(57)【要約】本発明は、エストロゲン受容体遺伝子／タンパクの、エストロゲン受容体アルファ遺伝子と新規の多型／ハプロタイプのゲノム構造を定義する、ヒト染色体６とｃＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列に基づく。このような多型／ハプロタイプは、ガン、骨粗鬆症、心臓血管疾患等へのかかりやすさ等の、変異エストロゲン受容体によって媒介／変調される、様々な異常を引き起こす可能性がある。この配列アプローチに基づいて、本発明は、エストロゲンアルファ遺伝子のゲノムヌクレオチド配列、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列、及び多型／ハプロタイプ配列、サンプル中のこれらの配列／多型／ハプロタイプを検出する方法、変異エストロゲン受容体により媒介される異常を持つ又は発現する危険性を測定する方法、及び変異エストロゲン受容体により媒介される異常を治療するために用いられる化合物をスクリーニングする方法を提供する。
2004531228.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる単離ペプチド。
（ａ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列。
（ｂ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸を含むフラグメント。
【請求項２】
下記（ａ）及び（ｂ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
（ａ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列。
（ｂ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列のフラグメントであって、少なくとも１０個の隣接するアミノ酸を含むフラグメント。
【請求項３】
請求項１記載のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる単離核酸分子。
（ａ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
（ｂ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列。
（ｃ）（ａ）−（ｂ）の核酸分子の補体である核酸分子。
【請求項５】
下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（ａ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
（ｂ）図２で与えられる変異エストロゲン受容体タンパクのアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列。
（ｃ）（ａ）−（ｂ）の核酸分子の補体である核酸分子。
【請求項６】
請求項４記載の核酸配列を含む核酸ベクター。
【請求項７】
請求項５記載の核酸配列を含む核酸ベクター。
【請求項８】
請求項６記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項７記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１記載の何れかのペプチドの生産方法であって、（ａ）−（ｂ）のペプチド配列の何れかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、その核酸配列からタンパクを発現する条件下で該宿主細胞を培養することを含む、ペプチドの生産方法。
【請求項１１】
請求項２記載の何れかのペプチドの生産方法であって、（ａ）−（ｂ）のペプチド配列の何れかをコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、その核酸配列からタンパクを発現する条件下で該宿主細胞を培養することを含む、ペプチドの生産方法。
【請求項１２】
サンプル中における請求項１記載の何れかのペプチドの存在の検出方法であって、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出可能な作用物質とサンプルを接触させ、その後該ペプチドの存在を検出することを含む検出方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法に使用するための試薬を含むキットであって、該試薬が前記ペプチドに特異的に結合する作用物質を含むキット。
【請求項１４】
サンプル中における請求項４記載の核酸配列の存在の検出方法であって、ストリンジェント条件下で該核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにサンプルを接触させ、該サンプル中の該核酸配列に該オリゴヌクレオチドが結合するか否かを決定することを含む検出方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法に使用するための試薬を含むキットであって、該試薬がストリンジェント条件下で前記核酸分子の何れかにハイブリダイズする化合物を含むキット。
【請求項１６】
請求項１記載の何れかのペプチドに結合する作用物質の特定方法であて、該ペプチドを物質に接触させ、その接触混合物を分析して前記物質がペプチドに結合して複合体を形成するか否かを決定することを含む特定方法。
【請求項１７】
変異エストロゲン受容体により媒介される疾患を有する、又は発症する危険があるヒトを特定する方法であって、エストロゲン受容体遺伝子配列の変更に関してそのヒトから単離した核酸分子を分析し、図２及び図４で与えられる変異体からなる群から選択される前記エストロゲン受容体遺伝子における変更を、骨疾患を有する又は発症する危険があると特定することを含む特定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年１０月２０日付け出願のＵ．Ｓ． Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０９／６９２，４１４（Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ ＣＬ０００２５８）、２００１年１月２４日付け出願のＵ．Ｓ． Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０９／７６８，１８４（Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ ＣＬ０００２５８ＣＩＰ）、２００１年３月１３日付け出願のＵ．Ｓ． Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０９／８０４，０７６（Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ ＣＬ０００２５８ＣＩ２）、及び２００１年４月５日付け出願のＵ．Ｓ． Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．０９／８２６，３１４（Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ ＣＬ０００２５８ＣＩ３）の優先権を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は疾患の発見と治療方法に関する。特に、本発明はエストロゲン受容体アルファ遺伝子（ＥＳＲ−α）における従来未知の核酸／アミノ酸多型、及びエストロゲン受容体により媒介／変調される疾患や障害の診断方法、治療方法の開発に用いるための、該遺伝子の遺伝子配列を提供するものである。
【０００３】
背景技術
エストロゲン受容体
ヒトエストロゲン受容体アルファは、核ホルモン受容体のファミリーに属する。核ホルモン受容体は、特定のホルモン応答因子を含む遺伝子の転写を開始又は増大することのできるホルモン活性転写因子のファミリーである。
エストロゲン受容体タンパクは、６６ｋＤａの分子量を有する５９５個のアミノ酸からなり、翻訳されたエキソン８つ、異なる機能を持つドメイン６つを有する。これらのドメインのうち２つでは、核ホルモン受容体スーパーファミリーの初期の配列が高く保持されている。このドメインのうちの１つであるＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、ホルモン応答遺伝子のプロモーター中のホルモン応答因子への受容体の結合を媒介する２つの亜鉛フィンガーを含んでいる。Ｃ末端領域では、ホルモン結合ドメイン（ＨＢＤ）は他のホルモン受容体と配列相同性を有する２つの領域を含み、ホルモン特性と選択性を与えている。ヒトエストロゲン受容体アルファ遺伝子は、染色体６ｑ．２５．１に位置している。
【０００４】
エストロゲン受容体、及びこれに類似した他のステロイド受容体は、ステロイド（エストラジオール）又はタモキシフェンのようなステロイド類似体と結合し、活性化される転写因子である。活性化に際して、受容体はエストロゲン活性化遺伝子のプロモーター領域に位置するエストロゲン受容体成分（ＥＲＥ）と結合してホモ二量体又はヘテロ二量体を形成し、宿主の補活性化剤との相互作用による転写を調整する。
【０００５】
心臓血管疾患におけるエストロゲンの役割
心臓病は女性の主な死亡原因であり、この事実は女性や医師達によって認識されている。４５〜６５歳の女性の９人に１人は何らかの心臓血管疾患を有しており、６５歳以上では３人に１人に増加する。毎年、全米で２４万人が心臓病により死亡しており、このうち、発作で死亡した人は約９万人である。さらに、１年以内に心臓発作を起こした人の約４４％が死亡している。これに比べて男性の場合は２６％である（Ｗａｒｒｅｎ ＭＰ ａｎｄ Ｋｕｌａｋ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓ Ｇｙｎ １９９８ １（４）：９７６−９８７）。
【０００６】
エストロゲンは、多種多様な細胞タイプに対して、広範囲にわたり生理的な影響を及ぼす。例えば、細胞の成長とアポトーシス、及び複製に関連する無数の機能を調節している。エストロゲン受容体には、αとβの２つのタイプがある。血管と骨にはβ受容体が含まれ、肝臓にはα受容体が含まれる。そして、中枢神経系ではα及びβ受容体の両方が見られる。これらの異なる受容体部位の相互作用は、エストロゲンと、例えばラロキシフェン等の選択的エストロゲン受容体モジュレータ（ＳＥＲＭ）の生物学的効果に影響する。結合パターンは、エストロゲン又はＳＥＲＭが、エストロゲンアゴニスト又はアンタゴニストとして作用するよう命令する（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ＭＥ ａｎｄ Ｋａｒａｓ ＲＨ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９９， ３４０（２３）：１８０１−１８１１；Ｇｒｅｓｅ ＴＡ ａｎｄ Ｄｏｄｇｅ ＪＡ Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓｉｇｎ １９９８， ４：７１−９２）。ＳＥＲＭと受容体結合部位には、組織に特有の関係が存在する。エストロゲンは、ＨＤＬコレステロール値を増大し、ＬＤＬコレステロール値を減少させ、プラスミノーゲン活性抑制因子値を減少させる（Ｍｅｉｓｌｅｒ ＪＧ Ｊｏｕｒ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ １９９９， ８（１）：５１−５７）。全てのエストロゲンは、発現に細胞受容体を必要とする。一般にエストロゲン受容体は、リガンド誘導性の転写因子であり、ホルモン結合後に、対象遺伝子の発現を調整する（Ｆａｕｓｔｉｎｉ−Ｆｕｓｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ １９９９， １４０：１１１−１２９）。エストロゲンは、おそらく血管壁にも重要な影響を及ぼしている。エストラジオールとプロゲステロン受容体が、動脈内皮及び平滑筋細胞で確認されている（Ｃａｍｐｉｓｉ Ｄ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓ Ｒｅａｃｔ １９８７， ＩＸ（５）：３９３−３９８）。エストロゲンは動脈壁に作用し、血管平滑筋を弛緩し、血管抵抗を減少させる。この機構は、内皮由来の弛緩因子及び内生的な硝酸塩の刺激によるようである（Ｗａｒｒｅｎ ＭＰ ａｎｄ Ｋｕｌａｋ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓ Ｇｙｎ １９９８ ４１（４）：９７６−９８７）。１７Ｂ−エストラジオールによる緩和は、心臓状態の調整に重要な役割を果たし、閉経後の女性における心臓疾患の危険性を低下する。一酸化窒素の産生はエストロゲン受容体により媒介される。なぜなら受容体が抗エストロゲン剤によりブロックされる際に一酸化窒素が抑制されるからである。
【０００７】
いくつかの研究においては、エストロゲンによる療法が心臓病の危険性を最高で５０％低下させることが示されている（ｍｏｓｔ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｂｙ Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ＭＥ ａｎｄ Ｋａｒａｓ ＲＨ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９９， ３４０（２３）：１８０１−１８１１；Ｒｉｃｈ−Ｅｄｗａｒｄｓ ＪＷ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， １９９５， ３３２：１７５８−１７６５； Ｇｅｒｈａｒｄ Ｍ， Ｇａｎｚ Ｐ， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １９９５， ９２：５−８； ｒｏｄｓｔｅｉｎ Ｆ， ｅｔ ａｌ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９７， ３３６：１７６９−７５； Ｃｈａｓｅｎ−Ｔａｂｅｒ Ｌ ａｎｄ Ｓｔａｍｐｆｅｒ ＭＪ Ａｎｎ ｏｆ Ｉｎｔ Ｍｅｄ， １９９８， １２８：４６７−４７７； Ｗａｒｒｅｎ ＭＰ ａｎｄ Ｋｕｌａｋ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎ １９９８， ４１（４）：９７６−９８７）。エストロゲンの減少は、女性における心血管系疾患の発症の最も重要な要因のうちの１つであるかもしれない。
【０００８】
エストロゲンがアテローム発生を防止するという直接の証拠がない間にも、エストロゲンが心臓血管疾患の減少に有効であることを示唆する多くの疫学的証拠が存在していた；（１）全ての年齢層において、女性の心臓血管疾患の発病率は男性より低い；（２）早期に閉経しエストロゲンを使用しない女性においては、同年代の閉経前の女性に対して、心臓血管疾患を有する数が２倍であった；（３）エストロゲンを使用する閉経後の女性は使用しない女性と比較して、心臓血管疾患の発病率がかなり低い；（４）血管造影法により検出された心臓血管疾患を有する女性は、エストロゲンを用いた場合、生存率が高い。
【０００９】
近年、エストロゲン療法による心臓血管疾患の発病率及び死亡率に対する良好な結果が報告されたので、閉経後の女性に対するエストロゲンの使用が、広範囲にわたり注目されるに至った（Ｍｅｉｎｅｒｔｚ Ｔ Ｈｅｒｚ １９９７， ２２： １５１−１５７）。米国の医科大学により刊行されたエストロゲン治療のためのガイドラインには、「冠状動脈性心臓病を持つ女性に対してホルモン療法が有効である」と述べられている。
【００１０】
３０以上の予見的な研究と１３の管理された研究により、心臓血管疾患の発生率又は普及、及び全ての死亡原因に対するエストロゲン代替療法の影響についての調査が行われた（Ｓｔａｍｐｆｅｒ ＭＪ ｅｔ ａｌ． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９９１， ３２５：７５６−６２； Ｇｒａｄｙ Ｄ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １９９２， １１７：１０１６−３７）。これらの研究のほとんどで、閉経後のエストロゲン使用者における冠状動脈性心臓病の発生率及び死亡率は、非使用者と比べてより低いことが示された。特に、エストロゲン使用者の冠状動脈性疾患は、非使用者の約５０％であることが示された。全体的には、この証拠の大部分は、０．５６の相対的な危険性でエストロゲンの保護効果を強く支持している（９５％  信頼区間  ０．５０−０．６１）。しかしながら、これらの研究には「健康な女性の選択の傾向」が存在し、潜在的に結果を混同させているかもしれない（エストロゲン使用者は、エストロゲン非使用者と比較し、より良い体重管理が行われ、運動量が多く、喫煙が少ない）。さらに、エストロゲン使用者がより高い教育を受け、より高い収入を有している等の傾向もこれらの疫学研究を混乱させている（Ａｂｒａｍｓ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９８， ２１：２１８−２２２）。
【００１１】
以前の観察は、ランダム化されていなかったために、種々の方法論的な傾向から、危険性減少の５０％のうち２５％が信頼されていた（Ｇｒｏｄｓｔｅｉｎ Ｆ ａｎｄ Ｓｔａｍｐｆｅｒ ＭＪ Ｐｒｏｇ Ｃａｒｄｉｏｌ Ｄｉｓ １９９５， ３８： １９９−２１０； Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｃｏｎｎｅｒ Ｅ ａｎｄ Ｇｒａｄｙ Ｄ １９９８， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ １９：５５−７２）。最近、２つのメタ分析により、エストロゲン使用による冠状動脈性心臓病の減少は３５〜４４％であると見積もられた。無傷の子宮を有するエストロゲン単独使用の女性において、子宮ガンの危険性が向上するとの報告があったことから、最近の研究では、エストロゲンの是否の調査が行われている。新しい証拠では、エストロゲンに加えてプロゲスチン（通常メドロキシプロゲスチンアセテート）を使用する場合には、エストロゲンを単独で使用する場合と等しい心臓を保護効果が受けられないことが示唆されている（Ｈｕｌｌｅｙ Ｓ ｅｔ ａｌ １９９８ ＪＡＭＡ ２８０：６０５−６１３； Ａｂｒａｍｓ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌ １９９８， ２１：２１８−２２２）。
【００１２】
閉経期におけるエストロゲンの低下は、ＨＤＬコレステロール値の６％の低下と、ＬＤＬコレステロール値の５％の増加に関連しており、これは閉経後の女性が閉経前の女性と比較して、より高い心臓血管疾患発病率を有することの説明となるかもしれない。エストロゲンを使用する閉経後の女性における心臓血管疾患の発病率が低いことは、ＬＤＬコレステロール値が１５〜１９％減少する、及びＨＤＬコレステロール値が１６〜１８％増加するという結果によって一部説明できるかもしれない（ＪＡＭＡ １９９５， ２７３：１９９−２０８）。ＰＥＰＩ（Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ／Ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）というランダム化された二重盲式偽薬対照試験では、単独でエストロゲンを使用する女性のＨＤＬコレステロール値が、組み合わせてエストロゲンを使用した女性と比較して著しく増大することが示された（ＪＡＭＡ １９９５、２７３：１９９−２０８）。最近、ヒト以外の霊長類の研究によりこれらの調査結果が立証された（Ｃｌａｒｋｓｏｎ ＴＢ Ｌａｂ Ａｎ Ｓｃｉ １９９８， ４８（６）：５６９−７２）。脂質側面のエストロゲンの影響についての統計モデルにより、エストロゲンによる２５〜５０％の明らかな心臓保護は、ＨＤＬ−コレステロールの良好な変化に媒介されることが示された（Ｂｕｓｈ ＴＬ ｅｔ ａｌ． １９８７ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ７５：１１０２−９； Ｇｒｕｃｈｏｗ ＨＷ ｅｔ ａｌ． １９８８ Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ １１５：９５４−６３）。
【００１３】
エストロゲン代替療法は危険を伴わない訳ではない。長年にわたり、経口避妊薬の使用者は非使用者と比較して、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）の危険性が３〜４倍に増大することが示されていた（Ｗｅｉｓｓ Ｇ Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １９９９ １８０：Ｓ２９５−３０１）。ある研究により、固有の凝固因子が経口避妊薬に関連するＶＴＥにおいて重要な役割を果たしていることが示された（Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ ＪＰ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ １９９４ ３４４：１４５３−７； Ｒｏｓｉｎｇ Ｊ ｅｔ ａｌ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９９７， ９７：２３３−２３８）。ライデン突然変異因子Ｖは、経口避妊薬非使用者においてはＶＴＥの危険性を５〜１０倍に増大するが、第三世代の経口避妊薬使用者においては３０倍に増大する。結合されたエストロゲンは、体内の自然な血液凝固阻止システム（ＡＰＣ）に対する抵抗を引き起こす。経口避妊薬の使用者におけるライデン突然変異因子Ｖによる異型接合体は、同型接合の女性と同等のＡＰＣ抵抗に発展する。
【００１４】
エストロゲンは子宮内膜ガンの危険性を約６倍に増大するが、プロゲスチンを加えることにより、この影響はほとんどなくなる（Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｃｏｎｎｅｒ Ｅ ａｎｄ Ｇｒａｄｙ Ｄ １９９８， Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ １９：５５−７２）。エストロゲン代替が乳ガンの危険性を増大するかどうかという議論は続けられているが、いくつかの研究により危険性は３０％増大することが示されている（Ｇｒｅｅｎｄａｌｅ ＧＡ ｅｔ ａｌ． Ｌａｎｃｅｔ １９９９， ３５３：５７１−８０）。
【００１５】
エストロゲン代替療法が女性の心臓血管疾患の危険性を減少するかどうか、そして、それが乳ガンの危険性を増大するかどうかについて立証するべく、ランダム化された多くの研究が進められている。最近完了したある試験ＨＥＲＳ（Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｅｓｔｒｏｇｅｎ／ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｓｔｕｄｙ）では、すでに心臓疾患を有する２７００人の女性において、連続的にエストロゲンとメドロキシプロゲステロンアセテートを処方した場合と、コントロール偽薬を処方した場合との比較を行った（Ｈｕｌｌｙ Ｓ ｅｔ ａｌ． １９９８ ＪＡＭＡ ２８０（７）：６０５−１３）。コントロールと比較して、介入グループは心臓病の発病が１年間の試験では著しく多かったが、４〜５年の試験では著しく少なかった。さらに、ホルモン使用女性の研究においては、初期の段階で血栓塞栓症の発病率の著しい増加が起こった。これらの結果に基づくと、ホルモン代替療法は心臓病の二次的予防に勧めることはできない。
【００１６】
エストロゲンを用いた心臓血管系疾患の一次的予防に関して、他に２つの大きな臨床研究が現在行われている。２００５年に英国で完了することになっているＴｈｅ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ、及び２０１０年に完了されることになっているＷＩＳ−ＤＯＭと呼ばれる研究では、エストロゲンの心臓血管系疾患に対する保護効果に新しい光を投じるであろう（Ｍｅｉｓｌｅｒ ＪＧ Ｊｏｕｒ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ １９９９， ８（１）：５１−５）。
【００１７】
まとめると、現在進行中の研究は、特に最近明らかにされたデザイナーエストロゲン又はＳＥＲＭに関連するエストロゲン代替療法が、胸と子宮内膜組織に悪影響を起こさずに、骨と同様に心血管系に有効な影響を及ぼすことを示唆している。それでもなお、慎重に観察する必要がある。エストロゲンを摂取する女性は平均して、より教育され、より健康で、より高い収入を持ち、より良く健康管理を行っている。むしろエストロゲンよりも、これらの違いにより心臓病の危険性が低下しているかもしれない。
【００１８】
現在疾患を持たない閉経後の女性においては、エストロゲン代替療法は、データの重要性、一貫性、生物学的信用性を考慮した場合、有用な影響を持つように見える。すでに疾患を持つ女性においては、安全性と、心臓血管疾患に対する保護医薬としての外因性エストロゲンの有効性に関し、問題が残っている。
【００１９】
エストロゲンと自己免疫性疾患
Ａ．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
エストロゲンが全身エリテマトーデスに関連するという見解が、以下のことから広く知られている：
１．子供を出産した女性は、全身エリテマトーデスを発症する可能性が男性の９倍高い。思春期以前では、女性の発症率は男性の３倍以上であるが、閉経後の女性では、発症率は同世代の男性と同程度である。多くの研究がなされ、これらの性による違いは、おそらくエストロゲンに関係があることが示された（Ｌａｈｉｔａ Ｒ．Ｇ．， １９８６： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９， ３０５−３１４； Ｋｒａｍｍｅｒ， Ｇ．Ｍ． ａｎｄ Ｔｓｏｋｏｓ， Ｇ．Ｃ． ， １９９８ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８９： １９２−１９５； Ｒｉｄｅｒ ａｔ ａｌ．， １９９８ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ８９： １７１−１８０）。
【００２０】
ＳＬＥでのエストロゲンの役割の糸口は、経口避妊薬がこの病状に不利な影響を及ぼすと結論した研究から得られた（Ｂｕｔｏｎ， Ｊ．Ｐ．， １９９６ Ａｎｎ． Ｍｅｄ． Ｉｎｔｅｒｎｅ， １４７：２５９−２６４； Ｊｕｌｋｕｎｅｎ， １９９１： Ｓｃａｎ． Ｊ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． ２０：４２７−４３３）。
【００２１】
２．ＳＬＥとともにＫｌｉｎｅｆｅｌｔｅｒ症候群（ＸＸＹ）を有する患者が報告された（Ｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９７７： Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ２０：１８−２２）。
【００２２】
３．ＳＬＥ患者は、抗エストロゲン抗体を有する（Ｆｅｌｄｍａｎ， １９８７： Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １４５：１３４２−１３４８： Ｂｕｃａｌａ ｅｔ ａｌ．， １９８７： Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６７：１６７−１７５）。
【００２３】
過去には、経口避妊薬がＳＬＥを突発的に引き起こすとされており、低量の服用はＳＬＥ患者にとって安全であるという現在の考えに至るまで、ＳＬＥの女性において経口避妊薬の使用は賛同されていなかった（Ｊｕｌｋｕｎｅｎ ＨＡ Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９９１；２０（６）：４２７−３３）。また同様に、ホルモン代替療法もＳＬＥ患者にとって安全であると考えられている（Ｍｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９９８；２７（５）：３４２−６： Ｋｒｅｉｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９９７ Ｎｏｖ；２４（１１）：２１４９−５２）。
【００２４】
４．エストロゲンアンタゴニストであるタモキシフェンは、疾患の進行を改善するようである（Ｓｔｈｏｅｇｅｒ， １９９７， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９７ Ａｐｒ ５；８１５：３６７−８： Ｓｔｈｏｅｇｅｒ， １９９４， Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９９４ Ｄｅｃ；２１（１２）：２２３１−８）。
【００２５】
Ｂ．エストロゲン、リウマチ関節炎（ＲＡ）及び骨関節炎
慢性関節リウマチにおけるエストロゲンに関連する文献は、骨関節炎に比べて明らかでない。疫学研究においては、経口避妊薬はＲＡの発病を遅らせるが、エストロゲン単独ではＲＡの症状を軽減することがないことから、ＲＡが女性ホルモンにより影響を受けることを示唆している（Ｂｉｊｌｓｍａ Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２ Ｏｃｔ−Ｄｅｃ；２８（３−４）：２３１−４）。エストロゲン補助剤の処方は、ＲＡをもつ閉経後の女性の骨密度を増大し、しばしばＲＡと併発することのある骨粗鬆症に対して保護となるかもしれない（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｉｎｋ： Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ １９９３ Ａｐｒ；５２（４）：３０２−５）。上述の研究ではエストロゲンがＲＡの症状を軽減しないことが示され、他の研究ではエストロゲン補助剤療法でさえも症状を改善しないと結論づけた。エストロゲン受容体において、ＲＡ発病の歳と関連すると考えられる１つの多型が報告された（Ｕｓｈｉｙａｍａ Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ １９９９ Ｊａｎ；５８（１）：７−１０）。
【００２６】
一方で骨関節炎は、エストロゲン置換療法（ＥＲＴ）を受けている閉経後の女性では起こりにくいということは（Ｆｅｌｓｏｎ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ １９９８ Ｍａｙ；１０（３）：２６９−７２）、ＥＲＴが骨関節炎の防止に有益であるかもしれないことを提案している。
【００２７】
Ｃ．エストロゲンと骨粗鬆症
骨粗鬆症は、骨がもろくなり、骨折の危険に至る骨の病気である。骨粗鬆症を有する閉経期後の女性の治療は、ホルモン、特にエストロゲンの代替を含む。エストロゲンは、骨損失及び骨折の発生を減少する（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８０ Ｎｏｖ ２０；３０３（２１）：１１９５−８ ：Ｐａｇａｎｉｎｉ−Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １９８１ Ｊｕｌ；９５（１）：２８−３１： Ｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １９８５ Ｍａｒ；１０２（３）：３１９−２４）。
【００２８】
さらに、エストロゲン受容体における多型は、ヒトとマウスの両方において骨損失と関係していた．（ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １９９６ Ｍａｒ；１１（３）：３０６−１１ ： Ｋｕｒａｂａｙａｓｈｉ Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １９９９ Ｍａｙ；１８０（５）：１１１５−２０； Ｄｅｎｇ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９８ Ｎｏｖ；１０３（５）：５７６−８５ ）。
【００２９】
エストロゲンと認識機能
女性は男性と比較してアルツハイマー病になる危険性が高い。いくつかの研究によって、エストロゲンを使用することにより、閉経期後の女性におけるアルツハイマー病の発病率を低下できることが示されている。アルツハイマー病の女性においても、エストロゲンを使用することにより、深刻な症状を抑え、知能の低下を遅らせる。長期間（１０年以上）使用している女性においては危険性が最も低い。しかし、短期間使用した女性においても効果は得られた。
【００３０】
エストロゲンと乳ガン
乳ガンの発病の主な危険因子は、性、年齢、家族の乳ガン歴、初潮の年齢、最初の妊娠満期産の年齢、及び閉経の年齢である。これらの要因の全て（家族歴を除く）は、エストロゲンの分泌寿命と直接関係していることが示され、ホルモン分泌の増大が乳ガンの危険性の増大と関連している。ガンの危険性の増大は、乳房上皮細胞でのエストロゲン受容体に媒介される増殖的反応に起因すると考えられている。
【００３１】
エストロゲン受容体アンタゴニストであるタモキシフェンは、乳ガンの防止と治療の両方に効果を示す医薬となることが示された。免疫組織化学方法を使用することにより、組織に発現するエストロゲン受容体タンパク量によって、胸腫瘍がエストロゲン受容体陽性であるか又は陰性であるかに分類することができる。エストロゲン受容体陽性の腫瘍は、エストロゲン受容体陰性の腫瘍より、タモキシフェンによる治療により好適に応答する。閉経前の女性は、閉経後の女性より、エストロゲン受容体陰性の乳ガンを発症することが多い。
【００３２】
エストロゲン受容体の構造と機能の突然変異は、初期の胸腫瘍又は乳ガン細胞系において説明されている。しかしながら、これらの変化が一次的（及び発ガンに至る過程に関する）か、二次的（及びガン組織中の遺伝子の不安定性の結果）かどうかは明らかでない。さらに、これらの身体の突然変異に加えて、いくつかの研究で、遺伝ＤＮＡ配列の変化と乳ガンの発達との関係の可能性を指摘しているが、これらについても議論の余地がある。
【００３３】
そしてさらに、最近、乳ガンにおけるエストロゲン受容体の役割を示す証拠として、乳ガンの発達の素因を作る変異体で遺伝する遺伝子ＢＲＣＡ１が、エストロゲン受容体の信号を抑制することが発見された。
【００３４】
エストロゲンと子宮内膜ガン
子宮内膜ガンは女性における最も一般的な骨盤の悪性腫瘍であるが、約７５％は診断の時点で子宮内に確認されるので、通常は子宮摘出によって治癒することができる。子宮内膜細胞をエストロゲンへ無抵抗に暴露すると、子宮ガン細胞への発達の機会を劇的に増大するため、エストロゲン単独のホルモン代替療法を無傷の子宮を有する女性に行ってはならない。プロゲステロンの周期的又は連続的投与は、子宮内膜細胞の過度の増殖防止に役立ち、またホルモン代替治療法の一部としてエストロゲンを処方されている閉経後の女性において、子宮内膜ガンの危険性を減らす。
【００３５】
子宮内膜ガンの多くの場合では、エストロゲン受容体が発現しており、一般的には、エストロゲン応答性の腫瘍は好適に予測することできる。後天的な（身体の）突然変異は、最大８．５％であるとされているが、子宮内膜ガンの発達、進行における突然変異の役割は、現在はっきりしていない。
【００３６】
いくぶん議論の余地があるとは言え、研究により、タモキシフェンの使用が子宮内膜ガンに発展する機会を増大していることが示唆されている。これは、エストロゲン受容体封鎖の役割に加えて、タモキシフェンが部分的な受容体アゴニスト活性を有し、子宮内膜増殖を誘発するエストロゲン応答性遺伝子を低級誘発していることを示す。
【００３７】
種々の疾患の媒介／変調におけるエストロゲン受容体の発展を得て、エストロゲン受容体中の配列多型を特定し、疾患の状態、治療効果等と関連づけることが重要である。本発明は、従来未知であった種々のＥＳＲ−アルファタンパクの多型を提供することにより、これらの技術を進歩させるものである。
【００３８】
ＳＮＰ
全生物のゲノムは、進化過程において自然発生的な突然変異を受け、祖先配列の変異形態を生成する（Ｇｕｓｅｌｌａ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５５， ８３１−８５４ （１９８６））。変異形態は祖先形態と比べ、進化の点で好都合又は不都合であるかもしれず、あるいは関係ないかもしれない。例えば、変異体が致命的な不都合を受けた場合は、後の世代には伝えられない。他方、変異形態が種の進化にとって好都合であった場合には、その種の多く又はほとんどのＤＮＡに組み込まれ、効果的に先祖形態となる。さらに変異形態の影響は、状況によって、有益、有害の両方でありうる。例えば、異型接合鎌状赤血球突然変異はマラリアに対しての抵抗を持つが、同型接合鎌状赤血球突然変異は通常致命的である。多くの例では、先祖形態と変異形態は、種の中で共存している。配列の複数形態の共存は、ＳＮＰ等の多型を引き起こす。
【００３９】
参照対立遺伝子形態は任意に示されて、例えば最も多い形態又は最初に特定される対立遺伝子形態であり、他方の対立遺伝子形態は、選択的、変異、多型対立遺伝子として示される。選ばれた集団の中で最も頻繁に起こる対立遺伝子形態は、「野生型」形態と呼ばれている。
【００４０】
ヒトゲノムの多型のうち約９０％が単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。ＳＮＰの位置又は部位は、通常、高度に保護された対立遺伝子（個体数の１／１００又は１／１０００以下が変化する配列）に従う。個体のそれぞれのＳＮＰ位置での対立遺伝子は同型接合又は異型接合であるかもしれない。本発明で確認されたように、ＳＮＰ位置での最小頻度の対立遺伝子は、より高頻度の対立遺伝子より少なく１％以下の頻度である。いくつかの例において、ＳＮＰは、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がアミノ酸コード化配列であることを意味する「ｃＳＮＰ」とされる。
【００４１】
ＳＮＰは、多型部位の一つのヌクレオチドが他のものに置換されることによって起こる。置換は転移又は転換により起こる。転移とはプリンヌクレオチドが他のプリンヌクレオチドに、又はピリミジンヌクレオチドが他のピリミジンヌクレオチドに換わることである。転換とはプリンがピリミジンに換わること、又はその逆である。またＳＮＰは、１つの塩基が挿入又は削除された変異形態（ｉｎｄｅｌと呼ばれる）であるかもしれない。コドンコーディングにおいてアミノ酸を他のアミノ酸とする置換は、非同義コドン変異又はミスセンス突然変異と呼ばれる。同義コドン変異又はサイレント突然変異は、遺伝コードの縮重のためアミノ酸の変異を生じない。ナンセンス突然変異は、終止コドンを形成する非同義コドン変異であり、ポリペプチド鎖の早期終結、及び不完全なタンパクを導く。
【００４２】
ＳＮＰは、原則的には、ｂｉ−、ｔｒｉ−、ｔｅｔｒａ−の対立遺伝子となることができる。しかしながら、ｔｒｉ−、ｔｅｔｒａ−は極めて珍しく、ほとんど存在しない（Ｂｒｏｏｋｅｓ， Ｇｅｎｅ ２３４ （１９９９） １７７−１８６）。このため、ＳＮＰはしばしば、「ｂｉ−対立遺伝子マーカー」又は 「ｄｉ−対立遺伝子マーカー」と呼ばれる。
【００４３】
原因ＳＮＰは、遺伝子発現、又は遺伝子生成物の機能発現の変化を生じるＳＮＰであり、ほとんどの場合で臨床表現型の予測が可能である。これらは、ポリペプチド生成物をコード化する遺伝子領域に入るＳＮＰ、すなわちｃＳＮＰを含んでいる。これらのＳＮＰは、ポリペプチド生成物のアミノ酸配列の変更（すなわち非同義コドン変異）を生じ、欠損、又は他の変異タンパクの発現を引き起こすかもしれない。さらに、ナンセンス突然変異の場合には、ＳＮＰはポリペプチド生成物の早期終結に至るかもしれない。このような変異生成物は、疾患状態、例えば遺伝子病を生じる可能性がある。コード化配列内に多型を有する遺伝子の例は、鎌状赤血球貧血と嚢胞性線維症を含む遺伝病を引き起こす。原因ＳＮＰは、必ずしもコード領域で起こる必要があるわけでなく、核酸によってコード化されるタンパクの発現及び／又は活動に最終的に影響する何れの領域でも起こりうる。これらの遺伝子領域には、プロモーター領域のＳＮＰ等の転写に関する遺伝子領域；欠損プライシングを引き起こすイントロン−エクソン境界のＳＮＰ、又はポリアデニル化信号領域等の信号配列を処理するｍＲＮＡ中のＳＮＰ等の転写過程に関連する遺伝子領域が含まれている。例えば、ＳＮＰはイントロンのスプライシングを抑制し、早期終止コドンを含むｍＲＮＡを引き起こし、欠損タンパクに至るかもしれない。したがって、調節領域のＳＮＰは発現に大きく影響を与えることとなる。
【００４４】
原因ＳＮＰではないいくつかのＳＮＰは、それでも疾患を引き起こす配列と密接に関連し、分離される。この場合、ＳＮＰの存在は疾患の存在又はかかりやすさと相関している。これらのＳＮＰは、診断学や疾患へのかかりやすさのスクリーニングに非常に有用である。
【００４５】
臨床試験では、患者の医薬での治療に対する反応がしばしば異質であることが示されている。したがって、医薬の設計及び治療の向上が必要であるといえる。ＳＮＰは、患者の治療に最も適した特定の医薬を決定するために用いることができる（これは、しばしば「薬理ゲノミクス」と呼ばれる）。薬理ゲノミクスは薬学研究における医薬の選択プロセスにも用いることができる。（Ｌｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７）， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４３， ２５４； Ｍａｒｓｈａｌｌ （１９９７）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １５， １２４９； Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９７／４０４６２， Ｓｐｅｃｔｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ； ａｎｄ Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８）， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ３．）
【００４６】
集団研究
集団遺伝学とは、メンデルの法則や他の遺伝原理が、どのように集団全体において適用されるかという研究である。このような研究は進化を適切に理解するために必要不可欠である。なぜなら、基本的に進化とは集団の遺伝子構成の革新的な変化の結果生じるものであるからである。従って、集団遺伝学により、分離、組換え、及び突然変異等の遺伝現象の影響を理解及び予測することが努められ、同時に、母集団の大きさ、交接パターン、個人の地理的分布、移住、及び自然淘汰等の生態学的及び進化的因子が考慮されなければならない。
【００４７】
理想的には、集団遺伝子の構成がどのようにしてなるかを解明し、自然淘汰又は人工的な選別の結果生じる集団の変化を予測するため、どのように集団遺伝子のタイプと頻度を論じるかを理解することが望まれる。
【００４８】
それらの多くの問題を説明するためには、遺伝子座間に存在する関係（連鎖）を理解することが重要である。
【００４９】
連鎖は、遺伝子座が同一染色体上の近接位置にあるので、２つ以上の非対立性遺伝子の共遺伝であり、減数分裂後も、非連鎖遺伝子と予測される５０％以上が関連している。減数分裂中に物理的な交差があり、生殖細胞生成中に個々の染色分体間で、母方、父方の遺伝寄与の物理的な交換が起こっていることは明らかである。この交換により、必然的にそれぞれの親と隣接していた染色体領域の遺伝子が分離され、残った配列と混合した結果、「組換え」が生じる。減数分裂の交差による組換えの生成工程は、遺伝特性の再配列において重要な特徴であり、遺伝子伝達の理解の中核をなしている。
【００５０】
組換えは、一般的にＤＮＡの大きなセグメント間で起こる。これはＤＮＡの隣接範囲と遺伝子とが連動していることを意味している。逆に、与えられた染色体上で互いに遠く離れたＤＮＡ領域は、交差の過程においても離れているようである。
【００５１】
減数分裂間に起こる組換え現象を明らかにするために、分子マーカーを用いることができる。異なる長さの（ＣＡ）ｎの繰り返しであるいくつかのマーカーは、ヒトＤＮＡの至る所に存在し、それらの長さにはわずかな選択圧力があり、位置マーカーと、染色体にそった位置確認特性として用いられる。これらのマーカーは、母方由来の遺伝子領域から、父方由来のものを区別するのに用いることができる。
【００５２】
他のマーカーは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり、これらはｂｉ−対立遺伝子マーカーであり、これらのマーカーの子孫への伝達についての分析にも用いることができる。
【００５３】
染色体に沿った１組のマーカーのパターンは「ハプロタイプ」と呼ばれる。そして、同一の小さな染色体セグメント上の対立遺伝子は、系図を通じてブロックとして伝達されるという傾向がある。ハプロタイプ公知の親の子孫においてハプロタイプを分析することにより、どの染色体中のどの親のセグメントがどの子に伝達されたかを確認することが可能である。組換えによって壊れていない場合、ハプロタイプは、マッピング目的で、単一高度多型遺伝子座の対立遺伝子とみなされうる。
【００５４】
連鎖マーカーの特定対立遺伝子と関連する病原性遺伝子が優先的に生成することを「連鎖不平衡」（ＬＤ）と呼ぶ。この種の不平衡は一般的に、ほとんどの病原性染色体が同一の突然変異を伝えること、及びテストされたマーカーが病原性遺伝子に非常に近いことを意味している。例えば、ＨＬＡ遺伝子座全体を通じて多くの連鎖不平衡がある。Ａ３対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ１４対立遺伝子と共にＬＤ中にあり、その結果、Ｂ７とＢ１４は血色素沈着症と高い関連性を有する。従って、たとえ他のファミリーメンバーが正式な連鎖分析に利用可能ではなくても、ＨＬＡ分類は単独で血色素沈着症の危険性の推定を著しく変更できる。結果として、遺伝子推定位置周辺のいくつかのマーカーを組合せて用いることにより、ファミリーに影響する又は影響しないように、ハプロタイプの決定を行うことができる。
【００５５】
ＳＮＰに基づくアソシエーション解析と連鎖不平衡マッピング
ＳＮＰは、特定のＳＮＰ、又は例えば乳ガンのような病的状態と関連する他の多型を特定するためのアソシエーション研究に有用である。アソシエーション研究は、一般的な母集団の範囲内で実行されるかもしれず、影響を受けるファミリーの個体に関連して行われる研究（連鎖研究）に限られるものではない。ＳＮＰを用いたアソシエーション研究は、重要な障害（例えば乳ガン）を有する多くの患者において、類似した年齢、経歴のコントロール同様に、ＳＮＰ対立遺伝子の頻度を決定することを含む。患者とコントロールの適切な選択は、ＳＮＰアソシエーション研究の成功に重要である。したがって、よく特徴づけられた表現型をもつ個人の集合が、極めて望ましい。例えば、特定のＳＮＰ遺伝子型と公知の表現型との間の関連を見つけるために、血圧と心拍数は、これらの生理学上のパラメータが公知である高血圧の人のＳＮＰパターンと相関させることができる。特定のＳＮＰ又はＳＮＰハプロタイプと表現型的性質との間の有意の関連は、標準の統計方法によって決定することができる。アソシエーション解析は、直接、またはＬＤに基づいて行うことができる。直接のアソシエーション解析においては、病原性配列の候補である原因ＳＮＰの試験を行う。
【００５６】
ＬＤに基づいたＳＮＰアソシエーション解析において、真の病原性配列または病原性ＳＮＰにより、ＬＤ中のＳＮＰが発見するために、ランダムなＳＮＰが広いゲノム領域（あるいはゲノム全体）で試験される。この研究のためには、アソシエーションを検出するために、その遺伝子座によって連鎖不均衡にあるように、ランダムなＳＮＰが未知の病原性遺伝子座の十分に近くに位置するように、高密度ＳＮＰマップが必要である。ＳＮＰは高頻度で起こる傾向があって、ゲノムを通じて均一に間隔をおいて配置される。ＳＮＰの頻度と均一性は、縦列繰り返し多型のような他のタイプの多型と比較して、病原性の遺伝子位置の近接で見つかる可能性がより高いことを意味する。また、ＳＮＰは、ＶＮＴＲ等の縦列繰り返し多型よりも、突然変異的に安定である。ＬＤに基づくアソシエーション研究では、何の遺伝子がどこにあるといった予備知識なしに、病気にかかりやすい遺伝子を発見することが可能である。
【００５７】
しかしながら、現在、全てのヒトゲノムにおいて実行可能なＳＮＰアソシエーション研究はなく、乳ガンと関係する候補遺伝子がＳＮＰ特定及びアソシエーション解析における対象とされている。候補遺伝子の研究では、直接疾患の発達に影響すると仮定される遺伝子を特定するために、疾患原因についての先見的な知識が用いられる。候補遺伝子の研究では、病気の治療に用いられる薬剤により直接の対象とされる遺伝子に焦点が当てられるかもしれない。乳ガンの感染性の増大に関連するＳＮＰを発見するために、候補遺伝子は疾患経路に生理的に関係するシステムから選ばれる。これらの遺伝子に発見されたＳＮＰは、適切なコントロールと比較して、病気にかかっている個人において、疾患との統計的な関連がテストされる。候補遺伝子の研究は、候補ＳＮＰの数と、分類し、広範囲（又は完全なゲノム領域）でのランダムＳＮＰのＬＤに基づいたアソシエーション研究との比較を行う必要のある個体数とを大幅に減らすことができる長所を持つ。さらに、候補遺伝子研究ではゲノムの特定領域のＬＤ範囲は予測されない。
【００５８】
適切に間隔をおいて配置され、十分な情報を有するＳＮＰマーカーの高密度マップの使用と組み合わせて、アソシエーション研究（連鎖不均衡ベースゲノムワイドアソシエーションを含む）により、乳ガン等の複合疾患に関連するほとんどの遺伝子の特定が可能になる。これは特定の疾患と関連する原因ＳＮＰを含む候補遺伝子の選択性を向上させる。本発明に開示されている全てのＳＮＰは、ゲノムワイドアソシエーション研究、又は候補遺伝子アソシエーション研究の一部に用いることができる。
【００５９】
本発明は、先端技術を進歩させるとともに、エストロゲン受容体遺伝子における従来未知のＳＮＰを提供することにより商業的に有用な例を提供する。
【００６０】
発明の概要
本発明は、エストロゲン受容体アルファ遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子／タンパクの新規な多型、及び未知のハプロタイプのゲノム構造を定義するヒトの染色体６からのゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの配列決定に基づく。このような多型／ハプロタイプは、癌、骨粗鬆症、心血管疾患等へのかかりやすさなどの変異エストロゲン受容体により媒介／変調される様々な病気を導き得る。この配列決定による手法に基づき、本発明はゲノムヌクレオチド配列、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列、ＥＳＲ−アルファ遺伝子中の配列多型、これらの多型のハプロタイプ、試料中のこれらの配列／多型を検知する方法、変異エストロゲン受容体により媒介される病気になるか又は進展する危険性を決定する方法、及び変異エストロゲン受容体により媒介される病気を治療するために使用される化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００６１】
発明の詳細な説明
一般説明
本発明は、エストロゲン受容体アルファ遺伝子、エストロゲン受容体遺伝子／タンパクの新規な多型、及び未知のハプロタイプのゲノム構造を定義するための、ヒトの染色体６及びｃＤＮＡからのゲノムＤＮＡの配列決定に基づく。このような多型／ハプロタイプは、変異エストロゲン受容体により媒介／変調される、癌、骨粗鬆症、心血管疾患へのかかりやすさなどの様々な病気へと導き得る。この配列決定による手法に基づき、本発明はゲノムヌクレオチド配列、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列、ＥＳＲ−アルファ遺伝子中の配列多型、これらの多型のハプロタイプ、試料中のこれらの配列／多型を検知する方法、変異エストロゲン受容体により媒介される病気になるか又は進展する危険性を決定する方法、及び変異エストロゲン受容体により媒介される病気を治療するために使用される化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００６２】
単離ＳＮＰ含有核酸分子
本発明は１種以上の本発明が開示するＳＮＰを含む単離核酸分子を提供する。さらに本発明は、変異タンパクをコード化する単離核酸分子を提供する。このような核酸分子は、１種以上の本発明に係るＳＮＰからなるか、実質的にこれらからなるか、又はこれらを含む。核酸分子は追加の核酸残基を有し得る。このような核酸残基は、例えば天然にその核酸分子と連なるものであるか又は異種のヌクレオチド配列である。
【００６３】
ここで、「単離」ＳＮＰ含有核酸分子は本発明のＳＮＰを含むものであり、核酸の天然源に存在する他の核酸から分離されたものである。一般に、ここで使われる単離ＳＮＰ含有核酸は、ＳＮＰのいずれかの側においてフランキングヌクレオチド配列を伴う本発明が開示するＳＮＰ位置を１つ以上含む。このフランキング配列は、検知試薬のために使用するならば、好ましくは概ね３００塩基まで、１００塩基まで、５０塩基まで、３０塩基まで、１５塩基まで、１０塩基まで、又は４塩基までを、又は図面に開示されたコーディング変異体を含むタンパクを生成するために使用するならば、全体のタンパクコード化配列の長さを、ＳＮＰ位置のいずれかの側に有する。重要な点は、核酸は遠隔の、及び重要でないフランキング配列から単離されることであり、そして組換え発現、ＳＮＰ位置のためのプローブ及びプライマーの調製、及びＳＮＰ含有核酸配列に特有な他の使用等の、ここに開示される特有の操作又は使用をし得る適切な長さであることである。
【００６４】
さらに、本発明のＳＮＰ位置を含むｃＤＮＡ分子等の「単離」核酸分子は、組換え技術、化学前駆体、又は化学的に合成する場合における他の化学物質により生産する場合には、他の細胞物質、又は培養媒体を実質的に含まないものであり得る。しかしながら、核酸分子は他のコーディング又は調節配列と融合し得、この場合もなお単離したものとみなされる。例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は単離したものとみなされる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異型宿主細胞に保持された組換えＤＮＡ分子、又は溶液中の精製（部分的に又は実質的な）ＤＮＡ分子が含まれる。単離ＲＮＡ分子には、本発明の単離ＳＮＰ含有ＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのＲＮＡ転写体が含まれる。本発明に係る単離核酸分子には、さらに合成的に生産された分子が含まれる。
【００６５】
単離ＳＮＰ含有核酸分子は、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ形態、又はＤＮＡ形態であり得る。このＤＮＡには、クローニングにより得られるか、化学合成技術により生産されるか、又はこれらの組み合わせにより生産されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡが含まれる。核酸、特にＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖の核酸はコーディング鎖（センス鎖）、又は非コーディング鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【００６６】
本発明はさらに、ここに開示される核酸分子にストリンジェント条件下でハイブリダイズした関連核酸分子を提供する。ここで「ストリンジェント条件下でのハイブリダイズ」とは、互いに少なくとも６０〜７０％の相同性を有するペプチドをコード化するヌクレオチド配列が、一般的には互いにハイブリダイズして残存するようハイブリダイズ及び洗浄を行う条件を意味する。この条件は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上が互いに相同である配列が通常なお互いにハイブリダイズしているようなものであり得る。そのようなストリンジェント条件は当業者に知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）， ６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェント条件下でのハイブリダイズの一例は、約４５℃において６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイズし、続いて５０〜６５℃において、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄するという条件である。低いストリンジェントハイブリダイズ条件へ加減する例は、当技術においてよく知られている。
【００６７】
具体的な実施例
ペプチド分子
【００６８】
本発明はエストロゲン受容体の変異体をコード化する核酸配列を提供する。これらの変異体分子／配列は、ここで本発明のエストロゲン受容体変異体、本発明のエストロゲン受容体タンパク、又は本発明のペプチド／タンパクとして参照される。
【００６９】
本発明は、ここに開示されるエストロゲン受容体変異タンパクのアミノ酸配列からなるか、実質的にそれからなるか、又はそれを含む単離エストロゲン受容体タンパク分子を提供する。
【００７０】
ここで、タンパク又はペプチドは、それが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前駆体や他の化学物質を実質的に含まない場合に、「単離」又は「精製」されたという。本発明のペプチドは均一に、又はある程度の純度に精製され得る。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な特徴は、相当量の他成分が存在したとしても、調製物がペプチドの所望の機能を発揮できるということである。
【００７１】
ここで、「細胞物質を実質的に含まない」とは、少なくとも約３０％（乾燥重量）以下の他のタンパク（即ち汚染タンパク）、２０％以下の他のタンパク、１０％以下の他のタンパク、又は５％以下の他のタンパクを有するペプチドの調製を含む。ペプチドが組換えにより生産される場合、実質的に培養媒体を含まない、即ち、培養媒体はタンパク調製物の約２０％以下である。
【００７２】
「化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、ペプチドがその合成時に関与する化学前駆体又は他の化学物質から単離される該ペプチドの調製を含む。ある例では、「化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とは、少なくとも約３０％（乾燥重量）以下の化学前駆体又は他の化学物質、２０％以下の化学前駆体又は他の化学物質、１０％以下の化学前駆体又は他の化学物質、又は５％以下の化学前駆体又は他の化学物質を有するエストロゲン受容体タンパクの調製を含む。
【００７３】
単離エストロゲン受容体タンパクは、天然にそれを発現する細胞から精製することができ、それを発現するように変異された細胞（組換え体）から精製することができ、又は公知のタンパク合成手法を用いて合成できる。例えば、エストロゲン受容体タンパクをコード化している核酸分子は発現ベクターへクローンされ、該発現ベクターは宿主細胞へ導入され、そしてタンパクが該宿主細胞で発現する。該タンパクはその後、標準のタンパク精製技術を用いて適当な精製過程により細胞から単離され得る。これらの技術の多くは以下に記述される。
【００７４】
したがって、本発明は図２に与えられる配列多型を１種以上含む、図１に概括されたアミノ酸配列からなるタンパクを提供する。アミノ酸配列がそのタンパクの最終的なアミノ酸配列である場合、タンパクはそのアミノ酸配列からなる。
【００７５】
さらに本発明は、図２に与えられる配列多型を１種以上含む、実質的に図１に概括されるアミノ酸配列からなるタンパクを提供する。アミノ酸配列が、例えば最終タンパク中に付加的アミノ酸残基が少量のみ存在する場合、タンパクは実質的にそのアミノ酸配列からなる。
【００７６】
さらに本発明は、図２に与えられる配列多型を１種以上含む、図１のアミノ酸配列を含むタンパクを提供する。このアミノ酸配列が該タンパクの最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部分である場合、タンパクはアミノ酸配列を含む。このようにこのタンパクは該ペプチドのみであり得、又は天然にそのタンパクに連なるか又は異型のアミノ酸残基／ペプチド配列であるアミノ酸残基（隣接するコード化配列）等の、追加のアミノ酸配列も持ち得る。このようなタンパクは、数個の追加アミノ酸残基を持ち得、または数百又はそれ以上の追加アミノ酸を含むことができる。これらの各種タンパクを調製／単離する方法を、以下に簡潔に説明する。
【００７７】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、異型配列と接合し、キメラ又は融合タンパクを形成し得る。このようなキメラ又は融合タンパクは、実質的にそのエストロゲン受容体タンパクとは相同でないアミノ酸配列を有する異型タンパクへ作用的に結合されたエストロゲン受容体タンパクを含む。「作用的に結合された」とは、エストロゲン受容体タンパクと異型タンパクがフレーム内に融合することを示す。異型タンパクは、エストロゲン受容体タンパクのＮ末端又はＣ末端に融合され得る。
【００７８】
ここで、融合タンパクはエストロゲン受容体タンパクの活性に本質的に影響しない。例えば、融合タンパクは、酵素融合タンパク、例えばベータガラクトシダーゼ融合体、イーストツーハイブリッドＧＡＬ融合体、ポリ−Ｈｉｓ融合体、ＭＹＣ標識、ＨＩ標識、Ｉｇ融合体を含むがこれらに限定されない。このような融合タンパク、特にポリ−Ｈｉｓ融合体は、組換えエストロゲン受容体タンパクの精製を容易にすることができる。ある宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）では、タンパクの発現及び／又は分泌は、異型の信号配列の使用により増加され得る。
【００７９】
キメラ又は融合タンパクは、標準の組換えＤＮＡ技術により生産され得る。例えば、異なるタンパク配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来技術により互いにフレーム内に括られる。他の例では、融合遺伝子は自動ＤＮＡシンセサイザーを含む従来技術により合成され得る。あるいは、二つの連続した遺伝子フラグメントの間の相補的な突出を生じるアンカープライマーを用い、続いてアニール及び再増幅してキメラ遺伝子配列を生成して遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２を参照）。さらに、融合部分をすでにコード化した多くの発現ベクターが商業的に入手可能である（例えばＧＳＴタンパクが挙げられる）。エストロゲン受容体タンパクをコード化した核酸は、融合部分をエストロゲン受容体タンパクにフレーム内で連結させることで発現ベクター等へクローニングし得る。
【００８０】
ポリペプチドは、２０天然由来アミノ酸と通常呼ばれる２０のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含む。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、天然の過程、加工や翻訳後修飾、又は従来技術としてよく知られている化学修飾技術により修飾される。ポリペプチドに天然に起こる典型的な修飾は基本書、詳細な専攻論文、及び研究文献に記述されており、当業者によく知られている。したがって、このポリペプチドは、置換アミノ酸残基が遺伝子コードによりコード化されたものではない誘導体又は類似体；置換基が含まれる誘導体又は類似体；成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半寿命を増加する化合物等の、他の化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合した誘導体又は類似体；リーダー又は分泌性の配列、又は成熟トランスポーターペプチドまたはプロタンパク精製のための配列等の付加的なアミノ酸が成熟トランスポーターペプチドに融合した誘導体又は類似体をふくむ。
【００８１】
知られている修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、フラビンの共有結合、ヘム半部の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジリノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミンの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水和化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解加工、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のアミノ酸のタンパクへの転移ＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化を含むがこれに限定されない。
【００８２】
このような修飾は当業者によく知られており、科学文献に大いに詳細に記述されている。いくつかの汎用されている修飾として、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、水和化、及びＡＤＰリボシル化はほとんどの基本書に記述されている。このような基本書としては、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＡＮＤ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄＥｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＡＮＤ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）が挙げられる。この主題についての多くの詳細な論評が入手でき、例えば Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｔｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６（１９９０）） ＡＮＤ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２（１９９２））が挙げられる。
【００８３】
さらに本発明は、本発明のエストロゲン受容体タンパクのフラグメント、加えてこれらのフラグメントを含む及びフラグメントからなるタンパク及びペプチドを提供する。しかしながら、本発明のフラグメントは、本発明に先立ち公開されたフラグメントを含まない。
【００８４】
ここで、フラグメントはエストロゲン受容体タンパク由来の隣接する８個以上のアミノ酸残基を含む。該フラグメントはエストロゲン受容体タンパクの１種以上の生物学的活性を保持する能力に基づき選択することができ、あるいは機能（例えば免疫抗原としての作用）を果たし得る能力のために選択することができる。特に重要なフラグメントは生物学的に活性なフラグメント、ペプチドであり、これらは例えば長さにして約８個以上のアミノ酸であり、変異アミノ酸残基（図２）を含む。このようなフラグメントは通常、本発明のエストロゲン受容体タンパクのドメイン又はモチーフ、例えば活性サイト、リガンド結合ドメイン、又はＤＮＡ結合ドメインを含む。さらに可能なフラグメントとしては、ドメイン又はモチーフを含有するフラグメント、溶解性ペプチドフラグメント、及び免疫原性構造を含有するフラグメントがあるがこれに限定されない。予測されるドメイン及び機能性サイトは、当業者に公知で直ちに入手可能なコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ分析）により直ちに特定し得る。
【００８５】
タンパク／ペプチドの使用
本発明のタンパクは、抗体を増加し又は他の免疫反応を誘発するため；生物的液体中のタンパク（又はその結合相手又は受容体）のレベルを定量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬（ラベル試薬を含む）として；対応するタンパクが優先的に発現する組織（形成的に、又は組織分化又は発達の特別な段階での、又は病気の状態における）のマーカーとして；ハイスループットのスクリーニングのための多数のタンパクパネルを含む、タンパクの生物活性を決定するため；のアッセイに使用できる。いずれかの又は全てのこれらの研究用途は、研究用製品としての商用化のための試薬グレード又はキットフォーマットへと発展させることができる。上記の使用を達成するための方法は、当業者に公知である。このような方法を開示する文献には、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＡＮＤ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．， １９８９，及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ． ＡＮＤ Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌｓ ｅｄｓ．， １９８７が含まれる。
【００８６】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは生物学的アッセイに有用である。該アッセイは、公知のエストロゲン受容体の機能又は活性、あるいはエストロゲン受容体に関連した状態の診断及び治療に有用な性質をも伴う。
【００８７】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、細胞系又は無細胞系のシステムでの薬剤スクリーニングアッセイにも有用である。細胞系のシステムは、ネイティブ、即ち通常該受容体タンパクを発現する細胞でもよく、生検としてでもよく、又は細胞培養へ拡張し得る。しかしながら、ある例において細胞系のアッセイは、受容体タンパクを発現する組換え宿主細胞を含む。
【００８８】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、受容体の活性を変調する化合物を特定するために使用することができる。本発明のエストロゲン受容体タンパク及び適当なフラグメントの双方は、受容体の活性を結合及び／又は変調するための能力についての候補化合物を検査するためのハイスループットのスクリーンとして使用できる。これらの化合物は、化合物の受容体活性に対する効果を決定するために、機能性受容体に対してさらにスクリーンすることができる。さらに、これらの化合物は、活性／効果を決定するために動物又は無脊椎動物のシステムでテストすることができる。受容体を所望の程度に活性化し（アゴニスト）、又は不活性化する（アンタゴニスト）化合物が特定される。このような化合物は、本発明の変異エストロゲン受容体タンパクの１種以上に作用する能力により選択される。
【００８９】
さらに受容体ポリペプチドは、受容体タンパクと、通常受容体タンパク（例えばエストロゲン）と相互作用する対象分子との間の相互作用を刺激又は阻害する能力により化合物をスクリーンするために使用することができる。該対象は、受容体タンパクが通常相互作用するリガンド又は結合相手（例えばエストロゲンリガンド又はＤＮＡ配列）であり得る。このようなアッセイは通常、受容体タンパク又はフラグメントが該対象分子と相互作用する条件下で、受容体タンパクを候補化合物と結合させ、そしてタンパクと対象との間の複合体生成を検知するか、又はタンパクと対象との間の相互作用の生物学的結果を検知するステップを含む。
【００９０】
候補化合物としては、例えば次のものを含む。１）Ｉｇ−テール融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えばＬａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４（１９９１）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８４−８６（１９９１）を参照）及び、Ｄ型及び／又はＬ型アミノ酸から作られる化学誘導分子ライブラリーのメンバーを含む可溶性ペプチド等のペプチド；２）ホスホペプチド（例えばホスホペプチドライブラリーのランダム及び部分的に縮退したメンバー（例えばＳｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８（１９９３）を参照）；３）抗体（例えば、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ‘）２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、抗体のエピトープ結合フラグメントだけでなく、ポリクロナール、モノクロナール、ヒューマナイズド、抗イディオティピック、キメラ、及び単一鎖抗体）；４）小型の有機、無機分子（例えばコンビナトリアル及び天然生産物ライブラリーから得られる分子）
【００９１】
ある候補化合物としては、リガンド結合と競合する受容体の可溶性フラグメントが挙げられる。他の候補化合物としては、変異受容体、又は受容体機能に影響を及ぼす変異を含む適切なフラグメントがあり、このためにリガンドとの競合が起こる。したがって、例えば高い親和性でリガンドと競合するフラグメント、又はリガンドと結合して離れないフラグメントが本発明に含まれる。
【００９２】
本発明はさらに、受容体の活性を変調（刺激又は阻害）する化合物を特定するための末端アッセイを含む。このアッセイは通常、受容体活性を表す信号伝達経路における挙動のアッセイを含む。例えば、受容体タンパクに依存する信号カスケードに応答して上下に調整される遺伝子の発現がアッセイできる。ある例において、このような遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼ等の容易に検知できるマーカーへ作用的に結合することができる。あるいは、受容体タンパク又は受容体タンパク対象のホスホリル化も測定できる。受容体により媒介される生物学的又は生化学的機能の何れもが末端アッセイとして使用できる。これらは、ここに記述された、引用文献における、これらの末端アッセイ対象の文献により取り入れた、全ての生化学的又は生化学／生物学的現象、及び当業者に公知の他の機能を含む。
【００９３】
受容体ポリペプチドは、受容体と相互作用する化合物を発見するために設計された方法における競合結合アッセイとしても有用である。化合物は該化合物がポリペプチドと結合又は他の相互作用をする条件下で受容体ポリペプチドにさらされる。受容体へのリガンドもその混合物へ加えられる。テスト化合物が受容体又はリガンドと相互作用する場合、形成される複合体の量又は受容体対象からの活性を減少させる。このタイプのアッセイは、受容体の特別な領域と相互作用する化合物を探す場合に特に有用である。
【００９４】
無細胞の薬剤スクリーニングアッセイを行うには、アッセイの自動化の便宜を図ると同時に、一方又は両方のタンパクの非複合体型からの、複合体の分離を容易にするため、受容体タンパク、フラグメント、又はその対象分子を固定化することが望ましいこともある。
【００９５】
マトリックスにタンパクを固定化する技術が薬剤スクリーニングアッセイに使用できる。ある例において、タンパクがマトリックスへ結合されるドメインを加えた融合タンパクが提供される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／１５６２５融合タンパクは、グルタチオンセファローゼビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着され得る。これはその後、細胞溶菌液（例えば３５Ｓでラベルした）及び候補化合物と結合され、この混合物は複合体形成へと導く条件下（例えば塩とｐＨの生理学的条件）で培養される。培養に続き、未結合のラベルを除くためにビーズを洗浄し、マトリックス固定化がなされ、放射性ラベルが直接、又は複合体が解離した後の上澄みで決定される。代わりに、複合体はマトリックスから解離することができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ビーズフラクション中に見いだされる受容体結合タンパクのレベルは標準の電気泳動技術を用いゲルから定量される。例えば、ポリペプチド又はその対象分子は、従来よく知られている技術を用いてビオチンとステプタビジンの共役を利用して固定化し得る。代わりに、タンパクと反応性があるがタンパクの対象分子への結合を妨害しない抗体が、プレートのくぼみへ誘導体化され、タンパクは抗体の共役によりくぼみにトラップされる。受容体結合タンパクと候補化合物の調製物は、受容体タンパクが存在するくぼみで培養され、くぼみにトラップされた複合体は定量され得る。このような複合体を検知する方法としては、ＧＳＴ固定化複合体のために上述したものに加えて、対象分子に関連した酵素活性を検知することによる酵素結合アッセイと同様に、受容体タンパク対象分子と反応性の、又は受容体タンパクと反応性であり対象分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検知を含む。
【００９６】
本発明のタンパクを変調する試薬は、上記の１種以上のアッセイを単独又は組み合わせて用いることにより特定できる。細胞系又は無細胞系のシステムを初めに使用し、その後動物又は他のモデルシステムで活性を確認するのが一般的には好ましい。このようなモデルシステムは従来よく知られており、この状況において直ちに用いることができる。これらの薬剤スクリーニングアッセイにより特定される受容体タンパクの変調剤は、エストロゲン受容体タンパクを発現する細胞を治療することにより、受容体経路で媒介される病気をもつ患者の治療に用いることができる。これらの治療方法は、ここに開示されたように医薬組成物中のタンパク活性の変調剤を、治療の必要に応じて患者へ投与するステップを含む。
【００９７】
本発明はさらに、上述のスクリーニングアッセイにより特定される新規な試薬に属する。したがって、適当な動物モデルにおいて、ここに開示されたように特定された試薬をさらに使用することは本発明の範囲内に属する。例えば、ここに開示されたように特定された試薬（例えばエストロゲン受容体変調試薬、アンチセンスエストロゲン受容体核酸分子、エストロゲン受容体特異抗体、又はエストロゲン受容体結合相手）が、このような試薬による治療の効率、毒性、副作用を決定するために動物モデルにおいて使用できる。あるいは、ここに開示されたように特定された試薬は、このような試薬の作用のメカニズムを決定するために動物モデルにおいて使用できる。さらに、本発明はここに開示されたような治療のために上述のスクリーニングアッセイにより特定された新規な試薬の使用に関係する。
【００９８】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、エストロゲン受容体により媒介される病気又は病気へのかかりやすさを診断するための対象を提供するのにも有用である。したがって、本発明は細胞中、組織中、又は有機体中における、本発明のエストロゲン受容体変異体（又はコード化ｍＲＮＡ）の存在、又はそのレベルを検知するための方法を提供する。この方法は、生物学的試料を、受容体タンパク（又は受容体をコード化する遺伝子、ｍＲＮＡ）と相互作用が可能な化合物に、相互作用が検知されるように接触させることを含む。
【００９９】
試料中のタンパクを検知する一つの試薬は、エストロゲン受容体タンパクの変異型に選択的に結合することができる抗体である。このような試料は、患者の体内に存在する組織、細胞、及び生物的液体と同時に、患者から分離された組織、細胞、及び生物的液体を含む。
【０１００】
本発明のエストロゲン受容体タンパクは、変異エストロゲン受容体をもつ患者の進行中の病気、病気へのかかりやすさを診断するための対象も提供する。ここでの病気は特に骨成長、細胞分化等のエストロゲン経由のものを含む。例えば、受容体は生物学的試料から単離され、異常型の受容体活性を生じる遺伝子突然変異の存在をアッセイすることができる。これは、アミノ酸置換、削除、挿入、再配列（異常型のスプライシング現象の結果として）、そして図２に与えられる適当な後翻訳修正を含む。分析手法は、変更電気伝導度、変更トリプシン消化、細胞ベース又は無細胞のアッセイにおける変更受容体活性、リガンド又は抗体結合パターンにおける変更、変更等電点、直接アミノ酸配列決定、そしてタンパク中の突然変異を検知するために有用な知られている他のアッセイ技術を含む。特に有用なのは図２に与えられるバリエーションである。
【０１０１】
ペプチドを検知するためのＩｎ ｖｉｔｒｏの技術は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、及び免疫蛍光を含む。あるいは、ペプチドは、患者にラベルした抗ペプチド抗体を導入することにより、Ｉｎ ｖｉｖｏで患者内に検知できる。例えば、抗体は、患者内におけるその存在と位置が標準のイメージング技術により検知できる放射性マーカーでラベルされ得る。特に有用なのは、患者内で発現する、ここに開示されるエストロゲン受容体の特異なアレル変異体を検知する方法及び、試料中のペプチドのフラグメントを検知する方法である。
【０１０２】
該ペプチドは、薬理ゲノミクス分析にも有用である。薬理ゲノミクスは、薬剤処理過程の改変及び患者における異常な作用により、薬剤への応答に対し臨床的に有意である遺伝的変異を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５（１９９６））や、Ｌｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６（１９９７））を参照。これらの変異の臨床結果は、代謝にかかる個人の変異の結果として、ある個人においては治療薬が激しい毒性となり、またある個人においては薬剤による治療が失敗する。このように、個人の遺伝子型が、治療化合物が体に作用する道筋を、又は体が化合物を代謝する道筋を決定し得るのである。さらに薬剤代謝酵素の活性は、薬剤作用の強さ及び長さの両方に影響を与える。このように、個人の薬理ゲノミクスにより、個人の遺伝子型に基づく予防的又は治療的治療のために、化合物の効果的な化合物及び、効果的な投薬量を選択できる。幾つかの薬剤代謝酵素における遺伝子多型の発見は、標準的な薬剤投与によって、なぜある患者において期待した薬剤効果が得られなかったり、過度の薬剤効果を示したり、又は深刻な毒性を経験するのかを説明する。多型は広い代謝の遺伝子表現型、及び乏しい代謝の遺伝子表現型に表現されうる。したがって、遺伝子多型は受容体タンパクの対立遺伝子タンパク変異を導き、この場合、１つの個体群における１つ以上の受容体の機能が、他の個体群とは異なる。したがって、ペプチドにより対象の治療法に影響を与え得る遺伝子的素質を確かめることができる。例えば、リガンドベースの治療において、多型はアミノ末端の細胞外ドメイン及び／又はリガンド結合が幾らか活性である他のリガンド結合領域を引き起こし、そして受容体の活性化を引き起こす。したがって、リガンドの服用量は当然に、ある多型／ハプロタイプを含む与えられた個体群において治療効果が最大となるように調節される。遺伝子型に代えて、特異的な多型ペプチドが特定し得る。
【０１０３】
抗体
また、本発明は本発明のエストロゲン受容体タンパクに選択的に結合する抗体、及びそのフラグメントを与える。ここで、抗体は、対象タンパクと結合し、関連しないタンパクとは有意に結合しない場合、選択的にそれと結合する。抗体は、対象タンパクと実質的に相同ではない他のタンパクとも結合する場合であっても、該タンパクが抗体の対象タンパクのフラグメント又はドメインと相同性を有する限り、なお選択的にタンパクと結合するとみなされる。この場合、タンパクに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、なお選択的であると理解される。
【０１０４】
ここで抗体は、当技術において認識されるものと一致する用語で定義される。これらは、抗原の攻撃に反応して哺乳類生物により生産されたマルチサブユニットタンパクである。本発明の抗体は、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体、そしてＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント等の抗体のフラグメントを含むがこれに限定されない。
【０１０５】
与えられた対象ペプチドに対する抗体を生成及び／又は特定する多くの方法が知られている。該方法の幾つかは、Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記述されている。一般に、抗体を生成するためには、単離ペプチドを免疫原とし、これがラット、ラビット、又はマウス等の哺乳類生物へ投与される。全長タンパク、抗原性ペプチドフラグメント、又は融合タンパクを使用することができる。
【０１０６】
抗体は、好ましくはエストロゲン受容体タンパクの領域又は離散的なフラグメントから調製される。抗体は、ここに開示されるペプチドのいかなる領域においても調製され得る。しかしながら、好ましい領域は機能／活性、及び／又は受容体／結合相手相互作用を伴う領域を含む。抗原性フラグメントは通常、少なくとも１０個の隣接アミノ酸残基を含む。しかしながら、該抗原性ペプチドは少なくとも１２、１４、２０又はそれ以上のアミノ酸残基を含むことができる。このようなフラグメントは、例えば疎水性領域等のタンパクの表面に位置する領域に相当するフラグメント等の、物理的性質により選択され得る。
【０１０７】
本発明の抗体の検知は、抗体を検知可能な物質へカップリング（即ち、物理的な結合）させることにより容易にすることができる。検知可能な物質の例としては、様々な酵素、補綴基、蛍光物質、発光物質、バイオ発光物質、及び放射性物質が含まれる。適当な酵素の例としては、ホルセラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適当な補綴基複合体の例としては、ストレプタビジン／ビオチン、及びアビジン／ビオチンが含まれる。適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナーゼ、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリスリンが含まれる。発光物質の例としては、ルミノールが含まれる。発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びアエクオリンが含まれ、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが含まれる。
【０１０８】
抗体の使用
抗体は、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降等の標準的な技術により、本発明のエストロゲン受容体タンパクを単離するために使用することができる。抗体は、細胞及び、宿主細胞で発現し組換え的に生産されたタンパクからの、天然タンパクの精製を容易にすることができる。さらにこの抗体は、生物の様々な組織間における、そして通常の発達過程において、本発明のエストロゲン受容体タンパクの発現パターンを決定するために、細胞又は組織中における該タンパクの存在の検知に有用である。さらにこの抗体は、発現の量及びパターンを評価するために、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、又は細胞溶解液又は上澄み中におけるタンパクの検知に使用することができる。またこの抗体は、発達中における異常な組織分布又は異常な発現の評価に使用することができる。全長エストロゲン受容体タンパクの循環フラグメントの抗体検知は、代謝回転の特定に使用することができる。
【０１０９】
さらにこの抗体は、病気の活性段階等の病気状態において、又はタンパクの機能と関連する病気への傾向を持つ個人において、発現の評価に使用することができる（特に骨の成長／形成／劣化を伴う病気）。変調が不適切な組織分布、成長的な発現、タンパクの発現レベル、又は発現／加工された型により引き起こされる場合、抗体は、通常のタンパクに対して調製することができる。変調がタンパクの特異的な突然変異により特徴付けられる場合には、この突然変異タンパクに特異的な抗体は、特異的な突然変異タンパクの存在のアッセイに使用できる。
【０１１０】
この抗体は、生物の様々な組織中の細胞の、通常及び異常型の遺伝子局在を評価するためにも使用できる。診断的な使用は、遺伝子試験だけでなく、治療法をモニターするためにも適用できる。したがって、治療が終局的に発現レベル、又は異常型配列の存在及び異常型組織分布、又は成長的な発現を直すことを意図している場合には、そのタンパク又は関連するフラグメントに対して向けられた抗体を、治療効率をモニターするために使用することができる。
【０１１１】
加えて、抗体は薬理ゲノム分析に有用である。例えば、多型タンパクに対して調製された抗体は、修正した治療法が求められる個人を特定するために使用することができる。この抗体は、電気伝導度、等電点、トリプシンペプチド消化、そして従来技術において知られている他の物理的アッセイにより分析される異常型エストロゲン受容体タンパクのための免疫的マーカーとしての診断ツールとしても有用である。
【０１１２】
この抗体は、タンパク機能の阻害、例えばリガンド等の結合相手へのエストロゲン受容体タンパクの結合の阻害にも有用である。これらの使用は、治療がタンパクの機能の阻害を伴う治療状況にも適用することができる。抗体は、例えば結合を阻害し、これによりタンパクの活性を変調（作用又は拮抗）するために使用することができる。抗体は、機能が要求されるサイトを含む特別なフラグメントに対して、又は細胞又は細胞膜と関連しているそのままのタンパクに対して調製することができる。
【０１１３】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパクの存在を検知するための抗体を使用するためのキットも包含する。このキットは、ラベル化又はラベル可能な抗体等の抗体及び、生物学的サンプル中のエストロゲン受容体タンパクを検知するための化合物又は試薬；該サンプル中のタンパクの量を決定する手段；該サンプル中のエストロゲン受容体タンパクの量を基準と比較する手段；及び使用のための手引きを含むことができる。
【０１１４】
核酸分子
本発明はさらに、本発明にかかるエストロゲン受容体タンパクをコード化する単離核酸分子を提供する。該核酸分子は、本発明のエストロゲン受容体タンパクの一つをコード化するヌクレオチド配列からなる、本質的に該ヌクレオチド配列からなる、又は該ヌクレオチド配列を含む。
【０１１５】
ここでいう「単離」核酸分子とは、核酸の天然源に存在する他の核酸から区別されたものである。好ましくは「単離」核酸は、本来核酸が誘導された有機体のゲノムＤＮＡ中で核酸にフランキングする配列（すなわち、核酸の５´又は３´末端に位置する配列）がない。しかしながら、いくらかフランキングするヌクレオチド配列を含むことができ、その例としては約５ＫＢ，４ＫＢ，３ＫＢ，２ＫＢ，又は１ＫＢ以下であり、特に連続的にペプチドをコード化する配列及び同一遺伝子内でペプチドをコード化する配列であるが、ゲノム配列のイントロンから離れた配列である。重要な点は、核酸が離れた重要でない隣接配列から単離されたことであり、ここで述べる組換えの発現、プローブ及びプライマーの調製、及び核酸配列に特異的な他の用途等の特殊な操作の対象となるということである。
【０１１６】
さらに、ｃＤＮＡ分子等の「単離」核酸分子は、他の細胞材料、又は組換え技術で製造された場合には培地、化学合成された場合には化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、核酸分子は他のコード化又は調節配列と融合することができ、これも単離したと考えられる。
【０１１７】
例えば、ベクターに含まれる組換えＤＮＡ分子は単離されていると考えられる。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、非相同な宿主細胞中に維持された組換えＤＮＡ分子、または溶液中の精製（部分的に又は実質的に）されたＤＮＡ分子があげられる。単離ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明の単離ＤＮＡ分子のＲＮＡ転写を含む。さらに本発明にかかる単離核酸分子は合成的に製造された分子を含む。
【０１１８】
従って、本発明は、図１に示されるヌクレオチド配列よりなる、図２に提供される一つ以上の配列多型を含む核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列が核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるので、核酸分子はヌクレオチド配列からなっている。
【０１１９】
本発明はさらに、図１に示されたヌクレオチド配列より実質的になる、図２に提供される１つ以上の配列多型を含む核酸分子を提供する。核酸分子は実質的に、最終的な核酸分子中に幾つかの付加的核酸残基が存在するヌクレオチド配列よりなる。
【０１２０】
本発明はさらに、図１のヌクレオチド配列を含む、図２に提供される１つ以上の配列多型を含む核酸分子を提供する。核酸分子は、該ヌクレオチド配列が核酸分子の最終的なヌクレオチド配列の一部である核酸配列の場合、該ヌクレオチド配列を含む。このように、核酸分子はヌクレオチド配列のみ、又は付加的核酸残基を有することができ、核酸残基はヌクレオチド配列又は非相同性ヌクレオチド配列と自然に関連したものである。このような核酸分子はわずかな付加的ヌクレオチドを有する、又は数百又はそれ以上の付加的ヌクレオチドを含む。これら様々なタイプの核酸分子がどのようにして作られ／単離されたかの簡単な説明を以下に提供する。
【０１２１】
単離核酸分子は、成熟タンパクと付加的アミノ酸又はカルボキシル末端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸（例えば成熟形態が１つ以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することがある。このような配列はタンパクが前駆体から成熟体へ成長する際、タンパク搬送の促進、タンパク半減期の延長又は短縮、又はアッセイ又は製造時のタンパク操作の効率化、又は他の事由に役割を果たす。一般にｉｎ ｓｉｔｕの場合、付加的アミノ酸は細胞酵素により成熟タンパクから切り離される。
【０１２２】
上記のように、単離核酸分子は、エストロゲン受容体タンパクのみをコード化する配列、主又は副配列（例えばｐｒｅ−ｐｒｏ 又はｐｒｏ−タンパク配列）等の、成熟ペプチド及び付加的コード配列をコード化する配列、付加的コード配列を有し又は有さない成熟ペプチドをコード化する配列、プロモーターなどのゲノム調節配列に加えて、例えばイントロン及び非コード化５´及び３´配列等の転写はされるが翻訳はされず、転写、ｍＲＮＡ処理（スプライシング及びポリアデニル化信号を含む）、リボゾーム結合及びｍＲＮＡの安定化に役割を果たす付加的非コード配列を含むが、これに制限されない。さらに、核酸分子は、例えば精製に有用なペプチドなどをコード化するマーカー配列に融合されたものでもよい。
【０１２３】
単離核酸分子は、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ形態、又はｃＤＮＡ及びクローニング又は化学合成技術、又はこれらの組み合わせで得られたゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ形態でありえる。核酸、特にＤＮＡは二重鎖又は一重鎖である。一重鎖はコード鎖（センス鎖）又は非コード鎖（アンチセンス鎖）でありえる。
【０１２４】
フラグメントは、１２又はそれ以上のヌクレオチドの連続的ヌクレオチド配列を含む。さらにフラグメントは、少なくとも３０，４０，５０，１００，２５０，又は５００のヌクレオチド長であることができる。フラグメントの長さは使用目的に依存する。例えば、フラグメントはペプチドのエピトープ挙動部分をコード化し、又はＤＮＡプローブ又はプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成する公知のヌクレオチド配列を用い、単離することができる。標識されたプローブは、コード部分に対応する核酸を単離するため、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡをスクリーニングするために用いることができる。さらに、プライマーは、遺伝子の特定部分をクローンするためＰＣＲ反応を用いることができる。
【０１２５】
プローブ／プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約１２，２０，２５，４０，５０又はそれ以上の連続的なヌクレオチドとなるように、ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列部分を含む。
【０１２６】
ここで「ストリンジェント条件下でのハイブリダイズ」とは、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列が互いに少なくとも５０−５５％の相同性を有するまでハイブリダイズ及び洗浄を行うことを意味する。前記条件は、典型的には相互にハイブリダイズして残存し、互いに配列が少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％以上相同性を有する。このようなストリンジェント条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントハイブリダイズ条件の一例は、６Ｘ  塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃でハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ  ５０−６５℃で１回以上洗浄するという条件である。
【０１２７】
核酸分子の利用
本発明の核酸分子はプローブ、プライマー、化学的中間体、および生物学的アッセイに有用である。プローブは図２に示した１つ以上の配列多型を含む、図１のヌクレオチド配列よりなる核酸分子の全長にわたっていずれかの配列にかかるものでありえる。従って、それは５´非コード化部分、コード化部分、及び３´非コード化部分から誘導できる。しかしながら、前述したように、フラグメントは、本発明以前に公開されたフラグメントを含むものではない。
【０１２８】
核酸分子は、ＰＣＲによる核酸分子のいずれかの与えられた部分の増幅に有用であり、また、望ましい長さ及び配列の反増感分子の合成に有用である。
【０１２９】
核酸分子はまた、組換ベクターを構成するのにも有用である。このようなベクターはペプチド配列の一部分又はすべてを発現する発現ベクターを含む。ベクターは挿入ベクターを含み、他の核酸分子配列に融合して使用され、例えば細胞ゲノム中に、遺伝子及び／又は遺伝子生成物の発現状態を変えるために用いられる。例えば、内生コード化配列を、そのすべて又はその一部について１以上の特に変異を引き起こすコード化部分に相同的に組換えることができる。
【０１３０】
核酸分子はまた、タンパクの抗原部分を示すのにも有用である。
核酸分子また、ここに記述された核酸分子から、全長又は一部のｍＲＮＡに対応するリボザイムを設計するのに有用である。
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部またはすべてを発現する宿主細胞を構築するのに有用である。
【０１３１】
核酸分子はまた、前記核酸分子及びペプチドのすべて又は一部を発現する遺伝子組換動物を構築するのに有用である。
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現するベクターを作るのに有用である。
【０１３２】
核酸分子はまた、核酸分子の発現の存在、レベル、形態及び分布を決定するハイブリダイズプローブとして有用である。従って、プローブは、細胞、組織及び有機体における特定核酸分子の存在を検知し、又はレベルを決定するために用いられ得る。核酸のレベルはＤＮＡ又はＲＮＡで決定される。従って、ここに記述されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、又は有機体で、発現及び／又は遺伝子複製数の評価に用いることができる。これらを使用することは、正常状態に比較し、エストロゲン受容タンパクの発現が増加又は減少することに関連した異常の診断に等価である。
【０１３３】
ｍＲＮＡの検出のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、ノーザンハイブリダイズ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズを含む。ＤＮＡ検出のｉｎ ｖｉｔｒｏ技術は、サウザンハイブリダイズ及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズを含む。
【０１３４】
プローブは、エストロゲン受容体タンパクを発現する細胞又は組織を特定するための診断検査キットの一部として用いることができ、それは対象からの細胞のサンプル中の受容体コード化核酸、例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡのレベルを測定すること、又はエストロゲン受容体遺伝子が変異していないかを検出することで行われる。
【０１３５】
核酸発現アッセイは、エストロゲン受容体核酸発現を変調する化合物を特定するスクリーニング試薬として有用である。
【０１３６】
従って本発明により、エストロゲン受容体遺伝子の核酸発現に関連した異常を処置するために用い得る化合物の特定のための方法が提供される。この方法は、典型的にはエストロゲン受容体核酸の発現を変調する化合物の能力をアッセイし、望ましくないエストロゲン受容体核酸発現により特徴づけられる異常の処置にその物質が使用し得るかを判定する。これらのアッセイは細胞ベース系及び細胞フリー系で行うことができる。細胞ベースのアッセイは、エストロゲン受容体核酸を自然に発現している細胞、又は特定の核酸配列を発現するように遺伝的に設計された組換え細胞を含む。
【０１３７】
エストロゲン受容体核酸発現のアッセイは、ｍＲＮＡレベルなどの核酸レベルの直接的アッセイ、又は信号経路に関連する二次的な化合物により行われる。さらにエストロゲン受容タンパク信号経路に対する遺伝子発現の上昇又は減少制御がアッセイされる。この具体例では、これらの遺伝子の調節部分はルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子と結合されることができる。
【０１３８】
そして、エストロゲン受容体遺伝子発現の変調剤は、細胞が候補化合物と接触し、ｍＲＮＡの発現が検出されることで特定される。候補化合物の存在下でのエストロゲン受容体ｍＲＮＡの発現レベルが、候補化合物不存在下でのエストロゲン受容体ｍＲＮＡの発現レベルと比較される。候補化合物は、この比較に基づき核酸発現の変調剤として判定され、例えば異常な核酸発現に特徴づけられる異常の処置に使用される。ｍＲＮＡの発現が候補化合物の存在下で、不存在下に比較して統計的に著しく大きい場合には、その候補化合物は核酸発現の刺激剤として特定される。ｍＲＮＡの発現が候補化合物の存在下で、不存在下に比較して統計的に著しく小さい場合には、その候補化合物は核酸発現の阻害剤として特定される。
【０１３９】
本発明は、核酸を対象として、エストロゲン受容体を発現する細胞又は組織にエストロゲン受容体核酸発現の変調を行う遺伝子変調剤とした薬剤スクリーニングを通して特定された化合物を用いた処置方法を提供する。変調は、向上変調（例えば活性化又はアゴニスト化）又は低下調整（抑制又はアンタゴニスト化）の両方の調節、または核酸発現を含む。
【０１４０】
あるいは、エストロゲン受容体核酸発現の変調剤は、その薬剤又は小分子がそのタンパクが発現している細胞又は組織中でエストロゲン受容体核酸発現を阻害するものである限り、ここに記述されたスクリーニングアッセイを用いて特定された小分子又は薬剤である。
【０１４１】
核酸分子は、臨床試験又は処理管理において、エストロゲン受容体遺伝子の発現又は活性に対する変調化合物の有効性のモニターに有効である。遺伝子発現パターンは化合物により処理の連続的効果のバロメーターとなり、特に患者が耐性を示す化合物に有効である。遺伝子発現パターンは化合物に影響された細胞の生理的反応を示すマーカーとしてもまた有用である。従って、このようなモニターは化合物の投与量の増加又は患者が耐性を示さない別の化合物の投与を許可する。同様に、核酸発現のレベルが好ましいレベル以下に落ちたら、化合物の投与を比例して減少させることができる。
【０１４２】
核酸分子はまた、エストロゲン受容体核酸発現の質的変化に対する診断アッセイに有用であり、特に病状に質的変化を導き出す。核酸分子はエストロゲン受容体遺伝子及びｍＲＮＡのような遺伝子発現生成物の変異を検出するのに用いることができる。核酸分子はエストロゲン受容体遺伝子中で自然に生じた遺伝子変異を検出するハイブリダイズプローブとして用いることができ、そして変異を有する対象が変異により生じる異常の危険性があるか否かを判定することができる。変異は、遺伝子中の１以上のヌクレオチドの欠如、付加、置換；転置又は転移のような染色体再配置；異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの変化、増幅のような遺伝子複写数の変化等を含む。逆機能に関連したエストロゲン受容体遺伝子の変異形態の検出は、活性診断、又は疾患がエストロゲン受容体タンパクの過剰発現、過小発現、又は変異発現の結果である場合には疾患へのかかりやすさの診断方法となる。
【０１４３】
エストロゲン受容体遺伝子に変異を有する個人は、各種技術により遺伝子レベルで検出することができる。ゲノムＤＮＡは直接に分析し、又は分析に先立ちＰＣＲを用いて増幅することもできる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡは同様に用いることができる。ある用途では、変異の検出は、アンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ  ＰＣＲのように、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２）におけるプローブ／プライマーの使用に関連し、又は異なるものではリゲーション鎖反応（ＬＣＲ）（Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０（１９８８）；及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４（１９９４）参照）に関連し、後者は特に遺伝子のポイント変異の検出に特に有効である（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２（１９９５）参照）。この方法は、患者から細胞サンプルを収集する工程、サンプルの細胞から核酸（例えばゲノム，ｍＲＮＡ又は両者）を単離する工程、核酸サンプルを遺伝子（もし存在すれば）のハイブリダイズ及び増幅が生じる条件下で、遺伝子に特にハイブリダイズした１以上のプライマーと接触させる工程、増幅生成物の存在又は不存在を検出し、又は増幅生成物の大きさを検出しコントロールサンプルの長さと対比する工程を含む。欠如及び挿入は増幅生成物を正常ゲノタイプと比較することにより、大きさの変化で検出することができる。ポイント変異は、増幅ＤＮＡを正常ＲＮＡ、又は不増感ＤＮＡとハイブリダイズすることで特定することができる。
【０１４４】
あるいは、エストロゲン受容体遺伝子の変異は直接に、例えば変形された限定酵素消化パターンをゲル電気泳動で決定することで特定することができる。
さらに、配列−特定リボザイム（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４９８，５３１）を、リボザイム分裂サイトの成長又は減少により特定変異の存在をスコア化することができる。完全に一致した配列は、ヌクレアーゼ開裂消化アッセイ又は融点の相違により、一致しない配列から区別することができる。
【０１４５】
特定位置の配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ又は化学開裂法により評価することができる。さらに、変異エストロゲン受容体遺伝子と野性型遺伝子との間の配列の相違を、直接ＤＮＡ配列化により決定する。自動配列化手段の各種は、診断アッセイを実行するときに有効であり（Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．，（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）、マススペクトルによる配列化を含む（ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２（１９９６）；及びＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８；１４７−１５９（１９９３）参照）。
【０１４６】
遺伝子の変異を検出する他の方法は、ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の不適合塩基を検出するため、開裂試薬から保護する方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０；１２４２（１９８５））；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ８５：４３９７（１９８８）；Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５（１９９２））、変異及び野性型核酸の電気泳動量を比較するもの（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８６；２７６６（１９８９）；Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４（１９９３）；及びＨａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９（１９９２））、及び変性グラジェントゲル電気泳動を用い、変性剤の傾斜濃度を含むポリアクリルアミドゲル中で変異又は野性型フラグメントの移動をアッセイするもの（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５（１９８５））が含まれる。ポイント変異を検出する他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイズ、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【０１４７】
核酸分子はまた、疾患を不要に起こさせず、治療様相に影響を与えるゲノタイプの個体を試験するためにも有用である。そして、核酸分子は個体の遺伝子型と、治療のために用いられた化合物に対する個体の反応との間の相関を研究するのに用いることができる（薬理ゲノム相関）。従って、ここに記述された核酸分子は、好ましい化合物及び治療のための投与量を選択するため、ある個体のエストロゲン受容体遺伝子の変異量を評価するために用いることができる。
【０１４８】
そして、治療に影響を与える遺伝子変異を示す核酸分子は、個体に対するテーラー治療に用いることのできる診断対象を提供する。従って、これらの多型／ハプロタイプを有する組換細胞及び動物の製造は、薬剤及び投与量の効果的な臨床設計を可能とする。
【０１４９】
核酸分子は、細胞、組織及び生体中でのエストロゲン受容体遺伝子発現の調整を行うため、不増感性の形成に有用である。ＤＮＡ不増感核酸分子は、転写及びその後のエストロゲン受容体タンパクの製造を阻止するため、転写に関連する遺伝子の部分に相補的に設計される。不増感ＲＮＡ又はＤＮＡ核酸分子は、ｍＲＮＡにハイブリダイズされ、ｍＲＮＡのエストロゲン受容体タンパクへの翻訳を阻止する。
【０１５０】
あるいは、不増感分子の１種は、エストロゲン受容体核酸の発現を減少させるためｍＲＮＡを不活性化するために用いられる。従って、これらの分子は、異常又は望ましくないエストロゲン受容体核酸発現により特徴づけられる異常を処置することができる。この技術は、ｍＲＮＡが翻訳される能力を減じる核酸配列を相補的にｍＲＮＡの１以上の部分に含ませたリボチームによる開裂に関する。可能な部分は、コード化部分及び特に基質結合部分のような、エストロゲン受容体タンパクの触媒及び他の機能的活性に関連したコード化部分である。
【０１５１】
核酸分子はさらに、エストロゲン受容体遺伝子発現に異常を有する細胞を含む患者の遺伝子治療のベクターを提供する。そして、ｅｘ ｖｉｖｏで変調され、患者に戻された患者の細胞を含む組換細胞を、個人の処置のため、患者の細胞が望ましいエストロゲン受容体タンパクを生成する位置に導入するものである。
【０１５２】
本発明はまた、生物的サンプル中のエストロゲン受容体核酸の存在を検知するキットを含む。例えば、このキットは、標識された又は標識できる核酸又は生物的サンプル中のエストロゲン受容体核酸を検知することのできる薬剤；、サンプル中のエストロゲン受容体核酸の量を決定できる手段；及びサンプル中のエストロゲン受容体核酸量を標準と比較する手段を含む。化合物又は薬剤は適当な容器に封入される。このキットはさらにエストロゲン受容体タンパクｍＲＮＡ又はＤＮＡを検出するキットの使用に関する説明書を含む。
【０１５３】
ＳＮＰ含有核酸検出方法の設計
本発明のＳＮＰ核酸分子はプローブ、プライマー、化学的中間体、およびＳＮＰの生物学的アッセイに有用である。プローブ／プライマーは図２に示した１つ以上のＳＮＰと一致しているか、または５´及び／又は３´と一致している。しかしながら、前述したように、フラグメントは、本発明のＳＮＰと関連しないフラグメント、又はＳＮＰ検出の技術において知られているフラグメントを含むものではない。ここで提供されたＳＮＰ含有核酸分子と情報は、ＰＣＲが、本発明において提供されたＳＮＰを増幅し、フォーマットされたＳＮＰ検出試薬／キットを設計するＰＣＲプライマーを設計するのにまた有用である。
【０１５４】
プローブ／プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含む。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約１２，２０，２５，４０，５０又はそれ以上の連続的なヌクレオチドとなるように、ストリンジェント条件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列部分を含む。特定の条件に基づいて、連続的なヌクレオチドは対象ＳＮＰ位置を含むことができ、又は、所望のアッセイを実行するＳＮＰ位置である近接５´及び／又は３´ＳＮＰに十分近い特定部分になることもできる。
【０１５５】
好ましいプライマーとプローブ配列は、図１、２、及び９において提供された配列を使ってすぐに決定できる。それは当技術者には明白であり、そのようなプライマーとプローブは、本発明のＳＮＰをゲノタイピングする診断プローブや増幅プライマーとして有効であり、キット型に組み入れることができる。
【０１５６】
ＳＮＰを分析するために、ＳＮＰ対立遺伝子（「対立遺伝子特定オリゴヌクレオチド」、「対立遺伝子特定プローブ」、または「対立遺伝子特定プライマー」として表される）に特有なオリゴヌクレオチドを使うことが適切である。多型を分析するための対立遺伝子特定プローブの設計と用途は、例えばＳａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２４， １６３−１６６ （１９８６）； Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ， ＥＰ ２３５，７２６， Ｓａｉｋｉ， ＷＯ ８９／１１５４８に説明されている。
【０１５７】
ハイブリダイズベースのアッセイにおいて、対立遺伝子特有プローブは、１人のヒト由来の対象ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、異なる多型が存在する別のヒト由来のセグメントにはハイブリダイズしないよう設計される。ハイブリダイズ条件は、対立遺伝子間のハイブリダイズ強度に重要な差異、好ましくは重要な二元性応答があるため、十分ストリンジェントであるべきであり、それによってプローブが対立遺伝子の１つだけにハイブリダイズする。いくつかのプローブが、対象ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするように設計されるので、多型部分はプローブの中心位置（例えば７位の１５量体、８又は９位の１６量体）に配列する。プローブの設計により、異なる対立遺伝子間のハイブリダイズが、よく識別できるようになる。
【０１５８】
対立遺伝子特定プローブはしばしば対で使われ、「対」は、ＳＮＰ位置での対立遺伝子の変異を表す１つのヌクレオチド不一致を除いて同一である。対の一方は対象配列と完全に一致し、他方は変異型と完全に一致している。配列において、数対のプローブは、同じ対象配列内の複数の多型を同時分析する同じ担体に固定することができる。
【０１５９】
あるタイプのＰＣＲベースのアッセイにおいては、対立遺伝子特定プライマーがＳＮＰ位置と重複している対象ＤＮＡ部分にハイブリダイズし、プライマーが完全な相補性を表す対立遺伝子型のプライマーだけが増幅する。（Ｇｉｂｂｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １７ ２４２７−２４４８ （１９８９）参照）。このプライマーは、末端部分でハイブリダイズする２番目のプライマーと共役して使われる。増幅は、２つのプライマーから生じ、特定の対立遺伝子型の存在を示すことのできる生成物を生じる。コントロールは、通常プライマーの２つの対により実行される。１対は多型部分の単一塩基が不一致であり、もう１対は末梢部分へ完全に相補性を表す。単一塩基不一致は増幅を阻止し、生成物は全く成形されない。この方法は、不一致が多型に配列したオリゴヌクレオチドの３´−ｍｏｓｔ位に含まれている時、最もよく機能する。それは、この位置がプライマーから伸張し最も不安定であるためである（例えばＷＯ ９３／２２４５６参照）。このＰＣＲベースのアッセイはＴａｑＭａｎアッセイの一部として利用され、下記のように説明される。
【０１６０】
ＳＮＰ検出キット、核酸配列、及び組み込みシステム
本発明にはさらに、図１、２、４、８、及び９において提供されたＳＮＰに基づく、核酸分子の配列又はマイクロ配列、プローブ／プライマーセットなどのＳＮＰ検出キットを提供する。
【０１６１】
本発明の１具体例において、ここで明らかにされた１つ以上のＳＮＰを検出する１回以上のアッセイを実行するために、必要な試薬を含むキットを提供する。本発明は、本発明おけるＳＮＰを分析するマルチ成分組み込みシステムも提供する。
【０１６２】
ＳＮＰ検出キットは１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ、または対のプローブを含むことができ、それは個々のＳＮＰ位置、またはその位置の近くでハイブリダイズする。本発明のＳＮＰの少なくとも１つのＳＮＰを含む多数のＳＮＰを試験するために、複数対の対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドをキットに同時に含むことができる。配列などのいくつかのキットにおいて、対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドが提供され、基質に固定される。例えば、同じ基質は、少なくとも１；１０；１００；１０００；１００００；１０００００；３０００００、又は図１、２、４、８、及び９において示された多型のうちのほぼすべてを検出するための対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。
【０１６３】
特に本発明は、小さく仕切られ、１以上の容器を有するもので、（ａ） 核酸プローブの１つ、例えばここに記述されるＳＮＰ含有ヒトゲノムのフラグメントを結合することのできる対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドを含む第一の容器；及び（ｂ）洗浄剤、又は結合プローブの存在を検出することのできる試薬の１つ以上を含むことのできる１以上の容器を含むコンパートメント化されたキットを提供する。
詳細には、コンパートメント化されたキットは、複数の試薬が入れられる隔離された容器を各キットが有する。そのような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器、プラスチックのストライプ、ガラス又は紙、又はシリカのような配列化材料を含む。このような容器は、１つのコンパートメントから他のコンパートメントに試薬を効率的に移行させ、サンプル及び試薬は相互汚染せず、各容器の試薬又は溶液は一の容器から他の容器へ定量的に添加される。このような容器は、被検サンプルを入れる容器、核酸プローブを入れる容器、洗浄液（リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液など）を入れる容器、結合プローブを検出する試薬を入れる容器を含む。さらにキットは、ＰＣＲ又は他の酵素反応のための試薬、及びキットを使用する使用説明書を含むことができる。当業者は、本発明の未特定ＳＮＰを識別し、ここに記述された配列を用い、定型的に特定することができ、これを周知のキット形式に折り込んで用いることができる。
【０１６４】
さらに本発明により、図２の変異態の１つ以上を含む、図１の配列情報に基づく核酸分子の配列またはマイクロ配列が提供される。
【０１６５】
ここで用いる「配列」又は「マイクロ配列」とは、基板上に合成された別個のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの配列を表し、基板は紙、ナイロン又は他種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス又は他の適当な固形担体である。１つの具体例において、マイクロ配列はＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ ５，８３７，８３２，Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ 出願 ＷＯ９５／１１９９５（Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．），Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１６７５−１６８０）及びＳｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１０６１４−１０６１９）に記載された方法にしたがって調製され且つ使用され、これらは参考としてここに折り込まれる。他の具体例では、このような配列はＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，８０７，５２２に記載される方法により製造される。配列またはマイクロ配列は、一般的に、「ＤＮＡチップ」と表される。
【０１６６】
異なるＳＮＰ位置と一致している個々のプローブまたは対のプローブにおいて、対立遺伝子特定オリゴヌクレオチドなどの多数のオリゴヌクレオチドプローブが配列される。オリヌクレオチドは、基板の特定領域に、光照射化学処理により合成される。基板は、紙、ナイロン又は他種の膜、フィルター、チップ、スライドグラス、又は他の適当な固体担体である。
【０１６７】
オリゴヌクレオチド配列に基づくハイブリダイズアッセイは、短いオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズ安定度において、完全に一致する及び不一致である対象配列変異における相違に依存している。多型情報は、選ばれた位置で固体の担体（例えばチップ）に取り付けられたオリゴヌクレオチドプローブの高密度配列を含む基本的な構造によって、効率的に得られる。個々のＤＮＡチップは、格子状に並び、ダイムサイズへ小型化され、個々の特定ＳＮＰ位置又は対立遺伝子変異と一致し、数千から数百万のＤＮＡプローブを含む。好ましくは、プローブは、アドレス可能な配列において、固体の担体に結び付けられる。
【０１６８】
配列／チップテクノロジーはすでに多くのケースにおいて成功し適用されている。例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子、ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異菌株、及びＨＩＶ−Ｉウイルスのプロテアーゼ遺伝子（Ｈａｃｉａ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６ ； Ｋｏｚａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６） において変異のスクリーニングが行われた。ＳＮＰ検出にて使う変異形チップがカスタマイズされた基質上に製造できる。
【０１６９】
ＳＮＰを検出するのに有用な配列ベースのタイリング計画は、ＥＰ ７８５２８０において説明される。すなわち配列は一般に多くの特定多型に「タイリングされる」。「タイリング」とは、前に選ばれた配列変異態だけでなく、対象配列に相補的な配列により構成されているオリゴヌクレオチドプローブの定義された合成、例えば１つ以上のモノマーベースの１つ以上の与えられた位置の置換、すなわちヌクレオチドを表す。タイリング計画はＰＣＴ出願 Ｎｏ．ＷＯ ９５／１１９９５でさらに説明されている。特定の面において、配列は多くの特定ＳＮＰにタイリングされる。特に、配列は、各検出ブロックが特定ＳＮＰまたはＳＮＰセットに特有の多くの検出ブロックを含むようタイリングされる。例えば、特定ＳＮＰを含む配列セグメントを測定する多くのプローブを含むように、検出ブロックがタイリングされる。個々の対立遺伝子に相補性を表すプローブを得るために、プローブは、ＳＮＰ位置で異なる対において合成される。ＳＮＰ位置で異なるプローブだけでなく、一置換体プローブもまた、一般に検出ブロック内でタイリングされる。この方法は、ここに記述されたＳＮＰ情報にすぐ適用できる。
【０１７０】
これらの一置換体プローブは、ヌクレオチド残基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及びＵから選ばれる）によって置換された多型からの一定数の塩基をどちらの方向にも持つ。一般に、タイリングされた検出ブロックのプローブは、ＳＮＰから５塩基離れた配列位置の置換を含む。一置換体プローブは、実際のハイブリダイズを人為的交雑ハイブリダイズと区別するために、内的コントロールをタイリング配列に行う。対象配列及び配列の洗浄を持つハイブリダイズの完成において、配列は、対象配列がハイブリダイズする配列における位置を決定するよう考察される。走査された配列からのハイブリダイズデーターは、サンプル内の対立遺伝子又はＳＮＰの対立遺伝子の存在を識別するために分析される。ハイブリダイズと走査は、ＰＣＴ出願Ｎｏ．ＷＯ ９２／１００９２、ＷＯ ９５／１１９９５とＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５４２４１８６における説明のように行われる。
【０１７１】
従って、いくつかの具体例において、チップは長さ約１５ヌクレオチドのフラグメントの核酸配列を含む。他の具体例では、チップは、図１、２、８、及び９に記述されているグループから選ばれる少なくとも１つの配列、相補的な配列、フラグメント、少なくとも８つ以上、好ましくは１０、１５、２０、より好ましくは２５、３０、４０、４７、又は５０の連続的なヌクレオチドと多型塩基を含むフラグメントを含む。いくつかの具体例では、多型塩基は、ポリヌクレオチドの中央から、５、４、３、２、又は１のヌクレオチド内にあり、より好ましくは該ポリヌクレオチドの中央にある。他の具体例では、チップは、本発明のポリヌクレオチドをいくつか持つ配列を含む。
【０１７２】
オリゴヌクレオチドは基板上に化学結合処理及びインクジェット処理装置により合成され、これはＰＣＴ 出願 ＷＯ９５／２５１１１６（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）に記載されており、そのすべては参考としてここに折り込まれる。他の例では、「格子化」配列はドット（又はスロット）がｃＤＮＡフラグメント又はオリゴヌクレオチドを、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合処理により基板の表面に配置及び結合する。上記のような配列は、手作業又は適当な機械（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（適当な固体担体のいずれか）及び機械（ロボット化設備）、及び８，２４，９６，３８４，１５３６，６１４４又はそれ以上のオリゴヌクレオチド、又は商業的に用いられる設備の効率的使用となるオリゴヌクレオチドにより製造される。
【０１７３】
このような配列を用い、本発明は、本発明にかかるＳＮＰを特定する方法を提供する。詳細には、このような方法は被検サンプルを１以上の核酸分子と共にインキュベートし、被検サンプル中の成分に核酸分子が結合することをアッセイする。このアッセイは、多くの遺伝子、少なくとも本発明にかかるＳＮＰ及び／又は本発明にかかるＳＮＰの対立遺伝子の１つを含む配列を含む。
【０１７４】
被検サンプルと核酸分子のインキュベーション条件は変化する。インキュベーション条件はアッセイに用いられた形態、採用された検出方法、及びアッセイに用いられた核酸分子の型及び性質に依存する。当業者は、ここに記述されたヒトゲノムの新規なＳＮＰを用いるのに適したように、一般的な適用されるハイブリダイゼーション、増幅、又は配列アッセイ形態を調製することができる。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に記載されている。
【０１７５】
本発明のテストサンプルは、タンパク、核酸抽出物、体液（血、尿、唾液、痰、胃液等）から得られる細胞膜抽出物、培養細胞、生検材料、または他の組織調製物から得ることができるが、これら限定されない。上記の方法により使われたテストサンプルは、アッセイフォーマット、検出方法の性質、およびサンプルとして使用された組織、細胞、抽出物に基づき変異する。核酸、タンパク、または細胞抽出物を用意する方法は、当業者によく知られており、利用された系と互換のサンプルを得るために、すぐに適応できる。
【０１７６】
マルチ成分組み込みシステムは、また、ＳＮＰ分析に使用できる。そのような系は、単一の機能的な装置において、ＰＣＲなどの製法及び毛管状の電気泳動法反応を小型化し、コンパートメント化する。このような技術の例はＵＳ ｐａｔｅｎｔ ５，５８９，１３６に記述されており、ＰＣＲ増幅及びチップの毛管状の電気泳動法を説明している。
【０１７７】
組み込みシステムは主に、マイクロ流体系が使われる時に考察できる。これらの系は、ガラス、ケイ素、石英、またはプラスチック製のウェハーの上に設計されたマイクロチップに含まれるマイクロチャンネル型を含む。サンプルの動きは、動作部なしで機能的な微視的なバルブとポンプを作成するためにマイクロチップの種々の区域に適用された電気、電気浸透、または流体静力によりコントロールされる。電圧を変えることにより、マイクロ機械加工されたチャンネル間の交差における液状の流量をコントロールし、マイクロチップの種々の断面を横切るポンピングの液体流率を変更する。
【０１７８】
ＳＮＰをゲノタイピングするために、マイクロ流体系は、例えば、核酸増幅、小型配列プライマー延長、毛管状の電気泳動法、及びレーザーを引き起こす蛍光検出等の検出方法を合成する。
【０１７９】
最初のステップにおいて、ＤＮＡサンプルは増幅され、好ましくはＰＣＲにより増幅される。そして、増幅生成物は、達成目標とされた多型塩基のすぐ上流にハイブリダイズするｄｄＮＴＰ（個々のｄｄＮＴＰのための特定蛍光）、及び適切なオリゴヌクレオチド小型配列プライマーを使って自動化された小型配列反応に従っている。いったん３´末端の延長が完成されたら、プライマーは、未包含である蛍光性のｄｄＮＴＰから毛管状の電気泳動法により単離される。毛管状の電気泳動法で使われる単離媒体は例えば、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはデキストランとすることができる。単一のヌクレオチドプライマー延長生成物に含まれるｄｄＮＴＰは、レーザー誘導蛍光検出により識別される。このマイクロチップは少なくとも９６から３８４またはそれ以上のサンプルを並行して処理するために使用できる。
【０１８０】
ベクター／宿主細胞
本発明は、ここに記載の核酸分子を含むベクターも提供する。「ベクター」とは、核酸分子を輸送するビヒクル、好ましくは核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子である場合、その核酸分子は共有結合でベクターの核酸と結合されている。本発明のこの見地から、ベクターはプラスミド、１本鎖又は２本鎖のファージ、１本鎖又は２本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベクター、又は人工染色体を含み、例えば、ＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＭＡＣなどが挙げられる。
ベクターは、染色体外成分として宿主細胞中で維持可能であり、そこで核酸分子の別のコピーを複製、生産する。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込み、宿主細胞が複製する際に核酸分子の別のコピーを生産してもよい。
【０１８１】
本発明は、維持のためのベクター（クローニングベクター）又は核酸分子発現のためのベクター（発現ベクター）を提供する。ベクターは、原核細胞又は真核細胞、又はその両者において機能することができる（シャトルベクター）。
発現ベクターは、シス作用性調節領域を含み、該領域は、核酸分子の転写が宿主細胞中でできるように、ベクター中で核酸分子に作動可能に結合されている。核酸分子は、転写に作用することが可能な別の核酸分子と共に宿主細胞に導入することができる。従って、この第２の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写ができるように、シス調節コントロール領域と相互作用するトランス作用性因子を与えてもよい。あるいは、トランス作用性因子は、宿主細胞により供給されてもよい。また、トランス作用性因子は、ベクターそれ自体から生産することもできる。しかしながら、いくつかの実験において、核酸分子の転写及び／又は翻訳は無細胞系で起こり得ることが理解される。
【０１８２】
ここに記載の核酸分子が作動可能に結合している調節配列は、ｍＲＮＡ転写を指示するプロモーターを含む。これは、これらに限定されないが、バクテリオファージλから残ったプロモーター、大腸菌からのｌａｃ、ＴＲＰ、及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期プロモーター、ＣＭＶ即時型プロモーター、アデノウイルス初期及び後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長末端反復を含む。
転写を促進するコントロール部位の他に、発現ベクターは、レプレッサー結合部位やエンハンサーなどの転写調節部位も含んでよい。例として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサーを含む。
【０１８３】
転写の開始及びコントロールのための部位を含む他、発現ベクターは、転写終止に必要な配列を含むことが可能であり、また転写される部位においては、翻訳のためのリボソーム結合部位を含むことも可能である。発現のための他の調節コントロール要素は、ポリアデニル化シグナルと共に、開始及び終止コドンも含む。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調節配列を知っているであろう。このような調節配列は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ， ＮＹ（１９８９）に記載されている。
【０１８４】
多様な発現ベクターを核酸分子の発現に用いることができる。このような発現ベクターは、染色体ベクター、エピソームベクター、ウイルス由来ベクターを含み、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母人工染色体を含む酵母染色体要素由来、バクロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスなどのウイルス由来のベクターが挙げられる。ベクターはプラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素、例えば、コスミド、ファージミドなどに由来するようなこれら起源の組み合わせに由来してもよい。原核及び真核宿主のための適当なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ， ＮＹ（１９８９）に記載されている。
【０１８５】
調節配列は１つ以上の宿主細胞における構成性発現を与えてもよく（すなわち、組織特異的）、又は、温度、栄養添加剤、又はホルモンや別のリガンドのような外因性因子によるような１つ以上の細胞型での誘導性発現を与えてもよい。原核及び真核宿主における構成性発現及び誘導性発現を与える様々なベクターは当業者に良く知られている。
【０１８６】
核酸分子は、周知の方法論により、ベクターの核酸に挿入することができる。一般に、最終的に発現するＤＮＡ配列は、１つ以上の制限酵素によりＤＮＡ配列と発現ベクターを切断し、その後そのフラグメントが互いに連結することにより発現ベクターに結合する。制限酵素の消化及び連結反応の手順は、当業者に良く知られている。
適当な核酸分子を含むベクターは、周知の技術を用い、増殖又は発現に適当な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞は、大腸菌、放線菌、及びネズミチフス菌を含むが、これらに限定されない。真核細胞は、酵母、ショウジョウバエなどの昆虫細胞、ＣＯＳやＣＨＯ細胞などの動物細胞、及び植物細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１８７】
ここに記載のように、融合タンパクとしてペプチドを発現することが望ましいかもしれない。従って、本発明は、ペプチドが生産できる融合ベクターを提供する。融合ベクターは、組換えタンパクの発現を増強し、組換えタンパクの溶解度を向上させ、そして例えばアフィニティー精製のためのリガンドとして作用することによりタンパク精製を助けることができる。タンパク加水分解の切断部位は、融合部分の接合点に導入してもよく、その結果、所望のペプチドを最終的に融合部分から分離することができる。タンパク加水分解酵素は、Ｘａ因子、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。代表的な融合発現ベクターは、ｐＧＥＸ （Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８））、 ｐＭＡＬ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）、及び目的とする組換えタンパクに対してグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク、又はプロテインＡとそれぞれ融合するｐＲＩＴ５ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を含む。
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ （Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５ （１９８８）） 及び ｐＥＴ １１ｄ （Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９ （１９９０））を含む。
【０１８８】
組換えタンパクの発現は、宿主細胞の組換えタンパクをタンパク加水分解的に切断する能力が減じられている遺伝的バックグラウンドを与えることにより、宿主細菌において最大化することができる（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。あるいは、関心のある核酸分子の配列は、大腸菌などの特定の宿主細胞のための優先的コドンの使用（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を提供するように変更することができる（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８ （１９９２））。
【０１８９】
核酸分子は、酵母において作用する発現ベクターにより発現することも可能である。酵母、例えばＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ （Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２２９−２３４ （１９８７））、 ｐＭＦａ （Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、 ｐＪＲＹ８８ （Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３ （１９８７））、 及び ｐＹＥＳ２ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を含む。
【０１９０】
核酸分子は、また、例えばバクロウイルス発現ベクターを用い、昆虫細胞中で発現させることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ ９ 細胞）中でのタンパク発現に有用なバクロウイルスベクターは、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５ （１９８３）） 及び ｐＶＬ系（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９８９））を含む。
本発明のある実施例においては、ここに記載の核酸分子は、ほ乳類の発現ベクターを用い、ほ乳類細胞においてする。ほ乳類発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８ （Ｓｅｅｄ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７）） 及び ｐＭＴ２ＰＣ （Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５ （１９８７））を含む。
【０１９１】
ここに挙げた発現ベクターは、核酸分子を発現するのに有用で当業者が利用可能な周知のベクターのうち、単なる例として提供するものである。当業者は、ここに記載の核酸分子の維持、増殖又は発現に適した他のベクターについて知っているであろう。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に認められる。
【０１９２】
本発明は、ここに記載の核酸配列が逆向きにベクター中にクローン化されてはいるが、アンチセンスＲＮＡの転写を許可する調節配列に作用可能に結合されているベクターも含む。従って、アンチセンス転写物は、コーディング領域及び非コーディング領域の両方を含む、ここに記載の核酸分子配列の全て又は１部に対して生産することができる。このアンチセンスＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現に関する上記各パラメータに従う（調節配列、構成性又は誘導性発現、組織特異的発現）。
【０１９３】
本発明は、また、ここに記載のベクターを含む組換え宿主細胞にも関する。宿主細胞は、従って、原核細胞、酵母のような下等真核細胞、昆虫細胞のような他の真核細胞、及びほ乳類細胞のような高等真核細胞を含む。
組換え宿主細胞は、ここに記載のベクター構成物を当業者が容易に使用可能な技術により細胞に導入することにより作製される。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、リポフェクション、及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）に認められるような他の技術を含むが、これらに限定されない。
【０１９４】
宿主細胞は、１つのベクター以上を含むことができる。従って、異なるヌクレオチド配列を同じ細胞の異なるベクター上に導入することができる。同様に、核酸分子を単独で、又は、発現ベクターのためのトランス作用性因子を提供する核酸分子に無関係な他の核酸分子とともに導入することもできる。１つのベクター以上を細胞に導入する場合、ベクターは独立して導入するか、共に導入するか、又は核酸分子ベクターに結合することができる。
【０１９５】
バクテリオファージ及びウイルス性ベクターの場合、これらは感染及び形質導入の標準的な方法によりパッケージ化ウイルス又はカプセル化ウイルスとして細胞内に導入することができる。ウイルスベクターは、複製能コンピテント又は複製能欠損であることが可能である。ウイルス複製が欠損している場合、複製は欠損を補足する機能を発揮する宿主細胞において起こる。
【０１９６】
ベクターは、一般的に、組換えベクター構成物を含む細胞亜集団が選択できる選択可能マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載の核酸分子を含む同一のベクター中に含まれていてもよく、又は別のベクター上にあってもよい。マーカーは、原核宿主細胞に関するテトラサイクリン抵抗性又はアンピシリン抵抗性遺伝子、及び真核宿主細胞に関するジヒドロ葉酸レダクターゼ抵抗性又はネオマイシン抵抗性を含む。しかしながら、表現型形質を選択する何れのマーカーも効果的であろう。
【０１９７】
成熟タンパクは細菌、酵母、ほ乳類細胞、および他の細胞において適当な調節配列のコントロール下に生産可能であるが、無細胞転写及び翻訳系をここに記載のＤＮＡ構成物に由来するＲＮＡを用いてこれらタンパクを生産するのに使用することも可能である。
ペプチドの分泌が必要な場合には、それはエストロゲンレセプターのようなタンパクを含むマルチトランスメンブランドメインで実行することは難しいが、適当な分泌シグナルをベクター中に加える。シグナル配列は、ペプチドに対して内因性であるか、又はこれらのペプチドに対して異型であることができる。
【０１９８】
そのペプチドを媒体中に分泌しない場合、それはエストロゲンレセプターの代表的なケースであるが、そのタンパクは凍結解凍、音波処理、機械的破砕、溶菌剤の使用等を含む標準的な破砕方法により宿主細胞から単離することができる。ペプチドは、その後、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー等の周知の精製方法により回収、精製することができる。
【０１９９】
ここに記載のペプチドの組換え生産における宿主細胞に依存して、ペプチドは、細胞によっては細菌中で生産する場合のようにグリコシル化されないかもしれないが、様々なグリコシル化パターンを有する可能性があることも理解される。さらに、宿主を媒介したプロセスの結果のような場合には、ペプチドは初期修飾メチオニンを含むかもしれない。
【０２００】
ベクター及び宿主細胞の使用
ここに記載のペプチドを発現する組換え宿主細胞は、様々な用途を有する。まず、その細胞は、エストロゲン受容体タンパクの生産、又は、さらに精製して所望量のエストロゲン受容体タンパクやフラグメントを生産することができるペプチドの生産に有用である。従って、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチド生産に有用である。
【０２０１】
宿主細胞は、また、当該分野で公知のフォーマットと共に前記のようなエストロゲン受容体タンパク又はエストロゲン受容体タンパクフラグメントに関連する細胞ベースアッセイにも有用である。従って、ネイティブエストロゲン受容体タンパクを発現する組換え宿主細胞は、エストロゲン受容体タンパク機能を刺激又は抑制する物質アッセイに有用である。
宿主細胞はまた、その機能に影響があるエストロゲン受容体タンパク突然変異体の特定にも有用である。その突然変異体が自然に発生し、病理を起こすのであれば、その突然変異を含む宿主細胞は、ネイティブエストロゲン受容体タンパクに対しては示さないかもしれない効果であって、エストロゲン受容体タンパク突然変異体に対しては望ましい効果（例えば、刺激機能や抑制機能）を有する化合物の分析に有用である。
【０２０２】
遺伝子工学宿主細胞は、さらに非ヒト形質転換動物の生産に使用することができる。形質転換動物は、好ましくはほ乳類、例えば、ラットやマウスなどの齧歯類であり、その動物の細胞の１つ以上が導入遺伝子を含むものである。導入遺伝子は、形質転換動物が発育した細胞のゲノム中に組み込まれ、その形質転換動物の１つ以上の細胞型又は組織中の成熟動物のゲノム中に残存する外因性ＤＮＡである。これらの動物は、エストロゲン受容体タンパクの機能の研究、ならびにエストロゲン受容体タンパク活性の変調剤の特定及び評価に有用である。形質転換動物の他の例として、非ヒト霊長目動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類を含む。
【０２０３】
形質転換動物は、受精卵母細胞の雄前核中に核酸を導入することにより生産することができる。例えばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染、卵母細胞の疑似妊娠雌養育動物中での発育などにより生産できる。エストロゲン受容体タンパクヌクレオチド配列は何れも、マウスのような非ヒト動物のゲノム中に導入遺伝子として導入することができる。
発現ベクターにおいて有用な調節配列又は他の配列は何れも、形質転換配列の部分を形成することができる。これは、既に含まれていない場合には、イントロン配列及びポリアデニル化シグナルを含む。組織特異的調節配列は、導入遺伝子に作用可能に結合し、特定の細胞に対してエストロゲン受容体タンパクの発現を指示する。
【０２０４】
胚操作（ｅｍｂｒｙｏ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）及びマイクロインジェクションによる形質転換動物の創出方法は、特にマウスのような動物では、当該技術分野において通常行われており、例えば、米国特許公報第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号（共にＬｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許公報第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．）、ならびにＨｏｇａｎ， Ｂ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６）等に記載されている。同様の方法は、他の形質転換動物の生産にも使用される。形質転換の基礎動物は、そのゲノム中の導入遺伝子及び／又はその動物の組織又は細胞中の形質転換ｍＲＮＡの発現に基づき特定することができる。形質転換動物は、その後、導入遺伝子を保有する別の動物を生むのに用いることができる。また、導入遺伝子を保有する形質転換動物は、さらに別の導入遺伝子を保有する別の形質転換動物に改良することができる。形質転換動物はまた、ここに記載の相同組換え宿主細胞を用いて完全な動物又はその動物の組織を生産する動物も含む。
【０２０５】
別の実施例において、形質転換非ヒト動物は、導入遺伝子発現調節ができる選択システムを含み生産することができる。そのようなシステムの一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムに関しては、例えば、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６ （１９９２）を参照。リコンビナーゼシステムの別の例はＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ のＦＬＰリコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５ （１９９１））。ｃｒｅ／ｏｘＰリコンビナーゼシステムを導入遺伝子の発現調節に使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択タンパクの両方をコード化する導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、「複」形質転換動物の構築を通じて、例えば、２つの形質転換動物、すなわち、１つは選択タンパクをコード化する導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコード化する導入遺伝子を含む２つの形質転換動物を交配することにより、得ることができる。
【０２０６】
ここに記載の非ヒト形質転換動物のクローンは、また、Ｗｉｌｍｕｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ （１９９７）ならびにＰＣＴ国際公開公報 ＷＯ ９７／０７６６８及びＷＯ ９７／０７６６９に記載の方法により生産することもできる。簡単に説明すれば、細胞、例えば、体細胞は、成長サイクルからの脱してＧ０期に入るように、形質転換動物から単離、誘導することができる。
休止細胞は、その後、例えばその休止細胞を単離したものと同種の動物からの無核卵母細胞に対して電気パルスを使用することにより、融合することができる。この再構築卵母細胞は、その後、培養して桑実胚又は尾胞に発達し、疑似妊娠雌養育動物にトランスファーする。この雌養育動物の子は、その細胞、例えば体細胞を単離した動物からのクローンであろう。
【０２０７】
ここに記載のペプチドを発現する組換え細胞を含む形質転換動物は、ここに記載のアッセイをｉｎ ｖｉｖｏ状況下で行うのに有用である。ｉｎ ｖｉｖｏで存在し、リガンド結合、エストロゲン受容体タンパク活性化、及びシグナル形質導入を果たすことができる様々な生理的因子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞分析又は細胞ベース分析から明らかでないかもしれない。従って、非ヒト形質転換動物の提供は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるエストロゲン受容体タンパク機能、例えば、リガンド相互作用、エストロゲン受容体タンパク機能に対する特異的突然変異エストロゲン受容体タンパクの影響、ならびにキメラエストロゲン受容体タンパクの影響を含む機能の分析に有用である。また、ヌル突然変異、すなわち、実質的に又は完全に１つ以上のエストロゲン受容体タンパク機能を除去する突然変異の影響を評価することもできる。
【０２０８】
【実施例】
１． ＳＮＰの特定及び評価
エキソンの各隣接配列（エキソン／イントロン境界）にフランキングするプライマーを用いて、エストロゲン受容体アルファ（ＥＳＲ１）の各エキソンをＰＣＲ増幅し、増幅フラグメントの配列を分析した。ＰＣＲ鋳型として、コリエール多様パネル（５民族群の各１０名）からのゲノムＤＮＡ（図２（ｂ）参照）、及び／又は４８名の患者からのリバプール臨床胸部腫瘍及び対応する血液サンプル（英国リバプールで得た組織より。図２（ａ）参照）を使用した。ＰｏｌｙＰｈｒｅｄ バーション２．０（Ｄ． Ａ． Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ， Ｓ． Ｔａｙｌｏｒ， Ｎ． Ｋｏｌｋｅｒ， Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， １９９８）を配列において（デフォルトセッティングで）実行し、潜在的な異型接合体を可視化した。標識部位の特性が試験され、多型性を確認した。
【０２０９】
頻度２以上、特性スコア２０以上の３６個のＳＮＰが、臨床サンプルに特有な１３で判明した。１５個のＳＮＰは、臨床サンプルの異型接合性における少なくとも１つの変化例を示し、４個のＳＮＰは、異型接合性における少なくとも１つの欠損例を示した。分析には、ＳＮＰ特定及び検出のためにＰＣＲプライマーを使用した（図２（ｅ）参照）。
さらに、図２（ｄ）のプライマーセット及びＭ１３プライマーをオーバーラッピングＰＣＲ及びクローンシーケンシングに使用した。
【０２１０】
【表１】
臨床サンプル中で判明したＳＮＰの要約：全ＳＮＰは、頻度２以上、特性スコア２０以上であった（図８参照）。
2004531228.tif 000003
【０２１１】
【表２】
臨床サンプルにおける異型接合体の変化の要約：ＳＮＰは頻度２以上、特性スコア２０以上であった（図８参照）。
2004531228.tif 000004
【０２１２】
図２（ｃ）は、リバプールコントロール群対血液又は腫瘍群における分析ＳＮＰを含んだ。
図５は、ＥＳＲ１タンパクのドメイン構造及びここに開示された多くのＳＮＰ位置を示す。図６は、被験サンプル中のＳＮＰ及び発生頻度のグラフ図である。
図８（ａ）（１）は、北欧州人、中国人、インド−パキスタン人、アフリカ系アメリカ人、及び南西部ネイティブアメリカ人の民族グループから集めたコリエールサンプル中のＳＮＰ及び発生頻度を示す。３’フランキングエキソン８において、ＳＮＰの位置は、遺伝子バンクにあるＡＬ０７８５８２の配列に基づく。結果は、特定の民族グループ間での検出のために使用可能である。図８（ａ）（２）は、コリエールパネル中の部位１６７９８９（イントロン１Ｄ，＃９）のＳＮＰのゲノタイピングを示す。このパネルは、１００名のコーカサス人を含み、５１名は男性で、４９名は女性である。結果は、マイナー対立遺伝子の頻度が９％であることを示す。
【０２１３】
図８（ｂ）（１）は、北欧人からの血液サンプル及び乳ガンサンプルのグループから選択したリバプールサンプルにおけるＳＮＰ及び発生頻度を示す。
図８（ｂ）（２）は、追加のリバプール患者６０名中のＳＮＰ部位１６７，９８９（イントロン１Ｄ，＃９）のタックヒトゲノタイピング（Ｔａｑ Ｍａｎ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）の結果を示す。この結果は、マイナー対立遺伝子（Ｇ）の頻度が血液中１４％、腫瘍中１０％であったことを示す。これは、図８（ｂ）（１）に示されるコリエールサンプルのＳＮＰゲノタイピングと同様であり、マイナー対立遺伝子での頻度は血液中１６％、腫瘍中１７％であった。リバプールコントロール群（９５のケース）は、マイナー対立遺伝子での頻度は１０．５％であったことを示す（図２（ｃ））。
【０２１４】
２．ハプロタイプ分析
ＳＮＰ発見のために開発された方法は、ハプロタイプデータを得るよう設計された。ＳＮＰは、特定のハプロタイプに関連させることが可能であった。サンプルｃＤＮＡは、未知の比率で存在するランダム群から得た。特定のクローンからのＳＮＰはハプロタイプ中にクラスター化され、作られた。
【０２１５】
データは、２つのサンプルタイプからなる（図４（ａ）及び（ｂ））。リバプールサンプルは、４８名の患者からのものであり、各患者は腫瘍及び対応する血液サンプルを有した。コリエールサンプルは、コントロールであったが、それらは対応するコントロールではなかった。むしろ、それらは、欧州人、中国人、インド−パキスタン人、及びアフリカ系アメリカ人の混合に含まれた。ＥＳＲ１における４６のＳＮＰは、リバプールサンプルにおいて記録された。同じ４６のＳＮＰと、ＲＳＲ１遺伝子の３’の追加の６のＳＮＰが、コリエールサンプルにおいて記録された。
【０２１６】
これらのデータは個体の最も適当なハプロタイプフェーズを推測するための分析に供した。その結果は、図４（ａ）に示されているが、各ハプロタイプはナンバーを有し、ダッシュのついたナンバーはそのハプロタイプのカウント（又は頻度）である。
図４（ｂ）は、近接接合樹形図に適合させた非単独ハプロタイプデータである。樹形図が矢印のところで切断されている場合には、３Ｌ， １０−４， …７３Ｌを含む分岐は樹形図の残部から「分岐Ｘ」として区画される。下記に分岐Ｘ対樹形図残部のハプロタイプにおける腫瘍発生率の違いを示す。各ハプロタイプの発生率は、まずダッシュのついたナンバーを足すことによりカウントした。Ｌは腫瘍性リバプールサンプルを示し、Ｌはコリエールコントロールを示す。
【０２１７】
2004531228.tif 000005
Ｘ２は、２×２の表に基づき０．０００１より小さな確率を有する自由度で、２１．２９と計算された。従って、ＥＲ１遺伝子の分岐Ｘは、腫瘍に関連するより多くの機会を有する。この全分岐は、世界の他の場所では大変まれである。欧州人の間でさえ、２０のハプロタイプからたった１つしか存在しなかった。
【０２１８】
コリエールコントロール、リバプールコントロール、リバプール腫瘍サンプルの間の大きな頻度差で分岐を特定した部位は以下の通り。
2004531228.tif 000006
【０２１９】
３．エストロゲン受容体１のプロモーター領域及びＳＮＰ
ＣＡＡＴ及びＴＡＴＡのボックスは配列の最初の２００ ｂ．ｐ．にあり、これらの距離は、基礎プロモーターとして機能的であるかもしれないと考えられる。
ＣＡＡＴ−ＴＡＴＡ部位間の距離及び実際に特定された転写の開始は、約３００ ｂ．ｐ．であり（通常は約２０−４０ ｂ．ｐ．）、この領域はＮＦＡＴ， ＮＦＫＢ， ＳＰ１−ファミリー， ＣＥＢＰ 及び ＥＢＯＸ等のマルチプルＴＦ領域を含む。これらの大部分は特異の（組織、細胞型）の発現の調節に関係した。
【０２２０】
Ｔ（ＳＮＰ）の領域は、興味深い性質を有する。それは維持（ＴＣ）６−繰り返しを有するだけでなく、５−プライムに（ＣＡ）６も有する。維持モチーフは同じ領域のＣＡＣＡＹＴＣＴＣである。公知のＴＦ部位からこの領域に顕著に合うものはなく、それは新規なＴＦ部位のようである。Ｔ（ＳＮＰ）に大変近いのはアリール炭化水素／Ａｒｎｔヘテロ二量体に関するＡＨＲＡＲＮＴ＿０２と呼ばれるＴＦ部位である。ＣＡＣＡＹＴＣＴＣ部位は、コファクターの結合点か、Ａｒｎｔ複合体を正しく配置するのを助けるものである。ＴＦ結合部位における単独の突然変異は、タンパク結合の親和性を数倍低下させ、疾患経路に導くかもしれない。
【０２２１】
本発明において、ＳＮＰはちょうど、短いＧＡの繰り返し（ＧＡＧＡＧＡＧＡ）中のエキソン１Ｃの１３ｂｐ上流に起こる。分岐（図４）中の関連ＳＮＰのうち、３つはサイレント突然変異であり、１つは３’ＵＴＲ中にあり、残りはイントロン領域中にある。
重要なＴからＧのＳＮＰ（＃９）は、プロモーター領域のサイト１６７９８９（イントロン１Ｄ）中にある（図２（ａ），（ｂ），（ｃ））。遺伝子コピーの欠損は、ガンの危険性に関連する。遺伝子発現を減じるプロモーター突然変異は、同様の影響を及ぼす。
【０２２２】
ＧからＴのトランスバージョンは、交互のプロモーター部位中にある。エストロゲン生理学、おそらくは核でのシグナル伝達の全体的なレベルに対してある効果がある。関連した分岐（及び分岐のハプロタイプ）（図４）の「効果」は、全体的なエストロゲン受容体感受性及び反応性を増加させること、又はそのサイクルが非調節（非生理学的）成長シグナルの方向である別の成長過程の方に誘導可能なことであると予測される。エストロゲンの露出は、事実すべての疫学的研究において乳ガンの原因に重大な役割を果たす。
【０２２３】
さらに、ＴＦ結合部位とＳＮＰは、下記のように、５のＳＮＰが転写結合部位に生じたＥＳＲ１遺伝子中に検出された。
2004531228.tif 000007
【０２２４】
４．ＥＳＲ１ ゲノム配列決定−エストロゲン受容体アルファの完全ゲノム構造
エストロゲン受容体（ＥＲ）は、核ホルモン受容体遺伝子スーパーファミリーの１つである。この遺伝子のファミリーは、３つの別個のドメイン、すなわち、変異（Ｎ）−末端ドメイン、高度維持ＤＮＡ結合ドメイン及び維持（Ｃ）−末端ドメインのモジュラー構造を特徴とする（参考文献１，２参照）。機能的には、（Ｎ）−末端ドメインはトランス活性化を、ＤＮＡ結合ドメインは二量体化及びＤＮＡ結合を、（Ｃ）−末端ドメインはトランス活性化、二量化、リガンド結合、核トランスロケーション、サイレンシング、及び熱ショックタンパク結合を、それぞれ調節する。核ホルモン遺伝子スーパーファミリーの各ドメインの機能は、それらが見つかる受容体に無関係で、ドメインは異なる異型タンパク中に位置する場合であっても、その機能を保有する（参考文献３、４、５参照）。これら遺伝子の主なサブファミリーは、進化の初期に単純な遺伝子複製を通じて進化したので、核ホルモン受容体遺伝子スーパーファミリーのドメインモジュール性が存在する（参考文献６）。核ホルモン受容体遺伝子ファミリーは、２つの異なる分類スキームに従って分離することができる。一方はホルモン結合に基づき、他方は二量化と、受容体のＤＮＡ応答エレメントへの結合方法に基づく（参考文献２参照）。
【０２２５】
ＥＲαのｃＤＮＡは、まず、ＭＣＦ−７乳ガン細胞系列からクローン化及びシークエンスし、ｖ−ｅｒｂ−Ａ 遺伝子に対して２７％の同一性と４１％の保存性を有することが判明した（参考文献７）。ＥＲαは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及び染色体結合を用いて染色体６ｑ２５．１にマップした（参考文献８）。１９９６年に、新規なエストロゲン受容体（ＥＲβ）が縮重ＰＣＲにより特定され（参考文献９）、ＦＩＳＨにより１４ｑ２２−２４にマップされた（参考文献１０）。ＥＲα及びＥＲβは、ＤＮＡ結合ドメイン中９６％の配列同一性と、リガンド結合ドメイン中５８％の同一性を有し、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）（ドメインＤ）と同様に５’及び３’末端においては同一性が低いことが示された。様々なＥＲα及びＥＲβ変異体は、これまで単一及び複数のエキソン欠損、切断転写、及び挿入を含む転写物を含め記載されてきた（参考文献１１，１２，１３）。これらの変異体は、正常組織、腫瘍組織及び細胞系列を含む様々な起源から単離された。乳ガン患者の腫瘍のＥＲ状態は、内分泌療法に対する応答のインジケータとして用いられ（参考文献１４，１５）、多くの研究により乳ガン腫瘍の進行、ＥＲ−ネガティブ状態、及びホルモンアンタゴニスト抵抗性におけるＥＲの役割が検討されてきた（参考文献１６参照）。
【０２２６】
ＥＲ遺伝子の重要性から、我々はその全体をクローン化し、その完全な構造を決定しようとした。初めに、標準細菌人工染色体（ＢＡＣ）配列決定を用いて遺伝子のコーディング領域の配列情報を発生させた。セレーラのヒトゲノム配列決定が進行したとき、ＥＲの残存領域はセレーラレジオンアセンブリを用いて埋められた。２５ｋｂより小さな領域は、公知のＢＡＣ（Ａｌ３５３６１１．６， ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ １，４９７−２５，９４１）を用いてＥＲα上に埋められた。
【０２２７】
材料及び方法
１）ＢＡＣスクリーニング
適当なマーカーがＥＲα及びＥＲβエキソンに設計され、リサーチジェネティクス（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ）から市販のＢＡＣクローンを得るために用いられた。いくつかのポジティブＢＡＣを選び、それぞれのクローンを確認のために再スクリーニングした。
【０２２８】
２）ＤＮＡの単離及びライブラリーの作製
ＢＡＣのＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮカラム（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ） を用い、メーカー仕様書に従って、確認したクローンから単離した。ショットガンライブラリーは、標準プロトコルに従い作製した（参考文献１７）。簡単に説明すると、単離したＢＡＣのＤＮＡを音波処理、ポリッシュ、及びサイズ分画した。サイズを選択したＤＮＡフラグメントは、その後標準の連結反応技術を用いてｐＵＣ１９中にサブクローン化した。連結したＤＮＡは、エレクトロコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）中にトランスフォームし、一晩成長させた。
【０２２９】
３）ＤＮＡ配列決定及び注釈
配列決定反応は、ビッグダイターミネーターケミストリー（Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて実行し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡアナライザー （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。Ｐｈｒｅｄ （参考文献１８）， Ｐｈｒａｐ 及び Ｃｏｎｓｅｄ （参考文献１９）は塩基呼び出し、アセンブリ及びフィニシングにぞれぞれ使用した。エキソン位置は、クロスマッチを用いて決定し、公表された遺伝子配列をゲノムのコンティグと比較した。
【０２３０】
結果
１．エストロゲン受容体アルファ
ＥＲαのゲノム配列及びＥＲαの公表されたｍＲＮＡ配列のアライメントは、その遺伝子が１４エキソンからなり、４４６，２９６ ｂｐのゲノム配列をカバーすることを示す （図７，表３）。
２． エストロゲン受容体ベータ
ＥＲβのゲノム配列及びＥＲβの公表されたｍＲＮＡ配列のアライメントは、その遺伝子が１７エキソンからなり、２５３，７４８ ｂｐのゲノム配列をカバーすることを示す（図２，表１）。セレーラゲノムブラウザでの分析により、遺伝子、ヒトシナプス核発現遺伝子２（ｓｙｎｅ−２， ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿０１５１８０．１）、を特定することができた。それは、反対の鎖上でＥＲβのイントロン９内に完全に含まれる。ｓｙｎｅ−２遺伝子のさらなる分析により、それは２１エキソンからなり、５１，４７１ ｂｐのゲノム配列をカバーすることが示された。
【０２３１】
考察
完全なＥＲαゲノム配列と様々なＥＲβ転写物のアライメントは、遺伝子が４４６，２９６ ｂｐのゲノム配列をカバーし、１４エキソンからなることを示す。エキソン１Ｅ（ＡＪ００２５６１） （参考文献２０）の公表配列とＥＲαゲノム配列のアライメントは、エキソン１Ｅが実際には２つの別のエキソンからなることを明らかにした。新しく示されたエキソンは、これまでに確立された命名規約に従い、ここではエキソン１Ｇという。エキソン１Ｇは、エキソン１Ｅの約４５ ｋｂ上流に位置し、ＧＴ／ＡＧ スプラス部位共通配列に一致する（図１，表１）。
【０２３２】
完全なＥＲβゲノム配列に対する様々なＥＲβ転写物のアライメントは、これまで受け入れられていたよりも複雑な体制を示す（参考文献１３）。ＥＲβｃｘ変異体（ＡＢ００６５８９）の５’ＵＴＲは実際には７つの非翻訳エキソン（ここではエキソン−１〜−７という）からなり、これらは全て、ＧＴ／ＡＧスプライス部位共通配列に一致する（図２，表１）。ＥＲβ変異体 ＡＦ０６１０５５及びＡＦ０６１０５４（参考文献１２）の配列アライメントは、これらの転写物が両方ともイントロン配列を含み、おそらく部分的に成熟した転写物であることを示した。これらの部分的成熟転写物は両方ともエキソン７と、エキソン９の一部を含むが、イントロン配列が存在する部位のスプライス部位共通配列には一致していない。
【０２３３】
セレーラゲノムブラウザを用いてＥＲゲノム配列を調べることにより、ＥＲβのイントロン９内に完全に含まれた分離遺伝子を特定することができた。この遺伝子は、ヒトシナプス核発現遺伝子２（ｓｙｎｅ−２）であり、５０Ｋｂのゲノム配列をカバーし、２１のエキソンからなることが示された。これらは全てＧＴ／ＡＧスプライス共通配列に一致する（表４）。ｓｙｎｅ−２遺伝子は、ＥＲβのアンチセンス鎖上に位置する。
ＥＲα及びＥＲβの配列及び構造の完成は、これらの重要な受容体のさらなる理解と特徴づけに寄与する。
【０２３４】
【表３】
ヒトエストロゲン受容体におけるエキソン−イントロン境界及び位置：
エキソン配列は大文字、イントロン配列は小文字、スプライス部位は太字で示す。
2004531228.tif 000008
【０２３５】
【表４】
ヒトシナプス核発現遺伝子２におけるエキソン−イントロン境界及び位置：
エキソン配列は大文字、イントロン配列は小文字、スプライス部位は太字で示す。
2004531228.tif 000009
【０２３６】
参考文献
１． Ｒｉｂｅｉｒｏ ＲＣ， Ｋｕｓｈｎｅｒ ＰＪ， Ｂａｘｔｅｒ ＪＤ， Ｔｅｎｂａｕｍ Ｓ， Ｂａｎｉａｈｍａｄ Ａ． Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．  Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ １９９５；４６：４４３−５３．
２． Ｔｅｎｂａｕｍ Ｓ， Ｂａｎｉａｈｍａｄ Ａ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９７ Ｄｅｃ；２９（１２）：１３２５−４１．
３． Ｂａｎｉａｈｍａｄ Ｃ， Ｂａｎｉａｈｍａｄ Ａ， Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ ＢＷ．  Ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． １９９４ Ｆｅｂ；１６（２）：１９４−６．
４． Ｐａｒｋｅｒ ＭＧ， Ｗｈｉｔｅ Ｒ． Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｓｐｒｉｎｇ ｉｎｔｏ ａｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． １９９６ Ｆｅｂ；３（２）：１１３−５．
５． Ｓｃｈｗａｂｅ ＪＷ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ： ｈｏｗ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｇｅｔ ｔｕｒｎｅｄ ｏｎ．  Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． １９９６ Ａｐｒ １；６（４）：３７２−４．
【０２３７】
６． Ｌａｕｄｅｔ Ｖ， Ｈａｎｎｉ Ｃ， Ｃｏｌｌ Ｊ， Ｃａｔｚｅｆｌｉｓ Ｆ， Ｓｔｅｈｅｌｉｎ Ｄ． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ． ＥＭＢＯ Ｊ． １９９２ Ｍａｒ；１１（３）：１００３−１３．
７． Ｇｒｅｅｎ Ｓ， Ｗａｌｔｅｒ Ｐ， Ｋｕｍａｒ Ｖ， Ｋｒｕｓｔ Ａ， Ｂｏｒｎｅｒｔ ＪＭ， Ａｒｇｏｓ Ｐ， Ｃｈａｍｂｏｎ Ｐ． Ｈｕｍａｎ ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃＤＮＡ： ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｖ−ｅｒｂ−Ａ．  Ｎａｔｕｒｅ． １９８６ Ｍａｒ １３−１９；３２０（６０５８）：１３４−９．
８． Ｍｅｎａｓｃｅ ＬＰ， Ｗｈｉｔｅ ＧＲ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＣＪ， Ｂｏｙｌｅ ＪＭ．  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｏｃｕｓ （ＥＳＲ） ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ６ｑ２５．１ ｂｙ ＦＩＳＨ ａｎｄ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｐｏｓｔ−ＦＩＳＨ ｂａｎｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９３ Ｊｕｌ；１７（１）：２６３−５．
９． Ｍｏｓｓｅｌｍａｎ Ｓ， Ｐｏｌｍａｎ Ｊ， Ｄｉｊｋｅｍａ Ｒ． ＥＲ ｂｅｔａ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９６ Ａｕｇ １９；３９２（１）：４９−５３．
１０． Ｅｎｍａｒｋ Ｅ， Ｐｅｌｔｏ−Ｈｕｉｋｋｏ Ｍ， Ｇｒａｎｄｉｅｎ Ｋ， Ｌａｇｅｒｃｒａｎｔｚ Ｓ， Ｌａｇｅｒｃｒａｎｔｚ Ｊ， Ｆｒｉｅｄ Ｇ， Ｎｏｒｄｅｎｓｋｊｏｌｄ Ｍ， Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ＪＡ．  Ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ−ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ．  Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ． １９９７ Ｄｅｃ；８２（１２）：４２５８−６５．
【０２３８】
１１． Ｍｕｒｐｈｙ ＬＣ， Ｄｏｔｚｌａｗ Ｈ， Ｌｅｙｇｕｅ Ｅ， Ｄｏｕｇｌａｓ Ｄ， Ｃｏｕｔｔｓ Ａ， Ｗａｔｓｏｎ ＰＨ． Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９７ Ａｕｇ；６２（５−６）：３６３−７２．
１２． Ｍｏｏｒｅ ＪＴ， ＭｃＫｅｅ ＤＤ， Ｓｌｅｎｔｚ−Ｋｅｓｌｅｒ Ｋ， Ｍｏｏｒｅ ＬＢ， Ｊｏｎｅｓ ＳＡ， Ｈｏｒｎｅ ＥＬ， Ｓｕ ＪＬ， Ｋｌｉｅｗｅｒ ＳＡ， Ｌｅｈｍａｎｎ ＪＭ， Ｗｉｌｌｓｏｎ ＴＭ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ｉｓｏｆｏｒｍｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． １９９８ Ｊｕｎ ９；２４７（１）：７５−８．
１３． Ｏｇａｗａ Ｓ， Ｉｎｏｕｅ Ｓ， Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ， Ｏｒｉｍｏ Ａ， Ｈｏｓｏｉ Ｔ， Ｏｕｃｈｉ Ｙ， Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｍ．   Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａｃｘ： ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８ Ａｕｇ １；２６（１５）：３５０５−１２．
１４． Ｏｓｂｏｒｎｅ ＣＫ， Ｙｏｃｈｍｏｗｉｔｚ ＭＧ， Ｋｎｉｇｈｔ ＷＡ ３ｄ， ＭｃＧｕｉｒｅ ＷＬ． Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ １９８０ Ｄｅｃ １５；４６（１２ Ｓｕｐｐｌ）：２８８４−８．
１５． ＤｅＳｏｍｂｒｅ ＥＲ， Ｃａｒｂｏｎｅ ＰＰ， Ｊｅｎｓｅｎ ＥＶ， ＭｃＧｕｉｒｅ ＷＬ， Ｗｅｌｌｓ ＳＡ Ｊｒ， Ｗｉｔｔｌｉｆｆ ＪＬ， Ｌｉｐｓｅｔｔ Ｍ Ｓｐｅｃｉａｌ ｒｅｐｏｒｔ． Ｓｔｅｒｉｏｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９７９ Ｎｏｖ １；３０１（１８）：１０１１−２．
【０２３９】
１６． Ｐａｒｌ， Ｆｒｉｔｚ Ｆ．， Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ， Ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ａｎｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ． ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ， ２０００．
１７． Ｂｉｒｒｅｎ Ｂ， Ｇｒｅｅｎ ＥＤ， Ｋｌａｐｈｏｌｚ Ｓ， Ｍｙｅｒｓ， Ｒ， Ｒｉｅｔｈｍａｎ Ｈ， Ｒｏｓｋａｍｓ Ｊ， （ｅｄｓ．） （１９９７）， Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．  Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．
１８． Ｅｗｉｎｇ Ｂ， Ｈｉｌｌｉｅｒ Ｌ， Ｗｅｎｄｌ ＭＣ， Ｇｒｅｅｎ Ｐ． Ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｔｒａｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈｒｅｄ． Ｉ． Ａｃｃｕｒａｃｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９８ Ｍａｒ；８（３）：１７５−８５．
１９． Ｇｏｒｄｏｎ Ｄ， Ａｂａｊｉａｎ Ｃ， Ｇｒｅｅｎ Ｐ． Ｃｏｎｓｅｄ： ａ ｇｒａｐｈｉｃａｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９８ Ｍａｒ；８（３）：１９５−２０２．
２０． Ｆｌｏｕｒｉｏｔ Ｇ， Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｃ， Ｋｅｎｅａｌｙ Ｍ， Ｓｏｎｎｔａｇ−Ｂｕｃｋ Ｖ， Ｇａｎｎｏｎ Ｆ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｇｅｎｅ ａｒｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｕｓａｇｅ．  Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９８ Ｄｅｃ；１２（１２）：１９３９−５４．
【０２４０】
上記明細書に記載の全ての出版物及び特許はここに織り込まれるものである。本発明に記載の方法及びシステムの様々な修飾及び変更は本発明の範囲ならびに精神を外れない範囲で当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい実施例に関連して記載しているが、クレームされた本発明はこのような特定の実施例に不当に限定されないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学及び関連する分野の当業者に自明な、前記本発明の実施態様の様々な修飾はクレームの範囲内である。
【配列表】
2004531228.tif 000010
2004531228.tif 000011
2004531228.tif 000012
2004531228.tif 000013
2004531228.tif 000014
2004531228.tif 000015
2004531228.tif 000016
2004531228.tif 000017
2004531228.tif 000018
2004531228.tif 000019
2004531228.tif 000020
2004531228.tif 000021
2004531228.tif 000022
2004531228.tif 000023
2004531228.tif 000024
2004531228.tif 000025
2004531228.tif 000026
2004531228.tif 000027
2004531228.tif 000028
2004531228.tif 000029
2004531228.tif 000030
2004531228.tif 000031
2004531228.tif 000032
2004531228.tif 000033
2004531228.tif 000034
2004531228.tif 000035
2004531228.tif 000036
2004531228.tif 000037
2004531228.tif 000038
2004531228.tif 000039
2004531228.tif 000040
2004531228.tif 000041
2004531228.tif 000042
2004531228.tif 000043
2004531228.tif 000044
2004531228.tif 000045
2004531228.tif 000046
2004531228.tif 000047
2004531228.tif 000048
2004531228.tif 000049
2004531228.tif 000050
2004531228.tif 000051
2004531228.tif 000052
2004531228.tif 000053
2004531228.tif 000054
2004531228.tif 000055
2004531228.tif 000056
2004531228.tif 000057
2004531228.tif 000058
2004531228.tif 000059
2004531228.tif 000060
2004531228.tif 000061
2004531228.tif 000062
2004531228.tif 000063
2004531228.tif 000064
2004531228.tif 000065
2004531228.tif 000066
2004531228.tif 000067
2004531228.tif 000068
2004531228.tif 000069
2004531228.tif 000070
2004531228.tif 000071
2004531228.tif 000072
2004531228.tif 000073
2004531228.tif 000074
2004531228.tif 000075
2004531228.tif 000076
2004531228.tif 000077
2004531228.tif 000078
2004531228.tif 000079
2004531228.tif 000080
2004531228.tif 000081
2004531228.tif 000082
2004531228.tif 000083
2004531228.tif 000084
2004531228.tif 000085
2004531228.tif 000086
2004531228.tif 000087
2004531228.tif 000088
2004531228.tif 000089
2004531228.tif 000090
2004531228.tif 000091
2004531228.tif 000092
2004531228.tif 000093
2004531228.tif 000094
2004531228.tif 000095
2004531228.tif 000096
2004531228.tif 000097
2004531228.tif 000098
2004531228.tif 000099
2004531228.tif 000100
2004531228.tif 000101
2004531228.tif 000102
2004531228.tif 000103
2004531228.tif 000104
2004531228.tif 000105
2004531228.tif 000106
2004531228.tif 000107
2004531228.tif 000108
2004531228.tif 000109
2004531228.tif 000110
2004531228.tif 000111
2004531228.tif 000112
2004531228.tif 000113
2004531228.tif 000114
2004531228.tif 000115
2004531228.tif 000116
2004531228.tif 000117
2004531228.tif 000118
2004531228.tif 000119
2004531228.tif 000120
2004531228.tif 000121
2004531228.tif 000122
2004531228.tif 000123
2004531228.tif 000124
2004531228.tif 000125
2004531228.tif 000126
2004531228.tif 000127
2004531228.tif 000128
2004531228.tif 000129
2004531228.tif 000130
2004531228.tif 000131
2004531228.tif 000132
2004531228.tif 000133
2004531228.tif 000134
2004531228.tif 000135
2004531228.tif 000136
2004531228.tif 000137
2004531228.tif 000138
2004531228.tif 000139
2004531228.tif 000140
2004531228.tif 000141
2004531228.tif 000142
2004531228.tif 000143
2004531228.tif 000144
2004531228.tif 000145
2004531228.tif 000146
2004531228.tif 000147
2004531228.tif 000148
2004531228.tif 000149
2004531228.tif 000150
2004531228.tif 000151
2004531228.tif 000152
2004531228.tif 000153
2004531228.tif 000154
2004531228.tif 000155
2004531228.tif 000156
2004531228.tif 000157
2004531228.tif 000158
2004531228.tif 000159
2004531228.tif 000160
2004531228.tif 000161
2004531228.tif 000162
2004531228.tif 000163
2004531228.tif 000164
2004531228.tif 000165
2004531228.tif 000166
2004531228.tif 000167
2004531228.tif 000168
2004531228.tif 000169
2004531228.tif 000170
2004531228.tif 000171
2004531228.tif 000172
2004531228.tif 000173
2004531228.tif 000174
2004531228.tif 000175
2004531228.tif 000176
2004531228.tif 000177
2004531228.tif 000178
2004531228.tif 000179
2004531228.tif 000180
2004531228.tif 000181
2004531228.tif 000182
2004531228.tif 000183
2004531228.tif 000184
2004531228.tif 000185
2004531228.tif 000186
2004531228.tif 000187
2004531228.tif 000188
2004531228.tif 000189
2004531228.tif 000190
2004531228.tif 000191
2004531228.tif 000192
2004531228.tif 000193
2004531228.tif 000194
2004531228.tif 000195
2004531228.tif 000196
2004531228.tif 000197
2004531228.tif 000198
2004531228.tif 000199
2004531228.tif 000200
2004531228.tif 000201
2004531228.tif 000202
2004531228.tif 000203
2004531228.tif 000204
2004531228.tif 000205
2004531228.tif 000206
2004531228.tif 000207
2004531228.tif 000208
2004531228.tif 000209
2004531228.tif 000210
2004531228.tif 000211
2004531228.tif 000212
2004531228.tif 000213
2004531228.tif 000214
2004531228.tif 000215
2004531228.tif 000216
2004531228.tif 000217
2004531228.tif 000218
2004531228.tif 000219
2004531228.tif 000220
2004531228.tif 000221
2004531228.tif 000222
2004531228.tif 000223
2004531228.tif 000224
2004531228.tif 000225
2004531228.tif 000226
2004531228.tif 000227
2004531228.tif 000228
2004531228.tif 000229
2004531228.tif 000230
2004531228.tif 000231
2004531228.tif 000232
2004531228.tif 000233
2004531228.tif 000234
2004531228.tif 000235
2004531228.tif 000236
2004531228.tif 000237
2004531228.tif 000238
2004531228.tif 000239
2004531228.tif 000240
2004531228.tif 000241
2004531228.tif 000242
2004531228.tif 000243
2004531228.tif 000244
2004531228.tif 000245
2004531228.tif 000246
2004531228.tif 000247
2004531228.tif 000248
2004531228.tif 000249
2004531228.tif 000250
2004531228.tif 000251
2004531228.tif 000252
2004531228.tif 000253
2004531228.tif 000254
2004531228.tif 000255
2004531228.tif 000256
2004531228.tif 000257
2004531228.tif 000258
2004531228.tif 000259
2004531228.tif 000260
2004531228.tif 000261
2004531228.tif 000262
2004531228.tif 000263
2004531228.tif 000264
2004531228.tif 000265
2004531228.tif 000266
2004531228.tif 000267
2004531228.tif 000268
2004531228.tif 000269
2004531228.tif 000270
2004531228.tif 000271
2004531228.tif 000272
2004531228.tif 000273
2004531228.tif 000274
2004531228.tif 000275
2004531228.tif 000276
2004531228.tif 000277
2004531228.tif 000278
2004531228.tif 000279
2004531228.tif 000280
2004531228.tif 000281
【図面の簡単な説明】
【図１】エストロゲン受容体アルファ遺伝子の完全ゲノム配列。
【図２】エストロゲン受容体アルファゲノムＤＮＡに見出される配列多型（ヌクレオチドの位置は図１で与えられる配列に基づく）。
（ａ）リバプール臨床組織サンプル中のＳＮＰ
（ｂ）コリエール多様性パネル中のＳＮＰ
（ｃ）リバプールコントロール母集団中のＳＮＰ
（ｄ）ＰＣＲプライマー
（ｅ）シークエンシングプライマー
【図３】エストロゲン受容体アルファタンパクのアミノ酸配列。
【図４】エストロゲン受容体ハプロタイプ（ハプロタイプの項参照）。
（ａ）４８人の患者からのリバプールサンプル、各患者は、腫瘍と対応する血液サンプルを有する。コリエールサンプルはコントロールである。
（ｂ）隣接樹に適する非単独ハプロタイプデータ（Ｌはリバプールサンプル）。
【図５】ＥＳＲ１タンパクのドメイン構造とここに開示されるＳＮＰ位置。
【図６】本発明に係る多くのＳＮＰの分布及び頻度。
【図７】ヒトＥＳＲ１遺伝子座のグラフ表現。
（ａ）ヒトエストロゲン受容体アルファ（ＥＲα）の完全構造。エキソンは塗りつぶした四角で、イントロンは水平線で表す。
（ｂ）ゲノム配列を完成するために使用されたコンティグの順番と名前。ＧＡナンバーはセレーラコンティグナンバーを表す。リサーチジェネティクスＢＡＣクローンは基準プレート及び詳細番号で表される。
【図８】ＥＳＲアルファＳＮＰ：ａ）コリエールサンプル中、ｂ）リバプールサンプル中（Ｔ＝腫瘍サンプル、Ｂ＝血液サンプル、ＬＣ＝リバプールコントロール）、ｃ）リバプールコントロールサンプル中。
【図９】ＳＮＰを有するＥＳＲアルファエキソン（「Ｎ」、「Ｃ」、「Ｉ」、「Ａ」、「Ｓ」については図２を参照）。下線の配列はプライマー配列を表す。
【図１】
2004531228.tif 000282
2004531228.tif 000283
2004531228.tif 000284
2004531228.tif 000285
2004531228.tif 000286
2004531228.tif 000287
2004531228.tif 000288
2004531228.tif 000289
2004531228.tif 000290
2004531228.tif 000291
2004531228.tif 000292
2004531228.tif 000293
2004531228.tif 000294
2004531228.tif 000295
2004531228.tif 000296
2004531228.tif 000297
2004531228.tif 000298
2004531228.tif 000299
2004531228.tif 000300
2004531228.tif 000301
2004531228.tif 000302
2004531228.tif 000303
2004531228.tif 000304
2004531228.tif 000305
2004531228.tif 000306
2004531228.tif 000307
2004531228.tif 000308
2004531228.tif 000309
2004531228.tif 000310
2004531228.tif 000311
2004531228.tif 000312
2004531228.tif 000313
2004531228.tif 000314
2004531228.tif 000315
2004531228.tif 000316
2004531228.tif 000317
2004531228.tif 000318
2004531228.tif 000319
2004531228.tif 000320
2004531228.tif 000321
2004531228.tif 000322
2004531228.tif 000323
2004531228.tif 000324
2004531228.tif 000325
2004531228.tif 000326
2004531228.tif 000327
2004531228.tif 000328
2004531228.tif 000329
2004531228.tif 000330
2004531228.tif 000331
2004531228.tif 000332
2004531228.tif 000333
2004531228.tif 000334
2004531228.tif 000335
2004531228.tif 000336
2004531228.tif 000337
2004531228.tif 000338
2004531228.tif 000339
2004531228.tif 000340
2004531228.tif 000341
2004531228.tif 000342
2004531228.tif 000343
2004531228.tif 000344
2004531228.tif 000345
2004531228.tif 000346
2004531228.tif 000347
2004531228.tif 000348
2004531228.tif 000349
2004531228.tif 000350
2004531228.tif 000351
2004531228.tif 000352
2004531228.tif 000353
2004531228.tif 000354
2004531228.tif 000355
2004531228.tif 000356
2004531228.tif 000357
2004531228.tif 000358
2004531228.tif 000359
2004531228.tif 000360
2004531228.tif 000361
2004531228.tif 000362
2004531228.tif 000363
2004531228.tif 000364
2004531228.tif 000365
2004531228.tif 000366
2004531228.tif 000367
2004531228.tif 000368
2004531228.tif 000369
2004531228.tif 000370
2004531228.tif 000371
2004531228.tif 000372
2004531228.tif 000373
2004531228.tif 000374
2004531228.tif 000375
2004531228.tif 000376
2004531228.tif 000377
2004531228.tif 000378
2004531228.tif 000379
2004531228.tif 000380
2004531228.tif 000381
2004531228.tif 000382
2004531228.tif 000383
2004531228.tif 000384
2004531228.tif 000385
2004531228.tif 000386
2004531228.tif 000387
2004531228.tif 000388
2004531228.tif 000389
2004531228.tif 000390
2004531228.tif 000391
2004531228.tif 000392
2004531228.tif 000393
2004531228.tif 000394
2004531228.tif 000395
2004531228.tif 000396
2004531228.tif 000397
2004531228.tif 000398
2004531228.tif 000399
2004531228.tif 000400
2004531228.tif 000401
2004531228.tif 000402
2004531228.tif 000403
2004531228.tif 000404
2004531228.tif 000405
2004531228.tif 000406
2004531228.tif 000407
2004531228.tif 000408
2004531228.tif 000409
2004531228.tif 000410
2004531228.tif 000411
2004531228.tif 000412
2004531228.tif 000413
2004531228.tif 000414
2004531228.tif 000415
2004531228.tif 000416
2004531228.tif 000417
2004531228.tif 000418
2004531228.tif 000419
2004531228.tif 000420
2004531228.tif 000421
2004531228.tif 000422
2004531228.tif 000423
2004531228.tif 000424
2004531228.tif 000425
2004531228.tif 000426
2004531228.tif 000427
2004531228.tif 000428
2004531228.tif 000429
2004531228.tif 000430
2004531228.tif 000431
2004531228.tif 000432
2004531228.tif 000433
2004531228.tif 000434
2004531228.tif 000435
2004531228.tif 000436
2004531228.tif 000437
2004531228.tif 000438
2004531228.tif 000439
2004531228.tif 000440
2004531228.tif 000441
2004531228.tif 000442
2004531228.tif 000443
2004531228.tif 000444
2004531228.tif 000445
2004531228.tif 000446
2004531228.tif 000447
2004531228.tif 000448
2004531228.tif 000449
2004531228.tif 000450
2004531228.tif 000451
2004531228.tif 000452
2004531228.tif 000453
2004531228.tif 000454
2004531228.tif 000455
2004531228.tif 000456
2004531228.tif 000457
2004531228.tif 000458
2004531228.tif 000459
2004531228.tif 000460
2004531228.tif 000461
2004531228.tif 000462
2004531228.tif 000463
2004531228.tif 000464
2004531228.tif 000465
2004531228.tif 000466
2004531228.tif 000467
2004531228.tif 000468
2004531228.tif 000469
2004531228.tif 000470
2004531228.tif 000471
2004531228.tif 000472
2004531228.tif 000473
2004531228.tif 000474
2004531228.tif 000475
2004531228.tif 000476
2004531228.tif 000477
2004531228.tif 000478
2004531228.tif 000479
2004531228.tif 000480
2004531228.tif 000481
2004531228.tif 000482
2004531228.tif 000483
2004531228.tif 000484
2004531228.tif 000485
2004531228.tif 000486
2004531228.tif 000487
2004531228.tif 000488
2004531228.tif 000489
2004531228.tif 000490
2004531228.tif 000491
2004531228.tif 000492
2004531228.tif 000493
2004531228.tif 000494
2004531228.tif 000495
2004531228.tif 000496
2004531228.tif 000497
2004531228.tif 000498
2004531228.tif 000499
2004531228.tif 000500
2004531228.tif 000501
2004531228.tif 000502
2004531228.tif 000503
2004531228.tif 000504
2004531228.tif 000505
2004531228.tif 000506
2004531228.tif 000507
2004531228.tif 000508
2004531228.tif 000509
2004531228.tif 000510
2004531228.tif 000511
【図２】
2004531228.tif 000512
2004531228.tif 000513
2004531228.tif 000514
2004531228.tif 000515
2004531228.tif 000516
2004531228.tif 000517
2004531228.tif 000518
2004531228.tif 000519
2004531228.tif 000520
2004531228.tif 000521
2004531228.tif 000522
2004531228.tif 000523
2004531228.tif 000524
【図３】
2004531228.tif 000525
【図４】
2004531228.tif 000526
2004531228.tif 000527
2004531228.tif 000528
2004531228.tif 000529
2004531228.tif 000530
2004531228.tif 000531
2004531228.tif 000532
2004531228.tif 000533
2004531228.tif 000534
2004531228.tif 000535
2004531228.tif 000536
2004531228.tif 000537
2004531228.tif 000538
【図５】
2004531228.tif 000539
【図６】
2004531228.tif 000540
【図７】
2004531228.tif 000541
【図８】
2004531228.tif 000542
2004531228.tif 000543
2004531228.tif 000544
2004531228.tif 000545
2004531228.tif 000546
2004531228.tif 000547
2004531228.tif 000548
2004531228.tif 000549
2004531228.tif 000550
2004531228.tif 000551
2004531228.tif 000552
2004531228.tif 000553
2004531228.tif 000554
2004531228.tif 000555
2004531228.tif 000556
2004531228.tif 000557
2004531228.tif 000558
2004531228.tif 000559
2004531228.tif 000560
2004531228.tif 000561
2004531228.tif 000562
2004531228.tif 000563
2004531228.tif 000564
2004531228.tif 000565
2004531228.tif 000566
2004531228.tif 000567
2004531228.tif 000568
2004531228.tif 000569
2004531228.tif 000570
2004531228.tif 000571
2004531228.tif 000572
2004531228.tif 000573
2004531228.tif 000574
【図９】
2004531228.tif 000575
2004531228.tif 000576
2004531228.tif 000577
2004531228.tif 000578
2004531228.tif 000579
2004531228.tif 000580
2004531228.tif 000581
2004531228.tif 000582
【国際公開パンフレット】
2004531228.tif 000583
2004531228.tif 000584
2004531228.tif 000585
2004531228.tif 000586
2004531228.tif 000587
2004531228.tif 000588
2004531228.tif 000589
2004531228.tif 000590
2004531228.tif 000591
2004531228.tif 000592
2004531228.tif 000593
2004531228.tif 000594
2004531228.tif 000595
2004531228.tif 000596
2004531228.tif 000597
2004531228.tif 000598
2004531228.tif 000599
2004531228.tif 000600
2004531228.tif 000601
2004531228.tif 000602
2004531228.tif 000603
2004531228.tif 000604
2004531228.tif 000605
2004531228.tif 000606
2004531228.tif 000607
2004531228.tif 000608
2004531228.tif 000609
2004531228.tif 000610
2004531228.tif 000611
2004531228.tif 000612
2004531228.tif 000613
2004531228.tif 000614
2004531228.tif 000615
2004531228.tif 000616
2004531228.tif 000617
2004531228.tif 000618
2004531228.tif 000619
2004531228.tif 000620
2004531228.tif 000621
2004531228.tif 000622
2004531228.tif 000623
2004531228.tif 000624
2004531228.tif 000625
2004531228.tif 000626
2004531228.tif 000627
2004531228.tif 000628
2004531228.tif 000629
2004531228.tif 000630
2004531228.tif 000631
2004531228.tif 000632
2004531228.tif 000633
2004531228.tif 000634
2004531228.tif 000635
2004531228.tif 000636
2004531228.tif 000637
2004531228.tif 000638
2004531228.tif 000639
2004531228.tif 000640
2004531228.tif 000641
2004531228.tif 000642
2004531228.tif 000643
2004531228.tif 000644
2004531228.tif 000645
2004531228.tif 000646
2004531228.tif 000647
2004531228.tif 000648
2004531228.tif 000649
2004531228.tif 000650
2004531228.tif 000651
2004531228.tif 000652
2004531228.tif 000653
2004531228.tif 000654
2004531228.tif 000655
2004531228.tif 000656
2004531228.tif 000657
2004531228.tif 000658
2004531228.tif 000659
2004531228.tif 000660
2004531228.tif 000661
2004531228.tif 000662
2004531228.tif 000663
2004531228.tif 000664
2004531228.tif 000665
2004531228.tif 000666
2004531228.tif 000667
2004531228.tif 000668
2004531228.tif 000669
2004531228.tif 000670
2004531228.tif 000671
2004531228.tif 000672
2004531228.tif 000673
2004531228.tif 000674
2004531228.tif 000675
2004531228.tif 000676
2004531228.tif 000677
2004531228.tif 000678
2004531228.tif 000679
2004531228.tif 000680
2004531228.tif 000681
2004531228.tif 000682
2004531228.tif 000683
2004531228.tif 000684
2004531228.tif 000685
2004531228.tif 000686
2004531228.tif 000687
2004531228.tif 000688
2004531228.tif 000689
2004531228.tif 000690
2004531228.tif 000691
2004531228.tif 000692
2004531228.tif 000693
2004531228.tif 000694
2004531228.tif 000695
2004531228.tif 000696
2004531228.tif 000697
2004531228.tif 000698
2004531228.tif 000699
2004531228.tif 000700
2004531228.tif 000701
2004531228.tif 000702
2004531228.tif 000703
2004531228.tif 000704
2004531228.tif 000705
2004531228.tif 000706
2004531228.tif 000707
2004531228.tif 000708
2004531228.tif 000709
2004531228.tif 000710
2004531228.tif 000711
2004531228.tif 000712
2004531228.tif 000713
2004531228.tif 000714
2004531228.tif 000715
2004531228.tif 000716
2004531228.tif 000717
2004531228.tif 000718
2004531228.tif 000719
2004531228.tif 000720
2004531228.tif 000721
2004531228.tif 000722
2004531228.tif 000723
2004531228.tif 000724
2004531228.tif 000725
2004531228.tif 000726
2004531228.tif 000727
2004531228.tif 000728
2004531228.tif 000729
2004531228.tif 000730
2004531228.tif 000731
2004531228.tif 000732
2004531228.tif 000733
2004531228.tif 000734
2004531228.tif 000735
2004531228.tif 000736
2004531228.tif 000737
2004531228.tif 000738
2004531228.tif 000739
2004531228.tif 000740
2004531228.tif 000741
2004531228.tif 000742
2004531228.tif 000743
2004531228.tif 000744
2004531228.tif 000745
2004531228.tif 000746
2004531228.tif 000747
2004531228.tif 000748
2004531228.tif 000749
2004531228.tif 000750
2004531228.tif 000751
2004531228.tif 000752
2004531228.tif 000753
2004531228.tif 000754
2004531228.tif 000755
2004531228.tif 000756
2004531228.tif 000757
2004531228.tif 000758
2004531228.tif 000759
2004531228.tif 000760
2004531228.tif 000761
2004531228.tif 000762
2004531228.tif 000763
2004531228.tif 000764
2004531228.tif 000765
2004531228.tif 000766
2004531228.tif 000767
2004531228.tif 000768
2004531228.tif 000769
2004531228.tif 000770
2004531228.tif 000771
2004531228.tif 000772
2004531228.tif 000773
2004531228.tif 000774
2004531228.tif 000775
2004531228.tif 000776
2004531228.tif 000777
2004531228.tif 000778
2004531228.tif 000779
2004531228.tif 000780
2004531228.tif 000781
2004531228.tif 000782
2004531228.tif 000783
2004531228.tif 000784
2004531228.tif 000785
2004531228.tif 000786
2004531228.tif 000787
2004531228.tif 000788
2004531228.tif 000789
2004531228.tif 000790
2004531228.tif 000791
2004531228.tif 000792
2004531228.tif 000793
2004531228.tif 000794
2004531228.tif 000795
2004531228.tif 000796
2004531228.tif 000797
2004531228.tif 000798
2004531228.tif 000799
2004531228.tif 000800
2004531228.tif 000801
2004531228.tif 000802
2004531228.tif 000803
2004531228.tif 000804
2004531228.tif 000805
2004531228.tif 000806
2004531228.tif 000807
2004531228.tif 000808
2004531228.tif 000809
2004531228.tif 000810
2004531228.tif 000811
2004531228.tif 000812
2004531228.tif 000813
2004531228.tif 000814
2004531228.tif 000815
2004531228.tif 000816
2004531228.tif 000817
2004531228.tif 000818
2004531228.tif 000819
2004531228.tif 000820
2004531228.tif 000821
2004531228.tif 000822
2004531228.tif 000823
2004531228.tif 000824
2004531228.tif 000825
2004531228.tif 000826
2004531228.tif 000827
2004531228.tif 000828
2004531228.tif 000829
2004531228.tif 000830
2004531228.tif 000831
2004531228.tif 000832
2004531228.tif 000833
2004531228.tif 000834
2004531228.tif 000835
2004531228.tif 000836
2004531228.tif 000837
2004531228.tif 000838
2004531228.tif 000839
2004531228.tif 000840
2004531228.tif 000841
2004531228.tif 000842
2004531228.tif 000843
2004531228.tif 000844
2004531228.tif 000845
2004531228.tif 000846
2004531228.tif 000847
2004531228.tif 000848
2004531228.tif 000849
2004531228.tif 000850
2004531228.tif 000851
2004531228.tif 000852
2004531228.tif 000853
2004531228.tif 000854
2004531228.tif 000855
2004531228.tif 000856
2004531228.tif 000857
2004531228.tif 000858
2004531228.tif 000859
2004531228.tif 000860
2004531228.tif 000861
2004531228.tif 000862
2004531228.tif 000863
2004531228.tif 000864
2004531228.tif 000865
2004531228.tif 000866
2004531228.tif 000867
2004531228.tif 000868
2004531228.tif 000869
2004531228.tif 000870
2004531228.tif 000871
2004531228.tif 000872
2004531228.tif 000873
2004531228.tif 000874
2004531228.tif 000875
2004531228.tif 000876
2004531228.tif 000877
2004531228.tif 000878
2004531228.tif 000879
2004531228.tif 000880
2004531228.tif 000881
2004531228.tif 000882
2004531228.tif 000883
2004531228.tif 000884
2004531228.tif 000885
2004531228.tif 000886
2004531228.tif 000887
2004531228.tif 000888
2004531228.tif 000889
2004531228.tif 000890
2004531228.tif 000891
2004531228.tif 000892
2004531228.tif 000893
2004531228.tif 000894
2004531228.tif 000895
2004531228.tif 000896
2004531228.tif 000897
2004531228.tif 000898
2004531228.tif 000899
2004531228.tif 000900
2004531228.tif 000901
2004531228.tif 000902
2004531228.tif 000903
2004531228.tif 000904
2004531228.tif 000905
2004531228.tif 000906
2004531228.tif 000907
2004531228.tif 000908
2004531228.tif 000909
2004531228.tif 000910
2004531228.tif 000911
2004531228.tif 000912
2004531228.tif 000913
2004531228.tif 000914
2004531228.tif 000915
2004531228.tif 000916
2004531228.tif 000917
2004531228.tif 000918
2004531228.tif 000919
2004531228.tif 000920
2004531228.tif 000921
2004531228.tif 000922
2004531228.tif 000923
2004531228.tif 000924
2004531228.tif 000925
2004531228.tif 000926
2004531228.tif 000927
2004531228.tif 000928
2004531228.tif 000929
2004531228.tif 000930
2004531228.tif 000931
2004531228.tif 000932
2004531228.tif 000933
2004531228.tif 000934
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004531228.tif 000935
2004531228.tif 000936
【国際調査報告】
2004531228.tif 000937
2004531228.tif 000938
2004531228.tif 000939
2004531228.tif 000940
2004531228.tif 000941
2004531228.tif 000942
2004531228.tif 000943
2004531228.tif 000944