(57)【要約】非保護酵素を含む生体サンプルにおいてＨＩＶなどのエンベロープウイルスから逆転写酵素（ＲＴ）活性などの酵素活性を回収する方法が開示される。システイン修飾物質を用いてこの非保護酵素の活性を破壊した後に、エンベロープウイルス粒子を除去するか、または化学物質でシステイン修飾物質を不活性化する。次にウイルスエンベロープを溶解し、放出された酵素を回収する。また、エンベロープウイルスから酵素活性を回収する実験工程を実施するための文書および／またはデータを記録した説明書および数種の化学物質を含む市販パッケージも開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非保護酵素を含む生体サンプル中のエンベロープウイルスから酵素活性を回収する方法であって、
ａ）  生体サンプルをシステイン修飾物質とともにインキュベートして、ウイルスエンベロープ内のウイルス酵素活性を保持しながら非保護酵素の活性を破壊し、
ｂ1）  インキュベーション混合液からエンベロープウイルス粒子を取り出すか、または
ｂ2）  システイン修飾物質を細胞溶解からのウイルスエンベロープを保持する不活性物質で不活性化し、
ｃ）  ウイルスエンベロープを細胞溶解バッファーを用いて溶解してウイルス酵素を遊離させ、さらに
ｄ）  遊離したウイルス酵素を細胞溶解バッファーから回収する
工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
エンベロープウイルスがレトロウイルス科から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスが、レンチウイルス、ＨＴＬＶ／ＢＬＶウイルス、哺乳類Ｄ型レトロウイルス、および哺乳類Ｃ型レトロウイルスから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
レンチウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
回収されるウイルス酵素活性が逆転写酵素（ＲＴ）活性である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体サンプルが体液サンプルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
体液サンプルが、血液、血漿または血清サンプルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
システイン修飾物質が水溶性非親油性物質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
水溶性非親油性物質が、Ｎ−エチルマレイミド、チメロサール、ｐ−ヒドロキシマーキュリベンゾエート、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、２’−アミノエタンチオールスルホン酸２−アミノエチル、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、およびチオスルホン酸メチルメタンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
不活性化物質が弱還元剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
弱還元剤が、システイン、システアミン、メルカプトコハク酸、およびグルタチオンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生体サンプル中に存在するエンベロープウイルスから酵素活性を回収する実験工程を実施するための文書および／またはデータを記録したの説明書、ならびに
システイン修飾物質、および
必要に応じて、ウイルス結合マトリックス、または
細胞溶解からのウイルスエンベロープを保持しつつ、システイン修飾物質を不活性化する物質、および
細胞溶解バッファー
を含む、市販パッケージ。
【請求項１３】
システイン修飾物質が、Ｎ−エチルマレイミド、チメロサール、ｐ−ヒドロキシマーキュリベンゾエート、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、２’−アミノエタンチオールスルホン酸２−アミノエチル、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、およびチオスルホン酸メチルメタンから選択され、
ウイルス結合マトリックスが陰イオン交換マトリックスであり、
不活性化する物質がシステイン、システアミン、メルカプトコハク酸、およびグルタチオンからなる群から選択され、かつ、
細胞溶解バッファーが界面活性剤を含む酵素アッセイ適合バッファーである、請求項１２に記載の市販パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明はエンベロープウイルスから酵素活性を回収する方法、すなわちエンベロープウイルスにパッケージングされている酵素の測定法に関する。この方法は詳しくはエンベロープウイルスの他に、非保護酵素を含む生体サンプル用に開発されている。
【０００２】
背景技術
従来からのこの分野の問題の一例は細胞抽出液または細胞培養液においてレトロウイルス逆転写酵素（ＲＴ）を同定する際に直面するものである。逆転写の際、ＲＴはウイルスＲＮＡのＤＮＡコピーを作る。従来のＲＮＡ活性アッセイは人工的な鋳型−プライマー構築とヌクレオチド基質としてのトリチウム化デオキシヌクレオチド三リン酸を用いることで行われる。この鋳型／プライマー対でポリ（ｒＡ）／オリゴ（ｄＴ）は最も効果的で、ＨＩＶならびにその他のレトロウイルスＲＴ（ボルティモア−７１、Lee et al−８７)の同定に最もよく用いられている組合せである。早くから、いくつかの細胞ＤＮＡ重合酵素が測定可能な産生量で生じることでこの種のアッセイ系の結果を不明瞭にすることが分かっている。
【０００３】
真核細胞では少なくとも９種の異なるＤＮＡポリメラーゼが確認されている。ポリメラーゼαは細胞分裂の際のＤＮＡ複製をつかさどっていると考えられ、βはＤＮＡ修復に関与する主要なポリメラーゼであると考えられ、λはミトコンドリアのＤＮＡ剛性をつかさどっている。これらの細胞内ポリメラーゼの各々は異なる形態で、種々の会合タンパク質とともに存在している。これらの酵素特性はその分子形態と細胞種起源の双方において異なる（総説としてはHubscher et al 2000を参照）。さらに、細胞は感染ウイルスまたはウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする内在ウイルス遺伝子に由来する酵素を含み得る。細胞内ＤＮＡポリメラーゼのうちＤＮＡポリメラーゼαは鋳型としてｐｒＡを用いる傾向が最も小さいが、効率的にｐｒＡをコピーできるこの酵素のある分子種が存在する(Goulian & Grimm 1990, Yoshida et al 1981)。
【０００４】
事実上、種々のポリメラーゼがレトロウイルスＲＴの定量の際に特有の問題を呈する。この問題を回避するための多くの方法が文献に見出せる。最も明解なアプローチは細胞タンパク質からウイルスを分離することである。この点で、遠心分離または特異的受容体もしくは抗体へのビリオンの吸着など様々な方法が用いられている。多量の細胞成分と微量のウイルスを含有する材料を精製する場合に起こる一般的な問題は、少量の細胞内ポリメラーゼが同時に精製されるということが避けられないということである。さらにまた、実施上の観点から、比較的煩雑な分離手順で多量のサンプルを処理するというのは魅力的なことではない。
【０００５】
もう一つのアプローチとして、検出から多少なりとも細胞内ポリメラーゼ、すなわちλポリメラーゼを排除するアイソザイム特異的酵素アッセイ条件を設計するものがある。これは組成物、選択的金属イオンまたは鋳型／プライマー対を用いることにより達成できる。例えばポリ(２’−Ｏ−メチル−ｒＣ)ｎオリゴ(ｄＧ)１２−１８はレトロウイルスＲＴの極めて特異的な基質であることが知られている。しかしながらこの種の方法によって達成される高い特異性も通常、それに応じて反応速度が低下すること、また、その後測定をしようとする酵素に対しての検出感度が低下することが障害となる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは最近、感染者から採取した血漿においてＨＩＶ  ＲＴを定量する方法を開発した。この方法は固定化したイオン交換樹脂を用いてウイルスをゲルに結合させることに基づくものである。抗体および妨害物質は洗浄によって除去し、酵素活性のあるＲＴを非イオン界面活性剤を用い固定化したウイルスを溶解させることで回収する(Gatu et al 2000)。最後に回収したＲＴの量は、ｏｄＴでプライミングした固定化ｐｒＡの使用に基づく高感度ＲＴアッセイで定量する。健康な血液ドナーからの血漿をこの系で処理したところ、精製画分中に少量のＲＴ活性が見られた。
さらに検討したところ、健康な人からの粗ＥＤＴＡ血漿は比較的多量のこの活性を含んでおり、同種のサンプルのリンパ球画分からの抽出物でも豊富であることが明らかとなった。まだ分類されていないこの酵素のいくつかの特性を表１に示す。本発明者らの分離系から「ウイルス固定化」の後に回収された活性の量は血漿中の前活性の千分の１未満であったが、少量のＨＩＶ  ＲＴの検出を著しく不明瞭にするには十分なものであった。
【発明の具体的説明】
【０００７】
本発明は上記に開示した特定の問題を解決するだけでなく、エンベロープウイルスに含まれる総ての酵素の検出全般に適用できる。エンベロープウイルス科およびその科のうちのいくつかのヒト種の例としては、ポックスウイルス科、例えば、ワクシニアまたはスモールポックス；イリドウイルス科；ヘルペスウイルス科、例えば、単純ヘルペス、水痘ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン・バーウイルス；トガウイルス科、例えば、黄熱病ウイルス(Yellow fewer virus)、thick-borne 脳炎ウイルス、風疹ウイルスおよび熱帯脳炎ウイルス；コロナウイルス科、例えば、ヒトコロナウイルス(Human coronovirus)；パラミクソウイルス、例えば、パラインフルエンザ、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルスおよびＲＳウイルス(respiratory syncytial virus)；ラブドウイルス科、例えば、水疱性口内炎ウイルスおよび狂犬病ウイルス；フィロウイルス科、例えば、マールブルグウイルスおよびエボラウイルス；オルトミクソウイルス科、例えば、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス；ブウンヤウイルス科、例えば、Ｂｗａｍｂａウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、サショウバエ熱ウイルスおよびリフトバレー熱ウイルス；アレナウイルス科、例えば、ＬＣＭウイルス、ラッサウイルスおよびジャニーウイルス(Juni virus)；ヘプナドナウイルス科、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス；ならびにレトロウイルス科、例えばＨＴＬＶおよびＨＩＶが挙げられる。
【０００８】
本発明の方法は非保護可溶性酵素、すなわち遊離酵素や、例えばタンパク質、細胞成分またはオルガネラと会合しているがウイルスエンベロープによって保護されていない酵素の活性を破壊するためにタンパク質修飾化学物質を用いることに基づくものである。化学物質がウイルスエンベロープを透過する能力はその疎水性に関連している。ウイルスエンベロープが選択された化学物質の作用に対する保護を与えているとすれば、反応性化学物質を除去するか、あるいは不活性化し、ビリオンを溶解し、放出されたウイルス酵素の活性を定量することができる。タンパク質修飾に適用できる多少なりとも部位特異的な試薬の宿主が存在する（総説としてはMeans & Feeney 1990参照）。
【０００９】
本発明の方法では、システイン修飾物質が非保護酵素活性を破壊するタンパク質修飾化学物質として選択された。Ｎ−エチルマレイミドに対する感受性は細胞内ＤＮＡポリメラーゼの分類に広く用いられてきた。この薬剤は通常反応混合物に直接加え、ＤＮＡポリメラーゼβ以外の総ての哺乳類ＤＮＡポリメラーゼを有効に「阻害」する。種々のレトロウイルスＲＴの共通アミノ酸配列におけるシステインの量は著しく異なり、すなわちＨＩＶ１  ＲＴではわずか２、ＨＩＶ２では３、マウス白血病ウイルス（ＭＵＬＶ）では８であり、一方、鳥類骨髄芽球症／肉腫ウイルスではβサブユニットに１２のシステインを有する。従ってウイルスＲＴのシステイン修飾に対する感受性は著しく異なると考えられる。ＨＩＶ  ＲＴにおけるシステイン残基の修飾の作用が研究されており、少なくともＨＩＶ１およびＨＩＶ２双方のＲＴのＤＮＡポリメラーゼ活性がまさに耐性であった(Hizi et al 1992)。しかしながら、種々のＨＩＶ系統で大きなバリエーションが報告されていることを考慮すれば、これは総てのＨＩＶ単離物についてそうであるとは考えにくい。
【００１０】
より詳しくは、本発明は、非保護酵素を含む生体サンプル中のエンベロープウイルスから酵素活性を回収する方法であって、
ａ）  生体サンプルをシステイン修飾物質とともにインキュベートして、ウイルスエンベロープ内のウイルス酵素活性を保持しながら非保護酵素の活性を破壊し、
ｂ1）  インキュベーション混合液からエンベロープウイルス粒子を取り出すか、または
ｂ2）  システイン修飾物質を細胞溶解からのウイルスエンベロープを保持する不活性物質で不活性化し、
ｃ）  ウイルスエンベロープを細胞溶解バッファーを用いて溶解してウイルス酵素を遊離させ、さらに
ｄ）  遊離したウイルス酵素を細胞溶解バッファーから回収する
工程を含んでなる方法に向けられる。
本発明の方法のある具体例では、エンベロープウイルスはレトロウイルス科から選択され、詳しくはレンチウイルス、ＨＴＬＶ／ＢＬＶウイルス、哺乳類Ｄ型レトロウイルス、および哺乳類Ｃ型レトロウイルスから選択される。
【００１１】
現在のところ好ましいレンチウイルスの具体例では、レンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。
【００１２】
もう一つの具体例では、回収される酵素活性は逆転写酵素（ＲＴ）活性である。
【００１３】
本発明の方法のさらにもう一つの具体例では、生体サンプルは体液サンプルである。体液の例としては尿、唾液、脳骨髄液、滑液、胸膜液、腹水、特には血液、血漿および血清がある。
【００１４】
本発明の方法のさらなる具体例では、システイン修飾物質はＮ−エチルマレミド(ethylmalemide)、チメロサール、ｐ−ヒドロキシマーキュリベンゾエート、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、２’−アミノエタンチオールスルホン酸２−アミノエチル、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸、およびチオスルホン酸メチルメタンなどの水溶性非親油性物質である。
【００１５】
さらにもう一つの具体例では、不活性化物質はシステイン、システアミン、メルカプトコハク酸、およびグルタチオンなどの低分子量の弱還元剤である。
【００１６】
本発明はまた、生体サンプル中に存在するエンベロープウイルスから酵素活性を回収する実験工程を実施するための文書および／またはデータを記録した説明書(carrier instruction)、ならびにＮ−エチルマレイミド、酢酸フェニル水銀、チメロサール、ｐ−ヒドロキシマーキュリベンゾエート、または５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）などのシステイン修飾物質を含む市販パッケージに向けられる。必要に応じてこのパッケージはまた、陰イオン交換マトリックスなどのウイルス結合マトリックス、またはシステイン、システアミン、メルカプトコハク酸、およびグルタチオンなど、溶解からのウイルスエンベロープを保持しつつシステイン修飾物質を不活性化する物質、ならびに界面活性剤を含む酵素アッセイ適合バッファーなどに細胞溶解バッファーを含んでもよい。
【００１７】
以下、実験の概説、実施例および図面により本発明を説明するが、本発明は開示される具体例に限定されるものではないと理解すべきである。
【００１８】
実験の概説
以下の手順は本発明の説明を意図するものであって、その使用を限定するものではない。本発明の異なる２つの具体例は異なる目的のために用いられる。プロトコールＩ）は主としてウイルス酵素活性の測定前に除去しなければならない酵素活性遮断抗体を含むサンプル（すなわち、血清変換後のＨＩＶ患者の血漿）に対して用いられる。以下のプロトコール中のポリメラーゼ不活性化工程は個別のインキュベーションで行う。あるいはまた、ビリオンがゲルに結合する場合には同じ工程の中で行うこともできる。これは、システイン修飾物質を直接血漿／ゲルスラリー混合物に加えるか、またはまず上記物質をゲルに結合した後に血漿サンプルを加えるかのいずれかで行う。必要な物質濃度は手法によって異なる。プロトコールＩＩ）は酵素遮断抗体などの妨害因子を実質的に含まないサンプル、例えばＨＩＶ急性期の血清に使用できる。
【００１９】
Ｉ）  可溶性細胞酵素の破壊、その後のミニカラムからのウイルスＲＴの単離に基づく、ＲＴ遮断抗体を含む材料からレトロウイルスＲＴを測定するプロトコール
１）  用いる５ｍｌ容のプラスチック試験管にラベルを付け、ナルゲンボックスに入れる。ラベルを付けた各試験管にサンプル（例えば、ＨＩＶ感染者からのＥＤＴＡ血漿）１ｍｌを加える。バッファー液中６６ｍＭの５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）１００μｌを加え、ボルテックスにかけ、それらのサンプルを室温で１時間インキュベートする。
【００２０】
この手順でビリオン内に含まれる酵素を完全な形に留めたまま、遊離した血漿酵素の活性を破壊する。次にこれらのビリオンを５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、酵素活性遮断抗体およびその他ウイルスＲＴの定量を妨害する可能性のある物質からいくつかの分離法により精製する。以下のプロトコールはFractogel（商標）EMD TMAE Hicapゲルの使用をもとにしたものである。
【００２１】
２）  分離ゲルを注意深く懸濁させ、１５００μｌのゲルスラリーを各サンプル前処理試験管に移す。
【００２２】
３）  これらのサンプルをゲルスラリーとともに室温で１時間、オービタルシェーカーに試験管を寝かせてインキュベートする。
【００２３】
４）  必要な数の１５ｍｌプラスチックミニカラムにラベルを付け、分析するサンプルを識別する。カラム洗浄装置、例えばSupelco Visiprep固相抽出バキュームマニホールドにカラムを設置する。結合試験管中の内容物を対応するカラムに移す。ゲルを均一に分布させるため、移行前に試験管を軽くボルテックスにかける。
【００２４】
５）  総てのカラムが充填されたところで、減圧をかけ、ゲルを吸引乾燥させる。バキュームを止め、各カラムに９ｍｌのバッファーＡを満たすことで洗浄を開始する。総てのカラムが充填されたところで、減圧をかけ、ゲルを吸引乾燥させる。
【００２５】
６）  工程５をさらに３回繰り返し、計４回洗浄する。各洗浄の後にゲルを吸引乾燥させる。４回洗浄した後ゲルを吸引乾燥させた後、バキュームを止め、工程７に進む。
この洗浄工程で、この系から結合していないＲＴ遮断抗体と５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を除去する。
【００２６】
７）  総ての乾燥ゲルに９ｍｌのコンディショニングバッファー（Ｂ）を加える。減圧をかけ、ゲルを吸引乾燥させる。
【００２７】
８）  工程７を繰り返す。バキュームは停止前に総てのゲルから総てのコンディショニングバッファー（Ｂ）が除去されているように調節する。
【００２８】
９）  カラム洗浄装置の上部を持ち上げ、清浄な容器にラベルを付けた試験管とともに試験管ホルダーを設置し、装置の上部を再び閉じる。細い管が各カラムから対応する試験管中へ降りるように調節する。
【００２９】
１０）  各カラムに３００μｌ細胞溶解バッファー（Ｃ）を加える。このバッファーは５分間カラム内で静置させる。その後、減圧をゆっくりかけ、ゲルを吸引乾燥させる。これにより各試験管につきおよそ３００μｌのウイルス溶解液が得られる。
工程１０からの細胞溶解液において回収されるＲＴ活性はＲＴ遮断抗体および細胞内ポリメラーゼ活性を実質的に含まず、高感度ＲＴ活性アッセイ、例えばEkstrand et al 1996が記載した方法に基づくCavidi HS-kit Lenti RTにより定量することができる。
注：  システイン修飾物質、例えば野生型ＨＩＶ１  ＲＴに感受性のないＲＴ酵素は必要に応じて５ｍＭまでの５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）の存在下でアッセイすることができる。
【００３０】
一方、ＭｕＬＶ  ＲＴおよびある種の治療耐性ＨＩＶ１系統由来のＲＴなどの感受性酵素では、溶解バッファーにメルカプト還元剤、例えばシステインまたはシステアミンを添加する必要がある。
【００３１】
ＩＩ）  可溶性細胞内酵素の不活性化、その後の５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）の不活性化に基づく、酵素遮断抗体からを実施的に含まないサンプル、例えば、ＨＩＶ急性期血漿またはウイルス培養上清においてＲＴ活性を測定するプロトコール
１）  ２００μｌのサンプル（例えば、ＨＩＶ急性期血漿）にバッファー液中３３ｍＭの５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）２０μｌを混合する。これらのサンプルをオービタルシェーカーにて室温で１時間インキュベートする。
【００３２】
２）  メルカプト還元剤、例えば水中３３ｍＭのシステアミン２０μｌを加え、これらのサンプルをオービタルシェーカーにて室温でさらに３０分間インキュベートする。
【００３３】
３）  界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００を含有するＲＴアッセイ適合バッファーでサンプルの４倍希釈シリーズを作製する。ここでビリオンを溶解し、各希釈率におけるＲＴ活性を高感度ＲＴアッセイ、例えばCavidi HS-kit Lenti RTを用いて測定することができる。
【００３４】
４）  もとのサンプル中のＲＴ活性の量をその希釈範囲の値から算出する。なお、サンプル希釈率と生じた生成物の量の間には直線的関係が存在する。
【実施例】
【００３５】
材料
分離ゲル：  例えば、２００ｍＭ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）（ＭＥＳ）ｐＨ５．４，２７５ｍＭヨウ化カリウムおよびヘパリン８０ＩＵ／ｍｌ中のFractogel(商標)EMD TMAEまたは Fractogel(商標)EMD TMAE Hicap。
ミニカラム：  例えば、Biorad Poly-Prep(商標)(7311553)。
ミニカラム洗浄装置：  例えば、Supelco Visiprep固相抽出バキュームマニホールド。
プラスチック試験管：  例えば、Nunc ４．５ｍｌ低温チューブ。
システイン修飾剤：  例えば、０．４Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ６．８）で緩衝させた水中６６ｍＭの５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）。
弱メルカプト還元剤：  例えば、水中３３ｍＭのシステアミン。
洗浄バッファー（Ａ）：  ２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０、５００ｍＭ酢酸カリウム（ＫＡｃ）。
コンディショニングバッファー（Ｂ）：  ＲＴアッセイ適合バッファー、例えば、１０ｍＭ （Ｎ−（２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（Hepes）ｐＨ７．６、２５ｍＭ  ＫＡｃ、２０ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．２ｍメチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２ｍＭスペルミンおよび０．５ｍｇ／ｍｌ熱不活性化ウシ血清アルブミン。
細胞溶解バッファー（Ｃ）：  界面活性剤、例えば１％ｔ−オクトフェノキシポリエトキシエタノール（トリトンＸ−１００）、酵素安定剤、例えば１３ｎｇ／ｍｌオリゴ（ｄＴ２２）、０．０２５ｍｇ／ｍｌ硫酸デキストランおよびコンディショニングバッファー（Ｂ）と同様の成分を含有するＲＴアッセイ適合バッファー。
メルカプト還元剤：  例えば、ＳＦ酸化／修飾に感受性があるＲＴでウイルスを処理する場合には必要に応じて０．２ｍＭシステアミンを加えてもよい。
【００３６】
例１：  ヒト血漿由来ＤＮＡポリメラーゼのいくつかの特性
プライマーを含まないＲＴ反応混合物に対する示された成分の添加の作用（Cavidi HS kit Lenti RT)を検討した。２人の健康な血液ドナーからのＥＤＴＡ血漿（１μｌ／アッセイ）、細胞培養起源の組換えＨＩＶ１ ＲＴまたはＦＩＶ ＲＴを酵素として用いた。結果は表１に示す。
【００３７】
ヒト血漿ポリメラーゼ活性はプライマーに依存し、鋳型に相補的なｄｄＮＴＰによる阻害に感受性があるが、ピロリン酸類似体には感受性がなかった。
【００３８】
例２：  種々のシステイン修飾剤のヒト血漿ポリメラーゼ活性破壊能
ヒトＥＤＴＡ血漿サンプル５０μｌに各物質の一連の希釈液からの５０μｌサンプルを混合した。これらのサンプルをオービタルシェーカーにて１時間インキュベートした。次に各サンプルを２０倍希釈し、残留するポリメラーゼ活性をCavidi(商標) HS-kit Lenti RTで測定した。各物質濃度におけるポリメラーゼ活性を、修飾物質の不在下でインキュベートした血漿からなる対照に対するパーセンテージとして換算し、物質濃度に対してプロットし、そのプロットから５０％活性低下に要される物質濃度を求めた。
【００３９】
内在性ＲＴ活性を含まないヒト血漿中のＨＩＶウイルスを、「ＲＴ遮断抗体を含む材料からレトロウイルスＲＴを測定するプロトコール」に従い、示された物質５ｍＭで処理した。ＨＩＶ ＲＴの回収量はCavidi(商標) HS kit Lenti RTで測定した。結果は表２に示す。
【００４０】
例３：  血清／血漿中の種々のポリメラーゼに対するチメロサールとのインキュベーションの作用
細胞培養に由来する組換え野生型ＨＩＶ１ ＲＴ（黒ぬり四角形）、ネビラピン耐性ＨＩＶ１変異体（Ｙ１８１Ｃ）（白ぬき菱形）、ヒツジ肺癌由来Jaagsiekteウイルス（ＪＳＶ）ＲＴ（黒ぬり三角形）、ネコ白血病ウイルス（ＦＩＶ）ＲＴ（白ぬき丸形）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＲＴ（黒ぬり菱形）およびブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）ＲＴ（黒ぬり丸形）を熱不活性化ウシ胎児血清で希釈した。これら種々のウイルス酵素調製物および健康な血液ドナーからのＥＤＴＡ血漿サンプル（白ぬき四角形）を示されたチメロサール濃度で室温（２２℃）にて６０分間インキュベートした。これらのサンプルを総てＲＴアッセイ適合バッファーで１００倍希釈した後、各サンプルに残留するＲＴ活性を測定した。各々測定したＲＴの種類に適した３種のＲＴアッセイを用いた：ＨＩＶ１、ＪＳＶ、およびＦＩＶ  ＲＴはＣａｖｉｄｉ(商標) HS kit Lenti RTで測定した、ＢＬＶ ＲＴはCavidi(商標) HS kit HTLV RTで測定し、ＰＥＲＶおよびヒト血漿ＲＴはＣａｖｉｄｉ(商標) HS kit Mn2+RTで測定した。結果は図１のグラフで示す。
【００４１】
検討した７種の酵素はチメロサール処理に対して著しく異なる感受性を示した。ＨＩＶ１ Ｙ１８１Ｃ変異体ＲＴおよびＦＩＶ ＲＴは最も感受性の高い酵素であった。有意な酵素破壊に要されるチメロサール濃度はヒト血漿ＲＴ、ＢＬＶ ＲＴおよびＰＥＲＶ ＲＴでは上昇した。二種の酵素、野生型ＨＩＶ１ ＲＴとＪＳＶ ＲＴは完全に耐性であった。
【００４２】
例４：  ＦＩＶ添加血漿からのウイルスＲＴ活性の回収および内在性ＲＴ活性の選択的破壊
リンパ球が破壊された健康な血液ドナーからのＥＤＴＡ血漿不活性化したウシ胎児血清で希釈したＦＩＶ（血漿ＲＴ活性が総て排除）を室温で１時間、示された濃度のＡ）５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、Ｂ）チメロサールとともにインキュベートした。これらのサンプルを「ＲＴ遮断抗体を含む材料からレトロウイルスＲＴを測定するプロトコール」に従って分離した。回収されたＲＴ活性はＲＴアッセイ(Cavidi HS-kit Lenti RT)で測定した。各活性を、メルカプト還元剤を用いずにインキュベートした同様の調製物からなる対照を同様に処理したものに対するパーセンテージとして換算した。この対照からのＦＩＶ  ＲＴの回収率はもとのサンプルの活性の７４％であり、ヒト血漿ＲＴに対する相当値は０．０１５％であった。図２を参照。なおここで、左の棒は血液ドナーの血漿であり、右の棒はウシ胎児血清中のＦＩＶウイルスである。
【００４３】
０．４ｍＭを超える濃度の５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）でインキュベートすると、ＦＩＶビリオンと会合したｒｔの回収率を低下させることなくヒト血漿ＲＴ活性が完全に排除された。
【００４４】
血漿ＲＴに対して同等の効果を達成するにはより高い濃度のチメロサール（＞３ｍＭ）を要した。この濃度範囲のチメロサールはＦＩＶ ＲＴの回収率を著しく低下させた。
【００４５】
例５：  健康な血液ドナーからの血漿サンプル中のポリメラーゼ活性の除去
２１人の健康な血液ドナーからのＥＤＴＡ血漿サンプル１ｍｌの２セットを「ＲＴ遮断抗体を含む材料からレトロウイルスＲＴを測定するプロトコール」に従って処理した。一方のサンプルセットでは５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）処理（工程Ａ）を行わず、他方には含めた。各サンプルから回収されたＲＴ活性の量はCavidi(商標) HS kit Lenti RTを用いた一晩のＲＴアッセイで測定した。図３を参照。なおここで、左側の群は本プロトコールを経た非処理サンプルを示し、右側の群は処理後にプロトコールを経た同様のサンプルである。分離対照、例えばサンプル適用バッファーの分離では、２６２〜１１００ｒｆｕ／時の間の値が得られた。蛍光計の検出範囲はおよそ１８０００００ｒｆｕまでであった。
【００４６】
例６：  本発明に従ってヒト血漿から回収されたＨＩＶ  ＲＴとＲＮＡ  ＰＣＲで測定されたウイルスＲＮＡの間の相関
ＨＩＶ感染者からのＥＤＴＡ血漿サンプル１ｍｌを「ＲＴ遮断抗体を含む材料からレトロウイルスＲＴを測定するプロトコール」に従って処理し、各サンプルから回収されたＲＴ活性の量をCavidi(商標) HS kit Lenti RTを用いた一晩のＲＴアッセイで測定した。得られたＲＴ活性は標準曲線に従い、ｐｇ ＨＩＶ１ ＲＴとして換算した。各サンプルのＨＩＶ１ ＲＮＡの量は標準的なＨＩＶ１ ＲＮＡ ＰＣＲ(Roche, Amplicore)によって測定した。プロットは図４に示すが、ＰＣＲ値＞５００コピー／ｍｌのサンプルに限定されている。
【００４７】
本発明に従って回収された血漿ＲＴの量とＰＣＲで測定されたＨＩＶ  ＲＮＡの量の間には強い相関が見られた（ｒ＝０．９３、ｎ＝３３、ｐ＜＜０．００１）。
【００４８】
例７：  ＨＩＶ感染患者からの血漿サンプルを処理する別のプロトコール
「ＲＴ遮断抗体を含む材料からレトロウイルスＲＴを測定するプロトコール」のポリメラーゼ不活性化工程を次の４種類の方法で行った：Ａ）血漿および物質の個別インキュベーション、Ｂ）ビリオンがゲルに結合するのと同時のインキュベーション、Ｃ）保存中にゲルスラリーに物質を含め、この前処理ゲルをＲＴ単離に用いる、Ｄ）まず物質をゲルに結合させ、結合していない物質を洗浄によって除去し、このようにして処理したゲルをプロトコールに従って用いる。結果は図５に示す。血漿ＲＴ活性（黒ぬり菱形）、ＨＩＶ ＲＴ活性（黒ぬり丸形）。
【００４９】
４種類の別法は総て有用である、すなわち、ＨＩＶ ＲＴ活性に影響を及ぼさずに血漿ＲＴ活性が不活性化されることが分かったが、ヒト血漿ポリメラーゼ活性の定量的排除に要される物質の量は様々であった。
【００５０】
例８：  種々のシステイン修飾剤による処理後の血漿ポリメラーゼ活性の復活
１セットのヒト血漿サンプル（水中６０％の血漿）をまず３ｍＭの示されたシステイン修飾物質または水（対照）とともに室温で１時間インキュベートした。次に反応性がある可能性のある物質を５段階の一連の希釈液として加え、サンプルをさらに１時間インキュベートした。最後に各サンプルを１：２０希釈し、残留するＲＴ活性をCavidi(商標) HS kit Lenti RTで測定した。サンプルインキュベーションとＲＴアッセイの間の物質濃度の総低下は２００倍であった。回収されたＲＴ活性は、両インキュベーション工程において添加を行わずにインキュベートした血漿からなる対照の活性に対するパーセンテージとして換算した。結果は表３に示す。
【００５１】
試験した３種のシステイン修飾剤は総て血漿ＲＴ活性を完全に不活性化する能力を有していた。しかし、種々の薬剤で処理したポリメラーゼ活性の再活性化に要する条件には明らかな違いがあった。チメロサールで処理した酵素は極めて容易に再活性化したが、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）またはクロラミンＴで処理した酵素は活性化に強い還元性の低分子量チオールを要した。
【００５２】
表３からまた、ポリメラーゼ修飾剤を不活性化するのにあまり強力なアンタゴニスト物質を用いる必要はないことも明らかである。血漿ポリメラーゼを再活性化させるリスクがある。
【００５３】
例９：  精製を行わず高い内在性ＲＴ活性を有するサンプルにおけるウイルスＲＴの定量
Ａ）健康な血液ドナーからのＥＤＴＡ血漿、Ｂ）不活性化したＦＣＳ（ＲＴ活性を除去）で希釈したＦＩＶウイルス、またはＣ）５％  ＦＣＳを含むダルベッコの最小必須培地を１：１希釈し、示された濃度の５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）とともに室温（２０℃）で１時間インキュベートした。次に各サンプルに対してコンディショニングバッファー（Ｂ）で４段階の一連の希釈を行った。その後総てのサンプルにシステアミンを最終濃度２０ｍＭまで加え、このセットを室温でさらに１時間インキュベートした。次に各サンプルのＲＴ活性をCavidi(商標) HS kit Lenti RTで測定した。反応混合物１３５μｌに各サンプル１５μｌを加え、アッセイにおけるシステアミンの最終濃度を２ｍＭとした。ＲＴアッセイ当たり７．５、１．９および０．５μｌサンプルに相当する最初の３つの希釈液において回収されたＲＴ活性を物質の不在下でインキュベートした対照に対するパーセンテージとして換算し、その物質濃度に対してプロットした。図６を参照。
【００５４】
ヒト血漿ポリメラーゼ活性は０．４７ｍＭを超える濃度の５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）とともにインキュベートした後に排除された。ＦＩＶウイルスＲＴの回収率は１．８８ｍＭより低い物質濃度でのインキュベーションによっては悪影響を受けなかった。このように２ｍＭ前後の濃度範囲の５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）とともにインキュベーションした後の粗サンプルにおいてＦＩＶ ＲＴを選択的に測定することができる。
【００５５】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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参照文献
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】血清／血漿中の種々のポリメラーゼの活性に対するチメロサールとのプレインキュベーションの作用を示す。組換え野生型ＨＩＶ１ ＲＴ（黒ぬり四角形）、ＨＩＶ１変異体（Ｙ１８１Ｃ）由来の組換えＲＴ（白ぬき菱形）、JaagsiekteウイルスＲＴ（黒ぬり三角形）、ＦＩＶ ＲＴ（白ぬき丸形）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）ＲＴ（黒ぬり菱形）、ブタ内在性レセプタートトウイルス（ＰＥＲＶ）ＲＴ（黒ぬり丸形）および健康な血液ドナーからの血漿サンプル（白ぬき四角形）。
【図２】ＦＩＶ添加血漿由来のウイルスＲＴ活性の回収および内在性ＲＴ活性の選択的破壊を表すグラフＡおよびＢを示す。リンパ球が破壊された健康な血液ドナーからのＥＤＴＡ血漿（左の棒）および不活性化したウシ胎児血清で希釈したＦＩＶの（右の棒）、Ａ）５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、およびＢ）チメロサールで不活性化したもの。物質濃度に対して回収されたＲＴ活性をプロットした。
【図３】健康なヒトドナーからの血漿サンプルにおけるポリメラーゼ活性の排除を示すグラフである。
【図４】本発明に従ってヒト血漿から回収されたＨＩＶ ＲＴとＲＮＡ ＰＣＲで測定されたウイルスＲＮＡの間の相関を示すグラフである。
【図５】ＨＩＶ感染患者からの血漿サンプル処理の別のプロトコールを示すグラフである。プロトコールＩのポリメラーゼ不活性化工程を、Ａ）個別のインキュベーションで行った；Ｂ）ビリオンがゲルに結合するのと同じ工程中に行った；Ｃ）ゲルを物質とともに保存したこと以外はＢと同様にして行った；Ｄ）使用前にゲルを洗浄したこと以外はＣと同様にして行った。血漿ＲＴ活性（黒ぬり菱形）、ＨＩＶ ＲＴ活性（黒ぬり丸形）。
【図６】精製を行わず高い内在性ＲＴ活性を有するサンプルにおけるウイルスＲＴの定量を示す図である。健康な血液ドナーからのＥＤＴＡ血漿（Ａ）、不活性化ＦＣＳ中（Ｂ）および細胞培養培地中（Ｃ）のＦＩＶウイルス。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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