(57)【要約】本発明は、プローブを用いて表面から物体を選択的に除去する方法である。プローブは、多くの物体が表面から除去されるように力のより大きな相対量を用いて表面上を走査する。物体を表面から除去するのに要する力は、フックの法則とプローブのばね定数を用いて計算することができる。表面との結合親和性が相対的に弱い物体を除去した後、残存している物体を収集し、確認し、実験に供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物体と表面との間の結合親和性を決定する方法であって、
少なくとも１つの物体を表面に付着する工程と、
該表面上の少なくとも１つの物体に力を加えて該表面に対する結合親和性が比較的小さい少なくとも１つの物体を除去する工程と、
少なくとも１つの物体に加えた該力をモニターする工程と、
少なくとも１つの物体と少なくとも１つの物体を除去するために加えた該力から少なくとも１つの物体と該表面との間の結合親和性を計算する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
走査型プローブ顕微鏡が、原子間力顕微鏡である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該力が少なくとも１つの物体に原子間力顕微鏡を用いて加えられる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
加えた該力によって該表面から除去された少なくとも１つの物体を集める工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該表面を再び走査して該表面上の少なくとも１つの物体の位置を決める工程を更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
（ａ）加えた該力を増加して該表面を走査する工程と、
（ｂ）該力の増加により除去された物体を集める工程と、
を更に含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
加えた該力を連続して増加させる工程（ａ）と工程（ｂ）とを繰り返す工程を更に含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該表面から少なくとも１つの物体を収集する工程を更に含む、請求項６記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの物体が、タンパク質、核酸、抗体、細胞、ウイルス、及びファージ粒子からなる群より選ばれる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
物体と１種以上の物質との間の結合親和性を決定する方法であって、
１種以上の物質が更に沈着した表面を得る工程と、
調べるべき少なくとも１つの物体を、該表面上に沈着した１種以上の該物質に付着する工程と、
少なくとも１つの物体に力を加えて少なくとも１つの物体を除去する工程と、
該物体と対応する該物質との間の結合親和性を、該物体を除去するために加えた該力から計算する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項１１】
該物体を対応する該物質から除去するのに要する該力をモニターする工程を更に含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該表面を走査型プローブ顕微鏡で走査して少なくとも１つの物体の位置を決める工程を更に含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
該表面を走査する工程と該力を少なくとも１つの物体に加える工程とが、液体媒体中で行われる、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
対応する該物質から除去された少なくとも１つの物体を集める工程を更に含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
加量的に増加した力を少なくとも１つの物体に加える工程と、
加えた該力の増加によって除去された少なくとも１つの物体を集める工程と、を更に含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
該表面上に残っている少なくとも１つの物体を収集する工程を更に含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該結合親和性相互作用が、分子相互作用である、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
決定した該結合親和性が、タンパク質相互作用を含んでいる、請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
決定した該結合親和性が、核酸相互作用を含んでいる、請求項１０記載の方法。
【請求項２０】
決定した該結合親和性が、抗体／抗原相互作用を含んでいる、請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
決定した該結合親和性が、レセプター／リガンド相互作用を含んでいる、請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
決定した該結合親和性が、細胞／細胞相互作用を含んでいる、請求項１０記載の方法。
【請求項２３】
決定した該結合親和性が、細胞／基質相互作用を含んでいる、請求項１０記載の方法。
【請求項２４】
決定した該結合親和性が、ウイルス／ウイルス相互作用を含んでいる、請求項１０記載の方法。
【請求項２５】
決定した該結合親和性が、ウイルス／基質相互作用を含んでいる、請求項１０記載の方法。
【請求項２６】
物体と表面との間の相互作用の力を評価する方法であって、
少なくとも１つの物質を表面上に沈着させる工程と、
少なくとも１つの物体を、該表面上に沈着させた該物質に付着する工程と、
該表面を原子間力顕微鏡で走査して、該表面に付着した少なくとも１つの物体の位置を決める工程と、
該原子間力顕微鏡で少なくとも１つの物体に力を加え、該力が使用者によって決定され、かつ該物体の一部がその力によって該表面から除去される工程と、
該表面を走査して、該表面になお付着している少なくとも１つの該物体の位置を決める工程と、
該原子間力顕微鏡を用いて該表面上の少なくとも１つの該物体に第２のより大きな力を加える工程と、
該表面になお付着している少なくとも１つの物体を集める工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２７】
物体と表面との間の結合親和性を決定する方法であって、
（ａ）１つ以上の物体を表面上に沈着させる工程と、
（ｂ）該表面を原子間力顕微鏡で走査して、該表面上の該物体の位置を決める工程と、
（ｃ）該原子間力顕微鏡で該表面上の少なくとも１つの物体に第１の力を加えて結合親和性が相対的に小さい該表面から少なくとも１つの物体を除去する工程と、
（ｄ）第１の該力によって該表面から除去された少なくとも１つの物体を集める工程と、
（ｅ）該原子間力顕微鏡を用いて少なくとも１つの物体に、より大きな第２の力を加えて、結合親和性が相対的に小さい該表面から少なくとも１つの物体を除去する工程と、
（ｆ）第２の該力によって該表面から除去された少なくとも１つの物体を集める工程と、
（ｇ）工程（ｂ）〜工程（ｆ）を繰り返す工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２８】
物体と表面上に沈着した物質との間の結合親和性を決定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの物質を表面上に沈着させる工程と、
（ｂ）少なくとも１つの物体を少なくとも１つの物質に結合させる工程と、
（ｃ）原子間力顕微鏡で該表面上の少なくとも１つの物体に第１の力を加える工程と、
（ｄ）第１の該力によって該表面から除去された少なくとも１つの物体を集める工程と、
（ｅ）該原子間力顕微鏡を用いて、少なくとも１つの物体に第２の力を加えて該表面から少なくとも１つの物体を除去する工程と、
（ｆ）第２の該力によって該表面から除去された少なくとも１つの物体を集める工程と、
（ｇ）工程（ｂ）〜工程（ｆ）を繰り返す工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２９】
加えた該力から、該物体と該表面上に沈着した該物体と該物質との間の最低結合親和性を計算する工程を更に含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
非特異的結合相互作用を用いて該物体を沈着させる、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
共有結合相互作用を用いて該物体を沈着させる、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
該物体が、タンパク質、核酸、抗体、細胞、又はウイルスからなる群の１種以上より選ばれる、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
該相互作用の力が、抗体と抗原との間にある、請求項２８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
優先権
本出願は、２０００年１０月１０日出願の米国仮特許出願第６０／２３８，５５６号と２００１年１０月９日出願の米国非仮特許出願第　　　　　号の優先権を主張する。仮特許出願第６０／２３８，５５６号と米国非仮特許出願第　　　　　号の開示内容はすべて本願明細書に含まれるものとする。
【０００２】
技術分野
本発明は、表面に結合した物体、又は表面上の物質をそれらの間の相互作用的分子力の関数として分析する方法である。更に詳細には、本発明は、結合親和性によって物体を識別評価する方法である。
【０００３】
背景
物質、分子、細胞間の結合親和性を測定することは、材料の開発、半導体の製造、生物学的分析、生物医学的診断、又は薬剤の発見を含むがこれらに限定されない広範囲の研究の鍵である。固体配列に基づく生物学的分析機器や遺伝子診断用機器及び関連装置の出現とともに、小型化された固体形態において多くの反応をコスト的に有効にスクリーニングする新規な方法がますます求められてきた。
これまでの好ましい方法は、蛍光標識した既知の分子が既知の分子化合物と分子配列の特定のアドレスで相互作用するときの光学的性質、通常は蛍光の変化をモニターする方法である。しかしながら、これらの装置と方法は分子配列の問い合わせを行うために用いられる分子にリポーターシステムを加えることにより立体化学的束縛がしばしば課されている。更に、これらの方法は、実際の結合親和性を直接報告するものではない。従って、マイクロメカニカルリポーターを用いた分子結合親和性の問い合わせを標識なしに直接行うことが有用であることは明らかである。この問い合わせを行う更に複雑で丈夫な方法が様々な表面に結合、吸着、或いは付着した異なる物体の範囲を良好に分析するために必要である。
【０００４】
分子又は他の物体が表面に結合しているかを直接検出する方法、又は表面上の物体を直接検出する方法が走査型プローブ顕微鏡である。走査型プローブ顕微鏡の一つが原子間力顕微鏡（“ＡＦＭ”）である。ＡＦＭには尖ったプローブが可撓性カンチレバーの端に位置し、試料表面上を走査する。走査しながら、プローブとカンチレバーはプローブの先端と表面及び／又は表面上に付着した物体との間の親和力と斥力の正味の合計によってたわむ。カンチレバーのたわみは、通常は、“光レバー”又は“ビームたわみ”メカニズムを構成するスプリットフォトダイオードにカンチレバーの裏から焦点レーザビームを反射させることにより測定される。たわみの変化によって、表面上の物体の存在が示される。これらの以前の方法は、プローブと表面上に結合した物質との間に生じた力の相互作用を示すためにプローブに結合した物質を利用したものであった。カンチレバーのたわみを検出する他の方法には、干渉計や圧電歪ゲージが含まれる。
【０００５】
最初のＡＦＭはカンチレバーの縦の変位だけを記録したものであった。最近の方法には、ねじれ力を記録すること、先端を共振させること、プローブと試料との間に一時的にのみ接触させ、ある場合には全く接触させないことが含まれる。試料表面を横切るプローブの先端変位のプロット、又は共振変化を用いてトポグラフィ像を作成する。その画像からマテリアル、化学、又は生物の試料を含む様々な種類の試料の三次元構造がわかる。後者の試料には、ＤＮＡ、タンパク質、クロマチン、染色体、イオンチャネル、生細胞さえも含まれる。しかしながら、これらの以前の方法は、プローブに結合してから表面上の種々の物質を横切って引っ張られることができる複合体に限定される。この方法に限定されない新規な方法が求められている。
画像化性能のほかに、ＡＦＭは微少な力を測定することができる。ＡＦＭは、力をマイクロニュートン（１０−６）〜ピコニュートン（１０−１２）の範囲で直接感知測定することができる。従って、ＡＦＭは分子対や単一分子にさえ力を加えるとともにそれらの間の力を測定することができる。更に、ＡＦＭは磁場、熱勾配又は粘弾性のような様々な他の力や現象を測定し加えることもできる。その性能は、試料表面上の力の場を走査し、かつそれらの場の位置と大きさを、例えば、個々の表面上に位置する問題の局在複合体のように高分解能で明らかにするために利用することができる。更に、分子力を更に測定するために、ＡＦＭプローブは問題の分子で機能化することもできる。
【０００６】
表面に結合した物体を除去するために必要な機械的力を評価する以前の方法には、１種以上の物体を表面に反復して結合させるようなコンビナトリアルケミストリー技術に続いて物体を洗い流すことが含まれた。この方法では物体が表面にどのようによく結合又は吸着するかという確認は集団の平均に基づいて求められた。表面上に存在する物体を移動させるのに要する力を確認する結果となるその方法のコスト的に有効で実施しやすい改良が求められている。
表面に結合した分子、細胞、又は他の物体の親和性を急速に評価する簡便で効率のよい方法が求められている。その方法は、プローブに付着しつつ表面を横切って物質を引っ張らねばならず、集団試料全体に基づいて親和性を決定するためにマイクロタイタープレートを順次洗浄しなければならないという従来技術の制限を克服しなければならない。その方法は、表面に結合した物体と他の物質との間の結合親和性を定量することを可能にしなければならない。最後に、より強固に結合した物体を調べるために収集し得るように問題の表面上に弱く結合した物体を除去する方法が求められている。
【０００７】
要約
本発明は、加えた力を調節することにより表面上に結合している物体を差別的に分離及び／又は除去するために力の変換デバイスを用いる方法である。加えた力を加量的に増加することにより、表面と表面上の物体との間の結合強度を決定することができる。物体としては、分子、ウイルス、細胞、ファージ、又は他の有機又は無機分子が含まれるがこれらに限定されない。表面に対して結合親和性の高いものを分類するために多くの結合相互作用を迅速で安価にスクリーニングするパターン形成面上でプロセスが行われ得る。本発明は、また、物体と表面上に載置された物質との間の結合親和性を確認するために利用し得る。
ＡＦＭとそれに装着されたプローブが表面上を走査するので、プローブの先端がぶつかる物体を押し、プローブのねじれとたわみを生じる。先端によって或る物体に加えらる力は、プローブのねじれと縦の双方のばね定数に関係がある。ねじれ及び／又は縦のプローブ変位の測定は、物体と表面との間の結合親和性を定性的と定量的の評価に使用し得る。縦の力については、ばね定数は加えた力を計算するために用いられる。ねじれに基づく測定については、プローブのねじれ度を測定し、プローブの既知のねじりばね定数をかけて観察されたねじり運動度に必要な力に対応する値を出すことができる。更に、表面から除去された各グループの物体は調べるために集めることができる。
【０００８】
本発明は、特異結合性をもった物質、薬剤と薬剤阻害剤、生体分子結合力を描写する診断分析、タンパク質−タンパク質相互作用スクリーン、ウイルス−抗体結合スクリーン等を開発研究するのに特に用いることができる。
本発明には、また、物体と表面との間の結合親和性を決定する方法であって、少なくとも１つの物体を表面にくっつける工程と、走査型プローブ顕微鏡で該表面を走査して該表面にくっつけた少なくとも１つの物体の位置を決める工程と、表面に対する結合親和性が相対的に低い少なくとも１つの物体を除去するために表面上の少なくとも１つの物体に力を加える工程と、少なくとも１つの物体に加えた力をモニターする工程と、少なくとも１つの物体と表面との間の結合親和性を少なくとも１つの物体を除去するために加えた力から計算する工程を含む、前記方法が含まれる。
本発明の他の実施態様には、物体と１種以上の物質との間の結合親和性を決定する方法であって、付着した１種以上の物質を更に含む表面を得る工程と、調べるべき少なくとも１つの物体を該表面上に付着した１種以上の物質にくっつける工程と、走査型プローブ顕微鏡で該表面を走査して少なくとも１つの物体の位置を決める工程と、少なくとも１つの物体を除去するために少なくとも１つの物体に力を加える工程と
を含む、前記方法が含まれる。
【０００９】
本発明の他の実施態様には、物体と表面との間の相互作用の力を評価する方法であって、少なくとも１つの物質を表面上に付着させる工程と、該表面上に付着させた該物質に少なくとも１つの物体をくっつける工程と、該表面を原子間力顕微鏡で走査して該表面にくっつけた少なくとも１つの物体の位置を決める工程と、該原子間力顕微鏡で少なくとも１つの物体に力を加え、該力が使用者によって決定され、該物体の一部がその力によって該表面から除去する工程と、該表面を走査して該表面になおくっついている少なくとも１つの該物体の位置を決める工程と、該原子間力顕微鏡を用いて該表面上の少なくとも１つの該物体により大きな第２の力を加える工程と、該表面になおくっついている少なくとも１つの物体を集める工程とを含む、前記方法が含まれる。
【００１０】
本発明の他の実施態様には、物体と表面間の結合親和性を決定する方法であって、（ａ）１種以上の物体を表面上に付着させる工程と、（ｂ）原子間力顕微鏡で該表面を走査して該表面上の該物体の位置を決める工程と、（ｃ）該原子間力顕微鏡で少なくとも１つの物体に第１の力を加えて結合親和性の相対的に小さい該表面から少なくとも１つの物体を除去する工程と、（ｄ）該第１の力によって該表面から除去された少なくとも１つの物体を集める工程と、（ｅ）該原子間力顕微鏡を用いて少なくとも１つの物体により大きな第２の力を加えて結合親和性の相対的に小さい該表面から少なくとも１つの物体を除去する工程と、（ｆ）該第２の力によって該表面から除去された少なくとも１つの物体を集める工程と、（ｇ）工程（ｂ）〜工程（ｆ）を繰り返す工程とを含む、前記方法が含まれる。
他の実施態様には、物体と表面上に付着した物質との間の結合親和性を決定する方法であって、（ａ）少なくとも１つの物質を表面上に付着させる工程と、（ｂ）少なくとも１つの物体を少なくとも１つの物質に結合する工程と、（ｃ）原始間力顕微鏡で該表面上の少なくとも１つの物体に第１の力を加える工程と、（ｄ）該第１の力で該表面から除去された少なくとも１つの物体を集める工程と、（ｅ）該原子間力顕微鏡を用いて該表面上の少なくとも１つの物体に第２の力を加える工程と、（ｆ）該第２の力によって該表面から除去された少なくとも１つの物体を集める工程と、（ｇ）工程（ｂ）〜工程（ｆ）を繰り返す工程とを含む、前記方法が含まれる。
【００１１】
実施態様の説明
本発明においては、“物体”という用語は、表面に結合し得る、また、ＡＦＭプローブのようなプローブを用いて検出及び／又は除去し得る物質を含むように用いられる。物体は、調べるのに興味深い無機分子、有機分子、生体分子、タンパク質、ファージ粒子、細胞等であってもよい。物体は表面に結合又は吸着し、その後に走査され、表面に対する物体の結合親和性によって除去される。物体は表面上に付着させた他の物質にも結合することができる。更に、“結合”という用語は、共有結合に限定されず、吸着、イオン結合、又は特異的又は非特異的分子相互作用を含む他の種類の分子結合を含んでもよい。
“相対的に”という用語は、調べるべき物体上にプローブによって加えられる力の量を記載するために用いられる。相対的にという用語は、単に力が物体を除去するのに十分大きいか或いは物体が除去されないほど小さいかによって力を記載する。本明細書に用いられる“相対的に小さい”力は、物体を表面から移すのに要する量より小さい力を記載する。それ故、相対的に小さい結合親和力は、力が加えられるときに物体が表面から除去される結果となる結合親和性である。相対的に高い結合親和性は、加えられる力に耐えるのに十分強い結合親和性である。“設定値”は、プローブが物体上に加えるために使用者が望む力の量である。
【００１２】
本発明は、表面上の物体に力を加えるために標準ＡＦＭプローブを用いる。標準ＡＦＭプローブにはプローブと先端が含まれる。プローブはＡＦＭに接続している。プローブのたわみが加えられた力を決定するために用いられ、本明細書に更に説明される。先端が表面を横切って走査するので表面とそれに結合した物体に接触している。評価することができるように、カスタムプローブ又は他のハードウエア部品が装着され、ＡＦＭ、又は他の機器化によって表面を移動することができる。機器と、プローブと、先端は、表面か又は表面上に付着した物質に結合した物体に所望の力を加えるのに十分正確であることだけが必要とされる。
最後に、本説明は、物体と表面、又は結合している表面上の物質との間の引力を一般に意味する“結合親和性”という用語を用いる。表面に結合した物質は、ランダムに結合してもよく、表面上に配列を作る特定の付着ドメインに配置されてもよい。付着物質と、その配列は、同時係属米国出願第０９／５７４，５１９号に記載され、この明細書の記載は教示しているすべてについて本願明細書に含まれるものとする。
図１ａ〜図１ｃと図２ａ〜図２ｂによって、本発明の方法の概要が記載される。後に、装置の種々の部品の詳細な説明が行われ、続いて個々の実施例が記載される。
【００１３】
方法
図１ａは、１種以上の物体１２が結合する表面を示す図である。物体１２は、当業者に既知の結合相互作用の方法を用いて表面１０に結合する。物質が表面に結合することができる種々の方法には、共有結合法、非共有結合法、自然結合法、静電結合法、又は当業者に既知の他の方法が含まれる。物体１２は、タンパク質又は細胞のような無機又は有機分子、又はファージ粒子のような粒子であってもよい。表面１０と物体１２は、本明細書に更に記載される。
図１ａに示されるように、本発明はプローブ１４を更に含む。本明細書に用いられるプローブ１４は、ディジタルインスツルメンツ、サンタバーバラ、カリフォルニア州から入手できるような標準的窒化ケイ素原子間力顕微鏡プローブである（図示せず）。プローブは、ディジタルインスツルメンツから入手できるＡＦＭ機器に装着されている。図１ａに示されるように、プローブ１４は先端１６を更に含むことができる。先端１６は、表面１０と実際に接触するプローブの部分であり、更に説明される。
【００１４】
表面１０（物体１２とともに）は、ＡＦＭフローセルやＡＦＭスキャンが行われる液体媒体中に配置される。液体媒体は当業者によって選択されてもよく、実験中の表面１０と物体１２に左右される。
本実施態様においては、ＡＦＭは表面を走査しかつ物体１２の位置を検出するために用いられる。図１ｂに示されるように、先端１６は表面１０上の物体に接触し、用いられるＡＦＭスキャニングのタイプによっては物体１２の上に乗っている。プローブ１４が物体１２と接触した状態にある時間、プローブ１４はプローブ１４と物体１２との相互作用のためにたわむ。プローブ１４のたわみはＡＦＭ機器化によって追跡され、それで物体１２の位置と大きさを決定し記録し得る。スキャンを行うためにＡＦＭを用いることは、当業者に周知であり、本発明の方法の使用者が表面１０に結合した物体１２の最初の位置を決定することを可能にする。本発明は、物体が本発明の方法の間に表面から除去されるときを決定するためにその工程を用いる。代替的実施態様においては、物体１２の位置を決める工程は本発明の本質と範囲を変更せずに省略することができる。他の実施態様においては、物体１２の位置は、表面１０上に特定の配列で載置されたことから既に知られていてもよい。
【００１５】
物体１２の位置が一旦決まると、次にＡＦＭの設定値が上げられる。設定値の増大は実験的に決定することができる。同様に、設定値は物体１２の異なる結合親和性の著しい層化を可能にする非常に微細な量で増やすことができる。設定値を増大すると表面１０上の物体１２に加えられる力の量が増加する。
第２スキャン中、設定値の力は表面１０上にある物体１２に加えられる。プローブ１４の先端１６が物体１２に接触するとき、力が物体１２を移動又は変位するのに要するものより小さい場合には、先端１６とプローブ１４は図１ｂに示されるように物体１２上に乗る。この場合、物体１２と表面１０との相対的に高い結合親和性は物体１２に加えられた相対的に小さい力によっては分解されない。先端１６とプローブ１４によって加えられる力が物体１２と表面１０との間の結合親和性より相対的に大きい場合には、物体１２が表面から除去されてしまう。図１ｃを参照されたい。
【００１６】
当業者によって更に評価されることができるように、プローブ１４は加えられる力が物体１２と表面１０との間の結合親和性を打ち勝つまで物体１２に加えられている力によってたわむことができる。このプローブ１４のたわみは、ＡＦＭ機器化によってモニターされる。この方法で表面１０全体が走査され、ＡＦＭ機器によって物体１２が除去されたことについてのデータが集められ、それぞれの除去された物体１２に対するプローブのたわみ度についてのデータも集められる。実施態様においては、たわみ度はそれぞれの設定値の力で除去される物体１２の結合親和性を決定するために後に利用し得る。代替的実施態様においては、結合親和性は加えられる設定値の力に関係するように決定することができる。
本発明の方法の次の工程においては、除去した物体１２を確認と後続実験のために集めることができる。本発明の方法において除去された物体１２は、フローセルの液体媒体に懸濁される。フローセルから分子と他の物質を集めることは、当業者に周知であり、標準法で行うことができる。集めた物体１２は、確認と後続実験のためにその方法で収集することができる。代替的実施態様においては、表面１０になお結合している物体１２も確認と実験のために収集することができる。代替的実施態様においては、付着ドメインが既知の位置の既知の物質を含む場合、物体１２が除去された位置を決めるために表面１０を再び走査すると、何の物質の結合親和性が相対的に高く相対的に低いかを確認のために物体１２を集めなければならないことなく使用者に知らせることができる。
【００１７】
本実施態様の次の工程においては、表面上に残っている物体の位置を決めるためにＡＦＭが用いられる。評価することができるように、設定値が表面１０に対する選択物体１２の結合親和性に比べて相対的に大きく設定された場合、加えた力は物体のすべてを除去することができる。同様に、設定値が相対的に小さく設定された場合には、加えた力は表面１０上の物体１２のわずかしか除去されず、或いは全く除去されない。残存している物体１２の位置が一旦求められると、プローブ１４と先端１６が次のスキャンで物体１２により大きな力を加えるように予め決められた量によって設定値が上げられる。
当業者によって認められるように、物体１２の位置を決める工程、物体１２に力を加える工程、次に溶液に移った物体１２を収集する工程のサイクルを多数回繰り返すことができる。表面１０上に配置された種々の物体１２によっては、表面１０から除去するのに要する異なる力の範囲が小さくても大きくてもよい。
【００１８】
力の加量的増加が特に小さい場合には、それぞれの実験中に除去される物体１２と物体１２の表面１０との間の結合親和性は既知の設定値の力から概算し得る。代替的実施態様においては、プローブのたわみ度は結合親和性を別個に計算するために利用し得る（後述される）。加量的力がより大きな量に増やす場合、プローブのたわみ度を用いることは物体１２と表面１０との間の相対結合親和性と絶対結合親和性を決定する最も正確な方法である。より小さな加量的設定値の力が物体１２に加えられる場合、結合親和性は異なる結合親和性の階層を決定するために加えられる設定値の力に相関することができる。
評価することができるように、本発明の方法は、第１物体１２と第２物体との間の結合親和性を調べるために特に用いられる。第１物体１２を表面に結合することができ、それに第２物体を結合することができる。第１物体から第２物体を分離することによって、使用者が２つの物体１２間の結合親和性を確認することを可能にすることができる。その相互作用には、相補的核酸と部分相補的核酸、薬剤候補分子とそれらの分子標的、細菌又は細菌群、ウイルス、バクテリオファージ、植物と動物細胞の部分的又は完全プロテオームを構成するタンパク質、又はすべての変種の物質と系が含まれてもよいがこれらに限定されない。
本発明の方法は、反復ベンチケミストリーと一連の連続したマイクロタイタープレート実験の利用を必要としないことから特に有利である。更に、本発明は、種々の結合親和性を同時に比較するために、異なるいろいろな種類の物体１２が同じ表面、又は表面上に付着した同じ物質に結合し得ることから有利である。
【００１９】
装置
ここで、本発明を十分に説明するために本発明の要素の説明に着手する。
物体１２は、機械的蒸着、インサイチュ化学合成、“インクジェット”印刷、又は他の蒸着法、例えば、溶液からの吸着、生体分子の認識、又は非共有結合又は共有結合の化学結合を含むがこれらに限定されない当業者に既知の方法で表面に配置、付着、接続、又は吸着させることができる。物体１２は、研究に興味深い分子、生体分子、例えば、タンパク質又は細胞、無機分子、又は他の粒子、例えば、ファージ粒子であってもよい。更に、研究用物体を本発明の本質と範囲を変更せずに表面１０上に配置させることができる。
代替的実施態様の結合親和性は下記を含むことができる。
自然吸着　この方法においては、物質を溶液から直接表面に吸着させることができる。付着過程は必ずしも十分に定義されず、物体が吸着しているようでも一様である。付着メカニズムには、静電成分、疎水成分又は他の成分が含まれてもよい。
【００２０】
特定静電相互作用　この方法においては、特定静電特性をもつ表面が生成する。例えば、ポリ−Ｌ−リシンを表面に吸着させることができ、正電荷の分布が相対的に一様な表面が生成する。次に、物質の負に荷電した部分と正に荷電した表面との間の相互作用によってポリ−Ｌ−リシン被覆表面に物質を吸着させる。電解質と種々のｐＨのバッファーを含有することができる周囲の溶液の変更が物質の表面への結合の強さに影響し得る。
特定疎水性相互作用　この方法においては、特定疎水性表面が生成し、物質に結合する。一例として、基質を金でコーティングし、続いて末端（遠位）メチル基を有するアルカンチオレートで処理することにより疎水性表面が調製される。次にこの表面を物質の付着基質として用いる。疎水性ドメインの強い物質は、疎水性ドメインの弱いものより遠位メチル基に強固に結合する。
共有結合　ある場合には、表面に共有結合した物質と非共有結合で結合した物質とを区別することが望ましい。その場合、特定の化学的カップリングケミストリーを用いることができる。
【００２１】
電気蒸着　この方法においては、電場によって生成した力で表面に物質が引きつけられる。非対称ＡＣ又はＤＣ電界を用いることができ、それぞれ誘電泳動又は電気泳動の環境が生じる。上記のように自然メカニズムで物質を表面に付着させ、付着はより特定されたカップリング法を含むこともできる。ある場合には、還元−酸化（レドックス）反応が付着している物質と表面との間で起こってしまい、表面間に共有結合カップリングが生じる。この方法については、表面は通常導電性であり、電極に結合している。第２電極は、回路を完成させかつ電場を生成させるシステム内に存在する。
化学架橋　この方法においては、特定の化学的特性を有する標準法で表面を調製する。例えば、ガラス表面は遠位遊離アミノ基を有するシラン誘導体で被覆することができる。シラン表面を安定化するために側方架橋した後、物質を表面に添加するとともに当該技術において周知である第一アミンを含む多くの化学反応によってカップリングすることができる。
【００２２】
上記結合相互作用のいずれもが本発明の本質と範囲を変更せずに本発明を用いて確認することができる。
前述のように、本実施態様の表面１０はスパッタ付着金層が堆積したガラスからできている。その表面は、スパッタ付着金層で被覆したカバーグラスが当該技術において周知であり容易に得られる（製造される）ことから特に用いられる。スパッタ付着金層を有するスライドガラスは、表面１０の性質が平滑でかつ一貫していることから特に用いられる。金をスパッタリングすると非常に平滑な表面を与えることができ、種々の化学分子結合を行うことができる。金表面が上記の理由から有利であるが、他の被覆又は被覆のない表面も本発明の本質と範囲を変更せずに用いることができる。
他の実施態様においては、金は平滑なシリコン、石英又は同様の平坦面、例えば、雲母、変性Ｓｉ、（ポリ）テトラフルオロエチレン、機能化シラン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、又はその組合わせにスパッタ付着することができる。下地基質に必要とされる平滑さは、具体的な試験に要求される感受性の関数である。より小さな物体を用いる結合親和性分析には、満足な結果を得るためにより均一な表面が必要とされる。実験中の物体と結合親和性によっては、受容することができかつ物体１２に強く結合し得る表面１０が所望される。
【００２３】
表面１０に残る物体１２は、表面１０に結合した物体１２に限定することができる。他の実施態様においては、表面１０は表面に結合した１種、数種、又は百以上の物体を含むことができる。各物体は、既知の領域又は不明の領域に結合することができ、標準ＡＦＭスキャンを用いることにより求められる。更に、物体１２は具体的な種類の分子又は粒子であってもよく、相対する結合親和性を決定するために同時に実験される種々の分子、生体分子、又は粒子であってもよい。
当業者によって評価されることができるように、プローブ１４と先端１６はユニットを含むことができる。ＡＦＭはプローブ１４と先端１６の移動を制御するので、物体１２に力を加える。改良されていないＡＦＭプローブは５〜４０ ｎｍであってもよい極率半径をもつ尖った点を有する。本明細書の方法は、１０〜５０ ｎｍオーダーの先端半径をもつ微小製造プローブを用いる。本発明の方法においては、所望の結果を得るのに必要なミクロファイン制御をもつ標準的使用可能機器であることからプローブを移動するためにＡＦＭが用いられる。本方法に用いるのに特に適したそのような機器は、ディジタルインスツルメンツ社、サンタバーバラ、カリフォルニア州から入手できるディメンション３１００である。他の実施態様においては、プローブと先端を制御するために他の種類の走査型プローブ顕微鏡を含む他の制御装置を用いることができる。
【００２４】
プローブ１４が物体１２に直接接触する場合、物体とプローブ１４の間に縦の力が存在し、その力は物体を一方向に押そうとする。評価することができるように、また、図２ａと図２ｂに示されるように、先端１６はプローブ１４のねじれを生じるような方法で的から外れて接触することができる。そのような状態では、プローブ１４は物体１２との縦とねじれ双方の力の相互作用を受ける。物体１２は、縦の力とねじれの力を受ける。これにより、図１ａに示されるように先端１６とプローブ１４の縦の変位が生じるが、図２ｂに示されるようにプローブ１６のねじれも生じてしまう。しかしながら、ＡＦＭ機器化は、プローブ１４の曲げとねじれで示されるように存在するねじれと縦の双方の力を同時に読取ることができる。次に縦の力とねじれの力双方を用いて表面１０又は物体１２に加えられる力の量を決定することができる。
プローブ１４のばね定数が既知であるので、物体１２が表面１０から除去される点までとその点を含む物体１２に加えられる力はフックの法則： Ｆ＝ｋＸ（式中、Ｆは力であり、ｋはばね定数であり、Ｘは変位距離である。）を用いて容易に計算し得る。
【００２５】
表面１０から物体１２、又は表面１０に結合した付着物質を移すのに要する負荷度は、物体１２が表面１０においてもつ結合力と直接相関し得る。プローブ１４のねじれと、先端と表面１０との間の摩擦相互作用は、量的測定を複雑にし得るが、相対的力の測定は容易に得られる。
本実施態様においては、物体１２が除去される点までとその点を含むＡＦＭプローブのたわみをモニターすることにより縦に加えた力を測定する。評価することができるように、物体１２に加えられる増加力とプローブによってかかる測定との間のずれ時間によって、直接測定されない物体に加えられる力の量が生じてしまう。しかしながら、このギャップはＡＦＭ機器化又はコンピュータにより計算することができる。
【００２６】
実施例１： 分子力パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
本実施例においては、本発明は表面１０に結合する抗原から抗体を選択的に除去するために用いられる。そのときに抗体と抗原間の結合親和性が求められる。本実施例は、付着したウサギＩｇＧと抗ウサギＩｇＧ間の結合親和性を測定するために本発明をどのように用いることができるかを示すものである。
本実施例の表面は、スパッタ付着金層で被覆されたスライドガラスからなる。ウサギＩｇＧは非特異的結合相互作用によって金表面に結合する。次に表面を水性画像化環境を含むＡＦＭフローセルの中に挿入する。緩衝溶液は、ＡＦＭのピエゾとウサギＩｇＧが載置された表面間に閉じ込められるｐＨ ７．５の２０ミリモルＰＢＳ溶液である。本実施態様においては、ウサギＩｇＧは表面上にランダムに載置され、表面を走査して表面上の抗原の位置を決定する。評価することができるように、抗原は多くの方法を用いて表面上の既知の位置に載置することができるので、既知の位置と大きさのドメインが残る。他の実施態様においては、抗体／抗原複合体は表面上にランダムでかつ不明の位置にある。結合親和性の定量は、本発明を用いてなお容易に行うことができる。抗原を含む溶液に表面を浸漬するような種々の付着手法を用いることもできる。
【００２７】
抗体の添加は、１マイクロリットルの０．１ ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳをフローセルへマイクロピペット注入することにより行われる。次に表面を標準ＡＦＭスキャンとプローブを用いて走査して抗原／抗体相互作用の位置を決定する。ＡＦＭの設定値レベルを上げた後、次のスキャンを用いる。プローブのたわみを注意深くモニターすると、抗原／抗体複合体との接触が起こる場所がわかる。次に設定値の加量的増加を行い、加えた力のかなり狭い範囲内で抗体が抗原から除去される結果となる。狭い範囲内での抗体の除去は、複合体が均一に同一であることから予想される。設定値の力のそれぞれの増加間で標準ＡＦＭスキャンを行うことにより、抗原／抗体複合体が分離するときの指示が援助される。それらの相対的結合親和性を決定するために、抗原／抗体を分解するのに要する力に相関する力の値を用いることができる。結合親和性は、抗原抗体複合体が除去されるときにＡＦＭ機器化によってモニターされるプローブのたわみとして計算することもできる。
評価することができるように、上記実施例は多くの異なる抗原で繰り返して対応する抗体に対する相対的結合親和性を決定することができる。他の実施態様においては、種々の抗体又は抗原を同時に実験してそれぞれの相対的結合親和性を決定することができる。抗体が種々の力レベルで引き離されることは、画像化水溶液を集めるとともにその力の設定値で除去される抗体を決定する確認試験を行うことにより決定することができる。
他の実施態様においては、全複合体が高設定値スキャン中に除去されないことを保証するように抗原／抗体複合体を表面に結合することができる。
【００２８】
実施例２： ファージとウイルスの相互作用の選択に基づく親和性の力のパニング
図３ａ〜図３ｃに示されるように、弱く結合したウイルス又はファージ粒子を表面から除去して表面に対する結合親和性の高い粒子の収集と同定を可能にするために力のパニングを用いることもできる。ファージディスプレイは、ファージ粒子の表面上の潜在的に所望される組換えタンパク質の全体を表示する当該技術において既知の方法である。ファージは、表面上に特定のタンパク質を産生するように操作される。タンパク質の非常に大きなコンビナトリアルライブラリーをファージの表面に表示させることができ、スクリーニングメカニズムによって選択することができる。一旦選択されると、所望のファージを増殖させることができ、所望の性質をもつ分子を精製及び同定することができる。これは組換え生体分子の大きなライブラリーを分析する強力な方法である。
ファージ集団が一旦構築されると、問題の分子を表示しているいくつかのファージを見つけるために選別することができる。従来、これはディスプレイ分子が結合する分子で被覆されたマイクロタイター皿からのファージを結合と洗浄を繰り返すことにより行われた。力のパニングは、この煩雑な方法の多くの制限を克服するものである。
【００２９】
本発明の実施例においては、フィブロネクチンに結合する細胞内マトリックスタンパク質が用いられる。本実施例は、フィブロネクチンに結合する種々のタンパク質がどのように結合親和性によって微分することができるかを示すものである。
ファージを標準法で作製し精製する。本実施例に用いられる表面はスパッタ付着金で被覆されたガラスである。フィブロネクチンを自発的かつ非特異的結合相互作用によって表面に結合し、ファージが複合体を形成させる。評価することができるように、代替的実施態様においては、フィブロネクチンは表面又は表面上に付着した付着物質に共有結合で或いは固定して結合することができる。
フィブロネクチンに結合しない過剰のファージは、金表面から洗浄することができる。次にフィブロネクチンとファージの複合体を有する表面をＡＦＭ機器に配置し、小さく加えた力で画像化して結合複合体の位置を決定する。次に設定値を加量的に上げてフブロネクチン／ファージ複合体に加える力を増加させる。次にゆるく結合したファージ粒子をそれぞれの設定値の加えた力によって表面から除去し、上にある溶液に拡散する。用いた溶液は、トリスバッファー、ｐＨ ７．２、ＮａＣｌ（１００ ｍＭ）を含有する結合バッファーである。このバッファーと他のバッファーを含有する他の溶液も所望されるときに用いることができる。この方法が行われる溶液は、力のパニング法によって表面から除去されるファージ粒子の除去を増やすために循環させるか或いは画像化チャンバに流し込むことができる。それぞれ加量的に増加した力で除去されたファージを集め、実験のために同定した。ファージのすべてが除去されるか又はある設定値に達した後に停止されるまで力を増大することができる。最後に力を加えた後に表面上に残っているファージを実験のために集めることもできる。
【００３０】
力のパニング後に表面に結合したままのファージを集めるためにいくつかの方法を用いることができる。ある方法は、所望される場合には溶液に残っているファージの除去を容易にするトゥイーン８０のような界面活性剤を含有する高塩（例えば、５００ ｍＭ ＮａＣｌ）溶液で表面を洗浄することであってもよい。これは、次に最大結合親和性を有するものを増殖及び分析するファージ粒子源として使用し得る。
ファージを集める代替的方法は、続いて回収するために表面からファージ粒子を集めることができる付着層（例えば、この例ではフィブロネクチン）で被覆されたＡＦＭプローブを用いることである。この方法には、表面からプローブへファージの移動を最適にする相対的結合力の微調整が必要である。
【００３１】
実施例３： 細胞−表面相互作用の選択に基づく親和性の力のパニング
他の実施例においては、細胞が種々の表面とその表面上に付着した物質に結合する強さを分析するために力のパニングを用いることができる。細胞と表面間の接着力は、種々の生理的機能の重要なパラメーターである。例えば、血液細胞が動脈壁に強固に結合する場合、血流の遮断が起こることがあり、結果として生理的機能障害或いは死さえも引き起こす。本発明の方法は、異なる種類の細胞と種々の表面間の接着力の量の確認を援助するために用いることができる。その方法は、問題の細胞に対して接着性の低い或いは高い表面を確認することを可能にする。（この例では、細胞は従来の分子相互作用の意味で表面に結合されなくてもよく、非特異的相互作用によって表面に付着してもよい。）この手法は、細胞や他の生物学的物質を付着する生物学的システムに用いられる物質の可能性を決定するために用いることができる。
本実施例においては、赤血球は第１合成ポリマー（ポリマー１）で被覆したガラスに結合させる（図４ａ）。結合後、細胞を本発明の方法に供して結合親和性を決定する。スキャンは生理的溶液（例えば、ＰＢＳ）中で行われ、表面から細胞を除去するのに要する力がわかる。次に同じ細胞種を第２ポリマー（ポリマー２）で被覆された表面に結合させ、この方法を繰り返す（図５ａ）。それぞれの表面から細胞を除去するのに必要な力を比較することにより、赤血球を結合する能力或いは結合しない能力について比較することができる。接着性の測定は、プローブによって加えられたねじれと縦の力に基づくものであり得る。定量的測定は、細胞を移すために用いられる力を計算することにより得ることができる。
【００３２】
代替的実施態様においては、種々のポリマーはコンタクト印刷又はインクジェット印刷により表面に“印刷”することができる。次にこの表面を赤血球とインキュベートし、精査中のポリマーすべてについて単一の力のパニング実験で同時に試験する。
図４ｂにおいては、細胞は走査法によって生成される力より小さい力で表面に結合している。細胞結合力が小さいことから、大多数の細胞が走査中に表面から移る。図５ｂにおいては、細胞は走査法によって生成される力より大きい力で表面に結合している。細胞は設定値の力を加える表面を走査するＡＦＭによって移っていない。この方法を変更することにより、使用者は細胞／表面結合の強さに関して定量的情報を得ることができる。
代替的実施態様においては、特殊なＡＦＭプローブを用いて細胞損傷をできるだけ少なくする。特殊なプローブは、ＡＦＭプローブの末端に微小粒子を結合することにより“刃先をなくす”ことができる。プローブの末端に微小粒子を結合することは、同時係属米国出願第０９／５７４，５１９号に記載されている。刃先のないプローブは分析される細胞をスライスする機会を減少させ、鍬のように作用して軟らかい細胞に対して破壊させずに押しやる。
【００３３】
他の代替的実施態様においては、細胞−基質相互作用に関与するタンパク質を同定し得るように細胞を分離し多数に増殖させることができる。組換えタンパク質を含む細胞の場合には、この方法は細胞がある種の望ましい特性をもつ細胞表面タンパク質を増幅するために使用し得る点でファージディスプレイ法に似ているとみなすことができる。
他の代替的実施態様においては、各物体に加えられる力は物体に加えられる反復連続した力の影響を決定するために一定のままであってもよい。評価することができるように、他の実験は表面、又は表面上に付着した物質に対する物体の結合親和性を分析するために行うことができる。
本明細書に記載される情報と実施例は、例示のためであり、本発明の概念上の文脈の範囲内にある誘導体又は代替法を除外することを意味しない。本発明の範囲から逸脱することなく本実施態様にさまざまな逸脱がなされ得ることが企図される。従って、本発明の範囲は本実施態様の上記の説明よりは前述の特許請求の範囲によって決定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａは表面上の物体に接触し、物体に縦の力を加えているプローブの側面図である。
図１ｂは表面上の物体の先端に乗っている図１のプローブの断面図である。
図１ｃは図１ａの物体を離れているプローブの縦の力の断面図である。
【図２】
図２ａは表面上の物体に近いプローブの断面図である。
図２ｂはねじれ力を加え、表面上の物体に乗っているプローブの断面図である。
【図３】
図３ａはプローブが表面を走査する前の表面に付着した多くのファージ粒子を含む表面の正面斜視図である。
図３ｂは弱く結合したファージ粒子が表面をプローブで走査することにより除去された後の図３ａの表面の正面斜視図である。
【図４】
図４ａは表面上に結合した細胞の分布の正面斜視図である。
図４ｂは多くの細胞が除去されているプローブで走査した後の図４ａの細胞の正面斜視図である。
【図５】
図５ａは表面上に結合した細胞の分布の正面透視図である。
図５ｂはいくつかの細胞が除去されているプローブで走査した後の図５ａの細胞の正面透視図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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