(57)【要約】本発明は、ポリヌクレオチドサンプル中の核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドを単離する方法に関する。その方法は、選択的スプライシング事象およびそれに対応するスプライシングアイソフォームを検出かつ同定するのに、かつゲノム間のゲノムＤＮＡ差異を検出するのに有用であるだろう。本発明による方法は、一本鎖トラップの使用に基づく。一本鎖トラップは、一本鎖結合タンパク質の使用を含むことが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドサンプル中の核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドを単離する方法であって、
少なくとも１つの内部一本鎖領域を含有するヘテロ二重鎖（ＩＳＳＲＨ）を一本鎖トラップ（ＳＳＴ）で選択する段階を含み、前記ＩＳＳＲＨが前記関連ポリヌクレオチド間で形成され、前記内部一本鎖領域が前記核酸差異を表し、かつＳＳＴが、二本鎖ポリヌクレオチドと比較して一本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的な親和性を有する認識エレメント（ＲＥ）の使用を含む方法。
【請求項２】
以下の段階：
（ａ）前記関連ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドサンプルを得る段階；
（ｂ）核酸差異を有する前記関連ポリヌクレオチド間でＩＳＳＲＨを形成させるために、前記サンプルに存在するポリヌクレオチドをアニーリングする段階；
（ｃ）一本鎖トラップを用いて、前記ＩＳＳＲＨを選択する段階；を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドのサイズを低減する段階をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アニーリング段階（ｂ）の前に前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドを変性させる段階を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記段階（ｃ）の前にＩＳＳＲＨの内部一本鎖領域以外の一本鎖領域を除去する段階を含む、請求項２〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記段階（ｂ）の後、段階（ｃ）の前に得られたポリヌクレオチドを平滑末端化する段階を含む、請求項２〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドの末端にアダプターをライゲートする段階を含む、請求項２〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記アダプターが、前記ポリヌクレオチドの末端から完全にまたは一部除去される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記一本鎖トラップによって選択された前記ＩＳＳＲＨを増幅する段階を含む、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記関連ポリヌクレオチドの前記単離が繰り返し行われる、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
前記の単離された関連ポリヌクレオチドをクローン化する最終段階を含む、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドサンプルが、単一ソース、環境または生理的条件からのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドサンプルが、少なくとも２種類の異なるソース、環境または生理的条件からのポリヌクレオチドの混合物を含む、請求項１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドサンプルがｃＤＮＡを含む、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドサンプルがゲノムＤＮＡを含む、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドサンプルが、単一遺伝子または限定セットの遺伝子に由来するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドサンプルが、複合ポリヌクレオチド混合物である、請求項１〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
前記一本鎖トラップが、二本鎖ＤＮＡと比較して一本鎖ＤＮＡに対して選択的な親和性を有する認識エレメント（ＲＥ）の使用を含む、請求項１〜１７の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
前記一本鎖トラップが、以下の段階：
ａ）前記ＩＳＳＲＨ中の前記内部一本鎖領域を前記ＲＥに結合させ、続いてヘテロ二重鎖−認識エレメント（ＩＳＳＲＨ−ＲＥ）複合体を含有する内部一本鎖領域を形成させる条件下にて、前記サンプルを前記ＲＥと混合する段階；
ｂ）前記ＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体を前記サンプルから分離する段階；を含む、請求項１〜１８の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
前記一本鎖トラップが、以下の段階：
ａ）前記ＲＥを固定化する段階；
ｂ）前記の固定化されたＲＥを前記アニール化されたサンプルと接触させて、前記ＩＳＳＲＨ中の前記内部一本鎖領域を前記ＲＥと結合させ、続いて、内部一本鎖領域含有ヘテロ二重鎖−認識エレメント（ＩＳＳＲＨ−ＲＥ）複合体を形成する段階；
ｃ）未結合のポリヌクレオチドを除去する段階；
を含む、請求項１〜１８の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
前記関連ポリヌクレオチドを前記ＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体から回収する段階を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＥが一本鎖結合タンパク質である、請求項１〜２１の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
前記一本鎖結合タンパク質が大腸菌ＳＳＢである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＥが、ベンゾイル化−ナフトイル化−ＤＥＡＥ−セルロース、ベントナイト上のメチル化アルブミンおよび珪藻土上のメチル化アルブミンからなる群から選択される物質である、請求項１〜２１の何れかに記載の方法
【請求項２５】
前記ＲＥがベンゾイル化−ナフトイル化−ＤＥＡＥ−セルロースである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸差異が少なくとも６個のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む、請求項１〜２５の何れかに記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６の何れかに記載の方法によって得られる、単離または精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項１〜２６の何れかに記載の方法によって得られる、核酸差異を有するポリヌクレオチドにおいて濃縮されたライブラリー。
【請求項２９】
請求項１〜２６の何れかに記載の方法を用いて同定された核酸差異と、厳密な条件下にて特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
請求項１〜２６の何れかに記載の方法によって得ることができるＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体。
【請求項３１】
請求項１〜２６の何れかに記載の方法によって得るＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体。
【請求項３２】
ポリヌクレオチドサンプル中の核酸差異を有するポリヌクレオチドを単離するためのキットであって、
ａ）前記サンプル中に存在するポリヌクレオチドをアニールするための試薬；
ｂ）二本鎖ポリヌクレオチドと比較して一本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的な親和性を有する認識エレメント；
ｃ）前記ＲＥによって一本鎖領域を選択するための試薬；を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、かつ異なるソース、起源、環境または異なる生理的状況に由来するポリヌクレオチド間の核酸の差異を同定かつクローン化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
所定の遺伝子のヌクレオチド配列は、単一種内の個体間で、単一個体内の細胞間で、同一細胞内の両染色体間で異なる。かかる差異は、挿入、欠失、点突然変異によって、または細菌、カビ、菌類およびウイルスによる感染により外来ＤＮＡもしくはＲＮＡを獲得することによって、ＤＮＡの遺伝的変異または環境変化から生じる可能性がある。例えば、病原体による、所定の薬物に対する突然の耐性獲得は、欠失によって、またはゲノム中の新しい配列の獲得によって生じる。あるいは、病原は、ゲノム領域の挿入または欠失の結果生じる。例えば、遺伝性精神遅滞の最も一般的な原因である脆弱Ｘ症候群は、リボソーム停止によりタンパク質合成が抑制される結果となる、脆弱ＸｍＲＮＡの５’非翻訳領域における複数のＣＧＣトリヌクレオチドの挿入が一部原因である（Ｆｅｎｇ 等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８： ７３１−４， １９９５）。ヌクレオチド配列の変化は、細胞に大きな影響を及ぼし得る。例えば、多くの腫瘍および多くの遺伝病は、特定のヌクレオチド配列の変化、または変異に起因する。タンパク質をコードするヌクレオチド配列の変異によって、変化したポリペプチド配列、場合によっては、変化した生物活性を有するタンパク質が生成される結果となり得る。単一タンパク質の活性の変化は時として、生物体全体の生理機能に大きな影響を及ぼし得る。
【０００３】
癌および遺伝病を治療するための、有効な予防的診断法および治療法を開発するために、疾患発生の一因となる遺伝子突然変異を最初に同定しなければならない。通常、突然変異は、その正常配列が既に分かっているクローン化遺伝子の研究で同定されている（例えば、Ｓｕｚａｎｎｅ 等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： ２１７，１９８９； Ｋｅｒｅｍ 等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５： １０７３，１９８９を参照のこと）。つまり、遺伝子は最初に、疾患に関連すると同定され、疾患状態と相関する特定の配列変化が引き続き同定される。
【０００４】
ゲノムＤＮＡの変異に加えて、ヌクレオチド配列の変異もまた、単一遺伝子から転写された、異なるメッセンジャーＲＮＡ分子間で起こる。実際、一部の遺伝子のプレｍＲＮＡが様々な方法でスプライスされて、異なるｍＲＮＡが産生され、したがって異なる機能を示すタンパク質アイソフォームが合成される。かかる選択的スプライシングは、細胞の型、発生の段階、または細胞の化学的もしくは物理的環境によって異なる。プレｍＲＮＡの選択的スプライシングは、遺伝子発現の定量的制御に影響を及ぼし、タンパク質の機能的多様性をもたらし得る、強力かつ可変性な調節メカニズムである。
【０００５】
遺伝子発現を調節するメカニズムとして、選択的スプライシングが普及することによって、それは、ヒト疾患を引き起こす変化に対する非常に可能性の高い標的となる。スプライシング機構は、いくつかの状況で変化し得る。例えば、遺伝子突然変異は、生理的なスプライシング部位を不活性化、または潜在的なスプライシング部位を明らかにすることによって、スプライシングのプロフィールを乱し得る。特に、遺伝子点突然変異は、スプライシング接合部を変化させるか、または除去し、異常に切断された転写物、または正常に欠失したエクソンを含有する、かつ／もしくは正常に存在する別のエクソンを含まない転写物のいずれかを生じる正常なスプライシングを妨げる可能性がある。
【０００６】
スプライシング変化の多数の例が、疾患またはそれに関連した障害と関連している。実際に、疾患に関連する遺伝子突然変異の１５％が、ＲＮＡスプライシングのプロセスを変化させる。多くの癌関連遺伝子が選択的にスプライスされ、それらの発現によって、多数のスプライス変異体が産生される（ＭｅｒｃａｔａｎｔｅおよびＫｏｌｅ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０００，８５： ２３７−４３）。これらの大部分の変異体の機能は明確に定義されていないが、一部は、細胞死制御機構に関連する拮抗活性を有する。数多くの癌および癌細胞株では、スプライス変異体の比は頻繁にシフトし、そのため、抗アポトーシスのスプライス変異体が優勢である。したがって、これらのスプライス変異体のキャラクタリゼーションによって、新規な治療標的を同定し、新規な薬物および新規な診断手段をデザインすることができる。
【０００７】
様々な技術が、核酸の配列変異を同定するのに用いられている。例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析では、ヌクレオチド配列の突然変異または変化により生じた制限部位を検出し（Ｋａｎ 等， Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ： ９１０，１９７８参照）；変性勾配ゲル電気泳動法および一本鎖ＤＮＡ電気泳動移動度の研究では、電気泳動ゲルにおけるバンドの移動度の変化によってヌクレオチド配列の差異を同定し（Ｍｙｅｒｓ等， Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ４９５，１９８５； Ｏｒｉｔａ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ２７６６，１９８９参照）；化学的な切断分析では、ヘテロ二重鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ部位を同定し（Ｃｏｔｔｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ４３９７， １９８８参照）；ＲＮアーゼ切断分析では、ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＲＮＡヘテロ二重鎖におけるミスマッチ部位を同定する（Ｍｙｅｒｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： １２４２， １９８５； Ｍａｎｉａｔｉｓ 等 ，米国特許第４，９４６，７７３号参照）。
【０００８】
核酸差異を同定する上述の方法それぞれに関する重大な問題は、対象の遺伝子の予備知識が一般に必要とされることである。
かかる差異を示す遺伝子の予備知識なく、核酸差異を検出し、最終的に続いて同定するために、最近３つの方法が開発されている。これらの方法は、関連ポリヌクレオチドの相補鎖を互いにアニールし、核酸差異以外は二重鎖分子を形成し、したがってヘテロ二重鎖を形成することができるであろうという事実に基づいている。その差異が単一ヌクレオチドの差異または小さな挿入もしくは欠失にある場合、ミスマッチした二重鎖が形成される。その差異が大きなヌクレオチド領域を含む場合、内部一本鎖領域を有する二重鎖が形成される。
【０００９】
その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号：ＷＯ９９／３６５７５には、核酸の２つのソース集団内でのハイブリダイゼーションから形成されたミスマッチ二重鎖核酸分子を、ＭｕｔＳなどのミスマッチ二重鎖に結合することができる酵素を用いてサンプルの残りから単離する方法が開示されている。しかしながら、この技術は、数個のヌクレオチドのミスマッチ領域よりも大きい内部一本鎖領域を含有するヘテロ二重鎖には適用されない。
【００１０】
その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９２２，５３５号には、異なる集団からの核酸鎖を互いにハイブリダイズさせ、その結果ヘテロ二重鎖が形成される方法が開示されている。次いで、ヘテロ二重鎖に依存する手法でそれらのヘテロ二重鎖を切断し、切断産物を単離し、核酸集団において異なる遺伝子配列を同定するのに使用する。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号：ＷＯ９９／４６０４３には、ヘテロ二重鎖の内部ループを、かかるヘテロ二重鎖の二本鎖領域を消化することによって回収する方法が開示されている。しかしながら、これらの最後から２つの方法は、その断片のみを単離することはできるが、核酸差異を含有する完全長ポリヌクレオチドを直接単離することができない。
【００１１】
本発明は、核酸差異を有する関連ポリヌクレオチド、または前記核酸差異を取り囲む領域を含む、その断片を単離する方法であって、前記核酸差異が、ヌクレオチドの大きな領域の挿入もしくは欠失、または置換にある方法を開示する。かかる方法は特に、ゲノム挿入／または欠失、選択的スプライシング事象および配列伸長の反復を単離することに対して興味深い。これらの技術の利点の一つは、核酸差異のみならず、フランキング配列、および前記核酸差異を含む完全長ポリヌクレオチドでさえも単離することである。次いで、かかる完全長ポリヌクレオチドは、いくつかの用途、例えばクローニングおよび／またはシークエンスに利用できる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ポリヌクレオチドサンプルにおける核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドの単離方法に関し、前記方法は、少なくとも１つの内部一本鎖領域を含有するヘテロ二重鎖（本明細書ではＩＳＳＲＨと呼ぶ）を一本鎖トラップ（本明細書ではＳＳＴと呼ぶ）で選択することを含み、前記ＩＳＳＲＨは前記関連ポリヌクレオチド間で形成され、かつ前記内部一本鎖領域は前記核酸差異を表す。
【００１３】
本発明の実施形態において、前記一本鎖トラップは、二本鎖ポリヌクレオチドと比較して、一本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的な親和性を有する認識エレメント（ＲＥ）の使用を含む。本発明の好ましい実施形態では、前記一本鎖トラップは、二本鎖ＤＮＡと比較して、一本鎖ＤＮＡに選択的な親和性を有する認識エレメント（ＲＥ）の使用を含む。さらに好ましい実施形態では、前記ＲＥは、ＲＮＡと比較してＤＮＡに選択的な親和性を有する。さらに好ましい実施形態では、前記ＲＥは、一本鎖ＤＮＡを選択するのに用いられる条件下にて、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡと比較して、一本鎖ＤＮＡに選択的な親和性を有する。
【００１４】
他の好ましい実施形態では、前記ＲＥは抗体である。他の好ましい実施形態では、前記ＲＥはペプチドである。さらに他の好ましい実施形態において、前記ＲＥはタンパク質である。さらに好ましくは、前記ＲＥは、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）である。またさらに好ましくは、前記ＲＥは、大腸菌ＳＳＢ、ファージＴ４の遺伝子３２の産物、アデノウイルスＤＢＰおよび子ウシ胸腺ＵＰ１からなる群から選択される。さらに好ましくは、前記ＲＥは大腸菌ＳＳＢである。さらに他の好ましい実施形態において、前記ＲＥは、ベンゾイル化−ナフトイル化−ＤＥＡＥ−セルロース（ＢＮＤＣ）、ベントナイト上のメチル化アルブミン（ＭＡＢ）および珪藻土上のメチル化アルブミン（ＭＡＫ）からなる群から選択される物質である。前記ＲＥは、ＢＮＤＣであることがさらに好ましい。
【００１５】
一実施形態において、前記ポリヌクレオチドサンプルは、一本鎖ポリヌクレオチドを含有する。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、（＋）鎖および（−）鎖のどちらも含むことが好ましい。他の実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルは、二本鎖ポリヌクレオチドを含有する。その他の実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルは、一本鎖分子および二本鎖分子のどちらも含有する。
【００１６】
一実施形態において、前記ポリヌクレオチドサンプルはＤＮＡを含有する。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルはｃＤＮＡを含有する。他の好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルはゲノムＤＮＡを含有する。他の好ましい実施形態では、ＲＮＡを含有し、好ましくはｍＲＮＡを含有する。さらに他の実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルは、ＤＮＡおよびＲＮＡのどちらも、好ましくはｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのどちらも含有する。
【００１７】
一実施形態において、前記ポリヌクレオチドサンプルは、単一ソースまたは単一環境または単一生理的条件に由来するポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルは、少なくとも２種類の異なるソース、環境または生理的条件に由来するサンプルからのポリヌクレオチドの混合物を含む。
【００１８】
一実施形態において、前記ポリヌクレオチドサンプルは、単一遺伝子または限定セットの遺伝子由来のポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルは、単一遺伝子または遺伝子の限定セット由来のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドサンプルは、複合ポリヌクレオチド混合物を含む。好ましい実施形態において、そのポリヌクレオチド混合物は、ｃＤＮＡ収集物、ｍＲＮＡ収集物、またはｃＤＮＡ収集物とｍＲＮＡ収集物の両方を含む。
【００１９】
特に、本発明は、ポリヌクレオチドサンプルにおける核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドの単離方法に関するものであり、前記方法は、以下の段階：
（ａ）前記関連ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドサンプルを得る段階；
（ｂ）前記サンプルに存在するポリヌクレオチドをアニールして、前記関連ポリヌクレオチド間でＩＳＳＲＨを形成させる段階；
（ｃ）一本鎖トラップを用いて、前記ＩＳＳＲＨを選択する段階；を含む。
【００２０】
任意に、前記方法は、好ましくは断片化によって、さらに好ましくはシングルパスＤＮＡシークエンスに適したサイズに、ポリヌクレオチドのサイズを低減する追加の段階を含む。その低減段階は、段階（ｃ）の前、さらに好ましくは段階（ｂ）の前に行うことが好ましい。
【００２１】
任意に、前記方法は、アニーリング段階（ｂ）前に前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドを変性させる追加の段階を含む。
任意に、前記方法は、ＩＳＳＲＨの内部一本鎖領域以外の一本鎖領域を除去する追加の段階を含み、前記追加の段階は段階（ｃ）の前に行う。
【００２２】
任意に、前記方法は、段階（ｂ）の後に得られたポリヌクレオチドを平滑末端化する追加の段階を含み、前記追加の段階は、好ましくは段階（ｃ）の後、さらに好ましくは浄化段階後に行う。
任意に、その方法は、ポリヌクレオチド末端にオリゴヌクレオチドアダプターをライゲートする追加の段階を含む。前記方法は、段階（ｂ）の後に、ポリヌクレオチドの末端にオリゴヌクレオチドアダプターをライゲートする追加の段階を含むことが好ましい。前記ライゲーション段階は、前記浄化段階後、前記平滑末端化段階後、または前記浄化および平滑末端化段階の後に、行うことがさらに好ましい。任意に、前記方法は、好ましくは増幅段階後、さらに好ましくは増幅段階後およびクローニング段階または核酸差異を含有する関連ポリヌクレオチドの単離の別のサイクルの前に、ポリヌクレオチドの末端からアダプターを完全にまたは一部除去する追加の段階を含む。
【００２３】
任意に、前記方法は、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、前記一本鎖トラップによって選択されたＩＳＳＲＨを増幅する追加の段階を含む。
任意に、前記単離方法は、数回、好ましくは１、２、３または５回繰り返し行ってもよい。
【００２４】
任意に、前記単離方法は、前記の単離されたポリヌクレオチドをクローン化する最終段階を含む。
任意に、前記単離方法は、前記の単離されたポリヌクレオチドの前記核酸差異を、好ましくはＤＮＡシークエンスを用いて同定する最終段階を含む。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、ＤＮＡサンプルにおいて核酸差異を有する関連ＤＮＡ分子を単離する方法に関し、前記方法は、以下の段階：
ａ）前記関連ポリヌクレオチドを含有するＤＮＡサンプルを得る段階：
ｂ）前記サンプル中のＤＮＡ分子を変性させる段階：
ｃ）前記の変性されたＤＮＡ分子をアニールして、前記関連ＤＮＡ分子間でＩＳＳＲＨを形成させる段階；
ｄ）ＩＳＳＲＨの内部一本鎖領域以外の一本鎖領域を除去する段階；
ｅ）一本鎖トラップを用いて、前記ＩＳＳＲＨを選択する段階；
ｆ）前記一本鎖トラップによって選択されたＩＳＳＲＨを、ＰＣＲを用いて増幅する段階；を含む。
【００２６】
任意に前記方法は、好ましくは断片化によって、さらに好ましくはシングルパスＤＮＡシークエンスに適したサイズに、ＤＮＡ分子のサイズを低減する追加の段階を含む。その低減段階は、段階（ｅ）の前、さらに好ましくは段階（ｂ）の前に行うことが好ましい。任意に、前記方法は、段階（ｃ）後および段階（ｅ）前に得られたポリヌクレオチドを平滑末端化する追加の段階を含む。
【００２７】
他の実施形態において、本発明は、ＤＮＡサンプル中の核酸差異を有する関連ＤＮＡ分子の単離方法に関し、前記方法は、以下の段階：
ａ）前記関連ＤＮＡ分子を含有するＤＮＡサンプルを得る段階；
ｂ）前記サンプル中のＤＮＡ分子を変性させる段階；
ｃ）前記変性ＤＮＡ分子をアニールして、前記関連ＤＮＡ分子間でＩＳＳＲＨを形成させる段階；
ｅ）前記ＩＳＳＲＨの末端にアダプターをライゲートする段階；
ｆ）一本鎖トラップを用いて、前記ＩＳＳＲＨを選択する段階；
ｇ）前記一本鎖トラップによって選択された前記ＩＳＳＲＨを、ＰＣＲを用いて増幅する段階；を含む。
【００２８】
任意に、前記方法は、好ましくは断片化によって、さらに好ましくはシングルパスＤＮＡシークエンスに適したサイズに、ＤＮＡ分子のサイズを低減する追加の段階を含む。その低減段階は、段階（ｆ）の前、さらに好ましくは段階（ｂ）の前に行うことが好ましい。任意に、前記方法は、段階（ｃ）後および段階（ｅ）前に得られたポリヌクレオチドを平滑末端化する追加の段階を含む。任意に、前記方法は、前記の増幅されたＩＳＳＲＨの末端から前記アダプターを完全にまたは一部除去する追加の段階を含む。
【００２９】
好ましい実施形態において、本発明の方法のいずれかにおける前記ＩＳＳＲＨの選択は、以下の段階：
ｉ）前記ＩＳＳＲＨ内の前記内部一本鎖領域を前記ＲＥに結合させ、続いて内部一本鎖領域含有ヘテロ二重鎖−認識エレメント（ＩＳＳＲＨ−ＲＥ）複合体を形成させる条件下にて、前記サンプルを前記ＲＥと混合する段階；
ｉｉ）前記サンプルから前記ＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体を分離する段階；を含む。
【００３０】
代替方法としては、前記一本鎖トラップは、以下の段階：
ｉ）前記ＲＥを固定化する段階；
ｉｉ）前記の固定化されたＲＥを前記のアニールしたサンプルと接触させて、前記ＩＳＳＲＨ内の前記内部一本鎖領域を前記ＲＥに結合させ、続いて、内部一本鎖領域含有ヘテロ二重鎖−認識エレメント（ＩＳＳＲＨ−ＲＥ）複合体を形成させる段階；
ｉｉｉ）未結合ポリヌクレオチドを除去する段階；を含む。
【００３１】
任意に、本発明のいずれかの選択方法は、前記ＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体から前記関連ポリヌクレオチドを回収する追加の段階を含むことが可能である。
特に、本発明は、選択的スプライシングにかけられたポリヌクレオチドを単離する方法であって、
ａ）スプライシングアイソフォームを含有する二本鎖ｃＤＮＡサンプルを得る段階；
ｂ）前記ｃＤＮＡを変性させて、一本鎖ｃＤＮＡを得る段階；
ｃ）異なるスプライシングアイソフォームからの一本鎖ｃＤＮＡ間でＩＳＳＲＨを形成させる条件下にて、前記一本鎖ｃＤＮＡをアニールする段階であって、内部一本鎖領域が前記選択的スプライシング事象を含む段階；
ｄ）前記ＩＳＳＲＨの内部一本鎖領域以外の一本鎖領域を除去する段階；
ｅ）平滑末端化されたｃＤＮＡの末端にアダプターをライゲートする段階；
ｆ）ＳＳＴを用いて、前記ＩＳＳＲＨを選択する段階；
ｇ）前記の選択されたｃＤＮＡを増幅する段階；を含む方法に関する。
【００３２】
任意に、前記方法は、段階（ｃ）後および段階（ｅ）前に得られたポリヌクレオチドを平滑末端化する追加の段階を含む。任意に、前記方法は、好ましくは断片化によって、ポリヌクレオチドのサイズが低減される、追加の低減段階を含む。その低減段階は、段階（ｃ）の前、さらに好ましくは段階（ｂ）の前に行うことが好ましい。
【００３３】
一実施形態において、前記ｃＤＮＡサンプルは、単一ソース、単一環境または単一生理的条件に由来するポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、前記ｃＤＮＡサンプルは、少なくとも２種類の異なるソース、環境または生理的条件に由来するサンプルからのポリヌクレオチドの混合物を含む。
【００３４】
一実施形態において、前記ｃＤＮＡサンプルは、単一遺伝子または限定セットの遺伝子由来のｃＤＮＡを含む。他の実施形態では、ｃＤＮＡサンプルは、複合ポリヌクレオチド混合物を含む。好ましい実施形態では、ｃＤＮＡ混合物は、ｃＤＮＡ収集物、ｍＲＮＡ収集物、またはｃＤＮＡ収集物およびｍＲＮＡ収集物のどちらも含む。
【００３５】
本発明は、本発明の方法のいずれかを実施するためのキットもまた包含する。
本発明は、本発明のいずれかの方法によって得ることができるＩＳＳＲＨ−ＲＥを包含する。本発明は、本発明のいずれかの方法によって得られたＩＳＳＲＨ−ＲＥもまた包含する。
【００３６】
本発明は、本発明の方法のいずれかを用いて得られたライブラリーもまた包含する。前記ライブラリーは、少なくとも１つの核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドにおいて濃縮されることが好ましい。前記ライブラリーは、選択的スプライシングアイソフォームまたは選択的スプライシング事象において濃縮されることがさらに好ましい。
【００３７】
本発明は、本発明のいずれかの方法を用いて単離されたいずれかのポリヌクレオチド、またはその断片を包含する。前記の単離されたポリヌクレオチドは、核酸差異を有するポリヌクレオチドであることが好ましい。一実施形態において、前記の単離されたポリヌクレオチドは、選択的スプライシングによって同一遺伝子から誘導される。好ましい実施形態では、前記の単離されたポリヌクレオチドは、他方のポリヌクレオチドと比較して、一方のポリヌクレオチド中に少なくとも１つのエクソンまたはエクソンの一部が存在することで異なる。他の好ましい実施形態では、前記の単離されたポリヌクレオチドは、一方のポリヌクレオチド中の１つのエクソンが他方のポリヌクレオチド中の異なるエクソンと置換されることで異なる。他の実施形態では、前記の単離されたポリヌクレオチドは、同一遺伝子の突然変異体と比較して、１つの遺伝子のヌクレオチド配列の挿入、欠失または置換によって異なる。
【００３８】
本発明は、好ましくは厳密な条件下にて、好ましくは特異的に、本発明のいずれかの方法を用いて単離されたポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドもまた包含する。前記ポリヌクレオチドは、好ましくは厳密な条件下にて、好ましくは特異的に、本発明の方法のいずれかを用いて単離された核酸とハイブリダイズできることが好ましい。
【００３９】
一実施形態において、前記核酸差異は、少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、５０００、１００００または５００００個のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む。前記核酸差異は、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、５００、１０００、１５００、３０００または５０００個のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含むことが好ましい。前記核酸差異は、１２、１５、１８、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、または５００個のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含むことがさらに好ましい。前記核酸差異は、１５、１８、２０、２５、５０、７５、１００、または１５０個のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含むことがまたさらに好ましい。
【００４０】
本発明は、すべてのオリゴヌクレオチド、好ましくは、本発明のいずれかの方法によって単離されたポリヌクレオチドを用いて核酸差異を検出するようデザインすることが可能なプライマーおよびプローブもまた包含する。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明は、ポリヌクレオチドサンプル中の核酸差異を含有する関連ポリヌクレオチドを単離する方法を説明する。核酸差異のかかる単離方法は、本発明の核心である一本鎖トラップ（ＳＳＴ）の使用を特徴とする。
【００４２】
特に、本発明は、ポリヌクレオチドサンプル中の核酸差異を含有する関連ポリヌクレオチドを単離することに関し、前記方法は、内部一本鎖領域を含有するヘテロ二重鎖（ＩＳＳＲＨ）を、一本鎖トラップ（ＳＳＴ）を用いて選択する段階を含み、前記ヘテロ二重鎖は、前記関連ポリヌクレオチド間で形成され、かつ前記一本鎖領域は前記核酸差異を表す。本発明の好ましい実施形態において、前記ＳＳＴは、二本鎖ポリヌクレオチドと比較して、一本鎖ポリヌクレオチドに選択的な親和性を有する認識エレメント（ＲＥ）の使用を含む。前記ＲＥは、二本鎖ＤＮＡと比較して、一本鎖ＤＮＡに対して選択的な親和性を特徴とする、タンパク質またはペプチドであることが好ましい。前記ＲＥは、一本鎖ＤＮＡに対する特異的親和性を特徴とする、タンパク質またはペプチドであることがさらに好ましい。前記ＲＥは、大腸菌ＳＳＢ、ファージＴ４の遺伝子３２の産物、アデノウイルスＤＢＰおよび子ウシ胸腺ＵＰ１からなる群から選択されることがさらに好ましい。前記ＲＥは大腸菌ＳＳＢであることがさらに好ましい。他の好ましい実施形態では、前記ＲＥは、抗体、好ましくは自己抗体である。さらに他の好ましい実施形態では、前記ＲＥは、ベンゾイル化−ナフトイル化−ＤＥＡＥ−セルロース（ＢＮＤＣ）、ベントナイト上のメチル化アルブミン（ＭＡＢ）および珪藻土上のメチル化アルブミン（ＭＡＫ）からなる群から選択される物質である。前記ＲＥはＢＮＤＣであることがさらに好ましい。
【００４３】
第１段階は、対象の関連ポリヌクレオチドを含有するサンプルを得ることであり、前記サンプルは、標的核酸集団または複合核酸集団のいずれかを含む。次に、ポリヌクレオチドサンプル中のポリヌクレオチドをアニールして、二重鎖を形成する。次いで、一本鎖トラップを用いて、１つまたはいくつかの内部一本鎖領域を有するヘテロ二重鎖を精製し、それによって、その内部一本鎖領域は、前記ヘテロ二重鎖を形成するためにアニールされた前記関連ポリヌクレオチド間の核酸差異に相当する。
【００４４】
したがって、本発明は、ポリヌクレオチドサンプル中の核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドを単離する方法を包含し、前記方法は、以下の段階：
ａ）前記関連ポリヌクレオチドを含有するサンプルを得る段階；
ｂ）前記サンプルに存在するポリヌクレオチドをアニールして、前記関連ポリヌクレオチド間で内部一本鎖領域を含有するヘテロ二重鎖（ＩＳＳＲＨ）を形成する段階；
ｃ）一本鎖トラップを用いて、前記ＩＳＳＲＨを選択する段階；を含む。
【００４５】
任意に、前記方法は、好ましくは断片化によって、さらに好ましくはシングルパスＤＮＡシークエンスに適したサイズに、ポリヌクレオチドのサイズを低減する追加の段階を含む。その低減段階は、段階（ｃ）の前、さらに好ましくは段階（ｂ）の前に行うことが好ましい。
【００４６】
任意に、前記方法は、前記サンプルが二本鎖ポリヌクレオチドを含有する場合に、アニーリング段階（ｂ）前に、前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドを変性させる追加の段階を含む。
任意に、前記方法は、ＩＳＳＲＨの内部一本鎖領域以外の一本鎖領域を除去する追加の段階を含み、前記追加の段階は、段階（ｂ）の後および段階（ｃ）の前に行われる。その追加の段階は、浄化段階と呼ぶ。
【００４７】
任意に、前記方法は、段階（ｂ）の後に得られたポリヌクレオチドを平滑末端化する追加の段階を含み、前記追加の段階は、好ましくは段階（ｃ）の前、さらに好ましくは浄化段階後に行う。
任意に、その方法は、オリゴヌクレオチドアダプターをポリヌクレオチドにライゲートして、その後のクローニングおよび／またはその後の増幅を可能にする追加の段階を含む。前記アダプターライゲーションは、その方法の都合の良いいずれかの段階で行うことが可能である。例えば、前記アダプターライゲーションは、前記アニーリング段階後または前記平滑末端化段階後に行われる。前記ライゲーション段階は、前記浄化段階および平滑末端化段階後に行われることが好ましい。代替方法としては、前記ライゲーション段階は、ＳＳＴを用いた選択段階後に行われる。任意に、ライゲートされたアダプターは、その方法の都合の良いいずれかの段階で、好ましくは増幅段階後に、およびクローニング段階もしくは核酸差異を含有するポリヌクレオチドに対する濃縮の別のサイクルの前にポリヌクレオチドから切断される。前記アダプターの切断は、対象のポリヌクレオチドをクローン化する任意の段階である。
【００４８】
任意に、前記方法は、前記一本鎖トラップによって選択されたＩＳＳＲＨを、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅する追加の段階を含む。
任意に、前記単離方法、あるいはアニーリングおよび選択段階にあり、かつ任意に低減段階、変性段階、浄化段階、平滑末端化段階、アダプターライゲーション段階、アダプター除去段階、およびＰＣＲ増幅段階からなる濃縮サイクルを数回、好ましくは１〜５回繰り返し行う。
【００４９】
任意に、前記単離方法は、前記の単離されたポリヌクレオチドをクローン化する最終段階を含む。
任意に、前記単離方法は、好ましくはＤＮＡシークエンスを用いて、前記の単離されたポリヌクレオチドの前記核酸差異を同定する最終段階を含む。
【００５０】
［定義］
本明細書において同義で用いられる「核酸分子（１つまたは複数）」および「ポリヌクレオチド（１つまたは複数）」という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡ（一本鎖または二本鎖、コーディング鎖、相補鎖またはアンチセンス鎖）、または単鎖もしくは二重鎖状の複数のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む（上記の種それぞれを詳細に指定することは可能であるが）。特に、それはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、不完全にスプライスされたｍＲＮＡ、およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を包含する。
【００５１】
本明細書において「ヌクレオチド」という用語は、一本鎖もしくは二重鎖状態における任意の長さのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を説明するために形容詞として使用される。さらに正確には、「ヌクレオチド配列」という表現は、核酸物質自体を包含し、したがって、特定のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を生物化学的に特徴づける配列情報（つまり、４つの塩基文字の中で選択される文字列）に限定されない。
【００５２】
本明細書において「ヌクレオチド」という用語もまた、分子を意味する個々のヌクレオチドまたは様々なヌクレオチド、あるいはプリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボースの糖部位、およびリン酸基、またはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの場合におけるホスホジエステル結合を含む、大きな核酸分子の個々のユニットを指すために名詞として使用される。また、本明細書において「ヌクレオチド」という用語は、（ａ）選択的結合（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｌｉｎｋｉｎｇ）基、（ｂ）プリンの類似型、（ｃ）ピリミジンの類似型、または（ｄ）類似糖などの少なくとも１種類の修飾を含む「修飾ヌクレオチド」を包含する意味で用いられる。例えば、類似結合基の中では、プリン、ピリミジン、および糖が挙げられ、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９５／０４０６４を参照のこと。本発明の好ましい修正形態には、限定されないが、５−フルオロウラシル，５−ブロモウラシル，５−クロロウラシル，５−ヨードウラシル，ヒポキサンチン，キサンチン，４−アセチルシトシン，５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル，５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン，５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル，ジヒドロウラシル，β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ），イノシン，Ｎ６−イソペンテニルアデニン，１−メチルグアニン，１−メチルイノシン，　２，２−ジメチルグアニン，　２−メチルアデニン，２−メチルグアニン，　３−メチルシトシン，　５−メチルシトシン，　Ｎ６−アデニン，　７−メチルグアニン，　５−メチルアミノメチルウラシル，　５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル，β−Ｄ−マンノシルクエオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ），５’−メトキシカルボキシメチルウラシル，５−メトキシウラシル，２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン，ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）ｙブトキソシン（ｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ），擬ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ），クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ），２−チオシトシン，５−メチル−２−チオウラシル，２−チオウラシル，４−チオウラシル，５−メチルウラシル，ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル，ウラシル−５−オキシ酢酸，５−メチル−２−チオウラシル，３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル，および２，６−ジアミノプリンが含まれる。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、ｅｘ ｖｉｖｏでの産生、またはそれらの組み合わせを含むいずれかの方法によって、ならびに当技術分野で公知のいずれかの精製方法を用いて作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３７８，８２５号；同第５，３８６，０２３号；同第５，４８９，６７７号；同第５，６０２，２４０号；および同第５，６１０，２８９号に記述されているように、メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシドならびに混合主鎖化合物を有するものを製造することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，２６４，５６４号に記述されているように、ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドを作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２３，６１８号に記述されているように、エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドを作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２３，６１８号に記述されているように、ホスフィネートオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４６９，８６３号に記述されているように、アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６１０，２８９号または同第５，６２５，０５０号に記述されているように、３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号に記述されているように、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開番号：ＷＯ９４／１７０９３およびＷＯ９４／１７０９３に記述されるように、アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４７６，９２５号に記述されているように、３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０２３，２４３号に記述されているように、ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３０，３０２号および同第５，１７７，１９８号に記述されているように、ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドを作製することが可能である。
【００５３】
本明細書において「相補（相補的）」または「その補体」という用語は、相補領域全体を通して、別の指定のポリヌクレオチドとワトソン−クリック型塩基対を形成することが可能なポリヌクレオチドの配列を指すために使用される。ワトソン−クリック型塩基対は、２つの水素結合によりアデニン残基に連結したチミンまたはウラシル残基、３つの水素結合によって連結したシトシンおよびグアニン残基を有する二重らせんＤＮＡにおいて見られるように、それらの配列同一性によって互いに水素結合することができるヌクレオチドを意味する。本発明の目的で、第１ポリヌクレオチド中の各塩基がその相補的塩基と対をなす場合、第１ポリヌクレオチドは、第２ポリヌクレオチドに相補的であると考えられる。相補的塩基対は一般に、ＡとＴ（またはＡとＵ）、またはＣとＧである。本明細書において「補体」は、「相補的ポリヌクレオチド」、「相補的核酸」および「相補的ヌクレオチド配列」の同義語として使用される。これらの用語は、２つのポリヌクレオチドが実際に結合すると考えられる特定の一連の条件ではなく、単にそれらの配列に基づく対のポリヌクレオチドに適用される。別段の指定がない限り、すべての相補的ポリヌクレオチドは、考察されるポリヌクレオチドの全長にわたって完全に相補的である。
【００５４】
本明細書において使用される「単離（された）ポリヌクレオチド」という用語は、そのポリヌクレオチドが、その元の環境（つまり、それが天然に存在する場合の自然環境）から取り除かれることを必要とする。例えば、生体動物に存在する天然ポリヌクレオチドは単離されないが、自然体系において共存する物質の一部またはすべてと区別される同一ポリヌクレオチドが単離される。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であることが可能であり、かつ／またはかかるポリヌクレオチドは、組成物の一部であることが可能であり、かつそのベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点からさらに単離することが可能である。具体的には、天然に存在する染色体（染色体の拡散など）、人工的な染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー、および核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏ標本として、または宿主細胞が異種なｉｎ ｖｉｔｒｏ標本であるか、もしくは単一コロニーの異種集団としてプレーティングされる、トランスフェクトされた／形質転換された宿主細胞の標本として、存在するｃＤＮＡライブラリーが、「単離ポリヌクレオチド」の定義から除外される。具体的には、指定のポリヌクレオチドが、ベクター分子における核酸インサート数の５％未満を占める上記のライブラリーもまた除外される。さらに、細胞全体のゲノムＤＮＡまたは細胞全体のＲＮＡ標本（機械的に切断された、または酵素により消化された前記の細胞全体の標本を含む）が除外される。さらに具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ標本としての、または対象のポリヌクレオチドが電気泳動媒体中の異種ポリヌクレオチドからさらに分離されない（例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロットにおいて異種バンド集団から単一バンドを切除することによる更なる分離）電気泳動（それのブロットトランスファーを含む）により分離された異種サンプルとしての、上記の細胞全体の標本が除外される。
【００５５】
本明細書において同義で用いられる「精製」または「濃縮」という用語は、完全な精製または濃縮を必要とするわけではなく；むしろ、それらは相対的な定義として意図される。ＳＳＴを用いて、少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、さらに好ましくは４桁または５桁のオーダーに核酸差異を含有するポリヌクレオチドを精製することが、特に企図される。例として、濃度０．１％から濃度１０％への精製は２桁のオーダーである。本明細書において「精製された」という用語は、限定されないが、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、炭水化物、脂質等を含む他の化合物から分離されたポリヌクレオチドを説明するために使用される。「精製された」という用語はまた、線状ポリヌクレオチドから共有結合的に閉環しているポリヌクレオチドを分離する場合を説明するために使用される場合がある。サンプルの少なくとも約５０％、好ましくは６０〜７５％が単一ポリヌクレオチド配列および配座（線状に対して共有結合的な閉環状）を示す場合、ポリヌクレオチドは実質上純粋である。実質的に純粋なポリヌクレオチドは通常、それぞれポリヌクレオチドサンプルの約５０％（重量／重量）、好ましくは６０〜９０％、さらに通常、約９５％を占め、約９９％を超える純度であることが好ましい。ポリヌクレオチドの純度、または均一性は、サンプルのアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当技術分野で公知の数多くの手段によって、続いてゲルを染色して単一バンドを可視化することによって示される。特定の目的で、ＨＰＬＣまたは当技術分野で公知の他の手段を用いて、より高い分解能を提供することができる。代わりの実施形態として、異質ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方）に対する「最低」純度％として、ポリヌクレオチドの精製が表される。好ましい実施形態として、そのポリヌクレオチドは、異質ポリヌクレオチドに対してそれぞれ、少なくとも；純度１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または１００％である。さらに好ましい実施形態として、そのポリヌクレオチドは、異質ポリヌクレオチドに対して、または担体に存在するもの以外のすべての化合物および分子に対する重量／重量比として、任意の位〜小数点以下第３位の範囲、９０％〜１００％（例えば、少なくとも純度９９．９９５％）のポリヌクレオチド）の純度を有する。小数点以下第３位までの純度％を表す各数字は、純度の個々の種類として主張することが可能である。
【００５６】
本明細書において使用される「ｃＤＮＡ」という用語は、完全なｍＲＮＡ鋳型から合成される相補的ＤＮＡまたはその断片を意味する。例えば、ｃＤＮＡという用語は、所定のｍＲＮＡから合成された完全長ｃＤＮＡおよび前記ｍＲＮＡから誘導されたいずれかのＥＳＴを意味する。
「（＋）鎖」という用語は、所定の遺伝子のｍＲＮＡに類似する配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味し、「（−）鎖」という用語は、対象のｍＲＮＡに対してアンチセンスおよび相補的配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味する。
【００５７】
「二重鎖」という用語は、二本鎖領域を含むポリヌクレオチドを意味する。完全な二重鎖または「ホモ二重鎖」は完全に相補的な鎖を含み、したがって完全な二本鎖分子である。「ヘテロ二重鎖」とは、完全に相補的ではない領域を含有し、したがってポリヌクレオチド末端または内部に位置する一本鎖領域もまた有し、したがって内部一本鎖領域またはミスマッチを形成する二本鎖ポリヌクレオチドを意味する。かかるヘテロ二重鎖は、核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドに由来する（＋）一本鎖および（−）一本鎖のハイブリダイゼーションから生じる。少なくとも１つの内部一本鎖領域を含有するヘテロ二重鎖は、本明細書においてＩＳＳＲＨと呼ばれる。核酸差異が、他方の関連ポリヌクレオチドと比較して、一方の関連するポリヌクレオチドの領域の追加または欠失にある場合、かかる内部一本鎖領域は「内部一本鎖ループ」である。核酸差異が、他方の関連ポリヌクレオチドと比較して、一方の関連ポリヌクレオチドのある領域の別の領域による置換にある場合、かかる内部一本鎖領域は「内部一本鎖バブル」である。
【００５８】
本明細書で使用される「一本鎖トラップ」という用語は、サンプル中に含まれる他の物質、つまり一本鎖領域を含有しない他のポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、および脂質から、少なくとも１つの一本鎖核酸領域を含有する分子を選択する手段を意味する。かかる分子は、その化学的性質にかかわらず一本鎖核酸分子または任意の分子であることが可能であり、前記分子中の前記一本鎖領域の位置にかかわらず、一本鎖核酸領域である少なくとも１つの領域を含有する。
【００５９】
本明細書で使用される「関連ポリヌクレオチド」とは、異なる配列を有するか、または他方と比較して一方のポリヌクレオチドから欠失もしくは追加される１つまたは少数の領域を除いて、同一配列を有するポリヌクレオチドを意味する。通常の関連ポリヌクレオチドは、同一遺伝子のスプライシングアイソフォーム、または同一遺伝子の別の対立遺伝子と比較してゲノム欠失または追加を有する遺伝子である。かかる関連ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、完全長ｃＤＮＡなどの完全長ポリヌクレオチド、またはその断片である。
【００６０】
「核酸差異」という用語は、本質的に領域の挿入、欠失または置換にある関連ポリヌクレオチド間のヌクレオチド差異を意味する。具体的には、数塩基対のみのヌクレオチド差異にあるミスマッチは本発明から除外される。
「選択的スプライシング事象」という用語は、選択的スプライシングによって同一遺伝子または同一プレｍＲＮＡから生じる２つのポリヌクレオチド間に存在する配列変異を示す。この用語は、前記配列変異を含有する、スプライシングアイソフォームまたはその断片を含むポリヌクレオチドもまた意味する。前記配列変異は、少なくとも１つのエクソンもしくはエクソンの一部の挿入または欠失によって特徴づけられることが好ましい。「選択的スプライシング事象」という用語は、本来のスプライシング事象、エクソンのスキッピング（Ｄｉｅｔｚ 等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，６８０ （１９９３）； Ｌｉｕ 等， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １６，３２８−３２９ （１９９７）； Ｎｙｓｔｒｍ−Ｌａｈｔｉ 等 Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｎａｏｓｏｒｎｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２６： ３７２−３７５ （１９９９））、細胞の環境条件（例えば、細胞の種類または物理的刺激）またはスプライシングの異常を引き起こす突然変異が原因のディファレンシャル・スプライシング（Ｓｉｆｆｅｒｔ 等， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８： ４５−４８ （１９９８））を包含する。
【００６１】
［ポリヌクレオチドのサンプル］
本明細書において使用される「ポリヌクレオチドサンプル」という用語は、少なくとも２種類の異なるポリヌクレオチド種、つまり完全に同一ではない配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの収集物を含有するサンプルを意味する。前記ポリヌクレオチドサンプルは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡもしくはｇＤＮＡ、またはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、または一部スプライスされたＲＮＡ）、またはそれらの混合物を含有することが可能である。前記ポリヌクレオチドサンプルは、一本鎖、二本鎖分子、または一本鎖核酸分子と二本鎖核酸分子との混合物を含有することが可能であり、その各形態は、本発明の実施形態である。前記ポリヌクレオチドサンプルは、（＋）鎖と（−）鎖との混合物を含有することが好ましい。前記ポリヌクレオチドサンプルは、二本鎖ポリヌクレオチドのみを、または二本鎖ポリヌクレオチドを大部分含有することが好ましい。さらに好ましくは、前記ポリヌクレオチドサンプルは、ｃＤＮＡのみを、またはｃＤＮＡを大部分含有するが、一本鎖ｃＤＮＡもまた本発明によって考察される。
【００６２】
一実施形態において、ポリヌクレオチドサンプルは、単一ソース、単一環境または単一生理的条件に由来するポリヌクレオチドを含有する。当業者が思い描くことができるすべてのソース、すべての生理的および環境条件は、本発明の範囲内である。前記の所定の生理的条件は、健康条件、病理的条件、アポトーシス条件、分化条件、未分化条件からなる群から選択されることが好ましい。
【００６３】
他の実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルは、少なくとも２種類のソース、環境または生理的条件に由来するサンプルからのポリヌクレオチドの混合物を含む。このような異なる生理的条件または環境条件には、限定されないが、対照対実験、健康対感染、Ｘ感受性対Ｘ耐性、未分化対分化、正常対形質転換細胞が含まれる。
【００６４】
本明細書において、生体サンプルから、またはｃＤＮＡもしくはｇＤＮＡライブラリーから生じる前記ポリヌクレオチドサンプルは、「複合ポリヌクレオチドサンプル」と呼ばれるだろう。本明細書において使用される「複合ポリヌクレオチドサンプル」という用語は、その一部が未知である不特定多数の遺伝子に由来するポリヌクレオチド収集物を意味する。一方、かなり限定された数のポリヌクレオチド種を含有する前記ポリヌクレオチドサンプルは、本明細書において「標的ポリヌクレオチドサンプル」と呼ばれるだろう。かかる標的ポリヌクレオチドサンプルは、単一遺伝子または限定セットの遺伝子に由来するポリヌクレオチドを含有する。本明細書において使用される「限定セットの遺伝子」という用語は、有限数の公知の遺伝子、好ましくは少なくとも２、３、５、１０、５０、１００または５００個の定義された遺伝子に由来するポリヌクレオチドを意味する。
【００６５】
一実施形態において、前記ポリヌクレオチドサンプルは、標的ポリヌクレオチドサンプルに由来するポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルは、複合ポリヌクレオチドサンプルに由来するポリヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルは、標的ポリヌクレオチドサンプル由来のポリヌクレオチドと複合ポリヌクレオチドサンプル由来のポリヌクレオチドのどちらも含む。さらに他の実施形態では、前記ポリヌクレオチドサンプルは、共に混合された複合ポリヌクレオチドサンプルに由来するポリヌクレオチドを含む。
【００６６】
選択的スプライシング事象を同定するための好ましいポリヌクレオチドサンプルは、二本鎖ｃＤＮＡ収集物または混合された少なくとも２種類の二本鎖ｃＤＮＡ収集物にあるポリヌクレオチドサンプルである。選択的スプライシング事象を同定する他の実施形態において、そのポリヌクレオチドサンプルは、一本鎖ｃＤＮＡ収集物または混合された少なくとも２種類の一本鎖ｃＤＮＡ収集物を含有する。前記一本鎖ｃＤＮＡ収集物（１種または複数種）は、（＋）一本鎖および（−）一本鎖を含むことが好ましい。ポリヌクレオチドサンプル中の選択的スプライシング事象を同定する好ましい実施形態において、対象の遺伝子に対する固有のポリヌクレオチド種をｃＤＮＡ収集物と混合する。前記の固有のポリヌクレオチド種を過剰に、つまりｃＤＮＡ収集物と比較して、１．０１：１〜１００：１、好ましくは１．１：１〜１０：１、さらに好ましくは１．５：１〜６：１の比の範囲で添加する。その結果得られた、かかるポリヌクレオチドサンプルは、ｃＤＮＡ収集物中の対象の遺伝子（１つまたは複数）に対して存在するすべてのスプライシング事象をさらに効率的に同定するのに有用である。
【００６７】
ゲノムの差異を同定するための好ましいポリヌクレオチドサンプルは、二本鎖ｇＤＮＡ収集物または混合された少なくとも２種類の二本鎖ｇＤＮＡ収集物を含有するポリヌクレオチドサンプルである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドサンプルは、一本鎖ｇＤＮＡ収集物または混合された少なくとも２種類の一本鎖ｇＤＮＡ収集物を含有する。前記一本鎖ｇＤＮＡ収集物（１種または複数種）は、（＋）一本鎖および（−）一本鎖を含むことが好ましい。
【００６８】
（生体サンプル）
本発明は、特定の制限なく、ポリヌクレオチドを含有するすべての生体サンプルを包含する。特に、本発明による生体サンプルは、細胞、組織、器官、固定もしくは非固定の外科的もしくは生検標本、例えば骨髄穿刺液、または全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、および呼吸器、腸管および尿生殖器の様々な外分泌物、涙、唾液、乳、白血球、細胞培養上清液などの体液を含む生体液から得られる。サンプルの起源は、動物（好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒト）、植物、ウイルス、細菌、原生動物または真菌であることが可能である。サンプルは、真核生物、原核生物、または非細胞生物であってもよい。特に組織、器官、生体液または生検材料に由来する場合、生体サンプル中に含まれる細胞を、利用可能な細胞の数を増やすために培養することができる。そのサンプルは、単一型からの細胞または混合細胞型の細胞を含有することが可能である。その細胞、組織および標本は、正常な個体または疾患もしくは障害を有する患者に由来するものであることが可能である。その疾患または障害は例えば、癌、神経変性疾患、炎症性疾患、心循環器疾患、免疫疾患、肥満症などの体重の疾患等である。いずれかの特定の細胞、細胞型、病理細胞、発生または疾患進行の特定の状態での細胞が本発明において考察される。
【００６９】
（複合ポリヌクレオチドサンプルの作製）
複合ポリヌクレオチドサンプルの作製は、所定の状況（サンプル内の差異）において発現した遺伝子を表すポリヌクレオチドの全集団内に存在するすべての核酸差異を系統的に単離するのに特に適している。例えば複合ｃＤＮＡサンプルを用いて、生体サンプル全体の所定の状況において存在するすべてのスプライシング事象またはすべてのスプライシングアイソフォームを単離することができる。複合ポリヌクレオチドサンプルの作製は、２種類以上の異なる状況（サンプル間の差異）を表すポリヌクレオチドの２つ以上の集団全体の間に存在するすべての核酸差異を続いて単離するのにもまた適している。例えば、２種類以上の生体サンプルからのポリヌクレオチドを混合することから得られる、かかる複合ｃＤＮＡサンプルは、異なる生体サンプル間の差次的発現から生じる選択的スプライシング事象またはアイソフォームを単離するのに有用である。一方、２種類以上の菌株のゲノムを混合することから得られる、かかる複合ｇＤＮＡサンプルは、それらの菌株間のゲノム差異を単離するのに有用である。
【００７０】
〈ゲノムＤＮＡサンプルの作製〉
それらは当業者にはよく知られており、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＧｉｌｍａｎ 等「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｖｏｌｕｍｅ １， Ｃｈａｐｔｅｒ ２ （Ａｕｓｕｂｅｌ 等， ｅｄｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．， １９９４）に記載の技術が含まれる。
【００７１】
〈ＲＮＡサンプルの作製〉
複合ポリヌクレオチドサンプルは、全ＲＮＡ中で濃縮された集団から、またはｍＲＮＡ中で濃縮された集団から作製することが可能である。
全ｍＲＮＡの抽出方法は当技術分野で公知であり、例えばその開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等， （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｖｏｌ． １， ｃｈ． ７； 上記の「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｃｈａｐｔｅｒ ４；ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ， （１９８７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｆｒａ． １６２： １５６−１５９に記述されている。通常、全ＲＮＡの単離は、塩化グアニジウムまたはチオシアン酸グアニジウムなどのカオトロピック剤の存在下で行い、続いてフェノール、クロロホルムなどの溶媒または両方のサンプルを用いて、ＲＮＡの抽出を行うが、その代わりに他の洗浄剤および抽出剤を使用することができる。全ＲＮＡの抽出に、いくつかの市販のキット、例えばＵＳ７３７５０キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）およびＲｎｅａｓｙキット（キアゲン社）も利用することができる。
【００７２】
代替方法として、複合ポリヌクレオチドサンプルをメッセンジャーＲＮＡから作製することが可能である。これらのｍＲＮＡは、製品供給元からまたは当業者にはよく知られている数多くの方法の１つから得ることができる。例えばポリＴオリゴヌクレオチドの使用（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９： １４０８−１４１２，１９７２）を含む当業者に公知のいずれかの方法を用いて、メッセンジャーＲＮＡを生体サンプルまたは全ＲＮＡ抽出物から直接単離することができる。通常、オリゴ（ｄＴ）−セルロースによるクロマトグラフィーまたはｍＲＮＡ分子のポリアデニル化３’−部分に結合する能力を有する他のクロマトグラフ媒体によって、ｍＲＮＡは全ＲＮＡから単離される。ｍＲＮＡを作製するために、いくつかの市販のキット、例えばＰｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ニュージャージー州ピスキャタウェイ）１９９５、カタログ番号２７−９２５５−０１および番号２７−９２５４−０１；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）１９９５、カタログ番号２００３４７、２００３４５、２００３４８、２００３４９、および２００３４４、ＵＳ７２７００キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）またはｏｌｉｇｏ−ｄＴビーズキット（Ｄｙｎａｌ社）も利用することができる。プレｍＲＮＡまたは不完全にスプライスされたプレｍＲＮＡによる汚染を防ぐために、細胞質ゾルの全ＲＮＡからｍＲＮＡを作製することが好ましい。これは、Ｒｎｅａｓｙキット（Ｎ ７４１０３、Ｑｕｉａｇｅｎ社）を用いて行うことができる。市販のｍＲＮＡライブラリーおよび／または公的に入手可能なｍＲＮＡライブラリーもまた、本発明に従って使用することができる。例えば、ＬＡＢＩＭＯ社およびＣＬＯＮＴＥＣＨ社は、異なる組織に由来するヒト全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡを販売している。
【００７３】
〈ｃＤＮＡサンプルの作製〉
本発明の好ましい実施形態において、本発明の複合ポリヌクレオチドサンプルは、当技術分野で公知の数多くの方法の１つを用いて、全ＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡから作製されたｃＤＮＡ分子を含有する。
【００７４】
一般に、これらの方法は、ｍＲＮＡ鋳型およびオリゴヌクレオチドプライマーから一本鎖ｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素の使用を含む。実験の詳細は、例えばその開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、上記の「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， ｖｏｌｕｍｅ １， ｃｈａｐｔｅｒ ５、およびＳａｍｂｒｏｏｋ 等， ｓｕｐｒａ， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｃｈａｐｔｅｒ ８に記述されている。
【００７５】
数多くの逆転写酵素が文献に記述されおり、かつ市販されている。例えば、最も使用されている逆転写酵素は、ＡＭＶおよびＭＭＬＶウイルス逆転写酵素である。さらに、Ｔｈｅｒｒｎｕｓ ｆｌａｖｕｓおよびＴｈｅｒｒｎｕｓ ｔｈｅｒｒｎｏｐｌａｉｌｕｓＨＢ−８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）からの逆転写酵素活性を有するいくつかの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼもまた使用することができる。好ましい実施形態では、伸長をブロックし得るＲＮＡ二次構造を不安定化するために、かなりの高温で第１ｃＤＮＡ鎖を合成することができる逆転写酵素、例えば約４２℃で働くＡＭＶ逆転写酵素および６０℃までで働くＴｔｈ逆転写酵素を使用し、結果として、向上した忠実度および効率を有する最初のｍＲＮＡ集団を表すと考えられる長いｃＤＮＡが得られる。他の実施形態において、ｃＤＮＡ合成のより高い収率を得るため、かつｃＤＮＡ合成中のＲＮＡ分解を防ぐために、リボヌクレアーゼＨ活性を持たない逆転写酵素を使用する。かかるＲＮアーゼＨ−逆転写酵素は、変異または欠失により逆転写酵素活性を有する公知のいずれかの酵素から作製することができる。その代わりとしては、かかるＲＮアーゼＨ−逆転写酵素は市販されている（参照：１８０５３−０１７、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。
【００７６】
第１ｃＤＮＡ鎖を作製するために、２種類のオリゴヌクレオチドプライマー、つまりランダムもしくはセミランダムプライマー、およびオリゴｄＴプライマーを使用することが可能である。ランダムオリゴヌクレオチドは、好ましくは長さ４〜１０ヌクレオチド、さらに好ましくは長さ６ヌクレオチドである。この方法は当業者にはよく知られており、ＲＮＡ鋳型のランダムな異なる位置で逆転写を開始させる。その代わりに、セミランダムプライマー、つまりｉ）更なる増幅を可能にする内部プライマー配列および／または更なるクローニングを可能にする制限部位を含有する安定化領域、ｉｉ）ランダム領域、およびｉｉｉ）プライマーを周期的にハイブリダイズさせる最小限のプライミングの領域を含有するプライマーを使用することが可能である。更なる実験の詳細は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９９／４６４０に記述されている。ランダムもしくはセミランダムプライマーと異なり、オリゴｄＴプライマーは、ｍＲＮＡのポリＡテールから逆転写を開始することを可能にする。そのプライマーは、好ましくは長さ４〜２０ヌクレオチド、さらに好ましくは長さ約１５ヌクレオチドである。オリゴｄＴプライマーの最後の３’ヌクレオチドを変性させて、ポリＡテールのごく最初でＤＮＡ合成を開始させることがさらに好ましい。
【００７７】
任意に、必要な場合には新たに合成されたｃＤＮＡから鋳型ＲＮＡを同定、選択または分類するために、標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してもよい。分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって、標識化を用いることが可能である。例えば、有用な標識には、放射性物質（３２ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉを含む）、蛍光染料（５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニンを含む）またはビオチンが含まれる。オリゴヌクレオチドの非放射性標識の例は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、フランス特許番号：ＦＲ７８１０９７５に、またはＵｒｄｅａ等 （１９８８） もしくはＳａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ 等（１９８８）によって記述されている。さらに、標識オリゴヌクレオチドは、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、１９９１年にＵｒｄｅａ 等によって記述されている、または欧州特許番号：ＥＰ ０ ２２５ ８０７（Ｃｈｉｒｏｎ）に記述されている分岐ＤＮＡプローブなど、シグナル増幅を可能にする構造特性を有することができる。
【００７８】
次いで二本鎖ｃＤＮＡは、例えば自己プライミング（上記の Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等， ｐ．８．１４参照）および置換合成（それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、上記の Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等， ｐ．８．１５； Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ 等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５， ｐ． ５．５．１−５．５．１４参照）を含む当技術分野で公知の方法のいずれか１つを用いて、得られた一本鎖ｃＤＮＡ鋳型から合成される。好ましい技術では、大腸菌ＲナーゼＨ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼおよび大腸菌ＤＮＡリガーゼが使用される。第二鎖合成の最終段階は通常、平滑末端を有するｃＤＮＡ分子を得るための、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの使用を含む。
【００７９】
任意に、レアなｍＲＮＡを表すｃＤＮＡが得られる最良の結果を得るために、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６３７，６８５号；Ｓａｎｋｈａｖａｒａｍ 等， （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８，１９４３−１９４７； Ｋｏ （１９９０）， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．１８，５７０９； および Ｂｏｎａｌｄｏ 等， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６： ７９１−８０６に記載の技術を含む、当業者には公知の技術を用いて、正規化されたｃＤＮＡライブラリー、つまり豊富な転写物の大部分において枯渇したライブラリーを作製することが可能である。
【００８０】
（標的ポリヌクレオチドサンプルの作製）
この場合には、ポリヌクレオチドサンプルは、所定の生体サンプルまたはＤＮＡライブラリー（つまり、複合ポリヌクレオチドサンプル）に存在するポリヌクレオチドの全セットを含有するわけではなく、１つの遺伝子もしくは限定セットの遺伝子から得られるまたそれに由来する、限定セットのポリヌクレオチド種のみを含有する。
【００８１】
かかる標的ポリヌクレオチドサンプルは特に、単一遺伝子または限定セットの遺伝子に由来し、かつ所定の環境または生理的条件を表すポリヌクレオチド間に存在するすべての核酸差異を続いて単離するのに適している。例えば、標的ｃＤＮＡサンプルを用いて、所定の状況において単一遺伝子または限定セットの遺伝子に存在するすべての選択的スプライシング事象を研究することができる。
【００８２】
かかる標的ポリヌクレオチドサンプルは、単一遺伝子または限定セットの遺伝子に由来し、かつ２種類以上の異なる環境もしくは生理的条件を表すポリヌクレオチド間に存在するすべての核酸差異を続いて単離するのにもまた適している。例えば、２種類以上の異なる状況を表す２種類以上の異なる標的ｃＤＮＡサンプルからのポリヌクレオチドを混合することによって得られた標的ｃＤＮＡサンプルは、単一遺伝子または限定数の遺伝子に対する状況の中の差異を表すすべてのスプライシング事象を単離するのに有用である。
【００８３】
限定数のポリヌクレオチド種を含有する標的ポリヌクレオチドサンプルは、当業者に公知のいずれかの方法を用いて、最初の複合ポリヌクレオチドサンプルから得ることができる。
当業者に公知の選択方法を用いて、複合ポリヌクレオチド集団の中から、対象のポリヌクレオチド種を選択することが可能である。例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、上記の「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」， Ｖｏｌｕｍｅ １， Ｃｈａｐｔｅｒ ６に記述されているように、前記単一遺伝子もしくは前記限定セットの遺伝子に由来する対象のポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能なハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、対象のポリヌクレオチドを検出かつ単離することが可能である。代替方法として、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社からのＲｅｃＡに基づく技術を用いて、標的クローンを単離することができる。ＲｅｃＡは、一本鎖ＤＮＡプローブおよび相同的二本鎖ＤＮＡ分子間での複合体の形成を促進し、このため、標的配列を含有する二本鎖プラスミドを直接単離することが可能となる。ＲｅｃＡに基づく選択手順を実施するために、必要なものは、２００〜３００ｂｐのビオチン化プローブを増幅するためのプライマーをデザインするのに十分な、各標的遺伝子からの配列情報のみである。次いで、これらのＰＣＲ産物を変性させ、ＲｅｃＡとの複合体を形成し、所定の複合ＤＮＡライブラリー内での標的クローンの選択に使用する。［更なる詳細については、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社からのＣｌｏｎＣａｐｔｕｒｅ ｃＤＮＡ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ （参照：ＰＴ３２４６−１）を参照のこと］。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＲｅｃＡに基づく技術を使用する代わりに、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社からのジーン・トラッパー（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｐｐｅｒ）技術を使用することが考えられる。
【００８４】
代替方法として、対象のポリヌクレオチド種に特異的なプライマーを、ランダム、セミランダムまたはオリゴｄＴプライマーなどの非特異的プライマーの代わりに使用することを除いては、「ｃＤＮＡサンプルの作製」という題名のセクションに記載の方法を含む当業者に公知のいずれかの方法を用いて、ＲＮＡサンプル、好ましくはｍＲＮＡサンプルから二本鎖ｃＤＮＡを選択的に合成することが可能である。好ましくは、かかるプライマーは、できる限り多くのスプライシングアイソフォームに対応するｃＤＮＡを合成することができるように、対象の遺伝子（１つまたは複数）の転写部分の予測される大部分の３’末端とハイブリダイズするようにデザインされる。さらに好ましくは、そのプライマーは、対象の遺伝子（１つまたは複数）の最後のエクソンにポリアデニル化部位を含有する領域とハイブリダイズすることが可能なようにデザインされる。代替方法として、そのプライマーは、対象の遺伝子（１つまたは複数）によってコードされるタンパク質（１種または複数種）に対して、最後のコーディングエクソン、好ましくは３’から終止コドンとハイブリダイズすることが可能なようにデザインされる。任意に、選択的な異なる大部分の３’エクソンとハイブリダイズすることが可能ないくつかのプライマーを、選択的な３’エクソンの存在に関して既に蓄積されている実験知識に基づく、または当業者に公知のソフトウェアを用いた選択的スプライシングに関する予測に基づく同一遺伝子に対してデザインすることができる。
【００８５】
増幅の方法を用いて、本明細書の他に開示されているような、標的ポリヌクレオチドサンプルを得ることが好ましい。ＥＰＡ−３２０ ３０８、ＷＯ９３２０２２７およびＥＰ−Ａ−４３９ １８２に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲまたはギャップＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）およびＧｕａｔｅｌｌｉ 等， （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ３５： ２７３−２８６および Ｃｏｍｐｔｏｎ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ． ３５０ （６３１３）： ９１９２に記載の核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などの技術、欧州特許出願第４５４４６１０号に記載のＱ−β増幅、Ｗａｌｋｅｒ 等， （１９９６） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４２： ９−１３およびＥＰ Ａ ６８４ ３１５記載の鎖置換による増幅、およびＰＣＴ公開番号：ＷＯ９３２２４６１に記載の標的仲介増幅などの技術を含む、増幅の直線的または対数的方法を用いることができる。上記の文献の開示内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。代替方法として、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｒｓｈａｌｌ 等， （１９９４） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ４： ８０−８４に記載の非対称ギャップＬＣＲ（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を用いて、ＲＮＡを直接増幅することが可能である。そのＰＣＲ技術は、本発明で使用するのに最も好ましい増幅技術である。様々なＰＣＲ技術が当業者に知られている。ＰＣＲ技術を再検討するために、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｈｉｔｅ （１９９７） Ｂ． Ａ． Ｅｄ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６７： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ； Ｅｒｌｉｃｈ， （１９９２） ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； 題名「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」の出版物 （１９９１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）参照。最初のポリヌクレオチドサンプルが主にＲＮＡを含有する場合、「複合ポリヌクレオチドサンプルの作製」という題名のセクションに上述されている技術を含む、当業者に公知のいずれかの技術を用いて、二本鎖ｃＤＮＡが最初に合成される。次いで、単一遺伝子または限定セットの遺伝子に由来する対象のｃＤＮＡは、好ましくはＰＣＲ技術（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌｕｍｅ ２， Ｃｈａｐｔｅｒ １５）を用いて、対象の単一遺伝子または限定セットの遺伝子に特異的なプライマーで前記二本鎖ｃＤＮＡサンプルから選択的に増幅される。実際には、少なくとも１組のプライマーが、以下に示す対象の各遺伝子に対して特異的にデザインされる。第１オリゴヌクレオチドプライマーは、対象のｃＤＮＡの５’末端にできる限り隣接してアニールするようにデザインされ、第２オリゴヌクレオチドプライマーは、対象のｃＤＮＡ３’末端にできるだけ隣接してアニールするようにデザインされることが好ましい。数組のプライマーを、選択的な５’および／もしくは３’エクソンの存在に関して既に蓄積されている実験知識に基づく、または当業者には公知のデータベース検索およびいずれかのソフトウェアを用いた選択的スプライシングに関する予測に基づく同一遺伝子に対して、異なる選択的な大部分の３’エクソンもしくは５’エクソンとハイブリダイズするようにデザインすることが可能である。したがって、当業者には容易に理解できるように、各標的遺伝子に対応する二本鎖ｃＤＮＡ分子の標的混合物が得られ、選択的スプライシング事象が２つのＰＣＲプライマー間に位置する領域で起こる場合には、前記標的遺伝子の異なるスプライシングアイソフォームが表現される。いくつかの遺伝子に由来する標的ｃＤＮＡサンプルが所望の場合には、ＰＣＲを同じチューブ中で、または好ましくは遺伝子のセットが大きい場合、最終の標的ｃＤＮＡサンプルを得るために次いで共にプールされる最初のｃＤＮＡサンプルの異なるアリコート中で並行して行うことができる。
【００８６】
同様に、最初のポリヌクレオチドサンプルが主にゲノムＤＮＡを含有する場合には、標的ＤＮＡサンプルは、好ましくはＰＣＲによって、さらに好ましくは広範囲のＰＣＲ技術を用いて、対象の特異的遺伝子または限定セットの遺伝子に特異的なプライマーで得られる。好ましくは、第１オリゴヌクレオチドプライマーは、対象の遺伝子（１つまたは複数）の大部分の５’末端にアニールし、第２オリゴヌクレオチドプライマーは、対象の遺伝子（１つまたは複数）の部分の大部分の３’末端にアニールする。したがって、得られる産物は、単一遺伝子または限定セットの遺伝子から生じる、異なるポリヌクレオチド種を含む二本鎖ポリヌクレオチドサンプルである。
【００８７】
標的ポリヌクレオチドサンプルの作製の代わりに、所定のポリヌクレオチド種または限定セットのポリヌクレオチド種およびそのポリヌクレオチドに対して存在する核酸差異を選択し、当業者に公知のいずれかの方法を用いて、本発明による方法の後の段階で単離することができる。例えば、対象のポリヌクレオチド種は、ハイブリダイズされた対象のポリヌクレオチドの読出しを可能にする特異的標識オリゴヌクレオチドを用いて、核酸差異を有するポリヌクレオチド中で濃縮された複合ポリヌクレオチドサンプルから単離することができる。
【００８８】
（ポリヌクレオチドサンプルの低減）
任意に、複合もしくは標識ポリヌクレオチドサンプルである最初のポリヌクレオチドサンプルを作製するために、低減段階を行うことが可能である。代替方法としては、単離プルプロセスの都合のよい段階で、前記選択段階の後でさえ、低減段階を行うことができる。低減は、好ましくはシークエンス技術を用いて核酸差異を実際に同定する最終段階を促進するために、対象のポリヌクレオチドを小さな断片に切断することによるプロセスである。ポリヌクレオチドを５’および／または３’のシングルパスによってシークエンスできる場合、シークエンス段階はさらに効率的かつ経済的である。したがって、断片のサイズは、好ましくは１０００ｂｐを超えないほうがよい。断片の長さは、４００〜１０００ｂｐであることが好ましく、さらに好ましくは約７００ｂｐである。
かかる低減は、ポリヌクレオチドのサイズを約１０００ｂｐ以下に低減することを可能にする断片化によって達成することができる。その断片化は、当技術分野で公知の方法、例えば酵素的、化学的、機械的等に達成することが可能である。
【００８９】
好ましい実施形態において、ウシ膵臓ＤＮアーゼＩで穏やかに消化することによって、ポリヌクレオチドが分解される。この酵素によって、Ｍｎ２＋の存在下にてＤＮＡの二本鎖切断が起こる。その切断はランダムであり、酵素濃度、温度および／またはインキュベーション時間を変化させることによって調節することができる。他の実施形態では、他のエンドヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼで切断または消化することによって、断片化を達成することができる。
【００９０】
任意に、適切なサイズ、好ましくは１０００ｂｐ以下のサイズを有する断片を選択するために、断片化産物をさらに処理することができる。例えば、得られた断片化産物をゲル電気泳動によって分離し、４００〜１０００ｂｐに相当するバンドをゲルから切り出し、数多くの既存の方法の１つによって回収することが可能である。代替方法としては、カラムクロマトグラフィーまたは当技術分野で公知の方法によって、ポリヌクレオチド断片を分離することができる。
本明細書において、低減段階にかけられたポリヌクレオチドサンプルは、「低減された」と表される。
【００９１】
［アニーリング段階］
この段階の目的は、Ｍ０ポリヌクレオチドサンプルからの一本鎖分子を、少なくともある領域にわたって相補的である鎖を含有する二重鎖にアニーリングし、その結果少なくとも一部二本鎖である二重鎖を形成することである。しかしながら、ポリヌクレオチドサンプルＭ０が主に二本鎖分子を含有する場合、アニーリング前の変性の追加段階が一本鎖分子を得るのに必要である。
【００９２】
本明細書において使用される「変性」という用語は、両方の鎖の相補塩基間の結合を分解することによって、二本鎖核酸分子がその構成物の一本鎖、（＋）極性を有する一方の鎖および（−）極性を有する他方の鎖に転換されるプロセスを意味する。
【００９３】
本明細書において同義で用いられる「アニーリング」、「再生」、「ハイブリダイゼーション」という用語は、一方は（−）鎖であり、他方が（＋）鎖である２本の核酸鎖を連結して、二本鎖分子、または二重鎖を形成するプロセスを意味し、前記連結は、両方の鎖の相補塩基間の水素結合によって仲介される。これらの核酸鎖は、２本のＤＮＡ鎖または１本のＤＮＡ鎖および１本のＲＮＡ鎖または２本のＲＮＡ鎖のいずれかである。
【００９４】
（二本鎖分子の変性）
変性プロセスにおいて、ＭＯポリヌクレオチドサンプルは変性条件にさらされ、その結果、サンプル中の個々の核酸鎖は互いに分離され、このため、Ｍ０に存在するポリヌクレオチドすべてとは限らないが、大部分が一本鎖分子となる。再生は、例えば高温、好ましくは約９５℃を超える温度、低いイオン強度、酸性またはアルカリ性ｐＨ、および／またはホルムアミドもしくは尿素などの特定の溶媒を使用することによって達成される。核酸を変性させる方法は当技術分野でよく知られている（例えば、ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｔａｉｌｓ ｉｎ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｃｏｔｔｏｎ 等 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５ ： ４３９７，１９８８； Ｓｈｅｎｋ 等 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７２： ９８９，１９７５； Ｓｔｅｇｅｒ Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２： ２７６０，１９９４；それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。
【００９５】
（一本鎖分子のアニーリング）
一本鎖分子のみを、または一本鎖分子を主に含有するポリヌクレオチドサンプルを、個々の鎖が互いにアニールするようにアニーリング条件にさらす。アニーリング条件は、例えばアニーリングを生じさせる温度、イオン強度、ｐＨおよび溶媒の値である。高いイオン強度および／または低い温度などのアニーリングを促進する条件、およびハイブリダイゼーションの厳密さを調整するためのこれらの条件の変動は当技術分野でよく知られており（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等， １９８９； 上記のＡｕｓｕｂｅｌ 等 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、サーモサイクラーで保持されるフェノール系エマルジョン中で（Ｋｏｈｎｅ等，（１９７７） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １６ Ｎ ２４， ５３２９−５３４１）、または攪拌によって（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｉｂｌｅｔ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． （１９９５） ２３： ２３３９）、ハイブリダイゼーションが実現されるＰＥＲＴ技術が含まれる。それらの開示内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。アニーリングの時間は、所望のハイブリダイゼーションの反応および程度において配列の複雑さに応じて変化させることができる。アニーリング条件は、所望の相補性のレベルに有利なように調整することもできる。
【００９６】
いずれかの適切な手段（例えば、エッペンドルフ型チューブなど）を用いて、液相中または適切な支持体上でアニーリングを行うことが好ましい。ハイブリダイゼーションは、少量で、好ましくは１０〜１０００μｌ、さらに好ましくは１０〜５００μｌで行うことがさらに好ましい。核酸物質の量は、当業者によって決定することが可能である。一般に０．１〜１００μｇの量が用いられる。
【００９７】
アニーリング段階にかけられたポリヌクレオチドサンプルは、「アニールされる」と記述される。
変性段階およびアニーリング段階では、数種類の構造の分子が生成される。その一部を図１に図示する。
【００９８】
α型分子：これらの分子は、完全もしくはほぼ完全な二本鎖の二重鎖またはホモ二重鎖である。例えば、この種類の分子は、所定の遺伝子の１つのスプライシングアイソフォームに対応する完全長一本鎖ｃＤＮＡが、同一のアイソフォームに対応する相補的完全長ｃＤＮＡ鎖とアニールする場合に形成される。
【００９９】
β型分子：これらの分子は、一方または両端に一本鎖テールを有する不完全な二重鎖である。例えば、ｍＲＮＡの変性、逆転写の早期停止、内部プライミングなどの現象によって、切断されたｃＤＮＡ鎖が産生され得る。切断されたｃＤＮＡ鎖が切断されていない相補鎖とアニールした場合、新たに形成された二重鎖は、一方または両端に一本鎖テールを有するだろう。一方、かかる二重鎖は、同一遺伝子の異なるスプライシングアイソフォームに属する２本の鎖の間に形成し、一方のアイソフォームは、他方と比較して一方の末端のエクソン領域の追加または欠失を特徴とする。
【０１００】
γ型分子：これらの分子は、一方または両端の一本鎖テールの存在を特徴とする１つまたは複数の内部一本鎖領域を有するヘテロ二重鎖である。例えば、かかる分子は、遺伝子のスプライシングアイソフォームに対応する切断されたｃＤＮＡ鎖が同一遺伝子の他のアイソフォームの完全長相補鎖とアニールする場合に得られ、そのアイソフォームは、それらの５’末端および３’末端の両方で共通のエクソンを共有する。アイソフォームが単に領域の挿入または欠失によって異なる場合、内部一本鎖ループが形成される。アイソフォームが単に、他の領域によるある領域の置換によって異なる場合、内部一本鎖バブルが形成される。
【０１０１】
δ型分子：これらの分子は、それらの末端に一本鎖テールが存在しないことを特徴とする１つまたは複数の内部一本鎖領域を有するヘテロ二重鎖である。例えば、この種類の分子は、遺伝子の一方のスプライシングアイソフォームに対応する完全長ｃＤＮＡ鎖が同一遺伝子のその他のアイソフォームに対応する完全長相補的ｃＤＮＡ鎖とアニールした場合に形成され、そのアイソフォームは、それらの５’末端および３’末端の両方で共通のエクソンを共有する。一方、これらの構造は、ゲノムＤＮＡからの鎖が、領域の挿入もしくは欠失を特徴とする変異を含むが、同一遺伝子に対応するゲノムＤＮＡの相補鎖とアニールする場合に存在する。
【０１０２】
σ型分子：その分子は完全に一本鎖の分子である。一本鎖分子のこの集団は、別の鎖にアニールしなかった、変性段階によって生成された個々の鎖の集団に相当する。
γおよびδ分子によって図１に表される、内部一本鎖領域（１つまたは複数）有するヘテロ二重鎖またはＩＳＳＲＨは、以下の本発明によって包含される対象の分子である。というのは、それらは、例えば選択的スプライシング事象、ゲノム挿入もしくは欠失、または配列反復の伸長に対応する核酸差異を含むからである。実際には、核酸差異を除いて相補的な２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、２種類のポリヌクレオチド間の前記核酸差異に対応する１つまたは複数の内部一本鎖領域（１つまたは複数）を有する二本鎖分子を形成するだろう。
【０１０３】
（浄化および平滑末端化段階）
ＩＳＳＲＨを選択するための一本鎖トラップの効率を向上させるために、アニールしたサンプルの一部の分子上に存在する《寄生的な》一本鎖領域、換言すれば、完全に一本鎖の分子（図１のσ分子）もしくは二重鎖の一本鎖末端（図１のβおよびγ分子）などの内部領域に対応しないすべての一本鎖ＤＮＡ領域は、平滑末端化手順によって最終的に完了する浄化手順を用いて取り出すことが可能である。特に、β型およびγ型分子の一本鎖末端が除去され、完全な一本鎖のσ型分子もまた除去される。したがって、γ型分子はδ型分子に転換され、β型分子はα型分子に転換される。
【０１０４】
本明細書において同義で用いられる「浄化」、「浄化する」または「浄化された」という用語は、対象のサンプルにおけるポリヌクレオチドからの内部一本鎖領域以外の一本鎖領域の部分的または完全な除去を意味する。
浄化段階は、ＩＳＳＲＨの一本鎖トラップの効率および特異性を妨げると考えられる内部一本鎖領域と異なる一本鎖断片の存在を実質的に低減するために用いられる。それは任意の段階であるが、最初のサンプルがランダムな低減段階にかけられる場合には必須である。核酸二重鎖から一本鎖末端を取り除くため、かつ一本鎖分子を除去するために、当技術分野では様々な技術を利用することができる。例えば、一本鎖末端および遊離の一本鎖分子は、エキソヌクレアーゼＶＩなどの一本鎖特異的なエキソヌクレアーゼを用いて消化することができる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｒｏｅｋｅｒ 等 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １５： ４４６３，１９７６）。５’末端もしくは３’末端から一本鎖ＤＮＡを消化するが、遊離末端なしの一本鎖ＤＡＮに作用することができないエキソヌクレアーゼＶＩＩは、β型およびγ型分子の一本鎖テールを消化し、σ型分子を取り除くが、ＩＳＳＲＨの内部一本鎖領域には作用しないだろう。エキソヌクレアーゼＶＩＩは、その作用様式によって、処理後に単一ヌクレオチドのオーバーハングが残る結果となることから、二本鎖ＤＮＡを平滑末端化するのには適していないことを留意するのは重要である。同様の適切な酵素特性を有する他の酵素を使用することができる。
【０１０５】
好ましい一実施形態において、浄化段階は、一本鎖核酸分子を消化することが可能なエキソヌクレアーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼＶＩＩを用いて行われる。
本明細書において同義で用いられる「平滑末端化する」、「平滑末端化」または「平滑末端化された」という用語は、一方の鎖が他方の鎖よりも長いのではなく、両方の鎖の末端が互いに平滑なポリヌクレオチドを得るために、二本鎖ポリヌクレオチドの末端を修飾することを意味する。
【０１０６】
この平滑末端化段階は、前の浄化段階なしで行ってもよい任意の段階であるが、浄化段階に加えて、行うことが好ましい。それは２つの目的：ｉ）一本鎖トラップの効率および特異性を妨げる一本鎖末端の除去、相乗的には浄化段階への寄与、ｉｉ）最終的なアダプターライゲーションのための二重鎖末端の作製を果たす。しかしながら、非平滑末端を有する断片を生じるランダムな低減段階が行われ、アダプターライゲーションが望まれる場合には、平滑末端化段階は必須である。
【０１０７】
この平滑末端化段階の他の利点は、必要または所望の場合にはいつでも、本発明の一本鎖トラップを用いた選択段階後に回収されたポリヌクレオチドのその後の増幅に適切な形にポリヌクレオチドを転化することである。かかる増幅によって、必要な場合には、核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドを単離するための新たな濃縮サイクルを実施することを可能となるだろう。ＰＣＲにより増幅することができる形でのアニールしたサンプル中に存在するポリヌクレオチドの転化は、アダプターをポリヌクレオチド末端にライゲートすることによって行うことが可能である。しかしながら、当業者には容易に理解されるように、平滑末端化段階はほとんどの場合、ライゲーション段階前の必須条件であるだろう。
【０１０８】
二本鎖ＤＮＡを平滑末端化する技術は当技術分野でよく知られている（Ｈｙｏｎｅ Ｍｙｏｎｇ Ｅｕｎ， ｃｈａｐｔｅｒ ６， ｐｐ ３６７， ３６８， ３８２， ３８３， 「Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｘｔｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９６； Ｇｕｂｌｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２： ３３０，１９８７；上記の Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等， ｐｇ． ５．４５；それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。それらは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Ｐｏｌ　Ｉｋ）の使用を含む。例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すＴ４ＤＮＡポリメラーゼは、二本鎖ＤＮＡ分子の３’突出末端の消化を完了し、劣性３’末端のためにギャップを充填して、平滑末端を有するＤＮＡ分子を生成するだろう。
【０１０９】
好ましい一実施形態において、平滑末端化段階は、ポリメラーゼ、好ましくはＴ４　ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて行われる。さらに好ましい実施形態では、平滑末端化段階は、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われる。
【０１１０】
［一本鎖トラップ］
本発明の方法の重要な段階は、サンプルの残りからの、内部一本鎖領域（１つまたは複数）を有するヘテロ二重鎖分子またはＩＳＳＲＨの集団の単離段階である。ポリヌクレオチドの残りからＩＳＳＲＨのこのサブセットを分離することによって、次いで核酸差異を非常に容易に同定することができる。
【０１１１】
本発明において、一本鎖トラップ、つまりサンプル中の一本鎖領域を含む分子を選択する手段を用いて、ＩＳＳＲＨの集団が選択かつ単離される。本発明の一本鎖トラップは、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチドに結合させるのに用いられる条件下にて、二本鎖ポリヌクレオチドと比較して、一本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的な親和性を有する「認識エレメント」（ＲＥ）に基づく。選択的な親和性とは、ＲＥが二本鎖ポリヌクレオチドよりも一本鎖ポリヌクレオチドに高い親和性を有すると理解されたい。一本鎖ポリヌクレオチドに対する前記親和性は、二本鎖ポリヌクレオチドよりも、少なくとも１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８以上高い。
【０１１２】
好ましい実施形態において、ＲＥは、一本鎖ＤＮＡを選択するのに用いられる条件下にて、一本鎖ＤＮＡに対して高い親和性を有するが、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡに対してほとんど親和性を有しない、さらに好ましくは親和性を有しない。ＤＮＡを選択するのに使用される条件下にて、ＲＮＡと比較してＤＮＡに対して選択的な親和性を有する、さらに好ましくはＲＮＡに対してほとんど親和性を有さない、またさらに好ましくはＲＮＡに対して親和性を有さないＲＥがさらに好ましい。
【０１１３】
他の好ましい実施形態において、認識エレメントは、一本鎖ＲＮＡに対して高い親和性を有するが、二本鎖ＲＮＡに対してはほとんど親和性を持たない、さらに好ましくは親和性を持たない。ＲＮＡを選択するのに使用される条件下にて、ＤＮＡと比較してＲＮＡに対して選択的な親和性を有する、さらに好ましくはＤＮＡに対してほとんど親和性を持たない、またさらに好ましくはＤＮＡに対して親和性を持たないＲＥがさらに好ましい。
【０１１４】
（認識エレメントとしてのタンパク質の使用）
本発明の一連の好ましいＲＥは、二本鎖ポリヌクレオチドと比較して、一本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的な親和性を有するペプチドおよびタンパク質である。好ましい実施形態では、前記ＲＥは、一本鎖ＤＮＡを選択するのに使用される条件下にて、一本鎖ＤＮＡに高い親和性を有するが、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡに対してほとんど親和性を持たない、さらに好ましくは親和性を持たない。一本鎖ＤＮＡに対して範囲１０８〜１０１１Ｍ−１の親和性を有するＲＥがさらに好ましく、二本鎖ＤＮＡに対するそれらの親和性は１０４〜１０５Ｍ−１を超えない。ＤＮＡを選択するのに使用される条件下にて、ＲＮＡと比較してＤＮＡに対して選択的な親和性を有する、さらに好ましくはＲＮＡに対してほとんど親和性を持たない、またさらに好ましくはＲＮＡに対して親和性を持たないＲＥがさらに好ましい。
【０１１５】
本発明のＲＥは、一本鎖ポリヌクレオチドに対するそれらの結合親和性に関して、記述または明記される。好ましい結合親和性には、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×ｌ０−ｌ２Ｍ、１０−ｌ２Ｍ、５×ｌ０−ｌ３Ｍ、１０−ｌ３Ｍ、５×ｌ０−ｌ４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×ｌ０−ｌ５Ｍ、および１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものが含まれる。
【０１１６】
本発明の好ましいＲＥは、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）として公知のタンパク質である。本明細書においてＳＳＢは、ＲＮＡよりもＤＮＡに対して、かつ二重鎖ＤＮＡよりも一本鎖ＤＮＡに対して強い選択性を有する結合タンパク質として定義される。ＳＳＢは密接かつ共同的に結合し、ヘリカーゼおよびトポイソメラーゼで見られるＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ活性などの他の酵素活性を触媒しない。ＳＳＢは原核生物と真核生物の両方で見られる。最もよく研究されている原核生物のＳＳＢはファージＴ４の遺伝子３２（ｇｐ３２）の産物および大腸菌ＳＳＢである。大腸菌ＳＳＢおよびｇｐ３２はそれぞれ、Ｐｒｏｍｅｇａ社（Ｍ３０１１）およびＡｍｂｉｏｎ社（２４２２）から購入することができる。最もよく研究されている真核生物のＳＳＢは、アデノウイルスＤＢＰおよび子ウシ胸腺ＵＰ１である（ＳＳＢタンパク質についての更なる情報については、その開示内容全体が参照により組み込まれる、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ， Ｃｈａｐｔｅｒ １０， 「ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； およびＣｈａｓｅ （１９８６） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５５： １０３−３６を参照のこと）。二本鎖ＤＮＡと比較して一本鎖ＤＮＡに対する選択的な親和性を保持するＳＳＢの相同体または変異体は、ＲＥとして本発明によって包含される。
【０１１７】
本発明の他の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼ、リコンビナーゼ、例えばＲｅｃＡおよびＵＶｓＸ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、および乳酸脱水素酵素など、様々な程度の特異性で一本鎖ＤＮＡに結合する他のタンパク質、ならびにそれらの相同体または変異体をＲＥとして使用してもよい（Ｇｒｏｓｓｅ 等 Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ （１９８６） １６０ （３）： ４５９−６７； Ｃｈａｓｅ 等 （１９８６） 上記の文献； Ａｎｄｏ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｃａｌ （１９９８） ２８３： ７８５−９６）。
【０１１８】
さらに他の実施形態では、ＲＥは、一本鎖ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方）に選択的に結合することが可能な抗体である。一般に、一本鎖ポリヌクレオチドに特異的な抗体は、プリンおよびピリミジンヌクレオチドに対する特異性を有する抗体である。実際には、入手しやすいプリンおよびピリミジンヌクレオチドは一本鎖ポリヌクレオチドに存在し、二本鎖ポリヌクレオチドには存在しない。ＲＥとして使用することができる抗体の例は：いくつかのリウマチ性疾患において、特定の種類の癌および全身性エリテマトーデスなどの他の疾患において見られるような、一本鎖ＤＮＡに結合する自己抗体である（その開示内容全体が参照により組み込まれる、Ｓｗａｎｓｏｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６ ３６： １６２４−３３； ＳｔｅｖｅｎｓおよびＧｌｉｃｋ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９ ３８： ５６０−８）。一本鎖ＤＮＡに特異的なかかる抗体は、Ｓｃｉｍｅｄｅｘ社（ＳＳＤ９６参照）から購入することができる。代替方法として、二本鎖ポリヌクレオチドと比較して一本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的な親和性を示す抗体を見つけるために、当業者に公知のいずれかの方法を用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングすることが可能である。代替方法として、一本鎖ポリヌクレオチに選択的な親和性を有するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を当業者に公知のいずれかの技術を用いて作製することが可能である。
【０１１９】
さらに他の実施形態において、ＲＥは、二本鎖ポリヌクレオチドと比較して、一本鎖ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方）に対して選択的な親和性を有するペプチドである。かかるペプチドは、何千万個のペプチドを含有するペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって見つけることができる。ペプチドライブラリーは、バクテリオファージ上で作成するか、または直接的な化学合成から得ることができる。例えば、ファージペプチドライブラリー法においては、所定の長さのランダムな遺伝子を合成し、バクテリオファージ遺伝子中に挿入する。対象のペプチド配列を同定したら、それらを化学合成することができる。この概念は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＢａｕｍｂａｃｈおよびＨａｍｍｏｎｄ， ＢｉｏＰｈａｒｍ．， Ｍａｙ １９９２，２４に詳細に記述されている。
【０１２０】
所望の長さまたは所望の範囲の長さの核酸差異を認識することが可能なＲＥを使用することができることに留意すべきである。かかるＲＥは、抗体もしくはペプチドライブラリーのスクリーニングおよびＤＮＡシャッフリングおよびＤＮＡファミリーシャッフリングなどのｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質進化技術を含む、当業者に公知の方法を用いて開発することが可能である［これらのシャッフリング法の例に関しては、Ｙａｎｏ， Ｔ等， （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５，５５１１−５５１５； Ｚｈａｎｇ， Ｊ． Ｈ等， （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４，４５０４−４５０９； Ｃｈａｎｇ， Ｃ．−Ｃ．等，（１９９９） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７，７９３−７９７；Ｋｉｋｕｃｈｉ， Ｍ．等， （２０００） Ｇｅｎｅ ２４３，１３３−１３７を参照のこと］。
【０１２１】
〈選択段階〉
選択段階は以下のように行われる。認識エレメントを溶液中のポリヌクレオチドサンプルと混合し、その結果、サンプル中のポリヌクレオチドの一本鎖領域に対するＲＥの結合が溶液中で起こる。結合段階後、ＲＥ−ポリヌクレオチド複合体が、サンプル中の遊離ポリヌクレオチドの残りから分離される。当業者であれば容易に理解されるように、遊離ポリヌクレオチドから、ポリヌクレオチドに結合したタンパク質またはペプチドを分離するのには、たくさんの可能性が存在する。これらの可能性は２種類の主要なカテゴリーに分類される。
【０１２２】
第一カテゴリーでは、タンパク質またはペプチドをポリヌクレオチドと区別する一般的な特性を用いて分離を行う。例えば、ポリヌクレオチドに結合したタンパク質の遊離ポリヌクレオチドからの分離は、ニトロセルロースが二本鎖ＤＮＡには結合しないがタンパク質に結合する能力を有することから、ニトロセルロースフィルターを用いて行うことが可能である（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、上記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｆｒｚｅ ２， Ｃｈａｐｔｅｒ １２を参照のこと）。タンパク質と相互作用するポリヌクレオチドを遊離ポリヌクレオチドから単離するための他の可能性は、１：１のフェノール−クロロホルムなどの溶媒で抽出を行うことである（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． １９９５ ｃａｔａｌｏｇ ｐ．６３を参照のこと）。
【０１２３】
第二カテゴリーでは、標的分子、つまりＲＥが固定化リガンドによって捕獲されることを特徴とするアフィニティー技術によって、分離が達成される。第一カテゴリーでは、リガンドは、標的自体、つまり無修飾形の標的タンパク質またはペプチドに対する親和性を有する。例えば、従来の多くのタンパク質のアフィニティー精製プロセスでは、固定化アフィニティーリガンドとしてモノクローナル抗体が使用されている。このように、例えばＲＥがＳＳＢタンパク質である場合、ＳＳＢとＩＳＳＲＨとの間で形成された複合体は、ＳＳＢタンパク質に特異的に結合する抗体を固定化リガンドとして用いることによって、サンプルの残りから分離することが可能である。
【０１２４】
第二サブカテゴリーにおいて、固定化リガンドに対して親和性部位を含有するようにするために、ＲＥが修飾される。例えば、ＲＥはビオチン化される。次いで、ビオチン化ＲＥおよびポリヌクレオチドサンプルを共に混合し、ビオチン化ＲＥと一本鎖領域を有するポリヌクレオチド分子との間で、この結合段階中に形成された複合体を、数多くのビオチン／ストレプトアビジン精製システムのうちの１つを用いて、ポリヌクレオチドサンプルの残りから分離する。ＲＥを修飾する他の手法は、ＲＥに添加された融合タグを含有する組換えＲＥタンパク質を生成することである。この手法では、ペプチドまたはタンパク質タグ（特に、アフィニティーテール、切断可能なリンカー、およびマーカー配列とも呼ばれる）をコードするポリヌクレオチドを、対象の遺伝子（例えば、大腸菌ＳＳＢタンパク質の遺伝子）の５’末端または３’末端に付ける。得られた遺伝子融合は宿主細胞中で発現し、コードされた組換え融合タンパク質は、当技術分野で公知の方法を用いて、遺伝子工学によるタグの特性に基づいて、混入する宿主タンパク質から単離される。この手法を用いて（時として、アフィニティータグタンパク質精製システムと呼ばれる）、精製された標識ＲＥタンパク質が得られ、一本鎖領域を有するポリヌクレオチドをポリヌクレオチドサンプルの残りから分離するのに使用することができる。例えば、標識ＳＳＢタンパク質と一本鎖領域を有するポリヌクレオチド分子との間の複合体は溶液中で形成される。次いで、タグに特異的に結合するアフィニティーリガンドが固定化されているアフィニティーマトリックスにサンプルを通すことによって、これらの複合体を溶液から除去する。
【０１２５】
上述の方法において、ＲＥは最初に、いわゆる結合段階において溶液中でその一本鎖ポリヌクレオチド標的との複合体を形成する。次いで、ＲＥ−ポリヌクレオチド複合体を遊離ポリヌクレオチドから精製する。本発明の更なる実施形態として、これらの２つの段階を組み合わせ、同時に行ってもよい。例えば、ＲＥを固体マトリックス上に固定化し、一本鎖領域を含まないポリヌクレオチドから、一本鎖領域を有するポリヌクレオチドを分離するために、サンプルをアフィニティーマトリックスに適用することが可能である。
【０１２６】
本発明の好ましい実施形態において、一本鎖トラップは以下のようにデザインされる。ＲＥは「一本鎖結合タンパク質」、好ましくは大腸菌ＳＳＢである。ＳＳＢとＩＳＳＲＨとの結合は、比較的高いイオン強度、０．２Ｍ〜０．８Ｍ　ＮａＣｌ、さらに好ましくは約０．３Ｍ　ＮａＣｌを有するバッファー中で生じる。これらのイオン条件下で、大腸菌ＳＳＢの結合は、一本鎖ＤＮＡに対して高度に特異的である。
【０１２７】
さらに好ましい実施形態では、大腸菌ＳＳＢは、精製タグ、好ましくはＨｉｓタグをそのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に有するように遺伝子改変されている。ＨｉｓタグＳＳＢを対象のポリヌクレオチドサンプルと混合し、その結果、標識ＳＳＢと一本鎖領域を有するポリヌクレオチドとの間の複合体が溶液中で形成する。次いで、Ｈｉｓタグ融合タンパク質を精製するためにデザインされた固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）マトリックスにサンプルを通すことによって、これらの複合体を溶液から除去する。標識タンパク質のアフィニティー精製に用いられる、当技術分野で公知のかかるＩＭＡＣマトリックスは、様々な供給元（例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ社など）から購入することができる。次いで、競合的な対リガンド、好ましくはイミダゾール、または非常に高いイオン強度のバッファーを使用することによって、ＨｉｓタグＳＳＢ／ＤＮＡ複合体を溶出する。
【０１２８】
任意に、対象のＩＳＳＲＨをＲＥから遊離させるために、ポリペプチドからポリヌクレオチドを分離するための当業者に公知のいずれかの技術を用いて、単離されたＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体を処理する。例えば、フェノール・クロロホルム抽出、続いて最終的にはクロロホルム抽出、およびアルコール沈殿段階を実施することが可能である。代替方法としては、ＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体をプロテアーゼまたはプロテアーゼのカクテルで処理して、複合体のタンパク質部分を分解し、続いて核酸部分、つまりＩＳＳＲＨを取り出す。
【０１２９】
任意に、サンプルからのＩＳＳＲＨの回収を最大限にするために、本発明の一本鎖トラップを用いたＩＳＳＲＨの選択を、好ましくは新しいＲＥを用いて同一サンプルで数回繰り返し行う。前記選択は１〜５回行うことが好ましい。繰り返しの最適回数は、主に各回でトラップされるＩＳＳＲＨの相対量およびトラップするのに利用可能なＲＥの量に応じて異なるだろう。
【０１３０】
当業者であれば、ポリヌクレオチドサンプルからＩＳＳＲＨを選択する上述の技術は、本発明の実施形態の一部の説明を表すということを理解されよう。様々な変更または修正は当業者には明らかであり、本発明の範囲または精神から逸脱することなく加えることができる。
【０１３１】
（認識エレメントとしての物質の使用）
また、本発明により包含される認識エレメントは、二本鎖ポリヌクレオチドと比較して、一本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的な親和性を示す物質である。かかる物質は、前記ポリヌクレオチドと前記物質との間の会合の性質に関係なく、可逆的方法で一本鎖ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドと比較して選択的に会合する支持体または物質であることが可能である。かかる会合は、吸収、吸着、または他の可逆型の会合である。
【０１３２】
ＲＥとして用いるのに好ましい物質は、ポリヌクレオチドサンプルを分画するのに使用される支持体であり、一本鎖ポリヌクレオチドを特異的に保持することが可能であり、限定されないが、ＭＡＢ（ベントナイトカラム上のメチル化アルブミン）もしくはＭＡＫ（珪藻土カラム上のメチル化アルブミン）などのメチル化アルブミンカラム、またはベンゾイル化−ナフトイル化ＤＥＡＥセルロース（ＢＮＤＣ）カラムが含まれる。
【０１３３】
本発明の好ましい実施形態において、当業者に公知の技術を用いて、カラムを作製するのに、かかる物質が使用される。かかる物質は使い捨てシリンジに充填されることが好ましい。洗浄段階後、一本鎖ポリヌクレオチドを選択的に保持するカラムに、ポリヌクレオチドサンプルを通す。結合の条件は、使用される支持体の種類によって異なり、当業者によって容易に理解されるだろう。ＭＡＫカラムを使用する場合、好ましい洗浄バッファーおよび結合バッファーは、ｐＨ６．７に調節されたバッファーであり、イオン強度は０．６Ｍ　ＮａＣｌ〜１．６Ｍ　ＮａＣｌである。ＢＮＤＣカラムを使用する場合、好ましい洗浄および結合バッファーは、１Ｍ　ＮａＣｌバッファーである。好ましいが任意の洗浄段階の後、次いで、当業者に公知のいずれかの方法を用いて、保持された一本鎖ポリヌクレオチドをカラムから溶出して、前記一本鎖ポリヌクレオチドと前記支持体との間に形成された種類の会合を分断する。例えば、より高いイオン強度を有するバッファーを使用する。時に、段階的な塩勾配を用いてもよい。結局のところ、異なるｐＨ条件を有するバッファーを使用することが可能である。ＭＡＫカラムを使用する場合、ｉ）結合バッファーのイオン強度〜１．６Ｍ　ＮａＣｌの範囲の段階的な塩勾配、および最終的にｉｉ）ｐＨ７、１０．７および次いで１１．６に調節された１Ｍ　ＮａＣｌ、バッファーを用いて、溶出を行うことが好ましい。ＢＮＤＣカラムを使用する場合には、ホルムアルデヒド５０％を含有する１Ｍ　ＮａＣｌバッファーを用いて、溶出を行うことが好ましい。実験条件についての更なる詳細は、ＢＮＤＣおよびＭＡＫについてはＤａｖｉｅｓおよびＭｉｌｌｅｒ， Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ （１９８１） ９８： ５４９−５７； ＢＮＤＣについてはＮｅｌｓｏｎ 等， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９９３） ４： １１−１７； ＭＡＫについてはＢｒａｕｎ，Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｈ． （１９７５） ３０： ２４８−２５２； ＭＡＢについてはＳｈｉｒｏｂｏｋｏｖ 等， Ｂｉｏｋｈｉｍｉａａ （１９７５） ４０： ５３１−５３７）に記述されている。それらの開示内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
任意に、サンプルからのＩＳＳＲＨの回収を最大限にするために、本発明の一本鎖トラップを用いたＩＳＳＲＨの選択が、前記カラムにサンプルを流すことによって、同一サンプルで数回繰り返し行われる。前記選択は１〜５回行うことが好ましい。繰り返しの最適回数は、主に各回でトラップされるＩＳＳＲＨの相対量およびトラップするのに利用可能なＲＥの量に応じて異なるだろう。
【０１３５】
当業者であれば、ポリヌクレオチドサンプルからＩＳＳＲＨを選択する上述の技術は、本発明の実施形態の一部の説明を表すということを理解されよう。様々な変更または修正が当業者には明らかであり、本発明の範囲または精神から逸脱することなく加えることができる。
【０１３６】
選択段階後に得られたポリヌクレオチドの集団はＩＳＳＲＨにおいて濃縮される。かかる濃縮された集団をクローン化して、核酸差異を含有するポリヌクレオチドで濃縮されたライブラリーが得られる。次いで、濃縮されたライブラリーをシークエンスすることによって、これらの差異を正確に同定する。代替方法としては、濃縮が十分でない場合には、クローニング段階前に濃縮サイクルをもう１回行うことが可能である。
【０１３７】
［アダプターのライゲーションおよび切断］
任意に、本発明による方法においてアダプターを使用して、対象のポリヌクレオチドを続いてクローニングまたは続いて増幅することができる。したがって、アダプターのライゲーション段階の目的は、更なるクローニングまたは増幅に適した形に、選択されたポリヌクレオチドを転換することである。当業者には容易に理解されるように、ポリヌクレオチドへのアダプター配列のライゲーションは、一本鎖トラップによって選択段階から回収されたポリヌクレオチドの増幅を可能にし、その結果最終クローニング段階が容易になるだけではなく、必要な場合には、新しい濃縮サイクルを再開することを可能にする。
【０１３８】
アダプターは、増幅プライマーに対して少なくとも１つの結合部位を含有し、かつその後の増幅に対して効率的なハイブリダイゼーション部位として働くのに十分長くなければならない。アダプターは、長さ１０〜４０ヌクレオチドであることが好ましい。アダプターは、長さ２０〜３０ヌクレオチドであることがさらに好ましい。プライマーは、必要または所望の場合には容易に除去されるように、デザインすることも好ましい。例えば、アダプターは、その配列内のどこかに、つまり対象のポリヌクレオチドにライゲートされるであろう末端の近く（ライゲーション部位）、遊離末端の近く（遠位部位）、または好ましくはライゲーション部位の近くであるが内部に制限部位を有する。次いで、アダプター内の制限部位の位置に応じて、適切な制限酵素でポリヌクレオチドサンプルを単に消化することによって、制限酵素部位を含有するアダプターを少なくとも一部または完全に除去する。好ましくは、限定されないがＮｏｔ　Ｉ、Ｅｃｏ　ＲＩ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩを含む、レア制限部位が選択され、その結果、アダプターを除去した際、対象のポリヌクレオチド内では望ましくない内部切断はほとんど起こらない。この状況での望ましくない切断は、正確な核酸差異の同定を妨げる可能性のあるもの、換言すれば、主に前記核酸差異を有する領域内またはその隣接する周囲内で起こると考えられる切断である。アダプター配列はさらに好ましくは、その後のクローニングを簡単かつ柔軟にする、複数の制限酵素部位、またさらに好ましくは複数のレア制限部位を含む。かかるオリゴヌクレオチドアダプターは、化学合成を含む、当業者に公知のいずれかの材料および方法を用いて完全に人工的に合成するか、または製品供給元から購入することができる。
【０１３９】
好ましいアダプターは、長い方が１〜３ヌクレオチド長い、異なるサイズの２つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることによって形成される。短い方だけがその５’末端でリン酸化される。２つのオリゴヌクレオチドは、アダプターライゲーション部位が平滑であるのに対して、遠位部位は１〜３ヌクレオチドの５’一本鎖テールを表すようにデザインされる。遠位部位でのこの４’突出領域の役割は、ライゲーション段階中のいずれかのアダプター重合プロセスを避けることである。
【０１４０】
アダプターは、当技術分野でよく知られている技術を用いて、ポリヌクレオチドの末端にライゲートすることが可能である。アダプターは、化学的または酵素的に付けられる。ポリヌクレオチドは、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いてアダプターにライゲートすることが好ましい。アダプターは、ポリヌクレオチドの平滑末端に付けることが好ましい。
【０１４１】
任意に、ライゲートされたアダプターは、本発明による方法においてポリヌクレオチドから切断される。アダプターは適切な制限酵素で切断することが好ましい。アダプターの切断は、クローニングに対して任意の段階である。したがって、代替の実施形態として、アダプターは、クローニング段階前に完全もしくは一部除去されるか、インタクトにクローン化される。
【０１４２】
［増幅］
本発明のいずれかの方法を用いて単離されたポリヌクレオチドを増幅するこの任意の段階は、２つの目的：ｉ）クローニング、その後の分析または濃縮の別の回など、その後の段階の効率を高めるために、得られる単離ポリヌクレオチドの量を増加すること、ｉｉ）組換え細菌による内部一本鎖領域の最終的な修復を防ぐことによって、単離された核酸差異のクローニングの効率を高めることを果たす。
【０１４３】
本明細書中で、特に「標的ポリヌクレオチドサンプルの作製」という題名のセクションで開示されている技術を含む、当業者に公知のいずれかの技術を用いて、増幅を行うことが可能である。ＰＣＲが好ましい増幅技術である。
ＰＣＲを行うために、ポリヌクレオチド末端が既知でなければならない。したがって、アダプターのライゲーション段階は、ほとんどの場合、増幅前に必要である。一方、ポリヌクレオチド末端が既知かつ均一である場合には、ＰＣＲを用いて標的にされ、低減段階にかけられていない最初のポリヌクレオチドサンプルの場合と同様に、アダプターのライゲーションは必須ではない（実施例４および７を参照のこと）。
【０１４４】
アダプターをライゲートする場合には、かかる単離ポリヌクレオチドを増幅するために、プライマーを特異的にデザインすることが可能である。かかるプライマーは、ライゲートされたアダプターと特異的にハイブリダイズすることができるようにデザインされることが好ましい。
【０１４５】
低減段階を行うことなく、ＰＣＲを用いた標的化段階に、最初のポリヌクレオチドサンプルをかける場合には、単離ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーは、標的ポリヌクレオチドサンプルを作製するのに使用されるプライマーと同一であるか、または標的ポリヌクレオチドサンプルを作製するのに使用されるプライマーに対して内部のプライマーであることが可能である。
【０１４６】
［クローニング］
その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、上記の Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等， Ｖｏｌｕｍｅ １， Ｃｈａｐｔｅｒｓ １，２ ａｎｄ ３， ａｎｄ Ｖｏｌｕｍｅ ２， Ｃｈａｐｔｅｒ ８に記載されているような当業者に公知のいずれかの技術を用いて、核酸差異を含む単離ポリヌクレオチドを適切なベクターでクローン化して、核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドにおいて濃縮されるライブラリーを得ることが可能である。宿主細胞において複製する多種多様なクローニングベクターが利用可能であり、核酸配列が未知の場合でさえ、クローニングベクター中に外来ポリヌクレオチドを導入する技術が十分確立されている（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ 等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ 等 ｅｄｓ， 上記の文献， ｐｐ ５．５．１−５．５．１４）。
【０１４７】
クローニングに使用されるベクターは当業者にはよく知られており、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ＨＡＣ、ファージ等が挙げられる。容易に配列決定できるように（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）、１９９４／９５カタログ番号Ｐ２２１１、Ｐ２５５１）、ＲＮＡプローブが容易に作製できるように（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）、１９９４／９５カタログ番号Ｐ２１２９、Ｐ２２２１、Ｐ１０９１、Ｐ１１０１、Ｐ１２４１、Ｐ２２１１、Ｐ２５５１、Ｑ６３０１、Ｑ６１２１、Ｑ６１１１；Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）ＲＮＡプローブ作製キット、１９９４／９５カタログ番号Ｐ１２８０、Ｐ１３００、Ｐ１２９０、Ｐ２０２０、Ｐ１２７０、Ｐ１０７１、Ｐ１２５０、Ｐ２５８０、Ｐ２５９０もまた参照のこと）、クローン化産物によりコードされるポリペプチドが容易に発現できるように（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）、１９９４／９５カタログ番号ｅＰ２２１１、Ｐ２５５１、Ｑ６１１１；Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）市販のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳キット、１９９４／９５カタログ番号Ｌ４５４０、Ｌ４９７０、Ｌ４１５２、Ｌ４３３０、Ｌ４１４０、Ｌ４４１０、Ｌ１０３０、Ｌ１０２０も参照）、デザインされたベクターが市販されている。例えば、クローニングは、ＴＯＰＯ　ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州サンディエゴ）、カタログ番号Ｋ４５００−０１）を用いて行われる。必要な場合には、これらのベクターのいずれかを用いて、例えばクローン化されたインサートを除去し、ニックトランスレーションまたはランダムプライミング法（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等， 上記の文献， Ｃｈａｐｔｅｒ １を参照のこと）を用いてそれを標識することによって、ポリヌクレオチドプローブを作製することができる。
【０１４８】
公知の手順（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，上記の文献，ｐｐ． １． ７４−１．７５参照）に従って、組換えベクターを適切な宿主細胞に導入し、その中で複製する。細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、ショウジョウバエ細胞等の実質的に任意の宿主細胞において複製するようにデザインされた特異的ベクターを利用することができる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州サンディエゴ）、１９９５ カタログ番号Ｖ７８０−２０、Ｖ０４４−５０、Ｖ００４−５０；その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙａｔｅｓ 等 Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ８１２，１９８５もまた参照のこと）。組換え細菌によるＩＳＳＲＨを含有する選択されたポリヌクレオチドの内部一本鎖領域の作製を避けるために、ＰＣＲ増幅段階をクローニング前に行うことが可能である。代替方法としては、ＤＮＡ修復システムにおいて欠陥のある菌株を使用してもよい。
【０１４９】
クローニングは、個々の単離断片を互いから本質的に分離する。任意に、クローニング前の分離段階は、当業者に公知のいずれかの技術を用いて行うことが可能である。例えば、ＳＳＴで選択されたポリヌクレオチドは、ゲル電気泳動、および特定のサイズもしくはサイズの範囲の断片によって分離し、他のサイズの断片から単離することができる。次いで、個々のサイズ分画された集団をベクターにクローン化する。
【０１５０】
（核酸差異において濃縮されたライブラリー）
核酸差異を含有する関連ポリヌクレオチドにおいて濃縮されたライブラリーは、本発明によって包含される。「核酸差異を含有するポリヌクレオチドにおいて濃縮されたライブラリー」という用語は、本発明による一本鎖トラップによって選択されたポリヌクレオチドを含むライブラリーを意味する。核酸差異において濃縮されたライブラリーは濃縮％で示され、それによって、ライブラリーは、核酸差異１％〜１００％を含有し、１から１００までのいずれかの整数が本発明の詳細な実施形態として含まれる。上記の実施形態は、「少なくとも」「Ｘ」％の核酸差異として表され、「Ｘ」は１から１００までのいずれかの整数に等しい。一方、核酸差異の濃縮のレベルが、１倍の増大として、または「少なくとも」１倍の増大として表され、それによって、非核酸差異に対する核酸差異の増大または非へテロ二重鎖ポリヌクレオチドに対するヘテロ二重鎖の増大の倍数は、２から１０，０００までのいずれかの整数である。
【０１５１】
本発明は、所定の状況（例えば、生理学的、環境、実験、もしくは自然）を特徴づける核酸差異を含有するポリヌクレオチドにおいて濃縮されたいずれかのライブラリーを包含する。本発明は、異なる状況（例えば、異なる組織、病的に対して健康な）を特徴づける核酸差異を含有するポリヌクレオチドにおいて濃縮されたいずれかのライブラリーもまた包含する。最初のポリヌクレオチドサンプルＭ０に応じて、かつ低減段階を行うかどうかに応じて、４種類のライブラリーを得ることができる：
最初のポリヌクレオチドサンプルが、低減段階にかけられていない複合ポリヌクレオチドサンプルである場合、単離されたポリヌクレオチドは核酸差異を含有するポリヌクレオチドのライブラリーを形成する。例えば、この技術を用いて、選択的スプライシング事象にかけられた遺伝子のアイソフォームに対応するｃＤＮＡのライブラリーが得られる；
最初のポリヌクレオチドサンプルが、低減段階にかけられた複合ポリヌクレオチドサンプルである場合、単離されたポリヌクレオチドは、核酸差異を含有するポリヌクレオチド断片のライブラリーを形成する。例えば、この技術を用いて、完全長スプライシングアイソフォームではなく、選択的スプライシングにおいて、つまり核酸差異および周囲の配列を含有する断片において濃縮されたライブラリーが得られる；
最初のポリヌクレオチドサンプルが、低減段階にかけられていない標的ポリヌクレオチドサンプルである場合、単離されたポリヌクレオチドは、単一遺伝子または限定セットの遺伝子から生じる核酸差異を含有するポリヌクレオチドにおいて濃縮されたライブラリーを形成する；
最初のポリヌクレオチドサンプルが、低減段階にかけられた標的ポリヌクレオチドサンプルである場合、単離されたポリヌクレオチドは、単一遺伝子または限定セットの遺伝子に関連する核酸差異を含有するポリヌクレオチド断片のライブラリーを形成する。
【０１５２】
異なる起源のポリヌクレオチドが混合された最初のサンプルから構成される、異なるディファレンシャルライブラリーが本発明にとって特に興味深い。好ましくは、２種類の異なる状況（例えば、健康対病的、アポトーシス対非アポトーシス等）由来のポリヌクレオチドを混合して最初のポリヌクレオチドサンプルが得られる、それらのディファレンシャルライブラリーは本発明によって包含される。したがって、かかるサンプルで得られたライブラリーは、両方の状況間で存在する核酸差異に特有なポリヌクレオチドにおいて濃縮される。
【０１５３】
本発明の他の目的は、それらがクローン化されるかどうかに関わらず、本発明の方法のいずれかによって単離されたポリヌクレオチドに関する。一実施形態において、本発明は、本発明のいずれかの方法によって単離された関連ポリヌクレオチドを含有する組成物に関するものであり、前記ポリヌクレオチド配列は、核酸差異を含有する、核酸差異から本質的になる、または核酸差異にある。好ましい実施形態では、本発明は、本発明のいずれかの方法によって単離された関連ポリヌクレオチドを含有する組成物に関連し、前記ポリヌクレオチド配列は、選択的スプライシング事象を含む、選択的スプライシング事象から本質的になる、または選択的スプライシング事象にある。他の実施形態では、本発明は、本発明のいずれかの方法によって単離された関連ポリヌクレオチドを含有する組成物に関連し、前記ポリヌクレオチド配列は、所定の状況または環境に関わらず、核酸差異、好ましくは選択的スプライシング事象を含む、核酸差異、好ましくは選択的スプライシング事象から本質的になる、または核酸差異、好ましくは選択的スプライシング事象にある。第２のさらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明のいずれかの方法によって単離された関連ポリヌクレオチドを含有する組成物に関連し、前記ポリヌクレオチド配列は、１つの試験状況に存在し、かつ参照状況に存在しない核酸差異、好ましくは選択的スプライシング事象を含む、それから本質的になる、またはそれにある。
【０１５４】
本発明のいずれかの方法によって単離されたポリヌクレオチドの断片もまた本発明によって包含される。好ましい断片は、核酸差異を含む、核酸差異から本質的になる、または核酸差異からなる断片である。他の好ましい断片は、核酸差異を検出するためのプライマーおよびプローブとして使用される断片である。かかるプライマーおよびプローブのデザインについては以下にさらに記述する。
【０１５５】
本発明のいずれかの方法を用いて単離された、ポリヌクレオチドのいずれか、またはその断片、ならびに本発明のいずれかの方法を用いて同定される核酸差異を検出するようにデザインされたプライマーおよびプローブは、固体支持体上に便利に固定化される。その固体支持体は重要ではなく、当業者によって選択することができる。したがって、ラテックス粒子、微粒子、磁気ビーズ、非磁気ビーズ（ポリスチレンビーズを含む）、膜（ニトロセルロース片を含む）、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラスもしくはシリコンチップ、ヒツジ（または他の適切な動物の）赤血球およびｄｕｒａｃｙｔｅｓはすべて適切な例である。本発明のいずれかのポリヌクレオチド、プライマーもしくはプローブ、またはそのセットを含むアレイが特に興味深い。
【０１５６】
［差異の同定］
任意に、核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドを同定の段階にかけることができる。かかるポリヌクレオチドを最初に、適切なベクターにクローン化し、宿主細胞中で複製し、培養液中で保持することができる個々のクローンを得るために単離することが好ましい。それぞれの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｙｅｒｓ 等， Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ４９５，１９８５； Ｃｏｔｔｏｎ 等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ４３９７，１９８８； Ｍｙｅｒｓ 等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： １２４２，１９８５； Ｏｒｉｔａ 等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ２７６６，１９８９に記載の方法を含む、当業者に公知のいくつかの方法によって核酸差異の分析を行うことが可能である。核酸差異を同定するための好ましい方法は、直接シークエンスである。ＤＮＡシークエンスは単調な手順であり、多くのプロトコルおよび試薬が当技術分野では容易に利用することができる（例えば、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社（オハイオ州クリーブランド）から市販のＳｅｑｕｅｎａｓｅキット、１９９４／９５カタログ番号７０７７０、７１３５０、および７０７００を参照のこと）。
【０１５７】
核酸差異が同定されたら、核酸差異が実際に適切な位置に存在し、本発明の方法を行った場合に導入される実験的人工産物の結果ではないことを確認するために、最初のサンプル（１つまたは複数）からの対応するポリヌクレオチド（１つまたは複数）（またはその一部）をクローン化することは一般に価値がある。
【０１５８】
同定された核酸差異が既知の遺伝子で生じるかどうかを決定するために、利用可能な遺伝子配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなど）を検索することもまた一般に価値がある。一方、本発明は、同定された核酸差異を含有する未知または一部が既知の遺伝子の少なくとも一部の配列を同定することを可能とする。部分配列が同定されれば、完全な遺伝子をクローニングすることが可能な技術を容易に利用することができる（例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等 ，上記の文献，　Ｃｈａｐｔｅｒｓ ８ ， ９； Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ 等 ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｃｏｔｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ 等， ｅｄｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ． Ｙ．， １９９５， Ｃｈａｐｔｅｒ ５を参照のこと）。
【０１５９】
関連ポリヌクレオチドが、少なくとも２種類の異なるソース、環境または生理的状況のサンプルを混合することによって得られるサンプルから単離される場合、ディファレンシャルライブラリーの場合と同様に、１種または複数種の最初のサンプル中に存在する核酸差異は、以下に示す状況間の実際の差異から得られる核酸差異と区別することが可能である。最初のサンプルそれぞれに存在する同定された核酸差異を有するポリヌクレオチドの検出は、前記の同定された核酸差異に特異的なプライマーまたはプローブを用いて、混合サンプル中に存在する同定された核酸差異を有するポリヌクレオチドの検出と並行して行われる。最初のサンプル間の差異に対して特異的な核酸差異が混合サンプルにおいてのみ検出されると考えられるのに対して、他の核酸差異は他のサンプルにおいて検出されるだろう。かかる検出は、ハイブリダイゼーションに基づく方法および増幅に基づく方法を含む当業者に公知のいずれかの技術を用いて行うことが可能である。
【０１６０】
好ましい実施形態において、各サンプル（すべての最初のサンプルおよび混合サンプル）からのポリヌクレオチドを、当業者に公知のいずれかの技術を用いて、簡便な固体支持体、例えばフィルター、膜もしくはバイオチップ上にスポットする。次いで、それらのアレイしたポリヌクレオチドを、同定された異なる核酸差異に結合するいくつかのポリヌクレオチドプローブと独立してハイブリダイズさせる。分析のために、核酸差異１つ当たり１対のプローブを使用することが好ましい。オリゴヌクレオチドプローブ対は、特異的ポリヌクレオチドに対して特異的であるようにデザインされることが好ましい。例えば、１対のプローブのうちの１つのプローブは、選択的にスプライシングされる特定の領域の存在に対して特異的であるのに対して、他方のプローブは同一領域の排除に対して特異的である。プライマーおよびプローブのデザインに対する更なる指示を以下に示す。
【０１６１】
このように、この方法を用いて、同定された核酸差異が所定のソース、環境または生理的状況に由来するサンプル中に存在するか、それが混合サンプル中にのみ存在するかどうかを決定することが可能である。混合サンプル中にのみ存在する核酸差異は、考慮されるソース、環境または生理的状況の間に存在する差異に起因している。さらに、かかる検出によって、異なるソース、環境または生理的状況における関連ポリヌクレオチド種の相対比率を測定かつ比較することも可能となる。このように比較することによって、一部の状況において一部のポリヌクレオチド種が存在するか、または存在しないかだけでなく（定性的変化）、スプライシングプロフィールにおける最終的な変化（定量的変化）もまた明らかとなるだろう。
【０１６２】
［キット］
本発明の方法のいずれかを行うのに使用されるキットもまた、本発明によって包含される。実際に、本発明は、ポリヌクレオチドサンプル中の核酸差異を有するポリヌクレオチドの単離に用いるキットを包含し、前記キットは、
ａ）前記サンプル中のポリヌクレオチドをアニールするための試薬；
ｂ）二本鎖ポリヌクレオチドと比較して、一本鎖ポリヌクレオチドに対して選択的な親和性を有する認識エレメント；
ｃ）前記ＲＥを用いた、ＩＳＳＲＨを選択するための試薬；を備える。
【０１６３】
ポリヌクレオチドをアニールするための前記試薬は、当業者に公知の試薬のいずれか、好ましくは本明細書に記載の試薬のいずれかである。さらに好ましくは、前記試薬は、一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリングを促進するための公知のいずれかのバッファーまたは溶媒である。
【０１６４】
一実施形態において、前記ＲＥは抗体、好ましくは一本鎖ＤＮＡ分子に選択的に結合することが可能な自己抗体である。他の実施形態では、前記ＲＥはペプチドである。さらに他の実施形態では、前記ＲＥはタンパク質である。前記ＲＥは一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）であることがさらに好ましい。またさらに好ましくは、前記ＲＥは、大腸菌ＳＳＢ、ファージＴ４の遺伝子３２の産物、アデノウイルスＤＢＰおよび子ウシ胸腺ＵＰ１からなる群から選択される。またさらに好ましくは、前記ＲＥは大腸菌ＳＳＢである。さらに他の実施形態では、前記ＲＥは、ベンゾイル化−ナフトイル化−ＤＥＡＥ−セルロース（ＢＮＤＣ）、ベントナイト上のメチル化アルブミン（ＭＡＢ）および珪藻土上のメチル化アルブミン（ＭＡＫ）からなる群から選択される物質である。前記ＲＥはＢＮＤＣであることがさらに好ましい。
【０１６５】
選択段階に使用される前記試薬は、前記ＲＥがＩＳＳＲＨに結合することを可能にし、前記ポリヌクレオチドサンプルからＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体を分離することを可能にする試薬を含む。かかる試薬は、前記選択段階で使用されるＲＥが決定され、結合および分離させる操作手順が決定されれば、当業者には明らかであるだろう。「一本鎖トラップ」という題名のセクションおよび実施例のセクションにおいて、使用する試薬の例を挙げる。例えば、ＲＥがタンパク質である場合には、前記試薬は、結合バッファーと、限定されないが、ニトロセルロースフィルターおよびフェノール・クロロホルムを含む、複合体を形成していない核酸からタンパク質−核酸複合体を分離するためのいずれかの手段を含む。一方、ＨｉｓタグＳＳＢを使用する場合、前記試薬は、標識タンパク質が結合するであろう、Ｎｉ−ＮＴＡヒス＊結合樹脂などのアフィニティーマトリックス、ならびに結合、洗浄および溶出バッファーを含む。あるいは、前記ＲＥがカラムとして使用できる材料である場合、前記試薬は、洗浄、結合および溶出バッファーを含む。
【０１６６】
任意に前記キットは、好ましくは断片化によって、さらに好ましくはシングルパスＤＮＡシークエンスに適切なサイズにポリヌクレオチドのサイズを低減するための低減試薬を含む。好ましい実施形態では、前記低減試薬は、ポリヌクレオチドを断片化することが可能な断片化酵素、ならびにかかる消化を行うためのバッファーを含む。さらに好ましい実施形態において、前記酵素はＤＮアーゼＩである。他の好ましい実施形態では、前記酵素は、エンドヌクレアーゼ、好ましくは制限エンドヌクレアーゼである。
【０１６７】
任意に、前記キットは変性試薬を含む。かかる変性試薬は、低いイオン強度、酸性もしくはアルカリ性ｐＨを有するバッファー、および／またはホルムアミドもしくは尿素などの特定の溶媒であることが可能である。
任意に、前記キットは、ＩＳＳＲＨ上の内部一本鎖領域以外の一本鎖領域を除去するための浄化試薬を含む。好ましい一実施形態において、前記浄化試薬は、内部一本鎖領域ではないが、二本鎖ポリヌクレオチドの一本鎖遊離末端を含む一本鎖核酸分子を消化することが可能なエキソヌクレアーゼ、ならびにかかる消化を行うためのバッファーを含む。さらに好ましい実施形態において、前記エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＶＩＩである。
【０１６８】
任意に、前記キットは、段階（ｂ）の後に得られるポリヌクレオチドを平滑末端化するための平滑末端化試薬を含む。好ましくは、かかる平滑末端化試薬は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性と５’→３’ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を示すＤＮＡポリメラーゼ、ならびにかかる平滑末端化を行うためのバッファーを含む。好ましい一実施形態では、前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片である。
【０１６９】
任意に、前記キットは、ポリヌクレオチド末端にオリゴヌクレオチドアダプターをライゲートするためのライゲート試薬を含む。かかるライゲート試薬は、本明細書に記述されるようにデザインされたオリゴヌクレオチドアダプター、リガーゼならびにライゲーションを行うためのバッファーを含む。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドアダプターは、少なくとも１つの制限酵素部位、好ましくは少なくとも１つのレア制限部位を含む。前記リガーゼはＴ４　ＤＮＡリガーゼであることが好ましい。任意に、前記キットは、前記のライゲートしたアダプターを除去するためのアダプター除去試薬も含む。前記アダプター除去試薬は、前記制限部位に対する制限酵素、ならびにかかる消化を行うためのバッファーを含むことが好ましい。
【０１７０】
任意に、前記キットは、前記一本鎖トラップによって選択されたＩＳＳＲＨを増幅するための増幅試薬を含む。かかる増幅試薬は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲを行うためのバッファーを含むことが好ましい。任意に、前記増幅試薬は、単離されたポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるプライマーも含む。かかるプライマーは、前記のライゲートされたアダプターとハイブリダイズすることが可能であり、かつＰＣＲで使用するのに適していることが好ましい。
【０１７１】
［用途］
本発明による方法を用いて、
ｉ）単一遺伝子または限定セットの遺伝子に由来し、かつ所定の状況を表す関連ポリヌクレオチド間に存在する核酸差異を、前記単一遺伝子または限定セットの遺伝子に対して標的にされた、かつ単一状況からのポリヌクレオチドサンプルを用いて同定することができる。例えば、前記遺伝子または前記限定セットの遺伝子に対するすべてのスプライシングアイソフォームを対象の組織などの所定の状況において単離することが可能である。他の例では、疾患の候補遺伝子などの１つの遺伝子または限定セットの遺伝子の異なる対立遺伝子（または、好ましくは、標的ＤＮＡサンプルが低減された場合には、かかる対立遺伝子間の核酸差異）を所定の疾患状態などの所定の状況において単離することができる。
【０１７２】
ｉｉ）単一遺伝子または限定セットの遺伝子に由来し、かつ異なる状況を表す関連ポリヌクレオチド間に存在する核酸差異を、異なる起源由来のサンプルを混合することから得られるが、前記単一遺伝子または前記限定セットの遺伝子に対して標的にされたポリヌクレオチドサンプルを用いて同定することができる。かかるアプローチは、対照対実験サンプル、病気のサンプル対健康なサンプル、組織特異的サンプル対他の組織特異的サンプルなど、２種類以上の異なる状況に由来する関連ポリヌクレオチドを比較するのに特に有用である。例えば、所定の遺伝子または限定セットの遺伝子、例えば所定の疾患の候補遺伝子の関連ポリヌクレオチド（または、好ましくは、標的ポリヌクレオチドサンプルが低減された場合には、核酸差異）に対する関連ポリヌクレオチドを、患者対健康なヒトにおいて、両方の個体に由来する複合ＤＮＡサンプルを混合し、次いで上述のように標的化段階を行うことによって単離することができる。
【０１７３】
ｉｉｉ）所定の状況を表す関連ポリヌクレオチド間に存在する核酸差異を、単一状況由来の複合ポリヌクレオチドサンプルを用いて同定することができる。例えば、所定の状況を表す選択的スプライシング事象（またはｃＤＮＡサンプルが低減される場合には、すべての選択的スプライシング事象）にさらされた転写物に対応するすべてのアイソフォームを単離することができる。
【０１７４】
ｉｖ）異なるソース、起源または状況を表す関連ポリヌクレオチド間に存在する核酸差異を、異なる起源に由来するサンプルを混合することによって得られる複合ポリヌクレオチドサンプルを用いて同定することができる。かかるアプローチは、対照対実験サンプル、病気のサンプル対健康なサンプル、組織特異的サンプル対他の組織特異的サンプル等の、２種類以上の異なるソース、起源または状況に由来する関連ポリヌクレオチドを比較するのに特に有用である。例えば、選択的スプライシング（または、ｃＤＮＡサンプルが低減される場合には、すべての選択的スプライシング事象）にさらされた転写物に対応するすべてのアイソフォームを、対照対実験のヒトにおいて、両方の個体に由来する複合ＤＮＡサンプルを混合することによって単離することができる。他の例として、２つの菌株間のゲノムＤＮＡ差異を、２種類の異なるゲノムＤＮＡを混合し、次いで本発明の方法を適用することによって同定することができる。
【０１７５】
これらの技術の利点の１つは、核酸差異だけではなく、フランキング配列（低減段階が行われる場合）、さらに対応する全長ポリヌクレオチド（低減段階が行われない場合）もまた単離することである。したがって、同定されれば、差異およびフランキング配列の知識から、核酸差異に特異的であるオリゴヌクレオチドをデザインすることができる。さらに、かかる核酸差異は、所定の環境に特異的または多様な状況間での差異に特異的であると思われ、したがって、核酸差異に特異的なだけではなく、前記環境または環境間の差異にも特異的なオリゴヌクレオチドをデザインすることができる。
【０１７６】
次いで、核酸差異に特異的であり、最終的に所定の状況または状況間の差異にも特異的である、かかるオリゴヌクレオチドをスクリーニングおよび診断アッセイで使用して、試験すべきサンプル中に核酸差異が存在するかどうか、最終的にはサンプルが特異的状況に由来するかどうかを検出することが可能である。それらは、遺伝子治療のアプローチのアンチセンスツールとして使用することもできる。
【０１７７】
（ペプチドの発現）
本発明による核酸差異を含有するポリヌクレオチド、またはその断片、好ましくは、低減段階にかけられていないｃＤＮＡを使用して、それらがコードするポリペプチドまたはその一部を発現させることが可能である。当業者によく知られている技術を用いて、かかるポリヌクレオチドを発現ベクターにおいてクローン化し、発現させる。本発明は、本発明による方法のいずれかによって選択された核酸差異を含有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを包含する。本発明は、前記の選択されたポリヌクレオチドの断片によってコードされるポリペプチドもまた包含する。さらに、本発明は、前記の選択されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片を包含する。
【０１７８】
（核酸差異を含有するポリヌクレオチドの検出）
核酸差異を含有するポリヌクレオチドの検出は、当業者に公知のいずれかの検出技術を用いて、前記核酸差異に特異的なプローブまたはプライマーを使用して行うことが可能である。核酸サンプルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ＲＮＡを含む様々なソース、または組織サンプルから得られた核酸を含む。一部の用途では、標識された特異的プローブとハイブリダイズすることができるか、または特異的プライマーを用いて増幅されたポリヌクレオチドを、発現ベクター、シークエンシングベクター、もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクターなどのベクターにクローン化して、サンプル中で検出されたポリヌクレオチドのキャラクタリゼーションおよび発現を促進することができる。
【０１７９】
核酸差異を含有するポリヌクレオチドの検出は、当業者に公知のハイブリダイゼーション技術を用いて、１種または数種類の特異的ハイブリダイゼーションプローブを使用して行うことが可能である。前記プローブとハイブリダイズすることができる核酸の存在を検出するのに用いられる方法には、　サザンブロット法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、コロニーハイブリダイゼーション法、およびプラークハイブリダイゼーション法などの公知の技術が含まれる。例えば、標識プローブとハイブリダイズすることができる配列を含有する、試験すべき核酸サンプルを標識プローブと接触させる。サンプル中の核酸が二本鎖である場合、それをプローブと接触させる前に変性させる。一部の用途では、核酸サンプルをニトロセルロースもしくはナイロン膜などの表面上に固定化する。前記ハイブリダイゼーションは、厳密な条件下にて行うことが好ましい。厳密な条件のセットは当技術分野ではよく知られている。
【０１８０】
代替方法としては、当業者に公知の増幅方法を用いて、「標的ポリヌクレオチドサンプルの作製」という題名のセクションで本明細書に記述されているものを含むサンプル中に存在するポリヌクレオチドの特異的な核酸差異を検出することができる。ＰＣＲ技術は、本発明で用いられるのに好ましい増幅技術である。
【０１８１】
〈プライマーおよびプローブの作製〉
プローブの融解温度、プライマーもしくはプローブの長さ、溶液のイオン強度、およびＧ＋Ｃ含有率（通常、１０〜７５％、好ましくは３５〜６０％、さらに好ましくは４０〜５５％）を考慮し、プライマーおよびプローブのデザインは当業者にはよく知られている。かかるプライマーおよびプローブは一般に、長さ８〜１０００ヌクレオチド、好ましくは長さ１０〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは長さ１５〜３０ヌクレオチドである。増幅の目的では、およそ同じＴｍを有する一対のプライマーが好ましい。ＧＣ含有率およびオリゴヌクレオチドの融解温度に基づくＯＳＰソフトウェア（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｉｌｌｉｅｒおよび Ｇｒｅｅｎ （１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．， １： １２４−８）を用いて、または８量体の振動数相違法（Ｇｒｉｆｆａｉｓ 等， １９９１）に基づくＰＣ−Ｒａｒｅ（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｈｔｔｐ ：／／ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ． ｗｅｉｚｍａｎｎ． ａｃ． ｉｌ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＰＣ Ｒａｒｅ／ｄｏｃ／ｍａｎｕｅｌ． ｈｔｍｌ）を用いてデザインすることが可能である。
【０１８２】
核酸差異に特異的なプローブを以下のようにデザインすることが可能である。核酸差異が領域の追加または欠失にある場合、プローブは、前記領域に（図２ａのプローブＯ＋）、前記領域と５’もしくは３’隣接領域の１つとの間の接合領域に（図２ａのプローブＯ＋’）、または前記領域が欠失している場合に共に連結される前記領域に隣接する領域５’および３’間の接合に（図２ａのプローブＯ−）にのみ結合するようデザインすることが可能である。第１タイプおよび第２タイプのプローブによって、前記領域を含有するポリヌクレオチドを検出することが可能となるのに対して（選択的エクソンを有するスプライシングアイソフォーム、挿入もしくは伸長の繰り返しを有するゲノム領域）、第３タイプのプローブによって、前記領域が存在しないポリヌクレオチドの検出が可能となる（選択的にスプライスされたエクソンを含まないスプライシングアイソフォーム、挿入のない、または欠失を有するゲノム領域）。
【０１８３】
核酸差異が別の（Ｒ２）領域による領域（Ｒ１）の置換にある場合、２つ以上のエクソンが転写物上の所定の位置で選択的に使用される選択的スプライシングの場合と同様に、Ｒ１またはＲ２領域に（図２ｂのプローブＯ１またはＯ２）、またはＲ１もしくはＲ２領域と、５’もしくは３’隣接領域の１つとの間の接合領域に（図２ｂのプローブＯ１’またはＯ２’）のみ結合するようにデザインすることが可能である。
【０１８４】
核酸差異に特異的なプライマーを以下のようにデザインすることができる。核酸差異が領域の追加または欠失にある場合、前記領域の隣接領域に結合するようにプライマーをデザインすることが可能である。前記領域を含有するポリヌクレオチドの増幅産物は、前記領域が存在しないポリヌクレオチドの増幅産物よりも長いだろう。したがって、アンプリコンのサイズから、所定のエクソンが存在するか、存在しないかを決定することができるだろう。
【０１８５】
核酸差異が、別の（Ｒ２）領域による領域（Ｒ１）の置換にある場合、２つ以上のエクソンが転写物上の所定の位置で選択的に使用される選択的スプライシングの場合と同様に、前記領域の５’および３’隣接領域に結合するようにプライマーをデザインすることができる。選択的に使用されるエクソンの長さが異なるという条件で、アンプリコンのサイズから、エクソンが存在するかを決定することができるだろう。代替方法としては、少なくとも１種類のプライマーを、Ｒ１もしくはＲ２と、それらの５’もしくは３’隣接領域のうちの１つとの間の接合領域に特異的に結合するようにデザインすることができる。この場合には、エクソンが存在するかどうかを決定することを可能にするのは、アンプリコンの存在または非存在である。
【０１８６】
ケースバイケースで、核酸差異を検出するように、他の種類のプライマーおよびプローブをデザインすることができることは当業者には明らかだろう。
プライマーおよびプローブを含む、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを、所望の場合には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出することが可能である、当技術分野で公知のいずれかの標識を組み込むことによって標識することができる。その検出可能なポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であることが可能であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ニックトランスレーション、もしくはキナーゼ反応を含む、当技術分野で公知の技術を用いて作製することができる。
【０１８７】
本発明の特定の実施形態において、１組のプライマーまたはプローブを、所定の環境を表す核酸差異を含有するポリヌクレオチドに基づいて生成することが可能である（例えば、所定の組織／細胞／細胞小器官における特異的な発現、胚の発生または疾患の発生など、プロセスの発生の所定の段階での発現）。かかるプライマーまたはプローブは特定のコンテクストのマーカーとして使用することができる。したがって、本発明は、コンテクスト・マーカーとしての本発明のポリヌクレオチドの使用を包含する。
【０１８８】
かかるプライマーおよびプローブは、例えばｉｎ　ｓｉｔｕ　ＰＣＲまたは免疫化学を含む当業者に公知のいずれかの方法を用いて、未知の起源のサンプル、例えば法医学サンプル、異物部位へ転移している分化した腫瘍を同定するのに、または組織断面における異なる組織タイプを分化するのに商業的に有用である。本発明のプライマーおよびプローブは、未知の環境の同一性を決定する方法において使用することができる。未知の環境の同一性を決定することの一部として、本発明のポリヌクレオチドを使用して、その未知の環境が何であるか、および未知のサンプルが何であるかを決定するのに使用することができる。
【０１８９】
かかるプライマーは、使用するプローブまたはプライマーのセットが所定の疾患または障害に特異的である場合、診断用途においても有用である。数セットのプローブが所定の疾患の異なる段階で利用可能である場合、かかるプローブは、前記疾患の進化および最終的な治療の効果を追跡するのにもまた有用である。したがって、かかるセットのプライマーおよびプローブは、薬理学的対象の分子を試験するのに有用である。このように、本発明は、治療的または診断的対象の分子の同定にもまた関するものである。
【０１９０】
かかるプライマーおよびプローブは、所定の薬物に対して病原抵抗性の同定のコンテクストにおいてもまた有用である。実際に、所定の病原体による所定の薬物に対する突然の抵抗性獲得が、欠失によって引き起こされるか、またはゲノムにおける新規な配列の獲得につながる場合、適切な治療を前記個体に提供するために、本発明のプライマーおよびプローブを使用して、所定の個体において同定される病原体のかかる抵抗性を検出することができる。
【０１９１】
さらに、多数の選択的スプライシング事象の検出に対して特異的なセットのプライマーおよびプローブは、対照の状況と比較して試験状況においてそれらの選択的スプライシング事象をモニターすることによって、スプライシング機構に影響を及ぼすことが可能な分子を試験するのに有用である。
【０１９２】
（アレイを用いたｍＲＮＡアイソフォームの定量化）
本発明のいずれかの方法を用いて同定した核酸差異によって、かかる核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドの相対比率を測定するために使用することが可能なオリゴヌクレオチドプローブをデザインすることが可能となる。例えば、異なるアイソフォームの相対比率は、本発明のいずれかの方法を用いて同定された、異なる選択的スプライシング事象に対して特異的なプライマーを用いて決定することができる。かかる決定に用いられるオリゴヌクレオチドアレイは以下のように作製することが可能である。
【０１９３】
１）本発明の方法によって同定された各選択的スプライシング事象に対して、一対のオリゴヌクレオチドをデザインする。一対のうち第１オリゴヌクレオチドは一方のアイソフォームに対して特異的であり（例えば、選択的にスプライスされるエクソンまたはエクソンの一部を含有するオリゴヌクレオチド）、第２オリゴヌクレオチドは他方のアイソフォームに対して特異的である（例えば、選択的にスプライスされる前記エクソンまたは前記エクソンの一部を含有しないオリゴヌクレオチド）。かかるオリゴヌクレオチドのデザインに関するさらに詳細な説明については、図２および「プライマーおよびプローブの生成」という題名のセクションを参照のこと。
【０１９４】
２）次いで、所定のアイソフォームに対して特異的なオリゴヌクレオチドの異なる対をいずれかの適切な支持体上にアレイする（マクロアレイまたはマイクロアレイ）。
３）次いで、かかるアレイは、分析すべき所定のソース、環境または生理的状況に特有な異なるプローブとハイブリダイズさせる。かかる特有のプローブは、分析すべき前記ソース、環境または生理的状況から単離されたｍＲＮＡの逆転写によって得られ、したがって複合一本鎖ｃＤＮＡプローブを生じる。
【０１９５】
４）各アイソフォームの相対比率は、各オリゴヌクレオチド対のシグナル強度の比によって測定される。かかる比は、各対に対して決定される。かかる比のセットは、分析される前記状況に特有である。かかるセットの比は、分析される各ソース、環境または生理的状況に対して決定され、次いで比較される。
【０１９６】
本明細書において「アイソフォーム・モニタリングアレイ」と呼ばれる、かかるアレイは、所定の生体プロセスにおいて、または所定の刺激に対する生理応答において、様々な病理の原因である遺伝子の同定、シグナル伝達経路に関与する遺伝子の同定、予後もしくは診断のためのマーカーの同定、試験化合物（ゲノム薬理学（ｇｅｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ））の治療可能性の予想または向上、薬理ゲノミクス、腫瘍の分類等の様々な用途において貴重なツールであるだろう。
【０１９７】
〈ゲノム薬理学における使用〉
その目的は、病理的状況における試験化合物の保護効果を評価することである。例えば、その細胞が一部の神経変性側面を模倣することが可能な細胞モデルを用いて、試験化合物の神経保護効果をどのように決定するかを調べてみよう。例えば、所定の処理Ｔの後、これらの細胞はアポトーシスとなる。前記化合物の神経保護効果は以下のように決定することができる：
１）限定セットの遺伝子、アポトーシスに関与する公知の遺伝子の選択的スプライシング事象は、刺激された細胞（病理的状況）からのサンプルと未処理の細胞（正常な状況）からのサンプルとが混合された、適切な標的ｃＤＮＡサンプルを用いて同定される。
【０１９８】
２）同定された核酸差異に対して特異的なアイソフォーム・モニタリングアレイを、上述のように作製し、次いで異なる状況：ｉ）未処理の細胞、ｉｉ）刺激された細胞、およびｉｉｉ）刺激され、かつ処理された細胞に特有な複合ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。
３）スプライシングアイソフォームの比のセットを３つの状況それぞれにおいて決定する。試験化合物の神経保護効果は、病理的状況から離れた、かつ正常な状況に近い比を生じるその能力によって評価される。
【０１９９】
〈腫瘍の分類における使用〉
癌患者の管理を託されている病理学者および臨床医は、２つの主要な問題、即ち、疾患の進化および癌治療に対するその感受性を確実に予想する、従来の組織学的および臨床的な特徴の中で、疾患の広範な不均一性および因子の欠如に直面している。例えば、明らかに同じ予後タイプの乳癌は、患者の治療および結果としての生存に対するそれらの応答性において大きく異なる。各患者の治療を個別化することができるように、新しい予後因子および予測因子が必要とされている。スプライシングのレベルでヒト腫瘍において起こる修飾をモニターすることが可能なオリゴヌクレオチドのアレイは、より均一な臨床結果で不均一な癌を腫瘍のサブタイプに分類するのに、かつ可能性のある新しい予後因子および予想因子を同定するのに非常に有用であるだろう。かかるアレイは以下のようにデザインすることができる：
【０２００】
１）限定セットの遺伝子、癌、例えば乳癌に関与することが知られている遺伝子の選択的スプライシング事象は、異なる乳癌患者由来のサンプルが混合された、適切な標的ｃＤＮＡサンプルを用いて同定される。
２）同定された核酸差異に対して特異的なアイソフォーム・モニタリングアレイを上述のように作製し、次いで、それぞれが所定のがん患者に特有である複合ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。このように、各患者に特有である、アイソフォーム比のセットが得られる。
【０２０１】
各患者の臨床状態が明確であるという条件で、異なる癌状況（異なるタイプの乳癌、異なるステージの所定の癌など）に特有なスプライシングプロフィールが得られる。例えば、かかるプロフィールを分析することによって、あるグループにおいて、明らかに均一な異なるサブグループの患者を異なる臨床パラメーター（もう一方のグループと比較して一方のグループにおける転移の非存在、所定の治療に応答する差異等）で区別することが可能となる。さらに、分類されていない患者に対して得られたプロフィールとかかるプロフィールとの比較は、前記の分類されていない患者に固有の診断および予後に役立つ。
【０２０２】
（スクリーニング）
本発明による核酸差異を含有するポリヌクレオチド、特に上述の差異に特異的であるようにデザインされたプライマーまたはプローブを使用して、以下に示す技術を含む当業者に公知のいずれかの技術を用いてゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等，上記の文献 Ｃｈａｐｔｅｒｓ ８ および９を参照のこと）。例えば、低減されたサンプルで核酸差異が同定されている場合、かかる核酸差異を含有する完全長ポリヌクレオチドは、前記差異に特異的なプライマーおよびプローブを用いて、スクリーニングライブラリー、好ましくはほぼ完全長のポリヌクレオチドを含有するライブラリーによって、取り出すことが可能である。他の例では、必ずしも既知の機能である必要はないが、特異的な機能を発揮すると考えられる定義領域（例えば、機能ドメイン）が所定の状況下にて選択的にスプライスされることが示された場合、このドメインに特異的なプライマーおよびプローブを使用して、同様なドメインを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくは同一タンパク質ファミリーに属するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取り出すことができる。当技術分野では公知のように、有効なライブラリースクリーニングでは、厳密なハイブリダイゼーション条件が必要とされる。厳密なハイブリダイゼーション条件の多くの適切なセットは当技術分野ではよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等，上記の文献 Ｃｈａｐｔｅｒｓ ８ を参照のこと）。
【０２０３】
（アンチセンス）
細胞において正常に転写された鎖に対して反対の鎖からの転写を可能にするために、選択的スプライシング事象を含むポリヌクレオチドをクローン化する。この実施形態によるライブラリーはアンチセンスライブラリーと呼ばれる。それらは、所定の遺伝子の発現を変化させることが可能なアンチセンスポリヌクレオチドを含有し、さらに所定のスプライシングアイソフォームに対して特異的である。次いで、かかるアンチセンスライブラリーを対象の細胞にトランスフェクトし、所定の表現型の変化が研究される。かかるトランスフェクションに続いて、表現型変異の分析は通常、発現ベクターに安定に組み込まれているクローンを選択して行われる。かかるアンチセンスライブラリーを使用する主な利点は、発現が変化しており、選択された表現型を生じる遺伝子を同定するだけでなく、どのスプライシングアイソフォームが影響を受けているかを同定する能力である。本発明は、選択的スプライシング事象を含むポリヌクレオチドで作製されたアンチセンスライブラリーを包含する。
【０２０４】
本発明は、単一種として選択的スプライシング事象を含むポリヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスポリヌクレオチドもまた包含する。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、所定のスプライシングアイソフォームに相補的な配列を含むことが好ましい。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、選択的にスプライスされたエクソンに、または前記の選択的にスプライスされたエクソンと隣接するエクソンとの間の接合部の少なくとも１つに相補的な配列を含むことがさらに好ましい。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、前記の選択的にスプライスされたエクソンを含有するアイソフォームに特異的であるだろう。一方、かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、選択的にスプライスされたエクソンが存在しない場合、フランキングエクソン間の接合部に相補的な配列を含む。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、前記の選択的にスプライスされたエクソンを含有しないアイソフォームに特異的であるだろう。前記アンチセンスポリヌクレオチドの発現に便利なかかるアンチセンスポリヌクレオチドまたはベクターを使用して、対応する遺伝子の発現を修飾すること、好ましくは前記遺伝子の１つまたはいくつかの選択的にスプライスされたｍＲＮＡの発現を修飾すること、さらに好ましくは前記発現を抑制することが可能である。かかるアンチセンスポリヌクレオチドまたはベクターを使用して、所定のスプライシングアイソフォームの発現を減少させることによって、またはスプライシングを抑制することによって、１つの遺伝子の選択的スプライシングプロフィールを修飾することも可能である。遺伝子治療で使用するのに適したアンチセンスポリヌクレオチドをデザインする方法は、例えば、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９５／２４２２３、 Ｓｃｚａｋｉｅｌ Ｇ． 等 （１９９５ Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３ （６）： ２１３−２１７）、Ｇｒｅｅｎ 等， （Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５５： ５６９−５９７ １９８６） 、 Ｉｚａｎｔ およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ（Ｃｅｌｌ １９８４ Ａｐｒ； ３６ （４）： １００７−１５）、および Ｒｏｓｓｉ 等 （Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． ５０： ２４５−２５４， （１９９１））に記載の技術を含み、当業者によく知られている。
【０２０５】
【実施例】
以下の実施例によって、本発明の特定の実施形態を説明する。それらは、本発明を例証するものであり、制限するものではない。
【０２０６】
［実施例１：ＳＳＢタンパク質を用いた一本鎖トラップ］
本発明による好ましい認識エレメントは大腸菌ＳＳＢである。一本鎖領域を有するポリヌクレオチドのサブセットに特異的に結合する大腸菌ＳＳＢの能力を以下に示すとおりアッセイした。
１）ＳＳＢタンパク質を用いたゲル遅延（ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）アッセイ
ａ）原理
２つの隣接領域ｘおよびｙ（ｘは長さ１０３ｂｐの配列であり、ｙは長さ７４ｂｐの配列である）を含む第１二重鎖ポリヌクレオチド（いわゆる、参照ポリヌクレオチド）を、以下の順番ｘ、ｚ、ｙで３つの隣接領域（ｘおよびｙは参照ポリヌクレオチドの配列と同一であり、ｚは介在配列である）を有する等量の第２二重鎖ポリヌクレオチドと混合した。個々の核酸鎖が互いに分離するように、得られたサンプルを変性条件にさらした。次いで、個々の鎖が互いにアニールするように、そのサンプルをアニーリング条件にさらした。次いで、２種類のポリヌクレオチドが得られた：１）完全に相補的な鎖、つまり、同じ参照分子の相補的な個々の鎖を有する参照分子の個々の鎖（ｘｙ）または介在配列を含有する相補鎖を有する介在配列を含有する個々の鎖（ｘｙｚ）のいずれか、をアニールすることによって形成されたホモ二重鎖；２）不完全な相補鎖、つまり、介在配列を含有する相補鎖（ｘｙｚ）を有する参照分子の個々の鎖（ｘｙ）を、アニールすることによって形成されたヘテロ二重鎖。ホモ二重鎖は、完全に二本鎖のポリヌクレオチドであるのに対して、ヘテロ二重鎖は、内部一本鎖領域を有する二重鎖分子、つまりＩＳＳＲＨであった。次いで、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖分子を含むサンプルを大腸菌ＳＳＢタンパク質と混合した。ヘテロ二重鎖分子のみと安定かつ特異的な複合体を形成する大腸菌ＳＳＢタンパク質の能力を、ゲル遅延アッセイを用いて分析した。
【０２０７】
ｂ）実験条件および結果
約２０００ｂｐのＤＮＡ断片（Ｆ）をプラスミドにクローン化した。この断片の中央には固有のＳｍａｌ部位が存在した。インサートＦを含有するプラスミドベクターはＳｍａｌ（プラスミドベクターに他のＳｍａｌ部位は存在しない）によってデザインされた。９、１２、１５、１７、３０、４０、６７、および１５０ｂｐの平滑末端化された二本鎖ＤＮＡ断片をインサートＦのＳｍａｌ部位においてクローン化した。９種類の異なる構築物が得られた：１つの構築物はインサートＦのみを含有し（つまり、参照ｘｙポリヌクレオチド）、８つの構築物は、それぞれ９、１２、１５、１７、３０、４０、６７、および１５０の介在配列を有するインサートＦを含有した（つまり、ｚのサイズがそれぞれ９〜１５０ｂｐと異なる、ｘｚｙ構造を有するポリヌクレオチド）。ＦのＳｍａｌ部位を取り囲む約２００ｂｐの領域を増幅するために、２種類のＰＣＲプライマーをデザインした。さらに詳細には、一方のプライマーの結合部位は、Ｓｍａｌ部位から約１００ｂｐに位置し、他方のプライマーの結合部位は、Ｓｍａｌ部位の他方の側に、それから約１００ｂｐ離れて位置した。上述の２種類のプライマーを用いて、９ポリヌクレオチドを、上述の９種類の構築物をＰＣＲ増幅することによって産生した。参照分子と呼ばれる、インサートＦのみを含有する構築物を増幅することによって得られたポリヌクレオチドは、長さ約２００ｂｐであり、Ｓｍａｌ部位の中央に位置した。他の構築物を増幅することによって得られた他の８種類のポリヌクレオチドは、それぞれ９、１２、１５、１７、３０、４０、６７、および１５０ｂｐの介在配列によるＳｍａｌ部位の置換によって参照分子のみと異なった。介在配列を含有する８種類のポリヌクレオチドｘｚｙのそれぞれを、等量の参照ポリヌクレオチドｘｙと混合し、以下に示すように変性／再生および大腸菌と共にインキュベートした。それらのうちの３種類で得られた結果を図３に示す。
実験Ａ：ｚ＝１７ｂｐ
【０２０８】
参照分子ｘｙ５００ｎｇを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（２５℃でｐＨ４，５）、２８０ｍＭ　ＮａＣｌおよび４，５ｍＭ　ＺｎＳＯ４を含有するバッファー３０μｌ中のｘｚ１ｙ分子５００ｎｇと共に４０℃で１５分間インキュベートした。次いで、得られたサンプルの半分（１５μｌ）を３７℃で１５分間インキュベートし、次いで、４％アクリルアミドゲル上に添加した（ライン１）。その他の半分を大腸菌ＳＢＢ６μｇと混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、ゲル上に添加した（ライン２）。
【０２０９】
レーン１において、２つのバンド、（ａ）および（ｂ）が見られ、（ａ）はｘｙホモ二重鎖分子に相当し、（ｂ）はｘｚ１ｙホモ二重鎖分子に相当する。全く同じパターンがレーン２で観察された。この観察から、ＳＳＢは、２つのホモ二重鎖分子のいずれかとの安定な複合体を形成することはできないことが結論付けられる。
【０２１０】
ｘｙ分子５００ｎｇを、Ｈ２Ｏ２７μｌの最終量でｘｚ１ｙ分子５００ｎｇと混合した。変性させるために、そのサンプルを９８℃で２分間インキュベートし、次いで４０℃でインキュベートした。次いで、１０×アニーリングバッファー［５００ｍＭ酢酸ナトリウム（２５℃でｐＨ４、５）、２．８Ｍ　ＮａＣｌおよび４５ｍＭ　ＺｎＳＯ４］３μｌを直ちに添加し、その結果得られたサンプルを、アニーリングのために４０℃で１５分間インキュベートした。次いで、その溶液の半分（１５μｌ）を３７℃で１５分間インキュベートし、次いで４％アクリルアミドゲル上に添加した（ライン３）。後の半分を大腸菌ＳＳＢ６μｇと混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、ゲル上に添加した（ライン４）。
【０２１１】
レーン１と比較すると、レーン３において、（ａ）および（ｂ）よりもゆっくり移動する追加のバンド（ａｂ）の出現を確認することができる。上述のように、これらの新しい形は、変性／アニーリング段階の結果として生成されたヘテロ二重鎖分子に相当する。レーン４において、ヘテロ二重鎖分子に相当するこれらの追加のバンド（ａｂ）が消失するのに対して、非常に遅れ、かつ（ａｂ）ヘテロ二重鎖とＳＳＢタンパク質との間に形成されたＩＳＳＲＨ−ＲＥ複合体に相当する新しいバンドが現れる。この観察から、ＳＳＢは、１７ヌクレオチドの内部一本鎖ループを有する二重鎖構造との安定な複合体を形成することができると結論付けられる。
実験ＢおよびＣ：ｚ＝３０または４０ｂｐ
【０２１２】
これらの実験では、実験Ａと同じ実験条件を用いた。唯一異なるのは、Ｂでは、介在配列ｚ２が長さ３０ｂｐの配列であるのに対して、Ｃでは、ｚ３の長さが４０ｂｐであることである。観察されたプロフィールは、ＡよりもＢおよびＣで同じであった。これは、驚くべきことではないが、ＳＳＢが、３０および４０ヌクレオチドの一本鎖ループを有するポリヌクレオチドとの安定かつ特異的な複合体を形成することができることを意味する。
２）ＳＳＢ一本鎖トラップの検出限界
１５、１７、３０、４０、６７、および１５０ヌクレオチドの一本鎖ループを有するヘテロ二重鎖に関して、強いシフトが認められたのに対して、対応するホモ二重鎖分子では、シフトが認められなかった。しかしながら、１２ヌクレオチドのループを含有するヘテロ二重鎖の小部分のみがＳＳＢによって保持され、９ヌクレオチドのループを含有するヘテロ二重鎖ではシフトは認められなかった。
【０２１３】
これらの結果から、大腸菌ＳＳＢタンパク質は、少なくとも１５ヌクレオチドの一本鎖領域を有するポリヌクレオチドとの安定かつ特異的な複合体を形成することができると結論付けた。１５ヌクレオチド未満の長さであるエクソンはごくわずかであることから、大腸菌ＳＳＢタンパク質は、選択的スプライシング事象を同定するためにデザインされた一本鎖トラップにおいて適切な認識エレメントである。
【０２１４】
［実施例２：所定の条件において見出されるすべての選択的スプライシングアイソフォームの単離］
この方法は、選択的スプライシングにさらされたｍＲＮＡを同定し、かつ所定のコンテクストで見出された対応する選択的スプライシング事象を特徴づけることができる。図４によってこの方法を説明する。
１）複合ｃＤＮＡサンプルの作製
最初のサンプルは、ポリヌクレオチド、好ましくは対象のソース（例えば、脳などの組織型）から単離されたｍＲＮＡから産生された二本鎖ｃＤＮＡを含有するサンプルである。代わりに、それは、一本鎖ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを含有してもよい。ｍＲＮＡは、製品供給元から、または当業者に公知の数多くの方法の１つによって得られる。ｍＲＮＡ作製の一方法を以下に記述する。
【０２１５】
ａ）ｍＲＮＡサンプルの作製
異なる組織に由来するヒト全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡは、ＬＡＢＩＭＯ社およびＣＬＯＮＴＥＣＨ社から購入し、以下に示すようにｃＤＮＡライブラリーを作製するために使用される。購入したＲＮＡは、酸性グアニジウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出を用いて細胞または組織から単離される（ＣｈｏｍｃｚｙｎｉｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ，上記の文献）。Ａｖｉｖ およびＬｅｄｅｒ，上記の文献によって述されているように、オリゴｄＴクロマトグラフィーの２つのパスによって、ポリＡ＋ＲＮＡを全ＲＮＡ（ＬＡＢＩＭＯ）から単離し、リボソームＲＮＡを除去する。
【０２１６】
ポリＡ＋ＲＮＡの質および完全性を以下のように調べる。確実にｍＲＮＡが分解しないように、伸長因子１もしくは伸長因子２など遍在するｍＲＮＡに対応するプローブと、ノーザンブロットをハイブリダイズさせる。リボソームの配列によるポリＡ＋ＲＮＡの汚染を、ノーザンブロットおよび２８ｒＲＮＡの配列から得られたプローブを用いて調べる。続いて、ｒＲＮＡを５％未満有するｍＲＮＡ標本をライブラリー構築に使用する。外来配列（原核生物または真菌の）により汚染されたＲＮＡでライブラリーを構築するのを避けるために、細菌の１６Ｓリボソーム配列の存在および高度に発現した２種類の真菌のｍＲＮＡの存在もまた、ＰＣＲを用いて調べる。最終的に、インタクトなｍＲＮＡおよび低レベルな内在性もしくは外来性汚染を含有するＲＮＡサンプルが、その後の段階のために保持される。
【０２１７】
ｂ）ｃＤＮＡサンプルの作製
次いで、インタクトなｍＲＮＡおよび低レベルな内在性もしくは外来性汚染を含有する、対象のｍＲＮＡサンプルのアリコート、例えばｍＲＮＡ１０μｇを使用して、耐熱性逆転写酵素、好ましくはＡＭＶ逆転写酵素、およびｍＲＮＡのポリＡテールからの逆転写を開始することを可能にするオリゴｄＴプライマーを用いて、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。場合によっては、オリゴｄＴプライマーは、ポリＡテールの５’末端で合成を開始するために３’変性ヌクレオチドを有する。第１鎖ｃＤＮＡを生成した後、第２鎖が、３種類、つまりＲＮアーゼＨ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、および大腸菌ＤＮＡリガーゼのカクテルを用いて合成される。ＲＮアーゼＨが、逆転写後に得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを除去する際、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩは第２ｃＤＮＡ鎖を生成する。次いで、新たに合成された第２ｃＤＮＡ鎖を大腸菌ＤＮＡリガーゼでライゲートする。第２鎖ｃＤＮＡ合成が終了すると、残りのＲＮＡは分解し、得られた二本鎖ｃＤＮＡは、ＲＮアーゼＨ、ＲＮアーゼＡ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、および大腸菌ＤＮＡリガーゼを含有する酵素カクテルを用いて平滑末端化される。
【０２１８】
その結果得られたＭ０サンプルは、対象の生理的状況から抽出されたｍＲＮＡに由来する二本鎖ｃＤＮＡを含む。
２）選択的スプライシングアイソフォームにおいて濃縮されたサンプルの作製
濃縮プロセスは以下のとおり、５つの段階、つまり変性／アニーリング段階、浄化／平滑末端化段階、アダプターライゲーション段階、選択段階および増幅段階を含む。
【０２１９】
ａ）Ｍ０サンプルの変性／アニーリングによるヘテロ二重鎖の形成
二本鎖分子が確実にそれらの一本鎖構成要素に分離するように、二本鎖ＤＮＡサンプルＭ０を変性条件にさらす（例えば、１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ中で９８℃にて２分間）。次いで、個々の一本鎖分子が互いにアニールするように、得られた一本鎖ＤＮＡサンプルをアニーリング条件にさらす（好ましくは、１２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　トリス（ｐＨ８．０）を含有するバッファー中で３０℃にて１２〜７８時間）。次いで、得られたＤＮＡ混合物をエタノールで沈殿させる。変性／アニーリング段階後に得られた新たなサンプルをＭ０’とする。
【０２２０】
ｂ）サンプルＭ０’の浄化および平滑末端化
浄化および平滑末端化段階はそれぞれ、エキソヌクレアーゼＶＩＩおよびファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで行うことが好ましい。最初に、３０ｍＭ　リン酸カリウム（ｐＨ７、９）、８ｍＭ　Ｎａ２・ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール中で４２℃にて３０分間、Ｍ０’からのＤＮＡ０、２〜５μｇを、エキソヌクレアーゼＶＩＩ２〜１０単位とインキュベートする。次いで、サンプルの浄化（ｃｌｅａｎ ｕｐ）を、ＱＩＡＧＥＮ社から市販のＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて行い、その結果得られたＤＮＡ分子を、０、２ｍＭの各ｄＮＴＰの存在下にて、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ＤＴＴ、ＢＳＡ５０μｇ／ｍｌ中でＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ２〜１０単位と共に１２℃で２０分間インキュベートする。次に、ＤＮＡ浄化を再度、ＱＩＡＧＥＮ社から市販のＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）Ｃｌｅａｎｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて行う。浄化／平滑末端化段階後に得られた新たなサンプルをＭ０’’とする。
【０２２１】
ｃ）オリゴヌクレオチドアダプターのライゲーション
その方法のこの段階は、アダプター、好ましくはＮｏｔＩアダプターをサンプルＭ０’’に存在する平滑末端化ポリヌクレオチドの末端へライゲートすることにある。
【０２２２】
好ましい実施形態では、Ｎｏｔｌアダプターは以下のように得られる：２００μｌの容積で１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　トリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で、配列：５’ＯＨ−ＣＣＣＧＣＣＡＣＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧ−３’ＯＨ（配列番号：１）を有する第１合成オリゴヌクレオチド３ｎｍｏｌを、配列：５’−ＰＯ４−ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＣＧＴＧＧＣＧ−３’ＯＨ（配列番号：２）を有する第２オリゴヌクレオチド３ｎｍｏｌと混合する。次いで、その混合物を最初に、９０℃で２分間置き、続いて４０℃で３０分間置く。ここでアダプターは、ライゲーション反応にそのまま使用できる。
【０２２３】
ライゲーション反応は以下のとおり行われる：Ｍ０’’からのＤＮＡ０、１〜２μｇおよびアダプター２〜１０μｇを、６６ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、６、６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＤＴ、６６ｍＭ　ＡＴＰ、５％ＰＥＧ８０００中にて最終容積１００μｌでＴ４　ＤＮＡリガーゼ５０ワイス（Ｗｅｉｓｓ）単位と共に混合する。次いで、この反応混合物を１０℃で５〜１５時間置く。ライゲーション反応の最後で、フェノール抽出に続いて、エタノール沈殿を行う。アダプターライゲーション後、新たなサンプルをＭ０’’’と呼ぶ。
【０２２４】
ｄ）一本鎖トラップを用いた、内部一本鎖領域を含有するヘテロ二重鎖（ＩＳＳＲＨ）の選択
サンプルＭ０’’’は、末端にアダプターを含有する二本鎖ポリヌクレオチドのサンプルである。このサンプルは本質的に、２種類の分子、二重鎖（完全に相補的な）および１つまたはいくつかの内部一本鎖領域を有するヘテロ二重鎖を含む。選択的スプライシング事象に対応するＭ０’’’サンプルからのＩＳＳＲＨは、大腸菌の組換えＨｉｓタグＳＳＢタンパク質を含む一本鎖トラップを用いて、サンプルの残りから単離することが好ましい。このＨｉｓタグＳＳＢタンパク質は、Ｄａｂｒｏｗｓｋｉおよび ＫｕｒによってＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １６，９６−１０２ （１９９９）に記述されているプロトコルを用いて有利に生成される。手元のＨｉｓタグＳＳＢタンパク質を用いて、ＩＳＳＲＨの選択を以下のように行うことができる：１）１０ｍＭトリス（ｐＨ７．８）、２８０ｍＭ塩化ナトリウム中で３７℃にて３０分間、Ｍ０’’’サンプルをＨｉｓタグＳＳＢ５μｇと共にインキュベートし、その結果ＨｉｓタグＳＳＢ／ＩＳＳＲＨ複合体が形成される。２）次いで、得られた混合物を、Ｎｏｖａｇｅｎ社から市販のＮｉ−ＮＴＡヒス＊結合樹脂で充填されたクロマトグラフィーカラム上に直接適用し、その結果ＨｉｓタグＳＳＢ／ＩＳＳＲＨ複合体がその樹脂に結合する。次いで、洗浄バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．８）でカラムを２回または３回洗浄し、次いで、イミダゾール溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ６）でカラムを溶出することによって、ＩＳＳＲＨを回収する。次いで、溶出されたＨｉｓタグＳＳＢ／ＩＳＳＲＨ複合体をプロテイナーゼＫで処理し、その結果複合体のタンパク質画分が乱され、ＩＳＳＲＨが遊離する。次に、プロテイナーゼＫを取り除くために、フェノール抽出を行い、次いで、その結果得られた除タンパクされた混合物のＩＳＳＲＨをエタノール沈殿によって濃縮する。
【０２２５】
一本鎖トラップ後、サンプルをＩＳＳＲＨ（またはＡＳＥを有する核酸）で濃縮する。この新たなサンプルをＭ１と呼ぶ。任意に、本発明の一本鎖トラップを含むこの選択段階を数回繰り返して、ＩＳＳＬＨの回収を好ましくは１〜３倍に最大限にすることが可能である。
【０２２６】
ｅ）Ｍ１サンプルのＰＣＲによる増幅
上記の選択段階後、Ｍ１サンプル中のポリヌクレオチドを、選択されたポリヌクレオチドの両端にライゲートされたアダプター中のプライマー結合部位に結合することが可能なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅する。例えば、配列：５’−ＡＣＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧ−３’（配列番号：３）を有するプライマーを使用することができる。
Ｍ１のＰＣＲ増幅によって生成された新たなサンプルをＭ１ａとする。
【０２２７】
ｆ）Ｍ１ａのクローニング（選択肢１）またはＭ１ａの更なる濃縮（選択肢２）
この濃縮サイクル後、ＡＳＥ（１種または複数種）を示すポリヌクレオチドを直接クローン化することが可能である（選択肢１）。代替方法としては、濃縮をもう１回を実施してもよい（選択肢２）。
【０２２８】
ｆ１）選択肢１：Ｍ１ａのクローニング
適切な付着末端または平滑末端で作製されたいずれかのクローニングベクターおよび当業者に公知の技術を用いて、ＡＳＥを含有するポリヌクレオチドをクローン化する。クローン化された単離ポリヌクレオチドは、核酸差異において濃縮されたライブラリー（ＮＡＤ−Ｌｉｂ）、さらに正確には選択的スプライシングアイソフォームにおいて濃縮されたライブラリー（ＡＳＩ−Ｌｉｂ）を形成する。任意に、かかるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの両端に存在する、Ｎｏｔ　Ｉなどの制限酵素部位のいずれかを用いて消化することが可能である。かかる消化段階によって、クローニングを促進するであろう付着末端が形成される。
【０２２９】
ｆ２）選択肢２：アダプター切断
上述の５つの段階（変性／アニーリング；浄化および平滑末端化、アダプターライゲーション、一本鎖トラップ、ＰＣＲ増幅）からなるＡＳＥ濃縮の新たな回を行う前に、Ｍ１ａのＤＮＡ分子上に存在するアダプターを、アダプター上に存在する制限酵素部位のいずれかを用いたサンプルの消化によって有利に除去する。濃縮サイクルをもう１回行うには、ＮｏｔＩなどのアダプター配列間のいくつかのハイブリダイゼーションの問題を避けるために、アダプターを消化することが好ましい。この消化後に得られた新たなサンプルをＭ１ａｄとする。ここでＭ１ａｄは、変性／アニーリング段階で始まり、ＰＣＲ増幅段階で終わるＡＳＥ濃縮の新たな回にすぐ入ることができる。
第２回のＡＳＥ濃縮の後に得られた、濃縮されたサンプルをＭ２ａとする。ここで再び、Ｍ２ａサンプルの濃縮されたポリヌクレオチドをクローン化してもよいし、またはＡＳＥ濃縮の新たな回にかけてもよい。
【０２３０】
［実施例３：所定の条件における特異的遺伝子の選択的スプライシング事象の単離および同定］
以下のプロトコルは、特異的遺伝子（遺伝子Ｘ）の異なるスプライシングアイソフォームの同定を提供する。実施例３に開示の方法を図５および図６によって説明する。
１）低減された標的ｃＤＮＡサンプルの作製
Ｍ０サンプルは、遺伝子Ｘに特異的な二本鎖ｃＤＮＡ断片のサンプルである。それは、以下のように、ＲＴ−ＰＣＲに続いてＲＴ−ＰＣＲ産物の断片化によって得られる。
【０２３１】
ａ）標的ｃＤＮＡサンプルの作製
第１段階では、単離されたｍＲＮＡまたは市販のｍＲＮＡを、実施例２に記載の技術を含む、当業者に公知のいずれかの技術を用いて一本鎖ｃＤＮＡに転換する。
【０２３２】
次いで、上記の逆転写産物の少量のアリコートを、対象の遺伝子、つまり遺伝子Ｘに特異的なプライマーを用いたＰＣＲ反応において鋳型として使用する。そのプライマーは、対象のｃＤＮＡの大部分を増幅することできるようにデザインすることが好ましい。つまり例えばポリアデニル化部位に相当する領域において、第１プライマーは遺伝子Ｘの転写開始部位のできる限り近くでアニールし、第２プライマーはメッセンジャーＸの３’末端のできる限り近くでアニールする。増幅する領域が非常に長い、通常６Ｋｂを超える長さである場合、例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社からのＥｘｐａｎｄ（登録商標）ｌｏｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＰＣＲシステムなどの広範囲のＰＣＲシステムが使用される。次いで、Ｘの異なるスプライシングアイソフォームを含有する二本鎖ポリヌクレオチドのサンプルが得られる。
【０２３３】
ｂ）ｃＤＮＡサンプルの低減
次に、遺伝子Ｘのスプライシングアイソフォームの断片を得るために、低減段階が行われる。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、Ｎｏｖａｇｅｎ社から市販のＤｎａｓｅ　Ｓｈｏｔｇｕｎ　Ｃｌｅａｖａｇｅキットの材料および条件を用いて、平均サイズ約６００ｂｐを有する断片にまで切断される。次いで、得られたポリヌクレオチド断片を１％〜１．５％アガロースゲル上で電気泳動によって分離し、２００〜８００ｂｐに相当するバンドを切り出す。範囲２００〜８００ｂｐのＤＮＡ断片を、当技術分野でよく知られている数多くの既存の方法の１つによってアガロースバンドから回収する。低減された標的ｃＤＮＡサンプルをＭ０とする。
【０２３４】
２）特異的ＡＳＥにおいて濃縮されたライブラリーの作製
遺伝子Ｘに特異的であり、対象の元のサンプル（１つまたは複数）に存在するＡＳＥ中へのＭ０サンプルの濃縮は、実施例２に記載の場合と同じ手順を用いて得られる。簡潔に言えば、遺伝子Ｘに特異的な断片を変性させ、次いで再生する。Ｍ０サンプル中に遺伝子Ｘのいくつかのアイソフォームが存在する場合、ＡＳＥにさらされた領域を表す鎖がエクソン（１つまたは複数）もしくはその一部（１つまたは複数）を欠くか、または追加のエクソン（１つまたは複数）もしくはその一部を有する相補鎖にアニールするたびに、内部一本鎖領域（１つまたは複数）を有する二重鎖ポリヌクレオチドが生成されるだろう。ここで、アニーリング段階後のサンプルをＭ０’と呼ぶ。
【０２３５】
次いで、Ｍ０’サンプルにおける変性／再生されたポリヌクレオチドを浄化し、平滑末端化する。次に、その後の増幅およびクローニングを促進するために、アダプターをライゲートする。次いで、本発明の一本鎖トラップを用いて、ＩＳＳＲＨを選択する。ＰＣＲ増幅後、ＡＳＥを含有するポリヌクレオチドは直接クローン化されるか、または濃縮にもう一回かけられる。プロセスの終わりに、遺伝子Ｘに対してＡＳＥを有する短い断片において濃縮されたライブラリー（ＡＳＥ−Ｌｉｂ）が得られる。
【０２３６】
３）ＡＳＥの同定
次いで、遺伝子Ｘに特異的なクローン化ＡＳＥを以下のように同定する。ＡＳＥ濃縮ライブラリーを最初にシークエンスし、当業者に公知のいずれかのバイオインフォマティクスツールを用いて、得られた配列をＡＳＥの存在に関して分析する。
【０２３７】
低減段階のために、遺伝子Ｘの異なるＡＳＥは、互いに独立して同定される場合が多い。というのは、その異なるＡＳＥが、低減段階後に得られた異なる断片に相当する、異なる単離ポリヌクレオチド種上に存在するためである。したがって、少なくとも２つの独立したＡＳＥが所定のメッセンジャーに対して同定され次第、次の段階で、この遺伝子の異なるアイソフォームを決定する。例えば、図６に示すように、４種類の異なるアイソフォーム、つまり１１、１２、１３および１４を、２つの独立したＡＳＥ、つまりエクソンまたはエクソンの一部が存在する、または存在しない２つのＡＳＥであるＡおよびＢを用いて生成される。可能性のあるこれら４つのアイソフォームに関して、最初のサンプルにおけるこれらの４つの異なるアイソフォームの全１１通りの組み合わせが可能である。しかしながら、可能性のあるこれら１１通りの組み合わせのうち７通りは、２つのＡＳＥの存在を明らかにする。
【０２３８】
その状況は、ＡＳＥの数が増大するに従って、さらに非常に複雑になる。さらに説明するために、以下を例にとってみよう。遺伝子ＸがプレｍＲＮＡに転写され、２種類のスプライシングアイソフォーム、約３ｋｂメッセンジャーのＸ１およびＸ２が生じると仮定する。Ｘ１は：１）それが、分子（第１ＡＳＥ）の５’部分に位置する８０ヌクレオチドの追加のエクソンを有し；２）それが、分子（第２ＡＳＥ）の中央に位置する２５ヌクレオチドのエクソンと、分子（第３ＡＳＥ）の３’部分に位置する６５ヌクレオチドのエクソンである、２つのエクソンを欠いている；という点でＸ２と異なるとさらに仮定する。そのため、本発明の方法を適用すると、遺伝子Ｘを特徴づける３つのＡＳＥは同定することができるが、低減段階のために、かつこれらの３つのＡＳＥが他のＡＳＥから遠位にあることから、ほぼ間違いなく、それらは独立して同定されるだろう。したがって、この段階では、遺伝子Ｘの異なるアイソフォームが何であるかを決定することはできない。実際には、３つのＡＳＥでおそらく生成することができるアイソフォームの総数は２３＝８であり、３つのＡＳＥに相当する組み合わせの数は非常に大きい。
【０２３９】
Ｘの異なるアイソフォームの同定は以下のように行われる。第１段階において、遺伝子Ｘのすべての異なるアイソフォームのライブラリーが作製される。例えば、ＲＴ−ＰＣＲは上述のように行われ、得られたサンプルのポリヌクレオチドを対象のベクターにクローン化する。このように、すべての異なるＸアイソフォームがライブラリーにおいて表現するだろう。
【０２４０】
第２段階において、Ｘのすべての異なるアイソフォームのライブラリーのクローン、好ましくはライブラリーの９６〜３８４個のクローンが、当業者に公知のいずれかの技術を用いて、固体支持体、たとえばフィルター、膜またはバイオチップ上にアレイされる。同一のアレイされたいくつかのライブラリーが作製される。
【０２４１】
第３段階では、アレイされたライブラリーを、遺伝子Ｘの同定された異なるＡＳＥと結合するいくつかのプローブと独立してハイブリダイズさせる。各プローブは、所定のＡＳＥに対して特異的であるようにデザインすることが好ましい。例えば、プローブは、それが前記エクソンの一部、または前記エクソンと周囲のエクソンとの接合部と特異的にハイブリダイズする場合、選択的にスプライスされた特定のエクソンの包含に特異的である。代替方法としては、前記エクソンがスプライスされた場合に共に連結されるエクソンと、存在する場合には前記エクソンを取り囲むエクソンと、の間の接合部と特異的にハイブリダイズする場合には、前記エクソンの排除に対して特異的であるようにプローブをデザインすることが可能である。したがって、この方法を用いて、選択的スプライシングにかけられた異なるエクソンが存在するかどうかを、アレイされたライブラリーの各クローンについて決定し、その結果、各クローンについて相当するアイソフォームが何であるかを正確に推測することが可能である。例えば、独立した２つのＡＳＥが同定されている場合（例えば、ＡＳＥ１およびＡＳＥ２）、ＡＳＥ１において選択的にスプライスされたエクソン配列（エクソン１）を認識するであろう第１オリゴヌクレオチド（オリゴ１）をデザインすることが可能であり、ＡＳＥ２において選択的にスプライスされたエクソン配列（エクソン２）を認識するであろう第２オリゴヌクレオチド（オリゴ２）をデザインすることができる。オリゴ１とのアレイされたライブラリーの第１ハイブリダイゼーションは、エクソン１が各クローンに存在するかどうかの情報を与える（ハイブリダイゼーションシグナルはエクソン１が存在することを示し、シグナルはエクソン１が存在しないことは示さない）。ライブラリーのオリゴ２との第２ハイブリダイゼーションは、各クローンにおいてエクソン２が存在するかどうかの情報を与える。そのように、クローンがオリゴ１とはハイブリダイズするが、オリゴ２とハイブリダイズしない場合、これによって、エクソン１が存在し、エクソン２が存在しないアイソフォームが存在することが明らかとなる。別のクローンがオリゴ１ともオリゴ２ともハイブリダイズしない場合、これは、エクソン１およびエクソン２が欠けている遺伝子Ｘのアイソフォームが存在することを示している。
【０２４２】
［実施例４：所定の条件における特異的遺伝子のスプライシングアイソフォームの単離および同定］
所定の状況における単一プレｍＲＮＡに由来する、異なるスプライシングアイソフォームを以下のように同定することができる。最初に、メッセンジャーＸに特異的なＡＳＥにおいて濃縮されたライブラリーは、先の実施例で記述するように作製される。次いで、クローン化ＡＳＥの配列を、濃縮されたライブラリーをシークエンスすることによって同定する。最後に、メッセンジャーＸの異なるアイソフォームを含有するライブラリーを、当業者に公知のいずれかの技術を用いて作製する。そのライブラリーからのクローンを固体支持体上にアレイし、次いで、各クローン上に存在するＡＳＥを同定し、かつ先の実施例で記述するように異なるＸアイソフォームを推論するために、メッセンジャーＸの異なるＡＳＥに結合することができるプローブとハイブリダイズさせる。
【０２４３】
代替方法として、低減段階が省略されていることを除いては、実施例３に記載の手順と本質的に同じ手順を用いて、単一遺伝子のスプライシングアイソフォームを作製することができる。したがって、ＡＳＥおよび濃縮ループ後のその周囲の配列を本質的に含有する短い断片を得る代わりに、この方法によって、ＡＳＥ、好ましくは完全長スプライシングアイソフォームを含有する長いポリヌクレオチドが生成される。この方法のフローチャートを図７に示す。この場合、予備的なＲＴ−ＰＣＲ段階によって、平滑末端を有するポリヌクレオチド種が生成することから、平滑末端化段階も必要ではないこともまた留意されたい。さらに、予備的なＲＴ−ＰＣＲ段階に使用される同じプライマーを濃縮の他の回に使用することができるため、アダプターライゲーションもまた、濃縮の他の回を行うのに必要ではない。
【０２４４】
［実施例５：所定の薬物に対するそれらの感受性の点で異なる、所定の病原体の２種類の株のゲノム間での配列差異の同定］
以下のプロトコルによって、所定の薬物に対するそれらの感受性の点で異なる、所定の細菌病原体の２種類の株のゲノム間での配列差異が同定される。
【０２４５】
両方の株からのゲノムＤＮＡを、当技術分野でよく知られている技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １， Ｃｈａｐｔｅｒ ２．４参照）を用いて単離する。次いで、第１株のゲノムＤＮＡ２〜５μｇを、第２株の等量のゲノムＤＮＡと混合する。得られたＤＮＡ混合物を３つのチューブに分ける。次いで、３種類のＤＮＡの混合物をそれぞれ、異なる６塩基カッター制限エンドヌクレアーゼ、例えばＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩおよびＤｒａＩで消化し、その結果、各混合物におけるＤＮＡ分子の平均サイズは、約４〜５Ｋｂに低減される。制限エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡ分子を消化する条件は、当業者にはよく知られている。通常、供給業者によって提供される適切なバッファーを用いて、ＤＮＡ１μｇまたは２μｇを、全反応容積５０μｌで制限エンドヌクレアーゼ２〜５単位を用いて３７℃にて１時間消化する。３通りの異なる低減パターンが用いられる理由は、切断が核酸差異中で生じ、このため、前記核酸差異の同定が妨げられる可能性を低減するためである。したがって、異なる手段、ここでは異なる制限酵素によって断片化を行うことによって、それぞれの核酸差異が低減段階によってインタクトなままであり、続いて同定される可能性が高くなる。消化後に得られた３種類のＤＮＡ混合物をＭ０ＥｃｏＲＶ、Ｍ０ＰｖｕＩＩ、およびＭ０ＤｒａＩとする。
【０２４６】
次いで、それらの３種類の混合物で、実施例２に記述した手順と本質的に同じ手順を行い、２種類の株の間に存在する配列差異に関連するＤＮＡ断片において濃縮された３種類の新たな混合物が得られる。簡単に言うと、Ｍ０ＥｃｏＲＶ、Ｍ０ＰｖｕＩＩ、およびＭ０ＤｒａＩ混合物のＤＮＡ断片を変性させ、次いで再生する。株のうちの１つが、１つまたはいくつかの欠失または１つまたはいくつかの挿入によって他の株と異なる場合、核酸差異に関連する領域を表す１つの株からの鎖が他の株からの相補鎖にアニールすると、内部一本鎖領域（１つまたは複数）を有する二重鎖ポリヌクレオチドが形成し得る。次に、再生段階後に得られた３種類のサンプル（Ｍ０’ＥｃｏＲＶ、Ｍ０’ＰｖｕＩＩ、およびＭ０’ＤｒａＩ）を浄化、平滑末端化およびアダプターライゲーション段階にかける。ここで、その結果得られた混合物をＭ０’’’ＥｃｏＲＶ、Ｍ０’’’ＰｖｕＩＩ、およびＭ０’’’ＤｒａＩと呼ぶ。次いで、これら３種類の混合物中のＩＳＳＲＨを、本発明の一本鎖トラップを用いて選択する。ＢＮＤＣカラムを、ＳＳＴのＲＥとして使用することが好ましい。Ｍ０’ＥｃｏＲＶ、Ｍ０’ＰｖｕＩＩ、およびＭ０’ＤｒａＩを１Ｍ　ＮａＣｌに調節し、次いで、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１Ｍ　ＮａＣｌで予め平衡化しておいたＢＮＤＣ１００ｍｇと混合する。その混合物を室温で１〜４時間攪拌する。次いで、高い塩濃度にてＢＮＤＣは二本鎖ＤＮＡを保持しないが、一本鎖ＤＮＡを保持することができるため、ＢＮＤＣを１４，０００ｒｐｍで３分間ペレットにし、その上清を捨てる。次いで、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１Ｍ　ＮａＣｌバッファーで２〜３回、ＢＮＤＣを洗浄する。各洗浄で、ＢＮＤＣを最初に再懸濁し、懸濁液中で２〜５分間保持し、遠心分離りよってペレットにし、次いで上清を捨てる。ＢＮＤＣ、主にＩＳＳＲＨを結合させたポリヌクレオチドは、溶出バッファー（５０％ホルムアミド、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８）、１Ｍ　ＮａＣｌ）５００μｌ中に洗浄されたＢＮＤＣを再懸濁し、懸濁液中でそのＢＮＤＣを５分間保持し、次いで、５分間遠心分離することによってＢＮＤＣをペレットにし、上清を回収することによって回収される。次いで、回収されたポリヌクレオチドをエタノール沈殿させる。
【０２４７】
一本鎖トラップによって選択された３種類の混合物をＰＣＲ増幅した後、配列差異を含有するポリヌクレオチドを直接クローン化するか、またはもう１回濃縮にかける。プロセスの終わりに、２種類の株間の配列差異を有するＤＮＡ断片において濃縮されたライブラリーが得られる（ＮＡＤ−Ｌｉ）。これらの配列差異は、ライブラリーをシークエンスすることによって、または当業者に公知のいずれかの方法によって特徴づけることができる。
【０２４８】
［実施例６：いくつかの条件における単一遺伝子の選択的スプライシング事象の単離および同定］
図８に示すこの方法によって、いくつかのソース、環境または生理学的条件間の差異に特有な選択的スプライシング事象において濃縮されたｃＤＮＡライブラリーを得ることができる。
【０２４９】
この方法は、濃縮法が実施されるｃＤＮＡサンプルが、単一ソース由来のものではなく、共に混合された異なるｃＤＮＡサンプルからのものであるという違いを有するが、実施例３に記載の段階と同じ段階を含む。
簡単に言えば、いくつかの標的ｃＤＮＡサンプルを、異なるソース、環境または生理学的条件に由来する最初のサンプルからの遺伝子Ｘに対して作製する。次いで、濃縮手順が実施されるポリヌクレオチドサンプルを構成するために、等量のこれらの標的ｃＤＮＡサンプルを共に混合する。
【０２５０】
次いで、実施例３に記載の手順と同じ手順を用いてＡＳＥ同定を行う。しかしながら、同定されたＡＳＥが、混合ポリヌクレオチドサンプルを得るのに使用されるｃＤＮＡサンプルの１つまたは複数内における選択的スプライシングアイソフォームの存在（サンプル内の差異）から、または異なるｃＤＮＡサンプルにおける異なる選択的スプライシングアイソフォームの存在（サンプル間の差異）から生じるかどうかを決定するために、混合ポリヌクレオチドサンプルから生じるポリヌクレオチドを、各ポリヌクレオチドサンプルそれぞれから生じるポリヌクレオチドと並行してスポッティングする。したがって、混合サンプルにおいて、１つまたはいくつかの最初のポリヌクレオチドサンプルにおいても同定されたＡＳＥは、結果としてサンプル内の差異から生じるのに対して、混合サンプルのみで同定され、最初のｃＤＮＡサンプルのいずれでも同定されないＡＳＥは、サンプル間の差異から生じるだろう。
【０２５１】
［実施例７：いくつかの条件における単一遺伝子の選択的スプライシングアイソフォームの単離および同定］
図９に示すこの方法によって、いくつかの生理的条件に対する単一遺伝子または限定セットの遺伝子のｃＤＮＡアイソフォームのライブラリーが得られる。濃縮法が実施されるｃＤＮＡサンプルが単一ソースに由来するものではなく、実施例６で記述されているように共に混合された、異なるｃＤＮＡサンプルに由来するものであることを除いては、実施例４に記載の手順と同じ手順を用いる。
【０２５２】
本発明は、特定の好ましい実施形態を参照して説明されている。本発明の精神および範囲から逸脱することのない様々な修正形態および変化は、当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲内に包含されることを意図する。
配列一覧のフリーテキスト
配列のソース：／注記＝「合成構築物」（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｏｕｒｃｅ：／ｎｏｔｅ＝”ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ”）
【図面の簡単な説明】
【図１】
核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドを単離するための本発明の方法のいくつかの段階を図示する。Ｍｏサンプルは、黒の太線で示される二本鎖ポリヌクレオチドを含む。核酸差異を有する２種類の関連ポリヌクレオチドを破線で表す。分子αは、完全またはほぼ完全なホモ二重鎖を表す。分子βは、一本鎖テールを有する二重鎖を表す。分子σは一本鎖分子を表す。分子γは、内部一本鎖領域および一本鎖テールを有するヘテロ二重鎖を表す。分子δは、内部一本鎖領域および平滑末端を有するヘテロ二重鎖を表す。白い長方形はアダプターを表す。
【図２】
核酸差異に対して特異的なプローブの選択を図示する。関連ポリヌクレオチドにおいて同一の領域は開いたボックスである。オリゴヌクレオチドプローブは黒の太線で表し、核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドに対して局在化している。図２ａにおいて、関連ポリヌクレオチドは、領域の追加／欠失によって異なる（影付きのボックス）。図２ｂにおいて、関連ポリヌクレオチドは、ある領域の他の領域による置換によって異なる（縞のボックス）。
【図３】
大腸菌ＳＳＢタンパク質を用いた一本鎖トラップの効率を示すゲルリターデイションアッセイのハーフトーンの複写である。３種類のサンプル（Ａ、ＢおよびＣ）は等量の２種類のポリヌクレオチドを含み、一方のポリヌクレオチドは領域ｙに隣接する領域ｘからなり、他方は隣接領域ｘ、ｚおよびｙからなる。ｚ領域の長さは３種類のサンプルの間で異なる：Ａの場合、ｚ１＝１７ｂｐ；Ｂの場合、ｚ２＝３０ｂｐ；Ｃの場合、ｚ３＝４０ｂｐである。変性／再生を意味するライン「Ｄ／Ｒ」で、「−」はこの段階が無いことを意味し、「＋」はこの段階があることを意味する。ＳＳＢラインでは、「−」は、ＳＳＢタンパク質を全く使用しないことを意味し、「＋」はＳＳＢタンパク質を使用することを意味する。一般的な３種類の分子：ホモ二重鎖分子（ａ＝ｘｙ、ｂ＝ｘｚｌｙ；ｃ＝ｘｚ２ｙ；　ｄ＝ｘｚ３ｙ）；ヘテロ二重鎖分子（ａｂ、ａｃ　ｅｔ　ａｄ）およびＩＳＳＲＨ−ＳＳＢ複合体（ａｂ／ＳＳＢ、ａｃ／ＳＳＢおよびａｄ／ＳＳＢ）が見出された。
【図４】
核酸差異を有する関連ポリヌクレオチドで濃縮されたライブラリー（ＮＡＤ−Ｌｉｂ）を得る方法のいくつかの段階を示すフローチャートである。破線は、必要な場合には数回繰り返してもよい濃縮ループを示す。この方法についての更なる情報は図２に開示されている。
【図５】
単一遺伝子または限定セットの遺伝子の選択的スプライシング事象で濃縮されたライブラリー（ＡＳＥ−Ｌｉｂ）を得る方法のいくつかの段階を示すフローチャートである。破線は、必要な場合には数回繰り返してもよい濃縮ループを示す。この方法についての他の情報は図３に開示されている。
【図６】
低減段階を含む、単一遺伝子または限定セットの遺伝子の選択的スプライシング事象を同定する方法を用いた選択的スプライシング事象の分析を示す。２つの選択的スプライシング事象（ＡおよびＢ）は、可能性のある４種類のアイソフォーム（Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３、Ｉ４）を導き、最初のサンプルにおいて可能性のある１１通りの組み合わせのうち、これら４種類のアイソフォームの７通りの組み合わせから、これらの２種類のＡＳＥが同定される。更なる詳細については、実施例３の「ＡＳＥの同定」のセクションを参照のこと。
【図７】
単一遺伝子または限定セットの遺伝子に対するアイソフォームのライブラリー（ＡＳＩ−Ｌｉｂ）を得る方法のいくつかの段階を示すフローチャートである。破線は、必要な場合には数回繰り返し行ってもよい濃縮ループを示す。この方法についての更なる情報は実施例４に開示されている。
【図８】
単一遺伝子または限定セットの遺伝子、およびいくつかの生理的条件に対する選択的スプライシング事象で濃縮されたライブラリー（ＡＳＥ−Ｌｉｂ）を得る方法のいくつかの段階を示すフローチャートである。破線は、必要な場合には数回繰り返し行ってもよい濃縮ループを示す。この方法についての更なる情報は実施例６に開示されている。
【図９】
単一遺伝子または限定セットの遺伝子、およびいくつかの生理的条件に対するアイソフォームのライブラリー（ＡＳＩ−Ｌｉｂ）を得る方法のいくつかの段階を示すフローチャートである。破線は、必要な場合には数回繰り返し行ってもよい濃縮ループを示す。この方法についての更なる情報は実施例７に開示されている。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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