(57)【要約】本発明は、動物に有効量のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍ．ハイオ）ワクチンを投与することにより、マイコプラズマ・ボビス（Ｍ．ボビス）による感染によって引き起こされる動物における疾病または疾患を治療または予防する方法に関する。Ｍ．ハイオ・ワクチンは、細胞全体または一部からなる不活化調製物または改変生ワクチン調製物でも、サブユニット・ワクチンまたは核酸もしくはＤＮＡワクチンでもよい。本発明に従って投与されるＭ．ハイオ・ワクチンは合成することも遺伝子組換えにより製造することもできる。
2004537543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）への感染によって引き起こされる動物における疾病または疾患を治療または予防する方法であって、有効量のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ワクチンをその動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ・ワクチン製剤が、細胞全体または一部からなる不活性化されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞調製物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｍ．ハイオニューモニエ・ワクチンが１投薬量当たり約１×１０６〜約５×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ワクチンの投与量が約０．５〜約５．０ｍｌである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞調製物がＲＥＳＰＩＳＵＲＥである請求項２に記載の方法。
【請求項６】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ・ワクチンが、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに由来する少なくとも１つのタンパク質またはその免疫原性断片を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質がＰ４６、Ｐ６５、Ｐ８５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０およびＰ４４からなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ・ワクチンが、マイコプラズマ・ハイオニューモニエに由来する少なくとも１つのタンパク質もしくはポリペプチドまたは前記タンパク質の免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質がＰ４６、Ｐ６５、Ｐ８５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０およびＰ４４からなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
約０．５ｍｌ〜５．０ｍｌの前記マイコプラズマ・ハイオニューモニエ・ワクチンを動物に投与する請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ・ワクチンがさらにアジュバントを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ・ワクチンがさらに薬剤として許容される担体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
約２１日齢の動物にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ・ワクチンを投与する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
動物に単回投薬量のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ・ワクチンを投与する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物に有効量のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍ．ハイオ）ワクチンを投与することにより、マイコプラズマ・ボビス（Ｍ．ボビス）による感染によって引き起こされる動物における疾病または疾患を治療または予防する方法に関する。Ｍ．ハイオ・ワクチンは、細胞全体または一部からなる不活性化または改変された生ワクチン調製物でも、サブユニット・ワクチンまたは核酸もしくはＤＮＡワクチンでもよい。本発明に従って投与されるＭ．ハイオ・ワクチンは合成することも遺伝子組換えにより製造することもできる。
【背景技術】
【０００２】
Ｍ．ボビスは屋内飼育または集中飼育される肉牛および乳牛における牛病原体である。最も頻繁に報告される臨床的な症状は子牛肺炎であり、これは、多くの場合、肺炎関節炎症候群（ｐｎｅｕｍｏｎｉａ−ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）としても知られる関節炎を伴う。その病因としての役割は、乳腺炎、耳炎、雌牛および雄牛の生殖系の疾病または疾患にも関わっている。Ｍ．ボビスは牛の呼吸疾病（ＢＲＤ）による死亡率の３６％に関わっていることから、Ｍ．ボビスが引き起こす呼吸疾病には著しい経済的損失が伴う。完全に認可されたワクチンがないため、死亡率を低減させるには、多くの場合、抗生物質療法が用いられる。Ｍ．ボビス疾病の予防は、動物の他の呼吸系疾患に対する素因も減少させ得る。したがって、Ｍ．ボビスに対して有効で安全なワクチンを開発する必要がある。Ｍ．ハイオは、豚流行性肺炎を引き起こす細菌性病原体である。知られているＭ．ハイオに対するワクチンの大多数は、Ｍ．ハイオの細胞全体を不活性化させた調製物に基づく。Ｍ．ハイオに対する他のワクチンは、Ｍ．ハイオ由来タンパク質、ポリペプチドまたはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドの免疫原性断片からなるサブユニット・ワクチン、および、１つまたは複数のＭ．ハイオ由来タンパク質もしくはポリペプチドまたそれらの免疫原性断片をコードするＤＮＡからなるＤＮＡワクチンを含む。
【０００３】
細胞全体を不活性化したＭ．ハイオ・ワクチンの例は、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥおよびＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ（Ｐｆｉｚｅｒ社（米国）から市販されている）を含む。
【０００４】
多くのＭ．ハイオタンパク質が記載されている。国際公開第９６／２８４７２号パンフレットは、分子量４６〜４８、５２〜５４、６０〜６４、７２〜７５、９０〜９４および１１０〜１１４キロダルトンの６つのＭ．ハイオタンパク質抗原種について記載し、また、５２〜５４、６０〜６４および７２〜７５キロダルトンの部分タンパク質配列抗原、ならびに４６〜４８キロダルトン抗原の全長ヌクレオチドおよびアミノ酸配列抗原を開示する。
【０００５】
Ｍ．ハイオタンパク質Ｐ４６をコードする遺伝子、すなわち、ｐ４６のクローニングもフトー他（Ｆｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７７：１９１５−１９１７（１９９５）、さらに欧州特許出願公開第０４７５１８５Ａ１号明細書に記載されている。
【０００６】
ワイズおよびキム（Ｗｉｓｅ  ａｎｄ  Ｋｉｍ）（１９８７年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６９：５５４６−５５５５）は、Ｍ．ハイオにおける４つの膜内在性タンパク質種（ｐ７０、ｐ６５（上掲Ｐ６５）、ｐ５０およびｐ４４と名づけられる）について報告している。これらの後の３つは共有結合性脂質結合によって修飾され、強い体液性免疫反応を引き起こす。もっとも、免疫反応の保護効果は検討されなかった。Ｐ６５タンパク質をコードする遺伝子はクローン化され、その配列、ならびにワクチンおよび診断におけるその使用は、米国特許第５，７８８，９６２号明細書に記載されている。
【０００７】
国際公開第９１／１５５９３号パンフレットは、見掛け分子量１０５、９０、８５、７０および４３キロダルトンの５つのＭ．ハイオタンパク質について記載する。８５キロダルトンタンパク質（タンパク質Ｃ）をコードする遺伝子の全長配列が、他の４つのタンパク質をコードする部分的なヌクレオチド配列とともに提供された。
【０００８】
フォールズ（Ｆａｕｌｄｓ）に対する米国特許第５，２５２，３２８号明細書は、免疫反応性のＭ．ハイオタンパク質（それらの分子量は３６、４１、４４、４８、６４、６８、７４．５、７９、８８．５、９６および１２１キロダルトンである）のアミノ末端配列抗原を開示する。電気泳動可動性に基づいて識別されているが、いずれについてもタンパク質配列は開示されていない他のタンパク質は、見掛け分子量２２．５、３４および５２キロダルトンを有する。米国特許第５，２５２，３２８号明細書は、Ｍ．ハイオ感染症に対するワクチン処方においてこれらのタンパク質の使用を提案しているが、ワクチンの試みの結果は報告されていない。
【０００９】
国際公開第９５／０９８７０号パンフレットは、Ｍ．ハイオ・アドヘシン（宿主の上部気道皮膜組織繊毛への付着の原因であるマイコプラズマの膜内在性タンパク質）の生化学的精製方法を開示する。国際公開第９５／０９８７０号パンフレットも、これらのタンパク質の分析法、ならびに、例えば、ワクチンおよび診断における使用を提案している。
【００１０】
キング他（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）による研究報告（１９９７；Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：２５−３５）は、Ｐ９７の株変種である１２４キロダルトンのアドヘシンであるＭｈｐ１を開示している。
【００１１】
Ｐ９７の９４キロダルトン変種がウィルトン他（Ｗｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）によって識別された（１９９８、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：１９３１−１９４３）。さらに、ｐ９７遺伝子は、Ｐ１０２と呼ばれる別のタンパク質（およそ１０２キロダルトンの分子量と予測される（フス他（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８、Ｇｅｎｅ  ２１４：１３−２３）もコードするオペロンの一部であることが示された。ミニオンとフス（Ｍｉｎｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｓｕ）は、国際公開第９９／２６６６４号パンフレットにおいて、Ｍ．ハイオ感染症に対するワクチンにおけるＰ１０２の使用を示唆するが、ワクチンの試みは報告していない。
【００１２】
本発明以前には、家畜において、Ｍ．ハイオ・ワクチンがＭ．ボビスによって引き起こされる疾病に対する保護効果をもたらし得るという認識はなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
家畜において、Ｍ．ハイオ・ワクチンがＭ．ボビスによって引き起こされる疾病に対する保護効果をもたらすこと。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、動物に有効量のＭ．ハイオ・ワクチンを投与することを含む、Ｍ．ボビスによる感染によって引き起こされる動物における疾病または疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００１５】
本発明は、乳生産家畜、特に乳牛などの動物を、例えば肺炎から保護し、肺傷害を防止および低減する方法をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、さらにＭ．ハイオを使用してワクチン接種し、子牛の免疫能力を増加させて、他のＢＲＤ病原体に対する抵抗力を増大させること、例えば、牛ヘルペス・ウイルス１型（ＢＨＶ−１）、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、牛呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｉｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐｌ３）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、マイコプラズマ・マイコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、マイコプラズマ・アガラクチア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・カリフォルニクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ボビリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ディスパル（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｄｉｓｐａｒ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｎｉｓ）およびマンハイミア・ヘモリティカ（Ｍａｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）など（但し、これらに限定されない）への感染素因およびこれらにより引き起こされる疾病を減少させる方法を提供する。本発明はまた、Ｍ．ハイオ・ワクチン、ならびに有効量のＭ．ハイオ・ワクチンおよび薬剤として許容される担体を動物に投与することにより、感染した家畜からマイコプラズマ・ボビスを一掃する方法を提供する。
【００１７】
本発明の方法で使用するＭ．ハイオ・ワクチンは、細胞全体または一部からなる調製物（例えば、細菌ワクチン、または改変生ワクチン調製物）、サブユニット・ワクチン（例えば、Ｍ．ハイオ由来のタンパク質、ポリペプチドまたは免疫原性を有するその断片）、ＤＮＡワクチン（例えば、Ｍ．ハイオ由来のタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの免疫原性断片をコードするＤＮＡ）とすることができる。Ｍ．ハイオ・ワクチン中で提供されるポリペプチド、タンパク質、それらの免疫原性断片、遺伝子または核酸は、合成したものでもよいし、または当技術分野で知られた技術を使用して遺伝子組換えにより生産したものでもよい。
【００１８】
本発明に従って投与されるＭ．ハイオ・ワクチンは、アジュバント、および場合によっては、組合せワクチンで使用される第２またはそれ以上の抗原などの追加的成分を含んでもよい。第２の抗原は以下のもの、すなわち、牛ヘルペス・ウイルス１型（ＢＨＶ−１）、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、牛呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐｌ３）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、マイコプラズマ・マイコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、マイコプラズマ・アガラクチア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・カリフォルニクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ボビリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ディスパル（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｄｉｓｐａｒ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｎｉｓ）およびマンハイミア・ヘモリティカ（Ｍａｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）から選択されるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、動物に有効量のＭ．ハイオ・ワクチンを投与することにより、Ｍ．ボビスによる感染によって引き起こされる動物における疾病または疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００２０】
ある実施形態では、本発明の方法で使用するワクチンは、Ｍ．ハイオニューモニエの不活性化された細胞全体またはその一部からなる調製物（細菌ワクチン）、または改変生ワクチン調製物、および薬剤として許容される担体をＭ．ハイオニューモニエの不活性化された細胞全体またはその一部からなる調製物（細菌ワクチン）、または改変生ワクチン調製物、およびアジュバントを含む。
【００２１】
他の特定の実施形態では、本発明の方法で使用するワクチンは、免疫原性を有するタンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片および薬剤として許容される担体を含み、または、免疫原性を有するタンパク質もしくはポリペプチドまたはその断片およびアジュバントを含む。
【００２２】
開示を明瞭にするために以下、本発明の詳細な説明を本発明のある特徴、実施形態または応用について記載するか例示するサブセクションに分けて述べるが、これらは、本願を限定するものではない。
【００２３】
定義および略語
本願においてＭ．ボビス感染症に関して「治療または予防する」という用語は、Ｍ．ボビス菌の増殖を阻害すること、Ｍ．ボビスの流出や放出を阻害すること、またはＭ．ボビスがその宿主に順応するのを防止すること、Ｍ．ボビス感染によって引き起こされる疾病または疾患の症状を緩和すること、Ｍ．ボビス菌の動物宿主からの除去を加速することを意味する。また、細菌の量に低減が見られる場合、肺感染が減少し、直腸温度が低下し、および／または食物吸収力および／または成長に増加が見られる場合、治療は、治療効果があると考えられる。本発明の方法は、例えば、Ｍ．ボビス感染症で通常見られる肺傷害を防止または低減し、直腸温度を低減し、および肺中のＭ．ボビスのレベルを低減するのに有効である。
【００２４】
Ｍ．ハイオ・ワクチンの投与によりＭ．ボビス感染症を治療または予防する本発明の方法を、本願ではワクチン接種方法とも呼ぶ。
【００２５】
本発明の方法において使用できる「Ｍ．ハイオ・ワクチン」という用語は、例えば不活性化された全体的または部分的なＭ．ハイオ細胞調製物、改変生ワクチン調製物、１つまたは複数のＭ．ハイオ由来タンパク質、ポリペプチド、またはそうしたタンパク質もしくはポリペプチドの免疫原性断片を有するサブユニット・ワクチン、１つまたは複数のＭ．ハイオ由来タンパク質、ポリペプチド、またはそうしたタンパク質もしくはポリペプチドの免疫原性断片をコードする１つまたは複数のＭ．ハイオ遺伝子または核酸であって、これらの遺伝子または核酸は動物生体内で発現され得るものを含み得る。Ｍ．ハイオ・ポリペプチド、タンパク質、そのようなポリペプチドおよびタンパク質の免疫原性断片、またはＭ．ハイオ遺伝子もしくは核酸は、当技術分野で知られた技術を使用して、合成してもよいし遺伝子組換えで生産してもよい。好ましくは、本発明の方法で使用するＭ．ハイオ・ワクチンは細菌ワクチンである。
【００２６】
本願において「免疫原性断片」という用語は、Ｍ．ハイオに由来するタンパク質断片であって宿主動物において免疫反応を引き起こすことができるものを指す。免疫反応は、細胞性および／または体液性免疫により誘導されるもの（但し、これらに限定されない）を含む。
【００２７】
本願において「動物」という用語は、哺乳動物を含むヒト以外のすべての動物を指す。
【００２８】
本願において「牛」という用語は、去勢牛、雄牛、雌牛および子牛を含む（但し、これらに限定されない）ウシ科動物を指す。好ましくは、本発明の方法は、非ヒト哺乳動物である動物、最も好ましくは、子牛に適用される。
【００２９】
本願において「細菌ワクチン」という用語は、ワクチンとしての使用に適した不活性化された全体または部分的なＭ．ハイオ細胞の調製物を指す。
【００３０】
「免疫学的な有効量」という用語は、それが投与される動物において免疫反応を誘発するのに十分なＭ．ハイオ・ワクチンの量を指す。免疫反応は、細胞性および／または体液性免疫により誘導されるもの（但し、これらに限定されない）を含む。有効量のＭ．ハイオ・ワクチンは、例えば、細菌ワクチンがマイコプラズマの肺炎の重症度を防止または低減することを意味する。
【００３１】
本願において「アジュバント」という用語は免疫反応の強化剤である。
【００３２】
「薬剤として許容される担体」という用語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつ、それが投与される対象に対して化学的に不活性で毒性を有しない担体媒体を指す。
【００３３】
不活性化された部分的または全体的な細胞および改変生ワクチン
本発明の方法で用いる不活性化Ｍ．ハイオ・ワクチンまたは改変生Ｍ．ハイオ・ワクチンは、当技術分野で知られている様々な方法を使用して調製できる。
【００３４】
例えば、Ｍ．ハイオ細菌ワクチンはＭ．ハイオ単離体から調製できる。多数のＭ．ハイオ単離体が当業者に知られており、例えばアメリカン・タイプ・カルチャーコレクション（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９）から入手可能である。これらは、例えば：ＡＴＣＣ番号２５０９５、２５６１７、２５９３４、２７７１４および２７７１５を含む。
【００３５】
Ｍ．ハイオ単離体はまた、知られた技術を使用して、感染した豚の肺損傷部から直接得ることもできる。
【００３６】
Ｍ．ハイオ単離体は、様々な知られた方法、例えば、米国特許第５，５６５，２０５号に記載されるような二元エチレンイミン（ＢＥＩ：ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）による細菌単離体の処理またはホルマリン、グルタルアルデヒド、熱、放射線、ＢＰＬまたは当技術分野で知られた他の不活性化剤による不活性化を使用して、不活性化できる。
【００３７】
細菌ワクチン製品は、不活性化された細菌単離体に加え、さらに適当な量の１種または複数の一般に使用されているアジュバントを含むことができる。適当なアジュバントは、鉱物性ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）；リゾレシチン（ｌｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ）などの界面活性剤；配糖体（例えばサポニン、Ｑｕｉｌ  ＡまたはＧＰＩ−０１００などのサポニン誘導体）；カチオン性界面活性剤、（例えば、ＤＤＡ（ハロゲン化炭化水素４級アンモニア塩）、ポリウロン酸ポリオール）；ポリアニオンおよび多原子イオン；ポリアクリル酸、非イオン性ブロックポリマー（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７）（Ｂ．Ａ．Ｓ．Ｆ．、米国）；アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）およびランチジン（Ｒａｎｔｉｄｉｎｅ）；ペプチド；組換え変異体不安定毒素（例えばロイコトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ））；化学上結合または近接分子搬送体；鉱油（例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５０（Ｓｅｐｐｉｃ、パリ（フランス））、ｃａｒｂｏｐｏｌ、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ（米国））、オマハ、ＮＥ、米国、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、デンマーク）、油性乳剤、例えば、ＢａｙｏｌＦ／Ａｒｌａｃｅｌ  Ａおよび水のような鉱油性乳剤、または、植物油、水およびレシチンなどの乳化剤からなる乳剤；ミョウバン、コレステロールサイトカインおよびアジュバントの組合せを含み得る（但し、これらに限定されない）。多原子イオンも、さらに長期の静置後にワクチンを単分散（ｍｏｎｄｉｓｐｅｒｓｅ）懸濁液として再懸濁可能にする分散剤、増粘剤およびケーキング防止剤として機能し得る。アジュバントの組合せは、水性液として、またはカプセル化（制御または緩やかな放出）もしくはマイクロカプセル化形式で提供してもよい。本発明の方法で使用するに適したＭ．ハイオ細菌ワクチンは様々な商業的な供給源から得ることができる。そのような供給源は以下を含む（但し、これらに限定されない）：ＲＥＳＰＩＦＥＮＤ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＨＹＯＲＥＳＰ（Ｍｅｒｉａｌ社）、Ｍ＋ＰＡＣ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ＰＲＯＳＹＳＴＥＭ  Ｍ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）、ＩＮＧＬＥＶＡＣ  Ｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（Ｐｆｉｚｅｒ社）およびＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ  ＭＹＣＯＰＬＡＳＭＡ（Ｐｆｉｚｅｒ社）。
【００３８】
本発明の方法で使用するＭ．ハイオ細菌ワクチンの１つの好ましい供給源は、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ  ＯＮＥおよびＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ  ＭＹＣＯＰＬＡＳＭＡである。
【００３９】
本発明の方法で使用するＭ．ハイオ細菌ワクチンの特に好ましい供給源は、菌株ＮＬ１０４２を含むＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（ＰＦＩＺＥＲ社）である。
【００４０】
好ましくは、菌株ＮＬ１０４２はＢＥＩで不活性化し、市販のアジュバント、好ましくは、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ（米国））で強化する。好ましい投薬量は約２．０ｍｌである。従来使用される保存剤はメルチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）／ＥＤＴＡを含んでいる。ワクチンは、液体の投薬として処方するか、または、可溶性成分で仕上げられた固体投薬または微粒子として提供され、使用に先立って薬剤として許容される希釈剤で再懸濁される。適当な可溶性成分または微粒子を調製する方法は、バイアセルベーション（ｂｉａｃｅｒｖａｔｉｏｎ）、凍結（ｃｏｎｇｅｌｇａｔｉｏｎ）、噴霧乾燥、泡注射、沈殿、超臨界溶媒和（ｓｏｖｌａｔｉｏｎ）／カプセル化および凍結乾燥を含む（但し、これらに限定されない）。担体、好ましくはＰＢＳを加えてもよい。継代培養を繰り返すことにより感染力の強い株を弱化させるなど改変生ワクチンの調製は、当技術分野で知られている。
【００４１】
不活性化されたマイコプラズマ・ハイオ単離体は以下の細菌およびウイルスと組み合わせることができる（但し、これらに限定されない）：牛ヘルペス・ウイルス１型（ＢＨＶ−１）、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、牛呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（Ｐｌ３）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、マイコプラズマ・マイコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、マイコプラズマ・アガラクチア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・カリフォルニクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ボビリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ディスパル（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｄｉｓｐａｒ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｎｉｓ）およびマンハイミア・ヘモリティカ（Ｍａｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）。
【００４２】
サブユニット・ワクチン
本発明の方法は、精製されたＭ．ハイオ免疫原性タンパク質、ポリペプチドまたはそのようなタンパク質およびポリペプチドの免疫原性断片から構成されたサブユニット・ワクチンを使用して実行できる。そのようなタンパク質およびポリペプチドは、当技術分野で知られた技術を使用して調製できる（例えば、界面活性剤を使用して調製された抽出物、熱抽出物、化学的抽出物および機械的抽出物）。さらに、タンパク質の純度や均質性は、当業者にはよく知られた方法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のゲルの適当な染色、ＨＰＬＣまたは当技術分野でよく知られた他の同様の方法など、当業者にはよく知られた方法）を使用して決定できる。
【００４３】
１つの実施形態では、本発明で使用されるサブユニット・ワクチンは、少なくとも１つのＭ．ハイオタンパク質またはポリペプチドを含む。ワクチンで使用する好ましいＭ．ハイオタンパク質またはポリペプチドは、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ８５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０およびＰ４４を含むが、これらに限定されるものではない。これらおよび他のＭ．ハイオタンパク質は、例えば、国際公開第９６／２８４７２号パンフレット、国際公開第９５／０９８７０号パンフレット、欧州特許公開公報第０４７５  １８５号明細書、米国特許第５，７８８，９６２号明細書、国際公開第９１／１５５９３号パンフレット、米国特許第５，２５２，３２８号明細書、キング他（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９７；  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：２５−３５）、ウィルトン他（Ｗｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９８、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：１９３１  １９４３）、およびフス他（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９８年、Ｇｅｎｅ  ２１４：１３−２３）に記載されている。
【００４４】
別の実施形態では、本発明の方法で使用されるワクチンは、Ｍ．ハイオタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１個の免疫原性断片を含んでいる。本発明に従ってワクチンに含められる免疫原性断片は、少なくとも約１０〜２０、好ましくは少なくとも約３０〜４０、またはより好ましくは少なくとも約５０〜１００のＭ．ハイオタンパク質またはポリペプチドの連続するアミノ酸配列を有する。好ましくは、免疫原性断片は、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ８５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０およびＰ４４（但し、これらに限定されない）を含むＭ．ハイオタンパク質またはポリペプチドの断片である。
【００４５】
好ましくは、ワクチンで使用されるＭ．ハイオタンパク質は実質的に純粋または均質である。例えば、所望のＭ．ハイオタンパク質またはポリペプチドは、そのようなタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞中で発現させ、次いで、当技術分野においてよく知られた様々な方法によって精製できる。例えば、「酵素学的方法」（「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（サンディエゴ））、「タンパク質精製：原理と実際」（「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、１９８２、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク）に記載された技術参照。精製Ｍ．ハイオ・ポリペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの免疫原性断片は知られた合成方法を使用しても調製できる。
【００４６】
別の実施形態では、本発明の方法で使用されるワクチンは、Ｍ．ハイオタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの免疫原性断片、およびＭ．ハイオタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの免疫原性断片ではない少なくとも１つの他の免疫原性または抗原ポリペプチド（好ましくはウイルスまたは細菌または寄生ポリペプチドである）を含む。好ましい実施形態では、抗原は、牛ヘルペス・ウイルス１型（ＢＨＶ−１）、牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、牛呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、マイコプラズマ・マイコイデス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、マイコプラズマ・アガラクチア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・カリフォルニクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ボビリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ディスパル（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｄｉｓｐａｒ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｎｉｓ）またはマンハイミア・ヘモリティカ（Ｍａｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）である。そのような組成物は組合せワクチンとして有益である。本発明のサブユニット・ワクチンおよび組合せワクチンは、Ｍ．ボビス感染によって引き起こされる疾病または疾患を治療または予防する本発明の方法において使用できる。
【００４７】
Ｍ．ボビスのポリペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの免疫原性断片は、生きている組換えウイルスやアデノウイルスまたはサルモネラ菌などの細菌ベクターを使用して、発現し送達することもできる。実際のベクターはさらに当技術分野において知られており、かつ、容易に利用可能であり、あるいは当業者であればよく知られた方法を用いて構築できる。
【００４８】
核酸ワクチン
本発明のワクチン接種方法は、Ｍ．ハイオタンパク質、ポリペプチドまたはそのようなタンパク質およびポリペプチドの免疫原性断片をコードするＭ．ハイオ遺伝子または核酸分子を用いて実施することができる。そのような遺伝子および核酸は、当技術分野で知られた技術を用いて調製し、動物に投与してそれがコードするタンパク質、ポリペプチドまたはその断片を生体内で発現することができる。
【００４９】
１つの実施形態では、本発明で用いるワクチンは、Ｍ．ハイオタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子または核酸分子（例えば、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ８５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０およびＰ４４などを含むが、これらに限定されない）を含む。
【００５０】
別の実施形態では、本発明で用いるワクチンは、Ｍ．ハイオタンパク質またはポリペプチドの免疫原性断片をコードする少なくとも１つの遺伝子または核酸分子を含む。ワクチンに含有される免疫原性断片は、少なくとも約１０〜２０、好ましくは少なくとも約３０〜４０、またはより好ましくは少なくとも約１００個のＭ．ハイオタンパク質またはポリペプチドの連続するアミノ酸から構成され、こうしたものとしては、Ｐ４６、Ｐ６５、Ｐ８５、Ｐ９７、Ｐ１０２、Ｐ７０、Ｐ５０およびＰ４４が含まれる（但し、これらに限定されない）。
【００５１】
例えば、遺伝子銃の使用などの知られた方法によって、遺伝子または核酸の分子を動物に投与できる。さらに、遺伝子または核酸分子は、リポソームまたは当技術分野で知られているトランスフェクションを容易にする他の薬剤と結合させて存在してもよい。
【００５２】
発現システム
多種多様な宿主発現ベクターシステムを利用して、Ｍ．ハイオの免疫原性タンパク質またはポリペプチドを発現することができる。そのような宿主発現システムを使用して対象とするコード配列を生成精製し、本発明のワクチン接種方法で使用するＭ．ハイオ・タンパク質、ポリペプチドまたはその断片を発現させ、精製することができる。典型的な宿主発現システムは、ｍｈｐ３コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；Ｍ．ハイオ遺伝子生成物コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセス・ピチア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｉｃｈｉａ）；Ｍ．ハイオ・コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロ・ウイルス）に感染した昆虫細胞システム；Ｍ．ハイオ・コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；タバコ・モザイク・ウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞システム；または哺乳類細胞（例えば、メタロチネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーター）のゲノムもしくは哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルスの後期プロモーター；牛痘ウイルス７．５  Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現コンストラクトを有する哺乳類細胞システム（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）を含む（但し、これらに限定されない）。
【００５３】
好ましい実施形態において、発現システムは細胞ワクチン・システムである。
【００５４】
投薬および投与方法
本発明によれば、子牛に投与された有効量のＭ．ハイオ・ワクチンは、Ｍ．ボビスの後の感染（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する有効な免疫を提供する。１つの実施形態では、Ｍ．ハイオ・ワクチンを約７〜２８日齢、より好ましくは約２１日齢の子牛に投与する。
【００５５】
好ましい実施形態では、Ｍ．ハイオ・ワクチンを子牛に２度投与する。動物が約７〜２８日齢、好ましくは約２１日齢のときに初回の投与を行う。２回目の投与は動物が約３５〜４９日齢のとき、好ましくは約４２日齢のときに行う。
【００５６】
有効なＭ．ハイオ・ワクチンの量は、ワクチンの成分および投与スケジュールに依存する。典型的には、不活性化された全細胞Ｍ．ハイオ調製物をワクチンに使用する場合、約３週間で２度、動物に投与する際に、１投薬量当たり約１×１０６〜約５×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む量のワクチンが有効である。約３週間で２度、動物に投与する場合、好ましくは、有効な免疫を提供するＭ．ハイオ細菌ワクチンワクチンは、約１×１０８〜約５×１０１０ＣＦＵ／投薬、より好ましくは約５×１０８〜約５×１０８  ＣＦＵ／投薬を含む。動物が約７〜２８日齢のとき、好ましくは約２１日齢のときに初回の投与を行う。２回目の投与は動物が約３５〜４９日齢のとき、好ましくは約４２日齢のときに行う。
【００５７】
本発明によれば、好ましい細菌ワクチン製品ＲＥＳＰＩＳＵＲＥを投与する場合、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥは好ましくは２度、各回、約０．５〜約５．０ｍｌ、好ましくは約１．５ｍｌ〜約２．５ｍｌ、最も好ましくは約２ｍｌまでの量を投与する。動物が約７〜２８日齢のとき、好ましくは約２１日齢のときに初回の投与を行う。２回目の投与は動物が約３５〜４９日齢のとき、好ましくは約４２日齢のときに行う。
【００５８】
少なくとも１個のＭ．ハイオタンパク質、ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含むＭ．ハイオサブユニット・ワクチンの量は、各回約０．１〜約２００μｇで２度投与する場合、有効である。動物が約７〜２８日齢のとき、好ましくは約２１日齢のときに初回の投与を行う。２回目の投与は動物が約３５〜４９日齢のとき、好ましくは約４２日齢のときに行う。
【００５９】
少なくとも１つのＭ．ハイオタンパク質、ポリペプチド、またはその免疫原性断片をコードする遺伝子または核酸分子（好ましくはＤＮＡ）を含むＭ．ハイオ・ワクチンの量は、各回約０．１〜約２００μｇで２度投与する場合、有効である。動物が約７〜２８日齢のとき、好ましくは約２１日齢のときに初回の投与を行う。２回目の投与は動物が約３５〜４９日齢のとき、好ましくは約４２日齢のときに行う。
【００６０】
本発明に従えば、経口、鼻腔内、経粘膜局所的、経皮的、および非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）を含む知られたルートで投与を行うことができる。投与はまた、無針送達装置を使用して達成することもできる。投与は、ルートを組み合わせて、例えば初回の投与は非経口ルートを使用し、後の投与は粘膜ルートを使用して行うことができる。好ましい投与ルートは皮下または筋肉内への投与である。
【００６１】
本発明ではさらに単回投薬ワクチン接種方法も考えられる。これによれば、Ｍ．ボビスに対する免疫を生成または維持するために子牛に追加的な投薬量の投与を必要としない。
【００６２】
本発明に従って投与するＭ．ハイオ・ワクチンは、アジュバント（鉱物性ゲル、例えば、水酸化アルミニウム；リゾレシチン（ｌｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ）などの界面活性剤；配糖体、例えばサポニン、Ｑｕｉｌ  ＡまたはＧＰＩ−０１００などのサポニン誘導体；コレステロール、ポリウロン酸ポリオール；ポリアニオン；非イオン性ブロックポリマー、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７；ペプチド；鉱油、例えばＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５０、ｃａｒｂｏｐｏｌ、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、油性乳剤、例えば、ＢａｙｏｌＦ／Ａｒｌａｃｅｌ  Ａおよび水のような鉱油性乳剤、または、植物油、水およびレシチンなどの乳化剤からなる乳剤；ミョウバン、サイトカインおよびアジュバントの組合せ）などの追加成分を含んでもよい。
【００６３】
本発明によれば、およそ３および６週齢で子牛に投与された、有効量のマイコプラズマ・ハイオ細菌ワクチンの投与は、肺炎を含む呼吸器感染症に対する有効な免疫をもたらし、肺中のＭ．ボビスのレベルを低減する。
【００６４】
本発明は、マイコプラズマ・ボビスによる感染に対して子牛を免疫する方法であって、マイコプラズマ・ボビス感染に対して子牛を免疫にするために、Ｍ．ハイオ細菌ワクチンを子牛に少なくとも１回、好ましくは２回投与することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、細菌ワクチンを皮下に投与する。さらに、細菌ワクチン投薬量は、細菌ワクチン約２ｍｌ（ｍｌ当たり約２．５×１０８  Ｍ．ハイオ  ＣＦＵを含む）を含むことが好ましい。望ましくは、子牛に２度、子牛の誕生後約３週目に１回、そして、約６週目に１回、細菌ワクチンを投与する。
【００６５】
本発明ではまた、動物、好ましくは牛に有効量のマイコプラズマ・ハイオ細菌ワクチンを投与して、そのような動物における肺炎、関節炎、乳腺炎、耳炎および生殖器疾患を含む疾患を治療および予防することが考えられる。
【００６６】
以下、実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６７】
材料および方法
動物
およそ１４日齢の健康な雑種の乳牛子牛を、ワクチン接種のために得た。子牛は研究の開始に先立って７日間順応させた。すべての子牛には、知られる限り汚染物質や殺虫剤を含まない薬物無添加の濃縮食餌を毎日与え、水は自由に飲ませた。
【００６８】
ワクチン
子牛にワクチン接種するために用いた細菌ワクチンには、ＢＥＩで不活性化したＭ．ハイオニューモニエ菌の細胞全体を１投薬量当たり適当な濃度で含有させた。さらに、ワクチン調製物にはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）および水中油型アジュバントを含有させた。偽薬にもＰＢＳを含有させた。
【００６９】
感染方法
各子牛に３日連続の鼻腔内ルートにより、新鮮なＭ．ボビス培養液（およそ１×１０８〜１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）１２ｍｌを与えた。感染接種原の生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を、各実験の感染の完了直後に測定した。
【００７０】
実験操作
一意的な耳タグ番号で各子牛を識別した。動物は、年齢により無作為に家畜囲いおよび処理群に割り当てた。
【００７１】
動物は、０日目（左の首）および２１日目（右の首）に皮下ルートによって、ワクチン２．０ｍｌまたは偽薬の２．０ｍｌのいずれかをワクチン接種した。
【００７２】
感染の１日前、感染の直前および感染に続く２０日間、直腸温度を毎朝測定した。
【００７３】
Ｍ．ボビスの感染実験およそ３週間後、すべての動物を検死した。子牛を安楽死させ、中枢神経系以外すべての主な器官を肉眼で検査した。
【００７４】
肺を取り出しＭ．ボビス感染症に起因する特有の傷害について肉眼で評価した。傷害は標準的肺図形上でスケッチした。各肺葉あたり、全肺葉に対する個々の肺葉の以下の割合を用いて関与部分の総重量（％）を計量した。
【００７５】
2004537543.tif 000003
【００７６】
次いで、肉眼的病変を有する肺の総パーセンテージを決定するために重み付けした肺葉値を合計した（ポワントン他（Ｐｏｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２）。さらに、以下の式を用いて減少率を計算した。
【００７７】
１００−（処理群の平均肺損傷（％）／対照群の平均肺損傷（％））＝減少率（％）
【００７８】
さらに、各肺をＰＢＳ５０ｍｌで洗浄した。気管支洗浄液からＭ．ボビス生菌を分離しその数を決定する試みがなされた。Ｍ．ボビス生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）は、気管支洗浄液の適当な連続稀釈液を調製し、試料を適当な寒天培地上に植菌することにより決定した。
【実施例２】
【００７９】
この例では、Ｍ．ハイオニューモニエ細菌ワクチンの効果を若い子牛において評価した。３０頭の健全な雑種子牛を年齢により無作為に割り当てた。
【００８０】
動物は、０日目（左の首）および２１日目（右の首）に皮下ルートによって、ワクチン２．０ｍｌまたは偽薬の２．０ｍｌのいずれかをワクチン接種した。使用した実験処理群およびワクチンを表１に示す。
【００８１】
2004537543.tif 000004
【００８２】
２回目のワクチン接種の３週後に、上記のように子牛を感染させた。各子牛には３日連続で鼻腔内ルートにより、新鮮なＭ．ボビス培養液１２ｍｌを与えた。
【００８３】
各感染接種原の生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を、Ｍ．ボビス実験感染の完了後１時間以内に決定した。結果を表２に示す。
【００８４】
2004537543.tif 000005
【００８５】
感染の１日前、感染の直前およびＭ．ボビス感染に続く２０日間、直腸温度を毎朝測定した。結果を図１にまとめて示す。偽薬ワクチンを接種した動物（処理群Ｂ）と比較したとき、Ｍ．ハイオニューモニエ細菌ワクチン（処理群Ａ）のワクチン接種を受けた子牛は、７日目、９〜１８日目および２０日目においてより低い平均体温を有していた。
【００８６】
Ｍ．ボビスの感染実験およそ３週間後、すべての動物を検死した。肺を取り出しＭ．ボビス感染症に起因する特有の傷害について肉眼で評価した。肺損傷スコア（％）および肺傷害減少率（％）を表３にまとめて示す。処理群Ａの動物（Ｍ．ハイオニューモニエ細菌ワクチン）は、偽薬群（処理群Ｂ）と比較して、肉眼での肺傷害部が４５．１％低減していた。
【００８７】
2004537543.tif 000006
【００８８】
各肺をＰＢＳ５０ｍｌで洗浄した。Ｍ．ボビスの感染実験後およそ２１日目に、気管支洗浄試料からのＭ．ボビスを単離した結果を表４にまとめて示す。偽薬ワクチンを接種した動物（処理群Ｂ）と比較すると、Ｍ．ハイオニューモニエ細菌ワクチンのワクチン接種を受けた子牛（処理群Ａ）は、肺洗浄試料から単離したＭ．ボビス生菌レベルが低減していた。
【００８９】
2004537543.tif 000007
【００９０】
結論として、Ｍ．ハイオニューモニエ細菌ワクチンで２回ワクチン接種を受けた子牛（処理群Ａ）は、偽薬ワクチン接種群（処理群Ｂ）と比較すると、肺傷害の総量が減少し、直腸温度が低減し、肺洗浄試料から単離したＭ．ボビス生菌レベルが低減していた。この結果は、Ｍ．ハイオニューモニエ細菌ワクチンが、牛において実験的Ｍ．ボビス感染に対しクロス保護をもたらすことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】Ｍ．ボビス感染実験の前後における子牛の平均体温を描いたグラフである（Ａ群の子牛は、感染に先立ちＭ．ハイオ細菌ワクチン２回の接種を受け、Ｂ群の子牛は感染に先立ち偽薬でワクチン接種を受けた）。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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