(57)【要約】本発明は新規なタンパク質を含む組成物と免疫関連疾患の診断と治療の方法に関する。
2004516227.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫関連疾患の治療に有用な組成物において、
（ａ）その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を増大させ、
（ｂ）その必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は増強し、又は
（ｃ）抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖を増加させる、特性を有し、ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチド、そのアゴニスト又は断片、及び担体又は賦形剤を含有する組成物。
【請求項２】
有効量のＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチド、そのアゴニスト、アンタゴニスト又は断片を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
成長阻害剤、細胞障害薬又は化学療法剤をさらに含有する請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を増大させ、（ｂ）その必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は増強し、又は（ｃ）抗原に反応してその必要とする哺乳動物においてＴ−リンパ球の増殖を増加させる、
特性を有する組成物を調製するための、ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチド、そのアゴニスト又は断片の使用。
【請求項５】
有効量のＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０、ＰＲＯ５７２７ポリペプチド、そのアゴニスト、アンタゴニスト又は断片を含む請求項４に記載の使用。
【請求項６】
成長阻害剤、細胞障害薬又は化学療法剤をさらに含有する請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
有効量のＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチド、そのアゴニスト抗体、そのアンタゴニスト抗体又は断片を哺乳動物に投与することを含み、その必要とする哺乳動物におけるＴ細胞媒介疾患などの免疫関連疾患の治療方法。
【請求項８】
疾患が、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、骨関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症、特発性炎症ミオパシー、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少、甲状腺炎、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患、多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、伝染性肝炎、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎等の肝疾患、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎等の肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アゴニスト又はアンタゴニストがモノクローナル抗体である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の組成物又は使用。
【請求項１０】
アゴニスト又はアンタゴニストが抗体断片又は単鎖抗体である請求項１ないし９のいずれか１項に記載の組成物又は使用。
【請求項１１】
抗体が非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）酸基を有する請求項９又は１０に記載の組成物又は使用。
【請求項１２】
ポリペプチドを含有すると推測される細胞を、抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０、抗−ＰＲＯ５７２７抗体に暴露し、抗体の細胞への結合を測定することを含んでなる、ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドの存在を決定する方法。
【請求項１３】
哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法において、（ａ）哺乳動物から得た組織細胞の試験試料と、及び（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料において、ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含んでなり、対照と比較して試験試料の発現レベルが高いか低いと、試験組織細胞を得た哺乳動物に免疫関連疾患が存在することを示すものである診断方法。
【請求項１４】
哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法において、（ａ）抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料に接触させ、（ｂ）試験試料中でのポリペプチドと抗体との複合体形成を検出することを含んでなる方法。
【請求項１５】
適当なパッケージに、抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７抗体又はその断片と担体を含有してなる免疫関連疾患診断キット。
【請求項１６】
ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドを検出するために抗体を使用するための説明書をさらに含んでなる請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
容器；
容器上の説明書；及び
容器内に含まれる活性剤を含有する組成物；
を含んでなる製造品において、組成物が哺乳動物における免疫反応の阻害又は低減に効果があり、容器上の説明書が組成物が免疫関連疾患の治療に使用できることを示しており、組成物中の活性剤がＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する薬剤である製造品。
【請求項１８】
前記活性剤が、抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７抗体である請求項１７に記載の製造品。
【請求項１９】
ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドの発現又は活性を阻害可能な化合物を同定する方法において、該ポリペプチドに候補化合物を、これら２つの成分を互いに作用させるのに十分な時間と条件下で接触させることを含んでなる方法。
【請求項２０】
候補化合物、又はＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドが固体支持体上に固定されている請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
非固定成分が検出標識を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｆｉｇ１（配列番号：１）、Ｆｉｇ３（配列番号：１１）、Ｆｉｇ５（配列番号：１３）、Ｆｉｇ７（配列番号：１８）、Ｆｉｇ９（配列番号：２０）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２５）、Ｆｉｇ１３（配列番号：３０）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３５）、Ｆｉｇ１７（配列番号：４０）、Ｆｉｇ１９（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２１（配列番号：５０）、Ｆｉｇ２３（配列番号：５６）、Ｆｉｇ２５（配列番号：６１）、Ｆｉｇ２７（配列番号：６６）、Ｆｉｇ２９（配列番号：７１）、Ｆｉｇ３１（配列番号：７９）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８６）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９１）、Ｆｉｇ３７（配列番号：１０１）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０６）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１１１）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１６）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１２３）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１３３）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３９）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１４１）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４３）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５７（配列番号：１４７）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１４９）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１５１）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１５６）、Ｆｉｇ６５（配列番号：１５８）、Ｆｉｇ６７（配列番号：１６０）、Ｆｉｇ６９（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ７１（配列番号：１６７）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ７５（配列番号：１７７）、Ｆｉｇ７７（配列番号：１７９）、Ｆｉｇ７９（配列番号：１８４）、Ｆｉｇ８１（配列番号：１８６）、Ｆｉｇ８３（配列番号：１８８）、Ｆｉｇ８５（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ８７（配列番号：１９２）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２２８）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２３０）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２３２）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２４０）、Ｆｉｇ９７（配列番号：２４８）、Ｆｉｇ９９（配列番号：２５０）、Ｆｉｇ１０１（配列番号：２５５）、Ｆｉｇ１０３（配列番号：２５７）、Ｆｉｇ１０５（配列番号：２６６）、Ｆｉｇ１０７（配列番号：２６８）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１１１（配列番号：２７２）、Ｆｉｇ１１３（配列番号：２７４）、Ｆｉｇ１１５（配列番号：２７６）、Ｆｉｇ１１７（配列番号：２７８）、Ｆｉｇ１１９（配列番号：２８０）、Ｆｉｇ１２１（配列番号：２８５）、Ｆｉｇ１２３（配列番号：２９２）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：２９４）又はＦｉｇ１２７（配列番号：２９６）に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項２３】
Ｆｉｇ１（配列番号：１）、Ｆｉｇ３（配列番号：１１）、Ｆｉｇ５（配列番号：１３）、Ｆｉｇ７（配列番号：１８）、Ｆｉｇ９（配列番号：２０）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２５）、Ｆｉｇ１３（配列番号：３０）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３５）、Ｆｉｇ１７（配列番号：４０）、Ｆｉｇ１９（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２１（配列番号：５０）、Ｆｉｇ２３（配列番号：５６）、Ｆｉｇ２５（配列番号：６１）、Ｆｉｇ２７（配列番号：６６）、Ｆｉｇ２９（配列番号：７１）、Ｆｉｇ３１（配列番号：７９）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８６）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９１）、Ｆｉｇ３７（配列番号：１０１）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０６）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１１１）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１６）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１２３）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１３３）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３９）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１４１）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４３）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５７（配列番号：１４７）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１４９）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１５１）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１５６）、Ｆｉｇ６５（配列番号：１５８）、Ｆｉｇ６７（配列番号：１６０）、Ｆｉｇ６９（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ７１（配列番号：１６７）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ７５（配列番号：１７７）、Ｆｉｇ７７（配列番号：１７９）、Ｆｉｇ７９（配列番号：１８４）、Ｆｉｇ８１（配列番号：１８６）、Ｆｉｇ８３（配列番号：１８８）、Ｆｉｇ８５（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ８７（配列番号：１９２）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２２８）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２３０）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２３２）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２４０）、Ｆｉｇ９７（配列番号：２４８）、Ｆｉｇ９９（配列番号：２５０）、Ｆｉｇ１０１（配列番号：２５５）、Ｆｉｇ１０３（配列番号：２５７）、Ｆｉｇ１０５（配列番号：２６６）、Ｆｉｇ１０７（配列番号：２６８）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１１１（配列番号：２７２）、Ｆｉｇ１１３（配列番号：２７４）、Ｆｉｇ１１５（配列番号：２７６）、Ｆｉｇ１１７（配列番号：２７８）、Ｆｉｇ１１９（配列番号：２８０）、Ｆｉｇ１２１（配列番号：２８５）、Ｆｉｇ１２３（配列番号：２９２）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：２９４）又はＦｉｇ１２７（配列番号：２９６）に示すヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項２４】
Ｆｉｇ１（配列番号：１）、Ｆｉｇ３（配列番号：１１）、Ｆｉｇ５（配列番号：１３）、Ｆｉｇ７（配列番号：１８）、Ｆｉｇ９（配列番号：２０）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２５）、Ｆｉｇ１３（配列番号：３０）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３５）、Ｆｉｇ１７（配列番号：４０）、Ｆｉｇ１９（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２１（配列番号：５０）、Ｆｉｇ２３（配列番号：５６）、Ｆｉｇ２５（配列番号：６１）、Ｆｉｇ２７（配列番号：６６）、Ｆｉｇ２９（配列番号：７１）、Ｆｉｇ３１（配列番号：７９）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８６）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９１）、Ｆｉｇ３７（配列番号：１０１）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０６）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１１１）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１６）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１２３）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１３３）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３９）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１４１）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４３）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５７（配列番号：１４７）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１４９）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１５１）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１５６）、Ｆｉｇ６５（配列番号：１５８）、Ｆｉｇ６７（配列番号：１６０）、Ｆｉｇ６９（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ７１（配列番号：１６７）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ７５（配列番号：１７７）、Ｆｉｇ７７（配列番号：１７９）、Ｆｉｇ７９（配列番号：１８４）、Ｆｉｇ８１（配列番号：１８６）、Ｆｉｇ８３（配列番号：１８８）、Ｆｉｇ８５（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ８７（配列番号：１９２）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２２８）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２３０）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２３２）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２４０）、Ｆｉｇ９７（配列番号：２４８）、Ｆｉｇ９９（配列番号：２５０）、Ｆｉｇ１０１（配列番号：２５５）、Ｆｉｇ１０３（配列番号：２５７）、Ｆｉｇ１０５（配列番号：２６６）、Ｆｉｇ１０７（配列番号：２６８）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１１１（配列番号：２７２）、Ｆｉｇ１１３（配列番号：２７４）、Ｆｉｇ１１５（配列番号：２７６）、Ｆｉｇ１１７（配列番号：２７８）、Ｆｉｇ１１９（配列番号：２８０）、Ｆｉｇ１２１（配列番号：２８５）、Ｆｉｇ１２３（配列番号：２９２）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：２９４）又はＦｉｇ１２７（配列番号：２９６）に示すヌクレオチド配列の全長コード化配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項２５】
ＡＴＣＣ受託番号２０９６５３、２０９３８０、２０９２５４、２０９３８１、２０９３７６、２０９２６０、２０９３７４、２０９２６５、２０９４１９、２０９４２４、２０９３８８、２０９４３３、２０９７０４、２０９７２０、２０９６２１、２０９６２０、２０９６１６、２０９４３６、２０９４２２、２０９７０２、２０９４８０、２０９８５９、２０９７７４、２０９８０１、２０９８０２、２０９８４９、２０９９０５、２０９９５０、２０９９６２、２０９８６６、２０３１２８、２０９９８６、２０３１７３、２０３１３２、２０３０９３、２０３４５７、２０３２４４、２０３０９４、２０３２８２、２０３２７６、２０３１６０、２０３２７７、２０３５７３、２０３５５３、−、２０９４５６、２０９３９７、２０９４９２、−、２０９８０８、２０９８０２、２０９７５０、２０９８５８、２０３５８３、２０９９８９、２０３０９２、２０３１３１、２０３２６９、２０３２６７、２０３６５７、２０３８１８、２０３８３４、２３−ＰＴＡ、２０３９０６で寄託されたＤＮＡの全長コード化配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２２ないし２５のいずれか１項に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２７】
ベクターで形質転換された宿主細胞により認識されるコントロール配列と作用可能に結合する請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２９】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記細胞が大腸菌である請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記細胞が酵母菌細胞である請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドの生産方法において、該ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項２８に記載の宿主細胞を培養し、細胞培養物から該ポリペプチドを回収することを含んでなる方法。
【請求項３３】
Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：１２）、Ｆｉｇ６（配列番号：１４）、Ｆｉｇ８（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２１）、Ｆｉｇ１２（配列番号：２６）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３１）、Ｆｉｇ１６（配列番号：３６）、Ｆｉｇ１８（配列番号：４１）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４６）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５７）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６２）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６７）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７２）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８０）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８７）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９２）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０７）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１２）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１７）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３４）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１４０）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４２）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５６（配列番号：１４６）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１４８）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１５２）、Ｆｉｇ６４（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１５９）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１６３）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ７４（配列番号：１７０）、Ｆｉｇ７６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ７８（配列番号：１８０）、Ｆｉｇ８０（配列番号：１８５）、Ｆｉｇ８２（配列番号：１８７）、Ｆｉｇ８４（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ８６（配列番号：１９１）、Ｆｉｇ８８（配列番号：１９３）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２２９）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２３３）、Ｆｉｇ９６（配列番号：２４１）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２４９）、Ｆｉｇ１００（配列番号：２５１）、Ｆｉｇ１０２（配列番号：２５６）、Ｆｉｇ１０４（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ１０６（配列番号：２６７）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１１０（配列番号：２７１）、Ｆｉｇ１１２（配列番号：２７３）、Ｆｉｇ１１４（配列番号：２７５）、Ｆｉｇ１１６（配列番号：２７７）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２７９）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：２８１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：２８６）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：２９３）、Ｆｉｇ１２６（配列番号：２９５）又はＦｉｇ１２８（配列番号：２９７）に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：１２）、Ｆｉｇ６（配列番号：１４）、Ｆｉｇ８（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２１）、Ｆｉｇ１２（配列番号：２６）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３１）、Ｆｉｇ１６（配列番号：３６）、Ｆｉｇ１８（配列番号：４１）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４６）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５７）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６２）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６７）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７２）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８０）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８７）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９２）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０７）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１２）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１７）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３４）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１４０）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４２）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５６（配列番号：１４６）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１４８）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１５２）、Ｆｉｇ６４（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１５９）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１６３）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ７４（配列番号：１７０）、Ｆｉｇ７６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ７８（配列番号：１８０）、Ｆｉｇ８０（配列番号：１８５）、Ｆｉｇ８２（配列番号：１８７）、Ｆｉｇ８４（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ８６（配列番号：１９１）、Ｆｉｇ８８（配列番号：１９３）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２２９）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２３３）、Ｆｉｇ９６（配列番号：２４１）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２４９）、Ｆｉｇ１００（配列番号：２５１）、Ｆｉｇ１０２（配列番号：２５６）、Ｆｉｇ１０４（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ１０６（配列番号：２６７）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１１０（配列番号：２７１）、Ｆｉｇ１１２（配列番号：２７３）、Ｆｉｇ１１４（配列番号：２７５）、Ｆｉｇ１１６（配列番号：２７７）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２７９）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：２８１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：２８６）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：２９３）、Ｆｉｇ１２６（配列番号：２９５）又はＦｉｇ１２８（配列番号：２９７）に示すアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも８０％のポジティブのスコアを示す単離されたポリペプチド。
【請求項３５】
ＡＴＣＣ受託番号２０９６５３、２０９３８０、２０９２５４、２０９３８１、２０９３７６、２０９２６０、２０９３７４、２０９２６５、２０９４１９、２０９４２４、２０９３８８、２０９４３３、２０９７０４、２０９７２０、２０９６２１、２０９６２０、２０９６１６、２０９４３６、２０９４２２、２０９７０２、２０９４８０、２０９８５９、２０９７７４、２０９８０１、２０９８０２、２０９８４９、２０９９０５、２０９９５０、２０９９６２、２０９８６６、２０３１２８、２０９９８６、２０３１７３、２０３１３２、２０３０９３、２０３４５７、２０３２４４、２０３０９４、２０３２８２、２０３２７６、２０３１６０、２０３２７７、２０３５７３、２０３５５３、−、２０９４５６、２０９３９７、２０９４９２、−、２０９８０８、２０９８０２、２０９７５０、２０９８５８、２０３５８３、２０９９８９、２０３０９２、２０３１３１、２０３２６９、２０３２６７、２０３６５７、２０３８１８、２０３８３４、２３−ＰＴＡ、２０３９０６で寄託されたＤＮＡの全長コード化配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項３６】
異種性アミノ酸配列に融合した請求項３３ないし３５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項３７】
前記異種性アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項３６に記載のキメラ分子。
【請求項３８】
前記異種性アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項３６に記載のキメラ分子。
【請求項３９】
請求項３３ないし３５のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項４０】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は単鎖抗体である請求項３９に記載の抗体。
【請求項４１】
（ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：１２）、Ｆｉｇ６（配列番号：１４）、Ｆｉｇ８（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２１）、Ｆｉｇ１２（配列番号：２６）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３１）、Ｆｉｇ１６（配列番号：３６）、Ｆｉｇ１８（配列番号：４１）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４６）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５７）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６２）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６７）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７２）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８０）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８７）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９２）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０７）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１２）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１７）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３４）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１４０）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４２）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５６（配列番号：１４６）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１４８）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１５２）、Ｆｉｇ６４（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１５９）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１６３）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ７４（配列番号：１７０）、Ｆｉｇ７６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ７８（配列番号：１８０）、Ｆｉｇ８０（配列番号：１８５）、Ｆｉｇ８２（配列番号：１８７）、Ｆｉｇ８４（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ８６（配列番号：１９１）、Ｆｉｇ８８（配列番号：１９３）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２２９）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２３３）、Ｆｉｇ９６（配列番号：２４１）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２４９）、Ｆｉｇ１００（配列番号：２５１）、Ｆｉｇ１０２（配列番号：２５６）、Ｆｉｇ１０４（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ１０６（配列番号：２６７）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１１０（配列番号：２７１）、Ｆｉｇ１１２（配列番号：２７３）、Ｆｉｇ１１４（配列番号：２７５）、Ｆｉｇ１１６（配列番号：２７７）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２７９）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：２８１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：２８６）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：２９３）、Ｆｉｇ１２６（配列番号：２９５）又はＦｉｇ１２８（配列番号：２９７）に示すポリペプチドをコードし、その関連シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列；
（ｂ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：１２）、Ｆｉｇ６（配列番号：１４）、Ｆｉｇ８（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２１）、Ｆｉｇ１２（配列番号：２６）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３１）、Ｆｉｇ１６（配列番号：３６）、Ｆｉｇ１８（配列番号：４１）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４６）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５７）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６２）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６７）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７２）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８０）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８７）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９２）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０７）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１２）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１７）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３４）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１４０）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４２）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５６（配列番号：１４６）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１４８）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１５２）、Ｆｉｇ６４（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１５９）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１６３）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ７４（配列番号：１７０）、Ｆｉｇ７６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ７８（配列番号：１８０）、Ｆｉｇ８０（配列番号：１８５）、Ｆｉｇ８２（配列番号：１８７）、Ｆｉｇ８４（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ８６（配列番号：１９１）、Ｆｉｇ８８（配列番号：１９３）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２２９）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２３３）、Ｆｉｇ９６（配列番号：２４１）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２４９）、Ｆｉｇ１００（配列番号：２５１）、Ｆｉｇ１０２（配列番号：２５６）、Ｆｉｇ１０４（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ１０６（配列番号：２６７）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１１０（配列番号：２７１）、Ｆｉｇ１１２（配列番号：２７３）、Ｆｉｇ１１４（配列番号：２７５）、Ｆｉｇ１１６（配列番号：２７７）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２７９）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：２８１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：２８６）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：２９３）、Ｆｉｇ１２６（配列番号：２９５）又はＦｉｇ１２８（配列番号：２９７）に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードし、その関連シグナルペプチドを伴うヌクレオチド配列；又は
（ｃ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：１２）、Ｆｉｇ６（配列番号：１４）、Ｆｉｇ８（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２１）、Ｆｉｇ１２（配列番号：２６）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３１）、Ｆｉｇ１６（配列番号：３６）、Ｆｉｇ１８（配列番号：４１）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４６）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５７）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６２）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６７）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７２）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８０）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８７）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９２）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０７）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１２）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１７）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３４）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１４０）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４２）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５６（配列番号：１４６）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１４８）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１５２）、Ｆｉｇ６４（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１５９）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１６３）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ７４（配列番号：１７０）、Ｆｉｇ７６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ７８（配列番号：１８０）、Ｆｉｇ８０（配列番号：１８５）、Ｆｉｇ８２（配列番号：１８７）、Ｆｉｇ８４（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ８６（配列番号：１９１）、Ｆｉｇ８８（配列番号：１９３）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２２９）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２３３）、Ｆｉｇ９６（配列番号：２４１）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２４９）、Ｆｉｇ１００（配列番号：２５１）、Ｆｉｇ１０２（配列番号：２５６）、Ｆｉｇ１０４（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ１０６（配列番号：２６７）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１１０（配列番号：２７１）、Ｆｉｇ１１２（配列番号：２７３）、Ｆｉｇ１１４（配列番号：２７５）、Ｆｉｇ１１６（配列番号：２７７）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２７９）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：２８１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：２８６）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：２９３）、Ｆｉｇ１２６（配列番号：２９５）又はＦｉｇ１２８（配列番号：２９７）に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードし、その関連シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列；
と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項４２】
（ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：１２）、Ｆｉｇ６（配列番号：１４）、Ｆｉｇ８（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２１）、Ｆｉｇ１２（配列番号：２６）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３１）、Ｆｉｇ１６（配列番号：３６）、Ｆｉｇ１８（配列番号：４１）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４６）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５７）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６２）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６７）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７２）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８０）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８７）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９２）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０７）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１２）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１７）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３４）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１４０）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４２）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５６（配列番号：１４６）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１４８）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１５２）、Ｆｉｇ６４（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１５９）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１６３）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ７４（配列番号：１７０）、Ｆｉｇ７６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ７８（配列番号：１８０）、Ｆｉｇ８０（配列番号：１８５）、Ｆｉｇ８２（配列番号：１８７）、Ｆｉｇ８４（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ８６（配列番号：１９１）、Ｆｉｇ８８（配列番号：１９３）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２２９）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２３３）、Ｆｉｇ９６（配列番号：２４１）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２４９）、Ｆｉｇ１００（配列番号：２５１）、Ｆｉｇ１０２（配列番号：２５６）、Ｆｉｇ１０４（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ１０６（配列番号：２６７）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１１０（配列番号：２７１）、Ｆｉｇ１１２（配列番号：２７３）、Ｆｉｇ１１４（配列番号：２７５）、Ｆｉｇ１１６（配列番号：２７７）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２７９）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：２８１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：２８６）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：２９３）、Ｆｉｇ１２６（配列番号：２９５）又はＦｉｇ１２８（配列番号：２９７）に示され、その関連シグナルペプチドを欠くポリペプチド；
（ｂ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：１２）、Ｆｉｇ６（配列番号：１４）、Ｆｉｇ８（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２１）、Ｆｉｇ１２（配列番号：２６）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３１）、Ｆｉｇ１６（配列番号：３６）、Ｆｉｇ１８（配列番号：４１）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４６）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５７）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６２）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６７）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７２）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８０）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８７）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９２）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０７）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１２）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１７）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３４）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１４０）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４２）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５６（配列番号：１４６）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１４８）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１５２）、Ｆｉｇ６４（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１５９）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１６３）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ７４（配列番号：１７０）、Ｆｉｇ７６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ７８（配列番号：１８０）、Ｆｉｇ８０（配列番号：１８５）、Ｆｉｇ８２（配列番号：１８７）、Ｆｉｇ８４（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ８６（配列番号：１９１）、Ｆｉｇ８８（配列番号：１９３）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２２９）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２３３）、Ｆｉｇ９６（配列番号：２４１）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２４９）、Ｆｉｇ１００（配列番号：２５１）、Ｆｉｇ１０２（配列番号：２５６）、Ｆｉｇ１０４（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ１０６（配列番号：２６７）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１１０（配列番号：２７１）、Ｆｉｇ１１２（配列番号：２７３）、Ｆｉｇ１１４（配列番号：２７５）、Ｆｉｇ１１６（配列番号：２７７）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２７９）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：２８１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：２８６）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：２９３）、Ｆｉｇ１２６（配列番号：２９５）又はＦｉｇ１２８（配列番号：２９７）に示され、その関連シグナルペプチドを伴うポリペプチドの細胞外ドメイン；又は
（ｃ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：１２）、Ｆｉｇ６（配列番号：１４）、Ｆｉｇ８（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２１）、Ｆｉｇ１２（配列番号：２６）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３１）、Ｆｉｇ１６（配列番号：３６）、Ｆｉｇ１８（配列番号：４１）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４６）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５７）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６２）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６７）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７２）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８０）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８７）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９２）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０７）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１２）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１７）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３４）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１４０）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４２）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５６（配列番号：１４６）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１４８）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１５２）、Ｆｉｇ６４（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１５９）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１６３）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ７４（配列番号：１７０）、Ｆｉｇ７６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ７８（配列番号：１８０）、Ｆｉｇ８０（配列番号：１８５）、Ｆｉｇ８２（配列番号：１８７）、Ｆｉｇ８４（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ８６（配列番号：１９１）、Ｆｉｇ８８（配列番号：１９３）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２２９）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２３３）、Ｆｉｇ９６（配列番号：２４１）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２４９）、Ｆｉｇ１００（配列番号：２５１）、Ｆｉｇ１０２（配列番号：２５６）、Ｆｉｇ１０４（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ１０６（配列番号：２６７）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１１０（配列番号：２７１）、Ｆｉｇ１１２（配列番号：２７３）、Ｆｉｇ１１４（配列番号：２７５）、Ｆｉｇ１１６（配列番号：２７７）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２７９）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：２８１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：２８６）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：２９３）、Ｆｉｇ１２６（配列番号：２９５）又はＦｉｇ１２８（配列番号：２９７）に示され、その関連シグナルペプチドを欠くポリペプチドの細胞外ドメイン；
と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
ＰＢＭＣ細胞をＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドの有効量と接触させ、コントロールレベルからの増殖の変化を測定することを含んでなるＴ細胞の増殖に影響を及ぼす方法。
【請求項４４】
ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドの有効量を試験動物に注入し、得られた血管透過性の度合いを測定することを含んでなる血管透過性に影響を及ぼす方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は免疫関連疾患の診断と治療のための組成物と方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
免疫関連及び炎症疾患は、正常な生理機能では、発作又は傷害に反応して、発作又は傷害から修復を開始し、外来生物体に対する生得及び後天的防御を開始するのに重要な、かなり複合化し、多くの場合は多重に相互に関連した生物学的経路の現れ又は結果である。疾患又は病理は、これらの正常な生理学的経路が、反応の強さに直接関連してか、異常な調節又は過度な刺激の結果として、自己に対する反応として、又はこれらの組合せとして、さらなる発作又は傷害を引き起こすときに生じる。
これらの疾患の発生は、多くの場合、多段階経路、及び多くの生物学的システム／経路、に関与しており、一又は複数のこれらの経路の重要点における介在により改善又は治療効果を有し得る。治療的介在は有害なプロセス／経路、又は有益なプロセス／経路の刺激のいずれかにより生じる。
【０００３】
多くの免疫関連疾患が知られており、広範囲にわたって研究されている。このような疾患には、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染疾患、免疫欠損症、異常増殖等が含まれる。
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は哺乳動物の免疫反応の重要な成分である。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）内の遺伝子によりコードされる自己分子と結合する抗原を認識する。抗原は抗原提示細胞、ウイルス感染細胞、癌細胞、移植片の表面上のＭＨＣ分子と共に示され得る。Ｔ細胞系は宿主哺乳動物の健康を脅かすこれらの改変細胞を除去するものである。Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞及び細胞障害性Ｔ細胞を含む。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞上の抗原−ＭＨＣ複合体の認識に続いて広範囲に増殖する。またヘルパーＴ細胞は種々のサイトカイン、例えばリンホカインを分泌し、これはＢ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、及び免疫反応に寄与している種々の他の細胞の活性化において中心的な役割を担っている。
【０００４】
体液及び細胞媒介性の免疫反応の双方における中心的事象は、ヘルパーＴ細胞の活性化及びクローン増殖である。ヘルパーＴ細胞の活性化は、抗原提示細胞の表面におけるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）−ＣＤ３複合体と抗原−ＭＨＣとの相互作用により開始される。この相互作用は休止ヘルパーＴ細胞が細胞サイクル（Ｇ０からＧ１転移）に入るのを誘発する生化学的事象のカスケードを媒介し、結果として、ＩＬ−２と、時々はＩＬ−４とに対する高親和性レセプターが発現する。活性化されたＴ細胞は増殖及び記憶細胞とエフェクター細胞への分化のサイクルを通って進行する。
ＴＣＲを通して媒介されたシグナルに加えて、Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞により放出されるサイトカイン、又は抗原提示細胞とＴ細胞上の膜結合性分子との相互作用により誘発される付加的な同時刺激に関与している。サイトカインＩＬ−１及びＩＬ−６は同時刺激シグナルを提供することが示されている。また、抗原提示細胞の表面で発現したＢ７分子とＴ細胞表面で発現したＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４分子との相互作用により細胞の活性化がなされる。活性化されたＴ細胞は増加した数の細胞付着分子、例えばＩＣＡＭ−１、インテグリン、ＶＬＡ−４、ＬＦＡ−１、ＣＤ５６等を発現する。
【０００５】
混合リンパ球培養又は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＴ細胞増殖は、化合物が免疫系を刺激する能力の確立された指標である。多くの免疫反応において、炎症細胞は傷害又は感染部位に浸潤する。移動細胞は、影響を受けた組織の組織学的検査により決定可能な好中球、好酸球、単球又はリンパ球でありうる。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 編集 Ｊｏｈｎ． Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．参照。
免疫関連疾患は免疫反応を抑制することにより治療することができる。免疫刺激活性を有する分子を阻害する中和抗体を使用することは、免疫媒介及び炎症疾患の治療に有用である。免疫反応を阻害する分子は免疫反応の阻害に有用であり（タンパク質を直接、又は抗体アゴニストの使用を介して）、よって免疫関連疾患を改善する。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、ヒトを含む哺乳動物における免疫関連疾患の診断と治療ための組成物と方法に関する。本発明は、哺乳動物における免疫反応を刺激又は阻害するタンパク質（アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む）の同定に基づく。免疫関連疾患は免疫反応を阻害又は増強することで治療することができる。免疫反応増強が有益である場合には、免疫反応を刺激する分子は治療に使用可能である。また、免疫反応の抑制が重要である場合には、このような刺激分子は阻害されうる。
中和抗体は、免疫刺激活性を有する分子を阻害する分子の例であり、免疫関連及び炎症疾患の治療に役立つ。また、免疫反応を阻害する分子は免疫反応の阻害に（タンパク質を直接又は抗体アゴニストの使用を経て）利用されうるし、こうして免疫関連疾患は改善する。
【０００７】
従って、ＰＲＯポリペプチド及び抗−ＰＲＯ抗体及びそれらの断片は、免疫関連疾患の診断及び／又は治療（予防を含む）に役立つ。刺激タンパク質に結合する抗体は免疫システム及び免疫反応の阻害に利用可能である。阻害タンパク質に結合する抗体は免疫システム及び免疫反応の刺激に有用である。また、ＰＲＯポリペプチド及び抗−ＰＲＯ抗体は免疫関連及び炎症疾患の治療のための薬や薬剤の調製に有用である。
一実施態様において、本発明はＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一態様において、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示された膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【０００８】
他の態様において、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示されたＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチドのコード配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片のコード配列を含むＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
さらなる態様では、本発明は、（ａ）ここに開示されたＡＴＴＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【０００９】
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されているか膜貫通ドメインが不活性化されているＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供し、またはそのようなコード化ヌクレオチド配列に相補的であり、ここでそのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示される。従って、ここに記載されたＰＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチドコード配列の断片、又はその補体に向けられ、それらは、例えば、場合によっては抗−ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含むポリペプチドをコードするＰＲＯポリペプチドの断片をコードする、ハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。そのような核酸断片は通常少なくとも約２０のヌクレオチド長、又は少なくとも約３０のヌクレオチド長、又は少なくとも約４０のヌクレオチド長、又は少なくとも約５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約６０のヌクレオチド長、又は少なくとも約７０のヌクレオチド長、又は少なくとも約８０のヌクレオチド長、又は少なくとも約９０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１００のヌクレオチド長、又は少なくとも約１１０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１２０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１３０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１４０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１６０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１７０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１８０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１９０のヌクレオチド長、又は少なくとも約２００のヌクレオチド長、又は少なくとも約２５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約３００のヌクレオチド長、又は少なくとも約３５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約４００のヌクレオチド長、又は少なくとも約４５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約５００のヌクレオチド長、又は少なくとも約６００のヌクレオチド長、又は少なくとも約７００のヌクレオチド長、又は少なくとも約８００のヌクレオチド長、又は少なくとも約９００のヌクレオチド長、又は少なくとも約１０００のヌクレオチド長、又は少なくとも約１５００ヌクレオチド長、又は少なくとも約２０００ヌクレオチド長、又は少なくとも約２５００ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０００ヌクレオチド長、又は少なくとも約４０００ヌクレオチド長、又は少なくとも約５０００ヌクレオチド長、又はそれ以上であり、ここで、「約」という用語は、その参照長のプラス又はマイナス１０％の参照ヌクレオチド配列長を意味する。それぞれのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くのよく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用して、それぞれのＰＲＯポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのヌクレオチド配列断片（類）が新規であるかを決定することにより常套的方法により決定することができることに留意される。そのようなそれぞれのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子によりコードされるＰＲＯポリペプチド断片、好ましくは抗−ＰＲＯポリペプチド抗体に対する結合部位を含んでなるそれらのポリペプチド断片である。
【００１０】
他の実施態様では、本発明は、上記で同定された単離された核酸配列の任意のものにコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
或る態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯポリペプチドに対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、ここに開示されたＡＴＴＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有しているアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメインのコード配列、又はここに開示された全長アミノ酸配列の任意の他の特に定められた断片を有するＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約８０％のポジティブ、又は少なくとも約８１％のポジティブ、又は少なくとも約８２％のポジティブ、又は少なくとも約８３％のポジティブ、又は少なくとも約８４％のポジティブ、又は少なくとも約８５％のポジティブ、又は少なくとも約８６％のポジティブ、又は少なくとも約８７％のポジティブ、又は少なくとも約８８％のポジティブ、又は少なくとも約８９％のポジティブ、又は少なくとも約９０％のポジティブ、又は少なくとも約９１％のポジティブ、又は少なくとも約９２％のポジティブ、又は少なくとも約９３％のポジティブ、又は少なくとも約９４％のポジティブ、又は少なくとも約９５％のポジティブ、又は少なくとも約９６％のポジティブ、又は少なくとも約９７％のポジティブ、又は少なくとも約９８％のポジティブ、又は少なくとも約９９％のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
特定の態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たない単離されたＰＲＯポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の態様では、本発明は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培地からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
【００１２】
他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。任意のこのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母でありうる。ここに記載のポリペプチドの任意のものを生産するための方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリぺプチド又はアミノ酸配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのＦｃ領域又はエピトープタグ配列に融合したここに記載のポリペプチドの任意のものが含まれる。
さらに他の実施態様では、本発明は、アンチセンスプローブとして、又はゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列を単離するために有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、ここでそれらプローブは上述の又は下記のヌクレオチド配列の任意の任意のものから誘導されうる。
【００１３】
さらなる他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドの一又は複数の機能又は活性を模倣又は阻害する、ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチド又は小分子に結合する抗体である。
他の実施態様では、本発明は上述の又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は単鎖抗体である。一態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。他の態様では、抗体はＰＲＯポリペプチドの活性を模倣し（アゴニスト抗体）、又は逆に抗体はＰＲＯポリペプチドの活性を阻害又は中和する（アンタゴニスト抗体）。他の態様では、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、抗体は抗体断片、モノクローナル抗体、単鎖抗体、又は抗−イディオタイプ抗体である。
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することによる、ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
【００１４】
他の実施態様では、本発明は、担体又は賦形剤との混合物においてポリペプチドと結合するＰＲＯポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニスト抗体を含む組成物に関する。一態様では、組成物は治療に有効な量のペプチド又は抗体を含む。他の態様では、組成物が免疫刺激分子を含むとき、組成物は：（ａ）その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を増大させ、（ｂ）その必要とする哺乳動物における免疫反応を刺激又は増強し、又は（ｃ）抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖を増加させるのに役立つ。さらなる態様では、組成物が免疫阻害分子を含むとき、組成物は：（ａ）その必要とする哺乳動物の組織への炎症細胞の浸潤を減少させ、（ｂ）その必要とする哺乳動物における免疫反応を阻害又は低減させ、又は（ｃ）抗原に反応してその必要とする哺乳動物におけるＴ−リンパ球の増殖を減少させるのに役立つ。他の態様では、組成物はさらなる活性成分を含み、それは例えばさらなる抗体又は細胞毒又は化学療法剤であり得る。好ましくは、組成物は滅菌される。
他の実施態様では、本発明は、上述の用途を有する組成物又は医薬品の調製のための、本発明のＰＲＯポリペプチド及び抗体の使用に関する。
さらなる実施態様では、本発明は、抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７抗体をコードする核酸、及びそのような核酸を構成するベクターや組み換え宿主細胞に関する。またさらなる実施態様では、本発明は、抗体が発現するような条件下で、抗体をコードする核酸を使って形質転換された宿主細胞を培養し、細胞媒地から抗体を回収することにより、そのような抗体を生産する方法に関する。
【００１５】
さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子、又はその補体にハイブリッド形成する単離された核酸分子に関する。この核酸は好ましくはＤＮＡであり、ハイブリッド形成は好ましくは緊縮条件下で起こる。このような核酸分子は、ここに同定される増幅遺伝子のアンチセンス分子として作用でき、翻って、対応する増幅遺伝子の変調において、又は増幅反応のアンチセンスプライマーとしての用途が見いだされる。さらに、このような配列はリボザイム及び／又はトリプルヘリックス配列の一部として燃使用でき、翻って、増幅遺伝子の調節で使用することもできる。
他の実施態様では、本発明は、ポリペプチドを含有及び／又はそれを発現すると疑われる細胞を、抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７抗体に暴露し、抗体の細胞への結合を測定することを含んでなるＰＲＯポリペプチドの存在を決定する方法に関する。
さらなる他の実施態様では、本発明は、（ａ）哺乳動物から得た組織細胞の試験試料における、及び（ｂ）同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における、ＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを検出することを含む、哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法に関し、ここで、対照試料と比較して試験試料の発現レベルが高い又は低いと、試験組織細胞を得た哺乳動物に免疫関連疾患が存在することを示す。
【００１６】
他の実施態様では、本発明は（ａ）抗−ＰＲＯポリペプチド抗体を哺乳動物から得た組織細胞の試験試料に接触させ、（ｂ）試験試料中でのそれぞれのＰＲＯポリペプチドと抗体との複合体形成を検出することを含む哺乳動物における免疫関連疾患の診断方法に関し、ここで、該複合体の形成は、該疾患の有又は無を示す。検出は、定性的でも定量的でもよく、同じ細胞型の既知の正常組織細胞の対照試料における複合体形成の監視との比較において実施される。試験試料における多量の複合体形成は、試験組織細胞を得た哺乳動物における免疫疾患の有又は無を示す。抗体は、好ましくは検出可能な標識を有する。複合体形成は、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光測定、又は他のこの分野で知られた技術により監視することができる。通常、試験試料は、免疫システムに欠陥又は異常があると推測される個体から採取される。
他の実施態様では、本発明は適当なパッケージに、抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７抗体と（例えば緩衝剤のような）担体を含んでなる診断キットに関する。好ましくはキットはＰＲＯポリペプチドを検出するための抗体を使用するための説明書を含む。
【００１７】
さらなる実施態様では、本発明は：
容器；
容器上の説明書；及び
容器内に収容された活性剤を含む組成物；
を含んでなる製造品に関し；ここでその組成物は哺乳類における免疫反応の刺激又は阻害に効果があり、容器上の説明書は組成物が免疫関連疾患の治療に使用されうることを示しており、組成物中の活性剤はＰＲＯポリペプチドの発現及び／又は活性を刺激又は阻害する薬剤である。好ましい態様では、活性剤は、ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチド、又は抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７抗体である。
【００１８】
さらなる実施態様は、ＰＲＯポリペプチドに候補化合物を、これら２つの成分を互いに作用させるのに十分な時間と状況の下で接触させることにより、ＰＲＯポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害可能な化合物を同定する方法である。特定の態様では、候補化合物又はＰＲＯポリペプチドのどちらかは固体支持体上に固定される。他の態様では、非固定成分は検出標識を保有する。
本発明の他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗−ＰＲＯ抗体に応答性のある症状の治療に有用な医薬品の調製のための、ここに記載されたＰＲＯポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−ＰＲＯ抗体の使用に向けられる。
【００１９】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド（類）」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、ＰＲＯ／数字、すなわち特に、ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を称する。「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」であって、「数字」がここで使用される実際の数値符号として与えられる用語は、天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体（ここで更に定義する）を含む。ここに記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列ＰＲＯポリペプチド（類）」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯ／数字ポリペプチドは、天然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド（類）」という用語には、特に、特定のＰＲＯ／数字ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここで記載の天然配列ＰＲＯポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字又は下線で示す。しかし、添付の図面に開示したＰＲＯ／数字ポリペプチドは、図面におけるアミノ酸位置１としてここに命名されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置１の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
「ＰＲＯポリペプチド（類）細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に有しない前記ポリペプチドの形態を称する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、ここで最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えないと思われる。よって、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書で同定されるように膜貫通ドメイン／細胞外ドメインの境界のいずれかの側から約５又はそれ未満のアミノ酸を含んでもよく、シグナルペプチドを伴う又は伴わない、そのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明で考慮される。
【００２０】
ここに開示する種々のＰＲＯ／数字ＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書及び添付の図面に示す。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ−末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ−末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸以下である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ−末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに当該技術にいて日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ等， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． １０： １−６ （１９９７）及びｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １４： ４６８３−４６９０ （１９８６））。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに同定されるシグナルペプチドのＣ−末端境界のいずれかの側の約５アミノ酸以下の範囲内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
「ＰＲＯポリペプチド変異体」、「ＰＲＯ／数字変異体」又は「ＰＲＯ変異体」とは、ここに（例えば以下に）定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ−又はＣ−末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示された全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチドを伴うか伴わないここに開示されたＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド配列の任意の他の特に定められた他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、又は少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、又は少なくとも約２０アミノ酸長、又は少なくとも約３０アミノ酸長、又は少なくとも約４０アミノ酸長、又は少なくとも約５０アミノ酸長、又は少なくとも約６０アミノ酸長、又は少なくとも約７０アミノ酸長、又は少なくとも約８０アミノ酸長、又は少なくとも約９０アミノ酸長、又は少なくとも約１００アミノ酸長、又は少なくとも約１５０アミノ酸長、又は少なくとも約２００アミノ酸長、又は少なくとも約３００アミノ酸長、又は少なくとも約４００アミノ酸長、又は少なくとも約５００アミノ酸長、又は少なくとも約６００アミノ酸長、又は少なくとも約７００アミノ酸長、又は少なくとも約８００アミノ酸長、又は少なくとも約９００アミノ酸長、又は少なくとも約１０００アミノ酸長、又は少なくとも約１２００アミノ酸長、又は少なくとも約１４００アミノ酸長、又は少なくとも約１５００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００２１】
ここで同定されているＰＲＯポリペプチド配列に対して「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、特定のＰＲＯ／数字ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが以下の表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、以下の表１に示したソースコードは米国著作権庁， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公に入手可能であり、また以下の表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは認識されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、表２と３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「ＰＲＯ」とは関心ある仮のＰＲＯ／数字ポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」とは関心ある「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されているポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」、「Ｚ」はそれぞれ異なった仮のアミノ酸配列を表す。
【００２２】
特に断らない限り、ここで用いられる全ての％アミノ酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、以下に記載するように、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて得ることもできる。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を用いた場合、％アミノ酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定されるように（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、関心ある比較アミノ酸配列（即ち、ＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含むポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが関心ある比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
また、パーセントアミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードしてもよく、別にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから得てもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【００２３】
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子でを意味し、（１）ここに開示された全長天然配列ＰＲＯポリペプチド；（２）ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド；（３）ここに開示されたシグナルペプチドを伴うか伴わないＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン又は（４）ここに開示された全長ポリペプチド配列の任意の他の断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯポリペプチド変異体ポリヌクレオチドは、（１）ここに開示された全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、（２）ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、（３）ここに開示されたシグナル配列を伴うか伴わないＰＲＯポリペプチド配列の細胞外ドメイン又は（４）ここに開示された全長ＰＲＯポリペプチド配列の任意の他の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９０％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９１％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９２％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９３％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９４％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９５％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９６％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９７％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９８％の核酸配列同一性、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。変異体は天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯポリペプチド変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０のヌクレオチド長、又は少なくとも約６０のヌクレオチド長、又は少なくとも約９０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１２０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約１８０のヌクレオチド長、又は少なくとも約２１０のヌクレオチド長、又は少なくとも約２４０のヌクレオチド長、又は少なくとも約２７０のヌクレオチド長、又は少なくとも約３００のヌクレオチド長、又は少なくとも約４５０のヌクレオチド長、又は少なくとも約５００のヌクレオチド長、又は少なくとも約６００のヌクレオチド長、又は少なくとも約７００のヌクレオチド長、又は少なくとも約８００のヌクレオチド長、又は少なくとも約９００のヌクレオチド長、又は少なくとも約１０００のヌクレオチド長、又は少なくとも約１２００のヌクレオチド長、又は少なくとも約１４００のヌクレオチド長、又は少なくとも約１６００ヌクレオチド長、又は少なくとも約１８００のヌクレオチド長、又は少なくとも約２０００ヌクレオチド長、又は少なくとも約２５００ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０００ヌクレオチド長、又は少なくとも約３５００のヌクレオチド長、又は少なくとも約４０００ヌクレオチド長、又は少なくとも約５０００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
ここで同定されるＰＲＯコード化核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、関心あるＰＲＯ核酸のヌクレオチド配列と同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが以下の表１に与えられている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、以下の表１に示したソースコードは米国著作権庁， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムはジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公に入手可能であり、また以下の表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００２４】
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。％核酸配列同一性の計算の例として、表４と５は、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示し、ここで「ＰＲＯ−ＤＮＡ」は、関心ある仮のＰＲＯポリペプチドコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」は関心ある「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」はそれぞれ異なった仮のヌクレオチド配列を表す。
特に断らない限り、ここで用いられる全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに記載したようにしてＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて得ることもできる。殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を用いた場合、％核酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定されるように（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列（すなわち参照配列）を有する関心あるＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、関心ある比較核酸分子（すなわち、関心あるＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子が比較されるＰＲＯ変異ポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）ＰＲＯ参照配列のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂと少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含む単離された核酸分子」という記載において、核酸配列Ａは関心ある比較核酸分子であり、核酸配列Ｂは関心あるＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【００２５】
また、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードしてもよく、別にＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤから得てもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチド数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なると認識されるであろう。
【００２６】
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成可能な核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
「ポジティブ（陽性）」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基（例えば、保存的置換の結果として、下記の表６参照）を含む。ここでの目的のために、ポジティブの％値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する関心あるＰＲＯポリペプチド配列と、関心ある比較アミノ酸配列（即ち、ＰＲＯポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列）との間の、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス内で決定されるようにポジティブ値をスコアされるアミノ酸残基の数を、（ｂ）関心あるＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。
特に断らない限り、陽性の％値は、直上のパラグラフに記載したようにして計算される。しかしながら、上述のＡＬＩＧＮ−２及びＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２について記載したように実施されるアミノ酸配列同一性比較には、同一のみならず類似した特性をもつ比較配列におけるアミノ酸残基が含まれる。関心あるアミノ酸残基に対してポジティブ値がスコアされたアミノ酸残基は、関心あるアミノ酸残基と同一であるか、又は関心あるアミノ酸残基の好ましい置換（下記の表１に定義）であるものである。
【００２７】
ＡＬＩＧＮ−２又はＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を用いたアミノ酸配列比較では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対するポジティブの％値（与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２又はＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによってポジティブ値であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％ポジティブは、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なると認識されるであろう。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、自然環境におけるＰＲＯポリペプチドの少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２８】
「単離された」ＰＲＯポリペプチドコード化核酸又は他のポリペプチドコード化核酸は、同定され、ＰＲＯポリペプチドコード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される状態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸は、天然の細胞中に存在するポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある特定のポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるものを含む。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を称す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２９】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、通常、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなればなる程、適切なアニーリングのために温度を高くする必要があり、プローブが短くなればなる程、温度を低くする必要が生じる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点より低い環境に存在する場合、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， （１９９５）を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定され得る。
【００３０】
「中程度の緊縮性条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件の例は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といったものある。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
「抗体」（Ａｂｓ）と「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は、概略的に、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、限定するものではないが、特に無傷のモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ＰＲＯポリペプチドに特異的なエピトープと結合する単鎖抗体、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片もカバーする。抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７抗体は、それぞれＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドに免疫学的に結合する抗体である。抗体は、抗体に接触し得るＰＲＯポリペプチドの任意のドメインに結合可能である。例えば、抗体はポリペプチドの任意の細胞外ドメインに、また全ポリペプチドが分泌されたものである場合は、抗体が結合のために利用可能なポリペプチドの任意のドメインに結合可能である。
【００３１】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を称する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の「高頻度可変領域」又は「相補性決定領域（ＣＤＲ）」と呼ばれる３又は４のセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成するＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４又は５のＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ等， ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ．９１−３２４２， Ｖｏｌ．Ｉ， ６４７−６６９頁［１９９１］を参照のこと）。ＣＤＲの範囲を決定するためには少なくとも２つの技術がある：（１）交雑種配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ等．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ． ＭＤ）；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．等．， （１９８９）， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７）。さらにまた、ＣＤＲは先の技術の両方により同定される残基を導入するハイブリッド形成アプローチを使用して決定することもできる。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
「抗体断片」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るＦ（ａｂ’）２断片が生じる。
【００３２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ−ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域（ＣＨ１）を有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ’に対するここでの命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらのいくつかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、σ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【００３３】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含む通常の（ポリクローナル）抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ等， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５ ［１９７５］により記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。また「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ等， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８［１９９１］、及びＭａｒｋｓほか， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。また、ファージミド及びファージベクターを使用する抗体の調製について記載した米国特許第５，７５０，３７３号、同５，５７１，６９８号、同５，４０３，４８４号及び同５，２２３，４０９号を参照のこと。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む（米国特許第４，８１６，５６７号； Ｍｏｒｒｉｓｏｎほか， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１−６８５５［１９８４］）。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそれらの断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細は、Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ ３３２， ３２３−３２９［１９８８］；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２， ５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心ある抗原でマカクザルを免疫化することにより生産された抗体から由来する「プリマタイズした（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体を含む。旧世界ザルの残基を含有する抗体も本発明の範疇に入れることができる。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号；同５，６９３，７８０号；同５，６８１，７２２号；及び同５，７５６，０９６号を参照のこと。
【００３４】
本発明の抗体及びその断片には、抗体を一又は複数のＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域のアミノ酸配列を変化させて、それが結合する抗原に対する抗体又はその断片の親和性を改変させた「親和成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒｅｄ）」抗体も含まれる。親和成熟により、出発抗体と比較して抗原に対する成熟抗体の親和性が増加又は低減する結果となる。典型的には、出発抗体はヒト化、ヒト、キメラもしくはマウス抗体であり、親和成熟した抗体は出発抗体よりも高い親和性を有する。成熟プロセス中、ＣＤＲ又はフレームワーク領域における一又は複数のアミノ酸残基は、任意の標準的な方法を使用して異なる残基に変えられる。適切な方法には、よく知られているカセット突然変異法（Ｗｅｌｌ等， １９８５． Ｇｅｎｅ ３４：３１５）又はオリゴヌクレオチド媒介突然変異法（Ｚｏｌｌｅｒ等， １９８７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０： ６４８７−６５０４）を使用する点突然変異が含まれる。また親和成熟は、多くの変異体を産出し、所望の親和性を有する変異体を抗原又はリガンドに対する改善された親和性に基づき、変異体のライブラリ又はプールから選択する、既知の選択法を使用して実施することもできる。既知のファージライブラリ技術をこのアプローチ法で簡便に使用することができる。例えば米国特許第５，７５０，３７３号、米国特許第５，２２３，４０９号等を参照のこと。
ヒト抗体は本発明の抗体の範囲に入る。ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９２）；Ｍａｒｋｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅ等及びＢｏｅｒｎｅｒ等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Ｃｏｌｅ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６−９５（１９９１）；米国特許第５，７５０，３７３号］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９−７８３ （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇ等， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９ （１９９４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８， ８１２−１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５−５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ ６５−９３ （１９９５）に記載されている。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７； ＷＯ ９３／１１１６１； 及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ６４４４−６４４８ （１９９３）により十分に記載されている。
【００３５】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、化合物、例えば抗体又はポリペプチドに直接又は間接的に抱合して、「標識」化合物を生成する検出可能な化合物又は組成物を称する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の化合物がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここで含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫システムの成分が、哺乳動物の病的状態を引き起こし、媒介し又は寄与等するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語に含まれるものは、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、免疫不全症、異常増殖等が含まれる。
「Ｔ細胞媒介疾患」という用語は、Ｔ細胞が直接的又は間接的に哺乳動物の病的状態を媒介するか寄与等する疾患を意味する。Ｔ細胞媒介疾患は細胞媒介効果、リンホカイン媒介効果等を伴い、例えばＴ細胞により分泌されるリンホカインによりＢ細胞が刺激されている場合はＢ細胞に関連した効果を伴う。
本発明で治療可能で、そのいくつかは免疫又はＴ細胞媒介性である免疫関連及び炎症疾患の例には、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｃｕｌｉｔｉｓ）、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少（特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少）、甲状腺炎（グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、例えば多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性（ｎｏｎｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎；クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。ウイルス性疾患、例えばＡＩＤＳ（例えばＨＩＶ感染）、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎、ヘルペス、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染等の感染症も含まれる。
【００３６】
「治療」とは、疾患の病理の進行又は改変の防止を意図して行われる。従って、「治療」とは、治癒的処置、予防的処置及び防止的処置の両方を称する。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。免疫関連疾患の治療において、治療薬は直接的に免疫反応の成分度合いを減少又は増加させてもよいし、又は他の治療薬、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等による治療に対してより敏感にしてもよい。
「有効量」という用語は、インビトロアッセイで測定される哺乳動物における免疫反応の成分で、検出可能な改善を引き起こすか、誘発するか、又は結果をもたらすＰＲＯポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの少なくとも最小濃度又は量のことである。例えば、Ｔ細胞の増殖及び／又は血管透過性の増加又は低減がここで提供される実施例で測定される。さらに「治療有効量」は、哺乳動物における免疫反応の成分で、病状を少なくとも緩和させる（ケースによっては増加又は減少させる）のに有効で、上述したパラグラフに定義された治療に効果的な結果をもたらすＰＲＯポリペプチド及び／又はアゴニスト／アンタゴニストの少なくとも最小濃度又は量のことである。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを称する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
免疫関連疾患の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、抗体生産、自己抗体生産、補体生産及び活性化、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化、組織空間への炎症細胞（好中球、エシオン好性球、単球、リンパ球）の侵入等を含む。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、ハムスター、イタチ、ネコ等を含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）を含む。
【００３７】
ここで用いられる「細胞障害薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を称する。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド類、例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ， Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）及びドキセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ， Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ， Ａｎｔｏｎｙ， Ｆｒａｎｃｅ）、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号を参照のこと）、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長を、インビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を称する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ相でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ相以外の位置で）ブロックする薬剤、例えばＧ１停止又はＭ相停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ相ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ相停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−Ｃである。さらなる情報は、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ， 編， Ｃｈａｐｔｅｒ １， 表題「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」， Ｍｕｒａｋａｍｉ等， （ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ： Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９５）、特にｐ１３に見出すことができる。
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子−Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
【００３８】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを称す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは、融合するＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基）を有する。
ＰＲＯポリペプチド変異体における「活性な」及び「活性」とは、ＰＲＯポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体の産生を誘発する能力及び／又は生物学的機能を保持する本発明のタンパク質の形態を指す。より詳細には、「生物学的活性」とは、天然配列又は天然発生ＰＲＯポリペプチドによって引き起こされる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能を指す。さらにより詳細には、ここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定可能な抗体又は他の分子（例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等）における「生物学的活性」とは、このような分子が、組織への炎症細胞の侵入を誘発又は阻害し、Ｔ細胞の増殖又は活性化を刺激又は阻害し、細胞からのサイトカインの放出を阻害し、又は血管透過性を増加又は低減させる能力のことである。他の特定の生物学的活性は増加した血管透過性又はその阻害である。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然配列ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全に阻止、阻害、又は中和する任意の分子を含む。同様に「アゴニスト」なる用語も最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然配列ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣又は増幅する任意の分子を含む。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子等を含む。ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニスト分子と接触させ、ＰＲＯポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
「小分子」とは、ここで、約６００ダルトン未満の分子量を持つと定義され、一般的に有機化合物である。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（場合によっては化学療法剤を含む）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
ＩＩ．  本発明の組成物と方法
１．本発明のＰＲＯポリペプチドの調製
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドとされるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に開示するように、種々のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ／番号」又は「ＰＲＯ」で呼称する。
特に、ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチド（それぞれ、ＵＮＱ１７４、ＵＮＱ１７８、ＵＮＱ１８６、ＵＮＱ１９０、ＵＮＱ２００、ＵＮＱ２１４、ＵＮＱ２０９、ＵＮＱ２１９、ＵＮＱ１４６、ＵＮＱ２４０、ＵＮＱ２３９、ＵＮＱ２９３、ＵＮＱ３３０、ＵＮＱ３６５、ＵＮＱ３１６、ＵＮＱ３１７、ＵＮＱ３１８、ＵＮＱ３１９、ＵＮＱ３１３、ＵＮＱ３３２、ＵＮＱ３３４、ＵＮＱ５４０、ＵＮＱ４３４、ＵＮＱ４０８、ＵＮＱ４０７、ＵＮＱ４３０、ＵＮＱ５５７、ＵＮＱ４９１、ＵＮＱ５９８、ＵＮＱ５１６、ＵＮＱ７０１、ＵＮＱ５８５、ＵＮＱ６３３、ＵＮＱ６７８、ＵＮＱ６０６、ＵＮＱ６３０、ＵＮＱ６５３、ＵＮＱ６０８、ＵＮＱ６９８、ＵＮＱ７３２、ＵＮＱ７２２、ＵＮＱ７２８、ＵＮＱ９００、ＵＮＱ８５９、ＵＮＱ１７９、ＵＮＱ２１、ＵＮＱ２３６、ＵＮＱ３０３、ＵＮＱ２９４、ＵＮＱ３２２、ＵＮＱ３８８、ＵＮＱ４３５、ＵＮＱ４３３、ＵＮＱ４８３、ＵＮＱ５４５、ＵＮＱ５８９、ＵＮＱ７０７、ＵＮＱ６８５、ＵＮＱ６９３、ＵＮＱ７３９、ＵＮＱ１８８８、ＵＮＱ１８６６、ＵＮＱ１９４７及びＵＮＱ２４４８に相当）をコードするｃＤＮＡは、以下の実施例においてさらに詳細に開示されているように、同定され単離されている。
【００４２】
特に、本明細書は、天然配列ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０及びＰＲＯ５７２７ポリペプチドをそれぞれコードする、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ２９１０１−１２７６、ＤＮＡ３０８７１−１１５７、ＤＮＡ３０９４２−１１３４、ＤＮＡ３３０８７−１１５８、ＤＮＡ３３４６０−１１６６、ＤＮＡ３４３８７−１１３８、ＤＮＡ３５５５８−１１６７、ＤＮＡ３５６３８−１１４１、ＤＮＡ３５９１６−１１６１、ＤＮＡ３９５２３−１１９２、ＤＮＡ４０６２０−１１８３、ＤＮＡ４０９８２−１２３５、ＤＮＡ４４１８４−１３１９、ＤＮＡ４４２０５−１２８５、ＤＮＡ４５４１０−１２５０、ＤＮＡ４５４１６−１２５１、ＤＮＡ４５４１９−１５２５、ＤＮＡ４７３６５−１２０６、ＤＮＡ４７４７０−１１３０、ＤＮＡ４８３１４−１３２０、ＤＮＡ４９４３５−１２１９、ＤＮＡ５０９２１−１４５８、ＤＮＡ５３９７４−１４０１、ＤＮＡ５４２２８−１３６６、ＤＮＡ５４２３１−１３６６、ＤＮＡ５６４０５−１３５７、ＤＮＡ５７０３３−１４０３、ＤＮＡ５７６９０−１３７４、ＤＮＡ５９２２０−１５１４、ＤＮＡ５９２９４−１３８１、ＤＮＡ５９７７６−１６００、ＤＮＡ５９８４９−１５０４、ＤＮＡ６０７７５−１５３２、ＤＮＡ６１８７３−１５７４、ＤＮＡ６２８１４−１５２１、ＤＮＡ６４８８５−１５２９、ＤＮＡ６５４０４−１５５１、ＤＮＡ６５４１２−１５２３、ＤＮＡ６６６７５−１５８７、ＤＮＡ６８８６４−１６２９、ＤＮＡ６８８７２−１６２０、ＤＮＡ６８８７４−１６２２、ＤＮＡ７６４００−２５２８、ＤＮＡ７７６２４−２５１５、ＤＮＡ３０８６８−１１５６、ＤＮＡ３６６３８−１０５６、ＤＮＡ３８２６０−１１８０、ＤＮＡ４０５９２−１２４２、ＤＮＡ４１３７４−１３１２、ＤＮＡ４４１９４−１３１７、ＤＮＡ５３５１７−１３６６、ＤＮＡ５３９７１−１３５９、ＤＮＡ５３９８７−１４３８、ＤＮＡ５７７００−１４０８、ＤＮＡ５９６２０−１４６３、ＤＮＡ６０６２７−１５０８、ＤＮＡ６４８９０−１６１２、ＤＮＡ６６６５９−１５９３、ＤＮＡ６６６６７−１５９６、ＤＮＡ６８８１８−２５３６、ＤＮＡ８４２１０−２５７６、ＤＮＡ９２２１８−２５５４、ＤＮＡ９６８７８−２６２６、ＤＮＡ９８８５３−１７３９を記載している。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの事実上のヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。寄託された配列とここに開示された配列との間で不一致がある場合は、寄託物の配列は正確な配列を含むと理解される。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【００４３】
Ｂ．ＰＲＯポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯの翻訳後プロセスを変えうると認識するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ配列又はここに記載したＰＲＯの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての技術及び指針の任意のものを用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯと比較してＰＲＯのアミノ酸配列が変化するＰＲＯをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化の数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然タンパク質によって提示された活性について試験することにより決定される。
ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ−末端又はＣ−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
【００４４】
ＰＲＯ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、関心ある保存的置換を、好ましい置換と題して表６に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に例示的置換と示した又は以下に参照としてアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００４５】
2004516227.tif 000024
【００４６】
本発明のポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン， ｍｅｔ， ａｌａ， ｖａｌ， ｌｅｕ， ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ， ｓｅｒ， ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ， ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ， ｇｌｎ， ｈｉｓ， ｌｙｓ， ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ， ｐｒｏ； 及び
（６）芳香族：ｔｒｐ， ｔｙｒ， ｐｈｅ。
【００４７】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、もしくは好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位指向性）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位指向性突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ４３３１ （１９８６）； Ｚｏｌｌｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０： ６４８７ （１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５ （１９８５）］、制限的選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ， ３１７： ４１５ （１９８６）］、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９）］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に頻繁に見られることが多い［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ａｍｐ； Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５０： １ （１９７６）］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【００４８】
Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−ＰＲＯ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐｐ．７９−８６ （１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００４９】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、この目的で意図されるのは、天然配列ＰＲＯに見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失（潜在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
ＰＲＯポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ． ２５９−３０６ （１９８１）に記載されている。
【００５０】
ＰＲＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ等， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２５９：５２ （１９８７）により、及びＥｄｇｅ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１８： １３１ （１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ等， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３８：３５０ （１９８７）に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号又は同第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、ＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した本発明のポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾されてもよい。
【００５１】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５ （１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６ （１９８５）］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３ （１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Ｈｏｐｐ等， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０ （１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４ （１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６ （１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７ （１９９０）］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ１分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて本発明のポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【００５２】
Ｄ．ＰＲＯの調製
以下の記述は、主として、ＰＲＯ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ等， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ （１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９−２１５４ （１９６３）参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯを生産してもよい。
【００５３】
１．ＰＲＯポリペプチド（類）をコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯをコードするＤＮＡは、ポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯコード化遺伝子は、ゲノムライブラリ、オリゴヌクレオチド合成、又は他の既知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、関心ある遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、ＰＲＯポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド）によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の手段はＰＣＲ法を使用するものである［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，上掲；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ等， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５）］。
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に与えられている。
【００５４】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ等の公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の他の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の定められた領域内又は全長配列に渡っての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【００５５】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された従来の栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編 （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ等， 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは、通常、当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物又は実質的な細胞壁障壁を有する他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗ等， Ｇｅｎｅ， ２３：３１５ （１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７ （１９７８）のリン酸カルシウム沈降法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ ｓｏｌｉｎｇｅｎ等， Ｊ． Ｂａｃｔ．， １３０：９４６ （１９７７）及びＨｓｉａｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：３８２９ （１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いられる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５：５２７−５３７ （１９９０）及び Ｍａｎｓｏｕｒ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３６：３４８−３５２ （１９８８）を参照のこと。
ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ） 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバシリリチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ ２６６，７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異に影響を与えるように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｌｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ ｉｌｖＧｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【００５６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｒｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ ［１９８１］； １９８５年５月２日発行のＥＰ １３９，３８３）；クルベロミセスホスツ（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号； Ｆｌｅｅｒ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： ９６８−９７５ （１９９１））、例えばケーラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４； Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ７３７ ［１９８３］）、ケーフラギリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、ケーブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、ケーウィケラミイ（Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、ケーワルチイ（Ｋ． ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、ケードロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： １３５ （１９９０））、ケーテモトレランス（Ｋ． ｔｈｅｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びケーマルキシアナス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ ４０２，２２６）；ピッチャパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０； Ｓｈｅｅｋｒｉｓｈｎａ等， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２８： ２６５−２７８ ［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマレーシア（ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｃａｓｅ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ５２５９−５２６３ ［１９７９］）；シュワニオマイセス（ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日発行のＥＰ ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日公開のＷＯ ９１／００３５７）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ｂａｌｌａｎｃｅ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２： ２８４−２８９ ［１９８３］； Ｔｉｌｂｕｒｎ等， Ｇｅｎｅ， ２６： ２０５−２２１ ［１９８３］； Ｙｅｌｔｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０−１４７４ ［１９８４］）及びクロカビ（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４： ４７５−４７９ ［１９８５］）が含まれる。ここではメチロトロピック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母が適切であり、これらに限られないが、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）に見出される。
グリコシル化ＰＲＯポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より特定の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 （ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ等， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９ （１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１ （１９８０））；ヒト肺細胞 （Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）； ヒト肝細胞 （Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）； 及びマウス乳房腫瘍細胞 （ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＴＣ ＣＣＬ５１）を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術範囲内にあると考えられる。
【００５７】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、ファージミド又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯコード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母菌の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ３６２，１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯコード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ 等により， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０）に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｍａｎ等， Ｇｅｎｅ， ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等， Ｇｅｎｅ， １０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８５：１２ （１９７７）］。
【００５８】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯコード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成に指向するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃａｈｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２７５：６１５ （１９７８）； Ｇｏｅｄｄｅｌ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：５４４ （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０）； ＥＰ ３６，７７６］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒ 等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：２１−２５ （１９８３）］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎ 等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５：２０７３ （１９８０）］又は他の糖分解酵素［Ｈｅｓｓ 等， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．， ７：１４９ （１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７：４９００（１９８７）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースを利用する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に用いられるベクターとプロモータはＥＰ ７３，６５７に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ ２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノム、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００５９】
より高等の真核生物による所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞（酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３：６２０−６２５ （１９８１）； Ｍａｎｔｅｉ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：４０−４６ （１９７９）； ＥＰ １１７，０６０； 及びＥＰ １１７，０５８に記載されている。
【００６０】
４．遺伝子発現の検出
遺伝子発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりの、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５ （１９８０）］、サザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又は特異的抗体エピトープをコードし、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡに融合した外因性配列に対して調製され得る。
【００６１】
５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン−Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。次の手順が適切な精製手順の例である：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８２ （１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）に記載された種々のタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯポリペプチドの性質に依存する。
【００６２】
Ｅ．組織分布
ＰＲＯを発現する組織の位置は、種々のヒト組織でのｍＲＮＡの発現を測定することにより同定可能である。このような遺伝子の位置により、ＰＲＯポリペプチドの活性の刺激又は阻害の影響を最も受けていると思われる組織の情報が提供される。また、特異的組織における遺伝子の位置により、以下で論議される活性阻止アッセイについての試料組織も提供される。
上記したように、種々の組織における遺伝子発現は、従来の、ｍＲＮＡの転写の定量化のためのノーザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ５２０１−５２０５ ［１９８０］）、サザンブロット、ドットブロット（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成により、ここに提供する配列にもとづいて適切な標識プローブを用いて測定できる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識可能な抗体を用いてもよい。
あるいは、種々の組織における遺伝子発現は、遺伝子産物を直接定量化するための、組織断片の免疫組織学的染色、及び細胞培地又は体液のアッセイ等の免疫学的方法によっても測定できる。免疫組織学的染色又は試料液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の動物から調製される。便利には、抗体は天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、又は特異的抗体エピトープをコードし、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡに融合した外因性配列に対して調製され得る。抗体を生成する一般的技術、及びノーザンブロット及びインサイツハイブリッド形成の特定のプロトコールは以下に提供する。
【００６３】
Ｆ．抗体結合性の研究
遺伝子増幅実験の結果は、それぞれ、組織細胞上でのＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチドの効果を阻害する、抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７抗体の能力が試験される抗体結合性の研究によって更に証明できる。例示的な抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びへテロ抱合体抗体を含み、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は、競合的結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイなどの既知のアッセイ法で実施してよい。Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｐｐ．１４７−１５８ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７）。
競合的結合アッセイは、標識標準物の、限られた量の抗体との結合について試験分析物と競合する能力による。試験試料中の標的タンパク質の量は、抗体に結合する標準物の量に逆比例する。結合する標準物の量の測定を促進するために、抗体は好ましくは競合の前又は後に不溶化し、抗体に結合した標準品及び分析物が未結合で残っている標準物及び分析物から容易に分離できるようにする。
サンドウィッチアッセイは２つの抗体の使用を含み、各々、検出されるタンパク質の異なる免疫原部分、又はエピトープに結合できる。サンドウィッチアッセイにおいて試験試料分析物は固体支持体上に固定化された第１の抗体に結合し、その後第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３成分複合体が形成される。例えば米国特許第４，３７６，１１０号参照。第２の抗体は検出可能部分で標識され（直接サンドウィッチアッセイ）、あるいは検出可能部分で標識された抗−免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一形態はＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合の検出可能部分は酵素である。
免疫組織学のために、組織試料は新鮮でも凍結したものでもよく、パラフィンに包埋して、例えばホルマリン等の保存剤で固定してもよい。
【００６４】
Ｇ．細胞ベースアッセイ
細胞ベースアッセイ及び免疫関連疾患の動物モデルは、ここで同定されたポリペプチドと遺伝子との関係、及び免疫関連疾患の進行及び病理との関係をさらに理解するために使用するすることができる。
異なる方法では、特定の免疫関連疾患に含まれることが知られた細胞型の細胞をここに記載のｃＤＮＡで形質移入し、これらのｃＤＮＡの免疫機能を刺激又は阻害する能力を分析する。適当な細胞を所望の遺伝子で形質移入し、免疫機能活性を監視できる。このような形質移入株化細胞は、次いで、例えばＴ細胞増殖又は炎症細胞の侵入を調節するといった、免疫機能を刺激又は阻害するポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の能力を試験するのに使用できる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、免疫関連疾患治療用の候補薬の同定に使用できる。
さらに、（下記のような）トランスジェニック動物から誘導された一次培地は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な株化細胞が好ましい。トランスジェニック動物から連続株化細胞を誘導する技術はこの分野で良く知られている（Ｓｍａｌｌ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５， ６４２−６４８ ［１９８５］参照）。
一つの適切な細胞ベースアッセイは混合リンパ球反応（ＭＬＲ）である。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｕｎｉｔ３．１２；Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｌｉｅｓ， Ｅ． Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編， 国立衛生研究所， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃから出版。このアッセイでは、試験化合物が活性化したＴ細胞の増殖を刺激又は阻害する能力をアッセイする。レスポンダーＴ細胞の懸濁液を同種刺激細胞で培養し、トリチウム化チミジンの取込によりＴ細胞の増殖度合いを測定する。このアッセイはＴ細胞反応性の一般的な測定法である。多くのＴ細胞が応答し、ＩＬ−２の活性化をもたらすため、このアッセイにおける応答性の差異は、応答細胞によるＩＬ−２生産の差異に部分的に反映する。ＭＬＲの結果を、標準的なリンホカイン（ＩＬ−２）検出アッセイにより証明することができる。上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３．１５．６．３．。
ＭＬＲアッセイにおける増殖性Ｔ細胞応答は、アッセイされる分子の直接的な有糸分裂促進特性又は外的な抗原誘発活性化による可能性がある。ＰＲＯポリペプチドのＴ細胞刺激活性のさらなる証明は、同時刺激アッセイにより得ることができる。Ｔ細胞活性化にはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を通して媒介される抗原に特異的なシグナル、及び第２のリガンド結合相互作用、例えばＢ７（ＣＤ８０、ＣＤ８６）／ＣＤ２８結合相互作用を通して媒介される同時刺激シグナルが必要である。ＣＤ２８の架橋により、活性化Ｔ細胞によるリンホカインの分泌が増加する。Ｔ細胞活性化はネガティブ又はポジティブ効果を有するリガンドの結合を通してネガティブ及びポジティブコントロールの双方を有する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４はＢ７に結合するＩｇスーパーファミリーの糖タンパク質に関連している。Ｂ７に結合するＣＤ２８は、ポジティブなＴ細胞活性化同時刺激効果を有し；逆にＢ７に結合するＣＴＬＡ−４はネガティブなＴ細胞非活性化効果を有する。Ｃｈａｍｂｅｒｓ． Ｃ．Ａ． ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ． Ｊ．Ｐ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９７）９：３９６。Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｒ．Ｈ．， Ｃｅｌｌ（１９９２）７１：１０６５；Ｌｉｎｓｅｙ， Ｐ．Ｓ． ａｎｄ Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ． Ｊ．Ａ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１１：１９１；Ｊｕｎｅ， Ｃ．Ｈ．等 Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ（１９９４）１５：３２１；Ｊｅｎｋｉｎｓ． Ｍ．Ｋ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：４０５。同時刺激アッセイにおいて、ＰＲＯポリペプチドはＴ細胞同時刺激又は阻害活性をアッセイするものである。
【００６５】
ＰＲＯポリペプチド、並びにＴ細胞の増殖の刺激剤（同時刺激剤）である本発明の他の化合物及びアゴニスト、例えばアゴニスト抗体で、例えばＭＬＲ及び同時刺激アッセイで決定されるようなものは、免疫機能の貧弱さ、最適下限又は不適切さに特徴付けられる免疫関連疾患の治療に有用である。これらの疾患はＴ細胞（及びＴ細胞媒介免疫性）の増殖及び活性化を刺激し、刺激化合物、例えば刺激性ＰＲＯポリペプチドの投与により哺乳動物における免疫反応を増強することにより治療される。刺激性ポリペプチドは、例えばＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７ポリペプチド又はそのアゴニスト抗体であり得る。
本発明の刺激化合物の直接的用途は、プライムＴ細胞上で発現するリガンド（４−ＩＢＢＬ）に結合し、Ｔ細胞活性化及び成長の信号を発する腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーである４−ＩＢＢ糖タンパク質を用いる実験において確認されている。Ａｌｄｅｒｓｏｎ， Ｍ．Ｅ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２２１９。
また、アゴニスト刺激化合物の用途は実験的に確認されている。アゴニスト抗−４−ＩＢＢ抗体を用いた治療による４−ＩＢＢの活性化は腫瘍の根絶化を増強する。Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ． Ｉ．及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｋ．Ｅ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１８：１。以下により詳細に記載する腫瘍治療のための免疫アジュバント治療は、本発明の刺激化合物の用途の他の例である。
さらに、免疫刺激又は増強効果はＭＬＲアッセイにおいて阻害することが見出されたＰＲＯの活性に拮抗又はこれをブロックすることにより達成することができる。化合物の阻害活性を無効にすることで、ネットの刺激効果が生じる。適切なアンタゴニスト／ブロック化合物は阻害タンパク質を認識し、これに結合する抗体及びその断片であり、それにより該タンパク質とそのレセプターとの効果的な相互作用がブロックされ、レセプターを通したシグナル化が阻害される。この効果は、おそらくＣＴＬＡ−４結合による阻害シグナルの除去することにより、Ｔ細胞増殖を増強する抗−ＣＴＬＡ−４抗体を使用する実験で確認されている。Ｗａｌｕｎａｓ， Ｔ．Ｌ．等， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：４０５。
別に、免疫刺激又は増強効果は、血管透過性増強特性を有するＰＲＯの投与により達成することもできる。増強した血管透過性は炎症及び免疫細胞（例えば単球、好酸球、ＰＭＮ）の局部的浸潤により緩和可能な疾患に有益である。
他方、Ｔ細胞増殖／活性化、リンホカイン分泌、及び／又は血管透過性の直接阻害剤であるＰＲＯポリペプチド並びに本発明の他の化合物は、免疫反応の抑制に直接使用することができる。これらの化合物は、過剰活性、最適上限（ｓｕｐｅｒｏｐｔｉｍａｌ）又は自己免疫反応により特徴付けられる免疫関連疾患の治療、及び免疫反応の程度を低減するのに有用である。本発明の化合物のこの用途は、レセプターＢ７に結合するＣＴＬＡ−４がＴ細胞を非活性化するという上述の実験により確認されている。本発明の直接阻害化合物は類似した方法で機能する。血管透過性を抑制する化合物の用途は炎症を低減することが期待される。このような用途は過度の炎症に関連した病状の治療に有益である。
別に、刺激ＰＲＯポリペプチドに結合し、これらの分子の刺激効果をブロックする化合物、例えば抗体により、ネットの阻害効果が生じ、Ｔ細胞の増殖／活性化及び／又はリホカイン分泌を阻害することにより、Ｔ細胞媒介免疫反応を抑制するために使用することができる。ポリペプチドの刺激効果をブロックすると、哺乳動物の免疫反応が抑制される。この用途は抗−ＩＬ２抗体を使用する実験において確認されている。これらの実験において、抗体はＩＬ２に結合し、そのレセプターへのＩＬ２の結合が阻害され、よってＴ細胞阻害効果が達成される。
【００６６】
Ｈ．動物モデル
さらに、インビトロにおける細胞ベースアッセイの結果は、インビボ動物モデルを使用し、Ｔ細胞機能アッセイにより証明することができる。免疫関連疾患の進行及び病因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデルが使用できる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。免疫関連疾患の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植等により、細胞を同系マウスに導入することにより作成される。（１９９７年９月１８日に発行されたＰＣＴ公報ＷＯ ９７／３３５５１参照。）
移植片対宿主疾患は、免疫適格細胞が免疫抑制された、又は耐性のある患者に移植された場合に生じる。ドナー細胞は認識し、宿主抗原に反応する。反応は生命に危険性のある重度の炎症から、下痢や体重の減少等の軽度のケースまで多様である。移植片対宿主疾患モデルはＭＨＣ抗原及び少量の移植抗原に対するＴ細胞反応性を評価する手段を提供する。適切な手順は上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ４．３．に詳細に記載されている。
皮膚同種移植片拒絶のための動物モデルは、Ｔ細胞がインビボ組織の破壊を媒介する能力を試験し、及び移植拒絶におけるそれらの役割を測定する手段である。最も一般的で容認されているモデルではマウスの尾の皮膚の移植片が使用される。繰り返し実験により、皮膚同種移植片拒絶がＴ細胞、ヘルパーＴ細胞及びキラー−エフェクターＴ細胞により媒介されるが、抗体では媒介されないことが示された。Ａｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ， Ｈ． Ｊｒ．及びＳａｃｈｓ， Ｄ．Ｈ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ ｅｄ．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， １９８９， ８８９−９９２。適切な手順は上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ４．４．に詳細に記載されている。本発明の化合物の試験に使用可能な他の移植拒絶は、Ｔａｎａｂｅ， Ｍ．等， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９４）５８：２３及びＴｉｎｕｂｕ， Ｓ．Ａ．等，  Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）４３３０−４３３８により記載されている同種心臓移植片モデルである。
遅延型過敏用の動物モデルは、細胞媒介免疫機能のアッセイを提供する。遅延型過敏反応は、抗原投与による攻撃後の経過した時間まで、ピークに達しない炎症により特徴付けられるＴ細胞媒介インビボ免疫反応である。またこれらの反応は組織特異的自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）及び実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ、ＭＳ用のモデル）で生じる。適切な手順は上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ４．５．に詳細に記載されている。
ＥＡＥは、Ｔ細胞及び単核細胞の炎症、続いて中枢神経系における軸索の脱髄により特徴付けられるＴ細胞媒介自己免疫疾患である。ＥＡＥは、一般的にヒトにおけるＭＳ用の関連動物モデルであると考えられている。Ｂｏｌｔｏｎ． Ｃ．， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（１９９５）１：１４３。急性及び再発性弛緩モデルの双方が開発されている。本発明の化合物は上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ１５．１及び１５．２．に記載されているプロトコールを使用して、免疫媒介脱髄疾患に対するＴ細胞刺激又は阻害活性を試験することができる。また、Ｄｕｎｃａｎ． Ｉ．Ｄ．等， Ｍｏｌｅｃ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ（１９９７）５５４−５６１に記載されているようにして、オリゴデンドロサイト又はシュワン細胞が中枢神経系に移植されたミエリン疾患用のモデルも参照のこと。
接触性過敏は、細胞媒介免疫機能の単純遅延型過敏インビボアッセイである。この手順において、遅延型過敏反応が生じている外因性ハプテンに皮膚を暴露し、測定して定量する。接触性過敏は最初に敏感相、続いて顕現相を含む。顕現相はＴリンパ球が以前接触したことのある抗原に遭遇したときに生じる。腫脹及び炎症が生じ、ヒトアレルギー性接触皮膚炎の優れたモデルが作成される。適切な手順は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，；Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｌｉｅｓ， Ｅ． Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ， 及びＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ， ｕｎｉｔ４．２に詳細に記載されている。また、Ｇｒａｂｂｅ， Ｓ．及びＳｃｈｗａｒｚ， Ｔ． Ｉｍｍｕｎ． Ｔｏｄａｙ １９（１）：３７−４４（１９９８）を参照のこと。
関節炎用の動物モデルは、コラーゲン−誘発関節炎である。このモデルはヒト自己免疫慢性関節リウマチの臨床的、組織的及び免疫学的特徴を共有し、ヒト自己免疫関節炎用の許容可能なモデルである。マウス及びラットモデルは滑膜炎、軟骨の腐食及びｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌ骨により特徴付けられる。本発明の化合物は上掲のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ１５．５．に記載されているプロトコルを使用し、自己免疫関節炎に対する活性度を試験することができる。また、Ｉｓｓｅｋｕｔｚ， Ａ．Ｃ．等， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９６）８８：５６９に記載されているＣＤ１８及びＶＬＡ−４インテグリンに対するモノクローナル抗体を使用するモデルも参照のこと。
喘息モデルでは、抗原誘発気道反応性亢進、肺好球菌増加症及び炎症が卵白アルブミンで動物を感作させることで誘発され、ついで、エアゾールにより送達された同様のタンパク質で動物を攻撃する、と記載されている。いくつかの動物モデル（モルモット、ラット、非ヒト霊長類）では、エアゾール抗原で攻撃されたヒトにおけるアトピー性喘息に類似した徴候が示された。本発明の化合物の、喘息治療における活性及び有効性を試験するのに適した手順は、Ｗｏｌｙｎｉｅｃ， Ｗ．Ｗ．等， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９９８）１８：７７７とそこに引用された文献に記載されている。
【００６７】
さらに、本発明の化合物は乾癬用疾患用の動物モデルにおいて試験することができる。Ｔ細胞が乾癬の病原である証拠も示唆されている。本発明の化合物はＳｃｈｏｎ． Ｍ．Ｐ．等， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．（１９９７）３：１８３により記載されているｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスモデルにおいて試験することができ、マウスは組織病理学的傷害に類似した乾癬を示す。他の適切なモデルはＮｉｃｋｏｌｏｆｆ． Ｂ．Ｊ．等， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ．（１９９５）１４６：５８０に記載されているようにして調製されたヒト皮膚／ｓｃｉｄマウスキメラである。
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここで同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、関心ある動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非−ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、前核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ及びＷａｎｇｅｒ， 米国特許第４，８７３，１９１号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ６１４８−６１５ ［１９８５］）；胚性肝細胞での遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等， Ｃｅｌｌ ５６， ３１３−３２１ ［１９８９］）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌ． Ｂｉｏｌ． ３， １８０３−１８１４ ［１９８３］）；精子媒介遺伝子転移（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等， Ｃｅｌｌ ５７， ７１７−７３ ［１９８９］）を含む。概説のためには、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、それらの細胞の一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Ｌａｓｋｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ６２３２−６３６ （１９９２）の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学等の技術を用いて分析できる。
さらに、特定組織中への免疫細胞の湿潤を測定するために、動物を、例えば組織学的検査により免疫疾患の病原の徴候について検査してもよい。またブロック実験も実施することができ、ここでトランスジェニック動物は本発明の化合物で処理され、化合物のＴ細胞増殖刺激又は阻害の度合いが測定される。これらの実験において、上述のようにして調製したＰＲＯポリペプチドに結合するブロック抗体は動物に投与され、免疫機能における効果が測定される。
あるいは、動物の胚性細胞に導入されたポリペプチドをコードする変更ゲノムＤＮＡと、その同じポリペプチドをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えの結果、ここに同定するポリペプチドをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、特定のポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って当該ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ（５’と３’末端の両方）を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターの記述についてはＴｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ， ５１： ５０３ （１９８７）を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に（例えばエレクトロポレーションによって）導入され、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Ｌｉ等， Ｃｅｌｌ，６９：９１５ （１９９２）参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． （ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８７）， ｐｐ． １１３−１５２参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ポリペプチドが存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【００６８】
Ｉ．免疫アジュバント治療
一実施態様において、本発明の免疫刺激化合物は腫瘍（癌）治療における免疫アジュバント治療に使用することができる。Ｔ細胞がヒト腫瘍特異的抗原を認識することは十分に確立されている。遺伝子のＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーによりコードされる腫瘍抗原の一グループは全ての成人の正常組織で無症状であるが、腫瘍、例えばメラノーマ、肺腫瘍、頭部及び頸部の腫瘍、膀胱癌においてはかなりの量が発現している。ＤｅＳｍｅｔ． Ｃ．等， （１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．９３：７１４９。Ｔ細胞の同時刺激により、インビトロ及びインビボの双方において、腫瘍の退行及び抗腫瘍反応が誘発されることが示されている。Ｍｅｌｅｒｏ． Ｉ．等， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）３：６８２；Ｋｗｏｎ． Ｅ．Ｄ．等，  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）９４：８０９９；Ｌｙｎｃｈ． Ｄ．Ｈ．等， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９７）３：６２５；Ｆｉｎｎ． Ｏ．Ｊ．及びＬｏｔｚｅ． Ｍ．Ｔ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）２１：１１４。本発明の刺激化合物はアジュバントとして単独で又は成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤と共に投与することができ、Ｔ細胞増殖／活性化及び腫瘍抗原に対する抗腫瘍反応を刺激する。成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤は既知の投与方法で使用されている従来からの量で投与することができる。本発明の化合物による免疫刺激活性により、成長調節剤、細胞障害薬又は化学療法剤の量を減らすことができ、よって、潜在的に患者に対する毒性を低下させることができる。
Ｊ．候補薬についてのスクリーニングアッセイ
候補薬のスクリーニングアッセイは、ここで同定される遺伝子にコードされるポリペプチド、又はその生物学的に活性な断片と結合又は抱合する化合物、あるいはコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。考慮される小分子とは、合成有機又は無機化合物を含み、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド−免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けられたタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。
全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるポリペプチド、即ち候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばマイクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化すべきペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、そのペプチドを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
候補化合物がここで同定される遺伝子にコードされる特定のタンパク質と相互作用するが結合しない場合、そのタンパク質との相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ及びＮａｔｈａｎｓ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ５７８９−５７９３ （１９９１）］に開示されているようにして、Ｆｉｅｌｄｓ及び共同研究者等［Ｆｉｅｌｓ及びＳｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３４０， ２４５−２４６ （１９８９）； Ｃｈｉｅｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ９５７８−９５８２ （１９９１）］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２−ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商品名））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
ここで同定される遺伝子と他の細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験することができる：通常は、遺伝子の生成物及び細胞内又は外成分を含む反応混合物を、条件下で２つの生成物が相互作用及び結合する時間に渡って調製する。試験化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物有り又は無しで実施する。さらに、第３の反応混合物にプラシーボを添加してポジティブ対照としてもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視する。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物ではしないことは、試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【００６９】
Ｋ．  免疫関連疾患の治療のための組成物及び方法
免疫関連疾患の治療に有用な組成物は、限定するものではないが、例えば、Ｔ細胞の増殖／活性化、リンホカインの放出、又は免疫細胞の浸潤等の免疫機能を阻害又は刺激するタンパク質、抗体、有機小分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子を含む。
例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Ｒｏｓｓｉ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４： ４６９−４７１ （１９９４）及びＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照のこと。
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は単鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１， 上掲を参照のこと。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの任意のもの又は任意の組合せにより、及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【００７０】
Ｌ．抗体
本発明は、さらにＴ細胞の増殖、エオシン好性白血球の浸潤、血管透過性等を阻害（アンタゴニスト）又は刺激（アゴニスト）する抗−ＰＲＯ抗体及びその断片を提供するものである。このような抗−ＰＲＯ抗体又はその断片の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
抗−ＰＲＯ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００７１】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗−ＰＲＯ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６） ｐｐ． ５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培養培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒやバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８７） ｐｐ． ５１−６３］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において既知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ， 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【００７２】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗−ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２９ （１９８８）； 及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３−５９６ （１９９２）］。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター（ｗｉｎｔｅｒ）及び共同研究者［Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６ （１９８８）］の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９２）；Ｍａｒｋｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅ等及びＢｏｅｒｎｅｒ等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Ｃｏｌｅ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６−９５（１９９１）；米国特許第５，７５０，３７３号 ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化してマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９−７８３ （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇ等， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９ （１９９４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８， ８１２−１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５−５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ ６５−９３ （１９９５）に記載されている。
また、抗体は上述した既知の選択及び／又は突然変異誘発を使用し、親和成熟させてもよい。好ましい親和成熟抗体は、成熟抗体が調製される（一般的にマウス、ヒト化又はヒトの）出発抗体のものよりも、５倍、より好ましくは１０倍、さらに好ましくは２０又は３０倍の親和性を有する。
【００７３】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにおいて、結合特異性の一方はＰＲＯに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９［１９８３］）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等， ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５６ （１９９１）に開示されている。
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【００７４】
ＷＯ ９６／２７０１１に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖が小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えられた第２の抗体分子の界面に作り出される。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１ （１９８５） は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再転換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ’断片を直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７５：２１７−２２５ （１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５４７−１５５３ （１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３６８ （１９９４）を参照されたい。
【００７５】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗−ＰＲＯアームは、特定のＰＲＯポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯポリペプチドを発現する細胞に細胞障害薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＰＲＯポリペプチド結合アーム及び細胞障害薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。関心ある他の二重特異性抗体はＰＲＯポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体は２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ ９１／００３６０； ＷＯ ９２／２００３７３； ＥＰ ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６７，９８０号に開示されているものが含まれる。
【００７６】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば免疫関連疾患の治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Ｃａｒｏｎ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６： １１９１−１１９５ （１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ， Ｂ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： ２９１８−２９２２ （１９９２）参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ等， Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ２５６０−２５６５ （１９９３）に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３： ２１９−２３０ （１９８９）参照。
７．免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞障害薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫抱合体の生成に有用な化学療法剤は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
抗体及び細胞障害薬の抱合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８： １０９８ （１９８７）に記載されたように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。ＷＯ ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、組織の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体−レセプター抱合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合抱合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【００７７】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示するタンパク質、抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８ （１９８５）； Ｈｗａｎｇ等， Ｐｒｏｃ． ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０ （１９８０）； 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、定められた孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ２８６−２８８ （１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療剤（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Ｇａｂｉｚｏｎ等， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（１９） １４８４ （１９８９）参照。
【００７８】
９．抗体の製薬組成物
本発明の活性ＰＲＯ分子（例えばＰＲＯポリペプチド、抗−ＰＲＯ抗体、及び／又はその変異体）、並びに上述のスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、免疫関連疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
本発明の活性ＰＲＯ分子、好ましくはポリペプチド又は抗体の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性分子を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． ［１９８０］）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロイド；ヘキサメトニウムクロイド；ベンズアルコニウムクロイド；ベンズエトニウムクロイド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は又はトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（商品名）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここで開示されたスクリーニングアッセイで同定された化合物は、同様の方式でこの分野で知られた標準技術を用いて製剤することができる。
リポフェクション又はリポソームもＰＲＯ分子を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。（例えば、Ｍａｒａｓｃｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ７８８９−７８９３ ［１９９３］を参照のこと）。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞障害薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性ＰＲＯ分子は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤又はＰＲＯ分子を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【００７９】
Ｎ．治療方法
本発明のポリペプチド、抗体及び他の活性物質は、組織への炎症細胞の浸潤、Ｔ細胞の増殖の刺激、Ｔ細胞の増殖の阻害、血管透過性の増加又は低減又はそれらの阻害によって特徴付けられるものを含む、Ｔ細胞媒介疾患等の種々の免疫関連疾患及び病状を治療するために使用できると考えられる。
本発明のポリペプチド、抗体及び他の化合物で治療される病状又は疾患の例には、限定するものではないが、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節症、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｃｕｌｉｔｉｓ）、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少（特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少）、甲状腺炎（グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、例えば多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性（ｎｏｎｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎；クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹等のアレルギー性疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
全身性紅斑性狼瘡において、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産出であり、続いて、免疫媒介炎症が生じ、抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。しかし、Ｔリンパ球は組織ダメージに直接関与しないことが示されており、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発育に必要である。よって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的な影響を受ける。
【００８０】
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに指向する自己抗体の生成を付随し、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合対照的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
若年性慢性関節炎は、多く場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節（ｐａｕａｒｔｉｃｕｌａｒ）、多関節（ｐｏｌｙａｒｔｉｃｕｌａｒ）及び全身性ものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
脊椎関節症は、一般的にＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎（ｓｐｏｎｙｌｉｔｉｓ）、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ−Ｂ２７（血清学的には、クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ座位にある定義された対立遺伝子）を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ−２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋細胞の反応が誘発されると仮定されている。
全身性硬化症（強皮症）は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり；これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的であり：血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象であり；血管傷害は免疫媒介されうる。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ＩＣＡＭ−１は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するＴ細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。関連する他の器官には：胃腸管：萎縮症及び線維症があり、結果として異常なぜん動／運動性となっている平滑筋：腎臓：小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼし、結果として腎皮質の血流が低下し、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧になる同心性内皮下内膜増殖：骨格筋：萎縮、間質性線維症：炎症：肺：間質性肺炎及び間質性線維症：及び心臓：収縮バンド壊死、瘢痕／線維症が含まれる。
【００８１】
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に係る成分、タンパク質及びＲＮＡに対して産生されてその機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ−タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、ｂｉｌａｒｙ硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、アレルギー性脈管炎、及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳ又は川崎病）、単離したＣＮＳ血管炎、ベヘット（Ｂｅｈｅｔ’ｓ）病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）及び皮膚壊死性細静脈炎（ｖｅｎｕｌｉｔｉｓ）が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞（いくつかのケースにおいは、血小板を含む他の血液細胞）表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ−レセプター−媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
【００８２】
他の臨床的セッティング（ｓｅｔｔｉｎｇ）における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ−レセプター−媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデルラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びチキン（肥満チキン種）；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）を用いた動物の免疫化が含まれる。
Ｉ型真性糖尿病又はインシュリン依存性糖尿病は膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インシュリン又はインシュリン様レセプターに対する抗体は、インシュリン−非−反応性の表現型を産出することができる。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫仲介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出／誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。ＭＳにおいて、疾患の誘発及び進行はＴリンパ球に依存すると示唆される証拠がある。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はＴ細胞媒介小膠細胞の優先的湿潤、及びマイクロファージの浸潤を含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は障害において優先的な細胞型であった。オリゴデンドロサイトの細胞死及び続く脱髄のメカニズムはよく知られていないが、Ｔリンパ球の駆動によると思われる。
好球性肺炎；特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連している。反応を阻害することは治療的に有益なことである。
水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患は自己抗体により媒介され、Ｔリンパ球に依存して発生する。
乾癬はＴリンパ球媒介炎症疾患である。障害はＴリンパ球、マクロファージ及び抗原プロセシング細胞及びある種の好中球の浸潤が含まれる。
【００８３】
喘息；アレルギー性鼻炎；アトピー性皮膚炎；食物過敏症及び蕁麻疹等を含むアレルギー性疾患はＴ細胞依存性である。この疾患は炎症により誘発されるＴリンパ球、及びＩｇＥ媒介炎症、又は双方の組合せにより主に媒介される。
拒絶反応及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患はＴリンパ球依存性であり；Ｔリンパ球の機能を阻害することで改善される。免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染（限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎、ヘルペス）、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染（ＭＬＲを刺激する分子（又は誘導体／アゴニスト）を治療に利用し、感染要因に対する免疫反応性を増強することができる）、ＭＬＲを刺激する（分子／誘導体／アゴニスト）を治療に利用し、受け継ぎ、獲得し、感染誘発された（例えばＨＩＶ感染）又は医原性（例えば化学療法）免疫欠損疾患の病状に対する免疫反応増強することができる免疫欠損疾患、及び異常増殖が含まれる。
ヒト癌患者の中には、異常増殖細胞上の抗原に反応する抗体及び／又はＴリンパ球が発育しているものもいることが示されている。また、異常増殖のある動物モデルにおいても、免疫反応を増強することで、特定の異常増殖が拒絶又は退行する結果になることが示されている。ＭＬＲにおけるＴリンパ球反応を増強する分子は、異常増殖に対する免疫反応を増強するインビボにて利用される。ＭＬＲにおけるＴリンパ球増殖反応を増強する分子（又は拮抗方式で同様のレセプターに影響を及ぼす小分子アゴニスト又は抗体）は、癌の治療に治療的に使用することができる。また、ＭＬＲにおいてリンパ球反応を阻害する分子は、異常増殖中に、新生物に対する免疫反応抑制するように、インビボで機能し；このような分子は新生物細胞自体により発現するか、又はそれらの発現は他の細胞中の新生物により誘発され得る。このような阻害分子（抗体、小分子アンタゴニスト又は他の手段）の拮抗作用により免疫媒介腫瘍拒絶が増強される。
加えて、炎症誘発性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害；脳卒中；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化；急性肺傷害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血症ショック；急性尿細管壊死；子宮内膜症；変性関節疾患及び膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｓ）の治療に有益である。
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入（鼻孔内、肺内）経路などにより投与される。抗体の静脈内又は吸入投与が好ましい。
免疫アジュバント治療、他の治療的養生法において、抗癌剤を、本発明のタンパク質、抗体又は化合物の投与と組み合わせて投与してもよい。例えば、本発明の免疫アジュバントで治療される患者は、抗癌剤（化学療法剤）又は放射線治療を受けてもよい。このような化学療法剤の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｍ．Ｃ． Ｐｅｒｒｙ編， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ （１９９２）にも記載されている。化学療法剤は、免疫アジュバントの投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。加えて、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（ＥＰ ６１６８１２参照）を、それらの分子について知られた用量で付与してもよい。
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。別に、あるいは加えて、同一のもの又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。ときどきは、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。一実施態様では、ＰＲＯポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いてＰＲＯポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とＰＲＯポリペプチドとの組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチド又は抗体が、例えば、一又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
【００８４】
Ｏ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質（例えばＰＲＯ分子を含有するもの）を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は通常、本発明のポリペプチド又は抗体である。容器上又は添付される使用説明書又はラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
Ｐ．免疫関連疾患の診断及び予知
或る種の免疫関連疾患で過剰発現されるタンパク質等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は疾患治療の優れた標的である。同じタンパク質は免疫関連疾患で増幅された遺伝子にコードされる分泌タンパク質とともに、これらの疾患の診断及び予知における用途が見出される。例えば、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、又は他の免疫関連疾患で増幅された遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は診断又は予知として使用できる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅又は過剰発現された遺伝子にコードされるタンパク質（「マーカー遺伝子産物」）の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。これらの技術は、過剰発現した遺伝子が細胞表面タンパク質をコードする場合に特に適切である。このような結合アッセイは、本質的に上述したように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、参照としてここに取り込む。
【００８５】
（実施例）
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して同定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。特記しない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ Ｎ．Ｙ．， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．， １９８９； Ｉｎｎｉｓ等， ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．．， １９９０； Ｈａｒｌｏｗ等， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８８； Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８４； Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９８７； Ｃｏｌｉｇａｎ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９１。
【００８６】
実施例１
ヒトＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０及びＰＲＯ５７２７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの単離
以下に記載するｃＤＮＡクローンを単離するための様々な技術を使用した。使用した方法の一般的な記載は直ぐ後に示すが、単離された特定の配列に関連した詳細は各天然配列に対して別個に記載している。ＰＲＯポリペプチドの実際の配列はＡＴＣＣに寄託されたクローンによりコードされるか、又はその中に含まれるものであり、寄託された配列とここに開示された配列との間に不一致がある場合は、寄託された配列が正しい配列であると理解される。
ＥＣＤ相同性
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（あれば、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）、私的ＥＳＴデータベース（例えば、ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）、及びジェネンテクの企業のＥＳＴを含む。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２［Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６）］を用いてＥＳＴ配列の６フレーム翻訳に対してＥＣＤタンパク質配列を比較することで実施した。既知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物を、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
公的及び私的データベースから引き出した種々のＥＳＴを使用して、コンセンサスＤＮＡ配列を構築した。次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定し、またここで同定された特定の天然配列ＰＲＯポリペプチドをコードするクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。
全長天然配列クローン源に対して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、以下に記載するＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリをプローブオリゴヌクレオチド及びプライマーの一方を用いて、特定の天然配列ＰＲＯポリペプチドをコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリ構築のためのＲＮＡは、胎児肺、胎児肝臓、胎児脳、小腸、胃筋肉細胞等を含む、種々のヒト組織ライブラリから単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。クローンは周知の直ぐに利用できる方法を使用して配列化した。
【００８７】
アミラーゼ酵母菌スクリーニング：
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリの調製
ｍＲＮＡを種々の組織（例えば、上述のＥＣＤ相同性の手法において示したもの）からＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからの試薬とプロトコールを用いて単離した（Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２）。このＲＮＡを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ （Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬とプロトコールを用いて、ベクターｐＲＫ５ＤにおいてオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡライブラリの作成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡを１０００ｂｐを越えるサイズに分類し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄは、ｓｐ６転写開始部位に続いてＳｆｉＩ制限酵素部位がありＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位がさらに続くクローニングベクターである。
２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優先的に提示するために二次ｃＤＮＡライブラリを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを（上述した）一次ライブラリから生成し、このＲＮＡを、ベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０においてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （上で参照したＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬とプロトコールを用いてランダムプライムしたｃＤＮＡライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００ｂｐにサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩアダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータを持ち、クローニング部位の後においてマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）に次いで酵母アルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。よって、アミラーゼ配列と読み枠を合わせて融合するこのベクターにクローニングされたｃＤＮＡは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
３．形質転換及び検出
上記第２項に記載したライブラリからのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ、２０ｍｌ）を添加した。細菌ろベクターの混合物を、次いで製造者に推奨されているようにして電気穿孔した。次いで、ＳＯＣ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｐｌｏｇｉｅｓ、１ｍｌ）を添加し、その混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体を、次いでアンピシリンを含む２０の標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした（３７℃）。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｉｓｃｏ−勾配を用いてＤＮＡを単離した。次いで精製したＤＮＡについて以下の酵母プロトコールを実施した。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定とさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
用いた酵母菌株はＨＤ５６−５Ａ（ＡＴＣＣ−９０７８５）であった。この株は以下の遺伝子型：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ＭＡＬ＋、ＳＵＣ＋、ＧＡＬ＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な作用を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に関与する他のタンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ又はＳＳＡ１ｐ−４ｐ）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Ｇｉｅｔｚ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２０： １４２５ （１９９２）に概略が記されたプロトコールに基づいて実施した。次いで、形質転換細胞を寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Ｋａｉｓｅｒ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ｐ． ２０７ （１９９４）に記載されているようにして調製した。終夜培養は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス（５００ｍｌ）中におよそ２ｘ１０６細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．１）となるまで希釈し、１ｘ１０７細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．４−０．５）まで再成長させた。
【００８８】
次いで細胞を収集し、５，０００ｒｐｍで５分間の間、Ｓｏｒｖａｌ ＧＳ３ ローター中のＧＳ３ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水中に再懸濁することにより形質転換のために調製し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６ＫＲ遠心機において５０ｍｌのファルコン管内で３，５００ｒｐｍにて再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（１０ｍｌ， １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ７．５， １００ｍＭのＬｉ２０ＯＯＣＣＨ３）で続けて洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（２．５ｍｌ）中に再懸濁させた。
形質転換は、ミクロチューブ内で、調製した細胞（１００μｌ）を新鮮な変性一本鎖サケ精巣ＤＮＡ（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ， ＭＤ）及び形質転換ＤＮＡ（１μｇ ｖｏｌ．＜１０μｌ）と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで４０％ＰＥＧ／ＴＥ（６００μｌ， ４０％のポリエチレングリコール−４０００， １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ， １００ｍＭのＬｉ２Ａｃ ｐＨ ７．５）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、３０℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で１２，０００ｒｐｍで５−１０秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ（５００μｌ， １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ ７．５）への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（１ｍｌ）中に希釈し、アリコート（２００μｌ）を１５０ｍｍ成長プレート（ＶＷＲ）に予め調製した選択培地上に拡げた。
あるいは、複数の少量反応の代わりに、形質転換を１回の大規模反応で実施したが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Ｋａｉｓｅｒ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ｐ． ２０８−２１０ （１９９４）に記載されているようにして調製されたウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ−Ｕｒａ）であった。形質転換体は３０℃で２−３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地に赤色デンプンを含ませることにより実施した。Ｂｉｅｌｙ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １７２： １７６−１７９ （１９８８）に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性 Ｒｅｄ−１２０， Ｓｉｇｍａ）に結合させた。結合したデンプンをＳＣＤ−Ｕｒａ寒天プレートに最終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）で導入し、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝した（最終濃度５０−１００ｍＭ）。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地（１５０ｍｍプレート）に画線し、良好に単離された同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌に対してポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝ＳＣＤ−Ｕｒａ寒天への赤色デンプンの直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
標準的な技術による単離と配列決定により、以下に記載するようにさらなるデータベース検索の基礎となる酵母ＥＳＴ断片を同定した。
【００８９】
４．アセンブリ
上述したように同定された酵母ＥＳＴ断片を使用し、種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースを検索した。ＥＳＴデータベースは、公的ＥＳＴデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ， Ｍｅｒｃｋ／Ｗａｓｈ Ｕ）及び私的ＥＳＴのデータベース（例えば、ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を含む。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２［Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６）］を用いてＥＳＴ配列の６フレーム翻訳とＥＣＤタンパク質配列を比較することにより実施した。既知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
ｐｈｒａｐを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、コンセンサスＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２及びｐｈｒａｐの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列及びジェネンテク社の企業のＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
このコンセンサス配列に基づいて：１）ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）特定のＰＲＯポリペプチドをコードするクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて関心ある遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリ構築のためのＲＮＡを種々のヒト組織から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分類し、適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【００９０】
シグナルアルゴリズム：
ジェネンテク社によって開発された企業のシグナル配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）及び／又は私的（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）， Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）なデータベースからの発現配列タグ（ＥＳＴ）並びに集団化及び構築されたＥＳＴ断片に使用した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮下の配列又は配列断片の５’末端の第１と、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの性質に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の一義的なアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡと対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られている７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。
上述した手順の結果、公的ＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）， Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較してＥＳＴ配列が同定された。相同性検索はコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ及又はＢＬＡＳＴ２を用いて実施された（Ａｌｔｓｈｕｌ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６：４６０−４８０（１９９６））。既知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。この結果、全長クローンに対応するさらなるＥＳＴ配列が同定され、検査され、配列決定され、又はオリゴヌクレオチドのクローン作成のためのテンプレートとして提供され、天然配列ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するための種々の組織ライブラリをスクリーニングするために使用された。
【００９１】
Ａ．ヒトＰＲＯ２００（ＵＮＱ１７４）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＶＥＧＦとの相同性に基づいてＩｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓデータベースから同定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に基づくプローブを、ヒト神経膠腫株化細胞Ｇ６１から誘導されたｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに使用した。スクリーニングは本出願の他の箇所で開示した手順と同様な方法で行った。特に、Ｉｎｃｙｔｅクローン「ＩＮＣ１３０２５１６」を以下の４つのプローブを生成するのに用いた：
2004516227.tif 000025
９つのポジティブを同定し特徴付けした。３つのクローンが全コード化領域を含み、配列で一致した。胎児肺ライブラリから部分的クローンも同定し、コードされるアミノ酸を変化させなかった一つのヌクレオチド変化を除いて神経膠腫誘導配列と一致した。
哺乳動物タンパク質発現のために、全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＣＭＶ−ベース発現ベクターにクローニングした。エピトープタグ（ＦＬＡＧ， Ｋｏｄａｋ）及びヒスチジンタグ（Ｈｉｓ８）をＯＲＦと停止コドンの間に挿入した。ＵＮＱ１７４−Ｈｉｓ８及びＵＮＱ１７４−ＦＬＡＧを、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によりヒト胚腎臓２９３細胞に形質移入し、［３５Ｓ］メチオニン及び［３５Ｃ］システインで３時間パルス標識した。１５倍濃縮無血清条件培地２０マイクロリットルをドデシル硫酸ナトリウムバッファー中においてポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動させたとき（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、両方のエピトープタグタンパク質が同時に移動する。ヒトＦｃ（ＩｇＧ）配列の前にＯＲＦにクローニングすることによりＵＮＱ１７４−ＩｇＧ発現プラスミドを作成した。
ＵＮＱ１７４−ＩｇＧプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、１０％ウシ胎児血清を添加したヒンクのＴＮＭ−ＦＨ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において成長させた１０５Ｓｆ９細胞中にＢａｃｕｌｏｇｏｌｄバキュロウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｇｅｎ）で同時形質移入した。細胞を２８℃で５日間インキュベートした。上清を収集し、次いで約１０の感染多発性（ＭＯＩ）でのＳｆ９細胞感染による第１のウイルス増幅に使用した。細胞を３日間インキュベートし、次いで上清を回収し、１ｍｌの上清の３０μｌのプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）への結合、続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により組換えプラスミドの発現を決定した。第１の増幅の上清を、ＥＳＦ−９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ）中において約０．１のＭＯＩで成長させたＳｆ９細胞のスピナー培地５００ｍｌの感染に使用した。収集した上清を無菌濾過した以外は細胞を上記のように処理した。特定のタンパク質を、プロテインＡセファロース４ファストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに結合させることにより精製した。
同定されたクローンＤＮＡ２９１０１の全ヌクレオチド配列をＦｉｇ１（配列番号：１）に示す。クローンＤＮＡ２９１０１（配列番号：１）は、太字の下線で示したように単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド残基２８５−２８７に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置１３２０−１３２２に見出される停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ１、配列番号：１）。予測されるＰＲＯ２００ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ１７４、配列番号２）は３４５アミノ酸長であり、３９０２９ダルトンの算定分子量及び６．０６のｐＩを持ち、これはＦｉｇ２（配列番号：２）に示される。潜在的Ｎ−グルコシル化部位はアミノ酸残基２５、５４及び２５４にある。ＣＵＢドメインはアミノ酸残基５２−６５、１１８−１２５及び２６０−２７３にある。
ＵＮＱ１７４（配列番号：２）をコードするＤＮＡを含むｃＤＮＡは、１９９８年３月５日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９６５３が付されている。
【００９２】
Ｂ．ヒトＰＲＯ２０４（ＵＮＱ１７８）をコードするｃＤＮＡの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を検索し、ＥＳＴを同定した。ヒト胎児網膜ｃＤＮＡライブラリをＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーでスクリーニングし、ＥＳＴ配列に基づく合成オリゴヌクレオチドプローブでハイブリッド形成することにより確認した。
2004516227.tif 000026
ｃＤＮＡクローンを同定し全体を配列決定した。ＤＮＡ３０８７１の全ヌクレオチド配列をＦｉｇ３（配列番号：１１）に示す。太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ３０８７１−１１５７（配列番号：１１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３６７−３７８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１４９８−１５００に見出される停止コドン（ＴＡＡ）で終端する（Ｆｉｇ３；配列番号：１１）。予測されるＰＲＯ２０４前駆体（すなわち、ＵＮＱ１７８、配列番号：１２）は３７４アミノ酸長であり、３９２８５ダルトンの算定分子量及び６．０６のｐＩを持ち、Ｆｉｇ４に示される。ＵＮＱ１７８（配列番号：１２）をコードするＤＮＡを含むｃＤＮＡクローンは１９９７年１０月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３８０が付与されている。
Ｃ．ヒトＰＲＯ２１２（ＵＮＱ１８６）をコードするｃＤＮＡの単離
ヒト胎児肺ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用した結果、ＤＮＡ３０９４２の全長ＤＮＡ配列（Ｆｉｇ５；配列番号：１３）と誘導天然配列タンパク質ＵＮＱ１８６（配列番号：１４）を同定をした。
この手順で使用したＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）とプローブは次のものである：
2004516227.tif 000027
ＤＮＡ３０９４２の全ヌクレオチド配列をＦｉｇ５（配列番号：１３）に示す。太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ３０９４２（配列番号：１３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１０１−１０３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１００１−１００３の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ５；配列番号：１３）。Ｆｉｇ６（配列番号：１４）の予測されるＰＲＯ２１２ポリペプチド前駆体は３００アミノ酸長であり、３２６８０ダルトンの算定分子量と８．７０のｐＩを持つ。Ｆｉｇ６（配列番号：１４）のＰＲＯ２１２配列は膜貫通ドメインを欠いていると考えられる。また、Ｆｉｇ６（配列番号：１４）のアミノ酸１〜２１５は４つのシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含むＥＣＤを提示していると考えられる。ＤＮＡ３０９４２（配列番号：１３）を含むｃＤＮＡクローンは１９９７年９月１６日にＡＴＣＣに寄託され（ＤＮＡ３０９４２−１１３４として特定）、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２５４が付与されている。
【００９３】
Ｄ．ヒトＰＲＯ２１６（ＵＮＱ１９０）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＰＲＯ２１２の単離のための上述した手順と類似した手順を使用し、ＰＲＯ２１６ポリペプチドＵＮＱ１９０（配列番号：１９）（Ｆｉｇ８）をコードするＤＮＡ３３０８７（配列番号：１８）（Ｆｉｇ７）を単離した。
太字の下線で示したように、ＤＮＡ３３０８７は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド残基２６８−２７０に見かけの翻訳開始部位を有し、残基１５３１−１５５３の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ７、配列番号：１８）。予測されるＰＲＯ２１５ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ１９０、配列番号：１９）は４２１アミノ酸長であり、４９４９２ダルトンの算定分子量及び５．５１のｐＩを持つ（Ｆｉｇ８）。
ヒドロパシー分析により、アミノ酸残基１から２０にシグナル配列、アミノ酸残基２６８−２７４及び３００−３０６にチロシンキナーゼリン酸化部位、及び残基２３０−２３５にＮ−ミリストイル化部位、及び残基１４６から１６７、２１７から２３８にロイシンジッパーの存在が示唆された。伝統的な単離技術とは別に、ＤＮＡ配列は、Ｄａｙｈｏｆｆタンパク質ＡＢ０００１１４＿１をコードする受託番号ＡＢ０００１１４としてＧｅｎｂａｎｋから公的に入手可能である。
また別に、配列はＯｈｎｏ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２８（２）：４１１−４１４（１９９６）に記載されている。ＤＮＡ３３０８７を含むｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ３３０８７−１１５７として同定）は１９９７年９月１６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３８１が付与されている。
Ｅ．ヒトＰＲＯ２２６（ＵＮＱ２００）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児肺ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ＤＮＡ３３４６０の全長ＤＮＡ配列（Ｆｉｇ９；配列番号：２０）と誘導天然配列タンパク質ＵＮＱ２００（配列番号：２１）を同定をした。
太字の下線で示したように、ＤＮＡ３３４６０は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド残基６２−６４に見かけの翻訳開始部位を有し、残基１３９１−１３９３の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ９、配列番号：２０）。予測されるＰＲＯ２２６ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ２００、配列番号：２１）は４４３アミノ酸長であり、４９３９１ダルトンの算定分子量及び４．８２のｐＩを持ち、これはＵＮＱ２００としてＦｉｇ１０（配列番号：２１）に示している。ＤＮＡ３３４６０−１１６６と命名されたＤＮＡ３３４６０（配列番号：２０）を含むｃＤＮＡクローンは１９９７年１０月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３７６が付与されている。
上述の手順で使用したヌクレオチド配列は以下の通りである：
2004516227.tif 000028
【００９４】
Ｆ．ヒトＰＲＯ２４０（ＵＮＱ２１４）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ＤＮＡ３４３８７の全長ＤＮＡ配列（Ｆｉｇ１１；配列番号：２５）と誘導天然配列タンパク質ＵＮＱ２１４（配列番号：２６）を同定をした。
ＤＮＡ３４３８７の全ヌクレオチド配列をＦｉｇ１１（配列番号：２５）に示す。太字の下線で示したように、ＤＮＡ３４３８７は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２−１４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置６９９−７０１の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ１１、配列番号：２５）。予測されるＰＲＯ２４０ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ２１４、配列番号：２６）は２２９アミノ酸長であり、２４６８９ダルトンの算定分子量、７．８３のｐＩを持ち、Ｆｉｇ１２に示している。ＤＮＡ３４３８７（配列番号：２５）を含むｃＤＮＡクローンは１９９７年９月１６日にＡＴＣＣに寄託されＡＴＣＣ寄託番号２０９２６０が付与されている。
上述に記載した手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000029
Ｇ．ヒトＰＲＯ２３５（ＵＮＱ２０９）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ＤＮＡ３５５５８の全長ＤＮＡ配列（Ｆｉｇ１３；配列番号：３０）と誘導ＰＲＯ２３５天然配列タンパク質ＵＮＱ２０９（Ｆｉｇ１４、配列番号：３１）を単離した。
ＤＮＡ３５５５８の全ヌクレオチド配列をＦｉｇ１３（配列番号：３０）に示す。太字の下線で示したように、Ｆｉｇ１３に示すＤＮＡ３５５５８クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６６７−６６９に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２３２３−２３２５の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ２３５ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ２０９、配列番号：３１）は５５２アミノ酸長であり、６１６７４ダルトンの算定分子量と６．９５のｐＩを持つ（Ｆｉｇ１４）。ＤＮＡ３５５５８を含むｃＤＮＡクローンは１９９７年１０月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３７４が付与されている。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000030
【００９５】
Ｈ．ヒトＰＲＯ２４５（ＵＮＱ２１９）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ＤＮＡ３５６５８の全長ＤＮＡ配列（Ｆｉｇ１５；配列番号：３５）と誘導ＰＲＯ２４５天然配列タンパク質ＵＮＱ２１９（Ｆｉｇ１６、配列番号：３６）を単離した。
上述の方法で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000031
ＤＮＡ３５６３８の全ヌクレオチド配列をＦｉｇ１５（配列番号：３５）に示す。クローンＤＮＡ３５６３８は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８９−９１に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１０２５−１０２７の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ１５、配列番号３５）。予測されるＰＲＯ２４５ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ２１９、配列番号：３６）は３１２アミノ酸長であり、３４５５４ダルトンの算定分子量と９．３９のｐＩを持つ（Ｆｉｇ３６）。ＤＮＡ３５６３８−１１４１と命名したＤＮＡ３５６３８（配列番号：３５）を含むｃＤＮＡクローンは１９９７年９月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２６５が付与されている。
Ｉ．ヒトＰＲＯ１７２（ＵＮＱ１４６）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ＤＮＡ３５９１６の全長ＤＮＡ配列（Ｆｉｇ１７；配列番号：４０）と誘導ＰＲＯ１７２天然配列タンパク質ＵＮＱ１４６（Ｆｉｇ１８、配列番号：４１）を単離した。
Ｆｉｇ１７に太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ３５９１６（配列番号：４０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３８−４０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２２０７−２２０９の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ１７２ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ１４６：配列番号：４１）は７２３アミノ酸長であり、７８０５５ダルトンの算定分子量と６．１７のｐＩを持つ（Ｆｉｇ１８）。ＤＮＡ３５９１６（配列番号：４０）を含むｃＤＮＡクローンは１９９７年１０月２８日にＡＴＣＣに寄託され（ＤＮＡ３５９１６−１１６１と命名）、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４１９が付与されている。
上述の方法で使用されるヌクレオチド配列は以下の通りである：
2004516227.tif 000032
【００９６】
Ｊ．ヒトＰＲＯ２７３（ＵＮＱ２４０）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ＤＮＡ３９５２３の全長ＤＮＡ配列（Ｆｉｇ１９；配列番号：４５）と誘導ＰＲＯ２７３天然配列タンパク質ＵＮＱ２４０（Ｆｉｇ２０、配列番号：４６）を単離した。
合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000033
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ３９５２３は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６７−１６９に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５００−５０２の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ１９）。予測されるＰＲＯ２７３ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ２４０、配列番号：４６）は１１１アミノ酸長であり、１３０７８ダルトンの算定分子量と１０．３７のｐＩを持つ（Ｆｉｇ２０）。ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）を含むｃＤＮＡクローンは１９９７年１０月３１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４２４が付与されている。
Ｋ．ヒトＰＲＯ２７２（ＵＮＱ２３９）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児肺組織において、プローブオリゴヌクレオチドとプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４０６２０（Ｆｉｇ２１；配列番号：５０）と誘導ＰＲＯ２７２天然配列タンパク質ＵＮＱ２３９（配列番号：５１）を同定した。
ＰＲＯ２７２をコードするＤＮＡ配列を単離するために合成して使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは以下の通りである：
2004516227.tif 000034
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４０６２０（配列番号：５０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３５−３７に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１０２０−１０２２の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ２１）。予測されるポリペプチド前駆体は３２８アミノ酸長であり（Ｆｉｇ２２）、３７４９３ダルトンの算定分子量と４．７７のｐＩを持つ。ＤＮＡ４０６２０（配列番号：５０）を含むｃＤＮＡクローンは１９９７年１０月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３８８が付与されている。
Ｌ．ヒトＰＲＯ３３２（ＵＮＱ２９３）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ＤＮＡ４０９８２の全長ＤＮＡ配列（Ｆｉｇ２３、配列番号：５６）と誘導ＰＲＯ３３２天然配列タンパク質ＵＮＱ２９３（Ｆｉｇ２４、配列番号：５７）を同定した。
上述した手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000035
ＤＮＡ４０９８２の全ヌクレオチド配列（配列番号：５６）をＦｉｇ２３に示す。Ｆｉｇ２３に太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４０９８２（配列番号：５６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３４２−３４４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２２６８−２２７０の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する。予測されるＰＲＯ３３２ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ２９３、配列番号：５７、Ｆｉｇ２４）は６４２アミノ酸長であり、７２０６７ダルトンの算定分子量と６．６０のｐＩを持つ。ＤＮＡ４０９８２（配列番号：５６）を含むｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ４０９８２−１２３５と命名）は１９９７年１１月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３３が付与されている。
【００９７】
Ｍ．ヒトＰＲＯ５２６（ＵＮＱ３３０）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４４１８４（Ｆｉｇ２５、配列番号：６１）と誘導ＰＲＯ５２６天然配列タンパク質ＵＮＱ３３０（Ｆｉｇ２６、配列番号：６２）を同定した。
合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000036
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４４１８４（配列番号：６１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５１４−５１６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１９３３−１９３５の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ６１）。予測されるＰＲＯ５２６ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３３０、配列番号：６２）は４７３アミノ酸長である（Ｆｉｇ６２）。Ｆｉｇ６２に示すＵＮＱ３３０（配列番号：６２）タンパク質は約５０７０８ダルトンの算定分子量と９．２８のｐＩを持つ。ＤＮＡ４４１８４を含むｃＤＮＡクローンは１９９８年３月２６日にＡＴＣＣに寄託され（ＤＮＡ４４１８４−１３１９と命名）、寄託番号２０９７０４が付与されている。
ＵＮＱ３３０（配列番号：６２）の分析により、シグナルペプチド配列はおよそアミノ酸１−２６にあることが明らかになった。ロイシンジッパーパターンはおよそアミノ酸１３５−１５６にある。グリコサミノグリカン結合部位は、およそアミノ酸４３６−４３９にある。Ｎ−グリコシル化部位は、およそアミノ酸８２−８５、１７９−１８２、２３７−２４０及び４２３−４２６にある。フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）型Ｃドメインは、およそアミノ酸４１１−４２５に見られる。当業者であれば、ここに提供した配列に基づいて、これらのアミノ酸にどのヌクレオチドが対応するかを理解できるであろう。
【００９８】
Ｎ．ヒトＰＲＯ７０１（ＵＮＱ３６５）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４４２０５（Ｆｉｇ２７、配列番号：６６）と誘導ＰＲＯ５２６天然配列タンパク質ＵＮＱ３６５（Ｆｉｇ２８、配列番号：６７）を同定した。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000037
Ｆｉｇ２７に太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４４２０５（配列番号：６６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５０−５２に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２４９８−３０００の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する。予測されるＰＲＯ７０１ポリペプチド前駆体（すなわちＦｉｇ２８、ＵＮＱ３６５、配列番号：６７）は８１６アミノ酸長であり、９１７９４Ｄａの算定分子量（ｐＩ：５．８８）を持つ。ＤＮＡ４４２０５を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：６６）（ＤＮＡ４４２０５−１２８５と命名）は１９９８年３月３１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７２０が付与されている。
ＵＮＱ３６５（配列番号：６７）は、およそアミノ酸位置２５に潜在的シグナルペプチド切断部位を含む。アミノ酸位置８３、５１１、７１６及び８０３には潜在的Ｎ−グリコシル化部位が存在する。カルボキシルエステラーゼＢ型シグネーチャー２配列は、およそ残基１２５から１３５である。カルボキシルエステラーゼＢ型に相同な領域は、およそ残基５４−７４、１９７−２１２及び２２１−２６１である。潜在的な膜貫通領域は、およそアミノ酸６７１からおよそ７００に相当する。対応する核酸は、ここに提供した配列から通常のようにして決定できる。
Ｑ．ヒトＰＲＯ３６１（ＵＮＱ３１６）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて、プローブオリゴヌクレオチドとプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４５４１０（Ｆｉｇ２９；配列番号：７１）と誘導ＰＲＯ３６１天然配列タンパク質ＵＮＱ３１６（Ｆｉｇ３０、配列番号：７２）を同定した。
ハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを上述の方法に使用するために合成した：
2004516227.tif 000038
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４５４１０（配列番号：７１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２２６−２２８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１５１９−１５２１の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する（Ｆｉｇ２９）。予測されるＰＲＯ３６１ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３１６、配列番号：７２）は４３１アミノ酸長である（Ｆｉｇ３０）。ＵＮＱ３１６としてＦｉｇ３０に示す天然配列ＰＲＯ３６１タンパク質は、約４６８１０の算定分子量と約６．４５のｐＩを持つ。さらに、アルギナーゼファミリータンパク質を示す領域が、およそ残基Ｆ３からＶ１４、またＩ３９からＴ５７に存在しており、膜貫通ドメインはおよそ残基Ｐ３８０からＳ４０９に存在している。ＤＮＡ４５４１０（配列番号：７１）を含むｃＤＮＡクローンは１９９８年２月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６２１が付与されている。
【００９９】
Ｐ．ヒトＰＲＯ３６２（ＵＮＱ３１７）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児脳ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４５４１６（Ｆｉｇ３１、配列番号：７９）と誘導ＰＲＯ３６２天然配列タンパク質ＵＮＱ３１７（Ｆｉｇ３２、配列番号：８０）を単離した。
上述の手順に使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000039
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４５４１６（配列番号：７９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１１９−１２１に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１０８２−１０８４の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する（Ｆｉｇ３１）。予測されるＰＲＯ３６２ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３１７、配列番号：８０）は３２１アミノ酸長である（Ｆｉｇ３２）。Ｆｉｇ３２に示すＵＮＱ３１７タンパク質（配列番号：８０）は約３５５４４ダルトンの算定分子量と約８．５１のｐＩを持つ。Ｆｉｇ３２に示すＵＮＱ３１７ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸１４９からおよそアミノ酸１５２にグリコサミノグリカン結合部位、及びおよそアミノ酸２７６からおよそアミノ酸３０６に膜貫通ドメインが存在することが証明された。ＤＮＡ４５４１６を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：７９）は１９９８年２月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６２０が付与されている。
【０１００】
Ｑ．ヒトＰＲＯ３６３（ＵＮＱ３１８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４５４１９（Ｆｉｇ３３、配列番号：８６）と誘導ＰＲＯ３６３天然配列タンパク質ＵＮＱ３１８（Ｆｉｇ３４、配列番号：８７）を単離した。
上述の手順に使用するために合成されたハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000040
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４５４１９（配列番号：８６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１９０−１９２に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１３０９−１３１１の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ３３）。予測されるＰＲＯ３６３ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３１８、配列番号：８７）は３７３アミノ酸長である（Ｆｉｇ３４）。Ｆｉｇ３４に示すＵＮＱ３１８タンパク質（配列番号：８７）は約４１２８１ダルトンの算定分子量と約８．３３のｐＩを持つ。Ｆｉｇ３４に示すＵＮＱ３１８ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸残基２２１からおよそ残基２５４に膜貫通ドメインの存在が証明された。ＤＮＡ４５４１９を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：８６）は１９９８年２月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６１６が付与されている。
Ｒ．ヒトＰＲＯ３６４（ＵＮＱ３１９）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト小腸ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのポリペプチドのメンバーと相同性を示すポリペプチドをコードした発現配列タグ（ＥＳＴ）（ＩｎｃｙｔｅＥＳＴ番号３００３４６０）を同定した。
次に、ＥＣＤ相同性手順で使用したのと類似した方法でＩｎｃｙｔｅ３００３４６０ＥＳＴに対するコンセンサスＤＮＡ配列を組み立て、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４７３６５（Ｆｉｇ３５、配列番号：９１）と誘導ＰＲＯ３６４天然配列タンパク質ＵＮＱ３１９（Ｆｉｇ３６、配列番号：９２）を単離した。
上述のスクリーニング法で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000041
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４７３６５（配列番号：９１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２１−１２３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置８４４−８４６の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ３５）。予測されるＰＲＯ３６４ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３１９、配列番号：９２）は２４１アミノ酸長である（Ｆｉｇ３６）。Ｆｉｇ３６に示すＵＮＱ３１９（配列番号：９２）タンパク質は約２６０００ダルトンの算定分子量と約６．３４のｐＩを持つ。潜在的Ｎ−グリコシル化部位はＦｉｇ３６に示すアミノ酸配列のアミノ酸１４６から１４９の間に存在する。推定シグナル配列はＦｉｇ３６に示す配列のアミノ酸１から２５、潜在的膜貫通ドメインはＦｉｇ３６に示す配列のアミノ酸１６２から１８０の間に存在する。ＤＮＡ４７３６５を含むｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ４７３６５−１２０６と命名）は１９９７年１１月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３６が付与されている。
【０１０１】
Ｓ．ヒトＰＲＯ３５６（ＵＮＱ３１３）（ＮＬ４）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を検索し、ヒトＴＩＥ−２ Ｌ１とＴＩＥ−２ Ｌ２との間に相同性を示すＥＳＴ（＃２９３９３４０）を同定した。
ＥＳＴに基づき、一対のＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）とプローブを合成した：
2004516227.tif 000042
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ （Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬とプロトコールを用いて、ベクターｐＲＫ５ＤにおいてＣｌｏｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．から購入した子宮ｍＲＮＡ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ， カタログ番号６５３７−１）よりオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡのライブラリーを作製した。ｐＲＫ５Ｄは、ｓｐ６転写開始部位に続いてＳｆｉＩ制限酵素部位を、さらにＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位を持つクローニングベクターである。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で約１０００ｂｐを越えるように適切にサイズ分類し、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ｐＲＫ５Ｄにおいて所定の方向でクローニングした。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上述で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅してスクリーニングを行った。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３５６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
上述のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、天然配列ＰＲＯ３５６（ＮＬ４）をコードする全長ＤＮＡ配列（すなわちＤＮＡ４７４７０、配列番号：１０１）及び誘導ＰＲＯ３５６タンパク質配列ＵＮＱ３１３（配列番号：１０２）が得られた。
ＤＮＡ４７４７０の全ヌクレオチド配列をＦｉｇ３７（配列番号：１０１）に示す。太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４７４７０（配列番号：１０１）は、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２１５−２１７に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置１０３８−１０４０にＴＡＡ停止コドンを有する。予測されるＰＲＯ３５６ポリペプチド前駆体は３４６アミノ酸長（すなわちＵＮＱ３１３、配列番号：１０２）であり、４００１８ダルトンの算定分子量及び約８．１９のｐＩを持つ。ＤＮＡ４７４７０（配列番号：１０１）を含むｃＤＮＡは１９９７年１０月２８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４２２が付与されている。
【０１０２】
Ｔ．ヒトＰＲＯ５３１（ＵＮＱ３２２）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児脳ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４８３１４（Ｆｉｇ３９、配列番号：１０６）と誘導ＰＲＯ５３１天然配列タンパク質ＵＮＱ３３２（Ｆｉｇ４０、配列番号：１０７）を単離した。
合成されたハイブリッド形成プローブＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000043
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４８３１４（配列番号：１０６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７１−１７３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２５６５−２５６７の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ３９）。予測されるＰＲＯ５３１ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３３２、配列番号：１０７）は７８９アミノ酸長である。Ｆｉｇ３９に示すＵＮＱ３３２タンパク質（配列番号：１０７）は約８７５５２ダルトンの算定分子量と約４．８４のｐＩを持つ。ＤＮＡ４８３１４を含むクローン（配列番号：１０６）は１９９８年３月２６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７０２が付与されている。
配列番号：１０７のＵＮＱ３３２アミノ酸配列の分析により、およそアミノ酸１２２−１３２、２３１−２４１、３３６−３４６、４３９−４４９及び５４９−５５９にカドヘリン細胞外反復ドメインシグネーチャーが見られる。ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ（Ｐ−ループ）は、配列番号：１０７のおよそアミノ酸２８５−２９２に見られる。Ｎ−グリコシル化部位は、配列番号：１０７のおよそアミノ酸５６７−５７０、７８６−７９０、４１８−４２１及び３３６−３３９に見られ、シグナルペプチドはおよそアミノ酸１−２６にあり、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸６８５−７１２にある。
Ｕ．ヒトＰＲＯ５３３（ＵＮＱ３３４）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＥＳＴ配列受託番号ＡＦ００７２６８であるマウス線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１５）を様々な公的ＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ， Ｄａｙｈｏｆｆ等）を検索するのに使用した。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ−２［Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６）］を用いて、ＥＣＤタンパク質配列をＥＳＴ配列の６フレーム翻訳と比較することにより実施した。検索の結果、ＧｅｎＢａｎｋＥＳＴ ＡＡ２２０９９４が同定され、これがストラタジーンＮＴ２ニューロン前駆体９３７２３０として同定された。
この配列に基づいて、１）ＰＣＲにより関心ある配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。ライブラリからのＤＮＡをＰＣＲプライマー対で、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに従って、ＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を使用するインビボクローニング手順により、関心あるＰＲＯ５３３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児網膜から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、市販試薬（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ等々）を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター（例えばｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１））に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
ｃＤＮＡクローンはその全体を配列決定した。全長ヌクレオチド配列ＤＮＡ４９４３５（配列番号：１１１）をＦｉｇ４１に示す。Ｆｉｇ４１に太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４９４３５（配列番号：１１１）は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４６４−４６６に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置６４９−６５１の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ５３３ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３３４、配列番号：１１２）は２１６アミノ酸長であり、２４００３ダルトンの算定分子量と６．９９のｐＩを有する。クローンＤＮＡ４９４３５−１２１９は１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣに寄託され（ＤＮＡ４９４３５−１２１９と命名）、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４８０が付与されている。
上述の手順に使用されるオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである：
2004516227.tif 000044
【０１０３】
Ｖ．ヒトＰＲＯ１０８３（ＵＮＱ５４０）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるＥＳＴ配列を得、ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ５０９２１（Ｆｉｇ４３、配列番号：１１６）と誘導ＰＲＯ１０８３天然配列タンパク質ＵＮＱ５４０（配列番号：１１７）を単離した。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000045
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ５０９２１（配列番号：１１６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５４−１５６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２２３３−２２３５の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ４３）。予測されるＰＲＯ１０８３ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ５４０、配列番号：１１７、Ｆｉｇ４４）は６９３アミノ酸長である。Ｆｉｇ４４に示すＵＮＱ５４０（配列番号：１１７）タンパク質は約７７７３８ダルトンの算定分子量と約８．８７のｐＩを持つ。ＤＮＡ５０９２１を含むクローンは１９９８年５月１２日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９８５９が付与されている。
アミノ酸配列ＵＮＱ５４０（配列番号：１１７）の分析により、推定シグナルペプチド配列がおよそアミノ酸１−２５にあり、膜貫通ドメインがおよそアミノ酸３８２−３９８、４０２−４２０、４４５−４６８、４７３−４９１、５１９−５３７、５６８−５９０及び６３４−６５７にあり、ミクロボディーＣ末端標的シグナルがおよそアミノ酸６９１−６９３にあり、ｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位がおよそアミノ酸１９８−２０１及び３７０−３７３に、Ｎ−グリコシル化部位がおよそアミノ酸３９−４２、１４８−１５１、１７１−１７４、２３４−２３７、３０３−３０６、３２４−２２７及び３４１−３４４に、さらにＧ−タンパク質結合レセプターファミリードメインがおよそアミノ酸４７５−５０４にあることが明らかになった。
【０１０４】
Ｗ．ヒトＰＲＯ８６５（ＵＮＱ４３４）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるＥＳＴ配列を得、ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ５３９７４（Ｆｉｇ４５、配列番号：１２３）と誘導ＰＲＯ８６５天然配列タンパク質ＵＮＱ４３４（配列番号：１２４）を単離した。
上述の手順で使用するために合成したハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000046
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ５３９７４（配列番号：１２３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７３−１７５に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１５７７−１５７９の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する（Ｆｉｇ４５）。予測されるＰＲＯ８６５ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ８６５、配列番号：１２４）は４６８アミノ酸長である。Ｆｉｇ４６に示すＵＮＱ４３４（配列番号：１２４）タンパク質は約５４３９３の算定分子量と約５．６３のｐＩを持つ。ＤＮＡ５３９７４（配列番号：１２３）を含むクローンは１９９８年４月１４日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９７７４が付与されている。
アミノ酸配列ＵＮＱ４３４（配列番号：１２４）の分析により、およそアミノ酸残基１−２３に推定シグナルペプチド、およそアミノ酸残基２８０からおよそ３８４に潜在的Ｎ−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基９４からおよそ残基９７に潜在的アミド化部位、およそアミノ酸残基２０からおよそ２３、及びおよそ残基２２３からおよそ残基２２６にグリコサミノグリカン結合部位、およそアミノ酸残基２１６からおよそ残基２２２にアミノトランスフェラーゼクラス−Ｖピリドキシル−ホスフェートアミノ酸配列ブロック、及びおよそアミノ酸残基３３８からおよそ残基３４３のインターロイキン−７タンパク質に見られるものと類似するアミノ酸配列ブロックが存在することが明らかになった。
【０１０５】
Ｘ．ヒトＰＲＯ７７０（ＵＮＱ４０８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
公的な発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（Ｍｅｒｃｋ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を全長マウスｍ−ＦＩＺＺ１ＤＮＡ（ＤＮＡ５３５１７）で検索し、ＡＡ５２４３００と命名した、ｍ−ＦＩＺＺ１ＤＮＡと相同性を示したＥＳＴを同定した。
ＥＳＴＡＡ５２４３００に相当する全長クローンをＩｎｃｙｔｅ（Ｌｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入し、その全体を配列決定した。
得られたＰＲＯ７７０コード化全長クローンの全ヌクレオチド配列をＦｉｇ４７に示す。太字の下線で示したように、ＤＮＡ５４２２８と命名されたこの全長クローン（配列番号：１３３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１００−１０２に見かけの翻訳開始部位を有し（Ｆｉｇ４７；配列番号１３３）、残基４３３−４３５の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ７７０ポリペプチド先駆体（２０のアミノ酸の推定シグナル配列を含む）（すなわちＵＮＱ４０８、配列番号１３４）は１１１アミノ酸長であり、１１７３０ダルトンの算定分子量と７．８２のｐＩを持つ。ｍ−ＦＩＺＺ１に対するその相同性に基づいて（ＡＬＩＧＮソフトウェアを使用して、５０％）、タンパク質はｍ−ＦＩＺＺ１のヒト相同体であると信じられ、ｈ−ＦＩＺＺ１と命名した。ＤＮＡ５４２２８を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１３３）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０１が付与されている。
ｍ−ＦＩＺＺ１（ＤＮＡ５３５１７）の同定とクローニング
マウス喘息モデル  ６〜８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスを、二つの実験グループ：対照と喘息に分けた。喘息グループを１０μｇの卵白アルブミン＋１ｍｇのミョウバンで腹腔内に免疫化する一方、対照グループは免疫しなかった。２週間後、ＵｌｔｒａＮｅｂネブライザー（ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ）でエアロゾル化したＰＢＳに入れた卵白アルブミン１０ｍｇ／ｍｌのエアロゾルに、７日連続して一日当り３０分間２ｍｌ／ｍｉｎの流速で毎日マウスをさらした。最後のエアロゾルの投与の１日後に、全血、血清及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料を収集し、肺を収集し、組織学的検査、免疫組織化学及びインサイツハイブリッド形成のために保存した。
ＢＡＬ試料のゲル電気泳動  １６％のトリシンゲル上でのゲル電気泳動法によるＢＡＬ試料の検査は、喘息マウスからのＢＡＬ試料にあっては低分子量のタンパク質が発現されるが、対照マウスのＢＡＬ試料では発現しないことが示された。この低分子量のタンパク質をｍ−ＦＩＺＺ１と名付けたが、８３００ダルトンのマーカータンパク質（ＩＬ−８）と同時移動することが分かった。
部分的タンパク質配列  関心あるタンパク質をＰＶＤＦ膜上に移し、エドマン分解により配列決定した。この配列は以下に記載する種々のクローニングオリゴの作成のためのテンプレートとなった。
部分的ｃＤＮＡ配列  我々は、部分的タンパク質配列の配列の最初の７個と最後の７個のアミノ酸に対する推定ＤＮＡ配列に対応する２つの縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを設計した。
2004516227.tif 000047
正常なマウスの肺から調製されたｃＤＮＡを８８ｂｐの生成物を生じたＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。この８８ｐｂの生成物は、ＰＣＲプライマーをコードする５４の既知の塩基対と、他の部分的ｍ−ＦＩＺＺ１配列をコードする３４の新規な塩基対を含んでいた。
全長ｃＤＮＡクローン  この第２の部分配列を使用してプライマーを設計し、最終的にマウスの肺ポリ（Ａ）＋ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる全長ＦＩＺＺクローン（ＤＮＡ５３５１７）を成功裡に得た。
2004516227.tif 000048
このオリゴをオリゴｄ（Ｔ）と組み合わせてＲＴ−ＰＣＲプライマーとして使用した。
【０１０６】
Ｙ．ヒトＰＲＯ７６９（ＵＮＱ４０７）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
公的な発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（Ｍｅｒｃｋ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を上述の全長マウス動物ｍ−ＦＩＺＺ１ＤＮＡ（ＤＮＡ５３５１７）で検索し、ＥＳＴ Ｗ４２０６９を同定した。
ＥＳＴ断片Ｗ４２０６９に相当する全長クローンをＬｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入し、全体を配列決定し、最終的に全長ヌクレオチド配列ＤＮＡ５４２３１（配列番号：１３９）を同定した。
全長の天然配列ＰＲＯ７６９クローンに相当するヌクレオチド配列をＦｉｇ４９に示す。太字の下線で示したように、ＤＮＡ５４２３１と命名されたこのクローン（配列番号：１３９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７５−７９に見かけの翻訳開始部位を有し、残基４１７−４１９の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ４９）。予測されるＰＲＯ７６９ポリペプチド先駆体（１０のアミノ酸のシグナル配列を含む）（すなわちＵＮＱ４０７、配列番号１４０）は１１４アミノ酸長であり、１２４９２ダルトンの算定分子量と８．１９のｐＩを持つ。ｍ−ＦＩＺＺ１に対するその相同性に基づいて（ＡＬＩＧＮソフトウェアを使用して、３４％）、タンパク質をｍ−ＦＩＺＺ３と命名した。ＤＮＡ５４２３１を含むクローン（ＤＮＡ５４２３１−１３６６と命名）は１９９８年４月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０２が付与されている。
Ｚ．ヒトＰＲＯ７８８（ＵＮＱ４３０）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、部分長ＥＳＴ配列２７７７８２８を同定した。さらに対応する全長配列を分析することにより、ＤＮＡ５６４０５（配列番号：１４１）と誘導天然配列ＰＲＯ７８８タンパク質ＵＮＱ４３０（配列番号：１４２）を同定した。
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ５６４０５（配列番号：１４１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８４−８６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置４５９−４６１の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ５１）。予測されるＰＲＯ７８８ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ４３０、配列番号：１０４２は１２５アミノ酸長であり（Ｆｉｇ５２）、１３１１５ダルトンの算定分子量と５．９０のｐＩを持つ。Ｆｉｇ５２に示すＵＮＱ４３０（配列番号：１４２）タンパク質は１９９８年３月６日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９８４９が付与されている。寄託物のヌクレオチド配列とここに開示された配列との間で不一致がある場合は、寄託されたクローンが正しい配列を含むものと理解される。さらにここで提供された配列を配列決定するための方法は周知の配列決定技術に基づくと理解される。
Ｆｉｇ５２に示すＵＮＱ４３０（配列番号：５２）の分析により、およそアミノ酸１−１７にシグナルペプチド、およそアミノ酸４６にＮ−グリコシル化部位があることが明らかになった。
【０１０７】
ＡＡ．ヒトＰＲＯ１１１４（ＵＮＱ５５７）をコードするｃＤＮＡクローンの単離  ヒト胎児腎臓組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるＥＳＴ配列を得、ヒト乳癌ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ５７０３３（Ｆｉｇ５３、配列番号：１４３）と誘導ＰＲＯ１１１４天然配列タンパク質ＵＮＱ５５７（Ｆｉｇ５４、配列番号：１４４）を単離した。
上述のパラグラフに記載した単離スクリーニングで使用されるＰＣＲプライマーは以下の通りである：
2004516227.tif 000049
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ５７０３３（配列番号：１４３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２５０−２５２に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１１８３−１１８５の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ５３、配列番号１４３）。予測されるＰＲＯ１１１４ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ５５７、配列番号：１４４）は３１１アミノ酸長であり、約３５０７６ダルトンの算定分子量と約５．０４の算定ｐＩを持つ。Ｆｉｇ５４に示す全長ＰＲＯ１１１４配列（配列番号：１４４）の分析により、以下の存在が証明された：およそアミノ酸１からおよそアミノ酸２９にシグナルペプチド、およそアミノ酸２３０からおよそアミノ酸２５５に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸４０からおよそアミノ酸４３及びおよそアミノ酸１３４からおよそアミノ酸１３７に潜在的Ｎ−グルコシル化部位、およそアミノ酸９２からおよそアミノ酸１１９にアミノ酸配列ブロック、及びおよそアミノ酸残基２３２からおよそアミノ酸２６２のインテグリンα鎖と相同性を有するアミノ酸配列ブロック。ＤＮＡ５７０３３を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１４３）は１９９８年３月２７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９０５が付与されている。
ＡＢ．ヒトＰＲＯ１００７（ＵＮＱ４９１）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ヒト肝臓組織（ライブラリ３４１からのクローン８３０１２）から誘導され、Ｍｅｒｃｋ ＥＳＴ Ｔ７０５１３と命名されたＥＳＴ配列を同定し、更に検査した。対応する全長クローンを更に検査して配列決定し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ５７６９０（Ｆｉｇ５５、配列番号：１４５）及び誘導ＰＲＯ１００７天然配列タンパク質ＵＮＱ４９１（Ｆｉｇ５６、配列番号：１４６）を単離した。
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ５７６９０（配列番号：１４５）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６−１８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１０５４−１０５６の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ５５）。予測されるＰＲＯ１００７ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ４９１、配列番号：１４６）は３４６アミノ酸長であり（Ｆｉｇ５６）、３５９７１ダルトンの算定分子量及び８．１７のｐＩを持つ。Ｆｉｇ５６に示すＵＮＱ４９１（配列番号：１４６）タンパク質は、約３５９７１ダルトンの算定分子量及び約８．１７のｐＩを持つ。ＤＮＡ５７６９０を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１４５）は１９９８年６月９日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９９５０が付与されている。
ＵＮＱ４９１（配列番号：１４６）のアミノ酸配列の分析により、およそアミノ酸残基１−３０に推定シグナルペプチド、およそアミノ酸残基３２５−３４６に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基１１８、１２９、１６３、１７６、１８３及び２２７にＮ−グリコシル化部位、及びおよそアミノ酸残基１７−３６及び２０９−２２２にＬｙ−６／ｕ−Ｐａｒドメインタンパク質があることが明らかになった。ここに提供されたアミノ酸の対応するヌクレオチド配列はここで提供された配列が与えられれば常套的に決定できる。
【０１０８】
ＡＣ．ヒトＰＲＯ１１８４（ＵＮＱ５９８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、回腸組織ライブラリ（３９、ＳＩＮＴＢＳＴ０１）から誘導されたＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ１４２８３７４を同定した。この配列に対応する全長クローンを更に検査して、全長ＤＮＡ５９２２０（Ｆｉｇ５７、配列番号：１４７）及び誘導ＰＲＯ１１８４天然配列タンパク質ＵＮＱ５９８（Ｆｉｇ５８、配列番号：１４８）を単離した。
Ｆｉｇ５８に太字の下線で示したように、ＵＮＱ５９８（配列番号：１４８）は、ヌクレオチド位置１０６−１０８に見かけの翻訳開始部位を示し、ヌクレオチド位置５３２−５３４に見られる停止コドン（ＴＧＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ１１８４ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ５９８、配列番号：１４８）は１４２アミノ酸長であり、約１５６９０ダルトンの算定分子量及び約９．６４の算定ｐＩを持つ。ＵＮＱ５９８（配列番号：１４８）の分析により、およそアミノ酸残基１−３８にシグナルペプチドの存在が証明された。ＤＮＡ５９２２０を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１４７）は１９９８年６月９日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９９６２が付与されている。寄託されたクローンが実際の配列を有しており、その提示がここになされていると理解される。
ＡＤ．ヒトＰＲＯ１０３１（ＵＮＱ５１６）をコードするｃＤＮＡクローンの単離  上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ＥＳＴ配列Ｍｅｒｃｋ Ｗ７４５５８（クローン３４４６４９）を同定した。対応する全長クローンを更に検査して配列決定し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ５７６９０（Ｆｉｇ５９、配列番号：１４９）及び誘導ＰＲＯ１０３１天然配列タンパク質ＵＮＱ５１６（Ｆｉｇ６０、配列番号：１５０）を単離した。
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ５９２９４（配列番号：１４９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４２−４４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５８２−５８４の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ５９）。予測されるＰＲＯ１０３１ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ５１６、配列番号：１５０）は１８０アミノ酸長である（Ｆｉｇ６０）。Ｆｉｇ６０に示すＵＮＱ５１６タンパク質は、約２０４３７ダルトンの算定分子量及び約９．５８のｐＩを持つ。クローンＤＮＡ５９２９４（配列番号：１４９）は１９９８年３月１４日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９８６６が付与されている。配列に関し、寄託されたクローンが正しい配列を含み、ここで提供された配列は既知の配列決定技術に基づいていることが理解される。対応するヌクレオチドはここで提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
ＡＥ．ヒトＰＲＯ１３４６（ＵＮＱ７０１）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ５９７７６（Ｆｉｇ６１、配列番号：１５１）と誘導ＰＲＯ１３４６天然配列タンパク質ＵＮＱ７０１（Ｆｉｇ６２、配列番号：１５２）を単離した。
ＤＮＡ５９７７６（配列番号：１５１）の単離に使用したハイブリッド形成プローブとＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000050
クローンＤＮＡ５９７７６（配列番号：１５１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１−３（ＡＴＧ）に見かけの翻訳開始部位を、ヌクレオチド位置１３８４−１３８６に見かけの停止コドン（ＴＡＧ）を有する。予測されるＰＲＯ１３４６ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ７０１、配列番号：１５２）は４６１アミノ酸長である。タンパク質は、アミノ酸位置約３１から約５０に見かけのＩＩ型膜貫通ドメインを、およそアミノ酸位置４０９−４２１にフィブリノーゲンβ及びγ鎖Ｃ末端ドメインシグネーチャーを、およそアミノ酸位置１４０−１６１、１４７−１６８、１５４−１７５及び１６１−１８２にロイシンジッパーパターンを含む。
ＤＮＡ５９７７６−１６００と命名されるＤＮＡ５９７７６を含むｃＤＮＡクローンは１９９８年８月１８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１２８が付与されている。Ｆｉｇ６２に示すＵＮＱ７０１（配列番号：１５２）タンパク質は約５０７４４ダルトンの算定分子量と約６．３８のｐＩを持つ（Ｆｉｇ１８）。
【０１０９】
ＡＦ．ヒトＰＲＯ１１５５（ＵＮＱ５８５）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、回腸組織ライブラリ（３９、ＳＩＮＩＮＯＴ０３）から誘導されたＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ２８５８８７０を同定した。この配列に対応する全長クローンを更に検査して、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ５９８４９（Ｆｉｇ６３、配列番号：１５６）及び誘導ＰＲＯ１１５５天然配列タンパク質ＵＮＱ５８５（Ｆｉｇ６４、配列番号：１５７）を単離した。
太字の下線で示したように、Ｆｉｇ６４に示されたＵＮＱ５８５（配列番号：１５７）ポリペプチドは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５８−１６０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５６３−５６５に見られる停止コドン（ＴＡＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ１１５５ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ５８５、配列番号：１５７）は１３５アミノ酸長であり、シグナルペプチドはおよそアミノ酸残基１からおよそ８にあり、ロイシンジッパーパターンはおよそアミノ酸残基４３からおよそ６４にあり、さらにタキキニンファミリーシグネーチャーはおよそアミノ酸残基８６からおよそ９１にある。ＵＮＱ５８５（配列番号：１５７）は約１４８３３ダルトンの算定分子量及び約９．７８の算定ｐＩを持つ。ＤＮＡ５９８４９を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１５６）は、ＤＮＡ５９８４９−１５０４と命名され、１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９９８６が付与されている。ＡＧ．ヒトＰＲＯ１２５０（ＵＮＱ６３３）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＩｎｃｙｔｅデータベースからのＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列番号５６５２３と称されるＥＳＴクラスター配列を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な様々なＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ３３７１７８４を同定した。このＥＳＴ配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６０７７５（Ｆｉｇ６５、配列番号：１５８）及び誘導ＰＲＯ１２５０天然配列タンパク質ＵＮＱ６３３（Ｆｉｇ６６、配列番号：１５９）を単離した。
クローンＤＮＡ６０７７５（配列番号：１５８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７４−７６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２２９１−２２９３の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ６５）。予測されるＰＲＯ１２５０ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ６３３、配列番号：１５９）は７３９アミノ酸長である（Ｆｉｇ６６）。Ｆｉｇ６６に示すＵＮＱ６３３（配列番号：１５９）タンパク質は約８２２６３ダルトンの算定分子量及び約７．５５の算定ｐＩを持つ。ＵＮＱ６３３（配列番号：１５９）の分析により、以下の存在が証明された：およそアミノ酸残基６１からおよそ８０にＩＩ型膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基３１４からおよそ３２５に推定ＡＭＰ−結合ドメインシグネーチャー、及びおよそアミノ酸残基１０２からおよそ１０５、およそアミノ酸残基５８８からおよそ５９１及びおよそアミノ酸残基６１９からおよそ６２２に潜在的Ｎ−グルコシル化部位。ＤＮＡ６０７７５を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１５８）は１９９８年９月１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１７３が付与されている。
【０１１０】
ＡＨ．ヒトＰＲＯ１３１２（ＵＮＱ６７８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＥＳＴ（ＤＮＡ５５７７３）を、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優先的に提示するヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリにおいて、酵母スクリーニングを使用して同定した。ＤＮＡ５５７７３配列に基づき、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６１８７３（Ｆｉｇ６７、配列番号：１６０）及び誘導ＰＲＯ１３１２天然配列ＵＮＱ６７８（配列番号：１６１）を単離するためのプローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドを合成した。
太字の下線で示すように、Ｆｉｇ６７に示す全長ＤＮＡ６１８７３クローン（配列番号：１６０）クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド位置７−９に見かけの翻訳開始部位を有し、およそヌクレオチド位置６４３−６４５に見られる停止コドン（ＴＧＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ１３１２ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ６７８、配列番号：１６１）は２１２アミノ酸長である。ＵＮＱ６７８（配列番号：１６１）は約２４０２４ダルトンの算定分子量及び約６．２６の算定ｐＩを持つ。他の特徴は、およそアミノ酸１−１４にシグナルペプチド：およそアミノ酸１４１−１６０の膜貫通ドメイン、及びおよそアミノ酸７６−７９及び９３−９６の潜在的Ｎ−グルコシル化部位を含む。ＤＮＡ６１８７３を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１６１）は、ＤＮＡ６１８７３−１３１２の名称で１９９８年８月１８日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０３１３２が付与されている。
ＡＩ．ヒトＰＲＯ１１９２（ＵＮＱ６０６）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６２８１４（Ｆｉｇ６９、配列番号：１６２）と誘導ＰＲＯ１１９２天然配列タンパク質ＵＮＱ６０６（Ｆｉｇ７０、配列番号：１６３）を単離した。
ＤＮＡ６２８１４（配列番号：１６２）の単離に使用したＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）及びハイブリッド形成プローブ及びは以下の通りである：
2004516227.tif 000051
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ６２８１４（Ｆｉｇ６９、配列番号：１６２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２１−１２３に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置７６６−７６８に見かけの停止コドン（ＴＡＡ）を有する。予測されるＰＲＯ１１９２ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ６０６、配列番号：１６３）は２１５アミノ酸長である。Ｆｉｇ７０に示すＵＮＱ６０６（配列番号：１６３）ポリペプチド前駆体は、およそアミノ酸１−２１にシグナルペプチド；およそアミノ酸１５３−１７６に膜貫通ドメイン；およそアミノ酸３９−４２及び１１８−１２１に潜在的Ｎ−グルコシル化部位；及びおよそアミノ酸２７−６８及び９９−１２８にミエリンＰ０タンパク質との相同体を有する。Ｆｉｇ７０に示すＵＮＱ６０６（配列番号：１６３）は約２４４８４ダルトンの算定分子量と約６．９８のｐＩを持つ（Ｆｉｇ３６）。
ＤＮＡ６２８１４−１５２１と命名されたＤＮＡ６２８１４を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１６２）は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９３が付与されている。
【０１１１】
ＡＪ．ヒトＰＲＯ１２４６（ＵＮＱ６３０）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＩｎｃｙｔｅデータベースからのＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列番号５６８５３と指定されたＥＳＴクラスター配列を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ２４８１３４５を同定した。このＥＳＴ配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６４８８５（Ｆｉｇ７１、配列番号：１６７）及び誘導ＰＲＯ１２４６天然配列タンパク質ＵＮＱ６３０（Ｆｉｇ７２、配列番号：１６８）を単離した。
太字の下線で示すように、クローンＤＮＡ６４８８５（配列番号：１６７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１１９−１２１に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１７２７−１７２９の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ７１）。予測されるＰＲＯ１２４６ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ６３０、配列番号：１６８）は５３６アミノ酸長であり（Ｆｉｇ７２）、約６１４５０ダルトンの算定分子量及び約９．１７のｐＩを持つ。ＵＮＱ６３０（Ｆｉｇ７２、配列番号：１６８）の分析により、以下のもの：およそアミノ酸１からおよそアミノ酸１５にシグナルペプチド、およそアミノ酸１０８からおよそアミノ酸１１１、およそアミノ酸１１６からおよそアミノ酸１６９、およそアミノ酸１９３からおよそアミノ酸１９６、およそアミノ酸２６２からおよそアミノ酸２６５、およそアミノ酸３７５からおよそアミノ酸３７８、およそアミノ酸４１３からおよそアミノ酸４１６及びおよそアミノ酸４９８からおよそアミノ酸５０１に潜在的Ｎ−グルコシル化部位、及びおよそアミノ酸２８６からおよそアミノ酸３１５、およそアミノ酸３５９からおよそアミノ酸３６９及びおよそアミノ酸７８からおよそアミノ酸９７にスルファターゼタンパク質と相同性を有するアミノ酸配列ブロックが、明らかになった。ＤＮＡ６４８８５−１５２９と命名されたＤＮＡ６４８８５を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１６７）は１９９８年１１月３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３４５７が付与されている。
ＡＫ．ヒトＰＲＯ１２８３（ＵＮＱ６５３）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト乳房腫瘍組織ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６５４０４（Ｆｉｇ７３、配列番号：１６９）と誘導ＰＲＯ１２８３天然配列タンパク質ＵＮＱ６５３（Ｆｉｇ７４、配列番号：１７０）を単離した。
ＤＮＡ６５４０４（配列番号：１６９）使用されたＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）及びハイブリッド形成プローブは以下の通りである：
2004516227.tif 000052
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ６５４０４（配列番号：１６９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４５−４７に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５５５−５５７の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ７３）。予測されるＰＲＯ１２８３ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ６５３、配列番号：１７０）は１７０アミノ酸長である（Ｆｉｇ７４）。Ｆｉｇ７４に示すＵＮＱ６５３（配列番号：１７０）タンパク質は約１９４５７ダルトンの算定分子量と約９．１０のｐＩを持つ。ＵＮＱ６５３（配列番号：１７０）の分析により、以下の存在が証明された：およそアミノ酸１からおよそアミノ酸１７にシグナルペプチド。ＤＮＡ６５４０４−１５５１と称されるＤＮＡ６５４０４を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１６９）は１９９８年９月９日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２４４が付与されている。
【０１１２】
ＡＬ．ヒトＰＲＯ１１９５（ＵＮＱ６０８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＩｎｃｙｔｅデータベースからのＥＳＴクラスター配列３２２０４を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ３５２９８０を同定した。このＥＳＴ配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６５４１２（Ｆｉｇ７５、配列番号：１７７）及び誘導ＰＲＯ１１９５天然配列タンパク質ＵＮＱ６０８（Ｆｉｇ７６、配列番号：１７８）を単離した。
太字の下線で示すように、全長クローンＤＮＡ６５４１２（配列番号：１７７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５８−６０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５１１−５１３の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ７５）。予測されるＰＲＯ１１９５ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ６０８、Ｆｉｇ７６、配列番号：１７８）は１５１アミノ酸長であり、１７２２７ダルトンの算定分子量及び約５．３３のｐＩを持つ。ＵＮＱ６０８（配列番号：１７８）の分析により、およそアミノ酸１−２２があり、約１７２７７ダルトンの算定分子量及び約５．３３の算定ｐＩを持つことが示される。ＤＮＡ６５４１２−１５２３と称されるＤＮＡ６５４１２を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１７７）は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９４が付与されている。
ＡＭ．ヒトＰＲＯ１３４３（ＵＮＱ６９８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト平滑筋細胞組織から単離された組織について上述のアミラーゼ酵母菌スクリーニング手順を使用し、以下のオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるＥＳＴ配列を得、ヒト平滑筋細胞組織ライブラリにおいて上述したようにスクリーニングして、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６６６７５（Ｆｉｇ７７、配列番号：１７９）と誘導ＰＲＯ１３４３天然配列タンパク質ＵＮＱ６９８（Ｆｉｇ７８、配列番号：１８０）を単離した。
使用したオリゴヌクレオチドプローブは以下の通りである：
2004516227.tif 000053
太字の下線で示したように、全長クローンＤＮＡ６６６７５（配列番号：１７９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７１−７３に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置８１２−８１４の停止シグナル（ＴＡＡ）を有する（Ｆｉｇ７７）。予測されるＰＲＯ１３４３ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ６９８、配列番号：１８０、Ｆｉｇ７８）は２７４アミノ酸長であり、約２５３３５ダルトンの算定分子量と約７．０の算定ｐＩを持つ。Ｆｉｇ７８に示すＵＮＱ６９８配列（配列番号：１８０）の分析により、以下の存在が証明された：およそアミノ酸１からおよそアミノ酸２５にシグナルペプチド、及びおよそアミノ酸３５からおよそアミノ酸２２５にサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）リピートと相同性の領域。ＤＮＡ６６６７５−１５８７と称されるＤＮＡ６６６７５を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１７９）は１９９８年９月２２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２８２が付与されている。
別に、上述のアミラーゼスクリーニングから単離された酵母ＥＳＴ配列の比較を、公的及び私的な種々のＥＳＴデータベースに対してスクリーニングし（例えば、上述のＥＣＤ相同性手順を参照のこと）、Ｉｎｃｙｔｅ ＥＳＴクローン番号４７０１１４８を同定した。対応全長クローンをさらに分析し配列決定して、Ｆｉｇ７７に示すＤＮＡ６６６７５配列（配列番号：１７９）を単離した。
【０１１３】
ＡＮ．ヒトＰＲＯ１４１８（ＵＮＱ７３２）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスター配列１０６９８（Ｉｎｃｙｔｅクラスター１２１４８０）を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベース（胎盤組織ライブラリから得られたものを含む）と比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ１３０６０２６を同定した。このＥＳＴ配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６８８６４（Ｆｉｇ７９、配列番号：１８４）及び誘導ＰＲＯ１４１８天然配列タンパク質ＵＮＱ７３２（Ｆｉｇ８０、配列番号：１８５）を単離した。
太字の下線で示すように、Ｆｉｇ７９に示す全長クローン（ＤＮＡ６８８６４、配列番号：１８４）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３８−１４０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１１８８−１１９０に見られる停止コドン（ＴＡＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ１４１８ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ７３２、配列番号：１８５）は３５０アミノ酸長であり、およそアミノ酸１−１９にシグナルペプチドを有し、約３９００３ダルトンの算定分子量及び約５．５９の算定ｐＩを持つ。ＤＮＡ６８８６４−１６２９と称されるＤＮＡ６８８６４を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：１８４）は１９９８年２月２２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２７６が付与されている。
【０１１４】
ＡＯ．ヒトＰＲＯ１３８７（ＵＮＱ７２２）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスター配列１０２９８を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ３５０７９２４を同定した。このＥＳＴ配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６８８７２（Ｆｉｇ８１、配列番号：１８６）及び誘導ＰＲＯ１３８７天然配列タンパク質ＵＮＱ７２２（Ｆｉｇ８２、配列番号：１８７）を単離した。
太字の下線で示すように、クローンＤＮＡ６８８７２（配列番号：１８６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７６−７８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１２５８−１２６０の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ８１）。予測されるＰＲＯ１３８７ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ７２２、配列番号：１８７）は３９４アミノ酸長である。Ｆｉｇ８２に示すＵＮＱ７２２（配列番号：１８７）タンパク質は、約４４３３９ダルトンの算定分子量及び約７．１０のｐＩを持つ。さらに、ＵＮＱ７２２（配列番号：１８７）は、およそアミノ酸残基１からおよそ残基１９にシグナルペプチド、およそ残基２７５からおよそ残基２９６に膜貫通ドメイン、およそ残基７６、２３１、３０２、３０７及び３７６に潜在的Ｎ−グリコシル化部位、及びおよそアミノ酸残基２１０からおよそ残基２３９及びおよそアミノ酸残基９２からおよそ残基１２１にミエリンｐ０タンパク質と相同性を有するアミノ酸配列ブロックを含む。ＤＮＡ６８８７２−１６２０と称されるＤＮＡ６８８７２を含むｃＤＮＡクローンは１９９８年８月２５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１６０が付与されている。
ＡＰ．ヒトＰＲＯ１４１０（ＵＮＱ７２８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスター配列９８５０２を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ１２５７０４６を同定した。このＥＳＴ配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６８８７４（Ｆｉｇ８３、配列番号：１８８）及び誘導ＰＲＯ１３８７天然配列タンパク質ＵＮＱ７２８（Ｆｉｇ８４、配列番号：１８９）を単離した。
太字の下線で示すように、クローンＤＮＡ６８８７４（配列番号：１８８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５２−１５４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置８６６−８６８の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ８３）。予測されるＰＲＯ１４１０ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ７２８、配列番号：１８９）は２３８アミノ酸長である（Ｆｉｇ８４）。Ｆｉｇ８４に示すＵＮＱ７２８タンパク質（配列番号：１８９）は、約２５２６２ダルトンの算定分子量及び約６．４４のｐＩ、およそアミノ酸残基１からおよそ残基２０にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基１９４からおよそ残基２２０に膜貫通ドメイン、及びおよそアミノ酸残基１３２に潜在的Ｎ−グリコシル化部位を有する。ＤＮＡ６８８７４を含むクローンは１９９８年９月２２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２７７が付与されている。
ＡＱ．ヒトＰＲＯ１９１７（ＵＮＱ９００）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスター配列８５４９６を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ３２５５０３３を同定した。このＥＳＴは卵巣腫瘍ライブラリから得た。このＥＳＴ配列に対応する全長クローンを更に検査し配列決定して、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ７６４００（Ｆｉｇ８５、配列番号：１９０）及び誘導ＰＲＯ１９１７天然配列タンパク質ＵＮＱ９００（Ｆｉｇ８６、配列番号：１９１）を単離した。
太字の下線で示すように、Ｆｉｇ８５に示す全長クローンＤＮＡ７６４００（配列番号：１９０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６−９に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１４６７−１４６９に見られる停止コドン（ＴＧＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ１９１７ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ９００、配列番号：１９１）は４８７アミノ酸長である。ＵＮＱ９００（配列番号：１９１）タンパク質は、約５５０５１ダルトンの算定分子量及び約８．１４のｐＩを持つ。付加的な特徴には、およそアミノ酸残基１−３０にシグナルペプチド；およそアミノ酸残基２４２から４８１に潜在的Ｎ−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基９５−９７、１８２−１８４及び４２７−４２９にプロテインキナーゼＣリン酸化部位；およそアミノ酸残基１０７−１１２、１１３−１１８、１１７−１２２、１１８−１２３及び１２８−１３３にＮ−ミリストイル化部位；およそアミノ酸残基４８４−４８７に小胞体標的配列があることが含まれる。
【０１１５】
ＡＲ．ヒトＰＲＯ１８６８（ＵＮＱ８５９）をコードするｃＤＮＡクローンの単離  ヒト胎児肝臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ＥＳＴクローン番号２９９４６８９を同定した。対応全長クローンをさらに分析し配列決定して、ＤＮＡ７７６２４（Ｆｉｇ８７、配列番号：１９２）及び誘導ＰＲＯ１８６８天然配列タンパク質ＵＮＱ８５９（Ｆｉｇ８８、配列番号：１９３）を単離した。
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ７７６２４（配列番号：１９３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５１−５３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９８１−９８３の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ１８６８ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ８５９、配列番号：１９３、Ｆｉｇ８９）は３１０アミノ酸長である。Ｆｉｇ８９に示すＵＮＱ８５９（配列番号：１９３）タンパク質は約３５０２０ダルトンの算定分子量と約７．９０のｐＩ、およそアミノ酸残基２４３からおよそ残基２６３に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基１０４から１９２にＮ−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基１０７からおよそ残基１１０にｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、およそアミノ酸残基１０６からおよそ残基１０９及びおよそアミノ酸残基２９６からおよそ残基２９９にカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、およそアミノ酸残基６９からおよそ残基７７にチロシンキナーゼリン酸化部位、及びおよそアミノ酸残基２６からおよそ残基３１、およそ残基２１５からおよそ残基２２０、およそ残基２２６からおよそ残基２３１、およそ残基２４３からおよそ残基２４８、およそ残基２４４からおよそ残基２４９及びおよそ残基２６２からおよそ残基２６７に潜在的Ｎ−ミリストル化部位を有する。ＤＮＡ７７６２４を含むクローン（配列番号：１９３）は１９９８年１２月２２日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０３５５３が付与されている。
【０１１６】
ＡＳ．ヒトＰＲＯ２０５（ＵＮＱ１７９）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、ヒト網膜ライブラリから誘導されたＥＳＴ配列を同定した。インビボクローニング手順を使用し全長クローンをさらに同定する試みがなされたが、これは他のＰＲＯ２０５コード化ＤＮＡ配列を同定できなかった。
Ｆｉｇ９０のＵＮＱ１７９（配列番号：２２９）ポリペプチドと実質的に相同な他のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ提出物ＡＢ０３３０８９＿１及びＨＳＭ８０２１４７＿１として見出され得る。
Ｆｉｇ８９に太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ３０８６８（配列番号：８９）は、不完全なオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４０５−４０７に見かけの翻訳開始部位を有する。予測される部分長ＰＲＯ１８６８ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ１７９、配列番号：２２９）は３４３アミノ酸長であり、約３９２８５ダルトンの算定分子量と６．０６のｐＩを持つ。
Ｆｉｇ９０に示すＵＮＱ１７９（配列番号：２２９）の分析により、およそアミノ酸残基１から２０にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基３１８−３２２にＮ−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基２１−２９およそアミノ酸残基２１１−２２０にチロシンキナーゼリン酸化部位、およそ残基６３−６９及び３１７−３２３にＮ−ミリストル化部位、及びおよそ残基２６０−２７１に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位があることが明らかになった。ＤＮＡ３０８６８を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２２８）はＤＮＡ３０８６８−１１５６との命名されて２０００年３月２日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号が付与されている。
ＡＴ．ヒトＰＲＯ２１（ＵＮＱ２１）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
天然配列ＰＲＯ２１ポリペプチドＵＮＱ２１（Ｆｉｇ９２、配列番号：２３１）をコードするＤＮＡ３６６３８（Ｆｉｇ９１、配列番号：２３０）は、米国特許第５，９５５，４２０号に先に記載されている。さらなるクローニング及び特徴付けの情報はＳｃｈｎｅｉｄｅｒ等， Ｃｅｌｌ ５４（６）：７８７−９３（１９８８）及びＭａｎｆｉｏｌｅｔｔｉ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，１３（８）：４９７６−８５（１９９３）に見出すことができる。
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ３６６３８は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６８−１７０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２１８７−２１９８の停止コドン（ＴＡＧ）終端する（Ｆｉｇ９１）。予測されるＰＲＯ２１ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ２１、配列番号：２３１）は６７３アミノ酸長であり、７４５１２ダルトンの算定分子量と５．４５のｐＩを持つ。ＤＮＡ３６６３８−１０５６と称されるＤＮＡ３６６３８を含むｃＤＮＡクローンは１９９７年１１月１２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４５６が付与されている。
Ｆｉｇ９２のＵＮＱ１７９ポリペプチド（配列番号：２３１）の分析により、およそアミノ酸残基１−２７にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基６１９−６３５に膜貫通ドメイン、およそ残基４１７−４２１及び４８８−４９２にＮ−グリコシル化部位、およそアミノ酸残基１２６−１３２、１３５−１４１、１４６−１５２、１７３−１７９、２１４−２２０、２５３−２５９、３４６−３５２、３７４−３８０、４４０−４４６、４７９−４８５、４９７−５０３、５１７−５２３、６１２−６１８にＮ−ミリストル化部位、およそアミノ酸残基１３０−１４２、１６８−１８０、２０９−２２１及び２４８−２６０にアスパラギン酸及びアスパラギンヒドロキシル化部位、およそアミノ酸残基１３９−１５１にビタミンＫ依存性カルボキシル化ドメイン及びＥＧＦ様ドメインシステインパターンシグネーチャーがあることが明らかになった。
ＡＵ．ヒトＰＲＯ２６９（ＵＮＱ２３６）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて、プローブオリゴヌクレオチドと以下のプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ３８２６０（Ｆｉｇ９３；配列番号：２３２）と誘導ＰＲＯ２６９天然配列タンパク質ＵＮＱ２３６（Ｆｉｇ９４、配列番号：２３３）を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは以下の通りである：
2004516227.tif 000054
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ３８２６０（配列番号：２３２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３１４−３１６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１７８４−１７８６の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ９３）。予測されるＰＲＯ２６９ポリペプチド前駆体は４９０アミノ酸長であり（すなわちＵＮＱ２３６、Ｆｉｇ９４、配列番号：２３３）（Ｆｉｇ３０）、５１６３６の算定分子量と６．２９のｐＩを持つ。ＤＮＡ３８２６０を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２３２）は１９９７年１０月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３９７が付与されている。
Ｆｉｇ９４のＵＮＱ２３６ポリペプチド（配列番号：２２３）の分析により、およそアミノ酸残基１−１６にシグナル配列、およそ残基３９９−４１８に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基１８９−１９３及び３８１−３８５にＮ−グルコシル化部位、およそアミノ酸残基２８９−２９３にグリコサミノグリカン付着部位、およそアミノ酸残基９８−１０２及び４３４−４３８にｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、およそアミノ酸残基３０−３６、３５−４１、５８−６４、５９−６５、１２１−１２７、１５１−１５７、１８５−１９１、２０９−２１５、２６７−２７３、３５０−３５６、３７４−３８０、４５３−４５９、４６３−４６９及び４７７−４８３にＮ−ミリストル化部位、及びおよそアミノ酸残基２６２−２７４にアスパラギン酸及びアスパラギンヒドロキシル化部位があることが明らかになった。
【０１１７】
ＡＶ．ヒトＰＲＯ３４４（ＵＮＱ３０３）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて、プローブオリゴヌクレオチドと以下のプライマー対の一方を使用するインビボクローニング手順を組み合わせて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４０５９２（Ｆｉｇ９５；配列番号：２４０）と誘導ＰＲＯ３４４天然配列タンパク質ＵＮＱ３０３（Ｆｉｇ９６、配列番号：２４１）を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは以下の通りである：
2004516227.tif 000055
クローンＤＮＡ４０５９２（配列番号：２４０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２２７−２２９に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９５６−９５８の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ９５）。予測されるＰＲＯ３４４ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３０３、配列番号：２４１）は２４３アミノ酸長であり（Ｆｉｇ９６）、２５２９８の算定分子量と６．４４のｐＩを持つ。Ｆｉｇ９６のＵＮＱ３０３ポリペプチド（配列番号：２４１）の分析により、およそアミノ酸残基１−１５にシグナル配列、およそアミノ酸残基１１−１７、６８−７４及び２１６−２２２にＮ−ミリストル化部位、及びおよそアミノ酸残基７７−８０に細胞付着部位があることが明らかになった。ＤＮＡ４０５９２を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２４０）は１９９７年１１月２１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４９２が付与されている。
【０１１８】
ＡＸ．ヒトＰＲＯ３３３（ＵＮＱ２９４）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
インビボクローニング手順を組み合わせて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、部分長配列ＤＮＡ４１３７４（配列番号：２４８、Ｆｉｇ９７）を同定した。
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４１３７４（配列番号：２４８）は、不完全なオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１１８５−１１８７に見かけの翻訳終止部位（すなわち停止コドン、ＴＧＡ）を有する。予測される部分長ＰＲＯ３３３ポリペプチド（すなわちＵＮＱ２９４、配列番号：２４９）は３９４アミノ酸長であり、４３７２５の算定分子量と８．３６のｐＩを持つ。
Ｆｉｇ９８のＵＮＱ２９４（配列番号：２４９）ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸残基１−１４にシグナル配列、およそアミノ酸残基３５９−３７６に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基１６６−１７２、２０６−２１２、２１７−２２３、２４６−２５２、３０８−３１４、３１２−３１８、３６１−３６７にＮ−ミリストル化部位、及びアミノ酸残基３１５−３２３に免疫グロブリンと主要組織適合性複合体タンパク質シグネーチャーがあることが明らかになった。ＤＮＡ４１３７４を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２４０）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号が付与されている。
ＡＹ．ヒトＰＲＯ３８１（ＵＮＱ３２２）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ４４１９４（Ｆｉｇ９９、配列番号：２５０）と誘導ＰＲＯ３８１天然配列タンパク質ＵＮＱ３２２（Ｆｉｇ１００、配列番号：２５１）を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは以下の通りである：
2004516227.tif 000056
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ４４１９４（配列番号：２５０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７４−１７６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置８０７−８０９の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する。予測されるＰＲＯ３８１ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３２２、Ｆｉｇ１００、配列番号：２５１）は２１１アミノ酸長であり、２４１７２の算定分子量と５．９９のｐＩを持つ。Ｆｉｇ１００に示すＵＮＱ３２２（配列番号：２５１）タンパク質は次の特徴を有する：およそアミノ酸残基１からおよそ２０にシグナル配列、およそアミノ酸残基１５６に潜在的Ｎ−グルコシル化部位、およそアミノ酸残基１４３からおよそ１４６，およそ残基１５６からおよそ１５９、およそ残基１７８からおよそ１８１、およそ残基２００からおよそ２０３に潜在的カゼインキナーゼリン酸化部位、およそアミノ酸残基７８からおよそ１１４及びおよそ残基１１８からおよそ１３１に小胞体標的配列、およそアミノ酸残基１４０からおよそ１５９にＥＦ−腕カルシウム結合ドメイン、及びおよそアミノ酸残基１８３からおよそ２０３にＳ−１００／ＩＣａＢＰ型カルシウム結合ドメインが存在する。ＤＮＡ４４１９４を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２５０）は１９９８年４月２８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０８が付与されている。
【０１１９】
ＡＺ．マウスＰＲＯ７２０（ＵＮＱ３８８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ５３５１７（配列番号：２５５）の調製については、上述の「Ｘ．ヒトＰＲＯ７７０（ＵＮＱ４０８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離」に記載されている。太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ５３５１７（配列番号：２５５）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３６−３８に見かけの翻訳開始部位を有し、３６９−３７１の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ７２０ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ３８８、配列番号：２５６）は１１１アミノ酸長であり（Ｆｉｇ１０２）、１１９３６の算定分子量と５．２１のｐＩを持つ。
Ｆｉｇ１０２のＵＮＱ３８８（配列番号：２５６）ポリペプチドの分析により、およそアミノ酸残基１−２３にシグナル配列、およそアミノ酸残基７０−７６及び７５−８１にＮ−ミリストル化部位、及び６６−７７及び６８−７９に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位があることが示される。ＤＮＡ５３５１７を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２５５）は１９９８年４月２３日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０２が付与されている。
ＢＡ．ヒトＰＲＯ８６６（ＵＮＱ４３５）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト胎児腎臓ライブラリにおいて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ５３９７１（Ｆｉｇ１０３、配列番号：２５７）と誘導ＰＲＯ８６６天然配列タンパク質ＵＮＱ４３５（Ｆｉｇ１０４、配列番号：２５８）を同定した。
使用したハイブリッド形成プローブ及び正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは以下の通りである：
2004516227.tif 000057
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ５３９７１（配列番号：２５７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２７５−２７７に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１２６８−１２７０の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する。予測される天然配列ＰＲＯ８６６ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ４３５、配列番号：２５８）は３３１アミノ酸長であり（Ｆｉｇ１０４）、３５８４４の算定分子量と５．４５のｐＩを持つ。Ｆｉｇ１０４に示すＵＮＱ４３５（配列番号：２５８）タンパク質は約３５８４４の算定分子量と約５．４５のｐＩを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基１からおよそ残基２６にシグナル配列、およそアミノ酸残基１３１−１３５にグリコサミノグリカン付着部位、およそアミノ酸残基１４４−１４８にｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、及びアミノ酸残基２６−３２、７４−８０、１３２−１３８、１３４−１４０、１９０−１９６、２８７−２９３及び２９０−２９６にＮ−ミリストイル化部位があることが明らかになった。ＤＮＡ５３９７１を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２５７）は１９９８年４月６日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９７５０が付与されている。
【０１２０】
ＢＢ．ヒトＰＲＯ８４０（ＵＮＱ４３３）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト甲状腺ライブラリから単離された組織について酵母菌スクリーニング手順を使用し、ＰＣＲオリゴヌクレオチドを作成するためのテンプレートとなるＥＳＴ配列を得、ＤＮＡ５３９８７（Ｆ配列番号：２６６、Ｆｉｇ１０５）と誘導ＰＲＯ８４０天然配列タンパク質ＵＮＱ４３３（配列番号：２６７、Ｆｉｇ１０６）を単離した。
またＦｉｇ１０６のＵＮＱ４３３（配列番号：２６７）と実質的に相同なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、受託番号ＨＥＥＰＳＳＡＲＣ＿１としてＧｅｎｂａｎｋから入手できる。
太字の下線で示したように、Ｆｉｇ１０５に示すＤＮＡ５３９８７（配列番号：２６６）はオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド位置１８−２０に翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１３２９−１３３１の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する（Ｆｉｇ４３）。ヌクレオチド残基９０−９２の第２のメチオニンコドンが実際の翻訳開始部位である可能性があり、あるいはこれは内部メチオニンをコードする。予測されるＰＲＯ８４０ポリペプチド（すなわちより長い翻訳）はＵＮＱ４３３（配列番号：２６７）と命名され、４３７アミノ酸長であり（Ｆｉｇ１０６）、４９８５１ダルトンの算定分子量と６．４７のｐＩを持つ。
ＤＮＡ５３９８７を含むクローン（配列番号：２６６）は、寄託番号２０９８５８で、１９９８年５月１２日にＡＴＣＣに寄託されている。
Ｆｉｇ１０６のＵＮＱ４３３ポリペプチド（配列番号：２６７）の分析により、およそアミノ酸残基１−４６にシグナル配列、およそアミノ酸残基３１９−３３８に膜貫通ドメイン、およそ残基２００−２０４にＮ−グルコシル化部位、アミノ酸残基２３−２７にｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、アミノ酸残基４３−５２にチロシンキナーゼリン酸化部位、及び残基１７−２３、１１２−１１８、１１６−１２２及び１８５−１９１にＮ−ミリストリル化部位があることが明らかになった。
ＢＣ．ヒトＰＲＯ９８２（ＵＮＱ４８３）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスター配列番号４３７１５を同定した。次いでこの配列を、上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＭｅｒｃｋ ＥＳＴ番号ＡＡ２４３８９を同定した。このＥＳＴに対応する全長クローンによって、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ５７７００（Ｆｉｇ１０７、配列番号：２６８）及び誘導ＰＲＯ９８２天然配列タンパク質ＵＮＱ４８３（Ｆｉｇ１０８、配列番号：２６９）を同定した。
太字の下線で示したように、Ｆｉｇ１０７のＤＮＡ５７７００配列（配列番号：２６８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２６−２８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置４０１−４０３の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ９８２ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ９８２、配列番号：１９１）は１２４アミノ酸長であり、約１４１９８ダルトンの算定分子量及び約９．０１の算定ｐＩを持つ（Ｆｉｇ１０８）。Ｆｉｇ１０８のＵＮＱ４８３（配列番号：２６９）ポリペプチドのさらなる分析により、およそアミノ酸残基１からおよそ２１にシグナルペプチド、及びおよそアミノ酸残基１からおよそ残基５９に潜在的アナフィラトキシンドメインがあることが示される。ＤＮＡ５７７００を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２６８）は１９９９年１月１２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３５８３が付与されている。
【０１２１】
ＢＤ．ヒトＰＲＯ８３６（ＵＮＱ５４５）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスターを同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ２６１００７５、大腸腫瘍組織から得られたＥＳＴを同定した。このＥＳＴに対応する全長クローンにより、全長配列ＤＮＡ５９６２０（Ｆｉｇ１０９、配列番号：２７０）及び誘導ＰＲＯ８３６天然配列タンパク質ＵＮＱ５４５（Ｆｉｇ１１０、配列番号：２７１）を同定した。
太字の下線で示したように、Ｆｉｇ１０９に示すヌクレオチド配列ＤＮＡ５９６２０（配列番号：２７０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６５−６７に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１４４８−１４５０の停止コドン（ＴＧＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ８３６ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ５４５、Ｆｉｇ１１０、配列番号：２７１）は４６１アミノ酸長である。Ｆｉｇ１１０に示すＵＮＱ５４５（配列番号：２７１）は約５２０８５ダルトンの算定分子量及び約５．３６のｐＩを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基１からおよそ２９にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基１９３から２３６にＮ−グルコシル化部位、及びおよそ残基１５、１９、２３４、２５１、４０２及び４５１にＮ−ミリストイル化部位、およそアミノ酸残基３６４からおよそ３７２にＹＪＬ１２６ｗ／ＹＬＲ３５１ｃ／ｙｈｃＸファミリーのタンパク質に保存されたドメイン、及びおよそアミノ酸残基６８から約３４０にＳＬＳ１タンパク質と配列同一性を有する領域があることが明らかになった。ＤＮＡ５９６２０を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２７０）は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０９９８９が付与されている。
【０１２２】
ＢＥ．ヒトＰＲＯ１１５９（ＵＮＱ５８９）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスター配列７７２４５を同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ番号３７６７７６を同定した。このＥＳＴに対応する全長クローンの分析により、全長配列ＤＮＡ６０６２７（Ｆｉｇ１１１、配列番号：２７２）及び誘導ＰＲＯ１１５９天然配列タンパク質ＵＮＱ５８９（Ｆｉｇ１１２、配列番号：２７３）を同定した。
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ６０６２７（配列番号：２７２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置９２−９４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置３６２−３６４の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ１１１）。予測されるＰＲＯ１１５９ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ５８９、配列番号：２７３）は９０アミノ酸長である（Ｆｉｇ１１２）。Ｆｉｇ１１２に示すＵＮＱ５８９（配列番号：２７３）は約９８４０ダルトンの算定分子量及び約１０．１３のｐＩを持つ。
Ｆｉｇ１１２に示すＵＮＱ５８９（配列番号：２７３）配列の分析により、以下の存在が証明された：およそアミノ酸残基１からおよそ残基１５にシグナルペプチド、及びおよそアミノ酸残基３８に潜在的Ｎ−グルコシル化部位。クローンＤＮＡ６０６２７（配列番号：２７２）は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９２が付与されている。
ＢＦ．ヒトＰＲＯ１３５８（ＵＮＱ７０７）をコードするｃＤＮＡクローンの単離  上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスター配列を同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ０８８７１８、肝臓組織ライブラリから得られる断片を同定した。このＥＳＴに対応する全長クローンの分析により、全長配列ＤＮＡ６４８９０（Ｆｉｇ１１３、配列番号：２７４）及び誘導ＰＲＯ１３５８天然配列タンパク質ＵＮＱ７０７（Ｆｉｇ１１４、配列番号：２７５）を同定した。
太字の下線で示したように、Ｆｉｇ１１３に示すＤＮＡ６４８９０（配列番号：２７４）クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８６から８８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１４１８から１４２０の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する（Ｆｉｇ１１３）。予測されるＰＲＯ１３５８ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ７０７、配列番号：２７５）は４４４アミノ酸長であり、シグナルペプチドはおよそアミノ酸残基１−１８にある。ＵＮＱ７０７（配列番号：２７５）は約５０７１９ダルトンの算定分子量及び約８．８２の算定ｐＩを持つ。ＤＮＡ６４８９０−１６１２と称されるＤＮＡ６４８９０（配列番号：２７４）を含むｃＤＮＡクローンは１９９８年８月１８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３１が付与されている。
ＢＧ．ヒトＰＲＯ１３２５（ＵＮＱ６８５）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスター配列番号１３９５２４を同定し、次いでこれを上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ３７４４０７９を同定した。このＥＳＴに対応する全長クローンの分析により、全長配列ＤＮＡ６６６５９（Ｆｉｇ１１５、配列番号：２７６）及び誘導ＰＲＯ１３２５天然配列タンパク質ＵＮＱ６８５（Ｆｉｇ１１６、配列番号：２７７）を同定した。
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ６６６５９（Ｆｉｇ１１５、配列番号：２７６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５１−５３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２５４７−２５４９の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する。予測されるＰＲＯ１３２５ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ６８５、配列番号：２２７）は８３２アミノ酸長である。Ｆｉｇ１１６に示すＵＮＱ６８５（配列番号：２２７）は約９４４５４ダルトンの算定分子量及び約６．９４のｐＩを持つ。ＵＮＱ６８５（配列番号：２２７）の分析により、およそアミノ酸１からおよそアミノ酸１８にシグナルペプチド、およそアミノ酸２９２からおよそアミノ酸３１７、およそアミノ酸４５１からおよそアミノ酸４７０、およそアミノ酸５０１からおよそアミノ酸５２０、およそアミノ酸６０７からおよそアミノ酸６２７、およそアミノ酸７５１からおよそアミノ酸７７０に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸４９７からおよそアミノ酸５１８にロイシンジッパーパターン配列、及びおよそアミノ酸２７からおよそアミノ酸３０、およそアミノ酸５４からおよそアミノ酸５７、およそアミノ酸６０からおよそアミノ酸６３、およそアミノ酸位置１２３からおよそアミノ酸位置１２６、およそアミノ酸位置１４１からおよそアミノ酸位置１４４、およそアミノ酸位置１６５からおよそアミノ酸位置１６８、およそアミノ酸位置３６４からおよそアミノ酸位置３６７、およそアミノ酸位置４７６からおよそアミノ酸位置４７９、およそアミノ酸位置４９６からおよそアミノ酸位置４９９、およそアミノ酸位置５７２からおよそアミノ酸位置５７５、およそアミノ酸位置６０３からおよそアミノ酸位置６０６及びおよそアミノ酸位置６９９からおよそアミノ酸位置７０２にＮ−グルコシル化部位があることが明らかになった。ＤＮＡ６６６５９を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２７６）は１９９８年９月２２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２６９が付与されている。
【０１２３】
ＢＨ．ヒトＰＲＯ１３３８（ＵＮＱ６９３）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
酵母菌スクリーニングを使用してＥＳＴ配列を得、ついで、ＥＣＤ相同性下で上述したものと類似した方法で公的及び私的な種々のＥＳＴデータベースと比較し、胆嚢炎のある胆嚢組織から得られたＥＳＴであるＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴ２６１５１８４を同定した。対応する全長配列の分析により、ＤＮＡ６６６６７（配列番号：２７８、Ｆｉｇ１１７）及び誘導ＰＲＯ１３３８天然配列タンパク質ＵＮＱ６９３（配列番号：２７９、Ｆｉｇ１１８）を単離した。
太字の下線で示したように、Ｆｉｇ１１７に示すＤＮＡ６６６６７（配列番号：２７８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド残基１１５−１１７に翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２２６３−２２６５の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する（Ｆｉｇ７７）。予測されるＰＲＯ１３３８ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ６９３、配列番号：１１８）は７１６アミノ酸長であり（Ｆｉｇ１１８）、８０７１６ダルトンの算定分子量と６．０６のｐＩを持つ。
Ｆｉｇ１１８のＵＮＱ６９３ポリペプチド（配列番号：２７８）の分析により、およそアミノ酸残基１から２５にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基６２９−６４８に膜貫通ドメイン、およそアミノ酸残基６９−７３、９６−１００、１０６−１１０、１１７−１２１、３８５−３８９、５１７−５２１、５８２−５８６及び６１１−６１５にＮ−グルコシル化部位、およそ残基５７３−５８２にチロシンキナーゼリン酸化部位、及びおよそアミノ酸残基１６−２２、２２４−２３０、４６４−４７０、６３７−６４３及び６９８−７０４にＮ−ミリストイル化部位があることが明らかになった。
ＤＮＡ６６６６７−１５９６と称されるＤＮＡ６６６６７を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２７８）は１９９８年９月２２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２６７が付与されている。
ＢＩ．ヒトＰＲＯ１４３４（ＵＮＱ７３９）をコードするｃＤＮＡクローンの単離  ヒト網膜組織ライブラリについて上述のＥＣＤ相同性手順を使用し、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ６８８１８（Ｆｉｇ１１９、配列番号：２８０）と誘導ＰＲＯ１４３４天然配列タンパク質ＵＮＱ７３９（Ｆｉｇ１２０、配列番号：２８１）を同定した。
この手順において合成されたハイブリッド形成プローブ及びＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）は以下の通りである：
2004516227.tif 000058
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ６８８１８（配列番号：２８０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５８１−５８３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１５５６−１５５８の停止コドン（ＴＡＧ）で終端する（Ｆｉｇ１１９）。予測されるＰＲＯ１４３４ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ７３９、配列番号：２８１）は３２５アミノ酸長である（Ｆｉｇ１２０）。Ｆｉｇ１２０に示すＵＮＱ７３９タンパク質（配列番号：２８１）は約３５２９６ダルトンの算定分子量と約５．３７のｐＩを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基１−２７にシグナル配列、およそアミノ酸残基８０−８４にグリコサミノグリカン付着部位、およそアミノ酸残基１０−１６、１０２−１０８、１０３−１０９にＭ−ミリストイル化部位、およそアミノ酸残基１１４−１１７に細胞付着配列、及びおよそアミノ酸残基１７６−１８８にＥＧＦ様ドメインシステインパターンシグネーチャーがあることが明らかになった。
ＤＮＡ６８８１８−２５３６と称されるＤＮＡ６８８１８を含むクローン（配列番号：２８０）は１９９９年２月９日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３６５７が付与されている。
【０１２４】
ＢＪ．ヒトＰＲＯ４３３３（ＵＮＱ１８８８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のＥＣＤ相同性手順下で上述したものと類似した方法で、発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を検索し、リンフォトキシン−ベータレセプターと相同性を示すＥＳＴを同定した。
ＥＳＴをオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを作成するためのテンプレートとして、ＥＣＤ相同性手順下で上述したものと類似した方法でヒト胎児腎臓ライブラリをスクリーニングした。
上述の手順で作成されたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
2004516227.tif 000059
その結果、全長ＤＮＡ配列ＤＮＡ８４２１０（配列番号：２８５、Ｆｉｇ１２１）が単離された。太字の下線で示したように、Ｆｉｇ１２１に記載したＤＮＡ８４２１０（配列番号：２８５）クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１８５−１８７に見かけの翻訳開始部位、ヌクレオチド位置１４３６−１４３８に停止コドン（ＴＡＡ）を有する。予測されるＰＲＯ４３３３ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ１８８８、配列番号：２８６）は４１７アミノ酸長である。Ｆｉｇ１２１に示すＵＮＱ１８８８タンパク質（配列番号：２８６）は、約４５３０５ダルトンの算定分子量と約５．１２の算定ｐＩを持つ。
Ｆｉｇ１２１のＵＮＱ１８８８ポリペプチド（配列番号：２８６）の分析により、およそアミノ酸残基１−２５にシグナルペプチド、およそ残基１６９−１９２に膜貫通ドメイン、およそ残基１０５−１０９、２１４−２１８、３１９−３２３、３５０−３５４、３６８−３７２、３７９−３８３にＮ−グルコシル化部位、およそ残基２００−２０４及び２３８−２４２にｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、およそ残基２０７−２１４にチロシンキナーゼリン酸化部位、およそ残基５５−６１、２１５−２１８及び２７０−２７６にＮ−ミリストイル化部位、およそ残基２５９−２７０に原核生物膜リポタンパク質脂質付着部位、及びおよそ残基８９−９６にＴＮＦＲ／ＮＧＦＲファミリーシステインリッチ領域があることが明らかになった。
【０１２５】
ＢＫ．ヒトＰＲＯ４３０２（ＵＮＱ１８６６）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒト組織から単離した組織について上述のアミラーゼスクリーニング手順を使用してＥＳＴ配列を得、ついでこれを種々のＥＳＴデータベースと比較し、アミラーゼスクリーニング手順及び／又はＥＣＤ相同性手順下で、上述の方法によりコンセンサス配列を作成した。このコンセンサス配列のさらなる分析により、Ｉｎｃｙｔｅ ＥＳＴ番号２４０８０８１Ｈ１を単離した。ＥＳＴ番号２４０８０８１Ｈ１に対応する全長クローンを分析し、全長天然配列クローンＤＮＡ９２２１８（配列番号：２９２）及び誘導ＰＲＯ４３０２全長天然配列タンパク質ＵＮＱ１８６６（配列番号：２９３）を単離した。
太字の下線で示したように、Ｆｉｇ１２３に示す全長クローンＤＮＡ９２２１８（配列番号：２９２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、およそヌクレオチド位置１７４−１７６に見かけの翻訳開始部位と、ヌクレオチド位置７６８−７７０に停止シグナル（ＴＡＧ）を有する。予測されるＰＲＯ４３０２ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ１８６６、配列番号：２９３）は１９８アミノ酸長であり、約２２２８５ダルトンの算定分子量と約９．３５のｐＩを持つ。ＵＮＱ１８６６（Ｆｉｇ１２４、配列番号：２９３）の分析により、およそアミノ酸残基１からおよそ残基２３にシグナルペプチド、およそアミノ酸残基１１１からおよそ残基１３０に膜貫通ドメイン、残基２６−３０にｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、残基４４−４７及び５８−６１にカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、残基３６−４３にチロシンキナーゼリン酸化部位、及び残基１２４−１３０、１４４−１５０及び１８９−１９５にＮ−ミリストイル化部位があることが明らかになった。
ＤＮＡ９２２１８−２５５４と称されるＤＮＡ９２２１８を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２９２）は１９９９年３月９日にＡＴＣＣに寄託され、寄託番号２０３８３４が付与されている。
ＢＬ．ヒトＰＲＯ４４３０（ＵＮＱ１９４７）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述のシグナルアルゴリズム手順を使用し、ＥＳＴクラスター配列を同定し、次いで上述のシグナルアルゴリズム手順下で記載されたようにして広範な種々のＥＳＴデータベースと比較して、さらにコンセンサス配列を同定した。このコンセンサス配列を更に分析して、全長配列ＤＮＡ９６８７８（Ｆｉｇ１２５、配列番号：２９４）及び誘導ＰＲＯ４４３０天然配列タンパク質ＵＮＱ１９４７（Ｆｉｇ１２６、配列番号：２９５）を同定した。
太字の下線で示したように、Ｆｉｇ１２５に示す天然配列ＤＮＡ配列ＤＮＡ９６８７８（配列番号：２９４）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５６−５８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置４３１−４３３に見られる停止コドン（ＴＧＡ）で終端する。予測されるＰＲＯ４４３０ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ１９４７、Ｆｉｇ１２６、配列番号：２９５）は１２５アミノ酸長である。Ｆｉｇ１２６のＵＮＱ４４３０タンパク質（配列番号：２９５）は約１３８２１ダルトンの算定分子量及び約８．６の算定ｐＩを持つ。さらなる分析により、およそアミノ酸残基１からおよそ１８にシグナル配列、およそ残基７７−８０、再度およそ残基８８−９１にＮ−グルコシル化部位、およそ残基６７−７０にカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、およそ残基８４−８９にＮ−ミリストイル化部位、及びおよそ残基８５−９８にＬｙｓ−６／ｕ−ＰＡＲドメインの存在が明らかになった。
ＤＮＡ９６８７８−２６２６と称され、ＤＮＡ９６８７８を含むクローン（配列番号：２９４）は１９９９年３月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２３−ＰＴＡが付与されている。
【０１２６】
ＢＭ．ヒトＰＲＯ５７２７（ＵＮＱ２４４８）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
種々の周知のＴＮＦ−レセプターを使用し、公的及び私的なＥＳＴデータベース（例えば、上述のＥＳＤ相同性手順を参照）をスクリーニングし、Ｉｎｃｙｔｅクローン５０９１５１１Ｈを単離した。ついで、子宮腫瘍組織から得られたこのＥＳＴ配列を以下に示すクローニングオリゴの作成のためのテンプレートとし、次いでこれを用いて関心ある配列を含むヒト胸腺ＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定した。これらのオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
2004516227.tif 000060
全長ＤＮＡ９８８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を単離するために、インバースロング（ｉｎｖｅｒｓｅ ｌｏｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ）ＰＣＲ法を実施した（Ｆｉｇ１２９）。ＰＣＲプライマーは一般に２０から３０ヌクレオチドの範囲であった。インバースロングＰＣＲのために、プライマー対を、各プライマーの５’から３’方向が互いに離間する方向に向くように設計した。
ＤＮＡ９８８５３のクローニングのための一対のインバースロングＰＣＲプライマーを合成した：
2004516227.tif 000061
インバースロングＰＣＲ反応では、テンプレートはプラスミドｃＤＮＡライブラリである。その結果、ＰＣＲ生成物は、中間部に、両端に関心ある挿入配列を有する全ベクター配列を含む。ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ混合物をテンプレートプラスミドのみを消化するＤｐｎＩで処理し、続いてライブラリクローニングベクターのサイズより大きなＰＣＲ生成物をアガロースゲル精製した。インバースロングＰＣＲで使用したプライマーはまた５’−リン酸化されているので、精製した生成物を次いでセルフライゲーションし、大腸菌コンピテント細胞中で形質転換させた。５’ベクタープライマー及び適切な遺伝子特異的プライマーを使用するＰＣＲによりコロニーをスクリーニングし、より大きな５’配列を有するクローンを同定した。ポジティブクローンから調製されたプラスミドを配列決定した。必要に応じて、プロセスを繰り返し、先のラウンドで得られた新規な配列に基づき、より多くの５’配列を得ることもできる。
インバースロングＰＣＲの目的は関心ある遺伝子の完全な配列を得ることである。ついで、全長コード化領域を含むクローンを一般的なＰＣＲにより得た。
ＤＮＡ９８８５３（配列番号：２９６）の全長コード化領域をクローニングするために使用されるプライマー対は以下の通りである：
2004516227.tif 000062
クローニングに対して、Ｃｌａ Ｉ部位とＮｏｔ Ｉ部位はそれぞれ正方向プライマー及び逆方向プライマーに含まれていた。
ＰＣＲ生成物の精度を確保するために、非依存性ＰＣＲ反応を実施し、いくつかのクローン化産物を配列決定した。
上述のようにして単離されたクローンを配列決定したＤＮＡにより、ＤＮＡ９８８５３（配列番号：２９６、Ｆｉｇ１２７）の全長ＤＮＡ配列と誘導ＰＲＯ５７２７天然配列タンパク質ＵＮＱ２４４８（配列番号：２９７、Ｆｉｇ１２８）が得られた。
太字の下線で示したように、クローンＤＮＡ９８８５３（配列番号：２９６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１−３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９０１−９０３の停止コドン（ＴＡＡ）で終端する（Ｆｉｇ１２８）。予測されるＰＲＯ５７２７ポリペプチド前駆体（すなわちＵＮＱ２４４８、配列番号：２９７）は２９９アミノ酸長であり（Ｆｉｇ１２８）、３２９２９ダルトンの算定分子量及び４．９５のｐＩを持つ。Ｆｉｇ１２８に示すＵＮＱ２４４８ポリペプチド（配列番号：２９７）は、約３．３キロダルトンの算定分子量及び約４．７２のｐＩを持つ。潜在的Ｎ−グルコシル化部位は、Ｆｉｇ１２８に示すアミノ酸配列のアミノ酸７４と７７の間に存在する。潜在的Ｎ−ミリストイル化部位は、Ｆｉｇ１２８に示すアミノ酸配列のアミノ酸２４と２９の間に存在する。潜在的カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位は、Ｆｉｇ１２８に示すアミノ酸配列のアミノ酸１２３−１２６、１８５−１８８、２００−２０３、２５２−２５５、２５７−２６０、２７１−２７４及び２８３−２８６に存在する。潜在的膜貫通ドメインはＦｉｇ１２８に示す配列のアミノ酸１３７と１５８の間に存在する。現在、上記ポリペプチドはシグナル配列を含んでいないと考えられている。
ＤＮＡ９８８５３−１７３９と称され、ＤＮＡ９８８５３を含むｃＤＮＡクローン（配列番号：２９６）は１９９９年４月６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号１９９９年４月６日が付与されている。
【０１２７】
実施例２
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける刺激活性（番号２４）
この実施例は、本発明のポリペプチドが刺激されたＴリンパ球の増殖の刺激剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫反応の増強が望まれる場合に治療的に有用である。治療薬は本発明のポリペプチドのアンタゴニスト、例えばポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体の形態を取ってもよい。
このアッセイの基本的プロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｕｎｉｔ３．１２；Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｌｉｅｓ， Ｅ． Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編， 国立衛生研究所， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃから出版のものに記載されている。
より詳細には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を哺乳動物個体、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する（一人のドナーには刺激物ＰＢＭＣを供給し、他のドナーにはレスポンダーＰＢＭＣを供給する）。望まれるならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地（３７℃、５％ＣＯ２）で一晩解凍し、ついで洗浄し、３ｘ１０６細胞／ｍｌのアッセイ用培地（ＲＰＭＩ；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルバート）に再懸濁させる。
刺激剤ＰＢＭＣは細胞を光にさらす（約３０００ラド）ことにより調製される。該アッセイは、１００μｌの１％又は０．１％に希釈された試験試料、５０μｌの光にさらされた刺激剤細胞、及び５０μｌのレスポンダーＰＢＭＣ細胞の混合物を三重ウェルに蒔くことにより調製される。１００マイクロタイターの細胞培養培地又は１００マイクロリッターのＣＤ４−ＩｇＧを対照として使用する。ついで、ウェルを３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートする。５日目に、各ウェルにトリチウム化チミジン（１．０ｍＣ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ）をパルス適用する。６時間後、細胞を３回洗浄し、次いで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、ＰＢＭＣをＢａｌｂ／ｃマウス及びＣ５７Ｂ６マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地（ＲＰＭＩ；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルバート）において新鮮に収集された脾臓から顕微鏡検査用に引き出し、リンホライト（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ）Ｍ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりＰＭＢＣを単離し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地中で単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に１ｘ１０７細胞／ｍｌになるように細胞を再懸濁させる。ついで、アッセイが上記のようにして行われる。本発明の化合物におけるこのアッセイの結果を次の表に示す。対照に対して正に増加しているとポジティブであると考えられ、１８０％以上の増加が好ましい。しかしながら、対照より多い値は全て、試験用タンパク質についての刺激効果を示す。
【０１２８】
2004516227.tif 000063
2004516227.tif 000064
【０１２９】
実施例３
無毛モルモットの炎症誘発アッセイ（番号３２）
このアッセイはＰＲＯポリペプチドが血管透過性を誘導する能力を示すかどうかを決定するためのものである。このアッセイにおいてポジティブであると試験されたポリペプチドは、例えば局部的免疫システム細胞湿潤を増強することで恩恵を受け得る病状を含む血管透過性を増強することで恩恵を受ける病状の治療に有用であることが期待される。
３５０ｇ又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン（７５−８０ｍｇ／ｋｇ）と５ｍｇ／ｋｇのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかけた。ＰＲＯポリペプチド又は試験ポリペプチドを含まない生理緩衝液を含む試験試料を、注射部位当たり１００μｌで試験動物の背の皮膚に皮内注射した。動物当たりおよそ１６−２４の注射部位があった。ついで１ｍｌのエバンスブルー染料（ＰＢＳ中１％）を心臓内注射した。化合物に対する皮膚血管透過性応答（すなわち、注射部位の斑点）について、試験動物の投与１、６及び／又は２４時間後に注射部位からの青色の漏出の直径（ｍｍ）を測定することで視覚によりスコアをつけた。注射部位の青さのｍｍ直径を観察して、記録し、同一の動物対照に対して４標準偏差を超えるスコアを持つ値に対して血管漏出の重症度を記録した。少なくとも５ｍｍの直径の斑点は、精製タンパク質を試験する場合はアッセイでは正であると考えられ、血管漏出又は浸透性を誘発する能力を示している。７ｍｍ直径を超える応答があると、条件培地試料に対してポジティブであると考えられる。ヒトＶＥＧＦが正の対照として使用され、０．１μｇ／１００μｌで４−８ｍｍの直径、１μｇ／１００μｌで１５−２３ｍｍ直径の応答を誘発した。
試験したポリペプチドを初期ストック溶液の１％まで希釈する。ＵＮＱ５８５は１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／１４０ｍＭのＮａＣｌ／４％のマンニトール／１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ６．８で希釈し、ＵＮＱ３３４は１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、４％のマンニトール、ｐＨ７．４に希釈した。
2004516227.tif 000065
【０１３０】
実施例４
皮膚血管透過性アッセイ（番号６４）
このアッセイはあるＰＲＯポリペプチドが動物の注入部位において単核細胞、好酸球及びＰＭＮ浸潤を誘発することにより免疫反応を刺激し炎症反応を誘発することを示す。この皮膚血管透過性アッセイは次のようにして実施される。体重が３５０グラム又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン（７５−８０ｍｇ／Ｋｇ）及び５ｍｇ／ｋｇの５キシラジンを筋肉注射（ＩＭ）して麻酔をかけた。精製されたＰＲＯポリペプチド又は条件培地試験試料を、注射部位あたり１００μＬで試験動物の背中に皮内注射した。動物当たり約１０−３０、好ましくは約１６−２４の注射部位があった。１ｍＬのエバンスブルー色素（生理的緩衝食塩水中に１％）を心臓内注射した。ついで注射部位における斑点を注入後１時間、６時間及び２４時間に測定（直径ｍｍ）した。動物は注入後６時間で屠殺した。それぞれの皮膚注射部位を生体組織検査し、パラホルムアルデヒドで固定した。ついで皮膚を組織病理学検査のために調製した。それぞれの部位について、皮膚中への炎症細胞浸潤を評価した。可視可能な炎症細胞の炎症を持つ部位をポジティブスコアとする。炎症細胞は好中球、好酸球、単球、リンパ球であり得る。
少なくとも注射部位の最小血管周囲の浸潤をポジティブスコアとし、注射部位で浸潤のなかった場合をネガティブスコアとする。
2004516227.tif 000066
【０１３１】
実施例５
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける阻害活性（番号６７）
この実施例は、一又は複数のＰＲＯポリペプチドが刺激されたＴリンパ球の増殖阻害剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、免疫反応の抑制が好ましい場合に治療的に有用である。
このアッセイの基本的プロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ｕｎｉｔ３．１２；Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｌｉｅｓ， Ｅ． Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編， 国立衛生研究所， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃから出版のものに記載されている。
より詳細には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を哺乳動物個体、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する（一人のドナーには刺激剤ＰＢＭＣを供給し、他のドナーにはレスポンダーＰＢＭＣを供給する）。望まれるならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地（３７℃、５％ＣＯ２）で一晩解凍し、ついで洗浄し、３ｘ１０６細胞／ｍｌのアッセイ用培地（ＲＰＭＩ；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルバート）に再懸濁させる。刺激剤ＰＢＭＣは細胞を光にさらす（約３０００ラド）ことにより調製される。
このアッセイは、
１００：１の１％又は０．１％に希釈された試験試料、
５０：１の光にさらされた刺激物細胞、及び
５０：１のレスポンダーＰＢＭＣ細胞、
の混合物を三重ウェルに蒔くことにより調製される。１００マイクロリッターの細胞培養培地又は１００マイクロリッターのＣＤ４−ＩｇＧを対照として使用する。ついで、ウェルを３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートする。５日目に、各ウェルにトリチウム化チミジン（１．０ｍＣ／ウェル；Ａｍｅｒｓｈａｍ）をパルス適用する。６時間後、細胞を３回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、ＰＢＭＣをＢａｌｂ／ｃマウス及びＣ５７Ｂ６マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地（ＲＰＭＩ；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸、１％ピルバート）において新鮮に収集した脾臓から顕微鏡検査用に引き出し、リンホライトＭ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりＰＭＢＣを単離し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に１ｘ１０７細胞／ｍｌになるように細胞を再懸濁させる。ついで、アッセイは上記のようにして行われる。
対照以下に減少していると阻害化合物としてポジティブであると考えられ、８０％以下の減少が好ましい。しかしながら、対照より少ない値は全て、試験用タンパク質の阻害効果を示す。
【０１３２】
2004516227.tif 000067
2004516227.tif 000068
2004516227.tif 000069
2004516227.tif 000070
【０１３３】
実施例６
インサイツハイブリッド形成
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び位置測定のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と位置測定、特定のｍＲＮＡ合成における変化の追跡及び染色体マッピングの補助に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Ｌｕ及びＧｉｌｌｅｔｔ， Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １： １６９−１７６ （１９９４）のプロトコールの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ−標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０ｇ／ｍｌ）で１５分間３７℃で脱タンパクし、さらに上掲のＬｕ及びＧｉｌｌｅｔｔに記載されたようにしてインサイツハイブリッド形成のために加工した。［３３−Ｐ］ＵＴＰ−標識アンチセンスリボプローブをＰＣＲ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
３３Ｐ−リボプローブ合成
６．０μｌ（１２５ｍＣｉ）の３３Ｐ−ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢＦ １００２， ＳＡ＜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ−ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加した：２．０μｌの５ｘ転写バッファー；１．０μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）；２．０μｌのＮＴＰ混合物（２．５ｍＭ： 各１０μｌの１０ｍＭ ＧＴＰ， ＣＴＰ及びＡＴＰ＋１０μｌのＨ２Ｏ）；１．０μｌのＵＴＰ（５０μＭ）；１．０μｌのＲｎａｓｉｎ；１．０μｌのＤＮＡテンプレート（１μｇ）；１．０μｌのＨ２Ｏ。
管を３７℃で１時間インキュベートした。１．０μＬのＲＱ１ ＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。９０μＬのＴＥ（１０ｍＭトリスｐＨ７．６／１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０）を添加し、混合物をＤＥ８１ペーパー上にピペットした。残りの溶液をＭｉｃｒｏｃｏｎ−５０限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（６分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた（３分間）。最終回収スピンの後、１００μＬのＴＥを添加した。１μＬの最終生成物をＤＥ８１紙にピペットし６ｍｌのＢＩＯＦＬＵＯＲ ＩＩで数えた。
プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。１−３μＬのプローブ又は５μＬのＲＮＡ ＭｒｋＩＩＩを３μＬの負荷バッファーに添加した。９５℃の加熱ブロック上で３分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、１８０−２５０ボルトで４５分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−７０℃の冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から終夜露出した。
【０１３４】
３３Ｐ−ハイブリッド形成
凍結切片の前処理  スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．５ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（２５ｍｌ ２０ｘＳＳＣ ＋ ９７５ｍｌ ＳＱ Ｈ２Ｏ）。０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（２５０ｍｌの予備加熱ＲＮａｓｅ無しＲＮＡｓｅバッファー中の１０ｍｇ／ｍｌストック１２．５μＬ）、切片を０．５ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、７０％、９５％、１００％エタノール中、各２分間脱水した。
パラフィン包埋切片の前処理  スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に配置し、２ｘＳＳＣで室温において各々５分間２回リンスした。切片を２０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μＬ；３７℃、１５分間）−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（２５０ｍｌのＲＮａｓｅバッファー中１００μＬ、３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く０．５ｘＳＳＣでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
プレハイブリッド化  スライドをＢｏｘバッファー（４ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド）−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を５０μＬのハイブリッド形成バッファー（３．７５ｇデキストラン硫酸＋６ｍｌＳＱ Ｈ２Ｏ）で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、１８．７５ｍｌのホルムアミド、３．７５ｍｌの２０ｘＳＳＣ及び９ｍｌのＳＱ Ｈ２Ｏを添加し、組織を良くボルテックスし、４２℃で１−４時間インキュベートした。
ハイブリッド形成  スライド当たり１．０ｘ１０６ｃｐ．のプローブ及び１．０μＬのＲＮＡ（５０ｍｇ／ｍｌストック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり４８μＬのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、５０μＬの３３Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド５０μＬに添加した。スライドを５５℃で終夜インキュベートした。
洗浄  洗浄は、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで２ｘ１０分間、室温で実施し（４００ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間行った（２５０ｍｌＲＮａｓｅバッファー中１０ｍｇ／ｍｌを５００μＬ−２０μｇ／ｍｌ）。スライドを２ｘ１０分間、２ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り：５５℃で２時間、０．１ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（２０ｍｌの２０ｘＳＳＣ＋１６ｍｌのＥＤＴＡ、Ｖｆ＝４Ｌ）。
種々のヒト組織からのポリＡ＋ＲＮＡ（レーン当り２μｇ）を含有するマルチ−組織ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈから購入した（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）。ＤＮＡプローブをランダムプライムＤＮＡラベルビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰでラベルした。ハイブリッド形成はＥｘｐｒｅｓｓｈｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、６８℃で１時間行った。ついで、ブロットを２ｘＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳ溶液を用い、室温で４０分間洗浄し、次に新鮮な溶液に変えて、０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液を用い、５５℃で４０分間洗浄した。ブロットをホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）にさらした。
【０１３５】
ＤＮＡ２９１０１（ＶＥＧＦＢ９）
2004516227.tif 000071
ＩＳ９７−０２９：
軟骨原基の縁（例えば外縁周辺）における発育中の下肢骨、発育中の腱、血管平滑筋及び細胞包含発育中の骨格筋筋細胞及び筋管における発現。発現は、次の組織でも観察された：骨端の成長板：リンパ節−周縁洞：胸腺−胸腺皮質の被膜下領域、おそらく、被膜下上皮細胞又はこの領域で見られる増殖中の二重ネガティブ胸腺のいずれか；気管平滑筋；脳（小脳皮質）−皮質ニューロンにおける病巣発現：小腸−平滑筋：甲状腺−甲状腺上皮；肝臓−管板；胃−壁平滑筋；胎児の皮膚−鱗状上皮の基底層；胎盤−栄養膜絨毛の間細胞；脊髄−動脈及び静脈の壁を除いて発現なし。脾臓と副腎では発現なし。
上述の発現パターンは、ＤＮＡ２９１０１が細胞分化／増殖に関与していることを示唆している。
ＩＳ９７−０３７
過剰排卵したラット卵巣での発現は、アンチセンス及びセンスプローブの双方において全ての切片でネガティブであった。何れのメッセージもこのモデルでは発現されず、あるいはヒトプローブはラットと交差反応しなかった。
【０１３６】
ＩＳ９７−０８７
高発現レベルは以下の部位で観察された：チンパンジー卵巣−成熟小胞の顆粒膜細胞、低強度シグナルが包膜細胞で観察；チンパンジー上皮小体−主細胞全体で高発現；ヒト胎児精巣−発育中の細管を囲む間質細胞全体に中程度の発現；ヒト胎児肺−発育中の気管支の軟骨細胞で高発現、及び分岐している気管支上皮において低レベル発現。
検査した胎児組織（Ｅ１２−Ｅ１６週）は：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）、小脳（ｒｍ）、陰茎、眼、膀胱、胃、胃腸肉腫、大腸、大腸癌腫及び骨盤癌腫を含む。また検査したものはアセトアミノフェン誘発肝臓障害及び肝硬変であった。
ＤＮＡ３０８７１：
ＩＳ９７−０４４：  胎児組織において、胎児の大脳皮質、脊髄、脊髄神経節のニューロン、並びに胎児胃壁の腸ニューロンに強いシグナルが観察された。さらに、大動脈の根本周囲の細胞（おそらくは刺激伝導系）、副腎髄質、神経血管束の間質細胞、腎臓実質及び骨格筋筋細胞間に位置する細胞においてもシグナルが観察された。全ての他の胎児組織はネガティブであった。
成人組織では何の発現も観察されなかった。検査した胎児組織（１２−１６週）は：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚を含む。
上述の分析で使用したプローブは以下の通りである。
2004516227.tif 000072
ＤＮＡ３０９４２：
ＤＮＡ３０９４２（配列番号：１３）を４つに分かれたインサイツ研究において検査し（実施例７の発病した組織研究における２つを含む）、次のプローブを使用した：
2004516227.tif 000073
【０１３７】
ＩＳ９７−０４３：
胎児組織では何の発現も観察されなかった。検査した胎児組織は：胎盤、臍帯、脳、脊髄、視神経、気管、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、食道、小腸、膵臓、副腎、甲状腺、体壁及び下肢を含む。
成人組織では何の発現も観察されなかった。検査した成人組織は：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚を含む。
ＤＮＡ３３０８７（ＩＳ９７−０５１）：
胎児組織において、ＤＮＡ３３０８７（配列番号：１８）の発現は、内軟骨及び骨膜性骨形成の全ての部位で骨芽細胞において、また発育中の肺動脈及び大動脈幹で観察された。検査した胎児組織は：胎盤、臍帯、脳、脊髄、眼、視神経、気管、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、食道、小腸、膵臓、副腎、甲状腺、体壁及び下肢を含む。
検査した成人組織では何の発現も観察されず、以下を含む：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚。
可能な役割は、骨マトリクス沈積及び／又は骨芽細胞成長の制御である。
多ブロックにおける全ての成人組織はβ−アクチンに対してポジティブであった。
この手順で使用したプローブは以下の通りである：
2004516227.tif 000074
【０１３８】
ＤＮＡ３４３８７（ＩＳ９７−１０９）：
ＤＮＡ３４３８７（配列番号：２５）の発現パターンは胎児及び成人ヒトの以下の部位で観察された：
胎児−甲状腺上皮、小腸上皮、生殖腺、膵臓上皮、肝臓の肝細胞及び腎尿細管。また発育中の長骨の血管組織でも見られた。
成人−胎盤細胞栄養芽層、腎尿細管上皮、膀胱上皮、副甲状腺及び上皮腫瘍に中程度のシグナル。
検査した胎児組織（Ｅ１２−Ｅ１６週）は：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。
検査した成人組織は：腎臓（正常及び末期）、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、胆嚢、膵臓、肺、皮膚、眼（網膜を含む）、前立腺、膀胱、肝臓（正常、肝硬変、急性機能不全）を含む。
検査した非ヒト霊長類組織は以下のものを含む：
チンパンジー組織：唾液腺、胃、甲状腺、副甲状腺、皮膚、胸腺、卵巣、リンパ節。
アカゲザル組織：大脳皮質、海馬、小脳、陰茎。
この手順で使用したプローブは以下の通りである。
2004516227.tif 000075
【０１３９】
ＤＮＡ３５６３８：
ＩＳ９７−０７８：
ＤＮＡ３５６３８（配列番号：３５）の発現は胎児及び胎盤血管のサブセットの内側の内皮に観察された。内皮発現はこれらの組織ブロックに限られていた。発現はまた胎盤の中間栄養芽細胞にわたって観察された。
検査した胎児組織（Ｅ１２−Ｅ１６週）は：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢を含む。
検査した成人組織は：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）、小脳（ｒｍ）、陰茎、眼、膀胱、胃、胃癌、大腸、大腸癌腫、甲状腺（チンパンジー）、副甲状腺（チンパンジー）、卵巣（チンパンジー）及び軟骨肉腫。アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。
上述の手順で使用したオリゴは以下の通りである。
2004516227.tif 000076
【０１４０】
Ｉ９８−０５２：
正常なヒト皮膚（新生児の包皮）及び成人の乾癬性皮膚のＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）は、双方とも、上部に重なる皮膚の表皮細胞の前駆体である基底膜に沿った単層の、基底層の上皮細胞において特異的な強い発現を示した。
上部に重なっている層（有棘層、顆粒層等）の上皮細胞では何の発現もなかった。シグナルの強さは乾癬皮膚でわずかに増加した。また、正常及び乾癬皮膚の双方の真皮（表皮直下にある結合組織）でも発現が明らかであった。間質性線維芽細胞であるコラーゲンマトリクス内の紡錘形細胞において発現が最も顕著であった。
脳では、小脳切片は、表在性皮質ニューロンで強い特異的な発現をし、皮質ニューロンの特定集団に独特なパターンが示唆された。
炎症した、また正常な腸：正常なヒトの大腸及びクローン病又は潰瘍性大腸炎のある腸では、絨毛の固有層内に多巣性パターンで特異的な中程度から強い発現があった。インサイツで標識された細胞は線維芽細胞として最もよく描写される紡錘状（ｓｐｉｎｄｌｏｉｄ）間質細胞であった。腸の上皮細胞では発現はなく、発病した腸においても明らかに増加した（強度又は頻度）発現はなかった。特に、炎症をした腸において病変部と発現との間には相関もなかった。
ヒト胎児腎臓では、多巣性の発育中細管において特異的な弱いないしは中程度の発現があった；これらの病巣における細管上皮に発現があった。
皮膚におけるＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）の発現と表皮細胞の基底上皮細胞への特異的な局在化は、基底上皮細胞の分化／維持における潜在的な役割を示唆している。発現が基底層に直接隣接する細胞で起こっているという事実と合わせて、この発現パターンは、該細胞が表皮における白血球の輸送を調節していることを示唆している。その結果、ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）は、表皮中への樹状突起／ランゲルハンス細胞又はリンパ球の輸送のための構成的に発現されるシグナルでありうる。このような輸送は正常な皮膚で生じる正常な生理的事象であり、皮膚の免疫監視に関与していると思われる。
炎症性腸疾患におけるＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）の発現は、正常な組織よりも増加しておらず、その発現の炎症性病変部との相関はなかった。同様に、乾癬皮膚病変部の基底表皮細胞における発現も正常な新生児の皮膚でみられる発現と等しいか、わずかに多いにすぎなかった（しかし、年齢が一致した対照成人皮膚は研究時点では入手できなかった）。
ＩＳ９７−１２８：
ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）の発現はマウス胚皮膚の上皮並びにヒト胎児皮膚の基底上皮及び上皮で観察された。チンパンジー舌の鱗状粘膜の基底上皮ペグ（ｐｅｇｓ）もポジティブであった。胎児腎臓の発育中の糸球体、成人腎臓細管、及び末期腎臓疾患の「甲状腺化」上皮の細胞のサブセットにおいても発現が観察された。しかしながら、腎細胞癌では、おそらく上皮細胞全体において低い発現が見られた。さらに、発現は、間質細胞では（１）胎児肺で低レベルで、また（２）胃腸腺の先端部分でも観察された。胎児小腸絨毛の固有層、正常大腸粘膜、及び大腸癌における間質細胞にわたって高い発現が示された。肉腫のヒラン化（ｈｙｌａｎｉｚｅｄ）ストローマにおける良性結合組織細胞に強い発現が生じた。胎盤絨毛及び脾赤髄における間質細胞においても発現が生じた。脳では、皮質ニューロンで発現が生じた。
ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）は発育中の骨を囲む結合組織においてと胎児の神経鞘細胞にわたっても発現した。
検査した胎児組織（Ｅ１２−Ｅ１６週）は以下を含む：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織は：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）、眼、胃、胃癌、大腸、大腸癌、甲状腺（チンパンジー）、副甲状腺（チンパンジー）、卵巣（チンパンジー）及び軟骨肉腫を含む。アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。
【０１４１】
ＩＳ９８−０９２：
サル大脳皮質の外層（Ｉ及びＩＩ）における多数の細胞にＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）の発現が存在した。より深い皮質層の細胞の小さなサブセットも、このケモカイン相同体のｍＲＮＡを発現した。海馬の分子層内と歯状回の内部辺縁の境界の散在細胞はＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）の発現を示した。大脳皮質内では発現は検出されなかった。ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）の発現は、ケモカイン相同体が通常は発現される領域において細胞死が起こった梗塞脳では観察されなかった。ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）は、おそらくは大脳皮質の外層のニューロンのサブセットのマーカーとなり、おそらくはニューロン移動障害を明らかにしうる。異常なニューロン移動は、幾つかの発作性疾患及び精神分裂病の原因となりうる。
ＩＳ９８−１２８：
ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）は、生後（Ｐ）１０日及び成体マウス脳内に興味ある特定のハイブリッド形成パターンを示した。Ｐ１０マウスの１つの矢状断面において、海馬の分子層及び歯状回の内辺縁に強いシグナルが散乱して観察された。プレ鉤状回の細胞は中程度に標識された；シグナルは強い帯域を、後部板状皮質の外層を通って後頭皮質に至るまで伸ばし、そこでシグナルはバックグラウンドレベルまで低下する。ポジティブニューロンの小セットがＰ１０運動皮質の深い領域で検出された；Ｐ１０皮質の外層内のニューロンはバックグラウンドレベルを越えるシグナルを示さなかった。中程度のハイブリッド形成シグナルもまた下丘で検出された。成体マウス脳におけるケモカイン相同体シグナルは、３つの冠状断面において異なるレベルで評価した。強いシグナルが隔壁及び橋核の散在ニューロン及び三叉神経の運動根で検出された；中程度のシグナルが海馬の分子層及び後部板状皮質の外層に見られた。
ＩＳ９９−０２７：
ボレカイン（ｂｏｌｅｋｉｎｅ）（ＢＲＡＫとしても知られ、ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）が有意な相同性を有するケモカインである）は、ｃｙｓ−ｘ−ｃｙｓ（ＣＸＣ）モチーフと、アミノ末端ｇｌｕ−ｌｅｕ−ａｒｇ（ＥＬＲ）が存在しないことにより特徴付けられるケモカインのサブグループに属する。非−ＥＬＲ ＣＸＣケモカイン（ＳＤＦ−１、ＩＰ１０、Ｍｉｇ及びＰＦ４を含む）はＢ及びＴリンパ球を含む白血球のサブセットに対して走化性を示す。またそれらは、アンギオスタティック（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）活性も有する。
ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）は生後（Ｐ）１日のマウスの脳で検出され、ボレカインシグナルは海馬（ラクノサム分子層（ｓｔｒａｔｕｍ ｌａｃｕｎｏｓｕｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅ）及び歯状回の門部）及び前側嗅覚核（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｎｕｃｌｅｕｓ）で検出されたが、発育中の大脳皮質と小脳では検出されなかった。Ｐ１０により、シグナルは大脳皮質の層１及び２の細胞のサブセットに存在する。またより深い層における細胞の小集団でもＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）を発現している。海馬におけるパターンはＰ１脳と類似していた。弱いシグナルが小脳、特に小葉ＩＸ及びＸに存在している。シグナルはまた背側線条体及び小丘にも存在している。
成人マウス脳において、ボレカインポジティブ細胞は成人大脳皮質で検出することは困難であるが、シグナルは前側嗅覚核と海馬に存在している。しかし、虚血マウス脳においては、ボレカインシグナルは境界域に誘発されている。
発育中の大脳皮質では、ボレカインの発現はニューロン遊走の最終段階及びシナプス形成と軸索突起の確立に相関している。他のＣＸＣキモカインは中枢神経系でのパターニングとニューロン遊走（ＳＤＦ−１）及びニューロン活動の調節（ＩＬ−８及びＧＲＯ−ａ）における役割を担っている。
ボレカインの発現は脳の虚血性再灌流傷害において誘発されるが、他の炎症状態では誘発されない。
【０１４２】
ＤＮＡ４７３６５（ＩＳ９７−１４２）：胎児組織において、ＤＮＡ４７６３５（配列番号：９１）の発現は、椎骨体の前側表面を内張りする筋膜で観察された。発現は、胎児網膜にわたって見られる。胎児ニューロンにわたって低レベルの発現。
次のプローブを上述の分析で使用した：
2004516227.tif 000077
ＤＮＡ４９４３５（配列番号：１１１）の中程度の発現が胎児脳の皮質ニューロンにわたって観察された。発現は胎児網膜の内面にわたってもまた観察され、発達中のレンズにも見られることがあった。発現は胎児皮膚、軟骨、小腸、胎盤絨毛及び臍帯にわたって見られた。成人組織では、胆嚢上皮に極めて高レベルの発現があった。ＤＮＡ４９４３５（配列番号：１１１）の中程度の発現は、成人腎臓、胃及び大腸上皮で見られた。
検査したヒト胎児組織（Ｅ１２−Ｅ１６週）は：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、精巣及び下肢を含む。検査した成人ヒト組織は：腎臓（正常及び末期段階）、副腎、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、眼（網膜を含む）、膀胱、肝臓（正常、肝硬変、急性機能不全）を含む。
検査した非ヒト霊長類組織は、チンパンジー組織の副腎、及びアカゲザル組織の大脳皮質、海馬及び小脳を含む。
上述の分析で使用したプローブは以下の通りであった：
2004516227.tif 000078
【０１４３】
ＤＮＡ５４２２８（ＩＳ９８−１０５）：
ＤＮＡ５４２２８（配列番号：１３３）の発現は骨スピクラ：胎児骨幹端、胎児頭蓋冠（頭蓋）及びヒト異常増殖の骨組織（骨肉腫及び軟骨肉腫）で観察された。軟骨肉腫及び骨肉腫の骨化スピクラ及び胎児骨の骨幹端の小骨スピクラに、弱いが一貫したシグナルがあった。ヒト肺、肝臓、胸腺、腎臓、甲状腺、脳、脾臓、副腎、脳、軟骨、肺、肝臓、腸、生殖腺、心臓及び皮膚を含む胎児組織では何のシグナルも検出されなかった。
上述の手順で使用したプローブは以下の通りであった：
2004516227.tif 000079
ＤＮＡ５４２３１（ｍＦＩＺＺ３）：
ＩＳ９８−０７０：
ＤＮＡ５４２３１（配列番号：１３９）は脂肪細胞に特異的な中程度のシグナルを示した。このシグナルは、首において気管の回りの腸間膜脂肪と間質性脂肪に存在する。発現パターンは成体脂肪に対して特異的であるようである。
ＩＳ９８−１０９：
ＤＮＡ５４２３１（配列番号：１３９）の発現は脂肪細胞に特異的であり、腹膜腸間膜、腎盂の脂肪被膜及び乳房肉趾を含む、この研究でこのような細胞が見出される場所には何れにも存在した。正常なマウス脳、肝臓、腎臓、乳腺、膵臓、脾臓、膵臓、骨髄、胃、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、精巣、皮膚又は肺における何れの他の細胞型においても発現はなかった。
脂肪細胞に対するこの分子の選択的分布は、肥満において何れも重要である、脂肪細胞の産生／生成又は脂肪代謝の何れかにおける役割を示唆している。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである：
ＤＮＡ５４２３１−ｐ１（配列番号：２２４）：
５’−ＧＧＡＴＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＧＧＧＡＣＡＧＧＡＧＣＴＡＡＴＡ−３’
ＤＮＡ５４２３１−ｐ２（配列番号：２２５）：
５’−ＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＴＣＣＣＡＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧ−３’
【０１４４】
ＤＮＡ５９２９４（ＩＳ９８−１３８）：
ＤＮＡ５９２９４（配列番号：１４９）は、正常成人及び胎児組織及び炎症、主に慢性リンパ球炎症を持つ組織からなるパネルで評価した。要約すると、発現は、筋肉、成人の或る種の型の平滑筋及び骨格及びヒト胎児の平滑筋に特異的であった。ヒト成人における発現は、大腸及び胆嚢を含む管器官の平滑筋において評価された。血管及び気管支の平滑筋では発現されなかった。ヒト成人骨格筋は評価しなかった。胎児組織において、骨格筋、体幹骨格及び肢における中程度から高度の拡散した発現があった。腸壁の平滑筋では弱い発現があったが、心筋では発現されなかった。
成人組織において、大腸、慢性炎症性腸疾患を持つ５検体において平滑筋（筋層）で低レベルの拡散した発現があった。胆嚢において、胆嚢の平滑筋で弱から低レベルの発現があった。
ヒト胎児組織では、骨格筋において中程度の拡散した発現が、また平滑筋において弱から低レベル発現があった。しかしながら、胎児心臓又は肝臓、脾臓、ＣＮＳ、腎臓、腸、肺を含む他の任意の器官では発現はなかった。
検出可能な発現のなかった試験された付加的なヒト組織には、慢性肉芽腫炎症及び慢性気管支炎（５患者）の肺、末梢神経、前立腺、心臓、胎盤、肝臓（傷害及び硬変を誘発するアセトアミノフェンを含む疾患多重ブロック）、脳（大脳及び小脳）、扁桃（反応性過形成）、末梢リンパ節、胸腺が含まれる。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである：
2004516227.tif 000080
ＤＮＡ３０８６８発現は次の胎児組織：脊髄、自律神経節、腸管神経、仙骨神経叢、末梢及び脳神経で見出された。
検査した胎児組織は次のものであった：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢。検査した成人組織は：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚を含む。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである：
2004516227.tif 000081
【０１４５】
ＤＮＡ５３５１７：
ＩＳ９８−０７０：
正常な成体マウスの肺におけるＤＮＡ５３５１７（配列番号：２５５）の発現は、大きな気道（気管支／細気管支）の粘膜上皮細胞のサブセット内にパッチ状の発現がある。また、大きな気道に隣接する粘膜下間質の希な離散した細胞内でも発現があった。これらの細胞は、典型的には正の病巣内に１−３であるが、大きな脈管に隣接し、平滑筋細胞、末梢神経又はシュワン細胞、又はリンパ管でありうる。
アレルギー性炎症を持つマウス成体肺（好酸性、リンパ性血管炎、細気管支炎及び肺炎）において、肺の大気道（気管支／細気管支）の全ての粘膜上皮細胞に強い拡散した発現があった。また、肺胞の内側の上皮細胞のサブセットを提示する離散細胞にも強い発現があった；これらの細胞はＩＩ型肺細胞である。また、正常な肺におけるように、大気道に隣接する粘膜下間質の希な離散細胞内に存在する発現がある。
正常な成体マウスの小腸及び大腸において、粘膜下、筋膜及び腸間膜に存在する多巣性の少しの離散したシングルの細胞内に強い発現がある。シグナルを発現する細胞は殆ど常にこれらの領域内の神経、静脈、動脈三連構造に付随している。これらの細胞は紡錘形をしており、末梢神経、そのような神経に付随するシュワン細胞又は脈管又はリンパに付随する支持細胞のあるタイプの何れかである。興味深いことに筋膜内にある同定可能な腸筋層間神経叢内には発現はない。
炎症性大腸（ＩＬ１０Ｒ ＫＯマウスからのもの）において、発現パターンは同様であるが、発現レベルは有意に減少していた。
ＩＳ９８−０９３：
さらに、ＤＮＡ５３７１５（配列番号：２５５）の分布を正常なマウス組織で広範囲なスクリーニングを行い評価した。正常な肺において、発現は変化するが、存在するときはマウスの肺の気管支上皮細胞及びＩＩ型肺胞細胞に限定されていた。炎症性肺におけるこれらの細胞（気管支粘膜肥大／過形成を伴うアレルギー性炎症：喘息モデル）では顕著な増加があった。腸におけるＤＮＡ５３７１５（配列番号：２５５）の発現は大腸において最も顕著であり、粘膜下及び筋膜（ｍｕｃｏｓａ ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ）、腸の筋壁と粘膜との間の血管新生化組織層内の少しの離散細胞に存在していた。これらの細胞の正確な同定は表されていないが、それらの紡錘状（ｓｐｉｎｄｌｏｉｄ）形態及び粘膜下の毛細管及び小血管の密接な関連性により次の可能性が示唆される：血管周皮細胞又は非有髄神経線維のサブセット。
腸粘膜下の離散細胞におけるＤＮＡ５３７１５（配列番号：２５５）の発現は大腸に制限され、空腸、回腸、近位十二指腸又は胃の切片では見られなかった。発現は次の正常なマウス組織：肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、肺、膵臓、胃、近位十二指腸、空腸、回腸、脳、皮膚、精巣又は乳腺では検出されなかった。
ＤＮＡ５３７１５（配列番号：２５５）は肺の粘膜免疫を増強又は刺激する役割を担っている可能性がある。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである：
2004516227.tif 000082
【０１４６】
実施例７
疾患組織と細胞におけるインサイツハイブリッド形成
実施例６のインサイツハイブリッド形成法を使用し、特定の病気にかかったヒト個体から単離された発病組織における、遺伝子発現の測定、転写物の組織分布の分析、本発明の遺伝子／ＤＮＡ及びタンパク質の特異的ｍＲＮＡの合成における変化の追跡を行った。これらの結果は、本発明の遺伝子が発病組織のどこにより特異的に発現されるかを示しており、本発明の阻害又は刺激化合物（及びそのアゴニスト又はアンタゴニスト）の病気における治療効果の特定の局在性が予測される。ハイブリッド形成は、一又は複数の次の組織及び試料を使用して、実施例６の方法に従って実施される：
（ａ）リンパ球及び抗原提示細胞（樹状細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ及び単球、ＮＫ細胞）；
（ｂ）リンパ組織：正常及び反応性リンパ節、胸腺、気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）；
（ｃ）ヒト疾患組織：
・関節炎及び変性関節疾患を患っている患者の滑膜と関節；
・潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患を患っている患者の大腸；
・乾癬及び他の形態の皮膚炎からの皮膚病変部；
・慢性及び急性気管支炎、肺炎、間質性肺炎、胸膜炎からのリンパ節組織及びＢＡＬＴを含む肺組織；
・喘息からの組織リンパ節及びＢＡＬＴを含む肺組織；
・鼻炎又は副鼻孔炎を患っている患者の鼻及び洞組織；
・多発性硬化症、アルツハイマー病及び卒中からの脳及び脊髄；
・腎炎、糸球体腎炎及び全身性エリテマドーデスからの腎臓；
・感染及び非感染肝炎及びアセトアミノフェン誘導性肝硬変からの肝臓；      ・新生物／癌からの組織。
発現は細胞又は組織試料に関連した疾患における本発明の化合物（及びそのアゴニスト又はアンタゴニスト）の治療効果の局在化を示す一又は複数の細胞又は組織試料において観察される。
先に報告された非疾患組織分布と発現が重複する場合に使用したオリゴヌクレオチドの配列は実施例６に記載する。
【０１４７】
ＤＮＡ３０９４２：
ＩＳ９８−０２１：発現は、正常なチンパンジー胸腺の単核食細胞、並びに胃癌（１／１）、結腸直腸癌（１／１）、乳癌（２／５）及び肺癌（１／４）で観察された。骨肉腫及びあまり分化していない脂肪肉腫の悪性細胞により発現。精巣テラトーマ及び乳癌（１／５）の悪性細胞におけるありうるシグナル。肺癌の一つにおいて、散在シグナルが肺リンパ組織内の高内皮細静脈で見られる。検査した胎児組織（Ｅ１２−Ｅ１６週）は：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は：肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、肺、皮膚、軟骨肉腫、眼、胃、胃癌、大腸、大腸癌腫、腎細胞癌腫、前立腺、膀胱粘膜及び胆嚢を含む。また、アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。検査したアカゲザル組織は：大脳皮質（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）を含む。検査したチンパンジー組織は：甲状腺、副甲状腺、卵巣、神経、舌、胸腺、副腎、胃粘膜及び唾液腺を含む。
ＩＳ９８−０８５：発現が８つの腺癌と７つの扁平上皮肺癌に観察された。アクチンは全ての腫瘍で強くポジティブであり、全てがインサイツハイブリッド形成分析に適していることが示されている。ＤＮＡ３０９４２の発現は次の６つの腫瘍で観察された：
６７２７−９５／扁平上皮癌−新生物上皮上に強い発現
９５５８−９５／扁平上皮癌−新生物上皮上に発現
１２２３５−９５／腺癌−インサイツ及び浸潤腫瘍細胞上に発現
６５４５−９５及び４１８７−９６／扁平上皮癌−腫瘍ストローマの細胞上で発現、腫瘍細胞では発現は見られなかった；
１２９５４−９４／扁平上皮癌−間質細胞上に弱い発現。
ＩＳ９９−１１２：
ＤＮＡ３０９４２（配列番号：１３）のインサイツ発現を多くの慢性炎症状態及びリンパ器官で評価した。要約すると、ＤＮＡ３０９４２（配列番号：１３）は、慢性喘息の気管支粘膜関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）、肺門リンパ節、扁桃腺の高内皮細静脈（ＨＥＶ）で強く発現し、大腸粘膜でパッチ状の発現が、腸粘膜関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）ＨＥＶで弱い不統一な発現があった。
リンパ組織では、慢性喘息のある場合、気管支粘膜関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）、肺門リンパ節、扁桃腺の単一断片、及びＩＢＤ（ＧＡＬＴ／ＭＡＬＴ）の切片において腸粘膜関連リンパ組織で強い特異的な発現が観察された。これらの各リンパ器官において、発現は高内皮細静脈（ＨＥＶ）に特に存在していた。
慢性喘息肺の組織では、ＢＡＬＴ ＨＥＶにおける発現に加えて、特異的発現が炎症性気管支の粘膜下にある高又は反応性の膨張した内皮細胞が裏打ちする小毛細管で観察された。この領域はＢＡＬＴと密接に関連していないが、気管支への炎症細胞輸送のための粘膜下部位に特異的である。これらの領域には、好酸球の有意な粘膜下浸潤があった。発病した肺（ＣＯＰＤ及び慢性間質性肺炎）の他の切片では、ＤＮＡ３０９４２（配列番号：１３）は何ら発現しておらず、これらの切片はいくつかのアーチファクト（スライドからの組織の損失）を有していた。
乾癬組織では、乾癬プラークにおけるいくつかの小真皮毛細管に弱い発現があった。扁桃腺組織では、濾胞に関連するＨＥＶにおける発現に加えて、網状扁桃腺陰窩上皮内に強い発現があった。また、発現は小上皮内毛細管の血管にも存在していた。発現はまたいくつかの上皮細胞内にもあった。これは重要な免疫学的部位であり、抗原提示に関与し、耐性誘発において役割を担っている。
クローン病及び潰瘍性大腸炎を患っている患者から単離された組織では、全ての場合ではないがそのいくつかの場合にパッチ状分布を伴って粘膜に発現が存在した。ＧＡＬＴのＨＥＶにおける発現は他のリンパ組織でみられるよりも顕著に弱いシグナルとして存在しており、粘膜に強いがパッチ状の発現が存在する切片においてさえ一貫して存在はしていなかった。
アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から単離された組織では、慢性リンパ性炎症を有する肝門管の領域内の小毛細管に弱い発現があった。
【０１４８】
ＤＮＡ３３４６０（ＩＳ９８−０１５）：
ＤＮＡ３３４６０（配列番号：２０）の発現は、胎児眼の発育中の外眼性筋肉に直ぐ隣接している緩い結合組織の細胞にわたって観察された。軟部組織肉腫上に中程度の発現。検査した胎児組織（Ｅ１２−Ｅ１６週）は：胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢を含む。検査した成人組織は：肝臓、腎臓、腎細胞癌腫、副腎、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、心筋層、皮膚、大脳皮質（ｒｍ）、海馬（ｒｍ）、小脳（ｒｍ）、膀胱、前立腺、胃、胃癌、大腸、大腸癌腫、甲状腺（チンパンジー）、副甲状腺（チンパンジー）、卵巣（チンパンジー）及び軟骨肉腫を含む。また、アセトアミノフェン誘導肝臓傷害及び肝硬変から得られた組織も検査した。
この手順で使用したプローブは以下の通りである：
2004516227.tif 000083
発現は肺癌腫瘍で観察され、８つ全ての扁平上皮癌及び６／８の腺癌においてポジティブであった。発現レベルは腺癌で低から中程度であり、扁平上皮癌で非常に強かった。腫瘍ストローマ、肺胞又は正常な呼吸上皮では何の発現も見られなかった。おそらくリンパ節で低レベル発現。
発現は肺癌で観察された。遺伝子を肺腫瘍パネルのＴａｑｍａｎ分析で増幅した。発現は８つの扁平上皮癌及び６／８の腺癌で観察された。発現はインサイツ及び湿潤成分においても見られた。腺癌における発現レベルは低から中程度であった。一般的に発現は扁平上皮癌でより高く、その２つでは発現は強かった。おそらくリンパ節では低レベル発現。
【０１４９】
ＤＮＡ３５６３８：
ＩＳ９８−１２４：
この研究では、炎症ヒト組織（乾癬、ＩＢＤ、炎症腎臓、炎症肺、肝炎（肝臓ブロック）、正常な扁桃腺、成人及びチンパンジーの多ブロック）におけるＤＮＡ３５６３８（配列番号：３５）を検査した。ＤＮＡ３５６３８（配列番号：３５）は、この出願の他の箇所で、免疫賦活性（ＭＬＲにおけるＴ細胞の増殖及び同時刺激の増強）及び炎症誘発特性（インビボにおける好中球湿潤の誘発）を有していることが示されている。
この研究では、非炎症組織と比べて、炎症ヒト組織の血管中におけるこの分子の差次的な発現を評価した。要約すると、発現は、扁桃腺の毛包周囲洞を含む毛細管、慢性硬化性腎炎の検体における細動脈、乾癬皮膚の表層真皮血管、慢性炎症を患っている肺の大血管の内皮／内膜に存在していた。ＤＮＡ３５６３８（配列番号：３５）は、正常な皮膚（ヒト包皮検体）、正常な肺、炎症（８ＩＢＤ検体）又は正常な大腸、慢性的に炎症した肝臓又は肝硬変、正常な成人心臓組織、又は副腎では、（この方法で検出可能な程には）発現しなかった。
ＤＮＡ３９５２３：
Ｉ９８−０５２：
ヒト正常皮膚（新生児の包皮）及び成人乾癬皮膚の双方において、ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）は、基底層の上皮細胞−上部に重なる皮膚の表皮細胞の前駆体であり、基底膜に沿った単層において所定強さの発現を示した。
上部に重なっている層（有棘層、顆粒層等）の上皮細胞では何の発現もなかった。シグナルの強さは乾癬皮膚でわずかに増加した。また、正常及び乾癬皮膚の双方の真皮（表皮直下にある結合組織）でも発現が明らかであった。間質性線維芽であるコラーゲンマトリクス内の紡錘形細胞において発現は最も明らかであった。
炎症した、また正常な腸：正常なヒトの大腸及びクローン病又は潰瘍性大腸炎のある腸では、絨毛の固有層内の多巣性パターンにおいて、特に中程度ないしは強い発現があった。インサイツで標識された細胞は線維芽細胞として最もよく表される紡錘状（ｓｐｉｎｄｌｏｉｄ）間質細胞であった。腸の上皮細胞では発現せず、発病した腸においても明らかに増加した（強度又は頻度）発現はなかった。特に、炎症をした腸の病変部と発現との間には相関もなかった。
皮膚におけるＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）の発現、及び表皮細胞の基底上皮細胞までの特異的な局在性により、基底上皮細胞の分化／維持における潜在的な役割が示唆される。発現が基底層に直接隣接する細胞で起こっているという事実と合わせて、この発現パターンにより、該細胞が表皮への白血球の輸送を調節していることが示唆される。そｎ結果、ＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）は、表皮における樹状突起／ランゲルハンス細胞又はリンパ球の輸送のための構成的に発現されるシグナルでありうる。このような輸送は正常な皮膚で生じる正常な生理的事象であり、皮膚の免疫監視に関与していると思われる。
炎症性腸疾患におけるＤＮＡ３９５２３（配列番号：４５）の発現は、正常な組織よりも増加しておらず、炎症性病変部に対するその発現の相関はなかった。同様に、乾癬皮膚病変部の基底表皮細胞における発現も正常な新生児の皮膚でみられる発現と等しいか、わずかに多いにすぎなかった（しかし、年齢が一致した対照成人皮膚は研究時点では入手できなかった）。
【０１５０】
ＤＮＡ４５４１６（ＩＳ９８−１４０）：
ＤＮＡ４５４１６（配列番号：７９）の発現を、種々のヒト及び非ヒト霊長類組織で評価し、高度に特異的であることが見出された。発現は、肺の肺胞マクロファージ及び肝臓洞様毛細血管のクップファー細胞にのみ存在した。これらの細胞での発現は、これら独特の細胞集団が活性化されたときに有意に増加した。組織マクロファージのこれら２つの亜集団は異なる器官に局在化し、それらは類似の生物学的機能を有する。これら両方の型の食細胞は、病原、老化細胞及びタンパク質を含む血流又は気道からの物質を除去するフィルターとして作用し、共に広範な重要なプロ炎症サイトカインを分泌することができる。
炎症肺（７患者試料）では、発現は反応性肺胞マクロファージ細胞集団において顕著であり、肺胞内に１個又は凝集体で存在する大きくて青白く、しばしば空胞を持つ細胞として定義され、正常で非反応性マクロファージ（正常サイズの単一の散乱細胞）においては弱からネガティブであった。肺胞マクロファージでの発現は、これらの細胞が数及びサイズともに増大（活性化）したとき、炎症の間に増加した。これらの組織の間質炎症及び気管支周辺リンパ細胞過形成の領域に組織球が存在するにも関わらず、発現は肺胞マクロファージに制限されていた。多くの炎症肺も幾分の炎症抑制を有していた；発現は神経向性の顆粒球に存在しなかった。
肝臓においては、急性中心小葉性壊死（アセトアミノフェン毒性）又はかなり顕著な門脈周囲の炎症を持つ肝臓において反応性／活性化クップファー細胞に強い発現があった。しかしながら、正常肝臓、又は中程度の炎症、又は穏和から中程度の小葉過形成／肥大のみを持つ肝臓におけるクップファー細胞では発現がなかった。よって、肺と同様に、活性化／反応性細胞において発現の増加があった。
炎症した腸、過形成／反応性扁桃腺又は正常リンパ節に存在する組織球／マクロファージにおいて、この分子の発現は無かった。全てが組織球炎症又は常在性マクロファージ集団を含むこれらの組織で発現がないことは、肺胞マクロファージ及び肝臓クップファー細胞として定義される独特のマクロファージサブセット集団に制限された発現を強く支持する。しかしながら、ＤＮＡ４５４２１６（配列番号：７９）の発現は、脾臓又は骨髄では評価できなかった。
検出可能な発現を示さなかった評価したヒト組織は：炎症性腸疾患（中程度から重症の７患者試料）、反応性過形成を持つ扁桃腺、末梢リンパ節、乾癬皮膚（穏和から中程度の疾患を持つ２患者試料）、心臓、末梢神経を含む。検出可能な発現を示さなかった評価したチンパンジー組織は：舌、胃、胸腺を含む。
上述の研究で使用したプローブは以下の通りである：
2004516227.tif 000084
【０１５１】
ＤＮＡ４１３７４：
ＩＳ−９８−０７７：
ＤＮＡ４１３７４（配列番号：２４８）は胸腺Ｔリンパ球で発現した。
要約：評価した多くの組織で、胸腺Ｔリンパ球に弱い拡散した発現が検出されただけであった。制限された分布パターンは、Ｔリンパ球又はＴリンパ球に密接に関連している細胞、例えば抗原提示細胞（樹状細胞集団等）による発現を示唆している。かなりのリンパ性炎症を有し、反応性濾胞形成が存在する炎症ヒト組織（炎症性腸疾患及び慢性リンパ間質性肺炎／気管支炎）において、有意な数のＴリンパ球を含む領域に検出可能な発現はなかった。検出可能な発現がなかった試験した組織は：ヒト正常組織：胎盤、肺、脾臓、副腎、皮膚、腎臓、眼、肝臓；ヒト発病組織：肝臓疾患：慢性肝炎、慢性胆管炎、急性小葉中心壊死（アセトアミノフェン毒性）；異常増殖（腫瘍多ブロック）；骨肉腫、扁平上皮癌；ヒト胎児組織：脳、脊髄、肺、腎臓、腎臓、軸及び肢筋骨格血管、臍帯；非ヒト霊長類：舌、甲状腺、副甲状腺、胃、唾液腺を含む。
ＩＳ９８−１２５
ＤＮＡ４１３７４（配列番号：２４８）はＴリンパ球特定領域にて、ヒト扁桃腺及び非ヒト霊長類胸腺において低レベルの発現をした。制限された分布パターンは、Ｔリンパ球又はＴリンパ球に密接に関連している細胞、例えば抗原提示細胞（樹状細胞集団等）による発現を示唆している。かなりのリンパ性炎症を有し、反応性濾胞形成が存在する炎症ヒト組織（炎症性腸疾患及び慢性リンパ間質性肺炎／気管支炎）において、有意な数のＴリンパ球を含みうる領域に検出可能な発現はなかった。
炎症肺：（慢性リンパ及び肉芽種性間質肺炎）：対照センスプローブと比較して間質に弱いないしはネガティブなシグナル。正常なチンパンジー胸腺（ヒト胸腺は入手できず）及びヒト扁桃腺で弱い発現があった。後者において、発現は毛包周囲縁部を含むこの構造のＴリンパ球領域及び副皮質に主として発現した。
次のヒト組織：炎症性腸疾患（８患者検体）、慢性的炎症及び正常な肺（６患者検体）、慢性硬化性腎炎（１）、慢性的及び急性的炎症及び正常及び肝硬変の肝臓（１０検体、多ブロック）、正常及び乾癬皮膚、末梢リンパ節（非反応性）で検出可能な発現はなかった。
上述の手順に使用したプローブは以下の通りである：
2004516227.tif 000085
【０１５２】
ＤＮＡ５３５１７：
ＩＳ９８−０７０：
正常な成体マウスの肺におけるＤＮＡ５３５１７（配列番号：２５５）の発現は、大きな気道（気管支／細気管支）の粘膜上皮細胞のサブセット内にパッチ状の発現がある。また、大きな気道に隣接する粘膜下間質の希な離散した細胞内でも発現があった。これらの細胞は、典型的に正の病巣内に１−３であるが、大きな脈管に隣接し、平滑筋細胞、末梢神経又はシュワン細胞、又はリンパ管を提示する。
アレルギー性炎症を持つマウス成体肺（好酸性、リンパ性血管炎、細気管支炎及び肺炎）において、肺の大気道（気管支／細気管支）の全ての粘膜上皮細胞に強い拡散発現があった。また、肺胞を裏打ちする上皮細胞のサブセットを提示する離散細胞に強い発現があり；これらの細胞はＩＩ型肺細胞である。また、正常な肺におけるように、大気道に隣接する粘膜下間質に希な離散細胞内に存在する発現がある。
正常な成体マウスの小及び大腸において、粘膜下、筋膜及び腸間膜に存在する多巣性の少しの離散したシングルの細胞内に強い発現がある。シグナルを発現する細胞は殆ど常にこれらの領域内の神経、静脈、動脈三連構造に付随している。これらの細胞は紡錘形をしており、末梢神経、そのような神経に付随するシュワン細胞又は脈管又はリンパに付随する支持細胞のあるタイプの何れかである。興味深いことに筋膜内にある同定可能な腸筋層間神経叢内には発現はない。
炎症性大腸（ＩＬ１０Ｒ ＫＯマウスからのもの）において、発現パターンは同様であるが、発現レベルは有意に減少していた。
ＩＳ９８−１３５：
ＤＮＡ５３７１５（配列番号：２５５、マウスＦＩＺＺ−１）は次のヒト組織：胃癌、炎症肺（３患者）（脈管、肺胞、大きな気道及び粘液腺）、大動脈、心臓、胎盤及び胆嚢において検出プローブとして使用された。
マウスＤＮＡ５３７１５（配列番号：２５５）の発現は正常なマウス肺の大きな気道上皮に存在し、炎症したマウス肺（気道上皮、ＩＩ型肺胞肺細胞）で顕著に増加した。また、血管チャンネルに沿った大腸粘膜下における離散細胞にも発現があった。
ＤＮＡ８４２１０：
インサイツ研究に使用したプローブを次に示す：
2004516227.tif 000086
ＤＮＡ８４２１０（配列番号：２８５）は胎児腎臓、主に発育中の糸球体及び皮質領の細管で発現し、胎児肺及び脊髄では弱かった。また発育中の軟骨及び骨に隣接する間質細胞にも発現があった。成人組織において、弱い発現が正常な気管支上皮、５つの肺腫瘍（２つは扁平上皮癌で３つは腺癌）の一つ（腺癌）、及び軟骨肉腫において見られた。皮膚及びその付属物で発現する可能性もあるが、切片は折り畳まれており、評価することは困難である。
ＩＳ９９−１０２：
悪性メラノーマ、肺腫瘍、大腸腫瘍、細胞ペレット、マウス組織、胎児組織におけるＤＮＡ８４２１０（配列番号：２８５）の発現。
ＤＮＡ８４２１０（配列番号：２８５）の発現は、いくつかの成人（異常増殖及び非異常増殖）及び胎児組織において見られた。正常な成人組織に関する限り、ＤＮＡ８４２１０（配列番号：２８５）は皮膚の表皮（ほとんどが基底部に位置する細胞）及び皮膚付属物、例えば毛髪の濾胞及びそれらに関する皮脂腺で見られる。また発現は、気管支上皮及び粘膜下気管支腺でも見られる。ヒト胎児組織において、ＤＮＡ８４２１０（配列番号：２８５）の発現は、皮膚及び皮膚付属物、肺、腎皮質及び膵管で見られる。また、発育中の骨及び軟骨に隣接する間葉細胞でも見られる。マウス胚で見られたハイブリッド形成シグナルはない。ＤＮＡ８４２１０（配列番号：２８５）の発現は６つの結腸直腸腺癌の一つ（弱）、３つの肺腺癌の２つ（一つは強を示すが、かなりの限局的発現であり、一つは非常に弱いポジティブである）、３つの肺扁平上皮細胞癌の０、及び一つの軟骨肉腫の一つ（弱）で見られる。また、５つの悪性メラノーマの５つで発現が見られ、発現の強度は非常に弱から強の範囲である。またこれらの切片は正常な表皮及び皮膚付属物におけるＤＮＡ８４２１０（配列番号：２８５）の発現を示す。
【０１５３】
実施例８
ハイブリッド形成プローブとしてのＰＲＯポリペプチドの使用
以下の方法は、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
全長又は成熟ＰＲＯポリペプチドのコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種ＤＮＡ類（天然発生変異体をコードするものなど）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識ＰＲＯ−誘導プローブ（例えば、ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２０４、ＰＲＯ２１２、ＰＲＯ２１６、ＰＲＯ２２６、ＰＲＯ２４０、ＰＲＯ２３５、ＰＲＯ２４５、ＰＲＯ１７２、ＰＲＯ２７３、ＰＲＯ２７２、ＰＲＯ３３２、ＰＲＯ５２６、ＰＲＯ７０１、ＰＲＯ３６１、ＰＲＯ３６２、ＰＲＯ３６３、ＰＲＯ３６４、ＰＲＯ３５６、ＰＲＯ５３１、ＰＲＯ５３３、ＰＲＯ１０８３、ＰＲＯ８６５、ＰＲＯ７７０、ＰＲＯ７６９、ＰＲＯ７８８、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１０３１、ＰＲＯ１３４６、ＰＲＯ１１５５、ＰＲＯ１２５０、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２４６、ＰＲＯ１２８３、ＰＲＯ１１９５、ＰＲＯ１３４３、ＰＲＯ１４１８、ＰＲＯ１３８７、ＰＲＯ１４１０、ＰＲＯ１９１７、ＰＲＯ１８６８、ＰＲＯ２０５、ＰＲＯ２１、ＰＲＯ２６９、ＰＲＯ３４４、ＰＲＯ３３３、ＰＲＯ３８１、ＰＲＯ７２０、ＰＲＯ８６６、ＰＲＯ８４０、ＰＲＯ９８２、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３５８、ＰＲＯ１３２５、ＰＲＯ１３３８、ＰＲＯ１４３４、ＰＲＯ４３３３、ＰＲＯ４３０２、ＰＲＯ４４３０又はＰＲＯ５７２７）のフィルターへのハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハート液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
次いで、全長天然配列ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０１５４】
実施例９
大腸菌におけるＰＲＯポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現によるＰＲＯポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を例示する。
ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Ｂｏｌｉｖａｒ等， Ｇｅｎｅ， ２：９５ （１９７７）を参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは制限酵素で消化され、脱リン酸化される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載された方法を用いた選択した大腸菌株の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培養は、続いて大規模培養の播種に用いられる。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離して採集することができる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＰＲＯポリペプチドタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製することができる。
以下の手法を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態でＰＲＯポリペプチドを発現させてもよい。ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ−Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用する。形質転換体は、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させる。ついで培養をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させる。試料を取り出してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により発現を確認し、バルク培養を遠心分離して細胞をペレット化する。細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させる。
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させる。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌する。この工程により、亜硫酸化によりブロックされた全てのシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされる。溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で４０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化する。条件に応じて、透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに充填する。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄する。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もる。
【０１５５】
試料を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中でゆっくりと希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択する。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌する。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％になるまで添加する。再折りたたみされたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかける。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールする。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたＰＲＯポリペプチドタンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去する。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に処方した。
【０１５６】
実施例１０
哺乳動物細胞でのＰＲＯポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＰＲＯポリペプチドの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開のＥＰ ３０７，２４７参照）を用いる。場合によっては、ＰＲＯＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、例えばｐＲＫ５−ＰＲＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化する。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯＤＮＡを約１μｇのＶＡＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ等， Ｃｅｌｌ， ３１：５４３ （１９８２））］と混合し、５００μＬの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させる。この混合物に、滴状の、５００μＬの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させる。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させる。培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加する。２９３細胞を、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートする。
形質移入の約２４時間後、培地を除去し、培地（単独）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換する。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに充填する。処理したゲルを乾燥させ、本発明のＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらす。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
これに換わる技術において、ｐＲＫ５−ＰＲＯは、Ｓｏｍｐａｒｙａｃ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １２：７５７５ （１９８１）に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去する。次いで発現された本発明のポリペプチドを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製する。
他の実施態様では、本発明のポリペプチドをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの既知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。本発明のポリペプチドの存在を決定した後、培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、本発明の発現されたＰＲＯを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製することができる。
また、本発明のエピトープタグポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。本発明の所望のポリペプチドをコードするＤＮＡはｐＲＫ５ベクター外でサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−Ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。本発明のポリ−ｈｉｓタグポリペプチド挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入することができる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。本発明の発現されたポリ−ｈｉｓタグポリペプチドを含む培地を、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【０１５７】
実施例１１
酵母菌でのＰＲＯの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然配列ＰＲＯシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）本発明のポリペプチドの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清を、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。本発明のポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
実施例１２
バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯの組換え発現を記載する。
ＰＲＯをコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、本発明のポリペプチド又はＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡのコード化配列の所望部分［例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列］が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、側方に位置する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商品名）ウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）中にリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙ等， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９４）に記載されているように実施する。
次に、本発明の発現されたポリ−ｈｉｓタグポリペプチドは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製することができる。抽出は、Ｒｕｐｅｒｔ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：１７５−１７９ （１９９３）に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させる。濾過した細胞抽出物を、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷する。カラムを分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄する。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開する。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）に抱合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析する。本発明の溶離したＨｉｓ１０−タグポリペプチドを含む画分をプールして負荷バッファーで透析する。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯポリペプチドの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１５８】
実施例１３
ＰＲＯに結合する抗体の調製
この実施例は、本発明のポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術はこの分野で知られており、例えば、上掲のＧｏｄｉｎｇに記載されている。用いられ得る免疫原は、本発明の精製ポリペプチド、本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質、及び細胞表面に本発明の組換えポリペプチドを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムの量で注入した本発明のポリペプチド免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｈ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）に乳化し、動物の後足蹠に注入する。免疫化したマウスを、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。本発明のポリペプチドに特異的な抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、本発明のポリペプチドの最後の静脈内注射を注入することができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【０１５９】
ハイブリドーマ細胞を、本発明のポリペプチド対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングする。本発明のポリペプチドに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗−ＰＲＯ２００、抗−ＰＲＯ２０４、抗−ＰＲＯ２１２、抗−ＰＲＯ２１６、抗−ＰＲＯ２２６、抗−ＰＲＯ２４０、抗−ＰＲＯ２３５、抗−ＰＲＯ２４５、抗−ＰＲＯ１７２、抗−ＰＲＯ２７３、抗−ＰＲＯ２７２、抗−ＰＲＯ３３２、抗−ＰＲＯ５２６、抗−ＰＲＯ７０１、抗−ＰＲＯ３６１、抗−ＰＲＯ３６２、抗−ＰＲＯ３６３、抗−ＰＲＯ３６４、抗−ＰＲＯ３５６、抗−ＰＲＯ５３１、抗−ＰＲＯ５３３、抗−ＰＲＯ１０８３、抗−ＰＲＯ８６５、抗−ＰＲＯ７７０、抗−ＰＲＯ７６９、抗−ＰＲＯ７８８、抗−ＰＲＯ１１１４、抗−ＰＲＯ１００７、抗−ＰＲＯ１１８４、抗−ＰＲＯ１０３１、抗−ＰＲＯ１３４６、抗−ＰＲＯ１１５５、抗−ＰＲＯ１２５０、抗−ＰＲＯ１３１２、抗−ＰＲＯ１１９２、抗−ＰＲＯ１２４６、抗−ＰＲＯ１２８３、抗−ＰＲＯ１１９５、抗−ＰＲＯ１３４３、抗−ＰＲＯ１４１８、抗−ＰＲＯ１３８７、抗−ＰＲＯ１４１０、抗−ＰＲＯ１９１７、抗−ＰＲＯ１８６８、抗−ＰＲＯ２０５、抗−ＰＲＯ２１、抗−ＰＲＯ２６９、抗−ＰＲＯ３４４、抗−ＰＲＯ３３３、抗−ＰＲＯ３８１、抗−ＰＲＯ７２０、抗−ＰＲＯ８６６、抗−ＰＲＯ８４０、抗−ＰＲＯ９８２、抗−ＰＲＯ８３６、抗−ＰＲＯ１１５９、抗−ＰＲＯ１３５８、抗−ＰＲＯ１３２５、抗−ＰＲＯ１３３８、抗−ＰＲＯ１４３４、抗−ＰＲＯ４３３３、抗−ＰＲＯ４３０２、抗−ＰＲＯ４４３０又は抗−ＰＲＯ５７２７モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１６０】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション， １０８０１  ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、ＶＡ２０１１０−２２０９米国（ＡＴＣＣ）に寄託した：
2004516227.tif 000087
2004516227.tif 000088
2004516227.tif 000089
【０１６１】
これらの寄託は、特許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則（特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む）に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】ＤＮＡ２９１０１−１２７６（配列番号：１）を示す図である。
【Ｆｉｇ２】天然配列ＰＲＯ２００ポリペプチドＵＮＱ１７４（配列番号：２）を示す図である。
【Ｆｉｇ３】ＤＮＡ３０８７１−１１５７（配列番号：１１）を示す図である。
【Ｆｉｇ４】天然配列部分長ＰＲＯ２０４ポリペプチドＵＮＱ１７８（配列番号：１２）を示す図である。
【Ｆｉｇ５】ＤＮＡ３０９４２−１１３４（配列番号：１３）を示す図である。
【Ｆｉｇ６】天然配列ＰＲＯ２１２ポリペプチドＵＮＱ１８６（配列番号：１４）を示す図である。
【Ｆｉｇ７】ＤＮＡ３３０８７−１１５８（配列番号：１８）を示す図である。
【Ｆｉｇ８】天然配列ＰＲＯ２１６ポリペプチドＵＮＱ１９０（配列番号：１９）を示す図である。
【Ｆｉｇ９】ＤＮＡ３３４６０−１１６６（配列番号：２０）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０】天然配列ＰＲＯ２２６ポリペプチドＵＮＱ２００（配列番号：２１）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１】ＤＮＡ３４３８７−１１３８（配列番号：２５）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２】天然配列ＰＲＯ２４０ポリペプチドＵＮＱ２１４（配列番号：２６）を示す図である。
【Ｆｉｇ１３】ＤＮＡ３５５５８−１１６７（配列番号：３０）を示す図である。
【Ｆｉｇ１４】天然配列ＰＲＯ２３５ポリペプチドＵＮＱ２０９（配列番号：３１）を示す図である。
【Ｆｉｇ１５】ＤＮＡ３５６３８−１１４１（配列番号：３５）を示す図である。
【Ｆｉｇ１６】天然配列ＰＲＯ２４５ポリペプチドＵＮＱ２１９（配列番号：３６）を示す図である。
【Ｆｉｇ１７】ＤＮＡ３５９１６−１１６１（配列番号：４０）を示す図である。
【Ｆｉｇ１８】天然配列ＰＲＯ１７２ポリペプチドＵＮＱ１４６（配列番号：４１）を示す図である。
【Ｆｉｇ１９】ＤＮＡ３９５２３−１１９２（配列番号：４５）を示す図である。
【Ｆｉｇ２０】天然配列ＰＲＯ２７３ポリペプチドＵＮＱ２４０（配列番号：４６）を示す図である。
【Ｆｉｇ２１】ＤＮＡ４０６２０−１１８３（配列番号：５０）を示す図である。
【Ｆｉｇ２２】天然配列ＰＲＯ２７２ポリペプチドＵＮＱ２３９（配列番号：５１）を示す図である。
【Ｆｉｇ２３】ＤＮＡ４０９８２−１２３５（配列番号：５６）を示す図である。
【Ｆｉｇ２４】天然配列ＰＲＯ３３２ポリペプチドＵＮＱ２９３（配列番号：５７）を示す図である。
【Ｆｉｇ２５】ＤＮＡ４４１８４−１３１９（配列番号：６１）を示す図である。
【Ｆｉｇ２６】天然配列ＰＲＯ５２６ポリペプチドＵＮＱ３３０（配列番号：６２）を示す図である。
【Ｆｉｇ２７】ＤＮＡ４４２０５−１２８５（配列番号：６６）を示す図である。
【Ｆｉｇ２８】天然配列ＰＲＯ７０１ポリペプチドＵＮＱ３６５（配列番号：６７）を示す図である。
【Ｆｉｇ２９】ＤＮＡ４５４１０−１２５０（配列番号：７１）を示す図である。
【Ｆｉｇ３０】天然配列ＰＲＯ３６１ポリペプチドＵＮＱ３１６（配列番号：７２）を示す図である。
【Ｆｉｇ３１】ＤＮＡ４５４１６−１２５１（配列番号：７９）を示す図である。
【Ｆｉｇ３２】天然配列ＰＲＯ３６２ポリペプチドＵＮＱ３１７（配列番号：８０）を示す図である。
【Ｆｉｇ３３】ＤＮＡ４５４１９−１２５２（配列番号：８６）を示す図である。
【Ｆｉｇ３４】天然配列ＰＲＯ３６３ポリペプチドＵＮＱ３１８（配列番号：８７）を示す図である。
【Ｆｉｇ３５】ＤＮＡ４７３６５−１２０６（配列番号：９１）を示す図である。
【Ｆｉｇ３６】天然配列ＰＲＯ３６４ポリペプチドＵＮＱ３１９（配列番号：９２）を示す図である。
【Ｆｉｇ３７】ＤＮＡ４７４７０−１１３０（配列番号：１０１）を示す図である。
【Ｆｉｇ３８】天然配列ＰＲＯ３５６ポリペプチドＵＮＱ３１３（配列番号：１０２）を示す図である。
【Ｆｉｇ３９】ＤＮＡ４８３１４−１３２０（配列番号：１０６）を示す図である。
【Ｆｉｇ４０】天然配列ＰＲＯ５３１ポリペプチドＵＮＱ３３２（配列番号：１０７）を示す図である。
【Ｆｉｇ４１】ＤＮＡ４９４３５−１２１９（配列番号：１１１）を示す図である。
【Ｆｉｇ４２】天然配列ＰＲＯ５３３ポリペプチドＵＮＱ３３４（配列番号：１１２）を示す図である。
【Ｆｉｇ４３】ＤＮＡ５０９２１−１４５８（配列番号：１１６）を示す図である。
【Ｆｉｇ４４】天然配列ＰＲＯ１０８３ポリペプチドＵＮＱ５４０（配列番号：１１７）を示す図である。
【Ｆｉｇ４５】ＤＮＡ５３９７４−１４０１（配列番号：１２３）を示す図である。
【Ｆｉｇ４６】天然配列ＰＲＯ８６５ポリペプチドＵＮＱ４３４（配列番号：１２４）を示す図である。
【Ｆｉｇ４７】ＤＮＡ５４２２８−１３６６（配列番号：１３３）を示す図である。
【Ｆｉｇ４８】天然配列ＰＲＯ７７０ポリペプチドＵＮＱ４０８（配列番号：１３４）を示す図である。
【Ｆｉｇ４９】ＤＮＡ５４２３１−１３６６（配列番号：１３９）を示す図である。
【Ｆｉｇ５０】天然配列ＰＲＯ７６９ポリペプチドＵＮＱ４０７（配列番号：１４０）を示す図である。
【Ｆｉｇ５１】ＤＮＡ５６４０５−１３５７（配列番号：１４１）を示す図である。
【Ｆｉｇ５２】天然配列ＰＲＯ７８８ポリペプチドＵＮＱ４３０（配列番号：１４２）を示す図である。
【Ｆｉｇ５３】ＤＮＡ５７０３３−１４０３（配列番号：１４３）を示す図である。
【Ｆｉｇ５４】天然配列ＰＲＯ１１１４ポリペプチドＵＮＱ５５７（配列番号：１４４）を示す図である。
【Ｆｉｇ５５】ＤＮＡ５７６９０−１３７４（配列番号：１４５）を示す図である。
【Ｆｉｇ５６】天然配列ＰＲＯ１００７ポリペプチドＵＮＱ４９１（配列番号：１４６）を示す図である。
【Ｆｉｇ５７】ＤＮＡ５９２２０−１５１４（配列番号：１４７）を示す図である。
【Ｆｉｇ５８】天然配列ＰＲＯ１１８４ポリペプチドＵＮＱ５９８（配列番号：１４８）を示す図である。
【Ｆｉｇ５９】ＤＮＡ５９２９４−１３８１（配列番号：１４９）を示す図である。
【Ｆｉｇ６０】天然配列ＰＲＯ１０３１ポリペプチドＵＮＱ５１６（配列番号：１５０）を示す図である。
【Ｆｉｇ６１】ＤＮＡ５９７７６−１６００（配列番号：１５１）を示す図である。
【Ｆｉｇ６２】天然配列ＰＲＯ１３４６ポリペプチドＵＮＱ７０１（配列番号：１５２）を示す図である。
【Ｆｉｇ６３】ＤＮＡ５９８４９−１５０４（配列番号：１５６）を示す図である。
【Ｆｉｇ６４】天然配列ＰＲＯ１１５５ポリペプチドＵＮＱ５８５（配列番号：１５７）を示す図である。
【Ｆｉｇ６５】ＤＮＡ６０７７５−１５３２（配列番号：１５８）を示す図である。
【Ｆｉｇ６６】天然配列ＰＲＯ１２５０ポリペプチドＵＮＱ６３３（配列番号：１５９）を示す図である。
【Ｆｉｇ６７】ＤＮＡ６１８７３−１５７４（配列番号：１６０）を示す図である。
【Ｆｉｇ６８】天然配列ＰＲＯ１３１２ポリペプチドＵＮＱ６７８（配列番号：１６１）を示す図である。
【Ｆｉｇ６９】ＤＮＡ６２８１４−１５２１（配列番号：１６２）を示す図である。
【Ｆｉｇ７０】天然配列ＰＲＯ１１９２ポリペプチドＵＮＱ６０６（配列番号：１６３）を示す図である。
【Ｆｉｇ７１】ＤＮＡ６４８８５−１５２９（配列番号：１６７）を示す図である。
【Ｆｉｇ７２】天然配列ＰＲＯ１２４６ポリペプチドＵＮＱ６３０（配列番号：１６８）を示す図である。
【Ｆｉｇ７３】ＤＮＡ６５４０４−１５５１（配列番号：１６９）を示す図である。
【Ｆｉｇ７４】天然配列ＰＲＯ１２８３ポリペプチドＵＮＱ６５３（配列番号：１７０）を示す図である。
【Ｆｉｇ７５】ＤＮＡ６５４１２−１５２３（配列番号：１７７）を示す図である。
【Ｆｉｇ７６】天然配列ＰＲＯ１１９５ポリペプチドＵＮＱ６０８（配列番号：１７８）を示す図である。
【Ｆｉｇ７７】ＤＮＡ６６６７５−１５８７（配列番号：１７９）を示す図である。
【Ｆｉｇ７８】天然配列ＰＲＯ１３４３ポリペプチドＵＮＱ６９８（配列番号：１８０）を示す図である。
【Ｆｉｇ７９】ＤＮＡ６８８６４−１６２９（配列番号：１８４）を示す図である。
【Ｆｉｇ８０】天然配列ＰＲＯ１４１８ポリペプチドＵＮＱ７３２（配列番号：１８５）を示す図である。
【Ｆｉｇ８１】ＤＮＡ６８８７２−１６２０（配列番号：１８６）を示す図である。
【Ｆｉｇ８２】天然配列ＰＲＯ１３８７ポリペプチドＵＮＱ７２２（配列番号：１８７）を示す図である。
【Ｆｉｇ８３】ＤＮＡ６８８７４−１６２２（配列番号：１８８）を示す図である。
【Ｆｉｇ８４】天然配列ＰＲＯ１４１０ポリペプチドＵＮＱ７２８（配列番号：１８９）を示す図である。
【Ｆｉｇ８５】ＤＮＡ７６４００−２５２８（配列番号：１９０）を示す図である。
【Ｆｉｇ８６】天然配列ＰＲＯ１９１７ポリペプチドＵＮＱ９００（配列番号：１９１）を示す図である。
【Ｆｉｇ８７】ＤＮＡ７７６２４−２５１５（配列番号：１９２）を示す図である。
【Ｆｉｇ８８】天然配列ＰＲＯ１８６８ポリペプチドＵＮＱ８５９（配列番号：１９３）を示す図である。
【Ｆｉｇ８９】ＤＮＡ３０８６８−１１５６（配列番号：２２８）を示す図である。
【Ｆｉｇ９０】部分天然配列ＰＲＯ２０５ポリペプチドＵＮＱ１７９（配列番号：２２９）を示す図である。
【Ｆｉｇ９１】ＤＮＡ３６６３８−１０５６（配列番号：２３０）を示す図である。
【Ｆｉｇ９２】天然配列ＰＲＯ２１ポリペプチドＵＮＱ２１（配列番号：２３１）を示す図である。
【Ｆｉｇ９３】ＤＮＡ３８２６０−１１８０（配列番号：２３２）を示す図である。
【Ｆｉｇ９４】天然配列ＰＲＯ２６９ポリペプチドＵＮＱ２３６（配列番号：２３３）を示す図である。
【Ｆｉｇ９５】ＤＮＡ４０５９２−１２４２（配列番号：２４０）を示す図である。
【Ｆｉｇ９６】天然配列ＰＲＯ３４４ポリペプチドＵＮＱ３０３（配列番号：２４１）を示す図である。
【Ｆｉｇ９７】ＤＮＡ４１３７４−１３１２（配列番号：２４８）を示す図である。
【Ｆｉｇ９８】部分長天然配列ＰＲＯ３３３ポリペプチドＵＮＱ２９４（配列番号：２４９）を示す図である。
【Ｆｉｇ９９】ＤＮＡ４４１９４−１３１７（配列番号：２５０）を示す図である。
【Ｆｉｇ１００】天然配列ＰＲＯ３８１ポリペプチドＵＮＱ３２２（配列番号：２５１）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０１】ＤＮＡ５３５１７−１３６６（配列番号：２５５）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０２】天然配列ＰＲＯ７２０ポリペプチドＵＮＱ３８８（配列番号：２５６）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０３】ＤＮＡ５３９７１−１３５９（配列番号：２５７）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０４】天然配列ＰＲＯ８６６ポリペプチドＵＮＱ４３５（配列番号：２５８）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０５】ＤＮＡ５３９８７−１４３８（配列番号：２６６）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０６】天然配列ＰＲＯ８４０ポリペプチドＵＮＱ４３３（配列番号：２６７）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０７】ＤＮＡ５７７００−１４０８（配列番号：２６８）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０８】天然配列ＰＲＯ９８２ポリペプチドＵＮＱ４８３（配列番号：２６９）を示す図である。
【Ｆｉｇ１０９】ＤＮＡ５９６２０−１４６３（配列番号：２７０）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１０】天然配列ＰＲＯ８３６ポリペプチドＵＮＱ５４５（配列番号：２７１）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１１】ＤＮＡ６０６２７−１５０８（配列番号：２７２）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１２】天然配列ＰＲＯ１１５９ポリペプチドＵＮＱ５８９（配列番号：２７３）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１３】ＤＮＡ６４８９０−１６１２（配列番号：２７４）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１４】天然配列ＰＲＯ１３５８ポリペプチドＵＮＱ７０７（配列番号：２７５）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１５】ＤＮＡ６６６５９−１５９３（配列番号：２７６）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１６】天然配列ＰＲＯ１３２５ポリペプチドＵＮＱ６８５（配列番号：２７７）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１７】ＤＮＡ６６６６７−１５９６（配列番号：２７８）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１８】天然配列ＰＲＯ１３３８ポリペプチドＵＮＱ６９３（配列番号：２７９）を示す図である。
【Ｆｉｇ１１９】ＤＮＡ６８８１８−２５３６（配列番号：２８０）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２０】天然配列ＰＲＯ１４３４ポリペプチドＵＮＱ７３９（配列番号：２８１）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２１】ＤＮＡ８４２１０−２５７６（配列番号：２８５）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２２】天然配列ＰＲＯ４３３３ポリペプチドＵＮＱ１８８８（配列番号：２８６）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２３】ＤＮＡ９２２１８−２５５４（配列番号：２９２）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２４】天然配列ＰＲＯ４３０２ポリペプチドＵＮＱ１８６６（配列番号：２９３）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２５】ＤＮＡ９６８７８−２６２６（配列番号：２９４）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２６】天然配列ＰＲＯ４４３０ポリペプチドＵＮＱ１９４７（配列番号：２９５）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２７】ＤＮＡ９８８５３−１７３９（配列番号：２９６）を示す図である。
【Ｆｉｇ１２８】天然配列ＰＲＯ５７２７ポリペプチドＵＮＱ２４４８（配列番号：２９７）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９６】
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【図９８】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０４】
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【図１０６】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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