(57)【要約】本発明は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍの特定の種を用いた、１−ハロ−２−オキソ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類の立体選択的な酵素的還元方法に関する。生成物である１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類は、ＡＣＥ、レニン及びＨＩＶプロテアーゼの阻害剤である化合物の合成における中間体として有用であるが、高収率で、かつ特に非常に高いジアステレオマー純度において得ることができる。本発明の方法は、生成物の１Ｓ，２Ｓエナンチオマーに対して高い選択性を示し有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表される（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類の立体選択的製造方法であって、
【化１】
2004511225.tif 000013
（式中、Ｈａｌはハロゲン、Ｒはアルキル、置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、並びにＲ１はアミノ官能基の保護基である）、
式ＩＩで表される（１Ｓ）−１−ハロ−２−オキソ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタンを、
【化２】
2004511225.tif 000014
（式中、Ｈａｌ、Ｒ及びＲ１は上記で定義したとおりである）
式ＩＩの化合物の立体選択的還元を触媒し得る微生物（前記微生物はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＡＴＣＣ ４２７７、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＤＳＭ ６９７１及びＲｈｏｄｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ ２１２２７、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＡＴＣＣ ２７８５４及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＡＴＣＣ １９６５３からなる群より選択される微生物である）と前記還元に効果のある条件下に接触させ、式Ｉで表される化合物を回収することを含む、上記方法。
【請求項２】
Ｈａｌがクロロであり、Ｒがフェニルであり、Ｒ１がｔ−ブトキシカルボニルである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＡＴＣＣ ４２７７である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＤＳＭ ６９７１である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＡＴＣＣ ２１２２７である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ＡＴＣＣ ２７８５４である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
微生物がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ １９６５３である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
一段階発酵で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
二段階発酵で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
誘導剤存在下に行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
誘導剤が式Ｉで表される化合物であり、それを微生物が生育する間に添加する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
式Ｉで表される化合物が少なくとも７０％の収率で得られ、かつ少なくとも９３％のジアステレマー純度で得られる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
式Ｉで表される化合物が少なくとも９５％の収率で得られ、かつ少なくとも９９％のジアステレマー純度で得られる、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
下記式で表されるエポキシ化合物を製造する方法であって、
【化３】
2004511225.tif 000015
（式中、Ｒはアルキル、置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、並びにＲ１はアミノ官能基の保護基である）
下記式で表されるアリールエステルを、
【化４】
2004511225.tif 000016
（式中、Ｒ及びＲ１は上記で定義したとおりであり、Ｒ２は水素またはニトロであり、及びフェニル環のオルトまたはパラ位で置換されていてもよい）
下記式で表される官能基を有するイオウイリド化合物と反応させ、
【化５】
2004511225.tif 000017
（式中、Ｒ３及びＲ４は、アルキル、置換アルキル及びアリールからなる群より選択される）
下記式で表される中間体ケトイリド化合物を製造し、
【化６】
2004511225.tif 000018
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４は上記で定義したとおりである）
式ＩＩＩで表される前記化合物を、塩素源及び有機酸を用いて処理して、下記式で表される１−置換−２−アミノ−３−オキソ−４−クロロブタンを形成し、
【化７】
2004511225.tif 000019
（式中、Ｒ及びＲ１は上記で定義したとおりである）
前記化合物を還元して、下記式で表される１−クロロ−２−ヒドロキシ−３−アミノ−４−置換ブタン化合物を形成し、
【化８】
2004511225.tif 000020
（式中、Ｒ及びＲ１は上記で定義したとおりである）
前記ヒドロキシ化合物を塩基と反応させて前記エポキシ化合物を形成することを含み、前記１−クロロ−２−オキソ−３−アミノ−４−置換ブタン化合物の還元を請求項１に記載の方法で行い、それにより前記１−クロロ−２−ヒドロキシ−３−アミノ−４−置換ブタン化合物を少なくとも７０％の収率で、かつ少なくとも９３％のジアステレオマー純度で得ることを特徴とする上記方法。
【請求項１５】
式Ｉで表される化合物が少なくとも９５％の収率で得られ、かつ少なくとも９９％のジアステレマー純度で得られる、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類を、相当するオキソ化合物を立体選択的に還元することにより製造する新規な方法に関する。本発明の方法により製造された置換ブタン類は、アンジオテンシン変換酵素、レニンおよびＨＩＶ−プロテアーゼの阻害剤として治療学的に有用な多数の分子に存在する、ヒドロキシエチルアミン生物学的等価体サブユニットの前駆体である。
【０００２】
発明の背景
Ｂｉｎｇ−ｎａｎ Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０５， ｐａｇｅｓ ５９２６−５９２８， １９８３には、ヒトの代謝及び長鎖脂肪酸の輸送において重要な役割を果たすＬ−カルニチンの化学微生物学的合成について記載されている。特にこの文献には、ベイカー酵素、すなわちＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ により、エチルＫ−クロロアセトアセテートをエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブタノエートへ還元することについて記載されている。
【０００３】
Ｋａｚｕｔｏｓｈｉ Ｕｓｈｉｏ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． ２７， Ｎｏ． ２３， ｐａｇｅｓ ２６５７−２６６０， １９８６， にはベータ−ケトエステルのメタノール生育酵素による還元について記載されている。この文献は、目的の反応においてＤ−異性体が増える方向に劇的にシフトしたエナンチオマー過剰の生成物が生じることを教示している。この現象は、メタノール中で生育する酵素を使用して反応を行った場合に生じるが、これはそのような媒体中で生育する酵素の性質によるものである。
【０００４】
Ｍａｒｋｕｓ Ｃｈｒｉｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ｐａｇｅｓ ２６４−２６６， １９８８，には、メチル−６−（ｐ−クロロフェニルチオ）−３，４−ジヒドロヘキサノエートの４種類の立体異性体の合成について開示されており、そのキーでありキラリティーの導入は、適する酵素還元により行われる。前記文献には、酵素によるベータ−ケトエステルの還元はかなり研究されているが、生成物の絶対立体配置がどちらであるか予測することは依然として困難であり、特に達成しえるエナンチオマー過剰については困難である。
【０００５】
Ａｎｔｏｎｉｏ Ｔｒｉｎｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ． ３５， ｐａｇｅｓ ５５９−５６４， １９９０にはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓの静止細胞によるケトンの非対称還元について記載されている。この微生物の静止細胞の還元能は、細胞生育のフェーズ（ｐｈａｓｅ）に強く依存している。
【０００６】
Ｒａｍｅｓｈ Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｖｏｌ． １３， ｐａｇｅｓ ９０６−９１２， １９９１には４，５−ジヒドロ−４−（４−メトキシフェニル）−６−（トリフルオロメチル−１Ｈ−１）−ベンズアゼピン−２−オンの立体特異的微生物学的還元について記載されている。特に、キー中間体である（３Ｒ−ｃｉｓ）−１，３，４，５−テトラヒドロ−３−ヒドロキシ−４−（４−メトキシフェニル）−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−１−ベンズアゼピン−２−オンを親ケトンの立体選択的微生物学的還元により製造したことを記載している。特定の条件を選択することにより、４種類の既知の可能性から単一の異性体を得ることが可能であることを述べている。
【０００７】
Ｒａｍｅｓｈ Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｖｏｌ． １５， ｐａｇｅｓ １０１４−１０２１， １９９３， にはジケト化合物３，５−ジオキソ−６−（ベンジルオキシ）ヘキサン酸メチルエステルの、得られたジヒドロキシ化合物の単一エナンチオマーへの立体選択的還元を記載している。
【０００８】
Ｒａｍｅｓｈ Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｖｏｌ． １４， ｐａｇｅｓ ７３１−７３８， １９９２にはベータ−ケトエステルの還元から得られるヒドロキシ生成物の光学的純度を改良する熱処理Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍのプロセスが記載されている。
【０００９】
Ｋｏｍｅｔａｎｉ ｅｔ ａｌ，， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｖｏｌ． ８０， Ｎｏ． ２， ｐａｇｅｓ ２０８−２１０， １９９５， には、エタノールをエネルギー源として使用する酵素媒介生物学的還元について記載されている。ベイカーズ酵素におけるエタノールの消費速度とプロキラルケトン還元速度の関係について研究され、プロキラルケトン類からキラルアルコール類の大量製造にエタノールを適用できると結論された。
【００１０】
Ｒａｍｅｓｈ Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，３９１，４９５（１９９５年２月２１日発行）には、還元を触媒し得る微生物または酵素を用いた、特定のケト含有スルホンアミド化合物の立体選択的還元により相当するヒドロキシ基含有化合物を形成することが記載されている。命名された酵素は、オキシド還元酵素またはデヒドロゲナーゼであり、微生物は好ましくはＨａｎｓｅｎｕｌａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、及びＮｏｒｃａｒｄｉａ種から選択される。
【００１１】
発明の要約
本発明は、特定の種のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍによる、相当するケト基含有化合物の還元による（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類製造の新規な立体選択的方法に関する。生成物は高収率かつ良好なジアステレオマー純度で得られる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の式で表される（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類の有利な合成方法を提供する。
【００１３】
【化９】
2004511225.tif 000002
式中、Ｈａｌはハロゲン、好ましくは塩素であり、Ｒはアルキル、置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、並びにＲ１はアミノ官能基の保護基である。
【００１４】
式Ｉで表される置換ブタン類は、ＡＣＥ、レニン及びＨＩＶプロテアーゼの阻害剤である分子の合成における中間体として有用である。ＨＩＶプロテアーゼに対するそのような分子の活性は、ＡＩＤＳのようなレトロウイウス感染の治療に非常に有効である。そのような化合物及びその使用については、例えば米国特許第５，８４９，９１１号明細書に記載されており、これらの記載は本明細書に組み込まれるものとする。米国特許第５，８４９，９１１号明細書に記載される特に重要なＡＩＤＳ化合物は［３Ｓ−（３Ｒ＊，８Ｒ＊，９Ｒ＊，１２Ｒ＊）］−３，１２−ビス（１，１−ジメチルエチル）−８−ヒドロキシ−４，１１−ジオキソ−９−（フェニルメチル）−６｛［４−（２−ピリジニル）フェニル］メチル｝−２，３，６，１０，１３−ペンタアザレテトラデカン二酸ジメチルエステルである。この化合物は、式Ｉの（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類から直接合成してもよい。本発明の方法により非常に高収率に式Ｉで表される置換ブタン類のトランス（１Ｓ，２Ｓ）エナンチオマーを製造できるという事実は、上記治療学的化合物の有用な合成に非常に重要である。
【００１５】
本明細書において以下の用語は下記の定義を有する。用語”アルキル”は１〜７炭素原子、好ましくは１〜４炭素原子を有する、任意に置換された直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素である。”低級アルキル”という表現は、任意に置換された１〜４炭素原子を有する置換アルキル基を表す。
【００１６】
用語”置換アルキル”は、例えば１〜４の置換基（例、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルコキシ、ヘテロシクロオキシ、オキソ、アルカノイル、アリール、アリールオキシ、アラルキル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ及び二置換アミノ）により置換されたアルキル基を意味する。ここでアルキル及び置換アルキルに与えられた定義は、アルコキシ基のアルキル部分についても適用される。
【００１７】
用語”アリール”は、環部分に６〜１２炭素原子を有する単環または二環の芳香族炭化水素基であり、たとえば、フェニル、ナフチル、ビフェニル及びジフェニル基が挙げられ、各々は置換されていてもよい。
用語”アラルキル”はアルキル基を介してより大きな部分（ｌａｒｇｅｒ ｅｎｔｉｔｙ）に結合したアルキル基を意味し、例えばベンジル基が挙げられる。
【００１８】
用語”置換アリール”は、例えば、１〜４の置換基（例、アルキル、置換アルキル、ハロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキルオキシ、ヘテロシクロオキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシクロアミノ、アルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロチオ、ウレイド、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルバミル、アルコキシカルボニル、アルキルチオノ、アリールチオノ、アルキルスルホニル、スルホンアミド、アリールオキシ等）により置換されたアリール基を意味する。置換基はさらに、一つ以上の、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリール、置換アルキル、置換アリール及びアラルキルからなる群から選択される基により置換されていてもよい。
用語”ハロゲン”または”Ｈａｌ”は、塩素、臭素、フッ素及びヨウ素を意味し、塩素が好ましい。
【００１９】
用語”アミノ官能基上の保護基”は、アミノ基が、結合した分子上のいずれかで起こる反応に関与しないように保護するそのアミノ基に結合し得る当業者が認識する基を意味する。そのような基の中で好ましいのはｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）であるが、当業者が認識するアミノ官能基保護基、一般にアルコキシカルボニル基〔例ベンジルオキシカルボニル〕を同様に使用することができる。
式Ｉで表される（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類を製造する本発明の方法の出発物質は、下記式で表される相当するケト基含有化合物である。
【００２０】
【化１０】
2004511225.tif 000003
式中、Ｈａｌ、Ｒ及びＲ１は上記で定義したとおりである。式ＩＩで表される化合物を、文献できさいされ、また当業者に既知の方法により製造することができる。式ＩＩで表される化合物を形成する好ましい方法は、同時継続特許出願Ｄｏｃｋｅｔ ＧＹ５５に開示されており、その記載を本明細書に組み入れるものとする。この方法において、下記式で表されるアリールエステル；
【００２１】
【化１１】
2004511225.tif 000004
（式中、Ｒ及びＲ１は上記で定義したとおりであり、Ｒ２は水素またはニトロであり、フェニル基のオルトまたはパラ位で置換されていてもよい）を、イオウイリド、すなわち、下記式で表される官能基を有する化合物と反応し；
【００２２】
【化１２】
2004511225.tif 000005
下記式で表される中間体ケトイリドを生成させる；
【００２３】
【化１３】
2004511225.tif 000006
式中、Ｒ及びＲ１は上記で定義したとおりであり、Ｒ３及びＲ４は、アルキル、置換アルキル及びアリールからなる群より選択される。上記式で表されるケトイリド化合物を次に、塩素源、好ましくは塩基性の塩素源、最も好ましくは塩化リチウム及び有機酸（例えばメタンスルホン酸）と反応させることにより、式ＩＩで表されるケト基含有化合物に変換する。
【００２４】
上記式Ｉで表される（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類は、ＡＣＥ、レニン及びＨＩＶプロテアーゼの阻害剤である分子の合成における重要な中間体である。ＨＩＶプロテアーゼに対するそのような分子の活性は、ＡＩＤＳのようなレトロウイルスの治療において非常に有用である。特に、式Ｉで表される（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類は適する塩基と処理して、下記式で示される相当するエポキシド類に変換する。
【００２５】
【化１４】
2004511225.tif 000007
【００２６】
上記式で表されるエポキシド化合物は、米国特許第５，８４９，９１１号明細書に記載される特に重要なＡＩＤＳ化合物、［３Ｓ−（３Ｒ＊，８Ｒ＊，９Ｒ＊，１２Ｒ＊）］−３，１２−ビス（１，１−ジメチルエチル）−８−ヒドロキシ−４，１１−ジオキソ−９−（フェニルメチル）−６｛［４−（２−ピリジニル）フェニル］メチル｝−２，３，６，１０，１３−ペンタアザレテトラデカン二酸ジメチルエステルに変換することができ、前記明細書の記載は本明細書に組み入れるものとする。
【００２７】
上記式ＩＩで表される（１Ｓ）−１−ハロ−２−オキソ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類の立体選択的還元による式Ｉで表される（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類の形成を、本発明に従い、酸化還元酵素との反応により、または好ましくは、式ＩＩで表されるケトンの酵素的還元を触媒することができる酸化還元酵素を供給する微生物との反応により、行うことができる。微生物の細胞は、無傷の湿潤細胞または凍結乾燥、スプレー乾燥または熱乾燥細胞のような乾燥細胞の形態であってもよく、あるいは破裂細胞または細胞抽出物のような処理細胞物質のような形態であってもよい。多数の様々な微生物が、いくつかの形態の酸化還元酵素を供給することが知られているが、本発明において、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍの選択された種のみが、式ＩＩにより表される化合物を触媒して目的の（１Ｓ，２Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類を高定量的にかつ高いエナンチオマー収率で生成することが見出された。これらの種は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＡＴＣＣ ４２７７、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＤＳＭ ６９７１及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＡＴＣＣ ２１２２７、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＡＴＣＣ ２７８５４及びＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＡＴＣＣ １９６５３である。本明細書において用語”ＡＴＣＣ”は、個々の微生物の寄託番号、すなわちＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２の番号である。用語”ＤＳＭ”は、ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｂｒａｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙを意味する。
【００２８】
本発明の酵素的還元法は、使用する微生物の発酵の次に行ってもよい。すなわち、二段階の発酵及び還元としてもよい。または同時に、すなわち一段階でまたはインシツ発酵及び還元で行ってもよい。後者において、微生物を適当な媒体中、特に窒素及び炭素源を含む媒体（ｍｅｄｉｕｍ、培地、培養液）中で、十分な生育が認められるまで生育させてもよく、次に式ＩＩの化合物から選択される化合物をそれに添加してもよい。式ＩＩで表される化合物の実質的に完全な変更が得られるまで酵素的還元をその後継続する。
【００２９】
二段階法において、微生物を上述した媒体中で、所定の酵素活性レベルを示すまで生育し、そのレベルにおいて細胞を従来の分離技術により収穫し、及び適するバッファー剤等を含有する微生物細胞懸濁液をそれから製造する。適するバッファー剤としては、ホスフェートバッファー類、特にカリウムホスフェートバッファー、トリス−ＨＣｌ、酢酸ナトリウム等である。また、水を用いて微生物細胞の懸濁液を製造してもよい。式ＩＩで表される化合物を次にそれに添加して、酵素的還元を、変換が実質的に完了するまで継続する。いずれの例においても、適する生育媒体は、既に述べたように、炭素及び窒素源及び微量元素を含む。誘導剤をまた添加してもよい。当業者が認識するように、誘導剤という用語は、細胞内での目的の酵素的活性、すなわち酸化還元酵素活性を開始するか若しくは増強するいずれかの化合物を意味する。式ＩＩで表される（１Ｓ）−１−ハロ−２−オキソ−３−（保護）アミノ−４−置換ブタン類は、特に微生物の生育中に少量添加した場合に誘導剤であると考えられる。
【００３０】
媒体のための適する炭素源としては、マルトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、ソルビトール、スクロース、スターチ、マンニトール、プロピレングリコール等の糖類、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸及びその塩、グルタミン酸ナトリウム等のアミノ酸及びその塩、及びエタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。適する窒素源としては、Ｎ−ＺアミンＡ、トウモロコシスティープ（ｓｔｅｅｐ）リカー、大豆ミール、ビーフ抽出物、酵素抽出物、糖蜜、ベイカーズ酵素、トリプトン、（ｎｕｔｒｉｓｏｙ）、ペプトン、イースタミン（ｙｅａｓｔａｍｉｎ）、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。適する微量元素としては、ホスフェート類、及びマグネシウム、マンガン、カルシウム、コバルト、ニッケル、鉄、ナトリウム及びカリウム塩を添加してもよい。本発明において使用される適する媒体は、これらのカテゴリーから選択される複数の成分を含んでいてもよい。代表的な好ましい媒体は、これらに限定する意図ではないが、以下を（質量％）含む水性媒体である。
【００３１】
2004511225.tif 000008
【００３２】
上述した媒体のｐＨは滅菌後のものである。滅菌前にｐＨは約６〜８に調整することが好ましく、最も好ましくは約６．５に調整することが好ましい。媒体を次に、例えば約１２０℃で３０分間加熱することにより、滅菌する。滅菌後、媒体のｐＨを６．５〜７．５に調整し、最も好ましくは約７．０に調整する。微生物の生育及び還元プロセスの間、ｐＨは約４．０〜９．０、好ましくは約６．０〜８．０の間に維持される。上述した成分から適する塩基または酸性塩をｐＨの調整のために使用することができる。
【００３３】
反応混合物の温度は、還元プロセスに用いることができる熱エネルギーの基準であり、この理由から、適する温度を維持してプロセスが完了するのに用いられる十分なエネルギーを保証するようにしなければならない。本発明の方法に適する温度範囲は、約１５℃〜約６０℃、好ましくは約２５℃〜約４０℃である。圧力は、本発明の方法の実行において決定的な条件ではないことがわかっており、簡便のためには、典型的にほぼ大気圧を維持する。
【００３４】
本発明の方法は好ましくは有酸素条件で行う。反応混合物の攪拌及び通気はまた本発明の方法に有用であり、生体内変換に利用できる酸素量に影響する。本発明の方法は、例えば振盪フラスコ培養または発酵タンク中で、微生物が生育する間、一段階または二段階法で上述したように行うことが有利である。約５０〜１０００ＲＰＭの範囲の攪拌が好ましく、約５０〜５００ＲＰＭの範囲が最も好ましい。媒体体積あたり、かつ１分あたり約０．１〜１０体積の空気（ｖ／Ｖｔ．）を通気するのが好ましく、媒体体積あたり、かつ１分あたり約５体積の空気（ｖ／Ｖｔ．）を通気するのが特に好ましい。
【００３５】
式ＩＩで表される化合物の完全な変換には、式ＩＩの化合物を媒体に添加した時間から測定して、例えば、約４〜４８時間、典型的には約４〜２４時間必要である。媒体は水性ベースであることが好ましいが、有機液体または混和性または非混和性、すなわち二相の有機／水性液体混合物も同様に使用してもよい。
本発明の立体選択的酵素還元方法は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）のような補助因子を、特に単離酵素を用いる場合に、使用して行ってもよい。ＮＡＤＨは例えば、その後再生して再利用してもよい。ホルメートデヒドロゲナーゼやグルコースデヒドロゲナーゼのようなｉｎ ｓｉｔｕでＮＡＤＨを再生する更なる酵素を用いてもよい。適する水素ドナーとしては、分子水素、ホルメート（例、アルカリ金属またはアンモニウムホルメート）、グルコース、ハイポホスファイト（次亜燐酸塩）、またはメチルビオロゲンを例とするビオロゲン存在下の電気化学的還元が挙げられる。また例えばエタノールまたはホルメートを用いて、更なる酵素を用いずにＮＡＤＨを再生することもできる。
【００３６】
式ＩＩの化合物を、出発原料と媒体の混合重量に対して約０．２〜５質量％となるように反応媒体に添加することもさらに好ましい。出発原料に対する微生物の接種量は、上述した時間で式ＩＩの化合物の酵素的還元を行うのに十分な量であり、一般的に約５〜３０質量％の細胞濃度である。所定の微生物に上述した好ましい反応パラメータを用いることにより、反応収率は７０％より多くなり、最適には９９％を超え、また驚くべきことに、ジアステレオマー純度は９３％より高くなり、最適には、式Ｉの化合物の目的のエナンチオマーが９９％を超える。本発明の還元方法の生成物、すなわち式Ｉの化合物は、適するいずれの単離および／または精製方法、例えば抽出、蒸留、結晶化、カラムクロマトグラフィー等の方法、によって回収してもよい。
【００３７】
本発明の実行において、上述した本発明の観点から遊離することなく、様々な実施態様及び変更が当業者に明らかであり、また当業者により容易に行われることが理解される。従って、請求の範囲の観点は、上述した記載そのものに限定されることなく、むしろ、当業者に等価なものとして取り扱われる全ての特性及び態様を含み、本発明に存在する特許性のある新規な性質の全てを包含するように請求の範囲は構成される。以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【００３８】
実施例１
立体選択的酵素的還元：全細胞の使用−一段階法
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＡＴＣＣ ４２７７細胞（１ ｍＬ）を、１００ ｍＬの媒体１に、５００ ｍＬフラスコ中で、接種し、振盪機上で２８℃でかつ２００ ＲＰＭで２２時間インキュベートした。５０細胞ブロスのｐＨは１Ｍリン酸カリウムバッファーで７．０に調整した。グルコースを細胞ブロスに２５ ｍｇ／ｍＬで添加し、５０ ｍｇの（１Ｓ）−［Ｎ−（１−ベンジル−２−オキソ−３−クロロ）プロピル］カルバミン酸ｔ−ブチルエステル（基質）をそれに加えた。生体内変換（還元）を振盪機上で２８℃でかつ２００ ＲＰＭで行った。所定の時間に、反応混合物を６０：４０のｔ−ブチルメチルエーテル及びトルエンの混合物の２倍体積でクエンチし、０．２ミクロンフィルターを介して分離した有機相をろ過し、集めた。２ ｍＬの有機相を窒素気流下蒸発させて乾燥し、残渣を１ ｍＬのアセトニトリルにとり、ろ過して、（１Ｓ，２Ｓ）−［Ｎ−（１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−クロロ）プロピル］カルバミン酸ｔ−ブチルエステル（生成物）についてＨＰＬＣにより分析した。結果を下記表１に要約した。
【００３９】
表１
2004511225.tif 000009
【００４０】
実施例２
全細胞使用：二段階法
本実施例における基質及び生成物は実施例１と同様である。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＡＴＣＣ ４２７７及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＤＳＭ ６９７１（１ ｍＬ）の細胞をそれぞれ上述した１００ ｍＬの媒体１に５００ ｍＬフラスコ中で接種し、振盪機上で２８℃でかつ２８０ ＲＰＭで４８時間インキュベートした。１００ ｍＬの各培養物を、発酵槽中で混合した１５ ｍＬの媒体１に接種した。発酵槽中での生育を２５℃、１５ ＬＰＭ（リットル／分）の通気及び５００ ＲＰＭの攪拌の条件下３６時間行った。細胞を発酵槽から収穫し、（１Ｓ）−［Ｎ−（１−ベンジル−２−オキソ−３−クロロ）プロピル］カルバミン酸ｔ−ブチルエステル（基質）から（１Ｓ，２Ｓ）−［Ｎ−（１−ベンジル−２−ヒドロキシ−３−クロロ）プロピル］カルバミン酸ｔ−ブチルエステル（生成物）への酵素的変換（生体内変換）に使用した。細胞懸濁液を、２０グラムの細胞を１００ ｍＬの６４ ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）中へ懸濁することにより製造した。各件濁液へ、２５ ｍｇ／ｍＬのグルコース及び所定の基質を添加した。基質から生成物への生体内変換を２８℃で１６０ ＲＰＭで振盪機上にて行った。所定の時間において、反応混合物をクエンチし、生成物を得て、実施例１と同様に分析した。結果を下記の表２に要約した。
【００４１】
表２
2004511225.tif 000010
表１及び表２の結果は、目的の生成物が本発明の方法により高収率かつ非常に高いジアステレオマー純度で得られることを示している。
【００４２】
実施例３
生体内変換における種々の微生物種の使用：全細胞
実施例１に記載の方法に従った生体内変換を、一連の微生物を使用して行った。結果を表３に示す。
【００４３】
表３
2004511225.tif 000011
【００４４】
表３の結果は本発明の微生物が明らかに許容し得る収率（すなわち、７０％を超える）と許容し得るジアステレオマー純度（すなわち９０％を超える）で生成物を生成することを示す。
【００４５】
実施例４
細胞抽出物及び補助因子の使用
本実施例の方法における基質及び生成物は上述の実施例に記載したものである。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＡＴＣＣ ４２７７の細胞を上述したように媒体１上で生育させた。細胞（１５０グラム）を１００ ｍＬのｐＨ７．０リン酸カリウムバッファー中に懸濁した。細胞懸濁液を４℃で、１３００ｐｓｉ圧力においてマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）で崩壊させた。崩壊した細胞懸濁液を１２０００ＲＰＭで３０分間遠心分離を行った。透明な上澄み（“細胞抽出物”）を、基質の生成物への生体内変換に使用した。
【００４６】
細胞抽出物の一部（１０ ｍＬ）に１０ｍｇの基質、グルコースデヒドロゲナーゼ（３５ユニット）、０．７ ｍＭ ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及び２００ ｍｇのグルコースを追加した。反応をｐＨ６．０において、１５０ＲＰＭの攪拌及び３０℃で行った。試料を定期的に反応媒体から抜き出して分析した。生成物を９５％収率でかつ＞９８％ジアステレオマー純度で得た。この実施例において、グルコースデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ＋及びグルコースを用いて、下記に示すようにＮＡＤＨ補助因子を再生した。
【００４７】
【化１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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