(57)【要約】本発明は、酸化条件下で改善された安定性を有する新規なＥＧＩＩＩ様セルラーゼに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ中の残基Ｍ７９，Ｍ１５４及び／又はＭ１１８の一つ又は複数に相当する位置において置換又は欠失を含む、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ。
【請求項２】
ＥＧＩＩＩ中の残基Ｍ７９，Ｍ１５４及び／又はＭ１１８の一つ又は複数に対応する位置の、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、セリン又はアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項１記載の変種。
【請求項３】
真菌、細菌又は放線菌に由来する、請求項１記載のセルラーゼ。
【請求項４】
真菌に由来する、請求項３記載のセルラーゼ。
【請求項５】
繊維状真菌に由来する、請求項４記載のセルラーゼ。
【請求項６】
繊維状真菌がＥｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅに属する、請求項５記載のセルラーゼ。
【請求項７】
Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ種、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒｅ種、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ種又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種に属する、請求項６記載のセルラーゼ。
【請求項８】
セルラーゼがエンドグルカナーゼである、請求項１記載のセルラーゼ。
【請求項９】
請求項１記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項９記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
工程：
（ａ）セルラーゼを生成するのに適した条件下で適当な培養培地中で請求項１１記載の宿主細胞を培養し；そして
（ｂ）生成されたセルラーゼを得ること
を含む、セルラーゼを生成する方法。
【請求項１３】
界面活性剤及びセルラーゼを含む洗浄剤組成物であって、上記セルラーゼが酸化感受性残基において置換を含む変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを含む、洗浄剤組成物。
【請求項１４】
上記変種ＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩセルラーゼがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ中の残基Ｍ７９，Ｍ１５４及び／又はＭ１１８の一つ又は複数に相当する位置において置換又は欠失を含む、請求項１３記載の洗浄剤。
【請求項１５】
上記変種がＥＧＩＩＩ中の残基Ｍ７９，Ｍ１５４及び／又はＭ１１８の一つ又は複数に対応する位置の、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、セリン又はアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項１４記載の洗浄剤。
【請求項１６】
洗浄剤がランドリー用洗浄剤である、請求項１３記載の洗浄剤。
【請求項１７】
セルロース含有織物の処理における、請求項１記載の変種ＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
政府後援の研究及び開発
適用外。
【０００２】
発明の背景
セルラーゼは、セルロース中のでβ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解が可能な酵素である。セルロース分解酵素は伝統的に３つの主要なクラスに分類されてきた：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドラーゼ及びβ−グルコシダーゼであり（Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８７），ＴＩＢＴＥＣＨ  ５，２５５−２６１）；多数の細菌、酵母及び真菌により製造されることが知られている。
【０００３】
多くの工業上のプロセスにおけるその有用性のため、ひとつ又は複数の特定の応用に関して特に有効な性能特性を有する特定のセルラーゼ組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）又は成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を研究する分野において時代の風潮があった。セルラーゼの可能な源として、実務家は真菌及び細菌に焦点を合わせた。例えば、特定の真菌、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種（特に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）により生産されるセルラーゼは大いに注目されたが、何故ならばセルロースの結晶形態を分解することができる完全なセルラーゼが発酵の手法により大量に容易に提供されるからである。この特定のセルロース複合体を広く分析することにより、その特定の成分の性質及びそれらの成分が工業上のプロセスにおいて機能する能力を測定した（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，１６０，２５，ｐａｇｅｓ  ２３４，及び次参照（１９８８））。米国特許番号５，４７５，１０１（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．）は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のエンドグルカナーゼＩＩＩ（ＥＧＩＩＩ）と呼ばれる一つの特に有用な酵素の精製及び分子クローニングを開示する。
【０００４】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１４９５３は、各２０ヌクレアーゼ有する一連のＤＮＡ配列の何れか一つを含む核酸によりコードされるエンドグルカナーゼを開示する。
【０００５】
Ｏｏｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２１７−２２２（１９９０）は、アミノ酸ストリングスＮＮＬＷＧ，ＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓにより生産されるエンドグルカナーゼＥＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を開示する。Ｓａｋａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３５−４３９（１９９５）は、アミノ酸ストリングスＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ由来のエンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１をコードするｃＤＮＡ配列を開示する。Ｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，は、アミノ酸ストリングスＮＮＬＷＧ，ＥＬＭＩＷ及びＧＴＥＰＦＴを有するＥＧＩＩＩの配列を開示する。さらに、２つのセルラーゼ配列、一方がＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖａｒａそしてＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓが、Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ９０：９−１４（１９９０）及びＨｒｅｇｇｖｉｄｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ．６２：３０４７−３０４９（１９９６）に開示されており、アミノ酸ストリングＥＬＭＩＷを含む。
【０００６】
上記のエリアの幾つか又は全てにおいて応用性を有する多くのセルラーゼ組成物に関する業界の知見に拘わらず、セルラーゼが有用な応用において存在する条件下で改良された安定性を有する新規のセルラーゼ組成物、例えば家庭の界面活性剤及びランドリーの界面活性剤及び織物処理用の組成物に関する継続する要求が存在する。
【０００７】
発明の概要
本発明によれば、変種（ｖａｒｉａｎｔ）のＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼが提供され、一つ又は複数のアミノ酸が修飾されるか又は欠失していることにより、改善された性能を授与するが、酸化系においての安定性を含む。
【０００８】
一つの態様において、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼが提供されるが、当該変種は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ中の残基Ｍ７９，Ｍ１５４及び／又はＭ１１８の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。好ましい態様において、上記変種は、７９、１１８及び／又は１５４位におけるメチオニンの、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、セリン又はアラニンによる置換を含む。
【０００９】
この発明の別の態様において、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、真菌、細菌又は放線菌に由来する。好ましい側面において、セルラーゼは真菌に由来する。より好ましい側面において、真菌は繊維状真菌である。もっとも好ましい態様において、繊維状真菌は、Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅに属し、限定ではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ種、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒｅ種、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ種又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種を含む。この態様の別の側面において、セルラーゼはエンドグルカナーゼである。
【００１０】
この発明の別の側面において、この発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡである。別の態様において、ＤＮＡはベクター中にある。さらに別の態様において、上記ベクターにより宿主細胞を形質転換する。
【００１１】
別の態様において、この発明のセルラーゼを生産する方法が提供される。上記方法は、セルラーゼを生産するために適した条件下で適当な培養培地中で請求項１２記載の宿主細胞を培養し、そして任意に上記セルラーゼを精製して、精製されたセルラーゼ生成物を提供する工程を含む。
【００１２】
この発明の別の態様において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ中の残基Ｍ７９及び／又はＭ１１８の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む変種ＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩセルラーゼを含む洗浄剤が提供される。好ましい態様において、上記変種は、７９、１１８及び／又は１５４位におけるメチオニンの、ロイシン、イソロイシン、バリン、スレオニン、セリン又はアラニンによる置換を含む。
【００１３】
この態様の別の側面において、洗浄剤はランドリー用洗浄剤である。さらに別の側面において、上記洗浄剤は皿用洗浄剤である。
別の態様において、この発明の変種ＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、セルラーゼ含有織物の処理において使用される。
【００１４】
発明の詳細な説明
出願人は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩの酸化が当該酵素中の特定の位置、＋７０，＋１１８及び＋１５４において起こることを発見した。天然のセルラーゼにおいて、これらの部位はメチオニンが占める。天然のメチオニンを別のアミノ酸に置換することにより、出願人は、酸化により安定な酵素を製造した。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩに対するセルラーゼ相同体は公知であって、ＥＧＩＩＩの中に見いだされるメチオニンに均等な残基が配列比較により決定され得るから；本発明は、さらに、酸化条件下でＥＧＩＩＩ様セルラーゼの性能を変化させるアミノ酸修飾をもつＥＧＩＩＩ様セルラーゼを包含する。
定義
他に定義しない限り、本明細書にて使用される全ての技術用語及び科学用語は、発明が属する分野の当業者に共通に理解されるのと同じ意味を有する。全ての文献は全ての目的のために引用により編入される。本明細書にて記載されたのと類似又は均等なあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験において用いることができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明のために、以下の用語を以下に定義する。
【００１５】
「セルラーゼ」は、当業界においてよく分類されているカテゴリーの酵素であり、セルロースポリマーを短いロ−オリゴサッカライドオリゴマー、セロビオース及び／又はグルコースに加水分解できる酵素を含む。セロビオース酵素の共通の例は、セロビオヒドロラーゼ類及びエンドグルカナーゼ類であり、そしてセルロース分解性生物の多くの種から得ることができ、特に真菌及び細菌を含む。
【００１６】
「ＥＧＩＩＩ」セルラーゼは、米国特許第５，４７５，１０１号及びＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｅｃｏｎｄ  ＴＲＩＣＥＬ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｒｅｅｓｅｉ  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ  Ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，Ｓｕｏｍｉｎｅｎ  ＆  Ｒｅｉｎｉｋａｉｎｅｎ  ｅｄｓ．，Ｅｓｐｏｏ  Ｆｉｎｌａｎｄ（１９９３），ｐｐ．１５３−１５８（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．８）に記載されたエンドグルカナーゼ成分を意味する。本明細書において議論されるとおり、ＥＧＩＩＩはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）に由来し、そして約５．８の至適ｐＨ、約７．４の等電点（ｐＩ）及び約２５ｋＤの分子量により特徴付けられる。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩと一般に呼ばれる酵素は、文献において数人の著者らにより名称ＥＧＩＩＩと呼ばれたが、その酵素は分子量、ｐＩ及び至適ｐＨに関して本明細書中のＥＧＩＩＩと定義した酵素とは実質的に異なる。
【００１７】
本発明による「ＥＧＩＩＩ様酵素」、「ＥＧＩＩＩ様蛋白質」又は「ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ」は、ＥＧＩＩＩと共通の特定のアミノ酸ストリングスを有することによりＥＧＩＩＩに関連する酵素を意味する。本明細書にて使用されるとおり、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩを包含することも意図する。即ち、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、
【００１８】
【化１】
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【００１９】
の一つ又は複数からなる群から選択されるアミノ酸ストリングスを中に含むアミノ酸配列を含む、セルロース溶解活性を有する酵素を含む。
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの非限定代表は、図３に見いだすことができる。
【００２０】
「変種」は、Ｃ−末端及びＮ−末端のいずれか又は両方への一つ又は複数のアミノ酸の追加、アミノ酸配列中の一つ又は複数の異なる部位における一つ又は複数のアミノ酸の置換、蛋白質の一方又は両方の末端か又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の欠失、又はアミノ酸配列中の一つ又は複数の部位における一つ又は複数のアミノ酸の挿入により、前駆体蛋白質（例えば、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ）から誘導される蛋白質を意味する。酵素の変種の調製は、好ましくは、天然蛋白質をコードするＤＮＡ配列を修飾し、そのＤＮＡ配列による適当な宿主の形質転換、及び修飾されたＤＮＡ配列の発現による変種酵素の形成により達成する。発明の変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、前駆体酵素のアミノ酸配列との比較の上で変更されたアミノ酸配列を含むペプチドを含み、但し上記変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは前駆体酵素の特徴的な酵素の性質は保持するが、いくつかの特定の側面において変更された特性を有してよい。例えば，上記変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、酸化条件下で増加した安定性を有してよいが、その特徴的なセルロース溶解活性は保持する。しかしながら、変種の活性は前駆体酵素に比較して増加しているか又は低下していてよい。本発明による変種は、発現されたセルラーゼ変種の機能活性が保持されたＥＧＩＩＩ様セルラーゼ誘導体をコードするＤＮＡ断片に由来してよいことが意図される。例えば、セルラーゼをコードするＤＮＡ断片は、コードされたセルラーゼの機能活性が保持されるように、５’又は３’の何れかにおいてセルラーゼＤＮＡ配列に連結したヒンジ又はリンカーをコードするＤＮＡ配列又はその一部をさらに含んでよい。
【００２１】
ＥＧＩＩＩ内に存在する残基に「相当する」か又は「均等な」ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ中の残基は、一次配列相同性、三次構造相同性（例えば、結晶構造又はコンピューターモデリングにより示される）又は機能均等性により示されるとおり、ＥＧＩＩＩ中のそれの均等な位置に存在する残基を意味する。変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、前駆体ＥＧＩＩＩ様セルラーゼのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。前駆体セルラーゼは天然のセルラーゼ及び組換えセルラーゼを含む（本明細書において定義される）。ＥＧＩＩＩ様セルラーゼのアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により前駆体ＥＧＩＩＩ様セルラーゼアミノ酸配列に由来する。そのような修飾は、前駆体セルラーゼ酵素自体の操作よりむしろ前駆体セルラーゼのアミノ酸配列をコードする前駆体ＤＮＡ配列の修飾である。前駆体ＤＮＡ配列のそのような操作のための適切な方法は、本明細書そして権利者が同じ米国特許第４，７６０，０２５号及び第５，１８５，２５８号に開示された方法を含む。界面活性剤の存在下で不安定性に必須の位置に相当する特定の残基が置換又は欠失に関して本明細書に同定される。アミノ酸の数（例えば、＋３５）は、図１に示す成熟Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ配列に付された番号を意味する。発明は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ中で特に同定された残基に均等な位置のアミノ酸残基を含むＥＧＩＩＩ様セルラーゼの変異に向けられる。前駆体セルラーゼの残基（アミノ酸）は、それがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ中の特定の残基又は残基の位置に相同であるか（即ち、一次又は三次構造の何れかの位置に相当する）又は機能上類似である（即ち、同じか又は類似の、化学上又は構造上、結合、反応又は相互作用する能力を有する）なら、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの残基に均等である。本明細書にて使用されるとおり、他に示さない限り、ナンバリングは図１に示した成熟ＥＧＩＩＩアミノ酸配列のそれに対応することを意図する。
【００２２】
「洗浄剤組成物」は、汚れたセルロース含有織物の洗濯のための洗浄媒質中の使用のために意図される混合物を意味する。本発明のコンテクストにおいて、そのような組成物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、追加の加水分解酵素、研摩剤、漂白剤、漂白活性化剤、青み剤及び蛍光染料、ケーキング阻害剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤、及び可溶化剤を含んでよい。そのような組成物は、汚れた衣服を洗濯するために一般的に使用されて、ストーンウオッシング組成物とは対照的に製造工程において使用されない。セルラーゼを含む界面活性剤組成物は、例えば米国特許第５，２９０，４７４号及びＥＰ公開番号２７１  ００４に記載されており、引用により本明細書に編入される。
【００２３】
「発現ベクター」は、適切な宿主において上記ＤＮＡの発現を作用させ得る適切な制御配列に作動可能なように連結させたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。そのような制御配列は、転写を作用させるためのプロモーター、転写を制御するための追加のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列を含んでよい。別の細胞種が別の発現ベクターと共に使用されるのが好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて使用されるベクターのための好ましいプロモーターはＡｐｒＥプロモーターであり；Ｅ．ｃｏｌｉにおいて使用される好ましいプロモーターはＬａｃプロモーターであり、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて使用される好ましいプロモーターはＰＧＫ１であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒにおいて使用される好ましいプロモーターはｇｌａＡであり、そしてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのための好ましいプロモーターはｃｂｈＩである。ベクターはプラスミド、ファージ又は単純に有力なゲノミック挿入物であってよい。適切な宿主細胞を形質転換したら、ベクターを宿主のゲノムと独立に複製させて機能させてよく、あるいは適切な条件下でゲノム自体に組み込んでよい。本明細書においては、プラスミド及びベクターを時々交換可能に使用する。しかしながら、発明は、均等な機能を担う発現ベクターの他の形態を含むことを意図し、そして当業界にて公知であるか又は公知になる。即ち、様々な宿主／発現ベクターの組み合わせをこの発明のＤＮＡ配列を発現させるために用いてよい。有用な発現ベクターは、例えば、染色体のセグメント、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の様々な公知の誘導体及び公知の細菌プラスミド、例えばｃｏｌ  Ｅ１，ｐＣＲ１，ｐＢＲ３２２，ｐＭｂ９，ｐＵＣ１９及びそれらの誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド、ホストレンジの広いプラスミド、例えばＲＰ４，ファージＤＮＡ、例えばファージλの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９及び他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３繊維状一本鎖ＤＮＡファージ、酵母プラスミド例えば２μプラスミド又はそれらの誘導体、真核生物において有用なベクター、例えば動物細胞において有用なベクター及びプラスミドＤＮＡとファージのＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、例えばファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミドからなってよい。本発明の発現ベクターを用いる発現技術は当業界公知であり、そして一般的には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載される。しばしば、発明のＤＮＡ配列を含むそのような発現ベクターは、組み込み事象を通して特定の種のゲノムに直接挿入することにより単細胞生物を形質転換する（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＆  Ｌａｓｕｒｅ，ＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．７０−７６（１９９１）及び真菌宿主における標的化ゲノミック挿入を記載するその中で引用された文献を参照、引用により本明細書に編入される）。
【００２４】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、本発明によるＤＮＡを含む発現ベクターに適した宿主を意味する。本発明において有用な宿主細胞は一般的に原核生物宿主及び真核生物宿主であり、発現を達成できるあらゆる形質転換可能な微生物を含む。好ましい宿主株は、限定ではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ｒ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを含む。宿主細胞、組換えＤＮＡ技術を用いて構築ベクターにより形質転換されるか又はトランスフェクトされる。そのような形質転換された宿主細胞は、変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするベクターを複製することができるか又は所望のペプチド生成物を発現できる。本発明による好ましい態様において、「宿主細胞」はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種から創製されたプロトプラストの両方を意味する。
【００２５】
「シグナル配列」は、細胞外への蛋白質の成熟形態の分泌を促進する蛋白質のＮ−末端部分に結合したアミノ酸の配列を意味する。シグナル配列のこの定義は機能性配列である。成熟形態の細胞外蛋白質は分泌プロセスの間に分断されるシグナル配列を欠く。
【００２６】
「ＤＮＡベクター」は、上で記載されたＥＧＩＩＩ様セルラーゼ又は変種をコードする一つ又は複数のＤＮＡ断片又はＤＮＡ変種断片を含むヌクレオチド配列を意味し、変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの発現を誘導するために適切な宿主細胞を形質転換することに際して使用され得る。
【００２７】
「機能的に結合させた」は、制御領域、例えばプロモーター、ターミネーター、分泌シグナル又は増強領域が構造遺伝子に連結されてその遺伝子の発現を制御することを意味する。
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩ
成熟ＥＧＩＩＩのアミノ酸配列は公知であり、図１に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。認識し得るとおり、成熟ＥＧＩＩＩは３つのメチオニンを含む。即ち、ＥＧＩＩＩの酸化安定性を修飾するためには、これら３つの位置のメチオニンを他のアミノ酸で置換する。好ましくは、当該置換は、ＥＧＩＩＩ自体の操作よりもＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡ配列を変更することによりなされる。ＥＧＩＩＩのＤＮＡ配列のそのような操作の適切な方法は、本明細書及び引用により編入される、共通の譲受人の米国特許第４，７６０，０２５号、第５，１８５，２５８号に開示された方法を含む。
【００２８】
好ましい態様において、ＥＧＩＩＩ変種ライブラリーを創製する。ライブラリー内に含まれるのは、ＥＧＩＩＩ変種をコードするＤＮＡ分子である。ＥＧＩＩＩ変種は７９、１１８又は１５４位のいずれか又は全てにおいてアミノ酸の置換又は欠失を有する。より好ましい態様において、ＥＧＩＩＩ変種はＥＧＩＩＩ変種に増加した酵素活性を提供する位置においても置換を有する。この態様の一つの側面において、ライブラリーはランダム化され、例えば、当該ＤＮＡ分子は決定的な位置において１２の天然に生じるアミノ酸の一つをコードするコドンを含む。好ましい側面においては、しかしながら、当該ＤＮＡ分子は各々の決定的な位置において均等なアミノ酸をコードするコドンを含む。均等なアミノ酸はＥＧＩＩＩ様セルラーゼを整列化することにより決定する。整列化は構造又は機能に基づき得る。例えば、図３において、メチオニンはＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの１３９位に存在することが認識され得る（これは図１に示すとおり成熟ＥＧＩＩＩの７９位に相当する）。図３にリストされるＥＧＩＩＩ様セルラーゼの１１において、イソロイシンは１３９位にある。即ち、イソロイシンは成熟ＥＧＩＩＩの７９位のメチオニンに対しての均等なアミノ酸である。
【００２９】
実施例３において認識され得るとおり、メチオニン残基の変更はＥＧＩＩＩを不活性化させる。即ち、活性を回復させるためには、アミノ酸残基の置換、欠失又は付加によりＥＧＩＩＩ変種をさらに操作することを必要とするかもしれない。この態様の一つの側面において、ＤＮＡシャッフリング技術または管理された進化の技術を使用することができる。ＤＮＡシャッフリング又は管理された進化の考察に関しては、その全体を引用により編入する、米国特許第５，８３０，７２１号を参照されたい。簡単に云えば、ＤＮＡライブラリーをＥＧＩＩＩ又はＥＧＩＩＩ変種の鋳型から創製する。ＥＧＩＩＩ配列を使用するなら、所望のメチオニン置換をシャッフリングの前にしなければならない。ＤＮＡコーディング配列へのコドンの変異の導入は、当業界においてよく知られており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌに見いだすことができる。所望の置換を有するＥＧＩＩＩ変種を用いるなら、この停止は不要である。所望のメチオニン置換を有するＥＧＩＩＩ変種が利用可能ならば、変異体のライブラリーを作成することができる。ライブラリーを創製するためには、ＥＧＩＩＩ変種及びシャッフルされる他の配列を断片化する。核酸配列の断片化は当業界においてよく知られており、例示の技術は米国特許第５，８３０，７２１号に見いだすことができる。他の配列は、限定ではないが、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを含んでよく、図３にリストしたものを含む。好ましくは、断片化された配列は二本鎖である。第１工程において二本鎖断片を変性する。これは、条件としては変性に適当な温度に核酸の混合物を加熱することにより達成され得る。好ましくは、温度は８０℃と１００℃の間である。
【００３０】
核酸を一本鎖に変生した後に、鎖を再アニールさせる。アニーリングの忠実度は多くの因子に依存するが、特に温度に依存する。当業者は、相対的に低い温度、例えば２０℃から３０℃が低度の相同性の配列の再アニーリングを促進することになると認識する。即ち、様々な配列を望むならば、クロスオーバー事象を助長して低温において再アニールさせることが最良なはずである。しかしながら、ほとんどの応用に関しては、４５℃から６５℃の再アニーリング温度で十分である。
【００３１】
再アニーリング工程の後又は再アニーリングと同時に、ポリメラーゼを加えて、完全なコーディング領域に断片を集合させる。相同の程度が低くて低温を使用するなら、クレノー断片を用いることができる。しかしながら、相同の程度が高くて再アニーリングに高温を用いるならば、Ｔａｑポリメラーゼを用いることによりコーディング領域を集合させてよい。
【００３２】
集合の後に、上記核酸断片は、コンカテマー核酸断片を含む長いＤＮＡ分子上に存在することになる。この大きな核酸は、オリジナルのＥＧＩＩＩ変種鋳型と同じサイズのＤＮＡの複数コピーを含んでよい。ＥＧＩＩＩ変種及びＥＧＩＩＩ様セルラーゼ変種の単一コピー（ＥＧＩＩＩ様セルラーゼコーディング領域が核酸断片混合物中で表されるなら）は、制限酵素消化又は当業者に知られている他の方法により大きなＤＮＡ分子から放出される。これらの単一コピーは、次に、伸長合成、クローン化及び分析のためにベクターに挿入される。当業者は、ＰＣＲ増幅を利用することにより、制限消化前の大きなＤＮＡ分子、制限消化後の単一コピー又は特別上等の（ｏｆ ｃｈｏｉｃｅ）ベクターに挿入した後の単一コピーのいずれかのコピー数を増加させてよいことを実感する。
【００３３】
好ましい態様においては、どのアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加が酵素活性を回復するのに必要な活性部位を復帰させるかを決定するために、ＥＧＩＩＩの三次構造を試験してモデル化する。これは、その三次構造がｘ線結晶解析により決定される、ＥＧＩＩＩを含むセルラーゼに関する三次構造のレベルにおいて相同性を決定することにより実施してよい。均等な残基はＴ．ｒｅｅｓｅｉからのＥＧＩＩＩ及びセルラーゼの特定のアミノ酸残基の主鎖の２つ又は複数の原子の原子配位結合（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣ、Ｏ上のＯ）が整列化後に０．１３ｎｍ及び好ましくは０．１ｎｍの範囲であるものとして定義される。整列化は、最良のモデルが並べられて配置されることにより、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩに対して問題のＥＧＩＩＩ相同物の非水素蛋白質原子の原子配位結合の最大のオーバーラップを提供した後に達成される。最良のモデルはもっとも高い解析において実験上異なるデータに関するもっとも低いＲ因子を利用可能にさせる結晶解析モデルである。
【００３４】
【数１】
2004518406.tif 000004
【００３５】
構造上均等な残基に加えて、機能上均等な残基を置換してよい。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの特定の残基に機能上類似する均等な残基は、それらがＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの特定の残基に対して定義され且つ原因とされるような様式にて蛋白質の構造、基質結合又は触媒性を変更するか又は修飾するか、又は一因となるコンフォメーションを採用してよい、セルラーゼのアミノ酸として定義される。さらに、それらは、与えられた残基の主鎖原子が相同の位置を占めることに基づいて均等の基準を満たさないかもしれないが、残基の側鎖原子の少なくとも２つの原子配位結合がＴ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍに位置する範囲に類似の位置を占めるセルラーゼの残基（ｘ線結晶解析により得られた三次構造に関して）である。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの結晶構造は、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｆｏｕｒｔｅｅｎｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．２０００年８月５−９日に存在し、その開示は全体を引用により編入する。ファミリー１２のグリコシルヒドロラーゼの相同メンバーである、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓのＣｅｌｌ  Ｂの配位結合は、Ｓｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：６０３２（１９９７）及びＳｕｌｚｅｎｂａｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：４８２６（１９９９）に提供される。
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ
この発明の別の態様において、ＥＧＩＩＩ（ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ）に類似のセルラーゼは、酸化安定性を改善するために修飾される前駆体蛋白質である。例えば、図３の計算式から、リストされた２１のＥＧＩＩＩ様セルラーゼ全てが１８１位においてメチオニンを有することが認識され得る（成熟ＥＧＩＩＩの１１８位）。ＥＧＩＩＩにおけるように、この位置におけるアミノ酸の置換はＥＧＩＩＩ様セルラーゼの酸化安定性を修飾する見込みがある。また、ＥＧＩＩＩにおけるように、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ変種の活性は他の決定的な残基の操作及び置換を通して回復されるか又は改善されてよい。
【００３６】
図３に示されたセルラーゼに加えて、この発明はＥＧＩＩＩに対して有意な構造上及び／又は配列上の相同性を有する他の酵素を包含する。即ち、発明のこの態様の一つの側面において、上記酵素は、ＥＧＩＩＩに対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％そしてもっとも好ましくは少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有する。しかしながら、相同性のみでは、本明細書にて記載された上記方法により同定された特定の酵素がＥＧＩＩＩ様セルラーゼを示すか否かについて、しばしば適当な基準でないことを認識するべきである。したがって、相同な酵素は、事実、本明細書にて記載及び例示された方法により検出できるが、相同の程度は発明の範囲を限定するものとして認識されるべきではない。
【００３７】
相同性蛋白質は、「配列比較計算式」を用いて決定することもできる。比較のための配列の最適な整列化は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性計算式によるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）１９７０）の相同性整列化計算式によるか、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によるか、これらの計算式のコンピューター化の実行によるか（ウイスコンシンジェネティックスソフトパッケージ、ジェネティックスコンピューターグループ、５７５サイエンス  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は可視点検により行うことができる。
【００３８】
配列類似性を決定するために適した計算式の例はＢＬＡＳＴ計算式であり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ計算式のを実行するためのソフトウエアは、バイオテクノロジー情報国立センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。この計算式は、データベース配列中の同じ長さの言葉と整列化したときに、いくつかの陽性評価された閾値スコアに適合するか又は満足する質問配列中の長さＷの短い言葉を同定することにより、高いスコアの配列対（ＨＳＰｓ）を最初に同定することを含む。これらの初期の隣接する言葉のヒットはそれらを含む長いＨＳＰｓを発見するための開始ポイントとして作用する。言葉のヒットは、蓄積する整列化のスコアが増加し得る限り、２つの配列の各々が比較される両方向に沿って伸長する。言葉のヒットの伸長は、蓄積する整列化スコアが達成された最大値からの量Ｘにより低下する場合；蓄積スコアがゼロ又はそれ以下になる場合；又は何れかの配列の末端が延びる（ｒｅａｃｈｅｄ）場合に停止する。ＢＬＡＳＴ計算式のパラメーターＷ，Ｔ及びＸは整列化の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは欠点としてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ＆２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）整列化（Ｂ）５０、気体（Ｅ）１０、Ｍ’５，Ｎ’−４、及び両鎖の比較を用いる。
【００３９】
ＢＬＡＳＴ計算式は次に、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴ計算式により提供される類似性の一つの測定は最少合計確率（Ｐ（Ｎ））であり２つのヌクレオチド又は間の配列の間の適合が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、プロテアーゼアミノ酸配列に対する試験アミノ酸配列の比較における最少合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そしてもっとも好ましくは約０．００１未満ならば、アミノ酸配列はプロテアーゼに類似であると考えられる。
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡの単離
発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼはセルラーゼを生産する多くの生物において見いだされるかもしれないことが予測される。しかしながら、おそらく、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの源は、細菌又は真菌、そしてより特定すれば放線菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ又は繊維状真菌由来のものを含む。好ましい態様において、上記セルラーゼは、繊維状真菌ファミリー後生動物、好ましくはＥｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓに由来する。後生動物の中で、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを生成する真菌の系統発生上の分類は、栄養胞子Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍを含む）、Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａを含む）、Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ（Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ、例えばＦｕｓａｒｉｕｍ、Ｎｅｃｉｔｉａ，Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ，Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ及びＧｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ；及びＨｙｐｏｃｒｅａを含む）及びＥｕｒｏｔｉａｌｅｓ（栄養胞子Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍを含む）に由来する。
【００４０】
Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅは、好ましくは、Ｄｉａｐｏｒｔｈａｌｅｓ，Ｈａｌｏｓｐｈａｅｒｉａｌｅｓ，Ｍｉｃｒｏａｓｃａｌｅｓ，Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａｔａｌｅｓ，Ｐｈｙｌｌａｃｈｏｒａｌｅｓ，Ｓｏｒｄａｒｉａｌｅｓ又はＸｙｌａｒｉａｌｅｓに属する。また、好ましくは、Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓは、Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ，Ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ，Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ，Ｎｉｅｓｓｌｉａｃｅａｅ又はＭｉｔｏｓｐｏｒｔｉｃ  Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓを含むＨｙｐｏｃｒｅａｌｅｓに属する。さらに好ましくは、Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａを含まないＨｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅに属する。もっとも好ましくは、Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅは、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ種、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ種、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ種、Ｅｍｅｒｃｅｌｌａ種及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ種である。Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ様セルラーゼを所有するものとして予期される特定の生物は、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ  ｖａｒ．ｔｈｅｒｍ．，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ａｔｒｏｂｒｕｎｎｅｕｍ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｇｌｏｂｏｓｕｍ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｖｉｔｅｌｌｉｕｍ，Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｌａｃｉｎｕｓ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ  ｖａｒ．ｄｉｓｓｉｔｕｍ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｂｒｅｖｉｓ，Ｍｅｍｎｏｎｉｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎａｔａ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｔｉｌｂｏｉｄｅｓ，Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍ，Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ，ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ，Ｓｔｉｂｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ，Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ，Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ  ｓｕｐｅｒｂａ，Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｈｉｎｕｎｉｌｅａ，Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｐａｃｈｙｐｏｄｉｏｄｅｓ，Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｙｓｏｇｅｎｕｍ，Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ  ｓｕｌｆｕｒｅａ，Ｌｕｎｕｌｏｓｐｏｒａ  ｃｕｒｖｕｌａ，Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕｍ，Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｔｒｉｃｔｕｍ，Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｎｅｍａ，及びＵｌｏｃｌａｄｉｕｍ  ｃｈａｒｔａｒｕｍを含む。放線菌の中で、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓはＥＧＩＩＩ様セルラーゼを所有しているらしい。
【００４１】
本発明によるＥＧＩＩＩ様セルラーゼは以下の方法に従い得てよい。縮重ＤＮＡプライマーを、
【００４２】
【化２】
2004518406.tif 000005
【００４３】
の一つ又は複数からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするように構築し、そして確立された方法によりセルロース溶解活性を有する酵素をコードするＤＮＡ及び遺伝子をクローン化するのに使用される。縮重プライマーを用いてＤＮＡを得る技術は当業者の範囲内であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．においてか又はＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（第２版）１−３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９８９）（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；及びＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，（編纂），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９７補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に見いだすことができる。さらに、発明のＥＧＩＩＩは、分子生物学の慣用の方法、例えば、標識プローブを用いたライブラリースクリーニング、発現スクリーニング及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍクローン化により、本明細書においてＥＧＩＩＩ様セルラーゼとして同定されたセルラーゼバックボーンの一つを用いて、得てよい。
【００４４】
縮重プライマーは、与えられた断片が標的生物中で類似の配列に相関するか否かを分析するために、標的生物から得られたゲノミックライブラリーに対してハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。有用なハイブリダイゼーションアッセイは以下のとおりである：特定の標的源からのゲノミックＤＮＡを制限酵素：例えばＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＫｐｎＩ，ＭｌｕＩ，ＳｐｅＩ，ＢｇｌＩＩ，ＮｃｏＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ及びＸｍａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｖ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ  ａｎｄ  Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍにより供給された）による、製造者の支持書に従った消化により断片化する。次に、サンプルをアガロースゲルを通して電気泳動して（例えば、０．７％アガロースのような）、ＤＮＡ断片の分離がサイズにより可視化できる。ゲルを簡単に蒸留水中で洗い、そして次に適切な溶液（例えば、０．２５Ｍ  ＨＣｌのような）中でゆるやかな撹拌により脱プリン化し、そして３０分間変性させる（例えば０．４Ｍ  ＮａＯＨ中で）。再生の工程は、ゲルを１．５Ｍ  ＮａＣｌ，１Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０の中においてゆるやかに３０分間撹拌する。次に、ＤＮＡを適切な陽性電荷膜、例えばＭａｘｉｍｕｍ  Ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ｎｙｔｒａｎ  Ｐｌｕｓ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ．）に、転写溶液（例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭ  ＮａＣｌ，９０ｍＭ）クエン酸３ナトリウムのような）を用いて転写する。転写後に、ゆるやかに２時間またはそれ以上、膜を洗浄して（例えば、２ＸＳＳＣ［２ＸＳＳＣ＝３００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸３ナトリウム］中で）、室温において空気乾燥する。次に、膜を再度ハイブリダイズさせる（約２時間またはそれ以上）が、適切な再ハイブリダイゼーション溶液（例えば、１００ｍＬあたり：３０−５０ｍＬホルムアミド、２５ｍＬの２０Ｘ  ＳＳＰＥ（１ＸＳＳＰＥ＝０．１８Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．７），２．５ｍＬの２０％ＳＤＳ、及び１ｍＬの１０ｍｇ／ｍｌ専断ニシン精子ＤＮＡを含む水溶液のような）中においてである。
【００４５】
上記プライマー配列に相当するＤＮＡプローブをアガロースゲル中で単離して、断片をゲルから切り出して、そして切り出したゲルから回収する。この精製されたＤＮＡ断片を次に標識する（例えば、製造者の支持書に従いＭｅｇａｐｒｉｎｅ標識システムを用いることによりＰ３２をＤＮＡに取り込む（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＬＣ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国））。標識されたプローブを９５℃において５分間変性させ、そしてすぐに上記膜を含む再ハイブリダイゼーション溶液に加える。ハイブリダイゼーション反応は適切な時間の間、適切な条件下で進行するべきであり、例えば、１８時間３７℃にてゆるやかに撹拌する。上記膜を洗浄し（例えば、２Ｘ  ＳＳＣ／０．３％ＳＤＳ中）、次に適切な洗浄溶液を用いて洗浄して、ゆるやかに撹拌する。所望のストリンジェンシーが、膜（フィルター）を洗浄する条件の反映になる。
【００４６】
特定すれば、与えられた反応のストリンジェンシー（即ち、ハイブリダイゼーションの成功に必要な相同性の程度）は、サザンブロットからのフィルターがハイブリダイゼーション後に供される洗浄条件に大きく依存する。本明細書にて定義される「低ストリンジェンシー」条件は、０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳの溶液を用いた２０℃における１５分間のサザンブロットからのフィルターを洗浄することを含む。標準のストリンジェンシー条件は、０．２Ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳの溶液を用いた３７℃における３０分間の２回目のサザンブロットからのフィルターの洗浄を含む洗浄工程をさらに含む。
【００４７】
発明のこの側面による好ましい態様において、縮重プライマーは、一つ又は複数の上記ペプチドに対応して調製される。上記プライマーを標準反応を開始するのに適した条件下で標的生物（即ち、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを検索した生物）からのゲノミックＤＮＡと混合する。この態様において、（ｃ）及び／又は（ｅ）に対応するペプチド（ａ）及び／又は（ｄ）プラスプライマーに相当する縮重プライマーを選択して、それらのプライマーを用いてＤＮＡを増幅するのが有利である。ＰＣＲ反応を実行後に、結果のＤＮＡをポリアクリルアミドゲル上を移動させ、（ｃ）及び／又は（ｅ）に加えて、ペプチド（ａ）及び／又は（ｄ）を含むＥＧＩＩＩ断片にサイズが相当するバンド、即ち４００−１０００塩基対の範囲のバンドを選択する。これらの断片をプールして、ペプチド（ｂ）に相当するペプチド（ａ）及び／又は（ｄ）プラスプライマーに相当するプライマーを用いるかあるいはペプチド（ｂ）に相当するペプチド（ｃ）及び／又は（ｅ）プラスプライマーに相当するプライマーを用いて再度増幅する。予測されたサイズの強いバンド（ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの場合、バンドは約２５０−５００塩基対に相当する）を切り出し、そして配列決定する。単離された配列を次にプライマーのデザインに用いて、これらのプライマーを、例えばゲノミックＤＮＡの末端の迅速な増幅（ＲＡＧＥ）を通して用いることにより、完全長の遺伝子を得る。例えば、Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：２１５−２１６（１９９３）を参照。
【００４８】
上記概要のＤＮＡプライマーとハイブリダイズするＤＮＡ、即ち対応するＥＧＩＩＩコーディング遺伝子をこの方法により同定したＤＮＡを、日常的な方法により単離して、日常的な技術に従い対応するＥＧＩＩＩ様セルラーゼを発現させるために使用してよい。クローン化された遺伝子を得る際、適切な宿主細胞を次に形質転換可能なベクターに上記ＤＮＡを挿入するための日常的な方法を用いる。適切な条件下で形質転換された宿主細胞を培養することは、必要に応じて特定の応用のために得ることができて、精製できてかつ調製できるＥＧＩＩＩ様セルラーゼの生産をもたらす。
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ及び変種の製造と精製
発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼは単離するか又は精製するのが好ましい。本発明のコンテクストにおいて、精製又は単離は一般的に、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを、天然において、例えば源生物において付随する天然に生じる置換体のいくつか又は全て、例えばＥＧＩＩＩセルラーゼに関連して源生物から発現される他のセルラーゼ又は酵素から分離する目的で、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをその天然状態から変更させることを意味する。同様に、発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼは天然状態において天然に存在しない他の成分と化合してよい。単離又は精製は、当業界において認識される分離技術、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性分離、透析、プロテアーゼ処理、硫酸アンモニウム沈殿又は他の蛋白質塩沈殿技術、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、濾過、マイクロ濾過、ゲル電気泳動又は勾配上の分離により、最終の組成物中において不所望な細胞、細胞残渣、不純物、無関係な蛋白質、又は酵素を除去してよい。
【００４９】
本発明は、変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの発現、生成及び／又は単離及び使用に関する。これらの酵素は、以下に記載される方法に従い同定及び単離された遺伝子を利用する組換え方法により調製するのが好ましい。しかしながら、本発明における使用のための酵素は他の当業界で認識される手段、例えば天然単離物からの精製により得てよい。
【００５０】
本発明に従いＥＧＩＩＩ様セルラーゼを発現させるために形質転換される微生物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ種由来の株を含むのが有利であるかもしれない。即ち、本発明に従いＥＧＩＩＩ様セルラーゼを製造するための好ましい様式は、上記のとおりに検出されたＥＧＩＩＩ様セルラーゼの一部又は全部をコードするＤＮＡの断片を少なくとも含むＤＮＡ構築物によりＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の宿主細胞を形質転換することを含む。当該ＤＮＡ構築物はプロモーターに機能するように結合させるのが一般的である。形質転換された宿主細胞は、次に、所望の蛋白質を発現する条件下にて生育させる。次に、所望の蛋白質生成物を実質均一までに精製する。
【００５１】
しかしながら、変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードする所定のＤＮＡのための最良の媒体は、その天然の宿主により異なってよい。即ち、変種ＥＧＩＩＩ  様セルラーゼに関して源の生物に対して系統発生上類似性をもつ形質転換宿主内で蛋白質を発現させるもっとも有利な事になるかもしれない。例えば、別の態様において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを発現宿主として用いることができる。Ａ．ｎｉｇｅｒによる形質転換技術の記載に関しては、ＷＯ  ９８／３１８２１を参照されたい。
【００５２】
従って、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の発現系の本記載は、例示の目的のみ及び発明の変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを発現するための一つのオプションとして提供される。当業者は、しかしながら、適切であれば別の宿主細胞内で変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡを発現させる傾向にあってよく、そして変種ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの源は最適な発現宿主を決定する際に考慮されるべきであることは認識されるべきである。さらに、当業者は、当業界において利用可能なツールを利用する日常の技術を通して特定の遺伝子のための最良の発現系を選択することができる。
【００５３】
一つの態様において、株は過剰発現された蛋白質を得るための有用な株であるＴ．ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）を含む。例えば、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３（１９８４）により記載されたＲＬ−Ｐ３７は上昇量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７の機能上の均等物は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５）及び株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）を含む。これらの株は変種ＥＧＩＩＩを過剰発現するためにも有用なはずであることが予期される。
【００５４】
潜在的に有害な天然のセルロース溶解活性の不在下で変種ＥＧＩＩＩを得ることが望まれる場合、変種ＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構築物又はプラスミドの導入前に欠損させた一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を有していたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主細胞株を得るために有用である。そのような株は、引用により編入される、米国特許第５，２４６，８５３号及びＷＯ  ９２／０６２０９に開示された方法により調製してよい。一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を欠落している宿主微生物中で変種ＥＧＩＩＩを発現させることにより、同定及び次の精製の手法を単純化させる。クローン化されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種からの何れの遺伝子も欠損させることができ、例えば、ｃｂｈ１，ｃｂｈ２，及びｅｇｌ３遺伝子並びにＥＧＩＩＩ及び／又はＥＧＶ蛋白質をコードするものである（例えば、それぞれ、米国特許第５，４７５，１０１号及びＷＯ  ９４／２８１１７）。
【００５５】
遺伝子の欠損は、欠損されるか又は破壊されるべき所望の遺伝子の形態を当業界公知の方法によりプラスミドに挿入することにより達成してよい。欠損したプラスミドは次に適当な制限酵素部位において所望の遺伝子コーディング領域内部で切断されて、そして遺伝子コーディング配列又はその一部を選択マーカーで置き換える。欠損させるか又は破壊する遺伝子の位置の周辺のＤＮＡ配列は、好ましくは約０．５から２．０ｋｂであり、選択可能なマーカー遺伝子の何れかのサイド上に保持される。適当な欠損プラスミドはその中に存在する唯一の制限酵素部位を有することにより、欠損遺伝子を含む断片、周辺ＤＮＡ配列、及び選択可能なマーカー遺伝子が単一の直鎖片として除去されることを可能にさせる。
【００５６】
選択可能なマーカーは、形質転換された微生物の欠損を可能にさせるように選択されなければならない。選択された微生物において発現されるあらゆる選択可能なマーカー遺伝子が適することになる。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種に関しては、選択可能なマーカーは形質転換体において選択可能なマーカーの存在が上記真菌の特性に顕著に影響しないように選択される。そのような選択可能なマーカーはアッセイ可能な生成物をコードする遺伝子であってよい。例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の遺伝子の機能性コピーを使用してよく、宿主内で欠損しているなら、栄養要求性表現型を表す宿主株をもたらす。
【００５７】
好ましい態様において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａのｐｙｒ４−誘導株は機能性ｐｙｒ４遺伝子により形質転換されて、即ち、形質転換のための選択可能なマーカーを提供する。ｐｙｒ４−誘導株は、フルオロオロティック酸（ＦＯＡ）に耐性のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の株の選択により得てよい。ｐｙｒ４遺伝子はオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードし、ウリジンの生合成に必要な酵素である。完全なｐｙｒ４遺伝子を含む株はウリジン欠損培地中で生育するが、フルオロオロティック酸には感受性である。機能性のオロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠くｐｙｒ４−誘導株を選択して、ＦＯＡ耐性に関して選択することにより、生育のためにウリジンを要求することは可能である。ＦＯＡ選択技術を用いることにより、機能性オロテートピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をコードする遺伝子の機能するコピーによりこれらの細胞を形質転換することができる（Ｂｅｒｇｅｓ  ＆  Ｂａｒｒｅａｕ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５（１９９１））。誘導株の選択は上で言及されたＦＯＡ耐性技術を用いて容易に実施され、即ち、ｐｙｒ４遺伝子は選択可能なマーカーとして好ましく用いられる。
【００５８】
一つ又は複数のセルラーゼ遺伝子を発現することに関する能力を欠如させるためにｐｙｒ４−Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を形質転換するため、破壊されたか又は欠損させたセルラーゼ遺伝子を含む単一のＤＮＡ断片を次に欠損プラスミドから単離して、適当なｐｙｒ−Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主を形質転換するのに用いた。次に、ｐｙｒ４遺伝子産物を発現させて即ち宿主株のウリジン栄養要求性を相補するそれらの能力に基づいて、形質転換体を同定及び選択する。サザンブロット分析を次に結果の形質転換体に実施することにより、欠損させた遺伝子のゲノミックコピーのコード領域の一部又は全てをｐｙｒ４選択可能マーカーにより置き換える二重クロスオーバー組み込み事象を確認（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）及び確証（ｃｏｎｆｉｒｍ）する。
【００５９】
上記の特定のプラスミドベクターはｐｙｒ−形質転換体の製造に関するが、本発明はこれらのベクターに限定されない。様々な遺伝子を上記技術を用いてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種において欠損及び置換させることができる。さらに、何れかの利用可能な選択可能なマーカーを上記のとおりに用いることができる。事実、クローン化されて即ち同定された何れのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の遺伝子も上記の戦略を用いてゲノムから欠損させることができる。
【００６０】
上記のとおり、用いられた宿主株は、非機能性遺伝子又は選択された選択可能なマーカーに相当する遺伝子を欠くか又は有するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の誘導体である。例えば、ｐｙｒ４の選択可能マーカーを選択したら、次に、特定のｐｙｒ４−誘導株を形質転換法においてレシピエントとして用い。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓの遺伝子ａｍｄＳ，ａｒｇＳ，ａｒｇＢ，ｔｒｐＣ，ｎｉａＤに均等なＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種遺伝子を含む選択可能なマーカーを用いてよい。対応するレシピエント株は、よって、誘導株、例えばそれぞれａｒｇＢ−，ｔｒｐＣ−，ｎｉａＤ−でなければならない。
【００６１】
次に、適当な微生物への挿入のために、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡを調製する。本発明によれば、変種ＥＧＩＩＩセルラーゼをコードするＤＮＡは、機能するセルロース溶解活性を有する蛋白質をコードするのに必要なＤＮＡを含む。変種ＥＧＩＩＩセルラーゼ又は誘導体をコードするＤＮＡ変種断片は、真菌のプロモーター配列、例えばｃｂｈ１又はｅｇｌ１遺伝子のプロモーターに機能するように連結されてよい。
【００６２】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡの一つより多いコピーを株の中で組換えることにより過剰発現を促進することも意図される。ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡは、セルラーゼをコードするＤＮＡを有する発現ベクターの構築により製造してよい。ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードする挿入されたＤＮＡ断片を有する発現ベクターは、所定の宿主生物内で自律複製可能であるか、又は宿主のＤＮＡに組み込み可能であるあらゆるベクターであってよく、典型的にはプラスミドである。好ましい態様において、遺伝子発現を得るための２種類の発現ベクターが意図される。第１は、プロモーター、遺伝子コード領域、及びターミネーター配列の全てが発現される遺伝子起源である、ＤＮＡ配列を含む。遺伝子の末端削除は、不所望のＤＮＡ配列（例えば、望まないドメインをコードする配列）を欠損させることにより、それ自身の転写及び翻訳制御配列の制御下で発現されるドメインを残すことが望まれる場合に、得てよい。選択可能なマーカーも当該ベクター上に含まれることにより、新規の遺伝子配列の複数コピーの宿主への組み込みのための選択を可能にさせる。
【００６３】
第２の種類の発現ベクターは予め集合させ、そして高いレベルの転写に必要な配列及び選択可能なマーカーを含む。遺伝子又はその一部のコード領域をこの一般的な目的の発現ベクターに発現カセットプロモーター及びターミネーター配列の転写制御下に挿入できることが意図される。例えば、ｐＴＥＸはそのような一般的な目的の発現ベクターである。遺伝子又はその一部は強いｃｈｂ１プロモーターの下流に挿入することができる。
【００６４】
上記ベクター中では、本発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡを転写及び翻訳配列、即ち適当なプロモーター配列及びシグナル配列に作動可能なように構造遺伝子とインフレームにて連結させるべきである。プロモーターは、宿主細胞中で転写活性を示す如何なるＤＮＡ配列でもよく、そして宿主細胞に対して同種又は異種の何れかの蛋白質をコードする遺伝子に由来してよい。上記シグナルペプチドは、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ又はその誘導体の細胞外生産を提供する。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は発現される遺伝子に天然では付随しているのが好ましいが、しかしながら、あらゆる適当な源、例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来のエキソセロビオヒドラーゼ又はエンドグルカナーゼからのシグナル配列が本発明において意図される。
【００６５】
本発明のＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするＤＮＡ配列のプロモーターとの連結及び適当なベクターへの挿入に用いられる手法は、当業界においてよく知られている。
【００６６】
上記のＤＮＡベクター又は構築物は、公知の技術、例えば形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、バイオリスティック砲撃等により宿主細胞に導入してよい。
【００６７】
好ましい形質転換技術において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種内のＤＮＡへの細胞壁の透過性が極めて低いことを考慮しなければならない。従って、所望のＤＮＡ配列、遺伝子又は遺伝子断片の取り込みはせいぜい最少である。形質転換プロセスの前に、誘導株（即ち、使用した選択可能なマーカーに相当する機能性遺伝子を欠く）内のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞壁の透過性を増加させるための多数の方法が存在する。
【００６８】
形質転換のためにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種を製造するために本発明において好ましい方法は、真菌の菌糸体からのプロトプラストの調製を含む。菌糸体は出芽した生長性胞子から得ることができる。菌糸体を、細胞壁を消化する酵素により処理することにより、プロトプラストをもたらす。次に、プロトプラストを懸濁媒質中で浸透圧スタビライザーの存在により保護する。これらのスタビライザーはソルビトール、マニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これらのスタビライザーの濃度は０．８Ｍと１．２Ｍの間で変動する。懸濁媒質中で約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【００６９】
宿主Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種株へのＤＮＡの取り込みはカルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭ  ＣａＣｌ２と５０ｍＭ  ＣａＣｌ２の間が取り込み溶液において用いられる。取り込み溶液におけるカルシウムイオンに関する要求のほかにも、通常含まれる他のアイテムは緩衝系、例えばＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）又は１０ｍＭ  ＭＯＰＳ，ｐＨ６．０バッファー（モルフォリンプロパンスルフォニック酸）及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させて、即ち媒質の含有物がＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種の細胞質へ送達されることを許容して、そしてプラスミドＤＮＡが核に移送されると信じられる。この融合は、宿主染色体へ優しく（ｔｅｎｄｅｒｌｙ）組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数コピーをしばしば残す。
【００７０】
通常、１０８から１０９／ｍＬ、好ましくは２ｘ１０８／ｍＬの密度にて透過性処理に供されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種のプロトプラスト又は細胞を含む懸濁液を形質転換に用いる。適当な溶液（例えば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭ  ＣａＣｌ２）中のこれらのプロトプラスト又は細胞の１００マイクロリットル容量を所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを取り込み溶液に加える。０．１から１容量の２５％  ＰＥＧ  ４０００をプロトプラスト懸濁液に加えることができる。しかしながら、プロトプラスト懸濁液に約０．２５容量を加えるのが好ましい。付加物、例えばジメチルスルフォキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等も取り込み溶液に加えて、形質転換を補助してよい。
【００７１】
通常、上記混合物を１０分から３０分の間０℃においてインキュベートする。追加のＰＥＧを次に混合物に加えることにより、所望の遺伝子又はＤＮＡ配列のとりこみをさらに増強する。２５％  ＰＥＧ４０００を通常は形質転換混合物の容量の５から１５倍の容量にて加える；しかしながら、より高いか又はより低い容量が適当かもしれない。２５％  ＰＥＧ４０００は形質転換混合物の容量の約１０倍が好ましい。ＰＥＧを加えた後に、形質転換混合物を次に室温においてソルビトールとＣａＣｌ２溶液の添加前にインキュベートする。プロトプラスト懸濁液を次にさらに加えることにより生育培地のアリコートを溶解する。この生育培地は形質転換体の生育のみを許容する。所望の形質転換体を生育させるのに適した如何なる生育培地も本発明において使用できる。しかしながら、Ｐｙｒ＋形質転換体が選択されるなら、ウリジンを含まない生育培地を用いることが好ましい。次のコロニーをウリジン枯渇生育培地上に移して精製する。
【００７２】
この段階において、ウリジンを欠く固形培養培地上でのそれらの早い生育及び不規則な輪郭よりむしろスムーズな環状コロニーの形成により、安定な形質転換体を不安定な形質転換体から識別してよい。さらに、いくつかの場合、安定性に関するさらなる試験を、固形の非選択培地上で形質転換体を生育させ（即ちウリジンを含む）、この培養培地から胞子を回収し、そしてウリジンを欠く選択培地上でのちに出芽及び生育するこれらの胞子のパーセンテージを測定することにより行ってよい。
【００７３】
上記の方法の特定の態様において、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ又はその誘導体は、新規なＥＧＩＩＩ様セルラーゼ又はその誘導体の適切な後翻訳プロセスの結果として、液体培地中で生育させた後に宿主細胞から活性形態で回収される。
【００７４】
発現されたＥＧＩＩＩ様セルラーゼは、遠心分離、濾過及び塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清又は濾過物中の蛋白質の沈殿により培地からの細胞の分離を含む慣用技術により培地か回収してよい。さらに、クロマトグラフィー手法、例えばイオン交換クロマトグラフィー又は親和性クロマトグラフィーを使用してよい。抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）を天然の精製されたＥＧＩＩＩ様セルラーゼに対して生じさせてよく、あるいは合成ペプチドをＥＧＩＩＩ様セルラーゼ分子の一部から製造して、ポリクローナル抗体を生じさせるために用いてよい。
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼ及び変種の使用
この発明のセルラーゼは、例えば織物の処理において多くの用途を有する。本発明による織物の処理は、セルラーゼを含む織物の加工又は洗浄を意図する。そのような処理は、限定ではないが、ストーンウオッシュ、セルロース含有織物の手ざわり、質感及び／又は外観を修飾すること又はセルロース含有織物の製造、洗濯／修理の間に使用される他の技術を含む。さらに、この発明のコンテクスト内での処理は、セルロース編み糸又は繊維製品からの「未成熟な」又は「死んだ」コットンの除去を意図する。未成熟なコットンは成熟コットンよりも顕著に無定形であり、そして例えば平行でない乾燥により存在する場合に質の低い織物をもたらす。本発明において意図される酵素は、よごして製造されたセルロース含有織物の洗浄において特に有用なはずであると信じられる。例えば、セルラーゼは洗濯ランドリーのための界面活性剤組成物中で使用してよい。本発明により有用な界面活性剤組成物は、特定の製剤、例えば、洗浄前の、前以て浸す、そしてホームユースの色再生組成物を含む。本明細書において記載されるそのような処理組成物は、希釈を必要とする濃縮物の形態又は希釈溶液の形態又はセルロース含有織物に直接適用できる形態であってよい。織物のセルラーゼ処理の一般的な処理技術は、例えば、ＥＰ公開番号２２０  ０１６及びＧＢ出願番号Ｎｏｓ．１，３６８，５９９号及び２，０９５，２７５号に記載される。
【００７５】
濃縮されたセルラーゼ組成物は本明細書に記載される方法における使用のために調製することができる。そのような濃縮物は、濃縮された量の上記セルラーゼ組成物、バッファー及び界面活性剤を、好ましくは水性溶液中に含む。そうして製剤化された場合、セルラーゼ濃縮物を水により希釈することにより、必要な濃度の各成分を有するセルラーゼ調製物を迅速かつ正確に調製することができる。水性濃縮物を製剤化する場合、これらの濃縮物を希釈することにより、上で示された通りに必要な濃度の成分をセルラーゼ溶液中にて達することができる。容易に明白なとおり、そのようなセルラーゼ濃縮物はセルラーゼ溶液の容易な製剤化を許容し、並びにそれが使用されることになる位置への上記組成物の便利な運搬を許容する。処理用濃縮物は当業界において認識された形態、例えば液体、エマルジョン、ゲル又はペーストであり得る。そのような形態は当業者によく知られている。
【００７６】
固形のセルラーゼ濃縮物を使用する場合、セルラーゼ組成物は顆粒、粉末、塊又は固形ディスクであってよい。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を減じる物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は、米国特許第５，２５４，２８３号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【００７７】
本発明の好ましい態様において、発明のセルラーゼは洗浄剤組成物中に用いてよい。本発明による洗浄剤組成物は前洗浄剤組成物、前浸潤組成物として、又は通常の洗浄又はリンスサイクルの間の洗浄のために有用である。好ましくは、本発明の洗浄剤組成物は、有効量のセルラーゼ、界面活性剤を含み、そして任意に以下に記載される他の成分を含む。特にこの発明のセルラーゼは、酸化剤、例えば漂白剤を含む洗浄剤中で特に有用になる。
【００７８】
この発明の洗浄剤組成物の中に用いられる有効量のセルラーゼは、例えば、毛玉除去（ｄｅｐｉｌｌｉｎｇ）、軟化、抗−毛玉化、表面繊維除去、抗−灰色化及び洗浄を含む、セルラーゼ含有織物上でセルラーゼにより生じることが知られている所望の効果を授与するのに十分な量である。好ましくは、上記洗浄剤組成物中のセルラーゼは約１０ｐｐｍから約２０，０００ｐｐｍの洗浄剤の濃度にて用いられる。
【００７９】
洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の濃度は、洗浄媒質への希釈に際してセルラーゼ酵素の濃度が約０．０１から約１０００ｐｐｍ、好ましくは約０．０２ｐｐｍから約５００ｐｐｍ、そしてもっとも好ましくは約０．５ｐｐｍから約２５０ｐｐｍ全蛋白質の範囲にあるように、選択されるのが好ましい。洗浄剤組成物中に用いられるセルラーゼ酵素の量は、洗浄剤が水への添加により希釈されて洗浄溶液を形成する程度に依存する。
【００８０】
本発明の洗浄剤組成物は、当業界において認識されている形態、例えば液体中、顆粒中、エマルジョン中、ゲル中、又はペースト中であってよい。そのような形態は当業者によく知られている。固形の洗浄剤組成物を用いる場合、セルラーゼは顆粒として用いるのが好ましい。好ましくは、顆粒を製剤化することにより、セルラーゼ保護剤を追加して含ませることができる。顆粒を製剤化することにより、洗浄媒質への顆粒の溶解速度を低下させるための物質を含ませることができる。そのような物質及び顆粒は米国特許第５，２５４，２８３号に記載されており、その全体を引用により本明細書に編入する。
【００８１】
この発明の洗浄剤組成物は表面活性化剤、例えば界面活性剤を用い、洗浄剤組成物中でのそれらの使用に関してよく知られた、アニオン性、非イオン性及び量性界面活性剤を用いる。上記セルラーゼ組成物及び界面活性剤に加えて、この発明の洗浄剤は以下の成分一つ又は複数を任意に含むことができる。
【００８２】
本発明によるセルロース溶解物質の処理は、さらに、動物用飼料、パルプ及び／又は紙、当業界公知の食品及び穀類の処理を意図する。例えば、セルラーゼは動物飼料の有用性を高め、ウッドパルプの排水性（ｄｒａｉｎａｂｉｌｉｔｙ）を改善し、食品を増強し、そして穀類の湿潤製粉プロセス又は乾燥製粉プロセスの間に穀類中の繊維を減少させることが知られている。
【００８３】
本発明及びその利点をさらに例示するために、以下の特定の実施例を、本発明を例示するために提供されるという理解のもとに提供するが、如何なる様式においてもその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００８４】
実施例
実施例１：ＥＧＩＩＩ様セルラーゼをコードするゲノミックＤＮＡの調製
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼが特定の生物のＤＮＡによりコードされているか否かを決定するためにＰＣＲ反応に着手する目的で、いくつかの異なる微生物に関してゲノミックＤＮＡを調製した。
【００８５】
ゲノミックＤＮＡは、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｂｒａｃｈｙｐｅｎｉｕｍ  寄託番号  ＣＢＳ  ８６６．７３；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｌｉｅｎｃｅ  寄託番号  ＣＢＳ  １４０．５０；Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｖｉｔｅｌｌｉｕｍ  寄託番号  ＣＢＳ  ２５０．８５；Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕ  寄託番号  ＣＢＳ  ６５３．７３；Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ  寄託番号  ＣＢＳ  １８５．３４；Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  寄託番号  ＣＢＳ  ４４３．６５；Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｉａ  寄託番号  ＣＢＳ  ２２５．６３；Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  寄託番号  ＡＴＣＣ  ４８１０３−４８１０４；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ  寄託番号  ＡＴＣＣ  ９１７８，９１７９；及びＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  寄託番号  ＡＴＣＣ  ２８３２６から得て、標準の方法に従い単離した。
【００８６】
ＰＣＲは、ＭＪリサーチ社のＰＣＴ−１５０  ＭｉｃｒｏＣｙｃｌｅｒのような標準のＰＣＲマシン上で、以下の条件下において実施した：
１）１分間、９８℃、１サイクル；
２）１分間、９４℃、
９０秒間、４０℃、
１分間、７２℃
３）工程２を３０サイクル繰り返す、
４）７分間、７２℃、１サイクル、及び
５）低温から１５℃にて貯蔵及び次の分析。
【００８７】
以下のＤＮＡプライマーを、様々な微生物から構築されたライブラリーからのＥＧＩＩＩ遺伝子の増幅における使用のために構築した。蛋白質及びＤＮＡの配列に関する本明細書中の全てのシンボルは、ＩＵＰＡＣ  ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎコードに対応する。
【００８８】
【化３】
2004518406.tif 000006
【００８９】
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：１０μＬの１０Ｘ反応バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ８−８．５；２５０ｍＭ  ＫＣｌ；５０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４；２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む１０Ｘ反応バッファー）；０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ（最終濃度）；１μＬの１００ｎｇ／μＬのゲノミックＤＮＡ；１μＬのＰＷＯポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイム、カタログ番号１６４４−９４７）をμＬあたり１ユニット；５００ｍＭのプライマー（最終濃度）及び水を１００μＬまで。上記溶液にミネラルオイルを重層した。
【００９０】
ＰＣＲの戦略は以下のとおりであった：ＢＯＸ１（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及び３２）及びＢＯＸ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）のフォワードプライマーを、ＢＯＸ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２−４６）からのリバースドプライマーと、所望のゲノミックＤＮＡサンプルと共に混合し、そして４００−１０００塩基対の範囲の断片を得るためゲル上を移動させた。そうして得られた断片をプールして、当該プールを２つのおおよそ等しい部分に分割した（ｓｐｌｉｔ）。第１のプールを、ＢＯＸ１（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１及び３２）及びＢＯＸ１’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）からのフォワードプライマーと、ＢＯＸ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）からのリバースドプライマーと共に、混合した。第２のプールを、ＢＯＸ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）と、ＢＯＸ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２−４６）からのリバースドプライマーと共に、混合した。上記遺伝子内のプライマーの位置を考慮してＥＧＩＩＩ様セルラーゼに比較して近似のサイズを有する断片、この場合約２５０−５００塩基対に相当する断片を単離して配列決定した。
【００９１】
配列決定した断片から、完全長の遺伝子の配列を迅速に得るために、ＲＡＧＥ技術（ゲノミックの末端の迅速な増幅）を使用することが可能であった。完全長の遺伝子を得て、図３のいくつかの追加のＥＧＩＩＩ様セルラーゼを提供する。図３に示すとおり、Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ（１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ（２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８），Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９），Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｌｉｅｎｓｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１），Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２），Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍ（１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３），Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍ（２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８），Ｍｅｍｎｏｎｉｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎａｔａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９），Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０），Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ  １１ＡＧ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１），Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＣｅｌＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２），Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖａｒａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）から単離された全部が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩに有意な相同性を含んだ。
実施例２：ＥＧＩＩＩ変種
部位特異的変異導入を実施して、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩにアミノ酸置換を取り込んだ。以下のプライマーを用いて、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来のＥＧＩＩＩ中のシステイン置換を生じさせた。ＰＣＲは公知の技術に従い実施した。
【００９２】
【表１】
2004518406.tif 000007
【００９３】
簡単に云うと、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩをコードするＤＮＡをｃＤＮＡクローンから（Ｗａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒｉｃｅｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ”Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．”Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ  １９９３  Ｅｄ．Ｓｏｕｍｉｎｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｒｅｉｎｉｋａｎｅｎ，Ｔ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．８，ｐｐ１５３−１５８；米国特許第５，４７５，１０１号）、ｅｇｌ３遺伝子の５’末端にＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（最初のＡＴＧコドンのすぐ上流）及び３’末端にＸｂａＩ部位を導入した（「停止」コドンのすぐ下流）ＰＣＲプライマーを用いて、増幅した。増幅された断片は、次に、ＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩにより消化し、そしてＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩにより消化されたｐＵＣ１９に連結した。
【００９４】
変種はこのプロトプラスト中においてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）変異導入法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて作成した。変種遺伝子を次にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの発現ベクターｐＰＧＰＴ−ｐｙｒＧ（Ｂｅｒｋａ  ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｄｖ．７：１２７（１９８９））にサブクローン化した。変種遺伝子を有するベクターにより次にＡ．ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ：ａｗａｍｏｒを形質転換して、その結果の株を撹拌フラスコ培養にて成育させた（ＷＯ  ９８／３１８２１）。
【００９５】
ＥＧＩＩＩ変種を次にこれらの培養物の細胞不含上清からカラムクロマトグラフィーにより精製した。簡単に云えば、１０ｍｇのＥＧＩＩＩあたり、約１ｍＬのＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（高速流）樹脂を０．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む使い捨てドリップカラムに負荷した。当該カラムを次に０．０５ＭのＢｉｓ  Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ及び０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８により平衡化した。
【００９６】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼを含む上清を一晩０．１８ｍｇ／ｍＬのエンドグルカナーゼＨにより３７℃において処理した。硫酸アンモニウムを処理上清に約０．５Ｍの最終濃度まで加えた。遠心分離後に、上清を上記カラムに負荷した。当該カラムを次に３容量の平衡化バッファーにより洗浄して、次に２ｘ１容量の０．０５Ｍ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ及び０．０５Ｍ酢酸安アンモニウムによりｐＨ８にて溶出した。フロースルーの各容量を別々の画分として回収したところ、ＥＧＩＩＩ様セルラーゼは第２の画分に出現した。
実施例３：ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの比活性
比活性をアッセイするため、ＮＰＣの加水分解アッセイを用いた。マイクロタイタープレート中で、１００μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５及び２０μｌの２５ｍｇ／ｍＬ  ｏ−ＮＰＣ（ｏ−ニトロフェニルｏ−Ｄ−セロビオシド（シグマＮ  ４７６４））をアッセイバッファー中で加えた。プレートを１０分間４０℃においてインキュベートした。
【００９７】
平衡化したら、１０μｌのＥＧＩＩＩ様セルラーゼを加えて、プレートを４０℃においてさらに１０分間インキュベートした。加水分解を消滅させて反応を停止するため、７０μＬの０．２Ｍグリシン、ｐＨ１０．０を加えた。次に、プレートをマイクロタイターリーダー中で４１０ｎｍにおいて読んだ。規準として、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩの１０μＬの０．１ｍｇ／ｍｌ溶液は約０．３付近のＯＤを提供した。
【００９８】
ＥＧＩＩＩ様セルラーゼの濃度を２８０ｎｍにおける吸光により測定したが、減衰定数はＰａｃｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｓｃｉ．４：２４１１（１９９５）に記載されたＥｄｅｌｈｏｃｈの方法により実験上測定された７８７１１  Ｍ−１ｃｍ−１又は３．３５２ｇ／Ｌ−１であった。
【００９９】
ＥＧＩＩＩ変種の融点は平衡ＣＤにより測定した。実験は、Ａｖｉｖにより供給された５位置熱電気セルホルダーを備えた、Ａｖｉｖ  ６２ＤＳ又は６２ＡＤＳ分光計上で実施した。バッファー条件は、酢酸によりｐＨ８．０に調節された５０ｍＭ  ｂｉｓ−ｔｒｉｓプロパン及び５０ｍＭ酢酸アンモニウムであった。各実験の最終蛋白質濃度は５−３０ｍＭの範囲であった。データは０．１ｃｍパス長のセル中で回収した。
【０１００】
スペクトルは、２６５−〜２１０ｎｍにおいて回収した。熱変性は２１７ｎｍにおいて３０から９０℃において実施し、データは２度おきに回収した。各温度における平衡時間は０．１分であり、そしてデータはサンプルあたり４秒間回収した。
【０１０１】
ｐＨ８．０サンプルの残りは５ｘ４００μＬアリコートに分割した。２つのサンプルを酢酸によりｐＨ５と７に調節し、そして他の２つを水酸化ナトリウムによりｐＨ９と１０に調節した。全５サンプルの熱変性を上記のとおりに同時に実施した。融点は、Ｌｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１０６６９及びＧｌｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：５６１２の方法に従い測定した。
【０１０２】
【表２】
2004518406.tif 000008
【０１０３】
表２から認識され得るとおり、他のアミノ酸による置換はＥＧＩＩＩ変種の比活性を有意に減少させた。しかしながら、他のアミノ酸のＥＧＩＩＩ変種への置換は変種の比活性を回復させるらしい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明により記載された残基を示すＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの成熟ＥＧＩＩＩ蛋白質のアミノ酸配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【図２】
図２は、イントロンを除いたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのＥＧＩＩＩのＤＮＡ配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
【図３】
図３は、２０のＥＧＩＩＩ様セルラーゼの完全長のＥＧＩＩＩの整列化における整列化を示し、一次配列モデリングに基づいた均等残基を示し、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３），Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ（１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ（２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７），Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８），Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９），Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０），Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｂｒａｓｉｌｌｉｅｎｓｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１），Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｅｑｕｉｓｅｔｉ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２），Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍ（１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３），Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｊａｖａｎｉｃｕｍ（２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７），Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ（４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８），Ｍｅｍｎｏｎｉｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎａｔａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９），Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｄｅｓｅｒｔｏｒｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０），Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ  １１ＡＧ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１），Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＣｅｌＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２），Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３），及びＥｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖａｒａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を含む。
【図１】
2004518406.tif 000009
【図２】
2004518406.tif 000010
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004518406.tif 000054
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