(57)【要約】本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の複製を阻害し得るオリゴヌクレオチドを提供する。より詳細には、本発明は、核酸またはタンパク質の標的との相互作用を通してＨＰＶの複製を阻害する、ＨＰＶ　Ｅ１オープンリーディングフレームの翻訳開始部位に対して相補的なオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも４個のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含み、かつ、ヌクレオチド間結合またはモノヌクレオチドに種々の改変を含み得る。さらに、本発明は、ＨＰＶ感染に関連した障害または疾患を処置するための薬学的組成物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド＋１位〜ヌクレオチド＋２０位の中に含まれる、ヒトパピローマウイルスのＥ１オープンリーディングフレームの部分に対して相補的であり、かつ少なくとも４個のヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが改変されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
少なくとも１つの改変が、ヌクレオチド間結合において生じている、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記改変が、アルキルホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホノチオエート結合、ホスホルアミデート結合、カルバメート結合、カルボネート結合、ホスフェートトリエステル結合、アセトアミデート結合、カルボキシメチルエステル結合、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記改変が、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
すべてのヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドおよび少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
少なくとも１つのイノシンヌクレオチドを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
少なくとも１つのモノヌクレオチドの糖部分に対して少なくとも１つの改変を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
少なくとも１つのモノヌクレオチドの塩基部分に対して少なくとも１つの改変を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
５’末端にキャップを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
３’末端にキャップを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
５’末端および３’末端にキャップを含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号３６の配列またはその一部分を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号１〜３７のいずれか１つ以上からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号１、２、３、４、１１、２１、２６、２８および３４からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号１を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号２を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号３を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号２８を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号３４を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
ＨＰＶの複製を阻害し得る、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記阻害が、前記オリゴヌクレオチドと核酸との相互作用に起因する、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記阻害が、前記オリゴヌクレオチドとタンパク質との相互作用に起因する、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
前記タンパク質がレセプターである、請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
前記オリゴヌクレオチドが、全部で４ヌクレオチドを有する、請求項１〜２８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが、全部で１８ヌクレオチドを有する、請求項１〜２８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチドが、全部で６〜１８ヌクレオチドを有する、請求項１〜２８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号１〜２５または配列番号２７〜３７のいずれか１つに記載の配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号１〜２５または配列番号２７〜３７の配列からなる、オリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである、請求項１〜３３のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１つに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項３６】
パピローマウイルスに感染した哺乳動物を処置する方法であって、請求項１〜３５のいずれか１つに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたは組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドを、別の抗ウイルス化合物と組み合わせて投与する、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＨＰＶに関連した障害または疾患に罹患している哺乳動物を処置する方法であって、請求項１〜３５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたは組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＰＶに関連した障害または疾患が、良性の皮膚疣贅、陰部疣贅、疣贅状表皮発育異常症、呼吸器乳頭腫症、咽頭乳頭腫症または子宮頚癌である、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＨＰＶに関連した障害または疾患が、ＨＰＶ６株、ＨＰＶ１１株、ＨＰＶ１６株、ＨＰＶ１８株、ＨＰＶ３１株、ＨＰＶ４５株、またはＨＰＶ５８株による感染と関連付けられる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
アンチセンス機構以外の機構によってＨＰＶの複製を阻害し得る、合成オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に関する。より詳細には、本発明は、ヒトパピローマウイルス感染の阻害および処置に関し、これは、ヒトパピローマウイルスに関連した障害または疾患の処置および予防を含む。本発明は、ＨＰＶの複製を阻害するために有用である短い合成オリゴヌクレオチドを提供する。
【０００２】
（２．背景）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、上皮細胞に感染して、良性の皮膚および陰部の疣贅（尖形コンジローマ）および疣贅状表皮発育異常症（ＥＶ）から呼吸器または咽頭の乳頭腫症および子宮頚癌までに及ぶ病変を生じさせるＤＮＡウイルスである。子宮頚癌は、女性が罹患する２番目に多い優勢型の癌であり、各年で４００，００〜５００，０００の新たな症例が報告され、そして２００，０００人が死亡している（Ｐａｒｋｉｎ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　５４：５９４−６０６）。新生児もまた、母親の産道を通過する間にＨＰＶに感染し、咽頭乳頭腫または咽頭の良性上皮腫瘍へと導かれ得る。乳頭腫は、２歳までのＨＰＶ感染乳児において発症し、気道を閉塞し得る良性乳頭腫を取り除くために、複数回の外科手術の必要を余儀なくさせる。
【０００３】
液体ハイブリダイゼーションによって測定された場合のＤＮＡ配列多様性に基づいて、少なくとも７０の異なる型のヒトパピローマウイルスが存在している（Ｐｆｉｓｔｅｒら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．３７：１４３−１４９）。各ＨＰＶ型は、宿主特異性を示す。いくつかのＨＰＶ型は、生殖器上皮に感染し、そして性感染ウイルス症の最も優勢な病因を表す。生殖器のＨＰＶ型はさらに、新生物の発症に関連付けられる「高リスク」型（最も一般的には、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８）；および悪性腫瘍と稀に関連付けられる「低リスク」型（最も一般的には、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１）に細分され得る。悪性型は、宿主細胞のゲノム中に組み込むことによって、ウイルスＤＮＡ複製遺伝子産物の必要性を排除し得る。対照的に、良性型（最も一般的には、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１）は、エピソームゲノムの複製をウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２に依存している。２つのＨＰＶ型であるＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１は通常、咽頭乳頭腫または咽頭の良性上皮腫瘍と関連付けられる。
【０００４】
ヒトパピローマウイルスは、環状二本鎖の７，９００塩基対のＤＮＡゲノムを含む、非エンベロープ型ＤＮＡウイルスであり、このＤＮＡゲノムは、以下の３つの別個の機能的ドメインに分割され得る：ウイルスＤＮＡ複製起点ならびに転写に関与するエンハンサーおよびプロモーターを含む、上流調節領域（ＵＲＲ）；構造タンパク質であるＬ１およびＬ２をコードする、Ｌ領域；ならびに、栄養機能に必要とされる遺伝子をコードする、Ｅ領域。ＨＰＶゲノムは、８つのウイルスタンパク質であるＥｌ、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＬ２をコードし（図１において図示される）、これらは、選択的スプライシングを受けたｍＲＮＡの複雑なファミリーから翻訳される。
【０００５】
大半のＨＰＶ型は、ウイルスＤＮＡ複製の開始のために（Ｕｓｔａｖら（１９９１）ＥＭＢＯ　Ｊ．，１０：４４９−４５７；Ｃｈｉａｎｇら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：５７９９−５８０３；Ｄｅｌ　Ｖｅｃｃｈｉｏ，Ａ．Ｍ．ら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５９４９−５９５８；Ｓａｎｄｌｅｒ，Ａ．Ｂ．ら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５０７９−５０８７；Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，Ｍ．ら（１９９４）Ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ（Ｚｕｒ　ｈａｕｓｅｎ，Ｈ．編）８３−１００頁，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、およびウイルスゲノムのエピソーム維持のために、ウイルスにコードされる２つのタンパク質であるＥ１およびＥ２の活性を必要とする。しかし、特定のインビトロ実験において、Ｅ１タンパク質の活性のみがウイルス複製に必須であることが示された（Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：９５９７−９６０１）。Ｅ１は、ＡＴＰ加水分解性ＤＮＡヘリカーゼであり、これは、ヒト宿主細胞ＤＮＡの複製複合体によるウイルスゲノム複製の間におけるウイルス起点でのＤＮＡの巻き戻しに関与していると考えられている（Ｈｕｇｈｅｓら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：５８１７−５８２３；Ｃｈｏｗら（１９９４）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．３７：１５０−１５８；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｏ．ら（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１８０５−１８０９；Ｃｏｎｇｅｒ，Ｋ．Ｌ．ら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２６９６−２７０５）。Ｅ２は、宿主タンパク質を含む転写複合体のアセンブリの促進を通してＨＰＶ転写活性の調節に関与している（Ｈａｍ，Ｊ．ら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６：４４０−４４４；Ｌｉｕ，Ｊ．−Ｓ．ら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７２８３−２７２９１）。
【０００６】
Ｅ４タンパク質は、宿主細胞の中間径フィラメントネットワークと関連付けられ、そしてパピローマウイルスによって発現される最も豊富な遺伝子産物である（Ｄｏｒｒｂａｒ，Ｊ．ら（１９８６）ＥＭＢＯ　Ｊ．５：３５５−３６２；Ｄｏｒｒｂａｒ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３５２：８２４−８２７）。Ｅ５、Ｅ６およびＥ７遺伝子産物は、トランスフォーミングタンパク質をコードする（Ａｎｄｒｏｐｈｙ，Ｅ．Ｊ．ら（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：９８９−９９２；Ｂｅｄｅｌ，Ｍ．Ａ．ら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：１２４７−１２５５；Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ，Ｅ．ら（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：１７４１−１７４６；Ｖｏｕｓｄｅｎ，Ｋ．Ｈ．ら（１９８８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅｓ．３：１６７−１７５）。Ｅ５は、高度に疎水性のタンパク質であり、これは、上皮成長因子レセプターと相互作用する（Ｃｈｅｎ，Ｓ．−Ｌ．ら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３２２６−３２３３；Ｌｅｅｃｈａｎａｃｈａｉ，Ｐ．ら（１９９２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　７：１９−２５；Ｌｅｐｔａｋ，Ｃ．ら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：７０７８−７０８３；Ｐｉｍ，Ｄ．ら（１９９２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　７：２７−３２；Ｓｔｒａｉｇｈｔ，Ｓ．Ｗ．ら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５２１−４５３２）。いくつかのＨＰＶ型では、Ｅ６およびＥ７タンパク質はそれぞれ、腫瘍抑制因子タンパク質であるｐ５３（Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら（１９９２）ＥＭＢＯ　Ｊ．１１：３０４５−３０５２；Ｗｅｒｎｅｓｓ，Ｂ．Ａ．ら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：７６−７９）および網膜芽細胞腫（Ｄｙｓｏｎ，Ｎ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３：９３４−９３７；Ｇａｇｅ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：７２３−７３０）と相互作用する。Ｅ６およびＥ７は両方とも、感染の結果に影響を及ぼす多くの細胞性タンパク質と相互作用する。Ｌ１およびＬ２は、すべてのＨＰＶ型に共通しており、そしてキャプシドタンパク質をコードしている（Ｂｒｏｋｅｒ，Ｔ．Ｒ．ら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ　４：１７−３６；ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ，Ｈ．ら（１９８７）Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｉ．第２巻、Ｔｈｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ（Ｓａｌｚｍａｎ，Ｎ．およびＨｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．編）２４５−２６３頁，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ；Ｐｆｉｓｔｅｒ，Ｈ．（１９８７）Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ．１４：３４９−３６１）。
【０００７】
ＨＰＶ感染に対する現在の処置は、極めて限られている。現在、認可されたＨＰＶ特異的抗ウイルス治療薬は存在していない。管理は通常、感染した組織の外科的除去、冷凍外科的除去、化学的除去またはレーザー除去による、疣贅の物理的破壊を含む。非肛門性器の疣贅は、皮膚と皮膚の接触によって伝達されるが、肛門性器の疣贅は通常、性感染する。両方の型の疣贅は、多くの罹患率を生ずるが、めったに悪性トランスフォーメーションを起こさない。これらは一般的に、外科的な治療または冷凍外科的な治療で処置されるが、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）のような免疫調節剤は、肛門性器の疣贅に非常に有効であることが証明されており、そして非肛門性器の疣贅において評価されつつある（Ｓｅｖｅｒｓｏｎ　Ｊ．，ら，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｍｅｄ．Ｓｕｒｇ．（２００１）Ｊａｎ；５（１）：４３−６０）。５−フルオロウラシルおよびポドフィルム調製物のような局所的代謝拮抗物質もまた使用されている（Ｒｅｉｃｈｍａｎ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１３版（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら編）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９３）８０１−８０３頁）。しかし、これらの手順後の再発は一般的であり、そして引き続いて繰り返される処置は、次第に健康な組織を破壊していく。インターフェロンは、これまでの所、抗ウイルス作用様式を伴う唯一の処置であったが、その限られた有効性は、その使用を制限する（Ｃｏｗｓｅｒｔ（１９９４）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌ．３７：２２６−２３０；Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎら（１９９３）Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ　Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｓｕｒ．４５０４：２５２−２６０；Ｂｒｏｗｄｅｒら（１９９２）Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．２６：４２−４５）。
【０００８】
他の型のＨＰＶは著しい発癌潜在能を有し、その結果、９９％を超える全子宮頚癌および５０％を超える他の肛門性器の癌は、発癌性ＨＰＶでの感染に起因する。喫煙、遺伝、およびヘルパーウイルスのような多くの補因子が、ＨＰＶ発癌性において潜在的な役割を有するが、それらの相対的な寄与率は、ほとんど理解されていない（Ｓｅｖｅｒｓｏｎ　Ｊ．，ら，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｍｅｄ．Ｓｕｒｇ．（２００１）Ｊａｎ；５（１）：４３−６０）。
【０００９】
近年では、ＨＰＶ抗ウイルス化合物の開発に関する研究は、ＨＰＶ特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発に焦点を当ててきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの法則に従って標的の一本鎖核酸分子に結合することによってか、または塩基対形成に関するＨｏｏｇｓｔｅｅｎの法則によって二本鎖核酸に結合することによって遺伝子発現を調節し得、そしてそうする際に、以下のいくつかの機構のうちの１つによって標的の機能を破壊し得る：正常な転写、スプライシング、または翻訳のために必要とされる因子の結合を妨げることによって；ＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡの酵素的破壊を誘発することによって；または、アンチセンスオリゴヌクレオチドに直接的に結合した反応性基を介して、標的を破壊することによって。
【００１０】
このようなウイルス、病原体、および選択的な遺伝子発現を阻害するにおいてより高い効力を有する改善されたオリゴヌクレオチドが、より近年になって開発された。ヌクレオチド間結合に改変を有するこれらのオリゴヌクレオチドのいくつかは、その未改変対応物よりも有効であることが示されている。例えば、Ａｇｒａｗａｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８８）８５：７０７９−７０８３）は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートおよび特定のオリゴヌクレオチドホスホルアミデートは、従来のホスホジエステル結合型オリゴデオキシヌクレオチドよりも、ＨＩＶ−１を阻害するのにより有効であることを教示している。Ａｇｒａｗａｌら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８９）８６：７７９０−７７９４）は、初期および慢性的に感染した細胞においてＨＩＶ−１を阻害するにおけるオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの利点を開示している。
【００１１】
さらに、オリゴヌクレオチド中に１より多い型のヌクレオチド間結合を有するキメラオリゴヌクレオチドが開発された。Ｐｅｄｅｒｓｏｎら（米国特許第５，１４９，７９７号および同第５，２２０，００７号）は、ヌクレオチドメチルホスホネートまたはホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）に隣接した、オリゴヌクレオチドホスホジエステルまたはオリゴヌクレオチドホスホロチオエートのコア配列を有する、キメラオリゴヌクレオチドを開示する。Ａｇｒａｗａｌら（ＷＯ　９４／０２４９８）は、デオキシリボヌクレオチドおよび２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの領域を有する、ハイブリッドオリゴヌクレオチドを開示する。
【００１２】
ＤＮＡ複製の機構は、パピローマウイルス間で保存されている。すべてのパピローマウイルスタンパク質の中でも、Ｅ１は最も保存されている。これは、ＡＴＰａｓｅおよびヘリカーゼであり、そしてシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原のＡＴＰａｓｅドメイン（ＳＶ４０起点配列（ｏｒｉ）の複製のイニシエーター）に対する配列相同性を有する。Ｔ抗原と同じように、Ｅ１タンパク質は、ｏｒｉに結合し、そして宿主の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質ＲＰＡおよびトポイソメラーゼＩの存在下においてＤＮＡを巻き戻す。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１）のＥ１タンパク質は、複製フォークでヘリカーゼとして機能すると考えられている。なぜなら、各々は、伸長の間に必要とされるからである。ＢＰＶ−１のＥ１タンパク質は、宿主のＤＮＡポリメラーゼαの１８０−ｋＤａ触媒性サブユニットと相互作用することによって、巻き戻されたｏｒｉに宿主の複製タンパク質をもたらすことが公知である。ｏｒｉならびにＥ１およびＥ２タンパク質の相同性の性質が理由により、１つのウイルス型由来のタンパク質は、相同性のウイルスｏｒｉまたは非相同性のウイルスｏｒｉのいずれも効率的に複製し得る（Ｎｉａｎｘｉａｎｇ　Ｚｏｕら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，（１９９８），７２（４）：４３４３６−３４４１）。
【００１３】
ＨＰＶの発現を阻害する、限られた数のアンチセンスオリゴヌクレオチドが設計されている。例えば、ＨＰＶのＥ１およびＥ２　ｍＲＮＡの種々の領域に特異的なオリゴヌクレオチドが調製されている（例えば、米国特許第５，３６４，７５８号、ＷＯ　９１／０８３１３、ＷＯ　９３／２００９５およびＷＯ　９５／０４７４８を参照のこと）。
【００１４】
ヒトパピローマウイルスの複製および発現を阻害し得るオリゴヌクレオチドであって、その使用が、首尾良い予後と低細胞毒性または無細胞毒性とを伴うオリゴヌクレオチドの開発についての必要性が、依然として存在する。
【００１５】
（発明の要旨）
ヒトパピローマウイルスに対する治療用化合物を設計するために、ＨＰＶ６型（Ｇｅｎ　Ｂａｎｋ　ＨＰＶ６ｂ登録番号Ｍ１４１１９）および１１型（Ｇｅｎ　Ｂａｎｋ　ＨＰＶ１１登録番号Ｘ００２０３）のＥ１遺伝子を標的化した。６型および１１型は共に、非悪性の陰部疣贅の９０％を超える症例と関連付けられる。タンパク質翻訳についての開始部位を中心とした４６個のヌクレオチド領域（Ｅ１オープンリーディングフレームの−１７位から＋２９位まで）を詳細に試験した。この領域は、ＨＰＶ６型および１１型の多くの臨床的単離株において保存されている。この遺伝子のオープンリーディングフレーム全体（−１７位から＋１９５０位まで）もまた研究した。この領域全体は、ＨＰＶ６型とＨＰＶ１１型との間において、高い配列同一性を示す。本発明において標的化されたさらなるＨＰＶ株は、ＨＰＶ１６型、１８型、３１型、４５型および５８型である。
【００１６】
本発明者らはここに、Ｅ１遺伝子の＋１位から＋２０位の領域に指向されたオリゴヌクレオチドが、ＨＰＶの複製を阻害するのに特に有用であることを見出した。より詳細には、本発明者らは、４ヌクレオチド程度に短い、この領域に指向されたオリゴヌクレオチドが、効率的にＨＰＶの複製を阻害し得ることを見出した。これらの短いオリゴヌクレオチド（すなわち、ショートマー（ｓｈｏｒｔ−ｍｅｒ））は、複数の機構を通してＨＰＶの複製を阻害するように作用し得る、特異的配列関連効果を有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸またはタンパク質の標的との相互作用を通して作用し得るか、または両方の型の相互作用を通して作用し得る。
【００１７】
本発明は、ＨＰＶ　Ｅ１タンパク質の翻訳開始部位の＋１位から＋２０位にわたる領域またはその一部に対して相補的な合成オリゴヌクレオチドを提供する。より詳細には、本発明は、安定性またはＨＰＶ阻害活性を増加させるように改変された、オリゴヌクレオチドを提供する。このような改変としては、例えば、ヌクレオシド間結合、糖、塩基、キャップ形成された末端、およびキメラオリゴヌクレオチドまたはハイブリッドオリゴヌクレオチドの改変が挙げられ得る。本発明はさらに、ＨＰＶ感染の処置（ＨＰＶに関連した障害または疾患の処置および予防を含む）のための薬学的組成物および方法を提供する。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
上記で議論したように、本発明者らは、顕著なＨＰＶ阻害活性を有する合成オリゴヌクレオチドを発見した。
【００１９】
本発明は、ヒトパピローマウイルス遺伝子Ｅ１の翻訳開始部位にまたがる核酸に対して相補的な合成オリゴヌクレオチドを提供する。本発明の目的のために、ヒトパピローマウイルス遺伝子Ｅ１の翻訳開始部位にまたがる核酸は、ヌクレオチド＋１位から＋２０位までのＥ１遺伝子の領域（例えば、ＨＰＶ−６ｂゲノムのヌクレオチド８３２〜８５１位）またはその部分を示すことを意図される。この領域は、配列番号３５に示される配列（５’−ａｔｇ　ｇｃｇ　ｇａｃ　ｇａｔ　ｔｃａ　ｇｇｔ　ａｃ−３’）を有し、そしてこの領域に対して相補的なオリゴヌクレオチドは、配列番号３６に示される配列（５’−ｇＸ　ａｃｃ　Ｘｇａ　ａＸｃ　ｇＸｃ　ｃｇｃ　ｃａＸ−３’）を有し、ここでＸは、チミジンまたはウラシルであり得、そして任意のヌクレオチドが、イノシンで置換され得る。
【００２０】
本発明の目的のために、核酸に対して相補的であるオリゴヌクレオチド配列は、このオリゴヌクレオチドの未改変バージョンが、生理的条件（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成または「Ｗｏｂｂｌｅ」塩基対形成による、オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸との間での相互作用）下でこの核酸配列に結合し得ることを意味することを意図される。
【００２１】
本発明の目的のために、ＨＰＶ阻害活性を有するオリゴヌクレオチドは、種々のあり得る機構を通して、ウイルス生活環のいくつかの時点でＨＰＶ複製に干渉し得るかまたはＨＰＶ複製を途絶させ得るオリゴヌクレオチドを意味することを意図される。例えば、オリゴヌクレオチドは、核酸またはタンパク質の標的との相互作用を通してＨＰＶ複製を阻害し得るか、または両方の型の標的を通して作用し得る。核酸標的を通して作用するオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、またはｍＲＮＡに結合し得、そして正常な転写、スプライシング、もしくは翻訳に必要とされる因子の結合を妨げることによってか、またはＲＮａｓｅ　ＨによるｍＲＮＡの酵素学的破壊などを誘発することによって、標的の機能を破壊し得る。タンパク質標的を通して作用するオリゴヌクレオチドは、レセプターまたは任意の他の型のタンパク質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、転写因子などのような）に結合し得る。
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、特異的配列関連効果を有する。これは、このオリゴヌクレオチドの配列（モノヌクレオチドの直鎖状配列、ならびに、モノヌクレオチドの配列とヌクレオチドまたはヌクレオチド間結合に対する任意の改変とによって決定されるような、全体としてのオリゴヌクレオチドの三次元構造を含む）が、特異的なＨＰＶ阻害効果を生ずることを意味することを意図される。しかし、これは、オリゴヌクレオチドと核酸との間での塩基対形成に依存する機構に本発明を制限することを意味しない。特異的配列関連効果は、上記で考察したように、種々の機構を通して生じ得る。
【００２３】
本発明の合成オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド＋１位〜＋２０位にまたがるＨＰＶ　Ｅ１オープンリーディングフレームの領域またはその部分に対して相補的な配列を含む。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、約４個から約２０個までのモノヌクレオチドを含み、より好ましくは、約４個から約１２個、１４個、１６個または１８個までのモノヌクレオチドを含む。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドとしては、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個または１９個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下に述べる表１に示される配列またはその一部分を含む。最も好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜３、２８および３４に示される配列を含む。
【００２４】
好ましい合成オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変、そしてより好ましくは１つより多い改変を含む。改変としては、例えば、ヌクレオチド間結合、塩基または糖部分、キャップ形成された末端、およびキメラオリゴヌクレオチドまたはハイブリッドオリゴヌクレオチドの改変が挙げられる。
【００２５】
合成オリゴヌクレオチドとしては、ヌクレオチド間結合によって連結されたデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドの化学的合成ポリマーが挙げられる。オリゴヌクレオチドは、すべてデオキシリボヌクレオチドから構成され得るか、すべてリボヌクレオチドから構成され得るか、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせから構成され得、これにはハイブリッドオリゴヌクレオチドおよび逆ハイブリッドオリゴヌクレオチドが挙げられる。ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドの隣接領域間に挿入されたデオキシオリゴヌクレオチドのコア領域を含む。逆ハイブリッドは、デオキシリボヌクレオチドの隣接領域間に挿入されたリボヌクレオチドのコア領域を含む。
【００２６】
本発明の合成オリゴヌクレオチドは、１つのモノヌクレオチドのペントース環の５’基と、隣接モノヌクレオチドの３’基との間で標準的なホスホジエステルヌクレオチド環結合によって連結され得る。このような結合はまた、５’→５’、３’→３’、２’→５’、および２’→２’、またはこれらの任意の組み合わせを含む、異なる連結部位を使用して確立され得る。ホスホジエステル結合に加えて、モノヌクレオチドはまた、アルキルホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホノチオエート結合、ホスホルアミデート結合、カルバメート結合、カルボネート結合、ホスフェートトリエステル結合、アセトアミデート結合、もしくはカルボキシメチルエステル結合、またはこれらの任意の組み合わせによって連結され得る。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、より好ましくは、オリゴヌクレオチド中のすべての結合が、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。
【００２７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、すべてのモノヌクレオチドが同じ型のヌクレオチド間結合によって連結されるかまたは異なるヌクレオチド間結合の組み合わせによって連結されるように構築され得、これにはキメラオリゴヌクレオチドまたは逆キメラオリゴヌクレオチドが挙げられる。キメラオリゴヌクレオチドは、メチルホスホネートまたはホスホルアミデートの隣接領域間に挿入されたホスホロチオエートのコア領域を有する。逆キメラオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート隣接領域間に挿入された非イオン性コア領域（例えば、アルキルホスホネートおよび／またはホスホルアミデートおよび／またはホスホトリエステルヌクレオシド間結合）を有する。
【００２８】
本発明の合成オリゴヌクレオチドは、アデニン、シトシン、グアニン、イノシン、チミジンまたはウラシルのモノヌクレオチドから構築され得る。好ましいオリゴヌクレオチドは、モノヌクレオチドの塩基および／または糖部分に改変を含むモノヌクレオチドから構築される。塩基または糖に対する改変としては、アルキル、炭素環式アリール、１〜３個の別々の環もしくは融合環と１〜３個のＮ、ＯもしくはＳ原子とを有する複素環式芳香族基もしくはヘテロ脂環基、または複素環式構造の共有結合性置換基が挙げられる。
【００２９】
アルキル基は好ましくは、１〜約１８個の炭素原子、より好ましくは、１〜約１２個の炭素原子、そして最も好ましくは１〜約６個の炭素原子を含む。アルキル基の特定の例は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどを含む。
【００３０】
アラルキル基としては、６個以上の炭素を有する炭素環式アリール基（例えば、フェニル、ナフチル、フェナントリル（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｙｌ）、アントラシル（ａｎｔｈｒａｃｙｌ）など）によって置換された、上記に列挙されたアルキル基が挙げられる。
【００３１】
シクロアルキル基は好ましくは、３〜約８個の環式炭素原子を有する（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、１，４−メチレンシクロヘキサン、アダマンチル（ａｄａｍａｎｔｙｌ）、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、１−または２−シクロヘキシルエチルおよび１−、２または３−シクロヘキシルプロピルなど）。
【００３２】
例示的な複素環式芳香族基およびヘテロ脂環基としては、ピリジル、ピラジニル、ピリミジル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾチアゾリル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノおよびピロリジニルが挙げられる。
【００３３】
糖に対する好ましい改変としては、リボース部分の２’位に対する改変が挙げられ、これには以下が挙げられるが、これらに限定されない：１〜６個の飽和炭素原子もしくは不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基、またはＯ−アリール、もしくは２〜６個の炭素原子を有するアリル基での２’−Ｏ−置換であって、ここでこのような−Ｏ−アルキル、アリールもしくはアリル基は、置換されていなくても、置換（例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシル（ｃａｒｂａｌｋｏｘｙｌ）、またはアミノ基で）されてもよいか、またはここで２’−Ｏ−基は、アミノもしくはハロゲン基により置換される。これらの置換はいずれも、リボースの場合のネイティブな２’−ヒドロキシル基も、デオキシリボースの場合の２’−Ｈ−も排除することを意図されない。
【００３４】
好ましい改変オリゴヌクレオチドとしては、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（２’−ＯＭｅ）および５−メチル化デオキシシトシン（５−Ｍｅ−ｄＣ）が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、すべて未改変モノヌクレオチドから構築され得るか、すべて特定の改変を含むモノヌクレオチドから構築され得るか、または異なる改変を含む種々のモノヌクレオチドから構築され得る。特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドの３’末端に、少なくとも１個、好ましくは１〜５個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含む。さらに、オリゴヌクレオチドは、その５’末端に、少なくとも１個、好ましくは１〜５個の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドをさらに含み得る。
【００３５】
モノヌクレオチドの糖基は、天然であっても改変（例えば、合成）であってもよく、そして鎖状形態または環形態であり得る。糖基は、モノ−、ジ−、オリゴ−、またはポリ−サッカリドから構成され得、ここで各モノサッカリド単位は、３〜約８個の炭素、好ましくは３〜約６個の炭素を含み、ポリヒドロキシ基、またはポリヒドロキシ基およびアミノ基を含む。限定することのない例としては、グリセロール、リボース、フルクトース、グルコース、グルコサミン、マンノース、ガラクトース、マルトース、セロビオース、スクロース、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンおよびセルロースが挙げられる。ヒドロキシル基およびアミノ基は、遊離基として存在するか、または例えば、水素および／またはハロゲンを含む保護された基として存在する。好ましい保護基としては、アセトニド、ｔ−ブトキシカルボニル基などが挙げられる。モノサッカリド糖基は、Ｌ配置またはＤ配置であり得、そして環式モノサッカリド単位は、αコンフォメーションまたはβコンフォメーションの５員環または６員環を含み得る。ジサッカリドは、２つの同一モノサッカリド単位または２つの異なるモノサッカリド単位から構成され得る。オリゴサッカリドは、２〜１０個のモノサッカリドから構成され得、そしてホモポリマー、ヘテロポリマー、または環式多糖（ｃｙｃｌｉｃ　ｐｏｌｙｓｕｇａｒ）であり得る。ポリサッカリドは、ホモグリカンであってもヘテログリカンであってもよく、そして分枝ポリマー鎖であっても非分枝ポリマー鎖であってもよい。ジ−、オリゴ−、およびポリ−サッカリドは、１→４結合、１→６結合、または１→４結合および１→６結合の混合物から構成され得る。糖部分は、炭水化物の任意のヒドロキシル基またはアミノ基を通して、連結基に結合され得る。
【００３６】
他の改変としては、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端にある改変が挙げられ、そしてヌクレオシド間ホスフェート結合での分子に対する付加（例えば、コレステリル、コレステロール、または２個のアミン基間に種々の数の炭素残基を有するジアミン化合物、ならびに末端のリボース、デオキシリボース、およびホスフェートの改変（これらは切断するか、あるいは対の鎖に対して架橋するか、または関連する酵素もしくはウイルスゲノムに結合する他のタンパク質に架橋する））を含む。非ヌクレオシドリンカーを含むさらなるリンカーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：種々の長さのポリエチレングリコール（例えば、トリエチレングリコール、モノエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール（Ｍａら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：２５８５−２５８９；Ｂｅｎｓｅｌｅｒら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８４８３−８４８４））、ヘキシルアミンおよびスチルベン（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：７３２３−７３２８）、または無塩基（ａｂａｓｉｃ）リンカーを含む任意の他の市販のリンカー、または市販の非対称性リンカーおよび対称性リンカー（ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（例えば、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）。
【００３７】
オリゴヌクレオチドの３’末端においてリボースでキャップ形成されたさらなるオリゴヌクレオチドは、ＮａＩＯ４酸化および／または還元的アミノ化に供され得る。アミノ化は、以下の部分に対するものが挙げられ得るが、これらに限定されない：スペルミン、スペルミジン、Ｔｒｉｓ（２−アミノエチル）アミン（ＴＡＥＡ）、ＤＯＰＥ、長鎖アルキルアミン、クラウンエーテル、補酵素Ａ、ＮＡＤ、糖、ペプチド、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）。
【００３８】
オリゴヌクレオチドはまた、その３’末端および／または５’末端において、嵩高い置換基でキャップ形成され得るか、あるいは１つのヌクレオチドにつき、１つまたは両方の非架橋酸素において１つの置換を有し得る。このような改変は、いくつかまたはすべてのヌクレオシド間結合においてであり得、そしてオリゴヌクレオチドのいずれかまたは両方の末端、および／または分子の内部であり得る（Ａｇｒａｗａｌら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１５２−１５８において概説される）。キャップ形成された種のいくつかの制限することのない例としては、３’−Ｏ−メチル、５’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メチル、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００３９】
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、表１に示される配列番号１〜３７の群から選択される配列（その改変物を含む）を有する。特に好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、４、１１、２１および２６からなる群から選択される配列（表１に示されるヌクレオチド間結合組成物およびさらなる改変物を含む）を有する。最も好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、２８、３４からなる群から選択される配列を有する。
【００４０】
本発明の合成オリゴヌクレオチドは、当該分野で認識されている方法によって調製され得る。例えば、ヌクレオチドは、ホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート化学、またはメチルホスホルアミダイト化学（例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．２：１６５−１８７；Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３−５８４；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：２８７−３１３；米国特許第５，１４９，７９８号を参照のこと）のような、当該分野で認識されている技術を使用して共有結合的に連結され得る。これらは、手動または自動化合成装置によって実行され得、次いで処理され得る（Ａｇｒａｗａｌら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１５２−１５８において概説される）。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、当該分野において周知の方法（例えば、ホスホルアミダイト（例えば、Ａｇｒａｗａｌら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：７０７９−７０８３を参照のこと）またはＨ−ホスホネート（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８を参照のこと）化学）を使用して調製され得る。Ｂｅｒｇｏｔら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．（１９９２）５５９：３５−４２）に記載される合成方法もまた使用され得る。他の型の改変ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、公知の方法に従って調製され得る（例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．２：１６５−１８７；Ａｇｒａｗａｌら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：７０７９−７０８３；Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５３４−５８３；およびＡｇｒａｗａｌら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１５２−１５８を参照のこと）。
【００４１】
他の局面では、本発明は薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、同一であるかまたは異なる配列、改変、および／または長さを有する、少なくとも１個のＨＰＶ特異的オリゴヌクレオチド、そして好ましくは２個以上のＨＰＶ特異的オリゴヌクレオチドの物理的混合物である。いくつかの実施形態では、この薬学的処方物はまた、生理学的または薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態は、治療量の脂質キャリアを含む。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、治療学的に活性な化合物としての用途、特に、ヒトパピローマウイルス感染の制御または予防における用途に適切である。
【００４３】
本発明のこの局面では、ＨＰＶ特異的合成オリゴヌクレオチドを含む治療量の薬学的組成物を細胞に投与して、ヒトパピローマウイルスの複製を阻害する。類似の局面では、本発明のオリゴヌクレオチドを、ヒトパピローマウイルス感染を処置するために使用し得る。ここでは、少なくとも１つのＨＰＶ特異的オリゴヌクレオチド、およびいくつかの実施形態では、少なくとも２つのＨＰＶ特異的オリゴヌクレオチドを含む、治療量の薬学的組成物を感染動物または細胞に投与する工程を包含する。いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、表１または配列表において配列番号１〜３７として示される配列（それらの改変物を含む）を有する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、または少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを投与する工程を包含する。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドの投与を含むすべての方法において、少なくとも１つ、そして好ましくは２つ以上の同一であるかまたは異なるオリゴヌクレオチドが、別個の薬学的組成物の形態における単回処置の一回分として、同時または連続的に投与され得る。
【００４５】
より詳細には、本発明は、ヒトパピローマウイルス科のウイルスに関連した疾患に対して感受性の哺乳動物の処置方法（予防的処置）またはヒトパピローマウイルス科のウイルスに関連した疾患に罹患している哺乳動物の処置方法を含む。このようなウイルスによって引き起こされる臨床的状態の例は、良性の皮膚および陰部の疣贅（尖形コンジローマ）、疣贅状表皮発育異常症（ＥＶ）、呼吸器または咽頭の乳頭腫症および子宮頚癌である。本発明の方法は、治療的有効量の本発明の１以上の化合物を、ウイルスに感染した細胞（例えば、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞）に投与することを包含する。
【００４６】
本発明の化合物の投与は、経口的、局所的（経皮的、口腔内、または舌下を含む）、経鼻的、および非経口的（腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、または筋肉内注射を含む）を含む、種々の適切な経路によってなされ得、経口または非経口が一般的に好ましい。好ましい投与方法および投薬量が、例えば、レシピエントの状態および年齢によって変動し得ることもまた理解される。
【００４７】
本発明の化合物は、他の薬学的に活性な医薬（例えば、別の抗ウイルス剤または抗癌剤）と組み合わせた治療において用いられ得る。さらに、本発明の１つ以上の化合物は単独で投与され得るが、これらはまた、従来の賦形剤（すなわち、非経口投与、経口投与または所望される他の投与に適切であり、そして活性化合物と有害に反応せず、かつそのレシピエントに対して有害ではない、薬学的に受容可能な有機または無機のキャリア物質）と混合した薬学的組成物の部分として存在し得る。適切な薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペトロエトラル脂肪酸エステル（ｐｅｔｒｏｅｔｈｒａｌ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｅｓｔｅｒｓ）、ヒドロキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドンなど。薬学的調製物は滅菌され得、そして所望される場合には、活性化合物と有害に反応しない補助剤（例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝液、着色剤、香料剤、および／または芳香物質など）と混合され得る。
【００４８】
非経口的適用のために、特に適切なのは、溶液、好ましくは、油性または水性の溶液、および懸濁物、エマルジョン、またはインプラント（坐剤を含む）である。アンプルは、従来の単位投薬物である。
【００４９】
経腸適用のために、特に適切なのは、タルクおよび／または炭水化物キャリア結合剤などを有する、錠剤、糖衣錠、またはカプセルであり、このキャリアは好ましくは、ラクトースおよび／またはトウモロコシデンプンおよび／またはジャガイモデンプンである。シロップ剤、エリキシル剤などが使用され得、ここでは加糖（ｓｗｅｅｔｅｎｅｄ）ビヒクルが使用される。これらを含む徐放性組成物が処方され得、ここでは活性成分が、例えば、マイクロカプセル化、多重コーティーングなどによって、示差的に分解可能なコーティーングで保護される。
【００５０】
本発明の治療用化合物はまた、リポソーム中に取り込まれ得る。取り込みは、公知のリポソーム調製手順（例えば、超音波処理および押出（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ））に従って実施され得る。リポソーム調製の適切な従来の方法はまた、以下において開示されている：Ａ．Ｄ．Ｂａｎｇｈａｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３：２３８−２５２（１９６５）；Ｆ．Ｏｌｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，５５７：９−２３（１９７９）；Ｆ．Ｓｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７５：４１９４−４１９８（１９７８）；Ｓ．Ｋｉｍら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２８：３３９−３４８（１９８３）；およびＭａｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８５８：１６１−１６８（１９８６）。
【００５１】
所定の治療において使用される活性化合物の実際の好ましい量は、利用される特定の化合物、処方された特定の組成物、適用様式、特定の投与部位などに従って変動することが理解される。所定の投与プロトコールについて最適な投与速度は、従来の投薬決定試験（ｄｏｓａｇｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）を使用して、当業者により容易に確認され得る。
【００５２】
本明細書中で言及されるすべての文書が、本明細書中で参考として援用される。
【００５３】
本発明をさらに、以下の実施例により例証する。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために提供され、そして本発明の制限として解釈されるべきではない。
【００５４】
（実施例１：オリゴヌクレオチドの合成）
オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ　３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ　Ｐｌｕｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）またはＧｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ　Ｓｐｅｃｉａｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のいずれかにおいて、製造業者の標準的なプロトコールおよびカスタム方法を使用し、標準的なホスホルアミダイト化学（Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３３−６１）を使用して合成した。カスタム方法は、２’−Ｏ−メチルＲＮＡアミダイトについてのカップリング時間を１．５分間から１２分間に増加させる役目を果たした。Ｐｈａｒｍａｃｉａの合成装置は、アミダイト、活性化試薬およびアセトニトリルのさらなる乾燥を必要とした。これは、機械への取り付け前に、３Å分子ふるい（ＥＭ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）を付加することによって達成された。
【００５５】
ＤＮＡ　β−シアノエチルホスホルアミダイトを、Ｃｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）から購入した。ＤＮＡ支持体は、１グラムあたり３０〜４０ｍｍｏｌｅの間のローディングを有する、適切な３’塩基で誘導体化された５００Å孔サイズの制御孔ガラス（ＣＰＧ）（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）であった。２’−Ｏ−メチルＲＮＡβ−シアノエチルホスホルアミダイトおよびＣＰＧ支持体（５００Å）を、Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から購入した。ランダムな配列の合成のために、ＤＮＡホスホルアミダイトを、製造業者のプロトコール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に従い、合成装置によって混合した。
【００５６】
すべての２’−Ｏ−メチルＲＮＡ含有オリゴヌクレオチドを、低水アセトニトリル（ｌｏｗ　ｗａｔｅｒ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）で０．２５Ｍに溶解されたエチルチオテトラゾール（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ＡＩＣ），Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を活性化剤として使用して合成した。いくつかのＤＮＡのみの合成を、０．２５Ｍエチルチオテトラゾールを用いて実施したが、大半は、０．５Ｍ　１−Ｈ−テトラゾール（ＡＩＣ）を用いて実施された。すべてのＰＳオリゴヌクレオチドにおいて使用されたチオ硫化試薬は、低水アセトニトリル（ｗ／ｖ）中の２％溶液としての３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｒ．Ｉ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ，またはＡＩＣ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）であった。
【００５７】
リンカーを伴うオリゴを合成するために使用された、コレステリルＣＰＧ（ｃｈｏｌ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、５’−アミノ−改変因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）［Ｃ６ＮＨ２］およびコレステリル（ｃｈｏｌ）ホスホルアミダイトは、製造業者の指示書（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）に従って用いられた。
【００５８】
３’−ＮＨ２Ｃａｐは、製造業者の指示書（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）に従って３’−アミノ改変因子Ｃ３　ＣＰＧを用いて調製された、３’−（３−アミノ２−プロパノール）結合体である。
【００５９】
３’末端にリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの酸化、酸化還元、またはアミノ化のために、合成を以下のように実施した。
【００６０】
３’末端にリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドホスホロチオエート（１ｍＭ）を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７５）中において氷上で３０分間ＮａＩＯ４（１．２ｍＭ）で酸化して、３’−ジアルデヒド（Ｏｘ．）生成物を得た。アミンの添加のために、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）中の６当量のアミンを、酸化オリゴヌクレオチドに３０分間室温で添加し、次いで、３０当量のＮａＣＮＢＨ３を添加した。この溶液を、室温で一晩放置した。この生成物を、２０％変性ゲルでの分取用ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。同じ手順を、アミンの非存在下において実施し、３’ジオール（Ｏｘ／Ｒｅｄ．）生成物を得た。
【００６１】
合成の完了後、ＣＰＧを風乾し、そして２ｍＬのスクリューキャップ付微量遠心チューブに移した。オリゴヌクレオチドを脱保護し、そして２ｍＬの水酸化アンモニウム（２５〜３０％）でＣＰＧから切断した。このチューブのキャップを閉め、そして室温で２０分間インキュベートし、次いで、５５℃で７時間インキュベートした。脱保護の完了後、このチューブをヒートブロックから取り出し、そして室温まで冷却させた。キャップを取り外し、そしてチューブを１０，０００ｒｐｍで３０分間微量遠心して、大半の水酸化アンモニウムを取り除いた。次いで、この液体を、新しい２ｍＬのスクリューキャップ付微量遠心チューブに移し、そしてＳｐｅｅｄ　Ｖａｃ濃縮装置（Ｓａｖａｎｔ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）で凍結乾燥した。乾燥後、この残渣を４００μｌの０．３Ｍ　ＮａＣｌ中に溶解し、そして１．６ｍＬの無水ＥｔＯＨを用いてＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを、１４，０００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によってペレット化し、上清をデカントし、そしてペレットを乾燥させた。このＤＮＡを再度、上記のように０．１Ｍ　ＮａＣｌから沈殿させた。最終的なペレットを、５００μｌのＨ２Ｏ中に溶解し、そして１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、いかなる固形物質をも取り除いた。この上清を別の微量遠心チューブに移し、そしてＤＮＡの量を分光光度学的に決定した。濃度を、２６０ｎＭでの光学密度によって決定した。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ部分についてのＥ２６０を、ＯＬＩＧＳＯＬ（Ｌａｕｔｅｎｂｅｒｇｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１０：７７８−７８０）によって算出した。２’−Ｏ−メチル部分のＥ２６０を、ＯＬＩＧＯ　４．０　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＢＩ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）を用いることによって算出した。
【００６２】
オリゴヌクレオチドの純度を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびＵＶシャドーイングによって検査した。０．２　ＯＤ２６０単位を、９５％ホルムアミド／Ｈ２ＯおよびＯｒａｎｇｅ　Ｇ色素と共に、２０％変性ポリアクリルアミドゲル（２０ｃｍ×２０ｃｍ）にロードした。Ｏｒａｎｇｅ　Ｇ色素が、ゲルの低面から１インチ以内になるまで、ゲルを泳動した。バンドを、薄層クロマトグラフィープレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０　Ｆ２５４，ＥＭ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）上での短波ＵＶ光でのシャドーイングによって可視化した。
【００６３】
いくつかのオリゴヌクレオチドは、５’−トリチル基（トリチル−オン（ｔｒｉｔｙｌ−ｏｎ））を取り除くことなく合成され、逆相ＨＰＬＣ精製を容易にした。トリチル−オンオリゴヌクレオチドを、３ｍＬ水中に溶解し、そして６０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を、０．４５ミクロンシリンジフィルター（Ｇｅｌｍａｎ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を通して濾過し、そして６００Ｅ　ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）を用いて、Ｃ−１８　μＢｏｎｄａｐａｋクロマトグラフィーマトリクス（Ｗａｔｅｒｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）を充填した１．５×３０ｃｍのガラス液体クロマトグラフィーカラム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）において精製した。オリゴヌクレオチドを、０．１Ｍ酢酸アンモニウム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）中の１４〜３２％アセトニトリル（Ｂａｘｔｅｒ，Ｂｕｒｄｉｃｋ　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｍｕｓｋｅｇｏｎ，ＭＩ）の４０分勾配を用いて５ｍＬ／分間で溶出し、次いで、３２％アセトニトリルで１２分間溶出した。ピークの検出を、Ｄｙｎａｍａｘ　ＵＶ−Ｃ吸光度検出器（Ｒａｉｎｉｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を用いて、２６０ｎｍで実施した。
【００６４】
ＨＰＬＣ精製されたトリチル−オンオリゴヌクレオチドを乾燥するまでエバポレートし、そしてトリチル基を、５ｍＬの８０％酢酸（ＥＭ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中で１５分間インキュベーションすることによって取り除いた。酢酸をエバポレートした後、オリゴヌクレオチドを、３ｍＬの０．３Ｍ　ＮａＣｌ中に溶解し、そしてエタノール沈殿した。この沈殿物を遠心分離によって単離し、そして再度、３ｍＬの０．１Ｍ　ＮａＣｌからエタノールで沈殿した。この沈殿物を遠心分離によって単離し、そしてＳａｖａｎｔ　Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）上で乾燥させた。定量分析およびＰＡＧＥ分析を、エタノール沈殿されたオリゴヌクレオチドについて上記のように実施した。
【００６５】
標準的なホスホルアミダイト化学を、２つのＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ　Ｓｐｅｃｉａｌ　ＤＮＡ合成装置を用いる、メチルホスホネート結合含有オリゴヌクレオチドの合成に適用した。一方の合成装置は、上記に考察されたβ−シアノエチルホスホルアミダイト法を用いる、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート部分の合成のために使用された。他方の合成装置は、メチルホスホネート部分の導入のために使用された。メチルホスホネート合成において有利であることが示されている試薬および合成サイクルを適用した（Ｈｏｇｒｅｆｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２０巻：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｓ（Ａｇｒａｗａｌら）（１９９３）Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。例えば、０．１Ｍメチルホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を、０．２５Ｍエチルチオテトラゾールによって活性化し；１２分間のカップリング時間を使用し；テトラヒドロフラン／２，６−ルチジン（ｌｕｔｉｄｉｎｅ）／水（７４．７５／２５／０．２５）中におけるヨウ素（０．１Ｍ）での酸化を、このカップリング工程の直後に適用し；ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）をキャップ形成手順のために使用して、標準的なＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）を置換した。これらの化学薬品を、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。
【００６６】
作業手順は、公表された手順（Ｈｏｇｒｅｆｅら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２１：２０３１−２０３８）に基づいた。生成物を、１ｍＬのエタノール／アセトニトリル／水酸化アンモニア（４５／４５／１０）との室温での３０分間のインキュベーションによって、樹脂から取り出した。次いで、エチレンジアミン（１．０ｍＬ）を混合物に添加して、室温で４．５時間脱保護した。得られた溶液および１ｍＬ　５０／５０アセトニトリル／０．１Ｍトリエチルアンモニウムビカルボネート（ＴＥＡＢ）（ｐＨ８）での樹脂の２つの洗浄液をプールし、そして十分に混合した。得られた混合物を氷上で冷却し、そして２０／８０アセトニトリル／水（４〜５ｍＬ）中において６Ｎ　ＨＣｌでｐＨ７まで中和し、次いで、Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ濃縮装置を用いて、乾燥するまで濃縮した。得られた固体残渣を、２０ｍＬ水中に溶解し、そしてサンプルを、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジを用いることによって脱塩した。２ｍＬ／分間の速度で２回このカートリッジに水溶液を通過させた後、このカートリッジを２０ｍＬの０．１Ｍ　ＴＥＡＢで洗浄し、そして生成物を、０．１Ｍ　ＴＥＡＢ中の５０％アセトニトリルを４ｍＬ用いて、２ｍＬ／分間で溶出した。この溶出物を、Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃによって、乾燥するまでエバポレートした。
【００６７】
粗生成物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製し、そしてＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジを使用して脱塩した。オリゴヌクレオチドを、０．３Ｍ　ＮａＣｌからエタノール沈殿し、次いで、０．１Ｍ　ＮａＣｌからエタノール沈殿した。この生成物を、４００μＬ水中に溶解し、そして２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量した。
【００６８】
（実施例２：生物学的試験）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、扁平上皮に対する向性を有する。ＨＰＶの生活環は、感染した細胞の分化状態（厳密な要件）と密接に関連付けられており、このことが以前に、インビトロでこのウイルスを研究することを困難なものとしていた。近年開発された器官型「ｒａｆｔ」培養系（これは、感染性ビリオンの産生を併発するＨＰＶの完全な分化特異的複製サイクルを支持する）を使用して、ＨＰＶ複製に対する本発明のオリゴヌクレオチドの効果を研究した（Ｍｅｙｅｒｓ，Ｃ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：９７１−９７３；Ｍｅｙｅｒｓ，Ｃ．ら（１９９８）Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編），５１３−５２０頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ；Ｍｅｙｅｒｓ，Ｃ．ら（１９９２）Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．３：１−３；Ｍｅｙｅｒｓ，Ｃ．ら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ　ｏｎ　Ｈｕｍａｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ（ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；Ｂｅｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２５４−２２６０；Ｍｅｙｅｒｓ，Ｃ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２４８：２１８−２３０）。
【００６９】
細胞およびｒａｆｔ培養物のアセンブリ：ＣＩＮ−６１２細胞株を、頚部上皮内新形成（ＣＩＮ）Ｉ型生検から確立した。ＣＩＮ−６１２細胞株は、ＨＰＶ３１ｂ　ＤＮＡを含み、このうち、９Ｅクローン誘導体は、１細胞あたり約５０コピーのＨＰＶ３１ｂゲノムのエピソームコピーを維持する。ＣＩＮ−６１２　９Ｅ細胞を、マイトマイシンＣ処理Ｊ２　３Ｔ３フィーダー細胞の存在下において、５％胎仔ウシ血清を含有するＥ培地を用いて単層培養物中に維持した。Ｊ２　３Ｔ３細胞を、５％新生仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中に維持した。皮膚の等価物を、ラット尾部Ｉ型コラーゲン、培養培地、および線維芽細胞を用いて、６ウェル培養皿中に調製した。線維芽細胞は、この系を馴化し、そして上皮の増殖および層別化に必要な間質性の影響を与える。ＣＩＮ−６１２　９Ｅ上皮細胞を計数し、そして６００，０００細胞を、Ｅ培地のもとで浸漬されたコラーゲンプラグ（ｐｌｕｇ）上に播種した。上皮細胞をコンフルエンスに到達させ、培地を取り除き、そしてコラーゲンマトリクスをステンレス鋼格子上に置いた。以後の上皮の給餌は、マトリクスの下からのＥ培地の拡散を介した。上皮組織を層別化させ、そして１０日間の期間にわたって気−液界面で分化させた。１０日後に、上皮を、コラーゲン層から分離することによって収集し、そしてさらなる操作まで、−２０℃で保存した。
【００７０】
２．５μＭおよび２５μＭのＨＰＶ／Ｌ１〜ＨＰＶ／Ｌ２５およびＯＲＩ　１００１（配列番号１〜３７）でのｒａｆｔ培養物の処理：ｒａｆｔ培養物に、１日おきに、試験化合物を含有するＥ培地で給餌した。各オリゴヌクレオチド（配列番号１〜３７）を滅菌水中に溶解して、５ｍＭのストック溶液を得た。試験された各オリゴヌクレオチドについて、１２ｍＬのＥ培地を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに添加した。次いで、ＨＰＶ／Ｌ１〜ＨＰＶ／Ｌ２５およびＯＲＩ　１００１（配列番号１〜３７）の各ストック溶液をこの培地に添加して、２５μＭの最終濃度を得た。別のセットのｒａｆｔ培養物を、２．５μＭの最終濃度のＨＰＶ／Ｌ１〜ＨＰＶ／Ｌ７およびＯＲＩ　１００１（配列番号１〜７および２６）で処理した。培地を、アスピレーションを介してｒａｆｔ培養物から取り除き、次いで、ｒａｆｔ組織の頂部にいかなる液体をも載せないように注意深く、新たに調製された培地を添加した。なぜなら、頂部に液体を載せると、上皮の層別化を遅延させるからである。偽性ｒａｆｔ培養物に、Ｅ培地のみで給餌した。
【００７１】
核酸抽出。核酸の抽出を、以前に記載されたように実施した（Ｏｚｂｕｎ，Ｍ．Ａ．ら（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２４８：２１８−２３０）。総細胞性ＤＮＡを、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２５ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．２％ＳＤＳおよび５０ｍｇ／ｍＬ　ＲＮａｓｅＡ中において５５℃で一晩ｒａｆｔ組織をインキュベートすることによって収集した。次いで、１００ｍｇ／ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを添加し、そしてさらに４時間インキュベートした。このＤＮＡを、１８ゲージ針に１０回通過させることによって剪断した。溶液を、等量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽出し、次いで、等量のクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出した。ＤＮＡを、０．３Ｍ酢酸ナトリウムを用いて、エタノール沈殿した。このＤＮＡを乾燥させ、そしてＴＥ中に溶解し、そしてサンプル濃度を、光学密度を決定することによって確証した。濃度を、アガロースゲルを通した電気泳動およびエチジウムブロミドでの染色によって確認した。
【００７２】
サザンブロッティングおよびハイブリダイゼーション。ＨＰＶ３１ｂ　ＤＮＡを検出するためのサザンブロッティングを、以前に記載されたように実施した（Ｏｚｂｕｎ，Ｍ．Ａ．ら（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２４８：２１８−２３０）。総細胞性ＤＮＡのサンプル（５μｇ）を、ＸｂａＩで一晩消化した。ＸｂａＩは、ヌクレオチド４９９８位でＨＰＶ３１ｂゲノムを線状化する。総細胞性ＤＮＡサンプルを、０．８％アガロースゲルにおいて分離した。このＤＮＡをＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓメンブレン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に転写し、このメンブレンを、製造業者の指示書に従って取り扱った。プローブの調製のために、プラスミドｐＢＳ−ＨＰＶ３１をＥｃｏＲＩで消化して、完全なＨＰＶ３１ゲノムを放出した。このＨＰＶ３１配列を、アガロースゲル電気泳動およびＧｅｎｅ　Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏｌ０ｌ，Ｖｉｓｔａ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって、プラスミド配列から精製した。ＤＮＡ配列を、製造業者の指示書に従ってＲａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｉｎｇキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）を用いて、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＤｕＰｏｎｔ　ＮＥＮ）で標識化した。標識化されたプローブを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０カラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃｏｒｐ．）を通した遠心分離によって、取り込まれなかったヌクレオチドから分離した。ハイブリダイゼーションを、１ｍＬのプローブあたり１０６ｃｐｍで実施した。メンブレンを洗浄して、非特異的ハイブリダイゼーションを取り除き、次いで、フィルムに曝露した。次いで、処理サンプル中のＨＰＶ３１ｂ複製の強度を、偽性処理コントロールＤＮＡと比較し、ウイルス複製に関する各処理の影響を決定した。サザンブロットの濃度測定分析を実施して、未処理コントロールサンプルに対するＨＰＶ３１ｂ複製における化合物の効果を数値的に比較した。複製レベルをまた、標準的なコピー数のコントロールに対して比較し、１細胞あたりのＨＰＶ３１ｂゲノムの数に対する処理の効果を数値的に決定した。
【００７３】
組織化学的分析。ｒａｆｔ組織の分化および形態に対する薬物処理の影響を決定するために、組織の組織学的分析を実施した。ｒａｆｔ培養物を、種々の処理の存在下において１０日間増殖させ、収集し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして、パラフィン中に包埋した。４μＭの横断面を調製した。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【００７４】
（結果）
サザンブロッティング分析からの結果は、表１および図２においてみられ得る。
【００７５】
表１は、偽性処理細胞において生じたＨＰＶ３１ｂ複製レベルと比較した場合の相対的濃度測定分析として表される、ＨＰＶ３１ｂの複製に対する各オリゴヌクレオチド（配列番号１〜３７）の効果を示す。これらのオリゴヌクレオチドは、偽性処理細胞と比較した場合に、ＨＰＶ３１ｂ複製を減少させるその能力において変動した。２５μＭで特に強力なオリゴヌクレオチドは、ＨＰＶ／Ｌ１、ＨＰＶ／Ｌ２、ＨＰＶ／Ｌ４、ＨＰＶ／Ｌ１１、ＨＰＶ／Ｌ２１およびＯＲＩ　１００１（配列番号１、２、４、１１、２１および２６）であった。ＨＰＶ／Ｌ１（配列番号１）は、試験された両方の濃度において、ＨＰＶ３１ｂ複製の最高の阻害効果を示し、２５μＭでは、ウイルス複製において１／３倍に近い減少を達成し、そして２．５μＭでは、ウイルス複製において１／５倍に近い減少を達成した。いくつかの化合物は実際に、偽性コントロールと比較して、ＨＰＶ３１ｂの複製を増強した。
【００７６】
図２．Ａ〜Ｅ：ＣＩＮ−６１２　９Ｅ　ｒａｆｔ培養物を、本発明のＨＰＶ／Ｌ１〜ＨＰＶ／Ｌ２５およびＯＲＩ　１００１（配列番号１〜３７）の２５μＭ（最終濃度）のオリゴヌクレオチドで処理し、そしてＨＰＶ３１ｂゲノム複製に対するその効果を決定した。処理されたＣＩＮ−６１２　９Ｅ　ｒａｆｔ培養物から単離された総ＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションを示す。各ｒａｆｔ由来の５μｇの総ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化して、エピソームＨＰＶ３１ｂ　ＤＮＡを線状化し、０．８％アガロースゲルにおいて電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写し、次いで、ＨＰＶ３１ｂ特異的プローブでハイブリダイゼーションした。試験された各化合物のレーン１は、未切断ＤＮＡからなる。試験された各化合物のレーン２は、ＨｉｎｄＩＩＩ消化されたエピソームＤＮＡからなる。Ｉ形態（ＦＩ）は、スーパーコイルＤＮＡを示し、ＩＩ形態（ＦＩＩ）は、ニック形成された環状ＤＮＡを示し、そしてＩＩＩ形態（ＦＩＩＩ）は、線状化されたＤＮＡを示す。
【００７７】
表１．ｒａｆｔ培養物におけるＨＰＶ３１ｂ複製に対する本発明のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜３４）の効果。オリゴヌクレオチドを、２．５ｍＭおよび２５ｍＭの最終濃度で試験した。処理された細胞の効果を、ＨＰＶ３１ｂ特異的プローブで探索されたｒａｆｔ細胞から単離された総ＤＮＡのサザンブロットの濃度測定分析において、偽性処理細胞と比較した。
【００７８】
【表１】
2004501614.tif 000002
ＮＤ＝決定されず。
Ｘ＝チミジンまたはウラシル、そして任意のヌクレオチドが、イノシンで置換され得る。
下線を付したヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであり、他のすべてのヌクレオチドは、未改変デオキシリボヌクレオチドである。
ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートである。
【００７９】
本発明を、その好ましい実施形態を参照して、詳細に記載した。しかし本開示を考慮して、当業者が、添付の特許請求の範囲に示される本発明の意図および範囲内にある改変および改良をなし得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＰＶゲノムの模式図である。
【図２】図２Ａ〜Ｅは、培養物中におけるＨＰＶ複製のレベルを決定するためにＨＰＶ３１ｂ特異的プローブとハイブリダイズされた、ＣＩＮ−６１２　９Ｅ　ｒａｆｔ培養細胞から単離された全ＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションを示す。ＣＩＮ−６１２　９Ｅ培養物を、２５μＭの本発明のオリゴヌクレオチドで処理し、そしてウイルス複製の阻害レベルを偽性（Ｍｏｃｋ）処理培養物と比較した。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、培養物中におけるＨＰＶ複製のレベルを決定するためにＨＰＶ３１ｂ特異的プローブとハイブリダイズされた、ＣＩＮ−６１２　９Ｅ　ｒａｆｔ培養細胞から単離された全ＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションを示す。ＣＩＮ−６１２　９Ｅ培養物を、２．５μＭの本発明のオリゴヌクレオチドで処理し、そしてウイルス複製の阻害レベルを偽性（Ｍｏｃｋ）処理培養物と比較した。
【図１】
2004501614.tif 000003
【国際公開パンフレット】
2004501614.tif 000004
2004501614.tif 000005
2004501614.tif 000006
2004501614.tif 000007
2004501614.tif 000008
2004501614.tif 000009
2004501614.tif 000010
2004501614.tif 000011
2004501614.tif 000012
2004501614.tif 000013
2004501614.tif 000014
2004501614.tif 000015
2004501614.tif 000016
2004501614.tif 000017
2004501614.tif 000018
2004501614.tif 000019
2004501614.tif 000020
2004501614.tif 000021
2004501614.tif 000022
2004501614.tif 000023
2004501614.tif 000024
2004501614.tif 000025
2004501614.tif 000026
2004501614.tif 000027
2004501614.tif 000028
2004501614.tif 000029
2004501614.tif 000030
2004501614.tif 000031
2004501614.tif 000032
2004501614.tif 000033
2004501614.tif 000034
2004501614.tif 000035
2004501614.tif 000036
2004501614.tif 000037
2004501614.tif 000038
2004501614.tif 000039
2004501614.tif 000040
2004501614.tif 000041
2004501614.tif 000042
2004501614.tif 000043
2004501614.tif 000044
2004501614.tif 000045
2004501614.tif 000046
2004501614.tif 000047
2004501614.tif 000048
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501614.tif 000049
【国際調査報告】
2004501614.tif 000050
2004501614.tif 000051