(57)【要約】本発明は流路内で種を分析、精製もしくは分離するための非感熱性の液状媒体に関し、いくつかのポリマーセグメントからなる少なくとも１つのポリマーを含む。本発明は、該ポリマーが不規則なブロックコポリマーもしくは不規則な、くし様ポリマー型であり、異なる化学的もしくは位相的性質を有するポリマ−セグメント間で平均して少なくとも３つの接合点を有することに特徴づけられる。さらに本発明は、非感熱性の分離媒体を用いて種を分析、精製もしくは分離する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路内の種を分析、精製もしくは分離するための非感熱液状媒体であり、いくつかのポリマーセグメントからなる少くとも１つのポリマーを含み、該ポリマーは不規則ブロックコポリマー型または不規則なくし型ポリマー型であり、そして異なる化学的もしくは位相的性質のポリマーセグメントの間に設けられた平均して少くとも３つの接合点を有することを特徴とする液状媒体。
【請求項２】
該ポリマーの組成の１部を形成する少くとも１種の化学的もしくは位相的性質を有するすべてのセグメントが少くとも１．５の多分散性を有することを特徴とする請求項１記載の媒体。
【請求項３】
該ポリマーの組成の１部を形成するそれぞれの種類の化学的もしくは位相的性質を有するセグメントが少くとも１．５の多分散性を有することを特徴とする請求項１もしくは２記載の媒体。
【請求項４】
該多分散性が１．８より大きいことを特徴とする媒体。
【請求項５】
該ポリマーが５００００より大きい、そして好適には３０００００より大きい平均分子量を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の媒体。
【請求項６】
該ポリマーが該流路の壁に対する特異的な親和性を示すことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の媒体。
【請求項７】
該ポリマーは、分離媒体内で壁に対する特異的な親和性を示す少くとも１種のポリマーセグメント、ならびに該媒体内で壁に対してほとんどもしくは全く親和性を示さない少くとも１種のポリマーセグメントを有することを特徴とする請求項６記載の媒体。
【請求項８】
壁に対する特異的な親和性を示すすべてのセグメントが該ポリマーの平均分子量の２ｗｔ％〜８０ｗｔ％を示すことを特徴とする請求項６もしくは７記載の媒体。
【請求項９】
ポリマーが１つ以上の被検体に対して特異的な親和性を示すことを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の媒体。
【請求項１０】
ポリマーが決定された序列のヌクレオチドもしくはポリペプチドを担持することを特徴とする請求項９記載の媒体。
【請求項１１】
ポリマーがタンパク、タンパク画分、タンパク複合体および／または酸もしくは塩基の基に結合されている請求項９記載の媒体。
【請求項１２】
少くとも１種の化学的もしくは位相的性質のすべてのポリマーは平均で７５より多い、好ましくは２１０より多い、原子数を有するか、または１５００より大きい、好ましくは４５００より大きい分子量を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の媒体。
【請求項１３】
ポリマーが構成される種々の種類のポリマーセグメントは、平均で７５より大きい、好ましくは２１０より大きい平均原子数、または１５００より大きい、好ましくは４５００より大きい分子量を有することを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の媒体。
【請求項１４】
ポリマーが平均して４〜１００の接合点の数を有することを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の媒体。
【請求項１５】
ポリマーが平均して少くとも４つのポリマーセグメントを含むブロックコポリマーであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の媒体。
【請求項１６】
ポリマーが平均して少くとも２つの側鎖を含むくし型ポリマーであることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の媒体。
【請求項１７】
ポリマーが、ポリエーテル、ポリエステル、たとえばポリグリコール酸、たとえばポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレンもしくはポリオキシエチレンのようなポリオキシアルキレン型の溶解性ランダムホモポリマーおよびコポリマー、多糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリオキサゾリン、ポリスチレンスルホネートならびに置換もしくは非置換アクリルアミド、メタクリルアミドおよびアリルポリマーおよびコポリマー、から選ばれる少くとも１種のセグメントを含む請求項１〜１６のいずれかに記載の媒体。
【請求項１８】
該ポリマーが：
−くし型コポリマー型のコポリマー、その骨格はデキストラン、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノールもしくは（Ｎ，Ｎ）−ジ−メチルアクリルアミド型であり、その上にアクリルアミド、置換アクリルアミドもしくは（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）型、またはＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）コポリマー型、またはオキサゾリンもしくはオキサゾリン誘導体のホモポリマーもしくはコポリマー、のグラフト側セグメントがある；
−不規則な序列コポリマー型の非感熱コポリマーであり、その骨格に沿って、ポリオキシエチレン型のセグメントおよびポリオキシプロピレン型のセグメントの交互変化、またはポリオキシエチレン型のセグメントおよびポリオキシブチレン型のセグメントの交互変化、またはポリエチレンのセグメントおよびポリエーテル型のセグメント（それらはポリオキシエチレンよりも疎水性である）の交互変化を有する；
−不規則な序列ブロックポリマー型のコポリマーであり、その骨格に沿って、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノールもしくはジメチルアクリルアミド型のセグメント、および一方では（Ｎ，Ｎ）−ジ−メチルアクリルアミド（ＤＭＡ）型、またはＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）コポリマー型、またはオキサゾリンもしくはオキサゾリン誘導体のセグメントの交互変化を有する；
−不規則なくし型ポリマー型のポリマーであり、その骨格はアガロース、アクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、もしくはアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー型、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー型、オキサゾリンおよびオキサゾリン誘導体、デキストラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、変性セルロース、多糖類、またはエーテルオキシド型であり、そしてその上に、アガロース、アクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、もしくはアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー型、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー型、オキサゾリンおよびオキサゾリン誘導体、デキストラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、変性セルロース、多糖類、またはエーテルオキシド型のグラフト側セグメントがある；
−不規則なくし型コポリマー型のコポリマーであり、その骨格はアクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、もしくはアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー型、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー型、オキサゾリンおよびオキサゾリン誘導体、デキストラン、アガロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、変性セルロース、多糖類またはエーテルオキシド型であり、そしてアルキル鎖、芳香族誘導体、フルオロアルキル、シランまたはフルオロシランのような短鎖疎水性側セグメントを担持する、
から選ばれる少くとも１つのポリマーを含む請求項１〜１７のいずれかに記載の媒体。
【請求項１９】
分子もしくは巨大分子種、核酸型の生物学的巨大分子、それらの合成類縁体、タンパク、ポリペプチド、グリコペプチドおよび多類、有機分子、合成巨大分子もしくは粒子、たとえば鉱物粒子、格子細胞もしくは細胞小器官、から選ばれる種を分離、精製、ろ過もしくは分析するための、請求項１〜１８のいずれかに記載の媒体の使用。
【請求項２０】
少くとも１つの寸法がサブミリメートルである流路における請求項１９記載の使用、または請求項１〜１８のいずれかに記載の媒体使用。
【請求項２１】
界面動電分離のための請求項１９もしくは２０記載の使用、または請求項１〜１８のいずれかに記載の媒体の使用。
【請求項２２】
診断、遺伝子検出および高流量スクリーニング、品質調節のため、または製品における遺伝学的に変性された微生物の存在を検出するための、請求項１９〜２１のいずれかに記載の使用、または請求項１〜１８のいずれかに記載の媒体の使用。
【請求項２３】
ａ／請求項１〜１８のいずれかに記載の分離媒体で分離装置の流路に充填すること、
ｂ／該種を含む該試料を該流路の一端に導入すること、
ｃ／試料に含まれる特定の種を移動させる外部場を用いること、ならびに
ｄ／試料の導入点とは異なる流路に沿った点で、該種を回収すること、またはそれらの通過を検出すること、
を含むことを特徴とする、試料に含まれる種を分離、分析および／または同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、「分離媒体」（“ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ”）として知られる流体において種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を移行することが必要である方法により、種を分析、分離および精製する方法の領域に関する。
【０００２】
本発明は流路（ｃｈａｎｎｅｌｓ）もしくは細管（ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ）、少くとも１つの寸法がサブミリメートル、そして通常２０μｍ〜２００μｍ（ここでは、以下、微小流路（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｅｓ）という）である、内で種を分離するのに適した分離媒体を提案することに特に関する。本発明は、とくに、細管電気泳動により、クロマトグラフィーにより、または微小流路において使用されるいかなる方法（細管電気泳動および細管クロマトグラフィー、微小流体系、ならびに「チップ実験室」（“ｃｈｉｐ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ”））によっても生物学的巨大分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を分離もしくは分析する方法に関する。
【０００３】
以下に、「微小流体系」（“ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ　ｓｙｓｔｅｍ”）という表現は、流体および／または流体に含まれる種が、少くとも１つの寸法がサブミリメートルである流路もしくは一連の流路内で移動される系をいい、そして「細管電気泳動（ＣＥ）」（“ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＣＥ）”）は種の輸送が電場の作用により行なわれる微小流体系をいう。
【０００４】
ＣＥおよび微小流体系は従来のゲル電気泳動法よりも高い分離能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）で比較的速い分離を可能にし、対流防止（ａｎｔｉｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ）媒体を必要とせず、そしてそれらの性質は液状媒体中でイオン分離を実施するのに広く使用されている。現在では、ＣＥにより実施される生物学的な巨大分子の分離の大多数は、必要なときはいつでも置換されうる利点を有する、結合された線状水溶性ポリマーの分離能を用いる。多くの非架橋ポリマーが、流路内、特に細管電気泳動において、種を分離するための媒体として提案されている。所定の用途のための最良の選択はいくつかのパラメータに依存する。たとえば、それらのサイズの関数として被検体の分離のために、媒体が十分に抵抗性の位相的障害物を被検体に与えることが必要である（Ｖｉｏｖｙら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９３，１４，３２２）。これは高度に結合され、そして比較的粘性のある分離媒体を含む。さらに、分離媒体中に存在するポリマーは被検体との引力相互作用を受けないことが必要である。この理由はこの種の相互作用はある被検体の減速およびさらなる分散をもたらすからである（Ｈ．Ｚｈｏｕら、ＨＰＣＥ　２０００，Ｓａａｒｂｒｕｃｋｅｎ　２０〜２４／２／２０００）。このように、ＤＮＡ塩基配列決定について、またはタンパク分離について、マトリックスがもっと疎水性を有すると不十分な結果が得られることがよく知られている。
【０００５】
さらに、分離媒体としてコポリマーを使用することが文献で提案されている。ＭｅｎｃｈｅｎのＷＯ９４／０７１３３において、細管電気泳動における分離媒体として、「規則的」（“ｒｅｇｕｌａｒ”）といわれるブロックコポリマー型のコポリマーを含む媒体を使用することが提案されている。それらはポリマー間に重複濃度よりも高い濃度で、選ばれた本質的な均一な長さの親水性セグメントならびに多数の規則的に間隔をおかれた疎水性セグメントを有するので「規則的」である。これらの媒体はせん断を低下させる（ｓｈｅａｒ−ｔｈｉｎｎｉｎｇ）利点を有する。すなわち、それらは、高圧下で細管に導入されうるが、同時に外部圧力なしで固体位相障害物を示す。不幸にも、この原理にもとづいて使用されうる媒体は合成するのが困難であり、そのことはそれらを高価にし、意図されうる構造の型を制限する。さらに、これらのポリマーは比較的疎水性であり、たとえばＤＮＡ塩基配列決定のためにそれらの性能品質は並みである。
【０００６】
さらに、分離媒体として感熱媒体を使用することも提案され、その粘度は温度の増加時に大いに変化する。この種の媒体は、低粘度の状態での第１の温度で細管に該媒体を注入すること、ならびにゲル電気泳動（特にアガロースを用いる）で通常実施されるように、良好な分離効率を示す比較的高い粘度の状態での第２温度で分離すること、を可能にする利点を有する。特許出願ＷＯ９４／１０５６１およびＷＯ９５／３０７８２は温度を上昇させることによりもっと容易な注入を可能にする媒体を特に提案する。事実上、該特許出願は、高温で容積を減少させ（低粘度の不連続粒子の希釈溶液をもたらす）、そして低温で膨潤して分離流路を完全に充たす（このように媒体にゲル性と良好な分離性能を付与する）、ことが可能なミクロゲルを本質的に記載する。特許出願ＷＯ９８／１０２７４自体は、少くとも１種のブロックコポリマーを含む分子分離媒体を提案し、それは第１の温度で溶液であり、第２の温度でゲル型状態である。記載される媒体は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン（ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥ）族、もっと具体的にはＰＯＥ９９−ＰＯＰ６９−ＰＯＥ９９（指数は各ブロックのモノマー数を示す）（商標「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７」）、の低分子量のトリブロックポリマーを含む。低温で、トリブロック系の末端の２つのＰＯＥは水溶性であり、そして、コポリマーの低分子量を付与され、溶液は高濃度まで比較的非粘性である。温度を約１５〜２５℃上昇させることにより、中央のＰＯＰセグメントはもっと疎水性になり、そしてこれらのポリマーは会合してゲル型状態になる。しかし、このメカニズムは電気泳動においていくつかの難点を示す。第１に、それは１５ｇ／１００ｍＬもしくは２０ｇ／１００ｍＬより大きい、高いポリマー濃度でのみ、良好な電気泳動分離特性を与え、それは高い摩擦および長い移行時間をもたらす。さらに、温度の変化速度の関数としての特性の依存は結果の再現性をランダムにする。最後に、多くの用途および多くの装置について、流路の充填段階および分離段階の間で温度を変化させることは不都合、もしくは不可能でさえある。
【０００７】
Ｍｏｄａｂｈｕｓｈｉの米国特許第５，５５２，０２８、ＷＯ９５／１６９１０およびＷＯ９５／１６９１１において、さらに、スクリーニング媒体、および壁吸着特性を有するポリマー（２置換アクリルアミドポリマー型で、５，０００〜１，０００，０００の分子量を有する）からなる表面相互作用成分からなる分離媒体を使用することも提案されている。これらのマトリックス、もっと具体的にはポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）は、電気浸透を低下し、ある用途で、たとえば塩基配列決定で、良好な分離特性をもたらすことを可能にする。しかし、それらは比較的、疎水性であり、ある用途、たとえばＤＮＡ塩基配列決定についてその性能の質を制約し、そして他の用途、たとえばタンパク分離について、もっと有害でさえある。さらに、それらは遅い分離をもたらす。
【０００８】
したがって、数多くの研究および提案されたシステムにもかかわらず、コスト、分離効率、壁との相互作用の低減、および使用の便利さの種々のすべての観点に最適な媒体は、上述のすべての用途については現時点では入手し得ない。
【０００９】
本発明の１つの目的は、流路内の種の分離、分析もしくは精製のための非感熱液状分離媒体として特に有利であるポリマー群の使用をまさに提案することである。
【００１０】
さらに詳しくは、本発明の主題は、流路内の種を分析、精製もしくは分離するための非感熱液状媒体であり、いくつかのポリマーセグメントからなる少くとも１つのポリマーを含み、該ポリマーは不規則ブロックコポリマー型または不規則なくし型（ｃｏｍｂ）ポリマー型であり、そして異なる化学的もしくは位相的（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ）性質のポリマーセグメントの間に設けられた平均して少くとも３つの接合点を有することを特徴とする。
【００１１】
本発明のために、「ポリマー」（“ｐｏｌｙｍｅｒ”）という用語は一連の巨大分子からなり、そしてある特性、たとえば分子量、多分散性、化学組成およびミクロ構造、により特徴づけられる生成物を示す。多分散性はこの分野で親しまれている質量平均の意味で、巨大分子の分子量分布を特徴づける。「ミクロ構造」（“ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”）という用語は、巨大分子の化学組成の一部を形成するモノマーが巨大分子内で配置される仕方を意味する。
【００１２】
本発明において、２官能もしくは多官能架橋剤の存在下でモノマーの共重合から得られるゲルは本発明の範囲から除かれる。この理由はそれらの架橋状態を与えられると、それらのゲルは固体もしくは弾性があり、したがって液体ではないからである。特に、それらは細管への導入に適さない。
【００１３】
本発明による液状媒体は非感熱性である。すなわち、それはその固化点＋１０℃と沸点−１０℃の間で粘度の急激な変化を示さない。「急激な変化」（“ｓｕｄｄｅｎ  ｃｈａｎｇｅ”）は２０℃以下の温度範囲にわたってファクター２以上の変動を意味する。
【００１４】
本発明のために、「分離方法」（“ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ”）という表現は試料中に含まれる種のすべてもしくはいくつかを分離、精製、同定もしくは分析するいかなる方法も包含する。この場合、液体は「分離媒体」（“ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ”）といわれ、それにより、分離プロセスの過程で分離される種、もしくは少くともそれらのいくらかを通過させる。
【００１５】
「種」（“ｓｐｅｃｉｅｓ”）という用語は、粒子、細胞小器官もしくは細胞、分子もしくは巨大分子、そして特に生物学的巨大分子、たとえば核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡもしくはオリゴヌクレオチド）、合成もしくは化学修飾により得られる核酸類縁体、タンパク、ポリペプチド、グリコペプチドおよび多糖類を示すのが通常である。分析的方法において該種は通常「被検体」（“ａｎａｌｙｔｅｓ”）といわれる。
【００１６】
本発明は、界面動電（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）分離法の場合に特に有利である。
【００１７】
「界面動電分離」（“ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”）という用語は、電場の作用により媒体中で種を移行させることにより混合物中に含まれる種のすべて、もしくはいくらかを分離するいかなる方法も包含するものである。それは、たとえば電気クロマトグラフィーにおいて、媒体自体の変位により、またはミセル電気クロマトグラフィーの場合にミセルのような会合種の変位により、または直接もしくは間接的作用の組合わせにより、電場が直接的もしくは間接的に電解液へのモータ作用を及ぼすかどうかにかかわらない。電場の該作用が非電気源のもう一つのモータ作用に結合されるいかなる分離法も本発明による界面動電分離と考えられる。したがって、「チップ」（“ｃｈｉｐｓ”）の細管電気泳動もしくは電気泳動は、「界面動電」（“ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ”）といわれる。
【００１８】
有利には、特に界面動電の場合には、液体は電解質からなる。
【００１９】
本発明のために、「電解液」（“ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ”）という用語はイオンを伝導しうる液体をいう。最も一般的には、この媒体は緩衝された水性媒体、たとえばリン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ホウ酸塩、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、ヒスチジン、リジン、等にもとづく緩衝液である。電気泳動で使用されうる緩衝液の数多くの例は当業者に知られており、そしてそれらの多くは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）に記載されている。しかし、いかなる種類の電解液も本発明に関して使用され得、特に水性−有機溶媒、たとえば水−アセトニトリル、水−ホルムアルデヒドもしくは水−尿素混合物、または極性有機溶媒、たとえば例としてＮ−メチルホルムアミドである。かなりの割合の尿素および／またはホルムアミドを含むアルカリ性ｐＨでの水性緩衝液からなる「配列決定緩衝液」（“ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ”）は本発明に関して特に有用である。
【００２０】
「流路」（“ｃｈａｎｎｅｌ”）という用語は１つ以上の固体壁により境界づけられるいかなる容積をも示し、少くとも２つのオリフィスを有し、流体を含み、またはそれを流体が通過するように意図されている。
【００２１】
本発明は少くとも１つの流路を含む系で特に有利であり、その少くとも１つの寸法はサブミリメートルであり、たとえば細管界面動電分離系、微小流体系、そしてもっと一般的には微小流路（ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ）を用いて種を分離するための系である。
【００２２】
好適な変形により、本発明は、少くとも４つの接合点、好ましくは４〜１００の接合点数、もっと好ましくは４〜４０の接合点数を平均で有するポリマーを含む溶液を液体分離媒体を使用することに関する。
【００２３】
「接合点」（“ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ”）は、たとえばブロックポリマーの場合に、著しく異なる化学的性質を有する両方の２つのポリマーセグメントを結合する点、またはたとえばくし型ポリマーの場合に、同一もしくは異なる化学的性質を有する２つ以上のポリマーの間の架橋点を意味する。例として、３つの側枝を有するくし型ポリマーは３つの接合点および７つの別個のポリマーセグメントを有する。同様に、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ型の序列ブロックコポリマーは３つの接合点および４つの別個のポリマーセグメントを有する。
【００２４】
本発明のために、「ポリマーセグメント」（“ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ”）および「セグメント」（“ｓｅｇｍｅｎｔ”）という用語は、線状で共有結合して一緒に結合され、そして所定の種類の化学的組成に属する、すなわち、特に溶媒和、固体壁との相互作用、ある分子への特異的親和性、もしくはそれらの特性の組合わせに関して特定の全体的物理化学的性質を有する、ような一連のモノマーをいう。
【００２５】
本発明のためにポリマーセグメントの例は、すべてが同一であるモノマー（ホモポリマーセグメント）のコポリマー内の、または２，３よりも多いモノマーの距離にわたって有意の組成相関を有さないコポリマー（ランダムコポリマー型のセグメント）の、配列により与えられる。本発明によるポリマーはいくつかの「異なる」ポリマーセグメントから構成される。化学的性質および／または位相、すなわち互いに関連するセグメント、たとえば側枝に相対する骨格、の空間分布は、本発明のためとは異なる。
【００２６】
第１の好適な変形によれば、本発明によるポリマーは不規則なブロックコポリマー型である。
【００２７】
本発明のために、「ブロックコポリマー」（“ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ”）は、共有結合的に一緒に結合された、いくつかのポリマーセグメントからなり、そして少くとも２つの異なる種類の化学組成に属するコポリマーをいう。このように、線状ブロックコポリマー内の２つの隣接するポリマーセグメントは、必然的に有意に異なる化学的性質を有する。ブロックコポリマーは、各セグメントが同一組成で同一サイズのホモポリマーに匹敵しうる物理化学的性質、特に溶媒和、を、分離媒体内で有するのに十分な数のモノマーを含むという事実により定義される。これは、種々の種類のモノマーが本質的にランダムな順序で互いに続き、そして考慮中のそれぞれの種のホモポリマーとは異なる性質を位置的にすべてにわたって鎖に与えるようなランダムコポリマーと対比される。このブロック特性を得るのに要求されるホモポリマーセグメントのサイズはモノマーおよび電解液の種類の関数として変動しうるが、該セグメントの骨格に沿う数十の原子であるのが通常である。同じ大きさで、物理化学的性質、特に溶媒和に有意の変動をセグメント毎に生じるに十分な化学組成の差異を有するポリマーセグメントを該ブロックコポリマー内で区別することが可能である限り、本発明の意味においてブロックコポリマーを製造することが可能であることを留意すべきであり、セグメント自体のすべてもしくはいくつかは、ランダム型のコポリマーからなる。特に、本発明の意味における「ポリマーセグメント」として考慮されるために、ポリマーの一部は骨格に沿って少くとも１０原子を含まなければならない。
【００２８】
この変形の１つの好適な態様にしたがって、本発明によるポリマーは不規則な序列ブロックコポリマー型である。
【００２９】
本発明のために、「序列ブロックコポリマー」は、少くとも２つの化学的種類に属し、線状に一緒に結合されているポリマーセグメントからなるブロックコポリマーを意味する。
【００３０】
第２の好適な変形によれば、本発明によるポリマーは不規則なくし型ポリマー型である。
【００３１】
本発明のために、「くし型ポリマー」（“ｃｏｍｂ  ｐｏｌｙｍｅｒ”）という用語は、ある化学的性質の線状骨格および同一もしくは異なる化学的性質を有する「側枝」（“ｓｉｄｅ  ｂｒａｎｃｈｅｓ”）として知られるポリマーセグメントを有するポリマーを示し、そのセグメントは線状であるが骨格より有意に短かく、そしてそれらの末端の１つにより該骨格に共有結合的に結合されている。くし型ポリマーにおいて、骨格を構成するポリマーセグメントおよび側枝を構成するポリマーセグメントは位相的性質を異にする。もしくし型ポリマーの側枝を構成するポリマーセグメントと骨格を構成するポリマーセグメントも化学的性質が異なると、そのポリマーは「くし型ポリマー」の特徴と「ブロックコポリマー」の特徴を同時に有する。「くし型コポリマー」として知られるこのようなポリマーは、一連の（ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ）くし型ポリマーを構成し、そしてもちろん本発明に関して使用されうる。
【００３２】
いうまでもなく、本発明により媒体中でブロックコポリマーとくし型ポリマーを組合わせて使用することも期待されうる。
【００３３】
本発明によるポリマー中に存在する所定の化学的もしくは位相的種類のポリマーセグメントの数は平均値として理解され、それは該数においてある多分散性を有する大きな数の分子の集団である。
【００３４】
本発明の説明において、他に言及がなければ、すべての分子量、およびすべての鎖もしくはすべてのポリマーセグメントについてのすべての平均値、たとえば平均分子量、もしくは骨格に沿った平均原子数、接合点の数、もしくはくし型ポリマーの場合におけるグラフトの平均数は、ポリマー物理学における通常の意味の範囲での質量平均として理解される。
【００３５】
本発明により考慮中のすべてのポリマー、すなわちブロックコポリマーもしくはくし型ポリマーは、不規則型である有利な特徴をさらに有し、すなわち、その組成の１部を形成する少なくとも１種の化学的もしくは位相的性質を有するすべてのセグメントは少なくとも１．５、そして好ましくは１．８より大きい多分散性を有する。
【００３６】
本発明によるポリマーの組成の１部を形成する１種のポリマーセグメントの多分散性は該セグメントの分子量の平均値であると理解され、該ポリマーの組成の１部を形成するこの種のすべてのセグメントに引継がれる（ポリマー物理化学の通常の意味における質量平均）。
【００３７】
不規則な、くし型ポリマーの１つの好適な変形は、少なくとも１．５、そして好ましくは１．８より大きい側枝の多分散性を示すことにある。
【００３８】
不規則な、くし型ポリマーのもう１つの好適な変形は、少なくとも１．５、そして好ましくは１．８より大きい、２つの側枝の間に含まれる骨格のセグメントの多分散性を示すことにある。
【００３９】
もう１つの好適な態様において、本発明によるポリマー組成の１部を形成する化学的もしくは位相的性質の種類を有するそれぞれのセグメントは、少なくとも１．５、そして好ましくは１．８より大きい多分散性を示す。
【００４０】
１つの好適な態様によれば、本発明によるポリマーの多分散性は１．５より大きく、そして好ましくは１．８より大きい。本発明により媒体中で使用されるくし型ポリマーもしくはコポリマー中に存在する異なるポリマーセグメントの長さおよび数、ならびにその化学的性質は、本発明に関して有意に変動し得、そして該媒体の性質は、実施例の説明でさらに詳しく示されるように、所望の用途に依存してこのように広く変動されうる。
【００４１】
１つの好適な態様によれば、本発明によるポリマーは５０，０００より大きい、好ましくは３００，０００より大きい、もっと好ましくは１，０００，０００より大きい、そしてなお好ましくは３，０００，０００より大きい分子量（質量平均）を有する。
【００４２】
１つの好適な態様によれば、本発明による該ポリマーは該流路の壁に対して、分離媒体内で有意の親和性を示す。
【００４３】
特に好適な１態様は、本発明によるポリマー中に、壁に対して特異的な親和性を分離媒体中で示す少なくとも１種のポリマーセグメントおよび該媒体中でほとんどもしくは全く親和性を示さない少なくとも１種のポリマーセグメントを与えることにある。
【００４４】
この種のポリマーセグメントの存在は本発明による媒体に、流路および／または電気浸透の壁上への種の吸着を低減させる。
【００４５】
特に、流路内で種を伴うすべての方法に関する１つの問題は、該流路の壁上への該種の吸着である。この問題は小さな流路で生物学的巨大分子の場合に特に悪化され、後者は、両性であることが多い。試料もしくは流路に含まれる種の壁上への吸着の現象は分析法の場合にある被検体を阻止し、付加的な分散を創出し、そして分離能の損失という結果になる。この吸着は、流路の壁のある量の汚染をさらに生じさせ得、その後に該流路に導入されるのが望ましい流体に影響しうる。
【００４６】
特に界面動電分離法に関する、もう１つの制約は、電気浸透、すなわち細管もしくは流路の壁での電荷の存在により分離媒体の全体としての移動である。この移動は時間により変動しやすく、そして不均一であるので、測定の再現性および分離能には有害である。それは化学的構造により細管の表面上に存在しうる電荷により引起されるが、分離されるべき試料、特にタンパク、に最初に含まれる電荷を帯びた種の壁への吸着により創出もしくは増加されうる。
【００４７】
分離媒体内で壁に対する特異的親和性を示す少なくとも１つの種類のポリマーセグメントを含む種類の本発明によるポリマーは、この種の多数のセグメントのために、そして該セグメントの比較的高い平均分子量のために、高い吸着エネルギーを有し、したがって永続する態様で電気浸透を低減させる。さらに、本発明によるポリマーは、その構造に、壁に対してほとんどもしくは全く親和性を該媒体中で示さないポリマーセグメントをさらに含むので、それらは分離能に有害である過度に疎水性の性質を避け、そして壁から被検体をもっと効率的にはね返す。
【００４８】
通常、壁に対する親和性を示さないポリマーセグメントの種類は分離媒体中で良好な溶解性を示す。しかし、該媒体において溶解性であるが、それにもかかわらず壁に対してその中で特定の親和性を示すポリマーがあり得る。分離媒体が水性溶液であるとき、壁に対して親和性を有さないセグメントは非常に親水性のセグメントであるのが通常である。一方、親和性を有するセグメントは比較的非親水性であるか、もしくは疎水性でさえある。いうまでもなく、壁の性質および分離媒体の性質に依存してもっと特異的な種類の親和性が使用され得る。
【００４９】
本発明を実施するのに最適なコポリマーは、特に、壁に対する特異的な親和性を有するすべてのセグメントが該コポリマーの全平均モルの２ｗｔ％〜８０ｗｔ％、そして好ましくは５ｗｔ％〜３０ｗｔ％、またはモノマーのモル数でコポリマー全組成の３％〜８５％、そして好ましくは５％〜５０％、を示すものである。
【００５０】
被検体が生物学的巨大分子であるとき、特に有利な、もう一つの好適な態様は、１つ以上の被検体に対して特異的な親和性を示す本発明によるポリマーを用いることである。
【００５１】
この親和性はある被検体に対して特異的な親和性を示すことのできるポリマーセグメントを該ポリマーの構造に組入れることにより得られうる。このようなポリマーセグメントは、異なるモノマー、たとえばポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの予め定められた配列から、たとえば完全でない態様で（ｉｎ ａ ｎｏｎｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ ｍａｎｎｅｒ）構成される。この親和性は、本発明によるポリマーに、天然もしくは変性タンパク、タンパク分画もしくはタンパク複合体、あるいは酸性もしくは塩基性基、および／またはルイス酸もしくはルイス塩基型の基と結合させることによっても得られうる。
【００５２】
本発明によるコポリマーにより採用されうる種々の構造の例として、該コポリマーのすべてもしくはいくつかは詳しくは次のようなものであると言及されうる：
−不規則な序列ブロックコポリマー。この場合、１つの好適な変形はポリマーに沿って、壁に対する特異的親和性を有するセグメントと、壁に対する親和性を低減した、もしくは全く有さないセグメントを交互にすることにある。さらに、ポリマーに沿って、ある被検体に対して特異的な親和性を示すセグメントと、該検体に対して親和性を低減した、もしくは全く示さないセグメントを交互にすることも意図されうる。
−不規則な、くし型コポリマーの形態。この場合、１つの好適な変形は次のように特徴づけられる。すなわち、該ポリマーは、くし型ポリマーの形態にあり、その骨格は壁に対して特異的な親和性を示すいくつかのポリマーセグメントからなり、そしてその側枝は壁に対する親和性を低減された、もしくは全く示さないポリマーセグメントからなる。あるいは、該ポリマーは、くし型ポリマーの形態にあり、その側枝は壁に対して特異的な親和性を示すポリマーセグメントからなり、そしてその骨格は壁に対する親和性を低減された、もしくは全く示さないポリマーセグメントからなる。さらに、これらのポリマーは、くし型ポリマーの形態であり得、ある側枝はある被検体に対して特異的な親和性を示すポリマーセグメントからなり、そしてその骨格はこれらの被検体に対する親和性を低減された、もしくは全く示さないポリマーセグメントからなる。
【００５３】
いうまでもなく、いくつかの種類の上述の好適な変形が２つより多い異なる種類のポリマーセグメントを組み合わせることにより、もしくは異なるコポリマーの混合物の形態で、一緒に組み合わされる系も、本発明の範囲内である。このように、たとえば壁に対して親和性を示すポリマーセグメント、ある被検体に対し特異的な親和性を示すポリマーセグメントもしくは基、および壁もしくは被検体のいずれに対しても特異的な親和性を示さないポリマーセグメントを、本発明によるコポリマー内で組合わせることができる。さらに、例として、壁に対して親和性を示すポリマーセグメント、および壁もしくは被検体のいずれにも特異的な親和性を示さないポリマーセグメントからなるブロックコポリマー、ならびにある被検体に対し特異的な親和性を示すポリマーセグメントもしくは基、および壁もしくは被検体のいずれにも特異的な親和性を示さないポリマーセグメントからなるポリマーを、本発明による媒体内で組合わせることもできる。
【００５４】
本発明の好適な１態様において、所定の種類の化学的もしくは位相的性質のすべてのポリマーは平均で７５より多い、好ましくは２１０より多い、原子数を有するか、または１５００より大きい、好ましくは４５００より大きい分子量を有する。もっと好適な態様によれば、種々の種類のセグメントは、平均で７５より大きい、好ましくは２１０より大きい平均原子数、または１５００より大きい、好ましくは４５００より大きい分子量を有する。
【００５５】
好適な１態様によれば、分離媒体は液体からなり、本発明による少なくとも１つのポリマーは０．１ｗｔ％〜２０ｗｔ％、そして好ましくは１ｗｔ％〜６ｗｔ％の割合で溶解される。
【００５６】
ブロックコポリマーもしくはくし型ホモポリマーを使用することは本発明を実施するのに特に有利であり、そこでは少なくとも１種のセグメントが、ポリエーテル、ポリエステル、たとえばポリグリコール酸、たとえばポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレンもしくはポリオキシエチレンのようなポリオキシアルキレン型の溶解性ランダムホモポリマーおよびコポリマー、多糖類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリオキサゾリン、ポリスチレンスルホネートならびに置換もしくは非置換アクリルアミド、メタクリルアミドおよびアリルポリマーおよびコポリマー、から選ばれるポリマーを含む。
【００５７】
水性分離媒体中で壁に対して親和性をほとんどもしくは全く示さないポリマーセグメントの種類の典型例として、最も具体的には、ポリアクリルアミドおよびポリアクリル酸、ポリアクリロイルアミノプロパノ−ル、水溶性アクリルおよびアリルポリマーおよびコポリマー、デキストラン、ポリエチレングルコール、多糖類および種々のセルロース誘導体、たとえば、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリオキサゾリン、ポリスチレンスルホネート、およびヒドロキシル基をもつポリマー類、ならびに上述の誘導体のランダムコポリマーのすべて、が挙げられうる。
【００５８】
いうまでもなく、分離媒体に溶解性である他のポリマーセグメントも、該流体の性質、流路の壁、特定の用途、および所望の構造のブロックポリマーへの導入の容易さ、の性質を関数として、本発明により使用されうる。
【００５９】
水性溶媒に溶解し得る、もしくはし得ず、そして壁に対して特定の親和性をそこで示し得るポリマーセグメントの典型例として、ジメチルアクリルアミド、アルキル基でＮ−置換されたアクリルアミド、アルキル基でＮ，Ｎ−二置換されたアクリルアミド、アリルグリシジルエーテル、上述のアクリル誘導体同志、または該誘導体と他のアクリル誘導体、アルカン類、フルオロ誘導体、シラン類、フルオロシラン類とのコポリマー、ポリビニルアルコール、オキサゾリン誘導体を含むポリマーおよびコポリマー、さらに通常、炭素−炭素結合、エーテルオキシド基およびエポキシド基の組合せを有するポリ−、ならびにこれらの化合物のランダムコポリマーのすべて、が挙げられうる。
【００６０】
多くの種類のポリマーセグメントが、当業者に知られているすべての種類のポリマーから、特に水性媒体に溶解性であるポリマーから、意図される電解液の関数として、本発明によるポリマーを形成するポリマーセグメントを構成するために選定されうる。参照は、書籍である「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  」（Ｂｒａｎｄｒｕｐｔ  ＆  Ｉｍｍｅｒｇｕｔ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）についてなされうる。
【００６１】
本発明によるポリマーは天然もしくは合成でありうる。微細構造に関して許容する多様性および調節のための１つの好適な変形によれば、本発明によるポリマーは合成ポリマーである。
【００６２】
本発明にとくに適切なものは次のとおりである：
−くし型コポリマー型のコポリマー、その骨格はデキストラン、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノールもしくは（Ｎ，Ｎ）−ジ−メチルアクリルアミド型であり、その上に、アクリルアミド、置換アクリルアミドもしくは（Ｎ，Ｎ）−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）型、またはＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）コポリマー型、またはオキサゾリンもしくはオキサゾリン誘導体のホモポリマーもしくはコポリマー、のグラフト側セグメントがある；
−不規則な序列コポリマー型の非感熱コポリマーであり、その骨格に沿って、ポリオキシエチレン型のセグメントおよびポリオキシプロピレン型のセグメントの交互変化、またはポリオキシエチレン型のセグメントおよびポリオキシブチレン型のセグメントの交互変化、またはポリエチレンのセグメントおよびポリエーテル型のセグメント（それらはポリオキシエチレンよりも疎水性である）の交互変化を有する；
−不規則な序列ブロックポリマー型のコポリマーであり、その骨格に沿って、アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノールもしくはジメチルアクリルアミド型のセグメント、および一方では（Ｎ，Ｎ）−ジ−メチルアクリルアミド（ＤＭＡ）型、またはＤＭＡ／アリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）コポリマー型、またはオキサゾリンもしくはオキサゾリン誘導体のセグメント、の交互変化を有する；
−不規則なくし型ポリマー型のポリマーであり、その骨格はアガロース、アクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、もしくはアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー型、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー型、オキサゾリンおよびオキサゾリン誘導体、デキストラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、変性セルロース、多糖類またはエーテルオキシド型であり、そしてその上にアガロース、アクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイルアミノエタノール、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、もしくはアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー型、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー型、オキサゾリンおよびオキサゾリン誘導体、デキストラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、変性セルロース、多糖類、またはエーテルオキシド型のグラフト側セグメントがある；
−不規則な、くし型コポリマー型のコポリマーであり、その骨格はアクリルアミド、置換アクリルアミド、アクリル酸、アクリロイアルアミノエタノール、ジメチルアミド（ＤＭＡ），もしくはアリルグリシジルエーテル（ＡＧＥ）ポリマー型、ＤＭＡ／ＡＧＥランダムコポリマー型、オキサゾリンおよびオキサゾリン誘導体、デキストラン、アガロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、変性セルロース、多糖類またはエーテルオキシド型であり、そしてアルキル鎖、芳香族誘導体、フルオロアルキル、シランまたはフルオロシランのような短鎖疎水性側セグメントを担持する、
から選ばれる少なくとも１つのポリマーを含む。
【００６３】
大部分の用途において、本質的に中性である本発明のポリマーを使用するのが好ましいことが留意されるべきである。しかし、特定の用途、特に電荷および疎水性部分を含む種の吸着を避けるために、意図的に電荷、好ましくは該種の電荷と逆の電荷、を帯びた本発明ポリマーを選定するのが有用でありうる。
【００６４】
本発明により使用されるコポリマーの調製に関して、それは従来のいかなる重合もしくは共重合法によっても実行されうる。調製法の選択はコポリマーに望まれる構造、すなわちくし型もしくは線状構造、ならびに構成される種々のブロックの化学的性質を考慮することによりなされるのが通常である。
【００６５】
これらの調製法の変形の典型例として、該ポリマーが得られる次の方法がとくに挙げられうる：
−重縮合であり、同一もしくは異なるモノマーの、同一もしくは異なる巨大モノマーの、または同一もしくは異なるモノマーおよび巨大の混合物の、イオンもしくはフリーラジカル重合もしくは共重合、により、または
−同一もしくは異なる化学的性質を有する線状もしくは分枝ポリマー骨格上にいくつかのポリマーセグメントをグラフトすることによる。
【００６６】
好適には、本発明により使用されるコポリマーのすべてもしくはいくつかは、−ａ：末端の少なくとも１つに反応性基を含むモノマーもしくは巨大モノマーの共重合、または
−ｂ：構造に少なくとも１つの反応性基を含む巨大モノマーの共重合、
により得られうる。
【００６７】
本発明のために、「反応性基」（”ｒｅａｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）という用語は、この基を持つ分子が該共重合を妨害することなく共重合反応時に巨大分子に組入れられることを可能にする基を意味する。
【００６８】
上述の規定および好適な態様の助けにより、当業者は、１つの用途もしくは他の用途に望ましい分離特性の関数として、該ポリマーの構造、性質および調製法を適合させることにより、本発明によるコポリマーを調製することができる。さらに、本発明の主題は、試料に含まれる種を分離、分析および／または固定する方法であり、次の段階を実施することを特徴とする：
ａ／本発明よる分離媒体を分離装置の流路に充填すること、
ｂ／該種を含む該試料を該流路の一端に導入すること、
ｃ／試料に含まれる特定の種を移動させる外部場を用いること、ならびに
ｄ／試料の導入点とは異なる流路に沿った点で、該種を回収すること、またはそれらの通路を検出すること、
を含む。
【００６９】
１つの好適な変形において、細管充填段階と分析段階の間の温度を変える必要はない。
【００７０】
特定の用途に関して、分離溶媒は、本発明によるポリマーの外に、他の成分、特に種もしくは壁と相互作用する成分を含有しうる。この種の成分の多くは当業者に知られている。
【００７１】
本発明において、不規則なブロックコポリマー型のポリマーと立体的相互作用により、もしくは親和性により被検体と相互作用しうる他のポリマーとを分離媒体中で組み合わせることができ、その結果、単独で用いられた本発明ポリマーで得られたものに比べて性能が向上する。この場合、本発明による、もっと好適なポリマーは、これらのポリマーが単独で使用されるときよりも大きい、壁に対する特異的な親和性を示すポリマーセグメントの質量分率を有するものである。この分率は２０％〜８０％でありうる。
【００７２】
さらに本発明の主題は、分子もしくは巨大分子種、特に生物学的巨大分子、たとえば核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはオリゴヌクレオチド）、合成もしくは化学修飾により得られる核酸類縁体、タンパク、ポリペプチド、グリコペプチドおよび多糖類、有機分子、合成巨大分子もしくは粒子、たとえば鉱物粒子、格子（ｌａｔｔｉｃｅ）、細胞もしくは細胞小器官、から選ばれる種を分離、精製、ろ過もしくは分析するための、本発明による分離媒体の使用である。
【００７３】
電気泳動分析法の場合に、本発明はＤＮＡ塩基配列決定に特に有用であり、それについては、最小限のバンド幅が得られることを可能にする。さらに、タンパク、プロテオグルカン、もしくは細胞を分離するのに特に好適であり、それについては、壁上への吸着の問題が特定の不利であり、解決が特に困難である。有利なことには、本発明の媒体は、少なくとも１つの寸法がサブミリメートルのサイズである流路に使用されうる。
【００７４】
装置に関して、本発明の媒体は微小流体系について特に有利である。なぜなら、永続的な処理を得るために流路表面に対して良好な親和性を示す、ブロック、ならびに分離されるべき種に対して良好な反発を示すブロックを、該種と該流路の化学的性質とにかかわりなく、ポリマー内で種々のブロックの最適の種類を選択することにより組合わせることを、それが可能にするからである。
【００７５】
本発明による媒体およびこれらの媒体を用いる分離法は、電気泳動分離および診断用途、遺伝子の型検出（ｇｅｎｅ ｔｙｐｉｎｇ）、および大流量スクリーニング、品質調節のために、または製品中の遺伝学的に変成された微生物の存在を検出するために、特に有利である。
【００７６】
実際に、本発明に関して考慮中の分離媒体が構成されるポリマーはいくつかの点で有利であることがわかる。
【００７７】
第１に、「ブロックポリマー」の性質を示すそれらの能力は、異なる化学的性質のポリマーに属するが、ホモポリマーもしくはランダムコポリマーに必ずしも結合され得ない、ような性質をそれらに結合させることができる。このように、それらは、第１に分離されるべき種の関数として、そして第２に分離が実施される流路の化学的性質の関数として、分離媒体の化学的性質にもっと柔軟に適合することができる。こうして、それらは、ポリマーもしくはエラストマー、たとえばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートもしくはポリイミド、または鉱物材料、たとえばガラス、セラミックス、ケイ素、ステンレス鋼、もしくはチタン、からなる流路を用いる用途、ならびに壁が溶融シリカで作成されるもっと伝統的な用途、の双方に特に有利である。
【００７８】
従来技術のブロックコポリマーと比べて、本発明によるポリマーは、分離能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ）の点で優れた性能をさらに示し、それはその不規則な性質、すなわち、本発明によるポリマーの一部を形成するポリマーセグメントの多分散性に関与しているのであろう。従来技術で用いられている一連のブロックコポリマーは、規則的に間隔をあけたセグメントを含有し、および／または選択され、本質的に均一な長さを有する（すなわち低い多分散性）コポリマーを意図的に含むので、この特徴は特に驚くべきことである。さらに、本発明によるポリマーにおけるセグメントのこの多分散性は、配合におけるコストおよび柔軟性の点でさらに利点を示す。なぜなら、そのような多分子セグメントを含有するポリマーはもっと効率的であるばかりでなく、調製するのがもっと容易であるからである。特に、それらは高い分子量で調製されうる。
【００７９】
壁に対する種の電気浸透もしくは相互作用の減少が望まれる用途において、本発明によるポリマーは、壁に対する有意の親和性を示す数多くのポリマーセグメントの構造の存在のために、高い吸着エネルギーを有し、そして永続的な態様で種の電気浸透および吸着を低減させることができる。
【００８０】
最後に、線状骨格の、そして多数の接合点の組合せは、本発明による分離媒体に、局部的な規模でゲルの性質をいくらか付与しそうであるが、それは分離効率の点で有利であり、同時に、特に流動性、線状ポリマーにも匹敵しうる性質、に関して、それらを大規模に変換する。
【００８１】
以下に示す図および例は本発明の非制限的な例示として表される。
例１  本発明によるコポリマーの調製のために１０，０００の領域の分子量を有する機能化ＰＤＭＡ巨大モノマーの調製
１）ＰＤＭＡの重合
Ｎ，Ｎ−ジメチル−アクリルアミド（ＤＭＡ）のフリーラジカル重合が純水中で実施された。開始剤はレドックスカップルであり、それについて酸化剤は過硫酸カリウムＫ２Ｓ２Ｏ８（ＫＰＳ）であり、そして還元剤はアミノエタンチオールＡＥＴ・ＨＣｌである。開始反応は次のとおりである。
Ｋ２Ｓ２Ｏ８＋２Ｃｌ−，ＮＨ３＋−ＣＨ２ＣＨ２−ＳＨ→２ＫＨＳＯ４＋２Ｃｌ−，ＮＨ３＋−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ＋
ＡＥＴ・ＨＣｌも転移剤（ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｇｅｎｔ）として作用し、鎖長を調節させる。
手順
ＤＭＡ０．１８モルおよび水２００ｍＬが、三つ口フラスコに入れられ、その上に凝縮器が取付けられ、そして窒素注入口を備える。ついで、混合物は攪拌され、水浴で２９℃に加熱される。窒素での分散が開始される。４５分後に、水２０ｍＬに予め溶解されたＡＥＴ・ＨＣｌ０．６１ｇ（０．００５４モル）が添加され、ついで最小量の水に溶解された過硫酸カリウム（ＫＰＳ）０．００１８モルが添加される。混合物は３時間、攪拌される。ついで溶液は濃縮され、凍結乾燥される。
【００８２】
ポリマーを単離するために、沈殿が次の手順にしたがって実施される：
得られる固体はメタノール１００ｍＬに再溶解される。存在する塩化水素は溶液に滴下して配合されるＫＯＨ０．００５４モル（すなわちメタノール約２５ｍＬに溶解された０．３０ｇ）を添加することにより中和される。生成される塩であるＫＣｌが沈殿し、ろ過により分取される。そして、回収されるろ液は濃縮され、エーテル４Ｌに滴下して注がれる。沈殿ポリマーはＮｏ．４燒結漏斗によりろ過して回収される。ついで固体はベーンポンプ（ｖａｎｅ−ｐｕｍｐ）真空下で乾燥される。質量収率は約５０％である。
【００８３】
上述のプロトコールは「ＰＤＭＡ」として知られるアミノポリマーを生成させ、開始剤／モノマー比Ｒ０＝０．０３およびＡ０＝０．０１に相当し、ここで
Ｒ０＝［Ｒ−ＳＨ］／［ＮＩＰＡＭ］およびＡ０＝［ＫＰＳ］／［ＮＩＰＡＭ］である。
２）アミノＰＤＭＡの変性
合成されたＰＮＩＰＡＭ巨大分子は鎖末端にアミン基を含み、これらの鎖は開始剤であるアミノエタンチオールＡＥＴ・ＨＣｌに由来する。
【００８４】
アミン基のアクリル酸との反応により、ビニル二重結合は次の反応スキームにしたがって鎖末端に結合される：
【００８５】
【化１】
2004502172.tif 000002
【００８６】
手順：
塩化メチレン５０ｍＬ、アクリル酸１．５ｇ（０．０２１モル）、ＰＤＭＡ９ｇおよびジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）（０．０２１モル）が１００ｍＬビーカーに入れられる。
【００８７】
反応媒体は１時間攪拌される。アクリル酸はＰＤＭＡに対し大過剰であるので（アクリル酸の量はＰＤＭＡの量の約２０倍である）、すべてのアミノ基は変性されている。ついで混合物はＮｏ．４燒結漏斗でろ過され、ＤＣＣＩの変換から得られる副生物である沈殿ジシクロへキシルウレアを除去する。精製はエーテルからの沈殿により実施される。
【００８８】
鎖端にアリル基を有する巨大モノマーＰＤＭＡ−１は質量収率約７０％であり、このようにして得られる。
【００８９】
このようにして調製され、ＳＥＣ（立体排除クロマトグラフィー）により測定される巨大モノマーの平均モル質量（ｍｏｌａｒ ｍａｓｓ）および多分散性は、それぞれ１５，０００のオーダーおよび２である。
例２
アクリルアミド骨格およびＰＤＭＡグラフトを有し、分子量１５００キロダルトンのコポリマーＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−１の調製
アミノＰＤＭＡ（０．４ｇ）およびアクリルアミド（２．８ｇ）の共重合が、室温で水５０ｍＬ中で４時間実施され、同時にアルゴンで強く脱気される。使用される開始剤は、過硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ８）［モノマーの量の０．０７５モル％］／二亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）（モノマーの量の０．０２２５モル％）のレドックスカップルである。得られるコポリマーはアセトンからの沈殿により精製され、そして真空下に乾燥される。その分量は１，５００キロダルトンであり、そしてその多分散性Ｍｗ／Ｍｎは約２である。プロトンＮＭＲで測定された巨大モノマーの配合度は約６％であり、骨格上の側枝の平均数約６に相当する。
【００９０】
使用されるフリーラジカル重合法のために、側鎖を構成する巨大モノマーは、分子間の衝突により偶然に決定されるランダムな位置でポリマー鎖に組込まれる（ランダム分布）。この重合法はおよそ指数の形（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｓｈａｐｅ）の２つの側枝の間に骨格のポリマーセグメントの分子量分布をもたらし、そして１．８を大きく超える骨格の該ポリマーセグメントの多分散性をもたらす。
例３
種々の分離媒体中のＮａ  ＴＡＰＳ１００ｍＭ，ＥＤＴＡ２ｍＭ，尿素緩衝液７Ｍで、５０℃において一本鎖ＤＮＡ（５０〜５００ｂｐサイザー（ｓｉｚｅｒ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）について得られた分離特性。
【００９１】
それは視覚的に（図４）、そして分離能測定（図５）によりもっと定量的に、本発明のＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２による分離媒体が側枝を有さない同一のポリマー骨格に対して（ＰＡＭ，図２および５）、さらに線状ＰＤＭＡにもとづく商業的製品に対しても（ＰＯＰ６、図３および５）分離能を改良する、ことが観察される。分離時間も低減され、それは本発明による媒体の付加的な利点でもある。大きな部分のアクリルアミドおよび比較的小さな部分のＰＤＭＡを含む、本発明によるポリマーは、本発明を特徴づける該部分の特定の配置のために、ホモポリマー形態におけるそれぞれの該成分のものに比べて優れた性質を有することは意外であるが有利である。
例４
アクリルアミド骨格およびＰＤＭＡグラフトを含み、分子量約３，０００キロダルトンのコポリマーＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２の調製。
【００９２】
調製は（（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ８）の濃度（モノマーの量の０．０７５モル％の代わりに０．１モル％）および（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）の濃度（モノマーの量の０．０２２５モル％）および（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）の濃度（モノマーの量の０．０２２５モル％の代わりに０．０１５モル％）を除けば、例２に記載されたのと同一である。図６に示される粘度は、結合された（ｉｎｔｅｒｌｏｃｋｅｄ）ポリマーについての分子量の関数として粘度の３次依存関係を用いて、Ｐ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−１のものから開始して、約３，０００キロダルトンの分子量を評価することを可能にする。
例５
ＰＤＭＡグラフトを有する、分子量約３０，０００のコポリマーＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−３の調製。
【００９３】
第１段階において、分子量３０，０００の巨大モノマーが、０．０３の代わりに０．０１５に設定される比Ｒｏの５を除けば例１に記載されるように調製される。この巨大モノマーは、ついで例４に記載されるプロトコールに従ってアクリルアミドと重合される。
例６
例２、４および５に記載されるポリマー、およびさらに線状アクリルアミドホモポリマーで得られる３％溶液の粘度測定。
【００９４】
この例で各ポリマーは３ｇ／１００ｍＬの率で精製水（ＭｉｌｌｉＱ）に導入された。対応する各溶液の粘度がＲｈｅｏｃａｌｃソフトウェア（Ｓｅｄｅｘｉｍ，Ｍｕｉｚｏｎ，Ｆ）により運転されるＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＤＶ３コーンプレートレオメータにより測定された。選ばれるせん断速度は１℃／分の温度勾配で１０（１／ｓ）である。本発明によるコポリマーは感熱性の性質を有さず（それらの粘度は温度とともに小さく、均一な低下を示す）、そして適度の粘度を有することが図６に観察される。さらに、コポリマーの構造および性質は重合条件を調節することにより変動されうることも観察される。
例７
例２，４および５に記載されるコポリマーにもとづく本発明による媒体中で、ならびに比較のために線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）および市販の分離媒体「ＰＯＰ５」（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、一本鎖ＤＮＡフラグメントの電気泳動分離。
【００９５】
分離条件は試料が１００〜１５００塩基の「サイザー」であることを除いて例４と同一である。配列決定にもとづく有利な範囲において（フラグメントサイズ６００〜１０００）、本発明によるコポリマーにもとづく媒体、とくに３％の分離媒体における質量濃度に相当するもの、は従来技術のポリマーで得られたものよりも著しく優れる分離能をもたらすことが図７で観察される。０．３〜０．５のオーダーの分離能が１塩基内でＤＮＡの配列決定をするのに十分であることを考慮すると、本発明による媒体は８００塩基より大きい長さを読み取ることを可能にすべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
不規則な序列ブロックコポリマーの概略図。太線は１種の化学的性質に相当し、そして細線はもう１つの種類の化学的性質に相当する。
【図１ｂ】
不規則な、くし型ポリマーの概略図。太線は１種の化学的性質に相当し、そして細線はもう１つの種類の化学的性質に相当する。
【図１ｃ】
不規則な、くし型コポリマーの概略図。太線は１種の化学的性質に相当し、そして細線はもう１つの種類の化学的性質に相当する。
【図２】
未処理細管、および分離媒体として、Ｎａ　ＴＡＰＳ　１００ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、尿素緩衝液７Ｍを用いて（そこではポリアクリルアミド型の市販ホモポリマー（分子量７００，０００−１，０００，０００）５％が溶解される）、ＡＢＩ３１０機械（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で５０℃において得られる、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｋ５０〜５００ｂｐサイザーの分離を示す対照電気泳動図。種々のピークに相当するＤＮＡサイズは塩基数として図に示される。
【図３】
ＢＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの市販分離媒体「ＰＯＰ６」で、図２における同一の条件下での分離を示す対照電気泳動図。
【図４】
Ｎａ  ＴＡＰＳ  １００ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、尿素７Ｍの分離媒体（そこでは図２に記載されるＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２くし型コポリマー５％が溶解される）を用いて、図２におけるのと同一の条件下での分離を示す電気泳動図。種々のピークに相当するＤＮＡサイズは塩基数として図に示される。
【図５】
分離媒体として以下のものを用いて、ＡＢＩ３１０機械（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で５０℃において得られる１塩基〜５００塩基で異なるピーク間で計算される分離能の比較：
ａ：ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの市販分離媒体「ＰＯＰ６」．
ｂ：Ｎａ  ＴＡＰＳ  ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、尿素緩衝液７Ｍ、そこでは線状アクリルアミド（分子量７００，０００〜１，０００，０００）５％が溶解されている。
ｃ：同一の緩衝液、そこでは例２に記載される本発明のＰ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２が５％が溶解されている。
【図６】
線状アクリルアミド（ＬＰＡ）の、ならびに例２により調製された本発明のポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−１によるコポリマー、例４により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２、および例５により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−３の、３％溶液の粘度。
【図７】
線状アクリルアミドの、市販ポリマー（ＰＯＰ５）の、ならびに例２により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−１によるコポリマー例４により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−２および例５により調製されたポリ（ＡＭ−ＰＤＭＡ）−３の、３％および５％での溶液における、ＤＮＡ電気泳動分離時に得られる分離能。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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