(57)【要約】本発明は表Ｉに示される遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびに該ポリペプチドを組換え法により産生する方法を開示する。また、表Ｉに示される遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの診断アッセイにおける利用方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）表Ｉに示す配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド；
（ｂ）表Ｉに示すポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド；および
（ｃ）表Ｉに示す遺伝子のポリペプチド配列；
から成る群から選択される単離ポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）表Ｉに示すポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド；
（ｂ）表Ｉに示す遺伝子の単離ポリヌクレオチド；
（ｃ）表Ｉに示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド；
（ｄ）表Ｉに示すポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドのＲＮＡ同等物であるポリヌクレオチド；
または上記単離ポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチド配列から成る群から選択される単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
適合する宿主細胞に存在する場合に、請求項１のポリペプチドを産生する能力のあるポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項１のポリペプチドを産生する能力のあるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞に導入して、適当な培養条件下で、宿主細胞が該ポリペプチドを産生する工程を含む、組換え宿主細胞の産生方法。
【請求項５】
請求項４の方法により産生される組換え宿主細胞。
【請求項６】
上記ポリペプチドを発現する請求項５の組換え宿主細胞の膜。
【請求項７】
ポリペプチドの産生に十分な条件下で、請求項５の宿主細胞を培養し、培養物からポリペプチドを取り出すことを特徴とする、ポリペプチドの産生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新たに同定されたポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、診断におけるそれらの使用、および治療において潜在的に有用であるアゴニスト、アンタゴニストであり得る化合物の同定におけるそれらの使用、ならびに該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの産生に関する。また、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、それらを細胞外分泌させるか、または膜結合させるシグナル配列を有する蛋白（以下、包括的に分泌蛋白または分泌ポリペプチドと称する）に関する。
【０００２】
発明の背景
薬剤発見プロセスは、高処理能ゲノムまたは遺伝子に基づく生物学である、「機能的ゲノム学」を包含するため、このプロセスは現在、基礎改革を受けている。治療標的としての遺伝子および遺伝子産生物を同定するための手段としてのこのアプローチは、「位置クローニング」に基く初期のアプローチに急速に取って代わっている。生物学的機能または遺伝疾患である表現型が同定され、ついで、遺伝学的地図の位置に基いて原因である遺伝子が追求されている。
機能的遺伝学は、高処理能ＤＮＡ配列決定法および現在利用できる多くの分子生物学的データベースから潜在的に関心のある遺伝子配列を同定するための生物情報学の種々の手段に大きく依存している。薬剤発見の標的としてのさらなる遺伝子およびそれらの関連するポリペプチド／蛋白を同定し、特徴付けることが必要とされ続けている。
【０００３】
血液、リンパ液および他の体液中に自然に分泌されるか、または細胞膜中に分泌される蛋白およびポリペプチドが、医薬品の研究および開発のために主に興味のあるところである。このように関心を集める理由は、それらの作用場所（体液または細胞膜）に蛋白治療薬を相対的に向けやすいからである。細胞外空間への蛋白分泌の天然経路が、真核生物では小胞体であり、原核生物では内膜である（Ｐａｌａｄｅ， １９７５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １８９， ３４７； Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｂｒｏｗｎｌｅｅ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ， ａｎｄ Ｍａｔｈｅｗｓ，　１９７２， Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．， ２３９， １１７； Ｂｌｏｂｅｌ、および Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ， １９７５， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ６７， ８３５）。一方、細胞外部から細胞質中に蛋白を転送する天然経路は知られていない（ただし、ヘビ毒が細胞中に侵入する飲作用、機構を除く）。したがって、蛋白を細胞に向けることは極めて困難である。
【０００４】
分泌蛋白および膜結合蛋白は、限定するものではないが、全てのペプチドホルモンおよびそれらの受容体（インスリン、成長ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、ニューロペプチド、インテグリン、カリクレイン、ラミン、メラニンナトリウム、利尿性ホルモン、ニューロプシン、ニューロトロピン、下垂体ホルモン、プレイオトロピン、プロスタグランジン、セクレトグラニン、セクレチン、スロンボグロブリン、チモシンを含むが、限定されるものではない）、乳癌および大腸癌遺伝子産生物、レプチン、肥満遺伝子蛋白およびその受容体、血清アルブミン、スーパーオキシドジスムターゼ、スプライセオソーム蛋白、Ｇ蛋白結合受容体としても称される７ＴＭ（膜貫通）蛋白、免疫グロブリン、セリンプロテアーゼのいくつかのファミリー（限定するものではないが、血液凝固カスケードの蛋白、消化酵素を含む）、デオキシリボヌクレアーゼＩ等を含む。
【０００５】
ＦＤＡまたは外国の省庁により承認された分泌蛋白または膜結合蛋白に基づく治療薬は、限定するものではないが、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン、絨毛性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、バソプレッシン、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリン、ラクトフェリン（いくつかの会社により市販されている多種の製品）、組織型プラスミノゲンアクチベーター（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＡｌｔｅｐｌａｓｅ）、ヒアルロニダーゼ（Ｗｙｅｔｈ−ＡｙｅｒｓｔによるＷｙｄａｓｅ）、ドルナーゼアルファ（ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによるＰｕｌｍｏｚｙｍｅ）、キモジアクチン（Ｋｎｏｌｌによるキモパパイン）、アルグルセラーゼ（ＧｅｎｚｙｍｅによるＣｅｒｅｄａｓｅ）、ストレプトキナーゼ（ＰｈａｒｍａｃｉａによるＫａｂｉｋｉｎａｓｅ）（ＡｓｔｒａによるＳｔｒｅｐｔａｓｅ）等を含む。これは分泌蛋白および膜結合蛋白が治療的標的として確立され、証明された歴史を有することを示している。明らかに、限定するものではないが、糖尿病、乳癌、前立腺癌、大腸癌および他の悪性腫瘍、高血圧および低血圧、肥満、貪食、拒食症、成長異常、喘息、躁鬱病、痴呆、譫妄、精神薄弱、ハンチントン病、トゥーレット症候群、分裂病、成長的、精神的または性的発達障害、および卒中を誘発するものを含む血液カスケード系の機能不全を含む機能不全または疾病の防止、改善または修正において役割を果たし得るさらなる分泌蛋白および膜結合蛋白の同定および特徴付けの必要がある。シグナル配列を含む本発明の蛋白は、現在完全には理解されていない蛋白輸送機構をさらに解明するために有用であり、したがって、研究手段として利用できる。
【０００６】
発明の概要
本発明は、組換え物質を含む、表Ｉに示す遺伝子の特定のポリペプチドおよびポリヌクレオチドおよびそれらの産生方法に関する。該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、限定するものではないが、以下「本発明の疾患」と称する表ＩＩＩおよびＶに示す疾患を含む、ある種の疾患の治療方法に関して関心がある。さらなる態様において、本発明は、本発明により提供される物質を用いるアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、阻害剤）の同定方法および同定された化合物と共に表Ｉに示す遺伝子のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの不均衡に付随する症状の治療方法に関する。本発明のさらなる態様において、本発明は表Ｉに示す遺伝子の不適当な活性またはレベルに付随する疾患を検出するための診断アッセイに関する。本発明の他の態様は、配列表に示すヌクレオチド配列のいずれかを含むポリヌクレオチド、およびヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドを含むポリペプチドに関する。他の態様において、本発明は配列表に示すポリペプチド配列のいずれかを含むポリペプチドおよび組換え物質ならびにそれらの産生方法に関する。本発明の他の態様は、該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法に関する。該方法は、本発明の遺伝子の異常な発現、産生、機能および／または代謝により引き起こされる疾患、異常および障害（以下、単に疾患と称する）の治療を含み、該疾患は、各々の添付配列に関して開示された他の蛋白との相同性から当業者により容易に明らかにされる。さらなる他の態様において、本発明は、本発明により提供される物質を用いるアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、および同定された化合物の不均衡に付随する症状の治療方法に関する。さらなる本発明の他の態様は、本発明の分泌蛋白の不適当な活性またはレベルに付随する疾患を検出するための診断アッセイに関する。
【０００７】
発明の記載
第１の態様において、本発明は表Ｉに示す遺伝子のポリペプチドに関する。該ポリペプチドは：
（ａ）配列表に示す配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる単離ポリペプチド（本明細書中、配列表のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに言及する場合、その配列表において言及された配列表をも参考とする）；
（ｂ）配列表に示すポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド；
（ｃ）配列表に示すポリペプチド配列を含む単離ポリペプチド；
（ｄ）配列表に示すポリペプチド配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する単離ポリペプチド；
（ｅ）配列表に示すポリペプチド配列；
（ｆ）配列表に示すポリペプチド配列と比較して、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９の同一性指数を有するポリペプチド配列を有するか、または含む単離ポリペプチド；
（ｇ）（ａ）から（ｆ）までにおける該ポリペプチドのフラグメントまたは変異体；
を含む。
本発明のポリペプチドは表ＩＩに示す遺伝子ファミリーのメンバーであると考えられる。したがって、これらは表ＩＩＩおよびＶに示す理由に関して、治療および診断的関心がある。表Ｉに示す遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの生物学的特性を、以下、表Ｉに示す遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの「生物学的活性」と称する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、表Ｉに示す遺伝子の少なくとも１つの生物学的活性を示す。
【０００８】
また、本発明のポリペプチドは、すべての対立遺伝子の形質およびスプライス変異体も含む、上記ポリペプチドの変異体も含む。該ポリペプチドは、保存的または非保存的であってもよく、あるいはそれらの組み合わせであってもよい挿入、欠失および置換により基準ポリペプチドと異なっている。特に好ましい変異体は、例えば５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜３、３〜２、２〜１または１個のアミノ酸がいずれかの組み合わせで挿入、置換または欠失されているものである。
本発明のポリペプチドの好ましいフラグメントは、配列表に示すアミノ酸配列から少なくとも３０、５０または１００連続アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド、または配列表に示すアミノ酸配列から少なくとも３０、５０または１００連続アミノ酸の末端切断または欠失しているアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドである。好ましいフラグメントは、同様の活性または改良された活性を有するもの、もしくは望ましくない活性を減少させたものを含む、表Ｉに示す遺伝子のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの生物学的活性を介する生物学的活性フラグメントである。また動物、特にヒトにおいて、抗原性または免疫原性であるフラグメントも好ましい。
【０００９】
本発明のポリペプチドのフラグメントは、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチドを産生するために用いることができ、したがって、これらの変異体は本発明の全長ポリペプチドを産生するための中間体として用いることができる。本発明のポリペプチドは、「成熟」蛋白の形態であってもよく、または前駆体もしくは融合蛋白のようなより大きい蛋白の一部であってもよい。分泌またはリーダー配列、プロ配列、精製を補助する配列、例えば多ヒスチジン残基、または組換え産生物の間の安定性のための付加的な配列を含む、付加的なアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利である。
本発明のポリペプチドは、いずれかの適当な方法、例えば天然に生じる源からの単離により、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から（下記参照）、または化学合成により、例えば自動ペプチド合成装置を用いて、もしくは該方法を組み合わせて調製することができる。該ポリペプチドを調製する方法は当該分野でよく理解されている。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は表Ｉに示す遺伝子のポリヌクレオチドに関する。該ポリヌクレオチドは：
（ａ）配列表に示すポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列表に示すポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド；
（ｃ）配列表に示すポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する単離ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列表に示す単離ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列表に示すポリペプチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド；
（ｆ）配列表に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド；
（ｇ）配列表に示すポリペプチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド；
（ｈ）配列表に示すポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド；
（ｉ）配列表に示すポリヌクレオチド配列と比較して０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を有するか、または含む単離ポリヌクレオチド；
（ｊ）配列表に示すポリペプチド配列と比較して０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９の同一性指数を有するポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を有するか、または含む単離ポリヌクレオチド；および上記ポリヌクレオチドのフラグメントおよび変異体であるポリヌクレオチド、または上記ポリヌクレオチドに対して、その全長にわたって相補的なポリヌクレオチド；
を含む。
【００１１】
本発明のポリヌクレオチドの好ましいフラグメントは、配列表に示す配列からの少なくとも１５、３０、５０または１００連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド、または配列表に示す配列から少なくとも３０、５０または１００連続ヌクレオチドの末端切断または欠失された配列を含む単離ポリヌクレオチドを含む。
本発明のポリヌクレオチドの好ましい変異体は、１つまたはそれ以上の単分子ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を有するポリヌクレオチドを含む、スプライス変異体、対立遺伝子変異体および多型を含む。
また、本発明のポリヌクレオチドは、数個、例えば５０〜３０、３０〜２０、２０〜１０、１０〜５、５〜３、３〜２、２〜１または１個のアミノ酸残基が、いずれかの組み合わせで置換されているか、欠失されているか、または付加されている配列表に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であるポリヌクレオチドを提供する。したがって：
（ａ）配列表に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含み；
（ｂ）配列表に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であり；
（ｃ）配列表に示すＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物を含み；または
（ｄ）配列表に示すＤＮＡ配列のＲＮＡ転写物であり；
ならびにそれらに対して相補的なＲＮＡポリヌクレオチド；
であるＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
配列表に示すポリヌクレオチド配列は、表ＩＩに示すポリヌクレオチド配列に対して相同性を示す。配列表に示すポリヌクレオチド配列は、配列表に示すポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列である。配列表に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列表に示すポリペプチドをコードする配列と同一的であってもよく、または遺伝学的の縮重（縮退）の結果として、また、配列表に示すポリペプチドをコードする、配列表に示す配列以外の配列であってもよい。配列表に示す配列のポリペプチドは、表ＩＩに示すポリペプチドに対して相同性および／または構造的類似性を有する、表ＩＩに示す遺伝子ファミリーの他の蛋白に関する。本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、特に、それらの相同性ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと類似の生物学的機能／特性を有することが期待される。したがって、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、表１に示す遺伝子の少なくとも１つの活性を有する。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニング法を用いて、表ＩＶに示す組織からのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）参照）。また、本発明のポリヌクレオチドも天然源、例えばゲノムＤＮＡライブラリーから得ることもでき、またはよく知られ、商業的に利用できる方法を用いて合成することもできる。
本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え産生に対して用いる場合、ポリヌクレオチドは、それ自体、成熟ポリペプチドのコーディング配列を含むものであってもよく、またはリーディングフレーム中にリーダーもしくは分泌配列、プレ−もしくはプロ−あるいはプレプロ−蛋白配列をコードするコーディング配列、または他の融合ペプチド部分などのコーディング配列を伴う成熟ポリペプチドに関するコーディング配列を含んでいてもよい。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するマーカー配列はコードされていてもよい。本発明のある種の好ましい具体例において、マーカー配列はｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）中に提供されるようなヘキサ−ヒスチジン蛋白であり、これはＧｅｎｔｚ ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ （１９８９） ８６：８２１−８２４に記載されており、またはＨＡタグである。また、ポリヌクレオチドは、非コーディング５’〜３’配列、例えば転写された非翻訳配列、スプライスおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化させる配列を含んでいてもよい。
【００１５】
配列表に示すポリヌクレオチド配列と同一であるか、または十分な同一性を有するポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅反応（例えばＰＣＲ）に対するプライマーとして用いることができる。該プローブおよびプライマーは、全長ｃＤＮＡおよび本発明のポリペプチドをコードするゲノムクローンを単離するため、および、典型的には、少なくとも９５％の同一性で配列表に示す配列に対して高い配列類似性を有する他の遺伝子（ヒト起源からのパラログおよび他の種からのオーソログおよびパラログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために用いることができる。好ましいプローブおよびプライマーは、一般的には、少なくとも１５個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドを含み、少なくとも１００個のヌクレオチドではないにしても、少なくとも５０個のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３０〜５０個のヌクレオチドを含むだろう。特に好ましいプライマーは２０〜２５個のヌクレオチドを有するだろう。
【００１６】
他の種からのホモログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列表に示す配列またはそのフラグメントを有する、好ましくは１５個のヌクレオチドの標識プローブを用いて、ストリジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングし、配列表に示すポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含む方法により得ることができる。該ハイブリダイゼーション法は当業者によく知られている。好ましいストリジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ）溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ｍｌの変性剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩インキュベーションし、ついで、約６５℃で０．１×ＳＳＣでフィルターを洗浄することを含む。したがって、また、本発明は、配列表に示す配列またはそのフラグメントを有する、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドの標識プローブを用いるストリジェントなハイブリダイゼーション条件下でのライブラリーのスクリーニングにより得られる、好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチドを含む。
【００１７】
当業者は、多くの場合において、ポリペプチドをコードする領域が５’末端までの全ての工程で伸長していないという点で、単離ｃＤＮＡ配列が不完全であることを理解するだろう。これは本質的に低い「前進性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）」（ポリマー化反応の間、鋳型に結合したままの酵素の能力の尺度）を有する逆転写酵素の結果であり、第１のストランドｃＤＮＡ合成の間に、ｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完成することができない。
【００１８】
全長ｃＤＮＡを得るための、または短いｃＤＮＡを伸長させるための利用可能およびよく知られたいくつかの方法、例えばｃＤＮＡの急速増幅（ＲＡＣＥ）法に基づく方法がある（例えばＦｒｏｈｍａｎ ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５， ８９９８−９００２， １９８８参照）。例えば、マラソン（Ｍａｒａｔｈｏｎ）（商標）法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）により例示される、最近の変法はより長いｃＤＮＡの検索を有意に単純化した。マラソン（商標）法において、ｃＤＮＡは選択された組織から抽出されたｍＲＮＡから調製され、「アダプター」配列が各々の末端に連結する。ついで、核酸増幅（ＰＣＲ）を、ｃＤＮＡの「消失している」５’末端を増幅するために、遺伝子特異的およびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて行なう。ついで、ＰＣＲ反応を、増幅生成物中にアニールするために設計されたプライマーである「ネステッド」プライマー（典型的には、アダプター配列のさらに３’側にアニールするアダプター特異的プライマーおよび公知の遺伝子配列のさらに５’側にアニールする遺伝子特異的プライマー）を用いて繰り返す。ついで、この反応の生成物をＤＮＡ配列決定法により分析し、完全配列を得るために、存在するｃＤＮＡに生成物を直接結合させるか、または５’プライマーの設計のための新たな配列情報を用いて別の全長ＰＣＲを行なうことのいずれかにより全長ＰＣＲを構築する。
【００１９】
本発明の組換えポリペプチドは、当該分野でよく知られた方法により、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から調製できる。したがって、さらなる態様において、本発明は、ポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含む発現系、該発現系で遺伝子操作された宿主細胞および組換え法による本発明のポリペプチドの生産に関する。また、無細胞翻訳系を、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて該蛋白を生産するために用いることができる。
組換え体生産のために、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明のポリヌクレオチドに対して発現系またはその一部を組み込むことができる。ポリヌクレオチドは、多くの標準的な実験教本、例えば、Ｄａｖｉｓ ら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋ ら（上述）に記載されている方法により宿主細胞に組み込むことができる。宿主細胞にポリヌクレオチドを組み込む好ましい方法は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入または感染を含む。
【００２０】
適当な宿主の代表的な例は、細菌細胞、例えばストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｉｓ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２）およびスポドプテラＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９）細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｓ）黒色腫細胞；および植物細胞が挙げられる。
【００２１】
非常に多くの発現系を使用することができ、例えば染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、およびそれらの組み合わせ由来のベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミドが使用できる。発現系は発現を制御ならびに引き起こす調節領域を含んでいてもよい。一般的には、宿主細胞にポリペプチドを産生させるためにポリヌクレオチドを保持、増殖または発現できるいずれかの系またはベクターが使用できる。適当なポリヌクレオチド配列を、種々のよく知られ、慣用的な方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（上述）に示される方法のいずれかにより発現系に挿入することができる。適当な分泌シグナルを、小胞体細網腔、ペリプラスミックスペースまたは細胞外環境に翻訳蛋白を分泌させるために、望ましいポリペプチドに組み入れることができる。これらのシグナルはポリペプチドに固有のものであってもよく、またはこれらは異種のシグナルであってもよい。
【００２２】
本発明のポリペプチドをスクリーニングアッセイにおいて用いるために発現させる場合、一般的には、ポリペプチドは細胞の表面で産生されることが好ましい。この事象において、細胞をスクリーニングアッセイにおいて用いる前に回収してもよい。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、ポリペプチドを回収し、精製するために培地を回収することができる。細胞内に産生される場合、最初に細胞を融解しなければならず、ついでポリペプチドを回収する。
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法により組換え細胞培養物から回収し、精製できる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製に用いる。ポリペプチドが細胞内合成、単離および／または精製中に変性した場合、蛋白再生のための公知の方法を用い、活性なコンホーメーションを再生成することができる。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、関連遺伝子における変異の検出を介して、診断試薬として用いることができる。変異形態の遺伝子の検出は、ｃＤＮＡまたはゲノム配列における機能不全に関連している配列表に示すポリヌクレオチドにより特徴付けられる。遺伝子の低発現、過剰発現または空間的もしくは時間的に変化した発現から生じる疾患、または疾患に対する感受性の診断に加えることができるか、または決定することのできる診断手段が提供されるだろう。遺伝子中の各々の運搬変異体を、当該分野においてよく知られた種々の方法により、遺伝子中に変異を有する個体をＤＮＡレベルで検出してもよい。
診断用の核酸は、対象の細胞、例えば血液、尿、唾液、生体組織または解剖物質から得ることができる。ゲノムＤＮＡは直接検出に用いることができるか、または分析前にＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲもしくは他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅できる。また、ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同様の方法で用いることができる。欠失および挿入を正常な遺伝子型と比較した場合の増幅された産生物の大きさの変化により検出できる。点突然変異は、増幅されたＤＮＡを表Ｉに示す遺伝子の標識ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることにより同定できる。完全に適合する配列はＲＮアーゼ消化、または融点の違いにより、不適合な二重らせんと区別できる。また、ＤＮＡ配列の違いを、変性剤を含む、または含まないゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動性の変化により、または直接的なＤＮＡの配列決定により検出できる（例えばＭｅｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８５）２３０：１２４２参照）。また、特異的な位置の配列の変化を、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的切断法により明らかにできる（例えばＣｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ，（１９８５） ８５：４３９７−４４０１参照）。
【００２４】
表Ｉに示す遺伝子のポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例えば遺伝学的変異の効果的なスクリーニングを行うことができる。該アレイは、好ましくは、高密度アレイまたは格子である。アレイ法はよく知られており、一般的な適用性を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝学的多様性を含む分子遺伝学における種々の問題を解決するために用いることができる。例えば、Ｍ． Ｃｈｅｅ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４， ６１０−６１３ （１９９６）およびそこに引用されている他の文献参照。
また、異常に減少または増加したレベルのポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現の検出は、本発明の疾患に対する対象の罹り易さを診断するか、または決定するために用いることができる。減少または増加した発現を、ポリヌクレオチドの定量に関して当該分野でよく知られたいずれかの方法、例えば核酸増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法を用いてＲＮＡレベルで測定できる。宿主由来の試料中の蛋白、例えば本発明のポリペプチドのレベルを測定するために用いることができるアッセイ法は当業者によく知られている。該アッセイ法はラジオ免疫アッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを含む。
【００２５】
したがって、他の態様において、本発明は：
（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列表に示すヌクレオチド配列、またはそのフラグメントもしくはＲＮＡ転写物；
（ｂ）（ａ）の配列に対して相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは配列表に示すポリペプチドまたはそのフラグメント；または
（ｄ）本発明のポリペプチドに対する、好ましくは配列表に示すポリペプチドに対する抗体；
を含む診断キットに関する。
該キットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的な成分を含んでいてもよいことは理解されるだろう。該キットは疾患の診断または疾患、とりわけ、特に本発明の疾患に対する感受性の診断に用いられるだろう。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチド配列は染色体位置研究に対して価値がある。配列表に示す配列は、別個のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的とし、ハイブリダイゼーションすることができる。本発明による染色体に関連する配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関する遺伝子と関連付ける重要な第１の工程である。一度配列が染色体位置に正確にマッピングされると、染色体上の配列の物理学的位置を遺伝子マップデータと関連付けることができる。該データは、例えばＶ． ＭｃＫｕｓｉｃｋ， Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ中に見られる（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを介してオンラインで利用可能）。ついで、同様の染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の間の関連性を連鎖分析（物理的隣接遺伝子の同時遺伝）を介して同定する。ゲノム配列（遺伝子フラグメント等）の正確なヒト染色体位置を、ラジエーションハイブリッド（ＲＨ）マッピング（Ｗａｌｔｅｒ， Ｍ． Ｓｐｉｌｌｅｔｔ， Ｄ．， Ｔｈｏｍａｓ， Ｐ．， Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ， Ｊ．， ａｎｄ Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ， Ｐ．， （１９９４） Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｐｓ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７， ２２−２８）を用いて決定することができる。多くのＲＨパネルがＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ， ＵＳＡ）、例えば、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ ＲＨパネル （Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １９９６ Ｍａｒ；５（３）：３３９−４６ Ａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ． Ｇｙａｐａｙ Ｇ， Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｋ， Ｆｉｚａｍｅｓ Ｃ， Ｊｏｎｅｓ Ｈ， Ｖｅｇａ−Ｃｚａｒｎｙ Ｎ， Ｓｐｉｌｌｅｔｔ Ｄ， Ｍｕｓｅｌｅｔ Ｄ， Ｐｒｕｄ’Ｈｏｍｍｅ ＪＦ， Ｄｉｂ Ｃ， Ａｕｆｆｒａｙ Ｃ， Ｍｏｒｉｓｓｅｔｔｅ Ｊ， Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ Ｊ， Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ ＰＮ）から利用可能である。このパネルを用いる遺伝子の染色体位置を決定するために、９３回のＰＣＲを、ＲＨ ＤＮＡ上の目的遺伝子から設計されたプライマーを用いて行う。これらの各々のＤＮＡは、ハムスターバックグラウンド（ヒト／ハムスターハイブリッド細胞系）中に維持されたランダムなヒトゲノムフラグメントを含む。これらのＰＣＲにより、目的遺伝子のＰＣＲ生成物の存在または非存在を示す９３個のスコアを得る。これらのスコアを既知の位置ゲノム配列からのＰＣＲ生成物を用いて生じたスコアと比較する。この比較はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／で行われる。
【００２７】
また、本発明のポリヌクレオチド配列は、組織発現研究用の価値ある手段である。該研究は本発明のポリヌクレオチドの発現パターンの決定を可能にし、それらをコードするｍＲＮＡを検出することにより、組織のコードされたポリペプチドの発現パターンに関する適用を得ることができる。用いられる方法は当該分野においてよく知られており、ｃＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションのような格子上にアレイされたクローンに系内でのハイブリダイゼーション法（Ｓｃｈｅｎａ ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７０， ４６７−４７０， １９９５ および Ｓｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ， ６， ６３９−６４５， １９９６）およびＰＣＲのようなヌクレオチド増幅法を含む。好ましい方法は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販されているＴＡＱＭＡＮ（登録商標）法を用いる。これらの研究からの結果は、生物中のポリペプチドの正常な機能の兆候を提供できる。加えて、ｍＲＮＡの正常な発現パターンと別の形態の同様の遺伝子（例えば、ポリペプチドのコーディングにて変化する可能性のあるものまたは調節的変異を有するもの）によりコードされるｍＲＮＡの発現パターンとの比較研究により、疾患における本発明のポリペプチドの役割またはその不適当な発現の役割の価値ある洞察を得ることができる。該不適当な発現は、時間的、空間的または量的な性質のものであってもよい。
【００２８】
本発明のさらなる態様は抗体に関する。本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメント、もしくはそれらを発現する細胞は、免疫源として、本発明のポリペプチドに対して免疫特異的である抗体を産生するために用いることができる。「免疫特異的」なる用語は抗体が先行技術の他の関連ポリペプチドのアフィニティーよりも実質的により大きな本発明のポリペプチドに対するアフィニティーを有することを意味する。
本発明のポリペプチドに対して生成された抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ担持フラグメントまたは細胞を、動物、好ましくは非ヒト動物に、慣用的なプロトコルを用いて投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の調製に関して、連続細胞系培養により産生される抗体を提供するいずれかの方法を用いることができる。例として、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ． ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオマ（ｔｒｉｏｍａ）法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，７７−９６，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ． １９８５）に記載されるような種々の技法が挙げられる。
【００２９】
また、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されているような単鎖抗体の産生に関する技術は、本発明のポリペプチドに対する単鎖抗体を産生するのに適用できる。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳類を含むその他の生物をヒト化抗体を発現させるために用いることができる。
上記抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離するか、または同定するため、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために用いることができる。また、本発明のポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、本発明の疾患を治療するために用いることができる。
【００３０】
また、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはワクチンとしても使用できる。したがって、さらなる態様において、本発明は、疾患が個体にすでに確立しているかいないかにかかわらず、哺乳動物における免疫学的反応を誘発する方法であって、疾患から該哺乳動物を保護するために、抗体および／または例えばサイトカイン産生Ｔ細胞または細胞毒性Ｔ細胞を含むＴ細胞免疫応答を生じさせるに十分な本発明のポリペプチドを哺乳類に接種することを特徴とする方法に関する。また、哺乳類における免疫学的応答を、本発明の疾患から該動物を保護するための抗体を産生するための該免疫学的応答を誘発するためにポリヌクレオチドの発現を指示し、インビボでポリペプチドをコードするベクターにより本発明のポリペプチドをデリバリーすることを含む方法により誘発できる。ベクターを投与する１つの方法は、粒子またはそれ以外のものの上のコーティングとして望ましい細胞中に加速させることによる。該核酸ベクターはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含み得る。ワクチンの使用に関しては、通常には、ポリペプチドまたは核酸ベクターをワクチン処方（組成物）として提供するだろう。さらに、処方は適当な担体を含んでいてもよい。ポリペプチドは胃で分解され得るので、非経口投与が好ましい（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または皮内注射）。非経口投与に適当な処方は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および処方を受容者の血液と等張にする溶液を含んでいてもよい、水性または非水性滅菌注射溶液；および懸濁剤または増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含む。処方は単位投与または多投与容器、例えばシールしたアンプルおよびバイアルで与えてもよく、使用直前に滅菌液体担体を添加するだけで復元する凍結乾燥状態で保存してもよい。また、ワクチン処方は、免疫原性を増強するためのアジュバンド系、例えば水中油系および他の当該分野で公知の系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの特定の活性に依存し、慣用的な実験により容易に決定できる。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の病態、特に本明細書に上記した本発明の疾患に関連のある１つまたはそれ以上の生物学的機能を有する。したがって、ポリペプチドの機能またはレベルを刺激するか、または阻害する化合物を同定することは有用である。したがって、さらなる態様において、本発明はポリペプチドの機能またはレベルを刺激するか、または阻害する化合物を同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。該方法は本明細書に上記した本発明の疾患に関して治療的および予防的な目的のために使用できるアゴニストまたはアンタゴニストを同定する。化合物は、種々の源、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、化合物の収集物および天然産物混合物から同定できる。そのように同定された該アゴニストまたはアンタゴニストは、ポリペプチドであり得る場合、天然または修飾基質、リガンド、受容体、酵素等；それらの構造的または機能的模倣物（Ｃｏｌｉｇａｎ ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ ５ （１９９１）参照）または小分子であり得る。好ましくは、該小分子は２０００ダルトン未満、より好ましくは３００〜１０００ダルトン、および最も好ましくは４００〜７００ダルトンの分子量を有する。これらの小分子は有機分子であることが好ましい。
【００３２】
スクリーニング方法は、候補化合物に直接または間接的に結合した標識により、ポリペプチド、またはポリペプチドもしくはその融合蛋白を有する細胞あるいは膜への候補化合物の結合を単に測定するだけでもよい。別法として、スクリーニング法は、標識競合体（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）に対するポリペプチドへの候補化合物競合的結合を測定するか、または検出すること（定性的または定量的）を含み得る。さらに、これらのスクリーニング法は、ポリペプチドを有する細胞に適当な検出系を用いて、候補化合物がポリペプチドの活性化または阻害により生じるシグナルを生じるかどうかを試験してもよい。一般的には、活性化の阻害は、既知のアゴニストの存在下でアッセイし、候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化の効果を観察する。さらに、スクリーニング法は、候補化合物を、本発明のポリペプチドを含有する溶液と混合し、混合物を形成し、混合物中の表Ｉに示す遺伝子の活性を測定し、表Ｉに示す遺伝子の混合物の活性と、候補化合物を含有しない対照混合物の活性とを比較する工程を単に含んでいてもよい。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、慣用的な低処理能スクリーニング法に用いることができ、高処理能スクリーニング（ＨＴＳ）フォーマットにも用いることができる。該ＨＴＳフォーマットは、９６ウェル、より最近には、３８４ウェルのマイクロタイタープレートの十分に確立された使用だけでなく、Ｓｃｈｕｌｌｅｋ ら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２４６， ２０−２９， （１９９７）により記載されたナノウェル法のような新たな方法も含む。
Ｆｃ蛋白および本明細書に上記した表Ｉに示す遺伝子のポリペプチドから得られるような融合蛋白は、高処理能スクリーニングアッセイに対して用いることができ、本発明のポリペプチドに対するアンタゴニストを同定することができる（Ｄ． Ｂｅｎｎｅｔｔ ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， ８：５２−５８ （１９９５）； および Ｋ． Ｊｏｈａｎｓｏｎ ら、 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７０（１６）：９４５９−９４７１ （１９９５）参照）。
【００３４】
また、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリペプチドに対する抗体は、細胞におけるｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生での添加化合物の効果を検出するためのスクリーニング法を構成するために用いることができる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイは、当該分野で公知の標準的な方法によりモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて、ポリペプチドの分泌レベルまたは細胞結合レベルを測定するために構築され得る。これは、適当に処理された細胞または組織からのポリペプチドの産生を阻害するか、または増強できる薬剤（各々、アンタゴニストまたはアゴニストとも称される）を見出すために用いることができる。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の標準的な受容体結合法により、もしあれば、膜結合または可溶性受容体を同定するために用いることができる。これらは、限定するものではないが、ポリペプチドが放射性同位体（例えば、１２５Ｉ）で標識化され、化学修飾され（例えば、ビオチン化）、または検出もしくは精製に適当なペプチド配列に融合され、推定受容体の源（細胞、細胞膜、細胞懸濁液、細胞抽出物、体液）と共にインキュベートされる、リガンド結合および架橋アッセイを含む。他の方法は、生物物理学的方法、例えば表面プラスモン共鳴および分光法を含む。また、これらのスクリーニングは、もしあれば、ポリペプチドのその受容体への結合を競合するポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために用いることができる。該アッセイを行うための標準的な方法は当該分野でよく理解されている。
本発明のポリペプチドのアンタゴニストとして、例えば、抗体またはある場合には、リガンド、基質、受容体、酵素等に密接に関連したオリゴヌクレオチドまたは蛋白、例えばリガンド、基質、受容体、酵素等のフラグメントであってもよく；またはポリペプチドの活性を妨害するために、本発明のポリペプチドに結合するが、応答を誘発しない小分子が挙げられる。
【００３６】
また、スクリーニング法はトランスジェニック技法および表Ｉに示す遺伝子の使用を含んでいてもよい。トランスジェニック動物を構築する技術は十分に確立されている。例えば、表Ｉに示す遺伝子を、受胎卵母細胞の雄の前核にマイクロインジェクションを介して導入してもよく、着床の前後に胚にレトロウイルスにより移入させてもよく、または、例えばエレクトロポレーションによるような遺伝学的に修飾された胚幹細胞の注入を介して宿主胚盤胞中に導入してもよい。特に有用なトランスジェニック動物は、その動物遺伝子はその動物のゲノム中でヒト同等物に置換されている、いわゆる「ノック−イン」動物である。ノック−イントランスジェニック動物は、化合物がヒト標的に特異的であるとする確認を目的とする、薬剤発見プロセスにおいて有用である。他の有用なトランスジェニック動物は、本発明の、内的ＤＮＡ配列により細胞内でコードされる動物にてオーソロガスなポリペプチドの発現が、部分的または完全に無効とされる、いわゆる「ノック−アウト」動物である。遺伝子ノック−アウトは、特定の細胞または組織に標的化でき、方法を限定した結果としてのある種の細胞または組織にのみ生じさせることができ、または動物中の全ての細胞もしくは実質的に全ての細胞において生じさせることができる。また、トランスジェニック動物法は、導入遺伝子が発現して大量の本発明のポリペプチドを生じる、全ての動物の発現クローニング系を提供する。
【００３７】
上記の方法において用いるためのスクリーニングキットは本発明のさらなる態様を形成する。該スクリーニングキットは：
（ａ）本発明のポリペプチド；
（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体；
を含み、ポリペプチドは表に示すものであることが好ましい。
いずれの該キットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的な成分を含んでいてもよいことは明らかだろう。
【００３８】
用語解説
本明細書において頻繁に用いられるある種の用語の理解を容易にするために以下の定義を提供する。
本明細書において用いられる「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物を含むＦａｂフラグメントを含む。
「単離」は、「人間の手により」天然の状態から変化させること、すなわち、天然に存在する場合、その本来の環境から変化させるか、または取り出すこと、もしくはその両方を意味する。例えば、生物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離されている同様のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用いる用語として、「単離」されている。さらに、形質転換、遺伝子操作または他のいずれかの組換え法により生物中に導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえそれが生物中にあるとしても、その生物が生きていても、または生きていないとしても「単離」されている。
「分泌蛋白活性または分泌ポリペプチド活性」または「分泌蛋白または分泌ポリペプチドの生物学的活性」は、同様の活性または改善された活性もしくは望ましくない副作用を減少するこれらの活性を含む、該分泌蛋白の代謝的または生理学的機能を意味する。また、該分泌蛋白の抗原および免疫原活性も含まれる。
「分泌蛋白遺伝子」は、いずれかの結合したヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはその対立変異体および／またはそれらの補体を意味する。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」は、一般的には、いずれのポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を意味し、これらは未修飾または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」は、限定するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖または、より典型的には二本鎖、もしくは一本鎖および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。また、「ポリヌクレオチド」なる用語は、１つまたはそれ以上の修飾された塩基を含むＤＮＡおよびＲＮＡならびに安定性または他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「修飾された」塩基は、例えばトリチル化塩基および通常でない塩基、例えばイノシンを含む。種々の修飾はＤＮＡおよびＲＮＡに対して成されてもよく；したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に見出されるような、化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性の化学形態を含む。また、「ポリヌクレオチド」は、相対的に短いポリヌクレオチドも含み、しばしばオリゴヌクレオチドと言われる。
【００４０】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により互いに結合した２つまたはそれ以上のアミノ酸を含むいずれのポリペプチド、すなわち、ペプチドアイソスターをいう。「ポリペプチド」は、通常にはペプチド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーと称される短鎖および、一般的には蛋白と称される長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、天然プロセス、例えば翻訳後プロセスまたは当該分野でよく知られている化学修飾法のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を含む。該修飾は基礎教本に、より詳細には研究論文に、ならびに多数の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチドのいずれの場所でも起こり得る。修飾の同様の型は、あるポリペプチドのいくつかの部位で、同じまたは異なる程度に存在し得ることは理解されるだろう。また、あるポリペプチドは修飾の多くの型を含み得る。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝鎖となり得、これらは分枝が存在するか、または存在しない環状であってもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスから得ることができるか、または合成法により製造できる。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチン化、フラビンの共有結合、ヘム部の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋化、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、蛋白へのアミノ酸の運搬ＲＮＡ媒介付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化を含む（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ， １−１２， ｉｎ Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３； Ｓｅｉｆｔｅｒ ら、 ”Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １８２， ６２６−６４６， １９９０および Ｒａｔｔａｎら、 ”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ”， Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ６６３， ４８−６２， １９９２参照）。
【００４１】
ポリペプチド配列の「フラグメント」は、基準配列よりも短いが、基準ポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポリペプチド配列を意味する。
「変異体」は、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性は保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。典型的なポリヌクレオチドの変異体は、ヌクレオチド配列が基準ポリヌクレオチドとは異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変化させても、または変化させなくてもよい。ヌクレオチド変化は、以下に議論するように、基準配列によりコードされたポリヌクレオチドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断を生じ得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、基準ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般的には、変性は、基準ポリペプチドおよび変異体の配列が全体的に密接に類似しており、多くの領域で同一なものに限定される。変異体および基準ポリペプチドは、いずれかの組み合わせにおける１つまたはそれ以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が異なり得る。
置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードによりコードされたものであってもよく、またはコードされていないものであってもよい。典型的な保存置換は、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅおよびＴｙｒを含む。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子のように天然に生じることができるか、または天然に生じることが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然にない変異体は、突然変異誘発法または直接合成により製造できる。また、１つまたはそれ以上の翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＰリボシル化等を有するポリペプチドも変異体として含まれる。具体例は、Ｎ−末端アミノ酸のメチル化、セリンおよびスレオニンのリン酸化およびＣ末端グリシンの修飾を含む。
【００４２】
「対立遺伝子」は、ゲノムのある遺伝子座に存在する２つまたはそれ以上の遺伝子の別の形態のうちの１つを意味する。
「多型」は、集団中のゲノムにおけるある位置でヌクレオチド配列（および適切な場合、コードされるポリペプチド配列）の変化を意味する。
「単一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）は、集団中のゲノムにおける単一ヌクレオチド位置でのヌクレオチド変化の発生を意味する。ＳＮＰは、遺伝子中またはゲノムの遺伝子間領域中で生じてもよい。ＳＮＰは対立遺伝子特異的増幅（ＡＳＡ）を用いてアッセイすることができる。プロセスに関して、少なくとも３つのプライマーが必要とされる。この共通プライマーは、アッセイされる多型に逆相体で用いられる。この共通プライマーは多型塩基からの５０〜１５００個の塩基対であり得る。他の２つ（またはそれ以上）のプライマーは、最終の３’塩基がゆらぎ、多型を形成する２つ（またはそれ以上）の対立遺伝子のうちの１つに適合することを除いて互いに同一である。ついで、２回（またはそれ以上）のＰＣＲ反応を、各々、共通プライマーおよび対立遺伝子特異的プライマーの１つを用いて行う。
【００４３】
本明細書で用いられる「スプライス変異体」は、同じゲノムＤＮＡ配列から初期に転写されたＲＮＡ分子から産生されるが、別のＥＮＡスプライシングを受けたｃＤＮＡ分子を意味する。別のＲＮＡスプライシングは、第１のＲＮＡ転写生成物がスプライシング、一般的にはイントロンの除去を受けた場合に生じ、各々、異なるアミノ酸配列をコードし得る１つ以上のｍＲＮＡ分子の産生が起こる。また、スプライス変異体なる用語は、上記ｃＤＮＡ分子によりコードされた蛋白を意味する。
【００４４】
「同一性」は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列、もしくは２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映し、配列を比較することにより決定される。一般的には、同一性は、比較される配列の全長にわたって２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の各々、ヌクレオチドに対するヌクレオチドの、またはアミノ酸に対するアミノ酸の正確な一致を意味する。
「％同一性」−正確に対応しない配列に関しては、「％同一性」が決定できる。一般的には、配列間の最大の関連性を得るために比較されるべき２つの配列を並べる。このことは配置の程度を向上させるための１つまたは両方の配列のいずれかに「ギャップ」を挿入することを含む。％同一性は、同じまたは非常に類似した長さに特に適している、比較される配列の全長にわたって決定でき（いわゆる、グローバル・アライメント）、あるいは、より短い限定された長さにわたって（いわゆる、ローカル・アライメント）決定してもよい。
【００４５】
「類似性」は２つのポリペプチド配列の間の関連性のさらにより精巧な尺度である。一般的には、「類似性」は、比較される各々の配列からの残基の対の間の正確な一致（同一性に関するもの）だけでなく、正確な一致が存在しない場合、進化論に基いて、１つの残基が他の残基で置換されている可能性も考慮した、残基毎の２つのポリペプチド鎖のアミノ酸間の比較を意味する。この可能性は関連した「スコア」を有し、それにより２つの配列の「％類似性」を決定できる。
【００４６】
２つまたはそれ以上の配列の同一性および類似性を比較する方法は当該分野でよく知られている。したがって、例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １２， ３８７−３９５， １９８４， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡから利用可能）において利用可能なプログラム、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムおよびＧＡＰを、２つのポリヌクレオチド間の％同一性および２つのポリペプチド配列間の％同一性および％類似性の決定に用いることができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ （Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １４７，１９５−１９７， １９８１， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ， ２， ４８２−４８９， １９８１）を用いて、２つの配列間の類似性の最もよい単一の領域を見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが類似していない２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の比較により適しており、プログラムはより短い配列がより長い配列の部分に相当することを仮定している。相対的に、ＧＡＰは、２つの配列を並べて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８， ４４３−４５３， １９７０）により「最大類似性」を見出す。ＧＡＰは、ほとんど同じ長さである配列を比較することにより適しており、配置は全長にわたることが望まれる。好ましくは、各々のプログラムに用いるパラメーター「ＧＡＰ重量」および「長さ重量」は、それぞれ、ポリヌクレオチド配列に関しては５０および３であり、ポリペプチドに関しては１２および４である。好ましくは、％同一性および類似性は比較される２つの配列が最適に並べられた場合に決定する。
【００４７】
また、配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムは、当該分野で公知のものであり、例えば、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２１５， ４０３−４１０， １９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆ ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５： ３８９−３４０２， １９９７、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｅｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡから利用可能、ＮＣＢＩのホームページｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖでアクセスできる）およびＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ Ｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８３， ６３−９９， １９９０； Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ Ｒ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ Ｄ Ｊ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ａｃｉ ＵＳＡ， ８５， ２４４４−２４４８， １９８８、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅの一部として利用可能）である。
好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｓ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ Ｊ Ｇ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８９， １０９１５−１０９１９， １９９２）を、ポリペプチド配列比較に用い、比較前にヌクレオチド配列がアミノ酸配列に最初に翻訳される場合を含む。
好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴは、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して疑問ヌクレオチドまたはポリペプチド配列の％同一性を決定するために用いられ、上記のような疑問配列および基準配列は最適に並べられ、プログラムのパラメーターを初期値にセットする。
【００４８】
「同一性指数」は、候補配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）および基準配列を比較するために用いることができる配列関連性の尺度である。したがって、例えば、基準ポリヌクレオチド配列と比較して０．９５の同一性指数を有する候補ポリヌクレオチド配列は、候補ポリヌクレオチド配列が基準配列の各々１００ヌクレオチド毎に平均５個までの相違を含んでいてもよいこと以外は、基準配列と同一である。該相違は、少なくとも１個のヌクレオチド欠失、転位およびトランスバージョンを含む置換、または挿入から成る群から選択される。これらの相違は基準ポリヌクレオチド配列の５’または３’末端位置またはこれらの末端位置間のいずれかの場所で生じてもよく、基準配列中のヌクレオチド、もしくは基準配列中の１つまたはそれ以上の連続群において別個に点在していてもよい。言いかえると、基準ポリヌクレオチド配列と比較して０．９５の同一性指数を有するポリヌクレオチド配列を得るためには、上記のように、基準配列中の１００個のヌクレオチド毎に平均５個までが欠失、置換または挿入されていてもよく、もしくはそれらの組み合わせであってもよい。同じことを他の同一性指数、例えば０．９６、０．９７、０．９８および０．９９に関しても準用する。
【００４９】
同様に、ポリペプチドに関しては、例えば基準ポリペプチド配列と比較して０．９５の同一性指数を有する候補ポリペプチド配列は、候補ポリペプチド配列が基準配列の１００個のアミノ酸毎に平均５個までの相違を含んでいてもよいこと以外は基準配列と同一である。該相違は、少なくとも１個のアミノ酸欠失、保存的および非保存的置換を含む置換または挿入から成る群から選択される。これらの相違は基準ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端位置もしくはこれらの末端位置間のいずれかの場所で生じてもよく、基準配列中のアミノ酸、または基準配列中の１つまたはそれ以上の連続群において別個に点在していてもよい。言いかえると、基準ポリペプチド配列と比較して０．９５の同一性指数を有するポリペプチド配列を得るためには、上記のように、基準配列中の１００個のアミノ酸毎に平均５個までが欠失、置換または挿入されていてもよく、もしくはそれらの組み合わせであってもよい。同じことを他の同一性指数、例えば０．９６、０．９７、０．９８および０．９９に関しても準用する。
【００５０】
ヌクレオチドまたはアミノ酸の相違数と、同一性指数間の関係を以下の式：
ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・Ｉ）
［式中：
ｎａはヌクレオチドまたはアミノ酸相違数であり、
ｘａは配列表に示す配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸総数であり、
Ｉは同一性指数であり、
・は乗法演算子に関する記号であり、
ここに、ｘａおよびＩの非整数の積は、ｘａからこれを引く前に、最も近い整数に切り捨てる］
で表現することができる。
【００５１】
「ホモログ」は、基準配列に対して高度の配列関連性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を示す当該分野で用いられる一般的用語である。該関連性は、上記のように、２つの配列間の同一性および／または類似性の程度を決定することにより定量することができる。「オーソログ」および「パラログ」なる用語は、この一般的用語の範囲に収まる。「オーソログ」は、他の種におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能的同等物であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。「パラログ」は、機能的に類似物した同一種中のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
「融合蛋白」は、２つ、しばしば関連していない、融合遺伝子またはそのフラグメントによりコードされる蛋白を意味する。一例において、ＥＰ−Ａ−０４６４５３３−Ａは、他のヒト蛋白またはその一部と一緒になった免疫グロブリン分子の不変領域の種々の部分を含む融合蛋白を開示している。多くの場合、融合蛋白の一部分として免疫グロブリンのＦｃ領域を用いることは、例えば、改善薬物動態学的特性を生じる治療および診断における使用に有利である（例えば、ＥＰ−Ａ０２３２２６２参照）。一方、いくつかの使用に関しては、融合蛋白が発現し、検出され精製された後、Ｆｃ部分を欠失できることが望ましいだろう。
【００５２】
限定するものではないが、特許および特許出願を含む本明細書で引用された全ての刊行物および参考文献は、各々完全に出典明示して本明細書に組み入れる。本出願が優先権を主張しているいずれの特許出願も、出典明示して本明細書に組み入れる。
【００５３】
【表１】
2004502453.tif 000002
【００５４】
【表２】
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【００５５】
【表３】
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【００５６】
【表４】
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【００５７】
【表５】
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【００５８】
【表６】
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【００５９】
【表７】
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【００６０】
【表８】
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【００６１】
【表９】
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【００６２】
【表１０】
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【００６３】
【表１１】
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【００６４】
【表１２】
2004502453.tif 000013
【００６５】
表ＩＶ．ＳｙｂｒＭａｎを用いて検出される定量的かつ組織特異的なｍＲＮＡの発現
遺伝子の定量的かつ組織特異的なｍＲＮＡの発現パターンをＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ定量ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ；Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ Ｔ．Ｄ． ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８５：１９４−２０４， ２０００を参照）および種々のヒト組織から調製したヒトｃＤＮＡを用いて測定した。各遺伝子に関して配列表に示す第１の核酸配列を用いて遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを設計した。
各遺伝子の第１のサブセットの表において、同定の遺伝子（ＧＯＩ）ｍＲＮＡの２回反復測定物を種々のヒト組織から測定した（カラム２および３）。２回反復試験の平均ＧＯＩ ｍＲＮＡコピー数を各組織ＲＮＡから求めた（カラム４）。各組織ＲＮＡから得た１８ＳｒＲＮＡの平均値を測定し（カラム５）、規準化に用いた。１８Ｓ ｒＲＮＡ５０ｎｇと同量の各組織を調製するために、５０ｎｇを各組織から測定した１８Ｓ ｒＲＮＡの量（カラム５）で割ることにより規準化因子（カラム６）を算出した。各ＧＯＩ規準化因子と平均ｍＲＮＡコピー数とを積算することにより全ＲＮＡ５０ｎｇ当たりのｍＲＮＡコピー数を得た（カラム７）。
各遺伝子の第２のサブセット表にて示した倍変化は、正常なカウンターパートを有する疾患組織についてのみ算出した。カウンターパートを有していない全ての試料についての倍変化のカラムはブランクになっている。加えて、倍変化の計算値は、正常な試料に対する疾患試料における倍変化である。したがって、正常な試料の次には倍変化の計算値はない。患者適合癌対（大腸、肺および乳房）について、各腫瘍をその特定の正常なカウンターパートと比較する。患者適合正常／疾患対が存在しない場合、各疾患試料を同一の組織タイプの全ての正常試料の平均と比較し直した。例えば、アルツハイマーの脳を提供した同一患者からの正常な脳は適用できない。３つの正常な脳試料および４つのアルツハイマーの脳試料を倍変化において用いる。３つの正常な試料の平均値を取り、アルツハイマーの試料の各々をその平均値と比較し直した。
【００６６】
略語
ＡＬＺ　　　アルツハイマー病
ＣＴ　　　　ＣＬＯＮＴＥＣＨ（１０２０ Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ ９４３０３−４２３０， ＵＳＡ）
ＫＣ　　　　ＧＳＫ研究者が調製した試料
ＣＯＰＤ　　慢性閉塞性肺疾患
ｅｎｄｏ　　内皮
ＶＥＧＦ　　血管内皮成長因子
ｂＦＧＦ　　塩基性線維芽細胞成長因子
ＢＭ　　　　骨髄
ｏｓｔｅｏ　骨芽細胞
ＯＡ　　　　変形性関節症
ＲＡ　　　　慢性関節リウマチ
ＰＢＬ　　　末梢血リンパ球
ＰＢＭＮＣ　末梢血単核細胞
ＨＩＶ　　　ヒト免疫不全ウイルス
ＨＳＶ　　　単純ヘルペスウイルス
ＨＰＶ　　　ヒトパピローマウイルス
【００６７】
遺伝子名　ｓｂｇ４５８４６３ＰＥＲＬＡＸＩＮａ
脳および肺において強力に発現。肺腫瘍（１／４）において過剰発現。ＣＯＰＤ肺のおいてダウンレギュレーション。アルツハイマー病において過剰発現。
【表１３】
2004502453.tif 000014
【００６８】
【表１４】
2004502453.tif 000015
【００６９】
【表１５】
2004502453.tif 000016
【００７０】
【表１６】
2004502453.tif 000017
【００７１】
遺伝子名　ｓｂｇ４５８４６３ＰＥＲＬＡＸＩＮａ
【表１７】
2004502453.tif 000018
【００７２】
遺伝子名　ｓｂｇ５０７８８５ＲＤＰａおよびｓｂｇ５０７８８５ＲＤＰｂ
免疫細胞のいて強力に発現。ＯＡおよびＲＡ試料の確実な発現は、この疾患での役割を示唆している。示された大脳皮質、小脳および視床下部の外側における発現は、脳における局部的な発現を示す。
【表１８】
2004502453.tif 000019
【００７３】
【表１９】
2004502453.tif 000020
【００７４】
【表２０】
2004502453.tif 000021
【００７５】
【表２１】
2004502453.tif 000022
【００７６】
遺伝子名　ｓｂｇ５０７８８５ＲＤＰａおよびｓｂｇ５０７８８５ＲＤＰｂ
【表２２】
2004502453.tif 000023
【００７７】
遺伝子名　ＳＢｈ５１１３６４．ＮＲ−ＣＡＭａおよびＳＢｈ５１１３６４．ＮＲ−ＣＡＭｂ
滑膜において強力に発現。免疫細胞における特定の発現プロフィールおよび確実な発現の欠乏は、この発現が滑膜から誘発され得ることを示している。脳において強力に発現し、視床下部はそれより劣る。大脳皮質で低発現。
【表２３】
2004502453.tif 000024
【００７８】
【表２４】
2004502453.tif 000025
【００７９】
【表２５】
2004502453.tif 000026
【００８０】
【表２６】
2004502453.tif 000027
【００８１】
遺伝子名　ＳＢｈ５１１３６４．ＮＲ−ＣＡＭａおよびＳＢｈ５１１３６４．ＮＲ−ＣＡＭｂ
【表２７】
2004502453.tif 000028
【００８２】
遺伝子名　ＳＢｈ５１１８２７．Ｃ１ｑ−関連因子
ＴおよびＢ細胞において発現。ＯＡおよびＲＡ試料における確実な発現は、この疾患での役割を示唆している。腫瘍における発現は、免疫細胞の浸潤による。全脳および大脳皮質において高脳発現するがアルツハイマー病に関連していない。
【表２８】
2004502453.tif 000029
【００８３】
【表２９】
2004502453.tif 000030
【００８４】
【表３０】
2004502453.tif 000031
【００８５】
【表３１】
2004502453.tif 000032
【００８６】
遺伝子名 ＳＢｈ５１１８２７．Ｃ１ｑ−関連因子
【表３２】
2004502453.tif 000033
【００８７】
遺伝子名　ｓｂｇ５３３６７７ＰＡＬＳａ
喘息の肺（３／４）における確実な発現を伴う免疫細胞における発現は喘息における可能性ある役割を示唆している。心臓疾患における過剰発現は、ＣＶ疾患における役割を示唆している。ＨＳＶ感染症におけるダウンレギュレーションは可能性ある宿主細胞因子を示唆している。全脳および大脳皮質において高脳発現するがアルツハイマー病に関係していない。
【表３３】
2004502453.tif 000034
【００８８】
【表３４】
2004502453.tif 000035
【００８９】
【表３５】
2004502453.tif 000036
【００９０】
【表３６】
2004502453.tif 000037
【００９１】
遺伝子名　ｓｂｇ５３３６７７ＰＡＬＳａ
【表３７】
2004502453.tif 000038
【００９２】
遺伝子名　ｓｂｇ５３５０６７ＭＥＬＡａ
脳（アルツハイマーに変化していない）、胎児肝臓および胸腺において最も高発現。ＣＯＰＤ疾患肺におけるダウンレギュレーションは、この疾患との関連を示唆している。脾臓、ＴおよびＢ細胞、好中球および軟骨細胞における発現は、ＯＡおよびＲＡ疾患との関連を示唆するＯＡおよびＲＡ滑膜における発現を確実にする。３／４の喘息の肺におけるアップレギュレーションは、喘息との関連を示唆している。ＧＩ管発現は、ＩＢＳ、ＩＢＤおよびクローン病の要求を示唆しうる。
【表３８】
2004502453.tif 000039
【００９３】
【表３９】
2004502453.tif 000040
【００９４】
【表４０】
2004502453.tif 000041
【００９５】
【表４１】
2004502453.tif 000042
【００９６】
遺伝子名　ｓｂｇ５３５０６７ＭＥＬＡａ
【表４２】
2004502453.tif 000043
【００９７】
遺伝子名　ｓｂｇ５９０９７９ＴＨＰ
胎児肝臓において高くおよび成体肝臓いくらか発現。成体および胎児脳において発現。視床下部は、糖尿病、耐糖能異常、代謝症候群および肥満症に関する代謝疾患要求を示唆する脳発現の有意なフラクションである。乳癌における有意な発現は、この領域に十分に要求する（注意：正常における発現の欠如は、過大な倍数発現を誘発し得る）。拡張型心筋症における減少した発現は、この疾患との関連を示唆している。ＯＡおよびＲＡ滑膜における発現、および免疫細胞における確実な発現（アデノイド、扁桃、Ｔ，Ｂおよび好酸球）は、ＲＡおよびＯＡ疾患の両方との関連を示唆している。ＤＣＭ心臓における有意な減少は、拡張型心筋症との関連を示唆している。
【表４３】
2004502453.tif 000044
【００９８】
【表４４】
2004502453.tif 000045
【００９９】
【表４５】
2004502453.tif 000046
【０１００】
【表４６】
2004502453.tif 000047
【０１０１】
遺伝子名　ｓｂｇ５９０９７９ＴＨＰ
【表４７】
2004502453.tif 000048
【０１０２】
遺伝子名　ｓｂｇ６５８６２９ＣＲＦ
脳において高発現。耳下腺の発現における発現は、そのが分泌されることごを示唆している。軟骨細胞における発現は、軟骨における発現と一致する。ＨＳＶ感染ＭＲＣ５細胞におけるダウンレギュレートは、ＨＳＶ感染症に関する可能性ある宿主因子を示唆している。
【表４８】
2004502453.tif 000049
【０１０３】
【表４９】
2004502453.tif 000050
【０１０４】
【表５０】
2004502453.tif 000051
【０１０５】
【表５１】
2004502453.tif 000052
【０１０６】
遺伝子名 ｓｂｇ６５８６２９ＣＲＦ
【表５２】
2004502453.tif 000053
【０１０７】
遺伝子名　ｓｂｇ５０７１３１マンノシダーゼ
脳、特に大脳皮質、ただしアルツハイマーに変化していないものにおいて発現。皮下脂肪および含脂肪細胞において発現。胎児肝臓、胸腺および免疫細胞群（アデノイド、扁桃腺、好酸球、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞および樹状細胞）における発現は、免疫細胞機能との関連を示唆している。Ｃｌｏｎｔｅｃｈプールと比較して有意にアップレギュレートされないが、喘息の肺において発現する。ＯＡおよびＲＡ滑膜、ＯＡ骨、軟骨および軟骨細胞における発現は、ＯＡおよびＲＡとの関連を示唆している。ＨＳＶ肺細胞株における有意なダウンレギュレートは、ＨＳＶ感染症に関する可能性ある宿主因子を示唆している。皮下脂肪における発現は、脂質代謝異常および肥満症に関する要求を示唆している。
【表５３】
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【０１０８】
【表５４】
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【０１０９】
【表５５】
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【０１１０】
【表５６】
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【０１１１】
遺伝子名　ｓｂｇ５０７１３１マンノシダーゼ
【表５７】
2004502453.tif 000058
【０１１２】
遺伝子名　ｓｂｇ６５５８７１ｃａｌｇｉｚｚａｒｉｎ−ｌｉｋｅ
脳において高発現。免疫発現と同様に腸における発現は、ＩＢＳ、ＩＢＤおよびクローン病に関する要求を示唆している。胎児肝臓、胸腺、アデノイド、扁桃腺、ＴならびにＢ細胞および単球は、免疫細胞発現を確実にする。ＲＡならびにＯＡ滑膜およびＯＡ骨における発現は、これらの疾患との関連を示唆している。乳房腫瘍における有意な過剰発現は、乳癌を要求するために十分である（注意：正常における未検出発現は、過大な倍数過剰発現を誘発する）。また、正常なマスタープレートにおける組織と比較して、正常に近いおよび腫瘍組織における確実な高発現は、活性免疫細胞における発現と一致する。
【表５８】
2004502453.tif 000059
【０１１３】
【表５９】
2004502453.tif 000060
【０１１４】
【表６０】
2004502453.tif 000061
【０１１５】
【表６１】
2004502453.tif 000062
【０１１６】
遺伝子名　ｓｂｇ６５５８７１ｃａｌｇｉｚｚａｒｉｎ−ｌｉｋｅ
【表６２】
2004502453.tif 000063
【０１１７】
遺伝子名　ｓｂｇ５０６４５４ＭＰＧ−１
乳腺癌腫における有意なアップレギュレーションは、乳癌を要求するために十分である。免疫細胞群における広範囲の発現、３／４の喘息肺におけるアップレギュレート発現、およびＲＡならびにＯＡ滑膜、ＯＡ骨および軟骨における高発現は、喘、ＯＡおよびＲＡ疾患との関連を示唆している。ＧＩ管ならびに皮下脂肪における発現は、ＩＢＳ、ＩＢＤおよびクローン病における要求を示唆している。皮下脂肪および網（脂肪組織）における発現は、脂質代謝異常および肥満症の要求を示唆している。
【表６３】
2004502453.tif 000064
【０１１８】
【表６４】
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【０１１９】
【表６５】
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【０１２０】
【表６６】
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【０１２１】
遺伝子名　ｓｂｇ５０６４５４ＭＰＧ−１
【表６７】
2004502453.tif 000068
【０１２２】
遺伝子名　ｓｂｇ６５９８３７ＯＢＣＡＭ
脳、ただしアルツハイマーに変わっていない脳において最も高い。腫瘍、各々の大腸および肺において有意に増加した発現は、大腸および肺癌を要求することに対して十分である。虚血および非閉塞性ＤＣＭにおけるアップレギュレートされた発現は、これらの疾患における役割を示唆している。
【表６８】
2004502453.tif 000069
【０１２３】
【表６９】
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【０１２４】
【表７０】
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【０１２５】
【表７１】
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【０１２６】
遺伝子名 ｓｂｇ６５９８３７ＯＢＣＡＭ
【表７２】
2004502453.tif 000073
【０１２７】
遺伝子名　ｓｂｇ４６７８７０ＣＢＰ
胎児肝臓、胸腺、単球、アデノイドおよび扁桃腺における発現は、炎症における役割に一致する。２／４の喘息肺におけるアップレギュレーション、ＯＡおよびＲＡ滑膜、軟骨細胞、ＯＡ骨およびＲＡ滑液における発現は、喘息、骨粗鬆症およびリウマチ様関節炎との関連を示唆している。差別的骨芽細胞におけるアップレギュレーションおよびＯＡ骨における発現は、骨粗鬆症のような骨疾患との関連を示唆している。ＨＳＶ感染肺細胞株におけるダウンレギュレーション発現は、ＨＳＶ感染症に関する可能性ある宿主因子を示唆している。脳において発現するがアルツハイマー病に変化していない。
【表７３】
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【０１２８】
【表７４】
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【０１２９】
【表７５】
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【０１３０】
【表７６】
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【０１３１】
遺伝子名　ｓｂｇ４６７８７０ＣＢＰ
【表７７】
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【０１３２】
遺伝子名　ｓｂｇ５１４１１２ＲＮアーゼ
全てのいて低発現。４／４の大腸腺癌腫、２／４の肺癌腫および２／４の乳癌腫におけるアップレギュレーションは、全ての癌に関する要求を示唆している。脾臓、ＰＨＡ刺激ＴおよびＢ細胞、樹状細胞における発現は、ＲＡおよびＯＡ疾患との関連を示唆するＲＡおよびＯＡ滑膜の発現を確実にする。２／４喘息肺におけるアップレギュレーション発現は、喘息における役割を示唆している。虚血心臓におけるアップレギュレーションは、虚血心臓疾患との可能性ある関連を示唆している。ＨＳＶ感染細胞株において強力にアップレギュレーション発現。
【表７８】
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【０１３３】
【表７９】
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【０１３４】
【表８０】
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【０１３５】
【表８１】
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【０１３６】
遺伝子名　ｓｂｇ５１４１１２ＲＮアーゼ
【表８２】
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【０１３７】
遺伝子名　ｓｂｇ９６２２７４ＦＧＦ−ＢＰ
胎児組織において最も高発現で、脳において発現。視床下部および甲状腺における有意な発現は、甲状線疾患における要求および糖尿病、耐糖能異常、代謝症候群および肥満症に関する代謝疾患要求を示唆している。全ての３つの心臓疾患におけるアップレギュレート発現は、非閉塞性ＤＣＭ、ＤＣＭおよび虚血心臓疾患との関連を示唆している。４つの乳癌腫瘍における過剰発現は、乳癌に関する要求を示唆している（注意：正常に近い非検出発現は、過大な倍数過剰発現を誘発しうる）。ＲＡおよびＯＡ滑膜、ＯＡ骨および軟骨と共に、ＴおよびＢ細胞、樹状細胞、軟骨細胞および刺激骨髄質における免疫細胞発現は、ｉｓＯＡおよびＲＡ疾患との関与を示唆している。
【表８３】
2004502453.tif 000084
【０１３８】
【表８４】
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【０１３９】
【表８５】
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【０１４０】
【表８６】
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【０１４１】
遺伝子名　ｓｂｇ９６２２７４ＦＧＦ−ＢＰ
【表８７】
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【０１４２】
【表８８】
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【国際公開パンフレット】
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2004502453.tif 000239
2004502453.tif 000240
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502453.tif 000241
【国際調査報告】
2004502453.tif 000242
2004502453.tif 000243
2004502453.tif 000244