(57)【要約】特定の環境のマトリクスへの細胞の移動またはこのマトリクスへの細胞の接着に関与する分子および／または化合物は、ここで記載される本発明の目的である。これらのペプチドで被覆されたインプラントは、骨組込みの速度および骨付着の割合を増加させる。インプラントの表面は、関連の細胞の現象学を許容するような特性を有する。インプラントの再現可能な生物学的組込みの達成は、所望の界面組織の形態形成に関連する分子生物学的事象の指標を必要とする。
2004531461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、オステオポンチン由来ペプチド。
【請求項２】
細胞発生を調節する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、細胞表面上の少なくとも１つのレセプターに結合する、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記レセプターが、インテグリンである、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記インテグリンが、αｖβ３、αｖβ５、４β１、２β１、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＣＤ４４、Ｖ３Ｖｘからなる群から選択される、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項３に記載のペプチドであって、前記細胞が、前骨芽細胞、腫瘍細胞、マクロファージ、骨膜細胞、内皮細胞、上皮細胞、好酸球細胞、幹細胞、制限された潜在的前駆細胞、前駆細胞、方向付けられた前駆細胞および分化した細胞からなる群から選択される、ペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、ＲＧＤモチーフを含まない、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
インプラントであって、以下：
オステオポンチン由来ペプチド含有インプラントを形成するオステオポンチン由来ペプチドと共に被験体内でインビボで使用するために適切な材料を含む、インプラント。
【請求項９】
前記オステオポンチン由来ペプチドが、前記材料に非共有結合的に付着される、請求項８に記載のインプラント。
【請求項１０】
前記オステオポンチン由来ペプチドの前記材料に対する非共有的付着が、該材料上の二価のイオン架橋またはムコ多糖のコーティングによるものである、請求項３に記載のインプラント。
【請求項１１】
前記オステオポンチン由来ペプチドが、細胞付着活性を有する、請求項８に記載のインプラント。
【請求項１２】
請求項１０に記載のインプラントであって、前記オステオポンチン由来ペプチドが、ＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号７）；ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号８）；およびアセチル−ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号１５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、インプラント。
【請求項１３】
請求項８に記載のインプラントであって、以下：
被験体内のインビボ使用に適切なチタンと組み合わせた、放出可能形態の、リン酸化オステオポンチンもしくはその活性フラグメント、またはそれら由来のペプチド、を含む、インプラント。
【請求項１４】
前記チタンインプラントが、歯科用インプラントである、請求項１３に記載のインプラント。
【請求項１５】
インプラントを、オステオポンチンもしくはその活性フラグメント、またはそれら由来のペプチドでコーティングする方法であって、以下：
オステオポンチンもしくはその活性フラグメント、またはそれら由来のペプチドを、インプラントの表面に付着させる工程、
を包含し、
ここで、該オステオポンチンもしくはその活性フラグメント、またはそれら由来のペプチドは、該インプラントが被験体に移植されると該表面から放出可能であるように、該インプラントに付着される、方法。
【請求項１６】
オステオポンチン含有細胞漸増システムであって、以下：
勾配を提供する形態の、放出可能なオステオポンチンもしくはそのフラグメント、またはそれら由来のペプチド；および
インプラントであって、該インプラントの近位に細胞漸増システムを形成する、インプラント、
を含み、
ここで、該インプラントは、該インプラントの近位に形成するオステオポンチンの勾配により、細胞漸増について標的化される、システム。
【請求項１７】
被験体において、組織の形成が必要な部位に新たな組織の形成を引き起こすための方法であって、以下：
オステオポンチンもしくはそのフラグメント、またはそれら由来のペプチドを、被験体の組織形成が必要な部位に加える工程であって、該オステオポンチンもしくはそのフラグメント、またはそれら由来のペプチドが、該部位の周りで新たな組織の形成を引き起こす、工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
細胞分化を促進するための方法であって、以下：
動物またはヒトに、治療的有効量のペプチドを投与する工程であって、ここで該ペプチドは、細胞に結合し、そして該細胞における発生変化を引き起こす、工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６０／２４１，２４８号（２０００年１０月１８日出願）および同第６０／３２７，２７３号（２００１年１０月５日出願）に関する。
【０００２】
（発明の背景）
周辺組織へのインプラントの首尾良い骨形成を生じるプロセスは、細胞の移動、接着、分化、増殖、細胞外マトリクス合成およびこのマトリクスの最終的な石灰化を包含する、複雑なプロセスである。インプラント材料は、この組織に関連の生物学的分子との有利な相互作用を可能にする表面化学と同程度に生体適合性である。
【０００３】
例えば、歯内骨内歯科インプラントの配置は、有利な骨の特徴の領域に制限され、そして固定具は、配置の後、かなりの期間、取り外さずに維持しなければならない。新規の歯内骨内インプラントの製造において直面した主な挑戦は、骨形成の速度および骨付着の割合を増加させることである。骨組織への一体型チタン（Ｔｉ）インプラントの組織学的分析は、多くの臨床的に首尾良いインプラントが、石灰化した骨により、３０〜６０％直接隣接して配置されることを示した。残りのインプラントの表面は、線維性組織および石灰化されていないコラーゲン線維が隣接していることが見出されている。骨形成インプラントの周囲全体が、石灰化した骨組織と直接隣接していることが望ましい。
【０００４】
細胞外マトリクスタンパク質、特に特定の接着分子は、骨の修復および形態発生において役割を果たす。これらの分子は、細胞表面−細胞外マトリクス相互作用により遺伝子発現を調節し得る。歯科インプラントの酸化チタン層と特定の細胞外マトリクスタンパク質との間の相互作用は、チタンインプラントに対する骨の再現可能な直接配置に必須であり得る。
【０００５】
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）に対する細胞の接着は、特定の、細胞外成分、膜貫通成分およびサイトゾル成分の構築および再構成を導く、レセプターにより媒介される事象である。インテグリンは、細胞表面タンパク質のスーパーファミリーを表し、この細胞表面タンパク質のほとんどは、α−サブユニットとβ−サブユニットとのヘテロ二量体から構成される。レセプターおよびインテグリン型レセプターの例は、線維芽細胞のフィブロネクチンレセプターおよびビトロネクチンレセプター、ＩＩｂ／ＩＩＩａ表面糖タンパク質、および以下で議論されるものである。このインテグリンスーパーファミリーに属する細胞表面レセプターは、ＥＣＭへの接着における重要なプレーヤーであると認識されており、そして細胞事象（例えば、移動、分泌、遺伝子発現、分化、および接触または固定依存性増殖）に認識シグナルを伝達する、中間メッセンジャーである。従って、これらの記載されるレセプターに結合するタンパク質または化合物は、広範な生物学的プロセスに影響する。
【０００６】
オステオポンチン（ＯＰＮ）およびオステオポンチン由来の多くのペプチドは、このようなタンパク質である。オステオポンチンのアスパラギン酸残基は、ヒドロキシアパタイト結合に重要であるようであるが、ＲＧＤ配列は、インテグリンレセプターによる細胞付着を媒介し、それによりこの細胞と共にシグナル伝達経路を活性化するようである。トロンビンによるオステオポンチンの切断は、インビトロにおいて細胞が付着および分散する能力を増大することが報告され（Ｓｅｎｇｅｒら、１９９４，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，５，５６５−５７４）、このことは、トロンビンの切断により、ＲＧＤモチーフにより接近可能になることを示唆する。ＯＰＮは、骨およびセメント質の両方に局在しており、そして今までのところ、骨（またはセメント質）とインプラントとの間の界面においてのみ検出されている。さらに、オステオポンチンはまた、セメント質へのシャーペー線維の挿入部位においてセメント質内で検出されており、このことは、歯周靱帯形成におけるタンパク質の構造的な役割を示唆する。シャーペー線維は、歯周靱帯から骨組織に延びるコラーゲン性線維であり、それにより例えば、歯との安定な連結を提供する。いくつかの研究室は、種々のオステオポンチンで被覆された表面への、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージまたは内皮細胞の差次的付着を証明した。オステオポンチンの「潜在性」特徴は、また、細胞結合についての潜在的な経路を研究し、細胞分化および細胞移動に影響を与えるために、利用される。
【０００７】
（マトリクスおよび環境依存型分化）
一時的マトリクスへの細胞の付着および増殖は、これらの細胞が成熟細胞へと分化し、そして適切なマトリクス合成のために必要な遺伝子を発現することを保証しない。細胞がバイオマトリクスまたは細胞外マトリクスに最初に遭遇する場合、これらの細胞は付着および分散するか、またはこれらの細胞はアポトーシスを受けるかのいずれかである。これらの細胞が付着および分散する場合、これらの細胞は、２つのさらなる代替物に面し、細胞周期のＧ１期および増殖に入るか、または特定の分化遺伝子の発現を上方制御する。どの代替物をこの細胞が「選択する」かは、局所細胞外シグナルおよび／またはキュー、ならびに細胞型（例えば、この細胞が末端で分化した前駆体であるかまたは幹細胞であるかということ）に依存する。適切な細胞外マトリクスとの接触が、細胞がトランス分化する可能性を抑制するために必要とされるということを証明する証拠が高まりつつある。トランス分化は、分化細胞が別の表現型と関連する遺伝子を発現し始めるプロセス（例えば、上皮細胞が間葉細胞になる場合）として定義される。
【０００８】
当業者は、方向付けられた前駆細胞および分化細胞へとの導く経路の複雑性を理解する。分化細胞は、「始原」細胞（幹細胞と呼ばれる）に由来する。一般に、幹細胞は、多能性であり、そして分裂して、より多能性の幹細胞または前駆細胞のいずれかを生成する。方向付けられた前駆細胞は、わずか１つまたは数種の細胞型のみを生成することが可逆的に決定される。これらの細胞はまた、非常に迅速に分裂するが、制限された回数しか分裂しない。一連の迅速な細胞分裂の後、これらは分化細胞に発達し、ここで周辺マトリクスに寄与する。細胞発達のこのプロセスの駆動は、運動性（走化性および／または走触性）、および／または増殖であり、ここで運動性および増殖は、例えば、ペプチド、タンパク質、サイトカイン、栄養分および／または細胞表面上のレセプターに結合するホルモンの勾配を増加または減少することによって、調節される。
【０００９】
ヒト骨芽細胞株は、インビトロにおけるそれらの分化の間に、骨芽細胞表現型マーカーの調整された一時的発現を受け、そして石灰化された細胞外マトリクスを生成する。この骨発達系は、チタン表面と骨細胞との間のインビトロにおける相互作用の研究のために理想的である。
【００１０】
ＯＰＮと類似の活性を示すペプチド、およびこれらを含む多くのレセプター（例えば、αｖβ３、αｖβ５、４β１、２β１、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＣＤ４４、Ｖ３Ｖｘ）と相互作用する新規のペプチドが、同定されている。これらのレセプターは、種々の細胞型の表面で見出され（幹細胞、制限された潜在的前駆細胞、前駆細胞、方向付けられた前駆細胞、および分化細胞で見出されるレセプターを含む）、そしてこれらが認識する細胞外キューに基づいて内部シグナルを提供する。インテグリン型細胞レセプターは、細胞外周囲または細胞外マトリクスへの細胞の接着を媒介する。これらのレセプターはまた、これらが認識および結合するすべての化合物、ペプチド、タンパク質または細胞外キューに応答して、細胞の内側の分子シグナル伝達事象および分子シグナル伝達経路を支配する。多くの細胞型は、増殖および生存力を保証するためにマトリクスに対する固着を必要とし、そして多くのインテグリンは、細胞外マトリクスと必須の内部細胞活性との間のこの結合を提供している。上記の同定されたレセプターのいずれかに対する抗体は、相互作用しているペプチドの活性を弱めるかまたは完全に排除する際に使用され得る。
【００１１】
これらのペプチドは、幹細胞、前駆細胞（方向付けられたおよび方向付けられていない）、および分化細胞を、骨、セメント質、ＰＤＬマトリクスまたは他の生体物質に接触させて結合する際に、作用する。レセプター（例えば、αｖβ３、αｖβ５、４β１、２β１、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＣＤ４４、Ｖ３Ｖｘ）に結合することによって、それらの活性を発揮する化合物を得ることにより、分化プロセスおよび漸増に影響を与えるかこれを指向することができる。一旦、目的のマトリクスまで漸増すると、細胞−細胞の連絡は、化合物の有効性全体を増加させる。
【００１２】
（疾患における細胞接着および漸増）
好酸球（これは、全白血球数の１〜３％を構成する）は、種々の疾患に寄与することが示されている。慢性アレルギー疾患（例えば、気管支ぜん息）、または症候群（例えば、好酸球性筋膜炎または好酸球性胃腸炎）は、それぞれ、喘息における気道の炎症部位における好酸球の優先的な蓄積、罹患した筋肉、組織および筋膜における好酸球の浸潤、ならびに小腸の粘膜、粘膜下組織および筋層の好酸球浸潤によって特徴付けられる。好酸球は、多くの同じ細胞接着レセプターおよび上記のインテグリンを介して、リガンド、細胞外マトリクス、内皮細胞および上皮細胞と相互作用する。これらの相互作用は、好酸球の浸潤および蓄積に重要である。好酸球の様な細胞の移動プロセスを制御し得る機構は、消耗性疾患の処置において有用である。従って、インテグリンおよびインテグリン様レセプターは、ヒト疾患における多くの細胞型の所望しない蓄積に置いて重要な役割を果たす。
【００１３】
（発明の要旨）
特定の環境のマトリクスへの細胞の移動またはこのマトリクスへの細胞の接着に関与する分子および／または化合物は、ここで記載される本発明の目的である。これらのペプチドで被覆されたインプラントは、骨組込みの速度および骨付着の割合を増加させる。インプラントの表面は、関連の細胞の現象学を許容するような特性を有する。インプラントの再現可能な生物学的組込みの達成は、所望の界面組織の形態形成に関連する分子生物学的事象の指標を必要とする。骨芽細胞の機能を支える高分子に結合し得ない物質表面は、良好な骨インプラントを作製しないようである。骨組込みの増加した速度および／または本発明のインプラントまたは細胞漸増システムの周りの骨付着の増大した割合は、インプラントの配置指標を増加し、負荷時間を促進し、そしてインプラント材料における研究のための新たな分野を開く。
【００１４】
いくつかの実施形態において、インプラントは、放出可能形態のオステオポンチンと組み合わせて、被験体内でインビボ使用するために適切な材料を含み、オステオポンチン含有インプラントを形成する。
【００１５】
別の実施形態において、このインプラントは、少なくとも２種のオステオポンチンポリペプチドと組み合わせて、被験体内でインビボ使用するために適切な材料を含み、オステオポンチン含有インプラントを形成する。
【００１６】
さらに別の実施形態において、このインプラントは、少なくとも２種のオステオポンチン活性ポリペプチドと組み合わせて、被験体内でインビボ使用するために適切な材料を含み、ここで、この活性ポリペプチドは、この材料に付着し、その結果、被験体に移植された際に、このオステオポンチン含有インプラントは、新たな骨形成を引き起こす。
【００１７】
別の実施形態において、このインプラントは、オステオポンチン由来ペプチドと共に、被験体内でインビボ使用するために適切な材料を含み、ここで、このオステオポンチン由来ペプチドは、この材料に付着し、その結果、この被験体に移植された際に、このオステオポンチン由来ペプチド含有インプラントは、新たな骨形成を引き起こす。
【００１８】
別の実施形態において、このインプラントは、放出可能形態のオステオポンチンと共に、被験体内でインビボ使用するために適切な材料を含み、ここでオステオポンチンは、この材料に付着し、その結果、この被験体に移植された際に、このオステオポンチン含有インプラントは、新たな骨形成を引き起こす。
【００１９】
別の局面において、本発明は、オステオポンチン含有チタンインプラントを特徴とする。このインプラントは、オステオポンチン含有チタンインプラントを形成する、被験体内におけるインビボでの使用に適するチタンと組み合わせた、リン酸化オステオポンチンの放出可能な形態を含む。
【００２０】
別の局面において、本発明は、オステオポンチン由来ペプチド含有チタンインプラントを特徴とする。このインプラントは、オステオポンチン誘導ペプチド含有チタンインプラントを形成する、被験体内でのインビボでの使用に適するチタンと組み合わせた、オステオポンチン由来ペプチドを含む。
【００２１】
さらに別の局面において、本発明は、インプラントを、オステオポンチン、その活性フラグメント、またはオステオポンチン由来ペプチドでコーティングする方法を特徴とする。この方法は、オステオポンチン、その活性フラグメント、またはオステオポンチン由来ペプチドを、インプラントの表面に、非共有結合的または静電的に付着することを包含し、ここでこのオステオポンチン、その活性フラグメント、またはオステオポンチン由来ペプチドは、被験体への移植の際に表面から放出可能であるように、インプラントの表面に付着される。
【００２２】
この方法は、被験体における新しい骨の形成の誘導において有用である。この方法は、上記のように、被験体にインプラントを移植することを包含し、ここでオステオポンチンはインプラントから被験体内へ放出され、それによって被験体内における新しい骨の形成を誘導する。
【００２３】
別の実施形態において、オステオポンチン含有細胞漸増システムは、勾配を与える形態で、放出可能なオステオポンチンまたはそのフラグメント、あるいはそれらに由来するペプチド、および、インプラントの近位で細胞漸増システムを形成するために用いられるインプラントを含み、ここでこのインプラントは、インプラントの近位で形成するオステオポンチンの勾配による細胞漸増のために、標的化される。
【００２４】
別の局面において、本発明は、移植可能な、コーティングされた骨組み込み因子（ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）を特徴とする。この骨組み込み因子は、ヒト骨芽細胞（ＨＯＳ）付着アッセイに基づいて、コーティングされていない材料と比較した場合、骨の組み込みについて少なくとも約１００％まで増強される、コーティングされた材料を含む。
【００２５】
別の局面において、本発明は、コーティングされたインプラントを特徴とする。このインプラントは、ヒト骨芽細胞（ＨＯＳ）増殖アッセイに基づいて、コーティングされていない材料と比較した場合、骨芽細胞の増殖を少なくとも約１００％まで増大させる、コーティングされた材料を含む。
【００２６】
さらに別の局面において、本発明は、組織形成が必要とされる部位で、被験体における新しい組織形成を誘導する方法を特徴とする。この方法は、組織形成が必要とされる部位で、オステオポンチンまたはそのフラグメント、あるいはそれらに由来するペプチドを被験体内に加えることを包含し、ここでこのオステオポンチンは、この部位周辺に新しい組織形成を誘導する。
【００２７】
さらに別の局面において、本発明は、オステオポンチン、ムコ多糖および多価金属（例えば、カルシウム、マグネシウムまたはマンガン）を含むオステオポンチングルー（ｇｌｕｅ）を特徴とする。好ましくは、このオステオポンチンは、約１００μｇ／グルー１ｇの濃度である。
【００２８】
さらに別の実施形態において、本発明は、単離された活性オステオポンチンフラグメントまたはオステオポンチン由来フラグメント（例えば、細胞付着活性を有する活性オステオポンチンフラグメントまたはオステオポンチン由来フラグメント、あるいは、走化活性を有する活性オステオポンチンフラグメントまたはオステオポンチン由来フラグメント）を特徴とする。好ましい活性オステオポンチンフラグメントおよび／またはオステオポンチン由来フラグメントとしては、配列ＬＶＬＤＰＫ（配列番号２）もしくは配列ＬＶＶＤＰＫ（配列番号３）を含むかまたは有する、フラグメントあるいはペプチド、配列ＲＧＲＤＳ（配列番号４）を含むかまたは有する、ペプチドあるいはフラグメント、配列Ｘ、Ｘ１、Ｄ、Ｚ、Ｚ１（ここで、ＸおよびＸ１は疎水性アミノ酸、Ｄはアスパラギン酸、Ｚはプロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、またはセリン（Ｓ）、そしてＺ１は塩基性アミノ酸である）を含むかまたは有する、ペプチドあるいはフラグメント、配列ＧＲＧＤＳ（配列番号５）を含むかまたは有する、ペプチドあるいはフラグメント、配列ＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号６）もしくは配列ＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号７）を含むかまたは有する、ペプチドあるいはフラグメント、ならびに、配列ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号８）（本明細書中では「ＯＣ−１０１６」と呼ばれる）を含むかまたは有する、ペプチドあるいはフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は、細胞付着活性および／または細胞拡散活性を有する、単離されたペプチドフラグメントを特徴とする。好ましいペプチドとしては、配列ＳＤＥＬＶＴＤＦＰＴＤＬＰＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号９）、
配列ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＲＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号１０）、
配列ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＲＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＡＧＡＡＧＧＰＡＧＰＡＧ  ＰＡＧＰＡＧＰＡＧＰＡ（配列番号１１）、
配列ＲＳＲＲＶＦＴＰＦＩＰＴＥＳＡＮＤＧＲＧＤＳＶＡＹＧＬＫＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号１２）、
配列ＤＴＦＴＰＩＶＰＴＶＤＶＰＮＧＲＦＤＳＬＡＹＧＬＫＳＫＳＫＫＦＱ（配列番号１３）、
配列ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＡＤＳＶＶＹＧＲＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号１４）、
もしくはアセチル−ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号１５）（本明細書中では「修飾ＯＣ−１０１６」または「ｍＯＣ−１０１６」と呼ばれる）を含むかまたは有する、フラグメントあるいはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明はまた、ペプチドおよびオステオポンチン由来ペプチド、ならびに、細胞の拡散、走化性、走触性、および分化に関する、それらの調節活性に関する。細胞型の例としては、骨芽前駆細胞、腫瘍細胞、マクロファージ、骨膜細胞、内皮細胞、好酸球、そしてより一般的には、幹細胞、限定された潜在的前駆細胞（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）、前駆細胞、方向付けられた前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）、および分化細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このペプチド（ＯＣ−１０１６およびｍＯＣ−１０１６を含む）はまた、抗炎症剤として活性である。
【００３１】
本発明は、単離されたペプチド分子、それらが細胞に結合する能力、およびそれらが分化を含む種々の細胞プロセスを調節する能力に関する。本発明はまた、抗体、特にモノクローナル抗体に関し、これらの抗体は、オステオポンチン由来ペプチド（以下で考察されるＯＣ−１０１６およびｍＯＣ−１０１６）の２つの形態に特異的に結合する。
【００３２】
別の局面において、本発明は、構成的プロモーターによってオステオポンチンの発現が制御される、ヒト骨芽細胞株を特徴とする。当業者は、当該分野において公知であることを考慮すると、オステオポンチンの発現がまた、調節可能なプロモーターから発現され得ることを認識する。このような発現、または構成的発現の調節は、細胞の拡散、走化性、走触性を含む細胞プロセスを調節する能力を提供し、それゆえに、創傷治癒、免疫応答、骨の発達、組織の再構築、および転移に影響する間接的な能力を提供する。
【００３３】
本発明の別の局面において、好酸球に結合するオステオポンチン由来ペプチドが提供される。ペプチドと相互作用する好酸球は、好酸球活性を調節する機構を提供し、それゆえに、好酸球の結合挙動および漸増挙動に影響する。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、標的部位へのまたは標的部位における、細胞移動または細胞分化をそれぞれ促進する方法において用いられ得るペプチドを提供する。治療的に有効な量のペプチドによって、標的部位への所望の細胞型の移動が促進される。このペプチドは、標的部位内に送達または注入され得る。
【００３５】
本発明のさらに別の局面において、細胞に結合し、かつ細胞の移動を促進するペプチドでコーティングされる、標的部位または標的領域に、材料を送達し得る。
【００３６】
これらの例は、ＯＣ−１０１６およびｍＯＣ−１０１６がインビボでの骨の組み込みを増強すること、ならびに、細胞増殖および細胞拡散を誘導することを実証する。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
オステオポンチンでコーティングされたインプラントは、オステオポンチン含有インプラントを形成する、オステオポンチンの放出可能な形態と組み合わせた、被験体内におけるインビボでの使用に適する材料を含む。
【００３８】
本明細書中で用いられる場合、用語「材料」とは、被験体（例えば、ヒト被験体または動物被験体）におけるインビボでの使用に適し、かつ、オステオポンチンまたはそのフラグメント（例えば、放出可能なオステオポンチン）とともにインプラントの一部であり得る材料をいう。インビボでの使用に適する、当該分野で認識されている多くの材料がある。これらの材料としては、チタン、タンタル、ＶｉｔａｌｌｉｕｍＴＭ、ガラス、プラスチック、クロモコバルト（ＣｒＣｏ）、ステンレス鋼、天然ポリマーおよび合成ポリマー（例えば、コラーゲン、セルロース、デキストラン）またはテフロン（登録商標）ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書中で用いられる場合、用語「オステオポンチン」または「オステオポンチンポリペプチド」とは、インビボでその意図された機能を実行し得る、オステオポンチンまたはそのフラグメントの形態（例えば、細胞（例えば、骨芽細胞または破骨細胞）付着を介する、初期の骨マトリックスの組織化および石灰化に影響し得る形態）をいう。オステオポンチン形態の例としては、リン酸化オステオポンチン（例えば、タンパク質１ｍｏｌ当たり、約６〜約１２のリン酸塩を有するオステオポンチン）、好ましくは、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２７、Ｓｅｒ６３、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７８、Ｓｅｒ８１、Ｓｅｒ９９、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１０５、Ｓｅｒ１０８、Ｓｅｒ１１７、そして好ましくはＴｈｒ１３８、そしてもっとも好ましくはＴｈｒ１５２からなる群より選択される１個以上のアミノ酸において、リン酸化されたオステオポンチン、組換えオステオポンチン（例えば、ヒト組換えオステオポンチンまたはマウス組換えオステオポンチン（例えば、マウスＢ３Ｈ細胞から分泌されるオステオポンチン））、ならびに、天然に存在するオステオポンチン（例えば、ヒト骨芽細胞から分泌された、天然に存在するオステオポンチン（配列番号１））が挙げられる。好ましい実施形態において、スレオニン１５２がリン酸化される。より好ましい実施形態において、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２７、Ｓｅｒ８１、Ｔｈｒ１５２およびＳｅｒ３０８がリン酸化される。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、用語「活性オステオポンチンペプチド」とは、天然に存在するオステオポンチンの少なくとも１つの生物学的活性を有する、オステオポンチンフラグメントをいう。好ましいペプチドとしては、走化活性を有するペプチド（本明細書中では走化ペプチドと呼ばれる）（例えば、アミノ酸配列ＬＶＬＤＰＫ（配列番号２）またはアミノ酸配列ＬＶＶＤＰＫ（配列番号３）を含むペプチド）、あるいは細胞付着活性を有するペプチド（本明細書中では細胞付着ペプチドと呼ばれる）（例えば、アミノ酸配列ＲＧＲＤＳ（配列番号４）を含むペプチド）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、このオステオポンチンペプチドは、共有結合性相互作用、非共有結合性相互作用、または静電的相互作用を介して、材料上にコーティングされ得る。
【００４１】
例示的な実施形態において、走化ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ、Ｘ１、Ｄ、Ｚ、Ｚ１（ここで、ＸおよびＸ１は疎水性アミノ酸であり、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｚはプロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）であり、そしてＺ１は塩基性アミノ酸である）を含むペプチドであり得る。
【００４２】
好ましい疎水性アミノ酸としては、アスパラギン（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、グルタミン（Ｑ）、またはメチオニン（Ｍ）が挙げられる。好ましい塩基性アミノ酸残基としては、リシン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）が挙げられる。１つの実施形態において、ＸおよびＸ１はＬ、Ｖ、Ｉ、Ｑ、Ｍからなる群より選択され；ＺはＰ、Ｇ、またはＳであり；そしてＺ１はＫまたはＲのいずれかである。もっとも好ましい実施形態において、ＸはＬであり、Ｘ１はＬであり、ＺはＧであり、そしてＺ１はＫである。
【００４３】
別の実施形態において、細胞付着ペプチドは、配列ＧＲＧＤＳ（配列番号５）を含む。ＧＲＧＤＳは、細胞付着を増強する、細胞結合ドメインである。別の実施形態において、細胞付着ペプチドは、配列ＧＲＧＤＳ（配列番号５）を有する。好ましい活性ペプチドは、アミノ酸配列ＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号６）；
アミノ酸配列ＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号７）；
アミノ酸配列ＳＤＥＬＶＴＤＦＰＴＤＬＰＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号９）；
アミノ酸配列ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＲＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号１０）；
アミノ酸配列ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＲＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＡＧＡＡＧＧＰＡＧＰＡＧ  ＰＡＧＰＡＧＰＡＧＰＡ（配列番号１１）；
ＲＳＲＲＶＦＴＰＦＩＰＴＥＳＡＮＤＧＲＧＤＳＶＡＹＧＬＫＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号１２）；
およびアセチル−ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号１５）（ｍ−ＯＣ−１０１６）を含む。
【００４４】
別の実施形態において、好ましい活性ペプチドは、「ＲＧＤ」配列を有さない。例えば、好ましい活性ペプチドは、アミノ酸配列ＤＴＦＴＰＩＶＰＴＶＤＶＰＮＧＲＦＤＳＬＡＹＧＬＫＳＫＳＫＫＦＱ（配列番号１３）を有する。さらに別の好ましい活性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＡＤＳＶＶＹＧＲＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号１４）を有する。
【００４５】
本明細書中で用いられる場合、オステオポンチン由来ペプチドは、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個または約１０個の、天然に存在するオステオポンチンペプチド中に存在するアミノ酸残基と異なる残基（これらの残基は、活性ペプチドの活性に干渉しない）を含む、本明細書中に定義されるような「活性オステオポンチンペプチド」を含む。例えば、残基は、活性オステオポンチンペプチドのＣ末端またはＮ末端に（例えば、この活性ペプチドの精製を容易にするために）付加され得る。あるいは、比較的少数の残基が、この活性ペプチドの連続する配列中で置換され得（例えば、天然に存在するオステオポンチン配列の配列中で置換され得）、この置換は、この活性ペプチドの活性に干渉しない。好ましいオステオポンチン由来ペプチドは、アミノ酸配列ＲＳＲＲＡＴＥＶＦＴＰＶＶＰＴＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰ（配列番号８）を含む。あるいは、任意の型の化学修飾が、このペプチドのうちのいずれかに導入され得るか、または付着され得る。選り抜きの化学修飾は、このペプチドの活性に干渉しない。配列番号１５（ｍＯＣ−１０１６）は、１つのそのような例を表す。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合、句「放出可能な形態で」は、オステオポンチンまたはそのフラグメント、あるいはそれらに由来するペプチドが、インプラントの表面から放出され得、かつインビボでの意図された機能を実行し得る（例えば、移植の、好ましくは約２４時間以内、より好ましくは約４８時間以内に、インプラントの近位にオステオポンチンの勾配を確立し得る）ように、材料の上端にコーティングされたオステオポンチンを含むことを意図する。本明細書中で用いられる場合、「オステオポンチンの勾配」とは、インプラントへの細胞（例えば、骨芽細胞または破骨細胞）の漸増を生じる、タンパク質の勾配をいう。好ましくは、このオステオポンチンは、材料に、非共有結合的にかまたは静電的に付着される。非共有結合的付着は、当該分野において公知であり、そしてこれらとしては、２価のイオン架橋（ｉｏｎ  ｂｒｉｄｇｅ）（例えば、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋またはＭｎ＋＋の架橋）を介する付着；オステオポンチンもしくはそのフラグメントまたはそれらに由来するペプチドの、材料への吸収を介する付着；材料への、ポリアミン（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、スペルミン、スペルミジンまたはカダベリン）のプラズマスプレーまたはコートドライを介する付着；材料にコーティングされた第２のポリペプチド（例えば、フィブロネクチンまたはコラーゲン）を介する付着；あるいは、材料への、二官能性架橋剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＡＳＡ）、スルホスクシンイミジル（４−アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル（Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル  ６［α−メチル−α（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル  ６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル  ６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジ（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル  ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル  ４（ｐ−マレイミドフェ��ル）ブチレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ）、またはアジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ））を介する付着が挙げられるが、これらに限定されない。他の好ましい実施形態において、オステオポンチンまたはそのフラグメント、あるいはそれらに由来するペプチドは、静電的相互作用を介して材料に付着される。
【００４７】
あるいは、このオステオポンチンは、上記のような、非共有結合的付着を介して、組織表面のためのインプラント（ムコ多糖をさらに含む）に付着され得る。ムコ多糖は当該分野で認識されており、そしてこれらとしては、例えば、Ｎ−アセチルコンドロシン、またはβ  １−３グルクロニド（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｉｃ）基およびβ  １−４グルコサミニド（ｇｌｕｃｏｎｓａｍｉｎｉｄｉｃ）基の繰り返し単位を有する、グリコサミノグリカンが挙げられる。適切なムコ多糖としては、硫酸コンドロイチンまたはヒアルロン酸が挙げられる。好ましくは、ヒアルロン酸は二糖よりも大きい；このヒアルロン酸は、１００ｋＤａ未満の、より好ましくは、約２０〜約１００ｋＤａ（例えば、約５０〜１００ｋＤａ、約７０〜１００ｋＤａ、または約３０〜８０ｋＤａ）の分子量範囲を有する。
【００４８】
本明細書中で用いられる場合、用語「インプラント」とは、インビボでの使用に適する外科用インプラントをいい、そしてインプラントが、細胞（例えば、骨芽細胞または破骨細胞）付着を促進するためのオステオポンチンを有することが望ましい。適切なインプラントの例としては、歯科用インプラント（例えば、歯科用ネジまたは歯科用固定具）、顎改変用インプラント、顔再構築用インプラント、整形用インプラント（例えば、整形用ネジ、ロッドまたは関節（例えば、臀部置換用インプラントまたは膝置換用インプラント））が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいインプラントは、歯科用チタンインプラントである。
【００４９】
本明細書中で用いられる場合、句「オステオポンチン含有細胞漸増システム」とは、オステオポンチンまたはそのフラグメント、あるいはそれらに由来するペプチドが、インプラントから独立して被験体に導入される、システムをいう。好ましくは、このオステオポンチンまたはそのフラグメント、あるいはそれらに由来するペプチドは、ゲルまたはスポンジの形態で、インプラントの近位に導入される。他の好ましい実施形態において、ゲルまたはスポンジに含有されるオステオポンチンまたはそのフラグメント、あるいはそれらに由来するペプチドは、細胞（例えば、骨芽細胞または破骨細胞）がインプラントに漸増されるように、インプラントの近位にオステオポンチンの勾配を生じ得る。句「オステオポンチン含有細胞漸増システム」はまた、創傷治癒の促進、および、周囲の組織に由来する組織再構築細胞の漸増の刺激における、オステオポンチンの走化効果を含むことを意図する。組織再構築細胞としては、間葉、マクロファージおよび顆粒球が挙げられる。創傷治癒細胞としては、例えば、ＴＧＦＢおよび増殖因子を含むサイトカイン、細胞刺激分子、ならびに、損傷した組織領域から慢性壊死性組織を除去することを助ける、マクロファージのような治癒細胞が挙げられる。
【００５０】
用語「間葉細胞」は、当該分野で認識されており、そしてこれらとして、間葉組織（例えば、結合性組織の生成の原因となる流体マトリックス中に包埋される、分枝細胞から構成される、未分化組織）、血管、血液、リンパ系が挙げられることを意図し、そして間葉細胞は、種々の分化した結合性組織へと分化する。
【００５１】
用語「増殖因子」は、当該分野で認識されており、そしてこれらとして、１つ以上の血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（例えば、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＰＤＧＦ  ＢＢ）；インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、β−内皮細胞増殖因子、ＦＧＦ  ４、ＦＧＦ  ５、ＦＧＦ  ６、ＦＧＦ  ７、ＦＧＦ８、およびＦＧＦ  ９）；トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１．２、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５）；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（例えば、ＢＭＰ  １、ＢＭＰ  ２、ＢＭＰ  ３、ＢＭＰ  ４）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、ＶＥＧＦ、胎盤増殖因子）；表皮増殖因子（ＥＧＦ）（例えば、ＥＧＦ、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、βセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、ヘパリン結合ＥＧＦ）；インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、ＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−ＧＭ、ＣＳＦ−Ｍ）；神経増殖因子（ＮＧＦ）；幹細胞因子；肝細胞増殖因子、および毛様体神経栄養性因子（ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。Ａｄａｍｓら、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第１１７巻、１１８３〜１１９８頁（１９９３）（本明細書中では以下「Ａｄａｍｓら」）、および、Ｋｒｅｉｓら編、表題「Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）（本明細書中では以下「Ｋｒｅｉｓら」）は、分化および発達を調節する細胞外マトリックス成分を記載する。さらに、Ａｄａｍｓらは、細胞外マトリックスタンパク質との増殖因子の会合の例、ならびに、細胞外マトリックスが微小環境の重要な部分であること、および、細胞外マトリックスが増殖因子と共同して、分化および発達の調節において、中心的役割を果たすことを開示する。
【００５２】
本明細書中で用いられる場合、句「新しい骨の形成の誘導」とは、骨細胞（例えば、骨芽細胞および／または破骨細胞）の付着、増殖および／または分化、ならびに、インプラントの近位における、引き続く骨の石灰化を生じるプロセスをいう。
【００５３】
本明細書中で用いられる場合、句「移植可能なコーティングされた骨組み込み因子」とは、インビボで被験体に移植されるときに、コーティングされていない材料と比較した場合、コーティングされた材料の近位における骨の組み込みを、少なくとも約１００％まで増強する、コーティングされた材料をいう。好ましくは、このコーティングされた材料は、本明細書中に記載されるような、オステオポンチンまたはそのフラグメント、あるいはそれらに由来するペプチドでコーティングされた材料である。他の好ましい実施形態において、骨の組み込みの速度は、コーティングされていない材料と比較した場合、少なくとも約３００％、５００％、８００％、１０００％、１１００％または１２００％まで増強される。列挙した割合の値の中間の値（例えば、３５０％、８７５％、または１１５０％）もまた、本発明の一部であることを意図する。骨組み込みの速度は、以下の実施例２および実施例７に記載されるように、ヒト骨芽細胞（ＨＯＳ）付着アッセイを用いてか、または当業者に公知の他の方法によって、測定され得る。
【００５４】
本明細書中で用いられる場合、用語「コーティングされたインプラント」とは、インビボで被験体に移植されるときに、コーティングされていない材料と比較した場合、コーティングされた材料の近位における骨芽細胞の増殖を、少なくとも約１００％まで増大させる、コーティングされた材料をいう。好ましくは、このコーティングされた材料は、本明細書中に記載されるような、オステオポンチンまたはそのフラグメント、あるいはそれらに由来するペプチドでコーティングされた材料である。他の好ましい実施形態において、この増殖の速度は、コーティングされていない材料と比較した場合、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約２００％まで増大される。列挙した割合の値の中間の値（例えば、７５％、１２５％または１５０％）もまた、本発明の一部であることを意図する。増殖の速度は、以下の実施例３および実施例８に記載されるように、ヒト骨芽細胞（ＨＯＳ）増殖アッセイを用いてか、または当業者に公知の他の方法によって、測定され得る。
【００５５】
本発明はまた、被験体において、組織形成が必要である部位に、新規な組織形成を導入するための方法に関する。この方法は、組織形成が必要である部位に、被験体中にオステオポンチンを添加する工程を包含し、そのオステオポンチンは、その部位の周囲で新規な組織形成を誘導する。好ましい実施形態において、そのオステオポンチンは、組換えオステオポンチンである。最も好ましい実施形態において、その部位は、本明細書中に記載されるようなインプラントを含む。
【００５６】
オステオポンチン接着剤は、オステオポンチンと、ムコ多糖と、多価金属とを含む。適切な多価金属としては、銅、亜鉛、バリウム、カルシウム、マグネシウム、およびマンガンが、挙げられる。このオステオポンチン接着剤は、修復が必要な組織領域（例えば、損傷、切断、または他の損傷組織領域（例えば、壊死組織））に投与され得る。このオステオポンチン接着剤は、当業者に公知の方法により（例えば、注射を介して）投与され得る。このオステオポンチン接着剤の投与は、組織再生を増強し、壊死細胞を同時除去する。好ましい実施形態において、このオステオポンチン接着剤は、本明細書中に記載されるようなインプラントとともに使用され得る。
【００５７】
これらは、注射、吸入、眼のローション、軟膏、座剤などによって、錠剤形態またはカプセル形態で投与され、注射、注入、または吸入により投与され、ローションまたは軟膏によって局所投与され、そして座剤により直腸投与される。注射または局所投与が、好ましい。
【００５８】
句「非経口投与」および「非経口投与される」とは、本明細書中で使用される場合、経腸的投与および局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内および胸骨下の、注射および注入が挙げられる。
【００５９】
その薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成、および投与様式について、所望の治療応答を達成するに有効でありその患者に対する毒性でない量の活性成分を得るように、変化され得る。
【００６０】
選択された投薬レベルは、使用される本発明のオステオポンチンの活性、投与経路、投与回数、使用されるオステオポンチンの排出速度、処置の期間、使用されるオテオポンチンと組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康および以前の医療歴、および医学分野で周知の要因を含む、種々の要因に依存する。好ましい実施形態において、その接着剤中のオステオポンチンの濃度は、キャリア１ｇあたり、約０．１μｇ〜約１００μｇ（好ましくは、約１００μｇ）である。
【００６１】
理論により拘束されることは望まないが、このオステオポンチン接着剤は、組織を組織に「積層する」かまたは組織をインプラントに「積層する」ための機構を提供する。組織の再構築または修復を促進する接着剤の能力のついてのもっともらしい説明は、以下の通りである：ムコ多糖は、疎水性ドメインおよび親水性ドメインの両方を含み、これらは、例えば、インプラントまたは組織の表面を被覆し得る（例えば、表面に付着し得る）。このムコ多糖は、そのムコ多糖と相互作用する多価カチオンにイオン電荷を提供し、インプラント表面とオステオポンチンとの間の架橋として作用する。一旦、細胞動員が必要な領域内にそのオステオポンチンが存在すると、そのオステオポンチンは、そのオステオポンチンの勾配領域中の組織の再生を促進するのを補助する。あるいは、インプラント表面は酸化され得て、多価金属がその酸化された表面と結合し得るようになり、それにより、そのオステオポンチンへの直接の架橋が提供される。そのオステオポンチンと、ムコ多糖のさらなる層との間の相互作用が、ムコ多糖、多価金属、オステオポンチンの多重層のための積層効果をさらに生じ得ることが、想像され得る。
【００６２】
句「薬学的に受容可能なキャリア」は、当該分野で認識されており、そして、本発明のオステオポンチン組成物を注射により哺乳動物に投与するために適切な、薬学的に受容可能な物質、組成、またはキャリアを包含する。そのビヒクルとしては、骨前駆体組成物を運搬または輸送する必要がある空洞にシリンジからその骨前駆体組成物を運搬または輸送することに関与する、固体または液体の、充填材、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化物質が、挙げられる。各キャリアは、その処方物中の他の成分と適合性でありかつ患者に対して損傷を与えない意味で、「受容可能」でなければならない。薬学的に受容可能なビヒクルとして役立ち得る物質のいくつかの例としては、糖（例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース）；デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤（例えば、ココアバターおよび坐剤ろう）；油（例えば、落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油）；グリコール（例えば、プロピレングリコール）；ポリオール（例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）；エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル）；緩衝剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張性生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝化溶液；ならびに薬学的処方物中にて使用される適合性の他の非毒性物質が、挙げられる。
【００６３】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）ならびに着色剤、安定化剤、保存剤または抗酸化剤もまた、この組成物中に存在し得る。
【００６４】
これらの処方物または組成物を調製するための方法は、本発明のオステオポンチン接着剤組成物を、キャリアと、そして必要に応じて、１つ以上の補助成分と会合させる工程を包含する。一般には、その処方物は、本発明のオステオポンチン接着剤の成分をキャリアと、均一かつ密接に会合させることによって、調製される。
【００６５】
本発明のオステオポンチン接着剤組成物の投与に適切な液体投薬形態は、薬学的に受容可能な乳濁物および微小乳濁物、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルを包含する。活性成分（例えば、オステオポンチン、多価金属およびムコ多糖）に加えて、この液体投薬形態は、当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール）、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚種油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ソルビタン、ならびにこれらの混合物を含み得る。
【００６６】
このオステオポンチン組成物はまた、補助物質（例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤）を含み得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸）を含めることによって、保証され得る。等張剤、糖、または塩（例えば、塩化ナトリウム）を含むこともまた、望ましくあり得る。さらに、このオステオポンチン組成物の長期吸収は、吸収を弱める薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン（例えば、コラーゲン））を含めることによって、もたらされ得る。
【００６７】
（オステオポンチンのインビトロ改変）
（オステオポンチンのリン酸化）
天然オステオポンチンおよび組換えオステオポンチンの両方が、ネイティブオステオポンチンをコードするアミノ酸配列のリン酸化によって改変され得る。このオステオポンチンは、グリコシル化の変化を伴わずにかまたは伴って、リン酸化が存在するように、改変され得る。このオステオポンチンはまた、ネイティブ形態のオステオポンチンよりも少ないリン酸化または多いリン酸化をそのオステオポンチンが有するように、あるいは天然にリン酸化される部位以外の部位でそのオステオポンチンがリン酸化されるように、改変され得る。
【００６８】
リン酸化は、真核生物キナーゼ（例えば、カゼインキナーゼＩＩ型）またはｃＡＭＰ依存性キナーゼのいずれかの存在下で、そのオステオポンチンをインキュベートすることによって、達成される。これらのキナーゼは、細胞質ゾル抽出物またはミクロソーム抽出物から入手され得るか、または供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．）から精製形態または半精製形態で入手され得るか、または文献に記載されるように入手され得る。下記実施例において記載されるように、マウス腎臓由来の少なくとも３つの異なるキナーゼ調製物が、インビトロでオステオポンチンをリン酸化するために使用され得る。これらの調製物は、キナーゼ活性の混合物を含み、そのキナーゼ活性のうちのいくつかは、融合タンパク質をリン酸化し得る。カゼインキナーゼＩ、カゼインキナーゼＩＩ、および乳腺カゼインキナーゼは、階層的リン酸化反応に関与する。これらのキナーゼのうちのいずれかによる１つの部位のリン酸化は、異なるキナーゼによる別の部位でのリン酸化に影響し得る。
【００６９】
下記実施例によってさらに示されるように、オステオポンチンは、表Ｉに示されるような、異なる型のキナーゼについて少なくとも５８個のコンセンサスリン酸化部位を有する、複合体基質であるようである。これらの推定リン酸化部位は、そのタンパク質全体にわたって無作為には分布していないが、それらの部位は、あたかも８つのクラスターに組織されたように見える。例えば、残基１００と残基１２６との間に、カゼインキナーゼＩ、カゼインキナーゼＩＩ、または乳腺カゼインキナーゼのいずれかについて、９つの潜在的リン酸化部位が存在する。これらの独立したカゼインキナーゼファミリーの酵素についての潜在的リン酸化部位に加えて、オステオポンチンはまた、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼおよびｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ、およびプロテインキナーゼＣについて、潜在的リン酸化部位を含む。組換えオステオポンチンにおいて、骨から単離されたオステオポンチンにおいて見出されるリン酸化部位よりも数倍多い潜在的リン酸化部位が、存在する。これらの潜在的部位のすべてが、所定の任意の時期にリン酸化され得るわけではない。なぜなら、いくつかの部位は、プロテインキナーゼに接近可能ではないかもしれないからであり、またはいくつかの組織は、オステオポンチンのリン酸化のために必要なキナーゼ活性のすべてを含むわけではないかもしれないからである。さらに、部位のクラスター形成は、特定のリン酸化残基が、特異性決定基として作用し得ることを、示唆する。例えば、任意のキナーゼによるＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のリン酸化が、カゼインキナーゼＩまたは乳腺カゼインキナーゼのいずれかによる、リン酸化可能な隣接残基のリン酸化のための部位を生成し得る。逆に、特定のキナーゼによる１つの部位でのリン酸化は、すぐ近くの残基のリン酸化を抑制し得る（例えば、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼおよびカルモジュリン依存性プロテインキナーゼによる、ホルモン感受性リパーゼの相互排除的なリン酸化）。
【００７０】
リン酸化の部位および程度のさらなる改変は、差次的スプライシング修飾および翻訳後修飾により、ならびにこれらのリン酸化部位のいずれか１つでのフラグメントおよび部位特異的変異の使用により、構造が変化したオステオポンチンの発現によって、達成され得る。
【００７１】
カルシウム／カルモジュリンキナーゼＩＩによるリン酸化について、１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２および３μｇカルモジュリンの存在下で、反応が実行される。プロテインキナーゼＣのリン酸化について、８μｇ／ｍｌホスファチジルセリン、０．８μｇ／ｍｌのジアシルグリセロール、および１ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下で、反応が実行される。自己リン酸化について、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で、反応が実行される。ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼによるリン酸化について、０．１μＭ  ｃＧＭＰの存在下で、反応が実行される。カゼインキナーゼＩまたは乳腺カゼインキナーゼによるオステオポンチンのリン酸化には、何の添加も必要ない。
【００７２】
（オステオポンチン中のリン酸化部位の決定）
３２Ｐ−ＡＴＰおよび所望のキナーゼを用いたリン酸化の後、オステオポンチンは、トリプシン、エンドペプチダーゼＧｌｕ−ＣまたはエンドペプチダーゼＡｓｐ−Ｎのいずれかを用いて消化される。生じたペプチドは、ＨＰＬＣにより分離され、そして放射性標識ペプチドが、配列決定される。リン酸化残基の位置は、そのサイクル中でのアミノ酸と放射能との共溶出によって、決定される。
【００７３】
（オステオポンチンの脱リン酸化）
オステオポンチンは、１００μｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．５）および１単位アルカリホスファターゼか、または１００μｌの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）および１単位の酸ホスファターゼのいずれかとともに、数時間そのオステオポンチンをインキュベートすることによって、脱リン酸化され得る。オステオポンチンはまた、そのリンタンパク質を、０．１単位と１単位との間のプロテインホスファターゼ２Ａとともに４℃で１時間インキュベートすることによって、脱リン酸化され得る。オステオポンチンはまた、そのタンパク質を０．１Ｎ  ＮａＯＨ中で３７℃にて１時間インキュベートすることによって、脱リン酸化され得る。
【００７４】
（表１：オステオポンチン中の推定リン酸化部位）
【００７５】
【表１】
2004531461.tif 000003
（グリコシル化）
（オステオポンチンのＮ−グリコシル化）
オステオポンチンは、コリコール−Ｐ−Ｐ−オリゴ糖およびミクロソームオリゴ糖トランスフェラーゼを使用して、Ｎ−グリコシル化され得る。そのオリゴ糖側鎖は、濃縮ゴルジ調製物および適切なＵＤＰ糖を使用して、さらに処理され得る。
【００７６】
（オステオポンチンのＯ−グリコシル化）
オステオポンチンは、市販のウサギ網状赤血球溶解物とともにそのオステオポンチンをインキュベートすることによりＯ−グリコシル化され、このことは、インビトロでグリコシレート発生タンパク質により示されている（例えば、Ｓｔａｒｒ，Ｓ．Ｍ．およびＨａｎｏｖｅｒ，Ｊ．Ａ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６８６８〜６８７３）。あるいは、オステオポンチンは、精製ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼおよびＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミンを使用することによって、Ｏ−グリコシル化され得る。生じるＯ−グリコシル化タンパク質は、精製トランスフェラーゼおよび適切な糖誘導体を使用して、より複雑なオリゴ糖側鎖を構築するために使用され得る。
【００７７】
（オステオポンチンの（非酵素的）グリケーション）
非酵素的グリケーションは、任意の糖アルデヒドまたは糖ケトン（糖のリン酸化誘導体を含む）と、αアミノ基またはεアミノ基のいずれかとが縮合して、まず、Ｓｃｈｉｆｆ塩基の迅速な形成を生じることを包含する。このＳｃｈｉｆｆ塩基付加物は、その後、より安定なＡｍａｄｏｒｉ生成物へと再編成され得る。例えば、オステオポンチンをグルコースと数時間インキュベートすると、β−ピラノシルＳｃｈｉｆｆ塩基付加物の形成を生じ、この付加物は、時間経過により、β−フラノシルＡｍａｄｏｒｉ生成物へと再編成される。あるいは、このβ−ピラノシルＳｃｈｉｆｆ塩基付加物は、０．１％水素化ホウ素ナトリウムを用いて２２℃にて１時間還元されて、１−デオキシ−１−アミノソルビトール誘導体を生じ得る。
【００７８】
（オステオポンチンのシアル化）
Ｏ−グルコシル化オステオポンチンは、シアル酸の付加によって、さらに改変され得る。簡単に述べると、２００μｇのオステオポンチンが、種々の濃度のＣＭＰ−シアル酸を含む１００μｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）中で、０．５ミリユニットのα２，３−シアリルトランスフェラーゼとともに３７℃にて１時間インキュベートされる。Ｎ−グリコシル化オステオポンチンは、α２，６−シアリルトランスフェラーゼおよび上記の条件を使用して、シアル化され得る。
【００７９】
（天然に存在するオステオポンチンの脱シアル化）
組織から単離されたオステオポンチンは、以下の方法によって脱シアル化され得る：
（Ｎ結合型オリゴ糖の除去）
ノイラミダーゼを用いてオステオポンチンを処理してシアル酸を除去した後、オステオポンチンは、０．３ユニットのＮ−グリカナーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）とともに、１００μｌの２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で３７℃にて一晩インキュベートされる。
【００８０】
（Ｏ結合型オリゴ糖の除去）
アシアロオステオポンチンは、４ミリユニットのＯ−グリカナーゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）とともに、１００μｌの２００ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中で３７℃にて１〜６時間インキュベートされる。
【００８１】
（オステオポンチンからのオリゴ糖の除去）
オステオポンチンの全脱グリコシル化は、そのオステオポンチンを、０．１％無水トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）とともに数時間インキュベートすることによって、達成され得る。この処理により、Ｏ結合型オリゴ糖およびＮ結合型オリゴ糖の両方が除去される。
【００８２】
（オステオポンチンの硫酸化）
オステオポンチンおよびその誘導体の硫酸化は、Ｖａｒａｈａｂａｈｏｔｌａら（１９８８）ＢＢＡ，９６６：２８７〜２９６により記載された手順を使用して、酵素スルホトランスフェラーゼおよび硫酸ドナーとしての３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェートを使用して、達成される。オステオポンチンは、４つのチロシンを含む。その後、その硫酸化タンパク質は、ゲル透過クロマトグラフィーによって精製される。
【００８３】
（チタン）
（１．チタンの表面特性）
チタン（Ｔｉ）は、空気に曝された場合に、酸素とただちに反応する。ミリ秒未満で、１０Åより大きな酸化物層が形成され、そして１分間以内に、その酸化物の厚さは、約５０〜１００オングストロームになる（Ｋａｓｅｍｏ  Ｂ．，Ｊ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３２〜８３７，１９８３）。超音波洗浄およびオートクレーブ処理は、表面酸化物のさらなる成長、およびその酸化物中へのＯＨラジカルの可能な取込みを包含する（Ｋａｓｅｍｏ  Ｂ．，Ｊ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３２〜８３７，１９８３）。チタンは、いくつかの安定な酸化物（例えば、ＴｉＯ２、ＴｉＯおよびＴｉ２Ｏ３）を形成し、ＴｉＯ２が、最も一般的な酸化物である。すべての酸化物は、５０〜１２０の範囲で、高い誘電率（ほとんどの他の金属酸化物よりも高い）を有する。これらの理由のための、単一の化学量論的酸化物がインプラント表面上に形成されるとは、予期されない。この酸化物は、ＴｉＯｘと呼ばれ得、ｘは、その酸化物の平均酸化の程度を与える。従って、この組織インプラント反応は、そのインプラント表面でのＴｉＯ２との反応であり、このようなチタン元素との反応ではない（Ｋａｓｅｍｏ  Ｂ．，Ｊ．ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３２〜８３７，１９８３）。
【００８４】
二酸化チタンは、金属チタンとは異なる物理的特徴／化学的特徴を有する；これらの特徴は、金属よりもセラミックにより密接に関連する（ＬｅＧｅｒｏｓ  ＲＺおよびＣｒａｉｇ  ＲＧ、Ｊ．Ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８（２）：ｓ５８３−ｓ５９３、１９９３）。ＴｉＯは、生体不活性であり、Ｔｉは、生体耐性である（ＬｅＧｅｒｏｓ  ＲＺおよびＣｒａｉｇ  ＲＧ、Ｊ．Ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８（２）：ｓ５８３−ｓ５９３、１９９３）。生体材料組成物は、表面化学および組織応答に影響を与える。生体不活性材料（これには、酸化セラミック（アルミナ、ジルコニア）および生体耐性材料（金属合金およびポリマー）が挙げられる）は、骨に直接接触せず、結果として、材料骨界面は、張度および剪断強度がより低いが、圧縮負荷は、必ずしも低くない。
【００８５】
酸化チタン表面が、カチオン、特に多価カチオンに結合することが確立されている（Ａｂｅ  Ｍ．、Ｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｕｓ  ｏｘｉｄｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｍｅｔａｌｓ  ａｓ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ，Ｉｎｏｒｇａｎｕｃ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ａ．Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ編）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、ＵＳＡ、１６１−２７３頁、１９８２）。チタン表面は、動物組織において遭遇するｐＨ値で正味の負の荷電を有し、ｐＫは４．０である。このカチオンの結合は、移植物表面上のチタン結合Ｏとカチオンとの間の静電的相互作用に基づく。酸化物層は、非常に極性であり、水を引き付け、そして一般に水溶性分子である（Ｐａｒｓｅｇｉａｎ  ＶＡ、Ｊ．Ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３８−８４１、１９８３）。
【００８６】
（２  骨−チタン層）
骨組込型インプラント（ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔ）は、有機界面層（骨と移植物との間に膠原原線維を含まない）の存在によって特徴付けられる。オッセオインテグレーテッドインプラントにおけるこの介在層は、ランタンおよびアルシアンブルー（ａｌｃｉｎ  ｂｌｕｅ）で染色され、ヒアルロニダーゼおよびコンドロイチナーゼの両方に感受性であることが報告されており、プロテオグリンカン含有であることを示唆する（Ａｌｂｒｅｋｔｓｓｏｎ  Ｔら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１１、１−２７、１９８３）。グリカン層の厚みは、移植物材料の生体適合性によって異なり、Ｔｉについて２０〜４０ｎｍ、およびジルコニアについて３０〜５０ｎｍであることが見出された（Ａｌｂｒｅｋｔｓｓｏｎ  Ｔ、Ｊａｃｏｂｓｏｎ  Ｍ、Ｊ．Ｐｒｏｓｔｈｅｔ  Ｄｅｎｔ  ５７：５９７−６０７、１９８７）。この層の確立は、移植の成功について重要であることが報告されている。なぜなら、この層は、歯科用移植物と新たに形成された骨との間の最適な界面を提供し得るからである（Ｎａｎｃｉ  Ａら、Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、４（１）：１−３０、１９９４）。
【００８７】
市販の純粋なＴｉ（ｃｐ  Ｔｉ）に応答する組織を試験して、骨移植物界面を特徴付けた。レクチンの細胞化学を使用して、糖結合体ならびに非膠原性骨および血漿タンパク質についての免疫細胞化学を検出した。天然の骨界面（例えば、セメント線および境界板）の組成とチタンマトリックス界面の組成を比較した。骨チタン界面でのオステオポンチン（Ｏｐｎ）およびαＨＳ−糖タンパク質の濃度は、マトリックス−マトリックス界面でのセメント線および種々の細胞−マトリックス界面での境界板の組成と一致した。さらに、このデータは、骨と移植物との間の界面層もまた、糖類（例えば、ガラクトース（オステオポンチンにおいて比較的多い割合で見出される糖残基））を含有する糖結合体に富んでいることを示す。
【００８８】
（３  Ｔｉ周辺の骨治癒）
骨創傷治癒の研究から、オッセオインテグレーションの概念が生じた。透過照明システムを備えるチタンチャンバを、ウサギの腓骨に挿入して、骨内膜損傷治癒の間の細胞変化を観察した。研究完了時に、チタンチャンバの回復は、チャンバ表面に取りこまれた骨組織の骨折を必要とした。この示唆的な知見が、骨内（ｅｎｄｏｓｓｅｏｕｓ）移植物構築におけるチタンの使用の基礎となった（Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｐ−Ｉ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ、Ｂｒａｎｅｍａｒｋ  Ｐ−Ｉ、Ｚａｒｂ  Ｇａ、Ａｌｂｅｒｋｔｓｓｏｎ  Ｔ．（編）Ｔｉｓｓｕｅ−Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、１１−７６頁、１９８５）。
【００８９】
移植物配置によって生じる骨外傷の後に、血塊形成、急性炎症、間質細胞の補充および増殖、ならびに間質細胞の骨形成系統細胞への分化が続き、その後、骨の欠損の充填、そして最終的にマトリックスの鉱化が生じる（Ｏ’Ｎｅａｌ  ＲＢら、Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ．１８：２４３−２５５、１９９２）。このプロセスを通じて、創傷治癒および骨形成の過程を調整する高分子（サイトカインおよび接着分子を含む）が、細胞外環境に分泌される（Ｏ’Ｎｅａｌら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（１９９２）、Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｏｌ．１８：２４３−２５５、１９９２）。移植物表面とのこれらの高分子の相互作用は、移植物がどの程度取り込まれているかを、測定可能な程度まで決定する。
【００９０】
不安定なデバイスにより生じ得る初期の手術後の動きは、骨再生を損ない、線維性修復の代わりに、被包および慢性炎症を生じ、これらはさらに、不安定性およびより過剰な動きに寄与し得る。界面が取り込まれない場合、界面を横切って生じる大きい剪断移動は、腐食および磨耗の組み合わせを生じ得る（Ｇａｌａｎｔｅ  ＪＯら、Ｊ．Ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ９：７６０−７７５、１９９１）。
【００９１】
移植物骨界面の性質はまた、移植物の表面化学および局所解剖学によっても影響される。チタンは、骨形成を誘導しないので、移植物への骨細胞の付着を補償する１つの方法は、これらの分子を引き付ける移植物表面および／または骨形態形成を支持する移植物表面を設計することである。
【００９２】
（４  チタンの巨視的特徴に対する変化）
取り込みを最大にする工程が、移植物に向けられた：移植物の表面についての研究は、骨細胞がチタン表面にしっかりと付着し、そして目の粗い（酸）多孔性コーティングされたＴｉ表面が、細胞外マトリックスの合成および鉱化の両方を増強することを示した（Ｂｏｗｅｒｓ  ＫＴら、Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｍａｘ．Ｉｍｐ．７（３）：３０２−３１０、１９９２、Ｇｒｏｓｓｎｅｒ−Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ｂ、Ｔｕａｎ  ＲＳ、Ｊ．Ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０１、２０９−２１７、１９９２）。多孔性状態の電気化学的特性は、滑らかな表面状態の電気化学的特性に比較的類似する。しかし、腐食速度は、単位容積当たりのさらなる面積に起因して、多孔性状態について増加される（Ｇａｌａｎｔｅ  ＪＯら、Ｊ．Ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９：７６０−７７５、１９９１）。
【００９３】
（５  タンパク質でコーティングされたチタンを使用する骨の治癒）
最近の研究は、移植物のＴｉ表面を種々の物質（ヒドロキシアパタイト（Ｋｌｅｉｎ  ＧＰら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．１５（２）：１４６−５０、１９９４；Ｊａｎｓｅｎ  ＪＡら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓ．２５（８）：９７３−８９、１９９１；Ｈｏｌｍｅｓ  ＲＥ、Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  ６３：６２６−６３６、１９７９）、フォブロネクチン（Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ  ＲＢら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ  ｉｍｐｌａｎｔｓ．７（３）：２９７−３０１、１９９２）および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）（Ｘｉａｎｇ  Ｗら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．５１（６）：６４７−５１１、９９３）を含む）を用いてコーティングすることによる、骨への移植物のオッセオインテグレーションを改善することに焦点を当ててきた。このような研究からの骨／移植物界面の組織学的試験は、Ｔｉ移植物のオッセオインテグレーションの改善における、種々の程度の成功を明らかにした。
【００９４】
（チタンおよびオステオポンチン）
（１  骨形成の間のタンパク質発現）
骨の発生についての形態学的研究および組織学的研究は、前骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）から前骨芽細胞（ｐｒｅｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、骨芽細胞、そして最終的には骨細胞および裏打ち細胞（ｌｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ）へと進む直線的な系列の細胞分化を分類した（Ａｕｂｉｎ  ＪＥら、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｌｉｎｅａｇｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ」（Ｈ．ＳｌａｖｋｉｎおよびＰ  Ｐｒｉｎｃｅ、編）、２６７−２７６頁、Ｅｘｃｅｐｔａ  Ｍｅｄｉｃａ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９２）。最近、形態学的件研究および組織学的研究は、発生の間の特定の段階で骨細胞によって分泌されるいくつかの特定のタンパク質の解明によって補完された。例えば、Ｉ型コラーゲンは、初期の骨芽細胞および成熟骨芽細胞によって分泌されるが、後期骨芽細胞および骨細胞では減少する。アルカリホスファターゼは、前骨芽細胞によって発現され、骨芽細胞についてのマーカーとして受け入れられている。オステオポンチンおよび骨シアロタンパク質は、鉱化の開始直前に初期骨芽細胞によって分泌されるが、鉱化が進み、骨芽細胞が成熟し、骨細胞へ分化するにつれて、減少する。インビトロの骨芽細胞は、初期培養時点でのＯｐｎ  ｍＲＮＡ発現の最初の発現ピーク、その後の培養物が鉱化し始めた時点の第二の主要な発現ピークを示す（Ｏｗｅｎ  ＴＡ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１４３、４２０−４３０、１９９０；Ｓｔｒａｕｓｓ  ＧＰら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０、１３６８−１３７８、１９９０）。オステオカルシンは、鉱化の開始後に成熟骨芽細胞によって分泌される。骨界面でのタンパク質の出現順序は、特にＩ型コラーゲンに関して、骨の形成およびターンオーバーを生じ、最終的にはオッセオインテグレーションを生じる事象を受ける上で重要である。
【００９５】
（２  骨形成におけるオステオポンチンの可能性のある役割）
オステオポンチンは、骨において最初に同定された細胞接着タンパク質であるが、現在、他の組織とも関連する。オステオポンチンは、ＲＧＤ細胞結合配列を含むリン酸化糖タンパク質である。鉱化した組織において、ＯＰＮは、鉱化の前に発現され、そして骨栄養性ホルモンによって調節され、ヒドロキシアパタイトに結合し、そして破骨細胞および骨芽細胞の接着を増強する。Ｏｐｎの正確な機能はいまだ未知であるが、可能性としては、鉱化部位への骨前駆細胞の補充における役割、および細菌感染に対する保護における役割が挙げられる（Ｂｕｔｌｅｒ  ＷＴ、Ｃｏｎｎｅｃｔ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２３、１２３−１３６、１９８９）。
【００９６】
骨界面の境界板におけるオステオポンチンは、破骨細胞の移動および骨マトリックスの吸収作用の間の、破骨細胞接着のための基板として、次いで、最初の封鎖領域（ｓｅａｌｉｎｇ  ｚｏｎｅ）誘引のための基板として、ぞれぞれ作用し得る。再造形順序の逆の段階の間、オステオポンチンの最初の発現は、細胞−マトリックス相互作用における非膠原性骨細胞タンパク質の関与を反映することを示唆した（Ｌｉａｎ  ＪＢ、Ｓｔｅｉｎ  ＧＳ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３、２６９−３０５、１９９２）。分化している前骨芽細胞の生活環において初期に分泌されるＯｐｎは、吸収された骨表面で蓄積して、セメント線を形成する。この平面的な配置のＯｐｎの沈着は、最初に、初期のマトリックスの組織化および鉱化に影響し、そしておそらくこれらの部位での前骨芽細胞の接着に影響するように作用し得る。これはまた、より広い意味で、マトリックス−マトリックス／金属の生物学的接着剤として機能し、骨再造形の間の全体の組織の統合性および強度を維持するために、新たに形成された骨を古い骨に接着させ得る（ＭｃＫｅｅ  ＭＤ、Ｎａｎｃｉ  Ａ、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ−Ｇｏｌｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ：Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７６０：１９９５年４月２１日）。マトリックスタンパク質の出現順序に基づいて、Ｏｐｎが、二重の役割を有し、最初は細胞接着に関与し、次いでインビボで見出されるセメント線様材料の鉱化に関与することが想定され得る（Ｓｈｅｎ  Ｘ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３、２５７−２７２、１９９３）。
【００９７】
（３  チタン表面へのタンパク質の結合）
移植された材料は、その表面を介して、界面組織との接触を達成および維持する。基板または移植物が体内環境に挿入される場合、これは、細胞および宿主のイオン種および分子種に曝され、最終的に界面事象の過程を決定する（Ｋａｓｅｍｏ  Ｂ、Ｊ．Ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３２−８３７、１９８３）。最初に起こることの１つは、基板上へのタンパク質の吸着である（Ｋａｓｅｍｏ  Ｂ、Ｊ．Ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３２−８３７、１９８３）。この吸着は、細胞が表面へ近づくかなり前の、接触の最初の１０〜６０秒以内に起こる。このことは、アロプラスト表面と相互作用する任意の細胞が、吸着したタンパク質層を介して間接的にのみ接着を行うことを意味する。
【００９８】
吸着したタンパク質の性質および量は、アロプラストの組成に特異的であり（Ｕｎｉｙａｌ  Ｓ、Ｂｒａｓｈ  ＪＬ、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．４７、２８５−２９０、１９８２）、所定の表面の物理的特性および電気化学的特性に依存する。吸着したタンパク質の不確実さが、どの種の細胞がアロプラスト表面と相互作用するかを決定し得ることを、考慮すべきである（Ｂａｇａｍｂｉｓａ  ＦＢら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ５、２１７−２２６、１９９４）。基板との細胞の接触は、焦点接着と呼ばれる空間的かつ形態的に規定された細胞下の接着部位の形成によって、維持される。焦点接着は、基質の近位の１５〜３０ｎｍ以内であり（Ｉｚｚａｒｄ  ＣＳ、Ｌｏｃｈｎｅｒ  ＲＬ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．２１：１２９−１５９、１９７６）、および長さ約２μｍ〜１０μｍ、そして幅１５０ｎｍ〜５００ｎｍである（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  Ｋら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４８７−５２５、１９８８）。材料表面に対する、細胞の異なる現象的応答は、湿潤性に起因するが、これは、最初の接近のみであり得る（Ｐａｒｓｅｇｉａｎ  ＶＡ、Ｊ．Ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３８−８４１、１９８３）。移植後の界面事象の調整に関与する重要な分子と相互作用する表面の能力について述べることは、より有用であるようである。材料表面が、骨芽細胞機能を支持する高分子に結合できない場合、この材料は、良好な骨移植物を作製するのに適切ではない。骨組織を移植物表面上に配置するために骨細胞を得る１つの方法は、細胞現象学、増殖および分化のような事象を担う高分子に対して誘因性の表面を有するかまたは作製することを介し得る（Ｂａｇａｍｂｉｓａ  ＦＢら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆ．Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ５：２１７−２２６、１９９４）。
【００９９】
マトリックスタンパク質またはマトリックス様タンパク質の水溶液のＴｉへの吸着は、結合した細胞数の有意な増加を生じた。この効果は、報告されており（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ  Ｋら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４８７−５２５、１９８８）、そして特定の細胞レセプターマトリックスタンパク質の相互作用が、細胞−Ｔｉ相互作用の規定されていないプロセスよりも、より有効な接着手段であることを示す。
【０１００】
組織学的情報は、骨と移植物材料との間の界面において利用可能であるが、移植物が骨内に挿入された場合に作動する機構の理解は、限定されており、そして概念は推測上のものである。
【０１０１】
取り込みのプロセスは、水性環境において持続する。これは、２つの物体が接触する場合、これらは、互いに介在する水か、または元々それらの間に存在した別のものを好むからである。電気的電荷の接近において、分子は、侵入する荷電した物体に近い誘引末端を維持するように変わる（Ｐａｒｓｅｇｉａｎ  ＶＡ、Ｊ．Ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ４９（６）：８３８−８４１、１９８３）。少量の正に荷電したカルシウムイオンは、特定の電気的に負の表面基に結合し、水を置換し、そして二層間の（−）（＋）構成、（＋）（−）構成の架橋によってそれを置換する。二層の膜の間で見られる指数関数的（ｅｘｐｏｔｅｎｔｉｏｎａｌｌｙ）に減衰する斥力は、単一分子間でも見られる（Ｐａｒｓｅｇｉａｎ  ＶＡ、Ｊ．Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３８−８４１、１９８３）。
【０１０２】
親密な相互作用範囲が分析され得る、２つの経路が存在する：第一は、水素結合、疎水性結合、塩橋、ファンデルワールス力のリストである。第二は、その構造が、Ｘ線回折による原子分解に対して決定される、タンパク質のモノマーまたはテトラマーを生じる、分子接触の直接的調査である。
【０１０３】
金属表面は、実際、非常に極性の酸化チタン層であり、おそらく、大量の金属相から蓄積した不純物によって修飾される。時間と共に、酸化物表面を有するチタンは、隣接組織からの材料と混和し、そして細胞起源の基質の薄層が、骨組織およびチタンを固定化するように、移植物上に沈着する。主に重要な相互作用は、おそらく、ファンデルワールス相互作用または疎水性相互作用ではなく、静電的相互作用である（Ｐａｒｓｅｇｉａｎ  ＶＡ、Ｊ．Ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３８−８４１、１９８３）。非常に極性の酸化物層は、荷電した物体に、水に対して強力に誘因性である代替物を提供する。このような表面におそらく生じるチタンおよび酸素の多くの構成は、水溶性基質上におそらく存在する種々の荷電のアレイを誘引する、広範な種々の吸着剤部位を提供する。
【０１０４】
酸化物層は、非常に極性であるので、元々水溶性である種を誘引することができる。正の電気的荷電は、特に、酸化物に向かって移動する。なぜなら、その分極率に加えて、この層は、負に荷電するからである。このような非常に極性の領域が、隣接する水相から（正の）カルシウムおよび（負の）リン酸イオンを取り込むことが観察されたことは、驚くべきことではない。ファンデルワールス力ではなく、生成された電気的二重層でもなく、疎水性誘引でもない、吸着剤および基質の極性特性が、接触を決定する（Ｐａｒｓｅｇｉａｎ  ＶＡ、Ｊ．Ｏｆ  Ｐｒｏｓｔｈ  Ｄｅｎｔ．４９（６）：８３８−８４１、１９８３）。
【０１０５】
酸化チタン表面の化学的特性は、カルシウムイオンが、上記のように、Ｏとの静電的相互作用による酸化物被覆表面へ誘引され得ることを示唆する。カルシウム沈着は、酸化チタンと直接接触して観察された（Ａｌｂｒｅｋｓｓｏｎ  ＴおよびＨａｎｓｓｏｎ  ＨＡ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、７、２０１−２０５、１９８６）。同じモデルに従って、カルシウム結合高分子は、次の順番の事象として、インビボで移植物表面に選択的に同化し得る。カルシウム結合高分子は、しばしば、表面が露出されたカルボキシル基、ホスフェート基またはスルフェート基を有して、酸性である。プロテオグリカンならびに／またはカルボキシル基およびホスフェート基／スルフェート基を含むタンパク質は、この機構によってＴｉＯ２表面に結合し得る。骨の主要な金属成分であるヒドロキシアパタイトもまた、カチオンを誘引し得る負に荷電した酸素（Ｐ−結合）によって、そして続いてアニオンのカルシウム結合高分子によって占有される表面を示す（Ｂｅｒｎａｒｄｉ  ＧおよびＫａｗａｓａｋｉ  Ｔ，Ｔ：Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６０、３０１−３１０頁、１９６８）。グリコサミノグリカンは、ヒドロキシアパタイト表面と静電的に相互作用する（Ｅｍｂｅｒｙ  ＧおよびＲｏｌｉａ  Ｇ、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ａｃｔａ  Ｏｄｏｎｔｏｌ．Ｓｃａｎｄ、３８、１０５−１０８、１９８０）。カルシウムが、ＣａＣｌ２での処理後に、この表面と同化することが示されている。チタン移植物表面へのカルシウムの吸収は、体液に曝される場合、骨との生体適合性を増大させ、そして移植物表面上への、カルシウム結合高分子の引き続く吸収を誘導する。ＴｉＯ２の表面特徴は、おそらく、Ｏｐｎのような酸性高分子を吸収する増大した能力を引き続いて有する表面への、カルシウムの吸着によって、アニオンからカチオン状態に変化する。この研究の結果は、カルシウム結合が、タンパク質がＴｉＯ２に同化する主要な機構であるという提案と一致した。
【０１０６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【０１０７】
（実施例１：移植物のコーティング）
チタン、プラスチック、ガラスおよびクロモコバルト（ｃｈｒｏｍｏｃｏｂａｌｔ）（ＣｒＣｏ）の表面を、ヒト組換えＯＰＮでコーティングした。ヒト骨芽細胞の接着および増殖を、コントロールとして非コーティング表面を使用して、マトリックス形成マーカーによって評価した。これらの表面にコーティングされ得る接着タンパク質の量もまた、調査した。
【０１０８】
ヒト組換えリン酸化形態のオステオポンチン（ｒｈＯｐｎ）を、接着分子として使用した。この形態のオステオポンチンは、７８Ｋｄの明らかな分子量を有して、１０％ＳＤＳゲル上を移動し、骨芽細胞によって分泌されるオステオポンチン（これは、同じゲルを、５８Ｋｄの明らかな分子量を有して移動する）からの識別を容易にする。
【０１０９】
以下に概説する実験は、組換えオステオポンチンでコーティングされたチタンディスク、プラスチック、ガラスおよびクロモコバルト表面上で培養されたヒト骨芽細胞における、細胞外マトリックス成分の発現および効果を調査する。これらの表面のコーティングとして使用される接着分子であるｒｈＯＰＮは、ヒト骨芽細胞株の付着および増殖を増強し、そして非コーティング表面と比較た場合、マトリックス成分の発現を増大させる。
【０１１０】
（材料および方法）
（ヒト骨芽細胞の細胞培養）
ヒト骨芽細胞株由来の５０，０００細胞を、２４ウェルプレート（直径１２ｍｍウェル）（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の内側に配置された、滅菌チタンディスク（直径１１ｍｍ）または組換えオステオポンチンでコーティングされたチタンディスク上に播種した。細胞を、コンフルエンスに達するまで、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変培地（ＤＭＥ）中で最初に維持した。次いで、細胞を、１０％ウシ胎仔血清、１２．５μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および５ｍＭのＢ−グリセロホスフェートを補充したＤＥＭ培地（完全培地と称される）中で増殖させた。
【０１１１】
（チタン表面上へのタンパク質吸収の決定）
チタンディスクを、１０％の硝酸中で１２時間洗浄し、水で完全に洗浄し、滅菌し、次いで２４ウェルプレート（直径１２ｍｍウェル）（Ｃｏｓｔｅｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の内側に配置し、そして０．５ｍｌの滅菌ＰＢＳで２回洗浄し、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２を８個のディスクに添加した。４つの異なる濃度のヒト組換えオステオポンチン（６０、２００、４００、６００μｇ）を、Ｓ３５で標識し、そして全てのチタンディスク上に配置した。２４時間後、結合したタンパク質および未結合のタンパク質を回収し、そしてシンチレーションカウンター（Ｂｅｒｇｍａｎ  ５０００）を使用して計数した。４つの濃度での２つの群間の値を比較して、結合因子としてのカルシウムの作用および組換えタンパク質の適切な濃度を決定した。
【０１１２】
（増殖させる基質の関数としてのＨＯＳ細胞の接着）
ＨＯＳ細胞を、１０μＣｉ３Ｈ−チミジンで一晩標識し、次いで、非酵素的分離溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いてプレートから分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして計数した。この細胞について、ＴＣＡ不溶物質への３Ｈ−チミジンの取り込みを決定した。５０００個の細胞（ｃｐｍ合計１０００）をコーティングしたチタンディスクまたはコーティングしていないチタンディスクにプレートし、そしてこのディスクを３７℃で３０分間インキュベートした。非接着細胞を除去し、そして付着した細胞を０．５ｍｌＰＢＳで３回洗浄した。この細胞を氷冷した２０％ＴＣＡに溶解し、そしてＴＣＡ不溶画分の放射活性をシンチレーションカウンター（Ｂｅｇｍａｎ  ５０００）を用いて決定した。
【０１１３】
（増殖させる基質の関数としてのＨＯＳ細胞の増殖）
細胞増殖を、ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取り込みの速度により決定した。細胞を、ＤＭＥ培地中で、１０μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンにより標識した。６時間後、細胞を冷却した１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）に溶解した。ＴＣＡ不溶物質を収集し、そして１０％ＴＣＡを用いて数回洗浄し、次いで、０．５Ｎ  ＮａＯＨに再懸濁した。ＴＣＡ不溶物質への３Ｈ−チミジン取り込みを、細胞増殖の指標として使用した。収集した物質を、シンチレーション液（Ｂｅｇｍａｎ）と混合した。生じた放射線の量を、コーティングしていないチタンディスクで増殖させた細胞と、ＯＰＮでコーティングしたチタンディスクで増殖させた細胞との間で比較した。
【０１１４】
（オステオポンチン（Ｏｐｎ）および骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）の合成、ならびに細胞外マトリクスへのそれらの分泌および沈殿）
オステオポンチンおよびＢＳＰを、Ｔｉディスクまたは組換えＯｐｎでコーティングしたＴｉディスクで培養したＨＯＳ細胞の細胞外マトリクスから溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、５ｍＭベンズアミジン、０．１ｍＭ  ｅ−アミノカプロン酸、０．１  ｂ−ヒドロキシ安息香酸水銀、０．１ｍＭピロリン酸、１ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）を用いて抽出した。次いで、サンプルをゲル電気泳動のために処理した。
【０１１５】
（ウェスタンブロット分析）
細胞層のタンパク質および馴化培地を、１５０ボルトで４時間、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲルで電気泳動した。ウェスタンブロット分析のために、ゲル中の分離したタンパク質を、セミドライブロッティングによりニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）へ移し、２０％メタノールおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０および１０％無脂肪粉ミルクを含む０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ８．２）中で９０分間１２Ｖにてゲルからの転写を実施し、次いで、１５０ｍＭ  ＮａＣＬ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、および１％無脂肪粉ミルクを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中でウサギ抗マウスオステオポンチン（Ａｓｈｋａｒ  Ｓら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７６０：２９６−２９８、１９９５）と共にインキュベートした。１時間後、メンブレンを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ１ｇ抗体と共に１時間インキュベートした。数回の洗浄工程の後、メンブレンをＥＣＬで発色した。非特異的相互作用を、一次抗体および二次抗体と、ウサギ血清アルブミンとの相互作用により評価した。
【０１１６】
収集したサンプルを、１５０ボルトで４時間、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲルで泳動し、タンパク質を同定した。次いで、クマシーブルー中に２４時間浸漬することにより、ゲルを染色した。このゲルを、１０％酢酸、２０％メタノール、７０％ｄｄ水で洗浄し、そしてサンプルと共に泳動した標準に対する分子量により、タンパク質を同定した。
【０１１７】
（培養物中のヒト骨芽細胞細胞膜におけるアルカリホスファターゼ酵素活性の発現）
アルカリホスファターゼ酵素活性を、記載されるようなｐ−ニトロフェノールホスフェート（Ｇｅｒｓｔｅｎｆｅｌｄ  ＬＣら、Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｂｉｏｌ；１２２：４９４０、１９８７）を用いて、グリシン緩衝液（ｐＨ１０．２）中で決定した。簡単に述べると、細胞層を、ＰＢＳ中で４℃にて１０分間、ＮＰ４０（界面活性剤）により抽出した。１００μｌのアリコートを、使用するまで凍結した。次いで、サンプルを解凍し、そして３７℃で１時間、グリシン緩衝液およびｐ−ニトロフェノールホスフェート中で調製した。サンプルが黄変した後、０．２ｍＭ  ＮａＯＨにより反応を停止し、そしてこのサンプルを分光光度計（Ｂｅｇｍａｎｎ）で読み取った。
【０１１８】
（ヒト骨芽細胞細胞培養物の鉱物含量の決定）
ＨＯＳ細胞を、コーティングしたチタンディスクまたはコーティングしていないチタンディスクのいずれかにおいて増殖させた。培地にアスコルビン酸塩およびｂ−グリセロールホスフェートを補充して、細胞外マトリクスの鉱化作用を刺激した。２週間後、培地を除去し、そして細胞をトリトンにより溶解した。次いで、全ての可溶性成分を除去し、そしてカルシウム含量を、５７５ｎｍでの定量、比色測定を用いて決定した（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃａｌｃｉｕｍ）。基本的に、カルシウムは、アルカリ性培地において紫色の錯体を形成する色素形成剤であるｏ−クレゾールフタレインと反応する。５７３ｎｍで測定される色の強度は、サンプル中のカルシウム濃度に直接的に比例する。
【０１１９】
（結合および細胞拡散活性を示すペプチドの決定）
実施例１１は、種々のペプチドの結合および細胞拡散活性を分析する。この活性を、１０μｇ／ｍｌの示されるリガンドまたはペプチドを用いて４℃で一晩コーティングした２４ウェルプレートにおいて測定し、次いで、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で、室温にて１時間、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）によりブロックした。接着レセプターの完全性を保存するために、前骨芽細胞を、非酵素的細胞分離溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により、サブコンフルエントな培養物から収集した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして０．１％ＢＳＡおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充した、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない滅菌ＰＢＳ１ｍｌあたり１×１０５細胞濃度に再懸濁した。５×１０４細胞を各々のウェルにてインキュベートし、そして３７℃で１時間後、ウェルを０．５ｍｌ  ＰＢＳで３回洗浄し、非接着細胞を除去し、室温にて１時間、１％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で固定し、次いで、トルイジンブルーおよびヘマトキシリンにより染色した。各々のウェルにおける接着または拡散した細胞の総数を、Ｓｏｎｙデジタルカメラを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡を用いて微視的に計数した。接着または拡散した細胞の総数を、Ｏｐｔｉｍａ５．２画像分析システムを用いて定量した。各々の実験を三連で行い、そして平均＋／−標準誤差として報告する。細胞接着研究に特有の可変性を最小限に抑えるために、細胞を、観察される規定された核が、円形の細胞形態から立方体の細胞形態への移行を伴う場合のみ接着しているとスコア付けした。規定された核を有さないゆるく接着した円形の細胞は、非接着とスコア付けした。これらの細胞は、繰り返し洗浄することにより除去され得る。細胞の生存度を、実験の終了前後で測定し、そして９５％より大きい細胞生存度を有する実験からのデータのみを使用した。さらに、これらの実験で使用した条件下で、細胞接着は温度依存性であり、トリプシン処理により居住可能（ｉｎｈａｂｉｔａｂｌｅ）であり、そしてタンパク質合成または分泌のインヒビターにより影響されなかった。細胞の拡散を、膜輪郭線分析により決定し、そして細胞体積／表面積の増加に従いスコア付けした。細胞体積／表面積は変化するので、細胞の拡散は、細胞発達の変化の尺度である。いくつかの実験において、細胞の拡散を、ストレス繊維の形成によっても評価した。ストレス繊維の形成および／または細胞体積／表面積の変化は、各々、分化をしている細胞に特徴的である。各々の実験を、四連のウェルで実施し、そしてこれを３回繰り返した。
【０１２０】
（走化性）
細胞の方向付けられた移動（走化性）を、記載されるようなマルチウェル走化性チャンバーで決定する（Ｗｅｂｅｒら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６：２７１：５０９−５１２）。簡単に述べると、上部ウェルと底部ウェルを分離するポリカーボネートフィルター（孔サイズ８〜１２μｍ）を備える２ウェルの培養プレート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を、５μｇのフィブロネクチンでコーティングした。２×１０５細胞を、上部チャンバーに添加し、そして下部チャンバーにおける目的のペプチドの存在下または非存在下で３７℃にてインキュベートする。４時間後、フィルターを取り除き、メタノール中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして下部表面の種々の領域に移動した細胞を、顕微鏡を用いて計数する。ケモキネシスに対するコントロールは、上部ウェルに２００ｎｇのオステオポンチンを含む。全てのアッセイを三連で実施し、そしてこれを平均＋／−標準偏差として報告する。
【０１２１】
（走触性（ｈａｐｔｏｔａｘｉｓ））
細胞株のペプチドまたはフラグメントへの走触性を、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを用いてアッセイする。８μｍの孔サイズのポリカーボネートフィルターの下部表面または両側を、異なる量のペプチドでコーティングした。２×１０５細胞を上部チャンバーに添加し、そして下部チャンバーにおける任意の因子の非存在下で３７℃にてインキュベートする。４時間後、フィルターを取り除き、メタノール中で固定し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。下部表面に移動した細胞を、顕微鏡下で計数する。全てのアッセイを三連で実施し、そしてこれを平均＋／−標準偏差として報告する。
【０１２２】
（実施例２：Ｔｉディスクへのオステオポンチンの結合に対するＣａ＋＋イオンの効果）
漸増濃度の３５Ｓ標識したＯＰＮ（６０、２００、４００、６００μｇ）を、ＣａＣｌ２を有するチタンディスク（黒四角）または有さないチタンディスク（十字）と共に、４℃にてインキュベートした。２４時間後、非結合タンパク質を除去し、そしてＴｉディスクをＰＢＳで洗浄した。結合したＯＰＮをシンチレーション液を用いてディスクから抽出し、そして計数した。各々の実験を三連で実施し、そしてこれを平均±ＳＥＭとして報告する。
【０１２３】
外部から添加したＣａ＋＋が、ＴｉへのｒｈＯＰＮの結合に対する何らかの効果を有するか否かを調査するために、添加したＣａＣｌ２を有するＴｉディスクおよび有さないＴｉディスクへのｒｈＯＰＮの結合を測定した。図１に示されるこの結果は、添加したＣａＣｌ２の非存在下で、Ｔｉディスクは６０μｇのｒｈＯＰＮで飽和するが、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下では、Ｔｉディスクは、より多くのｒｈＯＰＮに結合し得、１１０μｇより多いタンパク質／ディスクで飽和することを実証している。
【０１２４】
（実施例３：ｒｈＯＰＮでコーティングしたＴｉ表面に対するＨＯＳ細胞の接着）
５０００個の細胞（総ｃｐｍ  １０００）を、コーティングしたＴｉディスクまたはコーティングしていないＴｉディスクのいずれかにプレートし、そして加湿雰囲気下（９５％空気５％ＣＯ２）で３７℃にてインキュベートした。３０分後、非接着細胞を除去し、そしてディスクをＰＢＳで洗浄した。細胞を１０％ＴＣＡに溶解し、そして５ｍｌシンチレーション液に可溶化した後のディスクについて放出された総ｃｐｍとして、接着細胞の総数を決定した。全ての測定を三連で実施し、そしてこれを平均±平均の標準誤差としてグラフに表した。
【０１２５】
Ｔｉ表面への細胞の接種後の最初の現象は、接種細胞の接着、移動、および増殖を含む。５０μｇのｒｈＯＰＮでコーティングしたＴｉディスクは、３０分後に、ＴｉディスクへのＨＯＳ細胞の接着を１１００％増強した（図２）。これらの結果は、細胞接着および拡散を促進する上でのオステオポンチンの役割と一致する。
【０１２６】
（実施例４：リン酸化ヒト組換えＯｐｎでコーティングしたＴｉ表面におけるＨＯＳ細胞の増殖）
細胞増殖を、ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取り込みにより決定した。３Ｈ−チミジンで標識した細胞を６時間接種し、次いでＴＣＡを用いて溶解させた。ＴＣＡ不溶物質を収集し、そして０．５Ｎ  ＮａＯＨ中に再懸濁した。ＴＣＡ不溶物質への３Ｈ−チミジンの取り込みを、細胞増殖の指標として使用した。増殖速度は、ｃｐｍ／１０００細胞／６時間として表される。コントロール群：２５４、５４、ｒｈＯＰＮ群：５６０、８３。全ての測定を三連で実施し、そしてこれを平均±平均についての標準誤差として報告する。
【０１２７】
ｒｈＯＰＮは、Ｔｉディスクへの細胞接着を促進するので、このタンパク質が、Ｔｉディスクで増殖させたＨＯＳの増殖に対する何らかの効果を有するか否かを試験することは興味深い。コーティングしたＴｉディスクまたはコーティングしていないＴｉディスクで増殖させたＨＯＳ細胞の増殖速度の測定は、ｒｈＯＰＮでコーティングしたＴｉディスクで増殖させた細胞の増殖速度が、コーティングしていないＴｉディスクで増殖させた細胞の増殖速度の約２倍である（図３）ことを示した。
【０１２８】
（実施例５：コーティングしたＴｉディスクで増殖させたＨＯＳ細胞によるオステオポンチンおよびＢＳＰの分泌）
細胞層のタンパク質および馴化培地を、１５０ボルトで４時間、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル中で電気泳動した。分離したタンパク質を、転移緩衝液中で１２Ｖにて９０分間、セミドライブロッティングによりニトロセルロースメンブレンに移した。次いで、このメンブレンをウサギ抗マウスオステオポンチンまたはウサギ抗マウスＢＳＰのいずれかと共にインキュベートした。１時間後、メンブレンを、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ１ｇ抗体と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ中での数回の洗浄工程の後、メンブレンを、ＥＣＬを用いて、製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｌｏｎｄｏｎ）により記載されている通りに発色した。
【０１２９】
オステオポンチンおよびＢＳＰをＴｉディスクまたは組換えＯｐｎでコーティングしたＴｉディスクで培養されたＨＯＳ細胞の細胞外マトリクスから溶解緩衝液を用いて抽出した。次いで、サンプルを、ゲル電気泳動のために処理した。細胞外マトリクスへのＯＰＮの分泌についてのウェスタンブロット分析は、示されるようなコーティングしていないチタンコントロールで増殖させた細胞と比較した場合、コーティングしたＴｉディスクで増殖させた細胞からのＯＰＮの増加した分泌を示した。ウェスタンブロットによるＯｐｎ発現についてのアッセイを三連で実施した。
【０１３０】
ウェスタンブロット分析により、発現されたＢＳＰの細胞外マトリクス分泌は、ｒｈＯＰＮでコーティングしたインプラントで増殖させた細胞からのオステオポンチンの産生よりも顕著でなかった。コントロール群の細胞は、骨シアロタンパク質を発現しなかった。ウェスタンブロットによるＢＳＰ発現についてのアッセイを三連により実施した。
【０１３１】
（実施例６：培養物中のヒト骨芽細胞細胞膜におけるアルカリホスファターゼ酵素活性の発現）
アルカリホスファターゼ酵素活性を、ｐニトロフェノールホスフェートを用いて、グリシン緩衝液（ｐＨ１０．２）中で決定した。細胞層を、４℃で１０分間、ＮＰ４０を含むＰＢＳで抽出した。１００μｌのアリコートを使用した。アルカリホスファターゼ活性を、（材料および方法に記載されるように）比色アッセイにより決定した。単位を、１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノール／時間を放出する酵素の量として規定した。全ての測定を三連で実施し、そしてこれを平均±平均の標準誤差として報告する。
【０１３２】
分泌されたタンパク質および細胞外マトリクスの生成は、コーティングしたディクスで増殖させた細胞と、コーティングしていないディスクで増殖させた細胞との間で異なっていたので、両方の群におけるアルカリホスファターゼのレベルを試験し、コーティングしたＴｉ表面で増殖させたＨＯＳ細胞の分化の程度を評価した。図４に表されるこの結果は、Ｔｉディスクで増殖させた細胞におけるアルカリホスファターゼ活性のレベルが、コントロール群において検出されたＡｐａｓｅのレベルに対して減少していたことを示唆する。これらの結果は、Ａｐａｓｅ活性が、骨芽細胞の成熟マトリクス生成細胞への分化に伴い減少するという観察と一致する。
【０１３３】
（実施例７：コーティングしたＴｉまたはコーティングしていないＴｉのいずれかで増殖させたＨＯＳ細胞の細胞外マトリクスの鉱化作用）
ＨＯＳ細胞を、コーティグしたチタンディスクまたはコーティングしていないチタンディスクのいずれかで増殖させた。培地にアスコルビン酸塩およびβ−グリセロールホスフェートを補充した。２週間後、培地を除去し、そして細胞を溶解させた。次いで、全ての可溶性成分を除去し、そしてカルシウム含量を、５７５ｎｍでの定量、比色測定（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃａｌｃｉｕｍ）を用いて決定した。全ての測定を三連で実施し、そしてこれを平均±平均における標準誤差として報告する。
【０１３４】
アスコルビン酸塩およびβ−グリセロールホスフェートの存在下で培養した場合、コーティングしたＴｉディスクで増殖させたＨＯＳ細胞は、プラスチック上で培養したＨＯＳ細胞と同様の様式で、２週間以内にそれらの細胞外マトリクスを鉱化した（図５）。しかし、同様の条件下でコーティングされていないＴｉディスクで培養したＨＯＳ細胞は、それらの細胞外マトリクスを鉱化しなかった。これらの結果および上記の結果は、コーティングしていないＴｉディスクで増殖させた場合、コーティングしたディスクで培養された場合よりも遅い速度でＨＯＳ細胞が接着、増殖、および分化することを示唆する。さらに、コーティングしたディスクで培養されたＨＯＳは、２週間以内に鉱化する細胞外マトリクスを合成する。いくつかの点において、ｒｈＯＰＮでコーティングしたＴｉ表面で増殖させたＨＯＳ細胞は、プラスチックディッシュで増殖させた細胞と同様の様式で発色した。
【０１３５】
（実施例８：ＯＰＮでコーティングした表面へのＨＯＳ細胞の接着）
５００個の細胞を、コーティングしたプラスチック、ガラス、またはクロモコバルトの表面にプレートし、そして加湿雰囲気下（９５％空気５％ＣＯ２）で３７℃にてインキュベートした。ヒト組換えリン酸化ＯＰＮ（ｒｈＯＰＮ）または非リン酸化ＯＰＮのいずれかを用いて表面をコーティングした。フィブロネクチンでコーティングした表面を、コントロールとして使用した。１時間後、非接着細胞を除去し、そして表面をＰＢＳで洗浄した。細胞を１０％ＴＣＡを用いて溶解し、そして５ｍｌシンチレーション液に可溶化した後の表面について放出された総ｃｐｍとして、接着細胞の総数を決定した。全ての測定を三連で実施した。この結果を、以下の表２に略述する。
【０１３６】
【表２】
2004531461.tif 000004
ＯＰＮ＝非リン酸化ＯＰＮ
ＯＰＮ−ｐ＝リン酸化ＯＰＮ
上で略述された結果は、ヒト組換えリン酸化ＯＰＮ（ｒｈＯＰＮ）が、フィブロネクチンと同一またはそれよりも高い率で細胞接着を促進したことを実証している。これらの結果は、細胞接着および拡散を促進する上でのオステオポンチンの役割と一致する。
【０１３７】
（実施例９：リン酸化ヒト組換えＯｐｎでコーティングした表面におけるＨＯＳ細胞の増殖）
細胞増殖を、ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取り込みの速度により決定した。３Ｈ−チミジンで標識した細胞を６時間接種し、次いでＴＣＡで溶解した。ＴＣＡ不溶物質を収集し、そして０．５Ｎ  ＮａＯＨ中で再懸濁した。ＴＣＡ不溶物質への３Ｈ−チミジンの取り込みを、細胞増殖の指標として使用した。増殖速度を、ｃｐｍ／１０００細胞／６時間として表した。全ての測定を三連で実施した。
【０１３８】
ｒｈＯＰＮは異なる表面への細胞接着を促進したので、このタンパク質が、これらの表面で増殖させたＨＯＳの増殖に対する何らかの効果を有するか否かを試験することは興味深い。コーティングしているかまたはコーティングしていないガラス、プラスチック、およびクロモコバルトの表面で増殖させたＨＯＳ細胞の増殖速度の測定は、ｒｈＯＰＮでコーティングした表面で増殖させた細胞の増殖速度が、コーティングしていない表面で増殖された細胞の増殖速度の少なくとも２倍であったことを示した（表３）。
【０１３９】
【表３】
2004531461.tif 000005
（実施例１０：ＴｉのｒｈＯＰＮコーティングしたインプラントのインビボでの研究）
４０のインプラント（１象限につき５）を、４本の小臼歯（ＰＭ−１〜ＰＭ−４）および１本の大臼歯（Ｍ１）を抜歯し、３ヶ月間の治癒期間を設けた後、４匹のＨａｕｎｄｅｌ／Ｌａｂｒａｄｏｒイヌに配置した。８つの中空ネジＴｉインプラントをｒｈＯＰＮを用いてコーティングした。８つのコーティングしていないインプラントをコントロールとして供した。残りのインプラントを３つのさらなる異なる分子を用いてコーティングした（研究２、研究３、および研究４として示される）。
【０１４０】
インプラントを配置する前に、ドナーのその場所からのコアサンプルを採取し、抜歯後に骨の質を組織学的に分析した。この手順により、コーティングしたインプラントおよびコーティングしていないインプラントの内部の、骨の内部成長のための中空の空間もまた確保した。４週間後および８週間後にイヌを屠殺した。
【０１４１】
インプラントを、組織学的分析のために回収した。各インプラントを垂直に切断して切片にした。中空インプラントの内部のコアを、液体窒素を用いて取り出した。脱灰した切片をパラフィンに包埋し、Ｈｅｒｏｖｉｃｈｉの技術を用いて染色して、未熟コラーゲンを成熟コラーゲンと区別した。光学顕微鏡を用いて、４×倍率および４０×倍率で、ｒｈＯＰＮコーティングインプラントとコーティングしていないインプラントとの間の組織学的差異を比較した。
【０１４２】
インビボでの結果により、コーティングインプラント周辺の骨の治癒の増強が示される。コーティングしていないインプラントは、４週間後に、顆粒組織ならびにいくつかの領域の血管新生およびマトリクス蓄積により特徴付けられる通常の骨の治癒を示す。これらの結果は、ｒｈＯＰＮコーティングしたチタンインプラントが歯科インプラント周辺の治癒時間を短縮することを実証する。
【０１４３】
（実施例１１：組換えオステオポンチン（ｒＯＰＮ）またはｍＯＣ−１０１６（配列番号１５）でコーティングしたインプラントのインビボでの研究）
チタンは、骨の形成を誘導しないので、確実にインプラントへ骨細胞を付着させる１つの方法は、これらの分子を誘引するインプラント表面を設計することである。本実施例は、オステオポンチンまたはｍＯＣ  １０１６（配列番号１５）のいずれかを用いてコーティングした歯科インプラントの骨との一体化（ｏｓｓｅｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）の増強を、イヌモデルにおいて、コーティングしていないチタンプラズマ溶射（ＴＰＳ）表面と比較して評価する。イヌモデルにより、臨床適用において一般に用いられるインプラントの設計および大きさを使用することが可能である。
【０１４４】
計１２匹のイヌにおいて、下顎小臼歯および第１大臼歯を、左右ともに抜歯した。３ヶ月の治癒期間を設けた後、６つのインプラントＴＰＳ（ＩＴＩ４．１×８ｍｍ）を各小臼歯の象限に配置した。ｒＯＰＮおよびｍＯＣ−１０１６の試験コーティング、ならびにコーティングしていないＴＰＯコントロールを用いた。試験およびコントロールを無作為に割り当てた。試験溶液は、マンニトール、スクロース、クエン酸、水およびＯＰＮならびにＯＣ−１０１６から構成した。
【０１４５】
大型犬（ｌａｒｇｅ  ｈｏｕｎｄ）を本実施例で使用した。全ての外科手術手順（抜歯、インプラント配置、抜糸）に関して、アセプロマジン（０．１ｍｇ／ｋｇ  Ｓ．Ｃ．）を用いて鎮静化させた後に、動物を、ペントバルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔｏｌ）（２０ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｖ．）を用いて麻酔した。抗生物質（バシリン  ２００，０００ｕ  Ｉ．Ｍ．）および疼痛制御のためのイブプロフェン（２００ｍｇ／イヌ／日  Ｐ．Ｏ．）を抜歯およびインプラント配置手術の間に与えた。屠殺するために、過剰用量のペントバルビタール（アセプロマジン０．１ｍｇ／ｋｇ  Ｓ．Ｃ．により鎮静化した後、５０ｍｇ／ｋｇ  Ｉ．Ｖ．）を投与した。
【０１４６】
インプラントおよびその周辺の組織をブロックに切断し、４％ホルムアルデヒド中で固定し、ＰＭＭＡ中に包埋した。インプラントの骨との一体化を、画像分析システムを用いて、外形分析により総インプラント面積に対して直接付着した（ａｐｐｏｓｅｄ）骨のパーセントとして測定した。インプラントの外径と内径との間の領域における新たに石灰化した骨の程度（パーセントにおいて）もまた決定した。
【０１４７】
４週間における骨とインプラントとの接触（ＢＩＣ）の評価により、ｒＯＰＭまたはｍＯＣ−１０１６を用いて処理したインプラントが、コーティングしていないインプラントより有意に大きなＢＩＣを有することが示された（表４）。骨とインプラントとの接触の平均パーセントは、コーティングしていないインプラント群、ｒＯＰＮ群（２００μｇ／ｍｌ）、およびｍＯＣ−１０１６群（２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および２００μｇ／ｍｌ）において、それぞれ４５．００％、６５．６％、６１．３％、６４．９％、７３．１％、および７０．３％であった。１２週間の時点で、処置群は、コーティングしていないインプラントと比較した場合、より大きな骨とインプラントとの接触を再び有した（表５）。骨とインプラントとの接触の平均パーセントは、コーティングしていないインプラント群、ｒＯＰＮ群（２００μｇ／ｍｌ）、およびｍＯＣ−１０１６群（２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および２００μｇ／ｍｌ）において、それぞれ４６．５％、６２．５％、５８．３％、５４．７％、６０．５％および５９．７％であった。ｒＯＰＮ  ２００μｇ／ｍｌは、コーティングしていないインプラントと比較した場合、１２週間で統計学的に有意に大きなＢＩＣを有した。
【０１４８】
移植して４週間後のインプラント周辺の骨密度を、表６にまとめた。骨密度の平均パーセントは、コーティングしていないインプラント群、ｒＯＰＮ群（２００μｇ／ｍｌ）、およびｍＯＣ−１０１６群（２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および２００μｇ／ｍｌ）において、それぞれ５４．５％、７０．９％、６７．８％、６９．３％、７６．９％および７２．６％であった。全ての処置の応答間の差異は、コーティングしていないインプラント群より、統計学的に有意に大きかった。１２週間での骨密度の結果により、処置群の間に統計学的有意差が示される（表７）。
【０１４９】
上記に概説したインビボでの結果により、ＯＰＮおよびｍＯＣ−１０１６がイヌモデルにおける歯科インプラントの治癒を加速させ得ることが示される。骨とインプラントとの接触の百分率は、４週間で未処理インプラントと比較して、処置群において有意に大きかった。ｒＯＰＮおよびｍＯＣ  １０１６を用いて処理した歯科インプラントは、未処理インプラントと比較して、骨密度を改善することができた。骨密度の百分率は、４週間で未処理インプラントと比較した場合、処置群において有意に大きかった。移植して１２週間後では、ＯＰＮおよびｍＯＣ−１０１６を用いて処理したインプラントは、未処理インプラントと比較した場合、有意差があった。
【０１５０】
安全性という論点もまた、処置後に血清化学、血液学、および抗体の結果を評価することにより対処した。これらの安全性評価により、ベースラインからの臨床的有意差がないことが示される。従って、ｒＯＰＮおよびＯＣ−１０１６は、これらの評価に基づいて安全である。
【０１５１】
上記に概説した結果により、リン酸化した組換えヒトオステオポンチンでの異なる表面（例えば、チタンディスク、ガラス、プラスチック、またはＣｒＣｏ）のコーティングが、コーティングしていない表面と比較した場合に、ヒト骨芽細胞株のインビトロでの接着および増殖の割合を増大させることもまた実証される。この増大は、細胞のより良好な接着および増殖、細胞外マトリクス成分の生成の増大、ならびにそのより迅速な石灰化により実証される。これらの結果はまた、インプラント周辺の骨の治癒において生じ得る分子事象の理解に寄与する。
【０１５２】
【表４】
2004531461.tif 000006
【０１５３】
【表５】
2004531461.tif 000007
【０１５４】
【表６】
2004531461.tif 000008
【０１５５】
【表７】
2004531461.tif 000009
（実施例１２：ペプチド結合および細胞の拡がり）
５０００の総ヒト前骨芽細胞を、コーティングしていないプレートまたはコーティングしたプレートのいずれかにプレートし、加湿雰囲気下（９５％空気、５％ＣＯ２）で３７℃にてインキュベートした。３０分後、接着していない細胞を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄した。接着した細胞の総数を、材料および方法において記載されるように決定した。いくつかの実験（表８において＃を付して表記される）において、種々のインテグリンに対する抗体（０．１μｇ／ｍｌ）を、プレートする前に細胞とともに１５分間にわたりインキュベートした。
【０１５６】
オステオポンチン、ｍＯＣ−１０１６（配列番号１５）、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４を用いてコーティングした場合、ヒト前骨芽細胞を用いてコーティングしたプレートは、変化をもたらさない（コーティングしていない状態）から前活性状態（この状態において、接着した細胞数、拡がりのパーセントは有意に増加する）、までの変化を受ける（表８）。表８はまた、異なるインテグリンに対する抗体を用いて、特定のインテグリンに対する結合をブロックし得ることを示す。例えば、αｖβ３インテグリンに対する抗体は、ｍＯＣ−１０１６結合を有意に減少させる（表８）。このような抗体を用いて、インビボでＯＣ−１０１６のような特定のペプチドの活性を無効にするかまたは弱め得る。
【０１５７】
表８はまた、ペプチドｍＯＣ−１０１６（配列番号１５）、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４は、各々、前骨芽細胞に結合し、コントロールより細胞接着を有意に増加させるという証拠を提供する。これらの同じペプチドはまた、「細胞の拡がり」の百分率を増大させることにより、ヒト前骨芽細胞の細胞発生を調節する。材料および方法において示したように、細胞の拡がりは、表面積に対する細胞容積の変化、および張繊維の形成により測定される。これらのような形態的特徴における変化は、細胞が有意な遺伝的変化および生化学的変化を受け、分化した表現形に向かう発生経路における次の工程に方向付けられていることを示す。
【０１５８】
【表８】
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2004531461.tif 000011
（実施例１２：オステオポンチンのＣ末端は好酸球に結合する）
白血球は３つの主なカテゴリーである、顆粒球、単球およびリンパ球に分けられる。
【０１５９】
リソソームおよび分泌小胞は、顆粒球の主な成分である。これらのオルガネラの形態および染色特性に基づくと、顆粒球は、３つの主なカテゴリーである、好中球（これは、細菌を貪食するために働く）、好塩基球（これは、ヒスタミンを分泌することにより炎症反応を助ける）および好酸球（これは、小生物を破壊し、アレルギー性炎症応答を媒介する）に分けられる。
【０１６０】
選択的結合データにより、オステオポンチンのＣ末端の５９アミノ酸を含むペプチドが、インビトロで好酸球を結合し得ることが明らかになった。配列が以下のように同定された：
【０１６１】
【化１】
2004531461.tif 000012
上記の材料および方法に記載の細胞接着および拡散アッセイを用いて、結合データを得た。
【０１６２】
このペプチドが、ＲＧＤ配列を含まないこが注目される。上記で議論されるように、インテグリンおよび他のレセプターを介した細胞外マトリクスとの相互作用は、多くの疾患における好酸球の浸潤および蓄積に重要である。ＲＧＤ配列を欠くが、配列番号１５のアミノ酸配列に対してさらなる配列類似性を有するペプチドは、このようなペプチドが、ＲＧＤ配列がインテグリンレセプターに結合するために必須であることを示唆するという以前の証拠と矛盾するので、特に興味深い。これらのようなペプチドは、上記のこのような好酸球関連疾患の処置のための治療を開発するために使用され得る。例えば、このペプチドは、細胞への結合が細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分との相互作用、従って移動を阻害するように改変され得る。
【０１６３】
（実施例１３：配列番号８（ＯＣ  １０１６）および配列番号１５（ｍＯＣ−１０１６）に対する抗体）
抗体は、多くの中で単一の標的を結合し得る非常に選択的なタンパク質である。特定の抗体の治療的使用における主な制限は、有用であるに十分な量において生成されることである。モノクローナル抗体技術の進歩は、これらの有用な診断的タンパク質および治療的タンパク質の有意な量を得るために使用される経路をもたらした。目的の抗体を、免疫応答を誘発するために、マウスに注射する。リンパ球（抗体を生成する白血球の別の型）を動物の脾臓において保存する。脾臓を取り出し、細胞を特定の骨髄腫細胞株に融合する。融合した細胞（ハイブリドーマ）は、免疫した動物からのリンパ球により特異化される抗体を生成する。これらのハイブリドーマはまた、培養中に増殖し、分裂し続け、このことにより抗体の相対的に終わりのない供給を生じるという点で、骨髄腫の特徴を保持する。
【０１６４】
このモノクローナル抗体技術は、ＯＣ−１０１６および改変ＯＣ−１０１６に対する抗体の生成を可能にした。２つのハイブリドーマ細胞株を生成して、ＯＣ−１０１６および改変ＯＣ−１０１６に対する抗体を生成し、本明細書中でＨＹＢ  １０１６（ａ）およびＨＹＢ  １０１６（ｂ）と示す。
【０１６５】
（実施例１４：オステオポンチン発現の調節）
さらに、ヒトオステオポンチンがＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターの制御下にある２つのさらなる細胞株を、樹立した。これらの細胞株は、ヒト骨芽細胞（表Ｖ）である。これらの細胞株を生成するために使用した方法は、当業者が精通しており、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を用いて行われ得る。参考文献が、このような技術を十分に示している。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓによる）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；およびＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６））を参照のこと。
【０１６６】
本明細書中で提示される細胞株を用いて、ヒトオステオポンチンの発現を調節し得る。オステオポンチンのインビボでの発現は変化し、線維芽細胞を移動させることにおけるその存在は、その発現パターンの理解をなおさらに複雑にしている。Ｚｏｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７０：８８−１００。
【０１６７】
オステオポンチンは、発生的に調節された遺伝子の発現を調節することにおいて間接的になお重要な役割を果たすことは明らかである。オステオポンチンの発現が高レベルで構成的である骨芽細胞株を提供することにより、例えば、発生的に重要なリガンドのこの発現の、骨芽細胞の骨細胞および内層細胞（ｌｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ）への発生に対する効果を決定し得る。一旦これが決定されると、治療が開発されて、骨の再モデリングおよび歯周病に関連する論点に取り組まれる。隣接する細胞により生成され、分泌されるオステオポンチンを発現することにより、インビボでの細胞分化／発生をさらに調節し得る。このようなオステオポンチンの発現可能な構築物を有する細胞の例は、前骨芽細胞、腫瘍細胞、マクロファージ、骨膜細胞、内皮細胞、上皮細胞、好酸球、幹細胞、骨芽細胞、骨細胞、セメント質細胞（ｃｅｍｅｎｔｏｂｌａｓｔ）、線維芽細胞、制限された潜在的前駆細胞、前駆細胞、方向付けされた前駆細胞、および分化した細胞である。
【０１６８】
当業者は、オステオポンチンの発現が、ＣＭＶプロモーターにより駆動される構成的発現に限定されないことを認識する。オステオポンチンの発現はまた、多数の利用可能な異種調節可能プロモーターを有する核酸構築物を用いて調節され得る。異種は、ネイティブのオステオポンチンプロモーター以外の任意のプロモーターを記載するために用いられる。本明細書中に記載される２つの細胞株は、ＨＯＢＯＰ１（クローンＩａ−ＣＭＶプロモーターの制御下でｈＯＰＮ１ａを発現するヒト骨芽細胞）およびＨＯＢＯＰ１（クローン２ａ−ＣＭＶプロモーターの制御下でｈＯＰＮ１ａを発現するヒト骨芽細胞）といわれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、チタンディスクへのオステオポンチンの結合に対する、Ｃａ＋＋イオンの効果を示すグラフである。
【図２】
図２は、チタンへの細胞付着に対する、ｒｈＯＰＮの効果を示す棒グラフである。
【図３】
図３は、細胞増殖に対する、チタンに結合したｒｈＯＰＮの効果を示す棒グラフである。
【図４】
図４は、コーティングされたチタンおよびコーティングされていないチタンに対する、細胞のアパーゼ（Ａｐａｓｅ）活性を示す棒グラフである。
【図５】
図５は、ヒト骨芽細胞培養物の無機質含有量を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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