(57)【要約】本発明は、新規ポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、ならびに新規ヒトおよびマウス分泌幹細胞成長因子様ポリペプチドに相当するそれらの突然変異体または変異体を提供する。これらのポリヌクレオチドは、マウス骨髄、およびヒト胎児肝臓、脾臓、卵巣、成人脳、肺腫瘍、脊髄、頸部、卵巣、内皮細胞、臍帯、胎盤、リンパ球、肺線維芽細胞、胎児脳、および精巣から調製されるｃＤＮＡライブラリーから単離した核酸配列を含む。本発明の他の態様としては、新規ヒト分泌幹細胞成長因子様ポリペプチド、およびかかるポリペプチドに特異的な抗体を生産するプロセスを含有するベクターが挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞成長因子の活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号２７、２９、３３、３７、もしくは３９、それらの翻訳されるタンパク質をコードする部分、それらの成熟タンパク質をコードする部分、それらの細胞外部分、またはそれらの活性ドメインからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
生物活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項３】
生物活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、請求項１に記載のポリヌクレオチドと約９０％を超える配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＤＮＡ配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作した宿主細胞。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは、前記宿主細胞において前記ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に結合している、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号２８、３０、３１、３２、３４、３８、または４０、それらの翻訳されるタンパク質をコードする部分、それらの成熟タンパク質をコードする部分、それらの細胞外部分、またはそれらの活性ドメインからなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチド、およびキャリアを含む組成物。
【請求項１２】
配列番号２８、３０、３１、３２、３４、３８、または４０からなる群から選択されるポリペプチド配列由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含む、幹細胞成長因子様活性を有するポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２８、３０、３１、３２、３４、３８、または４０からなる群から選択されるポリペプチド配列由来の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３に記載するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１０に記載するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１０に記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項１８】
試料中の、請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する方法であって：
ａ）該試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドに結合して、該ポリヌクレオチドとの複合体を形成する化合物と、該複合体を形成するのに十分な期間接触させ、
ｂ）該複合体を検出し、もし複合体が検出される場合、請求項１に記載のポリヌクレオチドが検出されること
を含む方法。
【請求項１９】
試料中の、請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する方法であって：
ａ）該試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１に記載のポリヌクレオチドにアニーリングする核酸プライマーと、かかる条件下で接触させ、
ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む産物を増幅し、そして
ｃ）前記産物、およびそれによって該試料中の請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出すること
を含む方法。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子を含み、前記方法はアニーリングされたＲＮＡ分子を、ｃＤＮＡポリヌクレオチドへ逆転写することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料中の、請求項１０に記載のポリペプチドを検出する方法であって：
ａ）該試料を、前記ポリペプチドに結合して、該ポリペプチドとの複合体を形成する化合物と、該複合体を形成するのに十分な条件下で、そして十分な期間接触させ、そして
ｂ）該複合体の構造を検出し、もし複合体の構造が検出される場合、請求項１１に記載のポリペプチドが検出されこと
を含む方法。
【請求項２２】
請求項１１に記載のポリペプチドに結合する化合物を特定する方法であって：
ａ）該化合物を、請求項１０に記載のポリペプチドと、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な条件下で、そして十分な期間接触させ、そして
ｂ）該化合物を検出し、もし該ポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が特定されること
を含む方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物を特定する方法であって：
ａ）細胞において、該化合物を、請求項１０に記載のポリペプチドと、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な期間接触させ（ここで、該複合体は、細胞においてレポーター遺伝子の発現を駆動する）、そして
ｂ）レポーター遺伝子配列の発現を検出することにより該複合体を検出し、もし該ポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が特定されること
を含む方法。
【請求項２４】
幹細胞成長因子様ポリペプチドを生産する方法であって：
ａ）請求項８に記載の宿主細胞を、前記細胞において該ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で培養し、そして
ｂ）工程（ａ）の細胞培養物または細胞から、該ポリペプチドを単離することを含む方法。
【請求項２５】
請求項１０に記載のポリペプチドを含むキット。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または表面に結合させた請求項１に記載のポリヌクレオチドの特有のセグメントを含む核酸アレイ
【請求項２７】
前記アレイは、請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項１に記載のポリヌクレオチドの特有のセグメントに対する完全なマッチを検出する、請求項２６に記載のアレイ。
【請求項２８】
前記アレイは、請求項１に記載のポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドの特有のセグメントに対するミスマッチを検出する、請求項２６に記載のアレイ。
【請求項２９】
請求項１０に記載の幹細胞成長因子様ポリペプチドの増大した活性または発現を必要とする被験体の治療方法であって：
（ａ）治療的量の、前記ポリペプチドのアゴニスト、
（ｂ）治療的量の、前記ポリペプチド、および
（ｃ）治療的量の、該ポリペプチドが生産される形態かつ条件下にある前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される組成物、ならびに薬学的に許容可能なキャリアを、該被験体に投与することを含む方法。
【請求項３０】
請求項１０に記載の幹細胞成長因子様ポリペプチドの活性または発現を阻害することが必要な被験体の治療方法であって：
（ｄ）治療的量の、前記ポリペプチドのアンタゴニスト、
（ｅ）治療的量の、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチド、および
（ｆ）治療的量の、該幹細胞成長因子様ポリペプチドと、そのリガンドに関して競合するポリペプチド
からなる群から選択される組成物、ならびに薬学的に許容可能なキャリアを、該被験体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年１２月２３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／３５２６０号の一部継続出願である。
【０００２】
［背景］
１．１  技術分野
本発明は、新規ポリヌクレオチド、およびかかるポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、また例えば治療方法、診断方法および研究方法におけるこれらのポリヌクレオチドおよびタンパク質に関する使用を提供する。特に、本発明は、新規幹細胞成長因子様ポリペプチドに関する。
【０００３】
１．２  背景技術
特定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列には、例えば、診断法、法医学、遺伝子マッピング、遺伝病または他の形質の原因となる突然変異の特定において、生物学的多様性を評価するために、またＤＮＡおよびアミノ酸配列に依存する多くの他のタイプのデータおよび産物を生じるために、数多くの用途がある。タンパク質は、例えば、リーダー配列クローニングの場合ではそれらの分泌された性質によって、ＰＣＲベースの技法の場合にはそれらの細胞または組織源によって、あるいは既知の生物活性を有する他の遺伝子に対する構造的類似性によって、生物活性を有することが知られている。本発明は、これらのポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドに関するものである。特に、本発明は、新規幹細胞成長因子様ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。
【０００４】
幹細胞は、無制限または長期の自己複製の能力を有する細胞であるとして定義され、少なくとも１つの型の高度に分化された子孫を生じることができる。幹細胞とその最終的に分化された子孫との間には、限られた能力および制限された分化潜在能力を有するコミットした（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆体の中間集団が存在すると考えられる［Ｗａｔｔ ａｎｄ Ｈｏｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８７：１４２７−１４３０ （２０００）］。胚幹細胞の分裂および分化は、多細胞生物のすべての分化した細胞および臓器で起きる。造血細胞のような最終的に分化した細胞集団を補充するために、幹細胞の貯蔵は、生物の成年期中に維持される。成体幹細胞は、胚幹細胞に由来するものであり、分化に関して限られた能力のみを有すると一般に考えられる。概して幹細胞は、既定の分化経路にそれらを誘導するどころか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養および維持するのは極めて困難であった。
【０００５】
しかしながら、近年、新たな研究により、成体幹細胞が、分化に関して、これまで考えられてきたよりも相当広い潜在能力を有することがわかってきた。照射宿主において移植された場合の成体神経幹細胞は、骨髄に集まり（ｐｏｐｕｌａｔｅ）、骨髄性細胞、リンパ系細胞、および初期造血細胞を生じることが可能であることがわかった［Ｂｊｏｒｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８３：５３４−５３７ （１９９９）］。また、研究者等は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト胚幹細胞を初めて培養することができた。下記著者等は、ヒト胚盤胞細胞は、長期間にわたって培養することが可能であり、多種多様の細胞型に分化することができることを示した［Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８２：１１４５−１１４７ （１９９８）］。この結果は、臓器不全および変性性疾患の治療のための、同種移植および臓器再生の利用の道を開いた。幹細胞上の複数の受容体と、可溶性および間質性の細胞により発現される因子との正確な相互作用が、幹細胞を分裂させ、分化にコミットさせるのに必要とされる。因子を供給する組織ニッチ（ｎｉｃｈｅ）および微小環境が最も重要であることが明らかになってきた。ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７のようなサイトカイン、ならびにｆｌｔ−３、エリスロポエチン、および幹細胞因子のような可溶性タンパク質はすべて、特定の経路により分化を達成するために呼応して作用することがわかっている。成長因子、サイトカイン、および組織局在化の正確な組合せは、種々の分化した幹細胞の集団を生じ得ると考えられる。
【０００６】
したがって、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、胚幹細胞および成体幹細胞の分化を誘導して、種々の細胞型を生じさせるのに使用してもよい。それらはまた、白血病、血友病、およびアルツハイマー病のような変性疾患の治療に使用してもよい。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはさらに、移植組織を必要とする患者の助けとなり得る新たな組織および臓器を生成するのに利用してもよい。
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、新規幹細胞成長因子様ポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする新規単離ポリヌクレオチド（組換えＤＮＡ分子、それらのクローニングした遺伝子または縮重変異体（特に対立遺伝子変異体のような天然に存在する変異体）、アンチセンスポリヌクレオチド分子を含む）、およびかかるペプチド上に存在する１つまたはそれより多いエピトープを特異的に認識する抗体、ならびにかかる抗体を産生するハイブリドーマの発見に基づいている。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、マウス大腿部骨、およびヒト胎児肝臓、脾臓、卵巣、成人脳、肺腫瘍、脊髄、頸部、卵巣、内皮細胞、臍帯、胎盤、リンパ球、肺線維芽細胞、胎児脳、および精巣から調製されるｃＤＮＡライブラリーから単離したポリヌクレオチドに基づいている。本発明の組成物はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターのようなベクター、かかるポリヌクレオチドを含有するように遺伝子操作した細胞、およびかかるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現するように遺伝子操作した細胞を含む。
【０００８】
本発明の組成物は、配列番号２７、２９、３３、３７、または３９に記載されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、またはそれらの断片、それらの完全長タンパク質コード配列を含むポリヌクレオチド（例えば、配列番号２８、配３０〜３２、３４、３８、または４０）、およびそれらの成熟タンパク質コード配列のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、（ａ）配列番号２７、２９、３３、３７、または３９に記載されるヌクレオチド配列のいずれかの相補体にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号２３、２５、２８、３０〜３２、３４〜３５、３８、または４０のいずれかをコードするヌクレオチド配列、上記ポリヌクレオチドに少なくとも７０％ポリヌクレオチド配列同一性を有する上述の任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチド、上述のポリペプチドのいずれかの種相同体（例えば、オルソログ）をコードするポリヌクレオチド、または配列番号２３、２５、２８、３１、３８、または４０を含むポリペプチドの特定のドメインまたは切断型を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
本出願で使用する場合のコレクションは、たった１つのポリヌクレオチドの収集であり得る。配列情報または各配列の特有の特定用情報のコレクションは、核酸アレイ上で提供され得る。一実施形態では、配列情報のセグメントが、核酸アレイ上で提供され、このセグメントを含有するポリヌクレオチドを検出する。上記アレイは、このセグメントを含有するポリヌクレオチドに対する完全マッチまたはミスマッチを検出するように設計され得る。コレクションはまた、コンピュータ可読フォーマットで提供することができる。
【００１０】
本発明はさらに、上述のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含むクローニングまたは発現ベクター、およびこれらの発現ベクターで形質転換した宿主細胞または生物を提供する。有用なベクターとしては、当該技術分野で既知のプラスミド、コスミド、λファージ誘導体、ファージミド等が挙げられる。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド含むベクター、および上記ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。概して、ベクターは、少なくとも１種の生物で機能的な複製起点、利便性のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞に関する選択マーカーを含有する。本発明によるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシーケンシングベクターが挙げられる。本発明による宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得、そして、単細胞生物、または多細胞生物の一部であり得る。
【００１１】
本発明の組成物は、配列番号２８、３０〜３２、３４、３８、または４０のアミノ酸配列、および／または相当する完全長もしくは成熟タンパク質を含むか、またはそれらからなる群から選択される単離ポリペプチドを含むが、これらに限定されないポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドはまた、（ａ）配列番号２７、２９、３３、３７、または３９に記載されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドのいずれか、または（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、生物活性を有するポリペプチドを含む。生物活性または免疫学的活性を保持する、配列番号２８、３０〜３２、３４、３８、または４０として列挙されるタンパク質配列およびそれらの実質的等価体のいずれかの生物学的または免疫学的に活性な変異体も意図される。本発明のポリペプチドは、全体的または部分的に化学的に合成してもよいが、好ましくは本発明の遺伝子操作細胞（例えば、宿主細胞）を用いた組換え手段により生産される。
【００１２】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、および親水性（例えば、薬学的に許容可能な）キャリアのような許容可能なキャリアを含んでもよい。本発明はまた、所望のポリペプチドの発現を可能にする条件下で、適切な細胞培地中で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養することと、その培養物もしくは宿主細胞からタンパク質またはペプチドを精製することとを含む、本発明のポリペプチドを生産する方法に関する。好ましい実施形態としては、かかるプロセスにより生産されるタンパク質がタンパク質の成熟形態である実施形態が挙げられる。
【００１３】
本発明によるポリヌクレオチドには、分子生物学の技術分野の当業者に既知の様々な技法における多数の用途がある。これらの技法は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲ用のオリゴマーまたはプライマーとしての使用、アレイにおける使用、コンピュータ可読媒体における使用、染色体および遺伝子マッピングのための使用、タンパク質の組換え生産における使用、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、それらの化学的類似体の生成における使用等を含む。例えば、ｍＲＮＡの発現が特定の細胞または組織型に大きく制限される場合、本発明のポリヌクレオチドは、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて試料中の特定の細胞または組織ｍＲＮＡの存在を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
【００１４】
他の例示的実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現遺伝子を同定するための発現配列タグ（ＥＳＴ）として、あるいは当該技術分野で既知であり、Ｖｏｌｌｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５８：５２−５９ （１９９２）により例示されるように、ヒトゲノムのフィジカルマッピング用の発現配列タグとして、診断学において使用される。
【００１５】
本発明によるポリペプチドは、他のタンパク質に一般に適用される様々な従来の手順および方法で使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、このポリペプチドに特異的に結合する抗体を生成するのに使用することができる。かかる抗体、特にモノクローナル抗体は、組織中のポリペプチドを検出または定量化するのに有用である。本発明のポリペプチドはまた、分子量マーカーとして、また食品サプリメントとして使用することができる。
【００１６】
治療上有効な量の、本発明のペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を、哺乳動物被験体に投与する工程を含む、本発明のポリペプチドの大量の発現／活性に関連した医療状態を防止、治療または回復する方法も提供される。
【００１７】
特に、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、胚幹細胞および成体幹細胞の分化を誘導して、種々の細胞型を生じるのに使用してもよい。それらはまた、白血病、血友病、およびアルツハイマー病のような変性疾患などの疾患の治療に使用してもよい。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはさらに、移植組織を必要とする患者の助けとなり得る新たな組織および臓器を生成するのに利用してもよい。
【００１８】
本発明の方法はまた、治療上有効な量の、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を、上述の障害に関連した症状または傾向を示す哺乳動物被験体に投与することを含む、上述の障害の治療方法を提供する。さらに、本発明は、標的遺伝子産物の活性全体を調節する化合物および他の物質、ならびに薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与する工程を含む、上述の疾患または障害の治療方法を含む。化合物および他の物質は、標的遺伝子／タンパク質発現または標的タンパク質活性のレベルに対するかかる調節を達成することができる。具体的には、治療上有効な量の、本発明のポリペプチドを含む組成物、または治療上有効な量の、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドの結合パートナー（例えば、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドに対して特異的に反応性を有する抗体）を含む組成物を、ヒトを含むが、これに限定されない哺乳動物被験体に投与することを含む、ウイルス疾患を含む医療状態を防止、治療または回復する方法が提供される。特定の状態または病状の機構は、本発明のポリペプチドまたはこれらの結合パートナー（または阻害剤）が、治療を必要とする個体に有益であるかどうかに影響する。
【００１９】
この方法によれば、本発明のポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞機能の阻害をもたらすために投与することができる。本発明のポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、単独で、または他の療法に付随して、投与することができる。反対に、本発明のタンパク質または他の有効成分は、特定の作用物質の配合物中に含まれて、かかる作用物質の副作用を最低限に抑えてもよい。
【００２０】
本発明はさらに、上述の方法において有用な薬剤を製造する方法を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、試料（例えば、組織または試料）中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在を検出する方法に関する。かかる方法は、例えば、上述の障害の予後および診断評価の一部として、またかかる状態に対する素因を示す被験体の特定のために利用することができる。
【００２２】
本発明は、試料中の本発明のポリペプチドを検出する方法を提供し、試料は、本発明のポリペプチドに結合して、このポリペプチドとの複合体を形成する化合物と、複合体を形成するのに十分な条件下で、かつ十分な期間接触させ、この複合体の構造を検出し、もし複合体が形成される場合、本発明のポリペプチドが検出される。
【００２３】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための、ポリヌクレオチドプローブおよび／またはモノクローナル抗体、および任意には定量標準物質を含むキットを提供する。さらに、本発明は、上述の障害の治療のための臨床試験に関与した、薬剤の有効性を評価する方法、および患者の経過をモニタリングする方法を提供する。
【００２４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現あるいは活性を調節（例えば、増加または減少）する化合物の特定方法を提供する。かかる方法は、例えば、本明細書中に記載するような障害の症状を回復することができる化合物の特定のために利用することができる。かかる方法としては、本発明のポリペプチドと相互作用する（例えば、本発明のポリペプチドに結合する）化合物および他の物質を特定するためのアッセイを挙げることができるが、これに限定されない。
【００２５】
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物を特定する方法を提供し、化合物は、本発明のポリペプチドと、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な条件下で、かつ十分な期間接触させ、この複合体を検出し、もしポリペプチド／化合物複合体複合体が検出される場合、ポリヌクレオチドに結合する化合物が特定される。
【００２６】
また、ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法が提供され、細胞において、化合物を、ポリヌクレオチドと、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な期間接触させ（ここで、複合体は、細胞においてレポーター遺伝子配列の発現を駆動する）、レポーター遺伝子配列発現を検出することによりこの複合体を検出し、もしポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、このポリペプチドに結合する化合物が特定される。
【００２７】
［発明の詳細な説明］
配列番号２８の幹細胞成長因子様ポリペプチドは、グリコシル化されていない予測される分子質量およそ５９．２ｋＤａを有するおよそ５２９個のアミノ酸タンパク質である。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いたタンパク質データベース検索［Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．， ３６：２９０−３００（１９９３）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１：４０３−１０ （１９９０）、参照により本明細書に援用される］は、配列番号２８が、腫瘍内皮マーカー７前駆タンパク質に相同的であることを示す。
【００２８】
図２は、幹細胞成長因子様ポリペプチド配列番号２８によりコードされるタンパク質と、腫瘍内皮マーカー７前記タンパク質配列番号３６［Ｓｔ． Ｃｒｏｉｘ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９：１１９７−１２０１］との間のＢＬＡＳＴＸアミノ酸配列アラインメントを示し、２つの配列が、４４１個のアミノ酸残基にわたって７２％類似性、および同じ４４１個のアミノ酸残基にわたって５７％同一性を共有することを示している。
【００２９】
予測されるおよそ３０残基のシグナルペプチドは、配列番号２８のコードされたおよそ残基１〜残基３０である（シグナルペプチドは、配列番号３０に記載される）。細胞外部分は、それ自体で有用である。これは、哺乳動物細胞での発現および切断産物のシーケンシングにより確認することができる。シグナルペプチド領域は、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ１．１プログラム［Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｎｅｕｒ． Ｓｙｓｔ． ８：５８１ （１９９７）］（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋから）、およびＫｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアルゴリズム［Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５ （１９８２）］を用いた疎水性解析を用いて予測された。切断部位は、コンピュータプログラムにより予測されるのと異なり得ることが当業者に理解されよう。配列番号３１は、シグナルペプチドが配列番号２８から除去される場合に生じるペプチドである。
【００３０】
予測されるおよそ２８残基の膜貫通領域は、配列番号２８のコードされたおよそ残基４５２〜残基４７９であり（膜貫通領域は、配列番号３２に記載される）、それは、哺乳動物細胞における発現により確認され得る。膜貫通領域は、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ１．１プログラム［Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｎｅｕｒ． Ｓｙｓｔ． ８：５８１ （１９９７）］（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋから）、およびＫｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアルゴリズム［Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５ （１９８２）］を用いた疎水性解析を用いて予測された。膜貫通領域は、コンピュータプログラムにより予測されるのと異なり得ることが当業者に理解されよう。
【００３１】
配列番号２５の幹細胞成長因子様ポリペプチド（配列番号２３と同一）は、グリコシル化されていない予測される分子質量およそ５０ｋＤａを有するおよそ３９２個のアミノ酸タンパク質である。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いたタンパク質データベース検索［Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．， ３６：２９０−３００（１９９３）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１：４０３−１０ （１９９０）、参照により本明細書に援用される］は、配列番号２５が、腫瘍内皮マーカー７前駆タンパク質に相同的であることを示す。
【００３２】
予測されるおよそ２８残基の膜貫通領域は、配列番号２５のコードされたおよそ残基３１５〜残基３４２である（配列番号３２）。それは、哺乳動物細胞における発現により確認され得る。膜貫通領域は、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ１．１プログラム［Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｎｅｕｒ． Ｓｙｓｔ． ８：５８１ （１９９７）］（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋから）、およびＫｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアルゴリズム［Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５ （１９８２）］を用いた疎水性解析を用いて予測された。膜貫通領域は、コンピュータプログラムにより予測されるのと異なり得ることが当業者に理解されよう。
【００３３】
特に、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、胚幹細胞および成体幹細胞の分化を誘導して、種々の細胞型を生じるのに使用してもよい。それらはまた、白血病、血友病、およびアルツハイマー病のような変性疾患の治療に使用してもよい。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはさらに、移植組織を必要とする患者の助けとなり得る新たな組織および臓器を生成するのに利用してもよい。
【００３４】
４．１定義
本明細書中および併記の特許請求の範囲で使用される場合、単数形は、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数の言及を含む。
【００３５】
「活性」という用語は、任意の天然に存在するポリペプチドの生物活性および／または免疫学的活性を保持するポリペプチドの形態を指す。本発明によれば、「生物学的に活性な」または「生物活性」という用語は、天然に存在する分子の構造的機能、調節機能もしくは生化学的機能を有するタンパク質またはペプチドを指す。同様に、「生物学的に活性な」または「生物活性」はまた、天然、組換えまたは合成幹細胞成長因子様ペプチド、あるいはそれらの任意のペプチドの、適切な動物または細胞において特定の生物学的応答を誘導し、特定の抗体と結合する能力を指す。「幹細胞成長因子様生物活性」という用語は、本明細書中に記載するような幹細胞成長因子様の生物活性に類似した生物活性を指す。
【００３６】
本明細書で使用する場合「活性化細胞」という用語は、正常プロセスまたは疾患プロセスの一部として、分泌分子または酵素分子の搬出を含む、細胞外または細胞内膜輸送に携わる細胞を指す。
【００３７】
「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成によるポリヌクレオチドの天然結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）を指す。例えば、配列５’−ＡＧＴ−３’は、相補配列３’−ＴＣＡ−５’に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合するような「部分的」であってもよく、あるいは、相補性は、全相補性が一本鎖分子間に存在するような「完全な」ものであってもよい。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を及ぼす。
【００３８】
「胚幹細胞（ＥＳ）」という用語は、生殖細胞を含む、胚または成体において多くの分化した細胞型を生じることができる細胞を指す。「生殖細胞系幹細胞（ＧＳＣ）」という用語は、配偶子の産生用の生殖細胞の安定かつ連続した供給源を提供する始原幹細胞由来の幹細胞を指す。「始原幹細胞（ＰＧＣ）」という用語は、生殖細胞および他の細胞に分化する潜在能力を有する、特に胚形成中の卵黄嚢、腸間膜、または生殖隆起に由来する他の細胞系譜から除外された細胞の小集団を指す。ＰＧＣは、ＧＳＣおよびＥＳ細胞が由来する供給源である。ＰＧＣ、ＧＳＣ、およびＥＳ細胞は、自己複製が可能である。したがって、これらの細胞は、生殖細胞系を集合させ、成体の分化した臓器を含む複数の最終的に分化した細胞を生じるだけでなく、それ自体再生することが可能である。「全能性」という用語は、成体生物の細胞型のすべてに分化する、細胞の能力を指す。「多能性」という用語は、成体生物中に存在する多数の分化細胞型に分化する、細胞の能力を指す。多能性細胞は、全能性細胞と比較して、その分化能が制限されている。
【００３９】
「発現調整断片」、すなわちＥＭＦという用語は、作動可能に連結されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または別のＥＭＦの発現を調整する一連のヌクレオチドを意味する。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、配列の発現がＥＭＦの存在により変更される場合、配列は、「作動可能に連結された配列の発現を調整する」と言われる。ＥＭＦとしては、プロモーター、およびプロモーター調節配列（誘導要素）が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＭＦの１つの種類は、特定の調節因子または生理学的事象に応答して、作動可能に連結されたＯＲＦの発現を誘導する核酸断片である。
【００４１】
「ヌクレオチド配列」または「核酸」または「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列を指す。これらの語句はまた、一本鎖であっても、もしくは二本鎖であってもよく、またセンスもしくはアンチセンス鎖を表し得るゲノムまたは合成起源のＤＮＡあるいはＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、あるいは任意のＤＮＡ様またはＲＮＡ用物質を指す。配列では、Ａはアデニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｇはグアニンであり、Ｔはチミンである一方で、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである。ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、本明細書中の配列中のＴ（チミン）は、Ｕ（ウラシル）で置き換えてもよいことが意図される。一般に、本発明により提供される核酸セグメントは、微生物もしくはウイルスオペロン、または真核生物遺伝子に由来する調節要素を含む組換え転写ユニットにおいて発現されることが可能な合成核酸を提供するために、ゲノムの断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、あるいは一連のオリゴヌクレオチドから、または個々のヌクレオチドから構築されてもよい。
【００４２】
「オリゴヌクレオチド断片」または「ポリヌクレオチド断片」、「一部」、または「セグメント」または「プローブ」または「プライマー」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも約５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７個のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約９個のヌクレオチド、よりいっそう好ましくは少なくとも約１１個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約１７個のヌクレオチドであるヌクレオチド残基を有する配列を指す。断片は、好ましくは約５００個未満のヌクレオチド、好ましくは約２００個未満のヌクレオチド、より好ましくは約１００個未満のヌクレオチド、さらに好ましくは約５０個未満のヌクレオチド、最も好ましくは約３０個未満のヌクレオチドである。好ましくは、プローブは、約６個のヌクレオチド〜約２００個のヌクレオチド、好ましくは約１５個〜約５０個のヌクレオチド、より好ましくは約１７個〜３０個のヌクレオチド、最も好ましくは約２０個〜約２５個のヌクレオチドである。好ましくは、断片は、ｍＲＮＡもしくはＤＮＡ分子の同一または関連部分を同定あるいは増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、様々なハイブリダイゼーション手順、あるいはマイクロアレイ手順で使用することができる。断片またはセグメントは、本発明の各ポリヌクレオチド配列を一意的に特定し得る。好ましくは、断片は、配列番号２７、２９、２２、３７、または３９の一部に実質的に類似している配列を含む。
【００４３】
プローブは、例えばＷａｌｓｈ等［Ｗａｌｓｈ， Ｐ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ １：２４１−２５０ （１９９２）］に記載されるように、特定ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ分子が、細胞または組織に存在しているかどうかを確定するのに、あるいは染色体ＤＮＡから同様の核酸配列を単離するのに使用することができる。プローブは、ニックトランスレーション、クレノウフィルイン反応、ＰＣＲ、または当該技術分野で既知の他の方法より標識してもよい。本発明のプローブ、それらの調製および／または標識は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ、またはＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ（ともにそれらの全体が、参照により本明細書に援用される）に詳述されている。
【００４４】
本発明の核酸配列はまた、配列番号２７、２９、３３、３７、または３９の核酸配列のいずれかからの配列情報を含む。配列情報は、配列番号２７、２９、３３、３７、または３９の配列情報を一意的に特定するか、または配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のセグメントであり得る。２０量体がヒトゲノムにおいて完全に適合される確率は、１／３００であるため、１つのかかるセグメントは、２０量体核酸配列であり得る。ヒトゲノムでは、染色体一組中に３０億の塩基対が存在する。４２０個の考え得る２０量体が存在するため、一組のヒト染色体に塩基対が存在するよりも、３００倍多い２０量体が存在する。同じ分析を使用すると、ヒトゲノムにおいて完全に適合されるべき１７量体に関する確率は、約１／５である。これらのセグメントを発現研究用のアレイで使用する場合、１５量体セグメントを使用することができる。発現される配列が全ゲノム配列のおよそ５％未満を含むことから、１５量体が発現される配列において完全に適合される確率もまたおよそ１／５である。
【００４５】
同様に、一個のミスマッチの検出に関する配列情報を使用する場合、セグメントは２５量体であり得る。一個のミスマッチを有する２５量体がヒトゲノムに現れる確率は、完全マッチに関する確率（１÷４２５）と各ヌクレオチド位置でのミスマッチに関する増加した確率（３×２５）を乗算することにより算出される。一個のミスマッチを有する１８量体を発現研究用のアレイで検出することができる確率は、およそ１／５である。一個のミスマッチを有する２０量体がヒトゲノムで検出することができる確率は、およそ１／５である。
【００４６】
「オープンリーディングフレーム」、すなわちＯＲＦという用語は、１つの終止コドンを有するアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレットを意味し、タンパク質に翻訳が可能な配列である。
【００４７】
「作動可能に連結される」または「作動可能に結合される」という用語は、機能的に関連した核酸配列を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、プロモーターは、コード配列と作動可能に結合されるか、または作動可能に連結される。作動可能に連結される核酸は連続的であり、同じリーディングフレームにあり得え、ある一定の遺伝子要素（例えば、リプレッサー遺伝子）は、コード配列に連続的に連結されないが、コード配列の転写／翻訳を依然として制御する。
【００４８】
「多能性」という用語は、成体生物に存在する多数の分化した細胞型に分化する、細胞の能力を指す。多能性細胞は、全能性細胞と比較して、その分化能力において制限される。
【００４９】
「ポリペプチド」または「ペプチド」または「アミノ酸配列」という用語は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列もしくはそれらの断片を指し、天然に存在する分子または合成分子を指す。ポリペプチド「断片」、「一部」、または「セグメント」は、少なくとも約５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約７個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約９個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも１７個またはそれ以上のアミノ酸を有する一続きのアミノ酸残基である。ペプチドは好ましくは、約２００個以下のアミノ酸、より好ましくは約１５０個未満のアミノ酸、最も好ましくは約１００個未満のアミノ酸である。好ましくはペプチドは、約５個〜約２００個のアミノ酸である。活性であるために、いかなるポリペプチドも、生物学的および／または免疫学的活性を示すのに十分な長さを有さなくてはならない。
【００５０】
「天然に存在するポリペプチド」という用語は、遺伝子操作されていない細胞により産生されるポリペプチドを指し、具体的にアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、およびアシル化を含むが、これらに限定されないポリペプチドの翻訳後修飾から生じる様々なポリペプチドを意図する。
【００５１】
「翻訳タンパク質コード部分」という用語は、任意のリーダー配列またはプロセシング配列を含み得る完全長タンパク質をコードする配列を意味する。
【００５２】
「成熟タンパク質コード配列」という用語は、任意のリーダー／シグナル配列のないペプチドまたはタンパク質をコードする配列を指す。「成熟タンパク質部分」は、リーダー／シグナル配列のないタンパク質の一部を指す。ペプチドは、細胞におけるプロセシング中に除去されるリーダー配列を有してもよく、あるいはタンパク質は、合成的に、あるいは成熟コード配列のみをコードするポリヌクレオチドを用いて産生してもよい。成熟タンパク質部分は、開始メチオニン残基を含んでも含まなくてもよいことが意図される。開始メチオニンは、多くの場合、ペプチドのプロセシング中に除去される。
【００５３】
「誘導体」という用語は、ヒトタンパク質では通常起こらない、ユビキチン化、標識（例えば、放射性核種または様々な酵素を用いて）、ペグ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）のような共有結合的ポリマー結合、およびオルニチンのようなアミノ酸の化学合成による挿入または置換のような技法により化学的に修飾されたポリペプチドを指す。
【００５４】
「変異体」（または「類似体」）という用語は、例えば組換えＤＮＡ技法を用いて創出される、アミノ酸挿入、欠失、および置換において、天然に存在するポリペプチドと異なる任意のポリペプチドを指す。所定の活性を損なうことなくどのアミノ酸残基が置換、付加、または欠失され得るかを決定する方法は、特定のポリペプチドの配列を相同ペプチドの配列と比較して、高い相同性の領域に生じたアミノ酸変化の数を最小限に抑えることによって、あるいはアミノ酸をコンセンサス配列で置換することによって見出され得る。
【００５５】
あるいは、これらの同じポリペプチドまたは類似のポリペプチドをコードする組換え変異体は、遺伝暗号における「重複性」を利用することにより合成または選択され得る。様々な制限部位を生じるサイレント変更のような様々なコドン置換は、プラスミドもしくはウイルスベクターへのクローニングまたは特定の原核生物系または真核生物系における発現を最適化するように導入され得る。ポリヌクレオチド配列における突然変異は、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解／代謝回転率のような特性を変更するために、ポリペプチド、あるいはポリペプチドの任意の一部の特性を修飾するようにポリペプチドに付加される他のペプチドを有するドメインにおいて反映され得る。
【００５６】
好ましくは、アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、同様の構造特性および／または化学特性を有する別のアミノ酸で置き換えることの結果、すなわち、保存的アミノ酸置換である。「保存的」アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいてなされ得る。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ、中性な極性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ、正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギン、リシン、およびヒスチジンが挙げられ、負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が挙げられる。「挿入」または「欠失」は、好ましくは、約１個〜２０個のアミノ酸、より好ましくは１個〜１０個のアミノ酸の範囲である。可能な変動は、組換えＤＮＡ技法を用いてポリペプチド分子においてアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統だって作製し、得られた組換え変異体を活性に関してアッセイすることにより実験的に確定され得る。
【００５７】
あるいは、機能の変更が望ましい場合、挿入、欠失または非保存的変更を、変更ポリペプチドを産生するように操作することができる。かかる変更は、例えば、本発明のポリペプチドの１つまたはそれより多い生物学的機能または生化学的特性を変更することができる。例えば、かかる変更は、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解／代謝回転率のようなポリペプチド特性を変更し得る。さらに、かかる変更は、発現に関して選ばれた宿主細胞における発現、スケールアップ等により良好に適合されるポリペプチドを生成するように選定することができる。例えば、システイン残基は、ジスルフィド架橋を排除するために、欠失され得るか、または別のアミノ酸残基で置換され得る。
【００５８】
本明細書中で使用する場合「精製」または「実質的に精製」という用語は、示した核酸またはポリペプチドが、他の生物学的高分子、例えばポリヌクレオチド、タンパク質等の実質的に非存在下で存在することを表す。一実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、存在する示した生物学的高分子の少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％を構成するように精製される（が、水、緩衝液、および他の小分子、特に１００ダルトン未満の分子量を有する分子は存在することができる）。
【００５９】
本明細書中で使用する場合「単離」という用語は、その天然源中の核酸またはポリペプチドとともに存在する少なくとも１種の他の構成成分（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプチドを指す。一実施形態では、核酸またはポリペプチドは、（あるとしたら）溶媒、緩衝液、イオン、あるいは核酸またはポリペプチド溶液中に通常存在する他の構成成分のみの存在下で見出される。「単離」および「精製」という用語は、それらの天然源中に存在する核酸またはポリペプチドを含まない。
【００６０】
ポリペプチドまたはタンパク質を指すのに本明細書中で使用する場合の「組換え」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質が組換え（例えば、微生物、昆虫、または哺乳動物）発現系に由来することを意味する。「微生物」とは、細菌または真菌（例えば、酵母）発現系で作製される組換えポリペプチドまたはタンパク質を指す。産物として、「組換え微生物」は、自然内因性物質を本質的に含まず、かつ関連自然グリコシル化を伴わないポリペプチドまたはタンパク質を定義する。たいていの細菌培養物、例えば大腸菌で発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化修飾を受けず、酵母で発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳動物細胞で発現されるものとは概して異なるグリコシル化パターンを有する。
【００６１】
「組換え発現媒体またはベクター」という用語は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチドを発現するための、プラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターを指す。発現媒体は、（１）遺伝子発現において調節の役割を有する遺伝子要素（単数または複数）（例えば、プロモーター、またはエンハンサー）、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造またはコード配列、および（３）適切な転写開始および終止配列の構築を含む転写ユニットを含むことができる。酵母または真核生物発現系での使用を意図される構造ユニットは、好ましくは宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列なしで発現される場合、それは、アミノ末端メチオニン残基を有してもよい。この残基は、続いて発現組換えタンパク質から切断されても切断されなくてもよく、最終産物を提供する。
【００６２】
「組換え発現系」という用語は、染色体ＤＮＡに組換え転写ユニットを安定に組み込んだ宿主細胞、あるいは染色体外に組換え転写ユニットを運搬する宿主細胞を意味する。本明細書中で定義される組換え発現系は、発現されるＤＮＡセグメントまたは合成遺伝子に連結される調節要素を誘導する際に、異種ポリペプチドまたはタンパク質を発現する。この用語はまた、遺伝子発現において調節の役割を有する組換え遺伝子要素（単数または複数）（例えば、プロモーター、またはエンハンサー）を安定に組み込んだ宿主細胞を意味する。本明細書中で定義される組換え発現系は、発現される内因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子に連結される調節要素を誘導する際に、細胞にとって内因性のポリペプチドまたはタンパク質を発現する。細胞は、原核生物性または真核細胞性であり得る。
【００６３】
「分泌」という用語は、タンパク質が適切な宿主細胞に発現されると、そのアミノ酸配列中のシグナル配列の結果としての輸送を含む、膜を通して、あるいは膜により輸送されるタンパク質を含む。「分泌」タンパク質としては、それらが発現される細胞から、完全に（例えば、可溶性タンパク質）または部分的に（例えば受容体）分泌されたタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。「分泌タンパク質」としてはまた、小胞体の膜を通して輸送されるタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。「分泌」タンパク質はまた、非典型的シグナル配列を含有するタンパク質（例えば、インターロイキン−１β、Ｋｒａｎｓｎｅｙ， Ｐ．Ａ． ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｐ．Ｒ．， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ４（２）：１３４−１４３ （１９９２）を参照）、および損傷細胞から放出される因子（例えば、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、Ａｒｅｎｄ， Ｗ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６：２７−５５ （１９９８）を参照）を含むことが意図される。
【００６４】
望ましい場合、発現ベクターは、細胞の膜によりポリペプチドを誘導する「シグナルまたはリーダー配列」を含有するように設計してもよい。かかる配列は、本発明のポリペプチド上に天然に存在してもよく、あるいは組換えＤＮＡ技法により異種タンパク質源から提供されてもよい。
【００６５】
「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野で一般に認識される条件を指すのに使用される。ストリンジェントな条件は、高ストリンジェント条件（すなわち６５℃での０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡにおけるフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける洗浄）、および中ストリンジェント条件（すなわち、４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける洗浄）を含むことができる。他の例示的ハイブリダイゼーション条件は、本明細書中の実施例中に記載されている。
【００６６】
デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの例では、さらなる具体例としてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴヌクレオチドに関して）、４８℃（１７塩基オリゴヌクレオチドに関して）、５５℃（２０塩基オリゴヌクレオチドに関して）、および６０℃（２３塩基オリゴヌクレオチドに関して）での６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウムにおける洗浄が挙げられる。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「実質的に等価」は、１つまたはそれより多い置換、欠失または付加（これらの正味の効果は、参照配列と対象配列との間に不都合な機能的相違点を生じない）により参照配列と異なるヌクレオチドおよびアミノ酸配列の両方、例えば突然変異配列を指すことができる。通常、かかる実質的に等価な配列は、約３５％以下だけ本明細書中に列挙した配列の１つと異なる（すなわち、相当する参照配列と比較した場合の実質的に等価な配列中の個々の残基の置換、付加および／または欠失の数を、実質的に等価な配列中の全残基数で除算すると、約０．３５以下である）。かかる配列は、列挙した配列に６５％配列同一性を有すると言われる。一実施形態では、本発明の実質的に等価な（例えば、突然変異）配列は、３０％以下だけ列挙した配列と異なり（７０％の配列同一性）、この実施形態の変形では、２５％以下だけ列挙した配列と異なり（７５％の配列同一性）、この実施形態のさらなる変形では、２０％以下だけ列挙した配列と異なり（８０％の配列同一性）、この実施形態のさらなる変形では、１０％以下だけ列挙した配列と異なり（９０％の配列同一性）、この実施形態のさらなる変形では、５％以下だけ列挙した配列と異なる（９５％の配列同一性）。本発明による実質的に等価な（例えば、突然変異）アミノ酸配列は、好ましくは、列挙したアミノ酸配列と少なくとも８０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％配列同一性を有する。本発明の実質的に等価なヌクレオチド配列は、例えば、遺伝暗号の重複性または縮重を考慮して低い％配列同一性を有することができる。好ましくは、ヌクレオチド配列は、少なくとも約６５％同一性、より好ましくは少なくとも約７５％同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％同一性を有する。本発明の目的で、実質的に等価な生物活性および実質的に等価な発現特性を有する配列は、実質的に等価であるとみなされる。等価性を決定する目的で、成熟配列の切断型（例えば、擬似終止コドンを創出する突然変異により）を無視すべきである。配列同一性は、例えばＪｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ法［Ｈｅｉｎ， Ｊ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８３：６２６−６４５ （１９９０）］を用いて決定され得る。配列間の同一性はまた、当該技術分野で既知の他の方法により、例えばハイブリダイゼーション条件を変化させることで、測定することもできる。
【００６８】
「全能性」という用語は、成体生物の細胞型のすべてに分化する、細胞の能力を指す。
【００６９】
「形質転換」という用語は、適切な宿主細胞にＤＮＡを導入しその結果ＤＮＡは、染色体外要素として、あるいは染色体組込みにより複製可能であることを意味する。「トランスフェクション」という用語は、任意のコード配列が実際に発現されるか否かに関わらず、適切な宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。「感染」という用語は、ウイルスまたはウイルスベクターを用いて、適切な宿主細胞に核酸を導入することを指す。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「取り込み調整断片」、すなわちＵＭＦは、連結ＤＮＡ断片を細胞に取り込むことを媒介する一連のヌクレオチドを意味する。ＵＭＦは、以下に記載のコンピュータベースシステムにより、標的配列または標的モチーフとして既知のＵＭＦを用いて容易に同定することができる。ＵＭＦの存在および活性は、疑わしいＵＭＦをマーカー配列に結合することで確認することができる。次に、得られた核酸分子を、適切な条件下で、適切な宿主とともにインキュベートして、マーカー配列の取り込みを決定する。上述するように、ＵＭＦは、連結マーカー配列の取り込み頻度を増加する。
【００７１】
上記用語はそれぞれ、文脈が別の状況を指示しない限り、それぞれに関して記載されるすべてを含むことが意図される。
【００７２】
４．２本発明の核酸
本発明は、新規幹細胞成長因子様ポリペプチド、幹細胞成長因子様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに癌および他の免疫学的障害の診断、治療または防止のための、これらの組成物の使用に基づいている。
【００７３】
本発明の単離されたポリヌクレオチドとしては、配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のヌクレオチド配列のいずれかを含むポリヌクレオチド、それらの断片、それらの完全長タンパク質コード配列を含むポリヌクレオチド（例えば、配列番号２８、３８、または４０をコードするもの）、およびポリヌクレオチドの成熟タンパク質コード配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、（ａ）配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のヌクレオチド配列のいずれかの相補体、（ｂ）配列番号２３、２５、２８、３０〜３２、３４、３５、３８、または４２のポリペプチドのいずれか１つをコードするポリヌクレオチド、（ｃ）上述した任意のポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチド、（ｄ）上述したタンパク質のいずれかの種相同体をコードするポリヌクレオチド、または（ｅ）配列番号２３、２５、２８、３０〜３２、３４、３５、３８、または４０のポリペプチドの特定ドメインまたは切断型を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。所定のドメインは、コードされたポリペプチドの性質に依存してもよく、例えば、受容体様ポリペプチド中のドメインは、リガンド結合、細胞外、膜貫通または細胞質ドメイン、あるいはそれらの組合せを含み、免疫グロブリン様タンパク質中のドメインは、可変免疫グロブリン様ドメインを含み、酵素様ポリペプチド中のドメインは、触媒結合ドメインおよび基質結合ドメインを含み、リガンドポリペプチド中のドメインは、受容体結合ドメインを含む。
【００７４】
本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在するか、あるいは全体的または部分的合成のＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、およびゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡのコード領域すべてを含んでもよく、あるいはｃＤＮＡのコード領域の一部に相当してもよい。
【００７５】
本発明はまた、本明細書中に開示するｃＤＮＡ配列に相当する遺伝子を提供する。相当する遺伝子は、本明細書中に開示する配列情報を用いて、既知の方法に従って単離することができる。かかる方法は、適切なゲノムライブラリーおよび他のゲノム物質源における遺伝子の特定および／または増幅のための開示した配列情報からのプローブまたはプライマーの調製を含む。さらに、５’および３’配列は、当該技術分野で既知の方法を用いて得ることができる。例えば、配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のポリヌクレオチドいずれかに相当する完全長ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡは、プローブとして、配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のポリヌクレオチドのいずれか、またはそれらの一部を用いて、適切なハイブリダイゼーション条件下で、適切なｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることで得ることができる。あるいは、配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のポリヌクレオチドは、適切なゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーにおける遺伝子の特定および／または増幅を可能にする適切なプライマー（複数可）のための基礎として使用してもよい。
【００７６】
本発明の核酸配列は、ＥＳＴ、およびｄｂＥＳＴ、ｇｂｐｒｉおよびＵｎｉＧｅｎｅのような１つまたはそれより多い公的データベースから得られる配列（ｃＤＮＡおよびゲノム配列を含む）から構築することができる。ＥＳＴ配列は、完全長遺伝子に関する配列情報、代表的断片またはセグメント情報、あるいは新規セグメント情報を特定することを提供することができる。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、上述したポリヌクレオチドに実質的に等価なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明によるポリヌクレオチドは、例えば、上述したポリヌクレオチドに、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらに典型的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を有することができる。
【００７８】
配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のヌクレオチド配列のいずれか、あるいはそれらの相補体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列断片は、本発明の核酸配列の範囲内に含まれ、その断片は、約５個を超えるヌクレオチド、好ましくは７個のヌクレオチド、より好ましくは９個を超えるヌクレオチド、最も好ましくは１７個を超えるヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドのいずれか１つに選択的な（すなわち本発明のポリヌクレオチドにいずれか１つに特異的にハイブリダイズする）、例えば１５個、１７個、もしくは２０個またはそれ以上の断片が意図される。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることが可能なプローブは、同じファミリーの遺伝子において、本発明のポリヌクレオチド配列と他のポリヌクレオチド配列とを識別することができるか、あるいはヒト遺伝子と他の種の遺伝子を識別することができ、好ましくは特有のヌクレオチド配列に基づいている。
【００７９】
本発明の範囲内にある配列は、これらの特定の配列に限定されず、それらの対立遺伝子変異体および種変異体も含む。対立遺伝子変異および種変異は、配列番号２７、２９、３３、３７、または３９で提供される配列、それらの代表的断片、または配列番号２７、２９、３３、３７、または３９に少なくとも９０％同一、好ましくは９５％同一のヌクレオチド配列を、同種の別の単離体由来の配列と比較することで、ルーチンで決定することができる。さらに、コドン可変性を配慮して、本発明は、本明細書中に開示する特定のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。換言すると、ＯＲＦのコード領域において、あるコドンを、同じアミノ酸をコードする別のコドンで置換することが明らかに意図される。
【００８０】
配列番号２７、２９、３３、３７、または３９を含む本発明の核酸に関する最も近く隣接する結果は、アルゴリズムまたはプログラムを用いて、データベースを検索することで得ることができる。好ましくは、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを意味するＢＬＡＳＴが、局所配列アラインメントに関して検索するのに使用される［Ａｌｔｓｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｊ Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．， ３６：２９０−３００ （１９９３）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１：４０３−４１０ （１９９０）］。
【００８１】
開示したポリヌクレオチドおよびタンパク質の種相同体（すなわちオルソログ）もまた、本発明により提供される。種相同体は、本明細書に提供した配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、所望の種からの適切な核酸源をスクリーニングすることにより、単離および同定され得る。
【００８２】
本発明は、開示したポリヌクレオチドまたはタンパク質の対立遺伝子変異体、すなわちポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に、同一であるか、相同的であるか、または関連しているタンパク質を同様にコードする、天然に存在するオルタナティブ形態の単離ポリヌクレオチドを含む。
【００８３】
本発明の核酸はさらに、記載の核酸の変異体をコードする配列に関する。これらのアミノ酸配列変異体は、自然または変異ポリヌクレオチドに、適切なヌクレオチド変化を導入することで、当該技術分野で既知の方法により調製され得る。アミノ酸配列変異体の構築物には２つの変数：変異の位置および変異の性質が存在する。アミノ酸配列変異体をコードする核酸は好ましくは、自然状態では生じないアミノ酸配列をコードするようにポリヌクレオチドを変異させることで構築される。これらの核酸変更は、異なる種の核酸が異なる部位（可変位置）で、あるいは高度に保存された領域（定常領域）において作製することができる。かかる位置での部位は通常、例えばまず保存的選択（例えば、異なる疎水性アミノ酸に対して疎水性アミノ酸）で、次により離れた選択（例えば、帯電アミノ酸に対して疎水性アミノ酸）で置換することにより連続して修飾され、続いて欠失または挿入が、標的部位でなされてもよい。アミノ酸配列欠失は一般に、１〜３０残基、好ましくは１〜１０残基の範囲であり、通常連続している。アミノ酸挿入は、１〜１００個またはそれより多い残基の長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入は一般に、約１〜１０アミノ残基、好ましくは１〜５残基の範囲であり得る。末端挿入の例としては、異なる宿主細胞での分泌または細胞内ターゲッティングに必要な異種シグナル配列、および発現されるタンパク質を精製するのに有用なＦＬＡＧまたはポリヒスチジン配列のような配列が挙げられる。
【００８４】
好ましい方法では、新規アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異により変更される。この方法は、所望のアミノ酸変異体をコードするようにポリヌクレオチドを変更するためのオリゴヌクレオチド配列、ならびに変更した部位の両側に安定な二重鎖を形成するために、変更するアミノ酸の両側に十分に隣接したヌクレオチドを使用する。概して、部位特異的突然変異の技法は、当業者に既知であり、この技法は、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ２：１８３ （１９８３）のような刊行物により例証される。ポリヌクレオチド配列において部位特異的変化をもたらす用途の広くかつ効果的な方法は、Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０：６４８７−６５００ （１９８２）により公開された。また、新規核酸のアミノ酸配列変異体を創出するのに、ＰＣＲを使用してもよい。少量の鋳型ＤＮＡを出発原料として使用する場合、鋳型ＤＮＡの相当する領域と配列とがわずかに異なるプライマー（複数可）は、所望のアミノ酸変異体を生成することができる。ＰＣＲ増幅は、プライマーにより特定される位置にあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド鋳型と異なる産物ＤＮＡ断片の集団を生じる。産物ＤＮＡ断片は、プラスミド中の相当する領域を置き換え、これらにより所望のアミノ酸変異体をコードするポリヌクレオチドが得られる。
【００８５】
アミノ酸変異体を生成するさらなる技法は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４：３１５ （１９８５）に記載されるカセット変異導入技法、ならびに例えば上述のＳａｍｂｒｏｏｋ等、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．における技法のような当該技術分野で既知の他の変異導入技法である。遺伝暗号の固有の縮重性により、実質的に同じであるか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を、これらの新規核酸のクローニングおよび発現のための本発明の実施に使用してもよい。かかるＤＮＡ配列としては、ストリンジェントな条件下で、適切な新規核酸配列にハイブリダイズすることが可能なものが挙げられる。
【００８６】
本発明の好ましいポリヌクレオチド切断型をコードするポリヌクレオチドを使用して、本発明の１つまたはそれより多いドメイン、および異種タンパク質配列を含むキメラまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを生成することができる。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドはさらに、上述したポリヌクレオチドのいずれかの相補体を含む。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）、またはＲＮＡであり得る。かかるポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは、当業者に既知であり、例えば所望の配列同一性を有するポリヌクレオチドをルーチンで単離することができるハイブリダイゼーション条件を決定する方法を挙げることができる。
【００８８】
本発明によれば、配列番号２８、３０〜３２、３４、３４、３８、または４０のいずれか１つ、あるいはそれらの機能的等価体をコードする成熟タンパク質コード配列を含むポリヌクレオチド配列を使用して、適切な宿主細胞において、当該核酸またはその機能的等価体の発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成してもよい。本発明で同定されるクローンのいずれかのｃＤＮＡ挿入物も含まれる。
【００８９】
本発明によるポリヌクレオチドは、十分確立された組換えＤＮＡ技法により様々な他のヌクレオチド配列のいずれかに連結することができる［Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹを参照］。ポリヌクレオチドに連結するのに有用なヌクレオチド配列としては、当該技術分野で既知の各種ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、λファージ誘導体、ファージミド等）が挙げられる。したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよびポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を提供する。一般に、ベクターは、少なくとも１種の生物において機能的な複製起点、利便性のよい制限エンドヌクレアーゼ部位、および宿主細胞に関する選択マーカーを含有する。本発明によるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシーケンシングベクターが挙げられる。本発明による宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。本発明の宿主細胞は、単細胞生物、または多細胞生物の一部であり得る。
【００９０】
本発明はさらに、配列番号２７、２９、３３、３７、もしくは３９のヌクレオチド配列のいずれか、またはそれらの断片、あるいは本発明の任意の他のポリヌクレオチドを有する核酸を含む組換え構築物を提供する。一実施形態では、本発明の組換え構築物は、プラスミドまたはウイルスベクターのようなべクターを含み、それらに配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のヌクレオチド配列のいずれか、あるいはそれらの断片を有する核酸が、順方向または逆方向で挿入される。本発明のＯＲＦの１つを含むベクターの場合では、ベクターはさらに、ＯＲＦに作動可能に連結された、例えばプロモーターを含む調節配列を含んでもよい。多数の適切なベクターおよびプロモーターが、当業者に既知であり、本発明の組換え構築物を生成するのに市販されている。以下のベクターを一例として提供する。細菌：ｐＢｓ、ファージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【００９１】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、組換え的にタンパク質を生産するために、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９， ４４８５−４４９０ （１９９１）に開示されるｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターのような発現制御配列に作動可能に連結されてもよい。多くの適切な発現制御配列が当該技術分野で既知である。組換えタンパク質を発現する一般的な方法はまた既知であり、Ｒ． Ｋａｕｆｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５：５３７−５６６６ （１９９０）に例示されている。本明細書中で定義するように、「作動可能に連結される」は、タンパク質が連結されたポリヌクレオチド／発現制御配列で形質転換（トランスフェクト）された宿主細胞により発現されるように、本発明の単離ポリヌクレオチドおよび発現制御配列はベクターまたは細胞において位置されることを意味する。
【００９２】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択することができる。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８、およびｐＣＭ７である。特定の指定される細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λ  ＰＲ、およびｔｒｃが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選定は、十分に当業者レベル内である。一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を許容する複製起点および選択マーカー、例えば大腸菌アンピシリン耐性遺伝子、およびＳ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＰＲ１遺伝子、および下流構造配列の転写を誘導するための高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターを包含する。かかるプロモーターは、とりわけ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）のような解糖酵素、ａ−因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来され得る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、および好ましくは細胞膜周辺腔または細胞外媒質への翻訳されたタンパク質の分泌を誘導することが可能なリーダー配列を有する適切な相において構築される。任意に、異種配列は、所望の特性、例えば発現される組換え産物の安定化および簡素化した精製を付与するアミノ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。細菌用途に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターを有する作動可能なリーディング相において適切な翻訳開始および終結シグナルと一緒に、所望のタンパク質をコードする構造的ＤＮＡ配列を挿入することで構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、望ましい場合に宿主内での増幅を提供するために、１つまたはそれより多い表現型選択マーカー、および複製起点を含む。形質転換に適切な真核生物宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の様々な種が挙げられるが、他のものもまた、選択上使用され得る。
【００９３】
代表的であるが、限定的ではない例として、細菌用途に有用な発現ベクターは、既知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝子要素を含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌複製起点を含むことができる。かかる市販のベクターとしては、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「骨格」セクションは、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせられる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の成長後に、選択されたプロモーターを、適当な手段（例えば、温度移行または化学的誘発）により誘発または抑制し、細胞をさらなる期間培養する。細胞は通常遠心分離により収集し、物理的または化学的手段により崩壊して、得られた粗製抽出物をさらなる精製のために収穫する。
【００９４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、免疫応答を誘発するのに使用することができる。例えば、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １７： ８７０−８７２ （１９９９）（参照により本明細書に援用される）に記載されるように、ポリペプチドをコードする核酸配列を用いて、裸のプラスミドＤＮＡの局所投与後に、あるいはＤＮＡの注射、好ましくは筋内注後に、コードされるポリペプチドに対する抗体を生成してもよい。核酸配列は好ましくは、組換え発現ベクターにおいて挿入され、裸のＤＮＡの形態であってもよい。
【００９５】
４．２．１アンチセンス核酸
本発明の別の態様は、幹細胞成長因子様ヌクレオチド配列、もしくは断片、それらの類似体または誘導体を含む核酸分子にハイブリダイズすることができるか、あるいはそれらに相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な（例えば、二重鎖ｃＤＮＡのコード鎖に相補的な、あるいはｍＲＮＡ配列に相補的な）ヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、少なくとも約１０個、２５個、５０個、１００個、２５０個、もしくは５００個のヌクレオチドまたは全幹細胞成長様をコードする鎖に、あるいはそれらの一部のみに相補的な配列を含むアンチセンス核酸が提供される。幹細胞成長因子様の断片、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または幹細胞成長因子様核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【００９６】
一実施形態では、アンチセンス核酸分子は、幹細胞成長因子様タンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、幹細胞成長因子様タンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「容認（ｃｏｎｃｅｄｉｎｇ）領域」に対するアンチセンスである。「容認領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないコード領域（すなわち、５’および３’非翻訳領域とも呼ばれる）に隣接する５’および３’配列を指す。
【００９７】
本明細書中に開示した幹細胞成長因子様タンパク質をコードするコード鎖配列を考慮すると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンおよびクリック、またはフーグスティーン塩基対形成の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、幹細胞成長因子様ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であり得るが、より好ましくは、幹細胞成長因子様ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、幹細胞成長因子様ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を用いて、化学合成または酵素を介した連結反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増大するように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された様々に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる）を用いて化学的に合成することができる。
【００９８】
アンチセンス核酸を生成するのに使用することができる修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされた（すなわち、挿入核酸から転写されるＲＮＡは、所定の標的核酸に対してアンチセンス配向である、以下のセクションでさらに記載する）発現ベクターを用いて生物学的に生産することができる。
【００９９】
本発明のアンチセンス核酸分子は通常、それらが幹細胞成長因子様タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれらに結合するように、被験体に投与されるか、あるいはその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で生成されて、それによりタンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより）。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するため従来のヌクレオチド相補性によるもの、あるいは例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的な相互作用によるものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択細胞を標的とするように改変された後、全身投与することができる。例えば、全身投与に関して、アンチセンス分子は、それらが選択細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するように改変することができる（例えば、アンチセンス核酸を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することにより）。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載のベクターを用いて、細胞に送達させることができる。十分な核酸分子を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下にあるベクター構築物が好ましい。
【０１００】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補ＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成し、ここで通常のα−ユニットに相反して、鎖は、互いに平行している。例えば、Ｇａｕｌｔｉｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５： ６６２５−６６４１ （１９８７）を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド［例えば、Ｉｎｏｕｅ， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １５：６１３１−６１４８ （１９８７）を参照］あるいはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体［例えば、Ｉｎｏｕｅ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ２１５：３２７−３３０ （１９８７）を参照］を含むことができる。
【０１０１】
リボザイムおよびＰＮＡモチーフ
核酸修飾としては、修飾塩基、および糖リン酸骨格が修飾または誘導体化された核酸が挙げられるが、これらに限定されない。これらの修飾は、修飾核酸の化学的安定性を高めるために少なくとも部分的に実施され、その結果、修飾核酸は、例えば被験体における治療用途でのアンチセンス結合核酸として使用することができる。
【０１０２】
一実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、リボザイムが相補領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断することが可能なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（例えば、Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１ （１９９８）に記載されるようなハンマーヘッドリボザイム）は、幹細胞成長因子様ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するのに使用することができ、それにより幹細胞成長因子様ｍＲＮＡの転写を阻害する。幹細胞成長因子様コード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示する幹細胞成長因子様ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が幹細胞成長因子様コードｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９ＩＶＳ  ＲＮＡを構築することができる。例えば、米国特許第４，９８７，０７１号（Ｃｅｔｈ等）、および米国特許第５，１１６，７４２号（Ｃｅｔｈ等）を参照されたい。幹細胞成長因子様ｍＲＮＡはまた、ＲＮＡ分子のプールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用することができる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６１：１４１１−１４１８ （１９９３）を参照されたい。
【０１０３】
あるいは、幹細胞成長因子様遺伝子発現は、標的細胞における幹細胞成長因子様遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成するために、幹細胞成長因子様核酸の調節領域（例えば、幹細胞成長因子様プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列をターゲッティングすることで阻害することができる。［例えば、Ｈｅｌｅｎｅ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．， ６：５６９−８４（１９９１）； Ｈｅｌｅｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ６６０： ２７−３６ （１９９２）； Ｍａｈｅｒ， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ， １４：８０７−１５ （１９９２）を参照］
【０１０４】
様々な実施形態では、幹細胞成長因子様核酸は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改良するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾することができる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸骨格を生成することができる［例えば、Ｈｙｒｕｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．， ４：５−２３ （１９９６）を参照］。本明細書で使用する場合、「ペプチド核酸」、または「ＰＮＡ」という用語は、デオキシリボースリン酸骨格が、擬ペプチド骨格で置き換えられ、４つの天然の核酸塩基のみが保持された核酸擬似体（例えば、ＤＮＡ擬似体）を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることがわかっている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上述のＨｙｒｕｐ等、およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ９３： １４６７０−１４６７５ （１９９６）に記載されるように、標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて実施することができる。
【０１０５】
幹細胞成長因子様のＰＮＡは、治療用途および診断用途で使用することができる。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導するか、あるいは複製を阻害することによる遺伝子発現の配列特異的調整用のアンチセンスまたは抗遺伝子剤（ａｎｔｉｇｅｎｅ ａｇｅｎｔ）として使用することができる。幹細胞成長因子様のＰＮＡはまた、例えば遺伝子中の単一塩基対突然変異の解析（例えば、ＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピング）において、他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と併用する場合の人工制限酵素として（例えば、上述のＨｙｒｕｐ， ｅｔ ａｌ．， １９９６を参照）、あるいはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーション用のプローブまたはプライマーとして（上述のＨｙｒｕｐ， ｅｔ ａｌ．， １９９６、上述のＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ， ｅｔ ａｌ．， １９９６を参照））使用することができる。
【０１０６】
別の実施形態では、幹細胞成長様のＰＮＡは、例えば、ＰＮＡに親油性基または他のヘルパー基を結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、あるいはリポソーム、または当該技術分野で既知の薬物送達の他の技法を用いて、ＰＮＡの安定性または細胞取り込みを高めるために修飾することができる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの好適な特性を組み合わせ得る幹細胞成長因子様のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成することができる。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡ分解酵素ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にすると同時に、ＰＮＡ部分は、高結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数、および配向の観点で選択される適切な長さのリンカーを用いて連結することができる［上述のＨｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， １９９６を参照］ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、上述のＨｙｒｕｐ， ｅｔ ａｌ．， １９９６、およびＮｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２４：３３５７−３３６３ （１９９６）に記載されるように実施することができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固相上で合成することができ、修飾ヌクレオシド類似体（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトを、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用することができる。例えば、Ｍａｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， １７：５９７３−５９８８ （１９８９）を参照されたい。次に、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングさせて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生産する。例えば、上述のＦｉｎｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９６を参照されたい。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子を合成することができる。例えば、Ｐｅｒｔｅｒｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ５：１１１９−１１２４ （１９７５）を参照されたい。
【０１０７】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付随基（ｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞受容体をターゲッティングするため）、または細胞膜［例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：６５５３−６５５６ （１９８９）、Ｌｅｍａｉｔｒｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：６４８−６５２ （１９８７）、およびＰＣＴ国際公開第８８／０９８１０号を参照］または血液脳関門［例えば、ＰＣＴ国際公開第８９／１０１３４号を参照］を通っての輸送を促進する作用物質を含んでもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤［例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｉｅｓ， ６：９５８−９７６ （１９８８）を参照］、または挿入剤［例えば、Ｚｏｎ， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．， ５：５３９−５４９ （１９９８）を参照］により修飾することができる。この目的で、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤等）に結合することができる。
【０１０８】
４．３宿主細胞
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含有するように遺伝子操作した宿主細胞を提供する。例えば、かかる宿主細胞は、既知の形質転換、トランスフェクション、または感染方法を用いて、宿主細胞に導入された本発明の核酸を含有してもよい。本発明はさらには、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作した宿主細胞を提供し、ここでかかるポリヌクレオチドは、細胞においてポリヌクレオチドの発現を駆動する、宿主細胞にとって異種の調節配列に作動可能に連結している。
【０１０９】
宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核宿主細胞、酵母細胞のような下等真核宿主細胞であり得るか、あるいは宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であり得る。宿主細胞への組換え構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介性トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成することができる［Ｄａｖｉｓ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８６）］。本発明のポリヌクレオチドの１つを含有する宿主細胞は、単離断片によりコードされる遺伝子産物を産生するのに従来の様式で使用することができる（ＯＲＦの場合）か、あるいはＥＭＦの制御下で異種タンパク質を産生するのに使用することができる。
【０１１０】
任意の宿主／ベクター系は、１つまたはそれより多い本発明のＯＲＦを発現するのに使用することができる。これらとしては、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ−１細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳｆ９細胞のような真核生物宿主、ならびに大腸菌および枯草菌のような原核生物宿主が挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、特定のポリペプチドまたはタンパク質を通常発現しない細胞、あるいは低い自然レベルでポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞である。成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞において発現され得る。無細胞翻訳系はまた、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いて、かかるタンパク質を産生するのに使用することができる。真核生物宿主および原核生物宿主とともに使用するための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）（この開示は、参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０１１１】
様々な哺乳動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するのに用いることができる。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ， Ｃｅｌｌ， ２３：１７５ （１９８１）に記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合性ベクターを発現することが可能な他の細胞系（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞系）が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、また任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、たとえばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位を使用して、必要とされる非翻訳遺伝子要素を提供してもよい。細菌培養で産生される組換えポリペプチドおよびタンパク質は通常、細胞ペレットからの初期抽出、続いて１つまたはそれより多い塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィ工程により単離される。タンパク質リフォールディング工程は、必要に応じて、成熟タンパク質の立体配置を完全にする際に使用することができる。最終的に、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を、最終精製工程に使用することができる。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の従来法により破壊することができる。
【０１１２】
多数の細胞型が、タンパク質の発現に適した宿主細胞として作用し得る。哺乳動物宿主細胞としては、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換霊長類細胞系、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に由来する細胞株、初代外植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはジャーカット細胞が挙げられる。
【０１１３】
あるいは、酵母のような下等真核生物、または細菌のような原核細胞生物においてタンパク質を生産することが可能であり得る。潜在的に適切な酵母株としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、または異種タンパク質を発現することが可能な任意の酵母株が挙げられる。潜在的に適切な細菌株としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、または異種タンパク質を発現することが可能な任意の細菌株が挙げられる。タンパク質が酵母または細菌で作製される場合、機能的タンパク質を得るために、例えば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により、そこで生産されたタンパク質を修飾することが必要な場合がある。かかる共有結合は、既知の化学的方法および酵素的方法を用いて達成され得る。
【０１１４】
本発明の別の実施形態では、細胞および組織は、誘導性調節要素の制御下で本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように操作されてもよく、この場合では、内因性遺伝子の調節配列は、相同組換えにより置き換えられ得る。本明細書中で記載するように、遺伝子ターゲッティングを用いて、遺伝子の既存の調節領域を、異なる遺伝子から単離した調節配列、または遺伝子操作方法により合成した新規調節配列で置き換えることができる。かかる調節配列は、プロモーター、エンハンサー、担体結合領域、ネガティブ調節要素、転写開始部位、調節タンパク質結合部位、または上記配列の組合せから構成され得る。あるいは、ポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定性要素、スプライス部位、タンパク質の輸送もしくは分泌特性を増強または改変するためのリーダー配列、あるいはタンパク質もしくはＲＮＡ分子の機能または安定性を変更あるいは改善する他の配列を含む、生産されるＲＮＡもしくはタンパク質の構造または安定性に影響を及ぼす配列は、置換され得るか、除去され得るか、付加され得るか、またはターゲッティングにより改変され得る。
【０１１５】
ターゲッティング事象は、新たな調節配列の制御下に遺伝子を置くこと（例えば、遺伝子の上流に新たなプロモーターもしくはエンハンサー、またはその両方を挿入すること）による、調節配列の簡単な挿入であってもよい。あるいは、ターゲッティング事象は、組織特異的ネガティブ調節要素の欠失のような、調節要素の簡単な欠失であってもよい。あるいは、ターゲッティング事象は、既存の要素を置き換えてもよく、例えば組織特異的エンハンサーを、天然に存在する要素よりも広範であるか、またはそれと異なる細胞型特異性を有するエンハンサーで置き換えることができる。ここで、天然に存在する配列は欠失され、新たな配列が付加される。すべての場合で、ターゲッティング事象の特定は、外因性ＤＮＡが宿主細胞ゲノムに組み込まれた細胞の選択を可能にするターゲッティングＤＮＡと近接する１つまたはそれより多い選択マーカーを用いて促進され得る。ターゲッティング事象の特定はまた、ネガティブ選択マーカーが外因性ＤＮＡに連結されるように、ネガティブ選択の特性を示す１つまたはそれより多い選択マーカーを用いて促進されてもよいが、ネガティブ選択マーカーがターゲッティング配列に隣接し、宿主細胞ゲノム中の配列と正確な相同組換え事象がネガティブ選択マーカーの安定な組み込みをもたらさないように配置される。この目的で有用なマーカーとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、または細菌キサンチン−グアニンホルホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。
【０１１６】
本発明のこの態様により使用することができる遺伝子ターゲッティングまたは遺伝子活性化技法は、米国特許第５，２７２，０７１号（Ｃｈａｐｐｅｌ）、米国特許第５，５７８，４６１号（Ｓｈｅｒｗｉｎ等）、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７号（国際公開第９３／０９２２２号）（Ｓｅｌｄｅｎ等）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６号（国際公開第９１／０６６６７号）（Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉ等）（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）により詳細に記載されている。
【０１１７】
４．３．１  キメラタンパク質および融合タンパク質
本発明はまた、幹細胞成長因子様キメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用する場合、幹細胞成長因子様「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非幹細胞成長様ポリペプチドに作動的に連結された幹細胞成長因子様ポリペプチドを含む。「幹細胞成長因子様ポリペプチド」は、幹細胞成長因子様タンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すのに対し、「非幹細胞成長因子様ポリペプチド」は、幹細胞成長因子様タンパク質に実質的に相同的でないタンパク質、例えば幹細胞成長因子様タンパク質と異なる、かつ同じかまたは異なる生物に由来するタンパク質に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。幹細胞成長因子様融合タンパク質内では、幹細胞成長因子様ポリペプチドは、幹細胞成長因子様タンパク質のすべてまたは一部に相当することができる。一実施形態では、幹細胞成長因子様融合タンパク質は、幹細胞成長因子様タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、幹細胞成長因子様タンパク質は、幹細胞成長因子様タンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。さらに別の実施形態では、幹細胞成長因子様融合タンパク質は、幹細胞成長因子様タンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、「作動的に連結される」という用語は、幹細胞成長因子様ポリペプチドおよび非幹細胞成長因子様ポリペプチドが、互いにインフレームで融合されることを示すことを意図する。非幹細胞成長因子様ポリペプチドは、幹細胞成長因子様ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。
【０１１８】
一実施形態では、融合タンパク質は、幹細胞成長因子様配列がＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ−幹細胞成長因子様融合タンパク質である。かかる融合タンパク質は、組換え幹細胞成長因子用ポリペプチドの精製を容易にすることができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異所性のシグナル配列を含有する幹細胞成長因子様タンパク質である。ある特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）では、幹細胞成長因子様の発現および／分泌を、異所性のシグナル配列の使用により増大させることができる。
【０１１９】
さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、幹細胞成長因子様配列が免疫グロブリンタンパク質ファミリーの成員に由来する配列に融合された幹細胞成長因子様−免疫グロブリン融合タンパク質である。本発明の幹細胞成長因子様−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物に組み込むことができ、幹細胞成長因子様リガンドと細胞の表面上の幹細胞成長因子様タンパク質との相互作用を阻害するために被験体に投与することができ、それによりｉｎ  ｖｉｖｏでの幹細胞成長因子様媒介性シグナル伝達を抑制する。幹細胞成長因子様−免疫グロブリン融合タンパク質は、幹細胞成長因子様同族リガンドの生物学的利用能に影響を及ぼすのに使用することができる。幹細胞成長因子様リガンド／幹細胞成長因子様相互作用の阻害は、増殖性障害および分化性障害の両方の治療に、ならびに細胞生存の調整（例えば、促進または阻害）に、治療上有用であり得る。さらに、本発明の幹細胞成長因子様−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体における抗幹細胞成長因子様抗体を産生するために、幹細胞成長因子様リガンドを精製するために、また幹細胞成長因子様と幹細胞成長因子様リガンドとの相互作用を阻害する分子を特定するためのスクリーニングアッセイで、免疫原として使用することができる。
【０１２０】
本発明の幹細胞成長因子様キメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法により生産することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、従来の技法に従って、例えば連結反応のための平滑末端または付着末端の使用、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の充填（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素連結反応により、ともにインフレームで連結される。別の実施形態では、融合タンパク質は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技法により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片間の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて実施することができ、アンカープライマーは続いてアニ−ニングされ、再増幅されてキメラ遺伝子配列を生成することができる［例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９２を参照］。さらに、すでに融合部分（例えばＧＳＴポリペプチド）をコードしている多くの発現ベクターが市販されている。幹細胞成長因子様分子をコードする核酸は、融合部分が幹細胞成長因子様タンパク質にインフレームで連結されるように、かかる発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１２１】
４．４  本発明のポリペプチド
本発明の単離ポリペプチドとしては、配列番号２８、３０〜３２、３４、３８、または４０のいずれか１つとして記載されるアミノ酸配列、ヌクレオチド配列配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列、あるいは相当する完全長または成熟タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドはまた、（ａ）配列番号２７、２９、３３、３７、または３９に記載されるヌクレオチド配列のいずれか１つを有するポリヌクレオチド、または（ｂ）配列番号２８、３０〜３２、３４、３８、または４０として記載されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド、または（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、好ましくは生物学的または免疫学的活性を有するポリペプチドを含む。本発明はまた、配列番号２８、３０〜３２、３４、３８、または４０として記載されるアミノ酸配列、あるいは相当する完全長または成熟タンパク質、および生物活性を保持するそれらの「実質的等価体」（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より典型的には少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、さらにいっそう典型的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、最も典型的には少なくとも約９９％アミノ酸同一性を有する）のいずれかの生物学的に活性または免疫学的に活性な変異体を提供する。対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドは、配列番号２８、３０〜３２、３４、３８、または４０を含むポリペプチドと比較して、同様の活性、増加した活性、または減少した活性を有してもよい。
【０１２２】
生物活性を示すことが可能な本発明のタンパク質の断片もまた、本発明に含まれる。タンパク質の断片は、線状形態であってもよく、あるいはそれらは、既知の方法を用いて、例えばＨ．Ｕ． Ｓａｒａｇｏｖｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７３−７７８ （１９９２）、およびＲ．Ｓ． ＭｃＤｏｗｅｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １１４：９４２５−９２５３ （１９９２）（これらはともに、参照により本明細書に援用される）に記載されるように、環化されてもよい。かかる断片は、タンパク質結合部位の原子価を増加することを含む多くの目的のために、免疫グロブリンのような担体分子に融合させてもよい。
【０１２３】
本発明はまた、完全長および成熟形態（例えば、シグナル配列または前駆体配列を有さない）の両方の開示するタンパク質を提供する。タンパク質コード配列は、開示するヌクレオチド配列の翻訳により配列表で特定される。かかるタンパク質の成熟形態は、適切な哺乳動物細胞または他の宿主細胞における完全長ポリヌクレオチドの発現により得られ得る。成熟形態のタンパク質の配列はまた、完全長形態のアミノ酸配列から決定可能である。本発明のタンパク質が膜結合性である場合、可溶性形態のタンパク質もまた提供される。かかる形態では、タンパク質を膜結合性とさせる領域の一部またはすべての領域を欠失させて、その結果タンパク質は、それが発現される細胞から完全に分泌される。
【０１２４】
本発明のタンパク質組成物はさらに、親水性（例えば、薬学的に許容可能な）キャリアのような許容可能なキャリアを含んでもよい。
【０１２５】
本発明はさらに、本発明の核酸断片により、あるいは本発明の核酸断片の縮重変異体によりコードされる単離ポリペプチドを提供する。「縮重変異体」とは、ヌクレオチド配列により本発明の核酸断片（例えば、ＯＲＦ）と異なるが、遺伝暗号の縮重に起因して、同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド断片を意図する。本発明の好ましい核酸断片は、タンパク質をコードするＯＲＦである。
【０１２６】
当該技術分野で既知の様々な方法論を利用して、本発明の単離ポリペプチドまたはタンパク質のいずれか１つを得ることができる。最も簡単なレベルでは、アミノ酸配列は、市販のペプチド合成機を用いて合成することができる。タンパク質と一次、二次または三次構造および／または立体配座特性を共有する合成的に構築されたタンパク質配列は、タンパク質活性を含むそれらと共通の生物学的特性を保有し得る。この技法は、小ペプチドおよび大型ポリペプチドの断片を産生するのに特に有用である。断片は、例えば、天然のポリペプチドに対する抗体を生成するのに有用である。したがって、断片は、治療用化合物のスクリーニングにおいて、また抗体の作製のための免疫学的プロセスにおいて、天然の精製タンパク質の生物学的に活性または免疫学的に活性な代用物として有用である。
【０１２７】
あるいは、本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように変更した細胞から精製され得る。本明細書中で使用する場合、細胞は、細胞が遺伝子操作により、細胞が通常産生しないか、または細胞が通常低レベルで産生するポリペプチドまたはタンパク質を産生するように作製される場合、所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するように変更されると言われる。本発明のポリペプチドまたはタンパク質の１つを産生する細胞を生成するために、組換え配列または合成配列のいずれかを、真核細胞または原核細胞に導入して発現させる手順を、当業者は容易に適応させることができる。
【０１２８】
本発明はまた、適切な培地中で本発明の宿主細胞の培養物を成長させることと、細胞または細胞を成長させた培養物からタンパク質を精製することとを含むポリペプチドの産生方法に関する。例えば、本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドを含む適切な発現ベクターを含有する宿主細胞を、コードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する、ポリペプチドの生産方法を含む。ポリペプチドを、培養物から、利便性よく培地から、あるいは宿主細胞から調製される溶解産物から回収し、さらに精製することができる。好ましい実施形態としては、かかるプロセスにより生産されたタンパク質が、完全長または成熟形態のタンパク質である実施形態が挙げられる。
【０１２９】
代替的方法では、ポリペプチドまたはタンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質を本来生産する細菌細胞から精製される。当業者は、本発明の単離ポリペプチドまたはタンパク質の１つを得るために、ポリペプチドおよびタンパク質を単離する既知の方法を容易に行うことができる。これらとしては、免疫クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、およびイムノアフィニティクロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｓｃｏｐｅ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ （１９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい。生物学的／免疫学的活性を保持するポリペプチド断片としては、約１００個よりも多いアミノ酸、または約２００個よりも多いアミノ酸を含む断片、および特定のタンパク質ドメインをコードする断片が挙げられる。
【０１３０】
精製ポリペプチドは、ポリペプチドに結合する分子を同定するための、当該技術分野で既知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイに使用することができる。これらの分子としては、例えば小分子、コンビナトリアルライブラリーからの分子、抗体または他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。次に結合アッセイで同定された分子を、当該技術分野で既知のｉｎ  ｖｉｖｏ組織培養物または動物モデルにおいて、アンタゴニストまたはアゴニスト活性に関して試験する。要するに、分子は、複数の細胞培養物または動物へと滴定され、続いて動物／細胞死、または動物／細胞の生存の延長に関して試験される。
【０１３１】
さらに、本発明のペプチド、またはペプチドに結合することが可能な分子は、毒素、例えばリジンまたはコレラと、あるいは細胞にとって有毒な他の化合物と複合体を形成してもよい。次に、毒素結合分子複合体は、配列番号２８、３０〜３２、３４、３８、または４０に対する結合分子の特異性により、腫瘍または他の細胞へとターゲッティングされる。
【０１３２】
本発明のタンパク質はまた、トランスジェニック動物の産物として、例えばタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する体細胞または生殖細胞を特徴とするトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジの乳の構成成分として、発現されてもよい。
【０１３３】
本明細書中に提供したタンパク質はまた、精製タンパク質の配列と同様のアミノ酸配列を特徴とするが、改変が自然に提供されるか、または故意に操作されるタンパク質を含む。例えば、ペプチドまたはＤＮＡ配列における改変は、既知の技法を用いて、当業者によりなされ得る。タンパク質配列における所定の改変としては、コード配列における選択アミノ酸残基の変更、置換、置き換え、挿入または欠失が挙げられ得る。例えば、１つまたはそれより多いシステイン残基は、分子の立体配座を変更するために、欠失されるか、または別のアミノ酸と置き換えられ得る。かかる変更、置換、置き換え、挿入または欠失の技法は当業者に既知である（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号を参照）。好ましくは、かかる変更、置換、置き換え、挿入または欠失は、タンパク質の所望の活性を保持する。タンパク質機能にとって重要なタンパク質の領域は、単一アミノ酸またはアミノ酸列をアラニンで系統だって置換し、続いて得られたアラニン含有変異体を生物活性に関して試験することを含むアラニンスキャンニング方法を含む、当該技術分野で既知の様々な方法により決定することができる。このタイプの分析は、生物活性における置換アミノ酸（複数可）の重要性を決定する。タンパク質機能にとって重要なタンパク質の領域は、ｅＭＡＴＲＩＸプログラムによって決定されてもよい。
【０１３４】
全体的または部分的にタンパク質活性を保持すると予測され、かつスクリーニングまたは他の免疫学的方法論に有用なタンパク質の配列の他の断片および誘導体もまた、本明細書中の開示を考慮して、当業者は容易に作製し得る。かかる改変は、本発明に含まれる。
【０１３５】
タンパク質はまた、本発明の単離ポリヌクレオチドを、１つまたはそれより多い昆虫発現ベクターにおける適切な制御配列と作動可能に連結することと、昆虫発現系を使用することとにより生産され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための物質および方法は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．からキットの形態（ＭａｘＢａｔ（商標）キット）で市販されており、かかる方法が、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． １５５５ （１９８７）（参照により本明細書に援用される）に記載されるように、当該技術分野で既知である。本発明で使用する場合、本発明のポリヌクレオチドを発現することが可能な昆虫細胞は、「形質転換される」。
【０１３６】
本発明のタンパク質は、組換えタンパク質を発現するのに適した培養条件下で、形質転換宿主細胞を培養することで調製されてもよい。次に、得られた発現タンパク質は、ゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィのような既知の精製プロセスを用いて、かかる培養物から（すなわち、培地または細胞抽出物から）精製され得る。タンパク質の精製としてはまた、タンパク質に結合する作用物質を含有するアフィニティカラム、コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）、またはＣｉｂａｃｒｏｍ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）のようなアフィニティ樹脂による１つまたはそれより多いカラム工程、フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィを含む１つまたはそれより多い工程、またはイムノアフィニティクロマトグラフィが挙げられ得る。
【０１３７】
あるいは、本発明のタンパク質はまた、精製を容易とする形態で発現されてもよい。例えば、本発明のタンパク質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）の融合タンパク質のような融合タンパク質として、あるいはＨｉｓタグとして発現されてもよい。かかる融合タンパク質の発現および精製用のキットは、それぞれＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ （Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。タンパク質はまた、エピトープでタグ付けして、続いてかかるエピトープに対して誘導される特定の抗体を用いることで精製することができる。かかるエピトープの１つ（「ＦＬＡＧ（登録商標）」）は、Ｋｏｄａｋ （Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， Ｃｏｎｎ．）から市販されている。
【０１３８】
最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ培地（例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いた１つまたはそれより多い逆相高速クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を使用して、タンパク質をさらに精製することができる。上述の精製工程のいくつかまたはすべてはまた、様々な組み合わせで使用して、実質的に均質な単離組換えタンパク質を提供することもできる。こうして精製されたタンパク質は、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まず、本発明により「単離タンパク質」として定義される。
【０１３９】
本発明のポリペプチドは、類似体（変異体）を含む。本発明のポリペプチドは、幹細胞成長因子様類似体を含む。これは、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドの断片、同様に欠失、挿入もしくは置換された１つまたはそれより多いアミノ酸を含む幹細胞成長因子様ポリペプチドを含む。また、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドの類似体は、幹細胞成長因子様ポリペプチドの融合、または幹細胞成長因子様ポリペプチドの修飾を含み、ここで幹細胞成長因子様ポリペプチドまたは類似体は、別の部分（単数または複数）（例えば、ターゲッティング部分または別の治療薬）に融合される。かかる類似体は、活性および／または安定性のような特性の改善を示し得る。幹細胞成長因子様ポリペプチドまたは類似体に融合され得る部分の例として、例えば、ニューロンへのポリペプチドの送達を提供するターゲッティング部分（例えば、中枢神経系に対する抗体、または神経細胞上で発現される受容体およびリガンドに対する抗体）が挙げられる。幹細胞成長因子様ポリペプチドに融合され得る他の部分としては、治療に使用される治療薬（例えば、抗うつ薬、または神経学的障害用の他の薬剤）が挙げられる。また、幹細胞成長因子様ポリペプチドは、ニューロン成長モジュレータ、および標的送達のための他のケモカインに融合されてもよい。
【０１４０】
４．４．１  ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの同一性ならびに類似性の決定
好ましい同一性および／類似性は、試験される配列間の最大のマッチを付与するように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、ＧＡＰ［Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １２ （１）： ３８７ （１９８４）； Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ； Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ］、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＩＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＦＡＳＴＡ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｈ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０ （１９９０）］、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３３８９−３４０２（参照により本明細書に援用される）］、ｅＭａｔｒｉｘソフトウェア［Ｗｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．， ６：２１９−２３５ （１９９９）（参照により本明細書に援用される）］、ｅＭｏｔｉｆソフトウェア［Ｎｅｖｉｌｌ−Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＩＳＭＢ−９７， ４：２０２−２０９（参照により本明細書に援用される）］、ＧｅｎｅＡｔｌａｓソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ． （ＭＳＩ）， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）［Ｓａｎｃｈｅｚ ａｎｄ Ｓａｌｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９５：１３５９７−１３６０２ （１９９８）； Ｋｉｔｓｏｎ ＤＨ ｅｔ ａｌ．， （２０００） 「構造的モデル化を用いたリモートホモロジー検出−評価（Ｒｅｍｏｔｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ−ａｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）」提出； Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．， ５：９４７−９５５ （１９６６）］、およびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｏｔｔｌｅ疎水性予測アルゴリズム［Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １５７：１０５−３１ （１９８２）、参照により本明細書に援用される］を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられるが、これらに限定されないコンピュータプログラムにおいて体系化される。ＢＬＡＳＴプログラムは。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）、および他の供給源［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ２０８９４； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０ （１９９０）］から公的に利用可能である。
【０１４１】
４．５  遺伝子治療
本発明の遺伝子のポリヌクレオチドにおける突然変異は、コードされるタンパク質の正常機能の損失をもたらす。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドの正常活性を回復させるための、あるいは本発明のポリペプチドを含む疾患状態を治療するための遺伝子治療を提供する。本発明のポリペプチドをコードする機能的遺伝子の適切な細胞への送達は、ベクター、より詳細にはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス）を用いてｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで、あるいは物理的なＤＮＡ移入方法（例えば、リポソームまたは化学的処理）を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで達成される。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ， （Ｓｕｐｐｌ．） ３９２ （６６７９）：２５−２０ （１９９８）を参照されたい。遺伝子治療技術に関するさらなる概説に関して、例えばＦｒｉｅｄｍａｎｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１２７５−１２８１ （１９８９）、Ｖｅｒｍａ， Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ：６８−８４ （１９９０）、およびＭｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５７：４５５−４６０ （１９９２）を参照されたい。本発明のヌクレオチドのいずれか１つ、または本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の導入はまた、染色体外基質（一過性の発現）または人工染色体（安定な発現）により達成され得る。また細胞は、増殖のため、またはかかる細胞に対して目的の効果や活性を発揮するために、本発明のタンパク質の存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養されてもよい。次に、処理細胞を、治療目的でｉｎ  ｖｉｖｏで導入することができる。あるいは、他のヒト疾患状態では、本発明のポリペプチドの発現を阻止すること、またはその活性を阻害することが、疾患状態を治療するのに有用であることが考えられる。アンチセンス療法または遺伝子治療は、本発明のポリペプチドの発現をネガティブに調節するのに適用させることが考えられる。
【０１４２】
タンパク質の発現を阻害する方法は、当該技術分野で既知の方法として、本発明の核酸、それらの相補体、またはそれらの翻訳ＲＮＡ配列に対するアンチセンス分子の導入が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、標的欠失方法、または組織特異的なサイレンサのようなネガティブ調節要素の挿入を用いることで阻害することができる。
【０１４３】
本発明はさらには、本発明のポリヌクレオチドを発現するようにｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子操作した細胞を提供し、ここでかかるポリヌクレオチドは、細胞においてポリヌクレオチドの発現を促進する宿主細胞にとって異種の調節配列と作動的に連結している。これらの方法は、本発明のポリヌクレオチドの発現を増加または減少させるのに使用することができる。
【０１４４】
本発明により提供されるＤＮＡ配列の見解により、細胞の改変が内因性ポリペプチドの発現を許容、増加または減少させることが可能である。細胞は、細胞が高レベルでタンパク質を発現するように、全体的または部分的に、天然に存在するプロモーターを、異種プロモーターのすべてもしくは一部で置き換えることで、増加したポリペプチド発現を提供するように、改変させることができる（例えば、相同組換えにより）。異種プロモーターは、所望のタンパク質コード配列に作動的に連結されるように挿入される。例えば、ＰＣＴ国際公開第９４／１２６５０号、ＰＣＴ国際公開第９２／２０８０８号、およびＰＣＴ国際公開第９１／０９９５５号を参照されたい。異種プロモーターＤＮＡのほかに、増幅可能マーカーＤＮＡ（例えば、ａｄａ、ｄｈｆｒ、およびカルバミルリン酸シンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、およびヒドロオロラーゼをコードする多機能性ＣＡＤ遺伝子）、および／またはイントロンＤＮＡが異種プロモーターＤＮＡと一緒に挿入されてもよいことも意図する。所望のタンパク質コード配列に連結される場合、標準的な選定方法によるマーカーＤＮＡの増幅は、細胞における所望のタンパク質コード配列の同時増幅をもたらす。
【０１４５】
本発明の別の実施形態では、細胞および組織は、誘導性調節要素の制御下で、本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように操作されてもよく、この場合、内因性遺伝子の調節配列が、相同組換えにより置き換えられ得る。本明細書中に示すように、遺伝子ターゲッティングを用いて、遺伝子の既存の調節配列を、異なる遺伝子から単離した調節配列、または遺伝子操作方法により合成した新規な調節配列と置き換えることができる。かかる調節配列は、プロモーター、エンハンサー、担体結合領域、ネガティブ調節要素、転写開始部位、調節タンパク質結合部位、または上記配列の組合せから構成され得る。あるいは、生産されるＲＮＡもしくはタンパク質の構造または安定性に影響を及ぼす配列は、ターゲッティングにより置換され得るか、除去され得るか、付加され得るか、または改変され得る。これらの配列としては、ポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定性要素、スプライス部位、タンパク質の輸送もしくは分泌特性を増強または改質するためのリーダー配列、あるいはタンパク質もしくはＲＮＡ分子の機能または安定性を変更あるいは改善する他の配列が挙げられる。
【０１４６】
ターゲッティング事象は、新たな調節配列の制御下に遺伝子を置くこと（例えば、遺伝子の上流に新たなプロモーターもしくはエンハンサー、またはその両方を挿入すること）による、調節配列の簡単な挿入であってもよい。あるいは、ターゲッティング事象は、組織特異的ネガティブ調節要素の欠失のような、調節要素の簡単な欠失であってもよい。あるいは、ターゲッティング事象は、既存の要素を置き換えてもよく、例えば組織特異的エンハンサーを、天然に存在する要素よりも広範であるか、またはそれと異なる細胞型特異性を有するエンハンサーで置き換えることができる。ここで、天然に存在する配列は欠失され、新たな配列が付加される。すべての場合で、ターゲッティング事象の同定は、外因性ＤＮＡが細胞ゲノムに組み込まれた細胞の選択を可能にするターゲッティングＤＮＡと近接する１つまたはそれより多い選択マーカーを用いて促進され得る。ターゲッティング事象の特定はまた、ネガティブ選択マーカーが外因性ＤＮＡに連結されるが、ネガティブ選択マーカーがターゲッティング配列に隣接し、宿主細胞ゲノム中の配列と正確な相同組換え事象がネガティブ選択マーカーの安定な組み込みをもたらさないように配置されるような、ネガティブ選択の特性を示す１つまたはそれより多いマーカー遺伝子を用いて促進されてもよい。この目的で有用なマーカーとしては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、または細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子が挙げられる。
【０１４７】
本発明のこの態様により使用することができる遺伝子ターゲッティングまたは遺伝子活性化技法は、米国特許第５，２７２，０７１号（Ｃｈａｐｐｅｌ）、米国特許第５，５７８，４６１号（Ｓｈｅｒｗｉｎ等）、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９６２７号（国際公開第９３／０９２２２号）（Ｓｅｌｄｅｎ等）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６４３６号（国際公開第９１／０６６６７号）（Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉ等）（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）により詳細に記載されている。
【０１４８】
４．６  トランスジェニック動物
ｉｎ  ｖｉｖｏでの本発明のポリペプチドの生物学的機能を決定する好ましい方法において、本発明により提供される１つまたはそれより多い遺伝子は、相同組換えを用いた動物の生殖細胞系列で過剰発現されるか、または不活性化される［Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １２８８−１２９２ （１９８９）］。遺伝子が、外因性または内因性プロモーター要素の制御下で過剰発現される動物は、トランスジェニック動物として知られている。相同組換えにより内因性遺伝子が不活性化された動物は、「ノックアウト」動物と呼ばれる。ノックアウト動物、好ましくは非ヒト動物は、米国特許第５，５５７，０３２号（参照により本明細書に援用される）に記載されるように調製することができる。トランスジェニック動物は、生物学的プロセス、好ましくは疾患状態で果たす本発明のポリペプチドの役割を決定するのに有用である。トランスジェニック動物は、脂質代謝を調節する化合物を特定するためのモデル系として有用である。トランスジェニック動物、好ましくは非ヒト動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ国際公開第９４／２８１２２号（参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いて生産される。
【０１４９】
本発明のポリヌクレオチドのプロモーターのすべてまたは一部が本発明のポリペプチドの発現のレベルを変更するように活性化または不活性化されたトランスジェニック動物を調製することができる。不活性化は、上述の相同組換え方法を用いて実施することができる。活性化は、タンパク質発現の増加を提供するために、相同プロモーターを補充するか、さらには置き換えることにより達成することができる。相同プロモーターは、特定の組織におけるプロモーター活性化を付与することが知られている１つまたはそれより多い異種エンハンサー要素の挿入により補充することができる。
【０１５０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば相同組換えまたはノックアウト戦略による、機能的幹細胞成長因子様ポリペプチドを発現することができない動物、または幹細胞成長因子様ポリペプチドの変異体を発現する動物の開発を可能とする。かかる動物は、幹細胞成長因子様ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を研究するための、ならびに幹細胞成長因子様ポリペプチドのモジュレータを研究するためのモデルとして有用である。
【０１５１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの本発明のポリペプチドの生物学的機能を決定する好ましい方法において、本発明により提供される１つまたはそれより多い遺伝子は、相同組換えを用いた動物の生殖細胞系列で過剰発現されるか、または不活性化される［Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １２８８−１２９２ （１９８９）］。遺伝子が、外因性または内因性プロモーター要素の制御下で過剰発現される動物は、トランスジェニック動物として知られている。相同組換えにより内因性遺伝子が不活性化された動物は、「ノックアウト」動物と呼ばれる。ノックアウト動物、好ましくは非ヒト動物は、米国特許第５，５５７，０３２号（参照により本明細書に援用される）に記載されるように調製することができる。トランスジェニック動物は、生物学的プロセス、好ましくは疾患状態で果たす本発明のポリペプチドの役割を決定するのに有用である。トランスジェニック動物は、脂質代謝を調節する化合物を特定するためのモデル系として有用である。トランスジェニック動物、好ましくは非ヒト動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ国際公開第９４／２８１２２号（参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いて生産される。
【０１５２】
本発明のポリヌクレオチドのプロモーターのすべてまたは一部が本発明のポリペプチドの発現のレベルを変更するように活性化または不活性化されたトランスジェニック動物を調製することができる。不活性化は、上述の相同組換え方法を用いて実施することができる。活性化は、タンパク質発現の増加を提供するために、相同プロモーターを補充するか、さらには置き換えることにより達成することができる。相同プロモーターは、特定の組織におけるプロモーター活性化を付与することが知られている１つまたはそれより多い異種エンハンサー要素の挿入により補充することができる。
【０１５３】
４．７  ヒト幹細胞成長因子様ポリペプチドの使用および生物活性
幹細胞成長因子様活性を有する本発明のポリペプチドは、細胞成長および形態形成（造血幹細胞成長を含む）、上皮細胞成長および調節、卵胞発達、神経細胞成長の促進、神経細胞集団の維持、軟骨再構築、創傷修復、免疫抑制、および血管再構築に有用であるが、これらに限定されない。したがって、本発明のポリペプチドは、創傷治癒、成長および発達、軟骨成長および発達の調節、血管再構築（血管新生）、免疫抑制、卵胞成長および発達、ならびに神経突起成長および発達により引き起こされるか、またはそれらを含む障害および疾患の予防あるいは治療に使用することができるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドはまた、移植片（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）または上皮移植片（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒａｆｔ）の生産および維持に使用することもできる。
【０１５４】
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、本明細書中で特定される１つまたはそれより多い使用または生物活性（本明細書中で引用したアッセイに関連するものを含む）を示すことが予想される。本発明のタンパク質に関して記載される使用または活性は、かかるタンパク質、またはかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与あるいは使用（例えば、遺伝子治療、またはＤＮＡの導入に適したベクターにおいて）により提供され得る。特定の状態または病理学の基礎となるメカニズムは、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、またはそれらのモジュレータ（活性化剤または阻害剤）が治療を必要とする被験体にとって有用であるかどうかに影響する。したがって、「本発明の治療用組成物」は、本発明の単離されたポリヌクレオチド（組換えＤＮＡ分子、クローニングした遺伝子およびそれらの縮重変異体）またはポリペプチド（完全長タンパク質、成熟タンパク質、およびそれらの切断型またはドメインを含む）、あるいは標的遺伝子／タンパク質発現または標的タンパク質活性のレベルで標的遺伝子産物の活性全体を調節する化合物および他の物質を含む組成物を包含する。かかるモジュレータとしては、ポリペプチド、断片および融合タンパク質を含む類似体（変異体）、抗体および他の結合タンパク質、本発明のポリペプチドを直接もしくは間接的に活性化または阻害する化学化合物（例えば、本明細書中に記載される薬剤スクリーニングアッセイにより特定される）、アンチセンスポリヌクレオチドおよび三重らせん形成に適したポリヌクレオチド、および特に本発明のポリペプチドの１つまたはそれより多いエピトープを特異的に認識する抗体または他の結合パートナーが挙げられる。
【０１５５】
同様に、本発明のポリペプチドは、細胞活性化、または本明細書中に記載される他の生物学的経路に関与され得る。
【０１５６】
４．７．１  研究用途および有用性
本発明により提供されるポリヌクレオチドは、様々な目的で研究団体により使用され得る。ポリヌクレオチドは、分析、特性化または治療用途のために、相当するタンパク質が選択的に発現される（構成的に、あるいは組織分化または発達の特定段階にて、または疾患状態において）組織用マーカーとして、ゲル上の分子量マーカーとして、染色体を特定するため、または関連遺伝子の位置をマッピングするための染色体マーカーあるいはタグ（標識される場合）として、潜在的遺伝病を特定するために患者における内因性ＤＮＡ配列と比較するために、新規関連ＤＮＡ配列をハイブリダイズする、したがってそれを発見するためのプローブとして、遺伝子フィンガープリンティング用のＰＣＲプライマーを誘導するための情報源として、他の新規ポリヌクレオチドを発見するプロセスにおいて既知の配列を「差し引く（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」するためのプローブとして、例えば発現パターンの検査のための「遺伝子チップ」または他の支持体へ結合するためのオリゴマーを選定および作製するために、ＤＮＡ免疫化技法を用いて抗タンパク質抗体を産生するために、また抗ＤＮＡ抗体を産生するか、別の免疫応答を誘発するための抗原として、組換えタンパク質を発現するのに使用することができる。ポリヌクレオチドが別のタンパク質に結合するか、または結合する可能性がある（例えば受容体−リガンド相互作用において）タンパク質をコードする場合、ポリヌクレオチドはまた、結合が行われる他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定するために、あるいは結合相互作用の阻害剤を特定するために、インタラクショントラップアッセイ［例えば、Ｇｙｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ７５：７９１−８０３ （１９９３）に記載されるもののような］で使用することができる。
【０１５７】
本発明により提供されるポリペプチドは同様に、生物活性を決定するためのアッセイにおいて、例えばハイスループットスクリーニング用の複数タンパク質パネルにおいて、抗体を産生するか、または別の免疫応答を誘発するために、生物学的液体中のタンパク質（またはその受容体）のレベルを定量的に測定するように設計したアッセイにおける試薬（標識試薬を含む）として、相当するポリペプチドが優先的に発現される（構成的に、あるいは組織分化または発達の特定段階にて、または疾患状態において）組織用マーカーとして、および当然のことながら相互関係にある受容体またはリガンドを単離するために使用することができる。これらの結合相互作用に関与するタンパク質はまた、結合相互作用のペプチドもしくは小分子阻害剤またはアンタゴニストに関してスクリーニングするのに使用することができる。
【０１５８】
本発明のポリペプチドはまた、幹細胞成長因子様タンパク質と特異的に免疫反応性を有する抗体物質を作製するのにも有用である。本発明のポリペプチドに結合する抗体およびそれらの一部（例えば、Ｆａｂ断片）は、試料中のかかるポリペプチドの存在を特定するのに使用することができる。かかる決定は、任意の免疫アッセイ方式を用いて実施され、抗体が特異的に結合する本発明の任意のポリペプチドは、陽性対照として使用することができる。
【０１５９】
これらの研究有用性のいずれかまたはすべてが、研究産物として商業化のための試薬等級またはキット方式に開発され得る。
【０１６０】
上記に列挙した用途を実施する方法が、当業者に既知である。かかる方法を開示する参照文献としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．， １９８９、およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓ．Ｌ． ａｎｄ Ａ．Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ ｅｄｓ．， １９８７が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
４．７．２  サイトカインおよび細胞増殖／分化活性
本発明のポリペプチドは、サイトカインに関連する活性、細胞増殖（誘発または阻害を含む）または細胞分化（誘発または阻害を含む）活性を示してもよく、あるいはある特定の細胞集団における他のサイトカインの産生を誘発してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、かかる属性を示すポリペプチドをコードすることができる。既知のサイトカインすべてを含む現在までに発見された多くのタンパク質因子が、１つまたはそれより多い因子依存性細胞増殖アッセイにおける活性を示し、したがってアッセイは、サイトカイン活性の利便性のよい確認として作用する。本発明の治療用組成物の活性は、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（プレＢ  Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅ、ＣＭＫ、ＨＵＶＥＣ、およびＣａｃｏを含むが、これらに限定されない細胞系に関する多数のルーチンな因子依存性細胞増殖アッセイのいずれか１つにより立証される。本発明の治療用組成物は、以下のアッセイで使用することができる。
【０１６２】
Ｔ細胞または胸腺細胞増殖に関するアッセイとしては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ． Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｅ．Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ． Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｐｕｂ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （Ｃｈａｐｔｅｒ ３， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ３．１−３．１９； Ｃｈａｐｔｅｒ ７ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ）、Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３４９４−３５００ （１９８６）、Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４５：１７０６−１７１２ （１９９０）、Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １３３：３２７−３４１ （１９９１）、Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：３７７８−３７８３ （１９９２）、およびＢｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：１７５６−１７６１ （１９９４）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
脾細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖に関するアッセイとしては、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｅ．Ｍ． Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊ．Ｅ． ｅ．ａ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｄｓ． Ｖｏｌ １， ｐｐ． ３．１２．１−３．１２．１４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， １９９４、およびＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−ｇ， Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ， Ｒ．Ｄ． Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｊ．Ｅ． ｅ．ａ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｄｓ． Ｖｏｌ １， ｐｐ． ６．８．１−６．８．８， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｒｏｎｔｏ， １９９４に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
造血細胞およびリンパ球産生細胞の増殖および分化に関するアッセイとしては、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｕｒｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４， Ｂｏｔｔｏｍｌｙ， Ｋ．， Ｄａｖｉｓ， Ｌ．Ｓ． ａｎｄ Ｌｉｐｓｋｙ， Ｐ．Ｅ． Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｊ．Ｅ． ｅ．ａ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｄｓ． Ｖｏｌ １， ｐｐ． ６．３．１−６．３．１２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， １９９１、ｄｅＶｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７３．， １２０５−１２１１ （１９９１）、Ｍｏｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３６：６９０−６９２ （１９８８）、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８０：２９３１−２９３８ （１９８３）、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６−Ｎｏｒｄａｎ， Ｒ． Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｄｓ． Ｖｏｌ． １， ｐｐ． ６．６．１−６．６．５， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， １９９１、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｅｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８３：１８５７−１８６１ （１９８６）、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １１−Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｆ．， Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ， Ｊ．， Ｃｌａｒｋ， Ｓ．Ｃ． ａｎｄ Ｔｕｎｅｒ， Ｋ． Ｊ． Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｄｓ． Ｖｏｌ １， ｐｐ．６．１５．１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， １９９１、Ｍｅｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ９−Ｃｉａｒｌｅｔｔａ， Ａ．， Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ， Ｊ．， Ｃｌａｒｋ， Ｓ．Ｃ． ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ， Ｋ． Ｊ． Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｄｓ． Ｖｏｌ １， ｐｐ． ６．１３．１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， １９９１に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
抗原に対するＴ細胞クローン応答に関するアッセイ（増殖およびサイトカイン産生を測定することにより、とりわけＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用ならびに直接的Ｔ細胞の影響に影響を及ぼすタンパク質を特定する）としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ． Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｅ．Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ． Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｐｕｂ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （Ｃｈａｐｔｅｒ ３， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ； Ｃｈａｐｔｅｒ ６， Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ； Ｃｈａｐｔｅｒ ７， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ）、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｄｃｉ． ＵＳＡ， ７７：６０９１−６０９５ （１９８０）、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎ．， １１：４０５−４１１ （１９８１）、Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３７：３４９４−３５００ （１９８６）、Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ，ｍ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４０：５０８−５１２ （１９８８）に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６６】
４．７．３  幹細胞成長因子活性
本発明のポリペプチドは、幹細胞成長因子活性を示してもよく、また始原生殖細胞、胚幹細胞、造血幹細胞、および／または生殖細胞系幹細胞を含む多能性および全能性細胞の増殖、分化ならびに生存に関与され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの幹細胞への本発明のポリペプチドの投与は、損傷した組織または罹患した組織の再操作、移植、バイオ医薬品の製造、およびバイオセンサの開発に有用な全能性または多能性状態で、細胞集団を維持および拡大し得る。大量のヒト細胞を生産する能力は、非ヒト供給源またはドナーから現在得られるにちがいないヒトタンパク質の産生、パーキンソン病、アルツハイマー病、および他の神経変性疾患のような疾患の治療のための細胞移植、骨髄、皮膚、軟骨、腱、骨、筋肉（心筋を含む）、血管、角膜、神経細胞、胃腸細胞等のような移植用の組織、ならびに腎臓、肝臓、膵臓（島細胞を含む）、心臓および肺のような移植用の臓器用の重要な実用的用途を有する。
【０１６７】
所望の影響を達成するために、本明細書中に列挙した成長因子のいずれか、他の幹細胞維持因子を含む、具体的には幹細胞因子（ＳＣＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３）、インターロイキンのいずれか、ＩＬ−６に融合された組換え可溶性ＩＬ−６受容体、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、血小板第４因子（ＰＦ−４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む複数の異なる外因性成長因子および／またはサイトカインを、本発明のポリペプチドと併用して投与してもよいことが意図される。
【０１６８】
全能性幹細胞は、事実上任意の成熟細胞型を生じることができるため、培養でのこれらの細胞の増幅は、大量の成熟細胞の産生を促進する。幹細胞を培養する技法は、当該技術分野で既知であり、任意に他の成長因子および／またはサイトカインとともに本発明のポリペプチドを投与することにより、幹細胞集団の生存および増殖を増大することが期待される。これは、培地に本発明のポリペプチドを直接投与することにより達成することができる。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた間質細胞は、培養において、またはｉｎ  ｖｉｖｏで、幹細胞集団用の支持細胞層として使用することができる。支持細胞層用の間質支持細胞としては、胚骨髄線維芽細胞、骨髄間質細胞、胎児肝臓細胞、または培養胚線維芽細胞が挙げられ得る（米国特許第５，６９０，９２６号を参照）。
【０１６９】
幹細胞自体は、本発明のポリペプチドの自己分泌発現を誘発するために、本発明のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることができる。これにより、それ自体有用であるか、または続いて所望の成熟細胞型に分化することができる未分化全能性／多能性幹細胞系の生成が可能となる。これらの安定な細胞系はまた、ポリメラーゼ連鎖反応実験用のｃＤＮＡライブラリーおよび鋳型を創出するための、未分化全能性／多能性ｍＲＮＡの供給源として作用することができる。これらの研究により、幹細胞増殖および／または維持を調節する幹細胞集団において差次的に発現される遺伝子の単離および特定が可能となる。
【０１７０】
全能性幹細胞集団の増幅および維持は、多くの病理学的状態の治療に有用である。例えば、本発明のポリペプチドは、疾病、自己免疫疾患、事故による損傷、または遺伝病により損傷した細胞を増強するか、あるいは置き換えるのに使用することができる神経上皮細胞を生じるように、培養において幹細胞を操作するのに使用され得る。本発明のポリペプチドは、神経細胞の増殖を誘発するのに、また神経および脳組織の再生に、すなわち中枢神経系および末梢神経系疾患ならびに神経障害、ならびに神経細胞もしくは神経組織に対する変性、死または外傷を含む機械的および外傷性障害に治療に有用であり得る。さらに、これらの細胞は、移植に使用することができる皮膚組織のような他の分化細胞を形成するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。さらに、増幅した幹細胞集団はまた、遺伝子治療の目的で、また移植または組織移植後の置換組織の宿主拒絶を減少するために、遺伝的に改変させることもできる。
【０１７１】
本発明のポリペプチドの発現、および幹細胞に対するその影響はまた、より分化した細胞型への制御された幹細胞の分化を達成するように操作され得る。未分化幹細胞集団から特定の分化細胞型を有する純粋な集団を得る広範に適用可能な方法は、選択マーカーを駆動する細胞型特異的プロモーターの使用を含む。選択マーカーは、所望の型を有する細胞のみを生存させることが可能である。例えば、幹細胞は、心筋細胞［Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ４８：１７３−１８２， ）１９９１）； Ｋｌｕｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９８（１）：２１６−２２４， （１９９８）］、または骨格筋細胞［Ｂｒｏｗｄｅｒ， Ｌ．Ｗ． Ｉｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｄｓ． Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９７）］に分化するように誘発させることができる。あるいは、幹細胞の指向性分化は、レチノイン酸、および内因性幹細胞因子活性の影響を阻害し、分化を進行させることが可能な本発明のポリペプチドのアンタゴニストのような分化因子の存在下で幹細胞を培養することで達成され得る。
【０１７２】
幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物は、本発明のポリペプチドが幹細胞成長因子活性を示すかどうかを決定するのに使用することができる。幹細胞は、様々な細胞源（造血幹細胞および胚幹細胞を含む）のいずれか１つから単離され、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９２：７８４４−７８４８ （１９９５）に記載されるように、本発明のポリペプチド単独の存在下で、あるいは他の成長因子またはサイトカインと併用して、支持細胞層上で培養される。本発明のポリペプチドの、幹細胞増殖を誘発する能力は、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ７７：２３１６−２３２１ （１９９１）に記載されるように、半固体支持体上のコロニー形成により決定される。
【０１７３】
４．７．４  造血調節活性
本発明のポリペプチドは、造血の調節に、したがって骨髄性細胞またはリンパ系細胞障害の治療に関与され得る。コロニー形成細胞または因子依存性細胞系を支持する最低限の生物活性でさえ、造血の調節、例えば単独または他のサイトカインと併用した赤血球前駆細胞の成長および増殖の支持への関与を示し、それにより、例えば様々な貧血の治療における、あるいは赤血球前駆細胞および／または赤血球細胞の産生を刺激するための照射／化学療法と併用した使用のための、例えば必然的な骨髄抑制を阻止または治療するための化学療法と併用して有用な顆粒球および単球／マクロファージのような骨髄性細胞の成長ならびに増殖（すなわち、伝統的なコロニー刺激因子活性）を支持する際の、巨核球、したがって血小板の成長および増殖を支持する（それにより血小板減少症のような様々な血小板障害の阻止または治療を可能にする）際の、および上述の造血細胞のいずれかおよびすべてに成熟することが可能であり、したがって様々な幹細胞障害（再生不良性貧血、および発作性夜間血色素尿症が挙げられるが、これらに限定されない、通常移植で治療されるもののような）における治療上の有用性を有する造血幹細胞の成長および増殖を支持する際の、ならびに正常細胞または遺伝子治療用に遺伝子操作した細胞として、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで照射／化学療法後のすなわち、骨髄移植または末梢前駆細胞移植（同種または異種）と併用した）幹細胞区画の調節の際の有用性を示す。
【０１７４】
本発明の治療用組成物は、以下のアッセイで使用することができる：
【０１７５】
様々な造血系の増殖および分化に適したアッセイについて上述している。
【０１７６】
胚幹細胞分化に関するアッセイ（とりわけ、胚分化造血に影響を与えるタンパク質を特定する）としては、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １５：１４１−１５１， １９９５、Ｋｅｌｌａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：４７３−４８６ （１９９３）、ＭｃＣｌａｎａｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８１：２９０３−２９１５ （１９９３）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７７】
幹細胞生存および分化（とりわけ、リンパ性造血を調節するタンパク質を特定する）に関するアッセイとしては、Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｓｓａｙｓ， Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｍ．Ｇ． Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ． Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． Ｖｏｌ ｐｐ． ２６５−２６８， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｍ．Ｙ． １９９４、Ｈｉｒａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５８０７−５９１１ （１９２２）、Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ， ＭｃＮｉｅｃｅ， Ｉ．Ｋ． ａｎｄ Ｂｒｉｄｄｅｌｌ， Ｒ．Ａ． Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ． Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． Ｖｏｌ ｐｐ． ２３−２９， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １９９４、Ｎｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ２２：３５３−３５９ （１９９４）、Ｃｏｂｂｌｅｓｔｏｎｅ ａｒｅａ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ， Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ， Ｒ．Ｅ． Ｉｎ Ｃｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ． Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． Ｖｏｌ ｐｐ．１−２１， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｙ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １９９４、Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ， Ｓｐｏｏｎｃｅｒ， Ｅ．， Ｄｅｘｔｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ａｌｌｅｎ， Ｔ． Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ． Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． Ｖｏｌ ｐｐ． １６３−１７９， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｙ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １９９４、Ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ， Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ， Ｈ．Ｊ． Ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ． Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ． Ｖｏｌ ｐｐ． １３９−１６２， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｙ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １９９４に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
４．７．５  組織成長活性
本発明のポリペプチドはまた、骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織成長あるいは再生、ならびに創傷治癒、および組織修復および置換、ならびに火傷、切開および潰瘍の治癒に関与され得る。
【０１７９】
骨が正常に形成されない状況で軟骨および／骨成長を誘発する本発明のポリペプチドは、ヒトおよび他の動物において、骨折および軟骨損傷または欠陥の治癒での用途がある。本発明のポリペプチド、抗体、結合パートナー、または他のモジュレータの組成物は、閉鎖骨折ならびに開放骨折の低減、また人工関節の固定の改善において、予防的用途があり得る。骨形成剤により誘発されるデノボ骨形成は、先天性の外傷誘発性または腫瘍学的切除誘発性頭蓋顔面欠陥の修復に寄与し、また美容整形術においても有用である。
【０１８０】
本発明のポリペプチドはまた、骨形成細胞の誘引、骨形成細胞の成長の刺激、または骨形成細胞の前駆体の分化の誘発に関与され得る。例えば骨および／または軟骨修復の刺激によるか、または炎症もしくは炎症プロセスにより媒介される組織破壊プロセスの阻止（コラゲナーゼ活性、骨芽細胞活性等）による骨粗鬆症、変形性関節症、骨変性障害、または歯周病の治療もまた、本発明を用いて可能であり得る。
【０１８１】
本発明のポリペプチドを含む組織再生活性の別のカテゴリーは、腱／靭帯の形成である。以下の組織が正常に形成される状況における腱／靭帯様組織の誘発、または他の組織形成は、ヒトおよび他の動物における腱または靭帯の断裂、変形、および他の腱または靭帯の欠陥の治癒における用途がある。腱／靭帯様組織誘発タンパク質を用いたかかる調製物は、腱または靭帯組織に対する損傷の防止における予防的用途、ならびに骨もしくは他の組織に対する腱または靭帯の固定の改善、および腱または靭帯組織に対する欠陥の修復における用途があり得る。本発明の組成物により誘発されるデノボ腱／靭帯様組織形成は、先天性の外傷誘発性または他の腱もしくは他の起源の靭帯欠陥の修復に寄与し、また腱もしくは靭帯の付着または修復のための美容整形術においても有用である。本発明の組成物は、腱もしくは靭帯形成細胞を付着するための、腱もしくは靱帯形成細胞の成長を刺激するための、腱もしくは靭帯形成細胞の前駆体の分化を誘発するための、またはｉｎ  ｖｉｖｏに戻して組織修復を行うためのｅｘ  ｖｉｖｏでの腱／靭帯細胞もしくは前駆体の成長を誘発するための環境を提供し得る。本発明の組成物はまた、腱炎、手根管症候群、および他の腱または靭帯の欠陥の治療においても有用であり得る。組成物はまた、当該技術分野で既知であるように、キャリアとして適切なマトリックスおよび／または金属イオン封鎖剤を含んでもよい。
【０１８２】
本発明の組成物はまた、神経細胞の増殖、神経および脳組織の再生、すなわち中枢神経系および末梢神経系疾患および神経障害、ならびに神経細胞もしくは神経組織に対する変性、死または外傷を含む機械的および外傷性障害に治療に有用であり得る。より具体的には、組成物は、末梢神経障損傷、末梢神経障害および限局性神経障害のような末梢神経系の疾患、およびアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群のようは中枢神経系疾患の治療に使用され得る。さらに、本発明により治療され得る状態としては、脊髄障害、頭部外傷ならびに発作のような脳血管疾患のような、機械的および外傷性障害が挙げられる。化学療法または他の医療に起因する末梢神経障害も、本発明の組成物を用いて治療可能であり得る。
【０１８３】
本発明の組成物はまた、圧迫性潰瘍、血管不全に関連した潰瘍、手術による創傷および外傷性創傷等を含むが、これらに限定されない、非治癒性創傷のより良好な、あるいはより迅速な閉鎖を促進するのに有用であり得る。
【０１８４】
本発明の組成物は、臓器（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、および血管（血管内皮を含む）組織のような他の組織の生成または再生に、あるいはかかる組織を含む細胞の成長を促進するために包含され得る。線維性瘢痕の阻害または調節による所望の効果の一部は、正常組織が再生することを可能にする。本発明のポリペプチドはまた、血管新生活性を示してもよい。
【０１８５】
本発明の組成物はまた、腸の保護、または肺もしくは肝臓線維症、様々な組織における再灌流障害、および全身性サイトカイン損傷に起因する状態の再生ならびに治療に有用であり得る。
【０１８６】
本発明の組成物は、前駆組織もしくは細胞からの上述の組織の分化を促進または阻害するのに、あるいは上述の組織の成長を阻害するのに有用であり得る。
【０１８７】
また、本発明の治療用組成物は、以下のアッセイに使用することができる：
【０１８８】
組織生成活性に関するアッセイとしては、国際特許公開第９５／１６０３５号（骨、軟骨、腱）、国際特許公開第９５／０５８４６号（神経、ニューロン）、国際特許公開第９１／０７４９１号（皮膚、内皮）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
創傷治癒活性に関するアッセイとしては、Ｗｉｎｔｅｒ， Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ， ｐｐ． ７１−１１２ （Ｍａｉｂａｃｈ， Ｈ．Ｉ． ａｎｄ Ｒｏｖｅｅ， Ｄ．Ｔ．， ｅｄｓ．）， Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｃｈｉｃａｇｏ（Ｅａｇｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｍｅｒｔｚ， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ， ７１：３８２−８４ （１９７８）により修正）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
４．７．６．  免疫機能刺激または抑制活性
本発明のポリペプチドはまた、そのアッセイについて本明細書中に記載されている活性を含むが、これらに限定されない免疫刺激または免疫抑制活性を示し得る。本発明のポリヌクレオチドは、かかる活性を示すポリペプチドをコードすることができる。タンパク質は、様々な免疫不全および障害（重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）を含む）の治療において、例えば、Ｔおよび／またはＢリンパ球の成長および増殖を調節（アップレギュレートまたはダウンレギュレート）する際に、ならびにＮＫ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性を達成する際に有用であり得る。これらの免疫不全は、遺伝性であったり、またはウイルス（例えばＨＩＶ）ならびに細菌もしくは真菌感染により引き起こされたり、あるいは自己免疫障害に起因したりする。より具体的には、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、マラリア種による感染、およびカンジダ症のような様々な真菌ウイルスを含む、ウイルス、細菌、真菌または他の感染により引き起こされる感染性疾患は、本発明のタンパク質を用いて治療可能であり得る。当然のことながら、本発明のタンパク質はまた、免疫系に対するブーストが望ましい可能性がある場合に、すなわち癌治療において有用であり得る。
【０１９１】
本発明のタンパク質を用いて治療され得る自己免疫疾患としては、例えば、結合組織疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、自己免疫肺性炎症、ギヤン−バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、対宿主性移植片病、および自己免疫炎症性眼病が挙げられる。本発明のかかるタンパク質（または抗体を含むそれらのアンタゴニスト）はまた、喘息（特にアレルギー喘息）や他の呼吸器系の問題、アレルギー反応および状態（例えば、アナフィラキシー、血清病、薬剤反応、食物アレルギー、昆虫毒アレルギー、肥満、アレルギー性鼻炎、過敏性肺炎、じんま疹、血管性水腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、多形性紅斑、スティーヴンズ−ジョンソン症候群、アレルギー性結膜炎、萎縮性角結膜炎、性病性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、および接触アレルギー）の治療に有用であり得る。免疫抑制が望ましい他の状態（例えば、臓器移植を含む）もまた、本発明のタンパク質（またはそれらのアンタゴニスト）で治療可能であり得る。ポリペプチドまたはそのアンタゴニストの、アレルギー反応に対する治療効果は、累積接触増強試験（Ｌａｓｔｂｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ， １２５：５９−６６ （１９８８））、皮膚プリック試験（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｌｅｒｇｙ， ５４： ４４６−５４ （１９９９））、モルモット皮膚感作試験（Ｖｏｈｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｔｏｘｏｃｏｌ．， ７３：５０１−９）、およびマウス局所リンパ節アッセイ（Ｋｉｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｈｅａｌｔｈ， ５３：５６３−７９）のようなｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにより評価することができる。
【０１９２】
本発明のタンパク質を用いて、多数の方法で、免疫応答を調節することも可能である。ダウンレギュレーションは、すでに進行中の免疫応答を阻害または阻止する形態であってもよく、あるいは免疫応答の誘発を防止してもよい。活性Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞応答を抑制することにより、またはＴ細胞における特定の許容性を誘発することにより、あるいはその両方により阻害され得る。Ｔ細胞応答の免疫抑制は一般に、活性な抗原非特異的な、抑制剤へのＴ細胞の連続暴露を要するプロセスである。Ｔ細胞における非応答性またはアネルギーの誘発を含む許容性は、それが概して抗原特異的であるという点で、免疫抑制と識別可能であり、寛容化剤へのＴ細胞の暴露をやめた後に持続する。操作上、許容性は、寛容化剤の非存在下に特定の抗原への再暴露時のＴ細胞応答の欠如により実証され得る。
【０１９３】
１つまたはそれより多い抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えば、Ｂ７のような）ただしこれに限らない）をダウンレギュレートまたは防止すること、例えば活性Ｔ細胞による高レベルリンホカイン合成を防止することは、組織、皮膚、および臓器の移植の状況で、また対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）で有用である。例えば、Ｔ細胞機能の阻止は、組織移植における組織破壊の減少をもたらすはずである。通常、組織移植片では、移植片の拒絶は、Ｔ細胞により外来物としてのその認識に開始され、続いて移植片を破壊する免疫反応が起きる。本発明の治療用組成物の投与は、Ｔ細胞のような免疫細胞によるサイトカイン合成を防止してもよく、したがって免疫抑制剤として作用する。さらに、同時刺激の欠如はまた、Ｔ細胞をアナジーとする（ａｎｅｒｇｉｚｅ）に十分であり得て、それにより被験体において許容性を誘発する。Ｂリンパ球抗原阻止試薬による長期許容性の誘発は、これらの阻止試薬の繰り返し投与の必要性を回避し得る。被験体において十分な免疫抑制または許容性を達成するために、Ｂ細胞リンパ球抗原の組み合わせの機能を阻止することが必要である場合もある。
【０１９４】
臓器移植片拒絶またはＧＶＤＨを防止する際の特定の治療用組成物の有効性は、ヒトにおける有効性を予測する動物モデルを用いて評価することができる。使用することができる適切な系の例としては、ラットにおける同種異系心臓移植片、およびマウスにおける異種膵島細胞移植片が挙げられ、その両方が、Ｌｅｎｓｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−７９２ （１９９２）、およびＴｕｒｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８９：１１１０２−１１１０５ （１９９２）に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免疫抑制効果を検査するのに使用されている。さらに、ＧＶＨＤのマウスモデル［Ｐａｕｌ ｅｄ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｒｏｋ， １９８９， ｐｐ． ８４６−８４７参照］は、当該疾患の発達に対する本発明の治療用組成物の影響を決定するのに使用することができる。
【０１９５】
抗原機能の阻止はまた、自己免疫疾患を治療するのに治療上有用であり得る。多くの自己免疫障害は、自己組織に対して反応性であり、疾患の病理学に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するＴ細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化の防止は、病状を減少または排除し得る。Ｔ細胞の刺激を阻止する試薬の投与は、Ｔ細胞活性化を阻害し、疾患プロセスに関与され得る自己抗体またはＴ細胞由来サイトカインの産生を防止するのに使用することができる。さらに、阻止試薬は、疾患からの長期軽減を招くことができる自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的許容性を誘発し得る。自己免疫障害を防止または軽減する際の阻止試薬の有効性は、ヒト自己免疫疾患の多数の十分に特性化された動物モデルを用いて決定することができる。例としては、マウス実験用自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける糖尿病、ならびにマウス実験用筋無力症が挙げられる［Ｐａｕｌ ｅｄ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９， ｐｐ． ８４０−８５６を参照］。
【０１９６】
免疫応答をアップレギュレートする手段としての抗原機能（例えば、Ｂリンパ球抗原機能）のアップレギュレーションもまた、治療において有用であり得る。免疫応答のアップレギュレーションは、既存の免疫応答を増強するか、または初期免疫応答を誘発する形態であり得る。例えば、免疫応答の増強は、インフルエンザ、感冒、および脳炎のような全身性ウイルス疾患を含むウイルス感染の場合に有用であり得る。
【０１９７】
あるいは、抗ウイルス免疫応答は、患者からＴ細胞を取り出すことと、本発明のペプチドを発現するか、または本発明の刺激形態の可溶性ペプチドを有するウイルス抗原パルスＡＰＣにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を同時刺激することと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＴ細胞を患者に再導入することとにより、感染患者において高められ得る。抗ウイルス免疫応答を増強する別の方法は、患者から感染細胞を単離し、細胞がそれらの表面上でタンパク質のすべてまたは一部を発現するように、本明細書中に記載するような本発明のタンパク質をコードする核酸でそれらをトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を患者に再導入することである。ここで感染細胞は、同時刺激シグナルを、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞に送達することが可能であり、それによりｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞を活性化することが可能である。
【０１９８】
本発明のポリペプチドは、トランスフェクトした腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を誘発するために、Ｔ細胞に対して必要な刺激シグナルを提供し得る。さらに、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠如するか、あるいは十分量のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現することができない腫瘍細胞を、ＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質およびｂ２ミクログロブリンタンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩα鎖タンパク質およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖タンパク質のすべてまたは一部（例えば、細胞質ドメイン切断型部分）をコードする核酸でトランスフェクトして、それにより細胞表面上でＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現することができる。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドと併せた適切なクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣの発現は、トランスフェクトした腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する。任意に、不変鎖のようなＭＨＣクラスＩＩ関連タンパク質の発現を阻止するアンチセンス構築物をコードする遺伝子はまた、腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫性を誘発する、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＡＮで同時トランスフェクトすることができる。したがって、ヒト被験体におけるＴ細胞媒介性免疫応答の誘発は、被験体における腫瘍特異的許容性を克服するのに十分であり得る。
【０１９９】
本発明のタンパク質の活性は、他の手段の中でも、以下の方法により測定され得る。
【０２００】
胸腺細胞または脾細胞細胞障害性に関する適切なアッセイとしては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ． Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｅ．Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ． Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｐｕｂ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｅｓｃｉｅｎｃｅ （Ｃｈａｐｔｅｒ ３， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ３．１−３．１９； Ｃｈａｐｔｅｒ ７， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ）、Ｈｅｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７８：２４８８−２４９２ （１９８１）、Ｈｅｒｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２８：１９６８−１９７４ （１９８２）、Ｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３５：１５６４−１５７２ （１９８５）、Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｉ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３７：３４９４−３５００ （１９８６）、Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４０：５０８−５１２ （１９８８）、Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ６１：１９９２−１９９８、Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １３３：３２７−３４１ （１９９１）、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５３：３０７９−３０９２ （１９９４）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプ転換（とりわけＴ細胞依存性抗体応答を調節し、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響を及ぼすタンパク質を同定する）に関するアッセイとしては、Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４：３０２８−３０３３ （１９９０）に記載されるもの、およびＢ細胞機能に関するアッセイ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｍｏｎｄ， Ｊ．Ｊ． ａｎｄ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ， Ｍ． Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｊ． Ｅ． ｅ．ａ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｄｓ． Ｖｏｌ １， ｐｐ． ３．８．１−３．８．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， １９９４）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２０２】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（とりわけ主にＴｈ１およびＣＴＬ応答を生成するタンパク質を同定する）としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ． Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ， Ｅ．Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ． Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｐｕｂ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （Ｃｈａｐｔｅｒ ３， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ３．１−３．１９； Ｃｈａｐｔｅｒ ７， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ）、Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３７：３４９４−３５００ （１９８６）、Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４０：５０８−５１２ （１９８８）、Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：３７７８−３７８３ （１９９２）に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２０３】
樹状細胞依存性アッセイ（とりわけ自然Ｔ細胞を活性化する樹状細胞により発現されるタンパク質を同定する）としては、Ｇｕｅｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３４：５３６−５４４ （１９９５）、Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １７３：５４９−５５９ （１９９１）、Ｍａｃａｔｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５４：５０７１−５０７９ （１９９５）、Ｐｏｒｇａｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １８２：２５５−２６０ （１９９５）、Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ６７：４０６２−４０６９ （１９９３）、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６４：９６１−９６５ （１９９４）、Ｍａｃａｔｏｎｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｐｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６９：１２５５−１２６４ （１９８９）、Ｂｈａｒｄｗａｊ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ９４：７９７−８０７ （１９９４）、およびＩｎａｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １７２：６３１−６４０ （１９９０）に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２０４】
リンパ球生存／アポトーシスに関するアッセイ（とりわけスーパー抗原誘発後のアポトーシスを防止するタンパク質、およびリンパ球ホメオスタシスを調節するタンパク質を同定する）としては、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １３：７９５−８０８ （１９９２）、Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ７：６５９−６７０ （１９９３）、Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５３：１９４５−１９５１ （１９９３）、Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ６６：２３３−２４３ （１９９１）、Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １４５：４０３７−４０４５ （１９９０）、Ｚａｍ ａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， １４：８９１−８９７ （１９９３）、Ｇｏｒｃｚｙｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １：６３９−６４８ （１９９２）に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２０５】
Ｔ細胞収容（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）および発達の初期工程に影響を与えるタンパク質に関するアッセイとしては、Ａｎｔｉｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ８４：１１１−１１７ （１９９４）、Ｆｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５５：１１１−１１２ （１９９４）、Ｇａｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ８５：２７７０−２７７８ （１９９５）、Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：７５４８−７５５１ （１９９１）に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２０６】
４．７．７  走化性／ケモキネシス活性
本発明のポリペプチドは、例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮および／または内皮細胞などの哺乳動物細胞の走化性またはケモキネシス活性に関与され得る。本発明のポリヌクレオチドは、かかる属性を示すポリペプチドをコードすることができる。走化性およびケモキネシス受容体活性化は、所望の作用部位に、所望の細胞集団を動員または誘引するのに使用することができる。走化性またはケモキネシス組成物（例えば、本発明のタンパク質、抗体、結合パートナー、またはモジュレータ）は、組織の創傷および他の外傷の治療において、ならびに限局性感染の治療において特定の利点を提供する。例えば、リンパ球、単球、または好中球の、腫瘍または感染部位への誘引は、腫瘍または感染性作用物質に対する免疫応答の改善をもたらす。
【０２０７】
タンパク質またはペプチドは、それがかかる細胞集団の指向性配向または移動を直接的あるいは間接的に刺激することができる場合に、特定の細胞集団に対する走化性活性を有する。好ましくは、タンパク質またはペプチドは、細胞の指向性移動を直接的に刺激する能力を有する。特定のタンパク質が細胞の集団に対する走化性活性を有するかどうかは、細胞走化性に関する任意の既知のアッセイにおいて、かかるタンパク質またはペプチドを使用することで容易に決定することができる。
【０２０８】
本発明の治療用組成物は、以下のアッセイで使用することができる：
【０２０９】
走化性活性に関するアッセイ（走化性を誘導または防止するタンパク質を同定する）は、タンパク質の、膜を通っての細胞の遊走を誘導する能力、ならびにタンパク質の、ある細胞集団の別の細胞集団への接着を誘導する能力を測定するアッセイから構成される。遊走および接着に適したアッセイとしては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ．Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ． Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ， Ｅ．Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ． Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｐｕｂ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （Ｃｈａｐｔｅｒ ６．１２， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ６．１２．１−６．１２．２８）、Ｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９５：１３７０−１３７６ （１９９５）、Ｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．， ＡＰＭＩＳ， １０３：１４０−１４６ （１９９５）、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２５：１７４４−１７４８、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５８６０−５８６７ （１９９４）、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５３：１７６２−１７６８ （１９９４）に記載されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２１０】
４．７．８  止血性および血栓溶解性活性
本発明のポリペプチドはまた、止血製または血栓溶解性または血栓症に関与され得る。本発明のポリヌクレオチドは、かかる属性を示すポリペプチドをコードすることができる。組成物は、様々な凝固障害（血友病のような遺伝性障害を含む）の治療において、あるいは外傷、手術または他の原因に起因する創傷を治療する際に凝固および他の止血事象を高めるために有用であり得る。本発明の組成物はまた、血栓症の形成を溶解または阻害するのに、またそれら（例えば、心臓系および中枢神経系の血管の亀裂（ｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ））に起因する症状（例えば、発作）のの治療および防止に有用であり得る。
【０２１１】
本発明の治療用組成物は、以下のアッセイで使用することができる。
【０２１２】
止血性および血栓溶解性活性に関するアッセイとしては、Ｌｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ２６：１３１−１４０ （１９８６）、Ｂｕｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．， ４５：４１３−４１９ （１９８７）、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ， ５：７１−７９ （１９９１）、およびＳｃｈａｕｂ， Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ３５：４６７−４７４ （１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１３】
４．７．９  癌診断および治療
本発明のポリペプチドは、癌細胞生成、増殖または転移に関与され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの存在または量の検出は、１つまたはそれより多いタイプの癌の診断および／または予後に有用であり得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの存在または増加された発現は、癌の遺伝的危険性、前癌状態、または進行中の悪性疾患を示し得る。逆に、本発明のポリペプチドの遺伝子における欠陥、またはそれらの非存在が、癌状態に関連され得る。癌に関連する一塩基多型、あるいは癌に対する素因の特定は、また診断または予後に有用であり得る。
【０２１４】
癌治療は、腫瘍細胞増殖の阻害、血管新生（腫瘍成長を支持するのに必要な新規血管の成長）の阻害、および／または腫瘍細胞の運動性および侵襲性を低減することによる転移の阻止により、腫瘍の後退を促進する。本発明の治療用組成物は、固相腫瘍／悪性疾患、局所進行性腫瘍、ヒト軟部組織肉腫、転移性癌（リンパ転移を含む）、血球悪性疾患（多発性骨髄腫を含む）、急性および慢性白血病、およびリンパ腫、頭部および頸部癌（口腔癌を含む）、喉頭癌および甲状腺癌、肺癌（小細胞癌および非小細胞癌を含む）、乳癌（小細胞癌および腺管癌を含む）、胃腸癌（食道癌、胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、および結腸直腸新形成に関連したポリープを含む）、膵臓癌、肝臓癌、泌尿器系癌（膀胱癌および前立腺癌を含む）、女性性器路の悪性疾患（卵巣癌、子宮（子宮内膜を含む）癌、および卵胞中の固形腫瘍を含む）、腎臓癌（腎細胞癌を含む）、脳癌（内因性脳腫瘍を含む）、神経芽腫、星状細胞脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞浸潤、骨癌（骨腫を含む）、皮膚癌（悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、扁平上皮癌、基底細胞癌を含む）、管周囲細胞腫、およびカポージ肉腫を含む、成人および小児腫瘍学で有効であり得る。
【０２１５】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドのモジュレータ（本発明のポリペプチドの生物活性を有する阻害剤および刺激剤を含む）を投与して、癌を治療してもよい。治療用組成物は、単独で、あるいは手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、およびレーザ療法のような補助的癌療法と併用して、治療上有効な投与量で投与することができ、有益な効果、例えば腫瘍サイズの減少、腫瘍成長速度の減速、転移の阻害、あるいはそうでなければ癌を根絶する必要性のない臨床状態全体の改善を提供し得る。
【０２１６】
組成物はまた、抗癌カクテルの一部として、治療上有効な量で投与することができる。抗癌カクテルは、本発明のポリペプチドまたはモジュレータと、薬学的に許容可能な送達用キャリアのほかに、１つまたはそれより多い抗癌薬剤との混合物である。抗癌カクテルの癌治療薬としての使用はルーチンである。当該技術分野で既知であり、本発明のポリペプチドまたはモジュレータと併用して治療薬として使用することができる抗癌薬としては、アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブルスファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）、シクロホスファミド、シタラビンＨＣＬ（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ドキソルビシンＨＣＬ、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（Ｖ１６−２１３）、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンα２ａ、インターフェロンα２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、ロムスチン、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート（ＭＴＸ）、マイトマイシン、ミトザントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、アムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン、インターロイキン−２、ミトグアゾン、ペントスタチン、セムスチン、テニポシド、および硫酸ビンデシンが挙げられる。
【０２１７】
さらに、本発明の治療用組成物は、癌の予防的処理に使用され得る。個体に癌を発生させやすくしている当該技術分野で既知の遺伝的状態および／または環境状況（例えば、発癌物質への暴露）が存在する。これらの条件下では、癌を発生させる危険性を減少するために、治療上有効な用量の本発明のポリペプチドを用いてこれらの患者を処置することが有用であり得る。
【０２１８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、潜在的癌治療としての本発明のポリペプチドの有効な用量を決定するのに使用することができる。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしては、培養腫瘍細胞の増殖アッセイ、軟質寒天における培養細胞の成長（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， （１９８７） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， Ｗｉｌｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ Ｃｈ １８ ａｎｄ Ｃｈ ２１を参照）、Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎ． Ｉｎｓｔ．， ５２：９２１−３０ （１９７４）に記載されるようなヌードマウスにおける腫瘍系、Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １７：４１０７−９ （１９９７）に記載されるようなＢｏｙｄｅｎチャンバアッセイにおける腫瘍細胞の移動性および浸潤潜在能力、ならびにそれぞれＲｉｂａｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．， ４０：１１８９−９７ （１９９９）、およびＬｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ， １７：４２３−９ （１９９９）に記載されるようなヒヨコ絨毛尿膜の血管新生の誘発または血管内皮細胞遊走の誘発のような血管新生アッセイが挙げられる。適切な腫瘍細胞系は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎカタログから入手可能である。
【０２１９】
４．７．１０  受容体／リガンド活性
本発明のポリペプチドはまた、受容体、受容体リガンド、または受容体／リガンド相互作用の阻害剤もしくはアゴニストを明示し得る。本発明のポリヌクレオチドは、かかる特性を示すポリペプチドをコードすることができる。かかる受容体およびリガンドの例としては、サイトカイン受容体およびそのリガンド、受容体キナーゼおよびそのリガンド、受容体ホスファターゼおよびそのリガンド、細胞−細胞相互作用に関与した受容体およびそのリガンド（細胞接着分子（セレクチン、インテグリンおよびそのリガンドのような）を含むが、これらに限定されない）、ならびに抗原提示、抗原認識、および細胞性免疫応答および体液性免疫応答の発生に関与した受容体／リガンド対が挙げられるが、これらに限定されない。受容体およびリガンドはまた、関連受容体／リガンド相互作用の潜在的ペプチドまたは小分子阻害剤のスクリーニングにも有用である。本発明のタンパク質（受容体およびリガンドの断片を含むが、これらに限定されない）はそれ自体、受容体／リガンド相互作用の阻害剤として有用であり得る。
【０２２０】
本発明のポリペプチドの活性は、他の手段の中でも、以下の方法により測定され得る：
【０２２１】
受容体−リガンド活性に関する適切なアッセイとしては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｅｄ ｂｙ Ｊ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ， Ａ． Ｍ． Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ， Ｄ．Ｈ． Ｍａｒｇｕｉｌｉｅｓ， Ｅ．Ｍ． Ｓｈｅｖａｃｈ， Ｗ． Ｓｔｒｏｂｅｒ， Ｐｕｂ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ （Ｃｈａｐｔｅｒ ７．２８， Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ７．２８．１−７．２８．２２）， Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：６８６４−６８６８ （１９８７）、Ｂｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６８：１１４５−１１５６ （１９８８）、Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６９：１４９−１６０ （１９８９）、Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １７５：５９−６８ （１９９４）、Ｓｔｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ８０：６６１−６７０ （１９９５）に記載されるのものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２２】
例えば、本発明のポリペプチドは、リガンド（複数可）用の受容体として使用されてもよく、それにより当該リガンド（複数可）の生物活性を伝達する。リガンドは、結合アッセイ、アフィニティクロマトグラフィ、ジハイブリッドスクリーニングアッセイ、ＢＩＡコアアッセイ、ゲルオーバレイアッセイ、または当該技術分野で既知の他の方法により特定され得る。
【０２２３】
アゴニストもしくはアンタゴニスト、または部分的アゴニストまたは部分的アンタゴニストとしての薬剤またはタンパク質を特性化する研究は、競合リガンドとして他のタンパク質の使用を必要とする。本発明のポリペプチド、またはそれらのリガンド（複数可）は、従来法により、放射性同位体、比色用分子、または毒素分子にカップリングされることで標識され得る（「タンパク質精製の手引き（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」 Ｍｕｒｒａｙ Ｐ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ （ｅｄ） Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １８２ （１９９０） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）。放射性同位体の例としては、トリチウムおよび炭素１４が挙げられるが、これらに限定されない。比色用分子の例としては、フルオレスカミンまたはローダミンのような蛍光分子、あるいは他の比色用分子が挙げられるが、これらに限定されない。毒素の例としては、リシンが挙げられるが、これに限定されない。
【０２２４】
４．７．１１  薬剤スクリーニング
本発明は、様々な薬剤スクリーニング技法のいずれかにおいて、新規ポリペプチドまたはそれらの結合断片を用いることで、化学化合物をスクリーニングするのに特に有用である。かかる試験で使用されるポリペプチドまたは断片は、溶液中で遊離であり得るか、固体支持体に固定され得るか、細胞表面上に支えられ得るか、あるいは細胞内に位置され得る。薬剤スクリーニングの一方法は、ポリペプチドまたはそれらの断片を発現する組換え核酸で安定に形質転換した真核生物または原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、競合結合アッセイにおいてかかる形質転換細胞に対してスクリーニングされる。生存可能な形態または固体形態にあるかかる細胞を、標準的な結合アッセイに使用することができる。例えば、本発明のポリペプチドまたは断片と、試験される作用物質との間の複合体の形成が測定され得るか、あるいは当該技術分野で既知の新規ポリペプチドと適切な細胞系との間の複合体形成の減少が検査され得る。
【０２２５】
本発明のポリペプチドに結合するか、あるいはその活性を調節する（すなわち増加または減少させる）能力に関してスクリーニングされ得る試験化合物用の供給源としては、（１）無機および有機化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー、および（３）ランダムもしくは擬似ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。
【０２２６】
化学ライブラリーは、多数の市販源から、容易に合成されてもよく、あるいは購入されてもよく、また既知の化合物の構造類似体、または天然産物スクリーニングにより「ヒット」または「リード」として特定される化合物を含み得る。
【０２２７】
天然産物ライブラリーの供給源は、（細菌および真菌を含む）微生物、動物、植物または他の草木、あるいは海洋生物であり、スクリーニング用の混合物ライブラリーは、（１）土壌、植物または海洋微生物からのブロスの発酵および抽出、あるいは（２）生物自体の抽出により創出され得る。天然産物ライブラリーとしては、ポリケチド、非リボソームペプチド、およびそれらの（天然に存在しない）変異体が挙げられる。概説として、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８２：６３−６８ （１９９８）を参照されたい。
【０２２８】
コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物から構成され、伝統的な自動合成方法、ＰＣＲ、クローニングまたは専有の合成方法により容易に調製することができる。特に興味が持たれるのは、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドコンビナトリアルライブラリーである。さらに他の興味が持たれるライブラリーとしては、ペプチド、タンパク質、ペプチド擬似体、マルチパラレル合成収集物、組換え、およびポリペプチドライブラリーが挙げられる。コンビナトリアルケミストリーおよびそれから創出されるライブラリーの概説に関して、Ｍｙｅｒｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ８：７０１−７０７ （１９９７）を参照されたい。ペプチド擬似体ライブラリーの概説および例に関して、Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ９（３）：２０５−２３ （１９９８）、Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， １（１）：１１４−１９ （１９９７）、Ｄｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ４（５）：７０９−１５ （１９９６）（アルキル化ジペプチド）を参照されたい。
【０２２９】
本明細書中に記載する様々なライブラリーの使用によるモジュレータの同定は、「ヒット」の、本発明のポリペプチドを結合する能力を最適化するために、候補「ヒット」（または「リード」）の修飾を可能にする。次に結合アッセイで同定された分子を、当該技術分野で既知のｉｎ  ｖｉｖｏ組織培養物または動物モデルにおいて、アンタゴニストまたはアゴニスト活性に関して試験する。要するに、分子は、複数の細胞培養物または動物へと滴定され、続いて動物／細胞死、または動物／細胞の生存の延長に関して試験される。
【０２３０】
こうして同定された結合分子は、毒素、例えばリシンまたはコレラと、あるいは放射性同位体細胞にとって有毒な他の化合物と複合体を形成してもよい。次に、毒素結合分子複合体は、本発明のポリペプチドに対する結合分子の特異性により、腫瘍または他の細胞をへとターゲッティングされる。あるいは、結合分子は、ターゲッティングおよびイメージングの目的で、イメージング剤と複合体を形成してもよい。
【０２３１】
４．７．１２  受容体活性に関するアッセイ
本発明はまた、ポリペプチド、例えばリガンドまたは受容体の特異的結合を検出する方法を提供する。当該技術は、本発明の受容体ポリペプチドに対してこれまで未知の結合パートナーを同定するのに特に有用な多数のアッセイを提供する。例えば、哺乳動物または細菌細胞を用いた発現クローニング、あるいはジハイブリッドスクリーニングアッセイは、結合パートナーをコードするポリヌクレオチドを同定するのに使用することができる。別の例として、本発明の適切な固定化ポリペプチドを用いたアフィニティクロマトグラフィは、本発明のポリペプチドを認識し、結合するポリペプチドを単離するのに使用することができる。本発明のポリペプチドの生物活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）化合物、特に小分子の特定に使用される多数の種々のライブラリーが存在する。本発明の受容体ポリペプチドに関するリガンドは、本発明の受容体の発現以外は遺伝的に同一な２つの細胞集団（一方の細胞集団は、本発明の受容体を発現するのに対し、他方の細胞集団は発現しない）に、外因性リガンド、またはリガンドのカクテルを添加することで特定することができる。続いてリガンド（複数）の添加に対する２つの細胞集団の応答を比較する。あるいは、発現ライブラリーは、細胞において本発明のポリペプチドとともに同時発現させることができ、自己分泌応答に関してアッセイして、潜在的リガンド（複数可）を特定することができる。さらに別の例として、ＢＩＡコアアッセイ、ゲルオーバレイアッセイ、または当該技術分野で既知の他の方法を用いて、結合パートナーポリペプチドを特定することができる（（１）無機および有機化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー、および（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子から構成されるコンビナトリアルライブラリーを含む）。
【０２３２】
本発明のポリペプチドのシグナル伝達カスケードにおいて下流の細胞内シグナル伝達分子の役割を決定することができる。例えば、本発明のポリペプチドの細胞質ドメインが、リガンドが特定されたタンパク質の細胞外部分に融合されたキメラタンパク質は、宿主細胞で産生される。次に、細胞を、キメラタンパク質の細胞外部分に特異的なリガンドとともにインキュベートし、それによりキメラ受容体を活性化する。続いて、細胞内シグナル伝達に関与した既知の下流タンパク質を、予測される修飾、すなわちリン酸化に関してアッセイすることができる。当業者に既知の他の方法もまた、受容体活性に関与したシグナル伝達分子を同定するのに使用することができる。
【０２３３】
４．７．１３  白血病
白血病および関連障害は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの機能を促進または阻害する治療薬の投与により、治療あるいは防止され得る。かかる白血病および関連障害としては、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、および慢性リンパ性白血病が挙げられるが、これらに限定されない（かかる障害の概説に関して、Ｆｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２ｄ Ｅｄ．， Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照）。
【０２３４】
４．７．１４  他の活性
本発明のポリペプチドはまた、１つまたはそれより多い以下のさらなる活性または影響を示しうる：細菌、ウイルス、真菌および他の寄生生物を含むが、これらに限定されない感染性作用物質の成長、感染もしくは機能の阻害、またはそれらの死滅；伸長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪対赤身の割合もしくは他の組織組織沈着、または臓器もしくは身体の部分のサイズまたは形状（例えば、胸の増大または縮小、骨形成または形状の変化のような）を含むが、これらに限定されない身体の特徴の達成（抑制または増強）；バイオリズムまたは日周期サイクルもしくはリズムの達成、雄または雌被験体の受精能の達成；食事脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子または他の栄養因子もしくは構成成分（複数可）の代謝、異化作用、同化作用、プロセシング、利用化、貯蔵あるいは排除の達成、食欲、性欲、ストレス、認知（認知障害を含む）、うつ病（抑うつ性障害を含む）、および暴力行為を含むが、これらの限定されない行動特性の達成；鎮痛薬効果または他の疼痛減少効果の提供；造血系列以外の系列の胚幹細胞の分化および成長の促進；ホルモンまたは内分泌活性；酵素の場合では酵素の欠乏の矯正および欠乏関連疾患の治療；高増殖性障害（例えば、乾癬のような）の治療；免疫グロブリン様活性（例えば、抗原または補体を結合する能力のような）；およびかかるタンパク質、またはかかるタンパク質と交差反応性である別の物質もしくは物体（ｅｎｔｉｔｙ）に対する免疫応答を産生するためのワクチン組成物中の抗原として作用するする能力。
【０２３５】
４．７．１５  多型の特定
多型の実証により、ヒト被験体におけるかかる多型の特定、ならびに診断および治療のためのこの情報の遺伝薬理学的使用が可能となる。かかる多型は、例えば様々な疾患状態（炎症または免疫応答を含む障害のような）に対する差次的傾向または感受性、あるいは薬剤投与に対する差次的応答に関連され得て、この遺伝子情報は、予防上または治療上の処置を適切に適応させるのに使用することができる。例えば、炎症または自己免疫疾患に対する傾向に関連した多型の存在により、多型の存在を特定することによりヒトにおけるこの状態の診断を可能とする。
【０２３６】
多型は、一般に患者から試料を得ることと、試料からのＤＮＡを解析することと、任意にＤＮＡの単離または増幅を含むことと、ＤＮＡ中の多型の存在を特定することとを含む、当該技術分野で既知の様々な方法で特定することができる。例えば、ＰＣＲを用いて、ゲノムＤＮＡの適切な断片を増幅してもよく、続いてそれは配列決定され得る。あるいは、ＤＮＡは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ここで、適切なオリゴヌクレオチドは、単一塩基ミスマッチの検出を可能にする条件下でＤＮＡにハイブリダイズされる）に、あるいは単一ヌクレオチド伸長アッセイ（ここで、多型の位置にすぐ隣接してハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが１つまたはそれより多い標識ヌクレオチドで伸長される）に付してもよい。さらに、伝統的な制限断片長多型解析（多型の存在もしくは非存在に依存してゲノムＤＮＡの差次的消化を提供する制限酵素を用いて）を実施してもよい。本発明のヌクレオチド配列を有するアレイは、多型を検出するのに使用することができる。アレイは、本発明のヌクレオチド配列を検出するために、本発明の修飾ヌクレオチド配列を含んでもよい。代替法では、本発明のヌクレオチド配列のいずれか１つを、これらの配列からの変化を検出するためのアレイに配置されることができる。
【０２３７】
あるいは、アミノ酸配列の変化をもたらす多型はまた、タンパク質のアミノ酸配列中の相当する変化を検出することにより、例えば、変異配列に特異的な抗体により検出することもできる。
【０２３８】
４．７．１６  関節炎および炎症
慢性関節リウマチに対する本発明の組成物の免疫学的影響は、実験動物モデル系で決定される。実験モデル系は、ラットにおけるアジュバント誘発性関節炎であり、プロトコルは、Ｊ． Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚ， ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２１９：５６、またはＢ． Ｗａｋｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２３；１２９ （１２６３）に記載されている。疾患の誘発は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の死菌結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の懸濁液の単回注射（一般に、皮内）により引き起こすことができる。注射経路は、多種多様であり得るが、ラットは、アジュバント混合物を尾の基部に注射され得る。リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中のポリペプチドは、約１〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。対照は、ＰＢＳのみを投与することからなる。
【０２３９】
試験化合物の影響を試験する手順は、ＣＦＡ中の死菌結核菌の皮内注射、続いて試験化合物の即時投与、続いて２４日目まで隔日での処置からなる。マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＣＦＡの注射後１４、１５、１８、２０、２２、および２４日目に、上述のＪ． Ｈｏｌｏｓｋｉｔｚにより記載されるように、全関節炎スコアが得られ得る。データの解析により、試験化合物は、関節炎スコアの減少により測定されるように関節の腫脹に対して劇的な影響を及ぼすことが明らかである。
【０２４０】
４．８  治療方法
本発明の組成物（ポリペプチド断片、類似体、変異体、および抗体、あるいはアンチセンスポリヌクレチドを含む他の結合パートナーまたはモジュレータを含む）は、様々な治療方法で数多くの用途がある。治療用途の例としては、本明細書中に例示するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４１】
４．８．１  例
本発明の一実施形態は、有効な量の本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドまたは他の組成物を、本発明のペプチドを調節することで調節され得る疾患または障害に罹患した個体に投与することである。投与様式は特に重要ではないが、非経口投与が好ましい。例示的投与様式は、静脈内ボーラスを送達することである。本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドまたは他の組成物の投与量は通常、処方する医師により決定されることが予想される。投与量は、個々の患者の年齢、体重、状態および応答に従って様々であることが予想される。通常、用量当たりの投与されるポリペプチド量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲であり、好ましい用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）である。非経口投与に関して、本発明の幹細胞成長因子様ポリペプチドは、薬学的に許容可能な非経口用賦形剤と併用した注射可能形態で配合される。かかる賦形剤は、当該技術分野で既知であり、例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および少量のヒト血清アルブミンから構成される溶液が挙げられる。賦形剤は、ポリペプチドの等張性および安定性を維持する少量の添加剤または他の有効成分を含有してもよい。かかる溶液の調製は、当業者の範囲内である。
【０２４２】
４．９  薬学的配合物および投与経路
本発明のタンパク質または他の組成物（組換えおよび非組換え供給源を含むが、これらに限定されないものに由来するいかなる供給源からのもの、本発明のポリペプチドの抗体および他の結合パートナーを含む）を、必要としている患者に、単独で、あるいはそれが適切なキャリアまたは賦形剤（複数可）と混合された薬学的組成物で、様々な症状を治療あるいは回復するための用量で投与してもよい。かかる組成物は、任意に（タンパク質または他の有効成分、およびキャリアのほかに）、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、および当該技術分野で既知の他の材料を含有してもよい。「薬学的に許容可能な」という用語は、有効成分（複数可）の生物活性の有効性を妨害しない無毒性物質を意味する。キャリアの特性は、投与経路に依存する。本発明の薬学的組成物はまた、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンのようなサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子を含有してもよい。さらなる組成物では、本発明のタンパク質は、問題となっている疾患または障害の治療に有益な他の作用物質と組み合わせてもよい。これらの作用物質としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＦＧ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ａ、およびＴＧＦ−ｂ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ならびに本明細書中に記載するサイトカインなどの様々な成長因子が挙げられる。
【０２４３】
薬学的組成物はさらに、タンパク質または他の有効成分の活性を増強するか、あるいはその活性または治療における用途を補充する他の作用物質を含有してもよい。かかるさらなる因子および／または作用物質は、薬学的組成物中に含まれて、本発明のタンパク質または他の有効成分と相乗効果をもたらし得るか、あるいは副作用を低減し得る。反対に、本発明のタンパク質または他の有効成分が、特定の凝固因子、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤の配合物に含まれて、凝固因子、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解または抗血栓因子、あるいは抗炎症剤（例えば、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−１  Ｈｙ１、ＩＬ−１  Ｈｙ２、抗ＴＮＦ、コルチステロイド、免疫抑制剤）の副作用を最小限に抑え得る。本発明のタンパク質は、多量体（例えば、ヘテロ二量体またはホモ二量体）あるいはそれ自体または他のタンパク質との複合体で活性であり得る。結果として、本発明の薬学的組成物は、かかる多量体または複合体形態で、本発明のタンパク質を含んでもよい。
【０２４４】
第１のタンパク質を含む本発明の薬学的組成物中に含まれる代替物として、第２のタンパク質または治療剤が、第１のタンパク質とともに（例えば、同時に、あるいは異なる時間で（但し、作用物質の組合せの治療濃度が治療部位で達成される））投与され得る。本用途の化合物の配合物および投与に関する技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｉｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎに見出され得る。治療上有効な用量とはさらに、症状の回復、例えば関連医療症状の治療、治癒、防止または回復、あるいはかかる状態の治療、治癒、防止または回復の速度の増大をもたらすのに十分な化合物の量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用する場合、治療上有効な用量とは、単独の成分に相当する。組み合わせて適用する場合、治療上有効な用量とは、併用して投与されようと、順次投与されようと、あるいは同時に投与されようと、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせ量を指す。
【０２４５】
本発明の治療または使用方法を実施する際に、治療上有効な量の本発明のタンパク質または他の有効成分を、治療されるべき状態を有する哺乳動物に投与する。本発明のタンパク質または他の有効成分は、単独で、あるいはサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子を使用した治療のような他の療法と併用して、本発明の方法に従って投与してもよい。１つまたはそれより多いサイトカイン、リンホカイン、または他の造血因子と同時投与する場合、本発明のタンパク質または他の有効成分は、サイトカイン（複数可）、リンホカイン（複数可）、他の造血因子（複数可）、血栓溶解または抗血栓因子と同時に、あるいは順次投与され得る。順次投与する場合、主治医は、サイトカイン（複数可）、リンホカイン（複数可）、他の造血因子（複数可）、血栓溶解または抗血栓因子と併用して本発明のタンパク質または他の有効成分を投与する適切な順序を決定する。
【０２４６】
４．９．１  投与経路
適切な投与経路としては、例えば経口、直腸、経粘膜、あるいは腸投与、非経口送達（筋内、皮下、皮内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内または眼内注射を含む）が挙げられ得る。薬学的組成物中で使用される、あるいは本発明の方法を実施するための本発明のタンパク質または他の有効成分の投与は、様々な従来法（例えば、経口摂取、吸入、局所塗布、または皮膚、皮下、腹腔内、非経口または静脈内注射）で実施することができる。患者への静脈内投与が好ましい。
【０２４７】
あるいは、全身様式よりは局所様式で、例えば関節炎の関節に、あるいは線維症の組織中に直接化合物を注射することにより、多くの場合デポ剤または徐放配合物で、化合物を投与してもよい。緑内障手術の合併症として頻繁に出現する瘢痕プロセスを防止するために、化合物を局所的に、例えば目薬として投与してもよい。さらに、標的薬剤送達システム中、例えば関節炎または線維症の組織を標的とする、例えば特定の抗体で被覆したリポソーム中の薬剤を投与してもよい。リポソームは、罹患組織を標的として、それにより選択的に取り込まれる。
【０２４８】
本発明のポリペプチドは、所望の作用部位に有効な用量を送達する任意の経路で投与される。投与の適切な経路および特定の適応症のための有効投与量の決定は、当業者の水準内である。好ましくは、創傷治療に関して、部位に直接治療用化合物を投与する。本発明のポリペプチドに適した投与量範囲は、これらの投与量から、あるいは適切な動物モデルでの同様の研究から推定することができる。続いて、投与量は、必要に応じて、最大の治療的有益性を提供するために臨床医により調節され得る。
【０２４９】
４．９．２  組成物／配合物
したがって、本発明による使用のための薬学的組成物は、薬学的に使用することができる調製物中への有効化合物の加工を促進する賦形剤および助剤を含む１つまたはそれより多い生理学上許容可能なキャリアを用いて、従来の様式で配合され得る。これらの薬学的組成物は、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスにより、それ自体既知の様式で製造され得る。適正な配合物は、選択した投与経路に依存する。治療上有効な量の本発明のタンパク質または他の有効成分を経口投与する場合、本発明のタンパク質または他の有効成分は、錠剤、カプセル、粉末、溶液、またはエリキシル剤の形態である。錠剤形態で投与される場合、本発明の薬学的組成物はさらに、ゼラチンまたは補助薬のような固体キャリアを含有してもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、約５〜９５％の本発明のタンパク質または他の有効成分、好ましくは約２５〜９０％の本発明のタンパク質または他の有効成分を含有する。液体形態で投与する場合、水、石油、動物もしくは植物起源の油（例えば、ラッカセイ油、鉱油、ダイズ油、またはゴマ油）、または合成油のような液体キャリアを添加してもよい。液体形態の薬学的組成物はさらに、生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖類溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールを含有してもよい。液体形態で投与される場合、薬学的組成物は、約０．５〜９０重量％の本発明のタンパク質または他の有効成分、好ましくは約１〜５０％の本発明のタンパク質または他の有効成分を含有する。
【０２５０】
治療上有効な量の本発明のタンパク質または他の有効成分が静脈内、皮膚または皮下注射で投与される場合、本発明のタンパク質または他の有効成分は、発熱物質を含まない非経口的に許容可能な水溶液の形態である。ｐＨ、等張性、安定性等に十分配慮した、かかる非経口的に許容可能なタンパク質または他の有効成分溶液の調製は、当業者の範囲内である。静脈内、皮膚または皮下注射用の好ましい薬学的組成物は、本発明のタンパク質または他の有効成分のほかに、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸加リンゲル注射液のような等張性賦形剤、または当該技術分野で既知の他の賦形剤を含有すべきである。本発明の薬学的組成物はまた、安定剤、防腐剤、緩衝液、酸化防止剤、または当業者に既知の他の添加剤を含有してもよい。注射に関して、本発明の作用物質は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩緩衝液のような生理学的に相溶性の緩衝液中に配合され得る。経粘膜投与に関して、浸透される障壁に対する適切な浸透剤が配合物中に使用される。かかる浸透剤は概して当該技術分野で既知である。
【０２５１】
経口投与に関して、化合物は、当該技術分野で既知の薬学的に許容可能なキャリと有効成分を組み合わせることで容易に配合することができる。かかるキャリアにより、本発明の化合物が、治療されるべき患者による経口摂取用の、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として配合されるのが可能である。経口使用のための薬学的調製物は、固体賦形剤を用いて、任意に得られた混合物を粉砕することと、望ましい場合に適切な助剤を添加した後に、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることとにより得ることができる。適切な賦形剤は、特に糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む）のような充填剤、例えばトウモロコシスターチ、コムギスターチ、ライススターチ、ポテトスターチ、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース調製物、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。望ましい場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギニン酸もしくはアルギニン酸ナトリウムのようなその塩のような崩壊剤を添加してもよい。適切なコーティングを伴う糖衣錠コアが提供される。この目的で、濃糖溶液を使用してもよく、それは任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい。同定用に、あるいは有効成分用量の種々の組合せを特性するために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【０２５２】
経口的に使用することができる薬学的調製物としては、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのような可塑化剤製の軟質密閉カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースのような充填剤、スターチのような結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および任意に安定剤と混合して有効成分を含有することができる。軟質カプセルでは、有効化合物は、脂肪酸、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解あるいは懸濁させてもよい。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与用の配合物はすべて、かかる投与に適した投与量であるべきである。口腔投与に関して、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはロゼンザの形態をとってもよい。
【０２５３】
吸入による投与に関して、本発明による使用のための化合物は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス）を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエーロゾルスプレー提示を有する形態で利便性よく送達される。加圧エーロゾルの場合では、投与量単位は、定量を送達するための弁を提供することで決定され得る。化合物とラクトースまたはスターチのような適切な粉末基剤との粉末ミックスを含有する、吸入器または注入器で使用するための例えばゼラチンのカプセルまたはカートリッジを配合してもよい。化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用に配合されてもよい。注射用の配合物は、添加した防腐剤とともに、単位投薬形態で、例えばアンプルまたは複数回用量容器中で付与されてもよい。組成物は、油性もしくは水性賦形剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとってもよく、また沈殿防止剤、安定剤および／または崩壊剤のような配合剤を含有してもよい。
【０２５４】
非経口投与用の薬学的組成物としては、水溶性形態の有効成分の水溶液が挙げられる。さらに、有効化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒または賦形剤としては、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘性を増大させる物質を含有してもよい。任意に、懸濁液はまた、化合物の溶解性を増大させ高濃縮溶液の調製を可能にする、適切な安定剤または作用物質を含有してもよい。あるいは、有効成分はまた、使用前に、適切な賦形剤、例えば滅菌の発熱物質を含まない水を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【０２５５】
化合物はまた、例えばココアバターまたは他のグリセリドのような従来の座剤基剤を含有する座剤または停留浣腸のような直腸組成物中で配合してもよい。これまで記載した配合物のほかに、化合物はまた、デポ剤調製物として配合されてもよい。かかる長作用性配合物は、埋め込み（例えば、皮下または筋内）により、あるいは筋内投与により投与され得る。したがって、例えば、化合物は、適切な高分子もしくは疎水性物質（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）、またはイオン交換樹脂とともに、あるいは難溶性誘導体として（例えば難溶性塩として）配合され得る。
【０２５６】
本発明の疎水性化合物用の薬学的キャリアは、ベンジルアルコール、無極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、および水相を含む共溶媒系である。共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であってもよい。ＶＰＤは、絶対エタノール中で容積を補充（ｍａｋｅ ｕｐ）された３％ｗ／ｖベンジルアルコール、８％ｗ／ｖ無極性界面活性剤ポリソルベート８０、および６５％ｗ／ｖエチレングリコール３００の溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：５ｗ）は水溶液中に５％デキストロースと１：１の比で希釈させたＶＰＯからなる。この共溶媒系は、疎水性化合物を十分に溶解し、それ自体全身投与時に低毒性をもたらす。当然、共溶媒系の割合は、その溶解性および毒性特性を破壊しないで相当変化させてもよい。さらに、共溶媒構成成分の独自性は、様々であり得る。例えば、他の無毒性の無極性界面活性剤を、ポリソルベート８０の代わりに使用してもよい。ポリエチレングリコールの分画サイズは様々であり得る。他の生体適合性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）は、ポリエチレングリコールを置き換えてもよい。他の糖または多糖類は、デキストロースと置換し得る。あるいは、疎水性薬剤物のための他の送達システムを使用してもよい。リポソームおよびエマルジョンは、疎水性薬剤用の送達賦形剤またはキャリアの既知の例である。ジメチルスルホキシドのようなある特定の有機溶媒もまた使用してもよいが、通常より高い毒性が伴う。さらに、化合物は、治療剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような徐放系を用いて送達してもよい。様々なタイプの徐放マトリックスが確立されており、当業者に既知である。徐放カプセルは、他の化学的性質に応じて、数週間〜１００日以上の間化合物を放出し得る。治療試薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質または他の有効成分安定化のためのさらなる戦略が使用され得る。
【０２５７】
薬学的組成物はまた、適切な固体もしくはゲル相キャリアまたは賦形剤を含んでもよい。かかるキャリアまたは賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の有効成分の多くが、薬学的に適合性の対イオンを伴う塩として提供され得る。かかる薬学的に許容可能な塩基付加塩は、生物学的有効性および遊離酸の特性を保持し、かつ水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリアルキルアミン、ジアルキルアミン、モノアルキルアミン、二塩基アミノ酸、酢酸ナトリウム、安息香酸カリウム、トリエタノールアミン等のような無機または有機塩基との反応により得られる塩である。
【０２５８】
本発明の薬学的組成物は、タンパク質またはペプチド抗原との、本発明のタンパク質（複数可）または他の有効成分の複合体の形態であり得る。タンパク質および／またはペプチド抗原は、ＢおよびＴリンパ球に対する刺激シグナルを送達する。Ｂリンパ球は、それらの表面免疫グロブリン受容体により抗原に対して応答する。Ｔリンパ球は、ＭＨＣタンパク質による抗原提示後に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介し抗原に対して応答する。ＭＨＣおよび構造的に関連したタンパク質（宿主細胞上のクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ遺伝子によりコードされるものを含む）は、Ｔリンパ球に対してペプチド抗原（複数可）を提示するように作用する。また抗原構成成分は、精製ＭＨＣペプチド複合体単独で、あるいはＴ細胞を直接シグナル伝達することができる同時刺激分子とともに、供給され得る。あるいは、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンおよび他の分子を結合することが可能な抗体、ならびにＴ細胞上のＴＣＲおよび他の分子を結合することが可能な抗体は、本発明の薬学的組成物と組み合わせることができる。
【０２５９】
本発明の薬学的組成物は、本発明のタンパク質を、他の薬学的に許容可能なキャリアのほかに、水溶液中でミセル、不溶性単層、液晶、または層状層として凝集形態で存在する脂質のような両親媒性作用物質と組み合わせたリポソームの形態であってもよい。リポソーム配合物に適した脂質としては、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リソレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等が挙げられるが、これらに限定されない。かかるリポソーム配合物の調製は、例えば米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，７３７，３２３号（これらすべてが、参照により本明細書に援用される）に開示されるように、当業者水準内である。
【０２６０】
本発明の薬学的組成物中の本発明のタンパク質または他の有効成分の量は、治療されるべき状態の性質および重篤性、ならびに患者が受けた治療前の性質に依存する。最終的には、主治医が、本発明のタンパク質または他の有効成分の量を決定し、それを用いて個々の患者それぞれを治療する。初めに、主治医は、低用量の本発明のタンパク質または他の有効成分を投与し、患者の応答を観察する。患者にとって最適な治療効果が得られるまで、より大量の本発明のタンパク質または他の有効成分を投与してもよく、その時点で、投与量はさらに増加されない。本発明の方法を実施するのに使用される様々な薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは約０．１μｇ〜約１ｍｇ）の本発明のタンパク質または他の有効成分を含有することが意図される。骨、軟骨、腱、または靭帯再生に有用な本発明の組成物に関して、治療方法は、組成物を、局所的、体系的、または埋め込み物またはデバイスとして局部的に投与することを含む。投与する場合、本発明で使用するための治療用組成物は、当然のことながら発熱物質を含まない生理学的に許容可能な形態である。さらに、組成物は望ましくは、骨、軟骨、または組織損傷の部位へ送達するための粘性形態でカプセル化され得るか、あるいは注射され得る。局所投与は創傷治癒および組織修復に適切であり得る。上述の組成物中に任意にまた含まれ得る、本発明のタンパク質または他の有効成分以外の治療上有用な作用物質は、本発明の方法における組成物と同時にまたは順次、代替的にあるいはさらに投与され得る。好ましくは、骨および／または軟骨形成に関して、組成物は、骨および／または軟骨損傷の部位に、タンパク質含有または他の有効成分含有組成物を送達することが可能なマトリックスを含み、発達中の骨および軟骨のための任意に身体に吸収され得る構造を提供する。かかるマトリックスは、他の移植医療用途で現在使用中の物質から形成されてもよい。
【０２６１】
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械特性、表面的な外観、および界面特性に基づく。組成物の特定の用途は、適切な配合を規定する。組成物用の潜在的マトリックスは、生分解性であり、かつ化学的に規定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ無水物であってもよい。他の潜在的なマトリックスは、生分解性であり、かつ生物学的に明確にされたものである（例えば、骨または皮膚コラーゲン）。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリックス構成成分から構成される。他の潜在的なマトリックスは、非生分解性であり、かつ化学的に規定される（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミック）。マトリックスは、ポリ乳酸とヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンとリン酸三カルシウムのような上述のタイプの材料のいずれかの組合せから構成されてもよい。バイオセラミックは、カルシウム−アルミン酸塩−リン酸塩におけるような組成物において変更させてもよく、孔径、粒径、粒子形状、および生分解性を変更するために加工してもよい。現在好ましいのは、１５０〜８００ミクロンの範囲の直径を有する多孔質粒子の形態にある乳酸とグリコール酸の５０：５０（モル重量）コポリマーである。幾つかの用途では、タンパク質組成物がマトリックスから解離するのを防ぐために、カルボキシメチルセルロースまたは自系血餅のような金属イオン封鎖剤を利用することが有用である。
【０２６２】
金属イオン封鎖剤の好ましいファミリーは、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースを含むアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）のようなセルロース系材料であり、最も好ましいのは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の陽イオン塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤としては、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ（エチレングリコール）、ポリエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマー、およびポリ（ビニルアルコール）が挙げられる。本発明で有用な金属イオン封鎖剤の量は、総配合物重量に基づいて、０．５〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％であり、これは、ポリマーマトリックスからのタンパク質の脱離を防ぎ、かつ組成物の適切な取り扱いを提供するのに必要な量を表し、前駆細胞がマトリックスを浸潤するのを防止され、それによりタンパク質に、前駆細胞の骨形成活性を助長するための機会を提供するほどではない。さらなる組成物では、本発明のタンパク質または他の有効成分は、骨および／または軟骨欠損、創傷、または問題となっている組織の治療に有益な他の作用物質と組み合わせてもよい。これらの作用物質としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−ａおよびＴＧＦ−ｂ）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）が挙げられる。
【０２６３】
治療用組成物はまた、獣医学用途にとって現在価値がある。特に、ヒトのほかに、家畜およびサラブレッド馬は、本発明のタンパク質または他の有効成分でかかる治療するための望ましい患者である。組織再生で使用されるべきタンパク質含有薬学的組成物の投薬レジメンは、タンパク質の作用を改質する様々な要因、例えば形成されるのが望ましい組織重量の量、損傷部位、損傷組織の状態、創傷の大きさ、損傷組織の型（例えば、骨）、患者の年齢、性別、および食事、任意の感染の重篤性、投与回数、および他の臨床的容要因を考慮して、主治医により決定される。投与量は、再構築に使用されるマトリックスの型、および薬学的組成物中の他のタンパク質の含入により多種多様であり得る。例えば、ＩＧＦ  Ｉ（インスリン様成長因子Ｉ）のような他の既知の成長因子を、最終組成物に添加することはまた、投薬量に影響を及ぼし得る。組織／骨成長および／または修復の定期的評価（例えば、Ｘ線、組織形態計測的決定、およびテトラサイクリン標識）により、進行をモニタリングすることができる。
【０２６４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療に有用であり得る。かかるポリヌクレオチドは、哺乳動物被験体における発現のために、細胞に、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかで導入され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、細胞または生物に核酸（ウイルスベクターまたは裸のＤＮＡの形態にあるものを含むが、これらに限定されない）を導入するための他の既知の方法により投与されてもよい。細胞はまた、かかる細胞に対する所望の影響、またはかかる細胞中の活性を増殖するか、あるいはそれをもたらすために、本発明のタンパク質の存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養してもよい。続いて、治療した細胞は、治療目的でｉｎ  ｖｉｖｏに導入することができる。
【０２６５】
４．９．３  有効な投与量
本発明で使用するのに適した薬学的組成物は、有効成分が、その対象とする目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。より具体的には、治療上有効な量は、治療中の被験体の現存の症状の発達を防ぐか、あるいはその症状を回復するのに有効な量を意味する。有効な量の決定は、特に本明細書に提供する詳細な開示を鑑みて、十分に当業者の能力内である。本発明の方法で使用される任意の化合物に関して、治療上有効な用量は、最初は適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから推定することができる。例えば、用量は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するのに使用することができる循環濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方することができる。例えば、用量は、細胞培養において決定されるようにＩＣ５０（すなわち、タンパク質の生物活性の最大の半分の阻害を達成する試験化合物濃度）を含む循環濃度範囲に達成するよう、動物モデルにおいて処方することができる。かかる情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。
【０２６６】
治療上有効な用量とは、患者において、症状の回復、あるいは生存の延長をもたらす化合物の量を指す。かかる化合物の毒性および治療効率は、細胞培養物、、または実験動物において標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための）により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、それは、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトで使用するための投与量範囲を処方する際に使用することができる。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、または全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、使用する投薬形態、および利用される投与経路に応じて、この範囲内を変更してもよい。正確な処方、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して、個々の医師により選択され得る。例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５， ｉｎ「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」， Ｃｈ． １ ｐ．１を参照されたい。投与量および間隔は、所望の効果、または最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するのに十分な活性部分の血漿レベルを提供するように、個別に調製され得る。ＭＥＣは、各化合物に関して多種多少であるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特性および投与経路に依存する。しかしながら、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【０２６７】
投薬間隔はまた、ＭＥＣ値を用いて決定することができる。化合物は、時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％に関して、ＭＥＣを超える血漿レベルを維持するレジメンを用いて投与するべきである。局所投与または選択的取り込みの場合では、薬剤の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連しない場合がある。
【０２６８】
本発明のポリペプチドまたは他の組成物に関する例示的投薬レジメンは、一日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲であり、好ましい用量は、一日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから２５ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）であり、成人および子供で変更する。投薬は、一日一回であってもよく、あるいは投用量を、より長い間隔または短い間隔で送達してもよい。
【０２６９】
投与される組成物の量は、当然のことながら、治療中の被験体、被験体の年齢および体重、苦痛の重篤性、投与様式、および処方医の判断に依存する。
【０２７０】
４．９．４  包装
組成物は、望ましい場合、有効成分を含有する１つまたはそれより多い単位投薬形態を含有し得るパックまたはディスペンサー装置にて付与されてもよい。パックは、例えば金属またはプラスチック箔（例えば、ブリスターパック）を含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置に、投与の説明書を添えてもよい。相溶性薬学的キャリア中に配合された本発明の化合物を含む組成物を、調製し、適切な容器に入れ、適応症の治療に関してラベルしてもよい。
【０２７１】
４．１０  抗体
４．１０．１  ヒト抗体
完全ヒト抗体とは、ＣＤＲを含む、軽鎖および重鎖の両方の本質的に完全な配列が、ヒト遺伝子に起因する抗体分子に関する。かかる抗体は、本明細書中では「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［Ｋｏｚｂｏｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ， ４：７２（１９８３）を参照］、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法［Ｃｏｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６を参照］により調製することができる。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施に利用されてもよく、またヒト抗体ハイブリドーマにより［Ｃｏｔｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０ （１９８３）を参照］、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのエプスタイン−バーウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換することにより［Ｃｏｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６を参照］産生されてもよい。
【０２７２】
さらに、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含むさらなる技法を用いて産生することができる［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）］。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニックマウス、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活性化したマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作製することができる。曝露時に、ヒト抗体産生が観察され、それは、遺伝子再配列、構築、および抗体レパートリーを含むすべての点でヒト見られるのと酷似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、ならびにＭａｒｋｓ等［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：７７９−７８３ （１９９２）］、Ｌｏｎｂｅｒｇ等［Ｎａｔｕｒｅ， ３６８：８５６−８５９ （１９９４）］、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ［Ｎａｔｕｒｅ， ３６８：８１２−１３ （１９９４）］、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等［Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４：８４５−５１ （１９９６）］、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ［Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４：８２６ （１９９６）］、およびＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ［Ｉｎｔｅｒｎ： Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３：６５−９３ （１９９５）］に記載されている。
【０２７３】
ヒト抗体はさらに、抗原による曝露に応答して、動物内因性抗体でなく完全ヒト抗体を産生するように改変したトランスジェニック非ヒト動物を用いて産生してもよい（ＰＣＴ国際公開第９４／０２６０２号を参照）。非ヒト宿主における重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子を無能にし、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座を宿主ゲノムに挿入する。ヒト遺伝子を、例えば必須のＤＮＡセグメントを含有する酵母人工染色体を用いて組み込む。次に、所望の改変全てを提供する動物は、完全相補体よりも少ない改変を含有する中間トランスジェニック動物と交配させることで子孫として得られる。かかる非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ国際公開第９６／３３７３５号および同第９６／３４０９６号に開示されているように、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）と称される。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。抗体は、例えば所望する免疫原感作した後の動物からポリクローナル抗体の調製物として、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのような動物由来の不死化Ｂ細胞から直接得ることができる。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収して、発現させて、抗体を直接得ることができるか、あるいはさらに改変させて、例えば単鎖Ｆｖ分子のような抗体類似体を得ることができる。内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠如したマウスとして例示される、非ヒト宿主を生産する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を防止するために、および再配列した免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止するために、胚幹細胞において少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座由来のＪセグメント遺伝子を欠失させることを含む方法により得ることができ、欠失は、選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲッティングベクターにより達成され、胚幹細胞から体細胞および生殖細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを生産する。
【０２７４】
ヒト抗体のような所定の抗体を産生する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号に開示されている。それは、培養においてある１つの哺乳動物宿主細胞に重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入することと、別の哺乳動物細胞に軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入することと、２つの細胞を融合して、ハイブリッド細胞を形成することとを含む。ハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含有する抗体を発現する。
【０２７５】
この手法におけるさらなる改良では、免疫原上の臨床的に関連あるエピトープを同定する方法、および高親和性で関連エピトープに免疫特異的に結合する抗体の選定に関する方法は、ＰＣＴ国際公開第９９／５３０４９号に開示されている。
【０２７６】
４．１０．２  Ｆａｂ断片および単鎖抗体
本発明によれば、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に関する技法を適応させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照）、さらに、タンパク質、またはそれらの誘導体、断片、類似体もしくは相同体に対する望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速でかつ効率のよい同定を可能にするための、Ｆａｂ発現ライブラリー［例えば、Ｈｕｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７５−１２８１ （１９８９）］の構築のための方法を適応させることができる。（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂ断片、（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより生成されるＦａｂ断片、および（ｉｖ）Ｆｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない、タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体断片は、当該技術分野で既知の技術により生産され得る。
【０２７７】
４．１０．３  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２種の抗原に結合特異性を有するモノクローナル（好ましくは、ヒトまたはヒト化）抗体である。この場合では、結合特異性の１つが、本発明の抗原タンパク質に対するものである。第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、好適には、細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニットである。
【０２７８】
二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野で既知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、免疫グロブリン重鎖／軽鎖二対の同時発現に基づいており、ここで２つの重鎖は、異なる特異性を有する［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９ （１９８３）］。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類により、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうちのたった１つが、正確な二重特異性構造を有する。正確な分子の精製は通常、アフィニティクロマトグラフィ工程により達成される。同様の手順が、１９９３年５月１３日に公開された国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １０：３６５５−３６５９ （１９９１）に開示されている。
【０２７９】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原組合せ部位）は、免疫グロブリン定常配列に融合させることができる。融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とである。融合の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、および望ましい場合は免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入して、適切な宿主生物に同時トランスフェクトする。二重特異性抗体を生成するさらなる詳細に関しては、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０ （１９８６）を参照されたい。
【０２８０】
国際公開第９６／２７０１１号に記載される別のアプローチによれば、抗体分子の対間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大限にするように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１つまたはそれより多い小アミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きな側鎖（複数可）と同一または同様の大きさを有する代償性「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖を、より小さな側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることで、第２の抗体分子の界面上に創出される。これは、ホモ二量体のような他の望ましくない最終生成物を上回ってヘテロ二量体の収率を増加させるメカニズムを提供する。
【０２８１】
二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。抗体断片から二重特異性抗体を生成する技法は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、キメラ結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１ （１９８５）は、無傷抗体がタンパク質分解的に切断されて、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する手順について記載している。これらの断片は、ジチオール還元剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、ビシナルジチオールを安定化して、かつ分子内ジスルフィド形成を防止する。次に、生成されたＦａｂ’断片を、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。続いて、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体は、メルカプトエチルアミンによる還元によりＦａｂ’−チオールに再変換されて、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の作用物質として使用することができる。
【０２８２】
さらに、Ｆａｂ’断片は、大腸菌から直接回収されて、化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７５：２１７−２２５ （１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生について記載している。各Ｆａｂ’断片は、大腸菌から別個に分泌され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの指向性化学的カップリングに付されて、二重特異性抗体を形成した。こうして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞、および正常ヒトＴ細胞に結合することが可能であり、ヒト乳癌標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することが可能であった。
【０２８３】
組換え細胞培養から直接二重特異性抗体断片を作製および単離する様々な技法についても記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８（５）：１５４７−１５５３ （１９９２））。ＦｏｓおよびＪｕｍタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合による２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して、モノマーを形成し、続いて再酸化して、抗体へテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）により記載される「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異性抗体断片を作製する代替的メカニズムを提供した。断片は、短すぎて、同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能としないリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインを、別の断片の相補的ＶＨおよびＶＬドメインと対形成させ、それにより２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いた二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略もまた報告されている。例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３６８ （１９９４）を参照されたい。
【０２８４】
二価以上の原子価を有する抗体が意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる［Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７：６０ （１９９１）］。
【０２８５】
例示的な二重特性抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができ、その少なくとも１つが、本発明のタンパク質抗原に源を有する。あるいは、特定の抗原を発現する細胞に対して細胞防御メカニズムを集中させるように、免疫グロブリン分子の抗原アームを、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧ用のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）のような白血球上の誘発分子に結合するアームと組み合わせることができる。二重特異性抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に、細胞障害剤を誘導するのにも使用することができる。これらの抗体は、抗原結合アーム、およびＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡのような細胞障害剤または放射性核種キレート化剤を結合するアームを保有する。所定の別の二重特異性抗体は、本明細書中に記載するタンパク質抗原を結合し、さらに組織因子（ＴＦ）を結合する。
【０２８６】
４．１０．４  異種結合抗体
異種結合抗体も本発明の範囲内である。異種結合抗体は、２つの共有結合された抗体から構成される。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞へとターゲッティングするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、またＨＩＶ感染の治療用に（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号、欧州特許第０３０８９号）提唱されている。抗体は、架橋剤を包含するものを含む、合成タンパク質化学における既知の方法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができることが意図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、あるいはチオエーテル結合を形成することにより構築することができる。この目的に適切な試薬の例としては、イミノチオレート、およびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが挙げられる。
【０２８７】
４．１０．５  エフェクター機能操作
例えば癌を治療する際の抗体の有効性を増大するように、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましい。例えば、システイン残基（複数）を、Ｆｃ領域に導入することができ、それによりこの領域中に鎖間ジスルフィド結合形成を可能にする。こうして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力および／または増大した補体媒介性細胞死滅、および抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ．， １７６：１１９１−１１９５ （１９９２）、およびＳｈｏｐｅｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８：２９１８−２９２２ （１９９２）を参照されたい。増大された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５３：２５６０−２５６５ （１９９３）に記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、二重Ｆｃ領域有する抗体を操作することができ、それにより増大した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる［Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， ３：２１９−２３０ （１９８９）］。
【０２８８】
４．１０．６  免疫結合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に反応性のある毒素、あるいはそれらの断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性結合体）のような細胞障害剤に結合させた抗体を含む免疫結合体に関する。
【０２８９】
かかる免疫結合体の生成に有用な化学療法剤は上記に記載されている。使用することができるものとして酵素的に活性な毒素およびその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、エンドトキシンＡ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ毒素、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）のタンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モルモルディカ・キャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、カルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが挙げられる。様々な放射性核種が、放射性結合抗体の産生に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０２９０】
抗体と細胞障害剤との結合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレート（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデート（ａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ）ＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビズアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンジル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）のような様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３８：１０９８ （１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素１４標識したイソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドを結合するための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。
【０２９１】
別の実施形態では、抗体は、腫瘍プレターゲッティングに利用するための「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）に結合させることができ、ここで抗体−受容体結合体は、患者に投与されて、続いて清浄剤を用いて循環から未結合の結合体を除去し、次に「リガンド」（例えば、アビジン）を投与して、続いて細胞障害剤に結合させる。
【０２９２】
４．１１  コンピュータ可読配列
この実施形態の一用途では、本発明のヌクレオチド配列は、コンピュータ可読媒体上に記録することができる。本明細書中で使用する場合、「コンピュータ可読媒体」は、コンピュータにより直接読み取ることができ、かつアクセスすることができる任意の媒体を指す。かかる媒体としては、磁気記憶媒体（例えば、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ）、光記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）、電気記憶媒体（例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭ）、および磁気／光記憶媒体のようなこれらの種類のハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、どのようにして現在既知のコンピュータ可読媒体のいずれかを用いて、その上に本発明のヌクレオチド配列を記録したコンピュータ可読媒体を含む製品を創出することができるかを容易に理解することができる。
【０２９３】
様々なデータ記憶構造物は、本発明のヌクレオチド配列をその上に記録したコンピュータ可読媒体を創出するのに当業者に利用可能である。データ記憶構造物の選択は一般に、記憶される情報にアクセスするのに選択される手段に基づく。さらに、様々なデータプロセッサプログラムおよびフォーマットを用いて、コンピュータ可読媒体上に本発明のヌクレオチド配列情報を記憶させることができる。配列情報は、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄのような市販のソフトウェアにおいてフォーマット済みのワールドプロセシングテキストファイルで表すことができるか、あるいはＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅ等のようなデータベースアップリケ−ションに記憶されたＡＳＣＩＩファイルの形態で表すことができる。本発明のヌクレオチド配列情報を記憶させたコンピュータ可読媒体を得るために、当業者は、多数のデータプロセッサ構造化フォーマット（例えばテキストファイルまたはデータベース）を容易に適応させることができる。
【０２９４】
コンピュータ可読形態にあるヌクレオチド配列配列番号２７、２９、３３、３７、もしくは３９のいずれか、またはそれらの代表的断片、あるいは配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のヌクレオチド配列のいずれかにに少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を提供することにより、当業者は、様々な目的で配列情報にルーチンでアクセスすることができる。当業者がコンピュータ可読媒体に提供される配列情報にアクセスすることができるコンピュータソフトウェアが公的に利用可能である。以下の例は、Ｓｙｂａｓｅシステム上でＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０ （１９９０）］、およびＢＬＡＺＥ［Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐ． Ｃｈｅｍ．， １７：２０３−２０７ （１９９３）］検索アルゴリズムを実行するソフトウェアをどのように用いて、核酸配列内のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を特定するかを実証する。かかるＯＲＦは、タンパク質コード断片であってもよく、発酵反応および商業的に有用な代謝産物の産生に使用される酵素のような商業的に重要なタンパク質を生産するのに有用であり得る。
【０２９５】
本明細書中で使用する場合、「コンピュータベースシステム」は、本発明のヌクレオチド配列情報を解析するのに使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段を指す。本発明のコンピュータベースシステムの最小ハードウェア手段は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、インプット手段、アウトプット手段、およびデータ記憶手段を含む。当業者は、現在利用可能なコンピュータベースシステムの任意の１つが本発明で使用するのに適切であることを容易に理解することができる。上述のように、本発明のコンピュータベースシステムは、本発明のヌクレオチド配列を記憶させたデータ記憶手段、ならびに検索手段を支持および実行するための必要なハードウェア手段およびソフトウェア手段を含む。本明細書で使用する場合、「データ記憶手段」は、本発明のヌクレオチド配列情報を記憶することができるメモリー、または本発明のヌクレオチド配列情報を記憶させた製品にアクセスすることができるメモリーアクセス手段を指す。
【０２９６】
本明細書中で使用する場合、「検索手段」は、データ記憶手段内に記憶された配列情報と、標的配列または標的構造モチーフを比較するためのコンピュータベースシステム上で実行される１つまたはそれより多いプログラムを指す。検索手段は、特定の標的配列もしくは標的モチーフを適合させる既知の配列の断片または領域を特定するのに使用される。様々な既知のアルゴリズムは公的に開示されており、検索手段を実施するための様々な市販のソフトウェアが、本発明のコンピュータベースシステムで使用されるか、または使用され得る。かかるソフトウェアの例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮ、およびＢＬＡＳＴＡ（ＮＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＩＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、ホモロジー検索を実施するため利用可能なアルゴリズムまたは実行用ソフトウェアパッケージのいずれか１つが本コンピュータベースシステムにおいて使用するのに適応させることができることを容易に理解することができる。本明細書で使用する場合、「標的配列」は、６つ以上のヌクレオチド、または２つ以上のアミノ酸を有する任意の核酸あるいはアミノ酸配列であり得る。当業者は、より長い標的配列ほど、標的配列がデータベース中のランダム発生として提示される可能性が低いことを容易に理解するであろう。標的配列の最も好ましい配列長は、約１０〜１００個のアミノ酸、あるいは約３０〜３００個のヌクレオチド残基である。しかしながら、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関与する配列断片のような商業的に重要な断片に関する検索は、長さがより短い場合もあることが理解されよう。
【０２９７】
本明細書中で使用されるように、「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」は、任意の合理的に選定された配列または配列の組合せを指し、ここで配列（複数可）は、標的モチーフのフォールディング時に形成される三次元立体配置に基づいて選択される。当該技術分野で既知の様々な標的モチーフが存在する。タンパク質標的モチーフとしては、酵素活性部位およびシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。核酸標的モチーフとしては、プロモーター配列、ヘアピン構造、誘導性発現要素（タンパク質結合配列）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９８】
４．１２  三重らせん形成
さらに、広範に記載される場合、本発明の断片は、三重らせん形成あるいはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を制御するのに使用することができ、これらの方法の両方が、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチド配列の結合に基づく。これらの方法で使用するのに適したポリヌクレオチドは通常、２０〜４０塩基長であり、転写に関与した遺伝子領域［三重らせん：Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６：３０７３ （１９７９）、Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５２４１：４５６ （１９８８）、およびＤｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：１３６０ （１９９１）を参照］、またはｍＲＮＡ自体［アンチセンス：Ｏｌｍｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６：５６０ （１９９１）、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８）］に相補的であるように設計される。三重らせん形成が最適に、ＤＮＡからのＲＮＡ転写を遮断する結果をもたらす一方で、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を阻止する。両技法は、モデル系で有効であることが実証されている。本発明の配列中に含まれる情報は、アンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチドの設計に必要である。
【０２９９】
４．１３  診断アッセイおよびキット
本発明はさらに、任意に適切な標識と結合されるか、またはそうでなければ標識に連結している本発明の核酸プローブまたは抗体を用いて、試料中の本発明のＯＲＦの１つまたはそれらの相同体の存在あるいは発現を同定する方法を提供する。
【０３００】
一般に、本発明のポリヌクレオチドを検出する方法は、試料を、ポリヌクレオチドに結合して、それと複合体を形成する化合物と、上記複合体を形成するのに十分な期間を接触させ、上記複合体を検出し、もし複合体が検出される場合、本発明のポリヌクレオチドが試料中で検出されること、を含むことができる。かかる方法はまた、試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオチドにアニーリングする核酸プライマーと、かかる条件下で接触させ、アニーリングしたポリヌクレオチドを増幅し、もしポリヌクレオチドが増幅される場合、本発明のポリヌクレオチドが細胞中で検出されること、を含むことができる。
【０３０１】
一般に、本発明のポリペプチドを検出する方法は、試料を、ポリヌクレオチドに結合して、それと複合体を形成する化合物と、上記複合体を形成するのに十分な期間接触させ、上記複合体を検出し、もし複合体が検出される場合、本発明のポリペプチドが試料中で検出されること、を含むことができる。
【０３０２】
詳細には、かかる方法は、本発明の１つまたはそれより多い抗体、あるいは１つまたはそれより多い核酸プローブとともに試験試料をインキュベートすることと、試験試料内の構成成分への核酸プローブまたは抗体の結合に関してアッセイすることとを含む。
【０３０３】
試験試料とともに核酸プローブまたは抗体をインキュベートするための条件は様々である。インキュベーション条件は、アッセイで使用する方式、使用する検出方法、およびアッセイで使用する核酸プローブまたは抗体のタイプおよび性質に依存する。当業者は、一般に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅または免疫学的アッセイ方式のいずれか１つが、本発明の核酸プローブまたは抗体を利用するのに容易に適応させることができることを理解されよう。かかるアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ， Ｔ．， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８６）、Ｂｕｌｌｏｃｋｉ， Ｇ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ Ｖｏｌ．１ （１９８２）， Ｖｏｌ．２ （１９８３）， Ｖｏｌ．３ （１９８５）、Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８５）に見出すことができる。本発明の試験試料としては、細胞、細胞のタンパク質もしくは膜抽出物、または痰、血液、血清、結晶または尿のような生物学的液体が上げられる。上述の方法で使用される試験試料は、アッセイ方式、検出方法の性質、およびアッセイされるべき試料として使用される組織、細胞または抽出物に基づいて多種多様である。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製する方法は、当該技術分野で既知であり、利用される系と適合性である試料を得るために容易に適応させることができる。
【０３０４】
本発明の別の実施形態では、本発明のアッセイを実施するのに必要な試薬を含有するキットが提供される。具体的に、本発明は、（ａ）本発明のプローブまたは抗体の１つを含む第１の容器、および（ｂ）１つまたはそれより多い以下の：洗浄試薬、結合プローブまたは抗体の存在を検出することが可能な試薬を含む１つまたはそれより多い他の容器を含む、１つまたはそれより多い容器を、厳重に閉じ込めて収容するコンパートメントキットを提供する。
【０３０５】
詳細には、コンパートメントキットは、試薬が別個の容器に含有された任意のキットである。かかる容器としては、小ガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチックもしくは紙の細片が挙げられる。かかる容器は、あるコンパートメントから別のコンパートメントへ試薬を効率的に移動させることが可能であり、その結果試料および試薬は、交差汚染されず、各容器の作用物質または溶液を、あるコンパートメントから別のコンパートメントへ、定量的に添加することができる。かかる容器は、試験試料を入れる容器、アッセイで使用する抗体を含有する容器、洗浄試薬（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液等）を含有する容器、および結合抗体またはプローブを検出するのに使用される試薬を含有する容器を含む。検出試薬のタイプとしては、標的核酸プローブ、標識二次抗体、あるいは代替物としては、一次抗体が標識される場合、標識抗体と反応することが可能な酵素的または抗体結合試薬が挙げられる。当業者は、開示した本発明のプローブおよび抗体が、当業者に既知の確立されたキット方式の１つに容易に組み込ませることができることを容易に理解されよう。
【０３０６】
４．１４  医療用イメージング
本発明の新規ポリペプチドおよび結合パートナーは、本発明の分子を発現する部位（例えば、本発明のポリペプチドが、炎症または感染のイメージング部位に関する免疫応答に関与する場合）の医療用イメージングに有用である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第５，４１３，７７８号を参照されたい。かかる方法は、標識またはイメージング剤の科学的結合、薬学的に許容可能なキャリア中の標識ポリペプチドの被験体への投与、および標的部位でのｉｎ  ｖｉｖｏでの標識ポリペプチドのイメージングを含む。
【０３０７】
４．１５  スクリーニングアッセイ
本発明の単離タンパク質およびポリヌクレオチドを用いて、本発明はさらに、配列番号２７、２９、３３、３７、または３９に記載のヌクレオチド配列のいずれかに相当するＯＲＦによりコードされるポリペプチドに結合するか、あるいは核酸によりコードされるポリペプチドの特定ドメインに結合する作用物質を獲得および同定する方法を提供する。詳細には、上記方法は：
（ａ）本発明のＯＲＦによりコードされる単離タンパク質、または本発明の核酸と作用物質を接触させ、
（ｂ）作用物質が上記タンパク質または上記核酸に結合するかどうかを決定する工程
を含む。
【０３０８】
したがって、概して、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物を同定するかかる方法は、化合物を、本発明のポリヌクレオチドと、ポリヌクレオチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間を接触させ、上記複合体を検出し、もしポリヌクレオチド／化合物複合体が検出される場合、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物が同定されること、を含むことができる。
【０３０９】
したがって、同様に、概して、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するかかる方法は、化合物を、本発明のポリペプチドと、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間接触させ、上記複合体を検出し、もしポリヌペプチド／化合物複合体が検出される場合、本発明のポリヌクレオチドに結合する化合物が特定されること、を含むことができる。
【０３１０】
本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定する方法はまた、細胞において、本発明のポリペプチドと、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な時間化合物を接触させ、上記複合体は、細胞内の受容体遺伝子配列の発現を駆動し、レポーター遺伝子配列発現を検出することにより上記複合体を検出し、もし上記ポリペプチド／化合物複合体複合体が検出される場合、本発明のポリヌクレオチドを結合する化合物が特定されること、を含むことができる。
【０３１１】
かかる方法により同定された化合物としては、本発明のポリペプチドの活性を調節する（すなわち、化合物の非存在下で観察される活性に対して、その活性を増加または減少させる）化合物を挙げることができる。あるいは、かかる方法により同定された化合物は、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する（すなわち、化合物の非存在下で観察される発現レベルに対して、発現を増加または減少させる）化合物を挙げることができる。本発明の方法により同定された化合物のような化合物は、活性／発現を調節するその能力に関して、当業者には既知の標準的なアッセイを用いて試験することができる。
【０３１２】
上記アッセイでスクリーニングされる作用物質は、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体、または他の薬学的作用物質であり得るが、これらに限定されない。作用物質は、タンパク質モデリング技法を用いて、ランダムに選定およびスクリーニングされ得るか、あるいは合理的に選定または設計され得る。
【０３１３】
ランダムスクリーニングに関して、ペプチド、炭水化物、薬学的作用物質等のような作用物質は、ランダムに選定されて、本発明のＯＲＦによりコードされるタンパク質に結合するそれらの能力に関してアッセイされる。あるいは、作用物質は、合理的に選定または設計される。本明細書中で使用する場合、作用物質が特定のタンパク質の立体配置に基づいて選択される場合、その作用物質は、「合理的に選定または設計される」と言われる。例えば、当業者は、合理的に設計された抗ペプチドペプチド（例えば、Ｈｕｒｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， 「Ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， ＮＹ （１９９２）， ｐｐ． ２８９−３０７、およびＫａｓｐｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：９２３０−８ （１９８９）を参照）、あるいは薬学的作用物質等を生成するために、特定のペプチド配列に結合することが可能なペプチド、薬学的作用物質等を生成するための現在利用可能な手順を容易に適応させることができる。
【０３１４】
上述のもののほかに、本発明の作用物質に１つの種類を、大まかに記載する場合、本発明のＯＲＦまたはＥＭＦの１つに結合することにより、遺伝子発現を制御するのに使用することができる。上述のように、かかる作用物質は、ランダムにスクリーニングされ得るか、または合理的に設計／選定され得る。ＯＲＦまたはＥＭＦのターゲッティングにより、当業者は、発現制御用の同じＥＭＦに依存する単一ＯＲＦまたは複数ＯＲＦの発現を調節する配列特異的または要素特異的作用物質を設計することが可能である。ＤＮＡ結合作用物質の１つの種類は、ＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブリダイズするか、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡに結合することにより三重らせん形成を形成する塩基残基を含有する作用物質である。かかる作用物質は、古典的なホスホジエステル、リボ核酸骨格に基づくことができるか、あるいは塩基結合能力を有する様々なスルフィドリルまたは高分子誘導体であり得る。
【０３１５】
これらの方法で使用するのに適した作用物質は通常、２０〜４０個の塩基を有しており、転写に関与した遺伝子領域［三重らせん：Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６：３０７３ （１９７９）、Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１：４５６ （１９８８）、およびＤｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：１３６０ （１９９１）を参照］、またはｍＲＮＡ自体［アンチセンス：Ｏｋａｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６：５６０ （１９９１）、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８）］に相補的であるように設計される。三重らせん形成が最適に、ＤＮＡからのＲＮＡ転写を遮断する結果をもたらす一方で、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を阻止する。両技法は、モデル系で有効であることが実証されている。本発明の配列中に含まれる情報は、アンチセンスまたは三重らせんオリゴヌクレオチドおよび他のＤＮＡ結合作用物質の設計に必要である。
【０３１６】
本発明のＯＲＦの１つによりコードされるタンパク質に結合する作用物質は、診断剤として使用することができる。本発明のＯＲＦの１つによりコードされるタンパク質に結合する作用物質は、薬学的組成物を生成するための既知の技法を用いて配合することができる。
【０３１７】
４．１６  プローブとしての核酸の使用
本発明の別の態様は、天然に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能なポリペプチド特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供することである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ヌクレオチド配列配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のいずれかに由来され得る。相当する遺伝子は限定数の組織のみで発現されるため、ヌクレオチド配列配列番号２７、２９、３３、３７、または３９のいずれかに由来する核酸プローブは、試料中のかかる組織の細胞型のＲＮＡの存在の指標として使用することができる。
【０３１８】
例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのような任意の適切なハイブリダイゼーション技法を使用することができる。米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，９６５，１８８号に記載されるようなＰＣＲは、ヌクレオチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドに関するさらなる使用を提供する。ＰＣＲで使用されるかかるプローブは、組換え起源のものであってもよく、化学的に合成されてもよく、あるいはその両方の混合物であってもよい。プローブは、同一配列の検出のための別個のヌクレオチド配列、または密接に関連したゲノム配列の同定のための考え得る配列の縮重プールを含む。
【０３１９】
核酸用の特定のハイブリダイゼーションプローブを生産する他の手段としては、ｍＲＮＡプローブの生産のための、ベクターへの核酸配列のクローニングが挙げられる。かかるベクターは当該技術分野で既知であり、市販されており、またＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼおよび適切な放射性標識ヌクレオチドの添加を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するのに使用してもよい。ヌクレオチド配列は、それらの個々のゲノム配列のマッピング用のハイブリダイゼーションプローブを構築するのに使用されてもよい。本明細書中に提供されるヌクレオチド配列は、既知の遺伝子および／または染色体マッピング技法を用いて、染色体または染色体の特定領域に対してマッピングされ得る。これらの技法としては、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖分析、既知の染色体に特異的なライブラリーまたは流れ分類した（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体調製物を用いたハイブリダイゼーションスクリーニング等が挙げられる。染色体広がり（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｐｒｅａｄｓ）の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの技法は、他の場所にも記載されているが、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹに記載されている。
【０３２０】
染色体調製物の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および他の物理的染色体マッピング技法は、さらなる遺伝子マップデータと相関させてもよい。遺伝子マップデータの例は、１９９４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ （２６５：１９８１ｆ）に見出すことができる。物理的染色体マップ上の核酸の位置と特定の疾患（または特定の疾患にかかりやすい素因）との相関関係は、当該遺伝病と関連したＤＮＡ領域の範囲を定めることを助け得る。本発明のヌクレオチド配列は、正常な保有者と罹患した個体との間の遺伝子配列の差異を検出するのに使用され得る。
【０３２１】
４．１７  支持体結合性オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチド、すなわち小核酸セグメントは、一般に自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて実施されるように、例えば化学的手段により直接オリゴヌクレオチドを合成することにより容易に調製され得る。
【０３２２】
支持体結合性オリゴヌクレオチドは、ガラス、ポリスチレン、またはテフロンのような任意の適切な支持体を用いて、当業者に既知の任意の方法により調製され得る。１つの戦略は、標準的な合成機により合成されるオリゴヌクレオチドを正確にスポッティングすることである。固定化は、受動吸着を用いて［Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｈｏｎｄｏ， Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２８（６）：１４６２−７３ （１９９０）］、ＵＶ光を用いて［Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ． （１９８５）； Ｄａｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８７）； Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ， ３（２）：１８９−２０７ （１９８９）］を用いて、あるいは塩基修飾ＤＮＡの共有結合により［Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８； １９８９］（参照文献はすべて、具体的に本明細書中に援用される）達成することができる。
【０３２３】
使用され得る別の戦略は、リンカーとしての強力なビオチン−ストレプトアビジン相互作用の使用である。例えば、Ｂｒｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９１（８）：３０７２−６ （１９８４）は、ビオチン化プローブの使用について記載しているが、これらは、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ上に固定化された二重鎖プローブである。ストレプトアビジン被覆ビーズは、Ｄｙｎａｌ， Ｏｓｌｏから購入され得る。当然のことながら、この同じ連結化学は、ストレプトアビジンで任意の表面を被覆するのに適用可能である。ビオチン化プローブは、様々な供給源（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ａｌａｍｅｄａ， ＣＡ）のような）から購入され得る。
【０３２４】
Ｎｕｎｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， ＩＬ）はまた、使用することができる適切な材料を販売している。Ｎｕｎｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓは、ＤＮＡをＣｏｖａｌｉｎｋ  ＮＨと呼ばれるマイクロウェル表面に共有結合できる方法を開発した。Ｃｏｖａｌｉｎｋ  ＮＨは、さらなる共有結合のための架橋ヘッドとして作用する第二アミノ基（＞ＮＨ）でグラフトしたポリスチレン表面である。ＣｏｖａＬｉｎｋ Ｍｏｄｕｌｅｓは、Ｎｕｎｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入することができる。ＤＮＡ分子は、ホスホルアミデート結合により５’末端のみでＣｏｖａＬｉｎｋに結合されてもよく、１ｐｍｏｌより多いＤＮＡの固定化を可能にする［Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９８（１）１３８−４２ （１９９１）］。
【０３２５】
５’末端でのＤＮＡ分子の共有結合のためのＣｏｖａＬｉｎｋ  ＮＨ細片の使用について記載されている［Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１］。この技術では、ホスホルアミデート結合を使用する［Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， １１（１８）：６５１３−２９ （１９８３）］。単一共有結合のみを用いた固定化が好ましい場合に、これは有益である。ホスホルアミデート結合は、２ｎｍ長のスペーサーアームによりポリスチレン表面上に共有結合的にグラフトされたスペーサーアームの末端に位置されるＣｏｖａＬｉｎｋ  ＮＨ第二アミノ基にＤＮＡを連結する。ホスホルアミデートによるＣＯｖａＬｉｎｋ  ＮＨにオリゴヌクレオチドを連結するために、オリゴヌクレオチド末端は、５’末端リン酸基を有さなくてはならない。おそらく、ビオチンがＣｏｖａＬｉｎｋに共有結合し、続いて使用されるストレプトアビジンがプローブを結合することさえ可能である。
【０３２６】
より具体的には、結合方法は、水中にＤＮＡを溶解させること（７．５ｎｇ／μｌ）と、９５℃で１０分間変性させることと、１０分間氷上で冷却することとを含む。次に、氷冷０．１Ｍ  １−メチルイミダゾール（ｐＨ７．０）（１−ＭｅＩｍ７）を、最終濃度１０ｍＭ  １−ＭｅＩｍ７となるように添加する。次に、ｓｓＤＮＡ溶液を、氷上に固定したＣｏｖａＬｉｎｋ  ＮＨ細片に分取する（７５μｌ／ウェル）。
【０３２７】
１０ｍＭ  １−ＭｅＩｍ７中に溶解したカルボジイミド（０．２Ｍ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルオジイミド（ＥＤＣ）を新たに作製し、２５μｌをウェルごとに添加する。細片を５０℃で５時間インキュベートする。インキュベーション後、細片を、例えばＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｗａｓｈを用いて洗浄する：まずウェルを３回洗浄し、続いて洗浄用溶液を用いて５分間細片を浸し、最終的に細片を３回洗浄する（ここで、洗浄用溶液は、５０℃に加熱した０．４Ｎ  ＮａＯＨ、０．２５％  ＳＤＳである）。
【０３２８】
本発明で使用するためのさらなる適切な方法は、ＰＣＴ特許出願国際公開第９０／０３３８２号（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＆ Ｍａｓｋｏｓ）（参照により本明細書に援用される）に記載される方法が意図される。支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを調製するこの方法は、支持体により保有された脂肪族水酸基に、ホスホジエステル共有結合によりリン酸基を通じてヌクレオチド３’試薬を結合することを含む。次に、オリゴヌクレオチドを、支持されたヌクレオチシド上で合成し、支持体からオリゴヌクレオチドが切断されない標準的な条件下で、合成オリゴヌクレオチド鎖から保護基を除去する。適切な試薬としては、ヌクレオシドホスホルアミダイトおよびヌクレオシドリン化水素が挙げられる。
【０３２９】
ＤＮＡプローブアレイの調製のためのオンチップ戦略を使用してもよい。例えば、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１（４９９５）：７６７−７３（参照により本明細書に援用される）により記載されるように、アドレス可能なレーザ活性化光脱保護を、直接ガラス表面上でのオリゴヌクレオチドの化学合成で使用してもよい。プローブはまた、Ｖａｎ Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９（１２）：３３４５−５０ （１９９１）に記載されるようにナイロン支持体上に固定されてもよく、あるいはＤｕｎｃａｎ ＆ Ｃａｖａｌｉｅｒ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６９（１）：１０４−８ （１９８８）の方法を用いてテフロンに連結されてもよい（参照文献はすべて、具体的に参照により本明細書中に援用される）。
【０３３０】
Ｖａｎ Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， （１９９１）に記載されるように、ナイロン支持体にオリゴヌクレオチドを連結することは、アルキル化、およびシアヌル酸塩化物を用いたオリゴヌクレオチドの５’−アミンの選択的活性化により、ナイロン表面の活性化を必要とする。
【０３３１】
支持体結合性オリゴヌクレオチドを調製する１つの特定の方法の１つは、Ｐｅａｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９１（１１）：５０２２−６ （１９９４）により記載される光生成合成を利用することである。これらの著者等は、固定化オリゴヌクレオチドプローブのアレイ（ＤＮＡチップ）を生成する現在のフォトリソグラフィ技法を使用した。高密度小型化アレイ中のオリゴヌクレオチドプローブの合成を誘導するのに光が使用されるこれらの方法は、感光性５’−保護Ｎ−アシル−デオキシヌクレオシドホスホルアミダイト、表面リンカー化学、および可変性コンビナトリアル合成戦略を利用する。２５６個の空間的に規定されたオリゴヌクレオチドプローブのマトリックスは、この方法で生成され得る。
【０３３２】
４．１８  核酸断片の調製
核酸は、任意の増幅工程なく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、顕微解剖した染色体バンド、コスミドまたはＹＡＣ挿入物、およびＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）のような任意の適切な供給源から得られ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）は、哺乳動物細胞から高分子量ＤＮＡを単離するための３つのプロトコルについて記載している（ｐ．９．１４〜９．２３）。
【０３３３】
ＤＮＡ断片は、Ｍ１３、プラスミドまたはλベクター中でクローンとして調製されてもよく、かつ／またはＰＣＲもしくは他の増幅方法により、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから直接調製してもよい。試料は、マルチウェルプレート中で調製されてもよく、あるいは分取されてもよい。約１００〜１０００ｎｇのＤＮＡを、最終容量２〜５００ｍｌ中に調製してもよい。
【０３３４】
次に、核酸は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）の９．２４〜９．２８に記載されるような制限酵素の使用、超音波によるせん断、およびＮａＯＨ処理を含む、当業者に既知の方法のいずれかにより断片化される。
【０３３５】
Ｓｃｈｒｉｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８（２４）：７４５５−６ （１９９０）に記載されるように、低圧せん断もまた適切である。この方法では、ＤＮＡ試料を、様々な低〜中圧で、小さなフレンチプレスセルに通す。レバー装置は、セルへの低〜中圧の制御された印加を可能にする。これらの研究は、低圧せん断が音波および酵素ＤＮＡ断片方法に対する有用な代替法であることを示す。
【０３３６】
１つの特に適切なＤＮＡの断片化方法は、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．， ２０（１４）：３７５３−６２ （１９９２）に記載される２塩基認識エンドヌクレアーゼＣｖｉＪＩを用いた方法であることを意図される。これらの著者等は、ショットガンクローニングおよびシーケンシングに適切であることを意図する特定サイズへの迅速なＤＮＡの断片化および分画のためのアプローチについて記載している。
【０３３７】
制限エンドヌクレアーゼＣｖｉＪＩは通常、ＧとＣとの間で認識配列ＰｕＧＣＰｙを切断して、平滑末端を残す。典型的な反応条件は、この酵素（ＣｖｉＪＩ＊＊）の特異性を変更し、小分子ｐＵＣ１９（２６８８塩基対）由来のＤＮＡ断片の準ランダム分布をもたらす。Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ等（１９９２）は、迅速なゲルろ過方法によりサイズ分画され、末端修復なしでｌａｃＺ−Ｍ１３クローニングベクターに直接連結させたｐＵＣ１９のＣｖｉＪＩ＊＊消化物を用いて、この断片戦略のランダム性を定量的に評価した。７６個のクローンの配列分析により、ＣｖｉＪＩ＊＊は、ＰｕＧＣＰｙ部位のほかに、ＰｙＧＣＰｙ部位およびＰｕＧＣＰｕを制限し、新たな配列データがランダム断片化と一致した速度で蓄積されることがわかった。
【０３３８】
文献で報告されているように、音波処理およびアダロースゲル分画に比較したこのアプローチの利点としては、少量のＤＮＡが必要であること（２〜５μｇではなく、０．２〜０．５μｇ）、およびより少ない工程を伴うこと（前連結反応、末端修復、化学的抽出、またはアガロースゲル電気泳動、および溶出は必要とされない）が挙げられる。
【０３３９】
核酸断片が得られるか、または調製される様式に関係なく、ハイブリダイゼーションに利用可能な一本鎖片を付与するためにＤＮＡを変性させることが重要である。これは、８０〜９０℃で２〜５分間、ＤＮＡ溶液をインキュベートすることにより達成される。次に、溶液を迅速に２℃にまで冷却して、ＤＮＡ断片をチップと接触させる前にＤＮＡ断片が再生することを防止する。リン酸基はまた、当該技術分野で既知の方法によりゲノムＤＮＡから除去されなくてはならない。
【０３４０】
４．１９  ＤＮＡアレイの調製
アレイは、ナイロン膜のような支持体上にＤＮＡ試料をスポッティングすることで調製され得る。スポッティングは、金属ピンアレイ（その位置は、マイクロタイタープレート中のウェルのアレイに相当する）を用いて実施され、ナイロン膜にＤＮＡ溶液約２０ｎｌを転写するまで繰り返され得る。オフセット印刷により、ウェルの密度よりも高いドット密度が達成される。使用する標識タイプに依存して、１ｍｍ２中に１〜２５ドットが収容されてもよい。幾つかの予め選択した数の横列および縦列にスポッティングすることを回避することで、別個のサブセット（サブアレイ）が形成され得る。１つのサブアレイ中の試料は、異なる個体由来のＤＮＡ（または同じ遺伝子）の同じゲノムセグメントであってもよく、あるいは異なる重複したゲノム部分であってもよい。サブアレイはそれぞれ、同じ試料のレプリカスポッティングを表してもよい。一例では、選択遺伝子セグメントを、６４人の患者から増幅してもよい。各患者に関して、増幅した遺伝子セグメントは、９６ウェルプレート中に存在してもよい（ウェルはすべて、同じ試料を含有する）。６４人の患者それぞれ用のプレートを調製する。９６ピン装置を使用することで、試料はすべて、８×１２ｃｍ膜上にスポッティングされ得る。サブアレイは、各患者から１つずつ６４個の試料を含有してもよい。９６個のサブアレイが同一である場合、ドットスパンは、１ｍｍ２であってもよく、サブアレイ間に１ｍｍの空間が存在してもよい。
【０３４１】
別のアプローチは、物理的スペーサー、例えば膜上にわたって成形したプラスチックグリッドにより仕切られてもよい膜またはプレート（ＮＵＮＣ， Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能）を使用することであり、グリッドは、マルチウェルプレートの基部に適用した膜、または疎水性細片の種類と同様である。固定物理的リンカーは、平面蛍光貯蔵スクリーンまたはｘ線フィルムへの暴露によるイメージングには好ましくない。
【０３４２】
本発明は、以下の実施例で説明される。本開示を考慮して、当業者は、本発明の範囲内で多くの他の実施形態および変形がなされ得ることを理解されよう。したがって、本発明の広範な態様は、以下の実施例の開示により限定されないことを意図する。本発明は、本発明の単一態様の説明として意図される例示的実施形態により範囲を限定されず、機能的に等価な組成物および方法が本発明の範囲内である。実際に、本発明の実施における数多くの変更および変形が、この好ましい実施形態を考慮して、当業者の心に浮かぶことが予測される。したがって、本発明の範囲に課せられるべき唯一の制限は、併記の特許請求の範囲に見られるものである。
【０３４３】
本明細書の主要部分内で引用した参照文献はすべて、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０３４４】
５．実施例
実施例１
ヒト細胞のｃＤＮＡライブラリーからの配列番号１〜２１の単離
大多数の新規核酸は、標準的なＰＣＲ、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法による配列サイン解析、およびサンガーシーケンシング技法を用いて、ヒト胎児肝臓、脾臓、卵巣、成人脳、肺腫瘍、脊髄、頸部、卵巣、内皮細胞、臍帯、胎盤、リンパ球、肺線維芽細胞、胎児脳、および精巣から調製されるｃＤＮＡライブラリーから得られた。ライブラリーの挿入物を、挿入物に隣接するベクター配列に特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅させた。これらの試料をナイロン膜上にスポッティングして、オリゴヌクレオチドプローブにより応答させて（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ） 配列サインを付与した。クローンを、類似または同一の配列の群に集めて、単一の代表的クローンを、ゲルシーケンシング用に各群から選定した。次に、増幅挿入物の５’配列を、典型的なサンガーシーケンシングプロトコルにおいて、逆Ｍ１３シーケンシングプライマーを用いて推定した。ＰＣＲ産物を精製して、蛍光色素ターミネーターサイクルシーケンシングに付した。シングルパスゲルシーケンシングを、３７７Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）シーケンサーを用いて行った。これらの挿入物を、このライブラリーからはこれまで得られておらず、かつ公的データベースでこれまで報告されていない新規配列として同定した。これらの配列は、添付の配列表で、配列番号１〜２１として示す。
【０３４５】
実施例２
配列番号２２および２４の構築物
本発明の新規核酸（配列番号２２および２４）は、上記実施例１に記載する方法により、ｃＤＮＡライブラリーから得られる配列から構築された。最終的な配列は、シード（ｓｅｅｄ）としてＥＳＴ配列を使用することで構築した。次に、再帰的アルゴリズムを用いて、この構築物に属するＥＳＴ配列を含有するＨｙｓｅｑ’ｓデータベースからさらなる配列を引き寄せることで、伸長した構築物にシードを伸長させた。完全コンティグが構築されると、アルゴリズムは終了した。構築物へのコンポーネント配列の含入は、３００を超えるＢＬＡＳＴスコアおよび９５％を超える％同一性を有する伸長構築物に対するＢＬＡＳＴＮヒットに基づいていた。
【０３４６】
構築した配列（配列番号２２または２４）に関する隣接結果が、Ｆａｓｔｘｙアルゴリズムを用いた、Ｇｅｎｐｅｐｔリリース１１４に対するＦＡＳＴＡバージョン３検索により得られた。Ｆａｓｔｘｙは、コドン内フレームシフトを許容するＦＡＳＴＡアラインメントの改良バージョンである。隣接結果は、それぞれの構築物に関して最も近い相同体をＧｅｎｐｅｐｔから示した（隣接結果は、構築物がコードする翻訳アミノ酸配列を含有する）。隣接結果を以下に記載する：
【０３４７】
【表１】
2004518425.tif 000002
【０３４８】
以下に記載するように、ポリペプチドは、配列番号２２（または２４）によりコードされることが予測された。ポリペプチドは、既知のポリペプチドと、翻訳新規ポリヌクレオチドとの比較に基づいてポリペプチドを選定するＦＡＳＴＹと呼ばれるソフトウェアプログラム（ｈｙｙｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕから利用可能）を用いて予測された（Ｗ．Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８３：６３−９８ （１９９０）、参照により本明細書に援用される）。
【０３４９】
【表２】
2004518425.tif 000003
【０３５０】
実施例３
配列番号２７の構築物
本発明の新規核酸（配列番号２７）は初めに、上記実施例１に記載する方法により、ｃＤＮＡライブラリーから得られる配列から構築された。最終的な配列は、シードとしてＥＳＴ配列を使用することで構築した。次に、再帰的アルゴリズムを用いて、伸長した構築物に、この構築物に属するＥＳＴ配列を含有するＨｙｓｅｑ’ｓデータベースからさらなる配列を引き寄せることで、シードを伸長させた。完全コンティグが構築されると、アルゴリズムは終了した。構築物へのコンポーネント配列の含入は、３００を超えるＢＬＡＳＴスコアおよび９５％を超える％同一性を有する伸長構築物に対するＢＬＳＡＴヒットに基づいていた。
【０３５１】
この初期配列を用いて、初期配列を含むＥＳＴの増幅用に、適切なプライマーを設計した。産物をクローニングした。ＤＮＡを単離し、適切な制限酵素で切断し、連結して、再クローニングして、完全長コンティグを生成した。次に、完全長産物をクローニングして、３７７Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）シーケンサーを用いてシーケンシングした。このヌクレオチド配列は、配列番号２７と同一であった。
【０３５２】
あるいは、完全長幹細胞因子様ＤＮＡを、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。第一ＰＣＲ産物を、ネステッドＰＣＲプライマーを用いてさらに増幅した。第二ＰＣＲの産物を、３７７Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）シーケンサーを用いて配列決定した。この産物は、配列番号２７と同一であった。
【０３５３】
実施例４
配列番号２３および２５の構築物
ＲＨＰＡＰ（Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いて、完全長遺伝子ｃＤＮＡ配列および相当するタンパク質配列を、構築物から生成した。任意のフレームシフトおよび間違った終止コドンを、手動編集により正した。編集中、配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ（すなわち、Ｇｅｎｅｐｅｐｔリリース１１５）に対してＦＡＳＴＹおよび／またはＢＬＡＳＴを用いてチェックした。編集プロセスで使用し得た他のコンピュータプログラムは、ｐｈｒｅｄＰｈｒａｐおよびＣｏｎｓｅｄ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、ならびにｅｄ−ｒｅａｄｙ、ｅｄ−ｅｘｔ、およびｃｇ−ｚｉｐ−２（Ｈｙｓｅｑ， Ｉｎｃ．）であった。
【０３５４】
以下に記載するように、ポリペプチド（配列番号２８）は、配列番号２７によりコードされることが予測された。ポリペプチドは、既知のポリヌクレオチドと、翻訳された新規ポリヌクレオチドとの比較に基づいてポリペプチドを選定するＢＬＡＳＴＸと呼ばれるソフトウェアプログラムを用いて予測された。開始メチオニンは、配列番号３の位置１２３で始まり、推定終止コドンＴＡＡは、ヌクレオチド配列の位置１７１０から始まる。
【０３５５】
配列番号２８の幹細胞成長因子様ポリペプチドは、グリコシル化されていない予測分子質量およそ５９．２ｋＤａを有するおよそ５２９個のアミノ酸タンパク質である。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いたタンパク質データベース検索［Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．， ３６：２９０−３００（１９９３）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１：４０３−１０ （１９９０）、参照により本明細書に援用される］は、配列番号２８が、腫瘍内皮マーカー７前駆タンパク質に相同的であることを示す。
【０３５６】
図２は、幹細胞成長因子様ポリペプチド配列番号２８によりコードされるタンパク質と、腫瘍内皮マーカー７前駆タンパク質配列番号３６［Ｓｔ． Ｃｒｏｉｘ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９：１１９７−１２０１］との間のＢＬＡＳＴＸアミノ酸配列アラインメントを示し、２つの配列が、４４１個のアミノ酸残基にわたって７２％類似性、および同じ４４１個のアミノ酸残基にわたって５７％同一性を共有することを示している。
【０３５７】
予測されるおよそ３０残基のシグナルペプチドは、配列番号２８のコードされたおよそ残基１〜残基３０である（シグナルペプチドは、配列番号３０に記載される）。細胞外部分は、それ自体で有用である。これは、哺乳動物細胞での発現および切断産物のシーケンシングにより確認することができる。シグナルペプチド領域は、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ１．１プログラム［Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｎｅｕｒ． Ｓｙｓｔ． ８：５８１ （１９９７）］（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋから）、およびＫｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアルゴリズム［Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５ （１９８２）］を用いた疎水性解析を用いて予測された。切断部位は、コンピュータプログラムにより予測されるのと異なり得ることは当業者に理解されよう。配列番号３１は、シグナルペプチドが配列番号２８から除去される場合に生じるペプチドである。
【０３５８】
予測されるおよそ２８残基の膜貫通領域は、配列番号２８のコードされたおよそ残基４５２〜残基４７９であり（配列番号２３）、それは、哺乳動物細胞における発現により確認され得る。膜貫通領域は、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ１．１プログラム［Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｎｅｕｒ． Ｓｙｓｔ． ８：５８１ （１９９７）］（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋから）、およびＫｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアルゴリズム［Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５ （１９８２）］を用いた疎水性解析を用いて予測された。膜貫通領域は、コンピュータプログラムにより予測されるのと異なり得ることは当業者に理解されよう。
【０３５９】
ポリペプチド（配列番号２５）は、以下に記載するように、配列番号２４によってコードされることが予測された。このポリペプチドは、既知のポリヌクレオチドと、翻訳された新規ポリヌクレオチドとの比較に基づいてポリペプチドを選定するＢＬＡＳＴＸと呼ばれるソフトウェアプログラムを用いて予測された。開始メチオニンは、配列番号２４の位置１０７で始まり、推定終止コドンＴＡＡは、ヌクレオチド配列の位置１２８０から始まる。
【０３６０】
配列番号２５の幹細胞成長因子様ポリペプチド（配列番号２３と同一）は、グリコシル化されていない予測分子質量およそ５０ｋＤａを有するおよそ３９２個のアミノ酸タンパク質である。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いたタンパク質データベース検索［Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．， ３６：２９０−３００（１９９３）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１：４０３−１０ （１９９０）、参照により本明細書に援用される］は、配列番号２５が、腫瘍内皮マーカー７前駆タンパク質に相同的であることを示す。
【０３６１】
予測されるおよそ２８残基の膜貫通領域は、配列番号２５のコードされたおよそ残基３１５〜残基３４２である（配列番号２３）。それは、哺乳動物細胞における発現により確認され得る。膜貫通領域は、Ｎｅｕｒａｌ  Ｎｅｒｗｏｒｋ  ＳｉｇｎａｌＰ  Ｖ１．１プログラム［Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｎｅｕｒ． Ｓｙｓｔ． ８：５８１ （１９９７）］（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋから）、およびＫｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅアルゴリズム［Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７：１０５ （１９８２）］を用いた疎水性解析を用いて予測された。膜貫通領域は、コンピュータプログラムにより予測されるのと異なり得ることは当業者に理解されよう。
【０３６２】
実施例５
Ａ．可溶性幹細胞因子様ポリヌクレオチド（配列番号３３）およびポリペプチド（配列番号３４）のクローニングならびに発現
可溶性幹細胞因子様ポリペプチドを発現するために、完全長幹細胞因子様ＤＮＡを、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅した。第一ＰＣＲ産物を、適切な細胞系で発現させると可溶性幹細胞因子様ポリペプチドを生成するような、ネステッドＰＣＲプライマーを用いてさらに増幅した。第二ＰＣＲの産物（配列番号３３）を、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ部位との間でｐＣＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ａにクローニングした。可溶性幹細胞因子様ポリペプチドをコードするプラスミド、および対照ベクターを、ＦｕＧＥＮＥ−６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。培地、細胞溶解産物、および不溶性細胞片を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティングで分析した。予想通り、９５％を超える可溶性幹細胞因子様ポリペプチドが（配列番号３４）が分泌され、培地に存在することがわかった。
【０３６３】
同様のアプローチを用いて、配列番号３４を発現する２９３細胞の安定な細胞系もまた生成した。これらをさらにクローニングして、高発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）、中発現体、および低発現体を選定した。
【０３６４】
Ｂ．昆虫および細菌細胞からの配列番号３４の発現ならびに精製
幹細胞因子様タンパク質を、下記の通りに昆虫細胞で発現させた。
【０３６５】
幹細胞成長因子様遺伝子（配列番号３３）のＣ末端膜貫通ドメイン欠失型を、ｐＩＢ／Ｖ５−Ｈｉｓ  ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にＰＣＲによりクローニングした。ベクター中の幹細胞因子様ＤＮＡは、Ｍｙｃ／Ｈｉｓタグを用いて、あるいは任意のタグを用いずに生成した。昆虫細胞（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ ＴＭ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＮｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることで、タグを含有する幹細胞成長因子様プラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。幹細胞成長因子様タンパク質の発現は、一過性発現により確認された。発現された幹細胞成長因子様タンパク質を含有する培地を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、幹細胞成長因子様タンパク質を、ウェスタンブロット分析により同定した。幹細胞成長因子様タンパク質の大規模な生産のために、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＩｎｓｅｃｔＴＭＳｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を入れたフラスコに、耐性細胞を拡大させた。細胞を２７℃約１００ｍｐｈで４日間振とうした。精製用のタンパク質を含有する上清培地を遠心分離により回収した。
【０３６６】
幹細胞因子様タンパク質を、下記の通りに細菌細胞で発現させた。
【０３６７】
膜貫通ドメインをもたない成熟幹細胞成長因子様遺伝子（配列番号３３）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの発現ベクター（ＰＣＲ  Ｔ７／ＮＴ−ＴＯＰＯ）にクローニングした。生じたプラスミドを、大腸菌ＢＬ−２１（ＤＥ  ３）ｐＬｙｓ株で発現させた。アンピシリンを含有する（１００ｍｇ／ｍＬ）ＬＢ培地において３７℃で細胞を増殖させた。次に、幹細胞成長因子様タンパク質の発現を、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）で誘導し、細胞をさらに４時間増殖させて、回集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびウェスタンブロッティングによる幹細胞成長因子様産生の分析を上記で詳述するように行った。
【０３６８】
昆虫細胞培養物からの幹細胞成長因子様タンパク質の精製は、下記の通りに実施した。Ｈｉｓでタグ付けした幹細胞成長因子様を含有する昆虫Ｕｌｉｔｉｍａｔｅ培地は、適切な量の１Ｍ  ＮａＯＨを添加することでｐＨ７．５とした。次に、溶液に１ｍＭ  ＰＭＳＦ（最終濃度）を補充して、精製プロセス中のタンパク質分解性切断を防止した。０．２ミクロンフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ製のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｆｒｅｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ａｃｅｔａｔｅ１０００ｍＬフィルターユニット）に培地を通して、粒状物質を除去した。得られた溶液を１０倍濃縮して、同時に、１０ｋＤａの膜カットオフサイズを有するダイアフィルトレーションカートリッジを用いて、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）により平衡化した。１０倍濃縮し、ダイアフィルター処理した（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）培地を、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム上に載せた。３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭ  イミダゾールを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）によりカラムを洗浄することにより、保持されない成分を除去した。Ｈｉｓでタグ付けした幹細胞成長因子様タンパク質を同じ緩衝液およびイミダゾールの線形勾配（２０〜３００ｍＭ）を用いて溶出させた。溶出したタンパク質を上述のように同定した。幹細胞成長因子様を含有するプール分画を、１０ｋＤａの膜カットオフサイズを有するＡｍｉｃｏｎ製のｓｔｉｒｃｅｌｌを用いて、ＰＢＳ緩衝液により平衡化した。このプロセスはまた、イミダゾールの除去をもたらした。次に、タンパク質を、機能性研究用に、ＰＢＳ緩衝液中におよそ１０ｍｇ／ｍＬにまで濃縮した。
【０３６９】
細菌培養物からの幹細胞成長因子様タンパク質の精製は、以下の通りに実施した。封入体として幹細胞成長因子様タンパク質を発現する大腸菌を、１０倍容量（ｗｔ／ｖｏｌ）の抽出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．０）で、さらに抽出緩衝液中に６Ｍ塩酸グアニジンを含有する緩衝液で抽出した。可溶化幹細胞成長因子様タンパク質を、上述のようにＮｉ−ＮＴＡカラム上で分画した。このアフィニティ精製から得られるフォールディングしていない型の幹細胞成長因子様タンパク質に、ＤＴＴおよびグルタチオンから構成されるリフォールディング緩衝液とともにインキュベーションすることで天然立体構造を得られた。リフォールディングされた試料を、２０ｍＭトリス、０．１％ツイーンで平衡化し、１００ｍＬにまで濃縮した（１０倍濃縮）後、イオン交換体ＱセファロースおよびＳＰセファロース上での高速液体クロマトグラフィを行った。さらなるプロトコルがまた、６Ｍ塩酸グアニジンの代わりに８Ｍ尿素を用いて、適切なリフォールディング条件に関して開発された。
【０３７０】
実施例６
初代ヒト細胞における配列番号３３の発現
幹細胞成長因子様ポリペプチドをコードするＭａｒａｔｈｏｎ脾臓ライブラリー増幅からの第二ネステッドＰＣＲの産物を、適切な正および逆ＰＣＲプライマーを用いて、適切なクローニング部位でＭＳＣＶレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした（実施例３に記載されるように）。次に、レトロウイルスベクターを、パッケージング細胞系に（ＦＵＧＥＮＥ−６トランスフェクション試薬）を用いてトランスフェクトし、幹細胞成長因子様ＤＮＡを含む大量のレトロウイルスを生産した。レトロウイルス含有上清を、パッケージングされた細胞系から調製し、間質細胞と混合し、レトロウイルス形質導入により、幹細胞成長因子様タンパク質を発現する形質導入間質細胞を下記の通りに分析した。
【０３７１】
Ａ．液体培養アッセイ：造血幹細胞は、商業的に購入されるか、または製造業者が推奨するプロトコルを用いて精製される。約１×１０４個の幹細胞を、幹細胞因子様タンパク質（配列番号３３）を発現する間質細胞、または対照ベクターを発現する間質細胞からの上清とともに、９６ウェルプレート中で平板培養した。培養を、毎日顕微鏡で検査して、計数した。図３Ａおよび図３Ｂに見られるように、幹細胞因子様ポリプチドを発現する間質細胞からの上清は、造血幹細胞の総細胞計数およびコロニー数の有意な増加をもたらした。実験は２度繰り返した。細胞数の平均増加は、２．５倍である（図３Ａ）であると同時に、コロニー計数の増加は、１．５４倍であった（図３Ｂ）。以下の表は、別個の実験それぞれの結果を要約している。
【０３７２】
【表３】
2004518425.tif 000004
【０３７３】
Ｂ．間質細胞関連培養アッセイ：適切な組織由来の間質細胞は、商業的供給メーカーから得た。約１×１０４個のマウス造血幹細胞を、約１×１０４個の形質導入または対照間質細胞とともに共培養した。ある種の実験では、形質導入間質細胞からの上清を、幹細胞と野生型間質細胞との共培養に添加した。培養を、毎日顕微鏡で検査して、計数した。図４Ａおよび図４Ｂに見られるように、幹細胞因子様ポリペプチドを発現する間質細胞は、造血幹細胞の総細胞計数およびコロニー数の増加をもたらした。実験は４度繰り返した。細胞数の平均増加は、３．２倍である（図３Ａ）であると同時に、コロニー計数の増加は、３．２倍であった（図３Ｂ）。以下の表は、別個の実験それぞれの結果を要約している。
【０３７４】
【表４】
2004518425.tif 000005
【０３７５】
Ｃ．間質関連培養アッセイ：適切な組織由来の間質細胞は、商業的供給メーカーから得た。約１×１０４個の幹細胞を、約１×１０４個の形質導入間質細胞とともに共培養した。培養物を、毎日顕微鏡で観察して、フローサイトメリー染色を行い、細胞系列分化を決定した。
【０３７６】
実施例７
配列番号１〜２２、２４、２６〜２７、２９、または３３を用いた発現研究
様々な組織における配列番号１〜２２、２４、２６〜２７、３３の発現を半定量的ポリメラーゼ連鎖反応ベースの技法を用いて分析した。ヒトｃＤＮＡライブラリーを、所定の組織（例えば、成体膀胱、成体脳、成体心臓、成体腎臓、成体リンパ節、成体肝臓、成体肺、成体卵巣、成体胎盤、成体直腸、成体脾臓、成体精巣、骨髄、胸腺、甲状腺、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肝臓−脾臓、胎児皮膚、胎児脳、胎児白血球およびマクロファージを含む）からの発現遺伝子の供給源として使用した。遺伝子特異的プライマーを用いて、配列番号１〜２２、２４、２６〜２７、２９、または３３配列の一部を試料から増幅した。増幅産物をアガロースゲル上で分離して、ナイロンフィルターに転写して、化学的に連結した。次にフィルターを、クレノウポリメラーゼ、ランダムプライム方法を用いて、配列番号１〜２２、２４、２６〜２７、２９、または３３から生成した放射性標識した（３３Ｐ−ｄＣＴＰ）二重鎖プローブとハイブリダイズさせる。フィルターを洗浄して（高ストリンジェント）、それを用いて数時間ホスホイメージングスクリーンを感光させる。バンドは、特定ライブラリーにおける配列番号１〜２２、２４、２６〜２７、２９、または３３配列を含むｃＤＮＡの存在を、すなわち相当する細胞型または組織におけるｍＲＮＡ発現を示す。
【０３７７】
実施例８
配列番号３７マウス遺伝子（＃２７２８）断片の単離
パッケージの折り込み（ｉｎｓｅｒｔ ｌｅａｆｌｅｔｓ）に従って、ＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｊａｐａｎ）２０ｍＬ中のマウスＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９細胞（１．４×１０８個の細胞）から全ＲＮＡを調製した。ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）のプロトコルに従って、全ＲＮＡ（１ｍｇ）からメッセンジャーＲＮＡを精製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔプラスミドシステム（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてオリゴｄＴでプライミングしたメッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡを合成して、ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＯ Ｌｉｆｅｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を挿入した。ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９細胞特異的ｃＤＮＡを、ＳＢＨ法（Ｈｙｓｅｑ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）によりライブラリーから獲得した。得られたクローンのヌクレオチド配列を、ＡＢＩ３７７  ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）により決定した。配列を、ホモロジー検索方法により解析し、その結果マウス遺伝子（＃２７２８）を新規遺伝子として同定した。得られたヌクレオチド配列は、配列番号３７のヌクレオチド番号１４９９〜２８５７に相当する。
【０３７８】
実施例９
配列番号３７完全長マウス遺伝子（＃２７２８）の単離
パッケージの折り込みに従って、ＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｊａｐａｎ）２０ｍＬ中のＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９細胞（１．４×１０８個の細胞）から全ＲＮＡを調製した。ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）のプロトコルに従って、全ＲＮＡ（１ｍｇ）からメッセンジャーＲＮＡを精製した。パッケージの折り込みに従って、ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡライブラリー構築キット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）により、調製されたメッセンジャーＲＮＡ２ｍｇからｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーは、約４００，０００個の独立クローンを含有しており、１５個の画分に分けた。各画分を用いて、以下の条件下ＰＣＲを実施して、＃２７２８  ｃＤＮＡを含有する画分を同定した。
【０３７９】
下記プライマーは、実施例８で得られたマウス＃２７２８部分的遺伝子断片の配列を基に合成した。鋳型としてＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９−  ｃＤＮＡライブラリーの各画分を用いて、ＰＣＲを３５サイクルで実施した。各サイクルは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分から構成されていた。
【０３８０】
プライマー＃２７２８Ｆ：ＡＧＣＡＡＡＴＡＣＣＣＡＡＴＧＴＴＣＧＡＡ（１７４４〜１７６４）（配列番号４１）
プライマー＃２７２８Ｒ：ＡＧＡＴＧＴＣＡＣＡＧＣＴＣＴＣＣＴＧＧＴ（２１００〜２１２０）（配列番号４２）
【０３８１】
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動に付し、ＰＣＲ産物が予測サイズを有する画分を特定した。２つの陽性画分を２つのディッシュにそれぞれ播種して（直径１５ｃｍ、５０，０００個のプラークで）、３７℃で１０時間インキュベートした。１つのディッシュ中のプラークをそれぞれ、ナイロンフィルターＢｉｏｄｙｎｅ（Ｐａｌｌ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）に転写して、ナイロンフィルター上のＤＮＡをＵＶ架橋により固定化した。３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを実施した。
【０３８２】
鋳型としてマウス＃２７２８部分的遺伝子断片を含有するプラスミドを用いて、プライマーとして＃２７２８ＲおよびＴ７を用いて、プローブを下記の通りに調製した。ＰＣＲを３５サイクルで実施した。各サイクルは、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分から構成されていた。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動に付し、増幅断片をＪＥＴＳＯＲＢ（Ｇｅｎｏｍｅｄ， ＧＥＲ）により精製した。３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブは、鋳型としてＰＣＲ増幅断片２５ｎｇを用いて、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）により調製した。
【０３８３】
プライマーＴ７：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号４３）
【０３８４】
パッケージされたリーフレットに従って、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂＳｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いたハイブリダイゼーションおよび洗浄を実施した。ハイブリダイズしたナイロンフィルターを１日Ｘ線フィルム（Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｊａｐａｎ）に感光させた。Ｘ線フィルムを、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ製の自動現像装置を用いて現像した。最高のシグナル強度を有する単一プラークをディッシュから採取して、ディッシュ（直径１０ｃｍ）上に再び播種して、約２００個のプラークを生成させた。上述した方法によりスクリーニングを再び実施して、単一陽性プラークを単離した。ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡライブラリー構築キットに関するパッケージの折り込みに従って、得られたファージクローンを用いて、大腸菌ＢＭ２５．８を感染させた。感染した単一コロニーを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地３ｍＬ中に接種して、３０℃で一晩インキュベートした。ＲＰＭキット（ＢＩＯ １０１， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、培養細胞からプラスミド約１０ｍｇを精製した。
【０３８５】
挿入ＤＮＡ断片の５’末端にある配列を、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーにより、ＴｒｉｐｌＥｘ５’ＬＤ−Ｉｎｓｅｒｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｍｐｌｉｍｅｒプライマー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて決定した。挿入ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、配列番号３７の位置８９０にあるヌクレオチドから始まることがわかった。さらに、挿入ＤＮＡ断片の完全長配列をＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーにより決定し、配列番号３７におけるヌクレオチド８９０〜２８５７を含むことがわかった。
【０３８６】
Ａｍｐｌｉｍｅｒプライマー：ＣＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＴＴＧＧＴ（配列番号４４）
【０３８７】
さらに、プライマー＃２７２８  ＲＡＣＥ１（配列９２３〜９５２）を、得られた配列を基に合成した。以下の条件：それぞれが９４℃で２０秒、６８℃で３０秒および７２℃で４分から構成される５サイクル、それぞれが９４℃で２０秒、６０度で３０秒および７２℃で４分から構成される５サイクル、ならびにそれぞれが９４℃で２０秒、５５℃で３０秒および７２℃で４分から構成される２０サイクル下で、プライマーとして＃２７２８ＲＡＣＥ１およびＭ１３Ｒｅｖｅｒｓｅを、また鋳型としてｐＳＰＯＲＴ１ＡＧＭ−Ｓ３Ａ９  ｃＤＮＡライブラリーを用いることで、ＬＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｊａｐａｎ）を用いてＰＣＲを実施した。増幅断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）と連結し、大腸菌ＤＨ５ａに形質転換した。形質転換した細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上で平板培養した。単離コロニーを、ＰＣＲ用反応混合物に添加して（それぞれ１０μＬ）、９４℃で５分間インキュベートした。最終濃度０．２ｍＭにて、プライマーＴ７（配列番号４３）およびＳＰ６（配列番号４７）を用いて、それぞれが９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分から構成される３５サイクルでＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動に付して、増幅断片を確認した。ＰＣＲ増幅断片が得られた大腸菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地３ｍＬに接種して、３７℃で一晩培養した。ＲＰＭキット（ＢＩＯ １０１， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、培養細胞からプラスミドを精製し、プラスミド約１０ｍｇが得られた、クローンのヌクレオチド配列を、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーにより決定した。得られたヌクレオチド配列は、配列番号３７のヌクレオチド１〜９５２であることがわかった。
【０３８８】
ＲＡＣＥ１プライマー：ＡＡＣＴＧＧＡＡＣＣＧＧＴＣＴＧＴＴＡＡＡＡＡＧＴＧＡＣＡＡ（配列番号４５）
Ｍ１３プライマー：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ（配列番号４６）
ＳＰ６プライマー：ＧＡＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号４７）
【０３８９】
実施例１０
ヒト遺伝子＃２７２８（配列番号３９）のクローニング
配列番号３７のヌクレオチド配列に基づいて、Ｇｅｎｂａｎｋの遺伝子データベースをＢＬＡＳＴプログラムを用いて検索し、ヒトＥＳＴ配列ＡＩ９３５８８０、ＡＩ０５２１８５、ＡＩ９３７５０２、およびＡＩ８５８１２６が、マウス＃２７２８配列と相同性を示すことがわかった。続いて、下記プライマーを、これらのヒトＥＳＴの配列に基づいて合成した。
【０３９０】
Ｈ２７２８Ｆプライマー：ＣＡＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＡＡＡＧＧＡ（配列番号４８）
Ｈ２７２８Ｒプライマー：ＡＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＡＡ（配列番号４９）
【０３９１】
ヒト遺伝子を単離する試みとしては、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔシステム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、胎盤ｍＲＮＡ３ｍｇからオリゴｄＴでプライミングによりｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ，Ｉｎｃ．Ｕ．Ｓ．Ａ）を合成した。鋳型としてこのｃＤＮＡ、プライマーとしてＨ２７２８ＦおよびＨ２７２８Ｒ、ならびにＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてＰＣＲを実施した。増幅断片を単離して、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）に連結して、大腸菌株ＤＨ５ａに形質転換した。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地上で平板培養して、単一コロニーを単離した。単離コロニーを反応混合物に添加して（それぞれ１０μＬ）、９４℃で５分間インキュベートした。最終濃度０．２ｍＭにて、Ｔ７およびＳＰ６プライマーを用いて、それぞれが９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で２分から構成される３５サイクルでＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動に付して、増幅断片を確認した。ＰＣＲ増幅断片が得られた大腸菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地３ｍＬに接種して、３７℃で一晩インキュベートした。ＲＰＭキット（ＢＩＯ １０１， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、培養細胞からプラスミドを精製し、プラスミド約１０ｍｇが得られた、プラスミド挿入物のヌクレオチド配列を、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーにより決定し、それがマウス＃２７２８配列のヒトオルソログであることが確認された。得られたヌクレオチド配列は、配列番号３９に記載される。
【０３９２】
実施例１１
間質細胞におけるヒトおよびマウス＃２７２８遺伝子の発現
Ａ．マウス＃２７２８遺伝子の発現用のレトロウイルスベクターの調製
マウス＃２７２８配列からのオープンリーディングフレーム配列（配列番号３７におけるヌクレオチド塩基番号８７３〜２４６５）を、以下の手順により間質細胞における発現用のレトロウイルスベクターにクローニングした。
【０３９３】
ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９細胞由来の全ＲＮＡ１ｍｇから、メッセンジャーＲＮＡを精製した。常法により、メッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｍ２７８０ｏｒｆＲおよびｍ２７２８ｏｒｆＲプライマー、鋳型として上記ｃＤＮＡ、ならびにＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、それぞれが９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、および６８℃で２分で構成される３０サイクルでＰＣＲを実施した。
【０３９４】
ｍ２７８０ｏｒｆＦ：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＧＧＴＴＣＣＧＧＡＧＧＧＣＣＧＡＣ（配列番号５０）
ｍ２７２８ｏｒｆＲ：ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＧＴＴＣＡＣＴＣＴＧＴＣＴＧ（配列番号５１）
【０３９５】
増幅断片を制限酵素ＭｆｅＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ Ｂｉｏ Ｌａｂｓ ＩＮＣ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）およびＸｈｏＩで消化して、電気泳動に付した。次に、ＤＮＡ断片をｊＥＴＳＯＲＢ（Ｇｅｎｏｍｅｄ， Ｉｎｃ．， Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製し、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクター（Ｔ． Ｋｉｔａｍｕｒａ博士， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏから提供）に連結し、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターは、ｐＭＸレトロウイルスベクターにＩＲＥＳ  ＧＦＰ（内部リポソーム侵入部位グリーン蛍光タンパク質）を挿入することで調製した。組換えベクターを、大腸菌株ＤＨ５ａに形質転換して、細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上で平板培養した。単離コロニーを採取して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地１００ｍＬに接種し、ＱＩＡＧＥＮｔｉｐ１００（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて培養細胞からプラスミドを精製した。挿入遺伝子の配列を常法により決定し、挿入配列が配列番号３７の一部を含有することが確認された。
【０３９６】
Ｂ．ヒト＃２７２８遺伝子の発現用のレトロウイルスベクターの調製
マウス＃２７２８遺伝子に対するヒトオルソログからのオープンリーディングフレーム配列（配列番号３９におけるヌクレオチド５９６〜２１８５）を、間質細胞における発現用のレトロウイルスベクターに挿入した。
【０３９７】
まず、オリゴｄＴでプライミングしたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩシステム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、胎盤ｍＲＮＡ３μｇからｃＤＮＡを合成した。ｈ２７２８ｏｒｆＦおよびｈ２７２８ｏｒｆＲプライマー、鋳型として上記で調製したｃＤＮＡ、ならびにＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ Ｌｉｆｅｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、それぞれが９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、および６８℃で２分で構成される３０サイクルでＰＣＲを実施した。
【０３９８】
ｈ２７２８ｏｒｆＦ：ｃｃｇｃｔｃｇａｇｃｃａｃｃＡＴＧＧＣＧＡＧＧＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＣＣＧＡＣ（配列番号５３）
ｈ２７２８ｏｒｆＲ：ｃｃｇｇａａｔｔｃＴＴＡＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＡＣＡＡＴＡＡＡ（配列番号５４）
【０３９９】
増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化して、電気泳動に付した。次に、増幅ＤＮＡ断片をＪＥＴＳＯＲＢ（Ｇｅｎｏｍｅｄ， Ｉｎｃ．， Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製し、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターに連結した。組換えベクターを、大腸菌株ＤＨ５ａに形質転換して、細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天培地上で平板培養した。単離コロニーを採取して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地１００ｍＬに接種し、ＱＩＡＧＥＮｔｉｐ１００（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いてプラスミドを精製した。挿入遺伝子の配列を常法により決定し、挿入配列が配列番号３９の一部を含有することが確認された。
【０４００】
Ｃ．マウス＃２７２８遺伝子の間質細胞への移入
ＢＯＳＣ２３細胞（２×１０６個）を、コラーゲンＩ型コート６０ｍｍディッシュ（Ａｓａｈｉ Ｔｅｃｈｎｏ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）上に播種し、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地中で、３７℃で、ＣＯ２５％および湿度１００％下でインキュベートし、インキュベーションの１２〜１８時間後、ＤＭＥＭ培地を、ＯＰＴＩ  ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｉｎｃ．）２ｍＬで取り替えた。
【０４０１】
マウス＃２７２８配列をコードするプラスミド（上述のように調製した）約３μｇを、ＯＰＴＩ  ＭＥＭ培地１００μＬに希釈したＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｉｎｃ．）１８μＬに添加し、室温で３０分間インキュベートした。このＤＮＡ溶液を、ＢＯＳＣ２３細胞培地に添加して、約５時間後、２０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｉｎｃ．）２ｍＬを培地に添加した。リボソームは（内部リボソーム侵入部位）ＩＲＥＳにおいてｍＲＮＡの中央に結合することができるため、２つの遺伝子は、１つの転写ユニット中でＩＲＥＳの５’および３’末端に連結させることで、１つのｍＲＮＡから発現させることができる。上記で調製したプラスミドにおいて、＃２７２８遺伝子に関するｃＤＮＡを、ＩＲＥＳの５’側に挿入し、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を３’側に挿入した。この系では、＃２７２８遺伝子の発現は、蛍光標示式セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いてＧＦＰの発現を検出することでモニタリングすることができる。
【０４０２】
約２４時間後、培地を、１０％ＦＡＣＳを含有するＤＭＥＭ４ｍｌで取り替え、約４８時間、インキュベーションを続けた後、培地を単離した。培地を、０．４５μｍフィルターに通してろ過した後に、１２００×ｇで１６時間遠心分離し、上清を廃棄して、ウイルスペレットを得た。
【０４０３】
ＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞またはＡＧＭ−Ｓ３−Ａ７細胞（それぞれ１×１０４個の細胞）を、２４ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ， Ｉｎｃ．）上に播種して、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｉｎｃ．）１ｍＬ中でインキュベートした。播種して１２〜１８時間後、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα培地中にウイルスペレットを懸濁させて、間質細胞用の培地を、ウイルス懸濁培地１ｍＬで取り替えた。ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（Ｓｉｇｍａ， Ｉｎｃ．， ＳＥＱＵＡ−ＢＲＥＮＥ）を、最終濃度１０μｇ／ｍＬにまで、ウイルス懸濁培地に添加し、７００×ｇで４５分間培養プレートを遠心した後、混合物を３７℃で、ＣＯ２５％および湿度１００％下でインキュベートした。４８時間後、培地を、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα１ｍＬで取り替えて、２４時間、インキュベーションを続けた。次に、培養細胞を６ウェルプレート（ＦＡＬＣＯＮ， Ｉｎｃ．）にサブシード（ｓｕｂｓｅｅｄ）して、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα培地３ｍＬ中でインキュベートした。サブシードの４８時間後、間質細胞におけるＧＦＰ発現を、ＦＡＣＳ（Ｖａｎｔａｇｅ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｔｏｎ， Ｉｎｃ．）を用いて確認し、８０％以上の細胞が＃２８２８遺伝子を発現することがわかった。
【０４０４】
実施例１２
ヒト臍帯血からのＣＤ３４陽性幹細胞の単離
ヒト臍帯血は、凝固を防止するためにヘパリン添加したシリンジを用いて、Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｃｏｎｄｕｃｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｋｉｒｉｎ Ｂｒｅｗｅｒｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．に従って得られた。ヘパリン処理した臍帯血を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ ＰＨＡＲＭＡ， Ｉｎｃ．）に入れ、室温で３０分間、４００×ｇで遠心分離し、単核細胞を得た。単核細胞分画中の赤血球を、室温で２分間、塩化アンモニウム緩衝溶液（０．８３％ＮＨ４Ｃｌ−トリス−ＨＣｌ２０ｍＭ、ｐＨ６．８）で処理することにより溶血させた。ＰＢＳ−ＦＣＳで細胞を洗浄した後、単核細胞懸濁液にヒトＩｇＧ（１０ｍｇ）を添加して、混合物を氷冷条件下で１０分間維持した。細胞をＰＢＳ−ＦＣＳで洗浄し、ＣＤ２、ＣＤ１１ｃ（得られたＡＴＣＣハイブリドーマから精製）、ＣＤ１９（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．）、ＣＤ１５、ＣＤ４１（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）、およびグリコホリンＡ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ， Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）のようなヒト分化血球に特異的な抗原に対するビオチン化抗体を、単核細胞懸濁液に添加し、混合物を氷上で２０分間保持した。ＰＢＳ−ＦＡＳで洗浄した後、５％ＦＣＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＥＣＳ−ＥＤＴＡ−ＮａＮ３）１ｍＬ中に細胞を再懸濁させた。ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（ＢｉｏＭａｇ， ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）を細胞懸濁液に添加して、混合物を氷上で４０分間維持した。分化関連抗原を発現する分化血球を、磁気分離機（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ−１， Ｄｙｎａｌ， Ｉｎｃ．）を用いて除去して、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ Ｓ．Ａ．， Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ）を、残った分化血球抗原陰性細胞分画に添加した。混合物を氷上で２０分間インキュベートし、ＣＤ３４陽性分画を、セルソーターにより単離し、造血幹細胞集団を提供した。
【０４０５】
実施例１３
ヒト造血幹細胞および＃２７２８ヒト遺伝子を発現する間質細胞の共培養
ＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９細胞、ＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞、または＃２７２９遺伝子を発現するＡＧＭ−Ｓ３−Ａ９細胞もしくはＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞（それぞれ１×１０５個の細胞）を、２４ウェル培養ディッシュ上に接種し、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα培地中で１日インキュベートし、集密にまで成長させ、上述のＣＤ３４陽性造血幹細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＭＥＭα培地１ｍＬ中で上述の間質細胞（５００個の細胞／ウェル）とともにインキュベートした。１週間後、同じ培地をさらに１ｍＬ共培養に添加した。２週間後、間質細胞およびヒト血球を収集して、以下に記載するように、間質細胞の、造血幹細胞の生存度を支持する能力に関して評価した。
【０４０６】
実施例１４
コロニーアッセイによる造血幹細胞および／または造血前駆細胞の成長の評価  共培養細胞を、メチルセルロース培養系でアッセイし、三重反復試験で評価した。メチルセルロース培養系は、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦ、ヒトＩＬ−３、ヒトＩＬ−６、ヒトＧ−ＣＳＦおよびヒトＴＰＯ、ならびに２ＩＵ／ｍＬのＥＰＯを、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ４２３０（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に添加することで調製され、６ウェル培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ， Ｉｎｃ．）で培養を実施した。使用した様々な造血因子は、組換え技法を用いて調製して、純度を保証した。インキュベーションの２週後に、形成したコロニーを、顕微鏡下で観察し、ＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球マクロファージコロニー形成ユニット）、ＢＦＵ−Ｅ（赤血球バースト形成ユニット）、およびＣＦＵ−Ｅミックス（赤血球混合コロニー形成ユニット）の数を計数した。マウス＃２７２８遺伝子を発現するＡＧＭ−ｓ３−Ａ９と共培養したＣＤ３４陽性造血細胞のコロニー形成能力を図５に示す。ヒト＃２７２８遺伝子を発現するＡＧＭ−ｓ３−Ａ７と共培養したＣＤ３４陽性造血幹細胞のコロニー形成能力を図６に示す（＃２７２８−２（００７−２））。マウス＃２７２８遺伝子を発現するＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞、またはヒト＃２７２８遺伝子を発現するＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞との共培養におけるヒト造血幹細胞、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｃの数の増加は、＃２７２８遺伝子が、直接的あるいは間接的に、造血幹細胞の成長および生存を支持する能力を有することを示した。
【０４０７】
実施例１５
マウス造血幹細胞アッセイ
大腿骨髄を得て、ＰＢＳ中に懸濁させた。マウス骨髄単球を、比重遠心分離方法を用いて濃縮し、染色用緩衝液（５％ＦＣＳおよび０．０５％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）中に再懸濁させた。幹細胞分画は、Ｏｓａｗａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：２４２−２４５， １９９６の方法に従って、単球懸濁液から得られた。
【０４０８】
ＦＩＴＣ結合ＣＤ３４抗体、フィコエリトリン結合Ｓｃａ−１抗体、およびアロフィコシアニンｃ−キット（すべてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．製）、ならびに分化関連抗原ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｇｒ−１、Ｔｅｒ１１９およびＣＤ１１ｃに特異的な６個のビオチン化抗体（すべてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．製）を、骨髄単球懸濁液に添加して、混合物を氷上で２０分間維持した。次に、細胞を染色用緩衝液で２度洗浄し、ＣＤ３４陰性、Ｓｃａ−１陽性、ｃ−キット陽性およびＬｉｎ陰性細胞を、ＦＡＣＳ（Ｖａｎｔａｇｅ， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｉｎｃ．）を用いて単離した。
【０４０９】
３０個の造血幹細胞（ＣＤ３４陰性、Ｓｃａ−１陽性、ｃ−キット陽性およびＬｉｎ陰性細胞）を、マウス＃２７２８遺伝子を発現するＡＧＭ−ｓ３−Ａ９と７日間共培養した。培養の７日後に収集した細胞をすべて、Ｘ線（８．５Ｇｙ）を照射した５匹のＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｉｎｃ．， ８週齢、雄）に、２×１０５個の総骨髄細胞（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．２マウス、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ， Ｉｎｃ．）とともに、尾静脈への注射により移植した。
【０４１０】
移植後、末梢血を収集して分析した。蒸留水（３５０μＬ）を末梢血５０μＬに添加して、混合物を３０秒間インキュベートして、溶血させた。ＰＢＳ（２倍濃度）を添加した後、溶血させた溶液を遠心分離して、白血球を得た。抗ＣＤ１６抗体、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４５．１抗体、フィコエリトリン結合Ｇｒ−１およびＣＤ１１ｃ抗体、ならびにアロフィコシアニン結合ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）およびＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）抗体（すべて抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｉｎｃ．から購入）を、あらかじめ染色用緩衝液（５％ＦＣＳおよび０．０５％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）で一度洗浄した白血球とともにインキュベートし、混合物を氷上で３０分間インキュベートした。インキュベートした細胞を再び染色用緩衝液中で洗浄して、ＦＡＣＳを用いて分析した。
【０４１１】
結果を図７Ａおよび図７Ｂに示す。＃２７２８マウス遺伝子を発現するＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞と共培養した造血幹細胞を移植した動物は、トランスフェクトしていないＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞または対照ベクターのみを発現する細胞と共培養した造血幹細胞を移植した動物と比較して高い割合でキメラ化を示した。高い割合のキメラ化は、移植の２ヵ月後、骨髄性細胞系列およびリンパ系細胞系統の両方において依然として確認された。結果は、＃２７２８遺伝子を発現する間質細胞とともに培養した造血幹細胞および／または造血前駆細胞は、＃２７２８遺伝子産物と接触されない細胞と比較して、より激しく増殖したことを示す。これらの結果は、＃２７２８遺伝子産物が、直接的あるいは間接的に、造血幹細胞および／または造血前駆細胞の生存および成長を高める能力を有することを示した。
【０４１２】
実施例１６
モノクローナル抗体の産生
当該技術分野で既知の様々な方法が、本発明のポリペプチドおよび／またはその断片、誘導体、類似体、もしくは相同体に対するモノクローナル抗体の産生に使用され得る。培養における連続細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技法を使用してもよい。これらとしては、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［Ｋｏｚｂｏｒ， ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２を参照］、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法［Ｃｏｌｅ， ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｉｎ： Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６を参照］が挙げられるが、これらに限定されない。不死化抗体産生細胞系は、発癌遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、あるいはエプスタイン−バーウイルスによるトランスフェクション（例えば、Ｍ． Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， 「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」 （１９８０）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， 「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」 （１９８１）、Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， 「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」 （１９８０）、また米国特許第４，３４１，７６１号、同第４，３９９，１２１号、同第４，４２７，７８３号、同第４，４４４，８８７号、同第４，４５１，５７０号、同第４，４６６，９１７号、同第４，４７２，５００号、同第４，４９１，６３２号、および同第４，４９３，８９０号）のような、融合以外の技法により創出することができる。
【０４１３】
抗体の産生では、所望の抗体に関するスクリーニングが、当該技術分野で既知の技法、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を用いて）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ等により達成することができる。イムノアッセイにおける結合の検出に関する多くの手段が当該技術分野で既知であり、本発明の範囲内である。例えば、本発明のポリペプチドの特異的エピトープを認識する抗体を選定するために、ハイブリドーマを用いてもたらされるアッセイを実行して、かかるエピトープを含有するポリペプチド断片に結合する産物の同定を実施することができる。特定の動物種からのポリペプチドに特異的な抗体の選定に関して、選定は、当該動物種の細胞により発現されるか、あるいはその細胞から単離されるポリペプチドとの陽性結合の検出に基づく。抗体による結合の特異性は、本発明の範囲を超える密接に関連した幹細胞因子と併用して、本発明のポリペプチドを使用することにより決定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
配列番号２２の、配列番号１〜２１との概要的アラインメントを示す図である。
【図２】
幹細胞成長因子様ポリペプチド配列番号２８と腫瘍内皮マーカー７前駆タンパク質配列番号３６（Ｓｔ． Ｃｒｏｉｘ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８９， １１９７−１２０１）との間のＢＬＡＳＴＸアミノ酸アラインメントを示す図であり、２つの配列が、４４１個のアミノ酸残基にわたって７２％類似性、および同じ４４１個のアミノ酸残基にわたって５７％同一性を共有することを示している。ここで、Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リシン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝スレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン。ギャップは、ダッシュとして表されている。
【図３】
図３Ａおよび図３Ｂ
幹細胞因子様ポリペプチドを発現する間質細胞由来の上清により引き起こされる造血幹細胞の総細胞数およびコロニー数の増加を示す図である。
【図４】
図４Ａおよび図４Ｂ
幹細胞因子様ポリペプチドを発現する間質細胞より引き起こされる造血幹細胞の総細胞数およびコロニー数の増加を示す図である。
【図５】
マウス＃２７２８遺伝子を発現するＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞とともに２週間共培養したＣＤ３４陽性造血幹細胞のコロニー形成能を示す図である。
【図６】
ヒト＃２７２８遺伝子を発現するＡＧＭ−ｓ３−Ａ７細胞とともに２週間共培養したＣＤ３４陽性造血幹細胞のコロニー形成能を示す図である。
【図７】
図７Ａおよび図７Ｂ
＃２７２８遺伝子を発現するＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞とともに共培養した造血幹細胞を移植した動物は、＃２７２８遺伝子をもたないＡＧＭ−ｓ３−Ａ９細胞または対照ベクターのみを発現する細胞とともに共培養した造血幹細胞を移植した動物と比較して、より高い割合でキメラ現象を示したことを示す図である。
【図８】
図８Ａおよび図８Ｂ
ベクター形質導入間質細胞およびＳＣＦ−２形質導入間質細胞（２）と造血幹細胞の共培養を示す図である。
【図９】
図９Ａおよび図９Ｂ
ベクター形質導入間質細胞またはＳＣＦ−２形質導入間質細胞から供給される培養物を補充した造血幹細胞を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年2月10日(2003.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞成長因子の活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号２７、２９、３３、３７、もしくは３９、それらの翻訳されるタンパク質をコードする部分、それらの成熟タンパク質をコードする部分、それらの細胞外部分、またはそれらの活性ドメインからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
生物活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項３】
生物活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、請求項１に記載のポリヌクレオチドと約９０％を超える配列同一性を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
ＤＮＡ配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの相補体を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作した宿主細胞。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは、前記宿主細胞において前記ポリヌクレオチドの発現を制御する調節配列と作動可能に結合している、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号２８、３０、３１、３２、３４、３８、または４０、それらの翻訳されるタンパク質をコードする部分、それらの成熟タンパク質をコードする部分、それらの細胞外部分、またはそれらの活性ドメインからなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチド、およびキャリアを含む組成物。
【請求項１２】
配列番号２８、３０、３１、３２、３４、３８、または４０からなる群から選択されるポリペプチド配列由来の少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含む、幹細胞成長因子様活性を有するポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２８、３０、３１、３２、３４、３８、または４０からなる群から選択されるポリペプチド配列由来の少なくとも５個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３に記載するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１０に記載するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１０に記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項１８】
試料中の、請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する方法であって：
ａ）該試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドに結合して、該ポリヌクレオチドとの複合体を形成する化合物と、該複合体を形成するのに十分な期間接触させ、
ｂ）該複合体を検出し、もし複合体が検出される場合、請求項１に記載のポリヌクレオチドが検出されること
を含む方法。
【請求項１９】
試料中の、請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出する方法であって：
ａ）該試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１に記載のポリヌクレオチドにアニーリングする核酸プライマーと、かかる条件下で接触させ、
ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む産物を増幅し、そして
ｃ）前記産物、およびそれによって該試料中の請求項１に記載のポリヌクレオチドを検出すること
を含む方法。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子を含み、前記方法はアニーリングされたＲＮＡ分子を、ｃＤＮＡポリヌクレオチドへ逆転写することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料中の、請求項１０に記載のポリペプチドを検出する方法であって：
ａ）該試料を、前記ポリペプチドに結合して、該ポリペプチドとの複合体を形成する化合物と、該複合体を形成するのに十分な条件下で、そして十分な期間接触させ、そして
ｂ）該複合体の構造を検出し、もし複合体の構造が検出される場合、請求項１１に記載のポリペプチドが検出されこと
を含む方法。
【請求項２２】
請求項１１に記載のポリペプチドに結合する化合物を特定する方法であって：
ａ）該化合物を、請求項１０に記載のポリペプチドと、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な条件下で、そして十分な期間接触させ、そして
ｂ）該化合物を検出し、もし該ポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が特定されること
を含む方法。
【請求項２３】
請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物を特定する方法であって：
ａ）細胞において、該化合物を、請求項１０に記載のポリペプチドと、ポリペプチド／化合物複合体を形成するのに十分な期間接触させ（ここで、該複合体は、細胞においてレポーター遺伝子の発現を駆動する）、そして
ｂ）レポーター遺伝子配列の発現を検出することにより該複合体を検出し、もし該ポリペプチド／化合物複合体が検出される場合、請求項１０に記載のポリペプチドに結合する化合物が特定されること
を含む方法。
【請求項２４】
幹細胞成長因子様ポリペプチドを生産する方法であって：
ａ）請求項８に記載の宿主細胞を、前記細胞において該ポリペプチドを発現するのに十分な条件下で培養し、そして
ｂ）工程（ａ）の細胞培養物または細胞から、該ポリペプチドを単離することを含む方法。
【請求項２５】
請求項１０に記載のポリペプチドを含むキット。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、または表面に結合させた請求項１に記載のポリヌクレオチドの特有のセグメントを含む核酸アレイ
【請求項２７】
前記アレイは、請求項１に記載のポリヌクレオチド、または請求項１に記載のポリヌクレオチドの特有のセグメントに対する完全なマッチを検出する、請求項２６に記載のアレイ。
【請求項２８】
前記アレイは、請求項１に記載のポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドの特有のセグメントに対するミスマッチを検出する、請求項２６に記載のアレイ。
【請求項２９】
請求項１０に記載の幹細胞成長因子様ポリペプチドの増大した活性または発現を必要とする被験体の治療方法であって：
（ａ）治療的量の、前記ポリペプチドのアゴニスト、
（ｂ）治療的量の、前記ポリペプチド、および
（ｃ）治療的量の、該ポリペプチドが生産される形態かつ条件下にある前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
からなる群から選択される組成物、ならびに薬学的に許容可能なキャリアを、該被験体に投与することを含む方法。
【請求項３０】
請求項１０に記載の幹細胞成長因子様ポリペプチドの活性または発現を阻害することが必要な被験体の治療方法であって：
（ｄ）治療的量の、前記ポリペプチドのアンタゴニスト、
（ｅ）治療的量の、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を阻害するポリヌクレオチド、および
（ｆ）治療的量の、該幹細胞成長因子様ポリペプチドと、そのリガンドに関して競合するポリペプチド
からなる群から選択される組成物、ならびに薬学的に許容可能なキャリアを、該被験体に投与することを含む方法。
【請求項３１】
配列番号２８，３０，３１，３２，３４，３８、または４０のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３２】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片、単鎖抗体、二重特異性抗体、または異種結合抗体である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３３】
請求項１７に記載の抗体を含むキット。
【国際調査報告】
2004518425.tif 000212
2004518425.tif 000213
2004518425.tif 000214
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