(57)【要約】心血管障害の予防または治療処置の方法について開示し、方法は障害に関係するＴｈ２型Ｔ細胞応答のサイトカイン・プロフィールに比較してＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールを亢進的に調節するための１つ以上の物質の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。方法において使用するための組成物も更に開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管障害の予防または治療処置の方法であり、障害に関係するＴｈ２型Ｔ細胞応答のサイトカイン・プロフィールに比較してＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールを亢進的に調節するための１つ以上の物質の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む上記方法。
【請求項２】
Ｔｈ２型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールをＴｈ１応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールにシフトすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
被験者においてＴｈ１型Ｔ細胞応答を亢進的に調節し、Ｔｈ２型Ｔ細胞応答を抑制的に調節する能力がある物質を投与することを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
被験者においてＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカインの作用を増強し、Ｔｈ２応答に特徴的なサイトカインの作用を抑制する能力のある物質を投与することを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
被験者においてＴｈ１型Ｔ細胞応答を亢進的に調節する能力のある物質を投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
被験者においてＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカインの作用を増強する能力のある物質を投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
被験者においてＴｈ２型Ｔ細胞応答を抑制する能力のある物質を投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
被験者においてＴｈ２型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカインの作用を抑制する能力のある物質を投与することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の物質が微生物またはその成分、抽出物、音波処理物、もしくは分泌物、あるいは上記のいくつか、もしくは全ての混合物を含む、請求項１から８のいずれかに記載される方法。
【請求項１０】
抽出物が微生物の細胞壁画分を含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
微生物が酵母および細菌から成る群から選択される、請求項９または１０に記載される方法。
【請求項１２】
微生物が共生細菌である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
共生細菌が乳酸桿菌およびミコバクテリウム種から成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
乳酸桿菌種が被験者においてＴｈ２応答を抑制し、コレステロールレベルを低下させる能力を有する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
共生細菌が好酸性乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｐｈｉｌｕｓ）、発酵乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、およびミコバクテリウム・バッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｃｃａｅ）から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
微生物がラクトバチルス・カゼイ（ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・カムノサス（ｃｈａｍｎｏｓｕｓ）、およびビフィドバクテリウム・ブレーベ（ｂｒｅｖｅ）から成る群から選択される細菌である、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
微生物が生菌である、請求項１１から１６のいずれかに記載される方法。
【請求項１８】
Ｔｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールを亢進的に調節するための物質に加えて、被験者を治療するための医薬的に活性な少なくとも１つの物質の有効量を被験者に投与することを更に含む、請求項１から１７のいずれかに記載される方法。
【請求項１９】
医薬的に活性な物質が脂質低下剤、抗高血圧剤、および抗糖尿病剤から成る群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｔｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールを亢進的に調節するための物質を医薬的に活性な物質の前に、同時に、または後に被験者に投与する、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
障害に関係するＴｈ２型Ｔ細胞応答が細菌感染、細菌性抗原、多クローン性活性物質、超抗原、または自己抗原によって悪化する、請求項１から２０のいずれかに記載される方法。
【請求項２２】
感染がクラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、または型別不能ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）による、または細菌性抗原がそれら由来である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
心血管障害が安定した、または不安定な病状を有するアテローム患者から成る群から選択される、請求項１から２２のいずれかに記載される方法。
【請求項２４】
心血管障害の診断またはそれへの罹病性の評価の方法であり、被験者においてＴ細胞応答を評価することを含み、ここでＴｈ２型Ｔ細胞応答の亢進的調節および／またはＴｈ１型Ｔ細胞応答の抑制が障害への罹病性、またはその存在を示す、上記方法。
【請求項２５】
被験者が亢進的に調節されたＴｈ２型Ｔ細胞応答および抑制されたＴｈ１型Ｔ細胞応答を有するかどうかを測定することを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
評価が、Ｔｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的な１つ以上のサイトカインの活性もしくは生成が抑制されるかどうか、そして／またはＴｈ２型Ｔ細胞応答に特徴的な１つ以上のサイトカインの活性もしくは生成が促進されるかどうかの測定を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
評価が、Ｔｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的な１つ以上のサイトカインの活性または生成が抑制されるかどうか、およびＴｈ２型Ｔ細胞応答に特徴的な１つ以上のサイトカインの活性または生成が増強されるかどうかの測定を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
サイトカイン（単数または複数）がＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１２から成る群から選択される、請求項２６または２７記載の方法。
【請求項２９】
Ｔ細胞応答を循環Ｔ細胞の分析によって評価する、請求項２４から２８のいずれかに記載される方法。
【請求項３０】
心血管障害の診断する、または被験者が障害への罹病性を有するかどうかを評価する方法であり、以下：
（ａ）障害の影響を受けた１つ以上の免疫グロブリンレベルを測定して試験データを得；そして
（ｂ）参照データと試験データを比較して被験者が心血管障害への罹病性を有するかどうか、または心血管障害を有するかどうかを評価すること
を含む上記方法。
【請求項３１】
１つ以上のＩｇＧレベルを測定することを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
総ＩｇＧ２サブクラス免疫グロブリンの測定を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ＩｇＧ２サブクラス特異的抗体のレベルの測定を含む、請求項３１または３２のいずれかに記載される方法。
【請求項３４】
ＩｇＧ２サブクラス特異的抗体がクラミジア・ニューモニエ、ヘリコバクター・ピロリ、または型別不能ヘモフィルス・インフルエンザに特異的である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
総ＩｇＧ２サブクラスとＩｇＧ２サブクラス特異的抗体の比率、または総ＩｇＧ２サブクラスとＩｇＧ２サブクラス特異的抗体の比率の変化が障害への罹病性、またはその存在を示す、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
心血管障害が安定な、または不安定な病状を有するアテローム患者から選択される、請求項３０から３５のいずれかに記載される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は心血管障害の診断法および同障害の治療または予防処置における使用に好適な組成物に関する。特に本発明は冠状動脈疾患の診断および治療に好適な方法および組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
アテロームは動脈に関係する炎症過程であり、特に冠状動脈疾患、一般には血管変性疾患を実証するものである。Ｔリンパ球がアテローム斑内で炎症を作動するというコンセプトを支持するデータが存在する。特にプラーク内の単核細胞の２−１０％がＴ細胞であり、その２／３がＣＤ４＋ｖｅであり、そしてそのほとんどがＣＤ４５ＲＯ、ＭＨＣクラスＩＩ、およびＩＬ−２Ｒを発現することが報告されている（Ｌａｍｏｎら， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １８ （１９９７） ２７２−７）。前炎症性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＮＦ−γ）はプラーク内の細胞から分泌されるが、これは細胞修飾因子（例えばＰＤＧＦ、ＭＣＰ−１、およびＭ−ＣＳＦ）およびタンパク分解酵素（例えばマトリクス・メタロプロティナーゼ（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）、例えばコラゲナーゼおよびゼラチナーゼＢ）と同様である（Ｌａｍｏｎら， １９９７）。
【０００３】
プラーク内のＴリンパ球およびマクロファージ間の重要かつ複雑な関係には、一部には、マクロファージ（および他の細胞）上のＣＤ４０による活性化型プラークＴ細胞上のＣＤ４０Ｌのライゲーションを通したレセプター・リガンド結合が介在し、プラークのリモデリング、プラーク破壊（ｒｕｐｔｕｒｅ）、および抗原提示を含む一定の結果に影響しているのかもしれない（Ｌａｍｏｎら， １９９７）。
【０００４】
近年、特定の微生物がアテロームの促進と関連づけられている。クラミジア・ニューモニエは最もキャラクタライズされているが、最近の総説で、一般に持続感染は血管内炎症（ｉｎｔｉｍａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）およびアテローム斑増殖に関連づけられうることが示唆されている（Ｓａｉｋｕら， Ｌａｎｃｅｔ １１６ （１９９８） ９８３−５；Ｓｈａｒら， Ｓ Ｓｆｒ Ｍｅｄ Ｊ ８２ （１９９２） １５８−６１；Ｍｅｊｅｒら， ＪＡＭＡ ２８１ （１９９９）４２７）。アテロームの進行、または‘疫学的に関係する’微生物がアテローム増殖を促進する過程の原因となる基本的な機構を明らかにするデータは存在しない。
【０００５】
免疫応答に基づく心血管障害（例えば冠状動脈疾患）の診断を補助する改善された方法、およびそれらの症状の予防または治療のための組成物が必要とされている。
【０００６】
（発明の概要）
従来技術の問題の１つ以上を克服もしくは改善する、または少なくとも有用な代替法を提供することが本発明の目的である。
【０００７】
本発明は、アレルギーの状態のような現代生活の“Ｔｈ２サイトカイン”の偏りによる冠状動脈疾患（例えばアテローム）、および‘Ｔｈ２への偏り’に関係する“現代生活”の疾病の発症の主要な新規の機構の同定に基づく。多くの因子がＴｈ２炎症反応のアテローム促進効果を変化させる（例えば脂質レベル、喫煙、高血圧など）。特定の作用機構に拘束されることは望まないが、原因はおそらく腸内細菌に対する環境の影響であり、Ｔｈ１促進微生物（例えば乳酸桿菌）がＴｈ２応答に関係する他の微生物で置換されているためである。
【０００８】
この新たな所見により、アテロームの傾向にある、またはアテローム負荷量が高い被験者を、それぞれ検出および変更するための診断および治療の独自の機会が提供される。特に、一定の‘伝統的な’細菌（共生細菌）での腸の再構成は有用な治療的アプローチの１つであることが認められている。
【０００９】
いったん確立されたＴｈ２への偏りを更に悪化させる別の特定の微生物（例えばクラミジア・ニューモニエおよびヘリコバクター・ピロリ）に合わせた診断および治療も特にここで企図する。‘現代生活型アテローム’は腸内細菌叢の変化に次ぐサイトカイン・パターンの変化によって誘引されるというコンセプトは、先進国および発展途上国におけるアテローム間の本質的な相違は先進国におけるプラークでの過剰量の炎症であるという見解と一致する。
【００１０】
従って広義には、本発明は血中のＴｈ２応答の種々のマーカーおよび指標の評価に基づく顕著なＴｈ２介在型アテローム（例えば冠状動脈疾患）の診断または検出の方法、並びに、Ｔｈ１応答を促進する、および／またはＴｈ２応答を抑制する能力のある治療または予防物質として使用することができる組成物に関する。
【００１１】
特に、本発明のある観点では心血管障害の予防または治療処置の方法を提供し、方法はそれを必要とする被験者に、障害に関係するＴｈ２型Ｔ細胞応答のサイトカイン・プロフィールに比較してＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールを亢進的に調節するための少なくとも１つの物質の有効量を投与することを含む。
【００１２】
Ｔｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールの亢進的調節は、被験者におけるＴｈ１型Ｔ細胞応答の亢進的調節および／またはＴｈ２型Ｔ細胞応答の抑制によって行ってもよい。あるいはまた、亢進的調節はＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカインの活性の増強および／またはＴｈ２応答に特徴的なサイトカインの活性の抑制によって行ってもよい。
【００１３】
単一の物質または複数の物質を被験者に投与して所望の結果を得てもよい。これはＴｈ２型Ｔ細胞応答を抑制し、それによってＴｈ１型Ｔ細胞応答の相対的な亢進的調節を行う物質（単数または複数）を投与するか、またはＴｈ１型Ｔ細胞応答の測定可能な上昇を起こす物質（単数または複数）を投与することによって行ってもよい。あるいはまた、Ｔｈ１型Ｔ細胞応答の測定可能な上昇を起こす能力のある１つ以上の物質、並びにＴｈ２型Ｔ細胞応答を抑制する１つ以上の物質を被験者に投与してもよい。好ましくは、Ｔｈ１型Ｔ細胞応答を亢進的に調節し、Ｔｈ２型Ｔ細胞応答を抑制する能力のある少なくとも１つの物質を投与する。
【００１４】
一般に、方法はＴｈ２型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールをＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールにシフトすることを含む。
【００１５】
従って、本発明の別の観点では、心血管障害の予防または治療処置の方法を提供し、方法はそれを必要とする被験者に、Ｔｈ１型Ｔ細胞応答を亢進的に調節する能力のある少なくとも１つの物質、および／または障害に関係するＴｈ２型Ｔ細胞応答を抑制する能力のある少なくとも１つの物質の有効量を投与することを含む。
【００１６】
本発明の更に別の観点では、心血管障害の予防または治療処置の方法を提供し、方法はそれを必要とする被験者に、障害に関係するＴｈ２型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカインの活性を抑制する能力のある少なくとも１つの物質、および／またはＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカインの作用を増強する能力のある少なくとも１つの物質の有効量を投与することを含む。
【００１７】
本発明の更なる観点では、心血管障害を有する被験者におけるサイトカイン・バランスを変化させる方法を提供し、方法はそれを必要とする被験者に、Ｔｈ１型Ｔ細胞応答を亢進的に調節する能力のある少なくとも１つの物質、および／または障害に関係するＴｈ２型Ｔ細胞応答を抑制する能力のある少なくとも１つの物質の有効量を投与することを含む。
【００１８】
本発明の更に別の観点では、心血管障害を有する被験者におけるサイトカイン・バランスを変化させる方法を提供し、方法はそれを必要とする被験者に、障害に関係するＴｈ２型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカインの作用を抑制する能力のある少なくとも１つの物質、および／またはＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカインの作用を増強する能力のある少なくとも１つの物質の有効量を投与することを含む。
【００１９】
本発明の方法に使用するのに好ましい物質は所望の結果が得られる微生物、またはその成分、抽出物、もしくは分泌物である。微生物は例えば酵母、細菌、およびそれらの混合物であってもよい。好ましくは微生物は細菌であり、より好ましくは共生細菌である。好適な共生細菌は乳酸桿菌種および／またはミコバクテリウム種から選択してもよい。Ｔｈ２応答を抑制し、コレステロールを低下させる能力を有する乳酸桿菌は好ましい。特に好ましいのは好酸性乳酸桿菌およびミコバクテリウム・バッカエである。
【００２０】
理解されるように、微生物の投与は生きたまま、不活性化して、または死滅させて行ってもよい。好ましくは共生細菌を生菌として投与する。
【００２１】
しかしながら、本発明は微生物の使用に限定されるのではなく、理解されるようにＴｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールをＴｈ２型Ｔ細胞応答のそれに比較して亢進的に調節させる能力のある物質のいずれを利用してもよい。他の物質には、例えば抗体およびその結合フラグメントがある。抗ＣＤ４０抗体またはその結合フラグメントは特に好ましい。更に、ＣＤ４０の他のリガンドを使用してもよい。
【００２２】
サイトカイン・マーカーはＴｈ１またはＴｈ２応答のいずれかと特徴的に関係するサイトカイン（単数または複数）のいずれでもよい。例えばＴｈ１応答ではサイトカインはインターフェロン−γまたはインターロイキン−１２であってもよく、Ｔｈ２応答ではサイトカインはインターロイキン−４、インターロイキン−１０、ＴＧＦ−β、および／またはインターロイキン−１３であってもよい。しかしながら、理解されるように、他のサイトカイン・マーカーは、Ｔｈ１またはＴｈ２応答のいずれかに特異的な、または同定可能なマーカーである限り有用である。
【００２３】
上に概説した処置を、心血管障害を悪化させる根本となる症状の治療に使用される１つ以上の医薬的に活性な物質（例えば脂質低下剤、抗高血圧剤、および抗糖尿病剤）の投与と組み合わせることができる。
【００２４】
Ｔ細胞応答の変更または関連するサイトカインの活性の調節のために使用される物質をそれらの医薬的に活性な物質の１つ以上の前に、同時に、または後に投与することができる。
【００２５】
本発明の方法は、サイトカイン・バランスの障害または好適なＴ細胞応答の欠如が細菌感染、細菌性抗原、多クローン性活性化物質（例えばエンドトキシンなど）、超抗原（例えばコロニー形成細菌からの）、または自己抗原（血管壁のプラーク内の）によって悪化した被験者においても有効である。特に本発明に関連するのは、クラミジア・ニューモニエ、ヘリコバクター・ピロリ、または型別不能ヘモフィルス・インフルエンザによる感染、またはそれら由来の細菌性抗原である。
【００２６】
従って、本発明の更なる観点では心血管障害の診断またはそれへの罹病性の評価の方法を提供し、方法は被験者においてＴ細胞応答を評価することを含み、ここでＴｈ２応答の亢進的調節および／またはＴｈ１応答の抑制は、障害への罹病性またはその存在を示す。
【００２７】
本発明の別の観点では、心血管障害の診断またはそれへの罹病性の評価の方法を提供し、方法は被験者においてＴ細胞応答を評価することを含み、ここでＴｈ１応答に特徴的なサイトカインの活性もしくは生成の抑制、および／またはＴｈ２応答に特徴的なサイトカインの活性もしくは生成の増強は、被験者の障害への罹病性またはその存在を示す。
【００２８】
本発明の更なる観点では、心血管障害の診断、または被験者が障害への罹病性を有するかどうかの評価の方法を提供し、方法は以下を含む：
（ａ）障害によって影響される１つ以上の免疫グロブリンレベルを測定して試験データを得；そして
（ｂ）試験データを参照データと比較して被験者が心血管障害への罹病性を有するかどうか、または同障害を有するかどうかを評価する。
【００２９】
好ましくは免疫グロブリンはＩｇＧであり、より好ましくはＩｇＧ２サブクラスである。
【００３０】
好ましくは免疫グロブリンは病原性細菌（例えばクラミジア・ニューモニエ、ヘリコバクター・ピロリ、または型別不能ヘモフィルス・インフルエンザ）に特異的なＩｇＧ２サブクラスの抗体である。当業者に明らかなように、他の特異的抗体を使用してもよい。
【００３１】
好ましくは、総ＩｇＧ２とＩｇＧ２サブクラス特異的抗体との比率、または総ＩｇＧ２サブクラスの免疫グロブリンとＩｇＧ２サブクラスの特異的抗体の比率の変化を、心血管障害の存在またはその罹病性の指標として使用する。
【００３２】
‘心血管障害’という用語はアテロームおよび血管変性疾患、そして冠状動脈の炎症を伴う心血管症状または疾患（１から３の冠状動脈疾患を含む）を包含するものとみなす。
【００３３】
一般に心血管障害は血管変性疾患であり、より一般的にはアテロームである。
【００３４】
特に、本発明の方法は、最小限の、または広範な冠状動脈アテローム硬化症を有するが安定した疾病であるアテローム患者、並びに最近心筋梗塞を起こした、または不安定な狭心症を有する不安定な疾病であるアテローム患者の治療に適用できる。
【００３５】
好ましくは、Ｔ細胞応答を循環Ｔ細胞の分析によって評価する。しかしながら、理解されるようにＴ細胞応答は特定のＴ細胞応答に特徴的なマーカーサイトカイン（単数または複数）、例えばＴｈ１応答ではインターフェロン−γもしくはＩＬ−１２、またはＴｈ２応答ではインターロイキン−４および／もしくはインターロイキン−１３の測定によって評価してもよい。
【００３６】
ここに記載する方法に使用するための組成物もまた、明確に本発明の範囲内に含まれる。更に、心血管障害の予防または治療処置のために被験者に投与する医薬品または治療組成物の製造における、ここに記載する物質の使用も明確に包含される。
【００３７】
更に、本発明の診断または評価の方法に使用するためのキットも提供する。キットは例えばアッセイを実施するための１つ以上の試薬、例えば抗体、バッファー、コントロール、および使用説明書を含んでもよい。
【００３８】
ここで本発明の特徴および利点について、多くの好ましい非限定的な本発明の態様と関連して以下に記載する。
本発明の好ましい態様の詳細な説明
顕著なアテロームの存在によってＩＬ−４の血中レベルが上昇し、それに伴ってＩＦＮ−γレベルが低下することが観察されている。このサイトカイン・バランスの変化はＴｈ２応答へのシフトを示すものであり、アテロームの診断に有用である。またこの観察によってＴ細胞応答をＴｈ１応答へ変化させることを目的とする治療のための確実な基準が提供され、従って冠状動脈疾患、および同様の根本的な機構に基づくアテロームを含む他の心血管障害の予防および／または治療に有用である。
【００３９】
ここで企図される可能な治療製剤の例は、サイトカイン・バランスをＴｈ１応答の方に戻し、それによって心血管障害の進行を低減する、その発症を予防する、または逆行させることができる共生細菌（例えば乳酸桿菌）を含むものである。しかしながら、他の物質および組成物、例えば以下に記載する細菌アジュバントで応答をＴｈ２からＴｈ１にシフトさせる能力を有するものも、ここに記載する症状の治療に有用である。
【００４０】
循環Ｔ細胞中のＴｈ２への偏りを検出する方法は、それが直接的なものであっても、あるいは間接的なものであっても（例えばこの偏りの下流の効果、例えばＩｇＧサブクラスのバリエーションまたはＩｇＧサブクラス特異的抗体のバリエーションで、クラミジア・ニューモニエまたはヘリコバクター・ピロリ（しかしそれらの病原体に限定されない）に対する抗体産生において起こるもののモニタリングによるような）、冠状動脈疾患の指標として有用である。例えばＩｇＧ２は、サイトカイン・パターンがＴｈ２方向にシフトする場合、相対的に低い。ＩｇＧ２サブクラスの免疫グロブリン、または（例えばクラミジア・ニューモニエまたはヘリコバクター・ピロリに）特異的なＩｇＧ２サブクラス抗体全体のこのような比率の変化（または低レベル）は‘アテロームを促進する’サイトカインの偏りを示す。
【００４１】
実際、免疫グロブリン、例えばＩｇＧ２サブクラス抗体のレベルを測定し、参照レベルまたは比率と比較して、被験者が心血管障害（例えばアテローム）に罹患しやすいかどうか、あるいは疾病を有するかどうかについての評価を行ってもよい。好適な参照レベルまたは比率は一般に健康な個体から得た対応する測定値に基づき、通常、慣例的な方法に従って集団の代表群から得た平均値を含む。
【００４２】
更に、本発明で企図するアテロームの予防、治療、または逆行の方法は、共生細菌（特に乳酸桿菌種）の投与のような、サイトカイン・バランスをＴｈ１応答側にシフトまたは変化させる処置を含む。例えば好酸性乳酸桿菌はＩＬ−４を抑制的に調節し、脾臓内のＴ細胞（すなわち循環細胞）からのＩＮＦ−γ分泌を亢進的に調節し、従ってアテロームおよび他のそのような心血管障害の治療に適用できる。他の治療にはＴｈ２サイトカイン分泌を抑制する、もしくはそれらのサイトカインの作用を阻害する因子の投与、および／またはＩＮＦ−γのようなＴｈ１サイトカインの分泌または活性を促進する治療がある。
【００４３】
当業者に明らかなように、抗原（例えばクラミジア・ニューモニエまたはヘリコバクター・ピロリ）または非特異的活性化因子（例えば多クローン性活性化物質、エンドトキシン、または超抗原）と特異的に反応する循環Ｔ細胞からのサイトカイン分泌のレベルまたはパターンを特異的に修飾する治療をここで企図するように使用することができる。
【００４４】
更に、サイトカイン・バランスをＴｈ１応答側に変化させることができる共生細菌または他の物質と、‘リスク因子’ を対象とする既存の療法（例えば脂質低下物質、抗高血圧剤など）とを併用する治療を有効に利用してもよい。多くの更なる因子がアテロームを誘引し（例えば血中脂質、糖尿病、高血圧、喫煙）、サイトカイン・バランスを変化させる療法と根底にある症状を治療する療法との併用もここで企図する。
【００４５】
一般に、Ｔ細胞サイトカイン・プロフィールおよび／またはＴ細胞応答を評価するために被験者からサンプルを採取する。サンプルは全血サンプル、全血の細胞成分、単離した細胞、または例えばアッセイに好適な組織生検サンプルであってもよい。
【００４６】
微生物は細菌および酵母株から選択してもよく、それらにはサッカロミセス（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、例えばサッカロミセス・セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）およびサッカロミセス・ブラルディ（ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）がある。好ましくは細菌は共生細菌である。あるいはまた、微生物（単数または複数）の成分、音波処理物、抽出物もしくは分泌物、またはそれらの混合物を使用してもよい。抽出物には、例えば細胞壁画分がある。微生物（単数または複数）の成分は抗原、例えば、十分当業者の範囲内にある酵素的処理によって得られる抗原性ペプチドなどを含有してもよい。
【００４７】
細菌は例えば（それらに限定されるわけではないが）乳酸桿菌種、乳酸菌、ミコバクテリウム種、およびビフィドバクテリウム種から選択してもよい。更に好ましくは、好酸性乳酸桿菌（Ｌ． ａｃｉｄｐｈｉｌｕｓ）、発酵乳酸桿菌（Ｌ． ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、もしくはミコバクテリウム・バッカエ（Ｍ． ｖａｃｃａｅ）、またはその成分、抽出物、音波処理物、分泌物、もしくはそれらの混合物で、Ｔｈ１細胞応答を誘導する能力のあるものを使用する。特に好ましいのは好酸性乳酸桿菌、発酵乳酸桿菌、またはミコバクテリウム・バッカエであり、所望のＴｈ１型Ｔ細胞応答を誘導する能力がある限り、それらを生菌で、または不活性化標品として使用してもよい。
【００４８】
好ましくは好酸性乳酸桿菌および発酵乳酸桿菌を生菌標品として使用する。（共生作用を有するか、または有さない）他の細菌を使用してもよく、それらは例えばラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノサス（ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベなどのような周知の補助（ａｄｊｕｖａｔｉｎｇ）細菌である。
【００４９】
被験者に投与する微生物またはその抽出物などの用量は心血管障害の性質および重篤度、物質が投与されるのは予防目的か治療目的か、そして関係する生物のタイプに従って変化しうる。治療パラメーター、並びに必要な投与量は当業者が容易に決定できる。
【００５０】
好ましくは、微生物または微生物を含有する組成物は錠剤またはカプセルの形態である。しかしながら、当業者に明らかなように、微生物を液体、または他の形態の固体製剤として提供してもよい。特に、微生物を食物源（例えばヨーグルトまたは他の乳製品）、または（例えば大豆を主成分とする）同様の非乳製品として提供してもよい。
【００５１】
微生物などは一般に、一定間隔で経口投与し、通常、治療期間中は毎日であり、これは数カ月以上の期間まで延長してもよい。好ましくは微生物を１日あたりｌｏｇ３からｌｏｇ１２の用量で投与する。共生細菌を生きた全菌体として投与する場合、その用量は約１ｘ１０８から約１ｘ１０１２生物の範囲であってもよい。
【００５２】
しかしながら、Ｔｈ１型Ｔ細胞応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールを亢進的に調節する能力のある他の物質を本発明の方法に従って使用してもよい。当業者はここに提供する記述に基づく慣例的な試験および実験によってそのような他の物質を容易に同定できる。そのような他の物質には、例えば抗体およびその結合フラグメントが含まれうる。
【００５３】
この点について、発明者らはアテロームに関係するＴ細胞分泌ＩＬ−４の血中レベルが冠状動脈疾患の程度と相互に関係することを発見した。この印象的な相互関係は、Ｔ細胞が介在する炎症はＣＤ４＋　Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌと、一連の構造（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）および循環細胞（血小板を含む）上のＣＤ４０とのライゲーションによって誘導されるという発明者らによる観察と十分一致する。特に血小板は、活性化されたＣＤ４＋　Ｔ細胞上に発現した（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ＣＤ４０Ｌと血小板上に発現したＣＤ４０とのライゲーションの結果として、ＩＬ−４生成のための重要な因子であると考えられる。
【００５４】
従って、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０とのライゲーションを阻害する能力のある物質、例えば抗体、特に抗ＣＤ４０抗体またはその結合フラグメントの投与によって、患者におけるＴｈ２応答に特徴的なサイトカイン・プロフィールが変化しうる。結合フラグメントとは、抗体の結合能力を保持し、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２フラグメント（それぞれ、パパインまたはペプシンでの蛋白分解による開裂で得られる）を含む抗体のフラグメントを意味する。更に、当業者に周知のＣＤ４０の他のリガンドまたはそのペプチドフラグメントを投与して、所望の、Ｔｈ２型Ｔ細胞応答に比較したＴｈ１型Ｔ細胞応答の亢進的調節を行ってもよい。好適なそれらのリガンドおよび物質は、付記する実施例に開示するような方法論を使用して容易に同定することができる。それらの物質は静脈内、筋肉内、もしくは皮下、または好適であると考えられる他のいずれの経路で投与してもよい。
【００５５】
それらの物質、および微生物の抽出物、音波処理物などのような他の物質を、医薬的に許容されるキャリアー、希釈剤、および／または添加剤に混合して医薬組成物に調製し、意図する被験者に投与してもよい。そのような他の活性物質の投与量は一般に、それらの使用のための慣例的な治療計画に従い、年齢、体重、治療すべき症状の性質、および被験者の全身的な健康状態のような因子を考慮するが、これは容易に認識される通りである。
【００５６】
剤形には注射用の水溶液および注射液の即時調製用の粉末がある。それらの注射用組成物は注射可能な程度までの流動性を有し、一般に製造後の保存を考慮した安定性を有する。キャリアーは１つ以上のエタノール、ポリオール（例えばグリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒である。レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合は必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、流動性を保持してもよい。
【００５７】
注射液は通常、所望の量の活性物質を好適な溶媒に、種々の上記の他の成分と共に混合して調製する。一般的に、分散液の調製は分散媒および他の成分を含有する賦形剤に活性物質を混合して行う。注射液の調製のための粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００５８】
経口投与では、好適だと考えられる経口的に許容されるキャリアーに物質を調合してもよい。特に、活性成分を不活性な希釈剤、吸収可能な食用キャリアーと共に調製するか、または硬質もしくは軟質ゼラチンカプセルに封入してもよい。あるいはまた、上記のように食品に直接混合してもよい。更にまた、活性物質を経口摂取可能な錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップなどの形態で使用してもよい。
【００５９】
本発明の組成物に１つ以上の好適な保存剤（例えばソルビン酸）を混合してもよい。多くの場合、組成物は等張性物質（例えば糖または塩化ナトリウム）を更に含有してもよい。
【００６０】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは以下の１つ以上を含有してもよい：結合剤、例えばトラガカントガム、アカシアガム、コーンスターチ、またはゼラチン；添加剤、例えばリン酸２カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えばスクロース、ラクトース、もしくはサッカリン、または着香剤。投与ユニット形態がカプセルである場合、１つ以上の上記成分の他に液体キャリアーを含有してもよい。種々の他の成分をコーティングとして、あるいは投与ユニットの物理的形態を修飾するために含有してもよい。例えば錠剤、ピル、またはカプセルをシェラック、糖、または両方でコーティングしてもよい。更に、活性物質を好適な持続放出調剤または製剤に混合してもよい。
【００６１】
医薬的に許容されるキャリアー、希釈剤、および／または添加剤には慣例的に知られる好適な溶媒、分散媒、および等張性製剤または溶液がある。医薬的に活性な物質のためのそれらの成分および媒質の使用は周知である。慣例的な媒質または物質が活性成分と不適合でない限り、治療および予防組成物におけるそれらの使用は企図される。必要により、補足のための活性成分を組成物に混合することもできる。
【００６２】
認識されるように、それらの組成物中の物質（単数または複数）の量は、企図される投与様式を考慮して好適な有効量が被験者に運搬されるようなものである。
【００６３】
ここで使用する投与ユニット形態とは、治療すべき被験者に単位投与として好適な物理的に分離したユニットを意味し、各ユニットは所望の治療または予防効果が得られるように算出した既定の量の活性物質を、適切なキャリアー、希釈剤、および／または添加剤と共に含有する。
【００６４】
物質を１つ以上の抗生物質または１つ以上の他の医薬的に活性な物質と共に投与して心血管障害または障害を悪化させる元となる症状を治療してもよく、また抗生物質による治療または他の活性物質での治療の前に、それと同時に、またはその後に投与してもよい。
実施例
実施例１：乳酸桿菌はＩＬ−４分泌を阻害する
乳酸桿菌がＩＬ−４生成を調節する能力を有するかどうかを確認するために、段階的に変化させた用量の発酵乳酸桿菌（ＶＲＩ ００２株。Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ大学　Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（オーストラリア　シドニー）から入手可）を、等量の健常な被験者由来のヘパリン化全血およびＡＩＭ−Ｖ血清非含有培地を含有する培養液に添加した。コントロールの培養液には培地のみを含有させた。全ての培養液をＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）で刺激した。２４時間のインキュベーション後、分泌されたＩＬ−４の量を捕捉ＩＬ−４　ＥＬＩＳＡで測定した。図１に示すように、ＩＬ−４分泌は発酵乳酸桿菌の存在下で用量依存的に阻害され、２ｘ１０５細菌／培養液で最大効果を得た。このデータは、発酵乳酸桿菌がＴｈ２応答に関係するＩＬ−４介在型炎症の抑制的調節に有効であることを示している。
実施例２：Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン応答に対する共生細菌の効果
共生細菌がＴｈ２サイトカイン応答を抑制的に調節し、Ｔｈ１サイトカイン応答を亢進的に調節するかどうかを確認するために、Ｃ５７／Ｂ１６マウスに種々の数の好酸性乳酸桿菌（ＶＲＩ ００１株。Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ大学　Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（オーストラリア　シドニー）から入手可）を２週間にわたって連日、給餌針（ｆｅｅｄｉｎｇ ｎｅｅｄｌｅ）を使用して胃内投与し、その後、８μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）および水酸化アルミニウムを０．２ｍＬのリン酸バッファーに混合したものを腹膜内注射によって投与して刺激した。マウスに更に１０回、発酵乳酸桿菌を２週間にわたって２日毎に摂取させた後、殺害した。脾臓をふるいを通してｔｅａｓｉｎｇしてリンパ球を単離し、ＰＢＳで洗浄し、１０ｘ１０６細胞／ｍｌ培養液で再懸濁した。次いで細胞懸濁液の１ｍＬアリコートを２４ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルに分注し、ＯＶＡ（５μｇ／ｍＬ）で刺激した。４日間インキュベートした後、上清を回収し、標準的なＥＬＩＳＡ技術によってＩＬ−４またはＩＦＮ−γモノクローナル抗体ペアを使用してＩＬ−４およびＩＦＮ−γ生成についてアッセイを行った。
【００６５】
手短に言えば、２４ウェル・マイクロタイタープレートのウェルを捕捉抗ＩＬ−４抗体で被覆した。室温で１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、ビオチン化した抗ＩＬ−４抗体を各ウェルに添加した。更に１時間インキュベートした後、ウェルを洗浄してストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ペルオキシダーゼ・コンジュゲートを各ウェルに添加した。３０分間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、次いでＴＭＢ基質を添加した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーで、４５０／６２０ｎｍで発色を測定した。未知サンプル中のＩＬ−４レベルを、内挿法により検量線を使用して定量した。ＩＦＮ−γの測定にも同様の手順を使用した。
【００６６】
結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。ここに見られるように、図２Ａは好酸性乳酸桿菌の投与によってＩＬ−４の生成が用量依存的に抑制されることを示しており、図２ＢはＩＦＮ−γの生成が向上されることを示している。従って全血中の分泌ＩＬ−４の生成の増加は冠状動脈疾患を有する被験者における疾病の重篤度と相互に関係する。
実施例３：被験者の選択と測定
３．１　被験者　　Ｊｏｈｎ Ｈｕｎｔｅｒ 病院（オーストラリア　ニューキャッスル）の被験者を血管造影研究の後、選択した。リスク因子を記録した（脂質プロフィール、高血圧、糖尿病、喫煙、家族歴）。以下の群を同定した：（ａ）最小限の（ｍｉｎｉｍａｌ）冠状動脈アテローム硬化症（ｎ＝１００）；（ｂ）安定な病状である広範な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）冠状動脈アテローム硬化症（＞５０％　３つの主要な血管が関係）（ｎ＝１００）；および（ｃ）不安定な病状である広範な冠状動脈アテローム硬化症（ｎ＝１００）（最近の心筋梗塞または不安定な狭心症）。
【００６７】
抗体およびＴ細胞研究のために、血管造影の後、選択した被験者から血液（２０ｍｌ）を採取した。Ｊｏｈｎ Ｈｕｎｔｅｒ 病院（オーストラリア　ニューキャッスル）での血管造影研究数は約３０−４０／週で、正常な動脈または最小限の疾患が約１０−１５％、３つの動脈疾患が２０−３０％であり、その約１／３が不安定な病状であり、２／３が安定した病状であった。
【００６８】
３．２　抗クラミジア・ニューモニエ抗体　　クラミジア・ニューモニエ特異性抗原に対する免疫グロブリンＩｇＧについての微量免疫蛍光試験（ｍｉｃｒｏｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｔｅｓｔ）によって抗体を検出した（クラミジア−ｃｅｌ　Ｐｎキット、ＣｅＬＬａｂｓ Ｐｔｙ社、オーストラリア）。特異的ＩｇＧサブクラス抗血清を使用してＩｇＧサブクラス抗体を検出した。
【００６９】
３．３　Ｔ細胞の増殖　　全血リンパ球培養を３重複測定で、９６ウェル丸底マイクロタイター・プレート中で実施した。ヘパリン化した血液を、以下のように調製したクラミジア・ニューモニエの要素体（ｅｌｅｍｅｎｔａｌ ｂｏｄｉｅｓ）（ＥＢ）を段階的に変化させた量（０．１、１．０、１０μｇ／ｍｌ）で含有するＡＩＭ−Ｖ血清未含有培地で１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。全ての被験者を‘無関係の’抗原コントロールとしてクラミジア・トラコマチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）またはＥＢ抗原（０．１、１．０、１０μｇ／ｍｌ）で更に刺激した。５％　ＣＯ２中、３７℃で５日後、力価測定したチミジン（培養液あたり０．５μＣｉ）を最後の６時間に添加した後、回収してカウントした。
【００７０】
３．４　サイトカイン生成　　サイトカインに基づく全血アッセイをＥＢ反応性Ｔ細胞の検出に使用した。９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェル中で、ヘパリン化した血液を種々の濃度のＥＢ抗原を含有する、または含有しないＡＩＭ−Ｖ培地で１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。ＩＬ−４の生成を測定するために、いくつかのウェルを捕捉モノクローナル抗ＩＬ−４抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ， ＣＳＬ）であらかじめ被覆した。培養液を５％　ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２４−４８時間インキュベートし、その後ＩＬ−２、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γアッセイのために血漿上清を回収した（Ｅｎｄｏｇｅｎキット， ＣＳＬ）。アッセイキットに記載されるように洗浄してｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ抗ＩＬ−４抗体を添加した後、好適なスタンダードと共に捕捉されたＩＬ−４を直接測定した。抗原反応性Ｔ細胞およびサイトカイン生成プロフィールの測定のための全血アッセイは、ヘリコバクター・ピロリに感染したヒト被験者における研究に関して確認されている。
【００７１】
３．５　クラミジア・ニューモニエからの要素体の調製　　ＨｅＬａ細胞２２９にａｄａｐｔさせたクラミジア・ニューモニエＫａｊａａｎｉ株（Ｐ Ｓａｉｋｋｕ博士（ヘルシンキ大学、フィンランド）から入手）を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）およびストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地を含有する培養フラスコ中で、５％　ＣＯ２、加湿雰囲気下、３７℃でＨｅＬａ細胞中で増殖させた。３日後、培養した細胞からクラミジア要素体を単離した。無菌のヘラ（ｓｃｒａｐｅｒ）で細胞をフラスコから剥離させ、洗浄してリン酸バッファー（ＰＢＳ）に懸濁し、超音波処理によって封入体を破壊した。細胞破壊片を遠心分離によって除去した後、ＥＢ物質を超遠心分離によって３０，０００ｇで回収した。次いでＥＢ物質をＰＢＳに再懸濁し、３０−６０％Ｎｙｃｏｄｅｎｚ溶液（Ｎｙｃｏｍｅｄ、ノルウェイ）上に積層した。遠心分離後、６０％グラジエント以上で（ａｂｏｖｅ ｔｈｅ ６０％ ｇｒａｄｉｅｎｔ）回収したＥＢ物質を洗浄し、１％ホルムアルデヒドで２４時間不活性化した。十分に（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）洗浄した後、ＥＢ物質をＰＢＳに再懸濁し、タンパク質濃度を測定した（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎキット）。Ｓａｉｋｋｕ博士らから入手したＥＢ抗原も比較のために研究に使用した。クラミジア・トラコマチスからの要素体抗原の調製にも同様の方法を使用した（ここでもサンプルはＰ Ｓａｉｋｋｕ博士から提供を受けた）。
【００７２】
３．６　特異的にクローン化したタンパク質　　Ｓａｉｋｋｕ博士およびＭａｋｅｌａ博士（フィンランド、上記）から提供されたクラミジア・ニューモニエからクローン化した抗原のサイトカイン・バランスを試験した（上記）。クローン化した抗原は枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）で生成した組換えタンパク質としてＭＯＭＰ、ＯＭＰ２、およびＨＳＰ６０を含有した。これらは１μｇ／ｍｌで試験した。
【００７３】
特に、ヘパリン化した全血を、クラミジア・ニューモニエに関して血清陽性（ｎ＝１７）または血清陰性（ｎ＝２７）のいずれかである冠状動脈アテローム硬化症患者から回収した。上記のように３７℃で一晩インキュベートした後、分泌されたＩＬ−４を捕捉ＥＬＩＳＡで、ＩＦＮ−γを血漿上清中で測定した。
【００７４】
図３Ａおよび３Ｂに示すように、軽度または１血管疾患を有する被験者に比較して２−３冠状血管疾患を有する被験者では、より高いレベルのＩＬ−４が検出された。正常な被験者では低レベルまたは検出不能なレベルが観察された。クラミジア・ニューモニエ血清陽性被験者では、血清陰性被験者（特に１血管疾患を有する者）に比較して１−３血管疾患を有する被験者で、分泌されたＩＬ−４がより高いレベルで検出され、これは分泌されたＩＬ−４の生成の増加は感染状態と関係することを示唆している。しかしながら、研究を行った全ての被験者でＩＬ−４分泌は培養液中でのクラミジア・ニューモニエ抗原による刺激に依存しておらず、このことはＩＬ−４の自発的生成がｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞の活性化の結果であり、これらのＴ細胞は培養液中でもはや更なる抗原刺激には反応しないことを示唆している。４４被験者からのデータを合わせると結果は同様であり、抗原刺激に関係なく、全血培養液中でのＩＬ−４分泌のレベルは疾病の程度と相互に関係していた。
実施例４：自発的Ｔリンパ球活性化のパターン
著しく対照的に、ＩＬ−４分泌とＩＦＮ−γ生成の間には逆の関係がある（図４Ａおよび４Ｂ参照）。しかしながら、ＩＦＮ−γレベルおよび疾病の重篤度の間には相関関係がなく、これはアテロームにおける炎症反応がＩＬ−４の亢進的調節でのＣＤ４＋　Ｔｈ２ヘルパー細胞介在型炎症によって引き起こされることを示している。
【００７５】
特に、サイトカインの自発的生成の結果は、ＩＬ−４の生成量において‘正常な’冠状血管造影を有する者と２または３の血管疾患を有する者（‘高負荷量（ｈｉｇｈ ｌｏａｄ）’アテロームを表す）の間に有意な差異を示しており、軽度または最低限の冠状動脈アテローム硬化症と定義される者はその中間であった。ＩＮＦ−γに関して、正常と‘アテロームが検出された’被験者の間に差異があることが見出され、‘正常な’被験者はより高いレベルであった。ＩＮＦ−に関して軽度および重度のアテローム間の差異は、ＩＬ−４で観察された差異のレベルより顕著ではない。考え合わせると、これらの結果は明らかに、アテロームの量に相関してＴｈ１−Ｔｈ２バランスがシフトすることを示している。
【００７６】
Ｔｈ２パターンのサイトカイン応答を有するＴ細胞の刺激物質に反応する傾向がある被験者は、Ｔｈ２　Ｔ細胞活性化につながる炎症反応の経路の結果として血管壁におけるアテロームの過剰蓄積を促進すると結論づけられる。ここで測定されるサイトカインは全血培養液中でＴ細胞から自発的に分泌されるので、活性化はｉｎ ｖｉｖｏで起こったものである。刺激物質には多クローン性活性化物質（例えば腸内細菌叢からのエンドトキシン）、超抗原（例えばコロニー形成細菌からの）、自己抗原（プラークまたは血管壁内の（ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｑｕｅ ＯＦ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌ ｗａｌｌ？　英文ｐ６−１５行目参照）抗原を含む）、または特異性抗原（特にホスト（例えばクラミジア・ニューモニエ、ヘリコバクター・ピロリ、型別不能ヘモフィルス・インフルエンザなど）とコロニー形成または寄生関係にある微生物からの）がある。後者は、クラミジア・ニューモニエではなく“特定の微生物種に関係しない慢性感染”がアテローム硬化症の進行に関する‘リスク因子’であり、独自の抗原的役割を有するという見解と一致する（Ｇｒｏｙｓｔｏｎ ＪＴ， Ｋｕｏ Ｃｏｕｌｓｏｎ ＡＳら， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ （１９９５） ９２：３３９７−３４００；Ｂａｃｈｍａｉｅｒ Ｋ， Ｎｅｕ Ｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９９） ２８３：１３３５−１３３９；Ｍｅｊｅｒ Ｄ， Ｄｅｒｂｙ ＬＥら， ＪＡＭＡ （１９９９） １８：２７２−２７７）。更に図３Ａおよび３Ｂのデータが示すところによれば、クラミジア・ニューモニエ抗原で刺激した培養液中において‘Ｔｈ２極性化（ｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）’が高くなる傾向は、免疫系の‘Ｔｈ２傾向’に関して、特定の微生物はＴｈ２応答への作動を促進し、それによってアテロームプラークの更なる進行が促進されるという考えと一致する。循環細胞はアテロームプラークに含まれるものと交換される。従って慢性感染は顕著なアテロームを有する被験者においてＴｈ２への偏りを悪化させうる。しかしながら、クラミジア感染を有する被験者および有さない被験者についてのデータは、Ｔｈ２サイトカインの基本的な“傾向”はクラミジア感染に依存しないことを示している（上記のように感染が偏りを悪化させることはありうるが）。
【００７７】
この研究は、自発的Ｔリンパ球活性化のパターンが一般に（しかし、特に冠状動脈において）アテロームの量と関係するという結論を支持している。
実施例５：高コレステロール食を摂取させたマウスにおけるアテローム硬化症に対する乳酸菌投与の影響
アテローム硬化症の発生に対する抗コレステロール食の影響を、マウスの大動脈洞（根）における脂肪条痕の生成によって評価して確認した。
【００７８】
食餌は以下の成分を含有した：
【００７９】
【表１】
2004512307.tif 000002
【００８０】
手短に言えば、オスのＣ５７／Ｂ１６マウス（８週齢）に高コレステロール食（ＨＣＤ）またはコレステロール未含有普通食を施与し、飲料水は自由に摂取させた。マウス群（ｎ＝１０）にＨＣＤを１週間摂取させた後、発酵乳酸桿菌（ＶＲＩ　００２）を含有する食餌療法を行った。一晩培養した液からの洗浄した細菌懸濁液を再懸濁して最終密度をｌｏｇ９．５からｌｏｇ１０．５生物の間としたサンプルの２００μｌと共に投与量を１週間に３回、口／胃から投与した。コントロール・マウスには２００μｌの食塩水のみを投与した。５週間後、不完全フロインドアジュバントに乳濁した５ｍｇ／ｍＬの死滅ミコバクテリウム・ツベルクロシス（ｔｕｂｅｒｃｌｏｓｉｓ）（ＭＴ， Ｄｉｆｃｏ）の０．１ｍＬを２群のマウスに皮下投与して免疫化した。免疫化段階の理論的根拠は、死滅細菌での免疫化による免疫系の活性化によって大動脈洞での脂肪条痕生成が促進されることを示唆している最近の報告に基づく（Ｇｅｏｒｇｅ Ｊ ら， Ａｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９９， １９：５０５−５１０）。
【００８１】
ＨＣＤおよび共生細菌処理の開始後７週間で、全てのマウスを殺害した。心臓穿刺によって血液を回収した。心臓を一体として（ｅｎ ｂｌｏｃ）除去し、大動脈洞（根）を含む上部分を切除し、ＰＢＳに混合した１０％ホルマリンで固定した。ホルマリン／ＰＢＳ中で一晩固定した後、組織をＯＣＴ培地に包埋し、凍結した後、クリオスタット中で切片化した。６から７切片（厚さ８−１０μｍ）を採取し、オイルレッドＯで染色した。ブラインドの観察者によって切片毎の病変部にスコアを付けた。脂肪条痕生成の存在に従って０−５の病変スコアリングシステムを採用した。図５Ａに示すように、ＨＣＤのみを摂取したマウスは乳酸菌で処理したものより脂肪条痕の生成が多かった。同様の結果がＭＴで免疫化したマウスで観察されたが（図５Ｂ）、これらのマウスでは病変の量は免疫化していない群より低く、このことは免疫化はアテローム発生を制限しうることを示唆している。
実施例６：冠状動脈疾患を有する患者由来の全血培養液におけるＩＬ−４の生成は抗ＣＤ４０モノクローナル抗体によって阻害される
冠状動脈疾患を有する被験者からヘパリン化した血液を採取し、等量の血清未含有ＡＩＭ−Ｖ培地（総容量３００μＬ）（段階的に変化させた濃度の抗ＣＤ４０Ｌ抗体を含有）中、抗ＩＬ−４抗体でコーティングした９６ウェル平底プレートで培養した。コントロールの培養液には培地のみ、またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ・コントロールを含有させた。２４時間インキュベートした後、分泌されたＩＬ−４の量を捕捉ＥＬＩＳＡアッセイで測定した。図６に示すように、ＩＬ−４の生成はコントロールに比較して、抗ＣＤ４０によって用量依存的に阻害され（９被験者でｐ＜０．０５）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ・コントロールまたは抗ＣＤ４０Ｌの添加（データは示していない）による影響はなかった。結果が示すように、全血培養液中でのＩＬ−４の生成にはＣＤ４０の関与（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）が重要である。
【００８２】
本発明について好ましい態様を参照して記述したが、当業者に理解されるように多くの変化および修飾が、本発明の範囲から逸脱することなく可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、発酵乳酸桿菌による全血中のＩＬ−４分泌の抑制を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂはそれぞれ、好酸性乳酸桿菌によるＩＬ−４分泌の抑制およびＩＦＮ−γ分泌の増加を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｃはそれぞれ、正常な被験者に比較した冠状血管疾患を有するクラミジア・ニューモニエ血清陰性および血清陽性被験者におけるＩＬ−４の分泌を示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｄはそれぞれ、正常な被験者に比較した冠状血管疾患を有する被験者におけるＩＬ−４およびＩＦＮ−γの分泌を示す。
【図５】図５は、高コレステロール食を摂取させたマウスにおけるアテロームに対する発酵乳酸桿菌ＫＬＤの効果を示す。
【図６】図６は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を含有する全血培養液の処理によるＩＬ−４生成の阻害を示す。
【図１】
2004512307.tif 000003
【図２】
2004512307.tif 000004
【図３】
2004512307.tif 000005
2004512307.tif 000006
【図４】
2004512307.tif 000007
2004512307.tif 000008
【図５】
2004512307.tif 000009
【図６】
2004512307.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004512307.tif 000011
2004512307.tif 000012
2004512307.tif 000013
2004512307.tif 000014
2004512307.tif 000015
2004512307.tif 000016
2004512307.tif 000017
2004512307.tif 000018
2004512307.tif 000019
2004512307.tif 000020
2004512307.tif 000021
2004512307.tif 000022
2004512307.tif 000023
2004512307.tif 000024
2004512307.tif 000025
2004512307.tif 000026
2004512307.tif 000027
2004512307.tif 000028
2004512307.tif 000029
2004512307.tif 000030
2004512307.tif 000031
2004512307.tif 000032
2004512307.tif 000033
2004512307.tif 000034
2004512307.tif 000035
2004512307.tif 000036
2004512307.tif 000037
2004512307.tif 000038
2004512307.tif 000039
2004512307.tif 000040
2004512307.tif 000041
2004512307.tif 000042
2004512307.tif 000043
2004512307.tif 000044
2004512307.tif 000045
2004512307.tif 000046
2004512307.tif 000047
2004512307.tif 000048
【国際調査報告】
2004512307.tif 000049
2004512307.tif 000050
2004512307.tif 000051
2004512307.tif 000052