(57)【要約】本発明は、インターフェロンとサイモシンとの融合蛋白質（IFN-THY融合蛋白質）、該融合蛋白質をコードするDNA配列、該DNA配列を含有するベクター、該ベクターを含有する宿主細胞、遺伝子工学により該融合蛋白質を製造する方法、および該融合蛋白質を含有する医薬組成物を提供する。本発明のIFN-THY融合蛋白質はIFNの活性を有し、かつTHYの免疫刺激活性をも有する。従ってこれを、ウイルス感染などの疾患を治療するため、および生物体の免疫機能を増強するために用いることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトαインターフェロン2bのアミノ酸配列；ヒトサイモシンのアミノ酸配列；およびヒトαインターフェロン2bのアミノ酸配列とヒトサイモシンのアミノ酸配列との間の１〜20アミノ酸からなる接続ペプチド配列、を含有する融合蛋白質。
【請求項２】
上記接続配列が４〜10アミノ酸を有する、請求項１の融合蛋白質。
【請求項３】
上記融合蛋白質が配列番号２に示すアミノ酸配列を含有する、請求項１の融合蛋白質。
【請求項４】
請求項１の融合蛋白質をコードする、単離されたDNA分子。
【請求項５】
配列番号１に示すヌクレオチド配列を含有する、請求項４のDNA分子。
【請求項６】
請求項４のDNA分子を含有するベクター。
【請求項７】
組み換えカイコ核多角体病ウイルス(Bobyx Mori Nuclear polyhedrosis virus) BacIT CGMCC No. 0504を含有する、請求項６のベクター。
【請求項８】
請求項６のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項９】
請求項１の融合蛋白質の製造方法であって、
上記融合蛋白質を発現する適当な条件下で請求項８の宿主細胞を培養し、又は請求項８の宿主細胞を含有する動物を飼育し、これにより上記融合蛋白質を発現する過程；および
上記融合蛋白質を単離する過程
を含んで成る上記製造方法。
【請求項１０】
医薬上容認される担体、賦形剤又は稀釈剤、および有効量の請求項１の融合蛋白質を含有する、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換DNA技術および医薬分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒトαインターフェロン2b（HuIFNα2b；以下IFNと略記する）とヒトサイモシン（以下THYと略記する）との融合蛋白質、該融合蛋白質をコードするDNA配列、該DNA配列を含有するベクター、該ベクターを含有する宿主細胞、遺伝子工学により該融合蛋白質を製造する方法、並にウイルス感染などの疾患を治療するため、および生物体の免疫機能を増強するための、該融合蛋白質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンは1957年に最初に発見され、Isaaca and Lindermannにより同種又は異種ウイルス感染に拮抗する細胞生産物の生産を誘導することができるものとして報告された。40年を超える研究期間に、２つの主要なカテゴリーのインターフェロン（I型IFNとしても知られているIFN-α/βおよびII型IFNとしても知られているIFN-γ）の遺伝子と蛋白質構造、およびその受容体遺伝子と蛋白質構造の全てについてかなり詳細な研究が行われた。この間に、IFNの多数の生物学的活性、例えば抗ウイルス状態の誘導、細胞増殖の抑制、細胞増殖の促進、ナチュラルキラー細胞の活性化などの活性が見つかった。しかしこれらの中でも、抗ウイルス活性が最も知られている。INF-αは白血球により生産され、ウイルス複製の阻害、腫瘍細胞の複製の阻害、および免疫調整において比較的に強い作用を示す。現在、INF-αは、ウイルス感染などの多くの疾患の治療のために使用が認められている。
【０００３】
Capon D. J.らは、HuIFNα2bが免疫能を増強することができ、よって抗ウイルス治療効果を提供することを報告した(Capon D.J., Shepard H.M. and Goeddel D.V., Mol. Cell. Biol. 5(4), 768-779, 1985)。
【０００４】
サイモシンは1965年に最初にAbrahamらによって胸腺から単離された。サイモシンは、28アミノ酸から成るポリペプチドであり、Ｔリンパ球の分裂と成熟を促進し、かつ細胞免疫を増強する活性を有する。この活性ポリペプチドは既に、免疫不全症、腫瘍、ウイルス感染および自己免疫疾患などの疾患の治療のために広く用いられている。
【０００５】
従ってIFN-αおよびTHYは、類似的かつ補完的な生物活性、例えば免疫調整活性、およびウイルス感染や腫瘍などの疾患の治療活性を有する。しかし、現在、IFN-αおよびTHY調製品は共に単独に生産されており、またこれらは臨床適用において単独に投与されており、従って高い薬剤コストを生じている。更にIFN-αおよびTHYの調製（および特にそれらの分離と精製）はかなり単調である。
【０００６】
従って当該分野ではIFN-αおよびTHYの生物活性を有する新しい薬剤の開発が非常に求められている。更に当該分野では低コストであり、および／または単純な過程からなる製造方法の開発も非常に求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の１つの目的は、IFN-αおよびTHYの両者の生物活性を有する新規な薬剤、即ちIFN-αとTHYとの融合蛋白質を提供することである。
本発明の別の目的は、上記融合蛋白質をコードするDNA、このDNA配列を含有するベクター、およびこのベクターを含有する宿主細胞を提供することである。
本発明の別の目的は、低コストであり、および／または単純な過程からなる、上記IFN-THY融合蛋白質の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一の態様では、ヒトαインターフェロン2bのアミノ酸配列；ヒトサイモシンのアミノ酸配列；および両者のアミノ酸配列間の、１〜20アミノ酸からなる接続ペプチド配列、を含有する融合蛋白質を提供する。
好適には上記接続配列は４〜10アミノ酸を有する。より好適には上記融合蛋白質は配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。
【０００９】
本発明の第二の態様では、上記の本発明の融合蛋白質をコードする単離されたDNA分子を提供する。好適には上記DNA分子は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する融合蛋白質をコードし、より好適には上記DNA分子は、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
本発明の第三の態様では、上記DNA分子を含有するベクターを提供する。好適には上記ベクターは、組み換えカイコ核多角体病ウイルス(Bobyx Mori Nuclear polyhedrosis virus) BacIT CGMCC No. 0504である。また、上記ベクターを含有する宿主細胞も提供する。
【００１１】
本発明の第四の態様では、本発明の融合蛋白質の製造方法であって、
上記融合蛋白質を発現する適当な条件下で上記宿主細胞を培養し、又は上記宿主細胞を含有する動物を飼育し、これにより上記融合蛋白質を発現する過程；および
上記融合蛋白質を単離する過程
を含んで成る上記製造方法を提供する。
【００１２】
本発明の第五の態様では、医薬上容認される担体、賦形剤又は稀釈剤、および有効量の本発明の融合蛋白質を含んで成る医薬組成物を提供する。
【００１３】
広範かつ丹念な研究を通して、本発明者は、IFN遺伝子とTHY遺伝子とを融合し、そしてカイコの幼虫において高効率の発現を行い、IFN-THY融合蛋白質を生産した。従ってこの融合蛋白質は、IFNの全ての生物活性を保持し、他方で生物体の免疫を増強するTHYの刺激活性をも追加されており、従ってウイルス感染の治療、ウイルス複製の抑制、および生物体の免疫の増強のための新規な薬剤となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
定義
本明細書では、技術用語「インターフェロンとサイモシンとの融合蛋白質」および「IFN-THY融合蛋白質」などは交換可能であり、両者とも、インターフェロンのアミノ酸配列とサイモシンのアミノ酸配列との融合により形成された蛋白質を指す。ただし両者の間に接続ペプチド配列を有することも、有しないこともありうる。
【００１５】
本明細書では、上記融合蛋白質における技術用語「インターフェロンのアミノ酸配列」とは上記融合蛋白質のアミノ酸配列の一部分を指し、この配列は、基本的に天然または改変インターフェロンのアミノ酸配列と同じであり、かつ基本的に天然インターフェロンと同じ生物活性を有する。このインターフェロンのアミノ酸配列は、好適にはαインターフェロン、より好適にはαインターフェロン2b、そして理想的には天然のヒトαインターフェロン2bのアミノ酸配列である。
【００１６】
本明細書では、上記融合蛋白質における技術用語「サイモシンのアミノ酸配列」とは上記融合蛋白質のアミノ酸配列の一部分を指し、該配列は、基本的に天然または改変サイモシンのアミノ酸配列と同じであり、かつ基本的に天然サイモシンと同じ生物活性を有する。このサイモシンのアミノ酸配列は、好適には天然のヒトサイモシンの配列である。
上記のインターフェロンおよびサイモシンの配列はヒト又はヒト以外の動物に由来してよい。しかし好適にはこれらは天然のヒト配列である。
【００１７】
本明細書では、技術用語「接続ペプチド」とは、インターフェロンのアミノ酸配列とサイモシンのアミノ酸配列との間に存在する、接続機能を有する短いペプチドを指す。接続ペプチドの長さは通常１〜20アミノ酸であり、好適には３〜10アミノ酸であり、理想的には４〜６アミノ酸である。技術者は、当該分野の慣用の方法を用いて接続ペプチドを設計することができる。該接続ペプチドは、インターフェロンのアミノ酸配列およびサイモシンのアミノ酸配列により形成される正確なフォールディングおよび立体構造に、通常は影響しないか、又は重大には影響しないものである。
【００１８】
本発明の融合蛋白質をコードするDNA配列を人工的に完全に合成することができる。また、インターフェロン及び／又はサイモシンをコードするDNA配列を、PCR増幅法又は合成法により得ることもでき、その後これらを相互に結合して、本発明の融合蛋白質をコードするDNA配列を作製する。
【００１９】
本発明の融合蛋白質をコードするDNA配列を得た後、これを適当な発現ベクターに挿入し、次にこれを適当な宿主細胞に挿入する。最後に、この形質転換した宿主細胞を培養し、そして分離および精製を通して本発明の新規融合蛋白質を得る。
【００２０】
本明細書では、技術用語「ベクター」とは、プラスミド、発現ベクター、クローニングベクター、ウイルスベクターなどを含む。
本発明では、当該分野において既知である全ての種類のベクター、例えば市販ベクターを選択することができる。市販ベクターを選択した場合、次に本発明の新規融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列を、その発現制御配列に操作可能に接続することにより、該蛋白質発現ベクターを作製することができる。
【００２１】
本明細書では、「操作可能に接続することができる」とは、ある線状DNA配列のある部分が、同一の線状DNA配列の他の部分の活性に影響を与えることができる状態を指す。例えば、あるシグナルペプチドDNAが、前駆体の発現のために作用してポリペプチド分泌に関与する場合、そのシグナルペプチドDNA（プレ分泌誘導配列）をポリペプチドDNAに操作可能に接続することができ；制御配列の転写がスイッチオンになる場合、それをコード配列に操作可能に接続することができ；ヌクレオチド結合部位を、それの翻訳が可能になる位置に動かす場合、それをコード配列に操作可能に接続することができる。一般に「操作可能に接続することができる」とは隣接していることを意味し、他方プレ分泌誘導配列は、読み取り枠において隣接していることを意味する。
【００２２】
本発明では、技術用語「宿主細胞」は原核細胞および真核細胞を含む。通常使用される原核宿主細胞の例は大腸菌および枯草菌である。通常使用される真核宿主細胞の例は酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞である。宿主細胞は好適には真核細胞であり、より好適にはカイコ細胞である。
【００２３】
形質転換した宿主細胞を得た後、この細胞を、本発明の融合蛋白質の発現に適する条件下で培養し、これにより融合蛋白質を発現させる。その後、その発現した融合蛋白質を更に分離する。
【００２４】
しかし、更により好適な発現系はカイコの発現系である。現在、カイコのリンパ液に存在する大量の蛋白質の保護作用およびいくつかの未知の機構の作用により、カイコ発現系により生産された薬剤は、経口投与された場合、直接に血液循環に入りうることが知られている。従ってカイコ発現系により生産された薬剤によって、患者の注射に起因する痛みや感染の危険性を回避できるだけでなく、薬剤の分離精製工程を回避して、薬剤の生産コストを大きく下げることもできる。
【００２５】
本発明の１つの実施例では、IFN-THY融合遺伝子をバキュロウイルスのトランスファープラスミドにクローニングすることにより、IFN-THY融合遺伝子を含有する組み換え昆虫バキュロウイルスを作製した。この組み換え昆虫バキュロウイルスをカイコに感染させることにより、カイコを、本発明の融合蛋白質を生産するようにすることができる。
【００２６】
本発明のIFN-THY融合蛋白質は、IFNの活性およびTHYの活性を有する。１つの実施例では、カイコのリンパ液を5000 rpmで５分間遠心した後その上清液を取り、これを直接用いてIFN活性を測定した。その結果、96時間発現後の試料のIFN活性は3.72 x 104 IU/mlであり、110時間発現後の試料の活性は3.10 x 105 IU/mlであることが分かった。またロゼット法を用いてリンパ液の上清液のサイモシン活性を測定した。その結果、24〜110時間発現後の試料のロゼット形成率は、全てのケースで10％を超えることが分かった（図６参照）。このことは全てのケースで有意のサイモシン活性が存在することを示す。
【００２７】
本発明の別の態様では、外来性のIFN-THY融合遺伝子を含有するカイコを提供する。このカイコの一部又は全部の細胞は外来性IFN-THY融合遺伝子を含有する。
【００２８】
本発明の別の態様では、更に医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの医薬上容認される担体、希釈剤又は賦形剤と共に、有効量の本発明の新規なIFN-THY融合蛋白質を含有する。上記組成物を調製する場合、通常、活性成分を賦形剤と混合し、または賦形剤により希釈し、あるいはそれをゼラチンカプセル内に、又は医薬カプセル形状で存在する担体内に封入する。賦形剤が希釈機能を果たす場合、それは、賦形剤、担体又は活性成分の溶媒として固形、半固形または液形の物質であってよい。従って医薬組成物は錠剤、丸剤、顆粒剤、溶液、リンクタス剤、又は無菌注射溶液の剤形であってよい。適当な賦形剤の例は、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルボース、マンニトール、スターチ、微晶質セルロース、ポリエチレンピロリドン、セルロース、水などである。また製剤は、湿潤剤、乳化剤、保存剤（例えばメチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート）および甘味剤などを含有してもよい。
【００２９】
単成分又は多成分製剤として組成物を作製することができる。あらゆる形状の製剤は、期待する治療効果を生じるために計算され、予め決められた量の活性物質、および適当な医薬用賦形剤を含有する。
【００３０】
この医薬組成物を、治療を要する疾患に応じて、かつ（体重およびその他の関連要因に応じて）患者に有益な用量で用いることができ、医療従事者はこの用量を決定することができる。更に本発明の医薬組成物を、他の治療薬剤と組み合わせて用いることもできる。
【００３１】
上記のことを要約すると、本発明の利点は以下の通りである。
（１）IFNとTHYとの融合蛋白質を遺伝子工学的手法により製造することにより、化学的架橋法の欠点、例えば操作の煩雑性、架橋率の低さ、産物の不均一性、蛋白質の容易な不活性化、および比較的に高い費用を避けることができる；
（２）単一ベクターにおいてIFNおよびTHYを同時に生産することにより、労力の倍化を避けることができる；
（３）カイコにより発現させた蛋白質薬剤は、経口で直接摂取することができ、従って蛋白質の分離および精製操作にかかる高い費用を避けることができ、更に患者における注射の痛みおよび感染の恐怖を取り去ることができる；
（４）カイコの幼虫は餌として桑の葉のみを必要とし、その費用は非常に低い。
【００３２】
カイコの幼虫により発現させたIFN-THY融合蛋白質は、IFNの生物活性と、更にまたTHYの生物活性とを有するので、ウイルス感染などの疾患を治療するための、そして生物体の免疫を増強するための新規な薬剤となる。
【００３３】
以下に、実施例と組み合わせて、本発明を更に説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。下記実施例において実験方法の詳細な条件が明記されていない場合、それらは通常は慣用的な条件、例えばSambrook et al, Molecular Cloning: Laboratory Handbook (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載の条件、あるいは製造業者が推奨する条件に従う。
【実施例１】
【００３４】
IFN-THY融合遺伝子の合成および大腸菌発現プラスミドの構築
IFN-THY融合蛋白質が正確な立体構造を有するために、接続ペプチドとしてGGGGSを用いてIFNとTHYとを結合した。IFN遺伝子配列および上記接続ペプチドのヌクレオチド配列に従って、一対のプライマーIFNPRI1およびIFNPRI2を設計および合成した。これらのヌクレオチド配列は各々以下の通りである。
IFNPRI1: 5' GCCATATGTG CGATCTGCCT CAAACC 3'（配列番号３）
IFNPRI2: 5' ATGGATCCAC CACCGCCTTC CTTACTTCTT AAACTTTC 3'（配列番号４）
ここでIFNPRI1はIFN成熟蛋白質のＮ末端コード配列であり、IFNPRI2はIFNのＣ末端および接続ペプチドのコード配列の相補的配列である。
【００３５】
IFNPRI1およびIFNPRI2をプライマーとして、IFN遺伝子を含有するpSK-IFNプラスミドを鋳型として、接続ペプチドのヌクレオチド配列を有するIFN遺伝子配列をPCRにより増幅した。これによりNdeIおよびBamHI酵素の切断部位を各々5'末端および3'末端に導入した。このPCRの条件として、94℃で１分、50℃で１分、72℃で１分のサイクルを合計35回行い、最初のサイクルでは94℃で５分間変性を行い、そして最後のサイクルでは72℃で10分間伸長を行った。その結果約500 bpの増幅産物が得られた（図１）。
【００３６】
このPCR産物を低融点アガロースにより精製した後、それをpSK(+)のEcoRV部位に挿入して、プラスミドpSK-IFNLを作製した。配列を解読して、IFN遺伝子および接続ペプチドのヌクレオチド配列が完全かつ正確であることを確認した。
【００３７】
NdeIおよびBamHI酵素による二重切断を行って、pSK-IFNLプラスミド上のIFN遺伝子および接続ペプチドのヌクレオチド配列を単離した。そしてそれらを、予めNdeIおよびBamHI酵素による二重切断を行ったpET-28a(+)に連結して、プラスミドpET-IFNLを作製した。
【００３８】
THYアミノ酸配列に従って、かつ真核生物に相性の良いコードに従って、THY1断片およびTHY2断片を設計および合成した。それらのヌクレオチド配列は各々以下の通りである。
THY1: 5' GGCGGATCCG GCTCTGACGC TGCTGTGGAC ACCTCTTCTG AAATCACCAC CAAGGACCTG AAGGAAAAGA AGG 3'（配列番号５）
THY2: 5' CCAAGGACCT GAAGGAAAAG AAGGAAGTGG TGGAAGAAGC TGAAAACGGC TGAAGCTT 3'（配列番号６）
ここでTHY1は、THYのＮ末端コード配列であり、BamHI酵素の切断部位を導入した。THY2は、THYのＣ末端コード配列の相補的配列であり、XhoI酵素の切断部位を導入した。
【００３９】
THY1断片とTHY2断片を１：１で混合し、dNTPおよびクレノウ酵素を添加して平滑化を行い、そしてそれらをpSK(+)のEcoRV部位に挿入して、プラスミドpSK-THYを作製した。配列を解読して、合成されたTHY遺伝子の配列が正確であることを確認した。
【００４０】
BamHIおよびXhoI酵素による二重切断を行って、pSK-THYプラスミド上のTHY遺伝子を単離した。そしてそれを、予めBamHIおよびXhoI酵素による二重切断を行ったpET-IFNLプラスミドに連結して、IFN-THY融合遺伝子を含有する大腸菌発現用プラスミドpET-IT（図２）を作製した。このプラスミドは、IFN遺伝子、接続ペプチドのコード配列GGGGS、およびTHY遺伝子を、順に5'から3'の方向に含有した。
【００４１】
このIFN-THY融合遺伝子のDNA配列は、配列番号１に示した通りであった。そのコード領域は位置１〜594であった。コードされるIFN-THY融合蛋白質のアミノ酸配列は配列番号２に示した通りであった。これは合計198アミノ酸を有し、その分子量は22 kDaであった。
【実施例２】
【００４２】
IFN-THY融合遺伝子を含有する、昆虫バキュロウイルスのトランスファープラスミドpBacPAK-ITの構築
最初にNdeI酵素を用いて、IFN-THY融合遺伝子を含有する大腸菌発現用プラスミドpET-ITの切断を行い、次にクレノウ酵素により平滑化を行い、そしてXhoI酵素により切断を行った。低融点アガロースを用いてIFNとTHYとの融合遺伝子断片を単離し、次にこれを、予めBamHI酵素により切断を行い、クレノウ酵素により平滑化を行い、そしてXhoI酵素により切断を行ったpBacPAK8に連結することにより、IFN-THY融合遺伝子を含有する昆虫バキュロウイルスのトランスファープラスミドpBacPAK-IT（図３）を作製した。このプラスミドは、IFN遺伝子、接続ペプチドのコード配列GGGGS、およびTHY遺伝子を、順に5'から3'の方向に含有した。
【実施例３】
【００４３】
IFN-THY融合遺伝子を含有する組み換え昆虫バキュロウイルスの獲得
IFN-THY融合遺伝子を含有する昆虫バキュロウイルスのトランスファープラスミドpBacPAK-IT（５μl）、およびBsu36I酵素切断により線状化した改変ウイルスBmBacPAK6（６μl）を取り出し、血清フリーのTC-100培地100 μlを加え、均一になるまで混合した。血清フリーのTC-100培地100 μlをリポフェクチン６μlに加え、均一になるまで混合した。次にこれらの２つの混合液を均一になるまで混合し、室温で15分間静置した。次に血清フリーのTC-100培地800 μlを加え、均一になるまで混合した。予め35mm培養皿で培養したBm N細胞を、血清フリーのTC-100培地により２回洗浄し、上記のトランスファープラスミドとリポフェクチンとの混合液を一滴ずつ加え、そして27℃で４〜５日間培養を行った。
【００４４】
その上清液を取り出し、１回目の円形ファージプラークのスクリーニングを行った。上清液５μlを取り出し、これを35mm培養皿上でBm N細胞に接種した。１時間後、その上清液を捨て、等量のTC-100培地と低融点アガロースとの混合液を加えた。４〜５時間後、プラークを取り出し、そしてBm N細胞に３〜４日間接種し、その上清液を保存した。その細胞をNaOHにより溶解し、それを用いてサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。その陽性クローンの上清液を用いて２回目の円形ファージプラークスクリーニングを行った（図４参照、矢尻により示したプラーク）。その陽性クローンの上清液を接種したBm N細胞を増殖させることにより、IFN-THY融合遺伝子を含有する組み換えバキュロウイルスを大量に得ることができた。
【００４５】
この組み換えバキュロウイルスを、組み換えカイコ核多角体病ウイルス(Bobyx Mori Nuclear polyhedrosis virus) BacITと命名し、中国微生物菌株保存管理委員会の総合微生物センター（CGMCC、中国、北京）に2000年11月６日に保存番号CGMCC No. 0504として保存した。
【実施例４】
【００４６】
５日齢のカイコ幼虫におけるIFN-THY融合遺伝子の発現
実施例３において増幅により獲得した、IFN-THY融合遺伝子を含有する組み換えバキュロウイルスを採取し、各幼虫あたり約10 μlを５日齢のカイコ幼虫に注射した。発現させたカイコのリンパ液を24, 48, 72, 96および110時間で採取し、5000 rpmで５分間遠心した後、その上清液を回収した。それを、pH 7.4のPBSにより10倍に希釈し、そして等量の２Ｘ蛋白質サンプリング緩衝液を加えた。それから20 μlを回収し、SDS-PAGE分析にかけた。その結果、24時間でIFN-THY融合蛋白質の発現が始まること（図５参照）、およびIFN-THY融合蛋白質の分子量が約22 kDaであることが分かった。
【実施例５】
【００４７】
IFN-THY融合蛋白質のIFN活性の測定
L929細胞（マウス線維芽細胞株）の病理変化の抑制による方法を用いてIFN活性を測定した。測定するカイコリンパ液の上清液を、96ウエルトレー（50 μl／ウエル、３回反復）上で種々の程度に希釈した。次にL929細胞懸濁液50 μl（4 x 104細胞）を各ウエルに加え、そして細胞コントロールおよびウイルスコントロールを設けた。37℃で24時間培養を行い、その時点でウエル上の液体を捨て、そして水疱性口内炎ウイルス(VSV)懸濁液100 μlを各ウエルに加えた（250 TCID50/ml, TCID：組織培養感染量）。培地100 μlを細胞コントロールウエルに加え、そして36時間培養を行った。ウイルスコントロール群ウエルにおいてほぼ全てのL929細胞が病理変化を有した時に、培養を停止した。ウエル上の液体を捨て、0.5%クリスタルバイオレット溶液200 μl（クリスタルバイオレット0.5 g, NaCl 0.85 gを無水エタノール50 ml、メタノール３mlおよび蒸留水47 ml中に溶解した）を各ウエルに加え、そのまま37℃で15分間放置した。残留色素を水道水により洗浄し、そして脱色液200 μl（エチレングリコールモノホルムアルデヒド50 mlと蒸留水50 mlとの混合液）を各ウエルに加えた。撹拌器上で撹拌し、そして色素が完全に細胞から排除されてから、波長540 nmで分光光度計により色比較を行った。
【００４８】
下記の式を用いてIFNの力価を計算した。
【数１】
2004537286.tif 000003
その結果、96時間発現サンプルのIFN活性は3.72 x 104 IU/mlであり、そして110時間発現サンプルのIFN活性は3.10 x 105 IU/mlであることが分かった。
【実施例６】
【００４９】
IFN-THY融合蛋白質のTHY活性の測定
THY活性をロゼット法により測定した。サイモシンはＴリンパ系に作用して、生物体の免疫機能を調整および強化することができる。新鮮なブタ胸腺に由来する脱Ｅ胸腺細胞は、サイモシンによる活性化を介して、ヒツジ赤血球とのロゼットを形成させた。カイコ幼虫による発現後、IFN-THY融合蛋白質を含有するリンパ液と反応した胸腺細胞を、油浸顕微鏡下に計数した。視野の中心において薄青色でかつ比較的大きな細胞をリンパ球（即ち胸腺細胞）と見なし、毎回100個、合計200個の胸腺細胞を計数した。その中からE-ロゼットを形成した細胞数を計数し（胸腺細胞は４個を超えるヒツジ赤血球と結合する）、そしてその平均値、即ちサンプルまたはコントロールにおける検出数を算出した。
【００５０】
以下の式に従ってTHY活性を計算した。
【数２】
2004537286.tif 000004
【００５１】
測定結果を表１に示す。
表１：IFN-THY融合蛋白質のTHY活性
2004537286.tif 000005
上記の結果から、48〜110時間発現したサンプルは全て有意なTHY活性を有したことが分かる。これらの活性の棒グラフとして図６を参照されたい。
【００５２】
本発明において言及した全ての文献を、そのまま本明細書に引用する。本発明の上記説明から、当業者は、様々な本発明の変更または修正を行うことができ、そのような相同形態も添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】IFN遺伝子のPCR増幅産物の電気泳動像である。
【図２】IFN-THY融合遺伝子を含有する大腸菌発現用pET-ITを示す。
【図３】昆虫バキュロウイルスのトランスファープラスミドpBacPAK-ITを示す。
【図４】２回目の円形ファージプラークスクリーニングにおけるサザンブロットハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図５】カイコにより発現させた産物のSDS-PAGE分析像である。図中、電気泳動レーン１〜６は、組み換えウイルスによる感染後の種々の時間における試料であり、電気泳動レーン７は分子量の基準物質である。
【図６】カイコにより発現させた産物のTHY活性の棒グラフである。図中、コントロールは、生理食塩水およびBmPAKを感染させたカイコのリンパ液である。
【図７】本発明のINFα2b/THY融合蛋白質のアミノ酸配列およびこれをコードするDNA配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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