(57)【要約】本発明は、異種融合タンパク質の発現のための新規な改変宿主細胞、およびペプチド結合活性を有する試験サンプルのスクリーニング法に関し、前記改変宿主細胞は、ａ）転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはその対応する転写活性化ドメインのいずれかに連結された、ペプチド結合対の第一のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる異種融合タンパク質をコードする遺伝子配列と、ｂ）ＤＮＡ結合ドメインまたはその対応する転写活性化ドメインのいずれか（ただし、（ａ）で用いられていないもの）と融合し、（ａ）に記載のペプチド結合対の第二のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる異種融合タンパク質をコードする遺伝子配列と、ｃ）転写活性化タンパク質またはその一部と機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子と、ｄ）所望により、酵母宿主細胞中に転写活性化タンパク質の染色体ＤＮＡが存在する場合には、その宿主細胞の前期染色体ＤＮＡにおける欠失または突然変異と、を含んでなるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに連結された、ペプチド結合対の第一のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに連結された、前記結合対の第二のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
を含んでなり、ここで、前記第一のペプチドまたはそのセグメントと、前記第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合により、転写活性化タンパク質が再構成され、さらに、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるルシフェラーゼ遺伝子
を含んでなる、酵母細胞。
【請求項２】
前記転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、および前記転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも一つの内因性ヌクレオチド配列をさらに含んでなり、少なくとも一つの前記内因性ヌクレオチド配列が変異または欠失によって不活性化されてなる、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項３】
前記ペプチド結合対が、リガンドおよび該リガンドが結合する受容体を含んでなる、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項４】
前記転写活性化タンパク質が、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳類核受容体である、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項５】
少なくとも一種の前記異種融合タンパク質が、自己複製プラスミドから発現する、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項６】
前記ペプチド結合対の少なくとも一つのペプチドが、サイトカイン、インターロイキン、造血増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、プロラクチン、インターフェロン、増殖因子、Ｇタンパク質結合受容体のリガンド、グアニリルシクラーゼ受容体のリガンド、チロシンホスファターゼ受容体のリガンド、およびチロシンキナーゼ受容体のリガンドからなる群から選択される、請求項５に記載の酵母細胞。
【請求項７】
前記ペプチドが、上皮増殖因子、神経増殖因子、白血病阻害因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、腫瘍壊死因子、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、エリトロポイエチン、Ｓｌ因子、胎盤性ラクトゲンおよびＴＧＦからなる群から選択される増殖因子である、請求項６に記載の酵母細胞。
【請求項８】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、異種転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインである、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項９】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、哺乳類ステロイド受容体、および細菌ＬｅｘＡタンパク質からなる群から選択される、請求項８に記載の酵母細胞。
【請求項１０】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、またはピキア・パストリスである、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項１１】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエである、請求項１０に記載の酵母細胞。
【請求項１２】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項１３】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項１４】
前記ペプチド結合対の第一および第二のペプチドが、それらの自然環境下において細胞外相互作用により相互作用するものである、請求項１に記載の酵母細胞。
【請求項１５】
酵母細胞であって、
ａ）転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに連結された、ペプチド結合対の第一のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに連結された、ペプチド結合対の第二のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
を含んでなり、ここで前記第一または第二の異種融合タンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、酵母細胞当たり少なくとも５コピーの有効コピー数で存在し、かつ、他方の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、酵母細胞当たり１または２のコピー数で存在し、かつ、
前記第一のペプチドまたはそのセグメントと、前記第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合により、転写活性化タンパク質が再構成され、さらに、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるルシフェラーゼ遺伝子であって、その発現により、選択された表現型の発現が妨げられるもの、
を含んでなる、酵母細胞。
【請求項１６】
前記転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、および前記転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも一つの内因性ヌクレオチド配列をさらに含んでなり、少なくとも一つの前記内因性ヌクレオチド配列が再構成または欠失によって不活性化されてなる、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項１７】
前記ペプチド結合対が、リガンドおよび該リガンドの受容体とを含んでなる、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項１８】
前記転写活性化タンパク質が、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳類核受容体である、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項１９】
少なくとも一種の前記異種融合タンパク質が、自己複製プラスミドから発現する、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項２０】
前記ペプチド結合対の少なくとも一つのペプチドが、サイトカイン、インターロイキン、造血増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、プロラクチン、インターフェロン、増殖因子、Ｇタンパク質結合受容体のリガンド、グアニリルシクラーゼ受容体のリガンド、チロシンホスファターゼ受容体のリガンド、およびチロシンキナーゼ受容体のリガンドからなる群から選択される、請求項１９に記載の酵母細胞。
【請求項２１】
前記ペプチドが、上皮増殖因子、神経増殖因子、白血病阻害因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、腫瘍壊死因子、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、エリトロポイエチン、Ｓｌ因子、胎盤性ラクトゲンおよびＴＧＦからなる群から選択される増殖因子である、請求項２０に記載の酵母細胞。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、異種転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインである、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、哺乳類ステロイド受容体、および細菌ＬｅｘＡタンパク質からなる群から選択される、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項２４】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、またはピキア・パストリスである、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項２５】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエである、請求項２４に記載の酵母細胞。
【請求項２６】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項２７】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項２８】
前記ペプチド結合対の第一および第二のペプチドが、それらの自然環境下において細胞外相互作用により相互作用するものである、請求項１５に記載の酵母細胞。
【請求項２９】
ペプチド結合対の第一のペプチドと第二のペプチドとの相互作用を検出する方法であって、
（ｉ）少なくとも一種の酵母細胞を培養する工程であって、該酵母細胞が、
ａ）転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに連結された、前記第一のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに連結された、前記第二のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
を含んでなり、ここで前記第一のペプチドまたはそのセグメントと、前記第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合により、転写活性化タンパク質が再構成され、さらに、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるルシフェラーゼ遺伝子
を含んでなるものである、前記工程、
（ｉｉ）選択された表現型を検出するのに好適な条件下で、試験サンプルを前記酵母細胞とともにインキュベートする工程、および
（ｉｉｉ）前記ルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルを検出する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項３０】
前記酵母細胞が、前記転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、および前記転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも一つの内因性ヌクレオチド配列をさらに含んでなり、少なくとも一つの前記内因性ヌクレオチド配列が変異または欠失によって不活性化されてなるものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペプチド結合対が、リガンドおよび該リガンドが結合する受容体を含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記転写活性化タンパク質が、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳類核受容体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも一種の前記異種融合タンパク質が、自己複製プラスミドから発現する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチド結合対の少なくとも一つのペプチドが、サイトカイン、インターロイキン、造血増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、プロラクチン、インターフェロン、増殖因子、Ｇタンパク質結合受容体のリガンド、グアニリルシクラーゼ受容体のリガンド、チロシンホスファターゼ受容体のリガンド、およびチロシンキナーゼ受容体のリガンドからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドが、上皮増殖因子、神経増殖因子、白血病阻害因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、腫瘍壊死因子、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、エリトロポイエチン、Ｓｌ因子、胎盤性ラクトゲンおよびＴＧＦからなる群から選択される増殖因子である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、異種転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、哺乳類ステロイド受容体、および細菌ＬｅｘＡタンパク質からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、またはピキア・パストリスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペプチド結合対の第一および第二のペプチドが、それらの自然環境下において細胞外相互作用により相互作用するものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
試験サンプルが、ペプチド結合対の第一または第二のペプチドと相互作用するか否かを判定する方法であって、
（ｉ）少なくとも一種の第一の酵母細胞を培養する工程であって、該第一の酵母細胞が、
ａ）転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに連結された、前記第一のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに連結された前記第二のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
を含んでなり、ここで、前記第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、酵母細胞当たり少なくとも５コピーの有効コピー数で存在し、かつ、前記第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、酵母細胞当たり１または２のコピー数で存在し、かつ、
前記第一のペプチドまたはそのセグメントと、前記第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合により、転写活性化タンパク質が再構成され、さらに、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるルシフェラーゼ遺伝子、
を含んでなるものである、前記工程、
（ｉｉ）少なくとも一種の第二の酵母細胞を培養する工程であって、該第二の酵母細胞が、
ａ）転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに連結された、前記第一のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに連結された、前記第二のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
を含んでなり、ここで、前記第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、酵母細胞当たり少なくとも５コピーの有効コピー数で存在し、かつ、前記第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、酵母細胞当たり１または２のコピー数で存在し、かつ、
前記第一のペプチドまたはそのセグメントと、前記第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合により、転写活性化タンパク質が再構成され、さらに、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるルシフェラーゼ遺伝子、
を含んでなるものである、前記工程、
（ｉｉｉ）ルシフェラーゼ活性を検出するのに好適な条件下で、試験サンプルを前記第一および第二の酵母細胞とともにインキュベートする工程、
（ｉｖ）前記第一および第二の酵母細胞によって生じるルシフェラーゼ活性の有無を検出する工程、ならびに
（ｖ）前記第一および第二の酵母細胞のルシフェラーゼ活性を比較する工程であって、一方の酵母細胞におけるルシフェラーゼ活性の変化が、試験サンプルがルシフェラーゼ活性を示す前記酵母細胞中に１または２のコピー数で存在するヌクレオチド配列によってコードされる異種融合タンパク質に結合し、これにより、ペプチド結合対の結合相互作用に影響を与えることを示す、前記工程、
を含んでなる、方法。
【請求項４４】
前記酵母細胞が、前記転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、および前記転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも一つの内因性ヌクレオチド配列をさらに含んでなり、少なくとも一つの前記内因性ヌクレオチド配列が再構成または欠失によって不活性化されてなるものである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ペプチド結合対が、リガンドおよび該リガンドの受容体を含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記転写活性化タンパク質が、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳類核受容体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも一種の前記異種融合タンパク質が、自己複製プラスミドから発現する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ペプチド結合対の少なくとも一つのペプチドが、サイトカイン、インターロイキン、造血増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、プロラクチン、インターフェロン、増殖因子、Ｇタンパク質結合受容体のリガンド、グアニリルシクラーゼ受容体のリガンド、チロシンホスファターゼ受容体のリガンド、およびチロシンキナーゼ受容体のリガンドからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ペプチドが、上皮増殖因子、神経増殖因子、白血病阻害因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、腫瘍壊死因子、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、エリトロポイエチン、Ｓｌ因子、胎盤性ラクトゲンおよびＴＧＦからなる群から選択される増殖因子である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、異種転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、哺乳類ステロイド受容体、および細菌ＬｅｘＡタンパク質からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記酵母細胞が、
ａ）転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに連結された、それらの自然環境下において細胞外相互作用によって結合するペプチド結合対の第一のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに連結された、前記結合対の第二のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
を含んでなり、ここで、前記第一のペプチドまたはそのセグメントと、前記第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合により、転写活性化タンパク質が再構成され、さらに、
ｃ）再構成された転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化されるルシフェラーゼ遺伝子
を含んでなるものである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、またはピキア・パストリスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ルシフェラーゼ遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５７】
前記ペプチド結合対の第一および第二のペプチドが、それらの自然環境下において細胞外相互作用により相互作用するものである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５８】
第一のペプチドおよび第二のペプチドを含んでなる第一のペプチド結合対ならびに第三のペプチドおよび第四のペプチドを含んでなる第二のペプチド結合対からなる２つの異なるペプチド結合対の相互作用を同時に検出する方法であって、
（ｉ）少なくとも一種の酵母細胞を培養する工程であって、該酵母細胞が、
ａ）第一の転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに連結された、前記第一のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第一の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）第一の転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに連結された、前記第二のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第二の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｃ）第二の転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに連結された、前記第三のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第三の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
ｄ）第二の転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインに連結された、前記第四のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる第四の異種融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
を含んでなり、ここで、前記第一のペプチドまたはそのセグメントと前記第二のペプチドまたはそのセグメントとの結合により、前記第一の転写活性化タンパク質が再構成され、前記第三のペプチドまたはそのセグメントと前記第四のペプチドまたはそのセグメントとの結合により、前記第二の転写活性化タンパク質が再構成され、さらに、
ｃ）再構成された第一の転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化される第一のルシフェラーゼ遺伝子と、
ｄ）再構成された第二の転写活性化タンパク質の正の転写制御下で活性化される第二のルシフェラーゼ遺伝子と、
を含んでなるものである、前記工程、
（ｉｉ）ルシフェラーゼ活性を検出するのに好適な条件下で、少なくとも一種の試験サンプルを前記酵母細胞とともにインキュベートする工程、ならびに
（ｉｉｉ）前記第一および第二のルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルを検出する工程、
を含んでなる、方法。
【請求項５９】
前記酵母細胞が、前記転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、および前記転写活性化タンパク質の転写活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも一つの内因性ヌクレオチド配列をさらに含んでなり、少なくとも一つの前記内因性ヌクレオチド配列が変異または欠失によって不活性化されてなるものである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
少なくとも一つの前記ペプチド結合対が、リガンドおよび該リガンドが結合する受容体を含んでなる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記第一または第二の転写活性化タンパク質が、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、または哺乳類核受容体である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
少なくとも一種の前記異種融合タンパク質が、自己複製プラスミドから発現する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記ペプチド結合対の少なくとも一つのペプチドが、サイトカイン、インターロイキン、造血増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、プロラクチン、インターフェロン、増殖因子、Ｇタンパク質結合受容体のリガンド、グアニリルシクラーゼ受容体のリガンド、チロシンホスファターゼ受容体のリガンド、およびチロシンキナーゼ受容体のリガンドからなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ペプチドが、上皮増殖因子、神経増殖因子、白血病阻害因子、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、腫瘍壊死因子、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、エリトロポイエチン、Ｓｌ因子、胎盤性ラクトゲンおよびＴＧＦからなる群から選択される増殖因子である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、異種転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＤＮＡ結合タンパク質が、哺乳類ステロイド受容体および細菌ＬｅｘＡタンパク質からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、またはピキア・パストリスである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６８】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記ペプチド結合対の第一および第二のペプチドが、それらの自然環境下において細胞外相互作用により相互作用するものである、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、出願番号０８／２５９，６０９（１９９４年６月１４日出願；現米国特許第５，９８９，８０８号）の継続出願である、出願番号０９／３０５，４８３（１９９９年５月９日出願）の一部継続出願である。これらは引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、異種融合タンパク質を発現する新規な細胞、および本発明によ新規な細胞を用いた、ペプチド結合活性を有する化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００３】
【発明の背景】
一対のペプチドの相互の特異的結合は、生細胞において極めて多数の機能を誘導する。例えば、リガンドの表面受容体への特異的結合は、多くの外的シグナルに対する細胞応答の引金となる。哺乳類では、細胞は、多くの場合、単一膜貫通のドメイン受容体を通じて多種多様な循環ペプチドホルモンに応答する。サイトカイン受容体のスーパーファミリーは、多様な細胞機能および生理応答を示すことが確認されている。サイトカイン受容体機能についての最近の研究により、２−タンパク質（リガンド／受容体）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ら， １９９１； Ｓｔａｔｅｎ ら， １９９３）、および３−タンパク質（リガンド／受容体／受容体またはリガンド／受容体／トランスデューサー）（Ｙｏｕｎｇ， １９９２； Ｔａｇａ ａｎｄ Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ， １９９２； Ｍｕｉ ａｎｄ Ｍｉｙａｊｉｍａ， １９９４）の両相互作用をはじめ、種々のリガンド−受容体タンパク質の化学量論が明らかとなっている。かかるタンパク質会合の複雑さは、容易に操作できる遺伝子発現系が得られていなかったことから、多くは労力のかかるｉｎ ｖｉｔｒｏ法（Ｆｕｈ ｅｔ ａｌ．， １９９２； １９９３； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３）を用いて研究されてきた。本発明は、このようなタンパク質間相互作用の検討に使用できる新規な改変宿主系に関するものである。これらの新規な系は、既存の方法よりも著しく少ない労力で実施できる。
【０００４】
当技術分野で最近報告された系は、Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ （１９８９）およびＣｈｅｉｎ ら （１９９１）により考察されているように、「２−ハイブリッド」系と呼ばれるものである。この２−ハイブリッド系には、酵母転写アクチベーターＧａｌ４の分離可能なＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとの間の示差的相互作用（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）が関与する。異種タンパク質は、Ｇａｌ４のいずれか半分と融合した雑種タンパク質として発現する（２−ハイブリッド系の考察については、図１； Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ １９８９；Ｃｈｅｉｎ ら １９９１を参照）。これら異種タンパク質の正の相互作用により、Ｇａｌ４タンパク質の２つの半分が近接し、レポーター遺伝子の発現が活性化され、評価が可能となる。多くの酵母ベースのプラットフォームでは、目的の遺伝子または薬剤の所望の作用が、レポーター遺伝子の使用により酵母細胞表現型の変化に関連づけられる。酵母系において、レポーター遺伝子は一般的に、選択培地での細胞増殖の栄養要求性遺伝子や、β−ガラクトシダーゼ活性の検出評価を用いる比色終点のＬａｃＺ遺伝子に着目したものとされている。本明細書において、本発明者らは、酵母におけるレポーター遺伝子としての、例えばウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）またはホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）由来の、ルシフェラーゼの応用例を詳細に説明する。ルシフェラーゼは、レポーター遺伝子として哺乳類でよく用いられているが、酵母における同様の使用は報告されていない。本発明者らは、タンパク質相互作用の研究のための酵母２−ハイブリッド等の種々の酵母プラットフォームで用いるためのルシフェラーゼレポーターを設計し、実証し、実行した。酵母２−ハイブリッドのルシフェラーゼレポーターにより、アッセイの感度、速度、簡便性、シグナル・ノイズ比が増大し、無数の標的の同定や薬剤開発用途のための酵母系アッセイにおいて質の高い定量データが得られる。酵母におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用により、遺伝子同定、タンパク質間相互作用の同定および特性決定、ハイスループットスクリーニングプラットフォーム、これらのプラットフォームの自動化、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）の研究、ＧＰＣＲシグナル伝達経路の調節、およびイオンチャンネル研究に用いる酵母ベースのアッセイが実質的に改良される。
２−ハイブリッド系は、既知のペプチドに対する被験ペプチドの親和性が知られていない第一の被験ペプチド配列が第二の既知のペプチド配列に対して結合活性を有するか否かを調べるのに有用である。このような系は、転写因子やキナーゼ−標的タンパク質相互作用などの細胞内タンパク質を分析するのに用いられている（ｙａｎｇ ら， １９９２； Ｄｕｒｆｅｅ ら， １９９３； Ｌｉ ら， １９９４）。
【０００５】
レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いる、本発明による新規な改変酵母細胞ならびにこれらの細胞を組み込んだ新規な方法により、リガンド類似体や受容体類似体をはじめとするペプチド類似体の研究や発見に著しい伸展がもたらされる。現時点では、このような領域を調べるために有効かつ特徴的なスクリーニング系は開発されていない。本発明では、細胞において結合親和性が未知であるペプチド結合対を用いることにより、リガンドと受容体などの、細胞外相互作用によって結合するペプチド結合対を研究することが可能となる。本発明により、特異的な受容体またはトランスデューサーのリガンドとして相互作用し得る化合物の発見のための指数関数的な利点がもたらされる。可能性のあるリガンドとしては、限定されるものではないが、その受容体が同族の細胞外リガンド結合ペプチドである哺乳類ホルモンが挙げられる。さらに、本発明によれば、リガンドと受容体の特異的かつ可逆的な結合を確立する２種の異種融合タンパク質をはじめ、複数の異種タンパク質を発現する細胞系の使用が提供される。上記結合の特異的相互作用は細胞表現型、例えば選択培地での増殖、における測定可能な変化によって容易に検出される。
【０００６】
【発明の概要】
本発明の１つの態様は、異種融合タンパク質の発現のための新規な改変宿主細胞に関する。この新規な改変宿主細胞は、
ａ）転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはその対応する転写活性化ドメインのいずれかに連結された、ペプチド結合対の第一のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる異種融合タンパク質をコードする遺伝子配列と、
ｂ）ＤＮＡ結合ドメインまたはその対応する転写活性化ドメインのいずれか（ただし、（ａ）で用いられていないもの）と融合し、（ａ）に記載のペプチド結合対の第二のペプチドまたはそのセグメント、を含んでなる異種融合タンパク質をコードする遺伝子配列と、
ｃ）転写活性化タンパク質またはその一部と機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子と、
ｄ）所望により、酵母宿主細胞中に転写活性化タンパク質の染色体ＤＮＡが存在する場合には、その宿主細胞の前期染色体ＤＮＡにおける欠失または突然変異と、
を含んでなるものである。
【０００７】
本発明による新規な改変宿主細胞は、試験サンプルと、ペプチド結合対の選択されたペプチドとの相互作用を調べるのに使用できる。例えば、該細胞は、試験サンプルと選択されたリガンドまたは受容体との相互作用を調べるのに使用できる。
【０００８】
本発明の第二の態様は、試験サンプルと選択されたペプチドおよび受容体との相互作用が、表現型の検知可能な変化によって示される、新規な改変細胞およびスクリーニング法に関する。該細胞は、ペプチド結合対のペプチドに対する結合親和性、例えばリガンドまたはその受容体に対する結合親和性、を有する試験化合物の存在下でのみ表現型の変化を示す。
【０００９】
本発明の第三の態様は、試験サンプルがペプチド結合対のどちらのペプチドと結合するかを調べることを可能とする、新規な細胞およびスクリーニング法に関する。
【００１０】
本発明の第四の態様は、例えばリガンド依存性二量体化の研究など、三種以上のペプチド間の高次多重タンパク質会合の研究のための、三種以上の異種成分を発現する新規な細胞に関する。
【００１１】
本発明の第五の態様は、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含んでなる新規な酵母細胞、ならびに、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の結果として生じる検知可能な表現型の変化により、試験サンプルとペプチド結合対との相互作用を示すスクリーニング法に関する。
【００１２】
用語の定義：
「ペプチド結合対」とは、ＤＮＡ配列が既知または推定可能な既知の結合親和性を有するいずれかのペプチド結合対をいう。ペプチド結合対の両ペプチドは、改変細胞のあらゆる成分よりも優先的に相互に結合するものである必要がある。
【００１３】
上記の概要および本明細書において、「ペプチド」とは、特に断りのない限り、いずれのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をも意味する。上記のようにペプチド結合対のペプチドは、リガンドおよびその対応する受容体、またはリガンドおよびそのリガンドに対して既知の結合親和性を有するいずれかのペプチドとすることができる。
【００１４】
上記の概要および本明細書において、「異種」とは、（１）天然に存在する宿主細胞によっては発現されないペプチド、または（２）宿主細胞が通常そのペプチドを発現する発現方法以外の発現方法により、改変宿主細胞によって発現されるペプチドを意味する。
【００１５】
特に断りのない限り、本明細書において「受容体」は、受容体、可溶性受容体、トランスデューサー、および結合タンパク質を含む。本発明の好ましい実施態様によれば、用いられる「受容体」は、受容体または可溶性受容体であり、より好ましくは受容体である。
【００１６】
本明細書において「受容体」とは、増殖因子、ホルモンまたは神経伝達物質などの特異的な分子と結合し、細胞内部へシグナルを伝達して特異的な様式の細胞応答を起こす原形質膜タンパク質を意味する。この用語には一回膜貫通型タンパク質（ｓｉｎｇｌｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が含まれる。
【００１７】
「可溶性受容体」とは、リガンドに結合し得る非膜貫通型の受容体を意味する。これらは、タンパク質分解または選択的スプライシングにより生じるｍＲＮＡのいずれかによって細胞から放出される受容体である。
【００１８】
「結合タンパク質」とは、特定のリガンドに対して結合親和性を示すタンパク質を意味する。結合タンパク質は個別の異なる複数の遺伝子から生じるものであってもよい。あるリガンドについて、特定の遺伝子から生じる結合タンパク質は、その受容体またはその可溶性受容体のリガンド結合ドメインとは異なる。
【００１９】
「トランスデューサー」とは、ある種のシグナルを別のシグナルへ変換する分子、およびペプチド結合対の１以上のペプチドのトランスデューサー、例えばリガンド／受容体グループのトランスデューサーとして容易に分かる分子を意味する。
【００２０】
発明の具体的説明
本発明における改変細胞では宿主細胞が用いられる。本発明における使用に効果的な宿主細胞は、異種融合タンパク質、受容体および他のいずれかの所望の遺伝子操作物を適切に発現させるために、遺伝的に明確にされていればよい。宿主細胞は、真核細胞とすることができ、脊椎または非脊椎のいずれであってもよい。宿主細胞は、哺乳類や両生類、例えばアフリカツメガエル卵細胞としてもよい。好ましくは、宿主細胞は真菌細胞、例えばアスペルギルス属またはアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｐｏｒａ）、とする。好ましい実施態様によれば、宿主細胞は酵母細胞とされる。他の好ましい実施態様によれば、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、またはピキア・パストリスとされる。
【００２１】
改変宿主細胞においては、２種の異種融合タンパク質を個別に発現させるため、少なくとも２つの遺伝子が使用される。これらの融合タンパク質の一つは、ペプチド結合対の第一のペプチドまたは該第一のペプチドのセグメントを含んでなり、転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはその対応する転写活性化ドメインのいずれかに連結されている。第二の融合タンパク質は、ペプチド結合対の第二のペプチドまたはそのセグメントを含んでなる。該第二のペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインまたはその対応する転写活性化ドメインのいずれか（ただし、第一の異種融合タンパク質において用いられていないもの）に融合されている。ペプチド結合対の両ペプチド間における結合の活性は、前記２種の融合タンパク質において用いられている転写活性化タンパク質と機能しうる形で連結されているレポーター遺伝子の使用によってモニタリングされる。
【００２２】
転写活性化タンパク質としては、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインが既知であるか、利用可能な科学的方法によって推定できる限り、多種多様なものを用いることができる。この転写活性化タンパク質は、二成分、すなわちＤＮＡ結合成分および活性化成分、を有するいずれのタンパク質であってもよく、ここで、該転写活性化タンパク質は転写の活性化のための酸性αヘリックスを含有する。好ましくは、この転写活性化タンパク質はＧａｌ４、Ｇｃｎ４、Ｈａｐ１、Ａｄｒ１、Ｓｗｉ５、Ｓｔｅ１２、Ｍｃｍ１、Ｙａｐ１、Ａｃｅ１、Ｐｐｒ１、Ａｒｇ８１、Ｌａｃ９、Ｑａ１Ｆ、ＶＰ１６、ＬｅｘＡ、非哺乳類核受容体（例えば、エクジソン）、または哺乳類核受容体（例えば、エストロゲン、アンドロゲン、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド、レチノイン酸およびプロゲステロン、Ｐｉｃａｒｄ ら， １９９０参照）から選択される。好ましくは、転写活性化タンパク質は、酵母タンパク質であり、より好ましくは、転写酵母タンパク質は、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４またはＡｄｒ１から選択される。ここで活性化ドメインとともに機能するいずれのＤＮＡ結合タンパク質を用いてもよいことに留意すべきである。ＤＮＡ結合タンパク質は、レポーター遺伝子と機能しうる形で連結されたその認識配列が相応に操作されていれば、転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインに代えて用いることができる。非酵母ＤＮＡ結合タンパク質の例としては、哺乳類ステロイド受容体および細菌ＬｅｘＡ（Ｗｉｌｓｏｎ ら， １９９０参照）が挙げられる。
【００２３】
レポーター遺伝子は、一般に、転写活性化タンパク質のドメインの結合が周知の直接的方法によってモニタリングできるように選択される。好ましくは、レポーター遺伝子は、その費用、その活性の測定の容易さ、および低バックグラウンド（すなわち、シグナル対バックグラウンド比が高く、および／または誘導されない活性が相対的に低いか、全くなければ、レポーター遺伝子の活性が比較的低くても活性を測定することができる）に基づいて選択される。レポーターは、その活性が利用可能ないずれかの手段によって検出できる限り、いずれのレポーターであってもよい。本発明に使用できるレポーターの例としては、
ａ）ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子、ＣＡＴ；
ｂ）ＨＩＳ、ＵＲＡ、ＬＥＵ、ＡＲＧ、ＭＥＴ、ＡＤＥ、ＬＹＳ、ＴＲＰなどの栄養要求性補足遺伝子；
ｃ）ｎｅｏｒおよびＫＡＮなどの、抗生物質耐性を付与する遺伝子；ならびに
ｄ）ＣＹＨ２またはＣＡＮ１（カナバイン（ｃａｎａｖｉｎｅ）耐性）などの、化学物質への感受性を付与する遺伝子、
からなる群から選択されるレポーター遺伝子がある。多くの実施態様においては、増殖を抑制するレポーター遺伝子（ＣＹＨ２）が便宜である。好ましくは、レポーター遺伝子の活性は、比色法もしくは蛍光法により、および／または酵母細胞の増殖の測定により示される。
【００２４】
好ましい実施態様によれば、レポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子、例えばウミシイタケやホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子である。他の生物由来のルシフェラーゼ遺伝子も当業者に周知である。２−ハイブリッド分析におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用により、長いアッセイ枠（日）による非自動化寒天拡散系のアッセイとすべきところを、はるかに短いアッセイ枠（時間）の液体アッセイとすることができるという重要な利点が提供される。さらに、酵母中においてルシフェラーゼレポーターを使用することにより、現行のフォーマットよりもアッセイ感度が増幅され、定量的データが得られ、特にハイスループット（３８４ウェル）アッセイフォーマットにおいて、アッセイの自動化が可能となる。このレポーター系を用いる有用性は、アッセイ全体の速度、簡便性、およびレポーター遺伝子活性の迅速性（これにより有害な偽陽性が回避される）、ならびにより単純なデータの取り込みおよび処理（これにより容易にデータの定量化を行うことができる）にある。標準的な栄養要求性（ＨＩＳ３、ＬＹＳ２、ＵＲＡ３）レポーターやカウンターセレクション（ＣＡＮ１、ＵＲＡ３、ＣＹＨ２）レポーター（両者とも最終的な決定のためには細胞増殖を必要とする）においてこれまでに必要とされていた長いインキュベーション時間（４８時間以上）では、化合物に有害な作用を与えていたが、アッセイ時間の短縮により（４時間）、かかる有害作用を回避できるため、薬剤スクリーニング用途における有用性も提供される。酵母におけるルシフェラーゼ遺伝子の使用は２−ハイブリッドの系に応用することができる。
【００２５】
上記のように、改変細胞において用いられるペプチドは、そのＤＮＡ配列が既知であるペプチド結合対の一つのペプチド、ならびに前記結合対の第二のペプチドの配列である。前記ペプチドは、互いに結合して結合複合体を形成する２以上のペプチドを含むペプチド結合複合体のペプチドであってもよい。ペプチド結合対のペプチドは、特異的リガンドおよび対応する受容体であってもく、あるいは、酵素のサブユニットなど、互いに優先的に結合するその他のいずれのペプチドであってもよい。
【００２６】
本発明の顕著な利点の一つは、転写タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを使用する改変細胞を用いて、細胞外相互作用によって結合するペプチド結合対のペプチドの結合をモニタリングすることができるという新たな知見にある。ただし、所望により、細胞内相互作用によって結合するペプチドもまた、本発明による新規な改変細胞および方法のいずれにも使用できる。前記ペプチドは哺乳類細胞由来のものであっても非哺乳類細胞由来のものであってもよい。本発明の最も重要な実施態様の一つは、本発明による新規な改変細胞および対応するスクリーニング法を、多くの哺乳類のペプチド相互作用研究に適用することに関する。哺乳類ペプチドとしては、ホルモン／受容体相互作用等の哺乳類のリガンド／受容体相互作用が挙げられる。本発明において使用できるペプチドホルモンの例としては、限定されるものではないが、以下の群：（ａ）サイトカイン、インターロイキン、造血増殖因子、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、プロラクチン、インターフェロン、および増殖因子、（ｂ）Ｇタンパク質結合受容体のリガンド、（ｃ）非脊椎動物受容体のリガンド、（ｄ）グアニリルシクラーゼ受容体のリガンド、ならびに（ｅ）チロシンホスファターゼ受容体のリガンド、の一つから選択されるペプチドが挙げられる。
【００２７】
他の実施態様によれば、前記ペプチドは、上皮ＧＦ、神経ＧＦ、白血病阻害因子、繊維芽細胞ＧＦ、血小板由来ＧＦ、血管内皮ＧＦ、腫瘍壊死因子、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、エリトロポイエチン、Ｓｌ因子、胎盤性ラクトゲンおよびトランスフォーミングＧＦからなる群から選択される増殖因子である。
【００２８】
種々の好ましい実施態様によれば、前記ペプチドホルモンは、成長ホルモン放出因子、セクレチン、血管作用阻害ペプチド、グルカゴン、チロトロピン、インターロイキン−８、黄体形成ホルモン（ＬＨ）または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などのＧタンパク質結合受容体のリガンドである。
【００２９】
さらに他の実施態様によれば、使用するペプチドは、植物系および昆虫分化ペプチドからなる群から選択されるもの等の、非脊椎動物ペプチドである。しかしながら、好ましい実施態様によれば、前記ペプチドは、哺乳類ペプチド、より好ましくは、哺乳類ペプチドホルモンからなる群より選択される。
【００３０】
また、特定の受容体も、ペプチド結合対またはペプチド結合複合体のペプチドであってよいことに留意すべきである。このような受容体の例としては、以下の群：（ａ）細胞接着分子、および（ｂ）免疫調節抗原認識もしくは提示分子またはその他の関連ペプチド、の一つから選択されるものが挙げられる。細胞接着分子の例としては、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＥＣＡＭ、フィブロネクチン、インテグリン、セレクチンおよびフィブリノーゲンが挙げられる。免疫調節抗原認識または提示分子の例としては、Ｔ細胞受容体複合体、Ｂ細胞受容体複合体、Ｆｃ受容体、主要組織適合性複合体Ｉ、主要組織適合性複合体ＩＩ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ３０およびＭＡＣ複合体が挙げられる。
【００３１】
また、特定の種類のトランスデューサーも、ペプチド結合対またはペプチド結合複合体のペプチドであってよいことに留意すべきである。使用されるトランスデューサータンパク質は、ペプチド結合対またはペプチド結合複合体のペプチドの少なくとも一つと結合する限り、いずれのトランスデューサータンパク質であってもよい。トランスデューサータンパク質としては、ｇｐ１３０、ｋｈ９７、ＡＩＣ２ＡおよびＡＩＣ２Ｂが挙げられる。
【００３２】
好ましくは、異種融合タンパク質は、該融合タンパク質を発現し得る、自己複製プラスミドで酵母細胞を形質転換することによって発現され、あるいは、染色体改変によっても発現し得る。
【００３３】
上記のように本発明によるスクリーニング法は、ペプチド結合対の結合、例えばリガンド−受容体相互作用、に影響を与える試験サンプルの能力を検出するように設計される。基本的には、前記方法は、サンプルの存在下でレポーター遺伝子の活性を検出するのに好適な条件下、または、改変宿主細胞が、ペプチド結合対と結合相互作用を有するサンプルの存在の下でのみ前記活性を示す条件下で、本発明による改変宿主細胞に試験サンプルを加えた際の前記活性を調べることを含んでなる。前記レポーター遺伝子の活性は、該レポーターの活性に直接相関する選択された表現型における変化を測定することにより調べることが好ましい。
【００３４】
本発明による新規な改変細胞は、試験サンプルの結合能力を調べる種々のスクリーニング法に容易に適用できる。試験サンプルはペプチド、好ましくは約２アミノ酸長のペプチドであってもよく、あるいは非ペプチド性の化合物であってもよい。非ペプチド性の試験サンプルとしては、化合物、複合体、および塩、ならびに植物抽出液、および発酵液から得られた材料などの天然産物サンプルが挙げられる。改変宿主細胞は、ペプチド結合対の結合相互作用に対する試験サンプルの相互作用を検討するため、増殖に好適な条件下で培養される。改変宿主細胞は、表面に試験サンプルが塗布された増殖培地、好ましくは寒天を含有するものの中に置かれる。増殖培地は、酵母合成培地（ＢＩＯ１０１から入手できるＹＳＭ（Ｒｏｓｅ ら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９９０も参照））など、増殖試薬と水からなる通常の液体培地とすることが好ましい。
【００３５】
本発明の一つの実施態様は、試験化合物と選択されたペプチド結合対との相互作用示を、表現型における検知可能な変化によって示す、新規な改変宿主細胞、およびスクリーニング法に関する。この改変宿主細胞は、ペプチド結合対のペプチドの一つに対して結合親和性を有する試験化合物の存在下でのみ表現型の変化を示す。この宿主細胞は、本明細書においては「レスキュー」系という。通常、細胞応答は、転写活性化タンパク質の２つのドメインが相互作用した場合に現れる。しかし、レスキュー系においては、表現型の変化の陽性指標は、転写活性化タンパク質の２つのドメインが相互作用した場合には生じない。表現型の変化の陽性指標は、試験サンプルが転写活性化タンパク質の２つのドメインの相互作用を妨害した場合にのみ生じる。レスキュー系では、改変宿主細胞は、少なくとも２種の異種融合タンパク質を発現しうるものとされる。さらに、前記宿主細胞は、転写活性化タンパク質と機能しうる形で連結されたレポーター遺伝子を含んでなり、該レポーター遺伝子は、転写活性化タンパク質またはその一部の発現により、選択培地上での特定の表現型の出現を妨げる。宿主細胞の染色体ＤＮＡにおける変異により、レポーター遺伝子が発現しない場合において選択培地上で検出可能な表現型が反転する可能性がある。必要であれば、選択された結合対の生産的相互作用時にのみ転写の活性化が生じるように、転写活性化タンパク質の宿主細胞染色体ＤＮＡの欠失または変異が存在する。試験サンプルが転写活性化タンパク質の２つのドメインの相互作用を妨害した場合にのみ、改変細胞は増殖もしくは生存するか、または選択された別の表現型を示す。好ましくは、この表現型は細胞増殖に相当する。
【００３６】
上記のように、試験サンプルが、該試験サンプルの不在下で観測されるペプチド結合と相互作用するか否か、または妨害するか否かが、スクリーニング方法を用いて決定された後は、二次スクリーニングを用いて、試験サンプルの特異的結合親和性、すなわち試験サンプルがペプチド結合対のどのペプチドと結合するかを調べる。前記二次スクリーニングでは、ペプチド結合対の一方のペプチドと結合する試験サンプルの存在下でのみある表現型または表現型の変化を示すように適合された、本発明による新規な細胞が使用される。試験サンプルの特異的結合特性を調べるための好ましい方法の一つは、ペプチドの一つを含むいずれかの融合タンパク質の有効（相対的に高い）コピー数を含む細胞の使用を含んでなるものである。有効コピー数は、試験サンプルの特異的結合の決定を可能とするのに十分なコピー数であればよい。該遺伝子コピー数は、好ましくは少なくとも約５であり、より好ましくは約５〜約５０であり、このコピー数はできるだけ大きいことが最も好ましい。他方の融合タンパク質は、細胞染色体への組込み、あるいは発現プラスミド上の染色体動原体配列の使用のいずれかにより、相対的に低いコピー数（細胞当たり１〜約２コピー）で維持される。本発明による細胞において高いコピー数の第一のペプチドを用いると、制限された量の第二のペプチドがレポーター遺伝子の活性化レベル、すなわち観察される表現型の変化のレベルを決定づけるので、その細胞はペプチド結合対の第二のペプチドと結合する試験サンプルの存在に対して感度が高くなる。逆に、ペプチド結合対の第二のペプチドをコードする遺伝子の、コピー数を高くすると、制限された量の第二のペプチドがレポーター遺伝子の活性化レベル、すなわち観察される表現型の変化のレベルを決定づけるので、その細胞は第一のペプチドと結合する試験サンプルの存在に対して感度が高くなる。２つの株の表現型に対する試験化合物の作用の直接的な比較（受容体＞＞＞リガンド  対  リガンド＞＞＞受容体）により、その化合物の特異的なタンパク質相互作用が実証される。上記のように、ペプチドを発現する遺伝子およびレポーター遺伝子は、好ましくは自己複製プラスミドによる宿主細胞の形質転換により発現される。
【００３７】
本発明によるさらなる改変宿主細胞は、多重ペプチド結合成分、すなわち３以上のペプチド結合成分の結合からのシグナルの活性化または伝達に、２つの受容体または１つの受容体とトランスデューサーとを用いるペプチドリガンドを研究するのに使用できる細胞である。
【００３８】
受容体の二量体化は、あるクラスの受容体のシグナル伝達のための重要な第一ステップである。二量体受容体構造は、同一の受容体ユニットからなるもの（例えば、インスリン受容体、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＰＤＧＦ受容体、キナーゼ不活性ドメイン受容体（ｋｉｎａｓｅ ｉｎｅｒｔ ｄｏｍｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＫＤＲ）、またはコロニー刺激因子（ＣＳＦ）−Ｉ受容体）であってもよい。あるいは、二量体受容体構造は、異なる受容体ユニットからなるもの（例えば、ＩＬ−６Ｒ＋ｇｐ１３０、インスリン−ＩＧＦ−Ｉハイブリッド受容体、ＬＩＦ＋ｇｐ１３０、ＣＮＴＦ＋ｇｐ１３０、または種々のインターフェロン受容体）であってもよい。
【００３９】
「二重受容体」系を有するペプチドの結合活性をモニタリングするための改変宿主細胞の成分は以下の通りである：遺伝子配列（ａ）は、異種融合タンパク質をコードする遺伝子配列であり、前記融合タンパク質は、転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、またはその対応する転写活性ドメインのいずれかに連結された、多重ペプチド結合複合体の１つのペプチドまたはそのペプチドのセグメントを含んでなり；遺伝子配列（ｂ）は、異種融合タンパク質をコードする遺伝子配列であり、前記融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインまたはその対応する転写活性ドメインのいずれか（ただし、（ａ）で用いられていないもの）と融合した、前記多重ペプチド結合複合体の第二のペプチドまたは該受容体のセグメントを含んでなるものである。二重受容体系等の多重ペプチド結合複合体を研究するための改変宿主細胞はまた、上記のようなペプチド（リガンド／受容体）相互作用の特異的分析のための適当なレポーター遺伝子と染色体変異とを含んでなるものである。第三のペプチド（例えば、リガンド）を発現させることにより、比較試験または競合試験の対照とすることもできる。
【００４０】
上記のように、多重結合ペプチド複合体、すなわち３つ以上のペプチドを含む高次タンパク質の研究のために、実際に本発明による改変宿主細胞を用いて３つ以上のペプチドを発現させることができる。トリペプチド結合複合体の場合、いずれか２つのペプチドを、転写活性化タンパク質の２つの成分と融合させることができる。例えば、受容体の二量体化により相互作用するリガンドの相互作用を研究するために、融合タンパク質としてこれらの受容体を発現させ、非融合タンパク質としてリガンドを発現させることができる。この宿主細胞系は、多重タンパク質酵素複合体の研究に応用することもできる。多重ペプチド結合複合体のいずれについても、転写活性化タンパク質のドメインの一つと融合させた、ランダムな相補的ＤＮＡ配列、例えばｃＤＮＡライブラリーから新規なタンパク質を発現させることにより、前記複合体と相互作用する新規なペプチドを同定することができる。このような系では、ペプチド結合複合体の既知のペプチドの一つを転写活性化タンパク質の他方のドメインと融合させ、ペプチド結合複合体の他のユニットを非融合ペプチドとして発現させる。さらに、改変宿主細胞によって発現されるペプチドの数は、利用可能な検出手段および宿主細胞の能力によってのみ限定されるということに留意すべきである。
【００４１】
この新規なスクリーニング法を用いて、あらゆるペプチド結合対、例えばいずれかの受容体および／またはリガンド、と相互作用する化合物対を同定することができる。また、スクリーンとなるレポーター遺伝子を用いたこの改変細胞系を、いずれかのタンパク質間相互作用に適用して、その相互作用を妨げる新規な化合物を発見することもできる。具体例として、ａ）癌に関連づけられるタンパク質キナーゼをこの系に挿入することにより、キナーゼー標的相互作用を遮断し、従って、独自の癌治療薬として機能し得る新規な化合物を迅速にスクリーニングすることができ、ｂ）ヒト免疫不全ウイルス糖タンパク質などのウイルスコートタンパク質やＣＤ４などの対応する細胞表面受容体タンパク質をこの系に挿入することにより、この相互作用を妨げ、従って抗ウイルス薬として機能しうる化合物を迅速にスクリーニングすることができ、さらに、ｃ）プラスモジウムリボヌクレオチドレダクターゼ酵素の２つのサブユニットをこの系で発現させることにより、この特異的タンパク質会合を妨げ、従って新規な抗マラリア薬として機能しうる化合物をスクリーニングすることができる。
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明の種々の態様をさらに説明する。本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
実施例１：特異的かつ可逆的なリガンド−受容体相互作用
融合タンパク質をコードする遺伝子は、成長ホルモン（ＧＨ）および成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）ｃＤＮＡ配列をＧａｌ４のドメインのコード領域を含むプラスミド中へクローニングすることにより作製される。ＤＮＡ結合ドメイン（Ｇａｌ４）融合体は、Ｗａｄｅ Ｈａｒｐｅｒ らに記載されているｐＡＳ２中で構築する。遺伝子活性化ドメイン（Ｇａｌ４）融合体は、ポリリンカー領域の改変を伴うこと以外はｐＡＣＴ（Ｄｕｒｆｅｅ ら， １９９３に記載）と同一のｐＡＣＴ−ＩＩ中で構築する。Ｂｇｌ  ＩＩ部位に、ｐＡＳ２のポリリンカー配列（Ｗａｄｅ Ｈａｅｐｅｒ ら， １９９３）から適合させた以下の配列：Ｂｇｌ  ＩＩ−ヘマグルチニンエピトープ−ＮｄｅＩ−ＮｃｏＩ−ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ−Ｂｇｌ  ＩＩを付加する。ブタＧＨの成熟ペプチドをコードするｃＤＮＡは、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて作製する（Ｆｉｎｎｅｙ， １９９３参照）。
【００４４】
ＡＢＩオリゴシンセサイザーで作製するオリゴヌクレオチドは、ブタＧＨの公開されたｃＤＮＡ配列に従って設計する（Ｓｕ および Ｅｌ−Ｇｅｗｅｌｙ， １９８８参照）。３０塩基の５’オリゴヌクレオチドはＮｃｏＩ部位を含み（５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＣＣ ３’）（配列番号１）、２７塩基の３’オリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩ部位を含む（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴ−３’）（配列番号２）。ＧＨ  ｃＤＮＡは、鋳型としてブタ下垂体λｇｔｌｌライブラリーを用いて作製する。５４０ｂｐ断片が得られ、これをｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）中へ連結し、組換え体を制限酵素消化によって確認し、そのＤＮＡをＭａｎｉａｔｕｓ ら， １９８２に記載のようにして作製する。ｃＤＮＡ配列は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ．の試薬およびプロトコールならびにＡＢＩ３７３Ａ自動シーケンサーを用いて、ジデオキシターミネーター反応によって確認する。ＧＨ  ｃＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位を介してｐＡＣＴ−ＩＩ中へ指向的にクローニングする。ＧＨＲの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを標準的なＰＣＲ法を用いて作製する。ＮｃｏＩ部位を含む３３塩基の５’オリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＧＣＴ−３’）（配列番号３）、および、ＮｃｏＩ部位の後に終結コドンを含む３９塩基の３’オリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＡＣＣＧＧＡＡＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣ−３’）（配列番号４）を用いて、ラットＧＨＲのアミノ酸１〜２４７をコードする７４２ｂｐ断片を作製する（Ｂａｕｍｂａｃｈ ら， １９８９）。このＧＨＲ  ｃＤＮＡを上述のベクターｐＣＲＩＩへクローニングした後、ベクターｐＡＳ２のＮｃｏＩ部位へサブクローニングする。最終的な組換えベクターのＤＮＡは酢酸リチウム法により酵母株へ形質転換する（Ｒｏｓｅ ら， １９９０）。
【００４５】
ＵＡＳＧＡＬ−ＨＩＳレポーター遺伝子を含む酵母宿主（Ｙ１９０）を、Ｗａｄｅ Ｈａｒｐｅｒ ら， １９９３に記載の方法に従って作製する。Ｙ１９０株の遺伝子型は、ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３、１１２  ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１−９０１  ｈｉｓ３ｄ２００  ａｄｅ２−１０１  ｇａｌ４  ｇａ１８０  ＵＲＡ３：：ＧＡＬ−ｌａｃＺ  ＬＹＳ２：：ＧＡＬ−ＨＩＳ３  ｃｙｈｒである。Ｙ１９０株を両融合構築物を用いて、または１つの融合構築物と異種配列を含有しない相対するベクターとを用いて形質転換する。非選択培地ではいずれの株も同等の増殖を示すことが分かる（図２Ａ）。次に、当該株を、選択培地、すなわちレポーター遺伝子の活性化によって合成されるアミノ酸を欠いた増殖培地での増殖について試験する。両方の雑種タンパク質を含む株（ＣＹ７２２）のみが増殖することができるが、リガンド融合体または受容体融合体のいずれか一方のみを含む株は増殖できない（それぞれＣＹ７２４およびＣＹ７２３；図２Ｂ）。各株の独立した２サンプルを２％グルコース、酵母窒素基礎培地、硫酸アンモニウム、０．１ｍＭのアデニン、および６０ｍＭの３−アミノ−トリアゾールを含む合成培地（プレートＢ）か、またはヒスチジンを添加した同培地（プレートＡ）上に線状接種する。プレートＡは３０℃で３日間インキュベートし、プレートＢは５日間インキュベートする。これらの結果により、ＧＨおよびＧＨＲが、リガンド−受容体結合を示唆する相互作用においてレポーター遺伝子のＧａｌ４依存性の活性化を媒介し得ることが実証される。
【００４６】
実施例１Ａ：ＧＨおよびＧＨＲ融合タンパク質の存在下における発現した遊離リガンド（ＧＨ）の競合
酵母核の外部環境におけるＧＨとその受容体との外見上の結合を実証する目的で、ＧＨペプチドがＧＨ−Ｇａｌ４融合タンパク質と競合することを示すために、「遊離」リガンドの発現を媒介する第三のプラスミドを付加して系を改変し、実施例１に示される２−ハイブリッド相互作用を反転させる。親株Ｙ１９０（Ｗａｄｅ Ｈａｒｐｅｒ ら， １９９３）を、５−フルオロ−オロチン酸を含有する培地で増殖させて、自然にＵＲＡ３遺伝子を欠損する誘導体を選択する（Ｒｏｓｅ ら， １９９０）。得られた株（ＣＹ７７０と呼ぶ）を、第三の構成要素（すなわち、第三のプラスミド）から同時に発現したタンパク質の作用を調べるあらゆる実験に用いる。ＧＨをコードするｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ部位を含む３８塩基の５’オリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＣＣＴＴＧＴＣＣ−３’）（配列番号５）およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む２６塩基の３’オリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴ−３’）（配列番号６）を用いてＰＣＲ法にて作製し、次に、ベクターｐＣＵＰ中へサブクローニングする。ｐＣＵＰはｐＲＳ３１６由来の誘導型酵母発現ベクターである（Ｈｉｌｌ ら， １９８６）。簡単に説明すると、該ベクターは、酵母ＰＧＫ遺伝子（ｐＰＧＫ由来；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９０）の３’末端を、転写ターミネーターとするためのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片としてｐＲＳ３１６クローニング領域へ挿入することにより構築される。該プラスミドに対して、ＣＵＰ１プロモーター領域（Ｂｕｔｔ ら， １９８４）を、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてＰＣＲで増幅し、プラスミドの対応する部位へ挿入してｐＣＵＰを作製する。次に、該ＧＨ発現プラスミド（ＧＨ−ｐＣＵＰ）を、ＧＨおよびＧＨＲ融合構築物とともにＣＹ７７０株へ同時形質転換して、ＣＹ７８１を作製する。遊離ＧＨのＧＨおよびＧＨＲ融合タンパク質との同時発現（ＣＹ７８１）は、選択培地上でのＧＨ−ＧＨＲ依存性の細胞増殖をブロックすることにより示される（図２Ｂ）。本実験は、ｉｎ ｖｉｖｏ競合アッセイの典型であり、観測されたリガンド−受容体相互作用の可逆性を実証するものである。
【００４７】
実施例１Ｂ：ペプチドホルモンプロラクチン（ＰＲＬ）とその受容体の結合
本技術を拡張して検証するため、ペプチドホルモンプロラクチン（ＰＲＬ）およびその受容体を用いて同様の系を開発した。プロラクチンはＧＨと構造的に関連し、プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）もまたそのサイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーである。ヒトＧＨとは異なり、亜霊長類のＧＨは、ＰＲＬＲとは容易に結合せず（Ｙｏｕｎｇ および Ｂａｚｅｒ， １９８９）、ＰＲＬもＧＨＲとは容易に結合しない（Ｌｅｕｎｇ ら， １９８７）。成熟ブタＰＲＬはＧＡＬ４活性化ドメインとの融合体として作製する。オリゴヌクレオチドはブタＰＲＬと呼ばれ（ＧｅｎＢａｎｋから入手；受託番号Ｘ１４０６８）、これを用いて、標準的なＰＣＲ法によりブタ下垂体λｇｔｌｌライブラリーから成熟ブタＰＲＬタンパク質ホルモンを作製する。３１塩基の５’オリゴヌクレオチド（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＴ−３’）（配列番号７）はＥｃｏＲＩ部位を含み、アミノ酸１〜７をコードする配列に相当する。３０塩基の３’オリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＡＴＴＣＡＣＧＴＧＧＧＣＴＴＡＧＣＡＧＴＴＧＣＴＧＴＣＧ−３’）（配列番号８）はＥｃｏＲＩ部位を含み、ｃＤＮＡ３’から内因性終結コドンまでの領域に相当する。６００ｂｐ断片が得られ、これをベクターｐＣＲＩＩに連結し、制限酵素消化および配列解析により確認する。ＰＲＬ  ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ部位を介してｐＡＣＴ−ＩＩ中へクローニングする。
【００４８】
ブタＰＲＬ受容体（ＰＲＬＲ）の細胞外ドメインを、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインとの融合体として作製する。オリゴヌクレオチドは、マウスＰＲＬＲの配列をもとに設計する（Ｄａｖｉｓ および Ｌｉｎｚｅｒ， １９８９）。３１塩基の５’オリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＧＡＴＧＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＴＴＧＣＴＴＡＣ−３’）（配列番号９）は、ＳｍａＩ部位を含み、３１塩基の３’オリゴヌクレオチド（５’−ＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＣＴＴＴＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴ−３’）（配列番号１０）は、終結コドンとその後のＳａｌＩ部位とを含む。これらのオリゴヌクレオチドは、アミノ酸１−２２９をコードするＰＲＬＲの細胞外ドメインに隣接している。ブタ下垂体λｇｔｌｌライブラリーを鋳型源として用いる。標準的なＰＣＲ法を用いて６８７ｂｐ断片を作製し、ｐＣＲＩＩに連結し、ヌクレオチド配列を確認する。ＰＲＬＲ  ｃＤＮＡを、ＳｍａＩおよびＳａｌＩ制限部位を介してｐＡＳ２ベクター中にクローニングする。
【００４９】
Ｙ１９０株を、ＰＲＬまたはＰＲＬＲ融合発現プラスミドを用いて、単独（それぞれＣＹ７２７またはＣＹ７２８）またはともに（ＣＹ７２６）形質転換した。ＰＲＬおよびＰＲＬＲの両融合体を発現する細胞は、選択培地で増殖できるが、リガンド融合体または受容体融合体のいずれか単独しか含まない株は増殖できない。これらの結果は、上記実験におけるＧＨ−ＧＨＲ系で見られた結果と同様であり、リガンドがこの受容体スーパーファミリーのメンバーと結合するかどうかを調べる２−ハイブリッド系の全般的な有用性を確証するものである。
【００５０】
実施例１Ｃ：新規な酵母宿主細胞系のリガンド−受容体特異性のさらなる確認
リガンド−受容体特異性を評価するために、さらなる株を構築する。ＧＨおよびＧＨＲ融合タンパク質を発現するＵＲＡ株を、ｐＣＵＰまたはＰＲＬ−ｐＣＵＰを用いて形質転換し、ＰＲＬおよびＰＲＬＲ融合タンパク質を発現する株を、ｐＣＵＰまたはＰＲＬ−ｐＣＵＰを用いて形質転換する。簡単に説明すると、ＧＨ−ｐＣＵＰに関して説明した方法と同様にしてＰＲＬ−ｐＣＵＰを構築する。ＰＲＬ  ｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ部位を有する３３塩基の５’オリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＧＧＧ−３’）（配列番号１１）、および実施例１ｂの３’オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより作製する。得られた断片を、ＥｃｏＲＩ部位を介してｐＣＵＰ中に導入する。上記実施例に示したように、ＧＨおよびＧＨＲ融合体を発現する株は、競合物がない場合には選択培地で増殖するが、この増殖は遊離ＧＨが同時発現することにより停止する。プロラクチン実験でも同じ結果が得られ、酵母細胞におけるリガンド−受容体結合の特異性が確認される。ＰＲＬおよびＰＲＬＲ融合体を含む株（ＣＹ７８７）は選択培地で増殖できるが、この増殖は遊離ＰＲＬの発現によって停止する（ＣＹ７８６；表１）。
【００５１】
ＧＨＲの選択性を調べるため、ＧＨおよびＧＨＲ融合体を含む株をＰＲＬ−ｐＣＵＰを用いて形質転換する。この株は選択培地で増殖する（ＣＹ７８５；表１）。これらのデータは、この系におけるＧＨのその受容体への結合が過剰なＧＨ（ＣＹ７５１）結合とは有効に競合し得るが、関連のＰＲＬペプチド（ＣＹ７５５）とは競合しないことを示している。３種の異種タンパク質を発現する上記の実験結果は、本発明による系におけるリガンド−受容体相互作用の特異性を示している。
【００５２】
【表１】
2004527204.tif 000002
【００５３】
実施例２：リガンド−受容体相互作用を妨げる化合物のスクリーニング
ＧＨＲ−またはＧＨ−Ｇａｌ４融合タンパク質を発現する低コピー数プラスミド（それぞれｐＯＺ１５３およびｐＯＺ１５２）を構築し、これらのタンパク質の発現を低下させる。さらに、発現が停止しない限り、選択培地での細胞増殖を妨害する新規なレポーター遺伝子を構築する。ＧＨＲ融合体発現プラスミドを構築するため、酵母構成プロモーターおよびＧＡＬ４配列を含むＳａＣＩ−ＢａｍＨＩ制限断片を、ｐＡＳｌ（Ｄｕｒｆｅｅ ら， １９９３）から単離し、ｐＵＮ３０（Ｅｌｌｅｄｇｅ および Ｄａｖｉｓ， １９８８）中へクローニングする。次に、ＧＨＲの細胞外ドメインを、実施例１に記載のようなＮｃｏＩ断片として連結することにより、ＧＡＬ４と融合させてｐＯＺ１５３を作製する。ＧＨ融合体発現構築物を構築するため、プロモーターおよびターミネーター配列を含む全ＧＨ−Ｇａｌ４領域を、実施例１に記載のプラスミドからＰｖｕＩ−ＳａｌＩ断片として単離する。このＤＮＡセグメントを、ｐＵＮ１００（Ｅｌｌｅｄｇｅ および Ｄａｖｉｓ， １９８８）中へクローニングしてｐＯＺ１５２を作製する。レポーター遺伝子は、酵母ＣＹＨ２コード領域を単離してこれを酵母発現プラスミドのＧＡＬプロモーターに機能しうる形で連結することにより構築する。簡単に説明すると、ＧＡＬ１プロモーター領域をＹＥｐ３５２（Ｈｉｌｌ ら， １９８６）中に６８５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片として挿入する。ＣＹＨ２配列は、オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＴ−３’（配列番号１２）および５’−ＧＣＡＴＧＣＧＴＣＡＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＡＣＡＧ−３’（配列番号１３）、ならびに鋳型としてｐＡＳ２を用いてＰＣＲで増幅する。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩを用いて消化し、ＹＥｐ３５２−ＧＡＬベクターの対応する部位へクローニングする。これらのプラスミドを、タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド耐性を付与する染色体ｃｙｈ２遺伝子における変異を有する酵母ＣＹ７７０株中へ、形質転換する。シクロヘキシミド感受性（ｃｙｈｓ）とするには、３種総てのプラスミドが存在する必要がある。
【００５４】
リガンドおよび受容体融合プラスミドとレポータープラスミドとを含む株（ＣＹ８５７）は、ＧＨのその受容体への結合を妨げる化合物の簡便な第一のスクリーニングの基礎となる。ＣＹ８５７株を、１０．０ｉｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含有する標準酵母増殖培地に包埋する。ＣＹＨ２レポーター遺伝子の発現を引き起こすリガンド／受容体相互作用のため、この株はｃｙｈｓであり、従って増殖できない。この試験培地に化合物を入れる。ＣＹＨ２が発現しない状態では細胞は培地中に存在するシクロヘキシミド耐性となるので、ＧＨ−ＧＨＲ結合を損なう化合物は、その化合物周辺の細胞の増殖によって同定される。
【００５５】
サンプルの標的を決定する二次スクリーニング
このアッセイにおけるリガンド−受容体結合の妨害は、その化合物と受容体またはリガンド融合成分のいずれかとの反応により生じ得る。新規な化合物の特異的な標的は、融合タンパク質の一つを過剰発現する株を利用する簡便な第二のアッセイによって決定される。ＣＹ８５８株は、その構築物（ｐＯＺ１４９）が高コピー数で細胞内に維持されているため、ＧＨＲ−ＧＡＬ４融合体を大過剰に発現するが、ＧＨ−融合体（ｐＯＺ１５２）は基本株（ＣＹ８５７）と同レベルで維持される。逆に、ＣＹ８５９株は、その構築物（ｐＯＺ１４９）が高コピー数で細胞内に維持されているため、ＧＨ−ＧＡＬ４融合体を大過剰に発現するが、ＧＨＲ融合体（ｐＯＺ１５３）は基本株（ＣＹ８５７）と同レベルで維持される。ＣＹ８５７（低コピー数のプラスミドで発現するＧＨおよびＧＨＲ融合体）を用いる一次スクリーニングにおいて増殖を助ける化合物を、次に、試験株としてＣＹ８５８（ＧＨＲ＞＞ＧＨ）またはＣＹ８５９（ＧＨ＞＞ＧＨＲ）を用いる同様の方法によりアッセイする。例えば、リガンド−受容体結合がＧＨＲと反応する化合物によって阻害される場合、この二次スクリーニングは測定された表現型の検出可能な変化を示す。ＧＨＲ融合体を過剰発現するＣＹ８５８株におけるレスキュー化合物の二次試験は、化合物の存在下ではＣＹ８５９で見られたものよりも小さな増殖を示す。測定された表現型におけるこの検出可能な変化は、ＧＨＲの過剰な存在により化合物が滴定され、これによりＣＹＨ２発現が増強され、細胞増殖が阻害されるために生じるものである。ＧＨＲ融合タンパク質は制限されているので、ＣＹ８５９はＣＹ８５７と同様の検出可能な変化を生じる。リガンド融合体と相互作用する化合物は、この二次アッセイにおいて測定された表現型において逆の変化を示す。
【００５６】
実施例３：リガンド依存性受容体二量体化の証明
多重タンパク質相互作用（例えば、リガンド−受容体−受容体）を、以下のスキームを用いて第三のタンパク質を発現する拡張系により検討する。
受容体二量体の一つのユニットは、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインのいずれかを有する融合タンパク質として作製する。受容体二量体の別のユニットは、対応するＧａｌＤＮＡの結合ドメインまたは活性化ドメイン（ただし、第一の融合体に用いられていないもの）を有する融合タンパク質として作製する。リガンドをコードする遺伝子は第三のプラスミドから発現させ、遊離（非融合）リガンドとして生じる。これら融合タンパク質の相互作用はリガンドの存在下でのみ生じる（図３参照）。
【００５７】
この系の一例として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と、その同族受容体（ＫＤＲ、キナーゼインサートドメイン含有受容体）のリガンド結合ドメインとの相互作用を記載する。ＫＤＲはチロシンキナーゼ受容体であり、二量体の形成（１リガンド−２受容体）は、ホルモンにより誘導される受容体の機能にとって重要であることが示唆されている。ＫＤＲのリガンドドメインをコードするｃＤＮＡ（Ｔｅｒｍａｎ ら， １９９１）は、ＮＣＯＩ−ＢａｍＨＩ断片として単離し、ｐＡＣＴ−ＩＩおよびｐＡＳ２の両ベクター中へクローニングする。ＶＥＧＦの成熟タンパク質をコードするｃＤＮＡは標準的なＰＣＲ法を用いて作製する。オリゴヌクレオチドは公開されている配列（Ｆｉｓｃｈｅｒ ら， １９９１）から設計する。ＥｃｏＲＩ部位を含む３４塩基の５’オリゴヌクレオチド（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＴＡＴＧＧＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡ−３’）（配列番号１４）、およびＥｃｏＲＩ部位を含む２８塩基の３’オリゴヌクレオチド（５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＴＣＡ−３’）（配列番号１５）を用いて成熟タンパク質をコードする４５０ｂｐ断片を作製し、ｐＣＵＰのＥｃｏＲＩ部位へクローニングする。最終的な組換えベクターのＤＮＡを酢酸リチウム法によって酵母へ形質転換し、適当な株を作製する。
【００５８】
酵母宿主株（ＣＹ７７０）をＫＤＲ−ｐＡＣＴ−ＩＩ、ＫＤＲ−ｐＡＳ２およびＶＥＧＦ−ｐＣＵＰを用いて形質転換し、ＣＹ８４６株を作製するか、または両受容体融合体およびｐＣＵＰを用いて形質転換し、ＣＹ８４７株を作製する。さらに対照株として、ＫＤＲ−ｐＡＣＴ−ＩＩおよびＫＤＲ−ｐＡＳ２の双方は、ともに（ＣＹ８４５）、または個別に（ＣＹ８４３またはＣＹ８４４）、もしくは制御された株としてＶＥＧＦ−ｐＣＵＰ単独（ＣＹ８４１）で形質転換する。これらの株の増殖を選択培地上で試験する。ＶＥＧＦリガンドおよび２種の受容体タンパク質を発現する株（ＣＹ８４６）は、ＶＥＧＦリガンドを発現しないＶＹ８４７株と比較して、選択培地上で実質的増殖を示す（図４参照）。これらの結果は、本発明による有効な細胞が、受容体のリガンド依存性の二量体化を研究するために使用できることを示す。
【００５９】
実施例４：二量体受容体系においてリガンドとして機能する化合物のスクリーニング
受容体ユニットの二量体化（オリゴマー化）は、多くの場合、増殖因子、サイトカイン、および上記のもの等、受容体の活性化の重要な第一ステップである。実施例３に記載の新規な細胞系は、受容体の二量体化を促進する（または阻害する）新規な化合物の発見に適用できる。このような新規な相互作用性化合物は、これらの受容体と関連する病態の有効な治療薬として機能し得る。
【００６０】
二量体受容体ユニットを融合タンパク質として発現するプラスミドは実施例３に記載のようにして作製される。ＫＤＲ−ｐＡＣＴ−ＩＩおよびＫＤＲ−ｐＡＳ２融合体を含む株（ＣＹ８４５）は、二量体構造を示す受容体の簡便な一次スクリーニングの一例となる。ＣＹ８４５株を、ヒスチジンを欠く合成寒天培地に包埋する（Ｒｏｓｅ ら， １９９０）。この試験培地の上層に試験化合物を塗布する。２種の受容体融合体の相互作用を誘導する（リガンドの不在下で）化合物により、ＨＩＳ３などのレポーター遺伝子に連結されている内因性の転写アクチベーターの再構成がなされる。この再構成は化合物周辺の細胞の増殖によって確認される。
【００６１】
実施例５：Ｋｖ４．３とＫＣｈＩＰ１の相互作用に関する酵母２−ハイブリッド株の作製
カリウムチャネル４．３のＮ末端（ｈＫｖ４．３Ｎ）と上記の相互作用性タンパク質ＫＣｈＩＰ１との間の相互作用を用いて、Ｇａｌ−ルシフェラーゼレポーター（Ｋｐ１２６；下記のようにクローニングされる）の酵母２−ハイブリッド適用に関して試験を行った。プラスミドｈＫｖ４．３Ｎ−ｐＧＢＴ９およびＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２は、Ａｎ ら， （２０００）に記載されており、これらを用いて２−ハイブリッド解析のための適当な試験酵母株と対照株を作製する。酢酸リチウム法を用いて酵母株を形質転換し、適当な培地にプレーティングする（Ｒｏｓｅ ら， １９９０）。酵母培地および試薬は、すべて標準法を用いて調製する。プラスミドｈＫｖ４．３Ｎ−ｐＧＢＴ９、ＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２、およびＫｐ１２６［Ｇａｌ−ルシフェラーゼ］を、酵母株ＣＹ７７０（米国特許第５，９８９，８０８号明細書；Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， １９９５に記載）へ形質転換し、相互作用株ＫＹ１４０を作製した。プラスミドｐＧＢＴ９、ＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２およびＫｐ１２６を酵母株ＣＹ７７０へ形質転換し、対照株ＫＹ１４２を作製した。プラスミドｈＫｖ４．３Ｎ−ｐＧＢＴ９、ｐＡＣＴ２およびＫｐ１２６を酵母株ＣＹ７７０へ同時形質転換し、対照株ＫＹ１４３を作製した。プラスミドｐＧＢＴ９、ｐＡＣＴ２およびＫｐ１２６を酵母株ＣＹ７７０へ同時形質転換し、対照株ＫＹ１４４を作製した。
【００６２】
酵母２−ハイブリッドの適用において用いるルシフェラーゼレポータープラスミドは、以下のように作製した。プラスミドｐＥＫ１（Ｐｒｉｃｅ ら， １９９５に記載）を、制限酵素ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩで消化し、脱リン酸化してゲル精製した。ルシフェラーゼコード領域をｐＧＬ３ベーシック（Ｐｒｏｍｅｇａ）からＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ  １．９ｋｂ  ｃＤＮＡ断片として得、標準的な方法を用いて精製し、用意したｐＥＫ１ベクターに連結してプラスミドＫｐ１２６を作製した。標準的な方法を用いて組換えＤＮＡをＤＨ５α大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）へ形質転換し、プラスミドＤＮＡを調製する。この構築物を制限酵素解析およびｃＤＮＡ配列解析で確認する（プライマーＫｘ３８：５’−ＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＣＡＴＡＧＧＡＴ−３’）（配列番号１６）を用いる）。Ｋｐ１２６を酵母２−ハイブリッド系に拡張して使用したが、これはもとのＤＮＡ配列由来の原哺乳類コザック配列を有する。
【００６３】
このレポーターの低コピー数（ＣＥＮ）版を作製した。ＵＲＡ３マーキングされたｐＲＳ４１６ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をＳｍａＩで消化し、脱リン酸化し、ゲル単離して精製した。Ｋｐ１２６からＥｃｏＲＩ＋ＭｌｕＩ消化によりＧａｌ１／１０ｐ−ルシフェラーゼカセットを得、プロモーター、ルシフェラーゼＯＲＦおよびｓｔｅ７末端を含む３．５ｋｂ断片を作製した。このｃＤＮＡ断片を平滑末端化し、ゲル単離して精製し、調製したｐＲＳ４１６ベクターへ連結して、結果として得られる組換えプラスミドＫｐ１３２を作製した。プラスミドＫｐ１３２を細菌細胞へ形質転換し、ＤＮＡを調製し、制限解析で確認した。さらに、ＣＥＮルシフェラーゼプラスミドＫｐ１３２のＴＲＰ１マーキング型を作製した。Ｋｐ１２６由来のＧａｌ１／１０−ルシフェラーゼ−ＳＴＥ７タームカセットを含むＭｌｕＩ断片を得、平滑末端化し、適宜調製したｐＲＳ４１４主鎖へ連結してプラスミドＫｐ１３７を作製した。この組換えプラスミドを細菌細胞へ形質転換し、標準的な方法を用いてＤＮＡを調製した。
【００６４】
ｈＫｖ４．３ＮおよびＫＣｈＩＰ１融合タンパク質の２−ハイブリッド相互作用を評価するため、ルシフェラーゼアッセイを行った。簡単に説明すると、コロニーを３ｍｌのＳＣ−、−ロイシン、−トリプトファン−ウラシル酵母培地に接種し、３０℃で一晩増殖させた。細胞密度をＯＤ６００で測定し、密度をＯＤ６００  ０．２に調整した。細胞を９６ウェルプレートに播種し（１００μｌ）、さらに２〜３時間増殖させた。ルシフェラーゼ基質（ＬｕｃＬｉｔｅ， Ｐａｃｋａｒｄ）を加え（１００μｌ）、プレートを振盪しながら、室温、暗所で５０分間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、トップカウントルミノメーター（Ｐａｃｋａｒｄ）の２秒読み取りを用いて測定した。
【００６５】
酵母株ＫＹ１４０中におけるＫｖ４．３Ｎ−ｐＧＢＴ９と（１ｖ）ＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２との生産的タンパク質−タンパク質相互作用のための酵母２−ハイブリッド系における該受容体では、一方の融合タンパク質およびエンプティーベクターのみを含む（ＫＹ１４２、ＫＹ１４３株）、または２つのエンプティーベクターを含む（ＫＹ１４４）適当な陰性酵母対照株と比べて、およそ４７〜５０倍のルシフェラーゼシグナルの上昇が見られた（図５；右側参照）。
【００６６】
４．３Ｎ−ｐＧＢＴ７およびＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２を、低コピー数版のＧａｌ−ルシフェラーゼレポーター（Ｋｐ１３２）とともに用いて、類似の酵母株を作製した。プラスミドｈＫｖ４．３−ｐＧＢＴ９、ＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２およびＫｐ１３２［ＣＥＮに基づくＧａｌ−ルシフェラーゼ］を、酵母株ＣＹ７７０（米国特許第５，９８９，８０８号明細書；Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， １９９５）へ形質転換し、相互作用株ＫＹ１８３を作製した。プラスミドｐＧＢＴ９、ＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２およびＫｐ１３２を酵母株ＣＹ７７０へ形質転換し、対照株ＫＹ１８６を作製した。プラスミドｈＫｖ４．３Ｎ−ｐＧＢＴ９、ｐＡＣＴ２およびＫｐ１３２を、酵母株ＣＹ７７０へ同時形質転換し、対照株ＫＹ１８５を作製した。プラスミドｐＧＢＴ９、ｐＡＣＴ２およびＫｐ１３２を酵母株ＣＹ７７０へ同時形質転換し、対照株ＫＹ１８８を作製した。ルシフェラーゼアッセイは上述のように行った。低コピー数のプラスミドに関する最初の試験では、絶対的ルシフェラーゼシグナルは、同じｈＫｖ４．３およびＫＣｈＩＰ１の２−ハイブリッド相互作用において試験した場合、２ミクロン版のルシフェラーゼレポーターを用いて行ったもののおよそ１／３であった。しかし、ＣＥＮ型のルシフェラーゼレポーターでは、陰性対照株と比較した場合、試験株のルシフェラーゼ活性が１００倍上昇する（図５；左側参照）。
【００６７】
Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）およびＧａｌ４の活性化ドメイン（ＡＤ）との融合体として発現した２種の相互作用タンパク質は、相互作用して、ＧＡＬ−レポーター遺伝子、この場合では、ルシフェラーゼの発現を促す。Ｋｖ４．３タンパク質およびＫＣｈＩＰ１タンパク質は、この系ではＧａｌｌ／１０ルシフェラーゼレポーター遺伝子とともに融合タンパク質として発現した。ルシフェラーゼ活性は、一方の融合タンパク質およびエンプティーベクターのみを含む酵母株に比べ、両融合タンパク質を含む株では３０倍の上昇を示した。
【００６８】
実施例６：レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる酵母２−ハイブリッド系（Ｇ−アルファーＺとＲＧＳＺの相互作用）
酵母におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の機能性を証明するため、酵母２−ハイブリッド実験を行い、Ｇ−アルファーＺ（ＧａＺ）がＲＧＳ−Ｚと相互作用するか否かを調べた。標準的な方法を用いて分子クローニング法を行った（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔ． Ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．）。制限消化を製造仕様書に従って行った。クローニングスキームにおいて適当である場合には、クレノウおよび標準的な方法を用いてｃＤＮＡ断片の末端を埋めて平滑末端とした。ｃＤＮＡ断片および／またはベクターの脱リン酸化は、説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｈｅｉｍまたはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従い、エビアルカリ性ホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いて行った。標準的な方法を用いて連結反応を行い、組換えベクターを大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｇｉｂｃｏ， ＬＴＩ）へ形質転換し、適当な抗生物質を含有するＬＢ−寒天プレートにプレーティングした。コロニーを回収し、プラスミドＤＮＡを、ＤＮＡ  ｍｉｄｉ  ｐｒｅｐキットまたは自動ＤＮＡプレパレーション（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを用いて調製した。プラスミドおよびクローニングの方法論の完全性は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製の試薬およびＡＢＩ製の自動シーケンシス装置を用いて確認した。
【００６９】
ＧアルファーＺおよびＲＧＳ−Ｚの完全なＯＲＦを、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｑｕｉｃｋｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅によって単離した。ＰＣＲプライマーは、ＧアルファーＺ（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｊ０３２６０）およびＲＧＳ−Ｚ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ０７４９７９）のオープンリーディングフレームの５’および３’から設計した。ＰＣＲ増幅は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃＤＮＡ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡキットを用いて標準的なバッファー条件下で行った。プライマーは、ＧアルファーＺ用としては、ＧアルファーＺ−ｆｗｄ ５’−ＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＴＣＧＧＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＡＧＧＡＡＡ−３’（配列番号１７）およびＧアルファーＺ−ｒｅｖ ５’−ＣＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＣＡＴＴ−３’（配列番号１８）とし、ＲＧＳ−Ｚ用としては、ＲＧＳ−Ｚ−ｆｗｄ ５’−ＣＣＣＧＧＣＣＧＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣ−３’（配列番号１９）およびＲＧＳ−Ｚ−ｒｅｖ ５’−ＣＴＣＡＴＧＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＧＧＴＴＣ−３’（配列番号２０）とした。サイクルパラメーターは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で１分のサイクルを計３０回とした。
【００７０】
それぞれＧアルファーＺおよびＲＧＳ−Ｚについて予想される産物長１１９１ｂｐおよび１０３５ｂｐに相当する増幅ＤＮＡ断片を、ジーンクリーン・スピンカラム（Ｂｉｏ１０１）を用いてゲル精製した。次に、ゲル精製した断片を、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＡサブクローニングした。数個の個々のクローンの挿入配列を、ＡＢＩ自動ＤＮＡシーケンサーでの蛍光色素ターミネーティングシーケンシングによって確認した。
【００７１】
ＧアルファＺの全ＯＲＦを含むｐＣＲＩＩプラスミドをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。ＧアルファーＺ  ＯＲＦを含む挿入配列をゲル精製し、ベクターｐＧＢＫＴ７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐＡＣＴ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位に、読み枠が一致するように指向的に連結して、それぞれＧａＺ−ｐＧＢＫＴ７およびＧａＺ−ｐＡＣＴ２を作製した。ＲＧＳ−Ｚの野生型全ＯＲＦを含むｐＣＲＩＩプラスミドを、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、平滑末端化し、ゲル精製した後に、ｐＧＢＫＴ７およびｐＡＣＴ２のＳｍａＩ部位に、読み枠が一致するように連結して、それぞれＲＧＳＺ−ｐＧＢＫＴ７およびＲＧＳＺ−ｐＡＣＴ２を作製した。
【００７２】
構成的に活性な（Ｑ２０５Ｌ； Ｗａｎｇ ら， １９９８）型のＧアルファーＺを作製した。ＧアルファーＺ中のＱ２０５Ｌ変異を、ＧａＺ−ｐＧＢＫＴ７およびＧａＺ−ｐＡＣＴ２プラスミドにおいてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにプライマー５’−ＧＴＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧ−３’（配列番号２１）および５’−ＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＣＣＣＡＣ−３’（配列番号２２）を用いて作製した。組換え変異プラスミドを、細菌細胞へ形質転換し、ＤＮＡを標準的な方法を用いて単離した。得られたコロニーの配列解析により、Ｑ２０５Ｌ  ＧアルファーＺ変異体を確認し、これらをＱ２０５Ｌ／ＧａＺ−ｐＧＢＫＴ７およびＱ２０５Ｌ／ＧａＺ−ｐＡＣＴ２と命名した。
【００７３】
酵母株を酢酸リチウム法を用いて形質転換し、適当な培地にプレーティングした（Ｒｏｓｅ ら， １９９０）。酵母培地および試薬は、すべて標準的な方法を用いて調製した。適当な試験株および対照株としての酵母形質転換体を、プラスミド維持培地にて３０℃で３〜４日間増殖させた。Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ−Ｚを含む活性化ドメインおよび結合ドメインベクターを、酵母株ＣＹ７７０（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， １９９５）へ、シクロヘキシミド（ＣＹＨ２）レポーター（ｐＯＺ１４６；米国特許第５，９８９，８０８号明細書；Ｙｏｕｎｇ ら， １９９８）、またはルシフェラーゼレポーター（Ｋｐ１２６）のいずれかを含むｕｒａマーキングプラスミドとともに形質転換した。作製した酵母株およびその構成を表２にまとめる。
【００７４】
【表２】
2004527204.tif 000003
【００７５】
２−ハイブリッド系において相互作用し、下流のレポーター遺伝子の発現を引き起こすＱ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ−Ｚの能力を調べるため、ヒスチジンレポーター活性を試験した。各株の代表的なコロニーを単離し、１００μｌの水に再懸濁した。次に、５μｌの再懸濁コロニーのアリコートを、ヒスチジンが含まれていない増加濃度の３−アミノトリアゾール（Ｓｉｇｍａ）含有プラスミド維持培地を含んだ寒天プレートに分注し、ヒスチジンレポーターを調べた。Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ−Ｚの両融合タンパク質を含む酵母株は、対照株と比較した場合、ヒスチジン原栄養性および選択培地での増殖を示した。
【００７６】
シクロヘキシミド（ＣＹＨ２）レポーターとともに、ＣＹ７７０でＱ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ−Ｚ融合タンパク質を同時発現する２−ハイブリッド相互作用株を調べた。相互作用株（ｙｂｎ６６）由来のコロニーの大多数は増加濃度のシクロヘキシミド上で増殖できなかったが、このことはＱ２０５Ｌ／ＧａＺとＲＧＳ−Ｚとの間の正の相互作用を示すものである。エンプティーベクターとともにＱ２０５Ｌ／ＧａＺまたはＲＧＳ−Ｚを発現する陰性対照コロニーは、シクロヘキシミド上で増殖し続ける（図６Ａ参照）。
【００７７】
また、Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺ−ｐＧＢＫＴ７とＲＧＳ−Ｚ−ｐＡＣＴ２との間の相互作用に関し、２−ハイブリッド系中のルシフェラーゼレポーターの活性化について調べた。このタンパク質対（Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺ−ＢＤおよびＲＧＳ−Ｚ−ＡＤ）が相互作用し、下流のレポーター遺伝子の発現を引き起こす能力を調べるため、上述のようにルシフェラーゼアッセイを行った。簡単に説明すると、３ｍｌのプラスミド維持（ＳＣ−ロイシン、−トリプトファン−ウラシル）酵母培地にコロニーを接種し、３０℃で一晩増殖させた。細胞密度をＯＤ６００にて測定し、密度をＯＤ６００  ０．２に調整した。細胞を９６ウェルプレートに播種し（１００μｌ）、さらに２〜３時間増殖させた。ルシフェラーゼ基質を加え（１００μｌ）、プレートを振盪しながら、室温、暗所で５０分間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性は、トップカウントルミノメーター（Ｐａｃｋａｒｄ）の２秒読み取りを用いて測定した。図６Ｂに示すように、対照株に比べて、相互作用株でのルシフェラーゼ活性の誘導は５〜１０倍であった。個々のコロニー間で検出されたルシフェラーゼレベルの違いは、２ミクロンプラスミドコピー数または個々のコロニーの増殖速度が若干異なることによるものであった。
【００７８】
実施例７：酵母２−ハイブリッド（ＹＴＨ）一点スクリーニング
５０ｍｌのＳＣ−ｕｒａ−ｌｅｕ−ｔｒｐ培地が入った２５０ｍｌ組織培養フラスコ中で、独立した比較株（ＲＧＳ、および４．３）の培養物を一晩増殖させた（約１００μｌの飽和培養物を接種）［１ヶ月未満、４℃に維持］。一晩インキュベートした後、細胞密度をＯＤ６００で測定したところ、０．１５〜０．６の間であった。培養物を、最終濃度がＯＤ６００＝０．１５となるように、必要に応じてＳＣ−ｕｒａ−ｌｅｕ−ｔｒｐ培地で希釈した。９６ウェルプレートに１００μｌ細胞／ウェルで播種した。９６ウェル用レプリケーターを用いて、化合物を、ウェル当たり約１μｌとなるようにウェルに導入した。プレートを密封し、３０℃で２時間インキュベートした。２時間後、プレートを開封し、１００μｌのＬｕｃＬｉｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ）ルシフェラーゼ基質を各ウェルに加えた。プレートを再び密封し、室温、暗所のシェーカー上で５０分間インキュベートした。プレートを１分間暗所で平衡化（装置内）した後にＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔプレートカウンターで２秒／ウェルでカウントした。
【００７９】
アッセイ当たりの総数／ウェルをＤＭＳＯ（３％）対照ウェルにおける総数で割って、陰性対照株と比較した、株当たりの各化合物の阻害率（％）を求めた。種々の株を各特異的試験株の対照として用いた。
【００８０】
この一点アッセイで阻害を示した化合物を上記の用量応答曲線で試験した。化合物は、試験株と対照株で評価した。図７Ａによれば、化合物ＳＢＱ−１Ｂ３が、ｈＫｖ４．３Ｎ／（１ｖ）ＫＣｈＩＰ１相互作用酵母株対Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ含有酵母株におけるルシフェラーゼ活性の特異的調節を示すことが明らかとなる。これに対し、化合物ＳＢＱ−３Ｄ１０（図７Ｂ）は、Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ含有酵母株に比べ、ｈＫｖ４．３Ｎ／ＫＣｈＩＰ１相互作用株のルシフェラーゼ活性において特異的効果（低下）を有する。
【００８１】
これらの実験は、酵母２−ハイブリッド実験で用いられるルシフェラーゼレポーターがモジュレーター、この場合では小分子、の同定に有用であることを実証するものである。しかし、このアッセイ形式は、ペプチド、抗体、結合化学物質、または目的とするいずれかのタンパク質−タンパク質相互作用の可能性のあるモジュレーターとなり得る他のポリペプチド等の、その他の調節物質の評価のために全般的に有用である。
【００８２】
実施例８：レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる酵母２−ハイブリッド系（抗ＫＣｈＩＰ１一本鎖抗体［ＳｃＦｖ＿Ｅ２］とｈＫＣｈＩＰ１（エピトープ）の相互作用）
ＳｃＦｖ（抗ＫＣｈＩＰ１）の分子試薬を以下の方法を用いて作製した。ハイブリドーマ細胞溶解物（Ｋ５５／８２）からｍＲＮＡを単離し、標準的な方法でｃＤＮＡを作製した。可変Ｌ鎖およびＨ鎖配列をＰＣＲ増幅し、組換えファージ抗体系（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて構築した。次に、この構築した一本鎖抗体ＰＣＲ増幅産物をｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へクローニングし、配列解析を行った。何らかの組換えのに起因して酵母２−ハイブリッドベクターｐＡＳおよびｐＡＣＴ２への挿入配列の直接サブクローニングには問題があったため、代わりに、この挿入配列を、鋳型としてｐＣＲＩＩ一本鎖組換体を用いるＭ１３フォワードおよびリバースプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。約１ｋｂのＰＣＲ産物（ＳｃＦｖコード領域＋ＭＣＳの部分）をゲル精製し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＶで制限消化した。９００ｂｐのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＶ断片をゲル精製し、ＮｃｏＩおよびＳｍａＩで切断したｐＡＳおよびｐＡＣＴ２ベクターに連結し、それぞれＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＳおよびＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＣＴ２を作製した。一本鎖抗体ＤＮＡは不安なため、これらの連結産物をコンピテントＳＴＢＬ２細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ形質転換し、適当な培地にプレーティングし、３０℃でインキュベートした。組換えＤＮＡを示すいくつかのコロニーを選択し、プラスミド配列をＤＮＡ配列解析により確認した。
【００８３】
ＳｃＦｖ＿Ｅ２およびｈＫＣｈＩＰ１を発現する酵母株を作製するため、一本鎖抗体を発現する組換え酵母２−ハイブリッドプラスミド（ＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＳおよびＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＣＴ２）を、エピトープｈＫＣｈＩＰ１を発現する組換え酵母２−ハイブリッドプラスミド［ｈＫＣｈＩＰ１−ｐＡＳおよびｈＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２］およびＫｐ１２６（Ｇａｌｌｕｃ）とともに、親酵母株ＣＹ７７０へ同時形質転換した。特に、組換えＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＣＴ２プラスミドを含んでいた形質転換体は、いずれも酵母コロニーを生じなかったことから、この特定の組換えは致死的である可能性がある。適当な試験株および対照株を作製した。これらは下記表３にまとめる。
【００８４】
【表３】
2004527204.tif 000004
【００８５】
適当な試験株および対照株を、上記のように酵母２−ハイブリッドによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子活性に関して試験を行った。ＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＳ融合タンパク質［ｙｂｎ１３Ｌ］またはｈＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２融合タンパク質［ｙｂｎ１５Ｌ］のいずれかを発現し、付随エンプティーベクターを伴なう対照株と比較すると、一本鎖抗体ＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＳおよびｈＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２の両者を発現する酵母株［ｙｂｎ１１Ｌ］は、タンパク質−タンパク質相互作用を生じ、下流のルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を駆動した（図８参照）。図９に示されるように、一本鎖抗体とエピトープ融合タンパク質との両者を含む相互作用陽性酵母株ｙｂｎ１１Ｌでは、ルシフェラーゼ活性が７５倍に上昇した。さらに、ＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＳとｈＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２との融合タンパク質の相互作用も下流のＣＹＨ２遺伝子の発現を駆動し、対照株に比べてシクロヘキシミド感受性および選択培地での細胞増殖の欠如を生じた。
【００８６】
実施例９：ｐＥＫ１−Ｒｅｎレポーター遺伝子を用いた株の作製
ウミシイタケルシフェラーゼのレポーター遺伝子としての有効性を評価するため、ウミシイタケルシフェラーゼコード領域およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを、ｐＲＬ欠損ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ； Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号＃ＡＦ０２５８４４）のＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ二重消化から得た。１１９７ｂｐ断片を平滑末端化し、予めＢａｍＨＩで消化して平滑末端化したｐＥＫ−１ベクターに連結し、プラスミドｐＥＫ１−Ｒｅｎを作製した。組換えプラスミドを、細菌細胞へ形質転換して、精製し、配列解析により確認した。
【００８７】
Ｋｐ１２６（ホタルルシフェラーゼ）との２−ハイブリッド相互作用のために発生したものに類似の酵母株を、ウミシイタケルシフェラーゼレポーターを用いて作製した。酵母ＣＹ７７０を、ＧアルファーＺ（Ｑ２０５Ｌ）、ＲＧＳ−ＺおよびレポーターｐＥＫ１−Ｒｅｎの２−ハイブリッド融合体をコードするプラスミドで同時形質転換して、試験株と対照株とを作製した。同様にＣＹ７７０をｈＫｖ４．３−ｐＧＢＫＴ７およびＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２およびレポータープラスミドｐＥＫ１−Ｒｅｎで同時形質転換して、表４にまとめた試験株および対照株を作製した。
【００８８】
【表４】
2004527204.tif 000005
【００８９】
次に、これらの株を、ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現が引き起こされる生産的２−ハイブリッド相互作用について検討した。簡単に説明すると、コロニーを３ｍｌのプラスミド維持培地（ＳＣ−ｌｅｕ−ｔｒｐ−ｕｒａ）に接種し、３０℃で一晩増殖させた。細胞密度をＯＤ６００で測定し、適当な細胞密度（０．１〜０．５ＯＤ）に調整した。酵母細胞を１００μｌのアリコートとして９６ウェルに播種し、３０℃でさらに２〜３時間増殖させた。ウミシイタケルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）をプレートに加え、適当な時間（説明書に従い１〜１０分）で発光を測定した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性をトップカウントルミノメーター（Ｐａｃｋａｒｄ）の２秒読み取りで測定した。アッセイは３回行って平均値をとった。
【００９０】
酵母２−ハイブリッド相互作用における、ウミシイタケルシフェラーゼのレポーター遺伝子としての有効性を評価するため、ｈＫｖ４．３ＮとＫＣｈＩＰ１との間の相互作用、ならびにＲＧＳｚとＱ２０５Ｌ／ＧａＺとの間の相互作用の評価を行った。適当な試験株および対照株を上記のようにして試験した。ＲＧＳｚとＱ２０５Ｌ／ＧａＺとの相互作用に関しては、Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺ−ｐＧＢＫＴ７およびＲＧＳｚ−ｐＡＣＴ２の両融合タンパク質を発現する酵母株［ｙｂｎ７０Ｌ］は、下流のウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を引き起こす、生産的タンパク質−タンパク質相互作用を示した。これに対し、Ｑ２０５Ｌ  ＧアルファーＺ−ｐＡＳ融合タンパク質［ｙｂｎ７１Ｌ］またはＲＧＳｚ−ｐＡＣＴ２融合タンパク質［ｙｂｎ７２Ｌ］のいずれかをエンプティー付随ベクターとともに発現する対照株は、ルシフェラーゼ活性を示さなかった。両エンプティーベクター（ｐＡＳおよびｐＡＣＴ２）を含むｙｂｎ７３Ｌ株は、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の発現を示さなかった。両融合タンパク質を含む相互作用株ｙｂｎ７０Ｌでは、ウミシイタケルシフェラーゼ活性が４０倍上昇した。
【００９１】
ｈＫｖ４．３ＮとｈＫＣｈＩＰ１との相互作用に関しても同様の結果が見られた。酵母株ｙｂｎ７７Ｌ［ｈＫｖ４．３Ｎ−ｐＧＢＴ９およびＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２から両融合タンパク質を発現する］は、ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を引き起こし得る生産的タンパク質間相互作用を示した。ルシフェラーゼ活性は、それぞれ単一の融合タンパク質ｈ４．３Ｎ−ｐＧＢＴ９またはＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２と、付随のエンプティーベクターとを含む対照酵母株であるｙｂｎ７８ＬやｙＢＮ７９Ｌよりもずっと高かった。ｈＫｖ４．３ＮとｈＫＣｈＩＰ１との融合タンパク質間の生産的相互作用により、２−ハイブリッド系におけるウミシイタケルシフェラーゼ活性が２５倍上昇した。
【００９２】
実施例１０：異なるルシフェラーゼレポーター遺伝子（ホタル・ルシフェラーゼレポーターおよびウミシイタケルシフェラーゼレポーター）を発現する株を用いた多重アッセイ
２つの異なる酵母２−ハイブリッド相互作用株（ＲＧＳｚとＧアルファーＺ  Ｑ２０５Ｌ；およびｈＫｖ４．３とＫＣｈＩＰ１）における、ウミシイタケレポーター遺伝子活性が示されると、種々のスクリーニング用の株を効果的に多重化することができる。独立したレポーター遺伝子を用いることにより、１つのアッセイサンプル内や、ウェル内に、酵母株を混在させることができる（多重化）。さらに、独立したレポーター遺伝子を用いることにより、迅速に応答株の評価および同定を行うことができる。従来、すべての株に同じレポーター遺伝子を用いるサンプルの多重化には、特定のどの株がそのレポーター遺伝子活性の原因となっているのかを確かめるための包括的な追跡デコンヴォルーションが必要であった。２つの異なるレポーター遺伝子を用いることにより、次のようないくつかの利点が得られる：１）アッセイの経済性（２つの異なるアッセイを単一のウェルに圧縮し、供給量を少なくし、限られた化合物源でも使用できる）；２）１つのウェル中で化合物を適用および評価することによりウェル間の変動、例えばピペット操作などによる変動が小さくなるので、対照アッセイの完全性が高まること；３）特定のタンパク質−タンパク質相互作用に対して２−ハイブリッド相互作用の動態に対するアッセイ条件を調整制御しやすいこと。
【００９３】
１つのアッセイウェル中に、別々のルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いた２つの独立した２−ハイブリッド酵母株を、混合（すなわち、多重化）することができることを証明するため、融合タンパク質としてＱ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ−Ｚを発現し、かつ、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する酵母株（ｙｂｎ６６Ｌ）と、融合タンパク質としてｈＫｖ４．３およびＫＣｈＩＰ１を発現し、かつ、ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する酵母株（ｙｂｎ７７Ｌ）とを試験した。酵母株を３０℃にてプラスミド維持培地で一晩増殖させ、細胞密度をＯＤ６００で測定した。各株を種々の割合で混合し、両形態のルシフェラーゼ活性についてアッセイを行った。ｙｂｎ６６Ｌ（Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ−Ｚ）と、ｙｂｎ７７Ｌ（ｈＫｖ４．３およびＫＣｈＩＰ１）とが、それぞれ、１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、および０：１００（μｌ）の割合となるように、これら二種の株を混合した。これらの株を同じ細胞密度（ＯＤ＝０．１５）または異なる細胞密度（ｙｂｎ６６ＬがＯＤ＝０．２５、ｙｂｎ７７ＬがＯＤ＝０．１５）で試験した。各２−ハイブリッド株の酵母細胞を適宜混合し、上記のように、一般的なルシフェラーゼアッセイの後に２−ハイブリッドによって駆動されたルシフェラーゼ活性を調べた。酵母細胞を９６ウェルプレートに播種し、３０℃で約３時間インキュベートした。ホタルルシフェラーゼ基質（ＰｒｏｍｅｇａまたはＰａｃｋａｒｄ）を加え、細胞を約３０分間にわたって室温の暗所で振盪しながらインキュベートした。ホタルルシフェラーゼ活性を、トップカウントルミノメーター（Ｐａｃｋａｒｄ）の２秒読み取りで測定した。次に、ウミシイタケルシフェラーゼ基質を同じウェルに加え、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、トップカウントルミノメーター（Ｐａｃｋａｒｄ）の１０秒読み取りで測定した。各酵母株の、個々のルシフェラーゼレポーター遺伝子によるルシフェラーゼ活性の上昇倍率は、アッセイウェルにつき一株として個々に試験した場合に見られるものと同等であった。これらの２種の株の多重化においては、総ての組合せにおいて、２−ハイブリッドによって駆動されるルシフェラーゼ活性の検出が可能であった。最も適切な割合は、ｙｂｎ６６２Ｌ株（細胞密度０．２５）とｙｂｎ７７株（細胞密度０．１５）とが７５：２５となる割合のようであった。この組合せでは、約９５０，０００光単位のホタルルシフェラーゼ活性と、約４，５００，０００光単位のウミシイタケルシフェラーゼ活性とを生じ、対照株からはっきりと識別されるものであった（図１０および１１）。
【００９４】
この多重化方式は、目的とするタンパク質−タンパク質相互作用のモジュレーター（小分子、発現ペプチド、またはその他の分子）の作用を評価するために用いられる。例えば、独立した２−ハイブリッド酵母株由来の細胞を適当な割合で混合し、９６ウェルプレートに分注する。化合物を加え、細胞を上記のようにインキュベートする。ルシフェラーゼ活性を、上記のように各レポーター遺伝子について測定する。各株のルシフェラーゼ活性を、化合物陰性ウェルに対して（ビヒクル対照）規格化する。化合物の作用はルシフェラーゼ活性の変化によって判明する。あるタンパク質−タンパク質相互作用に対する化合物の特異的作用は、一方の試験株のみにルシフェラーゼ活性の変化があることにより判明する。例えば、ｈＫｖ４．３とＫＣｈＩＰ１との相互作用に対して特異的作用を有する可能性がある化合物は、酵母株ｙｂｎ７７Ｌのルシフェラーゼ活性に影響するが、Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ−Ｚを含むｙｂｎ６６Ｌでは、ルシフェラーゼ活性に対する影響は見られない。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用を妨害する化合物は、ルシフェラーゼ活性の低下として観測される。
【００９５】
本明細書に挙げられた刊行物および特許明細書は、引用によりその全開示内容が本明細書の一部とされる。
【００９６】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
個々のプラスミドから２種の異種融合タンパク質（一方は転写活性化タンパク質の活性化ドメインと融合したリガンドであり、他方は、転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと融合した受容体である）を発現する細胞の模式図である。本図は、二つの融合タンパク質の発現、および結合ドメインと活性化ドメインとを１つにし、転写活性化タンパク質を再構成した、リガンドと受容体との結合を示すものである。一旦、転写活性化タンパク質が再構成されて、ＤＮＡ結合ドメインにより上流活性化配列（ＵＡＳ）部位に固定されると、レポーター遺伝子（ＨＩＳ３）の転写が開始される。
【図２】
実施例１において、ＣＹ７２２、ＣＹ７２３、ＣＹ７２４およびＣＹ７８１の非選択培地および選択培地（それぞれ写真ＡおよびＢ）で行われた増殖実験の結果を示すプレートの写真である。
【図３】
リガンドが二重受容体系に結合した二量体モデルの模式図である。この模式図は３つの個別のプラスミドからタンパク質が発現する細胞を示す。２種の異種融合タンパク質（一方の融合タンパク質は転写活性化タンパク質の活性化ドメインと融合した第一の受容体であり、もう一方の融合タンパク質は転写活性化タンパク質のＤＮＡ結合ドメインと融合した第二の受容体である）を発現し、遊離リガンド（すなわち、転写活性化タンパク質の２つのドメインのいずれとも融合していないリガンド）が第三のプラスミドから発現する。本図は結合ドメインと活性化ドメインを１つにして転写活性化タンパク質を再構成した、２つの融合タンパク質の発現、および遊離リガンドおよび２つの受容体融合体との結合を示す。転写活性化タンパク質がひとたび再構成されて、ＤＮＡ結合ドメインによって上流活性化配列（ＵＡＳ）部位に固定されると、レポーター遺伝子（ＨＩＳ３）の転写が開始される。
【図４】
実施例３における、ＣＹ８４６およびＣＹ８４７株で得られた増殖プレートの写真であり、受容体の二量体化のリガンド依存性の刺激を示す。
【図５】
組換え酵母細胞におけるＫｖ４．３とＫＣｈＩＰ１との間のタンパク質−タンパク質相互作用から生じたルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図６Ａ】
両融合タンパク質を含むｙｂｎ６６株がシクロヘキサミド含有培地で増殖できず、これが生産的タンパク質−タンパク質相互作用、およびＣＹＨ２レポーター遺伝子活性の指標となることを示す培地プレートの写真である。
【図６Ｂ】
陰性対照（ｙｂｎ６８Ｌ株）と陽性対照とを比較した場合の、３種類の異なる試験で示されたｙｂｎ６６Ｌ株（表２）で見られるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図７Ａ】
化合物ＳＢＱ−１Ｂ３の、ｈＫｖ４．３Ｎ−ＫＣｈＩＰ１とＱ２０５Ｌ／ＧａＺとの相互作用から生じるルシフェラーゼ活性を調整する能力を示す用量応答曲線である。
【図７Ｂ】
化合物ＳＢＱ−３Ｄ１０の、ｈＫｖ４．３Ｎ−ＫＣｈＩＰ１とＱ２０５Ｌ／ＧａＺとの相互作用から生じるルシフェラーゼ活性を調整する能力を示す用量応答曲線である。
【図８】
ＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＳとｈＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２の双方を発現して生産的タンパク質−タンパク質相互作用を生じる酵母ｙｂｎ１１Ｌ株が有するルシフェラーゼ活性を示すグラフである。また陰性対照株ｙｂｎ１３Ｌおよびｙｂｎ１５Ｌも示す。
【図９】
ＳｃＦｖ＿Ｅ２−ｐＡＳとｈＫＣｈＩＰ１−ｐＡＣＴ２の双方を発現して生産的タンパク質−タンパク質相互作用を生じる酵母ｙｂｎ１１Ｌ株のルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化倍率を示すグラフである。
【図１０】
酵母細胞培養混合物中のウミシイタケルシフェラーゼ、およびホタルルシフェラーゼの活性レベルを示すグラフである。ウミシイタケルシフェラーゼ活性は、Ｑ２０５Ｌ／ＧａＺおよびＲＧＳ−Ｚのタンパク質−タンパク質相互作用から生じたものである。
【図１１】
酵母細胞培養混合物中のウミシイタケルシフェラーゼ、およびホタルルシフェラーゼの活性レベルを示すグラフである。ウミシイタケルシフェラーゼ活性は、４．３Ｎ＿ｐＧＢＴ９およびＫＣｈＩＰ１＿ｐＡＣＴ２のタンパク質−タンパク質相互作用から生じたものである。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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