(57)【要約】本発明は、一般には、遺伝子発現を活性化するか、またはｉｎ ｓｉｔｕでの組換え法よって遺伝子を過剰発現させることに関する。本発明はまた、一般には、細胞において通常的に見出されるレベルよりも高いレベルで内在性遺伝子を細胞内において発現させるための方法に関する。本発明の１つの実施形態において、遺伝子の発現を活性化させる調節配列が非相同的組換えまたは非正統的組換えによって細胞内に組み込まれた後に、内在性遺伝子の発現が活性化または増大する。別の実施形態において、内在性遺伝子の発現は、１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーを同時に組み込み、そして組み込まれたベクターに存在する１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーの増大したコピーについて選択することによってさらに増大させることができる。別の実施形態において、本発明は、本発明によって提供される特殊化された活性化ベクターの宿主細胞ゲノム内への非標的化組込みによる内在性遺伝子の活性化に関する。本発明はまた、標的配列が組込みには必要ないので、現在の方法で発見できない遺伝子を同定、活性化、単離および／または発現するための方法を提供する。本発明はまた、様々な方法を、膜貫通タンパク質を含む様々なタンパク質をコードする核酸分子（特に、ｃＤＮＡ分子）を単離するために、そして異種の膜貫通タンパク質であり得るそのような膜貫通タンパク質を発現する細胞を単離するために提供する。本発明はまた、単離された遺伝子、遺伝子産物、核酸分子に関し、そしてそのような遺伝子、遺伝子産物、核酸分子を含む組成物に関し、そしてそのような遺伝子および核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞に関する。これらは様々な治療的適用および診断的適用において使用され得る。従って、本発明により、ヒトの疾患および発達と関連する遺伝子を含む内在性遺伝子を、その遺伝子の配列、構造、機能または発現プロフィルに関する事前の知識を用いることなく活性化および単離することができる。
2004501601.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１の対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された第１の転写調節配列と、
（ｂ）第２の対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された第２の転写調節配列と
を含むベクター構築物。
【請求項２】
前記第１の転写調節配は前記第２の転写調節配列と同じ向きである請求項１に記載のベクター構築物。
【請求項３】
前記第１の転写調節配は前記第２の転写調節配列の向きに対して逆向きである請求項１に記載のベクター構築物。
【請求項４】
前記ベクターは線状である請求項２または請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
（ａ）転写調節配列と
（ｂ）対形成しないスプライスドナー部位と
（ｃ）希な切断制限部位と、
（ｄ）線状化部位と
をこの順で含むベクター構築物。
【請求項６】
（ａ）転写調節配列と、
（ｂ）希な切断制限部位を含むエキソンと、
（ｃ）対形成しないスプライスドナー部位と、
（ｄ）線状化部位と
をこの順で含むベクター構築物。
【請求項７】
前記対形成しないスプライスドナー部位と前記線状化部位との間に位置する第２の希な切断制限部位をさらに含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された第１の転写調節配列を含み、かつ対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第２の転写調節配列をさらに含むベクター構築物。
【請求項９】
前記第１の転写調節配列または前記第２の転写調節配列はプロモーターである、請求項１または請求項８に記載のベクター構築物。
【請求項１０】
前記プロモーターは、ＣＭＶ即時初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０Ｔ抗原プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される、請求項９に記載のベクター構築物。
【請求項１１】
前記転写調節配列はプロモーターである、請求項５〜７のいずれかに記載のベクター構築物。
【請求項１２】
前記プロモーターは、ＣＭＶ即時初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０Ｔ抗原プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選択される、請求項１１に記載のベクター構築物。
【請求項１３】
前記選択マーカーは、ネオマイシン遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、ジヒドロオラターゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ヒスチジンＤ遺伝子、カルバミルリン酸シンターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、多剤耐性１遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項８に記載のベクター構築物。
【請求項１４】
請求項１、５、６、７および８のいずれかに記載されるベクター構築物を含む真核生物宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞は動物細胞である、請求項１４に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項１６】
前記動物細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、環形動物細胞、両生類細胞、爬虫類細胞および魚類細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項１７】
前記動物細胞は哺乳動物細胞である、請求項１５に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項１８】
前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項１７に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項１９】
前記細胞は植物細胞である、請求項１４に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項２０】
前記細胞は真菌細胞である、請求項１４に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項２１】
前記真菌細胞は酵母細胞である、請求項２０に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項２２】
前記細胞は単離細胞である、請求項１５に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項２３】
前記ベクター構築物は前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１５に記載の真核生物宿主細胞。
【請求項２４】
ＰＣＲ増幅可能な配列および縮重した３’末端を含むプライマー分子であって、下記の構造、
５’−（ｄＴ）ａ−Ｘ−Ｎｂ−ＴＴＴＡＴＴ−３’
（式中、ａは１〜１００のすべての数であり、Ｘは、長さが約１０〜２０ヌクレオチドの核酸配列からなるＰＣＲ増幅可能な配列であり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｂは０〜６のすべての数である）
を有するプライマー分子。
【請求項２５】
前記ＰＣＲ増幅可能な配列は１つまたは２つ以上の制限部位を含む、請求項２４に記載のプライマー分子。
【請求項２６】
ａが１０〜３０のすべての数である、請求項２４に記載のプライマー分子。
【請求項２７】
前記プライマー分子の１つまたは２つ以上の塩基に結合した１つまたは２つ以上のハプテン分子を含む、請求項２４に記載のプライマー分子。
【請求項２８】
前記ハプテン分子は、ビオチン、ジゴキシゲニン、抗体、酵素、リポ多糖、アポトランスフェリン、フェロトランスフェリン、インスリン、サイトカイン、細胞外マトリックスタンパク質、インテグリン、アンキリン、Ｃ３ｂｉ、フィブリノーゲン、スペクトリン、サイトカイン受容体、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、ポリミキシンＢ、エンドトキシン中和タンパク質（ＥＮＰ）、酵素特異的基質、プロテインＡ、プロテインＧ、細胞表面Ｆｃ受容体、抗体特異的抗原、抗体特異的ペプチド、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項２７に記載のプライマー分子。
【請求項２９】
前記ハプテン分子はビオチンである、請求項２７に記載のプライマー分子。
【請求項３０】
第一鎖ｃＤＮＡを合成するための方法であって、
（ａ）請求項２４に記載されるプライマーをＲＮＡテンプレート分子とアニーリングして、プライマー−ＲＮＡ複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記プライマー−ＲＮＡ複合体の逆転写に好都合な条件のもとで前記プライマー−ＲＮＡ複合体を逆転写酵素および１つまたは２つ以上のデオキシヌクレオシド分子で処理して、第一鎖ｃＤＮＡを合成するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列と、１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーとを含み、かつ相同な標的化配列を含まないベクター構築物。
【請求項３２】
転写調節配列、増幅可能なマーカーおよびウイルス複製起点を含むベクター構築物。
【請求項３３】
選択マーカー、翻訳開始コドンに機能的に連結された転写調節配列、分泌シグナル配列、エピトープ標識、および対形成しないスプライスドナー部位を含むベクター構築物。
【請求項３４】
翻訳開始コドンに機能的に連結された転写調節配列、分泌シグナル配列、エピトープ標識、配列特異的プロテアーゼ部位、および対形成しないスプライスドナー部位を含むベクター構築物。
【請求項３５】
（ａ）翻訳開始コドンに機能的に連結された転写調節配列と、
（ｂ）４つ以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列をコードする核酸配列であって、前記アミノ酸配列は、単独ではシグナルペプチド活性を構成するには不十分であるが、前記核酸配列が内在性遺伝子のエキソンと一緒にされた場合、または前記核酸配列が内在性遺伝子の上流に存在する場合にはシグナルペプチド活性を構成するには十分である核酸配列と、
（ｃ）対形成しないスプライスドナー部位と
を含むベクター。
【請求項３６】
前記構築物は１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載にベクター構築物。
【請求項３７】
前記転写調節配列はプロモーターである、請求項３１および３３〜３５のいずれかに記載のベクター構築物。
【請求項３８】
前記プロモーターはウイルスプロモーターである、請求項３７に記載のベクター構築物。
【請求項３９】
前記ウイルスプロモーターはサイトメガロウイルス即時初期遺伝子プロモーターである、請求項３８に記載のベクター構築物。
【請求項４０】
前記プロモーターは非ウイルスプロモーターである、請求項３８に記載のベクター構築物。
【請求項４１】
前記プロモーターは誘導性プロモーターである、請求項３８に記載のベクター構築物。
【請求項４２】
請求項３１〜３５のいずれかに記載されるベクター構築物を含有する細胞。
【請求項４３】
請求項３６に記載されるベクター構築物を含有する細胞。
【請求項４４】
前記部ベクター構築物は細胞ゲノムに組み込まれている、請求項４２に記
載の細胞。
【請求項４５】
前記部ベクター構築物は細胞ゲノムに組み込まれている、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４６】
内在性遺伝子が、前記ベクター構築物の前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって前記細胞において過剰発現される、請求項４４または４５に記載の細胞。
【請求項４７】
前記細胞は単離細胞である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４８】
前記細胞は単離細胞である、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４９】
請求項３１〜３５のいずれかに記載されるベクター構築物を細胞に導入することを含む宿主細胞の作製方法。
【請求項５０】
内在性の細胞遺伝子またはその一部の発現産物を産生させるための方法であって、
（ａ）請求項３１〜３５のいずれかに記載される構築物をゲノム含有細胞に導入するステップと、
（ｂ）前記構築物を前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記内在性遺伝子を前記細胞内で過剰発現させるステップと
を含む方法。
【請求項５１】
前記過剰発現はインビトロで達成される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記過剰発現はインビボで達成される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記発現産物を前記細胞から単離することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
請求項３１〜３５のいずれかに記載される構築物で形質転換された細胞の集団を含む細胞ライブラリーであって、前記構築物が前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込まれている細胞ライブラリー。
【請求項５５】
細胞のライブラリーから遺伝子産物を得るための方法であって、請求項５４に記載されるライブラリーを前記遺伝子産物の発現についてスクリーニングすること、前記遺伝子産物を過剰発現する細胞を前記ライブラリーから選択すること、および前記選択された細胞から前記遺伝子産物を得ることを含む方法。
【請求項５６】
内在性の細胞遺伝子の発現産物を産生させるための方法であって、
（ａ）分泌シグナル配列に機能的に連結された転写調節配列と、対形成しないスプライスドナー配列とを含むベクターを細胞内に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性の細胞遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｄ）前記内在性の細胞遺伝子またはその一部の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
（ｅ）前記内在性の細胞遺伝子またはその一部の発現産物の前記細胞による産生に好都合な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項５７】
前記発現産物を単離することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
インビボでの細胞において内在性遺伝子を過剰発現させるための方法であって、
（ａ）転写調節配列を含むベクターを細胞内に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｄ）前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
（ｅ）インビボにおける前記細胞による前記内在性遺伝子の過剰発現に好都合な条件のもとで前記の単離されたクローン化細胞を動物に導入するステップと
を含む方法。
【請求項５９】
内在性の細胞遺伝子の発現産物をインビボで産生させるための方法であって、
（ａ）対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された転写調節配列を含むベクターを細胞内に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクター組み込み物を前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｄ）前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
（ｅ）インビボにおける前記細胞による前記内在性遺伝子の過剰発現に好都合な条件のもとで前記の単離されたクローン化細胞を動物に導入するステップと
を含む方法。
【請求項６０】
内在性の細胞遺伝子の発現産物を産生させるための方法であって、
（ａ）転写調節配列および１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーを含むベクターを細胞内に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同組合せによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｄ）前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
（ｅ）前記ベクターおよび前記内在性遺伝子が前記細胞において増幅される条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
（ｆ）前記内在性遺伝子の発現産物の前記細胞による産生に好都合な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項６１】
前記発現産物を単離することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ベクターは、前記転写調節配列に機能的に連結されたスプライスドナー部位をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記内在性遺伝子またはその一部は、エリスロポイエチン、インスリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、ＴＧＦ−β、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、ＴＳＨ−β、骨増殖因子−２、骨増殖因子−７、腫瘍壊死因子、α−１アンチトリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインＣ、プロテインキナーゼＣ、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経増殖因子、インスリン様増殖因子、インスリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害因子、血小板由来増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、肝細胞増殖因子、内皮細胞増殖因子、ニューロトロピン−３、トロンボポイエチン、絨毛性ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、α−グルコシダーゼ、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、細胞表面受容体、膜貫通イオンチャンネル、コレステロール受容体、リポタンパク質に対する受容体、インテグリン、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリン受容体およびＣＤ抗原からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項６０または請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記内在性遺伝子またはその一部はエリスロポイエチンタンパク質をコードする、請求項６０または請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記内在性遺伝子またはその一部は成長ホルモンタンパク質をコードする、請求項６０または請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記内在性遺伝子またはその一部はＧ−ＣＳＦタンパク質をコードする、請求項６０または請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記遺伝子発現産物は、エリスロポイエチン、インスリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、ＴＧＦ−β、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、ＴＳＨ−β、骨増殖因子−２、骨増殖因子−７、腫瘍壊死因子、α−１アンチトリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインＣ、プロテインキナーゼＣ、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経増殖因子、インスリン様増殖因子、インスリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害因子、血小板由来増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、肝細胞増殖因子、内皮細胞増殖因子、ニューロトロピン−３、トロンボポイエチン、絨毛性ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、α−グルコシダーゼ、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、細胞表面受容体、膜貫通イオンチャンネル、コレステロール受容体、リポタンパク質に対する受容体、インテグリン、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリン受容体およびＣＤ抗原からなる群から選択されるタンパク質である、請求項６０または請求項６２に記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
【請求項６８】
前記遺伝子発現産物はエリスロポイエチンタンパク質である、請求項６０または請求項６２に記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
【請求項６９】
前記遺伝子発現産物は成長ホルモンタンパク質である、請求項６０または請求項６２に記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
【請求項７０】
前記遺伝子発現産物がＧ−ＣＳＦタンパク質である、請求項６０または請求項６２に記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
【請求項７１】
インビボでの細胞において内在性遺伝子を過剰発現させるための方法であって、
（ａ）転写調節配列および１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーを含むベクターを細胞内に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｄ）前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
（ｅ）インビボにおける前記細胞による前記内在性遺伝子の過剰発現に好都合な条件のもとで前記の単離されたクローン化細胞を動物に導入するステップと
を含む方法。
【請求項７２】
前記転写調節配列はプロモーターである、請求項５６、５８〜６０、６２および７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記プロモーターはウイルスプロモーターである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ウイルスプロモーターはサイトメガロウイルス即時初期プロモーターである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記プロモーターは非ウイルスプロモーターである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記プロモーターは誘導性である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記ベクターが組み込まれる前に、または前記ベクターの組み込みと同時に、前記細胞のゲノムＤＮＡ内に複数の二本鎖切断を導入することをさらに含む、請求項５６、５８〜６０、６２および７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記ベクターが組み込まれる前に、または前記ベクターの組み込みと同時に、前記細胞のゲノムＤＮＡ内に複数の二本鎖切断を導入することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項７９】
前記ベクターが組み込まれる前に、または前記ベクターの組み込みと同時に、前記細胞のゲノムＤＮＡ内に複数の二本鎖切断を導入することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項８０】
請求項５６、５８〜６０、６２および７１のいずれかに記載される方法により産生される遺伝子発現産物。
【請求項８１】
前記ベクター構築物は線状である、請求項５６、５８〜６０、６２および７１のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
内在性遺伝子の発現産物を細胞内において産生させるための方法であって、
（ａ）転写調節配列を含むベクターを少なくとも１つの単離されたゲノム含有細胞に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｄ）前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
（ｅ）前記細胞を血清低下培地で培養するステップと
を含む方法。
【請求項８３】
タンパク質の発見方法であって、
（ａ）転写調節配列を含むベクターを少なくとも１つの単離されたゲノム含有細胞に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させることを可能にする条件のもとにおいて前記細胞を血清低下培地で培養し、それにより細胞馴化培地を作製するステップと、
（ｄ）前記遺伝子またはその一部の発現産物の存在について前記細胞馴化培地をスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項８４】
前記細胞馴化培地を（ｄ）におけるスクリーニングの前に濃縮することをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
高処理能力アッセイを含む、請求項８２〜８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
内在性の細胞遺伝子の発現産物を産生させるための方法であって、
（ａ）転写調節配列を含むベクターを細胞内に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｄ）前記内在性遺伝子の過剰発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
（ｅ）前記内在性遺伝子の発現産物の前記細胞による産生に好都合な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
（ｆ）１０４細胞／ｍｌである少なくとも１０リットルの細胞に等しい細胞塊から前記発現産物を単離するステップと
を含む方法。
【請求項８７】
前記ベクターは１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーをさらに含む、請求項８２〜８４および８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
前記ベクターは対形成しないスプライスドナー部位をさらに含む、請求項８２〜８４および８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
ｉｎ ｓｉｔｕでの細胞において、その表現型が知られている内在性遺伝子の発現を、前記遺伝子の何らかの配列情報を使用することなく増大させるための方法であって、
（ａ）増幅可能なマーカー、転写調節配列、および対形成しないスプライスドナー配列を含むベクターを構築するステップと、
（ｂ）複数コピーの前記ベクターを多数の細胞に送達するステップと、
（ｃ）挿入されたベクターと細胞のゲノムとの間の非相同的組換え事象を可能にする条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
（ｄ）前記遺伝子の発現が高められている細胞を同定するために、前記内在性遺伝子の表現型に関するアッセイによって前記組換え細胞をスクリーニングするステップと、
（ｅ）前記増幅可能なマーカーおよび前記内在性遺伝子の発現が増大した細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項９０】
前記表現型は特定のタンパク質の産生であり、かつ前記アッセイは前記タンパク質の増大した産生について試験することによって行われる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
挿入された遺伝子構築物をそのゲノム内に含む単離された細胞であって、前記遺伝子構築物は増幅可能なマーカーおよび転写調節配列を含み、そして前記構築物は遺伝子内または遺伝子の上流領域内に挿入され、かつ前記遺伝子の発現を活性化し、そして前記遺伝子および前記遺伝子の上流領域は前記遺伝子構築物に対するヌクレオチド配列相同性を有しない単離された細胞。
【請求項９２】
前記遺伝子構築物は、エキソンと対形成しないスプライスドナー配列をさらに含む、請求項９１に記載の単離された細胞。
【請求項９３】
前記遺伝子は、エリスロポイエチン、インスリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、ＴＧＦ−β、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、ＴＳＨ−β、骨増殖因子−２、骨増殖因子−７、腫瘍壊死因子、α−１アンチトリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインＣ、プロテインキナーゼＣ、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経増殖因子、インスリン様増殖因子、インスリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害因子、血小板由来増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、肝細胞増殖因子、内皮細胞増殖因子、ニューロトロピン−３、トロンボポイエチン、絨毛性ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、α−グルコシダーゼ、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、細胞表面受容体、膜貫通イオンチャンネル、コレステロール受容体、リポタンパク質に対する受容体、インテグリン、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリン受容体およびＣＤ抗原からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項９１または請求項９２に記載の単離された細胞。
【請求項９４】
前記遺伝子はエリスロポイエチンタンパク質をコードする、請求項９１または請求項９２に記載の単離された細胞。
【請求項９５】
前記遺伝子は成長ホルモンタンパク質をコードする、請求項９１または請求項９２に記載の単離された細胞。
【請求項９６】
前記遺伝子はＧ−ＣＳＦタンパク質をコードする、請求項９１または請求項９２に記載の単離された細胞。
【請求項９７】
遺伝子の発現を高めるための方法であって、
（ａ）エンハンサー配列および１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーを含有し、かつ遺伝子に特異的な標的化配列を含有しないベクターを細胞のゲノム内に導入するステップと、
（ｂ）内在性遺伝子の発現について前記細胞をスクリーニングするステップと、
（ｃ）前記増幅可能なマーカーおよび前記内在性遺伝子の発現が増大した細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項９８】
前記内在性遺伝子の発現が増大している細胞を単離することをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
細胞における内在性遺伝子の発現を高めるための方法であって、
（ａ）エンハンサー配列および１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーを含むベクターを細胞内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｂ）前記内在性遺伝子を発現する非相同的組換え細胞をスクリーニングするステップと、ただし、前記遺伝子、ならびに前記エンハンサー配列が活性である前記遺伝子の上流領域および下流領域は前記ベクターに対して相同的ではなく、
（ｃ）前記増幅可能なマーカーおよび前記内在性遺伝子の発現が増大した細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項１００】
挿入された人工遺伝子構築物をそのゲノム内に含む単離された細胞であって、前記遺伝子構築物は、１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーと、前記細胞における遺伝子の発現を高めるのに効果的なエンハンサーとを含み、そして前記遺伝子構築物は遺伝子内あるいは遺伝子の上流領域内または下流領域内に挿入され、かつ前記エンハンサーが活性である前記遺伝子および前記領域は前記遺伝子構築物に対して相同的でない単離された細胞。
【請求項１０１】
前記内在性遺伝子は膜貫通タンパク質をコードする、請求項５３、５６、５８〜６０、６２、７１、８２〜８４および８６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０２】
前記遺伝子は細胞膜貫通タンパク質をコードする、請求項８９、９７および９９のいずれかに記載の方法。
【請求項１０３】
前記細胞を動物に導入する前に前記細胞の単離およびクローニングを行うことをさらに含む、請求項５８、５９、６２および７１のいずれかに記載の方法。
【請求項１０４】
前記動物は哺乳動物である、請求項５８、５９、６２および７１のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
内在性膜タンパク質をコードする内在性遺伝子を発現する細胞を同定するための方法であって、
（ａ）（ｉ）開始コドンを含有するエキソン配列に機能的に連結された転写調節配列と
（ｉｉ）シグナル配列と
（ｉｉｉ）対形成しないスプライスドナー部位を伴うエピトープ標識と
を含むベクターを細胞内に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクターを前記細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませるステップと、
（ｃ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子またはその一部を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｄ）前記細胞の表面における前記エピトープ標識の発現について前記細胞をスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項１０７】
内在性膜タンパク質をコードする内在性遺伝子を発現する細胞を同定するための方法であって、
（ａ）真核生物宿主細胞からゲノムＤＮＡを単離するステップと、
（ｂ）（ｉ）開始コドンを含有するエキソン配列に機能的に連結された転写調節配列と、
（ｉｉ）シグナル配列と、
（ｉｉｉ）エピトープ標識と
を含むベクターと、前記単離されたゲノムＤＮＡを一緒にして、ゲノムＤＮＡ−ベクター複合体を形成させるステップと、
（ｃ）前記ゲノムＤＮＡ−ベクター複合体を真核生物宿主細胞に導入するステップと、
（ｄ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｅ）前記細胞の表面における前記エピトープ標識の発現について前記細胞をスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項１０８】
内在性膜タンパク質をコードする内在性遺伝子を発現する細胞を同定するための方法であって、
（ａ）原核生物宿主細胞からｃＤＮＡを調製するステップと、
（ｂ）（ｉ）開始コドンを含有するエキソン配列に機能的に連結された転写調節配列、
（ｉｉ）シグナル配列、および
（ｉｉｉ）対形成しないスプライスドナー部位を伴うエピトープ標識
を含むベクターと、前記単離されたｃＤＮＡを一緒にして、ｃＤＮＡ−ベクター複合体を形成させるステップと、
（ｃ）前記ｃＤＮＡ−ベクター複合体を真核生物宿主細胞に導入するステップと、
（ｄ）前記転写調節配列による前記遺伝子のアップレギュレーションによって内在性遺伝子を前記細胞において過剰発現させるステップと、
（ｅ）前記細胞の表面における前記エピトープ標識の発現について前記細胞をスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項１０９】
前記エピトープ標識を発現する前記細胞を単離することをさらに含む、請求項１０６〜１０８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１０】
前記単離細胞から前記の過剰発現した内在性遺伝子を単離することをさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
（ａ）エキソンおよび対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第１のプロモーターと、
（ｂ）ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された第２のプロモーターと
を含むベクター。
【請求項１１２】
前記の第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは同じ向きで前記ベクター内において存在する、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１３】
前記ベクターは線状であり、かつ前記選択マーカーは前記第１のプロモーターの３’に位置する、請求項１１２に記載のベクター。
【請求項１１４】
前記ベクターは線状であり、かつ前記選択マーカーは前記対形成しないスプライスドナー部位の５’に位置する、請求項１１２に記載のベクター。
【請求項１１５】
前記エキソンは翻訳開始コドンを有しない、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１６】
前記エキソンは翻訳開始コドンを含む、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１７】
前記エキソンは翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含む、請求項１１１に記載のベクター。
【請求項１１８】
（ａ）第１のプロモーターと、
（ｂ）ポジティブ選択マーカーと、
（ｃ）ネガティブ選択マーカーと、
（ｄ）対形成しないスプライスドナー部位と
を含むベクター構築物であって、
前記のポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーならびに前記スプライスドナー部位は、前記ベクターによりコードされるスプライスドナー部位とゲノムによりコードされるスプライスアクセプター部位との間でスプライシングが生じるような方法で前記ベクター構築物が真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込まれたとき、前記ポジティブ選択マーカーは活性な形態で発現し、かつ前記ネガティブ選択マーカーは発現しないか、または不活性な形態で発現するかのいずれかである向きで前記ベクター構築物において配向しているベクター構築物。
【請求項１１９】
前記のポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーは融合遺伝子として存在する、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２０】
前記ポジティブ選択マーカー、前記ネガティブ選択マーカー、または前記のポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーの両方はポリアデニル化部位を有しない、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２１】
第２の対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第２のプロモーターをさらに含む、請求項１１８に記載のベクター。
【請求項１２２】
第１のプロモーターおよび第２のプロモーターを含み、前記の第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは同じ向きで配向しているベクターであって、
（ａ）前記第２のプロモーターではなく、前記第１のプロモーターが、対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結され、
（ｂ）前記第１のプロモーターまたは前記第２のプロモーターのいずれの下流にもポリアデニル化シグナルを含まない
ことを特徴とするベクター。
【請求項１２３】
前記ベクターは線状であり、かつ前記第２のプロモーターは前記第１のプロモーターの３’に位置する、請求項１１２に記載のベクター。
【請求項１２４】
（ａ）対形成しないスプライスドナー部位を含有する第１の選択マーカーに機能的に連結された第１のプロモーターと、
（ｂ）第２の選択マーカーに機能的に連結された第２のプロモーターと
を含むベクターであって、
前記の第１の選択マーカーまたは第２の選択マーカーはいずれもポリアデニル化シグナルを含有しないベクター。
【請求項１２５】
前記の第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカーはポジティブ選択マーカーである、請求項１２４に記載のベクター。
【請求項１２６】
前記第１の選択マーカーは前記第２の選択マーカーの上流に位置する、請求項１２４に記載のベクター。
【請求項１２７】
（ａ）第１のエキソンおよび第１の対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第１のプロモーターと、
（ｂ）第２のエキソンおよび第２の対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第２のプロモーターと
を含むベクターであって、
前記第１のエキソンのヌクレオチド配列は前記第２のエキソンのヌクレオチド配列と異なるベクター。
【請求項１２８】
前記の第１のエキソンおよび第２のエキソンはそれぞれ、翻訳開始コドンと、停止コドンで終了しないオープンリーディングフレームとを含む、請求項１２７に記載のベクター。
【請求項１２９】
前記第１のエキソン、前記第２のエキソン、または前記の第１のエキソンおよび第２のエキソンの両方は翻訳開始コドンを有しない、請求項１２７に記載のベクター。
【請求項１３０】
（ａ）ポジティブ選択マーカーに機能的に連結された第１のプロモーターと、
（ｂ）ネガティブ選択マーカーに機能的に連結された第２のプロモーターと、
（ｃ）対形成しないスプライスドナー部位と
を含むベクター構築物であって、
前記のポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーならびに前記スプライスドナー部位は、ゲノム内の内在性遺伝子が転写的に活性化される方法で前記ベクター構築物が真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込まれたとき、前記ポジティブ選択マーカーは活性な形態で発現し、かつ前記ネガティブ選択マーカーは発現しないか、または不活性な形態で発現するかのいずれかである向きで前記ベクター構築物において配向しているベクター構築物。
【請求項１３１】
第２の対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第３のプロモーターをさらに含む、請求項１３０に記載のベクター構築物。
【請求項１３２】
１つまたは２つ以上の転位シグナルをさらに含む、請求項１、５〜７、８、３１、３２、３５、１１１、１１８、１２２、１２４、１２７、１３０および１３１のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３３】
１つまたは２つ以上の増幅可能なマーカーをさらに含む、請求項１１１、１１８、１２２、１２４、１２７、１３０および１３１のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３４】
１つまたは２つ以上のウイルス複製起点をさらに含む、請求項１、５〜７、８、３１、３２、３５、１１１、１１８、１２２、１２４、１２７、１３０および１３１のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３５】
１つまたは２つ以上のウイルス複製因子遺伝子をさらに含む、請求項１、５〜７、８、３１、３２、３５、１１１、１１８、１２２、１２４、１２７、１３０および１３１のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３６】
前記増幅可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロオロターゼ、およびカルバミルリン酸シンターゼからなる群から選択される、請求項１３３に記載のベクター。
【請求項１３７】
前記ウイルス複製起点は、エプスタインバールウイルスのｏｒｉＰおよびＳＶ４０のｏｒｉからなる群から選択される、請求項１３４に記載のベクター。
【請求項１３８】
ゲノムＤＮＡをさらに含む、請求項１、５〜７、８、３１、３２、３５、１１１、１１８、１２２、１２４、１２７、１３０および１３１のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３９】
請求項３１、３２、３５、１１１、１１８、１２２、１２４、１２７、１３０および１３１のいずれかに記載されるベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４０】
請求項１３２に記載されるベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４１】
請求項１３３に記載されるベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４２】
請求項１３４に記載されるベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４３】
請求項１３５に記載されるベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４４】
請求項１３８に記載されるベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４５】
前記宿主細胞は単離細胞である、請求項１３９に記載の宿主細胞。
【請求項１４６】
前記宿主細胞は単離細胞である、請求項１４０〜１４４のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１４７】
請求項１、５〜７、８、３１、３２、３５、１１１、１１８、１２２、１２４、１２７、１３０および１３１のいずれかに記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
【請求項１４８】
請求項１３２に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
【請求項１４９】
請求項１３３に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
【請求項１５０】
請求項１３４に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
【請求項１５１】
請求項１３５に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
【請求項１５２】
請求項１３８に記載されるベクターを含む細胞のライブラリー。
【請求項１５３】
細胞内における内在性遺伝子を活性化させるための方法であって、
（ａ）請求項１、５〜７、８、３１、３２、３５、１１１、１１８、１２２、１２４、１２７、１３０および１３１のいずれかに記載されるベクターでゲノム含有細胞をトランスフェクションするステップと、
（ｂ）前記細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含み、
前記組込みにより、前記細胞のゲノム内の内在性遺伝子の活性化がもたらされる方法。
【請求項１５４】
遺伝子を同定するための方法であって、
（ａ）請求項１、５〜７、８、３１、３２、３５、１１１、１１８、１２２、１２４、１２７、１３０および１３１のいずれかに記載されるベクターで多数のゲノム含有細胞をトランスフェクションするステップと、
（ｂ）前記宿主細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組み込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
（ｃ）前記ベクターが前記細胞のゲノム内に組み込まれた細胞を選択するステップと、
（ｄ）前記細胞からＲＮＡを単離するステップと、
（ｅ）前記単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを作製するステップと、
（ｆ）１つまたは２つ以上のヌクレオチド配列を含有する１つまたは２つ以上のｃＤＮＡ分子を前記ベクターから単離することによって前記ｃＤＮＡ内の遺伝子を同定するステップと
を含む方法。
【請求項１５５】
（ｆ）における前記同定は、前記ｃＤＮＡを前記ベクターにハイブリダイゼーションすることによって達成される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
（ｆ）における前記同定は、前記ｃＤＮＡを配列決定し、そして前記ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を前記ベクターのヌクレオチド配列と比較することによって達成させる、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
前記対形成しないスプライスドナー部位は、前記第１の選択マーカーの上流または前記第１の選択マーカーの内部に位置し、その結果、前記ベクターが真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、前記対形成しないスプライスドナー部位からゲノムコードのスプライスアクセプター部位へのスプライシングが生じたとき、前記第１の選択マーカーは不活性な形態で発現するか、またか全く発現しない、請求項１２４に記載のベクター。
【請求項１５８】
単一エキソン遺伝子が活性化された細胞を単離するための方法であって、
（ａ）請求項１５７に記載されるベクターで多数のゲノム含有真核生物細胞をトランスフェクションするステップと、
（ｂ）前記細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
（ｃ）前記の第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカーがその活性な形態で発現する細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項１５９】
（ａ）前記細胞からＲＮＡを単離するステップと、
（ｂ）前記単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを作製するステップと、
（ｃ）前記ｃＤＮＡから単一エキソン遺伝子を単離するステップと
をさらに含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
遺伝子のエキソンＩを単離するための方法であって、
（ａ）請求項１１１、１１２、１１４、１２２、１２４および１２７のいずれかに記載されるベクターで１つまたは２つ以上のゲノム含有真核生物細胞をトランスフェクションするステップと、
（ｂ）前記細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
（ｃ）前記ベクターによって、１つまたは２つ以上のエキソンを含有する内在性遺伝子が転写的に活性化された細胞を選択するステップと、
（ｄ）前記選択された細胞からＲＮＡを単離するステップと、
（ｅ）前記単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを作製するステップと、
（ｆ）前記内在性遺伝子に由来する第２のエキソンにスプラシングされた前記ベクターに由来する第１のエキソンを含有するｃＤＮＡ分子を回収し、それによって１つまたは２つ以上のベクターエキソン標識ｃＤＮＡ分子を得るステップと、
（ｇ）前記ベクターエキソン標識ｃＤＮＡ分子を使用して、エキソンＩを含有する活性化された内在性遺伝子を回収するステップと
を含む方法。
【請求項１６１】
遺伝子のエキソンＩを含有する転写物を発現させるための方法であって、
（ａ）請求項１１１、１１２、１１４、１２２、１２４および１２７のいずれかに記載されるベクターで１つまたは２つ以上のゲノム含有真核生物細胞をトランスフェクションするステップと、
（ｂ）前記細胞のゲノム内への前記ベクターの非相同的組込みに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと、
（ｃ）内在性遺伝子に由来するエキソンＩを含有する転写物の発現に好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１６２】
遺伝子産物を産生させるための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの遺伝子を含有するゲノムＤＮＡを真核生物細胞から単離するステップと、
（ｂ）１つまたは２つ以上の転位シグナル、１つまたは２つ以上のプロモーター、１つまたは２つ以上のエキソン、および１つまたは２つ以上の対形成しないスプライスドナー部位を含むベクターを、前記単離されたゲノムＤＮＡにインビトロ転位によって挿入し、それによってゲノムＤＮＡ−ベクター複合体を形成させるステップと、
（ｃ）前記ゲノムＤＮＡ−ベクター複合体を真核生物宿主細胞に導入するステップと、
（ｄ）前記遺伝子の発現に好適な条件のもとで前記宿主細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１６３】
前記遺伝子の発現産物を単離することをさらに含む、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
内在性の細胞ゲノム遺伝子によってコードされる遺伝子産物を産生させるための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの遺伝子を含有するゲノムＤＮＡを真核生物細胞から単離するステップと、
（ｂ）請求項１１１、１１２、１１４、１２２、１２４および１２７のいずれかに記載されるベクターを、前記単離されたゲノムＤＮＡ内に挿入するか、そうでなければ前記単離されたゲノムＤＮＡと一緒にし、それによってベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を作製するステップと、
（ｃ）前記ベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を好適な真核生物宿主細胞にトランスフェクションするステップと、
（ｄ）前記ベクター−ゲノムＤＮＡ複合体に含有される前記ベクターによってコードされる１つまたは２つ以上の遺伝子の転写を生じさせるのに好適な条件のもとで前記宿主細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１６５】
（ｅ）前記転写によって産生されるＲＮＡを前記宿主細胞から単離するステップと、
（ｆ）前記単離されたＲＮＡから１つまたは２つ以上のｃＤＮＡ分子を作製するステップと、
（ｇ）前記ｃＤＮＡの５’末端にベクター配列を含有する１つまたは２つ以上のｃＤＮＡ分子を回収し、それによって前記遺伝子を単離するステップと、
をさらに含む、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ベクターは１つまたは２つ以上の転位シグナルをさらに含み、そして前記ベクターは前記単離されたゲノムＤＮＡにインビトロ転位によって組み込まれる、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６７】
前記単離されたゲノムＤＮＡはクローニングベクターに存在する、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６８】
タンパク質を産生させるための方法であって、
（ａ）ゲノムＤＮＡを１つまたは２つ以上の細胞から単離するステップと、
（ｂ）請求項１１１、１１２、１１４、１２２、１２４および１２７のいずれかに記載されるベクターを、前記単離されたゲノムＤＮＡ内に挿入するか、そうでなければ前記単離されたゲノムＤＮＡと一緒にし、それによってベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を作製するステップと、
（ｃ）前記ベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を好適な宿主細胞にトランスフェクションするステップと、
（ｄ）前記ベクター−ゲノムＤＮＡ複合体に含有される前記ゲノムＤＮＡからのタンパク質発現を生じさせるのに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１６９】
タンパク質を産生させるための方法であって、
（ａ）ゲノムＤＮＡを１つまたは２つ以上の細胞から単離するステップと、
（ｂ）１つまたは２以上の転位シグナルと、エキソン−対形成しないスプライスドナー複合体に機能的に連結された転写調節配列とを含むベクターを、前記単離されたゲノムＤＮＡ内に転位によって組み込ませ、それによってベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を形成させるステップと、
（ｃ）前記ベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を好適な宿主細胞にトランスフェクションするステップと、
（ｄ）前記ベクター−ゲノムＤＮＡ複合体に含有される前記ゲノムＤＮＡからのタンパク質発現を生じさせるのに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１７０】
遺伝子を発現させるための方法であって、
（ａ）１つまたは２つ以上の遺伝子を含有するゲノムＤＮＡを１つまたは２つ以上の真核生物細胞から単離するステップと、
（ｂ）（ｉ）選択マーカーと
（ｉｉ）翻訳開始コドンに機能的に連結された転写調節配列と、
（ｉｉｉ）分泌シグナル配列と、
（ｉｖ）エピトープ標識と、
（ｖ）対形成しないスプライスドナー部位と
を含むベクターと、前記単離されたゲノムＤＮＡとを一緒にし、それによってベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を作製するステップと、
（ｃ）前記ベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を細胞に導入するステップと、
（ｄ）前記ベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を含有する細胞を選択するステップと、
（ｅ）前記ベクター−ゲノムＤＮＡ複合体に含有される遺伝子の発現を生じさせるのに好適な条件のもとで前記細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１７１】
前記宿主細胞は、タンパク質発現を生じさせるのに好適な条件で培養される前に、その途中で、またはその後で、前記トランスフェクションされたベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を含有する細胞について選択される、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７２】
前記ベクターは選択マーカーをさらに含み、そして前記宿主細胞は、タンパク質または遺伝子の発現を生じさせるのに好適な条件で培養される前に、前記トランスフェクションされたベクター−ゲノムＤＮＡ複合体を含有する細胞について選択される、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７３】
前記クローニングベクターは、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、ファージおよびプラスミドからなる群から選択される、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７４】
前記タンパク質を単離することをさらに含む、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１７５】
請求項１６８に記載される方法により産生されるタンパク質。
【請求項１７６】
請求項１７０〜１７２のいずれかに記載される方法により産生されるタンパク質。
【請求項１７７】
請求項１７４に記載される方法により産生されるタンパク質。
【請求項１７８】
タンパク質を発現させるための方法であって、
（ａ）（ｉ）翻訳開始コドンを有しないか、あるいは翻訳開始コドンと、停止コドンによって終了していないオープンリーディングフレームとをコードするかのいずれかである異種のエキソンと、
（ｉｉ）異種のスプライスドナー部位と、
（ｉｉｉ）遺伝子またはその一部をコードするゲノムＤＮＡフラグメントと
（ｉｖ）１つまたは２つ以上の選択マーカーと
に機能的に連結された異種のプロモーターを含むベクターで宿主細胞をトランスフェクションするステップと、
（ｂ）前記トランスフェクションされたベクターを含有する細胞を選択するステップと、
（ｃ）前記ベクターからのタンパク質発現に好適な条件のもとで、前記トランスフェクションされた宿主細胞を培養するステップと
を含む方法。
【請求項１７９】
前記ベクターはウイルス複製起点をさらに含む、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記ウイルス複製起点はエプスタインバールウイルスのｏｒｉＰである、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
（ａ）異種のプロモーターと、
（ｂ）異種のエキソンと、
（ｃ）異種のスプライスドナー部位と、
（ｄ）遺伝子またはその一部をコードするゲノムフラグメントと、
（ｅ）１つまたは２つ以上の選択マーカーと、
（ｆ）１つまたは２つ以上のウイルス複製起点と
を含むベクターであって、
前記異種のエキソンは翻訳開始コドンを有しないか、あるいは翻訳開始コドンと、停止コドンによって終了していないオープンリーディングフレームとをコードしているかのいずれかであり、そして前記ベクターが宿主細胞に導入されたときに前記ゲノムフラグメントによりコードされる前記遺伝子またはその一部からタンパク質が発現するように、前記ゲノムフラグメントが、前記異種のプロモーター、前記エキソンおよびスプライスドナー部位の下流に配向しているベクター。
【請求項１８２】
前記選択マーカーはポリアデニル化シグナルを有しない、請求項１８１に記載のベクター。
【請求項１８３】
１つまたは２つ以上のウイルス複製タンパク質をコードする１つまたは２つ以上の遺伝子をさらに含む、請求項１８１に記載のベクター。
【請求項１８４】
増幅可能なマーカーをさらに含む、請求項１８１に記載のベクター。
【請求項１８５】
請求項１８１〜１８４のいずれかに記載されるベクターを含む細胞。
【請求項１８６】
前記細胞は単離細胞である、請求項１８５に記載の細胞。
【請求項１８７】
前記第１の転写調節配列は、前記ベクター構築物において、前記第２の転写調節配列と同じ向きである、請求項８に記載のベクター構築物。
【請求項１８８】
前記ポジティブ選択マーカーは、ネオマイシン遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、ジヒドロオラターゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ヒスチジンＤ遺伝子、カルバミルリン酸シンターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、多剤耐性１遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子およびアデノシンデアミナーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項１１８または１３０に記載のベクター構築物。
【請求項１８９】
前記ネガティブ選択マーカーは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子およびジフテリアトキシン遺伝子からなる群から選択される、請求項１１８または１３０に記載のベクター構築物。
【請求項１９０】
前記ネガティブ選択マーカーは前記ポジティブ選択マーカーの上流に位置する、請求項１３０に記載のベクター。
【請求項１９１】
タンパク質を安定的に発現する宿主細胞であって、プロモーター、エキソン／スプライスドナー複合体、および前記タンパク質またはその一部をコードするゲノムフラグメントを含むベクターを含み、前記プロモーターおよびエキソン／スプライスドナー複合体は前記ゲノムフラグメントに対して異種である宿主細胞。
【請求項１９２】
前記ベクターは前記細胞のゲノム内に組み込まれる、請求項１９１に記載の宿主細胞。
【請求項１９３】
前記ベクターはウイルス複製起点をさらに含み、エピソームとして前記宿主細胞内に維持される、請求項１９１に記載の宿主細胞。
【請求項１９４】
前記ベクターは１つまたは２つ以上の選択マーカーをさらに含む、請求項１９０または請求項１９２に記載の細胞。
【請求項１９５】
前記ウイルス複製起点はエプスタインバールウイルスのｏｒｉＰである、請求項１９２に記載の細胞。
【請求項１９６】
内在性遺伝子からの発現を活性化するための方法であって、
（ａ）内在性遺伝子を活性化するのに好適なベクターを染色体含有宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）前記ベクターの導入前または前記ベクターの導入後において前記宿主細胞の染色体に複数のＤＮＡ切断を導入し得る薬剤で前記細胞を処理するステップと、
（ｃ）前記ベクターと前記内在性遺伝子との間において機能的な連結が形成されるように前記ベクターを前記ＤＮＡ切断部に組み込ませ、それにより、前記内在性遺伝子が１つまたは２つ以上のベクターコードのヌクレオチド配列によって活性化されるステップと
を含む方法。
【請求項１９７】
（ｄ）における前記活性化が、前記宿主細胞を単離して、前記内在性遺伝子の活性化に好都合な条件のもとで前記宿主細胞を培養することによって達成される、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
（ａ）遺伝子に機能的に連結された転写調節配列と、
（ｂ）ウイルス複製起点と、
（ｃ）増幅可能なマーカーと
を含むベクター。
【請求項１９９】
遺伝子の発現を増大させるための方法であって、
（ａ）エピソームとして宿主細胞内に維持される請求項１９８に記載のベクターを宿主細胞内に導入するステップと、
（ｂ）前記増幅可能なマーカーおよび前記遺伝子の増大した発現について選択するステップと
を含む方法。
【請求項２００】
対形成しない細胞転写物分子に由来するｃＤＮＡ分子を切断するための方法であって、
（ａ）請求項５または請求項７に記載されるベクターを、１つまたは２つ以上の真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込ませるステップと、
（ｂ）前記転写調節配列からの発現に好適な条件のもとで前記宿主細胞を培養するステップと、
（ｃ）前記宿主細胞からＲＮＡを単離するステップと、
（ｄ）前記単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを作製するステップと、
（ｅ）前記希な切断制限部位で切断する酵素により前記ｃＤＮＡを消化するステップと
を含む方法。
【請求項２０１】
薬物を発見するための方法であって、
（ａ）ベクターを真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込ませるステップと、ここで、前記ベクターの組込みにより、前記宿主細胞における内在性遺伝子の発現が活性化され、
（ｂ）前記活性化された遺伝子の発現に好都合な条件のもとで前記細胞を培養し、それにより、前記活性化された遺伝子の遺伝子産物を産生させるステップと、
（ｃ）薬物の活性についてスクリーニングされる１つまたは２つ以上の試験化合物により前記細胞を処理するステップと、
（ｄ）前記遺伝子産物と反応するか、または前記遺伝子産物によって誘導される細胞表現型に影響を及ぼす前記１つまたは２つ以上の試験化合物の能力を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２０２】
薬物を発見するための方法であって、
（ａ）ベクターを真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込ませるステップと、ここで、前記ベクターの組込みにより、前記宿主細胞における内在性遺伝子の発現が活性化され、
（ｂ）前記活性化された遺伝子の遺伝子産物の生成に好都合な条件のもとで、血清低下培地で前記細胞を培養し、それによって、前記遺伝子産物を含有する細胞馴化培地を作製するステップと、
（ｃ）１つまたは２つ以上の試験化合物を、前記細胞馴化培地における前記遺伝子産物と相互作用する前記試験化合物の能力を決定することによって薬物の活性についてスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項２０３】
（ｃ）における前記スクリーニングの前に前記細胞馴化培地を濃縮することをさらに含む、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
（ｃ）における前記スクリーニングの前に前記細胞馴化培地を濃縮することをさらに含む、請求項２０２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
（発明の分野）
本発明は、分子生物学および細胞生物学の分野に含まれる。本発明は、一般には、遺伝子発現の活性化、またはｉｎ ｓｉｔｕでの組換え法によって遺伝子を過剰発現させることに関する。より詳細には、本発明は、本発明によって提供される特殊化された活性化ベクターを宿主細胞のゲノム内に非標的化により組み込ませることによる内在性遺伝子の活性化に関する。本発明はまた、これまで発見できなかった遺伝子を同定、活性化および単離するための方法、ならびにそのような単離された遺伝子を含む宿主細胞およびベクターに関する。本発明はまた、単離された遺伝子、遺伝子産物、核酸分子、そしてそのような遺伝子、遺伝子産物および核酸分子を含む組成物に関し、これらは、様々な治療的適用および診断的適用において使用され得る。従って、本発明により、ヒトの疾患および発達と関連する遺伝子を含む内在性遺伝子を、その遺伝子の配列、構造、機能または発現プロフィルの事前の知識を用いることなく同定し、活性化し、そして単離することができる。
【０００２】
（背景技術）
ヒトの疾病に関連する新規遺伝子の同定および過剰発現は、新規な治療薬の開発に向けて重要なステップである。タンパク質を過剰発現する細胞のライブラリーの創製に対する現在のアプローチは、ｃＤＮＡの産生およびクローニングを基本とする。従って、このアプローチを使用して新規な遺伝子を同定するためには、遺伝子が、ライブラリーの作成に使用した細胞中に発現されていなければならない。遺伝子はまた、ライブラリー中に妥当に示されるに十分なレベルで発現されなければならない。これは、多くの遺伝子が非常に少ない量で、僅かな細胞個体群中に、または短い発達期間中にしか発現されていないため問題である。
【０００３】
さらに、いくつかのｍＲＮＡはサイズが大きいために、生物学的に活性なタンパク質を発現できる全長ｃＤＮＡ分子を産生することは困難であるか、または不可能である。全長ｃＤＮＡ分子の欠乏はまた、小さなｍＲＮＡにおいても観察され、逆転写により産生するのが困難であるか、または細菌における繁殖中に不安定であるメッセージ中の配列と関連があると考えられている。結果として、最も完全なｃＤＮＡライブラリーでさえ、あり得る遺伝子の全セットの一部のみしか発現しない。
【０００４】
最後に、多くのｃＤＮＡライブラリーが細菌ベクターで産生される。生物学的に活性な哺乳動物タンパク質を発現するためにこれらのベクターを使用することは、ほとんどの哺乳動物タンパク質が正しく折りたたまれず、および／または細菌中で不適切にグリコシル化されるために、極めて限定されている。
【０００５】
それ故、生物学的に活性なタンパク質の忠実な発現を容易にし得る、タンパク質発現のより代表的なライブラリーの創製法は、極めて価値がある。
【０００６】
現在のタンパク質過剰発現法は、目的の遺伝子をクローニングし、それを適切なプロモーター／エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびスプライス部位の隣の構築物中に配置し、構築物を適当な宿主細胞に導入することを含む。
【０００７】
別のアプローチは、強力なプロモーターまたは他の調節配列を、前もって同定した遺伝子に標的化することにより、遺伝子発現を活性化するための相同的組換えの使用を含む。
【０００８】
ＷＯ９０／１４０９２には、哺乳動物細胞において、目的のタンパク質をコードする遺伝子のｉｎ　ｓｉｔｕ修飾が記載されている。本出願は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の部位特異的修飾用の一本鎖オリゴヌクレオチドが記載されている。マーカーも含み得る。しかし、この方法は、実質的に標的部位に相同的なオリゴヌクレオチド配列が提供される場合に限定される。従って、この方法は、部位特異的修飾および相同的組換えによる活性化に必要とされる部位の知識を必要とする。新規な遺伝子は、この方法では発見できない。
【０００９】
ＷＯ９１／０６６６７には、哺乳動物遺伝子のｉｎ　ｓｉｔｕ発現法が記載されている。この方法を用いて、増幅遺伝子を、相同的組換えにより標的遺伝子の隣に導入する。次いで、細胞を適当な培地で増殖すると、増幅遺伝子および標的遺伝子の両方が増幅され、標的遺伝子の発現が増強する。上記のように、増幅遺伝子の導入法は、相同的組換えに限定され、配列（または存在）が知られていない新規な遺伝子の活性化には有用ではない。
【００１０】
ＷＯ９１／０１１４０には、相同的組換えによる細胞の修飾による内在性遺伝子の不活性化が記載されている。これらの方法により、相同的組換えを使用して、遺伝子を修飾して不活性化し、遺伝子療法におけるドナーとして利用できる細胞が産生される。
【００１１】
ＷＯ９２／２０８０８には、ゲノム標的部位のｉｎ　ｓｉｔｕ修飾法が記載されている。修飾は、小さく、例えば、ＤＮＡにおける単一の塩基の変化として記載される。この方法は、標的化のための相同的ＤＮＡを使用したゲノム修飾に依拠する。
【００１２】
ＷＯ９２／１９２５５には、相同的組換え（ここでＤＮＡ配列はゲノムまたは大きなゲノムフラグメントに組込まれる）により達成された、標的遺伝子の発現を増強する方法が記載されている。次いで、この修飾された配列は、発現させるために、二次宿主に移すことができる。増幅遺伝子は、標的遺伝子の隣に組込むことができ、よって標的領域は発現増強のために増幅され得る。相同的組換えは、この標的化アプローチに必要である。
【００１３】
ＷＯ９３／０９２２２には、所望の産物をコードする内在性遺伝子の活性化によりタンパク質を生成する方法が記載されている。調節領域を、相同的組換えにより標的化し、発現が望ましい遺伝子と通常関連する領域を置換または無効化する。この無効化または置換により、正常よりも高いレベルでの遺伝子の発現が引き起こされる。
【００１４】
ＷＯ９４／１２６５０には、細胞においてｉｎ　ｓｉｔｕで内在性遺伝子の発現を活性化および内在性遺伝子を増幅する方法を記載し、ここでこの遺伝子は細胞において発現されていないか、または所望のレベルで発現されていない。細胞を、細胞に存在する配列を修復、変化、欠失、または置換する、あるいは細胞の内在性遺伝子と正常に機能的に結合していない調節配列である外来性ＤＮＡ配列とトランスフェクトさせる。これを行うために、前以って選択した部位でゲノムＤＮＡ配列と相同的なＤＮＡ配列を使用して、内在性遺伝子を標的化する。さらに、選択マーカーをコードする増幅ＤＮＡも含めることができる。相同的に組換えた細胞を、増幅に選択した条件下で培養することにより、内在性遺伝子および増幅マーカーの両方が共増幅され、遺伝子の発現は増加する。
【００１５】
ＷＯ９５／３１５６０には、相同的組換え用のＤＮＡ構築物が記載されている。この構築物は、標的配列、調節配列、エキソン、および不対スプライスドナー部位を含む。標的化は、細胞におけるゲノム配列と構築物の相同的組換えにより達成され、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でのタンパク質の産生が可能となる。
【００１６】
ＷＯ９６／２９４１１には、相同的組換えにより、ゲノムの前以って選択した部位に導入した、外来性調節配列、コードまたは非コード、外来性エキソン、およびスプライスドナー部位を使用する方法が記載されている。本出願において、導入されたＤＮＡは、外来性調節領域の制御下の転写物が、トロンボポエチン、デオキシリボヌクレアーゼＩ、またはβ−インターフェロン遺伝子のいずれかに存在する、外来性エキソンおよび内在性エキソンの両方を含むように位置し、その結果、外来性および外来性エキソンが機能的に結合した転写物が生成する。新規な転写単位が、相同的組換えにより産生される。
【００１７】
米国特許第５，２７２，０７１号には、細胞において正常に発現される遺伝子の発現を促進できるＤＮＡ調節エレメントを挿入することによる、細胞における転写的にサイレントな遺伝子の転写活性化が記載されている。調節エレメントを、正常なサイレント遺伝子と機能的に結合するように挿入する。挿入は、正常なサイレント遺伝子（標的ＤＮＡ）のセグメントを有するＤＮＡ構築物および所望の転写を誘導するために使用したＤＮＡ調節エレメントを創製することにより、相同的組換えを用いて達成される。
【００１８】
米国特許第５，５７８，４６１号には、相同的組換えによる哺乳動物標的遺伝子発現の活性化を議論する。ＤＮＡ配列を、ゲノムまたは大きなゲノムフラグメントに組込み、標的遺伝子の発現を増強する。次いで、修飾された構築物を二次宿主に移すことができる。増幅遺伝子を標的遺伝子の隣に組込むことができ、よって標的領域は発現増強のために増幅される。
【００１９】
上記のアプローチは両方共（クローニングによる、またはインビボでの相同的組換えによる過剰発現構築物の構築）、過剰発現し得る前に、遺伝子をクローン化しおよびシークエンスする必要がある。さらに、相同的組換えを使用すると、ゲノム配列および構造も知らなければならない。
【００２０】
残念なことに、多くの遺伝子は未だに同定および／またはシークエンスされていない。従って、以前にクローン化されたかどうか、配列および構造が既知であるかどうかに関わらず、目的の遺伝子を過剰発現する方法が有用である。
【００２１】
（発明の要旨）
従って、本発明は、一般には、内在性遺伝子を細胞において過剰発現させるための方法に関する。この方法は、転写調節配列を含有するベクターを細胞内に導入すること、前記ベクターを非相同的組換えによって細胞のゲノム内に組み込ませること、および前記内在性遺伝子を細胞内において過剰発現させることを含む。この方法は、内在性遺伝子の配列に関する事前の知識を必要とせず、あるいは遺伝子の存在に関する知識さえも必要としない。従って、本発明は、標的化によらない遺伝子の活性化に関する。これは、本明細書中で使用されているように、宿主細胞のゲノム内への特殊化された活性化ベクターの（標的化組込みまたは相同的組込みとは対照的に）標的化によらない組込みまたは非相同的組込みによる内在性遺伝子の活性化を意味する。
【００２２】
本発明はまた、非相同的組換えにより、遺伝子発現を活性化または遺伝子を過剰発現させる、新規なベクター構築物を包含する。新規な構築物には、相同的な標的配列がない。すなわち、宿主細胞ＤＮＡを標的とし、その標的部位において相同的組換えを促進するヌクレオチド配列を含まず、導入された転写調節配列を介して細胞性遺伝子の過剰発現を引き起こす。
【００２３】
新規なベクター構築物は、不対スプライスドナー配列（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｐｌｉｃｅ ｄｏｎｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に機能的に結合した転写調節配列を含むベクターを含み、さらに、１つ以上の増幅可能なマーカーを含む。
【００２４】
新規なベクター構築物は、翻訳開始コドンとシグナル分泌配列と不対スプライスドナー部位とに機能的に結合した転写調節配列を有する構築物と、翻訳開始コドンとエピトープタグと不対スプライスドナー部位とに機能的に結合した転写調節配列を有する構築物と、翻訳開始コドンとシグナル配列とエピトープタグとに機能的に結合した転写調節配列および不対スプライスドナー部位を含む構築物と、翻訳開始コドンとシグナル分泌配列とエピトープタグと配列特異的プロテアーゼ部位に機能的に結合した転写調節配列および不対スプライスドナー部位を有する構築物とを含む。
【００２５】
ベクター構築物は、組換え宿主細胞選択のための１つ以上の選択マーカーを含むことができる。あるいは、選択は、活性化内在性遺伝子産物により付与される特性に関する表現型選択により実施できる。
【００２６】
これらのベクター、および実際本明細書に開示した任意のベクター、およびその技術分野における通常の当業者により容易に認識されるベクターの変形を、本明細書に記載した任意の方法に使用して、これらの方法により産生できる任意の組成物を形成することができる。
【００２７】
本発明のベクター構築物で使用した転写調節配列は、プロモーターを含むがこれに限定されない。好ましい実施形態において、プロモーターはウイルス性プロモーターである。非常に好ましい実施形態において、ウイルス性プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期プロモーターである。別の実施形態において、プロモーターは、細胞性、非ウイルス性プロモーターまたは誘導性プロモーターである。
【００２８】
本発明のベクター構築物に使用した転写調節配列は、エンハンサーを含み得るがこれに限定されない。好ましい実施形態において、エンハンサーはウイルス性エンハンサーである。非常に好ましい実施形態において、ウイルス性エンハンサーは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーである。別の実施形態において、エンハンサーは細胞性非ウイルス性エンハンサーである。
【００２９】
本明細書に記載した方法の好ましい実施形態において、ベクター構築物は、線状ＲＮＡまたはＤＮＡであるか、またはこれを含み得る。
【００３０】
ベクターを含む細胞は、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００３１】
遺伝子を過剰発現する細胞は、活性化されたまたはその発現が増加した内在性遺伝子の遺伝子産物（また、本明細書では互換的に「発現産物」とも呼ぶ）の所望の量が、細胞により産生されるに好ましい条件下で、インビトロで培養できる。次いで、発現産物を単離および精製して、例えば、タンパク質療法または薬物探索に使用することができる。
【００３２】
あるいは、所望の遺伝子産物を発現する細胞に、インビボで遺伝子産物を発現させることができる。本発明の、あるかかる態様において、ゲノムに取込まれた本発明のベクター構築物を含む細胞を、真核生物（例えば脊椎動物、特に哺乳動物、より特定するとヒト）に、その真核生物におけるインビボでの細胞による遺伝子の過剰発現または活性化に好ましい条件下で導入し得る。関連した、かかる本発明の態様において、真核生物に導入する前に、細胞を単離およびクローン化し得る。
【００３３】
本発明はまた、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および１つ以上の増幅マーカーを含むベクターを、細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに組込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００３４】
ベクターを含む細胞は、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００３５】
遺伝子を過剰発現する細胞を培養して、内在性遺伝子を増幅する。次いで、細胞をインビトロで培養し、活性化またはその発現が増加した、増幅した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生することができる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【００３６】
あるいは、増幅後、細胞に、内在性遺伝子を発現させ、インビボで所望量の遺伝子産物を産生させることができる。
【００３７】
しかし、本明細書に記載の方法に使用した任意のベクターは、１つ以上の増幅マーカーを含むことができると理解される。そこで、ベクターおよび目的のＤＮＡ（すなわち過剰発現した遺伝子を含む）の両方の増幅が細胞で生じ、内在性遺伝子のさらなる発現増強が得られる。従って、方法は、内在性遺伝子を増幅する段階を含むことができる。
【００３８】
本発明はまた、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および不対スプライスド供与配列を含むベクターを、細胞に導入し、ベクターを細胞の非相同的組換えによりゲノムに組込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００３９】
ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００４０】
遺伝子を過剰発現する細胞を、インビトロで培養し、その発現が活性化または増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生できる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【００４１】
あるいは、細胞に、インビボで所望の遺伝子産物を発現させることができる。
【００４２】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列から構成できる。
【００４３】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列および１つ以上の増幅マーカーから構成できる。
【００４４】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列およびスプライスドナー配列から構成できる。
【００４５】
本発明の任意のベクター構築物はまた、分泌シグナル配列を含むことができる。分泌シグナル配列は、活性化された内在性タンパク質に機能的に結合するように構築物中に配置している。よって、目的のタンパク質の分泌が細胞において生じ、そのタンパク質の精製が容易となる。従って、方法は、タンパク質発現産物が細胞から分泌される段階を含むことができる。
【００４６】
本発明はまた、上記の任意の方法により作成した細胞を包含する。本発明は、ベクター構築物を含む細胞、ベクター構築物が細胞ゲノムに組込まれた細胞、および内在性遺伝子から所望の遺伝子産物を過剰発現（この過剰発現は導入された転写調節配列により生じる）している細胞を包含する。
【００４７】
細胞を単離およびクローン化できる。
【００４８】
方法は、例えば真菌、植物または動物などの、真核起源の任意の細胞において実施することができる。好ましい実施形態において、本発明の方法は、脊椎を有する細胞、特に、哺乳動物細胞（ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびヒト細胞を含むがこれに限定されない）、およびより特定するとヒト細胞において実施し得る。
【００４９】
上記の方法により作成した単一の細胞は、単一の遺伝子または１つ以上の遺伝子を過剰発現することができる。細胞における１つ以上の遺伝子を、単一の型の構築物をゲノムの複数の位置に組込むことにより活性化できる。同様に、細胞における１つ以上の遺伝子を、複数の構築物（すなわち１つ以上の型の構築物）をゲノムの複数の位置に組込むことにより活性化できる。それ故、細胞は、唯一の型のベクター構築物または異なる型の構築物を含むことができ、各々、内在性遺伝子を活性化できる。
【００５０】
本発明はまた、以下を１つ以上行うことにより、上記した細胞を作成する方法に関する。１つ以上の本発明のベクター構築物の細胞への導入、導入した構築物の非相同的組換えによる細胞のゲノムへの組込み、細胞における１つ以上の内在性遺伝子の過剰発現、および細胞の単離およびクローニング。本発明はまた、かかる方法により産生した細胞（これは単離した細胞であり得る）にも関する。
【００５１】
本発明はまた、特徴づけられた（例えばシークエンスされた）、特徴づけられていない（例えば、その機能は既知であるが、クローン化またはシークエンスされていない遺伝子）、または過剰発現前にはその存在が知られていなかった遺伝子である、内在性細胞遺伝子などの遺伝子を過剰発現するための上記した細胞の使用法を包含する。細胞を使用して、インビトロまたはインビボで所望量の発現産物を産生できる。所望であれば、次いで、この発現産物を、例えば細胞溶解により、または増殖培地からの単離により、単離および精製することができる（ベクターが分泌シグナル配列を含む場合）。
【００５２】
本発明はまた、上記の方法により作成した細胞のライブラリーを包含する。ライブラリーは、単一のトランスフェクション実験から全クローン、または単一のトランスフェクション実験からの部分集合のクローンを包含できる。部分集合は、同一遺伝子または１つ以上の遺伝子、例えば１集合の遺伝子を過剰発現することができる。トランスフェクションは、単一の構築物を用いて、または１つ以上の構築物を用いて実施することができる。
【００５３】
ライブラリーはまた、２つ以上のトランスフェクション実験からの全ての組換え細胞を合わせることにより、単一のトランスフェクション実験からの細胞の１つ以上の部分集合を合わせることにより、または別々のトランスフェクション実験からの細胞の部分集合を合わせることにより形成できる。得られたライブラリーは、同一の遺伝子、または１つ以上の遺伝子、例えば１集合の遺伝子を発現できる。再度、各これらの個々のトランスフェクションにおいて、ユニークな構築物または１つ以上の構築物も使用できる。
【００５４】
ライブラリーは、同一の細胞型または異なる細胞型から形成できる。
【００５５】
本発明はまた、同一または異なるトランスフェクション実験から、細胞の様々な部分集合を選択することにより、ライブラリーを作成する方法に関する。
【００５６】
本発明はまた、内在性遺伝子を過剰発現または活性化するために、またはかかる過剰発現または活性化した遺伝子の遺伝子発現産物を得るために、上記の細胞または細胞のライブラリーを使用する方法に関する。本発明のこの態様により、細胞またはライブラリーは、遺伝子の発現についてスクリーニングし得、所望の遺伝子産物を発現する細胞を選択し得る。次いで、細胞を使用して、その後の使用のために遺伝子産物を単離または精製できる。細胞における発現は、細胞による内在性遺伝子の発現産物の産生に好ましい条件下で、インビトロで細胞を培養することにより、または細胞に遺伝子をインビボで発現させることにより行うことができる。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態において、方法は、発現産物を単離または精製するプロセスを含む。非常に好ましい実施形態において、内在性遺伝子産物を発現する細胞を、市販、特に診断、治療および薬物探索使用のために、十分量の遺伝子産物の産生に好ましい条件下で培養する。
【００５８】
いずれの方法も、さらに、ベクター組込み前または同時に、二本鎖破壊を細胞のゲノムＤＮＡに導入することを含むことができる。
【００５９】
本発明はまた、内在性遺伝子の発現を活性化させるために、そして活性化された遺伝子に対応するｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを単離するために有用なベクター構築物に関する。
【００６０】
１つのそのような実施形態において、ベクター構築物は、（ａ）第１の対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された第１の転写調節配列と、（ｂ）第２の対形成しないスプライスドナー配列に機能的に連結された第２の転写調節配列と、（ｃ）第１の転写調節配列と第２の転写調節配列との間に存在し得る線状化部位を含むことができる。本発明により、このベクター構築物が宿主細胞に形質転換され、次いで宿主細胞のゲノム内に組み込まれた場合、第１の転写調節配列は、好ましくは、第２の転写調節配列の向きに対して逆向きである。いくつかの好ましいそのような実施形態において、ベクターは、線状化部位での切断によって線状化され得る。
【００６１】
別の実施形態において、本発明は、対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された転写調節配列を含む、３’末端および５’末端を有する線状ベクター構築物であって、転写が線状ベクター構築物の３’末端または５’末端に向かって導かれる向きで転写調節配列が線状ベクター構築物において配向している線状ベクター構築物を提供する。
【００６２】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）転写調節配列と、（ｂ）対形成しないスプライスドナー部位と、（ｃ）希な切断制限部位と、（ｄ）線状化部位をこの順で含むベクター構築物を提供する。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された第１の転写調節配列と、（ｂ）エキソン−スプライスドナー部位複合体に機能的に連結された第２の転写調節配列とを含むベクター構築物であって、第１の転写調節配列がベクター構築物において第２の転写調節配列と同じ向きであり、かつ第１の転写調節配列がベクター構築物において第２の転写調節配列の上流に存在するベクター構築物を提供する。
【００６４】
さらなる実施形態において、本発明は、ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された転写調節配列を含み、かつ対形成しないスプライスドナー部位をさらに含むベクター構築物を提供する。
【００６５】
別の実施形態において、本発明は、ポリアデニル化シグナルを有しない選択マーカーに機能的に連結された第１の転写調節配列を含み、かつ対形成しないスプライスドナー部位に機能的に連結された第２の転写調節配列をさらに含むベクター構築物を提供する。
【００６６】
本発明により、転写調節配列（または、２つ以上の転写調節配列を有するベクター構築物における第１もしくは第２の転写調節配列）は、プロモーター、エンハンサーまたはリプレッサーであり得るが、好ましくは、動物細胞プロモーター、植物細胞プロモーターまたは真菌細胞プロモーターを含むプロモーターであり、最も好ましくは、ＣＭＶ即時初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０Ｔ抗原プロモーターおよびβアクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターである。本発明に従って使用され得る動物細胞起源、植物細胞起源または真菌細胞起源の他のプロモーターはこの分野では公知であり、本明細書中の教示を考慮すれば当業者には熟知のものである。
【００６７】
本発明のベクター構築物において使用される選択マーカーは、選択マーカーを含有するベクターが宿主細胞ゲノム内に組み込まれたときに、マーカー遺伝子を含有または発現する細胞の選択を可能にする任意のマーカーまたはマーカー遺伝子であり得る。好適なそのようなマーカーには、ネオマイシン遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、ジヒドロオラターゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ヒスチジンＤ遺伝子、カルバミルリン酸シンターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、多剤耐性１遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子およびチミジンキナーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
関連する実施形態において、本発明は、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカー、および対形成しないスプライスドナー部位を含むベクター構築物を提供する。この場合、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーならびにスプライスドナー部位は、ベクター構築物が真核生物宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、かつゲノム内の内在性遺伝子を活性化した場合に、ポジティブ選択マーカーの活性な形態での発現を生じさせ、そしてネガティブ選択マーカーの非発現またはネガティブ選択マーカーの不活性な形態での発現のいずれかを生じさせる向きでベクター構築物において配向している。いくつかの好ましいそのような実施形態において、ポジティブ選択マーカーまたはネガティブ選択マーカーまたはその両方のいずれかは、ポリアデニル化シグナルを有していなくてもよい。本発明のこれらの局面において使用されるポジティブ選択マーカーは、発現したときに、マーカーを発現する細胞の単離を容易にし得るタンパク質を産生する任意の選択マーカーであり得る。これには、ネオマイシン遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン遺伝子、ジヒドロオラターゼ遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ヒスチジンＤ遺伝子、カルバミルリン酸シンターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、多剤耐性１遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子またはアデノシンデアミナーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。同様に、本発明のこれらの局面において使用されるネガティブ選択マーカーは、発現したときに、マーカーを発現する細胞の除去を容易にし得るタンパク質を産生する任意の選択マーカーであり得る。これには、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子またはジフテリアトキシン遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
本発明はまた、本発明の１つまたは２つ以上のベクター構築物を含む、単離細胞であり得る真核生物宿主細胞に関する。好ましいそのような真核生物宿主細胞には、動物細胞（哺乳動物（特に、ヒト）細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、環形動物細胞、両生類細胞、爬虫類細胞および魚類細胞を含む）、植物細胞、および真菌（特に、酵母）細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかのそのような宿主細胞において、ベクター構築物を宿主細胞のゲノム内に組み込ませることができる。
【００７０】
本発明はまた、ＰＣＲ増幅可能な配列および縮重した３’末端を含むプライマー分子に関する。本発明のこの局面によるプライマー分子は、好ましくは、下記の一般構造を有する。
５’−（ｄＴ）ａ−Ｘ−Ｎｂ−ＴＴＴＡＴＴ−３’
式中、ａは１〜１００（好ましくは、１０〜３０）のすべての数であり、Ｘは、長さが約１０〜２０ヌクレオチドの核酸配列からなるＰＣＲ増幅可能な配列であり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ｂは０〜６のすべての数である。１つの好ましいそのようなプライマーは、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＮＮＮＮＴＴＴＡＴＴ−３’（配列番号１０）のヌクレオチド配列を有する。関連する実施形態において、本発明のこの局面によるプライマー分子はビオチン化することができる。
【００７１】
本発明はまた、第一鎖ｃＤＮＡを合成するための方法であって、（ａ）本発明の第１のプライマー（上記に記載されるプライマーなど）をＲＮＡテンプレート分子とアニーリングさせて、第１のプライマー−ＲＮＡ複合体を形成させることと、（ｂ）この第１のプライマー−ＲＮＡ複合体の逆転写に好都合な条件のもとでこの第１のプライマー−ＲＮＡ複合体を逆転写酵素および１つまたは２つ以上のデオキシヌクレオシド三リン酸分子により処理して、第一鎖ｃＤＮＡを合成することを含む方法に関する。
【００７２】
本発明はまた、活性化された遺伝子を、特に宿主細胞のゲノムから単離するための種々の方法に関する。本発明のこれらの方法は、本発明の標的化によらない遺伝子活性化ベクターを使用して産生されるｍＲＮＡ分子の構造を利用する。本発明の１つのそのような方法は、例えば、（ａ）転写調節配列および対形成しないスプライスドナー部位を含むベクター構築物を宿主細胞（好ましくは、上記に記載された真核生物宿主細胞の１つ）に導入することと、（ｂ）ゲノム内にエキソンを含む内在性遺伝子がベクターにより活性化されるような条件のもとで、ベクター構築物を宿主細胞のゲノム内に非相同的組換えによって組み込ませることと、（ｃ）宿主細胞からＲＮＡを単離することと、（ｄ）上記に記載された本発明の方法に従って第一鎖ｃＤＮＡを合成することと、（ｅ）ベクターによりコードされるエキソンに特異的な第２のプライマーを第一鎖ｃＤＮＡにアニーリングさせて、第２のプライマー−第一鎖ｃＤＮＡ複合体を生成させることと、（ｆ）第一鎖ｃＤＮＡに対して実質的に相補的である第二鎖ｃＤＮＡの産生に好都合な条件のもとで、この第２のプライマー−第一鎖ｃＤＮＡ複合体をＤＮＡポリメラーゼと接触させることとを含む。本発明のこの局面による方法は、１つまたは２つ以上のさらなるステップを含むことができ、例えば、対形成しないスプライスドナー部位の下流においてベクター上に存在する制限部位で切断する制限酵素で第二鎖ｃＤＮＡを処理すること、またはベクターによりコードされるエキソンに特異的な第３のプライマーと、第２のプライマーに特異的な第４のプライマーとを使用して第二鎖ｃＤＮＡを増幅することなどのステップを含むことができる。本発明はまた、これらの方法に従って産生された単離遺伝子、およびこのような単離遺伝子を含むベクター（発現ベクターであり得る）および宿主細胞に関する。本発明はまた、単離遺伝子（または単離遺伝子を含むベクター、特に発現ベクター）を含む宿主細胞を培養することと、および単離遺伝子によってコードされるポリペプチドの前記宿主細胞による発現に好都合な条件のもとで宿主細胞を培養することとを含むポリペプチドの産生方法に関する。本発明はまた、対形成しないスプライスドナー部位を伴うエキソン領域に機能的に連結された転写調節配列を含むベクターを宿主細胞に導入することと、およびそのエキソン領域によってコードされるポリペプチドの前記宿主細胞の発現に好都合な条件のもとで宿主細胞を培養することとを含むポリペプチドのさらなる産生方法を提供する。この場合、エキソンは、対形成しないスプライスドナー部位の最も５’末端側の塩基に対して、オープンリーディングフレーム位置のいずれかに位置する翻訳開始部位を含有する（例えば、ＡＴＧ開始コドンの「Ａ」は、スプライスドナー部位の最も５’末端側の塩基に対して、−３位に存在し得るか、またはその位置から上流に３塩基の間隔（例えば、−６、−９、−１２、−１５、−１８など）で存在し得るか、あるいは−２位に存在し得るか、またはその位置から上流に３塩基の間隔（例えば、−５、−８、−１１、−１４、−１７、−２０など）で存在し得るか、あるいは−１位に存在し得るか、またはその位置から上流に３塩基の間隔（例えば、−４、−７、−１０、−１３、−１６、−１９など）で存在し得る）。関連する実施形態において、本発明の方法は、得られたポリペプチドを単離することをさらに含むことができる。本発明はまた、これらの方法に従って産生されるポリペプチドに関し、これらは単離ポリペプチドであってもよく、または単離ポリペプチドでなくてもよい。
【００７３】
本発明の他の好ましい実施形態は、以下の図面および本発明の明細書、および請求の範囲に照らして、その技術分野における通常の当業者には明らかである。
【００７４】
（発明の詳細な説明）
非相同性組換による遺伝子活性化は、他の活性化手順よりも優れた利点がある。タンパク質過剰発現の以前の方法とは異なり、本明細書で述べる方法は、興味のある遺伝子をクローン化する（細胞から単離する）必要がない。過剰発現させるＤＮＡ配列または構造に関する知識（すなわち、ＯＲＦの配列、イントロン、エキソンまたは上流および下流調節要素）も、遺伝子の発現パターン（すなわち組織特異性、発達調節など）の知識も必要ない。さらに、本方法は興味のある遺伝子のゲノム構成（すなわちイントロンおよびエキソン構造）に関する知識も必要ない。
【００７５】
したがって、本発明の方法は、相同性組換のための標的ヌクレオチド配列を含まないベクター作成物を含む。標的配列によって、細胞ＤＮＡの予定部位におけるベクターＤＮＡと細胞ＤＮＡの相同的組換え可能となり、該部位はベクター内の配列に相同性を持ち、予定部位における相同性組換によって、転写調節配列をゲノムへの組込が行われ、次に内在性遺伝子が活性化される。
【００７６】
本発明の方法は、予定部位でのベクター組込は含まない。代わりに、本発明は、本発明のベクター作成物を、「非正統的」組換、または「非標的遺伝子活性化」とも呼ばれる非相同性組換によって、細胞ＤＮＡ（たとえば細胞ゲノム）に組込むことを含む。
【００７７】
関連する実施形態において、本発明は非標的遺伝子活性化にも関与する。非標的遺伝子活性化は、多くの重要な応用を含んでいる。最初に、所与の細胞種では通常発現しない遺伝子を活性化することによって、遺伝子のｃＤＮＡ複製を、その通常発現パターンとは独立に、単離することが可能となる。これにより、短い発達期間の間および／または非常に低い濃度にて、通常、まれな細胞で発現される遺伝子の単離が行いやすくなる。第２に、翻訳によって遺伝子を活性化することにより、全長ｃＤＮＡをクローニングせずに、タンパク質発現ライブラリーを生成することができる。これらのライブラリーは、新たな酵素およびタンパク質に対して、および／または内在性遺伝子の過剰発現より生じる興味ある表現型に対して、スクリーニングできる。第３に、特定のタンパク質を過剰発現する細胞系を作成し、商業規模のタンパク質を生産することができる。したがって、内在性遺伝子の活性化によって、新たな遺伝子およびタンパク質を発見および単離するための、そして商業化のために特定のタンパク質を大量に生産するための強力な手法が提供される。
【００７８】
本明細書に記載のベクターは標的配列を含まない。標的配列は、活性化する遺伝子内または活性化する遺伝子の上流の配列または配列群と相同性を有するベクター上の配列であり（ここで、上流領域は、目的の遺伝子の同一のコード鎖上の最初の機能的スプライス受容部位まで、およびこれを含む）、この相同性を用いて、目的の遺伝子を活性化する転写調節配列を、活性化する遺伝子を含む細胞のゲノムに組込む。内在性遺伝子を活性化するためのエンハンサー組込みベクターの場合、ベクターは、エンハンサー機能が有効な距離範囲において、目的の遺伝子の上流または下流のゲノム内（または目的の遺伝子内）のどの配列も相同性を含まない。
【００７９】
それ故、本法は、慣用的および現在利用可能なクローニング技術を使用して見落とした、または見落とし得る、新規な遺伝子を同定できる。本明細書に記載した構築物および方法の使用により、知られていないおよび／または特徴づけられていない遺伝子を、迅速に同定および過剰発現でき、タンパク質を産生できる。タンパク質は、とりわけ、ヒト治療剤および診断剤として、および薬物探索の標的として使用される。
【００８０】
この方法はまた、タンパク質をインビトロまたはインビボで産生するための、既知および／または特徴づけられている遺伝子の過剰発現を行うことができる。
【００８１】
「既知」遺伝子は、遺伝子の特徴づけのレベルに関する。本発明により、特徴づけられている遺伝子の発現、並びに、特徴づけられていない遺伝子の発現が可能となる。様々なレベルの特徴づけが可能である。これらは、詳細な特徴づけ（例えばクローニング、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質シークエンス）、および遺伝子の調節および機能のクローン化配列への関連を含む（例えば、プロモーターおよびエンハンサー配列の認識、オープンリーディングフレーム、イントロン等の機能）。特徴づけは、例えば遺伝子のマッピングおよび機能の関連づけ、部分的アミノ酸またはヌクレオチド配列の獲得、または精製タンパク質の獲得および機能の確認などのように詳細度を低くし得る。特徴づけは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が既知であるか、またはタンパク質を単離したが、その機能は知られていない場合には、最小限であってもよい。あるいは、機能は、既知であるが、関連するタンパク質またはヌクレオチド配列は知られていないか、たは既知であるが機能と相関させなくてもよい。最後に、遺伝子の存在およびその機能の両方が知られていないという点で特徴づけが全くないこともあり得る。本発明により、任意の様々な特有の特徴づけ度合いにおける任意の遺伝子の発現が可能となる。
【００８２】
多くの異なるタンパク質（また、本明細書では互換的に「遺伝子産物」または「発現産物」とも呼ぶ）を、単一の活性化構築物により、および１セットのトランスフェクションで活性化および過剰発現することができる。従って、１セットのトランスフェクション体（ライブラリー）における単一の細胞または異なる細胞は、同一または異なる構築物でトランスフェクションした後、１つ以上のタンパク質を過剰発現できる。以前の活性化法は、活性化する各遺伝子につき、ユニークな構築物を創製することが必要である。
【００８３】
さらに、単一の遺伝子に隣接する多くの異なる組込み部位を、単一の構築物を使用して同時に創製および試験することができる。これにより、タンパク質発現のための、活性化構築物の最適なゲノム位置を迅速に決定できる。
【００８４】
以前の方法を使用すると、目的の遺伝子の５’端を、配列および構造に関して広範に特徴づけなければならなかった。産生する各活性化構築物について、適当な標的配列を単離しなければならなかった。通常、これは、活性化する細胞として、同一のヒトまたは動物の実験室株から単離された同質遺伝子的配列でなければならない。ある場合には、このＤＮＡは、目的の遺伝子から５０ｋｂまたはそれ以上であり得る。従って、各標的構築物の産生は、至難の量の内在性遺伝子のクローニングおよびシークエンスを必要とする。しかし、配列および構造情報は、本発明の方法では必要ではないので、知られていない配列および特徴づけられていない上流領域を有する遺伝子を活性化できる。
【００８５】
これは、細胞性ＤＮＡと外来性ＤＮＡ配列の非相同的組換えを使用したｉｎ　ｓｉｔｕ遺伝子活性化を使用すると可能となる。非相同的組換えを使用したｉｎ　ｓｉｔｕ遺伝子活性化を達成するために必要な方法および組成物（例えばベクター構築物）は、本発明により提供される。
【００８６】
ＤＮＡ分子は、その遺伝内容をいくつかの異なるおよび別個の機構（相同的組換え、部位特異的組換え、および非相同的／非正統的組換えを含む）により再分配するために再結合できる。相同的組換えは、配列が非常に類似しているＤＮＡの伸展間の組換えを含む。相同的組換えは、遺伝物質の再分配前に、相同的配列間のその長さに沿った対形成を含むことが実証された。クロスオーバーの正確な部位は、相同的セグメントの任意の点であり得る。組換えの効率は、相同的標的配列の長さ（ホープ（Ｈｏｐｅ）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１３：３９９（１９９１）；レッディー（Ｒｅｄｄｙ）等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．　６５：１５０７（１９９１））、２つの組換え配列の間の配列同一度（フォン・メルフナー（ｖｏｎ　Ｍｅｌｃｈｎｅｒ）等、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　６：９１９（１９９２））、および構築物上に存在する非相同的ＤＮＡに対する相同的ＤＮＡの比（レトソン（Ｌｅｔｓｏｎ）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１７：７５９（１９８７））に比例する。
【００８７】
一方、部位特異的組換えは、特異的ＤＮＡ配列により示される、前もって決定した部位における遺伝物質の交換を含む。この反応において、タンパク質リコンビナーゼは、組換えシグナル配列に結合し、鎖切断を創製し、ＤＮＡ鎖交換を容易にする。Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換えは、部位特異的組換えの例である。
【００８８】
非相同的／非正統的組換え（例えば本発明の方法により有利に使用したもの）は、有意な配列相同性を共有せず、部位特異的組換え配列において生じない、遺伝物質の連結（交換または再分配）を含む。非相同的組換えの例は、非相同的部位での外来性ＤＮＡの染色体への取込み、染色体転座および欠失、ＤＮＡ末端連結、染色体末端の二本鎖破壊修復、架橋−破壊融合、およびトランスフェクトした配列のコンカテマー化を含む。ほとんどの場合、非相同的組換えは、「自由ＤＮＡ末端」の連結を通して生じると考えられている。自由末端は、二次ＤＮＡ末端に直接、または修復またはプロセシング後に、連結できる末端を含むＤＮＡ分子である。ＤＮＡ末端は、５’突出、３’突出、または平滑断端からなり得る。
【００８９】
本明細書に使用したように、レトロウイルス挿入および他の転位反応は、厳密ではない形の非相同的組換えと考えられる。これらの反応は、組換え分子間の相同性の使用を含まない。さらに、部位特異的組換えと異なり、これらの型の組換え反応は、個別の部位間で生じない。代わりに、特異的タンパク質／ＤＮＡ複合体が、唯１つの組換え対（すなわち、レトロウイルスまたはトランスポゾン）上に必要とされ、第二のＤＮＡ対（すなわち細胞ゲノム）は通常比較的に非特異的である。結果として、これらの「ベクター」は、標的化様式のように細胞ゲノムに取込まれず、それ故、それらを使用して本発明に記載の活性化構築物を送達することができる。
【００９０】
本明細書に記載の方法に有用なベクター構築物は、理想的には、細胞のゲノム配列と非相同的組換えを受けて、その細胞において内在性遺伝子を過剰発現する、転写調節配列を含み得る。本発明のベクター構築物はまた、相同的標的配列を欠失している。すなわち、それらは、宿主細胞ＤＮＡを標的化し、その標的部位で相同的組換えを促進する、ＤＮＡ配列を含まない。従って、本発明のベクター構築物の細胞ゲノムへの取込みは、非相同的組換えにより生じ、組込まれたベクター構築物上に含まれる導入された転写調節配列を介して細胞性遺伝子の過剰発現を導くことができる。
【００９１】
本発明は、一般的に、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列を含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。この方法は、内在性遺伝子の配列の、またはさらには遺伝子の存在の予備知識を必要としない。しかし、活性化する遺伝子の配列が既知である場合、構築物を操作して、適当な配置のベクターエレメント（例えば、開始コドンの位置、内在性遺伝子の最初のエキソンに存在するコドンの添加、および適当なリーディングフレーム）を含ませ、最大過剰発現および／または適当なタンパク質配列を達成することができる。
【００９２】
本発明のある実施形態において、ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングし得る。
【００９３】
遺伝子を過剰発現する細胞は、活性化されたまたはその発現が増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望の量が、細胞により産生されるに好ましい条件下で、インビトロで培養できる。所望であれば、次いで、発現産物を単離および精製して、例えば、タンパク質療法または薬物探索に使用することができる。
【００９４】
あるいは、所望の遺伝子産物を発現する細胞に、インビボで遺伝子産物を発現させることができる。
【００９５】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列から構成できる。
【００９６】
あるいは、ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列および１つ以上の増幅マーカーから構成できる。
【００９７】
本発明は、それ故、また、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および増幅マーカーを含むベクターを細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに取込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【００９８】
ベクターを含む細胞は、遺伝子発現用についてスクリーニングする。
【００９９】
遺伝子を過剰発現する細胞を培養して、内在性遺伝子を増幅する。次いで、細胞をインビトロで培養し、活性化またはその発現が増加した、増幅した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生することができる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【０１００】
あるいは、増幅後、細胞に、内在性遺伝子を発現させ、インビボで所望量の遺伝子産物を産生させることができる。
【０１０１】
ベクター構築物は、本質的に、転写調節配列およびスプライスドナー配列から構成できる。
【０１０２】
本発明は、それ故、また、細胞において内在性遺伝子を過剰発現する方法に関し、これは、転写調節配列および不対スプライスドナー配列を含むベクターを、細胞に導入し、ベクターを非相同的組換えにより細胞のゲノムに組込ませ、細胞において内在性遺伝子を過剰発現させることを含む。
【０１０３】
ベクターを含む細胞を、遺伝子の発現についてスクリーニングする。
【０１０４】
遺伝子を過剰発現する細胞を、インビトロで培養し、その発現が活性化または増加した内在性遺伝子の遺伝子産物の所望量を産生できる。次いで、遺伝子産物を単離および精製できる。
【０１０５】
あるいは、細胞に、インビボで所望の遺伝子産物を発現させることができる。
【０１０６】
ベクター構築物は、本質的に、不対スプライスドナー配列に機能的に結合した転写調節配列から構成でき、また、増幅マーカーも含むことができる。
【０１０７】
他の活性化ベクターは、転写調節配列、並びに翻訳開始コドンを含むエキソン配列を有する構築物；転写調節配列、並びに翻訳開始コドンおよび分泌シグナル配列を含むエキソン配列；転写調節配列、並びに翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソン配列を有する構築物；転写調節配列、並びに翻訳開始コドン、シグナル配列およびエピトープタグを含むエキソン配列を有する構築物；転写調節配列、並びに翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を有するエキソン配列を含む構築物を含む。各上記の構築物において、構築物上のエキソンは、不対スプライスドナー部位のすぐ上流に位置する。
【０１０８】
構築物はまた、調節配列、ポリ（Ａ）シグナルを欠失した選択マーカー、内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｉｔｅ）（ｉｒｅｓ）、および不対スプライスドナー部位を含むことができる（図４）。開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および／またはプロテアーゼ開裂部位が、任意により、ｉｒｅｓと不対スプライスドナー配列の間に含まれ得る。この構築物が遺伝子の上流に組込まれた場合、ポリ（Ａ）部位が内在性遺伝子により供給されるため、選択マーカーは効果的に発現される。加えて、ｉｒｅｓによりタンパク質翻訳が下流オープンリーディングフレーム（すなわち内在性遺伝子）で開始可能となるので、下流の遺伝子もまた発現される。従って、この活性化構築物により産生されたメッセージは、ポリシストロン性である。この構築物の利点は、遺伝子の近辺並びに適当な配向で起こらない組込み事象は、薬剤耐性コロニーを産生しないことである。この理由は、（内在性遺伝子により供給された）ポリ（Ａ）テールがないので、ネオマイシン耐性遺伝子が効果的に発現されないからである。非産生的な組込み事象の数を減少させることにより、ライブラリーの複雑性を、その範囲（活性化される遺伝子の数）に影響を及ぼすことなく減らすことができ、これはスクリーニングのプロセスを容易にする。
【０１０９】
この構築物の別の実施形態において、ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え配列を、調節配列とｎｅｏ開始コドンの間並びにｉｒｅｓと不対スプライスドナー部位の間（ｉｒｅｓと開始コドンの間、存在する場合）に含むことができる。目的の遺伝子を活性化した細胞を単離した後、細胞をｃｒｅリコンビナーゼをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトすることにより、ｎｅｏ遺伝子およびｉｒｅｓを除去することができる。これにより、ポリシストロン性メッセージの産生が削除され、組込まれた活性化構築物上の調節配列から直接、内在性遺伝子を発現することができる。哺乳動物染色体から遺伝子エレメントを欠失することを容易にするＣｒｅ組換えの使用が、記載されている（グ（Ｇｕ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６５：１０３（１９９４）：サウアー（Ｓａｕｅｒ）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２２５：８９０−９００（１９９３））。
【０１１０】
従って、本明細書に記載の方法に有用な構築物は、以下を含むがこれに限定されない（また図１から４参照）。
１） 調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンを有する構築物。
２） 調節配列、並びに翻訳開始コドンを欠失したエキソンをスプライスドナー部位と共に有する構築物。
３） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
４） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
５） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
６） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
７） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
８） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の翻訳開始コドンおよびシグナル分泌配列を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
９） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の（５’から３’）翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１０） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の（５’から３’）翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１１） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の（５’から３’）翻訳開始コドンおよびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１２） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の（５’から３’）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１３） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の（５’から３’）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１４） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の（５’から３’）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、およびエピトープタグを含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１５） 調節配列、並びにリーディングフレーム１（スプライスドナー部位に関して）の（５’から３’）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１６） 調節配列、並びにリーディングフレーム２（スプライスドナー部位に関して）の（５’から３’）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１７） 調節配列、並びにリーディングフレーム３（スプライスドナー部位に関して）の（５’から３’）翻訳開始コドン、シグナル分泌配列、エピトープタグ、および配列特異的プロテアーゼ部位を含むエキソンを不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１８） 選択マーカーに結合した調節配列を、内部リボソーム侵入部位、および不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
１９） ｃｒｅ／ｌｏｘ組換えシグナルが、ａ）調節配列と選択マーカーのオープンリーディングフレームとの間およびｂ）ｉｒｅｓと不対スプライスドナー部位との間に位置する構築物１８。
２０） 停止コドンを欠失した緑蛍光タンパク質を含むエキソンに機能的に結合した調節配列を不対スプライスドナー部位と共に有する構築物。
【０１１１】
しかし、本明細書に記載の方法に使用した任意のベクターは、１つ以上（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは１つまたは２つ）の増幅マーカーを含むことができると理解する。従って、方法は、内在性遺伝子を増幅する段階を含むことができる。活性化構築物上に１つ以上の増幅マーカーを配置することにより、活性化された細胞において目的の遺伝子と１つ以上の増幅マーカーの並置が生じる。一旦活性化された細胞が単離されれば、目的の遺伝子および活性化構築物の両方を含む遺伝子座のコピー数が増加した細胞を選択することにより、さらに発現を増加させることができる。これは、当業者に周知の選択法により、例えば、遺伝子構築物またはベクター上に含まれる１つ以上の増幅マーカーに特異的な１つ以上の選択剤を含む選択培養培地で、細胞を培養することにより達成できる。
【０１１２】
上記の任意のベクターの非相同的組込みにより内在性遺伝子を活性化した後、組込まれたベクター上に位置する増幅マーカーのコピーが増加したものを選択することにより、内在性遺伝子の発現をさらに増加させ得る。かかるアプローチは、組込まれたベクター上の１つの増幅マーカーを使用して達成し得るが、別の実施形態において、本発明は、２つ以上（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは２つ）の増幅マーカーを、ベクター上に含ませて、ベクターおよび目的のフランキング遺伝子が増幅した細胞をより効率的に選択し易くし得る方法を提供する。このアプローチは、ベクター上に含まれる１つ以上の機能的内在性増幅マーカーのコピーを有する細胞において特に有用である。なぜなら、この選択法により、ベクターにコードされた増幅マーカーではなく、内在性増幅マーカーを間違えて増幅した細胞を単離できるからである。このアプローチはまた、遺伝子増幅に関与しない機構により、選択剤に対する耐性を発達させた細胞に対して選択するのに有用である。２つ以上の増幅マーカーを使用したアプローチが、これらの状況では有利である。なぜなら、組込まれたベクターおよび目的のフランキング遺伝子を増幅することなく、２つ以上の選択剤に対する耐性（２つ以上の増幅マーカーによりコードされた耐性）を細胞が発達させる可能性は、任意の単一の選択剤に対する耐性を細胞が発達させる可能性よりも有意に低いからである。従って、２つ以上のベクターによりコードされた増幅マーカーを、同時または順次選択することにより、最終的に単離された細胞が、多くの割合で、増幅されたベクターおよび目的の遺伝子を含む。
【０１１３】
従って、別の実施形態において、本発明のベクターは、２つ以上（すなわち、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは２つ）の増幅マーカーを含み得る。このアプローチにより、発現の活性化後にベクター配列および隣接する目的の遺伝子のより効率的な増幅が可能となる。
【０１１４】
本ベクターの構築に使用し得る増幅マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロ−オロターゼ、およびカルバモイルリン酸シンターゼを含むがこれに限定されない。
【０１１５】
また、本明細書に記載した任意の構築物は、増幅マーカーの代わりに、またはそれと共に、真核ウイルス性複製起源を含み得ると理解される。ウイルス性複製起源の存在により、組込みベクターおよび隣接する内在性遺伝子をエピソームとして単離でき、および／または適当なウイルス性複製タンパク質を導入すれば多くのコピー数を増幅できる。有用なウイルス性起源の例は、ＳＶ　４０　ｏｒｉおよびＥＢＶ　ｏｒｉ　Ｐを含むがこれに限定されない。
【０１１６】
本発明はまた、本明細書で開示した構築物が、本質的に、これらの構築物について特記した成分から構成される実施形態を包含する。また、上記の構築物は、本明細書に記載の方法に有用な構築物の例であるが、本発明はかかる構築物の機能性等価体も含むことを理解する。
【０１１７】
「ベクター」なる語は、一般的に、ヌクレオチド配列を細胞に導入する媒体を意味すると理解される。任意の特定の配列に限定する意図はない。ベクターはそれ自体、内在性遺伝子を活性化するヌクレオチド配列であり得るか、または内在性遺伝子を活性化する配列を含み得る。従って、ベクターは、本質的に、活性化に必要なこれらの配列のみを含む単純な線形または環形ポリヌクレオチドであり得るか、または大きなポリヌクレオチド、または他の構築物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスゲノム、全ビリオン、または非常に重要なヌクレオチド配列の細胞への導入に使用する他の生物学的構築物）におけるこれらの配列であり得る。「ベクター構築物」または「構築物」なる語は、本明細書における語「ベクター」と相互に変更可能に使用できるということも理解される。
【０１１８】
ベクターは、天然に存在するか、または遺伝子工学または合成プロセスにより創製されたＤＮＡ配列を含むことができる。
【０１１９】
構築物は細胞のゲノムへの非相同的組込み時に、内在性遺伝子の発現を活性化できる。内在性遺伝子の発現により、組込み部位（例えば上流領域対イントロン２）に依存して、全長のタンパク質が産生されるか、または端を切り取った生物学的に活性な形の内在性タンパク質が得られる。活性化される遺伝子は、周知の遺伝子（例えば以前にクローン化または特徴づけられた）または知られていない遺伝子（以前にクローン化または特徴づけられていない）であり得る。遺伝子の機能は、既知であるか、または知られていない。
【０１２０】
周知の活性を有するタンパク質の例は、サイトカイン、成長因子、神経伝達物質、酵素、構造タンパク質、細胞表面レセプター、細胞内レセプター、ホルモン、抗体、および転写因子を含むがこれに限定されない。本法により産生できる既知タンパク質の特殊な例は、エリスロポエチン、インシュリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−８、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、ＴＧＦ−β、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、ＴＳＨ−β、骨成長因子−２、骨成長因子−７、腫瘍壊死因子、α−１アンチトリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、白血病阻害因子、グルカゴン、プロテインＣ、プロテインキナーゼＣ、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経成長因子、インシュリン様成長因子、インシュリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害剤、血小板由来成長因子、ケラチノサイト成長因子、肝細胞成長因子、内皮細胞成長因子、ニューロトロピン−３、トロンボポエチン、絨毛ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、αグルコシダーゼ、上皮成長因子、および繊維芽細胞成長因子を含むがこれに限定されない。本発明はまた、トランスメンブランタンパク質を発現する様々な遺伝子の活性化、およびかかるタンパク質［上記したような成長因子、ホルモン、神経伝達物質およびサイトカインの細胞表面レセプター、トランスメンブランイオンチャネル、コレステロールレセプター、リポタンパク質（ＬＤＬおよびＨＤＬを含む）および他の脂質部分のレセプター、インテグリンおよび他の細胞外マトリックスレセプター、細胞骨格固定タンパク質、免疫グロブリンレセプター、ＣＤ抗原（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ３４抗原を含む）、および当業者に周知の他の細胞表面トランスメンブラン構造および機能タンパク質を含むがこれに限定されない］の産生および単離を可能とする。通常の当業者には理解されるように、当業者に周知の他の細胞性タンパク質およびレセプターはまた、本発明の方法により産生し得る。
【０１２１】
本明細書に記載した方法の利点の１つは、事実上任意の遺伝子を活性化できることである。しかし、遺伝子は様々なゲノム構造（様々なイントロン／エキソン境界および開始コドンの位置）を有するので、細胞個体群内の様々な遺伝子を最も多く活性化するために、多様な活性化構築物が提供される。
【０１２２】
これらの構築物は、別々に細胞にトランスフェクトさせ、ライブラリーを産生できる。各ライブラリーは、独特な１セットの活性化された遺伝子を有する細胞を含む。ある遺伝子は、数個の異なる活性化構築物により活性化される。加えて、遺伝子の一部を活性化することにより、端を切り取った生物学的に活性なタンパク質を産生できる。端を切り取ったタンパク質は、例えば、活性化構築物を、第二エキソンの上流ではなく内在性遺伝子の中間のイントロンまたはエキソンに組込むことにより産生できる。
【０１２３】
また、異なる構築物の使用により、活性化された遺伝子を新しい配列を含むように修飾することができる。例えば、分泌シグナル配列を、活性化構築物上に含ませて、活性化された遺伝子の分泌を容易にすることができる。ある場合には、イントロン／エキソン構造または目的の遺伝子に依存して、分泌シグナル配列は、内在性遺伝子のシグナル配列の全部または一部を置換できる。他の場合には、シグナル配列により、通常は細胞内に位置するタンパク質の分泌が可能となる。
【０１２４】
ベクター上の調節配列は、構成プロモーターであり得る。あるいは、プロモーターは誘導性であり得る。誘導プロモーターの使用により、基礎レベルの低い活性化されたタンパク質が、慣用的な培養および増殖の間に、細胞により産生されることが可能となる。よって、細胞を、例えば製造またはスクリーニング中に、大量の所望のタンパク質を産生するために誘導し得る。誘導プロモーターの例は、テトラサイクリン誘導プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターを含むがこれに限定されない。
【０１２５】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のベクター上の調節配列は、プロモーターまたはエンハンサーでもよく、これらのうちのいずれもが組織特異的であっても良い。
【０１２６】
ベクター上の調節配列は、細胞性またはウイルス性ゲノムから単離できる。細胞性調節配列の例は、アクチン遺伝子、メタロチオネインＩ遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、カゼインＩ遺伝子、血清アルブミン遺伝子、コラーゲン遺伝子、グロビン遺伝子、ラミニン遺伝子、スペクトリン遺伝子、アンキリン遺伝子、ナトリウム／カリウムＡＴＰアーゼ遺伝子およびチューブリン遺伝子由来の調節エレメントを含むがこれに限定されない。ウイルス性調節配列の例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子、アデノウイルス後期遺伝子、ＳＶ４０遺伝子、レトロウイルスＬＴＲ、およびヘルペスウイルス遺伝子由来の調節エレメントを含むがこれに限定されない。典型的には、調節配列は、ＮＦ−ｋＢ、ＳＰ−１、ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＡＰ−１、およびＣＡＡＴ結合タンパク質などの転写因子の結合部位を含む。機能的には、調節配列は、内在性遺伝子の転写を、促進、増強、または別様に変化させる能力により定義される。
【０１２７】
ある好ましい実施形態において、調節配列は、ウイルス性プロモーターである。特に好ましい実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ最初期遺伝子プロモーターである。別の実施形態において、調節エレメントは、細胞性、非ウイルス性プロモーターである。
【０１２８】
別の好ましい実施形態において、調節エレメントは、エンハンサーであってもよいし、または、エンハンサーを含んでもよい。特に好ましいそのような実施形態において、エンハンサーは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子エンハンサーである。別の実施形態において、エンハンサーは細胞性、非ウイルス性エンハンサーである。
【０１２９】
さらに別の好ましい実施態様では、調節エレメントは、リプレッサーであってもよいし、またはリプレッサーを含んでもよい。特に好ましいこのような実施態様では、リプレッサーはウイルスリプレッサー、細胞性非ウイルス性リプレッサーであってもよい。
【０１３０】
転写調節配列は、一以上の、骨格付着領域またはマトリックス付着部位、負の調節エレメント、および転写因子結合部位を含んでもよい。調節配列はまた遺伝子座制御領域も含むことができる。
【０１３１】
本発明は、レトロウイルス転写調節配列、例えば長末端反復配列の使用をも包含する。しかし、これらを使用する場合、それらは活性化する内在性遺伝子（すなわち転写調節配列が再結合して活性化する細胞性遺伝子）の転写のプロモーターまたはエンハンサーとして、転写調節配列の機能に実質的に作用する任意のレトロウイルス配列に必ずしも結合しているわけではない。
【０１３２】
本発明のベクター構築物は、ベクター上のエキソン配列に機能的に結合していない調節配列をも含み得る。例えば、調節配列がエンハンサーである場合、それを内在性遺伝子の近く（例えば、上流、下流、またはイントロン中）に組込むと、その内在性プロモーターから遺伝子の発現を刺激することができる。この活性化機構により、ベクター由来のエキソン配列は、活性化された遺伝子の転写物には存在していない。
【０１３３】
あるいは、調節エレメントは、エキソンに機能的に結合し得る。エキソンは、天然の配列であり得るか、または非天然であり得る（例えば合成により製造）。最初のエキソンに開始コドンを欠失した内在性遺伝子を活性化するために（例えば卵胞刺激ホルモン−β）、開始コドンは、好ましくはベクター上のエキソンから削除する。最初のエキソンに開始コドンを含む内在性遺伝子を活性化するために（例えば、エリスロポエチンおよび成長ホルモン）、ベクター上のエキソンは、好ましくは、開始コドン、通常ＡＴＧ、および好ましくは効率的な翻訳開始部位を含む（コザック（Ｋｏｚａｋ）、Ｊ．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．１９６：９４７（１９８７））。エキソンは、開始コドンの後に追加のコドンを含み得る。これらのコドンは、天然遺伝子由来であり得るか、または非天然であり得る（例えば合成）。コドンは、活性化する内在性遺伝子の最初のエキソンに存在するコドンと同一であり得る。あるいは、コドンは、内在性遺伝子の最初のコドンに存在するコドンとは異なり得る。例えば、コドンは、エピトープタグ、シグナル分泌配列、トランスメンブランドメイン、選択マーカー、またはスクリーニングマーカーであり得る。任意により、不対スプライスドナー部位が、エキソン配列のすぐ３’側に存在し得る。活性化する遺伝子の構造が既知である場合、ベクターのコドンが、スプライシング後に内在性遺伝子の第二エキソンのコドンと共にフレーム内になるように、スプライスドナー部位を位置的にベクターエキソンの隣に配置する。活性化する内在性遺伝子の構造が既知である場合、各々異なるリーディングフレームを含む別々の構築物を使用する。
【０１３４】
機能的結合は、指定された配列（群）を介した転写を可能とする配置と定義する。例えば、エキソン配列に機能的に結合した調節配列は、エキソン配列が転写されることを示す。開始コドンがベクター上に存在する場合、機能的結合はまた、ベクターエキソン由来のオープンリーディングフレームが、内在性遺伝子のオープンリーディングフレームと共にフレーム内にあることを示す。非相同的組込み後、ベクター上の調節配列（例えばプロモーター）は、内在性遺伝子に機能的に連結し、通常ＣＡＰ部位と呼ばれる部位で転写開始を容易にする。転写は、ベクター上のエキソンエレメントを介して（存在する場合、開始コドン、オープンリーディングフレーム、および／または不対スプライスドナー部位を介して）、および内在性遺伝子を介して進行する。この機能的結合により産生された初期転写物は、スプライスを受けて、ベクターおよび内在性遺伝子の両方由来のエキソン配列を含むキメラ転写物を創製する。この転写物は、翻訳されて内在性タンパク質を産生できる。
【０１３５】
エキソンまたは「エキソン配列」は、成熟ＲＮＡ分子に存在する任意の転写された配列と定義する。ベクター上のエキソンは、例えば５’非翻訳領域などの非翻訳配列を含み得る。あるいは、または非翻訳配列と共に、エキソンは、開始コドンおよびオープンリーディングフレームなどのコード配列を含み得る。オープンリーディングフレームは、天然アミノ酸配列または非天然アミノ酸配列（例えば合成コドン）をコードできる。オープンリーディングフレームはまた、シグナル分泌配列、エピトープタグ、エキソン、選択マーカー、スクリーニングマーカー、または内在性遺伝子にスプライスされた場合にオープンリーディングフレームを保存するように機能するヌクレオチドをコードし得る。
【０１３６】
初期転写物のスプライシング（このプロセスによりイントロンが除去される）は、それぞれ、イントロンの５’および３’末端に位置する、スプライスドナー部位およびスプライス受容部位により指図される。スプライスドナー部位の共通配列は、（Ａ／Ｃ）ＡＧ　ＧＵＲＡＧＵ（ここでＲはプリンヌクレオチドを示す）であり、１−３位のヌクレオチドは、エキソンに位置し、ヌクレオチドＧＵＲＡＧＵはイントロンに位置する。
【０１３７】
不対スプライスドナー部位は、本明細書において、下流スプライス受容部位を含まない、活性化構築物上に存在するスプライスドナー部位として定義する。ベクターを非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組込む場合、不対スプライスドナー部位は、内在性遺伝子由来のスプライス受容部位と対を形成する。次いで、ベクター由来のスプライスドナー部位は、内在性遺伝子由来のスプライス受容部位と共に、ベクタースプライスドナー部位と内在性スプライス受容部位の間の全ての配列の切出しを指図する。これらの介入配列の切出しにより、内在性タンパク質の翻訳を妨害する配列が除去される。
【０１３８】
本明細書で使用した上流および下流なる語は、それぞれ、コード鎖に関して５’または３’方向にあることを意味する。遺伝子の「上流領域」なる語は、第二エキソンの５’核酸配列（コード鎖に関して）から、同コード鎖を有する最初に隣接する遺伝子の最後のエキソンまでを含むと定義する。機能的に、上流領域は、非相同的組込みベクターを内在性遺伝子に機能的に結合可能な、内在性遺伝子の第二エキソンの５’部位である。
【０１３９】
ベクター構築物は、非相同的に組込んだ活性化構築物を含む細胞の同定および単離を容易にする選択マーカーを含むことができる。選択マーカーの例は、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＲＴ）、プロマイシン（ｐａｃ）、ジヒドロ−オロターゼグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、ヒスチジンＤ（ｈｉｓＤ）、カルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＡＤ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、多剤耐性１（ｍｄｒ１）、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、およびアデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）をコードする遺伝子を含む。
【０１４０】
あるいは、ベクターは、選択マーカーの代わりに、または加えて、スクリーニングマーカーを含むことができる。スクリーニングマーカーにより、ベクターを含む細胞を、薬物または他の選択的圧力下に配置することなく、単離できる。スクリーニングマーカーの例は、細胞表面タンパク質、蛍光タンパク質、および酵素をコードする遺伝子を含む。ベクター含有細胞を、例えば、ベクターにコードされた酵素により蛍光産物に変換可能な細胞表面タンパク質または基質に、蛍光標識した抗体を使用してＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離装置）により単離し得る。
【０１４１】
あるいは、選択は、内在性遺伝子産物により付与される特性に関する表現型選択により実施できる。それ故、活性化構築物は、内在性遺伝子自体により付与される「マーカー」以外の選択マーカーを欠損し得る。この実施形態において、活性化された細胞は、活性化された遺伝子により付与される表現型に基づき選択可能である。選択表現型の例は、細胞増殖、成長因子依存性成長、コロニー形成、細胞分化（例えば、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞等への分化）、足場非依存性成長、細胞性因子の活性化（例えば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼ等）、細胞表面レセプター／タンパク質の発現、細胞間接着の増加または減少、遊走、細胞活性化（例えば、休止対活性化Ｔ細胞）を含む。
【０１４２】
トランスフェクトした細胞について、安定な組込み体を選択することなく、遺伝子活性化産物のスクリーニングを行う場合、選択マーカーは構築物から削除し得る。これは、安定な組込み体の効率が高い場合に特に有用である。
【０１４３】
ベクターは、組込みベクターおよび隣接する活性化された内在性遺伝子のコピーの増加した細胞の選択を可能とするために、１つ以上（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上、最も好ましくは１つまたは２つ）の増幅マーカーを含み得る。増幅マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）、ジヒドロ−オロターゼグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、およびカルバモイルリン酸シンターゼ（ＣＡＤ）を含むがこれに限定されない。
【０１４４】
ベクターは、遺伝子増幅に有用な真核ウイルス性複製起源を含み得る。これらの起源は、増幅マーカーの代わりに、または共に存在し得る。
【０１４５】
ベクターはまた、微生物において構築物の繁殖に有用な遺伝子エレメントを含み得る。有用な遺伝子エレメントの例は、微生物複製起源および抗生物質耐性マーカーを含む。
【０１４６】
これらのベクター、および本明細書で開示した任意のベクター、およびその技術分野における通常の当業者により認識される明らかなベクターを、本明細書に記載した任意の方法に使用して、これらの方法により産生できる任意の組成物を形成することができる。
【０１４７】
構築物の細胞ゲノムへの非相同的組込みにより、ベクター由来の調節エレメントと内在性遺伝子由来のエキソンの間に機能的な結合が形成される。好ましい実施形態において、ベクター調節配列の挿入を使用して、内在性遺伝子の発現をアップレギュレートする。遺伝子発現のアップレギュレーションは、転写的にサンレントな遺伝子の転写的に活性な遺伝子への変換を含む。また、転写的にはすでに活性であるが、所望よりも少ないレベルのタンパク質を産生する遺伝子についての遺伝子発現の増強も含む。他の実施形態において、内在性遺伝子の発現は、発現のダウンレギュレーション、誘導性表現型の創製、または発現の組織特異性の変化など別様に影響され得る。
【０１４８】
本発明によると、遺伝子発現生成物のインビトロでの生成方法は、たとえば、（ａ）本発明のベクターを細胞へ導入する；（ｂ）非相同組換により、ベクターの細胞をゲノムに組込む；（ｃ）ベクターに含まれる転写調節配列によって、遺伝子をアップレギュレートして、細胞内の内在性遺伝子を過剰発現させる；（ｄ）内在性遺伝子を過剰発現させるために、細胞をスクリーニングする；（ｅ）細胞による内在性遺伝子の発現生成物の生成に適した条件下で、細胞を培養する；ことで構成される。このような本発明のインビトロ方法はさらに、単離遺伝子発現生成物を生成するために、発現生成物の単離を含む。このような方法では、これに限定されるわけではないが、クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、ＬＣ、イオン交換、親和性、サイズ排除など）、沈降（硫酸アンモニウム沈降、免疫沈降など）、電気泳動、通常の当業者に周知のタンパク質単離および精製の別の方法を含む、周知のあらゆるタンパク質分離方法を有利に利用できる。
【０１４９】
同様に、遺伝子発現生成物のインビボ生成方法は、たとえば、（ａ）本発明のベクターを細胞へ導入する；（ｂ）非相同組換により、ベクターの細胞をゲノムに組込む；（ｃ）ベクターに含まれる転写調節配列によって、遺伝子をアップレギュレートして、細胞内の内在性遺伝子を過剰発現させる；（ｄ）内在性遺伝子を過剰発現させるために、細胞をスクリーニングする；（ｅ）単離およびクローン化された細胞を、真核生物のインビボ細胞による内在性遺伝子の過剰発現に適した条件下で、真核生物に導入する；ことで構成される。本発明のこの側面により、菌類（特に酵母）、植物、動物、さらに好ましくは動物、またさらに好ましくは脊椎動物、もっとも好ましくは哺乳類、特にヒトを含む、あらゆる真核生物を有利に使用できる。ある関連する例において、本発明は、細胞を真核生物に導入する前に細胞の単離とクローニングを含む方法を提供する。
【０１５０】
本明細書で使用するように、細胞またはインビトロの細胞による、発現生成物の「生成に有利な条件」、遺伝子の「過剰発現に有利な条件」、遺伝子の「活性化に有利な条件」という表現は、インビトロの細胞による、発現生成物の生成、遺伝子の過剰発現または活性化を実現・促進または助長する、適切な環境・物理・栄養または生化学に関するパラメータのいずれかおよびすべてを指す。このような条件はもちろん、インビトロの細胞による、発現性生物の生成、あるいは遺伝子の過剰発現または活性化に適した、あるいは実現・促進または助長する、培地、インキュベーション、照明、湿度などを含む。同様に、本明細書で使用するように、細胞またはインビボの細胞による、発現生成物の「生成に有利な条件」、遺伝子の「過剰発現に有利な条件」、遺伝子の「活性化に有利な条件」という表現は、インビボで真核生物内の細胞による、発現性生物の生成、遺伝子の過剰発現または活性化を実現・促進または助長する、細胞を含む動物を維持するための、適切な環境・物理・栄養・生化学・行動・遺伝子および感情に関するパラメータのいずれかおよびすべてを指す。所与の条件セットがインビトロまたはインビボで、遺伝子の発現、活性化または過剰発現にとって有利かどうかは、以下で説明および例証するスクリーニング法、あるいは遺伝子の発現、活性化または過剰発現を測定するための当業界において通常の、他の方法を用いて、通常の当業者が決定できる。
【０１５１】
本明細書で使用するように「内在性遺伝子の活性化」という句は、内在性遺伝子をコードする転写産物の生成を、内在性遺伝子を含む細胞で通常見られるよりも高いレベルで誘発することを意味する。一部の応用例では、「内在性遺伝子の活性化」は、内在性遺伝子を含む細胞で通常見られるよりも高いレベルで、内在性遺伝子によってコードされるタンパク質、またはタンパク質の一部を生成することを意味する場合もある。
【０１５２】
本発明は、上記の方法のいずれかを用いて作成した細胞も含む。本発明は、ベクター作成物、ベクター生成物が組込まれた細胞、内在性遺伝子による過剰発現する所期の遺伝子生成物である細胞、導入された転写調節配列によって引き起こされる過剰発現を含む。
【０１５３】
本発明で使用される細胞は、任意の真核種から得ることができ、一次化、二次化、不死化できる。さらに細胞は、インビボのいずれの組織から得てもよい。単離および活性化する細胞を得るための、有用な組織の例として、これに限定されるわけではないが、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺、脳、精巣、卵巣、島、腸、骨髄、皮膚、骨、胆嚢、前立腺、膀胱、胎仔、免疫および造血系が挙げられる。細胞の種類としては、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、幹細胞、卵胞細胞が挙げられる。しかし、本発明を用いて遺伝子発現を活性化するには、いずれの細胞または細胞の種類でも使用できる。
【０１５４】
本方法は、菌類、植物または動物などの、真核起源のいずれの細胞内でも実施できる。好ましい例として、脊椎動物、特に哺乳類、そしてさらに好ましくはヒトが挙げられる。
【０１５５】
作成物は、一次、二次または不死化細胞に組込める。一次細胞とは、脊椎動物から単離されて、継代培養されていない細胞である。二次細胞とは、継代培養されたが、不死化されていない一次細胞である。不死化細胞とは、見かけ上は無期限に継代培養可能な細胞系である。
【０１５６】
好ましい例では、細胞は不死化細胞系である。不死化細胞系の例として、これに限定されるわけではないが、ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、Ｊｕｒｋａｔ、２９３セル、ＫＢ癌、Ｔ８４結腸上皮細胞系、Ｒａｊｉ、Ｈｅｐ　Ｇ２またはＨｅｐ　３Ｂ肝癌細胞系、Ａ２０５８黒色腫、Ｕ９３７リンパ腫、Ｗ１３８繊維芽細胞細胞系、体細胞雑種、融合細胞が挙げられる。
【０１５７】
本発明で用いる細胞は、これに限定されるわけではないが、（ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびヒトなどの）哺乳類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、両生類細胞、は虫類細胞、植物細胞、酵母細胞を含む、任意の真核種から得られる。特定の種による内在性遺伝子または遺伝子生成物の過剰発現は、その種の細胞内での遺伝子発現を活性化することによって発生することが好ましい。たとえば、内在性ヒトタンパク質を過剰発現させるには、ヒト細胞を用いる。同様に、ウシタンパク質を過剰発現させるには、たとえばウシ成長ホルモン、ウシ細胞を用いる。
【０１５８】
細胞は真核生物のどの組織から得てもよい。単離・活性化する細胞を得る、有用な脊椎動物の組織としてはたとえば、これに限定されるわけではないが、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、筋肉、肺、脳、免疫系（リンパ腺を含む）、精巣、卵巣、島、腸、胃、骨髄、皮膚、骨、胆嚢、前立腺、膀胱、接合体、胎仔、造血組織が挙げられる。有用な脊椎動物の細胞の種類としては、これに限定されるわけではないが、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、生殖細胞（すなわち、精母細胞／精子および卵母細胞）、幹細胞、卵胞細胞が挙げられる。単離・活性化する細胞を得る、植物組織としてはたとえば、これに限定されるわけではないが、葉組織、子房組織、雄ずい組織、雌ずい組織、根組織、塊茎、配偶子、胚などが挙げられる。しかし、通常の当業者は、本発明を用いて遺伝子発現を活性化するのに、あらゆる真核細胞または細胞種類を使用できることを認識するであろう。
【０１５９】
説明したいずれかの方法を用いて生成した細胞はすべて、必要な遺伝子生成物の発現のためのスクリーニングと、細胞内で過剰発現する遺伝子生成物の必要量の供給に有効である。細胞は、単離・クローニングできる。
【０１６０】
本方法で生成された細胞は、インビトロ（たとえば、タンパク質療法として使用）またはインビボ（たとえば、細胞療法で使用）でタンパク質を生成するのに用いられる。
【０１６１】
工業用の培養および生成条件は、分析用途（クローニング、タンパク質または核酸シークエンシング、抗体培養、Ｘ線結晶分析、酵素学的分析など）に細胞を培養・調整するのに用いる条件によって変化することが多い。ローラーボトルで培養する場合の細胞のスケールアップには、細胞を固定する表面積の増加も含まれる。そのため、工業用の培養では、マイクロキャリアビーズを追加して表面積を増加することが多い。撹拌培養での細胞のスケールアップには、体積を大幅に増加させることが含まれる。マイクロキャリアおよび撹拌培養では、５リットル以上必要になることもある。興味のあるタンパク質の固有効力（比活性）によって、体積は１から１０リットルと少なくなることもある。１０から１５リットルが最も普通である。しかし、５０から１００リットルまで必要な場合もあり、体積が１０，０００から１５，０００リットルにもなることがある。場合によっては、さらに大きな体積が必要なこともある。細胞は、多数、たとえば５０から１００個のＴフラスコでも培養できる。
【０１６２】
培養条件にもかかわらず、工業規模のタンパク質精製は、分析目的の精製によってもかなり変化する。工業用の実際的な状況でのタンパク質精製は、最初は、約１０４細胞／ｍｌで、１０リットルの細胞の細胞量同等物である。細胞精製を開始する細胞量同等物は、最高１０６または１０７細胞／ｍｌで、１０リットルの細胞にもなり得る。しかし、通常の当業者は、本方法においては、最初の細胞量同等物が多くても少なくても有利に利用できることを認識するであろう。
【０１６３】
特に最終生成物を臨床的に使用する際の、別の工業用の培養条件は、意図された培地が血清をまったく、あるいは細胞培養に必要な量含まない、無血清培地で細胞を培養することである。これは明白に、好ましくない毒性汚染物質（ウイルスなど）あるいは、たとえば精製を複雑にするタンパク質などの他の種類の汚染物質の共精製を防ぐ。細胞培養用の無血清培地、このような培地の市販供給元、無血清培地での細胞の培養方法は、通常の当業者には周知である。
【０１６４】
上記の方法で作成した１個の細胞は、１個あるいは複数の遺伝子を過剰発現できる。複数の遺伝子は、同一の細胞内に作成物を１個組込むか、作成物を複数（すなわち、複数の種類の作成物）組込むことによって活性化できる。そのため、細胞は１種類のベクター作成物のみか、さまざまな種類の作成物を含むことが可能で、それぞれ内在性遺伝子を活性化できる。
【０１６５】
本発明は、以下の１つまたは複数による、上で説明した細胞作成方法も対象としている：１個以上のベクター作成物を導入する；導入した作成物を、非相同的組換によって細胞のゲノムに組込む；細胞内で１個以上の内在性遺伝子を過剰発現させる；細胞を単離・クローニングする。
【０１６６】
「トランスフェクション」という語は、本明細書では便宜上、ポリヌクレオチドの細胞への導入を説明する際に用いている。しかし、一般に、ポリヌクレオチドの細胞への導入を指すのに、この語が明確に使用されていることを理解すべきであり、本明細書では、（その明確な意味によるのと同様に）電気穿孔法、リポソーム仲介導入、レトロウイルス仲介導入などの、他の方法による導入を指すことも意図している。
【０１６７】
ベクターは、当業者に周知の多数の方法によって細胞に導入できる。これには、以下に限定されるわけではないが、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥデキストラン、リポフェクション、レセプタ仲介取込、ポリブレン、粒子照射、マイクロインジェクションが含まれる。あるいは、ベクターは（複製可能または不可能な）ウイルス性粒子として細胞に送達できる。核酸の送達に有用なウイルスとしてはたとえば、これに限定されるわけではないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスが挙げられる。核酸分子の細胞への送達に適した、通常の当業者に周知の他のウイルスが、本方法で同様に使用されることがある。
【０１６８】
トランスフェクションの後、細胞は当業者に周知の、ベクターと宿主細胞のゲノムとの非相同組込に適した条件下で培養される。非相同的に組込まれたベクターを含む細胞は、当業者に周知の、活性化された内在性遺伝子の発現を促す条件下でさらに培養される。
【０１６９】
ベクター作成物は、単一のＤＮＡ作成物、あるいは独立した作成物として細胞に導入され、コンカテマーとなる。
【０１７０】
好ましい例では、ベクター作成物が二本鎖ＤＮＡベクター作成物であるのに対して、ベクター作成物には、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの組合せ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの組合せも含まれる。したがってたとえば、ベクター作成物は、逆転写酵素によってｃＤＮＡに転換される一本鎖ＲＮＡ、２本鎖ＤＮＡに転換されるｃＤＮＡ、最終的に宿主細胞ゲノムと組換を行う二本鎖ＤＮＡとなる。
【０１７１】
好ましい例では、作成物は細胞への導入前に直線化される。活性化作成物の直線化によって、組込過程で染色体末端と反応可能な、ＤＮＡ遊離末端が作成される。一般に、作成物は調節要素（および、存在する場合は、エクソンおよびスプライスドナー配列）の下流で直線化される。直線化はたとえば、調節配列の下流に独特の制限部位を配置したり、トランスフェクション前に該当する制限酵素で作成物を処理することによって促進できる。要求されない場合は、作成物の直線化部位と、基部の最も機能的な要素（不対スプライスドナー配列）の間に「スペーサ」配列を配置すると都合がよい。スペーサ配列が存在すると、トランスフェクション過程におけるヌクレオチド鎖分解による劣化から、ベクターの重要な機能要素が保護される。このスペーサは、本明細書で説明したベクターの必須機能を変化させないヌクレオチド配列によって構成できる。
【０１７２】
内在性遺伝子発現を活性化するには、環状作成物も使用できる。環状プラスミドは、細胞へのトランスフェクション時に宿主細胞ゲノムに組込可能なことは、当業者に周知である。トランスフェクション過程で、おそらくＤＮＡの切断が環状プラスミドで発生するため、遊離ＤＮＡ末端が染色体末端に結合できるようになる。作成物ではこれらの切断の一部は、不可欠なベクター機能を破壊しない位置（たとえば、切断は調節配列の下流で発生する）で発生するため、内在性遺伝子を活性化できる配置で作成物を染色体に組込むことができる。上で述べたように、スペーサ配列が作成物に配置される場合がある（たとえば、調節配列の下流）。宿主細胞ゲノムへの組込後、トランスフェクションの間に、スペーサ領域で発生した切断が、内在性遺伝子の活性化に適した作成物の部位に遊離末端を生成する。
【０１７３】
本発明は、上で説明した方法で作成した細胞のライブラリも含む。ライブラリは、１回のトランスフェクション実験のクローンすべてか、１回のトランスフェクション実験によるクローンのサブセットを含むことができる。サブセットは、同一の遺伝子あるいは複数の遺伝子、たとえば遺伝子のクラスを過剰発現できる。トランスフェクションは、１種類の作成物か、複数の種類の作成物によって行うことも可能である。
【０１７４】
ライブラリは、２回以上のトランスフェクション実験による組換細胞すべてを組合わせるか、１回のトランスフェクション実験による細胞の１個以上のサブセットを組合わせるか、別々のトランスフェクション実験による細胞のサブセットを組合わせて作成することも可能である。得られたライブラリは、同一の遺伝子か、複数の遺伝子、たとえば遺伝子のクラスを発現できる。これらの各トランスフェクションにおいて再度、独特の作成物あるいは複数の作成物を使用できる。
【０１７５】
ライブラリは、同一の細胞種類または異なる細胞種類から作成できる。
【０１７６】
ライブラリは、自然なＤＮＡ切断、あるいは、照射、制限酵素および／またはＤＮＡ切断剤を、ともに（同じ細胞に）または個あるいは（細胞の各グループに適用し、セルを組合わせてライブラリを作成する）に適用して起こった切断で染色体に組込まれた１種類の活性化作成物を含む、１種類のセルから構成できる。このライブラリは、照射、制限酵素および／またはＤＮＡ切断剤を、ともに（同じ細胞に）または個あるいは（細胞の各グループに適用し、セルを組合わせてライブラリを作成する）適用して処理した細胞のゲノムに組込まれた１個または複数の作成物を含む、複数の種類の細胞で構成できる。
【０１７７】
本発明は、同一または別個のトランスフェクション実験による細胞の各種サブセットを選択してライブラリを作成する方法も対象とする。たとえば、（作成物２０をトランスフェクションした細胞において、緑蛍光タンパク質の存在によって判定した）核核因子を発現する細胞はすべて、活性化核因子を用いて細胞のライブラリを作成するためにプールできる。同様に、膜や分泌タンパク質を発現する細胞もプールできる。細胞は、たとえば成長因子独立成長、成長因子独立増殖、コロニー形成、細胞分化（たとえば神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞などへの分化）、足場独立成長、細胞因子（たとえば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど）の活性化、細胞間の癒着・移入の獲得・損失、細胞活性化（たとえば、静止対活性化Ｔ細胞）などの表現型によってもグループ化できる。
【０１７８】
本発明は、内在性細胞を過剰発現するために細胞のライブラリを用いる方法も対象としている。このライブラリは遺伝子の発現についてスクリーニングされ、必要な遺伝子生成物を発現する細胞が選択される。その後、この細胞を用いて、遺伝子生成物を後で使用するために精製する。細胞をインビトロで培養するか、インビボで細胞に遺伝子を発現させることによって、細胞を発現できる。
【０１７９】
本発明はまた、新規遺伝子および遺伝子生成物を識別するためにライブラリを用いる方法も対象としている。
【０１８０】
本発明はさらに、非相同組込のパターンを刺激またはこれに作用する作用薬を用いて細胞を処理することによって、遺伝子活性化の効率を高める方法も対象としている。細胞発現パターン、クロマチン構造、メチル化パターンは、細胞の種類によって劇的に異なることが実証されている。同じ細胞種類の異なる細胞系でも、大きく異なる場合がある。これらの違いは、ＤＮＡ切断パターンと修復過程の両方に影響を与え、非相同組込に大きく影響する。たとえば、ＤＮＡのクロマチン化された範囲（不活性遺伝子と結合しやすい特性）は、制限酵素と化学薬品による切断に対する耐性が大きい一方、照射による切断を受けやすい。
【０１８１】
さらに、不活性遺伝子はメチル化できる。この場合、ＣｐＧメチル化によってブロックされる制限酵素は、不活性遺伝子付近のメチル化部位を開裂できず、メチル化感受性酵素を用いて遺伝子を活性化するのがさらに困難になる。これらの問題は、さまざまなＤＮＡ切断剤を用いて複数の細胞系の活性化ライブラリを作成すれば回避できる。ライブラリを作成すると、より完全な組込パターンを作成でき、与えられた遺伝子が活性化される可能性は最大となる。
【０１８２】
本発明の方法には、２本鎖切断を、過剰発現される内在性遺伝子を含む細胞のＤＮＡに導入することが含まれる。これらの方法は、ベクター組込の前か同時に、２本鎖切断を細胞内のゲノムＤＮＡを導入する。ＤＮＡ切断の機構は、ゲノム内のＤＮＡ切断パターンに著しく影響を及ぼす。結果として、自然に、または照射、制限酵素、ブレオマイシン、または他の切断剤によって人為的に引き起こされたＤＮＡ切断は、異なる位置に発生可能である。
【０１８３】
組込効率を向上させ、組込部位のランダムな分布を改善するために、トランスフェクションの前か後に、少量、普通、大量の照射で細胞を処理できる。トランスフェクションされたＤＮＡは、人為的に２本鎖切断させることによって、宿主細胞の染色体にＤＮＡ修復過程の一部として組込可能である。通常、組込部位として作用する２本鎖切断を作成することは、律速段階である。そのため、照射（または他のＤＮＡ破壊剤）を用いた染色体切断を増やすことによって、所与のトランスフェクションで多数の構成要素が得られる。さらに、照射によるＤＮＡ切断の機構は、自然切断とは異なる。
【０１８４】
照射は、高エネルギーの光子がＤＮＡ分子にぶつかったときに、ＤＮＡ切断を直接引き起こす。照射はその代わりに、細胞内の化合物を活性化し、この化合物がＤＮＡ鎖と反応し、ＤＮＡ鎖を切断させる。一方、自然切断は、細胞内に生成された反応性化合物（スーパーオキシドおよび過酸化物など）とＤＮＡ分子の相互作用によって発生すると考えられる。しかし、細胞内のＤＮＡは、むき出しの除タンパクポリマーとして存在しているのではなく、代わりにクロマチンに結合し、凝集状態で存在している。結果として、一部の領域が、２本鎖を切断させる、細胞内の作用薬に接触できくなる。照射によって生じた光子の波長は、ＤＮＡの凝集領域にぶつかるほど短いため、自然切断で示したよりも下のＤＮＡ領域に切断を引き起こす。したがって、照射はＤＮＡの異なる切断パターンを作成可能で、次に、異なる組込パターンが生成される。
【０１８５】
結果として、細胞内の同一の活性化作成物を用いて作成したライブラリは、照射処理を行っても、行わなくても、活性化遺伝子の異なるセットを潜在的に含む。最終的に、照射処理によって、非相同組込の効率は最大５から１０倍上昇し、少ない細胞を用いて完全なライブラリを作成できる。したがって、照射処理は遺伝子活性化効率を高め、トランスフェクションされた細胞において新たな組込と活性化パターンを生成する。有用な照射の種類としては、α、β、γ、ｘ線、紫外線照射がある。有用な照射量は細胞の種類によって異なるが、一般に、細胞生存度が０．１から９９％となる照射量範囲が有用である。ＨＴ１０８０細胞の場合、これは１３７Ｃｓ源による約０．１から１０００ｒａｄの照射量に相当する。他の照射量も、組込頻度が増加したり、組込部位のパターンが変化する限りは有用である。
【０１８６】
トランスフェクションされた細胞で染色体切断を人為的に引き起こすには、照射以外にも、制限酵素を用いることができる。照射と同様に、ＤＮＡ制限酵素は染色体を切断させ、次にこれがトランスフェクションされたＤＮＡの組込部位として作用する。ＤＮＡ切断がこのように増えると、活性化作成物の組込全体の効率が上昇する。さらに、制限酵素による切断の機構は照射の場合とは異なり、染色体切断のパターンも異なると考えられる。
【０１８７】
制限酵素は、光子と比べると比較的大きな分子で、ＤＮＡを破壊する能力を持つ小型の代謝物質である。結果として、制限酵素は、ゲノム全体としてよりも、あまり凝集していない領域を切断しやすくする。興味のある遺伝子がゲノム内の接触可能な領域内にある場合は、細胞を制限酵素で処理すれば、興味のある遺伝子の上流に活性化作成物が組込まれる可能性を高めることができる。制限酵素は具体的な配列を認識するため、そして、所与の制限部位が興味のある遺伝子の上流にない場合があるため、さまざまな制限酵素を使用できる。各酵素は宿主染色体の開裂部位に影響を及ぼす、各種特性（たとえば、大きさ、安定性、メチル化部位の開裂能力、最適反応条件）を備えているため、いろいろな制限酵素を使用することも重要である。各酵素は、開裂可能な制限部位の分布が異なるため、さまざまな組込パターンを作成する。
【０１８８】
したがって、活性化作成物導入の前、導入中、導入後に制限酵素（または制限酵素を発現可能なプラスミド）を導入すると、異なるセットの遺伝子が活性化される。最終的に、制限酵素が引き起こした会列によって、組み込み効率が最大５から１０倍に上昇し（Ｙｏｒｉｆｕｊｉら、Ｍｕｔ．　Ｒｅｓ．　２４３：１２１（１９９０））、より少ない細胞をトランスフェクションして、完全なライブラリを作成できる。このため、制限酵素を用いて新しい組込パターンを作成し、自然切断あるいは他の人為的に引き起こされた切断での非相同組換によって作成されたライブラリで活性化できなかった遺伝子を活性化できる。
【０１８９】
制限酵素を用いて、活性化作成物をゲノム内の必要な場所にバイアス組込できる。たとえば、平均で５０から１０００キロベースごとに真核ＤＮＡを開裂する複数の希少制限酵素について記述されている。希少制限認識配列が偶然、興味のある遺伝子の上流に位置する場合、活性化作成物とのトランスフェクションの際に制限酵素を導入することによって、ＤＮＡ切断は、優先的に興味のある遺伝子の上流で起こる。そして、この切断裂は、活性化作成物の組込部位として作用することがある。興味のある遺伝子内あるいは付近の適当な位置で開裂させる酵素ならどれでもよく、部位はゲノムの残りの部分に過少表現されるか、ゲノム付近に過剰表現される（たとえば、ＣｐＧを含む制限部位）。以前認識されていない遺伝子の場合、８ｂｐの認識部位（たとえば、ＮｏｔＩ、ＳｆｔＩ、ＰｍｅＩ、ＳｗａＩ、ＳｓｅＩ、ＳｒｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、ＳｇｆＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉ）を備えた制限酵素、ＣｐＧを含む部位（たとえば、ＥａｇＩ、Ｂｓｉ−ＷＩ、ＭｌｕＩ、ＢｓｓＨＩＩ）を認識する酵素、他の希少な切断酵素を使用できる。
【０１９０】
このようにして、ある種の活性化遺伝子について強化した、「バイアス」ライブラリを作成できる。この点について、ＣｐＧジヌクレオチドを含む制限酵素部位は、一般にゲノムでは過少表現されるが、遺伝子活性化にまさに有用な場所の、多くの遺伝子の５’末端ではＣｐＧ島の形で過剰表現されるため、特に有用である。したがって、これらの部位を認識する酵素は、遺伝子配列の５’末端で優先的に開裂する。
【０１９１】
制限酵素は複数の方法によって、宿主細胞に導入できる。制限酵素はまず、電気穿孔法によって細胞に導入できる（Ｙｏｒｉｆｕｊｉら、Ｍｕｔ．　Ｒｅｓ．　２４３：１２１（１９９０）；Ｗｉｎｅｇａｒら、Ｍｕｔ．　Ｒｅｓ．　２２５：４９（１９８９））。一般に、細胞に導入される制限酵素の量は、電気穿孔媒体の濃度に比例する。電圧、静電容量、抵抗を調節して、各細胞系に対するパルス条件を最適化する必要がある。次に、制限酵素は、真核調節要素の制御下で酵素をコード化するプラスミドから、一時的に発現できる。生成される酵素のレベルは、誘導プロモーターを用いたり、誘導強度を変化させて制御できる。場合によっては、（酵素の毒性によって）生成される制限酵素の量を制限することが望ましいこともある。このような場合、弱い、または突然変異のプロモーター、スプライス部位、翻訳開始コドン、ポリＡ尾部を用いて、生成される制限酵素の量を低下させることができる。３番目に、制限酵素は、細胞膜に融着するか、細胞膜を透過する作用薬を導入できる。リポソームおよびストレプトリジン（Ｐｉｍｐｌｉｋａｒら、Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１２５：１０２５（１９９４））は、この種の作用薬の例である。最後に機械的穿孔（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｃｅｌｌ　５０：５２３−５３４（１９８７））とマイクロインジェクションを用いて、ヌクレアーゼと他のタンパク質を細胞に導入することも可能である。しかし、活性酵素を生体細胞に導入可能な方法ならすべて適切である。
【０１９２】
ブレオマイシンと他のＤＮＡ破壊作用薬が誘発したＤＮＡ切断によっても、異なるＤＮＡ切断パターンが生成できる。そのため、細胞内で２本鎖切断を生成可能な作用薬およびインキュベーション条件は、効率の上昇および／または非相同組換部位の変更に役立つ。ＤＮＡ切断化学薬品の種類の例として、これに限定されるわけではないが、過酸化物、他のフリーラジカル生成化合物、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗腫瘍薬、酸、置換ヌクレオチド、エネジエン（ｅｎｅｄｉｙｎｅ）抗体が挙げられる。
【０１９３】
具体的なＤＮＡ切断化学薬品の例としては、これに限定されるわけではないが、ブレオマイシン、過酸化水素、クメンヒドロペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、（アニリン、１−ナフチルアミンまたは１−ナフトールと反応させた）次亜塩素酸、硝酸、リン酸、ドキソルビシン、９−デオキシドキソルビシン、ジメチル−６−ドキソルビシン、５−イミノダウノルビシン、アドリアマイシン、４’−（９−アクリジニルアミノ）メタンスルフォン−ｍ−アニシジン、ネオカルチノスタチン、８−メトキシカフェイン、エトポシド、エリプチシン、イドクスウリジン、ブロモデオキシウリジンが挙げられる。
【０１９４】
照射あるいはブレオマイシンなどの、少量のＤＮＡ切断作用剤に細胞を事前に露出させておくと、細胞内のＤＮＡ修復機構を引き起こすことが可能である。トランスフェクションの約２４時間前にこれらの作用剤で細胞を事前処理すると、細胞は、ＤＮＡ切断の修復とトランスフェクション後のＤＮＡ組込がさらに効率よく行える。さらに、ＬＤ５０（露出された細胞の致死率が５０％となる量）が事前処理後は高くなるため、照射や他のＤＮＡ切断剤の量を多く使用することもできる。これにより、複数の投与量でランダムな活性化ライブラリが作成され、宿主細胞の染色体内の組込部位の種々の分布が生じる。
【０１９５】
（スクリーニング）
いったん活性化ライブラリ（または複数のライブラリ）が作成されると、多くのアッセイを用いてスクリーニングが可能である。興味のあるタンパク質（たとえば、分泌されたウイルス細胞内タンパク質）の特性とライブラリを作成するのに用いる活性化作成物の性質によって、以下で説明するアッセイのいずれか、あるいはすべてを利用できる。他のアッセイ形式も使用できる。
【０１９６】
（ＥＬＩＳＡ）
酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、活性化タンパク質を検出できる。活性化遺伝子生成物が分泌されると、活性化ライブラリ細胞のプールによる培養上清が、興味のあるタンパク質に固有の結合抗体を含むウェルでインキュベートされる。細胞または細胞のグループが興味のある遺伝子を活性化すると、タンパク質が培地に分泌される。ライブラリクローンのプール（プールは、１から１００，０００を超えるライブラリメンバの範囲でよい）をスクリーニングすると、興味のある遺伝子を活性化した細胞を含むプールが識別できる。それから、同朋選択、限界希釈、または当業者に周知の他の技術によって、興味のある細胞を他のライブラリ　メンバから精製できる。分泌されたタンパク質に加えて、ＥＬＩＳＡは、細胞間および膜結合タンパク質を発現する細胞のスクリーニングに用いることができる。このような場合、培養上清をスクーリンニングする代わりに、少数の細胞をライブラリプール（各細胞は、プールごとに少なくとも１００から１，０００回表現される）から除去し、溶解・清澄させ、抗体で被覆したウェルに加える。
【０１９７】
（ＥＬＩＳＡ　スポット　アッセイ）
ＥＬＩＳＡスポットは、興味のあるタンパク質に固有の抗体で被覆される。被覆後、ウェルを１％　ＢＳＡ／ＰＢＳで１時間、３７℃でブロックする。ブロック後、ランダム活性化ライブラリから１００，０００から５００，０００の細胞を各ウェルに加える（プール全体の最高１０％を表現）。一般に、各ウェルにプール１個を宛てる。興味のあるタンパク質を発現する細胞の頻度が１／１００００の場合（すなわち、プールが１０，０００個のクローンで構成されている場合、その中の１個が興味のあるタンパク質を発現する）、ウェル当たり５００，０００個の細胞で被覆すると、５０個の特異性の細胞が得られる。細胞は、動かしたり、分散させたりせずに、３７℃で２４から４８時間、ウェルでインキュベートする。インキュベーション後、細胞を除去し、プレートをＰＢＳ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０で３回、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで３回洗浄する。第２の抗体を適当な濃度でウェルに加え、室温で２時間か、４℃で１６時間インキュベートする。これらの抗体はビオチン化するか、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で直接標識できる。第２の抗体を除去し、プレートをＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄する。ＨＲＰで標識した、第３の抗体またはストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートする。
【０１９８】
（ＦＡＣＳアッセイ）
蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を用いて、ランダム活性化ライブラリを多くの方法でスクリーニングできる。興味のある遺伝子が細胞表面タンパク質をコード化する場合、蛍光標識された抗体を活性化ライブラリによる細胞と共にインキュベートする。興味のある遺伝子が分泌タンパク質をコード化する場合、細胞をビオチン化して、興味のあるタンパク質に固有の抗体に結合したストレプトアビジンとインキュベートできる（Ｍａｎｚら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：１９２１（１９９５））。インキュベーション後、細胞を高濃度のゼラチン（またはアガロースやメチルセルロースなど、他のポリマー）に入れて、分泌タンパク質の拡散を抑える。タンパク質が細胞から分泌されると、細胞表面に結合している抗体によって捕捉される。そして、興味のあるタンパク質の存在は、蛍光標識された第２の抗体によって検出される。細胞は、分泌タンパク質と膜結合タンパク質の両方について、蛍光シグナルに従って分類される。その後、蛍光細胞は単離、伸張され、さらにＦＡＣＳ、限界希釈、または、当業者に周知の他の細胞精製技術によって濃縮される。
【０１９９】
（磁気ビーズ分離）
この技術の原理は、ＦＡＣと類似している。（上で説明した）膜結合タンパク質や捕捉された分泌タンパク質は、活性化ライブラリを、興味のあるタンパク質固有の抗体結合磁気ビーズでインキュベートすることで検出される。タンパク質が細胞表面にある場合、磁気ビーズはその細胞に結びつく。磁石を用いると、興味のあるタンパク質を発現する細胞を、ライブラリ中の他の細胞から精製できる。これらの細胞をビーズから除去し、伸張、分析し、必要ならばさらに精製する。
【０２００】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
（少なくともプール中の各クローン数と等しい）少数の細胞を収集・溶解して、ＲＮＡを精製する。単離後、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡが逆転写される。このとき、興味のあるｃＤＮＡに固有のプライマーを用いて、ＰＣＲが行われる。
【０２０１】
あるいは、活性化作成物内の合成エクソンと内在性遺伝子のエクソンに渡るプライマーを使用できる。このプライマーは、興味のある、内在的に発現された遺伝子をハイブリダイズおよび増幅しない。逆に、活性化作成物が興味のある遺伝子と活性化された遺伝子の発現の上流で組込まれた場合、このプライマーは、遺伝子に固有の第２プライマーとともに、内在性遺伝子によるエクソンにスプライスされた合成エクソンの存在によって、活性化遺伝子を増幅する。したがって、この方法は、通常、興味のある遺伝子を必要なレベルよりも低レベルで発現させる細胞内で、活性化された遺伝子を検出するのに使用できる。
【０２０２】
（表現型選択）
本例では、活性化遺伝子に付与された表現型に基づいて細胞を選択できる。選択可能な表現型の例としては、増殖、成長因子独立成長、コロニー形成、細胞分化（たとえば、神経細胞、筋肉細胞、上皮細胞など）、足場独立成長、細胞因子の活性化（たとえば、キナーゼ、転写因子、ヌクレアーゼなど）、細胞間の癒着・移入の獲得・損失、細胞活性化（たとえば、静止対活性化Ｔ細胞）が挙げられる。上で説明したような表現型を示す活性化細胞を単離することが重要なのは、組込作成物による内在性遺伝子の活性化がおそらく、認められた細胞表現型の原因であるためである。したがって、活性化遺伝子は、認められた表現型を処理したり、誘起するために重要な治療薬または薬ターゲットとなる。
【０２０３】
上記の各アッセイの感受性は、ライブラリ細胞の遺伝子発現を一時的にアップレギュレートすることで、効果的に高めることができる。これは、たとえばライブラリにＰＭＡおよび腫瘍壊死因子αを加えることによって、ＮＦ−κＢ部位を含むプロモーターに対して実施できる。別個に、あるいはＰＭＡおよびＴＮＦ−αとともに、酪酸ナトリウムを加えると、さらに遺伝子発現を高めることができる。これらの試薬を加えると、興味のあるタンパク質の発現が増加するため、興味のある遺伝子活性化細胞を識別するために、より感受性の低いアッセイを使用できるようになる。
【０２０４】
多くの遺伝子の活性化を最大にする目的で活性化ライブラリが作成されるため、ライブラリクローンをプールに構成することは有用である。各プールは、１００，０００を超える各クローンで構成できる。したがって、あるプールでは、多くの活性化タンパク質が、多くの場合、希薄濃度で生成される（プール全体の大きさと、特定の活性化タンパク質を生成する、プール内の細胞数が限られていることによる）。したがって、スクリーニング前のタンパク質濃縮は、スクリーニングアッセイにおいて活性化タンパク質を検出する機能を効果的に高める。濃縮について特に有用な方法は、限外濾過である；しかし、他の方法も使用できる。たとえば、タンパク質は、存在する大半またはすべてのタンパク質を結合する条件で、イオン交換、疎水性、色素、ヒドロキシアパタイト、レクチンおよび他の適当な樹脂に吸着させて、非特異的に、または半特異的に濃縮できる。その後、結合タンパク質はスクリーニング前に、少量で除去できる。この方法は、タンパク質の濃縮を促進するために、無血清培地で細胞を培養する場合に有利である。
【０２０５】
別の例では、活性化作成物に含められる有用な配列は、エピトープタグである。エピトープタグは、活性化タンパク質の親和性精製（たとえば、免疫親和性またはキレート基質）を可能にするアミノ酸配列で構成できる。そのため、活性化作成物にエピトープタグを含ませると、活性化ライブラリによる活性化タンパク質すべてが精製できる。活性化タンパク質を他の細胞や培地タンパク質から精製することによって、新規タンパク質と酵素の活性のスクリーニングが行いやすくなる。ある例では、活性化タンパク質の精製後、エピトープタグを除去することが好ましい場合もある。これは、プロテアーゼ認識配列（たとえば、因子ＩＩａまたはエンテロキナーゼ開裂部位）を、活性化作成物のエピトープタグより下流に組込むことで実施できる。精製された活性化タンパク質を適当なプロテアーゼとインキュベートすると、タンパク質からエピトープタグが放出される。
【０２０６】
エピトープタグ配列が活性化作成物上に位置するライブラリでは、活性化タンパク質はすべて、親和性精製を用いて、他の細胞タンパク質および培地タンパク質から精製できる。親和性精製は活性化タンパク質を濃縮するだけでなく、これらのタンパク質を、ライブラリをスクリーニングするのに用いられるアッセイを妨害する可能性のある他の作業から精製する。
【０２０７】
興味のある遺伝子を過剰発現する細胞を含むクローンのプールが確認されると、活性化細胞を単離する手段を行える。活性化細胞の単離は、当業者に周知のさまざまな方法で実施できる。細胞精製方法の例としては、限界希釈、蛍光細胞分析分離、磁気ビーズ分離、同胞選択、クローニングリングを用いた単一コロニー精製が挙げられる。
【０２０８】
本発明の好ましい例では、発現生成物を精製する過程が含まれる。非常に好ましい例では、内在性遺伝子生成物を発現する細胞は、工業用途、特に診断・治療・薬剤発見用途に利用できる量の遺伝子生成物が生成されるように培養される。
【０２０９】
本明細書に記載する方法で使用するベクターはすべて、増幅可能なマーカーを含むことができる。その結果、ベクターと（たとえば、過剰発現遺伝子を含む）興味のあるＤＮＡの両方の増幅が細胞内で起こり、内在性遺伝子の発現がさらに高められる。したがって、内在性遺伝子を増幅する手段を方法に含めてもよい。
【０２１０】
活性化細胞が単離されると、興味のある遺伝子と活性化作成物の両方を含む座位を増幅して、発現をさらに強化することができる。これは、以下に示す方法を単独で、あるいは組合わせることによって、実施できる。
【０２１１】
増幅可能マーカーは、さらに多いコピー数の場合に選択可能な遺伝子である。増幅可能マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素、アデノシンデアミナーゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロ−オロターゼ、カルバミルリン酸シンターゼが挙げられる。これらの例の場合、増幅マーカーとフランキング配列（興味のある遺伝子を含む）の多いコピー数は、増幅マーカーによって作用を受ける薬剤や毒代謝物を使用するために選択できる。一般に、薬剤や毒代謝物濃度が上昇すると、増幅可能マーカーの少数のコピーを含む細胞が死に、これに対して、マーカーのコピーを多数含む細胞は生存し、コロニーを形成する。これらのコロニーは、単離、伸張され、興味のある遺伝子の生成の上昇をレベルについて分析できる。
【０２１２】
活性化作成物の増幅可能マーカーの配置は、活性化細胞内の興味のある細胞と増幅可能マーカーと並列になる。コピー数を増やした増幅可能マーカーと興味のある遺伝子を含む活性化細胞は、増量した選択性薬剤（通常は薬剤または代謝物）の存在下で、細胞を培養することによって選択できる。たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の増幅は、メトトレキサートを用いて選択できる。
【０２１３】
薬剤耐性コロニーは、増加させた各薬剤濃度において発生するため、各コロニーは、増幅可能なマーカーおよび興味のある遺伝子のコピー数に関して選択・特徴付けが可能で、興味のある遺伝子の発現について分析できる。活性化遺伝子発現が最高レベルのコロニーはそれぞれ、より高い薬剤濃度でさらに増幅するために選択できる。最高の薬剤濃度では、クローンが発現する、興味のあるタンパク質の量は著しく増加する。
【０２１４】
ＤＨＦＲを増幅する場合、複数の異なる濃度のメトトレキセートで約１ｘ１０７の細胞をプレートさせると都合がよい。メトトレキセートの有効所期濃度は、約５から１００ｎＭの範囲である。しかし、メトトレキセートの最適濃度は、各細胞系と組込部位について経験的に決定する必要がある。メトトレキセート含有培地での培養後、メトトレキセートの最高濃度によるコロニーを選んで、興味のある遺伝子発現の増加について分析する。その後、最高濃度のメトトレキセートによるクローンは、ＤＨＦＲと興味のある遺伝子をさらに増幅するために選択する、さらに高濃度のメトトレキセート中で培養する。遺伝子増幅の程度が最高のクローンには、マイクロモルおよびミリモル範囲のメトトレキセート濃度を使用できる。
【０２１５】
複製のウイルス起点（たとえば、ｏｒｉ　Ｐまたはヒト細胞のＳＶ４０、マウス細胞のｐｏｌｙｏｍａ　ｏｒｉ）を活性化作成物に配置すると、活性化細胞内の興味ある遺伝子と複製のウイルス起点が並列になる。そして、起点とフランキング配列は、ウイルス複製タンパク質をトランスに導入することで増幅できる。たとえば、ｏｒｉ　Ｐ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスの複製起点）を用いると、ＥＢＮＡ−Ｉが一時的、または安定して発現できる。ＥＢＮＡ−Ｉは、組込まれたｏｒｉ　Ｐ座位から複製を開始する。複製は、起点から双方向に広がる。各複製生成物が作成されると、これも複製を開始できる。結果として、ウイルス起点と、興味のある遺伝子を含むフランキングゲノム配列のコピーが多数作成される。コピー数が多くなると、細胞が興味のある遺伝子をより多く生成できる。
【０２１６】
複製生成物はある頻度で組換を行って、興味のある遺伝子を含む、フランキングゲノム配列を含む環状分子を生成する。興味のある遺伝子を持つ環状分子を含む細胞は、Ｈｉｒｔ抽出とサザンブロッティングによる１回の細胞クローニングと分析で単離できる。精製を行うと、コピー数を増やした（通常１０から５０コピー）エピソームゲノム座位を含む細胞を、培養により繁殖できる。より多く増殖するためには、元の作成物の第１の起点に隣接する第２の起点を含めることにより、エピソームをさらに増加できる。たとえば、Ｔ抗原を用いて、ｏｒｉ　Ｐ／ＳＶ４０エピソームのコピー数を最大１，０００まで増加できる（Ｈｅｉｎｚｅｌら、Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６２：３７３８（１９８８））。このようにコピー数を実質的に増加させると、タンパク質の発現を劇的に高めることができる。
【０２１７】
本発明は、インビボとインビトロの両方での、内在的遺伝子の過剰発現を含む。そのため、細胞は、遺伝子生成物の必要量を精製するためにインビトロで使用するか、その遺伝子生成物を無傷の動物に提供するためにインビボで使用することが可能である。
【０２１８】
本発明は、本明細書に記載した方法によって生成されたタンパク質も含む。タンパク質は、既知、あるいは以前未知であった遺伝子のいずれかから生成できる。本方法で作成可能な周知のタンパク質の例としては、これに限定されるわけではないが、エリスロポイエチン、インシュリン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージ刺激因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、ＴＧＦβ、血液凝固因子Ｖ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、ＴＳＨ−β、骨成長因子−２、骨成長因子−７、腫瘍壊死因子、アルファ−１　抗トリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、白血病抑制因子、グルカゴン、プロテインＣ、プロテインキナーゼＣ、マクロファージコロニー刺激因子、幹細胞因子、卵胞刺激ホルモンβ、ウロキナーゼ、神経成長因子、インシュリン様成長因子、インシュリノトロピン、副甲状腺ホルモン、ラクトフェリン、補体阻害剤、血小板由来成長因子、ケラチノサイト成長因子、ニューロトロピンー３、トロンボポイエチン、絨毛膜ゴナドトロピン、トロンボモジュリン、アルファグルコシダーゼ、上皮成長因子、ＦＧＦ、マクロファージコロニー刺激因子、上記の各タンパク質のための細胞表面レセプタが挙げられる。
【０２１９】
活性化細胞によるタンパク質生成物を生成する場合、当業者に周知の、いずれのタンパク質生成方法を用いてもよい。
【０２２０】
（活性化された膜タンパク質コード遺伝子を含む細胞の単離）
膜関連タンパク質をコードする遺伝子は、医薬品開発の観点から特に興味深い。これらの遺伝子およびこれら遺伝子のコードするタンパク質は、例えば、コンビナトリアルケミストリーライブラリーやハイスループットスクリーニングアッセイを用いて、低分子の医薬品を開発するのに利用可能である。また、これらのタンパク質やその可溶型タンパク質（例えば、膜貫通領域を欠いた切断型）は、ヒトや動物において治療的に活性のある医薬品として利用可能である。膜タンパク質の同定は、ツーハイブリッド研究法やアフィニティーキャプチャー技術を用いて、新規リガンド（例えば、サイトカイン、成長因子、および他のエフェクター分子）を同定するのにも利用可能である。他にも多くの膜タンパク質利用法が考えられる。
【０２２１】
内在性膜タンパク質コード遺伝子を同定するための現在の研究法は、ｃＤＮＡライブラリーからの遺伝子の単離とシークエンシングを含む。次に、タンパク質の膜貫通領域を同定できる疎水性プロットを用いて、ＯＲＦ解析により内在性膜タンパク質を同定する。残念ながら、ｃＤＮＡライブラリーを作製した細胞内で内在性膜タンパク質をコードする遺伝子が発現されていなければ、この方法を用いてその遺伝子は同定できない。さらに、多くの遺伝子は、発生段階の短い時期に、およびまたは非常に低レベルで、非常に限られた細胞でのみ発現する。その結果、現在利用できる研究法では、これらの遺伝子を効率的に同定することができない。
【０２２２】
本発明により、遺伝子の配列、構造、機能、あるいは発現の性質の知識なしに、内在性遺伝子を活性化することができる。この開示した方法を用いて、遺伝子は転写レベルでのみ、あるいは転写と翻訳の両レベルで活性化される。その結果、組み込みベクターを含む細胞内で、活性化内在性遺伝子にコードされるタンパク質が産生される。さらに、ここで開示した特異的ベクターを用いることにより、活性化内在性遺伝子から産生されるタンパク質に、例えばエピトープタグを含むなどの修飾ができる。他のベクター（例えば、上記したベクター１２から１７）は、エピトープタグの上流にシグナルペプチドをコードする。このベクターは、内在性膜タンパク質の発現を活性化した細胞を単離するのに利用できる（以下の例５を参照）。このベクターは、通常では分泌されないタンパク質を分泌させるのにも利用できる。
【０２２３】
このように、本発明は、細胞の内在性膜タンパク質や膜貫通タンパク質をコードする内在性遺伝子を同定する方法にも関連する。本発明のこのような方法は、一つあるいはそれ以上のステップからなる。例えば、本発明のこのような一方法は、（ａ）本発明の一つあるいはそれ以上のベクターを細胞に導入し；　（ｂ）非相同的組換えにより、ベクターを細胞のゲノムに組み込み；（ｃ）組み込まれたベクターコンストラクト内に含まれる転写制御配列によって遺伝子をアップレギュレートションし、内在性遺伝子を過剰発現させ；（ｄ）内在性遺伝子を過剰発現する細胞をスクリーニングし；（ｅ）活性化遺伝子をキャラクタライズし、細胞の内在性膜タンパク質をコードする遺伝子として同定する。というステップからなる。関連実施態様として、本発明は、活性化遺伝子のキャラクタライズ以前にさらに細胞からの活性化遺伝子の単離を含む方法を提供する。
【０２２４】
内在性膜タンパク質コード遺伝子を同定するため、細胞のゲノムに組み込むベクターは、開始コドン、シグナル配列、およびエピトープタグを含むエキソン配列に連結した制御配列を含み、その下流には不対スプライスドナー部位がくる。組み込みと内在性遺伝子の活性化により、ベクター由来のシグナルペプチドとエピトープタグが下流の内在性遺伝子のエキソンにコードされるタンパク質に融合したキメラタンパク質が産生される。このキメラタンパク質は、ベクターのコードするシグナルペプチドが存在するため分泌経路へと向けられ、タンパク質の翻訳終了後はそのタンパク質が分泌される。しかしながら、活性化内在性遺伝子が内在性膜タンパク質をコードし、その遺伝子の膜貫通領域がベクターの組み込み部位の３’側に位置するエキソンにコードされる場合には、このキメラタンパク質は細胞表面へ行き、エピトープタグが細胞表面上に提示される。周知の細胞単離法（例えば、フローサイトメトリーによるソーティング、マグネチックビーズによる細胞ソーティング、免疫吸着、あるいは当業者に周知の他の方法）により、エピトープタグに対する抗体を用いて、エピトープタグを提示し内在性膜タンパク質コード遺伝子を活性化した細胞を全体の中から単離することができる。これらの細胞は、次に膜タンパク質の機能の研究に利用できる。また、例えば、ベクターのコードするエキソンに特異的なＤＮＡプローブでハイブリダイゼーションし、これらの細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするなどの周知方法を利用して、あるいはここで示した遺伝子コンストラクトを用いて、さらに細胞から活性化遺伝子を単離できる。
【０２２５】
ベクターのエキソンにコードされるエピトープタグは、抗体に結合可能な短いペプチド、物質に結合可能な短いペプチド（例えば、ポリヒスチジン／二価金属イオン担体、マルトース結合タンパク質／マルトース担体、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／グルタチオン担体）、あるいは内在性膜タンパク質由来の細胞外ドメイン（膜貫通ドメインを欠く）で抗体やリガンドの存在するものである。しかしながら、当業者に周知の他のタイプのエピトープタグも、本発明に準じて同等に利用できると考えられる。
【０２２６】
内在性遺伝子の非標的活性化のためのベクター
上述したように非標的遺伝子活性化は、新たな遺伝子およびタンパク質を発見および単離するための、そして商業化のために特定のタンパク質を大量に生産するための強力な手法が提供を提供する、宿主細胞における内在性遺伝子の活性化を含め、多くの重要な用途がある。非標的遺伝子活性化の一部の用途では、細胞のライブラリーを作成することが望ましい。このライブラリーでは、各メンバが宿主細胞ゲノムの独自の位置に組込まれた活性化ベクターを含み、ライブラリーの各メンバが各種内在性遺伝子を活性化している。さらに、組込ベクターを含むが、内在性遺伝子を活性化できないライブラリーから細胞を除去することが望ましい。真核細胞は遺伝子を欠失した大規模領域を含むことが多く、遺伝子のない領域への活性化ベクター組込は頻繁に行われる。しかし、これらの組込ベクターは、内在性遺伝子を活性化できないが、（適切なプロモーターによって駆動され、ポリアデニル化シグナルが続く）選択マーカーを活性化ベクターに包含させると、宿主細胞に薬剤耐性を付与することができる。遺伝子発見用途ではさらに不確実であるが、ベクター配列を含む転写産物は、遺伝子が活性されているかどうかにかかわらず、これらの細胞内で生成される。遺伝子が活性化されていない場合、これらのベクター配列含有転写産物は、非遺伝子ゲノムＤＮＡ配列を含む。結果として、活性化遺伝子を単離する場合、単離されたベクター由来のＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）分子すべて（すなわちベクター配列を含む転写産物）を単離することはできない。なぜなら、これらの転写産物の多くは内在性遺伝子をコードしないためである。これらの問題を克服するために、本発明は、高特異性ベクターおよびベクター活性化遺伝子の単離を促進する方法を提供する。
【０２２７】
本発明のこれらのベクターは、内在性遺伝子発現の活性化と、活性化遺伝子に対応するｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの単離に有用である。このようなベクターの１つは、ベクターをゲノム内に組込む細胞の数を減少させるが、内在性遺伝子から発現を活性化（あるいは内在性遺伝子によって転写）することができなかった。これらの細胞を除去することによって、さらに少ないライブラリーメンバを作成およびスクリーニングし、所与の数の活性化遺伝子を単離できる。さらに、活性化遺伝子を発現できなかったベクター含有細胞は、真の活性化細胞の単離を妨害可能なＲＮＡ分子を生成する。したがって、本明細書で開示するベクターは、タンパク質過剰発現および／または活性化遺伝子に対応するｃＤＮＡ分子の単離に適した細胞を生成するのに特に有用である。本発明の第２の種類のベクターは、活性化内在性遺伝子からエキソンＩを単離するのに有用である。結果として、これらのベクターは活性化ＲＮＡ転写産物から全長遺伝子を得るのに使用できる。本明細書で述べる機能性ベクター成分はそれぞれ独立して、あるいは相互に組み合わせて使用できる。
【０２２８】
ポリ（Ａ）トラップ活性化ベクター
活性化遺伝子の単離を促進するために、本発明は、内在性遺伝子の活性化時に優先的に薬剤耐性コロニーを生成できる、新規の遺伝子活性化ベクターを提供する。このようなベクターは、本明細書では「ポリ（Ａ）トラップベクター」と呼ぶ。ポリ（Ａ）トラップベクターは、図８Ａ−８Ｆに示す。ｐＲＩＧ２１ｂと呼ばれる、このような二重ポリ（Ａ）トラップベクターの１つのヌクレオチド配列は、図１５Ａ−１５Ｂ（配列番号１９）に示す。これらのベクターは、ポリ（Ａ）シグナルを欠失した選択マーカー遺伝子に動作可能に結合された（これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはＣＭＶ即時型遺伝子プロモーター、ＳＶ４０　Ｔ抗原プロモーター、テトラサイクリン誘導プロモーターまたはβ−アクチンプロモーターなどのプロモーターである）転写調節配列を含む。選択マーカー遺伝子がポリアデニル化シグナルを欠失しているため、そのメッセージは安定ではなく、マーカー遺伝子生成物は十分に生成されない。しかし、活性化ベクターは内在性遺伝子の上流に組込まれる場合、選択マーカーは内在性遺伝子のポリアデニル化シグナルを利用して、それにより薬剤耐性を付与するのに十分な量の選択マーカータンパク質を生成することができる。したがって、この活性化ベクターを組込む細胞は一般に、内在性遺伝子が活性化された場合のみ、薬剤耐性コロニーを形成する。
【０２２９】
ポリ（Ａ）トラップ活性化ベクターは、任意の選択可能またはスクリーニング可能マーカーを含むことができる。さらに、選択マーカーは、組込ライブラリー作成に使用される細胞内で機能性であるどのプロモーターからも発現できる。したがって、選択マーカーはウイルス性または非ウイルス性プロモーターによって発現できる。随意に、不対スプライス供与体部位は作成物、好ましくは選択マーカーの３’に包含させて、選択マーカーをコードするエキソンを、内在性遺伝
子のエキソンに直接スプライスすることができる。下流の転写調節配列およびスプライス供与体部位がベクターに含まれている場合、選択マーカーに隣接してスプライス供与体部位が含まれていると、これらの下流要素がメッセンジャーＲＮＡから除去される。
【０２３０】
関連する実施形態において、（これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである）第２の転写調節配列は、選択マーカーの下流および選択マーカーと同じ方向に配置してもよい。随意に、不対スプライス供与体部位は下流の転写調節配列に結合してもよい。このような配置では、ポリ（Ａ）トラップ活性化ベクターは、内在性エキソンにスプライスされた下流ベクターコードエキソンを含むメッセージを生成できる。上述したように、これらのキメラ転写産物は、ベクターコードエキソンの性質によって、未変性または修飾タンパク質に翻訳可能である。
【０２３１】
本明細書で使用するように、「ベクターコードエキソン」は、転写調節配列下流と、ベクター上に見られる転写開始部位および不対スプライス供与体部位の間にあるベクターの領域を意味する。ベクターコードエキソンは、十分に処理されたメッセージ内に内在性遺伝子を含む転写産物の５’末端に存在する。同様に、本明細書で使用するように、「ベクターコードイントロン」は
、不対スプライス供与体部位の下流に位置するベクターの領域である。ベクターに線形化部位が存在する場合、ベクターコードイントロンは、不対スプライス供与体部位および直線化部位の間のベクターコードエキソンの下流であるベクターの領域である。ベクターコードイントロンは、ＲＮＡ処理中に活性化遺伝子転写産物から除去される。
【０２３２】
スプライス受容体トラップ（ＳＡＴ）ベクター
内在性遺伝子を活性化できない細胞を除去する別の方法として、本発明は、本明細書で「スプライス受容体トラップ（ＳＡＴ）」ベクターと呼ぶ別のベクターを提供する。これらのベクターは、ベクターコードスプライス供与体部位から内在性スプライス受容体までスプライスするように設計されている。さらに、該ベクターは、スプライシングが行われない場合には、宿主細胞にとって毒性である生成物（または対抗して選択可能な生成物）を生成するよう設計されている。したがって、これらのベクターは、ベクターコードエキソンが内在性エキソンをスプライスできない細胞の消滅を促進する。
【０２３３】
スプライス受容体トラップベクターは、ベクター上で同じ方向に向いたポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカー遺伝子の両方を含むことができる。本明細書で使用されるように、ポジティブ選択マーカーは発現時に、マーカーを発現する細胞の単離を促進可能なタンパク質を生成する遺伝子である。同様に、本明細書で使用されるように、ネガティブ選択マーカーは発現時に、マーカーを発現する細胞の除去を促進可能なタンパク質を生成する遺伝子である。
ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーは、不対スプライス供与体部位によってベクター作成物内で分離されることが好ましい。しかし、他の実施形態において、ポジティブ選択マーカーをネガティブ選択マーカー遺伝子内に融合させてもよい。この配置では、不対スプライス供与体部位は、ネガティブ選択マーカーのリーディングフレームが保存されるように、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーの間に配置される。不対スプライス供与体部位は、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーの接合部に配置されることが好ましい。しかし、不対スプライス供与体部位は、内在性スプライス受容体部位へのスプライシング時に、ポジティブ選択マーカーが活性形で発現され、ネガティブ選択マーカーが不活性形で発現される、あるいはまったく発現されないように、融合遺伝子のどこに配置してもよい。この配置では、ポジティブ選択マーカーは、ネガティブ選択マーカーの上流に配置される。
【０２３４】
本明細書に含まれる説明を考慮すれば、ＳＡＴベクター上のポジティブおよびネガティブ選択マーカーが融合タンパク質として発現される必要がないことも、当業者には明白である。ある実施形態において、内部リボゾームエントリー部位（ｉｒｅｓ）は、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーの間に挿入される。この配置において、不対スプライス供与体部位は２つのマーカーの間か、どちらかのマーカー遺伝子のリーディングフレーム内に、スプライシング時に、ポジティブ選択マーカーが活性形で発現され、ネガティブ選択マーカーが不活性形で発現される、あるいはまったく発現されないように配置できる。別の実施形態において、ポジティブ選択マーカーを、ネガティブ選択マーカー以外の各種の転写調節配列から駆動することができる。この配置において、不対スプライス供与体部位は、ネガティブ選択マーカーの５’未翻訳領
域、またはネガティブ選択マーカーのリーディングフレーム内のどこかに、スプライシング時に、ネガティブ選択マーカーが不活性形で発現される、あるいはまったく発現されないように配置される。さらに、ポジティブおよびネガティブマーカーが各種の転写調節配列から駆動される場合、ポジティブ選択マーカーはネガティブ選択マーカーの上流または下流に配置され、ポジティブ選択マーカーはその３’末端にスプライス供与体部位を含んでいても、含んでいなくてもよい。
【０２３５】
本明細書で述べるベクターは、どのポジティブ選択マーカーを含んでいてもよい。本明細書において有用なポジティブ選択マーカーの例としては、ネオマイシン（ｎｅｏ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ピューロマイシン（ｐａｃ）、デヒドロオラターゼ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、ヒスチジンＤ（ｈｉｓＤ）、カルバミルホスフェートシンターゼ（ＣＡＤ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、マルチドラッグ耐性（ｍｄｒ１）、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、キサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、アデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）をコードする遺伝子が挙げられる。あるいは、ベクターはポジティブ選択マーカーの代わりに、スクリーニング可能マーカーを含んでいていもよい。スクリーニング可能マーカーとしては、宿主細胞内で識別可能な表現形を生成可能な任意のタンパク質を含む。スクリーニング可能マーカーの例としては、細胞表面エピトープ（ＣＤ２など）および酵素（β−ガラクトシダーゼなど）が挙げられる。
【０２３６】
本明細書で述べるベクターも、あるいは、対抗して選択される任意のネガティブ選択マーカーを含んでいてもよい。ネガティブ選択マーカーの例としては、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）およびジフテリア毒素が上げられる。ネガティブ選択マーカーは、細胞表面タンパク質または酵素などの、スクリーニング可能マーカーでもよい。ネガティブ選択マーカーを発現する細胞はたとえば、蛍光発色セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気ビードセルソーティングによって除去できる。
【０２３７】
内在性遺伝子を活性化発現した細胞を単離するために、組込ベクターを含む細胞は、適切な薬剤選択によって識別できる。ポジティブ選択マーカー向けであり、ネガティブ選択マーカーに対抗する選択は同時に行える。他の実施形態では、選択は連続して行える。選択を連続して行う場合、ポジティブ選択マーカー向けの選択を最初に行い、次にネガティブ選択マーカーに対抗する選択を行う。あるいは、ネガティブ選択マーカーに対抗する選択を最初に行い、次にポジティブ選択マーカー向けの選択を行う。
【０２３８】
ポジティブおよびネガティブマーカーは、各遺伝子の翻訳開始部位の上流に位置する転写調節要素によって発現される。ポジティブ／ネガティブマーカー融合タンパク質またはｉｒｅｓ配列を使用する場合、１個の転写調節要素が両方のマーカーを発現させる。ポリ（Ａ）シグナルは各選択マーカーの３’に置かれる。ポジティブ／ネガティブ融合遺伝子を使用する場合、１個のポ
リ（Ａ）シグナルはマーカーの３’に配置される。あるいは、遺伝子活性化イベント（以下の二
重ポリ（Ａ）／スプライス受容体トラップを参照）のための追加特異性を与えるために、ポリ（Ａ）シグナルはベクターから排除してもよい。
【０２３９】
二重ポリ（Ａ）／スプライス受容体トラップベクター
遺伝子活性化イベントを欠失した細胞の数をさらに減少させるために、本発明は、ベクターコードエキソンを内在性遺伝子によるエキソンにスプライスし、ポリ（Ａ）シグナルを獲得しさえすれば、宿主細胞を生存させられるベクターも提供する。これらのベクターは本明細書では、「二重ポリ（Ａ）／スプライス受容体トラップベクター」または「二重ポリ（Ａ）／ＳＡＴベクター」と呼ぶ。細胞生存のためにスプライシングおよびポリアデニル化の両方の発生を必要とすることにより、内在性遺伝子を活性化できなかった細胞は、活性化ライブラリーからさらに効率よく除去される。
【０２４０】
二重ポリ（Ａ）／スプライス受容体トラップベクターは、ＳＡＴベクターで述べたように構成されたポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーを含む；しかし、どちらの遺伝子も機能性ポリ（Ａ）シグナルを含んでいない。したがって、ポジティブ選択マーカーは、スプライシングが発生して内在性ポリ（Ａ）シグナルを捕捉しなければ、高レベルで発現されない。ポリ（Ａ）シグナルがないことは別として、この種のベクターの他のすべての機能および実施形態は、本明細書で述べるＳＡＴベクターと同様である。二重ポリ（Ａ）／ＳＡＴベクターの例は図９Ａ−９Ｆおよび１０Ａ−１０Ｆに示す。ｐＲＩＧ２２ｂと呼ぶ、このような二重ポリ（Ａ）／ＳＡＴベクターの１つを１６Ａ−１６Ｂに示す（配列番号２０）。
【０２４１】
内在性遺伝子からタンパク質発現を活性化するのためのベクター
非標的遺伝子活性化の多くの用途では、活性化内在性遺伝子からタンパク質を生成することが望ましい。これを実現するには、（これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである）第２の転写調節配列を、本明細書で述べる任意のベクター上の選択マーカーの下流に配置できる。ポリ（Ａ）トラップベクター、ＳＡＴベクターまたは二重ポリ（Ａ）トラップ／ＳＡＴベクターを使用すると、下流転写調節配列は、上流の選択マーカーと同じ方向に発現させるように配置される。しかし、この種のベクターによって全長タンパク質の発現を活性化させるには、エキソンＩの潜在性開始ＡＴＧコドンを避けるために、ベクターを内在性遺伝子の５’ＵＴＲ内に組込む必要がある。
【０２４２】
あるいは、非標的遺伝子活性化を用いてタンパク質発現の頻度を増加させるために、ベクター上の下流転写調節配列を、スプライス供与体部位が続くエキソン配列に動作可能に結合してもよい。好ましい実施形態において、ベクターエキソンは開始コドンを欠失している。このベクターは、エキソンＩで翻訳開始コドンをコードしない遺伝子からタンパク質発現を活性化させるために特に有用である。別の好ましい実施形態において、ベクターエキソンは開始コドンを含んでいる。付加コドンは、翻訳開始コドンおよびスプライス供与体部位の間に配置でいる。たとえば、部分シグナル分泌配列はベクターエキソン上でコードできる。部分シグナル配列は、機能性シグナル配列を生成する内在性遺伝子による部分シグナル配列を補完可能な、どのアミノ酸配列でもよい。部分配列は、１および１００番目のアミノ酸をコードし、既存遺伝子から由来するか、新規配列より成る。したがってこのベクターは、エキソンＩの内在性シグナル配列の一部を、そしてそれ以降のエキソンから残りのシグナル配列の一部をコードする遺伝子からタンパク質を生成および分泌するのに有用である。特殊な種類の内在性遺伝子を活性化するのに有用なベクターの別の例では、機能性シグナル配列をベクターエキソン上にコードできる。このベクターによって、エキソンＩのシグナル配列をコードする遺伝子からタンパク質を生成および分泌することができる。通常は分泌されないタンパク質の分泌形を生成するために使用することもできる。
【０２４３】
開始コドンがベクターエキソンに含まれている場合、各リーディングフレーム内にベクターを生成することは有利である。これは、開始コドンおよびスプライス供与体結合部位の間のヌクレオチド数を変えて実施できる。同時に、好ましいベクター配置は、エキソン／イントロン構造、翻訳開始コドンの位置またはリーディングフレームとは無関係に、内在性遺伝子からタンパク質を生成することができる。
【０２４４】
活性化内在性遺伝子からエキソンＩを単離するためのベクター
上述した非標的遺伝子活性化ベクターは、内在性遺伝子の活性化および単離、内在性遺伝子からのタンパク質の生成に有用である。しかし、内在性遺伝子上流での組込時に、これらのベクターはそれぞれ、内在性遺伝子によるエキソンＩを欠失した転写産物を生成する。ベクターは、ベクター組込部位の下流の第１スプライス受容体部位にスプライスされたベクターコードエキソンを含む転写産物を生成するように設計されており、真核遺伝子の第１エキソンはスプライス受容体部位を含まないため、通常、内在性遺伝子の第１エキソンは非標的遺伝子活性化に由来するｍＲＮＡ分子上では回収されない。第１エキソン内にコード情報を含む遺伝子などの一部の遺伝子では、活性化内在性遺伝子の第１エキソンを効率よく回収する必要がある。
【０２４５】
活性化内在性遺伝子の第１エキソンを回収するために、転写調節配列（これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである）は、ベクターコードエキソンを発現させる第２の転写調節配列（これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサおよびリプレッサを含む任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである）下流の活性化ベクターに含まれている。したがって、上流の転写調節配列が不対スプライス供与体部位に結合され、下流転写調節配列はスプライス供与体部位に結合されない。両方の転写調節配列が同一方向に発現するように方向付けられている。このようなエキソンＩ回収ベクターの例を図１２Ａ−１２Ｇに示す。この種のベクターの組み込みは、少なくとも２つの異なるＲＮＡ転写産物を作成する（図１３）。第１の転写産物は上流転写調節配列から由来し、内在性遺伝子のエキソンＩＩに酢プライスされたベクターエキソンを含む。第２の転写産物は、下流転写調節酵素から由来し、５’から３’まで、ベクターと遺伝子、エキソンＩ、エキソンＩＩおよ
びすべての下流エキソンの転写開始部位の間の領域を含む。本明細書で述べる方法を用いて、両方の転写産物を回収および分析して、非標的遺伝子活性化によって単離された遺伝子によるエキソンＩのキャラクタリゼーションができる。
【０２４６】
活性化ベクターに位置するエキソンは、選択マーカー、タンパク質、タンパク質の一部、分泌シグナル配列、シグナル配列の一部、エピトープを発現可能であり、あるいは何も発現しないことも可能である。エキソンによってタンパク質が発現される場合、ポリ（Ａ）シグナルをベクターコード遺伝子の下流に包含させることもできる。あるいはポリ（Ａ）シグナルを省略してもよい。別の実施形態において、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを上流転写調節配列に、動作可能に結合することもできる。本実施形態では、選択マーカーに対応する不対スプライス供与体部位の位置は、ＳＡＴベクターおよび二重ポリ（Ａ）／ＳＡＴベクターについて上で述べられている。
【０２４７】
シングルエキソンおよびマルチエキソン遺伝子とラッピングのための遺伝子活性化ベクター
上述したように、ある実施形態において、本発明のポリ（Ａ）トラップベクターは、選択マーカーに動作可能に結合され、その後に不対スプライスドナー部位が続く。このようなベクターは、遺伝子内または付近に組込まれると、内在性遺伝子上にスプライスされる選択マーカーを含む転写産物を生成する。内在性遺伝子がポリ（Ａ）シグナルをコードすると、生じたｍＲＮＡはポリアデニル化され、それによって転写産物が、組込ベクターを含む細胞に対して薬剤耐性を付与するのに十分なレベルで翻訳される。
【０２４８】
上記のベクターは内在性遺伝子を「トラップ」できるが、選択マーカー下流のスプライス供与体部位は、このようなベクターの有力な用途のいくつかでは使用できず、場合によっては妨害をする。第１にこのようなベクターは、単一エキソン遺伝子がスプライス受容体部位を含んでいないため、それらを選択的にトラップするのに使用できない。第２にこれらのベクターは、薬剤耐性がポリ（Ａ）シグナルの上流のベクター組込のみに依存するため、潜在性遺伝子を「トラップ」することが多い。あいにく、潜在性ポリ（Ａ）シグナルがゲノム内に位置することは、薬剤耐性細胞の形成と、選択マーカーを含む非遺伝子転写産物の作成につながる。これらの細胞および転写産物は、これらのベクターを用いた遺伝子発見用途を妨害する。第３に、本明細書で述べるような新たな修飾を用いないと（上を参照）、これらのベクターは活性化内在性遺伝子からタンパク質を効率よく生成できない。さらに、内在性遺伝子によるタンパク質は、内部リボソームエントリー部位（ｉｒｅｓ）が選択マーカーおよびスプライス供与体部位の間に含まれている場合でさえ、わずかしか発現しない。なぜならｉｒｅｓによる翻訳は一般に、転写産物の５’末端の
第１開始コドンからの翻訳よりも効率が低いからである。したがって、単一エキソン遺伝子を含む内在性遺伝子をさらに特異的にトラップ可能であり、活性化内在性遺伝子からタンパク質を効率的に発現できるベクターが必要である。
【０２４９】
それゆえ、別の実施形態において、本発明はそのようなベクターを提供する。そのような実施形態の１つでは、ベクターは、１個以上の（すなわち１、２、３、４、５またはそれ以上）の選択マーカーに動作可能に結合されたプロモーターを含み、そこでは選択マーカーの後にスプライスド供与体部位またはポリ（Ａ）シグナルは続いていない（図１７Ａ−１７Ｇを参照）。マーカー転写産物はポリアデニル化されないため、一般に、宿主細胞ゲノムへの組込時にこのベクターは十分な量の選択マーカーを生成できない。しかし、ベクターが単一エキソン遺伝子を含む遺伝子付近、あるいは遺伝子内に組込まれると、選択マーカーは内在性遺伝子からポリ（Ａ）シグナルを捕捉し、それによってマーカー転写産物が安定し、細胞に薬剤耐性表現型が付与される。ベクター組込を遺伝子内か、遺伝子付近のどちらにするか選択することに加えて、本発明の本態様によるベクターも、本明細書の「活性化内在性遺伝子からエキソンＩを単離するためのベクター」という節で述べたように、活性化遺伝子からエキソンＩを回収するのに使用できる。
【０２５０】
好ましい実施形態では、ベクターは第１の選択マーカーの上流に第２の選択マーカーを含むことができる（図１８を参照）。上流の選択マーカーは、好ましくは転写調節配列に、最も好ましくはプロモーターに動作可能に結合される。随意に、不対スプライス供与体部位は、上流選択マーカーの転写開始部位および翻訳開始部位の間に配置できる。あるいは、スプライス供与体部位は、宿主細胞ゲノムへのベクター組込の後、ベクターコードスプライス供与体部位から内在性エキソンへのスプライス時に、上流選択マーカーが不活性化形で生成されるように、あるいは全く生成されないように、上流選択マーカーのリーディングフレーム内のどこに配置してもよい。下流ポジティブ選択マーカーを活性化形で生成する細胞のために選択することによって、遺伝子内または遺伝子付近に組込まれたベクターを含む細胞を単離できる。さらに、上流選択マーカーを活性化形で生成する細胞に対抗して選択することによって、ベクター転写産物がマルチエキソン内在性遺伝子によるエキソンにスプライスされた細胞を除去することができる。言い換えれば、これらの例では、ベクターコードスプライス供与体部位および内在性ポリ（Ａ）シグナルの間にスプライス受容体部位がないため、これらのベクターは、単一エキソン遺伝子またはマルチエキソン遺伝子の３’が最も多いエキソンに組込まれたベクターを含む細胞を使用できる。したがっ
て、活性化マルチエキソンを含む細胞の多くは選択後も生存せず、結果として、活性化シングルエキソンを含む細胞はライブラリー内で著しく濃縮される。
【０２５１】
別の好ましい実施形態において、本発明の本態様によるベクターは、第１の選択マーカーの上流に１個以上（すなわち１、２、３、４、５個以上、好ましくは１個の）ネガティブ選択マーカーを含む（図１９Ａおよび１９Ｂを参照）。ネガティブ選択マーカーはプロモーターに動作可能に結合されることが好ましい。随意に、不対スプライス供与体部位は、ネガティブ選択マーカーの転写開始部位および翻訳開始部位の間に配置してもよい。あるいは、スプライス供与体部位は、宿主細胞ゲノムへのベクター組込後、ベクターコードスプライス供与体部位から内在性エキソンへのスプライスの間にネガティブ選択マーカーが不活性化形で生成されるように、あるいは全く生成されないように、ネガティブ選択マーカーのリーディングフレーム内のどこに配置してもよい。ポジティブ選択マーカーを活性化形で生成する細胞のために選択し、ネガティブ選択マーカーを活性化形で生成する細胞に対抗して選択することによって、これらのベクターは内在性遺伝子の内部または上流に組込まれたベクターを含む細胞を同定するのに使用できる。（１）内在性エキソンへのスプライシングおよび（２）ポリ（Ａ）シグナルの捕捉はどちらも細胞生存に必要であり、潜在性遺伝子トラップイベントを含む細胞はライブラリー内で減少する。この理由は、潜在性スプライス受容体部位および潜在性ポリ（Ａ）シグナルの両者に隣接して組込まれるベクターの確率が、単一の潜在性部位に隣接して組込まれるベクターの確率よりも実質的に低いからである。したがって、これらのベクターは以前のベクターよりも、遺伝子を捕捉するための特異性が高い。
【０２５２】
本明細書の内容を考慮すると、当業者は、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを含むベクターを用いて活性化内在性遺伝子からタンパク質を生成できることも認識するであろう。タンパク質生成を指示できるあるベクター構成は、ネガティブ選択マーカーの５’ＵＴＲに配置され
たスプライス供与体部位より構成される。スプライシング時に、内在性遺伝子の第２エキソンに結合されたネガティブ選択マーカーによる５’ＵＴＲを含むキメラ転写産物が生成される。この
ベクターは、第２または次のエキソン内で翻訳開始コドンをコードする遺伝子よりタンパク質生成を活性化できる。同様に、スプライス供与体部位はネガティブ選択マーカーのリーディングフレーム内の、スプライスが生じなければマーカーの機能が妨害されない位置に配置できる。翻訳開始コドンに対応する別のリーディングフレーム内に配置されたスプライスドナー部位を含む同様のベクターも使用できる。内在性遺伝子にスプライスする場合に、これらのベクターは、活性化内在性遺伝子のエキソンＩＩに融合されたネガティブ選択マーカーによる開始コドンを含む、キメラ転写産物を生成する。したがって、これらのベクターは、エキソンＩで翻訳開始コドンをコードする遺伝子によるタンパク質発現を活性化できる。活性化内在性細胞からタンパク質を十分に生成できる、他のポジティブ／ネガティブ選択ベクターについて以下で述べる。
【０２５３】
本発明のベクターはどれも、選択マーカー下流の内部リボソームエントリー部位（ｉｒｅｓ）３’を含むことができる。ｉｒｅｓによって、内在性遺伝子にベクターを組込む際に、内在性遺
伝子を翻訳できる。随意に、翻訳開始コドンを、選択マーカーとｉｒｅｓ配列の間に包含させてもよい。開始コドンが存在する場合、付加コドンがエキソン上に存在することがある。開始コドンは、そして付加コドンが存在する場合は、スプライス供与体部位に対応する任意の、そして一括してすべてのリーディングフレーム内に存在してもよい。さらに翻訳開始コドン下流のコドンは、存在する場合、たとえば単一分泌シグナル、部分シグナル配列、タンパク質（全長タンパク質、タンパク質の部分、タンパク質モチーフ、エピトープ標識など）またはスペーサ領域をコードする。
【０２５４】
別の好ましい実施形態において、本明細書で述べたどのベクターも選択可能なマーカーの上流に、エキソン領域に動作可能に結合した第２の転写調節配列（最も好ましくはプロモーター）を含み、後に不対スプライス供与体部位が続く。この上流エキソンは、活性化内在性遺伝子からタンパク質を発現する場合に特に有用である。エキソンが翻訳開始コドンを欠失していることがある。あるいはエキソンが翻訳開始コドンを含むことがある。開始コドンが存在する場合、付加コドンがエキソン上に存在することがある。開始コドンは、そして付加コドンが存在する場合は、スプライス供与体部位に対応する任意の、そして一括してすべてのリーディングフレーム内に存在してもよい。さらに翻訳開始コドン下流のコドンは、存在する場合、たとえば単一分泌シグナル、部分シグナル配列、タンパク質（全長タンパク質、タンパク質の部分、タンパク質モチーフ、エピトープ標識など）またはスペーサ領域をコードする。
【０２５５】
タンパク質−タンパク質相互作用に有用な活性化ベクター
近年、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する一般的手法が述べられている（たとえば米国特許第５，２８３，１７３；５，４６８，６１４および５，６６７，９７３、その開示は引用することによって本明細書に全体が含まれている）。この手法は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子フラグメントに隣接し、それを含む枠内の第１ｃＤＮＡ分子のクローニング；および転写トランス活性化ドメインをコードする遺伝子フラグメントに隣接し、それを含む枠内の第２ｃＤＮＡ分子のクローニングに依存する。各キメラ遺伝子は、キメラ遺伝子の上流に配置されたプロモーター領域から発現される。発現を検出するために、両方のキメラ遺伝子をレポーター細胞にトランスフェクションする。（ＤＮＡ結合および転写活性化ドメインに融合されたクローン化ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質によって）第１のキメラタンパク質が第２のキメラタンパク質と相互作用すると、次にＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインはシングルタンパク質錯体内に結合される。結果として、タンパク質−タンパク質相互作用錯体は、レポーター遺伝子の調節領域に結合し、その発現を活性化できる。
【０２５６】
この以前の手法の限界は、ｃＤＮＡとしてクローン化された遺伝子間のタンパク質−タンパク質相互作用を検出できるのみであることである。本明細書で述べるように、多くの遺伝子はまれな細胞種内で非常に低いレベルにて、あるいは短い発達ウィンドウ中に発現される；したがって、これらの遺伝子は通常、ｃＤＮＡライブラリーにはない。さらに、多くの遺伝子は大きすぎて全長クローンとして効率よく単離できず、これらの以前の手法を使用するのが困難になる。
【０２５７】
本発明は、内在性遺伝子またはトランスフェクションされたゲノムＤＮＡからタンパク質発現を活性化できる。以前の手法とは異なり、実質的にどの遺伝子も、その通常の発現パターンとは関係なく、効率よく発現できる。さらに、本発明は内在性遺伝子から（あるいはトランスフェクションされたゲノムＤＮＡから）発現されるタンパク質を修飾することも可能なため、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイで使用するキメラタンパク質を生成することもできる。
【０２５８】
本発明によってタンパク質−タンパク質相互作用を検出するために、２つのベクターを使用する。第１のベクターは一般にＢＤ／ＳＤ（結合ドメイン／スプライス供与体）と呼ばれ、ＤＮＡ結合領域および不対スプライス供与体部位をコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合されるプロモーターを含む。第２のベクターは一般にＡＤ／ＳＤ（活性化ドメイン／スプライス供与体）と呼ばれ、転写活性化領域および不対スプライス供与体部位をコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合されるプロモーターを含む。異なるリーディングフレームを持つ遺伝子を調整するために、結合ドメインおよび活性化ドメインを、不対スプライス供与体部位に対応する３つの考えられるリーディングフレームのそれぞれでコードできる。さらに、他のベクターについて本明細書で述べるように、ＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターは、選択マーカーおよび増幅可能マーカーを含む、他の機能性要素を持つことも可能である。ベクターは、ベクターが遺伝子を活性化した細胞を選択可能な配置に向けた選択マーカーを含んでいてもよい。マルチプロモーター／活性化エキソンベクターも有用である。ＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターのいくつかの例を図２５に示す。これらのベクターを用いたタンパク質−タンパク質相互作用の検出を示す例は図２６に表示した。
【０２５９】
ＢＤ／ＳＤベクターのＤＮＡ結合ドメインは、特異性ヌクレオチド配列に結合可能な任意のタンパク質ドメインをコードする。転写活性化タンパク質を用いてＤＮＡ結合ドメインを供給すると、転写活性化ドメインはＢＤ／ＳＤベクターから省略される。ＤＮＡ結合ドメインを用いてタンパク質をコードする遺伝子の例としては、これに限定されるわけではないが、酵母ＧＡＬ４遺伝子、酵母ＧＣＮ４遺伝子および酵母ＡＤＲ１遺伝子が挙げられる。原核および原核供給源による他の遺伝子も、ＤＮＡ結合ドメインの供給に使用できる。
【０２６０】
ＡＤ／ＳＤベクターの転写活性化ドメインは、リポーター遺伝子のプロモーター領域付近に配置された場合、リポーター遺伝子の転写を向上可能なタンパク質ドメインをコードする。転写活性化タンパク質を用いて転写活性化ドメインを供給すると、ＤＮＡ結合ドメインはＡＤ／ＳＤベクターから省略される。転写活性化ドメインを用いてタンパク質をコードする遺伝子の例としては、これに限定されるわけではないが、酵母ＧＡＬ４遺伝子、酵母ＧＣＮ４遺伝子および酵母ＡＤＲ１遺伝子が挙げられる。原核および原核供給源による他の遺伝子も、転写活性化ドメインの供給に使用できる。
【０２６１】
本発明において、タンパク質−タンパク質相互作用は、ゲノムＤＮＡストレッチに配置された遺伝子の発現を活性化するために、上述したように、ＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターを用いて検出される。
【０２６２】
ある実施形態において、ＢＤ／ＳＤベクターはレポーター細胞系のゲノム内にランダムに組込まれる。本発明で述べる他のベクターと同様に、ＢＤ／ＳＤベクターは、ベクター組込部位下流に配置された遺伝子からのタンパク質発現を活性化できる。ＢＤ／ＳＤベクター上の活性化エキソンはＤＮＡ結合ドメインを活性化するため、活性化内在性タンパク質は、Ｎ−末端にＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質として生成される。それゆえ、ＢＤ／ＳＤベクターを宿主細胞のゲノムに組込むことにより、融合タンパク質のライブラリーが作成可能となり、このライブラリーでは、各タンパク質はＮ−末端にＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０２６３】
ＡＤ／ＳＤベクターをリポーター細胞系のゲノムに組込んで、細胞のライブライリを作成することが可能となり、このライブラリーでは、ライブラリーの各メンバが転写活性化ドメインに融合した異なる内在性遺伝子として発現されることも認識される。
【０２６４】
ＢＤ／ＳＤライブラリーはいったん作成すると、転写活性化ドメインに融合した（以下で遺伝子Ｘと呼ばれる）特異性遺伝子を発現するベクターを用いてトランスフェクションできる。これにより、ゲノム内でコードされる細胞は実質的に、遺伝子Ｘに対する相互作用について試験することができる。同様に、ＡＤ／ＳＤライブラリーは、ＤＮＡ結合ドメインに融合した（以下で遺伝子Ｘと呼ばれる）特異性遺伝子を発現するベクターを用いてトランスフェクションできる。これにより、ゲノム内でコードされる細胞は実質的に、遺伝子Ｘに対する相互作用について試験することができる。ＢＤ／ＳＤまたはＡＤ／ＳＤライブラリーの構成前に、特異性遺伝子が宿主細胞内で安定して発現することも認識される。
【０２６５】
別の実施形態では、ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインそれぞれの下流のＢＤ／ＳＤベクターおよび／またはＡＤ／ＳＤベクター内にクローニングする。遺伝子が存在し、ゲノムＤＮＡ内で正しく向けられている場合、ＢＤ／ＳＤベクター（またはＡＤ／ＳＤベクター）は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに有用な融合タンパク質として遺伝子を発現することができる。ｉｎ ｓｉｔｕでのＢＤ／ＳＤ（またはＡＤ／ＳＤ）ベクターの組込と同様に、以前にｃＤＮＡ分子として単離されているかどうかにかかわらず、どの遺伝子でも試験できる。
【０２６６】
別の実施形態では、第１のライブラリーの細胞内で第２のライブラリーを作成する。たとえば、ＡＤ／ＳＤベクターは、ＢＤ／ＳＤライブライを含む細胞内に組込める。逆に、ＢＤ／ＳＤベクターは、ＡＤ／ＳＤライブラリーを含む細胞内に組込める。これによって、結合ドメイン融合タンパク質として発現されるすべての活性化ドメインは、すべての活性化ドメイン融合タンパク質に対して試験できる。本発明は原核生物内で実質的にすべてのタンパク質を（結合および活性化ドメインを持つ融合タンパク質として）発現できるが、この手法は、初めての場合は、単一のライブラリーでタンパク質−タンパク質相互作用のすべての組合わせを試験できる。ある生物ですべてのンパク質−タンパク質相互作用を調査するには、ライブラリー内のライブラリーが実質的に包括的でなければならない。たとえば、１０，０００個の遺伝子を含む生物で５０％までのタンパク質−タンパク質相互作用を検出するには、第１のライブラリーは、それぞれ活性化遺伝子を発現する、少なくとも細胞１００，０００個を含んでいる必要がある。第１のライブラリーの各クローン内で、次に第２のベクターを用いて、それぞれ活性化遺伝子を含む、少なくとも１００，０００クローンのライブラリーを作成する。したがって、全ライブラリーは１００，０００クローンｘ１００，０００クローン、すなわち全部で１０１０クローンを含む。このことは、すべての遺伝子が同じ頻度で活性化され、各遺伝子活性化イベントによって、活性化内在性遺伝子を含むフレーム内で融合タンパク質が生成することを前提としている。タンパク質−タンパク質相互作用が５０％範囲を超えるライブラリーを作成するため、および／または、より低い頻度で活性化されるタンパク質を示すために、より大きなライブラリーを作成できる。
【０２６７】
ライブラリー対ライブラリーのスクリーンは複数の方法で作成できることも認識される。第１に、ＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターを同一のレポーター細胞のゲノム内に組込むことによって、両方のライブラリーを同時にまたは連続して作成できる。第２に、第１のライブラリーは、レポーター細胞のゲノム内にＢＤ／ＳＤベクターを組込むことによって作成され、第２のライブラリーは、クローン化ゲノムＤＮＡを含むＡＤ／ＳＤベクターをトランスフェクションすることによって作成される。この手法では、ＡＤ／ＳＤライブラリーが最初に作成され、続いて、クローン化ゲノムＤＮＡを含むＢＤ／ＳＤベクターが導入されることが認識される。第１のライブラリーはクローン化ゲノムＤＮＡを含むＢＤ／ＳＤベクター（またはＡＤ／ＳＤベクター）をトランスフェクションし、続いて第２のベクターをレポーター細胞ゲノムに組込むことに作成可能であることも認識される。第３に、それぞれクローン化ゲノムフラグメントを含むＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターを用いて細胞をトランスフェクションすることによって、両方のライブラリーを同時にまたは連続して作成できる。第４に、クローン化ゲノムフラグメントをＢＤ／ＳＤベクターまたはＡＤ／ＳＤベクターのどちらかで使用する場合、ｃＤＮＡライブラリーがもう一方のベクター内に作成され、細胞内に導入されることが認識される。これにより、ｃＤＮＡライブラリーに存在するすべての遺伝子を、ゲノム内の他のすべての遺伝子との相互作用について検査することができる。
【０２６８】
ライブラリー／ライブラリースクリーンには、細胞の大規模なライブラリーの作成を含むため、遺伝子の活性化およびライブラリーのメンバ間の枠内融合タンパク質生成の頻度を最大限にすることが重要である。これは、少なくとも２つの方法で実現できる。第１にＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターは、遺伝子を「トラップ」する配置内に選択トラップベクターを含むことができる。選択トラップベクターの例は、図８、９、１０、１７、１９、２１および２５に示す。これらのベクターは、活性化ベクターが転写により活性化した細胞のために選択する。第２に、複数のプロモーター／活性化エキソンユニットをＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターに包含させることができる。各プロモーター／活性化エキソンユニットは、不対スプライス供与対部位に対応する異なるリーディングフレーム内の結合ドメイン（または活性化ドメイン）をコードする。マルチプロモーター／エキソンベクターの例は図２３に示す。この種のベクターによって、転写レベルで活性化される遺伝子はどれでも、ベクター上のプロモーター／活性化エキソンの１つから枠内融合タンパク質として生成されるようになる。第３に、ベクターは、効率のよいトランスフェクション手順を用いて、レポーター細胞内に導入できる。この点では、レトロウイルス組込によるＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターの挿入が有利である。
【０２６９】
本発明で有用なレポーター細胞は、ＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターによって生成された転写産物を正しくスプライスできる細胞すべてを含む。該レポーター細胞は、ＢＤ／ＳＤおよびＡＤ／ＳＤベクターによって発現されたタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用の存在下で、より高いレベルにて発現するレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子は、本明細書で述べる任意のマーカーのような、選択可能なマーカーでもよい。あるいは、レポーター遺伝子はスクリーニング可能なマーカーでもよい。有用な選択マーカーおよびスクリーニング可能マーカーの例は、本明細書で述べる。
【０２７０】
レポーター細胞において、最小プロモーターはレポーター遺伝子に動作可能に結合される。タンパク質−タンパク質相互作用の存在下でレポーター遺伝子の発現を向上させるために、ＤＮＡ結合部位がＢＤ／ＳＤベクターのＤＮＡ結合ドメイン領域によってコードされるタンパク質に認識されるように、ＤＮＡ結合部位を最小プロモーターの中または付近に配置する。タンパク質−タンパク質相互作用がない場合、ＢＤ／ＳＤより生成されたＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質は転写活性化ドメインを欠失しているため、レポーター遺伝子の最小プロモーターから転写を活性化することができない。しかし、ＢＤ／ＳＤより生成されたＤＮＡ結合ドメイン融合タンパク質がＡＤ／ＳＤベクターから生成された活性化ドメイン融合タンパク質と相互作用すると、タンパク質錯体がレポーター遺伝子の発現を活性化できる。レポーター遺伝子の発現の向上は、スクリーニング可能マーカーに関するアッセイを用いて、あるいは選択マーカーの薬剤選択を用いて検出できる。
他のレポーター系を本発明と併せて用いて、タンパク質−タンパク質相互作用を検出可能なことも認識されている。特に、２つの分離可能なドメインを含んでおり、各ドメインが相互に近接して生化学または構造活性を生じるタンパク質を、本発明と併せて用いることができる。
【０２７１】
マルチプロモーター／活性化エキソンベクター
未知の遺伝子からタンパク質発現を活性化するを目標とする、非標的遺伝子活性化の用途では、通常、ベクターの集合を使用しなければならない。したがって、別の実施形態において、本発明は１つ以上のプロモーター／活性化エキソンユニットを含むベクターを提供する（図２０Ａ−２０Ｅ）。
【０２７２】
真核細胞のゲノムに存在する各種遺伝子構造を調整するために、本発明の本態様によるベクターは、異なる構造を持つ活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列（たとえばプロモーター）を含むことが望ましい。これらの活性化エキソンは全体として、実質的にすべて内在性遺伝子からタンパク質発現を活性化することができる。たとえば、エキソンＩＩ（あるいはエキソンＩＩの下流のエキソン）の翻訳開始コドンをコードする遺伝子からタンパク質発現を活性化するために、あるベクターは、翻訳開始コドンを欠失した活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列（たとえばプロモーター）を含むことができる。エキソンＩの翻訳開始コドンをコードするあらゆる種類の遺伝子からタンパク質発現を活性化するために、異なる活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列（たとえばプロモーター）をそれぞれ含む、３つの独立したベクターを使用する必要がある。各活性化エキソンは、異なるリーディングフレーム内で開始コドンをコードする。別の活性化エキソン配置も有用である。たとえば、エキソンＩのシグナル分泌配列の一部をコードする遺伝子からタンパク質発現および分泌を活性化するために、異なる活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列（たとえばプロモーター）をそれぞれ含む、３つの独立したベクターを使用する必要がある。各活性化エキソンは、異なるリーディングフレーム内で部分シグナル配列をコードする。エキソンＩのシグナル配列全体をコードする遺伝子からタンパク質発現および分泌を活性化するために、異なる活性化エキソンに動作可能に結合された転写調節配列（たとえばプロモーター）をそれぞれ含む、３つの独立したベクターを使用する必要がある。各活性化エキソンは、異なるリーディングフレーム内にシグナル分泌配列全体を含む。分泌タンパク質をコードする遺伝子発現を活性化することに加えて、シグナル配列全体をコードするプロモーター／活性化エキソンは、通常は分泌されないタンパク質の発現および分泌も活性化する。これはたとえば、通常細胞内に局在化されているタンパク質のタンパク質精製を促進できる。
【０２７３】
他の有用なコード配列は、これに限定されるわけではないが、配列コードタンパク質（全長タンパク質、タンパク質の一部、タンパク質モチーフおよび／またはエピトープ標識を含む）を含めて、本発明の本態様によるベクターのエキソン活性化に包含させることができる。本明細書で述べるように、本発明の本態様にベクターは個別または一括して、宿主細胞ゲノムに組込んで、細胞のライブラリーを作成することができる。ライブラリーの各メンバは、異なる内在性タンパク質を潜在的に過剰発現する。それゆえ、ベクターのこれらの集合によって、真核宿主細胞内の内在性遺伝子すべて、あるいは実質的にすべてを活性化することが可能となる。
【０２７４】
上述したように、ベクターの集合を宿主細胞内に組込む場合、タンパク質発現の活性化は実質的にどの細胞からでも行える。あいにく、すべての内在性遺伝子からタンパク質を生成するために、非常に多数のライブラリーメンバを生成しなければならない。これはひとつには、宿主細胞によってコードされる遺伝子の数が多いことである。さらに、これらの手法を用いると、多くの細胞は内在性遺伝子の中または付近に組込まれたベクターを含む；しかし組込まれたベクターは、内在性遺伝子からの活性化タンパク質発現とは適合しない構造を持つ活性化エキソンを含む。たとえば、ベクターエキソンは（スプライス結合に対応する）リーディングフレーム１内で開始コドンをコードできるが、組込ベクター下流の第１エキソンによってコードされたタンパク質は（スプライス結合に対応する）リーディングフレーム２内にある。したがって、多くのライブラリーメンバは、内在性遺伝子の転写を活性化したが、内在性遺伝子によってコードされたタンパク質を生成できなかった組込ベクターを含む。
【０２７５】
内在性遺伝子内または付近へのベクター組込の後、タンパク質発現を活性化できない細胞の数を減少させるために、複数のプロモーター／活性化エキソンを含むベクターを使用できる。このベクターでは、各プロモーター／活性化エキソンユニットは、異なる構造の内在性遺伝子からの発現を活性化できる。複数の活性化エキソンを含む単一のベクターは、それぞれ異なる活性化エキソンを含む複数の転写産物を生成できるため、遺伝子内または付近に組込まれた単一のベクターは内在性遺伝子の構造とは関係なく、タンパク質発現を活性化できる（図２１）。
【０２７６】
マルチプロモーター／活性化エキソンベクターは、２個以上のプロモーター／活性化エキソンを含むことができる。各プロモーター／活性化エキソンユニットには、不対スプライス供与対部位が続くことがある。そのような１つの実施形態において、２個のプロモーター／活性化エキソンがベクターに含まれ、各プロモーター／活性化エキソンは、異なる種類の内在性遺伝子からのタンパク質発現を活性化することができる。好ましい実施形態において、ベクターは３個のプロモーター／活性化エキソンを含み、各エキソンは異なるリーディングフレーム内で翻訳開始コドンをコードする。他の好ましい実施形態において、ベクターは３個のプロモーター／活性化エキソンを含み、各エキソンは異なるリーディングフレーム内で部分のシグナル分泌配列をコードする。さらに他の好ましい実施形態において、ベクターは３個のプロモーター／活性化エキソンを含み、各エキソンは異なるリーディングフレーム内でシグナル分泌配列全体をコードする。別の実施形態は、第４のプロモーター／活性化エキソンを含む上の各ベクターを含み、第４の活性化エキソンは、翻訳開始コドンをコードしない。
【０２７７】
ベクターは、任意の数（たとえば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上など）のプロモーター／活性化エキソンユニットを含んでいてもよい。複数のプロモーター／活性化エキソンが単一のベクターに存在する場合、それらは相互に対応する同一の方向に向けられていることが好ましい（すなわち、プロモーターは同一奉公に発現を引き起こす）。
【０２７８】
異なる活性化エキソンの転写を起こすプロモーターは、相互に同一であるか、１個以上のプロモーターが異なる場合がある。プロモーターはウイルス性、細胞性または合成でもよい。プロモーターは構造的でも、誘導性でもよい。当業者に認識可能であるか、本明細書で述べられているように、他の種類のプロモーターおよび調節配列も本発明の本態様に従って、ベクターの調製に使用してもよい。
【０２７９】
複数のプロモーター／活性化エキソンユニットを含むベクターはどれも、随意に１個以上の選択マーカーおよび／または増幅可能マーカーを含んでもよい。選択可能および／または増幅可能マーカーは、ポリ（Ａ）シグナルを含んでもよい。あるいは、マーカーがポリ（Ａ）シグナルを欠失していてもよい。選択マーカーは、ポジティブまたはネガティブ選択マーカーでもよい。選択マーカーはマーカーの上流、内部または下流に、不対スプライス供与対部位を含んでいてもよい。または、選択マーカー不対スプライス供与対部位を欠失していてもよい。選択マーカーおよび／または増幅可能マーカーは、存在している場合、プロモーター／活性化エキソンユニットの上流、内部または下流に配置できる。選択可能および／または増幅可能マーカーはベクトル上に、プロモーター／活性化エキソンユニットに対応する任意の方向に配置できる。選択マーカーの目的が内在性遺伝子を捕捉することである場合、選択マーカーがプロモーター／活性化エキソンと同一方向に向いていることが好ましい。
【０２８０】
増幅可能マーカー
本明細書で述べるどのマーカーも随意に、１個以上（たとえば、２、３、４、５またはそれ以上）の増幅可能マーカーを含んでいてもよい。増幅可能マーカーの例は、上で詳細に述べたものを含む。増幅可能マーカーは、ポジティブ／ネガティブ選択マーカーの上流に配置することが好ましい。ポリアデニル化トラップベクターを使用する場合、組込前のベクターコンカテマー化に由来するベクターコードポリ（Ａ）シグナルを捕捉する可能性を除去するために、増幅可能マーカーにポリアデニル化シグナルを省略することが有利である。
【０２８１】
増幅可能マーカーは存在する場合、活性化転写調節配列（すなわち内在性遺伝子によるベクターからの転写を指示するプロモーター）の上流に配置される。増幅可能マーカーは、ベクター上にどの方向で存在してもよい（すなわちリーディングフレームがどちらのＤＮＡ鎖上にあってもよい）。
【０２８２】
増幅可能マーカーも、ポジティブ選択マーカーと同じ遺伝子である。ポジティブ選択マーカーおよび増幅可能マーカーの両方として使用可能な遺伝子の例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素、アデノシンデアミナーゼ（ａｄａ）、ジヒドロオトターゼ、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、カルバミルホスフェートシンターゼ（ＣＡＤ）が挙げられる。
【０２８３】
一部の実施形態において、そしてある用途では、ベクターに複数の増幅可能マーカーを配置することが望ましい。１個以上の増幅可能マーカーを使用すると、各増幅可能マーカーの二重選択、あるいは連続選択が可能となる。これによって、興味のある遺伝子を含め、ベクターおよびフランキングゲノム座位を増幅した細胞の単離が促進される。
【０２８４】
プロモーター
選択マーカー、増幅可能マーカー（存在する場合）および／または内在性遺伝子を発現させるために、任意のプロモーターおよび調節要素がこれらの活性化ベクター上で使用できることは理解される。別の好ましい実施形態において、内在性遺伝子を発現させるプロモーターは強いプロモーターである。ＣＭＶ即時型遺伝子プロモーター、ＳＶ４０　Ｔ抗原プロモーターおよびβ−アクチンプロモーターは、この種のプロモーターの例である。別の好ましい実施形態において、誘導性プロモーターを用いて内在性遺伝子を発現させる。これによって内在性タンパク質を、さらに制御された方法で発現させることができる。テトラサイクリン誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、ｅｃｔｄｙｓｏｎｅプロモーター、およびメタロチオネインプロモーターは、この種のプロモーターの例である。さらに別の実施形態において組織特異性プロモーターを用いて内在性遺伝子を発現させる。組織特異性プロモーターの例としては、これに限定されるわけではないが、免疫グロブリンプロモーター、カゼインプロモーター、および成長ホルモンプロモーターである。
【０２８５】
制限部位
本発明のベクターは、ベクター内の不対スプライス供与対部位の下流に位置する１個以上の制限部位を含むことができる。これらの制限部位を用いて、トランスフェクションの前にプラスミドベクターを直線化することができる。直線配置では、活性化ベクターは転写鎖に対応する５’
から３’に、プロモーター、スプライス供与対部位および直線化部位を含む。
【０２８６】
制限部位も、ベクターイントロン含有ｃＤＮＡ分子の除去を促進するために、ベクターイントロンに含まれる。本態様において、ベクターは転写鎖に対応する５’から３’に、プロモーター
、スプライス供与対部位、制限部位および直線化部位を含む。不対スプライス供与対部位および直線化部位の間に制限部位を包含させることによって、スプライスされていない転写産物は、ｃＤＮＡを適切な制限酵素で消化することによって除去できる。遺伝子活性化に由来するｃＤＮＡ分子は、制限部位を含むベクターイントロンを除去したため、消化されない。これにより、増幅／クローニングの間に遺伝子活性化転写産物を優先的に濃縮し、内在性遺伝子の同定および分析を著しく促進することができる。
【０２８７】
制限部位は、活性化遺伝子のクローニングを促進するために、ベクターエキソンにも包含されることがある。遺伝子活性化に続いて、ｍＲＮＡは細胞から回収され、ｃＤＮＡへ合成される。ｃＤＮＡをベクターエキソンに切り込む制限酵素によって消化すると、遺伝子活性化ｃＤＮＡ分子は、次に適切なベクターにクローニングを行うために、５’末端に適切なオーバーハングを含
む。これによりｃＤＮＡ分子を活性化した遺伝子の単離が促進される。
【０２８８】
１つの実施形態において、ベクターエキソンに配置された制限部位は、ベクターイントロンに配置された制限部位とは異なる。これにより、転写産物を含むベクターイントロンによる消化されたｃＤＮＡフラグメントは消化されて、クローニングベクターと適合しないオーバーハングを持つため（以下参照）、ベクターイントロンを含むｃＤＮＡ分子の除去が促進される。あるいは、同じ酵素によって認識された変性制限部位は、ベクターエキソンおよびイントロン内に配置される。これらの部位を開裂する酵素は、複数の部位、認識配列内に奇数の塩基を持つ部位、中断されたパリンドロームを持つ部位、非パリンドローム配列、または１個以上の変性塩基を持つ部位を開裂することができる。言い換えれば、酵素が、ベクターイントロン内で生成されたオーバーハングとは異なる、ベクターエキソン内のオーバーハングを生成する場合、同一の制限エンドヌクレアーゼ制限部位によって認識される制限部位を使用してもよい。異なるオーバーハングが生成されるため、ベクターエキソンオーバーハングに適合する、およびベクターイントロンオーバーハングに適合しない部位を含むクローニングベクターを用いて、ｃＤＮＡ分子を含むベクターエキソンおよびｃＤＮＡ分子を欠失したベクターイントロンを優先的にクローニングすることができる。有用な変性制限部位の例としては、Ｓｆｉ　Ｉ、Ａｃｃｉ、Ａｆｌ　ＩＩＩ、ＳａｐＩ、Ｐｌｅ　Ｉ、Ｔｓｐ４５　Ｉ、ＳｃｒＦ　Ｉ、Ｔｓｅ　Ｉ、ＰｐｕＭ　Ｉ、Ｒｓｒ　ＩＩ、ＳｇｒＡ　Ｉによって認識されたＤＮＡ配列を含む。
【０２８９】
ベクターイントロンおよび／またはエキソンに配置された制限部位は、まれな制限部位（たとえば８ｂｐの制限部位）または非常にまれな部位（たとえばヌクレアーゼをコードしたイントロンに認識された部位）でもよい。８ｂｐ認識部位を持つ制限酵素の例としては、ＮｏｔＩ、ＳｆｉＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、ＰｍｅＩ、ＳｇｆＩ、ＳｒｆＩ、ＳｂｆＩ、Ｓｓｅ、８３８７　Ｉ、ＳｗａＩが挙げられる。制限酵素をコードするイントロンの例としては、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩが挙げられる。あるいは、８ｂｐ未満の制限部位をベクター上に配置することもできる。たとえば、７ｂｐ、６ｂｐ、５ｂｐ、４ｂｐより成る制限部位を使用できる。一般にさらに小さい制限認識部位を使用すると、全長遺伝子より短いクローニングが行われる。ハイブリタイゼーションプローブの作成などの場合では、小さいｃＤＮＡクローンの単離のほうが有利なことがある。
【０２９０】
双方向活性化ベクター
本明細書で述べる活性化ベクターは双方向でもよい。ベクター上に活性化転写調節配列が１個存在する場合、ベクターが適切な位置（たとえば遺伝子の上流）に、正しい方向で組込まれた場合のみに、遺伝子活性化が生じる。すなわち、内在性遺伝子を活性化するために、活性化作成物上のプロモーターは、コード鎖の転写を可能にする内在性遺伝子に面している必要がある。この方向性の要求事項の結果として、座位への組込イベントの半分のみによって、内在性遺伝子の転写活性化が生じる。組込イベントの残りの半分によって、興味のある遺伝子から離れてベクター転写が生じる。したがって、遺伝子活性化頻度を２倍にするために、本発明は、ベクターが宿主細胞ゲノムに組込まれる方向とは無関係に、内在性遺伝子の活性化に使用できる双方向ベクターを提供する。
【０２９１】
本発明の本態様による双方向ベクターは、（これに限定されるわけではないが、本明細書で述べるプロモーター、エンハンサ、リプロセッサを含む、任意の転写調節配列であり、好ましくはプロモーターまたはエンハンサであり、最も好ましくはプロモーターである）２個の転写調節配列、２個のスプライス供与体部位、１個の直線化部位を含むことが望ましい。スプライス供与対部位が有用な場合、各転写調節配列は独立したスプライス供与体部位に動作可能に結合され、転写調節配列／スプライス供与体対は、相互に逆向きであってもよい（すなわち、第１の転写調節配列は、第２の転写調節配列が宿主ゲノム細胞に組込まれた方向に対して反対の方向で宿主細胞ゲノムに組込んでもよい）。２個の対立する転写調節配列／スプライス供与体対は、直線化部位によって分離することができる。直線化部位の機能は、転写調節配列／スプライス供与体部位の間に（すなわち、内在性遺伝子の活性化に適した位置に）遊離ＤＮＡ末端を生成することである。本発明の双方向ベクターの例を、図１１Ａ−１１Ｃに示す。
【０２９２】
２個の対立する転写調節配列は、同一の転写調節配列でも、異なる転写調節配列でもよい。随意に、転写開始コドン（たとえばＡＴＧ）および１個以上の付加コドンを、片方または両方のベクターコードエキソンに包含させてもよい。翻訳開始コドンが存在する場合、片方または両方のベクターコードエキソンは、タンパク質、タンパク質の部分、シグナル分泌配列、シグナル分泌配列の部分、タンパク質モチーフまたはエピトープ標識をコードできる。あるいは、片方または両方のベクターコードエキソンが翻訳開始コドンを欠失していることがある。
本発明の本態様による双方向ベクターは随意に、本明細書で詳細に述べる選択マーカーおよび増幅可能マーカーを含む、１個以上の選択マーカーまたは１個以上の増幅可能マーカーを含んでいてもよい。双方向ベクターは上述したように、ポリ（Ａ）トラップ、スプライス受容体トラップ、二重ポリ（Ａ）／スプライス受容体トラップとして構成してもよい。単方向ベクターについて述べた他のベクター配置も、双方向ベクターに包含させてもよい。
【０２９３】
非標的活性化ベクターを用いたゲノムＤＮＡの共トランスフェクション
本明細書で述べるどのベクターも、真核宿主細胞内へのトランスフェクション前に、ゲノムＤＮＡ内に組込まれるか、そうでなければ結合されることが可能であることが認識されている。これにより、遺伝子の通常の発現特性とは無関係に、ゲノム内の実質的にどのゲノムからも高レベルの発現が可能となる。したがって、本発明のベクターは、単離ゲノムＤＮＡフラグメントによりコードされた遺伝子からの発現を活性化するのに使用できる。これを実施するために、ベクターを、少なくとも１個の遺伝子、または遺伝子の部分を含むゲノムＤＮＡ内に組込むか、結合させる。一般に活性化ベクターは、遺伝子発現を活性化させるために、遺伝子内か、遺伝子の上流に配置しなければならない。いったん挿入すると（または結合させると）、ベクター／ゲノムＤＮＡを適切な真核宿主細胞に導入することによって、下流の遺伝子が（転写産物またはタンパク質として）発現される。宿主細胞への導入の後、ベクターコードプロモーターは単離ＤＮＡ内でコードした遺伝子によって発言を行い、スプライシングの後に成熟したｍＲＮＡ分子を生成する。このプロセスは適切な活性化ベクターを用いて、トランスフェクションされたゲノムＤＮＡによってコードされたどの遺伝子からでもタンパク質を発現させることができる。さらに、本明細書で述べる方法を用いて、トランスフェクションされたゲノムＤＮＡによってコードされた遺伝子に対応するｃＤＮＡ分子が生成および単離される。
【０２９４】
活性化遺伝子を安定に発現されるために、トランスフェクション活性化ベクター／ゲノムＤＮＡを宿主細胞ゲノムに組込むことができる。あるいは、トランスフェクション活性化ベクター／ゲノムＤＮＡを安定したエピソームとして維持することができる（たとえば、ウイルス由来の複製および／または核維持機能を用いて−下を参照）。また別の実施形態において、活性化遺伝子はたとえばプラスミドから、過渡的に発現される。
【０２９５】
本明細書で使用するように、「ゲノムＤＮＡ」という用語は、細胞によるスプライスされていない遺伝子物質を指す。スプライシングとは、転写後に遺伝子からイントロンを除去するプロセスを指す。それゆえゲノムＤＮＡは、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡとは対照的に、エキソンとイントロンをスプライスされていない形で含む。本発明では、大半の真核細胞がエキソンおよびイントロンを含んでおり、本発明の多くのベクターが、第１の下流エキソンへのスプライシングと、介在性イントロンの除去によって、ゲノムＤＮＡ内でコードされた遺伝子を活性化するように設計されているため、真核細胞由来のゲノムＤＮＡは特に有用である。
【０２９６】
本発明で有用なゲノムＤＮＡは、当分野で周知のどの方法によっても単離できる。高分子量ゲノムＤＮＡおよび超高分子量ゲノムＤＮＡ（非損傷およびアガロースプラグ内に収納）を単離する方法の多くが述べられている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。加えて、各種サイズのゲノムＤＮＡを単離するための市販キットも入手できる（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈなど）。
本発明で使用するゲノムＤＮＡは、生物のゲノム全体を含んでもよい。または、ゲノムＤＮＡは、生物によるゲノム全体の一部のみを含んでいてもよい。たとえば、ゲノムＤＮＡは複数の染色体、１個の染色体、染色体の一部、遺伝子座、１個の遺伝子、遺伝子の部分を含んでもよい。
【０２９７】
本発明で有用なゲノムＤＮＡは、宿主細胞への導入前には実質的に非損傷（すなわち断片化されていない）である。または、ゲノムＤＮＡは、宿主細胞への導入前に断片化されてもよい。これは、たとえば、機械的剪断、ヌクレアーゼ処理、化学処理、照射、または当分野で周知の他の方法によって実施できる。ゲノムＤＮＡが断片化されると、望ましいサイズのＤＮＡフラグメントを生成するために断片化条件を調整できる。通常は、ＤＮＡフラグメントは、少なくとも１個の遺伝子、または遺伝子の部分（たとえば少なくとも１個のエキソン）を包含できるのに十分な大きさである必要がある。ゲノムＤＮＡは、事前クローニングを行わずに、適切な真核宿主細胞に直接導入してもよい。または、ゲノムＤＮＡ（またはゲノムＤＮＡフラグメント）は、トランスフェクションの前にベクター内にクローニングしてもよい。有用なベクターとしては、これに限定されるわけではないが、高および中間複写数のプラスミド（たとえばｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２など）、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、Ｐ１人工染色体（ＰＡＣｓ）、およびファージ（たとえばラムダ、Ｍ１３など）が含まれる。当分野で周知の他のクローニングベクターも使用できる。ゲノムＤＮＡをクローニングベクター内にクローニングした場合、特異性クローン化ＤＮＡ断片を単離し、本発明で使用してもよい。たとえば、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣまたはコスミドライブラリーは、特異性染色体領域にマップするクローンを同定するために、ハイブリダイゼーションによってスクリーニングできる。随意に、いったん単離すれば、これらクローンは配列され、興味のある染色体領域を通じてコンティグを生成できる。このコンティグ内に存在する遺伝子のｃＤＮＡコピーを迅速に単離するために、これらのゲノムクローンは、宿主細胞内への活性化ベクターによって、別個に、または一括してトランスフェクションしてもよい。次に、ベクターコードエキソンを含み、ベクターコードイントロンを欠失しているｃＤＮＡを単離し、分析できる。したがって、コンティグ内に存在するすべての遺伝子はｃＤＮＡクローンとして迅速に単離可能であるため、この手法は位置的なクローニング手法の速度を著しく向上させる。
【０２９８】
当業者が認識した誘導体を含め、本明細書で述べる活性化ベクターは、ゲノムＤＮＡとともに共トランスフェクションしてもよく、そのため本発明で有用である。ベクターはその最も簡単な形で、不対スプライス供与体部位を従えたエキソンに、動作可能に結合したプロモーターを含むことができる。他の有能なベクターの例としては、これに限定されるわけではないが、ポリＡトラップベクター（たとえば図８、９、１１Ｃ、１２Ｆおよび１７に示したベクター）、二重ポリ（Ａ）トラップ／スプライス受容体トラップベクター（たとえば図９、１０、１２Ｇ、１９および２１に示したベクター）、双方向ベクター（たとえば図１１に示したベクター）、シングルエキソントラップベクター（たとえば図１９に示したベクター）、マルチプロモーター／活性化エキソンベクター（たとえば図２３に示したベクター）、活性化遺伝子に対応するｃＤＮＡを単離するためのベクター、および活性化遺伝子からタンパク質発現を活性化するためのベクター（たとえば図２、３、４、８Ｂ−Ｆ、９Ｂ−Ｃ、９Ｅ−Ｆ、１０Ｂ−Ｃ、１０Ｅ−Ｆ、１１、１２、１７Ｂ−Ｇ、２３）が挙げられる。
【０２９９】
活性化ベクターは、ウイルス起源の複製を含んでいてもよい。ウイルス起源の複製が存在すると、ゲノムフラグメントを含むベクターが宿主細胞内でエピソームとして伝播される。有用なウイルス起源の複製の例には、ｏｒｉＰ（ＥＢウイルス）、ＳＶ４０　ｏｒｉ、ＢＰＶ　ｏｒｉおよびワクチンｏｒｉが含まれる。これらの起源による複製を促進するために、適切なウイルス複製タンパク質をベクターから発現させる。たとえば、ベクターを含むＥＢＶ　ｏｒｉ　ＰおよびＳＶｏ４０ｒｉもＥＢＮＡ−１またはＴ抗原をそれぞれコードおよび発現させることができる。あるいは、ベクターを、すでにウイルス複製タンパク質（たとえばＥＢＮＡ−１またはＴ抗原）を発現している細胞内に導入してもよい。ＥＢＮＡ−１またはＴ抗原を発現する細胞の例としてはそれぞれ、ＥＢＮＡ−１発現ユニットによってトランスフェクションされたヒト２９３細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＣＯＳ−７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＴＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５１）が挙げられる。
【０３００】
活性化ベクターは増幅可能マーカーを含んでいてもよい。このことにより、エピソームか、宿主細胞ゲノム内に組込まれている、ベクターおよびフランキングゲノムＤＮＡの増加性複製を含む細胞を単離することができる。ベクターおよびフランキングゲノムＤＮＡの増加性複製を含む細胞は、より高いレベルで活性化遺伝子を発現し、遺伝子単離およびタンパク質生成を促進する。
【０３０１】
活性化ベクターおよびゲノムＤＮＡを、ベクターコードスプライス供与体部位からゲノムＤＮＡによってコードされたスプライス受容体部位へのスプライシングが可能な任意の宿主細胞に導入してもよい。好ましい実施形態において、ゲノムＤＮＡ／活性化ベクターは、ゲノムＤＮＡが単離された細胞と同一の種による宿主細胞内にトランスフェクションされる。しかしある例では、ゲノムＤＮＡが単離された細胞とは異なる種による宿主細胞に、ゲノムＤＮＡをトランスフェクションすることは有利である。たとえば、ある種によるゲノムＤＮＡを第２の種の宿主細胞にトランスフェクションすると、ハイブリダイゼーション技術を用いた、トランスフェクションされたゲノムＤＮＡ中で活性化する遺伝子の分析が行いやすくなる。トランスフェクションされたＤＮＡによってコードされた活性化遺伝子は、高度な厳密性ハイブリダイゼーションに基づいて、宿主細胞に由来する遺伝子から区別することができる。ある種のゲノムＤＮＡを別の種による宿主細胞にトランスフェクションすることを用いると、非相同性細胞内でタンパク質を生成することも可能である。これにより、成長、タンパク質修飾または製造上の利点をもたらす非相同性タンパク質内で、タンパク質を生成することができる。
【０３０２】
活性化ベクターは、ゲノムＤＮＡとともに宿主細胞内に共トランスフェクションしてもよく、その場合、ベクターは細胞への導入前にゲノムＤＮＡに結合しない。本実施形態において、ゲノムＤＮＡはトランスフェクションプロセス間に断片化されるため、遊離ＤＮＡ末端が生成される。これらのＤＮＡ末端は、細胞のＤＮＡ修復機構によって、共形質導入された活性化ベクターに結合されるようになる。活性化ベクターへの結合の後、ゲノムＤＮＡおよび活性化ベクターは、非相同性組換プロセスによって宿主細胞ゲノムに組込むことができる。このプロセスの間にベクターが、トランスフェクションされたゲノムＤＮＡによってコードされた遺伝子に結合されるようになると、ベクターはその発現を活性化する。
【０３０３】
または、非標的活性化ベクターは、トランスフェクションの前にゲノムＤＮＡに物理的に結合されることもある。好ましい実施形態において、ゲノムＤＮＡフラグメントはトランスフェクションの前にベクターに結合される。これによって、ゲノムＤＮＡによってコードされる遺伝子にベクターが動作可能に結合される確率が最大となり、相同性ゲノムＤＮＡを含まない宿主細胞ゲノム内にベクターが組込まれる確率が最小となるため、有利である。
【０３０４】
関連する実施形態において、ゲノムＤＮＡは活性化エキソン下流の活性化ベクター内にクローン化される。この実施形態において、大規模なゲノムフラグメントのクローニングは、大規模なゲノムフラグメントを調整することのできるベクター内で促進することができる。したがって、活性化ベクターはＢＡＣｓ、ＹＡＣｓ、ＰＡＣｓ、コスミドまたはゲノムＤＮＡの大規模なフラグメントを伝播できる同様のベクター内に構成される。
【０３０５】
活性化ベクターをゲノムＤＮＡに結合する別の方法に、転位がある。本実施形態において、活性化ベクターは、細胞へのトランスフェクション前の転位またはレトロウイルス組込反応によって、ゲノムＤＮＡ内に生みこまれる。したがって、活性化ベクターは、転位および／またはレトロウイルス組込を促進するのに必要なｃｉｓ配列を含むことができる。トランスポンシグナルを含むベクターの例は図２７に示す；しかし、本明細書で述べるベクターがトランスポンシグナルを含んでもよいことは認識されている。
【０３０６】
ゲノムＤＮＡに異質配列を挿入できる転位系はどれでも、本発明で使用できる。さらに、反転および欠失を促進できるトランスポンも、本発明を実施するのに使用できる。欠失および反転系は活性化ベクターをゲノムＤＮＡに組込まないが、ゲノムＤＮＡが活性化ベクター内にクローン化される場合に、活性化ベクターによって、クローン化ゲノムＤＮＡに対応する位置を変化できるようにする。そのため、活性化ベクターを（組込、反転または欠失によって）ゲノムフラグメントの内部、または外部の複数の位置にシャッフリングすることによって、所与のゲノムフラグメント内の複数の遺伝子を活性化することができる。本発明に有用な転位系の例は、これに限定されるわけではないが、δγ、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｙ、レトロウイルス組込およびレトロトランスポン（Ｂｅｒｇら、「移動性ＤＮＡ（Ｍｏｂｉｌｅ　ＤＮＡ）」，ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ，ｐｐ．８７９−９２５（１９８９）；Ｓｔｒａｔｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１２４７（１９９１）；Ｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ　１１３：９（１９９２）；Ｌｉｕら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：９４６１（１９８７）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：８３９８（１９９５）；Ｐｈａｄｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：５９０８（１９８９）；Ｔｏｍｃｓａｎｙｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６３４８（１９９０）；Ｗａｙら、Ｇｅｎｅ　３２：３６９（１９８４）；Ｂａｉｎｔｏｎら、Ｃｅｌｌ　６５：８０５（１９９１）；Ａｈｍｅｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：９４１（１９８４）；Ｂｅｎｊａｍｉｎら、Ｃｅｌｌ　５９：３７３（１９９１）；Ｂｒｏｗｎら、Ｃｅｌｌ　４９：３４７（１９８７）；Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒら、Ｃｅｌｌ　５４：９５５（１９８８）；Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．４：３２４（１９９０）；Ｂｒａｉｔｅｒｍａｎら、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１４：５７１９（１９９４）；Ｂｒａｉｔｅｒｍａｎら、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１４：５７３１（１９９４）；Ｙｏｒｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２６：１９２７（１９９８）；Ｄｅｖｉｎｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：３７６５（１９９４）；Ｇｏｒｙｓｈｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７３６７（１９９８））が挙げられる。
【０３０７】
活性化ベクターは、転位を使用して、どの形のゲノムＤＮＡにも組込める。たとえば、活性化ベクターは、非損傷または断片化ゲノムＤＮＡのどちらにも組込める。または、活性化ベクターはゲノムＤＮＡのクローン化フラグメントに組込める（図２８）。本実施形態において、ゲノムＤＮＡは、高および中間複製数プラスミド（たとえば、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２など）、コスミド、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）、Ｐ１人工染色体（ＰＡＣｓ）およびファージ（たとえばラムダ、Ｍ１３など）を含め、どのクローニングベクターにも存在する。当分野で周知の他のクローニングベクターも使用できる。上述したように、特異性遺伝子座によるゲノムフラグメントを単離して、活性化ベクター組込の基質として使用してもよい。
【０３０８】
活性化ベクターの組込後、ゲノムＤＮＡは活性化遺伝子発現に適した宿主細胞に直接導入してもよい。あるいは、ゲノムＤＮＡを中間宿主細胞内に導入し、伝播させてもよい。たとえば、活性化ベクターをＢＡＣゲノムライブラリー内に組込んだ後、ＢＡＣライブラリーはＥ．コリに形質転換できる。これによって、活性化ベクター内に存在する抗体耐性マーカーを選択することによって、トランスポンを含むプラスミドを濃縮することができる。結果として、組込活性化ベクターを欠失したＢＡＣプラスミドは、抗体選択によって除去される。
【０３０９】
転位仲介活性化ベクター統合は、精製した酵素を用いてインビトロで起こる。あるいは、転位反応はインビボで起こる。たとえば転位は、ベクター内にトランスポンを含むか、ゲノム内に組込複製としてトランスポンを含む供与体菌株を用いて、細菌内で実施してもよい。興味のある標的は、組込を受容するトランスポーザ宿主内に導入される。次に、挿入を保持する標的を遺伝子選択によって宿主から回収する。同様に、酵母、食物、昆虫または哺乳類細胞などの真核宿主細胞を用いて、活性化ベクターをゲノムＤＮＡのフラグメント内にトランスポン仲介によって組込むことができる。
【０３１０】
活性化内在性遺伝子からのｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの単離
他の実施形態において、本発明は、本発明のベクターを用いて活性化された遺伝子、特に真核細胞のゲノム内に含まれた遺伝子を単離する方法を目的としている。これらの方法は、本発明の非標的遺伝子活性化ベクターを用いて精製されたｍＲＮＡ分子の構造を利用する。本明細書で述べる本発明の方法によって、実質的にどの活性化遺伝子でも、以前単離およびキャラクタリゼーションされたかどうかにかかわらず、および生理活性が基地であるかどうかにかかわらず、単離することができる。このことは、本発明の組込ベクターより生成されるキメラ転写産物の特性により可能である。本明細書で述べる方法を用いて、活性化ベクターを細胞のゲノム内に組込むことができる。しかし一般に、活性化ベクターは多くの細胞のゲノムに組込まれて、独自の組込イベントのライブラリーを生成する。ライブラリーの各メンバは、独自の組込部位に配置されたベクターを含む、活性化された内在性遺伝子を潜在的に含む。遺伝子活性化は、活性化ベクターが内在性遺伝子の３’−最大エキソンの上流に、ベクターからの転写によって内在性遺伝子によっ
て進行させることが可能な方向で組込まれた場合に行われる。組込部位は、内在性遺伝子のイントロンまたはエキソン内であるか、遺伝子の転写開始部位の上流であってもよい。組込の後、活性化作成物は、活性化ベクターによってコードされるエキソンから内在性遺伝子によってコードされるエキソンまでのすプライシングが可能な転写産物を生成するように設計される。結果として、内在性遺伝子によるエキソンに結合されたベクターエキソンを含むキメラメッセージが生成され、そこではベクター組込部位の下流に位置する領域から内在性エキソンが得られる。このキメラ転写三部ｔの構造は、遺伝子発見目的には利用できない。たとえば、キメラ転写産物は、（遺伝子の全長ｃＤＮＡまたはゲノム複写を単離するために、または遺伝子をキャラクタリゼーションするために）プローブとして使用するために、または直接配列決定および／またはキャラクタリゼーションのために迅速に単離できる。
【０３１１】
ベクター挿入によって活性化されたキメラ転写産物を単離するために、ｃＤＮＡは活性化イベントを含むライブラリーメンバから生成される。手順のスループットを向上させるために、キメラ転写産物をライブラリーメンバのプールから単離することも可能である。次に、ｃＤＮＡを、活性化細胞から収穫したｍＲＮＡから生成できる。あるいは、ＲＮＡ全体を用いて、ｃＤＮＡを生成する。どちらの場合でも、第１の鎖合成はオリゴｄＴプライマー、オリゴｄＴ／ポリ（Ａ）シグナルプライマー、またはランダムプライマーを用いて実施できる。ｃＤＮＡ生成物のクローニングを促進するために、ポリｄＴベースの５’−プライマーＸ（ｄＴ）１−１００−３’という構
造のプライマーを使用できる。オリゴｄＴ／ポリ（Ａ）シグナルプライマーは、５’−（ｄＴ）
１０−３０−プライマーＸ−Ｎ０−６−ＴＴＴＡＴＴ−３’という構造を取りうる。ランダムプライマ
ーは、５’−（プライマーＸ）ＮＮＮＮＮＮ−３’という構造を取りうる。各プライマーにおい
て、プライマーＸは標的核酸分子を引き続きＰＣＲ増幅するために使用可能なすべての配列である。活性化遺伝子増幅生成物をクローン化する場合、プライマーＸ配列内に１個以上の制限部位を包含させて、次のクローニングを促進することが有用である。プライマーＸ領域を欠失するプライマーを含め、当業者が認識する他のプライマーを用いて、第１の鎖ｃＤＮＡ生成物を作成することができる。
【０３１２】
本発明により、プライマーは１個以上のハプテン分子と結合して、その後の、そのようなプライマーを含む核酸分子（たとえば第１および／または第２鎖ｃＤＮＡ生成物）の単離を促進する。プライマーが（ｃＤＮＡ合成中の包含によって）核酸分子と結合した後、ハプテニル化プライマーを含む分子の選択的単離は、リガンド−ハプテン相互作用によって、特異的にハプテンと相互作用し、ハプテンに結合する、該当するリガンドを使用して実施される。好ましいそのような態様において、リガンドはたとえば、担体に結合することがある。興味のある固体（ハプテニル化プライマー含有核酸分子）は、いったん担体に結合すると、担体マトリクスを溶液、好ましくは緩衝液または水で洗浄することによって、汚染核酸および他の物質から分離できる。次に、プライマー内の１個以上の開裂部位の開裂、または核酸分子を含む単体の高イオン強度溶出緩衝液よる処理によって、担体から興味のある核酸分子を除去することができる。
【０３１３】
本発明の本態様でに使用に好ましい担体としては、これに限定されるわけではないが、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、デンプン、ナイロン、ラテックスビード、磁気ビード、常磁性ビード、超常磁性ビードまたはマイクロタイタープレートおよび最も好ましくは、プライマー上のハプテン分子に特異的に認識、およびそれらに結合する１個以上のリガンド分子を含む磁気ビード、常磁性ビードまたは超常磁性ビードが挙げられる。
【０３１４】
本発明のプライマー分子で使用するのに特に好ましいハプテン分子としては例外なく：（ｉ）ビオチン；（ｉｉ）抗体；（ｉｉｉ）酵素；（ｉｖ）リポ多糖類；（ｖ）アポトランスフェリン；（ｖｉ）フェロトランスフェリン；（ｖｉｉ）インシュリン；（ｖｉｉｉ）サイトカイン（成長因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子）；（ｉｘ）ｇｐ１２０；（ｘ）β−アクチン；（ｘｉ）ＬＦＡ−１；（ｘｉｉ）Ｍａｃ−１；（ｘｉｉｉ）グリコフォリン；（ｘｉｖ）ラミニン；（ｘｖ）コラーゲン；（ｘｖｉ）フィブロネクチン；（ｘｖｉｉ）ビトロネクチン；（ｘｖｉｉｉ）インテグリンαｖβ１およびαｖβ３；（ｘｉｘ）インテグリンα３β１、α４β１、α４β７、α５β１、αｖβ１、αＩＴｂβ３、αｖβ３、αｖβ６；（ｘｘ）インテグリンα１β１、α２β１、α３β１、αｖβ３；（ｘｘｉ）インテグリンα１β１、α２β１、α３β１、α６β１、α７β１、α６β５；（ｘｘｉｉ）アンキリン；（ｘｘｉｉｉ）Ｃ３ｂｉ、フィブリノーゲンまたはＸ因子；（ｘｘｉｖ）ＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−２；（ｘｘｖ）スペクトリンまたはフォドリン；（ｘｘｖｉ）ＣＤ４；（ｘｘｖｉｉ）サイトカイン（成長因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子）受容体；（ｘｘｖｉｉｉ）インシュリン受容体；（ｘｘｉｘ）トランスフェリン受容体；（ｘｘｘ）Ｆｅ＋＋＋；（ｘｘｘｉ）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和タンパク質（ＥＮＰ）；（ｘｘｘｉｉ）酵素特異性基質；（ｘｘｘｉｉｉ）タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、細胞表面Ｆｃ受容体または抗体特異性抗原；（ｘｘｘｉｖ）アビジンおよびストレプトアビジンが含まれる。特に好ましいのはビオチンである。
【０３１５】
本発明の本態様による、上述のハプテン分子に順に一致する、特に好ましいリガンド分子としては例外なく；（ｉ）アビジンおよびストレプトアビジン；（ｉｉ）タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、細胞表面Ｆｃ受容体または抗体特異性抗原；（ｉｉｉ）酵素特異性基質；（ｉｖ）ポリミキシンＢまたはエンドトキシン中和タンパク質（ＥＮＰ）；（ｖ）Ｆｅ＋＋＋；（ｖｉ）トランスフェリン受容体；（ｖｉｉ）インシュリン受容体；（ｖｉｉｉ）サイトカイン（成長因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子）受容体；（ｉｘ）ＣＤ４；（ｘ）スペクトリンまたはフォドリン；（ｘｉ）ＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−２；（ｘｉｉ）Ｃ３ｂｉ、フィブリノーゲンまたはＸ因子；（ｘｉｉｉ）アンキリン；（ｘｉｖ）インテグリンα１β１、α２β１、α３β１、α６β１、α７β１、α６β５；（ｘｖ）インテグリンα１β１、α２β１、α３β１、αｖβ３；（ｘｖｉ）インテグリンα３β１、α４β１、α４β７、α５β１、αｖβ１、αＩＴｂβ３、αｖβ３、αｖβ６；（ｘｖｉｉ）インテグリンαｖβ１およびαｖβ３；（ｘｖｉｉｉ）ビトロネクチン；（ｘｉｘ）フィブロネクチン；（ｘｘ）コラーゲン；（ｘｘｉ）ラミニン；（ｘｘｉｉ）グリコフォリン；（ｘｘｉｉｉ）Ｍａｃ−１；（ｘｘｉｖ）ＬＦＡ−１；（ｘｘｖ）β−アクチン；（ｘｘｖｉ）ｇｐ１２０；（ｘｘｖｉｉ）サイトカイン（成長因子、インターロイキンまたはコロニー刺激因子）；（ｘｘｖｉｉｉ）インシュリン；（ｘｘｉｘ）フェロトランスフェリン；（ｘｘｘ）アポトランスフェリン；（ｘｘｘｉ）リポ多糖類；（ｘｘｘｉｉ）酵素；（ｘｘｘｉｉｉ）抗体；および（ｘｘｘｉｖ）ビオチンが挙げられる。本発明のビオチン化プライマーとともに使用するのに特に適しているのは、アビジンおよびストレプトアビジンである。
【０３１６】
第１鎖合成の後、第２鎖ｃＤＮＡ合成は、ベクターコードエキソンに対して特異性のプライマーを用いて行う。これにより、ベクターコードプロモーターに由来したすべての転写産物から二重鎖ｃＤＮＡを作成する。内在性プロモーターから生成されたすべての細胞ｍＲＮＡ（およびｃＤＮＡ）は、転写産物が５’末端にベクターエキソンを欠失しているため、一本鎖のままである
。第２鎖合成を実施すると、ｃＤＮＡは制限酵素によって消化され、ベクター内にクローン化され、伝播される。
【０３１７】
クローニングを促進するために、ベクターエキソンを含むｃＤＮＡ分子は、ベクターエキソンに対して特異性のプライマーおよび第１鎖ｃＤＮＡプライマー（たとえばプライマーＸ）に対して特異性のＰＣＲによって増幅される。異なる遺伝子による複数のキメラ転写産物の第１鎖合成および／または増幅の間に、ＰＣＲ増幅によって、異なる位置のプライミングを表す可変長ＤＮＡフラグメントが生成される。これらの増幅生成物は、キャラクタリゼーションのためにプラスミド内にクローン化されるか、標識して、プローブとして使用することができる。
【０３１８】
ＲＮＡポリメラーゼを用いた直線増幅などの（Ｖａｎ　Ｇｅｌｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１６６３−１６６７（１９９０）；Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　１０：２８３−２８８（１９９６））、他の増幅技法を使用できる。たとえば、ＲＮＡポリメラーゼによる直線増幅を使用する場合、ベクターエキソン上にプロモーター（たとえばＴ７プロモーター）を配置できる。結果として、遺伝子活性化転写産物は、転写産物の５’末
端にプロモーター配列を含む。あるいは、第１鎖および第２鎖合成の後に、プロモーターをｃＤＮＡ分子に結合することができる。どちらかの戦略を使用して次に、リボヌクレオチドトリホスフェートの存在下でＲＮＡポリメラーゼをｃＤＮＡによってインキュベートし、ｃＤＮＡからＲＮＡ転写産物を作成する。これらの転写産物はそれからｃＤＮＡを生み出すために逆転写される。ＲＮＡポリメラーゼは１個のｃＤＮＡ分子から数千個の転写産物を作成でき、これらの転写産物がそれぞれｃＤＮＡ内へ逆転写できるため、大規模な増幅が行える。ＰＣＲと同様に、ＲＮＡポリメラーゼを用いた増幅によって、活性化遺伝子のクローニングを促進することができる。他の種類の増幅戦略も可能である。
【０３１９】
別の実施形態において、ｃＤＮＡ分子を含むベクターエキソンは増幅せずに単離できる。これはたとえば、増幅中にバイアスが発生した場合（たとえば、１個のＤＮＡフラグメントが他のＤＮＡフラグメントよりも効果的に増幅する場合）に有用である。標識メッセージ陽に濃縮されたｃＤＮＡを生成するために、活性化ライブラリーからＲＮＡを単離する。プライマー（たとえばランダム六量体、オリゴ（ｄＴ）、またはポリ（ｄＴ）またはランダムヌクレオチドに結合されたプライマーを含むハイブリッドプライマー）をアニーリングしてＲＮＡとし、第１鎖合成の指示に用いる）。次に第１鎖ｃＤＮＡ分子をハイブリダイズして、ベクターコードエキソンに対して特異性のプライマーとする。このプライマーは第２鎖合成を指示する。第２鎖合成の後、ｃＤＮＡは、ベクターエキソンをおよび第１鎖プライマー（たとえばプライマーＸに−上を参照）を切断する制限酵素によって消化する。次に第２鎖生成物を有用なベクター内にクローン化し、それらを伝播できるようにする。
【０３２０】
本明細書に含まれる説明を考慮すると、本発明の方法によって作成したｃＤＮＡ生成物も、各種の原核（細菌）または真核（酵母、植物あるいは、ヒトまたは他の哺乳類を含む動物）細胞のトランスフェクションまたは形質転換に適したクローニングベクター内へクローン化されることは、当業者には明らかである。このようなクローニングベクターは、発現ベクターでもよく、これらに限定されるわけではないが、染色体−、エピソーム−および、ウイルス由来ベクター、たとえば、コスミドおよびファージミド、ＢＡＣｓ、ＭＡＣｓ、ＹＡＣｓなどの、細菌性プラスミドまたはバクテリオファージに由来するベクター、その組み合わせによって由来するベクターが含まれる。本発明の本態様に従って使用するのに適した他のベクター、および、そこでのＤＮＡ断片の挿入方法、そのようなクローニングベクターをを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者には周知であろう。
【０３２１】
スプライスされていない転写生成物の除去
ある例において、活性化ベクターは遺伝子を欠失した領域内のゲノムに組込まれる。あるいは、遺伝子を含む領域に組込まれるが、非コード鎖の転写が起こる方法で配向されている。これらの各例において、通常、ベクターコードエキソンに隣接した未転写ＤＮＡ配列を含む、遺伝子活性化転写産物が生成される。これらの配列によって、新規遺伝子の同定および分析が複雑になる。したがって、これらのゲノム分子を選択的に除去すると有利である。
【０３２２】
ベクターコードイントロンを含むｃＤＮＡ分子を除去するために、二重鎖ｃＤＮＡを、ベクターコードイントロンに配置された配列を識別する制限酵素によって処理する。制限酵素は、ベクターエキソンの開裂によって生成されるオーバーハングとは異なるオーバーハングを作成することが好ましい。これにより、開裂生成物のクローニングベクター内への結合を防止することによってのみ活性化される細胞がクローニングされる。
【０３２３】
活性化内在性遺伝子からのエキソンＩの回収
活性化遺伝子からエキソンＩを回収するために、特殊ベクターを用いて非標的遺伝子活性化ライブラリーを作成できる。このベクターは、その最も簡単な形で５’から３’に、プロモーター
、不対スプライス供与対部位および第２プロモーターを含む。下流プロモーターは、上流プロモーターと同一の方向に向けられる。内在性遺伝子の上流への組込時に、この種のベクターは２種類の転写産物を生成する。第１の転写産物は、内在性遺伝子のエキソンＩＩに結合されるベクターエキソンを含む。この転写産物を単離する方法は上で述べている。第２の転写産物は、内在性遺伝子の上流領域と、それに続くエキソンＩＩに結合したエキソンＩおよび内在性遺伝子による下流エキソンを含む（図６）。
【０３２４】
エキソンＩは２段階のステップを用いて、組込ベクターを含む細胞から回収できる。第１に、転写産物（すなわち転写産物＃１、図１３）を含むベクターエキソンは、上述した方法を用いて単離する。エキソンＩＩを含む転写産物の５’末端はいったん単離すると、配列決定され、フラ
ンキング内在性エキソンの配列を決定できる。第２に、フランキング内在性エキソンの配列がわかれば、活性化細胞のエキソンＩＩ（または下流エキソン）にアニーリング可能なＰＣＲプライマーを発生させることができる。これらのプライマーは、反転ＰＣＲの修飾形を用いて、転写産物＃２（図１３）からエキソンＩを増幅するために使用できる（Ｚｅｉｎｅｒ，Ｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１７（６）：１０５１−１０５３（１９９４））。簡潔に言えば、内在性遺伝子からのエキソンＩは、上で決定した配列情報に基づき、遺伝子特異性プライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施することによって増幅される。第２鎖合成は、Ｅ．コリ　ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、当業者に周知の方法で実施できる。次に二重鎖ｃＤＮＡを、第１鎖ｃＤＮＡプライマー上流の内在性遺伝子で少なくとも１回開裂し、ベクターエキソン内で開裂しない、制限酵素によって消化する。消化の後、ｃＤＮＡは自己結合して、環状分子を生成する。制限／環状化部位の上流の内在性細胞内でアニーリングする反転ＰＣＲプライマーを用いると、ＰＣＲ増幅によって、内在性遺伝子からエキソンＩ配列を含むＤＮＡ生成物が生成される。
【０３２５】
より高レベルの遺伝子活性化転写産物／タンパク質を含む細胞の選択方法
開示した発明の複数の実施形態において、活性化ベクターは増幅可能マーカー（たとえばＤＨＦＲ）およびウイルス起源の複製（たとえばＥＢＶ　ｏｒｉ　Ｐ）を含む。別の実施形態において、増幅可能マーカーおよびウイルス起源の複製は、ゲノムＤＮＡのクローン化フラグメントを含むクローニングベクター上に存在する。また別の実施形態では、活性化ベクターは片方の要素（たとえばＤＨＦＲ）を含み、ゲノムインサートを保持するクローニングベクターはもう片方の要素（たとえばＯｒｉ　Ｐ）を含む。増幅可能マーカーおよびウイルス起源の初期位置とは無関係に、要素は、宿主細胞への導入前か、導入中に同一のＤＮＡ分子上で結合される。
【０３２６】
シス作用要素に加えて、トランス作用ウイルス性タンパク質は一般に、エピソームを十分に発現させるために必要である。トランス作用ウイルス性タンパク質の例は、ＦＢＮＡ−１とＳＶ４０Ｔ抗原を含む。エピソームの十分な複製を促進するために、トランス作用ウイルス性タンパク質はエピソームから発現させることができる。したがって、トランス作用ウイルス性タンパク質は、転位活性化ベクターから発現させるか、クローニングベクターの主鎖に配置してもよい。あるいは、トランス作用ウイルス性タンパク質は、エピソームを導入する真核宿主細胞によって発現させてもよい。
【０３２７】
増幅可能マーカーおよびウイルス起源の複製が同一分子上にあり、適切なウイルス複製タンパク質を発現する宿主細胞中に存在すると、エピソームの複製数を増加させることができる。エピソームの複製数を増加させるために、細胞を適切な選択下に配置することができる。たとえばＤＨＦＲがエピソーム上に存在する場合、メトトレキサートを培養物に添加してもよい。該選択的薬剤は、すでにエピソームの複製数が高まっている個体群において細胞を単離するために、比較的高濃度で使用してもよい。あるいは、該選択的薬剤は比較的低い濃度で使用し、濃度を周期的に上昇させてもよい。薬剤濃度を２倍に上昇させると、複製数が段階的に増加する。
【０３２８】
非特異性薬剤耐性（すなわちエピソームの複製数増加と関連しない薬剤耐性）の頻度を低下させるために、１個以上の増幅可能マーカーをベクター中に配置できる。複数の増幅可能マーカーをエピソームに包含させると、細胞を複数の薬剤を用いて選択することができる（同時にまたは連続的に）。非特異性薬剤耐性が比較的まれなイベントであるため、複数の薬剤に対する非特異性薬剤耐性を生じさせる細胞の確率は非常に低い。したがって、複数の増幅可能マーカーがエピソーム上に存在すると、エピソームの複製数が大きい細胞の単離が促進される。
【０３２９】
エピソームの複製数の増幅によって、ベクター活性化遺伝子に由来する転写産物の数が増加する。次に、これによって、活性化遺伝子に由来するｃＤＮＡ分子の単離が促進される。さらに、エピソーム複製数の増幅が、活性化遺伝子からのタンパク質発現を劇的に上昇させる。より高いレベルのタンパク質産出によって、バイオアッセイスクリーニング、細胞アッセイスクリーニングおよび製造目的のためのタンパク質生成が促進される。
【０３３０】
上述した非常に望ましい特性の結果として、ウイルス由来の複製および増幅可能マーカーを含むベクターおよびこれらのベクターを用いてエピソームベクターの複製数を迅速に増幅することは、ゲノムＤＮＡに存在する遺伝子の活性化発現の範囲を超えて膨張するブレークスルーとなっている。たとえば、これらのベクターを用いてｃＤＮＡコード遺伝子を過剰発現させると、増幅可能マーカーを持つ宿主細胞ゲノムに遺伝子を組込まなくても、高レベルのタンパク質発現を行うことができる。さらに、染色体配列の増幅と同様に、数百から数千個のベクターのエピソーム複製を持つ細胞を単離し、培養物内で維持することができる。そのため、本明細書で述べるベクターおよびその使用によって、高レベルのクローン化ゲノムＤＮＡを哺乳類細胞中で伝播させ、ベクター上に存在する遺伝子のｃＤＮＡ複製のゲノムインサートとしての単離を促進し、クローン化ｃＤＮＡによるタンパク質生成および真核遺伝子のゲノム複製をを最大限にすることができる。
【０３３１】
ここで示した方法や応用に対して他にも適当な修飾と適応があることは当業者には容易に明白なことであり、本発明あるいはその実施態様の範囲を逸脱することなく行える。本発明をここに詳細に記述したが、以下の例を参照することによってより明確に理解されよう。これは実例の目的でのみここに包含したものであり、本発明を限定するものではない。
【０３３２】
例１：内在性遺伝子発現を活性化するための細胞のトランスフェクション
方法：ｐＲＩＧ−１の構築
ヒトＤＨＦＲは、ＰＣＲにて作製したＨＴ１０８０細胞由来ｃＤＮＡから、プライマーＤＨＦＲ−Ｆ１（５’ＴＣＣＴＴＣＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴＣＧＣＴＡＡＡＣＴＧＣＡＴ ３’）（配列番号１）およびＤＨＦＲ−Ｒ１（５’ ＡＡＡＣＴＴＡＡＧＡＴＣＧＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＴＴＣＡＡ ３’）（配列番号２）を用いてＰＣＲにより増幅し、ｐＴＡＲＧＥＴＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＴ部位にクローニングしてｐＴＡＲＧＥＴ：ＤＨＦＲを作製したＰＲＥＰ９をＮｈｅＩとＸｂａＩで切断してＲＳＶプロモーターを単離し、ｐＴＡＲＧＥＴ：ＤＨＦＲのＮｈｅＩ切断部位に挿入してｐＴｇＴ：ＲＳＶ＋ＤＨＦＲを作製した。オリゴヌクレオチドＪＨ１６９（５’ ＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＧ ３’）（配列番号３）とＪＨ１７０（５’ ＧＡＴＣＣＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＴＡＡ ３’）（配列番号４）をアニーリングしてｐＴｇＴ： ＲＳＶ＋ＤＨＦＲのＩ−Ｐｐｏ−ＩとＮｈｅＩ切断部位に挿入し、ｐＴｇＴ： ＲＳＶ＋ＤＨＦＲ＋Ｅｘｌを作製した。プライマーＴｅｔ Ｆ１（５’ ＧＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＣＧＣＴＡＴＡＴＧＣＧＴＴＧＡＴＧＣＡＡＴ ３’）（配列番号５）およびＴｅｔ Ｆ２（５’ ＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＡＡＧＡＧＡＧＣＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＣＣＣＧＡＡ ３’）（配列番号６）を用いて、ＰＢＲ３２２のヌクレオチド２３０から５０８番に相当する２７９ｂｐの領域をＰＣＲにより増幅した。増幅した産物をＢｇｌＩＩで切断し、ｐＴｇＴ： ＲＳＶ＋ ＲＳＶ＋ＤＨＦＲ＋ＥｘｌのＢａｍＨＩ切断部位に挿入してｐＲＩＧ−１を作製した。
【０３３３】
トランスフェクション：ＨＴ１０８０細胞でのｐＲＩＧ−１遺伝子活性化
ライブラリーの作製
遺伝子発現を活性化するため、上記したコンストラクトのグループ内から適した活性化コンストラクトを選択する。次に、当業者に周知のいずれかのトランスフェクション法により、選択した活性化コンストラクトを細胞に導入する。トランスフェクション法の例として、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、および受容体依存性エンドサイトーシス法が挙げられる。細胞への導入に続き、ＤＮＡは非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれる。組み込みは、自然に生じた染色体の切れ目、あるいは人為的に誘発した染色体の切れ目で起こる。
【０３３４】
方法
ｐＲＩＧ１によるヒト細胞のトランスフェクション。ＨＴ１０８０細胞のＨＰＲＴ−サブクローンであるＨＨ１細胞２ｘ１０９コを、１５０ｍｍ組織培養プレートで９０％コンフルエントになるまで培養した。細胞から培地を除去し、培養上清として保存した（以下を参照）。トリプシンで短時間インキュベーションすることによりプレートから細胞を剥がし、培地／１０％ウシ胎児血清を添加してトリプシンを中和し、Ｊｏｕａｎ遠心機で５分間、１，０００Ｒｐｍで遠心分離して沈殿させた。１ｘＰＢＳで細胞を洗浄し、カウントし、上記のように再度沈殿させた。最終的に２．５ｘ１０７コ細胞／ｍｌになるように、１ｘＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，　Ｃａｔ　＃１４２００−０７５）で細胞の沈殿を再懸濁した。次に、細胞を１３７Ｃｓ由来の５０ラドのγ照射に曝露した。ｐＲＩＧ１は（図１４Ａ〜１４Ｂ：配列番号１８）、ＢａｍＨＩにより直鎖状にし、フェノール／クロロホルムで精製し、エタノールにより沈殿させ、ＰＢＳに再懸濁した。精製し直鎖状にした活性化コンストラクトを、最終濃度４０μｇ／ｍｌになるように細胞懸濁液に添加した。次にＤＮＡ／照射細胞混合液を混合し、０．４ｃｍのエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に４００μｌずつ分注した。エレクトロポレーション装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、キュベットを２５０ｖｏｌｔｓ，６００μファラッド，５０オームでパルスした。電気的パルスの後、細胞を室温で１０分間インキュベーションし、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含むαＭＥＭ／１０％ＦＢＳに加えた。続いて、約７ｘ１０６コ細胞／３５ｍｌのαＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ペニシリンストレプトマイシン（３３％培養上清／６７％新鮮培地）を含むプレートの割合で、細胞をプレーティングした。３７℃で２４時間インキュベーションした後、６０ｍｇ／ｍｌストックから最終濃度が５００μｇ／ｍｌになるように、それぞれのプレートにＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を添加した。４日間の選択後、培地を新鮮なαＭＥＭ／１０％　ＦＢＳ／ペニシリンストレプトマイシン／５００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８で置換した。さらに７から１０日間細胞をインキュベーションし、新規タンパク質因子の存在について培養上清をアッセイした、あるいは後に解析するため−８０℃にて保存した。薬剤耐性のクローンは、後に解析するため液体窒素で保存した。
【０３３５】
例２：ＤＮＡ組み込みの頻度とランダム性を増加させるための電離放射線の利用
方法：９０％コンフルエントの段階でＨＨ１細胞を回収し、１ｘＰＢＳで洗浄し、７．５ｘ１０６コ細胞／ｍｌになるように１ｘＰＢＳで再懸濁した。細胞に、１５μｇの直鎖状化ＤＮＡ（ｐＲＩＧ−１）を添加し混合した。それぞれのキュベットに４００μｌずつ分注し、エレクトロポレーション装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、２５０ｖｏｌｔｓ，６００μファラッド，５０オームでパルスした。電気的パルス後、細胞を室温で１０分間インキュベーションし、２．５ｍｌのαＭＥＭ／１０％　ＦＢＳ／１ｘペニシリンストレプトマイシンに加えた。それぞれショックをかけたうち３００μｌの細胞を、直ちに、あるいはトランスフェクション後１時間または４時間の時点で０，５０，５００，５０００ラドで照射した。照射後直ちに、細胞を完全培地で組織培養プレートにプレーティングした。プレーティングから２４時間後、Ｇ４１８を最終濃度５００μｇ／ｍｌになるよう培養細胞に添加した。選択から７日後、培養液を５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む新鮮完全培地に置換した。選択から１０日後、プレートから培地を除去し、コロニーをクーマシーブルー／９０％メタノール／１０％酢酸で染色し、５０細胞以上からなるコロニーをカウントした。
【０３３６】
例３：ゲノムにランダムの、半ランダムの、あるいはターゲットした）切れ目を生じるための制限酵素の利用
方法：９０％コンフルエントの段階でＨＨ１細胞を回収し、１ｘＰＢＳで洗浄し、７．５ｘ１０６コ細胞／ｍｌになるように１ｘＰＢＳで再懸濁した。組み込み効率をテストするため、１５μｇの直鎖状化ＤＮＡ（ＰＧＫ−βｇｅｏ）をそれぞれ４００μｌずつ分注した細胞に添加し、混合した。いくつかの分注細胞については、続いて制限酵素、ＸｂａＩ，ＮｏｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＩｐｐｏＩ（１０から５００ｕｎｉｔｓ）を別々の細胞／ＤＮＡ混合液に添加した。それぞれのキュベットに４００μｌずつ分注し、エレクトロポレーション装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、２５０ｖｏｌｔｓ，６００μファラッド，５０オームでパルスした。電気的パルス後、細胞を室温で１０分間インキュベーションし、２．５ｍｌのαＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１ｘペニシリンストレプトマイシンに加えた。それぞれショックをかけた全量２．５ｍｌの細胞のうち、３００μｌを完全培地で組織培養プレートにプレーティングした。プレーティングから２４時間後、Ｇ４１８を最終濃度６００μｇ／ｍｌになるよう培養細胞に添加した。選択から７日後、培養液を６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む新鮮完全培地に置換した。選択から１０日後、プレートから培地を除去し、コロニーをクーマシーブルー／９０％メタノール／１０％酢酸で染色し、５０細胞以上からなるコロニーをカウントした。
【０３３７】
例４：組み込みベクター上に位置する二つの増幅可能マーカーを選択することによる増幅
ベクターを宿主細胞のゲノムへ組み込んだ後、組み込みベクター上に位置する一つあるいはそれ以上の増幅可能マーカーを同時にあるいは連続して選択することにより、遺伝子座のコピー数が増幅される。例えば、二つの増幅可能マーカーを含むベクターがゲノムに組み込まれると、ベクター上に位置する両増幅可能マーカーを選択することにより、規定の遺伝子（すなわち、ベクター組み込み部位に位置する遺伝子）の発現は増加し得る。この研究法により、適当な遺伝子座（すなわち、組み込みベクターを含む遺伝子座）を増幅する細胞のクローンを非常に容易に単離できる。
【０３３８】
非相同的組換えによりベクターがゲノムに組み込まれると、独自の位置に組み込みベクターを含む個々の細胞クローンを、ゲノムの他の位置に組み込みベクターを含む他細胞から単離することができる。あるいは、混合した細胞集団でも増幅の選択が可能である。
【０３３９】
組み込みベクターを含む細胞は、次に一次増幅可能マーカーに特異的な一次選択薬剤の存在下で培養する。この薬剤により、ベクターあるいは内在性染色体上の増幅可能マーカーを増幅した細胞が選択される。次に、これらの細胞を二次増幅可能マーカーに特異的な二次選択薬剤の存在下で培養することにより、二次選択マーカーの増幅について選択する。ベクターと隣接するゲノムＤＮＡを増幅した細胞はこの二次選択ステップにおいて生存するが、内在性一次増幅可能マーカーを増幅した細胞、あるいは非特異的耐性を獲得した細胞は生存できない。２つ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、あるいはそれ以上）の増幅可能マーカーを含むベクターが細胞ゲノムに組み込まれた場合には、同様の方法でさらなる選択を行うこともあり、その場合、組み込みベクター上に含まれるさらなる増幅マーカーに特異的な選択薬剤の存在下で連続して培養する。選択後、生存細胞で目的遺伝子の発現レベルについてアッセイし、最も高いレベルで発現している細胞を選んでさらに増幅させる。代わりに、両方（２つの増幅可能マーカーを用いた場合）あるいはすべて（２つ以上の増幅可能マーカーを用いた場合）の選択薬剤に耐性の細胞プールを、個々のクローンを単離しないでさらに培養することもできる。その後、これらの細胞を拡大培養し、より高い濃度（通常、２倍高）の一次選択薬剤存在下で培養する。目的の発現レベルが得られるまで、この過程を続ける。
【０３４０】
あるいは、組み込みベクターを含む細胞を両方（２つを用いた場合）またはすべて（２つ以上を用いた場合）の増幅可能マーカーで同時に選択することもできる。同時選択は、両方（２つのマーカーを用いた場合）またはすべて（２つ以上のマーカーを用いた場合）の選択薬剤をトランスフェクションした細胞を培養する選択培地に添加して行う。生存細胞の大多数が、増幅した組み込みベクターを有する。次にこれらのクローンを個々にスクリーニングし、最も発現レベルの高い細胞を同定するか、またはプールして用いることもできる。さらに、それぞれの選択薬剤をより高い濃度（通常、２倍高）で細胞にかける。続いて、生存細胞で発現レベルについてアッセイする。目的の発現レベルが得られるまで、この過程を繰り返す。
【０３４１】
どちらの選択ストラテジー（つまり、同時あるいは連続選択）においても、細胞毒性のない低濃度から細胞の大多数が死滅する高濃度まで薬剤の力価測定を行い、選択薬剤の初期濃度を個々に決定する。一般的には、はっきりと区別のできるコロニー（例えば、プレーティングした１００，０００コの細胞当たり数百コのコロニー）を生じる濃度を初期濃度として選ぶ。
【０３４２】
例５：膜貫通タンパク質をコードするｃＤＮＡの単離
ｐＲＩＧ８Ｒ１−ＣＤ２（図５Ａ〜５Ｄ； 配列番号７）， ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２（図６Ａ〜６Ｃ； 配列番号８）， およびｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２（図７Ａ〜７Ｃ； 配列番号９）ベクターは、不対スプライスドナー部位の上流にあるエキソンに連結して働くＣＭＶ前初期遺伝子プロモーターを含む。ベクター上のエキソンはＣＤ２の細胞外ドメイン（フレームの合う終止コドンを欠く）に連結したシグナルペプチドをコードする。それぞれのベクターは、スプライスドナー部位について異なるリーディングフレームにあるＣＤ２をコードする。
【０３４３】
活性化遺伝子のライブラリーを作製するため、２ｘ１０７コの細胞を１３７Ｃｓ源にて５０ラドで照射し、１５μｇの直鎖状化ｐＲＩＧ８Ｒ１−ＣＤ２（配列番号７）をエレクトロポレーションした。ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２（配列番号８）、さらにｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２（配列番号９）を用いて、別々に同様の操作を行った。トランスフェクション後、３つの細胞グループを混合し、ディッシュ当たり５ｘ１０６コのトランスフェクションされた細胞となるように１５０ｍｍディッシュにプレーティングして、ライブラリー＃１を作製した。トランスフェクションから２４時間後、ライブラリー＃１を５００μｇ／ｍｌのＧ４１８で１４日間選択した。ホスト細胞のゲノムにベクターを組み込んだ薬剤耐性クローンを混合し、分注し、解析のため凍結した。３ｘ１０７コの細胞，３ｘ１０７コの細胞，および１ｘ１０７コの細胞をそれぞれｐＲＩＧ８Ｒ１−ＣＤ２，ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２，およびｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２でトランスフェクションし、あとは上記と同様の操作を行い、ライブラリー＃２を作製した。
【０３４４】
活性化した内在性膜タンパク質コード遺伝子を含む細胞を単離するため、それぞれのライブラリーから３ｘ１０６コの細胞を培養し、以下のように処理した。
・４ｍｌのトリプシンＥＤＴＡで細胞をトリプシン処理した。
・細胞が遊離した後、８ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳを添加してトリプシンを中和した。
・無菌のＰＢＳで細胞を１回洗浄し、８００ｘｇで７分間、遠心分離して回収した。
・細胞ペレットを２ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁した。１ｍｌをソーティングに用い、もう１ｍｌを５００μｇ／ｍｌＧ４１８を含むアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳで再度プレーティングして拡大培養し、保存した。
・ソーティングに用いる細胞を無菌のアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳで１回洗浄し、８００ｘｇで７分間、遠心分離して回収した。
・上清を除去し、ペレットを１ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁した。アイソタイプコントロールでの染色用に、１００μｌの細胞を除去した。
・９００μｌの細胞に２００μｌの抗ＣＤ２　ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ　カタログ＃３００５４Ｘ）を添加し、もう一方で１００μｌの細胞に２０μｌのマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ　カタログ＃３３８１４Ｘ）を添加した。細胞を氷上で２０分間インキュベーションした。
・抗ヒトＣＤ２　ＦＩＴＣで染色した細胞を含むチューブに、５ｍｌのＰＢＳ／１０％ＦＢＳを添加した。アイソタイプコントロールには、９００μｌのＰＢＳ／１０％ＦＢＳを添加した。６００ｘｇで６分間遠心分離することにより、細胞を回収した。
・チューブから上清を除去した。アイソタイプコントロールで染色した細胞を５００μｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁し、抗ＣＤ２　ＦＩＴＣで染色した細胞を１．５ｍｌのアルファＭＥＭ／１０％ＦＢＳに再懸濁した。
【０３４５】
ＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ；　Ｍｏｕｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により、連続して５回、細胞をソーティングした。それぞれのソーティングにおいて、全細胞中最も強い蛍光性を示す表示したパーセンテージの細胞（以下を参照）を回収し、拡大培養して、再度ソーティングした。ネガティブコントロールとして、ＨＴ　１０８０細胞をソーティングした。それぞれのソーティング段階において、以下の細胞集団をソーティングして回収した。
【０３４６】
【表１】
2004501601.tif 000003
それぞれのライブラリーについて各最終ソーティングした細胞を拡大培養し、液体窒素で保存した。
【０３４７】
ＦＡＣＳソーティングした細胞からの活性化遺伝子の単離
上記のように細胞をソーティングした後、ソーティングした細胞からＰＣＲベースのクローニング法により活性化遺伝子を単離した。しかし、ＦＡＣＳソーティングした細胞から活性化遺伝子を単離するためには、遺伝子クローニングのいずれの周知方法も同様に用いることができる。
【０３４８】
以下のプロトコールにより遺伝子を単離した。
（１）　ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　１０００　ｍＲＮＡ　単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、ライブラリー＃１および＃２由来の３ｘ１０７コのＣＤ２＋細胞（上記のように、ＦＡＣＳにより５回ソーティングした）からｍＲＮＡを単離した。
（２）　ｍＲＮＡを単離した後、０．５μｌの単離ｍＲＮＡを９９．５μｌの水に希釈し、ＯＤ２６０測定によりｍＲＮＡ濃度を定量した。ＣＤ２＋細胞から２１μｇのｍＲＮＡを回収した。
（３）　以下のようにして第一鎖ｃＤＮＡ合成を行った。
（ａ）　ＰＣＲ機を４℃に保温している間に、以下の成分を順に添加して第一鎖反応混合液を準備した。
４１μｌ　ＤＥＰＣ処理ｄｄＨ２０
４μｌ　１０ｍＭ各ｄＮＴＰ
８μｌ　０．１Ｍ　ＤＴＴ
１６μｌ　５ｘＭＭＬＶ第一鎖バッファー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）
５μｌ　（１０ｐｍｏｌ／μｌ）　コンセンサスポリアデニル化部位プライマー
ＧＤ．Ｒ１（配列番号１０）＊
１μｌ　　ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
３μｌ　（１．２５μｇ／μｌ）　ｍＲＮＡ
＊注釈：ＧＤ．Ｒ１， ５’ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＮＮＮＮＴＴＴＡＴＴ ３’（配列番号１０）は、ｍＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡ合成用（遺伝子発見「Ｇｅｎｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」）プライマーである。このプライマーはポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡおよび下流のポリＡ領域にアニールするように設計してある。このプライマーにより、第一鎖にＮｏｔＩ切断部位が導入される。
サンプル調製後、以下のようにインキュベーションした。
（ｂ）　７０℃、１分
（ｃ）　４２℃、保温
【０３４９】
次にそれぞれのサンプルに２μｌの４００　Ｕ／μｌ　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ）を添加し、最終全量を８２μｌとした。約３分後、サンプルを以下のようにインキュベーションした。
（ｄ）　３７℃、３０分
（ｅ）　９４℃、２分
（ｆ）　４℃、５分
続いてそれぞれのサンプルに２μｌの２０　Ｕ／μｌ　ＲＮａｃｅ−ＩＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、サンプルを３７℃で１０分間インキュベーションした。
【０３５０】
（４）　第一鎖合成に続き、ＰＣＲ　ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて以下のようにｃＤＮＡを精製した。
（ａ）　１．７ｍｌのシリコン処理したエッペンドルフチューブに８０μｌの第一鎖反応液を移し、４００μｌのＰＢを添加した。
（ｂ）　サンプルをＰＣＲ　ｃｌｅａｎｕｐカラムに移し、１４，０００Ｒｐｍで２分間、遠心分離した。
（ｃ）　カラムを分解して流出液をデカントし、ペレットに７５０μｌのＰＥを添加して、チューブを１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離した。
（ｄ）　カラムを分解して流出液をデカントし、チューブを１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離して樹脂を乾燥させた。
（ｅ）　５０μｌのＥＢを用いて、１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離することにより、カラムから新しくシリコン処理したエッペンドルフチューブに溶出した。
【０３５１】
（５）　次に以下のようにして第二鎖ｃＤＮＡを合成した。
（ａ）　以下の成分を順に添加して、第二鎖反応混合液を室温で準備した。
ｄｄＨ２Ｏ　 ５５μｌ
１０　ｘ　ＰＣＲバッファー　　１０μｌ
５０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　 ５μｌ
１０　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　２μｌ
２５　ｐｍｏｌ／μｌ　ＲＩＧ．７５１−Ｂｉｏ＊　４μｌ
２５　ｐｍｏｌ／μｌＧＤ．Ｒ２＊＊　４μｌ
第一鎖産物　２０μｌ
＊注釈：ＲＩＧ．Ｆ７５１−Ｂｉｏ，　５’　Ｂｉｏｔｉｎ−ＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＣＧＧ　３’（配列番号１１）は、
ｐＲＩＧベクターから発現される転写物のキャップ部位にアニールする。＊＊注釈：ＧＤ．Ｒ２， ５’ ＴＴＴＴＣＧＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣ ３’（配列番号１２）は、ＧＤ．Ｒ１プライマー（配列番号１０）を用いて作製したｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するのに用いるプライマーである。ＧＤ．Ｒ２はＧＤ．Ｒ１のサブ配列であり、ポリＡシグナル配列に先行する縮重塩基まで一致する。
（ｂ）　第二鎖合成の開始：
９４℃、１分
１μｌのＴａｑ（５　Ｕ／μｌ，　Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加；
１μｌのＶｅｎｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌ（０．１　Ｕ／μｌ，　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加
（ｃ）　６３℃で２分間インキュベーション
（ｄ）　７２℃で３分間インキュベーション
（ｅ）　（ｂ）のステップを４回繰り返す
（ｆ）　７２℃で６分間インキュベーション
（ｇ）　４℃でインキュベーション（保温）
（ｈ）　終了
【０３５２】
（６）　ＳＴＥで３回洗浄することにより、２００μｌの１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン常磁性粒子（ＳＡ−ＰＭＰ）を調製した。
（７）　第二鎖反応の産物をＳＡ−ＰＭＰに直接添加し、室温で３０分間インキュベーションした。
（８）　結合後、マグネットでＳＡ−ＰＭＰを捕集し、上清を除去した。
（９）　５００μｌのＳＴＥでビーズを３回洗浄した。
（１０）　ビーズを５０μｌのＳＴＥに再懸濁し、マグネットを用いてチューブの底に捕集した。次に、ピペットでＳＴＥ上清を注意深く除去した。
（１１）　５０μｌのｄｄＨ２０でビーズを再懸濁し、１００℃のウォーターバスに２分間入れてＰＭＰから精製ｃＤＮＡを遊離させた。
（１２）　マグネットにＰＭＰを捕集し、ｃＤＮＡを含む上清を注意深く除去し、精製ｃＤＮＡを回収した。
（１３）　精製産物をきれいなチューブに移し、１４，０００Ｒｐｍで２分間遠心分離して残りのＰＭＰをすべて除去した。
【０３５３】
（１４）　次に、以下のようにＰＣＲ反応を行い、ＲＩＧ活性化ｃＤＮＡを特異的に増幅した。
（ａ）　以下の成分を順に添加して、ＰＣＲ反応混合液を室温で準備した。
Ｈ２Ｏ ５９μｌ
１０　ｘ　ＰＣＲバッファー　　１０μｌ
５０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　５μｌ
１０　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　２μｌ
２５　ｐｍｏｌ／μｌ　ＲＩＧ．Ｆ７８１＊　２μｌ
２５　ｐｍｏｌ／μｌ　ＧＤ．Ｒ２　　２μｌ
第二鎖産物　２０μｌ
＊注釈：ＲＩＧ．Ｆ７８１，　５’　ＡＣＴＣＡＴＡＧＧＣＣＡＴＡＧＡＧＧＣＣＴＡＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＴＡＡＣＧＣＡＧ　３’（配列番号１３）は、ＧＤ．Ｆ１，　ＧＤ．Ｆ３，　ＧＤ．Ｆ５−Ｂｉｏ，　およびＲＩＧ．Ｆ７５１−Ｂｉｏの下流にアニールし、ｃＤＮＡの５’クローニング用にＳｆｉＩ切断部位を付加する。このプライマーは、ＲＩＧ　エキソン１特異的第二鎖ｃＤＮＡのｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ増幅に用いる。
（ｂ）　サーマルサイクラーの開始：
９４℃、３分
１μｌのＴａｑ（５　Ｕ／μｌ，　Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加；
１μｌのＶｅｎｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌ（０．１　Ｕ／μｌ，　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加
次に（ｃ）〜（ｅ）のステップを１０サイクル繰り返し、ＰＣＲを行った。
（ｃ）　９４℃、３０秒
（ｄ）　６０℃、４０秒
（ｅ）　７２℃、３分
続いて次のステップを行い、ＰＣＲを完了した。
（ｆ）　９４℃、３０秒
（ｇ）　６０℃、４０秒
（ｈ）　７２℃、３分
（ｉ）　７２℃　＋　各サイクル２０秒として１０サイクル分
（ｊ）　７２℃、５分
（ｋ）　４℃、保温
【０３５４】
（１５）　５０μｌのＥＢでライブラリー物質を溶出した後、１０μｌのＮＥＢバッファー２，４０μｌのｄＨ２Ｏ，および２μｌのＳｆｉＩを加えて５０℃で１時間インキュベーションし、ｆｏｒｗａｒｄプライマー（ＲＩＧ．Ｆ７８１；　配列番号１３）でコードされるＳｆｉＩ切断部位でｃＤＮＡの５’末を切断した。
（１６）　ＳｆｉＩ切断後、５μｌの１　Ｍ　ＮａＣｌと２μｌのＮｏｔＩをそれぞれのサンプルに加えて３７℃で１時間インキュベーションし、第一鎖プライマー（ＧＤ．Ｒ１；　配列番号１０）でコードされるＮｏｔＩ切断部位でｃＤＮＡの３’末を切断した。
（１７）　続いて切断したＤＮＡを１％低融点アガロースゲルで分画した。１．２　ｋｂ〜８　ｋｂの範囲にあるｃＤＮＡをゲルから切り出した。
（１８）　ＱｉａｅｘＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて切り出したアガロースゲルからｃＤＮＡを回収した。４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、全量１０μｌの１ｘＴ４リガーゼバッファー（ＮＥＢ）中で、２μｌのｃＤＮＡ（約３０ｍｇ）を７μｌ（３５ｎｇ）のｐＢＳ−ＨＳＰ（ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩで直鎖状化）にライゲーションした。
【０３５５】
（１９）　ステップ（１８）のライゲーション反応混合液０．５μｌをＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ１０Ｂに形質転換した。
（２０）　１０３コロニー／０．５μｌライゲーションＤＮＡを回収した。
（２１）　以下のように、１２．５μｌ容量のＰＣＲでプライマーＭ１３Ｆ２０およびＪＨ１８２（ＲＩＧエキソン１特異的）を用いて、これらのコロニーをエキソンについてスクリーニングした。
（ａ）　適当数の９６ウェルプレートに１００μｌのＬＢ（選択抗生物質を含む）を分注した。
（ｂ）　単一コロニーを拾って９６ウェルプレートの個々のウェルに播種し、プレートを３７℃のインキュベーターに振盪せずに２〜３時間置いた。
（ｃ）　以下のように、ＰＣＲ反応「マスターミックス」を氷上で調製した。
【０３５６】
【表２】
2004501601.tif 000004
【０３５７】
（ｄ）　ＰＣＲ反応プレートのそれぞれのウェルに１０μｌのマスターミックスを分注した。
（ｅ）　１００μｌのＥ．ｃｏｌｉ培養液から２．５μｌを、ＰＣＲ反応プレートの対応するウェルに移した。
（ｆ）　典型的なＰＣＲサイクル条件でＰＣＲを行った。
（ｉ）　９４℃／２分（細菌の溶解とプラスミドの変性）
（ｉｉ）　９２℃変性で１５分間；６０℃プライマーアニーリングを２０秒；７２℃プライマー伸張を４０秒を３０サイクル
（ｉｉｉ）　７２℃の最終伸張を５分
（ｉｖ）　４℃で保温
（ｇ）　次にＰＣＲ反応液にブロモフェノールブルーを添加した；サンプルを混合し、遠心分離した後、全反応混合液をアガロースゲルにのせた。
【０３５８】
（２３）　２００クローンをスクリーニングしたうち、７８％がベクターのエキソンに関して陽性であった。これらのうち９６クローンをミニプレップ用に培養し、Ｑｉａｇｅｎ　９６−ｗｅｌｌ　ｔｕｒｂｏ−ｐｒｅｐを用いてＱｉａｇｅｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ（１９９７年４月）にしたがい精製した。
（２４）　ＮＥＢバッファー３中、全量２２μｌで２μｌのＤＮＡをＮｏｔＩ，　ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＸｂａＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＩで同時に切断し、１％アガロースゲルで電気泳動することにより多くの重複クローンを除去した。
【０３５９】
結果
このプロトコールにより、２つの異なるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１つめのライブラリー（ＴＭＴ＃１）では、単離した活性化遺伝子８つをシークエンシングした。これら８つの遺伝子のうち、４つの遺伝子は周知の内在性膜タンパク質をコードし、６つは新規遺伝子であった。２つめのライブラリー（ＴＭＴ＃２）では、単離した活性化遺伝子１１個をシークエンシングした。これら１１個の遺伝子のうち、１つの遺伝子は周知の内在性膜タンパク質をコードし、１つの遺伝子は内在性膜タンパク質に相同な部分的にシークエンシングされた遺伝子をコードし、９つは新規遺伝子であった。単離した遺伝子がキャラクタライズされた既知遺伝子に相当する場合はすべて、その遺伝子は内在性膜タンパク質であった。
【０３６０】
それぞれのライブラリーから単離した遺伝子の典型的で顕著なアラインメント（ＧｅｎＢａｎｋから得た）を以下に示す。
【０３６１】
ＴＭＴ＃１の顕著なアラインメント：
2004501601.tif 000005
ＴＭＴ＃２の顕著なアラインメント：
2004501601.tif 000006
【０３６２】
例６：ポリ（Ａ）トラップベクターを用いた内在性遺伝子の活性化
ＨＴ１０８０細胞（１ｘ１０　７細胞）に、１３７Ｃｓ光源を用いて５０ｒａｄｓを照射し、１５μｇの直線化ｐＲＩＧ１４を用いて電気穿孔を行った（図２９Ａ−２９Ｂ）。トランスフェクションの後、細胞を１５０ｍｍシャーレに５ｘ１０６細胞／シャーレでプレーティングした。２４時間後にピューロマイシンを３μｇ／ｍｌとなるよう添加した。細胞は３μｇ／ｍｌピューロマイシンの存在下で１２日間３７℃でインキュベートした。培地は５日ごとに交換した。１２日後にコロニー数を数え、細胞をトリプシン処理し、新しいシャーレに再度プレーティングした。細胞は９０％集密まで増殖させ、凍結保管および遺伝子単離のために収集した。通常、トランスフェクションされた細胞１ｘ１０７個当たり１０００−３０００コロニーが生成された。
【０３６３】
例７：二重ポリ（Ａ）トラップ／ＳＡＴベクターを用いた内在性遺伝子の活性化
１ｘ１０７個のＨＨ１細胞（ＨＰＲＴ−マイナスＨＴ１０８０細胞）１３７Ｃｓ光源を用いて５０ｒａｄｓを照射し、１５μｇの直線化ｐＲＩＧ−２２を用いて電気穿孔を行った。トランスフェクションの後、細胞を１５０ｍｍシャーレに５ｘ１０６細胞／シャーレでプレーティングした。２４時間後、５００μｇ／ｍｌ　Ｇ４８１にネオマイシンを加えた。細胞は５００μｇ／ｍｌ　Ｇ４８１の存在下で、３７℃で４日間インキュベートした。培地は、５００μｇ／ｍｌ　Ｇ４８１およびＡｇＴｈｇを含む新しい培地と交換し、両方の薬剤の存在下でさらに７日間増殖させた。または、ＨＰＲＴ活性の対照として、培地を、５００μｇ／ｍｌ　Ｇ４８１およびＨＡＴ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，メリーランド州ロックビルより入手可能、製造者の推奨濃度で使用）む新しい培地と交換し、両方の薬剤の存在下でさらに７日間増殖させた。トランスフェクションの１２日後、コロニー数を数え、細胞をトリプシン処理し、新しいシャーレに再度プレーティングした。細胞は９０％集密まで増殖させ、凍結保管および遺伝子単離のために収集した。通常、Ｇ４１８／ＡｇＴｈｇ選択を行った細胞は、トランスフェクションされた細胞１ｘ１０１個当たり１０００−３０００コロニーを生成した。これに対して、通常、Ｇ４１８／ＨＡＴ選択を行った細胞は、トランスフェクションされた細胞１ｘ１０７個当たり１００コロニーを生成した。
【０３６４】
例８：活性化遺伝子の単離
本発明の方法を用いて、非標的遺伝子活性化ベクターを真核細胞のゲノム内に組込む。ベクターを複数の細胞に組込むことによって、細胞が異なるベクター活性化遺伝子を発現するライブラリーが生成される。市販のＲＮＡ単離キットを用いて、ＲＮＡをこれらの細胞から単離する。本例では、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｔｒａｃｔ　１０００（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞からＲＮＡを単離する。ＲＮＡは分析および配列決定のために、ｃＤＮＡに転換され、増幅、サイズ分画され、プラスミド内にクローン化される。本プロセスの簡単な説明を示す。
【０３６５】
（１）　４ｍｌのＧＴＣ抽出緩衝液（Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｔｒａｃｔ　１０００Ｋｉｔ−（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１５ｍｌのポリカーボネート製スクリューキャップ付き試験管に入れ、１６８μｌの２−メルカプトエタノールを加えて、７０℃の温浴に入れた。
（２）　処理した各ペレットのために８ｍｌの希釈緩衝液を１５ｍｌのポリカーボネート製スクリューキャップ付き試験管に入れ、１６８μｌの２−メルカプトエタノールを加えて、７０℃の温浴に入れた。
（３）　ゲノムに組込んだ非標的遺伝子活性化ベクターを含む−８０℃保管細胞ペレット（１ｘ１０７−１ｘ１０８細胞）から除去する。４ｍｌのＧＴＣ抽出緩衝液を細胞ペレット上にただちにピペットで加える。ペレットが再懸諾されるまでピペットで出し入れしてから、１５ｍｌのスナップキャップ付きポリプロピレン製試験管に移す。
（４）　８ｍｌの希釈緩衝液を加え、倒置して混合する。
（５）　１０μｌ（５００ｐｍｏｌ）のビオチン化オリゴｄＴプライマーを加え、混合する。
（６）　７０℃で５分間倒置させて放置する。２〜３分ごとに均等に加温されるように確認する。
（７）　Ｓｏｒｖａｌｌ　ＨＢ−６ロータを用いて７８００ｒｐｍ（１０ｋｘｇ）、２５℃で１０分間遠心分離を行う。この間、６ｍｌのストレプトアビジン−常磁性粒子（ＳＡ−ＰＭＰｓ）をＰｏｌｙ（Ａ）Ｔｒａｃｔシステム１０００マグネットによって、６ｍｌの０．５ｘＳＳＣで３回洗浄する。
（８）　３回洗浄後、６ｍｌ　０．５ｘＳＳＣ中にＳＡ−ＰＭＰｓを再懸濁させる。
（９）　ＲＮＡ調製物から上澄液をピペットで除去し、再懸濁させたＳＡ−ＰＭＰｓに加える（除去する際に上澄をペレットをかき混ぜないように注意すること）。
（１０）　ＳＡ−ＰＭＰ／ＲＮＡを混合させ、室温で２分間インキュベートする。
【０３６６】
（１１）　Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｔｒａｃｔシステム１０００マグネットを用いて磁気ビードを捕捉する。液体の粘度が高いため、すべてのビードがペレット化するまでしばらく時間がかかることに注意する。
（１２）　上澄を流し、２ｍｌピペットを用いて１．７ｍｌ　０．５ｘＳＳＣ中でビードを再懸濁させ、２ｍｌのスクリューキャップ付き試験管に移す。
（１３）　マグネットを用いてＳＡ−ＰＭＰｓを捕捉し、Ｐ１０００を用いて上澄をピペットで除去する。
（１４）　１．７ｍｌ　０．５ｘＳＳＣを加え、試験管を数回倒置させて混合する。
（１５）　ステップ１４および１５をさらに２回繰り返す。
（１６）　ヌクレアーゼを含まない水１ｍｌ中にＳＡ−ＰＭＰｓを再懸濁させ、数回倒置させて混合する。
（１７）　ＳＡ−ＰＭＰｓを捕捉し、ｍＲＮＡをピペットで採取する。
（１８）　０．５ｍｌのｍＲＮＡを２個のシリコン処理エッペンドルフ試験管に入れ、５０μｌのＤＥＰＣ処理３ＭＮａＯＡｃ溶液および０．５５ｍｌのイソプロパノールを加える。数回倒置させて混合し、−２０℃で少なくとも４時間置く。
（１９）　ｍＲＮＡを１０分間、最大ＲＰＭ（１４ｋ）で遠心分離にかける。
（２０）　注意して上澄をピペットで採取し、２分間、１４ｋ　ＲＰＭで再度遠心分離にかけて、２００μｌの８０％エタノールでペレットを洗浄する。ペレットの色がしばしば茶色または黄褐色であることに注意する。この色は残留ＳＡ−ＰＭＰｓより生じる。
【０３６７】
（２１）　洗浄液を除去し、ペレットを室温で１０分を超えないように風乾させる。
（２２）　ペレットをそれぞれ５μｌずつ再懸濁させ、１個の試験管で一緒にする。
（２３）　１４ｋ　ＲＰＭで２分間遠心分離にかけて、残留ＳＡ−ＰＭＰを除去し、注意深くｍＲＮＡを除去する。
（２４）　０．５μｌを９９．５μｌの水で希釈し、ＯＤ２６０を測定して、ｍＲＮＡの濃度を決定する。１ＯＤ２６０＝４０μｇＲＮＡであることに注意する。
（２５）　試験サンプルおよび負の対照（ＨＴ１０８０）の両方のために、ＰＣＲ装置を４℃に維持しながら以下成分を連続して加えて、第１鎖反応を開始するステップ１。
４２μｌ　ＤＥＰＣ−処理ｄｄＨ２Ｏ
４μｌ　１０ｍＭ各ｄＮＴＰ
８μｌ　０．１ＭＤＴＴ
１６μｌ　５ｘＭＭＬＶ第１鎖緩衝液
５μｌ　（１０ｐｍｏｌ／μｌ）ＧＤＲ１
１μｌ　ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
４μｌ　（１．２５μｇ／μｌ）ｍＲＮＡ
ステップ２：７０℃／１分
ステップ３：４２℃／維持
ステップ４：１分後、２μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｒ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；メリーランド州ロックビル）を加え、３７℃で３０分間インキュベートする。
ステップ５：９４℃／２分
ステップ６：４℃／∞
ステップ７：２μｌのＲＮａｓｅを加え、３７℃で１０分間インキュベートする。
ステップ８：４℃／∞
（２６）　１％アガロースゲル上で８μｌのＤＮＡを分析して、ｃＤＮＡ合成を確認し、７０μｌの第１鎖反応液を１．５ｍｌ　シリコン処理エッペンドルフ試験管に移し、４００μｌのＰＢを加えて、ＱｉａｇｅｎのＰＣＲクリーンアップキットを用いた残りのｃＤＮＡを生成する。
（２７）　ＰＣＲクリーンアップカラムに移し、最大ＲＰＭで２分間遠心分離する。
（２８）　カラムを分解し、流出物を完全に排出する。７５０μｌのＰＥを加え、最大ＲＰＭで２分間遠心分離する。
（２９）　カラムを分解し、流出物を完全に排出し、最大ＲＰＭで２分間遠心分離し、乾燥樹脂を得る。
（３０）　５０μｌのＥＢを用いて完全に溶出し、カラムを新しいシリコン処理エッペンドルフ試験管に移し、最大ＲＰＭで２分間遠心分離する。
【０３６８】
（３１）　第２鎖ｃＤＮＡ合成をＲＴで開始する。
Ｈ２Ｏ　８．５μｌ
１０ｘＰＣＲ緩衝液　５μｌ
５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２　２．５μｌ
１０ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　１μｌ
２５ｐｍｏｌ／μｌ　ＧＤＦ５Ｂｉｏ　１０μｌ
２５ｐｍｏｌ／μｌ　ＧＤＲ２　１０μｌ
第１鎖生成物　１５μｌ
ステップ９：９４℃／１分
ステップ１０：６０℃／１０分
０．２５μｌ　Ｔａｑポリメラーゼを加える。
ステップ１１：６０℃／２分
ステップ１２：７２℃／１０分
ステップ１３：９４℃／１分
ステップ１４：分「ステップ１１」へ戻りさらに４回
ステップ１５：６０℃／２分
ステップ１６：７２℃／１０分
ステップ１７：終了
【０３６９】
（３２）　ＳＴＥで３回洗浄し、マグネットで収集して、１００μｌのＳＡ−ＰＭＰｓを調製する。最終洗浄の後、ビードを１５０μｌ　ＳＴＥ中に再懸濁する。
（３３）　ＱｉａｇｅｎのＰＣＲクリーンアップキットを用いて第２鎖反応の生成物を精製する。５０μｌのＥＢを用いて溶出し、第２鎖反応の生成物を１５０μｌのＰＭＰｓに加える。
（３４）　ＲＴにて静かに３０分間撹拌する。
（３５）　結合後、マグネットを使用してＳＡ−ＰＭＰｓを収集し、物質によって流出物を回収する（この物質を取っておくこと！）。
（３６）　ビードを５００μｌ　ＳＴＥで３回、ＮＥＢ　２（１ｘ）で１回洗浄する。
（３７）　ビードを１００μｌ　ＮＥＢ　２（１ｘ）中に再懸濁する。
（３８）　２μｌ　Ｓｆｉｌを加え、１０分ごとに静かに混合して５０℃で３０分間消化する。
（３９）　マグネットを用いて精製ｃＤＮＡを回収し、上澄を注意深く除去する。
（４０）　生成物を新しい試験管に移し、最大ＲＰＭで２分間遠心分離にかけ、すべてのビードを除去する。
【０３７０】
（４１）　特にＲＡＧＥ活性化ｃＤＮＡを増幅するために、ＰＣＲ反応を開始する。
Ｈ２Ｏ　３７μｌ
１０ｘＰＣＲ緩衝液　１０μｌ
１０ｍＭ　ｄＮＴＰｓ　２μｌ
２５ｐｍｏｌ／μｌ　ＧＤＦ７８１　　１０μｌ
２５ｐｍｏｌ／μｌ　ＧＤＲ２　　１０μｌ
第２鎖生成物　２５μｌ
ステップ１：９４℃／２分
ステップ２：９４℃／４５秒
ステップ３：６０℃／１０分
０．５μｌ　Ｔａｑポリメラーゼを加える。
ステップ４：７２℃／１０分
ステップ５：９４℃／４５秒
ステップ６：６０℃／２分
ステップ７：７２℃／１０分
ステップ８：さらに８回ステップ５まで繰り返す
ステップ９：９４℃／４５秒
ステップ１０：６０℃／２分
ステップ１１：７２℃／１０分＋各サイクルごとに２０秒
ステップ１２：さらに１４回、ステップ９まで繰り返す
ステップ１３：７２℃／５分
ステップ１４：４℃保持
【０３７１】
（４２）　ライブラリー物質に対するＨＴ１０８０のＰＣＲ増幅の特異性を、１％アガロースゲル上での分析によって確認する。ｃＤＮＡ増幅に高い特異性がある場合は、Ｑｉａｇｅｎ　ＰＣＲクリーンアップキットを用いてＰＣＲ生成物を精製する。
（４３）　５０μｌのＥＢでライブラリー物質を溶出させた後、１０μｌ　ＮＥＢ２、４０μｌ　ｄＨ２Ｏおよび２μｌ　ＳｆｉＩを加え、５０℃で１時間消化する。
（４４）　５μｌの１Ｍ　ＮａＣｌおよび２μｌのＮｏｔＩを加え、３７℃で１時間消化する。
（４５）　１％Ｌ．Ｍ．アガロースゲルを調製し、ゲル上でライブラリー物質を移動させる。物質を描出した後、５００ｂｐ〜１０ｋｂの大きさでフラグメントを切り出す。
（４６）　ＱｉａｅｘＩＩゲル抽出プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてライブラリーＤＮＡを回収し、１０μｌ　ＥＢ中にＤＮＡを溶出させる。この物質５μｌを４μｌのｐＢＳ−ＨＢＳ（ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）またはｐＢＳ−ＳＮＳに連結させ、総体積を１０μｌとする。
（４７）　Ｅ．コリを、４０μｌ細胞当たり０．５μｌ連結ＤＮＡを用いて転換する。
（４８）　コロニーを選び、一晩ＬＢ中で増殖させ、プラスミドを単離する。
（４９）　制限消化およびＤＮＡ配列決定によって、遺伝子活性化ｃＤＮＡインサートを分析する。
【０３７２】
例９：減算ｃＤＮＡプールからの活性化遺伝子の単離
例８、ステップ１−２４で述べたように、Ｐｏｌｙ−Ａ　Ｔｒａｃｔ　１０００システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、トランスフェクションされていないＨＴ１０８０細胞から精製ｍＲＮＡを調製し、ＥＺ−ＬｉｎｋＴＭ　Ｂｉｏｔｉｎ　ＬＣ−ＡＳＡ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて以下のようにビオチン化した。
１）　２５μｌ　ＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏおよび１０μｇのＨＴ１０８０を含む１５μｌのｍＲＮＡをシリコン処理微量遠心管に入れ、氷上で維持する。
２）　抑制光のもとで作業し、反応管に４０μｌの調製ＬＣ−ＡＳＡストック試薬（１００％エタノール中に１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。
３）　紫外線光（３６５ｎｍ波長）を微量遠心管の５ｃｍ上に配置し、反応混合物に１５分間照射するのに用いた。
４）　未結合ビオチン試薬を標識ＨＴ１０８０ｍＲＮＡから除去し、反応混合物をＲＮａｓｅフリーＭｉｃｒｏＳｐｉｎ　Ｐ−３０カラム（ＢｉｏＲａｄ）に、製造者の指示どおり通過させた。
【０３７３】
ＨＴ１０８０細胞は、ポリ（Ａ）トラップｐＲＩＧ活性化ベクターを用いてトランスフェクションし、例１で述べたように、薬剤耐性コロニーの個体群を生成するために、選択性培地で増殖させた。プールしたコロニーから、例８で述べたようにＰｒｏｍｅｇａ　Ｐｏｌｙ−Ａ　Ｔｒａｃｔ　１０００システムを用いて、精製したｍＲＮＡを調製した。第１鎖ｃＤＮＡは、オリゴＧＤ．Ｒ１（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣＮＮＮＮＴＴＴＡＴＴ）（配列番号１０）を用いて、例８、ステップ２５で述べたように、５μｇのこのｍＲＮＡから調製した。反応混合物はＱｉａｇｅｎ　ＰＣＲ　Ｑｕｉｃｋ　Ｃｌｅａｎ−ｕｐカラムを通過させ、精製した第１鎖ｃＤＮＡを１００μｌ　ＥＢ中で回収した。
ビオチン化ＨＴ１０８０ｍＲＮＡｓ（サブストラクター個体群）およびｐＲＩＧ−トランスフェクションされたコロニーのスーパープール（標的個体群）から調製した第１鎖ｃＤＮＡ減算ハイブリダイゼーションは以下のように行った。
【０３７４】
１）　９μｇのビオチン化ｍＲＮＡを、０．５μｇの第１鎖ｃＤＮＡを含む０．５ｍｌ微量遠心管に加えた。
２）　１／１００ｘ体積の１０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン、ｐＨ５．５の１／１０ｘ体積の３Ｍ酢酸ナトリウム、２．６体積の１００％エタノールを管に加え、混合した。
３）　管を−８０℃に１時間おき、次に冷蔵微量遠心管で２０分間回転させた。
４）　沈殿核酸のペレットを排水し、７０％エタノールで１回洗浄してから、風乾させた。
５）　ペレットを５μｌのＨＢＳ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ　７．６；２ｍＭ　ＥＤＴＡ；０．２％ＳＤＳ；５００ｍＭ　ＮａＣｌ）中で溶媒和させ、５μｌの軽油を上に重ね、次に２分間９５℃まで加熱した後に、６８℃で２４時間置く。
６）　反応混合物を１００μｌ　ＨＢ（ＳＤＳを含まないＨＢＳ）で希釈し、１００μｌのクロロホルムで軽油を除去する。
７）　３００μｌ　ＨＢ中で３回予備洗浄した３００μｌのストレプトアビジン被覆常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）に、希釈したハイブリダイゼーション混合物を加えた。
８）　混合物を室温で１０分間インキュベートし、磁気捕獲によって、ＳＡ−ＰＭＰおよび結合ビオチン−ｍＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを溶液から除去する。
９）　ステップ７および８を１回繰り返す。
１０）　透明溶液に対して減算ハイブリダイゼーションおよび捕獲ハイブリッドの磁気による除去（ステップ１−９）を、以下の例外を用いて１回行った：
ステップ６：ハイブリダイゼーション反応物を２ｘ　ＰＣＲ緩衝液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４；１００ｍＭ　ＫＣｌ）によって希釈した。
ステップ７：ＰＭＰｓを１Ｘ　ＰＣＲ緩衝液で予備洗浄した。
【０３７５】
２回減算した第１鎖ｃＤＮＡを用い、４５μｌの第１鎖ｃＤＮＡに７μｌ　ｄＨ２Ｏ、５μｌ　５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２μｌの１０ｍＭ各ｄＮＴＰの予備混合物、１μｌ　１０ｘ　ＰＣＲ緩衝液、２０μｌの１２．５ｐｍｏｌ／μｌ　ＧＤ１９Ｆ１−Ｂｉｏ（５’ビオチン−ＣＴＣＧ
ＴＴＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＣＧＡＣＣＴ）（配列番号１４）、２０μｌの１２．５ｐｍｏｌ／μｌ　ＧＤ．Ｒ２（ＴＴＴＴＣＧＴＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＣ）（配列番号１２）、および０．５μｌ　のＴａｑポリメラーゼを、例８、ステップ３１で述べた熱サイクルを用いて結合させ、第２鎖ｃＤＮＡを生成した。第２鎖ｃＤＮＡ生成物は、例８、ステップ３２−４９で述べたように、増幅し、Ｅ．コリベースのｃＤＮＡライブラリーを生成するためにさらに処理した。
【０３７６】
例１０：ＲＩＧ活性化転写産物の選択的捕捉
ＨＴ１０８０細胞は、例６で述べたように、ｐＲＩＧ１９活性化ベクターを用いてトランスフェクションし（図３０Ａ−３０Ｃ）、選択的培地で２週間培養した。すべてのＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｒ）試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，メリーランド州ロックビル）を製造者のプロトコルに従って用いて、１０８個の細胞より成るペレットから調製し、７２０μｌのＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏ（ｄＨ２Ｏ　ＤＥＰＣ）に溶解させた。混在ゲノムＤＮＡは、８０μｌのＮＥＢ　１０ｘ緩衝液２、８μｌのＰｒｏｍｅｇａ　ＲＮａｓｉｎ、２０μｌのＲＱ１　Ｐｒｏｍｅｇａ　ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅを混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、同体積のフェノール：クロロホルム（１：１）およびクロロホルムで連続して抽出し、１／１０ｘ体積の酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と混合し、２ｘ体積の１００％エタノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、乾燥ＲＮＡペレットをｄＨ２Ｏ　ＤＥＰＣ中で溶媒和させることによってＲＮＡ調製物より除去し、最終濃度を４．８μｇ／μｌとした。
【０３７７】
ｐＲＩＧ１９活性化遺伝子に由来するｍＲＮＡ転写産物は、２ｍｌのＲＮａｓｅフリー微量遠心管内で１５０μｌのすべてのＲＮＡ、１５０μｌのＨＢＤＥＰＣ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６；２ｍＭ　ＥＤＴＡ；５００ｍＭ　ＮａＣｌ）、３μｌのＰｒｏｍｅｇａ　ＲＮａｓｉｎ、２．５μｌ（２５ｐｍｏｌ／μｌ）オリゴＧＤ１９．Ｒ１−Ｂｉｏ（表１を参照）を混合し、次に７０℃で５分間、次で５０℃で１５分間インキュベートして、細胞ＲＮＡ全体のプールから選択的に捕捉した。１ｍｌのＰｒｏｍｅｇａストレプトアビジン被覆常磁性粒子（ＳＡ−ＰＭＰｓ）を磁気的に捕捉し、１．５ｍｌの０．５ｘ　ＳＳＣでそれぞれ３回洗浄し、ＳＡ−ＰＭＰｓは再懸濁せずに放置した。温かいオリゴ：ＲＮＡハイブリダイゼーション反応物を、半乾燥ＳＡ−ＰＭＰｓを含む管に直接加えた。室温で１０分間インキュベートした後、ＳＡ−ＰＭＰを１ｍｌの０．５ｘＳＳＣで３回洗浄した。
【０３７８】
【表３】
2004501601.tif 000007
【０３７９】
最後の磁気捕捉の後、ＳＡ−ＰＭＰｓは１９０μｌのｄＨ２ＯＤＥＰＣａｎｄで懸濁し、６８℃で１５分間インキュベートした。ＰＭＰは、磁気への曝露によって固定化され、ＲＩＧ活性化転写産物を含む澄んだ溶液を微量遠心管に移した。６３μｌの捕捉ＲＩＧ活性化転写産物をＰＣＲ管に移し、ここで第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、ＰＣＲプログラム「１＋２ＣＤＮＡ」を用いて以下のように行った。
【０３８０】
ステップ１：
４℃／∞：ＲＩＧ活性化転写産物を含むＰＣＲ管に、２０μｌ　５ｘ　ＧｉｂｃｏＢＲＬ　ＲＴ緩衝液、１μｌ　Ｐｒｏｍｅｇａ　ＲＮａｓｉｎ、１０μｌ　１００ｍＭ　ＤＴＴ、それぞれ１０ｍＭの５μｌ　ｄＮＴＰ予備混合物、１μｌ　オリゴＧＤ．Ｒ１（表１を参照）を２５ｐｍｏｌ／μｌの濃度で加えた。
ステップ２：７０℃／３分
ステップ３：４２℃／１０分
ステップ４：２．５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｒ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を加え、次に３７℃で１時間インキュベートした。
ステップ５：９４℃／２分
ステップ６：４℃／∞
【０３８１】
第１鎖ｃＤＮＡ混合物に、２μｌのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ　ＲＮａｓｅ−Ｉｔを加え、混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。６００μｌのＱｉａｇｅｎ　ＰＢ試薬を反応物に加えた後、Ｑｉａｇｅｎ　ＰＣＲクリーンアップカラムに移し、製造者の指示に従って処理した。ｃＤＮＡを５０μｌのＥＢ中でカラムから溶出させ、ＰＣＲ管に移した。第２鎖ｃＤＮＡ反応は、例９で述べたように、オリゴＧＤ１９．Ｆ２−Ｂｉｏ（表１）およびＧＤ．Ｒ２（表１）を用いて実施した。第２鎖生成物は、ＳＡ−ＰＭＰｓの最終懸濁液は１ｘＮＥＢ　４緩衝液中にあり、捕捉ｃＤＮＡは制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩを用いて粒子から開裂させたことを除き、オリゴＧＤ１９．Ｆ２およびＧＤ．Ｒ２を用いた第２鎖ｃＤＮＡ生成物の増幅、エンドヌクレアーゼＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを用いた増幅ｃＤＮＡの消化、クローニング前のｃＤＮＡのサイズ選択はすべて、例９で述べたように実施した。最終ｃＤＮＡクリーンアップは、ｃＤＮＡプールをＱｉａｇｅｎ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎｕｐカラムから３０μｌのＥＢ中で溶出さえることによって実施した。１１μｌのｃＤＮＡを４μｌの５ｘ　ＧｉｂｃｏＢＲＬリガーゼ緩衝液、ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩおよびＣＩＰによる消化によって以前に調製した４μｌ　ｐＧＤ５ベクターＤＮＡと混合した。１μｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼを加え、反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした。１μｌの連結反応物を用いて、電気能力のあるＥ．コリ　ＤＨ１０Ｂ細胞を変換し、次に１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールのＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。通常、変換された連結混合物μｌ当たり６０〜８０個の細菌コロニーが回収された。
【０３８２】
例１１：ＲＩＧ活性化転写産物の選択的捕捉
ＨＴ１０８０細胞はｐＲＩＧ１９活性化ベクターによってトランスフェクションし、例６で述べたように選択的培地で２週間培養した。すべてのＲＮＡはＴ、ＲＩｚｏｌ（Ｒ）試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，メリーランド州ロックビル）を製造者のプロトコルに従って用いて、１０８個の細胞より成るペレットから調製し、７２０μｌのＤＥＰＣ処理ｄＨ２Ｏ（ｄＨ２Ｏ　ＤＥＰＣ）に溶解させた。混在ゲノムＤＮＡは、８０μｌのＮＥＢ　１０ｘ緩衝液２、８μｌのＰｒｏｍｅｇａ　ＲＮａｓｉｎ、２０μｌのＲＱ１　Ｐｒｏｍｅｇａ　ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅを混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、同体積のフェノール：クロロホルム（１：１）およびクロロホルムで連続して抽出し、１／１０ｘ体積の酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）と混合し、２ｘ体積の１００％エタノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、乾燥ＲＮＡペレットをｄＨ２Ｏ　ＤＥＰＣ中で溶媒和させることによってＲＮＡ調製物より除去し、最終濃度を４．８μｇ／μｌとした。
【０３８３】
ｐＲＩＧ１９活性化遺伝子に由来するｍＲＮＡ転写産物は、２ｍｌのＲＮａｓｅフリー微量遠心管内で１５０μｌのすべてのＲＮＡ、１５０μｌのＨＢＤＥＰＣ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６；２ｍＭ　ＥＤＴＡ；５００ｍＭ　ＮａＣｌ）、３μｌのＰｒｏｍｅｇａ　ＲＮａｓｉｎ、２．５μｌ（２５ｐｍｏｌ／μｌ）オリゴＧＤ１９．Ｒ１−Ｂｉｏ（表１を参照）を混合し、次に７０℃で５分間、次で５０℃で１５分間インキュベートして、細胞ＲＮＡ全体のプールから選択的に捕捉した。１ｍｌのＰｒｏｍｅｇａストレプトアビジン被覆常磁性粒子（ＳＡ−ＰＭＰｓ）を磁気的に捕捉し、１．５ｍｌの０．５ｘ　ＳＳＣでそれぞれ３回洗浄し、ＳＡ−ＰＭＰｓは再懸濁せずに放置した。温かいオリゴ：ＲＮＡハイブリダイゼーション反応はセミ−ドライＳＡ−ＰＭＰｓを含む間の中へ直接加えられる。室温で１０分間インキュベートした後、ＳＡ−ＰＭＰｓは１ｍｌ　０．５ｘＳＳＣで３回洗浄した。最後の磁気捕捉の後、ＳＡ−ＰＭＰｓは１９０μｌのｄＨ２ＯＤＥＰＣで懸濁し、６８℃で１５分間インキュベートした。ＰＭＰは、磁気への曝露によって固定化され、ＲＩＧ活性化転写産物を含む澄んだ溶液を微量遠心管に移した。６３μｌの捕捉ＲＩＧ活性化転写産物をＰＣＲ管に移し、ここで第１鎖および第２鎖ｃＤＮＡ合成を、ＰＣＲプログラム「１＋２ＣＤＮＡ」を用いて以下のように行った。
【０３８４】
ステップ１：
４℃／∞：ＲＩＧ活性化転写産物を含むＰＣＲ管に、２０μｌ５ｘＧｉｂｃｏＢＲＬ　ＲＴ緩衝液、１μｌ　Ｐｒｏｍｅｇａ　ＲＮａｓｉｎ、１０μｌ　１００ｍＭ　ＤＴＴ、それぞれ１０ｍＭの５μｌ　ｄＮＴＰ予備混合物、１μｌ　オリゴＧＤ．Ｒ１（表１を参照）を２５ｐｍｏｌ／μｌの濃度で加えた。
ステップ２：７０℃／３分
ステップ３：４２℃／１０分
ステップ４：２．５μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｒ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を加え、次に３７℃で１時間インキュベートした。
ステップ５：９４℃／２分
ステップ６：６０℃／∞；温度を維持しながら、以下を加えた。２０μｌの５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１μｌの２５ｐｍｏｌ／μｌオリゴＧＤ１９．Ｆ１−Ｂｉｏ（表１）、２μｌのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ　ＲＮａｃｅ−Ｉｔ。１０分後、０．５μｌのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を加え、サイクルを続けた。
ステップ７：７２℃／１０分
ステップ８：４℃／∞
【０３８５】
１００μｌ　の体積のｃＤＮＡ反応混合物を１．５ｍｌのシリコン処理微量遠心管に移し、同体積のフェノール：クロロホルム（１：１）およびクロロホルムによって連続的に抽出し、水相を新たな管に移して、３７℃で５分間、スピードバック内に置いた。ｃＤＮＡの制限消化は、７４μｌ　ｄＨ２Ｏ、２０μｌ　ＮＥＢ　１０ｘ緩衝液２、２μｌ　１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、４μｌ　ＳｆｉＩを加え、５０℃で１時間インキュベートした後、１０μｌ　１Ｍ　ＮａＣｌ、４μｌ　ＮｏｔＩを加え、３７℃で１時間インキュベートして行った。反応混合物は同体積のフェノール：クロロホルム（１：１）およびクロロホルムを用いて連続的に抽出し、次に１／１００ｘ体積の１０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン、１／３０ｘ体積の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、２ｘ体積の１００％無水エタノールを用いてｃＤＮＡを沈殿させ、−８０℃で１時間凍結させた。ｃＤＮＡペレットを７０％エタノールで１回戦上司、１５分間風乾させた後、５μｌのｄＨ２Ｏ、１μｌの１０Ｘ　ＮＥＢリガーゼ緩衝液、ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩおよびＣＩＰによる消化により以前調製した４μｌのｐＧＤ５ベクターＤＮＡ中で溶媒和させた。０．５μｌのＴ４　ＤＮＡリガーゼを加え、反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした。１０μｌ　ｄＨ２Ｏを連結反応物に加え、０．５μｌを用いて電気能力Ｅ．コリ　ＤＨ１０Ｂ細胞を変換した。一般に、変換連結混合物１μｌ当たり６〜１０個のコロニーが見られた。
【０３８６】
例１２：活性化ベクターのゲノムＤＮＡへの連結とヒト細胞へのトランスフェクション
ゲノムＤＮＡは、発表された手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８９））に従って、ヒト細胞系、ＨＴ１０８０（１０８細胞）から収集した。単離ゲノムＤＮＡは、不完全消化が行われる条件下でＢａｍＨＩによって消化した。これは、反応物中にＢａｍＨＩの量を滴定することによって行える。各反応物は、１０μｇのゲノムＤＮＡと濃度が０．０１、０．０２、０．０４、０．０８、０．１６、０．３２、０．６４、１．２８、２．５６、５．６２または１１．２４ユニットのいずれかであるＢａｍＨＩを含んでいた。３７℃で１時間インキュベートした後、反応をフェノール抽出によって停止させ、次いでエタノール沈殿させた。各反応物による消化ＤＮＡは、アガロールゲル電気泳動によって分離した。主として１０ｋｂ〜４００ｋｂの範囲のＤＮＡを含む反応物は、活性化ベクターに連結させるために一緒にした。プールされた消化ゲノムＤＮＡは次に、連結緩衝液中のＢａｍＨＩ直線化活性化ベクターに加えた。リガーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，４０ユニット）を加え、連結反応物を１６℃で２４時間インキュベートした。連結の後、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｒ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて製造者の手順に従って、ゲノムＤＮＡ／活性化ベクターをＨＴ１０８０細胞内にトランスフェクションした。随意に、トランスフェクション前後にＨＴ１０８０細胞に照射した。細胞に照射する場合、０．１〜２００ｒａｄｓの線量範囲が特に有用であることがわかった。トランスフェクションの後、細胞は完全培地で増殖させた。トランスフェクションの３６時間後、Ｇ４１８（３００μｇ／ｍｌ）を培地に加えた。選択の１０〜１４日後、薬剤耐性クローンをプールし、膨張させ、収集した。すべてのＲＮＡまたはｍＲＮＡは収集細胞から採取した。次に、本明細書で述べた方法を用いて、ベクター活性化遺伝子由来のｃＤＮＡを合成および単離した（たとえば上の例８を参照）。
【０３８７】
例１３：ＢＡＣコンティグクローンの活性化ベクターによる共トランスフェクション
ゲノムライブラリーは、発表された手順（Ｓｈｉｚｕｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：８７９４（１９９２））に従って、ｐＵｎｉＢＡＣ（図３４Ａ−３４Ｂ）内に生成した。通常、ゲノムフラグメントのサイズは１ｋｂ〜５００ｋｂであり、５０ｋｂ〜５００ｋｂであることが好ましい。ＢＡＣライブラリーは、Ｅ．コリ内で伝播させた。トランスフェクション用のプラスミドを調製するために、ライブラリーを１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。各１５０ｍｍプレート上に約１０００個のクローンが存在した。増殖および選択の後、ＬＢを加えて各プレートからのコロニーを溶出させ、プールした。各プール（〜１０，０００クローン）は、１リットルのＬＢ／１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール中で一晩増殖させた。次に、市販キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＢＡＣプラスミドを各プールから単離した。
【０３８８】
精製ＢＡＣクローンは、クローニング部位の側面にあるＢＡＣベクター内の独自の部位を開裂するＩ−Ｐｐｏ−Ｉを用いて消化した。Ｉ−Ｐｐｏ−Ｉは非常に珍しいカッターであるため、ゲノムＤＮＡインサートの大部分を消化しない。消化の後、直線化ゲノムライブラリークローンは、製造者の指示に従ってＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｒ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてＨＴ１０８０細胞に共トランスフェクションされた。簡単には、１０μｇのＢＡＣゲノムＤＮＡをαーＭＥＭ（血清なし）中で１μｇの直線化ｐＲＩＧ２０（図３１Ａ−３１Ｃ）と結合させた。５μｇのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｒ）をＤＮＡに加え、混合物を室温で１５分間インキュベートした。次にＤＮＡ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｒ）混合物を、６ウェルシャーレ内の１０５ＨＴ１０８０細胞に加えた。細胞はＤＮＡ／ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｒ）を用いて血清を含まないαーＭＥＭ中で１２時間インキュベートし、洗浄し、ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に３６時間置いた。ベクターおよびゲノムＤＮＡを組込んだ細胞を選択するために、トランスフェクションされた細胞を１０ｃｍシャーレに再度プレーティングし、３００μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８の存在下で１０日間インキュベートした。薬剤耐性クローンを膨張および収集し、本明細書の例８で述べたように活性化ｃＤＮＡ分子を単離した。
【０３８９】
例１４：活性化ベクターの精製ゲノムＤＮＡへのインビトロ組込および組込生成物の宿主細胞へのトランスフェクション
ゲノムＤＮＡは単離し、発表された手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）；Ｓｈｉｚｕｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：８７９４（１９９２））を用いて、細菌性人工染色体、ｐＵｎｉＢＡＣ（図３４Ａ−３４Ｂ）内へクローン化した。ゲノムインサートをｐＵｎｉＢＡＣ内に連結した後、プラスミドをＥ．コリ菌株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）内にトランスフェクションし、テトラサイクリン上で選択した。個々の細菌性クローンを合わせて、約１０００のメンバを含むプールに入れた。各プールを１リットルのＬＢ／テトラサイクリン中で飽和するまで増殖させた。ゲノムＤＮＡインサートを含むｐＵｎｉＢＡＣプラスミドは、市販キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細菌から単離した。
【０３９０】
ＵｎｉＢＡＣクローンの各プールでは、２μｇのライブラリーを、５０ｎｇの活性化ベクターｐＲＩＧ−Ｔおよび１ユニットの突然変異Ｔｎ５トランスポザーゼ（トランスポザーゼはＥｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）によって、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、ｐＵｎｉＢＡＣクローンをＤＨ１０Ｂ細胞内に形質転換し、クロラムフェニコール上で選択した。各プールのすべてのコロニーを合わせ、１リットルのＬＢ／クロラムフェニコール中で増殖させた。プラスミドは、製造者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ　Ｔｉｐ−５００を用いて収集した。
【０３９１】
各プールでは、２０μｇのライブラリーを、製造者の指示に従って３０μｇのＥｘ−ｇｅｎ５００（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて、２ｘ１０６ＨＴ１０８０細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、３μｇ／ｍｌピューロマイシンを含む培地内に細胞を入れた。ピューロマイシンの存在下で１０日間増殖させた後、薬剤耐性クローンをプールし、膨張し、遺伝子発見のために収集した。ベクター活性化遺伝子を単離するために、例８で述べたように、細胞の各プールによるｍＲＮＡを単離して、ｃＤＮＡに変換し、プラスミド内へクローン化した。個々のｃＤＮＡクローンは、制限消化および配列決定によって分析した。
【０３９２】
例１５：クローン化ゲノムＤＮＡによるタンパク質発現ライブラリーの作成
ゲノムＤＮＡインサートを含むゲノムライブラリー（平均サイズ１００ｋｂ）は、例１３および１４で述べたように、ｐＵｎｉＢＡＣ内で作成した（注記：本発明の一部の実施形態において、ゲノムフラグメントは活性化ベクターの直線化部位にクローン化される。その場合、活性化ベクターはＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣまたはコスミドベースベクターであることが好ましい）。本例では、活性化ベクターｐＲＩＧ−ＴＰは、例１４で述べたように、インビトロ転位を用いたＢＡＣゲノムライブラリー中に組込んだ。ｐＲＩＧ−ＴＰを図３６に示す。組込の後、ライブラリープラスミドは、Ｅ．コリに形質転換され、組込ｐＲＩＧ−ＴＰベクターを含むＢＡＣベクターをクロラムフェニコールプレート上で選択した。コロニーをプールし、ＬＢ／テトラサイクリン中で飽和するまで増殖させた。ＢＡＣプラスミドは市販キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて収集した。
【０３９３】
各トランスフェクションでは、２０ｕｇのＢＡＣライブラリーを、製造者の指示に従って３０ｕｇ　Ｅｘ−ｇｅｎ　５００（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて、２ｘ１０６ＨＴ１０８０細胞内にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、３μｇ／ｍｌピューロマイシンを含む培地内に細胞を入れた。選択の１０日後、薬剤耐性をクローンをプールおよび膨張させた。膨張させた薬剤耐性クローンのプールは、凍結、タンパク質生成およびエピソーム増幅のために別個のグループに分割した。
活性化分泌タンパク質を単離および試験するために、培養上澄を収集し、特異性アッセイで使用するまで−８０℃で保存した。活性化細胞内タンパク質は（当分野で周知の任意の方法によって調製した）細胞溶解物から収集し、インビトロアッセイで使用した。
【０３９４】
ＢＡＣエピソームの複製数を増幅するために、メトトレキサートの濃度を上昇させて細胞を選択した。これらの実験では、メトトレキサートの初期濃度は２０ｎＭであった。メトトレキサート濃度は、５μＭに耐性の細胞が得られるまで、７日ごとに倍にした。メトトレキサートの各濃度において、細胞の一部を保存およびタンパク質生成のために除去した。非メトトレキサート選択細胞について述べたように、活性化分泌および細胞内タンパク質をこれらの細胞から収集した。
【０３９５】
理解を確実にする目的で本発明を説明と例によりある程度詳細に十分に記述したが、本発明あるいはその特異的実施態様の範囲に影響を及ぼすことなく、広範で同等の条件、組成、および他のパラメータ範囲内で本発明を修飾あるいは変更して同様のことが実施実施可能であること、そうした修飾あるいは変更が添付のクレーム内に包含されることは、当業者には明らかであろう。
【０３９６】
この明細書で述べた刊行物、特許、および特許出願はすべて本発明に関連する当業者の熟練レベルを示しており、これらは、各刊行物、特許、あるいは特許出願が明示的に個々にあるいは個別に引用して本明細書の一部をなすものとされるように、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】本明細書に記載した遺伝子活性化事象の概略図。活性化構築物を細胞にトランスフェクトし、宿主細胞染色体のＤＮＡ破壊位置に組込ませる。破壊が目的の遺伝子の上流で生じ（例えば、Ｅｐｏ）、適当な活性化構築物が破壊位置に取込まれ、よって、その調節配列が目的の遺伝子に機能的に結合するようになる場合、遺伝子の活性化が生じる。転写およびスプライシングにより、活性化構築物由来および内在性遺伝子由来のエキソン配列を含むキメラＲＮＡ分子が産生される。続く翻訳により、目的のタンパク質が産生される。組換え細胞を単離した後、遺伝子発現はさらに遺伝子増幅により増強することができる。
【図２】翻訳されていない活性化構築物の概略図。矢印は、プロモーター配列を示す。エキソン配列は、白抜きのボックスで示され、スプライスドナー配列はＳ／Ｄにより示される。下記の明細書に対応する構築物番号は左に示される。選択および増幅マーカーは示していない。
【図３】翻訳された活性化構築物の概略図。矢印はプロモーター配列を示す。エキソン配列は、白抜きのボックスで示され、スプライスドナー配列はＳ／Ｄにより示される。翻訳された、シグナルペプチド、エピトープタグ、およびプロテアーゼ開裂配列は、構築物の下の説明に示す。下記の明細書に対応する構築物番号は左に示される。選択および増幅マーカーは示していない。
【図４】内在性遺伝子を活性化できる活性化構築物の概略図。
【図５Ａ−５Ｄ】ｐＲＩＧ８Ｒ１−ＣＤ２のヌクレオチド配列（配列番号７）。
【図６Ａ−６Ｃ】ｐＲＩＧ８Ｒ２−ＣＤ２のヌクレオチド配列（配列番号８）。
【図７Ａ−７Ｃ】ｐＲＩＧ８Ｒ３−ＣＤ２のヌクレオチド配列（配列番号９）。
【図８Ａ−８Ｆ】ポリ（Ａ）トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。未翻訳領域は斜線ボックスで表示され、リーディングフレームは白色ボックスで表示されている。以下の呼称を使用した。スプライスドナー部位（Ｓ／Ｄ）、シグナル分泌配列（ＳＰ）、エピトープ標識（ＥＴ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）。図８Ｂ−８Ｆに示したベクターでは、Ｎｅｏ遺伝子のすぐ下流のスプライス供与体部位を省略することができる。Ｎｅｏ遺伝子および下流プロモーターの間のスプライス供与体部位を欠失したベクターの場合、Ｎｅｏ転写産物は下流プロモーターの３’
に位置するスプライス供与体部位を利用する。さらに、図８Ｂ−８Ｅに示したベクターのように、下流プロモーターはエキソンを発現させることができる。このエキソンは、存在する場合、任意のリーディングフレーム内のコドンをコードする。複数のベクターを使用して、３つの予想リーディングフレーム内それぞれのコドンを作成できる。
【図９Ａ−９Ｆ】単一のプロモーターによって駆動されるポジティブネガティブ選択マーカーを含む、スプライス受容体トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。未翻訳領域は斜線ボックスで表示されている。ポリ（Ａ）シグナルはこれらの例には存在しない。しかし、明細書で述べるように、ポリ（Ａ）シグナルは選択マーカーの片側または両側のベクター３’に配置されることが
ある。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、シグナル分泌配列（ＳＰ）、エピトープ標識（ＥＴ）、内部リボソームエントリー部位（ｉｒｅｓ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）。これらの例において、Ｎｅｏはポジティブ選択マーカーを表し、ＨＰＲＴはネガティブ選択マーカーを表す。図９Ｃおよび９Ｆに示したベクトルにおいて、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを含む。詳細な説明に記載するように、エキソンはメチオニン残基、部分シグナル配列、全シグナル分泌配列、タンパク質の一部またはエピトープ標識をコードできる。さらに、コドンはスプライス供与体部位に対応するどのリーディングフレーム内に存在してもよい。表示していない他のベクター例において、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを欠失している。
【図１０Ａ−１０Ｆ】各種プロモーターによって駆動されるポジティブネガティブ選択マーカーを含む、スプライス受容体トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。未翻訳領域は斜線ボックスで表示されている。ポリ（Ａ）シグナルはこれらの例には存在しない。しかし、明細書で述べるように、ポリ（Ａ）シグナルは選択マーカーの片側または両側のベクター３’に配置されることがあ
る。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、内部リボソームエントリー部位（ｉｒｅｓ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）。図１０Ａ−１０Ｆに示すベクターでは、Ｎｅｏはポジティブ選択マーカーを表し、ＨＰＲＴはネガティブ選択マーカーを表す。示されているように、図１０Ａ−１０Ｆに示したベクターは、Ｎｅｏ遺伝子のスプライス供与体部位３’を含まない；しかし、表示して
いない他のベクターでは、スプライス供与体はＮｅｏ遺伝子の３’に位置し、ポジティブ選択マ
ーカーの内在性エキソンへのスプライスを促進する。図１０Ｃおよび１０Ｆに示したベクターでは、エキソンを示す領域が翻訳開始コドンを含む。詳細な説明に記載するように、エキソンはメチオニン残基、部分シグナル配列、全シグナル分泌配列、タンパク質の一部またはエピトープ標識をコードできる。さらに、コドンはスプライス供与体部位に対応するどのリーディングフレーム内に存在してもよい。表示していない他のベクター例において、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを欠失している。
【図１１Ａ−１０Ｃ】双方向活性化ベクターの概略図。矢印はプロモーター配列を示す。エキソンは格子ボックスとして示し、スプライス供与体部位はＳ／Ｄによって示す。斜線ボックスは、上流プロモーターに動作可能に結合したエキソン配列を示す。これらのベクターのエキソンは未翻訳であるか、本明細書で述べるように開始コドンおよび付加コドンを含むことが理解される。図１１Ｂ−１１Ｃに記載されたベクターに示されているように、ベクターは選択マーカーを含んでいてもよい。これらのベクターでは、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）遺伝子が示されている。図１１Ｂでは、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）が選択マーカーの下流に位置する。図１１Ｃでは、ポリアデニル化シグナルはベクトルから省略されている。
【図１２Ａ−１２Ｇ】活性化内在性遺伝子からエキソンＩを回収するのに有用なベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。未翻訳領域は斜線ボックスで表示されている。ポリ（Ａ）シグナルはこれらの例には存在しない。しかし、詳細な説明で述べるように、ポリ（Ａ）シグナルは選択マーカーの片側または両側のベクター３’に配置されることがある。以下の呼称を使用した。スプライス供与体
部位（Ｓ／Ｄ）、内部リボソームエントリー部位（ｉｒｅｓ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）。これらの例において、Ｎｅｏはポジティブ選択マーカーを表し、ＨＰＲＴはネガティブ選択マーカーを表すこれらの例において、エキソンを示す領域は、存在する場合に、翻訳開始コドンを欠失していることも認識される。表示していない他の例では、エキソンを示す領域は翻訳開始コードを含む。さらに、エキソンが翻訳開始コドンを含む場合、エキソンはメチオニン残基、部分シグナル配列、全シグナル分泌配列、タンパク質の一部またはエピトープ標識をコードできる。さらに、コドンはスプライス供与体部位に対応するどのリーディングフレーム内に存在してもよい。
【図１３】図１２Ａ−１２Ｇに示した組込ベクターから生成された２つの転写産物を描いた図。ＤＮＡ鎖は水平線として描かれている。ベクターＤＮＡは黒線として示されている。内在性ゲノムＤＮＡは灰色の線として示されている。長方形はエキソンを描いている。ベクターコードエキソンは、白色長方形として示されている。Ｓ／Ｄはスプライス供与体部位を示す。組込の後、ベクターコードプロモーターは内在性遺伝子の転写を活性化する。上流プロモーターから生じる転写は、内在性遺伝子による２番目以降のエキソンに結合したベクターコードエキソンを含む、スプライスされたＲＮＡ分子を生成する。これに対して、下流プロモーターによる転写によって、エキソンＩおよび内在性遺伝子によるそれ以降のエキソンに結合された組込ベクターの下流の配列を含む、転写産物が生成される。
【図１４Ａ−１４Ｂ】ｐＲＩＧ１のヌクレオチド配列（配列番号１８）
【図１５Ａ−１５Ｂ】ｐＲＩＧ２１ｂのヌクレオチド配列（配列番号１９）
【図１６Ａ−１６Ｂ】ｐＲＩＧ２２ｂのヌクレオチド配列（配列番号２０）
【図１７Ａ−１７Ｇ】ポリ（Ａ）トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、シグナル分泌配列（ＳＰ）、エピトープ標識（ＥＴ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）ベクタープロモーター＃１（ＶＰ＃１）およびベクタープロモーター＃２（ＶＰ＃２）。図１７Ｃ−１７Ｇに描いたベクターに示すように、エキソンおよび不対スプライス供与体部位に動作可能に結合したプロモーターは、選択マーカーの上流に配置できる。このエキソンは、存在する場合に、スプライス供与体部位に対応する任意のリーディングフレーム内の開始コドンをコードすることができる。異なるリーディングフレームを持つ遺伝子によるタンパク質発現を活性化するために、スプライス供与体部位に対応した異なるリーディングフレーム内にそれぞれ開始コドンを持つ、３つの独立したベクターを使用できる。
【図１８】マルチエキソン内在性遺伝子上流の宿主細胞ゲノムへの組込時の、図１７Ｃによるベクターによって生成された転写産物の説明。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。ＤＮＡ鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター／細胞ゲノム境界を示している。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）ベクタープロモーター＃１（ＶＰ＃１）、ベクタープロモーター＃２（ＶＰ＃２）、内在性プロモーター（ＥＰ）およびポリアデニル化シグナル（ｐＡ）組込の後、ベクタープロモーター＃１は、内在性遺伝子による処理（スプライス）済エキソンを含む、組込部位下流のゲノム配列に結合したＮｅｏ遺伝子を含むキメラ転写産物を発現する。転写産物＃１は内在性遺伝子におるポリ（Ａ）シグナルを含むため、Ｎｅｏ遺伝子生成物が効率よく生成され、それによって細胞に薬剤耐性が付与される。転写産物＃１に加えて、組込ベクター、転写産物＃２と呼ばれる、ベクタープロモーター＃２に由来する第２の転写産物を生成する。転写産物＃２の構造は、内在性遺伝子によってコードされるタンパク質の効率よい翻訳を促進する。図１７に示すように、ベクターコードエキソン内に代わりのコード情報を含むベクターは、たとえばシグナル配列および／またはエピトープ標識を含む各種キメラタンパク質を生成するのに使用できる。
【図１９】二重ポジティブ選択マーカーベクターの例。ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。ポリ（Ａ）シグナルはこれらの例には存在しない。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）、ベクタープロモーター＃１、およびベクタープロモーター＃２（ＶＰ＃２）。
【図２０Ａ−２０Ｂ】内在性遺伝子に隣接する宿主細胞ゲノム内に組込みされる、二重ポジティブ選択マーカーベクターによって生成された転写産物の例。図２０Ａは、マルチエキソン遺伝子付近のベクター組込時に生成された転写産物を示す。図２０Ｂは、単一エキソン遺伝子付近のベクター組込時に転写産物を示す。各水平線はＤＮＡ分子を表す。ＤＮＡ鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター／細胞ゲノム境界を示している。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転子領域は各プロモーターの下流に位置する全ての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）、ベクタープロモーター＃１（ＶＰ＃１）、ベクタープロモーター＃２（ＶＰ＃２）、内在性プロモーター（ＥＰ）およびポリアデニル化シグナル（ｐＡ）。組込の後、ベクタープロモーター＃１は、内在性遺伝子による処理（スプライス）済エキソンを含む、組込部位下流のゲノム配列に結合したＨｙｇ遺伝子を含むキメラ転写産物を発現する。転写産物＃１は内在性遺伝子におるポリ（Ａ）シグナルを含むため、Ｈｙｇ遺伝子生成物が効率よく生成され、それによって細胞に薬剤耐性が付与される。転写産物＃１に加えて、組込ベクター、転写産物＃２と呼ばれる、ベクタープロモーター＃２に由来する第２の転写産物を生成する。図２０Ａでは、Ｎｅｏ遺伝子はベクターコードスプライス供与体部位からスプライスされる時に、転写産物＃２から除去され、第１の内在性スプライス受容体がベクター組込部位の下流に位置した（すなわちこの例ではエキソンＩＩ）。マルチエキソン遺伝子は各エキソン（エキソンＩを除く）の５’末端にスプライス受容体部位を含むため、Ｎｅｏ遺伝
子はベクターが付近の、転写的に活性化されたマルチエキソン遺伝子を組込みした細胞中の転写産物＃２から除去される。結果として、マルチエキソン遺伝子を活性化した細胞は、Ｇ４１８およびハイグロマイシンによって選択すると消滅することがある。図２０Ｂでは、単一エキソン遺伝子はスプライス受容配列を含んでいないため、Ｎｅｏ遺伝子はスプライシングによって転写産物＃２から除去されない。したがって、単一エキソン遺伝子付近に組込みされたベクターを含む細胞は、Ｇ４１８およびハイグロマイシンによる二重選択後も残存する。これらの細胞は、本明細書で述べる方法を使用して、活性化単一エキソン遺伝子を効率よく単離するのに使用できる。
【図２１Ａ−２１Ｂ】ポジティブおよびネガティブ選択マーカーを含む二重トラップベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）、ベクタープロモーター＃１（ＶＰ＃１）、ベクタープロモーター＃２（ＶＰ＃２）およびベクタープロモーター＃３（ＶＰ＃３）。図２１Ａ−２１Ｂに示すベクターでは、Ｎｅｏはポジティブ選択マーカーを表し、ＨＰＲＴはネガティブ選択マーカーをあらわす。ｒｅ２１Ｂでは、第３のプロモーターが選択マーカーの上流に配置されている。この上流プロモーターはエキソンと不対スプライス供与対部位に動作可能に結合されている。本例では、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを含む。本明細書で述べるように、エキソンはメチオニン残基、部分シグナル配列、全シグナル分泌配列、タンパク質の一部またはエピトープ標識をコードできる。さらに、コドンはスプライス供与体部位に対応するどのリーディングフレーム内に存在してもよい。表示していない他のベクター例において、エキソンを示す領域は翻訳開始コドンを欠失している。
【図２２】マルチエキソン内在性遺伝子の上流の宿主細胞ゲノムに組込みされた、二重ポジティブ／ネガティブ選択マーカーベクターによって生成された転写産物の例。各水平線はＤＮＡ分子を表す。ＤＮＡ鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター／細胞ゲノム境界を示している。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）、ベクタープロモーター＃１（ＶＰ＃１）、ベクタープロモーター＃２（ＶＰ＃２）、ベクタープロモーター＃３（ＶＰ＃３）、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）および内在性プロモーター（ＥＰ）。組込の後、ベクタープロモーター＃１は、内在性遺伝子による処理（スプライス）済エキソンを含む、組込部位下流のゲノム配列に結合したＮｅｏ遺伝子を含むキメラ転写産物を発現する。転写産物＃１は内在性遺伝子におるポリ（Ａ）シグナルを含むため、Ｎｅｏ遺伝子生成物が効率よく生成され、それによって細胞に薬剤耐性が付与される。転写産物＃１に加えて、組込ベクター、転写産物＃２と呼ばれる、ベクタープロモーター＃２に由来する第２の転写産物を生成する。本例では、ベクターがマルチエキソン遺伝子の上流に組込した。マルチエキソン遺伝子は各エキソンの５’末端
にスプライス受容体部位を含んでいるため、ＨＰＲＴ遺伝子はベクターが付近の、転写的に活性化されたマルチエキソン遺伝子を組込した細胞中の転写産物＃２から除去される。結果として、活性化マルチエキソン遺伝子を含む細胞は、Ｇ４１８および８−アザグアニン６−チオグアニン（ＡｇＴｈｇ）を用いて選択すると単離できる。したがって、単一エキソン遺伝子付近に組込みされたベクターを含む細胞は、Ｇ４１８およびＡｇＴｈｇによる二重選択後に残存する。これらの細胞は、本明細書に述べる方法を用いて活性化マルチエキソン遺伝子を効率的に単離するために使われる。転写産物＃１および＃２に加えて、転写産物＃３と呼ばれる第３の転写産物が組込ベクターから生成される。ベクタープロモーター＃３に由来する転写産物＃３は、内在性遺伝子によるタンパク質発現を指示するのに適したエキソン配列を含む。これは、プロモーター＃３下流の第１スプライス供与体部位から内在性遺伝子による第１下流スプライス受容体部位までのスプライシングの後に発生する。タンパク質発現の指示に加えて、転写産物＃３、および／または転写産物＃１および／または＃２は、本明細書に述べる方法を用いて遺伝子発見のために単離することができる。
【図２３Ａ−２３Ｄ】マルチプロモーター／活性化エキソンベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印は、プロモーター配列を示す。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。これらのベクター上のエキソンは未翻訳であるか、本明細書で述べる開始コドンおよび付加コドンをふくむことが理解される。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ベクタープロモーター＃１（ＶＰ＃１）、ベクタープロモーター＃２（ＶＰ＃２）、ベクタープロモーター＃３（ＶＰ＃３）およびベクタープロモーター＃４（ＶＰ＃４）。それぞれのベクター活性化エキソンは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと呼ぶ。各エキソンは異なる構造を含む場合がある。各活性化エキソンおよびフランキングイントロンを下に示す。しかし、シグナル配列、部分シグナル配列、エピトープ標識、タンパク質、タンパク質の部分およびタンパク質モチーフをコードするエキソンを含め、本明細書で述べる活性化エキソンは、任意の組み合わせおよび／または順序でこれらのベクターで使用されることが理解される。いずれかのエキソンが開始コドンを欠失していることがある。さらにこれらの例には表示していないが、これらのベクターは選択マーカーおよび／または増幅可能マーカーを含むことがある。選択マーカーはポリ（Ａ）シグナルまたはスプライス供与体部位を含むことがある。スプライス供与体部位は、存在する場合、選択マーカーの上流または下流に配置できる。あるいは、選択マーカーは、ポリ（Ａ）シグナルおよび／またはスプライス供与体部位に動作可能に結合されないことがある。
【図２４】内在性遺伝子の上流にある宿主細胞ゲノムへの組込時の、マルチプロモーター／活性化エキソンベクターより生成する代謝産物の例。各水平線はＤＮＡ分子を表す。ＤＮＡ鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター／細胞ゲノム境界を示している。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域は各プロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ベクタープロモーター＃１（ＶＰ＃１）、ベクタープロモーター＃２（ＶＰ＃２）、ベクタープロモーター＃３（ＶＰ＃３）、ベクタープロモーター＃４（ＶＰ＃４）、内在性プロモーター（ＥＰ）およびポリアデニル化シグナル（ｐＡ）。それぞれのベクター活性化エキソンは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと呼ぶ。組込の後、各ベクターコードプロモーターは異なる転写産物を生成することができる。各転写産物は、内在性遺伝子による第１下流スプライス受容体部位に結合された異なる活性化エキソンを含む（この例ではエキソンＩＩ）。それぞれの活性化エキソンは、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）と呼ぶ。内在性エキソンは、（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＶＩ）と呼ぶ。一般にコード配列および／またはリーディングフレームは、存在する場合、活性化エキソン間で異なる。本例では４つの活性化エキソンを示すが、活性化エキソンは組込ベクター上に何個存在してもよい。
【図２５Ａ−２５Ｄ】タンパク質−タンパク質相互作用の検出に有用な活性化ベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印はプロモーター配列を示す。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。以下の呼称を使用した。スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）。ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、（スプライス供与体部位に対応する）任意のリーディングフレーム内でコードされ、異なるリーディングフレームを用いて内在性遺伝子を活性化することができる。
【図２６】図２５に示すベクターを用いたタンパク質−タンパク質相互作用を検出する手法の１つを示す概略図。各水平線はＤＮＡ分子を表す。ＤＮＡ鎖を通過する垂直線は、上流および下流のベクター／細胞ゲノム境界を示している。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。内在性エキソンはローマ数字を用いて番号付けされている。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、結合ドメイン（ＢＤ）、活性化ドメイン（ＡＤ）、認識配列（ＲＳ）およびポリアデニル化シグナル（ｐＡ）。結合ドメインベクターは、遺伝子Ａと呼ばれる内在性遺伝子の上流で、宿主細胞のゲノム内に組込まれることが示されている。活性化ドメインベクターは、遺伝子Ｂと呼ばれる内在性遺伝子の上流で、同じ宿主細胞のゲノム内に組込まれることが示されている。どちらのベクターも同じホスト細胞のゲノム内に組込まれる。組込後、各ベクターは結合ドメイン（または場合に応じて、活性化ドメイン）を含む融合タンパク質を生成し、このタンパク質は下流の内在性遺伝子のによってコードされる。結合ドメイン融合タンパク質が活性化ドメイン融合タンパク質と相互作用すると、タンパク質錯体が形成される。この錯体は、細胞に存在するレポーター遺伝子の発現を増加させることができる。
【図２７】インビトロおよびインビボ転位に有用な活性化ベクターの例。各ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印はプロモーター配列を示す。ボックスはエキソンを示す。斜線ボックスは未翻訳領域を示す。黒いボックスはトランスポンシグナルを示す。トランスポンシグナルに対する方向性があり、シグナルは転位反応（組込、逆位または欠失）の種類に適した配置に合わせられていることが認識される。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ）、ポリ（Ａ）シグナル（ｐＡ）、複製由来のＥＢウイルス（ｏｒｉ．Ｐ）。活性化エキソンは、（スプライス供与体部位に対応する）任意のリーディングフレームにおいてアミノ酸をコードし、異なるリーディングフレームを用いて内在性遺伝子を活性化することができる。
【図２８】インビトロ転位によるクローン化ゲノムＤＮＡフラグメント内への活性化ベクターの組込を示す概略図。各水平線はＤＮＡ分子を表す。クローン化ゲノムＤＮＡは、ＢＡＣベクター内にある。１本線はゲノムＤＮＡを表し、長方形はＢＡＣベクター配列を示す。矢印は、ＤＮＡ分子上に位置し、転写方向に向いているプロモーターを示す。転写領域はプロモーターの下流に位置するすべての配列を含む。ベクター活性化エキソンは白いボックスとして表示されている。クローン化ゲノムフラグメント内でコードされた遺伝子によるエキソンは斜線ボックスとして示される。黒いボックスはトランスポンシグナルを示す。トランスポンシグナルに対する方向性があり、シグナルは転位反応（組込、逆位または欠失）の種類に適した配置に合わせられていることが認識される。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）。ベクターをゲノムフラグメントに組込むために、活性化ベクターをトランスポサーゼの存在下でクローン化ゲノムＤＮＡによって培養した。活性化ベクターをゲノムフラグメントに組込んだ後、プラスミドを適切な真核宿主細胞に直接トランスフェクションして、ベクター組込部位の下流に位置する遺伝子を発現させることができる。あるいは、適切な真核宿主細胞にトランスフェクションするために、ＢＡＣプラスミドをＥ．コリに形質転換して大量のプラスミドを生成することができる。
【図２９Ａ−２９Ｂ】ｐＲＩＧ１４のヌクレオチド配列。
【図３０Ａ−３０Ｂ】図３０Ａ−３０Ｂ。ｐＲＩＧ１９のヌクレオチド配列。
【図３１Ａ−３１Ｂ】図３１Ａ−３１Ｂ。ｐＲＩＧ２０のヌクレオチド配列。
【図３２Ａ−３２Ｂ】ｐＲＩＧａｄ１のヌクレオチド配列。
【図３３Ａ−３３Ｂ】ｐＲＩＧｂｄ１のヌクレオチド配列。
【図３４Ａ−３４Ｂ】ｐＵｎｉＢＡＣのヌクレオチド配列。
【図３５Ａ−３５Ｂ】ｐＲＩＧ２２１のヌクレオチド配列。
【図３６】ｐＲＩＧ−ＴＰの概略図。ベクターはその直線化形で概略表示されている。各水平線はＤＮＡ分子を表す。矢印はプロモーター配列を示す。白いボックスはエキソンを示す。黒いボックスは、トランスポン組換シグナル（Ｔｎ５による−Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているインビトロ転位キットと互換性）を表す。以下の呼称を使用した：スプライス供与体部位（Ｓ／Ｄ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒｏ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ＥＢ核抗原−１複製タンパク質（ＥＢＮＡ−１）、複製由来のＥＢウイルス（ｏｒｉ．Ｐ）、ポリ（Ａ）シグナル（ｐＡ）および活性化エキソン（ＡＥ）。活性化エキソンは、タンパク質合成を指示可能な、任意のリーディングフレーム内の翻訳開始コドン、部分分泌シグナル配列、全体分泌シグナル配列、エピトープ標識、タンパク質、タンパク質の部分、タンパク質モチーフを含めて、任意の配列を含むことができることが理解される。活性化エキソンは翻訳開始コドンも欠失していることがある。
【図３７Ａ−３７Ｃ】図３７Ａ−３７Ｃ。ｐＲＩＧ−Ｔのヌクレオチド配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１８】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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