(57)【要約】本発明はタンパク質の安定化に関する。本発明によって、タンパク質内の強い水素結合の条件に基づく新たなタンパク質工学的手法のための理論的基礎を提供する。本発明においては、複数のカルボキシル基含有酸性側鎖対を用いてタンパク質を安定化したり、あるいはｐＨ依存性の分子スイッチを形成したりする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を包含する、タンパク質のｐＨに依存する挙動を制御する方法。
タンパク質構造体中に存在する少なくとも１対のアミノ酸残基対を同定する工程であって、該アミノ酸残基対は、その中の複数のアミノ酸の側鎖間に水素結合が形成され、複数のアミノ酸残基の空間位置によって該水素結合のｐＨに依存する挙動が変化し、該アミノ酸残基対は２つの酸性アミノ酸残基からなる対、アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対、または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対である、そして
１つのタンパク質あたり少なくとも１つの位置において或るタイプのアミノ酸残基対を他のタイプのアミノ酸残基対で置換する工程であって、
２つの酸性アミノ酸残基からなる対は、アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対によって置換し、
アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対は、２つの酸性アミノ酸残基からなる対または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対によって置換し、
２つのアミド型アミノ酸残基からなる対は、２つの酸性アミノ酸残基からなる対またはアミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対によって置換する。
【請求項２】
該アミノ酸残基対の側鎖間に形成される水素結合が、低バリア水素結合（ＬＢＨＢ）であることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのグルタミン酸残基をグルタミン残基で置換することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのアスパラギン酸残基をアスパラギン残基で置換することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのグルタミン残基をグルタミン酸残基で置換することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのアスパラギン残基をアスパラギン酸残基で置換することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項７】
アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対を、２つの酸性アミノ酸残基からなる対で置換することにより、タンパク質中にｐＨ依存性のスイッチを形成することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項８】
該タンパク質が抗体またはその断片であり、Ｈ鎖の３９番目のアミノ酸残基とＬ鎖の３８番目のアミノ酸残基がアミド型アミノ酸残基またはカルボキシル基を含有する酸性アミノ酸残基であることを特徴とする、請求項７の方法。
【請求項９】
該タンパク質の構造体がＥＮＡ５Ｈｉｓ抗体の断片であることを特徴とする、請求項７の方法。
【請求項１０】
２つのアミド型アミノ酸残基からなる対であるＱ３９（Ｈ）−Ｑ３８（Ｌ）を２つの酸性アミノ酸残基からなる対であるＥ３９（Ｈ）−Ｅ３８（Ｌ）で置換することを特徴とする、請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はタンパク質の安定化に関するものであり、新たなタンパク質工学的手法のための理論的基礎を提供する。本発明においては、複数のカルボキシル基含有酸性側鎖対を用いてタンパク質を安定化したり、あるいはｐＨ依存性の分子スイッチを形成したりする。
【０００２】
従来技術
バイオテクノロジー関連業界においては、長年に渡りタンパク質の安定化に対する関心が集まっており、主な課題は温度や化学変性剤、酸化作用やタンパク質分解作用に対する安定化である。現在、これらの課題を達成するための主な手段としては、分子進化工学（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）と合理的（構造をベースとした）タンパク質デザイン（ｒａｔｉｏｎａｌ （ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂａｓｅｄ） ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｓｉｇｎ）の２つが挙げられる。部位特異的突然変異を用いた研究によって得られた様々な変異体タンパク質の相対的な安定性に関する実験データによって、タンパク質の安定性に関する法則の理解も深まりつつある。それらのデータは、タンパク質構造体の中心部分に存在する疎水性相互作用の支配的な影響力だけでなく、静電的相互作用と水素結合が大変重要な役割を果たすことも確立した。カルボキシル基を含有する酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）およびアミド型アミノ酸（ＡｓｎおよびＧｌｎ）の側鎖は、例えば水素結合の形成などによるタンパク質構造体の安定化において重要な働きをすることがわかっている。またこれらアミノ酸の変更は、タンパク質の安定性や酵素活性、ｐＨ依存性やその他の物性に影響を及ぼす場合が多いことも実証されている。例えば、Ｈｏｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）やＣａｔａｎｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．， （１９８８）は、タンパク質主鎖の側鎖として存在するアミド型側鎖やカルボキシル側鎖の間に形成される水素結合がタンパク質の安定性に及ぼす影響について研究している。
【０００３】
本発明では、低バリア水素結合（ＬＢＨＢ）と呼ばれる一種の水素結合の関与について指摘しているが、これは「標準的な」水素結合よりも強い結合だと考えられている。ＬＢＨＢが酵素の触媒作用においてある役割を担っているということは、１９９３年に最初に提唱された（例えば、Ｇｅｒｌｔ ＆ Ｇａｓｓｍａｎ， １９９３を参照）。しかし、縮合相内にＬＢＨＢが存在しうるか否かについては議論の的となった。一般的に、水素結合の強さはその結合の長さや直線度、そのミクロ環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）（リガンドおよび溶媒和）、そして共役している複数の酸のｐＫａ値がどの程度調和しているかによって左右される。これまでＬＢＨＢの性質を特徴付けるための様々な量子化学的研究が行われてきた。ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒとその共同研究者らはタンパク質の酸性側鎖間の相互作用の最も単純なモデルと考えられるギ酸イオンとギ酸の間に起こる作用に焦点を絞って研究を行った。彼らの研究によれば、そのようなＬＢＨＢの強度の主な決定要因となるのは、（１）微溶媒和が全く無いか、あるいは溶媒化物が不斉であること（Ｐａｎ ＆ ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ， １９９７）、（２）幾何学的特徴（長さおよび角度）（Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ ＆ ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ， １９９７）、（３）ｐＫａ値がどの程度調和しているか （Ｋｕｍａｒ ＆ ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ， １９９８）である。
【０００４】
１９８２年にＳａｗｙｅｒとＪａｍｅｓは、タンパク質内のカルボキシル基とカルボキシルイオンとの相互作用の存在と、それがタンパク質の安定性においてどのような意義を持つかについて解説した。その後、この研究に関する系統的なアプローチとしては、ＦｌｏｃｃｏとＭｏｗｂｒａｙ （１９９５）の研究が唯一の研究である。具体的には、ＰＤＢ （Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ， Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）に登録されているタンパク質の中からアミノ酸配列の相同性が２５％未満のものを１群とし、その中でタンパク質内に存在する２つの酸性アミノ酸残基からなる対（以後、「酸性−酸性対」と呼ぶ）について分析を行った。同研究者らは、分析した１５１個のタンパク質構造体に見られる２８対の酸性−酸性対について、その立体配置と環境物性に関する傾向を発見した。彼らの発見は主に以下の点である：（１）最も一般的なＯ−Ｏの距離は２．６〜２．７Åである、（２）全ての対は付加水素結合に関与する、（３）Ｏ−Ｏの距離が短い対のほとんどは溶媒和の形成性（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ）が低い、（４）１つのカルボキシル基からなる平面と、それに最も近い他のカルボキシル基のＯ（酸素原子）との間の角度が約９０°である、（５）”ｏｕｔ−ｏｕｔ” （ａｎｔｉ−ａｎｔｉ）配置はあまり好まれない。同研究者らは、上記のような酸性アミノ酸残基対が酵素の触媒作用や酵素基質との結合にとって重要なのではないかと提案した。
【０００５】
一方、ＭｏｒｔｅｎｓｅｎとＢｒｅｄｄａｍは、セリンカルボキシペプチダーゼの活性中心からグルタミン酸残基対をひとつ取り除くとその安定性が著しく低下することを示した（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ ＆ Ｂｒｅｄｄａｍ， １９９４）。このような不安定化作用は、低いｐＨ値において最も強く観測された。同研究者らはまた、高いｐＨ値においては（野生型酵素中の）グルタミン酸架橋が、電荷の反発力によって不安定化因子として働く傾向があるとも結論付けている。
【０００６】
本発明では、タンパク質を安定化するために強い水素結合を利用する。水素結合の強度は複数の要因に依存するので、タンパク質の安定性を向上させるためには、まずアミノ酸置換の適切な位置や種類を予測するための基準が必要となる。本発明では、量子化学モデル系列と、膨大な種類のタンパク質構造のデータの統計的分析とを比較することにより、非常に安定な水素結合の幾何学的特徴（および環境）に関する諸条件を定義した。このような研究によって、本発明者らは、タンパク質の三次構造におけるアミド型側鎖を有するアミノ酸からなる対を同定することに成功し、これらのアミド型側鎖をカルボキシル基含有酸性側鎖によって置換して酸性−酸性対を形成することで、低度〜中度のｐＨ値におけるタンパク質の安定性を高める方法を提案する。また、高いｐＨ値におけるタンパク質分子の安定性を高めるために、酸性−酸性対を欠失させることもできる。さらに、酸性−酸性対は（ｐＨ７を超える）高いｐＨ値においては反発性相互作用を生じるため、酸性−酸性対の導入は、ｐＨ依存性の分子スイッチの導入にも応用できる。このｐＨ依存性のスイッチは、結合性などのタンパク質の特性をｐＨ値の上昇に伴って改変するものである。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ａ）タンパク質内のカルボキシル基を側鎖に有する２つの酸性アミノ酸残基対を、アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対（以後、「アミド型−酸性対」と呼ぶ）または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対（以後、「アミド型−アミド型対」と呼ぶ）によって置換するか、またはｂ）前記とは反対の置換をするための工学的手法を開示し、その結果、ｐＨ値に依存するタンパク質の安定性を向上または低下を図るものである。
【０００８】
カルボキシル基を有する酸性側鎖の対は、一定の条件下では「普通の」水素結合よりもはるかに強い低バリア水素結合（ＬＢＨＢ）を形成できる。最も一般的な水素結合の１種を形成するアミド型−酸性対またはアミド型−アミド型対を酸性−酸性対によって置換することで、種々のタンパク質に上記のような酸性−酸性対を導入することが可能である。この他にも水素結合の性質を変えるアミノ酸置換は存在するが、この置換ほどタンパク質に生じる幾何学的変形が少ない置換は他に存在しない。
【０００９】
Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ （ＰＤＢ）を駆使した徹底的な幾何学的配置に関する調査と量子化学的な計算によって、酸性−酸性対による置換に適したタンパク質内のアミノ酸残基を決定するための条件を編み出した。ＬＢＨＢは強いため、この酸性−酸性対による置換は、他のタンパク質工学的手法を用いた場合と比べて、低度〜中度のｐＨ値におけるタンパク質の安定性を向上させることができる。なお、高いｐＨ値でタンパク質を安定させるためには、既存の酸性−酸性対を欠失させることもできる。逆に、（ｐＨ７を超える）高いｐＨ値における酸性−酸性対による不安定化作用は、ｐＨ依存性の分子スイッチの導入に応用することができ、このｐＨ依存性の分子スイッチは、ｐＨ値の上昇に伴ってタンパク質の特性を改変する。
【００１０】
従って、本発明の主な目的は、次の工程を包含する、タンパク質のｐＨに依存する挙動を制御する方法である。
タンパク質構造体中に存在する少なくとも１対のアミノ酸残基対を同定する工程であって、該アミノ酸残基対は、その中の複数のアミノ酸の側鎖間に水素結合が形成され、複数のアミノ酸残基の空間位置によって該水素結合のｐＨに依存する挙動が変化し、該アミノ酸残基対は酸性−酸性対、アミド型−酸性対、またはアミド型−アミド型対であり、そして、
１つのタンパク質あたり少なくとも１つの位置において或るタイプのアミノ酸残基対を他のタイプのアミノ酸残基対によって置換する工程であって、酸性−酸性対は、アミド型−酸性対またはアミド型−アミド型対によって置換し、アミド型−酸性対は、酸性−酸性対またはアミド型−アミド型対によって置換し、アミド型−アミド型対は、酸性−酸性対またはアミド型−酸性対によって置換する。
【００１１】
本発明の具体的な目的のひとつは、互いの側鎖によって水素結合した酸性アミノ酸残基対を導入することによって、低度〜中度のｐＨ値においてタンパク質を安定化することである。
【００１２】
本発明のさらに具体的な目的のひとつは、酸性−酸性対をそれに対応するアミド型−アミド型対またはアミド型−酸性対で置換することで高いｐＨ値においてタンパク質を安定化することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、タンパク質内に酸性側鎖対を導入し、それをｐＨ依存性の分子スイッチとして利用することである。
【００１４】
好ましい態様に関する詳細な説明
本発明の主軸となる３つの考え方を以下に要約する。
（１）酸性−酸性対をタンパク質に導入し、低度〜中度のｐＨ値において該タンパク質を安定化する。
（２）酸性−酸性対を他の種類のアミノ酸残基対によって置換することで、高いｐＨ値においてタンパク質を安定化する。
（３）２つのカルボキシル基含有酸性側鎖からなる対をタンパク質内のｐＨ依存性の分子スイッチとして用いる。
【００１５】
本発明の利用の可能性
タンパク質においては、アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基の間の水素結合や２つのアミド型アミノ酸残基の間の水素結合が普遍的に存在するので、中性のｐＨ値近傍で行なわれる酵素反応に関与する膨大な種類のタンパク質の熱安定化を図るために、酸性−酸性対を導入することは可能だと考えられる。低いｐＨ値で起こる酵素反応（例えばアミラーゼによる反応など）の中には、タンパク質の安定化が必要なものがある。低ｐＨ値でタンパク質が不活化する原因のひとつは、水素結合に関与する側鎖カルボキシル基のプロトン化であり、従って、酸性−酸性対のタンパク質への導入の最も有利な利用方法は、低ｐＨ値におけるタンパク質の安定化であろう。
【００１６】
一方、酸性−酸性対はタンパク質内にあまり高頻度で存在しないので、酸性−酸性対を、例えば、アミド型−酸性対で置換して高いｐＨ値においてタンパク質を安定化させる方法の用途は限られていると考えられる。しかし、酸性−酸性対が存在する稀なケース（例えばＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａセルラーゼなど）では、このいまだ未解決だった課題を解決するための有望かつ実証された手段となる。
【００１７】
例えば、本願実施例１に記載したように、高いｐＨ値においてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのセロビオハイドロラーゼＣｅｌ６Ａを安定化する場合には、Ｔ． ｒｅｅｓｅｉの２つの突然変異体が有用であることが判明した。第一の変異体は、Ｔ． ｒｅｅｓｅｉのＣｅｌ６Ａセルラーゼの酸性−酸性対であるＥ１０７−Ｅ３９９を、アミド型−酸性対であるＱ１０７−Ｅ３９９によって置換することで導入したＥ１０７Ｑの点変異を有している。第二の変異体は、Ｔ． ｒｅｅｓｅｉのＣｅｌ６ＡセルラーゼのＥ１０７−Ｅ３９９、Ｄ１７０−Ｅ１８４およびＤ３６６−Ｄ４１９の３つの酸性−酸性対をそれぞれＱ１０７−Ｅ３９９、Ｎ１７０−Ｅ１８４およびＮ３６６−Ｄ４１９によって置換することで導入した、Ｅ１０７Ｑ、Ｄ１７０Ｎ及びＤ３６６Ｎの３つの点変異を有している。
【００１８】
これらの置換の結果、変異体タンパク質のｐＨ３〜６の範囲における変性温度は、野生型酵素のそれと比べて、酸性−酸性対１つごとに約４℃の割合で低下した。この結果を図５に示す。
【００１９】
高いｐＨ値において酸性−酸性対の側鎖は反発性を示すため、２つのタンパク質ドメインの間、あるいは１つのタンパク質ドメイン内のいずれにおいても、酸性−酸性対をｐＨ依存性の分子スイッチとして利用することができる。また、興味深い用途しては、２つか４つのドメインからなる抗体断片を含有する免疫アフィニティカラムから、そこに非常に強く結合したリガンドを溶出させるための利用が挙げられる。抗体の２つの可変性ドメインの間に酸性−酸性対を導入しておけば、厳しい溶出条件を使用することなく、ｐＨ値を（７．５を超える値に）上昇させるだけでリガンドを溶出させることができる。
【００２０】
本明細書および請求の範囲において、「カルボキシル基を有する酸性側鎖の対」という表現には、「側鎖を介して水素結合したアミノ酸残基に存在するカルボキシル基を有する酸性側鎖の一対」という一般的な意味がある。また、（１）「酸性−酸性対」、（２）「アミド型−酸性対」、（３）「アミド型−アミド型対」という表現は、３つのタイプのアミノ酸残基対を定義するのに用いられるが、それらはすなわち、（１）２つの酸性側鎖からなる対、（２）１つのアミド型側鎖と１つの酸性側鎖からなる対、（３）２つのアミド型側鎖からなる対、をそれぞれ有するアミノ酸残基対である。これらのアミノ酸残基対に関与するアミノ酸としては、Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＧｌｎ（Ｑ）が挙げられる。
【００２１】
本発明の目的において、「ｐＨ依存性の分子スイッチ」という用語は、「少なくとも２つの官能基からなる分子配置であり、官能基のプロトン化状態を変化させることのできるもの」と定義することができる。プロトン化状態の変化によって１つまたは複数の官能基対の間で誘引性相互作用または反発性相互作用が起こる。官能基間の相互作用が変化した結果、酵素の触媒機能の活性化や不活化、リガンドと基質の結合方式の変化、または安定性の変化などのタンパク質の性質や機能も変化する。
【００２２】
実施例
理論分析の方法
タンパク質構造体の統計分析
ＰＤＢ（０６／２２／１９９９付のバージョン） （Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９７７）から抽出した１６１９個のタンパク質構造体のデータからなる１群に対して統計分析を行った。この１群のデータにおいては、Ｒ因子が０．２５未満のＸ線解析結果によって求めたアミノ酸配列の相同性が９０％未満であり、且つ分離度が２．５Åを超えていた。Ｈｏｏｆｔ ｅｔ ａｌ． （１９９６）によって提供されたこのデータ群の中から、分離度が２．９Åを下回るカルボキシル基内の酸素原子からなる対を検索した。更にこのような酸素原子対の中から、二価の金属イオンの錯体を形成しているものを除外して、Ｏ−Ｏ距離の短い対を抽出した。そうして得られた２１９対について、その水素結合の幾何学的特徴を分析した（詳細な説明については図１を参照）。また、比較のために、上記と同様の分析をアミド型−酸性対およびアミド型−アミド型対についても行い、分離度が３．５Å以下のアミノ酸対５７５２対を抽出した。
【００２３】
幾何学的分析には、ＣＯＮＴＡＣＴ，ＡＮＧＬＥＳ，ＧＥＯＭＣＡＬＣというＣＣＰ４プログラム（ＣＣＰ４，１９９４）を使用した。酸素とカルボニル基内の炭素の形成する角度を用いて水素結合角度ａ１（図１）を算出した。また、第１残基の酸素原子と炭素原子及び第１残基と第２残基の間に形成される水素結合に関与する２つの酸素原子からなる二面角ｄ１、並びに第２残基の酸素原子と炭素原子及び第１残基と第２残基の間に形成される水素結合に関与する２つの酸素原子からなる二面角ｄ２を算出した（図１）。これらの計算値によって、水素結合に関与する酸素原子の非共有電子対に基づく分類が可能となった。２つの炭素と水素結合を形成する２つの酸素からなる二面角ｄ３（図１）からは、ある１つのカルボキシル基の形成する平面が他のカルボキシル基の形成する平面とどの程度離れているかがわかる。
【００２４】
酸性−酸性対のＯ−Ｏ間の距離（ｒ３、同じく図１を参照、）の分布においては、最大値は約２．５５Åであるが、一方、酸性−アミド型対においては、Ｏ−Ｏ間の距離の最大値は約２．９Åである。また、酸性−酸性対の角度ａ１の分布は比較的狭く、ａ１値の多くは１８０°近傍に集中している。酸性−アミド型対の場合は、角度値の分布は広く、これは酸性−酸性対の水素結合が線形角度に強く依存することを示している（図３ａおよび図３ｂ）。カルボキシル基内における、水素結合に関与しない酸素原子に対する水素結合の位置によって、酸性−酸性対の立体配置（ｄ１，ｄ２）を次の３つのグループに分類した。（ａ）ｓｙｎ−ｓｙｎ （１２０°〜１８０°、１２０°〜１８０°）、（ｂ）ａｎｔｉ−ｓｙｎ （０°〜６０°、１２０°〜１８０°）、（ｃ）ａｎｔｉ−ａｎｔｉ （０°〜６０°、０°〜６０°）（図２）。更なる分析に進む前に、上記で抽出したアミノ酸対のうちの３０対を除外した。その理由は、二面角の１つが６０°〜１２０°の場合、上記のような幾何学的分類が不正確となるからである（図２および表１）。残りの１８９対においては、ａｎｔｉ−ｓｙｎ配置が６８％と最も多く、ｓｙｎ−ｓｙｎ配置が最も少なかった（１３％）。異なる幾何学的配置においては、１つのあるカルボキシル基平面に対する他のカルボキシル基平面の好ましい配向が存在する。ａｎｔｉ−ａｎｔｉ配置の場合はこれが約１２０°であり、ａｎｔｉ−ｓｙｎ配置の場合は約９０°、そして ｓｙｎ−ｓｙｎ配置の場合は約１７０°である（図４ａ〜４ｃ）。
【００２５】
水素結合を形成するアミノ酸残基の側鎖に含まれる酸素原子の表面接触性（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）は、プローブ半径が１．４Åの条件で、Ｌｅｅ ＆ Ｒｉｃｈａｒｄｓ （１９７１）の方法を用いるプログラムであるＰＳＡ（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８）によって計算した。酸性−酸性対の側鎖に含まれる酸素の４９％の溶媒和形成性は１Å２未満であり、これは水とは相互作用しないことを示している。また、酸素の７％しか１０Å２を超える溶媒和形成性を示さなかったことは、２分子の水が酸性−酸性対に含まれる１つの酸素原子と相互作用することはまれであることを示している。２つの酸素原子の溶媒和形成性はたいてい同等であることから、対照的な配位が生じることを示唆している。
【００２６】
量子化学的分析に基づく幾何学構造とそのエネルギー
タンパク質内に存在する水素結合の幾何学的構造の分布について説明するために、各立体配置を表わす小さな分子モデルを作製した。タンパク質内で観察されるカルボキシル基を有する酸性側鎖からなる対のモデルとして、酢酸分子とアセテート分子を使用した。これら分子の機能は、アスパラギン酸やグルタミン酸の側鎖と同等である。また、アセトアミドをアスパラギンとグルタミンの側鎖に見立てて使用した。アプイニシオ法による計算はすべてＧＡＵＳＳＩＡＮ ９８パッケージソフト（ＧＡＵＳＳＩＡＮ ９８ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｓ） （Ｆｒｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９８） で行った。まず、構造体の幾何学構造をＢ３ＬＹＰレベルの原理（Ｂｅｃｋｅ， １９９３； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９８８）に基づく６−３１＋＋Ｇ（ｄ， ｐ）基底関数によって最適化した。
【００２７】
その結果、分析を開始した多様な幾何学構造の中から、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ、ａｎｔｉ−ｓｙｎおよびｓｙｎ−ｓｙｎの最小構造単位にそれぞれ相当する３種類の構造体（図２）が同定された。これらのエネルギーと幾何学的特徴を表１にまとめた。ａｎｔｉ−ｓｙｎ系が最もエネルギーが低く、ａｎｔｉ−ａｎｔｉ系はａｎｔｉ−ｓｙｎ系よりもわずか０．４ｋｃａｌ高いだけであり、ｓｙｎ−ｓｙｎ系はａｎｔｉ−ｓｙｎ系よりも２．０ｋｃａｌ高かった。ｓｙｎ−ｓｙｎ型のＯ−Ｏ距離が最も短く、水素はより中心に位置していた。つまり量子化学的計算の結果は、タンパク質に見られる幾何学的特徴と驚くほど一致していた（図４ａ〜４ｃ）。従って、気相データに基づく計算の結果から明らかとなったエネルギー特性の中には、タンパク質環境にも適用することのできるものがあるという結論に至った。
【００２８】
タンパク質内で強い水素結合を形成する条件
Ｘ線構造解析値の統計分析および量子化学的計算によって得られた情報を総合的に検討し、アミノ酸置換における以下の構造的制約を見出した。これらの条件をより多く満たすほど側鎖間の水素結合は強くなり、タンパク質変異体の安定性が増す。
【００２９】
１．　酸性アミノ酸残基対を構成する複数のアミノ酸に存在するプロトン供与体とプロトン受容体の間の距離が２．７Å未満の短距離となることが可能である。
２．　アミノ酸残基対の間に形成された水素結合の角度が１８０°の近似値に達することが可能である。
３．　酸性アミノ酸残基対の２つのカルボキシル基がａｎｔｉ−ｓｙｎの配置をとることが好ましい。
４．　酸性アミノ酸残基対の２つのカルボキシル基が形成する２つの平面の配向は、ａｎｔｉ−ｓｙｎ配置の場合は約６０°、ｓｙｎ−ｓｙｎ配置の場合は約１２０°、そしてａｎｔｉ−ａｎｔｉ配置の場合は約１８０°である。
５．　酸性アミノ酸残基対のカルボキシル基の酸素原子の溶媒和形成性が可能な限り低い。
６．　水素結合に関与する酸性アミノ酸残基対の２つのカルボキシル基において、そこに含まれる複数の酸素原子の溶媒和形成性が高い場合は、２つのカルボキシル基は類似した相互作用に関与している。
【００３０】
【表１】
2004511490.tif 000002
2004511490.tif 000003
2004511490.tif 000004
【００３１】
実施例１
１つ又は３つの酸性−酸性対をアミド型―酸性対によって置換することで、高いｐＨ値におけるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのセロビオハイドロラーゼＣｅｌ６Ａ（ＣＢＨＩＩと呼ばれていたもの）を安定化する
酸性−酸性対をｐＨ非依存性のアミド型−酸性対によって置換することで、高ｐＨ値における側鎖同士の反発作用を防止し、（高ｐＨ値において）タンパク質を安定化することができる。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉのセロビオハイドロラーゼＣｅｌ６Ａの結晶構造には上記に挙げた条件に適う４つの酸性−酸性対があり、そのうちの１つはこの酵素の活性中心（Ｄ１７５−Ｄ２２１）に位置し、触媒反応に関与している（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。高いｐＨ値においてこの酵素を安定化するために、Ｔ． ｒｅｅｓｅｉのセロビオハイドロラーゼＣｅｌ６Ａの変異体を２つ作成した。第一の変異体は、Ｔ． ｒｅｅｓｅｉのＣｅｌ６Ａセルラーゼの酸性−酸性対であるＥ１０７−Ｅ３９９を、アミド型−酸性対であるＱ１０７−Ｅ３９９によって置換することで導入したＥ１０７Ｑの点変異を有している。第二の変異体は、Ｔ． ｒｅｅｓｅｉのＣｅｌ６ＡセルラーゼのＥ１０７−Ｅ３９９、Ｄ１７０−Ｅ１８４およびＤ３６６−Ｄ４１９の３つの酸性−酸性対を３つのアミド型−酸性対であるＱ１０７−Ｅ３９９、Ｎ１７０−Ｅ１８４およびＮ３６６−Ｄ４１９によって置換することで導入した、Ｅ１０７Ｑ、Ｄ１７０Ｎ及びＤ３６６Ｎの３つの点変異を有している。各点変異をＴ． ｒｅｅｓｅｉのＣｅｌ６ＡのｃＤＮＡクローンにＰＣＲオーバーラップ・エクステンション法で導入し、全変異領域のＤＮＡ配列をシークエンシングした。初めにＥ１０７Ｑの点変異（ＧＡＡ→ＣＡＡ）と、Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎの３つの点変異（ＧＡＡ→ＣＡＡ／ＧＡＣ→ＡＡＣ／ＧＡＣ→ＡＡＣ）を、それぞれｐＳＰ７３プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ製）内のｃｅｌ６ＡｃＤＮＡに導入した。ＤＮＡの構築には、大腸菌ＤＨ５α（Ｐｒｏｍｅｇａ製）をクローニングの宿主として用いた。次に、変異体ｃＤＮＡを、既に報告されている（Ｋｏｉｖｕｌａ ｅｔ ａｌ．， １９９６ａ）真菌性発現構造体のプロモーターであるＴ． ｒｅｅｓｅｉのｃｅｌ７Ａ（ｃｂｈ１と呼ばれていた）の下流にクローニングした。
【００３２】
エンドグルカナーゼＣｅｌ５Ａ（ＥＧＩ）およびセロビオハイドロラーゼＣｅｌ６Ａ（ＣＢＨＩＩ）の遺伝子を欠失したＴ． ｒｅｅｓｅｉ株を変異酵素の産生宿主として用いた。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ形質転換体の選択には、ハイグロマイシン選択プラスミドｐＲＬＭｅｘ３０を用いた（Ｍａｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。形質転換および最適な産生形質転換株の選択は、基本的にＳｔａｈｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）の方法に従って行った。
【００３３】
生産性の最も高いＣｅｌ６Ａ変異株をＳｒｉｓｏｄｓｕｋ ｅｔ ａｌ． （１９９３）の方法で培養し、変異体タンパク質は実質的にＲｅｉｎｉｋａｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５）の方法で精製した。菌体から培養上清を遠心分離によって分離した後、濾過によって更に不純物を除去した。アジ化ナトリウム、フェニルメチルスルホニルフッ化物およびＥＤＴＡをそれぞれ最終濃度が０．０２％、３０μＭ、１ｍＭとなるように加え、ＰＴＧ１０膜（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いたペリコンラボラトリーセルシステムにより培養上清を濃縮した。Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ−６（米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使って脱塩後、得られたタンパク質溶液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で平衡したＤＥＡＥ−セファロースファストフローカラム（スウエーデン国、ウプサラ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけた。各画分については、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭｅＵｍｂ（Ｇｌｃ１））およびＭｅＵｍｂ（Ｇｌｃ）２を基質とした分析と共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ， １９７０）およびウエスタンブロッティング（Ｔｏｗｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９）を行った。Ｃｅｌ６Ａを含む溶出画分は、更にチオセロビオシドに基づくアフィニティクロマトグラフィー（Ｔｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８）でさらに精製した。得られた変異体精製物の確認とその純度測定をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングで行った。混入したセルロース分解活性は、前述したように（Ｋｏｉｖｕｌａ ｅｔ ａｌ．， １９９６ｂ）、ＭｅＵｍｂ（Ｇｌｃ１）、ＭｅＵｍｂ（Ｇｌｃ）２およびヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）に対する活性を測定することで除外した。精製した野生型タンパク質および変異体タンパク質の濃度は、それぞれ２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度から、Ｃｅｌ６Ａ野生型酵素の総アミノ酸分析に基づくモル吸光係数（ε＝１０４ ０００ ｍｏｌ−１ｃｍ−１）（Ａ． Ｋｏｉｖｕｌａ， 未発表データ）を使って算出した。
【００３４】
精製した、酸性残基対変異体であるＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７ＱとＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎ、および野生型Ｃｅｌ６Ａの安定性を、蛍光分光法および円偏光二色性分光法の両方で測定した。Ｃｅｌ６Ａと変異体のトリプトファン由来の内因性の蛍光をＳｈｉｍａｚｕ　ＲＦ−５０００分光蛍光計を用いて観測し、変性タンパク質について分析した（Ｅｆｔｉｎｋ， １９９５）。いずれのモノクロメーターの場合も、光路５ｎｍの条件下で発光と励起スペクトルを記録した。水浴に取り付けた温度調節機能つきのキュベットホルダーによって試料溶液の温度を調節した。野生型Ｃｅｌ６Ａおよび酸性残基対変異体について、温度誘導性のタンパク変性および塩酸グアニジン（Ｇｄｎ−ＨＣｌ）誘導性のタンパク変性をそれぞれ測定した。
【００３５】
温度誘導性のタンパク質変性は、各試料を徐々に８０℃まで加熱しながら（Ｅｆｔｉｎｋ， １９９５）蛍光強度を測定することによって観測した。試料溶液の温度は、試料溶液に浸漬した、Ｋ型熱電対を備えたＦｌｕｋｅ ５２ 型電子温度計を用いて連続的に計測した。各試料の内因性の蛍光は、２８０ｎｍの励起波長を使って３４０ｎｍにおける発光を温度が０．５℃上昇する毎に記録した。Ｏｒｉｇｉｎ社の画像およびデータ分析ソフト（Ｏｒｉｇｉｎ ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｅｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使い、各試料の蛍光強度の変化を温度に対する関数としてプロットし、プロットを回帰した後に微分した。各曲線の頂点を融点とした。全ての点について最低２回は測定を行った。緩衝液としては、５０ｍＭクエン酸／塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）、５０ｍＭグリシン／塩酸緩衝液（ｐＨ３．７）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，７および８）および５０ｍＭホウ酸ナトリウム／塩酸緩衝液（ｐＨ９）をそれぞれ使用した。図５にトリプトファン蛍光を用いて測定した野生型Ｃｅｌ６Ａおよび酸性残基対変異を有するＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７ＱとＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎの融点をｐＨに対する関数としたグラフを示す。このようにＴ． ｒｅｅｓｅｉの野生型Ｃｅｌ６Ａおよび酸性アミノ酸残基対変異体の安定性の測定によって、（ｐＨ７を超える）アルカリｐＨ領域において変異体は野生型酵素のそれよりも高いことがわかる。さらに、３つの点変異を有するＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎのほうが１つの点変異を有するＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑよりも安定であることもわかる。
【００３６】
このようにアルカリｐＨ領域において変異体酵素が野生型酵素よりも高い安定性を示す傾向は、塩酸グアニジンによる変性と円偏光二色性（ＣＤ）の測定によって確認できた。ＣＤの測定は、キュベット内の温度を調節するためのＰＴＣ−３８ＷＩペルティエ型温度調節システムを備えたＪａｓｃｏ Ｊ−７２０円偏光二色性分光計を使って行った。幅が１ｍｍのセルを用い、光路１ｎｍの条件で２４０ｎｍから１９０ｎｍの間のスペクトルを温度が８０℃に達するまで測定した。吸光度は５℃昇温するたびに測定し、融点の近傍では２．５℃昇温するたびに測定した。この測定はｐＨ６とｐＨ８で行った。これらの結果から、いずれの変異体酵素の融点も野生型酵素と比較すると、ｐＨ６では低く、ｐＨ８では高いことがわかった（ただしデータは記載しない）。また、ｐＨ６とｐＨ８における酵素の変性を塩酸グアニジンを用いて更に測定した（Ｐａｃｅ， １９８６）。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液の６Ｍ塩酸グアニジン原液を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液で希釈し、塩酸グアニジン濃度が増加する（０〜４Ｍ）２種の段階希釈系列を得た。５Ｍ ＮａＯＨを用いて２つの溶液系列のｐＨをそれぞれｐＨ６とｐＨ８に調整し、Ｎｏｚａｋｉ， １９７２の方法で屈折率を測定することで溶液中の塩酸グアニジンの濃度を決定した。酵素溶液２０μｌと塩酸グアニジン溶液４８０μｌを混合し、最終酵素濃度を１．０μＭとした。上記のｐＨ６とｐＨ８の溶液系列を共に２２℃で２４時間インキュベートし、塩酸グアニジン濃度が増加していくこれら試料系列の内因性の蛍光を、励起波長２８０ｎｍ、発光波長３４０ｎｍで測定した。両方の溶液系列においては、全ての測定時点で最低２回の測定を行った。変性タンパク質含量は次の方程式で計算した。
ｆｕ＝（ｙ−ｙｎ）／（ｙｕ−ｙｎ）。
（式中、ｆｕは変性タンパク質含量、ｙは試料の蛍光値、ｙｎは未変性の試料の蛍光値、ｙｕは変性した試料の蛍光値を表す。）
塩酸グアニジンを用いたＣｅｌ６Ａおよび酸性残基対を有する変異体の変性に関する分析結果も、前記の円偏光二色性による分光分析の結果と類似していた（ただしデータは記載しない）。
【００３７】
図５に示した融点曲線に基づき、全３酵素の４４℃における作用安定性について、セロテトラオース（Ｇｌｃ４）を基質とし、ｐＨを変化させながら測定した。インキュベーションと加水分解は共に４４℃で行い、既に提案されている方法（Ｔｅｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５）に従い、屈折率検出器を備えたＨＰＬＣ（米国、マサチューセッツ州、ミルフォード、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使って加水分解生成物を分析した。分離に用いたカラムはＡｍｉｎｅｘ　ＨＰＸ−４２　Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）であり、カラムの手前に脱塩カートリッジ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を設け、緩衝液イオンを除去した。代謝回転数は非線形回帰データ分析プログラム（Ｏｒｉｇｉｎ社製）を使って反応曲線の初期速度から求めた。反応混合物中のセロテトラオースの濃度は３００μＭで、酵素濃度は０．００７μＭから０．１５μＭの間であった。３００μＭが基質の飽和濃度であることを実証するためにｐＨ５とｐＨ８においては、基質濃度が６００μＭと９０μＭの条件下においても酵素活性を測定した。全ての加水分解測定において、試料は７〜１１の異なる時点で採取し、反応を止めてＨＰＬＣで分析した。緩衝液としては、５０ｍＭクエン酸／塩酸緩衝液（ｐＨ４）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６および７）および３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）をそれぞれ使用した。図６によると、セロテトラオースを基質とした場合、ｐＨ７．７における変異体Ｃｅｌ６Ａ−Ｅ１０７ＱとＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎの半減期は長くなり、それは３つの点変異を有する変異体Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎの方がより長かった。
【００３８】
両方の変異体の作用安定性の向上を、より天然の基質に近い細菌性微晶質セルロースを用いて証明した。細菌性微晶質セルロース（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ： ＢＭＣＣ）は、Ｇｉｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）の記載と実質的に同様の方法でにナタデココ（フィリピン国、Ｒｅｙｓｓｏｎｓ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）から調製し、平均重合度が２００〜３００のものを得た。ＢＭＣＣに対する酵素活性は、未変性の酵素（最終濃度１．４μＭ）と上記基質（０．７ｍｇ／ｍｌ）を４４℃においてｐＨ５の４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液又はｐＨ７．７の３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で振とうすることで測定した。あらかじめ決めておいた時点で試料を採取し、９４％エタノール９容量部と１ｍｏｌグリシン１容量部を含有するｐＨ１１．２の反応停止薬を採取した反応液に１／２等量加えて反応を停止した。各試料をＭｉｌｌｅｘ　ＧＶ　０．２２μｍユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を使って濾過した。濾液に含まれる可溶性の糖をＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０００）の方法に従ってｐ−ヒドラキシ安息香酸ヒドラジドを使って分析した。３種の異なる前処理時間で処理した野生型Ｃｅｌ６Ａと酸性アミノ酸残基対変異を有する２種の変異体のＢＭＣＣに対する活性を図７のグラフに示す。図７から明らかなように、酸性アミノ酸残基対変異を有する２つの変異体Ｃｅｌ６Ａ−Ｅ１０７ＱとＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎはいずれも４４℃においてｐＨ７．７で２時間前処理を施した後でもそのセルロース分解活性の大部分を保持していた（図７ｂ）のに対し、野生型Ｃｅｌ６Ａの残存活性は非常に低かった。
【００３９】
実施例２
タンパク質内におけるｐＨ依存性の分子スイッチとしてのカルボキシル基含有酸性側鎖対
本発明者らは、既にＥＮＡ５Ｈｉｓと呼ばれる特定の抗体断片（Ｆａｂ断片）は、免疫アフィニティカラム内に固定化した場合にさ薬品（Ｆｉｎｒｏｚｏｌｅ）のラセミ体を２つの鏡像異性体に分画することができることを示した（Ｎｅｖａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。その結果によると、鏡像異性体の１つはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中でカラムに特異的に結合するが、もう一方の鏡像異性体は移動相と共に溶出してしまう。しかし、カラムに結合した方の鏡像異性体を溶出させるときは、非常に高いｐＨ値（ｐＨ１１．５）が必要になり、この高いｐＨ値によって抗体断片が部分的に変性されてしまう。この免疫アフィニティカラムを何度も再利用するためには、より緩和な溶出条件が必要である。従って上記抗体断片の２つの可変性ドメインの間に酸性−酸性対を導入し、２つの可変性ドメインの配向を不安定なものとすることにより、高いｐＨ値における鏡像異性体の結合をも不安定なものとする。抗体−ハプテン複合体の三次元構造モデルに基づいて、設計した酸性−酸性対であるＥ３９（Ｈ）−Ｅ３８（Ｌ）を、Ｆａｂ断片であるＥＮＡ５ＨｉｓのＨ鎖（Ｈ）の点変異Ｑ３９Ｅとして導入し、Ｌ鎖（Ｌ）の点変異Ｑ３８Ｅとして導入した。アミノ酸残基の位置はＫａｂａｔの慣例（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， １９８７）に従っている。
【００４０】
点変異は、抗体断片ＥＮＡ５ＨｉｓのクローニングしたｃＤＮＡに導入した。ＥＮＡ５Ｈｉｓはモノクローナル抗体９５ＵＩからクローニングされた抗体断片（またはＦａｂ断片）であり（Ｎｅｖａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１）、２本のペプチド鎖、すなわちＬ鎖とＨ鎖で構成されている。これらのペプチド鎖はいずれも折りたたまれて２つのドメインをなしている。Ｌ鎖のＣ末端には６つのヒスチジン残基からなるタグが遺伝子工学によって導入されている。ＤＮＡ組み換え操作は標準的な方法で実施した。野生型Ｆａｂ断片ｃＤＮＡを含有するプラスミドをｐＥＮＡ５Ｈｉｓと呼ぶ。このプラスミドは、ｌａｃＩｑリプレッサーの制御下にあるｔａｃプロモーターを有する発現ベクターｐＴＩ８と、該プロモーターの下流に挿入された、Ｈ鎖とＬ鎖の２つのシストロンを含むオペロンからなる（Ｔａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１）。分泌のために、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクチン酸リアーゼのＰｅｌＢシグナル配列（Ｔａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１）をＨ鎖ｃＤＮＡとＬ鎖ｃＤＮＡのそれぞれの上流に連結した。さらに、ｐＥＮＡ５ＨｉｓプラスミドはＬ鎖のＣ末端に６つのヒスチジン残基を付加するためのタグも包含している。Ｈ鎖のＱ３９Ｅ変異およびＬ鎖のＱ３８Ｅ変異をｐＥＮＡ５Ｈｉｓ発現プラスミド内のＥＮＡ５Ｈｉｓ Ｆａｂ断片をコードするｃＤＮＡに導入し、その結果得られた変異遺伝子構造体をｐＥＮＡ５ＡＰＨｉｓと呼ぶ。
【００４１】
ｐＥＮＡ５ＡＰＨｉｓ構造体によって形質転換した大腸菌産生宿主を実験室規模の培養槽で培養した。ＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー） および プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使った標準的な方法（Ｎｅｖａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１）に従って培養上清からｐＥＮＡ５ＡＰＨｉｓ抗体断片を精製した。調製した変異体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって調べ、その存在を確認した。また、精製した野生型タンパク質および変異体タンパク質の濃度を測定した。精製後の変異体タンパク質をキレートセファロース （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に固定し、このカラムを使って変異体抗体断片の分画性能を試験した。結果は、ｐＥＮＡ５ＡＰＨｉｓカラムは野生型ＥＮＡ５Ｈｉｓカラムと同様に２つの鏡像異性体を分画することができるが、ｐＨ１〜１４のｐＨ勾配で溶出した際の溶出パターンが野生型ＥＮＡ５Ｈｉｓカラムとは変わっていることが示された。さらに、このｐＥＮＡ５ＡＰＨｉｓ変異体タンパク質の安定性をトリプトファン蛍光を使って調べた。ｐＨ３．７〜９．０の範囲において温度を様々に変えてトリプトファン蛍光を観測することによって変性の程度を測定した。その結果、実際に高いｐＨ値における変異体の挙動は、野生型ＥＮＡ５Ｈｉｓ Ｆａｂ断片の場合と比べて変化していることが示された。
【００４２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、相互作用している酸性−酸性対の幾何学的特徴を分析するために用いる角度の定義であり、距離ｒ１は（Ｏ−Ｈ）、距離ｒ２は（Ｈ．．．Ｏ）、そして距離ｒ３は（Ｏ．．．Ｏ）であり、角度ａ１はＯ−Ｈ．．．Ｏ間の角度であり、角度ｄ１およびｄ２はＯ−Ｃ−Ｏ．．．Ｏ間に形成される二面角であり、角度ｄ３は二面角（Ｃ−Ｏ．．．Ｏ−Ｃ）と定義されている、２つのカルボキシル基の平面間の角度である。
【図２】
図２は、二面角ｄ１およびｄ２の組み合わせによって定義される、酸性−酸性アミノ酸残基対からなる構造体の３種類の立体配置の概略図である。
【図３】
図３は、水素結合の角度ａ１（Ｏ−Ｈ．．．Ｏ）の分布を示し、図３ａはタンパク質のアミド型−酸性対における分布であり、図３ｂは酸性−酸性対における分布である。全てのデータはガウス関数の近似値である。
【図４】
図４ａ、４ｂおよび４ｃは、タンパク質において相互作用している２つのカルボキシル基のｄ１とｄ２の３種類の立体配置に見られる二面角ｄ３の分布を示す。各分布において、量子化学的に最適化した場合の最低値を矢印で示した。
【図５】
図５は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉセロビオハイドロラーゼＣｅｌ６Ａ（ＣＢＨＩＩ）の野生型酵素および酸性アミノ酸残基対変異を有する２種の変異体の融点を、ｐＨ値に対する関数として表したグラフである。Ｃｅｌ６Ａとその変異体のトリプトファン由来の内因性の蛍光を励起波長２８０ｎｍ、発光波長３４０ｎｍ、光路５ｎｍ（励起波長）と５ｎｍ（発光波長）の条件下で観測した。酵素濃度は０．５μＭとした。各試料を８０℃に達するまで徐々に加熱し、０．５℃昇温するごとに３４０ｎｍにおける発光強度を記録した。得られたデータはＯｒｉｇｉｎ社製のソフトウエアパッケージを使い、温度に対する関数としてプロットし、プロットを回帰した後に微分した。様々なｐＨ値における上記曲線の頂点を各酵素の融点とした。（ｐＨ３を除く）全ての点について最低２回は測定を行った。このとき使用した緩衝液は、５０ｍＭクエン酸／塩酸緩衝液（ｐＨ３．０、１．４ｍＳ）、５０ｍＭグリシン／塩酸緩衝液（ｐＨ３．７、０．３ｍＳ）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５、１．９ｍＳ）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６、３．７ｍＳ）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７、５．７ｍＳ）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８、６．９ｍＳ）、および５０ｍＭホウ酸ナトリウム／塩酸緩衝液（ｐＨ９、４．８ｍＳ）であった。図中、（□）は野生型Ｃｅｌ６Ａ、（○）はＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ変異体、そして（◇）はＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎ変異体を表す。
【図６】
図６に、セロビオハイドロラーゼ、即ち、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＣｅｌ６Ａ（ＣＢＨＩＩ）の野生型酵素および酸性アミノ酸残基対変異を有する２つの変異体の、４４℃、ｐＨ７．７における半減期を示す。この図は、４４℃におけるセロテトラオース活性の減少を、ｐＨ７．７におけるインキュベーションの時間に対して片対数でプロットした結果である。酵素は、４４℃、ｐＨ７．７において一定時間前処理に付し、その後、同じ温度とｐＨにおいてセロテトラオース（最終濃度３００μＭ）に対する活性を測定した。各酵素の活性は、前処理０時間の活性を１００％として標準化した。図中、（□）は野生型Ｃｅｌ６Ａ、（○）はＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ変異体、そして（◇）はＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１０７Ｎ／Ｄ３６６Ｎ変異体を表す。
【図７】
図７に、３つの前処理時間（０ｈ，２ｈ，２１ｈ）における、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉＣｅｌ６Ａ（ＣＢＨＩＩ）の野生型酵素および酸性アミノ酸残基対変異を有する２つの変異体の４４℃、ｐＨ７．５における細菌性微晶質セルロース（ＢＭＣＣ）に対する活性を示す。各酵素（１．９μＭ）を４４℃、ｐＨ７．５において０時間（図７ａ）、２時間（図７ｂ）または２１時間（図７ｃ）前処理し、同じ温度とｐＨにおいてＢＭＣＣ（最終濃度０．７ｍｇ／ｍｌ）に対する活性を測定した。セロビオース（Ｇｌｃ２）を基準として用い、還元糖をＰＡＨＢＡＨ試薬を用いて測定した（詳細は実施例１を参照）。図中、（□）は野生型Ｃｅｌ６Ａ、（○）はＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ変異体、（◇）はＣｅｌ６Ａ−Ｅ１０７Ｑ／Ｄ１７０Ｎ／Ｄ３６６Ｎ変異体を表す。
【図１】
2004511490.tif 000005
【図２】
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【図３ａ】
2004511490.tif 000007
【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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2004511490.tif 000018
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月22日(2002.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の第一の工程と第二の工程を包含する、タンパク質のｐＨに依存する挙動を制御する方法。
第一の工程は、タンパク質構造体中に存在する少なくとも１対のアミノ酸残基対を同定する工程であって、該アミノ酸残基対は、その中の複数のアミノ酸の側鎖間に水素結合が形成され、複数のアミノ酸残基の空間位置によって該水素結合のｐＨに依存する挙動が変化し、該アミノ酸残基対は２つの酸性アミノ酸残基からなる対、アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対、または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対である、そして
第二の工程は、１つのタンパク質あたり少なくとも１つの位置において或るタイプのアミノ酸残基対を他のタイプのアミノ酸残基対で置換する工程であって、
アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対は、２つの酸性アミノ酸残基からなる対によって置換し、但し、該置換によって導入される、カルボキシル基をそれぞれ有する２つの酸性アミノ酸残基からなる対は少なくとも下記条件（１−ａ）を満足し、更に、場合により、下記条件（１−ｂ）〜（１−ｆ）から選ばれる少なくとも１つを満足し、或いは、
２つの酸性アミノ酸残基からなる対は、アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対によって置換する。
（１−ａ）　酸性アミノ酸残基対を構成する複数のアミノ酸に存在するプロトン供与体とプロトン受容体の間の距離が２．７Å未満の短距離であることが可能である。
（１−ｂ）　該アミノ酸残基対の間に形成された水素結合の角度が１８０°の近似値に達することが可能である。
（１−ｃ）　該酸性アミノ酸残基対の２つのカルボキシル基がａｎｔｉ−ｓｙｎの配置をとることが可能である。
（１−ｄ）　該酸性アミノ酸残基対のカルボキシル基の酸素原子の溶媒和形成性が低い。
（１−ｅ）　該酸性アミノ酸残基対の２つのカルボキシル基の面角度は、ａｎｔｉ−ｓｙｎ配置の場合は約６０°、ｓｙｎ−ｓｙｎ配置の場合は約１２０°、そしてａｎｔｉ−ａｎｔｉ配置の場合は約１８０°である。
（１−ｆ）　水素結合に関与する酸性アミノ酸残基対の２つのカルボキシル基においては、そこに含まれる溶媒和形成性の高い複数の酸素原子はいずれも類似した相互作用に関与している。
【請求項２】
該アミノ酸残基対の側鎖間に形成される水素結合が、低バリア水素結合（ＬＢＨＢ）であることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのグルタミン酸残基をグルタミン残基で置換することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのアスパラギン酸残基をアスパラギン残基で置換することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのグルタミン残基をグルタミン酸残基で置換することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのアスパラギン残基をアスパラギン酸残基で置換することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項７】
アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対を、２つの酸性アミノ酸残基からなる対で置換することにより、タンパク質中にｐＨ依存性のスイッチを形成することを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項８】
該タンパク質が抗体またはその断片であり、該ｐＨ依存性のスイッチによって抗体の親和性を制御することを特徴とする、請求項７の方法。
【請求項９】
該タンパク質が抗体またはその断片であり、Ｈ鎖の３９番目のアミノ酸残基とＬ鎖の３８番目のアミノ酸残基がアミド型アミノ酸残基またはカルボキシル基を有する酸性アミノ酸残基であることを特徴とする、請求項７の方法。
【請求項１０】
該タンパク質構造体がＥＮＡ５Ｈｉｓ抗体の断片であることを特徴とする、請求項７の方法。
【請求項１１】
２つのアミド型アミノ酸残基からなる対であるＱ３９（Ｈ）−Ｑ３８（Ｌ）を２つの酸性アミノ酸残基からなる対であるＥ３９（Ｈ）−Ｅ３８（Ｌ）で置換することを特徴とする、請求項１０の方法。
【請求項１２】
タンパク質内でｐＨ依存性のスイッチを形成する２つの酸性アミノ酸残基からなる対を、アミド型アミノ酸残基と酸性アミノ酸残基からなる対または２つのアミド型アミノ酸残基からなる対で置換することによって該タンパク質のｐＨ依存性を低下させることを特徴とする、請求項１の方法。
【国際調査報告】
2004511490.tif 000046
2004511490.tif 000047
2004511490.tif 000048