(57)【要約】本発明はユビキチンリガーゼの新規な基質ターゲッティングサブユニットをコードするヌクレオチドの発見、同定および特性決定に関する。本発明はユビキチンリガーゼの新規な基質ターゲッティングサブユニット：FBP1、FBP2、FBP3、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、ＦBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24およびFBP25をコードするヌクレオチド、トランスジェニックマウス、ノックアウトマウス、宿主細胞発現系、ならびに本発明のヌクレオチドによりコードされるタンパク質を包含する。本発明は癌、重症の日和見感染、免疫障害、特定の心血管疾患および炎症性疾患などの増殖性および分化性疾患の治療のため、新規なユビキチンリガーゼの活性を調節する小分子、化合物または新規なユビキチンリガーゼの誘導体および類似体などの可能性のある治療薬を同定するために新規な基質ターゲッティングサブユニットを用いるスクリーニングアッセイに関する。本発明はさらに、増殖性疾患の治療のため、ユビキチンリガーゼおよびそれらの基質をターゲッティングするようデザインされた治療プロトコルおよび医薬組成物を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性および分化性疾患の治療に有用な化合物のスクリーニング方法であって、化合物を、Skp2およびp27とCks1の一方または双方を発現する細胞または細胞抽出物に接触させ、Skp2の活性における変化を検出することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
Skp2の活性における変化が、Skp2とp27またはCks1のいずれかとの相互作用における変化を検出することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Skp2の活性における変化が、p27のユビキチン化またはp27もしくはCks1の分解における変化を検出することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
増殖性および分化性疾患の治療に有用な化合物のスクリーニング方法であって、Skp2およびp27とCks1の一方または双方を含有する精製系に化合物を加え、Skp2の活性における変化を検出することを含んでなる、上記方法。
【請求項５】
Skp2の活性における変化が、Skp2とp27またはCks1のいずれかとの相互作用における変化を検出することにより検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Skp2の活性における変化が、p27のユビキチン化またはp27もしくはCks1の分解における変化を検出することにより検出される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
増殖性および分化性疾患の治療に有用な化合物のスクリーニング方法であって、187位にホスホトレオニンを含む、または含まない配列NAGSVEWTPKKPGLRRRQTを有するヒトp27鎖のカルボキシ末端に相当するポリペプチドおよびCks1の一方または双方およびSkp2を含有する精製系に化合物を加え、Skp2の活性における変化を検出することを含んでなる、上記方法。
【請求項８】
Skp2の活性における変化が、Skp2と前記ポリペプチドまたはCks1のいずれかとの相互作用における変化を検出することにより検出される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Skp2の活性における変化が、前記ポリペプチドのユビキチン化または前記ポリペプチドもしくはCks1の分解における変化を検出することにより検出される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は2001年1月5日出願の米国出願第60/260,179号に対して35 U.S.C.§119 (e)の下に優先権を主張するものであり、その内容を全て参照により本明細書に組み入れるものとする。
【０００２】
1.  緒言
本発明はユビキチンリガーゼの新規な基質ターゲッティングサブユニットをコードするヌクレオチド配列の発見、同定および特性決定に関する。本発明はユビキチンリガーゼの新規な基質ターゲッティングサブユニット：FBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP17、FBP18、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23およびFBP25をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、トランスジェニックマウス、ノックアウトマウス、宿主細胞発現系ならびに本発明のヌクレオチドによりコードされるタンパク質を包含する。本発明は癌、重症な日和見感染、免疫障害、特定の心血管疾患および炎症性疾患などの増殖性および分化性疾患の治療のため、新規なユビキチンリガーゼの活性を調節する小分子、化合物または新規なユビキチンリガーゼの誘導体および類似体などの可能性のある治療薬を同定するスクリーニングアッセイに関する。本発明はさらに、増殖性障害の治療のため、ユビキチンリガーゼおよびそれらの基質をターゲッティングするようデザインされた治療プロトコルおよび医薬組成物を包含する。
【背景技術】
【０００３】
2.  発明の背景
2.1  細胞周期調節タンパク質
真核生物の細胞周期は、それらの活性がサイクリンと呼ばれる調節サブユニットとの会合を必要とすることから、サイクリン依存性キナーゼ(Cdk)と呼ばれるセリン/トレオニンタンパク質キナーゼファミリーによって調節される(Hunter & Pines, 1994, Cell 79: 573)。Cdkはまた、種々の抗増殖シグナルに応答して細胞周期の休止を媒介するCdk阻害剤(Cki)とも会合する。それらの配列相同性に基づく限り、哺乳類細胞においては2つのCkiファミリーが確認されており、p21、p27およびp57が含まれるCip/Kipファミリーと、p15、p16、p18およびp20が含まれるInkファミリーである(Sherr & Roberts, 1999, Genes & Dev. 13: 1501)。
【０００４】
2.2  ユビキチン経路
ユビキチンにより媒介されるタンパク質分解はp27、p53、p300、サイクリン、E2F、STAT-1、c-Myc、c-Jun、EGF受容体、IkBα、NFkBおよびβ-カテニンをはじめとする多くの細胞調節タンパク質の定期的破壊を制御する非リソソーム型タンパク質分解の重要な経路である(Pagano, 1997, FASEB J. 11:1067に総説)。ユビキチンは全ての真核細胞に豊富に存在する進化上高度に保存された76アミノ酸のポリペプチドである。このユビキチン経路はポリユビキチン鎖の標的基質への共有結合をもたらし、その後これは多触媒性プロテオソーム複合体によって分解される(最近の総説としてはPagano, 前掲を参照)。タンパク質のユビキチン化を調節する多数の工程が知られている。まず、ユビキチン活性化酵素(E1)がユビキチンとの高エネルギーのチオエステルを形成し、これが次に多くのユビキチン結合酵素(UbcsまたはE2s)のうちの１つの反応性システイン残基へと転移される。最後にユビキチンが標的タンパク質の反応性リジン残基のe-アミノ基へと転移するが、これはユビキチンリガーゼ(E3)タンパク質を必要とするまたは必要としない反応において起こる。多数のユビキチンリガーゼが高レベルの基質特異性を確保する。
【０００５】
2.3  ユビキチン経路およびFボックスタンパク質によるG1期の調節
数種の生物での遺伝的・生化学的研究により、細胞周期のG1期はユビキチン経路によって調節されることが示されている。サイクリン、Ckiおよび他のG1調節タンパク質のタンパク質分解は、酵母では、ユビキチン結合酵素Ubc3(Cdc34とも呼ばれる)により、また、3つのサブユニット：Cdc53、Skp1および多数のFボックスタンパク質のうちの1つによって形成されるE3 ユビキチンリガーゼにより制御されている (E. Pattonら, 1998, TIG. 14:6に総説)。Fボックスタンパク質(FBP)はモチーフFボックスを含むためそう呼ばれているが、Fボックスは最初にサイクリンFで確認され、Skp1とのFBP相互作用に必要である(Baiら, 1996, Cell 86:263)。さらに、Fボックスタンパク質はまた、WD-40ドメインまたはロイシンに富む反復配列(LRR)タンパク質-タンパク質相互作用ドメインのいずれかを含む。Cdc53(CulAとも呼ばれる)およびSkp1は、それぞれ異なるFボックスタンパク質を含む少なくとも3つの明らかに区別されるE3の形成に関与すると考えられる。これらのリガーゼはSkp1、Cul AおよびFボックスタンパク質を含む類似のタンパク質モジュールであることから、SCFと呼ばれている。これらのリガーゼとその基質との相互作用はFボックスサブユニットを介して起こる。S.セレビシエ(S. cerevisiae)においてこれまでに同定された3種のSCFは、SCFCdc4(Fボックスタンパク質Cdc4を介する基質として、Ckis Sic1およびFar1、複製因子Cdc6、ならびに転写アクチベーターGcn4を動員する)、SCFGrr1(Fボックスタンパク質GRR1を介する基質としてのG1サイクリンClnlおよびCln2を動員する)、およびSCFMet30(Fボックスタンパク質MET30を介する基質としてのG1サイクリンCln3を動員する；最近の総説としてはPaganoおよびPatton,前掲を参照)である。
【０００６】
細胞周期によって調節されるサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)阻害剤であるヒトCkip27の細胞内レベルは主として分解によって調節され、ユビキチン系がp27の分解を制御していることが知られている(Paganoら, 1995, Science 269:682)。同様に、他のG1ヒト調節タンパク質(サイクリンE、サイクリンD1、p21、E2F、β-カテニン)の分解はユビキチン経路によって制御される(M. Pagano,前掲に総説)。しかし、G1調節タンパク質の分解に関与する特定の酵素はまだ確認されていない。S.セレビシエculAに相同な6つの遺伝子(CUL1、2、3、4a、4bおよび5)のファミリーがESTデータベースを検索することによって同定されている(Kipreosら, 1996, Cell 85:829)。ヒトSkp1およびFボックスタンパク質Skp2(5つのLRRを含む)はin vivoにおいてサイクリンAと会合した2つのタンパク質として同定されていることから、S期キナーゼ会合タンパク質1および2と呼ばれる(Zhangら, 1995, Cell 82:915)。リン酸化されたp27はSkp2によって特異的に認識されることが証明されている。Skp1およびSkp2はまた、Cul-1およびROC1/Rbx1と会合してSCFユビキチンリガーゼ複合体、SCFSkp2ユビキチンリガーゼ複合体を形成することも分かっている。いくつかの研究により、p27はSCFSkp2ユビキチンリガーゼ複合体による分解のターゲットとなることが確立されているが、この分解に関与する鍵となる因子は不明であった。種々のカリン(cullin)に連結される、高度に保存されたユビキチン様タンパク質Nedd8がp27の連結反応に必要な成分であるとの仮説が出されている(Podustら, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:4579)。
【０００７】
細胞周期調節タンパク質の高度に保存されたSuc1(Cdc2の突然変異のサプレッサー/Cks(サイクリン依存性キナーゼサブユニット)ファミリーは、いくつかのサイクリン依存性キナーゼおよびリン酸化タンパク質と結合し、細胞周期の進行に不可欠である。Suc1(Haylesら, 1986, Mol. Gen. Genet. 202:291)およびCks1(Hadwigerら, 1989, Mol. Cell Biol. 9:2034)は、それぞれ分裂酵母および発芽酵母で、サイクリン依存性キナーゼと相互作用する必須の遺伝子産物として発見されたものである。異なる生物種に由来する相同体は広範な配列の保存を示し、2つのヒト相同体は発芽酵母においてCks1と機能上置換が可能である(Richardsonら, 1990, Genes and Dev. 4:1332)。2つのヒト相同体と分裂酵母Suc1の結晶構造は、Cdk触媒サブユニットとの結合に関与する4重鎖β-シートを共有することを示した(Bourneら, 1996, Cell 84:863; Pines, J., 1996, Curr. Biol. 11:1399)。さらに、それらはCks-Cdk複合体のCdk触媒部位と連続した表面上に位置する高度に保存されたリン酸結合部位を共有する(Bourneら, 1996, Cell 84:863)。
【０００８】
Cksタンパク質は、G1からS期への遷移、有糸分裂の開始、および有糸分裂の停止をはじめとする、いくつかの細胞周期遷移に関与するが(Pines, J., 1996, Curr. Biol. 11:1399)、それら種々の作用の分子的基礎は十分には理解されていない。発芽酵母由来のCln2/Cln3-Cdk1複合体がCks1によって活性化される(Reynardら, 2000, Mol. Cell Biol. 20:5858)ことを除けば、Cksタンパク質はサイクリン依存性キナーゼの触媒活性に直接影響を及ぼさない。しかし、Cksタンパク質はサイクリン依存性キナーゼによるいくつかの基質の多重部位リン酸化を促進することができる。部分的にリン酸化されたタンパク質とCdkとに同時に結合することで、Cksタンパク質は基質に対する該キナーゼの親和性を高め、ゆえにその後の多重リン酸化を加速する(Pines, J., 1996, Curr. Biol. 11:1399)。実際、Cksタンパク質は、シクロソーム/APCのサブユニット(Patra, D. & Dunphy, W. G., 1998, Genes Dev. 12:2549; Shteinberg, M. & Hershko, A., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:12)、ならびにCdc25、Myt1およびWee1などのG2/Mレギュレーター(Patraら, 1999, J. Biol. Chem. 274:36839)のCdkにより触媒される多重リン酸化を促進する。
【０００９】
2.4  癌および他の増殖性疾患におけるユビキチン経路の脱調節
癌は細胞増殖が速すぎる場合に発症する。細胞増殖は正のシグナルと負のシグナルの正味のバランスによって決定される。正のシグナルが優っている場合または負のシグナルが存在しない場合には細胞増殖が速くなり過ぎて癌が発症する。
【００１０】
通常の細胞はいずれのタンパク質の量も厳密に制御しており、過剰のあるいは望ましくないタンパク質を排除する。このため、細胞はユビキチンと呼ばれる長鎖の分子により望ましくないタンパク質を特異的にタグ付けしている。これらの分子は次にプロテアソームと呼ばれる複合体によって認識され、破壊される。しかし、腫瘍ではこのメカニズムが全て異常となり、正のシグナル(発癌タンパク質)の過剰な蓄積に至るか、あるいは負のレギュレーター(腫瘍抑制タンパク質)の異常な分解が起こる。このように腫瘍抑制タンパク質が存在しないか、または発癌タンパク質の存在が多すぎる場合は、細胞がとどまることなく増殖し、腫瘍が生じる(Ciechanover, 1998, EMBO J. 17:7151 ; Spataro, 1998, Br. J. Cancer 77:448)。例えば、ユビキチンにより媒介されるp53腫瘍抑制タンパク質の異常な分解(J. BrownおよびM. Pagano, 1997, Biochim. Biophys. Acta 1332:1)、推定上の癌遺伝子であるβ-カテニン(Peifer, 1997, Science 275:1752)、およびCki p27(Ciechanover,上記; Spataro, 上記; Lloyd, 1999, Am. J. Pathol. 154:313)は腫瘍発生に関係しており、ユビキチン化される酵素をコードするいくつかの遺伝子が腫瘍においては突然変異している可能性があるとの仮説につながる。
【００１１】
初期の証拠により、ヒトF-ボックスタンパク質は、それらの相同体が酵母で同様に挙動するように、G1調節タンパク質のユビキチン化においてある役割を果たすことが示される(下記参照)。細胞周期調節タンパク質の抑制されない分解がある種の癌で認められており、脱調節ユビキチンリガーゼが細胞周期レギュレーターの改変された分解において何らかの役割を果たすと考えられる。十分理解されている例は、ユビキチンリガーゼMdm2のそれであり、その過剰発現はその基質である腫瘍抑制タンパク質p53の低レベルを誘導する。
【発明の開示】
【００１２】
3.  発明の概要
本発明は、新規なFボックスタンパク質、ならびに、増殖性および分化性疾患の治療のためにその新規なFボックスタンパク質およびFボックスタンパク質とその基質との相互作用をターゲッティングするようデザインされた治療プロトコルおよび医薬組成物に関する。本発明はまた、新規なFボックスタンパク質の基質を同定するため、また、新規なユビキチンリガーゼおよびユビキチンリガーゼとその基質との相互作用を調節またはターゲッティングする薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイに関する。本発明はさらに、既知のFボックスタンパク質Skp2、E2Fおよびp27の2つの新規な基質など、既知のFボックスタンパク質の新規な基質の同定に基づくスクリーニングアッセイに関する。本発明のスクリーニングアッセイは、増殖性または分化性疾患、およびFボックスタンパク質の発現または酵素活性のレベルに関連するその他の疾患を治療しうる可能性のある治療薬を同定するために用いることができる。
【００１３】
本発明は、一部には、本発明者らが、Fボックスモチーフを有する新規なユビキチンリガーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発見し、同定し、特性決定づけたことに基づくものである。本明細書に記載されるユビキチンリガーゼ複合体の26の新規な基質ターゲッティングサブユニット、FBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25が、ユビキチンリガーゼ複合体の成分とのそれらの相互作用に基づいて(FBP1、FBP2、FBP3a、FBP4、FBP5、FBP6およびFBP7)、あるいはDNAデータベースに存在するヌクレオチド配列とこれらのタンパク質との配列比較によって(FBP3b、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25)、最初に同定された。ユビキチンリガーゼ複合体のこれらの新規な基質ターゲッティングサブユニットは各々Fボックスモチーフを含み、これを介してそれらがユビキチンリガーゼ複合体の他の成分と相互作用する。さらに、これらFBPの一部はWD-40ドメインおよびLRR(それらと基質との相互作用に関与すると思われる)を含むが、他のFBPはロイシンジッパー、リングフィンガー、ヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフ、プロリンに富むモチーフ、およびSH2ドメインなど、FBPにおいてはまだ確認されていない、可能性のあるタンパク質-タンパク質相互作用モジュールを含む。本発明はまた、一部には、FBP特異的基質p27およびβ-カテニンの本発明者らによる発見および同定、ならびに、新規なFBP基質を同定する方法に基づくものである。新規なFボックスタンパク質をコードする遺伝子のいくつかはまた、乳癌、前立腺癌および卵巣癌、鼻咽頭および小細胞肺癌、胃肝癌、バーキットリンパ腫および副甲状腺癌で変異していることが多い染色体部位にマッピングされた。最後に、本発明はまた、一部には、本発明者らによる、野生型またはドミナントネガティブ型のFBPタンパク質を発現するトランスジェニックマウスの作出、およびFBSノックアウトマウスの作出に基づくものである。
【００１４】
本発明は以下のヌクレオチド配列、かかるヌクレオチド配列を発現する宿主細胞、およびかかるヌクレオチド配列の発現産物を包含する：(a)哺乳類FBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP17、FBP18、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、およびFBP25をコードするヌクレオチド配列(ヒトヌクレオチドを含む)、ならびにそれらの遺伝子産物；(b)ユビキチンリガーゼ複合体の新規な基質ターゲッティングサブユニットの部分をコードするヌクレオチド、および、かかるヌクレオチドによって特定されるポリペプチド産物、例えば、Fボックスモチーフ、基質結合ドメイン、WD-40ドメイン、およびロイシンに富む反復配列などを含むがこれらに限らない、；(c)ドメインの全部または一部が欠失または変異している新規なユビキチンリガーゼの突然変異体をコードするヌクレオチド、および、かかるヌクレオチド配列によって特定されるポリペプチド産物；(d)別のポリペプチドに融合された新規なユビキチンリガーゼまたはそのドメインの1つを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド。
【００１５】
本発明はさらに、ユビキチンリガーゼ複合体の新規な基質ターゲッティングサブユニットのアゴニストおよびアンタゴニストを包含し、これらには、例えば、天然Fボックス結合タンパク質と競合する小分子、大分子、変異体、および抗体、ならびにユビキチンリガーゼ遺伝子発現の阻害に使用できるヌクレオチド配列(例えばアンチセンスおよびリボザイム分子、ならびに遺伝子調節または置換構築物)またはユビキチンリガーゼ遺伝子発現の亢進に使用できるヌクレオチド配列(例えばユビキチンリガーゼ遺伝子が強力なプロモーター系の制御下にある発現構築物)が含まれる。また、本発明は、ユビキチンリガーゼトランスジーンを発現するトランスジェニック動物または新規なユビキチンリガーゼを発現しないノックアウト動物を包含する。
【００１６】
さらにまた本発明は、ユビキチンリガーゼ活性を調節する、すなわち、ユビキチンリガーゼのアゴニストまたはアンタゴニストとして働く化合物を同定するための、ユビキチンリガーゼ複合体の新規な基質ターゲッティングサブユニットの遺伝子および／または遺伝子産物の使用方法に関する。かかる化合物は増殖性または分化性疾患、例えば癌を抑制する薬剤として使用できる。特に本発明は、β-カテニンとFBP1、またはp27とSkp2の間の相互作用を阻害する方法を包含する。実際、これらの相互作用を遮断することができる薬剤を用いて、細胞の増殖および／または成長を調節することが可能である。
【００１７】
なおさらに本発明は、増殖性または分化性疾患の可能性のある治療薬としての新規リガーゼの活性を調節するユビキチンリガーゼ複合体の新規な基質ターゲッティングサブユニットの誘導体または類似体を同定するためのスクリーニング法を包含する。本発明は、Fボックスモチーフのような、FBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24およびFBP25またはその誘導体、断片もしくはドメインをはじめとする、ユビキチンリガーゼ複合体の新規な成分と相互作用するタンパク質のスクリーニング法を提供する。本発明によれば、これらのスクリーニング法では、ファージディスプレイアッセイまたは酵母ツーハイブリッドアッセイ系あるいはその変法を含めて、タンパク質-タンパク質相互作用を同定する公知のアッセイを利用することができる。
【００１８】
さらに、本発明は、増殖性疾患などのFBP関連疾患の診断評価、遺伝子試験および／または予後のためにFBP遺伝子配列および／またはFBP遺伝子産物の配列を利用する方法に向けられる。例えば本発明はFBP関連疾患、例えば増殖性疾患の診断方法に関し、かかる方法は患者のサンプルにおけるFBP遺伝子発現を測定するか、またはかかる疾患を示すと予想される哺乳類ゲノムにおいて、かかる疾患の存在または発生・進行に関係するFBP突然変異を検出することを含んでなる。特に本発明は、被験者(例えばヒト患者)に、(i)図3〜28のパートAに示されるタンパク質をコードするFBP遺伝子の突然変異、またはその相同体；(ii)FBP遺伝子の誤発現；(iii)FBPタンパク質の誤発現；のうちの1以上を特徴とする疾患のリスクがあるかどうかを決定する方法を包含する。
【００１９】
本発明はユビキチンリガーゼ複合体の新規な基質ターゲッティングサブユニットの同定および特性決定を実証する実施例によって説明される。本発明の実施例はさらに、(i)FBP1とβ-カテニンとの特異的相互作用、ならびに(ii)既知のFBPであるSkp2と、細胞周期調節タンパク質E2Fおよびp27ならびに細胞周期タンパク質Cks1との特異的相互作用の同定を実証する。これらの相互作用から、β-カテニンはFBP1の特異的基質であるが、E2Fおよびp27はSkp2の基質であり、Cks1はSkp2およびp27のメディエーターであることが示唆される。実際、本発明の実施例はさらに、β-カテニンがFBP1の特異的基質であり、p27はSkp2の基質であり、Cks1はp27とSkp2の双方に結合することを示す。新規なFBPと相互作用するタンパク質の同定は、本明細書に記載の方法を用いて、あるいは異なるアプローチによっても可能である。
【００２０】
3.1  定義
本明細書において「F-ボックスモチーフ」とは、F-ボックス含有タンパク質とSkp1との相互作用に必要であることが確認された、およそ40アミノ酸のストレッチを指す。F-ボックスモチーフの共通配列は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるBaiら, 1996, Cell 86:263-274に記載されている。
【００２１】
本明細書において「F-ボックスタンパク質」(FBP)とは、F-ボックスモチーフを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【００２２】
FBPはユビキチンリガーゼ複合体の基質ターゲッティングサブユニットであるが、本明細書において「ユビキチンリガーゼ」とは、F-ボックスモチーフを含み、かつSkp1と相互作用するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。
【００２３】
本明細書において「FBP遺伝子産物と機能的に同等」とは、内因性FBP遺伝子産物の少なくとも1つの生物活性を示す遺伝子産物を指す。例えば、機能的に同等なFBP遺伝子産物はSkp1と相互作用してユビキチンリガーゼ複合体と会合し得るものである。このような ユビキチンリガーゼ複合体はサイクリンまたはckiタンパク質などの特異的細胞周期調節タンパク質をユビキチン化することができる。
【００２４】
本明細書において「ターゲッティングする」とは、遺伝子発現、酵素活性もしくは他の細胞内因子との相互作用を阻害、遮断もしくは回避することを意味する。
【００２５】
本明細書において「治療薬」とは、増殖性疾患または関連疾患を軽減するか、その治療を助けるいずれかの分子、化合物または処置剤を指す。
【００２６】
本明細書において「WD-40ドメイン」、「ロイシンに富む反復配列」「ロイシンジッパー」、「リングフィンガー」、「ヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフ」および「SH2ドメイン」とは、タンパク質-タンパク質相互作用の媒介に関与する可能性のあるドメインを指す。「WD-40ドメイン」とは、トリプトファンおよびアスパラギン酸残基に富み、三量体Gタンパク質のβサブユニットに共通して見られる40アミノ酸反復の共通配列を指す(参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるNeerら, 1994 Nature 371:297-300およびその中の参考文献参照)。「LRR」すなわち「ロイシンに富む反復配列」はタンパク質-タンパク質相互作用の媒介に関与することも知られているロイシンが豊富な配列である(参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるKobe & Deisenhofer, 1994, Trends. Biochem. Sci. 19:415-421参照)。「ロイシンジッパー」ドメインとは、転写因子の大きなファミリーに存在し、7番目の位置ごとにロイシン残基を含むアミノ酸のストレッチを含むドメインを指す(Landshultzら, 1988, Science 240:1759-64参照、また、Sudolら, 1996, Trends Biochem. 21:1-3、およびKochら, 1991, Science 252:668-74も参照)。
【００２７】
4.  図面の説明
図１．  ヒトF-ボックスタンパク質FBP1(配列番号15)、FBP2(配列番号16)、FBP3a(配列番号17)、FBP3b(配列番号78)、FBP4(配列番号18)、FBP5(配列番号19)、FBP6(配列番号20)、FBP7(配列番号21)、Skp2(配列番号22)、FBP8(配列番号61)、FBP9(配列番号62)、FBP10(配列番号63)、FBP11(配列番号64)、FBP12(配列番号65)、FBP13(配列番号79)、FBP14(配列番号66)、FBP15(配列番号67)、FBP16(配列番号68)、FBP17(配列番号69)、FBP18(配列番号70)、FBP19(配列番号71)、FBP20(配列番号72)、FBP21(配列番号73)、FBP22(配列番号74)、FBP23(配列番号75)、FBP24(配列番号76)、FBP25(配列番号77)の保存されているF-ボックスアミノ酸残基のアライメント。ツーハイブリッドスクリーニング(囲み記号で示される)またはBLAST検索(十字記号で示される)によって同定されたFBPのF-ボックスを有するこれまでに知られているFBP、Skp2のF-ボックスのアライメントをClustal W法(MacVector(商標))を用いて行った後、手動調整を行った。少なくとも15のF-ボックスで同一の残基を濃いグレーの影で示し、類似の残基を薄いグレーの影で示す。1つの星印はcDNAにおいてポリAテールの前に停止コドンが存在することを示し、可能性のある全長クローンが2つの星印で示されている。図の下の星印はFBP3aで変異しているアミノ酸残基を示す(図29参照)。
【００２８】
図２．  FBPの模式図。ヒトFBPの推定上のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインが示されている(説明のための凡例枠を参照)。ツーハイブリッドスクリーニングによって同定されたFBPは囲み記号で示し、BLAST検索で同定されたFBPは十字記号で示す。ダブルスラッシュは対応するcDNAが5’末端では不完全であることを示し、星印はcDNAにおいてポリAテールの前に停止コドンが存在することを示す。
【００２９】
図3A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP1のアミノ酸配列(配列番号2)。B.対応するcDNA(配列番号1)。
【００３０】
図4A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP2のアミノ酸配列(配列番号4)。B.対応するcDNA(配列番号3)。
【００３１】
図5A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP3aのアミノ酸配列(配列番号6)。B.対応するcDNA(配列番号5)。
【００３２】
図6A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP3bのアミノ酸配列(配列番号24)。B.対応するcDNA(配列番号23)。
【００３３】
図7A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP4のアミノ酸配列(配列番号8)。B.対応するcDNA(配列番号7)。
【００３４】
図8A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP5のアミノ酸配列(配列番号10)。B.対応するcDNA(配列番号9)。
【００３５】
図9A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP6のアミノ酸配列(配列番号12)。B.対応するcDNA(配列番号11)。
【００３６】
図10A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP7のアミノ酸配列(配列番号14)。B.対応するcDNA(配列番号13)。
【００３７】
図11A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP8のアミノ酸配列(配列番号26)。B.対応するcDNA(配列番号25)。
【００３８】
図12A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP9のアミノ酸配列(配列番号28)。B.対応するcDNA(配列番号27)。
【００３９】
図13A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP10のアミノ酸配列(配列番号30)。B.対応するcDNA(配列番号29)。
【００４０】
図14A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP11のアミノ酸配列(配列番号32)。B.対応するcDNA(配列番号31)。
【００４１】
図15A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP12のアミノ酸配列(配列番号34)。B.対応するcDNA(配列番号33)。
【００４２】
図16A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP13のアミノ酸配列(配列番号36)。B.対応するcDNA(配列番号35)。
【００４３】
図17A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP14のアミノ酸配列(配列番号38)。B.対応するcDNA(配列番号37)。
【００４４】
図18A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP15のアミノ酸配列(配列番号40)。B.対応するcDNA(配列番号39)。
【００４５】
図19A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP16のアミノ酸配列(配列番号42)。B.対応するcDNA(配列番号41)。
【００４６】
図20A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP17のアミノ酸配列(配列番号44)。B.対応するcDNA(配列番号43)。
【００４７】
図21A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP18のアミノ酸配列(配列番号46)。B.対応するcDNA(配列番号45)。
【００４８】
図22A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP19のアミノ酸配列(配列番号48)。B.対応するcDNA(配列番号47)。
【００４９】
図23A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP20のアミノ酸配列(配列番号50)。B.対応するcDNA(配列番号49)。
【００５０】
図24A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP21のアミノ酸配列(配列番号52)。B.対応するcDNA(配列番号51)。
【００５１】
図25A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP22のアミノ酸配列(配列番号54)。B.対応するcDNA(配列番号53)。
【００５２】
図26A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP23のアミノ酸配列(配列番号56)。B.対応するcDNA(配列番号55)。
【００５３】
図27A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP24のアミノ酸配列(配列番号58)。B.対応するcDNA(配列番号57)。
【００５４】
図28A〜B．  A.ヒトF-ボックスタンパク質FBP25のアミノ酸配列(配列番号60)。B.対応するcDNA(配列番号59)。
【００５５】
図29．  FBPはそれらのF-ボックスを介してSkp1と特異的に相互作用する。FBSのcDNA(野生型および変異型)はin vitro(IVT)にて35S-メチオニンの存在下で転写および翻訳された。同量のIVTタンパク質(各レーンの上に示されている)に対して、ヒスチジンタグ付けSkap1(レーン1、3、4、6〜10、12、15、17、19および21)、ヒスチジンタグ付けエロンギンC(レーン2、5、11、14、16、18、19および22)、またはヒスチジンタグ付けp27(レーン12)のいずれかを予め結合させたニッケルアガロースビーズを用いて、ヒスチジンタグ付けプルダウンアッセイを行った。結合したIVTタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって分析した。パネルの左側の矢印は示されたFBPを指す。タンパク質標準の見かけの分子量をパネルの右側に示してある。
【００５６】
図30．  FBP1、FBP2、FBP3a、FBP4およびFBP7はin vivoにて内因性Skp1およびCul1との新規なSCFを形成する。HeLa細胞を、Flagタグ付き型のFBP1(レーン1)、(ΔF)FBP1(レーン2)、FBP4(レーン3)、FBP7(レーン5)、FBP2(レーン7)、(ΔF)FBP2(レーン8)、FBP3a(レーン9)、(ΔF)FBP3a(レーン10)をコードする哺乳類発現プラスミド、または空のベクター(レーン4および6)でトランスフェクトした。細胞を溶解し、抽出物に対してウサギ抗Flag抗体による免疫沈降を行った(レーン1〜8)。次に免疫沈降物を示されたようなマウス抗Cul1モノクローナル抗体、ウサギ抗Skp1ポリクローナル抗体またはウサギ抗Cul2ポリクローナル抗体を用いて免疫ブロットした。最後のレーンは非トランスフェクトHeLa細胞由来の抽出物25μgを含み、レーン9はマーカーとして用いた組換えCul1、Skp1、またはCul2タンパク質を含む。Cul1およびCul2に対する抗体で検出された移動の遅いバンドは、すでに酵母カリンCdc53および哺乳類Cul4aについて記載されたように、ユビキチン様分子のこれら2種のカリンへの共有結合によって生じる可能性がある。
【００５７】
図31．  FBP1、FBP2、FBP3a、FBP4およびFBP7はユビキチンリガーゼ活性と会合する。HeLa細胞はヒトSkp1、CullおよびFlagタグ付き型のFBP1(レーン3)、(ΔF)FBP1(レーン4)、FBP2(レーン2および5)、(ΔF)FBP2(レーン6)、FBP7(レーン7)、FBP3a(レーン8および13)、(ΔF)FBP3a(レーン9)、無関連のFlagタグ付きタンパク質(Irf3、レーン10)、FBP4(レーン11および12)をコードする哺乳類発現プラスミドで、または空のベクター(レーン1)でトランスフェクトした。細胞を溶解し、抽出物に対してウサギ抗Flag抗体による免疫沈降を行った。免疫沈降物を精製組換えE1およびUbc4(レーン1〜11)またはUbc2(レーン12および13)ならびにビオチン化ユビキチンを含有する反応混合物の存在下でインキュベートした。レーン2の反応物はまたNEMを含んでいた。ユビキチン化タンパク質はHRP-ストレプトアビジンでのブロッティングにより可視化した。パネルの左側の括弧はその反応で生じたユビキチン化タンパク質の塗抹（スミア）をマークし、星印は煮沸に抵抗するE1と結合したユビキチンを示す。
【００５８】
図32．  FBPの細胞下局在。HeLa細胞をFlagタグ付き型のFBP1(a-b)、FBP2(c-d)、FBP3a(e-f)、FBP4(g-h)、(ΔF)FBP2(I-j)、または(ΔF)FBP3a(k-l)をコードする哺乳類発現プラスミドでトランスフェクトした。24時間後、細胞に対してウサギ抗Flag抗体による免疫蛍光を行ってFBPを染色し(a、c、e、g、I、k)、ビスベンズイミドによって核を染色した(b、d、f、h、j、l)。
【００５９】
図33．  ヒト組織におけるFBP転写物の存在量。種々のヒト組織に由来する電気泳動分画されたポリ(A)+mRNAを含有する膜をFBP1、FBP2、FBP3a、FBP4、SKP2およびβ-アクチンcDNAから調製した特異的プローブとハイブリダイズさせた。図面の左側の矢印は本明細書に記載の主要な転写物を指す。
【００６０】
図34A〜E．  FBP遺伝子のFISH局在。ゲノムプローブを含む精製ファージDNAをジゴキシゲニンdUTPで標識し、Cy3結合抗体を用いて検出した。ゲノムプローブの遺伝子座に対応するシグナル(赤)がDAPI-アクチノマイシンDで染色した正常ヒト染色体(青白)に対して示されている。パネルAはFBP1の10q24への局在を示し、BはFBP2の9q34への局在を示し、CはFBP3aの13q22への局在を示し、DはFBP4の5pl2への局在を示し、EはFBP5の6q25-26への局在を示す。矢印はFBP特異的FISHシグナルを示す。
【００６１】
図35A〜C．  FBP1はβ-カテニンと会合する。  A. β-カテニンを単独(レーン1)で、またはFlagタグ付きFBP1との組合せ(レーン2)で、発現するバキュロウイルス感染昆虫細胞からの抽出物を、ウサギ抗Flag抗体(rα-Flag)で免疫沈降(IP)させた後、示されたように抗Flag(mα-Flag)および抗β-カテニンマウス抗体で免疫ブロッティングした。レーン3および4は同じ抗体で免疫ブロッティングした感染昆虫細胞からの抽出物25μgを含む。  B. Skp1の不在下(レーン1〜3)または存在下(レーン4〜6)でサイクリンD1、Flag-FBP1を発現するバキュロウイルス感染昆虫細胞からの抽出物を、正常ウサギIgG(r-IgG、レーン1および4)、ウサギ抗Flag抗体(r-Flag、レーン2および5)、またはウサギ抗サイクリンD1抗体(r-D1、レーン3および6)で免疫沈降させた。次に、示されたように、免疫沈降物を抗Flag(mα-Flag)およびサイクリンD1(mα-D1)マウス抗体で免疫ブロッティングした。最後のレーンは同じ抗体で免疫ブロッティングした感染昆虫細胞からの典型的な抽出物25μgを含む。  C. 293細胞を、HAタグ付きβ-カテニンを単独で、またはFlagタグ付きFBP1もしくはFlagタグ付き(ΔF)FBP1のいずれかとの組合せで、コードする哺乳類発現プラスミドでトランスフェクトした。細胞を溶解し、抽出物に対してウサギ抗Flag抗体(rα-Flag、レーン4〜6)による免疫沈降を行い、示されたように、ラット抗HA(α-HA)およびマウス抗Flag(mα-Flag)抗体で免疫ブロッティングした。最初の3つのレーンは同じ抗体で免疫ブロッティングしたトランスフェクト293細胞からの抽出物25μgを含む。高レベルのβ-カテニン発現ベクターをトランスフェクションすると、β-カテニンとFBP1および(ΔF)FBP1との会合がβ-カテニンレベルとは無関係に測定された。
【００６２】
図36A〜B．  ドミナントネガティブ(ΔF)FBP1変異体によるβ-カテニンの安定化。  A. ヒト293細胞を、HAタグ付きβ-カテニンを単独で、またはFlagタグ付き(ΔF)FBP1もしくはFlagタグ付き(ΔF)FBP2のいずれかとの組合せでコードする哺乳類発現プラスミドによりトランスフェクトした。細胞を溶解し、示されたように、抽出物に対してラット抗HAおよびウサギ抗Flag(rα-Flag)抗体で免疫ブロッティングを行った。  B. β-カテニンターンオーバー速度のパルスチェイス解析。HAタグ付きβ-カテニンを空のベクター、FBP1、または(ΔF)FBP1と組み合わせて293細胞に同時トランスフェクトした。24時間後、細胞を35S-メチオニンで30分間標識し、示された時間にわたり培地でチェイスした。次に、抽出物に対してラット抗HA抗体による免疫沈降を行った。
【００６３】
図37A〜C．  リン酸化p27のSkp2への結合。  A. in vitro翻訳した[35S]FBPのパネルを、187位にホスホトレオニン(T*)を有するヒトp27のカルボキシ末端に相当するホスホペプチドNAGSVEQT*PKKPGLRRRQTと結合させたビーズを用いる結合反応に用いた。ビーズをRIPAバッファーで洗浄し、結合したタンパク質を溶出させ、電気泳動およびオートラジオグラフィーを行った(上のパネル)。下のパネル：10%のin vitro翻訳[35S]FBP投入。  B. HeLa細胞抽出物をホスホ-p27ペプチド(レーン2)、非リン酸化p27ペプチドであること以外は同じもの(レーン1)または17位にホスホチロシン(Y*)を有するヒトCdk4のアミノ末端ペプチドに相当する対照ホスホペプチドAEIGVGAY*GTVYKARDPHS(レーン3)と結合させたビーズとともにインキュベートした。ビーズをRIPAバッファーで洗浄し、結合したタンパク質を各パネルの左側に示すタンパク質に対する抗体による免疫ブロッティングに付した。HeLa抽出物の一部(25μg)を対照として用いた(レーン4)。Cul1における移動の遅いバンドは、すでに他のカリン48に関して記載されるように、ユビキチン様分子の共有結合によって生じると思われる。  C. in vitro翻訳[35S]野生型p27(WT、レーン1〜4)またはp27(T187A)変異体(T187A、レーン5〜6)１μlをキナーゼバッファー10μl中で30分間インキュベートした。示されているように、約2.5pmolの組換え精製サイクリンE/Cdk2または約1pmolのSkp2(Skp1/Skp2複合体)を加えた。次にサンプルを、Skp2に対する抗体が共有結合されているプロテインAビーズ6μlとともにインキュベートした。ビーズをRIPAバッファーで洗浄し、結合したタンパク質に対して電気泳動およびオートラジオグラフィーを行った。レーン1〜6：Skp2結合タンパク質；レーン7および8：7.5%のin vitro翻訳[35S]タンパク質投入。
【００６４】
図38．  in vivoにおけるSkp2のp27への結合。HeLa細胞 (レーン1〜2および5〜6)またはIMR90繊維芽細胞(レーン9〜10)からの抽出物を、種々のアフィニティー精製(AP)したSkp2に対する抗体、または精製した対照IgG画分で免疫沈降させた。レーン1：ヤギIgG(G-IgG)で免疫沈降させた抽出物；レーン2：N末端Skp2ペプチドに対するAPヤギ抗体(G-α-Skp2)で免疫沈降させた抽出物；レーン5および9：ウサギIgG(R-IgG)で免疫沈降させた抽出物；レーン6および10：Skp2に対するAPウサギ抗体(R-α-Skp2)で免疫沈降させた抽出物。免疫沈降物を、各パネルの左側に示したタンパク質に対する抗体で免疫ブロッティングした。下のパネルのレーン1〜4はホスホ部位p27特異的抗体で免疫ブロッティングした。レーン3、7および11は25μgの細胞抽出物を含み、レーン4、8および12はマーカーとして用いた関連の組換えタンパク質を含む。いくつかのマーカーの改変された移動は組換えタンパク質上のタグの有無によるものである。
【００６５】
図39A〜B．  Skp2およびサイクリンE/Cdk2複合体はG1抽出物におけるp27ユビキチン化の律速条件である。  A. p27のin vitroユビキチン連結(レーン1〜12および17〜20)および分解(レーン13〜16)は、非同調的に増殖するHeLa細胞からの抽出物(Asyn. ext.、レーン2〜3)または G1休止させたHeLa細胞からの抽出物(G1 ext.、レーン4〜20)を用いて行った。レーン1は抽出物を含まない。示されたように、組換え精製タンパク質を添加した。反応は野生型p27(レーン1〜18)またはp27(T187A)変異体(T187A、レーン19〜20)を用いて行った。レーン1〜8、9〜12および17〜20は3回の別個の実験のものである。パネルの左側の括弧はポリユビキチン化p27に相当する＞27,000のバンドのラダーをマークしたものである。星印はほとんどのサンプルに存在している非特異的バンドを示す。  B. 非同調HeLa細胞(レーン1)またはG1休止HeLa細胞(レーン2)からの抽出物におけるSkp2およびp27のレベルの免疫ブロット解析。
【００６６】
図40A〜C．  Skp2はp27-ユビキチン連結活性に必要である。  A. 免疫枯渇。非同調HeLa細胞からの抽出物を、処理しない(レーン2)か、あるいは免疫前血清(レーン3)、2μgの精製GSTで予備インキュベートした抗Skp2抗体(レーン4)、または2μgの精製GST-Skp2で予備インキュベートした抗Skp2 抗体(レーン5)を用いて免疫枯渇させた。レーン1は抽出物を含まない。サンプル(30μgタンパク質)をサイクリンE/Cdk2の存在下でp27のユビキチン化に関してアッセイした。パネルの左側の括弧はポリユビキチン化p27に相当する＞27,000のバンドのラダーをマークしたものである。星印は全てのサンプルに存在している非特異的バンドを示す。  B. 再構成。Skp2免疫枯渇抽出物におけるp27ユビキチン化活性の回復を、示された精製タンパク質を添加することにより調べた。サンプルは全て30μgのSkp2枯渇抽出物(Skp2-depl. ext.)およびサイクリンE/Cdk2を含んだ。  C. 免疫精製。非同調HeLa細胞からの抽出物を、ウサギ抗Skp2抗体(レーン3および5)または免疫前血清(PI、レーン2および4)で免疫沈降させた。全抽出物(レーン1)および免疫ビーズ(レーン2〜5)を、p27、組換え精製サイクリンE/Cdk2およびユビキチン化反応混合物とともに加えた。レーン4および5のサンプルには組換え精製E1およびUbc3を添加した。次に全てのサンプルをp27ユビキチン化に関してアッセイした。
【００６７】
図41A〜B．  p27分解におけるSkp2のin vivoでの役割。  A. in vivoにおけるドミナントネガティブ(ΔF)Skp2変異体によるp27の安定化。NIH-3T3細胞を、ヒトp27を単独で（レーン2）、あるいは(ΔF)Skp2(レーン3)、または(ΔF)FBP1(レーン4)のいずれかとの組合せで、コードする哺乳類発現ベクターでトランスフェクトした。レーン1：非トランスフェクト細胞。細胞を溶解し、抽出物に対してp27、Skp2またはFlag[Flagタグ付き(ΔF)FBP1を検出するため]による免疫ブロッティングを行った。外因性ヒトp27タンパク質は内因性マウスp27よりも移動が遅い。  B. p27ターンオーバー速度のパスルチェイス解析。ヒトp27を空のベクターまたは(ΔF)Skp2のいずれかと組み合わせてNIH-3T3細胞にトランスフェクトした。24時間後、細胞を[35S]-メチオニンで20分間標識し、示された時間にわたり培地でチェイスした。次に、抽出物に対してマウス抗p27抗体による免疫沈降を行った。
【００６８】
図42．  SKP2 mRNAをターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞性p27の安定化。HeLa細胞を、SKP2 mRNAの2つの異なる領域をターゲッティングする2つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチド(AS)で16〜18時間処理した。レーン2、6、12および16：N末端SKP2領域(NT)をターゲッティングするAS；レーン4および8：C末端SKP2領域(CT)をターゲッティングするAS；レーン1、3、5、7、11および15：対照オリゴデオキシヌクレオチド対(Ctrl)。レーン1〜4および5〜8は2回の別個の実験からのものである。レーン11〜12および15〜16：HeLa細胞をG1/S期に、それぞれヒドロキシ尿素またはアフィジコリン処理のいずれかを用いて24時間遮断した。次に細胞をオリゴデオキシヌクレオチドでトランスフェクトし、12時間後(細胞が再びG1期に入る前)に溶解し、Skp2(上のパネル)およびp27(下のパネル)に対する抗体で免疫ブロッティングした。レーン9および13：非トランスフェクトHeLa細胞；レーン10および14：トランスフェクト細胞と同様の薬物で処理した非トランスフェクトHeLa細胞。
【００６９】
図43A〜C．  p27分解過程でのSkp2作用のタイミング。  A. IMR90繊維芽細胞を血清枯渇によりG0/G1期で同調させ、血清で再活性化し、示された間隔でサンプリングした。タンパク質抽出物を示されたタンパク質に対する抗体で免疫ブロッティングすることにより分析した。Skp2二量線は、オカダ酸の存在下で細胞溶解を行ったときのみ12.5%ゲルで一貫して観察されたことから、これはリン酸化によって生じた可能性がある。  B. ノコダゾールにより有糸分裂において遮断されたHeLa細胞を振盪し、新鮮培地に放出し、示された時間間隔でサンプリングした。タンパク質抽出物を、示されたタンパク質に対する抗体で免疫ブロッティングすることにより分析した。  C. G1期(ノコダゾール遮断からの解放の3時間後)(レーン1)およびS期(ノコダゾール遮断からの解放の12時間後)(レーン2) HeLa細胞からの抽出物を、抗p27抗体(上の2つのパネル)または抗Skp2抗体(下の3つのパネル)のいずれかで免疫沈降させた後、示されたタンパク質に対する抗体で免疫ブロッティングした。
【００７０】
図44．  熱安定性因子はトリプシン作用に対して感受性である。熱処理画分1(約0.1 mg/ml)を37℃で60分間、0.6mg/mlのTPCK処理トリプシン(Sigma T8642)の不在下(レーン1)または存在下(レーン2)、50mM Tris-HCl(pH8.0)とともにインキュベートした。トリプシン作用は2mg/mlのダイズトリプシン阻害剤(STI)の添加により停止させた。レーン3では、トリプシンでの同様のインキュベーションの5分前にSTIを加えた。次に、約50ngの熱処理画分1に対応するサンプルをp27-ユビキチン連結の刺激に関してアッセイした。
【００７１】
図45A〜C．  熱安定性因子はNedd8ではなく、Nedd8によるCul-1の修飾の後に必要とされる。  A. 精製Nedd8はp27-ユビキチン連結の刺激における因子に取って代わるものではない。示された場合、約50ngの熱処理画分1または100ngの精製組換えヒトNedd8をp27-MeUb連結アッセイに加えた。  B. Nedd8のCul-1への連結。Cul-1/ROC1(3μl)を、Tris(pH7.6)、MgCl2、ATP、ホスホクレアチン、クレアチンホスホキナーゼ、DTT、グリセロールおよびSTIをp27-ユビキチン連結アッセイに関して記載したものと同じ濃度で含有する100μl反応混合物中、Nedd8(10μg)および精製Nedd8コンジュゲート酵素(20μl)とともにインキュベートした。Cul1/ROC1の対照調製物を、Nedd8コンジュゲート酵素を含まないこと以外は同じ条件下でインキュベートした。30℃で2時間インキュベートした後、対照サンプル(レーン1)またはNedd8修飾(レーン2)調製物を8%ポリアクリルアミド-SDSゲルで分離し、抗Cul-1抗体(Zymed)で免疫ブロッティングした。  C. Nedd8修飾Cul-1を含有するSCFSkp2複合体は、p27-ユビキチン連結のために画分1由来の因子をなおも必要とする。35S標識p27を細菌で発現させた精製p27(20ng)に置き換え、Cul-1/ROC1を2μgの非修飾またはNedd8修飾Cul-1/ROC1調製物に置き換えたこと以外は、p27-MeUb連結をアッセイした。インキュベーション(30℃、60分)後、サンプルを12.5%ポリアクリルアミド-SDSゲルで分離し、ニトロセルロースに移し、抗p27モノクローナル抗体(Transduction Laboratories)でブロッティングした。交差反応タンパク質を星印で示してある。
【００７２】
図46A〜B．  p27-ユビキチン連結に必要な因子の精製およびそのCks1としての同定。  A. ゲル濾過クロマトグラフィーによる精製の最終段階。MonoS工程からの活性物質のピークを、20mM Tris-HCl(pH7.2)、150mM NaCl、1mM DTTおよび0.1% Brij-35で平衡化したSuperdex 75 HR 10/30カラム(Pharmacia)に適用した。流速0.4ml/分で0.5mlサンプルを回収した。カラム画分を遠心分離限外濾過(Centricon-10, Amicon)により50μlの量まで濃縮した。カラム画分の0.004μlサンプルをp27-ユビキチン連結を刺激する活性に関してアッセイした。結果はホスホルイメージャーによって定量し、ユビキチンコンジュゲートに変換された35S-p27のパーセンテージとして表した。上の矢印は分子量マーカータンパク質の溶出位置(kDa)を示す。  B. Superdex 75カラムの示された画分に由来する25μlサンプルを16%ポリアクリルアミド-SDSゲルで分離したもの銀染色。右の数字は分子量マーカータンパク質の移動位置を示す(kDa)。
【００７３】
図47．  細菌で発現させたCks/Suclタンパク質は全てサイクロソーム/APCのCdc27サブユニットの多重リン酸化を刺激する。S期HeLa細胞由来のサイクロソームを部分精製し、500ユニットのSuc1フリーCdk1/サイクリンB(Shteinberg, M. & Hershko, A., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:12; Yudkovskyら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 271:299)とともにインキュベートした。示された場合、10ng/μlの対応するCks/Suc1タンパク質を添加した。これらのサンプルに対し、ヒトCdc27に対するモノクローナル抗体(Transduction Laboratories)による免疫ブロッティングを行った。
【００７４】
図48A〜B．  p27-ユビキチン連結に必要とされる因子のCks1としての同定。  A.35S-p27とMeUbとの連結をアッセイした。示された場合、画分1(5μgタンパク質)または熱処理した画分1(約50ng)を加えた。パネルの左側の括弧はポリユビキチン化p27に相当する＞27,000Daのバンドのラダーをマークしている。  B. Cks1(他のCksタンパク質はそうではない)はp27-ユビキチン連結に必要である。示された場合、以下のタンパク質を添加した：「因子」、p27ユビキチン化に必要とされる因子の精製の最終段階であるSuperdexカラムのピークに由来する0.02μlのプール画分#28〜29；「Cks1 IVT」、0.3μlのin vitro翻訳Cks1；「Cks2 IVT」、0.3μlのin vitro翻訳Cks2；「Retic. lys」、0.3μlの網膜赤血球溶解物翻訳混合物；Cks1、Cks2およびSuc1、2ngの対応する細菌発現・精製タンパク質。レーン3および4におけるin vitro翻訳した35S標識Cks1およびCks2は、ゲルから移動しきってしまったので見えない。
【００７５】
図49A〜D．  Cks1はリン酸化p27とSkp2の結合を増強する。  A. Cks1はCdk2/サイクリンEによるp27のリン酸化に影響しない。精製p27は、その混合物を20℃で示された時間インキュベートした差分だけリン酸化された。示された場合、2ngの精製Cks1を加えた。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーのためにサンプル1μlを取った。  B. Cks1はp27のリン酸化に続く段階で働く。32P精製p27を調製した。示された場合、0.02μlの「因子」(図1b、レーン2のように精製)または1ngの精製組換えヒトCks1を加えた。この精製系を用いて、本発明者らは、ジユビキチン化形態より大きいMeUbとのコンジュゲートを観察しなかった。これに対して、in vitro翻訳35S-p27を用いると4〜5のコンジュゲートが観察された(図1と比較)。おそらくユビキチンはp27の2つのLys残基とのみ連結し、より大きなコンジュゲートはMeUbを末端とする短いポリユビキチン鎖(網状赤血球溶解物に存在するユビキチンに由来)を含む可能性がある。  C. Cks1は、Thr-187のリン酸化に依存して、p27とSkp2/Skp1との結合を増強する。35S標識野生型(WT)またはThr-187-Ala変異体p27(T187A)とSkp2/Skp1との結合を測定した。示された場合、1ngの精製Cks1をインキュベーションに加えた。この投入は出発物質の5%を示す。  D. Cks1は32P-p27とSkp2/Skp1との結合を増強する。この実験は、35S-p27が32P標識精製p27に置き換えられたこと以外は、2cに記載のものと同様である。
【００７６】
図50A〜D．  Cks1とSkp2およびリン酸化p27との結合。  A. Cks1(Cks2はそうではない)はSkp2/Skp1と結合する。35S標識Cks1またはCks2とSkp2/Skp1との結合は、Cdk2/サイクリンE、ATPおよびATP調節系を省いたこと以外は、p27とSkp2/Skp1との結合に関して記載したものと同様の手順によってアッセイした。示された場合、1μlのSkp2/Skp1を加えた。  B. Cks1はSkp1とは結合しない。35S-Cks1とHis6-Skp1またはSkp2/His6-Skp1複合体(各1μl)との結合は、沈降にNi-NTA-アガロースビーズ(Quiagen, 10μl)を用いたこと以外は、3aに記載のようにして測定した。3aおよび3bとも、投入は出発物質の5%を示す。  C. Cks1はSkp2とp27ホスホペプチドとの結合を刺激する。p27の19のC末端アミノ酸残基に相当するペプチド(「p27ビーズ」)またはリン酸化Thr187を含有する同様のペプチド(「P-p27ビーズ」)を結合させたセファロースビーズは、Carranoら, 1999, Nat. Cell Biol 1:193に記載のように調製した。in vitro翻訳35S-Skp2(3μl)を、10ng(レーン4)もしくは100ng(レーン2および5)のCks1の存在下または不在下(レーン１および3)で対応するビーズ15μlと混合した。4℃で2時間回転させた後、ビーズをRIPAバッファーで4回洗浄した。  D. Cks1はp27ホスホペプチドと結合する。35S-Cks1(2μl)を示されたビーズと混合し、ビーズを図3cの場合と同様にして処理した。投入は出発物質の10%を示す。
【００７７】
図51A〜C．  Skp2/E2F相互作用アッセイのウエスタンブロット解析。ウエスタンブロット実験の詳細は第9節の実施例に示されている。
【００７８】
5.  発明の詳細な説明
本発明は新規なF-ボックスタンパク質およびF-ボックスタンパク質の新規な基質に関する。本発明は、新規なF-ボックスタンパク質の基質を同定するため、また、F-ボックスタンパク質とその基質の相互作用および／または活性を調節する小分子および化合物を同定するためにデザインされたスクリーニングアッセイに関する。
【００７９】
本発明は新規なF-ボックスタンパク質の基質を同定する、また、可能性のある治療薬を同定するスクリーニングアッセイに関する。本発明はさらに、新規および既知双方のF-ボックスタンパク質の新規な基質の同定に基づくスクリーニングアッセイに関する。本発明のスクリーニングアッセイは、増殖性疾患の治療のために新規なユビキチンリガーゼおよびその基質との相互作用をターゲッティングするようデザインされた、プロトコルおよび医薬組成物において用い得る潜在的治療薬を同定するために用いることができる。ある特定の実施形態では、本発明は、本発明者らが同定した新規な基質β-カテニン、p27およびE2FとFBPとの相互作用をターゲッティングするスクリーニングアッセイおよび潜在的治療薬に関する。
【００８０】
本発明はさらに、新規なF-ボックスタンパク質、タンパク質およびペプチド、ならびに新規なユビキチンリガーゼに対する抗体(例えば、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうるもの)、ユビキチンリガーゼ活性もしくは発現を阻害するアンタゴニスト、またはユビキチンリガーゼ活性を活性化するか、もしくはその発現を増強するアゴニストをコードするヌクレオチドの使用を包含する。さらに、新規なユビキチンリガーゼをコードするヌクレオチドおよびタンパク質は、それらの活性を調節または模倣する化合物の同定に有用であり、従って癌および腫瘍形成の治療に有効でありうる。
【００８１】
特に、以下の小節に記載の本発明は、FBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25ポリペプチド、または新規なユビキチンリガーゼの機能的ドメインに相当するペプチド(例えば、F-ボックスモチーフ、基質結合ドメイン、およびロイシンに富む反復配列)、変異型、トランケート型もしくは欠失型(例えば、1以上の機能的ドメインまたはその一部が欠失されたもの)、ユビキチンリガーゼ融合タンパク質、かかる産物をコードするヌクレオチド配列、およびかかるユビキチンリガーゼ産物を産生し得る宿主細胞発現系を包含する。
【００８２】
本発明はFBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25、またはその誘導体、断片もしくは類似体をはじめとする、ユビキチンリガーゼ複合体の新規な成分と相互作用するペプチドおよびタンパク質をスクリーニングする方法を提供する。好ましくは、このスクリーニング方法は以下にさらに記載される酵母ツーハイブリッドアッセイ系またはその変法である。タンパク質の誘導体(例えば断片)および類似体は当技術分野で公知のいずれかの方法、例えば以下に記載される改変型酵母ツーハイブリッドアッセイ系、複合体のタンパク質と結合する抗体を用いた免疫沈降とそれに続く免疫沈降タンパク質のサイズ分画による分析(例えば、変性または非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による)、ウエスタン解析または非変性ゲル電気泳動などにより、結合相手との結合に関してアッセイすることができる。
【００８３】
本発明は新規なユビキチンリガーゼの活性を調節する薬剤を同定するスクリーニングアッセイを提供する。本発明は新規なユビキチンリガーゼの活性を調節する小分子、化合物、組換えタンパク質、ペプチド、核酸、抗体などをスクリーニングし、ひいては増殖性または分化性疾患の治療のための潜在的治療薬を同定するin vivoおよびin vitro双方のアッセイを包含する。ある実施形態では、本発明は、新規なユビキチンリガーゼと相互作用するタンパク質のスクリーニング方法を提供する。
【００８４】
本発明はまた、ユビキチンリガーゼ遺伝子の発現を阻害する(転写因子阻害剤、アンチセンスおよびリボザイム分子、または遺伝子もしくは調節配列置換構築物)か、あるいはユビキチンリガーゼの発現を促進する(例えば、ユビキチンリガーゼコード配列がプロモーター、プロモーター/エンハンサーなどのような発現制御エレメントと作動可能なように連結されている発現構築物)、抗体および抗イディオタイプ抗体、アンタゴニストおよびアゴニスト、ならびに化合物またはヌクレオチド構築物を包含する。本発明はまた、ヒト型(またはその変異体)を発現するように、あるいは動物の内因性ユビキチンリガーゼの発現を阻害またた「ノックアウト」するように遺伝子操作された宿主細胞または動物に関する。
【００８５】
最後に、ユビキチンリガーゼタンパク質産物および融合タンパク質産物(すなわち、タンパク質またはF-ボックスモチーフなどのタンパク質ドメインの融合体)、抗体および抗イディオタイプ抗体(Fabフラグメントを含む)、アンタゴニストまたはアゴニスト(ユビキチン化経路を調節する化合物を含む)は増殖性または分化性疾患の治療に使用することができる。従って本発明はまた、癌および腫瘍形成を治療する医薬製剤および方法も包含する。
【００８６】
本発明の種々の態様を以下の小節でさらに説明する。
【００８７】
5.1 FBP遺伝子
本発明は、7つの新規なヌクレオチド配列FBP1、FBP2、FBP3a、FBP4、FBP5、FBP6、およびFBP7、ならびにその断片を含んでなる核酸分子を提供し、それらの核酸は、その遺伝子産物と、ユビキチンリガーゼ複合体の一成分であるSkp1との相互作用によって同定された新規な遺伝子である。本発明はさらにFBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP17、FBP18、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25のヌクレオチド配列を含んでなる14の新規な核酸分子を提供し、同定されたFBP遺伝子の核酸配列が本明細書に記載されている。
【００８８】
本明細書おいて「FBP遺伝子」とは、以下のものを指す：
(a) 図3(配列番号1)で示されるFBP1のDNA配列、図4(配列番号3)で示されるFBP2のDNA配列、図5(配列番号5)で示されるFBP3aのDNA配列、図6(配列番号23)で示されるFBP3bのDNA配列、図7(配列番号7)で示されるFBP4のDNA配列、図8(配列番号9)で示されるFBP5のDNA配列、図9(配列番号11)で示されるFBP6のDNA配列、図10(配列番号13)で示されるFBP7のDNA配列、図11(配列番号25)で示されるFBP8のDNA配列、図12(配列番号27)で示されるFBP9のDNA配列、図13(配列番号29)で示されるFBP10のDNA配列、図14(配列番号31)で示されるFBP11のDNA配列、図15(配列番号33)で示されるFBP12のDNA配列、図16(配列番号35)で示されるFBP13のDNA配列、図17(配列番号37)で示されるFBP14のDNA配列、図18(配列番号39)で示されるFBP15のDNA配列、図19(配列番号41)で示されるFBP16のDNA配列、図20(配列番号43)で示されるFBP17のDNA配列、図21(配列番号45)で示されるFBP18のDNA配列、図22(配列番号47)で示されるFBP19のDNA配列、図23(配列番号49)で示されるFBP20のDNA配列、図24(配列番号51)で示されるFBP21のDNA配列、図25(配列番号53)で示されるFBP22のDNA配列、図26(配列番号55)で示されるFBP23のDNA配列、図27(配列番号57)で示されるFBP24のDNA配列、図28(配列番号59)で示されるFBP25のDNA配列を含む核酸分子；
(b) 図3A(配列番号2)で示されるFBP1のアミノ酸配列、図4A(配列番号4)で示される FBP2のアミノ酸配列、図5A(配列番号6)で示されるFBP3aのアミノ酸配列、図6A(配列番号24)で示されるFBP3bのアミノ酸配列、図7A(配列番号8)で示されるFBP4のアミノ酸配列、図8A(配列番号10)で示されるFBP5のアミノ酸配列、図9A(配列番号12)で示されるFBP6のアミノ酸配列、図10(配列番号14)で示されるFBP7のアミノ酸配列、図11(配列番号26)で示されるFBP8のアミノ酸配列、図12(配列番号28)で示されるFBP9のアミノ酸配列、図13(配列番号30)で示されるFBP10のアミノ酸配列、図14(配列番号32)で示される FBP11のアミノ酸配列、図15(配列番号34)で示されるFBP12のアミノ酸配列、図16(配列番号36)で示されるFBP13のアミノ酸配列、図17(配列番号38)で示されるFBP14のアミノ酸配列、図18(配列番号40)で示されるFBP15のアミノ酸配列、図19(配列番号42)で示されるFBP16のアミノ酸配列、図20(配列番号44)で示されるFBP17のアミノ酸配列、図21(配列番号46)で示されるFBP18のアミノ酸配列、図22(配列番号48)で示されるFBP19のアミノ酸配列、図23(配列番号50)で示されるFBP20のアミノ酸配列、図24(配列番号52)で示されるFBP21のアミノ酸配列、図25(配列番号54)で示されるFBP22のアミノ酸配列、図26(配列番号56)で示されるFBP23のアミノ酸配列、図27(配列番号58)で示されるFBP24のアミノ酸配列、図28(配列番号60)で示されるFBP25のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするいずれかのDNA配列；
(c) 高ストリンジェント条件下(例えば0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中65℃でフィルター結合DNAとハイブリダイズさせ、68℃、0.1xSSC/0.1% SDS中で洗浄する(Ausubel F. M.ら編, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc., New York, p. 2.10.3))で配列番号2、4、6、8、10、12もしくは14または図15のアミノ酸配列のいずれかをコードするDNA配列の相補体とハイブリダイズするDNA配列；および／または
(d) より低いストリンジェント条件下で、例えば中程度のストリンジェント条件下(例えば42℃、0.2xSSC/0.1% SDS中で洗浄する(Ausubelら, 1989,前掲))で、配列番号2、4、6、8、10、12もしくは14または図15のアミノ酸配列のいずれかをコードし、かつFBP遺伝子産物と機能的に同等な遺伝子産物をコードするDNA配列の相補体とハイブリダイズするDNA配列。
【００８９】
本発明のFBP遺伝子配列は、哺乳類F-ボックスタンパク質、Skp2、エロンギンA、サイクリンF、マウスMd6(Pagano, 1997,前掲; Zhangら, 1995, 前掲; Baiら, 1996, 前掲; Skowyraら, 1997, 前掲)をコードする、これまでに記載された遺伝子を含まないことが理解される。さらに、本発明の核酸分子はGenBank登録番号AC002428、AI457595、AI105408、H66467、T47217、H38755、THC274684、AI750732、AA976979、AI571815、T57296、Z44228、Z45230、N42405、AA018063、AI751015、AI400663、T74432、AA402415、AI826000、AI590138、AF174602、Z45775、AF174599、THC288870、AI017603、AF174598、THC260994、AI475671、AA768343、AF174595、THC240016、N70417、T10511、AF174603、EST04915、AA147429、AI192344、AF174594、AI147207、AI279712、AA593015、AA644633、AA335703、N26196、AF174604、AF053356、AF174606、AA836036、AA853045、AI479142、AA772788、AA039454、AA397652、AA463756、AA007384、AA749085、AI640599、THC253263、AB020647、THC295423、AA434109、AA370939、AA215393、THC271423、AF052097、THC288182、AL049953、CAB37981、AL022395、AL031178、THC197682、およびTHC205131のヌクレオチド配列のみからなる核酸分子を含まないことも理解される。
【００９０】
本発明のFBP配列は真核生物ゲノム、好ましくは哺乳類ゲノム、より好ましくはヒトまたはマウスゲノムに由来する。従って本発明のヌクレオチド配列は酵母ゲノムに由来するものは含まない。特定の実施形態では、本発明のヌクレオチドは高ストリンジェント条件下で配列番号1、3、5、7、9、11もしくは13、または図14に示されるDNA配列とハイブリダイズし、かつF-ボックスモチーフを含み、Skp1と結合する遺伝子産物をコードする哺乳類ゲノムに由来する任意のDNA配列も包含する。特定の実施形態では、本発明のヌクレオチドは、高ストリンジェント条件下で配列番号1、3、5、7、9、11または13とハイブリダイズし、かつF-ボックスモチーフと、WD-40、ロイシンに富む領域、ロイシンジッパーモチーフまたはその他のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインからなる群より選択される別のドメインとを含み、Skp-1と結合する遺伝子産物をコードし、少なくとも300または400ヌクレオチドの長さである、哺乳類ゲノムに由来する任意のDNA配列も包含する。
【００９１】
FBP配列としては、例えば、真核生物ゲノムDNAまたはcDNA配列のいずれかを含み得る。従って、所定のアミノ酸配列をコードする核酸についていう場合、その核酸は単にcDNA分子である必要はなく、例えば、所定のアミノ酸配列をコードするようプロセッシングされるcDNA配列（これよりmRNA種が転写される）をも指すことを理解すべきである。
【００９２】
本明細書において用いるFBP遺伝子はまた、DNA配列(a)から(d)の縮重変異体を指すこともある。
【００９３】
本発明はまた、上記段落に記載のDNA配列(a)〜(d)とハイブリダイズし、それゆえに該DNA配列の相補体である哺乳類核酸に由来する核酸分子、好ましくはDNA分子も含む。かかるハイブリダイゼーション条件は上記のような高ストリンジェントまたはそれより低いストリンジェント条件であり得る。例えば、核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド(「オリゴ」)である場合、高ストリンジェント条件とは、例えば37℃(14塩基のオリゴの場合)、48℃(17塩基のオリゴの場合)、55℃(20塩基のオリゴの場合)、および60℃(23塩基のオリゴの場合)にて6xSSC/0.05%ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を指す。これらの核酸分子は、例えばFBP遺伝子調節に有用な、FBP遺伝子アンチセンス分子をコードするものでも、FBP遺伝子アンチセンス分子として働く(FBP遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーをコードするおよび／またはとして働く)ものであってもよい。FBP遺伝子調節については、このような技術を用いて例えばFBP調節経路を調節して、癌関連の細胞増殖を遮断することができる。さらに、このような配列はFBP遺伝子調節に有用でもあるリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として用いてもよい。なおさらに、このような分子は診断法の成分としても使用でき、それにより、FBP関連疾患、例えば腫瘍形成または癌などの増殖性または分化性疾患の発生に関与する特定のFBP対立遺伝子の存在を検出できる。
【００９４】
本発明はまた、
(a)上記FBPコード配列および／またはその相補体(すなわち、アンチセンス)のいずれかを含むDNAベクター；
(b)コード配列の発現を指令する調節エレメントと作動可能なように連結された上記FBPコード配列のいずれかを含むDNA発現ベクター；および
(c)宿主細胞においてコード配列の発現を指令する調節エレメントと作動可能なように連結された上記FBPコード配列のいずれかを含む遺伝子操作された宿主細胞；
も包含する。
【００９５】
本明細書において調節エレメントとは、限定されるものではないが、誘導性または非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、およびその他当業者に発現を駆動および調節することが知られているエレメントが挙げられる。このような調節エレメントとしては、限定されるものではないが、サイトメガロウイルスhCMV前初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期または後期プロモーター、lac系、trp系、TAC系、TRC系、ファージAの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、および酵母接合因子のプロモーターが挙げられる。
【００９６】
本発明はさらに、本明細書に開示されるDNA配列のいずれかの断片を含む。
【００９７】
ある実施形態では、本発明のFBP遺伝子配列は哺乳類の遺伝子配列であり、ヒト配列が好ましいものである。
【００９８】
さらなる実施形態では、本発明のFBP遺伝子配列は、図2、4〜9または15で示されるアミノ酸配列に対応するポリペプチド部分(すなわち、図2、4〜9または15で示されるアミノ酸配列とのアミノ酸配列類似性を示すポリペプチド部分)を含有するFBP遺伝子産物をコードする遺伝子配列であり、この対応部分は、FBP遺伝子産物の全長にわたって平均して、示された配列に対して約50%を超えるアミノ酸同一性を示す。
【００９９】
特定の実施形態では、F-ボックスをコードする核酸は、配列番号1、3、5、23、7、9、11、13、15、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、または59のcDNA配列、それぞれ図3B、4B、5B、6B、7B、8B、9B、10B、11B、12B、13B、14B、15B、16B、17B、18B、19B、20B、21B、22B、23B、24B、25B、26B、27B、または28Bのヌクレオチド配列、もしくはそのコード領域、またはF-ボックスタンパク質 (例えば、配列番号2、4、6、24、8、10、12、14、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、68、または60の配列を有するか、あるいはそれぞれ図3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A、11A、12A、13A、14A、15A、16A、17A、18A、19A、20A、21A、22A、23A、24A、25A、26A、27A、または28Aで示された配列を有するタンパク質) をコードする核酸を含んでなる。
【０１００】
本発明はさらに、本発明のFBP1、FBP2、FBP3a、FBP4、FBP5、FBP6、またはFBP7(それぞれ配列番号1、3、5、7、9、11および13)をコードするヌクレオチド配列のヌクレオチド断片を提供する。このような断片はFBP遺伝子配列の少なくとも8ヌクレオチド(すなわち、ハイブリダイズ可能な部分)からなり、他の実施形態では、この核酸はF-ボックス配列の少なくとも25(連続する)ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、150ヌクレオチド、または200ヌクレオチド、あるいはまたは全長のF-ボックスコード配列からなる。もう1つの実施形態では、この核酸は35、200または500ヌクレオチド長よりも短い。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明はまた、上記配列とハイブリダイズし得る、または上記配列と相補的な核酸に関する。特定の態様では、F-ボックス遺伝子の少なくとも10、25、50、100もしくは200ヌクレオチド、または全コード領域に相補的な配列を含んでなる核酸が提供される。
【０１０１】
本発明はさらに、核酸のヒトゲノムヌクレオチド配列に関する。特定の実施形態では、F-ボックスをコードする核酸は、配列番号1、3、5、7、9、11もしくは13のゲノム配列、またはそのコード領域、またはFBPタンパク質(例えば、配列番号2、4、6、8、10、12または14の配列を有するタンパク質)をコードする核酸を含んでなる。本発明はFBP遺伝子配列の少なくとも8ヌクレオチド(すなわち、ハイブリダイズ可能な部分)からなる精製核酸を提供し、他の実施形態では、この核酸はFBP遺伝子配列の少なくとも25(連続する)ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、150ヌクレオチド、または200ヌクレオチド、あるいは全長FBP遺伝子コード配列からなる。もう1つの実施形態では、この核酸は35、200または500ヌクレオチド長よりも短い。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本発明はまた、上記配列とハイブリダイズし得る、または上記配列と相補的な核酸に関する。特定の態様では、FBP遺伝子配列の少なくとも10、25、50、100もしくは200ヌクレオチド、または全コード領域に相補的な配列を含んでなる核酸が提供される。
【０１０２】
本明細書に開示されるヒトFBPヌクレオチド配列に加えて、本明細書に開示されるFBP遺伝子配列と共に使用される当技術分野で周知の分子生物学的技術によって、過度な実験を行うことなく、他のFBP遺伝子配列を同定し、容易に単離することができる。例えば、配列番号1、3、5、7、9、11もしくは13で開示されるものと同じまたは異なる遺伝子座でさらなるヒトFBP遺伝子配列を容易に単離することができる。例えば、FBP遺伝子産物の1以上のドメインと広範囲にわたって相同性を有するタンパク質をコードし、FBP遺伝子産物と機能的に同等な遺伝子産物をコードするヒトゲノム内の他の遺伝子座または物理的座に遺伝子が存在する可能性がある。さらに、他の生物種に存在する相同なFBP遺伝子配列も容易に同定および単離することができる。
【０１０３】
本発明のFBPヌクレオチド配列はさらに、配列番号1、3、5、7、9、11もしくは13のFBPヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸の同一性％を決定するには、最適な比較のために配列をアライメントする(例えば、第2のアミノ酸配列または核酸配列と最適なアライメントを得るには、第1のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入することができる)。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列の位置が対応する第2の配列の位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められていれば、その分子はその位置で同一となる。2つの配列間の同一性％はそれらの配列によって共有される同一位置の数の関数である(すなわち、同一性％=同一の重なり合う位置の数／重なり合う位置の総数×100％)。ある実施形態では、これらの2つの配列は同じ長さである。
【０１０５】
また、2つの配列間の同一性％の決定は数学的アルゴリズムを用いても達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定例として、KarlinおよびAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載のように改変されたKarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムはAltschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いてBLASTヌクレオチド検索を実行すればよい。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るには、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いてBLASTタンパク質検索を実行すればよい。比較目的でギャップ入りのアライメントを得るには、Altschulら, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-Blastを用いて分子間の距離関係を検出する反復検索を実行してもよい(Altschulら, 1997, 上記)。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI-Blastプログラムを用いる場合、個々のプログラムのデフォルトパラメーター(例えば、XBLASTおよびNBLAST)を用いることができる(参照)。2つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムのもう1つの非限定例としては、KarlinおよびAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載のように改変されたKarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムはAltschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るためには、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いてBLASTヌクレオチド検索を実行すればよい。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3用いてBLASTタンパク質検索を実行すればよい。比較目的でギャップ入りのアライメントを得るには、Altschulら, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-Blastを用いて分子間の距離関係を検出する反復検索を実行してもよい(Altschulら, 1997, 上記)。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI-Blastプログラムを用いる場合、個々のプログラムのデフォルトパラメーター(例えば、XBLASTおよびNBLAST)を用いることができる(参照)。2つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムのもう1つの非限定例としては、MyersおよびMiller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムはGCG配列アライメントソフトウエアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを用いる場合、PAM120加重残基表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティー12、およびギャップペナルティー4を使用することができる。
【０１０６】
2つの配列間の同一性％はギャップを許容して、または許容せずに上記のものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性％を算出する際には、典型的には 正確な一致だけを数える。
【０１０７】
本明細書に開示された配列と同じ遺伝子座または物理的座に存在するFBP遺伝子配列の同定および単離については、かかる配列は例えば標準的なシーケンシング技術および細菌人工染色体(BAC)技術を用いることで容易に得ることができる。
【０１０８】
ヒトまたは他の生物種(例えばマウス)におけるFBP遺伝子相同体のクローニングについては、本明細書に開示される単離FBP遺伝子配列を標識し、対象となる生物(例えばマウス)由来の適当な細胞または組織(例えば脳組織)から得たmRNAから構築したcDNAライブラリーをスクリーニングするのに用い得る。そのcDNAライブラリーが、標識配列の起源となるる生物種とは異なる生物に由来する場合には、用いるハイブリダイゼーション条件はより低いストリンジェンシーにすべきである。
【０１０９】
あるいは、標識断片を用いて、ここでも適切なストリンジェント条件を用いて、対象の生物に由来するゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。低ストリンジェント条件は、当業者によく知られており、そのライブラリーおよび標識配列が誘導される特定の生物に応じて、予測可能に変化するだろう。このような条件に関する指針については、例えばSambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, N. Y.;およびAusubelら, 前掲を参照されたい。さらに、FBP遺伝子相同体は、本明細書で開示されるFBP遺伝子産物のいずれかのアミノ酸配列に基づいてデザインした2つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いたPCRを行うことで、例えばヒト核酸から単離し得る。
【０１１０】
このPCR産物をサブクローニングし、配列決定することにより、その増幅配列がFBP遺伝子核酸配列に相当することを確認することができる。次にこのPCR断片を用いて、種々の方法により全長cDNAクローンを単離することができる。例えば増幅断片を標識し、バクテリオファージcDNAライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。あるいは、標識断片を用いてゲノムライブラリーのスクリーニングによってゲノムクローンを単離してもよい。
【０１１１】
また、PCR技術を利用して全長cDNA配列を単離することもできる。例えば、標準的な手順に従って適当な細胞または組織源(すなわち、例えば血液サンプルまたは生検または死後得られた脳組織サンプルなど、FBP遺伝子を発現することが分かっているか、または予想されるもの)からRNAを単離する。このRNAに対し、第一鎖合成を開始させるために増幅断片の最も5’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転写反応を行うことができる。得られたRNA/DNAハイブリッドを次に、標準的なターミナルトランスフェラーゼ反応を用いてグアニンで「テイル付加」し、このハイブリッドをRNAアーゼHで消化し、次に第二鎖合成をポリCプライマーにより開始させる。このように、増幅断片の上流のcDNA配列が容易に単離され得る。使用できるクローニング戦略の総説としては、例えばSambrookら, 前掲を参照されたい。
【０１１２】
さらにFBP遺伝子配列を用いて突然変異FBP遺伝子対立遺伝子を同定することができる。このような突然変異対立遺伝子は、例えば腫瘍形成または癌発生に関連する増殖性または分化性疾患などのFBP遺伝子疾患の症状に寄与する遺伝子型をもつことが知られているか、または提起されている個体から単離することができる。次に突然変異対立遺伝子および突然変異対立遺伝子産物は以下に記載の治療、診断および予後系に使用できる。さらに、このようなFBP遺伝子配列を用いて、例えば腫瘍形成または癌発生に関連する増殖性または分化性疾患などのFBP疾患に関連し得るFBP遺伝子調節(例えばプロモーター)欠損を検出することもできる。
【０１１３】
FBP対立遺伝子は一本鎖コンホメーション多型(SSCP)突然変異検出技術、サザンブロット、および／またはPCR増幅技術によって同定され得る。プライマーは通常、プロモーター領域を含むFBP配列全体の重複領域を増幅するようにデザインすることができる。ある実施形態では、プライマーは、まずコード領域が突然変異に関してスキャンされ得るように、エキソン-イントロン境界をカバーするようデザインされる。正常および罹患個体のリンパ球から単離したゲノムDNAをPCR鋳型として用いる。正常および罹患個体からのPCR産物は、一本鎖コンホメーション多型(SSCP)突然変異検出技術および／またはシーケンシングのいずれかによって比較する。SSCP解析は以下のようにして行うことができる：100ngのゲノムDNAを10μl反応液中で増幅させるが、該反応液には、最終濃度2.5μM dNTP(Pharmacia)、10mM Tris-HCl(pH8.8)、50mM KCl、1mM MgCl2、0.01%ゼラチン中、各10pmolのプライマー、0.5UのTaq DNAポリメラーゼ(Promega)、1μCiのα-[32P]dCTP(NEN;比活性3000Ci/mmol)を加えた。サーマルサイクラー(MJ Research, Boston, MA, USA)にて、変性(94℃)、アニーリング(プライマー融解温度に応じて56℃〜64℃)、および伸長(72℃)を30サイクル行った後、72℃で7分の最終伸長を行った。2μlの反応混合物を0.1% SDS、10mM EDTAで希釈し、次に20mM NaOHを含有するシーケンシング停止溶液と1:1で混合する。サンプルを95℃で5分間加熱し、3分間氷上で冷却した後、5%(v/v)グリセロールを含有する6%アクリルアミド/TBEゲルに3μlをロードする。室温にて8Wでゲルを12〜15時間泳動させる。オートラジオグラフィーは-70℃で種々の時間、増強スクリーンにフィルムを露光させることで行う。次に、突然変異FBP遺伝子産物の機能の欠損または変化に寄与する突然変異を確認することができる。
【０１１４】
あるいは、変異型FBP遺伝子のcDNAを、例えばPCRを用いて単離することもできる。この場合、cDNA第一鎖の合成は、オリゴdTオリゴヌクレオチドを、突然変異FBP対立遺伝子をもつと予想される個体で発現することが分かっているか、または発現すると推測される組織から単離したmRNAにハイブリダイズさせ、逆転写酵素を用いて新しい鎖を伸長させることによって行うことができる。次にcDNAの第二鎖を、正常遺伝子の5’末端と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて合成する。次にこれらの2つのプライマーを用いて、PCRにより産物を増幅し、好適なベクターにクローニングし、当業者に周知の方法でDNA配列解析を行う。突然変異FBP対立遺伝子のDNA配列と正常なFBP対立遺伝子のDNA配列とを比較することで、変異型FBP遺伝子産物の機能の欠損または変化に寄与する突然変異が確認できる。
【０１１５】
あるいは、突然変異FBP対立遺伝子をもつと予想されるか、またはもつことが分かっている個体から得たDNAを用いてゲノムライブラリーを構築することもでき、また、突然変異FBP対立遺伝子を発現することが分かっているか、または発現すると予想される組織からのRNAを用いてcDNAライブラリーを構築することもできる。次に、損なわれていないFBP遺伝子またはそのいずれかの適当な断片を標識し、かかるライブラリーで対応する突然変異FBP対立遺伝子を同定するためのプローブとして用いてもよい。次に、変異型FBP遺伝子配列を含むクローンを精製し、当業者に周知の方法に従って配列解析を行ってもよい。
【０１１６】
また、例えばかかる突然変異対立遺伝子を有すると予想されるか、または有することが分かっている個体で突然変異FBP対立遺伝子を発現することが分かっている、または発現すると予想される組織から単離したRNAから合成したcDNAを用いて発現ライブラリーを構築することもできる。この方法では、推定上の突然変異組織によって作られた遺伝子産物を発現させて、以下の第5.3節に記載のように、正常なFBP遺伝子産物に対する抗体と共に標準的な抗体スクリーニング技術を用いてスクリーニングすることができる(スクリーニング技術に関しては、例えば、HarlowおよびLane編, 1988,"Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harborを参照されたい)。
【０１１７】
FBPタンパク質の誘導体および類似体をコードする核酸、ならびにFBPアンチセンス核酸は上記の方法によって単離することができる。本明細書において「F-ボックスタンパク質の断片または一部をコードする核酸」とは、挙げられたFBPの断片または一部だけをコードし、連続配列としてのFBPタンパク質の他の連続部分はコードしない核酸を指すものとする。
【０１１８】
また、同じまたは異なる生物種の他のFBP遺伝子核酸間で保存されている(すなわち、それらとの相同性を有する)領域を含んでなるFBP遺伝子核酸の断片も提供される。1以上のFBPドメインをコードする核酸は上に挙げた方法によって単離することができる。
【０１１９】
FBP突然変異が機能の変化した発現遺伝子産物をもたらす場合(例えばミスセンスまたはフレームシフト突然変異の結果として)、抗FBP遺伝子産物抗体のポリクローナルセットは変異型FBP遺伝子産物と交差反応する可能性がある。かかる標識抗体との反応によって検出されたライブラリークローンを精製し、当業者に周知の方法に従って配列解析を行うことができる。
【０１２０】
5.2 FBP遺伝子のタンパク質およびポリペプチド
図1、2および図3〜28のパートBに示されるアミノ酸配列はFBP遺伝子産物を表す。FBP1遺伝子産物は、本明細書では「FBP1タンパク質」とも呼ばれ、上記第5.1節に記載のFBP1遺伝子配列によってコードされる遺伝子産物を含む。同様に、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25遺伝子産物は本明細書ではFBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25タンパク質とも呼ばれ、FBP2、FBP3、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、 FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25遺伝子によってコードされる遺伝子産物を含む。本発明によれば、FBP遺伝子産物をコードする核酸配列は哺乳類ゲノムをはじめとする真核生物ゲノムに由来するものである。好ましい実施形態では、FBP遺伝子産物をコードする核酸配列はヒトまたはマウスゲノムに由来するものである。
【０１２１】
FBP遺伝子産物またはそのペプチド断片は様々な用途のために調製することができる。例えば、かかる遺伝子産物またはそのペプチド断片は診断および予後アッセイにおける抗体の作製のために用いることができ、あるいはユビキチン化経路に関与し、それにより細胞周期および増殖性疾患の調節に関わる他の細胞内または細胞外遺伝子産物の同定のために用いることもできる。
【０１２２】
また、本発明のFBP遺伝子産物は機能的に同等な(定義については第5.1節参照)遺伝子産物に相当するタンパク質を含み得る。本発明のFBP遺伝子産物はこれまでに同定されている哺乳類Fボックスタンパク質Skp2、サイクリンF、エロンギンA、またはマウスMd6(Pagano, 1997, 前掲; Zhangら, 1995, 前掲; Baiら, 199, 前掲; Skowyraら, 1997, 前掲参照)を含まない。
【０１２３】
機能的に同等なFBP遺伝子産物は、上記第5.1節に記載のFBP遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列内および／またはそれに隣接するアミノ酸残基の欠失(内部欠失を含む)、付加（融合タンパク質を生じる付加を含む）、または置換を含み得るが、これはその変化が機能的に同等なFBP遺伝子産物をもたらすという点で「サイレント」変異となるものである。アミノ酸置換は関係する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性をもとに行えばよい。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ、極性アミノ酸としてはグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ、正電荷(塩基性)アミノ酸としてはアルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ、負電荷(酸性)アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【０１２４】
あるいは、機能の改変が望まれる場合には、欠失また非保存的改変を操作して改変されたFBP遺伝子産物を作製することができる。かかる改変は、例えば、FBP遺伝子産物の1以上の生物学的機能を改変することができる。さらに、かかる改変は選択された宿主細胞における発現、スケールアップなどにさらに適したFBP遺伝子産物を生じるように選択することができる。例えば、ジスルフィド橋を排除するためには、システイン残基を欠失させるか、または別のアミノ酸残基で置換する。
【０１２５】
FBP遺伝子産物、そのペプチド断片およびその融合タンパク質は当技術分野で周知の技術を用い、組換えDNA技術によって作製することができる。従って、FBP遺伝子配列を含む核酸を発現させることによる、本発明のFBP遺伝子ポリペプチド、ペプチド、融合ペプチドおよび融合ポリペプチド作製方法も本明細書に記載される。当業者に周知の方法を用いて、FBP遺伝子産物コード配列、ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えが含まれる。例えばSambrookら, 前掲、およびAusubelら, 前掲に記載の技術を参照されたい。あるいは、FBP遺伝子産物配列をコードし得るRNAを、例えばシンセサイザーを用いて化学的に合成することもできる。例えば"Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait編, IRL Press, Oxfordに記載の技術を参照されたい。
【０１２６】
本発明のFBP遺伝子コード配列を発現させるには、種々の宿主-発現ベクター系を利用できる。かかる宿主-発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて精製され得るビヒクルであり、また、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトした際に本発明のFBP遺伝子産物をin situで発現し得る細胞でもある。これらのものとしては、限定されるものではないが、FBP遺伝子産物コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物(例えば大腸菌(E. coli)、枯草菌(S. subtilis))；FBP遺伝子産物コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピキア(Pichia))；FBP遺伝子産物コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス, CaMV；タバコモザイクウイルス, TMV)に感染させた、またはFBP遺伝子産物コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)でトランスフェクトした植物細胞系；あるいは哺乳類細胞ゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)または哺乳類ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を含有する哺乳類細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、3T3)が挙げられる。
【０１２７】
細菌系では、発現させるFBP遺伝子産物に意図された用途に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、FBPタンパク質の医薬組成物を製造するため、またはFBPタンパク質に対する抗体を作製するために、かかるタンパク質を大量に生産しようとする場合は、例えば、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を指令するベクターが望ましい。かかるベクターとしては、限定されるものではないが、大腸菌発現ベクターpUR278(Rutherら 1983, EMBO J. 2,1791)(ここでは、FBP遺伝子産物コード配列がベクター中のlacZコード領域とインフレームで個々に連結され、それにより融合タンパク質が生じる)；pINベクター(InouyeおよびInouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13,3101-3109; Van HeekeおよびSchuster, 1989, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509)などが挙げられる。また、pGEXベクターも、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズに吸着させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることで、溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングした標的遺伝子産物がGST部分から遊離できるように、トロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むようにデザインする。
【０１２８】
昆虫系では、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)が外来遺伝子を発現させるベクターとして用いられる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperd)細胞で増殖する。FBP遺伝子コード配列をこのウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)に個々にクローニングし、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置けばよい。FBP遺伝子コード配列が上手く挿入されると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非包埋組換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質性外被を欠いたウイルス)が生じることとなる。次にこれらの組換えウイルスを用いてスポドプテラ・フルギペルダに感染させ、そこで挿入遺伝子を発現させる (例えば、Smithら, 1983, J. Virol. 46:584; Smith, 米国特許第4,215,051号参照)。
【０１２９】
哺乳類宿主細胞では、ウイルスに基づくいくつかの発現系が使用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のFBP遺伝子コード配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三つ組みリーダー配列と連結すればよい。このキメラ遺伝子は次にin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入される。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、E1またはE3領域)に挿入することで、生存力があり、かつ、感染宿主でFBP遺伝子産物を発現し得る組換えウイルスが生じる(例えば、See LoganおよびShenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,3655-3659参照)。挿入FBP遺伝子産物コード配列の効率的翻訳には特定の開始シグナルも必要となろう。これらのシグナルにはATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。適当な発現ベクターにそれ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む全FBP遺伝子を挿入する場合、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない。しかし、FBP遺伝子コード配列の一部だけを挿入する場合には、おそらくATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供しなければならない。さらにまた、全インサートの翻訳を確保するには、この開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームとインフレーム（同じ読み枠）でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然および合成双方の様々な起源のものであり得る。発現効率は適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより高められる(Bittnerら, 1987, Methods in Enzymol. 153,516-544参照)。
【０１３０】
また、挿入配列の発現を調節したり、あるいは望ましい特定の様式で遺伝子産物を修飾またはプロセッシングしたりする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、切断)はタンパク質の機能にとって重要なものであり得る。種々の宿主細胞はタンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾の特徴的かつ特異的なメカニズムを有している。発現した外来タンパク質の正確な修飾およびプロセッシングを確保するため、好適な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的で、一次転写物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞内機構を有する真核宿主細胞が使用される。このような哺乳類宿主細胞としては、限定されるものではないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、およびWI38が挙げられる。
【０１３１】
組換えタンパク質の長期間、高収率の産生のためには安定した発現が好ましい。例えば、FBP遺伝子産物を安定して発現する細胞系を操作することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、適当な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択マーカーによって制御されたDNAで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAを導入した後、操作した細胞を富化培地で1〜2日間増殖させ、その後選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーはその選択に対する耐性を付与し、細胞の染色体にプラスミドを安定して組み込ませ、かつ増殖させて増殖巣を形成させ、次にこれをクローニングして細胞系へと増やすことができる。この方法は有利なことに、FBP遺伝子産物を発現する細胞系を作製するのに使用できる。このような操作細胞系はFBP遺伝子産物の内因的活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【０１３２】
限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら, 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(SzybalskaおよびSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48,2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら, 1980, Cell 22,817)遺伝子をはじめとする、いくつかの選択系を用いることができ、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞に使用される。また、代謝拮抗物質耐性を以下の遺伝子の選択の基礎として用いることができる：メトトレキセート耐性を付与するdhfr(Wiglerら, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77,3567; O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,1527); ミコフェノール酸耐性を付与するgpt(MulliganおよびBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,2072);アミノグリコシドG-418耐性を付与するneo(Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150,1);およびハイグロマイシン耐性を付与するhygro(Santerreら, 1984, Gene 30,147)。
【０１３３】
あるいは、発現する融合タンパク質に特異的な抗体を用いることにより、いずれの融合タンパク質でも容易に精製することができる。例えば、Janknechtらにより記載されている系はヒト細胞系で発現する非変性融合タンパク質の容易な精製を考慮したものである (Janknechtら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,8972-8976)。この系では、目的の遺伝子をワクシニア組換えプラスミド中に、その遺伝子のオープンリーディングフレームが6個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳上融合するようにサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞の抽出物をNi2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムにロードし、ヒスチジンタグ付きタンパク質をイミダゾール含有バッファーで選択的に溶出させる。
【０１３４】
FBP遺伝子産物はまた、トランスジェニック動物で発現させることもできる。限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミクロブタ、ヤギ、ヒツジ、および非ヒト霊長類、例えばヒヒ、サルおよびチンパンジーをはじめ、いずれの種の動物を用いてFBPトランスジェニック動物を作製してもよい。本明細書において「トランスジェニック」とは、異なる生物種に由来するFBP遺伝子配列を発現する動物(例えばヒトFBP配列を発現するマウス)、ならびに内因性(すなわち、同種)FBP配列を過剰発現するよう遺伝子操作された動物、または内因性FBP遺伝子配列を発現しないように遺伝子操作された動物(すなわち、「ノックアウト」動物)、およびそれらの後代を指す。
【０１３５】
特に本発明はFBP1ノックアウトマウスに関する。本発明はまた、ヒト変異型FBP1およびF-ボックスドメインが欠失したSkp2遺伝子配列を発現するよう操作されたマウスに加えて、ヒト野生型FBP1およびSkp2遺伝子配列を発現するトランスジェニックマウスに関する。当技術分野で公知のいずれの技術を用いて動物にFBPトランスジーンを導入してトランスジェニックマウスの創始系統を作出してもよい。このような技術としては、限定されるものではないが、前核マイクロインジェクション(HoppeおよびWagner, 1989, 米国特許第4,873,191号); レトロウイルスを媒介とする生殖細胞系への遺伝子導入(Van der Puttenら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 6148-6152);胚性幹細胞における遺伝子ターゲッティング(Thompsonら, 1989, Cell 56,313-321);胚のエレクトロポレーション(Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3,1803-1814);および精子を媒介とする遺伝子導入(Lavitranoら, 1989, Cell 57,717-723)が挙げられる(このような技術の総説としては、Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115, 171-229参照されたい)。
【０１３６】
当技術分野で公知のいずれの技術を用いてFBPトランスジーンを含むトランスジェニック動物クローンを作出してもよく、例えば、静止期へ誘導された培養した胚、胎児または成体細胞に由来する核の、除核した卵母細胞への核導入である(Campbellら, 1996, Nature 380,64-66; Wilmutら, Nature 385,810-813)。
【０１３７】
本発明はその全ての細胞にFBPトランスジーンを有するトランスジェニック動物、ならびに全ての細胞ではないが、一部の細胞にトランスジーンを有する動物、すなわちモザイク動物を提供する。トランスジーンは単一のトランスジーンとして組み込んでも、あるいはコンカテマー、例えば頭部-頭部タンデムまたは頭部-尾部タンデムで組み込んでもよい。トランスジーンはまた、例えばLaskoらの教示(Laskoら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-6236)に従って、特定の細胞型へ選択的に導入し、そこで活性化させることもできる。このような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は対象とする特定の細胞型によって異なり、当業者には明らかである。FBPトランスジーンの組織特異的発現を指令するのに使用できる調節配列の例としては、限定されるものではないが、膵腺房細胞で活性となるエステラーゼI遺伝子制御領域(Swiftら, 1984, Cell 38:639-646; Omitzら, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:42S-51S)；膵β細胞で活性となるインスリン遺伝子調節領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)；リンパ系細胞で活性となる免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら, 1984, Cell 38:647-658; Adamsら, 1985, Nature 318:533-538; Alexanderら, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)；肝臓で活性となるアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら, 1987, Genes and Devel. 1:268-276)；肝臓で活性となるα-フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammerら, 1987, Science 235:53-58)；肝臓で活性となるα-1-アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら, 1987, Genes and Devel. 1:161-171)；骨髄細胞で活性となるβ-グロビン遺伝子制御領域(Magramら, 1985, Nature 315:338-340; Kolliasら, 1986, Cell 46:89-94)；脳の乏突起神経膠細胞で活性となるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら, 1987, Cell 48:703-712)；骨格筋で活性となるミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Shani, 1985, Nature 314:283-286)；および;視床下部で活性となるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら, 1986, Science 234:1372-1378)が挙げられる。哺乳類細胞で増殖するウイルスのゲノムから単離したプロモーター(例えば、ワクシニアウイルス7.5K、SV40、HSV、アデノウイルスMLP、MMTV、LTRおよびCMVプロモーター)ならびに組換え技術または合成技術によって作製されたプロモーターを用いてもよい。
【０１３８】
FBPトランスジーンを内因性FBP遺伝子の染色体部位に組み込むことが望ましい場合には、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡単に説明すると、このような技術を用いる場合には、内因性FBP遺伝子に相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同組換えによって内因性FBP遺伝子のヌクレオチド配列へ組み込み、その機能を破壊する目的でデザインされる。このトランスジーンはまた、例えばGuら(Guら, 1994, Science 265,103-106)の教示に従って特定の細胞型に選択的に導入してもよく、そうすることで内因性FBP遺伝子はその細胞型でのみ不活性化される。このような細胞型特異的不活性化に必要な調節配列は対象とする特定の細胞型によって異なり、当業者には明らかである。
【０１３９】
ひとたびトランスジェニック動物が作出されれば、標準的な技術を用いて組換えFBP遺伝子の発現をアッセイすることができる。初期スクリーニングは、動物組織を分析してトランスジーンの組み込みが起こったかどうかをアッセイするために、サザンブロット解析またはPCR技術によって達成することができる。トランスジェニック動物の組織におけるトランスジーンのmRNA発現レベルも、限定されるものではないが、動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット解析、in situハイブリダイゼーション解析、およびRT-PCR(逆転写酵素PCR)を含む技術を用いてアッセイすることができる。FBP遺伝子発現組織のサンプルはまた、導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に評価することもできる。
【０１４０】
組織特異的トランスジーンを有するトランスジェニックマウスを用いて、インタクトな動物でFBP遺伝子発現の影響を調べることができる。ある実施形態では、その乳腺にヒトFBP1トランスジーンを有するトランスジェニックマウスを用いて、マウスの乳腺の発達および腫瘍形成におけるFBPの役割を評価することができる。もう1つの実施形態では、乳腺においてヒトFBP1ドミナントネガティブ変異型(F-ボックス欠損)を過剰発現するトランスジェニックマウスを作出することができる。特定の実施形態では、例えばMMTV LTRプロモーター(マウス乳癌ウイルスの長い末端反復)を用いて、乳腺におけるトランスジーンの組み込みを指令することができる。MMTV/FBP1融合遺伝子は、MMTV LTRプロモーター配列とFBP1遺伝子の最初のATGの上流のヌクレオチド配列とを融合させることによって構築することができる。また、SV40ポリアデニル化領域をFBP1コード領域の下流配列と融合させてもよい。トランスジェニックマウスは当技術分野で周知の方法によって作出される(Gordon, 1989, トランスジェニック動物, Intl. Rev. Cytol. 115,171-229)。要するに、未熟なB6D2F1雌マウスに過剰排卵させ、CD-1雄と交配する。翌朝、それらの雌について膣栓があるかどうか調べ、受精卵を回収し、プラスミドベクターによるマイクロインジェクションを行う。およそ2000コピーの材料を各前核にマイクロインジェクションする。創始動物のスクリーニングは脾臓からDNAを抽出し、MMTV/FBP1をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションを行うことによって行う。後代のスクリーニングは、尾のDNAのPCRにより行う。トランスジェニック系統が確立されれば、次にそれを病理学的変化と相関させるため、ノーザンブロットおよびRT-PCR解析によりトランスジーンの発現パターンを調べる。
【０１４１】
次に、得られたトランスジェニック動物は腫瘍形成におけるFBP遺伝子の役割について調べることができる。ある実施形態では、例えば乳癌モデルとして用いるFBPトランスジーンを構築することができる。このようなマウスでFBP1遺伝子が過剰発現するとβ-カテニンのユビキチン化および分解が増強され、腫瘍抑制の表現型が現れると予測される。逆に、FBP1欠失変異体が過剰発現すると、β-カテニンの安定化が起こり、乳腺上皮の増殖が起こると予測される。これらの表現型は、第5.4節、第5.5節および第7節に記載されたものなどのアッセイにより雌雄双方のトランスジェニックマウスで試験することができる。
【０１４２】
もう1つの特定の実施形態では、Tリンパ球でFBP1トランスジーンを発現するトランスジェニックマウスを作出する。この実施形態では、CD4陽性および陰性双方のT細胞で発現を駆動するCD2プロモーターと、FBP遺伝子、例えば野生型および変異型FBP1遺伝子の最初のATGの上流に位置する配列とを融合させることにより、CD2/FBP1融合遺伝子を構築する。この構築物はまた、FBP遺伝子の下流にSV40ポリアデニル化領域を含んでもよい。上記のようにトランスジェニックマウスの作出および試験の後、FBPトランスジーンの発現を調べる。トランスジーンは胸腺および脾臓で発現する。野生型FBP1の発現はある表現型を生じると予測される。例えば、可能性のある、予測されるFBP1トランスジェニックマウスの表現型としては、IKBαの分解の増強、NFKBの活性化の増強、または細胞増殖の増強が挙げられる。逆に、ドミナントネガティブ変異体であるF-ボックスドメインを欠くFBP1が過剰発現すると、例えば、IKBαの安定化の増強、NFKBの活性化の低下、または細胞増殖の低下などの反対の作用が生じると予測される。このようなトランスジェニック表現型は第5.4節および第5.5節で用いられるようなアッセイによって調べることができる。
【０１４３】
もう1つの特定の実施形態では、トランスジェニックマウスのTリンパ球でSKP2遺伝子を発現させる。これまでとは逆に、F-ボックス欠損型はドミナントネガティブとして働き、p27を安定化させ、T細胞の活性化を阻害する。CD2/SKP2融合遺伝子の構築およびトランスジェニックマウスの作出については、FBP1 cDNAの代わりにCD2プロモーターによって制御される野生型および変異型SKP2 cDNAを用いること以外は、CD2/FBP融合遺伝子に関して上記したものと同じである。創始個体およびそれらの後代をSKP2トランスジーンおよび変異型SKP2トランスジーンの存在および発現に関して分析する。脾臓および胸腺でのトランスジーン発現はノーザンブロットおよびRT-PCRにより分析する。
【０１４４】
もう1つの特定の実施形態では、マウスのFBP1遺伝子座の不活性化によってトランスジェニックマウスを構築する。相同組換えによるマウスFBP1遺伝子座の不活性化は、1)FBP1に対するターゲッティングベクターの構築；2)ES+/-細胞の作製;3)ノックアウトマウスの構築；および4)表現型の同定；の4段階を含む。マウスFBP1遺伝子を同定および単離するには129 SVマウスゲノムファージライブラリーを用いる。適当な密度でバクテリオファージを平板培養し、アガロースディッシュ表面にナイロン膜を静かに重ねることで、プラークパターンのインプリントをとることができる。バクテリオファージ粒子およびDNAは毛管作用によってプラークパターンの正確なレプリカとしてフィルターに移行される。DNAを変性させた後、焼き付けによってフィルターに結合させ、その後、32P標識FBP1 cDNAとハイブリダイズさせる。過剰なプローブを洗い流した後、このフィルターをオートラジオグラフィーに曝す。フィルムと元の寒天プレートを並べることで確認したハイブリダイズプラークを、純粋なプラーク調製物を得るための二次・三次スクリーニングのために採取する。この方法を用いると、目的の領域、例えばF-ボックスをコードする領域にわたる陽性ファージが単離される。PCR、サザンハイブリダイゼーション、制限マッピング、サブクローニングおよびDNAシーケンシングを用いて、野生型FBP１遺伝子の部分構造が決定できる。
【０１４５】
相同組換えによってFbp1遺伝子座を不活性化するには、Fbp1遺伝子座のエキソン3が選択マーカー（例えばneoR遺伝子）によりアンチセンス方向で置き換えられる遺伝子ターゲッティングベクターを構築する。エキソン3はFbp1とSkp1との相互作用に重要であることが知られているF-ボックスモチーフをコードする。このターゲッティング構築物は選択マーカー遺伝子に隣接する相同性の短腕と長腕を有する。相同組換えESクローンはPCRでスクリーニングされることから、効率的な増幅を確保するためにこのベクターの腕の一方は比較的短い(2kb)。他方の腕は相同組換えの頻度を最大にするため＞6kbとなっている。このベクターの長い相同腕の末端に含まれるチミジンキナーゼ(tk)遺伝子は、ターゲッティングベクターを無作為に組み込むESクローンに対して付加的な陰性選択マーカー(ガンシクロビルを使用)を提供する。相同組換えは線状DNAを用いて起こることが多いので、ES細胞のトランスフェクションに先立ってこのターゲッティングベクターを線状化する。エレクトロポレーションを行い、胚性幹細胞クローンの薬剤選択を2回行った後、PCRおよびサザン解析を用いて、FBP1遺伝子座で相同組換えが起こっているどうかを調べる。サザン解析よりも多数のコロニーが分析できることから、PCRによるスクリーニングが有利である。さらに、PCRスクリーニングでは陰性クローンの迅速な除去が可能であるので、組換え体を同定している間、全てのクローンを生育させ、その後凍結するということが避けられる。この相同組換えの検出のためのPCR戦略は、一方のプライマーがターゲッティング構築物に特異的な配列（例えばネオマイシン遺伝子またはその他の選択マーカーの配列）に内在遺伝子座以外でアニーリングし、他方のプライマーがその構築物の外側に内在遺伝子座内の領域でアニーリングするように選択したプライマー対を用いることに基づくものである。サザン解析を用いて、相同組換え現象が起こったこと(相同短腕および相同長腕の双方で)、かつ、その組換え中に遺伝子複製現象が起こっていないことを確認する。
【０１４６】
このようなFBP1ノックアウトマウスを用いて、細胞内調節および増殖制御Fbplの役割を調べることができる。ある実施形態では、このようなFbp1を欠くマウスの表現型は細胞の肥厚および腫瘍形成の増強である。もう1つの実施形態では、FBP1を欠くマウスの表現型としては、限定されるものではないが、β-カテニン活性の増強、β-カテニンの安定化、細胞増殖の増強、IK-Bαの蓄積、NF-KB活性の低下、免疫応答不全、炎症、または細胞死すなわちアポトーシス活性の増強が挙げられる。あるいは、FBP1遺伝子の欠失は胚の致死に至ることがある。この場合、FBP1対立遺伝子においてヘテロ接合のマウスを上記アッセイを用いて調べることができ、ヌルFBPマウスの胚も上記のアッセイを用いて調べることができる。
【０１４７】
FBPトランスジーンを有するトランスジェニックマウスはまた、FBP遺伝子の発現および／またはFBP1遺伝子または遺伝子産物の合成または活性を調節し得る化合物のスクリーニングに使用することもできる。このような化合物およびスクリーニング法を開示する。
【０１４８】
5.3 F-ボックスタンパク質およびそれらの誘導体に対する抗体の作製
本発明によれば、F-ボックスモチーフ、その断片またはその他の誘導体もしくはその類似体を免疫源として用いて、かかる免疫源と免疫特異的に結合する抗体を作製することができる。このような抗体としては、限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーが挙げられる。特定の実施形態では、ヒトFBPタンパク質に対する抗体を作製する。
【０１４９】
別の実施形態では、FBPのドメイン(例えばF-ボックスドメインまたは基質結合ドメイン)に対する抗体を作製する。
【０１５０】
FBPまたは誘導体もしくは類似体に対するポリクローナル抗体を作製するには当技術分野で公知の種々の手法を用いることができる。特定の実施形態では、FBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP 14、FBP 15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25の配列またはその部分配列によってコードされるFBPのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体が得られる(Pagano, M., 1995,"From peptide to purified antibody", in Cell Cycle: Materials and Methods. M. Pagano編, Spring-Verlag. 217-281)。抗体の作製のためには、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどをはじめとする種々の宿主動物を天然FBP、またはその合成型、または誘導体(例えば断片)を注射することにより免疫化すればよい。宿主種にもよって異なり、限定されるものではないが、フロインドの(完全および不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにBCG(カルメット・ゲラン桿菌(bacille Calmette-Guerin))およびコリネバクテリウム・パルブム(corynebacterium parvum)などの有用であり得るヒトアジュバントをはじめとする種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることができる。
【０１５１】
FBP配列またはその類似体に対するモノクローナル抗体の作製のためには、連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供するいずれかの技術を用いることができる。例えば、KohlerおよびMilsteinによって最初に開発されたハイブリドーマ技術、ならびにトリオーマ技術(1975, Nature 256:495-497)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ技術(Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 77-96頁)がある。本発明のさらなる実施形態では、モノクローナル抗体は最近の技術を用いて無菌動物で作製することができる(PCT/US90/02545)。本発明によれば、ヒト抗体を使用でき、ヒト抗体はヒトハイブリドーマ(Coteら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030)を用いることで、あるいはヒトB細胞をin vitroにてEBVウイルスで形質転換させること(Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 77-96頁)によって得ることができる。実際、本発明によれば、FBPに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物活性のヒト抗体分子に由来する遺伝子とともにスプライシングすることよる、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature 312:604-608; Takedaら, 1985, Nature 314:452-454)を用いることができるが、このような抗体も本発明の範囲内にある。
【０１５２】
本発明によれば、一本鎖抗体の作製に関して記載された技術(米国特許第4,946,778号)をFBP特異的一本鎖抗体の作製に適用することができる。本発明のさらなる実施形態では、所望のFBP特異性を備えたモノクローナルFabフラグメント、誘導体または類似体の迅速かつ容易な同定を可能とするため、Fab発現ライブラリーの構築に関して記載されている技術(Huseら, 1989, Science 246:1275-1281)を用いる。
【０１５３】
その分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは公知の技術によって作製することができる。例えば、このようなフラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作製し得るF(ab')2フラグメント；F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製し得るFab'フラグメント；抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製し得るFabフラグメント、およびFvフラグメントが挙げられる。
【０１５４】
抗体の作製において所望の抗体のスクリーニングは、当技術分野で公知の技術、例えばELISA(酵素結合免疫検定法)によって達成することができる。例えば、FBPの特異的ドメインを認識する抗体を選択するには、作製されたハイブリドーマについてかかるドメインを含むFBP断片に結合する産物をアッセイすればよい。あるFBP相同物とは特異的に結合するが、別のFBP相同物とは特異的に結合しない抗体を選択するには、あるFBP相同物とは陽性結合を示し、別のFBP相同物とは結合しないことに基づいて選択することができる。
【０１５５】
F-ボックスモチーフなど、FBPの１ドメインに特異的な抗体も提供される。
【０１５６】
上記の抗体は、例えば診断法におけるこれらのタンパク質のイメージング、適当な生理学的サンプルでのそのレベルの測定など、本発明のFBP配列の位置決定および活性に関して当技術分野で公知の方法で使用することができる。
【０１５７】
本発明の別の実施形態(下記参照)では、抗FBP抗体、および結合ドメインを含むそのフラグメントを治療薬として用いる。
【０１５８】
5.4 F-ボックス タンパク質と相互作用する、かつ／またはそれらの酵素活性を阻害する薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
FBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25をはじめとするユビキチンリガーゼ複合体の新規な成分は細胞内タンパク質と相互作用して細胞増殖を調節する。本発明の1つの態様は、ユビキチンリガーゼ活性の可能性のある基質など、新規なユビキチンリガーゼと相互作用するポリペプチドもしくはペプチド、またはその他の化合物を同定するための、新規な化合物の断片、誘導体および類似体をアッセイおよびスクリーニングする方法を提供する。本発明はまた、新規なFBPと他のサブユニットまたはいくつかのユビキチンリガーゼ複合体（例えば、Skp1）との相互作用を調節または阻害する化合物、あるいは新規なFBPが相互作用するユビキチン化酵素を同定するためのスクリーニングアッセイも提供する。
【０１５９】
さらに別の実施形態では、本発明のアッセイは新規なユビキチンリガーゼまたはユビキチンリガーゼ複合体の既知の(例えば、Skp1)成分と新規または既知の基質との間の相互作用を阻害または調節するポリペプチドもしくはペプチドまたはその他の化合物を同定するために使用できる。限定されるものではないが、例として、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを用いて既知のユビキチンリガーゼ成分Skp2とその新規な基質p27との間の相互作用を妨げるペプチドまたはタンパク質を同定することができる。別の例としては、本スクリーニングアッセイを用い、FBP1とその新規な基質β-カテニンとの間の相互作用を妨げる化合物を同定する。また別の例では、本スクリーニングアッセイを用い、Skp2と別の推定基質E2Fとの間の相互作用を妨げる化合物を同定する。さらに別の例では、本スクリーニングアッセイを用い、FBP1と別の推定基質IKBαとの間の相互作用を妨げる化合物を同定する。
【０１６０】
さらに別の実施形態では、本発明のアッセイを用いて、新規なFBPの酵素アクチベーターを阻害または活性化するポリペプチドまたはペプチドを同定することができる。
【０１６１】
5.4.1  タンパク質-タンパク質相互作用のアッセイ
本発明のユビキチンリガーゼ複合体の新規な成分と相互作用するタンパク質の誘導体、類似体および断片は酵母ツーハイブリッドアッセイ系(FieldsおよびSong, 1989, Nature 340:245-246、および米国特許第5,283,173号)によって同定することができる。これらの相互作用は酵母でスクリーニングされることから、この系で検出される分子内タンパク質相互作用は哺乳類細胞における条件を模倣する生理学的条件下で行う(Chienら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9578-9581)。
【０１６２】
改良型酵母ツーハイブリッド系による相互作用タンパク質の同定は、レポーター遺伝子の発現の検出に基づくものであり、この場合、レポーター遺伝子の転写は、それぞれが転写レギュレーターの半分と融合した2つのタンパク質の相互作用による転写レギュレーターの再構築に依存する。「ベイト(bait)」タンパク質(すなわち、本発明のユビキチンリガーゼ複合体またはその誘導体もしくは類似体の新規な成分)と「プレイ(prey)」タンパク質(ベイトと相互作用する能力を試験するタンパク質)はそれぞれDNA結合ドメインおよび転写調節ドメイン(あるいはその逆)との融合タンパク質として発現する。種々の特定の実施形態では、このプレイは少なくとも約50、約100、約500、約1,000、約5,000、約10,000、または約50,000の複雑性を有するか、あるいはまた約25ないし約100,000、約100ないし約100,000、約50, 000ないし約100,000、または約100,000ないし約500,000の範囲の複雑性を有する。例えば、このプレイ集団はタンパク質の変異体(例えば、位置指定突然変異誘発またはヌクレオチド配列で突然変異を作り出す別の方法によって作製される)をコードする1以上の核酸であり得る。好ましくはこのプレイ集団は、DNA、例えばcDNAまたはゲノムDNAまたは合成により作製されたDNA、によってコードされるタンパク質である。例えばこれらの集団は、mRNA由来のまだ特性決定されていないcDNA集団サンプルに由来するcDNA配列を含んでなるキメラ遺伝子から発現させることができる。
【０１６３】
特定の実施形態では、ランダムペプチドを発現する組換え生物ライブラリーをプレイ核酸の供給源として使用することができる。
【０１６４】
一般に、ベイトおよびプレイ集団のタンパク質は、予め選択された配列に連続して各タンパク質を含んでなる融合(キメラ)タンパク質(好ましくはキメラコード配列の組換え発現による)として提供される。ある集団では、この予め選択される配列はDNA結合ドメインである。このDNA結合ドメインはそれがプロモーター内で特異的にDNA配列を認識する限り、いずれのDNA結合ドメインであってもよい。例えば、このDNA結合ドメインは転写アクチベーターまたはインヒビターのものである。他の集団では、この予め選択される配列はそれぞれ転写アクチベーターまたはインヒビターのアクチベータードメインまたはインヒビタードメインである。この調節ドメイン単独(タンパク質配列との融合物としてのものではない)およびDNA結合ドメイン単独(タンパク質配列との融合物としてのものではない)は検出可能な相互作用を行わないことが好ましい(アッセイにおいて擬陽性を避けるため)。このアッセイ系は、転写アクチベーターの(またはインヒビター)のDNA結合ドメインの結合部位を含むプロモーターと作動可能なように連結されたレポーター遺伝子をさらに含む。よって、本発明の本方法では、ユビキチンリガーゼ融合タンパク質とプレイ融合タンパク質が結合すると、レポーター遺伝子の発現を活性化する(または阻害する)転写アクチベーター(またはインヒビター)の再構成が起こる。このレポーター遺伝子の転写の活性化(または阻害)は細胞内、例えば原核または真核細胞内、好ましくは培養細胞内で起こる。
【０１６５】
レポーター遺伝子ヌクレオチド配列と作動可能なように連結されるプロモーターは、そのヌクレオチド配列の天然または非天然プロモーターであってよく、また、融合タンパク質のDNA結合ドメイン部分によって認識されるDNA結合部位は、そのプロモーター本来のもの(そのプロモーターが通常かかる結合部位を含む場合)であってもよいし、あるいはそのプロモーター本来のものでないものであってもよい。
【０１６６】
あるいは、所望の遺伝子の転写活性化結合部位を欠失させ、GAL4結合部位に置き換えることもできる(Bartelら, 1993, BioTechniques 14:920-924, Chasmanら, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:4746-4749)。このレポーター遺伝子は好ましくは、その発現が転写アクチベーターによって調節され、マーカーが細胞内で特定の相互作用の存在に応じてオンまたはオフされる、検出マーカーまたは選択マーカーをコードする配列を含む。好ましくは、このアッセイは、(例えば変異体細胞で、あるいは転写アクチベーターを含まない細胞で)背景レベルの転写アクチベーター不在下で行う。
【０１６７】
このアッセイで用いる活性化ドメインおよびDNA結合ドメインは、それらの転写アクチベーターが分離可能な結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有している限り、多様な転写アクチベータータンパク質に由来するものが使用できる。例えば、S.セレビシエのGAL4タンパク質(Maら, 1987, Cell 48:847-853)、S.セレビシエのGCN4タンパク質(Hope & Struhl, 1986, Cell 46:885-894)、S.セレビシエのARD1タンパク質(Thukralら, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2360-2369)、およびヒトエストロゲン受容体(Kumarら, 1987, Cell 51:941-951)は分離可能なDNA結合ドメインおよび活性化ドメインを有する。この融合タンパク質で用いるDNA結合ドメインおよび活性化ドメインは同じ転写アクチベーターに由来するものである必要はない。特定の実施形態では、GAL4またはLEXA DNA結合ドメインを用いる。別の特定の実施形態では、GAL4また単純ヘルペスウイルスVP16(Triezenbergら, 1988, Genes Dev. 2:730-742)活性化ドメインを用いる。特定の実施形態では、GAL4のアミノ酸1〜147(Maら, 1987, Cell 48:847-853; Ptashneら, 1990, Nature 346:329-331)がDNA結合ドメインであり、VP16のアミノ酸411-455(Triezenbergら, 1988, Genes Dev. 2:730-742; Cressら, 1991, Science 251:87-90)は活性化ドメインを含む。
【０１６８】
好ましい実施形態では、酵母転写因子GAL4がタンパク質-タンパク質相互作用によって再構成され、宿主株はGAL4変異体である。別の実施形態では、DNA結合ドメインはAce1Nであり、かつ／または活性化ドメインはAce1であり、それぞれAce1タンパク質のDNA結合ドメインおよび活性化ドメインである。Ace1は二価の銅の存在下でCUP1オペロンからの転写を活性化する酵母タンパク質である。CUP1は銅をキレートするメタロチオネインをコードし、CUP1タンパク質が発現すると、そうでなければ宿主細胞に有毒な銅の存在下でも増殖を可能とする。またレポーター遺伝子は再構成されたAce1N転写アクチベーターが結合するとβ-ガラクトシダーゼ酵素(通常の発色アッセイによって検出できる)を発現するCUP1-lacZ融合物であってもよい(Chaudhuriら, 1995, FEBS Letters 357:221-226)。別の特定の実施形態では、ヒトエストロゲン受容体のDNA結合ドメインを、1または3つのエストロゲン受容体応答エレメントによって駆動されるレポーター遺伝子とともに用いる(Le Douarinら, 1995, Nucl. Acids. Res. 23:876-878)。DNA結合ドメインおよび転写アクチベーター/インヒビタードメインは、各々融合タンパク質が発現される細胞内で機能的な核局在化シグナルを有することが好ましい(Ylikomiら, 1992, EMBO J. 11:3681-3694, DingwallおよびLaskey, 1991, TIBS 16:479-481)。
【０１６９】
コードされているタンパク質の単離を容易にするため、これらの融合構築物はアフィニティー精製のためのグルタチオン-S-トランスフェラーゼまたはマルトース結合タンパク質または利用できる抗体のエピトープなどのアフィニティータグ(例えばそれぞれグルタチオン、マルトースまたはエピトープに特異的な特定の抗体と結合する)をコードする配列をさらに含んでもよい(Allenら, 1995, TIBS 20:511-516)。別の実施形態では、これらの融合構築物は細菌細胞での融合タンパク質の組換え産生のための細菌プロモーター配列をさらに含んでなる。
【０１７０】
相互作用アッセイを行う宿主細胞は、レポーター遺伝子の転写が起こり、検出可能である限り、限定されるものではないが、哺乳類(例えばサル、マウス、ラット、ヒト、ウシ)、ニワトリ、細菌、または昆虫細胞をはじめとする、原核生物または真核生物いずれの細胞であってもよいが、酵母細胞が好ましい。結合ドメイン融合タンパク質、転写活性化ドメイン融合タンパク質およびレポーター遺伝子産物をコードし、かつ、それを発現できる発現構築物は、それらの発現構築物を含む細胞の接合により、あるいは細胞融合、形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどにより、宿主細胞内に提供される。
【０１７１】
酵母での2つの融合タンパク質集団の発現のための種々のベクターおよび宿主系統が知られており、それらを使用することができる(例えば、米国特許第5,1468,614号;Bartelら, 1993,"Using the two-hybrid system to detect protein-protein interactions"In: Cellular Interactions in Development, Hartley編, Practical Approach Series xviii, IRL Press at Oxford University Press, New York, NY, 153-179頁; FieldsおよびSternglanz, 1994, Trends In Genetics 10:286-292参照)。
【０１７２】
予め内因性レポーター遺伝子活性を欠いていなくとも、レポーター遺伝子における細胞変異体は公知の方法によって選択することができ、あるいはこれらの細胞はレポーター遺伝子を導入する前に公知の遺伝子破壊法によって標的レポーター遺伝子に変異を起こさせることができる(Rothstein, 1983, Meth. Enzymol. 101:202-211)。
【０１７３】
特定の実施形態では、種々の融合タンパク質集団をコードするプラスミドを、同時形質転換によって1以上のレポーター遺伝子を含む単一の宿主細胞(例えば、半数体酵母細胞)へ同時に導入して、タンパク質-タンパク質相互作用についてアッセイを行うことができる。あるいは好ましくは、2つの融合タンパク質集団を接合(例えば酵母細胞の場合)、または細胞融合(例えば哺乳類細胞の場合)のいずれかによって単一の細胞へ導入する。接合型のアッセイでは、それぞれ結合ドメイン融合発現構築物(好ましくはプラスミド)および活性化(または阻害)ドメイン融合発現構築物(好ましくはプラスミド)で形質転換した反対の接合型の半数体酵母細胞を接合させることで同じ二倍体細胞へ両構築物を送り込める。酵母株の接合型はHO遺伝子で形質転換することによって操作することができる(Herskowitzおよび Jensen, 1991, Meth. Enzymol. 194:132-146)。
【０１７４】
好ましい実施形態では、酵母サッカロミセス・セレビシエの株型aおよびαという２つのタイプの異なる宿主細胞を用いる酵母相互作用接合アッセイを用いる。この宿主細胞は好ましくは、それぞれ1以上のDNA結合ドメイン結合部位(例えば、転写アクチベーターのもの)を有する少なくとも2つのレポーター遺伝子を含む。このアクチベータードメインおよびDNA結合ドメインは、2つのそれぞれのタンパク質集団から形成されたキメラタンパク質の各部分である。一方の宿主細胞株、例えばa株はGAL4などの転写アクチベーターのDNA結合ドメインを含むヌクレオチド配列ライブラリーの融合物を含む。この宿主細胞セットで発現したハイブリッドタンパク質はレポーター遺伝子構築物中のプロモーター領域またはエンハンサー領域DNA結合部位を認識し得る。もう1つの酵母宿主細胞セット、例えばα株は転写アクチベーターの活性化ドメインと融合したDNA配列ライブラリーの融合物をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１７５】
別の実施形態では、これらの融合構築物は相同組換えによって酵母染色体へ直接導入する。この目的の相同組換えは酵母の栄養成長に必須ではない酵母配列、例えばMER2、MER1、ZIPI、REC102、またはME14遺伝子を媒介とする。
【０１７６】
また、バクテリオファージを用いてDNA結合ドメインおよび／または活性化ドメイン融合タンパク質を発現させることもできる。ライブラリーは一般に、プラスミドベクターからよりもバクテリオファージベクターからの方が迅速かつ容易に調製することができる。
【０１７７】
特定の実施形態では、本発明は、(a)第1の接合型であって、本発明の新規なユビキチンリガーゼ成分およびDNA結合ドメインの配列を含む第1の融合タンパク質を含んでなる第1の酵母細胞集団で本発明の新規なユビキチンリガーゼ成分またはその誘導体もしくは類似体を組換え発現させ、上記第1の酵母細胞集団は、第1の融合タンパク質と、転写活性化ドメインを含んでなる第2の融合タンパク質との相互作用が第1のヌクレオチド配列の転写の増強をもたらすよう、そのDNA結合ドメインによって認識される1以上のDNA結合部位によって駆動されるプロモーターと作動可能なように連結された第1のヌクレオチド配列を含み；(b) 上記第2の融合タンパク質の不在下で上記第1のヌクレオチド配列の転写の増強が起こる上記第1の集団においてネガティブ選択を行って酵母細胞を除去し；(c)上記第1の接合型とは異なる第2の接合型の第2の酵母細胞集団において、第2の各融合タンパク質がタンパク質の断片、誘導体または類似体および転写アクチベーターの活性化ドメイン(なお、この活性化ドメインは上記の各第2の融合タンパク質において同じものである)の配列を含む、上記第2の複数の融合タンパク質を組換え発現させ；(d)上記第1の酵母細胞集団と上記第2の酵母細胞集団を接合させて第3の二倍体酵母細胞集団を形成し、上記第3の二倍体酵母細胞集団は、第1の融合タンパク質と第2の融合タンパク質との相互作用が第2のヌクレオチド配列の転写の増強をもたらすよう、そのDNA結合ドメインによって認識されるDNA結合部位によって駆動されるプロモーターと作動可能なように連結された第2のヌクレオチド配列を含み、この第1と第2のヌクレオチド配列は同じであっても異なっていてもよく；さらに(e)上記第1および／または第2のヌクレオチド配列の転写の増強を検出し、それにより第1の融合タンパク質と第2の融合タンパク質の間の相互作用を検出することを含んでなる、1以上のタンパク質-タンパク質相互作用を検出する方法を提供する。
【０１７８】
5.4.2  可能性のある基質を含む既知のタンパク質とのF-ボックスタンパク質相互作用を同定するアッセイ
サイクリンファミリーに属するものまたはCki阻害タンパク質などの細胞周期調節タンパク質の細胞内存在量はユビキチン経路によって調節される。哺乳類の細胞周期調節のユビキチン化を担う酵素は知られていない。酵母では、SCF複合体が細胞周期レギュレーターのユビキチンリガーゼとなる。本発明の新規なF-ボックスタンパク質などのユビキチンリガーゼ複合体F-ボックス成分はユビキチンリガーゼ複合体の標的の特異性を決定する。従って本発明は、結合へ導く条件下でF-ボックスタンパク質核酸、タンパク質、または誘導体への特異的結合に関して既知分子をスクリーニングするアッセイを提供し、これによりFBPタンパク質と特異的に結合する分子が同定される。
【０１７９】
特定の実施形態では、本発明は、F-ボックスタンパク質FBP1とCul1/Skp1複合体の間の相互作用およびβ-カテニンの安定性の調節におけるその役割を研究する方法を提供する。タンパク質-タンパク質相互作用は、第7節の実施例に詳細に記載されるように、これらのタンパク質に特異的な抗体を用いてin vivoおよびin vitroでプローブすることができる。
【０１８０】
別の実施形態では、第8節に記載されるように、Skp2と、細胞周期によって調節されるサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)阻害剤であるp27との間の相互作用を検出する方法が提供される。Skp2とp27との間の相互作用を標的として、p27などの細胞周期レギュレーターとの相互作用をはじめとするSkp2活性のモジュレーターを同定することができる。p27などのSkp2特異的基質のユビキチン化はSkp2活性を調節する試験化合物の能力を測定する手段として使用できる。本発明のスクリーニングアッセイの別の実施形態では、第8節に記載されるように、免疫枯渇アッセイを用いてSkp2/p27相互作用のモジュレーターを同定することができる。特に第8節ではp27を基質として用いるin vitroでのユビキチン化活性の検出方法について記載し、これはまたSkp2依存性のp27のユビキチン化のモジュレーターを同定するためも使用できる。本発明のスクリーニングアッセイの別の実施形態では、第5.7.1節に記載されるようなアンチセンスオリゴヌクレオチドをSkp2活性の阻害剤として使用することができる。このようにして同定されたp27ユビキチン化/分解のモジュレーターおよび Skp2/p27相互作用のモジュレーターは抗癌治療に有用であり得る。
【０１８１】
別の特定の実施形態では、Skp2とCks1、およびSkp2、Cks1とp27の間の相互作用を検出する方法が提供される。Skp2とCks1、およびSkp2、Cks1とp27の間の相互作用を標的として、Cks1およびp27などの細胞周期に関与する分子との相互作用をはじめとするSkp2活性のモジュレーターを同定することができる。p27などのSkp2特異的基質のユビキチン化は、Cks1の存在下または不在下で、Skp2活性を調節する試験化合物の能力を測定する手段として用いることができる。第9節では、基質としてp27または187番にホスホトレオニンを含むもしくは含まないp27のカルボキシ末端に相当するホスホペプチドを用いる、Cks1を伴うまたは伴わないSkp2によるユビキチン化活性の検出のためのin vitroでの本発明のスクリーニングアッセイの別の実施形態を記載するが、これはまたSkp2に依存するp27のユビキチン化のモジュレーターを同定するためにも使用することができる。本発明のスクリーニングアッセイの別の実施形態では、第5.7.1節に記載されるようなアンチセンスオリゴヌクレオチドをSkp2活性の阻害剤として使用することができる。このようにして同定されたp27ユビキチン化/分解のモジュレーターおよび Skp2/Cks1/p27相互作用のモジュレーターは抗癌治療に有用であり得る。
【０１８２】
別の特定の実施形態では、本発明は、F-ボックスタンパク質Skp2と細胞周期の進行に関与する転写因子E2F-1との間の相互作用を検出する方法を提供する。昆虫細胞をSkp2とE2F-1を同時発現するバキュロウイルスに感染させ、これらの細胞抽出物を調製し、タンパク質-タンパク質相互作用を分析することができる。第10節に詳細に記載されるように、このアッセイはSkp2などの既知のF-ボックスタンパク質に関してE2Fなどの可能性のある標的を首尾よく同定するのに用いられている。このアッセイを用いてその他のSkp2標的ならびに新規なFボックスタンパク質の標的を同定することができる。
【０１８３】
本発明はさらに、可能性のあるユビキチン化の基質として既知の細胞周期調節分子を用い、ユビキチンリガーゼ活性の成分の1つとして新規なF-ボックスタンパク質(またはその断片)を有するユビキチンリガーゼ複合体をスクリーニングする方法を提供する。例えば、FBP核酸を発現するように操作した細胞を用い、推定されるユビキチンリガーゼ基質分子も発現する細胞で野生型またはドミナントネガティブ変異体いずれかのFBPタンパク質を組換え産生させることができる。本発明の新規なFBPのこのような基質候補としては、限定されるものではないが、IKBα、β-カテニン、myc、E2F-1、p27、p21、サイクリンA、サイクリンB、cycD1、サイクリンEおよびp53のような可能性のある基質が挙げられる。次にこれらの抽出物を用いて、F-ボックスタンパク質とそれらの基質との会合(ウエスタンブロット免疫アッセイにより測定)およびFBPの存在がそれら可能性のある基質のレベルを上昇または低下させるかどうかを調べることができる。
【０１８４】
5.5 F-ボックスタンパク質の活性を調節する化合物の同定のためのアッセイ
本発明は以下のサブセクションに記載されるin vitroおよびin vivoアッセイ系に関して、これを用いて、既知のFBPとユビキチンリガーゼ複合体の新規な基質および新規な成分との相互作用を調節する化合物または組成物を同定することができる。本発明のこれらのスクリーニングアッセイはまた、新規なFBPとそれらのユビキチンリガーゼ複合体の同定された基質および成分との相互作用を調節する化合物または組成物を同定するためにも使用できる。
【０１８５】
FBPの発現および活性を破壊または調節するそれらの能力に関して可能性のある薬剤をスクリーニングする方法は、出願者らによる新規なFBPの発見と、ユビキチンリガーゼ複合体の他の成分ならびにそれの既知および可能性のある基質との相互作用に基づいてデザインすることができる。例えば候補化合物を、FBPとSkp1の相互作用、またはSkp2とE2F-1、Skp2とCks1、Skp2とCks1およびp27、FBP1/Cul1/Skp1複合体とβ-カテニンとの特異的相互作用を調節するそれらの能力に関してスクリーニングすることができる。本発明のアッセイのデザインに際しては基本的に当業者に公知の多くの方法を容易に適用することができる。
【０１８６】
本発明のスクリーニングアッセイはまた、FBP発現および活性のモジュレーターを同定するハイスループットスクリーニングおよびアッセイも包含する。この実施形態によれば、以下に記載の系をキットとすることができる。この目的で、FBPおよびユビキチン化リガーゼ複合体およびユビキチン化経路の成分を発現する細胞、またはその細胞溶解物を、例えばバイアル、チューブ、マイクロタイターウェルプレート、ボトルなどの種々の容器にパッケージングすることができる。その他の試薬、例えば、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、バッファー、細胞培養培地なども別個の容器に入れ、キットとして提供することができる。
【０１８７】
本発明は、FBP遺伝子およびそれらの遺伝子産物と結合するあるいは直接相互作用するタンパク質および他の化合物の同定に有用なスクリーニング法を提供する。スクリーニング法は当技術分野で周知のものである(例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、1996年10月31日公開のPCT国際公報WO 96/34099)。これらのタンパク質および化合物は、同定された遺伝子およびタンパク質とin vivoで相互作用する、従って医薬おおよび治療的介入の新たな標的となる内因性細胞成分、ならびに結合能を有することにより医薬の候補となり得る、組換え、合成、およびその他の外因性化合物を含む。このように一連の実施形態において、正常型または変異型FBP遺伝子およびFBPタンパク質の1つと結合するタンパク質およびその他の化合物に関して細胞溶解物または組織ホモジネートをスクリーニングすることができる。
【０１８８】
あるいは、天然および／または合成双方の種々の外因性化合物のいずれか(例えば小分子またはペプチドのライブラリー)を結合能に関してスクリーニングすることができる。これらの方法は全てFBPタンパク質または断片と試験化合物を混合し、結合が生じている時間放置し、結合した複合体をアッセイする工程を含んでなる。このような方法は全て、実質的に純粋なFBPタンパク質、実質的に純粋な機能的ドメイン断片、融合タンパク質、抗体、ならびにそれらの作製方法および使用方法の本開示によって可能となる。
【０１８９】
5.5.1 F-ボックスタンパク質アゴニストおよびアンタゴニストのアッセイ
FBP核酸、F-ボックスタンパク質および誘導体は、FBP核酸、タンパク質または誘導体と特異的に結合し、従ってFBPのアゴニストまたはアンタゴニストとして可能性のある用途を有する分子、特に細胞増殖に影響を及ぼす分子を検出するスクリーニングアッセイで用いることができる。好ましい実施形態では、抗癌剤または創薬のリード化合物として潜在的に有用な分子をスクリーニングするためにかかるアッセイが行われる。本発明はこのようにFBP核酸、タンパク質または誘導体と特異的に結合する分子を検出するアッセイを提供する。例えば、FBP核酸を発現する組換え細胞は、これらのアッセイでFBPタンパク質を組換え産生させ、FBPタンパク質と結合する分子をスクリーニングするのに用いることができる。同様の方法を、FBP誘導体または核酸と結合する分子をスクリーニングするために使用することもできる。以上を行うのに使用できる方法は当技術分野で一般に知られている。本発明のアッセイはまず小スケール(すなわち試験管内)で至適化した後、ハイスループットアッセイへとスケールアップすることができる。本スクリーニングアッセイは、精製した成分または細胞溶解物を用いて、in vitroすなわち試験管内で行ってもよい。また、本発明のスクリーニングアッセイはインタクトな培養細胞および動物モデルで行ってもよい。本発明によれば、in vitroにおいて本明細書に記載のようにFBPの活性を調節することが示される試験化合物はさらに、培養細胞および動物モデルを含むin vivoでアッセイして、その試験化合物がin vivoでも同様の効果を有するかどうかを調べることができ、また、細胞周期の進行、正および負のレギュレーターの蓄積または分解、細胞増殖などに対するその試験化合物の効果を調べることができる。
【０１９０】
本発明によれば、新規なF-ボックスタンパク質の活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する分子を検出するようにスクリーニングアッセイをデザインし得る。本発明のこの態様によれば、試験化合物をアッセイ系に加えて新規なFBPの活性、すなわちその基質のユビキチン化、ユビキチンリガーゼ複合体の他の成分との相互作用などに対するその作用を測定することができる。これらのアッセイは試験化合物の存在下および不在下の双方で実施する必要がある。
【０１９１】
本発明によれば、試験化合物の存在下または不在下での新規なFBPのユビキチン化活性は、ユビキチン化経路の精製された成分を用いてin vitroで測定することもできるし、あるいは組織培養細胞または組織サンプルから得られた粗細胞抽出物を用いて測定してもよい。本発明の態様の別の実施形態では、スクリーニングはウサギ網状赤血球溶解物(RRL)系などのin vitro翻訳系に試験薬を加えた後、確立された分析を行うことによって実施することができる。別法として、上記の方法によって互いに相互作用することが示された成分を精製または部分精製したものを、試験薬を添加または添加せずに、それらの相互作用が通常起こる条件下に置き、相互作用を分析するために従前に確立された手法を用いてその試験薬の影響を評価することができる。このアプローチでは、これらの精製および部分精製成分は、ユビキチンリガーゼ複合体および経路の成分を発現する細胞の抽出物の分画化によって調製してもよいし、あるいはクローニングした遺伝子またはcDNAまたはその断片を発現させた後、所望によりその発現材料を精製することにより得てもよい。
【０１９２】
in vitro選択法の広範なカテゴリーの中で数種の方法が試験薬のスクリーニングに特に便宜的かつ／または有用であると思われる。これらには、限定されるものではないが、2以上のユビキチンリガーゼ複合体成分間の結合相互作用または標的基質との相互作用を測定する方法、相互作用成分の1つである酵素の活性を測定する方法、および「レポーター」タンパク質、すなわちそれらの成分の1つの制御下に置かれた酵素またはその他の検出可能もしくは選択可能なタンパク質の活性または発現を測定する方法が含まれる。
【０１９３】
2以上の成分間の結合相互作用は種々の方法で測定することができる。1つのアプローチとしては、容易に検出できる標識でそれら成分の1つを標識し、それを他の成分とともにそれらが通常相互作用する条件下に置き、結合していない標識成分から結合した標識成分を分離する分離工程を行い、その後、結合した成分の量を測定することである。結合反応物に含まれる試験薬の影響は、この薬剤の存在下で結合する標識成分の量とその不在下で結合する量を比較することで調べることができる。
【０１９４】
別の実施形態では、ライブラリーのメンバーと固相に固定化したFBPタンパク質(または核酸もしくは誘導体)とを接触させ、そのタンパク質(または核酸もしくは誘導体)に結合するライブラリーメンバーを回収することでスクリーニングを行うことができる。「パンニング」技術と呼ばれるこのようなスクリーニング法の例が、ParmleyおよびSmith, 1988, Gene 73:305-318; Fowlkesら, 1992, BioTechniques 13:422-427; PCT公報WO 94/18318;ならびに上記に挙げられている参照文献に例示されている。
【０１９５】
別の実施形態では、酵母において相互作用タンパク質またはペプチドを選択するツーハイブリッド系(Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246; Chienら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582)を用いてFBPタンパク質または誘導体と特異的に結合する分子を同定することができる。
【０１９６】
あるいは、試験方法は標的基質のユビキチン化などの酵素活性の測定に依存し得る。新規なFBPの基質が同定されると、あるいは、Skp2、E2Fおよびp27の新規な基質などのような公知のFBPの新規な推定基質が同定されると、これらの成分をアッセイで用いてユビキチンリガーゼ複合体のユビキチンリガーゼ活性に対する試験化合物の効果を測定することができる。
【０１９７】
ある実施形態では、これらのスクリーニングアッセイは試験化合物の存在下および不在下で精製された系を用いて行えばよい。精製基質を試験化合物の存在下または不在下で精製ユビキチンリガーゼ複合体、ユビキチン結合酵素、ユビキチン活性化酵素、およびユビキチンとともにインキュベートする。基質のユビキチン化は免疫アッセイによって分析する(Paganoら, 1995, Science 269:682-685参照)。要するに、50mM Tris pH7.5、5mM MgCl2、2mM ATPγ-S、0.1mM DTTおよび5μMのビオチニル化ユビキチン中に50〜200ngのタンパク質を含有する反応液中、in vitroにて基質のユビキチン化を行うことができる。全反応液(30μl)を試験化合物の存在下または不在下で3時間まで25℃でインキュベートした後、分析用の8% SDSゲルまたは4〜20%勾配ゲルにロードすることができる。これらのゲルを泳動させ、タンパク質をニトロセルロースに電気泳動的に移す。基質のユビキチン化は免疫ブロッティングによって検出することができる。ユビキチン化基質は、Extravidin-HRP(Sigma)または基質特異的抗体およびECL検出システム(NEN)を用いて可視化することができる。
【０１９８】
別の実施形態では、基質のユビキチン化は試験化合物の存在下および不在下、インタクトな培養細胞または動物モデルでアッセイすることができる。例えば、動物モデルまたは動物組織サンプルから得られた粗抽出物に試験化合物を直接投与し、試験化合物の存在下および不在下で基質のユビキチン化を測定することができる。これらのアッセイでは、試験化合物を加える宿主細胞は、ユビキチンリガーゼ経路のFBP成分および標的基質を発現するように遺伝子操作してもよく、この発現は一時的であっても、誘導性または構成的であっても、あるいは安定したものでもよい。本発明のスクリーニング方法の目的では、限定されるものではないが、組織培養細胞、哺乳類細胞、酵母細胞および細菌をはじめ多様な宿主細胞が使用できる。各細胞型は固有の利点と欠点を有する。ヒト組織細胞の一次培養物などの哺乳類細胞は本発明のアッセイを行う上では好ましい細胞型であるが、これらの細胞型は培養が難しい場合がある。細菌および酵母は培養は比較的容易であるが、哺乳類細胞とはタンパク質プロセッシングが異なる。このユビキチン化アッセイは以下のようにして行える：まず、ヒトまたは動物組織から抽出物を調製する。ユビキチン化酵素を保持する動物組織サンプルを調製するためには、1gの組織を切断し、Brinkmann Polytronホモジナイザー(PT 3000, Westbury, NY)を用い、1mlの氷冷再蒸留水中、15,000r.p.m.でホモジナイズし得る。このサンプルを3回凍結解凍させる。この溶解物をBeckman JA-20.1ローター(Beckman Instruments, Palo Alto, CA)で4℃にて45分間遠心分離させる。上清を回収し、-80℃で凍結する。全抽出物を調製する本方法でユビキチン化酵素は保存される(参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Lodaら 1997, Nature Medicine 3:231-234)。
【０１９９】
精製した組換え基質をアッセイ系に加え、100μgのタンパク質組織ホモジネート、50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、および1mM DTT、2mM ATP、10mMクレアチンホスホキナーゼ、10mMリン酸クレアチンおよび5μMビオチニル化ユビキチンを含有するユビキチン化混合物30μl中で、37℃にて種々の時間インキュベートする。次にこの基質を抗体またはアフィニティークロマトグラフィーで再精製する。基質のユビキチン化は基質に特異的な抗体またはExtravidin-HRPのいずれかを用いる免疫アッセイによって測定する。
【０２００】
また、FBPと表現型的に相互作用する遺伝子を検出するためにショウジョウバエ(Drosophila)をモデル系として使用することもできる。例えば、ショウジョウバエの眼でFBPが過剰発現すると小型の粗面眼となる。ハエゲノムの突然変異誘発を行った後、突然変異誘発の結果、小型の粗面眼の表現型が抑制または増強されたハエを選択する。なお、このようなハエで変異した遺伝子はFBPと相互作用/結合するタンパク質をコードしている可能性がある。上記の方法で同定された活性化合物を培養細胞および／または動物モデルで試験して、in vivoでのFBP活性の遮断効果(例えば、細胞増殖、基質の蓄積などの効果)を試験することができる。
【０２０１】
その他種々の実施形態において、一般に知られている多くの方法のうちの1つによってスクリーニングを達成することができる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示している以下の参照文献：ParmleyおよびSmith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; ScottoおよびSmith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkesら, 1992; BioTechniques 13:422-427; Oldenburgら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yuら, 1994, Cell 76:933-945; Staudtら, 1988, Science 241:577-580; Bockら, 1992, Nature 355:564-566; Tuerkら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellingtonら, 1992, Nature 355:850-852;米国特許第5,096,815号、同第5,223,409号および同第5,198,346号(全てLadnerらによる); RebarおよびPabo, 1993, Science 263:671-673;ならびにPCT公報WO 94/18318参照。
【０２０２】
化合物、ペプチドおよび小分子をスクリーニングアッセイで用いて候補となるアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。ある実施形態では、ペプチドライブラリーを用いて本発明のFBPのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることができ、ランダムまたはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーなどの多様なライブラリーをFBPと特異的に結合する分子に関してスクリーニングすることができる。使用できる多くのライブラリーが当技術分野で公知であり、例えば化学合成ライブラリー、組換えライブラリー(例えば、ファージディスプレイライブラリー)、およびin vitro翻訳に基づくライブラリーがある。
【０２０３】
化学合成ライブラリーの例は、Fodorら, 1991, Science 251:767-773; Houghtenら, 1991, Nature 354:84-86; Lamら, 1991, Nature 354:82-84; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710; Gallopら, 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; Ohlmeyerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erbら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghtenら, 1992, Biotechniques 13:412; Jayawickremeら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmonら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; PCT公報WO 93/20242;ならびにBrennerおよびLerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383に記載されている。
【０２０４】
ファージディスプレイライブラリーの例は、ScottおよびSmith, 1990, Science 249:386-390; Devlinら, 1990, Science, 249:404-406; Christianら, 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718; Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kayら, 1993, Gene 128:59-65;ならびに1994年8月18日付けのPCT公報WO 94/18318に記載されている。
【０２０５】
in vitro翻訳に基づくライブラリーとしては、限定されるものではないが、1991年4月18日付けのPCT公報WO 91/05058; およびMattheakisら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026に記載されているものが含まれる。
【０２０６】
非ペプチドライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー(例えば、Buninら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712)が使用できる。またペプトイドライブラリー(Simonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371)も使用できる。使用できるその他のライブラリーの例としては、ペプチド中のアミド官能基を過メチル化して作製した化学変換コンビナトリアルライブラリーがあり、Ostreshら(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142)に記載されている。
【０２０７】
5.5.2 F-ボックスタンパク質とその他のタンパク質との相互作用を調節する化合物を同定するアッセイ
第5.4節に詳細に記載したように基質または相互作用タンパク質が同定されれば、次にかかるタンパク質とのF-ボックスタンパク質相互作用のモジュレーターに関してアッセイすることができる。本発明はこのような相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを検出する方法を提供する。
【０２０８】
ある実施形態において本発明は、第7節および図10で特定されたF-ボックスタンパク質Skp2とE2F-1との間の相互作用のインヒビターまたはアゴニストなどのモジュレーターを同定する方法を包含する。このような方法は、モジュレーター活性に関するin vivoおよびin vitro双方のアッセイを含む。例えば、in vivoアッセイでは、昆虫細胞を、Skp2およびE2F-1を同時発現するバキュロウイルスならびにSkp2/E2F-1相互作用の可能性のあるモジュレーターで同時感染させることができる。本発明のスクリーニング方法は上記第5.5.1節に記載されたようにSkp2の酵素活性を阻害する試験化合物の能力を測定するin vitroアッセイを包含する。細胞抽出物を調製し、ゲル電気泳動によってタンパク質-タンパク質相互作用を分析し、第7節に詳細に記載され、図10に示されるように免疫ブロッティングによって検出することができる。あるいは、in vitroタンパク質-タンパク質相互作用アッセイを用いることもできる。組換え精製Skp2、E2F-1および推定アゴニストまたはアンタゴニスト分子を、37℃30分など結合が起こる条件下でともにインキュベートすることができる。タンパク質-タンパク質複合体の形成は本明細書の第7節に記載のようなゲル分析によって検出することができる。このアッセイを用い、Skp2などの既知のFBPと新規な基質との相互作用のモジュレーターを同定することができる。
【０２０９】
別の実施形態では、本発明はF-ボックスタンパク質/Skp1相互作用のモジュレーターの同定方法を提供する。かかるアゴニストおよびアンタゴニストはin vivoまたはin vitroで同定することができる。例えば、F-ボックスタンパク質/Skp1相互作用のモジュレーターを同定するin vitroアッセイでは、37℃30分など結合が起こる条件下で精製Skp1と新規なFBPをともにインキュベートすることができる。並行反応では、上記第5.5.1節に記載のように可能性のあるアゴニストまたはアンタゴニストをボックスタンパク質/Skp1インキュベーションの前、またはインキュベーション中のいずれかに加える。タンパク質-タンパク質相互作用は本明細書の第7節に記載されるようなゲル分析によって検出することができる。FBP活性および他のタンパク質との相互作用のモジュレーターは、本明細書の第5.7節に記載の方法を用い、治療薬として使用することができる。
【０２１０】
これらのアッセイは以下のin vitroアッセイをはじめ、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかを用いて行うことができる。このスクリーニングは、ユビキチン経路の成分を発現するインタクトな細胞に試験薬を添加した後、確立されているいずれかの方法によって目的の成分を調べることによって行うことができる。あるいは、このスクリーニングは、in vitro翻訳反応液に試験薬を添加した後、確立された分析を行うことにより行うことができる。別法としては、上記の方法によって互いに相互作用するものと判断された精製または部分精製成分を、試験薬を添加してまたは添加せずに、それらの間の相互作用が通常起こる条件下に置けばよく、この相互作用を分析するために従前に確立された手法を用いてこの試験薬の影響を評価することができる。このアプローチでは、精製または部分精製成分は、ユビキチンリガーゼ複合体および経路の成分を発現する細胞の抽出物を分画することにより調製してもよいし、あるいはクローニングした遺伝子またはcDNAもしくはまたはその断片を発現させた後、所望によりその発現物質を精製することによって得てもよい。
【０２１１】
in vitro選択法の広範なカテゴリーの中で数種の方法が試験薬のスクリーニングに特に便宜的かつ／または有用であると思われる。これらには、限定されるものではないが、2以上のユビキチンリガーゼ複合体成分間の結合相互作用または標的基質との相互作用を測定する方法、相互作用成分の1つである酵素の活性を測定する方法、および「レポーター」タンパク質、すなわちそれらの成分の1つの制御下に置かれた酵素またはその他の検出可能もしくは選択可能なタンパク質の活性または発現を測定する方法が含まれる。
【０２１２】
2以上の成分間の結合相互作用は種々の方法で測定することができる。1つのアプローチとしては、容易に検出できる標識でそれら成分の1つを標識し、それを他の成分とともにそれらが通常相互作用する条件下に置き、結合していない標識成分から結合した標識成分を分離する分離工程を行い、その後、結合した成分の量を測定することである。結合反応物に含まれる試験薬の影響はは、この薬剤の存在下で結合する標識成分の量とその不在下で結合する量を比較することで調べることができる。
【０２１３】
この種の手法における分離工程は種々の方法で達成することができる。1つのアプローチでは、標識成分の結合相手(の1つ)を結合反応に先立ち固相に固定化することができ、結合しなかった標識成分は結合反応後に固相を洗浄することで除去することができる。結合相手の固相への結合は、限定されるものではないが、化学的架橋、プラスチック面への非特異的接着、固相に結合させた抗体との相互作用、結合相手に結合させたリガンド(ビオチンなど)と固相に結合させたリガンド結合タンパク質(アビジンまたはストレプトアビジンなど)の間の相互作用などをはじめとする、当業者に公知の種々の方法で達成することができる。
【０２１４】
あるいは、この分離工程は、液相で標識成分をその結合相手と相互作用させた後に達成することもできる。標識成分とその結合相手との大きさの違いがこのような分離を可能とする場合には、その孔が結合相手と結合していない標識成分は通過させるけれども結合相手または結合相手と結合している標識成分は通過させない限外濾過フィルターに結合反応生成物を通すことで分離が達成できる。また、結合相手に対する抗体、結合相手に予め結合させたリガンドと相互作用し得るリガンド結合タンパク質などのような、溶液から標識成分の結合相手を補足し得るいずれかの試薬を用いて分離を達成することもできる。
【０２１５】
5.6 F-ボックス、誘導体、およびモジュレーターの診断用途のための方法および組成物
細胞周期レギュレーターは癌遺伝子(サイクリン、β-カテニンなど)または腫瘍抑制遺伝子(ckis、p53など)の産物である。従って、ユビキチンリガーゼ複合体の一部であるFBPは、それらが細胞内存在量を調節する細胞周期調節タンパク質がどちらかによって、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の産物であり得る。
【０２１６】
FBPタンパク質、その類似体、誘導体、および部分配列、FBP核酸(およびそれと相補的な配列)、抗FBP抗体は診断用途を有する。FBPおよびFBP核酸は、腫瘍形成、癌腫、腺癌などをはじめとする増殖性または分化性疾患を検出、予測または診断するアッセイに使用できる。本発明の新規なFBP1核酸は核型の異常およびヘテロ接合性の欠如に関連する染色体部位に存在する。本発明のFBP核酸は染色体位置10q24にマッピングおよび限局化されているが、ヒト前立腺癌および小細胞肺癌(SCLC)の10%でこの欠損が示されており、このことは腫瘍抑制遺伝子がこの位置に存在することを示唆している。さらに、小児急性T細胞白血病の7%までがt(10;14)(q24;q11)またはt(7;10)(q35;q24)のいずれかのブレークポイントとしての10q24関連の転座を伴っている。9q34領域(FBP2が位置する)はヒト卵巣癌および膀胱癌においてヘテロ接合性の欠如(LOH)部位であることが示されている。本発明のFBP2核酸は、ヒト卵巣癌および膀胱癌においてヘテロ接合性の欠如(LOH)部位であることが示されている染色体位置9q34にマッピングおよび限局化されている。本発明のFBP3核酸はヒトSCLCのおよそ75%でヘテロ接合性を欠如する推定腫瘍抑制遺伝子を含むことが知られている染色体位置13q22にマッピングおよび限局化されている。本発明のFBP4核酸は、ヒト乳癌および鼻咽頭癌腫をはじめとする種々の腫瘍において核型異常の部位であることが知られている領域である染色体位置5p12にマッピングおよび限局化されている。本発明のFBP5核酸は、ヒト卵巣癌、乳癌および胃癌、肝癌腫、バーキットリンパ腫、神経膠腫、および副甲状腺癌においてヘテロ接合性欠如部位であることが示されている領域である染色体位置6q25-26にマッピングおよび限局化されている。本発明のFBP7核酸は乳癌および大腸癌における転移部位の進行および副甲状腺癌における異型結合性の欠如に関連する腫瘍抑制遺伝子を含む領域である染色体位置15q15にマッピングおよび限局化されている。
【０２１７】
本発明の分子は免疫アッセイなどのアッセイにおいて、FBP発現に影響がおよぶ種々の症状、疾病および疾患を検出、予測、診断または監視する、あるいはその治療を監視するために使用できる。特に、かかる免疫アッセイは、免疫特異的結合が起こり得る条件下で患者由来のサンプルを抗FBP抗体と接触させ、その抗体による免疫特異的な結合量を検出または測定することを含んでなる方法によって行う。特定の態様では、組織切片におけるこのような抗体の結合を用いて異常なFBP局在または異常な(例えば、低いまたは存在しない)レベルのFBPを検出することができる。特定の実施形態では、FBPに対する抗体を用いて、患者組織または血清サンプルをFBPの存在に関してアッセイすることができ、ここでは異常なレベルのFBPが病状の指標となる。「異常なレベル」とは、罹患していない身体の一部または罹患していない被験者に由来する同等のサンプル中に存在するレベルまたは存在するレベルを代表する標準レベルに対して高いレベルまたは低いレベルを意味する。
【０２１８】
使用できる免疫アッセイとしては、限定されるものではないが、少数の例を挙げれば、ウエスタンブロット、免疫組織化学ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫検定)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイなどの技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられる。
【０２１９】
また、FBP遺伝子、ならびに相補配列をはじめとする関連の核酸配列および部分配列はハイブリダイゼーションアッセイでも使用することができる。FBP核酸配列は、または少なくとも約8ヌクレオチドを含むその部分配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイは、上記の記載のようにFBPの発現および／または活性の異常な変化に関連する症状、疾患または病態を検出、予測、診断または監視するために使用することができる。特にかかるハイブリダイゼーションアッセイは、ハイブリダイゼーションが起こり得る条件下で核酸を含有するサンプルと、FBP DNAまたはRNAとハイブリダイズし得る核酸プローブとを接触させ、生じたハイブリダイゼーションを検出または測定することを含んでなる方法によって行う。
【０２２０】
特定の実施形態では、FBPタンパク質、FBP RNA、またはFBP機能活性(例えば、ユビキチンリガーゼ標的結合活性、F-ボックスドメイン結合活性、ユビキチンリガーゼ活性など)のレベルの低下を検出することにより、あるいはFBPの発現または活性の低下を引き起こすFBP RNA、DNAまたはFBPタンパク質における突然変異(例えば、FBP核酸の転座、FBP遺伝子またはタンパク質の末端切断、野生型FBPに対するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化)を検出することにより、細胞の過剰増殖に関わる疾病および疾患を診断することができ、あるいはそれらの疑わしい存在をスクリーニングすることができ、あるいはこのような疾患を発症する疾病素因を検出することができる。このような疾病および疾患としては、限定されるものではないが、第5.7.3節に記載のものが挙げられる。例としては、FBPタンパク質のレベルは免疫アッセイによって検出することができ、FBP RNAのレベルはハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーション)によって検出することができ、FBP活性はin vivoまたはin vitroで生じたE3ユビキチンリガーゼ複合体におけるユビキチンリガーゼ活性を測定することによってアッセイすることができ、F-ボックスドメイン結合活性は当技術分野で一般に公知の結合アッセイによりSkp1タンパク質への結合を測定することによってアッセイすることができ、FBP核酸における転座、欠失および点突然変異はサザンブロット、FISH、RFLP解析、SSCP、好ましくはFBP遺伝子の少なくとも大部分にわたる断片を生じプライマーを用いるPCR、その患者から得られたFBPゲノムDNAまたはcDNAの配列決定などによって検出することができる。
【０２２１】
好ましい実施形態では、患者サンプルにおけるFBP mRNAまたはタンパク質のレベルを検出または測定するが、場合によって、そこでのレベルの低下はその被験者が悪性または過増殖性疾患を有するかまたは発症する疾病素因を有することを示し、また、このレベルの低下は悪性または過増殖性疾患を有さない身体の部分または有さない被験者由来の同等のサンプル中のレベルに対してのものである。
【０２２２】
別の特定の実施形態では、細胞増殖の欠陥に関わる疾病および疾患または細胞の増殖が治療上望ましい疾病および疾患を、FBPタンパク質、FBP RNA、またはFBP機能活性(例えば、ユビキチンリガーゼ活性、Skp1結合活性など)のレベルの上昇を検出することにより、あるいはFBPの発現または活性の上昇を引き起こすFBP RNA、DNAまたはタンパク質における突然変異(例えば、FBP核酸の転座、その遺伝子またはタンパク質の末端切断、野生型FBPに対するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化)を検出することにより、診断することができ、あるいはそれらの疑わしい存在をスクリーニングすることができ、あるいはこのような疾患を発症する疾病素因を検出することができる。このような疾病および疾患としては、限定されるものではないが、第5.7.3節に記載のものが挙げられる。例としては、FBPタンパク質のレベル、 FBP RNAのレベル、ユビキチンリガーゼ活性、FBP結合活性、および転座または点突然変異の存在を上記のように測定することができる。
【０２２３】
特定の実施形態では、患者サンプルにおけるFBP mRNAまたはタンパク質のレベルを検出または測定するが、場合によって、そこでのレベルの上昇はその被験者が増殖欠陥または退化性もしくは低増殖性疾患を有するか、または発症する疾病素因を有することを示し、また、このレベルの上昇は増殖欠陥または退化性もしくは低増殖性疾患を有さない身体の部分または有さない被験者由来の同等のサンプル中のレベルに対してのものである。
【０２２４】
また、1以上の容器に抗FBP抗体および所望によりその抗体の標識結合相手を含んでなる診断用キットも提供される。あるいは、この抗FBP抗体は標識可能である(検出マーカー、例えば化学発光、酵素、蛍光または放射活性成分による)。また、1以上の容器にFBP RNAとハイブリダイズし得る核酸プローブを含んでなるキットも提供される。特定の実施形態では、キットは1以上の容器に、適当な反応条件下でFBP核酸の少なくとも一部の増幅をプライミングし得る[例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(例えば、Innisら, 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA参照)、Qレプリカーゼを用いるリガーゼ連鎖反応(欧州特許EP320,308参照)、環状プローブ反応、またはその他当技術分野で公知の方法による]一対のプライマー(例えば、各々6〜30ヌクレオチドの大きさ)を含み得る。キットは所望により1つの容器に例えば標品または対照として用いる所定量の精製FBPタンパク質または核酸をさらに含み得る。
【０２２５】
5.7 F-ボックスタンパク質、誘導体、およびモジュレーターの治療用途のための方法および組成物
増殖性疾患の治療においてF-ボックスタンパク質を用いる方法および組成物が以下に記載され、発癌性疾病の徴候は、FBPを活性化するまたはFBPの活性を増強する化合物によって改善され、それにより増殖性疾患および癌が改善され得る。
【０２２６】
特定の例では、FBPの活性を上昇させる、または増強する化合物および方法を用いて、増殖性および発癌性疾病の徴候を治療することができる。このようなケースには、例えば、少なくとも部分的なFBP遺伝子発現のレベルの低下またはFBP遺伝子産物の活性のレベルの異常によってもたらされる増殖性疾患が含まれる。例えば、その基質がサイクリンファミリーのメンバーなど正の細胞周期レギュレーターであるユビキチンリガーゼ複合体のFBP成分の活性の低下または不十分な発現は細胞増殖の上昇をもたらす。遺伝子発現のレベルおよび／またはかかるFBP遺伝子産物の活性の上昇はそれ自体、増殖性疾患の徴候の改善をもたらす。
【０２２７】
別の例として、FBPの活性を上昇させる、または増強する化合物を用いて、FBP基質分子などの細胞周期の制御に関与するその他の遺伝子および遺伝子産物の発現または活性の欠陥に起因する増殖性および発癌性疾患の徴候を治療することができる。例えば、サイクリンファミリーのメンバーなどの正の細胞周期分子の発現または活性の上昇はその過剰活性をもたらし、それにより細胞増殖の増大をもたらす。基質がこのような正の細胞周期レギュレーターであるユビキチンリガーゼ複合体のFBP成分の発現または活性を上昇させる化合物は、欠陥分子のユビキチン化をもたらし、それによりその分解の増大をもたらす。このような欠陥による疾病徴候は、FBP活性の上昇によりその疾患を補償する化合物によって改善され得る。FBP遺伝子発現レベルまたは遺伝子産物の活性レベルを上昇させる技術は以下の第5.7節に論じられている。
【０２２８】
あるいは、FBP活性を低下または不活性化させる化合物および方法を増殖性疾患および発癌性疾患の徴候を改善するために治療的に使用することもできる。例えば、増殖性疾患は少なくとも部分的にその過剰活性をもたらす欠陥型FBP遺伝子または遺伝子産物によって引き起こされ得る。このような欠陥型遺伝子産物が、その標的がCkiなどの細胞周期阻害分子であるユビキチンリガーゼ複合体の成分である場合、過剰活性型のFBPが細胞周期分子レベルの低下、従って細胞増殖の上昇をもたらす。このような場合、FBP機能を低下または不活性化する化合物および方法を用いてその疾病徴候を治療することができる。
【０２２９】
別の例では、FBPの活性を低下させる化合物および方法を用いて、FBP基質分子などの細胞周期の制御に関与する他の遺伝子および遺伝子産物の発現または活性の欠損に起因する疾患を治療することができる。例えば、Ckiなどの負の細胞周期調節分子の発現または活性の欠損はその不十分な活性をもたらし、それにより細胞増殖の増大をもたらす。その基質がこのような分子であるFBP成分のレベルおよび／または活性の低下はユビキチン化を低下させ、それによりこのような欠陥型分子のレベルを上昇させる。従って、このようなFBP分子の発現および／または活性の低下を目的とする化合物および方法はこの欠陥型遺伝子または遺伝子産物を補償することにより疾病徴候の治療に用いることができる。
【０２３０】
標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物の活性レベルを低下させる技術は以下の第5.7節に論じられている。
【０２３１】
5.7.1  阻害的アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん分子、ならびに同定されたアゴニストおよびアンタゴニストの治療的使用
別の実施形態では、腫瘍形成または癌を引き起こす増殖性または分化性疾患などの特定のFBP障害の徴候が、FBP遺伝子発現レベルを低下させるために、FBP遺伝子配列を周知のアンチセンス、遺伝子「ノックアウト」リボザイムおよび／または三重らせんと組み合わせて用いることで、FBP遺伝子発現および／またはFBP遺伝子産物活性のレベルを低下させることにより改善され得る。癌などのFBP障害の徴候を改善する能力をはじめ、FBP遺伝子の活性、発現または合成を調節する能力を示し得る化合物としてはアンチセンス、リボザイムおよび三重らせん分子がある。このような分子は、損なわれていないか適当であれば変異型いずれかの標的遺伝子活性を低下または阻害するようデザインすることができる。このような分子の作製および使用するための技術は当業者に周知のものである。例えば、第X節(図X)に記載のように、SKP2 mRNAを標的とするアンチセンスはSkp2基質p27を安定化する。
【０２３２】
アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的とするmRNAとハイブリダイズしてタンパク質の翻訳を妨げることで、mRNAの翻訳を直接遮断する働きをする。アンチセンスアプローチは標的遺伝子mRNAに相補的なオリゴヌクレオチドのデザインを含む。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的な標的遺伝子mRNA転写産物と結合して翻訳を妨げる。絶対的な相補性は好ましいが、必ずしも必要ではない。
【０２３３】
本明細書においてRNAの一部と「相補的な」配列とは、RNAとハイブリダイズして安定した二重らせんを形成し得るに十分な相補性を有する配列を意味し、二本鎖アンチセンス核酸の場合には、従って二重らせんDNAの一本鎖を試験するか、または三重らせんの形成をアッセイすればよい。ハイブリダイズ能はアンチセンス核酸の相補性の程度と長さの双方によって異なる。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほどそれが含むRNAとの塩基の誤対合が増え、なお、安定した二重らせん(三重らせんの場合もある)を形成する。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を調べる標準的な手法を用いることで、誤対合の許容度を確認することができる。
【０２３４】
ある実施形態では、FBP遺伝子の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドを内因性FBP mRNAの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに用いることができる。アンチセンス核酸は少なくとも6ヌクレオチドの長さでなければならず、好ましくはオリゴヌクレオチドは6ないし約50ヌクレオチドの範囲の長さである。特定の態様では、このオリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチドまたは少なくとも50ヌクレオチドである。
【０２３５】
本発明のある実施形態では、図2および4〜9に示されているようなF-ボックスモチーフをコードする核酸に相補的なオリゴヌクレオチドである。
【０２３６】
標的配列の選択に関わらず、遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量するin vitro試験をまず行うのが好ましい。これらの試験はアンチセンス遺伝子阻害とオリゴヌクレオチドの非特異的生物作用を識別する対照を利用することが好ましい。また、これらの試験では標的RNAまたはタンパク質のレベルと内部対照RNAまたはタンパク質のそれとを比較することも好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と対照オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果とを比較することも考えられる。対照オリゴヌクレオチドは試験オリゴヌクレオチドとおよそ同じ長さのものであること、また、そのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が標的配列との特異的ハイブリダイゼーションを妨げるのに必要とされる分だけアンチセンス配列と異なっていることが好ましい。
【０２３７】
これらのオリゴヌクレオチドはDNAもしくはRNA、またはそのキメラ混合物または誘導体または修飾型であってよく、一本鎖でもあっても二本鎖であってもよい。このオリゴヌクレオチドは、例えば分子およびハイブリダイゼーション等の安定性を向上させるために塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で修飾することができる。このオリゴヌクレオチドはペプチドなどの他の補助基(例えば、in vivoで宿主細胞受容体を標的とするため)、または細胞膜を通過する輸送を促進する薬剤(例えば、Letsingerら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86,6553-6556; Lemaitreら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84,648-652; 1988年12月15日公開のPCT公報WO 88/09810参照)、または血液脳関門を通過する輸送を促進する薬剤(例えば、1988年4月25日公開のPCT公報WO 89/10134参照)、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤(例えば、Krolら, 1988, BioTechniques 6,958-976参照)またはインターカレート剤(例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5,539-549参照)を含んでもよい。この目的で、このオリゴヌクレオチドは他の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などと結合させてもよい。
【０２３８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクエオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクエオシン、5-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンを含む群より選択される少なくとも1つの修飾塩基部分を含んでなってもよい。
【０２３９】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、限定されるものではないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシロースおよびヘキソースを含む群より選択される少なくとも1つの修飾糖部分を含んでなってもよい。
【０２４０】
さらに別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート(S-ODNs)、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはその類似体からなる群より選択される少なくとも1つの修飾リン酸主鎖を含んでなる。
【０２４１】
さらに別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドはアノマーオリゴヌクレオチドである。アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のユニットとは対照的に遺伝子鎖が互いに平行に走る相補的RNAと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する(Gautierら, 1987, Nucl. Acids Res. 15,6625-6641)。このオリゴヌクレオチドは、2-O-メチルリボヌクレオチド(Inoueら, 1987, Nucl. Acids Res. 15,6131-6148)またはキメラRNA-DNA類似体(Inoueら, 1987, FEBS Lett. 215,327-330)である。
【０２４２】
本発明のオリゴヌクレオチドは例えば自動DNAシンセサイザー(Biosearch, Applied Biosystemsなどから市販されているものなど)を用いて当技術分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。例としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはSteinら(1988, Nucl. Acids Res. 16,3209)の方法によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは孔径制御グラスポリマー支持体(Sarinら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85,7448-7451)などを用いることで調製できる。
【０２４３】
標的遺伝子コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドも使用できるが、転写、翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【０２４４】
本発明のある実施形態では、特異的標的mRNAがアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(S-ODN)とハイブリダイズさせた後にRNアーゼHで消化されることから、遺伝子発現のダウンレギュレーションが達成される。どのアンチセンスS-ODNがより効を奏するのかを予測する法則はないので、最良の方法論は完全に経験によるものであり、いくつかのアンチセンスS-ODNを試してみることからなる。アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(S-ODN)は目的のmRNAの特異的領域を標的とするようデザインする。アンチセンスS-ODNのスクランブル配列からなる対照S-ODNもまた、同じヌクレオチド含量を確保し、核酸含量による潜在的な差異を最小にするようデザインする。S-ODNは全てOligos Etc.(Wilsonville, OR)によって合成することができる。研究目的のアッセイまたはex vivo遺伝子治療プロトコールなどのように培養細胞に適用する場合のアンチセンス分子の有効性を試験するためには、細胞を100mm組織培養プレートで60〜80%密集まで増殖させ、PBSですすぎ、 8ml Opti-MEM、52.8lリポフェクチン、および最終濃度200nMのS-ODNからなるリポフェクション混合物を重層する。リポフェクションはリポフェクチン試薬およびOpti-MEM(Gibco BRL)を用いて行う。細胞をこのリポフェクション混合物の存在下で5時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を完全DMEM培地に交換する。リポフェクション後の種々の時点で細胞を回収し、タンパク質レベルをウエスタンブロットにより分析する。
【０２４５】
アンチセンス分子は、標的遺伝子を発現する細胞を、in vivoにて被験者に直接、またはex vivo遺伝子治療プロトコールなどにおける培養細胞を標的としなければならない。アンチセンスDNAまたはRNAを細胞へ送達するためにいくつかの方法が開発されており、例えば、アンチセンス分子は組織部位に直接注射することもできるし、あるいは所望の細胞を標的とするようにデザインされた改変アンチセンス分子(例えば、標的細胞表面で発現する受容体または抗原と特異的に結合するペプチドまたは抗体と結合させたアンチセンス)を全身投与することもできる。
【０２４６】
しかし、内因性mRNAの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成するのは困難であることが多い。従って好ましいアプローチでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なpol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下に置かれている組換えDNA構築物を用いる。このような構築物を用いて患者の標的細胞をトランスフェクトすると、内在する標的遺伝子転写産物と相補的な塩基対を形成するのに十分な量の一本鎖RNAの転写が行われ、それにより標的遺伝子mRNAの翻訳が妨げられる。例えば細胞に取り込まれ、アンチセンスRNAの転写を命令するようなベクターを導入することができる。このようなベクターは、転写されて所望のアンチセンスRNAが産生される限り、エピソームとして存在してもよいし、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは当技術分野において標準的な組換えDNA技術によって構築することができる。ベクターは、哺乳類細胞での複製および発現に用いられる、プラスミド、ウイルスまたは当技術分野で知られているその他のものであってもよい。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、当技術分野において、哺乳類、好ましくはヒト細胞で働くことが知られているいずれのプロモーターによるものであってもよい。このようなプロモーターは誘導型のものでも構成型のものでもよい。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、SV40初期プロモーター領域(BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290,304-310)、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復3に含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22,787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78,1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1982, Nature 296,39-42)などが挙げられる。いずれのタイプのプラスミド、コスミド、YACまたはウイルスベクターも、組織部位に直接導入できる組換えDNA構築物を作製するのに使用できる。あるいは、所望の組織に選択的に感染するウイルスベクターも使用でき、この場合には投与は別の経路(例えば全身投与)により達成でき
る。
【０２４７】
また、標的遺伝子mRNA転写産物を触媒切断するようにデザインされたリボザイム分子も、標的遺伝子mRNAの翻訳、従って標的遺伝子産物の発現を妨げるのに使用できる(例えば1990年10月4日公開のPCT国際公報 WO 90/11364; Sarverら, 1990, Science 247,1222-1225参照)。本発明のある実施形態では、FBP遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、図2および4〜9に示されているようにF-ボックスモチーフをコードする核酸と相補的となるようにデザインする。
【０２４８】
リボザイムはRNAの特異的切断を触媒し得る酵素的RNA分子である(総説としては、Rossi, 1994, Current Biology 4,469-471参照)。リボザイム作用のメカニズムにはリボザイム分子と相補的な標的RNAの配列特異的ハイブリダイゼーションとその後の内部ヌクレオチド切断が含まれる。リボザイム分子の組成は標的遺伝子mRNAに相補的な1以上の配列を含まなければならず、かつ、mRNAの切断を担う周知の触媒配列を含まなければならない。この配列に関しては、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第5,093,246号参照)。
【０２４９】
特異的認識配列部位でmRNAを切断するリボザイムは標的遺伝子mRNAの破壊に使用できるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは標的mRNAと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって指示された位置でmRNAを切断する。唯一の必要条件として、標的mRNAが以下の2塩基配列：5'-UG-3'を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および作製は当技術分野で周知のものであり、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, (特に833頁の図4参照)およびHaseloff & Gerlach, 1988, Nature, 334,585-591に詳しく記載されている。
【０２５０】
好ましくはこのリボザイムは切断認識部位が標的遺伝子mRNAの5’末端付近に位置するように操作する(すなわち、効率を高め、非機能的mRNA転写産物の細胞内蓄積を最小にするため)。
【０２５１】
本発明のリボザイムはまた、テトラヒメナ・テルモフィラ(Tetrahymena thermophila)に天然に存在し(IVSまたはL-19 IVS RNAとして知られる)、Thomas Cechおよび共同研究者ら(Zaugら, 1984, Science, 224,574-578; ZaugおよびCech, 1986, Science, 231,470-475; Zaugら, 1986, Nature, 324,429-433; University Patents Inc.による国際特許出願公開WO 88/04300; Been & Cech, 1986, Cell, 47,207-216)によって包括的に記載されているものなどのRNAエンドリボヌクレアーゼ(以下、「Cech型リボザイム」と呼ぶ)も含む。このCech型リボザイムは標的RNA配列とハイブリダイズして、その後標的RNAの切断が起こる8塩基対活性部位を有する。本発明は標的遺伝子に存在する8塩基対活性部位配列を標的とするCech型リボザイムを包含する。
【０２５２】
アンチセンスアプローチの場合と同様に、リボザイムは修飾オリゴヌクレオチド(例えば、安定性、標的指向性の向上などを目的とするもの)からなってもよく、また、in vivoで標的遺伝子を発現する細胞へ送達する必要がある。好ましい送達法は、強力な構成的pol IIIまたはpol IIプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」DNA構築物を用いることを含み、このようにしてトランスフェクトされた細胞は内在する標的遺伝子メッセージを破壊して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生する。アンチセンス分子とは異なりリボザイムは触媒的であるので、効率のために低い細胞内濃度しか必要としない。
【０２５３】
内因性標的遺伝子発現はまた、標的相同組換えを用いて標的遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することによって低下させることもできる(例えば、各々参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる、Smithiesら, 1985, Nature 317,230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51, 503-512 ; Thompsonら, 1989, Cell 5,313-321参照)。例えば、内因性標的遺伝子(標的遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか)と相同なDNAによってフランキングされる変異型の非機能的標的遺伝子(または完全に無関係のDNA配列)を、選択マーカーおよび／または負の選択マーカーを伴ってまたは伴わずに用いて、in vivoで標的遺伝子を発現する細胞をトランスフェクトすることができる。標的相同組換えによるDNA構築物の挿入により、標的遺伝子が不活性化される。このようなアプローチはES(胚幹)細胞の改変に特に適しており、不活性な標的遺伝子を有する動物後代を作出するのに使用できる(例えば、Thomas & Capecchi, 1987およびThompson, 1989, 上記参照)。しかしこのアプローチは、組換えDNA構築物が適当なウイルスベクターを用いてin vivoで必要な部位へ直接投与されるか、ターゲッティングされるならばヒトでの用途に適用することができる。
【０２５４】
あるいは、内因性標的遺伝子発現は、標的遺伝子の調節領域(すなわち、標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的として、体内の標的細胞での標的遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることによって低下させることができる(概説としては、Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6 (6), 569-584; Heleneら, 1992, Ann. N. Y. Acad. Sci., 660,27-36;およびMaher, 1992, Bioassays 14(12),807-815参照)。
【０２５５】
転写の阻害のために三重らせん形成に用いる核酸分子は一本鎖であって、デオキシヌクレオチドからなるものでなければならない。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、通常二重らせんの一方の鎖にプリンまたはピリミジンいずれかの相当の大きさのストレッチが存在する必要があるHoogsteen塩基対ルールによって三重らせんの形成を促進するようにデザインしなければならない。ヌクレオチド配列はピリミジンに基づくものであってもよく、これは生じる三重らせんの3つの会合鎖にわたってTATおよび CGC+トリプレットを形成する。このピリミジンに富む分子は、その鎖と平行方向に二重らせんの一本鎖のプリンに富む領域に対する塩基の相補性を与える。さらに、例えばG残基のストレッチを含むプリンに富む核酸分子を選択してもよい。これらの分子はGC対に富むDNA二重らせんと三重らせんを形成し、ここではプリン残基の大部分が標的二重らせんの一本鎖に位置し、三重らせんの3本の鎖にわたってGGCトリプレットを形成する。
【０２５６】
あるいは、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作出することで、三重らせんの形成を目的とし得る可能性のある配列を増やすこともできる。スイッチバック分子は5'-3'、3'-5'の交互様式で合成されるので、それらはまず二重らせんの一方の鎖と、次に他方と塩基対合し、二重らせんの一方の鎖にプリンまたはピリミジンいずれかの相当の大きさのストレッチが存在する必要がなくなる。
【０２５７】
本明細書に記載のアンチセンス、リボザイムおよび／または三重らせん分子を用いて変異型遺伝子の発現を阻害する場合、この技術は正常な標的対立遺伝子によって産生されるmRNAの転写(三重らせん)および／または翻訳(アンチセンス、リボザイム)を極めて効率的に低下させる、または阻害することができるので、存在する正常標的遺伝子産物の濃度が正常な表現型に必要とされるものよりも低くなる可能性が出てくることがある。従ってこのような場合、実質的に正常レベルの標的遺伝子活性の維持を確保するため、正常標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし、発現する核酸分子を、以下の第5.7.2節に記載のような遺伝子治療法によって、アンチセンス、リボザイムまたは三重らせん治療のいずれを用いる場合にも感受性のある配列を含まない細胞へ導入することができる。あるいは、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合には、必要なレベルの標的遺伝子活性を維持するために正常標的遺伝子タンパク質を同時投与するのが好ましい。
【０２５８】
本発明のアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイムならびに三重らせん分子は上記のようなDNAおよびRNA分子の合成のための当技術分野で公知の方法のいずれによって調製してもよい。これらには、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成のような当技術分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学合成する技術が含まれる。あるいは、RNA分子はアンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のin vitroおよびin vivo転写によっても作製できる。このようなDNA配列はT7またはSP6ポリメラーゼプロモーターなどの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを組み込んだ多様なベクターへ組み込むことができる。あるいは、用いるプロモーターに応じて構成的または誘導的にアンチセンスRNAを合成するアンチセンスcDNA構築物を用い、細胞系へ安定して組み込むこともできる。
【０２５９】
5.7.2  遺伝子置換療法
正常なFBP遺伝子発現および／またはFBP遺伝子産物活性のレベルの上昇については、上記第5.1節に記載のFBP遺伝子核酸配列を癌などの増殖性疾患の治療に利用できる。このような治療では例えば遺伝子置換療法の形態で施すことができる。具体的には、正常なFBP遺伝子機能を示すFBP遺伝子産物の産生を指令する1以上のコピーの正常FBP遺伝子またはFBP遺伝子部分を、限定されるものではないが、リポソームなどの細胞へDNAを導入するその他の粒子の他、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスベクターを含むベクターを用い、患者内の適当な細胞へ挿入すればよい。
【０２６０】
全ての組織で発現する、または選択的に発現する(例えば、FBP1遺伝子は脳で優先的に発現する)FBP遺伝子については、このような遺伝子置換療法技術は患者内のこれらの細胞型にFBP遺伝子配列を送達し得るはずである。このように一実施形態では、当業者に周知の技術(例えば、1988年4月25日公開のPCT公開WO 89/10134参照)を用いて、FBP遺伝子配列に血液脳関門を容易に通過させて脳の細胞へこれらの配列を送達することができる。血液脳関門を通過し得る送達については、例えば上記のものなどのウイルスベクターが好ましい。
【０２６１】
もう1つの実施形態では、送達技術としては、FBP遺伝子配列を発現させる細胞の部位にこのようなFBP遺伝子配列を直接投与することが挙げられる。
【０２６２】
FBP遺伝子発現および／またはFBP遺伝子産物活性の全体のレベルを上昇させるのに使用できるさらなる方法としては、適当なFBP発現細胞、好ましくは自己の細胞をFBP障害の徴候を緩和するに十分な位置および数で患者に導入することが挙げられる。このような細胞は組換え型または非組換え型のいずれかであってもよい。
【０２６３】
患者におけるFBP遺伝子発現の全体のレベルを上昇させるのに投与し得る細胞としては、通常FBP遺伝子を発現する細胞がある。
【０２６４】
あるいは、細胞、好ましくは自己の細胞はFBP遺伝子配列を発現するように操作することができ、これを次にFBP障害または増殖性もしくは分化性疾患、例えば癌および腫瘍形成の徴候の緩和に適当な患者の位置に導入すればよい。あるいは、損なわれていないFBP遺伝子を発現する細胞、およびMHC適合個体に由来する細胞を用いることもでき、例えば脳細胞が挙げられうる。FBP遺伝子配列の発現は必要な細胞型でのこのような発現を可能とする適当な遺伝子調節配列によって制御する。このような遺伝子調節配列は当業者に周知のものである。このような細胞に基づく遺伝子治療技術は当業者に周知のものである(例えば、Anderson, 米国特許第5,399,349号参照)。
【０２６５】
投与する細胞が非自己の細胞である場合、それらは導入された細胞に対する宿主の免疫応答の発生を妨げる周知の技術を用いて投与することができる。例えば、これらの細胞は隣接した細胞外環境で成分交換を可能とするが、導入された細胞が宿主の免疫系によって認識されないようにする封入形態で導入してもよい。
【０２６６】
さらに上記の第5.5節で記載されたものなど、FBP遺伝子産物活性をモジュレートし得る技術によって同定されるものなどの化合物は当業者に周知の標準的な技術を用いて投与することができる。投与される化合物が脳細胞との相互作用を含む場合には、これらの投与技術は血液脳関門の通過を可能とすることが周知であるものを含むべきである。
【０２６７】
5.7.3  標的増殖性細胞疾患
ユビキチンリガーゼ活性と関連する特定の増殖性および発癌性疾病に関して、本発明の方法により治療または予防することができる疾病としては、限定されるものではないが、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管性内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫; 白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病(骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病); 慢性白血病(慢性骨髄性(顆粒球性)白血病および慢性リンパ性白血病); および真性赤血球増加症、リンパ腫(ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに重鎖病が挙げられる。
【０２６８】
例えば、創傷治癒を促す、または変性、損傷または創傷組織などの再生を促すために、細胞増殖欠陥に関与する、またはその治療または予防に細胞増殖が望まれる、さらにFBP機能を阻害することによって治療または予防することができる疾病および疾患としては、限定されるものではないが、変性疾患、成長欠陥、低増殖性疾患、身体外傷、損傷および創傷が挙げられる。特定の実施形態では、神経系疾患が治療される。もう1つの特定の実施形態では、神経系のものではない疾患が治療される。
【０２６９】
5.8  医薬製剤および投与方法
FBP遺伝子発現または遺伝子産物活性に作用することが確認された化合物を治療上有効量で患者に投与して細胞増殖性疾患を治療または緩和することができる。治療上有効量とはかかる疾患の症状を緩和するのに十分な化合物の量をいう。
【０２７０】
5.8.1  有効量
かかる化合物の毒性および治療効果は細胞培養物または実験動物において標準製薬学的手順により、例えば、LD50(集団の50%に対する致死量)およびED50(集団の50%に治療上有効な量)を決定することにより決定できる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。有害な副作用を示す化合物を使用できる場合には、感染していない細胞に起こりうる損傷を最小限にし、それによって副作用を少なくするために、かかる化合物を罹患組織の部位にターゲッティングする送達系を慎重にデザインするべきである。
【０２７１】
細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータはヒトで使用する投与量範囲の計画策定に使用できる。かかる化合物の投与量はほとんどまたは全く毒性のないED50を包含する循環濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は使用する剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変更することができる。本発明の方法で使用するいずれの化合物についても、細胞培養物アッセイから治療上有効量を最初に推測することができる。用量は細胞培養物で決定されたIC50(すなわち、症状の50%抑制(half-maximal inhibition)を達成する試験化合物濃度)を包含する循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルで処方することができる。かかる情報を使用して、ヒトでの有効な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２７２】
5.8.2  製剤および使用
本発明に従い使用する医薬組成物は1種以上の生理学上許容される担体または賦形剤を用いて常法にて製剤化することができる。
【０２７３】
従って、化合物およびそれらの生理学上許容される塩および溶媒和物を吸入または通気による投与(口または鼻のいずれかを経由する)または経口、口内、非経口もしくは直腸投与用に製剤化することができる。
【０２７４】
経口投与では、医薬組成物が、例えば、従来の手段により結合剤(例えば、プレゼラチン化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース); 増量剤(例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム); 滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ); 崩壊剤(例えば、ポテトスターチまたはグリコール酸ナトリウムデンプン); または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの製薬上許容される賦形剤を用いて調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとってもよい。錠剤は当技術分野で周知の方法によってコーティングされていてもよい。経口投与用液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤、または懸濁剤の形態をとってもよいし、またはそれらを使用前に水または他の好適なビヒクルで構成する乾燥製品として提供してもよい。かかる液体製剤は従来の手段により懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂); 乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア); 非水性ビヒクル(例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油); および防腐剤(例えば、メチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)などの製薬上許容される添加剤を用いて調製してもよい。必要に応じて製剤に緩衝塩類、香味剤、着色剤および甘味剤を含めてもよい。
【０２７５】
経口投与用製剤は活性化合物の制御放出が提供されるよう好適に製剤化することができる。
【０２７６】
口内投与では、組成物が常法により製剤化される錠剤またはトローチ剤の形態をとってもよい。
【０２７７】
吸入による投与では、本発明により使用される化合物は好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを用いて加圧パックまたはネブライザーから提供されるエアゾールスプレーの形態で便宜送達する。加圧エアゾールの場合、定量を送達する弁を提供することで単位用量を決定することができる。例えば、吸入器または通気器で使用するゼラチン製カプセルおよびカートリッジを製剤化して化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤を含有してもよい。
【０２７８】
化合物を注入、例えば、ボーラス注射または連続的注入による非経口投与用に製剤化してもよい。注入用製剤は単位剤形、例えば、アンプルで、または防腐剤を添加した複数用量型容器で提供してもよい。組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤またはエマルジョン剤などの形態をとってもよく、さらに懸濁化剤、安定および／または分散剤などの製剤助剤(formulatory agent)を含んでいてもよい。あるいは、活性成分が使用前に好適なビヒクル、例えば、滅菌発熱物質不含水で構成する粉末形態であってもよい。
【０２７９】
また、化合物を、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの通常の坐剤用基剤を含有する、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化してよい。
【０２８０】
これまでに記載した製剤の他、また化合物をデポー製剤として製剤化してもよい。かかる長時間作用型製剤を移植(例えば、皮下または筋肉内)によりまたは筋肉内注射により投与してもよい。よって、例えば、化合物を好適な高分子または疎水性材料(例えば、許容される油中のエマルジョンとして)もしくはイオン交換樹脂とともに、または難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として製剤化してもよい。
【０２８１】
要すれば、組成物を、活性成分を含有する1以上の単位剤形を含みうるパックまたはディスペンサー装置で提供してもよい。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでなってもよい。パックまたはディスペンサー装置には投与についての使用説明書が同封されてもよい。
【実施例】
【０２８２】
6.  実施例: 新規ユビキチンリガーゼF-ボックスタンパク質および遺伝子の同定および特性決定
ユビキチン化経路に新規特異的基質を補充する働きをする考えられる新規F-ボックスタンパク質を同定するために次の研究を行った。数種類の生物に関する研究から、いくつかのFBPが重要な細胞調節タンパク質(例えば、サイクリン、cdk-阻害剤、β-カテニン、IκBαなど)の制御された分解に極めて重要な役割を果たすことが分かっている。これらのFBPは3つの基本サブユニット: カリンサブユニット(サッカロミセス・セレビシエではCdc53、またヒトではCul1と呼ばれる); Skp1; および多くのFBPの1つで形成されるユビキチンタンパク質SCFリガーゼのサブユニットである。SCFリガーゼはユビキチン結合酵素(Ubc3またはUbc4のいずれか)を種々のFBPによって補充される特異的基質にターゲッティングする。要するに、Ubcがカリンサブユニットを介してリガーゼと結合する一方で、その基質がFBPサブユニットと反応する。FBPはカリンサブユニットを直接結合できるが、第4のサブユニットの存在、カリン末端およびFBPのF-ボックスを同時に結合できるSkp1が複合体を安定させる。このように、ユビキチンリガーゼ複合体の基質特異性はF-ボックスサブユニットによって提供される。
【０２８３】
6.1  新規F-ボックス遺伝子の同定および特性決定に使用するするための材料と方法
酵母2-ハイブリッドスクリーニング  F-ボックスタンパク質をコードするヒト遺伝子をクローニングするため、Skp1と会合するタンパク質を改変酵母2-ハイブリッド系を用いて同定した(Vidal ら, 1996, Proc. Nat. Acad. Sci., 93: 10315-20; Vidal ら, 1996, Proc. Nat. Acad. Sci., 93: 10321-26)。この改変系では3つの異なるGal4結合部位プロモーターから発現される3つのレポーター遺伝子を使用することにより、偽陽性相互作用数が少なくなるという利点を生かしている。この複数レポーター遺伝子アッセイは真の相互作用物質の同定を容易にする。
【０２８４】
ヒトSkp1をベイト(bait)として使用して新規F-ボックスタンパク質およびCdc4の推定ヒト相同体などのSkp1と相互作用するタンパク質を探索した。各々が酵母GAL4のDNA結合ドメイン(DB、aa 1-147)および転写活性化ドメイン(AD、aa 768-881)をコードし、選択マーカーとしてLEU2およびTRP1を含有するプラスミドpPC97-CYH2およびpPC86プラスミドを使用した(Chevray および Nathans, 1992, Proc. Nat. Acad. Sci., 89: 5789-93; Vidal ら, 上記)。
【０２８５】
下記PCR産物の相同組換えによりSkp1とDBとの間のフレーム内融合が得られた。次の2つのオリゴヌクレオチドをデザインし、Gene Link Inc.から精製プライマーとして入手した: 5'-AGT-AGT-AAC-AAA-GGT-CAA-AGA-CAG-TTG-ACT-GTA-TCG-TCG-AGG-ATG-CCT-TCA-ATT-AAG-TT(配列番号80); 3'-GCG-GTT-ACT-TAC-TTA-GAG-CTC-GAC-GTC-TTA-CTT-ACT-TAG-CTC-ACT-TCT-CTT-CAC-ACC-A(配列番号81)。5'プライマーはskp1遺伝子の5'配列がフランキングするpPC97-CYH2 プラスミドのDBに位置する配列(下線部)に対応する。3'プライマーはskp1遺伝子の3'配列がフランキングするpPC97-CYH2プラスミドのポリリンカーが位置する配列(下線部)に対応する。これらのプライマーを次の成分: 100ng DNA鋳型(skp1 pETプラスミド)、1μMの各プライマー、0.2mM dNTP、2mM MgCl2、10mM KCl、20mM TrisCl pH8.0、0.1% Triton X-100、6mM(NH4)2S04、10μg/ml ヌクレアーゼ非含有BSA、1単位のPfu DNAポリメラーゼを含有するPCR反応物に使用した(4' 94℃、1' 50℃、10' 72℃で28サイクル)。BglIIおよびSalIで予め消化したpPC97-CYH2プラスミド100ngの存在または不在下で約100ngのPCR産物を酵母細胞に形質転換した(MaV103株; Vidal ら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 10315-10320; Vidal ら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 10321-10326)。相同組換えの結果として、skp1 cDNAと相同組換えしたpPC97-CYH2 プラスミドを含む酵母細胞だけがロイシンの不在下で増殖した。6個のコロニーを単離し、記載のとおりにSkp1の発現に関する免疫ブロットにより解析した(Vidal ら, 上記)。6個全てのコロニーが本発明者らのアフィニティー精製抗Skp1抗体により認識されたMr36,000融合タンパク質を発現した(対照コロニーは発現しなかった)。
【０２８６】
ADドメインの下流のフレーム内でcDNA断片をクローニングすることによりAD融合物を生成し、配列決定、免疫ブロット、およびSkp1との相互作用によって構築物を確認した。pPC86-Skp2s(pPC86)としては、pPC86-Skp2、およびpPC86-Skp2-CT(Skp2のaa 181-435)が挙げられる。Skp2は公知のSkp1相互作用物質であることから(Zhangら, 1995, Cell, 82: 915-25)、最初の融合物が本発明者らの陽性対照として示される。また、Skp1との相互作用に必要なF-ボックスが欠失していることから後の融合物を陰性対照として使用した。
【０２８７】
標準酢酸リチウム法を用い、pPC86においてDB-skp1融合物を有するMaV103株を活性化T細胞cDNAライブラリーで形質転換した(Alala 2; Huら, Genes & Dev. 11: 2701-14)。まず、形質転換体を合成完全(SC)-Leu-Trpプレートにプレーティングし、続いて2日後に複製を20mM 3-アミノトリアゾール(3-AT)を含有する(SC)-Leu-Trp-Hisプレート上にレプリカプレーティングした。インキュベーション後さらに3〜4日後に増殖した酵母コロニーを一次陽性として採取し、3つのレポーターアッセイ: i)20mM 3-ATを添加したSC-Leu-Trp-Hisプレートでの増殖; ii)-ガラクトシダーゼ活性; およびiii)カウンターセレクション法としての0.2% 5-フルオロオロチン酸を含有するSC-Leu-TrpプレートでのURA3活性化でさらに調べた。3つ全てを終えた後、3×106酵母形質転換体のうち、スクリーニングされたADプラスミドを選択された15個の陽性コロニーから回収した。MaV103細胞を回収されたADプラスミドおよびDBskp1融合物または回収されたADプラスミドおよび対照としてcDNA挿入物を含まないpPC97-CYH2ベクターのいずれかで再形質転換した。3つ全てのレポーターアッセイで繰り返し陽性と試験されたコロニーの11からADプラスミド(超強力相互作用物質)および3つ全てではないがいくつかのレポーターアッセイで陽性であったクローンから4つのさらなるADプラスミド(強力相互作用物質)を回収し、自動ABI 373 DNA 配列決定系を用いて配列決定した。
【０２８８】
全長FBPのクローニング  FBP4およびFBP5をコードする2つのクローンは全長であると考えられ、一方製造業者の使用説明書に従って、FBP1、FBP2、FBP3およびFBP7をコードするその他の4つのcDNA全長クローンをMarathon-Ready cDNAライブラリーを用いるRACE(Clonthec, cat. # 7406,7445,7402)により得た。FBP6をコードする全長クローンは得られなかった。全長クローンに関する規定には、次の、i)公知のF-ボックスタンパク質に関連する配列をもたらすORFが同定されること; ii)推定イニシエーターメチオニンコドンにコンセンサスコザック翻訳開始配列が存在すること; iii)推定開始コドンの上流ではなく同じリーディングフレーム内で停止コドンが同定されること; iv)3つの異なるcDNAライブラリーを用いたRACEによるクローンサイズのさらなる増加の可能性がないことのうち少なくとも2つを含めた。
【０２８９】
酵母抽出物からのタンパク質の免疫ブロットによる解析  酵母細胞を中間対数期まで増殖させ、回収し、洗浄し、バッファー(50mM Tris pH8.0、20%グリセロール、1mM EDTA、0.1% Triton X-100、5mM MgCl2、10mM β-メルカプトエタノール、1mM PMSF、1mg/mlロイペプチン、1mg/mlペプスタチン)で約109細胞/mlの細胞密度に再懸濁した。ガラスビーズの存在下で40℃にて10分間攪拌して細胞を破壊した。12,000RPM、40℃で15分間の遠心分離によりデブリをペレット化した。約50gのタンパク質を記載のとおりに免疫ブロット解析に供した(Vidal ら, 1996a, 上記 ; Vidal ら, 1996b, 上記)。
【０２９０】
タンパク質モチーフのDNAデータベース検索および解析  FBP遺伝子に対する相同性を有するEST(発現配列タグ)をBLAST、PSI-BLAST(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)およびTGI Sequence Search(http://www. tigr. org/cgi-bin/BlastSearch/blast_tgi. cgi)を用いて同定した。少なくとも100bpsにおいて95%を超える重複したESTをSequencher 3.0を用いて新規コンティグORFに構成した。タンパク質ドメインをProfileScan Server(http://www. isrec. isb-sib. ch/software/PFSCAN_form. html)、BLOCKS Sercher(http://www. blocks. fhcrc. org/blocks_search. html)およびIMB Jena(http://genome. imb-jena. de/cgi-bin/GDEWWW/menu. cgi)で同定した。
【０２９１】
F-ボックス突然変異体の構築  リーディングフレームを保存する適切な制限酵素での欠失によりDelta-F-ボックス突然変異体[(ΔF)FBP1、残基32〜179番; (ΔF)FBP2、残基60〜101番; (ΔF)FBP3a、残基40〜76番; (ΔF)FBP4、残基55〜98番]を得た。(ΔF)Skp2突然変異体はBspEIおよびXbaI制限酵素によってDNA断片(ヌクレオチド338〜997番)を除去し、これをヌクレオチド457〜997番を含有するPCR断片と置換することによって得た。最終構築物は残基113〜152番を欠いたタンパク質をコードしていた。ロイシン51-アラニン FBP3a突然変異体[FBP3a(L51A)]およびトリプトファン76-アラニンFBP3a突然変異体[FBP3a(W76A)]はQuikChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)のポリメラーゼ連鎖反応を利用したオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発により作製した。全ての突然変異体を完全に配列決定した。
【０２９２】
組換えタンパク質  次のヒトタンパク質: Flagタグ付きFBP1、Flagタグ付き(ΔF)FBP1、Flagタグ付きFBP3a、Skp2、HAタグ付きCul1、HAタグ付きCul2、β-カテニン、Hisタグ付きサイクリンD1、Skp1、Hisタグ付きSkp1、Hisタグ付きエロンガン(Elongin)CをコードするcDNA断片をバキュロウイルス発現ベクターpBacpak-8(Clonetech)に挿入し、BaculoGoldトランスフェクションキット(Pharmingen)を用いて線状バキュロウイルスDNAとともにSf9細胞に同時トランスフェクトした。組換えウイルスを使用して5B細胞を感染させ、上記のように免疫ブロットによりそれらのコード化タンパク質の発現をアッセイした。His-タンパク質を製造業者の使用説明書に従ってニッケル-アガロース(Invitrogen)により精製した。
【０２９３】
抗体  抗Cul1抗体は次のアミノ酸ペプチド: (C)DGEKDTYSYLA(配列番号82)をウサギおよびマウスに注射することにより作製した。このペプチドはヒトCul1のカルボキシ末端に対応するものであり、その他のカリンでは保存されていない。抗Cul2抗体は次のアミノ酸ペプチド: (C)ESSFSLNMNFSSKRTKFKITTSMQ(配列番号83)をウサギに注射することにより作製した。このペプチドはヒトCul2のカルボキシ末端から87個のアミノ酸に位置しており、その他のカリンでは保存されていない。抗Skp1抗体はヒトSkp1のカルボキシ末端に対応するペプチド (C)EEAQVRKENQW(配列番号84)をウサギに注射することにより作製した。ペプチドとキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)とをカップリングさせるためにシステイン残基(C)を加えた。抗体の全てを記載のとおりに作製し、アフィニティー精製(AP)し、特性決定した(Pagano, M.編, 1995,「ペプチドから精製抗体まで(From Peptide to Purified Antibody)」, in Cell Cycle: Materials and Methods, Spring-Verlag, 217-281)。要するに、高い抗原性指数(高親水性、優れた表面確率、優れたフレキシビリティ、および優れた二次構造)を示した配列を有するペプチドを選択した。ウサギおよびマウスに完全フロイントアジュバントと混合したペプチド-KLHを注射した。続いて、35S-メチオニン標識したHeLa抽出物の免疫沈降により有意な免疫反応性が検出されるまで、それらに2週間おきに不完全フロイントアジュバント中のペプチドを注射した。これらの抗血清はヒト抽出物と組換えタンパク質を含有する抽出物の両方において推定サイズのバンドを認識した。
【０２９４】
Ubc3に対するモノクローナル抗体(Mab)はZymed Inc.と協力して作製し、特性決定した。サイクリンBに対するMabはSanta Cruzから(カタログ番号sc-245); p21(カタログ番号C24420)およびp27(カタログ番号K25020)に対するMabはTransduction labから入手した。(Mab)サイクリンE、(Faha, 1993, J. of Virology 67: 2456); ヒトp27、Skp2、Cdk2(Pagano, 1992, EMBO J. 11: 761)およびサイクリンA(Pagano, 1992, EMBO J. 11: 761)に対するAPウサギ抗体、ならびにホスホ-部位p27特異的抗体は入手するかまたは標準法により作製した。示されるように、N末端Skp2ペプチドに対するAPヤギ抗体(Santa Cruz, カタログ番号sc-1567)を使用した。ラット抗HA抗体(カタログ番号1867423)はBoehringer Mannheimから、ウサギ抗HA抗体(カタログ番号sc-805)はSanta Cruzから、マウス抗Flag抗体(カタログ番号IB13010)はKodakから、ウサギ抗Flag抗体(カタログ番号71-5400)はZymedから、抗Skp1および抗-β-カテニンマウス抗体(各々、カタログ番号C19220およびP46020)はTransduction Laboratoriesから入手した。ヒトサイクリンD1に対するMab(クローンAM29, カタログ番号33-2500)の調製、精製および特性決定はZymed Inc.と協力して行った。ヒトサイクリンD1に対する抗血清は記載のとおりに産生した(Ohtsubo ら, 1995, Mol Cell Biol, 15,2612-2624)。
【０２９５】
抽出物調製および細胞の同調化  タンパク質抽出は、溶解バッファーに1μmオカダ酸が存在すること以外は、すでに記載されたようにして行った(Pagano, 1993, J. Cell Biol. 121: 101)。ヒト肺繊維芽細胞IMR-90を48時間の血清飢餓によりG0/G1に同調化し、血清再添加により再び刺激して細胞周期に復帰させた。HeLa細胞を記載のとおりに有糸分裂シェイクオフにより同調化した(Pagano, 1992, EMBO J. 11: 761)。同調化はフローサイトメトリーによりモニターした。in vitroユビキチン化および分解アッセイでは、48時間のロバスタチン処理によりG1 HeLa細胞を得て、下記のようにタンパク質抽出を行った。
【０２９６】
免疫沈降および免疫ブロット  3〜5容量の標準溶解バッファーを加えて細胞抽出物を調製し(Pagano ら, 1992, Science 255,1144-1147)、免疫沈降条件を記載のとおりにした(Jenkins および Xiong, 1995; Pagano ら, 1992a Science 255-1144-1147)。タンパク質は記載のとおりにウェットブロッティングによりゲルからニトロセルロース膜(Novex)に転写した(Tam ら, 1994 Oncogene 9,2663)。化学発光(DuPont-NEN)検出系を用いて製造業者の使用説明書に従ってフィルターを免疫ブロットに供した。
【０２９７】
in vitroユビキチン化アッセイでのタンパク質抽出  対数増殖するHeLa-S3細胞を6×105細胞/mlの密度で回収した。HeLa S3細胞ペレット約4mlを20mM Tris-HCl(pH7.2)、2mM DTT、0.25mM EDTA、10μg/mlロイペプチン、および10μg/mペプスタチンからなる氷冷バッファー6mlに懸濁した。この懸濁液を、使用前に十分にすすいで氷上で冷却した窒素ガス細胞破砕器(Parr, Moline, IL, カタログ番号4639)に移した。このボンベチャンバーを窒素タンクに接続し、圧力をゆっくりと1000psiにした。チャンバーを同じ圧力下で30分間氷上に置き、次いで、圧力をゆっくりと開放した。材料をエッペンドルフチューブに移し、マイクロ遠心分離機により10,000gで10分間遠心分離した。上清(S-10)をより少量のサンプルに分けて-80℃で凍結した。
【０２９８】
in vitroユビキチン化  ユビキチン化アッセイは記載のとおりに行った(Lyapina, 1998, Proc Natl Acad Sci U S A, 95: 7451)。要するに、抗Flag抗体を用いて免疫沈降させたFlagタグ付きFBPを含有する免疫ビーズを精製組換えヒトE1およびE2酵素(Ubc2、Ubc3またはUbc4)とともにビオチン化ユビキチンを含有する反応混合物に添加した。次いで、サンプルをHRP-ストレプトアビジンを用いたブロッティングにより解析した。E1およびE2酵素、ならびにビオチン化ユビキチンは記載のとおりに産生した(Pagano, 1995, Science 269: 682)。
【０２９９】
一過性トランスフェクション  次のヒトタンパク質: FBP1、(ΔF)FBP1、FBP2、(ΔF)FBP2、FBP3a、(ΔF)FBP3a、FBP3a(L51A)、FBP3a(W76A)、FBP4、(ΔF)FBP4、Skp2、(ΔF)Skp2、HAタグ付きβ-カテニン、タグなしβ-カテニン、Skp1、サイクリンD1をコードするcDNA断片を、それらのC末端にFlagタグをつけてフレーム内で哺乳類発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)に挿入した。細胞をFuGENEトランスフェクション試薬(Boehringer, カタログ番号1-814-443)で製造業者の使用説明書に従ってトランスフェクトした。
【０３００】
免疫蛍光  ガラスカバースリップ上で増殖させたトランスフェクト細胞単層をPBSですすぎ、PBS中4%パラホルムアルデヒドで4℃で10分間固定し、その後、PBS中0.25%Triton X-100を用いて10分間透過化させた。他の固定プロトコールでも匹敵する結果が得られた。免疫蛍光染色は記載のとおりに1μg/mlウサギ抗Flag抗体を用いて行った(Pagano, 1994, Genes & Dev., 8: 1627)。
【０３０１】
ノーザンブロット解析  ノーザンブロットはClontech Inc.製のヒトmultiple-tissue mRNAを用いて行った。プローブはランダムプライマーDNA標識キット(Gibco BRL)(2×106cpm/ml)を用いて[アルファ-32P]dCTP(Amersham Inc.)で放射性標識した。洗浄は0.2×SSC、0.1%SDSで55〜60℃において行った。FBP1およびFBP3aプローブは2つのHindIII制限断片(各々、ヌクレオチド1〜571番および1〜450番)であり、FBP2、FBP4、およびFBP1プローブはそれら各々の全長cDNAであり、さらにβ-ACTINプローブはClontech Inc.から入手した。
【０３０２】
蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)  2-ハイブリッドスクリーニングで得られたcDNAプローブを用いたλFIX II胎盤ヒトゲノムライブラリー(Stratagene)の高ストリンジェンシースクリーニング(65℃、0.2×SSC、0.1%SDS洗浄)によりゲノムクローンを単離した。ファージクローンは高ストリンジェンシーサザンハイブリダイゼーションおよび部分配列解析により確認した。精製した全てのファージDNAを標識し、記載のとおりFISHを行った(M. Pagano.編, 1994, in Cell Cycle: Materials and Methods, 29)。
【０３０３】
6.2  結果
6.2.1  新規F-ボックスタンパク質の特性決定およびそれらのin vivo活性
改良型酵母2-ハイブリッド系を使用してヒトSkp1の相互作用物質を探索した。ベイトとしてGal4 DB-Skp1融合タンパク質を有するMaV103酵母株を、プレイ(prey)としてGal4 AD融合タンパク質を発現する活性化T細胞cDNAライブラリーで形質転換した。最初の選択および再形質転換工程の後に3つの異なるレポーターアッセイを用いて、ヒトSkp1と特異的に相互作用する13の陽性クローンを得た。配列解析後、回収された13のcDNAが全てFBPをコードする7つの異なるオープンリーディングフレームに由来することが分かった。これらの新規FBPを次のように名付けた: FBP1、図3で示す(配列番号1); FBP2、図4で示す(配列番号3)；FBP3a、図5で示す(配列番号5)；FBP4、図7で示す(配列番号7)；FBP5、図8で示す(配列番号9)；FBP6、図9で示す(配列番号11)；FBP7、図10で示す(配列番号13)。また、7つのFBPのうちの1つである、FBP1(配列番号1)は本発明者らのスクリーニングの進行中に他者によって同定された(Margottin ら, 1998, Molecular Cell, 1: 565-74)。
【０３０４】
BLASTプログラムを使用してNational Center for Biotechnology InformationおよびThe Institute for Genomic Researchより入手可能なデータベースにおいて、F-ボックスを含有する推定ヒトタンパク質を探索した。これらの推定ヒトFBPからのF-ボックスモチーフのアラインメントを図1に示している。これまで特性決定されていない19のヒトFBPは入手可能な配列(GenBank受託番号 AC002428、AI457595、AI105408、H66467、T47217、H38755、THC274684、AI750732、AA976979、AI571815、T57296、Z44228、Z45230、N42405、AA018063、AI751015、AI400663、T74432、AA402415、AI826000、AI590138、AF174602、Z45775、AF174599、THC288870、AI017603、AF174598、THC260994、AI475671、AA768343、AF174595、THC240016、N70417、T10511、AF174603、EST04915、AA147429、AI192344、AF174594、AI147207、AI279712、AA593015、AA644633、AA335703、N26196、AF174604、AF053356、AF174606、AA836036、AA853045、AI479142、AA772788、AA039454、AA397652、AA463756、AA007384、AA749085、AI640599、THC253263、AB020647、THC295423、AA434109、AA370939、AA215393、THC271423、AF052097、THC288182、AL049953、CAB37981、AL022395、AL031178、THC197682、およびTHC205131)を上記F-ボックスタンパク質由来のヌクレオチド配列とアラインメントすることにより同定した。
【０３０５】
このように同定したこれまで特性決定されていない19のFBPヌクレオチド配列を次のように名づけた: FBP3b、図6で示す(配列番号23); FBP8、図11で示す(配列番号25); FBP9、図12で示す(配列番号27); FBP10、図13で示す(配列番号29); FBP11、図14で示す(配列番号31); FBP12、図15で示す(配列番号33); FBP13、図16で示す(配列番号35); FBP14、図17で示す(配列番号37); FBP15、図18で示す(配列番号39); FBP16、図19で示す(配列番号41); FBP17、図20で示す(配列番号43); FBP18、図21で示す(配列番号45); FBP19、図22で示す(配列番号47); FBP20、図23で示す(配列番号49); FBP21、図24で示す(配列番号51); FBP22、図25で示す(配列番号53); FBP23、図26で示す(配列番号55); FBP24、図27で示す(配列番号57); およびFBP25、図28で示す(配列番号59)。これらの推定ヒトFBPのF-ボックスモチーフのアラインメントを図1Aに示している。これらの配列のうち、同定された14のFBPのヌクレオチド配列、FBP3b(配列番号23)、FBP8(配列番号25)、FBP11(配列番号31)、FBP12(配列番号33)、FBP13(配列番号35)、FBP14(配列番号37)、FBP15(配列番号39)、FBP17(配列番号43)、FBP18(配列番号45)、FBP20(配列番号49)、FBP21(配列番号51)、FBP22(配列番号53)、FBP23(配列番号55)、およびFBP25(配列番号59)はこれまで構成されておらず、新規核酸分子であることが示される。残る5つの配列、FBP9(配列番号27)、FBP10(配列番号29)、FBP16(配列番号41)、FBP19(配列番号47)、およびFBP24(配列番号57)はこれまでに構成されており、データベースで公表されているが、F-ボックスタンパク質としてはこれまで認識されていなかった。
【０３０６】
ヒトFBPのコンピューター解析ではいくつかの興味深い特徴が示された(図2のFBPの概略図を参照)。3つのFBPがWD-40ドメインを含んでおり; 7つのFBPがLRRを含んでおり、また6つのFBPがFBPでは未確認のロイシンジッパー、リングフィンガー、へリックス-ループ-へリックスドメイン、プロリンリッチモチーフおよびSH2ドメインなどのその他の可能性あるタンパク質-タンパク質相互作用モジュールを含んでいる。
【０３０７】
ヒトFBPファミリーの例として、いくつかのFBPをさらに詳細な特性決定を行った。新規FBPとヒトSkp1との相互作用の特異性を確認するため、8つのin vitroで翻訳したFBPをニッケル-アガロースビーズと予め結合させたHisタグ付きSkp1への結合について調べた。対照として、エロンガンC、唯一公知のヒトSkp1相同体を使用した。7つ全てのFBPがHis-Skp1ビーズと結合できたが、Hisタグ付きエロンガンCビーズには結合できなかった(図29)。少量のFBPがHisタグ付きエロンガンCビーズと結合したが、ニッケル-アガロースビーズと結合した無関係のタンパク質(Hisタグ付きp27)をプルダウンアッセイに使用したときにも存在したため、これは非特異的結合を示すものと考えられる(例として、図29、レーン12を参照)。
【０３０８】
F-ボックス欠失突然変異体、(ΔF)FBP1、(ΔF)FBP2、(ΔF)FBP3a、およびF-ボックスの保存されたアミノ酸残基に単一点突然変異を含有する突然変異体、FBP3a(L51A)およびFBP3a(W76A)を構築した。F-ボックスを欠失した突然変異体および点突然変異を有するものはSkp1結合能を喪失していた(図29)。このことから、ヒトFBPがSkp1に特異的に結合するにはそれらのF-ボックスの完全性が必要であることが確認された。
【０３０９】
FBP1、FBP2、FBP3a、FBP4およびFBP7がin vivoにおいてヒトSkp1およびCul1と相互作用するか否かを決定するため(Skp2では相互作用することが知られているため)、Flagタグ付きFBP1、-(ΔF)FBP1、-FBP2、-(ΔF)FBP2、-FBP3a、-(ΔF)FBP3a、-FBP4および-FBP7をHeLa細胞で発現させた。その細胞から細胞抽出物を作製して抗Flag抗体を用いた免疫沈降に供した。Cul1、Cul2(もう1つのヒトカリン)、およびSkp1に対する特異的抗体を用いた免疫ブロットで検出されたように、抗Flag抗体は野生型FBPを発現する細胞からの抽出物で排他的にCul1およびSkp1を同時沈降させたが、Cul2は沈降しなかった(図29、データは示さず)。これらのデータから、ヒトSkp1/カリン複合体が酵母の場合のように数多くのFBPの足場を形成することが示される。
【０３１０】
FBPがSkp1/Cul1複合体と結合することはFBPがユビキチン連結活性と関連している可能性と一致している。この可能性を調べるため 、Flagタグ付きのFBPをヒトSkp1およびCul1とともにHeLa細胞内で発現させた。抽出物を抗Flag抗体を用いた免疫沈降に供し、ヒトユビキチン活性化酵素(E1)およびヒトUbcの存在下でユビキチンリガーゼ活性についてアッセイした。調べた全ての野生型FBPがユビキチン化タンパク質の特徴を示す高分子量スメアが生じるユビキチンリガーゼ活性と関係があったがFBP突然変異体ではなかった(図30)。リガーゼ活性はN-エチルマレイミド(NEM)感受性(図30、レーン2)であり、Ubc4およびE1両方の存在が必要であった。ヒトUbc3の使用ではUbc4の場合と同様の結果が得られたが、Ubc2ではこれらSCFのユビキチンリガーゼ活性の維持ができなかった(図30、レーン12、13)。
【０３１１】
FBP1、FBP2、FBP3a、FBP4およびFBP7の細胞小器官分布を間接免疫蛍光法を用いてヒト細胞で研究した。これらのタンパク質のFlagタグ付き型をHeLa、U20S、および293T細胞で発現させ、抗Flag抗体を用いた免疫蛍光染色に供した。FBP1、FBP4およびFBP7は細胞質内および核内のどちらにも分布していることが分かったが、FBP2は大部分が細胞質内で、またFBP3aは大部分が核内で検出された。図32は例としてHeLa細胞で観察されるFBP1、FBP2、FBP3a、FBP4の細胞小器官局在を示している。(ΔF)FBP1、(ΔF)FBP2、(ΔF)FBP3a突然変異体の局在は各々の野生型タンパク質のものと同じであり(図32)、このことによりF-ボックスおよびF-ボックス依存的Skp1結合がFBPの細胞小器官局在を決定するものではないことが示された。免疫蛍光染色は生化学的細胞小器官分画の結果に一致していた。
【０３１２】
6.2.2  新規ユビキチンリガーゼ遺伝子転写物のノーザンブロット解析
多数の正常ヒト組織(心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格、筋肉、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球、図33を参照)由来のポリ(A)+mRNAでRNAブロット解析を行った。FBP1 mRNA転写物(約7-kbの主要なバンドと約3.5および約2.5kbの2つのマイナーなバンド)は、調べた16ヒト組織全てにおいて発現されたが、脳および精巣でより広く見られた。精巣は7kb型を超えないまでもそれと同量のより小さいFBP1 mRNA型を発現する唯一の組織であった。FBP2転写物(約7.7-kbおよび約2.4kb)は調べた全ての組織において発現されたが、FBP2転写物の割合によって多少の組織差が示された。約4kb FBP3a転写物は調べた全ての組織に存在し、特に精巣ではより長時間の暴露で約3kbおよび2kbの2つのマイナーなFBP3a型が視認できた。約4.8kb FBP4転写物は調べた全ての正常ヒト組織において発現されたが、心臓および膵臓で特に多かった。最後に、新規FBPの発現パターンを、全ての組織でmRNA種(約4-kbの主要なバンドと約8.5kbのマイナーなバンド)が見られ、胎盤で特に多かったFBP1の発現パターンと比較した。
【０３１３】
6.2.3  ヒトFBP遺伝子の染色体局在
ある腫瘍で細胞調節タンパク質(例えば、p53、p27、β-カテニン)の確認されていない分解が観察され、脱制御された(deregulated)ユビキチンリガーゼがこの変更された分解に関与しているという仮説を提示した(A. Ciechanover, 1998, Embo J, 17: 7151で概説)。十分に理解された例がMDM2、その過剰発現がその基質、腫瘍サプレッサーp53を不安定にするユビキチンリガーゼをコードする癌原遺伝子のものである(Brown および Pagano, 1997, Biochim Biophys Acta, 1332: 1, 1998で概説)。ヒトFBP遺伝子の染色体局在をマッピングし、さらにこれらの位置が腫瘍または遺伝性疾病によって変更されることが知られている遺伝子座と一致するかどうかを決定するため、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を使用した。FBP1遺伝子はマッピングされて10q24(図34A)に、FBP2は9q34(図34B)に、FBP3aは13q22(図34C)に、FBP4は5p12(図34D)に、さらにFBP5は6q25〜26(図34E)に局在化された。FBP遺伝子(特にFBP1、FBP3a、およびFBP5)が腫瘍で多数変更される染色体遺伝子座に局在化された(参照および詳細は、Online Mendelian Inheritance in Man database, http://www3. ncbi. nlm. nih. gov/omim/を参照)。特に、10q24(FBP1が位置する場所)の欠失はヒト前立腺腫瘍および小細胞肺癌(SCLC)の約10%で立証されており、この位置に腫瘍サプレッサー遺伝子が存在することが示唆される。さらに、小児期急性T細胞白血病の7%まではブレークポイントとして10q24、t(10 ; 14)(q24; ql 1)またはt(7; 10)(q35; q24)のいずれかを含んだ転座を伴う。まれにではあるが、9q34領域(FBP2が位置する場所)がヒト卵巣癌および膀胱癌によってヘテロ接合性(LOH)を喪失する部位であることが示されている。LOHはその領域でも観察される。最後に、6q25〜26(FBP5が位置する場所)がヒト卵巣癌、乳癌および胃癌、肝癌、バーキットリンパ腫、ならびに副甲状腺腫においてヘテロ接合性を喪失する部位であることが示されている。
【０３１４】
7.  実施例: FBP1がβ-カテニンの安定性を調節する
β-カテニンタンパク質分解の脱調節は悪性形質転換と関係している。ゼノパス・スリム(Xenopus Slimb)およびショウジョウバエ(Drosophila)FBP1はWnt/β-カテニンシグナル伝達経路を負に調節する(Jiang および Struhl, 1998, 上記; Marikawa および Elinson, 1998)。ユビキチンリガーゼ複合体はそれらの基質と物理的に会合することから、本実施例における研究はFBP1がβ-カテニンと相互作用できるか否かを決定するためにデザインされた。その結果から、FBP1がβ-カテニンのin vivo安定性を調節する新規ユビキチンリガーゼ複合体を形成することが示されている。このように、FBP1を、β-カテニンをユビキチン化する新規ユビキチンリガーゼ複合体の１成分として同定することにより、本発明の方法を用いたアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、および新規な基質のスクリーニングに使用できる新しい標的が提供される。これらのアッセイによって同定された分子は癌および増殖性疾患の治療薬としての有用な薬剤である可能性がある。
【０３１５】
7.1 FBP1機能を同定するための材料および方法
組換えタンパク質、F-ボックス突然変異体の構築、抗体、一過性トランスフェクション、免疫沈降、免疫ブロット、細胞培養および抽出物調製  これらの方法の詳細は上記の第6.1節で記載している。
【０３１６】
7.2  結果
7.2.1  ヒトFBP1はβ-カテニンと相互作用する
Flagタグ付きFBP1およびβ-カテニンウイルスを使用して昆虫細胞を同時感染させ、抽出物を免疫沈降、続いて免疫ブロットにより解析した。抗Flag抗体によりβ-カテニンが同時免疫沈降され(図35A)、このことから完全な細胞においてβ-カテニンとFBP1とが物理的に相互作用することが示された。酵母FBP Cdc4とその基質Sic1との結合がSkp1の存在により安定化することが分かっている(Skowyra ら, 1997, Cell, 91, 209-219)。ヒトSkp1の同時発現によるFBP1とβ-カテニンとの相互作用強度への影響はなかった。FBP1/β-カテニン相互作用の特異性を調べるため、細胞をヒトサイクリンD1およびFBP1ウイルスで同時感染させた。このサイクリンの選択はヒトサイクリンD1がSkp2ユビキチンリガーゼ複合体と複合体を形成し得るという事実によって決定された(Skp1-Cul1-Skp2; Yu ら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 95: 11324-9)。FBP1/β-カテニン複合体の形成の実証に使用した同一条件下ではFlagタグ付きFBP1を用いてサイクリンD1を同時免疫沈降させることができず、抗サイクリンD1抗体はFBP1を同時免疫沈降させることができなかった(図35B、レーン1〜3)。Skp1(図35B、レーン4〜6)またはCdk4とFBP1およびサイクリンD1との同時発現ではサイクリンD1のFBP1との会合が刺激されなかった。
【０３１７】
次いで、HAタグ付きβ-カテニンおよびFlagタグ付きFBP1(野生型または突然変異体)を有する哺乳類発現プラスミドをヒト293細胞において同時トランスフェクトした。野生型または(ΔF)FBP1突然変異体のいずれかと同時発現させた場合にはβ-カテニンが抗Flag免疫沈降物中で検出され(図35C、レーン4〜6)、ヒト細胞においてβ-カテニンとFBP1とで形成された複合体の存在が確認された。
【０３１８】
7.2.2 F-ボックス欠失FBP1突然変異体はin vivoにおいてβ-カテニンを安定化する
(ΔF)FBP1とβ-カテニンとの会合により、(ΔF)FBP1がSkp1/Cul1複合体と結合できない一方でβ-カテニン結合能を保持していることからin vivoにおいてドミナントネガティブ突然変異体として働きうることが示唆された。HAタグ付きβ-カテニンをFlagタグ付き(ΔF)FBP1、または別のF-ボックス欠失FBP、(ΔF)FBP2とともに同時発現させた。また、FBP2は本発明者らのSkp1-相互作用物質についてのスクリーニングにより得た; これはFBP1と同様、複数のWD-40ドメインを含有している。(ΔF)FBP1が存在することによって、より多量のβ-カテニンの集積が特異的にもたらされた(図36A)。この集積がβ-カテニン安定性の高まりによるものか否かを決定するため、本発明者らはパルスチェイス解析を用いてβ-カテニンの半減期を測定した。ヒト293細胞をHAタグ付きβ-カテニン単独で、または野生型もしくは突然変異体FBP1との組合せでトランスフェクトした。野生型Fpb1によるβ-カテニン分解への影響はほとんどなかったが、F-ボックス欠失突然変異体によってβ-カテニンの半減期が1〜4時間延長された(図36B)。
【０３１９】
FBP1はHIV-1 Vpuタンパク質により誘導されるCD4分解にも関連している(Margottin ら, 上記)。VpuがFBP1をCD4に補充し、(ΔF)FBP1がVpuが媒介するCD4調節を阻害することが分かっている。さらに、FBP1-ユビキチンリガーゼ複合体はIκBαaの安定性もまた制御している(Yaron ら, 1998, Nature, 396: 590)。従って、FBP1と、β-カテニン、Vpuタンパク質、CD4、およびIκBαaとの相互作用が本発明の方法を用いたアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、および新規基質のスクリーニングに使用できる可能性のある標的である。
【０３２０】
8.  実施例: FBP Skp2の基質としてのp27の同定方法
哺乳類G1サイクリン依存性キナーゼ(Cdk)阻害剤p27の分解は休止状態から増殖状態への細胞移行に必要である。p27のユビキチン化および分解はサイクリン/Cdk複合体によるそのリン酸化に依存している。S期への移行に必須なSkp2、F-ボックスタンパク質はリン酸化に依存した様式でp27を特異的に認識する。さらに、in vivoおよびin vitroの双方においてSkp2はリン酸化されたp27をユビキチン化および分解する機構の律速成分である。そのため、p27分解は有糸分裂促進性刺激後のSkp2およびサイクリン両者の集積による二重の制御を受ける。
【０３２１】
本実施例ではin vitroにおけるSkp2とp27との相互作用の同定に使用した新規なアッセイを開示する。第1に、基質としてp27を用いて行ったin vitroユビキチン化アッセイを記載する。第2に、抗Skp2抗体を用いて細胞抽出物からSkp2を枯渇させ、p27ユビキチンリガーゼ活性への影響をアッセイする。精製したSkp2をかかる免疫枯渇抽出物に戻し入れてp27ユビキチン化および分解を回復させる。さらに、p27ユビキチン化および分解を阻害するドミナントネガティブ突然変異体、(ΔF)Skp2の使用についても開示している。
【０３２２】
本明細書に記載のアッセイは細胞増殖を抑制する化合物についての試験に使用できる。このアッセイは第5.5節に記載した分子、化合物、ペプチド、またはその他の薬剤の存在または不在下で実施可能である。相互作用またはユビキチン化活性を高めるまたは阻害する薬剤は同定される最終産物の形成を高めるまたは減少させることにより同定できる。かかる薬剤は、例えばSkp2により調節されるin vivo p27ユビキチン化および分解を阻害するのに使用できる。これらのアッセイによって同定された分子は癌および増殖性疾患に対する治療薬としての有用な薬物である可能性がある。
【０３２３】
ドミナントネガティブ突然変異体、例えば、突然変異体(ΔF)Skp2、およびSKP2をターゲッティングするアンチセンスオリゴ、mRNAはp27ユビキチン化および分解を阻害し、癌に対する遺伝子治療に使用できる。本明細書に記載のアッセイは新規FBPタンパク質の新規基質、ならびに新規ユビキチンリガーゼ複合体-基質相互作用および活性のモジュレーターの同定にも使用できる。
【０３２４】
8.1 Skp2基質としてp27を同定するための材料および方法
in vitroユビキチン化アッセイのためのタンパク質抽出  HeLa S3細胞ペレット約4mlを20mM Tris-HCl(pH7.2)、2mM DTT、0.25mM EDTA、10μg/mlロイペプチン、および10μg/m ペプスタチンからなる氷冷バッファー6mlに懸濁した。この懸濁液を、使用前に十分にすすいで氷上で冷却した窒素ガス細胞破砕器(Parr, Moline, IL, カタログ番号4639)に移した。このボンベチャンバーを窒素タンクに接続し、圧力をゆっくりと1000psiにした。チャンバーを同じ圧力下で30分間氷上に置き、次いで、圧力をゆっくりと開放した。材料をエッペンドルフチューブに移し、マイクロ遠心分離機により10,000gで10分間遠心分離した。上清(S-10)をより少量のサンプルに分けて-80℃で凍結した。窒素ガス細胞破砕器抽出を使用することに基づくこの抽出物調製法は、これまでに記載された方法よりもin vitroでp27をユビキチン化する活性を良好に保存する(Paganoら, 1995, Science 269: 682-685)。
【０３２５】
試薬および抗体  ユビキチンアルデヒド(Hershko & Rose, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1829-33)、メチル-ユビキチン(Hershko & Heller, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 128: 1079-86)およびp13ビーズ(Brizuela ら, 1987, EMBO J. 6: 3507-3514)を記載のとおりに調製した。β, γ-イミドアデノシン-50-トリホスフェート(AMP-PNP)、スタウロスポリン、ヘキソキナーゼ、およびデオキシ-グルコースはSigmaから; ロバスタチンはMerckから; フラボピリドールはHoechst Marion Rousselから入手した。ホスホ-部位p27特異的抗体はZymed Inc.と共同で187位にホスホトレオニン(T*)を有するヒトp27のカルボキシ末端に対応するホスホ-ペプチド NAGSVEQT*PKKPGLRRRQT(配列番号85)をウサギに注射することにより作製した。次いで、ホスホ-および非ホスホ-ペプチドクロマトグラフィーの両方を用いた2ラウンドのアフィニティクロマトグラフィーにより、血清からこの抗体を精製した。他の全ての抗体は第6.1節に記載している。
【０３２６】
免疫枯渇アッセイ  免疫枯渇アッセイに向けて、Skp2抗血清3μlをAffi-Prepプロテイン-Aビーズ(BioRad)15μlに4℃で90分間吸着させた。ビーズを洗浄した後、HeLa抽出物40μl(約400μgのタンパク質)と混合した(4℃、2時間)。遠心分離によってビーズを除去し、上清を0.45-μマイクロスピンフィルター(Millipore)で濾過した。免疫沈降および免疫ブロットは記載のとおりに行った(M. Paganoら, 1995, 上記)。精製GST-Skp2に対するウサギポリクローナル抗体はZymed Inc.と共同で記載のとおりに作製し、アフィニティ精製(AP)し、特性決定した(M. Pagano, in Cell Cycle-Materials and Methods, M. Pagano 編 (Springer, NY, 1995), chap. 24; E. Harlow および D. Lane, in Using antibodies. A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1998)(カタログ番号511900)。ヒトCul1およびサイクリンEに対するモノクローナル抗体(Mab)(Faha ら, 1993, J. of Virology 67: 2456); ヒトp27、Skp1(Latres ら, 1999, Oncogene 18: 849)、Cdk2(Pagano, ら, 1992, Science 255: 1144)に対するAPウサギ抗体およびホスホ-部位p27特異的抗体。サイクリンBに対するMabはSanta Cruzから(カタログ番号sc-245); p21(カタログ番号C24420)およびp27(カタログ番号K25020)に対するMabはTransduction labから; 抗Flagウサギ抗体はZymed(カタログ番号715400)から入手した。N末端Skp2ペプチドに対するAPヤギ抗体(Santa Cruz, カタログ番号sc-1567)を使用した。
【０３２７】
Skp2 F-ボックス突然変異体の構築  (ΔF)Skp2突然変異体はBspEIおよびXbaI制限酵素によってDNA断片(ヌクレオチド338〜997番)を除去し、これをヌクレオチド457〜997番を含有するPCR断片と置換することによって得た。最終構築物は残基113〜152番を欠くタンパク質をコードした。
【０３２８】
組換えタンパク質  次のヒトタンパク質: Flagタグ付きFBP1、Flagタグ付き(ΔF)FBP1、Flagタグ付きFBP3a、Skp2、HAタグ付きCul1、HAタグ付きCul2、β-カテニン、Hisタグ付きサイクリンD1、Skp1、Hisタグ付きSkp1、Hisタグ付きエロンガンCをコードするcDNA断片をバキュロウイルス発現ベクターpBacpak-8(Clonetech)に挿入し、BaculoGoldトランスフェクションキット(Pharmingen)を用いて線状バキュロウイルスDNAとともにSf9細胞に同時トランスフェクトした。ヒトHisタグ付きサイクリンEおよびHAタグ付きCdk2を発現するバキュロウイルスはD. Morgan(Desai, 1992, Molecular Biology of the Cell 3: 571)により供給された。組換えウイルスを使用して5B細胞を感染させ、上記の免疫ブロットによりそれらのコード化タンパク質の発現をアッセイした。His-タンパク質をニッケル-アガロース(Invitrogen)により製造業者の使用説明書に従って精製した。適切なバキュロウイルスの同時発現により種々の複合体を形成し、ニッケル-アガロースクロマトグラフィーによりSkp1およびサイクリンEの5'にあるHisタグを利用して精製した。特に断りのない限り、組換えタンパク質は次の量: サイクリンE/Cdk2, 約0.5pmol; Skp1, 約0.5pmol; Skp2, 約0.1pmol; FBP1, 約0.1pmol; FBP3a, 約0.1pmol, Cul1, 約0.1pmolで培養物に添加した。精製調製物中のSkp1/Skp2、Skp1/FBP1、Skp1/FBP3a、およびSkp1/Cul1のモル比は約5であった。
【０３２９】
抽出物調製ならびに細胞の同調化、一過性トランスフェクション、免疫沈降および免疫ブロット  第6.1節、上記で記載したようにこれらの方法は行われた。
【０３３０】
8.2  結果
8.2.1 p27in vitroユビキチン化アッセイ
典型的なin vitroユビキチン化アッセイでは、対数増殖するHeLa-S3細胞を6×105細胞/mlの密度で回収した。記載のとおりに70μMロバスタチンでの48時間処理により細胞をG1で停止させる(O'Connor & Jackman, 1995 in Cell Cycle-Materials and Methods, M. Pagano編, Springer, NY, chap. 6)。in vitroで翻訳した[35S]p27 1μlを40mM Tris pH7.6、5mM MgCl2、1mM DTT、10%グリセロール、1μMユビキチンアルデヒド、1mg/mlメチルユビキチン、10mMクレアチンリン酸、0.1mg/mlクレアチンホスホキナーゼ、0.5mM ATP、1μMオカダ酸、20〜30μg HeLa細胞抽出物を含有するユビキチン化混合物10μl中、30℃で異なる時間(0〜75分)インキュベートする。ユビキチンアルデヒドをユビキチン化反応物に添加するとp27からユビキチン鎖を除去するイソペプチダーゼを阻害することができる。メチルユビキチンを添加すると細胞抽出物に存在するユビキチンと競合し、p27ユビキチン鎖を終了させる。かかる鎖は高分子スメアの代わりに分離したバンドとして現れる。これらのより短いポリユビキチン鎖はプロテアソームに対する親和性がより低いためより安定している。反応はβ-メルカプトエタノールを含有するLaemmliサンプルバッファーを加えて終結させ、変性条件下で産物をタンパク質ゲルで解析することができる。
【０３３１】
ポリユビキチン化p27型はオートラジオグラフィーによって同定される。p27分解アッセイは、(i)メチル化ユビキチンおよびユビキチンアルデヒドを省略した; (ii)HeLa抽出物の濃度が約7μg/μlである; (iii)窒素ガス破砕法よりもプロテアソーム活性を良好に保存する低張性溶解により抽出物を調製する(Pagano ら, 1995, Science 269: 682)ことを除き、同様に行う。メチルユビキチンの不在下ではp27ユビキチン化活性の代わりにp27分解活性が測定できる。
【０３３２】
サンプルをp27に対する抗体を用いて免疫沈降させ、続けて抗ユビキチン抗体を用いて免疫沈降させて8%SDSゲル上を移動させる。このアッセイによって同定された高分子種がユビキチン化される。対照として全13個のリジンを欠失したp27突然変異体を使用した。この突然変異型p27はユビキチン化されず、8%SDSゲル上のより高分子量の位置に移動する。
【０３３３】
8.2.2 p27-Skp2相互作用アッセイおよびp27-Skp2免疫枯渇アッセイ
酵母およびヒトFBPによるSkp1/カリン複合体への特異的基質の補充はリン酸化依存的である。そのため、IκBαおよびβ-カテニン由来のペプチドは特異的にかつリン酸化に依存した様式でFBP1に結合する(Yaron, 1998, Nature 396: 590; Winston ら, 1999, Genes Dev. 13: 270)。第6節、上記に記載したように187位にホスホトレオニンを有するp27ホスホ-ペプチドを、Skp2ならびにFBP1、FBP2、FBP3a、FBP4、FBP5、FBP6、およびFBP7を含めたヒトFBPとのその結合能についてアッセイし、ベイトとしてSkp1を用いる2-ハイブリッドスクリーニングを使用することにより単離した。これらのFBPのうち4種類のものに、FBP1およびFBP2ではWD-40ドメイン、ならびにSkp2およびFBP3aではロイシンリッチ反復配列などの有望な基質相互作用ドメインが含まれている。ホスホ-p27ペプチドをセファロースビーズに固定化し、これら7種のin vitroで翻訳したFBPとともにインキュベートした(図37A)。ただ1つのFBP、Skp2だけがホスホ-T187 p27ペプチドと結合できた。次いで、p27ペプチドと結合させた(リン酸化または非リン酸化型のいずれか)または関係のないホスホ-ペプチドを含有するビーズをHeLa細胞抽出物とともにインキュベートした。ビーズと安定して会合したタンパク質を免疫ブロットにより調べた。Skp2およびその会合タンパク質、Skp1およびCul1はホスホ-p27ペプチドと結合したタンパク質として容易に検出された(これらは対照ペプチドには結合しなかった)(図37B)。
【０３３４】
p27のSkp2との会合をさらに研究するため、サイクリンE/Cdk2によりp27がT187でリン酸化される条件下でin vitroで翻訳したp27をSkp1/Skp2複合体、サイクリンE/Cdk2複合体、または両複合体の組合せのいずれかとともにインキュベートした(Montagnoli, A.ら, 1999, Genes & Dev 13: 1181)。次いで、サンプルを抗Skp2抗体を用いて免疫沈降させた。p27はサイクリンE/Cdk2複合体の存在下でのみSkp2とともに同時免疫沈降した(図37C)。特に、同一条件下でT187-アラニンp27突然変異体、p27(T187A)が抗Skp2抗体により同時免疫沈降しなかった。最後に、本発明者らはin vivoにおけるSkp2およびp27会合を調べた。HeLa細胞およびIMR90ヒト二倍体繊維芽細胞の抽出物をSkp2に対する2種類の異なる抗体を用いた免疫沈降に供した後、免疫ブロットした。Skp2免疫沈降物ではサイクリンD1およびサイクリンB1ではなくp27およびCul1が特に検出された(図38)。本発明者らがホスホ-T187部位p27特異的抗体を用いて、Skp2が結合したp27がT187でリン酸化されることを示したことは重要である(図38、レーン2、下部パネル)。さらに、抗ペプチドp27抗体によりSkp2が特異的に同時免疫沈降した。これらの結果から、p27とSkp2との安定した相互作用が高度に特異的なものであり、p27のT187でのリン酸化に依存していたことが分かる。
【０３３５】
p27の細胞周期特異的ユビキチン化および分解を正確に再現したp27ユビキチン化についての無細胞アッセイが開発された(Montagnoli ら, 上記)。このアッセイを用いると、p27-ユビキチン連結活性はG1休止細胞由来の抽出物よりも非同調増殖細胞由来の抽出物で高い(図39A、レーン2および4)。これまでの知見によれば(Montagnoli, A. ら, 上記)、サイクリンE/Cdk2の添加によって両方のタイプの抽出物においてp27のユビキチン化が刺激された(図39A、レーン3および5)。しかしながら、G1休止細胞由来の抽出物におけるこの刺激が増殖細胞由来のものよりもずっと低いことから、サイクリンE/Cdk2のほかにp27-ユビキチン連結系の他のいくつかの成分がG1の律速条件であることが示唆された。他のSCFサブユニットと比べ、G1細胞由来の抽出物におけるそのレベルが非同調細胞由来のものより低く、p27のレベルと逆相関していることからこの成分がSkp2であると考えられた(図39Bおよび43)。そこで、Skp2を試験してこれがp27ユビキチンリガーゼ活性の律速成分であるかどうかを確認した。組換え精製Skp1/Skp2複合体を単独でG1抽出物に添加してもp27ユビキチン化を有意に刺激しなかった(図39A、レーン6)。これに対し、Skp1/Skp2とサイクリンE/Cdk2複合体とを組み合わせて添加するとG1抽出物のp27ユビキチン化が強く刺激された(図39A、レーン7)。同様に、Skp1/Skp2とサイクリンE/Cdk2とを組み合わせて添加すると、分解アッセイによって測定されるp27タンパク質分解も強く刺激された(図39A、レーン13〜16)。これらの試験に使用したSkp1/Skp2複合体はバキュロウイルスHisタグ付きSkp1およびSkp2を同時発現する昆虫細胞から単離した(さらにニッケル-アガロースクロマトグラフィーにより同時精製した)ため、昆虫由来のF-ボックスタンパク質がHis -Skp1と同時精製されてG1抽出物のp27ユビキチン化の刺激に関与した可能性があった。Skp2の不在下、昆虫細胞内で発現させ、同じ手順で精製した同様の量のHisタグ付きSkp1を添加してもサイクリンE/Cdk2の存在下でp27ユビキチン化が刺激されなかった(図39A、レーン8)ことが示され、この可能性は排除された。さらに、本発明者らはFBP1もFBP3aもいずれもがG1抽出物のp27-ユビキチン連結を刺激するSkp2に取って代わることができないことを見出した(図39A、レーン9〜12)。Skp1/Skp2とサイクリンE/Cdk2との組合せ添加によるG1抽出物のp27ユビキチン化刺激は野生型p27でのみ見ることができ、p27(T187A)突然変異体では見られなかった(レーン17〜20)。このことからT187でのp27のリン酸化がSkp2が媒介するp27のユビキチン化に必要であることが分かった。これらの知見によりサイクリンE/Cdk2およびSkp1/Skp2複合体の双方がG1期のp27ユビキチン化および分解の律速条件となっていることが示された。
【０３３６】
p27ユビキチン連結に対するSkp2の必要性をさらに調べるために、Skp2に対する抗体を用いた免疫枯渇により非同調化増殖細胞の抽出物からSkp2を特異的に除去した。免疫枯渇手順によりこれらの抽出物から大部分のSkp2が効率的に除去され、p27-ユビキチン連結活性(図40A、レーン4)、ならびにp27分解活性の急激な低下がもたらされた。この作用は次の観察でわかるように特異的なものであった: (i)免疫前血清での同様な処理ではp27-ユビキチン化は阻害されなかった(図40A、レーン3); (ii)抗Skp2抗体を組換えGST-Skp2とプレインキュベーションした場合(レーン5)には抽出物からのp27-ユビキチン化活性の免疫枯渇が抑制されたが、対照タンパク質とのプレインキュベーション(レーン4)では抑制されなかった; (iii)His-Skp1/Skp2複合体の添加によりSkp2枯渇抽出物においてp27ユビキチン化活性を回復させることができた(図40B、レーン3)が、His-Skp1(レーン2)、His-Skp1/Cul1複合体(レーン4)、またはHis-Skp1/FBP1ではできなかった。
【０３３７】
次いで、本発明者らはHeLa抽出物からSkp2を免疫沈降させてこの免疫沈降物がp27ユビキチン化活性を含んでいるか否かを試験した。抗Skp2ビーズではサイクリンE/Cdk2の存在下でp27ユビキチン化を誘導できたが、免疫前(PI)血清により作製された免疫沈降物では誘導できなかった(図40C、レーン2および3)。精製組換えE1ユビキチン活性化酵素および精製組換えUbc3の添加では、Skp2免疫沈降物がp27ユビキチン化を維持する能力があまり高まらなかった(図40C、レーン5)。これはp27 in vitro翻訳に使用されるウサギ網状赤血球溶解物に両タンパク質が存在するためと考えられた。
【０３３８】
8.2.3 F-ボックス欠失SKP2突然変異体はin vivoにおいてp27を安定化する
Skp2はin vivoにおけるユビキチン媒介による分解においてもp27をターゲッティングする。F-ボックス欠失FBP1突然変異体、(ΔF)FBP1は、F-ボックスを欠き、Skp1/Cul1複合体と結合できない一方でその基質との結合能を保持していると考えられるため、in vivoにおいてドミナントネガティブ突然変異体として働く。そのため、いったん細胞で発現された(ΔF)Fbはβ-カテニンおよびIκBαを隔離し、それらの安定化をもたらす。F-ボックス欠失Skp2突然変異体、(ΔF)Skp2を構築した。p27は単独または(ΔF)Skp2もしくは(ΔF)FBP1との組合せのいずれかでマウス細胞で発現させた(図41参照)。(ΔF)Skp2が存在することによって、より多量のp27の集積がもたらされた。この集積がp27安定性の高まりによるものか否かを調べるために、パルスチェイス解析を用いてp27の半減期を測定した(詳細は第8節、上記参照)。実際に、(ΔF)Skp2でのp27半減期の延長は1時間〜3時間未満であった。これらの試験におけるトランスフェクション効率が約10%であったため、(ΔF)Skp2は同時発現されたヒト外因性p27の安定性にのみ影響を及ぼし、マウス内在性p27の安定性には影響を及ぼさなかった。
【０３３９】
8.2.4 SKP2アンチセンス試験
SKP2 mRNAをアンチセンスオリゴヌクレオチドでターゲッティングしてSkp2レベルの低下が内在性p27の存在量に影響を及ぼしているか否かを決定した。2つの異なるアンチセンスオリゴはSkp2タンパク質レベルの低下を誘導したが、対照オリゴデオキシヌクレオチドは誘導しなかった(図42)。Skp2の低下と同時に、内在性p27タンパク質のレベルの大幅上昇があった。ヒドロキシ尿素またはアフィジコリン処理でG1/S移行時に遮断した細胞でも同様の結果が得られた(レーン9〜16)。このように、SKP2アンチセンスオリゴのp27への作用はSkp2レベルの低下によって起こりうるG1における遮断の二次的な結果ではなかった。
【０３４０】
アンチセンス試験は記載のとおりに行った(Yu, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95: 11324)。要するに、ホスホロチオエート主鎖およびC-5プロピンピリミジンを含有する4種のオリゴデオキシヌクレオチドを合成した(Keck Biotechnology Resource Laboratory at Yale University): (1)5'-CCTGGGGGATGTTCTCA-3'(配列番号86)(アンチセンス方向のヒトSkp2 cDNA ヌクレオチド180〜196番); (2)5'-GGCTTCCGGGCATTTAG-3'(配列番号87)[(1)のスクランブル(scrambled)対照]; (3)5'-CATCTGGCACGATTCCA-3'(配列番号88)(アンチセンス方向のSkp2 cDNAヌクレオチド1137〜1153番); (4)5'-CCGCTCATCGTATGACA-3'(89)[(3)のスクランブル対照]。オリゴヌクレオチドをCytofectin GS(Glen Research)を用いて製造業者の使用説明書に従ってHeLa細胞に送達した。その後、トランスフェクション後16〜18時間に細胞を回収した。
【０３４１】
9.  実施例: FBP Skp2/p27相互作用のメディエーターとしてのCks1の同定方法
実施例8で記載したように、p27はS期への移行のためにSkp2によりリン酸化に依存した様式で認識される。Skp2はリン酸化されたp27をユビキチン化および分解する機構の律速成分である。本実施例ではin vitroおよび精製系におけるCks1とSkp2およびCks1とp27との相互作用の同定に使用した新規アッセイを開示する。第1に、HeLa細胞の抽出物を分画してp27の連結を促進する画分の活性を調べる。第2に、組換えCks1を使用してp27-ユビキチン連結に必要な因子としてCks1の同定を確認する。第3に、p27がリン酸化された後のp27-ユビキチン連結へのCks1の関与の同定。第4に、Cks1がSkp2とp27との結合を増大させる。第5に、Cks1がSkp2と結合する。第6に、Cks1がp27のC末端に結合する。
【０３４２】
本明細書に記載のアッセイは細胞増殖を抑制する化合物についての試験に使用できる。このアッセイは第5.5節に記載した分子、化合物、ペプチド、またはその他の薬剤の存在または不在下で実施可能である。相互作用またはユビキチン化活性を高めるまたは阻害する薬剤は同定される最終産物の形成を高めるまたは減少させることにより同定できる。かかる薬剤は、例えばSkp2により調節されるin vivo p27ユビキチン化および分解を阻害するのに使用できる。これらのアッセイによって同定された分子は癌および増殖性疾患の治療薬としての有用な薬物である可能性がある。
【０３４３】
ドミナントネガティブ突然変異体およびアンチセンスmRNA、Cks1に対する遺伝子をターゲッティングするオリゴはp27ユビキチン化および分解を阻害し、癌に対する遺伝子治療に使用できる。本明細書に記載のアッセイは新規FBPタンパク質のさらなる新規基質、ならびに新規ユビキチンリガーゼ複合体-基質相互作用および活性のさらなるモジュレーターの同定にも使用できる。
【０３４４】
9.1 FBP Skp2/p27相互作用のメディエーターとしてCks1を同定するための材料および方法
タンパク質  His6タグ付きp27およびCdc34を大腸菌(E. coli)内で発現させ、ニッケルアガロースクロマトグラフィーにより精製した。Cks2およびp13Suc1を細菌内で発現させ、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。His6-Skp1/Skp2、His6-Skp1/β-TrCP、His6-サイクリンE/Cdk2、およびHis6-Cul-1/ROC1を対応するタンパク質をコードするバキュロウイルスでの5B昆虫細胞の同時感染により産生し、これまでに記載されたようにニッケル-アガロースクロマトグラフィーにより精製した(Montagnoliら, 1999, Genes & Dev. 13: 1501; Carranoら, 1999, Nat. Cell Biol. 1: 193)。これらの調製物中の組換えタンパク質のおよその濃度(pmole/μl)は: Skp1, 5; Skp2, 0.5; Cul-1, 4; ROC1, 1; サイクリンE, 8; Cdk2, 1.5であった。精製組換えヒトNedd8はC. Pickartから厚意により提供されたものであり、精製組換えヒトCks1はS. Reedから厚意による提供されたものであった。精製GST-IκBα(1〜154)およびその構成的活性型キナーゼIKKβSl77E.S181EはZ.-Q. Panにより厚意により提供された。35S標識p27、Skp2およびCksタンパク質はTnT Quickキット(Promega)および35S-メチオニン(Amersham)を用いたin vitro転写-翻訳により調製した。
【０３４５】
Nedd8結合酵素の精製  精製組換えヒトNedd8はC. Pickartから厚意により提供されたものであった。Nedd8結合酵素の混合物(E1様APP-BP1-Uba3ヘテロダイマーおよびE2様Ubc12: Osakaら, 1998, Genes Dev. 12: 2263; Gong, L., Yeh, E. T., 1999, J. Biol. Chem. 274: 12036)は、未分画網状赤血球溶解物をGST-Nedd8-セファロース(5mg/ml)カラムに適用したことを除き、E2の精製(Hershkoら, 1983, J. Biol. Chem. 258: 8206)で使用される手順と同様の「共有結合アフィニティ」クロマトグラフィー手順によりウサギ網状赤血球溶解物から同時精製した。1M KClでの洗浄後、チオールエステル結合により固定化Nedd8に結合した全てのタンパク質を20mM DTTを含有する溶液で同時溶出した。DTT溶出液を限外濾過により網状赤血球溶解物の原体積の約1/10まで濃縮した。この調製物はNedd8のCul-1への連結において強い活性を有していたが、Cul-1からNedd8を除去する加水分解酵素活性は検出できなかった。
【０３４６】
p27-ユビキチン連結に必要な因子の精製  HeLa S3細胞(National Cell Culture Center)50gの凍結ペレットを、バッファーに10μg/mlキモスタチンおよび5μg/mlアプロチニンをさらに含めたこと以外は、Montagnoliら, 1999, Genes & Dev. 13: 1181で記載されたとおりに窒素ガス細胞破砕器(Parr, Moline, IL)により破砕した。この抽出物を15,000×gで20分間遠心分離し、上清を再度100,000×gで60分間遠心分離した。この上清を、タンパク質2,500mgを樹脂250mlにロードしたこと以外は、記載のとおりにDEAE−セルロースでの分画に供した(Hershkoら, 1983, J. Biol. Chem. 258: 8206)。樹脂に吸着されなかった画分(画分1)を回収し、遠心限外濾過により約10mg/mlに濃縮した。画分1(タンパク質100mg)を90℃で10分間の熱処理に供した。サンプルを氷上で30分間置いた後、遠心分離(10,000×g、15分間)により沈降物を除去した。約99%のタンパク質が熱処理により除去された。上清を限外濾過により濃縮した後、50mM Tris-HCl、1mM DTTおよび0.1%(w/v)Brij-35(Boehringer)で平衡化したMonoS HR 5/5 カラム(Pharmacia)に適用した。カラムを上記バッファー15mlで洗浄し、次いで、0〜200mM NaClの勾配で溶出した。精製SCFSkp2成分の存在下でのp27-ユビキチン連結アッセイによりカラム画分の活性を追跡した(以下を参照)。活性のピーク画分は約30〜40mM NaClで溶出した。因子活性を含有するピークをプールし、遠心限外濾過により濃縮し、20mM Tris-HCl(pH7.2)、150mM NaCl、1mM DTTおよび0.1%Brij-35で平衡化したSuperdex-75 HR 10/30カラム(Pharmacia)でのゲル濾過クロマトグラフィーの最終工程に供した。サンプル0.5mlを流速0.4ml/分で回収した。カラム画分を遠心限外濾過(Centricon-10, Amicon)により体積50μlに濃縮した。カラム画分のサンプル0.004μlをp27-ユビキチン連結刺激活性についてアッセイした。結果をホスホイメージャー(phosphorimager)解析により定量し、ユビキチンコンジュゲートに変換された35S-p27の割合として示した。上部の矢印は分子量マーカータンパク質(kDa)の溶出位置を示している。
【０３４７】
質量分析による配列決定  精製最終工程の10kDaタンパク質を切り出し、記載のとおりにゲル中で消化した(Shevchenkoら, 1996, Anal. Cham. 68: 850)。質量分析による解析はSciex QSTAR質量分析計(MDS-Sciex, Concord, ON, Canada)で行った。二重および三重荷電種から質量2163.5のトリプシンペプチドのフラグメンテーションを行い、ヒトCks1の残基5〜20番と完全な一致を得た。
【０３４８】
p27-ユビキチン連結アッセイ  特に断りのない限り、反応混合物には体積10μl中: 40mM Tris-HCl(pH7.6)、5mM MgCl2、1mM DTT、10%(v/v)グリセロール、10mMホスホクレアチン、100μg/mlクレアチンホスホキナーゼ、0.5mM ATP、1mg/ml ダイズトリプシン阻害剤、1μMユビキチンアルデヒド、1mg/mlメチル化ユビキチン、1pmol E1、50pmol Cdc34、0.25μl Skp2/Skp1、0.25μl Cul-1/ROC1、0.1μlサイクリンE/Cdk2、35S-p27 0.5μlおよび指定の添加物を含めた。30℃で60分間のインキュベーションの後、サンプルに対してSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーを行った。IκBαのユビキチンへの連結を、バキュロウイルス発現させ、精製したSkp1/β-TrCPを使用した(5pmol Skp1,約1pmol β-TrCP)ことを除き、記載のとおりにアッセイした(Chenら, 2000, J. Biol. Chem. 275: 15432)。
【０３４９】
32P標識した精製p27の調製およびそのユビキチン化アッセイ  精製p27(0.18μg)をCdk2/サイクリンE(0.25μl)とともに体積10μl中: 50mM Tris-HCl(pH7.6)、5mM MgCl2、1mM DTT、10%グリセロール、1mg/mlダイズトリプシン阻害剤、1μMオカダ酸および100μM[32P-γ-]ATP(約50μCi)を含有する反応混合物中でインキュベートした(30℃で60分)。この調製物を「32P-p27」と呼ぶ。p27のMeUbへの連結を、次の変更を加えて上記のようにアッセイした:35S-p27を32P-p27と置き換え、非標識ATPの濃度を2mM(32P-p27の調製物中に存在する標識ATPをより十分に同位体希釈するため)に高め、さらにオカダ酸(1μM)を添加した。
【０３５０】
p27とSkp2/Skp1との結合アッセイ  反応混合物には体積10μl中: 40mM Tris-HCl(pH7.6)、2mg/mlウシ血清アルブミン、1μl35S-p27、1μl Cdk2/サイクリンE、1μl Skp2/Skp1、ならびにp27-ユビキチン連結アッセイ用の上記濃度と同様の濃度のMgCl2、ATP、DTT、ホスホクレアチンおよびクレアチンホスホキナーゼを含めた。30℃で30分間のインキュベーションの後、ジメチルピメリミデートによって全長Skp2に対するポリクローナルウサギ抗体(Carranoら, 1999, Nat. Cell Biol. 1: 193)と共有結合させた(Harlow, E. & Lane, D., 1998, in Antibodies. A Laboratory Manual(Harlow, E. & Lane, D.編), Cold Spring Harb. LabPress, Cold Spring Harbor, NY)Affi-prep-プロテインAビーズ(BioRad)6μlを加えた。サンプルを抗Skp2-プロテインAビーズとともに4℃で2時間回転させた後、ビーズをRIPAバッファー各1mlで4回洗浄した(Harlow, E. & Lane, D., 1998, in Antibodies. A Laboratory Manual (Harlow, E. & Lane, D.編), Cold Spring Harb. LabPress, Cold Spring Harbor, NY)。SDS電気泳動サンプルバッファーで溶出した後、サンプルをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーに供した。
【０３５１】
9.2  結果
9.2.1  画分1由来の因子はタンパク質である
画分1の活性は90℃での加熱では破壊されない。しかしながら、熱処理した画分1をトリプシンとともにインキュベーションするとその活性が完全に破壊されたという観察から分かるように活性因子はタンパク質である(図44、レーン2)。熱処理画分1(約0.1mg/ml)をTPCK処理済のトリプシン(Sigma T8642)の0.6mg/mlの不在(レーン1)または存在(レーン2)下で、50mM Tris-HCl(pH8.0)とともに37℃で60分間インキュベートした。2mg/mlのダイズトリプシン阻害剤(STI)を添加してトリプシンの働きを停止させた。レーン3では、トリプシンを用いた同様のインキュベーションの5分前にSTIを添加した。続いて、熱処理画分1の約50ngに相当するサンプルをp27-ユビキチン連結刺激についてアッセイした。トリプシンを用いた画分1のインキュベーションは過剰のダイズトリプシン阻害剤(STI)の添加により停止させる。この阻害剤は系の他の成分へのタンパク質分解損傷を防ぐものであり、トリプシン処理後に添加される。トリプシンを用いたインキュベーションの前にSTIを加熱画分1に添加する対照試験で分かるようにSTIはトリプシンの働きを実に効果的に阻害する(図44、レーン3)。このインキュベーションにおいてp27-ユビキチン連結の有意な減少はない。
【０３５２】
9.2.2  画分1の因子はNedd8ではない
Podust ら(Podustら, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 4579)はp27のユビキチンへの連結には画分1が必要であることを報告し、Nedd8が画分1の活性成分であることを示唆してきた。Nedd8(酵母ではRub-1と呼ばれる)はCul-1(Yehら, 2000, Gene 248: 1)を含めた種々のカリンと連結する高度に保存されたユビキチン様タンパク質である。Nedd8のCul-1への連結は、ユビキチンのIκBαへの連結におけるSCFβ-TrCP複合体の活性にとって絶対的に必要なものではないが、それを刺激することが分かっている(Furukawaら, 2000, Mol. Cell Biol. 20: 8185; Readら, 2000, Mol. Cell Biol. 20: 2326; Wuら, 2000, J. Biol. Chem 275: 32317)。網状赤血球溶解物でin vitro翻訳により35S標識したp27を産生することが可能であり、さらに網状赤血球溶解物にはNedd8のカリンへの連結に必要な酵素が含まれているため(Osakaら, 1998, Genes Dev. 12: 2549)、これらの条件下でNedd8をCul-1に連結しうることが可能である。しかし、p27-ユビキチン連結を促進する場合、組換え精製Nedd8は画分1由来の因子の代わりにはならない(図45A)。示されるように、熱処理画分1の約50ngまたは精製組換えヒトNedd8の100ngをp27-MeUb連結アッセイに添加する。この問題をさらに調べるため、Nedd8をCul-1に連結する酵素をGST-Nedd8-セファロースでのアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。Cul-1をNedd8およびその精製結合酵素とインキュベーションすることで約2分の1のCul-1分子がSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動においてより遅く移動するNedd8結合型に変換される(図45B)。Nedd8のCul-1への連結。Cul-1/ROC1(3μl)をNedd8(10μg)および精製Nedd8結合酵素(20μl)とともにp27-ユビキチン連結アッセイのために記載された濃度と同様の濃度のTris(pH7.6)、MgCl2、ATP、ホスホクレアチン、クレアチンホスホキナーゼ、DTT、グリセロールおよびSTIを含有する反応混合物100μl中でインキュベートする。Cul1/ROC1の対照調製物を、Nedd8結合酵素を含まないことを除き、同様の条件下でインキュベートする。30℃で2時間のインキュベーションの後、対照またはNedd8改変調製物のサンプルを8%ポリアクリルアミド-SDSゲル上で分離し、抗Cul-1抗体(Zymed)を用いて免疫ブロットする。移動の遅い方の型が実際にNedd8を含み、これはNedd8に対して向けられた特異的抗体を用いた免疫ブロットにより確認される。Nedd8結合Cul-1および非改変Cul-1に関するこれらの調製物のp27ユビキチン化反応における活性を熱処理画分1の存在または不在下で測定する。網状赤血球溶解物には、Nedd8とCul-1とのアミド結合を迅速に切断する酵素も含まれているため、網状赤血球溶解物で翻訳された35S標識p27ではなく、細菌発現させ、精製したp27(20ng)が基質として使用される。p27のMeUbへの連結が30℃で60分間で起こった後、12.5%ポリアクリルアミド-SDSゲルでの分離、ニトロセルロースへの転写、さらにp27に対して向けられたモノクローナル抗体(Transduction Laboratories)での免疫ブロットを行う。この精製系の使用および熱処理画分1の存在下では、非改変Cul-1により有意なp27モノユビキチン化誘導体、および若干のジユビキチン化誘導体の形成が促進される(図45C)。精製系では、in vitroで翻訳した35S-p27で見られる4〜5コンジュゲートとは対照的にジユビキチン化型よりも大きなMeUbとのコンジュゲートは見られない(図44との比較)。Nedd8と結合したCul-1では、p27のユビキチン化への適度な刺激が見られ、ジユビキチン誘導体の形成が特別増大する(図45、���ーン3)。Cul-1の異なる調製物では、Nedd8連結によってp27-ユビキチン連結の全体速度が1.5〜3倍上がる。非改変Cul-1で見られるp27ユビキチン連結の基礎活性は、同様の活性がその特異的Nedd8連結部位(Yehら, 2000, Gene 248: 1)のLys720がArgに変化した突然変異体Cul-1でも見られることから、バキュロウイルス発現Cul-1が精製された昆虫細胞内でのNedd8によるその有意な改変によるものではない。他の研究者は同様の突然変異によりNedd8改変を排除することでIκBαのユビキチン化におけるSFCβ-TrCP活性がかなり低下するが完全に破壊されるのではなかったことにも気付いた(Furukawaら, 2000, Mol. Cell Biol. 20: 8185; Readら, 2000, Mol. Cell Biol. 20: 2326; Wuら, 2000, J. Biol. Chem 275: 32317)。重要なことは、Nedd8改変Cul-1の存在下でさえp27-MeUb連結に画分1の補給がなお必要であることである(図45、レーン5および6)。MeUbを天然ユビキチンと置き換えても、後者の場合にp27の高分子量ポリユビキチン誘導体が形成されることを除き、同様の結果が得られる。よって、このデータは画分1の活性成分がNedd8であるというPodust ら(Podust ら, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 : 4579)の結論を支持するものではない。
【０３５３】
9.2.3  因子の精製およびCks1としてのその同定
画分1の因子を精製する。図46Aはゲル濾過カラムでの精製の最終工程を示している。MonoS工程の活性材料のピークを20mM Tris-HCl(pH7.2)、150mM NaCl、1mM DTTおよび0.1%Brij-35で平衡化したSuperdex75 HR 10/30カラム(Pharmacia)に適用した。サンプル0.5mlを流速0.4ml/分で回収した。カラム画分を遠心限外濾過(Centricon-10, Amicon)により体積50μlに濃縮した。カラム画分のサンプル0.004μlを、p27-ユビキチン連結刺激活性についてアッセイした。結果をホスホイメージャー解析により定量し、ユビキチンコンジュゲートに変換された35S-p27の割合として示した。上部の矢印は分子量マーカータンパク質(kDa)の溶出位置を示している。活性は見かけの分子量 約10kDaでシャープなピークとして溶出した。Superdex 75カラムの指定の画分からのサンプル2.5μlの16%ポリアクリルアミド-SDSゲルでの電気泳動およびカラム画分の銀染色では約10kDaの単一タンパク質が示される(図46B)。右側の数字は分子量マーカータンパク質(kDa)の移動位置を示す。約10kDaタンパク質ピークの溶出は画分27〜28での活性のピークの溶出と一致した。しかしながら、活性が著しく下降する場合には画分30〜31でも同様のサイズのタンパク質が溶出され続ける。タンパク質を同定するため、画分28(活性のピーク)および活性のピーク後の画分31由来のサンプルを、質量分析によるトリプシンペプチドの配列決定に供する。ヒトCks1のアミノ酸残基5〜20番に相当する、配列QIYYSDKYDDEEFEYRのトリプシンペプチドは両画分の約10kDaタンパク質において検出される。これらの異なる画分においてCks1タンパク質の活性が異なる理由は分かっていない。画分31のCks1タンパク質はゲル濾過カラムにおける排除特性を変えうる変性コンフォーマーであると考えられる。
【０３５４】
9.2.4 Cks1/Sucタンパク質の活性
この研究で使用した全てのCks/Suc1タンパク質が機能的であったか否かを確認するため、本発明者らはタンパク質キナーゼCdk1/サイクリンBによるサイクロソーム/APCの多重リン酸化を促進する際のそれらの働きを調べた(Patra, D. & Dunphy, W. G., 1998, Genes Dev. 12: 2549; Shteinberg, M. & Hershko, A., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257: 12)。S期HeLa細胞由来のサイクロソームを部分的に精製し(Yudkovskyら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 271: 299)、Suc1を含まないCdk1/サイクリンB(Shteinberg, M. & Hershko, A., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257: 12)500単位とともに記載のとおりにインキュベートした(Yudkovskyら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun. 271: 299)。
【０３５５】
示されるように、対応するCks/Suc1タンパク質10ng/μlを補給した。サンプルを、ヒトCdc27に対して向けられたモノクローナル抗体(Transduction Laboratories)を用いた免疫ブロットに供した。図47で示されるように、Cdk1触媒によるCdc27、サイクロソーム/APCのサブユニットの高リン酸化は3種類の組換えCks/Suc1タンパク質全てによって明らかに刺激される。このことは非リン酸化型Cdc27の減少とSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動においてより遅く移動する数種類の高リン酸化型へのその変換によって示される(図47、レーン3〜5)。全ての組換えCks/Suc1タンパク質によって促進されるこの大きな電気泳動シフトにはタンパク質キナーゼCdk1/サイクリンBの働きが必要である(図47、レーン6)。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシー染色によって示されるように、使用した3種類の細菌発現Cks/Suc1タンパク質全てが少なくとも95%均一である。
【０３５６】
9.2.5 p27-ユビキチン連結に必要な因子がCks1であることの確認
in vitro翻訳により産生したCks1(図48B、レーン3)または細菌発現した精製Cks1(図48B、レーン6)はこの反応において因子と効果的に置き換えられた。この働きはCks1に特異的であることが分かり、Cks/Suc1タンパク質ファミリーの他のメンバーによって共有されない。Cks1と81%同一であり、かつ90%類似しているヒトCks2、ならびに分裂酵母相同体Suc1は、in vitro翻訳により(図48B、レーン4)または細菌発現した精製タンパク質(図48B、レーン7および8)として産生した場合、この反応において完全に不活性である。精製組換えCks2およびSuc1は、Cdk1によるCdc27の多重リン酸化を促進するそれらの能力によって示されるようにそれらが機能的であるにもかかわらず、濃度を50倍まで上げて加えてもp27-ユビキチン連結を刺激しない。よって、これらの立証を組み合わせると、p27-ユビキチン連結におけるCks1の働きは特異的なものであり、このタンパク質ファミリーの他のメンバーに共有されないことが強く示される。
【０３５７】
9.2.6 Cks1がユビキチンのP27への連結を促進する
全ての哺乳類のSCF複合体の働きにCks1が必要であるとは限らないようである。十分に特性決定されたSCFβ-TrCPの場合、精製複合体はin vitroにおいてIκBの強力なユビキチン化を行う(Tanら, 1999, Mol. Cell 3: 527)。さらに、Cks1の添加が精製SCFβ-TrCPによりリン酸化されたIκBαへのユビキチンの連結速度に与える影響は観察できなかった。Cks1はSCFSkp2複合体の働きまたはp27-ユビキチン連結に必要な他のいくつかのプロセスのいずれかに特に関連していると思われた。p27はSCFSkp2複合体による認識のためにCdk2によりThr-187でリン酸化される必要があり(Carranoら, 1999, Mat. Cell Biol. 1: 1993; Tsvetkovら, 1999, Current Biology 661)、さらにCksタンパク質が全てではないがいくつかのCdk/サイクリン複合体のタンパク質キナーゼ活性を刺激し得る(Reynardら, 2000, Mol. Cell Biol. 20: 5858)ことから、Cks1がCdk2によるp27のリン酸化を刺激することが可能であると思われる。しかしながら、(図49A)で示されるように、p27はCks1の不在下でCdk2/サイクリンEにより迅速にリン酸化され、Cks1の添加によりこのプロセスに与えた有意な影響はない。Cdk2/サイクリンEおよび32[P-γ]ATPとのインキュベーションにより精製p27が最初にリン酸化される場合、その後のMeUbへの連結にはCks1がなお必要である(図49B)という知見によりCks1がp27のリン酸化に続く工程で働くという結論が確証される。よって、Cks1はリン酸化p27とSkp2との結合を強く刺激する。
【０３５８】
9.2.7 Cks1はリン酸化p27のSkp2への結合に作用する
Cks1が作用する工程がリン酸化p27とSkpとへの結合であるか否かを調べた。Skp1の不在下では組換えSkp2が可溶形態で昆虫細胞で十分に発現されないことからSkp2の代わりにSkp2/Skp1複合体を使用した。これまでに、in vitroで翻訳した35S標識p27とSkp2/Skp1との少ないが有意な結合が検出された(Skp2に対して向けられた抗体を用いた免疫沈降により)。これはCdk2/サイクリンEによるThr-187でのそのリン酸化に依存するものである(Carranoら, 1999, Nat. Cell Biol 1: 193)。同様の手順を用いて、p27とSkp2/Skp1との結合がCks1により強く刺激される(図49C、レーン2および3)。リン酸化が可能ではない突然変異体 Thr-187-Alaの結合がCks1の存在下でも起こらなかったため、この働きにはp27のThr-187でのリン酸化が必要である(図49C、レーン4および5)。Cks1のこの働きがin vitroで翻訳したp27調製物に存在する網状赤血球溶解物を全く含まない完全精製系でも生じるか否かを調べるために、32[P-γ]ATPによりリン酸化される細菌発現した精製p27を用いて同様の試験を行う。この場合には、Skp2の不在下でリン酸化p27と抗Skp2-プロテインAビーズとのいくつかの非特異的結合が存在する。さらに、Cks1による32P-p27とSkp2/Skp1との特異的結合の著しい刺激が見られる(図49D)。よって、Cks1はリン酸化p27とSkp2との結合を強く刺激する。
【０３５９】
図50Aで示されるように、35S-Cks1とSkp2/Skp1複合体との強力な結合が見られた。同様の条件下で、35S-Cks2とSkp2/Skp1との結合は見られなかった。これらの試験ではSkp2/Skp1複合体を使用するため(組換え天然Skp2を欠くので)、Skp2の不在下でCks1がSkp1と結合し得るか否かが調べられる。図50Bで示した試験では、35S-Cks1をHis6-Skp1またはSkp2/His6-Skp1複合体のいずれかとともにインキュベートした後にNi-NTA-アガロースビーズとの結合を評価する。Cks1とSkp2/His6-Skp1との強力な結合は見られたが、His6-Skp1との結合は見られなかった。このように、ヒトCks1は恐らくSkp2タンパク質を介してSkp2/Skp1複合体と特異的に結合する。
【０３６０】
本明細書に示した結果から、Skp2とホスホペプチドセファロースビーズとの結合は(同一ではあるが非リン酸化p27-誘導ペプチドを含有する対照ビーズとは結合しない)Cks1によって著しく増強されることが示される(図50C)。これらの知見から、このホスホペプチドへの結合が、Cks1が助けとなるSkp2-p27相互作用を研究するための有効なツールとして役立ちうることがわかる。同じp27-誘導ペプチドビーズを用いて、35S-Cks1とリン酸化p27ペプチドとの有意な結合が見られる(非リン酸化p27ペプチドとの結合は見られない)(図50D)。これらの知見から、Cks1がp27のホスホ-Thr187と直接結合することが示され、Cdk2/サイクリンEの存在がSkp2のリン酸化p27への結合にとって必ずしも必要でないことが立証される。
【０３６１】
10.  実施例: FBPと細胞周期調節タンパク質(例えば、SKP2とE2F)との相互作用を同定するアッセイ
公知のFBP、Skp2の新規基質を同定するために次の研究を行った。
【０３６２】
図44で示されるように、p53およびサイクリンBを含めたE2F-1 (アッセイしたユビキチン経路のその他の基質ではなく)がSkp2と物理的に会合する。Skp2およびE2F-1(レーン1、4および5)、またはSkp2およびヘキサ-ヒスチジンp53(His-p53)(レーン2、6、7、10および11)、またはSkp2およびHis-サイクリンB(レーン3、8、9、12および13)を同時発現するバキュロウイルスで感染させた昆虫細胞抽出物をSkp2に対する抗血清を用いて直接免疫ブロットする(レーン1〜3)か、または最初にSkp2に対する抗血清を用いて免疫ブロットに供し(レーン1〜3)、または最初に指定の抗体を用いて免疫沈降に供した後、Skp2に対する抗血清を用いて免疫ブロットした(レーン4〜13)。免疫沈降に使用する抗体は: 標準精製マウス免疫グロブリン(IgG)(レーン4、6、10および12)、精製マウスモノクローナル抗E2F-1抗体(KH-95, Santa Cruz製)(レーン5)、精製マウスモノクローナル抗p53抗体(DO-1, Oncogene Science製)(レーン7)、精製ウサギIgG(レーン8)、精製ウサギポリクローナル抗サイクリンB抗体(レーン9)、精製マウスモノクローナル抗His抗体(clone 34660, Qiagen製)(レーン11および13)である。
【０３６３】
図44Bで示されるように、Skp2はユビキチン経路のその他の基質ではなくE2F-1と物理的に会合する(p53およびサイクリンB)。Skp2およびE2F-1(レーン1〜3)、またはSkp2およびHis-p53(レーン4〜6)、またはSkp2およびHis-サイクリンB(レーン7〜9)を同時発現するバキュロウイルスで感染させた昆虫細胞抽出物を指定のタンパク質に対する抗体を用いて直接免疫ブロットする(レーン1、4および7)か、または最初に指定の抗血清を用いて免疫沈降に供した後、指定のタンパク質に対する抗体を用いて免疫ブロットした(レーン2、3、5、6、8および9)。免疫沈降に使用する抗血清は: 抗Skp2血清(レーン2、5および8)、および標準ウサギ血清(NRS)(レーン3、6および9)である。
【０３６４】
図44Cで示されるように、E2F-1は別のF-ボックスタンパク質(FBP1)ではなくSkp2と物理的に会合する。Skp2およびE2F-1(レーン1、3および4)、またはFlagタグ付きFBP1およびE2F-1(レーン2、5および6)を同時発現するバキュロウイルスで感染させた昆虫細胞抽出物をマウスモノクローナル抗E2F-1抗体を用いて直接免疫ブロットする(レーン1および2)か、または最初に指定の抗体を用いて免疫沈降に供した後、マウスモノクローナル抗E2F-1抗体を用いて免疫ブロットした(レーン3〜6)。免疫沈降に使用する抗体は: 抗Skp2血清(レーン3)、NRS(レーン4)、精製ウサギポリクローナル抗Flag(レーン5)、精製ウサギIgG(レーン6)である。
【０３６５】
この実施例に使用する方法論は、限定されるものではないが、FBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、およびFBP25などの本発明のFBPを含めたいずれのFBPの新規基質の同定にも適用できる。
【０３６６】
本発明は記載した特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、それらの実施形態は本発明の各態様の一例として意図されるものであり、機能的に同等の方法および成分は本発明の範囲内にある。実際に、本明細書で示し記載したもの以外の本発明の種々の改変については、当業者ならば上記の説明および添付の図面から明らかであろう。かかる改変も添付の特許請求の範囲の範囲内にあると考えられる。
【０３６７】
本明細書において引用された全ての参照文献は全ての目的のために参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【０３６８】
【図１】ヒトF-ボックスタンパク質FBP1、FBP2、FBP3a、FBP3b、FBP4、FBP5、FBP6、FBP7、Skp2、FBP8、FBP9、FBP10、FBP11、FBP12、FBP13、FBP14、FBP15、FBP16、FBP17、FBP18、FBP19、FBP20、FBP21、FBP22、FBP23、FBP24、FBP25の保存されているF-ボックスアミノ酸残基のアライメントを示す。
【図２】FBPの模式図を示す。
【図３Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP1のアミノ酸配列(配列番号2)を示す。
【図３Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP1のcDNA(配列番号1)を示す。
【図４Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP2のアミノ酸配列(配列番号4)を示す。
【図４Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP2のcDNA(配列番号3)を示す。
【図５Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP3aのアミノ酸配列(配列番号6)を示す。
【図５Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP3aのcDNA(配列番号5)を示す。
【図６Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP3bのアミノ酸配列(配列番号24)を示す。
【図６Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP3bのcDNA(配列番号23)を示す。
【図７Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP4のアミノ酸配列(配列番号8)を示す。
【図７Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP4のcDNA(配列番号7)を示す。
【図８Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP5のアミノ酸配列(配列番号10)を示す。
【図８Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP5のcDNA(配列番号9)を示す。
【図９Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP6のアミノ酸配列(配列番号12)を示す。
【図９Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP6のcDNA(配列番号11)を示す。
【図１０Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP7のアミノ酸配列(配列番号14)を示す。
【図１０Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP7のcDNA(配列番号13)を示す。
【図１１Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP8のアミノ酸配列(配列番号26)を示す。
【図１１Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP8のcDNA(配列番号25)を示す。
【図１２Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP9のアミノ酸配列(配列番号28)を示す。
【図１２Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP9のcDNA(配列番号27)を示す。
【図１３Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP10のアミノ酸配列(配列番号30)を示す。
【図１３Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP10のcDNA(配列番号29)を示す。
【図１４Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP11のアミノ酸配列(配列番号32)を示す。
【図１４Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP11のcDNA(配列番号31)を示す。
【図１５Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP12のアミノ酸配列(配列番号34)を示す。
【図１５Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP12のcDNA(配列番号33)を示す。
【図１６Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP13のアミノ酸配列(配列番号36)を示す。
【図１６Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP13のcDNA(配列番号35)を示す。
【図１７Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP14のアミノ酸配列(配列番号38)を示す。
【図１７Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP14のcDNA(配列番号37)を示す。
【図１８Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP15のアミノ酸配列(配列番号40)を示す。
【図１８Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP15のcDNA(配列番号39)を示す。
【図１９Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP16のアミノ酸配列(配列番号42)を示す。
【図１９Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP16のcDNA(配列番号41)を示す。
【図２０Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP17のアミノ酸配列(配列番号44)を示す。
【図２０Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP17のcDNA(配列番号43)を示す。
【図２１Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP18のアミノ酸配列(配列番号46)を示す。
【図２１Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP18のcDNA(配列番号45)を示す。
【図２２Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP19のアミノ酸配列(配列番号48)を示す。
【図２２Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP19のcDNA(配列番号47)を示す。
【図２３Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP20のアミノ酸配列(配列番号50)を示す。
【図２３Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP20のcDNA(配列番号49)を示す。
【図２４Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP21のアミノ酸配列(配列番号52)を示す。
【図２４Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP21のcDNA(配列番号51)を示す。
【図２５Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP22のアミノ酸配列(配列番号54)を示す。
【図２５Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP22のcDNA(配列番号53)を示す。
【図２６Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP23のアミノ酸配列(配列番号56)を示す。
【図２６Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP23のcDNA(配列番号55)を示す。
【図２７Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP24のアミノ酸配列(配列番号58)を示す。
【図２７Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP24のcDNA(配列番号57)を示す。
【図２８Ａ】ヒトF-ボックスタンパク質FBP25のアミノ酸配列(配列番号60)を示す。
【図２８Ｂ】対応するヒトF-ボックスタンパク質FBP25のcDNA(配列番号59)を示す。
【図２９】FBPがそれらのF-ボックスを介してSkp1と特異的に相互作用することを示した図である。
【図３０】FBP1、FBP2、FBP3a、FBP4およびFBP7がin vivoにて内因性Skp1およびCul1との新規なSCFを形成することを示した図である。
【図３１】FBP1、FBP2、FBP3a、FBP4およびFBP7がユビキチンリガーゼ活性と会合することを示した図である。
【図３２】FBPの細胞下局在を示した図である。
【図３３】ヒト組織におけるFBP転写物の存在量を示した図である。
【図３４】FBP遺伝子のFISH局在を示した図である。パネルAはFBP1の10q24への局在を示し、BはFBP2の9q34への局在を示し、CはFBP3aの13q22への局在を示し、DはFBP4の5pl2への局在を示し、EはFBP5の6q25-26への局在を示す。
【図３５】FBP1がβ-カテニンと会合することを示した図である。
【図３６】ドミナントネガティブ(ΔF)FBP1変異体によるβ-カテニンの安定化を示した図である。
【図３７】リン酸化p27のSkp2への結合を示した図である。
【図３８】in vivoにおけるSkp2のp27への結合を示した図である。
【図３９】Skp2およびサイクリンE/Cdk2複合体がG1抽出物におけるp27ユビキチン化の律速条件であることを示した図である。
【図４０】Skp2がp27-ユビキチン連結活性に必要であることを示した図である。
【図４１】p27分解におけるSkp2のin vivoでの役割を示した図である。
【図４２】SKP2 mRNAをターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞性p27の安定化を示した図である。
【図４３】p27分解過程でのSkp2作用のタイミングを示した図である。
【図４４】熱安定性因子がトリプシン作用に対して感受性であることを示した図である。
【図４５】熱安定性因子はNedd8ではなく、Nedd8によるCul-1の修飾の後に必要とされることを示した図である。
【図４６】p27-ユビキチン連結に必要な因子の精製およびそのCks1としての同定を示した図である。
【図４７】細菌で発現させたCks/Suclタンパク質が全てサイクロソーム/APCのCdc27サブユニットの多重リン酸化を刺激することを示した図である。
【図４８Ａ】p27-ユビキチン連結に必要とされる因子のCks1としての同定を示した図である。35S-p27とMeUbとの連結をアッセイした。示された場合、画分1(5μgタンパク質)または熱処理した画分1(約50ng)を加えた。パネルの左側の括弧はポリユビキチン化p27に相当する＞27,000Daのバンドのラダーをマークしている。
【図４８Ｂ】Cks1(他のCksタンパク質はそうではない)がp27-ユビキチン連結に必要であることを示した図である。
【図４９Ａ−Ｂ】Cks1がリン酸化p27とSkp2との結合を増強することを示した図である。  A. Cks1はCdk2/サイクリンEによるp27のリン酸化に影響しないことを示す。  B. Cks1はp27のリン酸化に続く段階で働くことを示す。
【図４９Ｃ−Ｄ】C. Cks1は、Thr-187のリン酸化に依存して、p27とSkp2/Skp1との結合を増強することを示す。  D. Cks1は32P-p27とSkp2/Skp1との結合を増強することを示す。
【図５０Ａ−Ｂ】Cks1とSkp2およびリン酸化p27との結合を示した図である。  A. Cks1(Cks2はそうではない)はSkp2/Skp1と結合することを示す。  B. Cks1はSkp1とは結合しないことを示す。
【図５０Ｃ−Ｄ】C. Cks1はSkp2とp27ホスホペプチドとの結合を刺激することを示す。  D. Cks1はp27ホスホペプチドと結合することを示す。
【図５１】Skp2/E2F相互作用アッセイのウエスタンブロット解析を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ−Ｂ】
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【図４９Ｃ−Ｄ】
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【図５０Ａ−Ｂ】
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【図５０Ｃ−Ｄ】
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【図５１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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