(57)【要約】本発明は、アミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列を含む、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａのゲノム配列、ならびにＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｂのゲノム配列から免疫原性タンパク質を得る方法を提供する。そのように得られたタンパク質は、ワクチン、免疫原生組成物、および／または診断剤のための、有用な抗原である。
2004511201.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列を同定するための方法であって、配列番号１〜９６１および１０６８、または配列番号９６２〜配列番号１０４４の偶数の配列番号の、１以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列内で、推定オープンリーディングフレームまたはタンパク質コード配列について検索する工程を包含する、方法。
【請求項２】
開始コドンについてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列を検索する工程、およびインフレームの終始コドンについてその上流配列を検索する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質を産生するための方法であって、請求項１〜２のいずれか１項に記載の同定されたアミノ酸配列を含むタンパク質を発現させる工程を包含する、方法。
【請求項４】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいてタンパク質を同定するための方法であって、請求項３に記載のタンパク質を産生する工程、該タンパク質に結合する抗体を産生する工程、および該抗体が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによって産生されたタンパク質を認識するか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項５】
請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法によって同定されたオープンリーディングフレームまたはタンパク質コード配列を含む、核酸。
【請求項６】
請求項３の方法によって得られた、タンパク質。
【請求項７】
配列番号１〜９６１および１０６８、または配列番号９６２〜配列番号１０４４の偶数の配列番号の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列の１以上を含む、核酸。
【請求項８】
配列表の配列番号１〜９６１および１０６８、または配列番号９６２〜配列番号１０４４の偶数の配列番号に列挙される配列に開示されるヌクレオチド配列に対して、５０％を超える配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項９】
配列表の配列番号１〜９６１および１０６８、または配列番号９６２〜配列番号１０４４の偶数の配列番号に列挙される配列に開示されるヌクレオチド配列のフラグメントを含む、核酸。
【請求項１０】
前期フラグメントが、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのゲノムに固有である、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の核酸に相補的な、核酸。
【請求項１２】
配列番号１〜９６１および１０６８、または配列番号９６２〜配列番号１０４４の偶数の配列番号の、１以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列内にコードされるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１〜９６１および１０６８、または配列番号９６２〜配列番号１０４４の偶数の配列番号の、１以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列内にコードされるアミノ酸配列に対して、５０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１４】
配列番号９６３〜１０３７の奇数の配列番号の１以上、配列番号９６３〜１０３７の奇数の配列番号の１以上との５０％を超える同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１〜９６１および１０６８の１以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列内にコードされるアミノ酸配列、および配列番号９６２〜配列番号１０４４の偶数の配列番号の１以上によってコードされるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含む、タンパク質。
【請求項１５】
請求項６〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、核酸。
【請求項１６】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の核酸のヌクレオチド配列を含む、コンピューター、コンピューターメモリー、コンピューター記憶媒体またはコンピューターデータベース。
【請求項１７】
配列番号１〜９６１のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列の１以上を含む、コンピューター、コンピューターメモリー、コンピューター記憶媒体またはコンピューターデータベース。
【請求項１８】
請求項１２〜１４または６のいずれか１項に記載のタンパク質に結合する、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体。
【請求項１９】
請求項５、７〜１０または１５のいずれか１項に記載の核酸を含む、核酸プローブ。
【請求項２０】
請求項５、７〜１０または１５のいずれか１項に記載の核酸を含む、増幅プライマー。
【請求項２１】
（ａ）請求項５、７〜１０または１５のいずれか１項に記載の核酸；（ｂ）請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のタンパク質；および／または（ｃ）請求項１８に記載の抗体を含む、組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組成物の医薬または診断試薬としての、使用。
【請求項２３】
（ａ）ナイセリア細菌に起因する感染を処置または予防するための医薬、および／または（ｂ）ナイセリア細菌またはナイセリア細菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬の製造における、請求項２１に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
患者を処置する方法であって、請求項２１に記載の組成物の治療有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
本願は、その両方が本明細書中に参考として援用される米国特許仮出願第６０／１０３，７９４号（１９９８年１０月９日出願）および同第６０／１３２，０６８号（１９９９年４月３０日出願）に対して優先権を請求する。
本発明は，抗原および免疫原を得るための方法、この様に得られた抗原および免疫原、ならびに細菌種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の核酸配列に関連する。特に，この細菌由来のゲノム配列、さらに特にその「Ｂ」血清型に関連する。
（技術背景）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、非運動性のグラム陰性双球菌であるヒトにおいて病原体である。これは、咽頭にコロニー形成をし、髄膜炎（および、時折、髄膜炎のない敗血症）を引き起こす。これは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａと密接に関係しており、髄膜炎菌が淋病菌と明らかに異なる１つの特徴は、全ての病原性髄膜炎菌に存在する多糖性被膜の存在である。
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、風土病および伝染病を引き起こす。米国において、発病率は１年間に１００，０００人中０．６〜１人の割合であり、そして大発生の間にずっと大きくなり得る（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９６）Ｓａｆｅｌｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ａ　Ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｓ　Ａ／Ｃ　Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｖａｃｃｉｎｅ　ｉｎ　Ｙｏｕｎｇ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ．ＪＡＭＡ　２７５（１９）：１４９９−１５０３；Ｓｃｈｕｃｈａｔら（１９９７）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｉｎ　１９９５，Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ３７７（１４）：９７０−９７６）。発展途上国では、風土病の割合は、よりずっと大きくそして伝染病中の発生率は、１年間あたり１００，０００人あたり５００件に達し得る。死亡率は極めて高く、米国では１０〜２０％、そして発展途上国においてはよりずっと高い。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する混合ワクチンの導入の結果、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、米国において全ての年齢における細菌性髄膜炎の主な原因である（Ｓｃｈｕｃｈａｔ（１９９７）前出）。
生物の被膜多糖類に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２の血清群が同定されている。Ａ群は、サハラアフリカ周縁での伝染病において最も頻繁に関与している病原体である。血清型Ｂ群および血清型Ｃ群は、米国および大部分の先進国における症例の大部分の原因である。血清型Ｗ１３５およびＹは、米国および先進国における症例の残りの原因である。現在使用される髄膜炎ワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、およびＷ１３５で構成される４価の多糖類ワクチンである。これは、青年および成人には効果があるが、弱い免疫応答および短い保護持続期間を誘導し、そして乳児には使用され得ない（例えば、Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　ａｎｄ　Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　ｗｅｅｋｌｙ　ｒｅｐｏｒｔ、４６巻、ＰＲ−５号（１９９７））。これは、多糖類が、繰り返しの免疫により追加免疫され得ない弱い免疫応答を誘導するＴ細胞非依存性抗原であるからである。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａに対するワクチン接種の成功に続き、血清型Ａおよび血清型Ｃに対する混合ワクチンが開発されており、そして臨床試験の最終段階である（Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ　ＷＤ「Ｎｅｗ　ａｎｄ　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ」Ｎｅｗ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ，上記，４６９−４８８頁；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（１９９６）上記；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｐｈｅａｓｅ　Ｉ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ａｇａｉｎｓｔ　ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｕｓ　Ａ（ｍｅｎＡ）　ａｎｄ　Ｃ（ｍｅｎＣ）．Ｖａｃｃｉｎｅ　１０：６９１−６９８）。
しかし、髄膜炎菌Ｂ（ＭｅｎＢ）は問題を残している。この血清型は現在、米国、欧州、および南アメリカにおける全髄膜炎のおおよそ５０％の原因である。この多糖類アプローチは使用され得ない。なぜならばＭｅｎＢ被膜多糖類は、哺乳動物組織にもまた存在するα（２−８）−連結　Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマーであるからである。これは抗原に対する耐性を生ずる；確かに、免疫応答が惹起された場合、それは抗−自己であり、それ故、所望されない。自己免疫の誘導を回避しそして保護的免疫応答を誘導するために、この被膜性多糖類は、例えば、Ｎ−アセチル基をＮ−プロピオニル基と置換するように化学的に改変されるが、特異的抗原性は不変のままである（ＲｏｍｅｒｏおよびＯｕｔｓｃｈｏｏｒｎ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ：ｃａｐｓｕｌａｒ　ｏｒ　ｎｏｎ−ｃａｐｓｕｌａｒ？　Ｃｌｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｒｅｖ　７（４）：５５９−５７５）。
ＭｅｎＢワクチンに対する代替のアプローチは、外膜タンパク質（ＯＭＰ；ＯＭＰのみ、またはポーリンに富むＯＭＰのいずれかを含む）、または細菌活性をブロックする抗体を誘導すると考えられるクラス４のＯＭＰを欠失した複合体混合物を使用する。このアプローチは、十分に特徴付けられていないワクチンを産生する。それらワクチンは、相同株に対して保護し得えるが、外膜タンパク質の多くの抗原性改変体が多く存在する場合、全体として効果がない。抗原変異性を克服するために、９つまでの異なるポリンを含む多価ワクチンが構築されている（例えば、Ｐｏｏｌｍａｎ　ＪＴ（１９９２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｄｉｓ．４：１３−２８）。外膜ワクチンで使用されるさらなるタンパク質は、ｏｐａタンパク質およびｏｐｃタンパク質であるが、これらのアプローチは、いずれも抗原変異性を克服し得ない（例えば、Ａｌａ’ＡｌｄｅｅｎおよびＢｏｒｒｉｅｌｌｏ（１９９６）Ｔｈｅ　ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　ｔｒａｎｆｅｒｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１　ａｎｄ　２　ａｒｅ　ｂｏｔｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆ　ｋｉｌｌｉｎｇ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ａｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｓｔｒａｉｎｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ　１４（１）：４９−５３）。
特定の量の配列データは、髄膜炎菌および淋病菌の遺伝子およびタンパク質（例えば、ＥＰ−Ａ−０４６７７１４，ＷＯ９６／２９４１２）について利用可能であるが、これは決して完全ではない。さらなる配列の供給は、免疫系に対する標的と推測される分泌タンパク質または表面露出タンパク質を同定するための機会を提供し得た。これは、抗原的に変異し得ない、または他の領域およびより変異し得る領域よりも少なくともより抗原的に保存される。従って、より高く保存されたこれらの抗原性配列は、好ましい配列である。より高く保存されたＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに特異的なこれらの配列は、さらに好ましい配列である。例えば、同定されたタンパク質のいくつかは、髄膜炎菌Ｂに対して効果のあるワクチンの成分であり、いくつかは髄膜炎菌の全ての血清型に対するワクチンの成分であり、そして他は全ての病原性Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｅに対するワクチンの成分であり得た。この細菌由来の配列の同定はまた、生物学的なプローブ、特に生物体特異的なプローブの産生を容易にする。
従って、本発明の目的は、（１）抗原性もしくは免疫原性であると予想されるおよび／または示されるタンパク質をコードする、（２）プローブとしてまたは増幅プライマーとして用い得る、そして（３）生命情報科学によって分析し得るナイセリアＤＮＡ配列を提供することである。
（本発明）
本発明は、付表Ｃの配列番号１〜９６１に示されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのゲノム由来の９６１ヌクレオチド配列、および付表Ｄの配列番号１０６８に示されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの全長ゲノムに基づく。付表Ｃにおける９６１の配列は、実質的に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＢ血清型の全ゲノム（＞９９．９８％）を示す。付表Ｃにおける配列に示される９６１の連続する配列（「コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）」）のいくつかの間に部分的重複が存在する。この重複を用いて、付表Ｄにおける配列番号１０６８に示される単一の全長配列を構築した。これには、ＴＩＧＲ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ［Ｇ．Ｓ．Ｓｕｔｔｏｎら、ＴＩＧＲ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ　Ｌａｒｇｅ　Ｓｈｏｔｇｕｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：９〜１９（１９９５）］を用いた。コンティグ中のいくつかのヌクレオチドが以前に公開されている。（例えば、ワールドワイドウエブすなわち「ＷＷＷ」上のｆｔｐ：１１ｆｔｐ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｄａｔａ／ｎ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを参照のこと）。現在のコンティグにおける２５０８の公開された配列の組み合わせが付表Ａに示される。これらのデータは、第１の列に示されるように、コンティグ番号（すなわち、ｉ．ｄ．）を含む；ＷＷＷにみられる配列の名前は２番目の列である；これは、それぞれ、第３および第４の列におけるコンティグの組み合わせを含む。付表Ｂに示される特定のＭｅｎＢ　ＯＲＦの配列は、それぞれ、１９９８年１０月９日（ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１６６５）および１９９９年１月１４日（ＰＣＴ／ＩＢ９９／００１０３）にＣｈｉｒｏｎ　ＳｐＡによって提出された国際特許出願において記載される。
第１の局面において、本発明は、付表ＣおよびＥにおける配列番号１〜９６１および１０６８に示される１つ以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、本明細書において開示されるヌクレオチド配列に同一の配列を有する配列を含む核酸もまた提供される。特定の配列に依存して、配列同一性の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）。これらの配列は、例えば、変異体および対立遺伝子改変体を含む。本明細書において引用される配列同一性の程度は、以下のパラメーター：ギャップオープンペナルティー　１２、ギャップエクステンションペナルティー　１、を用いるアフィンギャップ（ａｆｆｉｎｅ　ｇａｐ）検索を用いてＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される配列の長さにわたり決定される。
本発明はまた、本明細書において記載される１つ以上のヌクレオチド配列のフラグメントを含む核酸を提供する。このフラグメントは、その配列由来の少なくともｎ個の連続したヌクレオチドを含むべきであり、そしてその特定の配列に依存して、ｎは１０以上（例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７５、１００以上）である。好ましくはこのフラグメントは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのゲノムに特有である。これは、すなわち、それは別の生物のゲノムに存在しないことをいう。さらに好ましくは、このフラグメントは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＢ株のゲノムに特有である。本発明はまた、本明細書において提供される核酸にハイブリダイズする核酸を提供する。ハイブリダイゼーションの条件は、本明細書中に示される。
本発明はまた、上記の配列に相補的な配列を含む核酸を提供する（例えば、アンチセンスのため、プローブのため、または増幅プライマーのため）。
本発明に従う核酸は、当然ながら、多くの様式（例えば、化学合成により、ＤＮＡライブラリーから、生物自体から、など）で調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブ、プライマーなど）をとり得る。用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに、またそれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むＤＮＡおよびＲＮＡ）ならびにまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
配列番号１〜９６１が、部分的重複を伴い、実質的に生物体の完全ゲノムを示すので、配列番号１〜９６１に対する参照は、完全ゲノム配列に対する参照をその範囲内に含む、例えば、２つの配列番号が重複する場合、本発明は、２つの重複する配列をアセンブルすることにより形成される１つの配列を包含することが理解される。従って、例えば、２つの配列番号にまたがるがいずれの配列番号中にもその全体が存在しないヌクレオチド配列はやはり、本発明の範囲内である。さらに、このような配列は、その全体が、配列番号１０６８の単一の全長配列に存在する。
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、発現ベクター、配列決定ベクター、クローニングベクターなど）およびこのようなベクターで形質転換した宿主細胞を提供する
さらなる局面に従って、本発明は、本明細書に記載されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列内にコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。本発明は、これらのタンパク質に配列同一性を有する配列を含むタンパク質もまた提供する。特定の配列に依存して、配列同一性の程度は好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）。配列同一性は、上記に開示されるように決定される。これらの相同性タンパク質としては、本明細書に記載のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列内にコードされる変異体および対立遺伝子改変体が挙げられる。
本発明はさらに、配列表に記載されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列内にコードされるアミノ酸配列のフラグメントを含むタンパク質を提供する。このフラグメントは、この配列からの少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むべきであり、そしてその特定の配列に依存して、ｎは７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０以上）である。好ましくはこのフラグメントは、その配列に由来するエピトープを含む。
本発明のタンパク質は、もちろん、種々の手段（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）によっておよび種々の形態で（例えば、ネイティブ、融合形態など）調製され得る。これらは、好ましくは実質的に純粋または単離された形態で調製される（すなわち、他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ宿主細胞タンパク質を実質的に含まない）。
本発明のタンパク質のインビボ免疫原性を評価するために種々の試験が用いられ得る。例えば、タンパク質は、組換え的に発現または化学的に合成され得、そしてイムノブロットによって患者の血清をスクリーニングするために使用され得る。タンパク質と患者の血清との間の陽性反応は、この患者が以前に問題のタンパク質に対する免疫応答を引き起こしたことを示す（すなわち、このタンパク質は免疫原である）。この方法はまた、免疫優性タンパク質を同定するために使用され得る。
本発明はまた、本発明のタンパク質をコードする核酸を提供する。
さらなる局面において、本発明はコンピューター、コンピューターメモリー、コンピューター記録媒体（例えば、フロッピーディスク、固定ディスク、ＣＤ−ＲＯＭなど）、および／または本発明による核酸のヌクレオチド配列を含むコンピューターデータベースを提供する。好ましくは、それは、本明細書に記載されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列の１つ以上を含む。
これは、本明細書に記載されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列の分析において用いられ得る。例えば、それは、配列内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはコーディング配列を同定するための検索において用いられ得る。
さらなる局面において、本発明は、アミノ酸配列を同定する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列内の推定オープンリーディングフレームまたはタンパク質コード配列について検索する工程を包含する。同様に、本発明は、推定オープンリーディングフレームまたは推定タンパク質コード配列についての検索における、本明細書中に記載されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列の使用を提供する。
オープンリーディングフレームまたはタンパク質コード配列の分析は、一般に標準的バイオフォマティック技術を用いてコンピューター上で行われる。この分析において用いられる代表的アルゴリズムまたはプログラムとしては、ＯＲＦＦＩＮＤＥＲ（ＮＣＢＩ）、ＧＥＮＭＡＲＫ［ＢｏｒｏｄｏｖｓｋｙおよびＭｃＩｎｉｎｃｈ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ　Ｃｈｅｍ　１７：１２２〜１３３］、およびＧＬＩＭＭＥＲ［Ｓａｌｚｂｅｒｇら（１９９８）Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２６：５４４〜５４８］が挙げられる。
オープンリーディングフレームまたはタンパク質コード配列についての検索は、開始コドンについて本明細書に記載されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列を検索する工程、およびインフレームの終止コドンについて上流配列を検索する工程を含み得る。介在コドンは推定のタンパク質コード配列を示す。代表的に、全ての６つの可能性のある配列のリーディングフレームが検索される。
この方法により同定されるアミノ酸配列は、タンパク質を得るための任意の適切な系を用いて発現され得る。このタンパク質は、同定されたアミノ酸配列内のエピトープを認識する抗体を惹起するために用いられ得る。これらの抗体は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓをスクリーニングするために用いられ、同定されたアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出し得る。
さらに、一旦、ＯＲＦまたはタンパク質コーディング配列が同定されれば、この配列は配列データベースと比較され得る。配列分析ツールは、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）例えば、アルゴリズムＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｐ、ｔＢＬＡＳＴｎ、ＢＬＡＳＴｘ、およびｔＢＬＡＳＴｘ［Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５：２２８９〜３４０２も参照のこと］に見出され得る。比較のための適切なデータベースとしては、非重複性ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＰＤＢ配列、ならびに非重複性ＧｅｎＢａｎｋ　ＣＤＳ翻訳物、ＰＤＢ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＳｐｕｐｄａｔｅおよびＰＩＲ配列が挙げられる。この比較は、タンパク質の機能の指標を示し得る。
アミノ酸配列における疎水性ドメインは、Ｅｓｐｏｓｔｉらの統計学的研究［Ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９０）Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９０：２０７〜２１９］に基づくアルゴリズムのようなアルゴリズムを用いて予測され得る。疎水性ドメインは、潜在的な膜貫通領域または疎水性リーダー配列を示し、これは、このタンパク質が分泌され得るかまたは表面に配置され得ることを示唆する。これらの特性は、代表的に、良好な免疫原を示す。
同様に、膜貫通ドメインまたはリーダー配列は、ＰＳＯＲＴアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ）を用いて予測され得る、そして機能的ドメインは、ＭＯＴＩＦＳプログラム（ＧＣＧ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　＆　ＰＲＯＳＴＩＴＥ）を用いて予測され得る。
本発明はまた、本明細書に記載されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレオチド配列に存在するオープンリーディングフレームまたはタンパク質コード配列を含む核酸を提供する。さらに、本発明は、このオープンリーディングフレームまたはタンパク質コード配列によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
さらなる局面に従って、本発明は、これらのタンパク質に結合する抗体を提供する。これらは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして当業者に公知の任意の適切な手段により産生され得る。
本発明の抗体は、種々の手段、例えば、タンパク質が発現されることの確認のため、またはタンパク質がどこで発現されるかを確認するために用いられ得る。標識された抗体（例えば、ＦＡＣＳのために蛍光標識する）は、インタクトな細菌とともにインキュベートされ得、そして細菌表面の標識の存在は例えば、タンパク質の位置を確認する。
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質、抗体および／または核酸を含む組成物を提供する。これらの組成物は、ワクチンとして、免疫原性組成物として、または診断試薬として適切であり得る。
本発明はまた、医薬として（例えば、ワクチンとして）または診断試薬としての使用のための本発明による核酸、タンパク質または抗体を提供する。これはまた、以下の製造における本発明による核酸、タンパク質または抗体の使用を提供する：（Ｉ）ナイセリア菌による感染を処置または予防するための医薬（ｉｉ）ナイセリア菌の存在、またはナイセリア菌に対して惹起された抗体の存在を検出するための診断試薬。このナイセリア菌は、任意の種または株（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）であってよいが、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、特にＡ株、Ｂ株またはＣ株である。
なお別の局面において、本発明は、タンパク質、核酸分子または抗体を含む組成物を提供する。本発明のより好ましい局面は、タンパク質の免疫原性組成物に関する。本発明のさらに好ましい局面は、タンパク質またはワクチンの薬学的免疫原性組成物、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａｌ菌による感染、好ましくはＭｅｎＢの感染の処置または予防のための医薬の製造におけるそれらの使用を意図する。
本発明はまた、患者を処置する方法を提供する。この方法は、本発明による核酸、タンパク質および／または抗体の治療上有効な量を患者に投与する工程を包含する。
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。
本発明のタンパク質を産生するためのプロセスであって、タンパク質の発現を誘導する条件下において、本発明に従う宿主細胞を培養する工程を包含する、プロセスが提供される。このプロセスは、タンパク質の化学合成および／またはヌクレオチドの（少なくとも１部の）化学合成をさらに含み得る。
本発明のポリヌクレオチドを検出するためのプロセスであって、以下：（ａ）本発明に従う核プローブを、二重鎖を形成するハイブリダイズの条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）上記の二重鎖を検出する工程を包含する、プロセスが提供される。
本発明のタンパク質を検出するためのプロセスであって、（ａ）本発明に従う抗体を、抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）上記の複合体を検出する工程を包含する、プロセスが提供される。
本発明の別の局面は、ナイセリア菌の任意の種または株に、そして好ましくは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの株に、ただしより好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株（特に、Ａ株、Ｂ株またはＣ株）に、より好ましくはＭｅｎＢに特異的な抗原またはポリペプチドもしくはタンパク質に選択的に結合する抗体を検出するためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程を含む：（ａ）本発明に従う抗原またはポリペプチドもしくはタンパク質を、抗体−抗原複合体の形成に適した条件下で生物学的サンプルと接触させる工程；および（ｂ）この複合体を検出する工程。
ここで、本発明を一般的に記載してきたが、同じことが、例示目的で提供され、そして明記しない限り、本発明を限定することを意図されない、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解され得る。
（方法論−標準的な手段および技術の要約）
（概論）
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　ＭｅｎＢヌクレオチド配列、そこにコードされるアミノ酸配列を提供する。これらの開示される配列を用いて、核酸プローブアッセイ、ならびに発現カセットおよび発現ベクターが産生され得る。タンパク質はまた、化学的に合成され得る。発現ベクターは、タンパク質を産生するために宿主細胞内に形質転換され得る。精製された、または単離されたポリペプチドは、ＭｅｎＢタンパク質を検出するための抗体を産生するために使用され得る。また、宿主細胞または抽出物は、アゴニストまたはアンタゴニストを単離するための生物学的アッセイに利用され得る。さらに、これらの配列を用いて、オープンリーディングフレームを同定して、そしてアミノ酸配列を同定するために検索し得る。タンパク質はまた、免疫原性組成物中で、およびワクチン成分として使用され得る。
本発明の実施は、他に示されなければ、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、これらは当該分野の技術の範囲内である。このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　第２版（１９８９）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ編　１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編　１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編　１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編　１９８４）；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編　１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に１５４巻および１５５巻；Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編１９８７，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻−第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編　１９８６）。
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な略語が、本明細書において使用される。
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は参考としてその全体が援用される。
（発現系）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ＭｅｎＢヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス、細菌、および酵母と共に使用される発現系において発現され得る。
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）およびＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置する上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が開始され、そしていずれかの方向において作用し得る割合を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｌｏｎｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ」　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版）。
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広範な宿主範囲を有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ　ＭＬＰ）、および単純疱疹ウイルスプロモーターを含む。さらに、マウスのメタロチオネイン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモーター配列を提供する。発現は、構成性であるかまたは調節される（誘導可能）かのいずれかであり得る。選択されるプロモーターに依存して、多くのプロモーターは、公知の基質を使用して誘導可能であり得る（例えば、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターのグルココルチコイド応答性エレメント（ＧＲＥ）との使用（このプロモーターは、ホルモン応答性形質転換細胞においてグルココルチコイドにより誘導される））。例えば、米国特許第５，７８３，６８１号を参照のこと。
上記に記載されるプロモーターエレメントと組み合わされるエンハンサーエレメント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサーは、同種プロモーターまたは異種プロモーターに連結される場合、転写を１０００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で開始する。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは逆の（ｆｌｉｐｐｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より上流または下流に、もしくはプロモーターから１０００ヌクレオチドを超える距離で位置される場合、活性である（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ，第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらが通常、より広い宿主範囲を有するので、特に有用であり得る。例は、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ　Ｊ．４：７６１）およびラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６７７７）およびヒトサイトメガウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ　４１：５２１）を包含する。さらに、いくつかのエンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３６：１２３７）。
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常にＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーションによりタンパク質から切断され得る。
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示する疎水性アミノ酸から構成される単一のペプチドをコードする。アデノウイルス３分割（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダーは、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分泌を提供するリーダー配列の例である。
通常、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら（１９８５）Ｃｅｌｌ　４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　３’ｅｎｄ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を方向づけ、そのｍＲＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のシグナルが挙げられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）。
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もまた、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳動物細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳動物複製系としては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｍ（１９８１）Ｃｅｌｌ　２３：１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含むプラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数まで複製する。哺乳動物レプリコンのさらなる例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコンは、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳動物細胞内で、ならびにクローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンを維持することが可能である。このような哺乳動物−細菌シャトルベクターの例としては、ｐＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら、（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内でのポリヌクレオチドのカプセル化、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が挙げられる。
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そのような細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ　Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。
（ｉｉ　植物細胞発現系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物体の遺伝子発現系が存在する。例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米国特許第５，６５９，１２２号；および米国特許第５，６０８，１４３号のような特許文献に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０：３８６１−３８６３（１９９１）に記載されている。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文献に加えて、以下の文献においても見出され得る；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌｅｒら，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３：４０７−４１８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ　５５：３５３−３５６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら，Ｇｅｎｅ　１２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモンであるジベレリン酸、およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素による植物遺伝子発現の調節の記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｃｏｌｍ　Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編，１９８４　Ｐｉｔｍａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁に見出され得る。他の代謝調節遺伝子が記載される参考文献；Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ　Ｊ．９：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。
代表的には、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列を、植物内で操作するために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセット中に挿入する。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクター中に挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミド起源またはウイルス起源のものあり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から所望の植物宿主へＤＮＡが移動することを可能にするために必要とされる特徴をベクターに提供する。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広範な宿主範囲の原核生物の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換のために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介転移のためのＴ　ＤＮＡ配列を植物染色体に提供する。異種遺伝子が検出に容易に反応しない場合は、その構築物は好ましくはまた、植物細胞が形質転換されたか否かの決定に適した選択マーカー遺伝子も有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科のメンバーについては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見出される。
植物ゲノムへの異種配列の組込みを可能にするために適した配列もまた、推奨される。これらは、植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能にする相同組換えのためのトランスポゾン配列など、およびＴｉ配列を含み得る。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリンのような抗生物質に対する耐性が挙げられる。当該分野で公知であるように、さらなる機能をコードする他のＤＮＡ配列もまた、そのベクター中に存在し得る。
本発明の核酸分子は、目的のタンパク質の発現のための発現カセット中に含まれ得る。２つ以上の発現カセットも可能であるが、通常は一つのみの発現カセットが存在する。組換え発現カセットは、異種タンパク質のコード配列に加えて、以下のエレメントを含む；プロモーター領域、植物の５’非翻訳配列、開始コドン（構造遺伝子が開始コドンを備えているか否かに依存する）、ならびに転写終結配列および翻訳終結配列。そのカセットの５’末端および３’末端の独特な制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入を可能にする。
異種のコード配列は、本発明に関連する任意のタンパク質についての配列であり得る。目的のタンパクをコードする配列は、適切に、そのタンパク質のプロセッシングおよびトランスロケーションを可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得る任意の配列を欠く。転写開始領域は、大部分は、発芽中に発現およびトランスロケーションされる遺伝子のためであるので、トランスロケーションを提供するシグナルペプチドを使用することにより、それはまた、目的のタンパク質のトランスロケーションを提供し得る。この方法で、目的のタンパク質は、それらが発現される細胞からトランスロケーションされ、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子における分泌は、種子の胚乳へ、アリューロン層または胚盤上皮層を通過する。タンパク質は、そのタンパク質が産生された細胞から分泌される必要はないが、これは組換えタンパク質の単離および精製を容易にする。
所望の遺伝子産物の最終的な発現は、真核生物細胞中であるので、クローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンとして宿主のスプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構によってプロセシングされる配列を含むか否かを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」領域の部位特異的変異誘発は、偽イントロンコード（ｆａｌｓｅ　ｉｎｔｒｏｎ　ｃｏｄｅ）として遺伝的メッセージの一部を欠失することを妨げるように実施され得る（ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ　４１：９５−１０５（１９８５））。
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用いることによって、植物細胞内に直接的に微量注入され得る。Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，２０２：１７９−１８５、１９８５。遺伝物質はまた、ポリエチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６、７２−７４、１９８２）。核酸セグメントの導入の別の方法は、小さいビーズまたは微粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいは表面に核酸を有する小さな微粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７ならびにＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８５：３３０−３３６は、オオムギ胚乳の粒子ボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によりトランスジェニックオオムギを作製することを教示する）。さらに別の導入方法は、他の実体、ミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の易融な脂肪表面体のいずれかとのプロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５８２４，１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含むプラスミドの存在下でエレクトロポレーションされる。高い電界の強さの電気衝撃により、生体膜を可逆的に透過し、プラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレーションされた植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂して、そして植物カルス形成する。
プロトプラストを単離し得、そして培養して完全な再生植物を提供し得る全ての植物は、本発明により形質転換され得、その結果、転移された遺伝子を保持する完全な植物が再生される。実際に、全ての植物は、培養細胞あるいは組織（サトウキビ、テンサイ、ワタ、果実および他の樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに限定されない）から再生され得る。いくつかの適した植物としては、例えば、以下の属からの種が挙げられる；Ｆｒａｇａｒｉａ，Ｌｏｔｕｓ，Ｍｅｄｉｃａｇｏ，Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ，Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ，Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ，Ｖｉｇｎａ，Ｃｉｔｒｕｓ，Ｌｉｎｕｍ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ，Ｍａｎｉｈｏｔ，Ｄａｕｃｕｓ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ，Ｒａｐｈａｎｕｓ，Ｓｉｎａｐｉｓ，Ａｔｒｏｐａ，Ｃａｐｓｉｃｕｍ，Ｄａｔｕｒａ，Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ，Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ，Ｓｏｌａｎｕｍ，Ｐｅｔｕｎｉａ，Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ，Ｍａｊｏｒａｎａ，Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ，Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ，Ｌａｃｔｕｃａ，Ｂｒｏｍｕｓ，Ａｓｐａｒａｇｕｓ，Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ，Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ，Ｎｅｍｅｓｉａ，Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ，Ｐａｎｉｃｕｍ，Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ，Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ，Ｓｅｎｅｃｉｏ，Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ，Ｃｕｃｕｍｉｓ，Ｂｒｏｗａａｌｉａ，Ｇｌｙｃｉｎｅ，Ｌｏｌｉｕｍ，Ｚｅａ，Ｔｒｉｔｉｃｕｍ，Ｓｏｒｇｈｕｍ，およびＤａｔｕｒａ。
再生のための手段は、植物の種によって変化するが、一般に異種遺伝子のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カルス組織が形成され、そしてシュートがカルスから誘導され得、続いて発根され得る。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これらの胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に、種々のアミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特に、コーンおよびアルファルファのような種にとって有利である。シュートおよび根は、通常、同時に発生する。効果的な再生は、培地、遺伝子型、および培養遍歴に依存する。これらの３つの変数が制御されるならば、再生は十分に再現性がありそして反復可能である。
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は分泌されるか、またはこのタンパク質は全植物体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク質が培地内に分泌される場合、これを回収し得る。あるいは、胚および胚を有さない不完全な種子または他の植物組織を機械的に破壊して、細胞と組織と間の任意の分泌タンパク質を放出させ得る。その混合物を緩衝液に懸濁して、可溶性タンパク質を回収し得る。次いで、慣用的なタンパク質の単離方法および精製方法を使用して、組換えタンパク質を精製する。時間、温度、ｐＨ、酸素、および容量のパラメーターを慣用的な方法により調整して、異種タンパク質の発現および回収を最適化する。
（ｉｉｉ　バキュロウイルス系）
タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベクター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、その発現系の構成要素として、以下のものが挙げられる：バキュロウイルスゲノムのフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入のための簡便な制限部位の両方を有する転移ベクター（通常は細菌プラスミド）；転移ベクター内のバキュロウイルス特異的フラグメントに対して配列相同性を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にする）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および増殖培地。
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこでベクターとウイルスゲノムを組換え可能にする。パッケージングされた組換えウイルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５（１９８７）（本明細書中以降、「Ｓｕｍｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入する前に、プロモーター配列、リーダー配列（所望される場合は）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（転移ベクター）に構築する。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結された調節エレメント；作動可能に連結された調節エレメントのセットを各々が所有する複数の遺伝子；あるいは同じ調節エレメントのセットにより調節される複数の遺伝子、を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはクローニングおよび増幅に適切な宿主内で維持され得る。
現在、外来遺伝子をＡｃＮＰＶへ導入するために、最も一般に使用される転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計される。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリヘドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、ＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと）が挙げられる。
そのプラスミドはまた、通常、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、および原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉでの選択および増殖のための複製起点を含む。
バキュロウイルス転移ベクターは、通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼを結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’から３’）方向の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始点を含む。バキュロウイルス転移ベクターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、存在する場合には、通常、構造遺伝子に対して遠位にある。発現は調節的または構成的のいずれかであり得る。
ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、（１９８６）「Ｔｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」：Ｔｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａｌｔｅｒ　Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開第１２７８３９号および同第１５５４７６号；およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら，（１９８８），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌される昆虫タンパク質、あるいはバキュロウイルスポリヘドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅｎｅ，７３：４０９）のようなバキュロウイルスタンパク質の遺伝子に由来し得る。あるいは、哺乳動物細胞の翻訳後修飾（シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、およびリン酸化のような）のシグナルは、昆虫細胞に認識されるようであり、ならびに分泌および核蓄積に必要なシグナルはまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されているようであるため、ヒトインターフェロンα（Ｍａｅｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１５：５９２）；ヒトガストリン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ　５８：２７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子に由来のような、非昆虫起源のリーダーもまた使用して、昆虫での分泌を提供し得る。
組換えポリペプチドまたは組換えポリタンパク質は細胞内に発現され得るか、あるいは適切な調節配列と共に発現される場合には、分泌され得る。非融合の外来タンパク質の優れた細胞内発現には通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要である。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。
あるいは、自然に分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することにより、昆虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞体内への輸送を指向する疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。
タンパク質の発現産物の前駆体をコードするＤＮＡ配列および／または遺伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクションによって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウイルスゲノムの２〜５ｋｂの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入は、相同二重交差組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｄｏｕｂｌｅ　ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリヘドリン遺伝子のような遺伝子内であり得る；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子に設計された制限酵素部位内であり得る。Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ　４；９１。発現ベクター内のポリヘドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合のＤＮＡ配列は、ポリヘドリン特異的配列に５’および３’の両側で隣接され、そしてポリヘドリンプロモーターの下流に位置される。
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバキュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１％〜約５％の間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されるウイルスの大半は、なお野生型ウイルスである。従って、組換えウイルスを同定するための方法が必要である。その発現系の利点は、組換えウイルスを区別させ得る可視的スクリーニングである。ネイティブのウイルスにより産生されるポリヘドリンタンパク質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された細胞の核内で非常に高いレベルで産生される。蓄積されたポリヘドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、それはまた包埋された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組換えウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルスを区別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により昆虫細胞の単層にプラーク形成させた。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で、閉塞体の存在（野生型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）についてスクリーニングする。Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、前出；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開発された：Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６；および一般には、Ｆｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を参照のこと）。
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプチドの直接発現および融合発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、一般に当業者に公知である。例えば、前出のＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈを参照のこと。
次いで、改変した昆虫細胞を、改変した昆虫宿主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする適切な栄養培地で増殖し得る。発現産物の遺伝子が、誘導性の制御下にある場合、宿主は高密度で増殖され得、そして発現は誘導され得る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に連続的に発現され、そして栄養培地を連続的に循環させる一方で、目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養を増大させる必要がある。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのような技術により精製され得る。適切には、必要ならば、その産物をさらに精製して、培地中にも分泌されたか、または昆虫細胞の溶解から生じる任意の昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主細片（例えば、タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を供給する。
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その条件は、当該分野で公知の条件に基づいて、当業者に容易に確かめられる。
（ｉｖ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流方向（３’方向）へのｍＲＮＡへの転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインを有し、これはＲＮＡ合成が始まる近接のＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合し、そのため特定の遺伝子の転写を阻害し得るような、負の調節された（誘導性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列により達成され得、その配列は、存在する場合には通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベータータンパク質の例としては、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）があり、それはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｌａｃオペロンの転写の開始を補助する（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。従って、調節される発現は、正または負のいずれかであり、それによって転写を増強するかまたは低下し得る。
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝の酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰＯ公開番号０３６　７７６および１２１　７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｍｉｓｔａｋｅｓ．」　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８）およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を提供する。
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとして機能する。例えば、ある細菌あるいはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌あるいはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを作製する（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ　２５：１６７；ｄｅ　Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物内でいくつかの遺伝子の高いレベルでの発現をもたらすために、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと結合され得る。バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結したプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ公開番号２６７　８５１）。
機能性のプロモーター配列に加え、効果的なリボソーム結合部位はまた、原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ　ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基対形成によりリボソームへのｍＲＮＡの結合を促進すると考えられている（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｉｇｎａｌｓ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編））。弱いリボソーム結合部位を有する真核生物遺伝子および原核生物遺伝子の発現のためには、ＳＤ配列と真核生物遺伝子のＡＴＧとの間の距離を最適化することが、しばしば必要とされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）。
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤＮＡ分子と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチオニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロのインキュベーションのいずれかによりタンパク質から切断され得る（ＥＰＯ公開番号２１９　２３７）。
融合タンパク質は、直接的発現に対する代替物を提供する。通常、内在性の細菌のタンパク質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種のコード配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺伝子は、外来遺伝子の５’末端と連結され得、そして細菌において発現され得る。生じた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子由来のバクテリオファージタンパク質を切断するためのプロセシング酵素（Ｘａ因子）用の部位を保持する（Ｎａｇａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ　６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（ＥＰＯ公開番号３２４　６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。２つのアミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、あるいはコードしなくてもよい。別の例は、ユビキチン融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切断するためのプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）用の部位を保持するユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、ネイティブの外来タンパク質は単離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７：６９８）。
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る（米国特許第４，３３６，３３６号）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または細胞の内膜と外膜との間に位置するペリプラズム腔（グラム陰性細菌）のいずれかへ分泌される。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシグナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位がある。
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂら、（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質についての遺伝子に由来し得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：５５８２；ＥＰＯ公開番号２４４０４２）。
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、頻繁に、転写の終結を補助するステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列が挙げられる。
通常、上記の構成要素（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物となる。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば細菌）において安定に維持し得る染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに維持される。このレプリコンは複製系を有し、従って、発現またはクローニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主において保持されることを可能にする。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細菌の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡによって構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（欧州特許公開番号１２７　３２８）。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含んで、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主において発現され得、そして細菌が薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリン）に耐性になるようにする遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにおいて組み立てられ得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて維持されるか、または組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー（ｍａｒｋｅｔ）から構成される。
発現ベクターまたは形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれも、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：５５８２；欧州特許公開番号０３６　２５９および欧州特許公開番号０６３　９５３；ＰＣＴ公開番号ＷＯ　８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ　４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；欧州特許公開番号０３６　７７６、欧州特許公開番号１３６　８２９および欧州特許公開番号１３６　９０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許４，７４５，０５６）。
外因性ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、ＣａＣｌ２または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：Ｂａｃｉｌｌｕｓの使用：Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７９：５５８２；欧州特許公開番号０３６　２５９および欧州特許公開番号０６３　９５３；ＰＣＴ公開番号ＷＯ　８４／０４５４１；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの使用：Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉの使用：Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｗｉｔｈ　Ｃｏ１Ｅ１−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｌａｓｍｉｄｓ」Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　９４９：３１８；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの使用：Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの使用：Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　１７０：３８；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの使用：Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの使用：Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ　ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ　Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１：４１２。
（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合可能であり、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍＲＮＡへの下流の（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、もし存在するならば、通常、構造遺伝子とは遠位である。このＵＡＳは、調節される（誘導できる）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節される発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるかまたは減少させるかのいずれかであり得る。
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性生物であり、従って、代謝経路における酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許公開番号２８４　０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許公開番号３２９　２０３）。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：１）。
さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとして機能する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域と連結されるＡＤＨ調節配列（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，８８０，７３４号）を含む。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＧＡＰまたはＰｙＫ（欧州特許公開番号１６４　５５６）のような解糖酵素遺伝子の転写活性化領域に結合された、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなるプロモーターを含む。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する、天然に生じる非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーターの例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「Ｔｈｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」、Ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅｎｅ　１１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２：１０９；）。
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端にある最初のアミノ酸は常にＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである。もし所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーションによって、タンパク質から切断され得る。
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、植物、バキュロウイルス、および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパク質、または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異種コード配列の５’末端に融合される。発現において、この構築物は、２つのアミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され、そして酵母において発現し得る。２つのアミノ酸配列の連結部にあるＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、欧州特許公開番号１９６　０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ましくは保持する、ユビキチン領域を伴って作製される。従って、この方法を通じて、ネイティブな外来タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４０６６）。
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供する、リーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リーダー配列フラグメントは、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを、通常コードする。
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質に関する遺伝子由来であり得、その遺伝子は例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（欧州特許公開番号０１２　８７３；日本国公開公報６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（米国特許４，５８８，６８４）である。あるいは、インターフェロンリーダーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在する（欧州特許公開番号０６０　０５７）。
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用するリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を含む。用いられ得るこの型のα因子フラグメントは、完全長の、プレ−プロα因子リーダー（約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許４，５４６，０８３および４，８７０，００８；欧州特許公開番号３２４　２７４）。分泌を提供するα因子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーは、第１の酵母のプレ配列および第２の酵母α因子からのプロ領域を用いて作製される、ハイブリッドα因子リーダーを含む（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、そして従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの配列は、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る、ｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例えば、解糖酵素をコードする配列である。
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（もし所望ならば）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物になる。発現構築物は、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいてしばしば維持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、このことが、例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のために原核生物宿主において維持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャトルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ　８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：４６４２〜４６４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまたは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより好ましくは少なくとも約２０個を有する。高コピー数ベクターまたは低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存する。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮＡと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するために適切な相同配列を選択することによって、酵母における特定の遺伝子座を指向され得る。Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、おそらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：６７５０）。ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（ベクター全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつベクターにおける発現構築物に隣接する２つのセグメント（発現構築物のみの安定した組み込みを生じ得る）のいずれかとして生じ得る。
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主において発現され得る生合成遺伝子を含み得、それは例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子であり、それぞれ、酵母細胞がツニカマイシンおよびＧ４１８に耐性になるようにする。さらに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）
あるいは、上記成分のうちのいくつかは、組み立てられて形質転換ベクターになり得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マーカーから構成される。
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。例えば、外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する発現ベクターおよび方法は、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ　ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）。Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ　ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
外因性ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そして通常、スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処置された無傷の酵母細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵母の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５；Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ　３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒｏｗｉａ）。
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであるとき、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも約９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量％さえをも含む。
用語「異種」とは、天然では共に見られない２つの生物学的成分をいう。この成分は、宿主細胞、遺伝子、または調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異種成分は天然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその遺伝子に作動可能に連結されるような場合、それらは共に機能し得る。別の例は、ナイセリア配列がマウス宿主細胞に対して異種であることである。
「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始および調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレオチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要であり得る。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律性複製配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。
「変異」配列は、天然の配列または開示された配列とは異なるが相同性を有するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の配列に依存して、天然の配列または開示された配列と変異配列との間の相同性（配列同一性）の程度は、上記のように算出して、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより大きい）。本明細書中で使用される場合、本明細書で核酸配列が提供される核酸分子、または領域の「対立遺伝子改変体」は、別のもしくは２番目の単離体のゲノム中の本質的に同じ遺伝子座で生ずる核酸分子または領域であり、そしてこれは、例えば、変異または組換えにより生ずる天然変化に起因して、類似するが、しかし同一でない核酸配列を有する。コード領域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）での変化を含み得る（例えば、米国特許第５，７５３，２３５号を参照のこと）。
（抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、少なくとも１つの抗体結合部位から構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群をいう。「抗体結合部位」は、内部表面形状および抗原のエピトープの特徴に相補的な電荷分布を有する、３次元結合空間であり、これが、抗体と抗原との結合を可能にする。「抗体」は、例えば、脊椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、変更された抗体、一価抗体、Ｆａｂタンパク質、および単一ドメイン抗体を含む。
本発明のタンパク質に対する抗体は、親和性クロマトグラフィー、免疫アッセイ、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａのＭｅｎＢタンパク質の識別／同定に有用である。本発明のタンパク質に対して惹起された抗体は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　ＭｅｎＢの株に存在および特異的に関連する抗原性のポリペプチドまたはタンパク質またはタンパク質フラグメントに結合する。いくつかの例では、これらの抗原は、特定の株に関連し得る（例えば、ＭｅｎＢ株に特異的な抗原）。本発明の抗体は、マトリックスに固定され得、そして免疫アッセイまたは親和性クロマトグラフィーカラムに利用され得、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメント、あるいはこのようなポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメントを含む細胞の検出および／または分離を可能にする。あるいは、このようなポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメントは、それらに特異的に結合し得る抗体を検出するために固定され得る。
本発明のタンパク質に対する抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）は、従来の方法によって調製され得る。一般に、タンパク質は、最初に、適切な動物、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫するために使用される。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清の容量、および標識された抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の入手可能性に起因して、ポリクローナル血清の調製のために好ましい。免疫は、一般的に、タンパク質を生理食塩水（好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント）に混合または乳化し、そしてその混合物または乳化物を非経口的に（一般的に皮下または筋肉内に）注射することによって行われる。５０〜２００μｇ／注射の用量が、代表的に充分である。免疫は、一般的に、２〜６週後に生理食塩水（好ましくはフロイント不完全アジュバントを使用する）のタンパク質の１回以上の注射でブーストされる。あるいは、当該分野において公知の方法を使用するインビトロ免疫によって抗体を産生し得、これは、本発明の目的にとっては、インビボ免疫に等しいと考えられる。ポリクローナル抗血清は、免疫された動物からガラスまたはプラスチック製容器へ採血し、その血液を２５℃で１時間インキュベートし、その後４℃で２〜１８時間インキュベートすることによって得られる。この血清は、遠心分離（例えば１，０００ｇ、１０分間）によって回収される。ウサギから、採血につき約２０〜５０ｍｌが得られ得る。
モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５〜９６）の標準的方法、またはその改変版を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりも、脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）が取り出され、そして単細胞へ解離される。もし所望ならば、脾臓細胞は、（非特異的付着細胞の除去後）細胞懸濁液をタンパク質抗原でコーティングされたプレートまたはウェルへアプライすることによって、スクリーニングされ得る。この抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、このプレートに結合し、そして残りの懸濁液によって、洗い落とされない。生じるＢ細胞、または全ての解離された脾臓細胞は、次に骨髄腫細胞と融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）において培養される。生じるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ、そして免疫する抗原に対して特異的に結合する（かつ関連しない抗原に結合しない）抗体の産生についてアッセイされる。選択されるＭＡｂ分泌ハイブリドーマは、次にインビトロ（例えば、組織培養瓶または中空繊維リアクター中で）、またはインビボ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培養される。
もし所望ならば、抗体は（ポリクローナルまたはモノクローナルいずれであっても）、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、以下が挙げられる：発蛍光団、発色団、放射性原子（特に３２Ｐおよび１２５Ｉ）、電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンド。酵素は、代表的に、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を青い色素（分光光度計を用いて定量可能）へ変換するその能力によって、検出される。「特異的結合パートナー」とは、高い特異性でリガンド分子に結合し得るタンパク質をいい、例えば抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合である。他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、ならびに当該分野において公知の多くのレセプター−リガンド対を含む。同じ標識がいくつかの異なる様式で働き得るので、以上の記載が、種々の標識を別個のクラスへ分類することを意味しないことは、理解されるべきである。例えば、１２５Ｉは、放射性標識として、または電子密度試薬として働き得る。ＨＲＰは、酵素として、またはＭＡｂについての抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために、種々の標識を組合せ得る。例えば、ＭＡｂおよびアビジンはまた、本発明の実施において、標識を必要とする。従って、ＭＡｂをビオチンで標識して、そして１２５Ｉで標識したアビジン、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンＭＡｂで、その存在を検出し得る。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内の等価物であると考えられる。
本発明の抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメントは、特異的結合パートナー抗体の形成を誘発する。本発明のこれらの抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメントは、本発明の免疫原性組成物を含む。このような免疫原性組成物は、本発明の抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質フラグメントを、促進または増強もしくは安定化するアジュバント、キャリア、または他の組成物をさらに含み得る（ｃｏｍｐｒｉｓｅ　ｏｒ　ｉｎｃｌｕｄｅ）。このようなアジュバントおよびキャリアは、当業者に容易に理解される。
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得る。この薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。
本明細書において使用される用語「治療上有効な量」とは、所望の疾患または状態を処置、改善、または予防するための治療薬剤の量、あるいは、検出可能な治療効果または予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、化学的マーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、発熱している患者に与えた場合の体温低下のような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療または治療の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を特定することは有用ではない。しかし、所定状況のための有効量は、慣用的な実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
本発明の目的のために、有効な用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体において、ＤＮＡ構築物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤のような、治療薬剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導せず、そして、過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のように、大きく、緩徐に代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて利用可能である。
治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義中に含まれる。
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
その組成物の直接送達は、一般的に、皮下的に、腹腔内に、静脈内に、または筋肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用および経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。
（ワクチン）
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染後に疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
このようなワクチンは、免疫する抗原もしくは免疫原、免疫原性ポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質フラグメント、または核酸（例えば、リボ核酸またはデオキシリボ核酸）を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリア自体は、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生を誘発しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤（「アジュバント」）として機能し得る。さらに、この免疫原または抗原は、細菌トキソイド（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原体由来のトキソイド）と結合体化され得る。
この組成物の有効性を増強するために好ましいアジュバントは、（１）アルミニウム塩（「明礬」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油型乳濁液処方物（他の特定の免疫刺激薬剤（例えば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴うか伴わない）を包含するが、それらに限定されず、例えば、以下：（ａ）５％スクアレン、０．５％　Ｔｗｅｅｎ　８０、および０．５％　Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含み、モデル１１０Ｙ微小流体化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のような微小流体化器を用いて１μｍ未満の粒子へと処方されたＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７）；（ｂ）１μｍ未満の乳濁液へと微小流体化されたか、またはボルテックスして、より大きな粒子のサイズの乳濁液を生成したかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％　Ｔｗｅｅｎ　８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％　Ｔｗｅｅｎ　８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ））を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；（６）コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）のような細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素の無毒化変異体（詳細には、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９）；例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと；および（７）その組成物の有効性を強化するための免疫刺激因子として作用する他の物質を包含するがそれらに限定されない。ミョウバンおよびＭＦ５９が好ましい。
上記で言及したように、ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するがそれらに限定されない。
免疫原性組成物（例えば、抗原、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバントを含み得る）を含むワクチン組成物は、代表的に、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が、このようなビヒクルに存在し得る。あるいは、免疫原性組成物を含むワクチン組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に、抗原、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質フラグメント、または核酸を含み得る。
より詳細には、免疫原組成物を含むワクチンは、免疫学的に有効な量の免疫原性ポリペプチド、ならびに、必要な場合、任意の他の上記の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単回用量または一連の一部のいずれかでの個体へのその量の投与が、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、処置される個体の分類上のグループ（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医療状況の処置医の判断、および他の関連因子に依存して変化する。この量は、慣用的な治験を通して決定され得る比較的広範な範囲に入ることが予想される。
代表的に、ワクチン組成物または免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射可能物質として調製され；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するに適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプセル化され得る。
免疫原性組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下または筋肉内のいずれかでの注射による）に投与される。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌおよびｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤とともに投与され得る。
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチン接種を使用し得る（例えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５：６１７−６４８）。
（遺伝子送達ビヒクル）
本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳動物へ送達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所または全身的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチまたは非ウイルスベクターアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利用し得る。このようなコード配列の発現は、内在性哺乳動物プロモーターまたは外来性プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはαウイルスベクターである。このウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般的には、Ｊｏｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：５１−６４；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：８４５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　６：１４８−１５３を参照のこと。
レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、これには、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性ウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０を参照のこと）、多向性レトロウイルス（例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルスに由来し得、そして第二の鎖合成の起源はトリ白血病ウイルスに由来し得る。
これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細胞株へそれらを導入することによって形質導入受容性レトロウイルスベクター粒子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みによって宿主細胞ＤＮＡへの部位特異的組込みのために構築され得る（ＷＯ９６／３７６２６号を参照のこと）。この組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウイルスであることが好ましい。
上記に記載のレトロウイルスベクターを伴う使用について適切なパッケージング細胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３号およびＷＯ９２／０５２６６号を参照のこと）、そしてこれを使用して、組換えベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称される）を作製し得る。好ましくは、このパッケージング細胞株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これは、ヒト血清における不活化を除去する。
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスとしては、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス（Ｍｉｎｋ−Ｃｅｌｌ　Ｆｏｃｕｓ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ｖｉｒｕｓ）、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスが挙げられる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：１９−２５）、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルスおよびＲａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が挙げられる。このようなレトロウイルスは、寄託機関または収集機関（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し得るか、または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターとしては、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９／０９２７１、ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、同４，４０５，７１２号、同４，８６１，７１９号、同４，９８０，２８９号、同４，７７７，１２７号、同５，５９１，６２４号に記載されるものが挙げられる。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｒｅｓ　３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ　Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ　７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ　３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８１；６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１もまた参照のこと。
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして本発明において使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１；ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明において使用可能な例示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターとしては、上記に参照される文書およびＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０９２４１，ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２２およびＷＯ９５／０９６５４において記載されるものが挙げられる。あるいは、Ｃｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載されるような殺傷したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要なおよび好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ　ＷＯ９３／０９２３９に開示されるＡＡＶ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブＤ配列は、ヌクレオチドの置換によって改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドおよび１８までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０のネイティブヌクレオチドから１８までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０のネイティブヌクレオチドが維持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失またはネイティブでないヌクレオチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイティブなＤ配列は、各ＡＡＶ逆方向末端反復において（すなわち、各末端に１つの配列が存在する）２０の連続するヌクレオチドの配列であって、これは、ＨＰ形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイティブなＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。他の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり、これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ　１２４：２５７−２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）である。別の例示的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ　ＩＴＲベクターである。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ　ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７４５号に開示される。なお他のベクターは、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第４，７９７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａの米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈａｒｔｅｊｅｅの米国特許第５，４７４，９３５号ならびにＫｏｔｉｎのＷＯ９４／２８８１５７に開示されるものである。本発明において使用可能なＡＡＶベクターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦＰエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優性に発現を指向する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝子治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、同５，１７３，４１４号、同５，１３９，９４１号、および同５，２５２，４７９号に記載される。
本発明の配列を含む遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要なおよび好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、およびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるもの）である。さらなる例示的な単純ヘルペスウイルスベクターとしては、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔａｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ＬａｃＺ、Ｇｅｌｌｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１６６７−１６６９ならびにＷＯ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：１１−１９に記載されるＨＳＶ　Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ）に記載されるＨＳＶ　７１３４、２ＲＨ　１０５およびＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ　ＶＲ−９７７およびＡＴＣＣ　ＶＲ−２６０として寄託されたものが挙げられる。
本発明において使用され得るαウイルス遺伝子治療ベクターもまた意図される。好ましいαウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターである。トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ　ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４７）、Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇウイルス（ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７０）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ　ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ　ＶＲ−５３２）および米国特許第５，０９１，３０９号、同５，２１７，８７９号、およびＷＯ９２／１０５７８に記載されるもの。より詳細には、米国特許出願第０８／４０５，６２７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９４／２１７９２号、ＷＯ９２／１０５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特許第５，０９１，３０９号、および米国特許第５，２１７，８７９号に記載されるαウイルスベクターが使用可能である。このようなαウイルスは、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷害性を減少させたαウイルスベクターを使用する（米国特許出願番号０８／６７９６４０号を参照のこと）。
ＤＮＡベクター系（例えば、真核生物層状発現系）もまた、本発明の核酸の発現に有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核生物層状発現系はαウイルスベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来する。
本発明における使用に適切な他のウイルスベクターとしては、以下に由来するものが挙げられる：ポリオウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ　３３９（１９８９）３８５およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ　１：１１５に記載されるもの）；リノウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−１１１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｌ４０１に記載されるもの）；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスルウイルスまたはワクシニアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ　ＶＲ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ　ＮＹ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ　８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同４，７６９，３３０号ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるもの）；ＳＶ４０ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ　２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ　７３：１５３３に記載されるもの）；インフルエンザウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａｍｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８７：３８０２−３８０５；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　６５：２７１１−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ　５９：１１０（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ　Ｍｅｄ　３０９：１３ならびにＹａｐ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ　２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝子技術を使用して作製した組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるようなヒト免疫不全ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６７およびＶＲ−１２４７ならびにＥＰ−０４４０２１９に記載されるもの）；アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３６８）；ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４０）；カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２２）；チクングニヤウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４１）；フォートモーガン（Ｆｏｒｔ　Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２４）；ゲタウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４３）；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２７）；マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６６）；ムカン（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４４）；ヌヅム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７１）；ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２５）；トリニティ（Ｔｒｉｎｉｔｙ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−４６９）；ユナ（Ｕｎａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７４）；ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−９２６）；Ｙ−６２−３３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−３７５）；オニョンニョンウイルス、東部脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２４２）；西部脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ　ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ　ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ　ＶＲ−１２５２）；ならびにコロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ　ＶＲ−７４０）およびＨａｍｒｅ（１９６６）Ｐｒｏｃ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ　１２１：１９０に記載のもの。
本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定されない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、殺傷したアデノウイルスに連結したポリカチオン性縮合ＤＮＡかまたは連結してないポリカチオン性縮合ＤＮＡ単独（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核電荷中和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　９１：１５８１−１５８５に記載される。
粒子媒介遺伝子移入が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８６７号を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド（ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ。２６２：４４２９−４４３２に記載されるような）、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　４０：２５３−２６３に記載されるようなインスリン、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ　３：５３３−５３９に記載されるようなガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された合成遺伝子移入分子（例えば、ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン、のような重合ＤＮＡ結合カチオン）とともにインキュベートされ得る。
裸のＤＮＡもまた、宿主細胞を形質転換するために使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率は、生分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。ＤＮＡコートラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にすることによってさらに改良され得る。
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ−５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、重合性ＤＮＡ結合カチオン（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミン）のような合成遺伝子移入分子とともにインキュベートされ得る。他の送達系は、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な非ウイルス送達は、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１（２４）：１１５８１−１１５８５に記載されるアプローチを含む。さらに、コード配列およびそのようなものの発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コード配列の送達について使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法としては、例えば、手動の遺伝子移入粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）が挙げられる。
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第５，４２２，１２０号および同４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　６００：１；Ｂａｙｅｒ（１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　５５０：４６４；Ｒｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　１４９：１１９；Ｗａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　８４：７８５１；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１７６：４２０に記載されるものである。
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量の遺伝子治療ビヒクル（この用語は上記に定義されるとおりである）を含み得る。本発明の目的のために、有効用量は、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接）；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて；または（３）組換えタンパク質の発現のためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。
この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）もしくは経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、静脈内、または筋肉内の注射によって、あるいは組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。この組成物はまた、腫瘍または病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与および肺投与、坐剤、ならびに経皮適用、針、および遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと。
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例としては、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞が挙げられる。
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接の微量注入（これらはすべて当該分野で周知である）で達成され得る。
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用され得る。
（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含するポリペプチドである：アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエチン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの環境スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）。
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
薬学的組成物に包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エストロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドとともに薬学的化合物に含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、このポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥデキストランである。また、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリド）が、薬学的化合物中に含有され得る。
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパッケージングされ得る。
脂質カプセル化は、一般的に核酸もしくはタンパク質に安定に結合し得るか、または核酸を捕捉および維持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロモル脂質）であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリアとしてリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７を参照のこと。
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した）アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。カチオン性リポソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：６０７７−６０８１；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示されている。
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹからの商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｇｎｅｒ前出もまた参照のこと）。他の市販されているリポソームは、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含む。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技法を使用する容易に利用可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：４１９４−４１９８；ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
同様に、アニオン性および中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような物質には、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などが含まれる。これらの物質はまた、適切な比率のＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの出発物質と混合され得る。これらの物質を使用してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
このリポソームは、多重膜のベシクル（ＭＬＶ）、小さな単一膜ベシクル（ＳＵＶ）、または大きな単一膜のベシクル（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　３９２：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（１９７９）Ｃｅｌｌ　１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：１４５；Ｆｒａｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１５：１６６を参照のこと。
（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドとともに含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例は、キロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬを含む。これらのタンパク質の変異体、フラグメント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポタンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へ、ポリヌクレオチドの送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれない。
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。このタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって命名されている。
１つのリポタンパク質は、１を超えるアポタンパク質を含み得る。例えば、天然に存在するキロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥからなり、そして時間が経てばこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲得する。ＶＬＤＬは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはアポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む。
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ　５４：６９９；Ｌａｗ（１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１９８６）Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７７：２４６５；Ｕｔｅｒｍａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ　６５：２３２に記載されている。
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在するリポタンパク質において変化する。例えば、キロミクロンは主としてトリグリセリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造において補助するために選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子との疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離され得る。そのような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：５４５４−５４６０およびＭａｈｅｙ（１９７９）Ｊ　Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ　６４：７４３−７５０に記載される。
リポタンパク質はまた、インビトロまたは所望の宿主細胞中のアポタンパク質遺伝子の発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｃｈｅｍ　１５：４０３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　３０：４４３を参照のこと。
リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのような商業的な供給者から購入され得る。
さらなるリポタンパク質の記載は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＰＣＴ出願番号ＵＳ９７／１４４６５に見い出され得る。
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを有する組成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに含まれ得る。
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするための核酸の電荷を中和し得る。これらの薬剤は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれもを有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのいずれかで核酸を送達するために使用され得る。
以下は、ポリカチオン性薬剤としての有用なポリペプチドの例である：ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。有用なポリペプチドの他の例は、ヒストン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）を含む。転写因子もまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ．ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ配列に結合する塩基性ドメインを含む。
有機ポリカチオン性薬剤は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）を含む。
ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から外挿されて、他のポリペプチドポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤が産生され得る。
（Ｇ．合成ポリカチオン性薬剤）
薬学的組成物において有用な合成ポリカチオン性薬剤は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレンを含む。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複合体を形成するモノマーである。
（免疫診断アッセイ）
本発明のＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ＭｅｎＢ抗原またはその抗原性フラグメントは、抗体レベルを検出するためのイムノアッセイにおいて使用され得る（または、逆に抗Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗体は抗原レベルを検出するために使用され得る）。充分に規定された組換え抗原に基づくイムノアッセイは、侵襲性の診断方法と置き換えるために開発され得る。生物学的サンプル（例えば、血液サンプルまたは血清サンプルを含む）内のＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ＭｅｎＢタンパク質またはそのフラグメントに対する抗体が検出され得る。このイムノアッセイの設計は、多くのバリエーションの対象であり、そして種々のこれらは当該分野で公知である。イムノアッセイのプロトコルは、例えば、競合アッセイ、または直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、または免疫沈降によってなされ得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を含み、その標識は、例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイは公知である；これらの例は、ビオチンおよびアビジンを利用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＡＳＡアッセイ）である。
免疫診断に適切でありそして適切な標識試薬を備えるキットは、適切な容器中に、アッセイの実行に必要とされる残りの試薬および物質（例えば、適切な緩衝液、塩溶液など）ならびに適切なセットのアッセイの説明書と共に本発明の組成物を含む適切な物質を詰めることによって構築される。
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いの会合をいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶液中で遊離している。次いで、２つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに接触して配置される。この結合に影響を与える因子は以下を含む：溶媒のタイプおよび容量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持体への非特異的な付着をブロックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬またはＢＬＯＴＴＯ）；配列の濃度；配列の会合の速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたはポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７〜９．５７頁を参照のこと。
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハイブリッドの計算されたＴｍより約１２０〜２００℃低い温度および塩濃度の組み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされるＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブおよび検出される配列の間の相同性である。研究されるフラグメント全量は、プラスミドまたはファージ消化物については０．１〜１μｇ、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピーについては１０−９〜１０−８ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチドについては、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、および曝露回数、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い非活性のプローブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０８ｃｐｍ／μｇを用いてハイブリダイズして、わずか１時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コピーの哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、一晩ブロットし、そして１０８ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約２４時間露光時間を生じる。
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そのプローブはフラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して直面する変化には、長さ、ハイブリダイズする配列の全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにイオン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量が含まれる。これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃｉ）＋０．４［％（Ｇ＋Ｃ）］−０．６（％ホルムアミド）−６００／ｎ−１．５（％ミスマッチ）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、およびｎは塩基対内のハイブリッドの長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７／２８４からわずかに改変した）。
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブリダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであり、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間のハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように）、ハイブリダイゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、およびバックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩濃度の減少とともに増大する。
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃、９０％〜９５％相同性では３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃である。より低い相同性については、上記の式を用いてホルムアミド含量が低くされ、そして温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメントとの間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ともにストリンジェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始することである。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが並行して試験されるべきである。
（核酸プローブアッセイ）
本発明に従う核酸プローブを利用する、ＰＣＲ、分枝ＤＮＡプローブアッセイ、またはブロッティング技術のような方法は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を決定し得る。プローブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合体を形成し得る場合に、本発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
核酸プローブは、本発明のＮｅｉｓｓｅｒｉａヌクレオチド配列（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む）にハイブリダイズする。多くの異なるヌクレオチド配列がアミノ酸配列をコードするが、ネイティブなＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列は、細胞に存在する実際の配列であるので、好ましい。ｍＲＮＡは、コード配列を表し、従ってプローブはコード配列に相補的であるはずであり、一本鎖ｃＤＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、従ってｃＤＮＡプローブは非コード配列に相補的であるはずである。
プローブ配列はＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列（またはその相補物）に同一である必要はない。核酸プローブが標的ヌクレオチドと検出され得る二重鎖を形成し得る場合、配列および長さのいくつかの変動は、アッセイの感受性の増加をもたらし得る。また、核酸プローブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み得る。さらなるＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標識としての一助となり得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプローブの５’末端に付着され得、ここでそのプローブ配列の残りはＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列に相補的である。あるいは、プローブ配列が、それとハイブリダイズし、そしてそれによって検出され得る二重鎖を形成するためにＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列との十分な相補性を有する場合、非相補的塩基またはより長い配列は、プローブ中に分散され得る。
プローブの正確な長さおよび配列は、ハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、塩条件など）に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列の複雑さに依存して、核酸プローブは、代表的には、少なくとも１０〜２０ヌクレオチド、好ましくは１５〜２５、そしてより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含むが、これよりも短くもあり得る。短いプライマーは、一般的には、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要とする。
プローブは、合成的手順（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法、（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３１８５））、またはＵｒｄｅａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：７４６１）に従って、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、生成され得る。
プローブの化学的性質は、優先度に従って選択され得る。特定の適用については、ＤＮＡまたはＲＮＡが適切である。他の適用については、改変（例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなバックボーンの改変）が組み込まれ得、インビボの半減期を増大させ、ＲＮＡ親和性を変化させ、ヌクレアーゼ耐性などを増大させるために使用され得（例えば、ＡｇｒａｗａｌおよびＩｙｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　６：１２−１９；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ　１４：３７６−３８７を参照のこと）；ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る（例えば、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ　１５：２２４−２２９；Ｂｕｃｈａｒｄｔら（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ　１１：３８４−３８６を参照のこと）。
ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの１つの実施態様は、国際特許出願ＷＯ９２／０２５２６（米国特許第５，１２４，２４６号をもまた参照のこと）においてＵｒｄｅａらにより記載される。
あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的核酸を検出する別の周知の手段である。そのアッセイは、Ｍｕｌｌｉｓら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５−３５０）；米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。２つの「プライマー」ヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズし、そして反応を開始するために使用される。このプライマーは、増殖標的（またはその相補物）の配列にハイブリダイズしない、二重鎖の安定性を補助するための、または、例えば、都合よい制限部位を組み込むための配列を含み得る。代表的には、このような配列は、所望のＮｅｉｓｓｅｒｉａ配列に隣接する。
熱安定性ポリメラーゼは、もともとの標的核酸を鋳型として使用して、プライマーから標的核酸のコピーを作製する。標的核酸の閾値量がポリメラーゼによって産生された後、それらはより従来的な方法（例えば、サザンブロット）によって検出され得る。サザンブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ配列（またはその相補物）にハイブリダイズする。
また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される、従来的なブロッティング技術によって検出され得る。ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡからポリメラーゼ酵素を使用して生成されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離され得る。次いで、ゲル上のこの核酸は、ニトロセルロースのような固体支持体にブロットされる。この固体支持体は、標識されたプローブに曝露され、次いですべてのハイブリダイズしていないプローブを洗浄して除去する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。代表的には、そのプローブは、放射活性部分で標識される。
（実施例）
本発明は、ＡｐｐｅｎｄｉｘＣ，配列番号１〜９６１に列挙されるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのゲノム由来の９６１ヌクレオチド配列に基づいており、これは、実質的にＢ型血清型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの完全ゲノムならびにＡｐｐｅｎｄｉｘＤ，配列番号１０６８示される全長ゲノム配列をともに表す。
上記のように、この配列情報が本発明に従ってどのように利用され得るかは、当業者に自ずと明らかである。
本発明を実施するため（例えば、ワクチン接種または診断的目的のために有用なポリペプチドを推定するために開示された配列を利用するため）に使用され得る標準的な技術および手順は、上記に要約された。この要旨は、本発明ついての限定ではなく、むしろ使用され得る（しかし要求はされない）実施例を与える。
これらの配列は、ＡｐｐｅｎｄｉｘＣ，配列番号１〜９６１において示されるコンティグおよびＡｐｐｅｎｄｉｘＤ，配列番号１０６８において示される全長ゲノム配列に由来し、これを、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｂ株）のゲノムの配列決定の間に調製した。全長配列を、Ｇ．Ｓ．Ｓｕｔｔｏｎら、ＴＩＧＲ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ　Ｌａｒｇｅ　Ｓｈｏｔｇｕｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：９−１９（１９９５）［また、Ｒ．Ｄ．Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９，４９６−５１２（１９９５）；Ｃ．Ｍ．Ｆｒａｓｅｒ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０，３９７−４０３（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｂｕｌｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３，１０５８−７３（１９９６）；Ｃ．Ｍ．Ｆｒａｓｅｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　３９０，５８０−５８６（１９９７）；Ｊ．−Ｆ．Ｔｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ　３８８，５３９−５４７（１９９７）；Ｈ．Ｐ．Ｋｌｅｎｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３９０，３６４−７０（１９９７）；Ｃ．Ｍ．Ｆｒａｓｅｒ，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８１，３７５−８８（１９９８）；Ｍ．Ｊ．Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２，１１２６−１１３２（１９９８）；Ｋ．Ｅ．Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３９９，３２３−９（１９９９）も参照のこと］に記載されるようなＴＩＧＲ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒを使用して構築した。次いで、上記の方法を使用して、この配列の推定翻訳産物を決定した。翻訳産物のコンピューター分析を、データベース比較に基づいて決定した。対応する遺伝子およびタンパク質配列（それらが存在する場合）を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ａ株）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定した。次いで、それらの抗原性および免疫原性を評価するために、このタンパク質を発現させ、精製し、そして特徴付けた。
詳細には、以下の方法を使用し、本発明のタンパク質を発現させ、精製し、そして生化学的に特徴づけた。
（染色体ＤＮＡ調製）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を、１００ｍｌのＧＣ培地中で指数増殖期まで増殖させ、遠心分離によって収集し、そして５ｍｌ緩衝液（２０％スクロース、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８に調整）に再懸濁した。氷上で１０分間インキュベーションした後、その細菌を１０ｍｌ溶解溶液（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　Ｎａ−サルコシル、５０μｇ／ｍｌ　プロテイナーゼＫ）の添加によって溶菌し、そしてその懸濁液を３７℃で２時間インキュベートした。２回のフェノール抽出（ｐＨ８に平衡化）および１回のクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行った。ＤＮＡを、０．３Ｍ　酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノールの添加によって沈殿させ、そして遠心分離によって収集した。ペレットを、７０％エタノールで１回洗浄し、そして４ｍｌ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に再溶解した。ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍにおけるＯＤを読みとることによって測定した。
（オリゴヌクレオチド設計）
合成オリゴヌクレオチドプライマーを、（ａ）利用可能な場合にはｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓＢ配列、または（ｂ）ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ／ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓＡ配列を使用して、ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓの好ましいコドン使用頻度に適合させて、各々のＯＲＦのコード配列に基づいて設計した。予測されるリーダー配列の直後の下流の５’末端増幅プライマー配列を推定することによって、任意の予測されるシグナルペプチドを除外した。
大部分のＯＲＦについて、５’プライマーは２つの制限酵素部位を含んだ（その遺伝子自体の制限パターンに依存して、ＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ、またはＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ）；３’プライマーは、ＸｈｏＩ制限部位を含んだ。この手順を、各々の増幅産物（各々のＯＲＦに一致する）のクローニングを２つの異なる発現系：ｐＧＥＸ−ＫＧ（ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩまたはＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩのいずれかを使用する）、およびｐＥＴ２１ｂ＋（ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩまたはＮｈｅＩ−ＸｈｏＩのいずれかを使用する）に指向させるために確立した。
５’末端プライマーテイル：ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧ　　　（ＢａｍＨＩ−ＮｄｅＩ）
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣ　　　（ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ）
ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣ　（ＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩ）
３’末端プライマーテイル：　　　ＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧ　　　　　（ＸｈｏＩ）。
いくつかのＯＲＦについては、２つの異なる増幅を、各々のＯＲＦを２つの発現系でクローニングされるように行った。２つの異なる５’プライマーを、各々のＯＲＦについて使用した；同じ３’ＸｈｏＩプライマーを以前のように使用した：
５’末端プライマーテイル：ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧ
（ＮｄｅＩ）
５’末端プライマーテイル：ＣＧＧＧＡＴＣＣ
（ＢａｍＨＩ）。
他のＯＲＦをｐＴＲＣ発現ベクターにクローニングし、そしてアミノ末端Ｈｉｓ−タグ融合物として発現させた。予想されたシグナルペプチドを最終産物に含ませ得る。ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ制限部位を、プライマーを使用して組み込んだ：
５’末端プライマーテイル：ＧＡＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＴＧ
（ＮｈｅＩ）
３’末端プライマーテイル：ＣＧＧＧＡＴＣＣ
（ＢａｍＨＩ）。
制限酵素認識配列を含むのと同様に、プライマーは、増幅される配列にハイブリダイズするヌクレオチドを含んだ。ハイブリダイズするヌクレオチドの数は、プライマー全体の融解温度に依存し、そして各々のプライマーについて以下の式を使用して決定した：
Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）
（テイルを除外）
Ｔｍ＝６４．９＋０．４１（％ＧＣ）−６００／Ｎ
（プライマー全体）。
選択したオリゴの融解温度の平均は、オリゴ全体について６５〜７０℃であり、そしてハイブリダイズ領域単独では５０〜５５℃であった。
Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機によってオリゴを合成し、２ｍｌのＮＨ４ＯＨ中でカラムから溶出し、５６℃での５時間のインキュベートにより脱保護した。このオリゴを０．３Ｍ　酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノールの添加によって沈殿させた。次に、このサンプル遠心分離し、そしてそのペレットを１００μｌまたは１ｍｌの水のいずれかに再懸濁した。ＯＤ２６０を、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｌａｍｂｄａ　Ｂｉｏ分光光度計を使用して決定し、濃度を決定し、そして２〜１０ｐｍｏｌ／μｌに調整した。
表１は、各増幅のために使用される順方向および逆方向のプライマーを示す。特定の場合において、プライマー配列は、ＯＲＦの配列に正確にはマッチしないことが注目される。対応する配列が、ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓにおいて同定されているかもしれない、初期の増幅が行われた時、完全な５’および／または３’配列は、いくつかのｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃｕｓ　ＯＲＦについて公知ではないかもしれない。従って、増幅について、ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ配列を、プライマー設計についての基礎として使用し得、コドンの優先性を考慮して変化され得る。特に、以下のコドンを変化させ得る：ＡＴＡ→ＡＴＴ；ＴＣＧ→ＴＣＴ；ＣＡＧ→ＣＡＡ；ＡＡＧ→ＡＡＡ；ＧＡＧ→ＧＡＡ；ＣＧＡおよびＣＧＧ→ＣＧＣ；ＧＧＧ→ＧＧＣ。
（増幅）
標準ＰＣＲプロトコールは、以下のとおりであった：５０〜２００ｎｇのゲノムＤＮＡを、２０〜４０μＭの各オリゴ、４００〜８００μＭのｄＮＴＰｓ溶液、１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む）、２．５単位のＴａｑＩ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＡｍｐｌｉＴａＱ、ＧＩＢＣＯ　Ｐｌａｔｉｎｕｍ、Ｐｗｏ　ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｋａｒａ　Ｓｈｕｚｏ　Ｔａｑポリメラーゼを使用する）の存在下でテンプレートとして使用した。
いくつかの場合において、ＰＣＲを１０μｌのＤＭＳＯまたは５０μｌの２Ｍベタインの添加によって最適化した。
ホットスタート（全混合物を９５℃で予め３分間インキュベーションしている間にポリメラーゼを添加する）の後に、各サンプルに二工程増幅を行った：最初の５サイクルを、制限酵素のテールを除く１つのオリゴのハイブリダイゼーション温度を使用して行い、次にオリゴ全長のハイブリダイゼーション温度に従って３０サイクルを行った。このサイクルの次に、７２℃で最後の１０分間の伸長工程をした。
標準サイクルは、以下のとおりであった：
変性　　　ハイブリダイゼーション　　　伸長
最初の５サイクル　　　３０秒　　　　　　３０秒　　　　　　３０〜６０秒
９５℃　　　　　５０〜５５℃　　　　　７２℃
最後の３０サイクル　　３０秒　　　　　　３０秒　　　　　　３０〜６０秒
９５℃　　　　　６５〜７０℃　　　　　７２℃。
伸長時間は、増幅されるＯＲＦの長さに従って変化する。
増幅を９６００または２４００　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲシステムのいずれかを使用して行った。結果を確認するために、増幅容量の１／１０を１〜１．５％アガロースゲルにロードし、そして各増幅フラグメントのサイズをＤＮＡ分子量マーカーと比較した。
増幅したＤＮＡを、１％アガロースゲルに直接ロードしたか、またはまずエタノール沈殿をして、適切な容量中に再懸濁し、１％アガロースゲルにロードした。次に、正確なサイズのバンドに対応するＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用し、製造業者の指示に従い、ゲルから溶出して精製した。ＤＮＡフラグメントの最終容量は、水または１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５のいずれかの、３０μｌまたは５０μｌであった。
（ＰＣＲフラグメントの消化）
増幅フラグメントに対応する精製ＤＮＡを２つのアリコートに分け、そして以下を用いて２重に消化した：
ｐＥＴ−２１ｂ＋へのクローニングおよびＣ末端Ｈｉｓ−タグ融合物としてのタンパク質のさらなる発現のためのＮｄｅＩ／ＸｈｏＩまたはＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ　ｐＧＥＸ−ＫＧへのクローニングおよびＮ末端ＧＳＴ融合物としてのタンパク質のさらなる発現のためのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩまたはＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ　ＯＲＦ７６について、ｐＴＲＣ−ＨｉｓＡベクターへのクローニングおよびＮ末端Ｈｉｓ−タグ融合物としてのタンパク質のさらなる発現のためのＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ。
各精製ＤＮＡフラグメントを、各制限酵素（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）２０単位を用い、３０または４０μｌのいずれかの最終容量中で、適切な緩衝液の存在下で、インキュベート（３７℃で３時間〜オーバーナイト）した。次に、消化産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キットを使用して、製造業者の指示に従って、精製し、そして、水または１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）のいずれかの３０または５０ｕｌの最終容量中で溶出した。最終ＤＮＡ濃度を、適定した分子量マーカーの存在下での１％アガロースゲル電気泳動によって決定した。
（クローニングベクター（ｐＥＴ２２Ｂ、ｐＧＥＸ−ＫＧ、ｐＴＲＣ−ＨｉｓＡ）の消化）
１０μｇのプラスミドを、適切な緩衝液の存在下で、２００μｌの反応容量中で、５０単位の各制限酵素を用いて、３７℃でオーバーナイトのインキュベーションで２重に消化した。消化物全体を１％アガロースゲルにロードした後に、消化したベクターに対応するバンドを、Ｑｉａｇｅｎ　ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを使用してゲルから精製し、そのＤＮＡを５０μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中に溶出した。ＤＮＡ濃度をサンプルのＯＤ２６０を測定することにより推定し、そして５０μｇ／μｌに調整した。１μｌのプラスミドを、各クローニング手順に使用した。
（クローニング）
予め消化して、そして精製した各ＯＲＦに対応するフラグメントを、ｐＥＴ２２ｂおよびｐＧＥＸ−ＫＧの両方に連結した。最終容量２０μｌ中で、モル比３：１のフラグメント／ベクターを、０．５μｌのＮＥＢ　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（４００単位／μｌ）を使用して、製造業者から供給された緩衝液の存在下で連結した。この反応物を、室温で３時間インキュベートした。いくつかの実験において、連結を、Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒの「Ｒａｐｉｄ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」を使用して、製造業者の指示に従って行った。
適切な株に組換えプラスミドを導入するために、１００μｌのＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５コンピテント細胞を、リガーゼ反応溶液とともに、４０分間氷上でインキュベートし、次に、３７℃で３分間インキュベートし、次に、８００μｌのＬＢブロスを添加した後、再度３７℃で２０分間インキュベートした。次に細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの微量遠心機において最大速度で遠心分離し、そして約２００ｕｌの上清に再懸濁した。次に、その懸濁物をＬＢアンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）上にプレーティングした。
組換えクローンのスクリーニングを、無作為に選択した５つのコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた２ｍｌ（ｐＧＥＸまたはｐＴＣクローン）または５ｍｌ（ｐＥＴクローン）のＬＢブロスのいずれかにおいて３７℃で一晩増殖させることにより行った。次に、細胞をペレットにして、そしてＱｉａｇｅｎ　ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔを使用して、製造業者の指示に従って、ＤＮＡを最終容量３０μｌに抽出した。各々個々のミニプレップ（約１ｇ）の５μｌを、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩまたはＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩのいずれかを用いて消化し、そして全消化物を、１〜１．５％アガロースゲル（予想されるインサートサイズに依存する）に、分子量マーカー（１Ｋｂ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、ＧＩＢＣＯ）と並行してロードした。陽性クローンのスクリーニングを、正確なインサートサイズに基づいて行った。
（クローニング）
特定のＯＲＦを、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩクローニング部位、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ、またはＳａｌＩ−ＰｓｔＩを用いてｐＧＥＸ−ＨＩＳベクター中にクローニングし得る。クローニングの後、組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主Ｗ３１１０に導入し得る。
（発現）
次いで、発現ベクター中にクローニングされた各ＯＲＦを、組換えタンパク質産物の発現に適切な株中に形質転換し得る。各構築物の１μｌを使用して、３０μｌのＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ｐＧＥＸベクター）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０（ｐＴＲＣベクター）またはＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１−ＤＥ３（ｐＥＴベクター）を、上記のように形質転換した。ｐＧＥＸ−Ｈｉｓベクターの場合、同一のＥ．ｃｏｌｉ株（Ｗ３１１０）を初期のクローニングおよび発現のために使用した。単一の組換えコロニーを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を加えた２ｍｌのＬＢに接種し、３７℃で一晩でインキュベートし、次に、１００ｍｌのフラスコ中でＡｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を加えた２０ｍｌのＬＢ中に１：３０で希釈し、ＯＤ６００の範囲が０．１と０．１５との間であることを確実にした。このフラスコを、ＯＤが発現の誘導に適切な指数増殖を示すまで（ｐＥＴおよびｐＴＲＣベクターについて、０．４〜０．８　ＯＤ；ｐＧＥＸおよびｐＧＥＸ−Ｈｉｓベクターについて０．８〜１　ＯＤ）、回転型水浴振とう機中で３０℃でインキュベートした。ｐＥＴ、ｐＴＲＣおよびｐＧＥＸ−Ｈｉｓベクターについて、タンパク質の発現を１ｍＭ　ＩＰＴＧの添加によって誘導し、一方、ｐＧＥＸ系の場合、ＩＰＴＧの最終濃度は、０．２ｍＭであった。３０℃での３時間のインキュベーションの後、サンプルの最終濃度を、ＯＤによって確認した。発現を確認するために、１ｍｌの各サンプルを取り出し、微量遠心機で遠心分離し、ペレットをＰＢＳ中で再懸濁し、そしてクマシーブルー染色を用いる１２％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。サンプル全体を６０００ｇで遠心分離し、そしてペレットをさらなる使用のためにＰＢＳ中に再懸濁した。
（ＧＳＴ融合タンパク質の大規模精製）
単一のコロニーを、Ａｍｐを加えたＬＢ寒天プレート上で３７℃で一晩で増殖させた。細菌を、水浴振とう機において、アンピシリンを加えた２０ｍｌのＬＢ液体培養物に接種し、そして一晩増殖させた。細菌を、６００ｍｌの新鮮な培地中に１：３０に希釈し、最適な温度（２０〜３７℃）でＯＤ５５０が０．８〜１になるまで増殖させた。タンパク質の発現を０．２ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導し、続いて、３時間インキュベートした。培養物を８０００ｒｐｍで４℃で遠心分離した。上清を捨て、そして細菌のペレットを７．５ｍｌの冷ＰＢＳ中に再懸濁した。この細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ　ｓｏｎｉｆｉｅｒ　Ｂ−１５を使用して、氷上で、３０秒間、４０Ｗで超音波処理することにより破砕し、そして２回凍結融解し、そして再度遠心分離した。この上清を回収し、１５０μｌのグルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（前もってＰＢＳで洗浄）と混合し、そして室温で３０分間インキュベートした。このサンプルを７００ｇで５分間４℃で遠心分離した。この樹脂を１０ｍｌの冷ＰＢＳを用いて、１０分間、２回洗浄し、１ｍｌの冷ＰＢＳに再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を素通り画分が０．０２〜０．０６のＯＤ２８０に到達するまで２ｍｌの冷ＰＢＳで２回洗浄した。ＧＳＴ融合タンパク質を、７００μｌの冷グルタチオン溶出緩衝液（１０ｍＭ　還元型グルタチオン、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）の添加によって溶出し、そして画分をＯＤ２８０が０．１になるまで回収した。各画分の２１μｌを、Ｂｉｏｒａｄ　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｂｒｏａｄ　ｒａｎｇｅ（Ｍ１）（２００、１１６．２５、９７．４、６６．２、４５、３１、２１．５、１４．４、６．５ｋＤａ）またはＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｒａｉｎｂｏｗ　Ｍａｒｋｅｒ（Ｍ”）（２２０、６６、４６、３０、２１．５、１４．３ｋＤａ）のいずれかを標準物として使用して、１２％　ＳＤＳゲル上にロードした。ＧＳＴの分子量が２６ｋＤａであるので、この値を各ＧＳＴ融合タンパク質の分子量に加えなければならない。
（Ｈｉｓ融合可溶性タンパク質の大規模精製）
単一のコロニーをＬＢ＋Ａｍｐアガープレート上で３７℃で一晩増殖させた。細菌を、２０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ液体培養物中に接種し、そして水浴振とう機において、一晩インキュベートした。細菌を、６００ｍｌの新鮮な培地中に１：３０に希釈し、そして最適な温度（２０〜３７℃）でＯＤ５５０が０．６〜０．８になるまで増殖させた。タンパク質の発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導し、そして、培養物をさらに３時間インキュベートした。培養物を８０００ｒｐｍで４℃で遠心分離した。上清を捨て、そして細菌のペレットを７．５ｍｌの冷１０ｍＭイミダゾール緩衝液（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　リン酸緩衝液、１０ｍＭ　イミダゾール、ｐＨ８）中に再懸濁した。この細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ　ｓｏｎｉｆｉｅｒ　Ｂ−１５を使用し、氷上で、３０秒間、４０Ｗで超音波処理によって破砕し、そして２回凍結融解して、そして再度遠心分離した。上清を収集し、そして１５０μｌのＮｉ２＋樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（１０ｍＭイミダゾール緩衝液で予め洗浄する）と混合し、そして３０分間、穏やかな撹拌をしながら、室温でインキュベートした。このサンプルを７００ｇで５分間４℃で遠心分離した。この樹脂を１０ｍｌの冷１０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いて１０分間、２回洗浄し、１ｍｌの冷１０ｍＭイミダゾール緩衝液に再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、２ｍｌの冷１０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いて４℃で、素通り画分が０．０２〜０．０６のＯ．Ｄ２８０に達するまで洗浄した。この樹脂を、２ｍｌの冷２０ｍＭイミダゾール緩衝液（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　リン酸緩衝液、２０ｍＭ　イミダゾール、ｐＨ８）で素通り画分が０．０２〜０．０６のＯ．Ｄ２８０に達するまで洗浄した。このＨｉｓ融合タンパク質を、７００μｌの冷２５０ｍＭイミダゾール緩衝液（３００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　リン酸緩衝液、２５０ｍＭ　イミダゾール、ｐＨ８）の添加によって溶出し、そしてＯ．Ｄ２８０が０．１になるまで、画分を収集した。２１μｌの各画分を、１２％ＳＤＳゲルにロードした。
（Ｈｉｓ融合不溶性タンパク質の大規模精製）
単一のコロニーをＬＢ＋Ａｍｐアガープレート上で３７℃で一晩で増殖させた。細菌を、水浴振とう機において、２０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ液体培養物中に接種し、そして一晩増殖させた。細菌を、６００ｍｌの新鮮な培地中に１：３０に希釈し、そして最適な温度（３７℃）でＯ．Ｄ５５０が０．６〜０．８になるまで増殖させた。タンパク質の発現を１ｍＭ　ＩＰＴＧの添加によって誘導し、そして、培養物をさらに３時間インキュベートした。培養物を８０００ｒｐｍで４℃で遠心分離した。上清を捨て、そして細菌のペレットを７．５ｍｌの緩衝液Ｂ（尿素８Ｍ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ８．８）中に再懸濁した。この細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ　ｓｏｎｉｆｉｅｒ　Ｂ−１５を使用し、氷上で、３０秒間、４０Ｗでの超音波処理により破砕し、そして２回凍結融解して、そして再度遠心分離した。上清を−２０℃に保存し、一方、ペレットを２ｍｌのグアニジン緩衝液（６Ｍ　塩酸グアニジン、１００ｍＭ　リン酸緩衝液、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、そしてホモジナイザー中で１０サイクル処理した。この産物を１３０００ｒｐｍで４０分間遠心分離した。上清を１５０μｌのＮｉ２＋−樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（緩衝液Ｂで予め洗浄する）と混合し、そして３０分間穏やかな撹拌をしながら、室温でインキュベートした。このサンプルを７００ｇで５分間４℃で遠心分離した。この樹脂を１０ｍｌの緩衝液Ｂを用いて１０分間、２回洗浄し、１ｍｌの緩衝液Ｂ中に再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、２ｍｌの緩衝液Ｂを用いて室温で、素通り画分が０．０２〜０．０６のＯＤ２８０に達するまで洗浄した。この樹脂を、２ｍｌの緩衝液Ｃ（尿素８Ｍ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ６．３）で、素通り画分が０．０２〜０．０６のＯ．Ｄ２８０に達するまで洗浄した。このＨｉｓ融合タンパク質を、７００μｌの溶出緩衝液（尿素８Ｍ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ４．５）の添加によって溶出し、そしてＯＤ２８０が０．１になるまで、画分を回収した。２１μｌの各画分を、１２％ＳＤＳゲルにロードした。
（Ｈｉｓ融合タンパク質の再生）
１０％グリセロールを、変性タンパク質に添加した。次にこのタンパク質を透析緩衝液Ｉ（１０％グリセロール、０．５Ｍ　アルギニン、５０ｍＭ　リン酸緩衝液、５ｍＭ　還元型グルタチオン、０．５ｍＭ　酸化型グルタチオン、２Ｍ　尿素、ｐＨ８．８）を使用して２０μｇ／ｍｌになるまで希釈し、そして同じ緩衝液に対して、４℃で１２〜１４時間透析した。このタンパク質をさらに透析緩衝液ＩＩ（１０％グリセロール、０．５Ｍ　アルギニン、５０ｍＭ　リン酸緩衝液、５ｍＭ　還元型グルタチオン、０．５ｍＭ　酸化型グルタチオン、ｐＨ８．８）に対して４℃で１２〜１４時間透析した。
タンパク質濃度を、以下の式を用いて評価した：
タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）＝（１．５５×ＯＤ２８０）−（０．７６×ＯＤ２６０）
（マウスの免疫化）
２０μｇの各精製タンパク質を使用して、マウスの腹腔内に免疫した。いくつかのＯＲＦの場合、Ｂａｌｂ−Ｃマウスを、Ａｌ（ＯＨ）３をアジュバントとして用いて、１、２１および４２日目に免疫し、そして５６日目に採取したサンプルにおける免疫応答をモニターした。他のＯＲＦについては、ＣＤ１マウスを、同じプロトコルを用いて免疫し得た。他のＯＲＦについては、ＣＤ１マウスを、フロイントアジュバントを用いて免疫し、そして免疫応答を５６日目ではなく４２日目に測定したことを除いて、同じ免疫プロトコルを使用した。同様に、なお他のＯＲＦについては、ＣＤ１マウスをフロイントアジュバントを用いて免疫したが、免疫応答を４９日目に測定した。
（ＥＬＩＳＡアッセイ（血清分析））
無莢膜のＭｅｎＢ　Ｍ７株を、チョコレートアガープレート上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。細菌のコロニーをアガープレートから滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを使用して収集し、そして０．２５％グルコースを含有する７ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ）中に接種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ６２０を追跡することによりモニターした。細菌をＯＤが０．３〜０．４の値に達するまで増殖させた。培養物を１０分間１００００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、そして細菌をＰＢＳで１回洗浄し、０．０２５％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中に再懸濁し、そして室温で２時間インキュベートし、次いで４℃で一晩で攪拌しながらインキュベートした。１００μｌの細菌細胞を、９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒプレートの各ウェルに添加し、そして４℃で一晩でインキュベートした。次いでそのウェルをＰＢＴ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて３回洗浄した。２００μｌの飽和緩衝液（水中の２．７％のポリビニルピロリドン　１０）を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＴで３回洗浄した。２００μｌの希釈血清（希釈緩衝液：ＰＢＳ中に１％　ＢＳＡ、０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％　ＮａＮ３）を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＴで３回洗浄した。希釈緩衝液中に１：２０００に希釈した１００μｌのＨＲＰ−結合体化ウサギ抗マウス（Ｄａｋｏ）血清を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＴ緩衝液で３回洗浄した。ＨＲＰに対する１００μｌの基質緩衝液（２５ｍｌのクエン酸緩衝液、ｐＨ５、１０ｍｇのＯ−フェニルジアミンおよび１０μｌのＨ２Ｏ２）を各ウェルに添加し、そしてこのプレートを室温で２０分間放置した。１００μｌのＨ２ＳＯ４を各ウェルに添加し、そしてＯＤ４９０を追跡した。ＯＤ４９０がそれぞれの免疫前血清の２．５倍である場合、ＥＬＩＳＡが陽性であるとみなした。
（ＦＡＣＳｃａｎ細菌結合アッセイ手順）
無莢膜ＭｅｎＢ　Ｍ７株をチョコレートアガープレートにプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。細菌のコロニーをアガープレートから滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを使用して回収し、そして各々０．２５％グルコースを含有する８ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ｄｉｆｃｏ）を含む４本のチューブに中に接種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ６２０を追跡することによりモニターした。細菌を、ＯＤが０．３５〜０．５の値に達するまで増殖させた。培養物を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を捨て、ペレットをブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中１％　ＢＳＡ、０．４％　ＮａＮ３）中に再懸濁し、そして５分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞をＯＤ６２０が０．０７に達するようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。１００μｌの細菌細胞を、Ｃｏｓｔｅｒ９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。１００μｌの希釈（１：２００）血清（ブロッキング緩衝液中）を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを４℃で２時間インキュベートした。細胞を５分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清を吸引し、そして各ウェルに２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加することにより、細胞を洗浄した。１００μｌのＲ−フィコエリトリン結合体化Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マウス（１：１００希釈）を各ウェルに添加し、そしてプレートを１時間４℃でインキュベートした。細胞を、４０００ｒｐｍ５分間の遠心分離によって遠心沈殿し、そして２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加することにより、洗浄した。その上清を吸引し、そして細胞を２００μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．２５％のホルムアルデヒドに再懸濁した。そのサンプルをＦＡＣＳｃａｎチューブに移して、そして読み取った。ＦＡＣＳｃａｎ設定の条件は、以下のとおりである：ＦＬ１オン、ＦＬ２およびＦＬ３オフ、ＦＳＣ−Ｈ閾値：９２；ＦＳＣ　ＰＭＴ電圧：Ｅ　０２；ＳＳＣ　ＰＭＴ：４７４；増幅利得　７．１：ＦＬ−２　ＰＭＴ：５３９；補償値：０。
（ＯＭＶ調製）
細菌を５ＧＣプレート上で一晩増殖させ、ループを用いて収集し、そして１０ｍｌの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に再懸濁した。５６℃、３０分の熱不活化を行い、そして細菌を１０分間氷上で超音波処理することにより破壊した（５０％　衝撃係数、５０％　出力）。未破壊細胞を５０００ｇ、１０分間の遠心分離によって除去し、そして全細胞エンベロープ画分を５００００ｇ、４℃、７５分間の遠心分離によって回収した。細胞質膜タンパク質を粗外膜から抽出するために、全画分を２％サルコシル（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁し、そして室温で２０分間インキュベートした。この懸濁液を、１００００ｇで１０分間遠心し、凝集物を除去し、そしてこの上清をさらに５００００ｇで７５分間、超遠心分離して、外膜をペレット化した。この外膜を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に再懸濁し、そしてそのタンパク質濃度をＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイによって、ＢＳＡを標準物として用いて測定した。
（全抽出物の調製）
細菌をＧＣプレート上で一晩増殖させ、ループを用いて収集し、そして１ｍｌの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁した。５６℃、３０分の熱不活化を行った。
（ウェスタンブロッティング）
ＭｅｎＢ株２９９６由来の精製タンパク質（５００ｎｇ／レーン）、外膜小胞（５μｇ）および全細胞抽出物（２５μｇ）を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードし、そしてニトロセルロース膜上に転写した。この転写を、２時間、１５０ｍＡ、４℃で転写緩衝液（０．３％　Ｔｒｉｓベース、１．４４％　グリシン、２０％メタノール）中で行った。この膜を飽和緩衝液（ＰＢＳ中の１０％　スキムミルク、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００）中での４℃の一晩のインキュベートにより飽和させた。この膜を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の３％　スキムミルク、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００）を用いて２回洗浄し、そして洗浄緩衝液中に１：２００に希釈したマウス血清とともに、２時間３７℃でインキュベートした。この膜を２回洗浄し、そして１：２０００希釈の西洋わさびペルオキシダーゼ標識化抗マウスＩｇとともに９０分間インキュベートした。この膜をＰＢＳ中の０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００を用いて２回洗浄し、そしてＯｐｔｉ−４ＣＮ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、発色させた。この反応を水を添加して停止した。
（殺菌性アッセイ）
ＭＣ５８株をチョコレートアガープレート上で、３７℃で一晩増殖させた。５〜７のコロニーを回収し、そして７ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロスに接種するために使用した。この懸濁液を、旋回装置上で３７℃でインキュベートし、そしてＯＤ６２０が０．５〜０．８の間になるまで増殖させた。この培養物を滅菌１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分取し、そして微量遠心機中で最大速度で２０分間遠心分離した。このペレットをＧｅｙ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中で１回洗浄し、そして同一の緩衝液中でＯＤ６２０が０．５になるように再懸濁し、Ｇｅｙ緩衝液中に１：２００００に希釈し、そして２５℃で保存した。
５０μｌのＧｅｙ緩衝液／１％　ＢＳＡを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加した。２５μｌの希釈（１：１００）マウス血清（希釈緩衝液：Ｇｅｙ緩衝液／０．２％　ＢＳＡ）を各ウェルに添加し、そしてそのプレートを４℃でインキュベートした。上記記載の細菌懸濁液の２５μｌを各ウェルに添加した。熱非働化（５６℃水浴中に３０分）または正常乳仔ウサギ補体のいずれかの２５μｌを各ウェルに添加した。乳仔ウサギ補体の添加の直後に、１ウェルあたり２２μｌの各サンプルをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレート上にプレートした（時間０）。この９６ウェルプレートを、１時間３７℃で回転しながらインキュベートし、次に、１ウェルあたり２２μｌの各サンプルをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレート上にプレートした（時間１）。一晩のインキュベートの後、時間０および時間１に対応するコロニーを計数した。
以下のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、以下の形式のタイトルによって同定される：［ｇ、ｍ、またはａ］［＃］．［ｓｅｑまたはｐｅｐ］。ここで「ｇ」は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列を意味し、「ｍ」は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｂ由来の配列を意味し、そして「ａ」は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ａ由来の配列を意味する；「＃」は、配列番号を意味する；「ｓｅｑ」はＤＮＡ配列を意味し、そして「ｐｅｐ」はアミノ酸配列を意味する。例えば、「ｇ００１．ｓｅｑ」は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｏｈｏｅａｅ　ＤＮＡ配列、番号１をいう。これらの配列への添字「−１」または「−２」の存在は、同じＯＲＦについて見出されたさらなる配列を示す。さらに、オープンリーディングフレームは、ＯＲＦ＃として同定され、ここで「＃」はＯＲＦの番号を意味し、これはＯＲＦをコードする配列の番号に対応し、そしてＯＲＦの指定は「．ｎｇ」または「．ａ」の添字を付けられ得、このことは、そのＯＲＦがそれぞれ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ配列またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ａ配列に対応することを意味する。コンピューター分析が、「ｇ」、「ｍ」、および「ａ」ペプチド配列の間を理解する比較のために行われた；そしてその中で添字「ｐｅｐ」は、はっきりと言及されていない場合は暗示される。
（実施例１）
以下のＯＲＦが、本明細書中に記載される方法を使用して、コンティグ配列および／または全長配列から推定された。
ＯＲＦの所在
ＯＲＦ：　コンティグ：
２７９　ｇｎｍ４．ｓｅｑ
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９６２）：
【化１】
2004511201.tif 000003
これは、アミノ酸配列（配列番号９６３；ＯＲＦ２７９）に対応する：
【化２】
2004511201.tif 000004
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号９６４）：
【化３】
2004511201.tif 000005
これは、アミノ酸配列（配列番号９６５；ＯＲＦ２７９．ｎｇ）に対応する：
【化４】
2004511201.tif 000006
ＯＲＦ２７９は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の推定ＯＲＦ（ＯＲＦ２７９．ｎｇ）との１５２アミノ酸重複にわたって８９．５％の同一性を示す：
【化５】
2004511201.tif 000007
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９６６）：
【化６】
2004511201.tif 000008
これは、アミノ酸配列（配列番号９６７；ＯＲＦ２７９．ａ）に対応する：
【化７】
2004511201.tif 000009
ｍ２７９／ａ２７９　ＯＲＦ２７９および２７９．ａは、１５２アミノ酸重複にわたって８８．２％の同一性を示す：
【化８】
2004511201.tif 000010
５１９および５１９−１　ｇｎｍ７．ｓｅｑ
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９６８）：
【化９】
2004511201.tif 000011
これは、アミノ酸配列（配列番号９６９；ＯＲＦ５１９）に対応する：
【化１０】
2004511201.tif 000012
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号９７０）：
【化１１】
2004511201.tif 000013
これは、アミノ酸配列（配列番号９７１；ＯＲＦ５１９．ｎｇ）に対応する：
【化１２】
2004511201.tif 000014
ＯＲＦ５１９は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の推定ＯＲＦ（ＯＲＦ５１９．ｎｇ）との２００アミノ酸重複にわたって８７．５％の同一性を示す：
【化１３】
2004511201.tif 000015
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９７２）：
【化１４】
2004511201.tif 000016
これは、アミノ酸配列（配列番号９７３；ＯＲＦ５１９．ａ）に対応する：
【化１５】
2004511201.tif 000017
さらなる研究は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された以下のＤＮＡ配列を明らかにした（配列番号９７４）：
【化１６】
2004511201.tif 000018
これは、アミノ酸配列（配列番号９７５；ＯＲＦ５１９−１）に対応する：
【化１７】
2004511201.tif 000019
以下のＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された（配列番号９７６）：
【化１８】
2004511201.tif 000020
これは、アミノ酸配列（配列番号９７７；ＯＲＦ５１９−１．ｎｇ）に対応する：
【化１９】
2004511201.tif 000021
以下のＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９７８）：
【化２０】
2004511201.tif 000022
これは、アミノ酸配列（配列番号９７９；ＯＲＦ５１９−１．ａ）に対応する：
【化２１】
2004511201.tif 000023
５７６および５７６−１　ｇｎｍ２２．ｓｅｑ
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９８０）：
【化２２】
2004511201.tif 000024
これは、アミノ酸配列（配列番号９８１；ＯＲＦ５７６）に対応する：
【化２３】
2004511201.tif 000025
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号９８２）：
【化２４】
2004511201.tif 000026
これは、アミノ酸配列（配列番号９８３；ＯＲＦ５７６．ｎｇ）に対応する：
【化２５】
2004511201.tif 000027
このアミノ酸配列のコンピューター分析は、以下の結果を与えた：
（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の推定ＯＲＦとの相同性）
【化２６】
2004511201.tif 000028
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９８４）：
【化２７】
2004511201.tif 000029
これは、アミノ酸配列（配列番号９８５；ＯＲＦ５７６．ａ）に対応する：
【化２８】
2004511201.tif 000030
さらなる研究は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された以下のＤＮＡ配列を明らかにした（配列番号９８６）：
【化２９】
2004511201.tif 000031
これは、アミノ酸配列（配列番号９８７；ＯＲＦ５７６−１）に対応する：
【化３０】
2004511201.tif 000032
以下のＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された（配列番号９８８）：
【化３１】
2004511201.tif 000033
これは、アミノ酸配列（配列番号９８９；ＯＲＦ５７６−１．ｎｇ）に対応する：
【化３２】
2004511201.tif 000034
以下のＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９９０）：
【化３３】
2004511201.tif 000035
これは、アミノ酸配列（配列番号９９１；ＯＲＦ５７６−１．ａ）に対応する：
【化３４】
2004511201.tif 000036
９１９および９１９−２　ｇｎｍ４３．ｓｅｑ
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９９２）：
【化３５】
2004511201.tif 000037
これは、アミノ酸配列（配列番号９９３；ＯＲＦ９１９）に対応する：
【化３６】
2004511201.tif 000038
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９９４）：
【化３７】
2004511201.tif 000039
これは、アミノ酸配列（配列番号９９５；ＯＲＦ９１９−２）に対応する：
【化３８】
2004511201.tif 000040
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号９９６）：
【化３９】
2004511201.tif 000041
これは、アミノ酸配列（配列番号９９７；ＯＲＦ９１９．ｎｇ）に対応する：
【化４０】
2004511201.tif 000042
ＯＲＦ９１９は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の推定ＯＲＦ（ＯＲＦ９１９．ｎｇ）との４４１アミノ酸重複にわたって９５．５％の同一性を示す：
【化４１】
2004511201.tif 000043
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号９９８）：
【化４２】
2004511201.tif 000044
これは、アミノ酸配列（配列番号９９９；ＯＲＦ９１９．ａ）に対応する：
【化４３】
2004511201.tif 000045
ｍ９１９／ａ９１９　ＯＲＦ９１９および９１９．ａは、４４１アミノ酸重複にわたって９８．６％の同一性を示す：
【化４４】
2004511201.tif 000046
１２１および１２１−１
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０００）：
【化４５】
2004511201.tif 000047
これは、アミノ酸配列（配列番号１００１；ＯＲＦ１２１）に対応する：
【化４６】
2004511201.tif 000048
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号１００２）：
【化４７】
2004511201.tif 000049
これは、アミノ酸配列（配列番号１００３；ＯＲＦ１２１．ｎｇ）に対応する：
【化４８】
2004511201.tif 000050
ＯＲＦ１２１は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の推定ＯＲＦ（ＯＲＦ１２１．ｎｇ）との３６６アミノ酸重複にわたって７３．５％の同一性を示す：
【化４９】
2004511201.tif 000051
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１００４）：
【化５０】
2004511201.tif 000052
これは、アミノ酸配列（配列番号１００５；ＯＲＦ１２１．ａ）に対応する：
【化５１】
2004511201.tif 000053
さらなる研究は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定されたＤＮＡ配列を明らかにした（配列番号１００６）：
【化５２】
2004511201.tif 000054
これは、アミノ酸配列（配列番号１００７；ＯＲＦ１２１−１）に対応する：
【化５３】
2004511201.tif 000055
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１００８）：
【化５４】
2004511201.tif 000056
これは、アミノ酸配列（配列番号１００９；ＯＲＦ１２１−１．ａ）に対応する：
【化５５】
2004511201.tif 000057
１２８および１２８−１
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０１０）：
【化５６】
2004511201.tif 000058
これは、アミノ酸配列（配列番号１０１１；ＯＲＦ１２８）に対応する：
【化５７】
2004511201.tif 000059
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号１０１２）：
【化５８】
2004511201.tif 000060
これは、アミノ酸配列（配列番号１０１３；ＯＲＦ１２８．ｎｇ）に対応する：
【化５９】
2004511201.tif 000061
ＯＲＦ１２８は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の推定ＯＲＦ（ＯＲＦ１２８．ｎｇ）との４７５アミノ酸重複にわたって９１．７％の同一性を示す：
【化６０】
2004511201.tif 000062
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０１４）：
【化６１】
2004511201.tif 000063
これは、アミノ酸配列（配列番号１０１５；ＯＲＦ１２８．ａ）に対応する：
【化６２】
2004511201.tif 000064
ｍ１２８／ａ１２８　ＯＲＦ１２８および１２８．ａは、６７７アミノ酸重複にわたって６６．０％の同一性を示した：
【化６３】
2004511201.tif 000065
さらなる研究は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定されたＤＮＡ配列を明らかにした（配列番号１０１６）：
【化６４】
2004511201.tif 000066
これは、アミノ酸配列（配列番号１０１７；ＯＲＦ１２８−１）に対応する：
【化６５】
2004511201.tif 000067
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号１０１８）：
【化６６】
2004511201.tif 000068
これは、アミノ酸配列（配列番号１０１９；ＯＲＦ１２８−１．ｎｇ）に対応する：
【化６７】
2004511201.tif 000069
以下のＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０２０）：
【化６８】
2004511201.tif 000070
これは、アミノ酸配列（配列番号１０２１；ＯＲＦ１２８−１．ａ）に対応する：
【化６９】
2004511201.tif 000071
ｍ１２８−１／ａ１２８−１　ＯＲＦ１２８−１および１２８−１．ａは、６７７アミノ酸重複にわたって９７．８％の同一性を示す：
【化７０】
2004511201.tif 000072
２０６
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０２２）：
【化７１】
2004511201.tif 000073
これは、アミノ酸配列（配列番号１０２３；ＯＲＦ２０６）に対応する：
【化７２】
2004511201.tif 000074
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号１０２４）：
【化７３】
2004511201.tif 000075
これは、アミノ酸配列（配列番号１０２５；ＯＲＦ２０６．ｎｇ）に対応する：
【化７４】
2004511201.tif 000076
ＯＲＦ２０６は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の推定ＯＲＦ（ＯＲＦ２０６．ｎｇ）との１７７アミノ酸重複にわたって９６．０％の同一性を示す：
【化７５】
2004511201.tif 000077
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０２６）：
【化７６】
2004511201.tif 000078
これは、アミノ酸配列（配列番号１０２７；ＯＲＦ２０６．ａ）に対応する：
【化７７】
2004511201.tif 000079
ｍ２０６／ａ２０６　ＯＲＦ２０６および２０６．ａは、１７７アミノ酸重複にわたって９９．４％の同一性を示す：
【化７８】
2004511201.tif 000080
２８７
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０２８）：
【化７９】
2004511201.tif 000081
これは、アミノ酸配列（配列番号１０２９；ＯＲＦ２８７）に対応する：
【化８０】
2004511201.tif 000082
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号１０３０）：
【化８１】
2004511201.tif 000083
これは、アミノ酸配列（配列番号１０３１；ＯＲＦ２８７．ｎｇ）に対応する：
【化８２】
2004511201.tif 000084
ｍ２８７／ｇ２８７　ＯＲＦ２８７および２８７．ｎｇは、４９９アミノ酸重複にわたって７０．１％の同一性を示す：
【化８３】
2004511201.tif 000085
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０３２）：
【化８４】
2004511201.tif 000086
これは、アミノ酸配列（配列番号１０３３；ＯＲＦ２８７．ａ）に対応する：
【化８５】
2004511201.tif 000087
４０６
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０３４）：
【化８６】
2004511201.tif 000088
これは、アミノ酸配列（配列番号１０３５；ＯＲＦ４０６）に対応する：
【化８７】
2004511201.tif 000089
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいて同定された
（配列番号１０３６）：
【化８８】
2004511201.tif 000090
これは、アミノ酸配列（配列番号１０３７；ＯＲＦ４０６．ｎｇ）に対応する：
【化８９】
2004511201.tif 000091
ＯＲＦ４０６．ｎｇは、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の推定ＯＲＦ（ＯＲＦ４０６．ａ）との３２０アミノ酸重複にわたって９８．８％の同一性を示す：
【化９０】
2004511201.tif 000092
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０３８）：
【化９１】
2004511201.tif 000093
これは、アミノ酸配列（配列番号１０３９；ＯＲＦ４０６．ａ）に対応する：
【化９２】
2004511201.tif 000094
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０４０）：
【化９３】
2004511201.tif 000095
これは、アミノ酸配列（配列番号１０４１；ＯＲＦ７２６）に対応する：
【化９４】
2004511201.tif 000096
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０４２）：
【化９５】
2004511201.tif 000097
これは、アミノ酸配列（配列番号１０４３；ＯＲＦ９０７−２）に対応する：
【化９６】
2004511201.tif 000098
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０４４）：
【化９７】
2004511201.tif 000099
これは、アミノ酸配列（配列番号１０４５；ＯＲＦ９５３）に対応する：
【化９８】
2004511201.tif 000100
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０４６）：
【化９９】
2004511201.tif 000101
これは、アミノ酸配列（配列番号１０４７；ＯＲＦ　ｏｒｆ−１）に対応する：
【化１００】
2004511201.tif 000102
以下の部分ＤＮＡ配列は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて同定された（配列番号１０４８）：
【化１０１】
2004511201.tif 000103
これは、アミノ酸配列（配列番号１０４９；ＯＲＦ　ｏｒｆ４６−２）に対応する：
【化１０２】
2004511201.tif 000104
上記の手順を使用して、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを、以下に示されるようなＯＲＦをクローニングするために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて使用した：
ＰＣＲに使用されるオリゴヌクレオチド
【表１】
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（実施例２）
（ＯＲＦ９１９の発現）
ＯＲＦ９１９について表１に記載されるプライマーを使用して、ＯＲＦ９１９を位置付けおよびクローニングした。推定遺伝子９１９をｐＥＴベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。タンパク質発現の産物および精製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＡ）において、９１９−Ｈｉｓ融合タンパク質精製の分析を示す。マウスを、精製９１９−Ｈｉｓで免疫し、そして血清を、ウェスタンブロット（パネルＢ）、ＦＡＣＳ分析（パネルＣ）、細菌性アッセイ（パネルＤ）、およびＥＬＩＳＡアッセイ（パネルＥ）のために使用した。記号：Ｍ１、分子量マーカー；ＰＰ、精製タンパク質、ＴＰ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ総タンパク質抽出物；ＯＭＶ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞調製物。矢印は、主要な組換えタンパク質産物（Ａ）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫反応性バンド（Ｂ）の位置を示す。これらの実験は、９１９が表面露出タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを確認する。親水性プロット、抗原性指標、およびＯＲＦ９１９の両親媒性領域を、図１０において提供する。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープを予測する（Ｇａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９６、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら、１９９２、Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｕｐｐｌ　１１：９）。ＯＲＦ９１９の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、実施例１に提供する。
（実施例３）
（ＯＲＦ２７９の発現）
ＯＲＦ２７９について表１に記載されるプライマーを使用して、ＯＲＦ２７９を位置付けおよびクローニングした。推定遺伝子２７９をｐＧｅｘベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。タンパク質発現の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＡ）において、２７９−ＧＳＴ精製の分析を示す。マウスを、精製２７９−ＧＳＴで免疫し、そして血清を、ウェスタンブロット分析（パネルＢ）、ＦＡＣＳ分析（パネルＣ）、細菌性アッセイ（パネルＤ）、およびＥＬＩＳＡアッセイ（パネルＥ）のために使用した。記号：Ｍ１、分子量マーカー；ＴＰ，Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ総タンパク質抽出物；ＯＭＶ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞調製物。矢印は、主要な組換えタンパク質産物（Ａ）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫反応性バンド（Ｂ）の位置を示す。これらの実験は、２７９が表面露出タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを確認する。親水性プロット、抗原性指標、およびＯＲＦ２７９の両親媒性領域を、図１１において提供する。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープを予測する（Ｇａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９６、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら、１９９２、Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｕｐｐｌ　１１：９）。ＯＲＦ２７９の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、実施例１に提供する。
（実施例４）
（ＯＲＦ５７６の発現）
ＯＲＦ５７６について表１に記載されるプライマーを使用して、ＯＲＦ５７６を位置付けおよびクローニングした。推定遺伝子５７６をｐＧｅｘベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。タンパク質精製の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＡ）において、５７６−ＧＳＴ融合タンパク質精製の分析を示す。マウスを、精製５７６−ＧＳＴで免疫し、そして血清を、ウェスタンブロット（パネルＢ）、ＦＡＣＳ分析（パネルＣ）、細菌性アッセイ（パネルＤ）、およびＥＬＩＳＡアッセイ（パネルＥ）のために使用した。記号：Ｍ１、分子量マーカー；ＴＰ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ総タンパク質抽出物；ＯＭＶ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞調製物。矢印は、主要な組換えタンパク質産物（Ａ）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫反応性バンド（Ｂ）の位置を示す。これらの実験は、ＯＲＦ５７６が表面露出タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを確認する。親水性プロット、抗原性指標、およびＯＲＦ５７６の両親媒性領域を、図１２において提供する。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープを予測する（Ｇａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９６、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら、１９９２、Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｕｐｐｌ　１１：９）。ＯＲＦ５７６の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、実施例１に提供する。
（実施例５）
（ＯＲＦ５１９の発現）
ＯＲＦ５１９について表１に記載されるプライマーを使用して、ＯＲＦ５１９を位置付けおよびクローニングした。推定遺伝子５１９をｐＥＴベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。タンパク質精製の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＡ）において、５１９−Ｈｉｓ融合タンパク質精製の分析を示す。マウスを、精製５１９−Ｈｉｓで免疫し、そして血清を、ウェスタンブロット（パネルＢ）、ＦＡＣＳ分析（パネルＣ）、細菌性アッセイ（パネルＤ）、およびＥＬＩＳＡアッセイ（パネルＥ）のために使用した。記号：Ｍ１、分子量マーカー；ＴＰ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ総タンパク質抽出物；ＯＭＶ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞調製物。矢印は、主要な組換えタンパク質産物（Ａ）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫反応性バンド（Ｂ）の位置を示す。これらの実験は、５１９が表面露出タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを確認する。親水性プロット、抗原性指標、およびＯＲＦ５１９の両親媒性領域を、図１３において提供する。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープを予測する（Ｇａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９６、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら、１９９２、Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｕｐｐｌ　１１：９）。ＯＲＦ５１９の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、実施例１に提供する。
（実施例６）
（ＯＲＦ１２１の発現）
ＯＲＦ１２１について表１に記載されるプライマーを使用して、ＯＲＦ１２１を位置付けおよびクローニングした。推定遺伝子１２１をｐＥＴベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。タンパク質精製の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＡ）において、１２１−Ｈｉｓ融合タンパク質精製の分析を示す。マウスを、精製１２１−Ｈｉｓで免疫し、そして血清を、ウェスタンブロット分析（パネルＢ）、ＦＡＣＳ分析（パネルＣ）、細菌性アッセイ（パネルＤ）、およびＥＬＩＳＡアッセイ（パネルＥ）のために使用した。結果は、１２１が表面露出タンパク質であることを示す。記号：Ｍ１、分子量マーカー；ＴＰ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ総タンパク質抽出物；ＯＭＶ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞調製物。矢印は、主要な組換えタンパク質産物（Ａ）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫反応性バンド（Ｂ）の位置を示す。これらの実験は、１２１が表面露出タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを確認する。親水性プロット、抗原性指標、およびＯＲＦ１２１の両親媒性領域を、図１４において提供する。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープを予測する（Ｇａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９６、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら、１９９２、Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｕｐｐｌ　１１：９）。ＯＲＦ１２１の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、実施例１に提供する。
（実施例７）
（ＯＲＦ１２８の発現）
ＯＲＦ１２８について表１に記載されるプライマーを使用して、ＯＲＦ１２８を位置付けおよびクローニングした。推定遺伝子１２８をｐＥＴベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。タンパク質精製の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＡ）において、１２８−Ｈｉｓ精製の分析を示す。マウスを、精製１２８−Ｈｉｓで免疫し、そして血清を、ウェスタンブロット分析（パネルＢ）、ＦＡＣＳ分析（パネルＣ）、細菌性アッセイ（パネルＤ）、およびＥＬＩＳＡアッセイ（パネルＥ）のために使用した。結果は、１２８が表面露出タンパク質であることを示す。記号：Ｍ１、分子量マーカー；ＴＰ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ総タンパク質抽出物；ＯＭＶ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞調製物。矢印は、主要な組換えタンパク質産物（Ａ）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫反応性バンド（Ｂ）の位置を示す。これらの実験は、１２８が表面露出タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを確認する。親水性プロット、抗原性指標、およびＯＲＦ１２８の両親媒性領域を、図１５において提供する。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープを予測する（Ｇａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９６、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら、１９９２、Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｕｐｐｌ　１１：９）。ＯＲＦ１２８の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、実施例１に提供する。
（実施例８）
（ＯＲＦ２０６の発現）
ＯＲＦ２０６について表１に記載されるプライマーを使用して、ＯＲＦ２０６を位置付けおよびクローニングした。推定遺伝子２０６をｐＥＴベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。タンパク質精製の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＡ）において、２０６−Ｈｉｓ精製の分析を示す。マウスを、精製２０６−Ｈｉｓで免疫し、そして血清を、ウェスタンブロット分析（パネルＢ）のために使用した。髄膜炎菌由来のタンパク質抽出物中の免疫反応性バンドは、１７ｋＤａの代わりに３８ｋＤａであることは注目に値する（パネルＡ）。この抗体染色の性質上の情報を得るために、本発明者らは、Ｈｉｓタグを含有せず、そして推定リーダーペプチドを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＯＲＦ２０６を発現した。２０６タンパク質のこのネイティブ形態を発現するＥ．ｃｏｌｉ由来の総タンパク質抽出物上でのウェスタンブロット分析は、髄膜炎菌において観察されるように、３８ｋＤａの位置で反応バンドを示した。本発明者らは、パネルＢ）における３８ｋＤａのバンドが、特異的であること、および抗２０６抗体が多量体タンパク質複合体を認識するようであることを結論付ける。パネルＣにおいてＦＡＣＳ分析を示し、パネルＤにおいて細菌性アッセイを示し、そしてパネルＥにおいてＥＬＩＳＡアッセイを示す。結果は、２０６が表面露出タンパク質であることを示す。記号：Ｍ１、分子量マーカー；ＴＰ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ総タンパク質抽出物；ＯＭＶ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞調製物。矢印は、主要な組換えタンパク質産物（Ａ）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫反応性バンド（Ｂ）の位置を示す。これらの実験は、２０６が表面露出タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを確認する。親水性プロット、抗原性指標、およびＯＲＦ５１９の両親媒性領域を、図１６において提供する。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープを予測する（Ｇａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９６、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら、１９９２、Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｕｐｐｌ　１１：９）。ＯＲＦ２０６の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、実施例１に提供する。
（実施例９）
（ＯＲＦ２８７の発現）
ＯＲＦ２８７について表１に記載されるプライマーを使用して、ＯＲＦ２８７を位置付けおよびクローニングした。推定遺伝子２８７をｐＧｅｘベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。タンパク質発現の産物および精製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＡ）において、２８７−ＧＳＴ融合タンパク質精製の分析を示す。マウスを、精製２８７−ＧＳＴで免疫し、そして血清を、ＦＡＣＳ分析（パネルＢ）、細菌性アッセイ（パネルＣ）、およびＥＬＩＳＡアッセイ（パネルＤ）のために使用した。結果は、２８７が表面露出タンパク質であることを示す。記号：Ｍ１、分子量マーカー。矢印は、主要な組換えタンパク質産物（Ａ）の位置を示す。これらの実験は、２８７が表面露出タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを確認する。親水性プロット、抗原性指標、およびＯＲＦ２８７の両親媒性領域を、図１７において提供する。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープを予測する（Ｇａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９６、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら、１９９２、Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｕｐｐｌ　１１：９）。ＯＲＦ２８７の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、実施例１に提供する。
（実施例１０）
（ＯＲＦ４０６の発現）
ＯＲＦ４０６について表１に記載されるプライマーを使用して、ＯＲＦ４０６を位置付けおよびクローニングした。推定遺伝子４０６をｐＥＴベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。タンパク質精製の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。パネルＡ）において、４０６−Ｈｉｓ融合タンパク質精製の分析を示す。マウスを、精製４０６−Ｈｉｓで免疫し、そして血清を、ウェスタンブロット分析（パネルＢ）、ＦＡＣＳ分析（パネルＣ）、細菌性アッセイ（パネルＤ）、およびＥＬＩＳＡアッセイ（パネルＥ）のために使用した。結果は、４０６が表面露出タンパク質であることを示す。記号：Ｍ１、分子量マーカー；ＴＰ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ総タンパク質抽出物；ＯＭＶ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜小胞調製物。矢印は、主要な組換えタンパク質産物（Ａ）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ免疫反応性バンド（Ｂ）の位置を示す。これらの実験は、４０６が表面露出タンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを確認する。親水性プロット、抗原性指標、およびＯＲＦ４０６の両親媒性領域を、図１８において提供する。ＡＭＰＨＩプログラムを使用して、推定Ｔ細胞エピトープを予測する（Ｇａｏら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３００７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９６、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１２：５９３；Ｑｕａｋｙｉら、１９９２、Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｓｕｐｐｌ　１１：９）。ＯＲＦ４０６の核酸配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列を、実施例１に提供する。
前述の実施例は、本発明を限定せずに例示されることが意図される。
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ９１９のタンパク質産物の発現および精製を図示する。
【図２】
図２は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ２７９のタンパク質産物の発現および精製を図示する。
【図３】
図３は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ５７６−１のタンパク質産物の発現および精製を図示する。
【図４】
図４は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ５１９−１のタンパク質産物の発現および精製を図示する。
【図５】
図５は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ１２１−１のタンパク質産物の発現および精製を図示する。
【図６】
図６は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ１２８−１のタンパク質産物の発現および精製を図示する。
【図７】
図７は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ２０６のタンパク質産物の発現および精製を図示する。
【図８】
図８は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ２８７のタンパク質産物の発現および精製を図示する。
【図９】
図９は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ４０６のタンパク質産物の発現および精製を図示する。
【図１０】
図１０は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ９１９のタンパク質産物の、親水性プロット、抗原性指数およびＡＭＰＨＩ領域を図示する。
【図１１】
図１１は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ２７９のタンパク質産物の、親水性プロット、抗原性指数およびＡＭＰＨＩ領域を図示する。
【図１２】
図１２は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ５７６−１のタンパク質産物の、親水性プロット、抗原性指数およびＡＭＰＨＩ領域を図示する。
【図１３】
図１３は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ５１９−１のタンパク質産物の、親水性プロット、抗原性指数およびＡＭＰＨＩ領域を図示する。
【図１４】
図１４は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ１２１−１のタンパク質産物の、親水性プロット、抗原性指数およびＡＭＰＨＩ領域を図示する。
【図１５】
図１５は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ１２８−１のタンパク質産物の、親水性プロット、抗原性指数およびＡＭＰＨＩ領域を図示する。
【図１６】
図１６は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ２０６のタンパク質産物の、親水性プロット、抗原性指数およびＡＭＰＨＩ領域を図示する。
【図１７】
図１７は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ２８７のタンパク質産物の、親水性プロット、抗原性指数およびＡＭＰＨＩ領域を図示する。
【図１８】
図１８は、Ｅ．ｃｏｌｉにクローン化され、そして発現された予想されたＯＲＦ４０６のタンパク質産物の、親水性プロット、抗原性指数およびＡＭＰＨＩ領域を図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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