｎ−標識２−タンパク質系のトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ−ＭＳ／ＭＳ検出であり、ＰＴＰタンパク質は「処理」試料で３倍ダウンレギュレーションされている。
【図１０】図１０．ＰＴＰタンパク質でスパイクした逆１５Ｎ−標識藻類細胞ライゼートのトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ−ＭＳ／ＭＳ検出であり、ＰＴＰは「処理」試料で３倍ダウンレギュレーションされている。
【図１１】図１１．逆ＩＣＡＴ標識６−タンパク質系のトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ検出。
【図１２】図１２．逆ＩＣＡＴ標識６−タンパク質系のトリプシン消化物のＬＣ／ＭＳ検出。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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