(57)【要約】本発明は、炎症性疾患などのＩＬ−１２の過剰産生に関わる障害を治療するために使用可能な新規な化合物であるエポキシビブサニンＢに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式
【化１】
2004529871.tif 000004
の化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物と医薬として許容可能な該化合物の担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項３】
投与を必要とする対象に有効な量の請求項１に記載の化合物を投与することからなる、インターロイキン１２の過剰産生に関わる障害を治療する方法。
【請求項４】
前記障害が炎症性疾患である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記炎症性疾患が自己免疫疾患である請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１２産生の阻害能についてスクリーニングした植物の抽出物ライブラリ由来の新規な化合物の同定に基づく。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、ＩＬ−１２受容体が炎症誘発性サイトカインを産生するのを仲介し、特定のリンパ球の応答を誘導する極めて重要なサイトカインである。ＩＬ−１２の重要な役割の１つは１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）の応答を誘導し、ひいては細胞性免疫を誘導することである。ＩＬ−１２の過剰産生はＴｈ１の過剰応答を誘発し、自己免疫疾患のような炎症性の障害を引き起こす可能性がある。ゲートリーら（Ｇａｔｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６巻、４９５ページ。従ってＩＬ−１２はＴｈ１細胞の過剰な増殖を原因とする炎症性疾患の治療における薬理学的治療処置の理想的な標的である。トレンブローら（Ｔｒｅｍｂｌｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第１６巻、３８３ページおよびアドリーニら（Ａｄｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６８巻、１７５ページ。ＩＬ−１２の過剰産生とその結果生じるＴｈ１タイプの免疫応答を、細胞内の環状ＡＭＰのモジュレーション、およびグルココルチコイドや核因子κＢの阻害などの薬理学的アプローチにより抑制することが可能である。ハスコーら（Ｈａｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、第１２７巻、１２９５ページ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＩＬ−１２の過剰産生に関わる障害を治療するための、新規な化合物を発見することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＩＬ−１２産生の阻害能についてスクリーニングした植物の抽出物ライブラリ由来の新規な化合物の同定に基づく。
【０００５】
本発明の態様は、［化１］の化合物エポキシビブサニンＢ（ｅｐｏｘｙｖｉｂｓａｎｉｎ  Ｂ）に関する。
【０００６】
【化１】
2004529871.tif 000002
この化合物は、有機化合物から合成すること、天然の供給源、例えばスイカズラ科のサンゴジュ（Caprifoliaceae vibrunum Awabuki ）から単離することのいずれも可能である。
【０００７】
本発明の別の態様は、エポキシビブサニンＢを用いてＩＬ−１２の過剰産生に関わる障害を治療する方法に関する。該方法は、投与を必要とする対象に本化合物を有効な量投与することを含む。
【０００８】
エポキシビブサニンＢは、自己免疫疾患を始めとする炎症性の（急性および慢性の）疾患などの、ＩＬ−１２の過剰産生に関わる障害の治療を必要とする対象に投与される前に、医薬組成物に製剤化される。従って、ＩＬ−１２の過剰産生に関わる障害の治療に使用される、有効量のエポキシビブサニンＢと医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物も本発明の範囲内にある。本発明は、上記障害の治療用薬剤を製造するためのエポキシビブサニンＢの使用も含む。
【０００９】
本発明の他の有利な点または特徴は、以下の発明を実施するための最良の形態から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の化合物、エポキシビブサニンＢは、以下の手順によりスイカズラ科のサンゴジュ（Caprifoliaceae vibrunum Awabuki ）から単離することが可能である。
【００１１】
スイカズラ科のサンゴジュ（Caprifoliaceae vibrunum Awabuki ）の葉をマイアミ（米国フロリダ州）で採取し、エタノールなどの有機溶媒に懸濁し、ブレンダーですりつぶす。得られた溶液を濾過して固形物を除去し、濾液を、減圧下、またはフラッシュエバポレータを用いて４５℃より低い温度で乾燥させ、固形抽出物を生成させる。酢酸エチルなどの他の有機溶媒をこの固形抽出物に添加し、液状抽出物とする。このステップを数回繰り返す。液状抽出物を合わせ、減圧下で乾燥させて別の固形抽出物を生成させる。該固形抽出物に、メタノールなどの別の有機溶媒を再度添加し、別の液状抽出物を生成させる。このステップを数回繰り返し、液状抽出物を全て合わせる。このようにして得た液状抽出物をフラッシュエバポレータで乾燥させてさらに濃縮された固形抽出物を生成させる。この固形抽出物をその後固相抽出カラム（ＳｅｐＰａｋ（登録商標）Ｃ１８）に通す。水とアセトニトリルの混合物を展開溶媒として使用し、溶出液を画分に分ける。各画分を、ＩＬ−１２産生阻害活性について試験する。活性を有する画分を回収し、混合し、減圧下で乾燥させて固形物を得る。次いで、展開溶媒を用いて再度カラムを溶出させ、先に述べた手順に従ってさらに固形物を得る。該固形物を、展開溶媒として水とアセトニトリルの混合物を使用する逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により、さらに精製する。エポキシビブサニンＢを含有する溶出画分を再度回収し、減圧下で乾燥させて純粋なエポキシビブサニンＢを白色粉末として得る。
【００１２】
エポキシビブサニンＢ、並びに、自己免疫疾患（例えば慢性関節リウマチ、乾癬、１型糖尿病、多発性硬化症などの自己免疫疾患）などの炎症性疾患を含むＩＬ−１２の過剰産生に関わる障害を治療するために有効な量のエポキシビブサニンＢを有する医薬組成物は、本発明の範囲内にある。有効な量のエポキシビブサニンＢとは、自己免疫疾患のような炎症性疾患の治療を必要とする対象に投与するとき、治療を受ける対象に対して治療効果を奏するために必要な化合物の量として定義される。動物およびヒトに関する用量の相関関係（体表面１平方メートルあたりのミリグラム数を基準とする）については、フライライヒら（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．１９６６年、第５０巻、２１９ページに記載されている。体表面の面積は、患者の身長および体重から概算可能である。例えばサイエンティフィック・テーブル（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ）、ガイギー製薬（Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ニューヨーク州アードレー所在、１９７０年、５３７ページを参照のこと。有効な量のエポキシビブサニンＢは、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にありうる。当業者には認識されているように、有効な用量は、投与経路、賦形剤の利用、および他の抗炎症剤の使用などの他の治療処置と共に使用する可能性によっても変動するであろう。
【００１３】
エポキシビブサニンＢを、従来の方法を用いて別の投与経路のための投与形態に製剤化することができる。例えば、エポキシビブサニンＢを経口投与用にカプセル剤、ゲル封入剤、または錠剤に製剤化することが可能である。カプセル剤は、ゼラチン又はセルロースなどの医薬として許容可能な任意の標準的な物質を含みうる。錠剤は、エポキシビブサニンＢに固形の担体および潤滑剤を添加した混合物を圧縮することにより従来の方法で製剤化可能である。固形の担体の例にはデンプンおよびシュガーベントナイトがある。エポキシビブサニンＢを、結合剤（例えばラクトースもしくはマンニトール）、従来の充填剤、および錠剤化物質を含んだ硬殻錠剤またはカプセル剤の形状で投与することも可能である。
【００１４】
医薬組成物を、経口、局所、皮下、腹腔内、筋肉内、および静脈内などの非経口ルートで投与してもよい。非経口の投与形態の例には、水溶液、活性物質の等張生理食塩水もしくは５％グルコース溶液、またはその他のよく知られた医薬として許容可能な賦形剤がある。シクロデキストリンなどの可溶化剤、または当業界の専門家によく知られた他の可溶化剤を、治療用化合物の送達のための医薬賦形剤として利用可能である。
【００１５】
以下の特定の実施例は単なる例示であって、開示内容以外の内容を全くどのようにも限定するものではないと解されるべきである。さらに詳述するまでもなく、当業者は本明細書の記載に基づいて本発明を最大限に利用することができる。本明細書に列挙された全ての刊行物は、引用によりその全体が本願に組み込まれる。
（天然の供給源からのエポキシビブサニンＢの単離）
２ｋｇの新鮮なスイカズラ科のサンゴジュ（Caprifoliaceae vibrunum Awabuki ）の葉をフロリダ州マイアミで採取し、３Ｌのエタノールに懸濁し、ブレンダーですりつぶし、室温で２−３時間浸した。得られた溶液を濾過して固形物を除去し、濾液をフラッシュエバポレータを用いて４５℃より低い温度で乾燥させ、約１００ｇの固形抽出物を生成させた。次いでこの固形抽出物を０．５Ｌの酢酸エチルで３回抽出した。得られた液状抽出物を混合し、減圧下で濃縮して濃縮固形抽出物とした。得られた固形抽出物に０．３Ｌのメタノールを添加し、液状抽出物を得た。このステップを３回繰り返した。該液状抽出物を混合し、フラッシュエバポレータを用いて乾燥させ、別の固形抽出物（２０ｇ）を得た。該固形抽出物０．２ｇをその後固相抽出カラム（ＳｅｐＰａｋ（登録商標）Ｃ１８，２ｃｍ×４ｃｍ）に通した。１００ｍＬの５０％メタノール水溶液、次に１００ｍＬの５０％アセトニトリル水溶液をさっと流した後、カラムを８０％アセトニトリル水溶液で溶出させた。エポキシビブサニンＢを含有する画分を回収し、減圧下で乾燥させて固形物を得た。次に展開溶媒を用いて再度カラムを溶出させ、さらにエポキシビブサニンＢを得た。固形物（１００ｍｇ）を、展開溶媒として１０−５０％アセトニトリル−水を用いてＨＰＬＣカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）Ｃ４ＩＤ  ５０×３００ｍｍ）によりさらに精製した。エポキシビブサニンＢを含有する画分を回収し、減圧下で濃縮して５．２ｍｇの白色粉末を得た。（ｍ．ｐ．１００−１０２℃）；λｍａｘ２２１ｎｍ（アセトニトリル）；ＨＲＥＩＭＳ  ｍ／ｚ  ４１７．２６２６（Ｃ２５Ｈ３７Ｏ５）；１Ｈ  ＮＭＲ、表１を参照。
【００１６】
【表１】
2004529871.tif 000003
（ＩＬ−１２阻害アッセイ）
ヒト末梢血由来単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的な手順を用いてｌｅｕｋｏｐａｋ（商品名）からハーベストした。細胞を希釈して１ｍＬあたり３００万個とし、ウシ胎児血清（１０％）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびＬ−グルタミン酸（２ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ培地中で維持した。ヒトインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ、ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）；カタログ番号１０４０５９６）を、細胞を含んだ添加培地に添加して６０ユニット／ｍＬに希釈した。得られた細胞培養物の１００μｌをＵ字形底の９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに入れ、加湿された３７℃、７％ＣＯ２のインキュベータ内で一晩インキュベートした。４×ＲＰＭＩストック培地中に含めたエポキシビブサニンＢを各ウェルに添加して終濃度１μｇ／ｍＬとした後、４×ＲＰＭＩストック培地中に含めたリポ多糖（セラチア菌（Serratia arscencens ）由来ＬＰＳ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）；カタログ番号Ｌ−４７６６）を添加して終濃度１μｇ／ｍＬとした。プレートを穏やかにボルテックス撹拌し、続いて１６時間インキュベートした。ＩＦＮ−γとＬＰＳによりＰＢＭＣが刺激されてＩＬ−１２を産生した。各細胞培養物の上清をハーベストし、上清中の分泌ＩＬ−１２  ｐ７０を、抗ヒトＩＬ−１２抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ；カタログ番号ｍＡｂ６１１およびＢＡＦ２１９）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量した。エポキシビブサニンＢを含まない対照実験も実施した。結果から、対照実験のＩＬ−１２産生と比較してエポキシビブサニンＢがＩＬ−１２産生を９０％阻害したことが示される。
【００１７】
ＩＬ−１２産生の阻害を、２つの細胞株、すなわちＰＢＭＣおよびヒト前単球白血病単核細胞（ＴＨＰ−１細胞）を用いた並行実験でさらに試験した。上述のように、ＰＢＭＣを９６ウェルプレートに１ウェルあたり５００，０００個ずつ入れ、ＩＦＮ−γ（２００Ｕ／ｍｌ）およびＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により刺激してＩＬ−１２を産生させた。並行して、ＴＨＰ−１細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり８００，０００個ずつ入れ、ＩＦＮ−γ（２０００Ｕ／ｍｌ）および黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ１株（０．０５％、ＳＡＣまたはＰａｎｓｏｒｂｉｎ（登録商標）；カルビオケム社より入手；ロット番号Ｂ１５９２１）により刺激してＩＬ−１２を産生させた。各細胞培養物から上清をハーベストし、上述の抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによりＩＬ−１２  ｐ７０について分析した。結果から、エポキシビブサニンＢがＰＢＭＣおよびＴＨＰ−１細胞のいずれにおいてもＩＬ−１２産生を阻害したことが示される。エポキシビブサニンＢは、ＰＢＭＣについては約１ｎＭのＩＣ５０、ＴＨＰ−１細胞については約２０ｎＭのＩＣ５０を有していた。ＩＬ−１２産生の阻害におけるエポキシビブサニンＢの活性は、既知の抗炎症化合物であるデキサメサゾンの活性の１０倍である。
（細胞毒性アッセイ）
エポキシビブサニンＢを、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅキット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、注文番号Ｇ５４２１）を用いて細胞毒性についても試験した。フェナジンメトサルフェート（シグマ（Ｓｉｇｍａ）；カタログ番号Ｐ５８１２）を、ＰＢＭＣ（１ウェルあたり５００，０００個）およびエポキシビブサニンＢ（終濃度１μｇ／ｍｌ）を含む細胞培養物に電子供与体として添加した。次いで３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）を添加した。細胞を、加湿された３７℃、７％ＣＯ２のインキュベータ内で２時間インキュベートした。細胞培養物から上清をハーベストし、該上清の４９０ｎｍにおける吸光度を記録した。ＭＴＳ（生きている細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ酵素により反応する）のレベルをエポキシビブサニンＢ非含有対照実験から得たＭＴＳレベルと比較することにより、細胞の生存率を測定する。エポキシビブサニンＢを、ＴＨＰ−１細胞に対する細胞毒性についてさらに試験した。結果は、エポキシビブサニンＢはＰＢＭＣおよびＴＨＰ−１細胞のいずれについても同程度の細胞毒性であったことを示している。エポキシビブサニンＢの細胞毒性は、抗炎症化合物であるデキサメサゾンの細胞毒性よりも低い。
（他の実施形態）
本明細書中に開示された全ての特徴を、任意の組合せに組み合わせることが可能である。本明細書中に開示された各々の特徴を、同一の、等価の、または類似の目的を果たす別の特徴により置き換えることができる。従って、別途特に記載のないかぎり、開示された各特徴は等価または類似の特徴を包括した一組のうちの単なる例にすぎない。
【００１８】
以上の説明から、当業者は本発明の本質的な特性を容易に確認することが可能であり、その趣旨および範囲を逸脱することなく、種々の用途および条件に合わせて本発明を様々に変更および修正することが可能である。例えば、本発明を実施するために、エポキシビブサニンＢに構造的に類似の化合物を製造し、（例えば上記実施例に記載の方法により）スクリーニングし、使用することが可能である。従って、他の実施形態も請求の範囲に含まれる。
【国際公開パンフレット】
2004529871.tif 000005
2004529871.tif 000006
2004529871.tif 000007
2004529871.tif 000008
2004529871.tif 000009
2004529871.tif 000010
2004529871.tif 000011
2004529871.tif 000012
2004529871.tif 000013
2004529871.tif 000014
2004529871.tif 000015
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529871.tif 000016
【国際調査報告】
2004529871.tif 000017