(57)【要約】本発明は少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性を調節することを含む、血管形成及び／又はアポトーシスを調節するための方法を提供する。本発明はまたＶＥＧＦ調節遺伝子の発現に関連する疾患の予防又は治療のための、血管形成及びアポトーシスを調節する製薬組成物を提供する。本発明はまたＶＥＧＦ調節遺伝子をコードする天然に生じる配列とハイブリダイズするＶＥＧＦ調節遺伝子ポリヌクレオチド及びタンパク質に特異的に結合する抗体を使用する診断アッセイ法を提供する。本発明はまた新規なヒト及びマウスアルギニンリッチタンパク質（ＡＲＰｓ）とヌクレオチド配列を提供する。本発明はＡＲＰｓをコードする核酸配列を含む遺伝子操作発現ベクター及び宿主細胞とタンパク質を生産する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３又は配列番号：２２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが活性なＡＲＰポリペプチドである請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：３又は配列番号：２２の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号：３又は配列番号：２２の配列と少なくとも９８％の配列同一性を有する請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１ないし４の何れか１項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖。
【請求項６】
配列番号：２又は配列番号：２１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖。
【請求項７】
配列番号：２、又は配列番号：２１の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖。
【請求項８】
配列番号：２又は配列番号：２１の配列と少なくとも９８％の配列同一性を有する請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖。
【請求項９】
請求項１ないし４の何れか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１０】
少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性を調節することを含んでなる、血管形成の調節方法。
【請求項１１】
上記血管形成の調節が血管形成の増大であり、上記活性の調節が、ネキシン、胎盤タンパク５（ＰＰ５）、アミロイド前駆体様タンパク２（ＡＰＬＰ２）、Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子−３（ＲＧＳ３）、グラビン、アルギニンリッチタンパク質（ＡＲＰ）、ダウン症必須領域タンパク−１（ＤＳＣＲ１）、インスリン誘導遺伝子−１（ＩＮＳＩＧ１）、プロゲステロン誘導脱落タンパク（ＤＥＰＰ）、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖１（ＮＤ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ＭＫＰ−１様プロテインチロシンホスファターゼ、オステオニドジェン及び結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの活性を増加させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記血管形成の調節が血管形成の低減であり、上記活性の調節が、アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）、酵母ＶＰＳ４１に類似のヒト遺伝子（ｈＶＳＰ４１ｐ）、チトクロムオキシダーゼサブユニットＩ（ＭＴＣＯ１）、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＮＤ４）からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの活性を増加させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
上記血管形成の調節が血管形成の低減であり、上記活性の調節が、ネキシン、ＰＰ５、ＡＲＬＰ２、ＲＧＳ３、グラビン、ＡＲＰ、ＤＳＣＲ１、ＩＮＳＩＧ１、ＤＥＰＰ、ＮＤ１、ＨＢ−ＥＧＦ、ＭＫＰ−１様プロテインチロシンホスファターゼ、オステオニドジェン及びＣＴＧＦからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの活性を減少させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
上記血管形成の調節が血管形成の増大であり、上記活性の調節が、ＡＰＰ、ｈＶＰＳ４１ｐ、ＭＴＣＯ１及びＮＤ４からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの活性を減少させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
上記活性の増加が、上記少なくとも１種のポリペプチドの発現を増加させることを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記活性の減少が、上記少なくとも１種のポリペプチドの発現を減少させることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
上記発現の増加が、細胞を形質転換して、上記少なくとも１種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を増加させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
上記発現の減少が、細胞を形質転換して、上記少なくとも１種のポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの少なくとも一部に対してアンチセンスなポリヌクレオチドを発現させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
上記活性の減少が、細胞を形質転換して、上記少なくとも１種のポリペプチドに対するアプタマーを発現させることを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２０】
上記活性の減少が、上記少なくとも１種のポリペプチドに対するアプタマーを細胞中に導入することを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２１】
上記活性の減少が、上記少なくとも１種のポリペプチドに選択的に結合する抗体を細胞に投与することを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１２又は１３に記載の方法によって、血管形成を低減させることを含む、腫瘍の治療方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって癌性腫瘍を治療することを含む、癌の治療方法。
【請求項２４】
請求項１１又は１４に記載の方法によって血管形成を増大させることを含む、心筋梗塞の治療方法。
【請求項２５】
請求項１１又は１４に記載の方法によって血管形成を増大させることを含む、治癒の促進方法。
【請求項２６】
化合物のＶＥＧＦ調節遺伝子の転写の上方制御又は下方制御活性を測定する方法であって、
上記化合物を、ＲＮＡポリメラーゼと上記遺伝子を含有する組成物に接触させ、ＶＥＧＦ調節遺伝子転写の量を測定することを含む方法。
【請求項２７】
上記組成物が細胞中にある、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
化合物のＶＥＧＦ調節遺伝子の翻訳の上方制御又は下方制御活性を測定する方法であって、
上記化合物を、上記遺伝子のｍＲＮＡに対応するポリヌクレオチドとリボソームを含有する組成物に接触させ、ＶＥＧＦ調節遺伝子翻訳の量を測定することを含む方法。
【請求項２９】
上記組成物が細胞中にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項５ないし８の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３２】
腫瘍発生の可能性について組織サンプルをスクリーニングする方法であって、
上記組織サンプル中における少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子の発現を測定することを含む、方法。
【請求項３３】
上記測定が、上記少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子によりコードされるポリペプチドの量を測定することである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記発現の測定が、上記少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子に対応するｍＲＮＡの量を測定することである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
破壊されたＡＲＰを有する、遺伝子組換え非ヒト動物。
【請求項３６】
非ヒト動物がマウスである請求項３５に記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
【請求項３７】
配列番号：２又は配列番号２１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する外来性のポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖を含む遺伝子組換え非ヒト動物。
【請求項３８】
上記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号：２又は配列番号：２１の配列、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３７に記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
【請求項３９】
上記外来性ポリヌクレオチドが、配列番号：２又は配列番号：２１の配列、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項３７に記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
【請求項４０】
ＡＲＰ変異についてサンプルをスクリーニングする方法であって、
サンプル中のＡＲＰヌクレオチド配列を配列番号：２又は配列番号２１と比較することを含む、方法。
【請求項４１】
ネキシン、ＰＰ５、ＡＲＬＰ２、ＡＰＰ、グラビン、ＡＲＰ、ＤＳＣＲ１、ＭＴＣＯ１、ＮＤ１、ＮＤ４、ＨＢ−ＥＧＦ、ＭＫＰ−１様プロテインチロシンホスファターゼ、オステオニドジェン及びＣＴＧＦからなる群から選択される少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性を調節することにより、細胞生存を調節する方法。
【請求項４２】
上記細胞生存の調節が、細胞生存を増大させることであり、上記活性の調節が、ネキシン、ＰＰ５、ＡＲＬＰ２、ＡＰＰ、グラビン、ＡＲＰ、ＤＳＣＲ１、ＭＴＣＯ１、ＮＤ１、ＮＤ４、ＨＢ−ＥＧＦ、オステオニドジェン及びＣＴＧＦからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの活性を増加させることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
上記細胞生存の調節が、細胞生存を低減させることであり、上記活性の調節が、少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性を増加させることを含み、該ＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドがＭＫＰ−１様プロテインチロシンホスファターゼである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
上記細胞生存の調節が、細胞生存を低減させることであり、上記活性の調節が、ネキシン、ＰＰ５、ＡＲＬＰ２、ＡＰＰ、グラビン、ＡＲＰ、ＤＳＣＲ１、ＭＴＣＯ１、ＮＤ１、ＮＤ４、ＨＢ−ＥＧＦ、オステオニドジェン及びＣＴＧＦからなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドの活性を減少させることを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
上記細胞生存の調節が、細胞生存を増大させることであり、上記活性の調節が、少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性を減少させることを含み、該ＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドがＭＫＰ−１様プロテインチロシンホスファターゼである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
上記活性の増加が、上記少なくとも１種のポリペプチドの発現を増加させることを含む、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４７】
上記活性の減少が、上記少なくとも１種のポリペプチドの発現を減少させることを含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４８】
上記発現の増加が、細胞を形質転換して、上記少なくとも１種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を増加させることを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
上記発現の減少が、細胞を形質転換して、上記少なくとも１種のポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの少なくとも一部に対してアンチセンスなポリヌクレオチドの発現を減少させることを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
上記活性の減少が、細胞を形質転換して、上記少なくとも１種のポリペプチドに対するアプタマーを発現させることを含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項５１】
上記活性の減少が、上記少なくとも１種のポリペプチドに対するアプタマーを細胞中に導入することを含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項５２】
上記活性の減少が、上記少なくとも１種のポリペプチドに選択的に結合する抗体を細胞に投与することを含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４３又は４４に記載の方法によって細胞生存を低減させることを含む、腫瘍の治療方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法によって癌性腫瘍を治療することを含む、癌の治療方法。
【請求項５５】
上記少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子がＤＳＣＲ１である、請求項４１、４２、４４及び４６ないし５４の何れか１項に記載の方法。
【請求項５６】
サンプル中における少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子の発現を、コントロールサンプル中における上記少なくとも１種の遺伝子の発現と比較することを含む、腫瘍の臨床病期を決定する方法。
【請求項５７】
上記少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子が、ＤＳＣＲ１とＡＲＰからなる群から選択される少なくとも一のメンバーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
上記サンプルが卵巣腫瘍のサンプルである請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項５９】
腫瘍に転移の可能性があるかどうかを決定する方法であって、請求項５６ないし５８の何れか１項に記載の方法によって上記腫瘍の臨床病期を決定することを含む、方法。
【請求項６０】
上記化合物がカルシウムチャネル調節因子である、請求項２６ないし２９の何れか１項に記載の方法。
【請求項６１】
上記カルシウムチャネル調節因子が、ニカルジフィン、ニフェジピン、ベラパミル及びジルチアゼムからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０００年３月２１日に出願した米国仮出願第６０／１９１２０１号に基づく優先権を主張する。
（背景）
都市には道路や路地があり、植物には木質部や篩部があり、人々には動脈、静脈及びリンパ管がある。これらの管路なしには、脊椎動物細胞は餓死するか、その代謝廃棄物中でおぼれるであろう。血管は食物や酸素を運び、代謝廃棄物を運び去るばかりでなく、遠隔位置にあるが応答する必要がある細胞に通告するシグナル伝達物質を移送する。ホルモンのメッセージは一般的なシグナルである。
全ての血管は内腔壁を裏打ちする極めて可塑性の内皮細胞の傷つきやすい単層と基底層による鞘で覆われている。位置と機能に応じて、平滑筋と結合組織も存在している。
【０００２】
健康な細胞ばかりでなく、所望されない細胞：腫瘍発生及び悪性細胞も、循環系により移送される血液源に依存している。これらの細胞はコロニー化し、それら自身に血液源を流用可能であるならば増殖する。新しい血管が既存の血管の増殖から派生するタイプの血管形成（Ｒｉｓａｕ， １９９５；Ｒｉｓａｕ及びＦｌａｍｍｅ， １９９５）は、例えば傷の治癒又は心筋梗塞の回復におけるような通常のプロセスによってばかりでなく、腫瘍それ自体、及び癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、乾癬及び慢性関節リウマチによってもなされる。そのプロセスにかかわらず、病理的であれ通常の生理的であれ、内皮細胞は多段階の様式で血管形成を媒介する：（１）内皮細胞が細胞外合図を受け、（２）分泌されたプロテアーゼにより、シグナルを受けた細胞が基底膜鞘を破壊し、（３）ついで細胞がシグナルにより移動して増殖し、最後に（４）細胞が管を形成して、形態形成がなされる（Ａｌｂｅｒｔｓら， １９９４）。このプロセスの複雑さは、細胞生理及び形態、遺伝子発現及びシグナル伝達における複雑な変化に示される。合図である血管形成の協力物質には、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＥ）、アンジオポイエチン（例えばＡＮＧ１）及び種々の形態の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれる。
【０００３】
ＶＥＧＦは、腫瘍細胞を含む、多くの細胞により分泌される多機能細胞分裂促進剤である（Ｆｅｒｒａｒａ， １９９９ｂ）。血管内皮細胞（ＶＥＣ）は２つのレセプター：（１）キナーゼ挿入ドメイン含有レセプター／胎児肝臓キナーゼ１（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１；ＶＥＧＦＲ１）、及び（２）Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ＦＬＴ−１；ＶＥＧＦＲ−２）（Ｗａｒｒｅｎら， １９９５）を使用して、ＶＥＧＦに反応する。これらのレセプターはＶＥＧＦに対し異なる親和性を有し、異なる細胞反応性を有すると思われる（Ａｔｈａｎａｓｓｉａｄｅｓ及びＬａｌａ， １９９８；Ｌｉら， １９９９）。ＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ−２がないマウスは胚発生の初期で死亡する（Ｆｏｎｇら， １９９５；Ｓｈａｌａｂｙら， １９９５）。これらのノックアウト研究から、ＶＥＧＦＲ１は血島形成と造血性前駆細胞の発生に必要である一方（Ｓｈａｌａｂｙら， １９９５）、ＶＥＧＦＲ−２は胚性脈管構造の組織化に必要である（Ｆｏｎｇら， １９９５）。これら２種のレセプターのなかで、ＶＥＧＦＲ１は有糸分裂誘発、血管拡張及び腫瘍血管新生を含む、ＶＥＧＦの生物学的効果の全範囲を媒介する一方（Ｆｅｒｒａｒａ， １９９９ａ）、ＶＥＧＦＲ−２は内皮生存を促進する（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら， １９９９）。
【０００４】
分子イベントとそれらが生じる順序とこのプロセスに必要な経路は、血管形成を理解するために基本的に重要である。インヴィトロモデルは、血管形成中に生じる遺伝子発現の変化を同定するために有用である。特に有益なモデル系には、３次元Ｉ型コラーゲンゲルと種々の刺激剤、例えば酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びＶＥＧＦとの縣濁液が含まれる。刺激剤とコラーゲンゲルとの組合せにより、相互に連絡する内腔構造を有する内皮細胞の３次元管状網状組織が形成される。このモデルでは、管状構造体への内皮分化は、新規のｍＲＮＡ又はタンパク質合成のインヒビターにより完全にブロックされる。さらに、細胞は、協調的かつ同調的な形での分化を通して発達し、遺伝子発現の性状が最適化される（Ｋａｈｎら， ２０００；Ｙａｎｇら， １９９９）。
【０００５】
ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２は内皮細胞の生存を確実にする。発育中の網膜においては、隣接する細胞によるＶＥＧＦ分泌の阻害に相関し、毛細管が過剰酸素症（酸素／酸素圧の増加）に応じて消失する。これらの血管は、内皮細胞の選択的アポトーシスにより消失する（Ａｌｏｎら， １９９５）。機能ブロック抗ＶＥＧＦ抗体を使用してＶＥＧＦを除去すると、また血管、さらには腫瘍の脈管構造を退行させる（Ｙｕａｎら， １９９６）。細胞生存を促進するＶＥＧＦの能力を媒介するメカニズムはＶＥＧＦＲ−２に関連している。ＶＥＧＦＲ−２のライゲーションにより、細胞内皮（ＶＥ）−カドヘリン、β−カテニン、ホスホイノシチド−３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）、及びＶＥＧＦＲ１の複合体が誘導される。ＰＩ３−Ｋが、セリン／スレオニンプロテインキナーゼＡｋｔ（プロテインキナーゼＢ）をリン酸化し活性化する（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら， １９９９）。活性化されたＡｋｔは、ＶＥＧＦ−依存性生存シグナルの媒介に必要であり、また十分なものである（Ｇｅｒｂｅｒら， １９９８）。
【０００６】
プログラムされた細胞死、すなわちアポトーシスと、細胞生存は、発生、ホメオスタシス、ストレス及び種々の病状において重要な役割を担っている。アポトーシス（ネクローシスと対照的）はカスパーゼにより媒介される。カスパーゼは、プロアポトーシス性刺激に反応して活性化される不活性なプロ酵素として健康な細胞中に存在する。ミトコンドリアは、サイトゾル中にチトクロムｃを放出し、アダプター分子Ａｐａｆ−１（アポトーシス性プロテアーゼ活性化因子１）に結合することによりカスパーゼを活性化する。Ａｐａｆ１はプロカスパーゼ−９をオリゴマー化し、補充し、活性化する。活性化されたカスパーゼ−９は下流のカスパーゼを活性化し、アポトーシスが開始される。チトクロムｃはミトコンドリアの透過性増大（ＰＴ）孔を通って放出される。Ｂｃｌ−２という抗アポトーシスインヒビターは、ＰＴ孔と相互作用してチトクロムｃの放出を防止する（Ｍａｒｚｏら， １９９８）。ＶＥＧＦはＶＥＣにおいてＢｃｌ−２の発現を誘発し、ミトコンドリアの透過性の調節がＶＥＧＦ生存メカニズムの一部であることを示している（Ｇｅｒｂｅｒら， １９９８）。
【０００７】
腫瘍細胞は血管形成を利用し、腫瘍成長を助長する。低酸素症−酸素レベルの低減−は腫瘍細胞を誘導してＶＥＧＦを分泌させ、新血管新生を促進する。ＶＥＧＦの分泌に加えて、造血細胞（Ｂｅｌｌａｍｙら， １９９９）、乳癌細胞（Ｓｐｅｉｒｓ及びＡｔｋｉｎ， １９９９）及びカポジ肉腫（Ｍａｓｏｏｄら， １９９７）を含む腫瘍細胞ではＶＥＧＦＲ１が発現している。ＶＥＧＦは、パラ分泌及び自己分泌の双方の方式で作用可能で、内皮の増殖と生存を刺激する。ＶＥＧＦとそのレセプターに加えて新血管新生を媒介し、最終的に、腫瘍の生存を可能にする分子は、腫瘍の診断、特徴付け及び最終的には治療に有用である。
【０００８】
ＶＥＧＦにより調節される遺伝子を同定することは、細胞増殖、リモデリング等々を含む、複雑な内皮応答を理解するのに有用であるばかりでなく、多様な診断的また治療的用途にも有用である。例えば、ミトコンドリアのチトクロムｃの放出がアポトーシスとそのような作用を阻害するＶＥＧＦの保護効果を開始するため、ＶＥＧＦにより調節される遺伝子を決定することは、治療的にアポトーシスを制御するのに有用である。このような遺伝子とそれらのタンパク質は、例えば遺伝子療法、又は遺伝子もしくはタンパク質それ自体の発現に作用する物質の発見により、調節され得る。ＶＥＧＦ調節遺伝子の発現の評価は、腫瘍細胞の転移の可能性を評価するのに使用することができる。血管新生アッセイのための内皮特異的マーカーの収集物は腫瘍成長のアッセイに使用することができる。種々の病状はＶＥＧＦ媒介性血管形成を用いることにより治療され得る。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、ＶＥＧＦ又は関連するサイトカインに反応して差次的に発現されるいくつかのＶＥＣ遺伝子に関する。これらの差次的に発現される遺伝子は「ＶＥＧＦ調節遺伝子（ＶＥＧＦｍｇ）」と称され：
１）グリア由来神経突起促進因子（ＧＤＮＰＦ）／ネキシン
２）組織因子経路インヒビター−２（ＴＥＰＩ２）／胎盤タンパク５（ＰＰ５）
３）ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）
４）Ｇタンパク質シグナル伝達の制御因子−３（ＲＧＳ３）
５）重症筋無力症（ＭＧ）自己抗原／グラビン（ｇｒａｖｉｎ）
６）ＭＫＰ−１様プロテインチロシンホスファターゼ
７）アミロイド前駆体様タンパク２（ＡＰＬＰ２）ＣＥＩ−ボックス結合タンパク
８）オステオニドジェン（ｏｓｔｅｏｎｉｄｏｇｅｎ）（ニドジェン−２前駆体）
９）アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）
１０）酵母ＶＰＳ４１類似のヒト遺伝子（ｈＶＰＳ４１ｐ）
１１）アルギニンリッチタンパク質（ＡＲＰ）
１２）ダウン症必須領域タンパク−１（ＤＳＣＲ１）
１３）インスリン誘発遺伝子−１（ＩＮＳＩＧ１）
１４）プロゲステロン誘導脱落タンパク（ＤＥＰＰ）
１５）チトクロムオキシダーゼサブユニットＩ（ＭＴＣＯ１）
１６）ＮＡＤＨユビキノンオキシドレダクターゼ鎖１（ＮＤ１）
１７）ＮＡＤＨユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＮＤ４）
１８）結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）
である。
【００１０】
第１の側面では、本発明は、配列番号：３又は配列番号：２２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたポリペプチド、それらをコードするポリヌクレオチド、及びそれらと特異的に結合する抗体にある。
第２の側面では、本発明は、配列番号：２又は配列番号：２１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する単離されたポリヌクレオチド、又はその相補鎖にある。
第３の側面では、本発明は破壊されたアルギニンリッチタンパク質（ＡＲＰ）遺伝子を有する遺伝子組換え非ヒト動物、又は配列番号：２又は配列番号：２１の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する外来性ポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖を発現している遺伝子組換え非ヒト動物にある。
第４の側面では、本発明は、ＡＲＰ変異のサンプルをスクリーニングするための方法にある。
【００１１】
第５の側面では、本発明は、少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性を調節することを含む、血管形成を調節する方法にある。
第６の側面では、本発明は、少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性を調節することを含む、血管形成を増大並びに低減する方法にある。ＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性の調節は、遺伝子を過剰発現させるか、又は発現をなくするか、もしくは特異的アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば抗体又はアプタマーと接触させることによりＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの機能を損傷させることによりなされ得る。
第７の側面では、本発明は、腫瘍、癌、心筋梗塞等を含む、種々の病状の治療方法にある。
第８の側面では、本発明は、化合物の、ＶＥＧＦ調節遺伝子の転写及び翻訳の上方制御又は下方制御活性を測定する方法にある。ある実施態様では、化合物はカルシウムチャネル調節因子である。
【００１２】
第９の側面では、本発明は、腫瘍発生の可能性について組織サンプルをスクリーニングする方法にある。
第１０の側面では、本発明は、少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性を調節することにより、細胞生存を調節する方法にある。
第１１の側面では、本発明は、少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性を調節することを含む、細胞生存を増大並びに低減させる方法にある。ＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの活性調節は、遺伝子を過剰発現させるか、又は発現をなくするか、もしくは特異的アンタゴニスト又はアゴニスト、例えば抗体又はアプタマーと接触させることによりＶＥＧＦ調節遺伝子ポリペプチドの機能を損傷さあせることによりなされ得る。
第１２の側面では、本発明は、ＶＥＧＦ調節遺伝子を調節することにより細胞生存を低減させることを含む、腫瘍及び癌の治療方法にある。一実施態様では、調節遺伝子はＤＳＣＲ１である。
【００１３】
第１３の側面では、本発明は、コントロールサンプルにおける少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子の発現と、サンプルにおける少なくとも１種のＶＥＧＦ調節遺伝子の発現を比較することによる、腫瘍の臨床病期を決定する方法にある。他の実施態様では、ＶＥＧＦ調節遺伝子はＤＳＣＲ１及び／又はＡＲＰである。
第１４の側面では、本発明は、腫瘍の臨床病期を決定することにより、腫瘍が転移する可能性があるか否かを決定する方法にある。
ここに記載したものと類似もしくは等価な方法及び物質を、本発明の実施又は試験に使用することは可能ではあるが、適切な方法及び物質を以下に記載しておく。物質、方法及び実施例は例証のためだけのものであって、限定することを意図したものではない。
【００１４】
（発明の詳細な記載）
ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（Ｓｈｉｍｋｅｔｓら， １９９９）と称される増幅及び画像化アプローチ法を使用して、ＶＥＧＦにより刺激された内皮細胞に差次的に発現する遺伝子を同定した。この方法は、既知の遺伝子と新規遺伝子の双方におけるｍＲＮＡの多さの定量的差異の感度の高い検出に関連して、ｃＤＮＡ集団の包括的サンプリングを提供するものである（Ｓｈｉｍｋｅｔｓら， １９９９）。本発明では、１８の差次的に発現した遺伝子を開示している。これら遺伝子の同定と差次的発現は、実時間定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用する第二の独立した方法により確認される。一般に、本発明は血管形成及び細胞生存に対するＶＥＧＦ調節遺伝子に関連する。
【００１５】
定義
他に定義しない限り、全ての技術的及び科学的用語は本発明の属する技術分野において当業者によって通常理解されるものと同一の意味を持つ。以下の定義は明確にするために示されるものである。
遺伝学に関係する（Ｄｅｍｅｒｅｃ等， １９６６）の推奨をここに適応させる。遺伝子（及び関連する核酸）とそれらがコードするタンパク質とを区別するために、遺伝子に対する略語はイタリック体（又は下線）で示され、一方タンパク質に対する略語は大文字で開始し、イタリック体ではない。従って、アルギニンリッチタンパク質（ＡＲＰ）又はアルギニンリッチタンパク質（ＡＲＰ）は、ＡＲＰをコードするヌクレオチド配列を称する。同様に、ＶＥＧＦｍｇはＶＥＧＦ調節遺伝子のヌクレオチド配列及び断片を表す一方、ＶＥＧＦｍｇはコードされたポリペプチド及び断片を意味する。
分子を指す場合に「単離された」とは、同定され、その天然の環境の成分から分離され及び／又は回収された分子を意味する。その天然の環境の夾雑成分とは診断又は治療上の使用を妨害する物質である。
「生存」とは、血清不足及び低酸素を含む細胞ストレスの状態下でさえ、その形態及び生理学的活性の全て又はほとんどを維持し、生存し続けている細胞のことである。
【００１６】
細胞におけるＶＥＧＦ調節遺伝子の役割
１．アポトーシス
細胞生存は、酸化ストレス及び血清欠乏化を含むストレス下で侵害される。ＶＥＧＦ刺激により、反応性酸素種（ＲＯＳ）により誘発される致死量以下の酸化ストレスの反応に類似した反応が喚起されると思われる。細胞生存における重要な要因はミトコンドリアの呼吸である。本発明のいくつかのＶＥＧＦ調節遺伝子、例えばＤＳＣＲ１、グラビン及びＨＢ−ＥＧＦはまたＲＯＳ反応に関連している（Ｋａｙａｎｏｋｉら， １９９９）。さらに、ＶＥＧＦ投与により、いくつかのミトコンドリア遺伝子（例えば、チトクロムｃオキシダーゼサブユニット及びＮＡＤＨ−ユビキノンレダクターゼ鎖１、４及び５；実施例）は下方制御され、呼吸は阻害される。
いくつかの知見により、本発明のＶＥＧＦ調節遺伝子の細胞生存における役割とそれらのミトコンドリア呼吸との関連性が裏付けされている。酸化ストレスは、ＨＡ−１線維芽細胞におけるミトコンドリアポリヌクレオチドの一般的なカルシウム依存性分解を引き起こす（Ｃｒａｗｆｏｒｄら， １９９８）。抗前立腺癌化合物ＢＭＤ１８８にさらされた場合、アポトーシス誘発性は、ミトコンドリア呼吸鎖に依存する（Ｊｏｓｈｉら， １９９９）。最後に、ミトコンドリアＲａｆ−１は、アポトーシスに抗するＡｋｔに反応して活性化される（Ｍａｊｅｗｓｋｉら， １９９９）。
【００１７】
本明細書においてその差次的な発現が確認され、ミトコンドリアに局在化する可能性のある全ての遺伝子は、ここに開示する実験に基づき、細胞生存において重要な成分であることが確認された。これらの遺伝子にはＤＳＣＲ１、ＡＲＰ、ＩＮＳＩＧ１及びＤＥＰＰが含まれ、重要な治療目的を表している。ＤＳＣＲ１が過剰発現すると、ヒト臍管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）におけるアポトーシスが促進させることができたが、アンチセンスＤＳＣＲ１が発現すると、活性化ＡＫＴが発現した場合と類似したレベルまで細胞生存が促進された（図１を参照）。
それらの基質から剥離した接着細胞はアポトーシスを受ける。それらが結合している基質、例えば細動脈及び細静脈の内側及び外側の細胞外マトリックス層に欠陥があるか、又はこれらが除去されると、細胞は死亡する。これらのマトリックスは、血管形成中に内皮細胞により補充される間葉細胞から一部分泌される。成長因子ＨＢ−ＥＧＦは、間葉細胞の増殖及び遊走を刺激し、例えば腎臓内皮細胞生存を促進する（Ｔａｋｅｍｕｒａら， １９９７）。
【００１８】
セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）活性は内皮における細胞死を防止し得る。血管形成中に内皮細胞が浸潤性の新しい非血管新生組織及びストローマである場合、トロンビン様活性を有するセリンプロテアーゼが存在する。セルピンであるネキシンは、トロンビン活性、組織の損傷部位に生成される多機能セリンプロテアーゼをブロックすることにより神経突起の成長及び生存を促進する。トロンビンは細胞表面プロテアーゼ活性化レセプター（ＰＡＲ−１）を介して作用し、細胞内の遊離のカルシウムレベル（［Ｃａ２＋］ｉ）を増加させる（Ｓｍｉｔｈ−Ｓｗｉｎｔｏｓｋｙら， １９９５）。本発明では、セリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）ネキシン及び胎盤タンパク質５（ＰＰ５）／ＴＥＰＩ２（ＴＦＰＩ２）がＶＥＧＦに反応して誘導されることを証明している。ＡＰＰ及びＡＰＬＰ２は、これらの膜結合タンパク質が、エンド型タンパク分解的に加工され、セルピン様特性を有する分泌形態を生じるために、セルピン様の役割を担うものと思われる。
【００１９】
本発明で差次的に発現され、同定された遺伝子の説明
いくつかの遺伝子は、ＶＥＧＦ又は関連サイトカインと接触する場合に、ＶＥＣｓにおいて差次的に発現され、４つの一般的なクラスに分割することができる（表１）。これらの遺伝子は、集合的に「ＶＥＧＦ調節遺伝子」（ＶＥＧＦｍｇ）、「ＶＥＧＦ調節遺伝子の組」又は「ＶＥＧＦと反応性のある遺伝子」と称される。さらに、ＶＥＧＦ調節遺伝子としては、新規の形態のＡＲＰが開示される。セルピン、Ｇタンパク質関連レセプター制御因子及び選択されたミトコンドリアタンパク質のクラスが特に好ましい。
2004501608.tif 000002
【００２０】
１．セルピン
セルピンは、セリンプロテアーゼインヒビターであり；それらは分泌性であっても、膜結合性であってもよい。ＶＥＧＦ調節セルピンには、ネキシン、ＰＰ５、ＡＰＬＰ２及びＡＰＰが含まれる。
【００２１】
（ａ）ネキシン／グリア由来神経突起促進因子（ＧＤＮＰＦ）
プロテアーゼネキシンＩ（ＰＮＩ又はＰＮ１；Ｇｅｎｂａｎｋ Ａ０３９１１；配列番号：４及び５；（Ｍｏｎａｒｄら， ＥＰ２３３８３８， １９９０））は、トロンビンの神経突起阻害活性を除去することにより、星状細胞及び神経細胞からのインヴィトロでの神経突起の成長及び生存を促進する。ネキシンは、トロンビンと翻訳後共有結合複合体を形成することにより、トロンビンのタンパク質分解活性を調節する（Ｓｍｉｔｈ−Ｓｗｉｎｔｏｓｋｙら， １９９５）。多機能セリンプロテアーゼであるトロンビンは、組織損傷部位で急速に生成され、血液凝固の最終段階を触媒する。
本発明ｄえは、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ分析により、２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞においてネキシンが上方制御されていることが示される（実施例１）。
【００２２】
（ｂ）胎盤タンパク５（ＰＰ５）／ＴＦＰＩ２（ＴＦＰＩ２）
ＰＰ５／ＴＦＰＩ２（配列番号：６及び７；ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００６５２８， Ｄ２９９９２）は、多くの、血液凝固及び線維素溶解セリンプロテアーゼを阻害する。胚形成において、ＰＰ５は栄養芽細胞の分化に関与しており、絨毛間の血流維持に助力している。ＰＰ５はまた卵巣腺癌に頻繁に発現する（Ｉｎａｂａら， １９８２）。ＰＮ１と同様、ＰＰ５はトロンビン活性をブロックすることにより作用する。
ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ分析により、２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞においてＰＰ５が上方制御されていることが見出された（実施例１）。
【００２３】
（ｃ）アミロイド前駆体様タンパク２（ＡＰＬＰ２）
ヒトアミロイド前駆体様タンパクＡＰＬＰ２（配列番号：８及び９；ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ２７６３１）は、アルツハイマーペプチド前駆体（ＡＰＰ）ファミリーに属する。アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）に構造的には関連しているが、ＡＰＬＰ２は異なった形で機能する。ＡＰＰと同様、ＡＰＬＰ２は膜貫通ドメインとＫｕｎｉｔｚ型プロテアーゼインヒビタードメインを含むが；ＡＰＰとは異なり、ＡＰＬＰ２は、セントロメアＤＮＡ配列エレメントＩ（ＣＤＥＩ）モチーフ（５’−ＧＴＣＡＣＡＴＧ−３’；配列番号：１０）を認識する、ＤＮＡに結合する（Ｙａｎｇら， １９９６）。
ＡＰＬＰ２は細胞の生存経路において重要な成分であると思われる。ＡＰＬＰ２の発現はアポトーシスを受けているＰＣ１２ニューロン細胞で増加しており（ＡｒａｋｉとＷｕｒｔｍａｎ， １９９８）、プロテアーゼインヒビターであると予想される。
ＡＰＬＰ２は、２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞において上方制御されていた。この結果はＴａｑｍａｎＴＭ分析により確認された（実施例を参照）。
【００２４】
（ｄ）アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）
アミロイド前駆体タンパク（配列番号：１１及び１２；ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ８７６７５）は、遍在的に発現される膜スパニング糖タンパク質であり、エンド型タンパク分解的に加工されて、プロテアーゼネキシンＩＩ（ＰＮ２）と同一の分泌タンパク質を産出し、内部移行した１１．５ｋＤａ、１００残基のＣ末端誘導体（ＣＴＤ）である。ＰＮ２は、トリプシン等のプロテイナーゼのインヒビターである。ＡＰＰは、アルツハイマー病（ＡＤ）のアミロイドプラークに沈着する主成分である３９−４３アミノ酸ペプチドであるβ−アミロイド（Ａβ）源である。ＡＰＰを発現するニューロンはアポトーシスから保護されているが（Ｘｕら， １９９９）、内皮におけるＡＰＰの過剰発現は毒性である（Ｊａｈｒｏｕｄｉら， １９９８）。
ＡＰＰは、６及び２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞において下方制御される（実施例１）。
【００２５】
２．Ｇタンパク質シグナル伝達レセプターの制御因子
Ｇタンパク質シグナル伝達レセプターの２種の制御因子は、ＲＧＳ３及びグラビンを含み、ＶＥＧＦで調節されている。
（ａ）Ｇタンパク質シグナル伝達制御因子３（ＲＧＳ３、ＲＧＰ３）
シグナル伝達経路を長時間刺激すると、応答性が低減する。この脱感作は、Ｇタンパク質関連レセプターによるＭＡＰキナーゼの活性化が損なわれるために生じる。ＲＧＳ３（配列番号：１３及び１４；ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２７６５５）は、Ｓｓｔ２ｐ、つまり脱感作を媒介する酵母遺伝子の相同体をコードする（Ｄｒｕｅｙら， １９９６）。ＲＧＳ３は、Ｇタンパク質αサブユニットのＧＴＰアーゼ活性を増加させ、それらを不活性なＧＤＰ結合形態にすることで、シグナル伝達を阻害する。
ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ分析（実施例１）により、２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞においてＲＧＳ３が上方制御されていることが明らかにされる。インサイツハイブリッド形成分析により、腫瘍及び肉腫、並びに成人の筋細胞においての高度な発現が明らかにされている（実施例を参照）。ＲＧＳ３発現は卵巣癌におけるＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ１の発現に相関しており、シグナル伝達経路が内皮細胞と腫瘍細胞との間で類似していることを示唆している。
【００２６】
（ｂ）グラビン／重症筋無力症（ＭＧ）自己抗原／Ａキナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ２５０）
グラビン（配列番号：１５及び１６；ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ８１６０７）は、アンカータンパク質ファミリーに属し、細胞下部位に対してプロテインキナーゼＡ及びＣの双方が固着する（Ｎａｕｅｒｔら， １９９７）。グラビンは酸化反応により誘発され（Ｓａｔｏら， １９９８）、ＲＧＳ３と同様にアゴニスト誘発性脱感作からの回復を媒介する（Ｓｈｉｈら， １９９９）。
ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ分析（実施例１）により、６及び２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞においてグラビンが上方制御されていることが明らかにされる。また、インサイツハイブリッド形成分析により、胎児組織及び非血管腫瘍成分において高発現し、成人組織及び腫瘍血管成分において低発現であることが示された。グラビン発現は卵巣癌におけるＶＥＧＦ発現と相関している（実施例）。
【００２７】
３．ミトコンドリアタンパク質
（ａ）アルギニンリッチタンパク質（ＡＲＰ）
本発明は、新規のアルギニンリッチタンパク質の核酸及びポリペプチド配列（配列番号：２、３、２１及び２２；表２及び３）を開示している。
以前に開示されたヒトＡＲＰ（配列番号：１（アミノ酸）及び１７（ヌクレオチド）；ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００６０１０， Ｍ８３７５１）は、ヒト染色体バンド３ｐ２１にマッピングし、塩基性で２３４アミノ酸残基のポリペプチドをコードする。高度に保存されたＡＲＰは、ハムスター、ラット、マウス、ウシ及び酵母を含む、全ての検査種に見出される（Ｓｈｒｉｄｈａｒら， １９９６ａ；Ｓｈｒｉｄｈａｒら， １９９６ｂ）。ＡＲＰ多形性はしばしば腫瘍形成に相関していることが観察されている（Ｅｖｒｏｎら， １９９７；Ｓｈｒｉｄｈａｒら， １９９６ａ；Ｓｈｒｉｄｈａｒら， １９９６ｂ；Ｓｈｒｉｄｈａｒら， １９９７）。
一方、Ｓｈｒｉｄａｒ（Ｓｈｒｉｄｈａｒら， １９９６ａ）は、ＡＲＰの１ｋｂ ｍＲＮＡクローン、並びに約８５０ｂｐのより小さい形態を定義することができた。ゲノム配列分析及び５’ＲＡＣＥを使用して、このクローンの５’領域を確立した。反対に、本発明では、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された配列の１８５アミノ酸残基のＣ末端断片のみを記載する（ＣｕｒａＧｅｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｎｏ．７８８９３６３８）。新規のヌクレオチド配列（配列番号：２）及びコードされたポリペプチド（配列番号：３）の翻訳を表２及び３に示す。配列番号：１が疎水性ポリペプチドであり、ＰＳＯＲＴ（Ｎａｋａｉ及びＨｏｒｔｏｎ， １９９９）により核に入ることが予期されているが（図２Ａ参照）、配列番号：３はより親水性で、核局在であることが予期される（図２Ｂ参照）。他のＡＲＰ配列にはショウジョウバエＡＲＰ様タンパク質（配列番号：１８及び１９；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ１３２９１２）が含まれる。
【００２８】
2004501608.tif 000003
【００２９】
2004501608.tif 000004
【００３０】
本発明は、ＥＳＴ配列から構築されたマウスＡＲＰの新規な遺伝子を開示している（配列番号：２０；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＩ５９５９３０）。マウスヌクレオチド配列（配列番号：２１）は表４に示し、それがコードする翻訳ポリペプチド配列（配列番号：２２）を表５に示している。
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【００３１】
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【００３２】
表６は本発明の新規のヒトＡＲＰ（Ｃｕｒａｇｅｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ７８８９３６０８；配列番号：３）、公表されているヒト配列（Ｓｈｒｉｄａｒら（１９９６ｂ）；ｇｂｈ ｍ８３７５１）、マウス（ＡＩ５９５９３０ ＥＸＴ）及びキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＡＡＤ３２６１５）の、ＣｌｕｓｔａｌＷアライメントを使用したアライメントを示す。Ｓｈｒｉｄａｒら（１９９６ｂ）により記載されたタンパク質のみがより長いＮ末端配列を有しており；本発明のものはＮ末端で切断されている。
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ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ分析（実施例１）は、最初の６時間のうちに、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞においてＡＲＰが上方制御されることを明らかにする。インサイツハイブリッド形成分析は、胎児及び非血管新生腫瘍成分における高発現を明らかにする。ＡＲＰの過剰発現は卵巣癌と相関している。
【００３３】
（ｂ）ダウン症必須領域タンパク１（ＤＳＣＲ１）
ＤＳＣＲ１（配列番号：２３及び２４；ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００４４１４， Ｕ２８８３３）は、ダウン症候群表現型の最小候補領域のメンバーである。ＤＳＣＲ１は、ＳＨ３ドメインリガンドと同様、プロリンリッチ領域、推定ＤＮＡ結合ドメイン、セリン−プロリンモチーフ及び酸性ドメインを有している（Ｆｕｅｎｔｅｓら， １９９５）。ハムスター相同体、ａｄａｐｔ７８は、グルコース調節タンパク質であるＧｐｒ７８、（Ｌｅａｈｙら， １９９９）に関連しており、オキシダント−及びカルシウム誘導性である。ＰＳＯＲＴ（Ｎａｋａｉ及びＨｏｒｔｏｎ， １９９９）はミトコンドリアの局在化を予想する。ＤＳＣＲ１の構造及び機能的特徴は転写調節及び／又はシグナル伝達における役割を示唆している。
ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ分析（実施例１）により、最初の６時間のうちに、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞においてＤＳＣＲ１が上方制御されることが証明された。ＴａｑｍａｎＴＭ分析では、内皮管形成のインヴィトロモデルにおいてＤＳＣＲ１が上方制御されることが明らかにされている。インサイツハイブリッド形成分析により、胎児組織においては高発現しているが、成人及び腫瘍非管組織において低発現であることが示された。ＤＳＣＲ１の過剰発現は卵巣癌の臨床病期と相関している。アンチセンス実験によるＤＳＣＲ１の除去により、内皮細胞の生存が増加する。
【００３４】
４．他のＶＥＧＦ調節遺伝子
（ａ）酵母ＶＰＳ４１に類似のヒト遺伝子（ｈＶＳＰ４１ｐ）
酵母ｎ（ＶＳＰ４１）においてｈＶＳＰ４１ｐ（配列番号：２５及び２６；ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ８７３０９）が、液胞輸送のために必要であり（Ｒａｄｉｓｋｙら， １９９７）、エンドサイトーシスに関連している（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｋｒｕｇｅｒ及びＦｅｒｒｏ−Ｎｏｖｉｃｋ， １９９７）。
本発明において、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ分析（実施例１）により、２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞においてｈＶＳＰ４１が下方制御されていることが明らかにされている。インサイツハイブリッド形成分析では、腫瘍の非血管新生領域に発現が局在化していた。ｈＶＳＰ４１の発現は卵巣癌と相関している（実施例）。
【００３５】
（ｂ）インスリン誘発遺伝子１（ＩＮＳＩＧ１）
ＩＮＳＩＧ１（配列番号：２７及び２８；ＧｅｎＢａｎｋ ５０３１８００， Ｕ９６８７６）の発現は、ラットの再生肝臓において転写的に上方制御され、マウス脂肪細胞の分化において誘発され、これはＩＮＳＩＧ１が代謝制御に関係する組織の成長及び分化に所定の役割を担っていることを示唆している（Ｐｅｎｇら， １９９７）。また、ＩＮＳＩＧ１はアテローム発生モデルにおいて単球により発現され、酸化されたリポタンパク質ＨＢ−ＥＧＦ及びグラビンと同様である（Ｆａｌｂ， ＷＯ９７３００６５， １９９７）。疎水性分析により膜貫通局在化が予想されている。タンパク質はナトリウムチャネル及びＧタンパク質結合レセプターと相同である。ＰＳＯＲＴ（Ｎａｋａｉ及びＨｏｒｔｏｎ， １９９９）はミトコンドリア内膜への局在化を予想する。
ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ分析（実施例１）により、２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞、及び内皮管形成のインヴィトロモデルにおいて、ＩＮＳＩＧ１が上方制御されていることが証明されている。
【００３６】
（ｃ）プロゲステロン誘導脱落タンパク（ＤＥＰＰ）
ＤＥＰＰ（配列番号：２９及び３０；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ０２２７１８）はデータベースにおいてのみ公開されている。配列番号：２９は、ステロイドプロゲステロンにより誘発される推定２１２アミノ酸ペプチドをコードする２１１４ｂｐ転写物を含む。ステロイドホルモンは血管形成、特に女性の生殖路において不可欠な役割を担っている（Ｈｙｄｅｒ及びＳｔａｎｃｅｌ， １９９９）。
ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ分析（実施例１）により、６時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞において、ＤＥＰＰが下方制御されていることが明らかにされている。
【００３７】
（ｄ）チトクロムオキシダーゼサブユニットＩ（ＭＴＣＯ１）
チトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩ（ＭＴＣＯ１， 配列番号：３１（完全ヒトミトコンドリアゲノム配列から抽出されたヌクレオチド配列、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００１８０７）及び配列番号：３２（アミノ酸；ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ ００８３４４）は呼吸複合体ＩＶの３つのミトコンドリアＤＮＡコード化サブユニットの一つである。複合体ＩＶはミトコンドリア内膜に局在し、酸化的リン酸化の電子伝達鎖の最終段階を媒介する。複合体ＩＶは還元チトクロムｃから電子を集め、それらを酸素に移送し、エネルギーと水を生成する。放出されたエネルギーはミトコンドリア内膜を横切ってプロトンを移送するのに使用される。
【００３８】
（ｅ）ＮＡＤＨユビキノンオキシドレダクターゼ鎖１（ＮＤ１又はＤＮＨＵＮ１）及び
（ｆ）ＮＡＤＨユビキノンオキシドレダクターゼ鎖４（ＮＤ１又はＤＮＨＵＮ４）
プロトン転位置ＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼ又は複合体Ｉ鎖１（配列番号：３３， ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００１８０７及び３４；ＧｅｎＢａｎｋ ＤＵＮＨＵＮ１）及び鎖４（配列番号：３５， ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００１８０７及び３６；ＧｅｎＢａｎｋ ＤＵＮＨＵＮ４）は、ミトコンドリアの内膜に局在している。複合体Ｉは、呼吸鎖へ入る電子のための部位であり、細胞エネルギーの保持に重要である。ＮＡＤＨの複合体Ｉ触媒酸化はプロトンの膜転位置に関連している。
【００３９】
（ｇ）ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）
ＨＢ−ＥＧＦ（配列番号：３７及び３８；ＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ ００１９４５）は、ＥＧＦレセプター１（ＨＥＲ−１）又は４（ＨＥＲ−４）に結合して、細胞分裂促進及び／又は走化性活性を誘発するＥＧＦファミリーのメンバーである。ＨＢ−ＥＧＦは、白血病細胞を含む多くの細胞型に発現しており（Ｖｉｎａｎｔｅら， １９９９）、内皮細胞の有糸分裂を直接は誘発しないが、これらの細胞の移動を誘発し、血管平滑筋細胞の、内皮有糸分裂誘発のための因子の放出を誘発する（Ｍｏｒｉｔａら， １９９３）。以前にＶＥＧＦにより誘発されることが観察されているが（Ａｒｋｏｎａｃら， １９９８）、内皮細胞生存における特定の役割については何の提案もされていない。
ＶＥＧＦに加えて、反応性酸素種及びカルシウムは、ＤＳＣＲ１に行うのと同様に、ＨＢ−ＥＧＦ発現を誘発する（Ｋａｙａｎｏｋｉら， １９９９）。膜結合性ＨＢ−ＥＧＦは成長活性、付着能力を保持しており、腎臓内皮細胞の生存を促進する（Ｔａｋｅｍｕｒａら， １９９７）。プロＨＢ−ＥＧＦは、ＨＢ−ＥＧＦ発現の生存活性をまた増加させるテトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）ＣＤ９と、原形質膜で複合体を形成する（Ｔａｋｅｍｕｒａら， １９９９）。
本発明において（実施例）、ＨＢ−ＥＧＦは２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞において上方制御されていることが見出されている。インサイツハイブリッド形成分析では、腫瘍、胎児及び成人組織の非血管成分で発現が見られ、虫垂の内皮細胞で高発現していた。
【００４０】
（ｈ）ＭＫＰ−１様プロテインチロシンホスファターゼ（配列番号：３９及び４０；ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ０３８８４４）
タンパク質配列は、細胞分裂促進剤活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼホスファターゼ−１（ＭＫＰ−１）、二重特異性プロテインチロシンホスファターゼに対して、５８％の類似性がある。ＭＫＰ−１様プロテインチロシンホスファターゼに特異的な基質は未だ記載されてないが、触媒ドメインに対する相同性は非常に高い。ＭＡＰキナーゼカスケードはアポトーシスの阻害、Ｂｃｌ−２のリン酸化において重要な役割を担っている（Ｄｅｎｇら， ２０００）。ＭＡＰキナーゼはチロシン及びスレオニンのリン酸化により活性化され、脱リン酸化により不活性化される（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＭｉｌｌａｒ， ２０００）。ＭＫＰ−１は細胞生存を増加させ（Ｗｉｎｔｅｒら， １９９８）、上昇したカルシウムにより誘発される（Ｓｃｉｍｅｃａら， １９９７）。ＭＫＰ−１に対する類似性の故に、ＭＫＰ−１様プロテインチロシンホスファターゼは、細胞生存に関与する一又は複数のＭＡＰキナーゼを調節しうる。
【００４１】
（ｉ）オステオニドジェン（ニドジェン−２前駆体）
ニドジェン−２（配列番号：４１及び４２；ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ８６４２５）は、基底膜（基底層）タンパク質ニドジェン−１／エナクチン（ｅｎａｃｔｉｎ）と４６％同一性であり、類似したドメイン構造を有する。ニドジェン１及び２は類似しているが、基底膜成分に対する結合性及び付着特性は異なる（Ｌｏｈｉら， １９９８）。ラミニン／エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）複合体は、用量依存的に血管形成を刺激し、また阻害することができる（Ｎｉｃｏｓｉａら， １９９４）。
本発明において、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ分析（実施例１）により、６及び２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞において、ニドジェン−２が上方制御されていることが明らかにされている。インサイツハイブリッド形成分析では、胎児組織、炎症虫垂、及び腫瘍周囲のストローマの血管及び非血管成分における発現が示されており（Ｏｉｖｕｌａら， １９９９）、癌腫の内皮基底層及びストローマでの発現も報告されている。
【００４２】
（ｊ）結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）
ＣＴＧＦ（結合組織成長因子；配列番号：４３及び４４， ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ７８９４７）は、ＣＹＲ６１、Ｎｏｖ、Ｅｌｍ−１、Ｃｏｐ−１／ＷＩＳＰ−２、ＷＩＳＰ−３及びマウスＣＴＧＦ相同体Ｆｉｓｐ１２を含む分泌タンパク質ファミリーのメンバーである。ＣＴＧＦは線維芽細胞の移動を刺激し、インテグリンレセプターαｖβ３を通して線維芽細胞と内皮細胞の双方における付着及び有糸分裂誘発を促進する。さらに、ＣＴＧＦが存在すると、内皮細胞の生存が促進する。インヴィボにおいて、ＣＴＧＦはラットの角膜マイクロポケット（ｍｉｃｒｏｐｏｃｋｅｔ）移植片における新血管新生を誘発する。
本発明において、ＣＴＧＦは、６及び２４時間後、ＶＥＧＦ刺激内皮細胞で上方制御されていた。インサイツハイブリッド形成分析では、ＣＴＧＦは試験したほとんどの組織で発現しており、胎児組織で最も高い発現であったことが示されている。血管形成組織及びアテローム硬化型プラークにおけるＣＴＧＦの局在化を伴うこれらの観察により、発育、創傷治癒及び管疾患中の血管成長の調節におけるＣＴＧＦの可能性のある役割が示唆された。
【００４３】
ＶＥＧＦｍｇポリヌクレオチド
本発明の一側面は、ＶＥＧＦｍｇをコードする単離された核酸分子、又は生物学的に活性なそれらの部分に関する。また、本発明に含まれるものは、ＶＥＧＦｍｇコード化核酸（例えばＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリッド形成プローブとしての使用に十分な核酸断片、及びＶＥＧＦｍｇ分子の増幅及び／又は変異のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用される断片である。「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体及び誘導体を用いて生成されるＤＮＡ又はＲＮＡの類似体、断片及び相同体が含まれる。該核酸分子は一本鎖又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡを含む。
１．コントロール配列
コントロール配列は特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード化配列の発現を可能ならしめるＤＮＡ配列のことである。原核生物のコントロール配列にはプロモーター、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用する。
２．作用可能に結合され
核酸が他の核酸配列と機能的に関連のある状態に配置される場合、作用可能に結合されている。例えば、プロモーター又はエンハンサーが配列の転写に影響を与える場合、コード化配列と作用可能に結合されており、又は、リボソーム結合部位が翻訳を促進するために配置されている場合、コード化配列と作用可能に結合されている。一般に、「作用可能に結合され」とは、結合されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接し、読み枠が合っていることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接する必要はない。結合は従来の組換ＤＮＡ法によって達成される。
３．単離された核酸
単離された核酸分子は天然に見出される環境から精製され、少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離される。単離されたＡＲＰ分子は、細胞内に存在する特定のＡＲＰ分子とは区別される。しかし、単離されたＡＲＰ分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞とは異なる染色体上の位置に存在し、普通にＡＲＰを発現している細胞内に含まれるＡＲＰ分子を含む。
【００４４】
４．プローブ
プローブは可変な長さの核酸配列であり、好ましくは特定の用途に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、又は多数（例えば、６０００ｎｔ）の間である。プローブは同一、類似又は相補的核酸配列を検出するために使用される。より長いプローブは天然又は組換体の原料から得ることが可能で、非常に特異的であって、より短い長さのオリゴマープローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは一本又は二本鎖であり、ＰＣＲ、メンブレンを用いたハイブリダイゼーション技術、又はエライザのような技術において特異性を持つようにデザインされる。プローブは、少なくとも至適には１２， ２５， ５０， １００， １５０， ２００， ２５０， ３００， ３５０， 又は４００の連続したセンス鎖ヌクレオチド配列；又はアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；又は関心あるＶＥＧＦｍｇの天然に生じる突然変異体を緊縮性の条件下においてハイブリダイズする実質的に精製されたオリゴヌクレオチドである。
全体又は部分的長さの天然配列ＶＥＧＦｍｇは；（１）何れかの種（例えば、ヒト、マウス、ネコ、イヌ、バクテリア、ウィルス、レトロウィルス、酵母）に由来するｃＤＮＡライブラリーからのＶＥＧＦｍｇ ｃＤＮＡの全長又は断片、（２）細胞又は組織に由来する、（３）種内の変異体、及び（４）他の種由来の相同体及び変異体などの、類似な（相同な）配列を「取り出す」ために使用されうる（Ａｕｓｕｂｅｌ等， １９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。関連遺伝子をコードしうる関連配列を見出すために、プローブはユニークな配列又は縮重配列をコードするようにデザインされうる。また、配列は天然配列ＶＥＧＦｍｇのプロモーター、エンハンサーエレメント及びイントロンを含むゲノム配列であってもよい。
例えば、他の種におけるＶＥＧＦｍｇコード化領域はそのようなプローブを用いて単離することが可能である。約４０ベースのプローブは、ＶＥＧＦｍｇに基づいてデザインされ、作製される。ハイブリダイゼーションを検出するために、プローブは、例えば、３２Ｐ又は３５Ｓなどの放射ヌクレオチド、又はプローブにアルカリホスファターゼを結合させたアビジン−ビオチンシステムによるような酵素ラベルを用いて標識される。標識化プローブは、所望の種のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡにおいて、ＶＥＧＦｍｇの配列と相補的な配列を持つ核酸を検出するために使用される。
そのようなプローブは、被検対象由来の細胞サンプル中のＶＥＧＦｍｇレベルを測定することにより、例えば、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡレベルを検出し又はゲノムＶＥＧＦｍｇが変異を起こしているか又は欠失しているかどうかを決定することにより、ＶＥＧＦｍｇを間違って発現させている細胞又は組織を同定するための診断テストキットの一部として使用することができる。
【００４５】
５．単離された核酸
単離された核酸分子は、核酸の天然原料中に存在する他の核酸分子から分離される。好ましくは、単離された核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸と元来隣接する配列（即ち、該核酸の５’−及び３’−末端に位置する配列）が除かれ得る。例えば、種々の実施態様において、単離されたＶＥＧＦｍｇ分子は、核酸が由来する細胞／組織（例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子と元来隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満を包含することができる。さらに、ｃＤＮＡ分子などの単離された核酸分子は、組換体技術によって生産される場合の他の細胞内物質又は培地、又は化学的に合成される場合の化学的前駆体または他の化学物質が実質的に除かれ得る。
本発明の核酸分子、例えば、ＶＥＧＦｍｇ核酸分子又はこの上述したヌクレオチド配列は、標準的な分子生物学的技術及び提供される配列情報を用いて単離することができる。関心あるＶＥＧＦｍｇ核酸配列の全て又は部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＶＥＧＦｍｇ分子を標準的ハイブリダイゼーション及びクローニング技術（Ａｕｓｕｂｅｌ等， １９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）を用いて単離することができる。
ＰＣＲ増幅技術はｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は或いはゲノムＤＮＡをテンプレート及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、ＶＥＧＦｍｇを増幅するために使用することができる。そのような核酸は適当なベクター中にクローン化することができ、ＤＮＡ配列解析によって性質決定できる。さらに、ＶＥＧＦｍｇ配列に相当するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術、例えば、自動ＤＮＡ合成装置などによって調製することができる。
【００４６】
６．オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは、一連の連結されたヌクレオチド残基を含み、オリゴヌクレオチドはＰＣＲ反応又は他の用途において使用されるのに十分な数のヌクレオチドベースを有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ配列に基づき又はそれからデザインされ、特定の細胞又は組織中の同一、類似又は相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの存在を増幅し、確証し、又は明らかにするために用いられる。オリゴヌクレオチドは長さが約１０ｎｔ、５０ｎｔ、又は１００ｎｔで、好ましくは長さが約１５ｎｔから３０ｎｔである核酸の部分を含む。本発明の一実施態様において、長さが１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドがさらに関心あるＶＥＧＦｍｇ配列、又はその相補鎖の少なくとも６つの連続するヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは化学的に合成され、プローブとして使用されてもよい。
【００４７】
７．相補的核酸配列；結合
他の実施態様において、単離された核酸分子は、本発明のＶＥＧＦｍｇヌクレオチド配列、又はこのヌクレオチド配列の一部（例えば、プローブ又はプライマー又はＶＥＧＦｍｇの生物学的に活性な部分をコードする断片として使用され得る断片）と相補的である核酸分子を含む。関心あるＶＥＧＦｍｇヌクレオチド配列と相補的な核酸分子は、該ヌクレオチド配列と十分相補的であるもの、つまり殆ど又は全くミスマッチな水素結合を形成せず、安定な二重鎖を形成する。
「相補的」とは、核酸分子のヌクレオチドユニット間のワトソン−クリック又はフーグスチンベース対形成のことを指し、「結合」という用語は、２つのポリペプチド又は化合物又は関連するポリペプチド又は化合物又はそれらの組み合わせ間の物理的又は化学的相互作用を意味する。結合には、イオン的、非イオン的、ファンデルワールス的、疎水的相互作用等が含まれる。物理的相互作用は直接的又は間接的のどちらかである可能性がある。間接的相互作用は、他のポリペプチド又は化合物の効果を通じ又は依存する可能性がある。直接的結合とは、他のポリペプチド又は化合物の効果を通じて又はその結果として起こらず、その代わりに他の実質的な化学的中間体無しでは起こらない相互作用を称する。
核酸断片は少なくとも６（連続した）の核酸又は少なくとも４（連続した）のアミノ酸であって、核酸の場合には特異的なハイブリダイゼーション、又はアミノ酸の場合にはエピトープの特異的な認識をそれぞれ可能ならしめるのに十分な長さであり、長くても全長配列未満のある部分である。断片は選択された核酸又はアミノ酸配列の何れかの連続する部分に由来しうる。
【００４８】
８．誘導体、及び類似体
誘導体は、天然化合物から直接、又は修飾により、又は部分置換によって形成される核酸配列又はアミノ酸配列である。類似体は、天然化合物と同一ではないが構造類似性を持ち、ある構成成分又は側鎖に関して異なる核酸配列又はアミノ酸配列である。類似体は、合成されるか又は異なる進化的起源に由来し、野生型と比較して類似の又は逆の代謝活性を持つ。相同体は異なる種から派生する特定の遺伝子の核酸配列又はアミノ酸配列のことである。
誘導体及び類似体は全長であり、又は誘導体又は類似体が以下に記述されるような修飾された核酸又はアミノ酸を含むならば、全長ではない。本発明の核酸又はタンパク質の誘導体又は類似体には、限定はしないが、本発明の核酸又はタンパク質と、種々の実施態様において、同じサイズの核酸又はアミノ酸配列に対して少なくと約も７０％、８０％ 又は９５％の同一性（好ましい同一性８０−９５％を有し）により、又はアライメントが当該技術分野において既知のコンピューターホモロジープログラムによって行われる整列配列と比較される場合、又はそのコード化核酸が緊縮性のストリンジェンシー、又は中程度のストリンジェンシー又は低いストリンジェンシーの条件下で前述のタンパク質をコードする配列の相補鎖とハイブリダイズすることができるような（Ａｕｓｕｂｅｌ等， １９８７）、実質的に相同である領域を含む分子が含まれる。
【００４９】
９．オープンリーディングフレーム
ＶＥＧＦｍｇ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はＶＥＧＦｍｇをコードする。ＯＲＦは開始コドン（ＡＴＧ）を持ち、３つの「ストップ」コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ）の一つによって終結するヌクレオチド配列である。しかしながら、本発明において、ＯＲＦは開始コドン及びストップコドンを含むか又は含まないコード化配列の何れかの部分であり得る。ユニークな配列を達成するために、好ましいＶＥＧＦｍｇ ＯＲＦｓは少なくとも５０アミノ酸をコードする。
【００５０】
１０．相同性
「相同な核酸配列」又は「相同なアミノ酸配列」又はその変異は、上述のようなヌクレオチドレベル又はアミノ酸レベルでの相同性によって特徴付けられる配列のことを指す。相同なヌクレオチド配列はＶＥＧＦｍｇのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果同一の生物の異なる組織において発現し得る。或いは、異なる遺伝子がアイソフォームをコードすることもあり得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、限定はしないが：脊椎動物、従って、例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、及び他の生物を含むヒト以外の種のＶＥＧＦｍｇをコードするヌクレオチド配列を含む。また、相同なヌクレオチド配列には、限定はしないが、天然に生じる対立遺伝子変異及びここで記載したヌクレオチド配列の突然変異も含まれる。しかしながら、相同なヌクレオチド配列にはヒトＶＥＧＦｍｇをコードするヌクレオチド配列そのものは含まれない。相同な核酸配列には関心あるＶＥＧＦｍｇ配列の保存的なアミノ酸置換、並びにＶＥＧＦｍｇの生物学的活性を持つポリペプチドをコードするこれらの核酸配列が含まれる。ＶＥＧＦｍｇの種々の生物学的活性は以下に記載する。
【００５１】
１１．配列同一性
ＶＥＧＦｍｇに対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、特定のＶＥＧＦｍｇのヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。％核酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
ヌクレオチド配列を整列させる場合、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
％核酸配列同一性＝Ｗ／Ｚ・１００
ここで、
ＷはＣ及びＤの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアライメントによって同一に一致したコアされた核酸残基の数であり、
ＺはＤの全ヌクレオチド数である。
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なる。
【００５２】
１２．緊縮性
相同体（即ち、ヒト以外の種に由来するＶＥＧＦ調節分子をコードする核酸）又は他の関連配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングに関する技術分野において周知の方法を用いて、プローブとして特定のヒト配列の全体又は部分を使用し、低い、中程度又は高い緊縮性のハイブリダイゼーションにより得ることができる。
相補性断片とハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡの特異性は、反応条件の「緊縮性」によって決められる。ＤＮＡ二重鎖を形成させる傾向が低下すると、ハイブリダイゼーションの緊縮性は増大する。核酸ハイブリダイゼーション反応において、緊縮性は、いずれかの好ましい特異性のハイブリダイゼーション（高い緊縮性）になるように選択することが可能であり、例えば、ライブラリーから全長クローンを同定するために用いることができる。より低い特異性のハイブリダイゼーション（低い緊縮性）は、関連性はあるが正確ではないＤＮＡ分子（相同体ではあるが同一ではない）又はセグメントを同定するために用いることができる。
ＤＮＡ二重鎖は、（１）相補的な塩基対の数、（２）塩基対のタイプ、（３）反応混合液の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度、及び（５）ＤＮＡ二重鎖の安定性を低下させるホルムアミドなどのある種の有機溶媒の存在によって安定化される。一般に、プローブが長くなれば、適切なアニーリングのためにより高い温度が必要である。通常のアプローチは温度を変化させることである：より高い相対温度はより緊縮性のある反応条件となる。（Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８７）には、ハイブリダイゼーション反応の緊縮性に関する優れた説明が提示されている。
「緊縮性の条件」下でハイブリダイズするとは、互いに少なくとも６０％の相同性を持つヌクレオチド配列がハイブリダイズした状態にあるようなハイブリダイズプロトコルのことである。一般に、緊縮性の条件は、設定されたイオン強度及びｐＨにおける特異的配列に対する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは標的の配列と相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡を保ってハイブリダイズする温度である（設定されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度）。標的配列は通常過剰に存在するため、Ｔｍではプローブの５０％が平衡状態となる。
【００５３】
（ａ）高い緊縮性
「緊縮性ハイブリダイゼーション条件」では、プローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドがその標的配列にのみハイブリダイズすることができる。緊縮性条件は配列依存的で、相違する。緊縮性条件には、（１）低いイオン強度及び高い温度での洗浄（例えば、５０℃において、１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム）；（２）ハイブリッド形成中に変性剤、（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５；７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃）；又は（３）５０％ホルムアミド。典型的には、洗浄にも、５ｘＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸が含まれ、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、ついで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高い緊縮性洗浄が含まれる。好ましくは、条件は、少なくと約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の相同性を持つ配列が、典型的には互いにハイブリダイズした状態にあるような条件である。これらの条件は、実施例に示してあるが、限定することが意味されるものではない。
【００５４】
（ｂ）中程度の緊縮性
「中程度の緊縮性条件」は、ポリヌクレオチドが標的ＶＥＧＦｍｇ標的配列の全長、断片、誘導体又は類似体とハイブリダイズするような、より低い緊縮性の洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件を用いる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。一実施例には、５５℃において、６ｘＳＳＣ、５ｘデンハード液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、ついで３７℃において１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での一又は複数回の洗浄が含まれる。温度、イオン強度等は、プローブ長などの実験的要因を至適化させるように調整することができる。他の中程度の緊縮性条件は（Ａｕｓｕｂｅｌ等， １９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０）中に記載されている。
（ｃ）低い緊縮性
「低い緊縮性条件」は、ポリヌクレオチドが標的ＶＥＧＦｍｇ標的配列の全長、断片、誘導体又は類似体とハイブリダイズするような、中程度の緊縮性よりも低い緊縮性の洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件を用いる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。低い緊縮性ハイブリダイゼーション条件の非限定的な実施例は、４０℃において、３５％のホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ） 硫酸デキストラン中でのハイブリダイゼーション、ついで５０℃において２ｘ ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳ中での一又は複数回の洗浄である。種間ハイブリダイゼーションなどの他の低い緊縮性条件は、（Ａｕｓｕｂｅｌ等， １９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， １９９０；Ｓｈｉｌｏ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ， １９８１）中に記載されている。
【００５５】
１３．保存的変異
天然に生じるＶＥＧＦｍｇ対立遺伝子変異に加えて、ＶＥＧＦ調節分子をコードするアミノ酸配列中のＶＥＧＦ調節分子の機能を変えない変更を受ける変化は、ＶＥＧＦｍｇ配列中に突然変異により導入することができる。例えば、「本質的でない」アミノ酸残基においてアミノ酸置換を誘起するヌクレオチド置換を、ＶＥＧＦｍｇポリペプチドの配列中に作製することができる。「本質的でない」アミノ酸残基とは、生物学的活性を変更することなくＶＥＧＦｍｇの野生型配列から変更され得る残基のことであり、「本質的な」アミノ酸残基は、そのような生物学的活性にとって必要である。例えば、本発明のＶＥＧＦ分子中で保存されるアミノ酸残基は、特に変更を受けいれ難いものであると予測される。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当該技術において周知である。
有用な保存的置換は、表Ａの「好ましい置換」中に示される。一つのクラスのアミノ酸が同じタイプの他のアミノ酸と置換される保存的置換は、当該置換が物質的に化合物の生物学的活性を変更しない限りにおいて、当該発明の範囲内に入る。そのような置換によって生物学的活性に変化が生じる場合、その時は、例として表Ｂに示されるより本質的変化が導入されており、生成物はＶＥＧＦｍｇポリペプチドの生物学的活性に対してスクリーニングされる。
2004501608.tif 000008
【００５６】
（１）β−シート又はα−へリックスコンフォメーションなどのポリペプチド骨格の構造、（２）荷電又は（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖部分に影響を与える非保存的な置換は、ＶＥＧＦｍｇの機能又は免疫学的同一性を修飾することができる。残基は、表Ｂ中に示される一般的な側鎖の特性に基づいてグループに分類される。非保存的置換は、必然的にこれらのクラスの１メンバーを他のクラスと置換えることを伴うものである。置換は保存的置換部位、より好ましくは非保存部位に導入され得る。
2004501608.tif 000009
【００５７】
変異体ポリペプチドはオリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異導入法、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異導入法などの当該技術分野において既知の方法を用いて行うことができる。部位特異的突然変異導入法（Ｃａｒｔｅｒ， １９８６；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ， １９８７）、カセット突然変異導入法、限定的選択突然変異導入法（Ｗｅｌｌｓ等， １９８５）又は他の既知の技術は、ＶＥＧＦｍｇ変異ＤＮＡを生産するために、クローン化されたＤＮＡ上で実施することができる（Ａｕｓｂｅｌ等， １９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。
一実施態様において、単離された核酸分子には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、該タンパク質が関心あるＶＥＧＦｍｇと少なくとも約４５％、好ましくは６０％、より好ましくは７０％、８０％、９０％、及び最も好ましくは約９５％の相同なアミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。
変異体ＶＥＧＦｍｇはインヴィトロにおける細胞生存及び／又は血管形成を調節することに関してアッセイすることができる。
【００５８】
１４．ＶＥＧＦｍｇ変異体ポリヌクレオチド、遺伝子及び組換遺伝子
さらに本発明は、遺伝子コードの縮重によるヌクレオチド配列とは異なるが、配列番号：２又は２１に示されるＡＲＰヌクレオチド配列によってコードされるものと同一のＶＥＧＦｍｇをコードする核酸分子をも包含する。本発明の単離された核酸分子は、例えば配列番号：３又は２２に示されるアミノ酸配列を持つＡＲＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
さらに、ＶＥＧＦｍｇのアミノ酸配列を変化させる配列の多型が集団の中に存在しうる。例えば、個々の対立遺伝子変異がＶＥＧＦｍｇ中の遺伝的多型を示すであろう。「遺伝子」及び「組換遺伝子」という用語は、ＶＥＧＦｍｇ、好ましくは脊椎動物のＶＥＧＦｍｇをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子を称する。このような天然の対立遺伝子の変異は、典型的にはＶＥＧＦｍｇ中に１−５％の変動が生じる可能性がある。ＶＥＧＦｍｇ中のこのような何れか及び全てのヌクレオチド変異と結果的に生じるアミノ酸多型は、天然の対立遺伝子変異の結果であり、ＶＥＧＦｍｇの機能的活性を変更しないものであって、本発明の範囲内のものである。
さらに、ＶＥＧＦｍｇのヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を持つ他の種由来のＶＥＧＦｍｇが考慮される。本発明のＶＥＧＦｍｇ ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異及び相同体に相当する核酸分子は、緊縮性の条件下で相同なＶＥＧＦｍｇ配列とハイブリダイズするｃＤＮＡ由来のプローブを用いてＶＥＧＦｍｇとの相同性に基づいて単離することができる。
「ＶＥＧＦｍｇ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＶＥＧＦｍｇ変異体核酸配列」とは、（１）全長の天然ＶＥＧＦｍｇ、（２）シグナルペプチドを欠く全長天然ＶＥＧＦｍｇ、（３）シグナルペプチドを持つか又は持たないＶＥＧＦｍｇの細胞外ドメイン、又は（４）全長ＶＥＧＦｍｇの他の何れかの断片をコードする核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を持つ活性なＶＥＧＦｍｇをコードする核酸分子を意味する。一般に、ＶＥＧＦｍｇ変異体ポリヌクレオチドは、全長の天然ＶＥＧＦｍｇをコードする核酸配列と少なくとも約８０％核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を持つであろう。ＶＥＧＦｍｇ変異体ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドを欠く全長天然ＶＥＧＦｍｇ、シグナル配列を持つか又は持たないＶＥＧＦｍｇの細胞外ドメイン、又は全長ＶＥＧＦｍｇの他の何れかの断片をコードする可能性がある。変異体は天然ヌクレオチド配列を包含しない。
一般に、ＶＥＧＦｍｇ変異体ポリヌクレオチドは少なくとも長さが約３０ヌクレオチドであり、しばしば少なくとも長さが約６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、４５０、６００ヌクレオチドであり、さらにしばしば少なくと長さが約９００ヌクレオチド又はそれより長い。
【００５９】
ＶＥＧＦｍｇポリペプチド
１．成熟
ＶＥＧＦｍｇは成熟ＶＥＧＦｍｇをコードする。当該発明で開示されるポリペプチド又はタンパク質の「成熟」形態は、天然に生じるポリペプチド又は前駆体形態又はプロタンパク質である。天然に生じるポリペプチド、前駆体又はプロタンパク質には、非限定的な例として、対応する遺伝子によってコードされる全長遺伝子産物が含まれる。或いは、ここで記載されるオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチド、前駆体又はプロタンパク質として定義される。「成熟」形態産物は、再度非限定的な例示によると、その遺伝子産物が生じる細胞又は宿主細胞内で起こる一又は複数の天然に発生するプロセッシングのステップの結果生じる。そのようなポリペプチド又はタンパク質の「成熟」形態へと誘導するプロセッシングステップの例には、オープンリーディングフレームの開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、又はシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解性の切断が含まれる。従って、残基１がＮ末端のメチオニンである残基１〜Ｎからなる前駆体ポリペプチド又はタンパク質から生じる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンを除去した残りの残基２〜Ｎを持つ。或いは、残基１〜残基Ｍに由来するＮ末端シグナル配列が切断される残基１〜Ｎを持つ前駆体ポリペプチド又はタンパク質から生じる成熟形態は、残りの残基Ｍ＋１〜残基Ｎの残基を持つであろう。さらに、ここで使用されるように、ポリペプチド又はタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解性切断よりもむしろ翻訳後修飾のステップから生じる可能性がある。このような更なるプロセスには、非限定的な例示によるが、グリコシル化、ミリストイル化又はリン酸化が含まれる。一般に、成熟ポリペプチド又はタンパク質はこれらのプロセスの一つだけ、又はそれらの何れかの組み合わせによる操作の結果生じる。
【００６０】
２．単離されたＶＥＧＦｍｇポリペプチド
「単離された」又は「精製された」ポリペプチド、タンパク質又は生物学的に活性な断片は、その自然環境の成分から分離され及び／又は回収される。夾雑成分には、ポリペプチドに対する診断又は治療上の使用を典型的に阻害する物質が含まれ、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様物質が含まれる。好ましくは、ポリペプチドは少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な程度にまで精製される。実質的に単離されるためには、乾燥重量で３０％未満の非ＶＥＧＦｍｇ夾雑物質（夾雑物）、より好ましくは２０％未満、１０％未満、及び最も好ましくは５％未満の夾雑物を有する標品である。単離された組換体として生産されたＶＥＧＦｍｇ又は生物学的に活性な部分は、好ましくは実質的に、培地からフリーである、即ち、培地がＶＥＧＦｍｇ標品の体積の２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。夾雑物の例には、細胞壊死片、培地、及びＶＥＧＦｍｇのインヴィトロにおける合成の間に使用され、生産された物質が含まれる。
分子が精製されたポリペプチドである場合、該ポリペプチドは（１）少なくともＮ末端又は内部アミノ酸配列の１５残基を配列決定装置を用いて得るために、又は（２）クマシーブルー又は銀染色を用いた非還元又は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製されるであろう。ＶＥＧＦｍｇの天然環境の少なくとも１つの成分は存在していないため、単離されたポリペプチドには、遺伝学的に操作された細胞において異種結合的に発現され、又はインヴィトロにおいて発現されたものが含まれる。一般に、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製段階によって調製される。
【００６１】
３．生物学的に活性な
ＶＥＧＦｍｇの生物学的に活性な部分には、全長ＶＥＧＦｍｇの配列より少ないアミノ酸を含み、少なくともＶＥＧＦｍｇの１の活性を示すＶＥＧＦｍｇアミノ酸配列と十分相同であるか、これから誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。生物学的に活性な部分は天然ＶＥＧＦｍｇの少なくとも１の活性を持つドメイン又はモチーフを含む。ＶＥＧＦｍｇの生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００又はそれより長いアミノ酸残基であるポリペプチドであり得る。他の生物学的に活性な部分は、タンパク質の他の領域が欠失されており、組換え技術により調製することができ、天然のＶＥＧＦｍｇの一又は複数の機能的活性に関して評価することができる。
ＶＥＧＦｍｇの生物学的に活性な部分は、タンパク質の機能的活性を保持するが、天然の対立遺伝子変異又は突然変異導入によるアミノ酸配列とは異なる。
【００６２】
４．抗ＶＥＧＦｍｇＡｂｓ
抗体とは、単一の抗ＶＥＧＦｍｇモノクローナルＡｂｓ（ｍＡｂｓ；アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和Ａｂｓを含む）、複数エピトープ特異的抗ＶＥＧＦｍｇ抗体組成物、単鎖抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂｓ、及び抗ＶＥＧＦｍｇＡｂｓの断片であり得る。「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一なＡｂｓ、即ち少量存在する天然に生じる変異を除いて同一である集団を含む個々のＡｂｓを意味する。
【００６３】
５．エピトープタグ
エピトープタグ化ポリペプチドとは、「タグポリペプチド」と融合したキメラポリペプチドを称する。このようなタグは、Ａｂｓが作製され又利用可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないエピトープを提供する。内在性エピトープと抗タグ抗体の反応性を減少させるために、タグポリペプチドは好ましくはユニークである。一般に、好適なタグポリペプチドは少なくとも６アミノ酸残基を有し、一般に、約８から５０アミノ酸残基の間であり、好ましくは８から２０アミノ酸残基の間である。エピトープタグ配列の例にはインフルエンザＡウィルス由来のＨＡ及びＦＬＡＧが含まれる。
【００６４】
６．変異体ＶＥＧＦｍｇポリペプチド
一般に、ＶＥＧＦｍｇ様機能を維持し、配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸によって置換されている何らかの変異を含み、さらに、親タンパク質の２残基間に更なる残基又は残基群を挿入する可能性、並びに親配列から位置又は複数の残基を欠失させる可能性を含むＶＥＧＦｍｇ変異体。いずれのアミノ酸置換、挿入又は欠失も本発明によって包含される。好ましい状況において、置換は上述した保存的置換である。「ＶＥＧＦｍｇポリペプチド変異体」とは、少なくとも：（１）全長天然配列ＶＥＧＦｍｇポリペプチド配列と、（２）シグナルペプチドを欠失したＶＥＧＦｍｇポリペプチド配列と、（３）シグナルペプチドを持つか又は持たないＶＥＧＦｍｇポリペプチドの細胞外ドメインと、又は（４）全長ＶＥＧＦｍｇポリペプチド配列の何れか他の配列と約８０％のアミノ酸配列同一性を持つ活性なＶＥＧＦｍｇポリペプチドを意味する。例えば、ＶＥＧＦｍｇポリペプチド変異体には、一又は複数のアミノ酸残基が全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端で付加又は欠失したＶＥＧＦｍｇポリペプチド配列が含まれる。ＶＥＧＦｍｇポリペプチド変異体は、ＶＥＧＦｍｇポリペプチド配列の全長天然配列と少なくとも約８０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％。、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。ＶＥＧＦｍｇポリペプチド変異体は、シグナルペプチドを欠いた配列、シグナルペプチドを持つか又は持たないＶＥＧＦｍｇポリペプチドの細胞外ドメイン、又は全長ＶＥＧＦｍｇポリペプチド配列の何れか他の断片を有する。一般に、ＶＥＧＦｍｇ変異体ポリペプチドは少なくとも長さが約１０アミノ酸、しばしば少なくとも長さが約２０アミノ酸、さらにしばしば少なくとも長さが約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００又は３００アミノ酸、又はそれより長い。
【００６５】
「パーセント（％）核酸配列同一性」は、２つの配列を整列させるとき、開示されるＶＥＧＦｍｇポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸同一性を決定するために、配列を整列させ、必要ならば、最大の％配列同一性を達成するために間隙が導入され；保存的置換は配列同一性の一部として考慮されない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸アライメント方法は、当業者にとって周知である。ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウエアが、しばしばペプチド配列を整列するために使用される。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
アミノ酸配列を整列させる場合、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ・１００
ここで、
ＸはＡ及びＢの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアライメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、
ＹはＢの全アミノ酸残基数である。
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なる。
【００６６】
７．２以上の配列間の相同性の決定
「ＶＥＧＦｍｇ変異体」とは、少なくとも：（１）全長天然配列ＶＥＧＦｍｇ配列と、（２）シグナルペプチドを欠失したＶＥＧＦｍｇ配列と、（３）シグナルペプチドを持つか又は持たないＶＥＧＦｍｇの細胞外ドメインと、又は（４）全長ＶＥＧＦｍｇ配列の何れか他の断片と約８０％のアミノ酸配列同一性を持つ活性なＶＥＧＦｍｇを意味する。例えば、ＶＥＧＦｍｇ変異体には、一又は複数のアミノ酸残基が全長天然アミノ酸配列のＮ又はＣ末端で付加又は欠失したＶＥＧＦｍｇ配列が含まれる。ＶＥＧＦｍｇ変異体は、ＶＥＧＦｍｇ配列の全長天然配列と少なくとも約８０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％のアミノ酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。ＶＥＧＦｍｇ変異体は、シグナルペプチドを欠いた配列、シグナルペプチドを持つか又は持たないＶＥＧＦｍｇの細胞外ドメイン、又は全長ＶＥＧＦｍｇ配列の何れか他の断片を有する。一般に、ＶＥＧＦｍｇ変異体ポリペプチドは少なくとも長さが約１０アミノ酸、しばしば少なくとも長さが約２０アミノ酸、さらにしばしば少なくとも長さが約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００又は３００アミノ酸、又はそれより長い。
【００６７】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、２つの配列を整列させるとき、開示されるＶＥＧＦｍｇ配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。％アミノ酸同一性を決定するために、配列を整列させ、必要ならば、最大の％配列同一性を達成するために間隙が導入され；保存的置換は配列同一性の一部として考慮されない。パーセント同一性を決定するためのアミノ酸アライメント方法は、当業者にとって周知である。ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウエアが、しばしばペプチド配列をアラインするために使用される。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
アミノ酸配列を整列させる場合、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ・１００
ここで、
ＸはＡ及びＢの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムのアライメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、
ＹはＢの全アミノ酸残基数である。
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なる。
【００６８】
８．キメラ及び融合タンパク質
融合ポリペプチドは、発現研究、細胞内局在、バイオアッセイ、及びＶＥＧＦｍｇの精製において有用である。ＶＥＧＦｍｇ「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」には、非ＶＥＧＦｍｇポリペプチドに融合したＶＥＧＦｍｇが含まれる。ＶＥＧＦｍｇ融合タンパク質は、幾つかの生物学的に活性な部分を含む、ＶＥＧＦｍｇ全長の何れかの部分を含む。ＶＥＧＦｍｇはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換体ＶＥＧＦｍｇの精製を促進する。ある宿主細胞において、（例えば、哺乳類）異種結合性シグナル配列融合体は、ＶＥＧＦｍｇ発現及び／又は分泌を改善する。更なる例示的な融合が表Ｃ中に示される。
他の融合相手が、治療上、ＶＥＧＦｍｇに適用することが可能である。イムノグロブリン（Ｉｇ）タンパク質ファミリーのメンバーとの融合は、ＶＥＧＦｍｇリガンド又は基質の相互作用を阻害し、結果的に、インビボにおけるＶＥＧＦｍｇ媒介シグナル伝達を抑制するような治療において有用である。このような薬剤組成物中に取り込まれた融合体は、増殖及び分化障害を治療するため、並びに細胞の生存を調整するために使用することができる。ＶＥＧＦｍｇ−Ｉｇ融合ポリペプチドも、被検対象中で抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂｓを生産させ、ＶＥＧＦｍｇリガンドを精製し、及び他の分子とＶＥＧＦｍｇの相互作用を阻害する分子をスクリーニングするための免疫原としても使用可能である。
融合タンパク質は、組換え法を用いることで容易に作り出すことができる。ＶＥＧＦｍｇをコードする核酸は、ＶＥＧＦｍｇのＮＨ２−もしくはＣＯＯ−末端、又は内部に対して非ＶＥＧＦｍｇコード化核酸をインフレームにて融合させることができる。また、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により合成してもよい。また、引き続いてキメラ遺伝子配列を生成させるためにアニール及び再増幅され得る２つの連続的な遺伝子断片間に、相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを用いたＰＣＲ増幅（Ａｕｓｕｂｅｌ等， １９８７）も有用である。ＶＥＧＦｍｇを融合部分とインフレームでサブクローニングすることを促進させる多くのベクターは購入可能である。
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【００６９】
９．ＶＥＧＦｍｇ組換体発現ベクター及び宿主細胞
ベクターは宿主細胞間でＤＮＡをシャトルするため、又はヌクレオチド配列を発現させる方法として用いられる道具である。幾つかのベクターは原核生物でのみ機能するが、他は原核生物と真核生物の両方で機能し、真核生物中での発現のために原核生物からの大規模ＤＮＡ調製を可能にする。対象のＤＮＡ、ＶＥＧＦｍｇヌクレオチド配列又は断片などの挿入は、ライゲーション技術及び／又は当業者において周知の接合方法により達成される。そのようなＤＮＡは、その組み込みがベクターの何れか必要な構成成分を破壊しないように挿入される。挿入されたＤＮＡをタンパク質に発現させるために使用されるベクターの場合、導入されたＤＮＡは、その転写及び翻訳を支配するベクターエレメントに作用可能に連結される。
ベクターは、２つの一般的なクラスに分配される：クローニングベクターは、適切な宿主細胞中での伝播には必須ではなく、外来のＤＮＡを挿入し得る領域を持つ複製可能なプラスミド又はファージである；外来ＤＮＡは、まるでベクターの構成成分であるかの如く、複製され、伝播される。発現ベクター（プラスミド、酵母、又は動物ウィルスゲノムなど）は、外来ＤＮＡを転写及び翻訳するために外来性の遺伝学的物質を宿主細胞又は組織中へ導入するために用いられる。発現ベクターにおいて、導入されたＤＮＡは、挿入ＤＮＡを転写するために宿主細胞へシグナルを送るためのプロモーターのようなエレメントに作用可能に連結される。特異的な因子に応答して遺伝子の転写をコントロールする誘導可能なプロモーターのような幾つかのプロモーターは非常に有用である。作用可能に連結するＶＥＧＦｍｇ又はアンチセンスコンストラクトは、ＶＥＧＦｍｇ又は断片、又はアンチセンスコンストラクトの発現をコントロールすることができる。古典的な誘導可能なプロモーターの例には、α−インターフェロン、ヒートショック、重金属イオン、及びグルココルチコイドなどのステロイド（Ｋａｕｆｍａｎ， １９９０）及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。他の望ましい誘導可能なプロモーターには、コンストラクトが導入される細胞には内在しないものではあるが、誘導剤が外から供給された場合には細胞内で応答するものが含まれる。
ベクターは、多くの異なる徴候を持つ。「プラスミド」は、付加的なＤＮＡセグメントが導入され得る環状二重鎖ＤＮＡ分子のことである。ウィルスベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウィルスゲノム中に受け入れることができる。ある種のベクターは宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、バクテリアの複製起点を持つバクテリアのベクターと、エピソームである哺乳類のベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は宿主細胞中に導入されると宿主細胞中のゲノムに組込まれ、それにより宿主ゲノムと一緒に複製される。通常、有用な発現ベクターはしばしばプラスミドである。しかしながら、発現ベクターの他の形態、ウィルスベクター（例えば、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ関連ウィルス）などが考慮される。ＶＥＧＦｍｇ（又は断片）を含む組換体発現ベクターは、ＶＥＧＦｍｇと作用可能に結合された一又は複数の宿主細胞応答（又はインヴィトロで操作可能な）制御配列を利用することにより、ＶＥＧＦｍｇの転写を制御する。「作用可能に結合された」とは、関心あるヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現が達成されるように制御配列と結合されていることを示す。
ベクターを種々の生物及び／又は細胞中に導入することができる（表Ｄ）。或いは、該ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列とＴ７ポリメラーゼを用いて、インヴィトロで転写及び翻訳することができる。
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【００７０】
ベクターの選択は、用いられる生物又は細胞及びベクターの望まれる運命による。ベクターは、標的細胞中で一度複製するか、又は「自殺」ベクターであり得る。一般に、ベクターはシグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらのエレメントの選択は、ベクターが使用される生物に依存して、容易に決定される。これらのエレメントの幾つかは、誘導可能又は条件が整うと「オン」になる条件的プロモーターのような、条件的なものである。誘導可能なプロモーターの例には、組織特異的で、ある種の細胞型に対しては発現を低下させるもの、ステロイド応答性のもの、又はヒートショックに反応するものが含まれる。ｌａｃオペロンなどのある種のバクテリアの抑制システムは、哺乳類細胞及び遺伝子操作動物中で利用される（Ｆｉｅｃｋ等， １９９２；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ等， １９９６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ及びＳｈｏｒｔ， １９９１）。ベクターはベクターが取り込まれた細胞の同定を促進するためにしばしば選択マーカーを使用する。多くの選択マーカーは原核生物の使用に関する技術において周知であり、通常、抗生物質耐性遺伝子又は独立栄養性及び栄養要求性突然変異である。
アンチセンス及びセンスのＶＥＧＦｍｇオリゴヌクレオチドを用いると、ＶＥＧＦｍｇポリペプチド発現を妨げることができる。これらのオリゴヌクレオチドは標的核酸配列に結合し、二重鎖の分解を増強し、未成熟な転写又は翻訳を終結させること、又はその他の方法によって標的配列の転写又は翻訳を阻止する二重鎖を形成する。
アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れかである単一鎖核酸であり、標的ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ（センス）又はＶＥＧＦｍｇ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合することができる。当該発明によると、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドのＶＥＧＦｍｇ ＤＮＡのコード化領域の断片を含む。一般に、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００塩基の長さ又はそれより長い塩基をを含み得る。特に、（Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ， １９８８；ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ等， １９８８ｂ）は付与されたｃＤＮＡ配列に由来するアンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドを導き出す方法を記述する。
アンチセンス及びセンスのオリゴヌクレオチドの修飾は、それらの効果を増大させる。修飾された糖−リン酸ジエステル結合又は他の糖結合（国際公開第９１／０６６２９号， １９９０）は、標的配列に対する結合特異性は破壊せずに内在性のヌクレアーゼに対する耐性を付与することにより、インビボにおける安定性を増加させる。共有結合された有機的部分（国際公開第９０／１０４４８号， １９９１）又はポリペプチド−（Ｌ）−リジンのような他の修飾は、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させることができる。他の吸着物は標的に対するオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾し、金属複合体又はインターカレート化（例えば、エリプチシン）又はアルキル化剤が含まれる。
【００７１】
アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドを標的細胞（標的核酸配列を含む細胞）中へ導入するために、何れかの遺伝子転移法が使用され、当業者において周知である。遺伝子転移法の例には、１）エプステイン−バーウィルス様遺伝子転移ベクター又は外来性のＤＮＡをリガンド結合分子に結合させる（国際公開第９１／０４７５３号， １９９１）などの、生物学的方法、２）エレクトロポレーションのような物理的な方法、及び３）ＣａＰＯ４沈殿及びオリゴヌクレオチド−脂質複合体（国際公開第９０／１０４４８号， １９９０）などの化学的な方法が含まれる。
「宿主細胞」及び「組換体宿主細胞」という用語は、互いに交換可能に使用される。これらの用語は、特定の対象細胞だけではなく、これらの細胞の子孫又は潜在的な子孫をも意味する。突然変異又は環境による影響のどちらかによりある種の修飾が、次の世代で生じるため、実際は、このような子孫は親細胞と同一ではない可能性があるが、やはり発明の範囲に含まれる。
真核細胞のトランスフェクション及び原核細胞のトランスフォーメーションの方法は、当該技術において周知である。宿主細胞の選択は関心ある核酸を導入するための好適な技術を決定する。表Ｅには、限定を意味するものではないが、当該技術において多くの周知技術をまとめてある。また、生物への核酸の導入、もしあれば特定の生物に対してインヴィトロのトランスフェクション技術、並びに確立された遺伝学的技術を用いるエキソビボの技術によっても行われる可能性がある。
【００７２】
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【００７３】
ベクターは、該ベクターが取り込まれた細胞の同定を促進するためにしばしば選択マーカーが用いられる。多くの選択マーカーは、原核生物の使用、通常は、抗生物質耐性遺伝子又は独立栄養性及び栄養要求性突然変異の使用に関する技術分野において周知である。表Ｆには哺乳動物細胞のトランスフェクションに対するしばしば利用される選択マーカーが列挙されている。
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【００７４】
原核細胞の又は真核細胞の宿主培養細胞などの本発明における宿主細胞は、ＶＥＧＦｍｇを生産するために使用することができる。従って、本発明は本発明の宿主細胞を用いてＶＥＧＦｍｇを生産するための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、ＶＥＧＦｍｇが生成されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ＶＥＧＦｍｇをコードする組換体発現ベクターが導入される）を培養することを含む。他の実施態様において、本方法には、さらにＶＥＧＦｍｇを培地又は宿主細胞から単離することが含まれる。
【００７５】
遺伝子導入ＶＥＧＦｍｇ動物
遺伝子導入動物は、ＶＥＧＦｍｇの機能及び／又は活性を研究し、ＶＥＧＦｍｇ活性の修飾因子を同定し及び／又は評価するために有用である。「遺伝子導入動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物、更に好ましくは、ラット又はマウスなどの齧歯類であって、その細胞の一又は複数は導入遺伝子を包含する。他の遺伝子導入動物には、霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、チキン、両生類などが含まれる。「導入遺伝子」は遺伝子導入動物が発育する細胞のゲノム中に組込まれ、成熟した動物のゲノム中にも残存する外来性のＤＮＡである。遺伝子導入は、好ましくは一又は複数の細胞型又は組織中で天然にコードされる遺伝子産物の発現を妨げる（「ノックアウト」遺伝子導入動物）、又は組み込み、染色体上での配置、又は組換え領域のマーカー又は指示薬として役立つ（例えばｃｒｅ／ｌｏｘＰマウス）目的を持って、遺伝子導入動物の一又は複数の細胞型又は組織中でコードする遺伝子産物の発現を導く。「相同組換え動物」は、齧歯類のような非ヒト動物であり、動物を発育させる前に（例えば、胎児性の）細胞中で内在性のＶＥＧＦｍｇと相同的に組換わる外来性ＤＮＡ分子によって内在性ＶＥＧＦｍｇが変えられてきた。外来性のＶＥＧＦｍｇを持つ、ＶＥＧＦｍｇコード化配列が導入された卵母細胞又は胎児性の幹細胞などの宿主細胞は、非ヒト遺伝子導入動物を生産するために使用される。その後、このような宿主細胞は非ヒト遺伝子導入動物又は相同組換え動物を創造するために用いることができる。
【００７６】
１．遺伝子導入動物の生産へのアプローチ
遺伝子導入動物は、ＶＥＧＦｍｇを受精後の卵母細胞中のオスの前核中に導入し（例えば、マイクロインジェクション、レトロウィルス感染によって）、卵母細胞が疑似妊娠したメスの養育動物（ｐｆｆａ）中で発育することを可能にすることにより創り出すことができる。ＶＥＧＦｍｇ ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。或いは、ＶＥＧＦｍｇの相同体を導入遺伝子として用いることができる。また、介在配列及びポリアデニル化シグナルも導入遺伝子の発現を増加させるために導入遺伝子中に含まれることが可能である。組織特異的な制御配列は、特定の細胞でＶＥＧＦｍｇ の発現を導くようにＶＥＧＦｍｇ 導入遺伝子と作用可能に結合させることができる。胎児の操作及びマイクロインジェクションを介した遺伝子導入動物、特にマウスなどの動物を生産するための方法は、当該技術分野において通常の方法、例えば、（Ｅｖａｎｓ等， 米国特許第４，８７０．００９号， １９８９；Ｈｏｇａｎ， ０８７９６９３８４３， １９９４；Ｌｅｄｅｒ及びＳｔｅｗａｒｔ， 米国特許第４，７３６，８６６号， １９８８；Ｗａｇｎｅｒ及びＨｏｐｐｅ， 米国特許第 ４，８７３，１９１号， １９８９）となっている。他の非マウス遺伝子導入マウスは、類似の方法によって作製され得る。遺伝子導入創出動物は、更なる遺伝子導入動物を繁殖させるために用いることができ、そのゲノム中での導入遺伝子の存在及び／又は動物の組織又は細胞中での導入ｍＲＮＡの発現に基づいて同定することができる。遺伝子導入（例えば、ＶＥＧＦｍｇ）動物は、他の導入遺伝子を保有する遺伝子導入動物を繁殖させることができる。
【００７７】
２．遺伝子導入動物を作製するためのベクター
相同組換え動物を産み出すために、欠損、付加又は置換が、例えば、機能的にＶＥＧＦｍｇを破壊するような変更を行うように導入されたＶＥＧＦｍｇの少なくとも一部を含むベクター。ＶＥＧＦｍｇはマウス遺伝子、又は天然に生じる変異体などの他のＶＥＧＦｍｇ相同体であり得る。一つのアプローチは、ノックアウトベクターは、相同組換えによって、内在性ＶＥＧＦｍｇ遺伝子を機能的に破壊し、その結果、もしあれば非機能的なＶＥＧＦｍｇタンパク質が発現される。
或いは、ベクターは、相同組換えにおいて、内在性ＶＥＧＦｍｇが変異され、さもなくば変更されるが、依然として機能的なタンパク質をコードするように設計することができる（例えば、上流の制御領域は、結果的に内在性のＶＥＧＦｍｇの発現を変更するように変更することができる）。このタイプの相同組換えベクターにおいて、ＶＥＧＦｍｇの変更された部分は、ベクターによって運ばれる外来性のＶＥＧＦｍｇと胎児性幹細胞中の内在性ＶＥＧＦｍｇとの間に生じる相同組換えを可能ならしめるために、ＶＥＧＦｍｇの付加的な核酸によってその５’及び３’末端に隣接される。付加的な隣接するＶＥＧＦｍｇ核酸は、内在性ＶＥＧＦｍｇと相同組換えを引き起こすために十分なものである。典型的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’及び３’の両末端における）は、ベクター中に包含される（Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ， １９８７）。その後、ベクターは、胎児性幹細胞株中に導入され（例えば、エレクトロポレーションにより）、導入されたＶＥＧＦｍｇが相同的に内在性のＶＥＧＦｍｇと組換わった細胞が選択される（Ｌｉ等， １９９２）。
【００７８】
３．ＶＥＧＦｍｇ導入遺伝子の発生中の細胞への導入
選択された細胞は、その後、集合キメラを形成させるために動物（例えば、マウス）の胚盤胞中へインジェクトされる（Ｂｒａｄｌｅｙ， １９８７）。その後、キメラ胎児は偽妊娠の雌性乳母中へ移植され、胎児には名前が付けられる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同的に組換えられたＤＮＡを動物の全細胞において含む動物を繁殖させるために使用される。相同組換えベクター及び相同組換え動物を構築するための方法が記述されている（Ｂｅｒｎｓ等， 国際公開第９３／０４１６９号， １９９３；Ｂｒａｄｌｅｙ， １９９１；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ等， 国際公開第９１／０１１４０号， １９９１；Ｌｅ Ｍｏｕｅｌｌｉｃ及びＢｒｕｌｌｅｔ， 国際公開第９０／１１３５４号， １９９０）。
或いは、導入遺伝子の制御された発現を可能ならしめるような選択された系を含む遺伝子導入動物が産み出され得る。そのような系の例として、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系がある（Ｌａｋｓｏ等， １９９２）。他のリコンビナーゼの系は、出芽酵母のＦＬＰリコンビナーゼの系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ等， １９９１）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を制御するために用いられる場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を持った動物が必要となる。そのような動物は、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を持つ動物と、リコンビナーゼをコードする導入遺伝子を持つ動物とを交尾させることによって、「二重」遺伝子導入動物として作製することが可能である。
また、遺伝子導入動物のクローンも作製することができる（Ｗｉｌｍｕｔ等， １９９７）。簡単に述べると、遺伝子導入動物由来の細胞は単離することができ、増殖サイクルを脱出してＧ０期に移行するように誘導することができる。その後、静止期の細胞は、該静止期細胞が単離された種と同一の動物由来の徐核卵母細胞と融合させることができる。再構成された卵母細胞は、その後、桑実胚又は未分化胚芽細胞に発生するまで培養し、次いで偽妊娠の雌性乳母中へ導入される。該雌の乳母から生まれた子孫は、「親」遺伝子導入動物のクローンとなる。
【００７９】
抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂｓ
本発明は、何れかのＶＥＧＦｍｇエピトープと免疫特異的に結合するＦａｂ又は（Ｆａｂ）２などのようなＡｂｓ及び抗体断片を含む。
「抗体」（Ａｂ）はＶＥＧＦｍｇ（抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂ；アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和Ａｂｓを含む）に対する単一Ａｂｓ、ポリエピトープ特異的な抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂ組成物、単一鎖抗Ａｂｓ、及び抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂｓ断片を含む。「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な集団から得られる、即ち、該集団を含む個々のＡｂｓは少量存在するであろう起こりえる自然発生的な突然変異を除いて同一である。例として、Ａｂｓには、ポリクローナル（ｐＡｂ）、モノクローナル（ｍＡｂ）、ヒト化、二重特異的な（ｂｓＡｂ）、及び異種結合性Ａｂｓが含まれる。
１．ポリクローナル Ａｂｓ（ｐＡｂｓ）
ポリクローナルＡｂｓは哺乳類ホスト中で、例えば、免疫原、及び所望であればアジュバントの一又は複数回のインジェクションによって生産される。典型的には、免疫原及び／又はアジュバントは複数回の皮下又は腹腔内へのインジェクションによってインジェクトされる。免疫原は、ＶＥＧＦｍｇ又は融合タンパク質を含む。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロース　ジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。免疫応答を改善するために、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターなどのホスト中での免疫原性のタンパク質に結合させてもよい。抗体産生のためのプロトコールは、（Ａｕｓｕｂｅｌ等， １９８７；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９８８）によって記述されている。或いは、ｐＡｂｓは、ＩｇＹ分子を生産するチキン中で作製されてもよい（Ｓｃｈａｄｅ等， １９９６）。
【００８０】
２．モノクローナルＡｂｓ（ｍＡｂｓ）
抗ＶＥＧＦｍｇ ｍＡｂｓは、ハイブリドーマ法を用いて調製される（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， １９８３）。ハイブリドーマ法は少なくとも４段階を含む：（１）ホストまたは、ホスト由来のリンパ球を免疫する；（２）ｍＡｂ分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を収集し（３）リンパ球を不死化した細胞に融合させ、及び（４）所望のｍＡｂ（抗ＶＥＧＦｍｇ）を分泌させる細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当なホストが、免疫原に特異的に結合するはずのＡｂｓを生産し又は生産することができるリンパ球を誘発させるために免疫される。或いは、リンパ球はインヴィトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が所望の場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される；しかしながら、他の哺乳類ソース由来の脾臓細胞又はリンパ球が好ましい。免疫原は典型的にはＶＥＧＦｍｇ又は融合タンパク質を含む。
その後、リンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために不死化細胞株と融合されが、ポリエチレングリコールなどの融合剤によって促進される（Ｇｏｄｉｎｇ， １９９６）。トランスフォーメーションによって不死化された齧歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞及び非融合不死化細胞ではない純粋な集団が好ましいため、融合後、非融合、不死化細胞の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で、細胞を成長させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。
【００８１】
好ましい不死化細胞は効率よく融合し、ＨＡＴなどの培地中で選択することにより混合集団から単離することができ、融合後、安定で高レベルの抗体の発現をサポートする。好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）より入手可能である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株についても、ヒトｍＡｂｓ産生に関し記述されている（Ｋｏｚｂｏｒ等， １９８４；Ｓｃｈｏｏｋ， １９８７）。
ハイブリドーマ細胞は細胞外に抗体を分泌するため、ＶＥＧＦｍｇに対するｍＡｂｓ（抗ＶＥＧＦｍｇ ｍＡｂｓ）の存在をアッセイすることが可能である。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫沈降又はインヴィトロでの結合アッセイは、ｍＡｂｓの結合特異性を測定し（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９９９）、スキャッチャード解析を含む（Ｍｕｎｓｏｎ及びＲｏｄｂａｒｄ， １９８０）。
抗ＶＥＧＦｍｇ ｍＡｂｓ分泌性ハイブリドーマ細胞は限界希釈法及びサブカルチャーにより単一クローンとして単離され得る（Ｇｏｄｉｎｇ， １９９６）。適切な培地にはダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、又は所望ならば、タンパク質−フリー又は−低減又は血清−フリー培地が含まれる（例えば、Ｕｌｔｒａ ＤＯＭＡ ＰＦ 又はＨＬ−１；Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）。ハイブリドーマ細胞は、腹水中でのインヴィボにおいて増殖させてもよい。
ｍＡｂｓは培地又は腹水からプロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィー（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９９９）などの従来のＩｇ精製方法によって単離又は精製される。
また、ｍＡｂｓは組換え技術によっても作製される（米国特許第４１６６４５２号， １９７９）。ＤＮＡコード化抗ＶＥＧＦｍｇｍＡｂｓは、抗ＶＥＧＦｍｇ分泌ｍＡｂｓハイブリドーマ細胞株から好ましいＤＮＡをプローブするために、従来の方法、例えば、マウスの重及び軽鎖抗体遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより容易に単離され、配列決定することができる。一度単離されると、単離されたＤＮＡ断片は、ｍＡｂｓを発現させるために、他にＩｇタンパク質を生産しないシミアンＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞などの宿主細胞中へトランスフェクトさせる発現ベクター中へサブクローニングされる。単離されたＤＮＡ断片は、例えば、ヒト重及び軽鎖定常ドメインに対するコード化配列を相同なマウス配列の代わりに置換することにより（米国特許第４８１６５６７号， １９８９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， １９８７）、又は非Ｉｇポリペプチドをコードする配列の全て又は一部に対するＩｇコード化配列を融合することにより、修飾することができる。そのような非Ｉｇポリペプチドは、キメラ二価抗体を創作するために、抗体の定常ドメインと置換することが可能であり、又は一抗原結合部位の定常ドメインと置換することができる。
【００８２】
３．一価Ａｂｓ
Ａｂｓはお互いに結果的にはクロスリンクしない一価Ａｂｓでもよい。例えば、ある方法には、Ｉｇ軽鎖及び修飾された重鎖の組換体発現が関与する。Ｆｃ領域中の何れかのポイントにおける通常の重鎖切断は、重鎖のクロスリンクを妨げる。或いは、それに関わるシステイン残基が他のアミノ酸残基で置換されるか又は除去され、クロスリンクするのを妨げる。インヴィトロの方法も、一価Ａｂｓの調製に適する。ＡｂｓはＦａｂ断片などの断片を生産するように消化することができる（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ， １９９９）。
【００８３】
４．ヒト化及びヒトＡｂｓ
抗ＶＥＧＦｍｇ　Ａｂｓにはさらにヒト化又はヒトＡｂｓが含まれる。非ヒトＡｂｓのヒト化形態は、非ヒトＩｇ由来の最小配列を含むキメラＩｇｓ、Ｉｇ鎖又は断片（ＦＶ， Ｆａｂ， Ｆあｂ’， Ｆ（ａｂ’）２又は他のＡｂｓの抗原結合サブ配列など）である。
一般に、ヒト化抗体は非ヒト由来から導入された一又は複数のアミノ酸残基を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と称され、典型的には「移入」可変ドメインから選ばれる。ヒト化は齧歯類のＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列と対応するヒト抗体配列とを置換することにより達成される（Ｊｏｎｅｓ等， １９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， １９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等， １９８８）。そのような「ヒト化」ＡｂｓはキメラＡｂｓであり（米国特許第４８１６５６７号， １９８９）、実質的に無傷のヒト可変ドメインより少ない部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化Ａｂｓは、典型的には、あるＣＤＲ残基及びおそらくあるＦＲ残基が齧歯類Ａｂｓ中の類似部位由来の残基と置換されているヒトＡｂｓである。ヒト化Ａｂｓには、マウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲであって、所望の特異的な親和性及び能力を持つ残基により、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が置換されるヒトＩｇｓ（レシピエント抗体）が含まれる。ある場合には、対応する非ヒト残基がヒトＩｇのＦＶフレームワーク残基を置換する。ヒト化Ａｂｓは、レシピエント抗体中にも移入ＣＤＲ又はフレームワーク配列中にも見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体には、全てではないがＣＤＲ領域のほとんどが非ヒトＩｇのものに対応し、全てではないがＦＲ領域のほとんどがヒトＩｇコンセンサス配列のものに対応する、少なくとも１つ、及び典型的には２つの可変領域が含まれる。また、ヒト化抗体には少なくともＩｇ定常領域（ＦＣ）の少なくとも一部分、典型的には、ヒトＩｇの一部分も、最適に含まれる（Ｊｏｎｅｓ等， １９８６；Ｐｒｅｓｔａ， １９９２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， １９８８）。　また、ヒトＡｂｓは、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等， １９９１；Ｍａｒｋｓ等， １９９１）及びヒトｍＡｂｓの調製（Ｂｏｅｒｎｅｒ等， １９９１；Ｒｅｉｓｆｅｌｄ及びＳｅｌｌ， １９８５）を含む、種々の技術を使用しても生産できる。同様に、内在性Ｉｇ遺伝子が部分的に又は完全に不活性化された遺伝子導入動物へヒトＩｇ遺伝子を導入することが、ヒトＡｂｓを合成するために利用される。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察され、遺伝子再編成、構築、及びレパートリーを含む全ての面においてヒトにおいて見られるような状況に酷似している（米国特許第５５４５８０７号， １９９６；米国特許第５５４５８０６号， １９９６；米国特許第５５６９８２５号， １９９６；米国特許第５６３３４２５号， １９９７；米国特許第５６６１０１６号， １９９７；米国特許第５６２５１２６号， １９９７；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等， １９９６；Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚｅｒ， １９９５；Ｌｏｎｂｅｒｇ等， １９９４；Ｍａｒｋｓ等， １９９２）。
【００８４】
５．二重特異的ｍＡｂｓ
二重特異的Ａｂｓは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を持つモノクローナルであり、好ましくはヒト又はヒト化である。例えば、結合特異性は、ＶＥＧＦｍｇ；他は選択された何れかの抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニット。
伝統的には、二重特異的Ａｂｓの組換体産生は、２つのＩｇ重鎖／軽鎖対の共発現に基づいており、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， １９８３）。Ｉｇ重鎖及び軽鎖のランダムな一揃いにより、生じるハイブリドーマ（クアドローマ）は１０の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、その内の一つだけが所望の二重特異的構造を持つ。所望の抗体は親和性クロマトグラフィー又は他の技術を用いて精製することができる（国際公開第９３／０８８２９号，１９９３；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等， １９９１）。
二重特異的抗体（Ｓｕｒｅｓｈ等， １９８６）を製造するために、所望抗体−抗原結合部位を持つ可変ドメインをＩｇの定常ドメイン配列と融合させる。融合は好ましくは、ヒンジの少なくとも一部分、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むＩｇ重鎖定常ドメインと行われる。好ましくは、軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、少なくとも融合体の一つの中に存在する。Ｉｇ重鎖融合体をコードするＤＮＡ及び、所望であれば、Ｉｇ軽鎖は別々の発現ベクター中に挿入され、適切な宿主生物へ同時形質移入される。
抗体分子対間の接点は、組換体細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にするように設計される（国際公開第９６／２７０１１号， １９９６）。好ましい接点には少なくとも抗体定常ドメインのＣＨ３領域の一部が含まれる。この方法において、第一の抗体分子の接点に由来する一又は複数の小アミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換される。大きな側鎖と同一又は同じサイズの代償性の「空洞」が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニン又はスレオニン）で置換することにより第二の抗体分子の接点上に創られる。このメカニズムは、ホモ二量体のような望まれない最終産物以上にヘテロ二量体の収量を増大させる。
二重特異的なＡｂｓは全長Ａｂｓ又は抗体断片として調製される（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異的Ａｂｓ）。二重特異的Ａｂｓを生産するための技術の一つは、化学結合を利用する。無傷のＡｂｓは、Ｆ（ａｂ’）２断片を生産するためにタンパク質分解的に切断され得る（Ｂｒｅｎｎａｎ等， １９８５）。近接するジチオールを安定化させ、分子間のジスルフィド形成を妨げるために、亜ヒ酸塩ナトリウムなどのジチオール複合化剤により断片を還元させる。その後、生じたＦａｂ’断片はチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体へ変換される。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つは、メルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールへ再変換され、二重特異的抗体を作るために他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と等モル量で混合される。生産された二重特異的Ａｂｓは酵素の選択的固定化に対する薬剤として使用することができる。
【００８５】
Ｆａｂ’’断片は大腸菌から直接回収され、二重特異的Ａｂｓを作るために化学的にカップルされる。例えば、完全にヒト化された二重特異的Ｆ（ａｂ’）２Ａｂｓを生産することができる（Ｓｈａｌａｂｙ等， １９９２）。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から別々に分泌され、インヴィトロにおいて直接化学的にカップルされ、二重特異的抗体を作る。
組換体細胞培養に直接由来する二重特異的抗体断片を作製し単離するための様々な技術も記述されている。例えば、ロイシンジッパーモチーフを利用することができる（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等， １９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のペプチドは、遺伝子融合により２つの異なるＡｂｓのＦａｂ’部分と連結される。抗体のホモ二量体は、ヒンジ領域において、モノマーを形成させた後抗体ヘテロ二量体を形成させるために再び酸化される。この方法も抗体ホモ二量体を作り得る。「ダイアボディー」技術（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ等， １９９３）は二重特異的抗体断片を生産するための代わりの方法を提供する。断片には、短かすぎて同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を許容しないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された重鎖可変領域（ＶＨ）が含まれる。一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは、他の断片の相補的なＶＨ及びＶＬドメインとの対形成を余儀なくされ、２つの抗原結合部位を形成する。二重特異的抗体を調製するための他の方策は、単一鎖ＦＶ（ｓＦＶ）ダイマーの使用である（Ｇｒｕｂｅｒｔ等， １９９４）。三重特異的Ａｂｓなどの二価以上のＡｂｓも考慮される（Ｔｕｔｔ等， １９９１）。
典型例である二重特異的Ａｂｓは、任意のＶＥＧＦｍｇ上の２つの異なるエピトープに結合する。或いは、細胞防御機構を、特定のＶＥＧＦｍｇを発現する特定の細胞に限定することができる：抗ＶＥＧＦｍｇのアームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、 ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）などの白血球が誘因する分子、又はＦＣγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦＣγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦＣγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧ（ＦＣγＲ）に対するＦＣレセプターと結合するアームと組合わされる。また、二重特異的Ａｂｓは、特定のＶＥＧＦｍｇを発現させる細胞に対して細胞毒性剤を標的するためにも使用される。これらのＡｂｓはＶＥＧＦｍｇ結合アーム及び細胞毒性剤又は放射性核種キレーターと結合するアームを持つ。
【００８６】
６．ヘテロ結合性Ａｂｓ
ヘテロ結合性Ａｂｓは、２つの共有結合性Ａｂｓから構成され、免疫系細胞を不要な細胞にターゲットさせること（４，６７６，９８０， １９８７）及びヒト免疫欠損ウィルス（ＨＩＶ）感染の治療（国際公開第９１／００３６０号， １９９１；国際公開第９２／２０３７３号， １９９２）のために提唱されてきた。架橋剤に関与することを含む合成タンパク質化学方法を用いてインヴィトロにおいて調製されるＡｂｓが考慮される。例えば、免疫毒は、ジスルフィド交換反応を使用し、又はチオエーテル結合を形成させることにより構築される。適切な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデートが含まれる（４，６７６，９８０， １９８７）。
【００８７】
７．免疫複合体
免疫複合体は、化学療法剤などの細胞毒性剤、毒素（例えば、バクテリア、真菌、植物、又は動物起源の酵素学的に活性な毒素又は断片）、又は放射活性アイソトープ（即ち、放射結合体）。
有用な酵素学的に活性な毒素及び断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、緑膿菌由来のエクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンシン（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質、ツルレイシインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。２１２Ｂｉ、 １３１Ｉ、 １３１Ｉｎ、 ９０Ｙ、 及び１８６Ｒｅなどの様々な放射性ヌクレオチドが放射性結合Ａｂｓの生成に利用可能である。
抗体及び細胞障害薬の結合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素を、調製することができる（Ｖｉｔｅｔｔａ等， １９８７）。１４Ｃ−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の抗体への結合のためのキレート剤の例である（国際公開第９４／１１０２６号， １９９４）。
【００８８】
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプタビジン等）に結合されてもよく、抗体−レセプター結合体は被検対象に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合結合体を循環から除去し、次に細胞障害薬（放射性核種等）に結合されたストレプタビジン「リガンド」（ビオチン等）を投与する。
８．エフェクター機能の設計
本抗体は、癌などの疾病の治療における抗体の有効性を向上させるために改変することができる。例えば、システイン残基をＦＣ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようなホモダイマーＡｂｓは、増強した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる（Ｃａｒｏｎ等， １９９２；Ｓｈｏｐｅｓ， １９９２）。向上した抗腫瘍活性を持つホモダイマーＡｂｓは、異種二官能性架橋を用いても調製しうる（Ｗｏｌｆｆ等， １９９３）。あるいは、抗体は、２つのＦＣ領域を有するように設計し、補体溶解を向上させることもできる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等， １９８９）。
【００８９】
９．免疫リポソーム
また、抗体を含むリポソームが調製されてもよい（米国特許第４４８５０４５号， １９８４；米国特許第４５４４５４５号， １９８５；米国特許第５０１３５５６号， １９９１；Ｅｐｐｓｔｅｉｎ等， １９８５；Ｈｗａｎｇ等， １９８０）。有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。このような調製物は、所望の径を有するリポソームが生成されるように定められた孔サイズのフィルターを通して押し出される。抗体のＦａｂ’断片は、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る（Ｍａｒｔｉｎ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ， １９８２）。また、ドキソルビシンなどの化学療法剤もリポソーム中に含まれてもよい（Ｇａｂｉｚｏｎ等， １９８９）。他に異なる組成の有用なリポソームが考慮される。
【００９０】
１０．ＶＥＧＦｍｇに対するＡｂｓの診断上の利用
抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂｓは、ＶＥＧＦｍｇを限局化させ及び／又は定量するために使用することができる（例えば、組織サンプル中のＶＥＧＦｍｇレベルの測定における使用のため又は診断上の方法における使用のため等）。抗ＶＥＧＦｍｇエピトープＡｂｓは薬剤的に活性な化合物として利用することができる。
抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂｓは、イムノアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降などの標準的な技術によりＶＥＧＦｍｇを単離するために使用することができる。これらのアプローチは、細胞及び組織から内在性のＶＥＧＦｍｇ抗原を含むポリペプチドの精製を促進する。これらのアプローチ並びに他のアプローチは、抗原性タンパク質の発現の量及びパターンを評価するためにサンプル中のＶＥＧＦｍｇを検出するために使用することができる。抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂｓは臨床的なテスト手順の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターするのに使用することができる；例えば、任意の治療計画の有効性を決定するため。抗体を検出可能な基質（標識）とカップリングさせることにより、Ａｂ−抗原複合体の検出が可能となる。標識のクラスには、蛍光性、発光性、生物発光性、及び放射活性物質、酵素、及び補欠分子族が含まれる。有用な標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプタビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン　イソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン　フルオレセイン、ダンシル　クロライド、フィコエリスリン、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン、及び１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが含まれる。
【００９１】
１１．抗体治療
本発明のＡｂｓには、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化及び完全体ヒトＡｂｓが含まれ、治療上使用され得る。このような薬剤は、一般に、被検対象の疾病又は病態を治療又は予防するために用いられるであろう。抗体調製物は、好ましくは高い抗原特異性及び親和性を有しており、一般に標的エピトープ（群）に結合することにより効果を媒介する。一般に、そのようなＡｂｓの投与は２つの効果のうち１つを媒介する：（１）抗体はリガンドの結合を妨げ、内在性のリガンド結合及びそれに続くシグナル伝達を除去する、又は（２）抗体が標的分子のエフェクター部位に結合することによる生理学的な結果を誘発し、シグナル伝達を開始させる。
治療上有効な量の抗体は、一般に、治療目的を達成するのに必要な量、エピトープ結合親和性、投与速度、及び被検対象からの抗体の除去速度と関係する。治療上有効な用量に関する通常の範囲は、限定はしないが、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。投薬頻度は、例えば、一日二回から週に一回である。
【００９２】
１２．Ａｂｓの薬剤的組成物
抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂｓ並びに他のアッセイで同定されたＶＥＧＦｍｇ相互作用分子（アプタマーなど）は、種々の障害を治療するための薬剤的組成物中にて投与される。そのような組成物を調製することに関与する原則及び考慮並びに構成成分の選択における指針は（ｄｅ Ｂｏｅｒ， １９９４；Ｇｅｎｎａｒｏ， ２０００；Ｌｅｅ， １９９０）中に見出すことができる。
ＶＥＧＦｍｇは細胞内に存在するため、Ａｂｓの完全体がインヒビターとして用いられる場合、細胞内移行するＡｂｓが好ましい。また、リポソームが細胞内への導入のための送達媒体として使用されてもよい。抗体断片が使用される場合、エピトープと特異的に結合する最小の阻害断片が好ましい。例えば、有用な抗体の可変領域配列に基づいて好適なエピトープに結合するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成し、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって合成することができる（Ｍａｒａｓｃｏ等， １９９３）。また、製剤には、１より多い特定の治療のための活性な化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない活性を伴うものも含まれる。組成物には、細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤などの機能を増強させる薬剤が含まれる。
また、活性成分は、コアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に包括させることもできる；例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマクロエマルション中。
インビボ投与に使用される製剤は無菌であることが極めて好ましい。これは、滅菌濾過膜を通した濾過又は多くの何れかの技術により容易に達成される。
抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、マトリクスが成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状であるような、徐放性製剤を調製してもよい。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（Ｂｏｓｗｅｌｌ及びＳｃｒｉｂｎｅｒ， 米国特許第３．７７３．９１９号，１９７３）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−（Ｄ）−３−ヒドロキシブチル酸酢から構成される注射可能な小球などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーを含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。
【００９３】
ＶＥＧＦｍｇの治療的適用
１．病理関連の有用性
本発明のポリヌクレオチドとタンパク質は、腫瘍及び新生組織形成、血管腫、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、特発性肺線維症、血管再狭窄、動静脈奇形、髄膜腫、血管新生緑内障、乾癬、血管線維腫、血友病性関節、肥厚性瘢痕、オスラー−−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫水晶体後線維増殖症、強皮症、トラコーマ、血管固着病理（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ）、滑膜炎、皮膚炎、子宮内膜症、翼状片、糖尿病性網膜症、角膜外傷又は移植に伴う新血管新生、創傷、腫れ物、及び潰瘍（皮膚、胃及び十二指腸）治癒に関連する潜在的な治療用途において有用である。例えば、ＡＲＰをコードしているｃＤＮＡは、遺伝子療法において有用であり得、ＡＲＰタンパク質はそれを必要とする患者に投与する場合に有用でありうる。ＡＲＰをコードしている新規な核酸と、本発明のＡＲＰタンパク質、又はその断片は、核酸又はタンパク質の存在又は量が評価される、診断用途において更に有用でありうる。これらの物質は、治療又は診断方法に使用される本発明の新規物質に免疫特異的に結合するＡｂｓの産生において更に有用である。
加えて、本発明は、患者から採取された細胞のバイオプシーのような、サンプルの臨床的状態又は病理を決定するために用いることができる。腫瘍又は癌のような増殖の臨床状態は、例えば癌の転移攻撃性を分類するものとして当業者によって認められている分類系である。
【００９４】
２．アゴニスト及びアンタゴニスト
「アンタゴニスト」には、内在性ＶＥＧＦｍｇの生物学的活性を一部又は完全に阻害し又は中和させる分子の何れもが含まれる。同様に、「アゴニスト」には、内在性ＶＥＧＦｍｇの生物学的活性を模倣する分子の何れもが含まれる。アゴニスト又はアンタゴストとして作用し得る分子には、Ａｂｓ又は抗体断片、内在性ＶＥＧＦｍｇの断片又は変異体、ペプチド、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、小有機分子、などが含まれる。
【００９５】
３．アンタゴニスト及びアゴニストの同定
アンタゴニストをアッセイするために、ＶＥＧＦｍｇ特定の活性に対してスクリーニングされる化合物と共に細胞に添加され、又は細胞中で発現される。ＶＥＧＦｍｇの存在下において、対象活性を化合物が阻害する場合、その化合物は、ＶＥＧＦｍｇに対するアンタゴニストである；ＶＥＧＦｍｇ活性が促進される場合、該化合物はアゴニストである。
（ａ）潜在的アンタゴニスト及びアゴニストの特異的な例
ＶＥＧＦｍｇの細胞内での効果を変更する何れかの分子は、アンタゴニスト又はアゴニストの候補である。当業者にとって周知のスクリーニング技術により、これらの分子を同定することができる。アンタゴニスト及びアゴニストの例には：（１）小有機及び無機化合物、（２）小ペプチド、（３）Ａｂｓ及び誘導体、（４）ＶＥＧＦｍｇに極めて関連性の強いポリペプチド、（５）アンチセンスＤＮＡ及びＲＮＡ、（６）リボザイム、（７）三重鎖ＤＮＡらせん、及び（８）核酸アプタマー、が含まれる。
ＶＥＧＦｍｇの活性部位又は該ペプチドの他の関連部分に結合し、及びＶＥＧＦｍｇの生物学的活性を阻害する小分子は、アンタゴニストである。小分子アンタゴニストの例には、小ペプチド、ペプチド様分子、好ましくは可溶であり、及び合成非ペプチジル有機もしくは無機化合物が含まれる。もしこれらがＶＥＧＦｍｇ活性を促進するならば、これらと同一の分子がアゴニストの例となる。
ＶＥＧＦｍｇ機能に影響を及ぼす何れかの抗体のほとんどが、アンタゴニストの候補であり、時にはアゴニストの候補である。抗体アンタゴニストの例には、ポリクローナル、モノクローナル、単一鎖、抗イディオタイプ、キメラＡｂｓ、又はこのようなＡｂｓ又は断片のヒト化型が含まれる。Ａｂｓは免疫応答が生じ得る何れかの種由来である。また、ヒト化Ａｂｓも考慮される。
或いは、潜在的アンタゴニスト又はアゴニストは、極めて関連性のあるタンパク質、例えば、ＶＥＧＦｍｇ相互作用タンパク質を認識するＶＥＧＦｍｇの突然変異型であるが、なんら効果を示さず、そのためＶＥＧＦｍｇの作用を競合的に阻害するものである。或いは、突然変異ＶＥＧＦｍｇは構成的に活性化され、アゴニストとして作用するかもしれない。
【００９６】
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトは有効なアンタゴニストであり得る。アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は標的のｍＲＮＡに対してハイブリダイズして翻訳を阻害することにより機能を阻止する。アンチセンス技術は、三重鎖へリックス形態、又は共にＤＮＡ又はＲＮＡに対するポリヌクレオチド結合に依存するようなアンチＤＮＡ又はＲＮＡを通じて遺伝子発現のコントロールをするために使用することができる。例えば、ＶＥＧＦｍｇ配列の５’コード化部分は、長さが約１０から４０塩基対であるアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドをデザインするために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に対して相補的であり（三重鎖へリックス）（Ｂｅａｌ及びＤｅｒｖａｎ， １９９１； Ｃｏｏｎｅｙ等， １９８８；Ｌｅｅ等， １９７９）そのため、転写及びＶＥＧＦｍｇの生産を阻害するようにデザインされる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インヴィボにおいてｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡのＶＥＧＦｍｇへの翻訳を阻止する（アンチセンス）（Ｃｏｈｅｎ， １９８９；Ｏｋａｎｏ等， １９９１）。また、これらのオリゴヌクレオチドもアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがＶＥＧＦｍｇの生産を阻害するようにインヴィボにおいて発現し得るように細胞へ導入することができる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０と＋１０の間の位置から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーション、次いで、ヌクレオチド内的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的における特異的リボザイム切断部位は、既知の技術によって同定され得る（国際公開第９７／３３５５１号， １９９７；Ｒｏｓｓｉ， １９９４）。
転写を阻害するために、一本鎖化される、デオキシヌクレオチドを含む三重鎖へリックス核酸は有用なアンタゴニストである。これらのオリゴヌクレオチドはフーグスチン塩基対ルールを介した三重鎖へリックスが促進されるようにデザインされ、一般に、プリン又はピリミジンのストレッチを必要とする（国際公開第９７／３３５５１号， １９９７）。
ＶＥＧＦｍｇ活性には核酸結合が含まれるため、ＢＡＴ ｍＲＮＡのようなＶＥＧＦｍｇ核酸結合部位と競合する分子は有効な細胞内競合因子となり得る。アプタマーは、ほぼ如何なる分子も認識し、特異的に結合するように用いることができる短いオリゴヌクレオチド配列である。指数関数的濃縮によるリガンドの体系的進化（ＳＥＬＥＸ）過程（Ａｕｓｕｂｅｌ等， １９８７；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ， １９９０；Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ， １９９０）は強力で、そのようなアプタマーを見つけるために使用可能である。アプタマーは多くの診断及び臨床的な使用を有する；臨床上、診断上使用されてきたほぼ全ての使用であって、アプタマーも使用され得るもの。さらに、一度同定されれば、より安価に作製され、製薬的な組成物、バイオアッセイ、診断テストにおいての投与を含む様々な形式において容易に適用することができる（Ｊａｙａｓｅｎａ， １９９９）。
【００９７】
製薬組成物
本発明のＶＥＧＦｍｇの核酸分子、ＶＥＧＦｍｇのポリペプチド及び抗ＶＥＧＦｍｇＡｂｓ（活性化合物）、及びその誘導体、断片、類似体及び相同体は、薬剤的組成物中へ取り込まれ得る。典型的に、そのような組成物には、核酸分子、タンパク質又は抗体及び製薬的に受容可能な坦体が含まれる。「製薬的に受容可能な坦体」は、何れかの及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックで吸着を遅らせる薬剤、及びその類似物を含み、薬剤的投与に適合する（Ｇｅｎｎａｒｏ， ２０００）。そのような担体又は希釈剤の好ましい例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが含まれる。リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。従来の培地又は薬剤が活性な化合物に適合しない場合以外は、これらの組成物の使用が考慮される。補充性の活性化合物も該組成物中に取り込まれる。
１．一般的な考慮事項
本発明の薬剤的な組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入など）、経皮性（即ち、局所的な）、経粘膜、及び直腸の投与を含む、意図された投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用のために使用される溶液又は懸濁液は：注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などのバッファー、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性の調製のための薬剤を含み得る。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製され得る。非径口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。
【００９８】
２．注射可能な製剤
注射に適する薬剤的組成物には、滅菌的な注射可能な溶液又は分散媒を即座に調製するための滅菌的水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌性のパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ．Ｊ．）、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌的であって、シリンジを用いて投与されるために流動的でなくてはならない。このような組成物は、調剤及び保存の間、安定であるべきで、バクテリア及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションから保護されなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地であり得る。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションを含み得る。例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれ得る。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分の一又は組み合わせとともに、適切な溶媒中に必要量の活性化合物（例えば、ＶＥＧＦｍｇ又は抗ＶＥＧＦｍｇ抗体）を取り込み、次に滅菌することで調製することができる。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーをもたらす真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。
【００９９】
３．経口組成物
通常、経口組成物には、不活性な希釈剤又は食用に適する担体が含まれる。それらは、ゼラチンのカプセル中に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口治療的な投与の目的には、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセルの形態で使用される。また、経口組成物は、うがい薬としての使用のための流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。製薬的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質が包含され得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロース、ガム　トラガガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの賦形剤、アルギン酸などの崩壊性剤、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチ；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＥＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリシル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。
４．吸入用組成物
吸入による投与に対して、化合物は、例えば、二酸化炭素などのガスのような適切な噴霧剤を含むネブライザー又は加圧容器からのエアロゾルスプレーとして提供される。
【０１００】
５．全身投与
また、全身投与は経粘膜的又は経皮的でもあり得る。経粘膜的又は経皮的投与について、標的のバリアー（群）を透過することができる浸透剤が選択される。経粘膜浸透剤は界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経鼻スプレー又は坐薬は経粘膜的な投与に対して使用することができる。経粘膜的投与に対して、活性化合物はオイントメント、軟膏、ジェル又はクリーム中へ製剤化される。
また、化合物は、直腸への送達に対して、坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの基剤と共に）又は滞留性の浣腸の形態で調製することもできる。
６．担体
一実施態様において、活性化合物は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムを含む制御放出製剤などの、体内からすぐに除去されることから化合物を保護する担体で調製される。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーが使用され得る。このような材料は、ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）及びＮＯＶＡ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ Ｅｌｓｉｎｏｒｅ， ＣＡ）から入手可能であり、当業者によって調製されることが可能である。また、リポソームの懸濁液も製薬的に受容可能な坦体として使用することができる。これらは、（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ等， 米国特許第４，５２２，８１１号， １９８５）にあるように当業者にとって既知の方法に従って調製することができる。
【０１０１】
７．単位投与量
単位投与量の形での経口製剤又は非経口製剤は、投与及び投与量の均一性を促進するように作成される。単位投与量形態は、治療されるべき被検対象に対する一回の投与量に適した物理的に別個の単位であって、必要とされる製薬的な担体と共に活性化合物の治療上の有効量を含む単位を意味する。本発明の単位投与量形態に対する特定化は、活性化合物のユニークな特徴及び特に所望される治療上の効果、及び活性化合物を化合物化すること固有の限界によって影響され、直接依存する。
８．遺伝子治療組成物
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入することができ、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、被検対象へ、例えば、静脈内注射、局所的投与（Ｎａｂｅｌ及びＮａｂｅｌ， 米国特許第５，３２８，４７０号， １９９４）又は定位的な注射（Ｃｈｅｎ等， １９９４）によって送達させることができる。遺伝子治療ベクターの製薬的調剤物は、受容可能な希釈剤を包含することができ、又は遺伝子送達媒体が組込まれた緩徐放出マトリックスを含むことができる。或いは、完全な遺伝子送達ベクターは、例えばレトロウィルスベクターのように、組換え体細胞から無傷で生産されるが、製薬的な調剤には、遺伝子送達系を生み出す一又は複数の細胞を包含し得る。
【０１０２】
９．製薬的組成物のキット
製薬的組成物はキット、容器、パック、又はディスペンサー中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明はキットとして供給される場合、組成物の異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装することは、活性構成成分の機能を失うことなく、長期間の貯蔵を可能にすることができる。
また、キットは診断テスト又は組織タイピングなどの特異的なテストの実施を促進するように、別々の容器中に試薬を包含する。例えば、ＶＥＧＦｍｇ ＤＮＡテンプレート及び適切なプライマーが内部コントロールとして供給される。
（ａ）容器又は器（ｖｅｓｓｅｌｓ）
キット中に含まれる試薬は、異なる構成成分の寿命が持続され、容器の材質によって吸着されず、変化されないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、凍結乾燥されたルシフェラーゼ又は窒素ガスのような中性で、不反応性ガスの下で包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために典型的に用いられる他の何れかの適切な材料など何れか適切な材質から構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似の物質から作られる簡単なボトル、及びアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた内部によって構成される包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物がが含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能でストッパを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。他の容器には、容易に除去可能で、除去することで区画を混合させるような膜によって分離された２つの区画を有する。除去可能な膜は、ガラス、プラスチック、ラバーなどである。
（ｂ）使用説明書
また、キットには使用説明書も供給されている。指示は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な指示は、キットに物理的に付随していないかもしれない；その代わりに、使用者はキットの製造者又は流通業者によって指定され又は電子メールで供給されるウェブサイトが案内されるであろう。
【０１０３】
スクリーニング及び検出方法
本発明の単離された核酸分子は、ＶＥＧＦｍｇを発現させ（例えば、遺伝子治療の適用における宿主細胞中での組換体発現ベクターを介して）、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプル中の）を検出し、後述のようにＶＥＧＦｍｇの活性を変更させるために使用される。さらに、ＶＥＧＦｍｇポリペプチドはＶＥＧＦｍｇ活性又は発現を調節する薬剤又は化合物をスクリーニングし、並びにＶＥＧＦｍｇの不十分な又は過剰な生産又は減少されたＶＥＧＦｍｇの生産又はＶＥＧＦｍｇの野生型タンパク質と比較すると異常である活性によって特徴付けられる疾患を治療し、又はＶＥＧＦｍｇが関与する生物学的機能（例えば、血管形成）を調節するために使用することができる。さらに、本発明の抗ＶＥＧＦｍｇ Ａｂｓは、ＶＥＧＦｍｇを検出し、単離し、及びＶＥＧＦｍｇ活性を調節するために使用することができる。
細胞の生存を調節することは、調節前の細胞と比較して、将来ある期間にわたって細胞が死ぬ確率を減少又は増加させることを意味する。
【０１０４】
１．スクリーニングアッセイ
本発明は、細胞中の遺伝子の翻訳、転写、活性又はコピーを含むＶＥＧＦｍｇへの刺激的又は阻害的な影響を与える様式、即ち、候補又はテスト化合物又は薬剤（例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、小分子、又は他の薬物）、食物、これらの組合わせなどを同定するための方法（スクリーニングアッセイ）を提供する。また、本発明は、スクリーニングアッセイにおいて同定される化合物も含む。
ＶＥＧＦｍｇ活性を増大又は減少させる化合物をテストすることが望ましい。化合物は：（１）細胞中の遺伝子のコピー数に影響を与えることにより（増幅因子及び減少因子）；（２）ＶＥＧＦｍｇの転写を増加又は減少させることにより（転写上方制御因子及び転写下方制御因子）；（３）タンパク質へのＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡの翻訳を増大又は減少させることにより（翻訳上方制御因子及び翻訳下方制御因子）；又は（４）ＶＥＧＦｍｇそれ自体の活性を増大又は減少させることにより（アゴニスト及びアンタゴニスト）、ＶＥＧＦｍｇの活性を調節する。
（ａ）化合物の影響
ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質レベルでＶＥＧＦｍｇに影響を与える化合物を同定するために、細胞又は生物体を候補化合物と接触させ、ＶＥＧＦｍｇ ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質における対応する変化を評価する（Ａｕｓｕｂｅｌ等， １９８７）。ＤＮＡ増幅因子及び減少因子については、ＶＥＧＦｍｇ ＤＮＡの量が測定され、転写上方制御因子及び下方制御因子である化合物については、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＡＮの量が測定され；翻訳上方制御因子及び下方制御因子である化合物については、ＶＥＧＦｍｇポリペプチドの量が測定される。アゴニスト又はアンタゴニストである化合物は、細胞又は生物体を化合物に接触させ、その後、インヴィトロにおける脂肪細胞の分化を測定することにより同定される。
一実施態様において、候補又はＶＥＧＦｍｇの活性又はポリペプチド又は生物学的に活性なタンパク質と結合又は調節するテスト化合物をスクリーニングするための多くのアッセイが利用可能である。テスト化合物は：生物学的ライブラリー；空間的アドレス可能固相又は液相ライブラリー；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法を含む、コンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの何れかを用いて得ることが可能である。生物学的ライブラリーによるアプローチは、ペプチドに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーを包含する（Ｌａｍ， １９９７）。
【０１０５】
（ｂ）小分子
「小分子」とは約５ｋＤ未満の分子量を持つ組成物のことを指し、最も好ましくは約４ｋＤ未満であり、更により好ましくは０．６ｋＤ未満である。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質又は他の有機もしくは無機分子であり得る。化学及び／又は真菌、バクテリア、又は藻類の抽出物などの生物学的混合物のライブラリーは、当該技術分野において既知であり、本発明のアッセイの何れかによりスクリーニングすることができる。分子ライブラリーの合成のための方法の実例は：（Ｃａｒｅｌｌ等， １９９４ａ；Ｃａｒｅｌｌ等， １９９４ｂ；Ｃｈｏ等， １９９３；ＤｅＷｉｔｔ等， １９９３；Ｇａｌｌｏｐ等， １９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ等， １９９４）中に見出すことができる。
化合物のライブラリーは溶液中（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ等， １９９２）又はビーズ上（Ｌａｍ等， １９９１）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ等， １９９３）、バクテリア、胞子（Ｌａｄｎｅｒ等， 米国特許第５，２２３，４０９号， １９９３）、プラスミド（Ｃｕｌｌ等， １９９２）又はファージ（Ｃｗｉｒｌａ等， １９９０；Ｄｅｖｌｉｎ等， １９９０；Ｆｅｌｉｃｉ等， １９９１；Ｌａｄｎｅｒ等， 米国特許第５，２２３，４０９号， １９９３；Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ， １９９０）上に提供されてもよい。無細胞アッセイには、アッセイ混合物を形成させるためにＶＥＧＦｍｇ又は生物学的に活性な断片にＶＥＧＦｍｇと結合する既知の化合物を接触させ、アッセイ混合物にテスト化合物を接触させ、テスト化合物がＶＥＧＦｍｇと相互作用する能力を決定することが含まれるが、テスト化合物がＶＥＧＦｍｇと相互作用する能力を決定することには、ＶＥＧＦｍｇがＶＥＧＦｍｇ標的分子と優先的に結合し、又はその活性を調節する能力を決定することを含む。
（ｃ）無細胞アッセイ
本発明の無細胞アッセイはＶＥＧＦｍｇの可溶性又は膜結合形態のどちらを利用してもよい。膜結合形態を含む無細胞アッセイの場合、ＶＥＧＦｍｇを溶液中に保つために可溶化剤を要する。そのような可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００及びＴＲＩＴＯＮ（登録商標）シリーズから選択されるその他のもの、ＴＨＥＳＩＴ（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォン酸、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンミニオール−１−プロパンスルフォン酸（ＣＨＡＰＳ）、又は３−（３−コラミドプロピル）ジメティルアンミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォン酸（ＣＨＡＰＳＯ）が含まれる。
【０１０６】
（ｄ）スクリーニングを促進するための標的分子の固定化
アッセイ方法の２以上の実施態様において、ＶＥＧＦｍｇ又はそのパートナー分子の何れかを固定化することは、タンパク質の一方又は両方の複合化されていない形態から複合化されたものの分離を促進し、同時にハイスループットアッセイを適応化させる。ＶＥＧＦｍｇへのテスト化合物の結合、又は候補化合物の存在下及び非存在下におけるＶＥＧＦｍｇの標的分子との相互作用は、反応物を収納するのに適した、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管などの何れかの容器中で達成される。タンパク質の一方又は両方がマトリックスに結合することを許容するドメインを付加するように、融合タンパク質が提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＶＥＧＦｍｇ融合タンパク質又はＧＳＴ−標的融合タンパク質は、後にテスト化合物又はテスト化合物及び非吸着標的タンパク質又はＶＥＧＦｍｇの何れかと混合されるグルタチオンセファロースビーズ（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着され、その混合物は複合体形成に至る条件下（例えば、塩及びｐＨに関して生理学的な条件にて）でインキュベートされる。インキュベーションの後、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルは、いずれの非結合成分をも除去するために洗浄され、ビーズの場合はマトリックスが固定化され、複合体は例えば上述のように直接又は間接的に決定される。或いは、複合体はマトリックスから分離され、ＶＥＧＦｍｇの結合又は活性レベルが標準的な技術を用いて決定される。
また、マトリックス上にタンパク質を固定化するためのその他の技術がスクリーニングアッセイにおいて用いられ得る。ＶＥＧＦｍｇ又はその標的分子のどちらかをビオチン−アビジン又はビオチン−ストレプタビジンシステムを用いて固定化させることができる。ビオチン化は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；ＰＩＥＲＣＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）などの多くの試薬によって達成され、ストレプタビジンでコートした９６ウェルプレート（ＰＩＥＲＣＥ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定化され得る。或いは、ＶＥＧＦｍｇ又は標的分子に反応性のＡｂｓが、標的分子とＶＥＧＦｍｇとの結合を妨げることなく、プレートウェルに誘導体化され、非結合標的又はＶＥＧＦｍｇが抗体結合によってトラップされる。そのような複合体を検出する方法は、ＧＳＴ−固定化複合体に関して記載されているものに加えて、ＶＥＧＦｍｇ又はその標的と反応性のＡｂｓを用いる複合体の免疫的検出、並びにＶＥＧＦｍｇ又は標的分子に関連する酵素的活性の検出に基づく酵素共役アッセイを含む。
【０１０７】
（ｅ）調節因子を同定するためのスクリーニング
ＶＥＧＦｍｇ発現の調節因子は、細胞を候補化合物と接触する方法において同定することができ、細胞中でのＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が決定される。候補化合物の存在下におけるＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡの発現レベルが、候補化合物の非存在下におけるＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルと比較される。例えば、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが候補化合物の存在下において、その非存在下よりも多い（即ち、統計学的に有意に）場合、候補化合物は、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の刺激因子として同定される。或いは、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が候補化合物の存在下において、その非存在下よりも少ない（統計学的に有意に）場合、候補化合物は、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又タンパク質発現の阻害因子として同定される。ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のレベルは、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又はタンパク質を検出するために記述された方法によって決定することができる。
（ｆ）ハイブリッドアッセイ
本発明のさらに他の態様において、ＶＥＧＦｍｇは、ＶＥＧＦｍｇ（ＶＥＧＦｍｇ結合タンパク質（ＶＥＧＦｍｇ−ｂｐｓ））と結合もしくは相互作用し及びＶＥＧＦｍｇ活性を修飾する他のタンパク質を同定するために２ハイブリッド又は３ハイブリット［Ｓａｉｆｅｒ， １９９４＃３８；Ｚｅｒｖｏｓ， １９９３＃３８２；Ｍａｄｕｒａ， １９９３＃３８３；Ｂａｒｔｅｌ， １９９３＃３８４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ， １９９３＃３８５；Ｂｒｅｎｔ， １９９４＃３８６］における「おとり」として使用され得る。また、そのようなＶＥＧＦｍｇ−ｂｐｓは、例えば、ＶＥＧＦｍｇ経路の上流又は下流エレメントとしてＶＥＧＦｍｇによるシグナル伝達にも関与する。
２ハイブリッドシステムはほとんどの転写因子のモジュラー（ｍｏｄｕｌａｒ）的性質に基づいており、分離可能なＤＮＡ結合及び活性化ドメインから成る。簡単には、該アッセイは二つの異なるＤＮＡコンストラクトを利用する。一方のコンストラクトにおいて、ＶＥＧＦｍｇをコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合される。他方のコンストラクトは、未同定タンパク質（「捕獲」又は「試料」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーに由来するＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインと融合される。「おとり」及び「捕獲」タンパク質がインヴィボにおいて相互作用することができると、ＶＥＧＦｍｇ依存的複合体を形成し、転写因子のＤＮＡ結合及び活性化ドメインが極めて近傍に位置せられることになる。この接近により転写因子に反応性の転写制御部位と作用可能に結合されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が許容される。レポーター遺伝子の発現が検出され、機能的な転写因子を含む細胞コロニーが単離され、ＶＥＧＦｍｇ相互作用タンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用することができる。
【０１０８】
（ｇ）カルシウムチャネル調節因子
幾つかの部類のカルシウムチャネル遮断薬が知られており、有効なアンタゴニスト及びアゴニストでありうる。例えば、Ｍａｋ等（Ｍａｋ等， １９９５）は親油性カルシウムチャネル遮断薬ニカルジピン、ニフェルジピン、ベラパミル及びジルチアゼムの内皮細胞の保護剤及び抗酸化剤としての活性を報告している。カルシウムチャネルは、ここで同定した遺伝子が差次的に発現される細胞生存において有意な役割を担っている可能性がある。カルシウムの調節において有意であるＶＥＧＦｍｇｓとしてはＤＳＣＲ１及びネキシンがある。例えば、ＤＳＣＲ１又はネキシンの発現を刺激し、ミトコンドリア呼吸鎖の活性を低減させる薬剤は、生存を促進し、血管形成関連疾患、つまり血管形成が抑制されるか不十分である疾患の治療に有用である。例えばＤＳＣＲ１又はネキシンの発現を低減させ、ミトコンドリア呼吸鎖の活性を増大させる薬剤は、アポトーシスを誘発又は促進し、よって血管形成が刺激される疾患を治療するのに有用である。
さらに、本発明は上述のスクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤及びここで上述した治療についてのその使用に関する。
【０１０９】
２．検出アッセイ
ここで同定されるＶＥＧＦｍｇ ｃＤＮＡ配列の部分又は断片（及び完全なＶＥＧＦｍｇ遺伝子配列）は、それら自体有用である。非限定的な例として、これらの配列は：（１）極めて少ない生物学的試料から個人を同定したり（組織タイピング）；及び（２）生物学的試料の法医学的な同定における手がかりとするために使用することができる。
（ａ）組織タイピング
本発明のＶＥＧＦｍｇ配列は、微少な生物学的試料から個人を同定するために使用され得る。この技術において、個人のゲノムＤＮＡは一又は複数の制限酵素によって消化され、ユニークなバンドを生じさせるようにサザンブロット上でプローブ化される。本発明の配列はさらに「制限酵素断片長多型」（ＲＦＬＰ；（Ｓｍｕｌｓｏｎ等， 米国特許第５，２７２，０５７号， １９９３））に対するＤＮＡマーカーとして有用である。
さらに、ＶＥＧＦｍｇ配列は、個人のゲノムの標的部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定するために用いることができる。ＶＥＧＦｍｇ配列は、個人のゲノム由来の対応配列を増幅し、その後増幅された断片の配列を決定するために使用できる配列の５’末端及び３’末端由来の２つのＰＣＲプライマーを調製するために使用される。
各個人は、対立遺伝子の相違によるＤＮＡ配列のユニークなセットを持つであろうから、個人由来のＤＮＡ配列に対応するパネルは、ユニークな個人の同定を提供することができる。本発明の配列は、そのように同定された個人及び組織由来の配列を得るために使用することができる。本発明のＶＥＧＦｍｇ配列は個人のゲノムの部分を独自に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度生じ、かなりの程度が非コード化領域に生じる。個々のヒトの間における対立遺伝子の変異は、約５００塩基ごとの頻度で生じる。対立遺伝子変異の多くは、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）によるもので、ＲＦＬＰｓが含まれる。
ここで記載される各配列は、ある程度、個人に由来するＤＮＡが同定の目的で比較され得る標準として使用される。非常に多くの数の多型が非コード化領域に生じているため、個人を区別するのに非常に少ない配列しか必要とされない。非コード化配列は、各々が１００塩基の非コード化増幅配列を生み出す１０から１０００のプライマーのパネルによって個人をポジティブに同定することができる。
【０１１０】
３．オリゴヌクレオチドアレイを用いるＶＥＧＦ調節遺伝子のアッセイ
上述のヌクレオチドプローブ、抗体等々の使用に加えて、他の方法もＶＥＧＦｍｇの発現を同定するために利用できる。
本発明は、ＨＵＶＥＣｓのような、内皮細胞の生存に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするための方法において差次的に発現されるものとして同定される遺伝子の用途を提供する。適切なコントロールとのＶＥＧＦｍｇ発現レベルの同時解析によって、薬物、タンパク質又は他の化合物及び製剤を評価することができる。ＶＥＧＦｍｇｓの差次的な発現の度合いの評価はＶＥＧＦｍｇｓに対応するｍＲＮＡｓに結合又はハイブリダイズ可能で、それに相補的なオリゴヌクレオチドを含むアレイ又は類似の装置を用いてなすことができる。例えば、そのようなアレイは、例えば化合物で処理された内皮細胞中でのｍＲＮＡレベルを測定し、未処理細胞中のｍＲＮＡレベルと比較することができる。この装置の一例は、ｍＲＮＡｓのある集合に結合又はハイブリダイズ可能で、それに相補的なオリゴヌクレオチドの微細化高密度アレイであるＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ， ＣＩＴＹ， ＣＡ）である。この方策の技術的な実施化は詳細に記載されている（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ等， １９９９）。
【０１１１】
予測的医薬
また、本発明は、診断上のアッセイ、予後のアッセイ、薬理ゲノム学、及び臨床試験をモニターすることが、予防的に個人を治療する予後の（予測的）目的のために使用される予測的医薬の分野にも関する。従って、本発明の一態様は、個人が疾病又は疾患に冒されていないかどうか、又は疾患を進行させる危険にあるかどうか、血管形成と細胞生存を含む異常なＶＥＧＦｍｇの発現又は活性に関係しているかどうかを決定する生物学的試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）との関連において、ＶＥＧＦｍｇ及び／又は核酸の発現並びにＶＥＧＦｍｇの活性を決定するための診断上のアッセイに関する。また、本発明は個人がＶＥＧＦｍｇ、核酸の発現又は活性に関連する疾患を進行させる危険に曝されているかどうかを決定するための予後の（予測的）アッセイにも関する。例えば、ＶＥＧＦｍｇの突然変異は生物学的試料においてアッセイされる。このようなアッセイは、ＶＥＧＦｍｇ、核酸発現、又は生物学的活性により特徴付けられ又は関連した疾患の発症よりも前に、予防的に個人を治療する診断上又は予測的目的のために使用され得る。
本発明の他の態様は、そのような個人にとって適切な治療上又は予防的薬剤を選択するため（ここでは「薬理ゲノム学」と称される）、個人におけるＶＥＧＦｍｇ活性、又は核酸の発現を決定するための方法を提供する。薬理ゲノム学は、個人の遺伝子型（例えば、特定の薬剤に対して応答する個人の能力を決定するための個人の遺伝子型）に基づいた個人の治療的又は予防的処置のための様式（例えば、薬物、食物）の選択を可能にする。本発明のその他の態様は、臨床試験におけるＶＥＧＦｍｇの発現又は活性における様式（例えば、薬物、食物）の影響をモニターすることに関する。
【０１１２】
１．診断上のアッセイ
生物学的サンプル中のＶＥＧＦｍｇの存在又は非存在を検出するための例示的な方法は、被検対象から生物学的サンプルを得ること、サンプル中でＶＥＧＦｍｇの存在を確認するために生物学的サンプルをＶＥＧＦｍｇ又はＶＥＧＦｍｇ核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出することができる化合物又は薬剤と接触させることに関与する。ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡをハイブリダイズすることができる標識化された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号：１又は３の核酸などの完全長ＶＥＧＦｍｇ核酸、又は少なくとも長さが１５、３０、５０、１００、２５０又は５００ヌクレオチドであって、緊縮性の条件下でＶＥＧＦｍｇｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなどのそれらの部分であり得る。
ＶＥＧＦｍｇポリペプチドを検出するための薬剤は、ＶＥＧＦｍｇと結合することが可能な抗体であり、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。Ａｂｓはポリクローナル抗体であり得、より好ましくはモノクローナル抗体である。無傷の抗体、又は断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。標識化プローブ又は抗体は、直接標識化される他の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的な検出と同様に、検出可能な基質と共役される。間接的な標識の例には、蛍光標識した二次抗体を用いる一次抗体の検出、及び蛍光標識したストレプタビジンで検出することができるようなビオチンによるＤＮＡプローブの末端ラベルが含まれる。「生物学的サンプル」という用語には、被検対象から単離された組織、細胞及び生物学的体液、並びに被検対象中に存在する組織、細胞及び体液が含まれる。本発明の検出方法は、インヴィトロ並びにインヴィボでの生物学的サンプル中のＶＥＧＦｍｇ　ｍＲＮＡ、タンパク質、又はゲノムＤＮＡを検出するために用いられ得る。例えば、インヴィトロにおけるＶＥＧＦｍｇ　ｍＲＮＡの検出のための技術には、ノーザンハイブリダイゼーション及びインサイツハイブリダイゼーションが含まれる。ＶＥＧＦｍｇポリペプチドの検出のためのインヴィトロでの技術には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡｓ）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、及び免疫蛍光法が含まれる。ＶＥＧＦｍｇゲノムＤＮＡの検出のためのインヴィトロでの技術には、サザンハイブリダイゼーション法及びインサイツハイブリダイゼーション蛍光法（ＦＩＳＨ）が含まれる。さらに、ＶＥＧＦｍｇを検出するためのインヴィボでの技術には、被検対象へ標識化された抗ＶＥＧＦｍｇ抗体を導入することが含まれる。例えば、抗体は、被検対象中における存在及び局在が標準的な画像化技術で検出することができる放射活性マーカーで標識化することができる。
【０１１３】
一実施態様において、被検対象由来の生物学的サンプルには、タンパク質分子、及び／又はｍＲＮＡ分子、及び／又はゲノムＤＮＡ分子が含まれる。好ましい生物学的サンプルは血液である。
他の実施態様において、さらにある方法が、コントロールを提供するために被検対象由来の生物学的サンプルを得ること、ＶＥＧＦｍｇ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡを検出するために該サンプルを化合物又は薬剤と接触させること、及びテストサンプル中のＶＥＧＦｍｇ、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在と、コントロール中のＶＥＧＦｍｇ、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在を比較することに関与する。
また、本発明は生物学的サンプル中のＶＥＧＦｍｇを検出するためのキットも包含する。例えば、キットには：サンプル中のＶＥＧＦｍｇ又はＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡを検出することができる標識化化合物又は薬剤；サンプル中のＶＥＧＦｍｇの量を決定するための試薬及び／又は装置；及びサンプル中のＶＥＧＦｍｇの量を標準と比較するための試薬及び／又は装置が含まれる。化合物又は薬剤は適切な容器中に包装される。キットはさらにＶＥＧＦｍｇ又は核酸を検出するためにキットを使用するための使用説明書を含み得る。
【０１１４】
２．予後のアッセイ
ここで記載された診断上の方法は、さらに、異常なＶＥＧＦｍｇ発現又は活性に関連した疾病又は疾患の進行の危険性を持つ又は危険状態にある被検対象を同定するために利用され得る。例えば、ここで記載されたアッセイは、ＶＥＧＦｍｇ、核酸発現又は活性に関連した疾病又は疾患の進行の危険性を持つ又は危険状態にある被検対象を同定するために使用され得る。或いは、予後のアッセイは疾病又は疾患の進行に関する危険性を持ち又は危険状態にある被検対象を同定するするために使用され得る。本発明は、異常なＶＥＧＦｍｇ発現又は活性と関連する疾病又は疾患であって、テストサンプルが被検対象から得られ、ＶＥＧＦｍｇ又は核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出される疾病又は疾患を同定する方法を提供する。テストサンプルは被検対象由来の生物学的サンプルである。例えば、テストサンプルは生物学的体液（例えば、血清）、細胞サンプル、又は組織であり得る。
予後のアッセイは、被検対象が異常なＶＥＧＦｍｇ発現又は活性と関連する疾病又は疾患を治療するための様式（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメチックス、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、食物など）を投与し得るかどうか決定するために使用することができる。そのような方法は、被検対象が疾患に対する薬剤で有効に治療され得るかどうか決定するために使用され得る。本発明は、テストサンプルが得られ、ＶＥＧＦｍｇ又は核酸が検出される被検対象が異常なＶＥＧＦｍｇ発現又は活性と関連した疾患のための薬剤によって効果的に治療され得るかどかを決定するための方法（例えば、ＶＥＧＦｍｇ又は核酸の存在が、異常なＶＥＧＦｍｇ発現又は活性と関連した疾患を治療するための薬剤を投与し得る被検対象に対する診断）を提供する。
また、本発明の方法は、遺伝的な損傷を持つ被検対象が異常な細胞増殖又は分化によって特徴付けられる疾患に対する危険性があるかどうか決定するためにＶＥＧＦｍｇにおける遺伝的な損傷を検出するために用いられ得る。被検対象由来のサンプル中において、変更位置におけるＶＥＧＦｍｇポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を与えることにより特徴付けられる遺伝的損傷、又はＶＥＧＦｍｇの異常発現の存在又は非存在を検出することが含まれる。そのような遺伝的損傷は：（１）ＶＥＧＦｍｇ由来の一又は複数の核酸の欠損；（２）一又は複数の核酸のＶＥＧＦｍｇへの付加；（３）ＶＥＧＦｍｇ中での一又は複数のヌクレオチドの置換；（４）ＶＥＧＦｍｇ遺伝子の染色体再構成；（５）ＶＥＧＦｍｇｍＲＮＡ転写産物のレベルの変更、（６）ゲノムＤＮＡのメチル化の変化などのＶＥＧＦｍｇの異常な修飾、（７）ＶＥＧＦｍｇｍＲＮＡ転写産物の非野生型スプライシングパターンの存在、（８）ＶＥＧＦｍｇの非野生型タイプのレベル、（９）ＶＥＧＦｍｇの対立遺伝子座の欠失、及び／又は（１０）ＶＥＧＦｍｇポリペプチドの不適切な翻訳後修飾、を確認することによって検出され得る。ＶＥＧＦｍｇにおける損傷を検出するために使用され得る多くの既知のアッセイ技術が存在する。有核細胞を含む何れの生物学的サンプルを使用してもよい。
【０１１５】
ある実施態様において、損傷の検出は、アンカーＰＣＲ又はｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ＲＡＣＥ）ＰＣＲなどのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、（Ｍｕｌｌｉｓ，米国特許第４，６８３，２０２号， １９８７；Ｍｕｌｌｉｓ等， 米国特許第４，６８３，１９５号， １９８７）において、或いは、ライゲーション鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等， １９８８；Ｎａｋａｚａｗａ等， １９９４）においてプローブ／プライマーを用いてもよく、後者は特にＶＥＧＦｍｇ遺伝子群における点突然変異を検出するために有用である（Ａｂｒａｖａｙａ等， １９９５）。この方法には被検対象からサンプルを収集すること、サンプルから核酸を単離すること、ＶＥＧＦｍｇ（存在するならば）のハイブリダイゼーション及び増幅が生じるような条件下で、ＶＥＧＦｍｇと特異的にハイブリダイズ化する一又は複数のプライマーと核酸とを接触させること、及び増幅産物の存在又は非存在を検出すること、又は増幅産物のサイズを検出すること、及び長さをコントロールサンプルと比較することが含まれる。ＰＣＲ及び／又はＬＣＲは、ここで記載された突然変異を検出するために使用される何れかの技術と共に、予備的な増幅ステップとして使用するのが望ましいと予想される。
別の増幅法には：自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ等， １９９０）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ等， １９８９）；Ｑβ複製（Ｌｉｚａｒｄｉ等， １９８８）、又はその他何れかの核酸増幅方法が含まれ、その後、当業者にとって周知の技術を用いて増幅された分子を検出する。これらの検出計画は特に低い存在量での核酸の存在の検出にとって有用である。
サンプルのＶＥＧＦｍｇ中の変異は、制限酵素の切断パターンの変化によって同定することができる。例えば、サンプル及びコントロールＤＮＡが単離され、増幅され（付加的に）、一又は複数の制限エンドヌクレアーゼによって切断され、断片の長さがゲル電気泳動によって決定され、比較される。サンプルとコントロールＤＮＡとの断片の長さにおける違いは、サンプルＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの配列の使用は、リボザイムの切断部位の発生又は喪失によって特異的突然変異の存在に関してスコアー化するために用いるいことができる。
【０１１６】
サンプル及びコントロール核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを数百又は数千ものオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズすることにより、ＶＥＧＦｍｇ中の遺伝的変異を同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎ等， １９９６；Ｋｏｚａｌ等， １９９６）。例えば、ＶＥＧＦｍｇ中の遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎ，等， 上掲中に記載されるように、光産生ＤＮＡを含む２次元アレイ中で同定することができる。簡単には、プローブの第一のハイブリダイゼーションアレイは、配列間の塩基の変化を同定するため、連続的にオーバーラップするプローブの直線的なアレイを作製することにより、サンプル及びコントロール中のＤＮＡの長いストレッチを通してスキャンするために使用することができる。このステップは、点突然変異の同定を可能ならしめる。この次に、検出されるべき全ての変異又は突然変異と相補的な、より小さく、特定化されたプローブアレイを用いることによって第二のハイブリダイゼーションアレイが行われる。各突然変異アレイは、一方は野生型遺伝子に相補的で、他方は突然変異遺伝子に相補的である、対応するプローブセットによって構成される。
さらに他の実施態様において、当該技術分野において知られている種々の配列決定反応の何れかが、ＶＥＧＦｍｇ配列を直接決定し、サンプルＶＥＧＦｍｇの配列を対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって突然変異を決定するために使用することができる。配列決定反応の例には、古典的な技術に基づくものが含まれる（Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ， １９７７；Ｓａｎｇｅｒ等， １９７７）。種々の自動配列決定方法の何れかが、マススペクトロメーターによる配列決定（Ｃｏｈｅｎ等， １９９６；Ｇｒｉｆｆｉｎ及びＧｒｉｆｆｉｎ， １９９３；Ｋｏｓｔｅｒ， 国際公開第９４／１６１０１号， １９９４）を含む予後的なアッセイ（Ｎａｅｖｅ等， １９９５）を実施する場合に使用することができる。
【０１１７】
ＶＥＧＦｍｇ中の突然変異を検出するための他の方法には、切断剤からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖におけるミスマッチの塩基を検出するために用いられるような方法が含まれる（Ｍｙｅｒｓ等， １９８５）。一般に、「ミスマッチ切断」の技術は、野生型ＶＥＧＦｍｇを含む（標識化）ＲＮＡ又はＤＮＡをサンプル由来の潜在的に変異のあるＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイズ化することによって形成されるヘテロ二重鎖を提供することにより開始する。二本鎖化二重鎖は、コントロールとサンプル鎖の間の塩基対ミスマッチから生じるような二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤によって処理される。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅで処理することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼによってミスマッチ領域を酵素的に切断するために処理することができる。他の実施態様では、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖が、ミスマッチ領域を切断するためにヒドロキシルアミン、四酸化オスミウム及びピペリジンで処理することができる。切断された物は、その後、突然変異部位を決定するために変性ポリアクリルアミド上でサイズにより分離される（Ｇｒｏｍｐｅ等， １９８９；Ｓａｌｅｅｂａ及びＣｏｔｔｏｎ， １９９３）。コントロールＤＮＡ又はＲＮＡは検出のための標識することができる。
ミスマッチ切断反応は、細胞サンプル由来のＶＥＧＦｍｇｃＤＮＡ中で点突然変異を検出し、マッピングするために確定された系において二本鎖ＤＮＡ中にミスマッチ塩基対を認識する（ＤＮＡミスマッチ修復）一又は複数のタンパク質を用いてもよい。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチにおいてＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシル酵素はＧ／ＴミスマッチにおいてＴを切断する（Ｈｓｕ等， １９９４）。典型的な実施態様に従うと、野生型ＶＥＧＦｍｇ配列に基づくプローブは、テスト細胞由来のｃＤＮＡ又は他のＤＮＡ産物とハイブリダイズ化する。二重鎖はＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、切断産物は、もしあれば、電気泳動法又は類似の方法で検出することができる（Ｍｏｄｒｉｃｈ等， 米国特許第５，４５９，０３９， １９９５）。
電気泳動上の移動度の変化は、ＶＥＧＦｍｇにおける突然変異を同定するために用いることができる。例えば、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）は突然変異と野生型核酸との電気泳動上の移動度における差を検出するために用いてもよい（Ｃｏｔｔｏｎ， １９９３；Ｈａｙａｓｈｉ， １９９２；Ｏｒｉｔａ等， １９８９）。サンプル及びＶＥＧＦｍｇ核酸の一本鎖ＤＮＡ断片は変性させた後再構成させる。一本鎖核酸変異体の二次構造は配列により変動する；電気泳動度において生じる変化により一塩基の変化でさえ検出可能である。ＤＮＡ断片は標識プローブにより標識され又は検出されてもよい。アッセイの感度はＲＮＡ（ＤＮＡよりはむしろ）を用いることにより増強され、この場合二次構造が配列変化に対してより感受性になる。対象の方法は、電気泳動上の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を用いることができる（Ｋｅｅｎ等， １９９１）。
【０１１８】
突然変異又は野生型断片の移動度は、変性濃度勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイすることができる（ＤＧＧＥ；（Ｍｙｅｒｓ等， １９８５））。ＤＧＧＥにおいて、ＤＮＡは完全な変性を防ぐために、例えば約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲによって付加することにより修飾される。また、コントロールとサンプルＤＮＡの移動度における差を同定するために変性濃度勾配の代わりに温度勾配を用いてもよい（Ｒｏｓｓｉｔｅｒ及びＣａｓｋｅｙ， １９９０）。
点突然変異を検出するための他の技術の例には、限定はしないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅法、又は選択的プライマー伸長法が含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の突然変異が中心部分に引き起こされた後、完全にマッチが確認される場合にのみハイブリダイゼーションが可能となる条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズ化されるように調製される（Ｓａｉｋｉ等， １９８６；Ｓａｉｋｉ等， １９８９）。このような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドがハイブリダイズメンブレンに付着されると、ＰＣＲ増幅標的又は多くの異なる突然変異に対してハイブリダイズし、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズ化される。
或いは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的な増幅技術が用いられてもよい。特異的増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーは、分子の中心部分に（増幅が差次的ハイブリダイゼーションに依存するように（Ｇｉｂｂｓ等， １９８９））、又は適切な条件下においてミスマッチを防ぐか又はポリメラーゼの伸長を減少させるように一方のプライマーの３’末端に（Ｐｒｏｓｓｅｒ， １９９３）目的の突然変異を保持する。変異領域における新規制限酵素部位が、切断に基づく検出を引き起こすために導入されてもよい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ等， １９９２）。また、特定の増幅は増幅に関してＴａｑリガーゼを用いて行ってもよい（Ｂａｒａｎｙ， １９９１）。このような場合において、ライゲーションは５’配列の３’端で完全にマッチする場合にのみ生じ、増幅をスコアー化することにより既知の突然変異の検出を可能にする。
上述の方法は、例えば、ＶＥＧＦｍｇに関する疾病又は病気の症状又は家族経歴を示す被検対象を診断するための臨床的な設定において用いられる少なくとも１つのプローブ（核酸又は抗体）を含むプレパックのキットを使用することにより実施してもよい。
さらに、ＶＥＧＦｍｇが発現されている任意の細胞型又は組織がここで記述された予後アッセイにおいて利用されてもよい。
【０１１９】
３．薬理ゲノム学
スクリーニングアッセイによって同定されるような、ＶＥＧＦｍｇ活性又は発現に対して刺激的又は阻害的な影響を及ぼす薬剤又は修飾因子を、不十分な血液供給又は不適切な細胞生存を含む疾患を予防的又は治療的に処置されるべき個人に対して投与することができる。このような治療に関して、薬理ゲノム学（即ち、被検対象の遺伝子型と、食物、化合物又は薬剤などの外来の様式に対する被検対象の反応との関連性に関する研究）が検討され得る。治療物上の代謝的相違は、薬理学的に活性な薬剤の投与量と血中濃度との関係を変更させることによって、重篤な毒性又は治療上の過誤を導く可能性がある。従って、個人の薬理ゲノム学は、個人の遺伝子型の考慮に基づき予防的又は治療的処置に対して有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を可能ならしめる。さらに、薬理ゲノム学は適切な用量及び治療計画を決定するために使用することができる。従って、個人におけるＶＥＧＦｍｇの活性、ＶＥＧＦｍｇ核酸の発現、又はＶＥＧＦｍｇの突然変異群は、治療上又は予防上の処置に対して適切な薬剤の選択を導くために決定され得る。
薬理ゲノム学は、病気に罹った人における様式の変化した性質及び異常な作用が原因である様式に対する反応における臨床的に有意な遺伝性の変異を扱う（Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ及びＥｖｅｒｔ， １９９６；Ｌｉｎｄｅｒ等， １９８７）。一般に、２つの薬理ゲノム学的状態が区別される：（１）様式と身体との相互作用を変化させる単独の因子（変化した薬物作用）として伝達される遺伝的状態又は（２）身体が様式に対して反応する方法を変化させる単独の因子（変化した薬物代謝）として伝達される遺伝的状態。これらの薬理ゲノム学的状態は、希な欠損又は核酸多型として生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤ）の欠損は、主な臨床上の合併症が酸化的薬物（抗マラリア性薬、サルファ剤、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取及び空豆の消費後の溶血である一般的な遺伝性の酵素異常症である。
例証となる実施態様として、薬物代謝酵素の活性は、薬物活性の強度及び持続時間の主な決定要因である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチル転移酵素２（ＮＡＴ２）及びチトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見により、標準的で安全な薬物用量を採用した後に過剰な薬物反応及び／又は重篤な毒性を示す被検対象達の現象が説明される。これらの多型は個体集団中の２つの表現型、多大な代謝型（ＥＭ）及び乏しい代謝型（ＰＭ）として発現される。ＰＭの有病率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は高度に多型を示し、幾つかの突然変異がＰＭにおいて同定されており、それら全てが機能的ＣＹＰ２Ｄ６ が存在しないことを導く。 突然変異体ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９による乏しい代謝型は、標準的な用量を摂取する場合において、過剰な薬物反応及び副作用を頻繁に経験する。代謝産物が活性な治療成分である場合、ＰＭはＣＹＰ２Ｄ６で形成される代謝産物のモルヒネによって介されるコデインの鎮痛効果に関して示されるような治療的反応はなんら示さない。他に極端な場合として、標準的な用量には反応しない、いわゆる超急速代謝型が挙げられる。最近、超急速代謝の分子的基礎がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の増幅に原因することが同定されている。
個体中でのＶＥＧＦｍｇの活性、ＶＥＧＦｍｇ核酸、又はＶＥＧＦｍｇ突然変異含有量が個人の治療的又は予防的処置に対する適切な薬剤を選択するために決定することができる。さらに、薬理ゲノム学研究は、薬物代謝酵素をコードする多型的な対立遺伝子の遺伝子型タイピングを個々の薬物反応表現型の同定に適用するために用いることができる。投薬又は薬物選択に適用する場合、この知識は有害な反応又は治療的過誤を避け、その結果、記述の典型的スクリーニングアッセイの一つにより同定される修飾因子のようなＶＥＧＦｍｇ修飾因子で被検対象を治療する場合、治療的又は予防的効果を増強させることができる。
【０１２０】
４．臨床的治験における効果のモニター
ＶＥＧＦｍｇの活性発現又は活性（例えば、異常な細胞増殖及び／又は分化を修飾する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニターすることは、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床的治験においても適用することができる。例えば、ＶＥＧＦｍｇ発現、タンパク質レベル、又は上方制御されたＶＥＧＦｍｇ活性を増大させるためのスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の効果は、減少したＶＥＧＦｍｇ発現、タンパク質レベル、又は下方制御されたＶＥＧＦｍｇ活性を示す被検対象の臨床的治験においてモニターすることができる。或いは、ＶＥＧＦｍｇ発現、タンパク質レベル、又は下方制御されたＶＥＧＦｍｇ活性を減少させるためのスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の効果は、増大したＶＥＧＦｍｇ発現、タンパク質レベル、又は上方制御されたＶＥＧＦｍｇ活性を示す被検対象の臨床的治験においてモニターすることができる。このような臨床的治験において、ＶＥＧＦｍｇ及び、好ましくは、例えば血管形成又はアポトーシスに関係する他の遺伝子の発現又は活性は、特定の細胞の反応性に対する「出力」又はマーカーとして用いることができる。
例えば、様式（例えば、食物、化合物、薬物又は小分子）による治療により細胞中において調節されるＶＥＧＦｍｇを含む遺伝子が同定され得る。細胞増殖疾患に対する薬剤の影響を研究するために、例えば、臨床的治験において、細胞が単離され、ＲＮＡが調製され、ＶＥＧＦｍｇ及び該疾患に関係する他の遺伝子の発現レベルについて分析される。遺伝子の発現パターンは、ノーザンブロット分析、核ラン・オンアッセイ又はＲＴ−ＰＣＲ実験により、又はタンパク質の量を測定することにより、又はＶＥＧＦｍｇ又は他の遺伝子産物の活性レベルを測定することにより定量することができる。このように、遺伝子の発現パターン自体は、薬剤に対する細胞内の生理的反応を示すマーカーとして役立ち得る。従って、この反応状態は、薬剤で個人を治療する前、及び治療中の種々の時間点において決定される可能性がある。
本発明は、（１）被検対象から投与前のサンプルを得る；（２）投与前のサンプル中のＶＥＧＦｍｇ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する；（３）被検対象から一又は複数の投与後のサンプルを得る；（４）投与後のサンプル中のＶＥＧＦｍｇ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現又は活性のレベルを検出する；（５）投与前のサンプル中のＶＥＧＦｍｇ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡと投与後のサンプル中のＶＥＧＦｍｇ、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡの発現又は活性のレベルとを比較する；及び（６）結果に応じて被検対象に対する薬剤の投与を変化させるステップを含む、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、食物又はここで記述のスクリーニングアッセイによって同定された他の薬物候補）による被検対象の治療の効果をモニターするための方法を提供する。例えば、薬剤の増大した投与により、検出されているレベルよりもさらに高いレベルにまでＶＥＧＦｍｇの発現又は活性を増大させること、即ち、薬剤の効果を増大させることが望ましい。或いは、薬剤の減少した投与により、検出されているレベルよりもさらに低いレベルにまでＶＥＧＦｍｇの発現又は活性を減少させること、即ち、薬剤の効果を減少させることが望ましい。
【０１２１】
５．治療方法
本発明は、異常なＶＥＧＦｍｇ発現又は活性と関係した疾患の危険性があり（又は感受性であり）又は疾患を有する被検対象を治療するための予防的及び治療的方法を提供する。
６．疾病及び疾患
増大したＶＥＧＦｍｇレベル又は生物学的活性によって特徴付けられる疾病及び疾患は、活性をアンタゴナイズする（即ち、減少又は阻害する）治療物によって治療される。アンタゴニストは治療的又は予防的方法で投与される。用いられる治療物は：（１）ＶＥＧＦｍｇペプチド、又はその類似体、誘導体、断片又は相同体；（２）ＶＥＧＦｍｇペプチドに対するＡｂｓ；（３）ＶＥＧＦｍｇ核酸：（４）アンチセンス核酸及び相同組換えによって（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８９）内在性の機能を除去するために用いられる「機能障害性の」（即ち、コード化配列中における異種性の挿入による）核酸；又は（５）ＶＥＧＦｍｇとその結合相手との相互作用を変化させる修飾因子（即ち、阻害因子、アゴニスト及びアンタゴニストであって、本発明の更なるペプチドミメチック又はＶＥＧＦｍｇに特異的なＡｂｓを含む）などを含む。
減少したＶＥＧＦｍｇレベル又は生物学的活性によって特徴付けられる疾病及び疾患は、活性を増大させる（即ち、アゴニストとなる）治療物によって治療される。活性を上方制御する治療物は、治療的又は予防的に投与される。用いられる治療物には、ペプチド、又はその類似体、誘導体、断片又は相同体；又は生物学的利用性を増大させるアゴニストが含まれる。
増大または減少したレベルは、ペプチド及び／又はＲＮＡを定量することにより、被検対象の組織サンプル（例えば、組織診からの）を得てインヴィトロでＲＮＡ又はペプチドレベル、構造及び／又は発現ペプチド（又はＶＥＧＦｍｇｍＲＮＡ）の活性をアッセイすることにより容易に検出することができる。限定はしないが、方法にはイムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、免疫沈降後のドデシル硫酸（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、免役組織化学、など）及び／又はｍＲＮＡｓの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイツハイブリダイゼーション及び類似した方法）が含まれる。
【０１２２】
７．予防的方法
本発明は、被検対象において、異常なＶＥＧＦｍｇ発現又は活性と関連する疾病又は状態を、ＶＥＧＦｍｇの発現又はＶＥＧＦｍｇ活性の少なくとも１つを修飾する薬剤を投与することにより防止するための方法を提供する。異常なＶＥＧＦｍｇ発現又は活性によって引き起こされ又は助長される疾病に対する危険のある被検対象は、例えば、診断上の又は予後的なアッセイの何れか又は組み合わせによって同定することができる。予防的薬剤の投与は、疾病又は疾患が防止され、或いは、その進行が遅れるように、ＶＥＧＦｍｇ異常性に特徴的な症状の出現前に行われる。ＶＥＧＦｍｇの異常性のタイプに依存して、例えば、ＶＥＧＦｍｇアゴニスト又はＶＥＧＦｍｇアンタゴニストが被検対象を治療するために用いられる。適切な薬剤は、スクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
ＶＥＧＦｍｇ核酸、又は断片はまた、核酸又はタンパク質の存在又は量が評価される診断用途にも有用であり得る。更なる用途は抗菌分子としてのものである（すなわち、あるペプチドは抗菌性を保有していることが見出されている）。これらの物質は、治療又は診断方法に使用される本発明の新規物質に免疫特異的に結合するＡｂｓの産生に更に有用である。
【０１２３】
８．治療的方法
本発明の他の態様は、治療目的のためにＶＥＧＦｍｇ発現又は活性を調節するための方法に関する。本発明の調節方法は、細胞に関連する一又は複数のＶＥＧＦｍｇ活性を調節する薬剤と細胞を接触させることを含む。ＶＥＧＦｍｇ活性を調節する薬剤は、核酸又はタンパク質、天然に生じる同起源のＶＥＧＦｍｇリガンド、ペプチド、ＶＥＧＦｍｇペプチドミメチック、又は他の小分子であり得る。該薬剤はＶＥＧＦｍｇ活性を刺激する。そのような刺激性薬剤の例には、活性ＶＥＧＦｍｇ及び細胞中へ導入されるＶＥＧＦｍｇ核酸分子が含まれる。他の実施態様において、該薬剤はＶＥＧＦｍｇ活性を阻害する。阻害性薬剤の例には、アンチセンスＶＥＧＦｍｇ核酸及び抗ＶＥＧＦｍｇＡｂｓが含まれる。調節方法は、インヴィトロ（例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより）で、又はインヴィボ（例えば、被検対象に薬剤を投与することにより）で実施することができる。このように、本発明はＶＥＧＦｍｇ又は核酸分子の異常な発現又は活性によって特徴付けられる疾病又は疾患に悩まされている個人を治療するための方法を提供する。一実施態様において、該方法は、薬剤（例えば、スクリーニングアッセイによって同定された薬剤）、又はＶＥＧＦｍｇ発現又は活性を調節する（例えば、上方制御又は下方制御）薬剤の組み合わせを投与することに関与する。他の実施態様において、該方法は、減少した又は異常なＶＥＧＦｍｇ活性又は活性を補償するための治療としてＶＥＧＦｍｇ又は核酸分子を投与することに関与する。
ＶＥＧＦｍｇ活性の刺激は、ＶＥＧＦｍｇが異常に下方制御され、及び／又は増大したＶＥＧＦｍｇ活性がおそらく有利な効果を有するような状況にあるのが望ましい。そのような刺激の一例は、被検対象が異常な細胞増殖及び／又は分化（例えば、癌又は免疫関連疾患）によって特徴付けられる疾患を持つ場合である。
【０１２４】
９．治療上の生物学的影響の決定
インヴィトロ又はインヴィボでの適切なアッセイは、特異的な治療物の効果を決定し、その投与が発症した組織の治療に対して望ましいかどうかを決定するために実施され得る。
種々の特定の実施態様において、インヴィトロのアッセイは任意の治療物がその細胞タイプ（群）に所望の効果を発揮するかどうか決定するために、被検対象の疾患に関与するタイプ（群）の代表的な細胞を用いて行われる。治療における使用に対する様式は、ヒト被検対象での治療に先立ち、限定はしないが、ラット、マウス、チキン、ウシ、サル、ウサギ、その他同種類のものを含む適切な動物モデル系においてテストされる。同様に、インヴィボでのテストに対して、当該技術分野における動物モデル系の何れかがヒト被検対象への投与に先立ち用いられる。血管形成誘導と細胞生存を測定するための様々なアッセイ法を使用することができる。
１０．アンチセンス核酸
アンチセンス及びセンスＶＥＧＦｍｇオリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦｍｇポリペプチドの発現を阻止することができる。これらのオリゴヌクレオチドは標的核酸配列と結合し、二重鎖の分解を促進し、未成熟な転写又は翻訳を終結させ、又は他の方法によって標的配列の転写又は翻訳をブロックする二重鎖を形成する。アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡどちらかの一本鎖核酸であり、標的ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ（センス）又はＶＥＧＦｍｇ ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合することができる。アンチセンス核酸はワトソン−クリック又はフーグスチンの塩基対ルールに従ってデザインすることができる。アンチセンス核酸分子はＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡの全コード化領域に対して相補的で、より好ましくは、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡのコード化又は非コード化領域の一部分だけに相補であり得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に対して相補的であり得る。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドのＶＥＧＦｍｇ ＤＮＡコード化領域の断片を含む可能性がある。一般に、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は少なくとも長さが５， １０， １５， ２０， ２５， ３０， ３５， ４０， ４５， ５０， ５５， ６０， ６５， ７０， ７５， ８０， ８５， ９０， ９５， １００のベース又はそれより長いものを含む可能性がある。特に、（Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ， １９８８；ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ等， １９８８ａ）には、任意のｃＤＮＡ配列からアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導させる方法が記載されている。
【０１２５】
アンチセンス核酸を生成するのに用いることができる修飾されたヌクレオチドの例として：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシンＮ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。或いは、アンチセンス核酸は、転写されたＲＮＡが対象の標的核酸に対して相補的になるようなアンチセンスの方向でサブクローン化された発現ベクターを用いて生物学的に発現させることができる。
アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドを標的細胞（標的核酸配列を含む細胞）中へ導入するためには、何らかの遺伝子導入法が用いられる。遺伝子導入法の例には、（１）エプステイン−バーウィルスなどの遺伝子導入ベクター、又は外来性のＤＮＡをリガンド結合分子に結合させることなどの、生物学的な、（２）エレクトロポレーション及びインジェクションなどの物理的な、（３）ＣａＰＯ４沈殿及びオリゴヌクレオチド−複合体などの化学的なものが含まれる。
【０１２６】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは適切な遺伝子導入レトロウィルスベクター中へ挿入される。標的核酸配列を含む細胞を、インヴィボ又はエクスヴィボにおいて組換体レトロウィルスベクターと接触させる。適当なレトロウィルスベクターの例には、マウスレトロウィルス Ｍ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶに由来するレトロウィルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと表される二重コピーベクターが含まれる（国際公開第 ９０／１３６４１号， １９９０）。十分な核酸分子の転写を達成するためには、アンチセンス核酸分子の転写が強力なｐｏｌ ＩＩ又はｐｏｌ ＩＩＩによってコントロールされるベクターコンストラクトが好ましい。
細胞の混合集団中の標的細胞を特定するために、標的細胞に対して特異的な細胞表面レセプターを開発することができる。アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドを、（国際公開第９１／０４７５３号， １９９１）中に記載されるように、リガンド結合分子と結合させる。リガンドは標的細胞に特異的なレセプターに対して選択される。適切なリガンド結合分子の例には、細胞表面レセプター、成長因子、サイトカイン、又は細胞表面レセプター又は分子と結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、実質的に、レセプター又は分子のリガンド結合分子結合体と結合する能力を妨害せず、又はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその結合体形態の細胞内への侵入を阻止しない。
リポソームは効率的にセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞へ導入する（国際公開第９０／１０４４８， １９９０）。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、内在性のリパーゼによって細胞内で好適に分離される。
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子であってもよい。α−アノマー核酸分子は、通常のα−ユニットとは反対に、ストランドが互いに平行に走るように、相補的ＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｔｉｅｒ等， １９８７）。アンチセンス核酸分子は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ等， １９８７ａ）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ等， １９８７ｂ）も含み得る。
【０１２７】
一実施態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、相補的な領域を持つ、ｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を持つ触媒性のＲＮＡである。従って、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ， １９８８）などのリボザイムは、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するために用いることができ、その結果翻訳を阻害する。ＶＥＧＦｍｇ−コード化核酸に対して特異的なリボザイムは、ＶＥＧＦｍｇ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいてデザインすることができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＶＥＧＦｍｇコード化ｍＲＮＡ中で切断されるヌクレオチド配列と相補的であるテトラヒメナ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる（Ｃｅｃｈ等， Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１１６，７４２， １９９２；Ｃｅｃｈ等， Ｕ． Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，９８７，０７１， １９９１）。また、ＶＥＧＦｍｇ ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を持つ触媒性ＲＮＡを選択するためにも使用することができる（Ｂａｒｔｅｌ及びＳｚｏｓｔａｋ， １９９３）。
或いは、ＶＥＧＦｍｇの発現は、標的細胞中でのＶＥＧＦｍｇの転写を阻害する三重らせん構造を形成するためのＶＥＧＦｍｇの制御領域（例えば、ＶＥＧＦｍｇプロモーター及び／又はエンハンサー）と相補的な標的ヌクレオチド配列によって阻害することもできる（Ｈｅｌｅｎｅ， １９９１；Ｈｅｌｅｎｅ等， １９９２；Ｍａｈｅｒ， １９９２）。
【０１２８】
アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドの修飾は、それらの有効性を増大することができる。修飾された糖−ホスホジエステル結合又は他の糖連鎖（国際公開第９１／０６６２９， １９９１）は、標的配列に対する結合特異性を損なうことなく内在性ヌクレアーゼに対する抵抗性を与えることによりインヴィボにおける安定性を増大させる。他の修飾は、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増大することができ、例えば、共有結合性有機体部分（国際公開第９０／１０４４８， １９９０）又はポリ−（Ｌ）−リジンなどである。他の結合は、標的に対するオリゴヌクレオチドの結合特異性を修飾し、金属複合体又はインターカレート（例えば、エリプチシン）及びアルキル化剤を含む。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生産するために修飾することができる（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６）。「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡｓ」は、デオキシリボースリン酸骨格が疑似ペプチド骨格によって置換され、４つの元来のヌクレオ塩基のみが保持される核酸模倣体（例えば、ＤＮＡ模倣体）を指す。ＰＮＡの中性の骨格は、低イオン強度条件下において、ＤＮＡ及びＲＮＡに対する特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。ＰＮＡオリゴマーの合成は、標準的固相ペプチド合成手順を用いて実施することができる（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ等， １９９６）。ＶＥＧＦｍｇのＰＮＡｓは、治療的及び診断上の適用において使用することができる。例えば、ＰＮＡｓは、転写又は翻訳停止を誘導し、又は複製を阻害することにより遺伝子発現の配列特異的な修飾のためのアンチセンス又は抗遺伝子剤として使用することができる。ＶＥＧＦｍｇ ＰＮＡｓは、単一塩基対変異の解析（例えば、ＰＣＲクランピングによるＰＮＡにおいて；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６）と組合わせて使用するとき、人工的な制限酵素として；又はＤＮＡ配列及びハイブリダイゼーションのためのプローブ又はプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ等， １９９６）用いることも可能であろう。
【０１２９】
ＶＥＧＦｍｇのＰＮＡｓはそれらの安定性または細胞内への取込みを増強するために修飾することができる。親油性又は他のヘルパーグループがＰＮＡｓ、ＰＮＡ−ＤＮＡ二量体構造に付着してもよく、又はリポソーム又は他の薬剤デリバリー技術の使用でもよい。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有利な特性を兼ね備えるＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成することができる。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ及びＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用し、一方ＰＮＡ部分は高い結合親和性及び特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、ヌクレオ塩基間の結合数、及び配向性という観点から選択される適切な長さのリンカーを用いて連結することができる（Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は実施可能である（Ｆｉｎｎ等， １９９６；Ｈｙｒｕｐ及びＮｉｅｌｓｅｎ， １９９６）。例えば、ＤＮＡ鎖を固体支持体上で標準的なホスホラミダイト共役化学反応を用いて合成することができ、修飾されたヌクレオチド類似体、例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジン ホスホラミダイトなどはＰＮＡ及びＤＮＡの５’末端間で用いることができる。その後、ＰＮＡ単量体は、５’ ＰＮＡセグメントと３’ ＤＮＡセグメントとのキメラ分子を生成するために段階的な方法で共役される（Ｆｉｎｎ等， １９９６）。或いは、キメラ分子は５’ ＤＮＡセグメント及び３’ ＰＮＡセグメントにより合成することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ等， １９７６）。
オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インヴィボにおいて宿主細胞レセプターを標的するために）、又は細胞膜（Ｌｅｍａｉｔｒｅ等， １９８７；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等， １９８９）又はＰＣＴ発行 国際公開第８８／０９８１０号）若しくは脳血管関門（例えば、ＣＴ発行 国際公開第８９／１０１３４号）を越えた輸送を促進させる薬剤などの他の付加されたグループを含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション トリガー切断剤（ｖａｎ ｋｅｒ ｒｏｌ等， １９８８ｂ）又はインターカレート剤（Ｚｏｎ， １９８８）によって修飾することができる。オリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション トリガークロスリンク剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション トリガー切断剤、その他同種類の分子に結合させてもよい。
【０１３０】
次の実施例は本発明の様々な側面を非限定的な実施例により例証するものである。
実施例
実施例１　ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）中での差次的遺伝子発現
１．背景
ＶＥＧＦ依存的な、又は変異ＶＥＧＦＲ１依存的な生存経路の間に発現が調節される遺伝子の包括的な性状を得るために、一群の成長因子で処理した血清不足ヒト臍帯内皮細胞と１０％血清の存在下で成長させた参照ＨＵＶＥＣ細胞とに、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ法（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ等， 米国特許第５８７１６９７号， １９９９； Ｓｈｉｍｋｅｔｓ等， １９９９）を適用した。成長因子と血清を両方とも欠く状態で成長させた細胞をネガティブコントロールとした。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭ法は所定の試料の遺伝子発現性状を得るために定量発現解析（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施し、ついで添加を含まないコントロールに対するこれらの性状を対にして比較する差次的な発現解析を実施する。差次的な発現を示すポリヌクレオチドは、増幅の検出を妨げる競合未標識プライマーを加えるＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇＴＭプロトコルに従ってＰＣＲ反応を実施することによって確認する。
２．使用される成長因子
（ａ）ＶＥＧＦ
この実施例において使用される主な成長因子はＶＥＧＦであり、これはＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２の双方に結合する。また、ＶＥＧＦＲ１のみに結合するＶＥＧＦの変異体（ＶＥＧＦＲ１ｓ）を使用した。この実験で使用される他の成長因子はＶＥＦＧＲ１以外のレセプターに結合し、異なった血管形成能を有している。これらをポジティブコントロールとして（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１ｓ）及びネガティブコントロールとして（ＰｌＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＳ／ＳＦ）含め、ＶＥＧＦＲ１経路の解析に焦点を当てる。
【０１３１】
（ｂ）ｂＦＧＦ
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は腫瘍新血管新生及び血管増殖性疾患において血管内皮に発現される。ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦはその組み合わさった分裂促進活性において潜在的に相乗的である。この相乗性の可能な説明は、ｂＦＧＦがＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦ自身の発現を誘導するという証拠である（Ｈａｔａ等， １９９９）。ｂＦＧＦでの処理は、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲ１ｓによって調節されたものとオーバーラップして遺伝子の集合を調節する。
（ｃ）ＨＧＦ／ＳＦ
肝細胞増殖因子／細胞分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）は内皮細胞の増殖と移動を刺激する多面的な成長因子である。ｂＦＧＦと同様に、ＨＧＦとＶＥＧＦはその組み合わさった血管形成活性において相乗的である（Ｖａｎ Ｂｅｌｌｅ等， １９９７）。ＨＧＦはＶＥＧＦの発現を誘発する（Ｇｉｌｌｅ等， １９９８）。従って、ｂＦＧＦでの処理によって、ＶＥＧＦによって調節されるものとオーバーラップして遺伝子の集合が調節されることが期待される。
（ｄ）ＰｌＧＦ
胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）はＶＥＧＦｓのファミリー（ＶＥＧＦｓ）に属する。３種のＰｌＧＦアイソフォームが選択的スプライシングによって生産され、全てが内皮細胞の移動を誘発するが、細胞増殖には影響を及ぼさない（Ｍｉｇｄａｌ等， １９９８）。それらはＶＥＧＦＲ２レセプターに結合するが、ＶＥＧＦの血管形成及び増殖効果の殆どを媒介すると考えられるＶＥＧＦＲ１には結合しない。ＰｌＧＦでの処理はＶＥＧＦによって調節されたものとオーバーラップするがＶＥＧＦＲ１ｓによって調節されたものとはオーバーラップしないで遺伝子の集合を調節する。この知見により、ＶＥＧＦＲ１レセプターを介してＶＥＧＦによって特異的に調節される遺伝子の集合を同定することが可能になる。
【０１３２】
３．解析した遺伝子と対応するＧｅｎＢａｎｋ受託
表Ｅ１はこの実施例において発現を解析した遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を提供する。
2004501608.tif 000017
【０１３３】
４．結果
ＨＵＶＥＣｓを様々な成長因子で処理し又は成長因子なしで処理し、６又は２４時間後に収集した。これにより、成長因子での処理（６時間後）によってより直接的に調節された遺伝子と、間接的に調節されうるものとの間の識別が可能になり、２４時間後にだけ調節されると思われるものも同様である。
この解析の結果は表Ｅ２にまとめる。
血清不足ＨＵＶＥＣｓは、細胞の３０％が血清欠乏化後にアポトーシスを受け、血清不足のないコントロールに対して６倍の増加を示すので、有効なインヴィトロモデルを表す。ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ１ｓの添加はアポトーシス細胞の数を強く減少させる一方、Ｐ１ＧＦ添加は生存を刺激しない（Ｇｅｒｂｅｒ等， １９９８）。これらの結果は、ＶＥＧＦＲ１を介し、ＰｌＧＦレセプターを介しないシグナル伝達がＶＥＧＦの活性に重要であることを示している。
【０１３４】
2004501608.tif 000018
2004501608.tif 000019
【０１３５】
実施例２　ＨＵＶＥＣｓ中での差次的遺伝子発現のＴａｑＭａｎＴＭ分析
ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ分析において調節されることが分かった遺伝子をついでＴａｑｍａｎＴＭ解析（ＴａｑＭａｎＴＭポリメラーゼ連鎖反応検出；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を施した。
１００ｎｇの全ＲＮＡを５０μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応（ＰＣＲ−Ａｃｃｅｓｓ， Ｐｒｏｍｅｇａ）に加えた。リアルタイムＰＣＲ解析のためのプライマーとプローブはＯｌｉｇｏバージョン４．０プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， ＭＮ）（Ｈｅｉｄ等， １９９６）を使用してデザインした。ＲＴ−ＰＣＲ反応とレポーター蛍光染料の発光の相対的増加の結果を７７００シークエンスディテクター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いてリアルタイムでモニターした。シークエンスディテクター１．０プログラム（ＰＥ）を用いてシグナルを解析した。条件は次の通りであった：１サイクル４８℃で４５分間、１サイクル９４℃で２分間、４０サイクル９４℃で３０秒、６０℃で１分、６８℃で２分。
結果は表Ｅ３に示す。
【０１３６】
2004501608.tif 000020
2004501608.tif 000021
【０１３７】
実施例３　差次的遺伝子発現の３３Ｐ−ハイブリダイゼーション解析
インサイツｍＲＮＡ発現についてホルマリン固定パラフィン包埋ヒト組織を調べた。組織には妊娠第１期（１４−１５週）胎盤、成人副腎皮質、大動脈、アテローム性動脈硬化症を持つ筋性動脈、脳、胆嚢、心臓、膵臓、前立腺、胃、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を持つ目、及び炎症性盲腸、肺腺癌、管性乳腺癌、腎細胞癌を持つ腎臓、肝細胞癌、扁平上皮細胞癌、骨肉腫、及び軟骨肉腫を含んでいた。センス及びアンチセンスリボプローブのインヴィトロ転写と［３３Ｐ］標識を次のようにして実施した：解析される遺伝子の配列を、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ開始部位をコードする遺伝子特異的プライマーを使用してプラスミドＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。センス及びアンチセンスリブプローブはＰＣＲ増幅した鋳型からのインヴィトロ転写によって調製し、１ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌの比活性になるまでハイブリダイゼーションバッファーで希釈した。５マイクロメートル厚の組織切片に脱パラフィン化処理を施し、３７℃で３０分間４μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で除タンパク化し、５５℃にて一晩ハイブリダイズし、ついで高緊縮性条件（０．１ＸＳＳＣ中で５５℃で２時間）で洗浄した。ガラススライドをＮＢＴ２核トラックエマルション（イーストマンコダック）中に浸し、デシカントを含む密封プラスチックスライドボックス中に４℃で４週間さらし、現像し、ヘマトキシリンとエオシンで対比染色した。
インサイツハイブリダイゼーション実験の結果は表Ｅ４に示す。
【０１３８】
2004501608.tif 000022
表４の結果は、胎児血管組織においてＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇによって同定される差次的に発現された遺伝子のある種のものがまたインサイツハイブリダイゼーションによっても差次的に同定されることを示している。しかし、成人血管組織では、腫瘍又は炎症の存在のような、病理状態のみが、差次的に発現された遺伝子の集合のなかで遺伝子の有意な調節を生じる。
【０１３９】
実施例４　ＶＥＧＦ調節遺伝子の差次的発現との卵巣腫瘍の臨床病期の相関
インヴィトロでの組織培養条件で観察されたＤＳＣＲ１発現とＶＥＧＦ刺激の間の相関がまた高度のＶＥＧＦ発現を伴う腫瘍でインヴィトロで翻訳したかどうかを試験するために、我々はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって同じ患者由来のコントロール組織（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）と卵巣腫瘍から取り出されたＲＮＡの３つのマッチした集合を解析した。ＶＥＧＦの過剰発現は、新血管新生と続いての固形腹腔内腫瘍の増殖を促進し、腫瘍脈管構造の透過性を増大させることによって腹水生成を誘発することによって、卵巣癌の進行に主要な役割を果たしていると考えられている（Ｍｅｓｉａｎｏ等， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ， １５３， ｐ１２４９， １９９８）。卵巣癌中のＶＥＧＦｍＲＮＡレベルは正常な卵巣におけるよりも顕著に高い。正常組織に対して腫瘍組織におけるＶＥＧＦの発現の平均レベルは３．２倍増加し、腫瘍ＲＮＡのＤＳＣＲ１発現において２．７倍の増加と相関していた。
上皮卵巣癌の２／３の患者が、高度に浸潤性の癌細胞（ＣＡ）の存在と急速に蓄積する腹水のために、診断の際に疾患を進行させ、予後に乏しかった。転移性が低い上皮腺癌（低悪性可能性（ｌｏｗ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）＝ＬＭＰｓ）の１／３の患者は極めて好ましい長期的結果を示した。過去の研究では疾患とＶＥＧＦ発現の相関が示されたばかりでなく、ＶＥＧＦが卵巣癌における腹水生成と血管形成の重要な調節因子として特定された（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ等， Ｃａｎｃｅｒ， ８３， ｐ２５３２， １９９８）。
ＶＥＧＦの発現に対してＬＭＰｓの１２人の患者とＣＡｓの９人の患者から単離した一連の全ＲＮＡｓを試験し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＶＥＧＦレセプターとＤＳＣＲ１を試験した。発現レベルをＧＡＰＤＨ又はβアクチンのレベルに正規化した（データ示さず）。これらの発現レベルに基づいて、ＳｔａｔＶｉｅｗ統計解析ソフトウェアプログラムを使用した統計解析により、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦレセプター及びＤＳＣＲ１の発現レベルの相関を特定した（表Ｅ５）。また、臨床病期（Ｒ＝）、ＫＤＲ（Ｒ＝０．８３４）及びＶＥＧＦ（Ｒ＝）発現間の相関を示す。これらの知見は、ＶＥＧＦの存在によって模倣された条件のような腫瘍に成長した内皮細胞での遺伝子性状決定実験は、腫瘍又は腫瘍脈管構造において特異的に上方制御される新規なＶＥＧＦ標的遺伝子の検索の道具になるかも知れないことを示している。更に、ＤＳＣＲ１レベルと腫瘍発達の臨床病期との間の相関は、ＤＳＣＲが卵巣腫瘍患者及び他の徴候において腫瘍進行に対する予測的マーカーとなり得るかどうかという疑問を呈する。
【０１４０】
全ＲＮＡを、低悪性可能性（ＬＭＰ）卵巣腫瘍の１２人の患者と、より悪性の嚢胞腺癌（Ｃｙｓｔｏａｄｅｎｏ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＣＡ）卵巣腫瘍の９人の患者の腫瘍バイオプシーから単離した。そのＲＮＡについて上述のようにしてＴａｑＭａｎＴＭによってＶＥＧＦ、ＶＥＧＦレセプター及びＶＥＧＦ標的遺伝子の発現を分析した。ＲＮＡを３通り実施して、ＨＵＶＥ細胞ＲＮＡでの標準曲線を各プローブについて作成し、相対的発現レベルを、標準としてハウスキーピング遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）を使用して計算し、内皮マーカーＣＤ３１を使用して存在する内皮細胞の量について補正した。結果を表Ｅ５にまとめる。第１の列は、与えられた遺伝子の発現と臨床病期ＬＭＰ対ＣＡに基づく腫瘍サンプルのグループ分けの間のＡＮＯＶＡ解析の結果を報告する。第２と第３の列は与えられた遺伝子の発現と腫瘍サンプルによるＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ１レセプターの発現の間の相関を報告する。それらは、ＤＳＣＲ１及びＡＲＧリッチな遺伝子に対して高度な転移可能性と発現レベルの増加の間にポジティブな相関があることを示している。
2004501608.tif 000023
【０１４１】
実施例５　ＶＥＧＦｍｇｓを形質移入した内皮細胞の生存
ＤＳＣＲ１が内皮細胞の生存を直接調節するかどうかを研究するために、我々は、ＥＧＦＰの発現ベクターと共にＤＳＣＲ１のエピトープタグ型を一過性に同時形質移入し、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰポジティブ及び健康な及びアポトーシス性内皮細胞の間の比を定量した。図１に示すように、ＤＳＣＲ１のエピトープタグ型（ＤＳＣＲ１−ＦＬＡＧ）の一過性の過剰発現により、細胞生存度が僅かに減少した。これに対して、アンチセンスコンストラクトの過剰発現により、Ａｋｔの構成型活性形態（Ａｋｔ１７９）に対して観察されたものと同様な程度まで生存度が増加した。これらの知見は、内皮細胞において過剰発現した場合のＤＳＣＲ１の直接の生存効果を除外しており、血清不足条件下での生存度の減少を示唆した。しかし、５％血清条件下で成長させた細胞ではそのような生存度の低下は観察されなかった（図１）。
コントロールでは、ＤＳＣＲ１の除去はアポトーシスを誘発し；６６時間で約２５％の細胞だけが生存していることが分かる。他方、Ａｋｔ２Ｄを形質移入した細胞の約８０％が生存している。ＤＳＣＲ１を形質移入した細胞はＡｋｔ２ｄと同様な生存率を持つ一方、ＤＳＣＲ１の有意鎖の形質移入はおそらくはより高い発現を生じ、より速やかな細胞死を誘発する。
【０１４２】
実験の詳細：
本発明の遺伝子に対応するセンス及びアンチセンスポリヌクレオチドのＨＵＶＥＣｓ中での発現は次のようにして実施した：
ａ）細胞：
６ｃｍの組織培養皿（Ｆａｌｃｏｎ ３８０２， ｐｒｉｍａｒｉａ， 表面修飾ポリスチレン）にＨＵＶＥＣ、ｐ６（Ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）を入れる。ゼラチン被覆プラスチック上で成長。
６ｃｍ皿を、細胞塗布前にＰＢＳ中０．２％のゼラチンで＞２０分被覆した。
細胞を６ｃｍ皿当たり１４００００細胞の密度、つまり約５０００細胞／ｃｍ２で被覆した。
細胞は少なくとも６０％のコンフルエンシーを達成しなければならない。さもないと毒性の増加が観察されるからである。高密度では、低形質移入効率になった。
微小血管細胞に対して、他のＤＮＡ／リポフェクチン比を決定しなければならない。さもないと毒性の増加が見られる。
コントロールサンプル：
＃　　ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）　　ＧＦＰ　　　アネキシン−ＰＥ
１　　　＋　　　　　　　　　−　　　　　　−
２　　　＋　　　　　　　　　＋　　　　　　−
３　　　＋　　　　　　　　　−　　　　　　＋
４　　　−　　　　　　　　　−　　　　　　−
５　　　−　　　　　　　　　＋　　　　　　−
６　　　−　　　　　　　　　−　　　　　　−
【０１４３】
ＤＮＡ：３．０μｇ全ＤＮＡ／６ｃｍ皿：２．０μｇ試験、１．０μｇ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）
Ｆｌ：４μｌ／６ｃｍ皿
ＯＰＴＩＭＥＭ：６ｃｍ皿当たり１．３ｍｌ
Ｆａｌｃｏｎ透明チューブ（ポリスチレン）を使用
ＨＭＶＥ細胞に対して：２μｇＤＮＡ＋４μｌＦ１
【０１４４】
ｂ）手順：
１日目：リポフェクチンの前に細胞を２４時間分裂させる
２日目：午後４時から午後６時：使用前に２０秒間透明Ｆａｌｃｏｎチューブ中で十分にリポフェクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）をボルテックスする。
最初に１．３５ｍｌ／サンプルのＯＰＴＩＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬカタログ番号３１９８５）を加える。ついで、１サンプル当たり３μｇの全ＤＮＡを加え、ボルテックスにより十分に混合する。ついで、１サンプル当たり４μｋのＦｌを加え、ボルテックスにより十分に混合する。ＤＮＡとリポフェクチンとＯＰＴＩＭＥＭを混合し、２０から３０分の間、３７℃にて水浴中でインキュベートする；ついでＯＰＴＩＭＥＭで細胞を２回洗浄する。１．３５ｍｌの形質移入混合物を加えて３７℃で２時間インキュベートする。２時間後、３ｍｌの完全培地を加え、１６から１９時間インキュベートする。
３日目：午前１０時：次の朝に培地を１０％血清含有培地に置き換えるが、細胞を洗浄しない。別法として、更に２４時間形質移入混合物を放置する；これによりより高度の形質移入効率が得られるが、また細胞死が増加する。
【０１４５】
アポトーシスを決定する場合：
３日目：夕方：細胞を２ｘＰＢＳで洗浄し、培地を血清不足のものに交換し、ついでＧＦ＋ＷＭを加える。
４日目：午後遅く：細胞をＦＡＣＳセットを用いて分析し、％アポトーシス細胞に対して（３０時の時点）アネキシン−ＰＥ及びＦＩＴＣチャネルを検出する。グリーンランタンを形質移入した場合、７２時間後に３２％までの形質移入効率を観察した。
生存を研究する場合：
４日目の朝：細胞を２ｘＰＢＳで洗浄し、培地を血清不足のものに交換し、ついでＧＦ＋ＷＭを加える。
４日目の夕方：ＧＦＰポジティブ細胞をカウントし、アポトーシス／健康を比較する。
５日目（２４時間後）：細胞をＦＡＣＳ分析のために収集する。
【０１４６】
ｃ）ＦＡＣＳ分析：
１．　上清（３ｍｌ）を引き上げ、０℃で上部にフィルターを有する予め標識した５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに加え、チューブを３分間２０００ｒｐｍでスピンダウンした。その間に、
２．　細胞を３ｍｌのＰＢＳで注意深く洗浄した。
３．　０．５ｍｌの２ｘトリプシンを加え、混合物を３７Ｃのインキュベーターにおいて３分間インキュベートした。
４．　３分後に、１０％の血清を含む３ｍｌの培地を加え、分解を停止させた。
５．　工程１の上清を吸引によって引き上げ、工程４の３．５ｍｌを、細胞ペレットを含むチューブに加えた。
６．　細胞を３分間２０００ｒｐｍでペレット化した。
７．　ペレットを２ｍｌの１ｘＣａ結合バッファーで１ｘ洗浄した。
８．　細胞を３分間２０００ｒｐｍでペレット化し、上清を吸引して除いた。
９．　ペレットを０．５ｍｌのＣａ結合バッファー（アネキシン−ＰＥを含むプール、又はコントロールサンプルのための単純な１ｘＣａ−結合バッファーをつくる）に取り上げ、６回ピペットで取ったり戻して、細胞を脱凝集する。
１０．　コントロールサンプルに、１０μｌのアネキシン−ＰＥ、又は１μｌのＢｉｏＶｉｓｏｎアネキシン−Ｃｙ３原液を加える。
１１．　チューブを氷上に保持し、ＦＡＣＳラボまで分析のために提出する。
【０１４７】
ｄ）材料
Ｆｌ：ターゲティングシステム、Ｔａｒｇｆｅｃｔ Ｆ−１ （２ｍｇ／ｍｌ）， カタログ番号＃００１（１ｍｌ）又は＃００２（４ｘ１ｍｌ）。
成長因子：６ｃｍ皿の５ｍｌ培地に対して
ＶＥＧＦ：１０μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ原液＋６５０μｌ無血清培地。１００μｌのこの原液を６ｃｍ皿中に存在する５ｍｌの培地に加え、３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼの強力な不可逆的阻害剤；ＢＩＯＭＯＬ， ＃ＳＴ−４１５； カタログ番号１２３２， Ｔｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ，英国）
バイアル（５ｍｇ）の内容物を５００μｌのジメチルスルホキシド（原液：１０ｍｇ／ｍｌ原液；２３．３ｍＭ）に取り上げた。４．３μｌの１０ｍｇ／ｍｌ原液を１ｍｌ培地中で希釈して１００μＭ溶液を得た。１０μｌのこの原液を６５０μｌの無血清培地で希釈し、１００μｌを、６ｃｍ皿中に存在する５ｍｌの培地に加えた。
ｅ）ＤＮＡ
空のベクター：ｐＲＬＣＭＶ，　 １．３μｇ／μｌ　　２．７μｌ／皿
ＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎＴＭ：　　　　　　　　０．７μｇ／μｌ　　１．５μｌ／皿
【０１４８】
ｆ）ＦＡＣＳ：
アネキシン−Ｃｙ３、ＧＦＰ及びＰｉ（良好に作用）を使用
アネキシン−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ）は、１０μｌの未希釈の原液を細胞に添加。前のように静置
アネキシン−Ｃｙ３、Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ， １００２−１０００
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−１　Ｇｉｂｃｏ， ＢＲＬカタログ番号３１９８５，０．５１
ＣＳＣ培地、カタログ番号４Ｚ０−５００、
ＧＦなし、無血清カタログ番号４Ｚ３−５００−Ｓ、
内皮細胞を、ｐＲＬＣＭＶ（空のベクター、ネガティブコントロール）又は上に概説した正方向のＤＳＣＲ１（ＤＳＣＲ１）又は逆方向のＤＳＣＲ１（ＤＳＣＲ１ＡＳ）、又はＡＫＴの活性化変異型（Ａｋｔ２Ｄ、細胞生存を誘発するポジティブコントロール）の何れかを発現するヌクレオチド配列を更に含むｐＲＬＣＭＶで形質移入した。その細胞を、形質移入の効率の指標を与え生存細胞に対する可視できるマーカーを提供する緑色蛍光タンパク質を発現するグリーンランタンと共に同時形質移入した。形質移入の１８時間後に血清を培地から取り除いた。
【０１４９】
実施例６　ＤＳＣＲ１の更なる分析
１．はじめに
ダウン症候群は精神遅滞と先天的心臓形成異常を誘発する。ＤＳＣＲ１をコードしているオープンリーディングフレームはダウン症候群の表現型を誘発可能な染色体２１上の最小領域内に位置する幾つかの一つである（Ｆｕｅｎｔｅｓ等， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １９９５ Ｏｃｔ； ４（１０）：１９３５−４４）。より最近になって、ＤＳＣＲ１は、Ｃａ（２＋）／カルモジュリン依存性タンパク質ホスファターゼＰＰ２Ｂの触媒サブユニットであるカルシニュリンＡと物理的にかつ機能的に相互作用することが見出された。ＤＳＣＲ１の一過性過剰発現は活性化されたＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）の核トランスロケーションの阻害を通じてカルシニュリン依存性遺伝子転写を遮断した。（Ｆｕｅｎｔｅｓ ＪＪ， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２０００年７月１日； ９（１１）：１６８１−９０）。　ＮＦＡＴはＴ細胞中でのサイトカイン遺伝子発現の活性化を支援する転写因子として、及びシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）及びＦＫ５０６の免疫調節効果の一次標的として元々は記載されていた。活性化された内皮細胞でのＮＦＡＴレベルの増加は、Ｃｏｃｋｅｒｉｌｌ等（Ｂｌｏｏｄ １９９５ Ｏｃｔ １； ８６（７）：２６８９−９８）によって最初に観察されたもので、ＣｓＡによるＮＦＡＴ活性の妨害によりＴＮＦ−αで刺激した内皮細胞でのＥ−選択発現の４０％の低減と、好中球の接着の２９％の減少が生じた。これらの知見は、ＤＳＣＲ１の生物学的役割が、活性化された内皮細胞上での細胞接着分子の発現とＮＦＡＴ活性を調節することにあることを示唆している。
【０１５０】
２．材料と方法
（ａ）細胞
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）をＣｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、５％の血清最終濃度まで補填した内皮成長培地（ＣＳ−Ｃ培地、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で増殖させた。細胞を１９０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で増殖させ、実験を３通り実施した。蒔種２４時間後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と培地、０．１％ＢＳＡ又は０．１％ＢＳＡ及びＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）又は５％血清で３回洗浄した。
（ｂ）ＲＮＡ収集とリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析
培地を培養物から吸引し、１０ｍｌのＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を１ｘ１０６細胞まで添加した。組織培養フラスコを１０分間垂直シェイカー上でインキュベートした。ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成及びデータ解析を他の場所で記載されているようにして行った（Ｋａｈｎ等， ２０００）。組織に対して、ＲＮＡをＳＴＡＴ６０法（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ ”Ｂ”； Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ）を使用して各処理グループの５つの標本から死亡させて収集した凍結腫瘍組織から単離し、ＲＮｅａｓｙ Ｑｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ； Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）で精製した。一反応当たり１００ｎｇの全ＲＮＡをパーキンエルマーのＲＴ−ＰＣＲキットを使用し、製造者の指示に従って（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、解析した。反応をモデル７７００シークエンスディテクター（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）で９６ウェルプレート中で実施し、シークエンスディテクションソフトウェア（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を使用して結果を解析した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は４８℃で３０分、９５℃で１０分、及び９５℃で３０秒、６０℃で９０秒の４０サイクルであった。各サンプルに対する相対的なＲＮＡ当量をＧＡＰＤＨレベルに規格化することによって得た。グループ当たり５つのサンプルのそれぞれを２通り実施してサンプルの再現性を決定し、サンプル対当たりの平均の相対ＲＮＡ当量を更なる分析に用いた。ＡＮＯＶＡソフトウェア（Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｒｋｅｌｅｙ， ＣＡ）を用いて統計的解析を実施した。プローブプライマーセットの種特異性を、ヒト上皮細胞由来の全ＲＮＡ又はマウス腎臓ＲＮＡを試験することによって証明した（データは示さず）。発現レベルを、それぞれヒト又はマウスＧＡＰＤＨに特異的なプローブ／プライマー集合に正規化した。
【０１５１】
（ｃ）一次ヒト内皮細胞の一過性形質移入
継代６に達する前のＨＵＶＥ細胞と、継代４に達する前のＨＭＶＥＣを使用した。
Ｆａｌｃｏｎのｐｒｉｍａｒｉａ６ウェル皿を未被覆で使用する。（ゼラチンでの被覆は推奨されない）。
２ｘトリプシンで３〜５分の間、室温でインキュベーションすることによって細胞を収集し、３容量の完全培地にトリプシン処理をした細胞を希釈する（あまりに長くトリプシン処理をしない）。
血球計算器で１０μｌの混合物をカウントする。
しばらくして２ｋｒｐにて５分細胞を遠心処理する。
上清を除去し、３ｍｌの完全培地中０．５ｘ１０ｅ５細胞まで完全培地で細胞を希釈し、プールをつくる。
プールから各ウェルに３ｍｌの細胞を添加する（５００００細胞／ウェル、（５０００細胞／ｃｍ２）
細胞は＜６０％コンフルエントでなければならず、さもないと毒性の増加が観察されるかもしれない。細胞密度＞８０％では、低い形質移入効率が観察された。
リポフェクション：
ＨＵＶＥ及びＨＭＶＥ細胞に対して：
次の量を３ウェルの形質移入に対して計算した。試験する各遺伝子に対して２通り又は３通りを持つために３つの形質移入のプールを産生することが好ましい。
ＤＮＡを１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ透明チューブ（ポリスチレン）にピペット操作で取る。最前の結果は、実験の直前にＤＮＡ濃度を測定したときである：
１１．２５μｇの発現ベクター（ｐＲＫＮに載せたもの）
３．７５μｇのルシフェラーゼレポーター
１．０μｇのＳＶ−レニラ参照レポーター。
４．５ｍｌのＯｐｔｉｍｅｎ（無血清）を添加する。
９．）Ｆ１タージェフェクチン（ｔａｒｇｅｆｅｃｔｉｎ）溶液を３０秒間混合し、１４μｌのＦ１を混合物に添加する。
１０．）転倒させてリポフェクチン混合物を混合し、２０から３０分間３７Ｃの水浴中でサンプルをインキュベートする。
１０．）細胞を一度ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳを除去し、皿当たり５ｍｌのプラスチックピペットを用いて１．５ｍｌのリポフェクション混合物を添加する。
１１．）ＣＯ２インキュベーター中で２．５時間細胞をインキュベートする。
１２．）３ｍｌの完全培地を添加し、終夜インキュベートする（１２〜１６時間）。延長したインキュベーションの効果はまだ決定されていない。
１３．）１ｘＰＢＳで細胞を洗浄する。
１４．）３ｍｌの完全培地を添加し、ドージング前に２４時間待つ。
１５．）リポフェクチンから３６時間後又はドージングから６〜９時間後に細胞を収集する。
血清枯渇化（０．５％ＦＣＳ）：
１．）次の朝：３ｍｌのＰＢＳで１ｘ細胞を洗浄する。
２．）０．５％のＦＣＳ培地、０．２％のＢＳＡ、Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐ、ファンギゾンを添加する。
ＥＧＦＰを形質移入したとき、７２時間後に３２％までの形質移入効率が観察された。
【０１５２】
細胞収集とルシフェラーゼ測定：
吸引により培地を取り除き、ＰＢＳで１ｘ注意深く洗浄し、３００μｌの１ｘパッシブ溶解バッファーを加える。サンプルをこの時点で−２０℃に保存することができるが、活性は５０％まで減少するかもしれない。
照度計：
１００μｌのルシフェラスト基質溶液でチューブを前もって満たす。
３０μｌの抽出物を添加する。
１００μｌのＳＴＯＰとＧＬＯＷを添加する。
更なる材料
材料：Ｆ１：ターゲッティングシステム、Ｔａｒｇｆｅｃｔ Ｆ−１ （２ｍｇ／ｍｌ）， カタログ番号＃００１（１ｍｌ）又は＃００２（４ｘ１ｍｌ）、（Ｔａｒｇｅｔｈｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｔｅｌ ６１９５６２１５１８， Ｒｈｕｍｐｉａ）
培養皿：６０ｍｍ細胞培養皿、Ｆａｌｃｏｎ３８０２、ｐｒｉｍａｒｉａ、表面改変ポリスチレン。
細胞：ＨＵＶＥＣ：Ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍｓ， ２ＶＯ−Ｃ７５
ＨＤＭＥＸ， Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ２Ｍ１−Ｃ７５
培地：
５％血清含有：
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ−１ Ｇｉｂｃｏ， ＢＲＬカタログ番号３１９８５，０．５１
ＣＳＣ培地，カタログ番号４Ｚ０−５００、１１０ドル
ＧＦなし、無血清カタログ番号４Ｚ３−５００−Ｓ， ９０ドル
【０１５３】
３．ＤＳＣＲ１は腫瘍脈管構造及び新生物細胞中で発現される
様々なヒト腫瘍及び他の悪性腫瘍中でのＤＳＣＲ１の発現の細胞局在化を研究するために、異なった一連のヒト腫瘍を含み、様々な健康なヒトの器官から調製された切片についてもまた、インサイツハイブリダーゼーションを実施した。ヒトの胎児発育中、ＤＳＣＲ１は胎児肝臓中及び後根神経節中、Ａ−Ｖ弁挿入近くの房室結合の細胞中及び限局的に左心室中隔及び右心室尖部の心内膜下層内の細胞中に発現することが見出された。胚性大肝静脈内皮及び小血管内皮中で弱い発現があった。胚性脊髄では、神経細胞中に発現があった。成体チンパンジーで研究した場合、正常な乳管を囲む筋上皮細胞中及び正常なチンパンジーの副甲状腺中にＤＳＣＲ１の発現を更に検出した。成体肝臓では、発現は硬変の正常ではない肝臓の肝細胞と胆管上皮に局在化していた。乳腺のヒト腺癌中並びに腎細胞癌中に限局的な発現があった。センス制御が全てのサンプルで実施され、バックグラウンドシグナルを明らかにしなかった（データは示さず）。これらの知見は、内皮細胞と形質転換腫瘍細胞でのＤＳＣＲ１の発現を調節するシグナル伝達経路のある程度の重複性を反映しているのかもしれない。あるいは、腫瘍細胞上のＶＥＧＦレセプターの上方制御とＶＥＧＦ特異的シグナル伝達経路の刺激は我々の発見を説明するのに役立つ。要するに、我々は正常な個体発生の間の胎児脈管構造中と、成体の新生物腫瘍細胞中にＤＳＣＲ１遺伝子の発現を見出し、従って遺伝子の腫瘍胎児ファミリーのメンバーとしてＤＳＣＲ１を同定した。
【０１５４】
４．一次ヒト内皮細胞の一過性トランスフェクションによるＤＳＣＲ１の機能分析
最近、酵母の二つのハイブリッド実験において、ＤＳＣＲ１が、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインホスファターゼＰＰ２Ｂの触媒サブユニットであるカルシニュリンＡと物理的かつ機能的に相互作用することが示された。Ｔ細胞での研究において、ＤＳＣＲ１の一過性過剰発現がＰＭＡ／カルシウム刺激に応答してインターロイキン２プロモーターの転写活性化を阻害した。ＤＳＣＲ１形質移入細胞では、ＮＦＡＴはイオノマイシンのようなカルシウムイオノフォアでの刺激後に核内に蓄積できなかった。
ＰＭＡ及びカルシウムイオノフォアＡ２３１８７で細胞を刺激した後、一次ヒト内皮細胞中でのＤＳＣＲの過剰発現がＮＦＡＴ活性化に効果をもたらしたかどうかを試験した。３つのＮＦＡＴ結合部位を含むルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ）とＤＳＣＲ１−ＦＬＡＧをコードする発現ベクターの一過性同時形質移入実験により、ＰＭＡとイオノフォアに応答して刺激６時間後にＮＦＡＴ活性の完全な除去が明らかになった。内皮細胞中でのＤＳＣＲの強制発現は、おそらくはカルシニュリン調節シグナル伝達経路との干渉によって、カルシニュリン調節シグナル伝達経路の有意な下方制御を生じる。
【０１５５】
均等性
特定の実施態様をここに詳細に開示したが、これは例証の目的のための例としてのみ行ったもので、添付の特許請求の範囲について限定を加えることが意図されるものではない。特に、特許請求の範囲によって定まる本発明の精神及び範囲から逸脱せずに様々な置換、変更、及び改変を本発明に施してもよいことは、発明者によって考慮されることである。核酸出発物質、対象のクローン、又はライブラリーのタイプの選択は、ここに記述された実施態様に関する知識を有する当業者にとって常套的な事柄であると考えられる。他の側面、利点、及び変更は、特許請求の範囲内のものであると考えられる。
【０１５６】
文献
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Ｄｅｍｅｒｅｃ， Ｍ．， Ｅ．Ａ． Ａｄｅｌｂｅｒｇ， Ａ．Ｊ． Ｃｌａｒｋ， 及び Ｐ．Ｅ． Ｈａｒｔｍａｎ． １９６６．　Ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｆｏｒ ａ ｕｎｉｆｏｒｍ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ． ５４：６１−７６．
Ｄｅｎｇ， Ｘ．， Ｐ． Ｒｕｖｏｌｏ， Ｂ． Ｃａｒｒ 及び Ｗ．Ｓ． Ｍａｙ． ２０００． Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ１／２ ａｓ ＩＬ−３−ａｃｔｉｖａｔｅｄ， ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂｃｌ２ ｋｉｎａｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９７：１５７８−８３．
Ｄｅｖｌｉｎ， Ｊ．Ｊ．， Ｌ．Ｃ． Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ， 及び Ｐ．Ｅ． Ｄｅｖｌｉｎ． １９９０． Ｒａｎｄｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ： ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２４９：４０４−６．
ＤｅＷｉｔｔ， Ｓ．Ｈ．， Ｊ．Ｓ． Ｋｉｅｌｙ， Ｃ．Ｊ． Ｓｔａｎｋｏｖｉｃ， Ｍ．Ｃ． Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ 等 １９９３． ”Ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ”： ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ， ｎｏｎｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９０：６９０９−１３．
Ｄｒｕｅｙ， Ｋ．Ｍ．， Ｋ．Ｊ． Ｂｌｕｍｅｒ， Ｖ．Ｈ． Ｋａｎｇ， 及び Ｊ．Ｈ． Ｋｅｈｒｌ． １９９６． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｎｅｗ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ． Ｎａｔｕｒｅ． ３７９ ：７４２−６．
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米国特許 ４，５２２，８１１号 Ｓｅｒｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｅｒｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ． １９８５．
Ｅｐｐｓｔｅｉｎ， Ｄ．Ａ．， Ｙ．Ｖ． Ｍａｒｓｈ， Ｍ． ｖａｎ ｄｅｒ Ｐａｓ， Ｐ．Ｌ． Ｆｅｌｇｎｅｒ， 等 １９８５． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８２：３６８８−９２．
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Ｏｋａｎｏ， Ｈ．， Ｊ． Ａｒｕｇａ， Ｔ． Ｎａｋａｇａｗａ， Ｃ． Ｓｈｉｏｔａ， 等 １９９１． Ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ｉｎ ｉｔｓ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｙｅｌｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎｔ ｍｏｕｓｅ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ５６：５６０−７．
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Ｓｈｒｉｄｈａｒ， Ｖ．， Ｓ． Ｒｉｖａｒｄ， Ｘ． Ｗａｎｇ， Ｒ． Ｓｈｒｉｄｈａｒ， 等． １９９７． Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ （ＡＲＰ） ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ． １４：２２１３−６．
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る様々な遺伝子の形質移入後の、ヒト臍帯内皮細胞の生存を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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