(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）の新規化合物を記載するが：【化１７】2004502701.tif 000019（Ｉ）式中、ＱはＨまたは糖もしくは糖類似体または核酸バックボーンもしくはバックボーン類似体であり、ＹはＯ、ＳまたはＮＲ１０（式中、Ｒ１０はＨ、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである）、ＸはＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールもしくはそれらの組合せまたは、好ましくは、レポーター基である。これらの新規化合物はオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド中への組込みに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造式を有する化合物であって、
【化１】
2004502701.tif 000015
式中、ＱはＨまたは糖もしくは糖類似体または核酸バックボーンもしくはバックボーン類似体であり、ＸはＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールもしくはそれらの組合せまたはレポーター基であり、そしてＹはＯ、ＳまたはＮＲ（式中、ＲはＨ、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである）である
化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、
ａ）Ｑが以下に示す置換基である、ヌクレオシドもしくはヌクレオシド類似体：
【化２】
2004502701.tif 000016
式中、ＺはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＳＯ、ＮＲ９（式中、Ｒ９はＨ、アルキル、アルケニル、アルキニルもしくはレポーター基である）またはＣＨ２であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一もしくは異なりかつそれぞれがＨ、ＯＨ、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、Ｏ−ヒドロカルビル、ＮＨＲ （式中、ＲはＨ、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである）またはレポーター基であり、
Ｒ５はＯＨ、ＳＨもしくはＮＨ２またはモノ−、ジ−もしくはトリ−ホスフェートまたはチオホスフェート、または対応するボラノホスフェートであり、またはＲ２、Ｒ４およびＲ５の一つはホスホルアミダイトもしくはポリヌクレオチド鎖に組込みのための他の基、またはレポーター基であり、またはＱは以下の修飾した糖構造式の一つからなるが：
【化３】
2004502701.tif 000017
2004502701.tif 000018
式中、Ｒ１２はＣ１−Ｃ４アルキル、ヒドロキシＣ１−Ｃ４アルキルもしくはＨ、好ましくはメチル、ヒドロキシメチルもしくはＨであり、そしてＲ１４はＣ１−Ｃ６アルキル、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミン、Ｃ１−Ｃ６カルボキシアルキルもしくは好ましくはレポーター部分であるか；
またはｂ）Ｑが、糖−ホスフェートの繰返し体もしくは修飾した糖−ホスフェートの繰返し体（ＬＮＡ）からなる核酸バックボーン、またはペプチドもしくはポリアミド核酸（ＰＮＡ）のようなバックボーン類似体である、ポリヌクレオチドである化合物。
【請求項３】
レポーター部分が存在する、請求項１もしくは２のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項４】
レポーター部分がシグナル部分である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
レポーター部分が反応性基もしくはシグナル部分または少なくとも２個の鎖原子を持つリンカーにより分子の残余に結合した固体表面である、請求項３もしくは請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘがヌクレオチド塩基に正味の正もしくは負の電荷を付与する、請求項１〜５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ５がトリホスフェートである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ２、Ｒ４およびＲ５の一つがホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホネートから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のヌクレオチド類似体の少なくとも一つの残基を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ＤＮＡもしくはＲＮＡである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ポリメラーゼもしくは末端のデオキシヌクレオチジル転移酵素の存在下で、ポリヌクレオチドを請求項１〜７のいずれか１項に記載のヌクレオシドトリホスフェート類似体と反応させることを含む、鎖伸長方法。
【請求項１２】
その方法がヌクレオシド類似体残基の塩基に結合する抗体を検出のために用いることを含む、請求項９もしくは請求項１０に記載のポリヌクレオチドを検出する方法。
【請求項１３】
逆転写酵素の存在下に、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヌクレオチド類似体を含むモノマー混合物と共にＲＮＡ鋳型をインキュベートすることを含む、ｃＤＮＡを作製する方法。
【請求項１４】
その方法が、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヌクレオチド類似体を含むモノマー混合物を用いることを含む、ＰＣＲによりポリヌクレオチドを増幅する方法。
【請求項１５】
質量分析法による分析のための標識として、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
治療に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
抗−ウィルス剤として使用するための、請求項１６に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（序言）
本発明は、新規化合物、例えば、広範な種々の分子生物学の応用に用いることができる核酸を標識化するために用いることができる、修飾した塩基類似体、に関する。
【０００２】
（背景技術）
レポーター基で標識化された核酸分子は、シークエンシングおよびハイブリダイゼーション研究のような多くの分子生物学技法に用いられている。標識化された核酸分子は種々の方法により生成されている。これらの方法としては、ヌクレオシド、デオキシヌクレオシドもしくはジデオキシヌクレオシドのトリホスフェートの標識化、ホスホルアミダイトの標識化および標識の核酸への直接結合が挙げられる（Ｒｅｎｚ、ＥＰ　１２０３７６）。生成した標識化ヌクレオチドおよび標識化核酸分子は、核酸のハイブリダイゼーション研究および核酸のシークエンシングに用いることができる。これらの技法には、例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐおよび３５Ｓの放射性同位元素、ハプテン、ビオチン、質量標識もしくは蛍光を含む、広範な種々の標識が用いられている。
【０００３】
核酸の標識化において、修飾した塩基またはヌクレオチド類似体の使用に益々興味がもたれている。これらの類似体の幾らかは、塩基特異的でありそして単一の天然塩基、即ちＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、の代わりに核酸中に組み込まれ得る。他の類似体は、一つ以上の天然塩基と塩基対になりこの故に一つ以上の天然塩基の代わりに組み込まれる潜在性を有する。
【０００４】
ＷＯ　９７／２８１７７は以下の構造式を含むヌクレオシド類似体を開示するが：
【化４】
2004502701.tif 000002
式中、ＸはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＳＯ、ＣＯもしくはＮＲ７であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一もしくは異なりかつそれぞれがＨ、ＯＨ、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、Ｏ−ヒドロカルビルもしくはレポーター基であり、
Ｒ５はＯＨまたはモノ−、ジ−もしくはトリ−ホスフェートまたはチオホスフェートまたは対応するボラノホスフェートであり、
またはＲ２およびＲ５の一つはホスホルアミダイトであり、
ＺはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＳＯ、ＮＲ９もしくはＣＨ２であり、
そして、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は同一もしくは異なりかつそれぞれがＨ、アルキル、アリールもしくはレポーター基である。
【０００５】
ＷＯ　９９／０６４２２は以下の構造式を含む塩基類似体を開示するが：
【化５】
2004502701.tif 000003
式中、ＸはＯもしくはＮＲもしくはＳであり、
ＹはＮまたはＣＨＲ６もしくはＣＲ６であり、
ＷはＮもしくはＮＲ６またはＣＨＲ６もしくはＣＲ６であり、
ｎは１もしくは２であり、
それぞれのＲ６は独立してＨもしくはＯまたはアルキルもしくはアルケニルまたはアルコキシもしくはアリールまたはレポーター部分であるが、
そこでは、必要により（即ち、Ｙおよび／もしくはＷがＮもしくはＣＲ６であるとき）、二重結合がＹおよびＷもしくはＷおよびＷの間に存在し、
そしてＱは糖もしくは糖類似体である。
【０００６】
（本発明の概要）
本発明は、下記の式の新規化合物を記載するが：
【化６】
式（Ｉ）
2004502701.tif 000004
式中、ＱはＨまたは糖もしくは糖類似体または核酸バックボーンもしくはバックボーン類似体であり、ＹはＯ、ＳまたはＮＲ１０（式中、Ｒ１０はＨ、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである）、ＸはＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールもしくはそれらの組合せまたは、好ましくは、レポーター基である。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
第一の態様において、本発明は、式（Ｉ）の新規化合物を提供するが、式中、ＱはＨまたは糖もしくは糖類似体または核酸バックボーンもしくはバックボーン類似体であり、ＹはＯ、ＳまたはＮＲ１０（式中、Ｒ１０はＨ、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである）、ＸはＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールもしくはそれらの組合せまたは、好ましくは、レポーター基である。このレポーター基は、Ｘについて既に定義したオプションと同様であり得るかもしくはより大きくてもよい、適切なリンカーアームを介して複素環に結合してもよい。この態様において、適切には、Ｘは、３０個の原子まで、さらに好ましくは１２個の原子までの鎖を含むことができる。レポーターは１２個の原子以上を含んでもよい。Ｘはまた、ヌクレオチド塩基に正味の正もしくは負の電荷を付与する、荷電した基を含んでもよい。
【０００８】
適切には、ＱはＨまたは以下の置換基から選択してもよい：
（ｉ）
【化７】
2004502701.tif 000005
式中、ＺはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＳＯ、ＮＲ９（式中、Ｒ９はＨ、アルキル、アルケニル、アルキニルもしくはレポーター基である）またはＣＨ２であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一もしくは異なりかつそれぞれがＨ、ＯＨ、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、Ｏ−ヒドロカルビル、ＮＨＲ１１（式中、Ｒ１１はＨ、アルキル、アルケニルもしくはアルキニルである）またはレポーター基である。適切には、ヒドロカルビル基は６炭素原子までを持つ。Ｒ１１およびＲ９は３０個の原子まで、さらに好ましくは１２個の原子までの鎖を含んでもよい。
【０００９】
Ｒ５はＯＨ、ＳＨもしくはＮＨ２またはモノ−、ジ−もしくはトリ−ホスフェートまたはチオホスフェート、または対応するボラノホスフェートであり、またはＲ２、Ｒ４およびＲ５の一つはホスホルアミダイトもしくはポリヌクレオチド鎖に組込みのための他の基、またはレポーター基であり；
またはＱは以下の修飾した糖構造式の一つであってもよい：
構造式（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）を持つ非環式糖
【化８】
2004502701.tif 000006
式中、Ｒ１２はＣ１−Ｃ４アルキル、ヒドロキシＣ１−Ｃ４アルキルもしくはＨ、好ましくはメチル、ヒドロキシメチルもしくはＨである、
または構造式（ｉｖ）〜（ｖｉ）を持つ糖
【化９】
2004502701.tif 000007
【化１０】
2004502701.tif 000008
【化１１】
2004502701.tif 000009
上記の式中、Ｒ１４はＣ１−Ｃ６アルキル、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミン、Ｃ１−Ｃ６カルボキシアルキルもしくは好ましくはレポーター部分である。
【００１０】
（ｖｉｉ）すなわちＱは、糖−ホスフェートの繰返し体もしくは修飾した糖−ホスフェートの繰返し体（例えばＬＮＡ）（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５４， ３６０７−３０）からなる核酸バックボーンまたはペプチドもしくはポリアミド核酸（ＰＮＡ）（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４， １４９７−１５００）またはポリカチオン系リボ核酸グアニジン（ＲＮＧ）（Ｂｒｕｉｃｅ ｅｔ ａｌ， １９９５ ＰＮＡＳ ９２ ６０９７）またはペントピラノシルオリゴヌクレオチド（ＨＮＡ）（Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｓｅｒ Ａ．， １９９９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８４， ２１１８−２１２４）のようなバックボーン類似体である。
【００１１】
一つの好ましい実施態様において、ＱがＨであるときには、これらの化合物は塩基類似体である。第二の好ましい実施態様において、Ｑは、糖もしくは糖類似体または修飾した糖、例えば（ｉ）〜（ｖｉ）に記載の構造式を持つ置換基、であり、そして化合物はヌクレオチド類似体もしくはヌクレオシド類似体である。Ｑが核酸バックボーンもしくはバックボーン類似体、（ｖｉｉ）、であるときには、これらの化合物を以後、核酸もしくはポリヌクレオチドと呼ぶ。
【００１２】
Ｑが構造式（ｉ）の置換基であるときには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれがＨ、ＯＨ、Ｆ、ＮＨ２、Ｎ３、Ｏ−アルキルもしくはレポーター部分であってもよい。かくして、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドおよびジデオキシリボヌクレオシドは他のヌクレオシド類似体と共にあると予測される。これらの糖置換基は、塩基上に存在し得るいずれかに加えてレポーター基を含んでもよい。好ましくは、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＨ、ＯＨ、Ｆ、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１３もしくはＯ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２（式中、ｎは０〜１２である）であり、Ｒ４はＨ、ＯＨ、Ｎ３、ＮＨ２、ＦもしくはＯ−Ｒ１３であり、そしてＲ３はＨ、ＯＨもしくはＯ−Ｒ１３（式中、Ｒ１３はアルキル、アルケニル、アルキニルもしくはレポーター基である）である。さらに好ましくは、少なくとも一つのＲ１およびＲ２ならびに少なくとも一つのＲ３およびＲ４はＨである。
【００１３】
Ｒ５はＯＨ、ＳＨもしくはＮＨ２またはモノ−、ジ−もしくはトリ−ホスフェートまたはチオホスフェートまたは対応するボラノホスフェートである。Ｒ５がトリホスフェートであるときには、そのようなトリホスフェートヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼもしくは逆転写酵素ならびにｄＮＴＰおよび必要によりｄｄＮＴＰと共に適切な鋳型−プライマーを用いることによりポリヌクレオチド鎖中に組み込んでもよい。ＮＴＰは適切なＲＮＡポリメラーゼと共に用いることができる。本発明の化合物は、標準技法を用いてＰＣＲ生成物中に組み込んでもよくまたは適切なＲＮＡ鋳型、プライマーｄＮＴＰミックスおよび逆転写酵素からのｃＤＮＡの生成に用いてもよい。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド鎖はまた、ターミナルトランスフェラーゼを使用して本発明のクレオチド類似体により伸長し得る。
【００１４】
これに代えて、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５の一つは、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネートもしくはメチルホスホネートまたはホスホロチオエートもしくはアミドであってもよく、または、例えばヘミスクシネート−制御細孔ガラスのような固体表面への適当な連鎖であっても、またはポリヌクレオチド鎖中に、一般的には化学手段により、組み込むための他の基であってもよい。オリゴヌクレオチドを合成する際にホスホルアミダイトおよび関連誘導体の使用は周知でありかつ文献に記載されている。
【００１５】
もう一つの好ましい実施態様において、定義したような塩基類似体を含む、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体を少なくとも一つのレポーター基で標識化する。適切なレポーター部分は種々のタイプのレポーターから選択し得る。レポーター基は、それによりヌクレオシド類似体が容易に検出されるようになる放射性同位元素、例えば、ホスフェートもしくはチオホスフェートまたはホスホルアミダイトもしくはＨ−ホスホネートに組み込まれた３２Ｐもしくは３３Ｐまたは３５Ｓ、またはそれに代えて３Ｈもしくは１４Ｃまたはヨウ素同位元素であってもよい。それは、質量分析法もしくはＮＭＲにより検出可能な同位体であってもよい。それは、シグナル基もしくは部分、例えば酵素、ハプテン、蛍光体、化学体、化学発光基、ラマン標識もしくは電気化学的標識、であってもよい。特に好ましいレポーターは、フルオレセイン、ローダミン、ボディピーおよびシアニンのような蛍光性染料である。
【００１６】
レポーター基は、シグナル基もしくは部分およびそれを分子の残余に結合させるリンカー基を含んでもよい。リンカー基は、３０個までの炭素、窒素、酸素および硫黄原子の鎖であって、硬くもしくは柔軟で、飽和もしくは不飽和でもよい。そのようなリンカーは当業者に周知である。このリンカー基は、末端のもしくは他の基、例えば、ＮＨ２、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＨ、マレイミド、ハロアセチル、またはそれによりシグナル部分が核酸鎖中にヌクレオシド類似体を組込む前後に取り付け得る他の基を持ってもよい。また、上述の適切なリンカー基を通して本発明の分子を固体表面に連結することが可能である。
【００１７】
また、本発明の分子はそれら自身でレポーターとして作用し得ることが可能である。抗体は分子全体もしくは分子の一部分、例えば環構造もしくは修飾した糖に対し産生してもよい。抗体は、それら自身で標識を保持しているかもしくは技術上周知の方法により第二の抗体によって検出されることができる。これらの方法はしばしば酵素検出もしくは蛍光を用いる。
【００１８】
この発明のクレオシド類似体は、ハプテン、蛍光体もしくは他のレポーター基で標識化した天然の核酸プローブを用いる、現存する応用のいずれかに使用することができる。これらには、ポリアクリルアミドもしくはアガロースゲルを基剤にする方法もしくは溶液ハイブリダイゼーションアッセイにおけるサザンブロットおよびドットブロットならびにマイクロタイタープレートもしくはチューブ中での他のアッセイまたは固体支持体上におけるアレイ上でのオリゴヌクレオチドもしくは核酸のアッセイが挙げられる。プローブは、類似体に取り付けたハプテンに対するか類似体自身に対するかのどちらかに標的化した抗体で検出され得る。抗体を酵素もしくは蛍光体で標識化することができる。
【００１９】
もし塩基類似体それ自身が蛍光性であるかもし類似体に取り付けた蛍光性の基があるならば、蛍光性検出をまた使用し得る。
【００２０】
異なる質量のヌクレオシド類似体の使用はまた、検出にならびにそれに特異的質量標識確認体を添加することにより用いられ得る。オリゴヌクレオチド、核酸断片およびプライマー伸長生成物の分析および検出のための方法は報告されている（ＵＳ　５，２８８，６４４およびＷＯ　９４／１６１０１）。これらの方法は通常ＭＡＬＤＩ　ＴｏＦ質量分析法にに基づいている。これらはオリゴヌクレオチドの全質量を測定し、そしてこれからオリゴヌクレオチドの配列を確認し得る。幾らかな場合において、オリゴヌクレオチドもしくは断片の質量は特定の配列についてユニークでないかもしれない。これは、天然の塩基、ＡＣＧＴ、の比率が異なる配列において同様であるときに起こる。例えば、簡単な４マーのオリゴヌクレオチドは２４個の他の可能な４マー、例えばＣＡＧＴ、ＣＡＴＧ、ＣＧＴＡ等、と同一の質量を持つであろう。
【００２１】
比較的長い核酸断片では、比較的高い分子量における質量スペクトルでの分解能の欠如のために、二つの断片間の質量差を区別することは困難であるかもしれない。本発明に従う塩基で修飾した類似体の組込みを用いて、特定のオリゴヌクレオチドもしくは核酸の断片を同定する助けをすることができるが、これは、これらの質量が天然の塩基のそれらと異なるからである。例えば、二つの配列、ＡＣＧＴおよびＣＡＧＴ、は、もし一つの配列の中で一つの天然ヌクレオチドが本発明の一つの類似体で置換されるならば、質量分析法により相互の存在下で同定することができる。例えば、オリゴヌクレオチドＣＡＧＴにおいて、このＴは、特定の応用、例えばハイブリダイゼーションもしくは酵素的組込み、に対して殆んど影響なしに本発明の一つの類似体で置換されることができる。まださらに、類似体の導入による質量の変化のために、二つの配列を質量分析法により容易に同定することができる。
【００２２】
塩基についてかつまた糖もしくはヌクレオチド間連鎖について、修飾することができる。例えば、チオ糖もしくはホスホチオレート連鎖はまた特徴的な質量変化をもたらすであろう。塩基、糖もしくはリンカーについて多くの種類の変化は異なる質量を持つ数多くの変化を生じることができるが、これらは、特に複合性の核酸ハイブリダイゼーションもしくはシークエンシングの応用において、特定の配列をその質量により正確に規定するために有用であろう。
【００２３】
ＲＮＡは極度に汎用性の生物分子である。幾つかの研究室による実験的試験によって示されているのは、インビトロの選択技法を使用して、通常はＲＮＡ結合に関連しない、少数の抗体を含むタンパク質に高い親和性と選択性を持って結合する短いＲＮＡをＲＮＡライブラリーから単離することができることである（Ｇｏｌｄ， Ａｌｌｅｎ， Ｂｉｎｋｌｅｙ， ｅｔ ａｌ， １９９３， ４９７−５１０ ｉｎ Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｗｏｒｌｄ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｎ． Ｙ．； Ｇｏｌｄ， Ｐｏｌｉｓｋｙ， Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ， ａｎｄ Ｙａｒｕｓ， １９９５， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：７６３−７９５； Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ５０５−５１０； Ｊｏｙｃｅ， １９８９， Ｇｅｎｅ ８２： ８３−８７； Ｓｚｏｓｔａｋ， １９９２， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ １７： ８９−９３； Ｔｓａｉ， Ｋｅｎａｎ ａｎｄ Ｋｅｅｎｅ， １９９２， ＰＮＡＳ ８９： ８８６４−８８６８； Ｔｓａｉ， Ｋｅｎａｎ ａｎｄ Ｋｅｅｎｅ， １９９２， ＰＮＡＳ ８９： ８８６４−８８６８； Ｄｏｕｄｎａ， Ｃｅｃｈ ａｎｄ Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ， １９９５， ＰＮＡＳ ９２：２３５５−２３５９）。これらのＲＮＡ分子の幾らかは、重症筋無力症および他の自己免疫性疾病のような疾病の治療のための薬剤候補として提案されている。
【００２４】
基礎原理は、興味のあるタンパク質もしくは分子へＲＮＡライブラリーを加えることを含む。洗浄して未結合のＲＮＡを除去する。それから、興味のあるタンパク質もしくは他の分子に結合したＲＮＡを特異的に溶出する。それから、この溶出したＲＮＡを逆転写させそしてＰＣＲにより増幅させる。それから、修飾したヌクレオチド（ヌクリアーゼ抵抗性を与える２’修飾、例えば２’Ｆ、２’ＮＨ２、２’ＯＣＨ３および／もしくはＣ５修飾ピリミヂンおよび／もしくはＣ８修飾プリンのどれか）を用いて転写させる。興味のあるタンパク質もしくは他の分子に結合したと見出されるこれらの分子をクローン化しかつシークエンス化して、共通の（“コンセンサス”）配列を捜す。この配列を最適化して、改善した特異的結合を示す短いオリゴヌクレオチドを生成するが、これは治療薬としてこれから使用されるかもしれない。
【００２５】
ここで説明した塩基類似体は、リボヌクレオシドトリホスフェートもしくはリボヌクレオシドホスホルアミダイトへ変換するときには、この選択プロセスに使用可能な分子的多様性を著しく増加させるであろう。これは、現行のビルディングブロックを用いては使用可能でない、標的への増加した結合親和性を有するオリゴヌクレオチドに至り得る。
【００２６】
本発明の類似体は、天然の塩基のそれらと異なる性質を持ちそして他の重要な応用を持つであろう。それらはアンチセンス分野に用途を見出すであろう。これらはまた、抗ウィルス性（抗−ＨＩＶおよび抗−ＨＢＶ等）（ＷＯ　９８／４９１７７）および抗がん性の薬剤として治療分野において有用であろう。多くのヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体が抗ウィルス剤として開発されている。それらはしばしば、ＤＮＡポリメラーゼおよび／もしくは逆転写酵素活性を数多くの手段によって阻害することによって作用する。ＡＺＴ、ｄｄＣ，ｄｄＩ、Ｄ４Ｔおよび３ＴＣのような、数多くのヌクレオシド類似体が、単独でまたは他のヌクレオシドもしくは非−ヌクレオシド類似体の組合せで、抗−ＨＩＶ剤として使用されつつある。本発明の類似体はまた、単独でもしくは他の化合物と組合わせて抗ウィルス性活性を所有し得る。組合わせ薬剤治療はさらに頻繁にウィルス性感染を治療するために使用されつつあるので、本発明の化合物を含むことにより増加した数の化合物が使用可能になることは治療の成功の可能性を増強させるであろう。
【００２７】
この発明の特に好ましい化合物は式（ＩＩ）の化合物であるが：
【化１２】
2004502701.tif 000010
式中、Ｘはここで以前に定義された通りである。
【００２８】
ここで、以下の非−限定的実施例を参照して、この発明をさらに説明する。
【００２９】
合成実施例１
６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−メチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン−５’−トリホスフェート（５）の合成。
【化１３】
2004502701.tif 000011
【００３０】
（ａ）３−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−６−メチル−フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン（３）。
１００−ｍｌのガラス圧力反応容器へ５−ヨード−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）ウリジン７．１ｇ（２０ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）２．３２ｇ（２ｍｍｏｌ）およびヨー化銅（Ｉ）０．７６ｇ （４ｍｍｏｌ）をアルゴン下に加えた。それから、無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）およびトリエチルアミン（４．２ｍｌ、３０ｍｍｏｌ）を反応容器に注入した。攪拌および冷却（０℃）した反応混合物中にプロピレンガスを１０分間泡立たせた。圧力容器を密封して、反応物の温度を油浴を介して５５〜６０℃に上昇させた。この条件で１８時間攪拌し反応させた。冷却すると原料はＴＬＣ分析で検出されなかった。メタノール（２５ｍｌ）、Ｃｈｅｌｅｘ １００樹脂（５ｇ、２００〜４００メッシュ、ナトリウム型）およびＡＧ １−Ｘ８樹脂（５ｇ、２０〜５０メッシュ、重炭酸塩型）を反応混合物に加え、そして１時間の間緩やかに攪拌した。ろ過後、溶液を高度真空にて油にまで留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／ＭｅＯＨ　１００％から１０：１）により精製して、５−プロピニル−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）ウリジン　２（ｒｆ：０．４）を淡褐色の泡沫物質として４５％収率で、および３−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−６−メチル−フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン　３（ｒｆ：０．２）を黄色固体として５０％収率で得た。５−プロピニル−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）ウリジンを、５％ヨー化銅（Ｉ）を含有するメタノール／トリエチルアミン（７：３）中で２時間還流することにより３−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−６−メチル−フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オンに変換した。カラムクロマトグラフィーの後、６１％の収率を得た。１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．０６（ｍ，１Ｈ，２’），２．３３（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），３．３８（ｍ，１Ｈ，２’），３．６５（ｍ，２Ｈ，５’），３．９１（ｑ，１Ｈ，４’），４．２４（ｍ，１Ｈ，３’），５．０９（ｔ，１Ｈ，ＯＨ−５’），５．２６（ｄ，１Ｈ，ＯＨ−３’），６．１８（ｔ，１Ｈ，１’），６．４１（ｓ，１Ｈ，Ｈ−５），８．６６（ｓ，１Ｈ，Ｈ−４）。１３Ｃ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２９．８（Ｍｅ），４０．３（２’），６０．８（５’），６９．９（３’），８５．３（１’），８８．１（４’），８８．８（Ｃ−５），９８．３（Ｃ−４ａ），１４４．８（Ｃ−４），１４７．８（Ｃ−６），１５０．１（Ｃ−２），１６２．１（Ｃ−７ａ）。
【００３１】
ｂ）６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−メチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン（４）。
２５−ｍｌの丸底フラスコ中の３−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−６−メチル−フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン（３）５００ｍｇ（１．３５ｍｍｏｌ）に無水ヒドラジン６ｍｌを加えた。反応混合物を室温で２時間攪拌した。それから、過剰のヒドラジンを高度真空にて留去することにより除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／ＭｅＯＨ　１０：１）により精製し、灰白色の結晶生成物を８５％収率で得た。Ｘ−線品質の結晶をメタノールから得た。１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１．８０（ｍ，１Ｈ，２’），２．１４（ｍ，１Ｈ，２’），２．４９（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），３．４９（ｍ，２Ｈ，５’），３．６２（ｑ，１Ｈ，４’），４．１６（ｍ，１Ｈ，３’），４．４０（ｓ，２Ｈ，Ｈ−５），４．７９（ｔ，１Ｈ，ＯＨ−５’），５．１３（ｄ，１Ｈ，ＯＨ−３’），６．２４（ｔ，１Ｈ，１’），７．３４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−４），１０．２９（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ−８）。１３Ｃ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：２１．１（Ｍｅ），３５．１（２’），４７．８（Ｃ−５），６１．８（５’），７０．６（３’），８３．１（１’），８６．０（４’），１２０．８（Ｃ−４ａ），１２４．８（Ｃ−４），１５１．８（Ｃ−７），１５３．２（Ｃ−３），１５５．２（Ｃ−８ａ）。
【００３２】
ｃ）６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−メチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン−５’−トリホスフェート（５）。
５０−ｍｌの丸底フラスコ中の乾燥した６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−メチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン（４）１４０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）へ、アルゴン下でトリメチルホスフェート５ｍｌを加えた。均一な溶液を冷却（氷浴）して、オキシ塩化リン（再蒸留した）７０μｌ（０．７５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。反応液を冷却しつつ１時間攪拌した。ＴＬＣ分析は反応が約７０％終了していることが示した。それ故に、追加のオキシ塩化リン２５μｌ（０．２７ｍｍｏｌ、０．５１当量）を加え、そして反応液をさらに１時間攪拌した。無水ＤＭＦ中の１Ｍ　トリブチルアンモニウムピロホスフェート（２．５ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ、５当量）およびｎ−トリブチルアミン（０．６ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ、５当量）の両者を、冷却した溶液に同時に加えた。３０分後、冷却した１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢ、ｐＨ＝７．０）を、溶液が中性になるまで反応混合物に加えた。それから、緩衝液を加えて４０ｍｌの最終容量にし、そして混合物を室温にて終夜攪拌した。反応混合物を高度真空にて留去して粘性な溶液にし、水で希釈してろ過した。それから、粗製のトリホスフェートを含むろ液を５０×３００ｍｍのＤｅｌｔａＰａｋ（１５μ，１００Ａ）Ｃ１８　ＨＰＬＣカラムに加え、それを毎分１３０ｍｌの流速で０．１Ｍ　ＴＥＡＢ（ｐＨ＝７．０）から２５％アセトニトリル中の０．１Ｍ　ＴＥＡＢで２５分間にわたる線形勾配を用いて溶出した。生成物５を含むピークを、１０．５分において収集した。留去後、得られたトリホスフェートは、２１×２５０ｍｍのＳｙｎｃｈｒｏｐａｋ Ａｘ１００　ＨＰＬＣカラム上で４０％ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍ　ＴＥＡＢから４０％ＣＨ３ＣＮ中の１Ｍ　ＴＥＡＢの毎分１５ｍｌで３０分間の線形勾配を用いて再精製した。３１Ｐ　ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：−９．２６（ｄ）；−１０．２０（ｄ）；−２２．４３（ｔ）。ＨＰＬＣ（ΔＰＡＫ Ｃ１８、３．９×３０ｃｍ、毎分１ｍｌで３０分にて０．１Ｍ　ＴＥＡＢ（ｐＨ＝７．０）から２５％ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍ　ＴＥＡＢ）：１２．７分。ＵＶ　λｍａｘ：２３７ｎｍおよび２９２ｎｍ。
【化１４】
2004502701.tif 000012
【００３３】
合成実施例２：
６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−アミノメチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン−５’−トリホスフェート（８ａ）の合成。
【００３４】
ａ）３−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−６−トリフルオロアセタミドメチル−フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン（６ａ）。
５−ヨード−２’−デオキシウリジン（７．１ｇ、２０ｍｍｏｌ、１当量）、Ｐｄ［Ｐ（Ｃ６Ｈ５）３］４（１．１６ｇ、１ｍｍｏｌ、０．０５当量）、ＣｕＩ（０．３８ｇ、２ｍｍｏｌ、０．１当量）および２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−プロパルギルアセタミド（４．５３ｇ、３０ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（７５ｍＬ）中で攪拌している溶液に、トリエチルアミン（３．０４ｇ、４．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えてから、得られた混合物を不活性な雰囲気下で５５℃にて２日間攪拌した。それから、反応混合物にＡｇ１ Ｘ８樹脂の重炭酸塩型を加えてヨー化トリエチルアンモニウムを除去し、ＣＨＥＬＥＸ樹脂を加えて金属陽イオンを除去しそして活性炭を加えて脱色した。セライト上でろ過後僅かに黄色の溶液が生成した。減圧下の溶媒除去およびシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、６ａの４．２ｇ（５６％）を得た。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ：３２４ｎｍ；１Ｈ　ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）１０．０７（ｓ，１Ｈ，交換可能，Ｈ−ＮＨ−ＣＯＣＦ３），８．７８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），６．６３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−ＣＨ＝Ｃ（Ｏ）ＣＨ２），６．１８（ｔ，Ｊ＝６．５５Ｈｚ，Ｈ−１’），５．００〜５．３（ｂｍ，２Ｈ，交換可能，２×ＯＨ），４．４８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−ＣＨ２−ＮＨ），４．２３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．６３（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’），２．４０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’ｂ），２．０７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−２’ａ）。
【００３５】
ｂ）３−（β−Ｄ−２，３−ジデオキシリボフラノシル）−６−トリフルオロアセタミドメチル−フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン（６ｂ）。
３−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−６−メチル−フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オンについて記載した方法に従って、表題化合物を合成した。１Ｈ　ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：１．９４（ｍ，２Ｈ，３’），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），２．１８（ｍ，１Ｈ，２’），２．５７（ｍ，１Ｈ，２’），３．７５〜４．０６（ｄｄｄ，２Ｈ，５’），４．２７（ｍ，１Ｈ，４’），４．５２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２ＮＨ），６．１１（ｄｄ，１Ｈ，１’），６．６５（ｓ，１Ｈ，Ｈ−５），９．１３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−４）。
【００３６】
ｃ）６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−トリフルオロアセタミドメチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン（７ａ）。
２５−ｍｌの丸底フラスコ中の３−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−６−トリフルオロアセタミドメチル−フロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン（６ａ）７５４ｍｇ（２ｍｍｏｌ）に、無水ヒドラジン５ｍｌを加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌した。それから、過剰のヒドラジンを高度真空にて留去することにより除去した。残渣にメタノール２０ｍｌ、トリエチルアミン０．５ｍｌ、引き続いてトリフルオロ酢酸エチル５ｍｌを加えた。反応混合物は約１時間後の攪拌で均一に成る。室温にて終夜攪拌後、反応混合物を留去し、そして得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ　２０：１）により精製した。微黄色の結晶化合物を８６％収率で収集した。１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１．７９（ｍ，１Ｈ，２’），２．１５（ｍ，１Ｈ，２’），３．４９（ｍ，２Ｈ，５’），３．６１（ｑ，１Ｈ，４’），４．１５（ｍ，１Ｈ，３’），４．４６（ｄ，２Ｈ，Ｈ−５），４．５７（ｄ，２Ｈ，ＣＨ２ＮＨ），４．８１（ｔ，１Ｈ，ＯＨ−５’），５．１４（ｄ，１Ｈ，ＯＨ−３’），６．２４（ｔ，１Ｈ，１’），７．４３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−４），１０．１（ｔ，１Ｈ，ＮＨ−ＴＦＡ），１０．５１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ−８）。１３Ｃ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：３５．１（ＣＨ２ＮＨ），３９．０（２’），４２．８（Ｃ−５），６１．７（５’），７０．５（３’），８３．０（１’），８５．９（４’），１１７．９（ＣＦ３），１２１．２（Ｃ−４），１２３．４（Ｃ−４ａ），１５２．７，１５２．８（Ｃ−３，Ｃ−７），１５４．２（Ｃ−８ａ），１５６．７（ｑ，ＣＯＣＦ３）。
【００３７】
ｄ）６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−アミノメチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン−５’−トリホスフェート（８ａ）。
乾燥した６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−トリフルオロアセタミドメチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン（７ａ）２００ｍｇ（０．５１ｍｍｏｌ）のリン酸化を、化合物５について上で報告したと同様な方法で実施した。粗製混合物を５０×３００ｍｍのＤｅｌｔａＰａｋ（１５μ，１００Ａ）Ｃ１８　ＨＰＬＣカラムに加え、それを毎分１３０ｍｌの流速で０．Ｍ　ＴＥＡＢ（ｐＨ＝７．０）から２５％アセトニトリル中の０．１Ｍ　ＴＥＡＢで２５分間にわたる線形勾配を用いて溶出した。生成物を含むピークを１５分において収集した。留去後、得られたトリホスフェートを、２１×２５０ｍｍのＳｙｎｃｈｒｏｐａｋ Ａｘ１００　ＨＰＬＣカラムにて毎分１５ｍｌで４０％ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍ　ＴＥＡＢから４０％ＣＨ３ＣＮ中の１Ｍ　ＴＥＡＢの３０分間の線形勾配を用いて精製した。このトリホスフェートを３０分間濃ＮＨ４ＯＨで処理したが、分析ＨＰＬＣで観測すると変化はなく、トリフルオロアセチル保護基がこのステップ以前に除去されていたことを証明した。３１Ｐ　ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：−９．６５（ｄ）；−１０．８６（ｄ）；−２２．５４（ｔ）。ＨＰＬＣ（ΔＰＡＫ Ｃ１８、３．９×３０ｃｍ、毎分１ｍｌで３０分にて０．１Ｍ　ＴＥＡＢ（ｐＨ＝７．０）から２５％ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍ　ＴＥＡＢ）：１２．２分。ＵＶ　λｍａｘ：２４１ｎｍおよび２９３ｎｍ。
【００３８】
ｅ）６−（β−Ｄ−２，３−ジデオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−トリフルオロアセタミドメチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン（７ｂ）。
化合物７ａについて上で報告したように合成を実施した。淡褐色の泡沫物質を６５％収率で収集した。１Ｈ　ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：１．８４〜２．２３（ｍ，４Ｈ，２’，３’），２．０１（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），３．５８〜３．７８（ｍ，２Ｈ，５’），３．９９（ｍ，１Ｈ，４’），４．５０〜４．７１（ｄｄ，２Ｈ，Ｈ−５），４．６６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２ＮＨ），６．２２（ｄｄ，１Ｈ，１’），７．４８（ｓ，１Ｈ，Ｈ−４）。
【化１５】
2004502701.tif 000013
【００３９】
実施例３
６−（β−Ｄ−１，２−ジデオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−アミノメチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン−５’−トリホスフェート（８ｂ）の合成。
８ｂの合成（０．７３ｍｍｏｌスケールで）および生成／単離を、化合物５について記載されたように実施した。
【００４０】
６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−Ｃｙ３−アミドメチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン−５’−トリホスフェート（９ａ）の合成。
８ａの６．０μｍｏｌ（６９０μＬ水溶液）をＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ＝９．４）３１０μＬで希釈し、そしてＣｙ３−ＮＨＳエステル（７．２μｍｏｌ、１．２当量）の攪拌したＤＭＦ溶液（１．０ｍＬ）に加えた。室温で２時間攪拌後、Ｃｙ３染料−ヌクレオチド抱合体（９ａ）をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰＬＣカラム（１０×１６ｍｍ）上で、５ｍＬ／分にて６０分間で緩衝液Ａ（０．１Ｍ　ＴＥＡＢ中の４０％ＣＨ３ＣＮ）から緩衝液Ｂ（１．０Ｍ　ＴＥＡＢ中の４０％ＣＨ３ＣＮ）の線形勾配を用いて精製することにより単離（３５％）した。ＴＯＦ　ＭＳ　ＥＳ−ｍ／ｚ、コーン１００ｖ、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ：１１４４（ＭＨ−３）。
【００４１】
６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−Ｃｙ５．５−アミドメチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン−５’−トリホスフェート（９ａ’）の合成。
９ａについて記載したように、同様なスケールで８ａをＣｙ５．５ＮＨＳエステルと反応させることによってＣｙ５．５蛍光染料−ヌクレオチド抱合体（９ａ’）を合成して、単離（３３％収率）した。
【００４２】
６−（β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−フルオレセイン（５，６）−ヘキサナミド−アミドメチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン−５’−トリホスフェート（９ａ’’）の合成。
８ａの８．０μｍｏｌ（水溶液）をＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ＝９．０）１．０ｍＬで希釈し、そして攪拌した溶液に（５，６）−カルボキシ−ｘ−ＮＨＳエステル（１７．０μｍｏｌ、２．１当量）の無水ＤＭＳＯ溶液を加えた。２時間後、染料で標識化したヌクレオチドを９ａについて記載したようにＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム上で精製して、９ａ’’を得た。ＴＯＦ　ＭＳ　ＥＳ−ｍ／ｚ、コーン１００ｖ、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ：１００３（ＭＨ−３）。
【００４３】
実施例４
【化１６】
2004502701.tif 000014
【００４４】
６−（５−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−メチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン（１０）の合成。
４の１．１６ｇ（４．１ｍｍｏｌ）を無水ピリジンと共に共留去し、そして無水ピリジン３０ｍＬ中に再溶解した。ＤＭＴ−Ｃｌの４．１５ｇ（１２．２４ｍｍｏｌ、３当量）を、４の攪拌した溶液にアルゴン雰囲気下で室温にて加えた。３．５時間後、反応混合物を減圧下で留去し、そして残渣をＣＨＣｌ３に溶解した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥しそして減圧下で留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラム上でＣＨＣｌ３に引き続いてＣＨＣｌ３中の５％ＭｅＯＨにより溶出して精製し、１０（２．３５ｇ、９９％）を得た。ＴＯＦ　ＭＳ　ＥＳ−ｍ／ｚ、コーン１００ｖ、ＣＨ３ＣＮ／０．１Ｍ　ＴＥＡＢ：５８１．２４（ＭＨ−１）。
【００４５】
６−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト）−β−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル）−５−ヒドロ−３−メチル−８Ｈ−ピリミド［４，５−ｃ］［１，２］ピリダジン−７−オン（１１）の合成。
化合物１０の５８３ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）を無水ピリジンに続いてトルエンと共に共留去し、そして無水のジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した。緩やかなアルゴン気流下で攪拌した溶液に、室温で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．７ｍＬ（４．０ｍｍｏｌ、４．０当量）を加え、引き次いて２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（０．２８ｍＬ、１．２５ｍｍｏｌ、ｓ）を滴下した。３０分後、１０％ＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ３中でのＴＬＣは、反応の終了を示した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、１０％Ｎａ２ＣＯ３で洗浄し、有機層を乾燥後（無水Ｎａ２ＳＯ４）減圧下で留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラム（４×１３ｃｍ）上にてＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ：Ｅｔ３Ｎ（２．９：７：０．１）により溶出して精製し、１１（５７０ｍｇ、７３％）を得た。３１Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１４９．６６。
【００４６】
実施例５
ＤＮＡポリメラーゼによるトリホスフェート　５の組込みを研究するためのプライマー拡張アッセイ
プライマー拡張アッセイを用いて、エキソヌクレアーゼを含まないクレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼＩ（ＥＦＫ）に対する基質としてのトリホスフェート　５を評価した。アッセイでは、２４マー鋳型にハイブリダイズした３３Ｐ　５’末端標識化１５マープライマーが使用された。プライマーと鋳型の配列は以下の通りである：
プライマー　５’　ＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＧＡ　３’
鋳型　　　　３’　ＡＣＧＴＡＣＡＣＧＡＣＣＴＣＴＧＡＡＣＴＡＧＴＣ　５’
【００４７】
１ピコモルの３３Ｐ標識化プライマーを、×２クレノウ緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　２−メルカプトエタノール）中で２ピコモルの鋳型にハイブリダイズさせた。これに４μＭ　ｄＮＴＰαＳもしくは４０μＭ（試験化合物５ｃ）または４μＭ　ｄＮＴＰαＳおよび４０μＭ（試験化合物）の混合物のいずれかを加えた。１単位のＥＦＫおよび２０ｍＵの無機ピロホスファターゼを反応ごとに用いた。プライマー単独、プライマープラス鋳型プラス酵素対照でも実施した。反応を３７℃で３時間インキュベートした。それから、ホルムアミド／ＥＤＴＡ停止溶液の添加により反応を停止させた。反応生成物を２０％ポリアクリルアミド　７Ｍ　尿素ゲル上で分離し、そして生成物断片は、Ｋｏｄａｋ Ｂｉｏｍａｘオートラジオグラフィーフィルムに露出後、標識化プライマーおよび４μＭ　ｄＮＴＰαＳの存在下における拡張の生成物と比較することによってサイジングした。
【００４８】
これにより試験化合物がＥＦＫに対する基質であり、そしてｄＴＴＰの代わりに組込まれることが示された。フルオレセインもしくはシアニンのような基を含むこの発明の他の化合物は、同様な方法により組込まれ得る。
【国際公開パンフレット】
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2004502701.tif 000022
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【国際調査報告】
2004502701.tif 000045
2004502701.tif 000046