(57)【要約】本発明は、Ｇタンパク質共役受容体をコードする完全長ｃＤＮＡ配列、ならびにその完全な遺伝子及びコードされるタンパク質を提供する。本発明は、治療用途のためにこれらの受容体において活性な新規化合物を同定しうるように、適切なレベルでこれらの受容体を発現する組換え細胞株を提供する。本発明の中で述べる受容体配列は、既知の内因性リガンドを持たない新規ＧＰＣＲ受容体サブファミリーのメンバーである。このｃＤＮＡは、特にＣＮＳ疾患、神経変性又は無痛法の分野における治療用途のために該受容体において活性な新規化合物を同定するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列又はそのアイソフォームをコードする、実質的に純粋なポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号４に記載の配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含む組換え発現ベクター。
【請求項４】
配列番号３に記載のポリペプチド又はそのアイソフォーム。
【請求項５】
請求項４に記載のポリペプチドの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドで形質転換した細胞株。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメントで形質転換するか、又は請求項３の発現ベクターで形質転換した細胞株。
【請求項７】
哺乳類由来の請求項６に記載の細胞株。
【請求項８】
ＯＲＧ１０遺伝子が、配列番号１及び／又は配列番号４に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしうる一連のＤＮＡと定義される、ＯＲＧ１０遺伝子産物を発現する請求項６又は７に記載の細胞株。
【請求項９】
ＯＲＧ１０遺伝子が、配列番号１及び／又は配列番号４に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしうる一連のＤＮＡと定義される、精神障害のインビトロ診断におけるＯＲＧ１０遺伝子にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
精神障害のインビトロ診断における、請求項６〜８に記載の細胞株の使用。
【請求項１１】
精神障害のインビトロ診断における、配列番号４を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメントによってコードされるポリペプチドの使用。
【請求項１２】
新しい薬剤の同定のためのスクリーニングアッセイにおける、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド若しくはそのフラグメント又は請求項３の発現ベクターの使用。
【請求項１３】
精神障害の治療のための薬剤の同定に関するスクリーニングアッセイにおける、請求項４に記載のポリペプチド又はその類似体又はフラグメントの使用。
【請求項１４】
精神障害の治療のための新しい薬剤の同定に関するスクリーニングアッセイにおける、請求項６〜８に記載の細胞株の使用。
【請求項１５】
医薬品としての使用のための、配列番号１を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメント。
【請求項１６】
医薬品としての使用のための、配列番号４を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメントによってコードされるポリペプチド。
【請求項１７】
精神障害治療のための医薬品として使用するための、配列番号４を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメント。
【請求項１８】
精神障害治療のための医薬品として使用するための、配列番号４を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメントによってコードされるポリペプチド。
【請求項１９】
精神障害治療のための医薬品の製造における、配列番号４を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメントの使用。
【請求項２０】
精神障害治療のための医薬品の製造における、配列番号４を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメントによってコードされるポリペプチドの使用。
【請求項２１】
請求項４に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項２２】
所与の被験者においてＯＲＧ１０遺伝子内の突然変異を検出するための方法であって、
ａ）ＯＲＧ１０遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる１組のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、
ｂ）被験者から核酸を含む試料を入手し、
ｃ）核酸増幅法を使用して、工程１のプライマーセットに挟まれた領域を増幅し、
ｄ）増幅した領域が突然変異を含むかどうかを次の工程（ｅ）によって検出し、
ｅ）増幅した配列を健常対照被験者の配列と比較する
工程を含み、ＯＲＧ１０遺伝子が、配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズしうる一連のＤＮＡと定義される方法。
【請求項２３】
ＯＲＧ１０遺伝子産物についてのリガンドを同定するための方法であって、
ａ）請求項１又は２に記載のポリヌクレオチドあるいは請求項３に記載の発現ベクター又はそのフラグメントを適当な宿主細胞に導入し、
ｂ）ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で細胞を培養し、
ｃ）場合により発現産物を単離し、
ｄ）おそらく工程ａ）からの該ＤＮＡによってコードされるタンパク質に結合するであろう潜在的リガンドに発現産物（又は工程ｂ）からの宿主細胞）を接触させ、
ｅ）リガンドが発現されたタンパク質に結合したかどうかを確認し、
ｆ）場合によってはリガンドを単離し、同定する
工程を含む方法。
【請求項２４】
ＣＮＳ疾患の治療において有用な、請求項２３に記載の方法によって選択される化合物。
【請求項２５】
ＣＮＳ疾患の治療において有用な医薬品の製造のための、請求項２４に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体をコードする完全長ｃＤＮＡ配列、ならびにその完全な遺伝子及びコードされるタンパク質を提供する。本発明は、治療用途のためにこれらの受容体において活性な新規化合物を同定しうるように、適切なレベルでこれらの受容体を発現する組換え細胞株を提供する。本発明の中で述べる受容体配列は、既知の内因性リガンドを持たない新規ＧＰＣＲ受容体サブファミリーのメンバーである。このｃＤＮＡは、特にＣＮＳ疾患、神経変性又は無痛法の分野における治療用途のために、該受容体において活性な新規化合物を同定するために使用することができる。
【０００２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーは、これまでに同定された最大のタンパク質ファミリーの１つである。このファミリーは広い範囲の種からの８００以上のクローン化されたメンバーを包含し、少なくとも３００のヒトメンバーを含む。ＧＰＣＲは卓越した治療標的として立証済みの歴史を有しており、現在まで薬剤標的の４０から５０％がＧＰＣＲである（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９８）。ＧＰＣＲは、光、生体アミン、アミノ酸、ペプチド、脂質、ヌクレオシド、及び高分子ポリペプチドを含めて多様な刺激及び化学伝達物質に対して応答性である。これは、神経伝達、細胞代謝、分泌、細胞の分化と増殖ならびに炎症及び免疫応答を含めた多くのプロセスの調節をもたらす。これらのＧＰＣＲの多くが脳内で発現され、ＣＮＳ疾患の治療のための治療標的として利用しうる。より重要な点として、既知の内因性リガンドを持たない多くのＧＰＣＲがまだ公的及び特許データベースにおいて同定されつつある。これらのオーファンＧＰＣＲは、一連の治療処置及び様々な疾患の治療のための潜在的な新規治療標的である。
【０００３】
逆薬理学あるいは機能的ゲノム学が、現在、薬剤発見のプロセスにおいて採用されつつある。これは、代理リガンド又は内因性リガンドのいずれかを同定することによって新規遺伝子を薬理学的に有効性確認することを目指す、遺伝子に基づいた生物学である。本発明は、新規治療化合物を同定するためのこの新規ＧＰＣＲの使用を述べる。
【０００４】
新規オーファンＧＰＣＲに加えて、これまでに同定されていないリガンドに結合する新規ＧＰＣＲ遺伝子サブファミリーも存在することを示唆する証拠がある。多くのオーファンＧＰＣＲが天然リガンドを割り当てられるのを待っている状態であるので、これらの受容体の多くがこれまでに同定されていない新規リガンドに結合すると考えられる（Ｃｉｖｅｌｌｉら、１９９９）。
【０００５】
不活性受容体は進化の過程で切り捨てられてきたはずであると考えられるので、オーファンＧＰＣＲはリガンドに結合すると予想される。オーファン受容体は、それ故、それらの天然リガンド又は代理リガンドを単離するためのベイト（ｂａｉｔ、餌、誘引物）として使用しうる。新規リガンドを同定する上でのこの戦略の使用は、オルファニン／ノシセプチン、オレキシン／ヒポクレチン及びプロラクチン放出ペプチドの同定に例示される（Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄら、１９９５、Ｓａｋｕｒａｉら、１９９８及びＨｉｎｕｍａら、１９９８）。
【０００６】
多くの既知のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が広く確立された薬剤標的であり、現在使用可能なかなりの数の薬剤がそのようなＧＰＣＲを標的とする（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）。受容体へのリガンド結合によってＧＰＣＲが活性化された後、一連のシグナル伝達カスケードを通してシグナルが増幅され、その結果、ＧＰＣＲへのリガンド結合によるこのシグナル伝達経路の調節が、厳密に制御された生物学的経路を調節する手段を提供する。
【０００７】
ＧＰＣＲは広い範囲の生物学的関連プロセスを仲介し、光、生体アミン、アミノ酸、ペプチド、脂質、ヌクレオシド、及び高分子ポリペプチドを含めて、多様な刺激及び化学／神経伝達物質に対して応答性である。特定受容体のクローニングがいかにして治療化合物の開発を導いてきたかは、特にセロトニン／アドレナリン作動性受容体の場合に例示される。さらに、多くの疾患が既知のＧＰＣＲの突然変異に関連することが報告されている（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）。ＧＰＣＲの作用を仲介するシグナル伝達経路はまた、製薬産業にとって重要な多くの生物学的プロセスに関連付けられてきた。そのようなシグナル伝達経路は、Ｇタンパク質、ｃＡＭＰ又はカルシウムのような第二メッセンジャー（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ、１９９１）、ホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼ、ＲＧＳタンパク質、プロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣのようなエフェクタータンパク質（Ｓｉｍｏｎら、１９９１）を含む。
【０００８】
例えば、リガンドによってＧＰＣＲが活性化され、受容体に結合してＧタンパク質の活性化をもたらし、Ｇタンパク質がシグナル伝達経路の次の成分にメッセージを伝達する。そのような成分はアデニル酸シクラーゼであると考えられる。この酵素を活性化するためには、ファミリーが存在する当該Ｇタンパク質は、Ｇタンパク質が不活性状態であるとき結合しているＧＴＰをＧＤＰに交換しなければならない。リガンドがＧＰＣＲに結合した後、ＧＤＰのＧＴＰへの交換が起こりうるが、ＧＤＰのＧＴＰへの一部の基本的交換はまた、ここで検討する受容体に依存しても起こりうる。
【０００９】
Ｇタンパク質に結合しているＧＴＰのＧＤＰへの変換は加水分解によって起こり、Ｇタンパク質そのものによって触媒される。この加水分解後、Ｇタンパク質はその不活性状態に戻る。その結果、Ｇタンパク質は、活性化された受容体から細胞内シグナル伝達経路へのシグナルの伝達を仲介するが、同時に、受容体がＧＴＰ結合Ｇタンパク質を通して細胞内シグナル伝達経路を活性化することができる時間の長さを制御することにより、付加的なレベルの制御を導入する。
【００１０】
一般にこれらの受容体の形態は、約２０−３０個のアミノ酸から成る７つの膜貫通ドメインを含む。そのため、これらの受容体はしばしば７ＴＭ受容体として知られる。これらの７ＴＭドメインは、コンセンサスアミノ酸配列及び構造予測アルゴリズムによって定義することができる。推定上の膜貫通ドメイン内では、細胞外と細胞内のループを通して連結された疎水性へリックスが形成される。ポリペプチドのＮ末端は膜の外側にあり、Ｃ末端は膜の内側にある。
【００１１】
ＧＰＣＲにはしばしばいくつかの付加的な特徴が認められる。それらはＮ末端テールのグリコシル化を含む。最初の２つの細胞外ループの各々における保存システインは、ジスルフィド結合が形成されるように修飾されており、安定化された機能的三次構造をもたらすと考えられる。ＧＰＣＲ上で起こる他の修飾は、脂質化（例えばパルミトイル化及びファルネシル化）及びしばしばＣ末端テールにおけるリン酸化を含む。大部分のＧＰＣＲはまた、３番目の細胞内ループにリン酸化のための部位、Ｇタンパク質相互作用とシグナル伝達に寄与すると考えられる領域を持つ。ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ｃＡＰＫ）あるいはβ−アドレナリン受容体のようないくつかのＧＰＣＲにおけるＧＰＣＲキナーゼ（ＧＲＫ）のクラスのような特異的受容体キナーゼによる３番目の細胞内ループのリン酸化はまた、そのような受容体の脱感作に介在する。従って、ＧＰＣＲの特定領域内の特定突然変異は機能的意味を持ちうる。ＧＲＫはトレオニン及びセリン残基を標的として多くの部位でＧＰＣＲをリン酸化することが知られている。リン酸化は受容体を不活性化するだけでなく、受容体をβ−アレスチンとして知られる付加的な阻害性タンパク質に接触させる。この相互作用は、対象とするＧＰＣＲが活性化されたことの指標としても使用できる。
【００１２】
ＧＰＣＲについてはまだごく限られた三次元結晶構造データしか得られていないが、ＧＰＣＲ上に存在するリガンド結合部位に関してはある程度の詳細が報告されている。一部の受容体については、リガンド結合部位は膜貫通ドメインの一部によって形成される親水性ポケットを含むと考えられる。膜貫通ドメイン内では、α−へリックス構造内のアミノ酸が、アミノ酸の親水性表面がリガンド結合ポケットの中心に向かって内側を向くように整列している。これは仮定上の極性リガンド結合部位を生じる。３番目の膜貫通ドメインはいくつかのＧＰＣＲにおいてリガンド結合に関与することが報告されている。特にＴＭ３のアスパラギン酸、ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギン及びＴＭ６及び／又はＴＭ７のフェニルアラニン又はチロシンがリガンド結合に関連付けられてきた。
【００１３】
細胞内シグナル伝達経路を活性化することに加えて、ＧＰＣＲはまた、Ｇタンパク質を通してイオンチャンネル、トランスポーター及び酵素のような付加的な遺伝子ファミリーに共役することができる。多くのＧＰＣＲが哺乳類系に存在し、非常に特異的なものから非常に広汎なものまで一連の分布パターンを示す。この理由から、生物情報科学によって推定上の新規ＧＰＣＲが同定された後、この多様な機能とこれまでに報告されたＧＰＣＲの分布の故に新規ＧＰＣＲに治療適用を割り当てることは容易ではない。
【００１４】
疾患状態を矯正、予防又は改善のいずれかへと変化させるように機能しうる新規ＧＰＣＲを同定し、特徴付ける必要が明らかに存在する。そのような疾患は多様であり、うつ病、精神分裂病、不安、神経障害、肥満、不眠、嗜癖、神経変性、低血圧症、高血圧症、急性心不全、アテローム血栓症、アテローム性動脈硬化症及び骨粗しょう症を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明は、我々がＯＲＧ１０と命名した、脳内で選択的に発現されることが認められた脳発現遺伝子／タンパク質を提供する。該タンパク質の分析は、それがＧＰＣＲであることの証拠を提供する。該遺伝子はそれ故、ＯＲＧ１０と特異的に反応する化合物を選択するために従来の発現系において使用しうる。これらの化合物は、その後、ＣＮＳ疾患を治療するために使用しうる。
【００１６】
本発明は、ＯＲＧ１０、特にＯＲＧ１０ポリペプチド、ＯＲＧ１０ポリヌクレオチド、組換え物質及びそれらの生成方法に関する。さらに本発明は、そのようなポリペプチド及びポリヌクレオチドに関して、精神障害及び神経変性、特に双極性及び単極性障害、精神分裂病及び不安のような疾患の治療のために、本発明において活性なアゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト又はアンタゴニストのような化合物を同定するために使用できる方法に関する。該発明において活性なリガンドの使用は、ＯＲＧ１０と関連経路の不均衡に関連する疾患を矯正するために利用しうる。特に、本発明は、ＣＮＳ疾患、特に好ましくは双極性うつ病、精神分裂病及び情動障害に関連するＯＲＧ１０遺伝子の修飾又は発現を同定するための診断アッセイに関する。
【００１７】
配列番号４に示すＯＲＧ１０の完全なｃＤＮＡ配列を翻訳して配列番号３のアミノ酸配列を作製し、それを既知のタンパク質配列と比較した。ＯＲＧ１０はこれまでに報告されたＧＰＣＲアクセス番号ｇ９９２５８２に関連することが認められた。
【００１８】
ＯＲＧ１０のゲノム配列を配列番号１に示す。
【００１９】
約８００ｂｐのオープンリーディングフレームを包含するＯＲＧ１０　ｃＤＮＡのフラグメントを使用して、７６の異なる組織からのヒトｍＲＮＡ試料を含むヒトＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＭＴＥ）アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプローブした。用いた実験手順は下記で述べる。ＭＴＥアレイの分析は、ＯＲＧ１０が脳梁、尾状核、被殻及び脊髄において高度に発現され、扁桃体及び海馬のような他の脳領域ではより低いレベルで発現されることを明らかにした。ＯＲＧ１０は基底核及び脳梁において高度に発現されるので、この分布パターンが、このオーファン受容体を基底核の障害、例えば運動障害、神経変性又は運動機能の他の損傷に結びつけるのであろうと考えられる。さらに、シュヴァン細胞の大きな群を持つ脳梁におけるＯＲＧ１０の発現はまた、神経変性性疾患におけるＯＲＧ１０の役割に関与すると考えられる。それ故、組換え細胞株においてこの受容体を発現することは、この受容体に結合する化学単位を同定するためのスクリーニングを可能にする。その後これらの化合物は、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、ジル・ド・ラ・トゥーレット症候群、ジストニー、強迫性障害及び精神分裂病、ならびに他のＣＮＳ及び神経変性性疾患を治療するために使用しうる。末梢的であるが、ＯＲＧ１０は、心臓及び骨格筋を含めた様々な組織においてはるかに低いレベルで発現されると思われる。
【００２０】
ＧＰＣＲはキー配列モチーフを持つので、オーファン及び非オーファンＧＰＣＲの７つの膜貫通ドメインを整列することによって系統樹を創造することができる。ＢＬＡＳＴ分析は、完全長ＯＲＧ１０がヒトセロトニン５ＨＴ６受容体と同一性を有することを明らかにし、精神医学、肥満及び糖尿病、無痛法及び麻酔の分野におけるＯＲＧ１０リガンドの潜在的治療用途を示唆した。
【００２１】
５ＨＴ６受容体は、この受容体に高い親和性を持つ種々の精神病薬及び抗うつ薬に関して、抗精神病薬作用に関与することが提起された（Ｍｅｌｔｚｅｒ、１９９９）。さらに５ＨＴ６はまた、もっぱら脳において発現されると思われる。この遺伝子の多型性も精神分裂病の遺伝的背景に寄与することが提起されており（Ｓｈｉｎｋａｉら、１９９９）、特に不安又はうつ症状を有する患者での、抗精神病薬、クロザピンに対する患者の応答性に寄与すると考えられる（Ｙｕら、１９９９）。ＯＲＧ１０が示すこの受容体との相同性により、ＯＲＧ１０で働く物質の同定は精神医学又は神経学の領域において治療上の利益を持つと予想される。
【００２２】
本発明のゲノムポリヌクレオチドはヒトゲノムＤＮＡライブラリーから標準的クローニング及びスクリーニング手法を用いて入手しうるが、配列番号１に記述されているような本発明の非コード領域を欠く完全長ｃＤＮＡ産物は、脳ｃＤＮＡライブラリーのようなｃＤＮＡライブラリーからしか得ることができない。本発明で詳述するポリヌクレオチドはまた、既知の商業的に入手可能な手法を用いてゲノムＤＮＡから作製するか又は合成することができるであろう。
【００２３】
診断手順を実施するため又は同様にＣＮＳ疾患の発現に関与しうる近傍遺伝子をさらに同定するために、本発明の配列を用いて、ＤＮＡ増幅反応において使用するためのプライマー及びプローブを誘導することができる。本発明の配列はまた、インシトゥハイブリダイゼーション分析によってより詳細な組織分布情報を得るためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するためにも使用しうる。さらに、本発明の配列はまた、アンチセンステクノロジーにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するのにも使用しうる。
【００２４】
遺伝子がそれらのヌクレオチド配列に関して種内及び種間で異なりうることは当該技術において既知である。上記のプローブ及びプライマーを使用して他の種からのＯＲＧ１０遺伝子を容易に同定することができる。それ故、本発明はまた、好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１に示すＯＲＧ１０配列の少なくとも一部にハイブリダイズしうることを特徴とする機能的等価物を包含する。
【００２５】
２つの核酸フラグメントは、それらが、例えばＭａｎｉａｔｉｓら、ｐ．３２０から３２８及び３８２から３８９に述べられているような典型的なハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、又は多くとも約２５から３０％の塩基対ミスマッチを許容する低いストリンジェンシー洗浄条件、例えば２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で各々３０分間ずつ２回、次に２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃で３０分間を１回、次に２×ＳＳＣ、室温で各々１０分間ずつ２回の条件を用いて、互いにハイブリダイズすることができれば、ハイブリダイズ可能な配列を持つとみなされる。好ましくは、相同核酸鎖は１５から２５％の塩基対ミスマッチ、さらに一層好ましくは５から１５％の塩基対ミスマッチを含む。これらの相同性の度合は、当該技術において既知であるように、遺伝子ライブラリー又は遺伝物質の他のソースからクローンを同定するために適切なストリンジェンシーの洗浄条件を用いることによって選択することができる。
【００２６】
さらに、コドンの変異性に適応するために、本発明はまた、ここで開示する配列と同じアミノ酸配列をコードする配列も包含する。発現されるタンパク質の個々のドメインをコードするコード配列の部分、ならびにその対立遺伝子及び種変異も本発明の一部である。時として遺伝子は、一部の組織においてスプライシング変異体を含めた異なるアイソフォームを発現し、変化した５’又は３’ｍＲＮＡあるいは付加的エクソン配列の組込みを生じることがある。代替的に、メッセンジャーがその相補物に比べて少ないエクソンを持つことがある。これらの配列ならびにこれらの配列によってコードされるタンパク質はすべて、同じ又は同様の機能を果たすと期待され、やはり本発明の一部を構成する。
【００２７】
ここで提供するような配列情報は狭義に解釈されるべきではないので、誤って同定された塩基の包含を必要とする。ここで開示する特定配列を使用してさらなる遺伝子を容易に単離することができ、次にその遺伝子をさらなる配列分析に供して、それによって配列決定の誤りを同定することができる。それ故、１つの態様では、本発明は、精神分裂病において分断されている新規遺伝子をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
本発明に従ったＤＮＡはｃＤＮＡから入手しうる。代替的には、コード配列はゲノムＤＮＡであるか、又はＤＮＡ合成手法を用いて作製することができる。ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であってもよい。ポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖形態のいずれでもよい。一本鎖はコード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖のいずれでもよい。
【００２９】
本発明はさらに、配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに一層好ましくは少なくとも９８％の同一性を持つポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドは、天然の成熟タンパク質と同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００３０】
「同一性」とは、２つの配列の長さに沿った直接比較によって決定されるそれら２つの配列間の類似性の度合又は関係に対して当該技術で与えられる語である。ＤＮＡ配列対間のパーセンテージ同一性の自動算定のために使用しうる数多くのアルゴリズムとコンピュータパッケージが存在する。これらのアルゴリズム及びコンピュータアプリケーションはまた、配列データベース内のいずれの配列が最も高い同一性を持つかを決定するために、単一配列を配列データベースのすべてのメンバーと比較することもできる。
【００３１】
そのような典型的なコンピュータアプリケーションの１つがＤＮＡＭＡＮ（Ｌｙｎｎｏｎ　Ｂｉｏｓｏｆｔ、バージョン３．２）である。このプログラムを使用して、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の至適配列比較アルゴリズムによって２つの配列を整列化することができる．２つの配列の整列化後、２つの配列間の同一ヌクレオチドの数を整列した配列の長さで割ることによってパーセンテージ同一性を算定することができる。
【００３２】
ポリペプチド配列の比較のために、上記のＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムはまた、ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）が示したような、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスとして知られる好ましいパラメータセットと共に使用することもできる。既知のＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ、１９９０）の一連のコンピュータプログラムも使用しうる。
【００３３】
本発明に従ったＤＮＡは、本発明に従った新規遺伝子を十分な量で且つ実質的に純粋な形態としてインビボ又はインビトロで発現するために非常に有用であろう。
【００３４】
本発明のもう１つの態様では、上述したＤＮＡ分子によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【００３５】
好ましくは、本発明に従ったポリペプチドは、配列番号３に示すようなアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。
【００３６】
同様に、まだ機能的特徴を維持しながら配列の変異を有する、配列番号３に相同なポリペプチド又はその部分である機能的等価物も本発明に包含される。
【００３７】
配列内で起こりうる変異は、全体配列内の１又はそれ以上のアミノ酸の相違によって、あるいは該配列内の１又はそれ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加によって示されうる。生物学的及び免疫学的活性を本質的に変化させないと予想されるアミノ酸置換が記述されている。関連アミノ酸の間でのアミノ酸置換又は進化の過程で頻繁に起こってきた置換は、中でも特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆｆ参照）である。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは、迅速で感受性の高いタンパク質比較と、相同ポリペプチド間の機能的類似性を決定するための方法を開発した。そのような変異体をコードするポリヌクレオチドも本発明の一部であることは明白である。
【００３８】
本発明に従ったポリペプチドは、配列番号３を含むポリペプチドだけでなく、それらのアイソフォーム、すなわち７０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の類似性を備えたポリペプチドも包含する。まだ生物学的作用を与えることができるそのようなポリペプチドの部分も包含される。特に、まだリガンドに結合する部分は本発明の一部を構成する。そのような部分はそれ自体で、例えば可溶化形態で機能性でありうるか、又はキメラタンパク質を得るために既知の生物工学的方法によって又は化学合成によって他のポリペプチドに連結されうる。そのようなタンパク質は、ＯＲＧ１０遺伝子の異常発現を有する個体において遺伝子産物を置換しうるという理由から治療薬として有用であると考えられる。
【００３９】
該遺伝子の配列はまた、適当な宿主細胞においてコードされるタンパク質を発現するためのベクター分子の作製においても使用しうる。広い範囲の宿主細胞及びクローニングビヒクルの組合せが、本発明のＯＲＧ１０遺伝子をコードする核酸配列又はその部分をクローニングする上で有用に使用しうる。例えば、有用なクローニングビヒクルは、様々な既知の細菌プラスミド、及びプラスミドとファージ又はウイルスＤＮＡの組合せから誘導されるより広い宿主範囲のプラスミド及びベクターのような染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列を含みうる。
【００４０】
本発明の遺伝子又はそのリガンド結合ドメインの発現において使用するためのビヒクルは、リガンド結合ドメインをコードする核酸配列に作動可能的に連結された制御配列をさらに含む。そのような制御配列は一般に、プロモーター配列及び発現レベルを調節する及び／又は促進する配列を含む。言うまでもなく制御及び他の配列は選択する宿主細胞に依存して変化しうる。
【００４１】
適当な発現ベクターは、例えば細菌又は酵母プラスミド、プラスミドとファージ又はウイルスＤＮＡの組合せから誘導される広い宿主範囲のプラスミド及びベクターである。染色体ＤＮＡから誘導されるベクターも含まれる。さらに、本発明に従ったベクター内には複製の起点及び／又は優性選択マーカーが存在しうる。本発明に従ったベクターは宿主細胞を形質転換するのに適する。
【００４２】
本発明のＤＮＡを含む組換え発現ベクターならびに該ＤＮＡ又は該発現ベクターで形質転換した細胞も本発明の一部を構成する。
【００４３】
本発明に従った適当な宿主細胞は、細菌宿主細胞、酵母及び他の真菌、植物、あるいはチャイニーズハムスター卵巣細胞又はサル細胞のような動物宿主である。それ故、本発明に従ったＤＮＡ又は発現ベクターを含む宿主細胞も本発明の範囲内である。構築された宿主細胞は、例えば適切な選択、増幅又は転写誘導のために修飾しうる従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ、栄養素、等々のような培養条件は当業者に周知である。
【００４４】
本発明に従ったＤＮＡ又はベクターの調製ならびに該ＤＮＡ又はベクターによる宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションのための手法は、標準的で、当該技術において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照。
【００４５】
本発明に従ったタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、抽出、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーを含めた一般的な生化学的精製法によって組換え細胞培養から回収し、精製することができる。必要であれば、タンパク質リフォールディング工程を含めることもできる。
【００４６】
本発明に従ったＯＲＧ１０遺伝子産物は、新規リガンド又はその類似体をインビボ又はインビトロで同定するために使用できる。このために、本発明に従ったＤＮＡ又は本発明に従ったＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換した細胞で結合試験を実施することができ、該細胞は本発明に従ったＯＲＧ１０遺伝子産物を発現する。
【００４７】
代替的には、本発明に従ったＯＲＧ１０遺伝子産物ならびにそのリガンド結合ドメインはまた、ＯＲＧ１０遺伝子産物についての機能的リガンド、内因性リガンド又は類似体を同定するためのアッセイにおいても使用できる。
【００４８】
発現された遺伝子産物への結合を調べる方法ならびに遺伝子産物の生物活性を測定するインビトロ及びインビボアッセイは周知である。一般に、発現された遺伝子産物を被験化合物に接触させ、結合、機能的応答の刺激又は阻害を測定する。
【００４９】
それ故、本発明は、ＯＲＧ１０遺伝子産物についてのリガンドを同定するための方法であって、
ａ）本発明に従ったポリヌクレオチドを適当な宿主細胞に導入し、
ｂ）ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で細胞を培養し、
ｃ）任意に発現産物を単離し、
ｄ）おそらく工程ａ）からの該ＤＮＡによってコードされるタンパク質に結合するであろう潜在的リガンドに発現産物（又は工程ｂ）からの宿主細胞）を接触させ、
ｅ）リガンドが発現されたタンパク質に結合したかどうかを確認し、
ｆ）任意にリガンドを単離し、同定する
工程を含む方法を提供する。
【００５０】
発現されたタンパク質へのリガンドの結合を検出する好ましい方法として、シグナル伝達能力を測定することもできる。
【００５１】
本発明は、それ故、ＣＮＳ障害に関連する疾患の予防及び／又は治療のための治療薬をスクリーニングする迅速で経済的な方法を提供する。かかる方法は特に、多数の潜在的リガンドのハイスループットスクリーニングのための使用に適する。
【００５２】
ＯＲＧ１０遺伝子産物の機能を活性化する又は阻害する化合物は、本発明のポリペプチドを活性化する又は阻害する治療処置において使用しうる。
【００５３】
本発明に従ったポリペプチド分子に対して産出される抗体、特にモノクローナル抗体も本発明の範囲内である。そのような抗体は、ＯＲＧ１０遺伝子産物の機能を阻害するために治療的に、またＯＲＧ１０遺伝子産物を検出するために診断的に使用することができる。
【００５４】
本発明はさらに、ＯＲＧ１０遺伝子をコードする核酸配列の突然変異に関連した精神異常又は精神障害への感受性を検出するための診断アッセイの一部としてのＯＲＧ１０遺伝子産物の使用に関する。そのような突然変異は、例えばＰＣＲを使用することによって検出しうる（Ｓａｉｋｉら、１９８６）。またＲＮＡの相対的レベルも、例えばハイブリダイゼーション又は定量的ＰＣＲテクノロジーを用いて測定することができる。ＯＲＧ１０遺伝子産物自体の存在及びレベルは、放射線免疫測定法、ウエスタンブロット法、及び遺伝子産物に対して産出された特異的抗体を用いるＥＬＩＳＡのような免疫学的テクノロジーによって検定することができる。ＲＮＡ及びタンパク質レベルを測定するためのそのような手法は当業者に周知である。
【００５５】
個々の患者におけるＯＲＧ１０遺伝子産物の発現レベルの測定は、治療プロトコールの微妙な調整を導くことができる。
【００５６】
また、ＯＲＧ１０遺伝子の発現が変化している又は破壊されているトランスジェニック動物も作製しうる。
【００５７】
実施例
ＯＲＧ１０　ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
ＯＲＧ１０をコードする完全及び部分ｃＤＮＡを、それぞれプルーフリーディングＥｘｐａｎｄポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）及びＡｍｐｌｉｔａｑＧｏｌｄ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）と、ＯＲＧ１０の配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応のために使用した鋳型ＤＮＡはＭａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙヒト全脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であった。すべての反応において使用したサイクリング条件は同一であるが、アニーリング温度だけが異なり、次の通りであった：
９４℃で５分間の初期変性後、一連の温度を通して反応を３３回サイクルさせた：１）９４℃で１分間の鋳型の変性、２）５５℃で１分３０秒間のプライマーアニーリング、３）７２℃で２分間の重合。完全長産物の生成を保証するために７２℃で１０分間の最終伸長工程も実施した。
【００５８】
完全長ＯＲＧ１０のクローニング
上述したＰＣＲ反応において生成された完全長ＯＲＧ１０　ｃＤＮＡを原核生物発現ベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。化学的形質転換及びミニプレップＤＮＡ単離後、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ　Ｉを使用して制限消化を行い、ベクターからＯＲＧ１０　ｃＤＮＡを切り出した。ベクターｐＣＲ２．１がマルチクローニングサイトのいずれの側にも２つのＥｃｏＲ　Ｉ部位を含み、サブクローニングした挿入物を有効に切り出すことができるので、この制限酵素を使用した。
【００５９】
完全長ＯＲＧ１０の配列確認
制限消化による確認後、配列分析のために完全長ＯＲＧ１０クローンを選択した。選択したＯＲＧ１０クローンを、ｔｈｅ　Ｂｉｇ　Ｄｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット及びＡＢＩ３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｅｒ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造者の指示に従って両方向で完全に配列決定した。選択したクローンを配列決定するために使用したプライマーは、Ｍ１３正及び逆プライマーならびに内部正及び逆ＯＲＧ１０特異的プライマーであった。
【００６０】
ＯＲＧ１０のノーザン分析
Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入したＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＭＴＥ）アレイを使用して、広い範囲のヒト組織におけるＯＲＧ１０の相対的存在率を分析した。ｃＤＮＡの５’最末端に対応する８００ｂｐプローブを生じる、ＯＲＧ１０の５’プライマーと内部逆プライマーを使用したＰＣＲによってＯＲＧ１０　ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、アガロースゲル電気泳動によってＤＮＡ濃度を測定した。Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ＤＮＡラベリング法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いてｃＤＮＡ（１００ｎｇ）を放射能標識し、その後ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ　Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて組み込まれなかったヌクレオチドからプローブを精製した。あらかじめ温めておいたＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１０ｍｌ及びせん断サケ精子ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）１ｍｇを含むプレハイブリダイゼーション混合物を調製した。サケ精子ＤＮＡを１００℃で１０分間熱変性し、氷上で速やかに冷却した後、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液に加えた。ＭＴＥアレイをＨｙｂａｉｄガラス管（２５ｃｍ）に入れ、直ちにＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ混合物を加えた。絶えず回転させながら６５℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った。精製標識ＯＲＧ１０　ｃＤＮＡプローブを１００℃で５分間熱変性し、次にプレハイブリダイゼーション混合物１ｍｌと混合して、これをガラス管内の残りのハイブリダイゼーション溶液にもどし加えた。絶えず回転させながら６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ＭＴＥアレイを次のような一連の洗浄工程に供した：２×ＳＳＣプラス１％ＳＤＳ中６５℃で２０分間の洗浄を４回、０．１×ＳＳＣプラス０．５％ＳＤＳ中５５℃で２０分間の洗浄を２回、そして０．１×ＳＳＣプラス０．５％ＳＤＳ中６５℃で３０分間の最終洗浄１回。すべての洗浄工程を、蓋つきの大きなプラスチック容器において絶えず攪拌しながら実施した。ＭＴＥをサランラップで包み、増感紙を用いて−７０℃で一晩Ｘ線フィルムに露光した。
【００６１】
哺乳類細胞発現
本発明の受容体は、例えばヒト胚腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞又は接着ＣＨＯ細胞において発現される。受容体発現を最大にするために、典型的にはすべての５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を受容体ｃＤＮＡから除去した後、任意にコザック５’コンセンサス配列を付加した適切な真核細胞発現ベクター、例えばｐＣＤＮＡ３に挿入する。細胞をリポフェクチンによって個々の受容体ｃＤＮＡでトランスフェクションし、選択した抗生物質（例えばヒグロマイシン）の存在下で選択する。選択の３週間後に、個々のクローンを採取し、さらなる分析のために増殖させる。ベクターだけでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞を陰性対照として使用する。個々の受容体を安定に発現する細胞株を単離するため、典型的には約２４のクローンを選択し、ノーザンブロット法によって分析した。受容体ｍＲＮＡは一般に、分析する抗生物質耐性クローンの約５０％において検出可能である。
【００６２】
ミクロ生理学的測定法（Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｉｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙｓ）
様々な第二メッセンジャー系の活性化は細胞から少量の酸の放出をもたらす。形成される酸は主として、細胞内シグナル伝達プロセスに燃料供給するために高い呼吸代謝活性の結果である。細胞を取り巻く媒質のｐＨの変化はごくわずかであるが、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲミクロフィジオメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｌｔｄ，Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって検出可能である。ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは、それ故、本発明のＧタンパク質共役受容体のような細胞内シグナル伝達経路を利用するエネルギーに共役した受容体の活性化を検出することができる。
【００６３】
抽出物／細胞上清スクリーニング
まだ同系の活性化リガンド（アゴニスト）が同定されていない数多くの哺乳類受容体が存在する。それ故、これらの受容体の活性リガンドは現在までに同定されているリガンドバンクには含まれていないと考えられる。従って、本発明の７ＴＭ受容体も、天然リガンドを同定するために組織抽出物に対して機能的にスクリーニングされる（カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理学、等々の機能的スクリーニングを用いて）。陽性機能応答を生じる抽出物を、活性化リガンドが単離され、同定されるまで連続的に分画することができる。
【００６４】
カルシウム及びｃＡＭＰ機能アッセイ
例えばＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞において発現される７ＴＭ受容体は、ＰＬＣの活性化及びカルシウムの動員及び／又はｃＡＭＰの刺激又は阻害に機能的に共役することが示された。受容体でトランスフェクションした細胞又はベクター対照細胞のＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞における基線カルシウムレベルは、１００ｎＭから２００ｎＭの正常範囲内であることが認められた。組換え受容体を発現するＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞にＦｕｒａ２を充填し、１日に＞１５０の選択リガンド又は組織／細胞抽出物をアゴニスト誘導のカルシウム動員に関して評価される。同様に、組換え受容体を発現するＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞を、ｃＡＭＰ定量アッセイを用いてｃＡＭＰ産生の刺激又は阻害に関して評価する。カルシウム過渡応答又はｃＡＭＰの周期的変動変動を示すアゴニストをベクター対照細胞において試験し、応答が受容体を発現するトランスフェクション細胞に固有であるかどうかを決定する。ｃＡＭＰの刺激／阻害及び／又はカルシウム過渡応答による機能的受容体の活性化についてのさらなる検出方法は、リポーター遺伝子構築物からの読み取り、例えばルシフェラーゼ発光及び分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を含みうる。
【００６５】
ＰＣＲによるＯＲＧ１０の組織分布分析
様々なヒト組織からの材料における配列番号１を含むＧタンパク質共役受容体の発現をさらに分析するため、予想ＯＲＧ１０　ｃＤＮＡ配列に対して設計したプライマー（ＯＲＧ１０正プライマー、５’−ＡＴＧ　ＧＣＣ　ＡＡＣ　ＴＣＣ　ＡＣＡ　ＧＧＧ　ＣＴＧ３’（１−２１、１＝ＡＴＧ翻訳開始部位）及びＯＲＧ１０逆プライマー、５’−ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＡＣＴ　ＣＴＣ　ＡＧＧ　ＴＧＧ　ＣＣＣ　３’（１１０４−１０８０）を用いてＰＣＲを実施した。各々のＰＣＲは、総容量５０μｌ中、１×ＰＣＲ緩衝液、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、２００μＭ　ｄＮＴＰ混合物、１μＭの各プライマー、１０％ＤＭＳＯ、２．５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ　Ｇｏｌｄ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）及び５μｌのヒトＭａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含んだ。ＯＲＧ１０の発現に関して検討したヒトｃＤＮＡは次の通りであった：心臓、腎臓、骨格筋、脾臓、卵巣、肺、肝臓、胸腺、精巣、小腸及び脳（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。ヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）との陽性対照反応も設定した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入した配列特異的プライマーを使用して、上述したようにハウスキーピング遺伝子Ｇ３ＰＤＨのＰＣＲ増幅を実施し、これを各々のｃＤＮＡ鋳型についての陽性対照として使用した。次の条件を使用してＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ＰＴＣ−２００　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒにおいて反応をサイクリングした：９４℃で５分間そして９４℃で１分間、５５℃で１分３０秒間、７２℃で２分間を３３サイクル、次いで７２℃で１０分間の伸長。ＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイド（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む１％アガロースゲル上で分離し、紫外光のもとで視覚化した。
【００６６】
３３サイクルの増幅後、完全長ＯＲＧ１０　ｃＤＮＡに対応する１１０４ｂｐの強いバンドが脳において認められ、心臓、骨格筋、肺、肝臓及び精巣では非常に弱いバンドが検出された（図３）。
【００６７】
インシトゥハイブリダイゼーションによるＯＲＧ１０のＣＮＳ組織分布
ＯＲＧ１０を標的とする３３Ｐ−標識オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ラット脳の冠状切断及び横断面切片においてＯＲＧ１０のＣＮＳ分布特性を検討した。体重２００−２５０ｇの雄性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ以下ＳＤとする）ラット（Ｈａｒｌａｎ　Ｏｌａｃ，ＵＫ）を頸椎脱臼によって屠殺した。脳を切除し、ドライアイスを用いて−３５℃に冷却したイソペンタン中で冷凍して、さらなる使用のときまで−８０℃で保存した。２０ｍの冠状切断切片を、ラット脳の吻尾範囲全体にわたってスーパーフロストスライド（ＢＤＨ）上にクリオスタット切断した。冠状切断切片については、ブレグマより４．７ｍｍから−１４．０８ｍｍまでの一連のスライド（各々のスライド上に３切片）を収集した。横断面切片については、ブレグマより３．１ｍｍから７．６ｍｍまでの一連のスライド（各スライド上に２切片）を収集した（ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ、１９８２のアトラスに従って）。切片を使用時まで、最大限６週間−８０℃で保存した。
【００６８】
ヒトＯＲＧ１０配列から、ＯＲＧ１０のげっ歯類オーソローグにも相補的な合成オリゴヌクレオチドプローブを設計した。選択した配列が他のいずれの既知配列にも非相補的であることを確認するため、Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）を利用するｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースを用いてこのオリゴヌクレオチドプローブの特異性を評価した。
【００６９】
選択した４５量体オリゴヌクレオチド（配列５’−ＴＧＧ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＧＴＣ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＧＴＣ−３’）はヒトＯＲＧ１０配列に９０％相同であり、配列番号４の塩基６９５−６５２への相同性を示した。
【００７０】
３３Ｐ−ｄＡＴＰを用いてオリゴヌクレオチドプローブの３’末端標識を行った。オリゴヌクレオチドプローブを、４ｐｍｏｌの濃度で、８μｌのターミナルトランスフェラーゼ反応緩衝液、２μｌのターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｐＨ７．２（すべてＰｒｏｍｅｇａの試薬）、及び３．２μｌの３３Ｐ−ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ）を含み、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理したＨ２Ｏで最終容量４０μｌにした混合物中、３７℃のインキュベーション温度で同位体によって放射能標識した。１時間インキュベートしたあと、反応混合物を７０℃に過熱して反応を停止させた。その後、Ｍｉｃｒｏ　Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎクロマトグラフィーカラム（Ｐ−３０　Ｔｒｉｓ　ＲＮアーゼ不含、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて４０００ｒ．ｐ．ｍ．で４分間遠心分離して（微量遠心分離機５４１５Ｃ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、標識プローブを精製した。プローブ１μｌを採取し、液体シンチレーションカウンター（Ｔｒｉｃａｒｂ，１５００　Ｐａｃｋａｒｄ）β−カウンターによって計数して、放射能標識の効率を評価した。１００，０００−３００，０００ｃｐｍ／μｌの範囲のカウントを有するオリゴヌクレオチドプローブだけをさらなるハイブリダイゼーション試験に使用した。
【００７１】
切片を−８０℃フリーザーから取り出し、室温で３０分間解凍した。次に切片を４％パラホルムアルデヒド溶液に１０分間固定し、ＤＥＰＣ処理した水で洗って、０．１Ｍトリエタノールアミン及び０．９％食塩水中無水酢酸０．２５％溶液（ｐＨ８．０）においてさらに１０分間インキュベートした。次に切片を一連の漸増濃度のエタノール中で（７０％中１分間、８０％中１分間、９０％中２分間、及び１００％中１分間）脱水し、１００％クロロホルム中で５分間脱脂して、１００％エタノール中で１分間及び９５％エタノール中で１分間再水和し、最後に室温で空気乾燥した。その後、５０％ホルムアルデヒドに浸したペーパータオルが入った気密ハイブリダイゼーションボックスにスライドを入れた。ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアルデヒド、４×標準クエン酸ナトリウム（ＳＣＣ）、１０％硫酸デキストラン及び１０ｍＭジチオトレイトール、０．２ｍｇ／ｍｌ変性サケ精巣ＤＮＡ、０．１％ポリアデニル酸、すべてＳｉｇｍａの試薬）に標識プローブを加えて、ハイブリダイゼーション溶液の最終濃度を０．５ｐｍｏｌとした。この溶液１５０μｌを各々のスライドに加え、Ｈｙｂｒｉｓｌｉｐｓ（Ｓｉｇｍａ）で覆って、インキュベーションオーブン（Ｍｉｎｉ　１０、Ｈｙｂａｉｄ）において４２℃で１８時間インキュベートした。インキュベーション期間後、２×ＳＳＣを用いてＨｙｂｒｉｓｌｉｐｓを浮遊させ、さらなるプロセシングのためにスライドをラックに戻した。１×ＳＳＣ中室温で３０分間、１×ＳＳＣ中５５℃で３０分間、０．１×ＳＳＣ中５５℃で１０分間、厳密な洗浄を行った。次に切片を７０％及び９５％エタノール中で２分間脱水し、空気乾燥させた。乾燥した後、切片をカセットに入れ、室温で２１日間Ｘ線フィルム（ＢｉｏＭａｘ　ＭＲ−１、Ｋｏｄａｋ）に露光した。既知の放射能（３１−８３３ｎＣｉ／ｇ）のオートラジオグラフィー用１４Ｃマイクロスケール（Ａｍｅｒｓｈａｍ）も各カセットに入れた。その後Ｋｏｄａｋ自動現像機（Ｍ−３５Ｍ　Ｘ−ＯＭＡＴ　Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）を使用してフィルムを現像した。
【００７２】
切片のＲＮアーゼ前処理によって又は１００倍過剰の非標識プローブの添加によって、オリゴヌクレオチドプローブの特異性をさらに評価した。パラホルムアルデヒドに固定し、無水酢酸中でインキュベートした後、ハイブリダイゼーションの前に脳切片をＲＮアーゼＡ溶液（リボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）１０μｇ／ｍｌ）中３７℃で３０分間インキュベートした。次にインシトゥハイブリダイゼーションのために上述したように切片を処理した。過剰の非標識プローブを含む対照については、ハイブリダイゼーションの前に非標識ＯＲＧ１０オリゴヌクレオチドプローブ５０ｐｍｏｌを適切なハイブリダイゼーション緩衝液に加えた。その後、先に述べたようにインシトゥハイブリダイゼーションを実施した。ＲＮアーゼＡによる切片の前処理後又は１００倍過剰の非標識オリゴヌクレオチドプローブの添加による競合後に、特異的なインシトゥハイブリダイゼーションシグナルは認められなかった。
【００７３】
Ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅ（ＭＣＩＤ）システムを用いてオートラジオグラフィーのデンシトメトリー分析を実施した。各ラット脳の吻尾範囲を通じた冠状面レベルから光学密度測定値を得た。ＯＲＧ１０シグナルの高いレベルの発現は、主として、大鉗子及び小鉗子脳梁、前交連、球内外側嗅結節、脳梁膝、前交連、脳梁、線条全体にわたる白質路、海馬采、内包、脳弓、視床髄条、深大脳白質、乳頭視床束、視索、上視床放線及び小脳皮質の白質路のような白質構造に限定された（図４、５）。
【００７４】
（参考文献）
【００７５】
【表１】
2004501629.tif 000002
2004501629.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】７つの膜貫通ドメインを示す、ＯＲＧ１０の予想タンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロット。膜貫通ドメインの最初の５つは長い細胞内ループによって後の２つと分けられている。赤い線は、Ｉｎｃｙｔｅ鋳型０７７１４６．１（５’ＵＴＲと最初の少数のアミノ酸をカバーする）及び４４６７１５．１（ＴＭｓ４−７をカバーする）によってカバーされる部分を示す。予想メチオニン開始部位の上流ＯＲＦは概念的に翻訳されている。明緑色の矢印は予想される実際の翻訳開始部位を示す。プロットは予想される終結コドンで厳密に終了する、すなわち非翻訳３’末端における概念上の翻訳は存在しない。
詳細なＣＮＳ　ＩＳＨは、脳梁と白質領域におけるＯＲＧ１０の発現を明らかにし、グリアのような神経支持細胞におけるＯＲＧ１０の潜在的な役割を示唆する。神経支持における役割に加えてグリアのための役割を裏付ける証拠が増えつつある。グリア細胞は神経シナプス伝達を積極的に調節し（Ｓｍｉｔら、２００１）、ＣＮＳシナプスの形成と機能を高める（Ｔｅｍｂｕｒｎｉら、２００１）ことが示されており、本質的な脳機能の調節におけるグリアの役割を示唆している。大神経膠細胞におけるＯＲＧ１０の発現は、この受容体がこれらの細胞の付加的な機能において役割を担うことを示唆すると考えられる。
【図２】ＯＲＧ１０とその類縁物質の間の系統発生的関係の図式的表示。
ＯＲＧ１０は他の既知のいかなるオーファンＧＰＣＲとも密接に関係していない。この図式の枝の長さは進化的距離の縮尺ではなく、進化的距離のいかなる数量的測定も示さない。
【図３】１１０４ｂｐのＰＣＲ産物を生じるＯＲＧ１０特異的プライマーを使用して検討した組織ｃＤＮＡを１−１１に分類している。各々のｃＤＮＡ試料についての対応する９００ｂｐのＧ３ＰＤＨ陽性対照反応をＧで表わしている。
【図４】ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ（１９８２）の図譜に従ってブレグマより０．２ｍｍのラット脳の冠状切断面におけるＯＲＧ１０　ｍＲＮＡの分布を示すインシトゥハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー画像。ＯＲＧ１０シグナルは、主として脳梁（ｃｃ）、前交連（ａｃａ）、外側嗅結節（ｌｏ）及び線条体全体にわたる白質線維路（ｓｔｒ）のような白質構造に局在する。
【図５】ＰａｘｉｎｏｓとＷａｔｓｏｎ（１９８２）の図譜に従ってブレグマより０３．６ｍｍのラット脳の横断面におけるＯＲＧ１０　ｍＲＮＡの分布を示すインシトゥハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィー画像。ＯＲＧ１０シグナルは、主として脳梁（ｃｃ）、海馬采（ｆｉ）、深大脳白質（ｄｃｗ）、大鉗子脳梁（ｆｍｊ）及び小脳全体にわたる白質線維路（ｃｗｍ）のような白質構造に局在する。
【図１】
2004501629.tif 000004
【図２】
2004501629.tif 000005
【図３】
2004501629.tif 000006
【図４】
2004501629.tif 000007
【図５】
2004501629.tif 000008
【国際公開パンフレット】
2004501629.tif 000009
2004501629.tif 000010
2004501629.tif 000011
2004501629.tif 000012
2004501629.tif 000013
2004501629.tif 000014
2004501629.tif 000015
2004501629.tif 000016
2004501629.tif 000017
2004501629.tif 000018
2004501629.tif 000019
2004501629.tif 000020
2004501629.tif 000021
2004501629.tif 000022
2004501629.tif 000023
2004501629.tif 000024
2004501629.tif 000025
2004501629.tif 000026
2004501629.tif 000027
2004501629.tif 000028
2004501629.tif 000029
2004501629.tif 000030
2004501629.tif 000031
2004501629.tif 000032
2004501629.tif 000033
2004501629.tif 000034
2004501629.tif 000035
2004501629.tif 000036
2004501629.tif 000037
2004501629.tif 000038
2004501629.tif 000039
2004501629.tif 000040
2004501629.tif 000041
2004501629.tif 000042
2004501629.tif 000043
2004501629.tif 000044
2004501629.tif 000045
2004501629.tif 000046
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501629.tif 000047
【国際調査報告】
2004501629.tif 000048
2004501629.tif 000049
2004501629.tif 000050
2004501629.tif 000051