(57)【要約】高レベルの神経栄養活性と低レベルの免疫抑制活性を有するタクロリムス誘導体。これらの化合物は、神経栄養剤、特に、神経傷害／機能不全の予防又は治療用の神経栄養剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経栄養剤の製造のための、以下の式：
【化１】
2004527472.tif 000012
の化合物の使用。
【請求項２】
神経栄養剤が神経傷害／機能不全の予防又は治療用である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
向神経剤が神経細胞成長又は再生の刺激又は促進用である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
向神経剤が神経傷害からの機能回復の促進用である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
神経傷害／機能不全が、多発性筋炎、ギラン−バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎、単発神経炎（孤立性神経炎）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、神経根障害、糖尿病性神経障害、化学療法誘発神経障害、老人性痴呆症、血管性痴呆症、多発性硬化症、身体麻痺又は脊髄損傷である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
神経傷害／機能不全が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、化学療法誘発神経障害又は脊髄損傷である、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
化合物（Ｉ）が、その医薬として許容できる塩、誘導体、プロドラッグ又は溶媒和物の形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
以下の式：
【化２】
2004527472.tif 000013
を有する化合物（Ｉ）を含む組成物。
【請求項９】
化合物（Ｉ）が、その医薬として許容できる塩、誘導体、プロドラッグ又は溶媒和物の形態である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
化合物（Ｉ）が化合物（Ｉａ）の形態である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの他の神経栄養剤を更に含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
包装物と包装物内に含まれる化合物（Ｉ）とを含む製品又はキットであって、包装物が、神経傷害／機能不全の予防、改善又は治療に化合物（Ｉ）を使用できること又は使用すべきであることを指示しているラベル又は記載物を含む、製品又はキット。
【請求項１３】
化合物（Ｉ）を含む医薬組成物とそれに添付される記載物とを含む商業パッケージ又はキットであって、記載物が、神経傷害／機能不全の予防、改善又は治療に化合物（Ｉ）を使用できること又は使用すべきであることを記述している、商業パッケージ又はキット。
【請求項１４】
神経栄養剤の生産又は製造方法であって、化合物（Ｉ）を、医薬として許容できる担体、溶媒又は賦形剤と混合することを含む方法。
【請求項１５】
神経傷害／機能不全の予防、改善又は治療の方法であって、その必要のある被験体に有効量の化合物（Ｉ）を投与することを含む方法。
【請求項１６】
被験体が哺乳動物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
被験体がヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
神経傷害／機能不全が、多発性筋炎、ギラン−バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎、単発神経炎（孤立性神経炎）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、神経根障害、糖尿病性神経障害、化学療法誘発神経障害、老人性痴呆症、血管性痴呆症、多発性硬化症、身体麻痺又は脊髄損傷である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
神経傷害／機能不全が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、化学療法誘発神経障害又は脊髄損傷である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
神経細胞成長又は再生の刺激又は促進の方法であって、神経細胞を化合物（Ｉ）と接触させることを含む方法。
【請求項２１】
軸索成長若しくは再生の速度、又は神経細胞の長さを増加させる方法であって、神経細胞を化合物（Ｉ）と接触させることを含む方法。
【請求項２２】
その必要のある組織で神経細胞成長を増加させる方法であって、組織に化合物（Ｉ）を投与することを含む方法。
【請求項２３】
組織が、脳組織、脊髄組織又は末梢神経組織からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
神経傷害からの機能回復の促進方法であって、その必要のある被験体に有効量の化合物（Ｉ）を投与することを含む方法。
【請求項２５】
神経傷害が、火傷、外傷性傷害、機械的傷害、手術性傷害、生理的傷害、病理的傷害及び免疫的傷害からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
断裂した末梢神経又は脊髄の修復方法であって、末梢神経又は脊髄の断裂末端を有効量の化合物（Ｉ）と接触させることを含む方法。
【請求項２７】
被験体における断裂した末梢神経又は脊髄の修復方法であって、被験体に神経成長刺激量の化合物（Ｉ）を投与し、末梢神経又は脊髄に移植することを含む方法。
【請求項２８】
移植片が同種異系移植片である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
移植片が人工神経移植片である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
末梢神経又は脊髄の断裂末端間の空間を、非細胞性間隙充填物質で充填することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
末梢神経又は脊髄の断裂末端間の空間を細胞懸濁液で充填することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
化合物（Ｉ）で処理された神経細胞を含む組成物。
【請求項３３】
化合物（Ｉ）で処理された神経細胞を含む組織。
【請求項３４】
化合物（Ｉ）で処理された神経細胞を含む移植片。
【請求項３５】
移植片が、同種同系移植片、同種異系移植片又は異種移植片である、請求項３４に記載の移植片。
【請求項３６】
神経傷害からの機能回復の促進方法であって、その必要のある被験体に、化合物（Ｉ）で処理された細胞を含む組成物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項３７】
神経傷害が、外傷性傷害、機械的傷害、手術性傷害、生理的傷害、病理的傷害及び免疫的傷害からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
断裂した末梢神経又は脊髄の修復方法であって、末梢神経又は脊髄の断裂末端を、化合物（Ｉ）で処理された細胞を含む組成物の有効量と接触させることを含む方法。
【請求項３９】
化合物（Ｉ）及び少なくとも１つの神経細胞成長促進剤で処理された細胞、組織又は移植片を含む組成物。
【請求項４０】
神経成長促進剤が、神経成長を促進する細胞懸濁液、非細胞性間隙充填物質又は神経成長因子からなる群より選択される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
神経成長促進剤としてコラーゲン又はメチルセルロースを含む、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
神経成長促進剤として細胞懸濁液を含む、請求項３９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、高レベルの神経栄養性活性と低レベルの免疫抑制活性を有するタクロリムス誘導体に関する。
【０００２】
背景の説明
ある種のマクロライド化合物、例えばタクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）及び関連化合物は、脳虚血の予防又は治療に役立つことが知られている（ＷＯ９４／１４４４３）。タクロリムスなどの、ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対し親和性を有する特定のピペコリン酸誘導体は、損傷した末梢神経の成長を刺激すること、又は神経再生を促進することが知られている（ＷＯ９６／４０１４０）。ある種の非免疫抑制化合物、即ち、ゲルダナマイシン及びそのアナログは、ステロイドレセプター複合体を分解し、神経成長を促進することが示されている（ＷＯ９９／２１５５２）。
【０００３】
発明の概要
本発明者らは、以下に記載の特定のタクロリムスアナログ、即ち、化合物（Ｉ）が優れた神経栄養性 （ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ） 活性を有するものの、タクロリムスとは異なり免疫抑制活性を殆ど又は全く有しないことを見出した。以下に示すように、例えば、神経突起の長さを増加させる能力により測定すると、化合物（Ｉ）は、タクロリムスと比較して優れたレベルの向神経性 （ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ） 活性を発揮する。同様に、化合物（Ｉ）の投与が、軸索再生を誘導し、神経挫滅又は脊髄損傷からの回復速度を増加させることが示される。更に、化合物（Ｉ）はこれらの利点のある向神経性効果を発揮するが、タクロリムスと比べて免疫抑制活性を殆ど又は全く有しない。
それ故、本発明は、優れた神経栄養剤としての、並びに殆ど又は全く免疫抑制活性を有しない向神経剤としての、化合物（Ｉ）の新規使用を提供する。
更に、本発明は、化合物（Ｉ）を含む神経栄養剤又は組成物を提供する。
更に尚、本発明は、哺乳動物に化合物（Ｉ）を投与することを含む、神経傷害／機能不全の予防又は治療の方法を提供する。
【０００４】
発明の詳細な説明
予想外なことに、本発明者らは、化合物（Ｉ）が、神経系への損傷若しくは傷害、神経系の悪化又は神経系の疾患によって引き起こされる神経傷害又は機能不全の改善、予防又は治療に有用であり、同時に、有利なことに免疫抑制効果を殆ど又は全く有しないことを発見した。
【０００５】
化合物（Ｉ）は、身体傷害、栄養性疾患、虚血、変性疾患、悪性腫瘍疾患、感染症、並びに薬物相互作用、毒素若しくは毒物によって引き起こされる損傷、悪化、又は機能不全の治療に有用である。例えば、化合物（Ｉ）は、神経手術、末梢神経傷害、火傷、脳脊髄炎、ＨＩＶ、ヘルペス、癌、放射線治療、薬物相互作用、葉酸若しくはビタミンＢ１２欠乏症、並びに、神経毒若しくは鉛などの化学物質への暴露によって引き起こされる神経学的損傷又は機能不全の治療に有用である。
【０００６】
従って、化合物（Ｉ）は、例えば、多発性筋炎、ギラン−バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎、単発神経炎（孤立性神経炎）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、神経根障害、神経障害（例えば、糖尿病性神経障害、化学療法誘発神経障害など）、脊髄損傷、老人性痴呆症、血管性痴呆症、多発性硬化症、身体麻痺などの神経傷害及び機能不全の予防又は治療に有用である。
【０００７】
本発明で使用するタクロリムスアナログである化合物（Ｉ）は、以下の化学式を有する：
【０００８】
【化３】
2004527472.tif 000002
【０００９】
本化合物は、米国特許第５，３７６，６６３号の実施例２９に記載の通りに製造してもよい。本発明で使用する化合物（Ｉ）については、立体配座体（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）、並びに、不斉炭素原子又は二重結合に起因する光学異性体や幾何異性体などの１個以上の立体異性体があり得、このような立体配座体及び異性体もまた、本発明の化合物の範囲に包含されることを理解すべきである。
【００１０】
化合物（Ｉ）は、医薬として許容できる塩、誘導体、溶媒和物又はプロドラッグの形態であり得、それらは全て本発明の範囲に包含される。溶媒和物としては好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００１１】
化合物（Ｉ）の好適な形態は、以下である：
【００１２】
【化４】
2004527472.tif 000003
【００１３】
本発明での化合物（Ｉ）は、純粋な化合物として、又は他の化合物若しくは別の成分との混合物として、好ましくは医薬用溶媒若しくは担体中で投与してもよい。化合物（Ｉ）が医薬製剤若しくは組成物の形態で使用されるとき、化合物（Ｉ）は、外用（局所）、経口、経腸、皮下、静脈内、筋肉内又は非経口適用に適した、有機若しくは無機の担体、溶媒又は賦形剤と混合してもよい。例えば、化合物（Ｉ）は、活性成分としての化合物（Ｉ）と１つ以上の担体、溶媒又は賦形剤を含む、固形、半固形又は液状の組成物中に存在していてもよい。典型的な担体、溶媒又は賦形剤としては、通常の医薬担体、医薬剤、緩衝剤、分散剤、乳化剤及びアジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。
【００１４】
化合物（Ｉ）はまた、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、点眼剤、坐剤、液剤（例えば、生理食塩水）、乳剤、懸濁剤（例えば、オリーブ油）、軟膏剤、エアロゾルスプレー剤、クリーム剤、皮膚プラスター剤、パッチ剤、及び使用に適した任意の他の剤形のための慣用の無毒性の、医薬として許容できる担体と複合化してもよい。
【００１５】
適切な担体としては、水、生理食塩水及びデキストロース水溶液、油（動物油、植物油及び合成油を含む）、並びに石油製品が挙げられる。他の有用な担体としては、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、澱粉ペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ジャガイモデンプン、尿素、並びに、固形、半固形若しくは液状形態の製剤の製造における使用に適した他の担体が挙げられる。更に、補助剤、安定化剤、乳化剤、増粘剤、着色剤、フレーバー剤、及び香料を使用してもよい。
【００１６】
化合物（Ｉ）は、特定の疾患プロセス又は状態に対し所望の効果を生じるのに有効な量で医薬組成物に含まれる。化合物（Ｉ）は、向神経性効果の提供又は神経細胞成長の刺激に十分な量で含まれる。
【００１７】
本発明の方法を用いて治療できる哺乳動物としては、牛、馬、豚などの家畜用哺乳動物、犬、猫、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターなどの家庭用動物、霊長類、及びヒトが挙げられる。
ヒトへの、化合物（Ｉ）を含む製品又は組成物の投与又は適用の好適な様式としては、注射又は経口投与が挙げられる。
化合物（Ｉ）の治療有効量又は治療有効投与量は、個々の患者で変動してもよく、また、治療する個々の患者の年齢や状態に依存するが、約０．０００１−１０００ｍｇ、好ましくは０．００１−５００ｍｇ、より好ましくは０．０１−１００ｍｇの範囲に及ぶ１日投与量の活性成分が、一般的に、疾患の治療に与えられ、約０．００１−０．０１ｍｇ、０．２−０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇの平均単回投与量が一般的には投与される。ヒトでの慢性的投与の１日投与量は、約０．１−３０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であろう。化合物（Ｉ）はまた、神経栄養性活性又は神経細胞成長刺激活性を有する他の薬剤と、同時に、別々に、又は順次、投与又は適用されてもよい。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、神経再生と機能回復を促進し、神経突起成長を刺激し、それによって種々の神経病理的状態を治療するために、このような治療の必要性のある哺乳動物被験体（例えば、ヒト患者）に定期的に投与できる。種々の神経病理的状態としては、身体傷害によって引き起こされる末梢神経及び中枢神経系への損傷（例えば、脊髄損傷及び外傷、坐骨若しくは顔面神経障害若しくは傷害、切断後四肢移植）；疾患（例えば、糖尿病性神経障害）；癌化学療法（例えば、アクリルアミド、タキソール、ビンカアルカロイド及びドキソルビシンによって誘起される神経障害）；後遺症−例えば、脳梗塞、出血性梗塞などに伴う言語障害（例えば、構音障害）、意識混濁、ジスキネジアなど；並びに、三叉神経痛、舌咽頭神経痛、顔面麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、進行性延髄性遺伝性筋萎縮症、椎間板ヘルニア症候群（ｈｅｒｎｉａｔｅｄ， ｒｕｐｔｕｒｅｄ ｏｒ ｐｒｏｌａｐｓｅｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、頚椎症、叢症、胸郭口破壊症候群、末梢神経障害（例えば、鉛、アクリルアミド、ガンマ−ジケトン（接着剤中毒（ｇｌｕｅ−ｓｎｉｆｆｅｒ’ｓ）神経障害）、二硫化炭素、ダプソン、チック （ｔｉｃｋｓ）、ポルフィリン症、ギラン−バレー症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン舞踏病を含むがそれらに限定されない種々の末梢神経障害及び神経学的疾患を含むがそれらに限定されない神経学的疾患が挙げられる。
【００１９】
末梢神経の断裂 （ｔｒａｎｓｓｅｃｔｉｏｎ） 又は脊髄損傷は、哺乳動物に神経成長刺激量の薬剤を投与し、末梢神経又は脊髄に、同種異系移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）などの神経移植片（Ｏｓａｗａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． １９：８３３−８４９， １９９０；Ｂｕｔｔｅｍｅｙｅｒら， Ａｎｎ．Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ３５：３９６−４０１，１９９５）又は人工神経移植片（Ｍａｄｉｓｏｎ及び Ａｒｃｈｉｂａｌｄ， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １２８：２６６−２７５，１９９４；Ｗｅｌｌｓら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４６：３９５−４０２，１９９７）を移植することによって治療できる。末梢神経又は脊髄の断裂末端間の空間は、好ましくは、コラーゲン、メチルセルロースなどの非細胞性間隙充填物質；又は、シュワン細胞（Ｘｕら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．２６：１−１６，１９９７）、臭覚細胞及び鞘細胞（Ｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：２０００−２００２，１９９７）などの、神経細胞成長を促進する細胞の懸濁液によって充填される。本神経成長促進剤は、このような細胞性又は非細胞性間隙充填物質と共に含ませることができ、又は、神経移植方法の前、間、又はその後に全身的に投与できる。
【００２０】
特に、化合物（Ｉ）は、神経傷害／機能不全、多発性筋炎、ギラン−バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎、単発神経炎（孤立性神経炎）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、神経根障害、糖尿病性神経障害、化学療法誘発神経障害、老人性痴呆症、血管性痴呆症、多発性硬化症、身体麻痺、又は脊髄損傷の治療又は予防に有用である。
【００２１】
以下の実施例は、更に詳細に本発明を説明する。これらの実施例は、本発明のある局面又は実施態様を記載するが、本発明の範囲の限定を意図するものではないことを理解すべきである。
【００２２】
実施例１：化合物（Ｉ）による処理は、海馬ニューロンの神経突起の長さを有意に増加させる
細胞培養物の調製：
Ｂａｎｋｅｒ及び Ｃｏｗａｎ （Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９７７， １２６： ３９７−４２５）に従い、胎仔海馬ニューロンを、胎生期１８．５日目（「Ｅ１８．５」）の仔ラットから得た。簡潔には、海馬を取り出し、細かく切断し、１００Ｉ．Ｕ．パパインとともに３７℃で４５分間インキュベートし、細胞を完全ニューロン培地（Ｌ−グルタミン非含有の最小必須培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）、高グルコース最小必須培地（ＧＩＢＣＯ）１．５ｍｌ／１００ｍｌ、血清増量培地（Ｈｉｔｏ＋Ｔｍ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ， Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ， ＭＡ）０．１ｍｌ／１００ｍｌ、グルタミン（ＧＩＢＣＯ）、５％胎仔ウシ血清（ＧＩＢＣＯ））に再懸濁した。
【００２３】
細胞を、ポリ−Ｌ−リジンで被覆したカバースリップに播種した（５００細胞／カバースリップ）。カバースリップをディッシュの上で逆さにした。ディッシュは、皮質アストロサイトの単層で予め被覆しておいた。
【００２４】
海馬ニューロン軸索の長さの解析：
海馬ニューロン（それらの特徴的な極性及び樹状突起で識別）を毎日検査し、７２時間で無作為に写真をとった（９−１２フレーム／カバースリップ）。軸索（最長の突起として定義）の長さを、適切なソフトウエア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ ＩＶ， Ｒ ＆ Ｍ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ， ＴＮ）を備えたＩＢＭ ＸＴコンピューターと連結したＨｏｕｓｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＨＩ−ＰＡＤデジタイジングタブレットを用い、写真印刷物で測定した（細胞体の長さの３倍を超える突起のみを測定した）。同様に処理したカバースリップからのデータ（１群当り３又は４）は異ならず、従って一緒にした。平均値を計算し、１要因（（化合物（Ｉａ）又はタクロリムス処理群）対（未処理対照群））ＡＮＯＶＡ、次いでＮｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ多重比較テスト（ＷＩＮＫＳ ４．６２ プロフェッショナル版）を用い、比較した。
【００２５】
結果：
７２時間では、未処理対照群と１０ｎＭタクロリムス処理群との間に有意差はなかった。しかし、化合物（Ｉａ）１０ｎＭ濃度処理群は、神経突起の長さが統計的に有意に増加した。下記の表１の結果を参照のこと。
【００２６】
【表１】
2004527472.tif 000004
【００２７】
実施例２：化合物（Ｉ）による処理は、ＳＨ−ＳＹＳＹヒト神経芽細胞腫の神経突起の長さの平均値を増加させる
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫培養物の調製：
１０％胎仔ウシ血清（ＳＩＧＭＡ）、ペニシリン５０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を補充したＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）中で、７％ＣＯ２中３７℃でＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫を維持した。１５，０００細胞／ウエルで６ウエルプレートに細胞を蒔き、０．４μＭアフィディコリン（ＳＩＧＭＡ）で処理した。５日目に細胞を洗浄し、タクロリムス（１０ｎＭ）又は化合物（Ｉａ）（１ｎＭ）の存在又は非存在下、１０ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）で処理した（突起成長を誘導するため）。培地を９６時間経過後に交換し、更なる７２時間経過後に、新鮮培地で置き換えた（合計時間１６８時間）。全ての実験は、ｄｕｐｌｉｃａｔｅで行い、各処理群につき、データを平均化した。
【００２８】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫の神経突起の長さの解析
突起の長さの解析のために、１６８時間で細胞を無作為に撮影した（１ウエル当り２０視野）。神経突起の長さを、適切なソフトウエア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ ＩＶ， Ｒ ＆ Ｍ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ， ＴＮ）を備えたＩＢＭ ＸＴコンピューターと連結したＨｏｕｓｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＨＩ−ＰＡＤデジタイジングタブレットを用い、写真印刷物で測定した（細胞体の長さの２倍を超える突起のみを測定した）。同様に処理したウエルからのデータは異ならず、従って一緒にした。平均値を計算し、１要因（（化合物（Ｉａ）又はタクロリムス処理サンプル）対（ＮＧＦ単独の処理サンプル））ＡＮＯＶＡ、次いでＮｅｗｍａｎ−Ｋｕｅｌｓ多重比較テスト（ＷＩＮＫＳ４．６２プロフェッショナル版）を用い、比較した。
【００２９】
結果：
神経突起の長さの測定により、化合物（Ｉａ）（１ｎＭ）とタクロリムス（１０ｎＭ）の両方が、ＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）のみと比較して、１６８時間で神経突起の長さを有意に増加させることが実証された。しかし、ＮＧＦとの組み合わせにおける１ｎＭ化合物（Ｉａ）の効果は、ＮＧＦとの組み合わせにおける１０ｎＭタクロリムスの効果より大きかった。
【００３０】
【表２】
2004527472.tif 000005
【００３１】
実施例３：化合物（Ｉ）による処理は、ラット坐骨神経挫滅モデルの機能回復を促進する
動物及び手術方法：
９匹の６週齢雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを２％ハロタンで麻酔し、右坐骨神経を露出させ、股関節のレベルで神経を２度押しつぶした（Ｎｏ．７ Ｄｕｍｏｎｔ宝石職人用鉗子を用い合計６０秒間）。神経鞘に滅菌済の９−Ｏ縫合糸を結びつけることにより、挫滅部位に印を付けた。
【００３２】
化合物（Ｉａ）の調製及び投与
３０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：７０％生理食塩水を含む溶媒に化合物（Ｉａ）を溶解した。３匹の神経挫滅ラットは、化合物（Ｉａ）（１又は５ｍｇ／ｋｇ）又は等容量の溶媒（生理食塩水中３０％ＤＭＳＯ）（５ｍｌ／ｋｇ）を毎日皮下注射した。
【００３３】
行動評価
灌流の日（１８日目）まで、動物を毎日試験した。以下の半定量的スケールを用い、動物の機能回復を評価した：
０：足が麻痺し、歩行時に外側に曲がり、つま先が曲がる；
１：足がまっすぐで、つま先を動かすことができる；
２：足で一定に歩くことができる；
３：歩行時につま先が広がっている；
４：かかとを離して歩き、ほぼ正常のつま先の広がりを示す；
中間の能力を示す動物には、部分的スコア：＋，０．２５；＋＋，０．５；＋＋＋，０．７５を与えた。
【００３４】
組織の固定及び調製：
神経挫滅後１８日目に、４％ハロタンでラットを深く麻酔し、ヘパリン処理し、４％パラホルムアルデヒドの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で１０秒間、次いで５％グルタルアルデヒド（ＩＬ）の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で灌流し、４℃で２４時間固定した。挫滅部位から既知（５ｍｍ）の距離にある坐骨神経から組織のサンプルを採取した。本研究では、ヒラメ筋を支配している後方脛骨神経枝のデータのみ報告する。組織を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に置き、１％四酸化オスミウム（０．１Ｍリン酸緩衝液中）で２．５時間後固定し、エタノール中で脱水し、プラスチックに包埋した。半薄切片を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、フィルムで支持された７５メッシュグリッドに載せ、ＪＥＯＬ１００ＣＸ電子顕微鏡を用いて観察した。
【００３５】
形態解析：
軸索直径の解析を脛骨神経で行った。電子顕微鏡を用い、再生有髄軸索の数を計測した。溶媒処理群、化合物（Ｉａ）（１ｍｇ／ｋｇ）処理群、及び化合物（Ｉａ）（５ｍｇ／ｋｇ）処理群について、平均値と標準誤差を計算した。
【００３６】
統計学的解析：
行動解析に関しては、個々の値の比較のために１要因ＡＮＯＶＡ、次いでＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較テストを用いて、機能回復の平均値を比較した。形態解析に関しては、個々の値の比較のために１要因ＡＮＯＶＡ、次いでＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較テストを用いて、軸索数の平均値を比較した。
【００３７】
結果：
機能回復：
機能回復は、１５−１７日目に観察し、溶媒処理ラットよりも１ｍｇ／ｋｇ処理ラットと５ｍｇ／ｋｇ処理ラットの両方においてより早期に生じた。下記の表３を参照のこと。
【００３８】
【表３】
2004527472.tif 000006
【００３９】
電子顕微鏡
形態学的検討を神経挫滅後１８日目に行った。
神経面積（５，０００μｍ２）当りの再生有髄軸索の数は、溶媒処理ラットの５．５±２．７（平均±ＳＥＭ）から、１ｍｇ／ｋｇ処理ラットと５ｍｇ／ｋｇ処理ラットでそれぞれ１９±２．４と２０±２．９へと劇的に増加した。下記の表４を参照のこと。
【００４０】
【表４】
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【００４１】
実施例４：化合物（Ｉ）による処理は、ラット脊髄損傷モデルの機能回復を促進する
（１）方法
動物及び手術方法
２８匹の６週齢雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを２％ハロタンで麻酔し、Ｔ１０／Ｔ１１で椎弓切除を行い、脊髄の片側切断手術をＴ１０／Ｔ１１脊髄のレベルで行った。
化合物（Ｉａ）の調製及び投与
３０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：７０％生理食塩水を含む溶媒に化合物（Ｉａ）を溶解した。脊髄損傷ラットは、手術後７週間にわたって、化合物（Ｉａ）（２ｍｇ／ｋｇ）又は等容量の溶媒（生理食塩水中３０％ＤＭＳＯ）（５ｍｌ／ｋｇ）を毎日皮下注射した。
【００４２】
機能回復の評価
損傷２週間後に、改変Ｔａｒｌｏｖ／Ｋｌｉｎｇｅｒスケール（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔａｒｌｏｖ／Ｋｌｉｎｇｅｒ ｓｃａｌｅ）、ｎａｒｒｏｗ ｂｅａｍテスト及びフットプリントテスト（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ ｔｅｓｔ）を用いて、機能回復を評価した。
Ａ．改変Ｔａｒｌｏｖ／Ｋｌｉｎｇｅｒスケール
ラットを、１分間オープンフィールドで自由に歩かせ、下記のスケールに基づき０−６に分類した。
０：損傷した後肢の動き無し
１：損傷した後肢の動きをかろうじて確認できる
２：損傷した後肢関節（股関節、膝関節又は足関節）は活発に動くが、連携は無く、体重を支えられない
３：損傷した後肢を交互に使って歩き推進力を伴うが、体重は支えられない
４：損傷した後肢で体重を支えることができる
５：若干の歩行障害が見られる
６：正常な歩行
【００４３】
Ｂ．ｎａｒｒｏｗ ｂｅａｍテスト
木製角材（長さ１．５ｍ）を用いて、７．７ｃｍ、４．７ｃｍ、２．７ｃｍ、１．７ｃｍと幅の広いものから順に試験を行なった。ラットを棒上で歩行させ、滑ることなく歩行可能な最も狭い棒を、少なくとも２回の試行において記録した。
０：如何なる角材でも歩行不可
１：７．７ｃｍ角材で歩行可能
２：４．７ｃｍ角材で歩行可能
３：２．７ｃｍ角材で歩行可能
４：１．７ｃｍ角材で歩行可能
【００４４】
Ｃ．フットプリントテスト
ラットの後肢にインクを付け、長さ６０ｃｍ、幅７．５ｃｍの狭い走路を覆う紙に足跡を付けた。１連の少なくとも６個の連続したフットプリントを用い、５ポイントフットプリントスコアを測定した。
０：後肢をひきずり、足跡は全く観察されない
１：少なくとも３個の足跡において、少なくとも３個のつま先の跡が見られる
２：個々のラットの神経挫滅前の値と比べて、２倍以上の足が外側又は内側に曲がっている
３：つま先を引きずる兆候は示さないが、足が曲がっている兆候を示す
４：外側にも内側にも足が曲がっていないが（ベースライン値の角度の２倍未満）、１個以上のかかと跡が観察される
５：かかと跡が全く観察されない
【００４５】
統計学的解析：
行動解析に関し、個々の値の比較のために１要因ＡＮＯＶＡ、次いでＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較テストを用いて、各機能試験のスコアの平均値を比較した。
【００４６】
（２）結果
機能回復
改変Ｔａｒｌｏｖ／Ｋｌｉｎｇｅｒスケール（表５）、ｎａｒｒｏｗ ｂｅａｍテスト（表６）及びフットプリントテスト（表７）を用いた３つの機能回復試験において、化合物（Ｉａ）は、改変Ｔａｒｌｏｖ／Ｋｌｉｎｇｅｒスケール（表５）、ｎａｒｒｏｗ ｂｅａｍテスト（表６）及びフットプリントテスト（表７）における運動機能不全を改善した。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
【表６】
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【００４９】
【表７】
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【００５０】
実施例５：化合物（Ｉａ）はＦＫＢＰ１２と結合するが、タクロリムスとは異なり免疫抑制効果を殆ど又は全く発揮しない
（１）ＦＫＢＰ１２との結合実験
Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｖｏｌ．２０２， Ｎｏ．１， ４３７−４９９，１９９４）と同様な方法に基づき、結合実験を行った。結果を表８に示す。
【００５１】
（２）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
米国特許第４，９２９，６１１号と同様な方法に基づき、ＭＬＲテストを行った。
結果を表８に示す。
【００５２】
【表８】
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【００５３】
上記結果は、化合物（Ｉａ）がＦＫＢＰ１２と結合できるが、免疫抑制活性を有しないことを示す。
上記結果は、インビトロとインビボモデルの両方を用いる化合物（Ｉ）の強力な神経栄養効果を示す。２つの細胞培養モデルにおいて、化合物（Ｉ）は低濃度でさえも神経突起成長を増加させた。更に、低用量の化合物（Ｉ）の全身投与は、坐骨神経の軸索再生の速度を増加させることにより神経挫滅損傷後の機能回復を促進し、脊髄損傷からの機能回復を促進した。
更に、上記のように、化合物（Ｉ）は、免疫抑制活性を有しないものの、強力な神経栄養活性又は神経細胞成長刺激活性を提供する。従って、本発明は、神経成長又は再生の刺激又は促進に、特に免疫抑制効果が有利でないとき又は所望されないときに、有用な神経栄養剤を提供する。
【００５４】
本発明の他の局面は以下を含む：
包装物と、包装物内に含まれる上記化合物（Ｉ）とを含む製品であって、化合物（Ｉ）が、神経機能不全の予防又は治療に治療的に有効である製品であり、包装物が、神経傷害／機能不全の予防又は治療に化合物（Ｉ）を使用できること又は使用すべきであることを指示しているラベル又は記載物を含む、製品。
上記の化合物（Ｉ）を含む医薬組成物と、それに添付される記載物とを含む商業パッケージであって、記載物が、神経傷害／機能不全の予防又は治療に化合物（Ｉ）を使用できること又は使用すべきであることを記述している、商業パッケージ。
化合物（Ｉ）で処理された細胞を含む、細胞懸濁液、組織又は移植片などの組成物。このような組成物は、神経系への損傷を修復するのに有用である。このような組成物はまた、神経細胞成長を促進又は支援する細胞懸濁液の他のタイプ（例えば、シュワン細胞又はオリゴデンドロサイト、グリア細胞及び鞘細胞などのミエリン産生細胞、コラーゲンなどの細胞外基質物質、又はサイトカイン、分裂促進因子、イムノフィリン、及びニューロトロフィン（例えば、ＮＧＦ−１、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、及びＮＴ−５）などの他の特定の神経調節剤）の他の神経細胞成長刺激剤を含んでいてもよい。
【００５５】
同種同系移植片 （ｈｏｍｏｇｒａｆｔ）、同種異系移植片又は異種移植片などの移植片もまた、神経成長並びに移植片としての、及びその他の適用のための使用を容易にするため、化合物（Ｉ）で処理してもよい。
【００５６】
参照による援用
本開示で引用された又は言及された各文献、特許出願又は特許刊行物の内容は、参照によりその全体が援用される。本出願が優先権を主張するいずれの特許文献の内容もまた、参照によりその内容の全体が援用される。具体的には、米国仮出願第６０／２５８，５００号の内容が、参照により援用される。
【００５７】
改変及び他の実施態様
明らかに、本発明の多数の改変やバリエーションが、上記教示により可能である。従って、添付した特許請求の範囲の範囲内で、本発明は、具体的に本明細書に記載した発明以外にも実施されうることを理解すべきである。記載した組成物及び方法の種々の改変やバリエーション並びに本発明の概念が、本発明の範囲及び思想から逸脱しないことは当業者にとって明白であろう。特定の好適な実施態様と関連して本発明を記載したが、請求項に係る発明は、このような特定の実施態様への限定を意図しないことを理解すべきである。本発明の実施のために記載された様式の種々の改変が、医学、生物学、化学、又は薬理学の技術分野又は関連分野の当業者にとって自明であり、本発明の範囲内であることが意図される。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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