(57)【要約】下記の各ステップからなることを特徴とするゲノムＤＮＡのシトシンのメチル化の検出方法。第一ステップで、ゲノムＤＮＡ試料を反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。次いで、前処理されたＤＮＡをポリメラーゼ及び少なくともプライマーオリゴヌクレオチッドを使用し増幅する。この増幅産物を新たに反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。最終ステップで、増幅産物中に新たな化学的処理後に残存しているシトシン塩基及び／またはグアニン塩基の存在を再度実証する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の各ステップからなることを特徴とするゲノムＤＮＡのシトシンのメチル化の検出方法。
ａ）ゲノムＤＮＡ試料を反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。
ｂ）前処理されたＤＮＡをポリメラーゼ及び少なくともプライマーオリゴヌクレオチッドを使用し、増幅する。
ｃ）増幅産物を新たに反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。
ｄ）増幅産物中に新たな化学的処理後に残存しているシトシン塩基及び／またはグアニン塩基の存在を実証する。
【請求項２】
下記の各ステップからなることを特徴とする請求項１に記載のゲノムＤＮＡのシトシンのメチル化の検出方法。
ａ）ゲノムＤＮＡ試料を反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。
ｂ）前処理されたＤＮＡをポリメラーゼ及び少なくともプライマーオリゴヌクレオチッドを使用し増幅する。
ｃ）増幅産物を新たに反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。
ｄ）化学的に前処理されたステップｃ）の増幅産物を新たに増幅する。
ｅ）増幅産物中に残存しているシトシン塩基及び／またはグアニン塩基の存在を実証する。
【請求項３】
化学的処理が重亜硫酸ソーダ（＝亜硫酸水素ナトリウム、酸性亜硫酸ソーダ）によることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
化学的処理がＤＮＡのアガロース中への埋め込みであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
化学的処理において、二本鎖ＤＮＡの変性剤及び／またはラジカル捕捉剤が存在することを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
変性剤が下記の物質の一つから選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
ポリエチレングリコールジアルキルエーテル、ジオキサン及びその置換誘導体、尿素またはその誘導体、アセトニトリル、第一級アルコール、第二級アルコール、第三級アルコール、ジエチレングリコールジアルキルエーテル、トリエチレングリコールジアルキルエーテル、テトラエチレングリコールジアルキルエーテル、ペンタエチレングリコールジアルキルエーテル、ヘキサエチレングリコールジアルキルエーテル、ＤＭＳＯまたはＴＨＦ。
【請求項７】
ラジカル捕捉剤が下記の物質の一つから選択されることを特徴とする請求項５または６に記載の方法。
ジ−、トリ−ヒドロキシベンゾール、緑茶抽出物、パインバーク抽出物（ピクノゲノール）、二葉性銀杏抽出物（ＥＧｂ７６１）、数種の果実および野菜の抽出物のフラボノイド混合物（ＧＮＬＤ）、バイオ−ノーマライザー（Ｓｕｎ−Ｏ Ｃｏｒｐ）、ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）、ＮＤＧＡ（ノルジヒドログアヤレート−酸）、トロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、２，６−ジ−ターシャリー−ブチルフェノール、４−メチル−ジ−ターシャリー−ブチルフェノール、４−メトキシ−ジ−ターシャリー−ブチルフェノール、２，６−ジ−ターシャリーブチル−ｐ−クレゾール、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、ビタミンＣ、Ｅ、Ｑ、ハイドロキノン、ユビキノン、リグナン、ヒドロキシテルペン、フラボノイド、ウコン、タンニン、レチン酸化合物、Ｇｅ−１３２−ビス−β−カルボキシエチルゲルマニウムセスキオキサイド、過酸化ジスムターゼ、過酸化カタラーゼ、α−ナフトフラボン、ジ（２−メチル−５−クロロフェニル）ジチオネート及びＣｕ（ＩＩ）−誘導体、メベンダゾール、ＣＳ（クロロホルムソリュブル）アルカロイド抽出物、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，２−ナフトキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロモ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロロ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−ナフトキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、３−ブロモ−４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−インダン−１，３−ヂオン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナ���タリン−１−オン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３，４−ジメトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナフタリン−１−オン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インダン−１−オン、３，３−Ｂｉ−［２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インデン−１−オン］−３−イル、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロモ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロロ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−ブロモ−３−（３−ブロモ−５−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−ブロモ−３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−ブロモ−３−（３−ブロモ−５−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、３−ブロモ−２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−アンスラキノン、５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１，３−ジオール、３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１−オール、４−（３−クロロ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル）−安息香酸、メチル−４−（３−クロロ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル）−ベンゾエート、４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、メチル−（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，���，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル）−安息香酸、メチル−４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル−アゾ）−ベンゾエート、４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル−アゾ）−安息香酸、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］ナフタリン−１，２−ジオン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロアンスラセン−３Ｈ−１，２，４−トリオン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャ���ー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３−ブロモ−５−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン。
【請求項８】
ＤＮＡの化学的処理に使用される反応剤を後続する増幅の前にその都度、完全に、または、部分的に、除去することを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
化学的処理後であって、増幅の前に、試料を希釈することを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
多くのＤＮＡ断片の増幅を同時に、一つの反応器で行なうことを特徴とする請求項１から９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
増幅に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする請求項１から１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１または２における増幅前にＤＮＡの脱硫を行なうことを特徴とする請求項１から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第二回目の化学的処理後に残存するシトシン塩基及び／またはグアニン塩基をハイブリッド化により実証することを特徴とする請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第二回目の化学的処理後に残存するシトシン塩基及び／またはグアニン塩基をシトシン塩基及び／またはグアニン塩基に施された実証可能なマーカーの特殊な組込みによって実証及び／または定量することを特徴とする請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１のステップｄ）または請求項２のステップｅ）において、前処理されたＤＮＡの検出のために、増幅産物をオリゴヌクレオチッドアレーにハイブリッド化させ、次いで、以下の部分的ステップを実施することを特徴とする請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
ａ）増幅されたゲノムＤＮＡが少なくとも、一つのオリゴヌクレオチッドに二本鎖構造の形成下にハイブリッド化され、その際、前記ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチッドが、その３’−末端で直接または１０塩基の間隔を置いた、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化が調べられる位置に配置される。
ｂ）オリゴヌクレオチッドを既知の配列のｎヌクレオチッドで、ポリメラーゼによって、少なくともヌクレオチッド一個分だけ伸長させる。その際、ヌクレオチッドは実証できるマーカーを帯びており、その都度、伸長はゲノムＤＮＡ試料のシトシンのメチル化状態に依存する。
【請求項１６】
第二回目の化学的処理後に残存するシトシン塩基及び／またはグアニン塩基を配列化反応によって実証することを特徴とする請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１のステップｄ）または請求項２のステップｅ）において、前処理されたＤＮＡの検出のために、増幅産物をオリゴヌクレオチッドアレーにハイブリッド化させ、次いで、以下の部分的ステップを実施することを特徴とする請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
ａ）一揃いのオリゴヌクレオチッドを増幅されたゲノムＤＮＡに二本鎖の形成下ハイブリッド化させ、その際、この一揃いのオリゴヌクレオチッドが二つの異なるスペシースからなり、最初のスペシースのハイブリッド化オリゴヌクレオチッドは、その３’−末端で直接または１０塩基の間隔を置いた、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化が調べられる位置に配置され、第二のスペシースの第二のオリゴヌクレオチッドは、目的分子の第二の領域下にハイブリッド化され、その結果、第二のスペシースの第二のオリゴヌクレオチッドの５’−末端が、個々のヌクレオチッドの大きさの隙間を通るかまたは、第一のスペシースのハイブリッド化オリゴヌクレオチッドの３’−末端から前記選択された位置だけ、離れているようにする。
ｂ）第一のスペシースのオリゴヌクレオチッドを既知の配列のｎヌクレオチッドで、ポリメラーゼによって、高々、第一のスペシースのオリゴヌクレオチッドの３’−末端と第二のスペシースのオリゴヌクレオチッドの５’−末端の間のヌクレオチッド数だけ、伸長させる。その際、ヌクレオチッドは実証できるマーカーを帯びており、伸長はゲノムＤＮＡ試料のシトシンのメチル化状態に依存する。
ｃ）リガーゼの存在下、オリゴヌクレオチッドを培養する。その際、隣接する、ポリメラーゼ反応により、伸長される第一のスペシースのオリゴヌクレオチッド及び第二のスペシースのオリゴヌクレオチッドが結合し、それまでのステップで、第一のスペシースのオリゴヌクレオチッドの伸長が、３’−末端が伸長されたオリゴヌクレオチッドの３’−ヒドロキシ機能で直接、第二のスペシースのオリゴヌクレオチッドの５’−末端に隣接するように、為されるかぎり、それによりライゲーション反応産物が得られる。
【請求項１８】
請求項１のステップｄ）における前処理されたＤＮＡの検出のために、ＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチッドアレーにハイブリッド化させ、次いで、以下の部分的ステップを実施することを特徴とする請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
ａ）増幅されたゲノムＤＮＡを少なくとも、一つの既知のｎヌクレオチッド配列のオリゴヌクレオチッドに、二本鎖構造の形成下に、ハイブリッド化し、その際、前記ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチッドが、その３’−末端で部分的または完全に、その、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化に関して、調べられる位置でハイブリッド化される。
ｂ）オリゴヌクレオチッドを、その３’−末端で、予め、塩基対欠失なしで、調べる位置にポリメラーゼによって、少なくともヌクレオチッド一個分だけ、ハイブリッド化して伸長させ、その際、少なくとも、一個のヌクレオチッドが実証可能なマーカーを帯び、伸長はゲノムＤＮＡ試料の、その都度の、シトシンのメチル化状態に依存する。
【請求項１９】
ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物に実証可能なマーカーを、検出が可能なように、帯びさせることを特徴とする請求項１から１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
マーカーが蛍光マーカーであることを特徴とする請求項１から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
マーカーが放射性核種であることを特徴とする請求項１から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
質量分析計で実証されるマーカーが分離可能であることを特徴とする請求項１から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
一つの増幅において、プライマーの一つが固相に結合していることを特徴とする請求項１から２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物を全て質量分析計で実証し、これらの質量によって一義的に、これらの各々を同定することを特徴とする請求項１から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物の一断片を質量分析計で実証することを特徴とする請求項１から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物の断片を一種または複数種のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる分解によって得ることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
質量分析計の検出精度改善のために、得られた断片が各々陽または陰電荷の帯電を示すことを特徴とする請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物がマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）または電子シュプレー質量分析（ＥＳＩ）によって検出され、且つ映像化されることを特徴とする請求項１から１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ＤＮＡ試料から採取されるゲノムＤＮＡの供給源が、例えば、細胞列、血液、喀痰、便、尿、脳脊髄液；パラフィン埋め込み組織、例えば、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓の組織；組織の顕微鏡スライドガラス及びこれらから得られる全ての可能な組み合わせであることを特徴とする請求項１から２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
患者または健常者の体調に現われる、好ましくない出来事についての診断または予診のための請求項１から２９の何れか１項に記載の方法の使用。
この好ましくない出来事は少なくとも以下のカテゴリーに属する。薬の副作用；癌；ＣＮＳ−機能欠失、障害、疾病；攻撃的徴候または異常行動；脳障害による臨床的、心理的及び社会的帰結；精神異常及び人格異常；痴呆及び／または結合する徴候；心臓血管系疾患、その機能欠失及び傷害；胃腸の領域の機能欠失、傷害または疾病；呼吸器系の機能欠失、傷害または疾病；障害、炎症、感染、免役性及び／または回復期；発育期の偏向的な機能欠失、傷害または疾病；皮膚、筋肉、結合組織、または骨の機能欠失、傷害または疾病；内分泌系及び代謝系の機能欠失、傷害または疾病；頭痛または性的機能欠失。
【請求項３１】
細胞型または組織の調査または細胞区分の研究のために、請求項１から２９の何れか１項に記載の方法の使用。
【請求項３２】
重亜硫酸塩含有反応剤、変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤及び増幅産物製造用の選択的プライマー及び請求項１から２９の何れか１項に記載のアッセイ実施用の選択的マニュアルからなるキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はゲノムＤＮＡ試料のメチル化状態の検出方法に関する。
【０００２】
近年の分子生物学における手法的開発による研究的観察は遺伝子自体、この遺伝子のＲＮＡの解読、そこから発生する蛋白などについてである。個々の開発過程で、どの遺伝子が評価されるか、そして、いかにして、特定の細胞および組織における特定の遺伝子の活動及び阻害が制御されるか、は遺伝子またはゲノムのメチル化の程度及び性格と関連づけることができる。個々の遺伝子またはゲノムの変化させられたメチル化サンプルにおいて、病気の状態が表現される。
【０００３】
５−メチルシトシンはしばしば、共有結合反応させられる、真核細胞のＤＮＡの塩基である。これは例えば、遺伝子刷り込み時の転写規制及び腫瘍遺伝子において、一定の役割を演じる。遺伝子情報の構成部分としての５−メチルシトシンの同定は、それ故に、非常に興味ある問題である。ＰＣＲ増幅では５−メチルシトシンを有する後成的情報は完全に失われている。
【０００４】
比較的新しい、最も頻繁に使用されるＤＮＡの５−メチルシトシンの調査方法は、シトシンと重亜硫酸塩との特殊な反応に基づく。このシトシンは後続するアルカリ加水分解により、ウラシルに変化し、これはその塩基対挙動がチミンに対応する。それに対して、５−メチルシトシンは、この条件下では変化しない。このようにして、元のＤＮＡが変化し、元来、シトシンのハイブリッド化挙動によってはシトシンと区別できなかった５−メチルシトシンは、今や、通常の分子生物学的技法によって、唯一、残存するシトシンが、例えば、増幅及びハイブリッド化または配列化によって、実証され得るようになった。これら全ての技法は、現在、完全に利用し尽くされている塩基対に基づく。従来の技術では、感度に関して、調査するＤＮＡをアガロースマトリックスに封入し、それによって、ＤＮＡの拡散及び変成復元化（重亜硫酸塩は単鎖ＤＮＡとのみ反応する）が阻害され、全ての沈殿および精製工程が迅速な透析によって、取って代られる（Ｏｌｅｋ Ａ、Ｏｓｗａｌｄ Ｊ、Ｗａｌｔｅｒ Ｊ． 変化し、改善された重亜硫酸塩ベースのシトシンメチル化分析。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６ Ｄｅｃ １５； ２４ （２４） ：５０６４〜６）。これらの方法によって、個々の細胞を調べることができ、この方法の潜在的効果が具体的に説明される。勿論、これまでに、単に、個々の領域で、約３，０００塩基対長までが調べられたに過ぎず、数千に及ぶ細胞のメチル化解析の調査は可能ではない。またこれらの方法では、僅かな量の試料からの小さな断片から信頼性のある解析は不可能である。これらの方法では拡散防止の措置にも拘らず、マトリックスから逸失される。
【０００５】
５−メチルシトシンを実証する既知の可能性についての概観は、以下の概観の刊行物から知ることができる。即ち、Ｒｅｉｎ Ｔ、ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ ＭＬ、Ｚｏｒｂａｓ Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＤＮＡ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．１９９８ Ｍａｙ １５； ２６ （１０）： ２２５５〜６４。重亜硫酸塩を使用した技法は、これまで僅かな例外［ｚ． Ｂ． Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ Ｍ、Ｌｉｃｈ Ｃ、Ｂｕｉｔｉｎｇ Ｋ、Ｄｏｅｒｆｌｅｒ Ｗ、Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ Ｂ． Ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ ＰＣＲ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｌｅｌｉｃ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ＳＮＲＰＮ ｌｏｃｕｓ ．Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． １９９７ Ｍａｒ〜Ａｐｒ； ５ （２）：９４〜８ ］が研究の中で使用されていたに過ぎない。常に、既知の遺伝子の、短い、特殊な断片が、重亜硫酸塩処理によって、増幅されるか、または、相補的に配列されるか［Ｏｌｅｋ Ａ 、Ｗａｌｔｅｒ Ｊ． Ｔｈｅ ｐｒｅ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｎｔｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ１９ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｉｎｔ、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １９９７ Ｎｏｖ； １７（３）：２７５〜６ ］ または、個々のシトシン位置を、プライマー伸長反応 ［Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＭＬ、Ｊｏｎｅｓ ＰＡ． Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ （Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ） ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７ Ｊｕｎ １５； ２５ （１２）： ２５２９〜３１、ＷＯ−Ｐａｔｅｎｔ ９５００６６９］ によって、または、一つの酵素断片［Ｘｉｏｎｇ Ｚ、Ｌａｉｒｄ ＰＷ． ＣＯＢＲＡ： ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７ Ｊｕｎ １５； ２５ （１２）： ２５３２〜４ ］によって実証される。そのために、ハイブリッド化により実証される（Ｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ ９９２８４９８）。
【０００６】
その他の、個々の遺伝子のメチル化実証のために重亜硫酸塩技法を使用することについて、記載されている刊行物は以下のものである。
Ｇｒｉｇｇ Ｇ、Ｃｌａｒｋ Ｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ． Ｂｉｏａｓｓａｙｓ． １９９４ Ｊｕｎ； １６ （６）： ４３１〜６、４３１； Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ Ｍ、Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｂ、Ｄｉｔｔｒｉｃｈ Ｂ、Ｂｕｉｔｉｎｇ Ｋ、Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ Ｂ、Ｄｏｅｒｆｌｅｒ Ｗ、Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐａｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｏｒｏｍｅ ｒｅｇｉｏｎ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ． Ｈｕｍ ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． １９９７ Ｍａｒ； ６ （３）： ３８７〜９５； Ｆｅｉｌ Ｒ、Ｃｈａｒｌｔｏｎ Ｊ、Ｂｉｒｄ ＡＰ、Ｗａｌｔｅｒ Ｊ、Ｒｅｉｋ Ｗ． Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｐｃｏｌ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４ Ｆｅｂ ２５； ２２ （４）： ６９５〜６； ＭａｒｔｉｎＶ、Ｒｉｂｉｅｒａｓ Ｓ、Ｓｏｎｇ− Ｗｏｎｇ Ｘ、Ｒｉｏ ＭＣ、Ｄａｎｔｅ Ｒ． Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＮＡ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ５’ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐＳ２ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｇｅｎｅ．１９９５ Ｍａｙ １９； １５７ （１〜２）： ２６１〜４； ＷＯ ９７４６７０５、ＷＯ ９５１５３７３及びＷＯ ９５４５５６０。
【０００７】
オリゴマーアレーの製造における従来の技術の概観は１９９９年１月のネイチャージェネティックスの特別版に記載がある（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ特別版、２１巻１９９９年１月）。そこで引用されている文献及び、米国特許５９９４０６５号には、非特異的背景信号での、オリゴヌクレオチッドのような目的分子の個体担体による製造方法が記載されている。
【０００８】
固定ＤＮＡアレーの調査には多重蛍光マーカーを付されたゾンデが使用されている。特に、その都度、ゾンデの５’−ＯＨにＣｙ３及びＣｙ５色素を一回付す蛍光マーカーが好適である。ハイブリッド化ゾンデの蛍光の検出は、例えば、コンフォカール顕微鏡を使用して行なわれる。Ｃｙ３及びＣｙ５色素は他の類似物と共に、市販されている。
【０００９】
マトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は分子生物学の解析において非常に有力な発展を齎した［Ｋａｒａｓ Ｍ、Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ Ｆ．１０，０００ダルトンを超える分子量の蛋白のレーザー脱離イオン化。Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． １９８８ Ｏｃｔ １５； ６０ （２０）： ２２９９〜３０１ ］。ある被分析物は光吸収性マトリックス中に埋め込まれる。短時間のレーザー照射によって、マトリックスが蒸発し、被分析分子は断片化せずに、ガス相に移行する。マトリックス分子の衝撃により、被分析物のイオン化が達成される。電圧をかけられてイオンが飛行管中へ加速される。分子量の差により、イオンは異なる強さで加速される。小さいイオンは大きいイオンよりも早い時期に検出器に達する。
【００１０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は蛋白質及びペプチッドの解析（分析）にとりわけ優れている。核酸の分析用としてはやや難点がある［Ｇｕｔ、Ｉ． Ｇ． ｕｎｄ Ｂｅｃｋ Ｓ． （１９９５）、ＤＮＡ ａｎｄ Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ １： １４７〜１５７ ］。核酸については、検出感度がペプチッドの場合の１００倍も悪く、断片の衝撃が増えるに従がって、超比例的に減少する。骨格に多くの負電荷を有している核酸は、マトリックスによるイオン化が本質的に非効率的である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析ではマトリックスの選択が、非常に重要な役割を演じる。
ペプチッドの脱離には、非常に細かい結晶の、有用なマトリックスを使用することが発見された。ＤＮＡには、幾つかの請求項記載のマトリックスがあり、その使用によって、感度の差異は減少しない。感度の差異は、ＤＮＡをペプチッドに類似するように化学変化させることにより、減少させることができる。通常の骨格の燐酸塩が、チオ燐酸塩によって、置換されるところの、核酸リンチオエートは、簡単なアルキル化反応によって、電荷的に中性なＤＮＡに変換される［Ｇｕｔ Ｉ． Ｇ．ｕｎｄ Ｂｅｃｋ、Ｓ． （１９９５）、ＤＮＡの選択的アルキル化及び質量分析による検出法。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３： １３６７〜１３７３ ］。チャージタッグスのこの変化したＤＮＡへの結合は、ペプチッドに見られるのと同じ程度の感度上昇を齎す。更なるチャージタッギングの利点は、変化しない基質の実証を著しく困難にする不純物の分析安定性を高めることである。
【００１１】
ゲノムＤＮＡは標準的方法によって、細胞、組織または他の試料から得られる。
この標準的方法はフリッチェ及びマニアティスによる、分子クローン：研究手引１９８９年のような参考文献に載っている。
【００１２】
尿素はゲノムＤＮＡの５−メチルシトシンの配列前の重亜硫酸塩の処理の効率を高める［Ｐａｕｌｉｎ Ｒ、Ｇｒｉｇｇ ＧＷ、Ｄａｖｅｙ ＭＷ、Ｐｉｐｅｒ ＡＡ． 尿素はゲノムＤＮＡの５−メチルシトシンの配列前の重亜硫酸塩の処理の効率を高める。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８ Ｎｏｖ １； ２６ （２１）： ５００９〜１０ ］。
【００１３】
全ての、非メチル化シトシンが特定の塩基に変換され、非メチル化シトシンは増幅後、なお、シトシンとして存在することにより、シトシンのメチル化が証明される方法がある。増幅時に、対向する鎖で、シトシンがなお常に相補体として、非変換グアニンに組込まれるので、逆に、増幅後に、なお存在する全てのシトシン塩基をメチル化シトシン以前に、配置することが容易にできる。もし、メチル化位置を決めるか、または、増幅された断片におけるメチル化の範囲を決めるために、簡単な方法で、シトシンに特徴的な反応を施したいと思えば、これが邪魔する。これらの問題点を本発明の方法が解決する。
【００１４】
本発明の課題は、増幅された二本鎖ＤＮＡに、ゲノムＤＮＡ試料内のシトシンのメチル化を一義的に同定するために利用できるマーキングを施す方法を用意することである。これらマーカーには、簡単な、新たに考案された分子生物学的方法が使用できる。
【００１５】
課題は本発明のゲノムＤＮＡのシトシンのメチル化の検出方法によって解決され、その際、以下のステップが実行される。
ａ）ゲノムＤＮＡ試料を反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。
ｂ）前処理されたＤＮＡをポリメラーゼ及び少なくともプライマーオリゴヌクレオチッドを使用し増幅する。
ｃ）増幅産物を新たに反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。
ｄ）新たな化学的前処理の後、増幅産物中に残存しているシトシン塩基及び／またはグアニン塩基の存在を実証する。
【００１６】
課題は、更に、本発明のゲノムＤＮＡのシトシンのメチル化の検出方法によって解決され、その際、以下のステップが実行される。
ａ）ゲノムＤＮＡ試料を反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。
ｂ）前処理されたＤＮＡをポリメラーゼ及び少なくともプライマーオリゴヌクレオチッドを使用し増幅する。
ｃ）増幅産物を新たに反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。
ｄ）化学的に前処理されたｃ）の増幅産物を新たに、ｅ）増幅産物中に残存しているシトシン塩基及び／またはグアニン塩基の存在を実証する。これらの本発明の変法は二つの増幅ステップを含む。
【００１７】
本発明の方法において、特に好ましい化学的処理は、重亜硫酸ソーダ（＝亜硫酸水素ナトリウム、酸性亜硫酸ソーダ）による方法で、更に、化学的処理がＤＮＡのアガロース中への埋め込みによって行なわれることが、特に好ましい。
【００１８】
本発明においては、二本鎖ＤＮＡの化学的処理において、変性剤及び／またはラジカル捕捉剤が存在することが好ましい。その際、変性剤が下記の物質の一つから選択されることが特に好ましい。
ポリエチレングリコールジアルキルエーテル、ジオキサン及びその置換誘導体、尿素またはその誘導体、アセトニトリル、第一級アルコール、第二級アルコール、第三級アルコール、ジエチレングリコールジアルキルエーテル、トリエチレングリコールジアルキルエーテル、テトラエチレングリコール−ジアルキルエーテル、ペンタエチレングリコールジアルキルエーテル、ヘキサエチレングリコールジアルキルエーテル、ＤＭＳＯまたはＴＨＦ及び／または下記の物質の一つから選択されるラジカル捕捉剤。
ジ−、トリ−ヒドロキシベンゾール、緑茶抽出物、パインバーク抽出物（ピクノゲノール）、二葉性銀杏抽出物（ＥＧｂ７６１）、数種の果実および野菜の抽出物のフラボノイド混合物（ＧＮＬＤ）、バイオ−ノーマライザー（Ｓｕｎ−Ｏ Ｃｏｒｐ）、ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）、ＮＤＧＡ（ノルジヒドログアヤレート−酸）、トロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、２，６−ジ−ターシャリー−ブチルフェノール、４−メチル−ジ−ターシャリー−ブチルフェノール、４−メトキシ−ジ−ターシャリー−ブチルフェノール、２，６−ジ−ターシャリーブチル−ｐ−クレゾール、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、ビタミンＣ、Ｅ、Ｑ、ハイドロキノン、ユビキノン、リグナン、ヒドロキシテルペン、フラボノイド、ウコン、タンニン、レチン酸化合物、Ｇｅ−１３２−ビス−β−カルボキシエチルゲルマニウムセスキオキサイド、過酸化ジスムターゼ、過酸化カタラーゼ、α−ナフトフラボン、ジ（２−メチル−５−クロロフェニル）ジチオネート及びＣｕ（ＩＩ）−誘導体、メベンダゾール、ＣＳ（クロロホルムソリュブル）アルカロイド抽出物、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，２−ナフトキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロモ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロロ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−ナフトキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、３−ブロモ−４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−インダン−１，３−ヂオン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナ���タリン−１−オン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３，４−ジメトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナフタリン−１−オン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インダン−１−オン、３，３−Ｂｉ−［２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インデン−１−オン］−３−イル、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロモ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロロ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−ブロモ−３−（３−ブロモ−５−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−ブロモ−３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−ブロモ−３−（３−ブロモ−５−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、３−ブロモ−２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−アンスラキノン、５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１，３−ジオール、３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１−オール、４−（３−クロロ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル）−安息香酸、メチル−４−（３−クロロ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル）−ベンゾエート、４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、メチル−（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，���，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル）−安息香酸、メチル−４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル−アゾ）−ベンゾエート、４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル−アゾ）−安息香酸、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］ナフタリン−１，２−ジオン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロアンスラセン−３Ｈ−１，２，４−トリオン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャ���ー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３−ブロモ−５−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン。
【００１９】
本発明においては、ＤＮＡの化学的処理に使用される反応剤を後続する増幅の前に、その都度、完全に、または、部分的に、除去することが好ましい。また、化学的処理後であって、増幅の前に、試料を希釈することが好ましい。更に
多くのＤＮＡ断片の増幅を同時に、一つの反応器で行なうこと、及び／または、増幅に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
【００２０】
本発明においては、増幅前にＤＮＡの脱硫を行なうことが好ましい。
【００２１】
第二回目の化学的処理後に残存するシトシン塩基及び／またはグアニン塩基をハイブリッド化で実証すること及び／または、第二回目の化学的処理後に残存するシトシン塩基及び／またはグアニン塩基をシトシン塩基及び／またはグアニン塩基に施された実証可能なマーカーの特殊な組込みによって実証することが好ましい。
【００２２】
本発明においては、最初の変法におけるステップｄ）または第二の変法におけるステップｅ）において、前処理されたＤＮＡの検出のために、増幅産物をオリゴヌクレオチッドアレーにハイブリッド化させ、次いで、以下の部分的ステップを実施することが好ましい。
ａ）増幅されたゲノムＤＮＡが少なくとも、一つのオリゴヌクレオチッドに二本鎖構造の形成下にハイブリッド化され、その際、前記ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチッドが、その３’−末端で、直接または１０塩基の間隔を置いた、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化が調べられる位置に配置される。
ｂ）オリゴヌクレオチッドを既知の配列のｎヌクレオチッドで、ポリメラーゼによって、少なくとも、ヌクレオチッド一個分だけ伸長させる。その際、ヌクレオチッドは実証できるマーカーを帯びており、伸長はゲノムＤＮＡ試料のシトシンのメチル化状態に依存する。
【００２３】
第二回目の化学的処理後に残存するシトシン塩基及び／またはグアニン塩基を配列化反応によって実証することが好ましい。
【００２４】
最初の変法におけるステップｄ）または第二の変法におけるステップｅ）において、前処理されたＤＮＡの検出のために、増幅産物をオリゴヌクレオチッドアレーにハイブリッド化させ、次いで、以下の部分的ステップを実施することが、更に好ましい
ａ）一揃いのオリゴヌクレオチッドを増幅されたゲノムＤＮＡに二本鎖の形成下ハイブリッド化させ、その際、この一揃いは、オリゴヌクレオチッドが二つの異なるスペシースからなり、最初のスペシースのハイブリッド化オリゴヌクレオチッドは、その３’−末端で直接または１０塩基の間隔を置いた、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化が調べられる位置に配置され、第二のスペシースの第二のオリゴヌクレオチッドは、目的分子の第二の領域下にハイブリッド化され、その結果、第二のスペシースの第二のオリゴヌクレオチッドの５’−末端が、個々のヌクレオチッドの大きさの隙間を通るか、または、第一のスペシースのハイブリッド化オリゴヌクレオチッドの３’−末端から前記選択された位置だけ、離れているようになる。
ｂ）第一のスペシースのオリゴヌクレオチッドを既知の配列のｎヌクレオチッドで、ポリメラーゼによって、高々、第一のスペシースのオリゴヌクレオチッドの３’−末端と第二のスペシースのオリゴヌクレオチッドの５’−末端の間のヌクレオチッド数だけ、伸長させる。その際、ヌクレオチッドは実証できるマーカーを帯びており、伸長はゲノムＤＮＡ試料のシトシンのメチル化状態に依存する。
ｃ）リガーゼの存在下、オリゴヌクレオチッドを培養する。その際、隣接する、ポリメラーゼ反応により、伸長される第一のスペシースのオリゴヌクレオチッド及び第二のスペシースのオリゴヌクレオチッドが結合し、それ以前のステップで、第一のスペシースのオリゴヌクレオチッドの伸長が、３’−末端が伸長されたオリゴヌクレオチッドの３’−ヒドロキシ機能で直接、第二のスペシースのオリゴヌクレオチッドの５’−末端に隣接するように、為されるかぎり、それによりライゲーション反応産物が得られる。
【００２５】
このとき、更に、前処理されたＤＮＡの検出のための、最初の変法におけるステップｄ）において、ＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチッドアレーにハイブリッド化させ、次いで、以下の部分的ステップを実施することが好ましい。
ａ）増幅されたゲノムＤＮＡを少なくとも、一つの既知のｎヌクレオチッド配列のオリゴヌクレオチッドに、二本鎖構造の形成下に、ハイブリッド化し、その際、前記ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチッドが、その３’−末端で部分的または完全に、その、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化に関して、調べられる位置でハイブリッド化される。
ｂ）オリゴヌクレオチッドを、その３’−末端で、予め、塩基対欠失なしで、調べる位置にポリメラーゼによって、少なくともヌクレオチッド一個分だけ、ハイブリッド化して伸長させ、その際、少なくとも、一個のヌクレオチッドが実証可能なマーカーを帯び、伸長はゲノムＤＮＡ試料の、その都度の、シトシンのメチル化状態に依存する。
【００２６】
本発明においては、ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物に実証可能なマーカーを検出可能なように帯びさせることが好ましい。マーカーが蛍光マーカーまたは放射性核種マーカーまたは、質量分析計で実証される分離可能な質量マーカーであることが好ましい。
【００２７】
一つの増幅において、プライマーの一つが固相に結合していることが好ましい。
【００２８】
ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物を全て質量分析計で実証し、これらの質量によって一義的に、これらの各々を同定することが特に好ましい。また、ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物の一断片を質量分析計で実証することも好ましい。ここで、ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物の断片を一種または複数種のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる分解によって得ることが特に好ましい。ここでは、質量分析計の検出精度改善のために、得られた断片が各々陽または陰電荷の帯電を示すことが、極めて、特に好ましい。
【００２９】
本発明の方法においては、ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物がマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）または電子シュプレー質量分析（ＥＳＩ）によって検出され、且つ映像化されることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法においては、ＤＮＡ試料から採取されるゲノムＤＮＡの供給源が、例えば、細胞列、血液、喀痰、便、尿、脳脊髄液；パラフィン埋め込み組織、例えば、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓の組織；組織の顕微鏡スライドガラス及びこれらから得られる全ての可能な組み合わせを包含するものであることが特に好ましい。
【００３１】
本発明の更なる対象は、本発明の方法を患者または健常者の体調に現われる好ましくない出来事についての診断または予診に適用することである。この好ましくない出来事は少なくとも以下のカテゴリーに属する。即ち、薬の副作用；癌；ＣＮＳ−機能欠失、障害、疾病；攻撃的徴候または異常行動；脳障害による臨床的、心理的及び社会的帰結；精神異常及び人格異常；痴呆及び／または結合した徴候；心臓血管系疾患、その機能欠失及び傷害；胃腸の領域の機能欠失、傷害または疾病；呼吸器系の機能欠失、傷害または疾病；障害、炎症、感染、免役性及び／または回復期；発育期の偏向的な機能欠失、傷害または疾病；皮膚、筋肉、結合組織、または骨の機能欠失、傷害または疾病；内分泌系及び代謝系の機能欠失、傷害または疾病；頭痛または性的機能欠失である。
【００３２】
本発明の方法の好ましい適用は、細胞型または組織の調査または細胞差別化の調査のために適用することである。
【００３３】
更に、本発明の対象は重亜硫酸塩含有反応剤、変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤及び増幅産物製造用の選択的プライマー及び請求項１から２８の何れか１項に記載のアッセイ実施用の選択的マニュアルからなるキットである。
【００３４】
本発明においては、ゲノムＤＮＡ試料からの二本鎖ＤＮＡの製造方法が記載されている。ゲノムＤＮＡ試料は、そのＣＧ塩基対が、予め、ゲノムＤＮＡ内のメチルシトシン塩基が存在する位置に存在するという特徴を有する。続いて、ゲノムＤＮＡ内のメチルシトシン塩基が存在する位置を、識別し易くするために、ＣＧ塩基対の化学的、生物学的または物理学的特性を利用する。専門家が、この、ＣＧ塩基対を実証すること及び挙げられた目的を役立てることのできるという、本線からずれた、または、別の、容易に推測できる可能性を見出すことができると仮定して、そのために、以下に、多くの変化した実施例を挙げる。
【００３５】
本発明の方法に組込まれたゲノムＤＮＡはＤＮＡ試料から得られるが、そのＤＮＡ供給源が、例えば、細胞列、血液、喀痰、便、尿、脳脊髄液；パラフィン埋め込み組織、例えば、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房または肝臓の組織；組織の顕微鏡スライドガラス及びこれらから得られる全ての可能な組み合わせを包含するものであることが好ましい。
【００３６】
ゲノムＤＮＡ中のシトシンのメチル化の検出方法は次ぎの各ステップからなることを特徴とする。最初に、ゲノムＤＮＡ試料を反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。次いで、前処理されたＤＮＡをポリメラーゼ及び少なくともプライマーオリゴヌクレオチッドを使用し増幅する。第３ステップで、増幅産物を新たに反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。最後のステップで、増幅産物中に新たな化学的処理後に残存しているシトシン塩基及び／またはグアニン塩基の存在を実証する。
【００３７】
本発明の方法の特に好ましい変法は、次ぎの各ステップからなることを特徴とする。ゲノムＤＮＡのシトシンのメチル化の検出方法は下記の各ステップからなることを特徴とする。最初に、ゲノムＤＮＡ試料を反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。第２ステップで、前処理されたＤＮＡをポリメラーゼ及び少なくともプライマーオリゴヌクレオチッドを使用し増幅する。第３ステップで、増幅産物を新たに反応剤で処理して、５−メチルシトシンは変化せず、シトシンをウラシルまたはその塩基対挙動がウラシルに類似する他の塩基に化学的に変換する。第４ステップで、化学的に前処理されたステップｃ）の増幅産物を、新たに、増幅する。最後のステップで、増幅産物中に、新たな化学的処理後も残存しているシトシン塩基及び／またはグアニン塩基の存在を実証する。
【００３８】
化学的処理は重亜硫酸ソーダ（＝亜硫酸水素ナトリウム、酸性亜硫酸ソーダ）溶液によるのが特に好ましい。この処理は、専門家が知っているように、好適な条件下、非メチル化シトシン塩基へ重亜硫酸塩を加えるものである。この反応では、アルカリ加水分解で、ウラシルに移行するスルフォン化ウラシルが生成するように、シトシンのアミノ官能基のケト官能基への量的変換が行なわれる。そして、この経路で非メチル化シトシン塩基のウラシルへの変換が行なわれる。一方、５−メチルシトシンは変化しないでそのままである。この反応はＤＮＡが単鎖のときにのみ、行なわれる。本発明の特に好ましい変法では、ＤＮＡの化学的処理が、これをアガロース中に埋め込んで行なわれる。これにより、二本鎖の形成が阻害される。
【００３９】
本発明の特に好ましい変法において、化学的処理では、二本鎖ＤＮＡを変性する溶剤または反応剤が添加される。この溶剤または反応剤としては下記の化合物が好ましく、重要である。
ポリエチレングリコールジアルキルエーテル、ジオキサン及びその置換誘導体、尿素またはその誘導体、アセトニトリル、第一級アルコール、第二級アルコール、第三級アルコール、ジエチレングリコールジアルキルエーテル、トリエチレングリコールジアルキルエーテル、テトラエチレングリコール−ジアルキルエーテル、ペンタエチレングリコールジアルキルエーテル、ヘキサエチレングリコールジアルキルエーテル、ＤＭＳＯまたはＴＨＦ。
【００４０】
更に、反応条件下で、ＤＮＡの分解を妨げるラジカル捕捉剤を添加することが好ましい。ラジカル捕捉剤としては下記の化合物が好ましく、重要である。
ジ−、トリ−ヒドロキシベンゾール、緑茶抽出物、パインバーク抽出物（ピクノゲノール）、二葉性銀杏抽出物（ＥＧｂ７６１）、数種の果実および野菜の抽出物のフラボノイド混合物（ＧＮＬＤ）、バイオ−ノーマライザー（Ｓｕｎ−Ｏ Ｃｏｒｐ）、ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）、ＮＤＧＡ（ノルジヒドログアヤレート−酸）、トロロックス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）、２，６−ジ−ターシャリー−ブチルフェノール、４−メチル−ジ−ターシャリー−ブチルフェノール、４−メトキシ−ジ−ターシャリー−ブチルフェノール、２，６−ジ−ターシャリーブチル−ｐ−クレゾール、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、ビタミンＣ、Ｅ、Ｑ、ハイドロキノン、ユビキノン、リグナン、ヒドロキシテルペン、フラボノイド、ウコン、タンニン、レチン酸化合物、Ｇｅ−１３２−ビス−β−カルボキシエチルゲルマニウムセスキオキサイド、過酸化ジスムターゼ、過酸化カタラーゼ、α−ナフトフラボン、ジ（２−メチル−５−クロロフェニル）ジチオネート及びＣｕ（ＩＩ）−誘導体、メベンダゾール、ＣＳ（クロロホルムソリュブル）アルカロイド抽出物、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，２−ナフトキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，２−ナフトキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，２−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロモ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロロ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−ナフトキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、３−ブロモ−４−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−インダン−１，３−ヂオン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３−ヒドロキシ−４−メトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナ���タリン−１−オン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−３，４−エポキシ−３，４−ジメトキシ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ナフタリン−１−オン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インダン−１−オン、３，３−Ｂｉ−［２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−インデン−１−オン］−３−イル、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ブロモ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−クロロ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−ブロモ−３−（３−ブロモ−５−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−ブロモ−３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、２−ブロモ−３−（３−ブロモ−５−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，４−アンスラキノン、３−ブロモ−２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−１，４−アンスラキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−１，４−アンスラキノン、５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１，３−ジオール、３−メトキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタリン−１−オール、４−（３−クロロ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル）−安息香酸、メチル−４−（３−クロロ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル）−ベンゾエート、４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、メチル−（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル）−安息香酸、４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，���，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル）−安息香酸、メチル−４−（３−ヒドロキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタリン−２−イル−アゾ）−ベンゾエート、４−（３−ヒドロキシ−５，５，８，８−テトラメチル−１，４−ジオキソ−１，４，５，６，７，８−ヘキサヒドロアンスラセン−２−イル−アゾ）−安息香酸、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロシクロペンタ［ｂ］ナフタリン−１，２−ジオン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−オキソシクロヘキサ−２，５−ジエニリデン）−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロアンスラセン−３Ｈ−１，２，４−トリオン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−メトキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−エチルチオ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，８−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャ���ー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−６−メチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３−ブロモ−５−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，６−ジメチル−１，４−ナフトキノン、２−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン、３−（３，５−ジ−ターシャリー−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）−２−ヒドロキシ−５，７−ジメチル−１，４−ナフトキノン。
【００４１】
本発明の変法においては、ＤＮＡの化学的処理に使用された反応剤を後続する増幅の前に、完全に、または、部分的に、除去することが好ましい。これは例えば、ＤＮＡの固相への結合と反応剤の洗浄ステップによって達成できる。本発明の特に好ましい変法において、化学的処理後に、反応剤が後続する増幅を直接妨害しない程度の低い濃度になるように、その都度、単に、試料が希釈される。本発明の特に好ましい変法において、多くのＤＮＡ断片の増幅が一つの反応器で行われる。本発明の特に好ましい変法において、増幅には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが使用され、専門家が原理を熟知しているＰＣＲが増幅に組み込まれる。
【００４２】
本発明において、同様の化学的前処理に基づいて、スルホン酸基を意のままにできるので、好ましくは、増幅の前に脱硫が行なわれる。特に好ましくは、この脱硫は塩基性バッファー中、好ましくは、増幅反応のために用意されるバッファー中で行なわれる。
【００４３】
次の多くの圧倒的に、専門家にとって原理的に周知の方法によって、本発明の実施後、残存する、最初のゲノムＤＮＡ試料内のシトシンメチル化の実施の指標となるシトシンまたはグアニン塩基が証明され得る。
【００４４】
本発明においては、残存するシトシン及び／またはグアニン塩基またはシトシン−グアニン塩基対がハイブリッド化反応によって実証されることが特に好ましい。この実証が、増幅産物がオリゴヌクレオチッドアレーにハイブリッド化されるように実施されることが好ましい。次いで、以下の各ステップが実施される。第一ステップで、増幅されたゲノムＤＮＡが少なくとも、一つのオリゴヌクレオチッドに二本鎖構造の形成下にハイブリッド化され、その際、前記ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチッドが、その３’−末端で、直接または１０塩基の間隔を置いた、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化が調べられる位置に配置される。オリゴヌクレオチッドを既知の配列のｎヌクレオチッドで、ポリメラーゼによって、少なくともヌクレオチッド一個分だけ伸長させる。その際、ヌクレオチッドは実証できるマーカーを帯びており、伸長は最初のゲノムＤＮＡ試料のシトシンのメチル化状態に依存する。テンプレートＤＮＡにおけるオリゴヌクレオチッドの３’−末端に、マーカーを帯びたシトシンの構造を許容するグアニンが隣接していると、例えば、伸長反応が行なわれる。オリゴヌクレオチッドへのマーカーを帯びたシトシンの結合は最終的に、最初のゲノム試料のメチル化シトシンの存在を実証する反応として役立つ。
【００４５】
更に、第二回目の化学的処理（及び通常の第二の増幅）後に残存するシトシン塩基及び／またはグアニン塩基を配列化反応によって実証することが可能である。専門家にとっては、なかんずく、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の配列化及びマクサム−ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）の配列化は周知である。最初のゲノムＤＮＡ試料のメチル化シトシンが存在する二本鎖構造に、ＣＧ塩基対のみが存在するので、とりわけ、後者がここで提供される。Ｃ及び／またはＧの特殊な分割反応によって、その大きさが直接試料のメチル化状態に結びつく断片を生成させることができる。この断片は例えば、配列化または毛管電気泳動法によりその大きさが決定される。従来技術のように一回の重亜硫酸塩処理に対して、本発明の方法はその変法において、これがＣもＧも含まないので、対向する鎖の分割は為されないという特別な利点を与える。それによって、生成する断片の数が、はっきりと減少し、多くの増幅産物が、同時に調べられる場合は、多くの概括的な評価が可能になる。
【００４６】
前処理されたＤＮＡの検出のために、増幅産物がオリゴヌクレオチッドアレーにハイブリッド化され、次いで、以下のステップが行なわれることが、本発明の変法では好ましい。即ち、最初のステップで、一揃いのオリゴヌクレオチッドを増幅されたゲノムＤＮＡに、二本鎖の形成下、ハイブリッド化させ、その際、この一揃いのオリゴヌクレオチッドが二つの異なるスペシースからなり、最初のスペシースのハイブリッド化オリゴヌクレオチッドは、その３’−末端で直接または１０塩基の間隔を置いた、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化が調べられる位置に配置され、第二のスペシースの第二のオリゴヌクレオチッドは、目的分子の第二の領域下に、ハイブリッド化され、その結果、第二のスペシースの第二のオリゴヌクレオチッドの５’−末端が、個々のヌクレオチッドの大きさの隙間を通るかまたは、第一のスペシースのハイブリッド化オリゴヌクレオチッドの３’−末端から前記選択された位置だけ、離れているようになる。
第二のステップで、第一のスペシースのオリゴヌクレオチッドを既知の配列のｎヌクレオチッドで、ポリメラーゼによって、高々、第一のスペシースのオリゴヌクレオチッドの３’−末端と第二のスペシースのオリゴヌクレオチッドの５’−末端の間のヌクレオチッド数だけ伸長させる。その際、ヌクレオチッドは実証できるマーカーを帯びており、伸長はゲノムＤＮＡ試料のシトシンのメチル化状態に依存する。例えば、もし、化学的前処理において、シトシンの代わりにチミンが対象になっているときに、３‘末端の伸長は可能である。それは例えば、使用されたヌクレオチッド混合物でグアニンだけが末端に散在し、それに伴って伸長が、シトシンが対象の場合、中断されるからである。シトシンは、最初のＤＮＡの当該位置に５−メチルシトシンが存在するとき、化学的処理後再びそこに存在する。
【００４７】
最後のステップで、リガーゼの存在下、オリゴヌクレオチッドを培養する。その際、隣接する、ポリメラーゼ反応により、伸長される第一のスペシースのオリゴヌクレオチッド及び第二のスペシースのオリゴヌクレオチッドが結合し、それまでのステップで、第一のスペシースのオリゴヌクレオチッドの伸長が、３’−末端が伸長されたオリゴヌクレオチッドの３’−ヒドロキシ機能で直接、第二のスペシースのオリゴヌクレオチッドの５’−末端に隣接するように、為されるかぎり、それによりライゲーション産物が得られる。
【００４８】
前処理されたＤＮＡの検出のために、ＰＣＲ産物をオリゴヌクレオチッドアレーにハイブリッド化させ、次いで、以下の部分的ステップを実施することが好ましい。第一のステップで、増幅されたゲノムＤＮＡを少なくとも、一つの既知のｎヌクレオチッド配列のオリゴヌクレオチッドに、二本鎖構造の形成下に、ハイブリッド化し、その際、前記ハイブリッド化されたオリゴヌクレオチッドが、その３’−末端で部分的または完全に、その、ゲノムＤＮＡ試料のメチル化に関して、調べられる位置でハイブリッド化される。第二のステップで、オリゴヌクレオチッドを、その３’−末端で、予め、塩基対欠失なしで、調べる位置にポリメラーゼによって、少なくともヌクレオチッド一個分だけ、ハイブリッド化して伸長させ、その際、少なくとも、一個のヌクレオチッドが実証可能なマーカーを帯び、伸長はゲノムＤＮＡ試料のその都度のシトシンのメチル化状態に依存する。例えば、ゲノムＤＮＡが、上記オリゴヌクレオチッドがその３‘−末端と結合する位置に、最初は非メチル化状態で存在するときに、伸長が行われる。それは、化学前処理後、この位置に、シトシンが残存し、これはオリゴヌクレオチッドの結合後、伸長を妨げる、３’−末端でのミスマッチの原因になる。メチル化が存在しないとき、プライマーはミスマッチもなく、３−‘末端でテンプレートＤＮＡと結合する。
【００４９】
シトシンのメチル化の実証に役立つ、生成したＤＮＡオリゴマーの解析は、例えば、マークされたヌクレオチッドとしてＤＮＡ中に組込まれた蛍光マーカーによって行なわれる。
【００５０】
関与するオリゴヌクレオチッドが固相に結合するように、前記実証反応の大部分を実施することは専門家にとって容易である。
【００５１】
ＰＣＲを例えば、二番目の化学的処理の後に、放射性核種または蛍光マーカーを帯びたＣ及び／またはＧヌクレオチッドが組込まれ、そして、ＰＣＲプライマーの一つが固相に結合するように、実施することが、例えば、特に好ましい。固相に結合していない、全ての抽出物及び産物の除去後、固相に結合しているＰＣＲ産物が残存する。この産物では組込まれたマーカーの数が、二番目の化学的処理の後に残存する、グアニン及び／またはシトシン塩基の数に比例し、そして、直接ゲノム試料のシトシンのメチル化に依存する。かくして、このＰＣＲ産物のシトシンのメチル化の直接の数量化が可能になる。
【００５２】
ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物が検出のために実証可能なマーカーを備えていることが特に好ましい。
【００５３】
これらのマーカーが質量分析計で実証可能な蛍光マーカー、放射性核種マーカーまたは分析可能な質量マーカーまたはこれらの組合わせであることが特に好ましい。
【００５４】
更に、特に好ましい本発明の方法の変法においては、ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物を全部合わせて、質量分析計で実証し、それらの質量によって、一義的に、それらを特徴付ける。更に、好ましい変法においては、その都度、ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物の一断片が質量分析計で実証される。更に、ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物のこれらの断片が一種または二種以上のエキソまたはエンドヌクレアーゼの酵素作用によって、生成されることが好ましい。更に、本発明の方法の実施においては、生成する断片が、質量分析計の感度向上のために、各々陽電荷または陰電荷を帯びることが特に好ましい。
【００５５】
更に、ＰＣＲ産物及び／または伸長産物及び／またはライゲーション産物をマトリックス補助レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）または電子シュプレー質量分析（ＥＳＩ）によって検出し、且つ映像化することが好ましい。
【００５６】
本発明の対象は前記方法を患者または健常者の体調に現われる、好ましくない出来事についての診断または予診のために使用することである。この好ましくない出来事は少なくとも以下のカテゴリーに属する。薬の副作用；癌；ＣＮＳ−機能欠失、障害、−疾病；攻撃的徴候または異常行動；脳障害による臨床的、心理的及び社会的帰結；精神異常及び人格異常；痴呆及び／または結合した徴候；心臓血管系疾患、その機能欠失及び傷害；胃腸の領域の機能欠失、傷害または疾病；呼吸器系の機能欠失、傷害または疾病；障害、炎症、感染、免役性及び／または回復期；発育期の偏向的な機能欠失、傷害または疾病；皮膚、筋肉、結合組織、または骨の機能欠失、傷害または疾病；内分泌系及び代謝系の機能欠失、傷害または疾病；頭痛または性的機能欠失。
【００５７】
更に、本発明の方法を細胞タイプまたは組織の区別または細胞区分の研究に使用することが特に好ましい。
【００５８】
本発明の対象は、重亜硫酸塩含有反応剤、変性剤または溶剤及びラジカル捕捉剤及び／または増幅産物製造用のプライマー及び選択的に本発明の方法実施用のマニュアルからなるキットである。
【００５９】
【実施例】
以下の実施例で本発明を解説するが、本発明はこれらの実施例によっては限定されない。
（実施例１）２回の重亜硫酸塩による処理でゲノム配列を変換する。
本発明の方法の解説用として、ここでは、下記の、潜在的にメチル化されたＣＧジヌクレオチッドを含む二本鎖ＤＮＡ配列を使用する。
Ａ　　３’−ＴＧＡＴＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＡＣ−５’
Ｂ　　５’−ＡＣＴＡＧＡＴＣＧＴＡＣＴＧＡＴＧ−３’
二本鎖配列は、患者または健常者の体調に現われる好ましくない出来事について調べるために使用する。制限酵素（ここではＭｓｓ１）で処理された、あるゲノムの、未知の、メチル化ＤＮＡ試料（２０ｎｇ）を使用する。処理されたＤＮＡは昇温させて、重亜硫酸水素塩（重亜硫酸塩、酸性亜硫酸塩）とラジカル捕捉剤で化学変化される。変性を補助する反応剤または溶剤が添加される。ＤＮＡは先ず熱変性され，次いで、重亜硫酸塩、ラジカル捕捉剤及び変性剤が加えられ、長時間、昇温状態で、培養される。重亜硫酸塩反応が全ての非メチル化シトシン塩基をウラシルに変化させる。重亜硫酸塩処理ＤＮＡの精製のために、これを逆相Ｃ１８固相上に結合させ、好適な化合物の緩衝液で洗浄して分離させる。次いで、ＤＮＡは例えば、アセトニトリルまたは水のような極性溶剤で溶出され、濃縮される。重亜硫酸塩処理断片のアルカリ加水分解は直接、特殊な増幅の前に塩基性条件下に行なわれる。次いで、試料は特殊なプライマーオリゴヌクレオチッド（ＣＧジヌクレオチッドを含まない）２５ｐｍｏｌによって希釈される。亜硫酸水素塩溶液による最初の処理後、非メチル化シトシン塩基のウラシルへの変化が行なわれ、後続する、亜硫酸水素塩による化学的処理後、もはや、相補的鎖を増幅せず、且つ、ウラシルが本質的にチミンで代替されるところの、ＰＣＲが下記の二本鎖ＤＮＡ配列を齎す。
Ａ）ＣＧ（＋）メチル化である場合
下記Ｂ鎖から：
Ｃ　　（＋） ３’−ＴＡＡＴＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＴＡＣ−５’
Ｂ’　（＋）５’−ＡＴＴＡＧＡＴＣＧＴＡＴＴＧＡＴＧ−３’　配列Ｌ（ｕｐ）
上記Ａ鎖から：
Ａ’　（＋）３’−ＴＧＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧＡＴＴＡＴ−５’
Ｄ　　（＋） ５’−ＡＣＴＡＡＡＴＣＧＴＡＣＴＡＡＴＡ−３’ 　配列Ｕ（ｕｐ）
Ｂ）ＣＧ（−）非メチル化である場合
下記Ｂ鎖から：
Ｃ　 （−）３’−ＴＡＡＴＣＴＡＡＣＡＴＡＡＣＴＡＣ−５’
Ｂ’　（−） ５’−ＡＴＴＡＧＡＴＴＧＴＡＴＴＧＡＴＧ −３’　 配列Ｌ（ｄｏｗｎ）
上記Ａ鎖から：
Ａ’　（−）３’−ＴＧＡＴＴＴＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＴ−５’
Ｄ　　（−） ５’−ＡＣＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＡＡＴＡ−３’ 　配列Ｕ（ｄｏｗｎ ）
【００６０】
二番目の亜硫酸水素塩処理は一番目と類似した操作で行なわれる。増幅は先ず、熱変性する、このとき、試薬または溶剤の投与が補助的に行なわれる。次いで、化学反応が起こり、続いて増幅される。そのとき、アルカリ加水分解が増幅に先立ち、もう一度、短時間行なわれる。二番目の特殊な増幅は重亜硫酸塩処理した試料の一部を使用して行なうことができる。反応溶液は亜硫酸水素塩反応で必要とする化合物がＰＣＲを妨げない程度に希釈される。他方、試料は再度、逆相Ｃ１８固相によって精製される。二度、亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡ試料は特殊なプライマーオリゴヌクレオチッド（ＣＧジヌクレオチッドを含まない）２５ｐｍｏｌによって希釈される。そのとき、第一、第二の増幅時のプライマーオリゴヌクレオチッドの配列は一致してはならない。
【００６１】
第二の亜硫酸水素塩溶液による処理後、もう一度、非メチル化シトシン塩基のウラシルへの変換が行なわれる。そして、後続の、亜硫酸水素塩による化学的処理後、もはや、相補的鎖を増幅せず、且つ、ウラシルが本質的にチミンで代替されるところの、ＰＣＲが下記の二本鎖ＤＮＡ配列を齎す。
Ａ）ＣＧ（＋）メチル化である場合
下記Ｂ’及びＣ鎖から：
Ｅ　　 （＋） ３’−ＴＡＡＴＣＴＡＡＣＡＴＡＡＣＴＡＣ−５’
Ｂ’’　（＋）５’−ＡＴＴＡＧＡＴＴＧＴＡＴＴＧＡＴＧ−３’　 配列ＬＬ（ｕｐ）
Ｃ’　 （＋）３’−ＴＡＡＴＴＴＡＧＴＡＴＡＡＴＴＡＴ−５’
Ｆ　　 （＋）５’−ＡＴＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＡＡＴＡ−３’　配列ＬＵ（ｕｐ）
上記Ｄ及びＡ’鎖から：
Ｇ　　 （＋）３’−ＴＡＡＴＴＴＡＡＣＡＴＡＡＴＴＡＴ−５’
Ｄ’　　（＋） ５’−ＡＴＴＡＡＡＴＴＧＴＡＴＴＡＡＴＡ−３’配列ＵＬ（ｕｐ）
Ｈ　　 （＋）３’−ＴＧＡＴＴＴＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＴ−５’
Ａ’’　（＋）５’−ＡＣＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＡＡＴＡ−３’ 配列ＵＵ（ｕｐ）
Ｂ）ＣＧ（−）非メチル化である場合
下記Ｃ及びＢ’鎖から：
Ｅ　 　（−）３’−ＴＡＡＴＣＴＡＡＣＡＴＡＡＣＴＡＣ−５’
Ｂ’’　 （−）５’−ＡＴＴＡＧＡＴＴＧＴＡＴＴＧＡＴＧ−３’ 配列ＬＬ（ｄｏｗｎ）
Ｃ’　（−）３’−ＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＴＡＡＴＴＡＴ−５’
Ｆ　　（−）５’−ＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＴＡ−３’ 配列ＬＵ（ｄｏｗｎ）
上記Ｄ及びＡ’鎖から、
Ｇ　　（−）３’−ＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＴＡＡＴＴＡＴ−５’
Ｄ’ 　（−）５’−ＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＴＡ−３’ 配列ＵＬ（ｄｏｗｎ）
Ｈ　　（−）３’−ＴＧＡＴＴＴＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＴ−５’
Ａ’’　 （−）５’−ＡＣＴＡＡＡＴＣＡＴＡＣＴＡＡＴＡ−３’ 配列ＵＵ（ｄｏｗｎ）
【００６２】
配列ＵＵは試料のメチル化状態に依存せず同一である。同様のことが配列ＬＬに当てはまる。従がって、両配列はメチル化状態の決定には使用できない。ＬＵ及びＵＬはＤＮＡ試料（配列内で高められる）のメチル化状態ヘの依存では、それ以前のＣＧ位置で決定される。注目すべき方法の本来の利点は、特に、シトシンまたはグアニンが鎖中に、メチル化が行なわれるとき、思いがけなく現われることである。それで、実際、ゲノム試料のメチルシトシン塩基の二本鎖の特徴を有する塩基への移行が行なわれ、一方、一回の重亜硫酸塩処理で、塩基が二本鎖の一本でのみ、メチルシトシンの特徴を示す。これは事実、全ての、専門家に知られている配列化法（例えば、マクサムギルバートの配列化）または遺伝子型分類法の使用を、対向鎖を考慮することなく許容する。例えば、二回目の重亜硫酸塩処理後、増幅されるＤＮＡの配列特異的分割がシトシン塩基の位置で行なわれるならば、一本鎖の分割が、他方が変化しないままで行なわれる。
【００６３】
（実施例２）２回の重亜硫酸塩処理によるゲノム配列の変化
サンプルとしてヒトゲノムのＨＳＭＤＲ１遺伝子が選択された。実験で、最初の重亜硫酸塩処理後、２０１０塩基対長の、この遺伝子のＤＮＡ断片が得られ、同時に、ｇｃリッチの領域が５‘−末端及び３−’末端に発生した。これらのＰＣＲ産物の人工的５‘−及び３’−末端が最初の重亜硫酸塩処理後に生成したので、これらは二回目の重亜硫酸塩処理において、一回の変換の基礎になっている。なお、Ｃ’ｓ及びＧ’ｓを含むので（他の配列への対比で）、これはこの領域のより高度の特殊性に通じる。それに伴って、これは特に２回目の重亜硫酸塩処理後、増幅用のプライマーのデザインに好適である。標的ＤＮＡの短い断片の増幅はＡ’ｓ及びＴ’ｓだけからなるプライマーによって行われる。ゲノム配列、１回の重亜硫酸塩処理及び２回の重亜硫酸塩処理によるＤＮＡは末端に示される。
【００６４】
（図面の説明）
図１：ｇｃ領域で、一回の重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡからＰＣＲ産物を製造する概略図である。
ａ） ５’ ｇｔｇａｔｃｃｃｇｇｇｃｇａｇｃｔｃｃｃＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧ；
ｂ） ３’ｇｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａｃｃＴＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣ；
ｃ） 重亜硫酸塩処理済みＤＮＡ、単鎖。
図２：ＨＳＭＤＲ１遺伝子の周囲のゲノム配列：ロカス（遺伝子座）ＨＳＭＤＲ１Ａ２９３２ ｂｐ　ＤＮＡ Ｐ−グリコプロティン用ヒトＭＤＲ１（多薬剤の抵抗性）遺伝子。
図３：第一回の重亜硫酸塩の後の、ＣＧ’ｓ、（プライマー１及び２によるＰＣＲ産物）の完全なメチル化の場合のための、前記鎖の配列。
図４：二回目の重亜硫酸塩処理後全てのＣＧ’ｓの完全なメチル化の場合のための下記の鎖の配列。
ａ）プライマー３及び４によるＰＣＲ産物（１５４ｂｐ）
ｂ）プライマー５及び６によるＰＣＲ産物（２０１０ｂｐ）
【００６５】
先行：
ａ）ヒトＤＮＡの未知のメチル化状態のＭｓｓ１による制限。
ｂ）アガロース法による重亜硫酸塩処理。
ｃ）１９３６塩基対長のＭＤＲ１断片製造用の重亜硫酸塩特殊ＰＣＲ。このとき、同時に、プライマー領分によりＰＣＲ産物に、合成のｇｃリッチの末端が生成する。
ｄ）アガロース不使用の２回目の重亜硫酸塩処理に続くＺｉｐＴｉｐ−精製。
ｅ）重亜硫酸塩処理二本鎖ＤＮＡのｇｃ領域のプライマーによる増幅。
【００６６】
実験に使用されたプライマー：
・重亜硫酸塩プライマー、産物の大きさ：２０１０塩基対長
１　ＭＤＲ１−Ｂ−Ｕ−ｇｃ　ｇｔｇａｔｃｃｃｇｇｇｃｇａｇｃｔｃｃｃＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧ
２　ＭＤＲ１−Ｂ−Ｌ−ｇｃ　ｇｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａｃＣＴＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＡＴ　　　　　　　　ＣＴＣＡＴＣＡＡＣ
＜−−ｇｃ領域−−−−−−−−−＞ ＜−遺伝子特殊性配列−−＞
・２回の重亜硫酸塩処理を施されるＤＮＡ用プライマー、ｇｃ領域がなく、産物の大きさ１５４ｂｐ。
３　ＭＤＲ１−２Ｂ−Ｕ３　　 ｔｔｔｔｔｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｔｔａｔｔａｔ
４　ＭＤＲ１−２Ｂ−Ｌ３　　 ａｔｔｔｔｔｔｔｔｔａｔｔａｔｔｔｔｔｔａａｔ
・２回の重亜硫酸塩処理を施されるＤＮＡ用プライマー、ｇｃ領域を有し、産物の大きさ２０１０ｂｐ。
５　ＭＤＲ１−２Ｂ−Ｌ−ｇｃ　　　 ＧＴＴＴＧＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＴＧＡＴ
６　ＭＤＲ１−２Ｂ−Ｕ−ｇｃ　　　 ａｔａａｔｃｃｃａａａｃａａａｃｔｃｃｃ
【００６７】
試験条件：
ヒトゲノムＤＮＡ（Ｆａ．プロメガ）の制限はＭｓｓ１（Ｆａ．ファーメンタス）で手引書に従がって行なった。分解されたＤＮＡの最初の重亜硫酸塩処理は従来公知のアガロース法で行なった。
【００６８】
ＤＮＡの増幅は下記の条件で行った（ＦＡ．Ｑｉａｇｅｎ）：
・１μｌ ＤＮＡ（１０ｎｇ亜硫酸塩処理ＤＮＡ）
・０．２μｌ Ｔａｑ（１ユニット）
・０．２μｌ ｄＮＴＰ （各２５ｍＭ） 最後に０．２５ｍＭ
・１μｌプライマー１（１２．５ ｐｍｏｌ／μｌ ）最後に０．５ｐｍｏｌ／μｌ
・１μｌプライマー２（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ ）最後に０．５ｐｍｏｌ／μｌ
・２．５μｌ １０倍ＰＣＲ緩衝液
・１９．１水（分子グレード）
【００６９】
下記のサイクルプログラムが使用された。
・最初の重亜硫酸塩処理後プライマー領域（プライマー１及び２）とのＰＣＲ：９５℃／２０：００；９５℃／１：００；５６℃／０：４５；７２℃／２：００；サイクルス：４０；７２℃／１０：００；４℃終り
・第二回の重亜硫酸塩処理後（プライマー３及び４）とのＰＣＲ：
９５℃／２０：００；９５℃／１：００；４０℃／０：４５；７２℃／１：００；サイクルス：４０；７２℃／１０：００；４℃終り
・第二回の重亜硫酸塩処理後（プライマー５及び５）とのＰＣＲ：
９５℃／２０：００；９５℃／１：００；５６℃／０：４５；７２℃／２：００；サイクルス：４０；７２℃／１０：００；４℃終り
【００７０】
製造されたＰＣＲ産物の第二回の重亜硫酸塩処理はアガロースなしで、溶液中で行った。塩及び化合物の除去のために、二回の重亜硫酸塩処理を施されたＤＮＡがＺｉｐＴｉｐョ法（ＦＡ：ミリポア）で精製された。そのとき、以下の処理がなされた：
・新しいピペットで、２モルのＴＥＡＡ緩衝液の１０μｌで３回洗浄する。
・３５μｌＰＣＲ産物
・２モルのＴＥＡＡの１０μｌで１回洗浄する。
・０．１モルのＴＥＡＡの１０μｌで３回洗浄する。
・水１０μｌで３回洗浄する。
・１００μｌシアン化メチルで産物を溶出する（新しいシアン化メチル１０μｌで１０回、チューブに溶出）。
・１００μｌ溶出物真空乾燥、水３０μｌ中で再懸濁、すぐにＰＣＲへ。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｇｃ領域で、一回の重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡからＰＣＲ産物を製造する概略図である。
ａ） ５’ ｇｔｇａｔｃｃｃｇｇｇｃｇａｇｃｔｃｃｃＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧ；
ｂ） ３’ｇｃｔｔｇｇｇｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａｃｃＴＴＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣ；
ｃ） 重亜硫酸塩処理済みＤＮＡ、単鎖。
【図２】ＨＳＭＤＲ１−遺伝子の周囲のゲノム配列：ロカス（遺伝子座）ＨＳＭＤＲ１Ａ２９３２ ｂｐ ＤＮＡ Ｐ−グリコプロティン用ヒトＭＤＲ１（多薬剤の抵抗性）遺伝子。
【図３】第一回の重亜硫酸塩の後の、ＣＧ’ｓ、（プライマー１及び２によるＰＣＲ産物）の完全なメチル化の場合のための、前記鎖の配列。
【図４】二回目の重亜硫酸塩処理後全てのＣＧ’ｓの完全なメチル化の場合のための鎖の配列。
ａ）プライマー３及び４によるＰＣＲ産物（１５４ｂｐ）
ｂ）プライマー５及び６によるＰＣＲ産物（２０１０ｂｐ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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