(57)【要約】遺伝子の遺伝子型およびハプロタイプを決定するための方法が説明される。また、ＡｐｏＥ遺伝子における一塩基多型およびハプロタイプ、ならびにその情報を使用する方法についても説明される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；
ｂ）第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率が少なくとも約１．５：１にまで増加するように、ＤＮＡの増幅を必要としない方法によって、選択された遺伝子の第一対立遺伝子を濃縮する段階；
ｃ）第一対立遺伝子における２つまたはそれ以上の多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項２】
選択された遺伝子における２つまたはそれ以上の多型部位を同定するために、段階（ａ）において提供されたＤＮＡの遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）において提供されたＤＮＡの遺伝子型を、段階（ｃ）において決定された第一対立遺伝子における２つまたはそれ以上の多型部位の遺伝子型と比較することにより、遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階をさらに含む方法であって、
それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
以下をさらに含む、請求項１記載の方法：
ｄ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡの第二の試料を提供する段階；
ｅ）第二対立遺伝子の第一対立遺伝子に対する比率が少なくとも約１．５：１にまで増加するように、ＤＮＡの増幅を必要としない方法によって、選択された遺伝子の第二対立遺伝子を濃縮する段階；および
ｆ）第二対立遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の２つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項５】
ＤＮＡ試料が、選択された遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位を含むＤＮＡ分子の増幅によって得られる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ試料がｃＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
濃縮段階以前に、試料中のＤＮＡを断片化する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡの断片化の段階が制限エンドヌクレアーゼ消化を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
第二対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項１１】
濃縮段階によって、第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率を少なくとも約２：１にまで増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
濃縮段階によって、第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率を少なくとも約５：１にまで増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
濃縮段階によって、第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率を少なくとも約１０：１にまで増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；
ｂ）２つまたはそれ以上の対立遺伝子のうち、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子には結合するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子には実質的に結合しないＤＮＡ結合分子に、ＤＮＡを接触させる段階；
ｃ）ＤＮＡ結合分子と第一対立遺伝子との間に複合体を形成する段階；
ｄ）複合体形成していないＤＮＡから、そのように形成された複合体の少なくとも１つの分画を、少なくとも部分的に精製する段階；
ｅ）第一対立遺伝子の第二多型部位における遺伝子型を解析し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項１５】
遺伝子における２つまたはそれ以上の多型部位を同定するために、段階（ａ）において提供されたＤＮＡ試料を遺伝子型決定する段階、および選択された遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位における遺伝子型を、第一対立遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプと比較する段階をさらに含む方法であって、
それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
以下をさらに含む、請求項１４記載の方法：
ｆ）被験者由来の第二のＤＮＡ試料を提供する段階；
ｇ）２つの対立遺伝子のうち、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第二対立遺伝子には結合するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子には実質的に結合しない第二ＤＮＡ結合分子とＤＮＡを接触させる段階；
ｈ）第二ＤＮＡ結合分子と第二対立遺伝子との間に複合体を形成する段階；
ｉ）複合体形成していないＤＮＡから、そのように形成された複合体の少なくとも１つの分画を、少なくとも部分的に精製する段階；
ｊ）第二対立遺伝子の第二多型部位における遺伝子型を解析し、それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項１７】
以下をさらに含む、請求項１４記載の方法：
ｆ）被験者由来の第二のＤＮＡ試料を提供する段階；
ｇ）２つの対立遺伝子のうち、第二多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第二対立遺伝子には結合するが、第二多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子には実質的に結合しない第二ＤＮＡ結合分子に、ＤＮＡを接触させる段階；
ｈ）第二ＤＮＡ結合分子と第二対立遺伝子との間に複合体を形成する段階；
ｉ）複合体形成していないＤＮＡから、そのように形成された複合体の少なくとも１つの分画を、少なくとも部分的に精製する段階；
ｊ）第二対立遺伝子の第一多型部位における遺伝子型を解析し、それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項１８】
第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
第二対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項１５から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ結合分子が二本鎖ＤＮＡに結合する、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
ＤＮＡ結合分子が単鎖ＤＮＡに結合する、請求項１４記載の方法。
【請求項２２】
ＤＮＡ結合分子がオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸である、請求項１４記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ結合分子がタンパク質である、請求項１４記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質がジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＤＮＡ結合分子が標識される、請求項１４記載の方法。
【請求項２６】
ＤＮＡ結合分子がビオチン化される、請求項１４記載の方法。
【請求項２７】
ＤＮＡ結合分子が直接的または間接的に固体支持体に結合される、請求項１４記載の方法。
【請求項２８】
タンパク質が転写因子である、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質が、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く不活性化制限エンドヌクレアーゼ、または二価陽イオンの非存在下において使用される制限エンドヌクレアーゼである、請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
段階（ｄ）が、ＤＮＡ結合分子に対する抗体に複合体を接触させる段階を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項３１】
抗体が固体支持体に結合される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
選択された遺伝子がＡｐｏＥである、請求項１４記載の方法。
【請求項３３】
接触段階以前に試料中のＤＮＡを断片化する段階をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項３４】
ＤＮＡを断片化する段階が制限エンドヌクレアーゼ消化を含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＤＮＡ結合分子が捕捉試薬と相互作用するリガンドを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
段階（ｄ）が、捕捉試薬と相互作用するリガンドを複合体に接着する段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
リガンドが、ポリヒスチジンタグ、抗体、ニッケル、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、磁気粒子、およびアプタマーからなる群より選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、ワトソン−クリック塩基対形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項２２記載の方法。
【請求項３９】
オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、Ｄループ形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項２２記載の方法。
【請求項４０】
オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、三本鎖ヘリックス形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項２２記載の方法。
【請求項４１】
オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、フーグステン型塩基対形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項２２記載の方法。
【請求項４２】
オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸が、逆フーグステン型塩基対形成によって第一対立遺伝子に結合する、請求項２２記載の方法。
【請求項４３】
ＤＮＡ結合分子が配列特異的なポリアミドである、請求項１４記載の方法。
【請求項４４】
以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；
ｂ）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子に結合し、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子には実質的に結合しない作用物質と、ＤＮＡを接触させる段階；
ｃ）第一対立遺伝子に作用物質を架橋結合し、架橋形成した複合体を含む混合物を形成する段階；
ｄ）架橋形成した複合体を含む混合物を、第一対立遺伝子の第一多型部位において、および、第一対立遺伝子の第二多型部位において、架橋形成した複合体を変性できないエキソヌクレアーゼに接触させる段階；および
ｅ）第一対立遺伝子の第二多型部位における遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項４５】
第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
作用物質がオリゴヌクレオチドである、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
オリゴヌクレオチドがホスホロチオネート群を含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
作用物質を架橋結合する段階が、二核白金（ＰｔＩＩ）、トランス白金（ＩＩ）、またはソラレンからなる群より選択される化合物に作用物質を接触させる段階を含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
作用物質がペプチド核酸、三本鎖ヘリックス、または配列特異的なポリアミドからなる群より選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
エキソヌクレアーゼが、Ｉ型ヘビ毒ホスホジエステラーゼまたはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項５１】
選択された遺伝子がＡｐｏＥである、請求項４４記載の方法。
【請求項５２】
以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；
ｂ）ＤＮＡを断片化し、選択された遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位を含むＤＮＡ断片を形成する段階；
ｃ）断片の末端を修飾し、エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性である修飾断片を形成する段階；
ｄ）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子を切断するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない第二対立遺伝子は切断しない制限エンドヌクレアーゼを用いて修飾断片を切断する段階；
ｅ）少なくとも１つの非修飾末端をもつＤＮＡを消化するエキソヌクレアーゼを用いて、段階（ｄ）の切断産物を消化し、第一対立遺伝子を実質的に除去する段階；および
ｆ）第二対立遺伝子に存在する第二多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項５３】
第二対立遺伝子における第三多型部位の遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
エキソヌクレアーゼが単鎖エキソヌクレアーゼである、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
エキソヌクレアーゼが二本鎖エキソヌクレアーゼである、請求項５２記載の方法。
【請求項５６】
単鎖エキソヌクレアーゼが、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ、λファージエキソヌクレアーゼ、Ｔ７ エキソヌクレアーゼ、Ｔ４ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、および大腸菌ポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ活性からなる群より選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
二本鎖エキソヌクレアーゼがＢａｌ３１である、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
単鎖ヌクレアーゼを用いて残余単鎖ＤＮＡを除去する段階をさらに含む、請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階
ｂ）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子を切断するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない第二対立遺伝子は切断しない、天然または合成の制限エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡを切断する段階；
ｃ）増幅産物が第二対立遺伝子のみから生じる、エンドヌクレアーゼ制限試料に対して増幅法を実施する段階；
ｄ）第二対立遺伝子における第二多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項６０】
第二対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
サイズ選択法によって増幅産物を単離する段階をさらに含む、請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
遺伝子がＡｐｏＥである、請求項５９記載の方法。
【請求項６３】
制限エンドヌクレアーゼがＮｏｔＩである、請求項５９記載の方法。
【請求項６４】
以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；
ｂ）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子を切断するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない第二対立遺伝子は切断しない、天然または合成の制限エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡを切断する段階；
ｃ）サイズ選択法によって、第一対立遺伝子を第二対立遺伝子から少なくとも部分的に分離する段階；
ｄ）第一対立遺伝子における第二多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【請求項６５】
第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
以下の段階を含む、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法：
ａ）平らな表面上に、選択された遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位を含むＤＮＡ断片を固定化する段階；
ｂ）作用物質の選択的な結合をさせるような条件下にて、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ対立遺伝子に選択的に結合する作用物質と固定化ＤＮＡ断片を接触させる段階；
ｃ）第二作用物質の選択的な結合をさせるような条件下にて、第二多型部位において、選択された遺伝子型を有する対立遺伝子に選択的に結合する第二作用物質と、固定化ＤＮＡ断片とを接触させる段階；および
ｄ）少なくとも１つのＤＮＡ断片上の第一作用物質および第二作用物質の位置を光学マッピングする段階。
【請求項６７】
第一作用物質および第二作用物質のいずれかまたは両方が、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６８】
第一作用物質の選択的な結合がＤループの形成をもたらし、第二作用物質の選択的な結合がＤループの形成をもたらす、請求項６６記載の方法。
【請求項６９】
ＲｅｃＡタンパク質に固定化ＤＮＡ断片を接触させる段階をさらに含む、請求項６６記載の方法。
【請求項７０】
第一作用物質および第二作用物質がタンパク質である、請求項６６記載の方法。
【請求項７１】
タンパク質が、転写因子、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く不活性化制限エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質、および二価陽イオンの非存在下にて使用される制限エンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項６６記載の方法。
【請求項７２】
標的核酸配列における多型部位の遺伝子型を決定するための方法であり、以下の段階を含む方法：
ａ）標的核酸配列を含むＤＮＡ試料を提供する段階；
ｂ）標的核酸配列を増幅させ、増幅産物を生み出す段階であり、増幅により、多型部位に近接した切断部位をもつ第一制限酵素および第二制限酵素によって増幅産物が切断されるような配列の、増幅産物への挿入がもたらされる段階。
ｃ）増幅産物を切断する段階；および
ｄ）多型部位の遺伝子型を決定する段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年１０月２５日に出願された、米国特許出願第０９／６９７，０２８号；２０００年１０月２５日に出願された、米国特許出願第０９／６９６，９９８号；および２０００年１０月２５日に出願された、米国特許出願第０９／９６７，０１３号の一部継続出願である；および、図面を含むその全てが参照として本明細書に組み入れられる、「ＤＮＡの遺伝分析法（ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＴＩＣ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＤＮＡ）」と題された、２０００年５月２３日に出願されたスタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）らの米国特許仮出願第６０／２０６，６１３号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の背景
遺伝分析は、配列変異の一部位の分析の方法（即ち、遺伝子型決定法）、および配列変異の集合の分析の方法（ハプロタイプ決定法）を含む、被験者生物体における関心対象のある遺伝子のヌクレオチド配列の決定を指す。遺伝分析は、疾患リスク、診断、予後または薬物療法管理と配列変異を相関させる方法をさらに含む。
【０００３】
現在のところ、ＤＮＡ診断試験は、メンデル形質に関連する低頻度の多型の同定に大いに関係している。これらの試験は長年に渡って使用されてきた。将来的には、遺伝学的検査は、予測的、診断的、予後予測的および薬理遺伝学的評価を行う手段として、臨床および研究のためにはるかに広範に使用されるようになると考えられる。これらの新たな遺伝学的検査は、多くの場合において、遺伝子型と表現型の相関がメンデル表現型よりも著しく複雑な場合の多遺伝子状態に関与する。必要な正確性を有する遺伝学的検査を生み出すために、正確性を損ねることなく、低コストおよび高速で、複数のＤＮＡ配列変異を同時に追跡できる新しい方法が必要である。理想的な試験は、非常に高い正確性を提供し、かつ最も重要なことである高度な遺伝分析を可能にする一方で、設置および実行するための費用が比較的安価なものである。
【０００４】
遺伝子型
疾患リスク、予後、および診断と特定の遺伝子型との関連、および、疾患のための最適な治療の選択は、ヒトゲノムプロジェクトから発生することが期待される利点の一部である。現在、医学的に重要な表現型と遺伝子型の関連を試験するための、最も一般的なタイプの遺伝学的研究設計は、遺伝子の変異形態の頻度を、１つまたはそれ以上の表現型決定された症例群において評価し、対照における頻度と比較する（または、２つまたはそれ以上の遺伝子型決定された群における表現型頻度を比較する）、患者対照研究である。公表されたそのような遺伝的関連研究のうち多数では、単一多型部位（通常、一塩基多型、ＳＮＰと省略される）の、医学的に重要な表現型における変異に対する寄与について評価することに焦点を当ててきた。これらの研究においては、１つの多型が、１つの遺伝子における（または近接遺伝子クラスターにも及ぶ）全ての変異についての代理としての役割を果たす。
【０００５】
最近の論文（例えば、ＴｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒおよびＷｅｉｓｓ， 複合疾患の連鎖不平衡マッピング：幻想かまたは現実か？（ Ｌｉｎｋａｇｅ ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｉｓｅａｓｅ ： ｆａｎｔａｓｙ ｏｒ ｒｅａｌｉｔｙ？ ）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ５７８〜５９４， １９９８）により、単一多型部位を用いたほとんどの関連研究の、再現性の程度の低さに注意が向けられた。多くの関連研究における再現性の低さの理由の幾つかは明らかである。特に、ヒトＤＮＡ多型の程度−ほとんどの遺伝子は１０個またはそれ以上の多型部位を含み、多くの遺伝子は１００個を超える多型部位を含む−は、１つの遺伝子における全ての変異（典型的には少なくとも数千ヌクレオチドに渡り、１，０００，０００ヌクレオチドにも渡り得る）については、単一多型部位では非常にまれにしか確実な代理としての役割を果たし得ないようなものである。１つの多型部位が著しい生物学的変異の原因となる場合においてでさえ、そのような部位を同定するための確実な方法がない。最近の幾つかの研究では、ヒト分子遺伝的変異の程度を概説することを始めた。例えば、ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子の遺伝的変異の包括的な調査（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｄ．Ａ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９： ２３３〜２４０， １９９８；Ｃｌａｒｋ， Ａ．Ｇ．ら， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６３： ５９５〜６１２，　１９９８）では、７１例のヒト被験者を比較し、９．７ ｋｂ領域において８８個の変異部位を見出した。平均的に、遺伝子の任意の２つの型は１７部位において異なっていた。この研究および他の研究によって、５０〜１００例の非関連被験者を比較した場合、およそ１００ヌクレオチドについて１つの配列変異が存在する可能性が示される。このデータの意味するところは、広範な医学的使用の根拠をなすのに十分な特異性および選択性をもつ遺伝学的診断試験を生み出すために、ヒトの遺伝的変異を評価するための、より高度な方法が必要とされるということである。
【０００６】
単一の多型部位の状態を評価する試験を越えて、遺伝学的検査の次なる洗練レベルにおいては、（例えば、重回帰分析法を使用して）２つまたはそれ以上の多型部位を遺伝子型決定し、遺伝子型と表現型の間の関連を評価する際に、各多型部位における遺伝子型を考慮に入れる。しかし、このアプローチは、多型間の可能な相互作用を考慮することにより単一多型法を改善する一方、多型部位の数が増加するにつれその能力が制限される。その理由は、多型部位数が増加するにつれ、比較すべき遺伝的サブグループの数が急増するためである。これによって、固定サイズの医学的研究においては、各サブグループのサイズが少数に減じる一方、比較すべき群数が著しく増加するという影響が現れる。これらの影響の結果、統計的検出力の許容できない低下が生じる。例えば、１０個の可変部位を含む遺伝子の臨床試験を考える。各部位が二対立遺伝子性である場合、２１０個または１０２４個の多型部位の可能な組み合わせがある。研究集団が５００被験者である場合、多くの遺伝学的に定義されたサブグループが少数の被験者しか含まない可能性が高い。したがって、（例えばＤＮＡ配列データから決定できるように）複数の多型を考慮に入れることは、統計解析に非常に有用であるように、二倍体の被験者由来のＤＮＡ配列が、その被験者の２つの染色体の配列を十分に制限しないという問題点を克服するものではない。各染色体上のＤＮＡ配列（ハプロタイプ）の直接決定のみが、多型の全てについて、または好ましくは少なくとも実質的なサブセットについて説明し、各被験者における遺伝的変数の数を２（対立遺伝子１および対立遺伝子２）にまで制限することができる。
【０００７】
ハプロタイプ
ＤＮＡセグメントにおける変異の、遺伝子型よりもはるかに強力な評価基準はハプロタイプであり、即ち、単一の染色体上に認められる多型のセットである。
【０００８】
哺乳動物においては、多くの他の生物におけるように、あらゆる細胞において各遺伝子の２つのコピー（対立遺伝子）が存在する（性染色体−男性におけるＸおよびＹ−に位置する幾つかの遺伝子を例外とする）。１つの対立遺伝子は各親から遺伝する。一般に、いかなる生物における２つの対立遺伝子も、配列においては実質的に同様であり、発生が１００ヌクレオチド毎よりも低い、およびある場合においては、１０００ヌクレオチド毎よりも低い多型部位を有する。非変異ヌクレオチド位置の配列の決定は、ハプロタイプ決定とは関連しない。ゆえに、ハプロタイプ決定では、２つの各対立遺伝子上の多型部位における多型（例えばヌクレオチド配列）を決定することになる。２つの部位においてヘテロ接合である被験者について、多型部位＃１がＡまたはＣである場合、および多型部位＃２がＧまたはＴである場合、対立遺伝子がＡ−ＧおよびＣ−Ｔであるかどうか、またはそれらがＡ−ＴおよびＣ−Ｇであるかどうかを知ることが望まれる。ＤＮＡが二倍体の生物から抽出される場合、２つの対立遺伝子は同じ試験管内において１：１の比率で共に混合される。したがって、多型部位の状態を一度に照会する、ＤＮＡ配列決定または標準遺伝子型決定法のような、総ゲノムＤＮＡについて実施されるＤＮＡ解析法では、２つまたはそれ以上の部位においてヘテロ接合であるＤＮＡ試料からハプロタイプを決定するのに必要な情報が提供されない。
【０００９】
ヒト集団の進化の歴史のため、全ての可能なハプロタイプの（１つの遺伝子座における多型部位の１セットを仮定する）ほんの一部のみが実際にかなりの頻度で生じる。例えば、１０個の多型部位を有するある遺伝子においては、１，０２４個の可能な遺伝子型のうち、ほんの一部のみ（多分、１％の範囲のもの）が、ヒト集団においては５％より大きな頻度で存在する可能性が高い。さらに、下記に説明されるように、ハプロタイプは、遺伝分析を容易にするため、関連配列群においてクラスタリングすることができる。ゆえにハプロタイプの決定は、特に多くの多型部位によって特徴付けられるＤＮＡセグメントに適用される場合、遺伝的関連研究の実施を（複数の多型の解析と比較して）容易にする段階である。また、１つの多型部位における遺伝子型よりも、ハプロタイプによって遺伝子を選別することには、可能性のある生物学的な理論的根拠が存在する：同じ染色体上の多型部位は、遺伝子の機能を決定する特定の様式で相互作用し得る。例えば、ある遺伝子における多型の２つの部位であり、その双方がアミノ酸の変化をコードするものを考える。２つの多型残基は三次元空間において（即ち、コードされるタンパク質の折りたたみ構造において）近接に位置し得る。２つの部位の各々においてコードされる多型アミノ酸の１つが大側鎖を有し、もう１つのアミノ酸が小側鎖を有する場合、［大−小］、［小−大］または［小−小］の多型残基のペアーのいずれかをもつタンパク質は完全に機能的であるが、２つの部位において［大−大］残基をもつタンパク質は、２つの大側基の相互作用により引き起こされる、混乱させるような形状変化によって損なわれるという状況を想像できる。ここで、その遺伝子型が双方の多型部位においてヘテロ接合の大／小である被験者について考える。そのような被験者における可能なハプロタイプペアーは、［大−小］／［小−大］、または［小−小］／［大−大］である。これら２つのハプロタイプペアーの機能的な意味は全く異なる：各々、活性／活性または活性／不活性である。遺伝子型試験は、被験者が複異型ヘテロ接合であることを簡単に明らかにする。ハプロタイプ試験のみが、変異の生物学的に重大な構造を明らかにする。当然のことながら、多型部位の相互作用はアミノ酸の変化に関与する必要はないが、事実上多型部位の任意の組合せに関与する可能性もある。
【００１０】
複合形質の遺伝分析は、例えば、最大節約法に基づきハプロタイプを関連群にクラスタリングする体系の使用によって、なおもより強力なものとすることが可能である。テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）および共同研究者らは、系統分岐図により、ハプロタイプデータを解析できることを示した（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、「制限酵素地図作製から推論される、ハプロタイプと表現型の関連の系統分岐解析。Ｉ．基礎理論およびショウジョウバエにおけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性の解析 （Ａ Ｃｌａｄｉｓｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ Ｉｎｆｅｒｒｅｄ Ｆｒｏｍ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｍａｐｐｉｎｇ． Ｉ． Ｂａｓｉｃ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．） 」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１７： ３４３〜３５１， １９８７；Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、「制限酵素地図作製およびＤＮＡ配列データから推論される、ハプロタイプと表現型の関連の系統分岐解析。ＩＩＩ．系統分岐図評価 （Ａ Ｃｌａｄｉｓｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ Ｉｎｆｅｒｒｅｄ Ｆｒｏｍ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ． ＩＩＩ． Ｃｌａｄｏｇｒａｍ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ．） 」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３２： ６１９〜６３３， １９９２；ＴｅｍｐｌｅｔｏｎおよびＳｉｎｇ， 「制限酵素地図作製から推論される、ハプロタイプと表現型の関連の系統分岐解析。ＩＶ．系統分岐図の不確かさに関するネスティド解析および組み換え。 （Ａ Ｃｌａｄｉｓｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ Ｗｉｔｈ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｉｎｆｅｒｒｅｄ Ｆｒｏｍ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｍａｐｐｉｎｇ． ＩＶ． Ｎｅｓｔｅｄ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｗｉｔｈ Ｃｌａｄｏｇｒａｍ Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．） 」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３４： ６５９〜６６９， １９９３；Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、「ヒトリポタンパク質リパーゼ遺伝子内の組み換えおよび突然変異のホットスポット（ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ａｎｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｔｓｐｏｔｓ Ｗｉｔｈｉｎ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ Ｇｅｎｅ．） 」、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． ６６： ６９〜８３， ２０００）。これらの解析では、推定されるそれらの進化の関連性に基づき、ハプロタイプを階層群にクラスタリングするための一連の法則を説明する。この系統樹は、ＰＨＹＬＩＰまたはＰＡＵＰ（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ， Ｊ．「分子配列からの系統関係：推論および信頼性（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ．） 」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． ２２： ５２１〜６５， １９８８；Ｒｅｔｉｅｆ， Ｊ．Ｄ．「ＰＨＹＬＩＰを用いた系統解析 （Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ＰＨＹＬＩＰ．） 」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １３２： ２４３〜５８， ２０００）のような、系統解析のための標準ソフトウェアパッケージを用いて構築でき、階層的ハプロタイプクラスタリングは、テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）および共同研究者らによって説明される法則を用いて達成できる。テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）および共同研究者らによって説明された方法は、各クラスタリングレベルにおける異なるハプロタイプ群間の変異のネスティド解析をさらに提供する。この解析の結果によって、表現型変異の原因となる多型部位の同定を導き得る、または最低でも、表現型にとって重要な可能性のある部位を絞り得る。したがって、ハプロタイプを決定する方法は、遺伝的変異と、疾患リスクおよび予後および治療に対する反応のような、医学的な関心対象の表現型における変異との間の関連を試験するために設計された研究において著しく有用である。
【００１１】
実験的なハプロタイプの決定のために現在利用可能な方法、特に長い距離に及ぶ（例えば、５ ｋｂを超える）ハプロタイプを決定する方法は、主にＰＣＲ増幅技術に基づいている。現在使用されている１つのハプロタイプ決定法は、多型部位において終結するオリゴヌクレオチドプライマーを用いた対立遺伝子特異的な増幅に基づいている（Ｎｅｗｔｏｎら、「嚢胞性線維症における、出生前診断および保因者評価のための増幅拒否性突然変異系 （Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｆｏｒ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ａｎｄ Ｃａｒｒｉｅｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｉｎ Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ．）」、Ｌａｎｃｅｔ． Ｄｅｃ ２３−３０； ２（８６７８〜８６７９）： １４８１〜３． １９８９；Ｎｅｗｔｏｎら、「ＤＮＡにおける任意の点突然変異の解析。増幅拒否性突然変異系（ＡＲＭＳ） （Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ａｎｙ Ｐｏｉｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｉｎ ＤＮＡ． Ｔｈｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ））」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． 第１７巻， ２５０３〜２５１６， １９８９）。ＡＲＭＳ系は引き続きさらに開発され（Ｌｏ， Ｙ．Ｍ．ら、「二重ＡＲＭＳ による直接ハプロタイプ決定：特異性、感受性および遺伝学的適用 （Ｄｉｒｅｃｔ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ＡＲＭＳ： ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．） 」、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊｕｌｙ １１： １９（１３）：３５６１〜７， １９９１）、以来、多くの他の研究において使用されてきた。ＡＲＭＳは米国特許第５，５９５，８９０号および同第５，８５３，９８９号の主題である。本方法は、長いＤＮＡセグメントの増幅を必要とする。加えて、対立遺伝子特異的な増幅のための異なるプライマーおよびアッセイ条件を、ハプロタイプ決定される各多型部位について確立しなければならない。例えば、５つの多型部位をもつ遺伝子座を考える。被験者Ａは部位１、２および４においてヘテロ接合である；被験者Ｂは部位２および３においてヘテロ接合であり、被験者Ｃは部位３および５においてヘテロ接合である。Ａをハプロタイプ決定するためには、部位１または４からの対立遺伝子特異的な増幅条件が必要である；Ｂをハプロタイプ決定するためには、部位２または３からの対立遺伝子特異的な増幅条件が必要である；およびＣをハプロタイプ決定するためには、部位３または５からの対立遺伝子特異的な増幅条件が必要である（Ｂをハプロタイプ決定するために使用されたものの反対側の鎖上の部位３からの対立遺伝子特異的なプライマーを用いる）。
【００１２】
対立遺伝子特異的な増幅を達成するための同様の方法は、幾つかの熱安定性ポリメラーゼのプルーフリーディング能を利用し、プライマーの３’末端におけるミスマッチを取り除く。プライマーは、３’末端の塩基が鋳型における変異塩基の反対に位置するように設計される。この場合、プライマーの３’塩基は、ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ポリメラーゼ活性により伸長されることを防ぐような仕方で修飾される。末端をブロックしたプライマーの相補的な鋳型配列へのハイブリダイゼーション後、試料にどの対立遺伝子が存在するかによって、３’塩基はマッチまたはミスマッチのいずれかとなる。プライマーの３’塩基が適切に塩基対を形成する場合、ポリメラーゼはそれをプライマーから取り除かず、したがって、ブロックされた３’末端は完全のままであり、プライマーは伸長できない。しかし、プライマーの３’末端と鋳型の間にミスマッチがある場合、ポリメラーゼの３’−５’プルーフリーディング活性により、ブロックされた塩基が除かれ、その後プライマーは伸長でき、増幅が起こる。
【００１３】
他の対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅法には、３’末端プライマーが１つの対立遺伝子とマッチを形成し、もう１つの対立遺伝子とミスマッチを形成するさらなる方法（米国特許第５，６３９，６１１号）、イントロン配列のＰＣＲ増幅および解析（米国特許第５，６１２，１７９号および同第５，７８９，５６８号）、またはＤＮＡの染色体領域における多型マーカーの増幅および同定（米国特許第５，８５１，７６２号）が含まれる。さらに、突然変異を検出するための対立遺伝子特異的な逆転写およびＰＣＲ増幅の方法（米国特許第５，８０４，３８３号）、および突然変異または多型を検出するためのプライマー特異的およびミスペアー伸長アッセイ法（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＡ９９／００７３３号）が説明されている。これらの方法の幾つかは、遺伝子型決定を行うものであり、ハプロタイプ決定を行うものではない。
【００１４】
説明されている他のハプロタイプ決定法は、単一の精子細胞の解析（Ｈｕｂｅｒｔら、「精子タイプ決定により、ヒト第３染色体の短腕上のＤ３Ｓ２とＤ３Ｓ３の間の組み換え割合の正確な評価がなされる （Ｓｐｅｒｍ Ｔｙｐｉｎｇ Ａｌｌｏｗｓ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｄ３Ｓ２ Ａｎｄ Ｄ３Ｓ３ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｓｈｏｒｔ Ａｒｍ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ３．） 」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． １９９２ Ａｐｒ； １２（４）：６８３〜６８７）；平均的に、各試験管に１つの鋳型分子のみが存在するようになるまでＤＮＡ試料の希釈を制限すること（Ｒｕａｎｏら、「単一のＤＮＡ分子の酵素的増幅により分析された、複数の多型のハプロタイプ（ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ Ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｂｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．） 」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９０ ８７（１６）：６２９６〜６３００）；または、様々なベクターおよび宿主微生物へのＤＮＡのクローニング（米国特許第５，９７２，６１４号）に基づく。
【００１５】
ヒトを含むほとんどの種における遺伝的変異のパターンはランダムではない；ヒトの進化の歴史の結果として、多型のあるセットが染色体上で共に生じる。そのため、１つの多型部位の配列を知ることにより、同じ染色体上にある、一定の他の部位の配列をある確率をもって予測できる。一旦多型部位のセット間の関連が解明されれば、ハプロタイプ決定試験の開発において全ての多型部位のサブセットが使用できる。ハプロタイプを含む多型は任意のタイプのものが可能である。ほとんどの多型（全てのＤＮＡ多型の約９０％）は、あるヌクレオチドの他のヌクレオチドへの置換に関与し、一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれる。その他のタイプの多型は、１つから数千のヌクレオチドのどこかにおける挿入または欠失の結果として生じる、ＤＮＡセグメントの長さにおける変化に関わる。挿入／欠失多型（インデルとも呼ばれる）は、ほとんどの非ＳＮＰ多型の原因となる。共通の種類のインデルは、ホモポリマー配列長における変異（例えば、ＡＡＡＡＡＡ対ＡＡＡＡＡ）、ＣＡのような、短縦列反復配列数における変異（例えば、ＣＡの１３反復対１５反復）、およびより複雑な反復配列の数における変異（縦列反復の可変数については、ときどきＶＮＴＲ多型と呼ばれる）、および、一定のＤＮＡセグメント長における任意の他のタイプの個体間変異を含む。配列においては、反復単位もまた変化し得る。
【００１６】
ＡｐｏＥ
アポリポタンパク質は、様々なクラスのリポタンパク質−脳を含む身体中に脂質（主にコレステロールおよびトリグリセリド）を輸送する膜結合粒子の表面上に認められる。アポリポタンパク質の機能は、例えば脂肪を貯蔵する細胞のような、脂質を必要とする特定の細胞にリポタンパク質を指向させることである。アポリポタンパク質は、脂質要求細胞の表面上の特異的な受容体に結合し、それにより、脂質の標的細胞への輸送を司る。アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）は、血液リポタンパク質上のおよそ１ダースあるアポリポタンパク質の１つであるが、脳における主要なアポリポタンパク質である。脳におけるＡｐｏＥの１つの重要な機能は、急性または慢性の脳傷害に反応してしばしば生じる、膜合成を行う細胞への脂質の輸送である。損傷後、通常、傷害を受けた細胞にかつて連結されていた細胞から生き残ったニューロンが新たなインプットを受けるにつれ、広範囲に渡るシナプスのリモデリングが生じる。このニューロンのリモデリング、または可塑性は、疾患プロセスに対する生理学的反応の重要な部分であり、疾患過程を調節する。低いＡｐｏＥレベルまたは損なわれたＡｐｏＥ機能を有する患者は、ニューロンの可塑性を損なわれている。
【００１７】
ＡｐｏＥ遺伝子における変異は、アルツハイマー病（ＡＤ）および他の神経変性疾患のリスク、器質性または外傷性脳傷害からの回復または予防、およびＡＤの薬物療法に対する反応と関連していた。アルツハイマー病においては、傷害を受ける１つの脳領域は、前脳基底部のコリン作用性経路およびその他の部分である。そのような領域におけるニューロンのリモデリングの程度は、コリン様作用性治療に対する反応に影響を与え得る。したがって、損なわれた脳の脂質の輸送はコリン作用性（および他の）経路におけるニューロンのリモデリングのパターンを変化させ、それにより、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤および多分他のコリン作用性アゴニストに対する反応に潜在的に影響を与える。
【００１８】
ＡｐｏＥ遺伝子における変異はまた、冠動脈性心疾患、異常脂肪血症、および免疫調節機能と関連していた。特定のアポリポタンパク質Ｅ遺伝子型は、コレステロールおよびＬＤＬ−コレステロールの高レベルに関連しており、冠動脈イベントの予測因子として独立の役割を担う可能性があった。ＡｐｏＥ遺伝子型およびハプロタイプにより、発症のより早期の年齢において冠動脈疾患（ＣＡＤ）を発達させるリスクを有する個体、環境的な（感染、薬剤治療または食事に対する）曝露に引き続く脂肪血症の発達に対してより感受性の高い個体、加速化した速度で病変を発達させる個体、またはより重篤な疾患病理学の徴候もしくは症状を発達させる個体が同定され得る。心臓血管領域における臨床試験においては、ＣＡＤのリスクを有する患者を同定し、したがって食餌療法の介入、薬理学的または外科的介入についての候補を識別するために、ａｐｏＥ ハプロタイプ決定を使用できる。ＡｐｏＥ　ハプロタイプ決定により、より早期の冠動脈バイパス移植片（ＣＡＢＧ）介入についてのリスクを有する個体を同定できる。ＡｐｏＥは、ａｐｏＢ、ａｐｏＣ、ａｐｏＪなどの他のリポタンパク質を含む、ＣＡＤにおいて発達する病理学に著しく寄与する付加的な遺伝子と、およびＯＡＴＰ２、ＣＥＴＰ、ＬＰＬ、ＦＡＢＰ２、ＡＢＣ１、ＣＹＰ７およびＰＯＮのような脂質代謝に関わる他の遺伝子と、相乗的に相互作用し得る。ＣＡＤは、高血圧のような、根本的および慢性の状態から発達し得るため、例えばａｐｏＥとＰＡＩ−１、ＡＧＴおよびＡＴ１受容体のような、他の遺伝標識との組み合わせに従って、ａｐｏＥが診断または治療指針に寄与する遺伝子としての役割を果たすことが可能である。
【００１９】
ＡｐｏＥはまた、マクロファージにおけるコレステロールの蓄積およびそれらの泡沫細胞への移行、およびじゅく状硬化症の線状脂肪沈着の病理学の形成を調節する。免疫応答および炎症性サイトカインネットワークの調節におけるａｐｏＥの役割は、進行を遅らせる、または泡沫細胞の活性化によって生じた病理学的病変を逆転するための、治療的戦略が可能である。ＡｐｏＥ遺伝子型により、例えば内皮細胞またはグリア細胞サブタイプのような、特定の細胞に対する相互作用を識別できる。マクロファージの生物学および神経修復におけるａｐｏＥの重複した役割は、ａｐｏＥが、糖尿病性末梢神経障害または網膜症のような、末梢神経障害を発達させるリスクの増加についてのマーカーとなり得る事を示唆する。さらに、ａｐｏＥは、コレステロールレベルに依存しない、ＣＡＤについての独立した危険因子となり得る。ＡｐｏＥ遺伝子型はまた、末梢動脈性疾患（ＰＡＤ）とも関連し得る。この関連は、例えば異常脂肪血症にも関連し、血管の疾患の素因でもある糖尿病のような、共存症状態の存在によって拡大される。加えて、ａｐｏＥ遺伝子型は、脳のアミロイドアンギオパチーにおける大脳の病理学および脳血管性病変、多発性硬化症のような神経変性疾患、および外傷または虚血性の発作イベントにおける脳傷害に引き続くてんかんおよび修復潜在性の診断をさらに能率化できる。
【００２０】
ＡｐｏＥ の３つの主要な変異形態（ε２、ε３およびε４と呼ばれる）の存在が２０年来知られている。確立されたＡｐｏＥ の３つの変異体の分類は、そのいずれもが成熟タンパク質の１１２位および１５８位における、ＡＰＯＥタンパク質のシステイン対アルギニンのアミノ酸多型をもたらす、ＡｐｏＥ 遺伝子のコード配列における２つの多型に基づいている。１９８０年代以来、ＡｐｏＥ についてのＤＮＡに基づく診断試験が利用できる。
【００２１】
ＡｐｏＥ ε４対立遺伝子は一貫して、総コレステロールの上昇、ＬＤＬコレステロールの上昇、ＡｐｏＥタンパク質の低レベル、および冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）のリスクの増加と相関があった。その原因をε４とすることができるＣＨＤのリスクは、コレステロールレベルおよび他のＣＨＤ危険因子（喫煙、加齢、肥満症、糖尿病、血圧）を補正した後においてでさえも明らかである。したがって、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症または不規則な脂質代謝を導くいかなる障害が存在する、いかなる疾患カテゴリーについても、被験者のＡｐｏＥ遺伝子型を考慮することは筋が通っている。さらに、正常脂肪血集団における研究により、ａｐｏＥ変異体と冠動脈疾患についてのリスクの上昇との関連が示された。ε４対立遺伝子はまた、疾患の進行速度に対する影響のため、明らかに、発症の遅いアルツハイマー病および多発性硬化症（ＭＳ）の危険因子でもある。ＡｐｏＥ ε４対立遺伝子の存在はまた、様々な他の神経学的疾患（発作、脳外傷、筋萎縮性側索硬化症および他の疾患）および精神医学疾患（例えば精神分裂病）を有する患者について、ε４対立遺伝子をもたない患者と比較して予後不良となることを予示するものである。
【００２２】
疾患リスクおよび疾患の予後に対する影響に加え、ＡｐｏＥ遺伝子型によってＡＤ患者の薬物治療に対する反応が予測されるという報告がある。特に、ＡＤ患者のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤に対する反応が、幾つかのグループによって研究されている。ＡｐｏＥ遺伝子型はまた、他の医学的治療、特に神経学的疾患および心臓血管疾患についての治療に対する患者の反応を予測するために有用である。
【００２３】
ＡｐｏＥε４変異体は、多分それが脳においてε２またはε３変異体よりも低レベルで発現され、このようにニューロンのリモデリングを損なうため、アルツハイマー病についての主要なリスクである。ε２対立遺伝子はＡＤについては若干保護的である。アセチルコリンエステラーゼ阻害剤およびバソプレシン作用性アゴニストの両方を含む、アルツハイマー病の薬剤についての幾つかの臨床試験により、ＡｐｏＥ遺伝子型と性別との有意な相互作用が示された。ε４対立遺伝子はアセチルコリンエステラーゼに対する反応の欠如と関連していた。
【００２４】
ε４対立遺伝子によって与えられるＡＤの相対リスクは、異なる集団間でほとんど１０倍変化する。最も高い相対リスクは、ε３／ε３ホモ接合体と比較して、ε４／ε４ ホモ接合体において３０倍の相対リスクを有する日本人に、一貫して報告された。黒人およびラテンアメリカ系のε４／ε４ホモ接合体は、３〜４倍までの相対リスクを有するに過ぎない。これに対して、ε４対立遺伝子の存在下においては、９０歳までのＡＤの累積リスクは、３群（日本人、ラテンアメリカ系および黒人）全てにおいて同様である。これにより、非日本人集団においては、他の因子がＡＤの原因に著しく寄与することが示唆される。これらの非ε４ＡＤ患者は、アセチルコリンエステラーゼに対し最も反応性が高い可能性がある。もしそれが真実であれば、これによって、ＡｐｏＥε４仲介のＡＤを有する患者の比が世界で最も多いと考えられる日本人における、反応の欠損について説明できる。
【００２５】
様々な集団において、ＡｐｏＥ 遺伝子座における３つの一般的な変異体がＡＤのリスクと相関することはよく立証されている。最近の研究によって、ＡｐｏＥ遺伝子型がＡＤ患者の２つのクラスの薬剤への反応と相関することもまた示された。とりわけ、ポイリャー（Ｐｏｉｒｉｅｒ）らは、ＡＤ患者のａｐｏＥ遺伝子型、性別とコリン様作用性薬タクリンに対する反応との相互作用を示した。一方、リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄ）らは、ａｐｏＥ遺伝子型と、臨床試験中のノルアドレナリン作用性／バソプレシン作用性薬、Ｓ１２０２４に対する反応との間の相互作用を示した。双方の研究においては、解析は、３つの一般的なＡｐｏＥ変異体を決定する、２つのアミノ酸の変異の解析に限られた。他の変異については、ＡｐｏＥ 機能に尤らしく影響を与え得るプロモーターの変異を含む、ＡｐｏＥ 遺伝子座において説明された。また、他の遺伝子における多型を発症の遅いＡＤのリスクに関連付ける研究が公表された（しかし、しばしば確証されなかった）；これらの遺伝子座における変異の、コリン様作用性薬への反応に対する影響を研究したものはない。
【００２６】
アルツハイマー病の治療のためには２つのＦＤＡ承認薬（タクリン、ドネペジル）が存在し、少なくとも１ダースのさらなる薬剤が後期臨床試験の段階にある、またはＦＤＡの医薬品審査中である。ＦＤＡ承認薬は、アセチルコリンエステラーゼを阻害することにより作用し、それにより、脳のアセチルコリンレベルを増加させる。この対症療法は、治療を受けた患者の半分未満に適度の便益を提供するが、疾患の進行には影響を与えない。利用可能な証拠により、進行中の製品は、根本的な疾患のプロセスに影響を与えずに、さらに部分的に症状を逆転し、ある患者に対して同様に適度の便益をもたらすものであることが示唆されている。それらの限られた有効性にも関わらず、これらの薬剤は高額である可能性が高い。それらはまた、ある患者においては重大な副作用に関連し得る。その結果として、適度の便益を限られた数のＡＤ患者に提供するコストは増大する。
【００２７】
より多くのＡＤ治療薬が利用可能になるにつれ、医師は複数の製品を識別するという困難な仕事に向き合うことになる。これらの製品はある集団において同程度の反応率を生じ得るが、臨床医が向き合う重大な決定は、各個別のＡＤ患者のために適切な治療薬を診断時に選択することである。これは、幾つかの治療薬の選択肢があり、特定の患者についてその１つのみが最適となり得る場合には特にそうである。診断時に最適な治療を提供しないと、最大の利益を達成することが可能であった期間に機能レベルの低下を導いてしまう可能性があるため、この選択は決定的である。ＡＤにおける臨床反応の評価は、周知のことではあるが不正確であるため、不適当な治療がある期間続く可能性がある；薬剤が有意な程度にまで効いているかどうかが明らかになる前に、６ヶ月間またはそれ以上が過ぎてしまう可能性がある。この間、疾患は進行し続け、それにより第二の薬剤または薬物療法プログラムの効果が制限されてしまう可能性がある。したがって、１つまたはそれ以上のＡＤ薬剤に対して有望な反応者を予測できる試験は、患者のケアの最適化、および効果のない治療のコスト削減においてきわめて重要である。
【００２８】
ＡｐｏＥ遺伝子型決定がそのような試験であり得ることを示唆するデータが発表された。特に、ファーロウ（Ｆａｒｌｏｗ）、ポイリャー（Ｐｏｉｒｉｅｒ）および共同研究者らは、ＡｐｏＥε４対立遺伝子を有する女性の患者はタクリンに反応しない一方、ε２およびε３対立遺伝子を有する女性の患者は有意な反応を示すこと；男性は遺伝子型に関わらず有意に反応しないことを示した。逆に、リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄ）らは、ε４対立遺伝子を有するがε２およびε３対立遺伝子をもたない患者は、バソプレシン作用性／ノルアドレナリン作用性シグナル伝達エンハンサーであるＳ１２０２４に対して統計的に有意な反応を示すことを表した。ゆえに、２つの薬剤（１つはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤であり、もう１つはバソプレシン作用性／ノルアドレナリン作用性アゴニストである）は、ＡｐｏＥ遺伝子型によって範囲を定められる、異なる患者群において有用である。
【００２９】
ＡｐｏＥ遺伝子活性または対立遺伝子の変異は、幾つかの他の神経学的疾患の過程を変化させることが知られている。多発性硬化症においては、脳脊髄液および髄腔内合成におけるＡｐｏＥの相対濃度が減少する。側頭葉てんかんおよび大脳の外傷のような、他の神経学的障害では、ＡｐｏＥ ε４変異体の存在は、疾患の進行に対する易傷性の増加と関連する一方、ＡｐｏＥ ε３の存在は適度の神経保護を提供すると考えられる。重篤な神経学的症状および病状の進行した肝臓を導き得る胆汁の銅排出の障害であるウィルソン病は、ＡｐｏＥ遺伝子型およびＨ１０６９Ｑ突然変異（ウィルソン病において同定される最も一般的な突然変異）を調べた研究の主題であった。ＡｐｏＥ ε３／ε３の存在により、提案された、ＡｐｏＥ ε３タンパク質の抗酸化特性および膜安定化特性の機構によって、ウィルソン病における臨床的な症状発現が減少される。
【００３０】
連続携行式腹膜透析（ＣＡＰＤ）が行われている患者においては、これらの患者が脂質代謝の様々な異常を発達させ、加速性じゅく状硬化症を発達させる傾向があることが示された。ＡｐｏＥ ε３／ε３遺伝子型がＣＡＰＤ患者における最も一般的な遺伝子型と考えられること、およびＡｐｏＥ ε２／ε３遺伝子型はコレステロールおよびトリグリセリドの高レベルに関連すると考えられることが示された。
【００３１】
最近のデータにより、ＡｐｏＥ ε変異体と加齢関連の黄斑変性のリスクの減少の間に関連があることが示唆された。
【００３２】
Ｉａ型糖原病の患者では、血清トリグリセリド濃度およびＶＬＤＬおよびＬＤＬ分画が上昇していたが、リン脂質およびコレステロールレベルは適度にのみ上昇していた。最近の研究では、Ｉａ型糖原病を有する患者においては、ε３およびε４変異体が支配的であり、高いトリグリセリド結合能をもち、それによってトリグリセリドクリアランスを増加すると考えられている。
【００３３】
さらに、非インスリン依存性糖尿病および関連代謝性症候群Ｘを有する個体においては、ＡｐｏＥ ε４／ε３表現型の関連があった。
【００３４】
しかし、上記に説明された多くの遺伝的関連に関わらず、ＡｐｏＥ遺伝子型を決定するための診断試験は広く用いられておらず、そしてまた、ＡｐｏＥ遺伝子型決定は、予後予測的試験または薬理遺伝学的試験に広く使用されていない。それどころか、多数の研究では、特にＡＤの診断の設定においては、ＡｐｏＥ の診断マーカーとしての限界に焦点を当てている。これらの研究のほとんどの結論は、ε２、ε３およびε４変異体についての試験では、臨床研究以外での使用を裏付けるのに十分に感受性の高い、または選択的な試験が提供されないというものである。多くの設定においてはＡｐｏＥ試験の結果が医学的な意思決定に影響を与えないため、ＡｐｏＥ遺伝子型について情報を得る理由はほとんどないのではないかというような懸念も示された。
【００３５】
多くの研究所におけるＡｐｏＥ遺伝子の最近の研究によって、新たなＤＮＡ多型の幾つかの同定が導かれた。これらの新しい多型の生物学的影響および医学的重要性は確立されていないが、幾つかの研究によって、プロモーターにおける多型がＡｐｏＥ転写速度に影響を与えることが示唆されている。発表されたほとんどの研究は、個々の多型またはほんのわずかな多型のセット、および１つまたは２つの生物学的または臨床的エンドポイントに対するそれらの影響の解析に限定されてきた。
【００３６】
ＡＤおよび上記に議論されたその他の疾患のような、進行性の消耗性疾患について、治療に対する反応を予測する能力は、これらの疾患を有する患者をその機能の最大レベルで治療する機会は一般に１回しかないため、臨床的重要性が極めて高い；最適な治療の選択におけるいかなる遅延も、可能な最大レベルの機能を保存する機会の喪失となる。ＡＤおよび他の疾患の病状のために開発されている複数の薬剤が存在する状態で、各患者のために最適な薬剤を予測することはますます重要になると考えられる。
【００３７】
発明の概要
本発明者らは、ハプロタイプ（即ち、個々の染色体上におけるＤＮＡ配列多型の編成）および遺伝子型を決定するための方法を開発した。遺伝子型またはハプロタイプの情報、またはその２つの組み合わせは、例えば、疾患リスク評価や、疾患の過程または転帰の予後予測に有用な診断試験を行うために、疾患もしくは状態を診断するために、または疾患もしくは状態について最適な治療を選択するために使用できる。
【００３８】
第一の局面においては、本発明は、対立遺伝子特異的な増加に基づくハプロタイプ決定法を特徴とする。そのような方法は、３つの基本段階：（ｉ）選択された遺伝子における２つまたはそれ以上の多型を同定するために、被験者のゲノムＤＮＡ（またはＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の試料を任意に遺伝子型決定する段階；（ｉｉ） 例えば１つの対立遺伝子を開始時比率１：１に基づき少なくとも１．５：１の比率になるまで濃縮するように、ＤＮＡの増幅を必要としない方法により、選択された遺伝子の２つの対立遺伝子のうちの１つを濃縮する段階；（ｉｉｉ）濃縮した対立遺伝子における、２つまたはそれ以上の多型の遺伝子型を決定する段階に関与する。
【００３９】
上記に説明された手順の第一段階（ｉ）はほとんど重要でなく；１つのみの多型部位の位置を知り（１つの対立遺伝子についての濃縮法を設計するための基礎を提供する）、続いて直接ＤＮＡ鎖の濃縮を行うことが可能である。第二段階（ｉｉ）は、関心対象のある遺伝子または他のＤＮＡセグメントの２つの対立遺伝子を含むゲノムＤＮＡ（またはＲＮＡもしくはｃＤＮＡ）の試料から、１つの対立遺伝子のみを濃縮したＤＮＡ分子集団を得る段階を伴う。これは、本明細書の下記にて説明される多様な新規の方法のうちの任意のものを用いて達成することができる。第三段階（ｉｉｉ）は、濃縮したＤＮＡについて実施される遺伝子型決定法である。本段階においては、実質的には任意の遺伝子型決定法を使用できる。しかし、対立遺伝子の濃縮が完了しない可能性もあるため、定量的または準定量的な遺伝子型決定法が好ましい。良質な定量的遺伝子型決定法は、段階（ｉｉ）からの対立遺伝子濃縮の程度が２：１またはそれ未満に過ぎない場合でさえ、正確なハプロタイプを決定させるものである。一方、実質的な対立遺伝子増加が段階２において達成される場合、段階３の遺伝子型決定法は、濃縮した材料についてＤＮＡ配列決定反応を実施する段階からなり得る。例えば、濃縮したＤＮＡのハプロタイプを決定するために、伸長鎖終結ＤＮＡ配列決定反応を使用できる。
【００４０】
好ましい態様においては、濃縮していない対立遺伝子上に存在するヌクレオチドは、段階（ｉ）において決定される開始ＤＮＡの遺伝子型から、濃縮した対立遺伝子のハプロタイプを「差し引くこと（サブトラクション）」によって、推定できる。例えば、部位１にＡまたはＴを有し、部位２にＣまたはＴを有し、部位３にＡまたはＧを有する、３つの部位においてヘテロ接合であるＤＮＡセグメントについては、最初のハプロタイプが：１ ＝ Ａ、２ ＝ Ｔ、３ ＝ Ａの場合、もう１つのハプロタイプは：１ ＝ Ｔ、２ ＝ Ｃ、３ ＝ Ｇでなければならない。
【００４１】
その他の好ましい態様においては、ハプロタイプ解析は、試料中に存在する双方のハプロタイプの独立した決定−別々の実験における、試料中に存在する２つの対立遺伝子の各々の濃縮およびそれに続く遺伝子型決定による−を伴う；それらは、段階１においてＤＮＡ試料から決定された遺伝子型について集合的に説明するはずである。これを実施することにより、本明細書において説明されるハプロタイプ決定法の正確性が増す。
【００４２】
好ましい態様においては、２つまたはそれ以上の多型部位が段階（ｉｉｉ）において遺伝子型決定され、最も好ましくは、関心対象のＤＮＡセグメントにおける全ての多型部位が遺伝子型決定される。
【００４３】
好ましい態様においては、最初の遺伝子型決定段階（ｉ）からの情報は、対立遺伝子増加のために最適なヘテロ接合部位を選択するために使用できる。
【００４４】
２つの対立遺伝子のうちの１つを濃縮する（段階（ｉｉ））ための幾つかの方法は、例えば、対立遺伝子「捕捉」による、または１つの対立遺伝子のもう一方の対立遺伝子からの物理的分離による、対立遺伝子増加（詳細な説明のＩＩ．Ａ．１節を参照のこと）；エキソヌクレアーゼ消化と組み合わせた対立遺伝子特異的な架橋結合による対立遺伝子増加（詳細な説明のＩＩ．Ａ．２節を参照のこと）；エンドヌクレアーゼ制限およびそれに続く、対立遺伝子特異的なサイズ分離またはエキソヌクレアーゼ消化のいずれかによる対立遺伝子増加（詳細な説明のＩＩ．Ａ．３節を参照のこと）；エンドヌクレアーゼ制限およびそれに続く、対立遺伝子特異的な増幅による対立遺伝子増加（詳細な説明のＩＩ．Ａ．４節を参照のこと）；または、ヘアピンループプライマーを用いた対立遺伝子特異的な増幅による対立遺伝子増加（詳細な説明のＩＩ．Ａ．５節を参照のこと）の方法のように、本明細書の下記にて提供される。
【００４５】
好ましい態様においては、ハプロタイプ決定されるＤＮＡはゲノムＤＮＡである。ある場合においては、全細胞ＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）が開始材料となり得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡに基づく方法は、遺伝子の双方の対立遺伝子が同等に転写されるという仮定に根拠を置く。この仮定は常に維持されるわけではなく、したがって、ｃＤＮＡが遺伝子型決定法またはハプロタイプ決定法のための開始材料として考慮されるいかなる場合においても実験的に試験を行うべきである。
【００４６】
したがって、第一の局面においては、本発明は、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；ｂ）第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率が少なくとも１．５：１にまで増加するように、ＤＮＡの増幅を必要としない方法により、選択された遺伝子の第一対立遺伝子を濃縮する段階；ｃ）第一対立遺伝子における２つまたはそれ以上の多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００４７】
その他の態様においては、本方法は、選択された遺伝子における２つまたはそれ以上の多型部位を同定するために、段階（ａ）において提供されるＤＮＡを遺伝子型決定する段階をさらに含む。
【００４８】
その他の態様においては、本方法は、段階（ａ）において提供されるＤＮＡの遺伝子型を、段階（ｃ）において決定される第一対立遺伝子における２つまたはそれ以上の多型部位の遺伝子型と比較し、それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定することにより、遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階をさらに含む。
【００４９】
なおもその他の態様においては、本方法は、以下をさらに含む：ｄ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来の第二のＤＮＡ試料を提供する段階；ｅ）第二対立遺伝子の第一対立遺伝子に対する比率が少なくとも１．５：１にまで増加するように、ＤＮＡの増幅を必要としない方法により、選択された遺伝子の第二対立遺伝子を濃縮する段階；および、ｆ）第二対立遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の２つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００５０】
様々な態様において、選択された遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位を含むＤＮＡ分子の増幅によってＤＮＡ試料が得られ、ＤＮＡ試料はｃＤＮＡであり、方法１は、濃縮段階以前に試料中におけるＤＮＡを断片化する段階をさらに含み、ＤＮＡ の断片化段階は、制限エンドヌクレアーゼによる切断を含む。他の態様においては、本方法は、第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型をさらに決定する、または、第二対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する。なおも他の態様においては、濃縮段階は、第一対立遺伝子の第二対立遺伝子に対する比率を、少なくとも約２：１、少なくとも約５：１、または少なくとも約１０：１にまで増加させる。
【００５１】
本発明は、一方の対立遺伝子の、もう一方の対立遺伝子に対する比率を１：１から少なくとも１．５：１またはそれ以上に増加させるための様々な方法を特徴とする。ある方法は、もう一方の対立遺伝子と比較して、一方の対立遺伝子を選択的に増幅させることによる。他の方法は、一方の対立遺伝子の量を選択的に減少させることによる。なおも他の方法は、一方の対立遺伝子の選択的な単離による。本方法は、関心対象の遺伝子における、少なくとも１つの多型部位を最初に同定する段階を一般に伴う。これは、双方の対立遺伝子（即ち、父系対立遺伝子および母系対立遺伝子）を含むＤＮＡ試料を遺伝子型決定することによって達成できる。この遺伝子型決定段階によって、以前から既知または未知であり得る、多型部位の存在を明らかにできる。遺伝子型決定段階はまた、被験者が多型部位においてヘテロ接合であるかどうか、および多型部位における２つの異なる対立遺伝子の配列を明らかにする。この情報はその後、一方の対立遺伝子のもう一方の対立遺伝子に対する比率を１：１から少なくとも約１．５：１にまで増加させる増加戦略を選択するために使用できる。多型部位における特定の遺伝子型の存在に依存するため、濃縮段階は、選択された対立遺伝子の第一多型部位における遺伝子型を有効に提供する。濃縮した試料はその後、第二多型部位における、および任意の数の付加的な多型部位における、選択された対立遺伝子を解析するために使用でき、したがって、選択された対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定できる。
【００５２】
本発明の方法において使用される対立遺伝子特異的な濃縮へのあるアプローチは、ＤＮＡ結合分子を用いた、選択された対立遺伝子の選択的捕捉を伴う。したがって、ある局面においては、本発明は、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；ｂ）２つまたはそれ以上の対立遺伝子のうち、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子には結合するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子とは実質的に結合しないＤＮＡ結合分子に、ＤＮＡを接触させる段階；ｃ）ＤＮＡ結合分子と第一対立遺伝子の間に複合体を形成する段階；ｄ）複合体形成していないＤＮＡから、そのように形成された複合体の少なくとも１つの分画を、少なくとも部分的に精製する段階；ｅ）第一対立遺伝子の第二多型部位における遺伝子型を解析し、それによって、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００５３】
ある態様においては、本方法は以下をさらに含む：遺伝子における２つまたはそれ以上の多型部位を同定するために、段階（ａ）において提供されたＤＮＡ試料を遺伝子型決定する段階、および、選択された遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位における遺伝子型を、第一対立遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプと比較する段階、それによって、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００５４】
その他の態様においては、本方法は以下をさらに含む：ｆ）被験者由来の第二のＤＮＡ試料を提供する段階；ｇ）２つの対立遺伝子のうち、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第二対立遺伝子には結合するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子とは実質的に結合しない第二ＤＮＡ結合分子に、ＤＮＡを接触させる段階；ｈ）第二ＤＮＡ結合分子と第二対立遺伝子の間に複合体を形成する段階；ｉ）複合体形成していないＤＮＡから、そのように形成された複合体の少なくとも１つの分画を少なくとも部分的に精製する段階；ｊ）第二対立遺伝子の第二多型部位における遺伝子型を解析し、それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００５５】
その他の態様においては、本方法は以下をさらに含む：ｆ）被験者由来の第二のＤＮＡ試料を提供する段階；ｇ）２つの対立遺伝子のうち、第二多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第二対立遺伝子には結合するが、第二多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子とは実質的に結合しない第二ＤＮＡ結合分子に、ＤＮＡを接触させる段階；ｈ）第二ＤＮＡ結合分子と第二対立遺伝子の間に複合体を形成する段階；ｉ）複合体形成していないＤＮＡから、そのように形成された複合体の少なくとも１つの分画を少なくとも部分的に精製する段階；ｊ）第二対立遺伝子の第一多型部位における遺伝子型を解析し、それにより、選択された遺伝子の第二対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００５６】
他の態様においては、本方法は、第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階、および第二対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む。
【００５７】
様々な態様において：ＤＮＡ結合分子は二本鎖ＤＮＡに結合する；ＤＮＡ結合分子は単鎖ＤＮＡに結合する；ＤＮＡ結合分子はオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸である；ＤＮＡ結合分子はタンパク質である；タンパク質はジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質である；ＤＮＡ結合分子は標識される；ＤＮＡ結合分子はビオチン化される；ＤＮＡ結合分子は直接的または間接的に（例えば、その他の分子によって）固体支持体に結合される；タンパク質は転写因子である；タンパク質は、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く不活性化制限エンドヌクレアーゼ、または二価陽イオンの非存在下において使用される制限エンドヌクレアーゼである；段階（ｄ）はＤＮＡ結合分子に対する抗体と複合体を接触させる段階を含む；抗体は固体支持体に結合される；選択される遺伝子はＡｐｏＥである；本方法は、接触段階以前に試料中のＤＮＡを断片化する段階をさらに含む；ＤＮＡを断片化する段階は、制限エンドヌクレアーゼ切断を含む；ＤＮＡ結合分子は捕捉試薬と相互作用するリガンドを含む；段階（ｄ）は、捕捉試薬と相互作用するリガンドを複合体に接着させる段階を含む；リガンドは、ポリヒスチジンタグ、抗体、ニッケル、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、磁気粒子、およびアプタマーからなる群より選択される；オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、ワトソン−クリック塩基対形成によって第一対立遺伝子に結合する；オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、Ｄ−ループ形成によって第一対立遺伝子に結合する；オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、三本鎖ヘリックス形成によって第一対立遺伝子に結合する；オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、フーグステン型塩基対形成によって第一対立遺伝子に結合する；オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、逆フーグステン型塩基対形成によって第一対立遺伝子に結合する；およびＤＮＡ結合分子は、配列特異的ポリアミドである。
【００５８】
濃縮へのその他のアプローチは、１つの対立遺伝子（多型部位における選択された遺伝子型の存在に基づく）に、対立遺伝子（または少なくとも対立遺伝子の１つの鎖）をエキソヌクレアーゼ消化から保護するような作用物質を結合する段階を伴う。例えば架橋形成オリゴヌクレオチドのような作用物質は、それが結合する多型部位のみならず、選択された対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するために遺伝子型決定できる、少なくとも１つの付加的な多型部位をも保護する。
【００５９】
したがって、本発明は、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；ｂ）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子には結合するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない対立遺伝子とは実質的に結合しない作用物質に、ＤＮＡを接触させる段階；ｃ）第一対立遺伝子に作用物質を架橋結合し、架橋形成した複合体を含む混合物を形成する段階；ｄ）架橋形成した複合体を含む混合物を、第一対立遺伝子の第一多型部位および第一対立遺伝子の第二多型部位において架橋形成した複合体を変性できないエキソヌクレアーゼと接触させる段階；およびｅ）第一対立遺伝子の第二多型部位における遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００６０】
様々な態様において、本方法は、第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む；作用物質はオリゴヌクレオチドである；オリゴヌクレオチドはホスホロチオネート群を含む；作用物質は、以下からなる群より選択される化合物に作用物質を接触させる段階を含む：二核白金（ＰｔＩＩ）、トランス白金（ＩＩ）、またはソラレン；作用物質は、以下からなる群より選択される：ペプチド核酸、三本鎖ヘリックス、または配列特異的ポリアミド；エキソヌクレアーゼはＩ型ヘビ毒ホスホジエステラーゼまたはＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼからなる群より選択される；および選択された遺伝子はＡｐｏＥである。
【００６１】
対立遺伝子の選択的増加へのなおもその他のアプローチにおいては、エキソヌクレアーゼ消化をブロックする修飾ＤＮＡ断片末端の存在によって、１つの対立遺伝子がエキソヌクレアーゼ消化から保護される。したがって、ある態様においては、本発明は、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；ｂ）ＤＮＡを断片化し、選択された遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位を含むＤＮＡ断片を形成する段階；ｃ）断片の末端を修飾し、エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性のある修飾断片を形成する段階；ｄ）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子を切断するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない第二対立遺伝子は切断しない制限エンドヌクレアーゼを用いて、修飾断片を切断する段階；ｅ）第一対立遺伝子を実質的に除去するために、少なくとも１つの非修飾末端をもつＤＮＡを消化するエキソヌクレアーゼを用いて、段階（ｄ）の切断産物を消化する段階；およびｆ）第二対立遺伝子に存在する第二多型部位を遺伝子型決定し、それにより、選択された遺伝子の１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００６２】
様々な態様において、本方法は、第二対立遺伝子における第三の多型部位を遺伝子型決定する段階をさらに含む；エキソヌクレアーゼは単鎖エキソヌクレアーゼである；エキソヌクレアーゼは二本鎖エキソヌクレアーゼである；単鎖エキソヌクレアーゼは、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩ、λファージエキソヌクレアーゼ、Ｔ７ エキソヌクレアーゼ、Ｔ４ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性、および大腸菌ポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ活性からなる群より選択される；二本鎖エキソヌクレアーゼはＢａｌ３１である；および本方法は、単鎖ヌクレアーゼを用いて残余単鎖ＤＮＡを除去する段階をさらに含む。
【００６３】
対立遺伝子特異的な濃縮へのなおもその他のアプローチは、対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ消化、およびそれに続く、制限エンドヌクレアーゼによって切断されない対立遺伝子のみが切断されるように設計されたプライマーを用いた増幅を伴う。したがって、本発明は、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；ｂ）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子を切断するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない第二対立遺伝子は切断しない天然または合成の制限エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡを切断する段階；ｃ）エンドヌクレアーゼ制限試料について増幅法を実施し、増幅産物が第二対立遺伝子のみから生じる段階；およびｄ）第二対立遺伝子における第二多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００６４】
様々な態様において、本方法は、第二対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む；本方法は、サイズ選択法によって増幅産物を単離する段階をさらに含む；遺伝子はＡｐｏＥである；および制限エンドヌクレアーゼはＮｏｔＩである。
【００６５】
対立遺伝子特異的な濃縮へのなおもその他のアプローチは、対立遺伝子特異的な制限エンドヌクレアーゼ消化およびそれに続くサイズ分離を伴う。したがって、本発明は、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：ａ）選択された遺伝子の２つの対立遺伝子を有する被験者由来のＤＮＡ試料を提供する段階；ｂ）第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ第一対立遺伝子を切断するが、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもたない第二対立遺伝子は切断しない天然または合成の制限エンドヌクレアーゼを用いてＤＮＡを切断する段階；ｃ）サイズ選択法によって、第二対立遺伝子から第一対立遺伝子を少なくとも部分的に分離する段階；ｄ）第一対立遺伝子における第二多型部位の遺伝子型を決定し、それにより、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。様々な好ましい態様において、本方法は、第一対立遺伝子の第三多型部位における遺伝子型を決定する段階をさらに含む。
【００６６】
第二の局面においては、本発明は、例えば光学マッピング法または原子間力顕微鏡によって、ＤＮＡ分子（例えば、単鎖ＤＮＡ分子）を光学的に視覚化することに基づくハプロタイプ決定法を特徴とする。
【００６７】
好ましい態様においては、ハプロタイプを決定するために、１つの対立遺伝子に対するもう１つの対立遺伝子を識別する方法を、光学マッピング技術と組み合わせる。そのような方法の例には、以下の段階が含まれる：（ｉ）ハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメント上の多型部位において切断する酵素を用い、制限エンドヌクレアーゼで切断する段階；（ｉｉ）多型部位に対応するオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡを添加し、対立遺伝子特異的なＤループを形成させる段階；（ｉｉｉ）多型を示す配列を認識し、その結果として対立遺伝子の１セットのみにしか結合しない、配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質を添加する段階。
【００６８】
したがって、本発明は、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：（ａ）平らな表面上に、選択された遺伝子の２つまたはそれ以上の多型部位を含むＤＮＡ断片を固定化する段階；（ｂ）作用物質の選択的な結合をさせるような条件下にて、第一多型部位において、選択された遺伝子型をもつ対立遺伝子に選択的に結合する作用物質と、固定化ＤＮＡ断片とを接触させる段階；（ｃ）第二作用物質の選択的な結合をさせるような条件下にて、第二多型部位において、選択された遺伝子型をもつ対立遺伝子に選択的に結合する第二作用物質と、固定化ＤＮＡ断片とを接触させる段階；および（ｄ）少なくとも１つのＤＮＡ断片上における、第一作用物質および第二作用物質の位置を光学マッピングし、それにより、選択された遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の、２つまたはそれ以上の多型部位におけるハプロタイプを決定する段階。
【００６９】
様々な態様において、第一作用物質および第二作用物質のいずれかまたは両方が、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸からなる群より選択される；第一作用物質の選択的な結合により、１つのＤループが形成され、第二作用物質の選択的な結合により、１つのＤループが形成される；本方法は、ＲｅｃＡタンパク質に固定化ＤＮＡ断片を接触させる段階をさらに含む；第一作用物質および第二作用物質はタンパク質である；およびタンパク質は、転写因子、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く不活性化制限エンドヌクレアーゼ、およびジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質、および二価陽イオンの非存在下において使用される制限エンドヌクレアーゼからなる群より選択される。
【００７０】
第三の局面においては、本発明は、遺伝子型決定、即ち、被験者のＤＮＡ試料の、多型部位における配列を決定するための方法を特徴とする。本方法は、多型塩基を含む小さなＤＮＡ断片の、対立遺伝子特異的な質量分析法を含む。断片は好ましくは１００塩基未満であり、より好ましくは５０塩基未満であり、最も好ましくは２５塩基未満である。本明細書において説明される遺伝子型決定法は頑強で、正確性が高く、および設置および実施するための費用が安い。本明細書において説明される遺伝子型決定法は、本明細書において説明されるハプロタイプ決定法の遺伝子型決定段階において使用できる、または、それらは遺伝子型決定単独のために、即ち、ハプロタイプ決定試験とは関連させずに使用できる。
【００７１】
したがって、本発明は、標的核酸配列における多型部位の遺伝子型を決定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：（ａ）標的核酸配列を含むＤＮＡ試料を提供する段階；（ｂ）標的核酸配列を増幅させ、増幅産物を生み出し、増幅によって、増幅産物を、多型部位に近接する切断部位をもつ第一制限酵素および第二制限酵素によって切断させるような配列の増幅産物への挿入がもたらされる段階；（ｃ）増幅産物を切断する段階；および（ｄ）多型部位の遺伝子型を決定する段階。
【００７２】
好ましい態様においては、本方法は、多型部位に近接するプライマーを使用するＰＣＲ増幅に関与する。プライマーの１つは、それによって増幅過程の間に２つの制限エンドヌクレアーゼ認識部位が増幅産物に導入されるように設計される。２つの制限エンドヌクレアーゼ制限酵素部位は、切断が多型部位の両側において生じるように設計される。好ましくは、２つの制限酵素部位は、１５またはそれ未満のヌクレオチドの配列の第一プライマーへの挿入によって作製される。この短い挿入配列は一般に、鋳型鎖と塩基対を形成しないが、プライマーが鋳型に結合した場合にはむしろループを形成する。ポリメラーゼによって相補鎖がコピーされた場合、挿入配列がアンプリコンに取り込まれる。その結果生じる増幅産物の、適切な制限エンドヌクレアーゼとのインキュベーションによって、多型ヌクレオチドを含む小さな（好ましくは１００塩基未満、より好ましくは５０塩基未満、最も好ましくは２０塩基未満）ポリヌクレオチド断片の切り出しがもたらされる。切り出した断片が小さなサイズであることによって、多型部位における塩基を同定するために、質量分析によって容易におよび頑強にそれを解析することができる。
【００７３】
本明細書において説明される方法は、技術的な容易さ、試料のハイスループット、（例えば、解析できるＤＮＡ長における）柔軟性、および解析自動化との適合性によって特徴付けられる。本方法は、候補遺伝子（例えばＡｐｏＥ）における変異の、医学的表現型または関心対象の他の表現型における被験者間変異への寄与についての高度な解析のための基礎を提供する。これらの方法は、疾患または障害を有する患者に、および、本明細書にて説明されるハプロタイプ決定試験の結果として、疾患または障害への素因が発見され得る、または定量化され得る、明らかに正常な被験者に適用可能である。本発明のハプロタイプ決定法の適用により、あらゆる種類の遺伝学的診断試験の正確性を増加することによって、改善された医学的ケアが提供される。
【００７４】
ハプロタイプの決定は、ハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメントが、互いにある程度連鎖不平衡にある多型からなる場合（即ち、それらが試験される集団においてランダムに組み合わされない場合）、遺伝学的解析に特に有用である。一般に、連鎖不平衡は、ゲノムにおける物理的距離が増加するにつれ減少するが、連鎖不平衡が維持される距離は、ゲノムの領域毎に大きく異なる。したがって、理想的なハプロタイプ決定法が扱うべきＤＮＡ長はそれぞれの遺伝子によって互いに異なる。しかし一般に、少なくとも２ ｋｂ；より好ましくは少なくとも５ ｋｂ；なおもより好ましくは少なくとも１０ ｋｂおよび最も好ましくは少なくとも２０ ｋｂの距離に及んでハプロタイプを決定することが望ましい。この適用においては、より長い範囲に及ぶハプロタイプ（即ち、ハプロタイプ ＞ １０ ｋｂ長）を決定する手法が重要視されるが、多くの場合において、より短い距離にかけてのハプロタイプが完全に許容され、より大きなＤＮＡ領域における生物学的に関連する変異の全てを、またはほとんど全てを捕らえうる。
【００７５】
高頻度の組み換えを受けるＤＮＡ領域の介入の存在によって、連鎖不平衡にない２つまたはそれ以上のＤＮＡセグメントからなる遺伝子においては、ハプロタイプ決定への好ましいアプローチは、２つまたはそれ以上の構成領域の各々におけるハプロタイプを別々に決定するものである。それに続く遺伝子型−表現型の関係の遺伝分析は、２つまたはそれ以上の、ハプロタイプ決定されたセグメントの間に存在する全てのハプロタイプ群を考慮することを伴う。例えば、中央の３ ｋｂ部分において高頻度の組み換えがあるが、２つの近接６ ｋｂ部分ＡおよびＢにおいて実質的な連鎖不平衡にある、１５ ｋｂのＤＮＡセグメントを考える。ハプロタイプ解析戦略は、２つの６ ｋｂ部分の各々における一般的な全てのハプロタイプ（またはハプロタイプ群、以下を参照のこと）を決定する段階、その後ＡおよびＢのハプロタイプの全ての可能な組合せを考慮する段階からなり得る。例えば、Ａにおいて３つのハプロタイプまたはハプロタイプ群（ａ、ａ’およびａ’’）がある場合、ならびにＢにおいて４つのハプロタイプまたはハプロタイプ群（ｂ、ｂ’、ｂ’’、ｂ’’’）がある場合、仮に５％またはそれ以上の頻度で生じるとした、全ての組み合わせ（ａ：ｂ、ａ：ｂ’、ａ：ｂ’’、ａ：ｂ’’’、ａ’：ｂ、ａ’：ｂ’、ａ’：ｂ’’、ａ’：ｂ’’’等）が、関連表現型に関して解析される。
【００７６】
ハプロタイプは遺伝子型からは直接的に推論できないことが多い（ハプロタイプがしばしば家系の解析によって推論され得る特別な家族の場合を除く）ため、関連のない被験者由来の試料からハプロタイプを決定するためには、特殊な方法が必要とされる。
【００７７】
定義
本明細書において使用されるように、「遺伝子型」とは、ある生物の遺伝的構成を指す。とりわけ、本明細書において使用されるように、「遺伝子型決定」とは、疾患または薬剤への反応に影響を及ぼす、例えば遺伝子のコード領域または非コード領域内のような、ゲノムの選択された領域におけるＤＮＡ配列を決定するための、被験者から得られた試料中におけるＤＮＡの解析を指す。ゲノムの選択された領域は、遺伝子の一部、全遺伝子、幾つかの遺伝子、または遺伝子を欠く（しかし、近くの遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列を含有し得る）領域を含み得る。「遺伝子型決定」という用語は、１つまたはそれ以上の多型部位におけるＤＮＡ配列の決定を指し、単一の対立遺伝子または２つの対立遺伝子の混合物のＤＮＡ配列を決定する段階を含み得る。関心対象の多型部位において異なるヌクレオチドをもつ２つの対立遺伝子の混合物の場合においては、遺伝子型によって、多型部位に存在する２つの可能なヌクレオチド（またはヌクレオチド配列）が明らかとなる。
【００７８】
本明細書において使用されるように、「ハプロタイプ」とは、単一の染色体（対立遺伝子）由来のＤＮＡセグメントの配列（例えば、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの同定）を指す。ＤＮＡセグメントは、遺伝子の一部、全遺伝子、幾つかの遺伝子、または遺伝子を欠く（しかし、近くの遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列を含有し得る）領域を含み得る。そして、「ハプロタイプ」という用語は、例えばある特定の遺伝子におけるもの、または同じ染色体上の２つもしくはそれ以上の遺伝子におけるもののように、特定の染色体上にある２つまたはそれ以上の多型ヌクレオチド（または配列）のシス配置を指す。ハプロタイプは、多型ヌクレオチドの相についての情報を保存する。したがって、ハプロタイプ決定は、どのセットの変異が一方の親から遺伝した（およびそのため一方の染色体上にある）ものか、およびどちらがもう一方から遺伝したものか、ということに関わる情報を提供する。遺伝子型決定試験は、単一対立遺伝子について実施されない限り、相（ｐｈａｓｅ）についての情報を提供しない。例えば、遺伝子のヌクレオチド２５（ＡおよびＣの両方が存在する）においてヘテロ接合であり、同じ遺伝子のヌクレオチド１００（ＧおよびＴの両方が存在する）においても同様の被験者は、２５Ａ−１００Ｇおよび２５Ｃ−１００Ｔのハプロタイプ、または２５Ａ−１００Ｔおよび２５Ｃ−１００Ｇのハプロタイプをもつ可能性がある。ハプロタイプ決定試験のみが、これらの２つの場合を決定的に識別できる。ハプロタイプは、各世代におけるいかなる配列についてもまれな出来事である、ハプロタイプによって規定されるＤＮＡセグメント内にて生じる減数分裂の間の組み換えイベントにおけるものを例外として、一般には単位として遺伝する。通常、ハプロタイプ決定における試料は、最初は、二倍体の被験者由来の、ハプロタイプ決定される染色体セグメントの２つの対立遺伝子からなる。ハプロタイプ決定は、染色体上の少なくとも２つの多型部位のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を決定する段階からなり得る。好ましくは、ハプロタイプ決定は、例えば少なくとも２、１０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、２００００ヌクレオチドまたはそれ以上の染色体セグメントのような、染色体セグメントにおける、少なくとも３、４、５、６、７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００個またはそれ以上の多型部位のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を決定する段階からなり得る。
【００７９】
本明細書において使用されるように、「対立遺伝子」とは、例えば二倍体の生物において、相同染色体のペアー上にて同じ染色体の遺伝子座を占有する遺伝子の２つのコピーのうちの１つである。２つの対立遺伝子は同じであり得る、または、遺伝子の変異形態または代替形態が可能である、即ち、それらはその間に１つまたはそれ以上の変動（多型）を有し得る。
【００８０】
「変動（ｖａｒｉａｎｃｅ）」および「多型」という用語は、本明細書においては交換可能なように使用され、例えば遺伝子のようなヌクレオチド配列の２つまたはそれ以上の変異形態間のヌクレオチド配列における相違を意味する。変動または多型は：例えば１つまたはそれ以上のヌクレオチドの、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加の、１つまたはそれ以上であり得る。「多型部位」は、そのような変動が生じる位置である。
【００８１】
「遺伝子の変異形態」、「遺伝子の変異体」、または「遺伝子の代替形態」という用語は、交換可能なように使用され、遺伝子配列において少なくとも１つの多型を、およびしばしば１つ以上の多型をもつことによって遺伝子の他の形態から識別できる、例えばヒト集団のような集団において存在する遺伝子の２つまたはそれ以上の形態のうち１つを指す。遺伝子の変異形態は、例えば１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失、置換、または付加によって、ヌクレオチド配列において異なり得る。「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、単一のヌクレオチド塩基対が他のものに置換された、遺伝子の２つまたはそれ以上の変異形態の間の相違を指す。
【００８２】
当技術分野において多型と交換可能なように使用されるその他の用語は、「突然変異」である。しかし、「突然変異」はしばしば、有害な表現型に関連する対立遺伝子を指すために使用される。
【００８３】
本明細書において使用されるように、「表現型」とは、例えばある生物の生理学的、形態学的、生物学的、生化学的または臨床的特徴のような、観察できる、またはさもなければ評価できる任意の特徴を指す。遺伝学的研究の主眼点は、表現型とＤＮＡ配列変異（遺伝子型）との間に一貫した関係を検出することである。特に関心対象の医学的表現型（例えば、一般的に生じる疾患）については、ＤＮＡ配列変異が表現型変異を完全に説明することはほとんどない。環境因子もしばしば重要となる。
【００８４】
本明細書において使用されるように、「遺伝学的検査」または「遺伝学的スクリーニング」とは、個体、集団、または集団サブセットにおいて存在する対立遺伝子を決定するために実施される、遺伝子型決定解析またはハプロタイプ決定解析を指す。
【００８５】
本明細書において使用されるように、「疾患リスク」とは、特定の疾患（例えば、冠動脈性心疾患）について、試験時には明らかな疾患を有さない個体がその後、その疾患に罹患する可能性を指す。
【００８６】
本明細書において使用されるように、「疾患診断」は、患者の発現した症候、病体または生理機能が、疾患、障害または機能不全と関連しているかどうかを適切に決定および同定するための、臨床医の能力を指す。
【００８７】
本明細書において使用されるように、「疾患予後」とは、疾患、障害または機能不全の可能性のある過程および／または転帰の予想を指す。
【００８８】
本明細書において使用されるように、「薬物療法管理」は、様々な医学的方法による、疾患、障害または機能不全の治療を指す。「疾病管理プロトコール」または「治療プロトコール」とは、患者の診断および遺伝子型を含む、臨床検査データ、臨床データおよび遺伝学的データを用いた、患者のための薬物療法プランを考案するための方法を意味する。プロトコールは治療薬の選択肢を明らかにし、異なる治療を用いた可能な予後についての情報を提供する。治療プロトコールは、患者が薬物療法介入に対して陽性にまたは陰性に反応する尤度の評価を提供し得る。治療プロトコールはまた、最適な薬剤用量および投与、および回復またはリハビリテーションの適当な時間のかけ方に関する指針を提供し得る。「疾病管理プロトコール」または「治療プロトコール」はまた、臨床検査変数、臨床変数および遺伝学的変数に基づいて、将来の疾患リスクを予測するために、無症候性の被験者および健常な被験者について組み立てることができる。この設定において、プロトコールにより、化合物の使用、食事もしくは行動の変更、または他の手段を含む、最適な予防または予防的介入が指定される。治療プロトコールは、コンピュータープログラムの使用を含み得る。
【００８９】
本明細書において使用されるように、「治療」という用語は、疾患、疾患の症状または疾患に向かう素因を、治癒する、癒す、緩和する、軽減する、変える、治す、改良する、改善するまたは影響を与える目的で行う、疾患、疾患の症状もしくは疾患に向かう素因を有する患者への治療的作用物質の適用もしくは投与として、または患者由来の単離された組織もしくは細胞系への治療的作用物質の適用もしくは投与として定義される。
【００９０】
本明細書において使用されるように、「集団」とは、地理的な（国を含むがそれに限定はしない）、民族的または人種的な遺伝産物を共有する個体群を指す。集団はまた、特定の疾患または状態を有する個体を含み得る（「疾患集団」）。集団の概念は、ＤＮＡの多型およびハプロタイプの発生および／または頻度、およびそれらの医学的な意味がしばしば集団間で異なるため、有用である。したがって、被験者が属する集団を知ることは、特定のハプロタイプを有することの健康への影響を解釈する上で有用となり得る。集団は、少なくとも１０００個体を包含する。好ましくは、集団は、１万個体、１０万個体、１００万個体またはそれ以上の個体を含み、より多数であることがより好ましい。対立遺伝子（ハプロタイプ）頻度、ヘテロ接合体頻度、または遺伝子の２つまたはそれ以上の対立遺伝子のヘテロ接合体頻度が、ある集団において決定できる。治療に対する反応を予測させ得る１つまたはそれ以上の変動の頻度は、診断試験を用いて、１つまたはそれ以上の集団において決定できる。
【００９１】
例えば遺伝子、対立遺伝子、ハプロタイプまたは多型のような遺伝学的特徴と、疾患または状態の間の関係に関して、「と関連する」という用語は、任意の一般的に許容される統計的関連性評価に基づき、それらの間に統計的に有意なレベルの関連性が存在することを意味する。当技術分野における当業者は、特定の実験的状況またはデータセットについての適切な統計的手段の選択に精通している。例えば遺伝子またはハプロタイプのような遺伝学的特徴は、例えば、疾患の発現頻度、有病率、発達、重篤度、進行、または過程に影響を与え得る。例えば、ＡｐｏＥ遺伝子が、示唆されるように疾患または状態に関与する場合、または、特定の配列変動、ハプロタイプまたは対立遺伝子が疾患の発現頻度または存在と相関する場合、ＡｐｏＥまたはその遺伝子の特定の対立遺伝子またはハプロタイプが、疾患に関与している。
【００９２】
本明細書において使用されるように、「ハイブリダイゼーション」という用語は、ＤＮＡ断片またはポリヌクレオチドに関して使用された場合、天然のポリヌクレオチド、非天然ポリヌクレオチドまたはその両者の組み合わせのいずれをも含む方法を包含する。天然のポリヌクレオチドは、４つの天然デオキシヌクレオチド（デオキシアデノシン三リン酸［ｄＡ］、デオキシシトシン三リン酸［ｄＣ］、デオキシグアニン三リン酸［ｄＧ］または、通常単にチミジン三リン酸［Ｔ］と呼ばれる、デオキシチミジン三リン酸［ｄＴ］）のポリマー、または４つの天然リボヌクレオチド（アデノシン三リン酸［Ａ］、シトシン三リン酸［Ｃ］、グアニン三リン酸 ［Ｇ］またはウリジン三リン酸［Ｕ］）のポリマーであるものである。非天然ポリヌクレオチドは、部分的にまたは完全に、天然のヌクレオチドではないヌクレオチドから構成される；即ち、それらは１つまたはそれ以上の修飾を有する。非天然ポリヌクレオチドには、ペプチド核酸（［ＰＮＡ］）のような、核酸に関連する分子もまた含まれる。非天然ポリヌクレオチドは、非天然ヌクレオチドのポリマー、天然および非天然ヌクレオチドのポリマー（少なくとも１つの非天然ヌクレオチドが存在する）、またはそれ以外に修飾されたポリヌクレオチドが可能である。非天然ポリヌクレオチドは、それらのハイブリダイゼーション特性が天然ポリヌクレオチドのものとは異なるため、有用となり得る。本明細書において使用されるように、「相補的」という用語は、ＤＮＡ断片に関して使用された場合、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）およびクリック（Ｃｒｉｃｋ）によって確立された塩基対形成則を指す：ＡはＴまたはＵと対を形成する；ＧはＣと対を形成する。相補的ＤＮＡ断片は、アンチパラレル配向において整列した場合、全ての位置において、または１つを除く全ての位置において、ワトソン−クリック塩基対形成則に従う配列を有する。本明細書において使用されるように、相補的ＤＮＡ断片は、天然ポリヌクレオチド、非天然ポリヌクレオチド、または天然および非天然ポリヌクレオチドの混合物が可能である。
【００９３】
本明細書において使用されるように、ＤＮＡに関して使用された場合、「増幅する」とは、開始ＤＮＡ断片のコピー数を増やすための一群の方法を指す。ＤＮＡの増幅はしばしば、遺伝子型決定またはハプロタイプ決定を含む、それに引き続くＤＮＡ配列決定を容易にするために実施される。増幅法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびＱβレプリカーゼを用いる方法、および自己持続的配列複製（３ＳＲ、Ｔ．Ｒ．Ｇｉｎｇｅｒａｓおよび共同研究者らにより開発された）として知られる等温増幅法のような転写に基づく増幅系、鎖置換増幅法（ＳＤＡ、Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒおよび共同研究者らにより開発された）、およびローリングサークル型増幅法（Ｐ．ＬｉｚａｒｄｉおよびＤ．Ｗａｒｄにより開発された）が含まれる。
【００９４】
発明の詳細な説明
本出願は核酸試料、例えば、好ましくはある被験者から取り出されたＤＮＡ試料またはｃＤＮＡ試料等に存在するハプロタイプまたは遺伝子型を決定する方法を提供する。しかしながら、これらの方法は、多数の被験者に由来するＤＮＡ試料を混合することにより生産されうる等の、複雑な混合物中に存在するハプロタイプ集団を決定するために使用されてもまたよい。本明細書に記載されている方法は、任意の二倍体生物の遺伝分析に適用可能である。方法は、２つの固有の遺伝子変異体のみしか存在しない、任意の多倍数体生物の遺伝分析にもまた有用である。本発明の方法の適用は改良型遺伝分析を提供し、医療、農業および動物育種の進展を可能にすると思われる。例えば疾患への素因を診断する、または医学治療への応答を予測するための、遺伝子試験の精度を改善することにより、患者において、適切な予防的または治療的方法の、より安全およびより効率的な使用が可能になると思われる。本発明の方法はまた、例えば、疾患危険度または疾患予測に関連している、ＡｐｏＥなどのヒト遺伝子の対立遺伝子の同定を含む、多様な基礎研究問題において改良型遺伝分析を提供する。
【００９５】
本出願の方法はまた医学資源のより効率的な使用も提供する、そしてそれゆえ、マネージドケア機構（Ｍａｎａｇｅｄ　Ｃａｒｅ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）、健康保険企業および連邦政府等の、保健医療に支出する機構にとってもまた有用である。本出願は、例えばＡｐｏＥ遺伝子型またはハプロタイプなどの、遺伝子型またはハプロタイプに基づいて診断、予測または最適治療の選択を定式化する、または定式化を支援するために、ヒト被験者において遺伝子型決定またはハプロタイプ決定試験を実施する方法を提供する。これらの方法は、脂質代謝により影響を受ける任意の疾患または異常を有する患者、ならびに例えば心血管系または神経系に影響を与える疾患または異常等の、疾患または異常を有する患者に適用可能である。本発明のハプロタイプ決定法は、本明細書に記載されている遺伝子型決定またはハプロタイプ決定試験の結果として疾患または異常への素因が発見されてもよい、見かけ上正常な被験者にも同等に適用可能である。本発明の方法の適用は、例えば、動脈硬化、痴呆、パーキンソン病、ハンチントン病、または他の臓器性または血管性の神経変性過程などの疾患の危険を有する患者に予防的方法を早期に実施することを可能にすること；または高脂血症、心血管疾患（末梢または中枢神経系動脈硬化ならびに冠状動脈性心疾患を含む）、アルツハイマー病、脳卒中、頭部または脳損傷、筋萎縮性側索硬化症および精神病、双極性疾患および鬱病などの精神疾患を含む、しかしそれらに限定されない神経疾患などの、疾患または病態を有する患者に最適な治療を選択することを可能にすることにより、改良型医療を提供すると思われる。
【００９６】
Ｉ．遺伝子型決定法
Ｉ．Ａ．制限酵素部位を用いて設計された増幅産物の制限により生成される小型ＤＮＡ断片の質量分析解析
本発明は、多型塩基を含む小型ＤＮＡ断片（好ましくは、２５塩基未満）の質量分析解析に基づく遺伝子型決定法を特徴とする。
【００９７】
第一段階は多型部位に隣接するプライマーを用いたＰＣＲ増幅を必要とする。第一のプライマーの３’末端は、鋳型ＤＮＡにおいて、数個、例えば１６個の多型部位のヌクレオチド内に位置しなければならない。第二のプライマーは多型部位の反対側に第一のプライマーから任意の距離に位置することができる。プライマーの１つは、増幅過程の間に増幅産物中に２個の制限エンドヌクレアーゼ認識部位が導入するように設計される。２個の制限エンドヌクレアーゼ制限酵素部位は、切断が多型部位の両側で生じるように配置される。好ましくは、２個の制限酵素部位は、最初のプライマー内に１５またはそれ未満のヌクレオチドを挿入することにより生成される。この短い挿入配列は、一般的には鋳型鎖に塩基対形成をせず、むしろプライマーが鋳型に結合する時にはループとして突出する。しかしながら相補鎖がポリメラーゼによりコピーされた時、挿入された配列がアンプリコン中に組み入れられる。この結果として生じる増幅産物を適切な制限エンドヌクレアーゼとともにインキュベーションすることで、多型ヌクレオチドを含む小型（一般的には２０塩基未満）ポリヌクレオチド断片を切り出す結果となる。切り出された断片の小型サイズは、多型部位の塩基の同一性を決定するために、質量分析法により容易におよび強健に解析されることを可能にする。制限酵素部位を有するプライマーは、制限酵素が（ｉ）生産が容易である、または商業的に取得するに安価である、（ｉｉ）同一の緩衝液中で効率的に切断する、すなわち全ての可能性のある切断可能アンプリコンが一段階で完全に切断される、（ｉｉｉ）多重解析を容易にするために（２個またはそれ以上の試料を同時に解析する）多数の異なるアンプリコンを切断するように設計することができる。
【００９８】
生成されたＤＮＡ断片の小型サイズは、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するために、質量分析により効率的に解析することを可能にする。適切なＤＮＡ断片の生成は、好ましくは９００ダルトン（３ ｍｅｒ）から９０００ダルトン（３０ ｍｅｒ）の範囲に入り、好ましくは９００から７５００ダルトン（２５ ｍｅｒ）の間であり、より好ましくは９００から６０００ダルトン（２０ ｍｅｒ）の間であり、または９００から４５００ダルトン（１５ ｍｅｒ）の間である。しかしながら、質量分析技術が発展するので、この現在の推奨範囲の外側のＤＮＡ断片を遺伝子型決定することも可能になり、そのようにより大きな範囲、例えば９００から９６００ダルトン（３２ ｍｅｒ）または９００から１０５００ダルトン（３５ ｍｅｒ）または９００から１２０００ダルトン（４０ ｍｅｒ）もまた好ましい実施態様に含まれる。したがって本明細書に記載されている方法は、現在利用可能な商業的質量分析計の能力に合わせて適合されており、しかしながら、当業者は、これらの方法が容易に、例えば改良型脱離、遅延型抽出または検出装置を有するＭＡＬＤＩ機器を含む、質量分析計装備における改良に適合可能であることを認識すると思われる。
【００９９】
本明細書に掲載されている方法は、プライマー伸長または増幅反応における単一の修飾プライマーの使用を必要とする。修飾プライマーは、プライマー伸長産物配列中に少なくとも２個の制限エンドヌクレアーゼ認識部位が導入されるように設計され、好ましくは増幅反応におけるアンプリコンである。制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、遺伝子型決定される多型塩基を囲むおよび／またはまたぐように、そして切断時に多型塩基を含む小型ＤＮＡ断片を遊離するように設計される。多型部位に近接する（５’側または３’側のいずれか）天然型配列がすでに制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいるならば、その時は２個の制限切断部位の１つがプライマー中に設計されないように（下記参照）、むしろアンプリコン中に天然に生じるように、修飾プライマーを設計することが可能でありうる。この事象においては、ただ１個の制限酵素部位のみがプライマー中に設計されなければならない。
【０１００】
発明の１つの実施態様は、増幅中に多型部位の近傍に、２個の制限酵素部位をアンプリコン配列中に導入することを含む。アンプリコンが相当する２個の制限酵素とインキュベーションされる時に、２個の小型ＤＮＡ断片が生成され、少なくともその中の１個が多型ヌクレオチドを含む、２個の制限酵素部位が選択される。制限酵素部位は、２個の制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含むプライマーを設計することにより、増幅過程中に導入される。そのようなプライマーを設計する様々な方法が下記に記載されるが、しかし単一のプライマーを用いて、少なくとも２個の切断可能部位をアンプリコン中に導入する任意の戦略がこの方法には効果的である。これらの方法の実施態様の好例は図１〜１０に説明される。
【０１０１】
ある方法は制限酵素部位を導入するためにプライマー中に選択された塩基の変更（プライマーが仮に天然型配列と完全に塩基対形成するならば、その時にそれらがあるべきものから相対的に）をすることを含む。制限酵素ＦｏｋＩおよびＦｓｐＩの認識部位を組み入れるそのようなプライマーの一例は図１に示されている。ＦｏｋＩおよびＦｓｐＩの認識部位および切断部位は図２中に描写されている。ＦｏｋＩは、認識配列の外側（ある鎖において認識部位の３’側での９塩基の距離において、および反対側の鎖において認識部位から１３塩基離れて、４塩基突出（突出５’末端）（図２）を残して）ＤＮＡを切断するタイプＩＩＳ制限酵素である。ＦｏｋＩ認識部位がプライマーの３’端から１２塩基またはそれ未満内に位置するようにプライマーを設計することにより、ＦｏｋＩ切断がプライマー配列の外側で切断し、そして多型ヌクレオチドを解析に組み入れることを確実にすることができる。その認識部位はＦｏｋＩのものと重複し、２つの部位が部分的に組み合わせられることを可能にすることができるので、ＦｓｐＩはＦｏｋＩと対にするのに有用な酵素である（図３）。これは、修飾プライマー中に導入される塩基の数を減少させ、プライマー設計をより単純にし、そして増幅において機能する可能性をより高くする。
【０１０２】
数個の塩基が標的配列から変化されているプライマーが設計される（図１中のプライマーＲ）。変化された塩基はプライマーＲ上の矢印で示される。このプライマーは、逆方向に設計された第二の（正常）増幅プライマーとともに標的配列増幅するために使用される。多型塩基（正方向でＴ、逆方向でＡ）が標的配列の下で斜字体で示され、そして矢印で示されている。増幅中に、２個の制限酵素部位がアンプリコン配列中に組み入れられる。組み入れられたＦｏｋＩ／ＦｓｐＩ部位は図１において四角で囲まれている。アンプリコンがＦｏｋＩおよびＦｓｐＩとともにインキュベーションされる時、切断は両方の部位で生じ、８ ｍｅｒ断片および１２ ｍｅｒ断片を放出する。１２ ｍｅｒ断片は多型塩基（Ａ）を含む。これらの断片はその後、１２ ｍｅｒ中の多型部位における塩基同一性を決定するために質量分析計により解析される。
【０１０３】
プライマー設計の第二の方法は、内部ループを有するプライマーの使用を含む。プライマーは天然型配列に相当する塩基の一つが除去およびループを用いて置換されるように設計される（プライマーＲ１、図４）。この事例において、標的配列の下に矢印で示されているＧ／Ｃ（図４）はＦｏｋＩおよびＦｓｐＩに関する認識配列を用いて置換される。ＤＮＡ鋳型にハイブリダイゼーションされた時に、プライマーはループ構造を形成する。このループは増幅過程においてアンプリコンに組み入れられ、それによりＦｏｋＩおよびＦｓｐＩ制限酵素部位（図４において囲みで示されている）が導入される。アンプリコンがＦｏｋＩおよびＦｓｐＩとともにインキュベーションされる時、切断が生じ、８ ｍｅｒ断片および１２ ｍｅｒ断片を放出する。図１の例にあるように、１２ ｍｅｒは多型塩基を含み、そして多型部位の塩基を同定するために質量分析により解析されうる。
【０１０４】
両方の戦略はＦｏｋＩおよびＦｓｐＩを用いて切断可能であるアンプリコンを結果生じ、断片の１個に多型ヌクレオチドが含まれている小型ＤＮＡ断片を遊離する。ループ戦略（図４）は、プライマー設計がより容易で、そしてより柔軟性があるので、好ましい方法である。
【０１０５】
質量分析による遺伝子型決定用の適切なＤＮＡ断片を生成する要件を同様に満たす他の可能性のある制限酵素の組み合わせが存在する。２つの他の例が図５（ＢｓｇＩ／ＰｖｕＩＩ）および図６（ＰｖｕＩＩ／ＦｏｋＩ）に概説される。プライマー設計の唯一の要件は、制限酵素部位が、質量分析計またはいくつかの他の適切な方法により容易に解析される適切なサイズである、および多型部位を含む、断片を生じることである。プライマーへの制限酵素部位の導入が、標的ＤＮＡの正確な領域に対するアンプリコンを生じるプライマーの能力を消し去らないこともまた要件である。両方の酵素に関する切断部位が食い違い状の５’突出、３’突出または平滑末端のいずれを生じるかは重要ではない。
【０１０６】
多型部位が伸長部分に含まれるように、５’伸長を有する食い違い状の末端を生産するように、増幅産物を切断する制限酵素の組み合わせを選択することは基本的な方法の増強策である。反応物からの天然型ヌクレオチドの除去（例えばエビアルカリフォスファターゼを用いて）および多型部位に存在する２個のヌクレオチドの１個に相当する少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを添加すること（例えば２個の多型ヌクレオチドのうち１個がＴであるならばブロモデオキシウリジン）は、２個の多型ヌクレオチドの天然型の質量差より大きい質量によって異なる断片を生産するために、陥没３’末端が埋めこまれる結果となると考えられる。１またはそれ以上の修飾ヌクレオチドが、２個の対立遺伝子性フィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）産物の差分質量を最大化するために選択されうる。基本的な方法のこの増強策は、１個の対立遺伝子に対して２個の対立遺伝子が存在することを信頼度をもって決定するために必要である質量分析分解能を減少させる利点を有しており、それによりベースコーリングソフトウェアの性能および遺伝子型決定システムが自動化される容易性を改善する。別の実施態様においては、５’突出が存在する切断産物が、図４に示されているようにＦｏｋＩおよびＦｓｐＩを用いて作製される。増幅反応（そこでＦｏｋＩおよびＦｓｐＩ部位がアンプリコンに組み入れられる、図７の囲み内の配列を参照）に続いて、セファデックスＧ５０などのサイズ排除カラムを通した遠心、または、例えばエビアルカリフォスファターゼ等のアルカリフォスファターゼとともにインキュベーションすることによるなど、当技術分野において既知である様々な方法の任意のものを用いて、残存するヌクレオチドが除去される。アンプリコンはその後、多型塩基を含む５’突出を生成する、制限酵素（ＦｏｋＩ）を用いて切断される。この陥没末端は、その後、多型部位における可能性のあるヌクレオチド塩基の１個に相当する標準ヌクレオチドが質量修飾ヌクレオチド（図７、Ｔｍｏｄ）である、ヌクレオチドを用いてフィルインされうる。そのようなヌクレオチドの例は、質量においてｄＴＴＰより６４．８ダルトン大きい、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）である。表１は標準ヌクレオチドおよびＢｒｄＵの質量、および可能性のあるヌクレオチド組の各々の間の質量差を列記する。陥没末端のフィルインのための質量修飾ヌクレオチドの使用は、断片間の質量のより大きな差を生じる結果となり、例えば自動化解析などの解析をより容易にする。
【０１０７】
断片の陥没末端をフィルインした後、ＦｓｐＩを用いて消化することで質量分析解析および関心対象の多型の同定に利用しやすい断片が生成される。結果として生じるＤＮＡ断片はまた、従来の電気泳動検出法により解析することができる。例えば、質量修飾ヌクレオチドを含むＤＮＡ断片は、未修飾断片とは異なる電気泳動度を示すと考えられる。
【０１０８】
または、（ＰＣＲ反応の間に）標識、例えば放射性または蛍光、プライマーを用いることは、試料がその後電気泳動に分離に供されるならば、検出可能なシグナルを生じると考えられる。この事例においては、標的ＤＮＡ試料は上述のものに類似した計画を用いて増幅される。ＦｏｋＩ制限酵素部位を有する５’標識プライマーは標的ＤＮＡとハイブリダイズしてヘアピンループを形成することを可能にされ、そして引き続く増幅はＦｐｋＩ部位をアンプリコン中に組み入れる。結果として生じるアンプリコンは、多型部位の３’の配列を分離するためにＦｏｋＩを用いての消化に供され、そしてＰＣＲ反応からの残存ヌクレオチドは上述のように除去される。突出配列はその後、多型部位のヌクレオチドの１つがジデオキシヌクレオチドまたは鎖終結ヌクレオチドである天然型ヌクレオチドの存在下で、ポリメラーゼによりフィルインされる。したがって、突出の異なるフィルインは多型の存在または非存在に依存し、そしてしたがってジデオキシ終結ヌクレオチドの組み込みに依存する。好ましい実施態様においては、プライマーは標識されず、しかし、断片が検出可能であるように、疑わしい多型塩基の１つを代表するジデオキシ鎖終結ヌクレオチドが標識される。好ましい実施態様においては、多型塩基ジデオキシヌクレオチドの各々は固有の検出可能な標識を用いて標識され、そして多型部位の同定は、ホモ接合の場合には１つのシグナルの存在および別のシグナルの非存在、またはヘテロ接合の場合には両シグナルの存在に基づく。
【０１０９】
ある実施態様においては、１個の制限酵素部位をプライマーを介してアンプリコンに組み入れることだけが必要であってもよい。これは、使用される酵素が、認識部位の５’側に１個、および３’側に１個の、２個の二本鎖切断を実施できるならば、施行可能である。そのような酵素の例は、（図８）の認識部位
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を有するＢｃｇＩである。矢印は両鎖上の切断部位を示す。この方法に好ましい酵素は、類似した様式で切断する能力を有するが、しかしより小さな断片を生じるものである。
【０１１０】
基本システムの別の修飾は、多型部位非存在下で観察されるものよりも、多型部位存在において短い断片を生じるように、２個の対立遺伝子の１個のみを切断する第三の制限酵素を使用することである。全ての多型が制限酵素部位を変更するわけではないので、そのような修飾は普遍的に適用可能というわけではない。しかしながら、この制限はプライマー中に制限酵素認識部位の一部を含めることにより、部分的に解決されうる。例えば、ＭｗｏＩ
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のような分断型回文認識部位は、最初のＧＣがプライマー中に、２番目のＧＣが多型ヌクレオチドを含むように配置することができる。２番目の部位のＧＣに相当する対立遺伝子のみが切断される。そのような制限エンドヌクレアーゼの使用は、多型部位において、およびその周りの配列要件（この例では、必要とされるすべてのことは、多型部位の１個の対立遺伝子がジヌクレオチドＧＣを含むことである）を単純化し、それによりこの方法で解析可能な多型部位の数を増加させる。
【０１１１】
別の実施態様では、（二本鎖切断を引き起こす代わりに）ＤＮＡにニックを入れるだけの制限酵素が使用される。そのような１つの酵素は、認識部位が
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であるＮ．ＢｓｔＮＢＩである。この計画により生成される断片は図９に概説されている。この戦略は、２個の代わりに１個の小型断片（この場合は１０ ｍｅｒ）のみを生じ、解析をよりずっと自動化に適合しやすくなる。別の戦略は、１個の制限酵素、およびプライマーが切断されることを可能にする修飾を含むプライマーを使用することを含む。そのような計画の例は図１０に概説されている。プライマー中のデオキシリボヌクレオシドの１つはリボヌクレオシド（ｒＧ）を用いて置換されている。リボヌクレオシドは塩基性に不安定であり、そしてその部位においてＤＮＡ骨格に切断を生じる。この例においては、アンプリコンは制限酵素（ＦｏｋＩ）とインキュベーションされ、二本鎖切断を生じる。アンプリコンはその後、リボヌクレオチドＧおよび３’のデオキシリボヌクレオチドＴの間で切断を生じる塩基存在下でインキュベーションされ、質量分析により容易に解析することが可能である７塩基の断片を放出する。
【０１１２】
ＩＩ．ハプロタイプ決定法
ＩＩ．Ａ．対立遺伝子濃縮法
ハプロタイプ決定の１つの型は、２個、選択的には３個の基本段階を含む。（ｉ）選択的には、選択された遺伝子の２またはそれ以上の多型を同定するために被験者のＤＮＡ試料（２個の対立遺伝子を含む）を遺伝子型決定する；（ｉｉ）開始時の比１：１に基づいて、少なくとも１．５：１の比まで１個の対立遺伝子を濃縮するなど、ＤＮＡ増幅を必要としない方法により、選択された遺伝子の２個の対立遺伝子のうち１個を濃縮する；および（ｉｉｉ）濃縮された対立遺伝子における２またはそれ以上の多型の遺伝子型を決定するために濃縮された対立遺伝子を遺伝子型決定する。遺伝子型決定法は当技術分野において既知である、および／または本明細書において開示されている。２個の対立遺伝子の１個を濃縮するいくつかの技術（段階（ｉｉ））は、ハプロタイプ決定法においても使用可能である。対立遺伝子捕捉による対立遺伝子特異的濃縮は以下のＩＩ．Ａ．１節に記載されている。エクソヌクレアーゼ消化が引き続く、クロスリンクによる対立遺伝子濃縮は以下のＩＩ．Ａ．２節に記載されている。サイズ分離またはエクソヌクレアーゼ消化が引き続く、対立遺伝子特異的エンドヌクレアーゼ制限による対立遺伝子濃縮は以下のＩＩ．Ａ．３節に記載されている。増幅が引き続く、対立遺伝子特異的エンドヌクレアーゼ制限による対立遺伝子濃縮は以下のＩＩ．Ａ．４節に記載されている。ヘアピンループプライマーを用いた対立遺伝子特異的増幅による対立遺伝子濃縮は以下のＩＩ．Ａ．５節に記載されている。
【０１１３】
対立遺伝子選択法の目的は、解析されるＤＮＡセグメントまたは複数のセグメントの１個の対立遺伝子が濃縮された分子集団を取得するために、ゲノムＤＮＡ試料（開始材料）を物理的に分画することである。処理の詳細は、対立遺伝子濃縮の基礎を提供する多型ヌクレオチドおよび、多型部位の上流および／または下流の直近隣接配列に依存する。以下に説明されるように、異なる型の配列多型は、異なる型の対立遺伝子濃縮法が適している。
【０１１４】
ＩＩ．Ａ．１　捕捉による対立遺伝子特異的濃縮
単一塩基差異を識別する、例えばタンパク質、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはポリアミドなどのＤＮＡ結合分子を用いることにより、対立遺伝子特異的様式でＤＮＡ断片を捕捉することができる。異なる型のＤＮＡ結合分子、例えばタンパク質および核酸親和性薬剤、は図１１に示されている。１個の対立遺伝子に結合するＤＮＡ結合分子、例えばタンパク質または核酸が、引き続いて核酸混合物から、例えばストレプトアビジンまたは抗体被膜ビーズ等の固体支持体にＤＮＡ結合分子／対立遺伝子複合体を直接または間接的に（例えば別の分子を介して）結合するなどの、当技術分野において既知である方法により、十分に選択されうる。
【０１１５】
多型部位が捕捉による対立遺伝子濃縮に関して一度選択されると、濃縮は以下の段階を含むことが可能である：（ａ）対立遺伝子濃縮のためのＤＮＡ断片を調製する、（ｂ）標的ＤＮＡセグメントの１個の対立遺伝子が結合する、および他の対立遺伝子は有意な程度には結合しないように、配列特異的様式でＤＮＡに結合する分子（ここでは以降「ＤＮＡ結合分子」と称する）にＤＮＡ断片を接触させる、（ｃ）対立遺伝子選択的結合に最適化された条件下で、ＤＮＡ断片および対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子間の複合体形成をさせる、（ｄ）未結合核酸から少なくとも複合体の一部分を十分に単離する、および（ｅ）引き続く遺伝子型決定のためにＤＮＡ結合分子から濃縮された対立遺伝子を含む結合ＤＮＡを放出する。
【０１１６】
段階（ａ）：
対立遺伝子濃縮のためにＤＮＡ断片を調製する際に、ＤＮＡの条件はいくつかの方法のうちの任意のもので調整される：ＤＮＡ濃度、サイズ分布、ＤＮＡ末端の状態（平滑、３’突出、５’突出、末端の特異的配列など）、伸長の程度、など。ＤＮＡは好ましくは、配列特異的ＤＮＡ結合を最大化する緩衝液中に懸濁される。これらの処理に好ましいＤＮＡ濃度は１０から１０００マイクロリッターの容積中に、１００ナノグラムから１０マイクログラムのゲノムＤＮＡの範囲である。好ましくは、費用を調製し、そしてハプロタイプ決定処理を成功させるための十分なＤＮＡを取得するために被験者から取得しなければならない血液または組織の量を最小化するために、より少ない量のＤＮＡおよびより少ない容量が使用される。ＤＮＡ断片のサイズは、ハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメントに及ぶ、大部分の所望の断片を生産するために、調整することができる。そのようなセグメントの長さは少なくとも２ヌクレオチドであり、そして好ましくは約１０ヌクレオチドから１ｋｂ、３ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂまたはそれ以上の間である。所望のサイズの断片は無作為または特異的ＤＮＡ切断処理により生産されてもよい。最適緩衝液および結合条件は、対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子の、非選択対立遺伝子に対して選択対立遺伝子に対する結合の間を最大に識別することを提供するように、容易に決定することが可能である（ＤＮＡ結合分子の、ゲノムＤＮＡ中の多くの他の無関係なＤＮＡ断片への結合は不可避であるが、しかし選択対立遺伝子の濃縮は阻害しないべきである。
【０１１７】
段階（ｂ）：
対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子のいくつかの型のうち任意のものが、ＤＮＡ断片に接触させるために使用されうる。対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子は、タンパク質、ペプチド、ＰＮＡ、ポリアミド、オリゴヌクレオチド、または低分子、ならびにそれらの組み合わせを含むことが可能である。これらの分子は配列特異的様式で、二本鎖（ｄｓ）または一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡに結合するように設計または選択されてもよい。
【０１１８】
段階（ｃ）：
結合特異性に関して最適化された条件下、例えば、結合分子およびＤＮＡ間の特異的複合体形成を促進するイオン強度、ｐＨ、温度、および時間などの条件下で、複合体がＤＮＡおよび対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子との間で形成される。対立遺伝子選択的結合条件の最適化は、一般的には経験的であり、塩、ｐＨおよび温度の最適化に加えて、補因子の添加を含んでもよい。補因子は、グリセロール、スペルミジンまたはテトラメチル塩化アンモニウム（ＴＭＣＡ）などのＤＮＡハイブリダイゼーション特性に影響を与えることが知られている分子、ならびにデキストラン硫酸およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水を排除する分子を含む。温度の最適化は、例えば９５℃超から４０℃未満に温度を傾斜づける（ｒａｍｐｉｎｇ）などの、温度勾配の使用も必要とするかもしれない。ＤＮＡ結合分子の結合が完全に選択的である必要はない。例えば、ＤＮＡ結合分子が非選択対立遺伝子にかなりの程度結合する時でさえ、適切な濃縮（例えば１．５：１または２：１比）を達成することが可能であるかもしれない。
【０１１９】
段階（ｄ）：
選択されたＤＮＡ断片が対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子に結合した後、当技術分野において既知である多数の方法のうち任意のものにより、複合体が十分に未結合核酸から単離されうる。複合体は、例えば物理的、親和性（免疫学的なものを含む）、クロマトグラフィーまたは他の方法、例えば（選択された対立遺伝子を含む断片を含むＤＮＡ断片に順に結合している）対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子に結合する、抗体などの薬剤の添加により、単離されうる。例えば、抗体、アプタマー、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、磁性粒子、ニッケル被膜ビーズまたは対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子に結合する他のリガンドなどの薬剤が反応混合物に添加されうる。その薬剤は、未結合ＤＮＡ断片からの自身の除去を容易にするＤＮＡ結合分子（およびそれが結合している任意のＤＮＡ断片）と複合体を形成することができる。もしＤＮＡ結合分子がすでにリガンドまたはビーズを含む、または接着している、またはさもなければ対立遺伝子特異的複合体を形成した後に分離を容易にする方法で修飾されているならば、この段階は省略可能である。例えば、ＤＮＡ結合分子がポリヒスチジンタグまたはインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープなどの抗体結合エピトープを追加することにより、修飾可能であるタンパク質であるならば。その時は、ニッケル被膜ビーズが、ＤＮＡ結合分子および結合対立遺伝子を開始混合物から十分に単離するために使用されうる。ニッケル被膜ビーズは、対立遺伝子特異的結合の後でＤＮＡ試料に添加されてもよく、または試料を、当技術分野において既知である方法（例えば、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ　Ｎｉ−ＮＴＡタンパク質精製システム、キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）により、クロマトグラフィー用ニッケルカラムに送達することができる。複合体を形成していないＤＮＡは最初にカラムを通じて洗浄され、その後ポリヒスチジン含有ＤＮＡ結合タンパク質に結合したＤＮＡが、当技術分野において既知である方法を用いて１００〜２００ｍＭイミダゾールにて溶出される。この方法では、両方の対立遺伝子が濃縮されたＤＮＡ分画（結合および未結合）が１個の処理で回収される。エピトープタグ付けがされたＤＮＡ結合分子に関する同等の方法は、その後様々な物理的方法により除去されうる、ビーズ−タンパク質−ＤＮＡ複合体を形成する、抗体被膜ビーズを含むことができる。
【０１２０】
または、物質は抗体カラム上（対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子内に設計されたエピトープに結合する抗体を用いて）に流すことが可能である。特異的対立遺伝子濃縮処理を設計および最適化する時に考慮すべき重要なことは、確固たるＤＮＡ増幅および遺伝子型決定の処理の最後に僅かにＤＮＡが残存する程度に、ＤＮＡ結合分子および選択された対立遺伝子の複合体の解離を引き起こさないほど、濃縮条件が緩和であることである。
【０１２１】
ある実施態様においては、ＤＮＡ結合分子および選択された対立遺伝子を含む複合体（ＤＮＡ結合タンパク質に結合する選択的な３番目の部分の存在または非存在）は、物理的方法により残りのＤＮＡ試料から十分に単離される。好ましい方法は、ＤＮＡ結合分子または他の部分を介して、選択された対立遺伝子に結合する磁性ビーズを除去するために磁場、遠心分離（例えば、抗体、ニッケル、ストレプトアビジンのようなリガンド、または当技術分野において既知であるＤＮＡ結合分子に結合する他のリガンドを用いて被膜化された密ビーズを用いて）；または濾過（例えば、遊離ＤＮＡ分子は通過させる一方で、ＤＮＡ結合分子および付着ＤＮＡ断片が結合しているリガンドを用いて被膜化されたビーズは捕縛するフィルターを用いて）を適応すること、または、免疫学的方法（例えば、選択されたＤＮＡに結合するＤＮＡ結合分子に結合する、または順にＤＮＡ結合分子に結合するリガンドに結合する、抗体カラム）などの親和性方法を用いて、または親和性クロマトグラフィー（例えば、もしＤＮＡ結合分子がポリヒスチジンタグを含むように修飾されたタンパク質であるならば、またはＤＮＡ結合分子がそのようなタグを含む第二の分子に結合するならば、ニッケルカラム上のクロマトグラフィーなど）を用いることを含む。対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子およびその結合ＤＮＡを残りのＤＮＡから分離することは、当技術分野において既知である上記のまたは関連する方法の任意のものにより達成でき、それらの多くは、キアゲン、ノバゲン、インビトロゲン、ストラタジーン、プロメガ、クロンテック、アマシャム／ファルマシアバイオテク、ニューイングランドバイオラボおよび当業者に既知である他の会社からキットの形で入手可能である。一般的には、解析に十分な物質を提供するためには、複合体の一部のみが単離される必要がある。加えて、濃縮が少なくとも１．５：１または２：１に達している限りは、いくらかの量の非選択対立遺伝子の存在は許容可能である。
【０１２２】
段階（ｅ）：
選択された対立遺伝子を含む十分に精製された複合体から結合ＤＮＡを放出することは、化学または温度変性条件（水酸化ナトリウム、プロテアーゼの添加、または沸騰）により、またはＤＮＡ結合分子の選択対立遺伝子に対する親和性を減少させる緩衝液条件（塩、補因子）の緩和な変化により達成することができる。そのような方法は通常の当業者には既知である。
【０１２３】
選択された対立遺伝子のハプロタイプを決定するための、濃縮されたＤＮＡの引き続く遺伝子型決定は、本明細書に記載されている遺伝子型決定法により、または化学切断法（ヌクレーブ（Ｎｕｃｌｅａｖｅ）、バリアジニックス、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）、プライマー伸長に基づく方法（オーキッド、プリンストン、ニュージャージー州；セクエノン、サンディエゴ、カリフォルニア州）、クレベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）に基づく方法（サードウエーブ、マジソン、ウィスコンシン州）、ビーズに基づく方法（ルミネックス、オースチン、テキサス州；イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州）、小型化電気泳動法（キバジェニックス、マウンテンビュー、カリフォルニア州）、またはＤＮＡ配列決定によることを含む、当技術分野において既知である他の遺伝子型決定法により達成することができる。任意の遺伝子型決定法の主要な要件は、対立遺伝子濃縮後に残存するＤＮＡの量を検出するのに十分感度が高いことである。対立遺伝子濃縮後に少量のＤＮＡが存在するならば（１ナノグラム未満）その時は遺伝子型決定処理の感度を引き上げるために、ＰＣＲサイクルの数を増加させること、または二段階の増幅処理を実施することが必要かもしれない。例えば、濃縮された対立遺伝子は、第一のプライマー組を用いて４０サイクルのＰＣＲ増幅に供されてもよく、そしてそのＰＣＲの産物はその後、第一のプライマー組の内側の２個の新規プライマーを用いて第二ラウンドの増幅に供されてもよい。
【０１２４】
対立遺伝子捕捉法においては、最後の遺伝子型決定までの濃縮処理のいかなる段階においても、ＤＮＡ増幅処理は必要とされない、したがって、対立遺伝子濃縮法はＰＣＲなどの増幅処理の制限により束縛されない。結果として、解析されうる断片の長さは、原則的に、非常に大きい。対照的に、ＰＣＲなどの増幅処理は、特に鋳型がヒトゲノムＤＮＡまたは同程度の複雑性を有するゲノムＤＮＡである時は、５〜１０ｋｂを超えては技術的に困難になり、そして２０ｋｂ超では非常に困難または不可能である。増幅中に（例えば、ＰＣＲなどの方法を用いているときに）ある程度のインビトロ対立遺伝子交換が生じることを防止することは困難である可能性もある。すなわち、ＰＣＲの変性−回復（Ｒｅｎａｔｕｒｅ）サイクルにおいて、リバースプライマーまでの全長を伸長していないプライマー伸長産物（すなわち不完全に伸長した鎖）が、自身が由来した鎖とは異なる鋳型鎖（ある場合においては、異なる対立遺伝子に相当する鋳型）にアニールするかも知れず、天然に生じる対立遺伝子のどれにも相当しないインビトロ組換えＤＮＡ産物を合成する結果となる。対照的に、増幅を利用せず、そしてより小さな分子の増幅を必要とするそれらの方法において危険性がほとんどない、本明細書に記載されている対立遺伝子濃縮法においては人工的なＤＮＡ鎖交換は生じる機会がない。下記の鎖選択法もまた、長範囲ＰＣＲ増幅の最適化および実施の費用を回避できる点で、魅力的である。さらに、本明細書に記載される対立遺伝子濃縮処理はほとんどの部分が一般的なものであり、任意のＤＮＡ断片に関して同一の基礎的段階が成立する。
【０１２５】
配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質
天然に生じる配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の主要な分類はジンクフィンガータンパク質およびヘリックス−ターン−ヘリックス転写因子を含む。付加的には、通常基質としてのＤＮＡに作用するタンパク質は、（ｉ）水相環境を変更する（例えば、二価陽イオンなどの、タンパク質の酵素機能に必須であるイオン、基質または補因子を除去することなど）または（ｉｉ）結合ではなく、酵素の機能を破壊するタンパク質変異導入を行う、ことのいずれかによりＤＮＡ結合タンパク質として作用するようにすることが可能である。特定のｄｓＤＮＡ配列に結合する酵素クラスは制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡメチラーゼを含む（最近の総説に関しては、Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｊ．およびＤ．Ｍａｃｅｌｉｓ 「ＲＥＢＡＳＥ−制限酵素およびメチラーゼ（ＲＥＢＡＳＥ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０００ Ｊａｎ １；２８（１）３０６〜７を参照）。最終的には、インビトロ進化法（ＤＮＡシャッフリング、ダーティＰＣＲおよび関連する方法）は、新規ＤＮＡ結合特性を有するタンパク質またはペプチドを作製または選択するために使用することができる。そのような方法の開始物質は、全体的に、またはＤＮＡ結合に影響を与えることが知られていると特定のセグメントに変異導入することが可能である、またはそうでなければ並べ換えられ、そしてその後ＤＮＡ結合特性に関して試験または選択することが可能である、既知のＤＮＡ結合タンパク質または複数のタンパク質のＤＮＡ配列であることが可能である。または、開始物質は、ＤＮＡが基質である酵素、例えば制限酵素、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡまたはＲＮＡヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼまたは他の酵素をコードする遺伝子であってもよい。そのような実験は、配列特異的ｄｓＤＮＡ結合タンパク質ならびに配列特異的ｓｓＤＮＡ結合タンパク質を生産するために有用であるかもしれない。インビトロ進化法の最近の記述に関しては、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ Ｊ．およびＷ．Ｐ．Ｓｔｅｍｍｅｒ：「分子育種によるタンパク質進化（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９９ Ｊｕｎ；３（３）：２８４〜９０；Ｇｉｖｅｒ、Ｌ．、およびＦ．Ｈ．Ａｒｎｏｌｄ：「インビトロ組換えによるコンビナトリアルタンパク質設計（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９８ Ｊｕｎ；２（３）：３３５〜８；ＢｏｇａｒａｄおよびＤｅｅｍ：「タンパク質分子進化の階層的方法（Ａ ｈｉｅｒａｒｃｈｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９９９ Ｍａｒ １６；９６（６）：２５９１〜５；Ｇｏｒｓｅら、分子多様性およびその解析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １９９９ ４（６）：２５７〜２６４。
【０１２６】
ＤＮＡ分子を選択するために使用することができる、上記に列挙されたＤＮＡ結合タンパク質のクラスのうち、タンパク質の好ましいクラスは以下の特性を有する：（ｉ）１ヌクレオチド（またはｄｓＤＮＡの場合には１ヌクレオチド対）により異なる任意の２個の配列が、１つのバージョンの配列が回文構造であるか否かによらず、または任意の他の配列束縛により制限されることなく、識別可能である、（ｉｉ）多くの異なる配列対のタンパク質の設計または選択が困難でないように、標準的条件下でＤＮＡ結合タンパク質を設計または選択することが可能である（ハプロタイプ決定用の任意の所定のＤＮＡ分子を容易に選択できるためには、各々が異なる配列対を識別可能である、ＤＮＡ結合タンパク質の大きな集合を有することが望ましい、との懸念からこの要件は生じている）、（ｉｉｉ）タンパク質の選択されたＤＮＡ配列への親和性が、対立遺伝子濃縮処理に導入される物理的および／または科学的ストレスに十分耐えうる、（ｉｖ）ＤＮＡ結合分子が対立遺伝子濃縮処理の間、未変性構造のままでいられるほど十分安定である、そして長い時間の間保存することが可能である、（ｖ）対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合タンパク質により結合される配列の長さは、好ましくは少なくとも６ヌクレオチド（またはヌクレオチド対）、より好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、そして最も好ましくは９ヌクレオチドまたはそれ以上である。認識配列が長ければ長いほど、より少ない数のゲノムＤＮＡ断片混合物中の分子が結合され、それゆえより少ない「バックグラウンド」ＤＮＡがそこで濃縮された対立遺伝子に伴っていると考えられる。５個の前述の基準に加えて、ＤＮＡ結合タンパク質の濃縮を容易にするために、ＤＮＡ結合タンパク質および第二のタンパク質の間で融合されることが望ましいかもしれない。例えば、エピトープ含有タンパク質を付加することは、抗体に基づく方法により選択することを可能にすると思われる。６またはそれ以上のヒスチジン残基を付加することは、亜鉛親和性法による選択を可能にすると思われる（ＤＮＡ結合タンパク質は、本出願の別のところに記載されている顕微鏡に基づくハプロタイプ決定法においても有用であるかもしれない、そしてその目的に関しては、検出可能なシグナルを生産するタンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質との融合が有用であるかもしれない）。
【０１２７】
ジンクフィンガータンパク質
上記の基準を仮定すれば、ジンクフィンガータンパク質は好ましいクラスのＤＮＡ結合タンパク質である。ジンクフィンガータンパク質が事実上任意のＤＮＡ配列モチーフに結合可能であることはよく確立されている。特に、それらは、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼおよびヘリックス−ターン−ヘリックス転写因子がそうであるように、回文構造配列に制限されない。例えば、ＣｈｏｏおよびＫｌｕｇ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９１：１１１６３〜１１１６７、Ｊａｍｉｅｓｏｎら（１９９６）「高親和性ＤＮＡ認識のためのジンクフィンガー辞書（Ａ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ Ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９３：１２８３４〜１２８３９、Ｓｅｇａｌら（１９９９）「自由自在に遺伝子発現を制御することに向けて：５’−ＧＮＮ−３’ＤＮＡ標的配列の各々を認識するジンクフィンガードメインの選択および設計（Ｔｏｗａｒｄｓ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｔ Ｗｉｌｌ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ Ｏｆ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ｅａｃｈ Ｏｆ Ｔｈｅ ５’−ＧＮＮ−３’ ＤＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９６：２７５８〜２７６３、ＳｅｇａｌおよびＢａｒｂａｓ（２０００）新規配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の設計（Ｄｅｓｉｇｎ Ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：３４〜３９を参照。その分野のこれらの論文および他の業績は、３ヌクレオチドから１８ヌクレオチドまでの事実上任意のＤＮＡ配列に結合することができるジンクフィンガータンパク質を生成することが可能であることを証明している。さらに、これらの研究はインビトロで生成されたジンクフィンガータンパク質が、低ナノモルまたはサブナノモルの親和性さえを持って、特異的ＤＮＡ配列に結合する能力を有すること、そして１塩基対しか異ならない配列を、親和性において１０から１００倍またはそれよりずっと大きい差異で、識別する能力を有する。ジンクフィンガータンパク質は、検出可能な標識または付着ドメインを提供する別のタンパク質ドメインを用いて融合することにより修飾されうる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、標識目的のために、クラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合、または、付着および選択目的で、アミノまたはカルボキシル末端のポリヒスチジンと融合、またはグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）（これに対する市販の抗血清が存在する）などの抗体結合ドメインと融合することができる。
【０１２８】
所望の配列特異性を有するジンクフィンガータンパク質を作製する方法は当技術分野においてよく知られており、そして最近大規模実験に適合されてきた。上記の参考文献に加えて、Ｂｅｅｒｌｉら（２０００）「設計された転写因子による内在性遺伝子の正および負の制御（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ａｎｄ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｅｇｕａｌｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ Ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９７：１４９５〜１５００；Ｂｅｅｒｌｉら（１９９８）「自由自在に遺伝子発現を制御することに向けて：モジュール構築ブロックから構築されるポリダクチルジンクフィンガータンパク質によるＥｒｂｂ−２／ＨＥＲ−２プロモーターの特異的制御（Ｔｏｗａｒｄｓ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｔ Ｗｉｌｌ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｅｒｂｂ−２／ＨＥＲ−２ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｆｒｏｍ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋｓ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９５：１４６２８〜１４６３３を参照。大ライブラリーから、所望の特異性を有するジンクフィンガータンパク質を選択するファージディスプレイを用いた方法：ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ（１９９４）「ジンクフィンガーファージ：新規ＤＮＡ結合特異性を有するフィンガーの親和性選択（Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｈａｇｅ：Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｉｎｇｅｒｓ Ｗｉｔｈ Ｎｅｗ ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３（５１４７）：６７１−６７３。Ｒｅｂａｒら（１９９６）「新規ＤＮＡ結合特異性を有するジンクフィンガータンパク質選択のためのファージディスプレイ法（Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｗｉｔｈ Ｎｏｖｅｌ ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：１２９〜１４９。ファージディスプレイ法は、ＤＮＡ断片の混合物から効率的に除去することが可能である大複合体に選択した対立遺伝子を結合させる、一つの方法を提供する。完全なファージへのＤＮＡの非特異的な結合を防止することはブロッキング条件の詳細な最適化を必要とする。
【０１２９】
本出願において記載されているハプロタイプ決定法に関しては、ジンクフィンガータンパク質により認識されるＤＮＡ配列の長さは約３ヌクレオチドから約３０またはそれ以上のヌクレオチドの範囲であってもよい。好ましいジンクフィンガータンパク質は６、９、１２、１５、１８または２０ヌクレオチドを認識し、より長い配列が好ましい。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された配列と１またはそれ以上のヌクレオチド異なる全ての配列に関して、少なくとも２倍の、好ましくは５から１０倍の、そしてより好ましくは１００倍またはそれ以上の特異性を有する。最適なジンクフィンガータンパク質はまた選択された配列に高い親和性を有さなければならない。好ましくは、標的ＤＮＡ配列に対するジンクフィンガータンパク質の解離定数は１００ナノモル未満であり、好ましくは５０ナノモル未満であり、より好ましくは１０ナノモル未満であり、そして最も好ましくは２ナノモル未満である。列挙された全ての基準を満たす、ジンクフィンガータンパク質の製造法は、例えば天然に生じるジンクフィンガータンパク質を修飾することなどにより、当技術分野において通常に実施される。例えば、各々のジンクフィンガーは３ヌクレオチドを認識するので、６ヌクレオチドまたはそれより大きい配列を認識するジンクフィンガータンパク質を製造する一つの方法は、既知の結合特性を有する２またはそれ以上のジンクフィンガーを組み合わせることである。モジュール構築ブロックとしてジンクフィンガーを使用することは、Ｇがグアニン、Ｎが４個のヌクレオチドの任意のもの、そしてｘがＧＮＮモチーフが繰り返される回数を示す、（ＧＮＮ）ｘ型のヌクレオチド配列に関して、Ｂａｒｂａｓおよび共同研究者によって証明されている（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９５：１４６２８〜１４６３３、１９９８を参照）。
【０１３０】
多数のジンクフィンガータンパク質が天然に存在しており、そしてずっと多くの数がインビトロで作製されてきた。これらの既知のジンクフィンガータンパク質の任意のものは、対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合タンパク質の有用なセットを構築するための有用な開始点を形成してもよい。タンパク質Ｚｉｆ２６８は最も精力的に特性化されたジンクフィンガータンパク質であり、そして近接ジンクフィンガー間で相対的に少ない標的部位重複しか存在しないという付加的な利点を有しており、所望のＤＮＡ配列結合特異性を有するジンクフィンガータンパク質のモジュール構築によく適合させることができる。例えば、Ｓｅｇａｌ、Ｄ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９６：２７５８〜２７６３（１９９９）を参照。Ｚｉｆ２６８は変異体ジンクフィンガータンパク質生産のための好ましい骨格である。
【０１３１】
結合特異性および親和性を改善する方法は、無作為または部位特異的変異導入、ファージの大ライブラリーから所望の特異性を有する変異体ジンクフィンガータンパク質を保持するファージを選択すること、およびインビトロ進化法を含む。
【０１３２】
制限エンドヌクレアーゼ
対立遺伝子濃縮に有用である別のクラスの配列特異的ＤＮＡ結合たんぱく質は制限エンドヌクレアーゼである。４００を超える市販の制限エンドヌクレアーゼが存在し、そしてその結合特異性が発見および特性化されたさらに数百以上のものが存在する（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＭａｃｅｌｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０００ Ｊａｎ １：２８（１）３０６〜７）。集合的には、これらの酵素は、全ての４、５、および６ヌクレオチド配列（それぞれ２５６、１０２４および４０９６個が存在する）のかなりの分画を認識する。ある多型ヌクレオチドに関しては、これらの酵素の精巧な配列特異性が、同族部位を欠失する他の対立遺伝子に相当するＤＮＡ断片に結合することはない一方、同族認識部位を含む１個の対立遺伝子性のＤＮＡ断片には選択的に結合するために使用されうる。制限エンドヌクレアーゼは非常に特異性が高く、容易に入手可能で、そしてほとんどの場合に生産が安価である。制限酵素結合配列の中に位置する多型部位の同定は、ヒトゲノム配列が完了したのでずっと単純になってきており、そして制限地図の生成は基本的には、実験活動というよりもむしろコンピューター活動になってきている。
【０１３３】
制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡ結合タンパク質として有用であるためには、そのＤＮＡ切断機能が最初に中和または不活性化されなければならない。不活性化は２つの方法で達成されうる。最初に、制限エンドヌクレアーゼをＤＮＡに添加し、切断を許さない条件下で結合させ、そしてその後ＤＮＡ−タンパク質複合体を除去する。制限酵素切断を防止する最も単純な方法は、緩衝液に二価陽イオンを与えないことである。第二には、依然としてＤＮＡには結合するが、しかしそれを切断できないように制限エンドヌクレアーゼを変更することができる。これは、当技術分野において既知である方法を用いて、制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子の配列を変更することにより達成することが可能である、または化学反応性低分子を用いて制限エンドヌクレアーゼを翻訳後修飾することにより達成することが可能である。
【０１３４】
第一の方法（マグネシウムまたはマンガンなどの必須の補因子を与えない）は制限酵素またはそれをコードする遺伝子の修飾が不要であるという利点を有する。代わりに、結合は許容するが、切断は許容しない条件が決定される。
【０１３５】
いくつかの酵素に関しては、同族ＤＮＡへの高親和性、特異的結合に二価陽イオンを必要としない変異体を生産することが可能であるかもしれない。例えば、マグネシウムイオン非存在下で高特異性および親和性を持って、同族ＤＮＡを認識および結合する（しかし制限はしない）制限酵素ＭｕｎＩ（配列ＣＡＡＴＴＧに結合する）の変異体が製造された。対照的に、野生型ＭｕｎＩはマグネシウムイオン非存在下では配列特異的ＤＮＡ結合を示さない。変異体ＭｕｎＩ酵素のアミノ酸変化（Ｄ８３Ａ、Ｅ９８Ａ）ばマグネシウムイオンが特異性を附与する効果を刺激することが提唱されている。例えば、ＬａｇｕｎａｖｉｃｉｕｓおよびＳｉｋｓｎｙｓ（１９９７）「ＭｕｎＩ制限エンドヌクレアーゼの推定活性部位残基の部位特異的変異導入：触媒的に必須なカーボリレート残基の置換がＤＮＡ結合特異性の引きがねとなる（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｏｆ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｏｆ ＭｕｎＩ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ：Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｏｆ Ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｃａｒｂｏｌｙｌａｔｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ Ｔｒｉｇｇｅｒｓ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１１０８６〜１１０９２）。
【０１３６】
マグネシウムイオン存在下でその切断特性は変えるがしかしその結合特性は変えない、制限酵素の構造修飾もまた証明されている。例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩ（配列ＧＡＡＴＴＣに結合する）の研究においては、ＤＮＡ配列認識および切断活性が分離可能であることが証明された。Ｍｅｔ１３７およびＩｌｅ１９７残基において様々なアミノ酸置換を有する変異体ＥｃｏＲＩ酵素が、同族ＤＮＡ（すなわち５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’）に高い特異性で結合するが、しかし減少または測定できない低活性でしか切断しないことを、研究が示してきた。Ｉｖａｎｅｎｋｏら（１９９８）「ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼによる配列特異的ＤＮＡ認識に関係している２つのアミノ酸、Ｍｅｔ１３７およびＩｌｅ１９７の機能の変異解析（Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｅｔ１３７ Ａｎｄ Ｉｌｅ１９７、Ｔｗｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ Ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｂｙ Ｔｈｅ ＥｃｏＲＩ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）」Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：４５９〜４６５を参照。他の業績は、同族結合部位に大きく増加した親和性を有するが、一方切断活性を欠落した変異体ＥｃｏＲＩタンパク質の同定につながった。例えば、ＥｃｏＲＩ変異体Ｇｌｎ１１１は野生型酵素より〜１０００倍高い親和性でＧＡＡＴＴＣに結合するが、しかし切断には〜１００００倍低い速度定数を有する。（Ｋｉｎｇら（１９８９）「Ｇｌｕ１１１はＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼのＤＮＡ切断中心の活性化に必須である（Ｇｌｕ−１１１ Ｉｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ Ｆｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ ＤＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃｅｎｔｅｒ Ｏｆ ＥｃｏＲＩ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１１８０７〜１５を参照）。ＥｃｏＲＩ Ｇｌｎ１１１は、変異体タンパク質の高結合親和性および無視できる切断活性を利用した方法である、原子力顕微鏡を用いた、直鎖化された３．２〜６．８ｋｂのプラスミド中のＥｃｏＲＩ部位の画像化に使用されてきた。ＥｃｏＲＩ Ｇｌｎ１１１タンパク質は、ＧＡＡＴＴＣ配列を含む対立遺伝子の選択的濃縮（およびそのような配列を欠失する対立遺伝子の結果的な枯渇）用の薬剤として、本発明の方法の好ましい薬剤である。ＥｃｏＲＩ Ｇｌｎ１１１の同族配列を有するＤＮＡ断片への選択的結合の模範的条件は、約５０〜１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０〜２０ｍＭマグネシウムイオン（例えばＭｇＣｌ２）およびトリスまたはリン酸緩衝液中のｐＨ７．５を含んでもよい。好ましくは、試料中のＥｃｏＲＩ Ｇｌｎ１１１および同族ＤＮＡ結合部位（例えばゲノムＤＮＡ）のモル同等性が存在する；より好ましくは、ＤＮＡに対して酵素が５、１０、２０または５０倍モル過剰に存在する。非結合対立遺伝子からのＥｃｏＲＩ結合対立遺伝子の濃縮の好ましい方法は、ＥｃｏＲＩ Ｇｌｎ１１１および、市販されている酵素の抗体結合部位を含むタンパク質ドメインとの融合タンパク質の合成を含む。インフルエンザヘマグルチニン、ベータガラクトシダーゼまたはグルタチオンＳトランスフェラーゼおよびポリヒスチジンドメインはタンパク質精製の市販キット��して入手可能である。
【０１３７】
ゲノムＤＮＡから、ＥｃｏＲＩ部位などの配列の存在または非存在に関して異なる２個の相同な（対立遺伝子性の）遺伝子断片を生産するいくつかの計画が存在する。計画１：ハプロタイプ決定される領域の完全配列が知られているならば、その時はその認識配列中に多型ヌクレオチドを含む制限酵素部位の亜集団を含む、全ての制限酵素部位の位置および同一性が、市販されているソフトウェアを用いてコンピューター解析により普通に決定されうる。関心対象のＤＮＡセグメント中の多型ヌクレオチドと重複するそれらの制限酵素部位は、対立遺伝子濃縮部位としての適合性に関して評価することが可能である。対立遺伝子濃縮部位の最適な特性は、（ｉ）部位はハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメント中に１回または０回（対立遺伝子に依存して）生じる。対立遺伝子濃縮の基礎は、濃縮される対立遺伝子中の結合部位へのタンパク質の付着、およびハプロタイプ決定されるゲノムＤＮＡ試料に存在する他の対立遺伝子中にそれが存在しないことであるので、これは重要である。（ｉｉ）対立遺伝子濃縮に使用される部位とは異なる、多型部位に隣接し、そしてハプロタイプ解析に有用であると考えられるＤＮＡセグメントをまたぐ、非多型制限酵素部位の対が存在する。
【０１３８】
したがって、対立遺伝子濃縮の段階はその後、（他の多くのゲノムＤＮＡ断片ならびに）ハプロタイプ解析に有用であると考えられるＤＮＡセグメントを生産するために、多型部位に隣接する選択された酵素を用いてゲノムＤＮＡを制限すること；同族部位への特異的結合を促進する（そして、もし必要ならば、制限酵素がその同族部位を切断することを防止する）ＤＮＡ結合タンパク質（すなわち、切断不活性制限酵素）を緩衝液中に添加すること；上記の物理的、または親和性を基礎とする方法−抗体、ニッケル−ヒスチジンなどの任意のものにより、ゲノムＤＮＡから制限酵素−複合体を選択的に除去すること、を含む。引き続いて、濃縮された対立遺伝子を水溶緩衝液中に懸濁し、そしてハプロタイプを決定するために２またはそれ以上の多型部位を遺伝子型決定する。計画２は類似しているが、しかし特異的な制限段階を必要としない。代わりに、平均的にハプロタイプ決定されるセグメントの長さにおよそなっているセグメントにゲノムＤＮＡを無作為に断片化する。その後ＤＮＡ結合タンパク質を添加し、そして上記の濃縮を続ける。この計画の欠点は、ＤＮＡ結合タンパク質に関して同族配列の非多型コピーを含みうるＤＮＡ断片が存在していてもよいことである。それらは標的対立遺伝子とともに共精製され、そして引き続く解析段階においてバックグラウンドシグナルを生じるので、そのような断片の存在は対立遺伝子濃縮の程度を制限する。この問題は、無作為断片化処理における断片の平均サイズを減少させることにより解決できる。
【０１３９】
濃縮された対立遺伝子断片は、制限付着のために使用される配列を０または１コピー有するとの要件のため、これらのハプロタイプ決定法における最適な制限酵素は５ヌクレオチドまたはそれ以上の配列を認識する；好ましくはそれらは６ヌクレオチドまたはそれ以上の配列を認識する；好ましくはそのような酵素の同族部位は、ハプロタイプ決定される生物のゲノムＤＮＡにおいて比例して低提示されている１またはそれ以上のジヌクレオチドまたは他の配列モチーフを含む；好ましくは哺乳類ゲノムＤＮＡに適用されるハプロタイプ決定法に関しては、ＣｐＧジヌクレオチドが哺乳類ゲノムにおいて大きく低提示されているので、それらは１またはそれ以上５’−ＣｐＧ−３’配列を含む。ＣｐＧジヌクレオチドを含む制限酵素は、ＴａｑＩ、ＭｓｐＩ、ＨｈａＩおよび当技術分野において既知である他のものを含む。
【０１４０】
制限酵素に基づく対立遺伝子捕捉法の限界は、ハプロタイプ決定されるＤＮＡ断片の長さが部分的な制限地図に依存することである。いくつかの事例においては、切断不活性制限酵素が利用可能である、および最近接の５’および３’隣接配列がハプロタイプ決定に最適な距離にある多型制限酵素部位を見出すことは難しいかもしれない；しばしば隣接制限酵素切断部位は、望むよりも多型部位に近すぎる、そしてハプロタイプ決定することが可能なＤＮＡセグメントの長さを制限する。例えば、遺伝的見地から見れば、１５ｋｂのＤＮＡセグメントをハプロタイプ決定することが最適かもしれないが、しかし所望の１５ｋｂセグメントを単離することを可能にする部位に隣接された多型制限酵素部位は存在しないかもしれない。この問題に対する一つの方法は、関心対象の１５ｋｂセグメントを集合的にまたぐ数個の小型ＤＮＡ断片をハプロタイプ決定することである。複合ハプロタイプは、その後、小型断片間の重複の解析により組み立てられることが可能である。
【０１４１】
困難な制限地図により時々課せられる制限を回避する、より一般的で、そしてより有用な方法は、ハプロタイプ決定処理においてＲｅｃＡ支援制限エンドヌクレアーゼ（ＲＡＲＥ）法の局面を組み入れることである。（ＲＡＲＥ処理の記載に関しては、ＦｅｒｒｉｎおよびＣａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：１４９４〜１４９７；Ｋｏｏｂら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：５８３１〜５８３６を参照）。ＲＡＲＥ技術がタンパク質媒介性対立遺伝子濃縮法において使用されるとき、局所制限酵素部位地図に関わらず、事実上、任意の長さのＤＮＡセグメントをハプロタイプ決定することが可能である。
【０１４２】
最初に、適切なサイズ範囲の断片（例えば、約１５ｋｂの平均サイズ）を生産するために、無作為断片化によりＤＮＡが大きさによって分けられる、または、ハプロタイプ決定されるセグメントをまたぐ断片を生産するために、（既知の制限地図に基づいて）ゲノムＤＮＡを切断する任意の制限エンドヌクレアーゼまたは制限エンドヌクレアーゼ対を使用することが可能である。ＲＡＲＥハプロタイプ決定処理においては、多型制限酵素部位（最終的にハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメントを捕捉するために使用される部位）を含むＤＮＡセグメントとともにＤループを形成するオリゴヌクレオチドをその後使用する。（分析物試料中に存在する対立遺伝子の別のコピーは、多型の結果、制限酵素配列を欠失する。）Ｄループの形成は、核タンパク質フィラメントを形成するために一本鎖ＤＮＡの周りに組み立てられ、その後相補鎖に到達するまで二本鎖ＤＮＡ断片に沿ってスライドする、大腸菌ＲｅｃＡタンパク質を添加することにより、増強されうる。ＡＴＰのガンマＳ類似体および、保護された制限酵素部位が埋めこまれている配列標的部位に相補的または同一である３０〜６０ヌクレオチド長のオリゴデオキシヌクレオチドの複合体において、ＲｅｃＡタンパク質はその後オリゴデオキシヌクレオチドによる鎖反転を媒介し、Ｄループを形成する。
【０１４３】
一度このループが形成されると、次の段階はＤＮＡメチラーゼを用いて多型制限酵素部位の全てのコピーをメチル化することである。実質的には、ゲノムＤＮＡ混合物中に存在する制限酵素部位の全てのコピーがメチル化される（１つのヌクレオチド、通常はＣ、がメチル化される）。ＤループはＤＮＡメチラーゼにより認識されないので、Ｄループに関係する１個の多型制限酵素部位はメチル化されない。続いて、Ｄループが脱組み立てされ、そしてメチラーゼが不活化または除去される。これは制限酵素結合に利用可能な（制限酵素部位を含む１つの対立遺伝子上の）標的制限酵素部位を残す。最終的には、制限不活性であるが高親和性の結合タンパク質（例えばＥｃｏＲＩ Ｇｌｎ１１１）がゲノムＤＮＡ断片の混合物に添加される。利用可能なＥｃｏＲＩ部位を有しているはずの断片のみが、ハプロタイプ決定される断片である。いくつかの方法の任意のものが、その断片を選択的に除去するために使用されうる：切断不活性制限酵素は、本発明の別の場所で詳述されているように、ニッケル−ヒスチジン、抗体−抗原または他のタンパク質−タンパク質相互作用により容易に除去されることを可能にするハンドルとして機能するタンパク質に融合されうる。または、制限酵素に対する抗体は、調整、および、抗体が結合するビーズまたはカラムに制限酵素−対立遺伝子断片複合体を捕捉するために使用することが可能であり、または当技術分野において既知の別の方法が使用することが可能である。
【０１４４】
ＲＡＲＥ支援ハプロタイプ決定法の利点は、局所制限地図、および特には近傍に（この例においては）ＥｃｏＲＩ部位が生じることがもはや制限ではないことである。さらに、多型部位を除く全ての部位のメチル化は、６またはそれ以上のヌクレオチドを認識する制限酵素の選好性を除去する。ＲＡＲＥハプロタイプ決定技術を用いて、４ヌクレオチド配列を認識するものを含む、任意の酵素が対立遺伝子濃縮に有効となる。制限酵素により認識される４ヌクレオチド配列は５または６ヌクレオチド配列よりも頻繁に多型部位をまたぎ、および制限酵素により認識される６ヌクレオチド配列よりも、４ヌクレオチド配列に関してより多くのＤＮＡメチラーゼが存在するので、これは本発明の特に有用な局面である。ＲＡＲＥ支援ハプロタイプ決定法に関する好ましい制限酵素部位は、ＤＮＡメチラーゼが市販されている、、ＡｌｕＩ、ＢａｍＨＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｐａＩＩ、ＴａｑＩ、ＭｓｐＩ、ＨｈａＩ、ＭｂｏＩおよびＥｃｏＲＩメチラーゼを含むが、これに制限されない。
【０１４５】
対立遺伝子濃縮にペプチドを使用することは、対立遺伝子濃縮に使用することができる低分子に関する考察において、下記に記載されている。
【０１４６】
核酸を基礎とする対立遺伝子捕捉法
本発明の別の局面では、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する核酸および核酸類似体を多型部位に標的化することが可能であり、および対立遺伝子の物理的分離のための基礎として使用することが可能である。標的オリゴヌクレオチドに結合しているリガンド、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、フルオレセイン、ポリヒスチジンまたは磁性ビーズなどが結合した対立遺伝子の引き続く濃縮の基礎を提供することが可能である。本発明のハプロタイプ決定法に有用である、二本鎖ＤＮＡ捕捉の配列特異的方法は、（ｉ）一本鎖ＤＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチド）および二本鎖ＤＮＡ間のフーグステン（Ｈｏｏｇｕｓｔｅｅｎ）または逆フーグステン型塩基対形成を介した三重ヘリックス相互作用、（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ間のＤ−ループ形成、（ｉｉｉ）ペプチド核酸（ＰＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ間のＤ−ループ形成、（ｉｖ）ワトソン−クリックまたはフーグステン型塩基対形成、水素結合、ファンデルワールス力または他の相互作用の任意の組み合わせを介して、配列特異的様式で二本鎖ＤＮＡに結合する天然型または修飾核酸（アプタマー）を導き出すために使用されうるインビトロ核酸進化法（ＳＥＬＥＸと称される）を含む
【０１４７】
Ｄ−ループは、二重ヘリックスの１本の鎖を、侵入してきた一本鎖により置換することで形成される。上で示されたように、ＲｅｃＡタンパク質は、侵入するおよび侵入される配列間の相同性の程度に関して限られた厳格性しか有さないが、Ｄ−ループ形成を容易にする。
【０１４８】
本発明の別の局面では、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する核酸は多型部位に標的化することが可能であり、そして対立遺伝子の物理的分離の基礎として使用することが可能となる。特定の相互作用の最もよく知られた型には、フーグステンまたは逆フーグステン型塩基対形成を介した三重ヘリックス相互作用が含まれる。フーグステンまたは逆フーグステン型塩基対形成の要件に適合するような配列文脈の中に多型部位が位置する時、これらの相互作用はハプロタイプ決定に有用である。これらの要件は、典型的には、ホモピリミジン／ホモプリン配列を含む。しかしながら、新規の塩基対形成を許容する核酸修飾の発見は、配列のレパートリーを拡大させる結果となる。それにも関わらず、多型ＤＮＡ配列への選択的結合に関するより一般的な計画が好ましい。
【０１４９】
本発明の別の局面では、ｄｓＤＮＡの鎖侵入によるＤループの形成は、対立遺伝子特異的相互作用および二次的には対立遺伝子濃縮計画の基礎となることが可能である。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は鎖侵入の好ましい物質である。その高親和性ＤＮＡ結合のために、ＰＮＡは二本鎖ＤＮＡへの高効率鎖侵入の能力を有することが示されてきた（Ｐｅｆｆｅｒ ＮＪ、Ｈａｎｖｅｙ ＪＣ、Ｂｉｓｉ ＪＥら、「ペプチド核酸オリゴマーによる二本鎖ＤＮＡの鎖侵入（Ｓｔｒａｎｄ−ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９９３ Ｎｏｖ １５：９０（２２）：１０６４８〜５２；Ｋｕｒａｋｉｎ Ａ、Ｌａｒｓｅｎ ＨＪ、Ｎｉｅｌｓｅｎ ＰＥ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）による協調的鎖置換（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＰＮＡ））Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９８　Ｆｅｂ；５（２）：８１〜９。ＰＮＡ鎖侵入親和性選択の基礎は、鎖侵入により形成される配列特異的ＤＮＡ−ＰＮＡ複合体が、ＰＮＡに付加された親和性タグを利用する際の濃縮処理の基礎である点を除けば、タンパク質を基礎とする方法と概念的には類似している。親和性タグはフルオレセインまたはローダミンなどの抗体の結合部位、またはポリヒスチジン（ニッケル親和性クロマトグラフィーにより選択される）、またはビオチン（アビジンまたはストレプトアビジン被膜ビーズまたは表面を用いて選択される）、または当業者に既知である他の親和性選択計画であってもよい。
【０１５０】
本発明の別の実施態様においては、配列特異的様式で二本鎖ＤＮＡに結合する天然型または修飾核酸を導き出すためにインビトロ核酸進化法（アプタマーまたはＳＥＬＥＸと称される）が使用されうる。事実上任意の標的分子に結合する能力を有する核酸の高処理能導出法が記載されている（Ｄｒｏｌｅｔ ＤＷ、Ｊｅｎｉｓｏｎ ＲＤ、Ｓｍｉｔｈら、「指数型濃縮によるリガンドの系統的濃縮の高処理能力プラットフォーム（Ａ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｔｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ））」Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ １９９９：Ｏｃｔ；２（５）：２７１〜８）。
【０１５１】
ヌクレオチド類似体
ヌクレオチド類似体の使用は、多型部位がフーグステンまたは逆フーグステン型塩基対形成の要件に適合する配列文脈に位置する時、対立遺伝子濃縮に有用である。配列要件は一般的には、二本鎖ＤＮＡ中のホモピリミジン／ホモプリン配列を含む。しかしながら、三本鎖構造中でピリミジンと塩基対を形成するヌクレオチド類似体の発見は、三本鎖複合体に関与する配列レパートリーを増加させた。それにも関わらず、多型ＤＮＡ配列への選択的結合のより一般的な計画が好ましい。
【０１５２】
他の二本鎖対立遺伝子選択法
本発明の別の局面では、非タンパク質、非核酸分子が二本鎖ＤＮＡの親和性選択の基礎となることが可能である（Ｍａｐｐら、「低分子転写因子による遺伝子発現の活性化（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｙ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． Ａｐｒ １１；９７（８）：３９３０〜５；ＤｅｒｖａｎおよびＢｕｒｌｉ、「ポリアミドによる配列特異的ＤＮＡ認識（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｂｙ Ｐｏｌｙａｍｉｄｅｓ）」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、１９９９ Ｄｅｃ；３（６）：６８８〜９３；Ｗｈｉｔｅら、「合成リガンドによるＤＮＡマイナー溝中の４個のワトソン−クリック塩基対形成の認識（Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｏｕｒ Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ Ｂａｓｅ Ｐａｉｒｓ Ｉｎ Ｔｈｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｙ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｌｉｇａｎｄｓ）」Ｎａｔｕｒｅ １９９８ Ｊａｎ ２９；３９１（６６６６）：４６８〜７１を参照。
【０１５３】
修飾ＤＮＡ結合分子
修飾タンパク質、オリゴヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド三リン酸が、それらが二本鎖を形成する相補的ＤＮＡ種（ハプロタイプ決定される対立遺伝子）を部分的に精製するための親和性薬剤として使用されうる。タンパク質、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド修飾は、例えばビオチン／アビジンまたはポリヒスチジン／ニッケルなどの既知の相手に高親和性に結合する化合物を添加することを構成する；または、例えばローダミンまたはフルオレセインなどの高親和性抗体が入手可能な化合物を共有結合で添加することからなってもよい；または、磁場を用いた物理的分離を可能にする金属の添加からなってもよい；または、特定の薬剤または物理的エネルギー（例えば紫外線）を加えた時に、物理的分離を可能にする分子または構造に順に連結される第二の化合物に共有結合を形成する反応性化学基を添加することを含んでいてもよい。
【０１５４】
好ましい実施態様においては、ＤＮＡ結合分子はビオチン化される。ビオチン化オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドに一度ハイブリダイズされると、ＤＮＡまたはＲＮＡは、固体支持体上のストレプトアビジンを用いてハイブリダイズしていないＤＮＡまたはＲＮＡから分離することが可能である。同様に、ビオチン化ＤＮＡ結合タンパク質はストレプトアビジン親和性により、非結合鎖から分離することが可能である。他の可能性のある変更は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドに付加された時に固体支持体上のいくつかの他の分子に結合する、抗原および抗体、ペプチド、核酸およびタンパク質を含むことができるが、それに制限されない。オリゴヌクレオチドは標準ヌクレオチドおよび／または連結または修飾ヌクレオチドおよび／または連結のいずれかから構成されうる。唯一の要件は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズする能力を維持しており、そして必要であれば適切な酵素により利用可能となることである。修飾オリゴヌクレオチドの例は、ペプチド核酸分子、ホスホロチオエートおよびメチルホスホン酸エステル修飾を含むことが可能であるがそれらに制限されない。以下で使用されるとき、オリゴヌクレオチドという用語は天然型および修飾オリゴヌクレオチドの両方に言及する。
【０１５５】
以下のものは、ハプロタイプ決定のためにＤＮＡまたはＲＮＡの対立遺伝子特異的捕捉を活用する例である。
【０１５６】
１．ヌクレオチド多様性に関してヘテロ接合である、単一の部位を指向したビオチン化オリゴヌクレオチドは、試料中に存在する２個の対立遺伝子のうちの１個にのみオリゴヌクレオチドが結合する結果となる条件下で標的ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズされうる。長さ、オリゴヌクレオチドおよび標的配列間のミスマッチの位置、およびオリゴヌクレオチドの化学的メークアップは全て対立遺伝子特異的識別を最大化するために調節される。固体支持体上のストレプトアビジンが、ビオチン化オリゴヌクレオチドおよびそのオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションにより組み合わせられている任意のＤＮＡまたはＲＮＡを除去するために使用される。例えば、多様性部位においてＴを含むオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、対立遺伝子１は特異的に捕捉される。対立遺伝子１由来の標的ＤＮＡまたはＲＮＡはその後変性条件下で、プライマーおよび固体支持体から分離される。対立遺伝子１由来の単離されたＲＮＡまたはＤＮＡはその後ハプロタイプを決定するために遺伝子型決定されることができる。または、試料中に残存するＲＮＡまたはＤＮＡ、対立遺伝子２は対立遺伝子１の捕捉および除去の後、そのハプロタイプを決定するために遺伝子型決定されることができる。
【０１５７】
２．標的ＤＮＡは２個のオリゴヌクレオチドとともにインキュベーションされる、その１つはビオチン化されている。この試料中でＲＮＡが使用されるならば、それは最初にｃＤＮＡに変換されなければならない。オリゴヌクレオチドは多様性部位においてお互いに隣接してハイブリダイズするように設計される。例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドの３’末端は多様性塩基の一塩基５’にハイブリダイズする。最も５’のオリゴヌクレオチドが多様性塩基にハイブリダイズするように、最も５’のオリゴヌクレオチドが多様性塩基にハイブリダイズするように、他のオリゴヌクレオチドはビオチン化プライマーに近接してハイブリダイズするように設計される。多様性部位において完全マッチが存在するならば（対立遺伝子１）、２つのプライマーはお互いにライゲーションされる。しかしながら、多様性部位においてミスマッチが存在するならば（対立遺伝子２）、ライゲーションは全く生じない。その後、試料は、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは許容するが、しかしより短いライゲーションされていないオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは許容しない条件下で、固体支持体上のストレプトアビジンに結合させられる。捕捉されたオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイズされた標的ＤＮＡは試料から除去され、標的ＤＮＡは固体支持体から溶出され、そしてハプロタイプを決定するために遺伝子型決定される。または試料から対立遺伝子１を除去した後にハプロタイプを決定するために対立遺伝子２が遺伝子型決定されうる。
【０１５８】
正しい対立遺伝子が存在する時のみハイブリダイゼーションおよびライゲーションが生じる可能性を増加させるために、オリゴヌクレオチドのサイズを変更することが可能である。完全にマッチしたオリゴヌクレオチドの隣にハイブリダイズして、そして安定化のためにスタッキングエネルギーを利用することが可能であるならば、より短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが許容されるのみの条件下で、ライゲーションが実施されうる。また、ビオチン化オリゴヌクレオチドまたは他のオリゴヌクレオチドのいずれかがミスマッチを含むことが可能である。ビオチンはまた、それがライゲーション部位でない限り、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端に付加されることも可能である。
【０１５９】
３．オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端が多様性塩基のちょうど５’にある標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。もしＲＮＡがこの実施例で用いられるなら、それは最初にｃＤＮＡに変換されなければならない。試料はその後、ジデオキシヌクレオチドの１個がビオチンを含むジデオキシヌクレオチドを組み入れることにより、プライマーを伸長する能力を有するポリメラーゼとともに、４個のジデオキシヌクレオチド存在下でインキュベーションされる。ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは、多様性部位に正しい塩基が存在する時にのみ組み入れられるように、多様性塩基の１つに相当するように選択される。例えば、選択される塩基は、対立遺伝子１にプライマーがアニールする時にのみ組み入れられるビオチンｄｄＴＴＰである。対立遺伝子１にハイブリダイズする、組み入れられたビオチン化されたジデオキシヌクレオチドを有するプライマーは、固体支持体上のストレプトアビジンを用いて試料中の残りのＤＮＡから分離される。単離された対立遺伝子１はその後、固体支持体から溶出され、そしてハプロタイプを決定するために遺伝子型決定することが可能である。上述のように、対立遺伝子１の捕捉および除去後、試料中に残された対立遺伝子２は、ハプロタイプを決定するために遺伝子型決定されることもまた可能である。
【０１６０】
ジデオキシおよびビオチン化ヌクレオチドは同一のヌクレオチドである必要はない。プライマーは、１個のビオチン化ヌクレオチド、１個のジデオキシヌクレオチド、および２個の標準ヌクレオチド存在下で伸長することが可能である。例えば、ビオチン化ｄＴＴＰおよび正常ｄＧＴＰが、（ｄＴＴＰまたはｄＧＴＰではない）別の標準ヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチド（ｄｄＴＴＰまたはｄｄＧＴＰではない）とともに添加される。ビオチン化ｄＴＴＰの別の部位への組み入れが生じる前に、伸長反応が停止するように、ジデオキシヌクレオチドが選択される。対立遺伝子１上のプライマーからの伸長はビオチン化ｄＴＴＰの組み入れを生じる結果となる。対立遺伝子２上のプライマーからの伸長は標準ｄＧＴＰの組み入れを生じる結果となる。固体支持体上のストレプトアビジンは、ハプロタイプを決定するために遺伝子型決定するために対立遺伝子２から対立遺伝子１を分離するために使用されうる。
【０１６１】
ＩＩ．Ａ．２　クロスリンクおよび引き続くエクソヌクレアーゼ消化による対立遺伝子特異的濃縮
対立遺伝子特異的濃縮の第二の方法は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの対立遺伝子特異的領域をエクソヌクレアーゼ消化から保護することを含む。この方法においては、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、薬剤、例えば、修飾オリゴヌクレオチド、存在下で、薬剤の対立遺伝子特異的な結合、例えばハイブリダイゼーションを可能にする条件下において、多型部位を含むＤＮＡ領域とともに、インキュベーションされる。この薬剤／ゲノムＤＮＡ複合体はその後、修飾薬剤をＤＮＡに共有結合でクロスリンクさせ、エクソヌクレアーゼ消化により破壊することができない付加物を形成する条件下でインキュベーションすることが可能である。
【０１６２】
好ましい薬剤は、多型部位を含むＤＮＡ配列に対立遺伝子特異的様式で結合する、チオフォスフォリオエート修飾オリゴヌクレオチドである。チオフォスフォリオエート修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、二核白金（ＰｔＩＩ）またはトランス白金（ＩＩ）により、ＤＮＡにクロスリンクさせることが可能であり、クロスリンクされた対立遺伝子の関心対象の領域（例えば、２またはそれ以上の多型を含む領域）のエクソヌクレアーゼ消化を防止する。オリゴヌクレオチドは、その部位をエクソヌクレアーゼによる消化から保護するように、関心対象の他の多型部位に対して相対的に配置される。クロスリンクされたＤＮＡに対するエクソヌクレアーゼ活性の防止は、クロスリンクされなかった対立遺伝子が破壊され、そして効果的に試料から除去される一方で、エクソヌクレアーゼ反応においての対立遺伝子特異的な残存を可能にする。なお、ある一つの対立遺伝子に濃縮されている試料は、その後、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型として使用することができる、当技術分野において既知のまたは本明細書に記載されているような、任意の遺伝子型決定方法論に利用可能である。したがって、この発明の方法は、残存対立遺伝子の、遺伝子型およびしたがってハプロタイプを決定するために有用である。
【０１６３】
他の対立遺伝子もまた、対立遺伝子特異的にそれを保護し、非保護対立遺伝子を除去し、そして上述のように残存対立遺伝子のハプロタイプを取得するために遺伝子型決定をすることにより、試験されることも可能である。多型部位を含むＤＮＡ領域とオリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡが修飾オリゴヌクレオチドとともにインキュベーションされうる。修飾オリゴヌクレオチドは、共有結合的にゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに結合されていなくても、エクソヌクレアーゼ活性を阻止する特性を有する。そのような化合物の例はペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【０１６４】
別の実施態様においては、薬剤は二本鎖ＤＮＡに配列特異的に結合する能力を有する化合物である。そのような化合物の例は三重ヘリックスおよびポリアミドである。これらの化合物は、自身でエクソヌクレアーゼ活性を阻害してもよく、またはエクソヌクレアーゼ活性を阻害する様式で二本鎖ＤＮＡを共有結合的に修飾するクロスリンク薬剤を用いて修飾されるいずれであってもよい。
【０１６５】
好ましい実施態様においては、修飾オリゴヌクレオチド、例えばチオフォスフォリオエート修飾オリゴヌクレオチドは、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下において、ハプロタイプ決定されるＤＮＡとともにインキュベーションされる。最適には、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０〜１００ヌクレオチドの長さであり、およびハイブリダイゼーションは引き続くオリゴヌクレオチド／ＤＮＡ複合体の操作に耐えるのに十分である。この複合体はその後、オリゴヌクレオチドのゲノムＤＮＡへのクロスリンクを可能にする条件に供される。修飾および未修飾ＤＮＡの両方を含むＤＮＡ試料は、その後未修飾ＤＮＡ破壊する薬剤に曝露され、保護された対立遺伝子濃縮ＤＮＡを残すことが可能である。
【０１６６】
好ましい実施態様においては、二核白金（ＩＩ）（ＰｔＩＩ）複合体（図３９）がチオフォスフォリオエート（チオ）基を含むオリゴヌクレオチドをゲノムＤＮＡへクロスリンクさせるために使用される。ＰｔＩＩに結合しているオリゴヌクレオチドを標的オリゴヌクレオチドにクロスリンクさせる方法、およびその引き続くエクソヌクレアーゼ消化からの保護は、Ｇｒｕｆｆら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｖｏｌ．１９、ｐｐ．６８９４〜６８５４（１９９１）により記載されている。この処理においては、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするようなチオ含有オリゴヌクレオチドが設計された。チオオリゴヌクレオチド（１μＬ中１０ピコモル）は、０．５μＬの０．１ｍＭＫＢＨ４、２μＬの１ｍＭリン酸／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４および０．５μＬの１０μＭ二核白金（ＩＩ）複合体とともに、３７℃にて９０分間インキュベーションされる。相補的オリゴヌクレオチド（０．５μＬ中０．０１ピコモル）は６０℃３分間加熱され、そして上記のチオオリゴヌクレオチド混合物に添加された。０．５μＬの０．５Ｍ　ＮａＣｌＯ４が添加され、そして反応物は室温にて１５分間静置させられた。反応物は３７℃６０分間インキュベーションされた。放射性標識された相補的オリゴヌクレオチドにクロスリンクされたチオオリゴヌクレオチドのアクリルアミドゲルは、２個のオリゴヌクレオチド間でクロスリンクが実際に生じたことを証明した。Ｇｒｕｆｆらはまた、５’チオを５’ＯＨで置換したオリゴヌクレオチド、または標的にミスマッチする５’チオを有するオリゴヌクレオチドとの間ではクロスリンクが生じなかったことを示すことにより特異性を証明した。
【０１６７】
クロスリンクの部位を決定するために、Ｇｒｕｆｆらは、０．１１Ｍトリス塩酸／ＮａＣｌ　ｐＨ８．８、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２において０．１単位／ｍｌのＩ型ヘビ毒ホスホジエステラーゼ１０μＬを上記の反応物に添加し、そして３７℃にて１時間インキュベーションした。Ｉ型ヘビ毒ホスホジエステラーゼは３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を有する酵素である。Ｉ型ヘビ毒ホスホジエステラーゼは、消化が停止する点であるＰｔＩＩクロスリンク部位に到達するまで、３’末端からオリゴヌクレオチドを消化した。
【０１６８】
Ｇｒｕｆｆらによる上記の実験は、ＤＮＡの特異的部位が白金含有オリゴヌクレオチドにクロスリンクすることにより修飾されること、およびその部位はエクソヌクレアーゼ消化に耐性であることを証明した。これらの結果は、以下の方法論を用いてハプロタイプ決定処理を開発するために利用することができる。
【０１６９】
（チオ）含有オリゴヌクレオチドは多型を含む標的ＤＮＡ領域に相補的であるように設計される（図４０、対立遺伝子１）。二核白金（ＩＩ）（ＰｔＩＩ）は、Ｇｒｕｆｆらにより記載された処理または類似の方法を用いて、チオ基を介してこのオリゴヌクレオチドに結合される。ＰｔＩＩ結合オリゴヌクレオチドは直接使用することが可能であり、または過剰の未結合ＰｔＩＩが、透析またはサイズ排除クロマトグラフィーなどの方法により除去されていてもよい。過剰の未結合ＰｔＩＩの除去は、非特異的バックグラウンド付加物形成を減少させるかもしれない。合成中に直接オリゴヌクレオチドを直接標識し、それゆえ標識および精製段階をバイパスする、オリゴヌクレオチド合成法を見出すこともまた可能でありうる。
【０１７０】
チオ基を有さない第二のオリゴヌクレオチドもまた設計される。このオリゴヌクレオチドは、他の対立遺伝子に相当する塩基を有する多様性部位を除いては、チオオリゴヌクレオチドと同一の配列を有する（図４０、対立遺伝子２）。これらの２個のオリゴヌクレオチドは多様性標的部位においてヘテロ接合である産物と混合され、そしてハイブリダイズさせられる。ＰｔＩＩ結合オリゴヌクレオチドは、それが完全にマッチする対立遺伝子（対立遺伝子１）にハイブリダイズし、そして他のオリゴヌクレオチドは、それが完全にマッチする対立遺伝子（対立遺伝子２）にハイブリダイズする。ＰｔＩＩ結合オリゴヌクレオチドはその後、標的ＤＮＡに化学的にクロスリンクされる。このクロスリンクは、標的ＤＮＡのこの対立遺伝子をエクソヌクレアーゼによる破壊から保護する。特定の末端から一本鎖および二本鎖ＤＮＡを破壊することが知られている、およびＰｔＩＩ付加物により阻止されることが知られているエクソヌクレアーゼは、とりわけＩ型ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（Ｇｒｕｆｆら）およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｉｃｈｏｌａｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（ＵＳＡ）ｖｏｌ．９１、ｐｐ．１０９７７〜０９８１（１９９４））を含む。ＤＮＡ試料をエクソヌクレアーゼとインキュベーションすることは、ＰｔＩＩ付加物を有さない、全てまたはほとんどのＤＮＡを除去する（図４１、対立遺伝子２）。３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を有するＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＩ型ヘビ毒ホスホジエステラーゼを用いる時、ＰｔＩＩ付加物を有する標的ＤＮＡ対立遺伝子は、最初のニック部位の５’にある付加物形成の部位から保護される（図４１、対立遺伝子１）。破壊の後、エクソヌクレアーゼは除去または不活化される。残存対立遺伝子は、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用することができる任意の方法により遺伝子型が決定されうる。試料中には１つの対立遺伝子しか残存しないので、遺伝子型決定はこの対立遺伝子のハプロタイプを決定する結果となる。
【０１７１】
二核白金（ＩＩ）は可能性のあるＤＮＡ修飾薬剤の一つにすぎない。トランス白金（ＩＩ）ジアミンジクロライドはオリゴヌクレオチドに付加されると、ＤＮＡをクロスリンクすることが示されている（Ｃｈｕ ＢＣ、Ｏｒｇｅｌ ＬＥ、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．９、ｐｐ．７１−７６（１９９０））。別の可能性のある薬剤は、オリゴヌクレオチドに付加されるとき、適切な条件下でＤＮＡをクロスリンクすることが示されているソラレンである（Ｂｈａｎ Ｐ、Ｍｉｌｌｅｒ ＰＳ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．１、ｐｐ．８２〜８８（１９９０））。方法は、上記に列記された薬剤に制限されず、そして一つの対立遺伝子を特異的に標的化することができる任意のエクソヌクレアーゼ阻止薬剤とともに機能する。例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）分子などの非共有結合阻止薬剤もまた使用されることができる。ＰＮＡは配列特異的にＤＮＡにハイブリダイズすることが示されており、そしてまた翻訳および転写などの活性を阻止することもまた知られている。二本鎖ＤＮＡに結合するおよびエクソヌクレアーゼ活性を阻止する能力を有する阻止薬剤もまた設計されていてもよい。そのような２個の薬剤は三重ヘリックスおよびポリアミドである。これらの薬剤は、単に二本鎖ＤＮＡに結合することによりエクソヌクレアーゼ活性が阻止されてもよく、またはそれらが、標的ＤＮＡの共有結合修飾を引き起こし、そしてそれゆえ二本鎖ＤＮＡのエクソヌクレアーゼ消化を阻止するために活性化されうるＰｔＩＩまたはソラレンなどの薬剤を用いて修飾されていてもよい。対立遺伝子濃縮ＤＮＡ試料の遺伝子型決定は、タックマン、サンガー法ジデオキシ終結配列決定、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび配列決定（ＡＳＯ）を含むがそれらに制限されない、当業者に既知である方法によって、および１９９９年９月９日に申請された「ポリヌクレオチドを解析する方法（Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」米国特許出願第０９／３９４４６７、０９／３９４４５７、０９／３９４７７４、０９／３９４３８７に記載されている方法により進行されうる。当業者が認識するように、ＤＮＡ試料のＰＣＲ増幅は、これらの遺伝子型決定反応および処理のために利用可能である適切な量の対立遺伝子を保証するために最初に必要であるかもしれない。
【０１７２】
ＩＩ．Ａ．３　選択的にエクソヌクレアーゼ消化が続く、エンドヌクレアーゼ制限による対立遺伝子特異的濃縮
高密度ヒト遺伝的地図を生産するために使用される最初の型の多型は制限断片長多型（ＲＦＬＰ）であった。ＲＦＬＰは、通常はそうであるがしかし必ずしもＳＮＰではない、制限エンドヌクレアーゼ認識部位に影響を与える多型である。ＲＦＬＰは最初にゲノムＤＮＡのサザンブロットを用いて同定され、そして引き続いてタイピングされた。（単一コピープローブでハイブリダイズされる）サザンブロットにおいてハイブリダイズする種のパターンが試料から試料の間（すなわちサザンブロットのレーンからレーン）で変動したときＲＦＬＰが検出された。一般的には、制限酵素部位を欠失する対立遺伝子のホモ接合、制限酵素部位を含む対立遺伝子のホモ接合、および２個の対立遺伝子のヘテロ接合に相当する、一個の検出可能断片がいくつかのレーンにおいて、１または２個のより小さな断片が他のレーンにおいて、そして、大きいものとより小さな断片の両方がさらにそれ以外のレーンで同定される。多型制限酵素部位を欠失する制限断片および制限酵素部位を有するそれらの間のサイズ差異は、同一の制限酵素の非多型制限酵素部位からの隣接非多型部位への距離に依存する。
【０１７３】
過去においては、多型制限酵素部位の場所および制限産物のサイズは、一般的には実験的に決定されてきた。多くの制限酵素部位多型は多型部位に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを設計することによりＰＣＲアッセイに変換されてきたが、これらのアッセイ法は、制限酵素が全ての仕事をする、および制限断片のサイズが広範囲に渡り変わる、初期のＲＦＬＰの特性を欠失している。
【０１７４】
本方法のある実施態様においては、少なくとも５ｋｂの距離に渡って、しばしば１０ｋｂの距離に渡って、および、いくつかの例においてはめったに生じない制限酵素部位を用いて、１００ｋｂまたはそれ以上までの距離の、長範囲ハプロタイプを生産するために、ＲＦＬＰが使用されうる。図１８に説明されている基本的な方法は以下のとおりである。
【０１７５】
（ｉ）ハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメントを選択する（正確な境界は次段階により束縛される）。
【０１７６】
（ｉｉ）セグメント内部、または好ましくは隣接ＤＮＡ内の、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ１）（図１８中ではＢａｍＨＩ）の制限酵素認識部位を変更する多型を同定する。ハプロタイプ決定されるセグメントの外部境界は、多型部位のいずれかの側の最も近傍に生じるＲＥ１により定義される。
【０１７７】
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）で同定された多型に関してヘテロ接合である試料由来のゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの平均長が、ハプロタイプ決定されるＤＮＡ断片の長さより大きいことが望ましい。
【０１７８】
（ｉｖ）選択された多型部位を認識する酵素を用いてゲノムＤＮＡを制限する。
【０１７９】
（ｖ）関心対象の制限断片のサイズ範囲に適した任意のＤＮＡサイズ分画法を用いて制限ＤＮＡを分離する。模範的な例はゲル電気泳動、塩、ショ糖、または他の勾配を通じた遠心分離、セファデックスなどのクロマトグラフィーまたは他のクロマトグラフィーを含む。
【０１８０】
（ｖｉ）より大きな制限断片を含む最初のＤＮＡ分画、および選択的にはより小さな制限断片を含む第二のＤＮＡ分画を単離し、そして必要ならば各分画由来のＤＮＡをＰＣＲのために精製する。断片が分画中に高度に濃縮される必要はなく、１またはそれ以上のＤＮＡ分画の各々が、他の対立遺伝子よりも有意に多い量の一つの対立遺伝子を含むことのみが必要である。ハプロタイプ決定に有用でありうる最低限の差異的対立遺伝子濃縮は２：１であり、より好ましくは少なくとも５：１であり、そして、最も好ましくは１０：１またはそれ以上である。
【０１８１】
（ｖｉｉ）分画のいずれか一つ（より大きな対立遺伝子を濃縮したもの、またはより小さな対立遺伝子を濃縮したもの）の関心対象の多型部位を遺伝子型決定する、または、選択的には、両方のサイズ分画において別々に遺伝子型決定する。各々の分画は原則的には１個の対立遺伝子を含むので、分画の遺伝子型は濃縮された対立遺伝子のハプロタイプを提供する。もし１個の分画のみが遺伝子型決定され、１個のハプロタイプを提供するならば、その時は他のハプロタイプは、関心対象の試料の総ゲノムＤＮＡの遺伝子型から、決定されたハプロタイプを差し引きすることにより推測することが可能である。ハプロタイプ決定プロジェクトにおいては、（関心対象のセグメント中に２個またはそれ以上のヘテロ接合部位を含むので）最初にどの試料が実際にハプロタイプ解析を必要とするか、第二にサイズにより対立遺伝子を分離するために選択された制限酵素部位多型においてどの試料がヘテロ接合であるか、およびそれゆえ上記の方法により解析されるのに適しているかを決定し、第三には、総試料の遺伝子型が可能性のあるハプロタイプを束縛する、およびハプロタイプの精度に関するチエックを提供するために、ハプロタイプ決定プロジェクトに先立って、関心対象の全ての試料の総ゲノムＤＮＡにおける遺伝子型を決定することが望ましい。好ましくは、両方の対立遺伝子のハプロタイプは別々に決定され、そして分画されていない試料の遺伝子型と比較される。（その制限酵素部位においてはヘテロ接合ではないので）１個の制限酵素を用いたハプロタイプ解析に適していない試料は、上記の段階を用いて異なる制限酵素を用いて解析することが可能である。
【０１８２】
標的セグメントに隣接する制限エンドヌクレアーゼ部位は、対立遺伝子選択のために最適なサイズにされた分子を生産するために利用することが可能である。例えば、ヘテロ接合ＤＮＡ試料は、長さが異なる２個の対立遺伝子性ＤＮＡ断片（およびおそらくまた、対立遺伝子特異的結合薬剤の結合部位の存在または非存在によってもお互いに異なる）を生産するために、制限されうる。制限エンドヌクレアーゼ消化の容易性、およびハプロタイプ決定される標的ＤＮＡセグメントのちょうど外側で切断される可能性（それにより単一の結合部位の存在／非存在に関して異なる最大サイズのＤＮＡ断片を生産する）のために、完全制限は、対立遺伝子濃縮に先立ってＤＮＡセグメントのサイズを調節する好ましい方法である。
【０１８３】
本方法の別の実施態様においては、２つの制限酵素にエクソヌクレアーゼを加えたものが、サイズ分離段階を必要としないハプロタイプ決定計画において使用されうる。図１９および２０において説明される、この方法においては、最小の段階は上記のとおりである。
【０１８４】
（ｉ）ハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメントを選択する（正確な境界は次の２個の段階により束縛される）。
【０１８５】
（ｉｉ）セグメント内部、または好ましくは隣接ＤＮＡ内の、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ１）（この例中ではＢａｍＨＩ）の制限酵素認識部位を変更する多型を同定する。ハプロタイプ決定されるセグメントの外部境界は、多型部位のいずれかの側の最も近傍に生じるＲＥ１により定義される。
【０１８６】
（ｉｉｉ）ハプロタイプ決定されるセグメント内においてただ一度だけ切断する第二の制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ２）（図１９中ではＮｈｅＩ）を同定する
【０１８７】
（ｉｖ）段階（ｉｉ）で同定された多型に関してヘテロ接合である試料由来のゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの平均長が、ハプロタイプ決定されるＤＮＡ断片の長さより大きいことが望ましい。
【０１８８】
（ｖ）ＲＥ１を用いてゲノムＤＮＡを制限する
【０１８９】
（ｖｉ）エクソヌクレアーゼ消化から全ての切断産物の末端を阻止する。この阻止段階は、例えば、エクソヌクレアーゼ消化に感受性でない終端（例えば、大腸菌エクソヌクレアーゼＩＩＩに耐性である３’突出終端）を生産するＲＥ１を選択することにより；またはヌクレアーゼ耐性修飾ヌクレオチド（例えば、５’アミノ−デオキシヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド類似体、２’−メトキシ−エトキシ−ヌクレオチド類似体、４−ヒドロキシ−Ｎ−アセチルプロリノールヌクレオチド類似体または、１９９９年９月９日に提出された、「ポリヌクレオチドを解析する方法（Ａ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＡＮＡＬＹＺＩＮＧ ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ）」と名づけられた、米国特許出願第０９／３９４７７４号に記載されているもののような、他の化学的に修飾されたヌクレオチド）を用いて陥没終端を埋めることにより；または制限終端にヌクレアーゼ耐性変化を有するアダプターをライゲーションすることにより、実施することが可能である。
【０１９０】
（ｖｉｉ）ＲＥ２を用いて制限する。この点においては、関心対象のＤＮＡ領域の２個の対立遺伝子は異なる状態にある。対立遺伝子Ａは多型部位においてＲＥ１により２個に切断された、両方の断片はエンドヌクレアーゼ消化から阻止される、そしてその後ＲＥ２は２個の断片の１個を２個の部分に切断し、その両方ともエクソヌクレアーゼに耐性でない１個の末端を有する（ＲＥ２の要件はエクソヌクレアーゼ消化に感受性である終端を生産することである）（図２０を参照）。ＲＥ２により切断されない断片は依然として両方の末端が保護されている。逆に、多型部位においてＲＥ１部位を欠失する対立遺伝子Ｂは、ＲＥ１消化の後、１個の部分内に存在した。ＲＥ２消化はその１個の部分を２個に切断し、その両方ともヌクレアーゼ消化に感受性であり、その結果は断片の両方の半分のエクソヌクレアーゼ消化である（未保護末端からの）。したがってヌクレアーゼは対立遺伝子Ｂにおいてハプロタイプ決定される全セグメントに作用する。
【０１９１】
（ｖｉｉｉ）ヌクレアーゼ消化後または同時に、エクソヌクレアーゼ消化後残存している任意の一本鎖領域を破壊するために、少量の一本鎖特異的ヌクレアーゼが加えられてもよい。これは、最初のヌクレアーゼが一本鎖ヌクレアーゼ活性を有さない時のみ（例えば、大腸菌エクソヌクレアーゼＩＩＩの場合のように）、重要である。ヌクレアーゼは必要であれば、例えば加熱により不活化することが可能である。
【０１９２】
（ｉｘ）遺伝子型決定処理は、ＲＥ２の部位を含まず、そしてそれゆえエクソヌクレアーゼ処理の間に両方の末端とも阻止されたままであった対立遺伝子Ａのセグメントにおける全ての多型部位の状態を決定するために使用することが可能である。試験管中には全く（またはほとんど）対立遺伝子Ｂが残存していないので、対立遺伝子Ａに相当するヌクレオチドのみが遺伝子型決定処理により登録され、そしてそれらはハプロタイプを構成する。例えば、未保護末端を有する断片を一本鎖ＤＮＡ分子に変換するもの、および一本鎖ＤＮＡをエクソまたはエンドヌクレアーゼ的に消化する他のものとともにヌクレアーゼの組み合わせ、ならびに多様なヌクレアーゼがこの方法に関して使用されうる。この方法に有用である特定のヌクレアーゼは、一本鎖特異的リョクトウヌクレアーゼ、ヒト細胞質３’→５’エクソヌクレアーゼならびに大腸菌エクソヌクレアーゼＩおよびＩＩＩ、ヌクレアーゼＢａｌ−３１（段階（ｖｉ）の適切な末端保護処理とともに使用されなければならない）および進行性を有する多くの他の原核および真核エクソヌクレアーゼを含む。ハプロタイプ決定標的として、短いものよりも長いセグメントがより興味深いので、ヌクレアーゼ進行性は方法の利用性を制限するかもしれない。したがって非常に進行性の高いヌクレアーゼが好ましい。そのようなヌクレアーゼは天然型または変異導入による修飾型のいずれかであってもよい。
【０１９３】
他のハプロタイプ決定法に関しては、有用な最低限の差異的対立遺伝子濃縮は２：１であり、より好ましくは少なくとも５：１であり、そして、最も好ましくは１０：１またはそれ以上である。別々の反応において両方の対立遺伝子の関心対象の多型部位をハプロタイプ決定することもまた好ましい。または、１個の対立遺伝子のみのハプロタイプが直接決定されるならば、その時は他のハプロタイプは、関心対象の試料の総ゲノムＤＮＡの遺伝子型から、既知のハプロタイプを差し引きすることにより推測することが可能である。ハプロタイプは、上記に概説された方法に適したいくつかの制限断片長多型を組み合わせて用いることにより、長い領域に及んで伸長させることが可能である。
【０１９４】
将来的には、ヒトゲノムを含む利用可能な多くのゲノムの完全配列、および数百万でないにしても、数十万の同定された多型部位を用いて、上記の方法用のＲＦＬＰを基礎とするアッセイ法をコンピュータ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で設計することが可能である。すなわち、関心対象の任意のＤＮＡセグメントに関して、任意の利用可能な制限酵素に関する隣接制限酵素部位、およびヒト（または他の）集団において多型性であるそれら部位の亜集団を同定することが可能になる。所望の断片位置、所望の断片長、（サイズによる分離のための）２個の対立遺伝子間の所望の長さの差、またはＲ２に関する部位の適切な場所（１個の対立遺伝子のエクソヌクレアーゼによる除去のための）（選択的エンドヌクレアーゼ消化による対立遺伝子濃縮のための）などの基準を用いて、ＲＦＬＰアッセイの設計を自動化することが可能になると思われる。本発明の別の局面においては、制限エンドヌクレアーゼおよび電気泳動（または他の）分離条件またはエクソヌクレアーゼを含む実験条件を自動的に設計するプログラムが、ちょうど記載された制約を仮定して、実行されうる。
【０１９５】
ＩＩ．Ａ．４　増幅が引き続く、エンドヌクレアーゼ制限による対立遺伝子特異的濃縮　別のものに対して１個の対立遺伝子を濃縮する別の方法は、（ａ）多型を含む、天然型または合成型の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を同定する段階、（ｂ）多型部位で１個の対立遺伝子を切断するが、他の対立遺伝子は切断しない、制限エンドヌクレアーゼを用いて被験者のＤＮＡ試料を消化する段階、および（ｃ）増幅産物が対立遺伝子依存的様式で生産される、例えば制限エンドヌクレアーゼにより切断されなかった対立遺伝子からのみ増幅産物が生産されるなど、エンドヌクレアーゼ制限試料に関して増幅処理を実施する段階を含む。この増幅産物は、引き続いて遺伝子型決定処理に供することが可能である。
【０１９６】
図３６〜３８において説明されている、この方法においては、最初の段階はハプロタイプ決定されるセグメント内部、または、好ましくは、隣接ＤＮＡ中のいずれかにおいて、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ１）（例えば図３６におけるＮｃｏＩ）に関する制限酵素認識部位を変更させる、多型を同定する段階を必要とする。ハプロタイプ決定されるセグメントの外部境界は、多型部位のいずれかの側の最も近傍に生じるＲＥ１により定義される。ゲノムＤＮＡの平均長が、ハプロタイプ決定されるＤＮＡ断片の長さより大きいことが望ましい。ゲノムＤＮＡはその後エンドヌクレアーゼＲＥ１を用いて制限される。その後増幅は、例えば多型ＲＥ１部位の反対側であるが隣接非多型ＲＥ１部位により境界を示されるＤＮＡセグメント内部に位置するフォワードおよびリバースプライマーを用いたＰＣＲ増幅などが実施される。増幅産物は、すなわち濃縮された対立遺伝子に存在する多型がＲＥ１制限酵素認識部位を変更したので、ハプロタイプ決定される対立遺伝子がＲＥ１により制限されない場合のみ、増幅産物は生産される。増幅ＤＮＡ（濃縮対立遺伝子）は、その後、増幅セグメント内に位置する１またはそれ以上の多型の遺伝子型決定試験に供することが可能である。
【０１９７】
事実上任意の遺伝子型決定法は、一度増幅されれば、濃縮対立遺伝子の遺伝子型決定ために使用することが可能である。１つの好ましい遺伝子型決定法は、電気泳動または質量分析解析が引き続く、プライマー伸長である。プライマーは、増幅セグメント中の１またはそれ以上の多型部位のちょうど上流に位置し、対立遺伝子特異的様式で伸長され、そして当技術分野において既知である方法を用いて解析される。この方法はまた、対立遺伝子増幅の特異性を高めるために、本発明の対立遺伝子特異的プライミング実験とともに、使用されることも可能である。
【０１９８】
ＩＩ．Ａ．５　対立遺伝子特異的ヘアピンループ増幅法による対立遺伝子濃縮
二倍体生物由来のＤＮＡ試料に存在するＤＮＡ断片のハプロタイプを決定する別の方法は、ａ）対立遺伝子特異的クランプＰＣＲ処理を用いて混合物から１個の対立遺伝子を選択的に増幅する段階、およびｂ）増幅されたＤＮＡセグメント中の２またはそれ以上の多型部位を遺伝子型決定する段階を含む。本明細書に記載されている他の濃縮法に関しては、最適遺伝子型決定を工夫するために２個またはそれ以上の多型部位において、ＤＮＡ試料の遺伝子型決定をすることにより選択的増幅が進行されてもよく、およびＤＮＡ試料はいくつかのＤＮＡ試料の混合物である。
【０１９９】
この方法は修飾プライマーを使用することを必要とする。しかしながら、対立遺伝子特異的増幅を達成するための基礎は、（ｉ）鎖の３’末端またはその近傍のヌクレオチド（相補鎖のプライマーにより少なくとも部分的には鋳型とされる該ヌクレオチド）と、（ｉｉ）３’末端からさらに内側に位置する同一の鎖のものであり、そして（決定的に）多型部位（または複数の部位）を含むヌクレオチドとの間で塩基対形成を生じることを含む二重または二次構造を形成することであり、その結果（ｉ）二次構造は２個の対立遺伝子において異なる程度に形成される（理想的には、二次構造は完全に対立遺伝子特異的様式で形成される）、かつ（ｉｉ）二次構造は少なくとも部分的にプライマー結合および／またはプライマー伸長を阻害し、結果として、３’末端において二次構造を有する鎖の増幅を阻害する。プライマー修飾の目的は、その後その末端からのさらなるプライマーの結合／伸長を阻害する二次構造を形成すると思われる配列につながる、相補鎖に関するポリマー化用の鋳型を生産することである。プライマー中の修飾は、プライマー５’末端または内部のいずれかにおいて、しかし３’末端においてではなく、導入することが可能である。ＡｐｏＥ遺伝子のハプロタイプ決定に適用されたこの方法の例は、プライマー結合／伸長を阻害するために生産されうる二次構造のいくつかの型を説明する図１４〜１７とともに、以下に提供される（実施例３）。
【０２００】
方法の１つの実行では、プライマー中に５’伸長を導入することが必要とされる。相補鎖がそのプライマーにかけて伸長し、そしてその後、変性サイクルにより分離した後、相補鎖は、ある対立遺伝子においてはヘアピンループ構造を形成するが、他のものでは形成しない。具体的には、相補鎖の遊離３’末端が多型部位を含む同一鎖の上流セグメントにアニールし、その結果多型部位はループのステムに関係する（図１４、１５を参照）。多型ヌクレオチドが鎖の３’末端に近いヌクレオチドに相補的であるならば、堅固なステムが形成される。そうでなければ、その時はより低い親和性の相互作用が存在し、そして適切な選択された条件下では、ステムは形成されないと考えられる。ステム形成は鎖の３’末端を結合遊離プライマーにはもはや利用不可能にするので、完全なステムを形成する鎖の増幅が、実施例１に示されているように阻害される。プライマーの５’伸長の長さは、ループの所望のサイズ、または別の構造または酵素認識部位を形成することが望ましいか否かに依存して変化することができる。
【０２０１】
対立遺伝子特異的様式でプライマー中に組み入れられることができる別の構造は、（ｉ）制限エンドヌクレアーゼなどの様々なＤＮＡ修飾酵素の認識部位、（ｉｉ）非常に安定であることができる、またはバクテリオファージレゾルバーゼ（例えば、Ｔ４Ｅ７、Ｔ７Ｅ１）などの酵素により認識されることができる十字型ＤＮＡ構造、または（ｉｉｉ）ジンクフィンガータンパク質、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼ、または転写因子などの（好ましくは耐熱性生物に由来する）ＤＮＡ結合タンパク質の認識部位を含む。そのような構造は、ＤＮＡへの対立遺伝子特異的結合、または修飾に影響を与えることができる。例えば、ＴａｑＩなどの耐熱性制限酵素の認識配列を含む１個の対立遺伝子由来の鎖によってのみ（または優先的に）形成される二本鎖が考慮される。対立遺伝子特異的鎖切断は、ＰＣＲ中に（耐熱性）ＴａｑＩを含めることにより達成されることが可能であり、各切断鋳型分子の完全な不活性化およびそれによる対立遺伝子選択的増幅につながる結果となる。
【０２０２】
そのような方法の限界は何であろうか？一つの要件はＰＣＲアンプリコン中の他の場所にはＴａｑＩ部位が存在しないことである；別の要件は２個の対立遺伝子の１個がＴａｑＩ認識配列を形成しなければならないことである。これらの制限は、内部プライマーループとともに５’プライマーを伸長設計することにより部分的に解決することが可能であり、内部プライマーは、（ｉ）分断回文構造である、または（ｉｉ）認識配列からいくらかの距離はなれて切断するような、稀に切断する制限エンドヌクレアーゼの認識配列を形成し、一方（ｉ）分断回文構造の別の末端、または（ｉｉ）制限酵素の切断部位を多型ヌクレオチドにもたらし、そしてそれゆえ多型部位において二本鎖または（部分的にまたは完全に）一本鎖領域が存在するか否かに感受性である。この計画のＰＣＲ実施のための好ましい酵素はＢｓｌＩ
2004511210.tif 000005
およびＭｗｏＩ
2004511210.tif 000006
などの好熱菌由来の酵素を含む。
【０２０３】
他の別の計画は、プライマー末端よりはむしろ内部にステム形成ヌクレオチドを設置することを必要とする。
【０２０４】
上記および実施例１において記載されている実験は、ＰＣＲ中のステム形成を指向し、ステムがアニーリング温度〜５０℃またはそれ以上で安定であることが必要である。しかしながら、３ＳＲおよびその他などの、等温増幅法もまた対立遺伝子特異的増幅を達成するために使用されうる。等温増幅法に関しては、ループ形成配列は、３７℃、４２℃またはその他の増幅に適した温度における、二次構造形成における最大の対立遺伝子識別を達成するために、異なるように設計することができる可能性が高い。これは、二本鎖領域の長さを短くすることにより達成されうる。実施例１はＰＣＲを基礎とする方法の典型的な長さの二本鎖領域を提供する。より短い二本鎖は等温増幅法に関して実験的に試験できる。
【０２０５】
本明細書において記載されている方法は、４ｋｂまでの断片長において達成されうる、優れた対立遺伝子特異性を提供する。
【０２０６】
ＩＩ．Ａ．６　濃縮法の他の考慮
ハプロタイプ決定に必要とされる対立遺伝子濃縮の程度：
本明細書において記載されている任意の方法による対立遺伝子濃縮は、正確および再現性のあるハプロタイプ決定結果を生むために、定量的または完全に選択的である必要はない。１つの対立遺伝子が他のものよりもより多い量で矛盾なく存在する限り、濃縮後両方の対立遺伝子が依然として存在するとしても、引き続く遺伝子型決定試験において対立遺伝子間の十分な識別を生産するのに、濃縮が適切であってもよい。好ましくは、鎖濃縮の程度は少なくとも１．５倍であり、より好ましくは２倍であり、より好ましくは少なくとも４倍であり、さらにより好ましくは少なくとも６倍であり、そして最も好ましくは少なくとも１０倍である。さらに１０倍を超える濃縮は望ましいが、しかしハプロタイプ決定試験の精度に有意な変化を生じる可能性は低い。所望の対立遺伝子を部分的に濃縮したのみのＤＮＡ集団を用いたハプロタイプ決定の妥当性は、異なる既知の対立遺伝子比に関連する誤謬率を決定するために、既知試料の反復解析により決定されうる。
【０２０７】
ハプロタイプ決定に必要とされる濃縮対立遺伝子の収量：
どの濃縮処理も選択された対立遺伝子の１００％回収が可能でないため、対立遺伝子濃縮後は、開始時のＤＮＡ分子数より必ず少ない数の遺伝子型決定解析用のＤＮＡ分子集団を有する。しかしながら、濃縮中には、高度の対立遺伝子選択性が必ずしも必要ではないので、高収率の濃縮対立遺伝子も必ずしも必要はない。濃縮対立遺伝子の量はもちろん部分的には開始ＤＮＡの量に依存する。したがって、引き続く遺伝子型決定段階（通常はＰＣＲに基づく）が、１ｎｇのゲノムＤＮＡ中に通常見出されうる量の鋳型（〜３００コピー）を増幅するために十分の感度を有するならば、１マイクログラムのゲノムＤＮＡを用いて開始するハプロタイプ決定実験においては、開始物質中のわずかに小さな割合の対立遺伝子（０．１％まで少ない）が対立遺伝子濃縮処理により捕捉されなければならない。必要ならば、遺伝子型決定処理のＰＣＲ増幅段階は、ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ（最初にプライマーの外側組を用い、その後内側組を用いる、２ラウンドのＰＣＲ）またはＰＣＲサイクル数を増加させるなどの、当技術分野において既知である方法を用いて感度を増加させるために修飾することが可能である。また、捕捉された対立遺伝子の低い効率を補うために、投入するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの量は、２μｇ、４μｇ、または１０μｇまたはそれ以上でまで増加させることが可能である。好ましくは、濃縮処理により捕捉される、投入対立遺伝子の割合は、少なくとも開始時の対立遺伝子の数の０．０１％であり、より好ましくは少なくとも０．０５％であり、ずっとより好ましくは少なくとも０．２５％であり、ずっとより好ましくは少なくとも２％であり、最も好ましくは少なくとも１０％である。投入対立遺伝子の依然としてより高い割合を補足することは、処理の性能には有意に寄与せず、鎖濃縮の選択性に妥協するならば実際それは好ましくない。
【０２０８】
ハプロタイプ決定されるＤＮＡ分子のサイズの調整：
ＤＮＡ断片の対立遺伝子濃縮処理を実施する前に、無作為または特異的切断処理により投入ＤＮＡのサイズを調整することが望ましい可能性がある。１つの理由は、非常に長いＤＮＡ断片は、より短い断片よりも選択的に濃縮されることは有意により困難である可能性がある（例えば、せん断力が長い断片を切断するより高い傾向、または長い断片が分離に必要とされる粒子またはマトリックスに接着または捕捉されるより高い傾向のため）。したがって、ハプロタイプ決定される領域（解析される生物学的問題、および解析される領域内の連鎖不平衡の程度を含む、ＤＮＡ多型の場所または関係により決定される；上記の考察を参照）のサイズよりもわずかにほどよくより大きいＤＮＡ断片を生産することが好ましい。ハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメントは、遺伝子、遺伝子部分、プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサーエレメントなどの遺伝子制御領域、または関心対象の生物学的現象において役割を果たす可能性が高いと考えられる任意の他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。
【０２０９】
所望のサイズ範囲のＤＮＡ断片の生産は、無作為断片化処理（例えば、ピペッティング、撹拌またはネブライザーの使用によりＤＮＡをせん断するなど）を用いて、部分的または完全な制限エンドヌクレアーゼ消化により、または大腸菌ＤＮＡａｓｅＩなどのＤＮＡａｓｅに調節して曝露することにより、達成することが可能である。
【０２１０】
部分的ヌクレアーゼ消化などの無作為または半無作為ＤＮＡ断片化処理を用いて、ハプロタイプ決定されるほとんど全領域にかけての（および対立遺伝子濃縮に効果を与えるために使用される部位を含む）ＤＮＡ断片の集合を生産することが目的である。算術的方法は、最適なサイズ分布（例えば、ＤＮＡ切断点の無作為な分布を仮定して、断片の８０％が標的領域をまたぐサイズ分布が選択されてもよい）を決定するために使用することが可能である。好ましくは少なくとも５０％のＤＮＡ断片がこのサイズ範囲に存在する。
【０２１１】
完全な制限エンドヌクレアーゼ消化は、特にハプロタイプ決定される全ＤＮＡ配列またはＤＮＡセグメントの制限地図が既知であるときは、投入ＤＮＡ分子のサイズを調節する別の有用な方法である。多型部位においてＤＮＡを切断する酵素を用いた制限消化は、異なる対立遺伝子から異なる長さの制限断片（いわゆる、制限断片長多型、すなわちＲＦＬＰ）を生産する。ＲＦＬＰを生産する制限酵素部位において切断することは、ゲノムＤＮＡ試料中の２個の対立遺伝子の１個のみが結合部位を含むように、ＤＮＡ結合分子（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡまたはＤＮＡに結合する低分子）の結合部位を含むまたは含まないＤＮＡ分子を生産するために使用することが可能である。この方法が機能するためには、対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合分子の全ての結合部位の場所が考慮されなければならない。特異的なＤＮＡ切断によるハプロタイプ決定されるＤＮＡ分子の調製は、対立遺伝子特異的結合段階において最適に実施されうる分子を生産するように、実施することが可能である。
【０２１２】
一本鎖ＤＮＡがハプロタイプ決定のための投入物質であるならば、その時は好ましくはＤＮＡ分子の最適なサイズ分布は、ＤＮＡが依然として二本鎖である一方で、上述の任意の方法を用いて取得される。引き続いて、試料は変性され、対立遺伝子濃縮段階に供され、そして引き続いてハプロタイプを決定するために遺伝子型が決定されうる。
【０２１３】
一本鎖ＤＮＡに対する二本鎖の使用：
対立遺伝子選択は一本鎖または二本鎖ＤＮＡを用いて達成されてもよい。好ましくはＤＮＡ断片の最適なサイズ分布を達成するために、サイズ決め処理を二本鎖ＤＮＡに適用した後で二本鎖ＤＮＡを変性することにより、例えば加熱により、またはアルカリ処理により、一本鎖ＤＮＡは生産される。一本鎖および二本鎖ＤＮＡ法はともに利点および欠点を有する。一本鎖法の１つの利点は、ワトソン−クリック塩基対形成の特異性が、１個の対立遺伝子の親和性捕捉に利用可能であることである。一本鎖法の欠点は、（ｉ）一本鎖ＤＮＡ分子が自身（複雑な二次構造を形成する）、または他の部分的にのみ相補的である一本鎖分子にアニールする傾向を含むことであり、例えば普遍的に存在するヒトＤＮＡ反復単位Ａｌｕ（約２８０ヌクレオチド長までの長さ）は２個の非相補的鎖がアニールすることをもたらしうる；（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡは二本鎖ＤＮＡよりも、より損傷されやすいことである。鎖切断は、ハプロタイプ決定に必須である物理的な連接を破壊する。
【０２１４】
二本鎖ＤＮＡは、本発明のハプロタイプ決定法の開始点として、一本鎖ＤＮＡに対していくつかの利点を有する。第一に、それはより破壊を受けにくいことである。第二に、自身または他のＤＮＡ分子（一本鎖または二本鎖のいずれか）に非特異的に結合する可能性はより低いことである。第三に、対立遺伝子濃縮の基礎を提供することができる、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡまたは修飾オリゴヌクレオチド間（例えば、フーグステンまたは逆フーグステン型塩基対形成を介して）、および、二本鎖ＤＮＡおよび低分子（例えばポリアミド）間の高親和性相互作用ならびに、二本鎖ＤＮＡおよびタンパク質（例えば、制限酵素、転写因子、天然および人工のジンクフィンガータンパク質）の間の、多様な高親和性、配列特異的相互作用が存在することである。対立遺伝子濃縮に利用可能な別の構造型は、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）などのＤＮＡ様分子により二本鎖ＤＮＡ分子が鎖侵入されることにより形成される、Ｄ−ループである。Ｄループ形成は、当技術分野において既知である方法を用いて大腸菌ＲｅｃＡタンパク質を添加することにより促進することが可能である。第四に、制限酵素切断二本鎖ＤＮＡは、親和性選択（例えば、アダプター鎖へのライゲーション）、鎖破壊（例えば、１個の対立遺伝子にはそうであるが、別の対立遺伝子にはそうではない、対立遺伝子選択的破壊）、環状化、および下記のその他の処理を含む、対立遺伝子特異的処理の基礎を提供することができる終端を有しうることである。
【０２１５】
ＩＩ．Ｂ．光学マッピング法
別の型のハプロタイプ決定法は、多型部位において対立遺伝子特異的変化を生じる様式で処理された、単一のＤＮＡ分子の顕微鏡的可視化を含む。これらのハプロタイプ決定法は、米国特許第５，７２０，９２８号のＤ．Ｓｈｗａｒｔｚの光学マッピングおよび配列決定法を基礎とする。
【０２１６】
これらの方法は、選択された遺伝子の２またはそれ以上の多型を含むＤＮＡ断片を平面表面に固相化する段階；（ｂ）薬剤の選択的結合を許容する条件下で第一の多型に選択されたヌクレオチドを有する対立遺伝子に選択的に結合する薬剤に固相化ＤＮＡ断片を接触させる段階；（ｃ）第二の薬剤の選択的結合を許容する条件下で第二の多型に選択されたヌクレオチドを有する対立遺伝子に選択的に結合する第二の薬剤に固相化ＤＮＡ断片を接触させる段階；および（ｄ）少なくとも１つのＤＮＡ断片上で第一および第二の薬剤の位置を光学マッピングする段階を含む。
【０２１７】
１個の対立遺伝子に選択的に結合する薬剤は、ゲノム試料中の１個の対立遺伝子のなかに存在する２またはそれ以上の多型に相補的なオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）であることが可能である。好ましくは、Ｄループ形成は、標的固相化断片の１個の特異的な鎖に完全にマッチするオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）により促進される。Ｄループ形成は、ＲｅｃＡタンパク質の添加、または塩濃度の変更により、増強されうる。
【０２１８】
別の実施態様においては、１個の対立遺伝子に選択的に結合する薬剤はタンパク質、例えば、多型ヌクレオチドにおいて２個の対立遺伝子の１個に結合する２個またはそれ以上のジンクフィンガータンパク質、であることが可能である。
【０２１９】
好ましい実施態様においては、２個またはそれ以上の対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合薬剤、例えば、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ結合タンパク質、が検出可能に標識されてもよい。
【０２２０】
固相化されたＤＮＡ断片は、サイズ選択処理に最初に供され、そして／または調整されたガラス表面に固相化されてもよい。
【０２２１】
ＩＩ．Ｂ．１　光学マッピング技術
ＤＮＡ分子上の対立遺伝子特異的薬剤の位置を光学マッピングする１つの方法は、直接ＤＮＡを可視化するために顕微鏡を使用することである。Ｄａｖｉｄ　Ｓｃｈｗａｒｔｚおよび共同研究者は、彼らが光学マッピングと称している、修飾ガラス表面上における巨大ＤＮＡ断片の解析法の一団を開発した。具体的には、Ｓｃｈｗａｒｔｚおよび共同研究者は、巨大ＤＮＡ断片を調製し、酵素への接近性を保持させながら伸長した状態で修飾ガラス表面にそれらを固定化し、染色後顕微鏡的にそれらを可視化し、そしてＤＮＡ分子の画像を回収および処理し巨大分子のＤＮＡ制限地図を生産するための方法を考案した（Ｌａｉら、「熱帯熱マラリア原虫全ゲノムのショットガン光学地図（Ａ Ｓｈｏｔｇｕｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｐ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｅｎｔｉｒｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｇｅｎｏｍｅ）」Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９９ Ｎｏｖ；２３（３）：３０９〜１３；Ａｓｔｏｎら、「大規模配列決定プロジェクトにおける光学マッピングおよびその能力（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｎｄ Ｉｔｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ｊｕｌ；１７（７）：２９７〜３０２；Ａｓｔｏｎら、「光学マッピング：詳細なマッピングのための方法（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｆｏｒ Ｆｉｎｅ Ｍａｐｐｉｎｇ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９；３０３：５５〜７３；Ｊｉｎｇら、「アレイ化液体固定ＤＮＡ分子を用いた自動高分解能光学マッピング（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ａｒｒａｙｅｄ Ｆｌｕｉｄ−Ｆｉｘｅｄ ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９９８ Ｊｕｌ ７；９５（１４）：８０４６〜５１）。多くの画像化および画像解析段階は自動化されている（上記引用記事およびＡｎａｎｔｈａｒａｍａｎら、「光学マッピングを介するゲノム学　ＩＩＩ：ゲノムＤＮＡのコンティグ化（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｖｉａ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍａｐｐｉｎｇ ＩＩＩ：Ｃｏｎｔｉｇｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）」Ｉｓｍｂ． １９９９；（６）：１８〜２７）。多くの光学マッピング法がまた米国特許第５，７２０，９２８号に記載されてもいる。
【０２２２】
Ｓｃｈｗａｒｔｚおよび共同研究者の光学マッピング法は、現在までのところ、概して、制限エンドヌクレアーゼを用いて、固相化され表面に結合した二本鎖ＤＮＡ分子を処理することにより、巨大ＤＮＡセグメントまたはゲノムの制限エンドヌクレアーゼ地図を生成することに限られてきた。より低い程度ではるが、これらの方法は単一のＤＮＡ分子上のＤＮＡポリメラーゼを研究することに適用されてきた。例えば、熱帯熱マラリア原虫ゲノムの完全なＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限地図は光学マッピングを用いて作製された。解析された断片の平均断片長は５８８〜６６６ｋｂであり、そして地図の平均カバー率はＮｈｅＩに関して２３ＸおよびＢａｍＨＩに関して３１Ｘであった（すなわち、平均してゲノムの各ヌクレオチドが、２３または３１の異なる解析断片中に存在した。この高いレベルの重複はより高い地図精度を提供する）。熱帯熱マラリア原虫は〜２４．６メガベースのゲノム長を有し、そして、ＢａｍＨＩ地図の３１Ｘの重複を考慮すると、〜７６３ｍｂが解析された。〜３，３００ｍｂであるヒトゲノムはこの実験のほんのわずかに約４倍大きいだけである（非常に正確な結果には不十分であろう１Ｘのカバーとはいえ）。しかしながら、ヒトゲノムの数倍相当に相当する断片とともに、高密度ＤＮＡ断片および／またはより大きな表面を用いて、ガラススライドを調製することも可能である。統計学的に信頼できるハプロタイプ決定結果は、下記の方法を用いてそのようなＤＮＡ処理から取得可能である。全ゲノム調製の代わりに、ゲノムのサイズ選択分画、または広範囲増幅産物がまた、本明細書に記載されているハプロタイプ決定法に関して使用されうると考えられる。
【０２２３】
いくつかの方法が、ハプロタイプ決定のための最適なマッピング技術に連結可能である：（ｉ）ハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメント上の多型部位において切断する酵素を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化、（ｉｉ）対立遺伝子特異的Ｄ−ループを形成するための、多型部位に相当するＰＮＡの添加、（ｉｉｉ）多型である配列を認識する、および結果として対立遺伝子の１セットのみに結合する、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の添加。上述の、例えば、上記ＩＩ．Ａ．１節の対立遺伝子特異的ＤＮＡ結合タンパク質の様々な型が、この局面においては全て有用であるが、しかしながら、ジンクフィンガータンパク質の配列認識および高親和性結合の観点からの万能性が、それらをＤＮＡ結合タンパク質の好ましいクラスとする。ジンクフィンガーおよび光学マッピングに基づく好ましいハプロタイプ決定法は以下の段階からなる：（ｉ）Ｓｃｈｗａｒｔｚの方法に従い、固定化された、伸長ＤＮＡ分子を調製する段階、（ｉｉ）ハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメント中の多型を認識するジンクフィンガーを添加する段階。好ましくはジンクフィンガーは、例えば融合タンパク質を作製するなど検出可能な標識を用いて合成される、または、それらは翻訳後に標識される。好ましくは、異なるジンクフィンガーは、検出可能な差異を生じる２つまたはそれ以上の異なる方法を用いて（融合タンパク質を作製することによる、または翻訳後化学修飾によるのいずれか）標識される。理想的には、２個またはそれ以上のジンクフィンガータンパク質がＤＮＡ分子に結合する時に、標識パターンが生成されるように少なくとも２個の異なる標識がジンクフィンガータンパク質に関して使用される。ジンクフィンガータンパク質間の距離、ならびにそのパターンは、タンパク質が結合するＤＮＡ分子を同定する助けとなる記号を提供する。
【０２２４】
ＩＩ．Ｂ．２　原子力顕微鏡
本発明の別の実施態様においては、原子力顕微鏡を、光学マッピングに関して上述されているのと十分に類似した様式において使用することができる。ＤＮＡ結合タンパク質、好ましくはジンクフィンガータンパク質を添加することにより、または多型部位において他の検出可能な複合体を形成することにより、検出可能な構造が多型部位において形成されうる。多型部位において検出可能な構造を形成する別の方法は、好ましくはＰＮＡ分子を用いた、鎖反転である。ＰＮＡ分子の適切な設計および最適化により、対立遺伝子特異的鎖反転がもたらされうる。
【０２２５】
光学マッピングに基づくハプロタイプ決定法に関しては、ハプロタイプ決定される分子はＰＣＲ産物またはゲノムＤＮＡ断片のいずれかであってもよい。
【０２２６】
ＩＩＩ．ＡｐｏＥ遺伝子型およびハプロタイプ
ＡｐｏＥ遺伝子の新規の多型が本明細書に記載されている。本明細書に記載されている遺伝子型決定およびハプロタイプ決定法を、未知試料のＡｐｏＥ遺伝子型およびハプロタイプを決定するために使用することが可能である。これらの遺伝子型決定およびハプロタイプ決定法は、全ＡｐｏＥ遺伝子全体（プロモーター、エクソン、イントロンおよび隣接ＤＮＡ）における変異の、血清コレステロール、ＣＨＤ危険度、ＡＤ危険度、神経変性疾患または脳外傷の予後、患者の様々な治療への応答、および本明細書に記載されている他の医学的に重要な変数における変動に対する寄与をより正確に測定できると思われる。本明細書に記載されている方法は、単独で、または他の適切な遺伝子に関する遺伝子試験と組み合わせてのいずれかで、神経学的、精神医学的または心血管疾患の診断、予知、または薬理ゲノム学試験の開発を成功させるために必要な程度の感度および選択性を提供することができる。
【０２２７】
いくつかの米国特許は、ＡｐｏＥハプロタイプ決定法に関するものであり、そしてその情報を用いて患者が遅発性型アルツハイマー病を発症する可能性が高いか（米国特許第５，５０８，１６７号、５，７１６，８２８号）、認知障害を有する患者がコリン様作動薬に応答する可能性が高いか（米国特許第５，９３５，７８１号）または非アルツハイマー神経疾患を有する患者が治療に応答する可能性が高いか（米国特許第５，５０８，１６７号）を予測する。ＡｐｏＥ試験は、一般的にはＡｐｏＥを、イプシロン２、イプシロン３、およびイプシロン４（および略語のε２、ε３およびε４）と名づけられた、３個の遺伝子変異体型に分類することを基礎としている。これらの変異体型はＡｐｏＥ遺伝子内の２個の多型部位に基づいて識別可能である。両方の部位の状態が、被験者中に存在する対立遺伝子を決定するために試験されなければならない。２個の多型部位は、プロセスされたＡｐｏＥタンパク質のアミノ酸１１２位および１５８位に相当するＡｐｏＥ ｃＤＮＡ（ジェンバンクアクセッション番号Ｋ００３９６）のヌクレオチド４４８および５８６に存在する。両部位におけるヌクレオチド多型はＴ対Ｃであり、そして両方の部位において、Ｔがシステインをコードし、そしてＣがアルギニンをコードする、システイン対アルギニンのアミノ酸多型に関連している。両方の多型部位にＴが存在すると（１１２位および１５８位の両方の残基でシステイン）ε２と指定され、部位４４８においてＴおよび部位５８６においてＣであれば（１１２位においてシステイン、１５８位においてアルギニン）ε３と指定され、そして両方の可変部位においてＣ（１１２位および１５８位の両方がアルギニン）であればε４と指定される。遺伝子のこれらの３つの変異型は（まれな変異型とともに）は、変異体型の頻度は集団毎に変動していて、実質的に全てのヒト集団において生じている。ε３変異体型が全ての集団で最も多く存在しており、一方ε２およびε４の頻度は変動する。無数の研究がＡｐｏＥ対立遺伝子および様々な疾患または生化学的異常の間の関連を証明してきた。例えば、ε４変異体型は、遅発性型アルツハイマー病の危険度および血清コレステロールレベルの上昇と相関する。
【０２２８】
コレステロールおよびトリグリセライドレベルおよび心疾患危険度に影響を与えるＡｐｏＥ遺伝子型およびハプロタイプと相互作用するかもしれない変数は、ＡｐｏＥ受容体（低密度リポタンパク質受容体、および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）をコードする遺伝子、および他のアポリポタンパク質およびその受容体、ならびに、ヒドロキシメチルグルタリル−コエンザイムＡ還元酵素、メバロン酸合成酵素、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、スクアレン合成酵素およびその他の酵素を含む、コレステロール生合成の遺伝子を含む。
【０２２９】
本明細書に記載されている方法は、ＡｐｏＥ変異の非常に感度の高い試験を提供することが可能である。具体的には、発明者は、ＡｐｏＥ遺伝子内および周囲に（伝統的に研究されてきた２個の多型を含む）２０個のＤＮＡ多型を記載している（表２を参照）。より重要なことには、発明者は、ＡｐｏＥ座位においてよく生じるハプロタイプ（すなわち、個々の染色体上で共に生じる多型ヌクレオチドの組）および臨床試料においてハプロタイプを決定する新規方法を記載している。臨床環境において、その有用性を増強させるために、ＡｐｏＥハプロタイプから最大限の情報を抽出するデータ解析戦略もまた記載されている。
【０２３０】
ＡｐｏＥハプロタイプは、本明細書において表２中に記載されている配列多型、またはそれらの多型の任意のサブセットから組み立てられることが可能な任意のハプロタイプを含むことができる。したがって、本発明は、明白に、同定された多型部位の任意の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の別のヌクレオチドのいずれかを含むハプロタイプを含む。ハプロタイプは、明白に、ハプロタイプに含まれている各部位において別のヌクレオチドの各選択を有する、部位の各組み合わせを含む。ハプロタイプはまた、１またはそれ以上の付加的な多型部位を含んでもよい。ハプロタイプの中で、現在のε２、ε３、ε４分類に沿っているが、しかしε２、ε３、ε４システムを指定するいずれのヌクレオチドも関与しないハプロタイプ組が以下に記載されている。
【０２３１】
ＡｐｏＥ遺伝子型決定またはハプロタイプ決定が試験された表現型は多数の遺伝子により決定され、そしてそれゆえ２個またはそれ以上の遺伝的座位における変異を同時に解析することを必要とする。本出願のハプロタイプ決定法は、（ｉ）集団または複数の集団中に相当の頻度で存在する実質的に全てのハプロタイプを同定することと、（ｉｉ）統計学的解析を容易にし、それにより関連解析の能力を増加させるために、ハプロタイプを２つまたはそれ以上のハプロタイプ群にクラスター化させることに関する基礎を提供することでそのような解析を促進する。
【０２３２】
本発明の他の特徴および利点は、その好ましい実施態様の以下の記載、および特許請求の範囲から明らかになると思われる。
【０２３３】
変異に関するＡｐｏＥ遺伝子のスクリーニング
ＡｐｏＥ遺伝子およびそれがコードするタンパク質における遺伝的にコードされた機能的な変異をよりよく理解するために、発明者は、ＡｐｏＥ座位における遺伝的変異を系統的に分類した。ＡｐｏＥゲノム配列はジェンバンクアクセッション番号ＡＢ０１２５７６に表される。遺伝子は４個のエクソンおよび３個のイントロンから構成される。転写開始部位（第１エクソンの最初）はジェンバンクアクセッション番号ＡＢ０１２５７６のヌクレオチド（ｎｔ）１８，３７１である、一方転写される領域の末端（３’非翻訳領域の末端、ポリＡ鎖を除く）はｎｔ２１，９５８である（表２）。
【０２３４】
発明者はヌクレオチド１６，３８２〜２３，９８４のＡｐｏＥゲノム配列をカバーするＰＣＲプライマー対を設計した。したがって、発明者は、解析は転写開始部位の１，９８９ヌクレオチド上流から開始し、全遺伝子に渡って伸長し、そして最終エクソン後２，０２６ヌクレオチドで終結した。ＤＮＡのこのセグメントは、上流、下流、または遺伝子間転写制御配列に影響を与えうる、または、ＲＮＡプロセシング（スプライシング、キャッピング、ポリアデニル化）、ｍＲＮＡ輸出、翻訳効率、ｍＲＮＡ半減期、またはｍＲＮＡ制御因子との相互作用に影響を与えるように転写配列を変更しうる、またはアミノ酸コード配列に影響を与えうる、任意の多型を見出すことを可能にするために選択された。
【０２３５】
別々には、ＡｐｏＥ ｃＤＮＡは多型がスクリーニングされた。ＡｐｏＥ ｃＤＮＡ配列は１１５６ｎｔをカバーするジェンバンクアクセッション番号Ｋ００３９６から取得された。ヌクレオチド４３から１１２９はＤＮＡ配列決定によりスクリーニングされた。
【０２３６】
発明者らはまた、制御エレメントの多型がＡｐｏＥレベルに影響を与えるかもしれないことを期待して、ＡｐｏＥ遺伝子の３’末端の約１５ｋｂに位置する推定ＡｐｏＥエンハンサーエレメントの多型も探索した。エンハンサー配列はＡｐｏＥ遺伝子（ＡＢ０１２５７６）と同一のジェンバンクアクセッション番号に存在する。多型がスクリーニングされたセグメントはｎｔ３６，７３７から３７，４９８に伸長する。
【０２３７】
模範的な多型スクリーニング法は実施例３に記載されている。簡単には、様々な地理的、人種的および民族背景の３２人の被験者のパネルがスクリーニングのために選択された。
【０２３８】
全体で２０個の多型部位が同定され、そのいくつかは以前に文献に報告された多型に相当する（表２を参照）。発明者はまた、これらの多型とともに観察された固有のハプロタイプも報告する。表３は９個の多型部位のサブセットにおいて存在するハプロタイプの解析を示す。これらのハプロタイプは実施例１に詳細に記載されている方法を用いて決定された。
【０２３９】
表４はＡｐｏＥ遺伝子の４２個の付加的なハプロタイプの配列を提供する。任意の所定のハプロタイプにおいて、列記されたヌクレオチド間のＡｐｏＥ配列（例えば、１６，５４１および１６，７４７の間）は一般的にはジェンバンクＡＢ０１２５７６中のそれと同一であり、しかしながら、この表に列記されていない付加的な多型部位が存在していてもよい。特定のハプロタイプにおける特定の部位において配列が提供されないところの（例えばハプロタイプ４の部位１８１４５）、列のどこか別の場所（列１８１４５の下のＴまたはＧ）に出現する２個のヌクレオチドのいずれかが指示された部位に出現することが可能であることは理解される。
【０２４０】
ＡｐｏＥ遺伝子の他のハプロタイプが表５に示されている。この表においては、有用なハプロタイプ群が示されている。これらのハプロタイプは、１６７４７、１７０３０、１７７８５、１９３１１および２３７０７（表の行１〜４に示されているように）の部位のＳＮＰにより、または、これらの部位のサブセットにおけるＳＮＰにより：１７７８５、１９３１１および２３７０７（行５〜８）；１７０３０、１９３１１および２３７０７（行９〜１２）；１６７４７、１９３１１、および２３７０７（行１３〜１６）；１７０３０、１７７８５および２３７０７（行１７〜２０）；１６７４７、１７０３０、１９３１１および２３７０７（行２１〜２４）；または１６７４７、１７７８５、１９３１１および２３７０７（表の２５〜２８）特定される。これらのハプロタイプの１つの有用な局面は、最も右の列に示されているように古典的な表現型によく沿っていることである。すなわち、列１のハプロタイプＧＣＡＧＣは古典的なＡｐｏＥ試験によりε３と名づけられた対立遺伝子を同定する；および列３のＧＣＡＧＡが古典的なＡｐｏＥ試験によりε４と名づけられた対立遺伝子を特定する；および列４のＧＣＡＧＡが古典的なＡｐｏＥ試験によりε２と名づけられた対立遺伝子を特定する。行５〜２８のハプロタイプは、ＧＥＮＯＴＹＰＥ列に示されている、相当する古典的ＡｐｏＥ遺伝子型／表現型を有する、列１〜４におけるそれらのより単純なバージョンである。古典的ＡｐｏＥ対立遺伝子を特定する多型はヌクレオチド２１２５０（成熟ＡｐｏＥタンパク質のコドン１１２の最初の場所）および２１３８８（成熟ＡｐｏＥタンパク質のコドン１５８の最初の場所）によりコードされていることは注意されるべきである。ヌクレオチド２１２５０および２１３８８は表４において特定されているハプロタイプの因子ではない。言い換えれば、表４のハプロタイプは、現在のＡｐｏＥ対立遺伝子分類および遺伝子型／表現型試験の基礎を形成するＳＮＰとは完全に異なるＳＮＰに基づいてる。したがって、以下の表４に提供されているＳＮＰの任意の組み合わせを試験することを含む方法により、試料中の１個のハプロタイプまたはハプロタイプ対を決定することは、試料の古典的なＡｐｏＥ遺伝子型／表現型状態を決定する新規の方法を構成する。
【０２４１】
好ましくは、表５において特定されているハプロタイプまたは複数のハプロタイプは、本明細書において特定されている少なくとも１個の付加的なＡｐｏＥ ＳＮＰと関連して決定される。ハプロタイプの新しい組を形成するために。
【０２４２】
好ましくは、少なくとも１個の付加的なＳＮＰ（表５のそれらを超えて）は、３個の古典的なＡｐｏＥ表現型の少なくとも１個を２個のハプロタイプ群に分割する。例えば、表５のそれらへのヌクレオチド２１３４９のＣ／Ｔ多型の追加は、Ｅ３様ハプロタイプを２個の群；２１３４９においてＣのものと、および２１３４９においてＴのものとに分割する。表５の群へのヌクレオチド１７９３７のＴ／Ｃ多型の追加は、Ｅ２様ハプロタイプを２個の群；１７９３７においてＴのものと、および１７９３７においてＣのものとに分割する。そのような亜集団は、古典的なｅ２、ｅ３、ｅ４分類よりも、生物学的および臨床的に均一な集団に相当する可能性がより高い。
【０２４３】
実施例
実施例１．対立遺伝子特異的ＰＣＲのためのヘアピン誘導プライマーを用いたハプロタイプ決定法
少なくとも２個の異なる領域を含むプライマーが設計される。プライマーの３’部分は増幅される鋳型ＤＮＡに相当する。プライマーのこの領域の長さは変動することが可能であるが、しかし関心対象のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの領域のみを増幅する結果となるために必要とされる特異性を与えるのに十分であるべきである。付加的なヌクレオチドが、ヌクレオチド多様性を含む配列中の領域に相補的であるプライマーの５’末端に付加される。２ラウンドのＰＣＲの後、プライマーの付加されたテール領域は配列内に組み入れられる。付加されたヌクレオチドの組み入れは、正しいヌクレオチドが多様性部位に存在するならば、プライマー鎖に相補的である逆鎖にヘアピンループを形成させることを引き起こす。ヘアピンループ構造は新しいプライマーのアニーリング、それゆえさらに増幅を阻害する。
【０２４４】
上記の特性を有するプライマーは、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）遺伝子のハプロタイプ決定のために設計された。図２１〜３２を参照。ＤＰＤ遺伝子は、各々Ｃｙｓ：ＡｒｇおよびＭｅｔ：Ｖａｌのアミノ酸変化を生じる、塩基１８６（Ｔ：Ｃ）および５９７（Ａ：Ｇ）におけるコード領域に２個の多様性部位を有する（図２１）。塩基５９７における２番目の部位は、もしＡ対立遺伝子が存在するならば酵素ＢｓｒＤＩを用いて切断される制限断片長多型（ＲＦＬＰ）である。プライマーは、塩基１８６の多様性部位においてどの塩基が存在するかに依存して、ある１個の、または別の対立遺伝子を増幅する結果となるプライマーが設計された（図２２）。プライマーの５’末端に付加された塩基は、ＰＣＲ産物への組み入れに続いて、ヘアピンループを形成する。囲みで囲まれた塩基は、変異塩基にハイブリダイズし、そしてヘアピンループの対立遺伝子識別に責任を有する、付加された塩基である。ＤＰＤＮＳＦプライマーはＤＰＤ相補的配列のみしか含まず、そして対立遺伝子特異的増幅にはつながらない。図２３は、ＤＰＤ標的配列のＴおよびＡの両方の対立遺伝子の、および、このプライマーを用いた増幅により生産されたＰＣＲ産物の５’末端への非特異的ＤＰＤＮＳＦプライマーのハイブリダイゼーションを示す。図２４および２５は、プライマーＤＰＤＡＳＴＦおよびＤＰＤＡＳＣＦに関する、図２３に示されている相当する説明図である。付加された塩基が増幅に続いてＰＣＲ断片に組み入れられることに注意する。図２６は、コンピュータープログラムオリゴ４を用いて、ＤＰＤＮＳＦプライマーを用いて作製されたＰＣＲ産物の逆鎖とともに形成される最も安定なヘアピンループ構造を示す。これが、ＤＰＤＮＳＦプライマーが引き続く増幅ラウンドでハイブリダイズする鎖であるため、逆鎖のみが示されている。ヘアピンループは安定ではないか、または低い融点を有しているかのいずれかである。図２７および２８は、それぞれプライマーＤＰＤＡＳＣＦおよびＤＰＤＡＳＴＦを用いて生成されたＰＣＲ産物の逆鎖においてに形成されるヘアピンループの相当する説明図である。Ｔ対立遺伝子のプライマーＤＰＤＡＳＣＦを用いた増幅は、融点８３℃を有する非常に安定なヘアピンループを形成する可能性の結果となる（図２７）。対照的に、Ｃ対立遺伝子のプライマーＤＰＤＡＳＣＦを用いた増幅は、融点４２℃しか有さないヘアピンループを生成する。プライマーＤＰＤＡＳＴＦに関しては逆が真である。ＤＰＤのＣ対立遺伝子の増幅は極めて安定なヘアピンループ（１００℃）を形成する結果となり、一方Ｔ対立遺伝子の増幅は非常に安定性が低いヘアピン（４２℃）を形成する結果となる（図２８）。
【０２４５】
図２９〜３１は、生成されたＰＣＲ断片に関してさらなる増幅が試行された時の、プライマーハイブリダイゼーションおよび増幅事象を描写している。ＤＰＤＮＳＦプライマーはＤＰＤ遺伝子のＴおよびＣ対立遺伝子の両者と形成されるヘアピン構造を効果的に競合することが可能であり、そしてそれゆえ両方の対立遺伝子の増幅が効率的に進行する（図２９）。ＤＰＤＡＳＣＦプライマーは（図３０）、その融点がヘアピンループのそれより高いので（４２℃と比較して６０℃）、Ｃ対立遺伝子と形成されるヘアピンループとのハイブリダイゼーションを競合することが可能である。しかしながら、Ｔ対立遺伝子に関して形成されたヘアピンループはプライマーよりも高い融点を有する、そしてしたがって効果的にプライマーとハイブリダイゼーションを競合する。ヘアピンループはＴ対立遺伝子のＰＣＲ増幅を阻害し、結果Ｃ対立遺伝子の対立遺伝子特異的増幅につながる。ＤＰＤＡＳＴＦプライマーに関しては逆が真である。ヘアピンループ構造は、Ｃ対立遺伝子に関してプライマーよりも高い融点を有し、そしてＴ対立遺伝子に関してプライマーよりも低い融点を有する。これはＣ対立遺伝子上でのプライマーハイブリダイゼーションおよび伸長の阻害を引き起こし、そしてＴ対立遺伝子の対立遺伝子特異的増幅につながる。
【０２４６】
ハプロタイプが、対立遺伝子１−Ｔ１８６：Ａ５９７、対立遺伝子２−Ｃ１８６：Ｇ５９７であることが知られているｃＤＮＡ試料を用いて、ハプロタイプ決定のためにこれを使用する能力は図３２において説明されている。プライマーＤＰＤＮＳＦ、ＤＰＤＡＳＴＦおよびＤＰＤＡＳＣＦを用いての増幅により生成された５９７ｂｐからＢｓｒＤＩにより生成される断片のサイズは、部位５９７の塩基がＡまたはＧであるかに依存する。ＢｓｒＤＩによる制限消化はＡ塩基が部位５９７にあることを示している。もし断片が５９７にＡ塩基を有するならば、１３８、１６４および２６７ｂｐの長さの３個の断片が生成される。もしＧ塩基が５９７部位に存在するならば、１６４および４０５ｂｐの長さの２個の断片のみが生成される。試料が部位５９７においてＡおよびＧのヘテロ接合であるならば、１３８、１６４（２ｘ）、２６７および４０５ｂｐの全部で４個のバンドが生じる。各プライマーに関してＢｓｒＤＩ制限により生成される予測断片は図３６の囲みの中に示されている。
【０２４７】
図３３は、各プライマーが、１８６および５９７部位の両方においてヘテロ接合であるｃＤＮＡ試料を増幅するために使用され、ＢｓｒＤＩ制限が引き続くアガロースゲル泳動の写真である。ＤＰＤＮＳＦレーンは、ＤＰＤＮＳＦプライマーを用いて選択されたｃＤＮＡの制限断片パターンを示し、この試料が実際に部位５９７においてヘテロ接合であることを示している。しかしながら、同じｃＤＮＡ試料およびプライマーＤＰＤＡＳＴＦを用いると（ＤＰＤＡＳＴＦレーン）、制限パターンは部位５９７においてＡのホモ接合である試料を代表するパターンと関連する。ＤＰＤＡＳＴＦプライマーはＴ対立遺伝子の増幅のみを可能にするので、試料中のそれに関するハプロタイプはＴ１８６：Ａ５９７でなければならない。プライマーＤＰＤＡＳＣＦを用いた制限消化パターン（ＤＰＤＡＳＣＦレーン）は部位５９７にＧが存在する予測パターンと関連する。プライマーＤＰＤＡＳＣＦを用いたｃＤＮＡ試料の増幅は、試料中のＣ対立遺伝子のみ増幅する結果となる。したがってこの対立遺伝子に対するハプロタイプはＣ１８６：Ｇ５９７でなければならない。２個の対立遺伝子間でわすか１個の塩基対差異しか存在しないとしても、１個の対立遺伝子のＰＣＲ増幅を阻害するが、しかしもう一方に対しては阻害しない、ヘアピンループ構造を形成する能力を有するＰＣＲ産物に配列を組み入れるプライマーが設計可能であることがこれにより証明される。これは、ＤＮＡ試料の対立遺伝子特異的増幅およびそれゆえハプロタイプ決定に利用可能である。
【０２４８】
または、ポリメラーゼがその領域を通じて伸長することを阻止するのに十分安定なＰＣＲ産物の５’末端にヘアピン構造を形成することも可能であるかもしれない。これは、正確な塩基にハイブリダイズする時、ポリメラーゼによる読み通しを阻害するのに十分安定な構造を形成する修飾ヌクレオチドまたは構造をプライマーを組み入れさせることにより可能となってもよい。
【０２４９】
この発明は、さらなるＰＣＲ増幅を阻害するＰＣＲ産物の一方または両方の鎖において安定な二次構造が形成される任意の方法をカバーすることを意図する。二次構造は、塩基または複数の塩基が多様性の既知の部位に存在する時のみ形成される。二次構造は、不正確な塩基または複数の塩基がＰＣＲ産物中の多様性の部位に存在する時には形成されず、その産物のさらなる増幅は許容されない。これは、その対立遺伝子のハプロタイプ決定を特異的に許容する、試料中の２個の可能性のある対立遺伝子の１個を特異的に増幅させる。
【０２５０】
実施例２．制限酵素生産断片の質量分析解析によるＡｐｏＥ多様性の遺伝子型決定
以下の例は、Ｔ：Ｃ多様性が、タンパク質のアミノ酸１７６位におけるシステインからアルギニンへのアミノ酸変化を生じる、ＡｐｏＥ遺伝子のゲノム部位２１２５０における多様性の遺伝子型決定を記載する。ＡｐｏＥ遺伝子の標的領域を増幅する、および、２個の制限酵素部位（ＦｏｋＩ、ＦｓｐＩ）を多様性部位に近接してアンプリコン内に導入することの両方のために、２個のプライマーが設計された。図３４はプライマーおよび標的ＤＮＡの配列を示す。Ａｐｏ２１２５０−ＬＦＲプライマーは制限酵素認識部位を含むループプライマーであり、そしてＡｐｏＥ２１２５０−ＬＲプライマーはＰＣＲ増幅過程において使用されるリバースプライマーである。多型ヌクレオチドは斜字体で示されている。各遺伝子型決定反応に関して、２００μｌ　ＰＣＲチューブ中で、以下の成分がお互いに混合された。全ての容量はμｌで与えられる。
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反応物はＭＪリサーチＰＴＣ２００サーモサイクラーを用いて以下の段階でサイクリングされた。
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【０２５１】
増幅に続く、Ｔ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子の両方のアンプリコンの配列が図３５に示されている。各反応物の５μｌが除去され、そして、正しいサイズの十分なＰＣＲ産物が存在することを保証するためにアガロースゲル電気泳動により、除去および解析された。以下の構成因子がＤＮＡの制限酵素切断のためにともに混合された。白金Ｔａｑ抗体（Ｔａｑｕｅｎｃｈ、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、カタログ番号１０９６５−０１０）が、ＦｏｋＩ切断により生成された３’陥没末端の任意の可能性のある埋め込みを阻害するために添加された。全ての容量はμｌである。
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【０２５２】
上記の反応物は３７℃で１時間インキュベーションされた。図３５は各アンプリコンの切断部位を示し、そしてＦｏｋＩおよびＦｓｐＩ切断に続いて生成される８ ｍｅｒおよび１２ ｍｅｒの断片、および予測される分子量を示す。インキュベーションに続いて、反応物は固相抽出により精製され、７０％アセトニトリル水混合物１００μｌ容量中において溶出された。試料は、Ｓａｖａｎｔ ＡＥＳ２０１０スピードバック中で真空および加熱下、１時間乾燥された。試料は３μｌのマトリックス（６５ｍｇ／ｍｌの３−ヒドロキシ−ピコリン酸、４０ｍＭのクエン酸アンモニウム、５０％アセトニトリル）に再懸濁され、そして、パーセプティブバイオシステムズ２０ｘ２０テフロン被膜プレート上にスポットされた。試料はパーセプティブバイオシステムズのＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ上で解析された。
【０２５３】
実施例３．ＡｐｏＥ遺伝子の多型スクリーニング
ＰＣＲプライマーは、ＧＣ含量、融点および塩基相補性の欠失の観点からフォワードおよびリバースプライマーをマッチさせるよう試みるコンピュータープログラムにより自動的に選択された。プログラムのパラメーターは、近接するＰＣＲ産物間で少なくとも５０塩基対の重なりを有する、各々から約５００塩基対離れたプライマーを選択するようにセットされた。プライマーは、９６ウェルマイクロタイタープレート中にて受領され、滅菌脱イオン水に５ピコモル／μｌの濃度にて再懸濁された。ＰＣＲ反応は、１ＸＰＣＲ緩衝液、ポリメラーゼおよび鋳型のマスター混合物を９６ウェルプレートにピペッティングするために、プログラムされたパッカードロボットを用いてセットアップされた。開始時のＰＣＲ条件は、３０μｌ容量中に、１０ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．８３μＭフォワードおよびリバースプライマー、０．７単位アンプリタックゴールド（ＰＥ Ｃｏｒｐ）および２５ｎｇのゲノム鋳型であった。サイクリングは、ＭＪリサーチＰＴＣ２００機器を用いて以下のサイクル条件で実施された：９５℃にて１２分間の変性、続いて９４℃で１５秒の変性、６０℃で３０秒のアニーリング、７２℃で４５秒の伸長を３５サイクル、続いて７２℃で１０分間の伸長。ＰＣＲの成功は、その後産物を６％ロングレンジャー（Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ）アクリルアミドゲル上で解析することにより試験された。もし二次増幅産物がほとんどない状態から全くない状態であり、１５ｎｇの標準よりもより強いきれいなバンドを示せば、産物は合格とした。失敗したＰＣＲ産物の条件を最適化する試みは、温度、共溶媒（特にＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからのＰＣＲエンハンサー）およびポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの白金タック対アンプリタックゴールド）の体系的な変化を用いて開始された。これらの修飾により最適化されないＰＣＲ産物は廃棄され、そして１または２個の新規ＰＣＲプライマーが注文され、そしてアンプリコンの成功が生み出されるまで過程が繰り返された。
【０２５４】
最適化されたＰＣＲプライマー対は、キット薬剤が１：８に希釈され、そして、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ反応が機械的に２０μｌ容量中にセットアップされた点を除いては、キットともに提供された指示書にしたがってＡＢＩ ＢｉｇＤｙｅ ＤＮＡシークエンシングキットを用いてＤＮＡサイクルシークエンシングを実施するために使用された。
【０２５５】
シークエンス反応はＡＢＩ３７７またはＡＢＩ３７００自動化ＤＮＡ配列決定機器上で泳動された。ＡＢＩ３７７およびＡＢＩ３７００の泳動時間は類似しており、約５０００ボルトで約５時間であった。データはＡＢＩコレクションソフトウェアを用いて自動的に回収された。ＤＮＡ配列決定反応の品質は、プログラムＰＨＲＥＤを用いて自動的に評価され、および数字的に記録された。品質レベルが３０またはそれ以上のＤＮＡ配列のみが解析に許容可能であると考えられた。
【０２５６】
生の配列決定反応はその後、カスタムデータベースにインポートされ、そしてＰＨＲＥＤ、ＰＨＲＡＰおよびＰＯＬＹＰＨＲＥＤを用いて解析され、そしてその後ＣＯＮＳＥＤビューアーが視覚的にデータを検査し、そして多様性を保証するために使用された。カスタムデータベースは処理している全ての試料を追跡する、およびデータ生成、操作および提示ならびに、全ての試料取り扱い段階の実質上のノート記録として機能するために使用された。
【０２５７】
実施例４．制限酵素ハプロタイプ決定法
本明細書に記載されているように、単一ヌクレオチド多型を識別する制限エンドヌクレアーゼは、染色体、座位、遺伝子または遺伝子部分の単一のセグメントの配列を直接決定することを可能にする。制限酵素はＤＮＡを部位特異的様式で切断するために使用し、そしてしたがって、これらの多型部位においてまたはその近傍において、個人から回収されたＤＮＡ試料を消化するために使用することが可能である。本方法においては、これらの消化のアリコートが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として使用される。制限酵素部位および引き続くＰＣＲは、未切断配列と同相である対立遺伝子特異的配列を同定する、すなわちハプロタイプ決定するために、縦列で使用することが可能である。別の配列は遺伝子型から既知配列を差し引くことにより取得される。
【０２５８】
本発明の説明図は図３６に描写されている。ＡｐｏＥ遺伝子の制限地図が、特異的に制限酵素部位、５’ＣＣＡＴＧＧ配列を認識する制限酵素であるＮｃｏＩの相対的な位置を説明している。部位の１６７４７のＧ対Ｔ多型
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がＮｃｏＩ部位内に存在することは知られている。したがってこの部位内のＧは消化されるが、Ｔは認識、または消化のいずれもされない。ＮｃｏＩに対する付加的な消化部位はＧ／Ｔ多型の１６７４７部位の５’および３’に生ずる。引き続くＰＣＲにおいて使用されるプライマーは５’および３’ＮｃｏＩ消化部位の内部であることが示されている。これらのプライマーはその後、制限酵素認識部位（部位１６７４７）においてＮｃｏＩにより消化された、または消化されなかった鋳型を増幅するために使用される。したがって、もしＧが１６７４７に存在するならば、その時はＮｃｏＩはＤＮＡを消化し、そしてＰＣＲは進行しない、一方対照的に、もしＴが１６７４７に存在するならば、その時はＮｃｏＩはＤＮＡを消化せず、そしてＰＣＲは記載された条件下で進行すると思われる。
【０２５９】
既知のＧ／Ｃ多型部位を有する１７０３０部位もまたこの図に示されている。もし対立遺伝子特異的制限消化および増幅が成功するならば、１７０３０のＧまたはＣのいずれかが１６７４７のＴに関連していることが予期されるだろう。
【０２６０】
あるヒト細胞株が、１６７４７位および１７０３０位においてヘテロ接合であるため選択された（多型はＮｃｏＩ部位により定義される境界の内部にある）。ゲノムＤＮＡは当技術分野において既知である標準的な方法により単離された。各ＤＮＡ試験試料に関して、２５μｌ反応容量中１００ｎｇのＤＮＡが０単位または５単位のＮｃｏＩ酵素を用いて、２時間、４時間および６時間の間、制限された。反応物はその後６５℃にて２０分間加熱され、制限酵素を不活性化した。各ＰＣＲ反応に関して、２００μＭ　ｄＮＴＰ、２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１ＸＰＣＲ緩衝液、１ピコモルの各プライマー、０Ｘまたは１．５Ｘのエンハンサー（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）および１単位のＴａｑＨＩＦＩ（ＤＮＡポリメラーゼ、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含む２０μｌ中ＰＣＲ反応において５μｌが使用された。反応はサーマルサイクラーを用いて以下の通り実施された：（１）９４℃で１分、（２）９４℃で１５秒、（３）５２℃で１５秒、および（４）７２℃で３分、その後（２）に戻るのを全体で３５サイクル。全ての試料はその後、水で１：５００に希釈された。
【０２６１】
５’および３’プライマーが１６７４７および１７０３０の多型に隣接するように二次反応が設計される。これらのプライマーは、その後第一反応から希釈された鋳型を増幅するために使用された、これらの二次反応は、試料の各々の中の１６７４７位および１７０３０位における実際の塩基を確認するために実施された。
【０２６２】
全ての反応は質量分析を介して解析され、そしてデータは図３７Ａ〜Ｂおよび３８Ａ〜Ｂに示されている。
【０２６３】
図３７Ａ〜Ｂは上述された二次反応実験の質量分析結果を描写する。パネル３７Ａにおいては、対照反応（ＮｃｏＩなし）において、２個の大きなピークの絶対強度は、それぞれ１６７４７位においてＴまたはＧのいずれかに起因するといえる３７５７．８および３７８１．８の２個の増幅断片により説明されうる。パネル３７Ｂにおいては、ＮｃｏＩ処理反応（酵素あり）において、３７５７．８ピークが完全にスペクトルから消え、１６７４７位においてＧが存在することを、および、酵素がＴを含む鎖を切断し、そして増幅が続いて生じたことを示している。図３８Ａ〜Ｂ、パネル３８Ａにおいては、対照反応（ＮｃｏＩなし）において、２個の大きなピークの絶対強度は、それぞれ１７０３０位においてＧまたはＣのいずれかに起因するといえる３７３４．７および３７７４．８の２個の断片により説明されうる。パネル３８Ｂにおいては、ＮｃｏＩ処理反応（ＮｃｏＩあり）において、３７７４．８ピークが完全にスペクトルから消え、この位置においてＣ塩基が存在することを示している。これらの実験の結果はこのＤＮＡ試料に関するハプロタイプが１６７４７−Ｔ、１７０３０−Ｇおよび１６７４７−Ｃ、１７０３０−Ｃであることを示している。
【０２６４】
本明細書において引用されている全ての参照および特許は、その全体が参照として本出願に組み入れられる。本発明の多数の実施態様が記載されている。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修飾が実施されてもよいことは理解される。したがって、他の実施態様は以下の特許請求の範囲内である。
【０２６５】
表の説明
表１は標準ヌクレオチドおよびＢｒｄＵの質量、およびヌクレオチドの可能性のある各々の組の質量差を列記する。
【０２６６】
表２はＡｐｏＥ遺伝子の２０個の多型部位を提供する。ＡｐｏＥゲノム配列はジェンバンクアクセッション番号ＡＢ０１２５７６から取られる。遺伝子は４個のエクソンおよび３個のイントロンからなる。転写開始部位（第１エクソンの最初）はジェンバンクアクセッション番号ＡＢ０１２５７６のヌクレオチド（ｎｔ）１８，３７１であり、一方転写される領域の終端（３’非翻訳領域の末端、ポリＡ鎖除く）はｎｔ２１，９５８である。２０個の多型部位は表において影付けされたヌクレオチドとして描写されており、以下の通りである（ヌクレオチド位置および可能性のあるヌクレオチド）１６５４１（Ｔ／Ｇ）、１６７４７（Ｔ／Ｇ）、１６９６５（Ｔ／Ｃ）、１７０３０（Ｇ／Ｃ）、１７０９８（Ａ／Ｇ）、１７３８７（Ｔ／Ｃ）、１７７８５（Ｇ／Ａ）、１７８７４（Ｔ／Ａ）、１７９３７（Ｃ／Ｔ）、１８１４５（Ｇ／Ｔ）、１８４７６（Ｇ／Ｃ）、１９３１１（Ａ／Ｇ）、２０３３４（Ａ／Ｇ）、２１２５０（Ｃ／Ｔ）、２１３４９（Ｔ／Ｃ）、２１３８８（Ｔ／Ｃ）、２３５２４（Ａ／Ｇ）、２３７０７（Ａ／Ｃ）、２３７５９（Ｃ／Ｔ）、２３８０５（Ｇ／Ｃ）および３７２３７（Ｇ／Ａ）。太字配列一覧表はＡｐｏＥ遺伝子の転写される配列を示す、灰色影付きの領域はＡｐｏＥ遺伝子エンハンサーエレメントを示す。下線の配列はＡｐｏＥ遺伝子のコード領域を描写する。多型がアミノ酸配列の変化につながるところでは、アミノ酸変化が示されている、例えばヌクレオチド２０３３４位のＡ／Ｔ多型は、それぞれＡｐｏＥ遺伝子産物のアミノ酸１８位におけるアラニン／スレオニンを結果として生じる。以下の詳細な説明において記載されているように、ジェンバンクヌクレオチド番号１７８７４、１７９３７、１８１４５、１８４７６、２１２５０および２１３８８位の多型は以前に記載されている。
【０２６７】
表３は実験的に導き出されたＡｐｏＥハプロタイプを提供する。ハプロタイプはＡｐｏＥ遺伝子（ジェンバンクアクセッション番号ＡＢ０１２５７６）内の９個の多型部位を包含する。表はＡｐｏＥ遺伝子内の９個の特異的な部位におけるハプロタイプデータを有する９個の列を有する。「ＷＷＰ＃」として列記されている列は、確立されたヒト細胞株の分類番号を参照するコリエル（Ｃｏｒｉｅｌｌ）番号を参照する。「ＶＧＮＸ＿記号（ｓｙｍｂｏｌ）」列は遺伝子の内部識別子を提供する。「ＶＧＮＸデータベース」列はＡｐｏＥ ｃＤＮＡの塩基対番号を同定する、および「ジェンバンク」列はＡｐｏＥ遺伝子配列のジェンバンク塩基対番号を同定する。略語は以下の通りである。Ａ＝アデニンヌクレオチド、Ｃ＝シトシンヌクレオチド、Ｇ＝グアノシンヌクレオチド、およびＴ＝チミジンヌクレオチド。括弧中の略記されたヌクレオチドは、試料においていずれのヌクレオチドが存在してもよいことを示す。したがって、例えば、ＧＥＮ−ＣＢＸおよびＷＷＰ＃１列の下の、ジェンバンク１７８７４位において同定される遺伝子型は「Ａ」であり、一方ジェンバンク１８４７６位においてＧＥＮ＿ＣＢＸ下において、ＷＷＰ＃１の下の遺伝子型は「Ｔ」または「Ｇ」のいずれかである。
【０２６８】
表４は２０個までの多型部位を含むＡｐｏＥハプロタイプの配列を提供する。表中に列記されている４２個のＡｐｏＥハプロタイプが存在する。表の最上行はＡｐｏＥ遺伝子内の多型ヌクレオチドの場所を提供する（表２を参照）。番号（１６５１４、１６７４７およびその他）は、ＡｐｏＥ遺伝子全体および隣接ＤＮＡを含むコスミドクローンの配列を提供するジェンバンクアクセッションＡＢ０１２５７６＿１の番号付けに相当する。各列は、列の最上に示されている位置におけるＡｐｏＥ遺伝子の配列を示す。略語は以下の通りである。Ａ＝アデニンヌクレオチド、Ｃ＝シトシンヌクレオチド、Ｇ＝グアノシンヌクレオチド、およびＴ＝チミジンヌクレオチド。各行は個々の表現型の配列を提供する。
【０２６９】
表５は５個の多型部位により決定されるＡｐｏＥ遺伝子のハプロタイプ配列を提供する。これらのハプロタイプは、ｅ２、ｅ３、ｅ４状態を決定するために従来使用されてきた多型部位に頼ることなく、ＡｐｏＥ対立遺伝子をｅ２、ｅ３、およびｅ４群に分類することを可能にする。この表において、列の見出しとして列記されている１６７４７、１７０３０、１７７８５、１９３１１および２３７０７位におけるＳＮＰによりハプロタイプが特定される。ＧＥＮＯＴＹＰＥ列は、各列に示されているハプロタイプに相当する古典的ＡｐｏＥ遺伝子型／表現型（ｅ２、ｅ３、およびｅ４）を提供する。
【０２７０】
【表１】ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびＢｒｄＵＴＰ間の質量差
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【０２７１】
【表２】示された多型を有するＡｐｏＥゲノム配列（ジェンバンクアクセッション番号ＡＢ０１２５７６）
（アクセションの部分配列）
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＝多型（多型ｎｔが番号付けされる）
太字＝ＡｐｏＥ転写配列（エクソン１〜４）
＝ＡｐｏＥエンハンサーを含む
下線＝ＡｐｏＥ遺伝子コード領域
＊＝当技術分野において以前に記載されていない多型
【０２７２】
【表３】
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【０２７３】
【表４】ＡｐｏＥハプロタイプ
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【０２７４】
【表５】ＡｐｏＥハプロタイプの１つの有用な群
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【図面の簡単な説明】
【図１】特定の制限酵素ＦｏｋＩおよびＦｓｐＩの制限酵素認識部位を組み入れるように設計されたプライマーの描写。プライマー（プライマーＲ配列）は標的ＤＮＡの所望の増幅領域由来の変更された塩基を有する。多型ヌクレオチドは標的ＤＮＡ領域に含まれている、および矢印により示されているように存在する。ＰＣＲ増幅後、組み入れられたプライマーの変更塩基対はそれによりアンプリコン中にＦｏｋＩおよびＦｓｐＩ制限酵素部位を組み入れる。アンプリコンは、引き続いて、両酵素による消化の最適条件下でＦｏｋＩおよびＦｓｐＩ制限酵素存在下で消化されうる。酵素消化後の結果としての断片は、８ ｍｅｒおよび１２ ｍｅｒであり、描写されている通りである。この図において、多型（Ａ、斜字体）は１２ ｍｅｒ断片内に含まれている。
【図２】この図は、ある鎖上において認識部位の３’に９塩基の距離で、認識配列の外側で、そして別の鎖上の認識部位から１３塩基離れてＤＮＡを切断し、４塩基突出（突出している５’末端）を残す、タイプＩＩＳ制限酵素であるＦｏｋＩの有用性を描写している。この図に示されているように、ＦｏｋＩ認識部位がプライマーの３’端から１２塩基またはそれ未満に位置するようにプライマーを設計することにより、ＦｏｋＩ切断がプライマー配列の外側で切断することを確実にすることが可能である。消化後に平滑末端を残す制限酵素であるＦｓｐＩの有用性がさらに示されている。消化後、ＦｓｐＩ認識部位、ＴＧＣＧＣＡ、は、示されているような断片を生じる。
【図３】この図においては、本発明に関するＦｏｋＩ／ＦｓｐＩの酵素対の有用性が示される。ＦｓｐＩ認識部位はＦｏｋＩ認識部位と重複し、２つの部位が部分的に組み合わせられることを可能にする。したがって、プライマー中に組み合わせＦｓｐＩ／ＦｏｋＩ配列を含むことは、修飾プライマー中に導入される塩基数を減少させ、プライマー設計をより単純にし、そして引き続く増幅反応において機能する可能性をより高くする。
【図４】この図においては、本発明におけるプライマー設計の別の方法が、内部ループを有するプライマーを使用することを含む。プライマー（プライマーＲ１）は天然型配列に相当する塩基の１つが除去され、そしてループで置換されるように設計される。この事例においては、標的配列の下に矢印で示されているＧ／Ｃは、ＦｏｋＩおよびＦｓｐＩに関する認識部位で置換される。ＤＮＡ鋳型にハイブリダイゼーションされた時に、プライマーはループ構造を形成する。このループは増幅過程においてアンプリコンに組み入れられ、それによりＦｏｋＩおよびＦｓｐＩ制限酵素部位（囲みで示されている）が導入される。結果生じるアンプリコンは最適消化条件下でＦｏｋＩおよびＦｓｐＩを用いてインキュベーションされ、８ ｍｅｒおよび１２ ｍｅｒ断片を生産する。図１にあるように、１２ ｍｅｒは多型塩基（斜字体のＡ）を含み、そして多型部位の塩基を同定するために質量分析により解析することが可能である。
【図５】標的ＤＮＡの増幅された領域に別の制限酵素認識部位を組み入れることが示されている。ＦｓｐＩ／ＦｏｋＩ酵素対に関して図１〜４に描写されているように、この図において、ＰｖｕＩＩ／ＦｏｋＩ制限酵素部位が図１〜４に関して以前に記載されたのと同じ方法で組み入れられることが可能である。標的ＤＮＡ配列にプライマーがハイブリダイズする時に、ＢｓｇＩ／ＰｖｕＩＩ部位がヘアピンループ構造を形成するようにプライマーが設計される。ＰＣＲによる増幅の後、結果生じるアンプリコンは、結果生じるアンプリコン中に組み入れられたＰｖｕＩＩ／ＦｏｋＩ部位を有する（囲み配列により示されているように）。ＰｖｕＩＩおよびＢｓｇＩに関して最適消化条件下で消化した後、１４ ｍｅｒおよび１６ ｍｅｒの結果として生じた断片は、質量分析解析に十分であり、そして多型部位は１６ ｍｅｒ中に含まれる（斜字体のＡ）。
【図６】質量分析解析用の多型部位を断片を調整するための別の制限酵素対がこの図に示されている。ＰｖｕＩＩ／ＦｏｋＩ制限酵素認識部位は、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズされた時に、ヘアピンループを形成する。ＰＣＲによる増幅の後、結果生じるアンプリコンは、結果生じるアンプリコン中に組み入れられたＰｖｕＩＩ／ＦｏｋＩ部位を有する（囲み配列により示されているように）。ＰｖｕＩＩおよびＦｏｋＩ制限に関して最適消化条件下で消化した後、１６ ｍｅｒおよび２０ ｍｅｒの結果として生じた断片は、質量分析解析に十分であり、そして多型部位は２０ ｍｅｒ中に含まれる（斜字体のＡ）。
【図７】この図においては、図４に描写されている方法の修飾が示される。図４に示されているように、多型を含むＤＮＡセグメントが２個のプライマーを用いて増幅される。１個のプライマーは、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズされた時にヘアピンループを形成する、鋳型ＤＮＡに相補的ではない、挿入されたＤＮＡセグメントを用いて設計される。非相補的ＤＮＡセグメントの挿入は、ＰＣＲ増幅後に、重複しているＦｏｋＩおよびＦｓｐＩ制限酵素部位（囲みで示されている）を組み入れる結果となる。ＰＣＲ増幅反応に続いて、反応物は、未取りこみプライマー、ヌクレオチドおよび緩衝液構成成分を除去するために浄化処理に供される。ＰＣＲ産物はその後、ＦｏｋＩ制限酵素を用いて消化され、プライマーの３’末端から多型ヌクレオチドを超えて伸長する５’突出を生じる。３’陥没末端はその後、多型部位における可能性のあるヌクレオチド塩基の１つに相当する標準ヌクレオチドが質量修飾ヌクレオチド（Ｔｍｏｄ）である、外来的に添加されたヌクレオチドを用いて埋めることが可能である。これらの断片は修飾多型ヌクレオチドの質量分析解析に十分である。
【図８】引き続く消化および調整された断片の質量分析解析のために、アンプリコン中に単一の制限酵素認識部位を組み入れることがこの図には示されている。その認識部位の５’側に１つおよび３’側に１つの、２つの二本鎖切断を作製する能力がある制限酵素であるＢｃｇＩを組み入れることがこの図に示されている。ＢｃｇＩの認識部位は１２／１０（Ｎ）ＣＧＡ（Ｎ）６ＴＧＣ（Ｎ）１２／１０であり、消化後、断片を用いた質量分析解析および多型塩基同定に十分である、断片を結果生じる。
【図９】制限酵素が二本鎖切断を生じる代わりにＤＮＡアンプリコン中にニックを生成する制限酵素認識部位を含む、本発明の有用性の例がこの図に示されている。この図に示されているように、プライマーＲはＦｏｋＩ制限酵素部位に加えてＮ．ＢｓｔＮＢＩ認識部位
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を組み入れるように設計される。以前の図にあるように、プライマーは標的ＤＮＡ領域にハイブリダイズされた時にヘアピンループ構造を形成する、しかしながらＰＣＲアンプリコンは組み入れられた制限酵素部位配列を有している。ＦｏｋＩおよびＮ．ＢｓｔＮＢＩを用いた消化は多型塩基（斜字体のＴ）を含む１０ ｍｅｒ断片を結果として生じる。そのような断片は質量分析を用いた解析に十分である。
【図１０】上記図９のニック酵素計画と類似した戦略がこの図に示されている。この方法においては、１個の制限酵素および、デオキシリボヌクレオチドの１つに対してリボヌクレオチドへの置換を含むプライマー。示されているように、プライマーは標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズされた時にヘアピンループを形成するＦｏｋＩ認識部位を含むように設計される。プライマーはまた付加的にアンプリコンの中に組み入れられるリボヌクレオシド（ｒＧ）置換を有する。リボヌクレオシド置換は塩基性に不安定であり、そして塩基性条件下ではその部位においてＤＮＡ骨格に切断を生じる。この計画に示されているように、アンプリコンは制限酵素（ＦｏｋＩ）とインキュベーションされ、二本鎖切断を生じる。アンプリコンはその後、リボヌクレオチドＧおよび３’のデオキシリボヌクレオチドＴの間で切断を生じる塩基存在下でインキュベーションされ、質量分析により容易に解析することが可能である７塩基の断片を放出する。
【図１１】説明図は、対立遺伝子濃縮法の対立遺伝子捕捉群内のハプロタイプ決定の主要な方法を説明する。示されているように、方法はおおまかには（ｉ）一本鎖ＤＮＡを指向するもの、および（ｉｉ）二本鎖ＤＮＡを指向するものに分類することが可能である。単一塩基差異を識別するタンパク質または核酸への親和性により対立遺伝子特異的様式でＤＮＡ断片を捕捉することが可能である。異なる型のタンパク質および核酸親和性薬剤が囲み内に示されている。１つの対立遺伝子に付着するタンパク質または核酸が、引き続いて核酸混合物から、ストレプトアビジンまたは抗体被膜ビーズ等の当技術分野において既知である方法により選択されうる。第三の非親和性を基本とする対立遺伝子分離法は多型部位における制限エンドヌクレアーゼ切断（２つの対立遺伝子から有意に異なるサイズの断片が生産されるように）および電気泳動または遠心分離を用いて、切断された産物を引き続いてサイズ分画することを含む。２つの対立遺伝子の各々に相当する単離された断片の遺伝子型決定がハプロタイプを提供すると考えられる。
【図１２】この説明図は、対立遺伝子特異的増幅に基づくハプロタイプ決定の様々な方法を描写する。１つの対立遺伝子を切断した後、他の対立遺伝子は選択的に増幅されてもよく、またはサイズ選択処理により分離されてもよく、または切断された対立遺伝子が対立遺伝子選択的破壊処理により除去されてもよい。
【図１３】この説明図は、対立遺伝子特異的制限に基づくハプロタイプ決定戦略の様々な方法の分類を描写する。これらの方法においては、多型部位における配列差異を利用するプライマーまたは複数のプライマーを設計することにより、２つの対立遺伝子の混合物から１つの対立遺伝子が優先的に増幅される。
【図１４】ヘアピンループプライマー。この図においては、ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーが示されている。対立遺伝子１において、多型部位はＴ（斜字体）であり、そして、プライマーのＡＴＣＴＧＧＡ ５’部分の組み入れが、少なくとも１ラウンドの増幅後に生じる。対立遺伝子２において、多型部位はまたＴ（斜字体）であり、そして、プライマーのＡＴＣＴＧＧＡ ５’部分の組み入れが、少なくとも１ラウンドの増幅後に生じる。
【図１５】ヘアピンループプライマー。この図においては、ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーが示されている。対立遺伝子１において、多型部位はＣ（斜字体）であり、そして、プライマーのＡＴＣＣＧＧＡ ５’部分の組み入れが、少なくとも１ラウンドの増幅後に生じる。対立遺伝子２において、多型部位はまたＣ（斜字体）であり、そして、プライマーのＡＴＣＣＧＧＡ ５’部分の組み入れが、少なくとも１ラウンドの増幅後に生じる。
【図１６】ヘアピンループプライマー。この図においては、図１４に示されているＰＣＲ増幅段階により生成された対立遺伝子１のマイナス鎖が、Ｔプライマーを用いることにより、５’プライマーがハイブリダイズすることおよび効果的に対立遺伝子１の増幅を防止することができないことを描写している。または対立遺伝子２のマイナス鎖はミスマッチのためヘアピンループを形成できない。したがってヘアピンループ形成およびＰＣＲ増幅の防止はもたらされず、この対立遺伝子２鎖の増幅がＴプライマーを用いてもたらされる。
【図１７】ヘアピンループプライマー。この図においては、図１９に示されているＰＣＲ増幅段階により生成された対立遺伝子２のマイナス鎖が、Ｃプライマーを用いることにより、５’プライマーがハイブリダイズすることおよび効果的に対立遺伝子２の増幅を防止することができないことを描写している。または対立遺伝子１のマイナス鎖はミスマッチのためヘアピンループを形成できない。したがってヘアピンループ形成およびＰＣＲ増幅の防止は生じず、そしてこの対立遺伝子１鎖の増幅がＣプライマーを用いて生じる。
【図１８】ハプロタイプ決定のためのエクソヌクレアーゼに基づく方法。ハプロタイプ決定されるＤＮＡセグメントにおいて、１つの同定された多型部位がＲＦＬＰである、その結果、１つの対立遺伝子に関しては制限酵素（この例ではＢａｍＨＩ）は対立遺伝子を消化すること、および異なる長さのセグメントを生じることが可能である。
【図１９】ハプロタイプ決定のためのエクソヌクレアーゼに基づく方法。図１８において示されている、および記載されているセグメントを用いて、ＤＮＡ断片の末端がエクソヌクレアーゼ消化より保護される。保護された断片はその後、示されているようにＮｈｅＩ部位の、ＲＦＬＰの突出のために、認識部位が１つの断片には存在するがもう１つには存在しない、第二の制限酵素を用いて消化される。ＮｈｅＩを用いて断片を制限消化することは効果的にＢａｍＨＩ断片を短縮するが、しかし付加的にエクソヌクレアーゼ消化からの保護を取り除く。
【図２０】ハプロタイプ決定のためのエクソヌクレアーゼに基づく方法。図１９において示されているように生成された断片を用いて、これらの断片はその後エクソヌクレアーゼ存在下でインキュベーションされる。示されているように、エクソヌクレアーゼは断片の１つを消化するが、しかし保護された断片は未消化で残る。
【図２１】対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅のプライマー媒介性阻害。上記の特性を有するプライマーがジヒドロピリミジン脱水素酵素（ＤＰＤ）遺伝子のハプロタイプ決定のために設計された。ＤＰＤ遺伝子は塩基１８６（Ｔ：Ｃ）および５９７（Ａ：Ｇ）においてコード領域内に２つの多様性部位を有し、図２１の囲み内に示されているように、各々Ｃｙｓ：ＡｒｇおよびＭｅｔ：Ｖａｌのアミノ酸変化を生じる。塩基５９７における２番目の部位は制限断片長多型（ＲＦＬＰ）であり、Ａ対立遺伝子が存在するならば酵素ＢｓｒＤＩを用いて切断される。予測断片は図に示されているとおりである。
【図２２】ＤＰＤ遺伝子の対立遺伝子特異的プライマー。Ａにおいては、少なくとも２つの異なる領域を含む３個のプライマーが設計された。プライマーの３’部分は増幅される鋳型ＤＮＡに相当する。ＤＰＤＡＳＣＦおよびＤＰＤＡＳＴＦプライマーに関しては、付加的なヌクレオチドが、ヌクレオチド多様性を含む配列内の領域に相補的なプライマーの５’末端に付加された。ＤＰＤＮＳＦプライマーはＤＰＤ相補的配列のみしか含まず、そして対立遺伝子特異的増幅にはつながらない。Ｂにおいては、多型部位を含むＤＰＤ遺伝子配列が示されている。
【図２３】ＤＰＤＮＳＦプライマーを用いたＤＰＤ遺伝子のＰＣＲ増幅。ＴまたはＣ対立遺伝子を含む鋳型へのＤＰＤＮＳＦプライマーのハイブリダイゼーションが示されている。以下は、示されているようにＴまたはＣ対立遺伝子に関して、ＤＰＤＮＳＦプライマーを用いたＤＰＤ遺伝子領域の予測産物。
【図２４】ＤＰＤＡＳＴＦプライマーを用いたＤＰＤ遺伝子のＰＣＲ増幅。ＴまたはＣ対立遺伝子を含む鋳型へのＤＰＤＡＳＴＦプライマーのハイブリダイゼーションが示されている。以下は、示されているようにＴまたはＣ対立遺伝子に関して、ＤＰＤＡＳＴＦプライマーを用いたＤＰＤ遺伝子領域の予測産物。
【図２５】ＤＰＤＡＳＣＦプライマーを用いたＤＰＤ遺伝子のＰＣＲ増幅。ＴまたはＣ対立遺伝子を含む鋳型へのＤＰＤＡＳＣＦプライマーのハイブリダイゼーションが示されている。以下は、示されているようにＴまたはＣ対立遺伝子に関して、ＤＰＤＡＳＣＦプライマーを用いたＤＰＤ遺伝子領域の予測産物。
【図２６】コンピュータープログラムオリゴ４を用いて、ＤＰＤＮＳＦプライマーを用いて作製されたＰＣＲ産物の逆鎖とともに形成される安定ヘアピンループ構造。これは、ＤＰＤＮＳＦプライマーが引き続く増幅ラウンドでハイブリダイゼーションする鎖であるため、逆鎖のみが示されている。
【図２７】コンピュータープログラムオリゴ４を用いてＤＰＤＡＳＣＦプライマーを用いて作製されたＰＣＲ産物の逆鎖とともに形成される安定ヘアピンループ構造。図２６にあるように、逆鎖のみが示されている。
【図２８】コンピュータープログラムオリゴ４を用いてＤＰＤＡＳＴＦプライマーを用いて作製されたＰＣＲ産物の逆鎖とともに形成される安定ヘアピンループ構造。図２６にあるように、逆鎖のみが示されている。
【図２９】生成されたＰＣＲ断片に関してＤＰＤＮＳＦプライマーを用いてさらなる増幅が試行された時の、プライマーハイブリダイゼーションおよび増幅事象。プライマーはＤＰＤ遺伝子のＴおよびＣ対立遺伝子の両者と形成されるヘアピン構造を効果的に競合することが可能であり、そして両方の対立遺伝子の増幅が効率的に進む。
【図３０】生成されたＰＣＲ断片に関してＤＰＤＡＳＣＦプライマーを用いてさらなる増幅が試行された時の、プライマーハイブリダイゼーションおよび増幅事象。ＤＰＤＡＳＣＦプライマーは、その融点がヘアピンループのそれより高いので（４２℃と比較して６０℃）、Ｃ対立遺伝子と形成されるヘアピンループとのハイブリダイゼーションを競合することが可能である。しかしながら、Ｔ対立遺伝子に関して形成されたヘアピンループはプライマーよりも高い融点を有する、そしてしたがって効果的にプライマーとハイブリダイゼーションを競合する。ヘアピンループはＴ対立遺伝子のＰＣＲ増幅を阻害し、結果Ｃ対立遺伝子の対立遺伝子特異的増幅につながる。
【図３１】生成されたＰＣＲ断片に関してＤＰＤＡＳＴＦプライマーを用いてさらなる増幅が試行された時の、プライマーハイブリダイゼーションおよび増幅事象。ヘアピンループ構造は、Ｃ対立遺伝子に関してプライマーよりも高い融点を有し、そしてＴ対立遺伝子に関してプライマーよりも低い融点を有する。これはＣ対立遺伝子上でのプライマーハイブリダイゼーションおよび伸長の阻害を引き起こし、そしてＴ対立遺伝子の対立遺伝子特異的増幅につながる。
【図３２】ＤＰＤ遺伝子のハプロタイプ決定のためのヘアピンループ形成を使用する能力が説明されている。ハプロタイプが、対立遺伝子１−Ｔ１８６：Ａ５９７、対立遺伝子２−Ｃ１８６：Ｇ５９７であることが知られているｃＤＮＡ試料を用いて。ＤＰＤＮＳＦ、ＤＰＤＡＳＴＦおよびＤＰＤＡＳＣＦプライマーを用いての増幅により生成された５９７ｂｐからＢｓｒＤＩにより生成される断片のサイズは、５９７位の塩基がＡまたはＧであるかに依存する。ＢｓｒＤＩによる制限消化はＡ塩基が５９７位にあることを示している。もし断片が５９７にＡ塩基を有するならば、１３８、１６４および２６７ｂｐの長さの３個の断片が生成される。もしＧ塩基が５９７位に存在するならば、１６４および４０５ｂｐの長さの２個の断片のみが生成される。試料が５９７位においてＡおよびＧのヘテロ接合であるならば、１３８、１６４（２ｘ）、２６７および４０５ｂｐの全部で４個のバンドの生成が生じる。各プライマーに関してＢｓｒＤＩ制限により生成される予測断片は囲みの中に示されている。
【図３３】１８６および５９７位の両方においてヘテロ接合であるｃＤＮＡ試料中のＤＰＤ遺伝子に関する各プライマーによる増幅および引き続くＢｓｒＤＩ制限により生成される断片のアガロースゲル電気泳動。ＤＰＤＮＳＦレーンは、ＤＰＤＮＳＦプライマーを用いて選択されたｃＤＮＡに関する制限断片パターンを示し、この試料が実際に５９７位においてヘテロ接合であることを示している。しかしながら、同じｃＤＮＡ試料およびプライマーＤＰＤＡＳＴＦを用いると（ＤＰＤＡＳＴＦレーン）、制限パターンは５９７位においてＡのホモ接合である試料を代表するパターンと関連する。ＤＰＤＡＳＴＦプライマーはＴ対立遺伝子の増幅のみを可能にするので、試料中のそれに関するハプロタイプはＴ１８６：Ａ５９７である。プライマーＤＰＤＡＳＣＦを用いた制限消化パターン（ＤＰＤＡＳＣＦレーン）は５９７位にＧが存在する予測パターンと関連する。プライマーＤＰＤＡＳＣＦを用いたｃＤＮＡ試料の増幅は、試料中のＣ対立遺伝子のみ増幅する結果となる。したがってこの対立遺伝子に対するハプロタイプはＣ１８６：Ｇ５９７でなければならない。
【図３４】ＡｐｏＥ遺伝子のゲノム２１２５０位における多様性の遺伝子型決定。このゲノム部位において、ＤＮＡのＴ：Ｃ多様性は、ＡｐｏＥタンパク質のアミノ酸１７６位におけるシステインからアルギニンへのアミノ酸変化を結果生じる。ＡｐｏＥ遺伝子標的領域を増幅する、および２つの制限酵素部位（ＦｏｋＩ、ＦｓｐＩ）を多様性部位に近接してアンプリコン内に導入する、両者のために２個のプライマーが設計された。この図はプライマーおよび標的ＤＮＡの配列を描写する。Ａｐｏ２１２５０−ＬＦＲプライマーは制限酵素認識部位を含むループプライマーであり、そしてＡｐｏ２１２５０−ＬＲプライマーはＰＣＲ増幅過程において使用されるリバースプライマーである。多型ヌクレオチドは斜字体で示されている。
【図３５】増幅後の、ＡｐｏＥ遺伝子のＴ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子の両方のアンプリコンの配列が示されている。多型部位は斜字体Ｔまたは斜字体Ｃで示されている。
【図３６】ＡｐｏＥ遺伝子のＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ消化部位が示されている。実施例４に示されているように、２つの外側部位および多型１６７４７位を含む１つの部位の、３つのＮｃｏＩ部位が存在する。加えて、２組のプライマーが示されている、第１の組（１０）は最も外側のＮｃｏＩ部位内に位置し、そして１６７４７位を通じてＤＮＡ配列を増幅することが可能である。第２の組（２０）プライマー組は、それらが１６７４７位および１７０３０位の周りの短い配列を増幅するために使用されているので、示されている。
【図３７Ａ】から
【図３７Ｂ】質量対絶対強度のスペクトルが、１６７４７多型部位を含む断片の、酵素なし（図３７Ａ）またはＮｃｏＩ消化（図３７Ｂ）のアンプリコン試料に関して示されている。
【図３８Ａ】から
【図３８Ｂ】質量対絶対強度のスペクトルが、１７０３０多型部位を含む断片の、酵素なし（図３８Ａ）またはＮｃｏＩ消化（図３８Ｂ）のアンプリコン試料に関して示されている。
【図３９】提案されている二核白金（ＩＩ）複合体が示されている。描写されているように、介在性炭素が４、５または６個のメチル基であることが可能である。オリゴヌクレオチドをＤＮＡ分子へクロスリンクさせるためのこれらの提案されている分子の使用は詳細な説明に記載されている通りである。
【図４０】既知の多型（対立遺伝子１）を含む標的ＤＮＡの領域に相補的であるチオ含有オリゴヌクレオチドが設計される。二核白金（ＩＩ）（ＰｔＩＩ）は、Ｇｒｕｆｆらにより記載された処理、または類似の方法を用いてチオ基を通じてこのオリゴヌクレオチドに連結される。チオ基を有さない第二のオリゴヌクレオチドもまた設計される。このオリゴヌクレオチドは、他の対立遺伝子（対立遺伝子２）に相当する塩基を有する多様性部位を除いて、チオオリゴヌクレオチドと同一の配列を有する。これら２つのオリゴヌクレオチドは、多様性の標的部位においてヘテロ接合である試料と混合され、そしてハイブリダイズされうる。ＰｔＩＩ結合オリゴヌクレオチドは、それが完全にマッチする対立遺伝子（対立遺伝子１）にハイブリダイズし、そして他のオリゴヌクレオチドは、それが完全にマッチする他の対立遺伝子（対立遺伝子２）にハイブリダイズする。ＰｔＩＩ結合オリゴヌクレオチドはその後、標的ＤＮＡに化学的にクロスリンクされる。このクロスリンクは標的ＤＮＡのこの対立遺伝子を、エクソヌクレアーゼ破壊から保護すると考えられる。
【図４１】特定の末端から一および二本鎖ＤＮＡを破壊することが知られている、およびＰｔＩＩ付加体により阻止されることが知られている、エクソヌクレアーゼからのクロスリンクされたＤＮＡの保護が、クロスリンクされた（対立遺伝子１）または二本鎖のＤＮＡ試料（対立遺伝子２）に関して描写されている。ＤＮＡ試料をエクソヌクレアーゼとインキュベーションすることは、ＰｔＩＩ付加体を有さない全てまたはほとんどのＤＮＡ（対立遺伝子２）を除去することが示されている、一方エクソヌクレアーゼと共に、クロスリンクされた複合体をインキュベーションすることはＤＮＡ（対立遺伝子１）の部分消化を結果として生じる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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