(57)【要約】多量体の凝集体を形成する傾向のあるオリゴヌクレオチドが、単量体形態におけるよりも高い毒性を凝集体形態において有することが、今日発見されている。したがって、本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏ毒性の減少した治療用オリゴヌクレオチド組成物、およびそのような組成物の作製方法、ならびに治療用オリゴヌクレオチドの投与方法を提供し、ここで、組成物中の治療用オリゴヌクレオチドは多量体の凝集体を形成する傾向がある。そのような凝集体形成オリゴヌクレオチドを含有する組成物は、好ましくは投与前２４時間以内に、加熱されて、または凝集を崩壊させるマンニトールのような化学種を使用して、処理される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多量体の凝集体を形成する傾向のある治療用オリゴヌクレオチドのｉｎ　ｖｉｖｏ毒性を減少させる方法であって、多量体の凝集体形態の該治療用オリゴヌクレオチドを含む組成物を処理する工程であって、それによって、実質的に全ての該治療用オリゴヌクレオチドを単量体形態へ変換するか、または前記多量体の凝集体の形成を実質的に阻止する、処理する工程を含む方法。
【請求項２】
前記治療用オリゴヌクレオチドは、５〜５０量体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療用オリゴヌクレオチドは、４Ｇモチーフを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記治療用オリゴヌクレオチドを含む前記組成物は、該組成物の加熱により処理される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、６０〜９０℃の温度で３〜６０分間加熱される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記治療用オリゴヌクレオチドを含む前記組成物は、ｉｎ　ｖｉｖｏ治療薬として使用される前２４時間未満の加熱により処理される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記治療用組成物は、凝集を実質的に阻止するのに有効な化学添加物の添加により処理される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記化学添加物は、マンニトールまたはスクロースである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程：
前記処理した組成物を凍結乾燥する工程であって、それによって、乾燥生成物を形成し、実質的に全ての前記オリゴヌクレオチドが単量体形態で存在する、凍結乾燥する工程と、
投与前に該凍結乾燥生成物を再構成する工程であって、それによって、再構成組成物を形成し、実質的に全ての前記オリゴヌクレオチドが単量体形態で存在する、再構成する工程と
をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかの方法に従って調製される、治療用オリゴヌクレオチド組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、実質的に脂質を含まない、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
多量体の凝集体を形成する傾向のある治療用オリゴヌクレオチドの投与方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１〜１０のいずれかの方法に従って治療用オリゴヌクレオチド組成物を調製する工程と、
（ｂ）実質的に全ての該治療用オリゴヌクレオチドが単量体形態である該組成物を、該オリゴヌクレオチドにより提供される治療を必要とする哺乳動物に投与する工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
本出願は、毒性を減少させ、その結果より高くかつより効果的な用量の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド治療薬の改善された使用法に関する。
【０００２】
短い（５〜５０量体）オリゴヌクレオチド組成物が、病院における治療薬として何らかの見込みがあることが実証されている。活性の機構は、ｍＲＮＡ結合（または「アンチセンス」）効果を通してであると主張する人もいる。もっとも、動物モデルにおける治療結果がしばしばアンチセンス機構と独立した免疫系刺激機構と矛盾しないことに注目する者もいる。機構にかかわらず、性能は期待より低かった。生成物の失敗の１つの重大な理由は、ｉｎ　ｖｉｖｏ試験において同定された、用量制限毒性であった。
【０００３】
オリゴヌクレオチドの毒性は、歴史的に、患者投与の前に組成物になされる化学修飾に起因してきた。天然に生じるオリゴヌクレオチドは、一般に、遊離形態では使用に不十分である。なぜなら、ホスホジエステル（「ＰＯ」）結合は、血液中で非常に分解しやすいからである。遊離形態の天然オリゴヌクレオチドは、哺乳動物において、疾患部位に蓄積するのに十分長くは循環しない。化学修飾は、第一に、血行性エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対する感受性を減少させるために導入される。
【０００４】
今日までに試された多くの修飾化学は、標準毒性アッセイにおいて、ＰＯオリゴヌクレオチドよりも高度の毒性を有する。ホスホロチオエート（ＰＳ）に関しては、補体活性化および凝固のｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ＧＶＲ Ｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， ｐｐ． １６９−２１５ （１９９８））ならびに毒性のｉｎ　ｖｉｖｏアッセイ（肝酵素放出など）の両方が、ＰＯＳに対して増加する（Ｈｅｎｒｙ， ＳＰ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８１： ８１０−８１６ （１９９７））。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の一時的増加は、十分に特性決定されたホスホロチオエートクラス効果である（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８））。（Ｓｈｅｅｈａｍ， ＪＰ． ａｎｄ Ｌａｎ ＨＣ， Ｂｌｏｏｄ， ９２： １６１７ （１９９８）およびＨｅｎｒｙ， ＳＰ， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ７： ５０３ （１９９７）を参照）。ｉｎ　ｖｉｖｏ実験は、他の種における毒性を予測するための毒性モデルの従来的な使用を混乱させる、種特異的毒性応答とされるものにより、複雑化した。Ｍｏｎｅｔｉｅｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １２ ： ４２１−４３２ （１９９７）。
【０００５】
オリゴヌクレオチドの毒性の他の源は、入念に調査されてはこなかった。哺乳動物への投与に際して驚くほどにかつ実質的に減少された毒性プロファイルを実証する、オリゴヌクレオチド組成物を提供することが、本発明の目的である。さらに、本発明は、治療薬として使用するためのオリゴヌクレオチドの毒性を減少する方法を提供する。
【０００６】
［発明の概要］
多量体の凝集体を形成する傾向のあるオリゴヌクレオチドが、単量体形態におけるよりも高い毒性を凝集体形態において有することが、今日発見されている。したがって、本発明は、以下の工程：
（ａ）多量体の凝集体形態で治療用オリゴヌクレオチドを含む組成物を処理して、実質的に全ての治療用オリゴヌクレオチドを単量体形態へ変換するか、または多量体の凝集体の形成を実質的に阻止する工程と
（ｂ）実質的に全ての治療用オリゴヌクレオチドが単量体形態である組成物を、オリゴヌクレオチドにより提供される治療を必要とする哺乳動物へ投与する工程とを含む、多量体の凝集体を形成する傾向のある治療用オリゴヌクレオチドの投与方法を提供する。組成物は、好ましくは投与前２４時間未満加熱されて、または凝集を崩壊させるマンニトールのような化学種を使用して、処理され得る。
【０００７】
［発明の詳細な説明］
本出願は、治療用オリゴヌクレオチド組成物の毒性を減少させるための方法に、およびヒトを含む哺乳動物に治療的利益を提供するための、得られる毒性の減少した組成物の使用に関する。本発明が関連するオリゴヌクレオチドの共通の特色は、多量体の凝集体の自発的形成である。既知のワトソンクリック型の塩基対、フーグスティーン塩基対（異なる水素結合の形成を通した、プリンとピリミジンとの幾分弱い会合）、ならびにヘテロ（プリン＋ピリミジン）およびホモ（プリン＋プリンまたはピリミジン＋ピリミジン）塩基対の様々な組合せ形態を含む、そのような多量体の形成を導き得る塩基対の立体配置が多く知られている。したがって、相互作用は、様々な構造を持つオリゴヌクレオチドにおいて多量体化を導くように生じ得る。
【０００８】
本発明は、オリゴヌクレオチドが投与されるときに多量体のオリゴヌクレオチド凝集体が毒性を伴うこと、および治療用オリゴヌクレオチド組成物の総合的な毒性が、組成物を処理して、存在する実質的に全ての多量体を単量体へ変換することにより、または多量体の凝集体の形成を実質的に阻止することにより、減少され得るということの発見に基づく。凝集体のオリゴヌクレオチド間の相互作用は、比較的弱い水素結合相互作用であるため、溶液中に存在する凝集体および単量体は平衡にある。このことは、任意の所与の条件のセットにおいて、凝集体および単量体のある混合物が存在することを意味する。例えば、多量体の凝集体を形成する傾向のあるオリゴヌクレオチドＩＮＸ−３２８０（以下に記載される）の通常（未処理）溶液において、単量体対四量体複合体で見いだされるオリゴヌクレオチド分子の比（重量により、またはモルにより）は、約４０〜６０：６０〜４０である。本発明の目標は、実質的に全てのオリゴヌクレオチドが単量体形態で存在するように、処置におけるオリゴヌクレオチドの使用の前に、この平衡を破壊させることである。本出願の明細書および請求項において使用されるとおり、用語「実質的に全ての」は、７５重量％を越える、好ましくは９５重量％を越えるレベルの単量体のオリゴヌクレオチドを示す。多量体の複合体の形成を実質的に阻止する手順は、存在する全オリゴヌクレオチドの約２５重量％より多くに達する多量体の複合体の形成を阻止するのに効果的なものである。
【０００９】
本発明の１つの実施形態において、オリゴヌクレオチド組成物は、投与前に、オリゴヌクレオチドを損傷することなく凝集体を単量体へ変換するのに十分な温度および時間で組成物を加熱することにより処理される。一般に、組成物は、４５〜１００℃の温度で３〜１８０分、適切に加熱される。臨床的使用のため、好ましくは、サンプルを６０℃で３０分間、または９０℃で３分間処理する。特定の組成物に必要とされる最適時間および温度は、多量体の水素結合の強さ、ならびに他の要因に依存するが、単量体および多量体のレベルをアッセイすることにより、または毒性減少をアッセイすることにより、任意の特定のオリゴヌクレオチドに対して容易に決定され得る。そのようなアッセイのための手順は、当該技術分野で既知であり、以下に記述される実施例に記載される。
【００１０】
本発明の代替的な実施形態において、凝集体の水素結合形成を阻止するのに有効な化学添加物が、組成物中へ導入される。この添加物は、ｉｎ　ｖｉｖｏ投与に際してそれ自体が好ましくない反応を誘導しないように、薬学的に許容可能でなければならない。新規合成されたオリゴ（これはまだ多量体形態へ凝集していない）または熱処理されたオリゴ（これは単量体として実質的な単量体形態へ変換されている）を維持することができる、適した化合物の１つの例は、マンニトールである。マンニトールは、多量体の凝集体が形成する傾向にある凍結乾燥工程の間に作用すると考えられる。マンニトールの使用は、水または薬学的に許容可能な緩衝液中の再構成に際して、オリゴヌクレオチドの単量体形態をもたらす。マンニトールは、５０〜５００ｍＭの濃度で使用され得る。この目的のために使用され得る他の化合物として、スクロース（１０〜１０００ｍＭ）、グルコース、トリアロース（ｔｒｉａｌｏｓｅ）、またはラクトースなどの他の単糖、二糖、または少糖類、および薬学的に許容可能なカチオン種（Ｍｎ＋、Ｃｏ＋、Ｎｉ２＋、およびＴｂ（ＩＩＩ）など）が挙げられる。
【００１１】
本発明が応用可能な治療用オリゴヌクレオチドは、一般に５〜５０塩基の大きさを有する。オリゴヌクレオチドは、アンチセンス効果を通じて、すなわちＲＮＡの相補配列へ結合してタンパク質合成を阻害することにより、治療的利益を提供し得るか、または非配列特異的方法を通じて治療的利益を提供し得る。したがって、本発明の方法は、広範な疾患および状態の処置に関連して、治療的利益を提供するために使用され得る。
【００１２】
多量体化を起こすオリゴヌクレオチドの１つの特異的で非制限的な例は、４Ｇ残基の配列を含むものである。そのようなオリゴヌクレオチドは、凝集して四重鎖になる。例えば、ｃ−ｍｙｃ　ＲＮＡ指向性の１５量体（ＩＮＸ−３２８０と呼ばれる場合もある）が既知であり、配列：
ＡＡＣ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ　配列番号１を有する。
本明細書中で開示される発明以前、この分子のホスホロチオエート版（これは直接投与に対して十分安定である）は、ホスホロチオエートクラスの他の成員と同じ毒性を被っていることが示されていた（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ． １９９７ａ； Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ｂ； Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）は、サルにおいて、生命にかかわる血行動態の障害を導き得る、よく認識されたクラス効果を有する（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ａ； Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ｂ； Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。幸いなことに、この効果は、血液レベル依存性であり、通常、静脈内注入の速度を減少させることにより（すなわち、所望の用量を送達するための注入期間を増加させることにより）改善される。しかしながら、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに関して、一般に、補体活性化のための４０〜５０μｇ／ｍＬという閾濃度が報告されている（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ａ； Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ｂ； Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
【００１３】
対照的に、以下の実施例において例示されるように、ＩＮＸ−３２８０アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが、化合物を単量体形態のままにしておく処理後に投与される場合、毒性は劇的に減少する。１５ｍｇ／ｋｇで処置したサルにおいて血漿中１０１．５〜１１９．６μｇ／ｍＬのＩＮＸ−３２８０ピーク濃度を有するｉｎ　ｖｉｖｏ用量は、Ｂｂ値（×１μｇ／ｍＬ）の明らかな増加を伴わず、かつＡＰＴＴ値にわずかな（３０％）増加を伴ったのみであった（実施例を参照）。
【００１４】
４−Ｇモチーフ（すなわち、４つの連続したＧ残基の配列）を含む、他の既知または提案される治療用オリゴヌクレオチドとして、特定のｃ−ｍｙｂおよびＲｅｌＡ（ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットを標的とする）配列等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は、何がＧ残基の配置に基づく逆平行アレイである可能性が高いかに基づいて、多量体の凝集体を形成することが実証されている。４Ｇモチーフを含まない他のオリゴヌクレオチドもまた、特異的または非特異的結合配置のいずれかにより、複合多量体を形成し得る。これらは、特に、パリンドローム（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｅ）構造または部分パリンドローム配列を持つオリゴヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチド全ての治療的利益は、本発明において教示される方法により増強され得る。
【００１５】
本発明に従い、オリゴヌクレオチドは、治療を必要としている被験体に直接投与される。好適な投与方法は注射によるものであり、静脈内、非経口内（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、筋肉内、および／または皮下注射を含む。オリゴヌクレオチドが直接循環中へ導入される時は常に、それらはヌクレアーゼによる分解の危険にさらされている。したがって、本発明は、好ましくは、ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの耐性を増加させるために構造的に修飾されたオリゴヌクレオチドの使用を作り、ここで修飾化学は、それ自体は多量体の複合体の形成に干渉しない。これは、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド、メトキシ−エトキシオリゴヌクレオチド、キメラおよびギャップマー（ｇａｐ−ｍｅｒｓ）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ホスホロジチオエートオリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドアミデート誘導体を含む。オリゴヌクレオチド組成物は、注射用治療薬の投与に適切な薬学的に許容可能な液体キャリア中で投与される。これには、滅菌生理食塩水溶液、水中５％ブドウ糖、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。
【００１６】
オリゴヌクレオチドの凝集が自発的な事象であるためということ、加熱による平衡の破壊が永久であり得ないということ、および投与の時点で単量体の所望のレベルを達成するために複数の工程が必要とされ得るということが理解されるだろう。多量体を崩壊させて解離させるために加熱が用いられる場合、簡潔な方策は、投与前の短時間内に加熱工程を行うことである。例えば、ｃ−ｍｙｃのような４Ｇオリゴヌクレオチドの場合、単量体および四量体の平衡混合物を返すために必要な時間は数日である。したがって、加熱の２４時間以内に組成物が使用される場合、本発明の利益が達成され得る。あるいは、化学添加物（マンニトールまたはスクロースなど）が、加熱された材料に加えられて、単量体の再形成を実質的に阻止し得る。
【００１７】
以下の実施例に例示されるように、抗凍結剤処理した組成物の凍結乾燥に際して、単量体構造が保持される。したがって、実質的に単量体形態に変換された組成物は、スクロースまたはマンニトールのような抗凍結剤の存在下で凍結乾燥されて、投与直前に再構成され得る。得られる再構成された組成物において、実質的に全てのオリゴヌクレオチドが単量体形態である。もちろん、単量体および多量体の平衡混合物への復帰が問題である場合、この再構成された組成物は即時に使用されなければならない。
【００１８】
本発明の方法を使用して、疾患治療への複数の新規治療アプローチが示唆される。詳細には、オリゴヌクレオチドを単量体化する処置は他の化学療法薬を使用する併用療法に有用である。シスプラチンおよび他の金属ベースの化学療法薬は、併用療法において特に有利である。したがって、本発明は、化学療法薬をそれらがこれまで推奨されていない臨床的徴候に使用するための有意義な新規治療選択肢を開拓する。詳細には、本発明の単量体化オリゴヌクレオチドは、ここで、本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせた、疾患、詳細には癌、より詳細には頭および首の癌、肝臓癌または下部もしくは上部食道癌のような上部消化管癌、ならびに転移性乳癌の治療のための、シスプラチンの治療的使用を可能にする。
【００１９】
次に、本発明を、以下の非制限的な実施例を参照してさらに記載する。
【００２０】
実施例１
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＮＸ−３２８０を、既に記載された方法（Ｆｅａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を使用して、適正製造基準に従って製造した。ＩＮＸ−３２８０を標準方法により２０ｍｇバイアル中で凍結乾燥し、２〜８℃で貯蔵した。ＩＮＸ−３２８０は、配列：
ＩＮＸ−３２８０：５’−ＡＡＣ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧ　ＣＡＴ−３’
配列番号１
を有するｃ−ｍｙｃ　ｍＲＮＡ指向性の１５量体配列である。
【００２１】
凍結乾燥したＩＮＸ−３２８０の各２０ｍｇバイアルを、４ｍＬの滅菌生理食塩水で再構成した。これらの溶液を、６０〜７０℃で３０分間水浴中に置き、オリゴヌクレオチドをその単量体形態へ変換した。冷却後、溶液を滅菌生理食塩水で投与に適した濃度（約０．５および２．５ｍｇ／ｍＬ）に希釈した。
【００２２】
以下に記載されるｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ（実施例３）のため、ＩＮＸ−３２８０を加熱（単量体化）プロセスの前後で使用した。単量体形態および四重鎖形態のＩＮＸ−３２８０の割合を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５ＨＲ１０／３０ゲル濾過カラムのサイズ排除クロマトグラフ−ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）により定量した。２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の０．２５ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡとの定組成勾配（ｐＨ７．５）を、室温で０．７５ｍｌ／分の流速で使用した。オリゴヌクレオチドを、２６０ｎｍの吸光度により検出した。表１に要約されるように、生理食塩水中での最初の水和後、非単量体化ＩＮＸ−３２８０は、単量体形態および四重鎖形態の４６：５４混合物として存在した。６０〜７０℃で３０分間の加熱は、四重鎖を効果的に解離させて、９８％を超える単量体オリゴヌクレオチドからなる調製物を得た。ＩＮＸ−３２８０の単量体形態は、室温に保持された場合、少なくとも２４時間安定であった。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
実施例２
本研究のｉｎ　ｖｉｖｏ試験および設計のためのカニクイザルの選択は、他のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの開発での、およびこのクラスの薬剤の開発のための刊行ガイドラインでの先の経験に基づいた（Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ａｈｎ ａｎｄ ＤｅＧｅｏｒｇｅ， １９９８）。
【００２５】
１６匹（８匹のオスおよび８匹のメス）の実験的に未処置のカニクイザル（マカカ・ファスキキュラリス）（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ （Ｒｅｎｏ， Ｎｅｖａｄａ）から入手した。動物は、研究前平均体重２．５〜３．０ｋｇを有した。動物を、１８〜２８℃で１２時間明／１２時間暗の光周期で、ステンレス鋼ケージで個別に飼育した。動物には、体重に応じた量のＨａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ霊長類食餌、ならびに補助フルーツ、野菜、およびシリアルが与えられた。水は適宜与えられた。動物の処置は、ＵＳＤＡ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ （９ ＣＦＲ Ｐａｒｔｓ １，２ ａｎｄ ３）に定義される規定に従った。
【００２６】
動物を、類似した群平均体重を達成するように設計された層別無作為化スキームにより群に割当てた。次いで、群を無作為に処置に割当てた。群１（２匹のオスおよび２匹のメス）は、滅菌生理食塩水のみで処置した。群２（３匹のオスおよび３匹のメス）は、３．０ｍｇ／ｋｇの用量で単量体のＩＮＸ−３２８０で処置した。群３（３匹のオスおよび３匹のメス）は、１５．０ｍｇ／ｋｇの用量で単量体のＩＮＸ−３２８０で処置した。用量は、１、３、５、８、１０、および１２日目に静脈内注入により投与した。静脈カテーテルを頭部または伏在静脈中に挿入し、注入またはピストンポンプを使用して生理食塩水（コントロール）またはオリゴヌクレオチド用量を、３．０ｍＬ／ｋｇ／時間の制御速度で２時間送達した。
【００２７】
臨床的徴候および生理的測定
臨床的徴候（全体的な様子、行動、食料消費）について、動物を１日２回観察した。血圧および心拍数を、最初および最後の注入（１日目および１２日目）の前および終わりの時点で、腕または脚から、外部カフ器具（Ｄｙｎａｍａｐ）で測定した。収縮期／拡張期圧、平均動脈圧（ＭＡＰ）、および心拍数が記録された。体重を、研究開始の７日前および３日前、ならびに研究が終了した時点で再度測定した。
【００２８】
血液学
血液サンプル（０．５ｍＬ）を、注入前、最初の用量（１日目）および最後の用量（１２日目）の注入終了時点および注入４時間後に、ＥＤＴＡ含有管に収集した。全血を、赤血球（ＲＢＣ）数、白血球（ＷＢＣ；全体および差異）、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、平均細胞ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球血色素量濃度（ＭＣＨＣ）、血小板数、および血球形態について分析した。さらに、網状赤血球数を、最初の用量の前（ベースライン）および最後の用量の注入２４時間後（１３日目）に測定した。
【００２９】
血清化学
血液サンプル（１．５ｍＬ）を、抗凝固剤なしに管中に収集し、血液を凝固させて遠心分離し、血清を得た。血清化学のための血液サンプルを、最初の投薬日（１日目）の注入前、および最後の用量の２４時間後（１３日目）に得た。これらのサンプルから得られた血清を、ナトリウム、カリウム、塩素、全二酸化炭素（重炭酸塩）、全ビリルビン、カルシウム、亜リン酸、グルコース、尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、全タンパク質、アルブミン、グロブリン、コレステロール、およびトリグリセリドの濃度について、ならびにアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐａｒｔａｔｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＡＬＴ）、およびγ−グルタミルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＧＧＴ）の活性について分析した。
【００３０】
凝固および補体アッセイ
凝固パラメーターの評価のため、約０．９ｍＬの血液を、抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを含有する管中に収集した。血液を遠心分離して血漿を得、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、およびフィブリノーゲンについて分析した。ＡＰＴＴおよびＰＴ決定のため、最初および最後の投薬日の、注入前、注入終了時、および注入４時間後に、サンプルを得た。フィブリノーゲンは、初日の注入前および最後の用量の２４時間後にのみアッセイした。
【００３１】
補体パラメーターの評価のため、約０．７５ｍＬの血液をＥＤＴＡ含有管中に収集して、補体開裂生成物（Ｂｂ）分析のための血漿を得た。さらに０．７５ｍＬを抗凝固剤なしに管中に収集し、ＣＨ５０分析のため遠心分離により血清を収集した。上記に記載されるように収集した血漿および血清をドライアイス上で凍結させ、そして分析するまで−７０℃で貯蔵した。
【００３２】
尿検査
死体解剖で膀胱から尿サンプルを収集し、色／特徴、ｐＨ、比重、白血球エステラーゼ、亜硝酸塩、ウロビリノーゲン、タンパク質、グルコース、ケトン、ビリルビン、潜血、および微視的な内容物について分析した。
【００３３】
毒物動態学サンプルおよびＩＮＸ−３２８０アッセイ
最初および最後の用量の、注入終了時、注入４時間後、および注入２４時間後、ならびに最初の注入前に、約０．７５ｍＬの血液をＥＤＴＡ含有管中に収集した。遠心分離により血漿を得て、サンプルをドライアイス上で凍結させて分析するまで−７０℃で貯蔵した。解凍した血漿サンプルのＩＮＸ−３２８０、ならびにＮ−１、Ｎ−２、およびＮ−３鎖短縮化（３’−末端）変異を、有効ＨＰＬＣ法を使用して定量した。報告される薬物動態学的パラメーターは、ノンコンパートメント分析を用いるＷｉｎＮｏｎｌｉｎ薬物動態学ソフトウェア（第３版；Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ， Ｉｎｃ．， ＣＡ）を使用して得た。非常に類似したパラメーターが、ノンコンパートメント薬物動態学的分析プログラム（第２．５版；Ｄｒ． Ｊ． Ｖｅｎｉｔｚ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＶＣＵ）を使用して得られた。
【００３４】
死体解剖および組織病理
動物を、深い麻酔下にあるうちに全採血により終結させた。最終体重を得て、完全な肉眼的死体解剖を行った。様々な組織の重さを量り、次いでパラフィンに包埋し、切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡法により検査した。
【００３５】
ｉｎ　ｖｉｖｏ毒物学の結果
研究の間に死亡した動物はなく、かつＩＮＸ−３２８０の投与から生じる副作用を示す異常な臨床的徴候もなかった。体重データは、研究の間、処置に関連した変化を示さなかった。平均血圧および心拍数のデータは、ＩＮＸ−３２８０の投与に伴う変化を示さなかった。
【００３６】
血液学パラメーターは、最初および最後の投薬日に測定された。わずかな変化が、好中球、単球、およびリンパ球数に観測された（一般に注入の終了時に最大であった）。しかしながら、類似した変化がＩＮＸ−３２８０処置群およびコントロール群の両方で観測されたので、これらの変化は実験手順に伴うストレスから生じた可能性が高い。さらに、循環赤血球質量（ＲＢＣ数、ヘモグロビン濃度、およびヘマトクリット）の指標は、血液採取により研究中にゆっくりと減少した。処置に関連した変化は、桿状球、好酸球、好塩基球、または網状赤血球について観測されなかった。結局、ＩＮＸ−３２８０の投与に伴う血液学パラメーターの変化はなかった。
【００３７】
血清化学パラメーターは、処置に伴う明らかな変化を示さなかった。最初の用量前に複数の動物で観測された、血清酵素（ＬＤＨ、ＡＳＴ、およびＡＬＴ）についてのいくつかの高い値は、カテーテル挿入および動物拘束の間に生じるわずかな組織損傷に起因した。ナトリウム、カリウム、塩素、ＣＯ２、カルシウム、亜リン酸、コレステロール、およびトリグリセリドの血清濃度についてのデータは、これらの成分の処置に伴う変化を示さなかった。さらに、尿検査は、ＩＮＸ−３２８０の投与に伴う変化を示さなかった。
【００３８】
凝固パラメーターに関して、１日目および１２日目の両方に１５ｍｇ／ｋｇを受けた動物において、ＩＮＸ−３２８０の注入終了時にＡＰＴＴ値のわずかな増加（約３０％）が観測された。このＡＰＴＴ延長は、１５ｍｇ／ｋｇ群において、注入４時間後に逆転した。類似した傾向がＰＴ値において観測されたが、ＡＰＴＴ変化ほど明白ではなかった。３．０ｍｇ／ｋｇでＩＮＸ−３２８０を投与された動物において、ＡＰＴＴまたはＰＴの変化がないことが明らかであった。フィブリノーゲン濃度における処置に伴う変化は観測されなかった。
【００３９】
補体活性化におけるＩＮＸ−３２８０の効果を評価するため、代替的補体経路開裂生成物、すなわちＢｂ、および全溶血性補体電位、すなわちＣＨ５０の両方を計測した。Ｂｂのわずかな増加のみが、ＩＮＸ−３２８０注入の間に観測された。これらの変化は、実験手順のストレスに起因した。なぜなら、増加の大きさは、群（コントロール群を含む）にまたがって類似しており、投与されたＩＮＸ−３２８０の用量に関連していなかったからである。Ｂｂにおいて同様なわずかな増加が、これらの実験条件下で一般的に見られるが、一方でより大きな増加が、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにより補体が活性化される場合に生じる。ＣＨ５０の著しい変化は、この研究の間に観測されなかった。結局、ＩＮＸ−３２８０の投与に伴う補体活性化パラメーターの変化はなかった。
【００４０】
研究の１５日目に、全ての動物で肉眼的死体解剖を行った。ＩＮＸ−３２８０での処置に関連した巨視的な変化は観測されなかった。ＩＮＸ−３２８０の投与に伴う器官重量の変化は観測されなかった。処置に関連した変化は、腎臓、肝臓、ならびに腸間膜リンパ節および下顎リンパ節において観測された。典型的な観測は、腎臓の近位尿細管の上皮細胞の、ならびにリンパ節および肝臓における細網内皮細胞の、細胞質における好塩基球性顆粒物質の存在であった。３．０および１５．０ｍｇ／ｋｇで処置した動物において、全ての病変が最小として格付けされたことが注記される。
【００４１】
薬物動態
薬物動態パラメーターを、３．０または１５ｍｇ／ｋｇでのＩＮＸ−３２８０投与後に測定した。１５ｍｇ／ｋｇでのＩＮＸ−３２８０の１回目および６回目の投与後、血漿濃度は、各時点で比較した場合、統計学的に同一であった。これらの結果は、サルの血液からのＩＮＸ−３２８０クリアランスがこのオリゴヌクレオチドについての繰り返し投与スケジュールにより変更されなかったことを示唆している。このことは、１回目の投与後（２．８５時間）のＩＮＸ−３２８０の推定クリアランス半減期（Ｔ１／２）が、６回目の投与後（２．８９時間）のものとほぼ同一であったという観測により支持される。同じような、１回目と６回目の投与との間の関連性は、３．０ｍｇ／ｋｇのＩＮＸ−３２８０で処置された動物において観測された。この用量では、２４時間の時点で有するＩＮＸ−３２８０濃度が有効ＨＰＬＣアッセイの定量化限界より低いため、この群の動物におけるＴ１／２を見積もることはできなかった。
【００４２】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、最初に３’（３−ｐｒｉｍｅ）末端でのエキソヌクレアーゼ活性を介して、ｉｎ　ｖｉｖｏで代謝される（Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。このため、完全長オリゴヌクレオチド、ＩＮＸ−３２８０、ならびに１（Ｎ−１）、２（Ｎ−２）、または３（Ｎ−３）塩基が除去された主要な代謝産物を定量するために、有効ＨＰＬＣ法が設計された。図１は、無傷のＩＮＸ−３２８０が、１５ｍｇ／ｋｇでの１回目および６回目の投与の注入完了時にそれぞれ血漿に存在する全オリゴヌクレオチドの５２．５および５６．５％を構成したことを示す。１５ｍｇ／ｋｇでのＩＮＸ−３２８０の１回目（１日目；パネルＡ）または６回目（１２日目；パネルＢ）ｉｎ　ｖｉｖｏ投与後の、カニクイザル血漿中のオリゴヌクレオチドの割合。割合は、完全長、無傷のＩＮＸ−３２８０（●）、Ｎ−１（■）、およびＮ−２（▲）配列について、ならびに未知のピーク合計（○）について報告される。値は、４匹の動物／群からの平均（±標準偏差）を表す。灰色の棒は、２時間の注入期間を表す。
【００４３】
示されるように、注入完了時点で、無傷のＩＮＸ−３２８０＋Ｎ−１およびＮ−２代謝産物は、血漿中の全オリゴヌクレオチドの９３％より多くを構成した。注入終了から４時間後、ＩＮＸ−３２８０＋Ｎ−１およびＮ−２代謝産物は主成分のままであり、それぞれ血漿中に存在する全オリゴヌクレオチドの８８％および８４％を占めた。注入後２４時間で、ＩＮＸ−３２８０は、１回目および６回目の投与後、それぞれ全オリゴヌクレオチドの２７．４％および３３．４％を占めた。１回目の投与後、残存するオリゴヌクレオチドは、主にＮ−１（２３．１％）およびＮ−２（２７．０％）ならびに未知のピーク（４６．０％）で構成された。対照的に６回目の投与後、残存するオリゴヌクレオチドは、未知のピークが検出されず、主にＮ−１（２９．４％）およびＮ−２（３４．２％）代謝産物で構成された。この後者の観測は、１回目および６回目の用量後のＩＮＸ−３２８０薬物動態の間の唯一の差異である。ＩＮＸ−３２８０のＮ−３代謝産物の割合は、調査された全ての時点で低かった（８．８％未満）。
【００４４】
本発明の重要な発見は、この実施例から描かれ得る。ここで、カニクイザルにおける２週間の毒性研究（ＩＮＸ−３２８０が１週間に３回、２時間の注入で与えられた）の結果が報告される。用量スケジュールは、ＩＮＸ−３２８０について提案される臨床レジメンに類似した。臨床的に関連する投薬条件下の補体活性化の特性決定に加えて、この研究はまた、ＡＰＴＴの延長により反映される固有凝固経路のＩＮＸ−３２８０阻害も調査した。補体活性化および凝固阻害の両方が、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの血液レベル関連クラス効果である（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。この研究の新規態様は、投薬溶液の調製における加熱工程の実施（これは通常複雑な三次構造（四重鎖）をとる溶液中のオリゴヌクレオチドの割合をその簡潔な単量体形態へ変換する）であった。
【００４５】
この研究の結果は、サルにおけるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのこれまでの研究の結果とは全く対照的であった。最大１５ｍｇ／ｋｇ／注入の用量レベルで、死亡した動物はなく、かつ食欲、体重、血圧、心拍数、血清化学パラメーター、血液学指標、補体開裂生成物ＢｂおよびＣＨ５０値、尿検査パラメーター、器官重量、ならびにＩＮＸ−３２８０に関連した肉眼的病態における臨床的徴候または変化はなかった。凝固パラメーターに対する唯一の効果が、１５ｍｇ／ｋｇの用量を受けた群における注入終了時のＡＰＴＴの緩やかな増加であった（しかし、３ｍｇ／ｋｇの注入で処置された低用量群ではそうではなかった）。１５ｍｇ／ｋｇ／群におけるＡＰＴＴの延長は、研究前の平均より３０％またはそれ未満多かっただけで、これは臨床的に有意とは考えられない。さらに、この変化は、循環からのオリゴヌクレオチドのクリアランスと平行して、注入の終了後数時間以内に逆転した。１５ｍｇ／ｋｇにおけるＡＰＴＴの増加の大きさは、同様な投薬条件下、他のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで観測されるものより少ない（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ｂ； Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ｃ； Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ． １９９８）。
【００４６】
同様に、１５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで与えられるＩＮＸ−３２８０による補体活性化の不在は、このクラスの他の化合物と比較した場合、珍しい（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ． １９９７ａ； Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ｂ； Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９８； Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる代替的経路の活性化は、サルにおいて、生命にかかわる血行動態の障害を導き得る、よく認識されたクラス効果である（Ｇａｌｂｒａｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ａ； Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ｂ； Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。幸いなことに、この効果は、血液レベル依存性であり、静脈内注入の速度を減少させることにより（すなわち、所望の用量を送達するための注入期間を増加させることにより）改善され得る。１５ｍｇ／ｋｇ注入の終了時点における完全長ＩＮＸ−３２８０の血漿濃度（１０１〜１２０ｇ／ｍＬ；表９）は、他のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対して報告されている、補体活性化のための４０〜５０ｇ／ｍＬという閾濃度を十分越えていた（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ａ； Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ｂ； Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）ことを注記することは重要である。これらの結果は、１００ｇ／ｍＬの単量体ＩＮＸ−３２８０が、非単量体化ＩＮＸ−３２８０および同濃度で投与したＩＮＸ２３０２の両方と比較して、補体消費を減少させたという、本明細書に添付される他の実施例で報告されるｉｎ　ｖｉｔｒｏ観測と一致する。
【００４７】
この差異は、他のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと比較して、明らかに、研究における単量体のＩＮＸ−３２８０の使用（これは血液タンパク質と相互作用する可能性を減少させ得る）に起因している。この解釈は、補体および凝固活性の、非単量体化および単量体のＩＮＸ−３２８０のｉｎ　ｖｉｔｒｏ比較、ならびにＩＮＸ２３０２とのｉｎ　ｖｉｔｒｏ比較により直接支持される。これらのｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、単量体のＩＮＸ−３２８０は、非単量体化ＩＮＸ−３２８０と比較した場合、明らかに劣って補体活性化および凝固阻害を行うことができたが、ＩＮＸ２３０２と比較して改善されてもいた。これらの観測は、単量体のＩＮＸ−３２８０による補体活性化および凝固のｉｎ　ｖｉｖｏ測定と一致する。例えば、ｃ−ｒａｆキナーゼに対して１０ｍｇ／ｋｇのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの用量を投与されたカニクイザルにおいて、３５ｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドのピーク血漿濃度が、補体活性化（１ｇ／ｍＬを超えるＢｂ）およびＡＰＴＴの５０〜７０％の増加を伴った（Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。同様に、ＩＮＸ２３０２を与えられたカニクイザルは、約５０ｇ／ｍＬの血漿濃度を伴う補体カスケードの活性化（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ａ）および約８０ｇ／ｍＬの血漿オリゴヌクレオチド濃度でＡＰＴＴの５０％を超える増加（Ｈｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７ｃ）を有した。全く対照的に、１５ｍｇ／ｋｇで処置されたサルにおける血漿中１０１．５〜１１９．６ｇ／ｍＬのピークＩＮＸ−３２８０濃度（表９）は、Ｂｂ値１ｇ／ｍＬの有意な増加を伴わず（表７）、ＡＰＴＴ値のわずかな増加（３０％）のみを伴った（表６）。
【００４８】
２週間のＩＮＸ−３２８０投薬後にサルから得られた組織の微視的検査からの唯一の発見は、腎臓の尿細管上皮細胞の、および肝臓の細網内皮細胞（クッパー細胞）およびリンパ節（常在マクロファージ）の細網内皮細胞内の、好塩基球性顆粒物質の存在であった。これらの変化は、両方のＩＮＸ−３２８０処置群に存在したが、全ての動物において最小として格付けされた。他のオリゴヌクレオチドで実行された研究に基づいて、顆粒物質は、それらの細胞に蓄積する、オリゴヌクレオチド自体または関連した物質（おそらくタンパク質結合代謝産物）であると思われる（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。これは、器官機能にどのような変性病変または変化も伴わず、単にオリゴヌクレオチドの堆積および進行するクリアランスを反映するだけの、良性変化である。したがって、それは毒物学的に明らかな発見とはみなされない。故に、単量体化ＩＮＸ−３２８０が週に３回の２時間静脈内注入で２週間与えられた場合、１５ｍｇ／ｋｇ／注入の用量レベルでは明らかな副作用はなかった。
【００４９】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの処分は十分に特性決定されており、このクラスにおける全ての化合物が非常に類似して振る舞うこと、ならびに動態および組織分布が種にまたがって類似していることが、広く認められている（Ｃｏｓｓｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｓａｎｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ． １９９６， Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ここで使用されるサンプリング時間はこれらの以前の研究を再現することを意図しなかった。それにもかかわらず、表８に報告されるクリアランス半減期は、オリゴヌクレオチドが血液コンパートメントから非常に迅速に排除されるという、公表された報告（Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７による概説）と一致する。重要なことに、血液コンパートメントからのＩＮＸ−３２８０のクリアランス速度は、１回目と比較して６回目の投与で同一であった。すなわち、分布の主要な器官（腎臓および肝臓）においてオリゴヌクレオチドの代謝が遅い（典型的な半減期は１〜２日）にもかかわらず、クリアランス速度は前のＩＮＸ−３２８０投与により影響されなかった（Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【００５０】
オリゴヌクレオチドは、血液コンパートメント中で、主にエキソヌクレアーゼに媒介される活性により広範に代謝され、「鎖短縮化」生成物を与えるということが、ここで十分に確証される。図１に示されるデータは、エキソヌクレアーゼに媒介される、ＩＮＸ−３２８０からそのＮ−１およびＮ−２代謝生成物への代謝と一致する。低レベルのＮ−３生成物が全ての標本抽出時において観測されたことから、ＩＮＸ−３２８０投与後後期での様々な未知の異化生成物の出現は、ＩＮＸ−３２８０の代謝におけるエンドヌクレアーゼ活性に対する役割を示し得る。
【００５１】
総合すると、これらの結果は、単量体のＩＮＸ−３２８０が優れた安全性プロファイルを有することを実証する。この２週間研究でサルに与えられたＩＮＸ−３２８０は、初回臨床試験のために意図されるものと同一のスケジュールで、１５ｍｇ／ｋｇまでの用量レベルで投与された。血液タンパク質との相互作用、補体活性化、および凝固の阻害から生じるこれらの毒性は、他のオリゴヌクレオチドの開発について第一の関心事であった。しかしながら、ＩＮＸ−３２８０の「単量体化」プロセスは、このクラスの他の化合物と相対して、これらの毒性を誘発する可能性を実質的に減少させ、かつＩＮＸ−３２８０に関する安全限界を実質的に増加させると思われる。
【００５２】
実施例３
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究のため、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＮＸ２３０２を、既に記載された方法（Ｆｅａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を使用して、適正製造基準に従って製造した。ＩＮＸ２３０２を水に溶解し、２〜８℃で貯蔵した。
ＩＮＸ２３０２は、配列：
ＩＮＸ２３０２：５’−ＧＣＣ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＣＧＴ　ＣＡ−３’
配列番号２
を有するＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡに対する２０量体の配列である。
【００５３】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ補体および凝固アッセイ
酵素イムノアッセイキット（ＤｉａＳｏｒｉｎ， Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ ＭＮ）を製造者により記載されるように使用して、ヒト血清において全補体活性の決定を評価した。ベロナール緩衝生理食塩水に懸濁させた複製オリゴヌクレオチドサンプルを、正常ヒト血漿で１：９に希釈し、次いで０．１〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度で試験した。
【００５４】
ＤａｄｅアクチンＦＳ　ＡＴＰＰ試薬（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ， Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ， ＩＬ）を使用して活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定することにより、凝固活性を決定した。３．８％クエン酸ナトリウムで抗凝血した正常ヒト血漿を使用して、製造者により記載されるようにアッセイを行った。ベロナール緩衝生理食塩水に懸濁させた複製オリゴヌクレオチドサンプルを、正常ヒト血清で１：９に希釈し、次いで０．１〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度で試験した。
【００５５】
実施例２において議論されたｉｎ　ｖｉｖｏデータは、ＩＮＸ−３２８０の単量体化が、補体活性化を誘起し、かつ凝固を阻害するその能力を減少させることを強く示唆する。しかしながら、四重鎖形態のＩＮＸ−３２８０の毒性のため、それをサルに投与しなかったので、単量体と四重鎖との直接の比較はできなかった。結果的に、単量体および四重鎖形態のＩＮＸ−３２８０の補体および凝固活性は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイを使用して比較された。
【００５６】
凝固前にオリゴヌクレオチドに曝された全血において、ＩＳＩＳ２３０２および単量体化（２％未満四重鎖；表１）ＩＮＸ−３２８０の両方を、相対的に非活性化した。詳細には、５０ｍｇ／ｍＬのオリゴヌクレオチドでインキュベートされた全血において、３０分後に残存する補体活性は、それぞれ１２８および１５２ＣＡＥユニットであった。対照的に、非単量体化ＩＮＸ−３２８０（５４％四重鎖；表１）は利用可能な補体の大部分を消費し、インキュベーションの終了時点で残存するのは３４ＣＡＥユニットであった。これらのオリゴヌクレオチド間の差異は、１００ｍｇ／ｍＬでのインキュベーション後により明白になった。このインキュベーション後に残存する補体活性は、単量体化ＩＮＸ−３２８０、非単量体化ＩＮＸ−３２８０、およびＩＳＩＳ２３０２について、それぞれ１０１、１９、および３６ＣＡＥユニットであった。正常ヒト血清をオリゴヌクレオチドに曝した場合に、同様な結果が観測された。
【００５７】
凝固に対するオリゴヌクレオチドの効果を、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定により評価し、結果が図２に要約される。活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ；秒）を、様々な濃度のオリゴヌクレオチドで処理された正常ヒト血液由来の血清で測定した。血液は、コントロールオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ２３０２（◆）で、または非単量体化（●）もしくは単量体（○）形態のＩＮＸ−３２８０のバッチ＃１で、または非単量体化（■）もしくは単量体（□）形態のＩＮＸ−３２８０のバッチ＃２でのいずれかで、処理された。データは、二重反復試験の平均値を表す。
【００５８】
正常なＡＰＴＴ値は、２４．４〜２８．６秒の範囲内であった。１００ｍｇ／ｍＬまでの濃度で加えられた場合、ＩＳＩＳ２３０２は、ＡＰＴＴを７４．４秒という値まで増加させた（図２）。非単量体化ＩＮＸ−３２８０は、明らかに血液凝固をより阻害した（図２）。詳細には、１００ｍｇ／ｍＬのＩＮＸ−３２８０で観測されたＡＰＴＴ値は１３４秒（バッチ＃１）〜２２５．４秒（バッチ＃２）の範囲にあった（表２）。ＩＮＸ−３２８０の単量体化は、効果的に血液凝固の阻害を改善した（図２）。ＩＮＸ−３２８０の単量体化（表１）は、１００ｍｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチドで１３４〜２２５秒から３９．１秒（バッチ＃１）、３９．７秒（バッチ＃２）への、ＡＰＴＴ値における明らかな減少として反映された（図２）。
【００５９】
実施例４
実験１：ＷＦＩからの凍結乾燥後の単量体：四重鎖比への初期ＩＮＸ−３２８０濃度の影響。
ＩＮＸ−３２８０についての単量体：四重鎖比は、溶液のオリゴヌクレオチド濃度により影響され得るので、本発明者らはＷＦＩ（注射用蒸留水）から凍結乾燥した生成物において観測される比へのこのパラメーターの影響を試験した。加熱により基本的に１００％単量体になったＢＤＳ（バルク原体（Ｂｕｌｋ　Ｄｒｕｇ　Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、すなわち溶液のオリゴのバッチ）で開始し、本発明者らは、１．５ｍｇ／ｍｌ〜１２．０ｍｇ／ｍｌのＩＮＸ−３２８０のＷＦＩ希釈溶液を調製し、次いでこれらのサンプルを以下に示されるサイクルを使用して凍結乾燥した。乾燥に続いて、全てのサンプルは、わずかにバイアル壁から収縮した均一な非晶質ケーキ（ｃａｋｅ）に類似した外見を示した。
【００６０】
2004512383.tif 000003
【００６１】
結果は表２に要約される。示されるように、ＩＮＸ−３２８０のＢＤＳは、約５１：４９の単量体：四重鎖比を表す。６５℃で３０分間の加熱は、基本的に全ての四重鎖を単量体へ変換する。しかしながら、この単量体溶液の凍結乾燥は、絶対比が初期オリゴヌクレオチド濃度によりわずかに影響された、四重鎖の顕著な形成をもたらす。１．５ｍｇ／ｍｌの初期ＩＮＸ−３２８０濃度において、凍結乾燥および再水和後の単量体の割合は約５０％であるが、これは、初期オリゴマー濃度が１２．０ｍｇ／ｍｌである場合、約４５％に落ちる。凍結乾燥したサンプルが全て同じ最終濃度、２．５ｍｇ／ｍｌに再水和され、そのためこれらの違いが濃度依存性、再水和後の四重鎖形成を反映していないということを、注記しなければならない。単量体：四重鎖比への初期オリゴマー濃度の実質的な影響は欠けているという観点から、続く研究は、６．７ｍｇ／ｍｌのＩＮＸ−３２８０（これは臨床用生成物の調製において一般に使用される濃度である）を含むサンプルを主に検査した。
【００６２】
【表２】
2004512383.tif 000004
【００６３】
実験２：ＷＦＩからの凍結乾燥後のＩＮＸ−３２８０の単量体：四重鎖比への凍結時間の影響。
ＩＮＸ−３２８０の単量体溶液は、凍結単独で、四重鎖の実質的割合を形成する。さらに、冷却の速度、または全凍結時間は、四重鎖形成の程度に影響を及ぼし得る。したがって、本発明者らは、生成物の全凍結時間のパラメーターがＩＮＸ−３２８０の単量体：四重鎖比に顕著な影響を及ぼすかどうかを決定するために、これを延長する変更した凍結乾燥サイクル（以下を参照）を採用した。再び、オリゴヌクレオチドを、試験される２種の濃度、１．５ｍｇ／ｍｌおよび６．７ｍｇ／ｍｌで、ＷＦＩから凍結乾燥した。
【００６４】
2004512383.tif 000005
【００６５】
【表３】
2004512383.tif 000006
【００６６】
表３に示されるデータは、最初の凍結乾燥サイクルにおいて使用される２時間から４時間まで凍結時間を増加させても、再水和生成物の単量体：四重鎖比に明らかな影響は及ぼさないことを示している。１．５ｍｇ／ｍｌの初期ＩＮＸ−３２８０濃度において、四重鎖の割合にわずかな増加らしいものがあるが（註、表２）、６．７ｍｇ／ｍｌにおいて違いはあらわれない。この結果は、バイアルに入れたＩＮＸ−３２８０溶液を凍結乾燥シェルフに−５０℃で２時間置けば完全な凍結を確実にするためには十分であることを示す。
【００６７】
実施例５
スクロースおよびマンニトールのような凍結保護物質を使用して、凍結乾燥の間の変性からタンパク質を保護する。この保護効果の部分は、凝集を阻害するそれらの能力を反映している可能性が高い。したがって、そのような抗凍結物質は、凍結乾燥の間ＩＮＸ−３２８０を単量体形態に維持するのに潜在的な有用性を有し得る。したがって、本発明者らは、スクロース（３００ｍＭ）またはマンニトール（３００ｍＭ）のいずれかを含む６．７ｍｇ／ｍｌのオリゴヌクレオチド濃度の溶液からＩＮＸ−３２８０を凍結乾燥し、再水和サンプルの単量体：四重鎖比を検査した。これらの賦形剤の使用は、凍結乾燥サイクルを、ＷＦＩから化合物を乾燥させる間に使用されるものから顕著に変更することを必要とした（以下を参照）。得られる乾燥サンプルは、バイアル壁からほとんどまたは全く収縮していない均一な非晶質ケーキであった。
【００６８】
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【００６９】
表４に示されるように、スクロースおよびマンニトールの両方が、ＩＮＸ−３２８０の凍結乾燥中の四重鎖形成を阻害する。マンニトールの存在下で乾燥されたサンプルは、約５％の四重鎖形成を示し、一方スクロースの存在下で乾燥された生成物は、２％未満の四重鎖を示した。この結果は、スクロースおよびマンニトールが効果的な抗凍結物質であり、かつ凍結乾燥中の四重鎖形成を阻害し得ることを立証する。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
実施例６
３００ｍＭのスクロースが乾燥中の四重鎖形成に対してＩＮＸ−３２８０を完全に保護し得るという実証に続いて、本発明者らは、この保護の濃度依存性を検査した。実施例５に示されるサイクルを使用して、オリゴヌクレオチドを６．７ｍｇ／ｍｌで、０、１０、５０、１００、３００、および５００ｍＭスクロースから凍結乾燥した。この実験もまた、ＷＦＩ（すなわち０ｍＭスクロース）から乾燥させたＩＮＸ−３２８０の四重鎖形成に関して、新規凍結乾燥サイクルと実施例４の実験１および２で使用されたものとの間での比較を可能にする。
【００７２】
表５からわかり得るように、１０ｍＭでさえも明らかに四重鎖形成を阻害する、スクロースによる濃度依存性保護が存在する：興味深いことに、これは、約３．４ｍｇ／ｍｌのスクロース、すなわちＩＮＸ−３２８０の重量のほぼ半分を表す。四重鎖形成に対する基本的に完全な保護は、５０ｍＭおよびそれを上回るスクロースで達成される。この振る舞いは、スクロースが、非共融抗凍結剤として作用し、かつ氷晶形成の間にオリゴヌクレオチドで濃縮されることと一致する。これらの３つの実験で使用された凍結乾燥サイクル間の相当な違いにもかかわらず、ＷＦＩ（０ｍＭスクロース）で凍結乾燥したサンプルの四重鎖：単量体比が表２および３に観測される比と類似していることを注記することは、興味深い。
【００７３】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａおよび図１Ｂ】
図１ＡおよびＢは、カニクイザルにおけるＩＮＸ−３２８０（配列番号１）のｉｎ　ｖｉｖｏ代謝を示す。
【図２】
図２は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの凝固への単量体化の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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