(57)【要約】本発明は、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体であって、第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインに対してアフィニティーを有する阻害抗体に対する抗イディオタイプ抗体およびその断片を開示する。本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、インビトロおよびインビボのマウスモデルにおいて、ＦＶＩＩＩインヒビターの阻害活性を完全に中和することができる。本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインに対する阻害抗体を有する血友病患者の出血障害を予防、治療または軽減するために適用することができる。
2006515565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に対するモノクローナル抗イディオタイプ抗体であって、前記阻害抗体が第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインに対するものである、モノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項２】
さらに、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体によってもたらされるＦＶＩＩＩの凝血活性阻害を少なくとも５０％中和することができることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項３】
リン脂質および／またはｖＷＦへのＦＶＩＩＩの結合を阻害しない、請求項１または２に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項４】
前記第ＶＩＩＩ因子阻害抗体が、ＶＨ１遺伝子ファミリーに由来するＤＰ５  ＶＨ遺伝子セグメントによってコードされている可変部重鎖ＶＨドメインを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項５】
第ＶＩＩＩ因子阻害抗体がＢＯ２Ｃ１１である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項６】
前記抗体の可変部重鎖および軽鎖の相補性決定領域が、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０に示されたアミノ酸配列の１つに７０％以上の配列同一性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項７】
前記抗イディオタイプ抗体の可変部重鎖が、配列番号：１に示された塩基配列もしくは配列番号：１に７０％以上配列が同一である塩基配列にコードされ、および／または、抗イディオタイプ抗体の可変部軽鎖が、配列番号：３に示された塩基配列もしくは配列番号：３に７０％以上配列が同一である塩基配列にコードされている、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項８】
Ｆ（Ａｂ’）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、または前記断片を改変したものである、請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項９】
ヒト化モノクローナル抗イディオタイプ抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項１０】
１４Ｃ１２、またはそれから派生した抗体である、請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項１１】
配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０より選択されたアミノ酸配列を有するペプチドに、アミノ酸配列において７０％以上同一である、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０より選択されたアミノ酸配列を有する、単離精製ペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体を発現する、モノクローナル細胞株。
【請求項１３】
ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ５８７８ＣＢとして寄託された細胞株１４Ｃ１２である、
請求項１２に記載のモノクローナル細胞株。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体、または請求項１２に記載の精製単離ペプチドを、少なくとも１種類の医薬的に許容される担体と混合して含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体、または請求項１２に記載の精製単離ペプチドの薬剤としての使用。
【請求項１６】
ＦＶＩＩＩ阻害抗体の作用を患う患者を治療する方法であって、治療上有効な用量の請求項１４に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
ＦＶＩＩＩ阻害抗体を有する患者における抑制できない出血を治療または予防する方法であって、治療上有効な用量の請求項１４に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
ＦＶＩＩＩを前記患者に投与することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が血友病患者である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＶＩＩＩインヒビターに対する薬剤を製造するためのモノクロナール抗イディオタイプ抗体を開発するための方法であって、第８因子のＣ２ドメインに対する阻害抗体によって動物を免疫することと、ａ）ＦＶＩＩＩインヒビターの抗凝血活性を５０％以上中和し、ｂ）ＦＶＩＩＩがｖＷＦおよびリン脂質に結合することと相互作用しない抗体を作製するために、前記動物の不死化脾臓細胞をスクリーニングすることとを含む、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗イディオタイプ抗体の、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を検出または精製するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血友病の治療、特に、Ｃ２ドメインに対するＦＶＩＩＩインヒビターを発症したヒト患者を治療するための薬学的組成物に関する。本発明は、Ｃ２ドメインに対するＦＶＩＩＩインヒビターに対する抗イディオタイプ抗体を提供する。さらに、本発明は、このような抗イディオタイプ抗体を発現するモノクローナル細胞系に関する。また、本発明は、本発明に係る抗イディオタイプ抗体を含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは、肝臓によって２３３２アミノ酸の一本鎖ポリペプチドとして産生される３３０ｋＤの糖タンパク質分子である機能的第ＶＩＩＩ因子が欠乏または十分量存在しないという特徴をもつＸ染色体連鎖疾患である。この欠乏症は、男性１０，０００人に１人の割合で起き、関節、筋肉および軟組織における出血を抑制できなくなることがある。本病の重篤な型（ＦＶＩＩＩ活性が正常量の１％よりも少なくなる）を患う患者は自然出血に苦しむ。同様にＦＶＩＩＩ活性が１〜５％、または５％よりも高い患者は、それぞれ中度または軽度血友病Ａと規定され、小さな外傷や手術の後、限定的な出血に悩まされる。血漿から調製されるか、組換えｃＤＮＡ技術によって製造されるＦＶＩＩＩ濃縮液を投与することによって凝血経路を回復させることができる。
【０００３】
ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子は、Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：３３０−３３７など、さまざまな著者によって報告されているように、すでに単離され、哺乳動物細胞の中で発現されており、また、そのアミノ酸配列もｃＤＮＡから推定されている。米国特許第４，９６５，１９９号は、哺乳動物宿主細胞においてＦＶＩＩＩを産生するＤＮＡ組換え法およびヒトＦＶＩＩＩ精製法を開示している。ヒトＦＶＩＩＩの詳細な構造が広範に研究されている。例えば、米国特許第５，６６３，０６０号には、ヒトＦＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡの塩基配列および推定アミノ酸配列が開示されている。ＦＶＩＩＩ分子には、内部アミノ酸配列相同性によって規定される一連のアミノ酸配列として、また、トロンビンなど適当なプロテアーゼによるタンパク質切断部位として規定することができるドメインがある。ＦＶＩＩＩタンパク質は、さまざまなドメインからなると記述されており、ヒトのアミノ酸配列では、残基番号１〜３７２のＡ１；残基番号３７３〜７４０のＡ２；残基番号７４１〜１６４８のＢ；残基番号１６９０〜２０１９のＡ３；残基番号２０２０〜２１７２のＣ１；残基番号２１７３〜２３３２のＣ２に相当する。残りの配列、残基番号１６４９〜１６８９は、通常、ＦＶＩＩＩ軽鎖活性化ペプチドと呼ばれている。Ｋａｕｆｍａｎら（１９８８、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：６３５２−６３６２）によると、ＦＶＩＩＩは、細胞内で処理される際、Ａ１、Ａ２およびＢドメインを含む重鎖と、Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインからなる軽鎖とからなるヘテロダイマーを形成するために分泌された後速やかに切断される一本鎖ポリペプチドとして産生される。この二本の鎖は二価カチオンによって非共有結合されている。Ｇａｎｚら（１９８８、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７０：５２１−５２８）の教示するところによれば、この一本鎖ポリペプチドもヘテロダイマーも、不活性前駆体として血漿内を循環する。Ｅａｔｏｎら（１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２）によれば、血漿内で第ＶＩＩＩ因子が活性化されると、トロンビンによるＡ２ドメインとＢドメインの間での切断が開始し、Ｂドメインが放出されて、Ａ１およびＡ２ドメインからなる重鎖ができる。ヒト組換えＦＶＩＩＩは、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＢＨＫ（ベイビーハムスター腎臓）細胞、その他同等の細胞などの哺乳動物細胞において遺伝子組換えによって生産することができる。
【０００４】
Ｐｒａｔｔら（１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：４３９−４２）は、ヒトＦＶＩＩＩのカルボキシ末端側Ｃ２ドメインの詳細な構造を開示しているが、それは、フォン・ヴィルブラント因子（ｖＷＦ）およびマイナスに荷電したリン脂質表面にそれが結合するために必須な部位を含んでいる。この構造は、そこから２個のβターンと１個のループが一群の溶媒曝露疎水性残基を提示するβサンドイッチコアが存在することを示しているが、この構造が、血友病Ａにおける出血障害をもたらすＣ２領域における変異を一部説明している。Ｇａｌｅら（２０００、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８３：７８−８５）によれば、第ＶＩＩＩ因子欠乏症および血友病Ａをもたらす少なくとも２５０種類のミスセンス変異のうち３４個がＣドメインに存在する。
【０００５】
ＦＶＩＩＩは、血液凝固カスケードの内因系の補助因子であり、いわゆる第Ｘ因子活性化複合体（ｔｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）形成において、活性化第ＩＸ因子の第Ｘ因子に対するタンパク質分解活性を増加させることによって作用する。血友病Ａを患う患者は、重病型では自然出血、または中度／軽症型では外傷の後に出血を起こす。
【０００６】
血友病Ａ患者には、通常、補充療法による治療を行うが、これは、供血者の血漿プールから精製したか、ｃＤＮＡ組換え技術によって得られたヒトＦＶＩＩＩを注入して行われる。
【０００７】
大部分の患者は、これらの注入液に対して免疫学的に不応答であるが、まだ未解明の理由によって、２５％の患者がＦＶＩＩＩに対するＩｇＧ免疫反応を起こして、注入されたＦＶＩＩＩの凝血促進活性を完全に阻害することがある（Ｂｒｉｅｔ  Ｅら、（１９９４）Ｔｈｒｏｍ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７２：１６２−１６４；Ｅｈｒｅｎｆｏｒｔｈ  Ｓら、（１９９２）Ｌａｎｃｅｔ，３３９：５９４）。このような特異的ＩｇＧは、ＩｇＧの１、２、４サブクラスに属し、ＦＶＩＩＩインヒビターと呼ばれる。公表された研究では、抗ＦＶＩＩＩ免疫反応は、ポリクローナルであって、主に、Ａ２、Ａ３およびＣ２ドメインに対するものであることが実証されている（Ｓｃａｎｄｅｌｌａ  Ｄら、（１９８９）Ｂｌｏｏｄ，７４：１６１８−１６２６；Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧら、（１９９３）Ｂｌｏｏｄ，８２：２４５２−２４６１）。
【０００８】
インヒビター発症患者の末梢記憶Ｂ細胞のレパートリーから得られたヒトモノクローナル抗体を用いた最近の研究によって、重要なエピトープがＣ１ドメインにも存在していることが示された（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  Ｍら、（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５：１５６−１６３）。抗ＦＶＩＩＩ抗体がＦＶＩＩＩの機能を阻害するメカニズムは、ＦＶＩＩＩのタンパク質分解による切断や、フォン・ヴィルブラント因子（ｖＷＦ）、リン脂質（ＰＬ）、ＦＩＸ、ＦＸａまたはＡＰＣなど、さまざまなパートナーとの相互作用など数多くある。これらのメカニズムのほとんどが、今では、マウスまたはヒトの抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いた研究において十分に説明されている。このように、抗体は、タンパク質分解的切断部位に結合するか、または、タンパク質分解を受けにくくするようにＦＶＩＩＩの３次元立体構造の変化を誘導することによって、ＦＶＩＩＩの活性化速度を低下させることができる。主要なｖＷＦ結合部位の１つであるＣ２ドメインに対するヒトモノクローナル抗体を用いた最近の研究で明らかにされたように、ｖＷＦのＦＶＩＩＩへの結合を阻害する抗体は、インヒビターとして非常に有効であると思われる（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  Ｍら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：４９６−５０１）。インヒビターの産生を抑制することと、ＦＶＩＩＩに対する免疫不応答状態を確立することは、いまだに主な目標となっているが、基本的には、特異的な抗体産生と制御の根本にあるメカニズムの解明が限られたものであるため、医学界は、この目標の達成からは程遠い状態にある。
【０００９】
現在、このような免疫反応を調節するために、デスモプレシン（ＤＤＡＶＰ）などのバイパス剤、プロトロンビン複合体濃縮液（ＰＣＣ）または活性化ＰＣＣなどの凝血促進剤
、組換えＦＶＩＩａ、血漿交換、および大投与量または中間投与量（それぞれ、２００−３００  ＩＵ／ｋｇ体重、または２５−５０  ＩＵ／ｋｇ体重）のＦＶＩＩＩ注入など、いくつかの治療法が用いられる。しかしながら、これらの方法はいずれも満足の行くものではなく、すべて大変な費用がかかる。
【００１０】
これらの観察結果、および免疫寛容のメカニズムについての理解に基づけば、抗イディオタイプ抗体は、インヒビター発症患者を治療する有望な方法と考えられる。実際、自己タンパク質に対する寛容が、まず、初期段階で、それぞれ骨髄および胸腺において、自己反応性のＢ細胞およびＴ細胞によって誘導されることが十分に確認されている。しかし、すべての自己反応性リンパ球が中央の除去によって消滅するわけではない。自己反応性Ｂ細胞は、低親和性または中親和性の自己反応性Ｔ細胞同様、末梢血に共通する特徴である。このような自己反応性細胞を非機能化するか、または末梢から除去するメカニズムがいくつか説明されてきた。抗イディオタイプ抗体は、抗体の機能を微調整したり、Ｂ細胞およびＴ細胞上に発現される相補性イディオタイプ間の微妙な平衡を維持したりすることができるため、この一般的なスキームにおける寛容維持の第三段階を代表しうる。
【００１１】
抗イディオタイプ抗体が、末梢において、どのように制御作用を発揮できるかをうまく示すものとして、ＦＶＩＩＩが正常レベルにある健常な個体が、かなり高い力価のＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を産生するが、相補的な抗イディオタイプ抗体が存在するため、血漿中ではその活性を検出できないと実証されたことが挙げられる（Ａｌｇｉｍａｎ  Ｍら、（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：３７９５−３７９９；Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧら、（１９９４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９４：１４９６−５０５）。しかし、このようなＦＶＩＩＩ阻害活性は、クロマトグラフィーと、不溶化ＦＶＩＩＩに対する特異的免疫吸着法を併用して精製すれば、簡単に検出することができる。ベセスダアッセイ法（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ａｓｓａｙ）によって測定したところ、アフィニティー精製された抗体がＦＶＩＩＩ阻害能力をもつことが、インヒビターを高レベルでもつ血友病Ａ患者の血漿から精製された抗ＦＶＩＩＩ抗体のＦＶＩＩＩ阻害能力に等しいことが実証された（Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧら、（１９９４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９４：１４９６−５０５）。
【００１２】
また、このような中和抗イディオタイプ活性は、ＦＶＩＩＩの高用量投与によって減感作に成功した患者グループにおいても検出されている（Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧら、（１９９６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９７：１３８２−１３８８）。この研究は、ベセスダアッセイ法を用いた、血漿におけるインヒビターの濃度測定値が検出不能レベルまで低下しても、健常なドナーと同じ処理によって精製された抗ＦＶＩＩＩ抗体の濃度は減感作の過程で変化しなかったこと、および、抗体が、ＦＶＩＩＩの凝血促進作用を阻害する能力を維持したことを明らかにした。これは、ＦＶＩＩＩ分子に対する寛容において、抗イディオタイプ制御が重要な機能をもつ可能性があることを示していた。したがって、ＦＶＩＩＩインヒビターを発症した患者の治療において、抗イディオタイプ抗体の増産を誘導する新規の治療法が関心を呼ぶ可能性がある。この線に沿った最初のアプローチでは、ＦＶＩＩＩとＦＶＩＩＩに対する特異的自己抗体から作られた免疫複合体を注射して患者を治療し、その結果、循環系のＦＶＩＩＩインヒビターの量が有意に低下し、対応する抗イディオタイプ抗体によって中和されたという研究が報告されている（Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧ，Ａｒｎｏｕｔ  Ｊ．、第２１回世界血友病連盟国際会議（ＸＸＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ）、１９９４年４月、要旨）。このようなアプローチによって、ＦＶＩＩＩインヒビターを標的とする新しい治療法であって、現在利用可能な治療法と比較して低コストになる可能性のある方法に向かう道を開くことができる。
【００１３】
本発明者らの研究室での以前の発見では、抗イディオタイプ抗体は、抗ＦＶＩＩＩ免疫
応答のホメオスタシスにおいて生理学的性質を発揮することを明らかにしていた。すなわち、健康な個体の末梢血は、ＦＶＩＩＩに特異的な抗体を含んでいるが、その中にはＦＶＩＩＩの凝血促進作用を阻害する性質をもつものがある（Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧＧおよびＳａｉｎｔ−Ｒｅｍｙ  ＪＭＲ（１９９４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９４：１４９６−１５０５）。これらの個体においては、特異的な抗イディオタイプ抗体によって抗体によるＦＶＩＩＩ阻害が中和されるため、ＦＶＩＩＩの機能は実際には変化しない。このため、我々は、抗イディオタイプ抗体は、正常なＦＶＩＩＩ活性の維持に生理学的な関連性を有すると結論した。
【００１４】
さらに、本発明者らは、インヒビターを有する血友病Ａ患者を、減感作または寛容誘導とも呼ばれる治療法である（上記参照）、常法どおりに高用量ＦＶＩＩＩを注入して治療すると、このような注入の生物学的結果の１つとして、インヒビターを中和できる特異的抗イディオタイプ抗体の誘導が起きる（Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧら、（１９９６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９７：１３８２−１３８８）。これらの知見は、抗イディオタイプ抗体の使用が、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を制御するための有益なアプローチとなりうることを示唆している。
【００１５】
ヒトモノクローナル抗体ＢＯ２Ｃ１１は、インヒビター発症患者の天然のレパートリーに由来するＦＶＩＩＩ特異的ＩｇＧ４κ抗体である（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ＭＧら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：４９６−５０６）。抗体ＢＯ２Ｃ１１は、Ｃ２ドメインを認識して、ＦＶＩＩＩが、ｖＷＦおよびリン脂質（ＰＬ）に結合するのを阻害する。この抗体は、ヒト阻害抗体の主要なクラスを代表するものである。その作用機作は、インヒビター発症患者においてはよく存在し、Ｃ２特異的抗体が最も高頻度で見られる阻害抗体である。さらに、抗体のＦａｂ断片とＣ２ドメインから作成された結晶のＸ線解析によって、Ｃ２ドメイン上にある、抗体ＢＯ２Ｃ１１の正確な結合部位が解明されている（Ｓｐｉｅｇｅｌ  Ｐ．Ｃ．  Ｊｒ．ら、（２００１）Ｂ１ｏｏｄ  ９８：１３−１９）。
【００１６】
以前の報告に、抗ＦＶＩＩＩ抗体に対する抗イディオタイプ抗体が記載されている。ＬｕｂａｈｎとＲｅｉｓｎｅｒ（１９９０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：８２３２−８２３６）は、塩沈殿法およびクロマトグラフィーによって、インヒビターを発症した血友病Ａ患者の血漿からヒト抗ＦＶＩＩＩ抗体を部分精製した。これらの著者は、精製したＩｇＧが、天然のＦＶＩＩＩの重鎖と、それをトロンビン分解した４３ｋＤａの鎖を認識したことを明らかにした。抗イディオタイプ抗体を得るために、この調製物（ＳＰ８．４）をマウスに注射した。いくつかのクローンが得られたが、そのうちの１つ、Ｍａｂ２０−２Ｈは、抗ＦＶＩＩＩ抗体による重鎖への結合を阻害した。機能的アッセイ法では、Ｍａｂ２０−２Ｈを高濃度で加えたとしても、ＳＰ８．４  ＩｇＧ画分の阻害活性を変更できなかった。Ｍａｂ２０−２Ｈは、検査した血友病インヒビター血漿の３．２％において抗体を検出したが、阻害活性を中和することはなかった。著者らは、Ｍａｂ２０−２Ｈが、ＦＶＩＩＩ分子の４３ｋＤａ鎖（Ａ２ドメイン）に対する抗ＦＶＩＩＩ非阻害抗体を認識したと結論した。
【００１７】
別の抗イディオタイプ抗体（Ｂ６Ａ２Ｃ１）が作成されて、本発明者らの研究室によって説明がなされた（Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧら、（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９４、要旨２０４８：４６０ａ）。この抗イディオタイプ抗体は、抗ＦＶＩＩＩ  Ｃ１ドメインのインヒビターに対するものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、（原発性または後天性の）血友病を患うヒト患者であって、ＦＶＩＩＩに対するインヒビターを発症した患者に使用するための医薬組成物を提供することであ
る。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、ヒトＦＶＩＩＩインヒビターに対する中和抗体を作製するための細胞株、および中和抗体を提供することである。
【００２０】
本発明の第一の局面において、ヒト第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインに対する阻害抗体であるヒト第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に対するモノクローナル抗イディオタイプ抗体が提供される。本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体によってもたらされるＦＶＩＩＩ凝血促進活性の阻害を、少なくとも５０％、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上中和することができるという特徴をもつ。
【００２１】
本発明のさらなる局面において、抗イディオタイプ抗体は、ＶＨ１ファミリーに由来するＶＨ生殖細胞セグメントＤＰ−５によって重鎖をコードされているＦＶＩＩＩ阻害抗体に対するものである。本発明のさらに別の局面において、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体はＡｂ
ＢＯ２Ｃ１１である。
【００２２】
また、本発明は、ヒト化抗イディオタイプ抗体に関する。
【００２３】
また、本発明は、例えば細胞株１４Ｃ１２から得ることのできるモノクローナル抗イディオタイプ抗体にも関係する。細胞株１４Ｃ１２は、２００２年７月３０日に、ＬＭＢＰ（プラスミドコレクション、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ，Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ  ３５，９０００  Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）のベルギー微生物協調収集機関（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ＢＣＣＭ）に、寄託番号ＬＭＢＰ  ５８７８ＣＢとして寄託された。
【００２４】
さらに、本発明は、抗イディオタイプ抗体の可変部重鎖が、配列番号：１に示した塩基配列、または配列番号：１に対し７０％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、より好ましくは９０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９５〜９９％以上の配列同一性を有する塩基配列によってコードされているか、および／または、該抗イディオタイプ抗体の可変部軽鎖が、配列番号：３に示した塩基配列、または配列番号：３に対し７０％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、より好ましくは９０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９５〜９９％以上の配列同一性を有する塩基配列によってコードされている抗イディオタイプ抗体に関係する。特に、これらの塩基配列には、遺伝子暗号の重複によって判定すると、配列番号：１および配列番号：３において特定されているトリヌクレオチドと同じ意味を持つトリヌクレオチドを使用していて、それによって、好ましくは、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を中和する能力を保持している塩基配列も含まれる。
【００２５】
さらに、本発明は、配列番号：２に示す可変部重鎖タンパク質配列、または配列番号：２と７０％以上の配列同一性、より好ましくは８０％以上の配列同一性、さらにより好ましくは９０％以上の配列同一性、さらに一層好ましくは９９％以上の配列同一性、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するタンパク質配列、および／または、配列番号：４に示す可変部軽鎖タンパク質配列、または配列番号：４と７０％以上の配列同一性、より好ましくは８０％以上の配列同一性、さらにより好ましくは９０％以上の配列同一性、さらに一層好ましくは９９％以上の配列同一性、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するタンパク質配列を有し、それによって、好ましくは、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を中和する能力を保持している抗イディオタイプ抗体に関係する。
【００２６】
また、本発明は、抗イディオタイプ抗体の可変部重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０に示した対応アミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性、より好ましくは８０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性、そして最も好ましくは９５〜９９％以上の配列同一性を有するか、または、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０に示した対応アミノ酸配列に一致しており、それによって、好ましくは、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を中和する能力を保持している抗イディオタイプ抗体に関係する。
【００２７】
また、本発明は、本発明に係る抗イディオタイプ抗体を改変したものに関係し、また、Ｆ（Ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、およびＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体のＣＤＲ領域を１個以上含む他の断片にも関係する。本発明は、上記断片の改変したものにも関係する。
【００２８】
本発明の別の局面は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０から選ばれた配列を有するか、または、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０から選ばれたアミノ酸配列をもつペプチドに７０％以上配列が一致している単離精製ペプチドである。この単離精製ペプチドは、選択的には、合成によって合成されたペプチドであり、また、精製度を測定する常法にしたがって測定すると、少なくとも９６％、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上という精製度を有する。
【００２９】
本発明のさらに別の局面は、寄託番号ＬＭＢＰ  ５８７８ＣＢをもつ寄託されたモノクローナル細胞株１４Ｃ１２など、抗イディオタイプ抗体を発現するモノクローナル細胞株である。
【００３０】
本発明の別の局面は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体に対する抗イディオタイプ抗体ならびに断片、該抗イディオタイプ抗体のペプチド、および、上記で詳しく開示したような改変抗体を含む医薬組成物である。
【００３１】
本発明の別の局面は、抗イディオタイプ抗体または断片、該抗イディオタイプ抗体のペプチド、およびそれらの改変抗体を薬剤として使用することである。
【００３２】
本発明の別の局面は、出血、より具体的には、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体を有する血友病患者の出血を予防または治療するための薬剤を製造するために、抗イディオタイプ抗体または断片、該抗イディオタイプ抗体のペプチド、およびそれらの改変抗体を使用することである。
【００３３】
本発明の別の局面は、阻害抗体の産生を阻害するための薬剤を製造するために、抗イディオタイプ抗体または断片、該抗イディオタイプ抗体のペプチド、およびそれらの改変抗体を使用することである。本発明のこの局面の実施形態の１つによれば、ＦＶＩＩＩインヒビターに対する抗イディオタイプ抗体は、抗Ｃ２阻害抗体をもつＢ細胞のアポトーシスを誘導するために使用される。そのため、本発明に係る抗イディオタイプ抗体およびそれらの断片は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対するインヒビターのエフェクター機能（可溶性抗体の作用を中和する）、およびそのような抗体の産生（Ｂ０２Ｃ１１と同一または類似のイディオトープをもつ細胞との相互作用）の両方を抑制することができる。
【００３４】
また、本発明は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体を有する患者、選択的には血友病患者の出血を予防または治療する方法であって、抗イディオタイプ抗体、その断
片、ペプチド、または改変抗体を患者に投与する工程を含む方法に関係する。
【００３５】
この方法は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体または断片、該抗イディオタイプ抗体のペプチド、およびその改変抗体を有する血友病患者において、抗Ｃ２阻害抗体をもつＢ細胞のアポトーシスを誘導する方法に関係する。
【００３６】
本発明の別の局面は、体液においてＦＶＩＩＩ抗体を検出するために、ＦＶＩＩＩインヒビターに対する抗イディオタイプ抗体を使用することに関係する。
【００３７】
ここで、本発明を、以下の図面を参照しながら、より詳細に説明する。
【００３８】
説明全体を通して、配列表に示されている以下の配列が参照される。
【００３９】
配列番号：１：Ａｂ  １４Ｃ２の重鎖可変部領域の塩基配列
配列番号：２：Ａｂ  １４Ｃ２の重鎖可変部領域のアミノ酸配列
配列番号：３：Ａｂ  １４Ｃ２の軽鎖可変部領域の塩基配列
配列番号：４：Ａｂ  １４Ｃ２の軽鎖可変部領域のアミノ酸配列
配列番号：５：Ａｂ  １４Ｃ２の重鎖可変部領域のＣＤＲ１（Ｈ１）のアミノ酸配列
配列番号：６：Ａｂ  １４Ｃ２の重鎖可変部領域のＣＤＲ２（Ｈ２）のアミノ酸配列
配列番号：７：Ａｂ  １４Ｃ２の重鎖可変部領域のＣＤＲ３（Ｈ３）のアミノ酸配列
配列番号：８：Ａｂ  １４Ｃ２の軽鎖可変部領域のＣＤＲ１（Ｌ１）のアミノ酸配列
配列番号：９：Ａｂ  １４Ｃ２の軽鎖可変部領域のＣＤＲ２（Ｌ２）のアミノ酸配列
配列番号：１０：Ａｂ  １４Ｃ２の重鎖可変部領域のＣＤＲ３（Ｈ３）のアミノ酸配列（定義）
ＦＶＩＩＩと略記される第ＶＩＩＩ因子は、タンパク質分解によるプロセシングを受ける、分子量３３０ｋＤで２３３２個のアミノ酸をもつグリコシル化血液凝固因子を意味する。
【００４０】
ＦＶＩＩＩの軽鎖は、タンパク質分解処理されたＦＶＩＩＩの、Ａ３、Ｃ１およびＣ２のドメインを含む部分を意味する。
【００４１】
Ｃ２ドメインは、ＦＶＩＩＩの２１７３から２３３２までの残基にわたる領域を意味する。
【００４２】
リン脂質（ＰＬ）結合部位は、Ｃ２ドメインの中にあって、アミノ酸番号２０３２と２３３２の間にある領域を意味する。
【００４３】
イディオトープは、単一の抗原決定基を意味する。
【００４４】
イディオタイプは、免疫グロブリン分子に抗原個別性を付与し、個体内における任意の抗体の特徴となっている、可変部領域内にあるイディオトープの集合を意味する。
【００４５】
イディオタイプは、それが、抗原エピトープを立体構造的に模倣する場合には、エピトープの内部イメージに対応すると言われている。
【００４６】
ここで、「抗体」（「Ａｂ」）という用語は、無処理のままのモノクローナルまたはポリクローナルの抗体分子、およびその断片であって、以下を含むものを意味する。
【００４７】
ａ）重鎖および軽鎖の両方（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２）、または一本鎖の重鎖または軽鎖（例えば、軽鎖ダイマー）、選択的には、それらの定常部（またはその
一部）、または、選択的に、この定常部領域の軽微な改変（アロタイプ変異体など）；
ｂ）それらの一部、特に、その特異性決定部分、すなわち、抗体の可変部領域；
ｃ）さらにそれらの一部、特に、少なくとも１個のＣＤＲを含む何連かのアミノ酸からなるペプチドなどであって、選択的には、例えば、１つまたは両方のＣＤＲにある約１０個までのアミノ酸配列からなる隣接枠組み領域配列をもつ超可変部。
【００４８】
本発明では、選択的には、抗体はＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１である。Ｆ（ａｂ’）２は、ペプシン切断後に得られる抗体断片を意味し、両方の軽鎖、およびヒンジ領域を経由してジスルフィド結合した重鎖の一部からできている。Ｆａｂ断片は、無処理のままの抗体から、またはＦ（ａｂ’）２から、ヒンジ領域のパパイン分解によって得られ、１個の軽鎖、および重鎖の一部を含む。抗体の断片は、当技術分野において説明されている合成または組換えによって得ることもできる。
【００４９】
ここで、「阻害抗体」または「ＦＶＩＩＩインヒビター」（Ａｂ１）とは、ＦＶＩＩＩの活性を阻害する抗体を意味する。本発明の特定の態様によれば、阻害抗体は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する抗体である。阻害抗体は、内因性ＦＶＩＩＩに対する同種異系抗体、または自己抗体のいずれでもよい。阻害抗体は、ヒトまたは動物由来のものでもよい。選択的には、阻害抗体は、ヒト第ＶＩＩＩ因子に対するヒト阻害抗体である。
【００５０】
本発明における抗イディオタイプ抗体は、ポリクローナルでもよいが、好ましくは、モノクローナルである、阻害抗体（Ａｂ１）の可変部分に対する第二世代抗体（Ａｂ２）を意味する。本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、好ましくは、阻害抗体を中和することができ、選択的にはＡｂ１を産生することができる。本発明に係る抗イディオタイプ抗体は、好ましくは、モノクローナルであって、選択的には組換え体である。
【００５１】
「阻害抗体を中和することができる」とは、ＦＶＩＩＩインヒビター（Ａｂ１）の阻害活性を遮断する、本発明に係る抗イディオタイプ抗体の性質を意味する。これは、Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ＭＧら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：４９６−５０６に記載されているような第ＶＩＩＩ因子発色テストなどのアッセイにおいて、インヒビターおよび抗イディオタイプ抗体存在下でＦＶＩＩＩ活性を測定することによって判定することができる。本発明における相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原上のエピトープと相互作用する抗体の可変部領域内にある超可変アミノ酸配列を意味する。本発明の１つの実施形態において、ＣＤＲ領域は、抗Ｃ２ドメイン阻害抗体に対する抗イディオタイプ抗体の可変部軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）それぞれの（それぞれＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＨ１、Ｈ２、Ｈ３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の領域である。具体的な実施形態は、抗イディオタイプ抗体１４Ｃ１２にある対応領域に関係する。
【００５２】
ここで、「ヒト化抗体」とは、ヒト抗体により近似させるために非抗原結合領域においてアミノ酸が置換されているヒト以外の抗体分子を意味する。
【００５３】
ここで、「再形成ヒト抗体（ｒｅｓｈａｐｅｄ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「ヒトハイブリッド抗体」とは、抗原結合領域のアミノ酸が、本発明による配列、例えば、ＣＤＲの配列、またはヒト抗体のレパートリーに由来する可変部領域の他の部分などによって置換されているヒト抗体を意味する。
【００５４】
配列比較。配列同一性または配列類似性に関して、タンパク質配列または塩基配列の比較が指定される。本発明によれば、比較は、２つのＶＨ領域または２つのＶＬ領域のアミノ酸配列間で行われるか、または、比較は、ＣＤＲ領域をコードする２つの塩基配列の間で行われ、２つの配列の間における配列の一致または類似の程度は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好まし
くは９９％以上の２つの配列間の配列同一性または類似性である。
【００５５】
同一性塩基配列またはアミノ酸配列とは、２つの配列を並べたときに、配列が同一であるパーセント、すなわち、同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸がある位置の数を塩基配列またはアミノ酸配列の数（配列の長さが異なるときには短い方）で割った割合が、７０％よりも高く、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５〜９９％以上、より具体的には１００％であることを意味する。２つの配列のアラインメントを、ＷｉｌｂｕｒとＬｉｐｍａｎｎ（１９８３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：７２６）によって記述されたアルゴリズムによって、２０ヌクレオチドのウインドウサイズ、４ヌクレオチドの語長（Ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）、および４というギャップペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を用いて行った。
【００５６】
２つのアミノ酸配列は、以下のグループの１つに属していれば、「類似」しているとみなされる；ＧＡＳＴＣＰ、ＶＩＬＭ、ＹＷＦ、ＤＥＱＮ、ＫＨＲ。したがって、類似している配列とは、２つのタンパク質配列を並べたとき、配列が類似するパーセント、すなわち、一致または類似するヌクレオチドまたはアミノ酸がある位置の数を塩基配列またはアミノ酸配列の数（配列の長さが異なるときには短い方）で割った割合が、７０％よりも高く、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５〜９９％以上、より具体的には１００％であることを意味する。
【００５７】
塩基配列が、類似性または同一性を有するアミノ酸配列をコードしていれば、それらの配列は「類似」しているとみなされる（すなわち、同一のタンパク質をコードする２つの塩基配列の間では、変異は、遺伝子暗号の縮退の限度内にある）。「改変された」とは、１個またはいくつかのアミノ酸が別のアミノ酸残基に置換されているか欠失しているタンパク質（またはポリペプチド）分子を意味する。このようなアミノ酸置換または欠失は、タンパク質分子のどこに位置していてもよい。また、アミノ酸残基が一箇所以上の位置で置換および／または欠失しているタンパク質分子も意味する。後者の場合、置換と欠失のあらゆる組合せを考えうる。それは、多型（すなわち、１つの遺伝子の２個以上のアリルの異種交配集団において、稀な方のアリルの頻度が、反復突然変異のみで説明できるよりも高い、典型的には１％よりも高いときに通常同時に出現するもの）も意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
一定の実施形態および一定の図面を参照しながら本発明を説明するが、本発明は、それらに限定されることはなく、請求の範囲のみによって限定される。
【００５９】
本発明は、ヒト第ＶＩＩＩ阻害抗体に対する抗イディオタイプ抗体に関係する。ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体は、血友病患者において最も一般的に発生し、インヒビターの発症率は１５〜２０％である。特に、若年患者、またはＦＶＩＩＩタンパク質の合成および／または分泌がなくなる結果をもたらす遺伝的欠陥をもつ患者（先天性血友病）のように、ＦＶＩＩＩの濃縮液に激しく曝露されている血友病患者は、ＦＶＩＩＩインヒビターを発症する高度のリスクに曝されている。しかし、阻害抗体は、自己免疫疾患、悪性腫瘍（リンパ増殖性疾患、リンパ腫、および固形癌など）、薬物反応（例えば、ペニシリン、クロラムフェニコール、フェニトイン）、妊娠期間中、および分娩後の状態にある患者においても生じる。例外的に、阻害抗体の存在が特発性のときもありうる（例えば、高齢の患者）。しかし、通常は、阻害抗体の存在は、あざができやすいことや、抑制できない出血などという症状を伴う。これは、通常、獲得性血友病と言われる。このように、本発明は、阻害抗体の存在を伴う、またはそれによって特徴付けられる、あらゆる症状の治療または予防に関係する。患者に阻害抗体が存在することは、抗ＦＶＩＩＩ活性の定量法、ＦＶＩＩＩインヒビターに対するＥＬＩＳＡ法、およびクロマトグラフィーおよび免疫吸着を用いた精製法など、さまざまな方法によって判定することができる（これらの方法の各文は
上述したＡｌｇｉｍａｎら、（１９９２）に記載されている）。
【００６０】
本発明は、ＦＶＩＩＩインヒビターの阻害作用を中和することができる抗イディオタイプ抗体に関係する。阻害抗体によるＦＶＩＩＩの阻害は、例えば、ＦＶＩＩＩのタンパク質分解切断部位への結合、または、タンパク質分解されにくくなるようなＦＶＩＩＩの３次元立体構造の変化を誘導することのいずれかによってＦＶＩＩＩが活性化される速度を低下させることによって生じさせることができる。抗体が、ＦＶＩＩＩのＦＩＸおよびＦＸへの結合を阻害すれば、阻害が起こることもある。同時に、または選択的に、阻害抗体は、ｖＷＦおよび／またはＰＬがＦＶＩＩＩに結合するのを阻害することができる。
【００６１】
本発明の特定の態様は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対するヒト第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に対する抗イディオタイプ抗体に関係する。特に、本発明は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体のＦＶＩＩＩ凝血促進活性の阻害を少なくとも５０％中和することができる抗イディオタイプ抗体に関係する。凝血促進活性の阻害は、本明細書に記載されているような第ＶＩＩＩ因子発色テストによって測定することができる。本発明の特定の局面によれば、抗イディオタイプ抗体は、モノクローナル抗体Ｂ０２Ｃ１１（インヒビターを発症した患者の天然のレパートリーに由来するＩｇＧ４κ抗体、Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ＭＧら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：４９６−５０６）、または同様のＣ２結合特性を有する他の抗体などの阻害抗体に対するものである。より具体的には、抗イディオタイプ抗体は、ＶＨ１遺伝子ファミリーに由来するＤＰ５  ＶＨ遺伝子のセグメントによってＶＨドメインがコードされているＦＶＩＩＩインヒビターに対するものである。このような阻害抗体およびその他の阻害抗体は、ＦＶＩＩＩ、またはその断片で、より具体的には、Ｃ２ドメインのすべてまたは一部を含む断片で免疫することによって、ヒトから（すなわち、阻害抗体を有する患者の血清から）得ることができ、または、マウス、モルモット、ウマ、ヤギ、ヒト以外の霊長類、および他の哺乳動物から得ることもできる。
【００６２】
特定の態様によれば、本発明は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対するヒト第ＶＩＩＩ因子阻害抗体による凝血活性阻害を５０％以上中和することができるが、ＦＶＩＩＩの生理学的活性を阻害しない、より具体的には、ＦＶＩＩＩによるｖＷＦまたはＰＬへの結合を阻害しない、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対するヒト第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に対する抗イディオタイプ抗体に関係する。ＦＶＩＩＩのｖＷＦおよび／またはＰＬへの結合能力に対する抗イディオタイプ抗体の影響を確認する方法が本明細書に記載されている。これらの方法を、ＦＶＩＩＩによるｖＷＦまたはＰＬへの結合と相互作用しない抗イディオタイプ抗体を選択するために、本発明に従って用いることができる。
【００６３】
ＦＶＩＩＩによるｖＷＦまたはＰＬへの結合を阻害しない抗イディオタイプ抗体の開発を促進する方法としては、これらに限定されないが、ａ）抗イディオタイプ抗体の開発において、それ自体は改変ＦＶＩＩＩに対して作製されている阻害抗体であって、ＰＬ結合ドメイン（Ｐｒａｔｔら、上記）も、ｖＷＦの結合にとって重要な領域も含まない阻害抗体を免疫原として使用すること（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎら、２００３、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １：４５６−４６３）；ｂ）ＰＬ結合部位、またはＦＶＩＩＩがｖＷＦに結合するのに重要な領域を認識するイディオトープが除去されている阻害抗体を免疫原として使用すること；ｃ）得られた抗イディオタイプ抗体の抗原結合部位とＦＶＩＩＩのＣ２ドメインとの間の類似性を解析すること、およびｉ）抗イディオタイプ抗体のイディオトープとＦＶＩＩＩの間の対応関係に、ＰＬ結合部位も、ＦＶＩＩＩがｖＷＦに結合するのに重要な領域も含まれないという事実関係をもとに抗イディオタイプ抗体を選択すること、または、ｉｉ）抗イディオタイプ抗体のイディオタイプの中にある、Ｃ２のＰＬ結合部位、または、ｖＷＦがＦＶＩＩＩに結合する領域に対応する領域を除去することなどが挙げられる。当然ながら、これらの選択手順のそれぞれの後に、選択または改変された抗イディオタイプ抗体が、阻害抗体を中和する能力を保持しているよう注意を払う必要が
ある。
【００６４】
本発明では、モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、ヒト由来でも動物由来でもよい。したがって、さまざまな方法でモノクローナル抗イディオタイプ抗体を取得することができる。抗ＦＶＩＩＩ抗体を有する患者（例えば、血友病患者）または健常な個体の末梢血から、抗イディオタイプ抗体を産生する細胞を取得することができる。常法を用いてこれらを不死化することができ、また、阻害抗体を中和する抗イディオタイプ抗体の能力にもとづいてこれらを選択すること、および、選択的には、ＦＶＩＩＩがＰＬおよびｖＷＦに結合する相互作用の欠如に基づいてこれらを選択することができる。選択的には、上記したように、関連するイディオタイプを確認、およびそれに基づいて選択するために、これらの細胞株のそれぞれが産生するモノクローナル抗体の配列を決定することもできる。
【００６５】
または、ヒトＦＶＩＩＩ阻害抗体（ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体ＢＯ２Ｃ１１など）をマウスに注射し、その脾臓リンパ球をマウスミエローマ細胞株と融合させ、その後、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に対する抗イディオタイプ抗体を産生する培養細胞を同定およびクロニーングすることによってマウスなどの動物を免疫して、意図的に本発明に係るモノクローナル抗イディオタイプ抗体を作製することができる。
【００６６】
このように、本発明は、さらに、上記したとおりに作製された、ＦＶＩＩＩインヒビターに対して反応するモノクローナル抗体を産生する細胞を提供する。これらの細胞株は、ヒト由来の不死化細胞とすることができ、選択的には、治療すべき患者に由来させることもできる。または、不死化細胞は動物（特にげっ歯類）由来でもよい。本発明の特定の実施形態は、抗イディオタイプ抗体１４Ｃ１２寄託番号ＬＭＢＰ  ５８７８ＣＢの寄託されたモノクローナル細胞株１４Ｃ１２によって提供される。
【００６７】
選択的には、動物において産生されるモノクローナル抗体は、例えば、非ヒト由来モノクローナル抗体の結合相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト枠組み領域、特に、Ｊｏｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５２２、またはＲｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３で開示されているようなヒト遺伝子の定常Ｃ領域と結合させることによってヒト化することができる。
【００６８】
または、抗ＦＶＩＩＩ抗体（それ自体は、（Ａｌｇｉｍａｎ  １９９４、上記、およびＧｉｌｌｅｓ  １９９４、上記によって実証されたように）不溶化ＦＶＩＩＩに対する免疫吸着によって同定することができる）に対してアフィニティー精製を行うことによって、ヒトまたは動物から得ることができる。選択的には、抗Ｃ２（阻害）抗体の選択を促進するために、Ｃ２ドメインをアフィニティー精製に用いることができる。
【００６９】
本発明の特定の実施形態は、抗イディオタイプモノクローナル抗体１４Ｃ１２、およびそれに由来する抗体断片などの抗体によって提供される。特定の実施形態によれば、本発明は、配列番号：５、６、または７に識別されているＶＨのＣＤＲ領域の少なくとも１個、または後述するように１４Ｃ１２抗体を改変したものを含む抗イディオタイプ抗体に関係する。
【００７０】
また、本発明は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体に対する上記抗イディオタイプ抗体のいずれかの断片であって、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＣＤＲ、単一可変ドメイン、およびこれらを改変したもの、ならびにこれら断片を組み合わせたものならびに改変したものを含む断片も提供する。
【００７１】
より具体的には、本発明は、本発明に係る抗イディオタイプ抗体の断片および改変抗体を提供し、特に、上記のようにして得られる、モノクローナル抗イディオタイプ抗体の相
補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含む断片、ならびに、それらを改変したものを提供する。例えば、本発明は、Ｓｔａｎｗｏｒｔｈら、実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（１９７８）、第１巻、第８章（ブラックウエル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に記載されているような、当技術分野において周知されている方法を用いて該モノクローナル抗体をタンパク質分解して生成される抗原結合断片Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を提供する。このような断片または人口的配列であって、この抗体結合部位を含むものは、補体活性化またはＦｃγレセプターへの結合能力のような親抗体の性質をいくつか失くしているかもしれないし、いないかもしれないが、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体を阻害する能力を失っていることはない。また、本発明は、一本鎖可変部断片（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ：ｓｃＦｖ）、抗体の単一の可変部ドメイン断片、およびこれらの断片ならびに上記断片を組み合わせたものも含む。各ＣＤＲ配列が、抗体の一方のアームで、他方のアームと異なっている抗体も本発明の範囲内に含まれる。
【００７２】
さらに、本発明は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対するＦＶＩＩＩ阻害抗体に対する再形成されたモノクローナル抗体またはヒトハイブリッドモノクローナル抗体を提供する。ヒトハイブリッドモノクローナル抗体とは、ヒト抗体、および本発明に係る可変部領域から構築されたハイブリッド抗体を意味する。また、本発明は、上記モノクローナル抗体の可溶性または膜に固定された一本鎖可変部部分を提供する。これらは、当技術分野において説明されている方法に基づいて取得することができ、その方法の一例が本明細書に記載されている。ヒト重鎖および軽鎖の可変部のＤＮＡ配列は、別々の反応で増幅され、クロニーングされる。１５個のアミノ酸リンカーの配列、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を、例えば、ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈとＤｖｅｋｓｌｅｒ、「ＰＣＲプライマー、実験マニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）」、（１９９５）、コールドスプリングハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ
Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州プレインビュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，ＵＳＡ）に従って、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＶＨとＶＬの間に挿入する。そして、可溶性またはファージ提示されたポリペプチドとして一本鎖可変部断片（ｓｃＦｖ）を発現させるために、得られた断片を適当なベクターに挿入する。これは、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、１９９６、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７：１−２０によって記載されているような、当業者に周知の方法によって行うことができる。また、本発明は、アプライド・バイオシステムの合成装置、例えば、ミリジェン社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ）（米国）から入手可能なモデル９０５０、または関連技術からのモデルなどのポリペプチド合成装置を用いて、合成によって得ることができる、モノクローナル抗体の超可変部領域に典型的なペプチドを含むリガンドであって、単独で、または、別個のもしくは類似した超可変部領域と組み合わされて、親抗体の性質と同じ性質を発揮することができるものも含む。ＤＮＡ組換え技術によって、断片およびペプチドを生成させることができる。ＢＯＣ（３級ブチルオキシカルボニル）またはＦＭＯＣ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）合成などのペプチド合成法、および当技術分野において公知の他の技術によって、約１００アミノ酸配列までの長さをもつペプチドを作製することができる。選択的には、ペプチドの安定性および寿命を高めるために、アミノ基およびカルボキシル基を変化させることができる（例えばホルミル化、アセチル化など）。または、ペプチドを担体に共有結合または非共有結合させることができる。
【００７３】
本発明によれば、ＦＶＩＩＩインヒビターに苦しむ患者を治療するための抗イディオタイプ抗体を、以下の手順によって選択的に得ることができる。
【００７４】
ａ）ＦＶＩＩＩインヒビターに苦しむ患者からのＦＶＩＩＩに対するヒト抗体を単離すること、
ｂ）（ａ）で得られた抗体から、そのＣ２に対する結合に基づいて、ＦＶＩＩＩ凝血促進活性を阻害する抗体を選択すること、
ｃ）（ｂ）で選択した抗体、または、その抗原認識部分（好ましくは、少なくともＶＬおよび／またはＶＬ）によって動物を免疫すること、
ｄ）選択的には、（ｃ）の動物が産生する抗体をクロニーングすること、
ｅ）抗イディオタイプ抗体を、１）そのＦＶＩＩＩインヒビターの阻害活性を中和する能力、２）ＦＶＩＩＩによるｖＷＦまたはＰＬへの結合を阻害しないという事実に基づいて選択すること、
ｆ）選択的には、（ｅ）で選択された抗イディオタイプ抗体のヒト化抗体または抗体断片をえること。
【００７５】
さらに、本発明は、ヒトにおけるＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体を有する血友病患者における出血を予防または治療するための医薬組成物であって、モノクローナル抗イディオタイプ抗体、および上記に開示されているような断片ならびに改変抗体を活性成分として、医薬的に許容される担体と混合して含む医薬組成物を提供する。より好ましくは、該モノクローナル抗体は、ベルギー微生物協調収集機関（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ＢＣＣＭ）に、寄託番号ＬＭＢＰ  ５８７８ＣＢとして寄託された細胞株１４Ｃ１２から得られるモノクローナル抗体、もしくは断片、改変抗体、またはそれに高い配列類似性を有する配列である。該モノクローナル抗体と比較される配列は、好ましくは７０％以上同一、より好ましくは８０％以上同一、さらに一層好ましくは９０％以上同一、また、最も好ましくは９５〜９９％以上同一で、配列の同一性は、好ましくは、特に抗体の相補性決定領域に関するものである。また、本発明に係るリガンドは、同等の能力をもつ合成ペプチドも含む。本発明に係る医薬組成物は、上記成分を、治療法または予防法に関して後に示すように、治療上有効な量含まなければならない。
【００７６】
本発明に係る医薬組成物において用いられる適当な医薬担体については、例えば、レミントンの薬化学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１６版（１９８０）に記載されており、それらの処方は当業者に周知されている。それらには、あらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗細菌剤ならびに抗菌剤（例えばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張剤（糖類または塩化ナトリウムなど）などが含まれる。組成物中のモノクローナル抗体活性成分の作用持続時間を調節するために補助成分を含ませることもできる。
【００７７】
このようにして、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル共重合体、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミンなど、適当なポリマーを選択することによって、放出制御組成物を完成させることができる。また、薬物の放出速度と作用持続時間は、モノクローナル抗体活性成分を、例えば、ヒドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリメチルメタクリル酸、およびその他上記ポリマーなどのマイクロカプセルのような粒子の中に入れることによって調節することもできる。このような方法には、リポソーム、マイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセルなどのコロイド薬物輸送系（ｃｏｌｌｏｉｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）も含まれる。投与経路によって、活性成分を含む医薬組成物は保護用被覆剤を必要とする。注射用に適した薬物の形態には、滅菌水溶液もしくは分散液、およびそれを即時調製するための滅菌粉剤などがある。したがって、典型的な担体には、生体適合性水性緩衝液、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびそれらの混合液などが含まれる。
【００７８】
また、本発明は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対するＦＶＩＩＩ阻害抗体に対するモノクローナル抗イディオタイプ抗体の薬剤としての使用を提供する。より好ましくは、本発
明において使用される薬剤は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体を有する血友病患者における出血を低下、および／または予防、および／または治療するための手段である。前記リガンドは、例えば、静脈内、動脈内、非経口、またはカテーテル化など、当技術分野において周知の方法で提供することができる。
【００７９】
したがって、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおけるＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体を有する患者、より具体的には、血友病患者における出血を予防、および／または治療、および／または抑制するための治療法および／または予防法であって、どのような治療もしくは予防、または血液凝固の低下を必要とする哺乳動物に、本明細書において上記開示したようなリガンドを治療上有効量投与することを含む方法を提供する。好ましくは、上記リガンドは、細胞株１４Ｃ１２から得られるモノクローナル抗体、または抗原結合断片Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２、または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む１個以上のペプチド、可溶性もしくは膜固定された一本鎖可変部断片（ｓｃＦＶ）、一本鎖可変部ドメイン、またはこれらの要素を改変したものもしくは組み合わせたものである。選択的には、上記治療法は、ＦＶＩＩＩを患者に投与することと併用される。
【００８０】
ここで、治療上有効な量とは、治療すべき動物の体重１キログラム当たり約１マイクログラムから約１０ミリグラム、より好ましくは、体重１キログラム当たり約１０マイクログラムから約１ミリグラム、さらに一層好ましくは、体重１キログラム当たり約１〜約１０ミリグラムである。ほとんどのＩｇＧ抗体の半減期が長いことを考慮すると、当然ながら、このクラスのモノクローナル抗体である本発明に係るリガンドは、治療周期を好適なものとし、患者の安楽に役立つといえる。
【００８１】
インヒビターを有する血友病Ａ患者は、しばしば、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する抗体を産生する。したがって、細胞株１４Ｃ１２によって産生される抗体などの本発明に係るリガンドは、例えば、外科的処置前などの緊急事態においても、また、Ａｂ  １４Ｃ１２が、対応する抗Ｃ２抗体をもつＢ細胞のアポトーシスを誘導することができる、より長期的な治療においても、そのような患者の治療に有効である。
【００８２】
細胞株１４Ｃ１２の抗イディオタイプ抗体であるＡＢ  １４Ｃ１２などの本発明に係るリガンドは、機能的凝血アッセイ法において、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体のＦＶＩＩＩ阻害特性を、５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、また最も好ましくは９０％以上中和する能力を有する。
【００８３】
本明細書を読んだ当業者には、ＡＢ  １４Ｃ１２の配列に関する知識、およびＣ２ドメインと組み合わせたときのＢＯ２Ｃ１１  Ｆａｂ断片の結晶構造に関する知識とから、Ａｂ  １４Ｃ１２の変異体がいくつか考えられることが理解できよう。したがって、点突然変異をＡｂ  １４Ｃ１２のＶＨ領域の中に導入して、Ｃ２の内部イメージを補強することができ、それによって、ＢＯ２Ｃ１１などのＣ２結合に対するＡｂ  １４Ｃ１２の阻害能力を補強することができる。または、Ｃ２の内部イメージを維持の有無にかかわらず、ＢＯ２Ｃ１１とＡｂ  １４Ｃ１２の間で接触する残基の数を増やすように配列を改変することができる。この方法の特定の局面は、ＢＯ２Ｃ１１の枠組み領域に含まれるアミノ酸を認識する接触残基を含む１４Ｃ１２変異抗体を得ることである。後者は、同じようなＣ２結合性を有する他の抗体同様、ＤＰ５重鎖サブファミリー遺伝子セグメントに属する（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ＭＧら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：  ４９６−５０６）。ヒトのレパートリーにおいてＤＰ５ファミリーの仲間が出現する頻度は非常に低いため、Ａｂ
１４Ｃ１２を使用して、ＤＰ５サブファミリー全部を中和することができ、それによって、ＶＨドメインがＶｈ１遺伝子ファミリーに由来するＤＰ５  ＶＨ遺伝子セグメントによってコードされている阻害抗体のすべてを中和することができる（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ
ら、（１９９８）前掲；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋら、（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９９：２８２８−２８３４）。
【００８４】
当業者の通常の知識によって、抗体１４Ｃ１２からさまざまな合成ペプチドを調製することができる。それらのうちの１個以上を、単独または組み合わせて、インビボでＢＯ２Ｃ１１様抗体を中和するために用いることができる。好適な実施形態において、これらのペプチドは、Ａｂ  １４Ｃ１２の重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来し、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＳＶＭＨＷＬ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］、ＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＴＡ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６］、およびＳＧＧＬＬＲＧＹＷＹＦＤＶ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］を有するペプチドで表される。別の好適な実施形態において、これらのペプチドは、Ａｂ  １４Ｃ１２の軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来し、アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＴＮＴＬＨ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８］、ＹＶＳＱＳＩＳ［ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：９］、およびＱＱＳＴＳＷＰＹＴ［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０］を有するペプチドで表される。したがって、１つの実施形態では、Ａｂ  １４Ｃ１２の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する合成ペプチドを用いて、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する阻害抗体を有する患者に手術前に注入する。これらのペプチドを阻害抗体と併用して、その阻害能力を中和する。さらに別の実施形態においては、さまざまなＣＤＲの配列に、適当な三次元立体構造を維持するのに適したリンカーポリペプチド配列を組み合わせることによって組換えポリペプチドを作製する。このポリペプチドは、手術などの緊急処置の前に患者に投与される。
【００８５】
Ａｂ  １４Ｃ１２など、本発明に係る抗イディオタイプ抗体の別の応用は、免疫系によるＦＶＩＩＩインヒビターの産生を不活性化させるためにそれらを用いることである。例えば、本発明に係る抗イディオタイプ抗体を用いて、抗Ｃ２抗体を有するＢ細胞のアポトーシスを誘導することができる。記憶細胞またはある種の抗体産生細胞などのＢ細胞は、分泌型と同じ表面抗体を発現する。Ｂ細胞の表面でイディオタイプが架橋されると、細胞の増殖またはアポトーシスの阻害をもたらすシグナルが伝達される。
【００８６】
本発明に係る抗イディオタイプ抗体のさらなる応用は、ＦＶＩＩＩインヒビターの検出および／または精製におけるそれらの使用である。本発明に関連して利用することができる免疫学的検出法および精製法は、当技術分野において広範に記載されている。
【００８７】
以下の実施例は、本発明を特定の実施形態に制限するものではなく、参照として本明細書に組み入れられる添付の図面と併せて理解可能になるものである。
（実施例）
【実施例１】
【００８８】
：ＦＶＩＩＩインヒビターＢＯ２Ｃ１１に対するモノクローナル抗体の作製
第ＶＩＩＩ因子特異的ヒトＩｇ４κ  ＢＯ２Ｃ１１抗体を、マウスにおいて抗イディオタイプ抗体を作製するために使用した。ＢＯ２Ｃ１１の特性は、Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ＭＧら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：４９６−５０６に記載されている。ＢＯ２Ｃ１１の可変部軽鎖および重鎖の塩基配列およびアミノ酸配列は、ＰＣＴ特許出願：ＷＯ０１／０４２６９に開示されている。
【００８９】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、初回はフロイント完全アジュバントで、次はフロイント不完全アジュバントで乳化したＢＯ２Ｃ１１で足蹠に免疫した。このような注射を４回行った後、同じアイソタイプのその他の抗ＦＶＩＩＩ抗体や無関係な抗体ではなく、ＢＯ２Ｃ１１を認識する抗体の存在を調べるために、ＥＬＩＳＡシステムでマウスの血清をテストした。特異的抗ＢＯ２Ｃ１１抗体を産生するマウスから得られた脾臓細胞をミエローマ細胞株と融合して、Ｂ細胞クローンを作製した（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇら、（１９７８）Ｅｕｒ  Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：８２−８８）。これらを培養によって展開し、ＢＯ２Ｃ１１特異性についてテストした。１個のクローン１４Ｃ１２が、ＢＯ２Ｃ１１でコートしたポリスチレン製のプレートに効果的に結合した。
【００９０】
細胞株１４Ｃ１２を、２００２年７月３０日に、ＬＭＢＰ（プラスミドコレクション、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ，Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ  ３５，９０００  Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）のベルギー微生物協調収集機関（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ＢＣＣＭ）に、寄託番号ＬＭＢＰ  ５８７８ＣＢとして寄託した。
【実施例２】
【００９１】
：細胞株１４Ｃ１２から得られる抗イディオタイプ抗体のインビトロにおける性質
細胞株１４Ｃ１２から得られる抗イディオタイプ抗体（Ａｂ  １４Ｃ１２）のインビトロにおける性質を、インビトロアッセイ系で調べた。Ａｂ  １４Ｃ１２は、ＢＯ２Ｃ１１に結合して、ＢＯ２Ｃ１１がその標的抗原であるＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに結合するのを用量依存的に阻害することが示された。さらに、ＢＯ２Ｃ１１のＦＶＩＩＩ阻害特性を中和するＡｂ  １４Ｃ１２の能力を機能的凝血アッセイ法においても測定した。発色（第ＶＩＩＩ因子発色試験（デイドベーリング社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、ドイツ、マールブルク（Ｍａｒｂｕｒｕｇ））は、トロンビンによって特異的に切断される無色の基質を変換することに基づく。このテスト系は、ＦＶＩＩＩ以外のトロンビンを産生するのに必要なすべての試薬を含んでいる。したがって、長時間にわたる発色の強度は、この系に加えられたＦＶＩＩＩの量に比例する。ＢＯ２Ｃ１１（０．１μｇ／ｍｌ）を加えると、基質のＦＶＩＩＩ依存型変換（０．３  ＩＵ／ｍｌ）が完全に阻害される。この検査系でＦＶＩＩＩ（０．３  ＩＵ／ｍｌ）を１００％阻害できる最低のＢＯ２Ｃ１１濃度であると決定されている０．１μｇ／ｍｌに最終濃度がなるよう、ＢＯ２Ｃ１１を発色アッセイに加えた。ＦＶＩＩＩを加える前に、さまざまな濃度のＡｂ  １４Ｃ１２を、この固定した量のＢＯ２Ｃ１１とインキュベートした。そして、この混合液を発色アッセイに適用した。
【００９２】
図１は、Ａｂ  １４Ｃ１２を検査系に加えると、用量依存的にＢＯ２Ｃ１１の阻害能力を中和することを示している。さらに、５０％の中和が、ＢＯ２Ｃ１１と１／１のモル比で得られる。
【００９３】
Ａｂ  １４Ｃ１２がポリクローナル抗ＦＶＩＩＩ抗体を中和する能力を、上記したような発色アッセイ法によってテストした。この目的のために、ＢＯ２Ｃ１１が由来する患者のポリクローナル抗体を、ＢＯＣ２Ｃ１１の代わりにこの系に加えた。このような条件下で、Ａｂ  １４Ｃ１２を段階希釈して加えると、最大６０％までの中和が得られた。このようなポリクローナル抗体製剤は、ＦＶＩＩＩの重鎖、すなわち、Ｃ２ドメインとは完全に別のエピトープに対する抗体をかなりの量含んでいることが知られている。したがって、ポリクローナル抗体によって６０％の中和が見られたことは、Ａｂ  １４Ｃ１２が抗Ｃ２インヒビターを中和する能力を過小評価していることであるとの結論に達した。
【００９４】
また、Ａｂ  １４Ｃ１２は、無関係な患者からのポリクローナル抗体の阻害特性も有意に中和した。このように、ウサギ網状赤血球を用いた転写／翻訳を併用することによって（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）のキット、ＴＮＴ結合網状赤血球ライセート（ＴＮＴ  ｃｏｕｐｌｅｔ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）、米国マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））放射性標識したＦＶＩＩＩドメインを作製する免疫沈殿アッセイに、ポリクローナル抗体をさまざまな希釈率で加えた。産生された微量の放射性標識ドメインを、抗体サンプルおよびプロテインＡセファロースと混ぜる。実質的にすべての抗体が捕捉される
濃度でセファロースビーズを加える。遠心分離および洗浄を行った後、テストされるＦＶＩＩＩ断片に対する特異性もつ抗体の存在量に比例するサンプルの放射活性を計測する。このようにして、血縁関係にない６人の血友病Ａ患者のポリクローナル抗体と、Ｃ２ドメインに対するインヒビターを、Ｃ２ドメインが翻訳されるアッセイに一定の濃度で加えた。そして、すべてのサンプルに濃度を上げながらＡｂ  １４Ｃ１２を加えた。６サンプルのうち３つで、ポリクローナル抗体の阻害特性が有意に（およそ５０％）中和され、Ａｂ
１４Ｃ１２が、ヒト抗Ｃ２抗体上で広く発現されるエピトープを認識することが示された。
【実施例３】
【００９５】
：Ａｂ  １４Ｃ１２のインビボでの特性
Ａｂ  １４Ｃ１２が、ＢＯ２Ｃ１１のＦＶＩＩＩ阻害特性をインビボで中和することができるかを、ヒト組換えＦＶＩＩＩによって再構築されたＦＶＩＩＩ−／−  Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｓｉｎｇｈ  Ｉら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９：３２３５−３２４０）で調べた。
【００９６】
このようなマウスは、ＦＶＩＩＩ活性または抗原を検出できず、それ以外には正常な表現型をもつため、血友病Ａの動物モデルとして適当であると考えられている（Ｒｅｉｐｅｒｔ  ＢＭら、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅａｍｏｓｔ  ２０００、８４：８２６−３２）。ＦＶＩＩＩ−／−Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの尾静脈に１  ＩＵのヒトＦＶＩＩＩを投与したところ、１０分後、１１０ｎｇ／ｍｌの血漿濃度、すなわち、ヒト血漿の正常なＦＶＩＩＩ濃度（１  ＩＵまたは１９２  ｎｇ／ｍｌ）の±６０％となった。このようなマウスに、最初０．５μｇのＢＯ２Ｃ１１を注射すると、ＦＶＩＩＩ凝血促進作用が９８％阻害される。そして、このモデルを用いて、Ａｂ  １４Ｃ１２が、ＦＶＩＩＩのＢＯ２Ｃ１１依存的阻害を中和することができるか否かを測定した。そのため、さまざまな濃度のＡｂ  １４Ｃ１２を、一定量のＢＯ２Ｃ１１（０．５μｇ）と、この複合体をＦＶＩＩＩ−／−Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに注射する前に混合するか、直接マウスに注射してから０．５μｇのＢＯ２Ｃ１１と１  ＩＵのＦＶＩＩＩを注射した。
【００９７】
０．５μｇのＢＯ２Ｃ１１を事前に投与したところ、ＦＶＩＩＩの凝血促進作用を９８％阻害した（図２Ａ）。一定量のＢＯ２Ｃ１１を、さまざまな濃度のＡｂ  １４Ｃ１２（０．１〜１０μｇ）をプレインキュベートし、その混合液をＦＶＩＩＩ−／−マウスに注入した。ＢＯ２Ｃ１１によるＦＶＩＩＩ阻害の用量依存的中和が見られた（図２Ｂ）。Ａｂ  １４Ｃ１２の後ＢＯ２Ｃ１１とＦＶＩＩＩを連続投与して、この実験を反復したところ、用量依存的な１４Ｃ１２による中和が得られた（図２Ｃ）。
【００９８】
図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃから、Ａｂ  １４Ｃ１２が、ＢＯ２Ｃ１１の阻害特性を用量依存的に中和することが分かり、それによって、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対するインヒビターを有する血友病Ａ患者の治療としてＡｂ  １４Ｃ１２に可能性があることが確認された。
【実施例４】
【００９９】
：ＢＯ２Ｃ１１に対するＡｂ  １４Ｃ１２の結合の特徴
Ａｂ  １４Ｃ１２の徹底的な生化学的評価を行った。Ａｂ  １４Ｃ１２は、表面プラズモン共鳴システムを用いて測定すると、Ｋon値およびＫoff値がそれぞれ１０5ｍ-1Ｓ-1、１０-5Ｓ-1という高いアフィニティーでＢＯ２Ｃ１１に結合する。常法によってＡｂ  １４Ｃ１２のＶＨおよびＶＬドメインの配列を決定した（図３）ところ、Ａｂ  １４Ｃ１２は、κ軽鎖をもち、ＩＪＨＶ１重鎖抗体ファミリーに属する。Ａｂ  １４Ｃ１２が、ＦＶＩＩＩ  Ｃ２ドメインへのＢＯ２Ｃ１１による結合を阻害できることから、発明者らは、Ａｂ  １４Ｃ１２のＶＨおよびＶＬドメインの配列を、ＣＤ２の配列と比較してみようと
思い立った。ＶＨのＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、それぞれ、Ｃ２ドメインと同一または相同なアミノ酸残基を６個および７個含んでいる。ＣＤＲ２は、Ｃ２領域のＶ２２２３〜Ｔ２２３７にほぼ同一であるが、この領域は、重要なリン脂質結合部位と、ＢＯ２Ｃ１１に対する接触残基をいくつか含んでいる。さらに、ＢＯ２Ｃ１１の可変部の配列（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  ＭＧら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：４９６−５０６）、およびＣ２と結合したその結晶構造（Ｓｐｉｅｇｅｌ  Ｐ．Ｃ．Ｊｒ．ら、（２００１）Ｂ１ｏｏｄ  ９８：１３−１９）に基づいて、ＢＯ２Ｃ１１とＡｂ  １４Ｃ１２の間の推定接触残基を同定したところ、その中には、ＢＯ２Ｃ１１の可変部の枠組みの中に位置しているものがある。まとめて考えると、これらのデータは、Ａｂ  １４Ｃ１２の重鎖の可変部は、１３個の同一または相同なアミノ酸残基からなるＣ２内部イメージと、ＢＯ２Ｃ１１の可変部に対する接触残基をいくつか含むことを示している。
【０１００】
したがって、Ａｂ  １４Ｃ１２は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対する抗イディオタイプ抗体の最初の実例に相当し、それを投与すると、血友病ＡのマウスモデルにおいてインビボでのＦＶＩＩＩ活性を回復する。そのようなものとして、ＦＶＩＩＩインヒビターを有する血友病Ａ患者を効果的に治療する方法を開示している。
【０１０１】
抗ＦＶＩＩＩ  Ｃ１ドメインインヒビターに対するイディオタイプ抗体で、Ｂ６Ａ２Ｃ１と名づけられた抗体（Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧら、（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９４、要旨２０４８、４６０ａ）が、ＦＶＩＩＩへのＢＯ２Ｃ１１の結合を阻害できるか否かを判定するために、この抗体の段階希釈液を作成して、ＦＶＩＩＩでコートしたポリスチレン製プレートへのＢＯ２Ｃ１１の結合を阻害できるかをテストした。図４は、阻害が起こらなかったことを示しており、Ｂ６Ａ２Ｃ１は、ＢＯ２Ｃ１１に対する特異性を全く発現しなかったことを示している。
【実施例５】
【０１０２】
：Ａｂ  １４Ｃ１２とＦＶＩＩＩのＣ２ドメインにおける相同性解析
それぞれ実施例２および３に記載されたインビトロおよびインビボにおける抗イディオタイプ抗体（Ａｂ  １４Ｃ１２）の性質（上記参照）は、抗イディオタイプ抗体の可変部とＦＶＩＩＩのＣ２ドメインとの間に広範な相同性が存在することを示唆していた。Ｃ２ドメインの結晶構造が得られている（Ｐｒａｔｔら（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：４３９−４４２）。そのため、Ａｂ  １４Ｃ１２の重鎖および軽鎖の可変部の配列を、Ｃ２ドメインの配列と並べてみた。
【０１０３】
ＶＨ領域について顕著な相同性が見られた。表１は、３１個のアミノ酸が同一または相同であることが分かったことを示している。これには、ＣＤＲ領域に関連する１３残基も含まれているが、ＣＤＲ１（Ｈ１〜１６残基）およびＣＤＲ３（Ｈ３〜６残基）にクラスター分けされた。興味深いことに、枠組み領域（１８アミノ酸）に位置する残基からの顕著な寄与が見られる。さらに、ＶＨ領域の２残基のみ（星印で示す）が、Ａｂ  １４Ｃ１２の生殖細胞系列の配列から変異している。Ｃ２ドメインの結晶構造によれば（Ｐｒａｔｔｋら（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：４３９−４４２）、Ａｂ  １４Ｃ１２のＶＨ領域同様、３１残基のすべてがＣ２の表面に露出している。このアラインメントの顕著な特徴は、Ａｂ  １４Ｃ１２のＶＨ  ＣＤＲ３におけるＬｅｕ１０２およびＬｅｕ１０３に対応するＬｅｕ２２５１およびＬｅｕ２２５２（全表面で１８０Ａ）からなる２個のＣ２リン脂質結合部位の１つの関与を示しているが、一方で、第二の部位（Ｍｅｔ２１９９およびＰｈｅ２００２）は示されていないことである。まとめると、これらの観察結果は、Ａｂ  １４Ｃ１２のＶＨ領域が、その生殖系列の立体配置では、Ｃ２ドメインに広範な相同性を有することを示している。図５は、Ｃ２ドメインをＡｂ  １４Ｃ１２のＶＨ領域と重ね合わせたものを図示している。
【０１０４】
表１に示されている情報のもう１つの重要な側面は、Ｃ２ドメインの表面にある残基を模倣するＡｂ  １４Ｃ１２のＶＨのアミノ酸残基が、連続した配列の一部ではなく、どちらかといえば、ＶＨ全体（Ｓ７〜Ｓ１２１残基まで）に分散しているという点である。この発見は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインに対するインヒビターが、配列上のエピトープではなく立体構造上のエピトープに結合することが示されたことと符合する（例えば、ＢＯ２Ｃ１１の結晶構造とＣ２ドメインについては、Ｓｐｉｅｇｅｌ  Ｐ．Ｃ．Ｊｒ．ら、（２００１）Ｂ１ｏｏｄ  ９８：１３−１９参照）。
【実施例６】
【０１０５】
：Ａｂ  １４Ｃ１２とＢＯ２Ｃ１１の相互作用領域の決定
ある抗原に対する抗体の特異性は、通常、１つか２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、大抵の場合はＶＨ領域に位置する残基によって決まる。結合は、最も好適な熱力学条件に対応して生じる（Ｍａｎｉｖｅｌら、（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：６１１−６２０）。その後、抗原に曝露すると、抗体の反応は成熟すると言われており、ＶＨ領域およびＶＬ領域にランダムに変異を導入することを含むプロセスになる。この後、抗原に対する結合活性に基づいて選択が起こる。したがって、完全に成熟した抗体の結合活性（この場合はＦＶＩＩＩに対する、患者のＢ細胞の天然のレパートリーから検出または単離できる結合活性）は、ＶＨ領域およびＶＬ領域全域にわたって存在する残基によってもたらされる協調力（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｆｏｒｃｅｓ）によって決まる。
【０１０６】
Ａｂ  １４Ｃ１２とＢＯ２Ｃ１１の間の相互作用が、ＶＨ領域の中にある少数の不連続領域に位置する残基によって決まるのか、それとも、ＶＨおよびＶＬの領域全域にわたって分散している残基によって決まるのかを判定するために、ＢＯ２Ｃ１１のＶＨ領域およびＶＬ領域と、Ａｂ  １４Ｃ１２のＶＨ領域およびＶＬ領域配列との間でアラインメントを行った。表２に示された結果は、相互作用への顕著な寄与は、両抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域に分散している残基によってもたらされることを示している。このデータによって、ＦＶＩＩＩインヒビターを有する患者に投与するための抗イディオタイプ抗体を得る好適な方法は、完全な抗ＦＶＩＩＩ抗体を使用することであることが確認された。
【実施例７】
【０１０７】
：Ａｂ  １４Ｃ１２のＦａｂ断片によるＢＯ２Ｃ１１の阻害活性の中和
当業者に周知の方法に従い、パパインアガロースビーズ（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いた分解によってＡｂ  １４Ｃ１２のＦａｂ断片を調製し、プロテインＡセファロースカラムを通過させて精製した。
【０１０８】
インヒビターＢＯ２Ｃ１１の存在下で、Ａｂ  １４Ｃ１２のＦａｂ断片がＦＶＩＩＩの機能を回復できるかを評価するために、我々は、まず、実施例２（上記参照）に記載されているように、機能的発色アッセイ法（第ＶＩＩＩ因子発色試験、デイドベーリング社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、ドイツ、マールブルク（Ｍａｒｂｕｒｕｇ））において、１  ＩＵ／ｍｌの組換えＦＶＩＩＩを用いて、ＦＶＩＩＩ活性を８０％阻害するのに必要なＢＯ２Ｃ１１の濃度を測定した。ＦＶＩＩＩ活性を８０％阻害するのに必要なＢＯ２Ｃ１１の量を、等量でさまざまな濃度のＡｂ  １４Ｃ１２のＦａｂ断片と混合した。組換えＦＶＩＩＩを加える前に、混合液を３７℃で１時間インキュベートした。さらに３７℃で１時間インキュベートした後、この混合液のアリコット（等量液）を取り出してから、発色アッセイ試薬に加えた。対照実験には、単独、または無関係の特異性をもつＡｂとともにインキュベートした組換えＦＶＩＩＩが含まれた。図６は、ＢＯ２Ｃ１１／Ａｂ  １４Ｃ１２  Ｆａｂのモル比が１／８で、Ｆａｂ断片がＢＯ２Ｃ１１のインヒビター活性を５０％中和することを示している。
【実施例８】
【０１０９】
：ＦＩＩＩのＶＷＦおよびＰＬへの結合に対するＡｂ  １４Ｃ１２の影響
ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインは、リン脂質（ＰＬ）の結合部位、およびフォン・ヴィルブラント因子（ｖＷＦ）の主要結合部位を含む。ＰＬへの結合は、ＦＶＩＩＩの生理活性にとって必須である。すなわち、ＦＩＸおよびＦＸと第Ｘ因子活性化複合体（ｔｅｎａｓｅ
ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。ｖＷＦは、シャペロンタンパク質として働き、ＦＶＩＩＩを早期分解およびクリアランスから防御する。
【０１１０】
Ａｂ  １４Ｃ１２が、ｖＷＦまたはＰＬいずれかに対するＦＶＩＩＩの結合を阻害できるかを、以下のようにして調べた。マイクロタイタープレートを抗ｖＷＦ抗体でコートした後、別記した（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  Ｍら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９５：１５６−１６３）とおりにｖＷＦを精製した。Ａｂ  １４Ｃ１２の希釈液（１００〜０．３μｇ／ｍｌ）を調製して、各希釈液の等量液を、ｖＷＦでコートしたプレートに加えた後、１  ＩＵ／ｍｌの最終濃度でＦＶＩＩＩを加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした。ビオチン標識したｍＡｂ１５（重鎖上に存在するＦＶＩＩＩの遠位部位を認識する抗ＦＶＩＩＩ抗体）を２μｇ／ｍｌ加え、その後、アビジン−ペルオキシダーゼおよび特異的基質を加えることによって、ｖＷＦでコートしたプレートへのＦＶＩＩＩの結合を検出した。ＰＬへのＦＶＩＩＩの結合を測定するためには、メタノールで１０μｇ／ｍｌに希釈したホスファチジルセリンでプレートをコートし、ｖＷＦでコートしたプレートにおけると同様にアッセイを行った。
【０１１１】
ｖＷＦおよびＰＬのいずれに対するＦＶＩＩＩ（したがってＣ２ドメイン）の結合の阻害は観察されなかった（図７）。Ａｂ  １４Ｃ１２の代わりにＢＯ２Ｃ１１を用いた対照実験では、ｖＷＦでコートしたプレートとＰＬでコートしたプレートの両方とも結合が完全に阻害されることが示された（データ不表示；Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  Ｍら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９５：１５６−１６３の図３参照）。したがって、Ｃ２ドメインとＡｂ  １４Ｃ１２のＶＨの間の広範な相補性は、ＦＶＩＩＩが、ＰＬおよび／またはＶＷＦに結合するのを阻害するのに十分ではなと結論された。したがって、Ｃ２ドメインに対するインヒビターを有する患者を治療する方法として、Ａｂ  １４Ｃ１２、またはその派生抗体を投与しても、ＦＶＩＩＩの機能的特性を阻害するという望ましくない結果を生じることはない。
【実施例９】
【０１１２】
：ＦＶＩＩＩのクリアランスに対するＡｂ  １４Ｃ１２の影響
循環血からのＦＶＩＩＩのクリアランスは、少なくとも部分的には、ＬＲＰレセプターにＣ２ドメインが結合することに起因する（Ｓａｅｎｋｏら、（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ  ２７４：３７６８５−３７６９２；Ｌｅｎｔｉｎｇら、（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：２３７３４−２３７３９）ため、Ａｂ  １４Ｃ１２によって抑制できることがある。このことを、尻尾に１  ＩＵのヒト組換えＦＶＩＩＩを注射して再構築したＦＶＩＩＩ−／−  Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで調べた。以前の計算では、このモデルにおけるヒトＦＶＩＩＩの平均ｔ1/2は１６５分であることが示された。Ａｂ  １４Ｃ１２がＦＶＩＩＩのクリアランスに変化を与えなかったことを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６  ＦＶＩＩＩ−／−マウスに１０μｇ／ｍｌのＡｂ  １４Ｃ１２、または無関係な特異性をもつＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を注射し、その１５分後、１  ＩＵのヒト組換えＦＶＩＩＩを静脈注射した。３時間後と６時間後、静脈穿刺によって血液サンプルを回収した。機能的発色アッセイ法（第ＶＩＩＩ因子発色試験、デイドベーリング社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）、ドイツ、マールブルク（Ｍａｒｂｕｒｕｇ））を用いて残留ＦＶＩＩＩ活性を評価した。図８に示すように、Ａｂ  １４Ｃ１２が存在するとき、ＦＶＩＩＩ  ｔ1/2に有意な差は見られなかった。したがって、Ｃ２ドメインに対するインヒビターを有する患者を治療する方法として、Ａｂ  １４Ｃ１２、またはその派生抗体を投与しても、ＦＶＩＩＩの生理学的クリアランスを変化させることはありえない。
【実施例１０】
【０１１３】
：Ｂ０２Ｃ１１を産生するＢ細胞株へのＡｂ  １４Ｃ１２の結合
Ａｂ  １４Ｃ１２を用いて、記憶Ｂ細胞、および、ＦＶＩＩＩ機能を阻害する抗体を産生するいくつかのＢ細胞株を標的することができる。このようなＢリンパ球は、その表面に抗体の分泌型の可変部領域と同じ可変部領域をもつ抗体分子を発現する。Ａｂ  １４Ｃ１２のその標的細胞への結合を用いて、細胞死すなわちアポトーシスをもたらすシグナルを伝達することができ、それによって、抗ＦＶＩＩＩインヒビターを産生する細胞を免疫系から極めて特異的に排除することができる。
【０１１４】
ＢＯ２Ｃ１１を産生するＢ細胞株（Ｊａｃｑｕｅｍｉｎ  Ｍら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９５：１５６−１６３）は、ＢＯ２Ｃ１１可溶性抗体を産生し、その表面に抗体の可変部を発現する。Ａｂ  １４Ｃ１２が細胞表面に結合できるかを判定するために、０．５％のウシ血清アルブミンと２  ｍＭ  ＥＤＴＡを含むバッファでＢＯ２Ｃ１１細胞株を洗浄し、４００  ｇで５分間遠心分離し、１００μｌに５×１０5細胞の濃度になるよう再懸濁した。そして、１または１０μｇ／ｍｌという２種類の濃度を使用して、Ａｂ  １４Ｃ１２またはＩｇＧ２ａ偽（Ｓｈａｍ）抗体のいずれかの抗体を細胞懸濁液に加えた。混合液を氷上で２０分間インキュベートし、上記したように、遠心分離によって洗浄し、バッファに再懸濁する。次に、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体を最終濃度１μｇ／ｍｌで各細胞懸濁液に加え、氷上でさらに２０分間インキュベートした。上記したように、細胞懸濁液を遠心分離によって最後に洗浄し、バッファに再懸濁した。蛍光細胞分析分離装置でカウントするために、最終懸濁液を、５００μｌで細胞濃度が１×１０5となるように作成した。
【０１１５】
図９は、Ａｂ  １４Ｃ１２とともにインキュベートした後、ＢＯ２Ｃ１１細胞株が、Ａｂ  １４Ｃ１２で特異的に標識され、細胞の６８％が抗体に対して陽性を示したが、一方、同じサブクラスの偽抗体は何の反応性も示さなかったことを示している。
【０１１６】
このように、Ａｂ  １４Ｃ１２は、ＢＯ２Ｃ１１に同一または類似する抗体を産生する標的細胞に特異的な試薬として使用することができ、それによって、高度に特異的な状況でアポトーシスを誘導する方法が提供される。
【０１１７】
【表１】
2006515565.tif 000003
【０１１８】
表１：Ａｂ  １４Ｃ１２のＶＨとＦＶＩＩＩのＣ２ドメインの配列アラインメント：同一および相同な残基を、それぞれ「＝」および「±」で表示した。ｍＡｂ  １４Ｃ１２の変異したＶＨ残基を星印で示す。ｍＡｂ  １４Ｃ１２と異なる推定Ｃ２残基を（Ｃ）で示す。ＣＤＲ：相補性決定領域、ＦＷ：枠組み
【０１１９】
【表２】
2006515565.tif 000004
【０１２０】
表２：ｍＡｂ  ２Ｃ１１とｍＡｂ  １４Ｃ１２の配列対応性。
【０１２１】
相互作用の強さを、それぞれ「＞＞」および「＞」で表示してある。ｍＡｂ  １４Ｃ１２の変異したＶＨ残基を星印で示す。ｍＡｂ  ２Ｃ１１と異なる推定Ｃ２残基を（Ｃ）で示す。ＣＤＲ：相補性決定領域、ＦＷ：枠組み、ＣＨ１：重鎖第一定常ドメイン
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】本発明の実施形態に従ってＡｂ  １４Ｃ１２によって中和された、ＢＯ２Ｃ１１によるＦＶＩＩＩ阻害の用量依存的中和を示す。
【図２ａ】本発明の実施形態による、ＦＶＩＩＩ−／−  Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける再構築実験の結果を示し、パネルＡはＡｂ  ＢＯＣ２Ｃ１１の存在下または不存在下における第ＶＩＩＩ因子による再構築を示す。Ａｂ  ＢＯＣ２Ｃ１１およびＡｂ  １４Ｃ１２は予めインキュベートした。
【図２ｂ】本発明の実施形態による、ＦＶＩＩＩ−／−  Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける再構築実験の結果を示し、パネルＢはＢＯＣ２Ｃ１１によるＦＶＩＩＩ阻害のＡｂ  １４Ｃ１２による用量依存的中和を示す。Ａｂ  ＢＯＣ２Ｃ１１およびＡｂ  １４Ｃ１２は予めインキュベートした。Ａｂ１４Ｃ１２投与はＢＯ２Ｃ１１およびＦＶＩＩＩの後に行った。
【図２ｃ】本発明の実施形態による、ＦＶＩＩＩ−／−  Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおける再構築実験の結果を示す。Ａｂ  ＢＯＣ２Ｃ１１およびＡｂ  １４Ｃ１２は予めインキュベートした。Ａｂ１４Ｃ１２投与はＢＯ２Ｃ１１およびＦＶＩＩＩの後に行った。
【図３ａ】抗イディオタイプ抗体１４Ｃ１２の重鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ領域をアミノ酸配列の下に示した。
【図３ｂ】抗イディオタイプ抗体１４Ｃ１２の軽鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。ＣＤＲ領域をアミノ酸配列の下に示した。
【図４】Ｃ１ドメインに対するインヒビターに対するマウス抗イディオタイプモノクローナル抗体（Ｂ６Ａ２Ｃ１）による、Ｃ１ドメインに対するヒト阻害抗体（２Ｅ９）およびＣ２ドメインに対するヒト阻害抗体（ＢＯ２Ｃ１１）へのＦＶＩＩＩの結合の中和を示す。
【図５】ＦＶＩＩＩのＣ２ドメイン（黒色）の、Ａｂ  １４Ｃ１２のＶＨ領域との重ね合わせを示す。ここで、濃い灰色の線は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインを表し、明るい灰色の線は１４Ｃ１２のＶＨドメインを表す。
【図６】さまざまな濃度のＡｂ  １４Ｃ１２を加えたときの、ＦＶＩＩＩに対するＢＯ２Ｃ１１の阻害活性の中和を示す。ＦＶＩＩＩ活性は、機能的発色アッセイ法で測定した。
【図７】Ａｂ  １４Ｃ１２によるＦＩＩＩのリン脂質またはＶＷＦへの結合阻害の欠如を示す。ホスファチジルセリン（パネルＡ）またはＶＷＦに対する抗体および精製ＶＷＦ（パネルＢ）でコートしたマイクロタイタープレートにＦＶＩＩＩを加えた。濃度を増加させながらＡｂ  １４Ｃ１２を加えて、ＰＬまたはＶＷＦへの結合を阻害するＡｂ  １４Ｃ１２の能力を測定した。
【図８】循環血からのＦＶＩＩＩのクリアランスに対するＡｂ  １４Ｃ１２の影響。ＦＶＩＩＩ−／−Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＩＶを、ＦＶＩＩＩのみ（ＦＶＩＩＩ）と注射するか、またはＡｂ  １４Ｃ１２と注射した１５分後にＦＶＩＩＩと注射した（ＶＩＩＩ＋１４Ｃ１２）。３時間および６時間後にＦＶＩＩＩの機能を測定して、ＦＶＩＩＩのクリアランス率を評価した。
【図９】Ｂ０２Ｃ１１を産生するＢ細胞へのＡｂ  １４Ｃ１２の結合。表面抗体を有するＢＯ２Ｃ１１リンパ芽球腫細胞株をＡｂ  １４Ｃ１２とともにインキュベートするか（上図）、同じサブクラスの偽（ｓｈａｍ）抗体とインキュベートした（下図）。上図に示す曲線が右に移動しているのは、６８％のリンパ芽球腫細胞株ＢＯ２Ｃ１１がＡｂ  １４Ｃ１２によって認識されることを示している。
【図１】
2006515565.tif 000005
【図２ａ】
2006515565.tif 000006
【図２ｂ】
2006515565.tif 000007
【図２ｃ】
2006515565.tif 000008
【図３ａ】
2006515565.tif 000009
【図３ｂ】
2006515565.tif 000010
【図４】
2006515565.tif 000011
【図５】
2006515565.tif 000012
【図６】
2006515565.tif 000013
【図７】
2006515565.tif 000014
【図８】
2006515565.tif 000015
【図９】
2006515565.tif 000016
【配列表】
2006515565000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月1日(2005.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に対するモノクローナル抗イディオタイプ抗体であって、前記阻害抗体が、第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインに対するものであり、前記抗体の可変部重鎖の相補性決定領域が、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７に示されたアミノ酸配列の１つに７０％以上の配列同一性を有し、前記抗体の可変部軽鎖の相補性決定領域が、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０に示されたアミノ酸配列の１つに７０％以上の配列同一性を有することを特徴する、モノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項２】
ヒト第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に対するモノクローナル抗イディオタイプ抗体であって、前記阻害抗体が、第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインに対するものであり、前記抗体の可変部重鎖の相補性決定領域が、配列番号：５、配列番号：６、または配列番号：７に示されたアミノ酸配列の１つに９５％以上の配列同一性を有し、前記抗体の可変部軽鎖の相補性決定領域が、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０に示されたアミノ酸配列の１つに９５％以上の配列同一性を有することを特徴とする、モノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項３】
前記抗イディオタイプ抗体の可変部重鎖が、配列番号：１に示された塩基配列、もしくは配列番号：１に９５％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ、または、抗イディオタイプ抗体の可変部軽鎖が、配列番号：３に示された塩基配列、もしくは配列番号：３に９５％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされている、請求項１または２に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項４】
前記抗イディオタイプ抗体の可変部重鎖が、配列番号：１に示された塩基配列、もしくは配列番号：１に７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされ、かつ、抗イディオタイプ抗体の可変部軽鎖が、配列番号：３に示された塩基配列、もしくは配列番号：３に７０％以上の配列同一性を有する塩基配列にコードされている、請求項１または２に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項５】
Ｆ（Ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ断片、または前記断片を改変したものである、請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項６】
ヒト化モノクローナル抗イディオタイプ抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項７】
１４Ｃ１２、またはそれから派生した抗体である、請求項１〜６のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体。
【請求項８】
第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインに対する抗体に結合可能な単離精製ペプチドであって、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０より選択されたアミノ酸配列、または、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、および配列番号：１０より選択されたアミノ酸配列に９５％以上アミノ酸配列が同一性を有する配列を含む、ペプチド。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体を発現する、モノクローナル細胞株。
【請求項１０】
ＢＣＣＭに寄託番号ＬＭＢＰ５８７８ＣＢとして寄託された細胞株１４Ｃ１２である、請求項９に記載のモノクローナル細胞株。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体、または請求項８に記載の単離精製ペプチドを、少なくとも１種類の医薬的に許容される担体と混合して含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体、または請求項８に記載の単離精製ペプチドの、ＦＶＩＩＩ阻害抗体の作用を患う患者を治療するため、または、前記患者においてそのような作用を予防する薬剤を調製するための使用。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗イディオタイプ抗体、または請求項８に記載の単離精製ペプチドの、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を有する患者における抑制不可能な出血を治療または予防する薬剤を調製するための使用。
【請求項１４】
ＦＶＩＩＩをさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＦＶＩＩＩインヒビターに対する薬剤を製造するためのモノクローナル抗イディオタイプ抗体を開発するための方法であって、第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインに対する阻害抗体によって動物を免疫することと、ａ）ＦＶＩＩＩインヒビターの抗凝血活性を５０％以上中和し、ｂ）ＦＶＩＩＩがｖＷＦおよびリン脂質に結合することと相互作用しない抗体を作製するために、前記動物の不死化脾臓細胞をスクリーニングすることとを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗イディオタイプ抗体、または請求項８に記載のペプチドの、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を検出または精製するための使用。
【国際調査報告】
2006515565.tif 000017
2006515565.tif 000018
2006515565.tif 000019
2006515565.tif 000020
2006515565.tif 000021