(57)【要約】本発明は、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質を産生することができる変異原核細胞、特にＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、前記タンパク質を産生し、そして精製する方法及び本発明に従う方法によって得られるタンパク質、に関する。本発明はまた、異なる分野、例えば治療、化粧品、診断又は有機化合物の生合成若しくは生分解、における前記細胞及びタンパク質の適用を網羅する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質を産生する能力を細胞に獲得せしめる方法であって、以下の段階：
ａ）前記細胞の増殖に必要なタンパク質であって、変異される遺伝子から合成されてもはや機能的でなくなるタンパク質をコードする遺伝子の標的コドンにおける少なくとも１つのミスセンス変異の誘導による、前記細胞の形質転換、
ｂ）その様に変異した前記タンパク質の機能性の損失を補うための栄養素を含む培養液中での、段階ａ）で得られた細胞の任意な培養、
ｃ）前記標的コドンによってコードされるアミノ酸を含む培養液中での、段階ａ）又はｂ）で得られた細胞の培養、
を含んで成る方法。
【請求項２】
段階ｃ）の培養液が、前記の変異タンパク質の機能性が失われたことによって必要とされる栄養素を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞の培養段階ｃ）が、前記標的コドンによってコードされるアミノ酸を含む培養液中での前記細胞の一連の細胞培養を含んで成り、一連の前記培養のそれぞれが、安定増殖期の獲得、それに続く、得られた細胞の洗浄、によってもたらされ、一連の培養の回数が、前記変異遺伝子のミスセンス変異を増大する変異の抑制を増大する変異を選択せしめるのに十分であることを特徴とする、請求項１及び２に記載の方法。
【請求項４】
ミスセンス変異が、少なくとも１／１０１５の生物の次数の、非常に低い頻度でしか自然に逆転しないミスセンス変異から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ミスセンス変異が、前記細胞の増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子の標的コドンを、当該標的コドンと比較して少なくとも２つの塩基、好ましくは３つの塩基の変化を示すコドンへと変換することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
標的コドンが立体的なかさの低いアミノ酸をコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
標的コドンが両親媒性のアミノ酸をコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
標的コドンが、ミスセンス変異によってコードされるアミノ酸の立体的なかさよりも低いか、若しくはそれとほぼ等しい立体的なかさを有するアミノ酸をコードすることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標的コドンがシステインをコードすることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ミスセンス変異によってコードされるアミノ酸がバリン又はイソロイシンであることを特徴とする、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の形質転換における段階ａ）が、前記ミスセンス変異を含んで成る細胞の増殖に必要なタンパク質をコードする前記遺伝子の配列を含んで成るベクターによって実施されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質を産生することができる細胞を選択する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法の段階ａ）、そして任意に段階ｂ）及びｃ）、並びに段階ｃ）で増殖しうる細胞の選択、を含んで成る方法。
【請求項１４】
前記標的コドンによってコードされる前記アミノ酸を含む培養液中で、段階ｃ）で得られた細胞を培養する段階ｄ）を更に含み、前記アミノ酸の濃度が段階ｃ）で使用される前記アミノ酸の濃度よりもおそらく高く、そして段階ｄ）で使用される前記アミノ酸の濃度に感受性のある細胞が選択されること、を特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
選択される細胞の前記ミスセンス変異によってコードされるアミノ酸を認識するアミノアシルｔＲＮＡが、その関連するｔＲＮＡの１つを、非慣用アミノ酸又は前記ミスセンス変異によってコードされる前記アミノ酸以外のアミノ酸と結合させることができることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の細胞の選択方法。
【請求項１６】
前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子の核酸配列が、相当する野生型遺伝子の配列と比較して、少なくとも１つの変異を含んで成ることを特徴とする、請求項１５に記載の細胞の選択方法。
【請求項１７】
前記変異が遺伝子組換え技術によって導入されたものではないことを特徴とする、請求項１６に記載の細胞の選択方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって得られる細胞。
【請求項１９】
アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質を産生することができる単離された細胞であって、関連するｔＲＮＡの１つを非慣用アミノ酸又は所定のアミノ酸以外のアミノ酸と結合することができる所定のアミノ酸を認識するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を含み、そして前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子の核酸配列が、相当する野生型と比較して少なくとも１つの変異を含み、前記変異が遺伝子組換え技術によって導入されていないことを特徴とする、細胞。
【請求項２０】
ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に寄託された以下の細胞：
ａ）２０００年４月２８日にＩ−２４６７の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
ｂ）２０００年４月２８日にＩ−２４６８の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
ｃ）２０００年４月２８日にＩ−２４６９の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、及び
ｄ）２０００年４月２８日にＩ−２４７０の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株。
から選択されることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の細胞。
【請求項２１】
アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含んで成るタンパク質の産生のための、請求項２０に記載の細胞の使用。
【請求項２２】
アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質の産生方法であって、以下の段階、
ａ）請求項２０に記載の細胞の、前記細胞の増殖せしめる培養液中での、且つ培養条件での培養；及び
ｂ）段階ｂ）で得られた培養上清及び／又は細胞の残査からの、少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含んで成る前記タンパク質の単離、
を含む方法。
【請求項２３】
前記細胞を増殖せしめる段階ａ）の前記培養液が前記の非慣用アミノ酸又はその前駆体の１つを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記の非慣用アミノ酸が、前記細胞によって合成されることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記の非慣用アミノ酸が、前記細胞の遺伝子の修飾によって増大されることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が前記標的コドンによってコードされるアミノ酸について栄養要求性であることを特徴とする、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、コード配列が少なくとも１つの標的コドンを含む、注目の同種又は異種遺伝子を含むことを特徴とする、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
段階ａ）が、注目の前記遺伝子によってコードされるタンパク質の合成の誘導に必要な化合物を含むことを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
注目の前記遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性が、注目の前記遺伝子の標的コドンにおける前記の非慣用アミノ酸の組み込み後に少なくとも部分的に保持されることを特徴とする、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
非慣用アミノ酸がＬ配置の式Ｉ
【化１】
2004518404.tif 000005
（ここで、Ｒ１又はＲ２は、選択的な方法で反応することができる）
の非慣用アミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
官能基が、アルデヒド、ケトン、エテニル、エチニル又はニトリル基から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
タンパク質の官能化のための、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
タンパク質を精製する方法であって、以下の段階：
ａ）前記タンパク質のアミノ酸配列における、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法による選択的に反応しうる官能基を含む非慣用アミノ酸の組み込み；
ｂ）段階ａ）で得られたタンパク質を含む溶液を、前記官能基と特異的に反応し、且つ前記タンパク質を特異的に固定することができる化合物を含んで成る支持体と接触させること；及び
ｃ）支持体上に固定された前記タンパク質の単離、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３４】
タンパク質を化合物又は生化学的化合物上に固定する方法であって、以下の段階：
ａ）前記タンパク質のアミノ酸配列における、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法による選択的に反応しうる官能基を含む非慣用アミノ酸の組み込み；
ｂ）段階ａ）で得られたタンパク質を、反応が可能な培地中で前記官能基と特異的に反応しうる基を含んで成る化合物又は生化学的化合物を含んで成る支持体と接触させること、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記化合物又は生化学的化合物が固体の支持体上に固定されるもの自体であり、又は固体の支持体を構成する化合物であることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
タンパク質複合体を調製するための、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記の固定されたタンパク質あるいは前記化合物又は生化学的化合物が、治療、化粧又は診断用の化合物から選択されることを特徴とする、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記化合物又は生化学的化合物が、固定されたタンパク質の生物学的活性を修飾しうる化合物から選択されることを特徴とする、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
化合物又は生化学的化合物が、固定されたタンパク質の生物活性によって修飾されうる化合物から選択されることを特徴とする、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物又は生化学的化合物が、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂肪酸、糖又は天然若しくは合成のポリマーを含む化合物から選択されることを特徴とする、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法によって得られるタンパク質であって、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含む組換えタンパク質に関する、タンパク質。
【請求項４２】
請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法によって得られるタンパク質複合体であって、アミノ酸配列が官能基を含む非慣用アミノ酸を含む組換えタンパク質、及び前記官能基と反応しうる基を含んで成る化合物又は生化学的化合物を含むことを特徴とする、タンパク質複合体。
【請求項４３】
請求項４１に記載のタンパク質、又は請求項４２に記載のタンパク質複合体の、診断用試薬としての使用。
【請求項４４】
請求項４１に記載のタンパク質、又は請求項４２に記載のタンパク質複合体を利用することを特徴とする、診断方法。
【請求項４５】
請求項４１に記載のタンパク質、又は請求項４２に記載のタンパク質複合体を含むことを特徴とする、診断用キット。
【請求項４６】
医薬又は化粧品の組成物の製造のための、請求項４１に記載のタンパク質、請求項４２に記載のタンパク質複合体、又は請求項２０に記載の細胞の使用。
【請求項４７】
請求項４１に記載のタンパク質、請求項４２に記載のタンパク質複合体、又は請求項２０に記載の細胞を含んで成る医薬又は化粧品の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質を産生することができる変異原核細胞、特にＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、前記タンパク質を産生し、そして精製する方法及び本発明に従う方法によって得られるタンパク質、に関する。本発明はまた、異なる分野、例えば治療、化粧品、診断又は有機化合物の生合成若しくは生分解、における前記細胞及びタンパク質の適用を網羅する。
【０００２】
組換え生物によって大量に産生される、より多くのタンパク質が化学工業における触媒として、又は治療剤として使用される。多様化した機能を有する新規タンパク質の探索は、好極限性生物のタンパク質をスクリーニングするか、又は突然変異及びスクリーニングによってタンパク質の変異体を創り出す、激しい競争の対象である。しかしながら、生物で産生されうるタンパク質の化学的な多様性は、遺伝暗号の不変性によって制限、すなわち、２０個のアミノ酸の正規な集合の組み合わせによって限定されたままである。天然の種の家系が、研究機関において異なる遺伝暗号に適用するように徐々に再構築された場合、タンパク質の進化は方向が変わり、そして生物学的多様性の人工的な供給源がそれにより確立されうる。
【０００３】
遺伝暗号からの実験的な逸脱は、この制限を打ち勝つことのできる唯一の方法である。別の遺伝暗号は、より大きな又はより小さなアミノ酸の集合、正規でないモノマーによって置換された集合又はコドンが再分布される正規のアミノ酸の集合を指定することがある。生きている系統における追加のアミノ酸の指定は、それ自身に多くの利用を与え、最も一般的なものとして、人工的な生物学的多様性の確立がある。
【０００４】
常用のアミノ酸を修飾することなく反応しうる化学的なモチーフを有する単一の追加のアミノ酸の恒久的な又は一過性の組み込みは、タンパク質の機能化の新規方法を確立するのに十分であるだろう。これが正確には本発明の目的である。
【０００５】
本発明は、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質を産生する能力を細胞に獲得せしめる方法であって、以下の段階：
ａ）前記細胞の増殖に必要なタンパク質であって、結果として変異される遺伝子から合成されてもはや機能的でなくなるタンパク質をコードする遺伝子の標的コドンにおける少なくとも１つのミスセンス変異の誘導による、前記細胞の形質転換、
ｂ）その様に変異した前記タンパク質の機能性の損失によって必要とされる栄養を含む培養液中での、段階ａ）で得られた細胞の任意な培養、
ｃ）前記標的コドンによってコードされるアミノ酸を含む培養液中での、段階ａ）又はｂ）で得られた細胞の培養、
を含んで成る方法、に関する。
【０００６】
本明細書において、タンパク質の用語は、等しくペプチド又はポリペプチドを、並びに前記タンパク質がグリコシル化されている場合には糖タンパク質を言及することが意図される。
【０００７】
本明細書において、非慣用アミノ酸の用語はまた、原核又は真核の単細胞又は多細胞生物によって合成されるタンパク質の生合成の間にリボソームによって組み込まれるアミノ酸以外の任意なアミノ酸、及び翻訳された核酸の配列に関してその場所に通常組み込まれるべきアミノ酸に代わって組み込まれる任意なアミノ酸、を言及することが意図される。
【０００８】
また、本明細書において、ミスセンス変異の用語は、アミノ酸を表すコドンを、別のアミノ酸をコードするコドンに変換する変異を言及し、ここで、後者のものは、適切な場合には、元のアミノ酸残基の代わりに、前記タンパク質内に機能的タンパク質を提供するための元のアミノ酸に取って代わることができない。
【０００９】
また、本明細書において、細胞の増殖に必要なタンパク質の用語は、それが機能的な方法で細胞によって合成される場合には、所定の培養条件で前記細胞を増殖せしめ、そしてそれが非機能的な方法で細胞によって合成される場合には、前記細胞を増殖せしめるために、前記の所定の培養液中に補助的な栄養分の導入を必要とする、タンパク質を言及する。その様な非機能的なタンパク質は、例えば、条件付きの変異、例えば感光性のタイプの変異に従う細胞によって合成されうる。
【００１０】
例によってこれを例示するために、アミノ酸配列の１４６位のシステインによって占められる触媒部位を提示する、特にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のチミジル酸合成酵素を引用することは可能であるが、それらに限定されず、ここで、その遺伝子（ｔｈｙＡ）の相当する変異は、チミン又はチミジンの栄養要求性をもたらし、他のアミノ酸はこの部位のシステインに取って代わることはできない。
【００１１】
本明細書において、標的コドンの用語は、ミスセンス変異によって形質転換される３つのヌクレオチド塩基を有するコドンを言及し、前記標的コドンは、前記のミスセンス変異によって形質転換する前の３塩基の配列である。
【００１２】
本発明はまた、本発明に従う方法であって、段階ｃ）の培養液が、前記変異タンパク質の機能性が失われたことによって必要とされる栄養素を含まないことを特徴とする方法、を含む。
【００１３】
本発明に従い、前記細胞の培養における段階ｃ）は、前記標的コドン（前記のミスセンス変異によって形質転換される前のもの）によってコードされるアミノ酸を含む培養液中での前記細胞の一連の細胞培養を含んで成り、一連の前記培養のそれぞれは、安定増殖期の獲得、それに続く、得られた細胞の洗浄によってもたらされ、一連の培養の回数は、前記変異遺伝子のミスセンス変異を増大する変異の抑制及び前記変異遺伝子に相当する対立遺伝子の伝播を増大する変異を選択せしめるのに十分である。
【００１４】
本発明は更に、本発明に従う方法であって、ミスセンス変異が、少なくとも１／１０１５の生物の次数の、非常に低い頻度でしか自然に逆転しないミスセンス変異から選択されることを特徴とする方法、に関する。
【００１５】
ミスセンス変異は、好ましくは、前記細胞の増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子の標的コドンを、当該標的コドンと比較して少なくとも２つの塩基、更に好ましくは３つの塩基の変化を示すコドンへと変換するミスセンス変異から選択される。
【００１６】
更に好ましいものに、本発明従う方法であって、立体的なかさが低く、そして／あるいは両親媒性であり、そして／あるいはミスセンス変異によってコードされるアミノ酸の立体的なかさよりも低いか、若しくはそれとほぼ等しい立体的なかさを有するアミノ酸をコードすることを特徴とする方法、がある。
【００１７】
標的コドンの中でも、特に好ましいものは、システイン及び、バリン又はイソロイシンをコードするコドンへと標的コドンを変換するミスセンス変異から選択されるミスセンス変異をコードする標的コドンである。
【００１８】
本発明は更に、本発明に従う方法であって、前記細胞の形質転換における段階ａ）が、前記ミスセンス変異を含んで成る細胞の増殖に必要なタンパク質をコードする前記遺伝子の配列を含んで成るベクターの手段によって、特にプラスミドベクターの手段によって達成されることを特徴とする方法、に関する。
【００１９】
その様なベクターは、当業者によって現在使用されている方法に従い調製され、そして生じたクローンは通常の遺伝子組換え法、例えばリポフェクション、エレクトロポレーション又は熱的ショックによって前記細胞内に導入されうる。
【００２０】
別の観点から、本発明は、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質を産生することができる細胞を選択する方法であって、本発明に従う方法の段階ａ）、そして任意に段階ｂ）及びｃ）、並びに段階ｃ）で増殖しうる細胞の選択、を含んで成る方法、に関する。
【００２１】
好ましくは、本発明に従う細胞の選択方法は、更に、段階ｃ）において、前記標的コドンによってコードされる前記アミノ酸を含む培養液中で得られた細胞を培養する段階ｄ）（ここで、前記アミノ酸の濃度は、おそらく段階ｃ）で使用される前記アミノ酸の濃度よりも高い濃度である）及び段階ｄ）で使用される前記アミノ酸の濃度に感受性のある細胞の選択を含む。
【００２２】
化合物又は生化学的な化合物に対し、あるいは所定の濃度の前記化合物に対して感受性のある細胞、の用語は、前記化合物又は生化学的な化合物あるいは所定の濃度の前記化合物を含む培養液中で培養される場合に、増殖が部分的又は全体的に阻害される細胞を言及する。
【００２３】
本発明はまた、本発明に従う細胞の選択方法であって、選択される細胞の前記ミスセンス変異によってコードされるアミノ酸を認識するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、その関連するｔＲＮＡの１つを、非慣用アミノ酸又は前記ミスセンス変異によってコードされる前記アミノ酸以外のアミノ酸と結合させることができることを特徴とする方法、を含む。
【００２４】
本明細書において、関連するｔＲＮＡの用語は、アミノ酸を認識するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって認識され、そして前記アミノ酸を転移しうるｔＲＮＡを言及することが意図される。
【００２５】
本発明は更に、本発明に従う変異細胞の選択方法であって、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子の核酸配列が、相当する野生型遺伝子の配列と比較しての少なくとも１つの変異であって、遺伝子組換え技術によって導入されたものではない変異を含む方法、を含む。
【００２６】
別の観点から、本発明は、本発明に従う方法によって得られる原核又は真核細胞に関する。
【００２７】
これらの目的に使用され得る細胞の中でも、当然のことながら、細菌細胞、例えばＥ．コリだけでなく、酵母細胞、更に動物細胞、特に哺乳類細胞の培養物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、そして更には昆虫細胞が言及されることがある。
【００２８】
本発明はまた、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質を産生することができる単離された原核又は真核細胞であって、関連するｔＲＮＡの１つと非慣用アミノ酸又は所定のアミノ酸以外のアミノ酸と結合させることができる所定のアミノ酸を認識するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を含むことを特徴とし、且つ前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子の核酸配列が、相当する野生型遺伝子と比較しての少なくとも１つの変異であって遺伝子組換え技術によって導入されたものではない変異を含むことを特徴とする細胞、に関する。
【００２９】
以下のように、本発明は、増殖に必要な代謝経路の、細胞ごとの構成に基づいて細胞を選択する方法であって、非慣用アミノ酸と結合することができる標準的でないアシルｔＲＮＡを産生することができる細胞を得ることを可能にする方法、に関する。
【００３０】
本発明に従う細胞の中でも、ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に寄託された以下の細胞から選択されることを特徴とする細菌細胞が好ましい：
ａ）２０００年４月２８日にＩ−２４６７の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
ｂ）２０００年４月２８日にＩ−２４６８の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
ｃ）２０００年４月２８日にＩ−２４６９の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、及び
ｄ）２０００年４月２８日にＩ−２４７０の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株。
【００３１】
Ｉ−２４６７の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そして選択を行うための開始菌株であるβ５４１９を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｔｈｙＡの遺伝子座における欠失及びエリスロマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｎｒｄＤの遺伝子座における欠失及びカナマイシン耐性遺伝子による置換、
を含んで成る菌株ＭＧ１６５５（野生型Ｅ．コリＫ１２）の子孫であり、チミジル酸合成酵素の対立遺伝子Ｃｙｓ１４６ＧＵＡを有するｐＴＺ１８プラスミド（ｃｏｌ Ｅ１ レプリコン、ｂｌａ＋）を有する。
【００３２】
Ｉ−２４６８の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そしてβ５４５６を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｔｈｙＡの遺伝子座における欠失及びエリスロマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｎｒｄＤの遺伝子座における欠失及びカナマイシン耐性遺伝子による置換、
−チミジル酸合成酵素の対立遺伝子Ｃｙｓ１４６ＧＵＡを有するｐＴＺ１８プラスミド（ｃｏｌ Ｅ１ レプリコン、ｂｌａ＋）を有すること、
−ｖａｌＳ遺伝子の対立遺伝子Ｔ２２２Ｐを有すること（ここで、この発現はｔＲＮＡ／ｖａｌを他の中性アミノ酸及び人工アミノ酸に結合させるバリル−ｔＲＮＡ合成酵素の変異型を産生する）、
を含んで成る、菌株ＭＧ１６５５（野生型Ｅ．コリＫ１２）の子孫である。
【００３３】
Ｉ−２４７０の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そしてβ５５２０を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｔｈｙＡの遺伝子座における欠失及びエリスロマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｃｙｃＡ３０：：Ｔｈ１０の遺伝子座にあるテトラサイクリン耐性遺伝子の組み込み、
−チミジル酸合成酵素の対立遺伝子Ｃｙｓ１４６ＧＵＡを有するｐＴＺ１８プラスミド（ｃｏｌ Ｅ１ レプリコン、ｂｌａ＋）を有すること、
−ｖａｌＳ遺伝子の対立遺伝子Ｋ２７７Ｑを有すること（ここで、この発現はｔＲＮＡ／ｖａｌを他の中性アミノ酸及び人工アミノ酸に結合させるバリル−ｔＲＮＡ合成酵素の変異型を産生する）、
を含んで成る、菌株ＭＧ１６５５（野生型Ｅ．コリＫ１２）の子孫である。
【００３４】
Ｉ−２４６９の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そしてβ５４９８を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｎｒｄＤの遺伝子座における欠失及びカナマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｖａｌＳ遺伝子の対立遺伝子Ｔ２２２Ｐを有すること、
−ｌｅｕ−４５５ ｇａｌＴ１２ ＬＡＭ−ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１ ＤＥ （ｉｌｖＥ−ｉｌｖＣ） ｎｒｄＤ：：ｋａｎ ｖａｌＳ：Ｔ２２２Ｐの遺伝子型の菌株、
−バリンの生合成が不可能で、且つバリンの置換によるＬ−アルファアミノ酪酸の誤組み込みが可能な菌株、
を含んで成る、菌株ＣＵ５０５の子孫である。
【００３５】
本発明は更に、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質、特に組換えタンパク質の産生のための、本発明に従う方法又は細胞の使用を含む。
【００３６】
別の観点から、本発明は、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質の産生方法であって、以下の段階、
ａ）任意の、本発明に従う方法による細胞の選択、
ｂ）段階ａ）で選択された前記細胞、又は本発明に従う細胞の、培養液中での、且つ前記細胞を増殖せしめる培養条件における培養、
ｃ）少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含んで成る前記タンパク質の、段階ｂ）で得られた培養上清及び／又は細胞の残査からの単離、
を含むことを特徴とする方法、に関する。
【００３７】
好ましい態様において、本発明は、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質の産生方法であって、以下の段階：
ａ）ＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に寄託された以下の細胞：
−２０００年４月２８日にＩ−２４６７の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
−２０００年４月２８日にＩ−２４６８の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
−２０００年４月２８日にＩ−２４６９の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
−２０００年４月２８日にＩ−２４７０の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
から選択された細胞の、培養液中での、且つ前記細胞を増殖せしめる培養条件での培養；及び
ｂ）段階ｂ）で得られた培養上清及び／又は細胞の残査から、少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含んで成る前記タンパク質の単離、
を含む方法、に関する。
【００３８】
本発明に従う方法によって産生されうるタンパク質の中でも、少なくとも１つの非慣用アミノ酸の組み込みによって、配列が慣用のアミノ酸のみから成るタンパク質によっては得られない、所望の活性を得ることを可能にするタンパク質を挙げることもできるが、これらには限定されない。活性の用語は、一般的に、任意な活性、例えば単細胞又は多細胞生物に関連する生理学的又は生物学的活性、更に部分的には、例えば構造的又は生化学的活性、例えば抗体の型の酵素的なもの、抗原的なもの、又は生物学的活性の調節、制御又は阻害、あるいは化合物又は生化学的化合物の生合成又は生分解においてそれを利用可能とするような他のもの、を言及することが意図される、
【００３９】
本発明に従い産生されうるタンパク質の中で、少なくとも１つの非慣用アミノ酸の組み込みが、相当する非修飾型のタンパク質の生物学的活性の必須の修飾を全くもたらさないように実施されるタンパク質を挙げることもできる。相当する非修飾型のタンパク質によって保持される生物学的活性の他に、本発明に従うこれらのタンパク質は、特異性が有利に活用されうる、非慣用アミノ酸を提示する。
【００４０】
非慣用アミノ酸によって与えられる特性の中でも、タンパク質の活性を変化させず、又は慣用のアミノ酸の修飾を回避する条件で、も容易に且つ特異的に化合物又は生化学的化合物と反応することができる前記の非慣用アミノ酸上の官能基の存在と直結した特性を特に挙げることができる。
【００４１】
この特異的な官能基の存在は、例えば、
（ｉ）前記非慣用アミノ酸を取り込んだ、任意のタンパク質、特に任意の組換えタンパク質を精製し；
（ｉｉ）その様なタンパク質を固体の支持体に結合させ；
（ｉｉｉ）その様なタンパク質に、検出することができる質分子、例えば様々な種類の分光学的プローブを結合させ；
（ｉｖ）その様なタンパク質に、溶媒中でそれらを可溶化することができ、又は抗体による認識からそれらを保護することができる親油性又は親水性のポリマーを結合させ；
（ｖ）その様なタンパク質をポリヌクレオチドに結合させ；
（ｖｉ）その様なタンパク質を、存在することによって前記タンパク質の生物学的活性を増大させ、減少させ、調節し、制御し、又は標的化し、あるいは治療目的の使用のための化合物としてその生物学的利用能を修飾することが可能となる化合物又は生化学的化合物に結合させ；あるいは
（ｖｉｉ）その様なタンパク質を、他の方法で溶液中に拡散する補酵素に永久に固定するために、
有利に使用され得る。
【００４２】
本発明に従い、少なくとも１つの非慣用アミノ酸の組み込みは、特異性又は活性の原因として、又は構造的な配置、電荷、疎水性、又は相当する非修飾型のタンパク質の多量体化する能力の原因として、アミノ酸に関与する。それにより、慣用のアミノ酸を有する相当する非修飾型のタンパク質と比較して等しい、増大した又は低下した活性、あるいは等しい、より狭い又はより広い特異性のタンパク質を創り出すことが可能となる。
【００４３】
非修飾型タンパク質の用語は、慣用のアミノ酸から作られた野生型又は組換えタンパク質を言及することを意図し、これから非慣用アミノ酸を含んで成るタンパク質が産生される。
【００４４】
本発明に従う製造の方法は、好ましくは、前記細胞を増殖せしめる段階ｂ）の前記培養液が前記の非慣用アミノ酸又はその前駆体の１つを含むことを特徴とする。
【００４５】
特定の態様に従い、本発明に従う製造方法は、前記の非慣用アミノ酸が、前記細胞によって合成され、前記細胞の遺伝子の修飾によって前記の非慣用アミノ酸の合成を増大することが可能となることを特徴とする。
【００４６】
本発明は更に、アミノ酸配列が少なくとも１つの本発明に従う非慣用アミノ酸を含んで成るタンパク質を産生する方法であって、前記細胞が前記標的コドンによってコードされるアミノ酸について栄養要求性であることを特徴とする方法、に関する。
【００４７】
更に本発明に含まれるものとして、本発明に従う方法であって、前記細胞が、コード配列が少なくとも１つの標的コドンを含む、注目の同種又は異種遺伝子を含むことを特徴とする方法、がある。
【００４８】
一般的に、注目の遺伝子は、結果として注目のタンパク質に翻訳されるメッセンジャーＲＮＡをコードする。
【００４９】
注目の遺伝子は、任意な常用の技術、例えばクローニング、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって単離され、あるいは化学的に合成されうる。それは遺伝子型のもの（１又は複数のイントロンを有するもの）又は相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のものであってもよい。注目のタンパク質は、成熟タンパク質、前駆体、そして特に分泌するように設計され、且つシグナルペプチドを含んで成る前駆体、短くされたタンパク質、異なる起源の配列の融合によって産生されるキメラタンパク質あるいは向上し、そして／あるいは修飾された生物学的特性を有する変異タンパク質、によって構成されうる。
【００５０】
一般的に、注目の同種又は異種タンパク質の遺伝子は、治療用又は化粧品用化合物として、あるいは診断用試薬として、あるいは生合成又は生分解の過程において利用されうる化合物として、使用され得る任意なタンパク質をコードする遺伝子から選択されうる。
【００５１】
例えば、以下の注目のタンパク質をコードする注目の遺伝子が挙げられる：
−サイトカイン又はリンホカイン（インターフェロンα、β及びγ、インターロイキン、特にＩＬ−２，ＩＬ−６，ＩＬ−１０又はＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ，Ｃ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ等）；
−細胞又は核の受容体、特に病原の生物（ウイルス、細菌又は寄生虫）によって認識されるもの又はそれらのリガンド；
−遺伝的な疾患に関与するタンパク質（第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ジストロフィン又はミニジストロフィン、インスリン、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維性膜貫通調節因子）タンパク質、成長ホルモン（ｈＧＨ））；
−酵素（ウレアーゼ、レニン、トロンビン等）、又はタンパク質、脂質、核酸、糖、アミノ酸、脂肪酸又はヌクレオチドの代謝若しくは生合成に関与する任意の酵素；
−酵素阻害剤（α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、ウイルスのプロテアーゼ阻害剤等）；
−腫瘍又はガンの発生又は進行を少なくとも部分的に阻害することができる抗腫瘍化合物（抗体、細胞分裂又は伝達のシグナルのレベルで作用する阻害剤、腫瘍抑制遺伝子の発現産物、例えばｐ５３又はＲｂ、免疫系を刺激するタンパク質等）；
−腫瘍組織適合遺伝子複合体タンパク質のクラスＩ又はＩＩ、あるいは相当する遺伝子の発現に作用する制御タンパク質；
−ウイルス、細菌又は寄生虫の感染あるいはその発生を阻害することができるタンパク質（免疫原性の特性を有する抗原タンパク質、抗原性のエピトープ、抗体等）；
−毒素、例えばリシン、コレラ毒素、ジフテリア毒素等、又は免疫毒素；
−マーカー（β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ等）；及び
−ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等。
【００５２】
本発明はまた、本発明に従うタンパク質の産生方法であって、段階ｂ）の培養液が、注目の前記遺伝子によってコードされるタンパク質の合成の誘導に必要な化合物を追加として含むことを特徴とする方法、を含む。これらの化合物は当業者に知られており、そして特に選択した細胞及び同種又は異種の遺伝子に依存する。
【００５３】
本発明はまた、本発明に従う方法であって、注目の前記遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性が、注目の前記遺伝子の標的コドンにおける前記の非慣用アミノ酸の組み込み後に少なくとも部分的に保持されることを特徴とする方法、に関する。
【００５４】
本発明はまた、本発明に従う方法であって、非慣用アミノ酸が式Ｉ
【化２】
2004518404.tif 000002
（ここで、Ｒ１又はＲ２は、選択的に反応することができ、好ましくはアルデヒド、ケトン、エテニル、エチニル又はニトリル基から選択される官能基を含む遊離基である）
及びＬ配置の、非慣用アミノ酸から選択されることを特徴とする方法、に関する。
【００５５】
これらの基の中でも、オキソ基（アルデヒド又はケトン）は、タンパク質の化学的官能化を容易にし得る選択反応性を有しており、特に好ましい。他の単純な基、例えばエチニル基はまた、それら自身を選択的な反応に適合される。細胞の翻訳系（ｅｘ ｖｉｖｏ）及びｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されるアシルｔＲＮＡの翻訳系を用いて実施される多くの実験が、非常に様々なアシル基がｔＲＮＡによって読まれるコドンに応じてリボソームに運ばれることを示した。要約すると、アミノ酸に対する側面の修飾は全て、翻訳と両立するようである（最近まで、側鎖が翻訳を阻害するほどかさが大きいアミノ酸は発見されていなかった）；アルキルアミノ、ヒドロキシ及びヒドラジノのアミノモチーフの置換は、リボソームによって触媒されるペプチド転移の化学と両立し（Ｂａｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９１）（リボソームがポリエステル及び慣用のポリアミドを形成しうることは知られている）；しかしながら、モチーフＨ２ＮＣＨ（Ｒ）−ＣＯＯＨのアルファ水素のアルキル（メチル）基による置換又はアルファ炭素における配置の変換（Ｄ−アミノ酸）は、リボソームに受け入れられない。
【００５６】
本発明はまた、タンパク質の官能化のための、本発明に従う方法に関する。
【００５７】
本発明はまた、タンパク質を精製する方法であって、以下の段階：
ａ）前記タンパク質のアミノ酸配列における、本発明に従う方法による選択的に反応しうる官能基を含む非慣用アミノ酸の組み込み；
ｂ）段階ａ）で得られたタンパク質を含む溶液を、前記官能基と特異的に反応し、且つ前記タンパク質を特異的に固定することができる化合物を含んで成る支持体と接触させること；及び
ｃ）支持体上に固定された前記タンパク質の単離、
を含んで成ることを特徴とする方法、に関する。
【００５８】
当業者によって通常使用される天然又は組換えのタンパク質を精製する方法は、一般的に個々に又は組み合わせて使用される方法、例えば分画、クロマトグラフィー法、特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体等を用いる免役親和性技術、を含む。これらの方法は、ときどき時間がかかり、且つ面倒であり、そして所望な比活性、又は精製の割合及び収率を常に得られることはできない。タンパク質の活性を変化させることなく精製の支持体と選択的に反応することができる、精製されうるタンパク質上の特異的な官能基の存在は、それらの使用に必要なタンパク質の精製をかなり容易にする。
【００５９】
本発明はまた、タンパク質を化合物又は生化学的化合物上に固定する方法であって、以下の段階：
ａ）前記タンパク質のアミノ酸配列における、本発明に従う方法による選択的に反応しうる官能基を含む非慣用アミノ酸の組み込み；
ｂ）段階ａ）で得られたタンパク質を、反応が可能な培地中で前記官能基と特異的に反応しうる基を含んで成る化合物又は生化学的化合物を含んで成る支持体と接触させること、
を含んで成ることを特徴とする方法、に関する。
【００６０】
化合物又は生化学的化合物上でのタンパク質の固定は、好ましくは共有結合の固定である。
【００６１】
本発明に従い、固定の前記方法において使用され得る化合物又は生化学的化合物は、取り込まれた非慣用アミノ酸の官能基と反応しうる全ての化合物から選択されうる。
【００６２】
本明細書において、タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｃ）複合体の用語は、上述の方法の段階ｂ）で得られる産物を言及することを意図し、これは化合物又は生化学的化合物上に固定された本発明に従うタンパク質を含んで成る。
【００６３】
本発明はまた、本発明に従う方法であって、前記化合物又は生化学的化合物が固体の支持体上に固定されるもの自体であり、又は固体の支持体を構成する化合物であることを特徴とする方法、に関する。
【００６４】
本発明はまた、タンパク質複合体を調製するための、本発明に従う方法に関する。
【００６５】
本発明は、好ましくは前記の固定されたタンパク質あるいは前記化合物又は生化学的化合物が、治療、化粧又は診断用の化合物から選択されることを特徴とする本発明の方法に関する。
【００６６】
前記の固定されたタンパク質は、特に、アミノ酸配列が本発明の方法に従う非慣用アミノ酸を含み、且つ相当する野生型又は組換え型の非修飾型のタンパク質が、治療及び化粧用の化合物として又は診断用試薬として使用され得るタンパク質から選択される、タンパク質から選択される。
【００６７】
本発明に従う方法は、好ましくは、化合物又は生化学的化合物が、固定されたタンパク質の生物学的活性を修飾しうる化合物から選択されることを特徴とする。
【００６８】
別の化合物の生物学的活性を修飾しうる化合物の用語は、前記の他の化合物の生物学的活性を増大させ、低下させ又は制御することができる化合物を言及することが意図される。
【００６９】
本発明はまた、本発明に従う方法であって、化合物又は生化学的化合物が、生物学的活性が固定されたタンパク質によって修飾されうる化合物から選択されることを特徴とする方法、に関する。
【００７０】
本発明はまた、本発明に従う方法であって、化合物又は生化学的化合物が、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂肪酸、糖又は天然若しくは合成のポリマーを含む化合物から選択されることを特徴とする方法、に関する。
【００７１】
別の観点から、本発明は、本発明の方法によって得られる、タンパク質、特に組換えタンパク質、及びタンパク質の複合体に関する。
【００７２】
本発明に従い、本発明のタンパク質産生方法によって得られるタンパク質は、天然の組換え体であり、そしてそれらのアミノ酸配列は少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含む。
【００７３】
本発明に従い、本発明のタンパク質複合体の産生のための方法によって得られ宇タンパク質は、特に、それらが、アミノ酸配列が官能基を含む非慣用アミノ酸を含む組換えタンパク質、及び前記官能基と反応しうる基を含んで成る化合物又は生化学的化合物を含む。
【００７４】
本発明はまた、本発明に従うタンパク質と結合することができ、又は本発明に従うタンパク質複合体の化合物又は生化学的化合物と結合することができる化合物を選択する方法に関する。これらの方法の中でも、以下の段階を含むことを特徴とする方法が例として挙げられる：
ａ）選択されるであろう化合物を、特に、固体支持体上におそらく固定されるであろう、本発明に従うタンパク質又はタンパク質複合体と結合させること；
ｂ）本発明に従うタンパク質又はタンパク質複合体と結合する、前記化合物の能力の決定。
【００７５】
選択されるであろう化合物は、有機化合物、例えばタンパク質又は炭水化物、あるいは既に知られている任意な他の有機又は無機化合物、あるいは当業者に知られた技術である、分子モデリング技術を用いて開発され、そして化学的又は生化学的合成によって得られた新規の有機化合物、であってもよい。
【００７６】
本発明に従う細胞も、本発明に従うタンパク質又は所望の活性を有するであろう化合物を研究し、同定し、そして／あるいは選択するためのモデルとして有利に役割を果たすこともあり、そしてそのための方法において使用されることもある。
【００７７】
本発明はまた、診断用試薬として本発明に従うタンパク質又はタンパク質複合体、及び、特に本発明に従うタンパク質又はタンパク質複合体を利用するポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出、同定、局在化及び／又は具体的な調剤のための診断方法、に関する。
【００７８】
事実上、本発明に従うタンパク質は、少なくとも１つの非慣用アミノ酸を組み込み、且つ部分的又は全体的に相当する非修飾型の野生型又は組換えタンパク質、例えば抗体、抗原、酵素又はそれらの生物学的に活性なフラグメントであって、診断方法において使用されることが知られているものの初期活性を保持したタンパク質を含む。
【００７９】
同様に、本発明に従うタンパク質複合体は、本発明に従うタンパク質と化合物又は生化学的化合物から形成されたタンパク質複合体、例えば検出可能な酵素、基質又は分子に結合した抗体、抗原又はオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る複合体を含む。
【００８０】
本発明に従う診断方法の中でも、例えば、以下の段階：
ａ）所望の化合物を含むと思われる生物学的試料を、特に固体の支持体上に恐らく固定されている本発明に従うタンパク質又はタンパク質複合体と接触させること、
ｂ）所望の化合物と本発明に従うタンパク質又はタンパク質複合体との間に形成される複合体の検出、同定、局在化及び／又は調剤、
を含んで成る方法を挙げることができる。
【００８１】
当業者は、既知の標準的な診断方法を、本発明に従うタンパク質又はタンパク質複合体に適合させることができる。
【００８２】
本発明の方法で使用されうる形成した複合体の検出、同定、局在化及び／又は調剤を可能にする技術及び特異的な試薬も当業者に知られており、そしてこれらは、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫蛍光、ＰＣＲ技術、又は当業者にとって知られている標的核酸の増幅のための他の技術、である。
【００８３】
本発明はまた、特に本発明に従うタンパク質又はタンパク質複合体を含むことを特徴とするタンパク質又はポリヌクレオチドの検出、同定、局在化及び／又は具体的な調剤のための、診断用キットに関する。
【００８４】
本発明はまた、医薬又は化粧品の組成物の製造のための、本発明に従うタンパク質、タンパク質複合体又は細胞の使用に関する。本発明は、最後に、本発明に従うタンパク質、タンパク質複合体又は細胞を含んで成る医薬又は化粧品の組成物に関する。
【００８５】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の例に関連して後文に記載される。
【００８６】
例
以下の実施例で言及される菌株の特徴。
Ｉ−２０２５の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そしてβ５３６６を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｔｈｙＡの遺伝子座における欠失及びエリスロマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｎｒｄＤの遺伝子座における欠失及びカナマイシン耐性遺伝子による置換、
−チミジル酸合成酵素の対立遺伝子Ｃｙｓ１４６ＧＵＡを有するｐＴＺ１８プラスミド（ｃｏｌ Ｅ１ レプリコン、ｂｌａ＋）を有すること、
を含んで成る、菌株ＭＧ１６５５（野生型Ｅ．コリＫ１２）の子孫である。
【００８７】
Ｉ−２０２６の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そしてβ８１４４を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｔｈｙＡの遺伝子座における欠失及びエリスロマイシン耐性遺伝子による置換、
−チミジル酸合成酵素の対立遺伝子Ｃｙｓ１４６ＧＵＡを有するｐＴＺ１８プラスミド（ｃｏｌ Ｅ１ レプリコン、ｂｌａ＋）を有すること、
を含んで成る、菌株ＭＧ１６５５（野生型Ｅ．コリＫ１２）の子孫である。
【００８８】
Ｉ−２０２７の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そしてβ８１４６を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｔｈｙＡの遺伝子座における欠失及びエリスロマイシン耐性遺伝子による置換、
−チミジル酸合成酵素の対立遺伝子Ｃｙｓ１４６ＧＵＡを有するｐＴＺ１８プラスミド（ｃｏｌ Ｅ１ レプリコン、ｂｌａ＋）を有すること、
を含んで成る、菌株ＭＧ１６５５（野生型Ｅ．コリＫ１２）の子孫である。
【００８９】
Ｉ−２３３９の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そしてβ５４７９を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｔｈｙＡの遺伝子座における欠失及びエリスロマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｎｒｄＤの遺伝子座における欠失及びカナマイシン耐性遺伝子による置換、
−チミジル酸合成酵素の対立遺伝子Ｃｙｓ１４６ＧＵＡを有するｐＴＺ１８プラスミド（ｃｏｌ Ｅ１ レプリコン、ｂｌａ＋）を有すること、
−ｖａｌＳ遺伝子の対立遺伝子Ｒ２２３Ｈを有すること、
を含んで成る、菌株ＭＧ１６５５（野生型Ｅ．コリＫ１２）の子孫である。
【００９０】
Ｉ−２３４０の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そしてβ５４８５を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｔｈｙＡの遺伝子座における欠失及びエリスロマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｎｒｄＤの遺伝子座における欠失及びカナマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｖａｌＳ遺伝子の対立遺伝子Ｖａｌ２７６Ａｌａを有すること、
−チミジル酸合成酵素の対立遺伝子Ｃｙｓ１４６ＧＵＡを有するｐＴＺ１８プラスミド（ｃｏｌ Ｅ１ レプリコン、ｂｌａ＋）を有すること、
を含んで成る、菌株ＭＧ１６５５（野生型Ｅ．コリＫ１２）の子孫である。
【００９１】
Ｉ−２３４１の番号のもとＣＮＣＭに寄託され、そしてβ５４８６を参照して同定されたＥ．コリの菌株Ｋ１２は、以下の特徴：
−ｔｈｙＡの遺伝子座における欠失及びエリスロマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｎｒｄＤの遺伝子座における欠失及びカナマイシン耐性遺伝子による置換、
−ｖａｌＳ遺伝子の対立遺伝子Ａｓｐ２３０Ａｓｎを有すること、
−チミジル酸合成酵素の対立遺伝子Ｃｙｓ１４６ＧＵＡを有するｐＴＺ１８プラスミド（ｃｏｌ Ｅ１ レプリコン、ｂｌａ＋）を有すること、
を含んで成る、菌株ＭＧ１６５５（野生型Ｅ．コリＫ１２）の子孫である。
【００９２】
例１：チミジル酸合成酵素の活性部位にミスセンス変異Ｃｙｓ−＞Ｖａｌを含んで成り、且つチミン、チミジン又はシステインについての栄養要求性を創り出すＥ．コリの菌株の構築
ｔｈｙＡ遺伝子の人工の対立遺伝子は、Ｅ．コリの野生型ｔｈｙＡ遺伝子が挿入によりｐＴＺ１８Ｒプラスミド（ＢｉｏＲａｄ）に由来する、ｐＴＳＯプラスミド（Ｌｅｍｅｉｇｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３）の指定突然変異によって構築される。オリゴヌクレオチドによって指定される変異は、Ｋｕｎｋｅｌ等によって記載された方法（１９８７）に従い、ファージミドｐＴＳ０上で実施される。菌株ＲＺ１０３２で増幅されたｐＴＳ０の一本鎖マトリックスの調製（Ｋｕｎｋｅｌ ａｎｄ ｃｏｌｌ．， １９８７）（Ｈｆｒ ＫＬ１６ Ｐ０４５［ｌｙｓＡ（６１−６２）］ ｄｕｔ１ ｕｎｇ１ ｔｈｉ１ ｒｅｌＡ１ ｓｕｐＥ４４ ｚｂｄ−２７９：：Ｔｎ１０）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等によって記載された手順（１９８９）に従い実施される。５’をリン酸化したオリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ社から購入）は、変異の開始因子として使用される。
オリゴヌクレオチド１（配列番号１）
５’ｐＴＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＧＴＡＣＡＴＧＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＧＴ
２つの構築物のいずれか一方の一本鎖マトリックスを有するこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、１０ｎｇのオリゴヌクレオチド及び２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５， ２ｍＭ ＥＤＴＡ及び５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む１０μｌのバッファー溶液の体積当たり０．２μｌのマトリックスを用いて実施される。試験管を７０℃で５分間インキュベートし、続いて徐々に３０℃に冷却する。この混合物に０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ， １ｍＭ ＡＴＰ， １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．５）， １０ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール及び１ユニットの、ファージＴ４  ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの２つの酵素のうちのいずれかを加える。最終体積が２０μｌのこの反応混合を３７℃で６０分間インキュベートし、このうちの５μｌが、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等によって記載された方法（１９８９）に従い、Ｅ．コリＫ１２の菌株ＧＴ ８６９ （Ｐａｒｓｏｔ， Ｃ． １９８６）（ｔｈｒＢ １００４ ｐｒｏ ｔｈｉ ｓｔｒＡ ｈｓｄＳ ｌａｃＺ ΔＭ１５ ［Ｆ’ｌａｃＺ ΔＭ１５ ｌａｃｌｇ ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡ＋ ｐｒｏＢ＋］） のコンピテント細胞を形質転換するために使用される。形質転換した細胞は、１００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを加えた（Ｂ培地を含むペトリ皿に広げられる。抗生物質に耐性のある１２個のクローンが、同一の培養上で再び単離される。これらのクローンのファージミドに相当する一本鎖ＤＮＡが調製され、そしてジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ ａｎｄ ｃｏｌｌ．， １９７７）に従い配列決定される。Ｍ１３配列決定キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）とデオキシアデノシン５’−（α−チオ）三リン酸（１３００Ｃｉ／ｍｍｏｌ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）が、取扱い説明書に従い組み合わされる。４つの開始因子が、ｔｈｙＡの対立遺伝子の配列を決定するために使用される：
オリゴデオキシヌクレオチド３（配列番号：３）：５’ＧＧＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＴＣ
オリゴデオキシヌクレオチド４（配列番号：４）：５’ＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＣＣＣ
オリゴデオキシヌクレオチド５（配列番号：５）：５’ＣＧＣＧＣＣＧＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＴＣ
オリゴデオキシヌクレオチド６（配列番号：６）：５’ＧＴＣＴＧＧＡＣＣＧＧＴＧＧＣＧＡＣＡ
【００９３】
この様にして得られたプラスミドｐＴＳ１は、野生型のｔｈｙＡ遺伝子においてはシステインのコドンＵＧＣによって占められている１４６位がバリンのコドンＧＵＡによって占められている、対立遺伝子ｔｈｙＡ：Ｖａｌ１４６を有して伝播する。プラスミドｐＴＳ１は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の方法（１９８９）に従い実施される形質転換によって、チミジル酸合成酵素の染色体の遺伝子ｔｈｙＡが欠失しているＥ．コリＫ１２のΔｔｈｙＡ菌株β１３０８に導入される。プラスミドの対立遺伝子ｔｈｙＡ：Ｖａｌ１４６を有する形質転換した菌株β５３５６は、それが由来する菌株β１３０８と同様に、培養液に加えられるチミン又はチミジン無しに生育することができないことを示す。他方で、菌株β５３６６は、２５ｍｌのグルコース無機性ＭＳ培地を含むペトリ皿中で実施した、０．１ｍｌの４００ｍＭ  Ｌ−システイン溶液を含む中心のウェルから開始するシステイン拡散勾配全体での３０℃での限界の増殖を示す。同一の条件下で、菌株β１３０８は、検出可能な増殖を全く起こさない。チミジル酸合成酵素の１４６位の触媒的なシステインをバリンに変換するミスセンス変異は、外来からのシステインの大量添加によって部分的に抑制され得る。ペトリ皿に対する０．１ｍＭのバリンの添加は、システイン勾配全体での菌株β５３５６の増殖を起こさせない。この様に、これら全ての事は、システインが、チミジル酸合成酵素の活性部位内でのバリンによるシステインの置換を補正することができる、誤ったＣｙｓ−ｔＲＮＡＶａｌを形成するために、バリル−ｔＲＮＡ合成酵素の活性部位に侵入するかの様に起こる。過剰なバリンは、これらの誤ったＣｙｓ−ｔＲＮＡＶａｌの形成を防ぐ。
【００９４】
例２：チミジル酸合成酵素の活性部位にミスセンス変異Ｃｙｓ−＞Ｉｌｅを含んで成り、且つチミン、チミジン、又はシステインについての栄養要求性を創り出すＥ．コリの菌株の構築。
対応する構築は、チミジル酸合成酵素を用いて１４６位のシステインを交換するために、例１と同一の手順に従い、オリゴヌクレオチドによって指示される変異によって実施される。
オリゴヌクレオチド２（配列番号２）：
５’ｐＴＧＧＡＴＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＴＡＴＧＴ
【００９５】
この様にして得られたプラスミドｐＴＳ２は、野生型のｔｈｙＡ遺伝子においてはシステインのコドンＵＧＣによって占められている１４６位がイソロイシンのコドンＡＵＡによって占められている、対立遺伝子ｔｈｙＡ：Ｉｌｅ１４６を伴ない伝播する。プラスミドの対立遺伝子ｔｈｙＡ：Ｉｌｅ１４６を伴い伝播する菌株β５２７４は、β５３５６の場合と同様に、過剰なチミン、チミジン又はシステインの栄養の添加を必要であることを示している。システインによる菌株β５２７４の表現型の抑制は、菌株β５３６６のものがバリンによって失われる様に、０．１ｍＭのイソロイシンによって失われる。これら全ての事は、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素が過剰なシステインの存在下で誤ったＣｙｓ−ｔＲＮＡＩｌｅを形成することができ、そしてこの誤った形成が過剰なイソロイシンの存在によって防がれたかの様に起こる。
【００９６】
例３：連続液体培養による、バリンの代わりにシステインを誤って取り込む遺伝暗号の変異体の選択及びそれにより得られたバリル−ｔＲＮＡの変異体の遺伝的な特徴づけ。
プラスミドｐＴＳ１上にミスセンス対立遺伝子ｔｈｙＡ：Ｖａｌ１４６を有する菌株β５３６６は、０．３ｍＭチミジンを添加したグルコース無機性ＭＳ培地（２ｇ／Ｌ， Ｒｉｃｈａｕｄ ａｎｄ Ｃｏｌｌ．， １９９３）中で、３０℃の嫌気性生活で２４時間培養される。続いて、細胞は脱酸素化した無機性ＭＳ培地で２回洗浄される。１．５ｍＭのシステインが添加された１０ｍｌのグルコース無機性ＭＳ培地を含む脱酸素化した栄養培地に洗浄した細胞を用いて１／１００で接種する。続いて、細胞を３０℃の嫌気性生活で２４時間培養し、そして１０ｍｌの脱酸素化したシステイングルコース無機性ＭＳ培地を含む新しい試験管に、先の定常期にある培養物の１／１００希釈液を接種する。この手順を２６回繰り返す。この連続培養の終わりに、液体培地から１２のクローンが、嫌気性条件下で、チミジン（０．３ｍＭ）グルコース無機性ＭＳ培地（２ｇ／Ｌ）の皿上で単離され、そして同一の液体培地の懸濁液中で−８０℃で維持される。１２のクローンは、栄養因子を添加したグルコース無機性ＭＳ培地を含む皿上で試験される。全てのこれらのクローンが、システインが少なくとも１．５ｍＭの濃度で培養液中に存在するにも関わらず、栄養因子としてチミン又はチミジンを必要としている様である。
【００９７】
前記クローンは、遺伝的な特徴づけを介してβ８１４４及びβ８１４６が選択される。バリル−ｔＲＮＡ合成酵素の遺伝子ｖａｌＳに隣接する、遺伝子座ｎｒｄＤに導入された（Ｅ．コリＫ１２の染色体の９７ｍｎ）、カナマイシン耐性であることが特徴のファージＰ１による形質導入の実験は、菌株β８１４４及びβ８１４６を用いて実施される。それぞれの場合において、カナマイシン耐性である約半分の形質導入因子も、少なくとも１．５ｍＭの濃度の外来のシステインによって抑制可能なチミジンについての栄養依存性を示す。この比率は、遺伝子ｖａｌＳとｎｒｄＤとの間の遺伝子の距離（０．４ｍｎ）に従うものであり、そして低濃度のシステインによるチミジル酸合成酵素の活性部位におけるミスセンス変異Ｃｙｓ−＞Ｖａｌの抑制の表現型が、遺伝子座ｖａｌＳの遺伝的な変化によって起こるという仮定を導く。適合した菌株のｖａｌＳ遺伝子における遺伝的な変化の固定化は、この遺伝子座の配列決定によって確認され：Ｃに変化したＡは、２つの適合した菌株β８１４４及びβ８１４６における、グルタミンによる２７７位のリジンの置換をもたらす。配列決定は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等によって記載された条件（１９８９）で実験されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られたマトリックス上で実施される。増幅反応は、β８１４４又はβ８１４６の菌株の１０ｎｇのゲノムＤＮＡ、２０ピコモルの各阻害剤、４０ナノモルの等モル量の４つのデオキシヌクレオチド三リン酸混合物、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３， ５００ｍＭ ＫＣｌ及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２から成る１０μｌのバッファーを含む１００μｌの溶液中で、１〜２ユニットのＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下実施される。各反応につき、３０回の重合の周期が、ＤＮＡアンプリファー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用いて、以下の様に完了する：変性は、９４℃で、最初の周期については５分間、そして以下の周期については１分間実施され、ハイブリダイゼーションは５８℃で１分間、そして伸長は７２℃で、最初の２９周期については３分間、そして最後の周期については１０分間実施される。オリゴヌクレオチド７及び８は、遺伝子の増幅に使用される。
オリゴデオキシヌクレオチド７（配列番号７）：
５’ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＧＣＡＧＡＡＣＧ
オリゴデオキシヌクレオチド８（配列番号８）：
５’ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＴＡＴＴＴＣＡＣＧＧＧＧＡＧＴＴＡＴＧＣ
【００９８】
この様にして得られたＰＣＲフラグメントは、ＱＩＡｑｕｉｃｋ （Ｑｉａｇｅｎ） キットを用いて精製され、そして配列決定のためにＧｅｎａｘｉｓ社に送られる。
【００９９】
例４：システインの代謝前駆体による表現型の抑制。
適合した菌株β８１４４及びβ８１４６のシステインについての栄養要求性は、酸化による分解をもたらすことなく培養液中のシステインを交換し得る代謝前駆体を特徴づけるために利用される。Ｓ−カルバミル−Ｌ−システイン（３ｍＭ）、Ｓ−メチル−Ｌ−システイン（３ｍＭ）及びＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸（２ｍＭ）は、チミジン又はチミンの代わりに、適合した菌株β８１４４及びβ８１４６の増殖因子としてシステインを交換することができることが証明された。前記化合物は、変異体ｃｙｓＮ：：ｋａｎ（菌株ＪＴ１， Ｍ． Ｂｅｒｌｙｎにより産生、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ＵＳＡ （Ｌｅｖｈ ｅｔ ａｌ．， １９８８））のシステイン要求性を満たすことができることも証明されている。しかしながら、これらの物質を全く添加しない場合、チミジル酸合成酵素の遺伝子ｔｈｙＡの染色体欠失を導くβ１３０８の増殖が可能となり、その結果、微量のチミン又はチミジンによってそれらの混入を排除することができる。
【０１００】
例５：固体の培地上での単離による、バリンの代わりにシステインを誤って取り込む遺伝暗号の変異体の選択及びシステインを誤って取り込むバリル−ｔＲＮＡ合成酵素の変異体の遺伝的な特徴づけ。
プラスミドｐＴＳ１上にミスセンス対立遺伝子ｔｈｙＡ：Ｖａｌ１４６を有する菌株β５３６６は、Ｅ．コリの補助菌株（β７１７０， Ｂｏｕｚｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）で採集されたファージＰ１のライゼートを用いて、バリル−ｔＲＮＡ合成酵素の遺伝子の遺伝子座ｖａｌＳに隣接する遺伝子座ｎｒｄＤにカナマイシン耐性マーカーを導入した染色体内に形質導入される。遺伝子ｄｎａＱの変異誘発対立遺伝子は、テトラサイクリンｄｎａＱ：：ｍｉｎｉＴｎ１０耐性マーカーを有する補助菌株（ＭＳ２１３１， Ｓｈａｐｉｒｕ， １９９０）上で採集されるファージＰ１のライゼートを用いる菌株β５４１９の形質導入によって一過的に導入される。テトラサイクリンに耐性があり、且つ約１０００倍に増幅された自然変異の割合（ストレプトマイシン耐性の獲得についてのもの）を示すその様なクローンは、チミジンの存在下（０．３ｍＭ）、最小グルコース培地中で３０℃で培養される。２４時間後、細胞を採集し、そしてチミジンを含まない同量の培養液中で２回洗浄される。約１０８個の細菌に相当する、０．１ｍｌの体積の結果として生じた懸濁液が、グルコース無機性ＭＳ培地（２ｇ／Ｌ）の１ｍＭの増分を添加することにより０〜８ｍＭに変化する濃度のＳ−カルバミル−Ｌ−システインを含む一連のペトリ皿の表面上に広げられる。同一の手順を変異誘発遺伝子のない菌株β５４１９、及び野生型の遺伝子ｄｎａＱに適用する。全てのペトリ皿を３０℃で９６時間インキュベートする。コロニーは、変異誘発対立遺伝子ｄｎａＱ：：ｍｉｎｉＴｎ１０が試験菌株内に導入された場合にのみ、２ｍＭ超の濃度のＳ−カルバミル−Ｌ−システインを有するペトリ皿上に出現する。
【０１０１】
その様なクローンから採集したファージＰ１のライゼートは、プラスミドの対立遺伝子ｔｈｙＡ：Ｖａｌ１４６を有する菌株β５３６６に形質導入するために使用される。カナマイシンに耐性がある約半分の形質導入体が、３ｍＭのＳ−カルバミル−Ｌ−システインの存在下、且つチミン又はチミジンの不在下で増殖することができ、それらの中でも特に菌株β５４５５がその様である。他の半分の形質導入体はこれができず、そして、菌株β５３６６の様に、増殖するためにチミン又はチミジンを必要とする。この表現型の比率は、遺伝子座ｖａｌＳとｎｒｄＤとの間の遺伝子の距離（０．４ｍｎ）に従う。この様に、低濃度の外部からのシステインによるｔｈｙＡ Ｃｙｓ−＞Ｖａｌのミスセンス変異の抑制は、バリル−ｔＲＮＡ合成酵素の遺伝子の変化に起因することがある。β５３６６の形質導入によって得られ、そして３ｍＭのＳ−カルバミル−Ｌ−システインの存在下、且つチミン又はチミジンの不在化で増殖することができ、β５４５５と表される菌株のうちの１つの遺伝子座ｖａｌＳは、例３に記載の様にポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され、そして配列決定される。Ｃに変化したＡは、プロリンによる２２２位のスレオニンの置換を招き、その結果菌株β５４５５の遺伝子ｖａｌＳにおける遺伝子の変化の固定が確認される。
【０１０２】
例６：正規でないアミノ酸に対するバリル−ｔＲＮＡ合成酵素変異体の感受性。
菌株β５４５５，β８１４４及びβ８１４６は、バリンに対して立体的な類似性を有する人工アミノ酸に対するそれらの感受性において試験される。当該試験は、チミジンを添加したグルコース無機性ＭＳ培地の皿上で実施される。細胞は、好気的な培地（グルコース無機性ＭＳ培地、０．３ｍＭチミジン）中で２４時間培養され、そして無機性ＭＳ培地中で１／２５０に希釈される。０．５ｍｌのこの細胞懸濁液を、２５ｍｇのグルコース無機性ＭＳ培地を含むペトリ皿上に広げる。ウェルは、皿の中央がえぐられ、そして０．１ｍｌのアミノ酸溶液：
（１）１００ｍＭ  Ｌ−２−アミノ−酪酸
（２）１００ｍＭ  Ｌ−２−アミノ−吉草酸
（３）１００ｍＭ  Ｌ−２−３−ジアミノ−プロピオン酸
（４）５０ｍＭ  Ｌ−３−チオール−２−アミノ−酪酸、
で満たされる。皿を続いて３０℃で２４時間インキュベートし、ウェルの周囲の、皿の上にある阻害領域の外観があれば、記録する。ペトリ皿上の弱められた増殖の阻害領域の直径が測定される：
Ｌ−２−アミノ−酪酸：５．２ｃｍ（β５４５５）， ５．７ｃｍ（β８１４４）， ６．７ｃｍ（β８１４６）；
Ｌ−２−アミノ−吉草酸：２．１ｃｍ（β５４５５）， １．５ｃｍ（β８１４４）， ６．７ｃｍ（β８１４６）；
Ｌ−２−３−ジアミノ−プロピオン酸：２．３ｃｍ（β５４５５）， ２．７ｃｍ（β８１４４）， １．９ｃｍ（β８１４６）；
Ｌ−３−チオール−２−アミノ−酪酸：２．０ｃｍ（β５３６６）， ４．６ｃｍ（β５４５５）， ４．０ｃｍ（β８１４４）， ４．０ｃｍ（β８１４６）。
【０１０３】
所定の濃度のＬ−２−アミノ−酪酸、Ｌ−２−アミノ−吉草酸及びＬ−２，３−ジアミノ−プロピオン酸は、野生型のｖａｌＳ対立遺伝子において、菌株β５３６６には効果を持たず、変異型ｖａｌＳ遺伝子を有する菌株の増殖を阻害する。Ｌ−３−チオール−２−アミノ−酪酸は、全ての菌株の増殖を阻害するが、当該阻害は変異した菌株上でより顕著である。この様な全ての事が、バリル−ｔＲＮＡ合成酵素の変異体が、当該酵素の野生型によっては取り込まれ得ないアミノ酸とｔＲＮＡＶａｌを結合させることをそれらに可能にさせる広範な特異性を有するかの様に起こる。
【０１０４】
例７：バリル−ｔＲＮＡ合成酵素が変異したＥ．コリの菌株のタンパク質における正規でないアミノ酸の取り込み。
菌株β５４５５から得られたファージＰ１のライゼート（例５を参照のこと）は、ＡＥｉｌｖＣＡＢＤ欠失及びｌｅｕ変異を有する菌株ＣＵ５０５に形質導入して、バリン、イソロイシン及びロイシンについて栄養要求性にさせるために使用された。菌株ＣＵ５０５は、エール大学（ＵＳＡ）にあるＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。形質導入クローンは、カナマイシンＬＢの皿から選択し、そしてアミノ酸、バリン、イソロイシン及びロイシンのいずれかを０．３ｍＭ含むグルコースＭＳ固体培地（２ｇ／Ｌ）中で、アミノ−酪酸（３ｍＭ）に対するそれらの感受性について試験された。約５０％の形質導入クローンが、これらの条件では生育することができず、このことは対立遺伝子ｖａｌＳ：Ｔ２２２Ｐ及びｎｒｄ：：ｋａｎ耐性マーカー（例５を参照のこと）が同時に形質導入されていることを示している。β５４９８と表される、形質導入クローンの１つは、アミノ−酪酸の取り込み、バリンの置換を、ＣＵ５０５と比較して示すために使用された。２つの菌株が、０．３ｍＭの濃度のジペプチドＩｌｅ−Ｌｅｕ及び０．０２ｍＭの濃度のジペプチドＩｌｅ−Ｖａｌを含むグルコースＭＳ液体培地（２ｇ／Ｌ）中で、０．２ｍＭのＬ−アミノ−酪酸の存在下、又はその類似体の不在下で、３０℃で培養された。各菌株に相当する種菌は、０．３ｍＭの濃度のジペプチドＩｌｅ−Ｌｅｕ及び０．０４ｍＭの濃度のジペプチドＩｌｅ−Ｖａｌを含むグルコースＭＳ液体培地（２ｇ／Ｌ）中であらかじめ培養したものから得た。３０℃で２４時間培養した後の定常期の培養物（５０ｍｌ）を遠心によって回収した。各試験につき、残査を１００ｇ／Ｌの２５ｍｌのトリクロロ酢酸溶液（１０％ＴＣＡ）中で４℃で再懸濁し、遠心し、５ｍｌの１０％ＴＣＡ中で再懸濁し、もう一度遠心し、残査を５％ＴＣＡ中で再懸濁し、懸濁物を９５℃で３０分間インキュベートし、遠心し、残査を５ｍｌのアセトン中で再懸濁し、遠心し、残査を５ｍｌのアセトン中で再懸濁し、遠心し、そして残査を乾燥させた。この様にして得られた残査を、５０ｍＭの１ｍｌのＮＨ４ＣＯ３溶液に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥したものを、２ｇ／Ｌのフェノールを含む２ｍｌの６Ｎ塩酸に溶解し、混合物を薬びん中に閉じ込め、１１０℃で２０時間インキュベートした。加水分解物中のアミノ酸の濃度は、Ｂｅｃｋｍａｎ６３００解析機の取扱い説明書に従い、ニンヒドリンで誘導体化することによって定量化した。アミノ−酪酸は、アミノ−酪酸が培養液に添加され、且つ菌株がβ５４９８の場合にのみ、タンパク質の加水分解物中に検出された。アミノ−酪酸の比率は、１／４の量のバリンに取って代わり、これは全タンパク質の１００アミノ酸当たり約５のアミノ−酪酸残査に相当する。２つの培養条件における２つの菌株ＣＵ５０５及びβ５４９８についての解析の詳細な結果を以下の表に示す。
【表１】
2004518404.tif 000003
【０１０５】
例８：固体の培地上での単離による変異誘導菌株からの、遺伝暗号の新規変異体の選択。
プラスミド由来の不活性対立遺伝子ｔｈｙＡ：Ｖａｌ１４６を発現し、且つ染色体においてマーカーＡＥｎｒｄＤ：：ｋａｎを有する菌株は、例５に記載のその構築によって説明した様に、スペクチノマイシンに対する耐性を付与し、菌株β５５５５を得るためにスペクチノマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ固体培地上で選択する変異誘発マーカーＥｍｕｔＳ：：ｓｐｃを有する菌株ＴＡＤ上で採集したファージＰ１のライゼートを用いて形質導入された。この菌株の変異誘発の表現型は、リファマイシン耐性変異体の頻度を数えることによって証明された。例５に記載の実験手順に従うことによって、チミジンを含まないグルコース無機性培地中で、２〜５ｍＭのＳ−カルバモイル−Ｌ−システイン（ＳＣＣ）の存在下で増殖することができるクローンが得られた。３つのクローンのうち２つが、例５の手順に従いカナマイシンに対する耐性について選択することによって、菌株β５３６６を形質導入するために使用されたファージＰ１のライゼートを調製する役割を果たした。３つのライゼートのそれぞれについて、約半分の形質導入体が、３ｍＭのＳＣＣを含むグルコース無機性固体培地中で増殖することができ、これはミスセンス対立遺伝子ｔｈｙＡ：Ｃ１４６Ｖを抑制する変異及びマーカーｎｒｄ：：ｋａｎの近くであることを示している。３つのライゼートのうちの１つから得られたＳＣＣで抑制可能な形質導入因子にそれぞれ相当する、３つの菌株β５４７９，β５４８５及びβ５４８６の遺伝子座ｖａｌＳは、例３に記載の様にＰＣＲによって増幅され、そして配列決定された。異なる位置でなされた変異が３つの菌株のそれぞれに見られ、すなわち、Ａｒｇ２２３はβ５４７９でＨｉｓに変化し、Ｖａｌ２７６は菌株５４８５でＡｌａに変化し、そしてＡｓｐ２３０は菌株β５４８６でＡｓｎに変化した。この様に、ｔｈｙＡのミスセンス変異体Ｃｙｓ１４６Ｖａｌの抑制の表現型も、アミノ−酪酸に対する感受性を示す。これらのクローンのそれぞれが、遺伝子ｖａｌＳ内に異なる位置の変異を有することが明らかとなり。これがＥ．コリにおけるバリル−ｔＲＮＡ合成酵素の活性を多様化する手段として選択的スクリーニングを有効にしている。
【０１０６】
β５４５６，β５５２０及びβ５４９８と引用された変異体のＥ．コリの菌株は、上文の例５で言及した様に、そして上文の例５及び８に記載した選択手順に従い、変異菌株β５４１９から得られた。
【表２】
2004518404.tif 000004
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年3月26日(2002.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質を産生する能力を細胞に獲得せしめる方法であって、以下の段階：
ａ）前記細胞の増殖に必要なタンパク質であって、変異された遺伝子から合成された結果もはや機能的でなくなるタンパク質をコードする遺伝子の標的コドンにおける少なくとも１つのミスセンス変異の誘導による、前記細胞の形質転換、
ｂ）その様に変異した前記タンパク質の機能性の損失を補うための栄養素を含む培養液中での、段階ａ）で得られた細胞の任意な培養、
ｃ）前記標的コドンによってコードされるアミノ酸を含む培養液中での、段階ａ）又はｂ）で得られた細胞の培養、
を含んで成る方法、によって得られる細胞であって、
ＣＮＣＭ（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ）に寄託された以下の細胞：
ａ）２０００年４月２８日にＩ−２４６７の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
ｂ）２０００年４月２８日にＩ−２４６８の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、
ｃ）２０００年４月２８日にＩ−２４６９の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株、及び
ｄ）２０００年４月２８日にＩ−２４７０の番号のもとＣＮＣＭに寄託されたＥ．コリの菌株。
から選択されることを特徴とする、細胞。
【請求項２】
アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含んで成るタンパク質の産生のための、請求項１に記載の細胞の使用。
【請求項３】
アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含むタンパク質の産生方法であって、以下の段階、
ａ）請求項１に記載の細胞の、前記細胞の増殖せしめる培養液中での、且つ培養条件での培養；及び
ｂ）段階ｂ）で得られた培養上清及び／又は細胞の残査からの、少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含んで成る前記タンパク質の単離、
を含む方法。
【請求項４】
前記細胞を増殖せしめる段階ｂ）の前記培養液が前記の非慣用アミノ酸又はその前駆体の１つを含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記の非慣用アミノ酸が、前記細胞によって合成されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の非慣用アミノ酸が、前記細胞の遺伝子の修飾によって増大されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が前記標的コドンによってコードされるアミノ酸について栄養要求性であることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、コード配列が少なくとも１つの標的コドンを含む、注目の同種又は異種遺伝子を含むことを特徴とする、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
段階ａ）が、注目の前記遺伝子によってコードされるタンパク質の合成の誘導に必要な化合物を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
注目の前記遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性が、注目の前記遺伝子の標的コドンにおける前記の非慣用アミノ酸の組み込み後に少なくとも部分的に保持されることを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
非慣用アミノ酸がＬ配置の式Ｉ
【化１】
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（ここで、Ｒ１又はＲ２は、選択的に官能基を含む遊離基を表す）
の非慣用アミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
官能基が、アルデヒド、ケトン、エテニル、エチニル又はニトリル基から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質の官能化のための、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質を精製するための方法であって、以下の段階：
ａ）前記タンパク質のアミノ酸配列における、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の方法による選択的に反応しうる官能基を含む非慣用アミノ酸の組み込み；
ｂ）段階ａ）で得られたタンパク質を含む溶液を、前記官能基と特異的に反応し、且つ前記タンパク質を特異的に固定することができる化合物を含んで成る支持体と接触させること；及び
ｃ）支持体上に固定された前記タンパク質の単離、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１５】
タンパク質を化合物又は生化学的化合物上に固定する方法であって、以下の段階：
ａ）前記タンパク質のアミノ酸配列における、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の方法による選択的に反応しうる官能基を含む非慣用アミノ酸の組み込み；
ｂ）段階ａ）で得られたタンパク質を、反応が可能な培地中で前記官能基と特異的に反応しうる基を含んで成る化合物又は生化学的化合物を含んで成る支持体と接触させること、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記化合物又は生化学的化合物が固体の支持体上に固定されるもの自体であり、又は固体の支持体を構成する化合物であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質複合体を調製するための、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記の固定されたタンパク質あるいは前記化合物又は生化学的化合物が、治療、化粧又は診断用の化合物から選択されることを特徴とする、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物又は生化学的化合物が、固定されたタンパク質の生物学的活性を修飾しうる化合物から選択されることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
化合物又は生化学的化合物が、固定されたタンパク質によって生物学的活性が修飾されうる化合物から選択されることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物又は生化学的化合物が、タンパク質、ポリヌクレオチド、脂肪酸、糖又は天然若しくは合成のポリマーを含む化合物から選択されることを特徴とする、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項３〜１５のいずれか１項に記載の方法によって得られるタンパク質であって、アミノ酸配列が少なくとも１つの非慣用アミノ酸を含む組換えタンパク質に関する、タンパク質。
【請求項２３】
請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法によって得られるタンパク質複合体であって、アミノ酸配列が官能基を含む非慣用アミノ酸を含む組換えタンパク質、及び前記官能基と反応しうる基を含んで成る化合物又は生化学的化合物を含むことを特徴とする、タンパク質複合体。
【請求項２４】
請求項２２に記載のタンパク質、又は請求項２３に記載のタンパク質複合体の、診断用試薬としての使用。
【請求項２５】
請求項２２に記載のタンパク質、又は請求項２３に記載のタンパク質複合体を利用することを特徴とする、診断方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載のタンパク質、又は請求項２３に記載のタンパク質複合体を含むことを特徴とする、診断用キット。
【請求項２７】
医薬又は化粧用の組成物の製造のための、請求項２２に記載のタンパク質、請求項２３に記載のタンパク質複合体、又は請求項１に記載の細胞の使用。
【請求項２８】
請求項２２に記載のタンパク質、請求項２３に記載のタンパク質複合体、又は請求項１に記載の細胞を含んで成る医薬又は化粧用の組成物。
【国際調査報告】
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