(57)【要約】（１）生体触媒を含む生体酸化反応混合物に所定の速度で基質および共基質を独立して添加する工程、（２）酸素消費速度および該反応混合物からの二酸化炭素発生速度を測定する工程、（３）酸素消費速度および二酸化炭素発生速度を基質酸化化学量論、共基質燃焼化学量論、および必要であればバイオマス形成化学量論と関係づける連立方程式を解くことにより、酸素消費および二酸化炭素発生の瞬間速度を決定する工程、および（４）生成物形成の速度を最大にし、一方、同時に共基質の使用速度を最小にするために、基質添加速度および共基質添加速度を酸素消費速度および二酸化炭素発生速度に同時に調整する工程を含む方法によって。生体酸化反応は制御できる。本方法は、インライン技法を使うことができる流加酸化反応を制御する迅速な手段であり、様々な酸化反応に対して広く適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体酸化反応を制御する方法であって、（１）生体触媒を含む生体酸化反応混合物に所定の速度で基質および共基質を独立して添加する工程と、（２）酸素消費速度および該反応混合物から発生する二酸化炭素の発生速度を測定する工程と、（３）二酸化炭素発生速度および酸素消費速度を基質酸化化学量論、共基質燃焼化学量論、および必要であればバイオマス形成化学量論と関係づける連立方程式を解くことにより、基質消費および共基質消費の瞬間速度を決定する工程と、（４）共基質の使用速度を最小にしながら生成物の形成速度を最大にするように、基質添加速度および共基質添加速度を基質酸化速度および共基質消費速度に同時に適合させる工程とを含む方法。
【請求項２】
前記基質がカルボン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カルボン酸がオレイン酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記基質がアルカンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記共基質がグルコースである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
α，ω−ジカルボン酸を製造する方法であって、（１）生体触媒を含む生体酸化反応混合物に、アルカン、アルケン、アルコール、アルデヒド、カルボン酸およびこれらの誘導体からなる群から選択される基質、と共基質とを所定の速度で独立して添加する工程と、（２）酸素消費速度および該反応混合物から発生する二酸化炭素の発生速度を測定する工程と、（３）二酸化炭素発生速度および酸素消費速度を基質酸化化学量論、共基質燃焼化学量論、および必要であればバイオマス形成化学量論と関係づける連立方程式を解くことにより、基質消費および共基質消費の瞬間速度を決定する工程と、（４）共基質の使用速度を最小にしながらα，ω−ジカルボン酸形成の速度を最大にするように、基質添加速度および共基質添加速度を基質酸化速度および共基質消費速度に同時に適合させる工程とを含む方法。
【請求項７】
前記基質がアルカンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記基質がカルボン酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記カルボン酸がオレイン酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記共基質がグルコースである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体触媒がＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｈ５３４３である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体触媒がＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｈ５３４３である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
９−オクタデセン二酸を製造する方法であって、（１）Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｈ５３４３を含む生体酸化反応混合物に、オレイン酸およびグルコースを所定の速度で独立して添加する工程と、（２）酸素消費速度および該反応混合物から発生する二酸化炭素の発生速度を測定する工程と、（３）二酸化炭素発生速度および酸素消費速度をオレイン酸酸化化学量論、グルコース燃焼化学量論、および必要であればバイオマス形成化学量論と関係づける連立方程式を解くことにより、オレイン酸消費およびグルコース消費の瞬間速度を決定する工程と、（４）グルコースの使用速度を最小にしながら９−オクタデセン二酸の形成速度を最大にするように、オレイン酸添加速度およびグルコース添加速度をオレイン酸酸化速度およびグルコース燃焼速度に同時に適合させる工程とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本願は、２００３年１月１４日に出願された継続中の仮出願Ｎｏ．６０／４３９，９９１の利益を請求し、該仮出願の全内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
政府後援研究開発に関する説明
本発明は、少なくとも部分的に、米商務省、国立標準研究所（ＮＩＳＴ−ＡＴＰ）共同契約Ｎｏ．７０ＮＡＮＢ８Ｈ４０３３の補助を受けてなされた。したがって、政府は本発明について一定の権利を有するものである。
【背景技術】
【０００２】
酵素および微生物は、分子酸素の直接の還元を通して、本来酸化反応の広い範囲に触媒作用を起こす。これらのかなり不可逆な反応は、反応の多くの自由エネルギーを熱として開放し、生化学的な見地から非常に暴力的なものであると見なすことができる。有機基質の多くの多様な生体酸化が起こる基本的なメカニズムは、一般に、最初分子酸素が励起し、反応性の高い酸素種を形成することであるとみなすことができる。この後、基質から活性化した酸素種への電子の移行が続き、最終的に基質の純粋な酸化となる。分子酸素からのオリジナルの酸素原子は、望ましい酸化物を作るために有機基質に取りこまれてもよいし、取り込まれなくてもよい。その反応は、一つの酵素によって、または多数の酵素の調和した作用を通して触媒され得る。シトクロム、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、デサチュラーゼおよびオキシダーゼを含む多くの酵素および酵素系は、従来の化学合成が遠く及ばないような選択性および特異性を有する有機基質の酸化のための分子酸素の反応力を利用することができる。
【０００３】
基質分子内における特に望ましい位置に１以上の化学官能性を加えることにより、それらを通常の化学基質に適用することによって、これらの反応を利用することには、多くの誘因がある。特定の生体触媒の選択性と特定性に起因して、副生物生成および基質損失を伴う多くの化学反応および精製段階は、排除することができる。あるいは、廃棄のために隔離することまたは次の変換段階においてさらに分解することをより容易にする機能性を分子に再び加えることによって、これらの反応は、望ましくない化学生成物の分解を助けることができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
商業用目的のためにこれらの反応を首尾よく操作することにおいて、克服するべき多くの障壁がある。高い反応性の酸素種の発生は、代謝の点から言えば、暴力的な反応である。これらの反応中間体は、生体触媒を損傷または分解し、望ましい転換をすることに求められる酵素活性を破壊し、または非特異的に基質と反応することがあり得る。Ｓｔｒｙｅｒが自らの教科書「生化学」で指摘しているように、「酸素の還元には危険が潜む。」分子酸素を利用している生物は、反乱する酸素ラジカルを取り除くための酵素および酵素系を本来有している。工業的な発酵で起こっている速い生体酸化反応においては、そのような酸素ラジカルは、これらの除去システムの本来のレベルを圧倒する。結果として、生きた細胞を伴う生体酸化反応では、細胞の生存および生きた細胞の再生が速く減衰することを観察することは普通である（Ｄｉｘｏｎ，Ｂ．，“Ｖｉａｂｌｅ  ｂｕｔ  Ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ”，ＡＳＭ  Ｎｅｗｓ，６４，ｐｇｓ．３７２−３７３，１９９８）。
【０００５】
広い範囲の有機分子は、酸化経路の自然な基質選択に限定されず、多くの酸化生成物を作るための生体酸化を行う可能性がある基質である。基質の特定の特性は、それが酸化をもたらすためにどのように酸化触媒と一緒にされるかを決め得るものである。基質は、
１）有毒であり、触媒の効力をなくし得る。
２）発酵槽オフガス（ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ  ｏｆｆ−ｇａｓｅｓ）において揮発性であり、そして損失の可能性がある。
３）それ自身の酸化を抑制し得る。
４）望まれない副反応を誘発するか、または起こし得る。
５）高価である。；もしバッチが装置の欠陥または汚染を通して失敗したなら、多量の基質を容器に収容することは、リスクが加わる。
６）非選択性の酸化反応または他の反応を生成しえる。
７）生成物の回収または生成において、問題が起こりえる。
８）可燃性の空気との混合物を形成し得る。
【０００６】
これらの理由のために、流加操作形態での発酵の間、連続的に、または不連続で一定の増加量で基質を加え、基質の蓄積を最小にすることはしばしば望ましい。
多くの生体酸化反応から得られる多量の熱力学的な自由エネルギーであるにもかかわらず、これらの反応は、新陳代謝の仕事に役立つ形としてよりむしろ熱として反応の自由エネルギーの多くを不可逆的に放出する傾向がある。これは、分子酸素から還元酸素種を作るのに要求される最初の代謝エネルギーインプットによるものである。望ましい生体酸化反応を推進し、生体触媒を維持するのに必要とされるこの代謝エネルギーを生み出すために、第２の基質が反応システムに供給される。この第２の基質は、しばしば共基質（共基質）と呼ばれて、発酵のための通常の用途において、例えば、多くの発酵可能な化合物、糖類、有機酸、アルコール、または炭化水素のいずれからでも選択することができる。生体酸化基質と同様の理由として、連続的に、または不連続で一定の増加量で共基質を加え、共基質の蓄積を最小にすることは望ましいかもしれない。
【０００７】
基質濃度のいくつかの制御は、当該技術分野で公知である。例えば、プラバスタチンを作るシトクロムＰ４５０媒介水酸化反応において、基質ＭＬ２３６Ｂ  Ｎａの濃度を制御した。交差流濾過法モジュールおよび蠕動ポンプが、濾過作用を生み出した。この濾過作用は、周期的に自動ＨＰＬＣによって分析され、水性反応混合物中のＭＬ２３６Ｂ  Ｎａ濃度のほぼリアルタイムの測定が得られた。交差流システムは、可溶性の基質についてうまく機能したようである。というのは、菌株は大きなペレットを作らず、油性の基質は反応混合物中に存在していないからである。しかしながら、反応過程にわたって一定に維持される共基質５０％グルコースの供給には、制御を適用しなかった。
【０００８】
したがって、生体酸化の分野において、多数の供給の流れの付加を同時に制御するための方法が必要とされている。生体酸化基質、共基質および生成物は、生体触媒と一緒に複合反応マトリックスを構成する水系でやや溶けにくいこともあり得る複合分子であることが多い。いろいろな分析技法は、生成物、基質および共基質の分析のために、オフラインで適用され得る。一方、このような方法は、これらの流加反応における栄養供給のリアルタイムの制御のために労力を必要とし、価値がほとんどない傾向にある。したがって、基質および共基質の生体酸化反応への供給を同時に制御するための迅速なコンピュータ化された方法を求める動機づけがある。
【０００９】
逆に、気相は、いろいろな装置が気相組成測定を得るために役立つ比較的単純なマトリックスである。生体酸化反応に出入りする気体の流れの測定と結びつけた場合、全体および成分の気相収支は、二酸化炭素発生速度（ＣＥＲ）および酸素摂取速度（ＯＵＲ）のリアルタイム測定を提供する。
【００１０】
成分のガス収支を用いた流加発酵において、栄養供給を制御するという考え方は、当該技術分野で公知である。特に、基質濃度を計算して制御すること、または特定の成長速度を制御するために、気体成分の収支測定が用いられてきた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、生体酸化反応を制御する方法であって、（１）生体触媒を含む生体酸化反応混合物に基質および共基質を所定の速度で独立して加える工程と、（２）酸素消費速度および反応混合物から発生する二酸化炭素の発生速度を測定する工程と、（３）二酸化炭素発生速度および酸素消費速度を基質酸化化学量論、共基質酸化化学量論および必要であればバイオマス形成化学量論と関係づける連立方程式を解くことによって、基質消費および共基質消費の瞬間速度を決定する工程と、（４）共基質の使用速度を最小にしながら生成物の形成速度を最小にするように、基質添加速度および共基質添加速度を基質酸化速度および共基質消費速度に同時に適合させる工程と、を含む方法に関する。
【００１２】
本発明による方法は、コンピュータ化されたテクニックを使用し、多様な反応に広く適用可能な流加生体酸化反応の速い手段を提供する。公知の方法の場合のように、非常に厳密な速度論的モデルを用いる必要がない。本発明による平衡状態を定義するために使われた化学量論的モデルもまた、非常に厳密である必要はない。一般的な平衡状態を定義することに対して、化学量論的モデルは、ただ生体酸化反応を反映する必要があるだけである。というのは、基質供給速度および共基質供給速度は、化学量論線と関係する操作線に追随するからである。微生物の成長を制御するために制限栄養を操る目的で開発されたいくつかの従来の技術方法に対して、本発明の方法は、定常プロセス制御の目的に適した方法によって測定できないであろう生体酸化反応における基質濃度または共基質濃度を制御しようとは試みない。
【００１３】
本発明は、入手できる場合、文献情報または生化学的経路情報から必要とされる反応化学量論を測定するための方法および例をさらに提供する。このようなデータが存在しない場合または矛盾するデータが存在する場合、本方法および本実施例は、さらに独立した実験を使って反応化学量論を測定するために提供される。
【００１４】
本発明は、生体酸化反応での生成物の蓄積を測定するための方法もまた提供する。本発明の方法は、実行することが容易であって、そして生体酸化の間にオフラインのサンプル分析をする必要がなくなるほど十分に正確であることが見いだされた。本発明の方法は、生体酸化活性をモニターおよび維持して、そしてプロセスの乱れの後に生体酸化反応の制御を復活させるか、または元に戻すことにおいて、不可欠であることもまた見いだされた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書で用いられる用語である生体触媒は、インビトロでの生体酸化または生存能力を評価するための当該技術分野で公知の従来の手段では、生存するものとして回復できない生物全体における生体酸化に適用可能な任意の共同因子が与えられるインビボでの生体酸化のための、微生物、酵素、酵素システム、または酵素経路を意味する。
【００１６】
本発明の方法は、好ましくはカルボン酸への有機基質の生体酸化を制御するために使われることができるが、それはどんなタイプの基質の生体酸化のためにでも使われることができる。このような基質としては、以下に限定されないが、アルカン、アルケン、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、ならびにエステル、アミド、酸無水物およびハロゲン化アシルのようなカルボン酸誘導体が含まれる。
【００１７】
生体酸化反応は、（１）望ましい生成物への基質の酸化、（２）エネルギーを提供する共基質の燃焼、（３）共基質からバイオマスを作る成長の同化プロセスという３つの同時に起こる反応で構成されていると考えことができる。反応１のプロセスは、明らかに望ましい生成物を形成する反応であるが、生体酸化反応において最も重要なのは、エネルギーを生み出す反応２であることが見いだされた。
【００１８】
多くの生体酸化反応は、反応３の速度がゼロである「静止期」または「休眠する」細胞を用いて行われる。さらに、生成物が細胞間に蓄積するか、または他の成長に関連づけられる生体酸化反応の多くの重要な例がある。これらの場合、十分な追加の共基質を与え、必要なバイオマスを生成させる。
【００１９】
反応化学量論は、反応１〜３の相対速度が酸素摂取速度と二酸化炭素発生速度の測定から同時に決定され得る関連した速度のシステムを確立する。生体酸化の進展をモニターすることにおいて、反応速度は直ちに有用である。次いで、個別の反応速度は、基質および共基質の瞬間的な消費速度を決定するために使われる。それから、得られた基質および共基質の消費速度は、平衡状態または化学量論状態を定義していると見られる。次いで、基質および共基質の供給速度は、この化学量論状態と関連のある操作線に従う。別の操作線および平衡線は、生体酸化における基質および共基質の供給に対して構築される。
【００２０】
この点において、本発明の方法は、例えば、蒸留、溶剤抽出および加湿操作を説明するのに、これらの操作の進行が平衡状態に関係する操作線に従う場合に、用いられるのと同類のものである。実のところ、これらの単位操作と関連する理論および専門用語は、本明細書でも適用可能である。これらの例と同様、平衡線は極めて稀に直線であり、生体酸化反応で定義される平衡状態は、特に生体酸化活性が誘導経路の一部である場合に実質的な湾曲を有することは見いだされている。平衡線において湾曲を引き起こす他の効果としては、酸化活性の衰退、溶解酸素効果および他の栄養制限効果、および反応系のレオロジー特性の変化が挙げられる。これらの効果は、すべて観察されて、そして最大の性能で生体酸化反応を持続する本発明の方法を使って補うことができる。
【００２１】
生体酸化反応をモニターする際に、本発明の鍵となる要素を説明するために図を構築することが好都合に使われる。生体酸化反応を含む化学量論式を実行し、そして定義する多くの代替の方法は存在する。生体酸化化学量論が、生体酸化、共基質のエネルギー生成燃焼、および必要であればバイオマスの形成の累積として表されるである場合は、方針はすべて同様である。酸素消費および二酸化炭素発生の速度は、反応化学量論に基づいた各反応のソースの総和として表される。得られた連立方程式を解き、反応速度を規定するために選択される生成物または基質による換算で、個々の反応速度が得られる。
【００２２】
個々の反応速度を決定すれば、基質および共基質の消費速度は、各反応に対するそれらの消費速度の総和として決定される。これらの反応速度は、平衡状態を規定する。なぜなら、所定の生体酸化は、反応の持続時間にわたって何らかの曲線または平衡線に従うからである。基質供給速度および共基質供給速度が平衡状態と同じ用語で表現される場合、それはまた、平衡線、通常は平衡線のいくつかの倍数に関連する道筋に従う。この倍数は、操作線の勾配と呼ばれ、それは、反応速度を維持するため、および望ましい最終の培養液組成を生み出すために必要なように、生体酸化反応の間に変えることができる。
【００２３】
本発明の記述おける慣例として、形成速度は正であるとみなす。二酸化炭素発生速度（ＣＥＲ）を表わす記号は、ｒCO2であり、酸素摂取速度（ＯＵＲ）を表わす記号は、−ｒO2である。本発明で使われる記号の定義および単位の例は、表１に挙げる。いずれかの一貫した測定単位が、本発明で用いられる。
【００２４】
生体酸化関連の速度のシステムを準備することに取り組むための多くの方法がある。上記の一般的な見解によれば、生体酸化反応は、生体酸化成分、エネルギー生成成分およびバイオマス形成成分を持つ３つの反応の総和である。そのことは、本発明の方法を使うことによって作成されたコンピュータ化されたデータを、物理的および生理学的に適切なものとするので、このようにして全体的な反応を起こす場合に有利であることが見いだされている。プロセスの乱れを扱うときも有利である。
【００２５】
生体酸化成分の一般的な化学量論は、基質または基質の混合物が生成物へと酸化させられる反応１に従って表されことができる。その最終の生成物形へと基質を変換することにおいて、共基質の一部もまた消費されるかもしれない。したがって、反応１は、生成物の統合が速度  ｒ1aを持っている生成物の合成に関連する多重反応の要点である。
【００２６】
【数１】
2006515991.tif 000002
【００２７】
【表１】
2006515991.tif 000003
【００２８】
第２の同時に起こる反応は、細胞を維持し、生体酸化反応を推し進めるエネルギーの発生に関するものである。これは、ｒ2aを有する共基質燃焼化学量論である。
【００２９】
【数２】
2006515991.tif 000004
【００３０】
反応３は、成長関連の生体酸化生成物の調製において重要なバイオマス形成に関する。
【００３１】
【数３】
2006515991.tif 000005
【００３２】
バイオマス形成である反応３に関して、この反応を、構成要素に、ある意味最終的な（ｎｅｔ）の異化反応および最終的な同化反応にさらに分割することが有用であることは見いだされている。酸素または二酸化炭素に基づいた共基質の燃焼を表す化学量論反応を差し引くことは、バイオマス形成反応から酸素または二酸化炭素を排除する。ここで、化学量論的な二酸化炭素を差し引いて、バイオマス形成に充てた共基質の量は反応４によって与えられ、そして成長のエネルギー成分は反応５によって与えられる。
【００３３】
【数４】
2006515991.tif 000006
【００３４】
【数５】
2006515991.tif 000007
【００３５】
反応５および反応２は、同じエネルギー生成反応である。本発明を利用する際に、どのように細胞がエネルギーを利用しているか識別することは必要ではない。バイオマス形成に十分な共基質を提供すること、そして必要であれば酸素または二酸化炭素の最終的な発生または消費を説明することがただ重要である。反応４に関して、酸素についての化学量論係数が、共基質の性質によって正または負の値を持ち得ることを指摘することは同じく重要である。化学量論係数は、文献からの情報または生理学経路の知識を用いて、あるいは独立した実験によって決定される。
【００３６】
同時に起こる主要な反応１、２および４に従って生体酸化反応を定義すれば、ガス成分収支換算で反応速度式を得ることは可能である。次いで、酸素収支は、式１によって与えられる。
【００３７】
【数６】
2006515991.tif 000008
【００３８】
同様に、二酸化炭素収支は、式２によって与えられる。
【００３９】
【数７】
2006515991.tif 000009
【００４０】
成長関連生成物について、特定のバイオマス生成速度は、生成と比較して求められる。
特に細胞内の生成物については、バイオマスは、全体の一部として、特定の生成の質量画分を含んでいると言われる。生体酸化反応の間に生成される必要があるバイオマスの画分については、以下の式が与えられる。
【００４１】
【数８】
2006515991.tif 000010
【００４２】
式１〜２は、生体酸化を含む各成分反応に対して、構成要素の反応３を用いて、同時に解くべき２つの未知数を有する方程式系を構成する。式２を用いて、反応２の速度を解けば、式４が与えられる。
【００４３】
【数９】
2006515991.tif 000011
【００４４】
式３を用いて反応４の速度を解けば、以下の式が与えられる。
【００４５】
【数１０】
2006515991.tif 000012
【００４６】
ここで、
【００４７】
【数１１】
2006515991.tif 000013
【００４８】
最後に、式４〜６を用いて、反応１の速度についての式１を解けば、以下の式が与えられる。
【００４９】
【数１２】
2006515991.tif 000014
【００５０】
ＣＥＲおよびＯＵＲの成分ガス収支が一列に並んでいれば、個々の反応速度は、最初に式７を用い、次に式４および式５を用いて、実験的に決定することができる。その結果、基質および共基質を使用する速度を決定することができる。そのことは、それぞれ式８および式９により与えられるように平衡反応状態を規定する。
【００５１】
【数１３】
2006515991.tif 000015
【００５２】
【数１４】
2006515991.tif 000016
【００５３】
発酵過程の間の時間に対する−ｒSおよび−ｒCのプロットにより、それぞれ基質および共基質についての前述された平衡線または化学量論線が得られる。
次いで、基質供給速度は、方程式１０に従って基質の操作線から決定される。
【００５４】
【数１５】
2006515991.tif 000017
【００５５】
ＦSＸSＭＷS／Ｖfのプロットは、基質についての操作線を規定する。原則として、操作線の勾配に１．０の値が選択されるなら、基質添加の速度は、基質消費速度に等しいであろう。実際は、生体酸化反応のどの段階かに依存して１．０より大きいまたは１．０未満のいずれかの値の操作線勾配において、生体酸化を操作することが有益であることが見出されている。特に、これは、生体酸化反応が誘導経路の一部であるとき、そして特に基質が誘導物質ｒであるときに当てはまる。
【００５６】
式１０は、自動システムにおいて基質供給速度を制御するための設定ポイントを規定する際の使用に適している。平衡線と関係する望ましい操作線を維持するために、周期的な基質供給速度調整を手動ですることによって、満足な結果が得られた。
【００５７】
同様に、次いで、共基質供給速度が、式１１に従って共基質の操作線から決定される。
【００５８】
【数１６】
2006515991.tif 000018
【００５９】
ＦcＸcＭＷc／Ｖfのプロットは、共基質についての操作線を規定する。原則として、操作線の勾配に１．０の値が選択されるなら、共基質添加の速度は、基質消費速度に等しいであろう。実際は、生体酸化反応のどの段階かに依存して１．０より大きいまたは１．０未満のいずれかの値の操作線勾配において、生体酸化を操作することが有益であることが見出されている。特に、これは、生体酸化反応が誘導経路の一部であるとき、そして特に基質が誘導物質ｒであるときに当てはまる。操作線勾配が１．０未満の値において生体酸化を操作することは、反応１の速度を増やし、基質を節約することができるが、生体触媒の寿命を犠牲にする。
【００６０】
式１１は、自動システムにおいて共基質供給速度を制御するための設定ポイントを規定する際の使用に適している。平衡線と関係する望ましい操作線を維持するために、周期的な基質供給速度調整を手動ですることによって、満足な結果が得られた。
【００６１】
同様に、次いで、共基質供給速度が、式１１に従って共基質の操作線から決定される。
この一般的な場合の生体酸化反応プロセス制御の戦略は、生体酸化反応を制御することにおいて広い用途を有する。それは、この戦略を実行することができる柔軟な制御システムを有するコンピュータ制御された設備で実施するのに非常に適している。実験室の設備において、およびその装備で実質的な再プログラミングの必要のない成分ガス収支を与える能力を有する多目的設備において即座に実行できる代替アプローチが、見いだされている。操作線と平衡線の多くの代替となる表現は、個々の反応速度の代替となる定義を選択して、生体酸化の要素反応を分割することによって、可能であることは明確である。
【００６２】
方法１は、反応速度が、基質消費および共基質消費の観点から直接明示されるという利点を持っている。それは、より正確な処理であって、そして生体酸化の広い範囲に適用できる好ましい方法である。適切な結果を与える代替の方法は、すぐに本発明をテストすることを望む人たちのために実施例１１として与えられる。
【００６３】
反応速度ｒiは、質量ベースまたは体積ベース、例えば、ｍｇモル／ｋｇ／時またはｍｇモル／リットル／時で慣習的に表現される。操作線および平衡線を表現するためにこれらを用いることは、実際には幾分扱いにくく不必要であることが見いだされている。基質および共基質は、１度にちょうど１ｋｇまたは１リットルの酸化反応混合物に供給されるのではなくて、全体に供給される。しかしながら、生体酸化反応への基質および共基質の供給装置を制御することが望ましいので、反応混合物の質量または体積が反応過程の間に相当に変化するかもしれないと予想される。したがって、積ｒi・Ｖfを用いて、それは全体の生体酸化反応混合物に対してｍｇモル／時の単位で形成速度を与えるが、反応速度を表現することが有用であることを見いだした。次いで、式の両辺にＶfを掛けることによって操作線、化学量論線および供給速度式を修正することが、より好ましい。反応速度についてのこの代替表現の他の利点は、本発明を利用するために、生体酸化反応器が反応質量または反応体積の瞬間的な測定を提供する測定デバイスを装備する必要がないということである。
【００６４】
ｒCO2および−ｒO2を表現する反応速度に対して習慣的な表現を使っている設備では、１ｋｇまたは１リットルという値を、反応速度をｍｇモル／時の単位で与えるユーザー規定反応ボリュームとして入力することができる。あるいは、ユーザーの好みで、ｍｇモル／時の単位を与えるために１０００という値を、ｌｂモル／時の単位を与えるために４５４，０００という値を、ｋｇモル／時の単位を与えるために１，０００，０００という値を入力してもよい。この方法は、比較することが難しい様々なスケールの操作においてなされた同様の生体酸化反応の比較を行う。この場合、量Ｖ0（バッチのスケールを特徴づける標準質量または標準体積）で割ることにより速度の表現を修正することが有用であることは、決定されている。その結果、反応速度は、積ｒi・Ｖf／Ｖ0によって表される。このことは、速度の表現をより習慣的な単位に戻すことになる。原則として、Ｖ0に対して良い選択となるものは、生体酸化反応混合物に充填される生体触媒の質量である。実際には、相対的な生体触媒の充填がバッチ間で同様である限り、反応の特徴的な質量または体積が選択される。一般的な値は、生体触媒を準備するのに用いられる開始質量、生体酸化の開始前の反応混合物の質量、またはバッチに充填されるよう予定された全ての試薬の総和である。生体触媒を生み出す成長段階で統合された生体酸化反応について、反応器に充填された生成培地の最初の質量としてＶ0を選択することは、０．０１ｍ3〜１００ｍ3のスパンを持つ様々なスケールの操作を比較するのに十分であることが見いだされている。この代替表現は、同じ反応が異なるサイズの反応器を有する設備で行われる場合に、比較可能で直ちに認識可能な結果を与えるという利点を有する。
【００６５】
反応水は、化学量論線、操作線、または制御式に入力されないことは注目すべきである。それらの式は、基質、共基質、バイオマス、酸素および二酸化炭素の間の化学量論的関係に依存するだけである。実のところ、例えば、部分的な燃焼生成物が共基質から形成される場合、または基質の一部が代謝されていない副産物を放出するために切断される場合に当てはまる。本明細書で提示される制御戦略は、有効なままであるが、反応水のようなものは、反応混合物内で蓄積する。
【００６６】
水性培地で行われる生体酸化は、過剰の水をすでに有しているが、しかし反応水は、反応の全体的な物質収支において重要なままである。反応水は、例えば、非水系で行われた生体酸化反応のために、さらなる重要性を有する。そのため、関連する化学量論的関係に支配される反応式に基づいて計算することができる水形成の速度をモニターすることは有用である。
【００６７】
【数１７】
2006515991.tif 000019
【００６８】
時間の区間の間の化学量論線の下の領域は、反応時間の区間にわたる反応成分の累積的な生産を与える。次いで、反応化学量論の適用は、それから供給の他の反応成分の累積的な生産および供給の累積的な付加を与える。不連続のデータは必要な積分を求めるために数値的に積分される。台形公式を使うことで満足な結果を得ることがわかっている。化学量論が知られていない、または文献から利用可能な化学量論データに不確実なところがあるとき、この原則は、生体酸化反応の化学量論を決定することに直ちに役立つ。反応質量の測定が利用可能である場合、生成物の濃度は、反応の間の生体酸化反応の開始から任意の時点までの積分によって決定することもさらにわかっている。これにより、生体酸化反応をモニターするために必要なオフラインのサンプル分析の量が十分に減少する。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は、本発明を例証することを意図しているが、本発明を制限することは意図していない。
【００７０】
（実施例１）
任意の酸素補給を用いる成分ガス収支計算
本発明の制御方法で使用するために容易に測定された発酵パラメータの観点から、ｒO2・Ｖfおよび−ｒCO2・Ｖfについての式を提供することが、本実施例における目的である。本発明の方法で用いる二酸化炭素発生速度および酸素摂取速度を決定する際に実行される数式は、現に気相成分収支から誘導される。酸素を含んだガス、通常は空気を反応混合物に散布した場合、成分ガス収支計算を規定するのに用いられる生体酸化反応器ガスフローシステムの単純化されたフローチャートが、図１に示される。必要であれば、酸素補給分を空気に混ぜても良いし、直接生体酸化反応器に散布しても良い。成分ガス収支式は、空気または任意の酸素供給について選択される供給配置にかかわらず有効であり、代数学的に同一である。反応混合物に接触した複合ガスは、幾分酸素を消費し、二酸化炭素が豊富となる。次いで、水分が生体酸化反応器から出て行く。ガス収支式で用いられる変数名および記号の定義を表１．１に示す。
【００７１】
【表２】
2006515991.tif 000020
【００７２】
安定したフロー条件の下では、反応混合物内での窒素、二酸化炭素、および酸素の蓄積は、無視できると考えられる。極端にアルカリ性の状態（ｐＨ＞８．５）の場合を除いて、二酸化炭素と重炭酸塩または炭酸塩との反応もまた、二酸化炭素収支において無視できる。窒素は、生体酸化反応において反応しないと考えられており、入り口でのガスフロー測定と出口でのガスフローを結びつける関係成分として用いられる。代替できる関係成分はアルゴンである。この関係成分を使用することで、出口における独立したフロー測定をする必要がなくなる。窒素、酸素および二酸化炭素のついての成分ガス収支は以下の式で与えられる。
【００７３】
【数１８】
2006515991.tif 000021
【００７４】
関係成分により、出口におけるガスフロー速度が、入口におけるガスフロー速度に関係していることは、式１．１を用いて以下の式より明らかである。
【００７５】
【数１９】
2006515991.tif 000022
【００７６】
ガスフロー速度は、通常モルフロー速度で表現されず、むしろ一般的には体積表現で測定される。モルガスフロー速度は、状態方程式に従って体積フロー速度と関係がある。生体酸化反応のたいていのフロー条件の下で、理想気体の法則は、成分ガス収支計算の目的のために十分である。他の状態方程式としては、例えば、ファンデルワールスの式またはＲｅｄｌｉｃｈ−Ｋｗｏｎｇの式が挙げられる。次いで、理想気体の法則は、生体酸化反応器に入ってくる空気および補給酸素のモルフロー速度を与える。
【００７７】
【数２０】
2006515991.tif 000023
【００７８】
記号Ｔ°およびＰ°は、Ｖ測定のフロー条件において評価されることが理解されるべきである。Ｖの測定が標準体積フロー速度として記録される場合、記号Ｔ°およびＰ°は、測定デバイスの標準参照条件である。記号Ｋは、生体酸化反応で測定されるガス以外のガス組成物により測定デバイスが較正されたときに適用される補正である。
【００７９】
式１．４、１．５および１．６を式１．２に代入することにより、酸素消費速度が与えられる。
【００８０】
【数２１】
2006515991.tif 000024
【００８１】
同様に、式１．４および１．５を式１．３に代入することにより、二酸化炭素発生速度が与えられる。
【００８２】
【数２２】
2006515991.tif 000025
【００８３】
これらの式１．７および１．８はともに、本発明の方法を実行する際に用いられる有益な中間誘導変数である。補給酸素を使わない場合は、式１．７の中でＶO2＝０である。
【００８４】
（実施例２）
成分ガス収支測定デバイス
ガスフロー速度を表している較正されたアナログ信号またはデジタル信号を発生する多くのガスフローデバイスのいずれかを用いて、ガスフロー測定をすることができる。これらのデバイスには、熱式質量フローメーター、オリフィスプレートメーターおよびコリオリ（ｃｏｒｉｏｌｕｓ）効果メーターが含まれる。これらの装置は、一般的に体積単位、すなわちある標準温度および標準圧力における体積速度で、ガスフロー速度を表現する。これらは、実施例１の方法で使われる標準Ｔ°および標準Ｐ°である。ガスフロー装置が較正ガス以外のガスで使われるなら、装置の販売元より、Ｋにあたる数値を得ることができる。
【００８５】
実施例１の方法では、いろいろな装置がガス組成分析のために使うことができる。通常の空気供給が、多数の生体酸化反応器でなされているという点で、順に繰り返す圧縮空気供給および生体酸化を通常の装置に試すことが最も有用である。質量分析計は、ガスサンプルのスキャンにおいてガス成分のモル分率または体積分率を同時に決定する能力および前述した他の理由（ＣｏｐｐｅｌｌａおよびＤｈｕｒｊａｔｉ、１９８７）のために、好ましい測定デバイスである。可変または固定の扇形質量分析計を用いることで、満足できる作業が達成される。
【００８６】
（実施例３）
純粋な共基質の燃焼のための操作および化学量論パラメータ
本実施例は、純粋な共基質の供給（Ｘｃ＝１）の燃焼についての反応２の化学量論係数の決定に関する。その結果、これらの係数は、本発明のモニタリング方式と制御方式において直接使われる。
【００８７】
反応２は、エネルギーが生体触媒によって共基質から生み出される一連の生化学反応のネットを表す。反応２の適切な化学量論的係数を決定することにおいて、その経路が知られていることは必要ではない。なぜなら、化学量論は、酸素の存在下での二酸化炭素および水になる同じ共基質の完全な燃焼について同じだからである。すなわち、化学式がＣｘＨｙＯｚである共基質については、燃焼化学量論は以下のように与えられる。
【００８８】
反応３．１
本明細書の反応２の検討により、以下のようになる。
【００８９】
【数２３】
2006515991.tif 000026
【００９０】
【数２４】
2006515991.tif 000027
【００９１】
以下の式もまた明らかである。
【００９２】
【数２５】
2006515991.tif 000028
【００９３】
さらに純粋成分の共基質を使った場合は、以下のようになる。
【００９４】
【数２６】
2006515991.tif 000029
【００９５】
式３．１〜式３．６のこれらの関係は、本発明の監視および管理方法において使用される幾分かの操作線パラメータおよび化学量論パラメータを定義する。該パラメータは、表３．１に示すように、本発明の方法により使用可能である、多数の例示的な純共気質に適用されている。
【００９６】
【表３】
2006515991.tif 000030
【００９７】
1定義および単位例は、表１で与えられている。
【００９８】
（実施例４）
共基質混合物の燃焼についての操作パラメータおよび化学量論パラメータ
本実施例は、共基質が代謝された成分または代謝されていない成分の混合物である場合の共基質の使用に関する。
【００９９】
純粋な化合物の高いコストと入手可能性のために技術的形態または商業的形態の化合物を共基質として用いることには、強い経済上の誘因がある。その結果、農芸化学工業および石油化学工業の基本的な化学物質から選択した共基質は、代謝された成分または代謝されていない成分の混合物を含んでいる。また、処理を補助するものを、生体酸化反応に供給される最終的な共基質の流れの準備の間に加えることができる。これらは、本発明の操作パラメータおよび化学量論パラメータに対応する適切な値を決定するのに明らかにされる必要がある。もし共基質が代謝された物質からのみ成り立ち、そして分子式が混合物に対して利用可能であるなら、化学量論パラメータおよびいくつかの操作パラメータを決定することにおいて、実施例２の方法を使うことが可能である。
【０１００】
もし共基質が成分ｊが代謝された成分ｉからなるのなら、操作パラメータは、以下の式により与えられる。
【０１０１】
【数２７】
2006515991.tif 000031
【０１０２】
および
【０１０３】
【数２８】
2006515991.tif 000032
【０１０４】
化学量論パラメータを計算するためには、代謝された成分の質量分率をモル分率に最初に変換することが有用であり、以下の式のようになる。
【０１０５】
【数２９】
2006515991.tif 000033
【０１０６】
その結果、各化学量論パラメータは、以下の式に従って実施例３の方法を使い、個々の純粋成分の各々の化学量論パラメータから決定される。
【０１０７】
【数３０】
2006515991.tif 000034
【０１０８】
これらの混合規則を実行することは、スプレッドシートソフトウェアプログラムで容易に達成される。
【０１０９】
（実施例５）
グルコース共基質供給原料の調製
１１９８ｋｇの水の中に１４９７ｋｇのグルコース一水和物を溶かすことによって、粘度調節しない（ｕｎ−ｔｅｍｐｅｒｅｄ）供給システムで用いるための５０．５％のグルコース供給物を調製した。次いで、その水溶液を圧力容器に移し、間接的な蒸気加熱によって消毒した。この供給物（２６９５ｋｇ）は、１３６１ｋｇのグルコース、１３６ｋｇの水和水および１１９８ｋｇの溶媒水を含んでいた。
【０１１０】
表５．１に示されるように、この供給物を共基質として用いることに対して、操作パラメータおよび化学量論パラメータを決定することにおいて用いられる式４．１〜４．７の適切な値が計算される。
【０１１１】
【表４】
2006515991.tif 000035
【０１１２】
（実施例６）
グルコース共基質供給物の調製
もう一つの方法として、グルコース共基質供給物を７２％の乾燥個体を含んでいる市販の９５ＤＥコーンシロップから調製した。乾燥固形物分画は、９６％の代謝されたブドウ糖を含み、残りの４％の固形物は代謝されていないものと考えられた。粘度調節しない貯蔵および分配システムに便利なように、袋詰めの９５ＤＥコーンシロップを５５％の乾燥固形物となるように水で薄めた。
【０１１３】
希釈されたコーンシロップの計量されたアリコートを殺菌および生体酸化反応に供するための貯蔵タンクに移された。使用の前にタンクおよび希釈されたコーンシロップは、蒸気濃縮物の蓄積により、さらにコーンシロップを薄めた直接の蒸気加熱によって消毒された。得られた共基質供給物の最終の乾燥固形物含有量は、４７．１％であった。
【０１１４】
この共基質供給物を調製する際のコーンシロップおよび中間の蒸気の中の固形物量は、屈折率測定との相互関係によって都合よく決定された。希釈操作および殺菌操作にわたる全体収支的および成分物質収支を同時に解くことにより、基本となる１０００ｋｇの最終の無菌共基質供給物は、４５２．２ｋｇのグルコース、１８．８ｋｇ他の固形物、１４３．６ｋｇの蒸気濃縮物、２０２．２ｋｇの希薄水と１８３．２ｋｇのコーンシロップ由来の水を含む。表６．１に示されるように、この供給物を共基質として用いることに対して、操作パラメータおよび化学量論パラメータを決定するのに用いられるための式４．１〜４．７の適切な値が計算される。
【０１１５】
【表５】
2006515991.tif 000036
【０１１６】
（実施例７）
混合糖類共基質供給物の調製
ＳＴＡＬＥＹＤＥＸ（登録商標）９５Ｍ液体デキストロースの仕様書には、その９５％（最小）が単糖類であり、８６％（最小）のグルコースおよび９％（最大）のフルクトースである７１％〜７２％の乾燥物質を含むことが示されている。ＳＴＡＬＥＹＤＥＸ（登録商標）９５Ｍ液体デキストロースのＨＰＬＣ分析により、そのグルコース成分が６１．３％のグルコースであったことを確認した。フルクトースは、乾燥物質９％であるとみなされ、生体酸化反応においてブドウ糖と平行して同様に代謝されることが判明した。従って、フルクトースは代謝された成分として包含されていた。
【０１１７】
１０ｋｇのＳＴＡＬＥＹＤＥＸ（登録商標）９５Ｍ液体デキストロースに２．２６ｋｇの脱イオン水を混ぜることによって、５０％のグルコースを含む混合糖類共基質供給物が調製された。希釈は、加減をしていない実験用の生体酸化系中での取り扱いを容易にした。その結果、この最終の共基質溶液（１２．２６ｋｇ）は、６．１３ｋｇのグルコース、０．６３５ｋｇのフルクトース、０．２８５ｋｇの他の固形物、２．９５ｋｇの液体デキストロース由来の水および２．２６ｋｇの希釈水を含んでいた。混合物を、製造業者の推薦に従って、キャニングジャーに配分して密封し、後の使用のために実験室オートクレーブで滅菌された。表７．１に示されるように、この供給物を共基質として用いることに対して、操作パラメータおよび化学量論パラメータを決定のに用いられるための式４．１〜４．７の適切な値が計算される。
【０１１８】
【表６】
2006515991.tif 000037
【０１１９】
（実施例８）
脂肪酸共基質供給物の調製
表８．１で与えられる一般的な組成を有する２００グラムのＥＭＥＲＳＯＬ（登録商標）オレイン酸を三角フラスコに充填した。間接蒸気加熱による殺菌の前に、１０グラムの蒸留水を加え、殺菌の効果を良くした。その結果、殺菌後の共基質は、９５．２％のＥＭＥＲＳＯＬ（登録商標）オレイン酸および４．８％の水を含んでいた。
【０１２０】
【表７】
2006515991.tif 000038
【０１２１】
表８．２に示されるように、この供給物を共基質として用いることに対して、操作パラメータおよび化学量論パラメータを決定するのに用いられるための式４．１〜４．７の適切な値が計算される。同様のアプローチが、多くの市販の脂肪酸に対して用いられる。
【０１２２】
【表８】
2006515991.tif 000039
【０１２３】
（実施例９）
生体酸化基質のための化学量論パラメータおよび操作パラメータを確立するためのアプローチの要旨
共基質の燃焼化学量論に依存する共基質についての化学量論パラメータおよび操作パラメータを確立するために用いられる方法とは逆に、潜在的な生体酸化基質および生体酸化生成物の多様性は、直ちにこのような単純な規則があてはまるものではない。基質を望ましい最終生成物に酸化する際にとられる経路は、分子酸素を伴う少なくとも１つのステップ、おそらく１以上のステップを含む。この経路は、直接分子酸素を伴わない追加のステップを含むことができる。
【０１２４】
基質から生成物までの経路が公知であり、そして各ステップの化学量論が知られている場合、全体的な反応化学量論を決定することができる。これは、遺伝子組み替えＤＮＡ技術により故意に作られた生体触媒についての場合であり得る。
【０１２５】
近年、分子酸素を使う酵素および酵素系についての多くの科学的な研究がなされてきている。望ましい酸化のための正しい全体的な反応化学量論が推測的に書かれている同様の生体酸化反応について開示されている文献の中に、利用可能な十分な情報があるかもしれない。
【０１２６】
しかしながら、少なくともまことしやかな化学量論が書かれている文献で十分な情報は本当に利用可能であるが、矛盾する情報が存在し、あるいは全体的な反応化学量論において情報が不確実なことを残しているのを見逃していることは、よくある状況である。
【０１２７】
（実施例１０）
ジカルボン酸へのアルカンおよび脂肪酸の酸化：文献データからの基質化学量論パラメータの決定
アルカンが代謝の分解経路に入るメカニズムは、末端のメチル炭素の連続的な酸化（最初にアルコール、次いでアルデヒド、最終的にカルボン酸となる）を通して起こると一般に考えられる。末端のメチル炭素をカルボン酸へと酸化させているこの経路は、ω酸化経路と呼ばれる。次いで、得られた脂肪酸は、さらなる分解のためにβ酸化経路に入るか、細胞脂質の溜まったものの中に組み込まれ得る。ＲｅｈｍおよびＲｅｉｆｆ（Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．  ，  ９，  ｐｇｓ．  １７５−２１５，１９８１）は、微生物内におけるアルカンの酸化のための種々の機構について意見を述べている。図２は、ω酸化経路、ω酸化経路とβ酸化との関係および脂肪酸の組み込みを概略的に示す。
【０１２８】
もしβ酸化経路がブロックされるなら、アルカン基質および脂肪酸基質は、高い純度および高い収率で対応するジカルボン酸に変換されることはＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓにおいて証明された（Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏら，  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ｐｐ  ８９４−８９８  １９９２  および  米国特許５，２５４，  ４６６）。このように、基質炭素はω酸化経路に導かれ、細胞から排出される。発酵手順は、細胞数を増やし、所定の速度においてブドウ糖共基質を供給することを含む。基質は、周期的なサンプリングおよびオフライン分析に基づいて添加され、発酵培養液の残渣基質濃度が４〜６０ｇ／リットルに維持される。
【０１２９】
本発明の方法をＰｉｃａｔａｇｇｉｏの生体酸化プロセスに適用するために、特に酵母、そして特に  Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓにおいて酸化反応の全体的な化学量論について知られていることを評価することはまず有用である。  Ｇａｌｌｏら（“Ａｌｋａｎｅ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｃｔａ，２９６，ｐｇｓ．６２４−６３８，１９７３）は、最初のＮＡＤＰＨ依存の水酸化ステップが混合機能性のモノオキシゲナーゼシトクロム  Ｐ４５０  によって媒介することを確認し、従来の研究を拡張した。図３に示されるように、ＲｅｈｍおよびＲｅｉｆｆ（前に引用された箇所は、この水酸化反応のための化学量論を与えた。
【０１３０】
Ｇａｌｌｏらの初期の研究（前に引用された箇所）は、アルデヒドへアルコールを酸化させる２番目のステップが分子酸素を伴わないＮＡＤ+依存デヒドロゲナーゼによって触媒作用を受けたことを示唆した。Ｋｅｍｐらによる後の研究（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２９，ｐｇｓ．３７０−３７４，１９８８）は先の研究を否定して、そして反応が、図３に示されるように、酸素の消費および過酸化水素の発生を伴うアルコールオキシダーゼによる触媒作用を受けたことを明示している。
【０１３１】
過酸化水素は、細胞で蓄積されにくい反応種である。アルデヒドおよび過酸化水素が、カルボン酸および水を形成するために自発的に反応することができたことは注目すべきである。むしろ、図３に示されるように、酵素カタラ−ゼが酸素および水を与えるこの反応種を処分することの方が可能性が高い。
【０１３２】
最終的に、Ｇａｌｌｏら（前に引用された箇所）およびケンプ（前に引用された箇所）らの両方の研究は、最終ステップがカルボン酸を産出するためにＮＡＤ+  依存デヒドロゲナーゼによって触媒作用を受けるということで一致している。
【０１３３】
末端メチル基の酸化のためのまことしやかな反応スキームは、特にアルカンおよび脂肪酸からのジカルボン酸形成と関係があるが、図３の最終的な（ｎｅｔ）ω酸化反応として与えられる。脂肪酸基質に適用されるとき、１．５モルの酸素を消費して１モルの生成物を産出するこの反応を通して、１つの経路が必要とされる。アルカン基質に適用されるとき、各１モルの基質および生成物に対して３モルの酸素を消費してアルカンの各末端をジカルボン酸へ酸化する２つの経路が必要とされる。
【０１３４】
若干のアルコールデヒドロゲナーゼ活性は、オキシダーゼ活性と平行して潜在的に存在することができるという点で、化学量論において不確実なことが発生する。アルデヒドおよび過酸化水素、ともにアルコールオキシダーゼの生成物であるが、の何らかの自発的な反応もまた、インビボで起こりえる。さらに、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ（Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，“Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ  Ｃａｓｃａｄｅ  ｉｎ  Ｃｏｎｖ
ｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎ−Ａｌｋａｎｅｓ  ｔｏ  ａ，−  Ｄｉｏｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ５２Ａ３”，Ｊ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７３，ｐｇｓ．３２５２８−３２５３４，１９９８）由来およびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（Ｅｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  Ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ”，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６９，ｐｇｓ．５９９２−５９９９，２００３）由来のシトクロムＰ４５０に関する最近の研究は、この酵素がω酸化経路のすべての反応を触媒することができることをインビトロで証明している。これは、経路を通る各々の通過に対して、３モルの酸素の必要な消費とともにカルボン酸を与える。
【０１３５】
（実施例１１）
生体酸化速度および制御方程式の別の表現
本発明の好ましい実施態様において、基質および共基質の消費速度は、成分ガス収支（化学量論線）から決定される。基質および共基質の供給速度（操作線）に対する比例的な調整がなされる。
【０１３６】
広い範囲の生体酸化反応について望ましい実施態様と同一の本発明の方法をテストしようとする人たちにとって、代替するものを容易に適用することができることが見いだされた。
【０１３７】
この代替方法は、本明細書ですでに記述した同時反応１〜５と同じシステムを利用する。しかしながら、この解析では、以下の単純化および定義がなされる。
１）  反応４の速度はゼロであるか、または実験目的のために、一時的にゼロであるようにする、すなわちΨ＝０であると考える。
２）  反応１および反応２の速度は、それぞれ酸素消費および二酸化炭素発生の観点から定義される。
３）  反応１において共基質の化学量論係数は、ゼロであるか、または実験目的のために、一時的にゼロであるようにする、すなわちｃ1＝０であると考える。
【０１３８】
反応１の化学量論によれば、反応１の速度は、以下のように酸素消費の観点から表現することができる。
【０１３９】
【数３１】
2006515991.tif 000040
【０１４０】
同様に、反応２の化学量論によれば、反応２の速度は、以下のように二酸化炭素発生の観点から表現することができる。
【０１４１】
【数３２】
2006515991.tif 000041
【０１４２】
式７を前記の仮定に支配されている式１２に代入することにより、次式が与えられる。
【０１４３】
【数３３】
2006515991.tif 000042
【０１４４】
この式１４は、反応１によって酸素消費の観点から基質酸化速度を与える。
同様に、式７および式４を、前記の仮定に支配されている式１３に代入することにより、二酸化炭素発生の観点から共基質の燃焼速度が与えられる。
【０１４５】
【数３４】
2006515991.tif 000043
【０１４６】
基質の酸化および共基質の燃焼のための得られた同時の反応は、可能性がある広い範囲の生体酸化反応をまさに説明する。反応化学量論が知られていないか、または不確実であるとき、この代替形式は、独立して反応化学量論を測定することにも役立つ。
【０１４７】
発酵の過程にわたる時間に対するそれぞれ式１５および式１４を使ったｒ2aおよびｒ1aのプロットは、発酵についての平衡線を確立する。
それぞれ、基質の酸化による予想される酸素消費の観点から、および共基質の燃焼による予想される二酸化炭素発生の観点から基質および共基質の操作線を確立することは、現在可能である。
【０１４８】
よって基質の酸化については、
【０１４９】
【数３５】
2006515991.tif 000044
【０１５０】
次いで、基質操作線は、式１７に従って、生体酸化の過程の間の−ｒ1a（理論値）のプロットにより規定される。
【０１５１】
【数３６】
2006515991.tif 000045
【０１５２】
同様に、共基質については、
【０１５３】
【数３７】
2006515991.tif 000046
【０１５４】
次いで、共基質操作線は、式１７に従って、生体酸化の過程の間の−ｒ2a（理論値）のプロットにより規定される。
【０１５５】
【数３８】
2006515991.tif 000047
【０１５６】
以前の仮定にもかかわらず、共基質が反応１で消費される場合および１より大きいＡ4の操作値を使って本発明の方法を実行することにによって、若干のバイオマスの蓄積が単に望ましい（反応４）場合でさえ、この代替方法は、制御目的のためにうまく使うことができた。
【０１５７】
すべての比較および制御式がコンピュータ上でプログラムされるわけではないが、ＯＵＲとＣＥＲだけが誘導される変数として与えられる場合に、満足できる生体酸化を与えるこの方法が便利なものとなることを我々は見いだした。これらの単純化された制御計算は、手持ちの電卓を使って容易になされる。発明者は、実験室でのこれらの計算を大きいパイロットスケールの生体酸化反応に適用した
【０１５８】
（実施例１２）
ω酸化による９−オクタデセン二酸へのオレイン酸基質の酸化：
オレイン酸基質供給物の調製
表１２．１に示された組成を有する約１５００ｋｇのオレイン酸を、殺菌した供給タンクに添加した。平均の脂肪酸分子量は、これらの組成から決定され、共基質に対するものに類似した方法を使って２８１．１ｇ／ｇモルであることがわかった。
【０１５９】
質量分析計によってなされた同様の測定により、この脂肪酸の実験化学式が、２８１．４ｇ／ｇモル（これは、上記の計算値とほぼ一致する。）の実験上の分子量をもつＣ17.92Ｈ33.86Ｏ2を与えるものであることが判明した。この化学式は、基本的な脂肪酸の構造を反映して、ＣＨ3Ｃ15.92Ｈ29.86ＣＯＯＨとして書くこともでき、ω酸化を介して、末端メチル基をカルボキシル基へ酸化する目標を想起させる。
【０１６０】
この基質供給物は、プロセス補助剤も他の代謝されていない成分も含んでおらず、したがってＸｓ＝１である。
実施例１０および図３の提案されたω酸化化学量論が正しいと仮定すれば、基質の酸化である反応１の化学量論パラメータは、ａ1＝１、ｂ1＝１．５、ｃ1＝０、ｄ1＝１、ｅ1＝０、ｆ1＝１となる。
【０１６１】
【表９】
2006515991.tif 000048
【０１６２】
（実施例１３）
ブドウ糖共基質を用いたω酸化による９−オクタデセン二酸へのオレイン酸基質の酸化：
制御式の設定
ω酸化の化学量論では不確実なことが残っているので、実施例１０と図３で提案された反応化学量論を最初に確かめることが必要である。これをするために、特性がよくわかっているグルコース基質供給物を選び、本発明の方法に従って、その供給速度を制御した。同様に、特性がよくわかっているオレイン酸基質を用いたが、反応化学量論の確認の結果が出るまで、その供給速度を制御しなかった。基質の操作線および化学量論線を、提案された酸化の化学量論が正しいとして作成した。
【０１６３】
こうして、米国特許５，２５４，４６６号（この全体の内容が本明細書において参照として援用される。）で記述されるように、実施例１２のオレイン酸供給物を、実施例５のグルコース供給物を用いて、β酸化がブロックされたＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  Ｈ５３４３によって酸化した。
これらの各供給物についての化学量論パラメータおよび操作パラメータを用いる実施例１１の方法を使って、生体酸化をモニターした。
【０１６４】
生体酸化の速度は、パラメーターを式１４に代入することで得られ、以下の式を与える。
【０１６５】
【数３９】
2006515991.tif 000049
【０１６６】
同様に、共基質の燃焼速度については、式１５を使って以下の式を与える。
【０１６７】
【数４０】
2006515991.tif 000050
【０１６８】
次いで、生体酸化反応の速度をＯＵＲおよびＣＥＲにおける差について決定し、一方、共基質の消費速度をＣＥＲから決定する。
示された操作パラメータおよび化学量論パラメータを式１６および式１８にそれぞれ代入することにより、基質および共基質の供給速度の設定ポイントを決定する。
【０１６９】
【数４１】
2006515991.tif 000051
【０１７０】
次いで、適切な化学量論パラメータおよび操作パラメータを式１７に代入することにより、基質供給物のための操作線が与えられる。
【０１７１】
【数４２】
2006515991.tif 000052
【０１７２】
この式１３．５は、基質供給速度Ｆｓと化学量論線の作成のために用いられるのと同じ基準とを関連付ける。すなわち、この式は、全てのオレイン酸が反応化学量論に従って生成物に変換されるなら、予想される酸素消費がどうなるかを算定する。実際の供給速度は、Ａ3に対して選択された値による反応速度より大きい、等しいまたは小さいかもしれない。
【０１７３】
同様に、適切な化学量論パラメータおよび操作パラメータを式１９に代入することにより、共基質の操作線が与えられる。
【０１７４】
【数４３】
2006515991.tif 000053
【０１７５】
この式１３．６は、共基質供給速度Ｆｃと化学量論線の作成のために用いられるのと同じ基準とを関連付ける。すなわち、この式は、全てのグルコースが燃焼化学量論に従って生成物に変換されるなら、予想される二酸化炭素発生がどうなるかを算定する。実際の供給速度は、Ａ4に対して選択された値による反応速度より大きい、等しいまたは小さいかもしれない。
【０１７６】
次いで、発酵は、２組のプロットとして、図式的に表される。第１のプロットは、測定値のＣＥＲ−Ｖf（化学量論線）によって表される共基質の燃焼速度を比較して、そして一般的なグルコース供給速度−ｒ2a（理論値）・Ｖf（操作線）に対して計算された理論値のＣＥＲ−Ｖfと比較される。第２のプロットは、（ＯＵＲ−ＣＥＲ）・Ｖf（化学量論線）によって表されたω酸化の速度を比較して、そして一般的なオレイン酸供給速度ｒ1a（理論値）・Ｖf（操作線）に対して計算された理論値の（ＯＵＲ−ＣＥＲ）・Ｖfと比較される。
【０１７７】
これらの式は、自動的なフィードバック制御ループで実行され得る。実際に、我々は、単に発酵をモニターして、そして周期的な供給速度調整をすることによって、成功した結果を得た。
【０１７８】
（実施例１４）
グルコース共基質を用いたω酸化による９−オクタデセン二酸へのオレイン酸基質の酸化
米国特許６，５６９，６７０号（この全体の内容が本明細書において参照として援用される。）で記述されるように、発酵器に９７００ｋｇの合成成長培地を充填した。ユーザー規定の発酵ボリュームを１０００ｋｇにセットしたので、ＣＥＲおよびＯＵＲのデータはｇモル／時間の単位となった。実施例１３のβ酸化ブロックＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ酵母の活発に成長している培養物３００ｋｇとともに、培地をインキュベートし、同じ培地で成長させた。３５℃における培養物は、急に指数関数的成長に入った。ｐＨを苛性カリ溶液を用いて５．８に維持した。５０．５％のグルコース共基質供給物を、この供給物に対する化学量論パラメータおよび操作パラメータが与えらている実施例５の方法を使って、デキストロース一水和物から調製した。共基質の供給を、２３．９ｋｇ／時間の速度において指数関数的成長段階の終わりの近くで始めた。
【０１７９】
ＯＵＲおよびＣＥＲにおける速い減少および溶解している酸素の速い増加によって判断されたグルコースが制限された成長段階の終わりに、４６．６ｋｇの投入量のオレイン酸を加えた。これは、ω酸化経路を導いた。オレイン酸の供給を、１８．５ｋｇ／時間の速度において約３時間後に始め、そしてω酸化反応速度をモニターするためにバッチ工程の間に一定を維持した。温度を３０℃に下げ、そして発酵期間の間でｐＨを苛性カリ溶液を用いて５．８に維持した。導入時（生体酸化時間がゼロ）におけるバイオマス濃度は、１７．８ｇ乾燥重量／ｋｇ培養液であった。
【０１８０】
図３は、この発酵バッチの経時変化を示す。実施例１３の式に従い、効果的にＡ4に値として１を用いて、グルコース供給速度を周期的に調節した。実施例１３の式を用いてω酸化反応をモニターした。そして、一定の供給速度を、ｂ1／ａ1＝１．５に対して描かれる基質操作線により表した。基質および共基質の供給速度（それぞれＦｓおよびＦｃ）を、供給タンクレベルの減少によりモニターした。基質操作線におけるノイズスパイクは、供給速度の実際の変動によるものではなく、むしろ発酵中の小さな供給タンクの周期的な補給によるものであった。
【０１８１】
また、二価酸、未反応の脂肪酸の蓄積が図３に示され、それらのメチルエステル誘導体としてガスクロマトグラフィーで測定されている。グルコースは、屈折率検出器を備えたイオン交換液体クロマトグラフィーを用いてテストされる発酵サンプル中で検出されなかった。
【０１８２】
基質の化学量論線は、発酵の最初の１０時間にわたるω酸化経路の誘導を明らかに示している。その活性は、バッチ工程の残りの時間にわたって衰退した。この実験は、化学量論線での重大な湾曲、すなわち反応過程の間に反応速度が連続的に変化することを明らかにした。
【０１８３】
本発明の技術がなければ、ただ供給速度が何であるべきであるかを推測するしかないままである。また、商業的規模の反応器と全く関係しないであろう様々な供給の計画でもって多数の小規模の試験を行うか、または何回ものオフラインのサンプル分析をを行い、それから一般的な速度（少なくとも最後のサンプルが供されたときの速度）に到達する時間に関する分析結果を区別しているままである。その結果、プロセスの乱れが起こるなら、再び推測するか、または８〜１２時間待機し、変更のために必要とすることを調べるためにさらなる１つのサンプルを掴み取るだけである。我々は、生体酸化反応を制御することにおいて、ストレスのたまるこれらの方法が、時間がかかって、高価で、そして究極的に効果的でないことを見いだした。
【０１８４】
バッチ工程の間にバイオマス蓄積がほとんどなかった。なぜなら、エネルギー目的のために二酸化炭素に換えられる量のみに共基質の供給速度が周期的に減らされたからである。そのため、炭素を追加することは、成長のために有効ではなかった。培養可能な生きた細胞の再生は、バッチ工程の導入から終了までの間の１０のファクターにより減らされた。しかし、基質化学量論線により判断されたように、ω酸化活性は、約半分のみによって減らされた。脂肪酸は、予想されたように、反応の間に蓄積した。というのは、基質供給がバッチ工程中の約９５時間で終るまで、操作線が化学量論線をかなり上回っていたからである。
【０１８５】
（実施例１５）
ジカルボン酸へのアルカンおよび脂肪酸の酸化：実験データからの基質化学量論パラメータの決定
実施例１４からのデータは、各サンプルポイントにおける二価酸の累積的な生産およびω酸化経路による酸素の累積的な消費を調べることによって、ω酸化経路の化学量論を実証するために有用である。すなわち、各サンプル時間ｔに対して化学量論比ｄ１／ｂ１は以下の式で与えられる。
【０１８６】
【数４４】
2006515991.tif 000054
【０１８７】
積分は、１列に並んだ基質化学量論線データを用いて、数学的に求めた。これは、実施例１４のデータを使っている図４に示される曲線より下の面積であり、導入時間ゼロから任意の時点までで求めることができる。
【０１８８】
生成した二価酸に対するω酸化により消費された累積的な酸素のプロットは、実施例１４のデータを使っている図５で示される比ｂ１／ｄ１を与える。そのデータの最小二乗法は、１．４６ｇモルＯ2／ｇモル二価酸として線の勾配を与え、実施例１０の文献データによって示唆される予想化学量論の１．５に非常に近い。
【０１８９】
（実施例１６）
ジカルボン酸へのアルカンおよび脂肪酸の酸化：実験データからの基質化学量論パラメータの決定
反応化学量論を実証したので、一列にならんだデータにのみ基づく発酵培養液の組成について予想することは今や可能である。次いで、二価酸濃度は、Ｘ二価酸についての式１５．１を解き、それから示された速度データの積分を行い、容器の装備質量データを集めることによって決定される。結果は、実施例１４のデータを使って、オフラインのサンプル分析と比較して図５で示される。この方法を使うことは、オフラインのサンプル分析の必要性を減らす。
【０１９０】
（実施例１７）
ω酸化によるジカルボン酸へのアルカン基質の酸化：反応化学量論の比較決定
様々な化学量論パラメータおよび操作パラメータを有している基質を用いて、ω酸化経路化学量論をさらにテストすることは有用である。滅菌供給容器の中へＮＯＲＰＡＲ（エクソン製品）アルカンをフィルター滅菌することにより、アルカン基質供給物を調製した。表１７．１に、ガスクロマトグラフィーによって得られたこのアルカン基質の組成を示す。この混合物中のアルカンの平均の分子量は１８６．６であった。対応する二価酸を作るためのω酸化経路を通る１つのパスのみである実施例１２の脂肪酸基質とは逆に、アルカンは２つのパスを必要とする。その結果、３モルの酸素が、１モルの基質を１モルの生成物に酸化するために必要とされる。基質酸化である反応１についての化学量論パラメータは、実施例１０および図３を用いて、ａ1＝１、ｂ1＝３、ｃ1＝０、ｄ1＝１、ｅ1＝０、ｆ1＝１となる。
【０１９１】
約１０分の１の発酵スケールであるが、実施例１４で用いたのと同様のグルコース供給物により、アルカン基質を用いて、生体酸化が行われた。上記で決定された気質のための共気質および操作パラメータによって決定される実施例１３の操作式を使用して、生体酸化をモニターし、グルコースの供給を制御した。
【０１９２】
図８は、実施例１５の方法に従ってプロットされたデータを示し、比ｂ1／ｄ1＝２．９７ｇモルＯ2／ｇモル二価酸を与える。これは、図３のω酸化経路を通る２つのパスと一致している。
【０１９３】
【表１０】
2006515991.tif 000055
【０１９４】
（実施例１８）
グルコース共基質を用いたω酸化によるオレイン酸のジカルボン酸への酸化：基質供給物および共基質供給物の同時の制御
同時係属出願シリアル番号０９／６６３，９６３に記載されるように、発酵器に８６トンの合成成長培地を充填した。複合グルコース／酵母抽出物／ペプトン培地で成長したβ酸化ブロックＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ酵母の活発に成長している培養物１．４トンとともに、培地をインキュベートした。３５℃における培養物は、急に指数関数的成長に入った。ｐＨを気体アンモニアを用いて５．８に維持した。４５．２％のグルコース共基質供給物を、この供給物に対する化学量論パラメータおよび操作パラメータが与えらている実施例６の方法を使って調製した。共基質の供給を、２５０ｋｇ／時の速度において指数関数的成長段階の終わり近くで始めた。
【０１９５】
オレイン酸基質供給物を、この供給物を直接蒸気加熱で滅菌した以外は、実施例１２の方法と同様にして調製した。結果として、この供給物は、約１７．７％の蒸気濃縮物を含んでいた。したがって、この供給物に対する操作パラメータＸｓは、０．８２であった。他の操作パラメータおよび化学量論パラメータは同じであった。
【０１９６】
ＯＵＲおよびＣＥＲにおける速い減少および溶解している酸素の速い増加によって判断されたグルコースが制限された成長段階の終わりに、４１０ｋｇの投入量のオレイン酸基質を加えた。これにより、ω酸化経路を導いた。オレイン酸の供給を、基質供給物の投入量を周期的に加えることにより始めて、約１４０ｋｇ／時の時間平均供給速度を得た。これらの基質供給物添加に用いられる時間は、一般的に１〜３時間である。温度を３０℃に下げ、そして発酵期間の間でｐＨを苛性ソーダ溶液を用いて５．８に維持した。導入時（生体酸化時間がゼロ）におけるバイオマス濃度は、１９．２ｇ乾燥重量／ｋｇ培養液であった。
【０１９７】
図９は、収率を含むこの生体酸化の経時変化を示す。化学量論線の傾向への対応に必要なように、共基質供給速度を周期的に調節した。同様に、オレイン酸供給速度を、基質化学量論線データに対応して、最初の１０時間にわたって３段階で増加した。
【０１９８】
このバッチは、好ましくないレオロジー特性が進展し、そしてω酸化活動が低下する１０時間〜約２５時間の間の段階に入った。しかしながら、基質供給速度は変えなかった、なぜなら残余のオレイン酸の蓄積を可能とすることで、好ましくない培養液のレオロジーを軽減するのを助けることに気づいたからである。この現象は、データにおいてランダムな散布に帰され得るオフラインのデータ（差分法）の傾向からかろうじて知ることができる。しかしながら、ω酸化活性に対する全体的な効果は、本発明の高感度積分法によって判断されるように非常に顕著である。
【０１９９】
バッチ工程が進行するにつれて、基質供給速度を基質化学量論線に対応して減少させて、未反応の基質のさらなる蓄積を止めた。６６時間〜７２時間の間の基質供給物の損失は、この場合生体酸化反応にほとんど効果を与えない予期せぬプロセスの乱れであった。バッチ工程の終わりに観察された最終のバイオマス濃度は、８．４ｇ／ｋｇであった。全体として、この生体酸化は、生産された二価酸の各１ｋｇに対して０．５４ｋｇのグルコース（無水ベース）供給物を消費した。
【０２００】
実施例１６の方法を用いて計算された培養液の二価酸濃度は、ガスクロマトグラフィーによって独立して決定された濃度とほぼ一致した。化学量論的二価酸曲線を作成することにおいて、少量の蓄積されたω−ヒドロキシ酸を作るために消費された酸素を考慮した場合、濃度の一致が際立って良くなることが後に見いだされた。
【０２０１】
この実施例では、基質および共基質の供給速度の必要な調整が、それぞれ、頻繁な間隔でなされたので、Ａ３およびＡ４の値はバッチ工程の間で変化した。基質は、それが生体酸化のための基質であるだけではなく、生体酸化経路へ導くものであって、そして若干の培養液の粘度修正機能を果たしたという点で、この生体酸化で多数の目的を果たした。
したがって、１より大きいＡ４で操作によって、バッチ工程の早い部分の間に、若干の残余の脂肪酸基質の蓄積を可能とすることは有用であった。バッチ工程の後で、蓄積した一価酸を減らすために、Ａ４を効果的に１まで減らし、次いでゼロにして、残余の一価酸を変換させた。基質の蓄積の制限を望むのであれば、いっそう頻繁な調整間隔が可能である。我々は、望ましくない成分ガス収支データでのノイズレベルにおける供給速度制御を見いだした。この場合に、データに平滑化テクニックを適用するか、調整するために適切なデッドバンドを選ぶことが有用である。
【０２０２】
（比較例１）
グルコース共基質を用いたω酸化によるジカルボン酸へのオレイン酸基質の酸化：基質または共基質の供給速度を制御しない場合。
本発明の方法は、生体酸化反応について特徴づける操作への非常に有用な洞察を提供した。しかしながら、この前に、一定の共基質の供給速度を使うことによって、または一連の計画された共基質供給速度の変更を実験的に展開することによって、単純に反応を実行させた。濃度が非常に低いために、残余のグルコースのオフラインの分析は、非実用的であると分かった。基質供給速度への調整は、培養液のオフラインのガスクロマトグラフィー分析に対応して、または同じく実験的に決定されたスケジュールによって、頻繁になされた。
【０２０３】
二価酸を生成するベータ酸化ブロックＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓの株は、１０ｋｇの基準体積の発酵培養液中で約１８ｇ／ｋｇの密度にグルコース上で増えていた。水中の５０％のグルコースの共基質供給物は、デキストロース一物水和物から作られ、成長段階の終わりの近くで３６ｇ／時において培養物に送り込まれた。この共基質の供給速度は、残りのバッチ工程を通して一定に維持した。
【０２０４】
ＥＭＥＲＳＯＬ（登録商標）オレイン酸基質の供給を、溶解している酸素が速く増加することによって判断されるように、細胞を成長させるために使われたブドウ糖が使い尽くされた時に始められた。これは、ω酸化経路を誘発した。オレイン酸基質供給速度を初めに１８ｇ／時に設定したが、生体酸化反応の中の約４８時間は１５ｇ／時に下げられた。基質供給はバッチ工程中の約９０時間に完全に止められた。図１０は、４つの別の実験の間の二価酸および一価酸の蓄積を示す。
【０２０５】
二価酸の生成は最初は良好であるが、バッチ工程が進むにつれて遅くなった。全体として、この制御されていない方法で操作される生体酸化反応は、生成された二価酸の各１ｋｇに対して１．７ｋｇのグルコースを消費した。近い試験では、バイオマスが約４５．５ｇ乾燥重量／ｋｇ培養液まで蓄積したことを示された。乾燥したバイオマスサンプルの赤外分光分析が、それが１３％〜１６％のトリアシルグリセロール脂肪酸エステルを含んでいることを示した。こうして、基質および共基質の両方を伴う副反応が、この制御されていない操作で起こった。
【０２０６】
（比較例２）
グルコース共基質を用いたω酸化によるジカルボン酸へのオレイン酸基質酸化：基質の過剰な添加
実施例１８の方法と同様にして、生体酸化反応を準備した。ここで、共基質は、共基質の化学量論線へ共基質供給速度を周期的に調整することによって制御された。過剰量の基質（最高９０ｇ／ｋｇ残余の一価酸）を、生体酸化反応の最初の１０時間に加えた。生体酸化時間の２１時間後に、培養液はたった１４ｇ／ｋｇのジカルボン酸を含んでいた、しかし、ω酸化経路（図３を参照）の最初の段階から生成したω−ヒドロキシ酸中間体は、１３ｇ／ｋｇにまで蓄積していた。こうして、基質供給速度制御をしないことにより、生産性が減り、そして生体酸化反応の中間体蓄積への基質の転換を招いた。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】１列に並んだ成分ガス収支計算の測定において使われる装置の一般的な配置を持つ生体酸化反応器に出入りするガスのフローチャートを示す。任意の純粋な酸素補給に使用するための代替の配置もまた示す。
【図２】ω酸化経路、およびω酸化経路と他の代謝経路との関係を示す。
【図３】化学量論パラメータを決定するために用いられる最終的な反応に導くω酸化経路におけるステップの文献に基づいた化学量論モデルを示す。３つのステップが分子の酸素を伴う。
【図４】ジカルボン酸への市販のオレイン酸の生体酸化の経時変化、残余のグルコースレベルおよび残余の脂肪酸レベルを示す。共基質（上）および基質（下）に対する化学量論線および操作線の構造もまた示す。
【図５】反応化学量論を実証することおよび生体酸化反応混合物中の生成物濃度を推測することにおいて用いるための図４からの１列に並んだ反応化学量論データの数値積分を図解する。
【図６】図４のデータから作成される、ジカルボン酸に対するω酸化経路によって消費された累積的な酸素のプロットである。示された勾配は、図３で酸素に関する全体的な最終の化学量論的係数を実証した。
【図７】ガスクロマトグラフィーによるサンプルの独立したオフラインの分析により、１列に並んだ反応データおよび化学量論計算を使って計算された反応混合物中のジカルボン酸の濃度を比較する。
【図８】ジカルボン酸へのアルカンの変換のために作り出されるジカルボン酸に対するω酸化経路によって消費された累積的な酸素のプロットである。アルカンは、３モルの酸素を必要とするω酸化経路を通る２つのパスを必要とする。
【図９】ジカルボン酸への市販オレイン酸の生体酸化の経時変化を示す。
【図１０】生体酸化反応を制御しない場合の、ジカルボン酸への市販オレイン酸の生体酸化の経時変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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