(57)【要約】本発明は、ＰＡＰＡＰ遺伝子のポリヌクレオチド、ＰＡＰＡＰ遺伝子によってコードされるポリペプチド、およびそのようなポリペプチドに対して特異的に産生される抗体に関する。本発明はさらに、精神分裂病、躁鬱病（二極性障害）、あるいは関連ＣＮＳ（中枢神経系）疾患の治療または診断方法に関する。本発明はまた、ＰＡＰＡＰと精神分裂病候補遺伝子ｇ３４８７２間の相互作用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のＰＡＰＡＰポリペプチドをコードする単離、精製、あるいは組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１またはその相補体のヌクレオチド配列を含む単離、精製、または組換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項３に記載の組換えベクターを含む非ヒト宿主動物または哺乳類。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがさらに標識を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされる精製または単離ＰＡＰＡＰポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２のアミノ酸配列を含む精製または単離ＰＡＰＡＰポリペプチド。
【請求項９】
ＰＡＰＡＰポリペプチド産生の方法であって、前記方法が、
ａ）請求項１に記載の組換えベクターを含む宿主細胞を供給すること；
ｂ）前記ＰＡＰＡＰポリペプチドの発現を誘導する条件下で前記宿主細胞を培養すること；
ｃ）前記宿主細胞によって産生されたＰＡＰＡＰポリペプチドを回収すること、
を含む方法。
【請求項１０】
請求項８のポリペプチドに特異的に結合する単離または精製抗体。
【請求項１１】
生物試料中のＰＡＰＡＰポリペプチドの存在を特異的に検出する方法であって、前記方法が：
ａ）生物試料を請求項８に記載のＰＡＰＡＰポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させること；ならびに
ｂ）前記抗体と前記ポリペプチドの間に形成された抗原−抗体複合体を検出すること、
を含む方法。
【請求項１２】
候補物質スクリーニングの方法であって、前記方法が：
ａ）請求項８に記載のポリペプチドを供給すること；
ｂ）前記ポリペプチドを前記候補物質と接触させること；
ｃ）前記ポリペプチドと前記候補物質の間に複合体が形成されたかどうかを測定すること、
を含む方法。
【請求項１３】
候補物質スクリーニングの方法であって、前記方法が：
ａ）ＰＡＰＡＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされた原核または真核細胞をそれ自体のプロモーターの制御下で培養すること；
ｂ）前記培養細胞を前記候補分子と接触させること；
ｃ）前記候補分子が存在する状態においてＰＡＰＡＰタンパク質の発現を検出すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＡＰＡＰ遺伝子のポリヌクレオチド、ＰＡＰＡＰ遺伝子によってコードされるポリペプチド、およびそのようなポリペプチドに対して特異的に産生される抗体に関する。本発明はさらに、精神分裂病、躁鬱病（二極性障害）、あるいは関連ＣＮＳ（中枢神経系）疾患の治療または診断方法に関する。本発明はまた、ＰＡＰＡＰと精神分裂病候補遺伝子ｇ３４８７２間の相互作用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
基礎および臨床研究者が利用できる技術的用品の進歩は、健康および疾病における脳と神経系機能について益々複雑な研究を可能にしている。精神医学的障害と神経変性疾患を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患に関与する神経化学的および遺伝的メカニズムに関して、神経生物学ならびに薬理学のどちらからも多数の仮説が提出されてきた。しかしながら、ＣＮＳ疾患は複雑で十分に理解されていない病因と、重複し、十分に特徴づけされていない、計測困難な症状を有する。その結果として、将来の治療法と創薬への努力は、さらに複雑化し、複遺伝子性原因にフォーカスする必要があり、したがって疾患集団を区分するための新アッセイを必要とし、ＣＮＳ疾患を罹患する患者についてのさらに正確な診断および予後に関する情報を提供する必要がある。
【０００３】
ＣＮＳ疾患は、広範囲の疾患を包含し、したがって広範囲の遺伝因子を包含し得る。ＣＮＳ疾患の例は、神経変性疾患、精神病性障害、気分障害、自閉症、物質依存症およびアルコール中毒、精神遅滞、ならびに認識、不安、食事、衝動制御、および人格障害を含むその他の精神医学的障害を含む。疾患は、「精神障害第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）分類についての診断および統計学的説明書」を用いて定義することができる。
【０００４】
ＣＮＳ疾患の小サブセットのみを考慮する場合でさえ、精神病性障害である精神分裂病と躁鬱病のための適切な治療法とその分子的基礎の理解が欠如していることから、治療に関する発明のための新しいターゲットおよび治療法の改善が必要とされていることは明らかである。精神分裂病と躁鬱病のどちらについても、精神分裂病の治療に使用されている全ての公知の分子は副作用を有し、さらに疾病の症状に対してのみ作用する。治療に関連する副作用がなく、精神分裂病と躁鬱病の原因メカニズムに関与するターゲットに対して直接作用する新しい分子の大きな需要がある。したがって、これらのターゲットの発見と特徴づけを可能にするツールは必要かつ有用である。
【０００５】
家族における精神分裂病と躁鬱病の集中、双子および養子研究からの証拠、ならびに全世界の発生率に変動がないことは、精神分裂病と躁鬱病が主として遺伝的状態であることを示すが、しかし、環境リスク因子もまた必然かつ十分に考えられる原因、あるいは相互作用的原因としてある程度関与する。例えば、精神分裂病は一般集団では１％出現する。しかし、祖父母の一人が精神分裂病であれば、前記疾患を罹患するリスクは約３％に増加し、両親の一人が精神分裂病であれば、リスクは約１０％に増加する。両親がどちらも精神分裂病であれば、リスクは約４０％に上る。
【０００６】
《染色体１３ｇ３１−ｑ３３上にある精神分裂病感受性遺伝子の同定》
精神分裂病などの特定の中枢神経系疾患のような特定の形質に関与する遺伝子の同定は、遺伝子マッピングに現在使用されている二つの主要なストラテジーである、連鎖分析と関連性調査によって実施することができる。連鎖分析は複数の罹患個体を有する家族についての研究を必要とし、一遺伝子性あるいは主働遺伝子性形質の検出に有用である。反対に、関連性調査は、形質ネガティブ（Ｔ−）コントロールと比較する血縁のない形質（Ｔ＋）個体におけるマーカー対立遺伝子の出現頻度を調査し、多遺伝子性遺伝の検出に用いられる。
【０００７】
遺伝子連鎖または「連鎖」は、染色体上の二つの隣接配列が減数分裂中の交差による最少の組換えを含むことについての分析に基づく。これを実行するために、マイクロサテライトマーカーのような染色体マーカーをゲノム上に正確に局在させた。遺伝子連鎖分析では、染色体マーカーを使用したターゲット遺伝子上の組換えの確率を、系統樹、疾患の伝播、およびこのマーカーの伝播によって計算する。したがって、もし所定のマーカーである特定の対立遺伝子がより頻繁に（０〜０．５の組換えレベルで）疾患と共に伝播されるならば、研究対象であるターゲット遺伝子がマーカーの近隣に発見されると推論することが可能である。本技術を用いて、家族性ガンの遺伝的素因を実証するいくつかの遺伝子を局在化することが可能であった。遺伝的疾患形態を罹患している家族が遺伝子連鎖研究の対象となり得るには、その遺伝的疾患形態を罹患している家族が、一世代に数人の（その体質性ＤＮＡを入手可能である）疾患を罹患している被験者を有すること、ならびに最適には多数の兄弟姉妹を有するという、「情報を有する」という基準を満たさなければならない。
【０００８】
過去の連鎖研究の結果は、染色体１３が１３ｑ３２に精神分裂病に感受性である遺伝子座を有するらしいという仮説を支持した（Ｂｌｏｕｉｎ  ＪＬら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０：７０〜７３；Ｌｉｎ  ＭＷら、１９９７、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．、９９（３）：４１７〜４２０）。染色体１３ｑ３２座に精神分裂病の遺伝子座の存在を示唆するこれらの観察は、連鎖研究の実施によって得られた。連鎖分析は、明らかなメンデル遺伝パターンを示しさらに高表現率を有する単一の遺伝的形質をマップするために用いると好結果が得られるが、本方法は様々な欠点を有する。第一に、連鎖分析は、各試験形質に適切な遺伝モデルの選択の信頼性によって制限を受ける。さらに、連鎖分析を用いて得られる解像度には限界があり、本方法によってまず同定された典型的な２０Ｍｂ領域の分析を精確にするために相補性試験が必要とされる。その上、複数の遺伝子および／または環境因子の共働作用に起因する形質のような複雑な遺伝的形質に適用する場合は連鎖分析は困難であることが証明されている。そのような場合は、これらの状況に連鎖分析を適用するために必要とされる罹患家族を適切な数だけ募集するために莫大な努力とコストが必要となる。結局、連鎖分析は、多数の情報を有する家族が利用できないような形質の研究には適用できない。
【０００９】
ごく最近に、連鎖研究を用いるかわりに、染色体１３ｑ３１〜ｑ３３座に局在するｇ３４８７２遺伝子として言及される新精神分裂病および躁鬱病関連遺伝子が、関連性調査を行う代替方法を用いて同定された。この代替方法は、目的の領域に二対立遺伝子マーカー（主として単ヌクレオチド多型性）を生成すること、精神分裂病との連鎖平衡異常でマーカーを同定すること、ならびに血縁のない精神分裂病および躁鬱病症例とコントロール集団において関連性調査を実施することを含む。
【００１０】
要約すると、候補ゲノム領域をカバーするＢＡＣコンティグを、染色体１３ｑ３１〜ｑ３３領域に局在する２７個の公開ＳＴＳを用いて構築して、固有のＢＡＣライブラリーに相当する７個のゲノムをスクリーンした。これらの物質から、新ＳＴＳが生成され、これによって前記領域の密度の高い物理的マップの構築を可能にした。総計して、２７５個のＳＴＳによって２５５個のＢＡＣが同定され、検証のためにインサイツ染色体ハイブリダイゼーションによってその全てがサイズ決定ならびにマップされた。新しい二対立遺伝子マーカーが、ヒト染色体１３ｑ３１〜ｑ３３領域に局在するＢＡＣインサートのいくつかのサブクローンに由来するインサート端の部分的配列決定によって生成された。本分析の第一フェーズでは、染色体１３ｑ３１〜ｑ３３候補座を横切る９個の別々のＢＡＣ上にある３４個の二対立遺伝子マーカーの第一セットを精神分裂病症例とコントロールにおいて分析して、それによって精神分裂病に関連性を示すサブ領域を同定した。この第一分析に引き続いて、ターゲット領域の極めて高密度マップを提供するために、前述のようにしてさらに二対立遺伝子マーカーを生成した。３５個のＢＡＣから成る最小セットが同定されて、完全に配列決定した結果、ターゲット領域の配列を含む９００ｋｂに及ぶコンティグを含むいくつかのコンティグが得られた。
【００１１】
これらの二対立遺伝子マーカーは、精神分裂病候補遺伝子であるｇ３４８７２を含む、特定の目的サブ領域を精確にするために、関連性調査に使用された。二対立遺伝子マーカーは、別々の集団で実施したいくつかの研究によって遺伝子型を決定されて、サブ領域との関連性が確認された。関連性調査は、１３９症例と１４１コントロール、および２１５症例と２４１コントロールをそれぞれ含むフランス系カナダ人集団からの精神分裂病症例とコントロールから成る二つの異なるスクリーニングサンプル、さらにアルゼンチン人集団からの躁鬱病症例とコントロールについて実施された。本集団を用いたいくつかの研究後得られた結果は、精神分裂病と有意な関連を示す約１５０ｋｂからなるゲノム領域を示した。この関連性は次に米国の精神分裂病集団からの症例とコントロール、ならびにアルゼンチンおよびフランス系カナダ人集団からのさらなるサンプルを用いる別々の研究において確認された。
【００１２】
精神分裂病と関連する約１５０ｋｂのゲノム領域は候補遺伝子ｇ３４８７２を含んでいることが発見された。ｇ３４８７２  遺伝子のイントロン−エキソン構造の特徴づけの他に、組織特異的ｍＲＮＡスプライシング変異体を含むｍＲＮＡスプライシング変異体の範囲を同定し、さらにｍＲＮＡの存在が実証された。次に、そのアミノ酸配列が配列番号５に示されている、ｇ３４８７２ポリペプチド産物由来のペプチドフラグメントは、マウスに腹腔内注射されると運動頻度の減少ならびに常同症の増加を示した。ｇ３４８７２遺伝子の同定に関するさらなる論説は、どちらも２０００年３月３０日に出願された、「Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ，  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｂｉａｌｌｅｌｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ（精神分裂病関連遺伝子、タンパク質、および二対立遺伝子マーカー）」と題する共出願中の米国特許出願シリアル番号０９／５３９，３３３  および共出願中の国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ００／００４３５に提供されており、それらの全文を参考文献として本願明細書に引用している。
【００１３】
精神分裂症と躁鬱病に関与する遺伝子を同定する強い需要がある。ｇ３４８７２経路に関与する遺伝子、ならびにその遺伝子産物がｇ３４８７２遺伝子産物と機能的に相互作用する遺伝子を同定する需要もまた存在する。これらの遺伝子は、精神分裂病と躁鬱病の治療において新しい介入点を提供し、ｇ３４８７２遺伝子ならびに関連生物学的経路のさらなる研究と特徴づけを可能にし得る。精神分裂病に関与するこれらの遺伝子および関連生物学的経路についての知見は、研究者が精神分裂病と躁鬱病の病因を理解することを助け、さらに前記疾患の原因に直接作用する薬物および投薬法を導出するであろう。精神分裂病と躁鬱病に対する感受性を検出する新方法、ならびに前記疾患発症の予防またはフォローアップについても大きな需要がある。診断ツールもまた極めて有用であることが証明された。事実、精神分裂病を発症するリスクにある被験者の早期同定は、初期および／または予防的処置の投与を可能にする。さらに、薬剤の実際の効力とその薬剤に対する患者の実際の耐容性の正確な査定によって、臨床医は精神分裂病と躁鬱病治療法の利益／リスク比を向上することが可能になる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、したがってｇ３４８７２ペプチドと相互作用する新遺伝子およびタンパク質に関する。発明者らは、ＰＡＰＡＰ遺伝子として言及される前記新遺伝子をクローン化して、ＰＡＰＡＰ遺伝子産物がｇ３４８７２ペプチドと相互作用することを実証した。ｇ３４８７２結合パートナーについての知見は、ｇ３４８７２および／またはＰＡＰＡＰによって媒介されるＣＮＳ疾患の治療用の薬剤の開発を可能にし、さらにＰＡＰＡＰ、  ｇ３４８７２  および  ｇ３４８７２−ＰＡＰＡＰ  複合体または相互作用の検出の手段を提供することによってｇ３４８７２の研究を可能とする。
【００１５】
本発明は、ＰＡＰＡＰタンパク質をコードする新ヒト遺伝子のゲノム配列を含む核酸分子に関する。ＰＡＰＡＰゲノム配列は、前記遺伝子の転写部分の上流（５’末端）および下流（３’末端）に局在する制御配列を含み、これらの制御配列もまた本発明の一部である。
本発明はまた、ＰＡＰＡＰタンパク質をコードする完全ｃＤＮＡ配列、ＰＡＰＡＰポリペプチド、ならびにＰＡＰＡＰポリペプチドを特異的に認識する抗体を扱う。さらに、天然会合するタンパク質を含まないＰＡＰＡＰ−ｇ３４８７２複合体と前記複合体を特異的に認識する抗体もまた含まれる。
【００１６】
ＰＡＰＡＰゲノムまたはｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、前記プライマーおよびプローブを用いるＤＮＡ増幅法および検出法と同様に、本発明の一部である。
本発明のさらなる目的は、前述する任意の核酸配列を含む組換えベクター、特にＰＡＰＡＰ制御配列あるいはＰＡＰＡＰタンパク質をコードする配列を含む組換えベクター、さらに前記核酸配列または組換えベクターを含む細胞宿主ならびにトランスジェニック非ヒト動物から成る。
【００１７】
本発明はまた、ＰＡＰＡＰ発現を阻害する物質または分子のスクリーニング法、ならびにＰＡＰＡＰポリペプチドと相互作用する、ＰＡＰＡＰポリペプチド活性を調節する、あるいはＰＡＰＡＰとｇ３４８７２ペプチドおよび／またはタンパク質の相互作用を分断、防止、不安定化、または増強する物質または分子のスクリーニング法に関する。
【００１８】
結局、本発明は、ＣＮＳ疾患の治療におけるＰＡＰＡＰポリペプチド、それに対する抗体、およびＰＡＰＡＰ活性のアゴニストとアンタゴニストの用途に関する。
＜配列一覧の配列の簡単な説明＞
配列番号１はＰＡＰＡＰのｃＤＮＡ配列を含む。
【００１９】
配列番号２は、配列番号１のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む。
配列番号３はＰＡＰＡＰのゲノムＤＮＡ配列を含む。
配列番号４は、実施例１に記述するｇ３４８７２ペプチド−アルカリホスファターゼ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００２０】
配列番号５は、実施例１に記述するように、ＰＡＰＡＰ遺伝子を同定かつクローン化するために使用されるｇ３４８７２ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。
配列番号６は、配列番号４のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
染色体ｌｐ３５〜ｐ３６に局在するＰＡＰＡＰ遺伝子の同定
発明者らは、本願明細書の実施例１に詳記されているように、発現クローニング法を用いてＰＡＰＡＰタンパク質を同定した。簡単に言えば、発明者らは、ｇ３４８７２ペプチドのペプチドフラグメントをコードするｃＤＮＡ配列とインサートの上流に局在する分泌シグナル配列を含むベクターの分泌性アルカリホスファターゼ（ＡＰ）のＣ末端とのフレーム内融合を作製して、融合タンパク質を培地中に分泌させ、融合タンパク質を含む培地を回収して、ＡＰ活性をアッセイして、インサイツレセプター／リガンドアッセイに使用した。発明者らは次にインサイツレセプター／リガンドアッセイを行った。ヒト脳ｃＤＮＡライブラリー由来ｃＤＮＡを発現ベクター中にクローン化して、ＣＯＳ−１細胞中にトランスフェクトした。分泌性ＡＰ融合タンパク質は、細胞を培地を含むｇ３４８７２ペプチド−ＡＰ融合タンパク質と共にインキュベートすることによってＰＡＰＡＰをクローン化するためのプローブとして用いた。陽性クローンが検出された場合、単一クローンが同定されるまで、ｃＤＮＡのより小さいプールを用いてアッセイを反復した。
【００２２】
本発明はしたがって、ＰＡＰＡＰ遺伝子に関連するポリヌクレオチドとポリペプチドに関する。ＰＡＰＡＰのゲノムまたはｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとプライマーもまた本発明の一部である。本発明のさらなる目的は、本発明に記述する任意の核酸配列を含む組換えベクター、特にＰＡＰＡＰの制御領域あるいはＰＡＰＡＰタンパク質をコードする配列を含む組換えベクター、さらに前記核酸配列または組換えベクターを含む細胞宿主から成る。本発明はまた、ＰＡＰＡＰ遺伝子の発現を阻害、ＰＡＰＡＰポリペプチド活性を調節、あるいはＰＡＰＡＰおよびｇ３４８７２ペプチドおよび／またはタンパク質の相互作用を分断、防止、不安定化、または増強する分子のスクリーニング法に関する。本発明はまた、診断用試薬として有用であるそのようなポリペプチドに対して特異的に産生された抗体を扱う。
【００２３】
同定されたＰＡＰＡＰ遺伝子およびタンパク質は、精神分裂病または躁鬱病の診断用アッセイのデザイン、さらに精神分裂病、躁鬱病および関連疾患に対する遺伝的感受性の信頼性のある検出のためのアッセイのデザインに使用することができる。ＰＡＰＡＰ核酸とポリペプチド、ならびに前記ポリペプチドに対して産生された抗体は、前記疾患の治療に使用することができる。ＰＡＰＡＰ遺伝子とタンパク質およびそれに対する抗体はまた、新規または既存の薬剤または治療法の治療的ならびに副作用の可能性について精確かつ効率的な評価を提供するための薬物スクリーニングプロトコルのデザインに使用することができる。さらに、ＰＡＰＡＰ核酸とポリペプチドはｇ３４８７２とＰＡＰＡＰおよびＣＮＳ疾患におけるその関与の研究リサーチに利用することができる。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
［定義］
本発明を詳細にわたって説明する前に、本願明細書において本発明を記述するために使用する用語の意味および範囲を説明かつ定義するために以下の定義を公示する。
【００２５】
「ＰＡＰＡＰ遺伝子」という用語は、本願明細書で使用する際は、ＰＡＰＡＰタンパク質をコードするゲノム、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を包含し、前記ゲノムＤＮＡの非翻訳制御領域を含む。
「異種タンパク質」という用語は、本願明細書で使用する際は、ＰＡＰＡＰタンパク質以外の任意のタンパク質またはポリペプチドを示すことを意図している。さらに詳細には、異種タンパク質はＰＡＰＡＰ制御領域についてのさらなる実験においてマーカーとして使用し得る化合物である。
【００２６】
「単離された」という用語は、物質がその本来の環境（例えば、天然物質であれば自然環境）から取り出されることを必要とする。例えば、生きている動物体内に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、天然系におけるいくつかのまたは全ての共存物質から分離された、同一のポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単離される。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であることが可能であり、かつ／またはそのようなポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは組成物の一部であることが可能であるが、ベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではないために単離することができる。
【００２７】
例えば、生きている動物体内に存在する天然ポリヌクレオチドは単離されないが、天然系におけるいくつかのまたは全ての共存物質から分離された同一のポリヌクレオチドは単離される。「単離された」の定義から特に除外されるものは、天然染色体（染色体拡散など）、人工染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー、およびインビトロ核酸調製物または、その宿主細胞がインビトロ異種調製物にあるか、もしくは単一コロニーから成る異種集団として播種されるトランスフェクト（形質移入）／形質転換宿主細胞調製物のいずれかとして存在するｃＤＮＡライブラリーである。さらに、特定のポリヌクレオチドが、ベクター分子中にある核酸インサート数の５％以下である場合はまた、上記びライブラリーは特に除外される。全細胞ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ調製物（機械的剪断あるいは酵素的消化を受けた前記全細胞調製物を含む）もさらに除外される。さらに、本発明のポリヌクレオチドが電気泳動媒体中において異種ポリヌクレオチドからさらに分離されていない（例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロット中にある異種バンド集団から単一バンドを切除することによりさらに分離される）、電気泳動（同様物のブロット転移を含む）により分離されるインビトロ調製物あるいは異種混合物のいずれかである上記全細胞調製物は特に除外される。
【００２８】
本願明細書において、「精製された」という用語は絶対純度を必要とするのではなく、むしろ相対的な定義を意図している。出発物質または天然物質を、少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、一層好ましくは４桁または５桁まで精製することが特に期待される。例えば、濃度が０．１％から１０％なると、２桁の精製が行われたことになる。
【００２９】
例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のｃＤＮＡクローンは、従来は電気泳動的な均一性が得られるまで精製されていた。これらのクローンから得られる配列は、ライブラリーまたは全ヒトＤＮＡのいずれからも直接得ることができなかった。ｃＤＮＡクローンは天然に生じることはなく、むしろ部分的に精製された天然物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作処理によって得られる。ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーへの変換は、合成物質（ｃＤＮＡ）を作出することを含み、クローン選択によって純粋な個々のｃＤＮＡクローンを合成ライブラリーから単離することができる。したがって、メッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作出し、続いてそのライブラリーから個々のクローンを単離すると、未変性メッセージを約１０４〜１０６倍に精製する結果となる。
【００３０】
本願明細書において、「精製された」という用語は絶対純度を必要とするのではなく、むしろ相対的な定義を意図している。出発物質または天然物質を、少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、一層好ましくは４桁または５桁まで精製することが特に期待される。例えば、濃度が０．１％から１０％なると、２桁の精製が行われたことになる。
【００３１】
例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のｃＤＮＡクローンは、従来は電気泳動的な均一性が得られるまで精製されていた。これらのクローンから得られる配列は、ライブラリーまたは全ヒトＤＮＡのいずれからも直接得ることができなかった。ｃＤＮＡクローンは天然に生じることはなく、むしろ部分的に精製させた天然物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作処理によって得られる。ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーへの変換は、合成物質（ｃＤＮＡ）を作出することを含み、クローン選択によって純粋な個々のｃＤＮＡクローンを合成ライブラリーから単離することができる。したがって、メッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作出し、続いてそのライブラリーから個々のクローンを単離すると、未変性メッセージを約１０４〜１０６倍に精製する結果となる。
【００３２】
「精製された」という用語は、本願明細書ではさらに、限定はしないが、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、炭水化物、脂質などを含むその他の化合物から分離された本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを説明する。「精製された」という用語は、ホモ−またはヘテロ−二量体、三量体のようなオリゴマー形から本発明の単量体ポリペプチドを分離することを特定するために使用されることがある。「精製された」という用語はまた、線状ポリヌクレオチドから共有結合によって閉鎖されたポリヌクレオチドを分離することを特定するためにも使用されることがある。ポリヌクレオチドは、試料の少なくとも５０％、好ましくは６０〜７５％が単一ポリヌクレオチド配列および高次構造（線状に対して共有結合閉鎖）を呈する場合に、実質的に純正である。実質的に純正なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、一般的には、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド試料の、それぞれ約５０％、好ましくは６０〜９０％、さらに一般的には約９５％を含み、約９９％以上純正であることが好ましい（ここで％は重量％）。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの純度、あるいは均質性は、試料のアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに後続するゲル染色による単一バンドの可視化のような当該分野で公知であるいくつかの手段によって示される。特定の目的のためには、ＨＰＬＣまたは当該分野で公知である他の手段の使用によってさらに高い解像度を得てもよい。他の実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの精製は、異種ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方）に関して「少なくとも」パーセント純度として表現されることもある。好ましい実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは少なくとも、異種ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関して、それぞれ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または１００％純正である。さらなる好ましい実施形態として、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドはそれぞれ、異種ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかに関して、９０％から１００％の間で１０００分の１までのいかなる数値の範囲の純度（例えば、少なくとも９９．９９５％純正のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）、あるいは担体中に存在するもの以外の全ての化合物および分子に関して重量／重量比としての純度を有する。パーセント純度を表す１０００分の１までの各数値は、純度の個別種と言える。
【００３３】
「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さとは無関係にアミノ酸のポリマーを意味する。したがって、ポリペプチドの定義には、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾を特定するものでもこれを除外するものでもなく、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などが共有結合的に付加されたポリペプチドもポリペプチドという用語に明示的に包含される。さらに、この定義には、１種以上のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸、非関連生物系で天然にのみ発生するアミノ酸、哺乳動物系由来の修飾アミノ酸などを含む）、置換結合を有するポリペプチド、ならびに天然および非天然ポリペプチドを含む当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドが含まれる。
【００３４】
「組換えポリペプチド」という用語は、本願明細書で使用する際は、人工的にデザインされ、当初の自然環境では隣接ポリペプチド配列として見いだされない少なくとも二つのポリペプチド配列を含むポリペプチドを意味するか、または組換えポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドを意味する。
「精製ポリペプチド」という用語は、本願明細書で使用する際は、限定はしないが、核酸、脂質、炭水化物、ならびに他のタンパク質を含むその他の化合物から分離された本発明のポリペプチドを説明する。ポリペプチドは、試料の少なくとも５０％、好ましくは６０〜７５％が一つのポリペプチド配列を呈示する場合は、実質的に純正である。実質的に純正なポリペプチドは、一般的には、タンパク質試料の、約５０％、好ましくは６０〜９０％を含み、さらに一般的には約９５％、約９９％以上純正であることが好ましい（ここで％は重量％）。ポリペプチドの純度あるいは均質性は、試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに後続するゲル染色による単一ポリペプチドの可視化のような当該分野で公知であるいくつかの手段によって示される。特定の目的のためには、ＨＰＬＣまたは当該分野で公知である他の手段の使用によってさらに高い解像度を得てもよい。
【００３５】
本願明細書で使用する際は、「非ヒト動物」という用語は、任意の非ヒト脊椎動物、鳥類とさらに一般的には哺乳類、好ましくは霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、およびウマなどの家畜動物、ウサギ、齧歯類、さらに好ましくはラットまたはマウスを意味する。本願明細書で使用する際は、「動物」という用語は、任意の脊椎動物、好ましくは哺乳類を意味するために使用される。「動物」および「哺乳類」のどちらも、特に「非ヒト」と特記しない限りは、積極的にヒト被験者を包含する。
【００３６】
本願明細書で使用する際は、「抗体」という用語は、少なくとも一つの結合ドメインを含み、抗体結合ドメインが抗体分子の可変ドメインの折り畳みにより形成され、抗原の抗原決定基の特徴に相補性のある内部表面形状および電荷分布を備える三次元結合空間を形成し、それによって抗原との免疫学的反応が可能である、ポリペプチドまたはポリペプチド群を意味する。抗体は、結合ドメインならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、および  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含むフラグメントを含む組換えタンパク質を含む。
【００３７】
本願明細書で使用する際は、「抗原決定基」とは、この場合はＰＡＰＡＰポリペプチドである、抗原分子の一部であり、抗原−抗体反応の特異性を決定する。「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を言及する。エピトープは、少ない場合は、エピトープの特有の空間配座にある３個のアミノ酸を含むことができる。一般的にエピトープは、少なくとも６個のそのようなアミノ酸から成り、少なくとも８〜１０個のそのようなアミノ酸から成ることがより一般的である。エピトープを作製するアミノ酸を決定するための方法は、Ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴、およびエピトープマッピングを含み、例えば、Ｇｅｙｓｅｎ  ら（１９８４）によって説明されるペプスキャン法；  国際公開番号ＷＯ８４／０３５６４；および  国際公開番号ＷＯ８４／０３５０６である。
【００３８】
本願明細書を通して、「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸を区別なく指定するために使用し得る。さらに精確には、「ヌクレオチド配列」という表現は、核性物質それ自体を包含し、したがって、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生化学的に特徴づける配列情報（すなわち、４塩基文字間で選択される文字の順序）に限定されない。
【００３９】
本願明細書において同義に用いられるように、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの状態にある複数のヌクレオチドから成るＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。「ヌクレオチド」という用語は、本願明細書では、任意の長さの一本鎖または二本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を説明する形容詞として使用される。「ヌクレオチド」という用語は、本願明細書では、個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドの変種を示す名詞としても使用され、分子、あるいは大型核酸分子に含まれる個々の単位を意味し、それはプリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボース糖部分、ならびにリン酸基、またはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中のヌクレオチドである場合はリン酸ジエステル結合を含む。本願明細書では、「ヌクレオチド」という用語を、（ａ）選択的結合基、（ｂ）プリン類似体、（ｃ）ピリミジン類似体、（ｄ）糖類似体のうち少なくとも一つの修飾を含む「修飾ヌクレオチド」を包含するものとして使用するが、例えば結合基、プリン、ピリミジンおよび糖の類似体については、例えば、国際公開番号ＷＯ  ９５／０４０６４を参照のこと。
本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組換え、エキソビボ生成またはこれらの組み合わせの他、当該分野に公知である任意の精製方法を含む、公知の方法のいずれかによって調製してもよい。
【００４０】
プロモーターのような制御配列に「作動可能に連結する（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」配列とは、前記制御エレメントが核酸に関して正しい位置および方向づけにあり、目的の核酸のＲＮＡポリメラーゼの開始と発現を制御することを意味する。本願明細書では、「作動可能に連結する」とは、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの結合を意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与えるならば、コード配列に作動可能に連結されている。
【００４１】
「形質」および「表現型」という用語は、本願明細書では同義に用いられ、例えば、疾患の症状、あるいは罹病性のような、任意の可視、検知、さもなければ測定可能である生物体の性質を意味する。一般的に「形質」または「表現型」という用語は、本願明細書では、疾患の症状または罹病性、治療に対する有益な応答または副作用を意味する。好ましくは、前記形質は、限定はされないが、ガン、発育障害、または神経性疾患であり得る。
【００４２】
「対立遺伝子」という用語は、本願明細書では、ヌクレオチド配列の変異体を言及する。二対立遺伝子による多型性は二つの形態を有する。二倍体生物は、対立遺伝子型についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
「遺伝子型」という用語は、本願明細書では、個体あるいは試料中に存在する対立遺伝子のアイデンティティを意味する。本発明との関連において、遺伝子型とは、個体または試料中に存在する二対立遺伝子マーカーである対立遺伝子を意味することが好ましい。二対立遺伝子マーカーについて試料または個体の「遺伝子型を決定すること」は、二対立遺伝子マーカーに個体が担う特定の対立遺伝子または特定のヌクレオチドを決定することを含む。
【００４３】
本願明細書で使用する際は、「変異」という用語は、異なるゲノムあるいは個体間のＤＮＡ配列の差異が１％以下の頻度を有することを意味する。
「多型性」という用語は、本願明細書で使用する際は、異なるゲノムあるいは個体間に二つ以上の別のゲノム配列または対立遺伝子が出現することを意味する。「多型性」とは、集団において特定のゲノム配列を有する二つ以上の変異体が見出される状態を意味する。「多型部位」とは変異が起こる遺伝子座である。単一ヌクレオチド多型性は、多型部位において一つのヌクレオチドが他のヌクレオチドによって置換されている。単一ヌクレオチドの欠失または単一ヌクレオチドの挿入もまた単一ヌクレオチド多型性を生じる。本発明との関連においては、「単一ヌクレオチド多型」は、単一ヌクレオチド置換を意味することが好ましい。一般的には、別々の個体間では、多型部位は二つの別々のヌクレオチドによって占有され得る。「二対立遺伝子多型性」および「二対立遺伝子マーカー」という用語は、本願明細書では同義に用いられ、集団においてかなり高頻度で二つの対立遺伝子を有する単一ヌクレオチド多型性を意味する。「二対立遺伝子マーカーである対立遺伝子」とは、二対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチド変異体を意味する。
【００４４】
「上流」という用語は、本願明細書で使用する際は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端方向にある位置を意味する。
「塩基対の」および「ＷａｔｓｏｎとＣｒｉｃｋ塩基対の」という表現は、本願明細書では同義に用いられ、二重らせん構造のＤＮＡの場合と同様に、アデニン残基が二つの水素結合によってチミン残基またはウラシル残基と結合し、シトシン残基とグアニン残基とが３つの水素結合によって結合する点で配列が同一であることから、互いに水素結合可能なヌクレオチドを示す（Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（生化学）、第４版、１９９５を参照）。
【００４５】
「相補的」または「その相補体」という用語は、本願明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎとＣｒｉｃｋ塩基対を形成できるポリヌクレオチド配列を意味する。本発明の目的では、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに相補性があると見なす。相補塩基とは一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。
本願明細書では、「相補」を、「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチド対に適用されるものであり、二つのポリヌクレオチドが実際に結合する条件での特定のセットに適用されるものではない。
変異体とフラグメント
１−ポリヌクレオチド
本発明はまた、本願明細書に記述するポリヌクレオチド、特に本発明による一つ以上の二対立遺伝子マーカーを有するＰＡＰＡＰ遺伝子の変異体とフラグメントに関する。
【００４６】
本願明細書に使用する際は、ポリヌクレオチドの変異体とは、対照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変異体は、天然対立遺伝子変異体のような天然変異体であるか、または天然発生することが公知ではない変異体であってもよい。そのようなポリヌクレオチドの非天然変異体は、変異形成法によって作出でき、その技術はポリヌクレオチド、細胞または生物体に応用されるものを含む。一般的には、差異は限定されており、対照と変異体のヌクレオチド配列が、総体的に極めて類似しており、多くの領域で同一である。
【００４７】
本発明によるポリヌクレオチドの変異体は、限定はされないが、配列番号１または３のポリヌクレオチドまたは配列番号１または３のポリヌクレオチドの少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを有する任意のポリヌクレオチドフラグメントと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列、さらに好ましくは、配列番号１または３のポリヌクレオチドまたは配列番号１または３のポリヌクレオチドの少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを有する任意のポリヌクレオチドフラグメントと少なくとも９９％同一、さらに好ましくは９９．５％同一、ならびに最も好ましくは９９．８％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
変異体ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの変化はサイレント（無変化）であってもよく、これはそのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を修飾しないことを意味する。しかし、ヌクレオチドの変化はまた、その結果として、対照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切断を起こすことがある。置換、欠失、または付加は、一つ以上のヌクレオチドに及ぶことがある。変異体は、コード領域または非コード領域、またはその両方に修飾を受けることがある。コード領域における修飾は、保存的あるいは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を起こすことがある。
【００４９】
本発明に関連して、特に好ましい実施形態は、ポリヌクレオチドが成熟ＰＡＰＡＰタンパク質と実質的に同一の生物機能または活性を有するポリペプチドをコードするもの、あるいはポリヌクレオチドが特定の生物活性を維持あるいは増加するが、第二の生物活性を低下させるポリペプチドをコードする実施形態である。
【００５０】
ポリヌクレオチドフラグメントは、所定のヌクレオチド配列、好ましくはＰＡＰＡＰ遺伝子、およびその変異体のヌクレオチド配列の全てではないが一部と完全に同一である配列を有するポリヌクレオチドである。フラグメントはＰＡＰＡＰ遺伝子のイントロンまたはエキソンの一部であり得る。フラグメントはまたＰＡＰＡＰの制御領域の一部であり得る。
【００５１】
そのようなフラグメントは、他のポリヌクレオチドの一部ではなく、またはこれに融合されていない「遊離状態」にあってもよく、あるいはそれらフラグメントが一部または領域を形成する単一の大型ポリヌクレオチド内に含まれていてもよい。事実、これらのフラグメントのいくつかは単一の大型ポリヌクレオチド内に存在していることがある。
【００５２】
任意に、そのようなフラグメントは、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、 ２０、２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００、２５０、５００または１０００ヌクレオチド長を有する 隣接スパンから成っていることがあり、あるいは実質的に成っている。
２−ポリペプチド
本発明はまた、変異ＰＡＰＡＰタンパク質を含む、本願明細書に記述するポリペプチドの変異体、フラグメント、類似体および誘導体に関する。
【００５３】
変異体は、１）一つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基で置換されており、さらにそのような置換アミノ酸残基が遺伝コードによってコードされているかあるいはコードされていないもの、または２）一つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または３）変異ＰＡＰＡＰがポリペプチドの半減期を増加するようなその他の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）に融合されているもの、または４）リーダーまたは分泌配列、あるいは変異を受けたＰＡＰＡＰまたはプレタンパク質配列の精製に用いられる配列のような付加アミノ酸が変異を受けたＰＡＰＡＰに融合されているものであり得る。そのような変異体は、当業者の技術範囲にあると見なされる。
【００５４】
ポリペプチドフラグメントは、所定のポリペプチド配列、好ましくはＰＡＰＡＰ遺伝子、およびその変異体によってコードされるポリペプチド配列の全てではないが一部と完全に同一である配列を有するポリペプチドである。
本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換の場合、１個または数個のアミノ酸が「等価」アミノ酸によって置換され得る。「等価」アミノ酸とは、本願明細書では、ペプチド化学分野の当業者がポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー性が実質的に変化されないと予測する類似特性を有するアミノ酸の一つを置換し得る任意のアミノ酸を意味する。一般的に、以下の群のアミノ酸：（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、 Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；  （３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ； （５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、が等価転換を示す。
【００５５】
本発明に従う目的の修飾ＰＡＰＡＰペプチド分子についての特定の実施形態は、限定はされないが、タンパク質分解に抵抗性であるペプチド分子、‐ＣＯＮＨ‐ペプチド結合が修飾され、かつ（ＣＨ２ＮＨ）還元結合、（ＮＨＣＯ）逆−反転結合、（ＣＨ２−Ｏ）メチレン・オキシ結合、（ＣＨ２−Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ２ＣＨ２）カルバ結合、（ＣＯ−ＣＨ２） セトメチレン結合、（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合）、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルセン結合または−ＣＨ＝ＣＨ− 結合によって置換されているペプチドであるペプチド分子を含む。本発明はまた、少なくとも一つのペプチド結合が前述するように修飾されている、ヒトＰＡＰＡＰポリペプチドまたはそのフラグメントまたは変異体を包含する。
【００５６】
そのようなフラグメントは、他のポリペプチドの一部ではなく、またはこれに融合されていない「遊離状態」にあってもよく、あるいはそれらフラグメントが一部または領域を形成する単一の大型ポリペプチド内に含まれていてもよい。しかしながら、いくつかのフラグメントは単一の大型ポリペプチド内に含まれていることがある。
【００５７】
本発明のポリペプチドフラグメントの代表例として、約５、６、７、８、９ または １０〜１５、１０〜２０、１５〜４０、または３０〜５５アミノ酸長を有するペプチドフラグメントがあり得ることが言及されている。好ましいものは、ＰＡＰＡＰタンパク質に少なくとも一つのアミノ酸変異を有するフラグメントである。
【００５８】
核酸またはポリペプチド間のアイデンティティ
「配列同一性の割合（パーセント）」および「相同率（パーセント）」という用語は、本願明細書では同義に用いられ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を意味し、比較ウインドウ上で最適に整列された二つの配列を比較することによって測定され、ここで比較ウインドウ内にあるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列部分は、二つの配列間の最適アライメントについて、（付加または欠失を含まない）対照配列と比較すると、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいることがある。割合は、両配列において同一核酸塩基またはアミノ酸残基が生じてマッチ位置数を産する位置の数を測定し、マッチ位置数を比較ウインドウ内の総位置数で割り算して、その結果に１００を掛け算することによって計算される。相同性は、当該分野で公知である様々な配列比較アルゴリズムおよびプログラムを使用して評価される。そのようなアルゴリズムおよびプログラムは、限定はされないが、ＴＢＬＡＳＴＩＮ、 ＢＬＡＳＴＰ、 ＦＡＳＴＡ、 ＴＦＡＳＴＡ、 ＣＬＵＳＴＡＬＷを含む（ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ、１９８８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ら、１９９４；Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９９６；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０； Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９３）。特に好ましい実施形態では、タンパク質と核酸配列の相同性は、当該分野で公知であるベーシック・ローカル・アライメント・サーチ・ツール（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価される（Ｋａｒｌｉｎ と Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０； Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、１９９３、１９９７を参照）。特に、５つの特異的ＢＬＡＳＴプログラムが、以下のタスクを実行するために使用される：
（１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３は、アミノ酸クエリー配列をタンパク質配列データベースに対して比較する；
（２）ＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較する；
（３）ＢＬＡＳＴＸは、クエリーヌクレオチド配列（両鎖）の６フレーム概念上の翻訳産物を、タンパク質配列データベースに対して比較する；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮは、クエリータンパク質配列を全６つの読み枠（両鎖）に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して比較する；ならびに
（５）ＴＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳を、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳に対して比較する。
【００５９】
ＢＬＡＳＴプログラムは、クエリーアミノ酸または核酸配列と好ましくはタンパク質または核酸配列データベースから得られる試験配列間の「高スコアリングセグメント対」として本願明細書で言及する、類似セグメントを同定することによって相同配列を同定する。高スコアリングセグメント対は、その多くが当該分野で公知であるスコアリングマトリックスの手段によって同定（すなわち、整列される）されることが好ましい。好ましくは、使用するスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔら、１９９２； ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９３）である。さほど好ましくはないが、ＰＡＭあるいはＰＡＭ２５０マトリックスを使用してもよい（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚと Ｄａｙｈｏｆｆ、編集、１９７８を参照）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定された全ての高スコアリングセグメント対の統計学的有意性を評価し、そして好ましくはユーザ特定相同率のような、ユーザ特定による有意性閾値を満たすようなセグメントを選択する。好ましくは、高スコアリングセグメント対の統計学的有意性は、カーリンの統計学的有意性公式を用いて評価される（例えば、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０を参照のこと）。
【００６０】
ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトパラメータあるいはユーザにより供給される変更パラメータを用いて使用することができる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本発明によるそのようなハイブリダイズ状態にある核酸を定義する目的では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の如くである：
ハイブリダイゼーション工程は、６×  ＳＳＣ緩衝液、５×  デンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で実現される。
【００６１】
ハイブリダイゼーション工程に引き続いて４回の洗浄工程が行われる。
−５分間に、好ましくは２×  ＳＳＣと０．１％ＳＤＳ緩衝液中、６５℃で２回洗浄；
−３０分間に、好ましくは２×  ＳＳＣと０．１％ＳＤＳ緩衝液中、６５℃で１回洗浄；
−１０分間に、好ましくは０．１×  ＳＳＣと０．１％ＳＤＳ緩衝液中、６５℃で１回洗浄；
これらのハイブリダイゼーション条件は、約２０ヌクレオチド長の核酸分子に適する。前述のハイブリダイゼーション条件が所望の核酸長に応じて適応されるべきことは言うまでもないが、以下の技術は当業者には公知である。適当なハイブリダイゼーション条件は、例えば、ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ（１９８５）による著述の教示に従って適応することができる。
［ＰＡＰＡＰ遺伝子のゲノム配列］
本発明はＰＡＰＡＰのゲノム配列に関する。本発明は、ＰＡＰＡＰ遺伝子、あるいは配列番号３の配列、その相補配列、さらにそのフラグメントと変異体の配列から成る、実質的に成る、あるいはこれを含むＰＡＰＡＰゲノム配列を包含する。これらのポリヌクレオチドは、精製、単離、または組換え型であり得る。
【００６２】
ＰＡＰＡＰ核酸は、配列番号３またはその相補体の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、あるいは１０００個のヌクレオチドを有する隣接スパンから成る、実質的に成る、またはこれを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含む。ＰＡＰＡＰ核酸はさらに、配列番号３またはその相補体のヌクレオチド位置１〜３０３８、１〜４２１、４２２〜５５７、２１５８〜２２１８および２６２０〜３０３９の群から選択される、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、あるいは１０００個のヌクレオチドを有する隣接スパンから成る、実質的に成る、またはこれを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含んでもよい。本発明はさらに、配列番号３のヌクレオチド配列またはその相補配列あるいはそのフラグメントに少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、または ９５％ヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列を含む精製、単離、または組換えポリヌクレオチドを包含する。 配列番号３のヌクレオチド配列に関してのヌクレオチドの差異は、一般的には全核酸を通じてランダムに分布し得る。それにも関わらず、好ましい核酸は、配列番号３のヌクレオチド配列に関するヌクレオチドの差異が優先的にエキソンに含まれるコード配列の外側に位置するものである。これらの核酸、ならびにそのフラグメントと変異体は、テストサンプル中にＰＡＰＡＰ遺伝子のコピーの存在を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして、あるいはＰＡＰＡＰ配列内におけるターゲットヌクレオチド配列を増幅するために使用することができる。本発明の他の目的は、前述のようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号３のヌクレオチド配列あるいはその相補配列またはその変異体とハイブリダイズする精製、単離、または組換え型核酸から成る。
【００６３】
本セクションは「ＰＡＰＡＰのゲノム配列」と題しているが、任意の大きさと配列を有する核酸フラグメントはさらに、二つ以上のそのようなゲノム配列のいずれかの側または間にＰＡＰＡＰのゲノム配列を隣接する、本セクションに記述するポリヌクレオチドによっても含まれ得ることに留意されるべきである。
［ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ配列］
ＰＡＰＡＰ遺伝子の発現は、配列番号１に示す核酸配列である、少なくとも一つのｍＲＮＡ種の産生を誘導することが示されている。
【００６４】
本発明の他の目的は、配列番号１のヌクレオチド配列、その相補配列、ならびにその対立遺伝子変異体、およびそのフラグメントを含む、精製、単離、または組換え型核酸である。さらに、本発明の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１の配列から成る、実質的に成る、またはこれを含む、精製、単離、また組換え型ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡを含む。本発明の特に好ましい核酸は、配列番号１またはその相補体の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、あるいは１０００個のヌクレオチドを有する隣接スパンから成る、実質的に成る、またはこれを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含む。本発明の核酸は、配列番号１またはその相補体の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、あるいは１０００個のヌクレオチドを有し、配列番号１の１〜１４０、１４１〜４６０、４６０〜６９０、８７〜３４６および６９１〜１１０４のヌクレオチド位置を少なくとも１、２、３、５、または１０個含む隣接スパンを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含む。本発明のさらなる好ましい実施形態は、配列番号１またはその相補体の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、あるいは１０００個のヌクレオチドを有し、さらに二対立遺伝子マーカーを含む隣接スパンを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含む。
【００６５】
本発明はさらに、配列番号１のポリヌクレオチドと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性、配列番号１のポリヌクレオチド、またはその相補配列、あるいはその生物活性フラグメントと好都合には９９％のヌクレオチド同一性、好ましくは９９．５％のヌクレオチド同一性、さらに最も好ましくは９９．８％同一性のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含む精製または単離核酸に関する。
【００６６】
本発明の他の目的は、本願明細書で定義したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のポリヌクレオチド、またはその相補配列、あるいはその変異体またはその生物活性フラグメントとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む精製、単離または組換え型核酸に関する。
配列番号１のｃＤＮＡは、配列番号１のヌクレオチド位置１から開始してヌクレオチド位置８６に終止する５’−ＵＴＲ 領域を含む。配列番号１のｃＤＮＡは、配列番号１のヌクレオチド位置３４７から開始してヌクレオチド位置１１０４に終止する３’ＵＴＲ領域を含む。ポリアデニル化シグナルは、配列番号１のヌクレオチド位置１０８５に開始して、ヌクレオチド位置１１０４に終止する。
【００６７】
その結果として、本発明は、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲのヌクレオチド配列、その相補配列、またはその対立遺伝子変異体を含む、精製、単離、ならびに組換え型核酸に関する。本発明は、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの３’ＵＴＲのヌクレオチド配列、その相補配列、またはその対立遺伝子変異体を含む、精製、単離、ならびに組換え型核酸に関する。
【００６８】
本セクションは「ＰＡＰＡＰのｃＤＮＡ配列」と題しているが、任意の大きさと配列を有する核酸フラグメントはさらに、二つ以上のそのようなゲノム配列のいずれかの側または間にＰＡＰＡＰのゲノム配列を隣接する、本セクションに記述するポリヌクレオチドによっても含まれ得ることに留意されるべきである。
［コード領域］
ＰＡＰＡＰ読み枠は、配列番号１の対応するｍＲＮＡに含まれる。さらに正確には、有効なＰＡＰＡＰコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号１のヌクレオチド位置８７（ＡＴＧコドンの第一ヌクレオチド）とヌクレオチド位置３４６（ＴＧＡコドンの最終ヌクレオチド）間の領域を含む。本発明はまた、配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８個または１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むポリペプチドをコードする、単離、精製、および組換えポリヌクレオチドを包含する。
【００６９】
ＰＡＰＡＰ遺伝子のコード配列を含む上記に開示したポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドが適切な発現シグナルの制御下に置かれたとき、所望の宿主細胞あるいは所望の宿主生物体で発現することができる。発現シグナルは、本発明のＰＡＰＡＰ遺伝子中にある制御領域に含まれる発現シグナル、あるいは対照的にシグナルは外因性制御核性配列のいずれかであり得る。そのようなポリヌクレオチドは、適切な発現シグナル下に置かれると、ベクター中に挿入されて発現および／または増幅できる。
【００７０】
［ＰＡＰＡＰの制御配列］
前述のように、ＰＡＰＡＰ遺伝子のゲノム配列は、非コード５’隣接領域、ならびにこの遺伝子の３つのエキソンを含むＰＡＰＡＰコード領域を境界する非コード３’隣接領域に制御配列を含んでいる。
５’および３’制御領域由来のポリヌクレオチドは、テストサンプル中に配列番号３のヌクレオチド配列またはそのフラグメントが少なくとも１コピー存在することを検出するために有用である。
【００７１】
ＰＡＰＡＰに含まれる５’制御領域のプロモーター活性は以下に記述するように調べることができる。
配列番号３の適切な生物活性ポリヌクレオチドフラグメントまたは変異体を同定するために、当業者は、マーカー遺伝子（すなわち、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなど）を担う組換えベクターの用途を記述するＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９） の著述を参照して、配列番号３の生物活性ポリヌクレオチドフラグメントまたは変異体の制御下でその発現が検出されよう。ＰＡＰＡＰ遺伝子の第一エキソンの上流に位置するゲノム配列を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ市販のｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃ（ｐＳＥＡＰ−ベーシック）、ｐＳＥＡＰ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ｐＳＥＡＰ−エンハンサー）、 ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（ｐβｇａｌ−ベーシック）、ｐβｇａ１−Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ｐβｇａｌ−エンハンサー）、あるいは ｐＥＧＦＰ−１ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒｓ（ｐＥＧＦＰ−プロモーターレポーターベクター 、またはＰｒｏｍｅｇａ市販のｐＧＬ２−ｂａｓｉｃ（ｐＧＬ２−ベーシック）またはｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ   ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ   ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ   ｒｅｐｏｒｔｅｒ   ｇｅｎｅ   ｖｅｃｔｏｒ （ｐＧＬ３−ベーシック・プロモーターレス・ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子ベクター）のような適切なプロモーターレポーターベクター中でクローン化する。 簡単に言えば、これらのプロモーターレポーターベクターのそれぞれは、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、または緑色蛍光タンパク質などの容易にアッセイできるタンパク質をコードするレポーター遺伝子の上流に位置する複数のクローニングサイトを含む。ＰＡＰＡＰコード領域の上流配列は、レポーター遺伝子の上流にあるクローニングサイトにどちらの方向に挿入してもよく、適切な宿主細胞中に導入される。レポータータンパク質レベルを検定して、クローニングサイトにインサートを欠損するベクターから得られるレベルと比較する。対照ベクターに関して、インサートを含むべクターにおける発現レベルの増加は、インサート中にプロモーターが存在することを示す。必要に応じて、弱小プロモーター配列からの転写レベルを増加するためにエンハンサーを含むベクター中に、上流配列をクローン化してもよい。インサートを欠損するべクターで観察される発現を有意に上回る発現レベルは、挿入した上流配列中にプロモーター配列が存在することを示す。
【００７２】
上流ゲノムＤＮＡ中のプロモーター配列は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは適切な制限エンドヌクレアーゼ消化のような先行技術を用いて上流ＤＮＡに入れ子５’および／または３’欠失を構築することによってさらに明らかにすることができる。生成された欠失フラグメントをプロモーターレポーターベクター中に挿入して、例えば、Ｃｏｌｅｓら（１９９８）に記述されるように、欠失によってプロモーター活性が低下または消失されているか否かを測定し得る（その開示は全文を本願明細書に参考文献として引用している）。このようにして、プロモーターの境界を定義することができる。所望するならば、個々のプロモーターまたはその組み合わせ内に潜在する転写因子結合部位を消失するために、プロモーター内に潜在する個々の制御部位を、部位特異的変異誘発またはリンカースキャニングを用いて同定することができる。転写レベルにおけるこれらの変異の影響は、プロモーターレポーターベクターのクローニングサイト中に変異を挿入することによって測定し得る。このタイプのアッセイは当業者には公知であり、国際公開番号ＷＯ ９７／１７３５９、 米国特許番号第５，３７４，５４４号； ヨーロッパ特許番号第 ５８２ ７９６号； 米国特許番号 第５，６９８，３８９号； 米国特許番号第５，６４３，７４６号； 米国特許番号 第５，５０２，１７６号；および米国特許番号 ５，２６６，４８８号に記述されており、それらの公開は全文を本願明細書中に参考文献として引用している。
【００７３】
ＰＡＰＡＰ遺伝子のプロモーターの強度および特異性は、異なる種類の細胞および組織中にあるＰＡＰＡＰプロモーターに作動可能に連結された検出可能なポリヌクレオチドの発現レベルによって調べることができる。検出可能なポリヌクレオチドは、予め定義されているオリゴヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはＰＡＰＡＰポリペプチドまたはそのフラグメントあるいは変異体を含む検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれかであり得る。このタイプのアッセイは当該分野では公知であり、米国特許番号第５，５０２，１７６号；および米国特許番号第５，２６６，４８８号に記述されており、その公開は全文を本願明細書中に参考文献として引用している。以下にこれらの方法のいくつかをさらに詳しく記述する。
【００７４】
ＰＡＰＡＰコード領域の５’末端および３’末端に位置する制御エレメントを担うポリヌクレオチドは、目的の異種ポリヌクレオチドの転写および翻訳活性を制御するために使用できる利点を有する。
したがって、本発明はまた、５’および３’末端制御領域、その相補配列、その生物活性フラグメントおよびその変異体から成る群から選択されるポリヌクレオチドを含む精製または単離核酸に関する。一つの態様において、「５’制御領域」は、配列番号３の１〜４２１の位置の間にあるヌクレオチド配列を含む。一つの態様において、「３’制御領域」は、配列番号３の３０４０〜３１８９の位置の間にあるヌクレオチド配列を含む。
【００７５】
本発明はまた、５’および３’制御領域から成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９５％ヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチド、５’および３’制御領域、その相補配列、その変異体または生物活性フラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと、好都合には９９％ヌクレオチド同一性、好ましくは９９．５％ヌクレオチド同一性、さらに最も好ましくは９９．８％ヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含む精製または単離核酸に関する。
【００７６】
本発明の他の目的は、本願明細書で定義されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、５’および３’制御領域のヌクレオチド配列、あるいはその相補配列、あるいはその変異体または生物活性フラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む精製、単離または組換え型核酸から成る。
【００７７】
５’制御領域の好ましいフラグメントは、約１５００または１０００ヌクレオチド長、好ましくは約５００ヌクレオチド長、さらに好ましくは約４００ヌクレオチド長、それよりも好ましくは３００ヌクレオチド長、そして最も好ましくは約２００ヌクレオチド長を有する。
３’制御領域の好ましいフラグメントは、少なくとも５０、１００、１５０、２００、３００または４００塩基長である。
【００７８】
配列番号３の「生物活性な」ポリヌクレオチド誘導体は、組換え細胞宿主内で、組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現するための制御領域として機能性のある前記ポリヌクレオチドのフラグメントを含むか、あるいは前記ポリペプチドのフラグメントから成るポリヌクレオチドである。それはエンハンサーまたはリプレッサーとして作用できる。
【００７９】
本発明において、核酸またはポリヌクレオチドは、前記の制御ポリヌクレオチドが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を含むならば、組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドを発現するための制御領域として「機能的」である。そして、そのような配列は、所望のポリペプチドまたは所望のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」。
【００８０】
本発明の制御ポリヌクレオチドは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら（１９８９）の著述に記述されるように、適当な制限酵素を用いる切断によって、配列番号３のヌクレオチド配列から調製することができる。制御ポリヌクレオチドはまた、Ｂａｌ３１のようなエキソヌクレアーゼ酵素による配列番号３の消化によって調製することができる（Ｗａｂｉｋｏら、１９８６）。これらの制御ポリヌクレオチドはまた、本願明細書の他の箇所で記述するように、核酸の化学的合成によっても調製できる。
【００８１】
本発明による制御ポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞または宿主生物内でコード配列を発現するために使用し得る組換え発現ベクターの一部であり得る。本発明による組換え発現ベクターは、本願明細書の他の箇所に記述されている。
本発明の好ましい５’−制御ポリヌクレオチドは、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）またはその生物活性フラグメントまたは変異体を含む。
【００８２】
本発明の好ましい３’−制御ポリヌクレオチドは、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）またはその生物活性フラグメントまたは変異体を含む。
本発明のさらなる目的は、
ａ）（ｉ）  ５’制御領域またはその相補配列であるポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
（ｉｉ）５’制御領域またはその相補配列であるヌクレオチド配列と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、５’制御領域またはその相補配列であるヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；かつ
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドの生物活性フラグメントまたは変異体；
から成る群から選択される制御ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）上記（ａ）に定義した核酸に作動可能に連結された、所望のポリペプチドまたは目的の核酸をコードするポリヌクレオチド；
ｃ）オプションとして、３’−制御ポリヌクレオチド、好ましくはＰＡＰＡＰ遺伝子の３’−制御ポリヌクレオチドを含む核酸、
を含む精製または単離核酸から成る。
【００８３】
前述に定義された核酸の特定の実施形態では、前記核酸は、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）またはその生物活性フラグメントまたは変異体を含む。
前述に定義された核酸の第二の特定の実施形態では、前記核酸は、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）またはその生物活性フラグメントまたは変異体を含む。
【００８４】
５’制御領域の制御ポリヌクレオチド、あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体は、所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結される。
３’制御領域の制御ポリヌクレオチド、あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体は、所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結される。
【００８５】
前述の核酸によってコードされる所望のポリペプチドは、様々な性質または起原を示し、原核性あるいは真核性起原のタンパク質を包含する。ＰＡＰＡＰ制御領域の制御下で発現されるポリペプチドには、細菌性、真菌性あるいはウイルス性抗原が含まれる。さらには、「ハウスキーピング」タンパク質のような細胞内タンパク質である真核性タンパク質、レセプターのような膜結合タンパク質、ならびにサイトカインのような内因性介在物質である分泌タンパク質も包含される。所望のポリペプチドはＰＡＰＡＰタンパク質であり、特に配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいはそのフラグメントまたは変異体であり得る。
【００８６】
前述のポリヌクレオチドによってコードされる所望の核酸は、一般的にはＲＮＡ分子であるが、例えば、ＰＡＰＡＰコード配列である、所望するコードポリヌクレオチドと相補性があり、したがってアンチセンスポリヌクレオチドとして有用であり得る。
そのようなポリヌクレオチドは、宿主細胞または宿主生物内で所望のポリペプチドまたは所望の核酸を発現するために、組換え発現ベクター内に含まれることがある。本願明細書に記述するようなポリヌクレオチドを含む適切な組換えベクターは、本明細書中の他の箇所に開示されている。
［ポリヌクレオチド構築物］
本願明細書では、「ポリヌクレオチド構築物」および「組換えポリヌクレオチド」という用語は同義に用いられ、人工的にデザインされ、当初の自然環境では隣接ヌクレオチド配列として見いだされない少なくとも二つのヌクレオチド配列を含む、線状または環状、精製または単離ポリヌクレオチドを意味する。
【００８７】
組換え細胞宿主およびトランスジェニック動物において時間的・空間的ＰＡＰＡＰ遺伝子発現を誘導することが可能なＤＮＡ構築物
細胞レベルおよび複数細胞から成る生物体レベルの両方において、ＰＡＰＡＰタンパク質合成欠損の生理学的ならびに表現型的結果を研究するために、本発明はまた、ＰＡＰＡＰゲノム配列またはｃＤＮＡ特定の対立遺伝子、ならびに配列番号１および３のＰＡＰＡＰヌクレオチド配列またはそのフラグメントに関して、一つ以上の塩基の置換、欠失、または付加を有し、これらの塩基の置換、欠失、あるいは付加がエキソン、イントロン、あるいは制御配列のいずれかに位置しているが、好ましくは５’−制御配列またはＰＡＰＡＰゲノム配列のエキソン、あるいは配列番号１のＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ内に位置している本ゲノム配列またはｃＤＮＡの一つのコピーの条件発現を可能にするＤＮＡ構築物と組換えベクターを包含する。好ましい実施形態では、ＰＡＰＡＰ配列は二対立遺伝子マーカーを含む。
【００８８】
本発明は、本発明に記述されているポリヌクレオチドの任意の一つを含む組換えベクターを包含する。特に詳細には、本発明によるポリヌクレオチド構築物は、「ＰＡＰＡＰ遺伝子のゲノム配列」セクション、「ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ配列」セクション、「コード領域」セクション、ならびに「オリゴヌクレオチドプローブとプライマー」セクションに記述されている任意のポリヌクレオチドを含むことができる。
【００８９】
第一に好ましいＤＮＡ構築物は、Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２、１９９５） および Ｆｕｒｔｈら（１９９４）に記述のように、ＰＡＰＡＰ遺伝子発現を制御するための大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスポソンＴｎ１０由来のテトラサイクリン抵抗性オペロンｔｅｔに基づく。そのようなＤＮＡ構築物は、ＰＡＰＡＰポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントを含む、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかをコードする、目的のポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、ＰＡＰＡＰ遺伝子の最小プロモーターまたは５’−制御配列のいずれかに融合されているＴｎ１０（ｔｅｔｏｐ）由来の７つのｔｅｔオペレーター配列を含む。同一細胞が、ＨＣＭＶＩＥ１ エンハンサー／プロモーターあるいはＭＭＴＶ−ＬＴＲのようなプロモーターの制御下に置かれている、単純ヘルペスウイルスのウイルスタンパク質ＶＰ１６の活性化ドメインに融合されている野生型（ｔＴＡ）または変異型（ｒＴＡ）リプレッサーのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むとき、このＤＮＡ構築物は目的のヌクレオチド配列のための条件発現システムとして機能性がある。事実、本発明の好ましいＤＮＡ構築物は、ｔｅｔオペレーター配列を含むポリヌクレオチドとｔＴＡまたはｒＴＡリプレッサーをコードする配列を含むポリヌクレオチドの両方を含む。
【００９０】
特定の実施形態では、条件発現ＤＮＡ構築物は、変異型テトラサイクリンリプレッサーｒＴＡをコードする配列を含み、目的のポリヌクレオチドの発現はテトラサイクリンが存在しないとサイレントであるが、存在すると誘導される。
相同組換えを起こすＤＮＡ構築物：置換ベクター
第二の好ましいＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端までに、（ａ）ＰＡＰＡＰゲノム配列に含まれる第一のヌクレオチド配列；（ｂ）ネオマイシン抵抗性（ｎｅｏ）マーカーのような正の選択マーカーを含むヌクレオチド配列；ならびに（ｃ）ＰＡＰＡＰゲノム配列に含まれ、さらに第一のＰＡＰＡＰヌクレオチド配列（ａ）のゲノム下流に位置する第二のヌクレオチド配列を含む。
【００９１】
好ましい実施形態では、このＤＮＡ構築物はまた、ヌクレオチド配列（ａ）の上流またはヌクレオチド配列（ｃ）の下流に位置する負の選択マーカーを含む。好ましくは、この負の選択マーカーは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６）、ヒドロマイシンベータ遺伝子（Ｔｅ Ｒｉｅｌｅら、１９９０）、ｈｐｒｔ遺伝子（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｕｇｔら、１９９１； Ｒｅｉｄら、１９９０）またはジフテリア毒素Ａフラグメント（Ｄｔ−Ａ）遺伝子（Ｎａｄａら、１９９３；Ｙａｇｉら、１９９０）を含む。正の選択マーカーは、ＰＡＰＡＰタンパク質をコードする配列を妨害するように、ＰＡＰＡＰエキソン配列内に位置することが好ましい。これらの置換ベクターは、例えば、Ｔｈｏｍａｓ ら（１９８６； １９８７）、 Ｍａｎｓｏｕｒ ら（１９８８） ならびにＫｏｌｌｅｒら（１９９２）に記述されている。
【００９２】
第一と第二ヌクレオチド配列である（ａ）と（ｃ）は、ＰＡＰＡＰ制御配列、イントロン配列、エキソン配列または制御および／またはイントロンおよび／またはエキソン配列をどれも含む配列内の異なる場所に位置し得る。ヌクレオチド配列（ａ）と（ｃ）の大きさは、１〜５０ｋｂ、好ましくは１〜１０ｋｂ、より好ましくは２〜６ｋｂ、そして最も好ましくは２〜４ｋｂの範囲である。
【００９３】
相同組換えを可能にするＤＮＡ構築物：Ｃｒｅ−ＬｏｘＰシステム
これらの新ＤＮＡ構築物は、Ｐ１ファージの部位特異的組換えシステムを利用する。Ｐ１ファージは、３４塩基対ｌｏｘＰ部位と特異的に相互作用するＣｒｅと呼ばれる組換え酵素を有する。ｌｏｘＰ部位は、８ｂｐの保存配列によって分離される１３ｂｐの二つの反復配列から構成される（Ｈｏｅｓｓ ら、 １９８６）。同一方向性を有する二つのｌｏｘＰ部位間におけるＣｒｅ酵素による組換えはＤＮＡフラグメントの欠失を誘導する。
【００９４】
相同組換え技術と併せて使用されるＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムは、Ｇｕ ら（１９９３、１９９４）によって最初に記述された。簡単に言えば、ゲノムのターゲット位置に挿入されるべき目的のヌクレオチド配列は、同一方向性にあり、組換えゲノムから切断されるべきヌクレオチド配列のそれぞれの端に位置する少なくとも二つのｌｏｘＰ部位を有する。切除イベントは、組換え細胞宿主の核内に組換え酵素（Ｃｒｅ）の存在を必要とする。組換え酵素は、（ａ）組換え細胞宿主をこの酵素を含む培養基中でインキュベートすること、Ａｒａｋｉ ら（１９９５）に記述のように、所望する細胞中にＣｒｅ酵素を直接注入すること、あるいはＢａｕｂｏｎｉｓら（１９９３）に記述のように、この酵素のリポフェクション；（ｂ）Ｇｕら（１９９３） および Ｓａｕｅｒら（１９８８）に記述のように、組換え細胞宿主中で機能性を有し、任意に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅコード配列を含み、組換え細胞宿主中に導入されているベクターで細胞宿主をトランスフェクトすること；（ｃ）Ｇｕら（１９９４）に記述のように、組換え細胞宿主中で機能性を有し、任意に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅコード配列を含み、ランダム挿入イベントまたは相同組換えイベントのいずれかによって細胞宿主のゲノム中に挿入されているポリヌクレオチドを細胞宿主のゲノム内に導入すること、のいずれかによって所望する時期に用いることができる。
【００９５】
特定の実施形態では、相同組換えによってＰＡＰＡＰ遺伝子に挿入されるべき配列を含むベクターは、選択マーカーが同一方向性にあるｌｏｘＰ部位によって隣接するように構築して、Ｃｒｅ酵素処理によって、相同組換えイベントによって挿入された目的のＰＡＰＡＰ配列はそのまま残して、選択マーカーを除去することが可能である。また、組換えイベントを選択するための正の選択マーカーと相同組換えイベントを選択するための負の選択マーカーである、二つの選択マーカーが必要とする。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ システムを用いるベクターおよび方法は、Ｚｏｕら（１９９４）によって記述されている。
【００９６】
したがって、本発明の第三の好ましいＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端までに、（ａ）ＰＡＰＡＰゲノム配列に含まれる第一ヌクレオチド配列；（ｂ）正の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含み、さらに同一方向に位置している、ｌｏｘＰ部位のような組換え酵素によって認識される部位を定義する二つの配列を含むヌクレオチド配列；ならびに（ｃ）ＰＡＰＡＰゲノム配列に含まれ、第一ＰＡＰＡＰヌクレオチド配列（ａ）のゲノム下流に位置している第二ヌクレオチド配列、を含む。
【００９７】
ｌｏｘＰ部位のような、組換え酵素によって認識される部位を定義する配列は、ヌクレオチド配列（ｂ）内にある条件的に切除しようとするヌクレオチド配列を境界する適切な場所に位置することが好ましい。一つの特定の実施形態では、二つのｌｏｘＰ部位は、相同組換えイベントが起こった後で所望する時期に切除を可能にするために、正の選択マーカー配列のそれぞれの側に位置される。
【００９８】
前述の第三のＤＮＡ構築物を用いる方法の好ましい実施形態では、組換え酵素によって認識される二つの部位、好ましくは二つのｌｏｘＰ部位、によって境界されるポリヌクレオチドフラグメントの切除は、この二つの部位がプロモーター配列に作動可能に連結されているＣｒｅ酵素をコードする配列である組換え宿主細胞のゲノム内に存在するために、所望する時期に行われる。前記プロモーターは、Ｇｕら（１９９４）が記述しているような、好ましくは誘導可能なプロモーター、さらに好ましくは組織特異的プロモーター配列、そして最も好ましくは誘導可能かつ組織特異性であるプロモーター配列である。
【００９９】
組換え細胞宿主のゲノム内におけるＣｒｅ酵素の存在は、前述のようにｌｏｘＰ部位を含む目的のＰＡＰＡＰ由来配列を有する第一トランスジェニック動物、および適切なプロモーター配列に作動可能に連結されているＣｒｅコード配列を有する第二トランスジェニック動物、２種のトランスジェニック動物の交配の結果として生じると、Ｇｕら（１９９４）に記述されている。
【０１００】
Ｃｒｅ酵素発現の空間的・時間的制御はまた、ＡｎｔｏｎとＧｒａｈａｍ （１９９５） ならびに Ｋａｎｅｇａｅら（１９９５）が記述するように、Ｃｒｅ遺伝子を有しているために、細胞を感染、あるいは臓器をインビボ感染して、Ｃｒｅ酵素をデリバリーするアデノウイルスベクターによって達成することができる。
【０１０１】
前述のＤＮＡ構築物は、ターゲットゲノムの予定位置内にある、所望する本発明のヌクレオチド配列、好ましくはＰＡＰＡＰゲノム配列またはＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ配列、そして最も好ましくはＰＡＰＡＰゲノムまたはｃＤＮＡ配列の修飾コピー、を導入して、ターゲット遺伝子の修飾コピーの産生（ノックアウト相同組換え）、あるいは相同組換えイベントを生じるために十分相同である他のコピーによるターゲット遺伝子コピーの置換のいずれかを誘導するために使用することができる。特定の実施形態では、前述のＤＮＡ構築物は、少なくとも一つの二対立遺伝子マーカーを含むＰＡＰＡＰゲノム配列あるいはＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ配列を導入するために使用することができる。
【０１０２】
核のアンチセンスＤＮＡ構築物
他の組成物は、対応するＰＡＰＡＰ遺伝子の発現を阻害するアンチセンスツールとして、核配列である配列番号ｃＤＮＡのオリゴヌクレオチドフラグメント、好ましくはＰＡＰＡＰ遺伝子の開始コドンを含むフラグメントを含む本発明のベクターを含む。本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを用いる好ましい方法は、Ｓｃｚａｋｉｅｌ ら（１９９５） あるいは国際公開番号ＷＯ ９５／２４２２３に記述される方法であり、それぞれの開示はその全文を参考文献として本願明細書に引用している。
【０１０３】
好ましくは、アンチセンスツールは、ＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡの５’末端に相補性があるポリヌクレオチド（１５〜２００長）から選択される。一つの実施形態では、所望のターゲット遺伝子の別々の部分に対して相補性がある別々のアンチセンスポリヌクレオチドの組み合わせが使用される。
本発明による好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンＡＴＧまたはスプライシング部位のいずれかを含むＰＡＰＡＰのｍＲＮＡ配列に相補性がある。本発明によるさらに好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、ＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡのスプライシング部位に相補性がある。
【０１０４】
好ましくは、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、Ｌｉｕら（１９９４）が記述するように、３’末端にｐｏｌｙ（Ａ）を含まないＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物が産生されるように、自己切断性のリボソーム配列で置換された３’ポリアデニル化シグナルを有し、これらのアンチセンスポリヌクレオチドは核からの輸出が不可能である。好ましい実施形態では、これらのＰＡＰＡＰアンチセンスポリヌクレオチドはまた、切断された転写物を３’−５’エキソヌクレアーゼによる分解に対して安定化するために、Ｅｃｋｎｅｒ ら（１９９１）が記述しているようなヒストンステム−ループ構造を、リボソームカセット内に含んでいる。
［オリゴヌクレオチドプローブとプライマー］
ＰＡＰＡＰ遺伝子由来のポリヌクレオチドは、テストサンプル中に配列番号１または３のヌクレオチド配列またはそのフラグメント、相補体、または変異体が少なくとも１コピー存在することを検出するために有用である。
【０１０５】
本発明の特に好ましいプローブとプライマーは、配列番号３またはその相補体の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、あるいは１０００個のヌクレオチドを有する隣接スパンを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含む。本発明の核酸は、配列番号３またはその相補体の少なくとも１２、１５、１８、２６、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、あるいは１０００個のヌクレオチドを有し、配列番号３の１〜３０３８、１〜４２１、４２２〜５５７、２１５８〜２２１８および２６２０〜３０３９のヌクレオチド位置の少なくとも一つを含む隣接スパンを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含む。本発明の他の好ましいプローブとプライマーは、配列番号１またはその相補体の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、あるいは１０００個のヌクレオチドを有する隣接スパンを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含む。本発明のさらに好ましいプローブとプライマーは、配列番号１またはその相補体の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、あるいは１０００個のヌクレオチドを有し、配列番号１の１〜１４０、１４１〜４６０、４６０〜６９０、８７〜３４６および６９１〜１１０４のヌクレオチド位置の少なくとも一つを含む隣接スパンを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含む。
【０１０６】
したがって、本発明はまた、前述のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１および３のヌクレオチド配列、その変異体、またはその相補配列から成る群から選択される核酸と特異的にハイブリダイズすることが特徴づけられる核酸プローブに関する。
一つの実施形態では、本発明は、配列番号１、３およびその相補体のいずれか一つの８〜５０個のヌクレオチドを有する隣接スパンから成る、または実質的に成る、単離、精製、および組換えポリヌクレオチドを包含し、ここで、前記スパンが、前記配列にＰＡＰＡＰ関連二対立遺伝子マーカーを含むか、あるいはＰＡＰＡＰと連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーに含み；任意に、前記隣接スパンは１８〜３５ヌクレオチド長であり、前記二対立遺伝子マーカーは前記ポリヌクレオチドの中心から４ヌクレオチド以内に存在してもよく；任意に、前記ポリヌクレオチドは前記隣接スパンから成り、さらに前記隣接スパンは２５ヌクレオチド長で、そして前記二対立遺伝子マーカーは前記ポリヌクレオチドの中心に存在してもよく；任意に、前記隣接スパンの３’末端は前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在してもよく；そして任意に、前記隣接スパンの３’末端が前記ポリヌクレオチドの３’末端に位置して、ならびに前記二対立遺伝子マーカーが前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在してもよい。
【０１０７】
他の実施形態では、本発明は、配列番号１、３またはその相補体の８〜５０個のヌクレオチドを有し、その３’末端が、前記ポリヌクレオチドの３’末端に位置し、ならびに前記ポリヌクレオチドの３’末端が、前記配列にあるＰＡＰＡＰ関連マーカーあるいはそれと連鎖不平衡状態にある二対立遺伝子マーカーの２０ヌクレオチド上流以内に位置している、隣接スパンから成る、実質的に成る、またはこれを含む単離、精製、および組換えポリヌクレオチドを包含する。
【０１０８】
さらに他の実施形態では、本発明は、配列番号１、３またはその相補体中のＰＡＰＡＰ関連二対立遺伝子マーカーのヌクレオチドのアイデンティティを決定するためのハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定法、ならびに酵素ミスマッチ検出法に使用するポリヌクレオチド、さらには配列番号１、３またはその相補体中のＰＡＰＡＰ関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドセグメントを増幅するために使用するポリヌクレオチドを包含する。
【０１０９】
本発明は、好ましくはハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定法、マイクロシーケンス法、または酵素ミスマッチ検出アッセイにおいて、ＰＡＰＡＰ関連二対立遺伝子マーカーのヌクレオチドのアイデンティティを決定するため、さらにはＰＡＰＡＰ関連二対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドセグメントを増幅するための本発明によるポリヌクレオチドの用途に関する。
【０１１０】
本発明によるプローブまたはプライマーは、８〜１０００ヌクレオチド長の範囲の長さを有し、少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２５０、５００、または１０００ヌクレオチド長であるように特定されている。より正確には、これらのプローブおよびプライマーの長さは、８、１０、１５、２０、または３０〜１００ヌクレオチド長、好ましくは１０〜５０長、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。短いプローブとプライマーは、ターゲット核酸配列について特異性を欠如する傾向があり、一般的に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度を必要とする。より長いプローブとプライマーの生産はコスト高であり、しばしば自己ハイブリダイズして、ヘアピン構造を形成することがある。特定のセットのアッセイ条件でのプライマーとプローブの適当な長さは、当業者が経験的に決定できる。
【０１１１】
安定なハイブリッドの形成は、ＤＮＡの融点（Ｔｍ）に依存する。Ｔｍは、プライマーまたはプローブの長さ、溶液のイオン強度およびＧ＋Ｃ含量に依存する。Ｇ：Ｃ対は３つの水素結合によって支えられているが、Ａ：Ｔ対は二つの水素結合のみを有するために、プライマーまたはプローブのＧ＋Ｃ含量が高いほど、融点は高くなる。本発明のプローブ中のＧＣ含量は、一般的には１０〜７５％、好ましくは３５〜６０％、そしてさらに好ましくは４０〜５５％の範囲である。
【０１１２】
プライマーとプローブは、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限、ならびにＮａｒａｎｇら（１９７９）によるリン酸ジエステル法、Ｂｒｏｗｎら（１９７９）によるリン酸ジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１） によるジエチルホスホルアミダイト法およびヨーロッパ特許番号第 ０ ７０７ ５９２号に記述される固体支持法のような方法による直接化学合成を含む適切な方法によって調製できる。
【０１１３】
検出プローブは一般的には、例えば、国際公開番号ＷＯ ９２／２０７０２に公開されているペプチド核酸、米国特許第５，１８５，４４４号；  ５，０３４，５０６号および ５，１４２，０４７号に記述されるモルホリン類似体のような核酸配列または未変核酸類似体である。プローブは、プローブにそれ以上ｄＮＴＰが付加できないように「非伸長性」にされなければならないことがある。類似体は通常は非伸長性であり、核酸プローブは、ヒドロキシル基が伸長に関与できないようにプローブの３’末端を修飾することにより、非伸長性にすることができる。例えば、プローブの３’末端は捕獲または検出標識によって官能基化して、これによってヒドロキシル基を消費またはさもなければ遮断することができる。あるいは、３’ヒドロキシル基を単に切断、置換または修飾することができ、１９９３年４月１９日に出願された米国特許出願シリアル番号第０７／０４９，０６１号は、プローブを非伸長性とするために使用できる修飾法について記述している。
【０１１４】
本発明のポリヌクレオチドのいずれも、所望するならば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、あるいは化学的手段によって検出可能であるように、当該分野で公知の標識を取り込むことによって標識できる。例えば、有用な標識は、放射性物質（３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉを含む）、蛍光色素（５−ブロモデソキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）またはビオチンを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドはその３’および５’末端に標識が付される。核酸フラグメントの非放射性標識の例は、フランス特許番号第ＦＲ−７８１０９７５号またはＵｒｄｅａら（１９８８） あるいは Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら（１９８８）に記述されている。さらに、本発明によるプローブは、シグナル増幅を可能とするような構造特徴を有し、そのような構造特徴は、例えば、Ｕｒｄｅａ ら、１９９１ またはヨーロッパ特許番号第ＥＰ ０ ２２５ ８０７号 （Ｃｈｉｒｏｎ）に記述される分岐ＤＮＡプローブである。
【０１１５】
標識はまた、プライマーまたは増幅ＤＮＡのようなプライマーエクステンション産物のいずれかを、固体支持体上に固定し易くするために、プライマーを捕獲するために使用できる。捕獲標識はプライマーまたはプローブに付着され、そして固体相試薬の特異的結合メンバー（例：ビオチンならびにストレプトアビジン）と結合対を形成する特異的結合メンバーとなり得る。したがって、ポリヌクレオチドまたはプローブによって担われている標識の種類に応じて、ターゲットＤＮＡの捕獲または検出に使用できる。さらに、本願明細書に提供されるポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、それ自体が捕獲標識として作働することが理解されよう。例えば、固体相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合は、プライマーまたはプローブの相補部分と結合するように選択して、それによってプライマーまたはプローブを固体相に固定化できる。ポリヌクレオチドプローブそれ自体が結合メンバーとして作働する場合は、当業者は、プローブが標識に相補性でない配列または「テール」を含むことを認識している。ポリヌクレオチドプライマーそれ自体が、捕獲標識として作働する場合は、プライマーの少なくとも一部は、固体相上にある核酸とハイブリダイズするために遊離している。ＤＮＡ標識技術は当業者に公知である。
【０１１６】
本発明のプローブは、いくつかの目的のために有用である。それらは、ゲノムＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションにおいて特に利用できる。プローブはまた、ＰＣＲ増幅産物の検出にも利用できる。それらはまた、他の技術を用いて、ＰＡＰＡＰ遺伝子またはｍＲＮＡのミスマッチを検出するために利用し得る。
本発明のポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブのいずれも、好都合なことには固体支持体上に固定化できる。固体支持体は当業者に公知であり、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリエチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロース片、膜、ラテックス粒子のような微小粒子、ヒツジ（あるいは他の動物）赤血球、ｄｕｒａｃｙｔｅｓなどを含む。固体支持体は重要ではなく、当業者が選択することができる。したがって、ラテックス粒子、微小粒子、磁気ビーズまたは非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロ滴定ウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（またはその他の適当な動物の）赤血球細胞およびｄｕｒａｃｙｔｅｓは全て適切な例である。核酸を固体相上に固定化するための適切な方法は、イオン、疎水、共有結合相互作用などを含む。本願明細書で使用する際は、固体支持体とは、不溶性であり、あるいは後続の反応によって不溶性にできる物質を意味する。固体支持体は、捕獲試薬を誘引かつ固定化する固有な能力を考慮して選択されるのがよい。あるいは、固体相は、捕獲試薬を誘引かつ固定化する能力を有する他のレセプターを保持できる。他のレセプターは、捕獲試薬自体に関して、あるいは捕獲試薬に結合されている電荷物質に関して反対に荷電された電荷物質を含み得る。さらにその他に、レセプター分子は、固体支持体上に固定化（付着）され、特異的結合反応によって捕獲試薬を固定化する能力を有する、任意の特異的結合メンバーであり得る。レセプター分子は、アッセイ実施前あるいはアッセイ実行中に、固体支持体物質への捕獲試薬の間接的な結合を可能にする。固体相はしたがって、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁気性または非磁気性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロ滴定ウェル、シート、ビーズ、微小粒子、チップ、ヒツジ（または他の適切な動物の）赤血球細胞、ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）および当業者に公知である他の形状であり得る。本発明のポリヌクレオチドは、個別に、または少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０個または２５個の別々の本発明のポリヌクレオチドの群として一つの固体支持体に付着または固定化できる。さらに、本発明によるポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを、一つ以上の本発明のポリヌクレオチドと同じ固体支持体に付着してもよい。
【０１１７】
その結果として、本発明はまた、試料中にある配列番号１または３のヌクレオチド、そのフラグメントまたは変異体ならびにその相補配列を含む核酸の存在を検出するための方法を含み、前記方法は、
ａ）配列番号１または３の核酸、そのフラグメントまたは変異体ならびにその相補配列に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズできる一つの核酸プローブまたは複数の核酸プローブをアッセイ対象となる試料に接触させること；ならびに
ｂ）プローブと試料中の核酸の間で形成されるハイブリッド複合体を検出すること、を含む。
【０１１８】
本発明はさらに、試料中にある配列番号１または３のヌクレオチド配列、そのフラグメントまたは変異体ならびにその相補配列を含む核酸の存在を検出するためのキットを含み、前記キットは、
ａ）配列番号１または３の核酸、そのフラグメントまたは変異体ならびにその相補配列に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズできる一つの核酸プローブまたは複数の核酸プローブ；ならびに
ｂ）オプションとして、ハイブリダイゼーション反応を行うために必要な試薬、を含む。
【０１１９】
本検出法とキットの第一の好ましい実施形態では、前記核酸プローブまたは複数の核酸プローブは、検出可能な分子で標識される。前記方法とキットの第二の好ましい実施形態では、前記核酸プローブまたは複数の核酸プローブは、基質上に固定化されている。
オリゴヌクレオチドアレイ
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを複数含む基質は、ＰＡＰＡＰ遺伝子にあるターゲット配列を検出または増幅するために使用することができ、さらにＰＡＰＡＰ遺伝子のコードまたは非コード配列の変異の検出にも使用することができる。
【０１２０】
本願明細書で提供されるポリヌクレオチドはいずれも、固体支持体上のオーバーラップ領域またはランダム位置に付着することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、各ポリヌクレオチドが、その他のポリヌクレオチドの付着部位とオーバーラップしない固体支持体の個別領域に付着される、整列アレイ内に付着されてもよい。好ましくは、そのようなポリヌクレオチドの整列アレイは、個別位置が記録され、アッセイ法の一部としてアクセスできるように、「アドレス可能」にデザインされる。アドレス可能なポリヌクレオチドアレイは、一般的には異なった公知の位置にある基質表面に結合された複数の別々のオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチドの正確な位置に関する知見によって、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてこれらの「アドレス可能」アレイは特に有用になる。当該分野において公知であるアドレス可能アレイテクノロジーのいずれも、本発明のポリヌクレオチドに利用できる。これらのポリヌクレオチドアレイの一つの特定の実施形態は、Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（商標）として公知であり、一般的に米国特許番号第５，１４３，８５４号；国際公開番号ＷＯ ９０／１５０７０ および９２／１００９２に記述されている。これらのアレイは、一般的には機械的合成法あるいは光リソグラフィー法および固体相オリゴヌクレオチド合成法の組み合わせを一体化した光誘導性合成法（Ｆｏｄｏｒら、１９９１）を用いて生産し得る。固体支持体上でのオリゴヌクレオチドアレイの固定化は、プローブがチップの固体表面上に高密度アレイとして固定化される、「超大型固定化ポリマー合成（ＶＬＳＩＰＳ（商標））として一般的に認識されるテクノロジーの開発によって可能となった。ＶＬＳＩＰＳ（商標）テクノロジーの例は、米国特許番号第５，１４３，８５４号；および ５，４１２，０８７号、国際公開番号ＷＯ ９０／１５０７０、ＷＯ ９２／１００９２、ＷＯ ９５／１１９９５に提供され、それは光誘導性合成法のような技術によってオリゴヌクレオチドアレイを形成するための方法を記述する。固体支持体上に固定化したヌクレオチドアレイの供給を目的とするデザインのストラテジーにおいて、ハイブリダイゼーションパターンおよび配列情報を最大化する試みとして、チップ上にオリゴヌクレオチドアレイを整列かつ表示するために、さらなるプレゼンテーション・ストラテジーが開発された。そのようなプレゼンテーション・ストラテジーの例は、国際公開番号ＷＯ ９４／１２３０５、 ＷＯ ９４／１１５３０、ＷＯ ９７／２９２１２および ＷＯ ９７／３１２５６に公開されており、それらの公開は全文を本願明細書中に参考文献として引用している。
【０１２１】
本発明のオリゴヌクレオチドアレイの他の実施形態では、ＰＡＰＡＰ遺伝子および好ましくはその制御領域に出現する変異を検出するため、オリゴヌクレオチドプローブトリックスを使用することが好都合である。この特定の目的のために、プローブは、（一つまたはいくつかのヌクレオチドの欠失、挿入または置換のいずれかによる）公知の変異を有する遺伝子へのハイブリダイゼーションを可能とするヌクレオチド配列を有するように特にデザインされる。公知の変異とは、例えば、Ｈｕａｎｇ ら（１９９６） またはＳａｍｓｏｎ ら（１９９６）が使用した技術に従って同定されたＰＡＰＡＰ遺伝子上の変異を意味する。
【０１２２】
ＰＡＰＡＰ遺伝子の変異を検出するために使用される他の技術は、高密度ＤＮＡアレイの使用である。高密度ＤＮＡアレイの単位エレメントを構成する各オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＡＰＡＰゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの特定の配列にマッチするようにデザインされる。したがって、ターゲット遺伝子配列のサブ配列に相補性があるオリゴヌクレオチドから成るアレイは、野生型遺伝子配列を有するターゲット配列のアイデンティティを決定し、その量を測定し、さらにＰＡＰＡＰ遺伝子のターゲット配列と対照野生型遺伝子配列間の差異を検出するために使用される。４Ｌタイル型アレイと称する、一つのそのようなデザインでは、好ましくは１５−ヌクレオチドオリゴマーである、４つのプローブ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）から成る一つのセットが使用される。４つのプローブから成る各セットでは、完全相補体は、ミスマッチプローブよりもさらに強くハイブリダイズする。その結果として、長さがＬである核酸ターゲットが、公知の野生型対照配列における可能な変異を全て含む全プローブセットである、４Ｌプローブを含むタイル型アレイで変異をスキャンされる。１５マープローブセットタイル型アレイのハイブリダイゼーションシグナルは、ターゲット配列の一つの塩基の変化によって混乱される。その結果として、変異位置を挟んで両側に隣接するプローブのシグナルあるいは「フットプリント」の特徴的喪失が起こる。この技術はＣｈｅｅ ら、１９９６に記述されている。
【０１２３】
したがって、本発明は、プローブおよびプライマーとして前述するポリヌクレオチドを少なくとも一つ含む核酸分子のアレイに関する。好ましくは、本発明は、プローブおよびプライマーとして前述するポリヌクレオチドを少なくとも二つ含む核酸分子のアレイに関する。
［ＰＡＰＡＰタンパク質およびペプチドフラグメント：］
「ＰＡＰＡＰポリペプチド」という用語は、本願明細書で使用する際は、本発明のタンパク質およびポリペプチドの全てを意味する。また本発明の構成部分は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドならびに、そのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。本発明は、配列番号２の配列から成る、実質的に成る、またはこれを含む、単離または精製ＰＡＰＡＰタンパク質を含む、ヒト由来のＰＡＰＡＰタンパク質を包含する。
【０１２４】
本願明細書に記述するように、本発明者らは、ＰＡＰＡＰタンパク質が、精神分裂病および躁鬱病、ならびに関連ＣＮＳ疾患の遺伝的感受性として係わるｇ３４８７２タンパク質またはペプチドに関連するという証拠を提供した。
本発明は、配列番号１または３のヌクレオチド配列、あるいはその相補配列またはそのフラグメントによってコードされるポリペプチドに関する。
【０１２５】
本発明は、配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含む単離、精製、および組換えポリペプチドを包含する。他の好ましい実施形態では、アミノ酸の隣接ストレッチは、ＰＡＰＡＰタンパク質配列におけるアミノ酸の欠失、付加、交換あるいは切断を含む、変異または機能的変異部位を含む。
【０１２６】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む、精製、単離、または組換えポリペプチドを包含する。 変異体ポリペプチドは、それが正常生物活性を有する如何に関わらず本発明に含まれる。これは、あるポリペプチド分子が生物活性を有していない場合でさえ、当業者は、例えば、ワクチンとしてまたは抗体を産生させるために、ポリペプチドの利用法を既に公知しているからである。ＰＡＰＡＰ活性を持たない本発明のポリペプチドのその他の用途は、なかでも、エピトープマッピングにおけるエピトープタグとして、さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上または当業者に公知である方法を用いる分子篩ゲル濾過カラム上での分子量マーカーを含む。後述するように、本発明のポリペプチドはまた、ＰＡＰＡＰタンパク質発現の検出用アッセイまたはＰＡＰＡＰタンパク質機能の増強または阻害が可能であるアゴニストならびにアンタゴニストとして有用である、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を産生するためにも使用できる。さらに、そのようなポリペプチドは、本発明によるアゴニストおよびアンタゴニスト候補でもある、ＰＡＰＡＰタンパク質結合タンパク質を「捕獲」するための酵母２ハイブリッド系で使用することができる。
他の実施形態では、本発明はまたＰＡＰＡＰおよびｇ３４８７２ポリペプチドによって形成される複合体にも関する。したがって、本発明は、配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸を有する少なくとも一つのＰＡＰＡＰポリペプチド、ならびに少なくとも一つのｇ３４８７２ポリペプチドの精製、単離、または組換え複合体を含む。好ましい実施形態では、前記ｇ３４８７２ポリペプチドは、配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸を含む。
その上、ＰＡＰＡＰポリペプチド構造のさらなる分析によって示唆されるように、本発明のＰＡＰＡＰポリペプチドは、アミノ酸位置６９〜７２（アミノ酸ＮＮＴＤ）にＮ−グリコシル化部位（ＡＳＰ）を含み得る。さらに、本発明のＰＡＰＡＰポリペプチドは、アミノ酸位置２６〜２８ （ＳＣＲ）、５３〜５５ （ＳＫＲ）、７１〜７３ （ＴＤＫ） および８０〜８２ （ＳＰＫ）にタンパク質キナーゼＣリン酸化部位を含み得る。その上、ＰＡＰＡＰポリペプチドは、アミノ酸位置１８〜２３ （ＧＧＤＺＧＱ）、２２〜２７ （ＧＱＩＦＳＣ）ならびに３７〜４２ （ＧＡＧＱＮＫ）にＮ−ミリスチン酸化部位を含み得る。その他の構造的態様は、アミノ酸位置８〜１６と９〜１６（アミノ酸Ｄ−−−− ＰＹＧ）に３５ ＡＳＰ とＧＬＵ ラセミ化酵素モチーフを含む。
【０１２７】
ｇ３４８７２との相互作用による精神分裂病と躁鬱病との関連に加えて、ＰＡＰＡＰポリペプチドはまた、神経伝達への関与が既に示されている、カルシウム／カルモヂュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣＡＭＫＥ）（受託番号：ＡＳ２７１１５６１）と配列相同性を共有する。一つの態様では、ＰＡＰＡＰは、分子シャペロンとして作用し、例えば、ＰＡＰＡＰはｇ３４８７２とｇ３４８７２レセプターの相互作用または結合を増強または防止することがある。他の態様では、ＰＡＰＡＰはｇ３４８７２に係わるシグナル経路で機能的に相互作用することがある。ＰＡＰＡＰタンパク質は、好ましくはヒトまたは哺乳類組織サンプルから単離されるか、またはヒトまたは哺乳類の遺伝子から発現される。
【０１２８】
本発明のＰＡＰＡＰポリペプチドは、当該分野で公知の一般的発現法を用いて作出できる。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、いずれかの便利な宿主に適切な発現ベクター中に結合される。原核および真核宿主系のどちらも、組換えポリペプチドの形成、およびいくつかのより一般的な系のまとまりの形成に使用される。ポリペプチドは次に溶解細胞または培養基から単離され、そして目的用途のために必要な程度まで精製される。精製法は当該分野で公知の技術のいずれか、例えば、分別抽出、塩分別、クロマトグラフィー、遠心分離など、によって行われる。例えば、タンパク質精製のための様々な方法については、酵素学の方法を参照のこと。
【０１２９】
その上、短いタンパク質フラグメントは化学的合成によって生成される。あるいは、本発明のタンパク質は、ヒトまたは非ヒト動物の細胞または組織から抽出される。タンパク質の精製方法は当該分野で公知であり、粒子を破壊するための洗剤またはカオトロピック剤の使用、ならびにそれに後続するイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、比重沈降法、およびゲル電気泳動によるポリペプチドの分別抽出および分離を含む。
【０１３０】
配列番号１を含むいずれのＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡも、ＰＡＰＡＰタンパク質およびポリペプチドを発現するために使用できる。発現されるべきＰＡＰＡＰタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸は、従来のクローニングテクノロジーを用いて、発現ベクター中のプロモーターに作動可能に連結される。発現ベクター中にあるＰＡＰＡＰインサートは、ＰＡＰＡＰタンパク質あるいはその一部の完全コード配列を含んでいる可能性がある。例えば、ＰＡＰＡＰ由来のインサートは、配列番号２のＰＡＰＡＰタンパク質の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドをコードし得る。
【０１３１】
発現ベクターは、当該分野で公知である哺乳類、酵母、昆虫または細菌発現系のいずれかである。市販のベクターおよび発現系は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、および Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含む多数のサプライヤーから入手が可能である。所望するならば、発現を増強し、さらに正しいタンパク質の折り畳みを容易にするために、Ｈａｔｆｉｅｌｄらによって米国特許第５，０８２，７６７号に説明されるように（その公開は全文を本願明細書に参考文献として引用している。）、コドン含量および配列のコドン対が、発現ベクターが導入される特定の発現生物用に最適化される。
【０１３２】
一つの実施形態では、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡからｃＤＮＡのポリＡシグナルに至るまでの全コード配列が、発現ベクター中のプロモーターに作動可能に連結される。あるいは、ＰＡＰＡＰタンパク質の一部分をコードする核酸が開始部位として作働するメチオニンを欠損する場合は、先行技術を用いて、開始メチオニンを核酸の第一コドンに隣接して導入することができる。同様にして、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ由来インサートがポリＡシグナルを欠損する場合は、この配列は、例えば、ＢｇｌＩ およびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いて、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）からポリＡシグナルをスプライシングして、これを哺乳類発現ベクターｐＸＴ１ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に組み込むことによって構築物に付加できる。ｐＸＴｌは、ＬＴＲおよびモロニーマウス白血病ウィルスからのｇａｇ遺伝子の一部分を含む。構築物におけるＬＴＲの配置は効率的で安定なトランスフェクションを可能とする。ベクターは、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部をコードする核酸は、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡまたはその一部に相補性があり、そして５’プライマー中に組み込まれているＰｓｔＩおよびｃＤＮＡ３’プライマーに対応する５’末端あるＢｇｌＩＩに対する制限エンドヌクレアーゼ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部をコードする配列がポリＡシグナルに関して正しく位置されることを注意深く確認しながら、配列番号２のＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡを含む細菌ベクターからＰＣＲによって得られる。ＰＣＲ反応の結果から得られる精製フラグメントは、ＰｓｔＩで消化され、エキソヌクレアーゼで末端平滑化され、Ｂｇｌ ＩＩで消化され、精製された後ｐＸＴ１に結合され、これによってポリＡシグナルを含みさらにＢｇｌ ＩＩで消化される。
【０１３３】
結合産物は、リポフェクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を製品説明書に概要されている条件下で用いて、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞中にトランスフェクトする。トランスフェクト細胞を６００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８ （Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）中で増殖後に、陽性を示すトランスフェクタントが選択される。
【０１３４】
前述の方法はまた、検出可能な表現型の原因である変異ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部を発現するためにも使用することができる。
発現タンパク質は、硫酸アンモニウム沈降法あるいはサイズまたは電荷に基づくクロマトグラフィー分離法のような従来の精製技術を用いて精製される。核酸インサートによってコードされるタンパク質はまた、標準免疫クロマトグラフィー技術を用いて精製してもよい。そのような方法では、細胞抽出物のような発現ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部を含む溶液を、ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部に対して産生された抗体がクロマトグラフィーマトリックスに付着されているカラムに通す。発現タンパク質は免疫クロマトグラフィカラムに結合される。その後、非特異的結合タンパク質を除去するためにカラムを洗浄する。特異的に結合された発現タンパク質は次にカラムから遊離されて、さらに標準技術を用いて回収される。
【０１３５】
ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部が発現されていることを確認するために、ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部をコードするインサートを含む発現ベクターを含む宿主細胞から発現されたタンパク質を、インサートを含まない発現ベクターを含む宿主細胞において発現されたタンパク質と比較することができる。インサートを含まない発現ベクターを含む細胞由来のサンプル中に存在しないが、インサートを有する発現ベクターを含む細胞由来のサンプル中に存在するバンドは、ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部が発現されていることを示す。一般的には、このバンドはＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部に予測される移動度を有するであろう。しかしながら、このバンドはグリコシル化、ユビキチン結合、または酵素切断のような修飾の結果として、予測される移動度と異なる移動度を有することがある。
【０１３６】
発現ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部を特異的に認識することのできる抗体について以下に説明する。
抗体産生が可能ではない場合は、ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部をコードする核酸は、キメラポリペプチドを利用する精製機構で使用するためにデザインされた発現ベクター中に組み込むことができる。そのようなストラテジーでは、ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部をコードする核酸が、キメラの他方の半分をコードする遺伝子と共にフレーム内に挿入される。キメラの他半分は、ベータグロビンまたはニッケル結合ポリペプチドコード配列である。ベータグロビンまたはそれに付着するニッケルに対する抗体を有するクロマトグラフィーマトリックスを、次にキメラタンパク質の精製に使用する。プロテアーゼ切断部位が、ベータグロビンまたはニッケル結合ポリペプチドとＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部の間に操作処理される。したがって、キメラの二つのポリペプチドは、プロテアーゼ消化によって互いに分離できる。
【０１３７】
ベータグロビンキメラタンパク質産生のための一つの有用な発現ベクターは、ウサギベータグロビンをコードするｐＳＧ５ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。ウサギベータグロビン遺伝子のイントロンＩＩは、発現転写物のスプライシングを促進し、そして構築物中に組み入れられたポリアデニル化シグナルが発現レベルを増加する。これらの技術は、分子生物学分野の当業者には公知である。標準方法は、Ｄａｖｉｓら（１９８６）のような方法教科書として出版されており、多数の方法が Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．またはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である。ポリペプチドはその他には、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ  （ｔｒａｄｅｍａｒｋ） Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （インビトロＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）翻訳キット）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなインビトロ翻訳系を用いて、構築物から産生できる。
【０１３８】
［本発明のＰＡＰＡＰポリペプチドを結合する抗体］
任意のＰＡＰＡＰポリペプチドまたは全タンパク質を使って、記述のように発現ＰＡＰＡＰタンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合することのできる抗体を産生できる。
本発明の一つの抗体組成物は、配列番号２のＰＡＰＡＰタンパク質に特異的に結合していること、あるいは特異的に結合することが可能である。ＰＡＰＡＰと特異的に結合する抗体組成物では、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはその他の抗体結合アッセイにおいて、ＰＡＰＡＰタンパク質の全長第一変異体に対する結合親和性が、ＰＡＰＡＰタンパク質の全長第二変異体よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、あるいは１００％ 高いことを実証しなければならない。
【０１３９】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むエピトープ含有ポリペプチドに選択的に結合している、あるいは選択的に結合する、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体組成物に関する。
【０１４０】
他の実施形態では、本発明は、ＰＡＰＡＰポリペプチドとｇ３４８７２ポリペプチドの複合体に選択的に結合している、あるいは選択的に結合する、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体組成物に関し、ここでＰＡＰＡＰポリペプチドは、配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、前記ｇ３４８７２ポリペプチドは、配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸を含む。
【０１４１】
エピトープは、少ない場合は空間配座にある３個のアミノ酸を含むことができ、これはエピトープに特有である。一般的にエピトープは、少なくとも６個のそのようなアミノ酸から成り、少なくとも８〜１０個のそのようなアミノ酸から成ることが多い。好ましい実施形態では、抗原エピトープは、３〜５０の間の任意の整数である数のアミノ酸を含む。エピトープとして機能するフラグメントは、従来の手段のいずれかによって産生することができる。エピトープはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの抗原性分析によって決定することができ、例えば、デフォルトパラメータ（バージョン４．０  ウインドウズ、 ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．， １２２８ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ．）を用いる、コンピュータープログラムＰＲＯＴＥＡＮを使用して実施できる。
【０１４２】
予測された抗原エピトープを以下に示す。免疫原性エピトープ一覧は、特定のアルゴリズムによって免疫原性が最も高いと予測されるエピトープを含むアミノ酸残基のみを記述することが指摘されている。免疫原性として特に記述されていない本発明のポリペプチドが非抗原性であるとは考慮されない。これは、これらはインビボでは抗原性であるが、使用した特定のアルゴリズムでは抗原性があると単に認識されない可能性があるためである。あるいは、ポリペプチドはファージディスプレイのような方法を用いるとインビトロで抗原性となる可能性がある。したがって、以下の一覧は、好ましいエピトープのみを含むアミノ酸残基であり、完全な一覧ではない。事実、少なくとも長さが６アミノ酸残基である、本発明のポリペプチドの全てのフラグメントは、抗原性エピトープとして有用であるとして本発明に含まれている。さらに、以下の一覧は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ 分析によって決定されたエピトープの重要な残基のみである。したがって、Ｎ末端、Ｃ末端、あるいはＮとＣ末端の両方のいずれかにあるその他の隣接残基は、少なくとも長さが６残基であるエピトープ含有部分を産生するための配列一覧に加えてもよい。他の免疫原性エピトープを含むアミノ酸残基は、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析と同様なアルゴリズムまたは本願明細書に記述の方法あるいは当該分野で公知である方法を用いる抗原性応答についてのインビボ試験によって決定できる。
【０１４３】
本発明のエピトープ含有フラグメントは、本発明のポリペプチドの６〜５０個のアミノ酸（すなわち、６〜５０の範囲の整数）を含むことが好ましい。また、本発明は、６と全長ＰＡＰＡＰ配列である整数の範囲にある抗原性フラグメントも含む。
好ましいＰＡＰＡＰ免疫原性エピトープ：
Ｇｌｙ ８〜Ｌｙｓ−１１
Ａｓｐ−３１〜Ａｓｎ−３３
Ｇｌｎ−４０〜Ｌｅｕ−４７
Ｇｌｙ −５１〜Ｌｙｓ−５４
Ｇｌｕ−５９〜Ａｒｇ−６２；ならびに
Ｓｅｒ−８０〜Ｔｈｒ−８３
本発明はまた、変異ＰＡＰＡＰタンパク質または、変異ＰＡＰＡＰタンパク質のエピトープを含むそのフラグメントまたは変異体と特異的に結合できる精製または単離抗体に関する。他の好ましい実施形態では、本発明は、ＰＡＰＡＰタンパク質の連続アミノ酸を少なくとも１０個含み、さらに形質の原因となる変異によってコードされ得るアミノ酸を少なくとも１個含むポリペプチドに結合可能な抗体に関する。
【０１４４】
抗体の結合が所望される種以外のＰＡＰＡＰの異なる種を発現する、野生型またはトランスジェニック型の非ヒト動物または哺乳類、およびＰＡＰＡＰを発現しない動物（すなわち、本願明細書に記述するようなＰＡＰＡＰノックアウト動物）は、抗体の調製に特に有用である。ＰＡＰＡＰノックアウト動物は、ＰＡＰＡＰタンパク質の全てまたはほとんどの露出領域を外来抗原として認識し、したがってＰＡＰＡＰエピトープのより広範なアレイについて抗体を産生する。さらに、１０〜３０個のアミノ酸のみを有する小ポリペプチドが、ＰＡＰＡＰタンパク質の任意の一つとの特異的な結合を得るために有用なことがある。さらに、抗原配列に類似するＰＡＰＡＰ種を産生する動物の液性免疫系は、動物の未変ＰＡＰＡＰ種と抗原配列間の差異を選択的に認識して、抗原配列に存在するこれらの特有部位に対する抗体を産生する。そのような技術は、ＰＡＰＡＰタンパク質の任意の一つと特異的に結合する抗体を得るために特に有用であろう。
【０１４５】
いずれかのプロトコルに従って調製された抗体調製物は、生物試料中にある抗原性物質の濃度を決定する定量免疫アッセイに有用であり、さらにこれらは生物試料中にある抗原の存在を半定量的または定性的に同定するためにも使用される。抗体はまた、タンパク質を発現する細胞を死滅させるため、あるいは体内におけるタンパク質レベルを低下させるための治療用組成物にも使用できる。
【０１４６】
本発明の抗体は、当該分野で公知の放射性、蛍光または酵素標識のいずれか一つによって標識できる。
その結果、本発明はまた、本発明によるＰＡＰＡＰポリペプチドが生物試料中に存在することを特異的に検出するための方法に関し、前記方法は以下の工程：
ａ）生物試料を、配列番号２のアミノ酸配列またはそのペプチドフラグメントまたは変異体を含むＰＡＰＡＰポリペプチドを特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体に接触させること；ならびに
ｂ）形成された抗原−抗体複合体を検出すること、を含む。
【０１４７】
本発明はまた、本発明によるＰＡＰＡＰポリペプチドが生物試料中に存在することをインビトロで検出するための診断キットに関し、前記キットが、
ａ）任意に標識されている、配列番号２のアミノ酸配列またはそのペプチドフラグメントまたは変異体を含むＰＡＰＡＰポリペプチドを特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体；
ｂ）任意に標識を有するか、または標識試薬によってそれ自体が認識されることが可能な状態にあるか、さらに詳細には、前述のモノクローナルまたはポリクローナル抗体自体は標識されていない場合、形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬、を含む。
【０１４８】
本発明はしたがって、ポリペプチドと特異的に結合する、そして限定はしないが、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ （ ＩｇＡ１と ＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、 ＩｇＭおよび ＩｇＹを含む、本発明のポリペプチドのエピトープと特異的に結合する、抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。好ましい実施形態では、抗体は、限定はされないが、Ｆａｂ、 Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２ およびＦ（ａｂ’）２、 Ｆｄ、 一本鎖 Ｆｖｓ （ｓｃＦｖ）、 一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ （ｓｄＦｖ） ならびにＶＬ または ＶＨ ドメインを含むフラグメントを含む、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントである。抗体は、鳥類および哺乳類を含むいずれの動物起原でもよい。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ由来である。
【０１４９】
一本鎖抗体を含む、抗原結合抗体フラグメントは、可変領域（複数でもよい）単独で、またはヒンジ領域、ＣＨ１、 ＣＨ２、および ＣＨ３ドメインの 全てまたはその一部と組み合わされた状態から成ることがある。本発明にはまた、可変領域（複数でもよい）およびヒンジ領域、ＣＨ１、 ＣＨ２、および ＣＨ３ ドメインの任意の組み合わせも含まれる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドと特異的に結合する、キメラ、ヒト化、ならびにヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプ（抗個特異性）である抗体も含む。
【０１５０】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、および三重特異性であり、またはより高次な多特異性であり得る。多特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープについて特異性があるか、または本発明のポリペプチドならびに、異種ポリペプチドまたは固体支持体物質のような異種組成物の両方に特異性があることもある。例えば、国際公開番号ＷＯ ９３／１７７１５； ＷＯ ９２／０８８０２； ＷＯ ９１／００３６０； ＷＯ ９２／０５７９３； Ｔｕｔｔら（１９９１）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０〜６９；米国特許番号第５，５７３，９２０号、 ４，４７４，８９３号、５，６０１，８１９号、４，７１４，６８１号、 ４，９２５，６４８号； Ｋｏｓｔｅｌｎｙら  （１９９２）、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７〜１５５３を参照のこと。
【０１５１】
本発明の抗体は、抗体によって認識されるかまたは特異的に結合される、本発明のポリペプチドのエピトープ（複数でもよい）またはエピトープ含有部分（複数でもよい）に関して、記述または特定できる。分泌タンパク質である本発明のタンパク質の場合、抗体は本発明の核酸によってコードされる全長タンパク質、本発明の核酸によってコードされる成熟タンパク質（すなわち、シグナルペプチドの切断によって産生されるタンパク質）、本発明の核酸によってコードされるシグナルペプチド、あるいは本発明によるその他の任意のポリペプチドを特異的に結合することができる。したがって、エピトープ（複数でもよい）またはエピトープ含有ポリペプチド部分（複数でもよい）は、本願明細書に記述するように、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置、隣接アミノ酸残基の大きさ、またはさもなければ本願明細書の説明（配列一覧を含む）によって、特定することができる。本発明によるエピトープまたはポリペプチドのいずれも特異的に結合する抗体はまた、個別種として除外され得る。したがって、本発明は、本発明に特定されるポリペプチドを特異的に結合する抗体を含み、同様物を除外する。
【０１５２】
本発明の抗体はまた、その交差反応性に関して記述または特定し得る。本発明のポリペプチドのその他のいずれの類似体、相同分子種、または相同体も特異的に結合しない抗体は含まれる。本発明のポリペプチドに対して同一性（当該分野に公知であり、本願明細書に説明する方法を用いて計算される）が９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、および５０％以下であるポリペプチドとは結合しない抗体がまた、本発明に含まれる。本発明はさらに、（本願明細書の記述のような）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのみを結合する抗体を含む。本発明の抗体はまた、その結合親和性に関して記述または特定し得る。好ましい結合親和性は、解離定数またはＫｄが、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、 ５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍ以下であるものを含む。
【０１５３】
本発明の抗体は、限定はされないが、インビトロおよびインビボ診断および治療方法を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出、およびターゲット化するための当該分野で公知の方法を含む用途を有する。例えば、抗体は、生物試料中にある本発明のポリペプチドのレベルを定性的ならびに定量的に測定するための免疫アッセイに用途を有する。Ｈａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（抗体：実験マニュアル）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第二版、 １９８８）を参照のこと（その全文を参考文献として引用する）。
【０１５４】
本発明の抗体は、単独で、あるいはその他の組成物と組み合わせて使用できる。抗体はさらに、組換えによってＮ末端またはＣ末端で異種ポリペプチドに融合するか、またはポリペプチドまたはその他の組成物と化学的に複合体形成（共有結合と非共有結合）することができる。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用な分子、および異種ポリペプチド、薬物または毒素のようなエフェクター（作動体）分子に組換えによって融合または複合し得る。例えば、国際公開番号ＷＯ ９２／０８４９５；ＷＯ ９１／１４４３８；ＷＯ ８９／１２６２４；米国特許番号第５，３１４，９９５号；ならびにヨーロッパ特許番号第ＥＰ０ ３９６ ３８７号を参照のこと。
【０１５５】
本発明の抗体は、当該分野に公知である適切な方法のいずれかによって調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントは、ポリクローナル抗体を含む血清の生成を誘導するために動物に投与できる。「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定はされない。「抗体」という用語は、少なくとも一つの結合ドメインを含み、結合ドメインが抗体分子の可変ドメインの折り畳みにより形成され、抗原の抗原決定基の特徴に相補性のある内部表面形状および電荷分布を備える三次元結合空間を形成し、それによって抗原との免疫学的反応を可能とする、ポリペプチドまたはポリペプチド群を意味する。「モノクローナル抗体」という用語は、原核、真核、またはファージクローンを含む、単一クローン由来の抗体を意味するものであり、その産生方法を言及するものではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイテクノロジーの使用を含む、当該分野で公知の広範な技術を用いて調製できる。
【０１５６】
ハイブリドーマ法は、当該分野で公知の方法を含む（例えば、Ｈａｒｌｏｗら１９９８； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、１９８１を参照のこと）（前記参考文献はその全文を参考文献として引用している）。Ｆａｂ と Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生する）のような酵素を用いて、タンパク質分解切断によって、ハイブリドーマによって産生された抗体から生成できる。
【０１５７】
あるいは、本発明の抗体は、組換えＤＮＡテクノロジーの応用、または当該分野に公知の方法を用いる合成化学によって産生することができる。例えば、本発明の抗体は、当該分野に公知の様々なファージディスプレイ法を用いても調製できる。ファージディスプレイ法では、機能性抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に表示される。所望する結合特性を有するファージが、抗原、一般的には固体表面またはビーズに結合または捕獲された抗原、で直接的に選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法で使用されるファージは一般的には、ｆｄ、およびＦａｂを有するＭ１３、Ｆｖ、または組換えによってファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに融合されたジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを含む線状ファージである。本発明の抗体を作出するために使用し得るファージディスプレイ法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｕ．ら（１９９５）；Ａｍｅｓ，Ｒ．Ｓ．ら（１９９５）； Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら（１９９４）； Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．ら（１９９７）； Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら（１９９４）； 国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；国際公開番号ＷＯ ９０／０２８０９； ＷＯ ９１／１０７３７； ＷＯ ９２／０１０４７； ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６； ＷＯ ９５／１５９８２； ＷＯ ９５／２０４０１； および 米国特許番号第５，６９８，４２６号、５，２２３，４０９号、 ５，４０３，４８４号、５，５８０，７１７号、５，４２７，９０８号、 ５，７５０，７５３号、 ５，８２１，０４７号、 ５，５７１，６９８号、 ５，４２７，９０８号、 ５，５１６，６３７号、 ５，７８０，２２５号、 ５，６５ ８，７２７ 号および ５，７３３，７４３号に公開・開示されるものを含む（ 前記参考文献はその全文を参考文献として引用している）。
【０１５８】
前述の参考文献に記述するように、ファージ選択後、ファージからの抗体コード領域を単離して、ヒト抗体、またはその他の所望する抗原結合フラグメントのいずれかを含む全抗体を産生するために使用すると、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望する宿主において発現することができる。例えば、組換えによってＦａｂ、 Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２ およびＦ（ａｂ’）２ フラグメントを産生するための技術はまた、国際公開番号ＷＯ ９２／２２３２４； Ｍｕｌｌｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．ら（１９９２）；およびＳａｗａｉ，Ｈ．ら（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ら（１９８８）（前記参考文献はその全文を参考文献として編入している） に開示されるもののような当該分野に公知な方法を用いて使用できる。
【０１５９】
一本鎖Ｆｖｓおよび抗体を産生するために使用し得る技術の例は、米国特許番号第 ４，９４６，７７８号 および ５，２５８，４９８号； Ｈｕｓｔｏｎら（１９９１）； Ｓｈｕ，Ｌ．ら（１９９３）；ならびにＳｋｅｒｒａ，Ａ．ら（１９８８）に記述されるものを含む。ヒトにおける抗体のインビボ用途およびインビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途では、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましいことがある。キメラ抗体産生のための方法は当該分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ （１９８５）； Ｏｉら（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．ら（１９８９）；ならびに米国特許番号第 ５，８０７，７１５号を参照のこと。 抗体は、ＣＤＲ移植術（ヨーロッパ特許番号ＥＰ０ ２３９ ４００号； 国際公開番号ＷＯ ９１／０９９６７； 米国特許番号第 ５，５３０，１０１号；および５，５８５，０８９号）、ベニヤ法または再装法（ヨーロッパ特許番号ＥＰ０ ５９２ １０６； ヨーロッパ特許番号ＥＰ ０ ５１９ ５９６号； Ｐａｄｌａｎ  Ｅ．Ａ、（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  Ｇ．Ｍ．ら（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ  Ｍ．Ａ．ら（１９９４）、および鎖シャフリング法（米国特許番号第５，５６５，３３２号）を含む様々な技術を用いてヒト化し得る。ヒト抗体は、前述のファージディスプレイ法を含む当該分野で公知である様々な方法によって作出できる。例えばさらに、米国特許番号第４，４４４，８８７号、４，７１６，１１１号、 ５，５４５，８０６号、および ５，８１４，３１８号； 国際公開番号ＷＯ ９８／４６６４５； ＷＯ ９８／５０４３３；ＷＯ ９８／２４８９３； ＷＯ ９６／３４０９６；ＷＯ ９６／３３７３５；およびＷＯ ９１／１０７４１を参照のこと（前記参考文献はその全文を参考文献として引用している）。
【０１６０】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに組換えによって融合または化学的に複合された（共有結合性または非共有結合による複合を含む）抗体を含む。抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異性があり得る。例えば、抗体は、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または複合することによって、インビトロまたはインビボで、本発明のポリペプチドを特定の細胞型にターゲット化するために使用できる。本発明のポリペプチドに融合または複合されている抗体はまた、当該分野で公知な方法を用いて、インビトロ免疫アッセイおよび精製法に使用できる。例えば、Ｈａｒｂｏｒら前出；国際公開番号 ＷＯ ９３／２１２３２；ヨーロッパ特許番号 ＥＰ ０ ４３９ ０９５号； Ｎａｒａｍｕｒａ， Ｍ．ら（１９９４）；米国特許番号第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．ら（１９９２）； Ｆｅｌｌ，Ｈ．Ｐ．ら（１９９１）を参照のこと）（前記参考文献はその全文を参考文献として引用している）。
【０１６１】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合または複合された本発明のポリペプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域、またはその一部に融合または複合されてもよい。本発明のポリペプチドに融合された抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ならびにＣＨ３ドメインまたは全ドメインあるいはその部分の任意の組み合わせを含み得る。本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのインビボ半減期を増加するため、あるいは免疫アッセイにおける用途のために、当該分野で公知の方法を用いて、上記の抗体部分に融合または複合できる。ポリペプチドはまた、上記抗体部分に融合あるいは複合して多量体を形成してもよい。例えば、本発明のポリペプチドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合によって二量体を形成できる。ポリペプチドをＩｇＡとＩｇＭの一部に融合することにより、高次多量体の形状が作出できる。抗体部分に本発明のポリペプチドを融合または複合するための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許番号第５，３３６，６０３号、 ５，６２２，９２９号、 ５，３５９，０４６号、 ５，３４９，０５３号、 ５，４４７，８５１号、５，１１２，９４６号；ヨーロッパ特許番号ＥＰ ０ ３０７ ４３４号、 ＥＰ ０ ３６７ １６６号； 国際公開番号ＷＯ ９６／０４３８８、 ＷＯ ９１／０６５７０； Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら（１９９１）； Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．ら（１９９５）；および Ｖｉｌ，Ｈ．ら（１９９２）を参照（前記参考文献はその全文を参考文献として引用している）。
【０１６２】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を、部分的あるいは完全に破壊する抗体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体のどちらも含まれる。リガンド結合は妨げないがレセプター活性化を防止するレセプター特異的抗体が含まれる。レセプター活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本願明細書に記述の、さもなければ当該分野で公知の技術によって判定できる。リガンド結合およびレセプター活性化の両方を防止するレセプター特異的抗体もまた含まれる。同様に、リガンドに結合してリガンドがレセプターに結合することを防止する中和抗体、ならびにリガンドに結合して、それによってレセプター活性化を防止するが、リガンドがレセプターに結合することは防止しない抗体が含まれる。レセプターを活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体は、リガンド介在性レセプターの活性化によって影響される全ての生物活性のまたは全てよりは少ない生物活性のアゴニストとして作用し得る。抗体は、本願明細書に開示される特定の活性を含む生物活性についてのアゴニストまたはアンタゴニストとして特定化することができる。上記の抗体アゴニストは、当該分野に公知な方法を用いて作出できる。例えば、国際公開番号ＷＯ ９６／４０２８１；米国特許番号第 ５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら（１９９８）； Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら（１９９８）； Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら（１９９８）； Ｚｈｕ，Ｚ．ら（１９９８）； Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．ら（１９９８）； Ｐｒａｔ，Ｍ．ら（１９９８）； Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．ら（１９９７）； Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら（１９９７）； Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら（１９９７）； Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ら（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら（１９９８）： Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら（１９９６）を参照（前記参考文献はその全文を参考文献として引用している）。
【０１６３】
上記に考察するように、本発明のポリペプチドの抗体は、次に、当業者に公知な技術を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために利用できる。例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ と Ｂｏｎａ （１９８９）；Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ （１９９１）を参照のこと。例えば、結合して、ポリペプチドの多量体化または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体は、ポリペプチド多量体化または結合ドメインを「模倣」して、その結果として、ポリペプチドまたはそのリガンドに結合して中和する、抗イディオタイプを産生するために使用できる。そのような中和抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドまたはそのリガンド／レセプターを結合して、それによって生物活性を遮断するために使用できる。
［組換えベクター］
「ベクター」という用語は、本願明細書で使用する際は、二本鎖または一本鎖であり、細胞宿主または単細胞または多細胞宿主生物に移入することが望まれる少なくとも一つの目的ポリヌクレオチドを含む、環状または線状ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子を呼称する。
【０１６４】
本発明は、ＰＡＰＡＰゲノム配列由来の制御ポリヌクレオチド、および／またはＰＡＰＡＰゲノム配列あるいはｃＤＮＡ配列のいずれに由来するコードポリヌクレオチドを含む、組換えベクターファミリーを包含する。
一般的には、本発明の組換えベクターは、前述に定義するような制御配列、コード配列およびポリヌクレオチド構築物、ならびに任意のＰＡＰＡＰプライマーまたはプローブを含む、本願明細書に記述するポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。特に詳細には、本発明の組換えベクターは、「ＰＡＰＡＰ遺伝子のゲノム配列」セクション、「ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ配列」セクション、「コード領域」セクション、「ポリヌクレオチド構築物」セクション、ならびに「オリゴヌクレオチドプローブとプライマー」セクションに記述されている任意のポリヌクレオチドを含むことができる。
【０１６５】
第一の好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターは、配列番号３のＰＡＰＡＰゲノム配列由来の挿入ポリヌクレオチド、または、例えば、配列番号１のｃＤＮＡのようなＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡを適切な細胞宿主中で増幅するために使用され、組換えベクターが複製するときはいつもこのポリヌクレオチドが増幅される。
【０１６６】
本発明による組換えベクターの第二の好ましい実施形態は、本発明の制御ポリヌクレオチドまたはコード核酸もしくはその両方を含む、発現ベクターを含む。ある実施形態では、発現ベクターはＰＡＰＡＰポリペプチドを発現するために使用され、発現ポリペプチドは次に精製することができ、そして例えば、リガンドスクリーニングアッセイにおいて、またはＰＡＰＡＰタンパク質に対して誘導される特異的抗体を産生するための免疫原として使用される。その他の実施形態では、発現ベクターは、トランスジェニック動物の作製、ならびに遺伝子療法にも使用される。発現は、宿主細胞内で目的の遺伝子発現を生起するウイルスおよび哺乳類起原両方からのエンハンサー／プロモーターなどの様々な制御エレメントを含む、適切なシグナルがベクター中に供給されることを必要とする。産物を発現する永久的、安定な細胞クローンを確立するための優性薬物選択マーカーは、本発明のベクターが薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に関連するエレメントであるために、一般的には本発明の発現ベクターに含まれている。
【０１６７】
さらに詳細には、本発明は、ＰＡＰＡＰタンパク質、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有するＰＡＰＡＰタンパク質、あるいはその変異体またはフラグメントをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
本発明はまた、ＰＡＰＡＰコード配列の発現に有用な、配列番号１の核酸を含む、組換え発現ベクターに関する。
【０１６８】
本発明のベクターに見出すことのできるエレメントのいくつかを、以下のセクションにさらに詳細に記述する。
１． 本発明の発現ベクターの一般的特徴
本発明による組換えベクターは、限定はしないが、ＹＡＣ （酵母人工染色体）、ＢＡＣ （細菌人工染色体）、ファージ、ファージミド、コスミド、プラズミド、または染色体、非染色体、半合成および合成ＤＮＡを含む線状ＤＮＡ分子をさえ含む。そのような組換えベクターは、以下のアセンブリを含む転写ユニットを含み得る：
（１）  例えば、プロモーターまたはエンハンサーのような、遺伝子発現において制御的役割を有する遺伝エレメント（複数でもよい）。エンハンサーは、一般的には長さが約１０〜３００ ｂｐであり、転写を増加するためにプロモーターに作用するＤＮＡのシス作用エレメントである。
【０１６９】
（２）  ｍＲＮＡ中に転写されて結局はポリペプチドに翻訳される、（１）に記述する制御エレメントに作動可能に連結されている、構造またはコード配列；ならびに
（３）適切な転写開始および終結配列。酵母または真核発現系における使用を目的とする構造ユニットは、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含むことが好ましい。あるいは、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列なしで発現される場合は、Ｎ末端残基を含んでいる可能性がある。この残基は、最終産物を生じるために、発現された組換えタンパク質から後に切断されることも、切断されないこともある。
【０１７０】
一般的には、組換え発現ベクターは、複製の起原、宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、ならびに高度に発現されている遺伝子に由来し下流構造配列の転写を指示するプロモーターを含んでいる。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、好ましくは、翻訳されたタンパク質の細胞膜周辺腔または細胞外培地中への分泌を指示することが可能であるリーダー配列によって適当なフェーズにおいて構築される。ベクターが哺乳類宿主細胞内で所望する配列をトランスフェクトおよび発現するために適用される特定の実施形態では、好ましいベクターは、所望する宿主中の複製起原、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまた必要とするリボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’−隣接非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起原の、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化シグナルは、必要とされる非転写遺伝エレメントを供給するために使用できる。
【０１７１】
配列番号２のＰＡＰＡＰポリペプチドあるいはそのフラグメントまたは変異体のインビボ発現は、宿主生物内の未変遺伝子の発現、あるいは生物不活性ＰＡＰＡＰタンパク質の産生に関する遺伝的欠陥の補正のために有用であり得る。
したがって、本発明はまた、適切な遺伝物質を治療対象の患者である生物体内への導入することによって、配列番号２のＰＡＰＡＰポリペプチド、あるいはそのフラグメントまたは変異体をインビボ産生させるために主としてデザインされた組換え発現ベクターを含む。この遺伝物質は、予め生物体から抽出された細胞内にインビトロで導入し、この修飾細胞を引き続いて前記生物体に再導入して、インビボで直接適切な組織中に導入できる。
【０１７２】
２． 制御エレメント
プロモーター
本発明による発現ベクター中で使用する適切なプロモーター領域は、異種遺伝子が発現されなければならない細胞宿主を考慮に入れて選択される。目的の核酸配列の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、ターゲット細胞内で核酸の発現を指示することが可能である限りは、重要ではないと考えられる。したがって、ヒト細胞がターゲットである場合は、核酸コード領域を、例えば、ヒトまたはウイルスプロモーターのような、ヒト細胞内で発現されることが可能なプロモーターに隣接して、ならびにその制御下に配置することが好ましい。
【０１７３】
適切なプロモーターは、発現を制御する対象となる核酸に関して異種、あるいは、発現されるコード配列を含む未変ポリヌクレオチドについて内在性であり得る。さらに、プロモーターはその中に構築物プロモーター／コード配列が挿入される組換えベクター配列に関しては一般的に異種である。
プロモーター領域は、例えば、ＣＡＴ（クロラムフェニコール転移酵素）ベクター、およびさらに好ましくは、ｐＫＫ２３２−８ とｐＣＭ７ ベクターを用いて所望の遺伝子から選択できる。
【０１７４】
好ましい細菌プロモーターは、ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３ またはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｇｐｔ、 ｌａｍｂｄａ ＰＲ、 ＰＬ および ｔｒｐプロモーター（ ヨーロッパ特許番号第ＥＰ ００３６７７６号）、ポリヘドリンプロモーター、またはバキュロウイルス由来のｐ１０タンパク質プロモーター（Ｋｉｔ Ｎｏｖａｇｅｎ）（Ｓｍｉｔｈら、１９８３； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９２）、ｌａｍｂｄａ ＰＲプロモーターまたはさらにｔｒｃプロモーター である。
【０１７５】
真核生物プロモーターは、最初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタルチオネイン−Ｌを含む。便利なベクターとプロモーターの選択は、当業者の技術範囲である。
プロモーターの選択は、遺伝子工学分野の当業者の技能の範囲である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）による著述、あるいはＦｕｌｌｅｒら（１９９６）が記述する方法を参照してもよい。
【０１７６】
その他の制御エレメント
ｃＤＮＡインサートを使用する場合は、遺伝子転写物の正しいポリアデニル化を影響するために、ポリアデニル化シグナルを含むことが一般的に望まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功には重要ではないと考えられ、ヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのようないずれの配列を使用してもよい。発現カセットのエレメントとして企画されるものにはまた、ターミネーターがある。これらのエレメントはメッセージレベルを強化し、そのカセットから他の配列へのリードスルーを最少化するための役割を果たす。
【０１７７】
３． 選択マーカー
選択マーカーは、発現構築物を含む細胞を容易に同定できるように、同定可能な変化を細胞に供与する。形質転換宿主細胞選択用の選択マーカー遺伝子は、好ましくは、ジヒドロ葉酸還元酵素または真核培養細胞のネオマイシン抵抗性、線虫（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）のＴＲＰ１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるテトラサイクリン、リファンピシンまたはアンピシリン抵抗性、または放線菌のレバンサッカラーゼであり、この最後のマーカーは負の選択マーカーである。
【０１７８】
４． 好ましいベクター
細菌ベクター
細菌用途用の代表例であるが限定例ではない、有用な発現ベクターは、選択マーカーとｐＢＲ３２２ （ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝エレメントを含む市販のプラズミドに由来する細菌性の複製原を含み得る。そのような市販ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｕｐｐｓａｌａ、 Ｓｗｅｄｅｎ）、 およびＧＥＭ１ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を含む。
【０１７９】
多数のその他の適切なベクターが当業者には公知であり、以下の細菌ベクターのようなものが市販されている：ｐＱＥ７０、 ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９ （Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、 ｐＤ１０、 ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、 ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、 ｐｂｓｋｓ， ｐＮＨ８Ａ、 ｐＮＨ１６Ａ、 ｐＮＨ１８Ａ、 ｐＮＨ４６Ａ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、 ｐＫＫ２２３−３、 ｐＫＫ２３３−３、 ｐＤＲ５４０、 ｐＲＩＴ５ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）； ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、 ｐＯＧ４４、 ｐＸＴ１、 ｐＳＧ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）； ｐＳＶＫ３、 ｐＢＰＶ、 ｐＭＳＧ、 ｐＳＶＬ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＱＥ−３０ （ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ）。
【０１８０】
バクテリオファージベクター
Ｐ１バクテリオファージベクターは、約８０〜約１００ ｋｂにわたる大きなインサートを含むことができる。
ｐ１５８またはｐ１５８／ｎｅｏ８ のようなＰ１バクテリオファージベクターの構築は、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ （１９９２、１９９４）によって特記されている。ＰＡＰＡＰヌクレオチド配列を含む組換えＰ１クローンは、４０ｋｂ以上の大型ポリヌクレオチドを挿入するためにデザインされ得る（Ｌｉｎｔｏｎら、１９９３）。トランスジェニック実験用にＰ１  ＤＮＡを産生するために、好ましいプロトコルがＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ら（１９９４）に記述されている。簡単に言えば、Ｐ１プラズミドを組み込んでいる大腸菌（好ましくは ＮＳ３５２９株） を、２５ μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む適切なブロス培養基中で一晩増殖する。 Ｐ１ ＤＮＡを、製造元の指示に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ ｋｉｔ （プラズミドマキシキット）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、 ＣＡ、 ＵＳＡ）を用いるアルカリ溶解によって大腸菌から調製する。キットに含まれる洗浄および溶出緩衝液を用いて、二つのＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ ５００カラム上で溶菌液 からＰ１ ＤＮＡ を精製する。７０％エタノールでＤＮＡを沈降する前に、フェノール／クロロホルム抽出を行う。ＤＮＡをＴＥ（１０ ｍＭ トリス‐塩酸、ｐＨ ７．４、１ ｍＭ ＥＤＴＡ）中で可溶化後、ＤＮＡ濃度を分光測定によって調べる。
【０１８１】
トランスジェニック動物、一般的にはトランスジェニックマウス、でＰＡＰＡＰヌクレオチド配列を含むＰ１クローンを発現することが目的である場合は、例えば、Ｐ１ポリリンカー（ＳｆｉＩ， ＮｏｔＩ またはＳａｌＩ）内にある希な切断部位でＰ１ ＤＮＡを切断することにより、Ｐ１ ＤＮＡフラグメントからベクター配列を除去することが望ましい。Ｐ１インサートを次に、最初に報告されたＹＡＣからのＤＮＡの単離方法（Ｓｃｈｅｄｌら、１９９３ａ；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９３）と同様な方法を用いて、パルスフィールドアガロースゲル上でベクター配列から精製した。この段階では、生成された精製ＤＮＡインサートを、必要に応じて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルタユニット（ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、 Ｂｅｄｆｏｒｄ、 ＭＡ、ＵＳＡ、３０，０００分子量リミット）上で濃縮して、次に マイクロ透析膜 （タイプＶＳ、 ０．０２５ μＭ   Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）上で１００ ｍＭ 塩化ナトリウム、 ３０ μＭ スペルミン、７０ μＭ スペルミジンを含むマイクロインジェクション緩衝液（１０ ｍＭ トリス−塩酸， ｐＨ ７．４； ２５０ μＭ ＥＤＴＡ） に対して透析する。精製Ｐ１ ＤＮＡインサートが損なわれていないことは、１％アガロース（Ｓｅａ Ｋｅｍ ＧＴＧ； ＦＭＣ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）パルスフィールドゲル上の電気泳動および臭化エチジウム染色によって判定される。
【０１８２】
バキュロウイルスベクター
配列２のＰＡＰＡＰポリペプチドあるいはそのフラグメントまたは変異体の発現のための適切なベクターは、昆虫細胞および昆虫細胞株で増殖できるバキュロウイルスベクターである。特に適切な宿主ベクター系は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳＦ９細胞株（ＡＴＣＣ 番号 ＣＲＬ １７１１）をトランスフェクトするために使用されるｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウイルス転移ベクター（ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）である。
【０１８３】
バキュロウイルス発現系における配列番号２のＰＡＰＡＰポリペプチドあるいはそのフラグメントまたは変異体の発現用のその他の適切なベクターは、Ｃｈａｉら（１９９３）、Ｖｌａｓａｋら（１９８３）ならびに Ｌｅｎｈａｒｄら（１９９６）に記述されるものを含む。
ウイルスベクター
一つの特定の実施形態では、ベクターはアデノウイルスに由来する。本発明による好ましいアデノウイルスベクターは、ＦｅｌｄｍａｎとＳｔｅｇ（１９９６）または Ｏｈｎｏら（１９９４）に記述されるものである。本発明のこの特定の実施形態による他の好ましい組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス２または５型（Ａｄ２またはＡｄ５）あるいは動物起原のアデノウイルス（フランス特許出願番号ＦＲ９３．０５９５４号）である。
【０１８４】
レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは、一般的には、ヒトを含む、特に哺乳類への外因性ポリヌクレオチドのインビボ移入のために選択される組換え遺伝子デリバリーシステムとして理解されている。これらのベクターは、細胞中への効率のよい遺伝子デリバリーを供給し、移入された核酸は、安定的に宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれる。
【０１８５】
本発明によるレトロウイルスインビトロまたはインビトロ遺伝子デリバリー媒体の調製または構築のための特に好ましいレトロウイルスは、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮増殖症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスから成る群から選択されるレトロウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７０Ａ および １５０４Ａ ウイルス、 Ａｂｅｌｓｏｎ（アベルソン）（ＡＴＣＣ 番号 ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（フレンド） （ＡＴＣＣ番号 ＶＲ−２４５）、Ｇｒｏｓｓ（グロス）（ＡＴＣＣ番号 ＶＲ−５９０）、Ｒａｕｓｃｈｅｒ（ラウシャー）（Ｒａｕｓｃｈｅｒ）（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−９９８） および モロニーマウス白血球ウイルス （ＡＴＣＣ 番号ＶＲ−１９０；国際公開番号ＷＯ ９４／２４２９８）を含む。特に好ましいラウス肉腫ウイルスは、Ｂｒｙａｎ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ（ブライアン高力価）（ＡＴＣＣ番号 ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９ および ＶＲ−７２８）を含む。その他の好ましいレトロウイルスベクターは、Ｒｏｔｈら（１９９６）、国際公開番号ＷＯ ９３／２５２３４、ＷＯ ９４／ ０６９２０、Ｒｏｕｘら（１９８９）、Ｊｕｌａｎら（１９９２）およびＮｅｄａら、（１９９１）に記述されているものである。
【０１８６】
本発明により企画されるさらに他のウイルスベクター系は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を含む。アデノ関連ウイルスは、効率のよい複製および増殖性生活環のためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのような他のウイルスを必要とする（Ｍｕｚｙｃｚｋａら、１９９２）。本ウイルスはＤＮＡを非分裂細胞中に組み込むことが可能な数少ないウイルスの一つであり、高い頻度の安定な組み込みを呈示する（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２； Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９； ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８９）。ＡＡＶの利点となる特徴の一つは、形質転換細胞に比べて形質導入一次細胞に対するその効力の低下に由来する。
【０１８７】
ＢＡＣベクター
細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローニングシステム（Ｓｈｉｚｕｙａら、１９９２）は、大腸菌内でゲノムＤＮＡの大型フラグメント（１００〜３００ ｋｂ）を安定的に維持するために開発された。好ましいＢＡＣベクターは、Ｋｉｍら（１９９６）に記述されているｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターを含む。 ＢＡＣライブラリーは、ベクター内の Ｂａｍ ＨＩ または ＨｉｎｄＩＩＩ部位いずれかへの結合を可能にする酵素を用いて部分消化されたサイズ選択によるゲノムＤＮＡを用いて、このベクターで調製される。隣接するこれらのクローニングサイトは、ＲＮＡ転写またはＰＣＲ法のいずれかによってエンドプローブを産生するために使用できるＴ７とＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ転写開始部位である。大腸菌においてＢＡＣライブラリーの構築後、超コイル環として宿主細胞からＢＡＣ  ＤＮＡが精製される。サイズの判定およびレシピエント細胞中へのＢＡＣの導入前にこれらの環状分子が線状形態に転換される。クローニングサイトは二つのＮｏｔ Ｉ部位によって挟まれ、したがってＮｏｔ Ｉ消化によってクローン化セグメントをベクターから切断することが可能となる。あるいは、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターに含まれるＤＮＡインサートは、特有のｃｏｓＮ部位での切断を誘導する市販の酵素であるｌａｍｂｄａターミナーゼ（終結酵素）でＢＡＣベクターを処理することにより線状化することが可能であるが、この切断方法では、インサートＤＮＡおよびＢＡＣ配列の両方を含む全長ＢＡＣクローンが得られる。
【０１８８】
５． 組換えベクターのデリバリー方法
本発明のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド構築物の発現を影響するためには、これらの構築物は細胞内にデリバリーされなければならない。このデリバリーは、細胞株の形質転換のための実験手法にはインビトロで、または特定の疾病状態の治療にはインビボまたはエキソビボで達成できる。
【０１８９】
一つのメカニズムは、発現構築物が感染性ウイルス粒子内に被包されるウイルス感染である。
ポリヌクレオチドの培養哺乳類細胞中への運搬のためのいくつかの非ウイルス性方法がまた本発明によって企画されており、限定はされないが、リン酸カルシウム沈降法（Ｇｒａｈａｍら、１９７３；Ｃｈｅｎら、１９８７）；ＤＥＡＥ‐デキストラン法（Ｇｏｐａｌ、１９８５）；電気穿孔法（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、 １９８６； Ｐｏｔｔｅｒら、 １９８４）；直接マイクロインジェクション法（Ｈａｒｌａｎｄら、１９８５）；ＤＮＡを付加したリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８２； Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）；ならびにレセプター介在性トランスフェクション（Ｗｕ とＷｕ、１９８７、１９８８）を含む。これらのテクニックのいくつかは、インビボまたはエキソビボ用途に都合よく適応することが可能である。
【０１９０】
いったん発現ポリヌクレオチドが細胞内にデリバリーされると、それはレシピエント細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。この組み込みは、相同的組換え（遺伝子置換）による同族位置および方向づけあるいは、ランダムな非特定位置への組み込みであり得る（遺伝子増強）。さらに他の実施形態では、核酸を細胞内で、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして安定的に維持することができる。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞サイクルとは独立して、あるいはそれと同調して、維持と複製を可能にするために十分な配列をコードする。
【０１９１】
インビボで脊椎動物の細胞内部にタンパク質またはペプチドをデリバリーする方法についての一つの特定の実施形態は、生理学的に認容性のある担体と目的のポリペプチドが操作によってコードされている裸のポリヌクレオチドを含む調製物を、細胞を含む組織の間質性腔中に導入するステップを含み、それによって裸のポリヌクレオチドが細胞内部に取り込まれ、生理学的影響を有する。これは、特にインビトロでの運搬に適応性があるが、インビボでも同様に適応し得る。
【０１９２】
「裸」のポリヌクレオチドを含むインビトロおよびインビボ用途のための組成物は、国際公開番号ＷＯ ９０／１１０９２ （Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．） およびまた、国際公開番号ＷＯ ９５／１１３０７ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（パスツール研究所）、 ＩＮＳＥＲＭ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄ’Ｏｔｔａｗａ（オタワ大学）） ならびにＴａｃｓｏｎら（１９９６） と Ｈｕｙｇｅｎら（１９９６）の論文に記述されている。
【０１９３】
本発明の他の実施形態ではさらに、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む、本発明の裸のポリヌクレオチドの細胞中への運搬は、Ｋｌｅｉｎら（１９８７）に記述されているように、粒子衝撃（遺伝子銃）によって行うことができ、前記粒子がＤＮＡ被覆微粒子発射物であり、高速で加速して細胞膜を貫通し、細胞を死滅することなく細胞内に侵入することができる。
【０１９４】
さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、リポソーム内に包括される（Ｇｈｏｓｈ と Ｂａｃｃｈａｗａｔ、１９９１；Ｗｏｎｇら、１９８０； Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７）。
特定の実施形態では、本発明は、本願明細書に記述されているＰＡＰＡＰタンパク質またはポリペプチドのインビボ産生用の組成物を提供する。組成物は、生理学的に認容性のある担体溶液中にある、本ポリペプチドを操作によってコードされていて、組織中に導入して組織細胞に前記タンパク質またはポリペプチドを発現させるための適切な裸のポリヌクレオチドを含む。
【０１９５】
所望する宿主生物に注射されるベクター量は、注射部位に応じて変化する。指示投与量として、動物体内、好ましくは、哺乳類体内、例えばマウス体内に、０．１ 〜１００ μｇ のベクターが注射される。
本発明によるベクターの他の実施形態では、宿主細胞、好ましくは治療される動物から予め収集した宿主細胞、さらに好ましくは、筋細胞のような体細胞にインビトロで導入できる。後続工程では、所望のＰＡＰＡＰポリペプチドまたは所望するそのフラグメントをコードするベクターで形質転換された細胞が、組換えタンパク質を体内で局所あるいは全身的にデリバリーするために動物の身体に再導入される。
【０１９６】
［細胞宿主］
本発明の他の目的は、本願明細書に記述するポリヌクレオチド、特にＰＡＰＡＰ制御ポリヌクレオチドまたは配列１または３のＰＡＰＡＰポリペプチドのコード配列、あるいはそのフラグメントまたは変異体のいずれかを含むポリヌクレオチドの一つによって形質転換あるいはトランスフェクト（形質移入）されている宿主細胞を含む。さらに、前述する組換えベクターの一つによって形質転換（原核細胞）またはトランスフェクト（真核細胞）された宿主も含まれる。特に詳細には、本発明の細胞宿主は、「ＰＡＰＡＰ遺伝子のゲノム配列」セクション、「ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ配列」セクション、「コード領域」セクション、「ポリヌクレオチド構築物」セクション、および「オリゴヌクレオチドプローブとプライマー」セクションに記述されている任意のポリヌクレオチドを含むことができる。
【０１９７】
本発明によるその他の組換え細胞宿主は、本願明細書に記述されている任意のベクター、さらに正確には「組換えベクター」セクションに記述されている任意のベクターを含む。本発明の発現ベクター用のレシピエントとして使用される好ましい宿主細胞は以下である：
ａ）原核宿主細胞：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ ）株 （Ｉ．Ｅ．ＤＨ５−α株）、枯草菌（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ） ならびにシュードモナス属（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、 ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のような種に由来する株。
【０１９８】
ｂ）真核宿主細胞：ＨｅＬａ細胞 （ＡＴＣＣ番号  ＣＣＬ２；ＡＴＣＣ番号  ＣＣＬ２．１； ＡＴＣＣ番号  ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ １細胞（ＡＴＣＣ番号  ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞 （ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ１６５０； ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ１６５１）、 Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ１７１１）、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ−１８０４）、 ３Ｔ３（ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ−６３６１）、ＣＨＯ （ＡＴＣＣ番号  ＣＣＬ−６１）、 ヒト腎臓 ２９３ （ＡＴＣＣ番号  ４５５０４； ＡＴＣＣ番号  ＣＲＬ−１５７３） ならびにＢＨＫ （ＥＣＡＣＣ 番号  ８４１００５０１； ＥＣＡＣＣ 番号  ８４１１１３０１）。
【０１９９】
ｃ）その他の哺乳類宿主細胞。
哺乳類細胞、そして特にヒト細胞、におけるＰＡＰＡＰ遺伝子発現は欠損を受けたり、あるいは本発明によるＰＡＰＡＰポリヌクレオチドによって動物細胞のゲノム中にあるＰＡＰＡＰ遺伝子のカウンターパートが置換されることを伴うＰＡＰＡＰゲノムまたはｃＤＮＡ配列の挿入を受けることがある。これらの遺伝的修飾は、前述した特定のＤＮＡ構築物を用いる相同組換えイベントによって生起され得る。
【０２００】
使用することができる細胞宿主の一つの種類は、マウス接合体のような哺乳類接合体である。例えば、１００ ｍＭ 塩化ナトリウム、 ３０ μＭ スパーミン および７０ μＭ スパーミジンを含む、１０ ｍＭ トリス−塩酸、 ｐＨ ７．４、 ２５０ μＭ ＥＤＴＡで、１ ｎｇ／ｍｌ（ＢＡＣインサートの場合 ）〜３ ｎｇ／μｌ （Ｐ１バクテリオファージインサートの場合）の濃度に予め調製した精製ＤＮＡ分子である、目的の精製ＤＮＡ分子で、マウス接合体にマイクロインジェクションを行う。マイクロインジェクトするＤＮＡが大型の場合は、Ｓｃｈｅｄｌら（１９９３ｂ）が記述するように、このＤＮＡの機械的破壊を避けるために、ポリアミンと高濃度の塩が使用できる。
【０２０１】
本願明細書に記述するポリヌクレオチド構築物を含む、本発明のポリヌクレオチドの任意の一つを、胚幹細胞（ＥＳ）株、好ましくはマウスＥＳ細胞株、に導入してもよい。ＥＳ細胞株は、予め着床された胚盤胞の内部細胞塊の多分化性、未分化細胞に由来する。好ましいＥＳ細胞株は以下である：ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ （ＡＴＣＣ 番号ＣＲＬ−１８２１）、 ＥＳ−Ｄ３ （ＡＴＣＣ 番号ＣＲＬ１９３４ およびＣＲＬ−１１６３２）、 ＹＳ００１ （ＡＴＣＣ 番号 ＣＲＬ−１１７７６）、 ３６．５ （ＡＴＣＣ 番号 ＣＲＬ−１１１１６）。未分化状態に維持するために、ＥＳ細胞は、この胚の表現型を保存するための適当なシグナルを与え、またＥＳ細胞付着性のためのマトリックスの役割を果たす成長を抑制されたフィーダー細胞が存在する状態で培養される。好ましいフィーダー細胞は、Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏら（１９９３） が記述しているような、継代培養されている実質的には任意のマウス株の１３日齢胚〜１４日齢の胚組織から株化された一次胚線維芽細胞であり、 照射法（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ （１９８７））、あるいは阻害濃度のＬＩＦの添加（Ｐｅａｓｅ と Ｗｉｌｌｉａｍｓ （１９９０））によって成長が抑制される。
【０２０２】
宿主細胞中の構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生するために従来の方法で使用できる。
適切な宿主を形質転換して、さらに適当な細胞密度まで宿主が成長した後、温度シフトまたは化学的誘導のような適当な手段によって、選択プロモーターを誘導して、さらに細胞を追加期間培養する。
【０２０３】
細胞を一般的には遠心分離によって収集して、物理的または化学的手段によって破壊して、生成された粗抽出物をさらなる精製のために保存する。
タンパク質の発現に使用される微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波、機械的破壊、あるいは細胞溶解剤の使用を含む従来の方法のいずれかによって破壊できる。そのような方法は当業者には公知である。
【０２０４】
［ＰＡＰＡＰ遺伝子の活性化］
本発明はまた、脊椎動物起原、好ましくは哺乳類起原および特にヒト起原であり、ａ）外在性（異種）ポリヌクレオチドをターゲット遺伝子の内在性染色体ＤＮＡ中に挿入する、ｂ）内在性染色体ＤＮＡを欠失する、および／またはｃ）内在性染色体ＤＮＡを外在性ポリヌクレオチドで置換する、ように工学操作されている、相同組換えされた宿主の一次、二次、および不死化細胞を包含する。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失、および／または置換は、ターゲット遺伝子のコード配列および／または制御領域、例えばターゲット遺伝子と作動可能に会合されたプロモーターおよびエンハンサー配列、について行うことができる。
【０２０５】
本発明はさらに、細胞内で通常は発現されないターゲット遺伝子の発現が修飾されている、相同組換え宿主細胞をインビトロまたはインビボで作出する方法に関する。好ましくは、この修飾は、正常生育条件下またはターゲット遺伝子によってコードされたポリペプチドを産生するために適切な条件下で、ターゲット遺伝子の発現を起因する。本方法は、（ａ）（ｉ）ターゲット配列；（ｉｉ）制御配列および／またはコード配列；ならびに（ｉｉｉ）必要に応じて、それによってトランスフェクト細胞を産生するような不対のスプライスドナーサイト、を含むポリヌクレオチド構築物で細胞をインビトロまたはインビボでトランスフェクトすること；  ならびに（ｂ）相同組換えに適切な条件下でトランスフェクト細胞をインビトロまたはインビボ維持すること、から成る工程を含む。
本発明はさらに、細胞内で通常は発現されていないターゲット遺伝子の発現を細胞内でインビトロまたはインビボで修飾する方法に関し、前記方法が、（ａ）（ｉ）ターゲット配列；（ｉｉ）制御配列および／またはコード配列；ならびに（ｉｉｉ）必要に応じて、それによってトランスフェクト細胞を産生する、不対のスプライスドナーサイト、を含むポリヌクレオチド構築物で細胞をインビトロまたはインビボでトランスフェクトすること；ならびに（ｂ）相同組換えに適切な条件下でトランスフェクト細胞をインビトロまたはインビボで維持して、それによって相同組換え細胞を産生すること；さらに（ｃ）遺伝子発現に適切な条件下で、相同組換え細胞をインビトロまたはインビボで維持すること、から成る工程を含む。
本発明はさらに、細胞内で通常は発現されていないターゲット内在性遺伝子の発現を細胞内でインビトロまたはインビボで修飾することによって本発明のポリペプチドを作出する方法に関し、前記方法が、（ａ）（ｉ）ターゲット配列；（）制御配列および／またはコード配列；ならびに（ｉｉｉ）必要に応じて、それによってトランスフェクト細胞を産生する不対のスプライスドナーサイト、を含むポリヌクレオチド構築物で細胞をインビトロでトランスフェクトすること；（ｂ）相同組換えに適切な条件下でトランスフェクト細胞をインビトロまたはインビボで維持して、それによって相同組換え細胞を産生すること；さらに（ｃ）遺伝子発現に適切な条件下で、相同組換え細胞をインビトロまたはインビボで維持して、それによってポリペプチドを作出すること、から成る工程を含む。
本発明はさらに、ターゲット遺伝子が通常では発現されない細胞型において、ターゲット遺伝子の発現を修飾するポリヌクレオチド構築物に関する。これは、ａ）ターゲット配列；ｂ）制御配列および／またはコード配列；ならびにｃ）必要に応じて、不対のスプライスドナーサイト、を含むポリヌクレオチド構築物がターゲット細胞の染色体ＤＮＡ中に挿入される場合に生じる。ポリペプチドをコードし、染色体ＤＮＡとの相同組換え後にターゲットされた内在性遺伝子と同一フレーム内にあるポリヌクレオチドをさらに含む、前述のようなポリヌクレオチド構築物がさらに含まれる。
【０２０６】
組成物は、米国特許番号第 ６，０５４，２８８号；６，０４８，７２９号； ６，０４８，７２４号； ６，０４８，５２４号； ５，９９４，１２７号；５，９６８，５０２号； ５，９６５，１２５号；５，８６９，２３９号；５，８１７，７８９号；５，７８３，３８５号；５，７３３，７６１号； ５，６４１，６７０号； ５，５８０，７３４号；国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１、ＷＯ ９４／１２６５０に記述されるもの、ならびにＫｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８９３２〜８９３５ （１９８９） を含む科学論文のような当該分野で公知の技術によって産生しならびに、方法を実施できる（それぞれの公開ならびに開示はその全文を参考文献として引用している。
【０２０７】
［トランスジェニック動物］
「トランスジェニック動物」または「宿主動物」という用語は、本願明細書で使用する際は、本発明による核酸の一つを含むように遺伝的かつ人工的に操作処理されたゲノムを有する動物を呼称する。好ましい動物は、非ヒト哺乳類であり、本発明による核酸の挿入によって人工的かつ遺伝的に修飾されたゲノムを有する、Ｍｕｓ （例：マウス）、Ｒａｔｔｕｓ （例：ラット） およびＯｒｙｃｔｏｇａｌｕｓ （例：ウサギ） から選択される属に属するものを含む。一つの実施形態では、本発明は、本発明の組換えベクター、またはノックアウトベクターとの相同組換えによって破壊されたＰＡＰＡＰ遺伝子を含む、非ヒト宿主哺乳類と動物を包含する。
【０２０８】
本発明のトランスジェニック動物は全て、その複数細胞内に、クローン化された組換えまたは合成ＤＮＡ配列を含み、より詳細には、ＰＡＰＡＰコード配列を含む精製または単離核酸、または本願明細書に記述するようなＰＡＰＡＰ制御ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、あるいはアンチセンスポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列の一つを含む。
【０２０９】
一般的には、本発明によるトランスジェニック動物は、本発明に記述されるポリヌクレオチド、組換えベクターおよび細胞宿主のいずれか一つを含む。特に詳細には、本発明のトランスジェニック動物は、「ＰＡＰＡＰ遺伝子のゲノム配列」セクション、「ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ配列」セクション、「コード領域」セクション、「ポリヌクレオチド構築物」セクション、「オリゴヌクレオチドプローブとプライマー」セクション、「組換えベクター」セクション、ならびに「細胞宿主」セクションに記述されている任意のポリヌクレオチドを含むことができる。
【０２１０】
第一の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物、特にそのゲノム中に未変のＰＡＰＡＰタンパク質あるいは変異ＰＡＰＡＰタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一つまたは数コピーが挿入されたトランスジェニック動物は、細胞分化に関連する多様な病態を研究するための優れた実験モデルとなり得る。
【０２１１】
第二の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物は、ＰＡＰＡＰ遺伝子の制御ポリヌクレオチドの制御下で、目的の所望するポリペプチドを発現することが可能で、目的であるこのタンパク質を高収量で合成し、したがって目的であるこのタンパク質の組織特異的発現を導出することができる。
本発明のトランスジェニック動物のデザインは、当業者に公知な先行技術によって行われよう。トランスジェニック動物の産生、特にトランスジェニックマウスに関する詳細については、１９８９年１０月１０日発布の米国特許番号第４，８７３，１９１号；１９９５年１１月７日に発布の 米国特許番号第５，４６４，７６４号；ならびに１９９８年８月４日発布の米国特許番号第５，７８９，２１５号を参照することができ、これらの文書は、トランスジェニックマウスを産生する方法の開示のために本願明細書に参考文献として引用している。
【０２１２】
本発明のトランスジェニック動物は、外因性遺伝物質を組み込んだゲノムを有する動物を生じる方法の応用によって生産される。この方法は、本願明細書に記述のようなＰＡＰＡＰコード配列、ＰＡＰＡＰ制御ポリヌクレオチドまたは、ＰＡＰＡＰアンチセンスポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列のいずれかをコードする遺伝物質、あるいはその一部を得ることに関する。
【０２１３】
本発明の組換えポリヌクレオチドは、胚性またはＥＳ幹細胞株中に挿入される。挿入は、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）に記述のような電気穿孔を用いて行われることが好ましい。電気穿孔された細胞は、そのゲノム中に外因性組換えポリヌクレオチドを、好ましくは相同組換えイベントを介して組み込んでいる陽性細胞を捜すために（例えば、選択マーカーによる選択、ＰＣＲまたはサザンブロット分析によって）スクリーンされる。本発明に従って使用され得る陽性−陰性選択法の例示は、Ｍａｎｓｏｕｒら（１９８８）に記述されている。
【０２１４】
次に、Ｂｒａｄｌｅｙ （１９８７）に記述のように、陽性細胞を単離、クローン化してから、マウスの３．５日齢胚盤胞中に注入する。この胚盤胞を次に雌宿主動物中に挿入して、満期まで成長させる。
あるいは、陽性ＥＳ細胞を、Ｗｏｏｄら（１９９３）またはＮａｇｙら（１９９３）に記述のように、２．５日齢８〜１６細胞ステージ（桑実胚）にある胚と接触させると、ＥＳ細胞が取り込まれて、生殖細胞株を生じる細胞を含む胚盤胞を広くコローニー化する。
【０２１５】
雌宿主の子孫は、どの動物がトランスジェニックであるか、例えば挿入された外因性ＤＮＡ配列を含むか、また野生型であるかについて判定するために試験される。
したがって、本発明はまた、本発明による核酸、組換え発現ベクター、または組換え宿主細胞を含むトランスジェニック動物に関する。
【０２１６】
本発明のトランスジェニック動物由来の組換え細胞株
本発明のさらなる目的は、本願明細書に記載のトランスジェニック動物から得られた組換え宿主細胞を含む。本発明の一つの実施形態は、本発明の組換えベクター、またはノックアウトベクターとの相同組換えによって破壊されたＰＡＰＡＰ遺伝子を含む、非ヒト宿主哺乳類および動物に由来する細胞を包含する。
【０２１７】
組換え細胞株は、例えば、Ｃｈｏｕ （１９８９）およびＳｈａｙら（１９９１）に記述のように、ＳＶ４０大型Ｔ抗原のようなｏｎｃ−遺伝子を発現するベクターで一次細胞培養をトランスフェクトすることによって、本発明によるトランスジェニック動物の組織から得られるいずれの細胞からでもインビトロで株化できる。
【０２１８】
精神分裂病および躁鬱病治療用化合物を同定するためのアッセイ
本発明は、ＣＮＳ疾患を治療する能力、特に、ＰＡＰＡＰによって媒介されるＣＮＳ疾患の症状を改善する能力について化合物を試験するために使用できるアッセイを提供する。好ましい実施形態では、ＰＡＰＡＰによって媒介される精神分裂病または躁鬱病の症状を改善する能力について化合物が試験された。化合物はまた、精神障害第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）分類についての診断および統計学的説明書で定義されるような、なかでも精神病性障害、気分障害、自閉症、物質依存症およびアルコール中毒、精神遅滞、ならびに認識、不安、食事、衝動制御、および人格障害を含むその他の精神医学的障害、を含む関連疾患を治療する能力について試験することができる。
【０２１９】
本発明はまた、精神分裂病、躁鬱病、ならびに関連疾患の、細胞および動物（霊長類と齧歯類を含む）モデルを提供する。
一つの態様では、ＰＡＰＡＰ活性に影響を与える化合物同定用の、無細胞系、細胞系、動物系アッセイが提供される。ＰＡＰＡＰ活性は色々なメカニズムによって影響を受け、ある実施形態では、ＰＡＰＡＰ活性は、ＰＡＰＡＰ遺伝子発現レベル、あるいはＰＡＰＡＰ遺伝子産物の活性を調節することに影響を受け得る。
【０２２０】
一つの態様では、ｇ３４８７２ 活性を影響する化合物同定用の、無細胞系、細胞系、動物系アッセイが提供される。Ｇ３４８７２活性は、ＰＡＰＡＰ遺伝子発現レベル、あるいはＰＡＰＡＰ遺伝子産物の活性を調節することに影響を受け得る。ｇ３４８７２活性に影響を与えるそのような化合物の同定用アッセイは、ＰＡＰＡＰとｇ３４８７２ポリペプチドの相互作用を検出し得るか、あるいはＰＡＰＡＰ−ｇ３４８７２複合体を検出し得ることが好ましい。
【０２２１】
本方法によれば、ＰＡＰＡＰまたはｇ３４８７２活性に直接的あるいは間接的に影響を与える化合物を同定することができる。本発明の無細胞系、細胞系、ならびに動物系アッセイは、ＰＡＰＡＰ自体よりもＰＡＰＡＰ経路のエレメントに作用する化合物を同定するために使用することができる。これらの化合物は次に、精神分裂病、躁鬱病、ならびに関連疾患に関与するＰＡＰＡＰおよびその他の遺伝子産物を調節するための治療的処置として使用することができる。
《細胞および無細胞系アッセイ》
一つの態様では、組換えまたは非組換え細胞を用いる細胞系アッセイを用いて、ＰＡＰＡＰ活性を調節する化合物が同定できる。
【０２２２】
一つの態様では、本発明の細胞系アッセイは、精神分裂病、躁鬱病、または関連ＣＮＳ疾患の治療のための試験化合物を同定する方法を包含し、前記方法は（ａ）精神病、躁鬱病、あるいは関連ＣＮＳ疾患に関する指標を改善するために十分な濃度で十分な時間、細胞を試験化合物に暴露すること、ならびに（ｂ）細胞中のＰＡＰＡＰ活性あるいはＰＡＰＡＰ−ｇ３４８７２相互作用または複合体レベルを測定すること、を含む。ＰＡＰＡＰ活性は、例えば、ｍＲＮＡ転写レベル、ＰＡＰＡＰペプチド発現、局在化またはタンパク質活性について細胞をアッセイすることによって測定できる。好ましくは、試験化合物は、精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患の症状を改善することができる、あるいは改善可能であると考えられる化合物である。ＰＡＰＡＰ活性を調節可能な試験化合物は、薬剤開発の用途について選択され得る。そのような細胞系アッセイはさらに、本願明細書では「ＰＡＰＡＰ遺伝子発現を調節するリガンドのスクリーニング方法」と題するセクションで記述されている。
【０２２３】
他の態様では、本発明の細胞系アッセイは、精神分裂病または躁鬱病治療のための化合物同定の方法を包含し、前記方法は（ａ）細胞を、精神分裂病関連、または躁鬱病関連指標を起因するに十分なＰＡＰＡＰ活性レベルに暴露すること、ならびに（ｂ）前記細胞を試験化合物に暴露すること、を含む。試験化合物は次に、前記精神分裂病関連、あるいは躁鬱病関連指標を改善する能力に従って選択することができる。ＰＡＰＡＰ活性は、限定はしないが、ＰＡＰＡＰヌクレオチド配列を含むベクターを供給すること、前記細胞をＰＡＰＡＰ発現を増加できる化合物で処理すること、ならびに前記細胞をＰＡＰＡＰペプチドで処理することを含む、適切な方法のいずれかによって得ることができる。好ましくは、試験化合物は、精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患の症状を改善することができる、あるいは改善可能であると考えられる化合物であり、もしくは試験化合物は精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患の指標を悪化すると考えられる。精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患のいずれかの検出可能な症状または指標を改善することのできる試験化合物は、薬剤開発の選択肢の一つに成り得る。当業者は適切な細胞株を決定することができ、好ましくは細胞株または神経系起原の細胞株が使用される。
【０２２４】
他の実施形態では、本発明は、ＰＡＰＡＰペプチドが細胞表面に結合するかどうかを測定し、ならびにＰＡＰＡＰレセプターと相互作用する精神病、躁鬱病、ならびに関連疾患の治療用化合物を同定するために、ＰＡＰＡＰに対する細胞系、無細胞系アッセイを提供する。一つのそのような実施形態では、ＰＡＰＡＰポリヌクレオチドまたはそのフラグメントが、本願明細書に記載するような発現ベクター中にクローン化される。タンパク質は、サイズ（排除）、電荷、免疫クロマトグラフィー、あるいは当業者に公知であるその他の技術によって精製される。精製後、タンパク質は当業者に公知の技術を用いて標識される。標識タンパク質に、様々な臓器または組織由来の細胞あるいは細胞株を加えてインキュベートして、細胞表面に存在する任意のレセプターと結合させる。インキュベーション後、細胞を洗浄して、非特異的結合タンパク質を除去する。標識タンパク質をオートラジオグラフィーで検出する。あるいは、非標識タンパク質は、細胞を加えてインキュベートして、蛍光分子のような検出用標識を有する抗体によって検出される。細胞表面結合の特異性は、種々に異なる量の非標識タンパク質を標識タンパク質と共にインキュベートする競合分析を行うことによって分析することができる。細胞表面に結合された標識タンパク質の量は、競合する非標識タンパク質の量が増加するにしたがって減少する。コントロールとして、種々に異なる量の標識タンパク質と無関係な非標識タンパク質をいくつかの結合反応に含む。無関係な非標識タンパク質の量を増加した結合反応において、細胞表面に結合した標識タンパク質量が減少しないことは、この核酸によってコードされたタンパク質が特異的に細胞表面に結合することを示す。そのようなアッセイの一例が、以下の実施例１に示されている。一つの態様では、ＰＡＰＡＰ結合を使用してｇ３４８７２ポリペプチドを検出かつ局在化することができる。
【０２２５】
他の実施形態では、本発明は、前述の細胞系結合アッセイと同様にしてＰＡＰＡＰポリペプチドが調製かつ精製される無細胞系結合アッセイを含む。精製後、タンパク質を標識して、目的である任意の臓器、組織、あるいは臓器または組織の組み合わせからの所望する任意の細胞に由来する細胞膜抽出物または単離物を加えてインキュベートして、ＰＡＰＡＰポリペプチドを膜上に存在する任意のレセプターと結合させる。インキュベーション後、膜を洗浄して、非特異的結合タンパク質を除去する。標識タンパク質はオートラジオグラフィーで検出できる。ＰＡＰＡＰを結合する膜の特異性は、種々に異なる量の試験化合物を、標識タンパク質と共にインキュベートする競合分析を行うことによって分析し得る。試験ペプチドを含む所望の試験化合物に細胞を加えてインキュベートすることができる。試験化合物は、蛍光分子のような検出用標識を有する抗体によって検出できる。細胞表面に結合された標識ＰＡＰＡＰポリペプチドの量は、競合するタンパク質の量が増加するにしたがって減少する。コントロールとして、種々に異なる量の試験化合物と無関係な非標識タンパク質をいくつかの結合反応に含む。細胞膜に結合するＰＡＰＡＰの量を減少できる試験化合物は、治療用候補化合物として選択し得る。一つの態様では、ＰＡＰＡＰ結合を使用してｇ３４８７２ポリペプチドを検出することができる。
【０２２６】
細胞系と無細胞系アッセイの好ましい実施形態では、前記ＰＡＰＡＰペプチドは、配列番号２のアミノ酸の少なくとも４，６，または８個の隣接アミノ酸を有する隣接スパンを含む。
前記細胞系アッセイは、任意の適切な起原の細胞を含んでよく、特に好ましい細胞はヒト細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、ならびにマウス細胞である。
【０２２７】
《動物モデル系アッセイ》
非ヒト動物系アッセイはまた、ＰＡＰＡＰ活性を調節する化合物を同定するため、ＰＡＰＡＰとｇ３４８７２ならびにｇ３４８７２生物学的経路を研究するために使用できる。本発明は、ＰＡＰＡＰ遺伝子を欠損している、あるいはＰＡＰＡＰ遺伝子を条件発現している、あるいはヒト型または修飾型のＰＡＰＡＰ遺伝子を含んでいる動物を含む、非トランスジェニックまたはトランスジェニック動物を含む、動物モデルならびに適切な動物系アッセイを包含する。
【０２２８】
したがって、本発明は、ＰＡＰＡＰ活性を直接的あるいは間接的に調節することができる試験化合物で、精神分裂病または躁鬱病あるいはその症状を罹患している動物を治療することを含む。
一つの態様では、本発明の動物系アッセイは、精神分裂病または躁鬱病治療のための試験化合物を同定する方法を包含し、前記方法は（ａ）精神病または躁鬱病に関する指標を改善するために十分な濃度で十分な時間、動物を試験化合物に暴露すること、ならびに（ｂ）前記動物の部位における細胞中のＰＡＰＡＰ活性あるいはＰＡＰＡＰ−ｇ３４８７２相互作用または複合体のレベルを測定すること、を含む。ＰＡＰＡＰ活性は、任意の適切な細胞、組織または部位で測定できる。好ましくは、試験化合物は、精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患の症状を改善することができる、あるいは改善可能であると考えられる化合物である。任意に、前記試験化合物は、ＰＡＰＡＰ活性を調節できるか、あるいは調節可能であると考えられる。ＰＡＰＡＰ活性を調節可能である試験化合物は、薬剤開発の用途について選択することができる。試験化合物のいくつかの例が、本願明細書に挙げられている（例えば、ベンゾジアセピン、選択的セロントニン（ｓｅｒｏｎｔｏｎｉｎ）再取込み阻害剤など）。
【０２２９】
他の態様では、本発明の動物系アッセイは、精神分裂病または躁鬱病治療のための化合物同定の方法を包含し、前記方法は（ａ）動物を、精神分裂病関連、または躁鬱病関連症状または指標を起因するに十分であるＰＡＰＡＰ活性レベルに暴露すること、ならびに（ｂ）前記動物を試験化合物に暴露すること、を含む。試験化合物は次に、前記精神分裂病関連、あるいは躁鬱病関連指標を改善する能力に従って選択することができる。ＰＡＰＡＰ活性は、限定はしないが、ＰＡＰＡＰヌクレオチド配列を含むベクターを供給すること、前記動物をＰＡＰＡＰ発現を増加できる化合物で処理すること、ならびに前記細胞をＰＡＰＡＰペプチドで処理することを含む、いずれかの適切な方法によって提供することができる。好ましくは、前記動物は、配列番号２の少なくとも４、６、または好ましくは８隣接アミノ酸を有する隣接スパンを含むＰＡＰＡＰペプチドで処理される。好ましくは、試験化合物は、精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患の症状を改善することができる、あるいは改善可能であると考えられる化合物であり、あるいは試験化合物は精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患の症状を悪化すると考えられる。精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患のいずれかの検出可能な症状または指標を改善することのできる試験化合物は、薬剤開発の用途について選択することができる。
【０２３０】
一つの実施形態では、マウスをＰＡＰＡＰポリペプチド処理して、試験化合物に暴露した後、常同症を観察することによって、精神分裂病、躁鬱病、あるいは関連疾患を示す症状を調べる。他の実施形態では、前記症状を、ホームケージ観察、神経学的評価、ストレス誘導性低体温症、強制水泳、ＰＴＺ痙攣、運動活性、尾懸垂、高架迷路、新物体の認識、プレパルス阻害、温度疼痛、Ｙ迷路、ならびに代謝チャンバーテスト（Ｐｓｙｃｈｏｇｅｎｉｃｓ Ｉｎｃから市販のＰｓｙｃｈｏｓｃｒｅｅｎ（登録商標）テスト）から成る群から選択される少なくとも一つのテストを行うことによって調べる。その他のテストは、例えば、Ｃｒａｗｌｅｙら、Ｈｏｒｍ． Ｂｅｈａｖ． ３１（３）：１９７〜２１１ （１９９７）；Ｃｒａｗｌｅｙ、 Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ８３５（１）：１８〜２６ （１９９９）によって公知である。
【０２３１】
適切な試験化合物はいずれも本発明のスクリーニング法に使用できる。
本発明の方法によってスクリーンできる化合物の例は、小さな有機または無機分子、ランダムおよび定方向ポリヌクレオチドライブラリー由来のポリヌクレオチドを含む核酸、ランダムおよび定方向ペプチドライブラリー由来のペプチド、可溶性ペプチド、融合ペプチド、およびリン酸ペプチドを含むペプチド、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、および抗イディオタイプ抗体、ならびに一本鎖抗体を含む抗体、ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ならびにＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、およびそのエピトープ結合フラグメントを含む。ある態様では、精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患の症状または指標を改善または悪化することのできる化合物は、例として、一般的な抗精神病薬、神経弛緩薬、非定型神経弛緩薬、抗鬱薬、抗不安薬、ノルアドレナリンアゴニストとアンタゴニスト、ドパミン作動性アゴニストとアンタゴニスト、セロトニン再取込み阻害剤、ベンゾジアゼピンを含み得る。
【０２３２】
これらのアッセイでは、試験化合物は例えば、種々に異なる用量レベルで動物に投与できる（例えば、経静脈、腹腔内、筋肉内、経口、またはその他）。ＰＡＰＡＰ発現に対する化合物の効果は、例えば、血液中、あるいは選択された組織中のＰＡＰＡＰレベルを、前述するように、ノーザンブロット、免疫アッセイ、ＰＣＲなどを用いて比較することによって測定される。任意の適切な動物を使用し得る。好ましくは、前記動物は霊長類、非ヒト霊長類、哺乳類、またはマウスである。内因性マウスタンパク質が除去（ノックアウト）されて、標準トランスジェニック法によって相同ヒトタンパク質が付加されているヒト化マウスをまた試験動物として使用できる。そのようなマウスはヒト型タンパク質のみを発現する。ヒトＰＡＰＡＰのみを発現するヒト化マウスは、ＰＡＰＡＰタンパク質またはｍＲＮＡレベル、あるいはＰＡＰＡＰ−ｇ３４８７２ 相互作用または複合体を制御する薬剤候補に対する応答におけるＣＮＳ疾患のインビボ症候性応答の研究に使用できる。例として、ヒトａｐｏＥ４遺伝子を有するようにトランスジェニックマウスが作製されている。これらのマウスを内因性ａｐｏＥを欠損するマウス株と交配して、アルツハイマー病理学の開発に役に立つと考えられるヒトタンパク質を有する動物モデルが作製される。そのようなトランスジェニック動物は、疾患の生化学的および生理学的工程を解明し、疾患介入のための治療法の開発に有用である（Ｌｏｒｉｎｇら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ １７：１７３ （１９９６） 、本願明細書にその全文を参照文献として引用している）。
［ＰＡＰＡＰポリペプチドと相互作用する物質のスクリーニング法］
本発明の目的では、リガンドとは、タンパク質、ペプチド、抗体、あるいはＰＡＰＡＰタンパク質あるいはそのフラグメントまたは変異体の一つに結合可能もしくはＰＡＰＡＰあるいはそのフラグメントまたは変異体をコードするポリヌクレオチドの発現を調節可能な任意の合成化合物などの分子を意味する。
【０２３３】
本発明によるリガンドのスクリーニング法では、生物試料またはＰＡＰＡＰタンパク質の推定リガンドとして試験対象となる特定の分子を、例えば、本願明細書で前述するような組換え細胞宿主によって産生された対応する精製組換えＰＡＰＡＰタンパク質のような対応する精製ＰＡＰＡＰタンパク質と接触させて、本タンパク質と試験対象である推定リガンド分子の間に複合体を形成させる。
【０２３４】
例示として、ＰＡＰＡＰタンパク質、または配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むフラグメントと、薬物またはコンビナトリアル化学方法によって生成された分子のような小分子との相互作用を研究するために、Ｗａｎｇら（１９９７）に記述されるＨＰＬＣ法に共役させたマイクロ透析を、あるいはＢｕｓｈら（１９９７）に記述されるアフィニティー毛細管電気泳動法を使用することができる（それらの開示は参考文献として引用している）。
【０２３５】
さらなる方法では、ＰＡＰＡＰタンパク質、または配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むフラグメントと相互作用するペプチド、薬物、脂肪酸、リポタンパク質、または小分子は、以下のようなアッセイを用いて同定することができる。結合を試験される分子は、蛍光、放射性、または酵素タグのような検出用標識で標識され、特異的結合が起こるような条件下で、固定化ＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントに接触するように位置される。非特異的結合分子を除去した後、適切な手段を用いて結合分子を検出する。
【０２３６】
本発明の他の目的は、ＰＡＰＡＰポリペプチドと相互作用する候補物質スクリーニング用の方法とキットを含む。
本発明は、ＰＡＰＡＰタンパク質あるいはそのフラグメントまたは変異体の一つと相互作用する目的の物質をスクリーニングするための方法に関する。ＰＡＰＡＰあるいはそのフラグメントまたは変異体に共有結合的あるいは非共有結合的に結合するその能力によって、これらの物質または分子は、便利なことにはインビトロとインビボのどちらでも使用することができる。
【０２３７】
インビトロでは、前記相互作用分子は、試料中、好ましくは生物試料中、におけるＰＡＰＡＰタンパク質の存在を同定するための検出手段として使用できる。
候補物質スクリーニング法は、以下の工程：
ａ）ＰＡＰＡＰタンパク質、または配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むフラグメントから成る、から実質的に成る、あるいはこれを含む、ポリペプチドを供給すること；
ｂ）候補物質を得ること；
ｃ）前記ポリペプチドを前記候補物質と接触させること；
ｄ）前記ポリペプチドと前記候補物質の間に形成された複合体を検出すること、を含む。
【０２３８】
一つの実施形態では、本発明は、ＣＮＳ疾患におけるｇ３４８７２経路研究のためのＰＡＰＡＰの用途に関する。相互作用物質をスクリーニングするための方法は、ＰＡＰＡＰとｇ３４８７２の相互作用を検出するために使用できる。したがって、本発明はさらに、
ａ）ＰＡＰＡＰタンパク質、または配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むフラグメントから成る、から実質的に成る、あるいは含むポリペプチドを供給すること；
ｂ）ｇ３４８７２ポリペプチドを得ること；
ｃ）前記ＰＡＰＡＰポリペプチドをｇ３４８７２ポリペプチドと接触させること；
ｄ）前記ＰＡＰＡＰポリペプチドと前記ｇ３４８７２ポリペプチドの間に形成された複合体を検出すること、を含む。
【０２３９】
好ましくは、前記ｇ３４８７２ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも４、６、または好ましくは８個の隣接アミノ酸を含む。
本発明はさらに、ＰＡＰＡＰポリペプチドと相互作用する候補物質のスクリーニング用キットに関し、前記キットは、
ａ）  配列番号２のアミノ酸配列、あるいは配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むペプチドフラグメントから成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＰＡＰＡＰタンパク質；
ｂ）オプションとして、ＰＡＰＡＰタンパク質あるいはそのペプチドフラグメントまたは変異体と候補物質の間に形成された複合体を検知するために有用な手段、を含む。
【０２４０】
前述のキットの好ましい実施形態では、検出手段は、ＰＡＰＡＰタンパク質あるいはそのフラグメントまたは変異体に対して産生されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む。
種々の候補物質または分子を、ＰＡＰＡＰポリペプチドとの相互作用についてアッセイすることができる。これらの物質または分子は、限定されないが、天然または合成有機化合物あるいはポリペプチドのような生物起原の分子を含む。候補物質または分子がポリペプチドを含む場合、このポリペプチドは、ファージ系ランダムペプチドライブラリーに属するファージクローンによって生成された発現産物、あるいはこのペプチドは２ハイブリッドスクリーニングアッセイを実施するために適切なベクター内でクローン化されたｃＤＮＡライブラリーによって生成された発現産物であり得る。
【０２４１】
本発明はまた、本願明細書で前述されたスクリーニング法を実施するために有用なキットに関する。好ましくは、そのようなキットは、ＰＡＰＡＰポリペプチドあるいはそのフラグメントまたは変異体、ＰＡＰＡＰポリペプチドあるいはオプションとしてそのフラグメントまたは変異体と候補物質の間に形成された複合体を検出するために有用な手段を含む。好ましい実施形態では、検出手段は、対応するＰＡＰＡＰポリペプチドあるいはそのフラグメントまたは変異体に対して産生されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む。
【０２４２】
Ａ．ランダムペプチドライブラリーから得られる候補リガンド
スクリーニング法のある特定の実施形態では、推定リガンドはファージベクターに含まれるＤＮＡインサートの発現産物である（Ｐａｒｍｌｅｙ とＳｍｉｔｈ、 １９８８）。特に、ランダムペプチドファージライブラリーが使用される。ランダムＤＮＡインサートは、８〜２０アミノ酸長であるペプチドをコードする（Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ Ｋ．Ｒ．ら、１９９２；Ｖａｌａｄｏｎ Ｐ．ら、１９９６； Ｌｕｃａｓ Ａ．Ｈ．、 １９９４；Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋ Ｍ．Ａ．Ｊ．、 １９９５； Ｆｅｌｉｃｉ Ｆ． ら、１９９１）。この特定の実施形態によると、固定化ＰＡＰＡＰタンパク質に結合するタンパク質を発現する組換えファージは保持されて、ＰＡＰＡＰタンパク質と組換えファージの間に形成された複合体は次にＰＡＰＡＰタンパク質に対して産生されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体によって免疫沈降することができる。
【０２４３】
組換えファージにおいてリガンドライブラリーが構築されたら、ファージ集団を固定化ＰＡＰＡＰタンパク質に接触させる。次に、非特異的に結合した組換えファージを除去するために、複合体の調製物を洗浄する。ＰＡＰＡＰタンパク質に特異的に結合するファージを次に、緩衝液（酸性ｐＨ）で溶出するか、あるいは抗ＰＡＰＡＰハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体で免疫沈降して、さらにこのファージ集団を次に細菌（例えば、大腸菌）の過剰感染によって増幅する。より特異的な組換えファージクローンを選択するためには、この選択工程を数回、好ましくは２〜４回反復するとよい。最終工程は、選択された組換えファージクローンによって産生されたペプチドを感染細菌中または単離物中で発現させて特徴づけを行うこと、ファージインサートを他の宿主−ベクター系で発現すること、あるいは選択された組換えファージに含まれるインサートの配列決定を行うことを含む。
【０２４４】
Ｂ．競合実験によって得られる候補リガンド
あるいは、ＰＡＰＡＰタンパク質、または配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むフラグメントに結合するペプチド、薬物、または小分子は、競合実験によって同定することができる。そのようなアッセイでは、ＰＡＰＡＰタンパク質、あるいはそのフラグメントは、プラスチックプレートなどの表面に固定化される。検出用標識で標識された公知のＰＡＰＡＰタンパク質リガンドの存在下で、ペプチド、薬物、または小分子を量を増加させながら、固定化ＰＡＰＡＰタンパク質、あるいはそのフラグメントに接触させる。例えば、ＰＡＰＡＰリガンドは、蛍光、放射性、または酵素タグによって検出できるように標識することができる。試験分子がＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントに結合する能力は、試験分子の存在下で結合した公知の検出用標識リガンドの量を測定することによって決定される。試験分子が存在するときにＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントに結合した公知リガンド量が減少することは、試験分子がＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントに結合可能であることを示す。
【０２４５】
Ｃ．アフィニティークロマトグラフィーによって得られる候補リガンド
ＰＡＰＡＰタンパク質、または配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むフラグメントと相互作用するタンパク質またはその他の分子はまた、ＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントを含むアフィニティーカラムを用いて発見することができる。ＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントは、アガロース、Ａｆｆｉ Ｇｅｌ（登録商標）のような適切なカラムマトリックス、あるいは当業者に公知であるその他のマトリックスへの化学的結合を含む先行技術を用いて、カラムに付着させることができる。本方法のある実施形態では、アフィニティーカラムは、ＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントが、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）に融合されているキメラタンパク質を含む。前述のような細胞タンパク質または発現タンパク質のプールの混合物をアフィニティーカラムにかける。カラムに付着されたＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントと相互作用するタンパク質またはその他の分子を次に単離して、Ｒａｍｕｎｓｅｎら（１９９７）に記述のように（その開示は参考文献として引用している）２−Ｄ電気泳動ゲル上で分析できる。あるいは、アフィニティーカラムに保持されたタンパク質は、電気泳動法によって精製してから配列決定することができる。同一方法を使って、抗体を単離して、ファージディスプレイ産物をスクリーンしたり、あるいはファージディスプレイヒト抗体をスクリーンすることができる。
【０２４６】
Ｄ．光学的バイオセンサー法によって得られる候補リガンド
ＰＡＰＡＰタンパク質、または配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むフラグメントと相互作用するタンパク質はまた、Ｅｄｗａｒｄｓ とＬｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ（１９９７）ならびに Ｓｚａｂｏら（１９９５）に記述の光学的バイオセンサーを用いてスクリーンすることができる（それらの開示は参考文献として引用している）。この技術は、標識分子を必要とすることなく、リアルタイムで分子間の相互作用の検出を可能にする。本技術は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）現象に基づく。簡単に言えば、試験対象となる候補リガンド分子を（カルボキシメチルデキストランマトリックスのような）表面に付着させる。光線をサンプルを含まない試験対象である表面の側面に向けて、前記表面によって反射させる。ＳＰＲ現象は、角度と波長の特定の関連によって反射光の強度の減少に起因する。候補リガンド分子の結合は、表面上の屈折インデックスの変化を起こして、その変化はＳＰＲシグナルの変化として検出される。ＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントと相互作用できる候補リガンド分子または物質のスクリーニングでは、ＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントが表面上に固定化される。この表面は、アッセイ対象である候補分子を流し込むセルの一つの側面を含む。ＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントへの候補分子の結合は、ＳＰＲシグナルの変化として検出される。試験対象となる候補分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、あるいはコンビナトリアル化学によって生成された小分子であり得る。この技術はまた、内因性または組換え発現によるＰＡＰＡＰタンパク質を呈示する真核細胞または原核細胞あるいは脂質小胞をその表面に固定化することによって実行してもよい。
【０２４７】
本方法の主な利点は、ＰＡＰＡＰタンパク質とＰＡＰＡＰタンパク質と相互作用する分子の間の結合率の決定を可能とすることである。したがって、強い、あるいは反対に弱い結合定数によって、ＰＡＰＡＰタンパク質、またはそのフラグメントと相互作用するリガンド分子を特定して選択することが可能である。
Ｅ．２ハイブリッドスクリーニングアッセイによって得られる候補リガンド
酵母２ハイブリッド系は、インビボでのタンパク質−タンパク質相互作用を研究するためにデザインされ（Ｆｉｅｌｄｓ とＳｏｎｇ、１９８９）、そしてベイトタンパク質の酵母Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへの融合に基づく。本技術は、米国特許番号第５，６６７，９７３ 号および米国特許番号第５，２８３，１７３ 号（Ｆｉｅｌｄｓら）に記述されており、両特許の技術的教示は本願明細書に参考文献として引用している。【０２４８】
２ハイブリッドアッセイによるライブラリースクリーニングの一般的方法は、Ｈａｒｐｅｒら（１９９３）またはＣｈｏら（１９９８）あるいはさらに Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら（１９９７）に記述のように実施できる。
ベイトタンパク質またはポリペプチドは、ＰＡＰＡＰタンパク質または配列番号２の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００ 個のアミノ酸を有する隣接スパンを含むフラグメントから成るか、実質的に成るか、あるいはそれらを含む。
【０２４９】
さらに詳細には、ＰＡＰＡＰポリペプチドあるいはそのフラグメントまたは変異体をコードするヌクレオチド配列は、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合されており、この融合ヌクレオチド配列は、例えばｐＡＳ２またはｐＭ３のような適切な発現ベクター内に挿入されている。
【０２５０】
次にヒトｃＤＮＡライブラリーを、ヒトｃＤＮＡインサートがＧＡＬ４タンパク質の転写ドメインをコードするベクター内のヌクレオチド配列に融合するように、特別にデザインされたベクター内に構築する。好ましくは、使用されるベクターはｐＡＣＴベクターである。ヒトｃＤＮＡライブラリーのヌクレオチドインサートによってコードされるポリペプチドは、「プレイ（被食）」ポリペプチドと呼ばれる。
【０２５１】
第三のベクターは、転写活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインの両方を含んでいる完全Ｇａｌ４タンパク質の結合を起こす制御配列の制御下に置かれているベータガラクトシダーゼ遺伝子またはＣＡＴ遺伝子などの検出可能なマーカー遺伝子を含む。例えば、ベクターｐＧ５ＥＣを使用することができる。
二つの別々な酵母株がまた使用される。例示目的で限定はしない例として、二つの別々な酵母株は以下であり得る：
−  表現型が（ＭＡＴａ、 Ｌｅｕ２−３、１１２ ｕｒａ３−１２、ｔｒｐｌ−９０１、ｈｉｓ３−Ｄ２００、ａｄｅ２−１０１、ｇａｌ４Ｄｇａ１１８０Ｄ ＵＲＡ３ ＧＡＬ−ＬａｃＺ、ＬＹＳ ＧＡＬ−ＨＩＳ３、ｃｙｈ’）であるＹ１９０；
−表現型が（ＭＡＴａ ｇａｌ４ ｇａｌ８０ ｈｉｓ３ ｔｒｐｌ−９０１ ａｄｅ２−１０１ ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−３、 −１１２ ＵＲＡ３ ＧＡＬ−ｌａｃＺｍｅｔ’）であり、Ｙ１９０の反対の交配型である、Ｙ１８７。
【０２５２】
簡単に言えば、２０μｇのｐＡＳ２／ＰＡＰＡＰ と２０μｇのｐＡＣＴ−ｃＤＮＡ ライブラリーを酵母株Ｙ１９０中に同時形質転換する。この形質転換体を、ヒスチジン、ロイシン、ならびにトリプトファンを欠損するが、ヒスチジン合成インヒビター３−ＡＴ（５０ ｍＭ）を含む最小培地での増殖について選択する。陽性コロニーをフィルターリフトアッセイによってベータガラクトシダーゼについてスクリーンする。二重陽性コロニー（Ｈｉｓ＋、ベータ−ｇａｌ＋）を次に、ヒスチジン、ロイシンを欠損するが、トリプトファンとシクロへキシイミド（１０ ｍｇ／ｍｌ）を含むプレート上で増殖させて、ｐＡＣＴ−ｃＤＮＡ ライブラリープラズミドの保持によってｐＡＳ２／ＰＡＰＡＰプラズミドの欠損について選択する。結果生じるＹ１９０株を、Ｈａｒｐｅｒら（１９９３） と Ｂｒａｍら（Ｂｒａｍ ＲＪら、１９９３）に記述のように、Ｇａｌ４融合体として、ＰＡＰＡＰまたは、シクロフィリンＢ、ラミン、またはＳＮＦ１などの非関連制御タンパク質を発現するＹ１８７株と交配して、フィルターリフトアッセイによってベータガラクトシダーゼについてスクリーンする。コントロールＧａｌ４融合体と交配後にベータｇａｌ−である酵母クローンは擬陽性と考えられる。
【０２５３】
本発明による２ハイブリッド法の他の実施形態では、ＰＡＰＡＰあるいはそのフラグメントまたは変異体と細胞タンパク質の間の相互作用は、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｔｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２ （マッチメーカー２ハイブリッドシステム２）（カタログ番号Ｋ１６０４−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて調べることができる。Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｔｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２ （カタログ番号 Ｋ１６０４−１、 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に付随の取扱説明書（その開示は本願明細書に参考文献として引用している）に記述されるように、ＰＡＰＡＰタンパク質あるいはその一部をコードする核酸は、酵母転写アクチベーターであるＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡと同一フレイム内にあるように、発現ベクター中に挿入される。所望するｃＤＮＡ、好ましくはヒトｃＤＮＡ、は、ＧＡＬ４の活性化ドメインをコードするＤＮＡと同一フレーム内にあるように、第二発現ベクター中に挿入される。二つの発現プラズミドを酵母中に形質転換して、この酵母を、発現ベクターのそれぞれにある選択マーカーの発現、およびＨＩＳ３遺伝子のＧＡＬＡ依存性発現のために選択される選択培地上に播種する。ヒスチジンを欠損する培地で増殖可能である形質転換体をＧＡＬ４依存性ＬａｃＺ発現についてスクリーンする。ヒスチジン選択およびｌａｃＺアッセイのどちらについても陽性である細胞は、ＰＡＰＡＰと当初に選択されたｃＤＮＡインサートによってコードされたタンパク質またはペプチド間の相互作用を含む。
【０２５４】
［ＰＡＰＡＰ遺伝子の制御配列と相互作用する物質のスクリーニング法］
本発明はまた、例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列などのＰＡＰＡＰ遺伝子の制御配列と相互作用可能な物質または分子をスクリーニングするための方法に関する。
ＰＡＰＡＰ遺伝子の制御配列、さらに詳細には５’および３’制御領域のポリヌクレオチドあるいはそのフラグメントまたは変異体、ならびに好ましくは本発明の二対立遺伝子マーカーの一つを含む変異体から成る群から選択されるヌクレオチド配列と相互作用が可能なタンパク質をコードする核酸は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販のＭａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（マッチメーカー１ハイブリッドシステム）キット （カタログ番号 Ｋ１６０３−１）に付随の小冊中に記述されている１ハイブリッド系を用いて同定することができ、その技術的教示は本願明細書に参考文献として引用している。簡単に言えば、ターゲットヌクレオチド配列は、選択可能なレポーター配列の上流にクローン化され、その結果生じるＤＮＡ構築物が酵母ゲノム（Ｓａｃｃｈａｒｏｉｎｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に組み込まれる。ゲノム中にレポーター配列を含む酵母細胞は次に、ＰＡＰＡＰ遺伝子の制御配列上に結合する候補タンパク質をコードするｃＤＮＡとＧＡＬ４などの酵母転写因子のアクチベータードメインをコードする配列の融合分子を含むライブラリーで形質転換される。組換え酵母細胞を培養ブロスに播種して、レポーター配列を発現する細胞を選択する。このようにして選択された組換え酵母細胞は、ＰＡＰＡＰ遺伝子のターゲット制御配列上に結合可能である融合タンパク質を含む。次に、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列決定を行い、そしてインビトロで発現または転写ベクター中にクローン化することができる。コードされたポリペプチドのＰＡＰＡＰ遺伝子のターゲット制御配列への結合は、ゲル遅延測定法またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡ分解酵素）保護分析のような当業者に公知な技術によって確認することができる。
【０２５５】
ゲル遅延測定法はまた、ＰＡＰＡＰ遺伝子の制御配列と相互作用可能な候補分子をスクリーンするために独立して実施することができ、これについてはＦｒｉｅｄとＣｒｏｔｈｅｒｓ（１９８１）、ＧａｒｎｅｒとＲｅｖｚｉｎ（１９８１）ならびにＤｅｎｔとＬａｔｃｈｍａｎ（１９９３）に記述されており、これらの出版物による教示は本願明細書に参考文献として引用している。これらの技術は、タンパク質に結合されているＤＮＡフラグメントは、タンパク質を結合していない同一ＤＮＡフラグメントよりも遅く移動するという原理に基づいている。簡単に言えば、ターゲットヌクレオチド配列を標識して、次に、標識されたターゲットヌクレオチド配列を、転写因子を含む細胞の全核抽出物、あるいは試験対象である異なる候補分子のいずれかと接触させる。ＰＡＰＡＰ遺伝子のターゲット制御配列と候補分子または転写因子の間の相互作用は、ゲルまたは毛細管電気泳動後に、移動の遅延によって検出される。
【０２５６】
［ＰＡＰＡＰ遺伝子発現を調節するリガンドのスクリーニング法］
本発明の他の主題は、ＰＡＰＡＰタンパク質発現を調節する分子のスクリーニング法である。そのようなスクリーニング法は、以下の工程：
ａ）ＰＡＰＡＰタンパク質あるいはその変異体またはフラグメントをコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトされた原核または真核細胞を、それ自体のプロモーターの制御下で培養すること；
ｂ）培養細胞を被試験分子と接触させること；
ｃ）ＰＡＰＡＰタンパク質あるいはその変異体またはフラグメントの発現を定量すること、を含む。
【０２５７】
ある実施形態では、ＰＡＰＡＰタンパク質あるいはその変異体またはフラグメントをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも一つのＰＡＰＡＰ関連二対立遺伝子マーカーである対立遺伝子、ならびにその相補体を含む。
当業者に公知であるＤＮＡ組換え技術を用いて、ＤＮＡ配列をコードするＰＡＰＡＰタンパク質をそのプロモーター配列下流にある発現ベクター中に挿入する。例示として、ＰＡＰＡＰ遺伝子のプロモーター配列は、核酸の５’制御領域に含まれている。
【０２５８】
ＰＡＰＡＰタンパク質発現の定量化は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかで実現することができる。後者の場合、例えばＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイにおいて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して産生されているＰＡＰＡＰタンパク質の量を定量することができる。
好ましい実施形態では、ＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡの定量化は、ＰＡＰＡＰに特異的なプライマー対を用いて、培養されたＰＡＰＡＰトランスフェクト宿主細胞の全ｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ増幅法によって実現される。
【０２５９】
本発明はまた、ＰＡＰＡＰ遺伝子の発現レベルを増加、あるいは反対に低下させることができる物質または分子のスクリーニング法に関する。そのような方法を使って、当業者はＰＡＰＡＰ遺伝子の発現レベルに制御効果を誘導し、精神分裂病、躁鬱病または関連性中枢神経系疾患を罹患する患者を治療するための薬剤組成物中に含まれる活性成分として有用であり得る物質を選択することができる。
【０２６０】
したがって、本発明の一部はまたＰＡＰＡＰ遺伝子の発現を調節する候補物質または分子のスクリーニング法であり、本方法は以下の工程：
−検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する、５’制御領域のヌクレオチド配列あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体を含む核酸を含む組換え細胞宿主を提供すること；
−候補物質を得ること；ならびに
−検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルを調節するための候補物質の能力を測定すること、を含む。
【０２６１】
さらなる実施形態では、５’制御領域のヌクレオチド配列あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体を含む核酸はまた、配列番号１のＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ領域、あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体の一つを含む。
検出可能なタンパク質をコードする好ましいポリヌクレオチドのなかには、ベータガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ならびにクロラムフェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）が例証できる。
【０２６２】
本発明はまた、本願明細書で前述されたスクリーニング法を実施するために有用なキットに関する。好ましくは、そのようなキットは、検出可能なタンパク質またはＰＡＰＡＰタンパク質あるいはそのフラグメントまたは変異体をコードするポリヌクレオチドの上流に位置して、さらにそれに作動可能に連結されている、５’制御領域のヌクレオチド配列あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体の発現を可能にする組換えベクターを含む。
【０２６３】
ＰＡＰＡＰ遺伝子の発現を調節する候補物質または分子のスクリーニング法の他の実施形態では、前記方法は以下の工程：
ａ）  配列番号１のＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列、あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体の一つを含み、その５’ＵＴＲ配列あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体が検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、核酸を含む組換え宿主細胞を提供すること；
ｂ）候補物質を得ること；ならびに
ｃ）検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルを調節するための候補物質の能力を測定すること、を含む。
【０２６４】
前述のスクリーニング法の特定の実施形態では、配列番号１のＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体の一つから成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸が、ＰＡＰＡＰ  ５’ＵＴＲ配列に関して内因性であるプロモーター配列を含む。
前述のスクリーニング法の他の特定の実施形態では、配列番号１のＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体の一つから成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸は、本願明細書で定義されるＰＡＰＡＰ  ５’ＵＴＲ配列に関して外因性であるプロモーター配列を含む。
【０２６５】
さらなる好ましい実施形態では、配列番号１のＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの５’−ＵＴＲ配列、あるいはその生物活性フラグメントを含む核酸は、ＰＡＰＡＰ関連二対立遺伝子マーカー、あるいはその相補体を含む。
本発明はさらに、配列番号１のＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列、あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体の一つを含み、その５’ＵＴＲ配列あるいはその生物活性フラグメントまたは変異体が検出可能タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている核酸を含む組換えベクターを含む、ＰＡＰＡＰ遺伝子の発現を調節する候補物質スクリーニング用キットを含む。
【０２６６】
前述のスクリーニング法を実行するために有用である適切な組換えベクターをデザインするためには、本発明の好ましい組換えベクターが詳記されている、本願明細書のセクションが参照されよう。
ＰＡＰＡＰの発現レベルとパターンは、その全文を参考文献として本願明細書に引用している、国際公開番号ＷＯ ９７／０５２７７に記述されているように、長いプローブを用いる溶液ハイブリダイゼーション法によって分析することができる。簡単に言えば、前述のＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡまたはＰＡＰＡＰゲノムＤＮＡ、あるいはそのフラグメントを、バクテリオファージ（Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６）ＲＮＡの直ぐ下流にあるクローニングサイトに挿入して、アンチセンスＲＮＡを産生する。好ましくは、ＰＡＰＡＰインサートは、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列の少なくとも１００個以上の連続ヌクレオチドを含む。プラズミドは、修飾リボヌクレオチド（即ち、ビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰ）を含むリボヌクレオチドの存在下で線状化され転写される。この過剰量の二重標識ＲＮＡは、目的の細胞または組織から単離されたｍＲＮＡを含む溶液中でハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションは、標準的なストリンジェント条件下（８０％ホルムアミド、０．４Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７〜８中で４０〜５０℃、１６時間）で実施される。ハイブリダイズされなかったプローブは、一本鎖ＲＮＡに特異的なリボヌクレアーゼ（即ち、リボヌクレアーゼ  ＣＬ３、Ｔ１、Ｐｈｙ  Ｍ、Ｕ２またはＡ）による消化によって除去される。ビオチン−ＵＴＰ修飾が存在すると、ストレプトアビジンでコートされたマイクロ滴定プレート上にあるハイブリッド体が捕獲される。ＤＩＧ修飾が存在すると、アルカリホスファターゼに結合された抗ＤＩＧ抗体を用いて、ＥＬＩＳＡによってハイブリッド体を検出かつ定量することができる。
【０２６７】
ＰＡＰＡＰ遺伝子発現の定量分析はまたアレイを用いて実施することもできる。本願明細書に使用する際は、アレイという用語は、それに対してハイブリダイズすることが可能なｍＲＮＡ発現の特異的検出を可能にするために十分な長さである複数の核酸の一次元、二次元、あるいは複次元配列を意味する。例えば、アレイは発現レベルを査定されるべき遺伝子由来の核酸を複数含むことができる。アレイは、ＰＡＰＡＰゲノムＤＮＡ、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ配列あるいはその相補配列またはそのフラグメント、特に少なくとも一つのＰＡＰＡＰ関連二対立遺伝子マーカーを含むものを含み得る。好ましくは、フラグメントは少なくとも１５ヌクレオチド長である。他の実施形態では、フラグメントは、少なくとも２５ヌクレオチド長である。ある実施形態では、フラグメントは、少なくとも５０ヌクレオチド長である。さらに好ましくは、フラグメントは、少なくとも１００ヌクレオチド長である。他の好ましい実施形態では、フラグメントは１００ヌクレオチド長以上である。ある実施形態では、フラグメントは、５００ヌクレオチド長以上であり得る。
【０２６８】
例えば、ＰＡＰＡＰ遺伝子発現の定量分析は、Ｓｃｈｅｎａら（１９９５と１９９６）に記述のように、相補性を用いるＤＮＡマイクロアレイで行うことができる。全長ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントはＰＣＲ増幅をしてから、高速ロボット技術を用いてシリレート化顕微鏡スライド上の９６ウェルマイクロ滴定プレートからアレイ分析される。プリントされたアレイを加湿チャンバー内でインキュベートして、アレイエレメントを再水和してから、以下のようにリンスを行う（０．２％ＳＤＳ、１分間１回；  水、１分間２回；  さらに水素化ホウ素ナトリウム溶液、５分間１回）。アレイは９５℃で２分間水中に浸けてから、０．２％ＳＤＳに１分間移して、水で２回リンスし、空気乾燥してから２５℃で暗所に保管する。
【０２６９】
細胞または組織ｍＲＮＡは単離したり、あるいは市販品として入手して、一回の逆転写によってプローブを調製する。プローブは、１４ × １４ ｍｍ のカバーグラスの下で１ ｃｍ２ マイクロアレイに６〜１２時間、６０℃でハイブリダイズする。アレイを低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（１× ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ）中、２５℃で５分間洗浄してから、次に高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０．１ × ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳ）中、室温で１０分間洗浄する。カスタムフィルターセットを装着した蛍光レーザースキャニング装置を用いて、アレイを０．１ × ＳＳＣ 中でスキャンする。二つの別々のハイブリダイゼーションの比率の平均値を取ることによって、正確な発現の差の測定値が得られる。
【０２７０】
ＰＡＰＡＰ遺伝子発現の定量分析はまた、Ｐｉｅｔｕら（１９９６）に記述のように、相補性を用いるＤＮＡアレイで全長ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いて行うことができる。全長ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントは、ＰＣＲ増幅されてから膜にスポットされる。次に、種々の組織または細胞由来のｍＲＮＡを放射性ヌクレオチドで標識する。制御条件でハイブリダイゼーションと洗浄後、ハイブリダイズされたｍＲＮＡをリン酸イメージングまたはオートラジオグラフィーで検出する。二重実験を行い、別々に発現されたｍＲＮＡの定量分析を次に行う。
【０２７１】
あるいは、ＰＡＰＡＰゲノムＤＮＡ、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いる発現分析は、Ｌｏｃｋｈａｒｔら（１９９６） ならびにＳｏｓｎｏｗｓｋｙら（１９９７）に記述のように高密度ヌクレオチドアレイによって行ってもよい。ＰＡＰＡＰゲノムＤＮＡ配列、ＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡ配列、あるいはその相補配列からの１５〜５０ヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドは、チップ上で直接に合成され（Ｌｏｃｋｈａｒｔら、前出）るか、合成されてからチップに配置される（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ、前出）。好ましくは、オリゴヌクレオチドは約２０ヌクレオチド長である。
【０２７２】
ビオチン、ジゴキシゲニンまたは蛍光色素のような適切な化合物で標識されたＰＡＰＡＰ  ｃＤＮＡプローブは、適切なｍＲＮＡ集団から合成され、次に平均サイズが５０〜１００ヌクレオチドになるようにランダムに断片化される。前記プローブを次にチップにハイブリダイズする。Ｌｏｃｋｈａｒｔら、前出に記述のように洗浄して、異なる電場（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｙら、１９９７）を印加した後に、色素または標識化合物が検出ならびに定量化される。二重ハイブリダイゼーションが行われる。異なるｃＤＮＡ試料中にある同一ターゲットオリゴヌクレオチド上のｃＤＮＡプローブに発するシグナル強度の比較分析は、ＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡ発現の差を示す。
【０２７３】
［ＰＡＰＡＰ遺伝子発現を阻害するための方法］
本発明によるその他の治療用組成物は、好都合なことに、ＰＡＰＡＰの核配列のオリゴヌクレオチドフラグメントを、対応するＰＡＰＡＰ遺伝子の発現を阻害するアンチセンスツールまたはトリプルヘリックスツールとして含む。
アンチセンス法
本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを用いる好ましい方法は、Ｓｃｚａｋｉｅｌら（１９９５）に記述の方法である。
【０２７４】
好ましくは、アンチセンスツールは、ＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡの５’末端に相補性のあるポリヌクレオチド（１５〜２００ｂｐ長）から選択される。他の実施形態では、所望のターゲット遺伝子の別々の部分に対して相補性のある別々のアンチセンスポリヌクレオチドの組み合わせが使用される。
本発明による好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンＡＴＧまたはスプライシングドナーまたはアクセプター部位のいずれかを含むＰＡＰＡＰのｍＲＮＡ配列に相補性を有する。
【０２７５】
アンチセンス核酸は、二重鎖のＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡの発現を阻害するために十分な安定性を有する細胞内二重鎖の形成が可能であるように十分な長さと融点を有していなければならない。遺伝子療法の用途に適切なアンチセンス核酸をデザインするためのストラテジーは、Ｇｒｅｅｎ ら 、（１９８６）ならびに Ｉｚａｎｔ とＷｅｉｎｔｒａｕｂ、（１９８４）によって開示されており、それらの開示を本願明細書に参考文献として引用している。
【０２７６】
あるストラテジーでは、アンチセンス分子は、プロモーターに対して、細胞内で通常転写されるものと反対の鎖を転写するようにＰＡＰＡＰコード領域の方向性を逆転することによって得られる。アンチセンス分子は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼを利用して転写物を産生するようなインビトロ転写系を用いて転写し得る。他の方法は、アンチセンス配列を含むＤＮＡを適切な発現ベクター中にあるプロモーターに作動可能に連結することによるインビボでのＰＡＰＡＰアンチセンス核酸の転写に関与する。
【０２７７】
あるいは、適切なアンチセンスストラテジーは、Ｒｏｓｓｉら（１９９１）、国際公開番号ＷＯ ９４／２３０２６、ＷＯ ９５／０４１４１、ＷＯ ９２／１８５２２ 、ならびにヨーロッパ特許出願番号第ＥＰ ０ ５７２ ２８７ Ａ２号に記述されているものである。
本発明に従って使用されるアンチセンステクノロジーの代替法は、その相補ポリヌクレオチドテールを介してターゲット配列に結合して、さらにそのターゲット部位を加水分解することによって対応するＲＮＡを切断するリボザイム（即ち、「ハンマーヘッドリボザイム」）を用いることを含む。簡単に言えば、ハンマーヘッドリボザイムの簡略化サイクルは、（１）相補アンチセンス配列を介してターゲットＲＮＡに特異的に結合する配列；（２）ターゲット鎖の切断モチーフの部位特異的加水分解；ならびに（３）切断産物を遊離し、これによって他の触媒サイクルを生じること、を含む。事実、長鎖アンチセンスポリヌクレオチド（少なくとも３０塩基長）または長いアンチセンスアームを有するリボザイムの使用は簡便である。アンチセンスリボザイムの好ましい送達系は、これらのアンチセンスリボザイムを親油基に共有結合するか、あるいはリポソームを都合の良いベクターとして使用することによって達成される。本発明による好ましいアンチセンスリボザイムは、Ｓｃｚａｋｉｅｌら（１９９５）に記述のように調製され、前記論文中で言及されている特定の調製法は本願明細書に参考文献として引用している。
【０２７８】
トリプルヘリックス法
ＰＡＰＡＰゲノムＤＮＡはまた、細胞内トリプルヘリックス形成に基づくＰＡＰＡＰ遺伝子の発現を阻害するために使用できる。
トリプルヘリックスオリゴヌクレオチドは、ゲノムからの転写を阻害するために使用される。それらは、細胞活性の修飾が特定の遺伝子に関連する場合における細胞活性の修飾を研究するために特に有用である。
【０２７９】
同様にして、ＰＡＰＡＰゲノムＤＮＡの一部は、細胞内におけるＰＡＰＡＰ転写の阻害効果を研究するために使用できる。従来、ホモプリン配列は、トリプルヘリックスストラテジーに最も有用であると考えられていた。しかしながら、ホモピリミジン配列もまた遺伝子発現を阻害できる。そのようなホモピリミジンオリゴヌクレオチドは、ホモプリン：ホモピリミジン配列の主要な溝に結合する。したがって、ＰＡＰＡＰゲノムＤＮＡからの配列は両型ともに本発明の範囲に含まれる。
【０２８０】
トリプルヘリックス法を用いて遺伝子療法ストラテジーを実行するためには、ＰＡＰＡＰゲノムＤＮＡ配列をまずスキャンして、トリプルヘリックスに基づくストラテジーでＰＡＰＡＰ発現を阻害するために使用できる１０マー〜２０マーのホモピリミジンまたはホモプリンのストレッチを同定する。候補ホモピリミジンまたはホモプリンのストレッチを同定後、候補配列を含むオリゴヌクレオチド量を変化させながら、ＰＡＰＡＰ遺伝子を発現する組織培養細胞中に導入することによって、ＰＡＰＡＰ発現阻害の効率を調べる。
【０２８１】
オリゴヌクレオチドは、限定はしないが、リン酸カルシウム沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、リポソーム介在性トランスフェクション、あるいは未変性取り込みを含む、当業者に公知である様々な方法を用いて細胞中に導入することができる。
処理細胞は、オリゴヌクレオチドで処理された細胞におけるＰＡＰＡＰ遺伝子の転写レベルをモニタするためのノーザンブロット、リボヌクレアーゼ保護分析、あるいはＰＣＲに基づくストラテジーなどの技術を用いて、細胞機能の修飾またはＰＡＰＡＰ発現の低下についてモニタされる。
【０２８２】
組織培養細胞における遺伝子発現の阻害に効果的であるオリゴヌクレオチドは次に、アンチセンス法で前述するようにインビトロの結果に基づいて算定された用量で、アンチセンス法で前述した技術を用いてインビボ導入することができる。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドユニットの天然（ベータ）アノマーをアルファアノマーで置換して、オリゴヌクレオチドをさらにヌクレアーゼ抵抗性にすることができる。さらに、臭化エチジウムまたはその類似物のような挿入剤をアルファオリゴヌクレオチドの３’末端に付着して、トリプルヘリックスを安定化することができる。トリプルヘリックス形成に適切なオリゴヌクレオチドの産生に関する情報については、本願明細書に参考文献として引用している、Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９８９）を参照のこと。
【０２８３】
［医薬品組成物と製剤］
《ＰＡＰＡＰ活性調節化合物》
本願明細書に開示の方法を用いて、インビトロおよびインビボでＰＡＰＡＰ活性を選択的に調節あるいはＰＡＰＡＰ−ｇ３４８７２相互作用を調節する化合物を同定することができる。本発明の方法によって同定される化合物は、例えば、ＰＡＰＡＰペプチドに対して結合特異性を有する抗体を含む。ＰＡＰＡＰの相同体は、ＰＡＰＡＰ介在性活性および精神分裂病または躁鬱病に関連するＰＡＰＡＰ介在性活性に関連する生理学的状態の調節に有用であり得ることがまた予測される。一般的には、中枢神経系疾患におけるＰＡＰＡＰの役割に基づく本発明のアッセイ法は、その疾患経路に介入することのできる化合物を同定するために使用できると予測される。
《適応用途》
ＰＡＰＡＰは精神分裂病と躁鬱病に関連していることが実証されているが、ＰＡＰＡＰに関する適応用途は様々な中枢神経系疾患を含む可能性がある。神経系疾患は複雑な遺伝的基礎を有し、さらにしばしば特定の症状を共有することが予測される。特に、本願明細書に前述するように、適応用途は、精神障害第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）分類についての診断および統計学的説明書で定義されるような、精神分裂症とその他の精神病性障害、神経変性疾患、気分障害、自閉症、物質依存症およびアルコール中毒、精神遅滞、ならびに認識、不安、食事、衝動制御、および人格障害を含むその他の精神医学的障害を含み得る。
《医薬品製剤と投与ルート》
本発明の方法を用いて同定された化合物は、ヒト患者を含む哺乳類に、精神分裂病または躁鬱病関連疾患を治療または改善するための治療有効量を、単独あるいは適切な担体または賦形剤（複数でもよい）と混合した医薬品組成物の状態で投与することができる。治療有効量はさらに、本願明細書に記述する方法によって測定されるような症状の改善を起こすために十分な化合物の量を意味する。治療有効量は、定期的な継続使用または投与に適切であることが好ましい。本出願による化合物の製剤および投与技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ レミントン薬理科学）」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、 Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版に記載がある。《投与ルート》
適切な投与ルートは、経口、経直腸、経粘膜、あるいは経腸投与、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内あるいは眼内注射を含む非経口投与を含む。中枢神経系疾患治療用の化合物を投与するために特に有用な方法は、インプラントポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ， Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮより市販）による髄液中への輸液を含む髄腔内投与のような、長期にわたって化合物を投与するためのデバイスの外科的インプラントを含む。本発明による薬剤の徐放性製剤が特に考慮されている。
《組成物／製剤》
本発明に従う用途のための医薬品組成物と薬剤は、賦形剤と補助剤を含む一つ以上の生理学的に認容性のある担体を用いて、従来の方法で製剤することができる。適切な製剤は、選択する投与ルートに拠る。
【０２８４】
注射用には、本発明の薬剤は、水溶液、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、あるいはリン酸緩衝液または炭酸緩衝液などの緩衝生理食塩水のような生理的適合性のある緩衝液中で製剤することができる。経粘膜投与には、透過するバリヤーに適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は一般的には当該分野に公知である。
【０２８５】
経口投与できる医薬品製剤は、ゼラチン製のプッシュフィットタイプカプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤から製造されるソフト、シールドタイプカプセルを含む。プッシュフィット型カプセルは、乳糖などの充填剤、スターチなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、オプションとして安定剤を加えた混合物中に活性成分を含むことができる。ソフトカプセルでは、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解あるいは懸濁することができる。さらに、安定剤を加えてもよい。経口投与用の全ての製剤は、そのような投与に適切な用量でなければならない。
【０２８６】
舌下投与では、組成物は、従来の方法で製剤された錠剤あるいはロゼンジの剤形をとってもよい。
吸入による投与には、本発明に従う用途のための化合物は、例えば、二酸化炭素のような適切なガス状推進剤を使用して、圧縮パックまたはネブライザからのエアロゾル噴霧の剤形で投与することが便利である。圧縮エアロゾルの場合は、用量単位は計測量を投与するためのバルブを備えることによって決定することができる。吸入器または注入器に使用される、例えばゼラチン製のカプセルとカートリッジは、化合物と乳糖またはスターチなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含むように製剤してもよい。
【０２８７】
化合物は、例えば、ボーラス注射（大量注射）による注射、あるいは持続輸液による非経口投与用に製剤してもよい。注射用製剤は、例えば、アンプルまたは複数用量容器中に、保存剤を加えて、単位用量の剤形で生産することができる。組成物は、水性賦形剤中の懸濁液、溶液または乳濁液としての剤形をとることも可能であり、さらに懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような製剤化剤を含んでもよい。
【０２８８】
非経口投与用の医薬品製剤は、活性化合物が水溶性剤形である水性溶液を含む。水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、あるいはデキストランのような懸濁液の粘度を増加する物質を含んでもよい。オプションとして、懸濁液はまた、安定剤または、化合物の溶解度を増加して高濃縮溶液の調剤を可能にする適切な作用薬を含んでもよい。
【０２８９】
あるいは、活性成分は、使用前に発熱物質を含まない滅菌水のような適切な賦形剤で組成する、粉末あるいは凍結乾燥形態であってもよい。
前述の製剤の他に、化合物はまたデポー剤として製剤してもよい。そのような長時間作用性の製剤は、インプラント（例えば、皮下または筋肉内）あるいは、筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物は、適切な高分子または疎水性物質（例えば、認容性のある油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂、あるいは、例えば、難溶性塩のような難溶性誘導体として製剤してもよい。
【０２９０】
さらには、化合物は、治療薬を含む固体疎水性ポリマーから成る半浸透性基質のような、徐放性システムを用いて投与してもよい。多様な徐放性物質が確立されており、当業者には公知である。徐放カプセルは、その化学的本質に基づいて、化合物を数週間から１００日以上に至るまで放出することができる。
治療薬の化学的本質および生物学的安定性に基づき、タンパク質安定化のためにその他のストラテジーを利用してもよい。
【０２９１】
医薬品組成物はまた、適切な固体またはゲル相担体、あるいは賦形剤を含んでもよい。そのような担体または賦形剤の例は、限定はされないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、ならびにポリエチレングリコールのようなポリマーを含む。
《有効用量》
本発明の用途に適する医薬品組成物は、その用途目的を達成するために有効量の活性成分を含有している組成物を含む。さらに詳細には、治療有効量とは、治療される被験者の既存の症状の進展を予防するか、あるいは軽減するために有効な量を意味する。有効量の決定は、当業者の能力の範囲で十分であり、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らせば尚更である。
【０２９２】
本発明による方法で使用されるいずれの化合物についても、治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができ、用量は動物モデルでも処方できる。そのような情報は、ヒトにおける有効用量をさらに正確に決定するために使用できる。
治療有効用量は、患者の症状の改善を起因する化合物の量を意味する。そのような化合物の毒性と治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（試験集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％対する治療有効用量）を測定するために、細胞培養または実験動物における標準的な製薬方法によって決定することができる。毒性と治療効果との用量比は治療インデックスであり、ＬＤ５０とＥＤ５０の比で表される。高い治療指数を呈示する化合物が好ましい。
【０２９３】
これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒト使用における用量範囲の処方に使用することができる。そのような化合物の用量は、ほとんどあるいは全く毒性がなく、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にあることが好ましい。用量は、使用する用量の剤形および投与ルートに基づいて、この範囲内で変化してもよい。的確な剤形、投与ルート、および用量は、患者の状態に応じて個々の医師によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「治療の薬理学的基礎」、第１章を参照のこと）。
【０２９４】
精神医学的疾患の予防、診断ならびに治療
前述のように、本発明の態様は、精神医学的疾患、特に精神分裂病と躁鬱病、治療用の薬剤の調製法に関する。本発明はしたがって、ＰＡＰＡＰに作用する薬剤を包含する。
好ましい実施形態では、本発明の薬剤は、ＰＡＰＡＰ、ＰＡＰＡＰ複合体、ＰＡＰＡＰ−ｇ３４８７２複合体と会合するサブユニットに直接作用するか、あるいはＰＡＰＡＰ経路に間接的に作用することによってＰＡＰＡＰに作用する。例えば、薬剤は、細胞もしくは特定の組織に生じるＰＡＰＡＰ活性レベルを調節し、さらに好ましくは低下させるか、あるいはＰＡＰＡＰタンパク質活性を増加または低下させることができる。ある実施形態では、本発明はしたがって、ＰＡＰＡＰ発現またはＰＡＰＡＰタンパク質活性を増加または低下させることができる化合物の薬剤調製法または製薬における用途を含む。好ましくは、前記化合物は、精神医学的疾患、好ましくは精神分裂病または躁鬱病の治療に使用される。好ましくは、前記化合物は、ＰＡＰＡＰ、ｇ３４８７２、またはＰＡＰＡＰレセプターに結合することによって直接作用する。前記ｇ３４８７２は、配列番号５のポリペプチド、あるいは２０００年３月３０日に出願された、「Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ， ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ（精神分裂病関連遺伝子、タンパク質、および二対立遺伝子マーカー）」と題する共出願の米国特許出願シリアル番号第０９／５３９，３３３号に記述されるポリペプチドを含む、任意のｇ３４８７２ポリペプチドであってよい。
【０２９５】
そのような薬剤はまた、ＰＡＰＡＰ類似化合物、配列番号２の配列と少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む化合物、配列番号２の配列と少なくとも５０％アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む化合物、ならびに配列番号２の配列と少なくとも８０％アミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む化合物の活性を増加または低下させることができる。
【０２９６】
個体においてこれらの化合物の活性を増加または低下させる薬剤は、本願明細書に論述されているような精神医学的疾患を罹患しているか、あるいはその素因を有する個体の症状を改善または予防するために使用することができる。
あるいは、ＰＡＰＡＰ活性は、遺伝子療法を用いて、同定されたＰＡＰＡＰ活性調節化合物をコードする遺伝子を発現することによって増加または低下され得る。遺伝子療法での用途に適切なベクターとプロモーターの例は前述されている。ＰＡＰＡＰ活性はまた、ＰＡＰＡＰペプチド、それに関連するＰＡＰＡＰレセプターまたはタンパク質、ならびにこれらのタンパク質のフラグメントに結合する抗体を調製することによって、増加または低下させることができる。そのような抗体は、ＰＡＰＡＰとそれに関連するＰＡＰＡＰレセプターまたはタンパク質の間の相互作用を調節し得る。抗体とその産生法については本願明細書にさらに記述している。
【０２９７】
前述のように、本発明は、精神医学的疾患の治療用化合物を同定するための細胞アッセイを提供する。このアッセイは、ＰＡＰＡＰ発現の検出、ＰＡＰＡＰタンパク質活性の測定に基づくか、あるいは精神分裂病、躁鬱病、または関連する精神医学的障害のその他の適切な疾患指標の決定に基づく。精神医学的疾患の治療のための化合物は、野生型ＰＡＰＡＰタンパク質活性を阻害することのできる誘導タンパク質またはペプチドを含み、それは野生型ＰＡＰＡＰタンパク質を結合するその能力を測定することによって同定し得る。化合物はまた、抗体、ならびにコンビナトリアル化学に基づく技術を含む、当業者に公知な種々の合成法を用いて得られる小分子と薬物を含む。化合物同定法、製剤の調製法、ならびに薬剤投与法はさらに本願明細書で説明されている。
【０２９８】
ＣＮＳ疾患に対する素因の診断または検出法におけるＰＡＰＡＰ
精神分裂病、躁鬱病、または関連疾患を罹患しているか、あるいはその素因を有する個体は、異常レベルのＰＡＰＡＰを発現することがある。血漿、体液、または身体組織においてＰＡＰＡＰ活性の増加あるいは低下を呈する個体は、一般的な疾患メカニズムに関連して精神分裂病、躁鬱病、あるいは種々のＣＮＳ疾患または関連する精神医学的状態を発症するリスクがあり得る。本発明の一つの態様は、個体がそのような障害（例えば、精神障害第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）分類についての診断および統計学的説明書で定義されるような、精神分裂症、躁鬱病またはその他の精神病性障害、気分障害、自閉症、物質依存症およびアルコール中毒、精神遅滞、ならびに認識、不安、食事、衝動制御、および人格障害を含むその他の精神医学的疾患）を罹患するリスクがあるか、または現在罹患状態にあるのかを決定するための方法であり、前記方法が、個体が、ＰＡＰＡＰタンパク質活性および／またはＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡ発現を含むＰＡＰＡＰ活性の異常レベルを呈しているか、もしくは血漿、体液、または身体組織中に異常レベルのＰＡＰＡＰタンパク質を有しているかを測定することを含む。血漿、体液、または身体組織中のＰＡＰＡＰまたは類似化合物のレベルは、種々の方法を用いて測定できる。特に、ＰＡＰＡＰタンパク質レベルは、例えば、ウエスタンブロット、タンパク質電気泳動法を用いて測定することができる。ＰＡＰＡＰの検出はまた、本発明のＰＡＰＡＰポリペプチドに対して産生された抗体を用いても実施できる。抗体に対する特異的結合の検出は、試料中のＰＡＰＡＰポリペプチドの存在を示す（例えば、ＥＬＩＳＡ）。これは、ＰＡＰＡＰに関連する病態を反映する。
【０２９９】
他の態様では、一つ以上のＰＡＰＡＰ二対立遺伝子マーカー、多型性または変異体を使って、特定の遺伝子型の結果としての検出可能な形質を発現する個体、あるいはその遺伝子型のために将来検出可能な形質を生じるリスクのある個体を同定することのできる診断テストを開発し得る。本診断法を用いて分析された形質を使って、前記の例に記述するような精神分裂病または躁鬱病あるいは関連疾患に対する素因、検出可能な症状を発症する年齢、前記疾患の一つに対する治療への有益な応答または治療に関する副作用を含む任意の検出可能な形質を診断することができる。そのような診断は、疾患のモニタ、予後、および／または予防あるいは治療法に有用である。これらの診断技術は、ＰＡＰＡＰ核酸配列についての知見に基づき、被験者が検出可能な形質を発症するリスクの増加に関連する遺伝子型を有するか、あるいは個体が特定の変異の結果として検出可能な形質を罹患しているか否かを決定する種々の方法を利用することができ、ハプロタイプ決定、家族研究、単精子ＤＮＡ分析または体細胞ハイブリッド解析のための個体の染色体分析を可能とする方法を含む。これらの診断技術は、ＰＡＰＡＰ制御配列または一般的にはヒト染色体１３ｑ３３領域を含む、ＰＡＰＡＰ配列内に存在する特定の対立遺伝子の検出に関与し得る。さらに詳細には、本発明は、配列番号１または３のヌクレオチド配列、あるいはそのフラグメントまたはそれに対する相補配列の少なくとも一つを含む核酸の検出に関する。
【０３００】
これらの方法は、個体から核酸サンプルを得ること、この核酸サンプルが少なくとも一つの対立遺伝子または少なくとも一つの二対立遺伝子マーカーハプロタイプを含んでいるか否かを決定することを含み、これは特定のＰＡＰＡＰ関連多型性または変異（形質原因対立遺伝子）を有する結果として、その形質を発症するリスクの示度、あるいは個体がその形質を発現する示度となる。
【０３０１】
本診断は、一つの二対立遺伝子マーカーあるいは二対立遺伝子マーカー群に基づく。これらの方法のそれぞれにおいては、被験者から核酸サンプルを得て、一対以上の本発明の二対立遺伝子マーカーの二対立遺伝子マーカーのパターンが決定される。一つの実施形態では、核酸サンプルについてＰＣＲ増幅を行って、検出可能な表現型と関連して多型性が同定された領域を増幅する。増幅産物の配列決定を行って、個体が検出可能な表現型と関連するＰＡＰＡＰ関連多型性を一つ以上有するか否かを決定する。あるいは、核酸サンプルにマイクロ配列決定反応を行って、個体がヒトＰＡＰＡＰ遺伝子の変異または多型性に起因する検出可能な表現型に関連する一つ以上のＰＡＰＡＰ関連多型性を有するか否かを決定する。他の実施形態では、核酸サンプルを、検出可能な表現型に関連する一つ以上のＰＡＰＡＰ関連対立遺伝子に特異的にハイブリダイズした一つ以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブと接触させる。他の実施形態では、核酸サンプルを、増幅反応で対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドと共に使用すると増幅産物を産生することができる第二オリゴヌクレオチドに接触させる。増幅反応における増幅産物の存在は、個体が検出可能な表現型に関連するＰＡＰＡＰ関連対立遺伝子を一つ以上有することを示す。好ましい実施形態では、この検出可能な形質は、精神分裂病または躁鬱病である。診断キットは、本発明によるポリヌクレオチドのいずれかを含む。これらの診断方法は、特定の状況において、予防処置を開始したり、あるいは有意なハプロタイプを有する個体が軽い症状のような警告サインの予知を可能にするために使用できるために、極めて価値がある。
【０３０２】
薬物に対する応答あるいは薬物に対する副作用を分析かつ予測する診断は、個体がある特定の薬物で治療されるべきか否かを決定するために使用することができる。例えば、診断によって個体が特定の薬物による治療に肯定的に応答する可能性が示されたならば、その薬物を個体に投与することができる。反対に、診断によって個体が特定の薬物による治療に否定的に応答する可能性が示されたならば、別の治療法が処方されよう。否定応答は、有効な応答の欠如あるいは毒性のある副作用の発症のいずれかとして定義される。
【０３０３】
薬物の臨床治験は、本発明による診断法のその他の適応用途を示す。精神分裂病に対して作用する薬剤に対する応答、あるいは精神病に対して作用する薬剤に対する副作用を示す一つ以上のマーカーを、前述の方法を用いて同定することができる。したがって、そのような薬剤のための臨床治験の参加予定者について、その薬物に好都合に応答する可能性のある個人を同定して、副作用を起こす可能性のある個人を除外するためにスクリーンすることができる。このようにして、薬物療法の有効性を、試験に肯定的に応答しない可能性のある個人を含む結果、測定値を低下させたり、望ましくない安全性の問題のリスクを冒すことなく、その薬物に肯定的に応答する個人において測定することができる。
【０３０４】
疾患の予防と管理
自殺のリスクがあるため、例えば、個人の精神分裂病、躁鬱病、ならびにその他の精神医学的疾患に対する感受性の検出は極めて重要である。したがって、本発明は、特に精神分裂病または躁鬱病、あるいはその関連疾患を含むＣＮＳ疾患の治療法に関し、前記方法は、以下のステップ：
−ＤＮＡがＰＡＰＡＰ関連多型性の対立遺伝子、二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカー群を含むか、あるいはＣＮＳ疾患に関連する異常なＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡの発現またはＰＡＰＡＰタンパク質活性を呈する個人を選択すること；
−  前記ＣＮＳ疾患に関する症状の出現（またオプションとして進展も含む）について前記個人をフォローアップすること；ならびに
−  前記個人に、ＣＮＳ疾患またはその症状に対して作用する療法を疾患の適切な段階で投与すること、を含む。
【０３０５】
本発明の他の実施形態は、ＣＮＳ疾患治療法を含み、前記方法は以下のステップ：
−ＤＮＡがＰＡＰＡＰ関連多型性の対立遺伝子、二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカー群を含み、ＣＮＳ疾患に関連する異常なＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡ発現またはＰＡＰＡＰタンパク質活性を呈する個人を選択すること；
−前記個人に前記ＣＮＳ疾患の予防的療法を投与すること、を含む。
【０３０６】
さらなる実施形態では、本発明はＣＮＳ疾患治療法に関し、前記方法は以下のステップ：
−ＤＮＡがＰＡＰＡＰ関連多型性の対立遺伝子、二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカー群を含み、ＣＮＳ疾患に関連する異常なＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡ発現またはＰＡＰＡＰタンパク質活性を呈する個人を選択すること；
−前記個人に前記ＣＮＳ疾患の予防的療法を投与すること；
−前記ＣＮＳ疾患の症状の出現と進展について前記個人をフォローアップすること；ならびにオプションとして
−  前記個人に、前記ＣＮＳ疾患またはその症状に対して作用する療法を疾患の適切な段階で投与すること、を含む。
【０３０７】
疾患を罹患する個人の治療経過の決定に使用するために、本発明はまたＣＮＳ疾患治療法に関して、前記方法は以下のステップ：
−ＤＮＡがＰＡＰＡＰ関連多型性の対立遺伝子、二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカー群を含み、ＣＮＳ疾患の重症度またはその症状に関連する異常なＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡ発現またはＰＡＰＡＰタンパク質活性を呈する、精神分裂病または躁鬱病を罹患する個人を選択すること；
−前記個人に、ＣＮＳ疾患またはその症状に対して作用する療法を投与すること、を含む。
【０３０８】
本発明はまた、選択された個体集団におけるＣＮＳ疾患の治療法に関する。前記方法は：
−ＣＮＳ疾患を罹患しておりそのＤＮＡがＰＡＰＡＰ関連多型性の対立遺伝子、二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカー群を含む個人、あるいは前記ＣＮＳ疾患またはその症状に対して作用する有効量の薬剤による療法への肯定応答に付随する異常なＰＡＰＡＰ  ｍＲＮＡ発現またはＰＡＰＡＰタンパク質活性を呈する個人、
−  および／またはそのＤＮＡがＰＡＰＡＰ関連多型性の対立遺伝子、二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカー群を含まない個人、もしくは前記薬剤による療法への否定応答に付随する異常なＰＡＰＡＰ発現またはＰＡＰＡＰタンパク質活性を呈する個人を選択すること；ならびに
−前記薬剤を前記の選択された個人に適切な間隔で有効量投与すること、を含む。
【０３０９】
本発明に関連しては、薬剤に対する「肯定応答」は、疾患に関連する症状の軽減を含むとして定義することができる。本発明に関連しては、薬剤に対する「否定応答」は、その薬剤に対する肯定応答を欠如するために症状の軽減を生じないか、あるいはその薬剤投与後に観察される副作用を誘導することを含むとして定義することができる。
【０３１０】
本発明による方法での好ましいＣＮＳ疾患とは精神分裂病と躁鬱病である。しかしながら、本発明はまた、関連疾患、特に関連するＣＮＳ疾患を予防し、診断し、管理し、さらに治療する方法において本願明細書に記述されている予防、診断、予後、ならびに治療方法のいずれをも含む。例として、関連疾患は、精神障害第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）分類についての診断および統計学的説明書で定義されるような、精神病性障害、気分障害、自閉症、物質依存症およびアルコール中毒、精神遅滞、ならびに認識、不安、食事、衝動制御、および人格障害を含むその他の精神医学的疾患を含む。
【０３１１】
本発明はまた、被験者がその薬剤による療法に肯定的に応答する可能性があるかどうかを決定する方法に関連する。本方法は、前記薬剤に肯定的に応答する個人から成る第一集団と前記薬剤に否定的に応答する個人から成る第二集団を同定することを含む。一つ以上の二対立遺伝子マーカーを、前記薬剤に対する肯定応答に関連する第一集団において同定し、さらに一つ以上の二対立遺伝子マーカーを、前記薬剤に対する否定応答に関連する第二集団で同定する。二対立遺伝子マーカーは、本願明細書に記述した技術を用いて同定することができる。
【０３１２】
ＤＮＡサンプルを次に試験対象である被験者から得る。このＤＮＡサンプルを分析して、薬剤による療法に対する肯定応答に関連する一つ以上の二対立遺伝子マーカー、および／または薬剤による療法に対する否定応答に関連する一つ以上の二対立遺伝子マーカーである対立遺伝子を含んでいるかどうかを決定する。
ある実施形態では、ＤＮＡサンプルが薬剤による療法に対する肯定応答に関連する一つ以上の二対立遺伝子マーカーである遺伝子を含むか／またはＤＮＡサンプルが薬剤による療法に対する否定応答に関連する一つ以上の二対立遺伝子マーカーである遺伝子を欠如している場合に、その薬剤は臨床治験において被験者に投与され得る。好ましい実施形態では、この薬剤は、精神分裂病または躁鬱病に対する作用薬である。
【０３１３】
本発明の方法を用いて、薬効の評価を、薬剤に対して好都合に応答する可能性のある個人から成る集団で行うことができる。
本発明の他の態様は、被験者からＤＮＡサンプルを得ること、ＤＮＡサンプルが薬剤に対する肯定応答に関連する一つ以上の二対立遺伝子マーカーである遺伝子を含むか／またはＤＮＡサンプルが薬剤に対する否定応答に関連する一つ以上の二対立遺伝子マーカーである遺伝子を含んでいるかを決定すること、ならびにＤＮＡサンプルが薬剤に対する肯定応答に関連する一つ以上の二対立遺伝子マーカーである遺伝子を含むか／またはＤＮＡサンプルが薬剤に対する否定応答に関連する一つ以上の二対立遺伝子マーカーである遺伝子を欠如している場合に、薬剤を被験者に投与すること、を含む薬剤の使用方法である。
【０３１４】
本発明はまた、薬剤、好ましくは精神分裂病または躁鬱病あるいはその症状に対する作用薬の臨床試験方法に関する。前記方法は以下のステップ：
−薬剤、好ましくは精神分裂病または躁鬱病あるいはその症状に対する作用薬を、個人の異種集団に投与すること、
−前記薬剤に肯定的に応答する個人から成る第一集団と前記薬剤に否定的に応答する個人から成る第二集団を同定すること、
−前記薬剤に対する肯定応答に関連する二対立遺伝子マーカーを前記第一集団において同定すること、
−ＤＮＡが前記薬剤に対する肯定応答に関連する二対立遺伝子マーカーを含む個人を選択すること、ならびに
−前記薬剤を前記個人に投与すること、を含む。
【０３１５】
そのような方法は、通常投与される患者集団の一部に対して望ましくない副作用を起因したり／または有効ではない薬剤の投与に起因する利益／リスク比を増加するために極めて有用であると見なされている。
いったん個人が精神分裂病または躁鬱病を罹患していると診断されると、この個人のＤＮＡが療法に対する肯定応答、あるいは副作用または非応答のいずれかを含み得る療法に対する否定応答に関連する二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカー群である対立遺伝子を含んでいるかどうかを決定するために選択試験が行われる。
【０３１６】
本発明の方法を用いて治療されるべき患者の選択は、前述の検出方法によって行うことができる。選択されるべき個人は、そのＤＮＡが療法に対する否定応答に関連する二対立遺伝子マーカーまたは二対立遺伝子マーカー群である対立遺伝子を含まない個人であることが好ましい。特定の薬剤に対する非応答または副作用の個人の遺伝的素因についての知見によって、臨床医は精神分裂病または躁鬱病あるいはその症状に対する適切な薬物による療法を指示することが可能になる。
【０３１７】
いったん患者の遺伝的素因が決定されると、臨床医は、否定応答、特に副作用、が報告されていないか、あるいは報告されているにしても非常に低い患者にのみに適切な治療を選択することができる。
本出願には、様々な出版物、特許、公開特許出願が引用されている。本出願に参照されているこれらの出版物、特許ならびに公開特許明細書の開示は、本発明に関する技術の水準をさらに詳しく記述するために、本開示に参考文献として引用している。
【０３１８】
【発明の実施の形態】
【０３１９】
【実施例】
＜実施例  １＞
［インサイツレセプター結合アッセイ（細胞染色）］
《ＡＰ融合構築物》
ＰＡＰペプチドアミノ酸配列（配列番号５）をコードするｃＤＮＡと分泌性アルカリホスファターゼ（ＡＰ）のＣ−末端とのフレイム内融合を、ｐＡＰｔａｇ発現ベクター内に作製した。ベクターに挿入された（融合）タンパク質配列のヌクレオチドとアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４と６に示す。
【０３２０】
本ベクターは、培地中への融合タンパク質の分泌を指示する、インサート上流に位置する分泌シグナル配列を有する。融合タンパク質を含む培地を回収して、ＡＰ活性をアッセイして、インサイツレセプター／リガンドアッセイに使用できる。
ＡＰ融合タンパク質を次に２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトして、安定なトランスフェクタントをゼオシン抵抗性に照らして選択した。安定なトランスフェクタントを含む細胞からの培地を３日ごとに回収してＡＰ活性についてアッセイした。このＡＰ−融合含有培地は、次に以下のように、インサイツレセプター結合アッセイに使用される。
【０３２１】
ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｃＤＮＡ合成キットを用いて構築した。ｃＤＮＡを、哺乳類発現ベクターであるｐＭＴ２１−ｎｅｏ （ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）中にクローン化した。プラズミドＤＮＡをＱｉａＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて〜１０００個のコロニーのプールから得た。ＤＮＡのこれらのプールを次に、以下のようにＣＯＳ−１細胞中に一過性トランスフェクトした。２マイクログラムのヒト脳  ｃＤＮＡの各プールＤＮＡを２００ｕＬの無血清培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ製のＤＭＥＭ培地、添加物なし）中で希釈した。１２ｕｌの（使用前に混合した）ＰＬＵＳ試薬を無血清培地中でＤＮＡに加えることにより、ＤＮＡをＰＬＵＳ試薬と複合体化した。２００ｕｌのＤＮＡ−ＰＬＵＳリポフェクタミン試薬複合体を、トランスフェクションの前日に６ウェルディッシュ（３５ｍｍ）にウェル当たり０．２５ ｘ １０５ 細胞で播種されたＣｏｓ−１ 細胞を含むウェルに加えた（抗生物質を含まない完全培地）。ＤＮＡ／リポフェクタミン／ＰＬＵＳ複合体添加に先立ち、細胞から完全培地を除去して、８００ｕｌの無血清培地に交換した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の条件で３時間インキュベートして、次に各ウェルの培地を２ｍｌの完全培地で交換した。
《レセプター／リガンドのレセプタークローニング》
分泌されたＡＰ融合タンパク質は、発現クローニング法によるＰＡＰＡＰのクローン化のためのプローブとして使用した。
【０３２２】
トランスフェクションの２日後、細胞染色を開始した。培養培地を、６ウェルディッシュ内の細胞から除去した。付着細胞を２ｍｌのＨＢＨＡ洗浄緩衝液（（５０ ｍｌ  １０× ＨＢＳＳ （１×）、０．２５ グラム   ＢＳＡ （０．５ ｍｇ／ｍｌ）、１０ ｍｌ １Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５ （２０ ｍＭ）、 ｄＨ２Ｏで ５００ ｍｌとする））で一回洗浄してから、２ｍｌ  培地を含むＰＡＰ−ＡＰ融合タンパク質、または培地を含むＡＰ（ネガティブコントロールとして）を加えて、室温で９０分間インキュベートした。培地を除去して、１０分間にわたって、サンプルを少なくとも５回、２ｍｌのＨＢＨＡ緩衝液で洗浄した。ＨＢＨＡ緩衝液を完全に除去してから、細胞に２ｍｌの固定試薬（６０％アセトン、３％ホルムアルデヒド、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）を加えて３０秒固定した。固定試薬を直ちに除去して、ＨＳ緩衝液（１５ ｍｌ   ５Ｍ ＮａＣｌ （１５０ ｍＭ）、 １０ ｍｌ １ Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５ （２０ ｍＭ）、ｄＨ２Ｏで ５００ ｍｌとする ）をウェル当たり２ｍｌ使用してサンプルを２回洗浄した。サンプルをＨＳ緩衝液中で、内因性ＡＰを加熱不活性化するために６５℃で１００分インキュベートした。ＨＳ緩衝液を除去してから、細胞表面結合ＡＰ活性を１ｍｌのＡＰアッセイ試薬（５０ ｍｌ １ Ｍ トリス塩酸 ｐＨ ９．５ （１００ ｍＭ）、１０ ｍｌ  ５ Ｍ ＮａＣｌ （１００ ｍＭ）、 ２．５ ｍｌ   １Ｍ ＭｇＣｌ２ （５ ｍＭ）、を ５００ｍｌとしてこれに最終濃度が０．３３ ｍｇ／ｍｌ となるようにＮＢＴ、最終濃度が ０．１７ ｍｇ／ｍｌとなるようにＢＣＩＰを加えた）で染色した。
【０３２３】
陽性クローンが検出された場合、単一クローン（ＰＡＰＡＰ核酸）が同定されるまで、ｃＤＮＡのより小さいプールを用いてアッセイを反復した。
＜実施例  ２＞
［ＰＡＰＡＰタンパク質に対する抗体組成物の調製］
実質的に純正なタンパク質またはポリペプチドを、ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部をコードする発現ベクターを含むトランスフェクト細胞または形質転換細胞から単離する。最終調製物中のタンパク質濃度は、例えば、アミコンフィルタ装置による濃縮によって、数マイクログラム／ｍｌのレベルまで調整する。タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は次に以下のようにして調製できる：
Ａ．ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生
ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部にあるエピトープに対するモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇと Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．，（１９７５）の古典的方法あるいはそれに派生する方法に従って、マウスハイブリドーマから調製することができる。Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．，と Ｄ． Ｌａｎｅ、１９８８をまた参照のこと。
【０３２４】
簡単に言えば、数マイクログラムのＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部で、マウスを数週間にわたり反復接種する。マウスを次に屠殺して、脾臓の抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールを使用して脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合して、過剰な非融合細胞は、この系をアミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）で増殖することによって破壊する。融合に成功した細胞を希釈して、希釈液のアリコートをマイクロ滴定プレートのウェル内に入れて、培養物の増殖を継続する。抗体産生クローンは、Ｅｎｇｖａｌｌ （１９８０）が初めて記述したＥＬＩＳＡのような免疫アッセイ法、およびそれに派生する方法によってウェルの上清液中の抗体を検出することによって同定される。選択された陽性クローンを増殖して、そのモノクローナル抗体産物を収穫して使用することができる。モノクローナル抗体産生についての詳細な方法については、Ｄａｖｉｓ， Ｌらによる、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学の基礎的方法）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２１−２章に記述されている。
【０３２５】
Ｂ．免疫化によるポリクローナル抗体産生
ＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部にある異種エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、適切な非ヒト動物をＰＡＰＡＰタンパク質またはその一部で免疫化することによって調製され、これは、修飾されなくてもよいし、または免疫原性を増強するために修飾されてもよい。適切な非ヒト動物とは好ましくは、通常はマウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマから選択される非ヒト哺乳類である。あるいは、ＰＡＰＡＰ濃度を濃縮した粗調製物を使用して抗体を産生することもできる。そのようなタンパク質、フラグメントまたは調製物を、当該分野で公知な適切なアジュバント（例えば、水酸化アンモニウム、ＲＩＢＩなど）を添加した状態で非ヒト哺乳類中に導入する。その上、タンパク質、フラグメント、または調製物は抗原性を増加させる作用薬で予め処理することができ、そのような作用薬は当該分野では公知であり、例えば、メチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、肝炎Ｂ表面抗原、ならびにキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む。公知の方法に従って、免疫化動物からの血清を回収、処理、ならびに試験する。血清が望ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体を含んでいる場合は、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってポリクローナル抗体を精製することができる。
【０３２６】
効果的なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の両方に係わる多数の因子によって影響される。また、宿主動物は接種部位と用量に対する応答に変化があり、不適当な抗原または抗原の用量過剰は抗血清の低力価の原因となる。複数の皮内部位への少用量（ｎｇレベル）の抗原投与が、最も信頼性があると思われる。ポリクローナル抗血清の産生およびプロセシング技術は当該分野に公知であり、例えば、Ｍａｙｅｒ とＷａｌｋｅｒ （１９８７）を参照のこと。ウサギを使う有効な免疫化プロトコルは、Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ， Ｊ． ら （１９７１）に記載されている。
【０３２７】
規則的間隔で追加注射を行ってもよく、例えば、公知の抗原濃度に対する寒天内二重免疫拡散法によって半定量的に決定されたその抗体力価が降下し始めたときに抗血清を回収するとよい。例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ， Ｏ．ら （１９７３）を参照のこと。抗体のプラトー濃度は、通常では血清の０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの範囲である（約１２μＭ）。抗原に対する抗血清の親和性は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ．（１９８０）に記述されるような、競合結合曲線を作成することによって測定される。
【０３２８】
モノクローナルまたはポリクローナルプロトコルのいずれかによって調製された抗体調製物は、生物試料中にある抗原性物質の濃度を決定する定量免疫アッセイに有用であり、さらにこれらは生物試料中にある抗原の存在を半定量的または定性的に同定するためにも使用される。抗体はまた、タンパク質を発現する細胞を死滅させるため、あるいは体内におけるタンパク質レベルを低下するための治療用組成物において使用できる。
【０３２９】
本発明の好ましい実施形態が例示ならびに記述されているが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、当業者によって様々な変態を作製することが可能であることが理解されよう。
【０３３０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004516015.tif 000099
2004516015.tif 000100