(57)【要約】腎機能の喪失を治療または予防するためのＴＧＦ−β拮抗薬の有効な使用が本明細書で述べている。ＴＧＦ−β拮抗薬が糸球体の線維増殖性障害の治療に有用であり得るという現行の見解とは反対に、抗ＴＧＦ−β拮抗薬によって治療された高血圧および腎機能不全の遺伝的動物モデルでは対照動物と比較して、皮質肥大（特に、糸球体損傷）の有意な差は観察されなかった。対照的に、本発明は、正しい髄質機能の重要性、特に、腎臓の疾患および障害の発症および進行における髄質低酸素損傷の役割を証明する。ＴＧＦ−β拮抗薬は腎臓血管循環の喪失を効果的に妨げ、腎臓髄質の尿細管損傷を緩和し、ならびに全身性高血圧を妨げるのに有用であるという初めての証明が本明細書で開示される。抗ＴＧＦ−β治療動物は、対照動物と比較して、有意に低い平均動脈圧、有意に少ない直細血管線維症、有意に小さい髄質尿細管損傷、有意に少ない髄質尿細管壊死、および有意に多い髄質血流量を示した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎臓の疾患または障害に関連する腎臓傷害の進行を治療するか、または遅くする方法であって、このような疾患または障害に罹患した個体に薬学的有効量のＴＧＦ−β拮抗薬を投与する段階を含む方法。
【請求項２】
腎臓の疾患または障害が急性腎損傷である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
腎臓の疾患または障害が慢性腎損傷である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
腎臓髄質機能の喪失が緩和される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
低酸素尿細管損傷が緩和される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
腎機能を喪失した個体または腎機能喪失を潜在的に受けやすい個体において体血圧を維持する方法であって、個体に薬学的有効量のＴＧＦ−β拮抗薬を投与する段階を含む方法。
【請求項７】
腎機能を喪失した個体または腎機能喪失を潜在的に受けやすい個体において全身性高血圧を低下させる方法であって、個体に薬学的有効量のＴＧＦ−β拮抗薬を投与する段階を含む方法。
【請求項８】
腎機能を喪失した個体または腎機能喪失を潜在的に受けやすい個体において適切な範囲内で髄質血流量を維持する方法であって、個体に薬学的有効量のＴＧＦ−β拮抗薬を投与する段階を含む方法。
【請求項９】
腎臓の疾患または障害が、リウマチ障害／免疫学的障害；遺伝的障害／代謝障害；血液学的障害／腫瘍学的障害；感染性障害；放射線損傷；腎臓手術；砕石術；および薬物または毒素による障害／腎毒素障害からなる群より選択される障害に関連する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
腎臓の疾患または障害が、糖尿病性腎症；閉塞性腎症；多発性嚢胞腎；髄質海綿腎；馬蹄腎；糸球体腎炎；腎硬化症；腎石灰症；全身性狼瘡；シェーグレン症候群；高血圧；尿細管間質性腎症（ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）；腎尿細管性アシドーシス；腎結核；および腎閉塞からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
腎臓の疾患または障害が糖尿病および高血圧からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ＴＧＦ−β拮抗薬が、ＴＧＦ−βの１つまたはそれ以上のイソ型に対する抗体；ＴＧＦ−β受容体；１つまたはそれ以上のＴＧＦ−β受容体に対する抗体；潜在型結合ペプチド；大きな潜在型ＴＧＦ−β；ＴＧＦ−β阻害プロテオグリカン；ソマトスタチン；マンノース−６−リン酸；マンノース−１−リン酸；プロラクチン；インシュリン様増殖因子ＩＩ；ＩＰ−１０；ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ含有ペプチド；植物、菌類、または細菌の抽出物；アンチセンスオリゴヌクレオチド；およびＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
ＴＧＦ−β阻害プロテオグリカンが、フェチュイン、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリンからなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質がＳＭＡＤｓ、ＭＡＤｓ、Ｓｋｉ、およびＳｎｏからなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ＴＧＦ−βの１つまたはそれ以上のイソ型に対する抗体がモノクローナル抗体１Ｄ１１．１６のヒト型またはヒト化型である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
腎臓の疾患または障害に関連する腎臓傷害の進行を治療するか、または遅くするのに有用な薬学的組成物を調製するためのＴＧＦ−β拮抗薬の使用。
【請求項１７】
腎臓の疾患または障害が急性腎損傷である、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
腎臓の疾患または障害が慢性腎損傷である、請求項１６記載の使用。
【請求項１９】
腎臓髄質機能の喪失が緩和される、請求項１６記載の使用。
【請求項２０】
低酸素尿細管損傷が緩和される、請求項１６記載の使用。
【請求項２１】
腎機能を喪失した個体または腎機能喪失を潜在的に受けやすい個体において体血圧を維持するのに有用な薬学的組成物を調製するためのＴＧＦ−β拮抗薬の使用。
【請求項２２】
腎機能を喪失した個体または腎機能喪失を潜在的に受けやすい個体において全身性高血圧を低下させるのに有用な薬学的組成物を調製するためのＴＧＦ−β拮抗薬の使用。
【請求項２３】
腎機能を喪失した個体または腎機能喪失を潜在的に受けやすい個体において適切な範囲内で髄質血流量を維持するのに有用な薬学的組成物を調製するためのＴＧＦ−β拮抗薬の使用。
【請求項２４】
腎臓の疾患または障害が、リウマチ障害／免疫学的障害；遺伝的障害／代謝障害；血液学的障害／腫瘍学的障害；感染性障害；放射線損傷；腎臓手術；砕石術；および薬物または毒素による障害／腎毒素障害からなる群より選択される障害に関連する、請求項１６記載の使用。
【請求項２５】
腎臓の疾患または障害が、糖尿病性腎症；閉塞性腎症；多発性嚢胞腎；髄質海綿腎；馬蹄腎；糸球体腎炎；腎硬化症；腎石灰症；全身性狼瘡；シェーグレン症候群；高血圧；尿細管間質性腎症；腎尿細管性アシドーシス；腎結核；および腎閉塞からなる群より選択される、請求項１６記載の使用。
【請求項２６】
腎臓の疾患または障害が糖尿病および高血圧からなる群より選択される、請求項１６記載の使用。
【請求項２７】
ＴＧＦ−β拮抗薬が、ＴＧＦ−βの１つまたはそれ以上のイソ型に対する抗体；ＴＧＦ−β受容体；１つまたはそれ以上のＴＧＦ−β受容体に対する抗体；潜在型結合ペプチド；大きな潜在型ＴＧＦ−β；ＴＧＦ−β阻害プロテオグリカン；ソマトスタチン；マンノース−６−リン酸；マンノース−１−リン酸；プロラクチン；インシュリン様増殖因子ＩＩ；ＩＰ−１０；ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ含有ペプチド；植物、菌類、または細菌の抽出物；アンチセンスオリゴヌクレオチド；およびＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質からなる群より選択される、請求項１６記載の使用。
【請求項２８】
ＴＧＦ−β阻害プロテオグリカンが、フェチュイン、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリンからなる群より選択される、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質がＳＭＡＤｓ、ＭＡＤｓ、Ｓｋｉ、およびＳｎｏからなる群より選択される、請求項２７記載の使用。
【請求項３０】
ＴＧＦ−βの１つまたはそれ以上のイソ型に対する抗体がモノクローナル抗体１Ｄ１１．１６のヒト型またはヒト化型である、請求項２７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０００年３月９日に出願された米国特許仮出願第６０／１８８，０６０号に基づいて優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学および腎臓（病理）生物学の分野である。本発明は、有効量のＴＧＦ−β拮抗薬を個体に投与することによって腎機能の喪失を治療または予防する新規の方法に関する。
【０００３】
発明の背景
脊椎動物において、腎臓は、水を再吸収し、廃棄代謝産物を濃縮して循環系から除去し、ならびにｐＨ、塩平衡、および血液量を調節するように機能する。損傷、疾患、またはある内因性の障害による急性または慢性の腎機能喪失は、様々な全身性合併症を引き起こすことがある。末期腎不全は透析または臓器移植でしか治療することができず、死に至ることがある。
【０００４】
腎臓は、巨視的に３つの主な領域、（外側）腎臓皮質、（内側）腎臓髄質、および腎盂に分けられる。微視的には、腎臓は、おびただしい数の毛細血管床に埋め込まれた数百万もの単位機能ネフロンからなる。各ネフロンにはそれぞれに血液が供給される。構造ネフロンは、腎臓の皮質および髄質にまたがる「Ｕ」字形の腎細管である。ネフロンは、腎臓皮質に位置する、糸球体毛細血管のふさ状分岐（すなわち、糸球体）とそれを取り囲むボーマン嚢からなる。ボーマン嚢から近位曲尿細管が下行脚、ヘンレ係蹄、次いで、上行脚へとつながり、下行脚、ヘンレ係蹄、上行脚の全てが腎臓髄質に位置し、腎臓髄質内に存在する尿細管周囲毛細血管の領域である直細血管と密接に関連している。上行脚は皮質に位置する遠位曲尿細管へとつながり、遠位曲尿細管は集合管に注ぎ、集合管は腎盂で終わる。
【０００５】
３つの生理学的プロセス：加圧濾過、選択的再吸収、および尿細管分泌が正しい腎機能に関与している。これらの全てが水を維持し、毒性レベルに達する前に窒素廃棄産物および塩を身体から取り除くように働く。
【０００６】
加圧濾過は、皮質において糸球体内の毛細血管の薄い壁を横断して行われる。加圧濾過は、大きな分子および血液の形成成分が循環系に保持されるが、水および小さな分子（塩および様々な栄養分および廃棄化合物）が通常の糸球体血圧（一般的に約６０ｍｍＨｇ）によって、近位尿細管の内腔とつながっているボーマン嚢空間に押し出されるプロセスを意味する。
【０００７】
選択的再吸収は、様々な成分（例えば、水、グルコース、ナトリウム、および塩化物）がヘンレ係蹄の薄い上行脚および下行脚ならびにヘンレ係蹄の厚い上行脚から直細血管へと能動的および受動的に再吸収されるように、腎臓髄質内で行われる。選択的再吸収は、一部分は、髄質内の直細血管毛細血管および腎細管を伴う複雑な対向流系の結果として生じ、これによって、ナトリウムイオンが能動的に再吸収されると付随して塩素イオンおよび水が受動的に再吸収され、重量モル浸透圧濃度の勾配が生じる。
【０００８】
尿細管分泌は、様々な血液成分（例えば、水素イオンおよびアンモニウムイオン、クレアチン、ならびにペニシリンなどの様々な薬物）が、循環系から近位曲尿細管および遠位曲尿細管へと能動的に分泌されるプロセスである。水素イオンの能動輸送のために、尿細管分泌も血液ｐＨを調節する。
【０００９】
従って、正しい腎機能は、糸球体を通る加圧濾過、ならびに腎臓皮質の近位曲尿細管および遠位曲尿細管への尿細管分泌、ならびに腎臓髄質の濃縮機構によるヘンレ係蹄の下行脚および髄質集合管で行われる（主として）水の再吸収によって循環系から除去された物質を含む最終廃棄産物を生じる。
【００１０】
腎臓が正しい体液ホメオスタシスの維持において働く生体機能のために、腎機能の喪失は生命にかかわる事象である。一般的に、腎臓が損傷すると創傷修復応答が始まる。この防護機構の一部は組織修復および再構築を伴う。しかしながら、組織修復が正しく調節されない場合、線維症が起こる。従って、多くの腎臓の疾患および障害が随伴腎線維症を示す。
【００１１】
腎臓の疾患および障害の進行および治療に関する現在の研究は、腎臓皮質内の線維症を阻止する機構に焦点を当てている。ヒトにおいて腎臓の血流量は臓器重量を基準とすると体内で最も多く、総心拍出量の１／４である。ほとんどの腎臓血流は、糸球体濾過を最適化するために皮質に向けられる。糸球体が加圧濾過部位として果たす役割のために、従来から培われてきた知識は、研究者を、糸球体線維症を止めるか、または少なくとも遅くする治療剤の研究および開発に向けてきた。ＴＧＦ−βは糸球体線維症治療における標的であり、皮質線維症の進行を遅くするための潜在的治療剤としてのＴＧＦ−β拮抗薬の使用が広範囲に研究されてきた。しかしながら、皮質線維症と腎機能不全との関連は証明されていない。
【００１２】
ＴＧＦ−βは、ショウジョウバエおよびヒトなど非常に多岐にわたる生物における発生および組織ホメオスタシスを制御するポリペプチドのスーパーファミリーの一員である（グランデ（Ｇｒａｎｄｅ）、１９９７）。ＴＧＦ−βは、ミトコンドリアにおけるエネルギー生産から、血管緊張の調節、細胞の分化、増殖、およびアポトーシスに及ぶ広範かつ多様な生物学的機能を示す。とは言っても、ＴＧＦ−βは、創傷修復に関連する細胞外マトリックス生成の活性化を担うサイトカインとして最もよく知られている。
【００１３】
ＴＧＦ−βは、糸球体硬化症などの糸球体疾患につながる、糸球体における細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、およびプロテオグリカン）の合成増大および代謝減少の誘導に重要な役割を果たすことが広範囲の研究から分かっている。潜在型結合ペプチド（ＬＡＰ、実際には前駆体ＴＧＦ−βのＣ末端ドメインである）、ＴＧＦ−β、および潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）からなる大きな潜在型ＴＧＦ−β複合体が糸球体で見い出されている（マッケイ（Ｍａｃｋａｙ）ら、１９９２）。
【００１４】
ＴＧＦ−β血清中レベルの上昇が糸球体硬化症および線維症と関連づけられている（ボテインガー（Ｂｏｔｔｉｎｇｅｒ）およびコップ（Ｋｏｐｐ）、１９９８）。ルイストレス（Ｒｕｉｚ−Ｔｏｒｒｅｓ）ら（１９９８）は、ＴＧＦ−βが、老化に関連する腎臓皮質間質性線維症の少なくとも部分的な原因となる線維形成増殖因子として作用し、アンギオテンシン変換酵素阻害剤であるカプトプリルによる治療が皮質間質性病変の進行を遅くし得ることをを示唆している（Ｗｏｌｆ、１９９８も参照のこと）。
【００１５】
ボーダー（Ｂｏｒｄｅｒ）ら（１９９０、１９９２ａ、１９９２ｂ、１９９４；ボーダーおよびルオスラチ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）、１９９１；ルオスラチら、１９９３；ルオスラチおよびボーダー、１９９３；ルオスラチら、１９９８も参照のこと）は、損傷を受けた糸球体内での細胞外マトリックス蓄積を特徴とする腎臓炎症である糸球体腎炎がＴＧＦ−β１の産生および活性の増加と関連しており、ＴＧＦ−β１拮抗薬の投与が糸球体内での細胞外マトリックス生成の増加を抑制することができることを報告している。ＴＧＦ−β拮抗薬を使用して、ＴＧＦ−βにより誘導される細胞外マトリックス沈着および線維症を抑制し得ることができることが他の人達によって報告されている（ダッシュ（Ｄａｓｃｈ）ら、１９９６；フェルグソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）ら、１９９７；ゴトウォールズ（Ｇｏｔｗａｌｓ）ら、１９９８；ローガン（Ｌｏｇａｎ）およびバイルド（Ｂａｉｒｄ）、１９９９；ルオスラチら、１９９５、１９９６、１９９７、１９９８；セガリニ（Ｓｅｇａｒｉｎｉ）ら、１９９７）。
【００１６】
しかしながら、線維症それ自体は腎機能不全の最大要因ではない。確かに、線維形成プロセスは腎細管閉塞の一要因であると考えられるが、腎線維症と腎機能の低下の正確な関係は未知である（エディ（Ｅｄｄｙ）、１９９６）。腎細管傷害は、実際には、進行性腎臓疾患の経過の初期に起こる。尿細管傷害の疑わしい原因として、尿細管閉塞、リソソーム酵素、活性酸素代謝産物、補体タンパク質、および虚血が挙げられる（エディ、１９９４）。
【００１７】
前記で詳述した広範囲の研究の取り組みにもかかわらず、腎機能不全の有効な治療法および予防法がない。糸球体毛細血管閉塞による腎機能喪失を悪化させ得る腎臓皮質線維症の治療における潜在的な治療剤として抗ＴＧＦ−β剤が示唆されてきた。しかしながら、これらの薬剤は腎機能に影響を及ぼすことが今まで報告されていない。さらに、腎機能の初期喪失および進行性喪失の正確な機構がはっきりしていない。従って、腎機能不全の最大要因を理解し、腎機能の喪失を直接治療および予防するのに有用な有効な治療剤を発見および開発することが当技術分野において必要とされる。
【００１８】
発明の概要
本発明は、ＴＧＦ−β拮抗薬が、急性および慢性の腎疾患において生じる腎機能喪失の治療および予防に有用であるという発見に基づいている。様々な線維増殖性障害（腎臓皮質の線維増殖性障害を含む）を治療するために抗ＴＧＦ−β剤を使用することが他の研究で示唆されているが、線維症の緩和が関連疾患それ自体に影響を及ぼすことは誰も証明していない。ＴＧＦ−β拮抗は、例えば、腎臓血管循環の喪失を妨げ、腎臓髄質の尿細管損傷を緩和し、全身性高血圧を妨げることで腎臓傷害の進行を効果的に遅くするという初めての証明が本明細書で開示される。
【００１９】
この発見は、（続発性および症候性）皮質線維症の治療に焦点を当ててきた腎臓治療研究に関する現行の最新技術とはかなり異なる。皮質線維症（例えば、糸球体硬化症）は、腎臓皮質の脈管構造および尿細管を物理的に塞ぐことによって腎機能喪失を悪化させる役割を果たす。しかしながら、皮質線維症の治療によって腎機能不全を防ぐことができるという証拠はない。
【００２０】
対照的に、本発明は、正しい髄質機能の重要性、特に、腎臓の疾患および障害の発症および進行における髄質尿細管の低酸素損傷の役割を証明する。この発見は、腎臓循環の損傷が急性および慢性の腎臓の障害の発症に必須であるという考えを裏付けている。腎臓の健康状態は、最終的には、腎臓循環と尿細管完全性の相関関係である。腎線維症は、低下した毛細血管機能および尿細管機能の別個の（恐らく続発的な）結果（ならびに低下した毛細血管機能および尿細管機能に及ぼす後の悪化作用）と考えられる。結果として、腎臓疾患の有効な治療は、腎臓の循環および尿細管完全性の維持に焦点を当てる必要がある。
【００２１】
ＴＧＦ−βは、創傷修復に関連する細胞外マトリックス生成の活性化を担うサイトカインとして最もよく知られ、依然として、特に糸球体線維症に関する研究の最も重要な線維形成サイトカインであるが、広範かつ多様な生物学的機能を示す。本発明は、ＴＧＦ−βが皮質線維増殖性状態における役割とは別に腎機能それ自体において重要な役割を果たすことを開示し、ＴＧＦ−β拮抗薬が、特に腎臓髄質において十分な循環を維持することによって腎機能の喪失を妨げる有効な治療剤として作用することを証明する。
【００２２】
従って、本発明の主題は、腎臓の疾患または障害を治療する方法であって、このような疾患に罹患した個体に薬学的有効量のＴＧＦ−β拮抗薬を投与する段階を含む方法を提供することである。
【００２３】
本発明の関連した局面において、主題は、本明細書に記載の腎臓の疾患または障害の治療に有用な薬学的組成物を調製するためのＴＧＦ−β拮抗薬の使用を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる主題は、腎機能を維持するために、腎機能（特に、腎臓髄質の機能）の喪失を遅くするか、止めるか、妨げるか、または逆転させるために、より詳細には、腎臓髄質の血管完全性および尿細管完全性を保つためにＴＧＦ−β拮抗薬が使用されることである。本発明の好ましい態様は、体血圧、髄質血流量に望ましいレベルを維持および調節するために、またはタンパク尿、髄質線維症、髄質虚血、全身性高血圧、ならびに／もしくは髄質の低酸素尿細管損傷および壊死を緩和もしくは阻害するために、腎機能を維持するのに十分な薬学的有効量のＴＧＦ−β拮抗薬を投与することを含む。
【００２５】
本発明のＴＧＦ−β拮抗薬として、細胞内または生理学的系内でのＴＧＦ−βの量または活性を減少させることができる任意の分子が挙げられる。本発明のＴＧＦ−β拮抗薬として、ＴＧＦ−βの量または活性を減少させることができる分子をコードする任意の核酸配列も挙げられる。好ましくは、ＴＧＦ−β拮抗薬として、ＴＧＦ−βの１つまたはそれ以上のイソ型に対する抗体；ＴＧＦ−β受容体およびその可溶性断片；ＴＧＦ−β受容体に対する抗体；潜在型結合ペプチド；大きな潜在型ＴＧＦ−β；ＴＧＦ−β阻害プロテオグリカン（例えば、フェチュイン、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリン）；ソマトスタチン；マンノース−６−リン酸；マンノース−１−リン酸；プロラクチン；インシュリン様増殖因子ＩＩ；ＩＰ−１０；ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ含有ペプチド；植物、菌類、または細菌に由来する抽出物；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質（ＳＭＡＤｓ、ＭＡＤｓ、Ｓｋｉ、Ｓｎｏを含む）；ならびにＴＧＦ−β活性を阻害する能力を維持する前記分子の任意の変異体、断片、または誘導体が挙げられる。より好ましくは、ＴＧＦ−β拮抗薬は、ＴＧＦ−β受容体へのＴＧＦ−β結合を遮断するヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体（またはその断片（例えば、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、およびＴＧＦ−βに結合する能力を維持する「抗体」の他の形態））である。最も好ましくは、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ１Ｄ１１．１６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ ９８４９）から得られるマウスモノクローナル抗体のヒト型またはヒト化型である。
【００２６】
発明の詳細な説明
ＴＧＦ−β拮抗薬を使用しなければ慢性腎疾患中に起こる腎臓傷害の進行を遅くするためのＴＧＦ−β拮抗薬の有効な使用について述べる初めての報告が本明細書で開示される。本明細書で証明されるように、ＴＧＦ−β拮抗薬は、腎臓血管循環の喪失、腎臓髄質の尿細管損傷、および全身性高血圧を妨げ、緩和するのに有用である。高血圧動物モデルでの糸球体硬化症発現の以前の研究に基づいて、皮質傷害が腎機能の喪失の近因であることが当技術分野において従来考えられてきた。ＴＧＦ−β拮抗薬で治療された高血圧動物群と未治療対照群との皮質肥大および糸球体損傷の指標は、（試験群で示されるタンパク尿の有意な低下にもかかわらず）有意に差がなかったという予想しない発見が本明細書で初めて示される。しかしながら、予期せずに、抗ＴＧＦ−β治療動物は、対照動物と比較して有意に低い平均動脈圧、有意に少ない直細血管線維症、有意に小さい髄質尿細管損傷、有意に少ない髄質尿細管壊死、および有意に多い髄質血流量を示した。
【００２７】
前述のように、腎機能は、加圧濾過、選択的再吸収、および尿細管分泌のプロセスによって達成され、これらの全てが、周囲の脈管構造と密接に関連する各ネフロンの完全性に大きく依存している。選択的再吸収プロセスを担う腎臓髄質の対向流系は、局在的な酸素が少ない（低酸素）髄質環境において生じる。髄質血流量および尿細管系の正確な調節による酸素供給量および酸素要求量の厳密な一致が正しい腎機能に重要である（ブレジス（Ｂｒｅｚｉｓ）およびローゼン（Ｒｏｓｅｎ）、１９９５）。ヒトにおいて、髄質酸素分圧は約１０〜２０ｍｍＨｇであるのに対して、皮質Ｏ２分圧は約５０ｍｍＨｇである（ブレジスら、１９９１、１９９４ａ、および１９９４ｂ）。しかしながら、髄質の低酸素は細胞完全性に対して絶え間ない脅威を与え、特に、髄質内の微妙な酸素平衡が壊れた場合に、髄質を非常に損傷を受けやすくする。
【００２８】
髄質低酸素損傷は、一般的に、特に、代謝が非常に活発な厚い上行ヘンレ係蹄における髄質虚血および尿細管壊死によって特徴付けられる。さらに、髄質における無酸素状態および酸素欠乏状態は直細血管線維症を促進する。本発見は、正しい髄質機能の重要性、特に、腎臓の疾患および障害の発症および進行において髄質低酸素損傷が果たす役割をはっきり示す。本発見は、腎臓循環損傷および尿細管損傷が急性腎障害および慢性腎障害の発症に必須であるという考えを裏付ける。
【００２９】
本発明は、腎臓の疾患または障害に関連する腎臓傷害の進行を治療するか、または遅くする方法であって、このような疾患または障害に罹患した個体に薬学的有効量のＴＧＦ−β拮抗薬を投与する段階を含む方法に関する。本発明はまた、本明細書に記載の腎臓の疾患または障害に関連する腎臓傷害の進行を治療するか、または遅くするのに有用な薬学的組成物を調製するためのＴＧＦ−β拮抗薬の使用に関する。１つの態様において、腎臓の疾患または障害は、慢性の疾患または障害である。別の態様において、腎臓の疾患または障害は、急性の疾患または障害である。
【００３０】
腎臓の疾患または障害として、腎臓循環を損なうか、尿細管損傷を引き起こすか、または腎機能の低下を引き起こす、任意の急性または慢性の疾患または障害が挙げられる。様々な疾患または障害が、リウマチ障害／免疫学的障害、遺伝的障害／代謝障害、血液学的障害／腫瘍学的障害、感染性障害、放射線損傷、腎臓手術、砕石術、または薬物もしくは毒素による障害／腎毒素障害を含む腎臓病理を誘導し得る。このような疾患または障害として、（Ｉ型およびＩＩ型）糖尿病性腎症、閉塞性腎症、遺伝性腎臓疾患（例えば、多発性嚢胞腎、髄質海綿腎、馬蹄腎）、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰症、全身性狼瘡、シェーグレン症候群、高血圧、尿細管間質性腎症（ｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、腎尿細管性アシドーシス、腎結核、または腎閉塞が挙げられるが、これに限定されない。
【００３１】
本明細書で使用する「腎臓傷害の進行を治療するか、または遅くする」とは、一般的に、腎機能の喪失を遅くするか、止めるか（初期の兆候を止めることを含む）、または逆転させるように機能する任意のプロセスを意味する。
【００３２】
本明細書で使用する腎機能（または腎臓機能）の喪失は、動物の正常な腎機能の任意の生理学的混乱または不全を意味する。本発明のために、腎臓の単なる構造異常（例えば、線維症）それ自体は、腎機能不全または腎臓の疾患もしくは障害とみなされない。腎機能の喪失は、詳細に述べると、腎臓の加圧濾過、選択的再吸収、または尿細管分泌の低下を意味する。腎機能の喪失として、髄質低灌流；髄質低酸素；低酸素尿細管損傷、尿細管壊死、タンパク質円柱の形成、および尿細管閉塞、または尿細管流量を減少させる他の発現；ならびに髄質血流量を減少させる発現（例えば、虚血および他の直細血管損傷）が挙げられるが、これに限定されない。
【００３３】
本明細書で使用する「薬学的組成物」とは、薬学的有効量の１つまたはそれ以上の種類の活性成分（例えば、ＴＧＦ−β拮抗薬）を１つまたはそれ以上の種類の薬学的担体および／または添加剤と併用して含む任意の組成物を意味する。薬学的組成物に有用な適切な薬学的担体および／または添加剤、ならびにこのような組成物の形態、処方、および投与量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、「レミングトンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照のこと）。担体および／または添加剤として、賦形剤；崩壊剤；結合剤；増粘剤、潤滑剤；水性賦形剤；油性賦形剤；分散剤；防腐剤；ならびに等張化剤、緩衝剤、可溶化剤、無痛化剤、および／または安定化剤が挙げられ得るが、これに限定されない。本発明の薬学的組成物における１つまたはそれ以上の種類の活性成分の割合は、例えば、個体、個体の年齢および体重、個体の臨床状態、投与時間、剤形、投与方法、ならびに活性成分の組み合わせに基づいて、当業者によって適切に決定することができる。好ましくは、本発明の薬学的組成物は毒性が低く、脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて安全に使用することができる。
【００３４】
本明細書で使用する「薬学的有効量」とは、被検体における望ましい生理学的結果を達成するのに有効な量である。詳細に述べると、ＴＧＦ−β拮抗薬の薬学的有効量は、腎機能の喪失に関連する生理学的プロセスの１つまたはそれ以上を改善するのに十分な期間、ＴＧＦ−βの量または活性を減少させるのに十分な量である。有効量は、選択された特定のＴＧＦ−β拮抗薬によって異なってもよく、また、治療しようとする被検体に関連する様々な要因および条件ならびに障害の重篤度（例えば、患者の年齢、体重、および健康状態、ならびに用量反応曲線および毒性データ）によって決まる。特定の薬剤についての薬学的有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００３５】
個体への「投与」は任意の特定の送達系に限定されず、非経口投与（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内もしくは腹腔内注射を含む）、直腸投与、局所投与、経皮投与、または経口投与（例えば、カプセル、懸濁剤、もしくは錠剤）が挙げられ得るが、これに限定されない。個体への投与は、単回投与または反復投与で、ならびに様々な生理学的に許容される任意の塩形態で、ならびに／または薬学的組成物（前記）の一部として許容される薬学的担体および／もしくは添加剤を用いて行ってもよい。前と同じように、生理学的に許容される塩形態および標準的な薬学製剤化法は当業者に周知である（例えば、「レミングトンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．を参照のこと）。個体へのＴＧＦ−β拮抗薬の投与はまた、遺伝子治療によるものでもよく、ここで、拮抗薬をコードする核酸配列が患者にインビボで投与されるか、またはインビトロで細胞に投与され、次いで、この細胞は患者に導入され、拮抗薬は、核酸配列によりコードされる産物の発現によって生成される。ＴＧＦ−β拮抗薬を送達するための遺伝子治療の方法も当業者に周知である（例えば、ボーダー（Ｂｏｒｄｅｒ）、１９９６を参照のこと）。
【００３６】
本明細書で使用する「個体」とは、腎機能を喪失した個体または腎機能喪失を潜在的に受けやすい任意の脊椎動物を意味し、腎機能の喪失は本明細書で定義される任意の腎臓の疾患または障害を含む。当技術分野において周知であり、塩感受性高血圧および腎機能不全の研究のために当技術分野において用いられるダール（Ｄａｈｌ）Ｓラットは、代表的な動物モデルとして本明細書で具体的に述べられるだけであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。以前の研究によって、ダール Ｓラットは、ヒトでの塩感受性高血圧に関連する多くの形質を示すことが分かっている。ダール Ｓラットは塩感受性、インスリン抵抗性、および高脂血症性であり、変換酵素阻害剤では効果がないが、Ｃａ＋＋チャンネル遮断薬および利尿薬による治療によく応答する低レニン形態の高血圧を有する。ダール Ｓラットはまた、高血圧の発現中に重篤なタンパク尿、糸球体硬化症、および尿細管間質性腎臓疾患を速やかに発現し、末期腎臓疾患に進行する。発現する糸球体病変は、高血圧および糖尿病による糸球体硬化症を有するヒト患者で見られるものと似ている。
【００３７】
本明細書で使用する「ＴＧＦ−β」とは、ＴＧＦ−βの全てのイソ型を意味する。現在、５つのＴＧＦ−βイソ型（１〜５）が知られており、これらの全てが相同（６０〜８０％同一性）であり、約２５ｋＤのホモ２量体を形成し、共通するＴＧＦ−β細胞受容体（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）に作用する。ＴＧＦ−βの遺伝生物学および分子生物学は当技術分野において周知である（例えば、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、１９９８；ウラナ（Ｗｒａｎａ）、１９９８を参照のこと）。
【００３８】
本明細書で使用する「ＴＧＦ−β拮抗薬」とは、細胞内または生理学的系内でのＴＧＦ−βの量または活性を減少させることができる任意の分子である。好ましくは、ＴＧＦ−β拮抗薬は、哺乳動物ＴＧＦ−β１、２、または３の量または活性を減少させるように作用する。例えば、ＴＧＦ−β拮抗薬は、転写、翻訳、プロセシング、または輸送の段階でＴＧＦ−β発現を阻害する分子でもよく、ＴＧＦ−βの安定性または前駆体分子から活性成熟形態への変換に影響を及ぼしてもよく、ＴＧＦ−βが１つまたはそれ以上の細胞受容体（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）に結合する能力に影響を及ぼしてもよく、ＴＧＦ−βシグナル伝達を妨げてもよい。
【００３９】
様々なＴＧＦ−β拮抗薬およびそれを作製する方法が当技術分野において周知であり、さらに多くのＴＧＦ−β拮抗薬が現在開発中である（例えば、デニス（Ｄｅｎｎｉｓ）およびデメトリオウ（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ）、１９９８を参照のこと）。使用される特定のＴＧＦ−β拮抗薬は限定する特徴ではない。本明細書で定義される任意の有効なＴＧＦ−β拮抗薬が本発明の方法および組成物に有用であり得る。好ましくは、ＴＧＦ−β拮抗薬は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、またはＴＧＦ−β３拮抗薬である。最も好ましくは、拮抗薬はＴＧＦ−β１拮抗薬である。
【００４０】
ＴＧＦ−β拮抗薬の例として以下が挙げられるが、これに限定されない：ＴＧＦ−βの１つまたはそれ以上のイソ型に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（ダッシュ（Ｄａｓｃｈら、１９９６；トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、１９９７および２０００）；ＴＧＦ−β受容体またはＴＧＦ−β受容体に対する抗体（セガリニ（Ｓｅｇａｒｉｎｉ）ら、１９９７；リン（Ｌｉｎ）ら、１９９９ａ；リンら、１９９９ｂ；リンら、２０００；イワタ（Ｉｗａｔａ）ら、１９９２；リンら、１９９３；ルオスラチら、１９９５；およびゴトウォールズ（Ｇｏｔｗａｌｓ）ら、１９９８）；潜在型結合ペプチド（レビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）ら、１９９１）；大きな潜在型ＴＧＦ−β（ヘルディン（Ｈｅｌｄｉｎ）ら、１９９４）；フェチュイン（デニスおよびデメトリオウ、１９９８）；デコリンおよび他のプロテオグリカン（例えば、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリン）（ルオスラチおよびヤマグチ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）、１９９６；ルオスラチら、１９９７；ルオスラチら、１９９８；ルオスラチら、１９９８；ボーダー、１９９８；レタルテ（Ｌｅｔａｒｔｅ）ら、１９９８；レタルテら、２０００；ボーダーおよびルオスラチ、１９９１；ルオスラチおよびヤマグチ、１９９１；ルオスラチら、１９９３；ならびにレタルテら、１９９４）；ソマトスタチン（クラー（Ｃｕｌｌｅｒ）およびカスプシーク（Ｋａｓｐｒｚｙｋ）、１９９８）；マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（ファーグソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）、１９９６）；プロラクチン（ミクファーソン（Ｍｃｐｈｅｒｓｏｎ）およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、１９９７）；インシュリン様増殖因子ＩＩ（ジェフリー（Ｊｅｆｆｒｅｙ）およびゴシエフスカ（Ｇｏｓｉｅｗｓｋａ）、１９９８）；ＩＰ−１０（ラスター（Ｌｕｓｔｅｒ）およびレダー（Ｌｅｄｅｒ）、１９９７）；ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ含有ペプチド（プフェファー（Ｐｆｅｆｆｅｒ）、１９９９；ルオスラチおよびボーダー、１９９３）；植物、菌類、または細菌の抽出物（アオキ（Ａｏｋｉ）ら、１９９３；マユミ（Ｍａｙｕｍｉ）ら、１９９６；およびマツナガ（Ｍａｔｓｕｎａｇａ）ら、１９９７）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（チャン（Ｃｈｕｎｇ）、１９９７；ファクライ（Ｆａｋｈｒａｉ）ら、１９９８；ドザウ（Ｄｚａｕ）、１９９８；ドザウ、１９９９；およびシュリンゲンシーペン（Ｓｃｈｌｉｎｇｅｎｓｉｅｐｅｎ）ら、１９９４）；ＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質（ＳＭＡＤｓおよびＭＡＤｓ（オカザキ（Ｏｋａｚａｋｉ）およびキタムラ（Ｋｉｔａｍｕｒａ）、１９９８；ドナホ（Ｄｏｎａｈｏｅ）およびワング（Ｗａｎｇ）、１９９７；ゴールドステイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）、１９９７；マツモト（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）およびイリエ（Ｉｒｉｅ）、１９９８；ニ（Ｎｉ）ら、１９９８；ワラナ（Ｗｒａｎａ）ら、１９９８；ギメノ（Ｇｉｍｅｎｏ）およびファルブ（Ｆａｌｂ）、１９９８；ナカオ（Ｎａｋａｏ）ら、１９９８；ベルシューレン（Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ）ら、１９９８；ミヤゾノ（Ｍｉｙａｚｏｎｏ）およびカワバタ（Ｋａｗａｂａｔａ）、１９９８；ウィトマン（Ｗｈｉｔｍａｎおよびチェン（Ｃｈｅｎ）、１９９８；グリネル（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ）ら、１９９９；ファルブ、１９９８；ファルブおよびギメノ、１９９８；ならびにギメノおよびファルブ、１９９９）、ＳｋｉおよびＳｎｏ（ボーゲル（Ｖｏｇｅｌ）、１９９９；およびストロシェイン（Ｓｔｒｏｓｃｈｅｉｎ）ら、１９９９）を含む）；ならびにＴＧＦ−β活性を阻害する能力を維持する前記分子の任意の変異体、断片、または誘導体。
【００４１】
好ましい態様において、ＴＧＦ−β拮抗薬は、ＴＧＦ−β受容体へのＴＧＦ−β結合を遮断するヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体、またはその断片（例えば、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体、およびＴＧＦ−βに結合する能力を維持する「抗体」の他の形態）である。１つの態様において、ＴＧＦ−β拮抗薬は、ファージディスプレイによって産生されたヒト抗体である（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、２０００）。より好ましい態様において、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ１Ｄ１１．１６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ９８４９、ダッシュ（Ｄａｓｃｈ）ら、１９９６、１９９８ａ、および１９９８ｂに記載）から得られるマウスモノクローナル抗体のヒト型またはヒト化型である。
【００４２】
前記のＴＧＦ−β拮抗薬の変異体、異型、誘導体、および類似体もまた本発明の方法において有用であり得る。本明細書で使用する「変異体、異型、誘導体、および類似体」とは、親化合物に似た形状または構造を有し、ＴＧＦ−β拮抗薬として作用する能力を維持する分子を意味する。例えば、本明細書で開示される任意のＴＧＦ−β拮抗薬を結晶化することができ、１つまたは複数の活性部位の形状を担当する座標に基づいて有用な類似体を合理的に設計することができる。または、当業者は、過度の実験なく既知の拮抗薬の官能基を修飾し、このような修飾された分子を、向上した活性、半減期、生物学的利用能、または他の望ましい特徴についてスクリーニングすることができる。ＴＧＦ−β拮抗薬がポリペプチドである場合、送達の容易さ、活性、半減期などを向上させるようにポリペプチドの断片および修飾（例えば、前記のようなヒト化抗体または機能的抗体断片）を生成することができる。合成および組換えポリペプチド生成の当技術分野における技術レベルがあれば、このような修飾は過度の実験なく行うことができる。
【００４３】
本明細書に記載の本発明の組成物および方法の他の適切な変更および適応が自明であり、本発明の範囲または本明細書で開示される態様を逸脱することなく行うことができることは当業者には容易に明らかである。今や本発明が詳細に説明されたが、以下の実施例を参照することで本発明はさらにはっきりと理解されると思われる。以下の実施例は例示のためだけに含まれ、本発明を限定することを意図するものではない。
【００４４】
実施例１：ＴＧＦ−β拮抗薬で治療された高塩飼料ダール Ｓラット動物モデル
腎臓ＴＧＦ−β産生が飼料食塩摂取量の増加によって刺激され得ることが研究によって示されている（イン（Ｙｉｎｇ）およびサンダース（Ｓａｎｄｅｒｓ）、１９９８ｂ；ユ（Ｙｕ）ら、１９９８；タマキ（Ｔａｍａｋｉ）ら、１９９６）。高血圧および腎機能不全の発現に対するＴＧＦ−β拮抗薬の予防効果を研究するために、高血圧および腎損傷の動物モデルとして、ダール Ｓラットに高塩（８．０％ＮａＣｌ）飼料を与えた。前述したように、高塩飼料で攻撃された場合に高血圧および腎損傷が現れるダール塩感受性（ダール Ｓ）ラットは当技術分野において周知であり、慢性腎臓障害モデルとして使用されている（例えば、カールセン（Ｋａｒｌｓｅｎ）ら、１９９７を参照のこと）。
【００４５】
正常血圧を維持し、腎損傷を最小限にするために、（ウィスコンシン医科大学（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）で飼育された集団から入手した）雄ダール ＳＳ／Ｊｒラットに９週齡まで低塩飼料（０．１％ＮａＣｌ）を与えた。
【００４６】
９週齡で、動物（約２５０〜３００ｇ）を３週間、高塩（８％ＮａＣｌ）飼料に切り換えた（水は自由に与えた）。１０週齡で、動物を３つの治療群に分けた。群Ｉの動物には、２週間１日おきに、５．０ｍｇ／Ｋｇの用量の抗ＴＧＦ−β抗体１Ｄ１１．１６（ジェンザイムコーポレーション（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を腹腔内注射した。群ＩＩの動物には、２週間１日おきに、０．５ｍｇ／Ｋｇの用量の抗ＴＧＦ−β抗体１Ｄ１１を与えた。対照群の動物には、２週間１日おきに５．０ｍｇ／Ｋｇの用量の対照抗体を与えた。対照抗体は、抗ベロ毒素マウスモノクローナルＩｇＧ１抗体（ＭＡｂ１３Ｃ４、ジェンザイムコーポレーション、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）であった。統計解析のために、２つの試験群からのデータをプールし、対照群と比較した。
【００４７】
実施例２：平均動脈圧（ＭＡＰ）に対するＴＧＦ−β拮抗薬の効果
高血圧誘導動物モデルでの適切な体血圧の維持におけるＴＧＦ−β拮抗薬の効果を証明するために、実施例１に記載の治療計画に供されたダール Ｓラットの動脈圧をモニターした。
【００４８】
高塩飼料２週目の間に、被検体動物に、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（２．５ｍｇ／ｋｇ）、およびアセプロマジン（０．６ｍｇ／Ｋｇ）を筋肉内注射して麻酔した。平均動脈圧（ＭＡＰ）を連続測定するために、大腿動脈に留置カテーテルを挿入した。カテーテルを首の後ろまで皮下に通して進め、皮膚真下で縫合されたダクロンメッシュボタン（Ｄａｃｒｏｎ−ｍｅｓｈ ｂｕｔｔｏｎ）に送り込み、スイベル（インステックラボラトリーズ（Ｉｎｓｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）に接続しているステンレス鋼ばねに進め、ケージ内で動物が自由に動けるように動物ケージ上に取り付けた。
【００４９】
動物は一週間で外科手術から回復した。３週目の間に、意識があり活発な動物のＭＡＰおよび心拍数（ＨＲ）を、４日間連続して毎日１：００〜５：００ＰＭの間に（１００ＨＺのサンプリング周波数（ｓａｍｐｌｅ ｒａｔｅ）で）記録した。心拍数、収縮期血圧、拡張期血圧、および平均動脈圧を１分間隔で平均した。個々の１日平均値を計算した。各動物についての４日記録期間の全体平均値を計算するために、１日平均値を使用した。
【００５０】
平均値（±１ ＳＥＭ）を計算した。分散分析、続いてダンカンの多重範囲検定を用いて、対照群と抗ＴＧＦ−β抗体治療群の平均値の差の有意性を解析した。＜０．０５のＰ値が統計的に有意であるとみなされた。
【００５１】
対照群ＭＡＰの平均値は１９０±４ｍｍＨｇ（ｎ＝１２）であった。低用量（０．５ｍｇ／Ｋｇ）抗ＴＧＦ−β抗体で治療された動物のＭＡＰと高用量（５．０ｍｇ／Ｋｇ）抗ＴＧＦ−β抗体で治療された動物のＭＡＰには有意な差がなかった。ＭＡＰの全体平均値は、試験群において１７７±３ｍｍＨｇ（ｎ＝１７）であった。試験動物のＭＡＰは対照動物のＭＡＰより有意に低かった。
【００５２】
これらの結果は、ＴＧＦ−β拮抗薬による治療が高血圧動物モデルにおいて高血圧を有意に低下させることを証明している。
【００５３】
実施例３：タンパク尿ならびに血漿および尿クレアチニンクリアランスの測定
腎傷害に供された動物モデルでの尿タンパク質クリアランスに対する抗ＴＧＦ−β治療の効果を証明するために、一晩尿試料を、実施例１に記載の治療計画に供されたダール Ｓラットから３週高塩飼料の３週目の終わりに収集し、タンパク尿および尿クレアチニンクリアランスについてアッセイした。
【００５４】
平均値（±１ ＳＥＭ）を計算した。分散分析、続いてダンカンの多重範囲検定を用いて、対照群と抗ＴＧＦ−β抗体治療群の平均値の差の有意性を解析した。＜０．０５のＰ値が統計的に有意であるとみなされた。
【００５５】
対照動物タンパク尿の平均値は２２６±２０ｍｇ／日（ｎ＝１２）であった。しかしながら、抗ＴＧＦ−β抗体治療動物タンパク尿の平均値は１５４±１６ｍｇ／日（ｎ＝２０）であり、対照群より有意に少なかった。
【００５６】
対照的に、実験群と対照群の血漿クレアチニン濃度および尿クレアチニンクリアランスには有意差が観察されなかった。血漿クレアチニン濃度の平均値は、対照群では０．９±０．１５ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝１１）であり、抗ＴＧＦ−β抗体治療動物では１．２８±０．２３（ｎ＝１６）であった。両方の値は、高塩飼料を３週間与えた塩耐性ブラウンノルウェー（Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙ）ラットの対照群で測定された０．５２±０．０６ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝１６）の正常値と比較して上昇している。クレアチニンクリアランスの平均値は、対照動物では０．４０±０．０８ｍｌ／分／Ｋｇ体重（ｎ＝７）であり、抗ＴＧＦ−β抗体治療動物では０．３５±０．０７ｍｌ／分／Ｋｇ体重（ｎ＝８）であった。
【００５７】
これらの結果は、インビボで腎臓傷害に関連した尿タンパク質排出を有意に低下させるＴＧＦ−β拮抗薬の効果を証明している。
【００５８】
尿タンパク質排出の有意な低下にもかかわらず、糸球体機能の指標（血漿クレアチニン濃度およびクレアチニンクリアランス）は対照群とＴＧＦ−β拮抗薬治療群とで有意な差がなかった。
【００５９】
これらの結果は、糖尿病ラット（シャルマ（Ｓｈａｒｍａ）およびジヤデ（Ｚｉｙａｄｅｈ）、１９９４）、正常血圧ラット（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、１９９４）、ＴＧＦ−βを過剰発現するトランスジェニックマウス（コップ（Ｋｏｐｐ）ら、１９９１）、およびダール Ｓラット（タマキ（Ｔａｍａｋｉ）ら、１９９６）でのＴＧＦ−β発現の増大と糸球体細胞外マトリックスの相関関係を証明する現行の科学的証拠を考えると、極めて予想外のものである。本発明は、ＴＧＦ−β拮抗薬が腎（髄質）機能を維持するのに有用であり、（当技術分野において示唆されるような）糸球体硬化症に対するＴＧＦ−β阻害剤のどの潜在的な治療効果とも別個のものであり、異なることを初めて証明している。
【００６０】
実施例４：腎血管流量および尿細管流量に対するＴＧＦ−β拮抗薬の効果
腎臓にストレスを加えた動物モデルでの適切な腎機能の維持におけるＴＧＦ−β拮抗薬の効果を証明するために、実施例１に記載の治療計画に供されたダール Ｓラットにおいて腎臓血流量（ＲＢＦ）、皮質血流量（ＣＢＦ）、髄質血流量（ＭＢＦ）、および糸球体流量（ＧＦＲ）をモニターした。
【００６１】
３週高塩飼料の３週目の終わりに、研究動物に、ケタミン（３０ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射し、チオバルビツル酸（イナクチン、５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して麻酔した。個体を、（実験手順を通じて３７℃の体温を維持するために）サーモスタットで制御された加温テーブル（ｗａｒｍｉｎｇ ｔａｂｌｅ）の上に置き、１％ウシ血清アルブミン含有０．９％ＮａＣｌ溶液を６ｍｌ／ｈの速度で静脈内注入した。（クレアチニンクリアランスとは別の）ＧＦＲの１つの尺度としてイヌリンクリアランスを定量するために、［３Ｈ］−イヌリン（２μＣｉ／ｍｌ）を注入溶液に含めた。
【００６２】
気管切開後、カニューレを静脈内注入のために外頚静脈に挿入し、動脈圧測定のために大腿動脈に挿入した。尿収集のために左尿管にカニューレを挿入した。電磁流量計（カロリナインスツルメンツ（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｋｉｎｇ、ＮＣ）を用いてＲＢＦを測定するために、２ｍｍ血流量プローブ（ｆｌｏｗ ｐｒｏｂｅ）を左腎動脈の周りに配置した。外科処置後、被検体を、尿流量および血漿［３Ｈ］−イヌリン濃度サンプリング前に１時間安定させた。
【００６３】
平衡期間後、ＧＦＲおよびＲＢＦを測定するために、２回の別個の連続２０分クリアランス期間の間に尿および血漿試料を収集した。血圧も記録した。
【００６４】
２回目のクリアランス期間後に、外部プローブ（ＰＦ３１６）およびレーザードップラー流量計（Ｐｆ３、ペリメッドコーポレーション（Ｐｅｒｉｍｅｄ Ｃｏｒｐ．）、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ＣＢＦを腎臓皮質の５つの部位から測定した。（マットソン（Ｍａｔｔｓｏｎ）、１９９３；およびケリー（Ｋｅｌｌｙ）ら１９９９に記載のように）鋭角に埋め込まれた光ファイバープローブを用いて、ＭＢＦを測定した。
【００６５】
平均値（±１ ＳＥＭ）を計算した。分散分析、続いてダンカンの多重範囲検定を用いて、対照群と抗ＴＧＦ−β抗体治療群の平均値の差の有意性を解析した。＜０．０５のＰ値が統計的に有意であるとみなされた。
【００６６】
対照動物の麻酔後のＭＡＰ平均値は１６０±１４ｍｍＨｇであった。しかしながら、抗ＴＧＦ−β抗体治療動物のＭＡＰは有意に低かった（麻酔後の平均値１４５±１２ｍｍＨｇ）。
【００６７】
ＲＢＦの平均値は、対照動物では３．１３±０．６７ｍｌ／分／Ｋｇ体重（ｎ＝７）であり、抗ＴＧＦ−β抗体治療動物では３．２２±０．４１ｍｌ／分／Ｋｇ体重（ｎ＝１４）であった。このデータは、ＴＧＦ−β拮抗薬治療動物における腎臓血流量が対照群と比較して３％増加したことを証明している。対照群と試験群の平均値の差は統計的に有意ではなかった。
【００６８】
ＣＢＦシグナルは、対照群と比較して治療動物において２２％高かったが、抗ＴＧＦ−β抗体治療動物（１．８５±０．２３ボルト；ｎ＝１３）と対照動物（２．２６±０．１９ボルト；ｎ＝１０）との差は統計的に有意ではなかった。
【００６９】
さらに詳細に述べると、（実施例３で報告したクレアチニンクリアランスとは別のＧＦＲの別個の尺度としての）イヌリンクリアランスは対照群と比較して試験群において１７％高かったが、統計的に有意ではなかった。ＴＧＦ−β拮抗薬治療を受けた動物のイヌリンクリアランスの平均値は０．４７±０．０３ｍｌ／分／Ｋｇ体重であった。対照動物のイヌリンクリアランスの平均値は０．５２±０．１０ｍｌ／分／Ｋｇ体重であった。
【００７０】
しかしながら極めて対照的に、抗ＴＧＦ−β抗体治療動物のＭＢＦ（０．９９±０．１２；ｎ＝１３）は、対照動物のＭＢＦ（０．３９±０．０９；ｎ＝１０）と比較して有意に高かった（１５４％）。
【００７１】
これらの結果は、腎臓髄質機能の維持におけるＴＧＦ−β療法の効果を初めて証明している。これらの発見は、ＴＧＦ−β拮抗薬による治療的処置が低酸素尿細管損傷を緩和するのに有用であり、従って、糸球体機能または糸球体構造に対するどの効果とも関係なくタンパク尿を低下させるという本発見をさらに裏付けており、髄質血流量の維持が（実施例２で証明されたような）ＴＧＦ−β療法の抗高血圧作用に寄与することをさらに示唆している。
【００７２】
実施例５：腎臓構造に対するＴＧＦ−β拮抗薬の効果
腎臓にストレスを加えた動物モデルでの腎臓構造完全性の維持におけるＴＧＦ−β拮抗薬の効果を調べるために、実施例１に記載の治療計画に供されたダール Ｓラットの腎臓に対して肉眼腎臓解析および組織学的腎臓解析ならびに分子アッセイを行った。
【００７３】
実施例１で概説した１２週実験プロトコールの終わりに、被検体腎臓を採取し、秤量した。コラーゲンＩＩＩ型、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２ ｍＲＮＡレベルの測定のために、各動物の右腎臓を液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。光学顕微鏡解析のために、左腎臓を５％緩衝ホルマリン溶液で固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、ＰＡＳで染色した。
【００７４】
切片１枚につき最低２０個の糸球体について糸球体直径を測定し、マトリックス拡大および糸球体損傷の程度を評価した。ラジ（Ｒａｉｊ）ら（１９８４）によって以前に述べられたように、糸球体硬化症の程度をスコア付けした。マトリックスで満たされた糸球体毛細血管領域のパーセントを、０〜４の段階に分けて記録した。スコア０は傷害がないことを示し、スコア２は、糸球体毛細血管領域の５０％が閉塞していることを示し、スコア４は、特定の糸球体内の全毛細血管が完全（１００％）に閉塞していることを示す。
【００７５】
組織学的切片もまた、直細血管毛細血管の線維症および尿細管間質性傷害の程度について調べた（光学顕微鏡用切片をＰＡＳで染色した）。
【００７６】
対照動物の平均腎臓重量（１．８７±０．０６ｇ；ｎ＝１２）と抗ＴＧＦ−β抗体治療動物の平均腎臓重量（１．７６±０．０６ｇ；ｎ＝２０）はほぼ同一であった。このことから、２つの群の腎臓肥大の程度はほぼ同じであったことが分かる。
【００７７】
糸球体形態に対するＴＧＦ−β機能を阻止する効果は、図１（パネルＡおよびＢ）に示す代表的なＰＡＳ染色腎臓切片によって図示される。治療群および未治療群からの腎臓の組織学的検査から、ほぼ全ての糸球体に糸球体間質マトリックスの著しい拡大があることが明らかになった。糸球体毛細血管の大きな割合（５０〜７５％）がマトリックス物質で満たされており、かなりひどく損傷を受けた糸球体の大部分にＰＡＳ陽性染色があった。
【００７８】
対照治療（１２１．２±２．３μｍ）と比較して、抗ＴＧＦ−β抗体治療は平均糸球体直径（１２３．３±１．４μｍ）に影響を及ぼさなかった。さらに、抗ＴＧＦ−β抗体治療は、糸球体損傷の程度に有意に影響を及ぼさなかった。ＦＧＳスコアの平均値は、対照動物の２．５±０．１１（６３％傷害；ｎ＝１４０糸球体（７匹の動物から））と比較して、治療動物では２．８±０．１８（７０％傷害；ｎ＝１７６糸球体（８匹の動物から））であった。
【００７９】
これらの結果は、低塩（０．１％ＮａＣｌ）飼料を与えた正常血圧ダール Ｓの対照群における糸球体損傷の程度の検査を促した。対照群、治療群、低塩飼料を与えて飼育した群において見られるＦＧＳスコアには有意な差がなかった（しかしながら、低塩飼料群では、平均糸球体直径および腎臓重量はより小さく、タンパク尿の程度も著しく低下した）。
【００８０】
これらの発見から、ダール Ｓラットが自然発生的に腎臓疾患を発症し、高血圧がタンパク尿および腎臓肥大を促進するが、糸球体損傷の重篤度を高めないことが分かる。比較組織学的検査によって、糸球体病変がダール Ｓラットでの食事塩攻撃前に存在している可能性があることが示唆され、糸球体損傷と高血圧の関連が疑問視される。
【００８１】
皮質損傷の前記観察とは全く対照的に、腎臓髄質の組織学的検査によって、対照動物と比較してＴＧＦ−β拮抗薬治療動物における損傷および傷害の緩和が明らかになった。図１のパネルＣおよびＤは、未治療動物および抗ＴＧＦ−β治療動物から作成された腎臓髄質の組織学的切片を表す。抗ＴＧＦ−β治療動物から採取された腎臓切片は髄質への最小限の影響を示し、厚い上行脚の毛細血管傷害または尿細管壊死の証拠はなかった。しかしながら、対照動物から採取された腎臓切片では、直細血管束（ｖａｓａ ｒｅｃｔａ ｂｕｎｄｌｅ）には線維があり、毛細血管は完全に閉塞していた。さらに、対照動物からの腎臓切片によって、毛細血管を取り囲む厚い上行脚は壊死し、尿細管内腔はタンパク質円柱で満たされていることが明らかになった。
【００８２】
抗ＴＧＦ−β抗体は効果的に尿タンパク質排出を５０％低下させたが（実施例３、前記）、組織学的検査によって、糸球体または皮質の糸球体損傷または肥大の程度の改善は全く示されなかった。これらの結果は、腎臓髄質への血流量低下に関連した髄質低酸素損傷を妨げることによるＴＧＦ−β拮抗薬療法の腎臓保護効果を証明している。
【００８３】
実施例６：ｍＲＮＡ発現レベルに対するＴＧＦ−β拮抗薬の効果
腎臓にストレスを加えた動物モデルでの重要なタンパク質の細胞発現に対するＴＧＦ−β拮抗薬の効果を調べるために、実施例１に記載の治療計画に供されたダール Ｓラットの腎臓におけるコラーゲンＩＩＩ型、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２のｍＲＮＡ発現レベルを、当技術分野において周知のリボヌクレアーゼプロテクション法 （ＲＰＡ）プロトコールに従って定量した。
【００８４】
各アッセイ標的（すなわち、コラーゲンＩＩＩ型、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２ ｍＲＮＡ）のＲＰＡに有用なＲＮＡプローブ（すなわち、リボプローブ）を作成するために、アッセイしようとする各標的配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて（全細胞ＲＮＡから）ｃＤＮＡを作成する、当技術分野において周知の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）プロトコールを使用した（フィブロネクチンｃＤＮＡ配列についてはオーダーマット（Ｏｄｅｒｍａｔｔ）ら、１９８５；フィブロネクチンＥＤＡドメインおよびコラーゲンＩＩＩ型ｃＤＮＡ配列についてはグルモフ（Ｇｌｕｍｏｆｆ）ら、１９９４；ＴＧＦ−β１ ｃＤＮＡ配列についてはデリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ）ら、１９８５；ならびにＴＧＦ−β２ ｃＤＮＡ配列についてはマディセン（Ｍａｄｉｓｅｎ）ら、１９８８を参照のこと）。
【００８５】
マキシスプリクト（ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ）（商標）インビトロ転写キット（アムビオンインク（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用い製造業者の説明書に従って、直鎖化ｃＤＮＡをインビトロで転写した。Ｐ３２標識リボプローブを作成するために、Ｔ７ポリメラーゼおよびＰ３２ＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ−ＮＥＮ）、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を反応混合物に含めた。反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、０．５Ｕ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅを用いた消化によってＤＮＡテンプレートを除去した。６％ポリアクリルアミド／ＴＢＥゲルでの電気泳動によって、完全長プローブを転写反応物から精製した。バンドをオートラジオグラフィーによって同定し、各（アンチセンス）ＲＮＡプローブをゲルバンドから切り出し、プローブ溶出緩衝液Ｍマキシスプリクト（ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ）（商標）キット（アムビオンインク、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に受動的に３７℃で一晩拡散させた。各プローブの放射能をシンチレーションカウンティングによって定量した。
【００８６】
実施例１で概説した１２週実験プロトコールの終わりに、被検体腎臓を採取し、秤量した。コラーゲンＩＩＩ型、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２ ｍＲＮＡレベルのアッセイ法のために、各動物の右腎臓を液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。
【００８７】
全ＲＮＡ精製用ＲＮアクエアス（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ）（商標）キット（アムビオンインク、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用い製造業者の説明書に従って、腎臓全組織から全細胞ＲＮＡを得た。ハイブスピード（ＨｙｂＳｐｅｅｄ）（商標）ＲＰＡキット（アムビオンインク、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用い製造業者の説明書に従って、ＲＰＡを行った。簡単に述べると、フィブロネクチン、コラーゲンＩＩＩ型、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２に対する放射標識アンチセンスＲＮＡプローブを、様々な腎臓試料からの全細胞ＲＮＡ １０μｇと混合し、ハイブリダイズさせた。個々の試料中の全ＲＮＡを標準化するために、１８Ｓ ＲＮＡプローブ（アムビオンインク、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）も各ハイブリダイゼーション混合物に含めた。ＲＰＡは、陰性対照として酵母ＲＮＡに対しても行った。ハイブリダイズしていないＲＮＡを分解するために、ＲＮａｓｅＡ／ＲＮａｓｅＴ１ミックスによる消化を行った。消化から保護されたハイブリダイズＲＮＡを電気泳動で分離し、富士フィルムＢＡＳ−１５００ホスホイメージャー （富士フィルム、Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）を用いて視覚化した。コラーゲンＩＩＩ型、フィブロネクチン、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２細胞ｍＲＮＡを示すホスホイメージャーバンドを、マクバス（ＭａｃＢＡＳ）バージョン２．４ソフトウエアを用いて定量化した。各試料から得られたデータを標準化した。
【００８８】
コラーゲンＩＩＩ型およびフィブロネクチンのｍＲＮＡ発現レベルは、対照群（それぞれ、相対強度１００±７．５および１００±４．５；ｎ＝５）と比較して、抗ＴＧＦ−βＡｂ治療ダール Ｓラット（それぞれ、相対強度３８．５±７．５および３８．９±４．５；ｎ＝１３）では著しく低下した。
【００８９】
ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２のｍＲＮＡ発現レベルもまた、対照群（それぞれ、相対強度０．２６±０．０４および０．３０±０．０２；ｎ＝５）と比較して、抗ＴＧＦ−βＡｂ治療ダール Ｓラット（それぞれ、相対強度０．０８±０．０１および０．０７±０．０１；ｎ＝１３）では著しく低下した。これらの結果は腎線維症の緩和を反映している可能性が高く、コラーゲンＩＩＩ型およびフィブロネクチンのｍＲＮＡ発現プロファイルと一致する。
【００９０】
実施例７：ＴＧＦ−β拮抗薬療法の初期介入効果
ＴＧＦ−β拮抗薬療法の初期介入の腎臓保護効果を証明するために、高塩飼料を与えた６週齢雄ダール Ｓラットを、３週間、実施例１に記載の治療計画とほぼ同じ抗ＴＧＦ−βＡｂ（０．５ｍｇ／日）治療計画に供した。
【００９１】
（実施例１に記載の９週齡に対して）６週齡で、ダール Ｓラット（ｎ＝２２、１７５〜２００ｇ）を、３週間、高塩（８％ＮａＣｌ）飼料に切り換えた（水は自由に与えた）。また、試験治療はまた、（実施例１に記載の１０週齡に対して）６週齡から開始した。動物を２つの実験群に無作為に分けた。治療群には、抗ＴＧＦ−βＡｂを０．５０ｍｇ／ｋｇの用量で３週間１日おきに腹腔内注射した。対照群には、対照ＭＡｂ（ＭＡｂ１３Ｃ４、ジェンザイムコーポレーション、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を３週間１日おきに腹腔内注射した。
【００９２】
実施例７．１：タンパク尿およびミクロアルブミン尿の初期介入測定
腎傷害に供された動物モデルでの尿タンパク質クリアランスに対するＴＧＦ−β拮抗薬療法の初期介入効果を証明するために、実施例７に記載の治療計画に供されたダール Ｓラットから高塩飼料４、１１、１８、および２１日目に尿試料を収集し、タンパク尿および尿アルブミンクリアランスについてアッセイした。ベースラインデータポイントとして、動物を高塩飼料に切り換える前の一晩尿試料も収集した。
【００９３】
タンパク尿は、標準としてウシ血清アルブミンを用いてブラッドフォード法（バイオラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて測定した。尿アルブミン濃度は、アルブミンブルー（Ａｌｂｕｍｉｎ Ｂｌｕｅ）５８０法（モレキュラーブローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）によって測定した。
【００９４】
平均値（±１ ＳＥＭ）を計算した。分散分析、続いてダンカンの多重範囲検定を用いて、対照群と抗ＴＧＦ−β抗体治療群の平均値の差の有意性を解析した。＜０．０５のＰ値が統計的に有意であるとみなされた。
【００９５】
結果を図２に示す。
【００９６】
タンパク尿は、低塩（０．１％）飼料を与えた抗ＴＧＦ−βＡｂ治療ダール Ｓラットおよび対照ダール Ｓラットにおいて２０ｍｇ／日未満であった。対照ラットおよび抗ＴＧＦ−βＡｂ治療ラットの両方とも、高塩飼料の初めの２週間、タンパク質排出が徐々に増加した。高塩飼料１８日目までに、重篤なタンパク尿が両実験群において観察された。しかしながら、タンパク尿の程度は、対照群（１０２．７±１６．８ｍｇ／日；ｎ＝７）より抗ＴＧＦ−βＡｂ治療群（７４．２±１１．６ｍｇ／日；ｎ＝１５）において低くなる傾向があった。高塩飼料を与えて３週間後、ダール Ｓラットにおけるタンパク尿の重篤度は、対照群（１７２±２０ｍｇ／日）と比較して抗ＴＧＦ−βＡｂ治療動物（９１±２０ｍｇ／日）において有意に低かった（図２ａ）。
【００９７】
試験動物におけるアルブミン排出に対する抗ＴＧＦ−βＡｂ治療の効果は同様であった（図２ｂ）。低塩飼料（０．１％ＮａＣｌ）を与えた対照動物および抗ＴＧＦ−βＡｂ治療動物の両方とも、アルブミン排出は１０ｍｇ／日未満であった。しかしながら、高塩飼料を与えて３週間後、アルブミン排出は、対照ラットの尿（８４．６±２１．４ｍｇ／日；ｎ＝７）より抗ＴＧＦ−βＡｂ治療ダール Ｓラットの尿（４４．８±８．４ｍｇ／日；ｎ＝１５）において有意に低かった。
【００９８】
これらの結果は、腎臓傷害に関連する尿タンパク質およびアルブミン排出をインビボで有意に低下させるＴＧＦ−β拮抗薬療法の初期介入の効果を証明している。
【００９９】
実施例７．２：腎臓構造に対するＴＧＦ−β拮抗薬の初期介入効果
腎臓にストレスを加えた動物モデルでの腎臓構造完全性の維持におけるＴＧＦ−β拮抗薬の初期介入効果を調べるために、実施例７に記載の治療計画に供されたダール Ｓラットの腎臓に対して肉眼腎臓解析および組織学的腎臓解析ならびに分子アッセイ法を、実施例５に記載のプロトコールに従って行った。
【０１００】
採取された腎臓の組織学的検査から、糸球体毛細血管の大きな割合がマトリックス物質で満たされており、かなりひどく損傷を受けた糸球体の大部分にＰＡＳ陽性物質があることが明らかになった。しかしながら、若いダール Ｓラットでの高塩飼料を始める前の抗ＴＧＦ−βＡｂ治療は、糸球体損傷の程度を低下させた。対照Ａｂ治療ダール Ｓラットにおける巣状糸球体硬化症損傷スコアの平均値は、３．２５±０．０６（ｎ＝１４４糸球体（７匹の動物から））であった。対照的に、抗ＴＧＦ−βＡｂ治療ダール Ｓラットにおける糸球体損傷は有意に低かった（２．７３±０．０４；ｎ＝３８２糸球体（１５匹の動物から））。
【０１０１】
抗ＴＧＦ−βＡｂ療法はまた、直細血管毛細血管の線維症、厚い上向ヘンレ係蹄の壊死、およびタンパク質円柱の形成の程度を低下させた。抗ＴＧＦ−βＡｂ治療動物の５．５７±０．３２％（ｎ＝１５）と比較して、対照群における外側髄質領域の２２．２±１．３％（ｎ＝７）がタンパク質円柱で満たされていた。これは、タンパク質円柱形成の程度の１／４の減少に相当する。
【０１０２】
分子生物学の分野で周知の技術が、その全体が参照として本発明に組み入れられる。これらの技術として以下の刊行物に記載の技術が挙げられるが、これに限定されない。
2004502644.tif 000002
【０１０３】
参考文献
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2004502644.tif 000004
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【０１０４】
本明細書で述べられた各刊行物が参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】未治療の高塩飼料を与えたダール Ｓラット（パネルＡおよびＣ）、および抗ＴＧＦ−βで治療された高塩飼料を与えたダール Ｓラット（パネルＢおよびＤ）から作成された、ＰＡＳ染色糸球体切片（パネルＡおよびＢ）ならびにＰＡＳ染色腎臓髄質切片（パネルＣおよびＤ）の比較組織学的光学顕微鏡写真を示す。
【図２】高塩飼料を与えたダール Ｓラットにおけるタンパク質（ａ）およびアルブミン排出（ｂ）に対する抗ＴＧＦ−βＡｂ療法の初期介入効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004502644.tif 000039
2004502644.tif 000040
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