(57)【要約】単離された胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）の集団の生存性を改善する方法は、細胞、または１以上のその祖先を、少なくとも１つの生存性促進因子と接触させる工程を含む。ＴＥＰＣ株が、胸腺機能を回復または増強するために、あるいは造血幹細胞からのＴ細胞の生成のために提供されそして使用される。【選択図】図３
2004516834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）の分化に必須である遺伝子の発現をＴＥＰＣにおいて可逆的に抑制する少なくとも１つの核酸構築物を含む、動物細胞。
【請求項２】
Ｆｏｘｎ１発現を可逆的に抑制する核酸構築物を含む、請求項１に記載のＴＥＰＣ。
【請求項３】
請求項２に記載のＴＥＰＣ株。
【請求項４】
請求項１、２、または３に記載の細胞またはＴＥＰＣ、および薬学的に受容可能なベヒクル、希釈剤、またはキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
皮質または髄質の胸腺上皮の発生運命への前記ＴＥＰＣの分化を促進する１以上の因子をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
患者における胸腺機能を回復または増強させる方法であって、請求項１、２、または３に記載の細胞またはＴＥＰＣの薬学的有効量、または請求項４または５に記載の薬学的組成物を、該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項７】
胸腺機能を回復または増強するための医薬品の製造における、請求項１、２、または３に記載の細胞またはＴＥＰＣの使用。
【請求項８】
成熟胸腺上皮細胞を得るためのインビトロ方法であって、該細胞、または１以上のその祖先を、少なくとも１つの生存性促進因子と接触させることによって、単離された胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）の集団の生存性を改善する工程、および該ＴＥＰＣの分化を可能にするまたは引き起こす工程を含み、該生存性促進因子が、該ＴＥＰＣの分化に必須である遺伝子の発現をＴＥＰＣにおいて可逆的に抑制する、方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの生存性促進因子が、皮質および／または髄質の胸腺上皮細胞への前記ＴＥＰＣの分化を阻害する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの生存性促進因子が、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、骨形成因子（ＢＭＰ）２、ＢＭＰ４および／またはＢＭＰ７からなる群より選択される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの生存性促進因子が、前記集団におけるＴＥＰＣの遺伝子型の変化を引き起こす、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの生存性促進因子が、不死化癌遺伝子を含むまたは該遺伝子からなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの生存性促進因子が、条件付きで不活性化可能である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの生存性促進因子が、Ｆｏｘｎ１発現の可逆的抑制を引き起こす、請求項８から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒトＨＳＣからのヒトＴ細胞の生成における、請求項２または３に記載の細胞から得られる、非ヒト皮質および／または髄質の胸腺上皮細胞の使用。
【請求項１６】
成熟胸腺上皮細胞を得る方法であって、細胞生存に伝導性のある培養条件下で動物細胞のソースを維持することによってＴＥＰＣに対する該動物細胞の集団を富化する工程であって、該動物細胞のソースが、ＴＥＰＣの分化を可逆的に阻害する核酸構築物を含む動物細胞を含む、工程；該動物細胞を培養する工程；および続いて該阻害を逆にすることによって該ＴＥＰＣの分化を可能にするまたは引き起こす工程、を含む、方法。
【請求項１７】
前記ＴＥＰＣの分化が、ＴＥＰＣの分化に必須である遺伝子の発現を可逆的に抑制する前記動物細胞に、遺伝子構築物を挿入することによって阻害される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法に適切な細胞のソースを含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法における使用に適切となるように細胞を遺伝学的に改変するために使用するベクターであって、ＴＥＰＣの分化に必須である遺伝子の発現を可逆的に抑制するように前記動物細胞のゲノムを結合する配列を含む、ベクター。
【請求項２０】
前記動物細胞のゲノムとの相同的組換えのための、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
動物細胞のＦｏｘｎ１遺伝子への相同的組換えのための、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
ヒト細胞のＦｏｘｎ１遺伝子への相同的組換えのための、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
部位特異的組換えによって組込まれた構築物を後で切除することを可能にする認識配列、例えば、ＬｏｘＰまたはＦＲＴ部位をさらに含む、請求項１９から２２のいずれかの項に記載のベクター。
【請求項２４】
Ｔ細胞発生における遺伝子機能をアッセイするための、請求項２または３に記載のＴＥＰＣの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）に関し、そしてより特定すると、例えば、治療目的で、該細胞を産生し、維持し、そして使用するための材料および方法に関する。
【０００２】
胸腺は、Ｔ細胞発生の主要な部位であり、Ｔ細胞分化およびレパートリー選択を支援するために必要とされる微環境を提供する（Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ．Ｆ．Ａ．Ｐ． Ｌａｎｃｅｔ ２： ７４８−７４９ （１９６１）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｇ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４： ７３−９９ （１９９６））。これらの独特のプロセスは、胸腺基質に依存する（Ｂｏｙｄ， Ｒ．Ｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １４： ４４５−４５９ （１９９３））。これは、非上皮基質細胞タイプが散在した胸腺上皮細胞の高度に秩序づけられた三次元ネットワークを含み、そして２つの主なコンパートメント、皮質および髄質に組織化され、これらはそれぞれいくつかの異なる上皮亜集団を含む（Ｂｏｙｄ （１９９３）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ （１９９６）；Ｖａｎ Ｅｗｉｊｋ， Ｗ． Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１： ５７−６４ （１９９９））。Ｔ細胞発生が複数の上皮亜集団との相互作用を必要とするので、異なる胸腺上皮細胞タイプは、胸腺細胞の分化および成熟の異なる段階に必要とされる特定の分子ニッチを提供すると考えられる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｇ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ２０： ４６３−４６８ （１９９９）；Ｇｅ， Ｑ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： １１２７−１１３３ （２０００））。
【０００３】
胚形成中に、第３咽頭嚢内胚葉、神経冠由来間葉、およびおそらく第３鰓溝外胚葉からの寄与は、胸腺原基の形成に必要とされ、これは、マウス胚発生の１２．５日目（Ｅ１２．５）の分離した臓器として最初に存在する（Ｍａｎｌｅｙ， Ｎ． Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： ４２１−４２８ （２０００））。胸腺細胞と未成熟胸腺上皮との間の連続的な相反相互作用は、結果として、皮質および髄質コンパートメントの適切な組織化および機能を樹立するために必要とされる（Ｖａｎ Ｅｗｉｊｋ （１９９９）；Ｒｉｔｔｅｒ， Ｍ．Ａ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １４： ４６２−４６９ （１９９３））。血管形成もまた、髄質の成熟を必要とし得（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｍ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： １１０５−１１１０ （２０００））、そして胸腺細胞成熟を支援するための能力の獲得に関連する発生のチェックポイントを構成し得る（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ， Ｐ．Ｊ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３０： １９４８−１９５６ （２０００））。
【０００４】
Ｔ細胞およびその前駆体を発生させるインビトロ手段を有することが所望される。胸腺上皮の複雑性は、インビトロでＴ細胞を生成する試みに対する障害によって証明され、そしてこれは、現在エクスビボ胸腺組織に基づく臓器培養物においてのみ可能である（Ｈａｒｅ， Ｋ．Ｊ．， Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ， Ｅ．Ｊ．およびＡｎｄｅｒｓｏｎ Ｇ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１， ３−１２ （１９９９）；Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ， Ｍ．Ｃ．ら Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａ ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｙｍｉｃ ｏｒｇａｎｏｉｄ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １８， ７２９−７３４ （２０００））。インビトロでＴ細胞を効率的に生成する能力が、化学放射線療法後の白血病および癌患者ならびに臓器移植レシピエントの処置における臨床結果に著しく強い影響を与えるので、この領域における改善が非常に所望される（Ｅｉｓｎｅｒ， Ｙ．およびＭａｒｔｅｌｌｉ， Ｍ．Ｆ． Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ’ｍｅｇａｄｏｓｅ’ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｏｆ ＣＤ３４＋ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； ａ ｎｅｗ ｏｐｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｎ ＨＬＡ−ｍａｔｃｈｅｄ ｄｏｎｏｒ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２， ５３６−５４１ （２０００）， Ｓｌａｖｉｎ， Ｓ． Ｎｅｗ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １２， ５４２−５５１ （２０００））。
【０００５】
野生型胸腺上皮細胞、ならびに胸腺上皮系統であるがＦｏｘｎ１（以前は、ｗｈｎ／Ｈｆｈ１１）（Ｋａｅｓｔｎｅｒ， Ｋ．Ｈ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４： １４２−１４６ （２０００））、これはすべての成熟胸腺上皮亜集団（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ， Ｃ．Ｃ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ， Ｓｃｉ， ＵＳＡ ９３：５７４２−５７４６ （１９９６））の発生に細胞自律的に必要とされる転写因子（Ｎｅｈｌｓ， Ｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２： ８８６−８８９ （１９９６））である、を発現できない胸腺上皮系統に委任される細胞の分析に基づいて；本発明者らは、２つのモノクローナル抗体ＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４がネズミの胸腺原基内の前駆細胞の集団を同定したことを示している。野生型Ｅ１２．５マウス胚から単離されそしてレシピエントマウスの腎臓嚢の下に移植された胸腺原基から精製された場合、これらのＭＴＳ２０＋／２４＋細胞は、皮質および髄質の胸腺上皮細胞タイプに分化し、リンパ様前駆体を誘引し、そして胸腺細胞分化を支援した。さらに、これらは、先天性無胸腺症レシピエントマウスにおいて胸腺機能を与えた。対応するＭＴＳ２０−／２４−集団は、成熟皮質上皮に付随するマーカーを発現する細胞を含んでいるが、これらの機能を果たすことができなかった。したがって、ＭＴＳ２０＋／２４＋発現は、インビボで機能的胸腺を形成するために十分な、皮質または髄質の胸腺上皮細胞の両方に分化し得る胸腺前駆細胞または幹細胞である、１または複数の胸腺上皮前駆細胞タイプ（ＴＥＰＣ）を同定する。
【０００６】
本出願において、発明者らは、Ｔ細胞の生成を可能にするための方法の必要性を示し、そしてＴＥＰＣの使用およびそれを含む組成物を開示する。インビボにおいて、それらは、無胸腺症個体において、例えば、ディジョージ症候群またはヒト「ヌード」状態に病む患者において胸腺機能を回復するために、あるいは例えば、骨髄および臓器移植レシピエントにおいて、例えば、同種移植受容を促進するために、胸腺機能を増大またはカスタマイズするために使用され得る。インビトロにおいては、これらは、人工胸腺を生成するために使用され得、それによって造血幹細胞（ＨＳＣ）および／またはリンパ様前駆体からの成熟Ｔ細胞集団の生成を可能にする。このような人工胸腺は、特定の目的、例えば、２以上の個体の組織に耐性であるＴ細胞集団のインビトロまたはインビボ生成のためにカスタマイズされ得る。ＴＥＰＣのこれらおよび他の使用は、本発明の開示の重要な局面を提供する。
【０００７】
それらのインビボ特性に基づいて、ＴＥＰＣは、移植治療での使用のために、またはインビトロ胸腺生成のために、理想的な材料である。それらは、拡張可能な細胞タイプであり、すべての主要な成熟胸腺上皮亜集団を産生し得る。しかし、インビトロでは、それらは培養物中に維持することが困難であることが示されている。したがって、本発明の開示は、ＴＥＰＣ集団を富化するため、単離されたＴＥＰＣの生存性を改善するため、インビトロでのＴＥＰＣの集団を拡張するため、およびＴＥＰＣがインビトロまたはインビボで機能的胸腺を生成するために皮質および髄質の胸腺上皮細胞タイプに分化することを引き起こすまたは可能にするための、材料および方法を提供する。この方策は、培養物での使用またはヒト胎児組織から直接得られた細胞の移植を含む、倫理的および実際的な問題の両方を回避する。特に、各胎児は、臨床目的には不十分な、少数の細胞のみを提供する。
【０００８】
第１の局面では、本発明は、単離された胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）の集団の生存性を改善する方法を提供し、この方法は、細胞、または１以上のその祖先を、少なくとも１つの生存性促進因子と接触させる工程を含む。
【０００９】
「単離された胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）の集団の生存性を改善する」とは、集団中の生存ＴＥＰＣの数の減少速度が低下することを意味する。これは、集団中の生存ＴＥＰＣの数が実質的に一定レベルに維持されること、または集団中の生存ＴＥＰＣの数が時間をかけて増加することを含み得る。
【００１０】
「単離されたＴＥＰＣ」とは、ＴＥＰＣが、ＴＥＰＣが通常生理学的条件下でインビボにおいて関連する少なくとも１つの細胞タイプと関連しないことを意味する。ＴＥＰＣは、間葉細胞、Ｔ細胞前駆体、胸腺細胞、血管内皮細胞、分化した胸腺上皮細胞、骨髄由来胸腺間質細胞の１以上から単離され得る。
【００１１】
好ましい実施態様では、１以上の生存性促進因子は、ＴＥＰＣ複製を誘導または増強する。この方法では、ＴＥＰＣ集団の全体としての生存性の減少は、少なくとも一部は、ＴＥＰＣの元の群からの娘細胞の産生によって、遅延、阻止、または逆転され得る。細胞の複製集団がコンフルエンスに近づくと、この集団は、２以上の娘集団に分割され得る。各集団は、本明細書の他の箇所で論じるように、適切な培地で希釈され得る。
【００１２】
１以上の生存性促進因子は、天然のタンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、炭水化物、オリゴ糖、多糖、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸であり得る。因子は、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、ステロイド、インターフェロン、コロニー刺激因子、細胞外マトリクス物質からなる群より選択され得る。特定の１または複数の細胞タイプによって産生され得、そして細胞表面因子および／またはこれらの細胞の培養上清中に分泌される因子であり得る。
【００１３】
適切な因子の特定の例としては、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、骨形成因子（ＢＭＰ２）２、（ＢＭＰ）４および（ＢＭＰ）７頭部、線維芽細胞増殖因子１（Ｆｇｆ１）、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ３、Ｆｇｆ８、およびソニックヘッジホッグ（ｓｈｈ）が挙げられる。
【００１４】
１以上の生存性促進因子は、ＴＥＰＣ集団に連続的にまたは周期的に添加され得る。あるいは、単回の最初の期間の１以上の因子への曝露であり得、この期間は、１以上の因子の単回添加または複数の連続添加を含み得る。ＴＥＰＣ集団が多くの連続的な機会において１以上の生存性促進因子と接触する場合、各機会に添加された１または複数の因子は、先の機会に添加された因子とは異なってもよい。
【００１５】
ＴＥＰＣ集団が、単回の最初の期間の曝露を受ける場合、１以上の因子は、細胞に長期の生理学的変化を受けさせ得る。この変化は、ＴＥＰＣの集団の生存性が、任意のさらなる生存性促進因子の次の添加の必要なしに実質的に改善されることを可能にし得る。
【００１６】
本発明のある実施態様では、１以上の生存性促進因子は、集団中の少なくとも１つのＴＥＰＣの遺伝子型の変化を引き起こし得る。この遺伝子型の変化は、例えば、ＴＥＰＣを不死化または可逆的不死化状態に形質転換することによって、ＴＥＰＣの生存性を改善し得る。この点について、１以上の生存性促進因子は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み得る。
【００１７】
ポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、プラスミドあるいはウイルスまたは人工染色体であり得る。適切なベクターが選択または構築され得、適切な調節配列、例えば、プロモーター配列、タミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列を含む。ベクターは、選択可能マーカー遺伝子および適切な他の配列を含み得る。
【００１８】
抗生物質耐性または感受性遺伝子のようなマーカー遺伝子、あるいは蛍光またはエピトープタグ付きタンパク質は、当該技術分野で周知のように、目的の核酸を含むクローンの同定に使用され得る。クローンもまた、結合研究によって、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーションによって、同定またはさらに研究され得る。
【００１９】
ＴＥＰＣ内において、ポリヌクレオチド含む核酸は、遊離されたゲノム外配列として存在し得るか、または宿主細胞ゲノムに、好ましくは安定に組込み得る。遊離された配列として、例えば、エピゾームまたは人工染色体として複製可能であり得る。組込みは、標準的技法に従って、ゲノムとの組換えを促進する核酸配列中に含ませることによって、促進され得る。核酸は、ゲノム中の特定の部位への組込みを指示する配列を含み得、その部位において内部に含まれるコード配列がＴＥＰＣ中のその配列の発現を誘導および／または制御し得る調節エレメントの制御下に置かれる。
【００２０】
細胞に核酸を導入する方法は、当業者に周知であり、そして例えば、弾道衝撃、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、およびレトロウイルスまたは他のベクターを用いる形質導入が挙げられる。適切なベクターとしては、アデノウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスが挙げられる。無能力化ウイルスベクターは、感染性ウイルス粒子の産生に必要とされる遺伝子が発現されるヘルパー細胞株中で産生され得る。適切ヘルパー細胞株は当業者に周知である。例として、Ｆａｌｌａｕｘ， Ｆ．Ｊ．ら （１９９６） Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７（２）， ２１５−２２２；Ｗｉｌｌｅｎｂｒｉｎｋ， Ｗ．ら （１９９４） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１２）， ８４１３−８４１７；Ｃｏｓｓｅｔ， Ｆ．Ｌ．ら （１９９３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３（１）， ３８５−３９５；Ｈｉｇｈｋｉｎ， Ｍ．Ｋ．ら （１９９１） Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ ７０（４）， ９７０−９８１；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ， Ｊ．Ｐ．ら （１９８９） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６３（７）， ３２０９−３２１２；Ｓａｌｍｏｎｓ， Ｂ．ら （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １５９（３）， １１９１−１１９８；Ｓｏｒｇｅ， Ｊ．ら （１９８４） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４（９）， １７３０−１７３７；Ｗａｎｇ， Ｓ．ら （１９９７） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４（１１）， １１３２−１１４１；Ｍｏｏｒｅ， Ｋ．Ｗ．ら （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８（４９６０）， １２３０−１２３４；Ｒｅｉｓｓ， Ｃ．Ｓ．ら （１９８７） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３９（３）， ７１１−７１４を参照のこと。ヘルパー細胞株は、一般に、ウイルスゲノムをパッケージするメカニズムによって認識される配列がない。それらは核酸を含まないビリオンを産生する。送達される遺伝子または他の配列とともに無傷のパッケージングシグナルを含むウイルスベクターが、ヘルパー細胞において感染性ビリオン粒子中にパッケージされ、次いでＴＥＰＣへの遺伝子送達に使用され得る。
【００２１】
ＴＥＰＣに核酸を導入するために使用される方法の特定の選択が本発明に必須ではなくまたは本発明の限定ではないことは、当業者に明らかである。
【００２２】
ポリヌクレオチドからなるまたはポリヌクレオチドを含む生存性促進因子は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全体または一部を含み得る。ＯＲＦは、ＴＥＰＣにおいてその発現を誘導するプロモーターに作動可能に連結され得る。「作動可能に連結される」とは、同じ核酸分子の一部として連結され、プロモーターから始まる転写に対して適切に配置されそして配列されることを意味する。
【００２３】
ポリヌクレオチドは、使用者の制御下でそれを配置するために、外部の誘導性遺伝子プロモーターの制御下に配置され得る。用語「誘導性」は、プロモーターに適用される場合、当業者に十分理解される。本質的に、誘導性プロモーターの制御下での発現は、適用された刺激に応じて「スイッチオンにされる」かまたは増加する。刺激の性質はプロモーター間で異なる。いくつかの誘導性プロモーターは、適切な刺激の不在下において、ほとんど発現しないかまたは検出不可能なレベルの発現を引き起こす（または発現しない）。発現のレベルが刺激の不在下であっても、任意の誘導性プロモーターからの発現は、正確な刺激の存在下で増加する。誘導性プロモーターの例は、テトラサイクリンオン／オフシステム（Ｇｏｓｓｅｎら （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６８， １７６６−１７９６）であり、そこでは遺伝子発現はテトラサイクリンアナログによって調節される。ポリヌクレオチドの発現もまた、形質転換された核酸中の１以上の追加エレメントによって、例えば、エンハンサーによって、制御または調節され得る。
【００２４】
ポリヌクレオチドからなるまたはポリヌクレオチドを含む生存性促進因子は、ＯＲＦに作動可能に連結されないプロモーターを含み得る。これは、エンハンサーまたは他の転写制御配列を含み得る。核酸は、隣接するコード配列の発現を誘導、増加、阻害、または抑制するようにＴＥＰＣのゲノムに組込まれ得る。核酸は、例えば、その部位の周囲の配列との相同性によって、ゲノム中の特定の部位に組込みを指示する配列を含み得る。ポリヌクレオチド生存性促進因子もまた、アンチセンス配列またはリボザイム、あるいはこのような配列をコードするＤＮＡを含み得る。アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムは、細胞周期チェックポイントを妨害し得、それによって宿主細胞を不死化する。
【００２５】
ポリヌクレオチドの発現は、形質転換された核酸の一部またはＴＥＰＣゲノムのいずれに由来するとしても、構成的または誘導性であり得る。誘導は、例えば、ＴＥＰＣと生存性促進因子との接触と同時またはそれに続いて、ＴＥＰＣへの１以上の追加因子の添加を必要とし得る。
【００２６】
生存性促進因子として使用され得るポリヌクレオチドの例としては、癌遺伝子および転移因子が挙げられる。特定の例は、ＳＶ４０Ｔ抗原である。
【００２７】
癌遺伝子は、ＴＥＰＣを不死化状態に形質転換し得る。可逆的不死化が達成され得るように条件付きで不活性化可能であり得る。ヒト患者の体温で不活性である不死化癌遺伝子が使用され得る。ＴＥＰＣまたはその子孫が治療方法中に患者に導入される場合、癌遺伝子の不活性化は腫瘍形成の危険性を減少させる。不死化している癌遺伝子はまた、このような細胞の患者への導入前に、ＴＥＰＣまたはその子孫から除去され得る。癌遺伝子の除去は、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステムを用い得る（Ｗｅｓｔｅｒｍａｎ， Ｋ．Ａ．ら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， ８９７１ （１９９６））。
【００２８】
例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、核酸の細胞への導入、および遺伝子発現における、核酸の操作、ならびにタンパク質の分析のための多くの公知の技法およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， （１９９２）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：第３版， ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ， ２００１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに詳細に記載される。
【００２９】
本発明で使用するための生存性促進因子は、当業者に周知のルーチンの技法に基づいて容易に同定され得る。例としては、新たに単離されたＴＥＰＣの集団は、まず、２つの集団：「テスト」集団および「コントロール」集団に小分けされ得る。次いで、１以上のテスト因子は「テスト」集団に添加され、そして各集団中でＴＥＰＣ表現型を保持している生存細胞の比率が決定される（ｔ＝０で測定）。所定の時間の後（ｔ＝１）、その時間の間に１または複数のテスト因子が再度テスト集団に添加され得、その集団中でＴＥＰＣ表現型を保持している生存細胞の比率が再度決定される。各集団中のｔ＝０からｔ＝１までのＴＥＰＣ表現型を保持する生存細胞の比率の変化が算出される。
【００３０】
テスト集団内のＴＥＰＣ表現型を保持する生存細胞の比率の減少が、コントロール集団における減少よりも少ないならば、１以上のテスト因子は生存性促進因子の適切な候補である。各集団中の生存細胞の比率は、１以上のテスト因子がＴＥＰＣの生存性を促進する能力をより良好に評価するように、ｔ＝１に引き続いて時間間隔をおいて決定され得る。
【００３１】
ＴＥＰＣ集団の生存細胞の比率は、細胞生存性を評価するための公知の技法を用いて容易に決定され得る。例として、ＴＥＰＣ集団の試料が採取され得、そして試料中の生存細胞の数は、試料の全体または一部中で、必要に応じて希釈後に、例えば、顕微鏡を用いて、例えば、トリパンブルーを用いて、生存細胞の数をカウントすることによって決定される。生存細胞の比率は、例えば、（ａ）試料中の細胞の総数；または（ｂ）試料の総容量に対して決定され得る。ＴＥＰＣ表現型を保持する生存細胞の比率は、フローサイトメトリーまたは免疫細胞化学分析で決定され得る。
【００３２】
条件付きで活性なテスト因子、例えば、条件付きで活性な癌遺伝子が使用される場合、その因子が接触したＴＥＰＣの生存性を改善または維持する能力における許容条件と非許容条件との間の差は、テスト因子が生存性促進因子の候補であることを示す。
【００３３】
本発明のある実施態様では、１以上の生存性促進因子と接触する単離されたＴＥＰＣは、例えば、皮質または髄質の胸腺上皮細胞への、ＴＥＰＣの分化を阻害する条件下で培養される。ＴＥＰＣは、例えば、間葉細胞および／またはＴ細胞前駆体および／または胸腺細胞の不在下で培養され得る。このような細胞タイプは、胸腺臓器培養において皮質および髄質の胸腺上皮細胞タイプの産生を誘導することが示されている。
【００３４】
例えば、皮質または髄質の胸腺上皮細胞への、ＴＥＰＣの分化もまた、ＴＥＰＣへの、またはその祖先への核酸配列の導入によって阻止され得る。
【００３５】
核酸配列は、増殖を促進することによって分化を阻害し得る。このような核酸配列は、細胞周期の制御に影響を及ぼし得る。これは癌遺伝子であり得る。核酸配列は、１以上の制御エレメントを含み得、これは、誘導または阻害時に、宿主ＴＥＰＣの分化の進行を可能にする。
【００３６】
ＴＥＰＣの分化を阻止する核酸は、Ｆｏｘｎ１発現の抑制または除去を引き起こし得：本明細書で他の箇所で論じるように、ＴＥＰＣは、Ｆｏｘｎ１を発現せずに成熟胸腺上皮細胞亜集団に分化できない。核酸は、Ｆｏｘｎ１発現の条件付き抑制を引き起こし得、そのため許容条件下でＴＥＰＣの分化が進行し得る。例えば、核酸は、（ｉ）１以上の因子の添加に応答性の誘導性プロモーター；および（ｉｉ）野生型Ｆｏｘｎ１プロモーターを機能的に置換するようにＴＥＰＣゲノムへのプロモーターの組込みを指示するターゲティング配列；または（ｉｉｉ）Ｆｏｘｎ１調節エレメントが１以上の因子の添加に応答性の誘導性プロモーターによって置換されるＦｏｘｎ１導入遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、Ｆｏｘｎ１−／−であるＴＥＰＣゲノム、またはＦｏｘｎ１−／−バックグラウンド、例えば、ヌードマウスに後で戻し交配される野生型ＴＥＰＣゲノムにランダムに組込まれ得る。あるいは、核酸は、（ｉ）野生型遺伝子を機能的に置換するようにＴＥＰＣゲノムへの改変Ｆｏｘｎ１遺伝子の組込みを指示するターゲティング配列；または（ｉｉ）これもまたＦｏｘｎ１−／−であり得る、またはＦｏｘｎ１−／−バックグラウンド上に後で戻し交配される野生型ＴＥＰＣゲノムであり得るＴＥＰＣゲノムへの、Ｆｏｘｎ１調節領域を含む改変Ｆｏｘｎ１導入遺伝子のランダム組込みを可能にする配列を含み得る。Ｆｏｘｎ１導入遺伝子はＦｏｘｎ１発現が可逆的に除去されるように改変され得る。これは、Ｆｏｘｎ１遺伝子のＦｏｘｎ１転写開始点の下流への、停止カセットの導入によって達成され得る。停止カセットは、ゲノムから切り出され得、Ｆｏｘｎ１発現を可能にする。したがってＴＥＰＣ分化が進行する。これは、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステム、またはＦｌｐリコンビナーゼシステム、または他のリコンビナーゼシステムを用いて達成され得る。あるいは、Ｆｏｘｎ１発現は、アンチセンスＦｏｘｎ１ＲＮＡを発現するように設計された構築物、Ｆｏｘｎ１特異的リボザイムを発現するように設計された構築物、優性ネガティブＦｏｘｎ１タンパク質をコードする構築物、または細胞内でＦｏｘｎ１を隔離しそのためこれを不活性にし得るタンパク質または因子をコードする構築物を含む核酸のＴＥＰＣゲノムへの導入によって、可逆的に除去され得る。
【００３７】
ＴＥＰＣゲノムの特定の部位への核酸の組込みは、相同組換えを促進する配列によって達成され得る。あるいは、核酸は、ランダムに組込まれた導入遺伝子として挿入され得る。ＴＥＰＣを核酸で形質転換するための材料および方法は、本明細書で他の箇所に記載されている。
【００３８】
ＴＥＰＣの皮質または髄質の胸腺上皮細胞タイプへの分化は、本明細書の他の箇所に記載の方法のいずれかによって検出され得る。
【００３９】
本発明のある実施態様では、単離されたＴＥＰＣは、１以上の生存性促進因子と接触し、および／または胎児心臓組織および鰓弓由来の組織（例えば、鰓弓全体または鰓弓外胚葉）からなる群より選択される１以上の組織からの外移植培養物に隣接して、または外移植培養物によって条件付けした培地中で培養される。これらの組織は、胚状態で胸腺原基に隣接する。この組織は、適切なメンブランまたはフィルターによって単離されたＴＥＰＣから隔離され得る。単離されたＴＥＰＣは、これらの組織で発現された１以上の増殖因子の存在下で接触され得る。単離されたＴＥＰＣは、線維芽細胞、または胚胸腺上皮細胞、または鰓弓細胞からなる群より選択される、放射線照射した供給細胞上で培養され得る。線維芽細胞は、特定の増殖因子をコードする１または複数の遺伝子を発現するようにトランスフェクトされ得る。
【００４０】
単離されたＴＥＰＣは、元来、胚由来であり、例えば、少なくともマウスＥ１１．２５まで発生した胚または他の哺乳動物における等価の段階由来であり得る。１つのプロトコルでは、胚胸腺における細胞は、それぞれ分離され、そしてフローサイトメトリーによってＴＥＰＣが単離される。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）は、ＴＥＰＣを他の胸腺細胞タイプから同定および分割するために使用され得る：モノクローナル抗体ＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４が使用され得る。あるいはまたはさらに、ＴＥＰＣは、光散乱パラメータを用いるサイズ選択によって他の胸腺細胞集団から単離され得る。サイズ選択によるＴＥＰＣの単離は、モノクローナル抗体の潜在的な活性化効果を回避し、それによってＴＥＰＣを未分化状態に維持する助けをする。あるいはまたはさらに、ＴＥＰＣは、インビトロでは多型潜在性の祖先細胞、例えば、ＥＳ細胞に由来し得る。
【００４１】
単離されたＴＥＰＣは、非ヒトトランスジェニックまたはキメラ哺乳動物胚、すなわち、対応する野生型細胞またはヒト胚を含まない外来または異種核酸を含む胚に由来し得る。異種核酸は、胚全体を通して見出され得、または特定の部分に局在し得る。これは、限定された数の細胞タイプにおいて表現型効果を生じるエレメントを含み得る。このように、単離されたＴＥＰＣの生存性を改善する方法は、ＴＥＰＣの祖先をポリヌクレオチドベースの生存性促進因子と接触させる工程を含み得る。核酸を細胞に導入する材料および方法は、本明細書の他の箇所に記載される。
【００４２】
ＴＥＰＣとして単離された細胞の同定は、該細胞による１以上の以下に記載のマーカーの発現を分析することによって確認され得る：Ｆｏｘｎ１（以前はｗｈｎ／Ｈｆｈ１１）、Ｐａｘ−１、Ｐａｘ−９、Ｈｏｘａ−３、ケラチン５、ケラチン８、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＴＳ２０および／またはＭＴＳ２４と反応性のエピトープ。
【００４３】
マーカーは、当業者に公知の任意の方法に従って検出され得る。検出方法は、マーカーをコードする核酸配列に結合し得る特異的結合メンバーを用い得、特異的結合メンバーは、該配列とハイブリダイズし得る核酸プローブ、または核酸配列またはそれによってコードされるポリペプチドに対する特異性を有する免疫グロブリン／抗体ドメインを含む。特異的結合メンバーは、マーカーに対する特定の特異性を有し、そして正常条件下で他の種よりも優先してマーカーに結合する。あるいは、マーカーに対する特異的ｍＲＮＡは、特異的オリゴヌクレオチドプライマーへの結合、および例えば、ポリメラーゼ連鎖反応での増幅によって検出され得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， （１９９２）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： 第３版， ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ， ２００１， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ．， １９８８， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００４４】
結合または相互作用は、定性的または定量的な、当該技術分野で公知の多くの技法によって決定され得る。特異的結合メンバーとマーカーとの間の相互作用は、いずれか一方を検出可能な標識で標識した一方を、固体支持体に固定されていてもよい他方、例えば、固体支持体に結合した二次抗体、と接触させることによって研究され得る。特異的結合メンバーと細胞表面に発現したマーカーとの間の相互作用は、フローサイトメトリーによって検出され得る。
【００４５】
フローサイトメトリー技法は、現在までに十分に樹立されている。詳細なプロトコルは、いくつかの最近の概論に応じており、以下が挙げられる：Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， 第２版 Ｍ．Ｇ． Ｏｒｍｅｒｏｄ編， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９７）； Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｊ． Ｐａｕｌ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９３）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｊ． Ｐａｕｌ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９７および最新版）。特異的結合メンバーへの結合のための蛍光標識としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）、ＰｅｒＣＰ（ペリジニウムクロロフィルプロテイン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＰＥ−ＣＹ５タンデムフルオロホア（フィコエリトリン−シアニン５タンデム共鳴エネルギー移行フルオロホア；Ｃｙｃｈｒｏｍｅ）またはＰｅｒＣＰ−ＣＹ５．５タンデムフルオロホアが挙げられる。
【００４６】
ＴＥＰＣを単離するための他の材料および方法としては、磁気ソーティング（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら， （１９９９） Ｃｅｌｌ， ９６， ２５−３４）および／または非ＴＥＰＣ細胞を、例えば、抗体で標識しそして補体に曝露することによって溶解することが挙げられ得る。皮質胸腺上皮細胞は、４Ｆ１で標識され得、そして皮質および髄質胸腺上皮細胞は両方とも適切なＭＨＣクラスＩＩ特異的抗体で標識され得る。
【００４７】
一旦胸腺細胞集団から単離されると、ＴＥＰＣは、適切な培地中に再懸濁される。このような培地の例は、Ｄ−バリン改変ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａから入手可能）である。基本培地は、栄養添加物、ビタミンまたはミネラル、抗生物質、抗菌剤、および抗ウイルス剤からなる群より選択される１以上の化合物が補充され得る。ＤＭＥＭは、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ウシ胎児血清、およびゲンタマイシン溶液の１以上が補充され得る。
【００４８】
ＴＥＰＣ集団は、細胞を以下のウェルに播種することによって維持され得る：（ｉ）細胞外マトリクスゲルでコーティングしたウェル；（ｉｉ）非コーティングウェル；（ｉｉｉ）所定の細胞外マトリクス成分（例えば、ラミニン、コラーゲン）でコーティングしたウェル；（ｉｖ）ゼラチンでコーティングしたウェル；または放射線照射した供給細胞（例えば、照射した線維芽細胞、例えば、照射したＥ１２．５胸腺細胞）でコーティングしたウェル。１以上の生存性促進因子は、細胞の播種の前または後に、単離されたＴＥＰＣの集団と接触され得る。
【００４９】
さらなる局面では、本発明は、本明細書に開示されたいずれか１つの方法によって、生存している未分化状態で維持されているＴＥＰＣを提供する。
【００５０】
関連する局面は、インビトロでＴＥＰＣの生存性を促進する異種核酸を含むＴＥＰＣである、この核酸は、本明細書で他の箇所に記載されるタイプのものであり得、例えば、条件付きで不活性化可能であり得るトランスフォーミング癌遺伝子である。
【００５１】
本発明はさらに、本発明によるＴＥＰＣを含む薬学的組成物、医薬品、薬物、または他の組成物；医学的治療の方法におけるこのようなＴＥＰＣまたは組成物の使用；このようなＴＥＰＣまたは組成物を、（例えば、ディジョージ症候群またはヒト「ヌード」状態の治療のために）例えば、無胸腺症個体において胸腺機能を回復するために、あるいは胸腺機能を増大またはカスタマイズし、そして例えば、骨髄および臓器移植患者において、同種異系移植受容を促進するために、患者に投与する工程を含む方法；例えば、ディジョージ症候群またはヒト「ヌード」状態における胸腺機能の回復のために無胸腺症患者に、あるいは胸腺機能を増大またはカスタマイズし、そして例えば、骨髄および臓器移植患者において、同種異系移植受容を促進するために、患者に投与するための医薬品の製造における、本発明のＴＥＰＣの使用；およびこのような集団を薬学的に受容可能な賦形剤、ベヒクル、またはキャリアと混合する工程を含む、薬学的組成物を製造する方法に拡張する。
【００５２】
本発明による、および本発明に従った使用のための薬学的組成物は、ＴＥＰＣの集団の他に、薬学的に受容可能な賦形剤、キャリア、緩衝剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、または当業者に周知の他の材料を含み得る。このような材料は、非毒性であるべきであり、そしてＴＥＰＣの活性を妨害するべきではない。キャリアまたは他の材料の正確な性質は、投与経路に依存する。
【００５３】
液体の薬学的組成物は、一般に、水、石油、動物または植物油、鉱油、または合成油などの液体キャリアを含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他の糖溶液、あるいはエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのようなグリコールが含まれ得る。
【００５４】
組成物は、発熱性物質を含まずそして適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。当業者は、例えば、塩化ナトリウム、リンゲル注射液、または乳酸加リンゲル注射液のような等張性ベヒクルを用いて適切な溶液を十分に調製することができる。
【００５５】
本発明による組成物の投与は、好ましくは、「予防的有効量」または「治療的有効量」（予防は治療であると考えられるが、事情次第で）であり、これは、個体に利益を示すために十分である。投与される実際の量、および投与の速度および時間経過は、治療される症状の性質および重篤度に依存する。治療の指示、例えば、投与量の決定などは、一般医および他の医師の責任の範囲内である。
【００５６】
組成物は、治療される症状に依存して同時または連続してのいずれかで、単独で、または他の治療と組み合わせて投与され得る。ＴＥＰＣは、当該技術分野で公知の任意の技法によって患者に移植され得る。
【００５７】
本発明に従って維持され単離されたＴＥＰＣは、成熟胸腺上皮細胞タイプ、例えば、皮質または髄質胸腺上皮細胞への分化を可能にするまたは引き起こし得る。このような分化は、適切には、不死化因子の除去および／または分化ブロック因子の除去の後にインビトロまたはインビボで生じ得る。したがって、本発明の薬学的組成物、医薬品、または薬物は、単離されたＴＥＰＣの他に、例えば、皮質胸腺上皮細胞または髄質胸腺上皮細胞への、ＴＥＰＣの分化を促進する１以上の要素を含み得る。このような要素は、間葉細胞および／またはＴ細胞前駆体または胸腺細胞によって供給されるかまたはこれらに由来し得る。
【００５８】
さらなる局面では、本発明は、ＴＥＰＣから成熟胸腺上皮細胞を生成するインビトロ方法を提供し、この方法は、適切であれば不死化因子の除去および／または分化ブロック因子の除去を促進する条件下で、成熟胸腺上皮細胞タイプへの、例えば、皮質または髄質胸腺上皮細胞へのＴＥＰＣの分化を促進する間葉細胞および／またはＴ細胞前駆体または胸腺細胞によって供給されるかまたはこれらに由来する１以上の要素の存在下で、ＴＥＰＣを培養する工程を含む。
【００５９】
ＴＥＰＣの集団が使用されるならば、大多数のＴＥＰＣが、成熟胸腺上皮の発生運命を採用させるかまたは採用することを可能にし得る。好ましい実施態様では、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超える、９０％を超えるＴＥＰＣが、成熟胸腺上皮細胞に分化する。ＴＥＰＣを分化させ得る特定の要素は、Ｗｎｔファミリーのタンパク質（Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ）、ＢＭＰファミリーのタンパク質（ＢＭＰ２、ＢＭＰ４）、Ｆｇｆファミリーのタンパク質（Ｆｇｆ７、Ｆｇｆ８、Ｆｇｆ１０）である。
【００６０】
この方法は、ＴＥＰＣ（例えば、不死化因子および／または分化ブロッキング因子が除去されているもの）を、
（ｉ）間葉細胞および／またはＴ細胞前駆体または胸腺細胞；および／または
（ｉｉ）間葉細胞、胸腺細胞、Ｔ細胞前駆体、Ｔ細胞、または血管内皮から選択される１以上の要素、
とともに培養する工程を含み得る。
【００６１】
これは、ＴＥＰＣを線維芽細胞または骨髄細胞とともに培養する工程を含み得る。
【００６２】
間葉細胞、Ｔ細胞前駆体、線維芽細胞、および骨髄細胞は、それぞれ細胞株に由来し得る。細胞株は、同種細胞集団を提供する。
【００６３】
この方法は、ＴＥＰＣの皮質または髄質胸腺上皮細胞のいずれかへの分化を検出する工程を含み得る。皮質胸腺上皮細胞は、モノクローナル抗体４Ｆ１と反応性のエピトープの発現および／またはＭＨＣクラスＩＩの発現によって同定され得る。髄質胸腺上皮細胞は、ＭＴＳ１０と反応性のエピトープの発現および／またはＭＨＣクラスＩＩの発現によって同定され得る。４Ｆ１および／またはＭＴＳ１０および／またはＭＨＣクラスＩＩと皮質および／または髄質胸腺上皮細胞タイプとの結合または相互作用は、本明細書の他の箇所に記載された方法のいずれかに従って検出され得る。分化はまた、例えば、顕微鏡によって、細胞形態学の変化を観察することによって、および／または遺伝子発現分析によって、検出され得る。
【００６４】
この方法は、成熟胸腺上皮細胞タイプへの分化を受けたＴＥＰＣの培養物から、皮質および／または髄質上皮細胞を分離する工程を含み得る。このような分離は、例えば、蛍光標識した４Ｆ１および／または抗ＭＨＣクラスＩＩを用いて、および／または該細胞を免疫吸着体に、例えば、固定された４Ｆ１および抗ＭＨＣクラスＩＩを有する固体支持体に吸着させて、ＦＡＣＳを用い得る。あるいは、この方法は、成熟胸腺上皮細胞タイプへの分化を受けたＴＥＰＣを含む培養物から未分化のＴＥＰＣを分離する工程を含み得る。このような分離は、ＦＡＣＳを用いて行われ得、例えば、ＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４を用いて、例えば、ＴＥＰＣで発現されるが成熟胸腺上皮細胞タイプでは発現しないように、あるいはマーカーが不死化因子および／または分化ブロッキング因子の除去時に除去されるように、ＴＥＰＣのゲノムに導入されたマーカーを用いる。ＴＥＰＣはＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４の両方を用いて、あるいはいずれかの抗体単独で精製される。精製されたＴＥＰＣは、ＭＴＳ２０またはＭＴＳ２４のいずれかまたは両方によって認識される決定基を発現し得る。
【００６５】
種々のさらなる局面では、本発明は、本発明の方法によって産生される成熟胸腺上皮細胞、このような細胞を含む薬学的組成物、医薬品、薬物、または他の組成物に拡張する。本発明はまた、医学的治療方法におけるこのような細胞または組成物の使用；例えば、無胸腺症個体において、例えば、ディジョージ症候群またはヒト「ヌード」状態の治療のために、胸腺機能を回復するために、あるいは例えば、骨髄および臓器移植患者において、胸腺機能を増大またはカスタマイズしそして同種異系移植受容を促進するために、患者にこのような細胞または組成物を投与する工程を含む方法；例えば、ディジョージ症候群またはヒト「ヌード」状態における胸腺機能の回復のために無胸腺患者に、あるいは例えば、骨髄および臓器移植患者において、胸腺機能を増大またはカスタマイズしそして同種異系移植受容を促進するために、患者に投与するための医薬品の製造におけるこのような細胞の使用；およびこのような細胞と薬学的に受容可能な賦形剤、ベヒクル、またはキャリアとを混合する工程を含む、薬学的組成物の製造方法に拡張する。
【００６６】
薬学的条件の処方および投与は、本明細書の他の箇所に記載される。
【００６７】
ＴＥＰＣおよび／またはその子孫、皮質および髄質胸腺上皮細胞は、インビボまたはインビトロのいずれかで、胸腺機能を提供するために使用され得る。インビトロまたはインビボでの胸腺機能の供給は、不死化因子および／またはＴＥＰＣの分化をブロックする因子をＴＥＰＣから除去することを必要とし得る。インビボでの胸腺機能の供給は、患者への細胞の移植を必要とする。
【００６８】
インビトロでの人工胸腺について、細胞は、１以上の他の細胞タイプをさらに含み得る栄養培地中で培養され、これは、例えば、胸腺基質の非上皮細胞、間葉細胞、血管内皮の細胞、造血幹細胞／リンパ様前駆細胞である。細胞は、固体支持体マトリクス上で増殖され得る。機能的人工胸腺の産生は、胸腺が造血幹細胞（ＨＳＣ）および／またはリンパ様前駆細胞の成熟ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞への分化を引き起こす能力によって検出され得る。成熟Ｔ細胞は、本明細書の他の箇所に記載のように、例えば、顕微鏡を用いてまたはフローサイトメトリーによって、ＣＤ４またはＣＤ８に対する標識抗体を用いて検出され得る。
【００６９】
さらなる局面では、本発明は、したがって、インビトロで人工胸腺を生成する方法を提供する。この方法は、皮質および髄質胸腺上皮細胞の集団を提供する工程を含み、この集団は、単離されたＴＥＰＣの集団の分化を引き起こすまたは可能にすることによって得られている。
【００７０】
この方法は、間葉細胞、ＨＳＣ、リンパ様前駆体、胸腺細胞、血管内皮細胞、またはこのような細胞の混合物によって供給されるまたはこれらに由来する１以上の要素とＴＥＰＣとを接触させることによって、この分化を誘導する工程を含み得る。この方法は、ＴＥＰＣを１以上のこれらの細胞と同時培養する工程を含み得る。
【００７１】
本発明はまた、成熟Ｔ細胞を産生する方法に拡張し、この方法は、ＨＳＣおよび／またはリンパ様前駆体／胸腺細胞を、本発明の人工胸腺と接触させる工程を含む。ＨＳＣおよびリンパ様前駆体は、例えば、バイオプシーによって、次いで適切な細胞マーカーに対する抗体を用いて、例えば、ＦＡＣＳ、アフィニティー精製によって、当業者に周知の標準的な技法を用いて、血液または骨髄から得られ得る。このような技法はまた、人工胸腺から成熟Ｔ細胞を得るために使用され得る。
【００７２】
本発明によって産生した成熟Ｔ細胞は、例えば、シクロスポリンで、例えば、化学および／または放射線療法によって、免疫系が抑制されている個体の免疫学的機能を回復するために、例えば、同種または異種移植拒絶の可能性を減少させるために、あるいは、個体に、免疫学的機能、例えば、ドナー由来レシピエント腫瘍特異的Ｔ細胞、または特定の病原体に特異的なＴ細胞を供給するために、使用され得る。
【００７３】
人工胸腺は、成熟Ｔ細胞の意図されたレシピエントの胸腺から抽出されたＴＥＰＣから生成され得、または意図されたレシピエントに由来する多型潜在性細胞に由来し得る。このように、胸腺によって産生されるＴ細胞は、レシピエントの組織に寛容であり得る。本発明のある実施態様では、人工胸腺のＴＥＰＣは、２以上の異なる個体または２以上の種に由来し得る。このように、胸腺によって産生される成熟Ｔ細胞は、２以上の個体または種の組織に寛容であり得る。これは、Ｔ細胞が同種または異種移植患者に使用される場合に、有益な結果を有し得る：Ｔ細胞は移植片および宿主の両方に寛容であり得る。さらなる選択肢は、適切な選択が個々の患者に対して行われ得る免疫学的適合性の範囲をカバーする細胞のバンクを樹立することである。１個体に由来するＴＥＰＣ細胞もまた、それらまたはその子孫が、第２の個体に導入される場合、拒絶を改善するように変化され得る。例としては、ドナー細胞における１以上のＭＨＣ対立遺伝子は、例えば、同種組換えによって、レシピエントの対立遺伝子と置換され得、またはレシピエントの対立遺伝子とともに、または、例えば、追加の遺伝子変異によってドナーの対立遺伝子とともに増大される。
【００７４】
本発明のさらなる局面は、ＴＥＰＣ由来の人工胸腺によって産生されるＴ細胞、ならびにこのようなＴ細胞を含む組成物、医薬品、または薬物を包含する。本発明はまた、例えば、細胞性免疫を回復するために、医学的治療の方法におけるこのようなＴ細胞または組成物の使用、ならびに医薬品の製造のためのこのようなＴ細胞の使用を提供する。薬学的組成物の処方および投与は、本明細書の他の箇所に記載される。
【００７５】
以下でより詳細に記載される実施例において、Ｆｏｘｎ１活性の抑制は、ヒトＴＥＰＣを得るために使用される。これは、ヒト胚胸腺上皮培養物への、Ｆｏｘｎ１−アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加、あるいはアンチセンス−Ｆｏｘｎ１ＲＮＡまたは抗Ｆｏｘｎ１リボザイムのウイルスまたはリポソーム送達によって、あるいは他の適切な手段によって、達成され得る。ＴＥＰＣまたはＴＥＳＣ特異的遺伝子由来の調節エレメントが選択可能マーカー発現を制御するために使用されるような構築物の使用を利用する方策があり得るのと同様に、条件付きで不活性化可能なＳＶ４０Ｔ抗原を有する構築物の、一次ＴＥＰＣ培養物への送達（例えば、レトロウイルス送達、アデノウイルス送達）のための代替方策もまた使用され得る。
【００７６】
成体マウス胸腺に存在するＭＴＳ２０＋／２４＋細胞は、残りの臓器特異的な幹細胞であり得、そのため代替のアプローチは、成体ヒト胸腺組織におけるこれらの残りのＴＥＳＣの再活性化に基づき得る。また、これは、生存性促進因子と細胞とを接触させる工程、および／またはＦｏｘｎ１タンパク質発現の可逆的抑制、および／または細胞の可逆的不死化、次いで表現型および機能分析を用いる。
【００７７】
したがって、発明者らは、インビトロでクローン細胞株として増殖し得るＴＥＰＣ集団を提供し、そしてＴＥＰＣ株の誘導、増殖、および分化のための、ならびにＴ細胞発生を支援するためのクローナルＴＥＰＣ株の使用のための、有効なプロトコルも提供する。細胞株は、容易に操作可能でありそして随意に拡張され得るので、これは、現在のインビトロＴ細胞分化方策よりも著しい有利点を提供し、これはエクスビボ由来の胸腺組織の培養物に依存する。したがって、ＴＥＰＣ株は、ドナー−宿主組織に対して寛容であるラージＴ細胞レパートリーをインビトロでルーチンで生成する能力を有するので、強力な臨床ツールであることを証明し得る。これらは、Ｔ枯渇骨髄の移植を必要とする治療における感染関連罹患率を減少させるために使用され得る。さらに、特定の特異性を有するＴ細胞は、これらのレパートリーから拡張され得、例えば、ドナー−リンパ球注入プロトコルのためのドナー由来のレシピエントのリンパ球特異的Ｔ細胞、例えば、免疫低下患者への移植のための病原体特異的Ｔ細胞を生成する有効な手段を提供する。ＴＥＰＣ株に基づく胸腺はまた、複合臓器移植プロトコルで使用され得、これは、Ｔ細胞再構成の速度を増加させ、そして同種または異種移植受容を促進させ、あるいは無胸腺個体に胸腺機能を回復させる。
【００７８】
これらの有益性にさらに、可逆的に不死化したＴＥＰＣ株は、胸腺臓器形成およびＴ細胞発生の期間中の遺伝子機能の研究のための健康で容易に操作可能なインビトロモデルを提供する。これは、これらのプロセスにおいて重要な役割を有する遺伝子を同定することに適用される。
【００７９】
本発明の局面および実施態様は、ここでは実施例のみによっておよび以下の図面を参照して説明される。さらなる局面および実施態様は、当業者に明らかである。本明細書に記載のすべての文献は、参考として本明細書に援用される。
【００８０】
実施例１
マウスのＴＥＰＣ株の生成
材料および方法
抗体
以下のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、免疫蛍光およびフローサイトメトリーに使用した：ＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４（両方ともラットｍＡｂ）；４Ｆ１（Ｉｍａｍｉ， Ｎ． Ｄｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２： １６１−１７３ （１９９２））；ＭＴＳ１０（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）；抗サイトケラチン（ウサギポリクローナル抗ケラチン、Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；抗ＭＨＣクラスＩＩ（Ｍ５１１４−ビオチン、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）；抗Ｔｈｙ−１（Ｔ２４、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）；抗ＣＤ４（ＧＫ１．５、ＰＥ結合、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）；抗ＣＤ３（１４Ｓ−２Ｃ１１、Ｃｙ−ｃｈｒｏｍｅ結合、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）；抗ＣＤ８（５３−６．７、ＦＩＴＣ結合、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）。
【００８１】
適切な同位体コントロール抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を、すべての実験においてネガティブコントロールとして使用した。フローサイトメトリーについては、非結合ｍＡｂを、ヤギ抗ラットＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）またはヤギ抗ウサギＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。免疫組織化学については、非結合ｍＡｂを、ウサギ項ラットＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）、ロバ抗ウサギＨＲＰ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｓｃｏｔｌａｎｄ）またはストレプトアビジンＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出した。
【００８２】
マウス
雌Ｃ５７ＢＬ／６および雄ＣＢＡマウスを一緒に一晩ケージに入れた。膣栓が見られた朝を胚日数０．５（Ｅ０．５）とした。雌ＩＣＲＦ ｎｕ／ｎｕマウスを、Ｈａｒｌａｎ ＵＫから得、そして換気した個別ケージに滅菌条件下で保持した。
【００８３】
組織学および免疫組織化学
薄片にするための組織を、ＰＢＳで洗浄し、そしてＯＣＴ化合物（Ｂａｙｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中に包埋した。８μｍの凍結した切片を、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）でコーティングしたスライド上で切断した。切片を冷アセトンで手短に固定し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学染色については、切片を１０％正常血清でブロックし、一次抗体とともに１〜２時間インキュベートし、次いで適切な二次抗体とともにインキュベートした。さらに、いくつかの切片を、次にチラミド増幅試薬（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で製造業者の指示書に従って処理した。
【００８４】
フローサイトメトリー
固体組織を、２ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ、０．７ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ、０．０５ｍｇ／ｍｌＤＮＡｓｅ（すべてＳｉｇｍａ）中で３７℃にて３０分間、単一細胞懸濁液になるまで解離させ、次いでよく洗浄した。細胞を、７０μｍ細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）を通過させることによって、リンパ節および成体胸腺から遊離させた。細胞を、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳ中でｍＡｂとともに４１℃にて２０分間インキュベートし、そしてＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄した。細胞内染色については、細胞を、Ｆｉｘ ａｎｄ Ｐｅｒｍ（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処理した。細胞をＦＡＣｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析し、そしてデータをＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて提示した。
【００８５】
ＦＡＣＳソーティングについては、細胞を上記のように調製し、そしてＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４で、次いで抗ラットＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）で染色した。ソーティングをＦＡＣＳ  Ｓｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。ＭＴＳ２０＋／２４＋およびＭＴＳ２０−／２４−細胞を回収し、そしてソーティングした細胞のアリコートをＦＡＣＳによって再分析した。すべての場合、ソーティングした集団の純度は９５％よりも大きかった。
【００８６】
細胞
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、内臓（胸腺を含む）から剥離したＥ１３．５またはＥ１４．５野生型胚から調製し、そして単一細胞懸濁液になるまですりつぶした。これらの細胞を、１０％ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中にプレートし、そして最小３日後にトリプシン処理（０．０２５％トリプシン）によって採取した。二重のネガティブ胸腺細胞を、製造業者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従って成体胸腺から回収した胸腺細胞由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞のＭＡＣＳ枯渇によって調製した。ＭＴＳ２０＋／２４＋およびＭＴＳ２０−／２４−細胞を、上記のように初期Ｅ１２．５胚から切除した胸腺から調製した。Ｅ１２．５に、各胸腺葉は、約５，０００細胞（未公開データ）を含み、約３０００のＭＴＳ２０＋／２４＋、または約７０００のＭＴＳ２０−／２４−細胞は、２つの未処理のＥ１２．５胸腺葉で見られるのと同等の数の各集団の細胞を構成する。
【００８７】
腎臓嚢移植
再凝集培養物を、既述のように調製した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｇ． Ｎａｔｕｒｅ ３６２：７０−７３ （１９９３））。適切な数の各細胞タイプを、少量の培地中で混合し、そして細胞スラリーを、培地に浮かべている０．８μｍ  Ｉｓｏｐｏｒｅメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に１滴落とした。２４〜４８時間後、再凝集物を雌ＩＣＲＦ  ｎｕ／ｎｕマウスの腎臓嚢の下に、移植の位置をマークするためにフィルターの小片とともに移植した（Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｍ．Ｗ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： ２５２６−２５３０ （１９９２））。以下の移植条件を使用した：
【００８８】
短期間移植
ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞は、１２，５００細胞（ｎ＝２）；８０，０００細胞（ｎ＝１）を移植する。ＭＴＳ２０−／２４−細胞は、１２，５００細胞（ｎ＝２）；２５，０００細胞（ｎ＝１）を移植する。すべて１００，０００ＭＥＦを有する。両方ともすべて１００，０００のＣＤ４−８−胸腺細胞を有するおよび有さない。
【００８９】
長期間移植
ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞は、５００細胞（ｎ＝１）；５００細胞＋１，０００ＭＥＦ（ｎ＝１）；５００細胞＋２００，０００ＭＥＦ（ｎ＝２）；１，０００細胞＋１，０００ＭＥＦ（ｎ＝１）；１，０００細胞＋２００，０００ＭＥＦ（ｎ＝１）；５，０００細胞（ｎ＝１）を移植する。
【００９０】
ＭＴＳ２０−／２４−細胞は、５００細胞＋２００，０００ＭＥＦ（ｎ＝２）；１，０００細胞＋２００，０００ＭＥＦ（ｎ＝１）；１０，０００細胞（ｎ＝１）；１０，０００細胞＋４，０００ＭＥＦ（ｎ＝１）；１６０，０００細胞＋１００，０００ＭＥＦ（ｎ＝１）を移植する。
【００９１】
解離しそして再凝集したＥ１２．５胸腺細胞は、１０，０００細胞（ｎ＝６）；１０，０００細胞＋１，０００ＭＥＦ（ｎ＝２）；１００，０００細胞（ｎ＝１）を移植する。
【００９２】
非操作ｎｕ／ｎｕコントロールマウスを、年齢を合わせ、そしてすべての実験において同じ購入群の由来とした。実験手順中の細胞の損失は不可避であり、このモデルにおいては定量可能ではないため、引用した入力細胞数は過大評価されている。
【００９３】
統計学的有意差を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて決定した。
【００９４】
結果
１．単離したＴＥＰＣの集団からの機能的胸腺の生成
所定の数の精製したＴＥＰＣ（ＭＴＳ２０＋／２４＋）またはＭＴＳ２０−／２４−細胞および初期胚線維芽細胞を混合し、インビトロで１〜２日間再凝集し、ヌードマウスの腎蔵嚢の下に移植し（Ｆｌａｎａｇａｎ， Ｓ．Ｐ． Ｇｅｎｅｔ． Ｒｅｓ ８： ２９５ （１９６６）；Ｐａｎｔｅｌｏｕｒｉｓ， Ｅ．Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ ２１７： ３７０−３７１ （１９６８））、そして分析前に３週間放置する。
【００９５】
健康な移植片を、すべてのＭＴＳ２０＋／２４＋レシピエントマウスから回収する（図１ａ）。これらの移植片は、被包されそして血管新生され、そしてリンパ様の外見を有する細胞を含むことが見出される（図１ｃ）。
【００９６】
免疫組織化学分析は、各移植片内のサイトケラチンポジティブ上皮細胞の拡張したネットワークを示し（図１ｅ）、大部分はＭＨＣクラスＩＩを発現し（図１ｈ）、そして４Ｆ１ポジティブ領域およびＭＴＳ１０ポジティブ領域の両方を含む（図１ｆ、ｇ）。髄質および皮質領域は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色した切片で明らかに見える（図１ｃ）。移植片内のリンパ様細胞はＴｈｙ−１ポジティブであり（Ｖａｎ Ｅｗｉｊｋ， Ｗ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： ２６２−２７１ （１９８２））（図１ｉ）そしてＢ２２０ネガティブであり、これは、それらがＴ系統の細胞であることを示す。これらは主にケラチンポジティブ領域内で見られる。いくつかの上皮Ｔｈｙ−１染色も明らかである。
【００９７】
これらのデータは、ＭＴＳ２０＋／２４＋集団内の細胞が、成熟皮質（４Ｆ１＋）および成熟髄質（ＭＴＳ１０＋）胸腺上皮系統の両方のマーカーを発現する細胞に分化し得ることを示す。さらに、ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞またはその子孫は、Ｔ細胞子孫を誘引しそして移植片の血管新生を開始し得る。初期胚線維芽細胞のみを含むコントロール移植片は、いくつかのレシピエントにおいて生存するが、リンパ様細胞によってコロニー形成されない。これらは、ケラチン、４Ｆ１、またはＭＴＳ１０のいずれも発現しない。
【００９８】
ＭＴＳ２０−／２４−細胞レシピエントにおいて、移植した細胞が見られる証拠はないが、すべての動物において、移植部位は明らかにマークされている（図１ａ〜ｄ）。
【００９９】
ＭＴＳ２０−／２４−細胞が胸腺細胞とともに供給される場合に機能的胸腺を形成し得る可能性、これらは生存のために胸腺細胞由来要素を必要とするがＴ細胞子孫を誘引し得ない場合に相当するが、この可能性を除外するために、ＭＴＳ２０＋／２４＋およびＭＴＳ２０−／２４−細胞移植片を、成体胸腺から精製したＣＤ４−８−胸腺細胞とともに播種する。移植後３週間のＭＴＳ２０＋／２４＋移植物の免疫組織化学分析は、上記と同一の結果を得る。ＭＴＳ２０−／２４−細胞移植片は、回収され得ない。したがって、ＭＴＳ２０−／２４−細胞は、たとえ未成熟胸腺細胞とともに供給されても、胸腺機能を再構成できない。これらのデータは、ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞が、上記の役割以外に、分化中および／または成熟皮質胸腺上皮の増殖および生存を支援するために直接的または間接的に必要とされ得ることを示唆する。なぜなら、ＭＴＳ２０−／２４−集団は、皮質上皮のマーカーである４Ｆ１を発現する上皮細胞を含み、これは、未成熟ＣＤ４＋およびＣＤ８＋単一ポジティブ段階への胸腺細胞の発生を支援するために十分であると、これまで考えられていたからである（Ｇｅ， Ｑ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２： １１２７−１１３３ （２０００）；ＤｅＫｏｎｉｎｇ， Ｊ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８： ２５５８−２５６６ （１９９７））。
【０１００】
ＭＴＳ２０＋／２４＋集団の機能の潜在性をテストするために、胸腺細胞発生を、ＣＤ４−８−Ｔ細胞子孫とともに播種した移植片で分析する。ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞移植片から回収した胸腺細胞のフローサイトメトリー分析は、移植片がＣＤ４−８−子孫のＣＤ４＋およびＣＤ８＋単一ポジティブＴ細胞への分化を支援し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットの分布が正常成体胸腺内の分布と同一であることを示す（図１ｋ）。
【０１０１】
ＭＴＳ２０＋／２４＋集団の機能の潜在性を、レシピエントヌードマウスにおける末梢Ｔ細胞の存在をアッセイすることによってさらにテストする。これらの実験において、少数の細胞を、ヌードレシピエントの腎臓嚢の下に移植し、分析前に１２〜１６週間放置する。レシピエントマウスは、５００〜５，０００ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞（移植片当たり０．２〜２胚−胸腺等価物）、５００〜１６０，０００ＭＴＳ２０−／２４−細胞（移植片当たり０．７〜１．４胚−胸腺等価物）、または全Ｅ１２．５胸腺葉の移植片を受ける。５００ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞のみを移植した４匹のマウスを含む６／７のＭＴＳ２０＋／２４＋細胞レシピエントマウスの腋窩、鼠蹊、および膝窩のリンパ節に、著しいＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団が存在する（図２ａ、ｂ；表１）。Ｅ１２．５全葉移植片を受けるマウスにおいて等価の集団が見られるが（図２ｃ、ｄ；表１）、非操作ヌードコントロールは、これらのリンパ節にほとんどＴ細胞を有さない（図２ｇ、ｈ；表１）。ＭＴＳ２０−／２４−細胞を受けるマウスは、胸腺機能を得ることができない：別個のＴ細胞集団が、ＭＴＳ２０−／２４−細胞移植片の６レシピエントのうちの１匹のみで見られ（表１）、そしてこの場合には１０，０００ＭＴＳ２０−／２４−細胞が移植されるので、夾雑している少数のＭＴＳ２０＋／２４＋細胞の増殖の結果であり得る。未分割のＥ１２．５胸腺由来の解離および再凝集した細胞の移植片を受けるマウスは、５／９ケースのみで末梢Ｔ細胞集団が発生し、そしてＣＤ８＋Ｔ細胞集団を発生せず、これらの細胞がＭＴＳ２０＋／２４＋細胞と比較して胸腺生成潜在性が減少していることを示す。まとめると、これらのデータは、ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞移植片内の分化した上皮細胞の機能および表現型の成熟度を示す。したがって、これらは、Ｅ１２．５マウス胸腺原基内のＭＴＳ２０＋／２４＋細胞が、インビボで機能的胸腺を生成するために十分である特定化ＴＥＰＣであることを証明する。
【０１０２】
２．増殖因子の添加によるＴＥＰＣ生存性の改善
マウスＴＥＰＣを、フローサイトメトリーによって胚日数Ｅ１２．５胸腺原基から富化する。前方および側方散乱パラメータを用いて、ＴＥＰＣ集団を選択する。細胞を２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ）を補充した改変ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁する。増殖因子を添加し、そして細胞をプレートに播種する。２４ウェルプレートのウェル当たり約４×１０５細胞の播種密度を用いる。増殖因子を２日ごとに添加する。ＴＥＰＣ培養物がコンフルエントに近づくと、追加するＤＭＥＭ（上記）で細胞集団を希釈し、そしてフラスコ中で３７℃にて維持する。これらの培養物の表現型を、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、および遺伝子発現分析によって定期的に評価して、ＴＥＰＣ表現型の維持を確実にする。
【０１０３】
３．不死化ＴＥＰＣ株の調製
Ａ）トランスジェニックＥＳ細胞を、Ｆｏｘｎ１転写開始の下流の、ＬｏｘＰで挟まれたＳＶ４０Ｔ抗原＋選択可能マーカーおよび停止カセットの標的組込みによって、Ｆｏｘｎ１発現が条件付きで除去されている（図３）ように調製する。標準的なＥＳ細胞ターゲティング技法を用い、そして両方のＦｏｘｎ１対立遺伝子をターゲティングする。本明細書の他の箇所で議論するように、Ｆｏｘｎ１（以前はｗｈｎ／Ｈｆｈ１１）を発現できない胸腺細胞は、成熟胸腺上皮細胞亜集団に分化し得ない。したがって、Ｆｏｘｎ１発現の抑制により、ＴＥＰＣ段階での発生が阻止される。
【０１０４】
Ｆｏｘｎ１−／−ＥＳ細胞を、野生型胚盤胞に注入し、そして偽妊娠雌マウスに移す。これは、キメラ胚を生成する。ＬｏｘＰで挟まれたＳＶ４０Ｔ抗原／選択可能マーカー／停止カセットを有するＴＥＰＣを、キメラ胚胸腺から得る。Ｅ１２．５日目で胚を殺し、そしてその胸腺を取り出す。ＴＥＰＣを、前方および側方散乱パラメータを用いてＦＡＣＳ精製により富化する。細胞を単一細胞懸濁液になるまで解離し、そして追加した改変ＤＭＥＭ中で増殖する。抗生物質を培地に添加して、Ｆｏｘｎ１プロモーターが活性であるトランスジェニック細胞のみの増殖を確実にする。候補ＴＥＰＣ株を、モノクローナル抗体ＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４、または適切にＴＥＰＣで発現される他のマーカーを用いて、表現型で特徴づける。ＴＥＰＣマーカーを発現する株を、さらなる繁殖のために選択する。
【０１０５】
Ｂ）あるいは、Ｆｏｘｎ１を、Ｆｏｘｎ１転写開始の下流の、ＬｏｘＰで挟まれた選択可能マーカーおよび停止カセットの標的組込みによって、条件付きで除去し、そしてＴｅｔプロモーターによって調節されるＬｏｘＰで挟まれたＳＶ４０Ｔ抗原を含む導入遺伝子を、同じＥＳ細胞に導入し、それによってＳＶ４０Ｔ抗原発現が、テトラサイクリンアナログ中での細胞の増殖によって誘導される。テトラサイクリンアナログを含む培地中での増殖時に、ＴＥＰＣ株を上記のように誘導する。
【０１０６】
Ｃ）あるいは、Ｆｏｘｎ１を、Ｆｏｘｎ１遺伝子座における導入遺伝子のランダム組込みによって条件付きで除去する。導入遺伝子は、ＬｏｘＰで挟まれた選択可能マーカーおよび停止カセットがＦｏｘｎ１転写開始の下流に位置しており、そしてＴｅｔプロモーターによって調節されるＬｏｘＰで挟まれたＳＶ４０Ｔ抗原を含む導入遺伝子を、同じＥＳ細胞に導入し、そのためＳＶ４０Ｔ抗原発現が、テトラサイクリンアナログ中での細胞の増殖によって誘導される。トランスジェニックマウスを産生し、そしてＦｏｘｎ１−／−バックグラウンド（すなわち、ｎｕ／ｎｕ）に戻し交配する。テトラサイクリンアナログを含む培地中での増殖時に、ＴＥＰＣ株を上記のように誘導する。
【０１０７】
Ｄ）あるいは、ＴＥＰＣ株を、精製ＴＥＰＣまたは富化ＴＥＰＣ培養物への、条件付きで不活性化可能なＳＶ４０Ｔ抗原の、レトロウイルスまたはアデノウイルス送達によって誘導する。可逆的不死化を達成する。
【０１０８】
Ｅ）あるいは、ＴＥＰＣ株を、精製ＴＥＰＣまたはＴＥＰＣ富化培養物への、条件付きで不活性化可能なＳＶ４０Ｔ抗原およびＦｏｘｎ１−アンチセンスオリゴヌクレオチドの、レトロウイルスまたはアデノウイルス送達によって誘導する。Ｆｏｘｎ１の可逆的不死化および可逆的抑制の両方を達成する。
【０１０９】
４．ＴＥＰＣの成熟胸腺上皮細胞タイプへの分化
上記（３）のように調製したＴＥＰＣ細胞株中のＦｏｘｎ１の再活性化および／またはＳＶ４０ラージＴ抗原の除去は、皮質および髄質胸腺上皮細胞を含む、成熟胸腺上皮細胞タイプへのＴＥＰＣの分化を可能にする：ＳＶ４０ラージＴ抗原／選択可能マーカー／停止カセット、または別々のＳＶ４０ラージＴ抗原および選択可能マーカーおよび停止カセットのＣｒｅ媒介切除は、Ｃｒｅ発現ベクターで細胞株を形質転換することによって、またはＴＥＰＣ内の誘導性Ｃｒｅ導入遺伝子の活性化によって達成される。
【０１１０】
Ｆｏｘｎ１の再活性化およびＳＶ４０ラージＴ抗原の除去の後、ＴＥＰＣ株を、胸腺間葉細胞および／または造血幹細胞および／またはリンパ様前駆細胞および／または胸腺細胞の存在下で培養する。ＴＥＰＣの皮質および髄質胸腺上皮亜集団への分化を、免疫細胞化学および遺伝子発現分析を用いて評価する。必要ならば、未分化ＴＥＰＣをＦＡＣＳによって培養物から除去する。
【０１１１】
実施例２
ヒトＴＥＰＣ株誘導
ヒトＦｏｘｎ１＋／−ＥＳ細胞株を、本明細書に記載のように生成する。ＴＥＰＣを、マウスＴＥＰＣについて記載したように光散乱パラメータを用いてフローサイトメトリーによって最初の３ヵ月のヒト流産児から得た胸腺組織から富化し、そしてＤ−バリン改変補充ＤＭＥＭに再懸濁し、そしてプレートに播種する。
【０１１２】
次いで、不活性化可能なＳＶ４０Ｔ抗原および可逆的Ｆｏｘｎ１抑制を、Ｆｏｘｎ１−アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＦｏｘｎ１−アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドのＴＥＰＣ培養物への添加によって、または条件付きでアンチセンス−Ｆｏｘｎ１を発現する構築物のウイルスまたはリポソーム送達によって、および条件付きで不活性化可能な（すなわち、ＬｏｘＰで挟まれた）ＳＶ４０Ｔ抗原のレトロウイルスまたはアデノウイルス送達によって、ＴＥＰＣの培養物に送達する。
【０１１３】
個々のコロニーの細胞を、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学による表現型分析のためにサンプリングし、ＭＴＳ２０およびＭＴＳ２４のヒトオーソロガスを含むマウスＴＥＰＣの特徴的なマーカーの発現を評価する。候補ＴＥＰＣを、表現型によってさらなる繁殖およびクローニングについて選択し、次いでＳＶ４０Ｔ抗原不活性化／Ｆｏｘｎ１活性化後の系統および機能分析によって特徴づけ、これは、上記のようにＣｒｅを不死化細胞に送達することによって、および適切な場合に培地からＦｏｘｎ１アンチセンスオリゴヌクレオチドを離脱させることによって達成される。
【０１１４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＦｏｘｎ１発現の抑制の証明のための材料および方法
マウス
全胚培養のための胚を、異型接合Ｆｏｘｎ１−βｇａｌ雄と交尾したＣ５７ＢＬ／６雌から得た。この雄は、ターゲティングされたトランスジェニックマウスであり、ＬａｃＺの転写がＦｏｘｎ１プロモーターによって制御されるようにＦｏｘｎ１（ｗｈｎ）遺伝子座にｌａｃＺ導入遺伝子が挿入されている（Ｎｅｈｌｓ， Ｍ．ら Ｔｗｏ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｅｐａｒａｂｌｅ ｓｔｅｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２， ８８６−８８９ （１９９６））。そして、１０．５日目の胚発生（Ｅ１０．５）を回収した。膣栓の出現の日をＥ０．５とみなした。
【０１１５】
オリゴヌクレオチド
フルオレセインでタグ付けしたＦｏｘｎ１−アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドおよびフルオレセインでタグ付けしたコントロールモルホリノオリゴヌクレオチドを、Ｇｅｎｅｔｏｏｌｓ， ＬＬＣ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ， Ｏｒｅｇｏｎ）から得た。これらのオリゴの配列を、供給業者の指示書に従って決定した。
【０１１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの全胚培養およびエレクトロポレーション
Ｅ１０．５胚を、未処理胎盤とともに、子宮筋肉および脱落膜から切開した。各胚を、卵黄嚢の無血管領域に作製した小（２〜３ｍｍ）スリットを通して穏やかに押出し、そして羊膜を除去した。切開後、胚を小滴の培地の一方の側に置いた。次いで、フルオレセインでタグ付けしたＦｏｘｎ１−アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（５０マイクロモル）およびフルオレセインでタグ付けしたコントロールモルホリノオリゴヌクレオチド（５０マイクロモル）を、胚の片側の第３鰓嚢の内腔にマイクロインジェクトし、コントロールとして反対側の嚢を放置した。あるいは、胚に模擬注射した。次いで、１ｍｍ ｇｅｎｅｔｒｏｄｅ電極（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）とともにＢＴＸ８３０装置（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を用いるエレクトロポレーション（３０Ｖの２または３パルス、５０ミリ秒）を用いて、第３鰓嚢の細胞にオリゴヌクレオチドを導入した。胚を、ボトル当たり２ｍｌ全胚培養培地中の１つの胚および９５％酸素の連続供給での回転培養システム（ＢＴＣ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ）に移した。胚を、３０時間の培養期間中モニタリングして分析した。
【０１１７】
全胚のＸｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）染色
胚を、ＰＢＳ中の（０．２％グルタルアルデヒド、１％ホルムアルデヒド、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％ ＮＰ４０）の溶液中で４℃にて３０〜６０分間固定し、次いでＰＢＳ＋０．０２％ ＮＰ４０で室温にて５分間３回洗浄した。次いで、これらを、ＰＢＳ中（１ｍｇ／ｍｌ Ｘｇａｌ、５ｍＭフェロシアン化カリウム、５ｍＭフェリシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％ ＮＰ４０）の溶液中で暗所で３７℃にて４〜１２時間、染色が見えるまで染色した。染色後、胚を、ＰＢＳ＋０．０２％ ＮＰ４０で室温にて５分間３回洗浄し、次いで上記のように４℃にて３０〜６０分間再固定した。次いで、胚をＰＢＳ＋０．０２％ ＮＰ４０で洗浄し、そして必要に応じて従来のパラフィン包埋および薄片切り出しのための操作まで４℃にて保存した。
【０１１８】
組織学
新鮮な組織を、ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ ＴＥＫ）で急速冷凍し、そして８マイクロメートルの横断切片を、ｃｒｙｏｔｏｍｅ ６５０（Ａｎｇｌｉａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて切断した。切片を、−８０℃にて保存し、そして使用前に風乾した。組織学的染色のために、切片をアセトン固定し、洗浄し、そしてＭａｙｅｒ’ｓヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）中で１０分間、次いでエオシン（Ｓｉｇｍａ）中で５分間インキュベートした。
【０１１９】
結果
アンチセンスオリゴヌクレオチドがＦｏｘｎ１発現を抑制する能力についての証拠を、培養したマウス胚におけるＦｏｘｎ１発現のアッセイによって調べた。上記のようにＣ５７ＢＬ／６×Ｆｏｘｎ１−βｇａｌ＋／−交配から得た胚を、Ｅ１０．５で切開し、フルオレセインでタグ付けしたＦｏｘｎ１−アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドまたはコントロールのフルオレセインでタグ付けしたアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドでマイクロインジェクトし、あるいは模擬注射し、次いで上記のようにエレクトロポレートし、そして３０時間培養した。培養期間の最後に、胚を顕微鏡によって検査し、そして正常な発生を示す胚をさらなる分析のために先に取り出した。最初に、これらの胚をＰＣＲによって遺伝子型に分けた。ｌａｃＺ導入遺伝子についての異型接合である胚を、Ｘｇａｌで染色して、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、これはＦｏｘｎ１発現を示す（Ｎｅｈｌｓ １９９６；Ｇｏｒｄｏｎ， Ｊ． Ｇｃｍ２ ａｎｄ Ｆｏｘｎ１ ｍａｒｋ ｅａｒｌｙ ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ− ａｎｄ ｔｈｙｍｕｓ− ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｔｈｉｒｄ ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｐｏｕｃｈ． Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １０３， １４１−１４３ （２０００））。染色後、発現を可視的にスコア付けし、そして写真で記録した。次いで、胚を、記載のように、薄片作成および詳細な組織学的検査のために処理した。
【０１２０】
強いＸｇａｌ染色を、模擬注射したコントロール胚の胸腺葉およびコントロールモルホリノオリゴヌクレオチドで注射／エレクトロポレートした胚の両方で観察した。Ｆｏｘｎ１−アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドで注射／エレクトロポレートした胚は、非注射／エレクトロポレートした嚢に由来する胸腺葉で強いＸｇａｌ染色を示したが、注射／エレクトロポレートした嚢に由来する胸腺葉ではＸｇａｌ染色非常に弱いか全く示さなかった。これらの胚に由来する切片の組織学的検査は、これらのデータを確認し、そして胚発生が非操作コントロール胚、模擬注射胚、およびコントロールモルホリノオリゴヌクレオチドでの注射／エレクトロポレートした胚において等価であることを示した。このように、手順自体はＦｏｘｎ１発現または胸腺発生に効果がないことを示した。したがって、これらのデータは、Ｆｏｘｎ１−アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドの第３鰓嚢細胞への導入が、β−ガラクトシダーゼ活性によって報告されたように、Ｆｏｘｎ１発現を抑制できたことを証明する。
【０１２１】
実施例３  カスタマイズしたヒトＴ細胞レパートリーの発生
胸腺細胞発生の間、ポジティブおよびネガティブ選択に必要とされるＭＨＣリガンドは、胸腺上皮細胞によって供給される必要はない。なぜなら、線維芽細胞および造血由来細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方のポジティブ選択を媒介し得、一方、ネガティブ選択は、骨髄由来胸腺樹状細胞（ＤＣ）および髄質上皮細胞の両方によって行われるからである。したがって、Ｔ細胞成熟は胸腺依存的であるが、胸腺−ＭＨＣ非依存的と見なされ得る。さらに、マウス胸腺上皮は、ヒトＴ細胞発生を支援し得る。
【０１２２】
したがって、マウスＴＥＰＣ株は、キメラ再凝集胎児胸腺臓器培養物（ＲＦＴＯＣ）（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｇ．， Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ， Ｅ．Ｊ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｎ．Ｃ．およびＯｗｅｎ， Ｊ．Ｊ．Ｔ． ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｂｏｔｈ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｔ−ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｈｙｍｕｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３６２， ７０−７３ （１９９３））における上皮機能が、分化したマウスＴＥＰＣ株によって供給されるという方策によって、特定のヒトＴ細胞レパートリーを生成するために使用されるが、ＭＨＣ選択は、ヒト線維芽細胞およびＤＣによって媒介される。ヒトＴＥＰＣは同様に使用され得た。
【０１２３】
このアプローチは、Ｃｒｅ誘導された分化しているＴＥＰＣ株が同種異系ＭＨＣ特異性を補充されている完全なマウス系において行われる。ここで、ＴＥＰＣとハプロタイプがミスマッチしているマウスに由来する線維芽細胞およびＤＣは、ＴＥＰＣ株に基づくＲＦＴＯＣに包含される。
【０１２４】
これらは、ＴＥＰＣ株と同系のヌードマウスに移植され、そして１２〜１６週間放置し、その後レシピエントマウスがＴＥＰＣおよび「ドナー」ハプロタイプと同系および同種異系の皮膚移植片を拒絶する能力を決定する。ＴＥＰＣおよび「ドナー」ハプロタイプの両方の皮膚移植片の受容と、第三者の移植片の拒絶は、これらのキメラＲＦＴＯＣ移植片で生成したＴ細胞レパートリーがＴＥＰＣおよびドナー組織の両方に対して十分に機能的かつ寛容であることを証明する。
【０１２５】
ヒトＴ細胞を生成するために、個々のヒト由来の線維芽細胞および造血前駆細胞がマウスＴＥＰＣに基づくＲＦＴＯＣに付加するように、システムを改変する。これらは、ＴＥＰＣ株と同系のＳＣＩＤ／ヌードマウスに移植され、これは、さらなるヒト造血前駆細胞を受ける。得られるヒトＴ細胞レパートリーの特異性は、同系および同種異系ヒトおよびマウス細胞を溶解する能力がテストされる細胞傷害性アッセイを用いて明らかにする。必要ならば、ヒトタンパク質に対するＴ細胞レパートリーの寛容化は、移植したＲＦＴＯＣへのヒト細胞ライセートの注入によって、またはキメラＲＦＴＯＣの生成の前にヒト細胞ライセートの存在下でインビトロで誘起したヒトＤＣの使用によって、最適化される。
【０１２６】
さらに、ＴＥＰＣ株は、クラスＩおよびクラスＩＩ欠損マウスから生成される。なぜなら、マウスＭＨＣ複合体におけるＴ細胞レパートリーのポジティブまたはネガティブ選択がこの場合に生じ得ず、したがって、このようなＴＥＰＣが、臨床使用のためのヒトＴ細胞の産生の可能性を有するからである。
【０１２７】
ヒトＴＥＰＣはまた、以下の改変とともに使用され得る；ＲＦＴＯＣは、ＴＥＰＣ、および１以上の個々のヒト由来の造血前駆細胞を含み、そしてまた、１以上の個々のヒト由来の線維芽細胞を含む。
【０１２８】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ヌードマウスの腎臓嚢の下に移植した細胞の分析を示す：（ａ）Ｅ１２．５ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞移植片；（ｂ）Ｅ１２．５ＭＴＳ２０−／２４−細胞移植片部位；（ｃ）（ａ）からの移植片のヘマトキシリンおよびエオシン染色した切片；（ｄ）（ｂ）からの移植片部位のヘマトキシリンおよびエオシン染色した切片；（ｅ〜ｊ）（ｅ）サイトケラチン、（ｆ）４Ｆ１、（ｇ）ＭＴＳ１０、（ｈ）ＭＨＣクラスＩＩ、（ｉ）Ｔｈｙ−１、（ｊ）二次Ａｂのみ、について染色したＭＴＳ２０＋／２４＋細胞移植片；（ｋ）ＣＤ４−８−胸腺細胞とともに播種したＭＴＳ２０＋／２４＋細胞移植片から回収した細胞のフローサイトメトリー分析、一重および二重ポジティブ集団の発生を示す。スケールバー：（ａ，ｂ）１ｍｍ；（ｃ〜ｊ）１００μｍ。矢印：（ａ，ｂ）移植部位の点、（ｃ，ｄ）移植部位をマークするフィルター。四角：（ｃ）（ｅ〜ｊ）で示す領域。３実験の代表：移植片は、８００００、ｎ＝１、１２５００、ｎ＝２のＭＴＳ２０＋／２４＋細胞；２５０００、ｎ＝１、１２５００、ｎ＝２のＭＴＳ２０−／２４−細胞を含んでいた。
【図２】
ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞がヌードマウスにおいてどのように胸腺機能を与えるかを示す。グラフは、リンパ節におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団のフローサイトメトリー分析を示す：（ａ，ｂ）５００のＭＴＳ２０＋／２４＋細胞を移植したヌードマウス；（ｃ，ｄ）Ｅ１２．５全胸腺葉を移植したヌードマウス；（ｅ，ｆ）解離しそして再凝集したＥ１２．５胸腺葉を移植したヌードマウス；（ｇ，ｈ）操作していないコントロールのヌードマウス；リンパ様細胞についてゲート制御後。図２（ａ，ｃ，ｅ，ｇ）は、ＣＤ３、ＣＤ４発現を示す；図２（ｂ，ｄ，ｆ，ｈ）は、ＣＤ３、ＣＤ８発現を示す。図は、各グラフの右上象限にリンパ様細胞のパーセントを示す。ＭＴＳ２０＋／２４＋細胞を移植したマウスはｎ＝７；Ｅ１２．５胸腺葉全体を移植したマウスはｎ＝７；解離しそして再凝集したＥ１２．５胸腺葉を移植したマウスはｎ＝９；操作していないマウスはｎ＝１５であった。
【図３】
（Ａ）ＬｏｘＰに隣接するＳＶ４０Ｔ抗原（Ｔａｇ）＋ＩＲＥＳ結合した選択可能マーカー−停止カセットの、Ｆｏｘｎ１遺伝子座への組込みは、Ｆｏｘｎ１プロモーターの制御下にＳＶ４０Ｔａｇを置き、そしてＦｏｘｎ１ヌル対立遺伝子を生成する。エクソン１５は、非コード配列であり、そしてＳＶ４０ Ｔａｇ ＩＲＥＳ ＧＦＰ／ネオマイシン耐性カセットに含まれる強力なスプライスアクセプターにスプライスされる。転写は、ポリアデニル化部位で短縮され、そして転写中段で終了し、したがってＦｏｘｎ１コード配列は、転写または翻訳されない。Ｆｏｘｎ１対立遺伝子の両方がターゲティングされる細胞はＦｏｘｎ１ヌルであり、そしてＦｏｘｎ１を正常に発現する細胞はＳＶ４０Ｔａｇによって不死化される。遺伝子ターゲティングに使用される構築物は、ＥＳ細胞において発現されるプロモーター下流に、さらなる選択可能マーカーを含み、このマーカーは、ターゲティングされた細胞の使用前に欠失されるので、示されない。このターゲティング方策に使用されるＥＳ細胞は、組込まれた誘導性Ｃｒｅ導入遺伝子（示さない）を含み得、またはＣｒｅは、ウイルスまたはプラスミド発現構築物を介してターゲティングされたＥＳ細胞に送達され得る；ならびに（Ｂ）Ｃｒｅリコンビナーゼ発現の誘導後、ＬｏｘＰに隣接するカセットを、Ｃｒｅ媒介組換えによって切り出し、イントロン中の単一のＬｏｘＰ部位をなくす。これは、正常Ｆｏｘｎ１発現を回復し、そしてＳＶ４０Ｔａｇを除去する。したがって、細胞は、脱不死化を受け、そして適切なシグナルの受容の際に分化するためにコンピテントになる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図１ｉ】
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【図１ｊ】
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【図１ｋ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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