(57)【要約】１つの系における、高いカプセル化率、迅速な放出速度、およびＤＮＡの超らせん形態における保存の組み合わせを提供する、核酸送達系が提供される。核酸送達系は、生分解性ミクロスフェア中にカプセル化された、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの核酸分子を含み、ＤＮＡワクチンの送達に特に適している。本発明は、核酸分子をミクロスフェア中にカプセル化するための方法をさらに提供する。本発明はさらに、本発明の方法によって産生されたミクロスフェア中にカプセル化された核酸分子を含む組成物、および核酸分子を被験者に送達するための方法を提供する。本発明は、アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）を含む、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの免疫刺激有効性を調節するためのアジュバントをさらに提供する。本発明はまた、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの免疫刺激有効性を調節するための方法を提供する。
2004502721.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプセル化前に、ＤＮＡが凍結温度より高く３７℃未満に維持され、少なくとも５０％のＤＮＡが超らせんＤＮＡを含み、少なくとも５０％のＤＮＡが約３７℃にて７日後にミクロスフェアから放出される、生分解性重合体のミクロスフェア（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）中にカプセル化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む核酸送達系。
【請求項２】
ミクロスフェアが少なくとも約４０％のカプセル化率を有する、請求項１記載の核酸送達系。
【請求項３】
少なくとも約７０％のＤＮＡが、約３７℃において７日後にミクロスフェアから放出される、請求項１または２記載の核酸送達系。
【請求項４】
少なくとも約９０％のミクロスフェアが直径約１μｍから約１０μｍである、請求項１から３のいずれか一項記載の核酸送達系。
【請求項５】
ミクロスフェアがポリ（ラクト−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）を含む、請求項１から４のいずれか一項記載の核酸送達系。
【請求項６】
アジュバントをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項記載の核酸送達系。
【請求項７】
アジュバントがアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）を含む、請求項６記載の核酸送達系。
【請求項８】
ＤＮＡが癌または感染性疾患に関連する抗原をコードする、請求項１から７のいずれか一項記載の核酸送達系。
【請求項９】
癌が乳癌である、請求項８記載の核酸送達系。
【請求項１０】
抗原がｈｅｒ２／ｎｅｕである、請求項９記載の核酸送達系。
【請求項１１】
感染性疾患が結核である、請求項８記載の核酸送達系。
【請求項１２】
抗原がＴｂＨ９である、請求項１１記載の核酸送達系。
【請求項１３】
ミクロスフェア中に核酸分子をカプセル化するための方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）溶媒中で重合体を溶解させ、重合体溶液を形成する段階；
（ｂ）核酸分子を含む水溶液を重合体溶液に加え、一次乳剤（ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を形成する段階；
（ｃ）一次乳剤を均質化する段階；
（ｄ）安定化剤を含む加工媒質と一次乳剤を混合し、二次乳剤を形成する段階；および
（ｅ）抽出前に、核酸分子が凍結温度より高く３７℃未満に維持される、二次乳剤から溶媒を抽出し、核酸分子をカプセル化しているミクロスフェアを形成する段階。
【請求項１４】
重合体がＰＬＧを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＰＬＧがエステル末端基またはカルボン酸末端基を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＰＬＧが約８ ｋＤａ〜約６５ ｋＤａの分子量を有する、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
抽出前に、核酸分子が約２℃から約３５℃に維持される、請求項１３から１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
抽出前に、核酸分子が約４℃から約２５℃に維持される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
溶媒がジクロロメタン、クロロホルム、または酢酸エチルを含む、請求項１３から１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
重合体溶液が陽イオン脂質をさらに含む、請求項１３から１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
重合体溶液がアジュバントをさらに含む、請求項１３から２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
アジュバントがＭＰＬを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
安定化剤がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、またはＣＭＣとＰＶＡの混合物を含む、請求項１３から２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
安定化剤が陽イオン脂質をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
安定化剤が約１％から約５％の加工媒質を含む、請求項１３から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
溶媒が約０．００１％から約０．５％の内部水容積（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｗａｔｅｒ ｖｏｌｕｍｅ）を含む、請求項１３から２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
水溶液が約０％から約７５％（ｖ／ｖ）のエタノール含量を含む、請求項１３から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
核酸分子がＤＮＡを含む、請求項１３から２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
水溶液が約０．２ ｍｇ／ｍｌから約１２ ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡが約３ ｋｂから約９ ｋｂのプラスミドを含む、請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
水溶液がアジュバントをさらに含む、請求項１３から３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
アジュバントがＱＳ２１を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
水溶液が安定化剤をさらに含む、請求項１３から３２のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
安定化剤がウシ血清アルブミンを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
抽出段階を通して、少なくとも５０％のＤＮＡが超らせん構造を保持する、請求項１３から３４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
カプセル化率が少なくとも約４０％である、請求項１３から３５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
ミクロスフェアが、少なくとも約５０％の核酸分子を約７日以内に放出する、請求項１３から３６のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
ミクロスフェアが、少なくとも約５０％の核酸分子を約４日以内に放出する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも約９０％のミクロスフェアが約１μｍから約１０μｍである、請求項１３から３８のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
請求項１３から３９のいずれか一項記載の方法によって産生されたミクロスフェア中にカプセル化された核酸分子を含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
アジュバントをさらに含む、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
アジュバントがアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）を含む、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
ＤＮＡが癌または感染性疾患に関連する抗原をコードする、請求項４０から４２のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４４】
癌が乳癌である、請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】
抗原がｈｅｒ２／ｎｅｕである、請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
感染性疾患が結核である、請求項４３記載の組成物。
【請求項４７】
抗原がＴｂＨ９である、請求項４６記載の組成物。
【請求項４８】
被験者への核酸分子送達用の組成物の調製のための、請求項１記載の核酸送達系の使用。
【請求項４９】
被験者における抗原に対する免疫応答惹起用の組成物の調製のための、請求項８記載の核酸送達系の使用。
【請求項５０】
被験者におけるｈｅｒ２／ｎｅｕ抗原に関連する癌の治療用または予防用の組成物の調製のための、請求項１０記載の核酸送達系の使用。
【請求項５１】
被験者における結核の治療用または予防用の組成物の調製のための、請求項１２記載の核酸送達系の使用。
【請求項５２】
核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの免疫刺激有効性の増強用のアジュバントの調製のための、アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）の使用。
【請求項５３】
ＡＧＰが水性製剤を含む、請求項５２記載の使用。
【請求項５４】
ＡＧＰが５１７、５２７、５４７、５５７または５６８を含む、請求項５２または５３記載の使用。
【請求項５５】
ＡＧＰがミクロスフェアと同時に投与される、請求項５２から５４のいずれか一項記載の使用。
【請求項５６】
ＡＧＰがミクロスフェアの投与の前または後に投与される、請求項５２から５４のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる、２０００年７月７日に出願された、米国特許仮出願第６０／２１６，６０４号の恩典を主張する。
【０００２】
本出願を通して、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する技術の様子をより完全に説明するために、その全体が本明細書において参照として組み入れられる。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は、ワクチンの送達のために使用できる製剤、組成物および方法に関連する。とりわけ、本発明は、より効率的な、およびより有効な、ＤＮＡワクチンの送達のためのミクロスフェアおよびアジュバントに関連する。
【０００４】
発明の背景
癌および慢性感染性疾患の予防および治療のために、新しいワクチンが開発されつつある。最も有効なワクチンは、Ｔヘルパー反応および抗体に加えて、ＣＴＬ反応を惹起すると考えられうる。ＤＮＡワクチンは、ヒトにおける使用のためにはさらなる改善が必要であるが、マウスにおけるＣＴＬ反応の発生の際に十分に作用することが見出されている。ＤＮＡワクチン送達のためのビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）としてミクロスフェアを開発する試みは、カプセル化率の低いこと、およびＤＮＡのニック形成、および付随する超らせん構造の喪失によって制限されてきた。これらの制限を克服するための努力により、放出速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）が遅すぎ、カプセル化の間にＤＮＡの分解が起こってしまうようなミクロスフェアが作製された。
【０００５】
より効率的でより効果的なＤＮＡワクチン送達手段、特に、高いカプセル化率を、ＤＮＡ超らせんの保存および迅速な放出速度と組み合わせる方法が、なおも必要とされている。
【０００６】
発明の概要
本発明は、１つの系において、驚くべきことに、高いカプセル化率、迅速な放出速度、およびＤＮＡの超らせん形態における保存の組み合わせを提供する、核酸送達系を提供する。本発明の核酸送達系は、生分解性のミクロスフェア中にカプセル化された、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの核酸分子を含む。好ましい態様において、ミクロスフェア中の少なくとも５０％のＤＮＡが超らせんＤＮＡを含み、少なくとも５０％のＤＮＡが、約３７℃において７日後にミクロスフェアから放出される。ある態様において、少なくとも７０％のＤＮＡが、約３７℃において７日後にミクロスフェアから放出される。好ましくは、ミクロスフェアは、少なくとも約４０％のカプセル化率を有する。ある態様において、少なくとも約９０％のミクロスフェアは、直径約１μｍ〜約１０μｍである。このサイズ範囲内のミクロスフェアは、抗原提示細胞によって貪食されるのに十分適しており、これにより有効なＴ細胞刺激がもたらされる。
【０００７】
本発明のミクロスフェアは、好ましくは、ポリ（ラクト−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、および／またはそれらの共重合体などの生分解性重合体を含む。または、ミクロスフェアは、その他の壁形成材料を含み得る。適した壁形成材料には、これらに限定されるわけではないが、ポリ（ブタジエン）などのポリ（ジエン）；ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリ（アルケン）；ポリ（アクリル酸） などのポリ（アクリル）；ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート） などのポリ（メタクリル）；ポリ（ビニルエーテル）；ポリ（ビニルアルコール）；ポリ（ビニルケトン）；ポリ（塩化ビニル） などのポリ（ハロゲン化ビニル）；ポリ（ビニルニトリル）；ポリ（酢酸ビニル） などのポリ（ビニルエステル）；ポリ（２−ビニルピリジン）、ポリ（５−メチル−２−ビニルピリジン） などのポリ（ビニルピリジン）；ポリ（スチレン）；ポリ（カーボネート）；ポリ（エステル）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（エステルアミド）；ポリ（無水物）；ポリ（ウレタン）；ポリ（アミド）；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロースエーテル；酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ ｐｈｔｈａｌａｔｅ）、酢酸酪酸セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｔｙｒａｔｅ）などのセルロースエステル；多糖類、タンパク質、ゼラチン、デンプン、ゴム、樹脂などが含まれる。これらの物質を、単独で、物理的混合物（混成物）として、または共重合体として使用してよい。核酸送達系は、アジュバント、好ましくはアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）をさらに含み得る。
【０００８】
本発明の核酸送達系は、ＤＮＡワクチンの送達のために特に適している。好ましい態様において、ミクロスフェア中にカプセル化されるＤＮＡは、癌または感染性疾患に関連する抗原をコードする。ある態様において、抗原は、自己免疫疾患に関連する内因性の抗原に由来する。癌の例には、これらに限定されるわけではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病が含まれる。癌抗原の例の一つは、乳癌抗原であるＨｅｒ−２／ｎｅｕである。
【０００９】
感染性疾患に関連する抗原は、病原体、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物を含む、様々な感染性物質のいずれかに由来してよい。ウイルスの例には、これらに限定されるわけではないが、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウイルスＩ型またはＩＩ型、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型またはＩＩ型が含まれる。細菌の例には、これらに限定されるわけではないが、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ナイセリア属およびレジオネラ属が含まれる。寄生生物の例には、これらに限定されるわけではないが、リケッチア属およびクラミジア属が含まれる。感染性疾患抗原のある例は、結核抗原である、ＴｂＨ９（Ｍｔｂ３９Ａとしても知られる）である。その他の結核抗原には、これらに限定されるわけではないが、ＤＰＶ（Ｍｔｂ８．４としても知られる）、３８−１、Ｍｔｂ４１、Ｍｔｂ４０、Ｍｔｂ３２Ａ、Ｍｔｂ９．９Ａ、Ｍｔｂ９．８、Ｍｔｂ１６、Ｍｔｂ７２ｆ、Ｍｔｂ５９ｆ、Ｍｔｂ８８ｆ、Ｍｔｂ７１ｆ、Ｍｔｂ４６ｆおよびＭｔｂ３１ｆ（「ｆ」とは、それが融合体または２つ以上のタンパク質であることを指す）が含まれる。
【００１０】
本発明は、核酸分子をミクロスフェア中にカプセル化するための方法をさらに提供する。本方法は、以下の段階を含む：重合体を溶媒に溶解させ、重合体溶液を形成する段階；核酸分子を含む水溶液を重合体溶液に加え、一次乳剤を形成する段階；一次乳剤を均質化する段階；一次乳剤を、安定化剤を含む加工媒質と混合し、二次乳剤を形成する段階；および溶媒を二次乳剤から抽出し、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアを形成する段階。典型的に、これらの方法の段階は、氷上で、好ましくは、凍結温度より高く３７℃未満に温度を維持しながら実行される。ある態様において、溶液および媒質は約２℃〜約３５℃に維持される。その他の態様において、溶液および媒質は約４℃〜約２５℃に維持される。ミクロスフェア調製の一次乳化段階および二次乳化段階中に、材料を３７℃未満に保つことにより、ＤＮＡのニック形成を減少できる。より多くのＤＮＡを超らせん形態に保存することにより、細胞のより効率的なトランスフェクションが容易になる。本方法は、その後の、ミクロスフェアの洗浄段階、凍結段階および凍結乾燥段階をさらに含み得る。
【００１１】
好ましい態様において、重合体はＰＬＧを含む。いくつかの態様において、ＰＬＧはエステル末端基またはカルボン酸末端基を含むことができ、約４ ｋＤａ〜約１２０ ｋＤａの分子量、または好ましくは、約８ ｋＤａ〜約６５ ｋＤａの分子量を有する。溶媒は例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、または酢酸エチルを含み得る。いくつかの態様において、重合体溶液は、陽イオン脂質および／またはＭＰＬなどのアジュバントをさらに含む。安定化剤の例には、これらに限定されるわけではないが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、またはそれらの混合物が含まれる。安定化剤は選択的に、陽イオン脂質をさらに含み得る。いくつかの態様において、安定化剤は、約０％〜約１０％の加工媒質、または好ましくは、約１％〜約５％の加工媒質を含む。いくつかの態様において、溶媒は、約０．００１％〜約０．５％の内部水容積を含み、かつ／または、水溶液は、約０％〜約７５％（ｖ／ｖ）のエタノール含量を含む。
【００１２】
核酸分子は、好ましくはＤＮＡを含む。ある態様において、水溶液は、約０．２ ｍｇ／ｍｌ〜約１２ ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含む。水溶液は、選択的に、ＢＳＡ、ＨＳＡもしくは糖などの安定化剤、またはＱＳ２１などのアジュバントをさらに含み得る。ある態様において、ＤＮＡは、約２ ｋｂ〜約１２ ｋｂのプラスミド、好ましくは約３ ｋｂ〜約９ ｋｂのプラスミドを含む。
【００１３】
好ましくは、少なくとも５０％のＤＮＡは、抽出段階を通して、より好ましくは、その後の、凍結乾燥などの全ての段階を通して、超らせん構造を保持する。カプセル化率が少なくとも約４０％であり、かつ／または、ミクロスフェアが、３７℃での水性環境のような望ましい送達環境との接触後約７日以内に、少なくとも約５０％の核酸分子を放出するような方法もまた好ましい。より好ましい態様において、ミクロスフェアは、少なくとも約５０％の核酸分子を約４日以内に放出する。少なくとも約９０％のミクロスフェアが、約１μｍ〜約１０μｍであるような方法もまた好ましい。
【００１４】
本発明は、本発明の方法によって産生されたミクロスフェア中にカプセル化された核酸分子を含む組成物をさらに提供する。好ましくは、組成物は、アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）などのアジュバントをさらに含む。被験者に核酸分子を送達するための方法、被験者において免疫応答を惹起するための方法、および被験者において癌または感染性疾患を治療するおよび／または防御するための方法もまた提供される。これらの方法は、被験者に本発明の核酸送達系または組成物を投与する段階を含む。
【００１５】
本発明は、アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）を含む、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの免疫刺激有効性を調節するためのアジュバントをさらに提供する。好ましい態様において、ＡＧＰは、水性製剤を含む。ＡＧＰアジュバントの例には、これらに限定されるわけではないが、５１７、５２７、５４７、５５７および５６８が含まれる。本発明はまた、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの免疫刺激有効性を調節するための方法を提供する。本方法は、核酸分子をカプセル化したミクロスフェアの投与に対するアジュバントとしてＡＧＰを投与する段階を含む。ＡＧＰを、ミクロスフェアと同時に投与することができる、または、ミクロスフェアの投与の前もしくは後に投与することができる。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、１つの系において、驚くべきことに、高いカプセル化率、迅速な放出速度、およびＤＮＡの超らせん形態における保存の組み合せを提供する核酸送達系を提供する。本発明の核酸送達系は、生分解性のミクロスフェア中にカプセル化された、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などの核酸分子を含む。本発明に従って調製されたミクロスフェアは、インビトロにおいて、３７℃で４８時間後に、それらの含量の３３％を上回って、４日後に５０％を上回って、および７日後に７０％を上回って放出することが示された。加えて、これらのミクロスフェアは、超らせんＤＮＡ対ニックＤＮＡの高い比率を維持する一方、約４０％〜約８０％のカプセル化率を有する。本発明のミクロスフェアは、直径約１μｍ〜約１０μｍである。このサイズ範囲内のミクロスフェアは、抗原提示細胞によって貪食されるのに十分適しており、有効なＴ細胞刺激をもたらす。本発明の核酸送達系は、被験者において免疫応答を惹起するために、１つまたは複数の関心対象の抗原をコードする核酸分子を送達するために使用できる。
【００１７】
本発明は、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの免疫刺激有効性を調節するためのアジュバントをさらに提供する。アジュバントは、ミクロスフェア中にカプセル化されたＤＮＡによってコードされる抗原に対して強い細胞性免疫応答を提供する、アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）を含む。本発明はまた、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの免疫刺激有効性を調節するための方法を提供する。本方法は、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの投与に対するアジュバントとしてＡＧＰを投与する段階を含む。
【００１８】
定義
本出願において使用される全ての科学用語および技術用語は、特に指定されない限り、当技術分野において一般的に使用される意味を有する。本出願において使用される以下の用語は、所定の意味を有する。
【００１９】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、単鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体を指し、かつ特に限定されない限り、天然のヌクレオチドと同様の様式で核酸にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む。
【００２０】
本明細書において使用される「免疫応答」とは、抗体の産生、ＩＦＮ−γなどの免疫調節因子の産生、およびＣＴＬ活性の誘導を含む。免疫応答の惹起とは、免疫応答の開始、刺激または増強を含む。
【００２１】
本明細書において使用される、ある状態または疾患「を予防する」または「に対して防御する」とは、その状態または疾患の発症または進行を妨げる、軽減させる、または遅延させることを意味する。
【００２２】
本明細書において使用される「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」とは、抗原を処理し、およびリンパ球に対して提示できる細胞を意味する。ＡＰＣの例には、これらに限定されるわけではないが、マクロファージ、ランゲルハンス樹状細胞、濾胞内樹状細胞、Ｂ細胞、単球、線維芽細胞および線維細胞が含まれる。樹状細胞は、好ましい種類の抗原提示細胞である。樹状細胞は、多くの非リンパ系組織において見出されているが、求心性のリンパ経由または血流経由でリンパ系器官のＴ細胞依存性領域まで移動できる。樹状細胞は、非リンパ系器官においては、ランゲルハンス細胞および間質樹状細胞を含む。リンパおよび血液においては、求心性のリンパヴェール（ｖｅｉｌｅｄ）細胞および血液樹状細胞を各々含む。リンパ系器官においては、リンパ系樹状細胞および交互嵌合（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ）細胞を含む。
【００２３】
本明細書において使用される、あるエピトープを提示するための「修飾型」とは、天然または組み換え的な方法によって、あるエピトープを提示するように操作された、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を指す。例えば、単独で、もしくは混合物の一部として、単離された抗原に曝露することによって、ペプチド充填によって、または、１つもしくは複数のエピトープを含むポリペプチドを発現するようにＡＰＣを遺伝学的に改変することによって、ＡＰＣを修飾することができる。
【００２４】
本明細書において使用される「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の望ましい生物活性を維持し、望ましくない毒性的影響を全く与えない塩を指す。そのような塩類の例には、これらに限定されるわけではないが、（ａ）例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの無機酸で形成される酸付加塩類；および、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸で形成される塩類；（ｂ）亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属陽イオンを有する塩類；または（ｃ）Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンで形成される塩類；または（ｄ）例えば亜鉛タンニン酸塩など、（ａ）および（ｂ）もしくは（ｃ）の組み合わせなどが含まれる。好ましい酸付加塩類は、トリフルオロ酢酸塩および酢酸塩である。
【００２５】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」とは、活性成分と組み合わされた場合に、その成分の生物活性を維持させ、被験者の免疫系とは非反応性である、任意の材料を含む。例としては、これらに限定されるわけではないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、水中油型乳剤などの乳剤、および様々な種類の湿潤剤などの、任意の標準薬学的担体が挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水または標準（０．９％）生理食塩水である。
【００２６】
そのような担体を含む組成物は、既知の従来法によって製剤化される（例えば、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第４３章、第１４版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ １８０４２、ＵＳＡを参照のこと）。
【００２７】
本明細書において使用される「アジュバント」には、免疫応答の刺激を容易にするために当技術分野において一般的に使用されるアジュバントが含まれる。アジュバントの例には、これらに限定されるわけではないが、ヘルパーペプチド；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩類；フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；メルクアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５）（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；ＡＳ−２（Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）；ＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌｌａ）；ＭＰＬ（商標）免疫刺激剤または３ｄ−ＭＰＬ（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；ＬＥＩＦ；カルシウム、鉄または亜鉛の塩類；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖類；陽イオン性または陰イオン性に誘導された多糖類；ポリホスファゲン；生分解性のミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ Ａ；ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン、または、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７もしくは−１２）および免疫刺激性ＤＮＡ配列を含む免疫刺激複合体が挙げられる。ポリヌクレオチドワクチンの使用を伴うようないくつかの態様において、ヘルパーペプチドまたはサイトカインなどのアジュバントを、そのアジュバントをコードするポリヌクレオチドを経て提供することができる。
【００２８】
本明細書において使用される「ある（ａまたはａｎ）」とは、他に明らかに示されない限り、少なくとも１つを意味する。
【００２９】
核酸送達系
本発明は、生分解性のミクロスフェア中にカプセル化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む、核酸送達系を提供する。好ましい態様において、ミクロスフェア中の少なくとも５０％のＤＮＡが超らせんＤＮＡを含み、かつ少なくとも５０％のＤＮＡが、約３７℃において７日後にミクロスフェアから放出される。いくつかの態様において、少なくとも７０％のＤＮＡが、約３７℃において７日後にミクロスフェアから放出される。好ましくは、ミクロスフェアは少なくとも約４０％のカプセル化率を有する。ある態様において、少なくとも約９０％のミクロスフェアが、直径約１μｍ〜約１０μｍである。このサイズ範囲内のミクロスフェアは、抗原提示細胞によって貪食されるのに十分適しており、有効なＴ細胞刺激をもたらす。
【００３０】
本発明のミクロスフェアは、好ましくは、ポリ（ラクト−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリ（ラクチド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、および／またはそれらの共重合体などの生分解性重合体を含む。または、ミクロスフェアは、その他の壁形成材料を含み得る。適した壁形成材料には、これらに限定されるわけではないが、ポリ（ブタジエン） などのポリ（ジエン）；ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリ（アルケン）；ポリ（アクリル酸） などのポリ（アクリル）；ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート） などのポリ（メタクリル）；ポリ（ビニルエーテル）；ポリ（ビニルアルコール）；ポリ（ビニルケトン）；ポリ（塩化ビニル） などのポリ（ハロゲン化ビニル）；ポリ（ビニルニトリル）；ポリ（酢酸ビニル） などのポリ（ビニルエステル）；ポリ（２−ビニルピリジン）、ポリ（５−メチル−２−ビニルピリジン） などのポリ（ビニルピリジン）；ポリ（スチレン）；ポリ（カーボネート）；ポリ（エステル）；ポリ（オルトエステル）；ポリ（エステルアミド）；ポリ（無水物）；ポリ（ウレタン）；ポリ（アミド）；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロースエーテル；酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸酪酸セルロースなどのセルロースエステル；多糖類、タンパク質、ゼラチン、デンプン、ゴム、樹脂などが含まれる。これらの材料を、単独で、物理的混合物（混成物）として、または共重合体として使用してよい。核酸送達系は、アジュバントを、好ましくはアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）をさらに含み得る。
【００３１】
ミクロスフェア製剤
本発明は、核酸分子をミクロスフェア中にカプセル化するための方法を提供する。本方法は、重合体を溶媒に溶解させ、重合体溶液を形成する段階；核酸分子を含む水溶液を重合体溶液に添加し、一次乳剤を形成する段階；一次乳剤を均質化する段階；一次乳剤を、安定化剤を含む加工媒質と混合し、二次乳剤を形成する段階；および二次乳剤から溶媒を抽出し、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアを形成する段階を含む。典型的には、これらの方法の段階は、氷上で、好ましくは凍結温度より高く３７℃未満に温度を維持しながら実行される。ある態様において、溶液および媒質は約２℃〜約３５℃に維持される。別の態様において、溶液および媒質は、約４℃〜約２５℃に維持される。ミクロスフェア調製の一次乳化段階および二次乳化段階の間、材料を３７℃より低く維持することにより、ＤＮＡのニック形成を減少できる。より多くのＤＮＡを超らせん形態に保存することにより、細胞のより効率的なトランスフェクションが容易になる。本方法は、その後のミクロスフェアの洗浄段階、凍結段階および凍結乾燥段階をさらに含み得る。
【００３２】
好ましい態様において、重合体はＰＬＧを含む。いくつかの態様において、ＰＬＧはエステル末端基またはカルボン酸末端基を含むことができ、約４ ｋＤａ〜約１２０ ｋＤａの分子量、または好ましくは、約８ ｋＤａ〜約６５ ｋＤａの分子量を有する。溶媒は例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、または酢酸エチルを含み得る。いくつかの態様において、重合体溶液は、陽イオン脂質および／またはＭＰＬなどのアジュバントをさらに含む。安定化剤の例には、これらに限定されるわけではないが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、またはそれらの混合物が含まれる。安定化剤は選択的に、陽イオン脂質をさらに含み得る。いくつかの態様において、安定化剤は、約０％〜約１０％の加工媒質、または好ましくは、約１％〜約５％の加工媒質を含む。いくつかの態様において、溶媒は、約０．００１％〜約０．５％の内部水容積を含み、かつ／または、水溶液は、約０％〜約７５％（ｖ／ｖ）のエタノール含量を含む。
【００３３】
核酸分子は、好ましくはＤＮＡを含む。ある態様において、水溶液は、約０．２ ｍｇ／ｍｌ〜約１２ ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含む。水溶液は、選択的に、ＢＳＡ、ＨＳＡもしくは糖などの安定化剤、またはＱＳ２１などのアジュバントをさらに含み得る。ある態様において、ＤＮＡは、約２ ｋｂ〜約１２ ｋｂのプラスミド、好ましくは約３ ｋｂ〜約９ ｋｂのプラスミドを含む。
【００３４】
好ましくは、少なくとも５０％のＤＮＡは、抽出段階を通して、より好ましくは、その後の、凍結乾燥などの全ての段階を通して、超らせん構造を保持する。カプセル化率が少なくとも約４０％であり、かつ／または、ミクロスフェアが、３７℃での水性環境のような望ましい送達環境との接触後約７日以内に、少なくとも約５０％の核酸分子を放出するような方法もまた好ましい。より好ましい態様において、ミクロスフェアは、少なくとも約５０％の核酸分子を約４日以内に放出する。少なくとも約９０％のミクロスフェアが、約１μｍ〜約１０μｍであるような方法もまた好ましい。
【００３５】
核酸分子のような水溶性の薬剤は、ラクチド／グリコリド共重合体のような疎水性壁形成材料を通して拡散しないため、徐放性適用のためにこれらの薬剤が外へ拡散できるよう、ミクロスフェア膜に孔（ｐｏｒｅ）を作製しなければならない。得られる多孔性には幾つかの要因が影響を与える。カプセル化される薬剤の量は、ミクロスフェアの多孔性に影響を及ぼす。より大きな薬物領域がミクロスフェア内に存在するため、明らかに、より多くの量を充填されたミクロスフェア（即ち、約２０重量％を上回り、かつ好ましくは２０重量％〜８０重量％の間）は、少量の薬剤（即ち、約２０重量％未満）を含むミクロスフェアよりも多孔性である。ミクロスフェアに取り込むことができる薬剤の壁形成材料に対する比率は、０．１％くらいの低さから８０％くらいの高さまで可能である。
【００３６】
壁形成材料を溶解させるのに使用される溶媒もまた、膜の多孔性に影響を与えると考えられる。酢酸エチルなどの溶媒から調製されるミクロスフェアは、クロロホルムから調製されるミクロスフェアより多孔性のものと考えられる。これは、酢酸エチル中ではクロロホルム中よりも水の可溶性が高いことに起因する。より具体的には、乳化段階中は、加工媒質が溶媒で飽和されるため、溶媒は微小滴（ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）から除去されない。しかし、本過程の乳化段階中に、水を微小滴の溶媒中に溶解させることは可能である。適切な溶媒または共溶媒を選択することにより、微小滴中に溶解すると考えられる連続的な加工媒質量を調節でき、これはミクロスフェアの膜の最終的な多孔性および内部構造に影響すると考えられる。
【００３７】
膜の多孔性に影響すると考えられるその他の要因は、溶媒中における壁材料／賦形剤の初期濃度である。溶媒中の壁材料が高濃度であれば、壁材料／賦形剤が低濃度の場合よりも、多孔性のより低い膜が生じる。また、溶媒中の壁材料／賦形剤が高濃度であれば、溶液の粘度がより高くなるため、水溶性化合物のカプセル化率が改善される。一般に、溶媒中の壁形成材料／賦形剤の濃度は、使用される壁形成材料および溶媒の分子量などの、壁材料／賦形剤の物理的／化学的な特性に依存して、約３％〜約４０％の範囲にわたると考えられる。
【００３８】
組成物
本発明は、核酸分子を送達するために有用な組成物を提供する。核酸分子は、癌または感染性疾患に関連する抗原をコードするものを含むことができ、癌または感染性疾患を治療および予防するための組成物を提供する。ある態様において、組成物は薬学的組成物である。組成物は、癌または感染性疾患に関連する１つまたは複数の抗原をコードまたは提示する、治療的または予防的有効量のポリヌクレオチド、組み換えウイルス、ＡＰＣまたは免疫細胞を含み得る。有効な量とは、例えばＴ細胞を活性化することにより、免疫応答を惹起するまたは増大させるのに十分な量である。Ｔ細胞の活性化の測定法の一つは、下記の実施例において記載されるような、細胞傷害性アッセイまたはインターフェロン−γ放出アッセイである。いくつかの態様において、組成物はワクチンである。
【００３９】
いくつかの態様において、治療または予防されるべき状態とは、癌または前癌状態（例えば、過形成、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｍａ）、異形成）である。癌の例には、これらに限定されるわけではないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮癌、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病が含まれる。
【００４０】
いくつかの態様において、治療または予防されるべき状態とは、感染性疾患である。感染性疾患の例には、これらに限定されるわけではないが、病原体、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物への感染が含まれる。ウイルスの例には、これらに限定されるわけではないが、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウイルスＩ型またはＩＩ型、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス、サイトメガロウイルス、ｅｃｈｉｎｏｖｉｒｕｓ、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型またはＩＩ型が含まれる。細菌の例には、これらに限定されるわけではないが、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ナイセリア属およびレジオネラ属が含まれる。寄生生物の例には、これらに限定されるわけではないが、リケッチア属およびクラミジア属が含まれる。
【００４１】
組成物は選択的に、薬学的に許容される担体などの担体を含み得る。薬学的に許容される担体は、部分的に、投与される特定の組成物によって、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の薬学的組成物には広範な種類の最適な製剤が存在する。製剤は、例えば（関節における）関節内、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および皮下経路などの、非経口投与に適しており、担体は、抗酸化薬、緩衝液、静菌薬を含み得る水性等張滅菌注射溶液、および対象となるレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、および懸濁化剤、可溶化剤、粘稠化剤、安定化剤、保存剤、リポソーム、ミクロスフェアおよび乳剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。
【００４２】
本発明の組成物は、１つまたは複数のアジュバントをさらに含み得る。アジュバントの例は、これらに限定されるわけではないが、ヘルパーペプチド、ミョウバン、フロイントのムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミンまたはサイトカインを含む免疫刺激複合体を含む。ポリヌクレオチドワクチンの使用を伴うようないくつかの態様において、ヘルパーペプチドまたはサイトカインなどのアジュバントを、アジュバントをコードするポリヌクレオチドを経て提供できる。好ましいアジュバントはＡＧＰである。
【００４３】
ワクチン調製物については、例えばＭ．Ｆ．パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）およびＭ．Ｊ．ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）編、「ワクチン設計（サブユニットおよびアジュバントのアプローチ）（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ））」、プレナム出版（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）（ＮＹ、１９９５）において概要が記載されている。本発明の範囲内の薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性または不活性でありうるその他の化合物を含み得る。
【００４４】
担体として使用するための生分解性のミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸塩ポリグリコール酸塩（ｐｏｌｙｌａｃｔａｔｅ ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌａｔｅ））は、例えば米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号；および同第５，９４２，２５２号において開示されており、その各々の開示は参照として本明細書に組み入れられている。特に米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，４０７，６０９号などの、これらの特許は、様々な使用のための生分解性のミクロスフェアの産生について説明しているが、ＤＮＡ送達のための、ミクロスフェアの製剤化および特性の最適化については開示していない。
【００４５】
そのような組成物はまた、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、ショ糖もしくはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、もしくはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化薬、ＥＤＴＡもしくはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、および／または保存剤を含み得る。または、本発明の組成物は、凍結乾燥剤として製剤化されうる。化合物はまた、既知の技術を用いてリポソーム内にカプセル化されうる。
【００４６】
アジュバント
本発明は、ＤＮＡワクチンと共に使用するための、特に、生分解性のミクロスフェア中にカプセル化されたＤＮＡワクチンと共に使用するためのアジュバントをさらに提供する。そのようなアジュバントは、その開示の全体が参照として本明細書に組み入れられる、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号および同第０９／０７４，７２０号において記載されるものなどのように、アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）を含む。
【００４７】
本発明の組成物は、ＡＧＰアジュバントおよび／または付加的なアジュバントを含み得る。ほとんどのアジュバントは、抗原を急速な異化作用から保護するように設計された、水酸化アルミニウムまたはワセリンなどの物質、および、リピドＡや、百日咳菌または結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のタンパク質などの免疫応答の刺激物質を含む。適したアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；メルクアジュバント６５（Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５）（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩類；カルシウム、鉄または亜鉛の塩類；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖類；陽イオン性または陰イオン性に誘導された多糖類；ポリホスファゲン生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌＡとして市販されている。ＧＭ ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７もしくは−１２などのサイトカインもまた、アジュバントとして使用することができる。
【００４８】
本明細書において提供されるワクチン内において、アジュバント組成物は好ましくは、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する、細胞仲介型免疫応答の誘導を促進する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−β）は、液性免疫応答の誘導を促進する傾向がある。本明細書において提供されるようなワクチンの適用後、患者は、Ｔｈ１型およびＴｈ２型の反応を含む免疫応答を確立すると考えられる。反応が主にＴｈ１型であるような、ある好ましい態様内においては、Ｔｈ１型サイトカインのレベルがＴｈ２型サイトカインのレベルよりも著しく上昇する。これらのサイトカインのレベルは、標準アッセイを用いて容易に評価されうる。サイトカインファミリーの概要については、モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）およびコフマン（Ｃｏｆｆｍａｎ）、１９８９、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：１４５〜１７３を参照のこと。
【００４９】
Ｔｈ１型反応を主に惹起する際に使用するための好ましいアジュバントには、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）の、アルミニウム塩との組み合わせが含まれる。ＭＰＬアジュバントは、リビイムノケムリサーチ社（ＲｉＢｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）から入手可能である（米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）。（ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていない）ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドもまた、主にＴｈ１反応を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドはよく知られており、例えば、国際公開公報第９６／０２５５５号において記載されている。その他の好ましいアジュバントは、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて使用されうる、サポニン、好ましくはＱＳ２１である。例えば、増強系は、国際公開公報第９４／００１５３号において記載されたＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせのような、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合せを含む、または、国際公開公報第９６／３３７３９号において記載されるた、ＱＳ２１がコレステロールによって抑制されるような、より反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）の低い組成物との組み合わせを含む。その他の好ましい製剤は、水中油型乳剤およびトコフェロールを含む。水中油型乳剤中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む、特に強力なアジュバント製剤は、国際公開公報第９５／１７２１０号において記載される。使用されうるその他のアジュバントは、ＡＳ−２（Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）である。本明細書において提供される任意のワクチンが、抗原、免疫応答増強剤および適した担体または賦形剤の組み合わせを生じるような既知の方法を用いて調製されうる。
【００５０】
本明細書において記載される組成物を、徐放性製剤（即ち、投与後に化合物の遅延型の放出をもたらす、カプセルまたはスポンジなどの製剤）の一部として投与できる。そのような製剤を一般に、既知の技術を用いて調製でき、例えば、口、直腸、もしくは皮下への移植によって、または望ましい標的部位における移植によって投与できる。徐放性製剤は、担体マトリクス中に分散されている、および／または速度制御膜に囲まれたリザバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）内に含まれる、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を含み得る。そのような製剤内での使用のための担体は、生体適合性であり、また生分解性であってもよい。好ましくは、製剤は比較的一定のレベルの活性成分の放出を提供する。徐放性製剤内に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および予想持続期間、ならびに治療または予防される状態の性質に依存する。
【００５１】
方法
本発明は、被験者に核酸分子を送達するための方法を提供する。本発明は、被験者において免疫応答を惹起するための方法、および、被験者における癌または感染性疾患に対する治療および／または防御のための方法を付加的に提供する。本方法は、本発明の核酸送達系または組成物を被験者に投与する段階を含む。投与を、上記に記載されるように実行することができる。ある態様において、癌は乳癌である。この態様において、好ましい核酸送達系は、乳癌抗原であるｈｅｒ２／ｎｅｕをコードする核酸分子を含む。その他の態様において、感染性疾患は結核である。この態様において、好ましい核酸送達系は、結核抗原であるＴｂＨ９をコードする核酸分子を含む。
【００５２】
本発明はまた、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの免疫刺激有効性を調節するための方法を提供する。本発明は、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアの投与に対するアジュバントとしてＡＧＰを投与する段階を含む。ＡＧＰを、ミクロスフェアと同時に、または、ミクロスフェア投与の前もしくは後に投与することができる。ＡＧＰをミクロスフェア内にＤＮＡと共にカプセル化してもよく、ミクロスフェアと共に組成物に含ませてもよく、または、ミクロスフェアとは別の組成物内に投与してもよい。本発明の方法の典型的な態様において、ＡＧＰは、核酸分子をカプセル化するミクロスフェアによって惹起される免疫応答を増強する。
【００５３】
本発明の送達ビヒクルを、癌性細胞または感染細胞を標的とする抗原特異的な免疫応答の発生を容易にするために使用してもよい。本発明のある好ましい態様では、樹状細胞またはその前駆細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用する。樹状細胞は非常に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３９２： ２４５〜２５１、１９９８）、予防的または治療的な免疫性を惹起するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ５０： ５０７〜５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞を、それらの典型的な形状に基づいて（インサイチューにおいては星状であり、インビトロでは目に見える明らかな細胞質の突起（樹状突起）を有する）、および、標準アッセイを用いて決定される、Ｂ細胞の分化マーカー（ＣＤ１９およびＣＤ２０）、Ｔ細胞の分化マーカー（ＣＤ３）、単球の分化マーカー（ＣＤ１４）、およびナチュラルキラー細胞の分化マーカー（ＣＤ５６）の欠如に基づいて同定できる。樹状細胞は、当然のことながら、インビボまたはエクスビボにおいて、樹状細胞上では一般に見出されない特定の細胞表面受容体またはリガンドを発現するよう操作されうり、そのように修飾された樹状細胞は、本発明によって意図されるものである。樹状細胞の代替物として、分泌小胞抗原充填樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ ｄｅｎｄｒｉｃ ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）を、ワクチン内にて使用することができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４：５９４〜６００）。
【００５４】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血または任意の他の適切な組織もしくは体液から得られる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαなどのサイトカインの組み合わせを、末梢血から収集された単球の培養物にエクスビボにおいて加えることにより、樹状細胞を分化させることが可能である。または、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／もしくは、樹状細胞の成熟および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを培養媒質に加えることにより、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞を、樹状細胞に分化させることができる。
【００５５】
樹状細胞は便宜上、「未熟な」細胞および「成熟した」細胞に分類されており、それにより、２つの十分特徴付けられた表現型の識別が簡単になる。しかし、この命名法は、全ての潜在的な分化の中間段階を除外するものと解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、Ｆｃγ受容体、マンノース受容体およびＤＥＣ−２０５マーカーの高発現と相関する、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられる。成熟表現型は、これらのマーカーは低発現であるが、Ｉ型およびＩＩ型のＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）、ならびに共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６）などの、Ｔ細胞活性化の原因となる細胞表現分子は高発現であることにより、典型的には特徴付けられる。ＡＰＣがＤＮＡを取り込み、細胞表面上にて発現されるポリペプチドまたはその免疫原性部分を発現できるように、ＡＰＣを、本発明のミクロスフェア中にカプセル化されたポリヌクレオチドと組み合わせることができる。そのようなトランスフェクションは、エクスビボにて行われうり、本明細書において記載されるように、そのようなトランスフェクションされた細胞を含む組成物またはワクチンを、その後、治療目的のために使用することができる。または、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルを患者に投与してもよく、その結果、インビボにおけるトランスフェクションが起こる。インビボおよびエクスビボにおける樹状細胞のトランスフェクションは、例えば、国際公開公報第９７／２４４４７号において記載されるもの、またはマーヴィ（Ｍａｈｖｉ）ら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５：４５６〜４６０に記載された遺伝子銃アプローチなどの、当技術分野において既知の任意の方法を用いて一般に行われうる。樹状細胞の抗原充填は、カプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡと共に樹状細胞または前駆細胞をインキュベートすることによって達成できる。Ｔ細胞の援助を提供する免疫学的パートナー（例えば担体分子）を用いて、樹状細胞を感作してもよい。
【００５６】
組成物の投与
治療法には、予防および治療が含まれる。予防または治療は、一回または複数の時点における、単回の直接注射によって達成できる。また投与を、ほぼ同時に複数部位に対して行うことができる。患者または被験者には、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、およびヒツジなどの哺乳動物が含まれる。好ましくは、患者または被験者はヒトである。
【００５７】
組成物はインビボにおいて典型的に、非経口（例えば、静脈内、皮下、および筋内）経路を介して、または、口腔内／舌下、直腸、経口、点鼻、局所的（経皮用および眼性など）、膣、肺、動脈内、腹腔内、眼内、または鼻内の経路などの、その他の従来的な直接経路を介して投与され、あるいは特定の組織へ直接投与される。筋内投与が好ましい。
【００５８】
本発明の状況において、患者に投与される用量は、経時的に患者において有益な治療反応をもたらすのに十分、または、感染もしくは感染による疾患を阻害するのに十分でなければならない。したがって、特定の抗原に対する有効な免疫応答を惹起するのに十分な量、ならびに／または、疾患または感染由来の症状および／もしくは合併症を緩和、軽減、治癒もしくは少なくとも部分的に停止もしくは少なくとも部分的に予防するのに十分な量の組成物が患者に投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療的に有効な用量」と定義される。
【００５９】
産生される組成物の活性、および患者の状態、ならびに治療される患者の体重または体表面積によって、用量が決定されると考えられる。用量サイズはまた、特定の患者における特定の組成物の投与に伴う、任意の有害副作用の存在、性質、および程度によっても決定されると考えられる。疾患の治療または予防において投与されるべき組成物の有効量の決定の際、医師は、病原体に対する免疫応答の発生、疾患の進行、および任意の治療関連性の毒性について評価することを必要とする。
【００６０】
免疫細胞を含む組成物を、その組成物が投与される被験者から得られる免疫細胞から調製するのが好ましい。または、免疫細胞を、ＨＬＡ適合性ドナーから調製することができる。免疫細胞は、当技術分野において既知の従来技術を用いて被験者またはドナーから得られ、本発明のエピトープを提示するように修飾されたＡＰＣに曝露され、エクスビボにおいて増殖し、被験者に投与される。エクスビボ治療のためのプロトコールは、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、１９９０、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ． Ｍｅｄ． ９：５７０〜５７８において記載されている。
【００６１】
本明細書において記載されるように、インビトロにおける増殖による養子免疫療法のために十分な量の免疫細胞を一般に得ることが可能である。単一の抗原特異的エフェクター細胞を、インビボにおける抗原認識を保持したまま数十億個まで増殖させるための培養条件は、当技術分野においてはよく知られている。そのようなインビトロの培養条件では典型的に、しばしば（ＩＬ−２などの）サイトカインおよび非分裂フィーダー細胞の存在下において、抗原による間欠的な刺激が用いられる。上記のように、免疫療法のために十分な数の細胞を産生するために、本明細書において提供される免疫反応性ポリペプチドを用いて抗原特異的Ｔ細胞培養物を富栄養化して迅速に増殖させることができる。特に、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞および／またはＢ細胞などの抗原提示細胞を、免疫反応性ポリペプチドで感作できる、または、当技術分野において既知の標準技術を用いて１つまたは複数のポリヌクレオチドでトランスフェクションできる。例えば、抗原提示細胞を、組み換えウイルスまたはその他の発現系における発現増加のために適したプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクションできる。治療において使用するための培養エフェクター細胞は、増殖および広範な分布が可能でなければならず、かつ、インビボにおいて長期間生存できなければならない。ＩＬ−２添加抗原を用いた反復刺激によって、インビボにおいて増殖し、かつ実質的な数が長期間生存するように、培養エフェクター細胞を誘導できることが、研究によって示された（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５７：１７７を参照のこと）。
【００６２】
本明細書において記載された、またはさもなくば当技術分野において既知の多くの投与経路を介した投与は、針、カテーテルまたは関連装置を用いた、一回または複数の時点における直接的な投与によって、簡単に達成されうる。
【００６３】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するために、および当業者がこれを作製および使用することを助けるために示される。本実施例は、本発明の範囲を特に制限することを決して意図するものではない。
【００６４】
実施例１：ＰＬＧミクロスフェア中にカプセル化されたＤＮＡは、ＣＴＬ反応を生じる
本実施例は、所望のインビトロ特性を有するＤＮＡ ＰＬＧミクロスフェア製剤について説明する。特に、そのＤＮＡ内容物を１週間に渡って放出することが可能な直径１μｍ〜１０μｍのミクロスフェアを、高いカプセル化率（６０％〜８０％）およびＤＮＡ超らせん状態の高い保持率（７０％）をもたらすような過程を用いて調製した。マウスにおいてこれらのミクロスフェアが、感染性疾患（結核）および癌の双方に関するタンパク質抗原をコードするプラスミドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を生じることを見出したら、最も強く最も安定したＣＴＬ反応を生じる原因となる要因を解明するために一連の実験を行った。筋内および腹腔内における免疫化が、免疫化の最も有効な経路であった。ミクロスフェア再懸濁緩衝液も重要なパラメータであることが見出され、ＰＢＳは塩非含有緩衝液と比べてＣＴＬ反応を阻害した。さらに、幾つかのアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）アジュバントが、これらのＤＮＡミクロスフェアと共にＣＴＬ反応を増強することが見出された。
【００６５】
材料および方法
二重乳剤技術（Ｊ．Ｈ． Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２８：２８７〜２９４、１９９１；Ｓ． Ｃｏｈｅｎら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ、８：７１３〜７２０、１９９１）の変法を用いて、抗原性タンパク質をコードするＤＮＡを含むＰＬＧミクロスフェアが調製された。特に、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ ｍＭ；ｐＨ ８）中のプラスミドＤＮＡ（１０ ｍｇ〜３０ ｍｇ）、エタノール０．３８ ｍｌを組み合わせ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ ｍＭ；ｐＨ ８）を用いて、容積を５．１ ｍｌまで調整した。これは内部（水）相である。１２００ ｍｇのポリ（ラクチド−コ−グリコリド）重合体を、１３．９ ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させ、氷上に置いた。内部水性相をＰＬＧ溶液に加え、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザーを用いて、氷上に置いたまま３０ ｍｌシリンジ中で２０秒間混合し、一次乳剤（油中水型）を形成した。二次乳剤は、氷上で、１．４％ カルボキシメチルセルロース（ｗ／ｖ）または加工媒質２８０ ｍｌを含むビーカーに一次乳剤を添加し、氷上に置いたままＳｉｌｖｅｒｓｏｎミキサーで４５００ ｒｐｍにて７５秒間混合することにより調製した。二次乳剤を約５リットルのＭｉｌｉＱ水を用いて希釈し、その後、ミクロスフェアからジクロロメタンを抽出してミクロスフェアを硬化するために、オーバーヘッドスターラーを用いて約２０分間混合した。
【００６６】
得られたミクロスフェアを、ＭｉｌｉＱ水および遠心分離法を用いて２〜３回洗浄した。洗浄後、濃縮ミクロスフェアにマンニトールを加え、凍結および凍結乾燥した。凍結乾燥されたミクロスフェアをその後、サイズ分布、ＤＮＡ含量（コア充填（ｃｏｒｅ−ｌｏａｄｉｎｇ）；この値から、カプセル化率が計測された）、放出速度、およびカプセル化されたＤＮＡの超らせん含量についてアッセイした。
【００６７】
粒子サイズ決定は、ＭＩＥ光散乱を用いて行われた。コア充填は、塩化メチレン中にミクロスフェアを溶解し、水性緩衝液を用いてＤＮＡを抽出することにより決定された。その後、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光アッセイを用いてＤＮＡ濃度を測定した。アガロースゲルのデジタルＵＶ画像解析によって、プラスミドの形態を決定した。本研究においては２つのプラスミド、一方は結核抗原ＴｂＨ９をコードするもの、およびもう一方は乳癌抗原Ｈｅｒ−２／ｎｅｕをコードするものを使用した。
【００６８】
水性緩衝液中に分散されたＤＮＡミクロスフェアを用いてマウスを免疫化した。２週間間隔をあけて３×２０μｇによりマウスを免疫化することによって、筋内、腹腔内および皮下を含む幾つかの投与経路について試験を行った。過去の研究では、複数回の免疫化およびより高用量のカプセル化ＤＮＡによって、より強いＣＴＬ反応が得られることが示された。選択されたアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸アジュバントとミクロスフェアとの組み合わせは、１０μｇのアジュバントと共に、最適以下の（ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ）免疫化スケジュールを用いることによって、すなわちＰＢＳ中に分散されたカプセル化ＤＮＡの１０μｇの単回用量を用いることによって調べられた。最後に、ＰＢＳまたは塩化ナトリウム非含有リン酸緩衝液（ＰＢ）のいずれかの中に分散されたカプセル化ＤＮＡの１０μｇの単回用量をマウスに投与することにより、再懸濁緩衝液の影響を調べた。
【００６９】
マウスから収集された脾細胞を用いて、ＣＴＬ反応を測定した。関心対象の抗原でトランスフェクションしたＡＰＣ系を用いた免疫脾細胞の培養によって、ＣＴＬ系を作製した。系を一週間毎に刺激し、インビトロにおける刺激の６日後、標準クロム５１放出アッセイにおいてＣＴＬ活性を評価した。
【００７０】
結果
本過程によって、小型で（直径約１μｍ〜１０μｍ）、放出速度が迅速で、カプセル化率が高く（４０％〜８０％）、かつ超らせんＤＮＡのの保持に優れたミクロスフェアが得られた。３３％を上回るミクロスフェア内容物が、インビトロにおいて、３７℃にて４８時間後に放出された；５０％を上回る内容物が、４日後に放出された；かつ７０％を上回る内容物が、７日後に放出された。ミクロスフェアから抽出されたプラスミドについての超らせんＤＮＡ対ニックＤＮＡの比率は、入力ＤＮＡの比の５０％を上回った。
【００７１】
図１は、本発明のＤＮＡミクロスフェアの、小型で多孔性という性質を示す、走査型電子顕微鏡写真である。ミクロスフェアは、多孔性に加え、高い表面積対体積比、および特徴的な短い拡散距離を有し、それらが、カプセル化されたＤＮＡの１０日間に渡る比較的迅速な放出を容易にしている。バーは５μｍを表し、倍率は３，０００×である。
【００７２】
図２は、本発明に従って製剤化されたＤＮＡミクロスフェアの典型的な粒子サイズ分布を示すグラフである。ミクロスフェアの直径は１μｍ〜１０μｍの範囲に渡り、このため、抗原提示細胞によって貪食されるのに十分適したものとなっている。
【００７３】
図３Ａは、ミクロスフェア製剤において使用されるＤＮＡ量（ｍｇ）の関数としてカプセル化率を示すグラフである。
【００７４】
図３Ｂは、製剤において使用されるＤＮＡ量（ｍｇ）の関数としてミクロスフェアのコア充填を示すグラフである。ＤＮＡ量の増加に伴う、コア充填における直線的な増加により、カプセル化率が約７２％で本質的に一定に維持される可能性が示唆される。約１．２％のコア充填においてミクロスフェアはＤＮＡで飽和されており、より多くの量のＤＮＡを加えるとカプセル化率が低くなる。
【００７５】
図４は、カプセル化されていないＤＮＡ（レーン２）およびＰＬＧミクロスフェアから抽出されたＤＮＡ（レーン３〜８）のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。レーン１は、分子量マーカーを含む。ＤＮＡの最小のニック形成（上方のバンド）は、ミクロスフェアの調製中に生じた。具体的には、デンシトメーター解析により測定されたように、カプセル化および抽出の後、初期ＤＮＡの超らせん含量の８１％（±３％）が保持されていた。裸のＤＮＡの８９％、および、カプセル化され抽出されたＤＮＡの７２％が超らせん状態にあった。
【００７６】
図５は、本発明のミクロスフェアを用いた、１０日間に渡る、ＤＮＡ放出速度を示すグラフである。データは、時間（日数）の関数として、ＤＮＡ放出率（％）としてプロットされる。ミクロスフェア製剤はＤＮＡを比較的迅速に放出し、ほぼ全てのＤＮＡが１０日目までに放出された。そのような速い放出速度は、部分的には、ミクロスフェア内におけるＤＮＡの分解がより長期間に渡って起こらないということによって、遅い放出（例えば３０＋日）よりも有利である。
【００７７】
図６は、ＰＢＳ中に再懸濁されたカプセル化Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＤＮＡ ２０μｇを用いた免疫化に２週間の間隔で３回供されたマウス由来の培養Ｔ細胞の、細胞溶解活性を示すグラフである。細胞溶解活性は、標準５１Ｃｒアッセイを用いて測定された。データは、エフェクター：標的の比率の関数として、溶解率（％）としてプロットされる。マウスを腹腔内（丸）、筋内（三角）、または皮下（四角）にて免疫化した。黒および白の記号は、特異的または非特異的な標的をそれぞれ表す。各群は５個体のマウスを含み、反応の平均が示されている。腹腔内および筋内における免疫化の双方で、一貫してより強い反応が生じた一方、皮下における免疫化では、典型的にはより弱い反応が生じた。
【００７８】
図７は、ＴｂＨ９ ＤＮＡの１０μｇ単回用量を筋内にて与えられたマウス由来の培養Ｔ細胞の細胞溶解活性を示すグラフである。細胞溶解活性は、標準５１Ｃｒアッセイを用いて測定された。データは、エフェクター：標的の比率の関数として、特異的な溶解率（％）としてプロットされる。マウスには、ＤＮＡミクロスフェア単独（下方の丸）、ＡＧＰアジュバント１０μｇを加えたＤＮＡミクロスフェア（５１７、５２７、５４７および５６８という印が付けられた線）、裸のＤＮＡ（下方の四角）または生理食塩水（下方の三角）が投与された。各群はマウス４個体を含み、反応の平均が示される。この最適以下の免疫化スケジュール（即ち、ＰＢＳを緩衝液として用いた１×１０μｇによる免疫化）下において、裸のＤＮＡ、またはミクロカプセル化されたＤＮＡ単独のいずれかを用いて免疫化されたマウス群は、実質的なＣＴＬ反応を生じなかった。対照的に、ＡＧＰ−５６８、ＡＧＰ−５１７、またはＡＧＰ−５４７と組み合わせたミクロスフェアを用いて免疫化されたマウスは、強いＣＴＬ反応を生じることができた。ＡＧＰ−５２７は、本アッセイにおいては抑制性であると考えられた。
【００７９】
図８は、ＤＮＡミクロスフェアに関連して評価された、アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）の分子構造を示す。これらの合成分子は、エナンチオ選択的過程を用いて調製された。
【００８０】
図９は、ＰＢＳ（三角）、または塩化ナトリウム非含有等張リン酸緩衝液（丸）のいずれかに再懸濁されたＴｂＨ９ ＤＮＡの１０μｇ単回用量を与えられたマウス由来の培養Ｔ細胞の、細胞溶解活性を示すグラフである。四角は生理食塩水を用いて免疫化されたマウスを示す。細胞溶解活性は、標準５１Ｃｒアッセイを用いて測定された。データは、エフェクター：標的の比率の関数として、特異的な溶解率（％）としてプロットされる。各群はマウス４個体を含み、反応の平均が示される。この最適以下の免疫化スケジュール（即ち、１×１０μｇによる免疫化）下において、ＰＢＳ中に分散した、ミクロカプセル化されたＤＮＡを用いて免疫化されたマウス群は、実質的なＣＴＬ反応を生じなかった。対照的に、等張リン酸緩衝液（即ち、塩化ナトリウム非含有）中に分散したミクロスフェアを用いて免疫化されたマウスは、強いＣＴＬ反応を生じた。
【００８１】
ミクロスフェアの基本的な特性を実質的に変化させることなく、上記に記載された過程に対する多数の改変が行われた。これらの改変は以下を含む。
【００８２】
内部水相：
エタノール含量を、０％から７５％（ｖ／ｖ）まで変化させた。容積を、０．１ ｍｌから６．６ ｍｌまで変化させた。ＱＳ２１を含むアジュバントが加えられた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む安定化剤が添加された。
【００８３】
ＤＮＡ：
ＤＮＡ量を、１ ｍｇから６０ ｍｇまで変化させた。内部水相におけるＤＮＡ濃度を、０．２ ｍｇ／ｍｌから１２ ｍｇ／ｍｌまで変化させた。プラスミドのサイズを、約３ ｋｂから約９ ｋｂの間で変化させた。ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＴｂＨ９などの、プラスミドによってコードされる抗原もまた変化させた。
【００８４】
重合体：
ＰＬＧ重合体上の末端基を、エステル末端基とカルボン酸末端基の間で変化させた。ＰＬＧ重合体の分子量を、約８ ｋＤａから６５ ｋＤａまで変化させた。いくつかの場合において、陽イオン脂質（ＤＯＴＡＰ）を重合体溶液に加え、０．５ ｍｇから５ ｍｇまで変化させた。ＰＬＧ重合体の量を、１５０ ｍｇから３０００ ｍｇの間で変化させた。ＭＰＬを含むアジュバントが、重合体溶液に加えられた。
【００８５】
溶媒：
溶媒を、ジクロロメタン、クロロホルムおよび酢酸エチルの間で変化させた。内部水容積の溶媒容積に対する比率を、０．０１から０．４８まで変化させた。ＰＬＧの溶媒に対する濃度比を、１１から２１７の間で変化させた。
【００８６】
安定化剤：
加工媒質中における安定化剤を、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および、ＣＭＣとＰＶＡの混合物の間で変化させた。加工媒質中の安定化剤の含量を、１％と５％の間で変化させた。陽イオン脂質（ＤＯＴＡＰ）を安定化剤に加えた。
【００８７】
混合条件：
３０ ｍｌのシリンジおよび２０ ｍｌのシリンジの両方を、一次乳剤のための混合容器として試験した。Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎミキサー上の様々な混合ヘッドについても試験を行った。
【００８８】
要約
放出が迅速で、効率が高く、多孔性の、１μｍ〜１０μｍのＤＮＡミクロスフェア製剤を開発し、試験を行った。２つの抗原、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＴｂＨ９に対するＣＴＬ反応が、これらのＤＮＡミクロスフェアを用いて生じた。さらに、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕまたはＴｂＨ９ ＤＮＡ免疫化によって作製されたＴ細胞が、対応する抗原を発現しているヒト腫瘍を認識し、殺すことが示された。筋内および腹腔内の経路は、ＣＴＬ惹起のために最適であることが証明された。幾つかのＡＧＰは、ＤＮＡミクロスフェアに実質的なＣＴＬアジュバント活性を提供した。塩化ナトリウムは、ＤＮＡミクロスフェアに対するＣＴＬ発生を阻害した。
【００８９】
実施例２：ＡＧＰアジュバントはＤＮＡミクロスフェアの有効性を増強する
本実施例においては、水性製剤中のＡＧＰ１０μｇを、ＰＢＳ懸濁液中のＰＬＧミクロスフェアの中にカプセル化された１０μｇのＤＮＡに加えた。二重乳剤技術、ＣＭＣ 安定化剤および「５．１」法を使用し、５０３Ｈ重合体を用いてミクロスフェアを調製し、直径約１μｍ〜１０μｍのミクロスフェアを得た。４個体のＣ５７Ｂ１／６マウス群において、ミクロスフェアを筋内に注射した。免疫化の３〜４週間後、脾臓を収集し、単一細胞懸濁液に加工した。ＴｂＨ９遺伝子を安定に発現しているＥＬ−４細胞を用いて、脾細胞をインビトロにて刺激した。標準プロトコールによってＣＴＬ活性をアッセイした。新しい脾細胞をまた、５μｇ／ｍｌの組み換えＴｂＨ９を用いてインビトロにて刺激し、ＩＦＮ−γの分泌について、ＥＬＩＳＡによって上清をアッセイした。ＡＧＰアジュバントが、ミクロスフェア中にカプセル化されたＤＮＡによりコードされる抗原に対する、アジュバントなしで生じるものを上回る、強い細胞性免疫応答を提供できることが結果により示された。
【００９０】
図１０は、ＰＬＧミクロスフェア中にカプセル化されたＴｂＨ９ ＤＮＡをＡＧＰと共に用いた免疫化の３〜４週間後に、マウスから収集された脾細胞を用いてアッセイされた、組み換えＴｂＨ９を用いたインビトロ刺激に応答したＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【００９１】
図１１は、ＡＧＰを加えたＰＬＧミクロスフェア中にカプセル化されたＴｂＨ９ ＤＮＡを用いて免疫化されたマウスから収集された脾細胞の、ＴｂＨ９遺伝子を安定に発現するＥＬ−４細胞を用いた、インビトロにおける単回刺激後の平均ＣＴＬ活性を示すグラフである。グラフは、生理食塩水（黒菱形）、裸のＤＮＡ（濃い四角）、ＤＮＡ−ＰＬＧ（下方の三角）、および、ＡＧＰ−５１７（薄い×）、ＡＧＰ−５２２（星印）、ＡＧＰ−５２５（丸）、ＡＧＰ−５２７（＋）、ＡＧＰ−５２９（点線）、ＡＧＰ−５４０（−）、ＡＧＰ−５４４（白菱形）、ＡＧＰ−５４７（薄い四角）、ＡＧＰ−５５７（上方の三角）、またはＡＧＰ−５７８（濃い×）を加えたＤＮＡ−ＰＬＧを含む、免疫化条件に関する、エフェクター：標的の比率の関数として、特異的溶解率の平均を示す。
【００９２】
図１２Ａは、ＴｂＨ９ ＤＮＡ−ＰＬＧ単独（白四角）、ＡＧＰ−５２７（黒四角）、ＡＧＰ−５４４（濃い菱形）、ＡＧＰ−５５７（黒丸）との併用、または裸のＤＮＡ（白丸）もしくは生理食塩水（三角）を用いて免疫化されたマウスに由来する脾細胞の、インビトロにおける第２回目の刺激後の平均ＣＴＬ活性を示す。
【００９３】
図１２Ｂは、ＴｂＨ９ ＤＮＡ−ＰＬＧとＡＧＰ−５１７（黒四角）、ＡＧＰ−５４７（濃い菱形）、ＡＧＰ−５６８（濃い三角）との併用、または裸のＤＮＡを用いて（×）免疫化されたマウスに由来する脾細胞の、インビトロにおける第２回目の刺激後の平均ＣＴＬ活性を示す。
【００９４】
実施例３：カプセル化されたＤＮＡにより、サルにおいて惹起された免疫応答
本実施例は、裸のＴｂＨ９−ＶＲ１０１２ ＤＮＡ、または本発明に従って調製されたミクロスフェア内にカプセル化されたＴｂＨ９−ＶＲ１０１２ ＤＮＡのいずれかを用いた、１ヶ月間隔の３回の免疫化の後、アカゲザルにおいて惹起された免疫応答を説明する。プラスミド ３．３ ｍｇおよびＲＣ５２７−ＡＦ ４０μｇからなる裸のＤＮＡを用い、皮内および筋内の経路によって免疫化を行った。プラスミド ３ ｍｇおよびＲＣ ５６８−ＡＦ ５０μｇからなるミクロスフェアＤＮＡは、筋内にて送達された。各群には４個体が含まれた。図１３から１５において示される結果により、ミクロスフェア中にカプセル化されたＤＮＡが、裸のＤＮＡを用いた場合に見出されたものよりも強い免疫応答を惹起したことが示されている。
【００９５】
図１３Ａ〜図１３Ｂは、ミクロスフェア中にカプセル化され、筋内に投与され（図１３Ａ）、または裸のＤＮＡとして皮内または筋内経路を経て送達された（図１３Ｂ）、ＴｂＨ９を用いた第３回目の免疫化の４週間後における、アカゲザルのＴｂＨ９に対する血清抗体価を示すグラフである。各グラフにおいて示された４つの線は、個々の被験者を表す。
【００９６】
図１４は、生理食塩水、組み換えＴｂＨ９（ｒＴｂＨ９）、ＴｂＨ９をコードする裸のＤＮＡ、またはＴｂＨ９をコードするＤＮＡをカプセル化するミクロスフェアを用いた、第３回目の免疫化の４週間後における、サルのＰＢＭＣからの、抗原誘導性のγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の産生を示す棒グラフである。個々のバーは、個々の被験者を示す。
【００９７】
図１５Ａ〜図１５Ｂは、ＴｂＨ９をコードする、ミクロカプセル化された（図１５Ａ）または裸の（図１５Ｂ）ＤＮＡを用いた第３回目の免疫化の２ヶ月後における、サルのＣＴＬ反応を示すグラフである。特異的な溶解率（％）は、エフェクター：標的の比率の関数としてプロットされる。丸は、ＴｂＨ９標的細胞を表す。対照標的には、非感染細胞（四角）、および、非特異的標的であるＥＧＦＰ（蛍光タンパク質）細胞（三角）が含まれる。
【００９８】
当業者には、前述の説明において開示される概念および特定の態様が、本発明の同じ目的を実行するためにその他の態様を改変または設計するための基礎として容易に利用されうることが理解されよう。当業者にはまた、そのような同等の態様が、添付の特許請求の範囲に記載された、本発明の精神および範囲から逸脱しないことが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤＮＡミクロスフェアの、小型で多孔性という性質を示す、走査型電子顕微鏡写真である。ミクロスフェアは、多孔性に加え、高い表面積対体積比、および特徴的な短い拡散距離を有し、それらが、カプセル化されたＤＮＡの１０日間に渡る比較的迅速な放出を容易にしている。バーは５μｍを表し、倍率は３，０００×である。
【図２】本発明に従って製剤化されたＤＮＡミクロスフェアの典型的な粒子サイズ分布を示すグラフである。ミクロスフェアの直径は１μｍ〜１０μｍの範囲に渡り、このため、抗原提示細胞によって貪食されるのに十分適したものとなっている。
【図３Ａ】ミクロスフェア製剤において使用されるＤＮＡ量（ｍｇ）の関数としてカプセル化率を示すグラフである。
【図３Ｂ】製剤において使用されるＤＮＡ量（ｍｇ）の関数としてミクロスフェアのコア充填を示すグラフである。ＤＮＡ量の増加に伴う、コア充填における直線的な増加により、カプセル化率が約７２％で本質的に一定に維持される可能性が示唆される。約１．２％のコア充填においてミクロスフェアはＤＮＡで飽和されており、より多くの量のＤＮＡを加えるとカプセル化率が低くなる。
【図４】カプセル化されていないＤＮＡ（レーン２）およびＰＬＧミクロスフェアから抽出されたＤＮＡ（レーン３〜８）のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。レーン１は、分子量マーカーを含む。ＤＮＡの最小のニック形成（上方のバンド）は、ミクロスフェアの調製中に生じた。具体的には、デンシトメーター解析により測定されたように、カプセル化および抽出の後、初期ＤＮＡの超らせん含量の８１％（±３％）が保持されていた。裸のＤＮＡの８９％、および、カプセル化され抽出されたＤＮＡの７２％が超らせん状態にあった。
【図５】本発明のミクロスフェアを用いた、１０日間に渡る、ＤＮＡ放出速度を示すグラフである。データは、時間（日数）の関数として、ＤＮＡ放出率（％）としてプロットされる。ミクロスフェア製剤はＤＮＡを比較的迅速に放出し、ほぼ全てのＤＮＡが１０日目までに放出された。そのような速い放出速度は、部分的には、ミクロスフェア内におけるＤＮＡの分解がより長期間に渡って起こらないということによって、遅い放出（例えば３０＋日）よりも有利である。
【図６】ＰＢＳ中に再懸濁されたカプセル化Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ ＤＮＡ ２０μｇを用いた免疫化に２週間の間隔で３回供されたマウス由来の培養Ｔ細胞の、細胞溶解活性を示すグラフである。細胞溶解活性は、標準５１Ｃｒアッセイを用いて測定された。データは、エフェクター：標的の比率の関数として、溶解率（％）としてプロットされる。マウスを腹腔内（丸）、筋内（三角）、または皮下（四角）にて免疫化した。黒および白の記号は、特異的または非特異的な標的をそれぞれ表す。各群は５個体のマウスを含み、反応の平均が示されている。腹腔内および筋内における免疫化の双方で、一貫してより強い反応が生じた一方、皮下における免疫化では、典型的にはより弱い反応が生じた。
【図７】ＴｂＨ９ ＤＮＡの１０μｇ単回用量を筋内にて与えられたマウス由来の培養Ｔ細胞の細胞溶解活性を示すグラフである。細胞溶解活性は、標準５１Ｃｒアッセイを用いて測定された。データは、エフェクター：標的の比率の関数として、特異的な溶解率（％）としてプロットされる。マウスには、ＤＮＡミクロスフェア単独（下方の丸）、ＡＧＰアジュバント１０μｇを加えたＤＮＡミクロスフェア（５１７、５２７、５４７および５６８という印が付けられた線）、裸のＤＮＡ（下方の四角）または生理食塩水（下方の三角）が投与された。各群はマウス４個体を含み、反応の平均が示される。この最適以下の免疫化スケジュール（即ち、ＰＢＳを緩衝液として用いた１×１０μｇによる免疫化）下において、裸のＤＮＡ、またはミクロカプセル化されたＤＮＡ単独のいずれかを用いて免疫化されたマウス群は、実質的なＣＴＬ反応を生じなかった。対照的に、ＡＧＰ−５６８、ＡＧＰ−５１７、またはＡＧＰ−５４７と組み合わせたミクロスフェアを用いて免疫化されたマウスは、強いＣＴＬ反応を生じることができた。ＡＧＰ−５２７は、本アッセイにおいては抑制性であると考えられた。
【図８Ａから図８Ｄ】ＤＮＡミクロスフェアに関連して評価された、アミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）の分子構造を示す。これらの合成分子は、エナンチオ選択的過程を用いて調製された。
【図９】ＰＢＳ（三角）、または塩化ナトリウム非含有等張リン酸緩衝液（丸）のいずれかに再懸濁されたＴｂＨ９ ＤＮＡの１０μｇ単回用量を与えられたマウス由来の培養Ｔ細胞の、細胞溶解活性を示すグラフである。四角は生理食塩水を用いて免疫化されたマウスを示す。細胞溶解活性は、標準５１Ｃｒアッセイを用いて測定された。データは、エフェクター：標的の比率の関数として、特異的な溶解率（％）としてプロットされる。各群はマウス４個体を含み、反応の平均が示される。この最適以下の免疫化スケジュール（即ち、１×１０μｇによる免疫化）下において、ＰＢＳ中に分散した、ミクロカプセル化されたＤＮＡを用いて免疫化されたマウス群は、実質的なＣＴＬ反応を生じなかった。対照的に、等張リン酸緩衝液（即ち、塩化ナトリウム非含有）中に分散したミクロスフェアを用いて免疫化されたマウスは、強いＣＴＬ反応を生じた。
【図１０】ＰＬＧミクロスフェア中にカプセル化されたＴｂＨ９ ＤＮＡをＡＧＰと共に用いた免疫化の３〜４週間後に、マウスから収集された脾細胞を用いてアッセイされた、組み換えＴｂＨ９を用いたインビトロ刺激に応答したＩＦＮ−γ分泌（ｐｇ／ｍｌ）を示す棒グラフである。
【図１１】ＡＧＰを加えたＰＬＧミクロスフェア中にカプセル化されたＴｂＨ９ ＤＮＡを用いて免疫化されたマウスから収集された脾細胞の、ＴｂＨ９遺伝子を安定に発現するＥＬ−４細胞を用いた、インビトロにおける単回刺激後の平均ＣＴＬ活性を示すグラフである。グラフは、生理食塩水（黒菱形）、裸のＤＮＡ（濃い四角）、ＤＮＡ−ＰＬＧ（下方の三角）、および、ＡＧＰ−５１７（薄い×）、ＡＧＰ−５２２（星印）、ＡＧＰ−５２５（丸）、ＡＧＰ−５２７（＋）、ＡＧＰ−５２９（点線）、ＡＧＰ−５４０（−）、ＡＧＰ−５４４（白菱形）、ＡＧＰ−５４７（薄い四角）、ＡＧＰ−５５７（上方の三角）、またはＡＧＰ−５７８（濃い×）を加えたＤＮＡ−ＰＬＧを含む、免疫化条件に関する、エフェクター：標的の比率の関数として、特異的溶解率の平均を示す。
【図１２】Ａは、ＴｂＨ９ ＤＮＡ−ＰＬＧ単独（白四角）、ＡＧＰ−５２７（黒四角）、ＡＧＰ−５４４（濃い菱形）、ＡＧＰ−５５７（黒丸）との併用、または裸のＤＮＡ（白丸）もしくは生理食塩水（三角）を用いて免疫化されたマウスに由来する脾細胞の、インビトロにおける第２回目の刺激後の平均ＣＴＬ活性を示す。Ｂは、ＴｂＨ９ ＤＮＡ−ＰＬＧとＡＧＰ−５１７（黒四角）、ＡＧＰ−５４７（濃い菱形）、ＡＧＰ−５６８（濃い三角）との併用、または裸のＤＮＡを用いて（×）免疫化されたマウスに由来する脾細胞の、インビトロにおける第２回目の刺激後の平均ＣＴＬ活性を示す。
【図１３】ミクロスフェア中にカプセル化され、筋内に投与され（図１３Ａ）、または裸のＤＮＡとして皮内または筋内経路を経て送達された（図１３Ｂ）、ＴｂＨ９を用いた第３回目の免疫化の４週間後における、アカゲザルのＴｂＨ９に対する血清抗体価を示すグラフである。各グラフにおいて示された４つの線は、個々の被験者を表す。
【図１４】生理食塩水、組み換えＴｂＨ９（ｒＴｂＨ９）、ＴｂＨ９をコードする裸のＤＮＡ、またはＴｂＨ９をコードするＤＮＡをカプセル化するミクロスフェアを用いた、第３回目の免疫化の４週間後における、サルのＰＢＭＣからの、抗原誘導性のγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の産生を示す棒グラフである。個々のバーは、個々の被験者を示す。
【図１５】ＴｂＨ９をコードする、ミクロカプセル化された（図１５Ａ）または裸の（図１５Ｂ）ＤＮＡを用いた第３回目の免疫化の２ヶ月後における、サルのＣＴＬ反応を示すグラフである。特異的な溶解率（％）は、エフェクター：標的の比率の関数としてプロットされる。丸は、ＴｂＨ９標的細胞を表す。対照標的には、非感染細胞（四角）、および、非特異的標的であるＥＧＦＰ（蛍光タンパク質）細胞（三角）が含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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