(57)【要約】本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野である。本発明は、一般的に、逆転写酵素、および核酸分子（特に、メッセンジャーＲＮＡ分子）を逆転写する方法に関する。特に、本発明は、耐熱性を増大させ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を減少させ、および／または忠実度を増大させるように変異または改変されている逆転写酵素、ならびにこれらの逆転写酵素または組成物を用いて核酸分子（特に、ｃＤＮＡ分子）を生成、増幅、または配列決定する方法に関する。本発明はまた、これらの方法によって生成された核酸分子および望ましいポリペプチドを生成するためのこのような核酸分子の使用に関する。本発明はまた、このような酵素を含むキットまたは組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
耐熱性を増大させるか、または向上するように改変または変異されている逆転写酵素。
【請求項２】
以下からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上の改変または変異を有する、請求項１記載の逆転写酵素：
（ａ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のロイシン５２；
（ｂ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のチロシン６４；
（ｃ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のリジン１５２；
（ｄ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のヒスチジン２０４；
（ｅ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のメチオニン２８９；および
（ｆ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のスレオニン３０６。
【請求項３】
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である、請求項２記載の逆転写酵素。
【請求項４】
ロイシン５２がプロリンで置換されている、請求項３記載の逆転写酵素。
【請求項５】
チロシン６４がアルギニンで置換されている、請求項３記載の逆転写酵素。
【請求項６】
リジン１５２がメチオニンで置換されている、請求項３記載の逆転写酵素。
【請求項７】
ヒスチジン２０４がアルギニンで置換されている、請求項３記載の逆転写酵素。
【請求項８】
メチオニン２８９がロイシンで置換されている、請求項３記載の逆転写酵素。
【請求項９】
スレオニン３０６がリジンまたはアルギニンのいずれかで置換されている、請求項３記載の逆転写酵素。
【請求項１０】
アミノ酸ヒスチジン２０４およびスレオニン３０６で変異または改変を有する、請求項３記載の逆転写酵素。
【請求項１１】
ヒスチジン２０４がアルギニンで置換され、スレオニン３０６がリジンまたはアルギニンのいずれかで置換されている、請求項１０記載の逆転写酵素。
【請求項１２】
５分間５０℃に加熱した後に逆転写酵素活性の少なくとも５０％を保持する、請求項１記載の逆転写酵素。
【請求項１３】
５分間５０℃に加熱した後に逆転写酵素活性の少なくとも７０％を保持する、請求項１記載の逆転写酵素。
【請求項１４】
５分間５０℃に加熱した後に逆転写酵素活性の少なくとも８５％を保持する、請求項１記載の逆転写酵素。
【請求項１５】
５分間５０℃に加熱した後に逆転写酵素活性の少なくとも９５％を保持する、請求項１記載の逆転写酵素。
【請求項１６】
以下からなる群より選択される１つまたはそれ以上の特性を有する、請求項１記載の逆転写酵素：
（ａ）低下した、または実質的に低下したＲＮａｓｅＨ活性；
（ｂ）低下した、または実質的に低下したターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性；および
（ｃ）増大した忠実度。
【請求項１７】
低下した、または実質的に低下したＲＮａｓｅＨ活性を有する、請求項１６記載の逆転写酵素。
【請求項１８】
低下した、または実質的に低下したターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する、請求項１６記載の逆転写酵素。
【請求項１９】
以下からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に１つまたはそれ以上の改変または変異を有する、請求項１８記載の逆転写酵素：
（ａ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のチロシン１３３；
（ｂ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のスレオニン１９７；および
（ｃ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のフェニルアラニン３０９。
【請求項２０】
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である、請求項１９記載の逆転写酵素。
【請求項２１】
チロシン１３３がアラニンで置換されている、請求項２０記載の逆転写酵素。
【請求項２２】
スレオニン１９７がグルタミン酸で置換されている、請求項２０記載の逆転写酵素。
【請求項２３】
フェニルアラニン３０９がアスパラギンで置換されている、請求項２０記載の逆転写酵素。
【請求項２４】
増大した忠実度を有する、請求項１６記載の逆転写酵素。
【請求項２５】
以下からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に１つまたはそれ以上の改変または変異を有する、請求項２４記載の逆転写酵素：
（ａ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のチロシン６４；
（ｂ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアルギニン１１６；
（ｃ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のグルタミン１９０；および
（ｄ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のバリン２２３。
【請求項２６】
Ｍ−ＭＬＶ、ＲＳＶ、ＡＭＶ、およびＨＩＶ逆転写酵素からなる群より選択される、請求項１記載の逆転写酵素。
【請求項２７】
Ｍ−ＭＬＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＲＳＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＡＭＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＲＡＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、およびＨＩＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素からなる群より選択される、請求項２６記載の逆転写酵素。
【請求項２８】
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素である、請求項２６記載の逆転写酵素。
【請求項２９】
アスパラギン酸５２４がグリシンで置換され、グルタミン酸５６２がグルタミンで置換され、アスパラギン酸５８３がアスパラギンで置換されている、請求項２８記載の逆転写酵素。
【請求項３０】
請求項１記載の逆転写酵素をコードする核酸を含むベクター。
【請求項３１】
核酸がプロモーターに機能的に連結されている、請求項３０記載のベクター。
【請求項３２】
プロモーターが、λ−ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ａｒａ ＢＡＤプロモーター、およびｔｒｃプロモーターからなる群より選択される、請求項３１記載のベクター。
【請求項３３】
請求項３０記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３４】
逆転写酵素を生成する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）請求項３３記載の宿主細胞を培養する段階；
（ｂ）核酸を発現させる段階；および
（ｃ）宿主細胞から逆転写酵素を単離する段階。
【請求項３５】
宿主細胞が大腸菌である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
１つまたはそれ以上の核酸分子を逆転写する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）１つまたはそれ以上の核酸鋳型と、請求項１記載の１つまたはそれ以上の逆転写酵素を混合する段階；および
（ｂ）１つまたはそれ以上の鋳型の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、（ａ）の混合物をインキュベートする段階。
【請求項３７】
核酸鋳型がメッセンジャーＲＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子の集団である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
１つまたはそれ以上の第１の核酸分子の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、１つまたはそれ以上の第１の核酸分子をインキュベートする段階をさらに含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
請求項３６記載の方法に従って作製されたｃＤＮＡ分子。
【請求項４０】
請求項３８記載の方法に従って作製されたｃＤＮＡ分子。
【請求項４１】
１つまたはそれ以上の核酸分子を増幅する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）１つまたはそれ以上の核酸鋳型を、請求項１記載の１つまたはそれ以上の逆転写酵素および１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを混合する段階；および
（ｂ）１つまたはそれ以上の鋳型の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、（ａ）の混合物をインキュベートする段階。
【請求項４２】
１つまたはそれ以上の核酸分子を配列決定する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）配列決定しようとする１つまたはそれ以上の核酸分子と、１つまたはそれ以上のプライマー、請求項１記載の１つまたはそれ以上の逆転写酵素、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および１つまたはそれ以上の反応停止薬剤を混合する段階；（ｂ）配列決定しようとする１つまたはそれ以上の分子の全てまたは一部と相補的な分子の集団を合成するのに十分な条件下で、（ａ）の混合物をインキュベートする段階；および
（ｃ）集団を分離して、配列決定しようとする１つまたはそれ以上の分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する段階。
【請求項４３】
核酸分子を配列決定する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）配列決定しようとする核酸分子と、１つまたはそれ以上のプライマー、請求項１記載の１つまたはそれ以上の逆転写酵素、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および１つまたはそれ以上の反応停止薬剤を混合する段階；
（ｂ）配列決定しようとする分子の全てまたは一部と相補的な分子の集団を合成するのに十分な条件下で、（ａ）の混合物をインキュベートする段階；および
（ｃ） 集団の一員を分離して、配列決定しようとする分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する段階。
【請求項４４】
請求項１記載の１つまたはそれ以上の逆転写酵素を含む、核酸分子の逆転写、増幅、または配列決定において使用するためのキット。
【請求項４５】
１つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、１つまたはそれ以上のプライマー、および１つまたはそれ以上の反応停止薬剤からなる群より選択される１つまたはそれ以上の成分をさらに含む、請求項４４記載のキット。
【請求項４６】
反応停止薬剤がジデオキシヌクレオチドである、請求項４５記載のキット。
【請求項４７】
逆転写酵素がＭ−ＭＬＶ逆転写酵素である、請求項４４記載のキット。
【請求項４８】
逆転写酵素が、以下からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に１つまたはそれ以上の改変または変異を有する、請求項４７記載のキット：
（ａ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のロイシン５２；
（ｂ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のチロシン６４；
（ｃ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のリジン１５２；
（ｄ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアルギニン２０４；
（ｅ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のメチオニン２８９；および
（ｆ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のスレオニン３０６。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
従来の技術
発明の属する技術分野
本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野である。本発明は、一般的に、逆転写酵素、および核酸分子（特に、メッセンジャーＲＮＡ分子）を逆転写する方法に関する。特に、本発明は、耐熱性を増大させ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を減少させ、および／または忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）を増大させるように変異または改変されている逆転写酵素、ならびにこれらの逆転写酵素または組成物を用いて核酸分子（特に、ｃＤＮＡ分子）を生成、増幅、または配列決定する方法に関する。本発明はまた、これらの方法によって生成された核酸分子および望ましいポリペプチドを生成するためのこのような核酸分子の使用に関する。本発明はまた、このような酵素を含むキットまたは組成物に関する。
【０００２】
関連技術
ｃＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラリー
生物、組織、または細胞の構造および生理学を調べる際に、多くの場合、その遺伝的な内容を決定することが望ましい。生物の遺伝的な枠組みは、生物の体細胞および生殖細胞に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のヌクレオチド塩基の二本鎖配列にコードされている。ＤＮＡの特定のセグメントすなわち遺伝子の遺伝的な内容は、一般的に、その遺伝子がコードするタンパク質が産生されると明らかになる。タンパク質を産生するために、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖の相補的コピーがＲＮＡポリメラーゼ酵素によって生成され、特殊なリボ核酸（ＲＮＡ）配列が生じる。この特殊なタイプのＲＮＡは、タンパク質産生のためのＤＮＡからの遺伝的メッセージを含むのでメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と呼ばれる。
【０００３】
ある特定の細胞、組織、または生物には、無数のｍＲＮＡ種が存在し、それぞれが別々の、かつ特定のタンパク質をコードする。この事は、組織または細胞における遺伝子発現の研究に関心を持つ研究者に強力なツールをもたらす。ｍＲＮＡ分子は単離し、さらに、様々な分子生物学的技法によって操作することができ、それによって、細胞、組織、または生物の完全な機能的な遺伝的内容の解明が可能になる。
【０００４】
遺伝子発現研究の１つの一般的なアプローチは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンの作製である。この技法では、生物に由来するｍＲＮＡ分子を、その生物の細胞または組織の抽出物から単離する。この単離では、多くの場合、チミジン（Ｔ）オリゴマーが複合体化している固形のクロマトグラフィーマトリックス（例えば、セルロースまたはアガロース）を使用する。ほとんどの真核生物ｍＲＮＡ分子の３’末端はアデノシン（Ａ）塩基の連なりを含み、ＡはＴと塩基対を形成するので、ｍＲＮＡ分子は、組織または細胞抽出物中の他の分子および物質から迅速に精製することができる。これらの精製されたｍＲＮＡ分子から、一本鎖ｃＤＮＡ分子を生成する逆転写酵素（ＲＴ）を用いてｃＤＮＡコピーを作製することができる。この反応は一般的に第１鎖反応と呼ばれる。次いで、ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、一本鎖ｃＤＮＡを元のｍＲＮＡ（従って、生物ゲノムに含まれる、このｍＲＮＡをコードする元の二本鎖ＤＮＡ配列）の完全な二本鎖ＤＮＡコピー（すなわち、二本鎖ｃＤＮＡ）に変換することができる。次いで、このタンパク質特異的二本鎖ｃＤＮＡをプラスミドまたはウイルスベクターに挿入することができ、次いで、宿主である細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、または植物細胞に導入する。次いで、宿主細胞を培養培地中で増殖させ、関心対象の遺伝子を含む（または、多くの場合、関心対象の遺伝子を発現する）宿主細胞の集団が得られる。
【０００５】
供給源の生物または組織からのｍＲＮＡの単離から、プラスミドまたはベクターへのｃＤＮＡの挿入、単離された遺伝子を含む宿主細胞集団の増殖までの、この全プロセスは「ｃＤＮＡクローニング」と呼ばれる。ある特定のｍＲＮＡ供給源から調製されたｃＤＮＡセットは「ｃＤＮＡライブラリー」と呼ばれる。ｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡクローンは、供給源の組織において転写される遺伝子に対応する。ｃＤＮＡライブラリーを分析すると、ｃＤＮＡライブラリーが得られた生物または組織における遺伝子発現パターンに関する多くの情報を得ることができる。
【０００６】
レトロウイルス逆転写酵素
レトロウイルス逆転写酵素の３つのプロトタイプ形態が徹底的に研究されている。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅＨ活性を有する７８ｋＤａのシングルサブユニットを含む。この酵素はクローニングされ、大腸菌において完全に活性を有する形態で発現されている（プラサド（Ｐｒａｓａｄ），Ｖ．Ｒ．，「逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１３５頁（１９９３）に概説される）。ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素はｐ６６およびｐ５１サブユニットからなるヘテロ二量体であり、ここで小さな方のサブユニットは大きな方のサブユニットからタンパク質分解によって得られる。ｐ６６サブユニットはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼドメインおよびＲＮａｓｅＨドメインの両方を有するのに対して、ｐ５１サブユニットはＤＮＡポリメラーゼドメインのみを有する。活性型ＨＩＶ ｐ６６／ｐ５１逆転写酵素がクローニングされ、大腸菌を含む多数の発現宿主において首尾よく発現されている（レグリス（Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ），Ｓ．Ｆ．Ｊ．，「逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，１６３頁（１９９３）に概説される）。ＨＩＶ ｐ６６／ｐ５１ヘテロ二量体内で、５１ｋＤサブユニットは触媒的に不活性であり、６６ｋＤサブユニットはＤＮＡポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅＨ活性を両方とも有する（レグリス，Ｓ．Ｆ．Ｊ．ら，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １０：３９０５（１９９１）；ホストムスキー（Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ），Ｚ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３１７９（１９９２））。鳥類肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）逆転写酵素（これにはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、鳥類赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ逆転写酵素、鳥類骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ逆転写酵素、鳥類細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ逆転写酵素、鳥類肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ逆転写酵素、鳥類肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、および骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない）もまた、２つのサブユニットα（約６２ｋＤａ）およびβ（約９４ｋＤａ）からなるヘテロ二量体であり、ここで、αはタンパク質切断によってβから得られる（プラサド，Ｖ．Ｒ．，「逆転写酵素」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３），１３５頁に概説される）。ＡＳＬＶ逆転写酵素は、２つのさらなる触媒的に活性な構造形態ββおよびαで存在することがある（ハイジ（Ｈｉｚｉ），Ａ．およびジョクリック（Ｊｏｋｌｉｋ），Ｗ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２２８１（１９７７））。沈降分析は、αβおよびββが二量体であり、α形態が単量体形態と二量体形態との平衡状態で存在することを示唆している（グランゲネット（Ｇｒａｎｄｇｅｎｅｔｔ），Ｄ．Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７０：２３０（１９７３）；ハイジ，Ａ．およびジョクリック，Ｗ．Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：２２８１（１９７７）；ならびにソルティス（Ｓｏｌｔｉｓ），Ｄ．Ａ．およびスカルカ（Ｓｋａｌｋａ），Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３７２（１９８８））。ＡＳＬＶαβおよびββ逆転写酵素は、同じタンパク質複合体に３つの異なる活性：ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅＨ活性、およびＤＮＡエンドヌクレアーゼ（インテグラーゼ）活性を含むレトロウイルス逆転写酵素の唯一知られている例である（スカルカ，Ａ．Ｍ．，「逆転写酵素」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３），１９３頁に概説される）。α形態はインテグラーゼドメインおよび活性を欠いている。
【０００７】
ＡＳＬＶ逆転写酵素の個々のサブユニットの様々な形態がクローニングおよび発現されている。これらの形態として、通常、タンパク質分解によってβに処理される９８ｋＤａ前駆体ポリペプチドおよびβカルボキシ末端から除去される４ｋＤａポリペプチド（アレクサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ），Ｆ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：５３４（１９８７）およびアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ），Ｄ．ら，Ｆｏｃｕｓ １７：５３（１９９５））、成熟βサブユニット（ウェイス（Ｗｅｉｓ），Ｊ．Ｈ．およびサルストロム（Ｓａｌｓｔｒｏｍ），Ｊ． Ｓ．，米国特許第４，６６３，２９０号（１９８７）、ソルティス，Ｄ．Ａ．およびスカルカ，Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３７２（１９８８））が挙げられる。（ウェルナー（Ｗｅｒｎｅｒ）Ｓ．およびウォール（Ｗｏｈｒｌ）Ｂ．Ｍ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：４７４０−４７４４（２０００）；ウェルナーＳ．およびウォールＢ．Ｍ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３２４５−３２５２（２０００）；ウェルナーＳ．およびウォールＢ．Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２６３２９−２６３３６（１９９９）も参照のこと）。ヘテロ二量体ＲＳＶαβ逆転写酵素はまた、クローニングされたＲＳＶβ遺伝子を発現する大腸菌細胞から精製されている（ケルノフ（Ｃｈｅｒｎｏｖ），Ａ．Ｐ．ら，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２：４９（１９９１））。
【０００８】
逆転写の効率
前述のように、逆転写酵素を介した逆転写によるｍＲＮＡからｃＤＮＡの変換は、クローニングされた遺伝子から発現されるタンパク質の研究において必須の段階である。しかしながら、逆転写を触媒するために、改変されていない逆転写酵素を使用することは多くの理由から非効率である。第一に、時として、逆転写酵素は、主として、逆転写酵素に存在する本来備わっているＲＮａｓｅＨ活性のために、第１鎖反応が開始または完了する前にＲＮＡ鋳型を分解する。さらに、ｍＲＮＡ鋳型分子のミスプライミング（ｍｉｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）がｃＤＮＡ第１鎖への誤りの導入につながることがあり、その一方で、ｍＲＮＡ分子自体の二次構造が一部のｍＲＮＡに第１鎖合成を行えなくすることがある。
【０００９】
逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性を除去すると第１の問題が無くなり、逆転写の効率が改善される（ジェラルド（Ｇｅｒａｒｄ），Ｇ．Ｆ．ら，ＦＯＣＵＳ １１（４）：６０（１９８９）；ジェラルド，Ｇ．Ｆ．ら，ＦＯＣＵＳ １４（３）：９１（１９９２））。しかしながら、このような逆転写酵素ｓ（「ＲＮａｓｅＨ−」形態）は、ミスプライミングおよびｍＲＮＡ二次構造のさらなる問題に対処しない。
【００１０】
逆転写の効率に影響を及ぼす別の要因はＲＮＡが二次構造を形成する能力である。例えば、ＲＮＡ分子の領域がハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、二本鎖ＲＮＡを形成する場合に、このような二次構造が形成することがある。一般的に、ＲＮＡ分子を含む溶液の温度を上げることによって、ＲＮＡの二次構造の形成を減らすことができる。従って、多くの場合、３７℃を超える温度でＲＮＡを逆転写することが望ましい。しかしながら、当技術分野で既知の逆転写酵素は、３７℃よりかなり上の温度（例えば、５０℃）でインキュベートされると一般的に活性を失う。
【００１１】
発明の概要
本発明は、前記の逆転写の制限を乗り越えるのに有用な逆転写酵素、このような酵素を含む組成物、および方法を提供する。一般的に、本発明は、本発明の逆転写酵素活性を有する１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５など）ポリペプチドを含む、核酸分子の逆転写に使用するための組成物を提供する。このような組成物は、さらに、１つもしくはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５など）ヌクレオチド、適切な緩衝液、および／または１つもしくはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５など）ＤＮＡポリメラーゼを含んでもよい。本発明の組成物はまた、１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５など）オリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよい。
【００１２】
本発明の逆転写酵素は、好ましくは、酵素の耐熱性が増大または向上するように改変または変異されている。特定の態様において、本発明の逆転写酵素は一本鎖（シングルサブユニット）でもよく、複数の鎖（マルチサブユニット）でもよく、ＲＮａｓｅＨ活性が低下していてもよく、実質的に低下していてもよい。好ましくは、本発明の酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素または他のＡＳＬＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、およびヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ならびにその変異体からなる群より選択される酵素である。好ましい組成物において、逆転写酵素は作用濃度で存在する。
【００１３】
ある局面において、本発明は、耐熱性を増大させるか、または向上するように改変または変異されている逆転写酵素を含む。このような逆転写酵素の例として、以下からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上の改変または変異を有する酵素が挙げられる：
（ａ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のロイシン５２；
（ｂ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のチロシン６４；
（ｃ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のリジン１５２；
（ｄ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のヒスチジン２０４；
（ｅ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のメチオニン２８９；および
（ｆ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のスレオニン３０６。
【００１４】
特定の態様において、本発明は、ロイシン５２がプロリンで置換され、チロシン６４がアルギニンで置換され、リジン１５２がメチオニンで置換され、ヒスチジン２０４がアルギニンで置換され、メチオニン２８９がロイシンで置換され、および／またはスレオニン３０６がリジンもしくはアルギニンのいずれかで置換されているＭ−ＭＬＶ逆転写酵素に関する。さらに、前記のアミノ酸置換に対応する変化を含む、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素以外の逆転写酵素が本発明の範囲内に含まれる。
【００１５】
さらなる局面において、本発明はまた、５分間５０℃に加熱した後に、逆転写酵素活性の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％を保持する耐熱性逆転写酵素を含む。
【００１６】
前述のように、本発明の酵素は、多量体（例えば、二量体）を形成すると、または個々のタンパク質分子として（すなわち、単量体の形で）逆転写酵素活性を示す逆転写酵素を含む。多量体を形成すると逆転写酵素活性を示す逆転写酵素の例として、ＡＭＶ、ＲＳＶ、およびＨＩＶ逆転写酵素が挙げられる。別々の個々のタンパク質として（すなわち、単量体の形で）逆転写酵素活性を示す逆転写酵素の一例はＭ−ＭＬＶ逆転写酵素である。
【００１７】
本発明の多量体逆転写酵素は、ホモ多量体を形成してもよくヘテロ多量体を形成してもよい。言い換えると、多量体タンパク質複合体のサブユニットは同一でもよく異なってもよい。ヘテロ二量体逆転写酵素の一例は、一次アミノ酸配列が異なる２つのサブユニットからなるＡＭＶ逆転写酵素である。より詳細には、既に述べたように、ＡＭＶ逆転写酵素は、これらのサブユニットの一方が他方のサブユニットのタンパク質分解処理によって生成される２つのサブユニットからなってもよい。従って、二量体ＡＭＶ逆転写酵素は、アミノ酸配列同一性の領域を共有するサイズが異なるサブユニットからなってもよい。
【００１８】
本発明は、特に、変異も改変もされていない逆転写酵素と比較して核酸合成において酵素を耐熱性にする１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０など）アミノ酸変化が加えられている、逆転写酵素変異体または改変された逆転写酵素に関する。表１に、本発明の耐熱性逆転写酵素および／または他の特徴（例えば、忠実度の増大、ＴｄＴ活性の減少など）を示す逆転写酵素を生成するための変異または改変の部位を一部の逆転写酵素について列挙する。表１に示した改変は、好ましくは、本発明の耐熱性逆転写酵素を生じる。さらなる耐熱性逆転写酵素ならびに他の特徴（例えば、忠実度の増大、ＴｄＴ活性の減少など）を示す逆転写酵素を生成するために、他の逆転写酵素における類似部位もしくは等価な部位または対応する部位を変異または改変することができる。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
前記で特定された位置で異なるアミノ酸を有する逆転写酵素を、異なるウイルス分離株がコードし得ることを当業者は理解するだろう。このような分離株は、本発明の耐熱性逆転写酵素を生成するように改変することができる。
【００２１】
本発明の耐熱性逆転写酵素はまた、以下の１つまたはそれ以上の特性を有してもよい：（ａ）低下した、もしくは実質的に低下したＲＮａｓｅＨ活性、（ｂ）低下した、もしくは実質的に低下したターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、および／または（ｃ）増大した忠実度。
【００２２】
低下した、または実質的に低下したターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を有する本発明の酵素は、以下からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に１つまたはそれ以上の改変または変異を有してもよい：
（ａ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のチロシン１３３；
（ｂ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のスレオニン１９７；および
（ｃ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のフェニルアラニン３０９。
【００２３】
特定の態様において、本発明は、チロシン１３３がアラニンで置換され、スレオニン１９７がグルタミン酸で置換され、および／またはフェニルアラニン３０９がアスパラギンで置換されているＭ−ＭＬＶ逆転写酵素に関する。さらに、前記のアミノ酸置換に対応する変化を含む、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素以外の逆転写酵素が本発明の範囲内に含まれる。
【００２４】
他のある特定の態様において、本発明の逆転写酵素は、ヒスチジン２０４のアルギニンへの変異（Ｈ２０４Ｒ）とスレオニン３０６のリジンへの変異（Ｔ３０６Ｋ）を組み合わせた逆転写酵素；Ｈ２０４ＲおよびＴ３０６Ｋとフェニルアラニン３０９のアスパラギンへの変異（Ｆ３０９Ｎ）を組み合わせた逆転写酵素；ならびにＨ２０４Ｒ、Ｔ３０６Ｋ、およびＦ３０９Ｎとバリン２２３のヒスチジンへの変異（Ｖ２２３Ｈ）を組み合わせた逆転写酵素などの変異の特定の組み合わせを含まない可能性がある。
【００２５】
さらに、増大した忠実度を示す酵素は、以下からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に１つまたはそれ以上の改変または変異を有してもよい：
（ａ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のチロシン６４；
（ｂ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアルギニン１１６；
（ｃ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のグルタミン１９０；および
（ｄ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のバリン２２３。
【００２６】
特定の態様において、本発明の逆転写酵素は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、および／またはＲＳＶ逆転写酵素を含まない可能性がある。従って、例えば、ある態様において、本発明は、ＨＩＶ逆転写酵素でない、耐熱性が増大した逆転写酵素に関する。他の態様において、本発明は、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素でない、耐熱性が増大した逆転写酵素に関する。さらに他の態様において、本発明は、ＡＭＶ逆転写酵素でない、耐熱性が増大した逆転写酵素に関する。さらに他の態様において、本発明は、ＲＳＶ逆転写酵素でない、耐熱性が増大した逆転写酵素に関する。
【００２７】
本発明はまた、本発明の逆転写酵素変異体または改変された逆転写酵素をコードする遺伝子または核酸を含む核酸分子（例えば、ベクター）およびこのようなＤＮＡまたは他の核酸分子を含む宿主細胞に関する。関心対象の遺伝子または核酸分子を発現するために、原核細胞および真核細胞を含む任意の数の宿主細胞を使用することができる。特定の態様において、本発明の逆転写酵素を発現するために原核細胞が用いられる。本発明との使用に適した原核生物宿主の一例は、大腸菌である。本発明との使用に適した真核生物宿主の例として、菌類細胞（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞など）、植物細胞、および動物細胞（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９およびＳｆ２１細胞、トリコプルサハイファイブ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ）細胞、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）細胞、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞など）が挙げられる。
【００２８】
本発明はまた、本発明の逆転写酵素を生成する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）本発明の逆転写酵素をコードする遺伝子または他の核酸分子を含む宿主細胞を培養する段階（好ましくは、このような逆転写酵素の遺伝子または他の核酸分子は宿主細胞内においてベクターに含まれる）；
（ｂ）該遺伝子または該核酸分子を発現させる段階；および
（ｃ）宿主細胞から該逆転写酵素を単離する段階。
【００２９】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）核酸分子を作製する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）核酸鋳型（好ましくは、１つまたはそれ以上のＲＮＡ鋳型、最も好ましくは、１つまたはそれ以上のメッセンジャーＲＮＡ鋳型）と１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５など）本発明の逆転写酵素を混合する段階；および１つまたはそれ以上の核酸鋳型の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階。ある態様において、混合物は高温でインキュベートされる。特定の態様において、高温は、約４０℃以上、約４５℃以上、約５０℃以上、約５１℃以上、約５２℃以上、約５３℃以上、約５４℃以上、約５５℃以上、約５６℃以上、約５７℃以上、約５８℃以上、約５９℃以上、約６０℃以上、約６１℃以上、約６２℃以上、約６３℃以上、約６４℃以上、約６５℃以上、約６６℃以上、約６７℃以上、約６８℃以上、約６９℃以上、約７０℃以上、約７１℃以上、約７２℃以上、約７３℃以上、約７４℃以上、約７５℃以上、約７６℃以上、約７７℃以上、または約７８℃以上からの温度でもよく、約３７℃〜約７５℃、約４０℃〜約７５℃、約４５℃〜約７５℃、約５０℃〜約７５℃、約５１℃〜約７５℃、約５２℃〜約７５℃、約５３℃〜約７５℃、約５４℃〜約７５℃、約５５℃〜約７５℃の温度範囲でもよい。他の態様において、高温は、約５０℃〜約７０℃、約５１℃〜約７０℃、約５２℃〜約７０℃、約５３℃〜約７０℃、約５４℃〜約７０℃、約５５℃〜約７０℃、約５５℃〜約６５℃、約５６℃〜約６５℃、約５６℃〜約６４℃、または約５６℃〜約６２℃の範囲内である。他の態様において、高温は、約４５℃〜約６０℃、約４６℃〜約６０℃、約４７℃〜約６０℃、約４８℃〜約６０℃、約４９℃〜約６０℃、約５０℃〜約６０℃、約５１℃〜約６０℃、約５２℃〜約６０℃、約５３℃〜約６０℃、または約５４℃〜約６０℃の範囲内でもよい。さらなる特定の態様において、第１の核酸分子は一本鎖ｃＤＮＡである。
【００３０】
本発明のこの局面による逆転写に適した核酸鋳型として、任意の核酸分子または核酸分子の集団（好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡ）、特に、細胞または組織に由来する核酸分子が挙げられる。特定の局面において、本発明に従ってｃＤＮＡライブラリーを作製するためにｍＲＮＡ分子の集団（多数の異なるｍＲＮＡ分子、一般的に、特定の細胞または組織タイプから得られる）が用いられる。核酸鋳型の細胞供給源の例として、細菌細胞、菌類細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられる。
【００３１】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）二本鎖核酸分子を作製する方法に関する。このような方法は、以下の段階を含む：（ａ）１つまたはそれ以上の核酸鋳型（好ましくは、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ、より好ましくは、ｍＲＮＡ鋳型の集団）と１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５など）本発明の逆転写酵素を混合する段階；（ｂ）１つまたはそれ以上の鋳型の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の第１の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階；および（ｃ）１つまたはそれ以上の第１の核酸分子の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の第２の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、１つまたはそれ以上の第１の核酸分子をインキュベートし、それによって第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む１つまたはそれ以上の二本鎖核酸分子を形成する段階。ある態様において、段階（ｂ）のインキュベーションは高温で行われる。特定の態様において、高温は、約４０℃以上、約４５℃以上、約５０℃以上、約５１℃以上、約５２℃以上、約５３℃以上、約５４℃以上、約５５℃以上、約５６℃以上、約５７℃以上、約５８℃以上、約５９℃以上、約６０℃以上、約６１℃以上、約６２℃以上、約６３℃以上、約６４℃以上、約６５℃以上、約６６℃以上、約６７℃以上、約６８℃以上、約６９℃以上、約７０℃以上、約７１℃以上、約７２℃以上、約７３℃以上、約７４℃以上、約７５℃以上、約７６℃以上、約７７℃以上、または約７８℃以上からの温度でもよく、約３７℃〜約７５℃、約４０℃〜約７５℃、約４５℃〜約７５℃、約５０℃〜約７５℃、約５１℃〜約７５℃、約５２℃〜約７５℃、約５３℃〜約７５℃、約５４℃〜約７５℃、または約５５℃〜約７５℃の温度範囲でもよい。ある態様において、高温は、約５０℃〜約７０℃、約５１℃〜約７０℃、約５２℃〜約７０℃、約５３℃〜約７０℃、約５４℃〜約７０℃、約５５℃〜約７０℃、約５５℃〜約６５℃、約５６℃〜約６５℃、約５６℃〜約６４℃、または約５６℃〜約６２℃の範囲内である。他の態様において、高温は、約４５℃〜約６０℃、約４６℃〜約６０℃、約４７℃〜約６０℃、約４８℃〜約６０℃、約４９℃〜約６０℃、約５０℃〜約６０℃、約５１℃〜約６０℃、約５２℃〜約６０℃、約５３℃〜約６０℃、または約５４℃〜約６０℃の範囲内でもよい。このような方法は、１つまたはそれ以上の二本鎖核酸分子を作製するプロセスの一部として１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）ＤＮＡポリメラーゼの使用を含んでもよい。このようなＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、最も好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて達成される核酸合成は高温（すなわち、３７℃を超える温度）で行われる。本発明はまた、このような二本鎖核酸分子の作製に有用な組成物に関する。このような組成物は、１つもしくはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０など）本発明の逆転写酵素、選択的に、１つもしくはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、１つもしくはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）プライマー、および／または１つもしくはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５など）ヌクレオチドを含む。
【００３２】
本発明はまた核酸分子を増幅する方法に関する。このような増幅方法は、前記のように生成された１つまたはそれ以上の二本鎖核酸分子と１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）を混合する段階、および二本鎖核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階を含む。第１の態様において、本発明は核酸分子を増幅する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：（ａ）１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０など）核酸鋳型（好ましくは、１つまたはそれ以上のＲＮＡまたはｍＲＮＡ鋳型、最も好ましくは、ｍＲＮＡ鋳型の集団）と、１つまたはそれ以上の本発明の逆転写酵素と、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを混合する段階、および（ｂ）１つまたはそれ以上の鋳型の全てまたは一部と相補的な核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階。ある態様において、段階（ｂ）のインキュベーションは高温で行われる。特定の態様において、高温は、約４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５１℃以上、約５２℃以上、約５３℃以上、約５４℃以上、約５５℃以上、約５６℃以上、約５７℃以上、約５８℃以上、約５９℃以上、約６０℃以上、約６１℃以上、約６２℃以上、約６３℃以上、約６４℃以上、約６５℃以上、約６６℃以上、約６７℃以上、約６８℃以上、約６９℃以上、約７０℃以上、約７１℃以上、約７２℃以上、約７３℃以上、約７４℃以上、約７５℃以上、約７６℃以上、約７７℃以上、または約７８℃以上からの温度でもよく、約３７℃〜約７５℃、約４０℃〜約７５℃、約４５℃〜約７５℃、約５０℃〜約７５℃、約５１℃〜約７５℃、約５２℃〜約７５℃、約５３℃〜約７５℃、約５４℃〜約７５℃、約５５℃〜約７５℃の範囲内でもよい。ある態様において、高温は、約５０℃〜約７０℃、約５１℃〜約７０℃、約５２℃〜約７０℃、約５３℃〜約７０℃、約５４℃〜約７０℃、約５５℃〜約７０℃、約５５℃〜約６５℃、約５６℃〜約６５℃、約５６℃〜約６４℃、または約５６℃〜約６２℃の範囲内である。他の態様において、高温は、約４５℃〜約６０℃、約４６℃〜約６０℃、約４７℃〜約６０℃、約４８℃〜約６０℃、約４９℃〜約６０℃、約５０℃〜約６０℃、約５１℃〜約６０℃、約５２℃〜約６０℃、約５３℃〜約６０℃、または約５４℃〜約６０℃の範囲内でもよい。好ましくは、逆転写酵素は、（１）ＲＮａｓｅＨ活性が低下しているか、もしくは実質的に低下している、（２）ＴｄＴ活性が低下しているか、もしくは実質的に低下している、および／または（３）増大した忠実度を示す。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する第１のＤＮＡポリメラーゼ、および実質的に低下した３’エキソヌクレアーゼ活性を有する第２のＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００３３】
本発明はまた、増幅反応に使用するための１つまたはそれ以上の本発明の逆転写酵素および１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを含む組成物に関する。このような組成物は、さらに、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドおよび／または増幅に適した緩衝液を含んでもよい。本発明の組成物はまた、１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよい。
【００３４】
本発明はまた、前記の方法に従って生成された核酸分子（特に、一本鎖もしくは二本鎖ｃＤＮＡ分子）または増幅された核酸分子、およびこれらの核酸分子または増幅された核酸分子を含むベクター（特に、発現ベクター）に関する。
【００３５】
本発明は、さらに、前記の核酸分子、増幅された核酸分子、またはベクターを含む組換え宿主細胞に関する。このような宿主細胞の例として、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、ならびに動物細胞（昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む）が挙げられる。
【００３６】
本発明は、さらに、本発明の方法によって生成される核酸分子によりコードされるポリペプチドを生成する方法であり、前記の組換え宿主細胞を培養する段階およびコードされるポリペプチドを単離する段階を含む方法、ならびにこのような方法によって生成されたポリペプチドに関する。
【００３７】
本発明はまた、本発明の組成物または酵素を用いて１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）核酸分子を配列決定する方法に関する。このような方法は、（ａ）配列決定しようとする１つまたはそれ以上の核酸分子（例えば、１つまたはそれ以上のＲＮＡまたはＤＮＡ分子）と、１つまたはそれ以上のプライマー、１つまたはそれ以上の本発明の逆転写酵素、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および１つまたはそれ以上の反応停止薬剤（例えば、１つまたはそれ以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸）を混合する段階；（ｂ）配列決定しようとする１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０、５０、１００、２００など）核酸分子の全てまたは一部と相補的な核酸分子の集団を合成するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階；および（ｃ） 核酸分子の集団を分離して、配列決定しようとする１つまたはそれ以上の核酸分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する段階。このような方法はまた、（ａ）配列決定しようとする核酸分子（例えば、１つまたはそれ以上のＲＮＡまたはＤＮＡ分子）と、１つまたはそれ以上のプライマー、１つまたはそれ以上の本発明の逆転写酵素、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および１つまたはそれ以上反応停止薬剤（例えば、１つまたはそれ以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸）を混合する段階；（ｂ）配列決定しようとする核酸分子の全てまたは一部と相補的な核酸分子の集団を合成するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階；および（ｃ） 核酸分子の集団の一員を分離して、配列決定しようとする核酸分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する段階を含んでもよい。ある態様において、このようなインキュベーションは、本明細書に記載のように高温で行うことができる。
【００３８】
本発明はまた、本発明の方法において使用するためのキットに関する。このようなキットは、好ましくは本明細書に記載の高温で、核酸分子（一本鎖または二本鎖）を作製、配列決定、または増幅するのに使用することができる。本発明のキットは、１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）容器（例えば、バイアル、チューブ、瓶など）が密に閉じ込められている運搬装置（例えば、ボックスまたはカートン）を含む。本発明のキットにおいて、第１の容器は、本発明の逆転写酵素の１つまたはそれ以上を含む。本発明のキットはまた、同じ容器または異なる容器に、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、核酸合成のための１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）適切な緩衝液、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５など）オリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよい。または、キットの成分を別々の容器に分けてもよい（例えば、それぞれの酵素および／または成分について１つの容器）。本発明のキットはまた、本発明の方法を実施するための説明書またはプロトコールを含んでもよい。本発明の好ましいキットにおいて、逆転写酵素はＲＮａｓｅＨ活性が低下しているか、または実質的に低下しており、最も好ましくは、Ｍ−ＭＬＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＲＳＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＡＭＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＲＡＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＭＡＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、およびＨＩＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素からなる群より選択される。本発明の他の好ましいキットにおいて、逆転写酵素は、本明細書の他の場所に記載のようにＴｄＴ活性が低下しているか、もしくは実質的に低下しており、および／または増大した忠実度を示す。
【００３９】
本発明のさらなる好ましいキットにおいて、容器内の酵素（逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼ）は作用濃度で存在する。
【００４０】
従って、本発明は、さらに、１つまたはそれ以上の耐熱性逆転写酵素を含む、核酸分子の逆転写、増幅、または配列決定に使用するためのキットに関する。
【００４１】
特定の態様において、本発明のキットの逆転写酵素は、以下からなる群より選択されるアミノ酸に対応する位置に１つまたはそれ以上の改変または変異を有してもよい：
（ａ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のロイシン５２；
（ｂ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のチロシン６４；
（ｃ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のリジン１５２；
（ｄ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアルギニン２０４；
（ｅ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のメチオニン２８９；および
（ｆ）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のスレオニン３０６。
【００４２】
本発明の逆転写酵素は、耐熱性が向上した任意の逆転写酵素を含む。このような逆転写酵素として、レトロウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素（例えば、Ｔｙ１および／またはＴｙ３レトロトランスポゾンの逆転写酵素）、ならびに逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。好ましい本発明の逆転写酵素として、シングルサブユニットおよびマルチサブユニット逆転写酵素、好ましくは、レトロウイルス逆転写酵素が挙げられる。特に、本発明は、Ｍ−ＭＬＶ−逆転写酵素ならびにＡＳＬＶ−逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ−ＲＴおよびＲＳＶ−ＲＴ）に関する。このような本発明の逆転写酵素は、好ましくは、低下した、または実質的に低下したＲＮａｓｅＨ活性を有する。
【００４３】
他のある特定の態様において、本発明の逆転写酵素は、ヒスチジン２０４のアルギニンへの変異（Ｈ２０４Ｒ）とスレオニン３０６のリジンへの変異（Ｔ３０６Ｋ）を組み合わせた逆転写酵素；Ｈ２０４ＲおよびＴ３０６Ｋとフェニルアラニン３０９のアスパラギンへの変異（Ｆ３０９Ｎ）を組み合わせた逆転写酵素；ならびにＨ２０４Ｒ、Ｔ３０６Ｋ、およびＦ３０９Ｎとバリン２２３のヒスチジンへの変異（Ｖ２２３Ｈ）を組み合わせた逆転写酵素などの変異の特定の組み合わせを含まない可能性がある。
【００４４】
本発明の以下の図面および説明ならびに特許請求の範囲を考慮すれば、本発明の他の態様は当業者に明らであろう。
【００４５】
発明の詳細な説明
以下の説明では、組換えＤＮＡ、ウイルス学、および免疫学において用いられる多くの用語が用いられる。このような用語に与えられる範囲を含めて、明細書および特許請求の範囲をはっきりとかつ首尾一貫して理解できるようにするために、以下の定義が示される。
【００４６】
クローニングベクター
本明細書で使用する「クローニングベクター」は、宿主細胞内で自律複製することができ、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴付けられる核酸分子（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミド、または他の核酸分子）を意味する。制限エンドヌクレアーゼ認識部位で、このような核酸配列は決まったやり方で切断することができ、ＤＮＡを複製およびクローニングするために、これにＤＮＡを挿入することができる。クローニングベクターは、さらに、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定での使用に適したマーカーを含んでもよい。マーカーは、例えば、認識可能な表現型を、このようなマーカーが発現される宿主細胞に付与する遺伝子である。一般的に用いられるマーカーとして、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
発現ベクター
本明細書で使用する「発現ベクター」は、クローニングベクターに似ているが、宿主細胞への形質転換後に、クローニングされた遺伝子または他の核酸分子の発現を増強および／または制御することができる核酸配列をさらに含み得る核酸分子を意味する。さらなる核酸配列は、プロモーター配列、リプレッサー結合配列などを含んでもよい。クローニングされた遺伝子または核酸分子は、通常、このような制御配列（例えば、プロモーター配列）の１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４など）に機能的に連結されている。
【００４８】
組換え宿主
本明細書で使用する「組換え」は、例えば、発現ベクター、クローニングベクター、または任意の核酸分子に、望ましいクローニングされた遺伝子または核酸分子を含む任意の原核生物または真核生物または微生物を意味する。用語「組換え宿主」はまた、宿主染色体またはゲノムに、望ましい遺伝子または他の核酸分子を含むように遺伝子操作されている宿主細胞を含むことが意図される。
【００４９】
宿主
本明細書で使用する「宿主」は、複製可能な発現ベクター、クローニングベクター、または任意の核酸分子のレシピエントである任意の原核生物または真核生物を意味する。核酸分子は、構造遺伝子、プロモーターおよび／または複製起点を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００５０】
プロモーター
本明細書で使用する「プロモーター」は、一般的に遺伝子の５’領域と呼ばれ、遺伝子または他の核酸配列の転写を指向することができる開始コドンに近接して位置する核酸配列を意味する。プロモーター領域で、隣接する１つまたはそれ以上の遺伝子または核酸の転写が開始する。
【００５１】
遺伝子
本明細書で使用する「遺伝子」は、ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含む核酸配列を意味する。遺伝子は、プロモーターおよび構造遺伝子ならびにタンパク質発現に関与する他の配列を含む。
【００５２】
構造遺伝子
本明細書で使用する「構造遺伝子」は、メッセンジャーＲＮＡに転写され、次いで、特定のポリペプチドの特徴を示すアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡまたは他の核酸配列を意味する。
【００５３】
機能的に連結された
本明細書で使用する「機能的に連結された」は、構造遺伝子または他の核酸分子によりコードされるポリペプチドの発現の開始に影響を及ぼすように核酸エレメントが配置されていることを意味する。
【００５４】
発現
本明細書で使用する「発現」は、遺伝子または他の核酸分子がポリペプチドを生じるプロセスを意味する。これは、遺伝子または核酸分子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写およびこのようなｍＲＮＡの１またはそれ以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【００５５】
実質的に純粋な
本明細書で使用する「実質的に純粋な」は、望ましい物質が、自然状態では望ましい物質に結合している汚染細胞成分を本質的に含まないことを意味する。汚染細胞成分として、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、または望ましくないＤＮＡポリメラーゼ酵素などの酵素活性を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の逆転写酵素は実質的に純粋である。
【００５６】
プライマー
本明細書で使用する「プライマー」は、ＤＮＡ分子の増幅または重合の間にヌクレオチドモノマーの共有結合によって伸長される一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【００５７】
鋳型
本明細書で使用する用語「鋳型」は、増幅、コピー、または配列決定しようとする二本鎖または一本鎖の核酸分子を意味する。二本鎖ＤＮＡ分子の場合、これらの分子を増幅、コピー、または配列決定する前に、一本鎖である第１鎖および第２鎖を形成するために二本鎖の変性を行ってもよい。核酸鋳型の一部と相補的なプライマーを適切な条件下でハイブリダイズさせ、次いで、本発明の逆転写酵素などの核酸ポリメラーゼがヌクレオチドモノマーをプライマーに付加し、それによって鋳型またはその一部と相補的な核酸分子が合成される。本発明によって新たに合成された核酸分子は元の鋳型と同じでもよく、それより短くてもよい。新たに合成された核酸分子の合成または伸長の間のミスマッチ取り込みは、１つまたは多数のミスマッチ塩基対をもたらすことがある。従って、合成された核酸分子は鋳型に正確に相補的である必要はない。
【００５８】
取り込み
本明細書で使用する用語「取り込む」は、核酸分子またはプライマーの一部になることを意味する。
【００５９】
オリゴヌクレオチド
「オリゴヌクレオチド」は、あるヌクレオチドの五単糖の３’位と隣接するヌクレオチドの五単糖の５’位との間のホスホジエステル結合によって結合されたヌクレオチドの共有結合配列を含む合成または天然の分子を意味する。
【００６０】
ヌクレオチド
本明細書で使用する「ヌクレオチド」は、塩基−糖−リン酸の組み合わせを意味する。ヌクレオチドは核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノマー単位であり、ＤＮＡポリメラーゼによってデオキシリボヌクレオチドがＤＮＡに取り込まれる。用語ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはその誘導体）を含む。このような誘導体として、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、および７−デアザ−ｄＡＴＰが挙げられる。本明細書で使用する用語ヌクレオチドはまた、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体を意味する。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例示的な例として、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。本発明によれば、「ヌクレオチド」は標識されなくてもよく、周知の技法によって検出可能に標識されてもよい。検出可能となるように標識として、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識が挙げられる。
【００６１】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用するハイブリダイゼーション（ハイブリダイズする）は、二本鎖分子を生じるための２つの相補的な一本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の対形成を意味する。当業者が理解するように、２つの核酸分子は塩基対形成が完全に相補的でなくてもハイブリダイズすることができる。従って、当技術分野において周知の適切な条件が用いられれば、ミスマッチ塩基は２つの核酸分子のハイブリダイゼーションを妨げない。
【００６２】
耐熱性逆転写酵素
本開示のために、耐熱性逆転写酵素は、熱処理後に、野生型の耐熱性を有する逆転写酵素が同一の処理後に保持するより大きな割合の活性を保持する逆転写酵素と定義される。従って、耐熱性が増大／向上した逆転写酵素は、耐熱性について野生型である逆転写酵素の活性を低下させるのに十分な熱処理後の耐熱性が増大した（好ましくは、約１．２〜約１０，０００倍、約１．５〜約１０，０００倍、約２〜約５，０００倍、または約２〜約２０００倍（好ましくは約５倍を超える、より好ましくは約１０倍を超える、さらにより好ましくは約５０倍を超える、さらにより好ましくは約１００倍を超える、さらにより好ましくは約５００倍を超える、最も好ましくは約１０００倍を超える）活性を保持する）ポリメラーゼと定義される。好ましくは、耐熱性の相対的な向上または増大を確かめるために、本発明の逆転写酵素変異体または改変された逆転写酵素は、対応する改変されていない逆転写酵素または野生型逆転写酵素と比較される。例えば、５２℃で５分間の熱処理後に、耐熱性逆転写酵素は、熱処理処理前に存在していた活性の約９０％を保持してもよいが、耐熱性について野生型である逆転写酵素は最初の活性の１０％を保持してもよい。同様に、５３℃で５分間の熱処理後に、耐熱性逆転写酵素は最初の活性の約８０％を保持してもよいが、耐熱性について野生型である逆転写酵素の活性は測定不可能であってもよい。同様に、５０℃で５分間の熱処理後に、耐熱性逆転写酵素は、最初の活性の約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％を保持してもよいが、耐熱性について野生型である逆転写酵素の活性は測定不可能であってもよく、最初の活性の１０％、１５％、または２０％を保持してもよい。最初の例において（すなわち、５２℃で５分間の熱処理後）、耐熱性逆転写酵素は、野生型逆転写酵素より耐熱性が９倍であると言われる。逆転写酵素の耐熱性を測定するのに使用することができる条件の例を以下の実施例２に示す。
【００６３】
逆転写酵素の耐熱性は、熱処理に供された（すなわち、５２℃で、ある特定の時間（例えば、５分間）インキュベートされた）逆転写酵素試料の残留活性と、室温で、熱処理と同じ時間の長さでインキュベートされた同じ逆転写酵素の対照試料を比較することによって決定することができる。一般的に、残留活性は、相補的なオリゴヌクレオチド鋳型を用いた、オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマーへの放射性標識デオキシリボヌクレオチドの取り込みを追跡することによって測定することができる。例えば、逆転写酵素の残留活性を確かめるために、ポリ（リボＣ）鋳型を用いて逆転写酵素が［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰをオリゴｄＧプライマーに取り込む能力をアッセイしてもよい。
【００６４】
別の局面において、本発明の耐熱性逆転写酵素は、対応する野生型の、変異されていない、または改変されていない逆転写酵素と比較して高い温度で不活化される任意の逆転写酵素と定義される。好ましくは、本発明の耐熱性逆転写酵素の不活化温度は、対応する野生型の、変異されていない、または改変されていない逆転写酵素の不活化温度より約２℃〜約５０℃（例えば、約２℃、約４℃、約５℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３３℃、約３５℃、約３８℃、約４０℃、約４２℃、約４４℃、約４６℃、約４８℃、または約５０℃）高い。より好ましくは、本発明の逆転写酵素の不活化温度は、同じ条件下で比較した場合、対応する野生型の、変異されていない、または改変されていない逆転写酵素の不活化温度より約５℃〜約５０℃、約５℃〜約４０℃、約５℃〜約３０℃、または約５℃〜約２５℃高い。
【００６５】
対応する野生型の、変異されていない、または改変されていない逆転写酵素と比較した本発明の逆転写酵素の不活化温度の差は、このような逆転写酵素の試料をある特定の時間、異なる温度で処理し、次いで、試料が熱処理された後に、残留逆転写酵素活性をもしあれば測定することによって決定することができる。試験逆転写酵素と野生型の、変異されていない、または改変されていない対照と比較した不活化温度の差すなわちΔは、それぞれの逆転写酵素が不活化される（すなわち、残留逆転写酵素活性が、使用された特定のアッセイにおいて測定することができない）温度の差を比較することによって決まる。認知されているように、試験される任意の逆転写酵素の不活化温度の差すなわちΔを決定するために、任意の数の逆転写酵素アッセイを使用することができる。
【００６６】
末端伸長活性
本明細書で使用する末端伸長活性は、逆転写酵素（ＲＴ）が、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ鋳型の５’末端を越えて、新たに合成されたｃＤＮＡ鎖の３’末端にさらなる塩基を付与する能力を意味する。末端伸長活性は（ヌクレオチドの偏りによって）特異的に塩基を付加してもよく、ランダムに塩基を付加してもよい。
【００６７】
末端伸長活性はまた、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性とも知られる。ＴｄＴ活性が低下した、実質的に低下した、または無くなった逆転写酵素は、対応する野生型の、変異されていない、または改変されていない酵素の比活性より低いＴｄＴ活性（特に、対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約９０％未満、対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約８５％未満、対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約８０％未満、対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約７５％未満、対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約５０％未満、対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約２５％未満、対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約１５％未満、対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約１０％未満、対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約５％未満、または対応する野生型の、変異されていない、もしくは改変されていない酵素の比活性の約１％未満）を有する任意の逆転写酵素と定義される。ＴｄＴ活性が無いことは、本明細書の実施例３に示されるアッセイ法によって検出することができない活性レベルと定義される。
【００６８】
以下の実施例３に示すように、鋳型（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型）の末端を過ぎて核酸分子を２〜３ヌクレオチド伸長する逆転写酵素が当技術分野において周知である。さらに、逆転写が起こるどれか１つの反応混合物において、鋳型末端を越えて伸長した異なる数のヌクレオチドを含む、分子の混合物が存在してもよい。本明細書では、ＴｄＴ活性は、鋳型末端を越えて伸長した１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含む分子の数または割合（％）に関して決定される。例えば、野生型逆転写酵素が、逆転写の間に生成された分子の９０％まで、鋳型末端を越えて１つまたはそれ以上のヌクレオチドを付加し、改変された逆転写酵素が、同じまたは類似する条件下で分子の４５％まで、鋳型末端を越えて１つまたはそれ以上のヌクレオチドを付加した場合、改変された逆転写酵素は、野生型酵素と比較してＴｄＴ活性が５０％減少したと言われる。さらに、ＤＮＡを鋳型として使用した場合に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩによって示されたＴｄＴ活性の約０％を示し、ＲＮＡを鋳型として使用した場合に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩによって示されたＴｄＴ活性の約１０〜２０％を示す、Ｍ−ＭＬＶ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩのＦ３０９Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｈ２０４Ｒ変異体が作製されている。しかしながら、本発明のある特定の他の態様は、特に、Ｆ３０９Ｎ、Ｔ３０６Ｋ、Ｈ２０４Ｒ変異体を除外する。
【００６９】
忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）
忠実度は、重合の正確さ、すなわち、逆転写酵素が鋳型に相補的な核酸分子を合成する時に、正しい基質（例えば、ヌクレオチド）と誤った基質を区別する能力を意味する。逆転写酵素の忠実度が高ければ高いほど、逆転写酵素が核酸合成間に成長鎖にヌクレオチドを誤って取り込む数は少なくなる。すなわち、忠実度の増大または向上は、誤り率が減少したか、または誤って取り込む率が減少した、より忠実な逆転写酵素をもたらす。
【００７０】
増大した／向上した／より高い忠実度を有する逆転写酵素は、忠実度が増加した（好ましくは、所定の長さの任意の所定の核酸分子の合成の間に誤って取り込まれるヌクレオチドの数が、対照逆転写酵素と比較して、約１／１０，０００〜約１／１．２、約１／１０，０００〜約１／１．５、約１／５，０００〜約１／２、または約１／２０００〜約１／２に（好ましくは約１／５以下、より好ましくは約１／１０以下、さらにより好ましくは約１／５０以下、さらにより好ましくは約１／１００以下、さらにより好ましくは約１／５００以下、最も好ましくは約１／１００以下に）減少した）ポリメラーゼと定義される。好ましくは、忠実度の相対的な向上または増加を確かめるために、本発明の逆転写酵素変異体または改変された逆転写酵素は、対応する改変されていない、または野生型の逆転写酵素と比較される。例えば、１０００塩基の核酸分子セグメントの合成において、同じサイズのセグメントに１０個のヌクレオチドを誤って取り込む変異されていない逆転写酵素と比較して、変異された逆転写酵素は１個のヌクレオチドを誤って取り込むことがある。このような逆転写酵素変異体は忠実度が１０倍に増加したと言われる。
【００７１】
忠実度はまた、以下の実施例５に記載のように、フレームシフトの発生の減少によって測定することができる。忠実度が増大した逆転写酵素は、対照逆転写酵素（例えば、野生型逆転写酵素）と比較して、フレームシフトに関して忠実度が増大したポリメラーゼまたは逆転写酵素（例えば、フレームシフトに関して約１．２倍を超えて忠実度が増大した、フレームシフトに関して約１．５倍を超えて忠実度が増大した、フレームシフトに関して約５倍を超えて忠実度が増大した、フレームシフトに関して約１０倍を超えて忠実度が増大した、フレームシフトに関して約２０倍を超えて忠実度が増大した、フレームシフトに関して約３０倍を超えて忠実度が増大した、またはフレームシフトに関して約４０倍を超えて忠実度が増大した、逆転写酵素）と定義される。
【００７２】
フレームシフトに関して増大した／向上した／より高い忠実度を有する逆転写酵素はまた、忠実度が増大した（例えば、フレームシフトに関して忠実度が約１．５〜約１０，０００倍、約２〜約５，０００倍、約２〜約２０００倍、約１．５〜約４０倍、約５〜約４０倍、約１０〜約４０倍、約２０〜約４０倍、約３０〜約４０倍、約５〜約３０倍、約１０〜約３０倍、約１５〜約３０倍、約２０〜約３０倍、約５〜約２０倍、約１０〜約２０倍、約１５〜約２０倍、約１０〜約１００倍、約１５〜約１００倍、約２０〜約１００倍、約３０〜約１００倍、または約５０〜約１００倍増大した）逆転写酵素またはポリメラーゼと定義することができる。
【００７３】
誤った取り込みが低下した逆転写酵素は、本明細書では、相対的な誤った取り込みが、対応する野生型の、変異されていない、または改変されていない酵素と比較して、約９０％もしくは９０％未満、約８５％もしくは８５％未満、約７５％もしくは７５％未満、約７０％もしくは７０％未満、約６０％もしくは６０％未満、または、好ましくは約５０％もしくは５０％未満、好ましくは約２５％もしくは２５％未満、より好ましくは約１０％もしくは１０％未満、最も好ましくは約１％もしくは１％未満である、変異または改変された逆転写酵素と定義される。
【００７４】
逆転写酵素の忠実度または誤って取り込む率は、配列決定または当技術分野において周知の他の方法によって決定することができる（エッカート（Ｅｃｋｅｒｔ）およびクンケル（Ｋｕｎｋｅｌ），１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３７３９−３７４４）。一例では、変異されていない逆転写酵素および変異された逆転写酵素によって合成されたＤＮＡ分子の配列を予想（既知）配列と比較することができる。このように、誤り（誤った取り込みまたはフレームシフト）の数を各酵素について決定し、比較することができる。別の例では、既知配列を有するＤＮＡ分子を配列決定するために、変異されていない逆転写酵素および変異された逆転写酵素を使用してもよい。酵素の忠実度または誤った取り込みの率を決定するために、配列決定の誤り（誤った取り込みまたはフレームシフト）の数を比較することができる。忠実度または誤った取り込みの率を決定する他の手段として、以下で説明され、およびボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）Ｊ．Ｃ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７５：５２３（１９９６）に以前に述べられたような、ＲＮＡ鋳型を用いたフォワード相補アッセイ（ｆｏｒｗａｒｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）が挙げられ、実施例に示される。忠実度または誤った取り込みの率を決定する他の方法は当業者に理解されるだろう。
【００７５】
ストランドジャンピング（ｓｔｒａｎｄ ｊｕｍｐｉｎｇ）
本明細書で使用するストランドジャンピングは、逆転写酵素がｍＲＮＡ鋳型上で１を超える（例えば、２、５、１０、１５、１００など）ヌクレオチドを「飛ばして進む」ことによって引き起こされるランダム変異の一種を意味し、これによって、結果として生じるｃＤＮＡにおいて対応するヌクレオチドが欠失する。
【００７６】
ハンドドメイン
本明細書で使用するハンドドメインは、逆転写酵素の鋳型、プライマー、またはヌクレオチドの相互作用を制御する１つまたはそれ以上の領域にあるアミノ酸を意味する。このドメインは、さらに、逆転写酵素における二次構造の一群の３領域である、サム領域、フィンガー領域、パーム領域によって特徴付けられる。サム領域は、ＨＩＶ逆転写酵素のアミノ酸２４０〜３１５またはＭ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸２８０〜３５５に存在すると定義される。フィンガー領域は、ＨＩＶ逆転写酵素のアミノ酸１〜８５および１２０〜１５４またはＭ−ＭＬＶ逆転写酵素の１〜１２４および１６１〜１９３に存在すると定義される。パーム領域は、ＨＩＶ逆転写酵素のアミノ酸８６〜１９９および１５５〜２３９またはＭ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸１２６〜１６０および１９３〜２７９に存在すると定義される。これらの領域はおおまかに定義されており、Ｎ末端およびＣ末端を定義するアミノ酸はおおよそである。他の逆転写酵素についても、対応する領域を定義することができる。好ましい本発明の逆転写酵素は、ハンドドメイン内に１つまたはそれ以上の改変または変異を有する。より詳細には、本発明の逆転写酵素は、サム領域、フィンガー領域、およびパーム領域を含む１つまたはそれ以上の領域に１つまたはそれ以上の変異または改変を含む。
【００７７】
一般的に、本発明は、逆転写酵素を耐熱性にする１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０など）変異または改変を有する逆転写酵素を含む、核酸分子の逆転写において使用するための組成物を提供する。本発明はまた、逆転写酵素を効率的にする１つもしくはそれ以上の変異または改変を有する、高い忠実度を有する、および／または低いＴｄＴ活性を有する逆転写酵素を含む、核酸分子の逆転写において使用するための組成物を提供する。本発明は、さらに、逆転写酵素を耐熱性および効率的にする１つまたはそれ以上の変異または改変を有する逆転写酵素を含む組成物を提供する。
【００７８】
これらの組成物における酵素は、好ましくは、作用濃度で存在し、好ましくは、ＲＮａｓｅＨ活性も低下しているか、または実質的に低下している。または、本発明の組成物において用いられる逆転写酵素はＲＮａｓｅＨ活性を有してもよい。好ましい逆転写酵素として、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、およびＭＡＶ逆転写酵素、もしくは他のＡＳＬＶ逆転写酵素、またはこれらの対応するＲＮａｓｅＨ−誘導体などのレトロウイルス逆転写酵素が挙げられる。本発明の組成物を調製するために使用することができるさらなる逆転写酵素として、細菌逆転写酵素（例えば、大腸菌逆転写酵素）（例えば、マオ（Ｍａｏ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２７：４８９−９３（１９９６）を参照のこと）およびサッカロマイセス・セレビシエ逆転写酵素（例えば、Ｔｙ１またはＴｙ３レトロトランスポゾンの逆転写酵素）（例えば、クリストファリ（Ｃｒｉｓｔｏｆａｒｉ）ら，Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６６４３−３６６４８（１９９９）；ムレス（Ｍｕｌｅｓ）ら，Ｊｏｕｒ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６４９０−６５０３（１９９８）を参照のこと）が挙げられる。
【００７９】
本発明によれば、任意の数の変異を逆転写酵素に生じさせることができ、好ましい局面において、耐熱性を増大させるために複数の変異を生じさせることができる。このような変異としては、点変異、フレームシフト変異、欠失および挿入が挙げられ、１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０など）点変異が好ましい。本発明の逆転写酵素への変異の導入は、当業者に周知の任意の方法を用いて行うことができる。変異は、例えば、二価金属イオン補助因子として用いられるマンガンの存在下でＰＣＲ反応を行うことによってランダムに導入することができる。または、ポリメラーゼ変異体を作製するために、コードＤＮＡ分子に沿って任意の決定された部位で塩基対変化の可能な全てのクラスを可能にするという効果がオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を使用することができる。一般的に、この技法は、関心対象の逆転写酵素をコードする一本鎖ヌクレオチド配列に（１つまたはそれ以上のミスマッチを除く）相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリングを伴う。次いで、ミスマッチオリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、一方の鎖に望ましい配列変化を含む二本鎖ＤＮＡ分子を生じる。配列変化は、例えば、アミノ酸の欠失、置換、または挿入をもたらすことができる。次いで、二本鎖ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入し、従って、変異体ポリペプチドまたは改変されたポリペプチドを生成することができる。前記のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発は、例えば、ＰＣＲを介して行うことができる。
【００８０】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０など）核酸分子を逆転写する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０など）核酸鋳型（好ましくはＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、より好ましくはｍＲＮＡ分子の集団）と、１つまたはそれ以上の本発明の逆転写酵素を混合する段階、および１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０など）鋳型の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の核酸分子を作製するのに十分な条件下で混合物をインキュベートする段階。１つまたはそれ以上の鋳型に相補的な１つまたはそれ以上の核酸分子を作製するために、好ましくは、プライマー（例えば、オリゴ（ｄＴ）プライマー）および１つまたはそれ以上のヌクレオチドが５’から３’方向の核酸合成に用いられる。本発明のこの局面による逆転写に適した核酸分子として、任意の核酸分子（特に、原核細胞または真核細胞に由来する核酸分子）が挙げられる。このような細胞は、正常細胞、罹患細胞、形質転換細胞、株化細胞、始原細胞、前駆細胞、胎児細胞、胚細胞、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む）、鳥類細胞、植物細胞など、または植物もしくは動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、マウス、ヒツジ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、鳥類、魚類、昆虫など）から単離された組織を含んでもよい。このような核酸分子はウイルスから単離することもできる。
【００８１】
本発明は、さらに、核酸分子と本発明の逆転写酵素を接触させる段階を含む、核酸分子を増幅または配列決定する方法を提供する。好ましいこのような方法は、１つまたはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。
【００８２】
逆転写酵素の供給源
本発明の組成物、方法、およびキットに使用するための酵素として、逆転写酵素活性を有する任意の酵素が挙げられる。このような酵素として、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（サイキ（Ｓａｉｋｉ），Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−４９１（１９８８）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣＴ国際公開公報第９６／１０６４０号）、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）、およびその変異体、断片、変種、または誘導体（例えば、その全体が参照として本明細書に引用される、権利者が同一の米国特許第５，９４８，６１４号および同第６，０１５，６６８号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用するための逆転写酵素として、好ましくはＭ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素、一般的に、ＡＳＬＶ逆転写酵素などのレトロウイルス逆転写酵素が挙げられる。当業者に理解されるように、改変された逆転写酵素は、かつ当技術分野において日常的かつ周知の組換えまたは遺伝子操作法によって得ることができる。逆転写酵素変異体は、例えば、部位特異的変異誘発またはランダム変異誘発によって、関心対象の逆転写酵素をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子を変異させることによって得ることができる。このような変異は、点変異、欠失変異、および挿入変異を含んでもよい。例えば、本発明の逆転写酵素変異体を構築するために、１つまたはそれ以上の点変異（例えば、１つまたはそれ以上の異なるアミノ酸による１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換）を使用することができる。
【００８３】
本発明は、さらに、野生型逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素など）とアミノ酸レベルで７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、耐熱性が増大した逆転写酵素を含む。本発明は以下の表３に示したアミノ酸配列（配列番号：２）を含む逆転写酵素とアミノ酸レベルで７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、耐熱性が増大した、ならびに／またはより効率的な（例えば、忠実度が高いおよび／もしくはＴｄＴ活性が低い）逆転写酵素も含む。本発明はまた、前記の逆転写酵素をコードする核酸分子を含む。
【００８４】
本発明はまた、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、または７００のアミノ酸残基を含み、逆転写酵素に関連する１つまたはそれ以上の活性を保持する逆転写酵素断片を含む。このような断片は、欠失変異によって、当技術分野において日常的かつ周知の組換え技法によって、または多数の周知のタンパク質分解酵素のいずれかを用いた関心対象の逆転写酵素の酵素消化によって得ることができる。本発明は、さらに、前記の逆転写酵素変異体および逆転写酵素断片をコードする核酸分子を含む。
【００８５】
本発明の逆転写酵素断片はまた、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸の１番目〜３５５番目、１番目〜４９８番目、１番目〜５００番目、および１番目〜５５０番目、ならびに他の逆転写酵素の対応する断片を含む。本発明の逆転写酵素断片は、さらに、前記の断片の１つまたはそれ以上と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のポリペプチドを含む。
【００８６】
例えば、参照アミノ酸配列と少なくとも７０％「同一の」アミノ酸配列を有するタンパク質またはタンパク質断片によって、このタンパク質のアミノ酸配列は、参照タンパク質のアミノ酸配列の１００アミノ酸ごとに３０アミノ酸まで変化を含むことを除いて、参照配列と同一であることを意味する。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を得るためには、参照配列のアミノ酸配列の３０％までが欠失されてもよく、別のアミノ酸で置換されてもよく、または参照配列の総アミノ酸残基の３０％までの多数のアミノ酸が参照配列に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ（Ｎ）末端および／もしくはカルボキシ（Ｃ）末端の位置で、ならびに／またはこれらの末端の間の任意の位置で起こってもよく、また参照配列の残基間で個々におよび／もしくは参照配列内の１つまたはそれ以上の連続グループに点在してもよい。実際に、所定のアミノ酸配列が、例えば、参照タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム（例えば、核酸配列同一性の決定について前述されたプログラム）を従来通りに用いて、またはＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラム（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ），Ｊ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））を用いて確認することができる。
【００８７】
本発明において使用するための好ましい酵素として、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低下した、または実質的に低下した酵素が挙げられる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低下した、または実質的に低下した、このような酵素は、例えば、関心対象の逆転写酵素内のＲＮａｓｅ Ｈドメインを変異させることによって（例えば、前記のような１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０など）点変異、１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０など）欠失変異、および／または１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０など）挿入変異を導入することによって）得ることができる。
【００８８】
「ＲＮａｓｅ Ｈ活性が実質的に低下した」酵素とは、この酵素が、対応する野生型またはＲＮａｓｅＨ＋酵素（例えば、野生型モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素）のＲＮａｓｅＨ活性の約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、より好ましくは約１５％未満、約１０％未満、約７．５％未満、または約５％未満、最も好ましくは約５％未満または約２％未満を有することを意味する。
【００８９】
ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低下した、または実質的に低下した逆転写酵素は既に記述されている（米国特許第５，６６８，００５号、米国特許第６，０６３，６０８号、およびＰＣＴ国際公開公報第９８／４７９１２号を参照のこと）。任意の酵素のＲＮａｓｅ Ｈ活性が、様々なアッセイ（例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、コテウィクツ（Ｋｏｔｅｗｉｃｚ），Ｍ．Ｌ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）、ジェラルド（Ｇｅｒａｒｄ），Ｇ．Ｆ．ら，ＦＯＣＵＳ １４（５）：９１（１９９２）、および米国特許第５，６６８，００５号に記載のアッセイ（これらの全ての開示を参照として本明細書に完全に引用する））によって決定することができる。
【００９０】
本発明において使用するための特に好ましい酵素として、Ｍ−ＭＬＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＲＳＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＡＭＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＲＡＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、ＭＡＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素、およびＨＩＶ ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、ＲＮａｓｅＨ活性が低下した、または実質的に低下した、リボ核酸分子からＤＮＡ分子を生成することができる（すなわち、逆転写酵素活性を有する）任意の酵素を、本発明の組成物、方法、およびキットにおいて等しく使用できることは当業者に理解されると思われる。
【００９１】
本発明において使用するための酵素としては、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性が低下した、実質的に低下した、または無くなった酵素も挙げられる。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性が低下した、もしくは実質的に低下した、またはＴｄＴ活性が無くなった、このような酵素は、例えば、鋳型−プライマーに近接する、または鋳型−プライマーと接触する、関心対象の逆転写酵素内のアミノ酸残基を変異させることによって（例えば、１つもしくはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、３０など）点変異、１つもしくはそれ以上の欠失変異、および／または１つもしくはそれ以上の挿入変異を導入することによって）得ることができる。減少したＴｄＴ活性を示す逆転写酵素は、２００１年３月１５日に出願された米国特許出願第０９／８０８，１２４号（この全開示を参照として本明細書に引用する）に記載されており、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のＹ６４、Ｍ２８９、Ｆ３０９、Ｔ１９７、および／またはＹ１３３に等価な、またはこれらに対応するアミノ酸位置に１つまたはそれ以上の変化を有する逆転写酵素を含む。
【００９２】
１つの局面において、アミノ酸置換は、前記で特定された位置の１つまたはそれ以上で行われる（すなわち、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のＹ６４、Ｍ２８９、Ｆ３０９、Ｔ１９７、またはＹ１３３に等価な、またはこれらに対応するアミノ酸位置）。従って、これらの位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌを含む他の任意のアミノ酸で置換することができる。低下した、または実質的に低下したＴｄＴ活性を示す逆転写酵素の特定の例として、（１）位置３０９のフェニルアラニン残基がアスパラギンで置換されている、（２）位置１９７のスレオニン残基がアラニンもしくはグルタミン酸のいずれかで置換されている、および／または（３）位置１３３のチロシン残基がアラニンで置換されている、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ）が挙げられる。
【００９３】
本発明において使用するための酵素として、忠実度が増大した酵素も挙げられる。忠実度が増大した逆転写酵素は、２０００年３月１５日に出願された米国特許出願第６０／１８９，４５４号および２００１年３月１５日に出願された米国特許出願第０９／８０８，１２４号（これらそれぞれの全開示を参照として本明細書に引用する）に記載されており、以下の表２に示した位置に等価な、またはこれらに対応する位置での１つまたはそれ以上の変化を有する逆転写酵素を含む。
【００９４】
【表２】
2004511211.tif 000004
【００９５】
本発明のある態様において、アミノ酸置換は、前記で特定された位置の１つまたはそれ以上で行われる。従って、これらの位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌを含む他の任意のアミノ酸で置換することができる。忠実度が増大した逆転写酵素の特定の例としては、（１）２２３位のバリン残基がヒスチジン、フェニルアラニン、もしくはイソロイシンで置換されている、（２）１１６位のアルギニン残基がメチオニンで置換されている、（３）位置１５２のリジン残基がアルギニンで置換されている、（４）１９０位のグルタミン酸残基がフェニルアラニンで置換されている、（５）１９７位のスレオニン残基がアラニンもしくはグルタミン酸で置換されている、（６）３０９位のフェニルアラニン残基がアスパラギンもしくはアルギニンで置換されている、（７）１３３位のチロシン残基がヒスチジンもしくはアラニンで置換されている、および／または（８）６４位のチロシン残基がトリプトファンもしくはアルギニンで置換されている、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素が挙げられる。
【００９６】
従って、特定の態様において、本発明は、耐熱性が増大し、選択的に、以下の特徴：（１）ＲＮａｓｅＨ活性が低下した、もしくは実質的に低下した、（２）ＴｄＴ活性が低下した、もしくは実質的に低下した、および／または（３）忠実度が増大した１つまたはそれ以上も示す逆転写酵素を含む。
【００９７】
本発明はまた、逆転写酵素の認められた領域において変異または置換が行われている逆転写酵素変異体に関する。このような領域として、フィンガー領域、パーム領域、およびサム領域が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明は、本明細書の他の場所に記載されるように増大した耐熱性（ならびに他の特性）を示し、ハンドドメインにおいて、より詳細にはフィンガー領域、パーム領域、および／またはサム領域を含む１つまたはそれ以上の領域において１つまたはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５など）変異または改変を有する逆転写酵素を含む。
【００９８】
本発明において使用するための逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、天然タンパク質を単離および精製するための当業者に周知の標準的な手順に従って天然のウイルス供給源または細菌供給源から単離することができる（例えば、ホウトス（Ｈｏｕｔｓ），Ｇ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９）を参照のこと）。さらに、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者によく知られている組換えＤＮＡ技法によって調製することができる（例えば、（コテウィクツ（Ｋｏｔｅｗｉｃｚ），Ｍ．Ｌ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）；ソルティス（Ｓｏｌｔｉｓ），Ｄ．Ａ．，およびスカルカ（Ｓｋａｌｋａ），Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３７２−３３７６（１９８８）を参照のこと）。
【００９９】
本発明の１つの局面において、逆転写酵素変異体または改変された逆転写酵素は組換え技法によって作製される。多くのクローニングされた逆転写酵素遺伝子が入手可能であり、または標準的な組換え技法を用いて得ることができる（米国特許第５，６６８，００５号およびＰＣＴ国際公開公報第９８／４７９１２を参照のこと）。
【０１００】
本発明によって改変される逆転写酵素をコードする遺伝子または他の核酸分子をクローニングするために、逆転写酵素遺伝子またはオープンリーディングフレームを含む単離されたＤＮＡを使用して、組換えＤＮＡライブラリーを構築することができる。関心対象の逆転写酵素をクローニングするために、当技術分野において周知の任意のベクターを使用することができる。しかしながら、使用されるベクターは、組換えベクターが形質転換される宿主と適合しなければならない。
【０１０１】
プラスミドライブラリーを構築するための原核生物ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＵＣベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など：「分子クローニング，実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；およびサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，「分子クローニング，実験マニュアル（第２版）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））などの、大腸菌内で複製することができるプラスミドが挙げられる。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プラスミドとしては、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２１７などが挙げられる。このようなプラスミドは、グリクザン（Ｇｌｙｃｚａｎ），Ｔ．分子生物学バチルス（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｂａｃｉｌｌｉ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｙｏｒｋ（１９８２），３０７−３２９によって開示されている。適切なストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）プラスミドとしては、ｐＩＪ１０１（ケンダル（Ｋｅｎｄａｌｌ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４１７７−４１８３（１９８７））が挙げられる。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドは、ジョン（Ｊｏｈｎ）ら（Ｒａｄ．Ｉｎｓｅｃ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１９８６））およびイガキ（Ｉｇａｋｉ）（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９７８））に概説されている。ｐＣＰ１３（ダージンズ（Ｄａｒｚｉｎｓ）およびチャクラバティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：９−１８（１９８４））などの、広い宿主域のプラスミドまたはコスミドも本発明に使用することができる。本発明の遺伝子および核酸分子をクローニングするための好ましいベクターは原核生物ベクターである。好ましくは、本発明の遺伝子をクローニングするのにｐＣＰ１３およびｐＵＣベクターが用いられる。
【０１０２】
関心対象の逆転写酵素遺伝子および核酸分子をクローニングするための適切な宿主は原核生物宿主である。原核生物宿主の一例は大腸菌である。しかしながら、本発明の望ましい逆転写酵素遺伝子および核酸分子は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属、ストレプトマイセス属、シュードモナス属、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、およびプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）の宿主を含むが、これらに限定されない他の原核生物宿主にクローニングすることができる。特に関心のある細菌宿主としては、インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手することができる大腸菌ＤＨ１０Ｂが挙げられる。
【０１０３】
関心対象の逆転写酵素をクローニングおよび発現するための真核生物宿主としては、酵母細胞、菌類細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。このような真核細胞における望ましい逆転写酵素の発現は、真核生物プロモーターを含む真核生物調節領域の使用を必要とする場合がある。周知の真核生物ベクター系を用いて周知の技法によって、真核細胞における逆転写酵素遺伝子または核酸分子のクローニングおよび発現を達成することができる。
【０１０４】
一旦、ＤＮＡライブラリーが特定のベクターに構築されたら、周知の技法によって適切な宿主を形質転換する。ペトリ皿一枚につき約２００〜３００個の形質転換コロニーを生じる密度で、形質転換細胞をプレートする。次いで、逆転写酵素の選択のために、以下の実施例に記載のように、耐熱性逆転写酵素が発現しているかどうかコロニーをスクリーニングする。簡単に述べると、個々の形質転換コロニーの一晩培養物を、標識デオキシヌクレオチドを用いて耐熱性逆転写酵素活性について直接アッセイし、標識産物が存在するかどうか分析する。耐熱性逆転写酵素活性が検出されたら、どのアミノ酸が逆転写酵素活性を維持したかを確かめるために、変異体を配列決定する。本発明の逆転写酵素をコードする遺伝子または核酸分子は、当業者に周知の技法を用いてクローニングすることができる。
【０１０５】
ポリメラーゼの改変または変異
本発明によれば、本発明に従って酵素の耐熱性を増大させるために、または本明細書に記載の他の特性を酵素に付与するために、任意の逆転写酵素において１つまたはそれ以上の変異を生じさせることができる。このような変異としては、点変異、フレームシフト変異、欠失、および挿入が挙げられる。好ましくは、耐熱性が向上または増大した逆転写酵素を生成するために、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をもたらす１つまたはそれ以上の点変異が用いられる。本発明の好ましい局面において、関心対象の他の逆転写酵素において望ましい結果を生じるために、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の位置Ｈ２０４（例えば、Ｈ２０４Ｒ）および／またはＴ３０６（例えば、Ｔ３０６ＫもしくはＴ３０６Ｒ）に等価な、またはこれらに対応する位置で１つまたはそれ以上の変異を生じさせることができる。ある特定の他の態様において、本発明の逆転写酵素は、ヒスチジン２０４のアルギニンへの変異（Ｈ２０４Ｒ）とスレオニン３０６のリジンへの変異（Ｔ３０６Ｋ）を組み合わせた逆転写酵素；Ｈ２０４ＲおよびＴ３０６Ｋとフェニルアラニン３０９のアスパラギンへの変異（Ｆ３０９Ｎ）を組み合わせた逆転写酵素；ならびにＨ２０４Ｒ、Ｔ３０６Ｋ、およびＦ３０９Ｎとバリン２２３のヒスチジンへの変異（Ｖ２２３Ｈ）を組み合わせた逆転写酵素などの変異の特定の組み合わせを含まない可能性がある。
【０１０６】
特定の態様において、望ましい結果（例えば、耐熱性の増大、忠実度の増大、ＴｄＴ活性の減少など）を生じるために、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の位置Ｌ５２、Ｙ６４、Ｒ１１６、Ｙ１３３、Ｋ１５２、Ｑ１９０、Ｔ１９７、Ｈ２０４、Ｖ２２３、Ｍ２８９、Ｔ３０６および／またはＦ３０９に等価な、またはこれらに対応する位置で１つまたはそれ以上の変異を生じさせることができる。従って、特定の態様において、基準系としてＭ−ＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸位置を用いて、本発明のタンパク質は、本明細書の他の場所で記載されるある特定の態様において特に排除される変異または変異の組み合わせを除く、以下の変化：Ｌ５２Ｐ、Ｙ６４Ｓ、Ｙ６４Ｗ、Ｙ６４Ｒ、Ｒ１１６Ｍ、Ｙ１３３Ａ、Ｙ１３３Ｈ、Ｋ１５２Ｒ、Ｋ１５２Ｍ、Ｑ１９０Ｆ、Ｔ１９７Ｒ、Ｔ１９７Ｅ、Ｔ１９７Ａ、Ｔ１９７Ｋ、Ｈ２０４Ｒ、Ｖ２２３Ｈ、Ｖ２２３Ｆ、Ｖ２２３Ｉ、Ｍ２８９Ｌ、Ｔ３０６Ｋ、Ｔ３０６Ｒ、Ｆ３０９Ｒ、および／またはＦ３０９Ｎの１つまたはそれ以上を有する逆転写酵素（例えば、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素など）、ならびにこれらのタンパク質を含む組成物、これらのタンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含む宿主細胞を含む。
【０１０７】
これらのタンパク質の耐熱性を変える、逆転写酵素における変異は、逆転写酵素に通常関連する活性（例えば、ＲＮａｓｅＨ活性、逆転写酵素活性、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴａｓｅ）活性など）にほとんど、もしくは全く影響を及ぼさない変化または逆転写酵素に通常関連する１つまたはそれ以上の活性を実質的に変える変化と共に存在してもよい。このような変異の組み合わせを有する逆転写酵素の一例は、以下の変化：Ｋ１５２Ｍ、Ｖ２２３Ｈを有するＭ−ＭＬＶ逆転写酵素である。
【０１０８】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）カタログ番号１８０６４−０２２）の忠実度を向上することが示されている１つの変異はＶ２２３Ｈである（２０００年３月１５日に出願された米国特許出願第６０／１８９，４５４号および２００１年３月１５日に出願された米国特許出願第０９／８０８，１２４号を参照のこと。これらのそれぞれの全開示を参照として本明細書に引用する）。しかしながら、Ｖ２２３Ｈ変化は、この酵素の耐熱性を減少させる。Ｖ２２３Ｈ変異を有する酵素の不安定作用を抑制する、１つの変異体Ｋ１５２Ｍが特定された。従って、本発明は位置Ｋ１５２およびＶ２２３に変化を含むＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を含み、忠実度と耐熱性の両方の増大を示す。このような逆転写酵素の特定の例は、Ｋ１５２がメチオニンで置換され、Ｖ２２３がヒスチジンで置換されている逆転写酵素である。対応する変化を有する他の逆転写酵素（例えば、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素など）もまた本発明の範囲内に含まれる。
【０１０９】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩは、以下の置換：Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、およびＤ５８３Ｎを有するＭ−ＭＬＶ由来ＲＮａｓｅＨ−逆転写酵素である（米国特許第５，０１７，４９２号、米国特許第５，２４４，７９７号、米国特許第５，４０５，７７６号、米国特許第５，６６８，００５号、および米国特許第６，０６３，６０８号を参照のこと。これらの全開示を参照として本明細書に引用する）。
【０１１０】
関心対象の任意の逆転写酵素について１つまたはそれ以上のアミノ酸置換が１つまたはそれ以上の選択された位置で行われる。従って、選択された位置でのアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌを含む他の任意のアミノ酸で置換することができる。ある好ましい態様において、選択されたアミノ酸は非荷電表面残基であり、荷電残基によって置換される。ある好ましい態様において、非荷電表面残基は、正に荷電したアミノ酸（例えば、リジンまたはアルギニン）で置換することができる。
【０１１１】
他の逆転写酵素について、前記で特定されたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素の対応する位置は当業者によって容易に特定することができる。従って、本明細書に記載の特定された領域およびアッセイがあれば、当業者は、関心対象の任意の逆転写酵素の耐熱性を増大させる１つまたは多数の改変を加えることができる。本発明に従って改変される残基として、前記の表１に列挙された残基を挙げることができる。
【０１１２】
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のヌクレオチド配列（シニック（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ）ら，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９３：５４３−５４８；ゲオルギアディス（Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ）ら，１９９５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：８７９−８９２）、ＡＭＶ逆転写酵素のヌクレオチド配列（ジョリオット（Ｊｏｌｉｏｔ）ら，１９９３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９５：８１２−８１９）、ＲＳＶ逆転写酵素のヌクレオチド配列（シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら，１９８３，Ｃｅｌｌ ３２：８５３−８５９）、およびＨＩＶ逆転写酵素のヌクレオチド配列（ウォングスタール（Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ）ら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７−２８４）が知られている。
【０１１３】
好ましくは、逆転写酵素変異体を作製するために、コードＤＮＡ分子に沿って任意の決定された部位で塩基対変化の全てのクラスを可能にするという効果があるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発が用いられる。
【０１１４】
逆転写酵素の発現の向上
本発明の逆転写酵素の発現を最適化するために、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターが周知であり、組換え宿主において高レベルの逆転写酵素構造遺伝子を発現するのに使用することができる。同様に、高レベルの発現を達成するのに、当技術分野において周知の高コピー数ベクターを使用してもよい。誘導性の高コピー数を有するベクターもまた、組換え宿主において本発明の逆転写酵素の発現を向上させるのに有用な場合がある。
【０１１５】
望ましい構造遺伝子を原核細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属など）において発現させるためには、望ましい構造遺伝子を機能的な原核生物プロモーターに機能的に連結することが必要である。しかしながら、逆転写酵素遺伝子の発現を可能にする、逆転写酵素遺伝子の天然プロモーターが原核生物宿主において機能する場合がある。従って、逆転写酵素遺伝子を発現させるために、天然プロモーターまたは他のプロモーターを使用してもよい。発現を向上させるのに使用することができる、このような他のプロモーターとしては、構成的または調節的（すなわち、誘導性の、もしくは活性化の）プロモーターが挙げられる。構成的プロモーターの例としては、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーターおよびｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターが挙げられる。誘導性原核生物プロモーターの例としては、バクテリオファージλの主要な右および左プロモーター（ＰＲおよびＰＬ）、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ｔｅｔ、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ ＢＡＤ（ガズマン（Ｇｕｚｍａｎ）ら，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７（１４）：４１２１−４１３０）およびｔａｃプロモーターが挙げられる。枯草菌プロモーターとしてα−アミラーゼ（ウルマネン（Ｕｌｍａｎｅｎ）ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １６２：１７６−１８２（１９８５））およびバチルス属バクテリオファージプロモーター（グリクザン（Ｇｒｙｃｚａｎ），Ｔ．，バチルス属の分子生物学（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｉ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２））が挙げられる。ストレプトマイセス属プロモーターはワード（Ｗａｒｄ）ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８４７８（１９８６）に述べられている。原核生物プロモーターはまた、グリック（Ｇｌｉｃｋ），Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７−２８２（１９８７）；セナチエムプト（Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｔｏ），Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６８：５０５−５１６（１９８６）；およびゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（１９８４）に概説されている。原核細胞における発現はまた、遺伝子コード配列の上流にリボソーム結合部位の存在を必要とする。このようなリボソーム結合部位は、例えば、ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５４０４（１９８１）に開示されている。
【０１１６】
真核細胞における本発明のポリメラーゼの発現を向上させるために、周知の真核生物プロモーターおよび真核宿主を使用することができる。ポリメラーゼの発現の向上は原核生物宿主において達成することができる。本発明との使用に適した原核生物宿主の一例は大腸菌である。
【０１１７】
逆転写酵素の単離および精製
本発明の１つまたはそれ以上の酵素は、好ましくは、望ましい逆転写酵素遺伝子を含み、発現する組換え宿主を培養において増殖させることによって生成される。しかしながら、本発明の逆転写酵素は、本発明の逆転写酵素を生成する任意の株から単離することができる。逆転写酵素の断片もまた本発明に含まれる。このような断片は、逆転写酵素活性を有する１つまたはそれ以上のタンパク質分解断片を含む。
【０１１８】
クローニングされた逆転写酵素遺伝子を含む宿主によって同化される任意の栄養分を培養培地に添加することができる。使用される株および培養培地の組成に応じて個別的に最適な培養条件を選択すべきである。発現させようとする望ましい遺伝子を含むベクターＤＮＡの維持を確実なものにするために、抗生物質を増殖培地に添加することもできる。培地配合物は、ＤＳＭまたはＡＴＣＣカタログならびにサンブルックら，「分子クローニング，実験マニュアル（第２版）」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されている。
【０１１９】
本発明の逆転写酵素を生成する組換え宿主細胞は、例えば、遠心分離によって、液体培養から分離することができる。一般的に、収集された微生物細胞を適切な緩衝液に分散させ、次いで、超音波処理によって、または緩衝液溶液による酵素の抽出を可能にする他の周知の手順によって破壊することができる。超遠心分離または遠心分離によって細胞破片を除去した後に、逆転写酵素を、標準的なタンパク質精製法（例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動など）によって精製することができる。精製中の逆転写酵素の存在を検出するためのアッセイは当技術分野において周知であり、これらの酵素の存在を確かめるために従来の生化学的精製法の間に使用することができる。
【０１２０】
ある態様において、本発明の逆転写酵素は、逆転写酵素の精製を容易にするためにアフィニティタグを含むように改変することができる。適切なアフィニティタグは当業者に周知であり、６ヒスチジンなどのアミノ酸反復配列、ヘマグルチニンエピトープおよびｍｙｃエピトープなどのエピトープ、ならびに逆転写酵素の簡単な精製を可能にする他のアミノ酸配列を含むが、これらに限定されない。
【０１２１】
本発明の逆転写酵素は、好ましくは約５単位／ｍｇを超える、より好ましくは約５０単位／ｍｇを超える、さらにより好ましくは約１００単位／ｍｇ、２５０単位／ｍｇ、５００単位／ｍｇ、１０００単位／ｍｇ、５０００単位／ｍｇ、または１０，０００単位／ｍｇを超える、最も好ましくは約１５，０００単位／ｍｇを超える、約１６，０００単位／ｍｇを超える、約１７，０００単位／ｍｇを超える、約１８，０００単位／ｍｇを超える、約１９，０００単位／ｍｇを超える、および約２０，０００単位／ｍｇを超える比活性を有する。ある態様において、本発明の逆転写酵素は、約５０，０００単位／ｍｇを超える、約１００，０００単位／ｍｇを超える、約１５０，０００単位／ｍｇを超える、約２００，０００単位／ｍｇを超える、約２５０，０００単位／ｍｇを超える、および約３００，０００単位／ｍｇを超える比活性を有してもよい。本発明の逆転写酵素の比活性の好ましい範囲は、約５単位／ｍｇ〜約３５０，０００単位／ｍｇの比活性、約５単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、約５０単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、約１００単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、約２５０単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、約５００単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、約１０００単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、約５０００単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、約１０，０００単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、約２５，０００単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、約１００単位／ｍｇ〜約５００単位／ｍｇの比活性、約１００単位／ｍｇ〜約４００単位／ｍｇの比活性、および約２００単位／ｍｇ〜約５００単位／ｍｇの比活性を含む。比活性の他の好ましい範囲は、約２００，０００単位／ｍｇ〜約３５０，０００単位／ｍｇの比活性、約２２５，０００単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性、および約２５０，０００単位／ｍｇ〜約３００，０００単位／ｍｇの比活性を含む。好ましくは、比活性の範囲の下限は、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７００、９００、１，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、および８０，０００単位／ｍｇから変化し得るに対して、範囲の上限は、３５０，０００、３００，０００、２５０，０００、２００，０００、１５０，０００、１４０，０００、１３０，０００、１２０，０００、１１０，０００、１００，０００、および９０，０００単位／ｍｇから変化し得る。本発明のある態様において、本発明に従って調製される耐熱性逆転写酵素の比活性は非耐熱性逆転写酵素の比活性より高くてもよい。ある態様において、耐熱性逆転写酵素の比活性は、対応する非耐熱性逆転写酵素の比活性より５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％高いか、またはそれより高くてもよい。ある好ましい態様において、本発明による耐熱性逆転写酵素の比活性は、対応する非耐熱性逆転写酵素の比活性より３０％以上高くてもよい。本発明によれば、比活性は、反応に使用されるタンパク質または酵素の総量に対するタンパク質または酵素の酵素活性（単位）の尺度である。比活性の尺度は、当業者に周知の標準的な技法によって決定することができる。
【０１２２】
本発明の逆転写酵素は、１つまたはそれ以上の鋳型から核酸分子を作製するのに使用することができる。このような方法は、１つまたはそれ以上の核酸鋳型（例えば、ｍＲＮＡ、より好ましくは、ｍＲＮＡ分子の集団）と本発明の逆転写酵素の１つまたはそれ以上を混合する段階、およびに１つまたはそれ以上の核酸鋳型の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の核酸分子を作製するのに十分な条件下で混合物をインキュベートする段階を含む。
【０１２３】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の核酸分子を増幅する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：１つまたはそれ以上の核酸鋳型と本発明の逆転写酵素の１つを混合する段階、および１つまたはそれ以上の核酸鋳型の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階。このような増幅法は、さらに、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼの使用を含んでもよく、標準的なＲＴ−ＰＣＲ反応と同様に使用することができる。
【０１２４】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の核酸分子を配列決定する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：（ａ）配列決定しようとする１つまたはそれ以上の核酸分子と、１つまたはそれ以上のプライマー核酸分子、１つまたはそれ以上の本発明の逆転写酵素、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および１つまたはそれ以上の反応停止薬剤を混合する段階；（ｂ）配列決定しようとする１つまたはそれ以上の核酸分子の全てまたは一部と相補的な核酸分子の集団を合成するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階；および（ｃ）核酸分子の集団を分離して、配列決定しようとする１つまたはそれ以上の核酸分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する段階。
【０１２５】
本発明はまた、このような方法によって生成された核酸分子（完全長ｃＤＮＡ分子でもよい）、これらの核酸分子を含むベクター（特に、発現ベクター）、ならびにこれらのベクターおよび核酸分を含む宿主細胞に関する。
【０１２６】
ＤＮＡポリメラーゼの供給源
本発明によれば様々なＤＮＡポリメラーゼが有用である。このようなポリメラーゼとして、サームス・サーモフィリス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、サームス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｉｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス種ＧＢ−Ｄ（ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス・ウォーシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｏｓｉｉ）（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステロサーモフィリラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・カルドフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、サームス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、サームス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、サームス・ブロキアヌス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、メサノバクテリウム・サーモオートロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、マイコバクテリウム種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）、ならびにその変異体、変種、および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
本発明に従って使用されるＤＮＡポリメラーゼは、核酸鋳型からＤＮＡ分子を一般的に５’から３’方向に合成することができるどの酵素でもよい。このようなポリメラーゼは中温性でも高温性でもよいが、好ましくは高温性である。中温性ポリメラーゼとしては、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩなどが挙げられる。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、Ｔｔｈ、ならびにその変異体、変種、および誘導体などの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；ＰＣＴ国際公開公報第９２／０６１８８号；ＰＣＴ国際公開公報第９２／０６２００号；ＰＣＴ国際公開公報第９６／１０６４０号；バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ），Ｗ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ １１２：２９−３５（１９９２）；ロウヤー（Ｌａｗｙｅｒ），Ｆ．Ｃ．ら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（１９９３）；ファルマン（Ｆｌａｍａｎ），Ｊ．−Ｍ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４））。長い核酸分子（例えば、約３〜５Ｋｂ長より長い核酸分子）を増幅するために、少なくとも２種類のＤＮＡポリメラーゼ（一方は３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、他方は３’エキソヌクレアーゼ活性を有する）が一般的に用いられる。米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；バーンズ，Ｗ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ １１２：２９−３５（１９９２）；ＰＣＴ国際公開公報第９８／０６７３６号；および１９９７年２月１４日に出願された、権利者が同一である同時係属中の米国特許出願第０８／８０１，７２０号（これらの全ての開示はその全体が本明細書に引用される）を参照のこと。３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例として、Ｔａｑ、Ｔｎｅ（ｅｘｏ−）、Ｔｍａ、Ｐｆｕ（ｅｘｏ−）、Ｐｗｏ、およびＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにその変異体、変種、および誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの限定しない例として、Ｐｆｕ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、およびＴｌｉ／ＶＥＮＴ（商標）、ならびにその変異体、変種、および誘導体が挙げられる。
【０１２８】
酵素組成物の処方
本発明の組成物を形成するために、好ましくは、１つまたはそれ以上の逆転写酵素を緩衝塩溶液に溶解して混合する。本発明の組成物を作製するために、選択的に、１つもしくはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ、および／または１つもしくはそれ以上のヌクレオチド、および／または１つもしくはそれ以上のプライマーを添加してもよい。より好ましくは、酵素は、安定な緩衝塩溶液中で作用濃度で提供される。本明細書で使用する用語「安定な」および「安定性」は、一般的に、酵素または酵素を含む組成物が約４℃の温度で約１週間、約−２０℃の温度で約２〜６ヶ月、および約−８０℃の温度で約６ヶ月以上保存された後に、酵素組成物などの組成物が最初の酵素活性（単位）の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を保持することを意味する。本明細書で使用する用語「作用濃度」は、特定の機能（例えば、核酸の逆転写）を果たすために溶液中に用いられる最適濃度の、または最適濃度近くの酵素濃度を意味する。
【０１２９】
本発明の組成物を形成する際に用いられる水は、好ましくは、蒸留され、脱イオンされ、（０．１〜０．２マイクロメートルフィルターに通して）滅菌濾過されており、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ酵素による汚染がない。このような水は、例えば、シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から市販されているか、または当業者に周知の方法に従って、必要とされるように作製することができる。
【０１３０】
酵素成分に加えて、本発明の組成物は、好ましくは、核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）の合成に必要な１つまたはそれ以上の緩衝液および補助因子を含む。本発明の組成物を形成する際の使用に特に好ましい緩衝液は、酢酸緩衝液、硫酸緩衝液、塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、または遊離酸形態のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））緩衝液であるが、ＴＲＩＳ（登録商標）と同じ適切なイオン強度およびｐＫａの代替緩衝液を同等の効果をもって使用することができる。緩衝塩に加えて、補助因子塩（例えば、カリウム塩（好ましくは、塩化カリウムまたは酢酸カリウム）およびマグネシウム塩（好ましくは、塩化マグネシウムまたは酢酸マグネシウム））が組成物に含まれる。保存の際の組成物および／または反応混合物の安定性の向上を保つために、組成物および／または合成反応混合物への１つまたはそれ以上の炭水化物および／または糖の添加も有利なことがある。本発明の組成物および／または合成反応混合物に添加するための好ましいこのような炭水化物または糖としては、スクロース、トレハロース、グリセロールなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、このような炭水化物および／または糖を、本発明の酵素組成物およびキットの作製に用いられる酵素の保存緩衝液に添加してもよい。このような炭水化物および／または糖はシグマ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む多くの供給源から市販されている。
【０１３１】
多くの場合、まず最初に、緩衝塩、補助因子塩、および炭水化物または糖を作用濃度で水に溶解し、酵素を添加する前に溶液のｐＨを調節することが好ましい。このように、ｐＨ感受性酵素は、本発明の組成物の処方中に酸またはアルカリを介した不活化を受けない。
【０１３２】
緩衝塩溶液を処方するためには、緩衝塩（好ましくは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ（登録商標））の塩、最も好ましくは、その塩酸塩）と十分な量の水を混合して、ＴＲＩＳ（登録商標）の濃度が５〜１５０ミリモル濃度、好ましくは１０〜６０ミリモル濃度、最も好ましくは約２０〜６０ミリモル濃度の溶液を得る。この溶液に、マグネシウム塩（好ましくは、その塩化物または酢酸塩のいずれか）を、作用濃度が１〜１０ミリモル濃度、好ましくは１．５〜８．０ミリモル濃度、最も好ましくは約３〜７．５ミリモル濃度になるように添加してもよい。この溶液に、作用濃度が１０〜１００ミリモル濃度、最も好ましくは約７５ミリモル濃度になるようにカリウム塩（好ましくは、カリウムの塩化物または酢酸塩）も添加してよい。この溶液にジチオスレイトールなどの還元剤を、好ましくは約１〜１００ｍＭの最終濃度で、より好ましくは約５〜５０ｍＭまたは約７．５〜２０ｍＭの濃度で、最も好ましくは約１０ｍＭの濃度で添加してもよい。本発明の組成物に含めるための炭水化物および／または糖の好ましい濃度は、約５％（ｗ／ｖ）〜約３０％（ｗ／ｖ）、約７．５％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１０％（ｗ／ｖ）〜約１５％（ｗ／ｖ）である。少量のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩（例えば、ジソジウムＥＤＴＡ）（好ましくは、約０．１ミリモル濃度）も添加してよいが、ＥＤＴＡの含有は、本発明の組成物の機能または安定性に必須でないようだ。全ての緩衝液および塩を添加した後、全ての塩が溶解するまで、この緩衝塩溶液をよく混合し、当技術分野において周知の方法を用いて、ｐＨを７．４〜９．２、好ましくは８．０〜９．０、最も好ましくは約８．４のｐＨ値まで調節する。
【０１３３】
これらの緩衝塩溶液に酵素（逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼ）を添加して、本発明の組成物を得る。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は、好ましくは、溶液中で約１，０００〜約５０，０００単位／ｍｌ、約２，０００〜約３０，０００単位／ｍｌ、約２，５００〜約２５，０００単位／ｍｌ、約３，０００〜約２２，５００単位／ｍｌ、約４，０００〜約２０，０００単位／ｍｌの作用濃度で、最も好ましくは、約５，０００〜約２０，０００単位／ｍｌの作用濃度で添加される。（前記の本発明の酵素を含む）ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、およびＨＩＶ逆転写酵素は、好ましくは、溶液中で約１００〜約５０００単位／ｍｌ、約１２５〜約４０００単位／ｍｌ、約１５０〜約３０００単位／ｍｌ、約２００〜約２５００単位／ｍｌ、約２２５〜約２０００単位／ｍｌの作用濃度で、最も好ましくは約２５０〜約１０００単位／ｍｌの作用濃度で添加される。高温性ＤＮＡポリメラーゼ群（Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、ＶＥＮＴ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ、Ｔｔｈ、ならびにその変異体、変種、および誘導体）の酵素は、好ましくは、溶液中で約１００〜約１０００単位／ｍｌ、約１２５〜約７５０単位／ｍｌ、約１５０〜約７００単位／ｍｌ、約２００〜約６５０単位／ｍｌ、約２２５〜約５５０単位／ｍｌの作用濃度で、最も好ましくは、約２５０〜約５００単位／ｍｌの作用濃度で添加される。酵素は溶液に任意の順番で添加されてもよく、同時に添加されてもよい。
【０１３４】
本発明の組成物は、さらに、１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、好ましくは、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である。本発明の組成物のｄＮＴＰ成分は新たに合成される核酸の「基本要素」として働き、ポリメラーゼの働きによって新たに合成される核酸に取り込まれ、ｄｄＮＴＰは、本発明による配列決定方法において使用することができる。本発明の組成物における使用に適したヌクレオチドの例として、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、α−チオ−ｄＣＴＰ、ｄｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄｄＧＴＰ、α−チオ−ｄｄＡＴＰ、α−チオ−ｄｄＴＴＰ、α−チオ−ｄｄＧＴＰ、α−チオ−ｄｄＣＴＰ、またはその誘導体（これらの全てが、インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、およびシグマケミカルカンパニー（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含む供給源から市販されている）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのヌクレオチドは標識されなくてもよく、当技術分野において周知の方法でヌクレオチドと放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、または３５Ｓ）、ビタミン（例えば、ビオチン）、蛍光成分（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、またはフィコエリトリン）、化学発光標識（例えば、インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されているＰＨＯＴＯ−ＧＥＮＥ（商標）またはＡＣＥＳ（商標）化学発光システムを用いる）、ジゴキシゲニンなどを結合することによって検出可能に標識されてもよい。標識ヌクレオチドはまた、例えば、インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはシグマケミカルカンパニー（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から商業的に入手することができる。本発明の組成物において、ヌクレオチドは、各ヌクレオチドの作用濃度が約１０〜４０００マイクロモル濃度、約５０〜２０００マイクロモル濃度、約１００〜１５００マイクロモル濃度、または約２００〜１２００マイクロモル濃度、最も好ましくは約１０００マイクロモル濃度の作用濃度になるように添加される。
【０１３５】
成分の劣化を遅らせるために、試薬組成物の保存は、好ましくは約４℃で１日まで、最も好ましくは−２０℃で１年までである。
【０１３６】
別の局面において、本発明の組成物および逆転写酵素は、１つまたはそれ以上の炭水化物、糖、または合成ポリマーの存在下で乾燥した形で調製および保存することができる。乾燥した組成物または逆転写酵素を調製するための好ましい炭水化物、糖、またはポリマーとして、スクロース、トレハロース、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、またはその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，０９８，８９３号、同第４，８９１，３１９号、および同第５，５５６，７７１号（これらの開示は全体が本明細書に引用される）を参照のこと。このような乾燥した組成物または酵素は、本発明の組成物の酵素または成分が著しく劣化することなく様々な温度で長期間保存することができる。好ましくは、乾燥した逆転写酵素または組成物は４℃または−２０℃で保存される。
【０１３７】
ｃＤＮＡ分子の生成／供給源
本発明によれば、ｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）は様々な核酸鋳型分子から調製することができる。本発明において使用するための好ましい核酸分子として、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、ならびに二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが挙げられる。より好ましい核酸分子として、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子が挙げられるが、ｍＲＮＡ分子が本発明の好ましい鋳型である。
【０１３８】
本発明の方法に従ってｃＤＮＡ分子を調製するのに用いられる核酸分子は、当業者に公知の標準的な有機化学合成法に従って合成することにより調製することができる。より好ましくは、核酸分子は、天然の供給源（例えば、様々な細胞、組織、器官、または生物）から得ることができる。核酸分子の供給源として使用することができる細胞は、原核生物（細菌細胞（エシェリキア属、バチルス属、セラチア属、サルモネラ属、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、およびストレプトマイセス属）の種が挙げられるが、これらに限定されない））でもよく、真核生物（菌類（特に、酵母）、植物、原生動物および他の寄生生物、ならびに昆虫（特に、キイロショウジョウバエ属の種の細胞）、線虫（特に、セノルハブディティス・エレガンス細胞）、および哺乳動物（特に、ヒト細胞）を含む動物を含む）でもよい。
【０１３９】
核酸の供給源として使用することができる哺乳動物体細胞として、血液細胞（網状赤血球および白血球）、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞（中枢神経系または末梢神経系に由来する細胞）、筋肉細胞（骨格筋、平滑筋、または心筋に由来する筋細胞および筋芽細胞を含む）、結合組織細胞（線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞、および骨芽細胞を含む）、ならびに他の間質細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、シュワン細胞）が挙げられる。哺乳動物生殖細胞（精母細胞および卵母細胞）もまた本発明において使用するための核酸供給源として使用することができ、同様に、前記の体細胞および生殖細胞を生じる始原細胞、前駆細胞、および幹細胞を使用することができる。哺乳動物の組織または器官（例えば、脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器、循環器、リンパ、胃腸管、および結合組織供給源に由来する組織または器官、ならびに哺乳動物（ヒトを含む）胚または胎児に由来する組織または器官）も核酸供給源として使用するのに適している。
【０１４０】
前記の原核生物または真核生物の細胞、組織、および器官のどれも、正常でもよく、患部由来でもよく、形質転換されたものでもよく、株化細胞でもよく、始原細胞でもよく、前駆体でもよく、胎児に由来してもよく、胚に由来してもよい。患部細胞として、例えば、（細菌、菌類もしくは酵母、ウイルス（ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペス、肝炎などを含む）、または寄生生物によって引き起こされる）感染症、遺伝的もしくは生化学的な病理（例えば、嚢胞性繊維症、血友病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、もしくは多発性硬化症）、または癌プロセスに関与する細胞を挙げることができる。形質転換された、または株化された動物細胞系として、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｌ９２９細胞、Ｆ９細胞などを挙げることができる。本発明において使用するための核酸供給源として適した他の細胞、細胞系、組織、器官、および生物は当業者に明らかであろう。
【０１４１】
出発細胞、組織、器官、または他の試料が得られたら、それらから核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）を当技術分野において周知の方法によって単離することができる（例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．ら，Ｃｅｌｌ １５：６８７−７０１（１９７８）；オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ），Ｈ．およびバーグ（Ｂｅｒｇ），Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２）；グブラー（Ｇｕｂｌｅｒ），Ｕ．，およびホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ），Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）を参照のこと）。次いで、このように単離された核酸分子は、本発明に従ってｃＤＮＡ分子およびｃＤＮＡライブラリーを調製するのに使用することができる。
【０１４２】
本発明の実施において、ｃＤＮＡ分子またはｃＤＮＡライブラリーは、前記のように得られた１つまたはそれ以上の核酸分子（好ましくは、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子の集団））と本発明の逆転写酵素活性を有するポリペプチドまたは本発明の組成物の１つもしくはそれ以上を、１つまたはそれ以上のｃＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖）を形成するための、酵素または組成物の働きによる核酸分子の逆転写に好ましい条件下で、混合することによって生成される。従って、本発明の方法は、（ａ）１つまたはそれ以上の核酸鋳型（好ましくは、１つまたはそれ以上のＲＮＡまたはｍＲＮＡ鋳型（例えば、ｍＲＮＡ分子の集団））と、１つまたはそれ以上の本発明の逆転写酵素を混合する段階、および（ｂ）１つまたはそれ以上の鋳型の全てまたは一部と相補的な１つまたはそれ以上の核酸分子を作製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階を含む。このような方法は、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、１つまたはそれ以上のプライマー、１つまたはそれ以上の緩衝液などの使用を含んでもよい。本発明は、ｃＤＮＡ合成法（例えば、以下の実施例に記載の方法）または当技術分野において周知の他の方法と共に使用することができる（例えば、ｃＤＮＡ分子またはライブラリーを生成するには、グブラー（Ｇｕｂｌｅｒ），Ｕ．およびホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ），Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ ２５：２６３−２６９（１９８３）；クラグ（Ｋｒｕｇ），Ｍ．Ｓ．およびバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ），Ｓ．Ｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３１６−３２５（１９８７）；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら，「分子クローニング：実験マニュアル，第２版」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，８．６０頁−８．６３頁（１９８９）；ＰＣＴ国際公開公報第９９／１５７０２号；ＰＣＴ国際公開公報第９８／４７９１２号；およびＰＣＴ国際公開公報第９８／５１６９９号）を参照のこと）。
【０１４３】
本発明を有利に使用することができる他のｃＤＮＡ合成法は当業者に容易に明らかであろう。
【０１４４】
本発明に従ってｃＤＮＡ分子またはライブラリーを入手した場合、さらなる分析または操作のために、これらのｃＤＮＡを単離することができる。詳細なｃＤＮＡ精製法は、その全体が参照として本明細書に引用されるＧＥＮＥＴＲＡＰＰＥＲ（商標）マニュアル（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に開示されているが、当技術分野において周知である別の標準的なｃＤＮＡ単離法（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら，「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），第２版」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，８．６０頁−８．６３頁（１９８９）を参照のこと）も使用することができる。
【０１４５】
本発明の他の局面において、本発明は、核酸分子を増幅および配列決定する方法において使用することができる。本発明のこの局面に従う核酸増幅法は一段階（例えば、一段階ＲＴ−ＰＣＲ）反応でもよく、二段階（例えば、二段階ＲＴ−ＰＣＲ）反応でもよい。本発明によれば、一段階ＲＴ−ＰＣＲ型反応は１つのチューブ内で達成することができ、それによって汚染の可能性が低くなる。このような一段階反応は、（ａ）核酸鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）と、１つまたはそれ以上の本発明の逆転写酵素および１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを混合する段階、および（ｂ）鋳型の全てまたは一部と相補的な核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階を含む。このような増幅は、逆転写酵素活性単独で、またはＤＮＡポリメラーゼ活性と組み合わせて達成することができる。二段階ＲＴ−ＰＣＲ反応は２つの別々の段階で達成することができる。このような方法は、（ａ）核酸鋳型（例えば、ｍＲＮＡ）と本発明の逆転写酵素を混合する段階、（ｂ）鋳型の全てまたは一部と相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）を作製するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階、（ｃ）核酸分子と１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを混合する段階、および（ｄ）核酸分子を増幅するのに十分な条件下で、段階（ｃ）の混合物をインキュベートする段階を含む。長い核酸分子（すなわち、約３Ｋｂ〜５Ｋｂ長より長い核酸分子）を増幅するために、ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせ（例えば、１つのＤＮＡポリメラーゼは３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、もう１つのＤＮＡポリメラーゼは３’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下している）を使用してもよい。
【０１４６】
本発明のこの局面に従う核酸配列決定法は、サイクルシークエンシング（増幅と組み合わせた配列決定）と標準的な配列決定反応の両方を含んでもよい。従って、本発明の配列決定法は、（ａ）配列決定しようとする核酸分子と、１つまたはそれ以上のプライマー、本発明の１つまたはそれ以上の逆転写酵素、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および１つまたはそれ以上の反応停止薬剤を混合する段階、（ｂ）配列決定しようとする分子の全てまたは一部と相補的な核酸分子の集団を合成するのに十分な条件下で、混合物をインキュベートする段階、および（ｃ）集団を分離して、配列決定しようとする分子の全てまたは一部のヌクレオチド配列を決定する段階を含む。本発明によれば、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）を、本発明の逆転写酵素と組み合わせて、または本発明の逆転写酵素とは別に使用することができる。
【０１４７】
本発明に従って使用することができる増幅法として、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ；米国特許第５，４５５，１６６号；欧州特許第０ ６８４ ３１５号）、ならびに核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ；米国特許第５，４０９，８１８号；欧州特許第０ ３２９ ８２２号）、ならびにより複雑なＰＣＲに基づく核酸フィンガープリンティング法（例えば、ランダム増幅多型ＤＮＡ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ：ＲＡＰＤ）分析（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ），Ｊ．Ｇ．Ｋ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（２２）：６５３１−６５３５，１９９０）、アービトラリリープライムドＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ Ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ：ＡＰ−ＰＣＲ；ウェルシュ（Ｗｅｌｓｈ），Ｊ．およびマククレランド（ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ），Ｍ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（２４）：７２１３−７２１８，１９９０）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ：ＤＡＦ；カエタノ・アノレス（Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ）ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５５３−５５７，１９９１）、マイクロサテライトＰＣＲまたはミニサテライト領域ＤＮＡの特異的増幅（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅ−ｒｅｇｉｏｎ ＤＮＡ：ＤＡＭＤ；ヘアス（Ｈｅａｔｈ），Ｄ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（２４）：５７８２−５７８５，１９９３）、および増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）分析（欧州特許第０ ５３４ ８５８号；ボス（Ｖｏｓ），Ｐ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３（２１）：４４０７−４４１４，１９９５；リン（Ｌｉｎ），Ｊ．Ｊ．およびクオ（Ｋｕｏ），Ｊ．，ＦＯＣＵＳ １７（２）：６６−７０，１９９５））が挙げられる。本発明の組成物を使用することができる核酸配列決定法として、ジデオキシシークエンシング法（例えば、米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号に開示される方法）が挙げられる。特に好ましい局面において、本発明は、１つまたはそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、核酸分子を増幅または配列決定する方法（例えば、前記のＰＣＲに基づく任意の方法）において使用することができる。
【０１４８】
キット
別の態様において、本発明は、核酸分子を逆転写もしくは増幅において使用するためのキットまたは核酸分子の配列決定に使用するためのキットとしてまとめることができる。本発明のこの局面に従うキットは、１つまたはそれ以上の容器手段（例えば、バイアル、チューブ、アンプル、瓶など）が密閉されている運搬手段（例えば、ボックス、カートン、チューブなど）を含み、ここで、第１の容器手段は、逆転写酵素活性を有する本発明の１つまたはそれ以上のポリペプチドを含む。逆転写酵素活性を有する１つを超えるポリペプチドが用いられる場合、これらのポリペプチドは、２つ以上のポリペプチドの混合物として１個の容器に入れられてもよく、別々の容器に入れられてもよい。本発明のキットはまた、（同じ容器または別々の容器に）１つもしくはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、１つまたはそれ以上のヌクレオチド、および／または１つもしくはそれ以上のプライマーを含んでもよい。
【０１４９】
本発明の特定の局面において、逆転写および増幅のキットは、本発明の逆転写酵素活性を有する１つもしくはそれ以上のポリペプチド、核酸分子の合成に必要とされる１つもしくはそれ以上のヌクレオチド、および／または１つまたはそれ以上のプライマー（例えば、逆転写用オリゴ（ｄＴ））を含む１つまたはそれ以上の成分を（混合物で、または別々に）含んでもよい。このような逆転写および増幅のキットは、さらに、１つまたはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼを含んでもよい。本発明の配列決定キットは、本発明の逆転写酵素活性を有する１つもしくはそれ以上のポリペプチド、必要に応じて、１つもしくはそれ以上のＤＮＡポリメラーゼ、核酸分子の配列決定に必要とされる１つもしくはそれ以上の反応停止薬剤（例えば、ジデオキシヌクレオシド三リン酸分子）、１つもしくはそれ以上のヌクレオチド、および／または１つもしくはそれ以上のプライマーを含んでもよい。本発明の逆転写、増幅、および配列決定のキットに使用するのに適した、好ましい逆転写酵素活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、および他の成分は前記のものを含む。本発明のこの局面に含まれるキットは、さらに、標準的な核酸の逆転写、増幅、または配列決定プロトコールを実施するのに必要な、さらなる試薬および化合物を含んでもよい。このような本発明の逆転写酵素活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、およびさらなる試薬、成分、または化合物は１つまたはそれ以上の容器に含まれてもよく、このような容器に２つ以上の前記成分の混合物で含まれてもよく、本発明のキットの別々の容器に含まれてもよい。
【０１５０】
核酸分子の使用
本発明の方法によって調製された核酸分子またはｃＤＮＡライブラリーは、例えば、クローニングおよび配列決定（すなわち、核酸分子のヌクレオチド配列の決定）によって、本発明の配列決定法によって、または当技術分野において標準である他の方法（例えば、ＤＮＡ配列決定法に関する米国特許第４，９６２，０２２号および同第５，４９８，５２３号を参照のこと）によってさらに特徴付けることができる。または、これらの核酸分子は、当技術分野において周知の方法によって、産業工程において様々な材料（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ）を製造するために使用することができる。ｃＤＮＡからハイブリダイゼーションプローブが作製されると、例えば、医学分野の分野において、特定の遺伝子マーカー（例えば、癌マーカー、感染症もしくは遺伝病のマーカー、または胚発生マーカー）の存在について患者の細胞または組織を調べることができる。さらに、このようなハイブリダイゼーションプローブは、さらなる特徴付けのために、異なる細胞、組織、または生物から調製されたゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡ断片を単離するのに使用することができる。
【０１５１】
本発明の核酸分子はまた、組換えＤＮＡ法において使用するための組成物を調製するのに使用することができる。従って、本発明は、本発明のｃＤＮＡまたは増幅された核酸分子を含む組換えベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、これらのベクターおよび宿主細胞を用いて組換えポリペプチドを生成する方法、ならびにこれらの方法を用いて生成された組換えポリペプチドに関する。
【０１５２】
組換えベクターは、本発明のこの局面に従って、当技術分野において周知の方法を用いて、本発明の方法に従って調製されたｃＤＮＡ分子または増幅された核酸分子の１つまたはそれ以上をベクターに挿入することによって生成することができる。本発明のこの局面において用いられるベクターは、例えば、ファージでもプラスミドでもよく、好ましくは、プラスミドである。関心対象のポリペプチドをコードする核酸にシス作用制御領域を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用因子は宿主によって供給されてもよく、相補ベクターによって供給されてもよく、宿主への導入の際にベクター自身によって供給されてもよい。
【０１５３】
これに関するある好ましい態様において、ベクターは特異的発現をもたらし（従って「発現ベクター」と呼ばれる）、特異的発現は誘導性および／または細胞特異的でもよい。このようなベクターの中で、操作しやすい環境因子（例えば、温度および栄養添加物）によって誘導されるベクターが特に好ましい。
【０１５４】
本発明において有用な発現ベクターは、染色体、エピソーム、およびウイルスに由来するベクター（例えば、細菌プラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター）、およびその組み合わせに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）を含み、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカー（例えば、細菌宿主細胞を培養するためのテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子）を含む。本発明のｃＤＮＡまたは増幅された核酸分子は、このような発現ベクターに挿入される前に適切なプロモーター（例えば、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、およびｔａｃプロモーター）に機能的に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは当業者に周知であろう。
【０１５５】
本発明での使用に好ましいベクターの中には、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手可能）；ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手可能）；ｐＧＥＸ、ｐＴｒｘｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能）；ならびにｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、およびｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手可能）が含まれる。他の適切なベクターは当業者に容易に明らかであろう。
【０１５６】
本発明はまた、本発明のｃＤＮＡ分子、増幅された核酸分子、または組換え体ベクターを含む組換え宿主細胞を生成する方法、ならびにこのような方法によって生成された宿主細胞を提供する。本発明に従って生成することができる代表的な宿主細胞（原核生物または真核生物）として、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、および動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい細菌宿主細胞として、大腸菌細胞（最も詳細には、市販されている大腸菌ＤＨ１０Ｂ株およびＳｔｂｌ２株（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、枯草菌細胞、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞、ストレプトマイセス属の種の細胞、エルウィニア属の種の細胞、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）の種の細胞、およびネズミチフス菌細胞が挙げられる。好ましい動物宿主細胞として、昆虫細胞（最も詳細には、スポドプテラ・フルギペルダＳｐ９およびＳｆ２１細胞ならびにトリコプルサハイファイブ細胞）、ならびに哺乳動物細胞（最も詳細には、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、およびヒト細胞）が挙げられる。このような宿主細胞は、当業者によく知られている周知の形質転換、エレクトロポレーション、またはトランスフェクション技法によって調製することができる。
【０１５７】
さらに、本発明は、組換えポリペプチドを生成する方法、およびこれらの方法によって生成されたポリペプチドを提供する。本発明のこの局面によれば、組換えポリペプチドは、前記の任意の組換え宿主細胞を、組換え宿主細胞からのポリペプチドの生成およびポリペプチドの単離に好ましい条件下で培養することによって生成することができる。組換え宿主細胞を培養する方法ならびに組換え宿主細胞からポリペプチドを生成および単離する方法は当業者に周知である。
【０１５８】
本明細書に記載の方法および用途への他の適切な変更および適応が自明であり、本発明の範囲または本発明のどの態様も逸脱することなく変更および適応が可能なことは関連技術の当業者に容易に明らかであろう。これまでに、本発明を詳細に説明したが、例示のために本明細書に含まれ、本発明を限定することが意図されない以下の実施例を参照することによって、本発明はさらに明確に理解されるだろう。
【０１５９】
実施例
実施例１：逆転写酵素変異体の調製
プラスミドｐＢＡＤをインビトロゲンから入手し、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のコード配列を挿入して、プラスミドｐＢＡＤ−６−Ｈｉｓ−Ｍ−ＭＬＶ Ｈ−（Ｆ１）を得た。プラスミドｐＢＡＤ−６−Ｈｉｓ−Ｍ−ＭＬＶ Ｈ−（Ｆ１）をクローニングベクターおよびＰＣＲ変異誘発の標的として使用した（図１）。ｐＢＡＤ−６−Ｈｉｓ−Ｍ−ＭＬＶ Ｈ−（Ｆ１）は大腸菌において複製し、形質転換細胞にアンピシリン耐性を付与する。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素遺伝子は、アラビノースの存在によって誘導されるａｒａ ＢＡＤプロモーターから発現される。このプロモーターは、プラスミドに存在するａｒａＣ遺伝子産物によって抑制される。使用した宿主、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株はａｒａＤ変異体であり、アラビノースを代謝することができず、このため、アラビノースは、ｐＢＡＤ−６−Ｈｉｓ−Ｍ−ＭＬＶ Ｈ−（Ｆ１）で形質転換されたＤＨ１０Ｂ細胞において無償性誘導物質となる。このプラスミドは、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素遺伝子のコード配列とインフレームで６ヒスチジン含有リーダー配列を含む。表３に示される、このプラスミドの配列（配列番号：１および２）に関して、ヌクレオチド１〜９６はリーダー配列をコードし、ヌクレオチド９７〜９９はメチオニンをコードする。野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素は前駆体ポリタンパク質からのタンパク質分解によって得られ、従って、野生型Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素はメチオニンから始まらないことを、当業者は理解するだろう。従って、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の一番目のアミノ酸は、ヌクレオチド９７〜９９によってコードされるメチオニンの後のスレオニンである。
【０１６０】
これらの実験で用いられたｐＢＡＤ−６−Ｈｉｓ−Ｍ−ＭＬＶ Ｈ−（Ｆ１）におけるＭ−ＭＬＶ逆転写酵素遺伝子の配列はプラスミドｐＲＴ６０１の配列から得た。ｐＲＴ６０１は、その全体が参照として本明細書に引用される米国特許第５，６６８，００５号および同第５，０１７，４９２号に開示されている。
【０１６１】
【表３】
2004511211.tif 000005
2004511211.tif 000006
【０１６２】
表４は、使用したプラスミドを生成するためにｐＲＴ６０１のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素コード配列に導入された点変異のリストを示す。点変異の番号付けは表３に示したヌクレオチド配列に対応する。
【０１６３】
【表４】
2004511211.tif 000007
【０１６４】
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のＲＮＡｓｅＨ−変異体を作製するために導入された変異は、Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ、およびＥ５６２Ｑである。残りの変異は、ランダムＰＣＲ変異誘発用の適切な大きさのセグメントの生成を容易にする制限酵素部位を挿入または除去するために導入された。このＲＮａｓｅＨ−変異体は、本明細書ではＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩまたはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ遺伝子と呼ばれる。
【０１６５】
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の配列は、この配列によってコードされるアミノ酸を変えることなく図２に模式的に示すように制限酵素切断部位を導入するように操作された。配列を５つのセグメントに分け、各セグメントを増幅できるようにオリゴヌクレオチドを設計した。
【０１６６】
セグメントを、制限酵素消化によってｐＢＡＤ−６−Ｈｉｓ−Ｍ−ＭＬＶ Ｈ−（Ｆ１）から調製し、ゲル精製してベクターバックボーンから分離した。各セグメントを、マンガンの存在下でＰＣＲによってランダムに変異誘発させた。ＰＣＲ条件は、０．２５ｍＭ ＭｎＣｌ２が存在した以外は標準的な条件であり、ヌクレオチド三リン酸濃度は２０μＭ（各ｄＮＴＰ）に制限された（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ ｄＧＴＰ、２０μＭ ｄＣＴＰ、２０μＭ ｄＡＴＰ、２０μＭ ｄＴＴＰ、１単位Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ／１００μｌ反応）。ＰＣＲ産物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、変異セグメントを、所定のセグメントが除去されているベクターにクローニングした。各変異セグメントの形質転換体ライブラリーを耐熱性変種についてスクリーニングした。
【０１６７】
実施例２：耐熱性逆転写酵素のスクリーニング
本実施例では、以下の溶液を使用した。
ＥＧ／リットル：バクトトリプトン ２０ｇ、バクト酵母エキス １０ｇ、グリセロール ２ｍｌ、ＮａＣｌ ０．５４ｇ、ＫＣｌ ０．１９４ｇ
ＥＧ−アラビノース： ＥＧ １５０ｍｌ＋１０ｍｇ／ｍｌ アンピシリン １．５ｍｌおよび２０％（ｗ／ｖ）アラビノース １．５ｍｌ（プレートにアラビノースを添加する場合）
２０×ＰＥＢ−Ｉ緩衝液：１８％（ｗ／ｖ）グルコース、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ ＥＤＴＡ
キナーゼ保存緩衝液：５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ βＭＥ
１００ｍｇ／ｍｌ リゾチーム：キナーゼ保存緩衝液に溶解して作製し、−２０℃で保存
２×ＰＬＤ：２０×ＰＥＢ−Ｉ ５ｍｌ、１Ｍ ＤＴＴ １ｍｌ、１０％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ リゾチーム １ｍｌ、および水 ３８ｍｌ
２×ＰＺＤ：２０×ＰＥＢ−Ｉ ０．５ｍｌ、１Ｍ ＤＴＴ １００μｌ、１０％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５ｍｌ、ザイモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ） １０μｌ、水 ３．９ｍｌ
１０×ポリ（Ｃ）反応緩衝液：５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２
１．２５×反応ミックス： １０×ポリ（Ｃ）反応緩衝液１ｍｌ、１Ｍ ＤＴＴ １００μｌ、ポリ（Ｃ）／オリゴ（ｄＧ）（ヌクレオチド中で３０ｍＭ／１２ｍＭ） １ｍｌ、１００ｍＭ ｄＧＴＰ １０μｌ、水 ５．８７ｍｌ、および ［α−３２Ｐ］ｄＧＴＰ（１０μＣｉ／μｌ） ２０μｌ。
【０１６８】
個々の形質転換体コロニーを９６ウェル培養プレートのシングルウェルに接種した。各ウェルは、０．２％アラビノースを含むＥＧ−Ａｐ培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＥＧ培地）１２０μｌを含んでいた。まず最初に、９６ウェルプレートに誘導物質を含まない選択培地を接種し、このマスタープレートを一晩増殖させ、次いで、マスタープレートのレプリカを、誘導物質を含む９６ウェルプレートに作製し、このプレートを一晩増殖させることが好ましい。培養物を振盪せずに３７℃で一晩（例えば、１５〜２０時間）増殖させた。一晩培養物を等量の２０×ＰＬＤと室温で混合した。時には、これらの抽出物を加熱段階前に逆転写酵素について直接アッセイした。抽出物を、水浴に５０℃〜６０℃の温度で５分または１０分間入れることによって加熱した。好ましくは、培養物を５２℃で５分間加熱した。加熱段階後、抽出物１０μｌを１．２５×ＲＴ反応ミックス４０μｌと混合した。この反応物を３７℃の水浴に１０分間入れた。少量（５μｌ）の混合物を等量、荷電したナイロン膜（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ＋，ＮＥＮ）の上にスポットした。膜を１０％ＴＣＡ＋１％ピロリン酸ナトリウムで２回洗浄し、エタノールですすぎ、乾燥させ、ホスファースクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｓｃｒｅｅｎ）のすぐ隣に配置した。代替として、膜を４％ピロリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で２回洗浄し、エタノールですすぎ、乾燥させ、次いで、ホスファースクリーンのすぐ隣に配置した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（モレキュラーデバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））を用いて、スクリーンをＰｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒにおいて分析することで、フィルター上に捕らえられた放射性産物を検出した。
【０１６９】
候補は、加熱不活化段階後に大きな逆転写酵素活性（放射能）を示した場合に選択された。表現型を確認するために、これらの候補に２回目のスクリーニングを行った。２回目のスクリーニング後に耐熱性であると判断された候補を少量培養で増殖させ、耐熱性逆転写酵素活性についての３回目の試験を行った。再現可能に熱に対して耐性であった候補を配列決定し、各クローンの変異を決定した。変異誘発部位に対応するオリゴヌクレオチドを設計し、ここで、変異誘発アミノ酸のコドンはランダムに選択された（ＮＮＫまたはＮＮＮ）。変異誘発部位で可能な全ての置換が行われたライブラリーを作製するために、これらのオリゴヌクレオチドを部位特異的変異誘発に使用した。このライブラリーを耐熱性逆転写酵素活性についてスクリーニングし、最も見込みのあるクローンを配列決定した。
【０１７０】
セグメント２（図２を参照のこと）における変異体のスクリーニングによって、１つの変異体Ｈ２０４Ｒが特定された。部位Ｈ２０４で変異誘発されたライブラリーのスクリーニングによって、いくつかの変異体が得られたが、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素より耐熱性がある唯一の変異体は別のＨ２０４Ｒ変異体であった。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のＨ２０４Ｒ変異体は耐熱性が向上している。セグメント３（図２を参照のこと）における変異体のスクリーニングによって、１つの変異体Ｔ３０６Ｋが得られた。Ｔ３０６位置の無作為化によって耐熱性変異体が得られ、これを配列決定するとＴ３０６Ｒであった。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のＴ３０６Ｋ変異体およびＴ３０６Ｒ変異体は両方とも耐熱性が約１．５倍向上している。
【０１７１】
実施例３：ＴｄＴ逆転写酵素変異体
３ ｄＮＴＰアッセイにおける誤伸長について逆転写酵素（ＲＴ）の忠実度変異体を調べた際に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素は、３種類および４種類のｄＮＴＰの存在下で鋳型末端を過ぎて２〜３個塩基を伸長することが観察された。この非鋳型特異的伸長すなわちＴｄＴ活性は多くの変異体において低下しているが、Ｆ３０９ＮおよびＴ１９７Ｅなどの少数の変異体において、この活性は著しく低下しているか、または無くなっているように見える。これらの変異体は、恐らく、ＨＩＶ逆転写酵素との相同性および結合した鋳型−プライマーとの結晶構造によって確かめられたように、鋳型−プライマーに近接しているか、または鋳型−プライマーと接触している。
【０１７２】
方法
変異誘発
Ｆ３０９Ｎの場合：
アミノ酸位置３１０〜３１１にＮｇｏＭＩＶ制限部位のサイレント挿入を有する、変異位置Ｆ３０９に対応したプライマーを設計した。このプライマーは、この位置に、Ｆ３０９変異体のランダムライブラリーを生じるランダムＮＮＫ配列をコードしていた。式中、Ｎは４種類の塩基のいずれかであり、ＫはＴまたはＧである。このプライマーと、上流ＳｓｔＩ制限部位および下流ＳａｌＩ制限部位での内部ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素プライマーを標準的なＰＣＲ反応に使用して（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素鋳型１０ｎｇ、２μＭ各プライマー、ＳｕｐｅｒＭｉｘ（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））４８μｌ、９４℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃３０秒の２０サイクル）、２つのＰＣＲ断片を得た。これらは、２４０塩基対のＳｓｔＩ−ＮｇｏＭＩＶ断片および２００塩基対のＮｇｏＭＩＶ−ＳａｌＩ断片であった。断片を単離し、消化し、一緒に連結し、次いで、ＳｓｔＩおよびＳａｌＩで切断された最初のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素クローンに挿入した。結果として生じた連結産物を、Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂ（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））コンピテント細胞において形質転換して、部位Ｆ３０９の変異体ライブラリーを得た。次いで、選択のために、このライブラリーを一晩プレートした。
【０１７３】
Ｔ１９７ＥおよびＹ１３３Ａの場合：
変異体Ｔ１９７ＥおよびＹ１３３Ａは、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ），Ｔ．Ａ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０４：１２５（１９９１）に記載のようにオリゴ特異的変異誘発によって作製した。簡単に述べると、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素遺伝子をｐＢＡＤｈｉｓＡ（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．））ベクターに挿入し、ｐＢＡＤ−ＳＳＩＩと名付けた。このプラスミドをＤＨ１１Ｓ細胞に形質転換し、この細胞にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させ、このファージから一本鎖ＤＮＡを単離した。各変異：Ｔ１９７ＥおよびＹ１３３Ａに対応するオリゴを設計した。各オリゴ（１００μＭ）を、フォワード反応緩衝液（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））でリン酸化した。オリゴを一本鎖ｐＢＡＤ−ＳＳＩＩ ＤＮＡとアニールさせた。合成緩衝液（０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、１７．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＤＴＴ、および１ｍＭ ＡＴＰ）と共に、ネイティブなＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（インビトロゲンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を、氷上で、アニールされた反応物に添加した。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １μｌを添加することで終結させた。反応物をＤＨ１０Ｂ細胞で形質転換し、プレートした。コロニーをつつき、変異体を制限酵素分析によって確かめ、確認のために、ＡＢＩ ３７７装置およびＡＢＩ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎキットを用いて配列決定した。
【０１７４】
活性のある逆転写酵素を含むコロニーの選択
個々の形質転換体コロニーを９６ウェル培養プレートのシングルウェルに接種した。各ウェルは、０．２％アラビノースを含む培地（ＥＧ−Ａｐ）１２０μｌを含んでいた。まず最初に、９６ウェルプレートに誘導物質を含まない選択培地を接種し、このマスタープレートを一晩増殖させ、次いで、マスタープレートのレプリカを、誘導物質を含む９６ウェルプレートに作製し、このプレートを一晩増殖させることが好ましい。培養物を振盪せずに３７℃で一晩増殖させた。一晩培養物を、等量の２×ＰＬＤ（１．８％グルコース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍｇ／ｍＬリゾチーム）と室温で混合した。抽出物１０μｌを１．２５×ＲＴ反応ミックス（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、６２．５ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１２．５ｍＭ ＤＴＴ、１．２５ｍＭ ｄＧＴＰ、ポリＣ／オリゴｄＧ（ヌクレオチド中３．７５ｍＭ／１．５ｍＭ）、［３２Ｐ］ｄＧＴＰ）４０μｌと混合することで、これらの抽出物を逆転写酵素活性について直接アッセイした。この反応物を３７℃の水浴に１０分間入れた。反応混合物の少量のアリコート（５μｌ）を、荷電したナイロン膜（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ＋，ＮＥＮ）の上にスポットした。膜を１０％ＴＣＡ＋１％ピロリン酸ナトリウムで２回洗浄し、エタノールですすぎ、乾燥させ、ホスファースクリーンのすぐ隣に配置した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（モレキュラーデバイシーズ）を用いて、スクリーンをＰｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒにおいて分析することで、フィルター上に捕らえられた放射性産物を検出した。候補は、逆転写酵素活性（放射能）を示した場合に選択された。表現型を確認するために、これらの候補に２回目のスクリーニングを行った。次いで、どのアミノ酸が検出可能な逆転写酵素活性を維持したかを確かめるために、確認された候補を配列決定した。
【０１７５】
逆転写酵素変異体の精製
細胞ペレット１グラムにつき溶解緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）２ｍＬの比で、誘導された逆転写酵素を含む細胞ペレットを懸濁した。懸濁液を氷上で超音波処理し、次いで、２７，０００ｇで３０分間遠心分離した。細胞を含まない抽出物を０．４５μシリンジフィルターに通して濾過した。緩衝液Ａ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％グリセロール、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１Ｍ ＫＣｌ）に溶解した５容量の５ｍＭイミダゾールで予め平衡化された５ｍＬ Ｎｉ２＋ＨＩ−ＴＲＡＰカラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に、１ｍＬ／分で、細胞を含まない抽出物を加えた。カラムを、緩衝液Ａに溶解した１０容量の５ｍＭイミダゾールで洗浄した。緩衝液Ａに溶解した２０容量の５ｍＭ〜１Ｍイミダゾールの勾配で洗浄することで、逆転写酵素を溶出させた。緩衝液Ｂ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％グリセロール、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ）に溶解した５０ｍＭ ＫＣｌ １０カラム体積で予め平衡化された１ｍＬ Ｍｏｎｏ−Ｓカラム（ファルマシア）に、１．０ｍＬ／分の流速で、逆転写酵素タンパク質を含む溶出液を加えた。カラムを、緩衝液Ｂに溶解した１０容量の５０ｍＭ ＫＣｌで洗浄した。逆転写酵素を、緩衝液Ｂに溶解した２０容量の５０ｍＭ〜１Ｍ ＫＣｌの勾配で溶出させた。個々の画分をＲＴ活性について分析した。ピークＲＴ活性を含む画分を、保存緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０％グリセロール、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｍ ＫＣｌ）に対して透析した。精製された逆転写酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断されたように９５％を超えて純粋であった。タンパク質濃度はバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）比色キットを用いて決定した。
【０１７６】
３ ｄＮＴＰアッセイ法
手順は、プレストン（Ｐｒｅｓｔｏｎ），Ｂ．Ｄ．らＳｃｉｅｎｃｅ ２４２：１１６８（１９８８）の手順に変更を加えたものであった。ＤＮＡ鋳型−プライマーは、４７マー鋳型
2004511211.tif 000008
（配列番号：３）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端に［３２Ｐ］標識された１８マープライマー
2004511211.tif 000009
（配列番号：４） （鋳型：プライマー，３：１）にアニールさせることで調製された。アッセイ混合物（１０μｌ）は、５ｎＭ鋳型−プライマー、図の説明文に明記したような５０ｎＭ〜２００ｎＭの逆転写酵素、３種類または４種類のｄＮＴＰ（各２５０μＭ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴを含んでいた。反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、９９％ホルムアミド５μｌを添加することで終結させた。９５℃で５分間インキュベートすることで反応産物を変性させ、尿素６％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析した。
【０１７７】
４種類全てのｄＮＴＰを使用した３ ｄＮＴＰアッセイの対照反応においてＴｄＴ活性が生じたかを確かめるために、３７℃で３０分間、様々な量の酵素（＞６００単位から２０単位）を用いて対照反応を繰り返した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ，Ｔ１９７ＥおよびＹ１３３Ａについては、２００、１００、５０、および２０単位を使用した。Ｆ３０９Ｎについては、６４６、２００、５０、および２０単位を使用した。
【０１７８】
結果
本発明者らは、ＤＮＡ鋳型を用いてＦ３０９Ｎ（Ｈ２０４Ｒ、Ｔ３０６Ｋ）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（以下、Ｆ３０９Ｎと呼ぶ）の誤挿入アッセイを行った。このアッセイは、変異体とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩとの誤った取り込みの能力を比較するために用いられた。このアッセイは、合成ＤＮＡ鋳型−プライマーおよび４種類のｄＮＴＰのうち３種類しか含まない偏ったｄＮＴＰプールを用いたプライマー伸長アッセイである。反応を図３のゲルに示す。誤挿入／誤伸長の率が低い変異体をスクリーニングするために、この手順を行っている間、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素は鋳型末端を越えて２〜３個ヌクレオチドを伸長し、一部の変異は、この非鋳型特異的伸長すなわちＴｄＴ活性を低下させたか、または無くすように観察された。図４に示すように、４種類全てのｄＮＴＰの存在下で、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素および変異体Ｆ３０９Ｎはほぼ等しくプライマーを伸長することができ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素は鋳型を越えて２ヌクレオチドを付加し、Ｆ３０９Ｎは鋳型末端を越えて何も付加しなかった。この非鋳型特異的伸長をさらに評価するために、４種類全てのｄＮＴＰを含む３ ｄＮＴＰ誤挿入アッセイの対照反応を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ、Ｆ３０９Ｎ、Ｔ１９７Ｅ、およびＹ１３３Ａ逆転写酵素を用いて、３０分間、様々な量の酵素で行った。３つの変異体は、先のスクリーニングにおいて非常に低下したレベルのＴｄＴ活性を示していた。２０単位の酵素で５分は、完了させようとするプライマー伸長に十分すぎる時間であることが観察されているので、３０分のインキュベーションおよび２００〜６４６単位の逆転写酵素は両方とも、完了させようとする反応に必要なものをはるかに超えていた。図４に示すように、試験した最小量での逆転写酵素反応の全てに最大単位濃度での反応と同様の伸長産物があり、このことは反応が完了したことを証明している。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素は鋳型末端を越えて２ヌクレオチドを付加し、Ｆ３０９ＮおよびＴ１９７Ｅは鋳型末端を越えて伸長せず、Ｙ１３３Ａには、鋳型末端を越えて１ヌクレオチドの少量の産物があるように見える。
【０１７９】
実施例４：二重耐熱性ＴｄＴ変異体
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）におけるアミノ酸Ｆ３０９位はＨＩＶ逆転写酵素におけるＷ２６６位と一列に並ぶ。この位置はサムドメインの基部にあり、鋳型−プライマーの副溝（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）と相互作用する副溝結合トラクト（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｃｔ）の一部であると考えられる。変異Ｈ２０４ＲおよびＴ３０６Ｋは酵素の耐熱性を増大させることが示されている。Ｈ２０４Ｒ／Ｔ３０６ＫクローンにおけるＦ３０９Ｎ変異は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素におけるＨ２０４Ｒ／Ｔ３０６Ｋより、ＲＮＡ鋳型に対するｌａｃＺフォワードアッセイ（表５）において１／２．３倍の変異頻度および３ ｄＮＴＰ伸長アッセイにおいて短い伸長産物を示す。両発見とも、より高い忠実度を有する酵素の請求項を裏付ける（表６）。
【０１８０】
【表５】Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の高忠実度変異体の変異頻度
2004511211.tif 000010
表５．ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素および点変異体の変異頻度。変異頻度（ＭＦ）は、変異体プラーク（淡青色または白色）の数をプラークの総数で割ることで求めた。出発ＤＮＡのバックグラウンド変異体頻度は、最初の３つの構築物については１７×１０−４であり、最後の構築物については２０×１０−４であった。
【０１８１】
【表６】Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素の高忠実度変異体の誤り率
2004511211.tif 000011
【０１８２】
方法
変異誘発
実施例３に記載のように標準的な部位特異的変異誘発プロトコールを用いて、Ｖ２２３Ｈ変異を含むプライマーを、以下の変異：Ｈ２０４Ｒ、Ｔ３０６Ｋ、Ｆ３０９Ｎを有するＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩの一本鎖ＤＮＡにアニールさせた。Ｖ２２３Ｈ、Ｈ２０４Ｒ、Ｔ３０６Ｋ、およびＦ３０９Ｎの新たな組み合わせを確認するために、コロニーを配列決定した。
【０１８３】
活性のある逆転写酵素を含むコロニーの選択
実施例３に記載のようにコロニーの選択を行った。
【０１８４】
ＲＴ変異体の精製
実施例３に記載のように精製を行った。
【０１８５】
プラークの配列決定
ｌａｃＺフォワードアッセイからのプラークを軟寒天プレートからワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｎ）３ＭＭ紙に移し、少なくとも１時間乾燥させた。次いで、プラークを打ち抜き、プラーク／紙ディスクを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））４〜８μｌ、プライマー
2004511211.tif 000012
（配列番号：５）１μｌ、および蒸留水（総体積２０μｌまで）を含む配列決定反応ミックスに直接加えた。９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分の２５サイクルのために、ＡＢＩサイクルシークエンシングプロトコールを使用した。紙ディスクを取り出し、反応物を沈殿させ、次いで、ローディングダイに再懸濁し、ＡＢＩ３７７配列決定機で測定した。
【０１８６】
配列を野生型ｌａｃＺα配列と比較し、次いで、フレームシフト（１ヌクレオチドの挿入もしくは欠失）、ミスマッチ、またはストランドジャンプ（反復配列間の挿入もしくは欠失）として分類した。各クラスの全誤り率は、検出可能な部位（すなわち、変化によって表現型が変わる部位）の数（１１６）と（最初の一本鎖の寄与を排除するために）０．５を掛けたもので、変異頻度を割り、次いで、これに各クラスであることが観察された変異体のパーセントを掛けることによって求めた。ＥＲ＝ＭＦ／（検出可能な部位＊０．５）＊（各クラスにおける％）。
【０１８７】
３ ｄＮＴＰアッセイ法
実施例３に記載のように３ ｄＮＴＰアッセイを行った。
【０１８８】
結果
本発明者らは、ＤＮＡ鋳型を用いて、Ｆ３０９Ｎ（Ｈ２０４Ｒ Ｔ３０６Ｋ）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（以下、Ｆ３０９Ｎと呼ぶ）およびＶ２２３Ｈ Ｆ３０９Ｎ（Ｈ２０４Ｒ Ｔ３０６Ｋ）（以下Ｖ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎ）と呼ぶ）の誤挿入アッセイを行った。このアッセイは、変異体とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩとの誤って取り込む能力を比較するために用いられた。アッセイは、合成ＤＮＡ鋳型−プライマーおよび４種類のｄＮＴＰのうち３種類しか含まない偏ったｄＮＴＰプールを用いたプライマー伸長アッセイである。反応を図５および図６のゲルに示す。このアッセイにおいて、高いプライマー伸長効率は低い忠実度を示す。図５および図６に示すように、４種類全てのｄＮＴＰの存在下で、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素ならびに変異体Ｆ３０９ＮおよびＶ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎは、プライマー末端での非鋳型特異的ヌクレオチドの付加にいくらかの変化はあるが、ほぼ等しくプライマーを伸長することができた。しかしながら、ヌクレオチドの偏ったプールと共にインキュベートした場合、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素は、鋳型ヌクレオチドを越えてかなりの伸長を触媒することができ、このために相補的ｄＮＴＰが欠除していた。このことは、誤ったヌクレオチドの使用および低い忠実度を示している。図５において、Ｆ３０９Ｎ（２）変異体は、３種類のｄＮＴＰの偏ったプールのそれぞれにおいてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素より短い伸長産物を示した。このことは、誤ったヌクレオチドを取り込む能力が低いこと、従って忠実度が高いことを示している。図６において、Ｖ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎ変異体はｄＡＴＰプールおよびｄＣＴＰプールだけで伸長された。いずれの場合でも、Ｖ２２３Ｈ／Ｆ３０９ＮもＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩより短い伸長産物を有した。これは、Ｆ３０９ＮおよびＶ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎ変異体の変異頻度がＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素より低かったｌａｃＺαアッセイの結果（１７×１０−４および１４×１０−４〜３９×１０−４）と一致している。Ｆ３０９ＮはなくＨ２０４Ｒ Ｔ３０６Ｋ変異だけしかない逆転写酵素の変異頻度は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素と似ていた（４１×１０−４〜３９×１０−４）。このことは、これらの変異が忠実度に影響を及ぼさないことを示唆している。このデータは、ＤＮＡに対する誤挿入アッセイとＲＮＡに対するｌａｃＺαアッセイとの相関関係を示し、ここで、高忠実度変異体はｄＮＴＰの偏ったプールによる伸長産物が短く、ｌａｃＺαアッセイにおいて変異頻度が低かった。
【０１８９】
実施例５：誤り率の決定
誤り率を決定するために、ｌａｃＺフォワードアッセイからの変異体プラークを既知の方法を用いて配列決定した。次いで、変異を以下のカテゴリーの１つに分類した：誤挿入事象によるミスマッチ、１つの挿入もしくは欠失の事象によるフレームシフト、または類似配列間のジャンプにより引き起こされる大きな挿入もしくは欠失によるジャンプ。次いで、以下の式：ＥＲ（誤り率）＝ＭＦ（変異頻度）／（検出可能な部位の数×０．５）（式中、検出可能な部位の数は１１６である）を用いて、ｌａｃＺαペプチドをコードする核酸について全誤り率を求めた。
【０１９０】
ｌａｃＺフォワードアッセイにおいて変異された全ての塩基が、検出可能な表現型変化を生じるとは限らない。ミスマッチ、フレームシフト、およびジャンプについて特有の誤り率を求めるために、変異頻度は各変異体カテゴリーの合計のパーセントを掛けることで修正され、次いで、特有の誤り率を求めるために用いられた。以下は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素および高忠実度ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ Ｈ２０３Ｒ Ｔ３０６Ｋ Ｆ３０９Ｎ逆転写酵素アッセイからのＭ１３ｍｐ１９におけるｌａｃＺαペプチドの配列地図である。下線は欠失を示す。「＾」は、上に示した塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧの挿入を示す。完全配列の上に示したＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧはミスマッチを示す。
【０１９１】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩによって導入された変異の地図
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【０１９２】
【表７】
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【０１９３】
【表８】
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【０１９４】
本明細書で述べられた全ての刊行物、特許、および特許出願は本発明が関係する当業者の技術レベルを示し、個々のそれぞれの刊行物、特許、または特許出願が本明細書に引用されるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に参照として本明細書に引用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＢＡＤ−６−Ｈｉｓ−Ｍ−ＭＬＶＨ−（Ｆ１）の地図である。
【図２】変異を生じさせるのに用いられる遺伝子セグメントを作製するのに用いられる制限酵素切断部位の位置を示す、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素のコード配列の線形図である。
【図３】（１）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素および（２）Ｆ３０９Ｎを用いた伸長アッセイの、走査して読み込まれたリン酸画像（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅ）である。４種類全てのヌクレオチドを用いた伸長反応から分かるように、同じ単位の逆転写酵素によって、４７マーＤＮＡ鋳型（５ｎＭ）とアニールした［３２Ｐ］標識１８マープライマーを３７℃で３０分間伸長させた。６％ゲル電気泳動を変性することによって、伸長反応を分析した。Ｐ，伸長されなかったプライマー。
【図４】ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素ならびに変異体Ｆ３０９Ｎ、Ｔ１９７Ｅ、およびＹ１３３ＡのＴｄＴ伸長アッセイを示す、走査して読み込まれたリン酸画像である。４７マーＤＮＡ鋳型（５ｎＭ）とアニールした［３２Ｐ］標識１８マープライマーを、単位が減少する逆転写酵素（レーン（１）６４６単位、レーン（２）２００単位、レーン（３）５０単位、およびレーン（４）２０単位）と４種類全てのヌクレオチドを用いて３７℃で３０分間伸長させた（以下の実施例３の方法の項を参照のこと）。６％ゲル電気泳動を変性することによって、伸長反応を分析した。このアッセイでは、４７ヌクレオチド鋳型を通り過ごした伸長は、非鋳型特異的付加すなわちＴｄＴ活性とみなされる。Ｐ，伸長されなかったプライマー。
【図５】ＤＮＡ鋳型を用いた（１）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素および（２）Ｆ３０９Ｎ逆転写酵素変異体タンパク質の誤挿入アッセイを示す、走査して読み込まれたリン酸画像である。４種類全てのヌクレオチドを用いた伸長反応に示されるように、４７マーＤＮＡ鋳型（５ｎＭ）とアニールさせた［３２Ｐ］標識１８マープライマーを、同じ単位の逆転写酵素タンパク質によって３７℃で３０分間伸長させた。伸長反応を、３種類だけの相補的ｄＮＴＰの存在下でも（ｄＣＴＰなし、ｄＡＴＰなし、ＴＴＰなし、およびｄＧＴＰなし）行った。６％ゲル電気泳動を変性することによって、伸長反応を分析した。このアッセイでは、３種類だけのヌクレオチドを用いた高効率の終結プライマー伸長は、アッセイされたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素の低い忠実度を反映している。Ｐ，伸長されなかったプライマー。
【図６】ＤＮＡ鋳型を用いた（１）ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素ならびに（２）変異体タンパク質Ｔ１９７Ａ／Ｆ３０９Ｎ逆転写酵素および（３）Ｖ２２３Ｈ／Ｆ３０９Ｎの誤挿入アッセイを示す、走査して読み込まれたホスホイメージである。４種類全てのヌクレオチドを用いた伸長反応に示されるように、４７マーＤＮＡ鋳型（５ｎＭ）とアニールさせた［３２Ｐ］標識１８マープライマーを、同じ単位の逆転写酵素タンパク質によって３７℃で３０分間伸長させた。３種類だけの相補的ｄＮＴＰの存在下でも（ｄＡＴＰなしおよびｄＣＴＰなし）伸長反応を行った。６％ゲル電気泳動を変性することによって、伸長反応を分析した。このアッセイでは、３種類だけのヌクレオチドを用いた高効率の終結プライマー伸長は、アッセイされたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素の低い忠実度を反映している。Ｐ，伸長されなかったプライマー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004511211.tif 000221
2004511211.tif 000222
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