(57)【要約】ＨＬＡ汎ＤＲペプチドを提供し、ならびに炎症性および自己免疫疾患、癌および微生物感染のような免疫仲介性疾患および状態の治療において免疫応答を調節する、遮断するまたは抑制するためにＨＬＡ汎ＤＲペプチドを使用する方法を提供する。ペプチドおよび方法は診断的に、病的免疫応答の抑制または異常細胞もしくは浸潤性細胞に対する免疫応答の上方制御が可能なペプチドまたはペプチド類似体をスクリーニングするため、効果または治療用途をモニターするため、および免疫応答の抑制または調節に有効であると考えられる他の物質を同定するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するストレスタンパク質の断片を含む、実質的に純粋なＨＬＡ汎ＤＲ結合ペプチド。
【請求項２】
ペプチドがＨＬＡＤＲ１、ＤＲ４およびＤＲ７に結合する、請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項３】
ペプチドが、ヒトと細菌熱ショックタンパク質との間で保存されているアミノ酸配列を含む、請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項４】
ペプチドが、ヒトとミコバクテリアタンパク質との間で保存されているアミノ酸配列を含む、請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項５】
ペプチドが、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列と少なくとも７０％同一である、請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項６】
ペプチドが、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列と少なくとも８０％同一である、請求項５記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項７】
ペプチドが、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列と少なくとも９０％同一である、請求項５記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項８】
ペプチドが、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列と少なくとも９５％同一である、請求項５記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項９】
ペプチドが、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列を有する、請求項５記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１０】
ストレスタンパク質が熱ショックタンパク質である、請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１１】
熱ショックタンパク質が細菌熱ショックタンパク質である、請求項１０記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１２】
熱ショックタンパク質がミコバクテリウム種の熱ショックタンパク質である、請求項１０記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１３】
ミコバクテリウム種の熱ショックタンパク質がｈｓｐ６５またはｈｓｐ６０である、請求項１２記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１４】
熱ショックタンパク質が哺乳類熱ショックタンパク質である、請求項１０記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１５】
哺乳類熱ショックタンパク質がヒト熱ショックタンパク質である、請求項１４記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１６】
ヒト熱ショックタンパク質がヒトｈｓｐ６０である、請求項１５記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１７】
断片の長さが約１０〜３０アミノ酸である、請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１８】
断片の長さが約１５〜２５アミノ酸である、請求項１７記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１９】
断片の長さが約１５〜２０アミノ酸である、請求項１７記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項２０】
ペプチドが１個以上のＤ−アミノ酸を有する、請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項２１】
配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０の１個以上のアミノ酸が同様の大きさ、電荷および極性を持つ１個以上のアミノ酸によって置換されている、請求項５記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項２２】
ペプチドがアジュバントに共有結合している、請求項１記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項２３】
アジュバントがキーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンまたは同系（ｉｓｏｌｏｇｏｕｓ）ＩｇＧである、請求項２２記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項２４】
薬学的に許容される担体中に請求項１記載のペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項１記載のペプチドをコードする単離核酸配列。
【請求項２６】
配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列を持つペプチドをコードする、請求項２５記載の核酸配列。
【請求項２７】
ＴがＵであるか、または配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列を持つペプチドをコードする核酸配列に特異的にハイブリダイズする１５〜２０ヌクレオチド長の上記配列の相補的配列でありうる、請求項２６記載の単離核酸配列。
【請求項２８】
請求項１記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２９】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２８記載の抗体。
【請求項３０】
抗体が薬学的に許容される担体中に製剤されている、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
作動可能に連結された請求項２５、２６または２７の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３１記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
炎症性疾患を治療するまたは予防する際に使用するための免疫調節組成物であって、１個以上のＭＨＣクラスＩＩ分子へ結合するストレスタンパク質の断片を薬学的に許容される担体中に含む、実質的に純粋なペプチドを含有する免疫調節組成物。
【請求項３４】
断片がＨＬＡＤＲ１、ＤＲ４およびＤＲ７に結合する、請求項３３記載の免疫調節組成物。
【請求項３５】
炎症性疾患が免疫仲介性疾患である、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
免疫仲介性疾患が自己免疫疾患である、請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
免疫仲介性疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、強皮症、重症筋無力症および潰瘍性大腸炎から成る群より選択される、請求項３４記載の組成物。
【請求項３８】
実質的に純粋なペプチドが、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列を有する、請求項３４記載の組成物。
【請求項３９】
生体応答調節物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）をさらに含む、請求項３４記載の組成物。
【請求項４０】
生体応答調節物質が、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、ステロイドおよびインターロイキンから成る群より選択される、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
生体応答調節物質がインターフェロンである、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
生体応答調節物質が、ＩＬ−１（αまたはβ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＬＴ、ＴＧＦ−β、γ−ＩＦＮ、ＴＮＦ−α、ＢＣＧＦ、ＣＤ２またはＩＣＡＭから成る群より選択される、請求項３９記載の組成物。
【請求項４３】
免疫仲介性疾患を有するまたは免疫仲介性疾患に罹患する危険性を有する対象において該疾患を治療するまたは予防するための方法であって、薬学的に許容される担体中にＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するストレスタンパク質の断片を含む実質的に純粋なペプチドの有効量を対象に投与する段階を含み、該ペプチドが免疫応答を調節し、それによって疾患を治療するまたは予防する方法。
【請求項４４】
対象が哺乳類である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
哺乳類がヒトである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
免疫仲介性疾患が自己免疫疾患である、請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
免疫仲介性疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、強皮症、重症筋無力症および潰瘍性大腸炎から成る群より選択される、請求項４３記載の方法。
【請求項４８】
免疫仲介性疾患が癌である、請求項４３記載の方法。
【請求項４９】
癌が、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺、肝臓、腎臓、脳、膀胱の固形腫瘍、網膜芽細胞腫、肉腫および結合組織の癌から成る群より選択される、請求項４３記載の方法。
【請求項５０】
免疫仲介性疾患が感染症である、請求項４３記載の方法。
【請求項５１】
実質的に純粋なペプチドが、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列を有する、請求項４３記載の方法。
【請求項５２】
１個以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するストレスタンパク質の断片を含む実質的に純粋なＨＬＡ汎ＤＲ結合ペプチドの有効量を対象に投与する段階を含む、対象において免疫応答を調節するための方法。
【請求項５３】
断片がＨＬＡＤＲ１、ＤＲ４およびＤＲ７に結合する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
対象が哺乳類である、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
哺乳類がヒトである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
免疫応答が、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ、エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、強皮症、重症筋無力症および潰瘍性大腸炎から成る群より選択される免疫仲介性疾患に結びつく、請求項５２記載の方法。
【請求項５７】
免疫応答が感染症に関連している、請求項５２記載の方法。
【請求項５８】
免疫応答が、黒色腫、白血病、リンパ腫、肺、肝臓、腎臓、脳、膀胱の固形腫瘍、網膜芽細胞腫、肉腫および結合組織の癌から成る群より選択される免疫仲介性の癌に結びつく、請求項５２記載の方法。
【請求項５９】
実質的に純粋なペプチドが、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示すような配列を有する、請求項５２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規ストレス関連ペプチドおよびその使用方法に関する。特に、自己免疫から癌、感染症までの範囲にわたる免疫仲介性疾患において炎症応答を調節する上で有用な新規熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）ペプチド配列を提供する。
【０００２】
発明の背景
脊椎動物は、環境からの病原体に対する防御、ならびに内的に発現する腫瘍細胞のような異常細胞に対する防御として免疫応答を惹起する能力を有する。これは、ＮＫ細胞、好中球および単球／マクロファージ系列の細胞によって仲介される先天性免疫の形態、あるいはリンパ球によって仲介される特異性抗原に対しての獲得免疫または能動免疫の形態をとりうる。能動免疫応答はさらに２つの群に細分することができ、すなわち全身循環に曝露される抗原を中和する役割を果たし、プロフェッショナル（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）貪食細胞によるそれらの取込みを助ける特異的抗体の産生を必要とする体液性応答と、体内の感染細胞または異常細胞の認識のために必要とされる細胞性応答とに分けられる。しばしばこれらの免疫応答は、生物自体に有害作用を引き起こす疾患および障害をもたらす。そのような疾患は、自己タンパク質および細胞を異種として認識することに結びつき、それ故そのような細胞または細胞タンパク質を攻撃する誘因となる。一般的な自己免疫疾患は、例えば乾癬、関節炎、ループス、糖尿病および当技術分野において既知の他の疾患を含む。
【０００３】
Ｉ型糖尿病のような自己免疫疾患の病因に関して可能性が最も高いシナリオの１つは、バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）活性化または分子擬態のいずれかによる自己反応性Ｔ細胞の異常制御から始まると考えられる。例えば、ウイルス感染またはスーパー抗原への曝露は、胸腺選択を免れる数少ない低アフィニティー自己反応性Ｔ細胞の活性化をもたらす十分な共刺激を提供しうる。そのような自己反応性応答の異常な下方制御により、認識される抗原が存在する器官に浸潤する病原性Ｔ細胞を拡大させることができる。非病原性自己反応性から自己免疫疾患への移行を促進するいくつかの宿主関連因子；より多数の自己反応性前駆物質をエスケープさせる漏出性中枢での負選択；リンパ球活性の下方制御を仲介する受容体またはリガンドに関する異常により引き起こされる末梢トレランス障害；よりバランスのとれたＴＨ１／ＴＨ２応答に対してＴＨ１炎症誘発性応答を生じる偏り；プロフェッショナルＡＰＣの高い発現率と異常活性。局所炎症と宿主細胞の直接破壊は、抗原放出、プロフェッショナルＡＰＣによる取込みおよび特異的Ｔ細胞への提示の誘因となり、その結果、自己免疫を増悪させる正のフィードバックを永続させる。同時に、通常は潜在性の器官関連抗原が、プロフェッショナル抗原提示細胞の活性化と抗原放出とに関連して露出され、これら他の自己抗原に特異的なＴ細胞の活性化をもたらすと考えられる。特に全体的なＴＨ１／ＴＨ２不均衡を促進する条件下では、付加的な特異性の使用により疾患が進むことがある。ＩＮＦ−ＫのようなＴＨ１サイトカインは自己免疫の病因に寄与し、ＩＬ−４およびＩＬ−１０のようなＴＨ２サイトカインは病原性ＴＨ１またはＴｃ１細胞の活性を抑制しうると広く考えられている。
【０００４】
熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）は様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす高度に保存されたタンパク質である。ｈｓｐは、典型的には細胞ストレスの際に上方制御されるストレスタンパク質である。それとは別に、ｈｓｐは免疫優性であることが示されている。ｈｓｐのそれら固有の性質（進化学的保存、免疫優性およびストレスの際の上方制御）により、ｈｓｐは免疫療法およびワクチンのための標的として魅力的な候補物質となってきた。実際に、現在、癌から感染症および自己免疫疾患にわたる様々な疾患モデルにおいてｈｓｐに対する免疫反応性の役割が提案されている。炎症性疾患の免疫調節におけるｈｓｐの役割についての最大の証拠は慢性関節炎のモデルからのものである。この研究は、ｈｓｐ１０、ｈｓｐ６０およびｈｓｐ７０による免疫はすべて、実験的関節炎の実質的にすべてのモデルにおいて防御を与えるうることを明らかにした。アジュバント関節炎のモデルでは、疾患の誘発と疾患からの防御の両方においてｈｓｐに対する免疫反応性が役割を果たす。他方で、ミコバクテリアｈｓｐ６０ １８０−１８８に特異的な、Ａ２ｂと呼ばれるＴ細胞クローンによってアジュバント関節炎を誘発できることが示された。また他方では、その後の試験は、ミコバクテリアｈｓｐ６０による前免疫は疾患の誘発に対して有効に防御できることを示した。しかし、ｈｓｐ６０による免疫後、いくつかのエピトープが免疫系によって認識されることが認められた。興味深いことに、８個のエピトープのうち１個のエピトープ（ミコバクテリアｈｓｐ６０ ２５６−２７０）だけが防御を誘導できることが認められた。この防御は、（自己ｈｓｐ）交叉反応性Ｔ細胞の誘導に基づくものであった。従って、アジュバント関節炎の動物モデルのデータから、防御および疾患誘発の両方に関して、関節炎の調節におけるｈｓｐに対する免疫反応性の重要な役割という像が提起された。異なるエピトープが完全に反対の作用を持つという事実は、ヒトの系においても、ペプチドＴ細胞エピトープを定義することの重要性を強調した。
【０００５】
この１０年間に、ｈｓｐに対する免疫反応性はまた、ヒト慢性関節炎、すなわち若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）および慢性関節リウマチ（ＲＡ）においても決定的に重要な役割を果たすことが明らかになった。第一に、ＪＩＡおよびＲＡを有する被験者の滑膜管壁細胞においてｈｓｐ６０の高い発現が検出された。第二に、自己および非自己ｈｓｐ６０の両方に対するＴ細胞反応性がこれら２つの疾患で認められた。同様にｈｓｐ７０およびＤｎａＪのような他のｈｓｐに対する免疫反応性がＪＩＡとＲＡとを有する被験者において検出された。ＪＩＡを有する小児では、自己ｈｓｐ６０に対する免疫反応性は良好な予後を予測すると思われた。従って、自己免疫から癌、感染症に及ぶ免疫仲介性疾患ではｈｓｐに対する炎症応答の調節が望ましい。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するストレスタンパク質の断片を含む実質的に純粋なＨＬＡ汎ＤＲ結合ペプチドを提供することにより、当技術分野における問題の多くを克服する。
【０００７】
１つの実施形態では、本発明は、免疫仲介性疾患を有するまたは免疫仲介性疾患に罹患する危険性を有する対象において免疫仲介性疾患を治療するまたは予防するための方法であって、薬学的に許容される担体中に１個以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するストレスタンパク質の断片を含む実質的に純粋なペプチドの有効量を対象に投与することを含み、ペプチドが免疫応答を調節し、それによって疾患を治療するまたは予防するための方法を提供する。
【０００８】
もう１つの実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中に１個以上の本発明のＨＬＡ汎ＤＲ結合ペプチドを含む薬学的組成物を提供する。
【０００９】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、本発明のＨＬＡ汎ＤＲ結合ペプチドをコードする単離核酸配列を提供する。
【００１０】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するストレスタンパク質の断片を含む実質的に純粋なＨＬＡ汎ＤＲ結合ペプチドの有効量を対象に投与する段階を含む、対象において免疫応答を誘導するための方法を提供する。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、様々なＭＨＣ分子とペプチドとの無差別の結合および提示によってＴ細胞の反応性を調節する、新規ペプチド配列を提供する。ある態様においては、本発明のペプチドの提示が増加することによって、免疫学的認識の尤度の増加がもたらされる。したがって、そのようなペプチドは、免疫応答を下方制御させる、ワクチンおよび炎症性反応の調節因子、ならびに、免疫応答を上方制御させ、異常細胞に対する身体による攻撃を増強する、癌および感染性疾患の治療薬のような、免疫応答を調節する分子として理想的な候補である。
【００１２】
アジュバント関節炎においては、ミコバクテリアｈｓｐ６０の異なるエピトープが矛盾した役割を果たすことから、ＪＩＡおよびＲＡを有する対象において、ｈｓｐ６０ペプチドのＴ細胞エピトープを決定することが必須となった。動物モデルにおいて集積されたデータに基づき、ＪＩＡを有する対象におけるＴ細胞エピトープを同定するために様々な試みがなされた。しかし、アジュバント関節炎モデルからのデータに基づく潜在的なエピトープの予測は、ヒトの系におけるＴ細胞エピトープの同定には無効であることが証明された。特にＪＩＡの場合、ＪＩＡの対象が異種ＨＬＡのバックグラウンドをもつことによって、ｈｓｐ６０の潜在的なＴ細胞エピトープの予測が妨げられた。このことから、ＭＨＣ結合アッセイ法に基づく予測は不可能となり、ＤＲ４への理論的な最適結合に基づく予測には価値がなくなってしまった。
【００１３】
本発明では、無差別汎ＤＲ Ｔ細胞エピトープを同定する。これらのペプチドは、様々な異なるＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩＩ分子に適合し、したがって大多数の対象におけるＴ細胞によって認識される。無差別汎ＤＲペプチドを同定するために、ペプチドが様々なＭＨＣクラスＩＩ分子へ結合するモチーフを同定する、米国特許第６，０３７，１３５号（その全体が参照として本明細書に組み入れられる）に記載のコンピューターアルゴリズムが使用された。ミコバクテリアおよびヒトの双方のｈｓｐ６０の配列はスキャンされ、ＨＬＡ ＤＲの３つのサブタイプ、即ち、ＤＲ１、ＤＲ４およびＤＲ７へのペプチド配列の予測される結合に基づき、ペプチドが設計された（表１）。ペプチドは、ＤＲ１、ＤＲ４およびＤＲ７への予測結合レベルにて選択された。表１に挙げられたものを含む本発明のペプチドは、自己反応性Ｔ細胞の増殖の誘導能、またはこれらのＴ細胞からのサイトカイン（例えばリンフォカイン）分泌の誘導能、または細胞傷害性のような他のエフェクター機能の誘導能を有することが、インビトロの試験において決定された。
【００１４】
上述したように、ｈｓｐは、免疫仲介性慢性炎症における免疫機構の標的である。より明確に言えば、実験的モデルに基づき、ｈｓｐを用いた免疫調節によって、糖尿病、炎症性腸疾患、糖尿病、関節炎および移植関連疾患のための、新規治療薬を提供することができる。
【００１５】
本発明は、炎症性反応を調節、ブロック、または阻害するためのペプチド、および、新規本ペプチドを使用する方法を提供する。本ペプチドおよび本方法は；病原性免疫応答を調節する（即ち、下方制御するか、上方制御するか、または産生されるＴＨ１分子：ＴＨ２分子の比率を変化させる）ペプチドまたはペプチド類似体をスクリーニングするために；有効性または治療的使用をモニタリングするために；および、そのような慢性炎症性状態の治療において免疫応答を下方制御または阻害するために有効となり得る他の作用物質を同定するのに有用である。
【００１６】
ｈｓｐは、免疫仲介性癌性状態および病原性感染においても、免疫機構の標的となる。この状況においては、実験的モデルに基づきｈｓｐを用いた免疫調節によって、黒色腫、白血病、リンパ腫、固形腫瘍（肺、肝臓、腎臓、脳、膀胱）、網膜芽腫、肉腫および他の結合組織癌等のような癌性状態のための、新規治療薬を提供できる。本発明のＨＬＡ汎 ＤＲペプチドを用いて治療できる免疫仲介性病原性感染は、結核、らい、グラム陽性微生物およびグラム陰性微生物への微生物感染のような免疫仲介微生物感染、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、エプスタイン−バーウイルスおよびサイトメガロウイルス感染、およびリーシュマニア属のような原生動物への感染等を含む。
【００１７】
本発明は、前癌状態または癌性状態および微生物感染を調節、ブロックまたは阻害するように、身体の免疫応答を上方制御するために、ペプチドおよび新規ペプチドを使用する方法を提供する。本ペプチドおよび方法は；癌性状態または微生物感染の進行を和らげるように身体の免疫応答を上方制御するペプチドまたはペプチド類似体をスクリーニングするために；そのようなペプチドの有効性または治療的使用をモニタリングするために；および、そのような免疫仲介性前癌状態または癌性状態および微生物感染の治療において、免疫応答を上方制御または調節するのに有効となり得る他の作用物質を同定するために有用である。
【００１８】
本発明の実質的に純粋なＨＬＡ汎ＤＲ結合ペプチドは、例えばＨＬＡ ＤＲ１、ＤＲ４およびＤＲ７のようなＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するストレスタンパク質の断片を含む。本発明のＨＬＡ汎ＤＲ結合ペプチドは、例えば、ミコバクテリア熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）およびヒト熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）に由来しうる。
【００１９】
脊椎動物は、環境からの病原体に対する防御、および腫瘍細胞のような、内部にて発達する異常細胞に対する防御として免疫応答を増加させる能力を有する。これは、ＮＫ細胞、好中球および単球／マクロファージ系の細胞に仲介される先天免疫の形態、または、リンパ球によって仲介される、特異的な抗原に対する獲得免疫または能動免疫の形態をとり得る。能動免疫応答は、さらに、体循環に曝露された抗原を中和する役割を果たし、プロフェッショナル貪食細胞によるそれらの摂取を助ける特異的な抗体の産生を伴う液性応答と、体内における感染細胞または異常細胞の認識に必要とされる細胞性応答との、２つの群に細分できる。
【００２０】
双方の場合において、特異的な反応は、抗原の細胞内での処理およびエフェクターＴ細胞による認識によって制御される。成熟した細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはＴヘルパー細胞（Ｔｈ）は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子の状況において、それらの受容体が認識できる抗原に遭遇しない限り、休止状態のままである。特異的な抗原との遭遇後、Ｔ細胞は増殖し、エフェクター機能を果たし、その結果、反応性の抗原が除去される。細胞質経路を経て抗原が処理される場合、結果的に生じるペプチドは新生ＭＨＣクラスＩ分子に結合され、それによりエフェクターＴ細胞への適切な提示が促進される。ＭＨＣクラスＩの提示により、ＣＤ８リガンドを有する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による認識が促進される。対照的に、液性免疫の刺激に関わるＴヘルパー反応を促進する機序でのエンドサイトーシス経路を経た細胞内の処理により、ＭＨＣクラスＩＩ分子上における提示がもたらされる。ワクチン接種の目的は、免疫機構が感作されて病原性感染に対して反応するように、双方の免疫応答を感作し、メモリーＴ細胞を生み出すことである。
【００２１】
Ｔ細胞の活性化は、一連の化学的シグナル（主にサイトカイン）の発生を伴い、直接作用をもたらすか、または、免疫機構の他の細胞を刺激して作用させる。クラスＩ ＭＨＣ抗原による活性化の場合、ＣＴＬが増殖し、その与えられた抗原を提示している感染細胞を破壊するよう作用する。感染細胞が殺されることによって、ウイルスは増殖を阻害され、中和抗体に接近可能になり、したがって、ウイルスが除去される。対照的に、クラスＩＩ ＭＨＣ−抗原複合体によるＴｈ細胞の活性化によっては、抗原提示細胞（宿主の防御機構の部分）は破壊されないが、むしろ、Ｔｈ細胞が刺激されて増殖し、様々な細胞に影響を与えるシグナル（再度、主にサイトカイン）を生じる。他の影響としては、シグナル伝達により、Ｂ細胞の刺激、マクロファージの活性化、ＣＴＬの分化および炎症の促進が導かれる。この協奏反応は比較的特異的であり、通常、クラスＩＩ ＭＨＣ系によって提示されるペプチドを有する外来因子に標的指向される。
【００２２】
適切に作用した場合、顕微鏡的病原体の除去、および、より狭い範囲においては、新形成性細胞の除去において、免疫応答は驚くほど有効である。一般に、自己認識のための複雑な機構は効率がよく、外来抗原に排他的に標的指向される強い反応を行わせる。免疫機構の重大な機能である、自己／非自己の識別の制御は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球の発達および寿命の間に渡って、複数の機構に関与する。中枢リンパ器官における自己反応性Ｔ細胞前駆体および自己反応性Ｂ細胞前駆体の欠失によって、自己反応性細胞のほとんどが除去される一方、Ｆａｓ、ＩＬ−２ＲおよびＣＴＬＡ−４仲介のシグナル伝達を必要とする末梢性機構が、免疫ホメオスタシスには必須であると考えられる。あいにく、免疫機構はときに機能不全となり、宿主の細胞に対して指向し、それにより自己免疫反応が誘発される。自己免疫または自己反応性は典型的に、免疫細胞上の抗原受容体が宿主細胞上の特異的な自己抗原（例えば、自己エピトープ）を認識し、宿主細胞の破壊をもたらす反応を開始した場合に生じる。多くの場合、自己免疫反応は、それらを誘発した抗原が除去された場合に消失するという点において、自己限定性である。しかし、ある例においては、自己反応性リンパ球は、それらが存続するはずだと考えられるより長く存続し、アポトーシスを誘導し続けるか、またはさもなければ、宿主細胞を除去してしまう。自己免疫障害または自己免疫状態の例には、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ（多分１つより多くの機序）、エリテマトーデスおよびＩ型糖尿病が含まれる。
【００２３】
当技術分野、特に対立遺伝子特異的ペプチド結合モチーフの同定における近年の発展によって、当技術分野は一変した（Ｍａｄｄｅｎら、１９９１；ＲｏｔｓｃｈｋｅおよびＦａｌｋ， １９９１）。この知識に基づいて、自己免疫疾患に対するＭＨＣ関連感受性についての構造的な基礎を、当技術分野における積年の疑問を解決するのに十分な詳細レベルにて再評価することができる。幾つかのＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子に結合するペプチドについてのモチーフは、天然に処理されたペプチドの配列解析によって、および既知のエピトープの突然変異解析によって定義づけられた。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、短いこと（一般に８〜１０アミノ酸長）、および、２つの主要なＭＨＣアンカー残基を有することが見出された；ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、より長く、大きさがより不均一であることが見出された（Ｍａｄｄｅｎら、１９９１；ＲｏｔｓｃｈｋｅおよびＦａｌｋ， １９９１；Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、１９９１；Ｃｈｉｃｚら、１９９３）。より最近には、ＨＬＡ−ＤＲ１についての結晶構造解析によって、ペプチドのＮ末端近辺に主要な疎水性アンカー残基が存在すること、および第二のアンカー残基が幾つかの他のペプチド位置に認められることが示された（Ｂｒｏｗｎら、１９９３）。
【００２４】
本発明の実施において有用な、ストレスタンパク質として知られるクラスに含まれる熱ショックタンパク質は、以下の基準の任意の１つを満たす任意の細胞タンパク質の間から選択することができる。熱ショックタンパク質は、細胞がストレス刺激に曝露された場合に、その細胞内濃度を増加させること、他のタンパク質またはペプチドに結合できること、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）または低ｐＨの存在下にて、結合したタンパク質またはペプチドを解離できること、または、上記の特性のうち任意のものを有する任意の細胞タンパク質と、少なくとも３５％の相同性を有することによって特徴づけられる。
【００２５】
今までのところ、分子量に基づいて、ｈｓｐの３つの主要なファミリーが同定されている。それらのファミリーは、ストレスタンパク質のキロダルトンでのおよその分子量を数字に反映させて、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０およびｈｓｐ９０と呼ばれている。哺乳動物のｈｓｐ９０およびｇｐ９６の各々は、ｈｓｐ９０ファミリーのメンバーである。これらのファミリーの多くのメンバーは、限定はしないが、栄養素剥奪、代謝撹乱、酸素ラジカル、および細胞内病原体による感染を含む、他のストレス刺激に反応して誘導されることが後に認められた（その開示が参照として本明細書に組み入れられる、Ｗｅｌｃｈ， Ｍａｙ １９９３， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ５６〜６４；Ｙｏｕｎｇ， １９９０， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：４０１〜４２０；Ｃｒａｉｇ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： １９０２１９０３；Ｇｅｔｈｉｎｇら、１９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：３３〜４５；およびＬｉｎｄｑｕｉｓｔら、１９８８， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２：６３１〜６７７を参照のこと）。これら３つのファミリーのうち全てに属するｈｓｐ／ストレスタンパク質が、本発明の実施において使用できることが予測される。好ましい態様においては、ｈｓｐ６０タンパク質およびタンパク質配列が本発明のペプチドを誘導するために使用される。ｈｓｐ６０タンパク質は、全てではないがほとんどの哺乳動物細胞において、通常の温度にて豊富にあり、熱によってさらに誘導される（Ｌａｉら、１９８４， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ４：２８０２〜１０；ｖａｎ Ｂｅｒｇｅｎ ｅｎ Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎら、１９８７， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：５２５〜３１）。
【００２６】
熱ショックタンパク質は、高度に保存されたタンパク質である。例えば、ｈｓｐ６０ファミリーおよびｈｓｐ９０ファミリーは、高レベルのファミリー内保存を示す。さらに、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０およびｈｓｐ９０ファミリーは、例えば３５％より大きなアミノ酸同一性を有するが、その発現レベルがストレスによって変化しない、ストレスタンパク質に配列上関連するタンパク質から構成されることが見出されている。したがって、本明細書において使用されるように、ストレスタンパク質の定義は、ストレス刺激に反応して細胞における発現レベルが増強される３つのファミリーのメンバーと、少なくとも３５〜５５％、好ましくは５５〜７５％、および最も好ましくは７５〜８５％のアミノ酸同一性を有する、他のタンパク質、ムテイン、類似体およびその変異体を包含することが意図される（その全体を参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，９６１，９７９号を参照のこと）。これら３つのファミリーに属するストレスタンパク質の精製については、下記にて説明される。
【００２７】
ある態様においては、本発明に従って使用されるｈｓｐは哺乳動物のｈｓｐである。その他の態様においては、自己免疫疾患の治療のために本発明に従って使用されるｈｓｐは、ｈｓｐ６０ファミリーのメンバーである。
【００２８】
６０ ｋＤａの熱ショックタンパク質（ｈｓｐ６０）は、身体の細胞の全てにおいて発現可能なストレスタンパク質である。それにも関わらず、健常な個体は、ｈｓｐ６０自己エピトープに特異的な自己免疫Ｔ細胞を高頻度に発現する。正常な健康体のマウスおよびヒトは、それらの自己ｈｓｐ６０抗原を標的指向するＴ細胞を有することが示された（Ｋａｕｆｍａｎｎ， １９９０；Ｋａｕｆｍａｎｎら、１９９４；Ｙｏｕｎｇ， １９８９；Ｃｏｈｅｎ， １９９２ｂ）。しかし、これらの自己免疫Ｔ細胞は、Ｔ細胞仲介の自己免疫疾患にも関与している：自己ｈｓｐ６０抗原を標的指向する高濃度のＴ細胞が、ヒトの慢性関節炎（Ｃｏｈｅｎ， １９９１；Ｒｅｓら、１９８９；ｖａｎ Ｅｄｅｎら、１９８９）、多発性硬化症（Ｓｅｌｍａｊら、１９９１）、実験的自己免疫脳脊髄炎（Ｓｅｌｍａｊら、１９９１）およびアジュバント関節炎（Ｈｏｇｅｒｖｏｒｓｔら、１９９２）の自己免疫病変において認められた。また、抗ｈｓｐ６０ Ｔ細胞は、非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおいて、糖尿病におけるある役割を果たしていることも示された（Ｅｌｉａｓら、１９９０；Ｅｌｉａｓら、１９９１；Ｅｌｉａｓら、１９９４；Ｅｌｉａｓら、１９９５；Ｂｉｒｋら、１９９６ａ；Ｂｉｒｋら、１９９３；Ｃｏｈｅｎ， １９９１）。
【００２９】
本発明のＨＬＡ汎ＤＲ結合ペプチドは、ヒトと他の下等生物の対応する熱ショックタンパク質の間において保存されたアミノ酸配列、特に、それぞれｈｓｐ６０およびｄｎａＪのような、ヒトおよび細菌の熱ショックタンパク質間、またはヒトおよびミコバクテリアの熱ショックタンパク質間において保存されたアミノ酸配列を有する。
【００３０】
「単離された」または「精製された」という用語は、その天然の状態から「人の手によって」変化させられたこと、即ち、それが天然に生じる場合、本来の環境から変えられた、または除去された、またはその両方を意味する。例えば、天然に生じるポリヌクレオチド、または、生きた動物において天然の状態で天然に存在するポリペプチドは、「単離」または「精製」されていないが、共在する素材から天然の状態で分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本用語が本明細書において使用されるように、「単離」または「精製」されている。
【００３１】
「実質的に純粋なペプチド」は、それが重量パーセントで少なくとも６０％であり、それが天然にて関連するタンパク質および天然に生じる有機分子を含まない場合に、典型的に純粋である。好ましくは、調製物は、重量パーセントで少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％であり、配列番号：１または配列番号：１３において示されるような配列の断片である配列（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を有する。実質的に純粋な本発明のｈｓｐ６０ペプチドは、例えば、天然供給源からの抽出によって；全長ポリペプチド（例えば、配列番号：１または配列番号：１３）をコードする組換え核酸の発現、およびそれに続く、プロテアーゼによる切断によって；配列番号：１または配列番号：１３の断片（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０）をコードする組換え核酸の発現によって；または、本発明のペプチドを化学的に合成することによって得ることができる。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析のような、任意の適切な方法によって測定できる。
【００３２】
本発明の熱ショックタンパク質６０（ｈｓｐ６０）ペプチドは、配列番号：１において示されるような配列の断片を含む。本発明のｈｓｐ６０ 熱ショックタンパク質の断片（即ちペプチド）の例には、表１において示されるような配列を有するペプチド（Ｐ１、２、３、４、５、６、７および８は、各々、配列番号：２、３、４、５、６、７、８および９である）が含まれる。本発明の熱ショックタンパク質ｄｎａＪペプチドは、配列番号：１０の配列を有するペプチドのように、配列番号：１４において示されるような配列の断片を含む。本発明のそのようなペプチドまたはポリペプチドは、実質的に精製されうる。
【００３３】
【表１】
2004518430.tif 000002
【００３３】
ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質は、単量体がアミド結合により共に結合されるアミノ酸残基であるような重合体を指す。アミノ酸がα−アミノ酸である場合、Ｌ型光学異性体またはＤ型光学異性体のいずれかを使用することができ、Ｌ型異性体が典型的である。本発明のペプチドは、配列番号：１の断片を包含することが意図される。本発明に包含される、配列番号：１または配列番号：１３の断片の特定の例は、Ｌ型またはＤ型アミノ酸からなる、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０において示されるような配列を包含し、糖タンパク質のような修飾配列を含む。したがって、本発明のペプチドは、天然に生じるタンパク質、および組換えまたは合成によって合成されるものを含むことが意図される。本発明には、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０と実質的に同じ配列を有し、およびそれが関連する配列の機能的活性を保持するようなペプチドもまた包含される。実質的に同じ配列を有するペプチドは、本来のペプチドに対し、対応する部分に渡っておよそ７０〜９０％の相同性をなおも有するような保存的なアミノ酸置換に基づいて設計することができる。類似のアミノ酸、即ち保存的アミノ酸置換が配列における変化としてみなされない場合には、なおより大きな程度で相同性からの逸脱が許容される。ペプチドは、約１０〜３０アミノ酸長；好ましくは１５〜２５アミノ酸長、およびより特定的には１５〜２０アミノ酸長である。
【００３４】
保存的な変異は、あるアミノ酸残基の、生物学的に類似した他の残基への置換を意味する。保存的な変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのようなある疎水性残基の他の残基への置換、または、アルギニンのリシンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、またはグルタミンのアスパラギンへの置換および同様の、ある極性残基の他の残基への置換が含まれる。保存的な置換の他の実例は、以下の変化を含む：アラニンからセリン；アルギニンからリシン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リシンからアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；バリンからイソロイシンまたはロイシン。「保存的変異」という用語はまた、置換されたポリペプチドに対して生じた抗体が未置換のポリペプチドに対しても免疫反応性であるならば、置換されていない親アミノ酸の代わりに、置換されたアミノ酸を使用することをも含む。
【００３５】
修飾および置換は、アミノ酸の置き換えには限定されない。安定性、可溶性、または立体配置関係の増加のような、様々な目的のためには、当業者には（欠失、置き換え、または付加によって）他の修飾を導入する必要性が認識される。そのような他の修飾の例には、希有アミノ酸、Ｄ（ｄｅｘｔｒａ）−アミノ酸、グリコシル化部位、特定のジスルフィド架橋形成のためのシトシンの取り込みが含まれる。修飾ペプチドは、化学的に合成することができる、または、単離された遺伝子の部位特異的突然変異誘発を行うことができる、または、合成遺伝子を合成し、細菌、酵母、バキュロウイルス、組織培養等において発現させることができる。
【００３６】
本発明によって意図される本発明のｈｓｐ６０ペプチドの「塩類」は、生理学的に許容できる有機塩類および無機塩類である。
【００３７】
本明細書において使用されるように、ｈｓｐ６０ペプチドの「機能的な誘導体」は、当技術分野において既知の方法によって、残基またはＮ末端基もしくはＣ末端基上の側鎖として生じる官能基から調製できる誘導体を含み、それらが依然として薬学的に許容できるままである限り、即ち、それらがペプチドの活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性を与えず、およびその抗原性に有害に影響を及ぼさない限り、本発明に含まれる。
【００３８】
これらの誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一級アミンまたは第二級アミンを用いた反応によって作製されたカルボキシル基のアミド、アシル基（例えばアルカノイル基または炭素環式アロイル基）を用いた反応によって形成されたアミノ酸残基のフリーアミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル基を用いた反応によって形成されたフリーヒドロキシル基（例えばセリル残基またはスレオニル残基のもの）のＯ−アシル誘導体を含み得る。
【００３９】
配列解析アルゴリズムは、既知の配列と未知の配列との間の相同性または同一性を評価するために使用することができる。そのような方法およびアルゴリズムは、他の生物体に存在する対応配列の同定において、および本発明のペプチドの設計において有用である。相同性または同一性は、しばしば、配列解析ソフトウェア（例えば、ジェネティックスコンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， １７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７０５）の、配列解析ソフトウェアパッケージ）を用いて評価される。そのようなソフトウェアは、相同性の程度を、様々な欠失、置換および他の修飾に割当てることによって、類似した配列を合致させる。２つまたはそれ以上の核酸、ポリペプチド、またはペプチド配列についての文脈における「相同性」および「同一性」という用語は、同じものである２つもしくはそれ以上の配列もしくは部分配列を指すか、または、任意の数の配列比較アルゴリズムを用いて評価される場合もしくは手動アラインメントおよび視覚的検査により、比較ウインドウもしくは設計領域に渡って比較し最大の一致についてアラインメントが行われる場合に、アミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージが同じになるような２つあるいはそれ以上の配列もしくは部分配列を指す。
【００４０】
配列比較については、典型的には、１つの配列が、被験配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および参照配列はコンピューターに入力され、必要であれば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを用いることができる、または、代替パラメータを指定することができる。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメータに基づき、参照配列と比較した、被験配列についての配列同一性のパーセントを算出する。
【００４１】
本明細書において使用されるように、「比較ウインドウ」は、２つの配列が最適に整列化された後に、同じ数の隣接位置を有する参照配列に対して配列を比較することができる、８〜１０、１０〜２０、２０〜６００、通常約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群より選択される、任意の数の隣接位置からなるセグメントへの言及を含む。比較のための配列アラインメントの方法は、当技術分野においてはよく知られている。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）， Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびワンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、パーソン（Ｐｅｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター処理実行（ウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、または手動アラインメントおよび視覚的検査によって行うことが可能である。
【００４２】
有用なアルゴリズムの一例は、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９〜３４０２（１９７７）、および、アルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３〜４１０（１９９０）において各々説明されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと整列化された場合に、ある正値閾値スコアＴに合致するかそれを満たす、照会配列中の短ワード長Ｗを同定することによって、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を最初に同定する段階に関与する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシード（タネ）としての役割を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（合致する残基のペアについてのリワードスコア；常に ＞ ０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、累積スコアを算出するために、スコアリングマトリックスが使用される。以下の場合、各方向におけるワードヒットの伸長は停止される：量Ｘによって、累積アラインメントスコアがその最大達成値から低下する場合；１つまたはそれ以上の負スコア残基アラインメントの蓄積によって、累積スコアがゼロまたはそれ以下に下がる場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）では、デフォルトとしてワード長（Ｗ）または１１、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および双方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、デフォルトとして、ワード長３、および期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方の鎖の比較を使用する。
【００４３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析をも実行する（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの評価基準は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の合致が偶然に生じ得る確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、核酸は、被験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似していると考えられる。
【００４４】
相同性または同一性を決定するための他のアルゴリズムには、例えば、ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に加え、ＡＬＩＧＮ、ＡＭＡＳ（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、ＡＭＰＳ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＡＳＳＥＴ（Ａｌｉｇｎｅｄ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ）、ＢＡＮＤＳ、ＢＥＳＴＳＣＯＲ、ＢＩＯＳＣＡＮ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｏｄｅ）、ＢＬＩＭＰＳ（ＢＬｏｃｋｓ ＩＭＰｒｏｖｅｄ Ｓｅａｒｃｈｅｒ）、ＦＡＳＴＡ、Ｉｎｔｅｒｖａｌｓ ＆ Ｐｏｉｎｔｓ、ＢＭＢ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＬＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、ＷＣＯＮＳＥＮＳＵＳ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、ＤＡＲＷＩＮ、Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ アルゴリズム、ＦＮＡＴ（Ｆｏｒｃｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ）、Ｆｒａｍｅａｌｉｇｎ、Ｆｒａｍｅｓｅａｒｃｈ、ＤＹＮＡＭＩＣ、ＦＩＬＴＥＲ、ＦＳＡＰ（Ｆｒｉｓｔｅｎｓｋｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）、ＧＡＰ（Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＧＥＮＡＬ、ＧＩＢＢＳ、ＧｅｎＱｕｅｓｔ、ＩＳＳＣ（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）、ＬＡＬＩＧＮ（Ｌｏｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＬＣＰ（Ｌｏｃａｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＭＡＣＡＷ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ＆ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ）、ＭＡＰ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）、ＭＢＬＫＰ、ＭＢＬＫＮ、ＰＩＭＡ（Ｐａｔｔｅｒｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｌｔｉｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ＳＡＧＡ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｂｙ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）およびＷＨＡＴ−ＩＦが含まれる。そのようなアラインメントプログラムはまた、実質的に同一の配列を有するポリヌクレオチド配列を同定するためのゲノムデータベースのスクリーニングのために用いることもできる。多くのゲノムデータベースが利用可能である。例えば、ヒトゲノムの実質的な部分は、ヒトゲノム配列決定プロジェクト（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ）の部分として得ることができる（Ｊ．Ｒｏａｃｈ， ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｅｒ．ｕ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／〜ｒｏａｃｈ／ｈｕｍａｎ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｐｒｏｇｒｅｓｓ２．ｈｔｍｌ）（Ｇｉｂｂｓ， １９９５）。例えば、マイコプラズマ（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）（Ｆｒａｓｅｒら、１９９５）、メタン細菌（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（Ｂｕｌｔら、１９９６）、インフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら、１９９５）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７）および酵母（Ｓ．ｃｅｒｅ���ｉｓｉａｅ）（Ｍｅｗｅｓら、１９９７）、およびショウジョウバエ（Ｄ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（Ａｄａｍｓら、２０００）を含む、少なくとも２１個の他のゲノムが既に配列決定されている。マウス、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属種）およびショウジョウバエのようなモデル生物のゲノムの配列決定においても著しい進展があった。ある機能的情報を注釈付けされたゲノム情報を含む幾つかのデータベースは、異なる組織体によって維持されており、例えば、
2004518430.tif 000003
のように、インターネットを通じてアクセス可能である。
【００４５】
本発明のペプチドに加え、配列番号：１または配列番号：１３の断片（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）をコードする核酸配列（例えばオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列）が、本発明によって包含される。例えば、本発明のＤＮＡ配列は、幾つかの方法によって得ることができる。例えば、核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列は、遺伝暗号の縮重に基づき、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０または１２に由来することができ、コンピューターに基づくアルゴリズムおよび配列プログラムを用いて決定できる。２０個の天然のアミノ酸が存在し、そのほとんどが１つより多くのコドンによって特定される。したがって、核酸配列によってコードされる本発明のペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しない限り、全ての縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。
【００４６】
ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸配列は、ヌクレオチドの重合形態を指し、本明細書においては交換可能なように使用される。本用語はしたがって、例えば、ベクターに；自律複製するプラスミドもしくはウイルスに；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み入れられるか、あるいは、他の配列とは独立した別個の分子（例えばｃＤＮＡ）として存在する、組換えＤＮＡを含む。本発明のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾形態が可能である。さらに、ポリペプチド鎖の産生に関与するポリヌクレオチド配列は、コード領域のすぐ前、および次に続く（リーダーまたはトレーラー）領域、同様に、ポリヌクレオチド配列の供給源に依存する個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含み得る。
【００４７】
ポリヌクレオチドという用語は一般に、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。したがって、例えば、本明細書において使用されるようなポリヌクレオチドは、数ある中で、単鎖および二重鎖のＤＮＡ、単鎖領域および二重鎖領域の混合物であるＤＮＡ、単鎖および二重鎖のＲＮＡ、ならびに単鎖領域および二重鎖領域の混合物であるＲＮＡ、単鎖、またはより典型的には、二重鎖もしくは単鎖領域および二重鎖領域の混合物であり得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を指す。
【００４８】
さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸配列は、１つまたはそれ以上の修飾塩基を含み得る。したがって、安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書においてその用語が意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、ほんの２例をあげると、イノシンのような特異塩基、またはトリチル化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書にてその用語が使用されるようなポリヌクレオチドである。
【００４９】
本発明のペプチドをコードする核酸配列（例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）は、相補的なポリヌクレオチド配列を含む。配列がＲＮＡである場合、デオキシリボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、リボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＵによって各々置き換えられる。本発明には、本発明のポリペプチドまたはペプチド配列をコードするＤＮＡに断片を選択的にハイブリダイズさせるのに十分な、少なくとも１５塩基長である、上記に説明された核酸配列の断片（部分）もまた含まれる。本明細書において使用されるような「選択的なハイブリダイゼーション」は、関連ヌクレオチド配列を非関連ヌクレオチド配列から識別する、適度にストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな生理学的条件下におけるハイブリダイゼーションを指す（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９ 「分子生物学、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．において説明される技術を参照のこと）。
【００５０】
核酸ハイブリダイゼーション反応においては、特定レベルのストリンジェンシーを達成するために使用される条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質によって様々である。例えば、長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、ＧＣ含量対ＡＴ含量）、および、核酸のハイブリダイズ領域の核酸タイプ（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）が、ハイブリダイゼーション条件の選択において考慮され得る。付加的に考慮すべき問題は、核酸の一方を、例えばフィルター上に、固定化するかどうかということである。
【００５１】
漸次高めていくようなストリンジェンシー条件の例は、以下の通りである：およその室温における２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；およその室温における０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃における０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（中程度のストリンジェンシー条件）；および約６８℃における０．１×ＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件）。例えば高いストリンジェンシー条件のような、これらの条件のうち１つのみを用いて、洗浄を行うことができる、または、挙げられた段階の任意のものまたは全てを反復し、上記に挙げられた順にて、条件の各々を、例えば各々１０〜１５分間使用することができる。しかし、上記に言及されるように、最適条件は、関与する特定のハイブリダイゼーション反応に依存して変化させ、経験的に決定することができる。
【００５２】
核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法により、適切なプローブが利用可能であるならば、任意の遺伝子配列が任意の生物体から単離されうる。例えば、他の生物体における他の相同遺伝子を同定するために、そのようなプローブを使用できることが予測される。これを完遂するに当たっては、ゲノムデータベースをスクリーニングするために、アラインメントアルゴリズム（上記に説明されるような）を使用することができる。または、問題のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成することができる。これに必要なのは、アミノ酸配列の一続きの短いオリゴペプチドが既知でなければならないことである（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）。タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、遺伝暗号から推定できるが、コードの縮重は考慮されねばならない。
【００５３】
本発明においては、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０をコードする核酸配列を、組換え発現ベクターに挿入することができる。「組換え発現ベクター」という用語は、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０をコードする核酸配列の挿入または取り込みによって操作された、プラスミド、ウイルス、または当技術分野において既知の他の媒体を指す。そのような発現ベクターは、挿入された遺伝子配列の効率のよい転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは、典型的に、複製起点、プロモーター、および形質転換細胞を表現型選択させるような特定の遺伝子を含む。本発明における使用に適したベクターは、本明細書にて説明されるものを含む。
【００５４】
当業者によく知られている方法を、例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０および適切な転写／翻訳調節シグナルをコードする配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの組換え／遺伝学的技術を含む（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９， 「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．において説明される技術を参照のこと）。
【００５５】
遺伝的構築物は、例えば、カラム上における捕捉による、または、抗体の使用による精製を容易にする、Ｃ末端またはＮ末端のアミノ酸残基の付加のような、付加的な便益を提供するよう設計されうる。全てのこれらの方法論は累積的なものである。特定の構築物の生産方法についての選択は、実施上考慮すべき事柄：望ましいペプチドのサイズ、開始材料の利用可能性およびコスト等に基づき、当業者によって容易に行われ得る。関与する全ての技術は、当技術分野においては十分に確立されており、よく知られている。例えば、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１巻および第２巻（１９８７）、補遺を含める、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）を参照のこと。なおも他の技術的参照が、当業者には既知であり、容易に利用可能である。
【００５６】
核酸配列は、融合タンパク質をコードするように作製することができ、発現調節配列に操作的に連結可能である。「操作的に連結された」とは、そのように説明される成分が、その意図された仕方でそれらを機能させるような関係にある並置を指す。例えば、ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を１つのｍＲＮＡに転写し、それがその後両方のコード配列に由来するアミノ酸を有する１つのポリペプチドに翻訳される場合、１つのコード配列はもう１つのコード配列に「操作的に連結されている」。コード配列は、発現された配列が最終的に望ましい産物を作製するようプロセシングされる限り、互いに隣接する必要はない。コード配列に操作的に連結された発現調節配列は、その発現調節配列と適合性の条件下にてコード配列の発現がなされるようにライゲーションされる。本明細書において使用されるように、「発現調節配列」という用語は、それが操作的に連結される核酸配列の発現を制御する核酸配列を指す。発現調節配列は、その発現調節配列が、核酸配列の転写、および適切には、翻訳を調節および制御する場合、核酸配列に操作的に連結されている。したがって、発現調節配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写終結配列、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列の前の開始コドン（即ちＡＴＧ）、ｍＲＮＡの適切な翻訳をさせるためのその遺伝子の正しい読み枠の維持のための、イントロンについてのスプライシングシグナル、および停止コドンを含み得る。「調節配列」という用語は、最低限でも、その存在が発現に影響を与え得る成分を含むことを意図され、例えばリーダー配列および融合パートナー配列のような、その存在が有益であるような付加的な成分をも含み得る。発現調節配列は、プロモーターを含み得る。
【００５７】
「プロモーター」とは、転写を司るのに十分な最小配列を意味する。本発明においては、細胞タイプ特異的、組織特異的に調節可能な、または外部のシグナルまたは作用物質によって誘導可能な、プロモーター依存性の遺伝子発現を変えるのに十分であるようなプロモーター因子もまた含まれる；そのような因子は、核酸配列の５’領域または３’領域に位置し得る。構成的なプロモーターおよび誘導可能なプロモーターの双方は、本発明に含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６〜５４４， １９８７を参照のこと）。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、バクテリオファージのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）のような誘導可能なプロモーター等を使用できる。哺乳動物細胞系におけるクローニングの場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルス末端反復配列；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が使用できる。組換えＤＮＡまたは合成技術によって作製されるプロモーターもまた、本発明の核酸配列の転写の手段を与えるために使用できる。
【００５８】
例えば、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む本発明の核酸配列を、組換え発現ベクターに挿入することができる。組換え発現ベクターは一般に、核酸配列の挿入または取り込みによって操作された、プラスミド、ウイルスまたは当技術分野において既知の他の媒体を指す。例えば、本発明の組換え発現ベクターは、例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０において示されるような配列を有するペプチドをコードする核酸配列を含む。発現ベクターは典型的に、複製起点、プロモーター、および、形質転換細胞を表現型選択させるような特定の遺伝子を含む。本発明における使用に適したベクターは、限定はしないが、細菌における発現のためのＴ７に基づく発現ベクター（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ ５６：１２５， １９８７）、哺乳動物細胞における発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（ＬｅｅおよびＮａｔｈａｎｓ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：３５２１， １９８８）、昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス由来のベクター、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶを含む。本発明の核酸配列はまた、適切な細胞小器官標的指向シグナルまたは局在性宿主タンパク質への融合によって、指示物質を特定の細胞部位に指向させるような局在化配列をも含み得る。例えば、局在化配列、またはシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、リプレッサーとして使用することができ、したがって、局在化ペプチドまたはシグナルペプチドが、結果的に生じるコードされた融合ポリペプチドのアミノ末端に配置されるように、本発明のペプチドをコードする核酸配列の５’末端においてライゲーションまたは融合することができる。発現ベクターの構築、およびトランスフェクションされた細胞における遺伝子の発現は、当技術分野において同様によく知られている分子クローニング技術の使用に関与する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ− Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９、 および「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編， （Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．の共同出版， 最新増補）を参照のこと）。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの組換え／遺伝的組換えを含む（Ｍａｎｉａｔｉｓら、「分子クローニング、実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ．， １９８９も参照のこと）。
【００５９】
酵母においては、構成的または誘導可能なプロモーターを含む多くのベクターが使用できる。概観については、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２巻， オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｉｃｅｎｃｅ， 第１３章， １９８８；グラント（Ｇｒａｎｔ）ら、「酵母のための発現および分泌ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ）」， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ウー（Ｗｕ）およびグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）編， １９８７， Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， 第１５３巻， ５１６〜５４４ページ， １９８７；グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）， 「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、第ＩＩ巻， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈ．， Ｄ．Ｃ．， 第３章， １９８６；およびビター（Ｂｉｔｔｅｒ）， 「酵母における異種遺伝子発現（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ）」， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）編， Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， 第１５２巻， ６７３〜６８４ページ， １９８７；および「酵母サッカロミセスの分子生物学（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）」， ストラサーン（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ）編， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， 第Ｉ巻および第ＩＩ巻， １９８２を参照のこと。ＡＤＨまたはＬＥＵ２のような構成的な酵母プロモーター、または、ＧＡＬのような誘導可能なプロモーターを使用することができる（「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、第１１巻， 「実践アプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＤＭ Ｇｌｏｖｅｒ編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈ．， Ｄ．Ｃ．， １９８６の、「酵母におけるクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ）」， 第３章， Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）。または、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターを使用することができる。
【００６０】
例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０において示されるような配列を有するペプチドを発現させるために使用可能な代替の発現系は、昆虫の系である。そのようなある系においては、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来配列または突然変異配列を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。本発明のペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化でき、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の調節下に置くことが可能である。本発明のペプチドをコードする配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子の不活性化、および、非閉鎖組換えウイルス（即ち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質様外皮を欠くウイルス）の生産がもたらされる。これらの組換えウイルスは、その後、挿入遺伝子が発現されるＳ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染するために用いられる。スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．４６：５８４， １９８３；スミス（Ｓｍｉｔｈ）， 米国特許第４，２１５，０５１号を参照のこと。
【００６１】
本発明のベクターは、宿主細胞を形質転換するために使用することができる。形質転換すること、または形質転換とは、新しいＤＮＡ（即ち、細胞にとって外因性のＤＮＡ）の取り込みに引き続き、細胞において誘導される、永続的なまたは一過性の遺伝的変化を意味する。細胞が哺乳動物細胞の場合、永続的な遺伝的変化は、一般にＤＮＡの細胞のゲノムへの導入によって達成される。
【００６２】
形質転換細胞または形質転換宿主細胞は、一般に、組換えＤＮＡ技術によって、本発明のペプチドまたはその類似体をコードするＤＮＡ分子を、それに（またはその祖先細胞に）導入された細胞（例えば原核細胞または真核細胞）を指す。
【００６３】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られるような従来的な技術によって行うことができる。大腸菌のように、宿主が原核生物である場合、指数増殖期後に採集され、続いて当技術分野においてよく知られた手法によるＣａＣｌ２法によって処理された細胞から、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞を調製し得る。または、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することができる。形質転換はまた、宿主細胞のプロトプラストを形成した後に、またはエレクトロポレーションによって、行うこともできる。
【００６４】
宿主が真核生物である場合、ＤＮＡによるトランスフェクションまたは形質転換の方法には、リン酸カルシウム共沈降法が含まれ、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびウイルスベクターに包まれたプラスミドの挿入等の従来的な機械的手法が含まれ、同様に、当技術分野において既知の他の方法が使用されうる。真核細胞は、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列、および、単純疱疹チミジンキナーゼ遺伝子のような選択可能なマーカーをコードする第二の外来ＤＮＡ分子によって、共トランスフェクションすることが可能である。その他の方法は、真核細胞を一過的に感染または形質転換させ、タンパク質を発現させるために、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスのような、真核ウイルスベクターを使用するものである（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｇｌｕｚｍａｎ編， １９８２）。典型的に、真核宿主は、宿主細胞として用いられる。真核細胞は、酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ種）、または、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞が可能である。
【００６５】
真核生物系および哺乳動物発現系では、生じてくる、発現された哺乳動物タンパク質の翻訳後修飾がなされる。一次転写産物のプロセシング、グリコシル化、リン酸化、および遺伝子産物の有利な分泌のための細胞機構を有する真核細胞が用いられるべきである。そのような宿主細胞系は、限定はしないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ−２９３、およびＷＩ３８を含み得る。
【００６６】
発現を行うために組換えウイルスまたはウイルス因子を利用する哺乳動物細胞系は、操作することが可能である。例えば、アデノウイルス発現ベクターを用いる場合、本発明のペプチドをコードする核酸配列は、例えば後期プロモーターおよび三分節系リーダー配列のような、アデノウイルス転写／翻訳調節複合体にライゲーションすることができる。このキメラ配列はその後、インビトロまたはインビボの組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入できる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染した宿主において生存可能である、および本発明のペプチドを発現できる、組換えウイルスをもたらす（例えばＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：３６５５〜３６５９， １９８４を参照のこと）。または、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを使用することができる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７９：７４１５〜７４１９， １９８２；Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ４９：８５７〜８６４， １９８４；Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：４９２７〜４９３１， １９８２を参照のこと）。染色体外因子としての複製能をもつウシパピローマウイルスに基づくベクターは、特に重要である（Ｓａｒｖｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １：４８６， １９８１）。このＤＮＡのマウス細胞への侵入の少し後に、プラスミドは細胞当たり約１００〜２００コピーにまで複製する。挿入されたｃＤＮＡの転写では、プラスミドの宿主染色体への組み込みが必要とされないことにより、高レベルの発現がもたらされる。これらのベクターは、ｎｅｏ遺伝子のような選択可能なマーカーをプラスミドに含むことによって、安定した発現のために使用することができる。または、宿主細胞において遺伝子を導入し、その発現を司ることができるベクターとして使用するために、レトロウイルスゲノムを修飾することができる（ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６３４９〜６３５３， １９８４）。高レベルの発現はまた、限定はしないが、メタロチオネインＩＩＡプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含む、誘導可能なプロモーターを用いて達成することができる。
【００６７】
組換えタンパク質の、長期の高収量生産のためには、安定した発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いずに、適切な発現調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写終結配列、およびポリアデニル化部位等）によって調節される、本発明のペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０において示されるような配列を有するペプチド）をコードするＤＮＡ、および選択可能なマーカーを用いて、宿主細胞を形質転換することができる。組換えベクターにおける選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞の染色体にプラスミドを安定して組み込ませ、増殖させ、続いてクローン化され細胞系へ拡大できるような増殖巣を形成させる。例えば、外来ＤＮＡの導入に続き、操作された細胞は、栄養化培地において１〜２日間増殖させ、その後、選択培地に切り替えることが可能である。限定はしないが、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞においてそれぞれ使用できる、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ， １１：２２３， １９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ４８：２０２６， １９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ， ２２：８１７， １９８０）を含む、多くの選択系を使用することができる。また、メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：３５６７， １９８０；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８：１５２７， １９８１）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ遺伝子（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８：２０７２， １９８１）；アミノ配糖体Ｇ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ遺伝子（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１， １９８１）；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ遺伝子（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７， １９８４）についての選択の基礎として、抗代謝産物耐性を用いることもできる。近年、さらなる選択可能な遺伝子、即ち、トリプトファンの代わりに細胞にインドールを利用させるｔｒｐＢ；ヒスチジンの代わりに細胞にヒスチノールを利用させるｈｉｓＤ（ＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：８０４７， １９８８）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯ（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ Ｌ．， 「分子生物学における最新情報（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編， １９８７）に対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）について説明がなされている。
【００６８】
その他の態様においては、本発明は、本発明のペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）に特異的に結合する抗体を提供する。例えば、配列番号：２の配列を有するペプチドに特異的に結合する抗体は、配列番号：４の配列を有するペプチドには結合しない。ペプチドがグリコシル化される場合、グリコシル化パターンは、例えばレクチンクロマトグラフィーを経た精製計画の一部として利用できる。そのような抗体は、炎症性障害および疾患（例えば、慢性関節リウマチ、および糖尿病等）、および関連病理学一般の研究における探究および診断のために有用である。
【００６９】
そのような抗体は、単独で、または、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０において示されるような配列に特異的に結合する抗体、ならびに、インビトロおよびインビボにおける炎症性反応の調節因子として有効な他の試薬を含む薬学的組成物に含めて投与することができる。
【００７０】
本明細書において使用されるように、「エピトープ」という用語は、本発明の配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０において示されるような配列に特異的に結合する抗体のような抗体のパラトープが結合する、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０において示されるような配列を有するペプチドのような抗原上の抗原決定基を指す。抗原決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のような、化学的に活性な表面分子群からなり、特有の三次元構造特性および特有の電荷特性を有し得る。
【００７１】
本発明のペプチドに結合する抗体は、関心対象の小ペプチドを免疫化抗原として含む、本発明のペプチドの配列に一致する完全なペプチドまたはペプチド断片（例えば、配列番号：１または配列番号：１３の断片）を用いて調製できる。ある動物個体を免疫化するために使用される、望ましい場合はキャリアタンパク質に結合することができるポリペプチドまたはペプチドは、ｃＤＮＡを翻訳したもの、または、化学的合成に由来することができる。ペプチドに化学的に結合される、一般的に使用されるそのような担体は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および破傷風トキソイドを含む。結合されたペプチドはその後、動物個体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫化するために使用される。
【００７２】
望ましい場合、例えば、それに対して抗体が産生されたポリペプチドまたはペプチドが結合されているマトリックスに結合し、そのマトリックスから溶出することによって、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をさらに精製することができる。当業者には、免疫学の分野において一般的な、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮のための様々な技術が知られる（例えば、参照として組み入れられる、Ｃｏｌｉｇａｎら、第９章、「免疫学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１を参照のこと）。
【００７３】
エピトープを模倣するモノクローナル抗体を作製するために、抗イディオタイプ技術を使用することもまた可能である。例えば、第一モノクローナル抗体に対して作製される抗イディオタイプのモノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体により結合されるエピトープの「イメージ」である、超可変領域における結合ドメインを有する。
【００７４】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびに、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の断片を含む。
【００７５】
ポリクローナル抗体の調製については、当業者によく知られている。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、「ポリクローナル抗血清の産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ）」、「免疫学のプロトコール（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（Ｍａｎｓｏｎ編）、１〜５ページ、（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ １９９２）；コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、「ウサギ、ラット、マウスおよびハムスターにおけるポリクローナル抗血清の産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ， Ｒａｔｓ， Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ）」、「免疫学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第２．４．１節（１９９２）を参照のこと。
【００７６】
モノクローナル抗体の調製もまた、従来的なものである。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５（１９７５）；コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら、第２．５．１〜２．６．７節；およびハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）ら、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、７２６ページ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ． １９８８）を参照のこと。または、抗体は、「ヒト化された」モノクローナル抗体に由来することが可能である。ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに転移し、その後、マウス同等物の枠組み構造領域においてヒト残基を置換することによって作製される。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用によって、マウスの定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題は取り除かれる。マウス免疫グロブリンの可変ドメインをクローニングするための一般的な技術は、例えば、その全体を参照として本明細書に組み入れられる、オーランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：３８３３（１９８９）によって説明されている。ヒト化モノクローナル抗体を作製するための技術については、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２（１９８６）；リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３（１９８８）；バーホイエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４（１９８８）；カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：４２８５（１９９２）；サンデュー（Ｓａｎｄｈｕ）， Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １２：４３７（１９９２）；およびシンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５０：２８４４（１９９３）によって説明されている。
【００７７】
その他の態様においては、本発明は、疾患を増進させる可能性を有さずに、器官特異的抗原の認識能、および病原性細胞の活性を抑制するメディエータの産生能を有する、自己反応性細胞の作製の手段を提供する。例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＴＧＦ−βなどのサイトカインのような、免疫調節化合物の産生を選択的に刺激することが望ましい。そのような免疫調節化合物の誘導が、Ｔ細胞レパートリーの状況、感作および接種プログラムにおけるサイトカインの状況において選択されるエピトープと関連し得ることは理解される。さらに重要なことには、そのような戦略では、自己免疫疾患の病原論にとって中枢である抗原に限定されず、任意の器官特異的抗原が潜在的に使用されることが理解される。そのような免疫調節化合物の選択的な誘導には、それ自体、自己免疫障害の改善において幾つかの利点がある。例えば、そのような治療は、病原論を誘発するエピトープの同定を必要としないばかりか、様々なエピトープに対して反応性であるＴ細胞の、広範な基礎のバイスタンダー抑制を提供できるという利点がある。その上、そのような戦略では、抗原療法の期間中において病原性Ｔ細胞の一過的な活性化段階により疾患が悪化されるリスクが制限され、アネルギーおよび欠失を仲介する末梢性寛容のメカニズムに対する病原性Ｔ細胞の不応性が妨げられ得る。
【００７８】
その他の態様においては、本発明のペプチドは、免疫仲介疾患（即ち、免疫応答に関連する疾患）を調節する（例えば予防するまたは抑制する）ために投与される薬学的組成物中における免疫学的作用物質として使用される。したがって、本発明のペプチドは、塩類およびその機能的誘導体、および、免疫仲介疾患（即ち、免疫応答に関連する疾患）の調節に関するタンパク質またはペプチドの生物学的活性が維持される限り、ｈｓｐ６０ペプチド類似体を包含することが意図される。
【００７９】
本発明のペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９、または１０において示されるような配列を有するペプチド）は、好ましくは、そのリスクを有する対象における免疫仲介疾患の発生以前に投与される。「以前に」という用語は、ｈｓｐ６０自己免疫に基づくある反応が、宿主におけるそのような治療によって調節される期間、好ましくは、最適な調節（例えば下方制御）が炎症性反応の時期と一致するような時期を意味することが意図される。または、本発明のペプチドは、抗炎症性サイトカインまたは抗ＴＮＦＩ作用物質のような、その他の抗炎症薬と共に投与することができる。
【００８０】
本発明においては、対象における炎症を調節するための、ｈｓｐ６０ペプチドまたはその類似体を含む薬学的組成物の、免疫学的に活性な作用物質としての投与は、局所的、経口、鼻内、静脈内、筋内または皮下のような、当技術分野において既知の様々な経路を通して行うことができる。投与の好ましい方法は、寛容を誘導することが知られる静脈内、またはＴＨ１→ＴＨ２の転換を誘導することが知られる経口もしくは鼻内への投与である。本発明のペプチドまたはその類似体の好ましい用量は、疾患の種類、対象の年齢および体重、および症状の重篤度を含む多数の要因に依存する。当業者は、経験的に、適切な用量を決定することができる。例えば、最適用量および投与計画は、ＴＨ１サイトカイン反応からＴＨ２サイトカイン反応への転換を評価することにより、当技術分野における当業者によって決定されうる。
【００８１】
本発明のペプチドまたはその類似体は、炎症性反応をさらに調節する（例えば低減または下方制御する）ために、免疫学的反応または炎症性反応の間に、または後に与えられてもよい。本発明の方法および組成物に適用できる炎症性反応は、例えば、自己免疫疾患または障害（例えば、インスリン依存性糖尿病 （ＩＤＤＭ）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、活動性慢性肝炎、混合性結合組織病、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫甲状腺炎、特発性アディソン病、白斑、グルテン感受性腸症、グレーヴス病、炎症性腸疾患、重症筋無力症、自己免疫好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫不妊症、グッドパスチャー病、水疱性類天疱瘡、円板状エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、および膜性増殖性糸球体腎炎）を含む。本明細書にて言及されるように、上記に示される疾患は、例えばＩＤＤＭについての非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウス、および多発性硬化症についての実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスのような、そのような疾患についての動物モデルによって表されるものを含む。
【００８２】
本発明の方法は、対象自身の（自己）組織に対する免疫応答を調節する（例えば、低減または排除する）ことによって、または、自己免疫反応によって損傷を受けた自己の組織または器官を置き換えるために移植された組織または器官を標的指向する、事前に存在する自己免疫反応を低減または排除することによって、そのような自己免疫仲介疾患および炎症性疾患または障害を治療するために使用することができる。
【００８３】
本発明の１つまたはそれ以上のペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０において示されるような配列を有するペプチド）の投与は、好ましくは、従来的な抗炎症性療法または免疫抑制療法の投与に付随して行われる。
【００８４】
表１において示されるもの（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０）のような、ｈｓｐ６０タンパク質の異なるエピトープは、異なる個体における炎症性反応においてより有効となることが予測される。したがって、本発明のペプチドは、どのペプチドが炎症に対して最適な効果を有するのかを見出すために、意図される対象の末梢血リンパ球に対してスクリーニングすることができる。例えば、クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、１２〜１５アミノ酸残基長のペプチド（例えば、９アミノ酸残基ほどの短いもの）に結合し、クラスＩ ＭＨＣ分子は、７〜９アミノ酸残基のペプチドに結合する。したがって、表１において示されるもののようなｈｓｐ６０のペプチド断片は、例えばＴＨ２サイトカイン反応へ転換し、およびそれによって炎症を下方制御するように、個体の免疫応答を調節するために、特定の個体対象に、または一定のＨＬＡタイプの対象に投与できる、１つまたはそれ以上の最適ペプチドを決定するために、容易にスクリーニングすることができる。
【００８５】
個々のヒト対象の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、当技術分野においてよく知られるように、フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離法によって、全血から単離できる。対象のこのリンパ球サンプルは、モーゼス（Ｍｏｚｅｓ）ら、米国特許第５，３５６，７７９号において開示される方法に従って、スクリーニングされるペプチドへの結合について試験することができ、または、特定の個体対象に最適な、または最適に近いペプチド配列を決定するアッセイ法として、インビトロのＴ細胞増殖およびそれに続くＴ細胞サイトカイン反応について試験することができる。
【００８６】
ペプチド集団のスクリーニングのためのその他の方法は、ペプチド集団の各々の存在下におけるインビトロの増殖について対象のリンパ球を試験すること、または、そのようなペプチドにより引き起こされるＴＨ１→ＴＨ２の転換について試験することである。したがって、被験ペプチドと共に５〜５０μｇ／ｍｌの濃度で培養されたＴ細胞の上清を異なる時点で収集し、培養培地に分泌されるＩＦＮＫおよびＩＬ−４のように、標準ＥＬＩＳＡプロトコールを用いたＥＬＩＳＡによって定量化できる様々なサイトカインの活性について、または特定のクラスの抗体の存在について試験することができる。ＴＨ１細胞は、Ｔ細胞の増殖を誘導するサイトカイン、および組織の炎症を仲介するＩＦＮＫのようなサイトカインを分泌する。また他方では、ＴＨ２細胞は、ＩｇＧおよびＩｇＥクラスの抗体をＢ細胞が分泌するよう支援するＩＬ−４を分泌し、ＴＨ１炎症性サイトカインの産生を抑制し、同様にマクロファージによる抗原提示および炎症性サイトカインの産生に影響を与えることによって間接的にＴＨ１の活性化を阻害するＩＬ−１０の産生を抑制する。したがって、インビトロにおいて増殖されたＴ細胞のサイトカインプロフィールの評価もまた、ＴＨ１ Ｔ細胞反応からＴＨ２ Ｔ細胞反応への転換の指標となる。したがって、ＴＨ１→ＴＨ２の転換は、最適または最適に近いペプチドの決定における様々な被験ペプチドに対する対象のＴリンパ球のインビトロ反応をモニタリングするためのマーカーとしての役割を担い得る。
【００８７】
本発明の投与計画および薬学的組成物は、限定はしないが、サイトカインＩＦＮ−Ｉ、ＩＦＮ−Ｋ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ、または免疫細胞に影響を及ぼす他のサイトカインを含む、付加的な免疫応答増強物質または生体反応調節物質と共に使用することができる。
【００８８】
本発明の１つまたはそれ以上のペプチドは、インビボの適用については、粘膜を経て（例えば、坐剤、吸入または経口によって）、注入によって非経口に、または経時的で緩徐な潅流によって投与することができる。投与は、経口、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、腔内、または経皮的なものが可能である。本発明の１つまたはそれ以上のペプチドはまた、アジュバント、ホルモン、サイトカイン、またはコルチコステロイド等と共に投与することができる。インビトロの試験については、生物学的に許容できる適切な緩衝液に作用物質を添加または溶解し、細胞または組織に加えてもよい。
【００８９】
非経口投与のための調製物には、滅菌水溶液または滅菌非水性溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、生理食塩水および緩衝培地を含む、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口の媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムが含まれ、乳酸リンガー静脈内媒体には、輸液および栄養素補充液、ならびに電解質補充液（リンガーデキストロースに基づくような）等が含まれる。例えば、抗菌薬、抗酸化薬、キレート化剤および不活性ガス等のような、保存剤および他の添加剤もまた含まれ得る。
【００９０】
本発明は、治療される対象における免疫応答を調節することにより、炎症および自己免疫障害、病原性感染および癌性状態または前癌状態のような、免疫仲介性障害に関連する病理学を治療するために使用できると予測される。したがって、本発明は、自己抗原に対する抗原特異的な免疫応答に関連するものを含む、免疫仲介疾患に関連する障害を改善するための方法を包含する。本発明の方法は、例えば配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０に示されるような配列またはその類似体を有する、１つまたはそれ以上の本発明のペプチドを用いて、障害または状態を有する部位において、障害または疾患の状態をもつ対象を治療する段階を含む。一般に、「治療する」、「治療」および同様の用語は、本明細書においては、望ましい薬理学的効果および／または生理学的効果を得るために、対象、組織または細胞に影響を与えることを意味するように使用される。その効果は、疾患またはその徴候もしくは症状を完全または部分的に予防することによって予防的となり得る、ならびに／あるいは、感染もしくは疾患、および／または、感染もしくは疾患に帰することができる有害効果についての部分的または完全な治癒によって治療的となり得る。本明細書において使用されるように、「治療する」には、脊椎動物、哺乳動物、特にヒトにおける、疾患の任意の治療または予防が含まれ、（ａ）障害の素因があり得るが、それを有することを未だ診断されていない対象において障害が生じるのを予防する段階；（ｂ）障害を阻害する、即ち、その発生を阻止する段階；（ｃ）障害を軽減または改善する、即ち、障害の退行を引き起こす段階、または（ｄ）状態または障害の進行を和らげるように、障害を仲介する進行中の免疫応答を調節する段階、が含まれる。
【００９１】
本発明は、本明細書において説明されるように、免疫仲介性障害に帰することのできる症状を改善するために有用な様々な薬学的組成物を含む。本発明のある態様に従った薬学的組成物は、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０からなる群より選択される配列を有するペプチド、前述の配列のペプチド類似体、前述のもののペプチド模倣物に対する抗体、薬剤、本発明のペプチドの生物学的活性を調節する化学物質または化学物質の組み合わせ、または作用物質を、担体、賦形剤および添加剤または補助剤を用いて、対象への投与に適した形態にすることによって調製される。頻繁に用いられる担体または補助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖類、タルク、ミルクタンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物油および植物油、ポリエチレングリコール、および、滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールのような溶媒が含まれる。静脈内投与用の媒体には、輸液および栄養素補充液が含まれる。保存剤には、抗菌薬、抗酸化薬、キレート化剤および不活性ガスが含まれる。薬学的に許容できる他の担体は、例えば、その内容が参照として本明細書に組み入れられる、「レミントンの製剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１５版、Ｅａｓｔｏｎ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， １４０５〜１４１２， １４６１〜１４８７（１９７５）、および「米国医薬品規格ＸＩＶ」、第１４版、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：米国薬剤師会（１９７５）において説明されるような、塩類を含む水溶液、非毒性賦形剤、保存剤、および緩衝液等を含む。薬学的組成物の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、当技術分野における常用の技術に従って調整される。「グッドマンおよびギルマンの治療薬のための薬理学的基礎（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」（第７版）を参照のこと。
【００９２】
薬学的組成物は、好ましくは、用量単位において調製および投与される。固形用量単位は、錠剤、カプセルおよび坐剤である。対象の治療のためには、化合物の活性、投与方法、障害の性質および重篤度、対象の年齢および体重によって、異なる一日量が必要である。しかし、ある状況下においては、より高いまたはより低い一日量が適当となり得る。一日量の投与は、１つの個別の用量単位、またはさもなければ数個の少用量単位の形態における単回投与によっても、および、特定の間隔を置いた細分用量の複数回投与によっても行うことができる。
【００９３】
本発明に従った薬学的組成物は、治療的に有効な用量を、局所的にまたは全身に投与することができる。この使用のために有効な量は、当然のことながら、疾患の重篤度および対象の体重および一般状態に依存する。典型的には、インビトロにおいて使用される用量は、薬学的組成物のインサイチューの投与のために有用な量における有用なガイダンスを提供し得、動物モデルは、特定の障害の治療のために有効な投薬量を決定するために使用できる。様々な考察については、例えば、その各々が参照として本明細書に組み入れられる、ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：１５２７， （１９９０）；ギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）ら（編）（１９９０）において説明されている。
【００９４】
ある態様においては、本発明は、本発明のペプチド、その類似体、または本発明のペプチドをコードする核酸をそのような治療を必要とする対象に投与するために有用な、薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物を「投与すること」は、当業者に知られる任意の方法によって達成することができる。好ましくは、「対象」は、哺乳動物、最も好ましくはヒトを指すが、任意の生物体が可能である。
【００９５】
本発明のペプチドまたは抗体は、経口、非経口、腸内にて、注入、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収によって、直腸および経口にて、投与することができる。非経口投与のための、薬学的に許容できる担体調製物は、滅菌水溶液または滅菌非水性溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。閉鎖包帯のための担体は、皮膚浸透性を増加させ、抗原吸収を増強するために使用することができる。経口投与のための液体剤形は一般に、液体剤形を含有する溶液を含み得る。固体または液体の適切な薬学的調製形態は、例えば、崩壊剤、結合剤、錠皮剤、膨脹剤、滑沢剤、香料、甘味料、および、当技術分野において一般に使用される精製水のような不活性希釈剤を含有するエリキシルのような、賦形剤および添加剤および／または補助剤を含む、顆粒、パウダー、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、乳濁液、懸濁液、クリーム、エアロゾル、ドロップ、またはアンプル形態の注入可能な溶液、およびまた、活性化合物の持続性放出を行うような調製物である。
【００９６】
本発明の核酸およびペプチド配列のためのその他の送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、およびビーズ等が含まれる。
【００９７】
その他の態様においては、本発明は、その作用物質を相互作用させるのに十分な条件下において、ある作用物質および本発明のペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０において示されるような配列を有するペプチド）を含む成分、またはそのようなペプチドを発現する組換え細胞をインキュベーションする段階、および、ポリペプチドまたはペプチドの活性に対する作用物質の影響を決定する段階を含む、ｈｓｐ６０タンパク質の活性または本発明のペプチドの生物学的活性と相互作用する、またはその活性を調節する作用物質を同定するための方法を提供する。本明細書において使用されるように、「影響を与える」という用語は、ペプチドの活性を調節できるような任意の方法を包含し、例えば作用物質のペプチドへの結合の蛍光検出法を含む物理的手法によって、作用物質のペプチドとの相互作用を評価する段階を含む。「作用物質」は、例えば、ポリペプチド、ペプチド模倣物、化学的な化合物、小分子、および、本明細書において説明されるような生物学的作用物質を含み得る。
【００９８】
インキュベーション段階には、被験作用物質と本発明のペプチド、または本発明のペプチドを発現している細胞との間で接触させるような条件が含まれる。接触させる段階には、溶液中および固体相中が含まれる。被験作用物質は選択的に、複数の作用物質をスクリーニングするためのコンビナトリアルライブラリであり得る。本発明の方法において同定される作用物質はさらに、ＰＣＲ、オリゴマー制限（Ｓａｉｋｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３：１００８〜１０１２， １９８５）、およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１：１０７７， １９８８）等のような、特定のＤＮＡ配列の検出に通常適用される任意の方法によって、溶液中、または固体支持体への結合後のいずれかにおいて、評価、検出、クローン化、および配列決定等がなされうる。ＤＮＡ解析のための分子技術については概観されている（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２： ２２９〜２３７， １９８８）。
【００９９】
研究の領域は、治療的療法の開発に関わるものである。スクリーニングによって、標的とされた生物体における本発明のペプチドの生物学的活性を調節する作用物質が同定される。毒性の低い、またはヒトに対する副作用の数が少ない作用物質についてのスクリーニングアッセイ法は、特に重要である。
【０１００】
本明細書において使用されるように、「作用物質」という用語は、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０において示されるような配列を有するペプチドの、生理学的機能または発現を変化させるまたは模倣する能力を有する、例えばタンパク質または薬剤のような任意の分子を説明する。一般に、複数のアッセイ混合物が異なる作用物質濃度を平行して実施され、様々な濃度に対する示差的な反応を得る。典型的には、これらの濃度の１つが、負の対照、即ち、ゼロ濃度におけるものまたは検出レベル未満のものとしての役割を担う。
【０１０１】
その他の態様においては、本発明は、ｈｓｐ６０関連障害を有する細胞または対象に、本発明のペプチドまたはその類似体、またはｈｓｐ６０関連障害の症状と相互作用するもしくは症状を阻害する作用物質（例えば、抗体、リボザイム、アンチセンス分子、または二重鎖干渉ＲＮＡ分子）を含む組成物の有効量を投与することにより、ｈｓｐ６０関連障害（例えば、炎症性障害または疾患）を調節する（例えば、阻害する）作用物質を同定するための方法を提供する。症状は、例えば、本明細書において同定されるようなサイトカインの産生、ＴＨ１反応およびＴＨ２反応、および炎症関連の病理学（例えば、膨脹、および血管拡張等）を含み得る。
【０１０２】
インビボおよびインビトロにおけるｈｓｐ６０またはｄｎａＪＰ１ポリペプチドの検出
さらなる態様においては、本発明は、ｈｓｐ６０またはｄｎａＪＰ１ポリペプチドを含む、または含むことが疑われる細胞成分を、細胞ポリペプチド（以下細胞成分とする）に結合する試薬（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０において示されるようなペプチド配列に特異的に結合する抗体）と接触させる段階を含む、対象においてｈｓｐ６０ポリペプチドを検出する方法を提供する。細胞成分は、ｈｓｐ６０またはｄｎａＪＰ１ポリペプチドに加え、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸を含み得る。細胞成分がタンパク質である場合、試薬は典型的には抗体プローブである。プローブは、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート化剤または酵素を用いて、検出可能なように標識される。当業者には、抗体または核酸プローブへの結合のために適した他の標識が知られる、または、常用の実験法を用いてそれを確かめることができる。当業者には既知の、多くの異なる標識および標識法が存在する。本発明において使用できる標識のタイプの例には、酵素、ラジオアイソトープ、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物が含まれる。
【０１０３】
本発明のペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、９または１０において示されるような配列を有するペプチド）に対して標的指向する、本発明のモノクローナル抗体は、インビボおよびインビトロにおける抗原の検出のために有用である。検出可能なように標識されたモノクローナル抗体は、診断上有効な用量で与えられる。「診断上有効な」という用語は、検出可能なように標識されたモノクローナル抗体の量を、そのモノクローナル抗体を特異的とするタンパク質抗原またはポリペプチド抗原が十分検出可能となる量にて投与することを意味する。
【０１０４】
対象に投与される、検出可能なように標識されたモノクローナル抗体の濃度は、バックグラウンドと比較された場合に、ｈｓｐ６０ポリペプチド配列を有するその細胞、体液、または組織への結合が検出できるように十分であるべきである。さらに、検出可能なように標識されたモノクローナル抗体は、標的シグナル対バックグラウンドシグナルの最大の比率を与えるために、循環系から迅速に取り除かれることが望ましい。
【０１０５】
インビボにおける診断のために、ラジオアイソトープは、中間官能基を用いることにより、直接的または間接的のいずれかにて、免疫グロブリンに結合することができる。金属イオンとして存在するラジオアイソトープを免疫グロブリンに結合するためにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および類似の分子のような、二価性のキレート試薬である。本発明のモノクローナル抗体に結合できる金属イオンの典型的な例は、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、および２０１Ｔｌである。
【０１０６】
本発明のモノクローナル抗体はまた、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるように、インビボの診断のために、常磁性同位体を用いて標識することもできる。一般には、画像診断を視覚化するための任意の従来法を利用することができる。通常、カメラ画像化のためにはγ放出ラジオアイソトープおよび陽電子放出ラジオアイソトープが、ＭＲＩのためには常磁性同位体が用いられる。そのような技術において特に有用な元素は、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、および５６Ｆｅを含む。
【０１０７】
ある例においては、本発明のペプチド配列を局所的に（例えば、特定の組織または細胞タイプ内において）送達し発現することが有益となり得る。例えば、本発明のペプチド（例えば、配列番号：２、３、４、５、６、７、８、または９において示されるような配列を有するペプチド）の、ある動物個体の軟骨組織、膵臓組織、皮膚組織、または消化管組織における局所的発現。例えば、核酸配列は、組織および細胞に直接送達できる。そのような送達方法は、当技術分野において知られており、エレクトロポレーション、ウイルスベクターおよびＤＮＡの直接取り込みを含む。
【０１０８】
例えば、本発明の核酸構築物は、宿主組織内の標的細胞への取り込みに適した形態における核酸分子を含む。核酸は、１つもしくはそれ以上の構造遺伝子、１つもしくはそれ以上の制御遺伝子、アンチセンス鎖、または三重鎖ヘリックス形成をなし得る鎖等を含み得る、裸のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の形態にあることが可能である。一般に、核酸構築物は、適切な制御領域の転写および翻訳調節下にある少なくとも１つの構造遺伝子を含む。さらに一般には、本発明の核酸構築物は、トランスフェクション効率を改善するために送達媒体中に取り込まれる核酸であり、その送達媒体が、乾燥した親水性賦形剤物質を含むより大きな粒子中に分散されるような核酸を含む。
【０１０９】
そのようなある送達媒体は、自己複製を阻害するために不活性化されているが、標的宿主細胞への天然のウイルスの結合能を維持し、標的宿主細胞の細胞質へ遺伝物質を送達し、粒子中に取り込まれた構造遺伝子または他の遺伝子の発現を促進するレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスのようなウイルスベクターを含む。仲介される遺伝子導入のために適しているレトロウイルスベクターについては、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、カーン（Ｋａｈｎ）ら（１９９２） ＣＩＲＣ． ＲＥＳ． ７１：１５０８〜１５１７において説明される。適切なアデノウイルス遺伝子送達については、その開示が参照として本明細書に組み入れられる、ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４において説明される。レトロウイルス送達系およびアデノウイルス送達系の双方については、その開示が同様に参照として本明細書に組み入れられる、フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５〜１２８１において説明される。
【０１１０】
実施例１
ペプチドの同定
無差別汎ＤＲペプチドを同定するために、様々なＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチドの結合に関するモチーフを同定する、米国特許第６，０３７，１３５号（その全体が参照として本明細書に組み込まれる）に述べられているコンピュータアルゴリズムを使用した。ミコバクテリアとヒトｈｓｐ６０の両方の配列を走査し、３つのサブタイプのＨＬＡＤＲ、すなわちＤＲ１、ＤＲ４およびＤＲ７へのペプチド配列の予測結合に基づいてペプチドを設計した（表１）。ＤＲ１、４および７への予測結合のレベルに関してペプチドを選択した。表１に列挙するものを含む本発明のペプチドは、自己反応性Ｔ細胞の増殖を誘導する能力またはこれらのＴ細胞からサイトカイン（例えばリンホカイン）の分泌を誘導する能力または細胞傷害性のような他のエフェクター機能を誘導する能力についてのインビトロ試験によって同定した。
【０１１１】
コンピュータアルゴリズムによって同定されたエピトープは、ＨＬＡ ＤＲ１、ＤＲ４およびＤＲ７に十分なアフィニティーを持つことが予測されれば（汎ＤＲスコア＝３）、適格とみなした。その後、少なくとも２個、好ましくは３個のフランキングアミノ酸残基が予測コアエピトープの両側に存在するように１５ｍｅｒペプチドを設計した。汎ＤＲ結合エピトープを持つあらゆるペプチドが、その後、その相同（ヒトまたはミコバクテリア）相対物とマッチした。このようにして、合計８個のペプチドを設計し、４個はミコバクテリアペプチド（ｐ１、ｐ３、ｐ５、ｐ７）であり、４個は相同ヒトペプチド（ｐ２、ｐ４、ｐ６、ｐ８）であった。ペプチドを表１に示す。
【０１１２】
実施例２
Ｔ細胞増殖
Ｔ細胞増殖を調べるために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の直接培養を表１のペプチドと接触させた。ＪＩＡを有する８０名以上の被験者を試験した。群は、疾患の活動および医学的治療の様々な段階にある、すべてのサブタイプのＪＩＡを有する被験者の無作為な選択から構成した。被験者のＰＢＭＣを標準増殖アッセイ法において試験した。フィコールイソパック（Ｆｉｃｏｌｌ Ｉｓｏｐａｑｕｅ）密度勾配を使用してヘパリン添加血からＰＢＭＣを単離した。９６穴丸底プレートの１５％ＡＢ血清を含むＲＰＭＩ中、２００，０００細胞／２００μｌ（Ｔ１）／ウェルの数でＰＢＭＣを培養した。細胞を５％ＣＯ２中３７℃、１００％相対湿度で６日間（１２０時間）培養した。培養の最後の１６時間に、１ＴＣｉ（＝３７ｋＢｑ）の粉砕したチミジンを各穴に加えた。液体シンチレーション計数によって取り込まれた放射能を測定し、計数／分（ｃｐｍ）で表わした。増殖応答の度合を、ｃｐｍおよび刺激指数（ＳＩ）：抗原と共に培養した細胞の平均ｃｐｍを、培地だけで培養した細胞の平均ｃｐｍで割ったもので表わした。２またはそれ以上のＳＩは抗原に対する陽性応答とみなすことができる。結果を図１に示す。被験者の大半は、これまでのデータから予測されるように、ヒトおよびミコバクテリア全ｈｓｐ６０の両方に対して陽性Ｔ細胞増殖応答を示した。すべてのｈｓｐ６０ペプチドが、ＪＩＡの被験者の４０〜６０％においてペプチド特異的な増殖性Ｔ細胞応答を誘導した。
【０１１３】
ＪＩＡを有する１８名の被験者の小さな群において、Ｔ細胞増殖を抗原特異的サイトカイン産生の測定と組み合わせた。上述したようにＰＢＭＣを９６穴プレートにおいて２００Ｔ１中２００，０００細胞／ウェルで培養した。７２時間後、上清を採取し、製造者のプロトコール（Ｂ＆Ｄ）に従って標準ＥＬＩＳＡでサイトカイン産生を測定した。次のサイトカインを試験した：ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−Ｋ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−ＩおよびＩＬ−１ＲＡ。図２から図４は、汎ＤＲ結合ペプチドと共に７２時間培養した後のＩＬ−１０、ＩＦＮ−ＫおよびＴＮＦ−Ｉの抗原特異的サイトカイン産生を示す。やはり、被験者の大部分においてペプチドと共にインビトロで培養したＰＢＭＣ中で抗原特異的サイトカイン産生を検出することができた。おそらくはサイトカインＥＬＩＳＡの感受性のゆえに、ＩＬ−４の抗原特異的産生は検出できなかった。
【０１１４】
抗原の免疫学的認識は、特異性抗原と共に培養した後の抗原特異的Ｔ細胞増殖および／または抗原特異的サイトカイン産生として定義することができる。さらに、被験者の非常に高いパーセンテージ（６０〜１００％）においてこれらの汎ＤＲ結合ｈｓｐ６０ペプチドのＴ細胞認識を検出することができた（図５）。これまでの試験がＪＩＡにおけるＴ細胞エピトープを決定することができなかったこと、そしてＪＩＡを有する被験者での異種遺伝子型ＨＬＡバックグラウンドを考慮すると、このパーセンテージは極めて高いとみなすことができる。
【０１１５】
このようにして同定したペプチドを、これまでに関節炎のラットモデルを通して同定されたペプチドと比較すると、ここで使用した方法の優位性が明らかになる。アジュバント関節炎のモデルにおけるこれまでの試験で、アミノ酸２５６〜２７０位を含むミコバクテリアｈｓｐ６０ペプチドがアジュバント関節炎において防御を誘導しうることが示された。この所見に従い、ＪＩＡを有する被験者において２５６〜２７０位特異的Ｔ細胞の存在を同定することを目指して多大の努力が為されてきた。コンピュータアルゴリズムによって提供されたデータに基づき、我々は２５６〜２７０アミノ酸（ａａ）ペプチドに匹敵する新しいペプチドを設計した。この新しいペプチド、ミコバクテリアｈｓｐ６０ ２５４−２６８（ｐ１）は、ＪＩＡ被験者の大部分においてＴ細胞増殖とサイトカイン産生によって定義されるようなＴ細胞応答を誘導したが、２５６−２７０ペプチドはＪＩＡを有する被験者において認識されなかった。データを図６に示す。従って、ＤＲ１、ＤＲ４およびＤＲ７への予測結合を使用することは、ＪＩＡを有する被験者においてＴ細胞エピトープを同定するためのはるかに効率的な方法を提供した。
【０１１６】
実施例３
ＲＡを有する患者における炎症誘発性エピトープとしてのｄｎａＪＰ１の同定
熱ショックタンパク質ｄｎａＪからのペプチドは、これまでにＲＡ患者の末梢血および滑液細胞からのＴ細胞増殖および炎症誘発性サイトカイン産生の誘因として同定されている。このペプチド
2004518430.tif 000004
は、ＲＡ関連のＨＬＡ対立遺伝子間で共通する５個のアミノ酸長の「共有エピトープ（ｓｈａｒｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ）」と配列相同性を有する。この試験は、ＲＡにおいてＨＬＡおよびｄｎａＪ由来のペプチド間の相互作用が、自己免疫炎症に関与するＴ細胞を保持し、刺激するかどうかを調べるために実施された第Ｉ相免疫寛容誘導試験である。治験（完了した患者数＝１３）は、効果の評価に関する米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（ＡＣＲ）の２０の判定基準に従うように計画された。
【０１１７】
第Ｉ相試験からのデータ：図７Ａから図７Ｅおよび図８Ａから図８Ｅに示すデータは、合計１３名のヒトＲＡ患者を３つの異なる用量のｄｎａＪＰ１により経口経路で毎日６ヶ月間治療した第Ｉ相試験からのものである。免疫学的データ：１ヶ月ごとの間隔で、本発明のペプチドｄｎａＪＰ１によって治療した患者と対照によって治療した患者におけるＴ細胞増殖とサイトカイン産生を測定することにより、ｄｎａＪＰ１に対するインビトロでのＴ細胞応答を観察した。対照には、マイトジェン（ＰＨＡ）、および無関係なペプチドのｄｎａＪｐＶ
2004518430.tif 000005
、患者において刺激性ではない変化したリガンドペプチド、およびデザイナー汎ＤＲバインダーペプチド
2004518430.tif 000006
のＰＡＤＲＥが含まれた。１０Ｔｇ／ｍｌのｄｎａＪＰ１ペプチドで５日間刺激した７名の患者のＰＢＭＣからのＴ細胞増殖応答の結果を図７Ａから図７Ｅ（１ヶ月ごとの間隔で実施したＦＡＳＣによる評価）に示す。図７Ａから図７ＥのＦＡＣＳサイトカインデータ分析のための対照実験（示していない）は、ＰＡＤＲＥで治療した臨床試験からの４名の患者のＰＢＭＣからの、炎症誘発性細胞内サイトカインＩＬ−２、ＩＦＮ−ＫおよびＴＮＦ−Ｉの産生のＦＡＣＳ測定を含んだ。対照はまた、ＰＡＤＲＥで治療した臨床試験からの４名の患者のＰＢＭＣによって産生された、寛容原性細胞内サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０のＦＡＣＳ測定を含んだ。
【０１１８】
寛解と再発を繰り返すＲＡの循環性、および検討した患者数が少ないことを考慮して、認められた免疫変化が治療によって誘導されたものであり、循環している患者が偶然集まった群の、より一般的な活動の「状態」に依存するものではないことを示すことが重要であった。
【０１１９】
３つの異なる時点で採取し、ｄｎａＪＰ１で刺激した４名の未処置患者からのＰＢＭＣによって産生された寛容原性細胞内サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０についてもＦＡＣＳ測定を実施した。寛容原性試験の結果は、図７Ａから図７Ｅに示す免疫変化が治療特異的であり、治療によって誘導されたものであることを明らかにした。
【０１２０】
図８Ａから図８Ｅは、ｄｎａＪＰ１で刺激した患者（ｎ＝１３）における患者自己評価によって実施した試験（Ｒａｐｉｄ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、ＲＡＤＡＲ）の結果を示す。
【０１２１】
評価の完全性を保つためにあらゆる努力を行ったが、ここで述べた第Ｉ相試験のようなオープンラベル治験の性質は治療効果に関する傾向だけしか提供できないことをここで強調しておかねばならない。患者の８４．６％がＡＣＲの２０判定基準に従って応答者として分類することができた。
【０１２２】
上述した方法および組成物は本発明の一部の局面を実施するために使用できる典型的なものであるが、当業者に既知の他の手順も使用することができる。
【０１２３】
さらに、上記の開示に照らして本発明の数多くの修正や変法が可能であり、それ故付属の特許請求の範囲内で、特定して述べた以外の方法でも本発明を実施することができる。上記の詳細な説明を参照して本発明を述べたが、上記の説明は例示であり、本発明の範囲を限定することを意図しないことは明白である。本発明の他の局面、利点、および修正は添付の特許請求の範囲内である。本明細書で言及したすべての公表文献、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】若年性特発性関節炎を有する８０名の被験者からの細胞における、汎ＤＲ結合ｈｓｐ６０ペプチドに対してのＴ細胞増殖性応答を示す。Ｙ軸上には、抗原と共に培養した細胞を含むウエル中の平均計数／分（ＣＰＭ）を、培地だけで培養したウエル中の平均ｃｐｍで割ったものとして定義される刺激指数（ＳＩ）を示している。Ｘ軸はアッセイ法において試験した種々の抗原を示す：（左から右へ）全ミコバクテリアｈｓｐ６０（Ｍｈｓｐ）、全ヒトｈｓｐ６０（Ｈｈｓｐ６０）、ｐ１（ｍｙｃ２５４−２６８）、ｐ２（ｈｕｍ２８０−２９４）、ｐ３（ｍｙｃ２１６−２３０）、ｐ４（ｈｕｍ２４２−２５６）、ｐ５（ｍｙｃ２１０−２２４）、ｐ６（ｈｕｍ２３６−２５０）、ｐ７（ｍｙｃ５０３−５１７）、およびｐ８（ｈｕｍ５３５−５４６）。
【図２】汎ＤＲ結合ｈｓｐ６０ペプチドと共にインビトロ培養した後のＩＬ−１０の抗原特異的産生を示す。Ｙ軸上には種々のペプチドに応答したＩＬ−１０の産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す。Ｘ軸上にはこの試験で使用した種々の抗原を示す：（左から右へ）全ミコバクテリアｈｓｐ６０（Ｍｈｓｐ）、全ヒトｈｓｐ６０（Ｈｈｓｐ６０）、破傷風、および汎ＤＲ結合ペプチドｐ１〜ｐ８（ｐ１（ｍｙｃ２５４−２６８）、ｐ２（ｈｕｍ２８０−２９４）、ｐ３（ｍｙｃ２１６−２３０）、ｐ４（ｈｕｍ２４２−２５６）、ｐ５（ｍｙｃ２１０−２２４）、ｐ６（ｈｕｍ２３６−２５０）、ｐ７（ｍｙｃ５０３−５１７）、およびｐ８（ｈｕｍ５３５−５４６））。
【図３】汎ＤＲ結合ｈｓｐ６０ペプチドと共にインビトロ培養した後のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の抗原特異的産生を示す。Ｙ軸上には種々のペプチドに応答したインターフェロン−γの産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す。Ｘ軸上にはこの試験で使用した種々の抗原を示す：全ミコバクテリアｈｓｐ６０（Ｍｈｓｐ）、全ヒトｈｓｐ６０（Ｈｈｓｐ６０）、破傷風、および汎ＤＲ結合ペプチド（ｐ１〜ｐ８）。陰性対照ペプチド、ミコバクテリアｈｓｐ６０ ２５６−２７０はサイトカイン産生を誘導しなかった。
【図４】汎ＤＲ結合ｈｓｐ６０ペプチドと共にインビトロ培養した後のＴＮＦ−αの抗原特異的産生を示す。Ｙ軸上には種々のペプチドに応答したＴＮＦ−αの産生（ｐｇ／ｍｌ）を示す。Ｘ軸上にはこの試験で使用した種々の抗原を示す：全ミコバクテリアｈｓｐ６０（Ｍｈｓｐ）、全ヒトｈｓｐ６０（Ｈｈｓｐ６０）、破傷風、および汎ＤＲ結合ペプチド（ｐ１からｐ８）。陰性対照ペプチド、ミコバクテリアｈｓｐ６０ ２５６−２７０はサイトカイン産生を誘導しなかった。
【図５】ＪＩＡを有する１８名の被験者からの細胞における、本発明のｈｓｐ６０ペプチドに応答した免疫学的認識（Ｔ細胞増殖および／またはサイトカインの産生として定義される）を示す。
【図６】汎ＤＲ結合に基づく本発明の２個のペプチド（ｐ１、ｍｙｃ２５４−２６８；およびｐ２、ｈｕｍ２８０−２９４）と比べた、ペプチド２５６−２７０によって誘導される免疫反応性の比較を示す。右Ｙ軸は刺激指数を表わし、左Ｙ軸はｐｇ／ｍｌで示したサイトカイン産生を表わす。
【図７Ａから図７Ｅ】治療が誘導する、ｄｎａＪＰ１に対するＴ細胞応答の調節を示す一連のグラフである。図７ＡはＴ細胞増殖応答を示す：患者（ｎ＝７）からのＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌのｄｎａＪＰ１ペプチドで５日間刺激した。１ヵ月ごとの間隔で評価を実施した。対照は、一般的マイトジェンとしてのＰＨＡおよびｄｎａＪｐＶを含む。図７Ｂから図７Ｅは、ｄｎａＪＰ１ペプチドに対するスクリーニングで応答性であった患者のＰＢＭＣによる細胞内サイトカイン（炎症誘発性：図７Ｂから図７Ｄ；寛容原性：図７Ｅ）の産生の、１ヶ月ごとの間隔でのＦＡＣＳによる評価を示す。図７Ｂ：ＩＬ−２、ｎ＝６；図７Ｃ：ＩＦＮ−γ、ｎ＝８；図７Ｄ：ＴＮＦ−α、ｎ＝６；図７Ｅ：ＩＬ−４およびＩＬ−１０、ｎ＝４。結果はｄｎａＪＰ１刺激−非刺激培養における％ＣＤ３＋細胞として表わしている（＊＝ ｐ＜０．０５）。
【図８Ａ】ｄｎａＪペプチドで治療した被験者についてのＲＡＤＡＲ質問表の結果を示すグラフである（＊＝ ｐ＜０．０５）。
【図８Ｂから図８Ｅ】ｄｎａＪペプチドで治療した被験者における、圧痛のある関節および腫脹した関節の数を示すグラフである（ｎ＝１３）。図８Ａは圧痛のある関節の数を示す；図８Ｂは腫脹した関節の数を示す。測定は１ヶ月ごとの間隔で実施した（＊＝ ｐ＜０．０５）。
【図１】
2004518430.tif 000007
【図２】
2004518430.tif 000008
【図３】
2004518430.tif 000009
【図４】
2004518430.tif 000010
【図５】
2004518430.tif 000011
【図６】
2004518430.tif 000012
【図７Ａ】
2004518430.tif 000013
【図７Ｂ】
2004518430.tif 000014
【図７Ｃ】
2004518430.tif 000015
【図７Ｄ】
2004518430.tif 000016
【図７Ｅ】
2004518430.tif 000017
【図８Ａ】
2004518430.tif 000018
【図８Ｂ】
2004518430.tif 000019
【図８Ｃ】
2004518430.tif 000020
【図８Ｄ】
2004518430.tif 000021
【図８Ｅ】
2004518430.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004518430.tif 000023
2004518430.tif 000024
2004518430.tif 000025
2004518430.tif 000026
2004518430.tif 000027
2004518430.tif 000028
2004518430.tif 000029
2004518430.tif 000030
2004518430.tif 000031
2004518430.tif 000032
2004518430.tif 000033
2004518430.tif 000034
2004518430.tif 000035
2004518430.tif 000036
2004518430.tif 000037
2004518430.tif 000038
2004518430.tif 000039
2004518430.tif 000040
2004518430.tif 000041
2004518430.tif 000042
2004518430.tif 000043
2004518430.tif 000044
2004518430.tif 000045
2004518430.tif 000046
2004518430.tif 000047
2004518430.tif 000048
2004518430.tif 000049
2004518430.tif 000050
2004518430.tif 000051
2004518430.tif 000052
2004518430.tif 000053
2004518430.tif 000054
2004518430.tif 000055
2004518430.tif 000056
2004518430.tif 000057
2004518430.tif 000058
2004518430.tif 000059
2004518430.tif 000060
2004518430.tif 000061
2004518430.tif 000062
2004518430.tif 000063
2004518430.tif 000064
2004518430.tif 000065
2004518430.tif 000066
2004518430.tif 000067
2004518430.tif 000068
2004518430.tif 000069
2004518430.tif 000070
2004518430.tif 000071
2004518430.tif 000072
2004518430.tif 000073
2004518430.tif 000074
2004518430.tif 000075
2004518430.tif 000076
2004518430.tif 000077
2004518430.tif 000078
2004518430.tif 000079
2004518430.tif 000080
2004518430.tif 000081
2004518430.tif 000082
2004518430.tif 000083
2004518430.tif 000084
2004518430.tif 000085
2004518430.tif 000086
2004518430.tif 000087
2004518430.tif 000088
2004518430.tif 000089
2004518430.tif 000090
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004518430.tif 000091
【国際調査報告】
2004518430.tif 000092
2004518430.tif 000093
2004518430.tif 000094
2004518430.tif 000095
2004518430.tif 000096
2004518430.tif 000097