(57)【要約】本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドおよび抗原性ペプチドを含むキメラ分子を用いて、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答などの免疫応答を誘導および増強するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、キメラ分子をコードする裸のＤＮＡもしくは発現ベクターなどの核酸を投与することによってｉｎ ｖｉｖｏで作製されるポリペプチドにより誘導される免疫応答を増強するための組成物および方法を提供する。本発明は、個体において腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。また本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで作製されたキメラポリペプチドにより誘導される免疫応答を増強するための新規の自己複製ＲＮＡウイルス構築物を提供する。
2004527213.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン組成物として有用な融合ポリペプチドをコードする核酸分子であって、
（ａ）小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドをコードする第１核酸配列；
（ｂ）場合によっては、第１核酸配列とインフレームで融合された、リンカーペプチドをコードするリンカー核酸配列；および
（ｃ）前記第１核酸配列とインフレームで連結されるか、または前記リンカー核酸配列とインフレームで連結され、かつ抗原性ポリペプチドもしくはペプチドをコードする第２核酸配列、
を含む前記核酸分子。
【請求項２】
抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩタンパク質に結合するエピトープを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記エピトープが約８アミノ酸残基〜約１１アミノ酸残基の長さである、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
シャペロンポリペプチドがカルレティキュリンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記カルレティキュリンがヒトカルレティキュリンである、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項６】
カルレティキュリンが配列番号１の配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
カルレティキュリンポリペプチドが本質的に配列番号１の第１残基付近〜第１８０残基付近の配列からなる、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
カルレティキュリンポリペプチドが本質的に配列番号１の第１８１残基付近〜第４１７残基付近の配列からなる、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項９】
シャペロンポリペプチドが、
（ａ）カルネキシンポリペプチドもしくはその等価物；
（ｂ）ＥＲ６０ポリペプチドもしくはその等価物；
（ｃ）タパシンポリペプチドもしくはその等価物；または
（ｄ）ＧＲＰ９４／ＧＰ９６ポリペプチド、ＧＲＰ９４ポリペプチドもしくはその等価物、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
抗原が病原性生物、細胞もしくはウイルスに存在するか、または病原性生物、細胞もしくはウイルスのエピトープと交差反応性を有する抗原である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
ウイルスがヒトパピローマウイルスである、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
抗原がＨＰＶ−１６のＥ７ポリペプチドまたはその抗原性断片である、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
ＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチドが非腫瘍形成性である、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
病原性生物が細菌である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１５】
病原性細胞が腫瘍細胞である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１６】
抗原が腫瘍特異的抗原もしくは腫瘍関連抗原またはそれらの抗原性エピトープである、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
抗原がＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質またはそのペプチドを含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
プロモーターに機能的に連結された、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
プロモーターが抗原提示細胞（ＡＰＣ）において発現されるプロモーターである、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
ＡＰＣが樹状細胞である、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２１】
（ａ）プロモーター；および
（ｂ）場合によっては、真核細胞において核酸の発現を調節する付加的調節配列、に機能的に連結された請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現ベクターもしくはカセット。
【請求項２２】
ウイルスベクターまたはプラスミドである、請求項２１に記載の発現ベクターもしくはカセット。
【請求項２３】
自己複製ＲＮＡレプリコンである、請求項２１に記載の発現ベクターもしくはカセット。
【請求項２４】
自己複製ＲＮＡレプリコンがシンドビスウイルスの自己複製ＲＮＡレプリコンである、請求項２３に記載の発現ベクターもしくはカセット。
【請求項２５】
レプリコンがＳＩＮｒｅｐ５である、請求項２４に記載の発現ベクターもしくはカセット。
【請求項２６】
シャペロンポリペプチドがカルレティキュリンポリペプチドを含む、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の発現ベクターもしくはカセット。
【請求項２７】
シャペロンポリペプチドがタパシン、ＥＲ６０、ＥＲＰ９４もしくはカルネキシンポリペプチドまたはそれらの等価物のうちのいずれか１種以上を含む、請求項６に記載の発現ベクターもしくはカセット。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の核酸または発現カセットもしくはベクターを含むように改変された細胞。
【請求項２９】
前記核酸分子を発現する、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
ＡＰＣである、請求項２８または２９に記載の細胞。
【請求項３１】
ＡＰＣが樹状細胞、ケラチノサイト、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、小膠細胞、星状細胞または活性化内皮細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の核酸または発現カセットもしくはベクターを含む粒子。
【請求項３３】
パーティクルボンバードメントによる細胞もしくは動物への導入に好適な物質を含む、請求項３２に記載の粒子。
【請求項３４】
物質が金である、請求項３３に記載の粒子。
【請求項３５】
（ａ）小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチド；および
（ｂ）抗原性ペプチドもしくはポリペプチドを含む第２ポリペプチド、
を含む融合もしくはキメラポリペプチド。
【請求項３６】
抗原性ペプチドもしくはポリペプチドがＭＨＣクラスＩタンパク質に結合し、かつＭＨＣクラスＩタンパク質によって細胞表面上に提示されるエピトープを含む、請求項３５に記載の融合もしくはキメラポリペプチド。
【請求項３７】
シャペロンポリペプチドおよび抗原性ポリペプチドもしくはペプチドが化学的リンカーによって連結されている、請求項３５または３６に記載の融合もしくはキメラポリペプチド。
【請求項３８】
リンカーが柔軟性のある化学的リンカーである、請求項３７に記載の融合もしくはキメラポリペプチド。
【請求項３９】
請求項３５または３６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４０】
第１ポリペプチドが第２ポリペプチドに対してＮ末端側にある、請求項３９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４１】
第２ポリペプチドが第１ポリペプチドに対してＮ末端側にある、請求項３９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４２】
シャペロンポリペプチドがカルレティキュリンポリペプチドまたはその相同体を含む、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の融合もしくはキメラポリペプチド。
【請求項４３】
シャペロンポリペプチドがタパシン、ＥＲ６０、ＥＲＰ９４もしくはカルネキシンポリペプチドまたはそれらの等価物のうちのいずれか１種以上を含む、請求項３５〜４１のいずれか１項に記載の融合もしくはキメラポリペプチド。
【請求項４４】
抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる医薬組成物であって、
（ａ）（ｂ）の組成物と組み合わせる製薬上および免疫学上許容される賦形剤；
（ｂ）  （ｉ）請求項１〜３７のいずれか１項に記載の核酸分子または発現ベクターもしくはカセット；
（ｉｉ）請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の細胞；
（ｉｉｉ）請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の粒子；
（ｉｖ）請求項３５〜４３のいずれか１項に記載の融合もしくはキメラポリペプチド；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ、
からなる群から選択される組成物、
を含む前記医薬組成物。
【請求項４５】
シャペロンポリペプチドがカルレティキュリンポリペプチドを含む、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
小胞体シャペロンポリペプチドがタパシン、ＥＲ６０またはカルネキシンポリペプチドを含む、請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
被験者において抗原特異的免疫応答を誘導または増強する方法であって、該被験者に請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を投与し、それによって前記応答を誘導または増強することを含む、前記方法。
【請求項４８】
応答が少なくとも部分的にはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
応答が少なくとも部分的には抗体によって媒介される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
細胞または被験者において抗原特異的免疫応答を誘導または増強する方法であって、前記細胞または被験者に請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を投与し、それによって前記応答を誘導または増強することを含む、前記方法。
【請求項５１】
組成物が前記細胞にｅｘ ｖｉｖｏで投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞がＡＰＣを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＡＰＣが樹状細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＡＰＣもしくは前記樹状細胞がヒト起源である、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５５】
ＡＰＣが生きた被験者から単離される、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
組成物がｅｘ ｖｉｖｏで投与された前記細胞を、（ｉ）組織適合性の被験者または（ｉｉ）前記細胞が採取された被験者に投与する工程をさらに含む、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞がヒト細胞であり、および前記被験者がヒトである、請求項５０〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記被験者がヒトである、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記投与が筋内、皮内または皮下経路によるものである、請求項４７〜５０または５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
組成物が前記核酸分子、発現ベクターもしくはカセット、または粒子を含み、かつ前記投与がバイオリスティックインジェクションによるものである、請求項４７〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
投与が腫瘍内投与または腫瘍周辺投与である、請求項４７〜５０、５６〜５８または６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
被験者において選択した抗原に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬの数または溶解活性を増大する方法であって、
（ｉ）前記核酸分子、発現ベクターもしくはカセット、細胞、粒子または融合もしくはキメラポリペプチドが前記選択した抗原を含み、そして
（ｉｉ） 前記選択した抗原がＭＨＣクラスＩタンパク質に結合し、かつＭＨＣクラスＩタンパク質によって細胞表面上に提示されるエピトープを含む、
請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を前記被験者に投与し、それによって前記ＣＴＬの数または活性を増大することを含む、前記方法。
【請求項６３】
被験者において腫瘍の増殖を阻害するかまたは腫瘍の再生を予防する方法であって、前記核酸分子、発現ベクターもしくはカセット、細胞、粒子または融合もしくはキメラポリペプチドが前記被験者の前記腫瘍に存在する１種以上の腫瘍関連エピトープまたは腫瘍特異的エピトープを含む請求項４４〜４６のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を前記被験者に投与し、それによって前記増殖を阻害するかまたは前記再生を予防することを含む、前記方法。
【請求項６４】
前記投与が腫瘍内投与または腫瘍周辺投与である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記医薬組成物の投与の前に、共にまたは後に前記被験者に抗脈管形成活性を有する第２組成物を投与することをさらに含む、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗脈管形成組成物がアンジオスタチン、エンドスタチンまたはＴＩＭＰ−２である、請求項７８に記載の方法。
【請求項６７】
前記被験者を放射線療法または化学療法で治療することをさらに含む、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
連邦支援研究に関しての陳述
本発明は、国立衛生研究所（ＲＯ１ ＣＡ７２６３１）；ＮＣＤＤＧ（ＲＦＡ ＣＡ−９５−０２０）からの援助の下、連邦政府の支援によりなされた。米国政府は、本発明における特定の権利を有しうる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、免疫学と医学の分野に含まれ、小胞体シャペロンポリペプチド（例えば、カルレティキュリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ））およびポリペプチドもしくはペプチド抗原をコードするキメラもしくはハイブリッド核酸分子を用いて、抗原特異的免疫応答、特に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって媒介される応答の増強を誘導するための組成物および方法を提供する。裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡおよび自己複製ＲＮＡレプリコンワクチンが提供される。
【０００３】
背景技術の説明
ＤＮＡワクチンは、抗原特異的免疫療法を誘導するための魅力的な方法となっている。ＤＮＡワクチンの形態としては、「裸の」ＤＮＡ、例えば、プラスミドＤＮＡ（米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，７０３，０５５号）、ウイルスＤＮＡなどが挙げられる。基本的には、所望の免疫原性タンパク質もしくはペプチドをコードするＤＮＡ分子が個体に投与され、タンパク質がｉｎ ｖｉｖｏで生成される。「裸の」ＤＮＡワクチンの使用は、安全であるという利点を有する。なぜならば、例えばプラスミド自体は免疫原性が低く、高純度で容易に調製することができ、そしてタンパク質または他の生物学的試薬と比較して、高度に安定しているからである。しかしながら、ＤＮＡワクチンは効力が限られる。幾つかのストラテジーが、ＤＮＡワクチンの効力を増大するために適用されている。そのようなストラテジーには、例えば、迅速な細胞内分解のための抗原のターゲティング；ＡＰＣ受容体に対するリガンドに融合することによる抗原提示細胞（ＡＰＣ）への抗原の指向；ケモカインもしくは抗原性の病原性配列への抗原の融合、サイトカインもしくは補助的刺激分子またはアジュバント組成物との同時注射が含まれる。
【０００４】
癌ワクチンは、癌治療において魅力的な方法である。なぜならば、癌ワクチンは身体において複数の部位における全身性腫瘍を根絶する効力および新生物性細胞と非新生物性細胞とを識別する特異性を有しうるからである（Ｐａｒｄｏｌｌ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４：５２５−５３１）。免疫系の抗腫瘍効果は、主に細胞性免疫によって媒介される。免疫系の細胞媒介性構成要素は、腫瘍を根絶することができる多数のエフェクター機構を備える、これらの抗腫瘍免疫応答のほとんどが、Ｔ細胞によって調節される。従って、腫瘍特異的Ｔ細胞応答の増強を目的とした癌ワクチン（特にＤＮＡワクチンとして）を開発して、腫瘍を制御することが望まれる。
【０００５】
ＨＰＶ腫瘍形成タンパク質Ｅ６およびＥ７は、ＨＰＶに関連する子宮頸癌のほとんどで共発現されており、細胞トランスフォーメーションの誘導および維持に重要である。従って、Ｅ６もしくはＥ７タンパク質をターゲティングするワクチンは、ＨＰＶ関連子宮頸部悪性腫瘍を予防および治療するための機会を提供しうる。ＨＰＶ−１６ Ｅ７は、よく特性付けられた細胞質／核タンパク質で、ＨＰＶ関連癌細胞においてＥ６よりも保存されており、多くのＨＰＶワクチンに利用されている。
【０００６】
カルレティキュリン（ＣＲＴ）は、細胞の小胞体（ＥＲ）の内腔に位置する豊富な４６キロダルトン（ｋＤａ）タンパク質であり、レクチン活性を示し、そして初期の糖タンパク質の折畳みおよび組立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）に参加する。例えば、Ｎａｓｈ （１９９４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３５：７１−７８；Ｈｅｂｅｒｔ （１９９７） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３９：６１３−６２３；Ｖａｓｓｉｌａｋｏｓ （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：３４８０−３４９０；Ｓｐｉｒｏ （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：１１５８８−１１５９４を参照されたい。ＣＲＴは、抗原プロセシングに関連する輸送体、例えばＴＡＰ−１およびＴＡＰ−２によってＥＲに輸送されたペプチドに会合する（Ｓｐｅｅ （１９９７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：２４４１−２４４９）。またＣＲＴは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドと複合体を形成する。マウスへの投与では、これらの複合体はペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き出した（Ｂａｓｕ （１９９９） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８９：７９７−８０２；Ｎａｉｒ （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２：６４２６−６４３２）。マウスの腫瘍から精製されたＣＲＴは、ＣＲＴが採取された腫瘍に特異的な免疫を引き出したが、抗原的に異なる腫瘍に対しては免疫を引き出さなかった（Ｂａｓｕ， 前掲）。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてマウス樹状細胞（ＤＣ）にＣＲＴ−ペプチド複合体をパルスすること（ｐｕｌｓｉｎｇ）によって、ペプチドがＤＣ上のＭＨＣクラスＩ分子によって再提示され、ペプチド特異的ＣＴＬ応答が刺激された（Ｎａｉｒ，前掲）。
【０００７】
またＣＲＴは抗脈管形成効果を有する。ＣＲＴおよびアミノ酸残基１−１８０を含む断片（「バソスタチン（ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ）」と呼ばれている）は、腫瘍増殖を抑制することができる内皮細胞インヒビターである（Ｐｉｋｅ （１９９９） Ｂｌｏｏｄ． ９４：２４６１−２４６８）。腫瘍増殖および転移は、十分な血液供給の存在に依存する。腫瘍がより大きく増殖するので、十分な血液供給は新しい血管形成（脈管形成とよばれるプロセス）によって確保されることが多い（Ｆｏｌｋｍａｎ （１９８２） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ４０１：２１２−２７；Ｈａｎａｈａｎ （１９９６） Ｃｅｌｌ． ８６：３５３−３６４）。腫瘍の脈管構造を標的とし、損傷を与える治療薬は、腫瘍増殖を防止または遅延させることができ、そして退行もしくは休止を促進することさえもできる。
【０００８】
自己複製ＲＮＡワクチン（ＲＮＡレプリコン）は、核酸ワクチンの重要で、より強力な形態として現れた。ＲＮＡレプリコンワクチンは、アルファウイルスベクター、例えば、シンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８−１１９１）、セムリキ森林ウイルス（Ｙｉｎｇ （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ５：８２３−８２７）またはべネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏ （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１）ベクターから誘導しうる。これらのワクチンは自己複製および自己制御し、そしてＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとして投与され、次いでトランスフェクトした細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡレプリコンに転写されうる（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：５６２−５６５）。自己複製ＲＮＡは、多様な範囲の細胞型に感染し、高レベルで目的の抗原の発現を可能にする（Ｈｕａｎｇ （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７：５３１−５３５）。さらに、ウイルス複製は、感染宿主細胞にとって有毒なので、自己複製ＲＮＡは最終的にはトランスフェクトした細胞の溶解を引き起こす（Ｆｒｏｌｏｖ （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：１１８２−１１９０）。従って、これらのベクターには、宿主ゲノムに組み込まれるという裸のＤＮＡワクチンに関連する懸念が生じない。このことは、潜在的に腫瘍形成性であるタンパク質、例えばＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質をターゲティングするワクチン開発にとって特に重要である。
【０００９】
Ｃｈｅｎ （（２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：１０３５−１０４２）により、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６） Ｅ７抗原とマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ ７０）との連結によりＤＮＡワクチンの効力が増強されることが示された。他の研究では、腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞から単離された熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）複合体を用いた免疫感作は、強力な抗腫瘍（Ｊａｎｅｔｚｋｉ （１９９８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２１：２６９−２７６）または抗ウイルス免疫（Ｈｅｉｋｅｍａ （１９９７） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ５７：６９−７４）を誘導することができることが示されている。また免疫原性ＨＳＰ−ペプチド複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでペプチドとＨＳＰとを混合することで再構成することができる（Ｃｉｕｐｉｔｕ （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７：６８５−６９１）。またＨＳＰに基づくタンパク質ワクチンは、ＨＳＰに抗原を融合することによって投与することができる（Ｓｕｚｕｅ （１９９６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５６：８７３−８７９，「ＨＳＰ ７０融合タンパク質はＨＩＶ−１ ｐ２４に対する体液性および細胞性免疫応答を引き出した（ＨＳＰ ７０ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＨＩＶ−１ ｐ２４）」）。これらの実験により、１）腫瘍細胞もしくはウイルス感染細胞から誘導されたＨＳＰ−ペプチド複合体は、腫瘍もしくはウイルス特異的免疫を刺激することができること；２）この免疫応答の特異性はＨＳＰに結合した腫瘍に由来するペプチドによって引き起こされるのであって、ＨＳＰ自体では引き起こされないこと；および３）免疫応答を、ＨＳＰドナーのＭＨＣと同一または異なるＭＨＣを有するマウスで誘導することができることが示されている（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ （１９９８） Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ４：４７８−４８４；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ （１９９８） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：６５７−６６５）。これらの研究により、ＨＳＰを免疫療法において使用することがより魅力的になった一方、ここまで試験されたＨＳＰワクチンは、タンパク質に基づくワクチンまたはＤＮＡに基づくワクチンの形態のみである。
【００１０】
発明の概要
本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと少なくとも１種の抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸を提供する。抗原性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープを含むことができる。抗原性ペプチド、例えばＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープは、約８アミノ酸残基〜約１１アミノ酸残基の長さであることができる。
【００１１】
小胞体シャペロンポリペプチドには、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン（ｃａｌｎｅｘｉｎ）、タパシン（ｔａｐａｓｉｎ）もしくはＥＲ６０ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のＥＲポリペプチド；あるいはそれらの類似体もしくは擬似体（ｍｉｍｅｔｉｃ）、またはそれらの機能的断片が含まれる。そのような機能的断片は、例えば下記の実施例１および２に記載されるような、慣例のスクリーニング試験を用いてスクリーニングすることができる。従って、別の実施形態では、小胞体シャペロンポリペプチドは、カルネキシンポリペプチドまたはその等価物、ＥＲ６０ポリペプチドまたはその等価物、ＧＲＰ９４／ＧＰ９６もしくはＧＲＰ９４ポリペプチドまたはその等価物、あるいはタパシンポリペプチドまたはその等価物を含むか、またはからなる。
【００１２】
一実施形態において、カルレティキュリンポリペプチドは、ヒトカルレティキュリンポリペプチドを含む。別の実施形態において、ヒトカルレティキュリンポリペプチド配列は配列番号１を含むか、あるいは本質的に配列番号１の第１残基付近〜第１８０残基付近の配列からなるか、または本質的に配列番号１の第１８１残基付近〜第４１７残基付近の配列からなることができる。
【００１３】
一実施形態において、抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープ）は、病原体から誘導される。例えば抗原は、病原体によって発現されるペプチドを含む。病原体は、例えばパピローマウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ−１などの免疫不全ウイルス）、アデノウイルスなどのウイルスであることができる。パピローマウイルスはヒトパピローマウイルスであってよく；例えば、抗原（例えば、クラスＩ結合性ペプチドエピトープ）をＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチドから誘導することができる。一実施形態において、ＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチドは実質的に非腫瘍形成性である。すなわち、ＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチドは網膜芽細胞腫ポリペプチド（ｐＲＢ）に結合しないか、あるいはｉｎ ｖｉｖｏで発現または送達された場合に、ＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチドが事実上、非腫瘍形成性である程度に低い親和性でｐＲＢに結合する。
【００１４】
別の実施形態において、病原体は細菌、例えば、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；エーリキア・チャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）；スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）；レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）；サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）；マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）； マイコバクテリウム・ツベルクローシス；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）；クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；リケッチシア・リケッチー（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）；または例えばパラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）などの真菌；あるいは、他の病原体、例えばプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である。
【００１５】
別の実施形態において、ＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープは腫瘍細胞から誘導される。腫瘍細胞に由来するペプチドエピトープは、腫瘍関連抗原、例えば、腫瘍特異的抗原（例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原など）を含むことができる。
【００１６】
一実施形態において、単離されたまたは組換え核酸分子は、例えば、構成的、誘導性または組織特異的プロモーターなどのプロモーターに機能的に連結される。プロモーターは、免疫系の細胞（例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む）を含む任意の細胞において、例えば構成的、誘導性または組織特異的な方法で発現させることができる。
【００１７】
別の実施形態において、ＡＰＣは、樹状細胞、ケラチノサイト、星状細胞、単球、マクロファージ、Ｂリンパ球、小膠細胞または活性化内皮細胞などである。
【００１８】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと少なくとも１種の抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。別の実施形態において、第１ドメインはカルレティキュリンポリペプチドを含み、そして第２ドメインはＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープを含む。別の実施形態において、発現カセットは発現ベクター、組換えウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、プラスミドを含む。発現カセットは自己複製ＲＮＡレプリコンを含むことができる。自己複製ＲＮＡレプリコンは、シンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクター、例えばシンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクターＳＩＮｒｅｐ５（米国特許第５，２１７，８７９号）などを含むことができる。本発明の適用可能な実施形態の全てと同様に、ＥＲシャペロンポリペプチドは、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、１、タパシンもしくはＥＲ６０ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のＥＲポリペプチド；あるいはそれらの類似体もしくは擬似体、またはそれらの機能的断片を含むことができる。
【００１９】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと少なくとも１種の抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸を含む粒子を提供する。一実施形態においては、少なくとも２種のドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを含む単離された粒子であって、この場合、第１ドメインはカルレティキュリンポリペプチドを含み、そして第２ドメインはＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープを含む。単離された粒子は、パーティクルボンバードメント（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）に好適な任意の物質（例えば、金など）を含むことができる。ＥＲシャペロンポリペプチドは、本明細書で論じたように、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン、タパシンもしくはＥＲ６０ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のＥＲポリペプチドを含むことができる。
【００２０】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと少なくとも１種の抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含むキメラタンパク質をコードする核酸配列を含む細胞を提供する。一実施形態において、細胞は、第１ドメインがカルレティキュリンポリペプチドを含み、そして第２ドメインがＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープを含む、少なくとも２種のドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットを含む。細胞を、例えば本発明の核酸でトランスフェクト、感染、形質導入させることができ、あるいは本発明の組換えウイルスで感染させることができる。細胞は、本発明の発現カセットを含む細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物から単離することができる。例えば免疫系の細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）などのいずれの細胞も本発明の発現カセットを含むことができる。ＡＰＣは、樹状細胞、ケラチノサイト、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、星状細胞、小膠細胞または活性化内皮細胞であってよい。
【００２１】
また本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと少なくとも１種の抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含むキメラポリペプチドを提供する。抗原性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープを含むことができる。例えばｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成的にまたは組換え的に生産することができる、例えば融合タンパク質のように（例えば、ペプチド結合）、ＥＲシャペロンポリペプチドを抗原性ペプチドに化学的に連結することができる。ポリペプチドドメインを、柔軟性のある化学的リンカーによって連結することができる。
【００２２】
別の実施形態において、キメラポリペプチドの第１ポリペプチドドメインが第２ポリペプチドドメインよりもアミノ末端に近くてもよく、または第２ポリペプチドドメインが第１ポリペプチドドメインよりもアミノ末端に近くてもよい。ＥＲシャペロンポリペプチドは、本明細書で論じたように、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン、タパシンもしくはＥＲ６０ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のＥＲポリペプチドを含むことができる。
【００２３】
本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる本発明の組成物と製薬上許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、組成物は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、を含む。ＥＲシャペロンポリペプチドは、本明細書で論じたように、典型的なシャペロンである、カルレティキュリン、カルネキシン、タパシンもしくはＥＲ６０ポリペプチドに類似のシャペロン機能を有する任意のＥＲポリペプチドを含むことができる。
【００２４】
本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導または増強する方法であって、（ａ）抗原特異的免疫応答を誘導または増強することができる本発明の組成物（別の実施形態においては、該組成物は、小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、であることができる）を含む組成物を提供し、そして（ｂ）抗原特異的免疫応答を誘導または増強するのに十分な量の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。抗原特異的免疫応答は、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答のような細胞性応答を含みうる。また抗原特異的免疫応答は、抗体媒介応答または体液性応答および細胞性応答を含みうる。
【００２５】
上記方法を実施する上で、組成物をｅｘ ｖｉｖｏで投与しても、または組成物をｅｘ ｖｉｖｏで抗原提示細胞（ＡＰＣ）に投与してもよい。別の実施形態において、ＡＰＣは、樹状細胞、ケラチノサイト、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、星状細胞、小膠細胞または活性化内皮細胞である。ＡＰＣは、ヒト細胞であってよい。ＡＰＣは、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ供給源から単離することができる。さらに上記方法は、ｅｘ ｖｉｖｏ処置されたＡＰＣを、哺乳動物、ヒト、組織適合性の個体に、またはＡＰＣを単離した同一の個体に投与することを含むことができる。あるいは、組成物は、哺乳動物、例えばヒトにｉｎ ｖｉｖｏで直接投与される。
【００２６】
組成物を、筋内、皮内または皮下に投与することができる。組成物、例えば核酸、発現カセットまたは粒子は、バリスティックインジェクション（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって投与することができる。組成物を、腫瘍内または腫瘍周辺に投与することができる。
【００２７】
上記方法の別の実施形態において、抗原性ペプチドはヒトパピローマウイルスなどのウイルスから誘導することができる。抗原性ペプチドは、ＨＰＶ−１６ Ｅ７ペプチドであることができる。抗原性ペプチドは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕペプチドなどの腫瘍特異的もしくは腫瘍関連ペプチドであることができる。
【００２８】
本発明は、個体において所望の抗原に特異的なＣＤ８＋ＣＴＬの数を増大する方法であって、（ａ）小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、を含む組成物（この場合、ＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープは抗原から誘導される）を提供し、そして（ｂ）抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの数を増大するのに十分な量の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２９】
本発明は、個体において腫瘍の増殖を阻害する方法であって、（ａ）小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含むキメラポリペプチド；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸分子；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット；小胞体シャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む粒子；または小胞体シャペロンポリペプチドコード配列を含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む細胞、を含む組成物を提供し、そして（ｂ）腫瘍の増殖を阻害するのに十分な量の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。本発明の一実施形態において、組成物は、腫瘍内にまたは腫瘍周辺に投与される。組成物を、抗脈管形成活性を含む第２組成物、例えばアンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）もしくはＴＩＭＰ−２またはそれらの等価物、あるいはそれらの混合物などとともに同時投与することができる。組成物を、放射線療法または化学療法組成物とともに同時投与することができる。
【００３０】
また本発明は、例えばＥＲシャペロンと抗原性ペプチド、熱ショックタンパク質と抗原性ペプチド、ならびにそれらの等価物およびそれらの混合物を含むキメラタンパク質を含めた、本発明の免疫応答増強融合タンパク質をコードする核酸を含む自己複製ＲＮＡウイルス構築物を提供する。一実施形態において、自己複製ＲＮＡウイルスは、下記の実施例２で論じるような、ＳＩＮｒｅｐ５などのシンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクターを含む。
【００３１】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、添付した図面と下記の記載で説明される。本発明の他の特徴、目的および利点は、記載および図面ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３２】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ配列およびＡＴＣＣ寄託物は、全ての目的のために参照により本明細書に明らかに組み入れられるものとする。
【００３３】
好ましい実施形態の説明
本発明は、小胞体シャペロンポリペプチドと少なくとも１種の抗原性ペプチドとを含むキメラポリペプチドのｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ投与によって誘導される、免疫応答、特に細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答を増強するための組成物および方法を提供する。キメラポリペプチドは、キメラ分子をコードする核酸の投与によって「間接的に」投与することができ、核酸構築物、従って融合タンパク質がｉｎ ｖｉｖｏで発現される。一実施形態において、キメラ核酸またはポリペプチドは、ＤＮＡワクチンの形態で投与される。
【００３４】
融合タンパク質は、少なくとも２種のドメインを含む。第１ドメインは小胞体シャペロンポリペプチドを含み、そして第２ドメインは、それに対する免疫応答を誘導することが望まれる抗原から誘導されたペプチドを含む。カルレティキュリン、タパシン、ＥＲ６０もしくはカルネキシンポリペプチドなどの小胞体シャペロンポリペプチドまたはそれらの機能的断片もしくは変異体のいずれも本発明に用いることができる。
【００３５】
キメラ分子の第２ドメインは、それに対する免疫応答の誘導、増強もしくは抑制が望まれる病原体、癌または任意の供給源から誘導することができる抗原性ペプチドを含む。一実施形態において、ペプチドはＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープを含む。
【００３６】
本発明の方法において、キメラポリペプチドまたはそれをコードする核酸が免疫応答を誘導または増強するために適用される。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫学的機構および抗脈管形成機構の双方を介して免疫応答および抗腫瘍効果を相乗的に増強する。
【００３７】
本明細書に記載の実験により、本発明の方法がヒト病原体のエピトープをコードするＤＮＡワクチンによって誘導される、細胞性免疫応答、特にＣＴＬ反応性を増強できることが示されている。ヒトＨＰＶ−１６ Ｅ７を用いた。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、特にＨＰＶ−１６がヒト子宮頚癌のほとんどに関連するので、ワクチン開発にとってヒトＨＰＶ−１６ Ｅ７はモデル抗原である。腫瘍形成性ＨＰＶタンパク質Ｅ７は、細胞トランスフォーメーションの誘導と維持に重要であり、ＨＰＶ含有子宮頸癌およびそれらの前駆体病変のほとんどで共発現される。従って、Ｅ７を標的とする本発明の組成物のような癌ワクチンを用いて、ＨＰＶ関連新生物を制御することができる（Ｗｕ （１９９４） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：７４６−７５４）。
【００３８】
下記の実施例１に記載するように、これらの実験結果より、全長Ｅ７ポリペプチドに連結されたＣＲＴを含む融合タンパク質をコードする核酸を含むＤＮＡワクチンは、ＤＮＡワクチンの効力を増強できることが示されている。キメラＣＲＴ／Ｅ７融合遺伝子を含有する本発明のＤＮＡワクチンを、バリスティック皮下方法によってマウスに投与した。それらは、Ｅ７特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ前駆体の増大を誘導し、それによって腫瘍に対する免疫保護が改善された。Ｅ７特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ前駆体のこの増大は、野生型Ｅ７もしくはＣＲＴ遺伝子を単独で含有するＤＮＡワクチンと比較して有意なものであった。
【００３９】
さらに、ＣＲＴ ＤＮＡもしくはキメラＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡのいずれかを用いたＣ５７ＢＬ／６マウス（正常な免疫系を有する近交系統）もしくはヌードマウス（Ｔ細胞および機能的な免疫系を欠いた系統）を処置することで、肺転移結節が低減され、肺結節内での脈管形成が阻害された。従って、キメラＣＲＴ／Ｅ７をコードする本発明のＤＮＡワクチンは、強力な抗腫瘍効果の発生のための免疫学的方法と抗腫瘍形成的方法とを組み合わせた特有の方法を示す。
【００４０】
上記で論じたように、研究により熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）を免疫療法において使用することがより魅力的となった一方、ここまで試験されたＨＳＰワクチンは、タンパク質に基づくワクチンまたはＤＮＡに基づくワクチンの形態にすぎない。本発明により、初めて自己複製ＲＮＡワクチンの形態にあるＨＳＰなどの抗原および本発明のキメラポリペプチドの投与が組み入れられ、そして示される。
【００４１】
下記の実施例２に記載されるように、自己複製ＲＮＡワクチン中のＨＳＰ７０−ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＳＰ−１６）Ｅ７融合タンパク質の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現された場合にこの抗原性ポリペプチドの効力を大いに増強した。下記に記載する結果により、Ｅ７／ＨＳＰ７０融合遺伝子を含有するＲＮＡレプリコンワクチンは、ワクチン接種したマウスにおいて野生型Ｅ７遺伝子を含有するワクチンよりもかなり高いＥ７特異的Ｔ細胞媒介免疫応答を誘導したことが示された。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞に由来するＥ７抗原を、骨髄由来樹状細胞によって取り込ませ、野生型Ｅ７ ＲＮＡレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞よりもＭＨＣクラスＩ経路を介して効率的に呈示させることができることが示された。Ｅ７へのＨＳＰ７０の融合は、あまり効果的でないワクチンをＥ７発現腫瘍に対する有意な効力を有するワクチンへと変えた。これらの結果より、自己複製ＲＮＡワクチンの使用は本発明の融合タンパク質の免疫原性を増強できることが示された。
【００４２】
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の増強に対する可能性のある機構は、抗原を発現する細胞からのアポトーシス小体（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｏｄｙ）の取り込みによるＭＨＣクラスＩ経路を介した抗原提示であり、「クロスプライミング」とも呼ばれる。下記の実施例２で論じるように、ＣＴＬアッセイにより、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡによってトランスフェクトしたアポトーシス細胞をパルスした骨髄由来樹状細胞におけるＨＰＶ Ｅ７ポリペプチドのＭＨＣクラスＩ提示の増強が示された。
【００４３】
定義
別段定義しない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は別段特記しない限りそれらに特有のものとされる意味を有する。
【００４４】
本明細書で使用する「抗脈管形成活性」という用語は、血管増殖（例えば、毛細血管、細動脈など）阻害のいずれの形態をも意味する。従って、そのような活性には、血管またはその置換物の増殖の遅延が含まれ、例えば、内皮細胞の増殖の遅延または阻害が挙げられるだろう。
【００４５】
本明細書で使用する「抗原」または「免疫原」という用語は、適切な量（「免疫原性上有効な量）」で投与した（または投与された核酸、例えばＤＮＡワクチンによってｉｎ ｖｉｖｏで発現された）場合に「抗原性」または「免疫原性」である、すなわち単独で、あるいは別の物質と組み合わせてまたは連結もしくは融合して（１回でまたはいくらかの間隔にわたって投与することができる）、細胞性および／または体液性免疫応答を、引き出し、増大しまたは増進することができる、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む化合物または組成物を意味する。
【００４６】
「カルネキシン」は、分子シャペロンとしておよびＥＲ品質管理機構の成分として機能する小胞体（ＥＲ）のよく特性付けられた膜タンパク質を示す。カルレティキュリンは、カルネキシンの可溶性類似体である。ｉｎ ｖｉｖｏでカルレティキュリンおよびカルネキシンは、タンパク質合成、折畳みおよび翻訳後修飾中の品質管理に重要な役割を果たす。カルネキシンポリペプチドならびにそれらの等価物および類似体は、本明細書で記載されるようにＥＲシャペロンポリペプチド属における種である（Ｗｉｌｓｏｎ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：２１２２４−２１３２；Ｄａｎｉｌｃｚｙｋ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１３０８９−１３０９７；米国特許第６，０７１，７４３号および第５，６９１，３０６号）。
【００４７】
「カルレティキュリン」または「ＣＲＴ」は、レクチン活性を有し、そして初期の糖タンパク質の折畳みおよび組立てに参加する、よく特性付けられたＥＲ内腔の約４６ｋＤａ内在タンパク質を示す。ＣＲＴは「シャペロン」ポリペプチドとして、およびＭＨＣクラスＩ輸送体ＴＡＰ複合体のメンバーとして働く。ＣＲＴは、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２輸送体、タパシン、ＭＨＣクラスＩ重鎖ポリペプチドならびにβ２ミクログロブリンと会合して初期のＭＨＣクラスＩ分子上へのペプチドエピトープのローディングにおいて機能する（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ （２０００） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７：２９４５−２９５４）。「カルレティキュリン」または「ＣＲＴ」という用語は、本明細書に記載する典型的なＣＲＴ配列に対して実質的な同一性（本明細書で規定する）を有するポリペプチドおよび核酸分子を意味する。ＣＲＴポリペプチドは、ＣＲＴのアミノ酸配列に同一な、または実質的に同一な（本明細書で規定する）配列を含むポリペプチドである。本発明の組成物および方法で使用するＣＲＴの典型的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２である。「カルレティキュリン」または「ＣＲＴ」という用語は、天然タンパク質、ならびにＣＴＬ応答を含む免疫応答を誘導する組換え的に産生した改変タンパク質を包含する。「カルレティキュリン」または「ＣＲＴ」という用語は、ＣＲＴの相同体および対立遺伝子変異体を包含し、これらにはｉｎ ｖｉｔｒｏ技法によって構築された天然タンパク質の変異体および天然供給源から単離されたタンパク質が含まれる。また本発明のＣＲＴポリペプチドおよびそれらをコードする配列には、非ＣＲＴ配列、特にＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドを含む融合タンパク質；またさらに他のドメイン、例えばエピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含む融合タンパク質が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用する「小胞体シャペロンポリペプチド」という用語は、典型的なシャペロンタンパク質である、ＣＲＴ、タパシン、ＥＲ６０もしくはカルネキシンと実質的に同じＥＲシャペロン機能を有するいずれのポリペプチドをも意味する。従って、この用語には、それらの全ての機能的断片または変異体もしくは擬似体が含まれる。ポリペプチドもしくはペプチドを、実施例１で説明するような当技術分野で公知のアッセイを用いてＥＲシャペロンとしてのその活性について慣例的にスクリーニングすることができる。本発明は特定の作用機構のいずれによっても限定されないが、ｉｎ ｖｉｖｏでシャペロンは、ＭＨＣクラスＩへテロ三量体分子（重（Ｈ）鎖、β２ｍおよびペプチド）の組立てを含めたＥＲにおける多くの糖タンパク質の正確な折畳みおよびオリゴマー化を促進する。またそれらは、不完全に組立てられたＭＨＣクラスＩへテロ三量体複合体をＥＲに保持する（Ｈａｕｒｉ （２０００） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４７６：３２−３７）。
【００４９】
本明細書で使用する「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用する抗原決定基または抗原性部位、例えば本発明の方法に用いられるＭＨＣクラスＩ結合性ペプチド組成物を意味する。「抗原」とは、免疫応答を誘導するか、あるいは抗体またはＣＴＬなどの免疫応答の産物によって特異的に認識または結合される分子または化学構造である。抗体またはＴＣＲが結合する特異的な配座もしくは立体化学的「ドメイン」が「抗原決定基」または「エピトープ」である。ＴＣＲは、第３の分子、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩもしくはクラスＩＩタンパク質と物理的に会合するペプチドエピトープに結合する。
【００５０】
本明細書で使用する「ＥＲ６０」または「ＧＲＰ９４」または「ｇｐ９６」または「グルコース調節タンパク質９４」という用語は、ストレス誘導タンパク質の熱ショックタンパク質−９０（ＨＳＰ９０）ファミリーのＥＲ代表種である、よく特性付けられたＥＲシャペロンポリペプチドを示す。これらは、恐らくは先進の折畳み中間体または不完全に組立てられたタンパク質を認識することによって、分泌経路において限定された数のタンパク質に結合する。ＥＲ６０ポリペプチドならびにそれらの等価物および類似体は、本明細書で記載するように、ＥＲシャペロンポリペプチド属における種である（Ａｒｇｏｎ （１９９９） Ｓｅｍｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．． Ｂｉｏｌ． １０：４９５−５０５；Ｓａｓｔｒｙ （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：１２０２３−１２０３５；Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ （１９９８） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１０３−１０９；米国特許第５，９８１，７０６号）。
【００５１】
本明細書で使用する「発現カセット」または「発現ベクター」という用語は、そのような配列と適合する宿主においてタンパク質コード配列の発現に影響を及ぼすことができるヌクレオチド配列を意味する。発現カセットには、ポリペプチドコード配列に；および場合によっては、他の配列、例えば転写終結シグナルに機能的に連結された少なくとも１つのプロモーターが含まれる。また、発現の達成に必要なまたは役立つさらなる因子、例えばエンハンサーを含むことができる。「機能的に連結された」とは、プロモーターがＤＮＡ配列の転写に介在するようなＤＮＡ配列の上流へのプロモーターの連結を意味する。従って、発現カセットには、プラスミド、組換えウイルス、「裸のＤＮＡ」組換えベクターの任意の形態などが含まれる。「ベクター」は、細胞に感染、トランスフェクト、一過的にもしくは永続的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは裸の核酸またはタンパク質もしくは脂質と複合体化した核酸であることができることは理解されよう。場合によっては、ベクターはウイルスもしくは細菌の核酸および／またはタンパク質、および／または膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど）を含む。ベクターには、限定されるものではないが、ＤＮＡ断片を備え、複製させることができるレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン（下記の実施例２を参照されたい）、バクテリオファージ）が含まれる。従って、ベクターとしては、限定されるものではないが、ＲＮＡ、自律自己複製環状もしくは線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えばプラスミド、ウイルスなどが挙げられ（米国特許第５，２１７，８７９号）が挙げられ、発現プラスミドおよび非発現プラスミドの双方が含まれる。組換え微生物または細胞培養物が発現ベクターの宿主として記載されている場合には、これには染色体外の環状および線状のＤＮＡならびに宿主染色体に組み込まれたＤＮＡの双方が含まれる。ベクターが宿主細胞によって維持されている場合には、ベクターは自律構造として有糸分裂の間に細胞によって安定して複製されるか、または宿主ゲノム内に組み込まれうる。
【００５２】
「化学的に連結された」という用語は、２つの部分の化学結合のいずれをも意味し、例えば、本発明の一実施形態において、ＥＲシャペロンポリペプチドが抗原性ペプチドに化学的に連結されることである。このような化学的連結としては、組換え的に、またはｉｎ ｖｉｖｏで生成された融合タンパク質のペプチド結合が挙げられる。
【００５３】
「キメラ」もしくは「融合」ポリペプチドもしくはタンパク質という用語は、第２のポリペプチドもしくはペプチドドメインと会合した少なくとも１つのポリペプチドもしくはペプチド配列もしくはドメインを含む組成物を意味する。本発明の一実施形態は、第１ドメインが小胞体シャペロン、例えばＣＲＴを含み、そして第２ドメインが抗原性エピトープ、例えばＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープを含むものである、少なくとも２つのドメインを含む融合タンパク質をコードする単離されたまたは組換え核酸分子である。付加的ドメインは、ポリペプチド、ペプチド、多糖類などを含むことができる。「融合」は、ペプチド結合、化学的連結、電荷相互作用（例えば、塩橋、Ｈ−結合などの静電引力）などによって生じた会合であることができる。ポリペプチドが組換え体である場合、「融合タンパク質」は一般的なメッセージから翻訳することができる。あるいは、ドメインの組成物を任意の化学的もしくは静電的手段によって連結することができる。また本発明のキメラ分子（例えば、ＣＲＴ−クラスＩ結合性ペプチド融合タンパク質）は、付加的配列、例えばリンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含むことができる。あるいは、ペプチドを単純に担体に連結し、ペプチドの操作または同定／位置決定を容易にすることができる。
【００５４】
「免疫原」または「免疫原性組成物」という用語は、「免疫原性」である、すなわち単独で、あるいは別の物質と組み合わせてまたは連結もしくは融合して、細胞性および／または体液性免疫応答を、引き出し、増大しまたは増進することができる、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む化合物または組成物を意味する。免疫原性組成物は、少なくとも約５アミノ酸の長さのペプチド、１０アミノ酸の長さのペプチド、１５アミノ酸の長さの断片、２０アミノ酸の長さの断片またはそれより大きいものであってよく；より小さい免疫原は、例えば好ましくは免疫原に連結された（化学的にまたは別な方法で）融合タンパク質、凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、コンジュゲートまたは混合物のような「担体」ポリペプチドの存在が必要である場合がある。免疫原は、ワクチンベクター（プロモーターに機能的に連結された免疫原コード配列を含む裸のＤＮＡであってよく、例えば、発現カセット）から組換え的に発現させることができる。免疫原は、約３〜約１５アミノ酸のサイズで変化しうる１以上の抗原決定基もしくはエピトープを含む。
【００５５】
例えばＣＲＴ核酸またはポリペプチドなどの分子または組成物に言及する場合には、本明細書で使用する「単離された」という用語は、分子または組成物がｉｎ ｖｉｖｏまたはその天然の状態で会合するタンパク質、他の核酸（例えばＲＮＡ）または他の混在物などの少なくとも１つの他の化合物から分離されたことを意味する。従って、ＣＲＴ組成物は、細胞抽出物中のように、天然には会合する任意の他の成分（例えば細胞膜）から単離された場合に、単離されたとみなされる。しかしながら、また単離された組成物は実質的に純粋でありうる。単離された組成物は、均一状態にあってよく、そして乾燥していても、または水溶液中にあってもよい。純度および均一性は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分析化学技法を用いて測定することができる。従って、単離された本発明の組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕ環境でそれらと通常会合する物質を含まない。タンパク質を均一なもしくは主要なバンドで単離した場合でさえも、所望のタンパク質とともに同時精製する微量混在物が存在する。
【００５６】
本明細書で使用する「ＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチドが非腫瘍形成性である」というフレーズは、網膜芽細胞腫ポリペプチド（ｐＲＢ）に結合しないか、またはＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチド変異体が実質的に非腫瘍形成性である程度に低い親和性でｐＲＢに結合する、ＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチドの変異体（例えば、欠失、置換など）を意味する。ＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチドを含むＨＰＶポリペプチドは、当技術分野で十分に記載されている。ＨＰＶ−１６ Ｅ７については、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２５６７３（１９９９年６月１日）が完全なＨＰＶ−１６ゲノムおよび配列番号５の配列を有するＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質（下記を参照されたい）を示す。
【００５７】
「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語には、変異体を誘導したポリペプチドに実質的に対応する構造と活性を有する「類似体」もしくは「保存的変異体」および「擬似体」もしくは「ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」をも含む本発明の組成物が含まれ、例えば下記で詳細に論じるような、ヒトＣＲＴまたはＨＰＶ−１６ Ｅ７ポリペプチドなどのクラスＩ結合性ペプチドエピトープが挙げられる。
【００５８】
「医薬組成物」という用語は、例えば被験者におけるワクチンとしての医薬的使用に好適な組成物を意味する。本発明の医薬組成物は、例えば本発明の核酸もしくはベクターもしくは細胞を含む組成物の薬理学上有効な量と製薬上許容される担体とを含む製剤である。
【００５９】
「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指令する一連の核酸制御配列である。本明細書で使用する場合、プロモーターは、転写開始部位近くの必要な核酸配列（例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にはＴＡＴＡエレメント）を含む。また場合によっては、プロモーターは転写開始部位から数千塩基対ほどの位置に位置することができる遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性のあるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生調節下にあるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、生物の特定の組織型中で活性であるが、同じ生物の他の組織型中では活性ではない。「機能的に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（プロモーターまたは一連の転写因子結合部位など）と第２核酸配列との間の機能的連結を意味し、この場合、発現制御配列は第２配列に対応する核酸の転写を指令する。
【００６０】
「組換え」という用語は、（１）合成された、またはその他の方法でｉｎ ｖｉｔｒｏで操作されたポリヌクレオチド（例えば「組換えポリヌクレオチド」）、（２）細胞または他の生物系で遺伝子産物を産生するための組換えポリヌクレオチドの使用方法、あるいは（３）組換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド（「組換えタンパク質」）を意味する。例えば、組換えＣＲＴまたはＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープは、本発明を実施するために使用する場合には組換え体であってよい。また「組換え手段」は、異なる供給源に由来する様々なコード領域もしくはドメインもしくはプロモーター配列を有する核酸の発現カセットもしくは発現用ベクター（例えば、本発明を実施するために用いられるベクター中のポリペプチドコード配列の誘導性または構成的発現用）への連結を包含する。
【００６１】
「自己複製ＲＮＡレプリコン」という用語は、異種ＲＮＡおよびタンパク質の発現を可能にするように遺伝子工学的に操作された、ＲＮＡウイルス、例えばアルファウイルスゲノムＲＮＡ（例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスなど）に基づく構築物を意味する。これらの組換えベクターは自己複製し、下記で詳細に説明するように、裸のＲＮＡもしくはＤＮＡとして細胞に導入することができる。一実施形態において、自己複製ＲＮＡレプリコンは、シンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクターＳＩＮｒｅｐ５（米国特許第５，２１７，８７９号に詳細に記載されている）を含む。
【００６２】
「全身投与」という用語は、被験者の循環系への組成物の導入をもたらす方法での、本明細書で記載する分子ワクチンまたはＣＲＴ−クラスＩ結合性ペプチドエピトープ融合タンパク質などの組成物もしくは薬剤の投与を意味する。「局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）」投与という用語は、腹腔内、髄腔内、硬膜下などの特定の解剖学的空間への、または特定の器官などに対する組成物の投与を意味する。例えば、局所投与は肝動脈への組成物もしくは薬物の投与を含む。「局部（ｌｏｃａｌ）投与」という用語は、腫瘍塊への腫瘍内注射、皮下注射、筋内注射などの、限定されたまたは限局性の解剖学的空間への組成物もしくは薬物の投与を意味する。当業者であれば、また局部投与または局所投与は循環系への組成物もしくは薬物のエントリーをもたらしうることが理解されるだろう。
【００６３】
「タパシン」は、上記で論じたように公知のＥＲシャペロンポリペプチドである。特定の作用機構のいずれによっても限定されないが、ｉｎ ｖｉｖｏでタパシンは、ＴＡＰ（抗原プロセシングに関連する輸送体）複合体のサブユニットであり、ＴＡＰ１およびＭＨＣクラスＩポリペプチドの双方に結合する。タパシンポリペプチドならびにそれらの等価物および類似体は、本明細書で記載されるようにＥＲシャペロンポリペプチド属における種である（Ｂａｒｎｄｅｎ （２０００） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５：３２２−３３０；Ｌｉ （２０００） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１５８１−１５８６）。
【００６４】
核酸の生成と操作
本発明の方法は、上記したように、ＣＲＴ−クラスＩエピトープ結合性ペプチド融合タンパク質をコードする核酸の投与を提供するものである。組換えＣＲＴ含有融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで合成することができる。これらの組成物をコードする核酸は、「裸のＤＮＡ」の形態であってよく、あるいはｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ投与のためにプラスミド、ベクター、組換えウイルス（例えば「レプリコン」）などに組み込むことができる。本発明の核酸およびベクターを作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができ、これらの遺伝子およびベクターを作製および発現する様々な手段を用いることができる。当業者であれば、所望の遺伝子活性を、本発明を実施するために用いるベクター内の遺伝子および核酸（例えば、プロモーター）の発現もしくは活性をモジュレートすることによって得ることができることは理解されよう。遺伝子の発現もしくは活性または組織特異性を増大または低減するために記載される公知の方法のいずれも本発明のために使用することができる。本発明は、科学文献および特許文献において十分に記載されている当技術分野で公知の任意の方法またはプロトコールと組み合わせて実施することができる。
【００６５】
一般的技法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、組換えウイルスまたはそれらのハイブリッドのいずれであれ、本発明を実施するために用いる核酸配列は、様々な供給源から単離し、遺伝子工学的に操作し、増幅し、および／または組換え的に発現させることができる。細菌細胞に加えて、例えば哺乳動物、酵母、昆虫もしくは植物細胞発現系を含めた任意の組換え発現系を使用することができる。あるいは、例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ （１９８２） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ （１９８３） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ （１９９５） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０；Ｂｒｏｗｎ （１９７９） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ （１９８１） Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されるような周知の化学合成技法によって、これらの核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができる。次いで二本鎖ＤＮＡ断片を、相補鎖を合成し、適切な条件下で一緒にそれらの鎖をアニーリングさせることによって、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を添加することによって得ることができる。
【００６６】
ヒトＣＲＴを含めたＣＲＴの配列は、当技術分野で周知である（ＭｃＣａｕｌｉｆｆｅ （１９９０） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８６：３３２−３３５；Ｂｕｒｎｓ （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６７：４７６−４８０；Ｃｏｐｐｏｌｉｎｏ （１９９８） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３０：５５３−５５８）。核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００４３４３として載っており、配列番号１である。
【００６７】
2004527213.tif 000003
2004527213.tif 000004
【００６８】
核酸の操作技法、例えば配列における突然変異生成、サブクローニング、プローブ標識、配列決定分析、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献および特許文献に十分に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ （第２版），第１−３巻， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， （１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ａｕｓｕｂｅｌ編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９７）；ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ ＩＮ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ ＷＩＴＨ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＰＲＯＢＥＳ， Ｐａｒｔ Ｉ． Ｔｉｊｓｓｅｎ編， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ． （１９９３）を参照されたい。
【００６９】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチドなどを、当業者に周知の多数の一般的手段のうちいずれかによって分析し、定量化することができる。これらとしては、例えば、ＮＭＲ、分光測光法、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーなどの生化学的分析方法、様々な免疫学的方法、例えば液体もしくはゲル沈降素反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、他の核酸もしくは標的もしくはシグナル増幅方法、放射標識、シンチレーション計数法およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【００７０】
核酸の増幅
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸を増幅して、本発明を実施するために用いる融合タンパク質コード配列を生成し、ｉｎ ｖｉｖｏ投与後のワクチンレベル（例えば、プラスミドもしくはウイルスレベル）をモニターし、活性化ＣＴＬの存在および表現型を確認することなどができる。当業者であれば、既知配列（例えば、配列番号１）を用いて好適なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択し、設計することができる。また増幅方法は当技術分野で周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９９０）およびＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ （１９９５）， Ｉｎｎｉｓ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ） （Ｗｕ （１９８９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ （１９９０） Ｇｅｎｅ ８９：１１７）；転写増幅（Ｋｗｏｈ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１１７３）；および自立配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１８７４）；Ｑβレプリカーゼ増幅（Ｓｍｉｔｈ （１９９７） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３５：１４７７−１４９１；Ｂｕｒｇ （１９９６） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ １０：２５７−２７１）ならびに他のＲＮＡポリメラーゼ介在技法（ＮＡＳＢＡ， Ｃａｎｇｅｎｅ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ；Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３０７−３１６；米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３−５６４）が挙げられる。
【００７１】
発現カセットのクローニングおよび構築
本明細書に記載の融合タンパク質をコードする、プラスミド、組換えウイルス（例えば、下記に記載のレプリコンのようなＲＮＡウイルス）および他のベクターを含めた発現カセットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでこれらのポリペプチドを発現するために用いられる。組換え核酸は、様々な従来技法（Ｒｏｂｅｒｔｓ （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ （１９９５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ６４３５：１０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前掲；Ｔｉｊｓｓｅｎ，前掲；Ａｕｓｕｂｅｌ，前掲）によって発現される。プラスミド、ベクターなどは、天然供給源から単離するか、ＡＴＣＣもしくはＧｅｎＢａｎｋライブラリーなどの供給者から入手するか、または合成もしくは組換え方法によって調製することができる。
【００７２】
本発明を実施するために用いる核酸を、エピソーム発現系などの細胞において安定してまたは一過的に発現させることができる。選択マーカーを組み込み、形質転換細胞に選択可能な表現型を供与することができる。例えば、選択マーカーは、宿主ゲノムへの組込みを必要としないようにエピソーム維持および複製をコードすることができる。例えば、マーカーが抗生物質耐性（例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン）をコードすることで、所望のＤＮＡ配列で形質転換した細胞の選択を可能にすることができる（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ （１９９７） Ｇｅｎｅ １９０：３１５−３１７；Ａｕｂｒｅｃｈｔ （１９９７） Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８１：９９２−９９７）。
【００７３】
ｉｎ ｖｉｖｏ核酸投与
一実施形態において、ＣＲＴ−クラスＩ結合性ペプチドエピトープをコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで細胞にトランスフェクトまたは感染することができるプラスミドまたは他のベクター、ウイルスなどの発現カセットにクローニングされる。多数の送達手法が知られており、脂質もしくはリポソームに基づく遺伝子送達（Ｍａｎｎｉｎｏ （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９１；米国特許第５，２７９，８３３号）、レトロウイルスゲノムの一部として所望の外因性配列を有する複製欠陥レトロウイルスベクター（Ｍｉｌｌｅｒ （１９９０） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：４２３９；Ｋｏｌｂｅｒｇ （１９９２） Ｊ． ＮＩＨ Ｒｅｓ． ４：４３；Ｃｏｒｎｅｔｔａ （１９９１） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２１５；Ｚｈａｎｇ （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． １５：３８５−４０１；Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９２） ２５６：８０８−８１３；Ｎａｂｅｌ （１９９３） ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７；Ｍｉｔａｎｉ （１９９３） ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ９２６−９３２；Ｄｉｌｌｏｎ （１９９３） ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５；Ｍｉｌｌｅｒ （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０）が挙げられる。
【００７４】
また発現カセットをウイルスゲノムから誘導することができる。用いることができるベクターには、組換えで改変したエンベロープもしくは非エンベロープＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれ、例えば、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｎｎａｖｉｒｉｄａｅ）またはアルファウイルス科が挙げられる。また各親ベクターの特性の有利な長所を利用するキメラベクターを用いることができる（Ｆｅｎｇ （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：８６６−８７０）。このようなウイルスベクターを組換えＤＮＡ技法によって改変することで目的の遺伝子を含ませることができ、そして遺伝子工学的に操作して、複製欠陥に、条件付きで複製する、または複製能力があるようにすることができる。ベクターは、アデノウイルスゲノム、アデノ随伴ウイルスゲノムまたはレトロウイルスゲノムから誘導することができる。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびそれらの組合せに基づくものを含むことができる（Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ （１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６ （５） ２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎ （１９９２） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６ （５）：１６３５−１６４０ （１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ （１９９０） Ｖｉｒｏｌ． １７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎ （１９８９） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒ （１９９１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：２２２０−２２２４）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターは、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生のために細胞に形質導入することができ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ治療方法に用いることができる（Ｏｋａｄａ （１９９６） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３：９５７−９６４；Ｗｅｓｔ （１９８７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７；Ｃａｒｔｅｒ （１９８９） 米国特許第４，７９７，３６８号；Ｃａｒｔｅｒら ＷＯ９３／２４６４１ （１９９３）；Ｋｏｔｉｎ （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ （１９９４） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｓｔ． ９４：１３５１）。
【００７５】
自己複製ＲＮＡレプリコンを用いたｉｎ ｖｉｖｏ投与
上記の発現ベクターおよび組換えウイルスに加えて、また自己複製ＲＮＡレプリコンを用いて細胞もしくは組織もしくは生物全体に感染させ、本発明の融合タンパク質発現核酸を供与することができる。従って、また本発明には、遺伝子工学的に操作して異種ＲＮＡおよびタンパク質の発現を可能にした、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、べネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスなどに由来するアルファウイルスゲノムＲＮＡを含むＲＮＡウイルスが組み入れられる。ウイルス構造遺伝子が異種コード配列によって置換された場合、本発明の融合ポリペプチドなどの異種配列の高レベルの発現が達成される。
【００７６】
これらの組換えＲＮＡは自己複製し（「レプリコン」）、裸のＲＮＡもしくはＤＮＡとして細胞に導入することができる。しかしながら、これらは、感染性ウイルス粒子としてパッケージングされ、細胞から放出されるにはトランス補足性（ｔｒａｎｓ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を必要とする。欠陥ヘルパーＲＮＡは、複製に必要なシス作用性配列ならびにオープンリーディングフレームの発現を駆動するＲＮＡプロモーターを含有する。レプリコンおよび欠陥ヘルパーＲＮＡの双方で同時トランスフェクトした細胞においては、レプリコンＲＮＡから翻訳されるウイルス非構造タンパク質が欠陥ヘルパーＲＮＡの複製と転写を可能にし、ウイルス粒子の構造タンパク質を産生する（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ （１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：６４３９−６４４６）。
【００７７】
ＲＮＡレプリコンワクチンは、アルファウイルスベクター、例えば、シンドビスウイルス（トガウイルス科）（Ｘｉｏｎｇ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８−１１９１）、セムリキ森林ウイルス（Ｙｉｎｇ （１９９９） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：８２３−８２７）またはべネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏ （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１）ベクターから誘導することができる。これらのワクチンは自己複製および自己制御し、そしてＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとして投与され、次いでトランスフェクトした細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡレプリコンに転写されうる（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：５６２−５６５）。自己複製ＲＮＡは、多様な範囲の細胞型に感染し、高レベルで目的の抗原の発現を可能にする（Ｈｕａｎｇ （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７：５３１−５３５）。さらに、ウイルス複製は感染宿主細胞にとって有毒なので、自己複製ＲＮＡは最終的にはトランスフェクトした細胞の溶解を引き起こす（Ｆｒｏｌｏｖ （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：１１８２−１１９０）。従って、これらのベクターには、宿主ゲノムに組み込まれるという裸のＤＮＡワクチンに関連する懸念が生じない。このことは、潜在的に腫瘍形成性であるタンパク質、例えばアデノウイルスＥ７タンパク質をターゲティングするワクチン開発にとって特に重要である。
【００７８】
一実施形態において、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，前掲およびＨｅｒｒｍａｎｎ （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５３：５２４−５３１に詳細に記載されるように、自己複製ＲＮＡレプリコンはシンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクターＳＩＮｒｅｐ５を含む。
【００７９】
ポリペプチド
他の実施形態において、本発明は、第１ドメインがカルレティキュリン（ＣＲＴ）ポリペプチドを含み；そして第２ドメインがＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープを含む、少なくとも２種のドメインを含む単離されたまたは組換えポリペプチドに向けられている。上記で述べたように、本発明を実施するために用いる、ＣＲＴ、ペプチドと結合するＣＲＴ断片およびＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープを含めたポリペプチドを意味する「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、またＣＲＴおよびＭＨＣクラスＩ結合性ペプチドエピトープに実質的に対応する構造および活性を有する「類似体」もしくは「保存的変異体」および「擬似体」もしくは「ペプチド擬似体」を含めた本発明の組成物を含む。従って、また「保存的変異体」または「類似体」または「擬似体」という用語は、変化がポリペプチドの（保存的変異体の）構造および／または活性（「抗原性」ペプチドとの結合能力、免疫応答の刺激能力）を実質的に改変しないように改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはペプチドを意味する。これらとしては、アミノ酸配列の保存的な改変変異、すなわちタンパク質活性に重要ではない残基のアミノ酸置換、付加もしくは欠失、あるいはたとえ重要なアミノ酸の置換であっても構造および／または活性を実質的に改変しないような類似の特性（酸性、塩基性、正にもしくは負に荷電した、極性もしくは非極性など）を有する残基を用いたアミノ酸の置換が挙げられる。機能的な類似アミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。例えば、保存的置換を選択するための１つの典型的なガイドラインとしては、（元の残基／置換）：Ａｌａ／ＧｌｙもしくはＳｅｒ；Ａｒｇ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／ＧｌｎもしくはＨｉｓ；Ａｓｐ／Ｇｌｕ；Ｃｙｓ／Ｓｅｒ；Ｇｌｎ／Ａｓｎ；Ｇｌｙ／Ａｓｐ；Ｇｌｙ／ＡｌａもしくはＰｒｏ；Ｈｉｓ／ＡｓｎもしくはＧｌｎ；Ｉｌｅ／ＬｅｕもしくはＶａｌ；Ｌｅｕ／ＩｌｅもしくはＶａｌ；Ｌｙｓ／ＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ；Ｍｅｔ／ＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ；Ｐｈｅ／ＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ；Ｓｅｒ／Ｔｈｒ；Ｔｈｒ／Ｓｅｒ；Ｔｒｐ／Ｔｙｒ；Ｔｙｒ／ＴｒｐもしくはＰｈｅ；Ｖａｌ／ＩｌｅもしくはＬｅｕが挙げられる。
【００８０】
別の典型的なガイドラインは、以下の表に示す群を使用する。タンパク質化学および構造の詳細な説明については、Ｓｃｈｕｌｚ， ＧＥら， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８、およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ．Ｅ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， １９８３を参照されたい（これらは、参照により本明細書に組み入れられるものとする）。本発明のポリペプチドにおいて行うことができる置換のタイプは、以下の５群のうちの１群内での置換として本明細書で規定する、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変化の頻度分析に基づくものとすることができる：
2004527213.tif 000005
【００８１】
上記で丸括弧中の３種のアミノ酸残基は、タンパク質構造において特別な役割を有する。Ｇｌｙは、側鎖を欠く唯一の残基であり、従って鎖に対して柔軟性を付与する。Ｐｒｏは、その普通でない幾何学的配置のために鎖を厳密に拘束する。Ｃｙｓは、タンパク質折畳みに重要なジスルフィド結合形成に参加できる。
【００８２】
生化学的、機能的（または免疫学的）特性におけるより実質的な変化は、上記の５群内以外の間などのあまり保存的でない置換を選択することによって行う。そのような変化は、（ａ）置換領域におけるペプチド主鎖の構造（例えば、シートもしくはらせん配座）、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ（ｂｕｌｋ）の維持に及ぼす影響においてより有意に異なるだろう。そのような置換の例としては、（ｉ）別のアミノ酸によるＧｌｙおよび／もしくはＰｒｏの置換、またはＧｌｙもしくはＰｒｏの欠失もしくは挿入；（ｉｉ）疎水性残基（例えば、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＶａｌもしくはＡｌａ）に対する（または、による）親水性残基（例えば、ＳｅｒもしくはＴｈｒ）の置換；（ｉｉｉ）任意の他の残基に対する（または、による）Ｃｙｓ残基の置換；（ｉｖ）電気陰性電荷を有する残基（例えば、ＧｌｕもしくはＡｓｐ）に対する（または、による）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓ）の置換；あるいは（ｖ）かさ高い（ｂｕｌｋｙ）側鎖を有さない残基（例えば、Ｇｌｙ）に対する（または、による）かさ高い側鎖を有する残基（例えば、Ｐｈｅ）の置換が挙げられる。
【００８３】
当業者であれば、上記で確認された置換のみが可能な保存的置換ではないことが理解されるだろう。例えば、ある目的で、全ての荷電アミノ酸を、それらが陽性または陰性であろうともお互いに保存的置換とみなすことができる。また、コード配列において単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を変える、付加するまたは欠失する個々の置換、欠失または付加により、「保存的な改変変異体」を得ることを考えることができる。
【００８４】
「擬似体」および「ペプチド擬似体」という用語は、本発明の方法における使用が可能なペプチドの必要な構造的および／または機能的特性を有する合成化学化合物を意味し、例えば、ペプチドとＭＨＣクラスＩタンパク質との相互作用におけるＣＲＴを模倣するものである。擬似体は、完全にアミノ酸の合成非天然類似体から構成されていても、または部分的には天然アミノ酸および部分的には非天然類似体の組合せであってもよい。また擬似体は、天然アミノ酸保存的置換が実質的に擬似体の構造および／または活性を変えない限り、そのような置換の任意の量を組込むことができる。保存的変異体と同様に、慣例の実験により、擬似体が本発明の範囲内にあるか否か、すなわち擬似体の立体化学的構造および／または機能が実施的に変化していないことが決定されるだろう。ペプチド擬似体は、典型的には以下の３群からの「非天然」構造的構成要素の任意の組合せを含むことができる：（ａ）天然アミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基連結基；（ｂ）天然アミノ酸に置き換わる非天然残基；または（ｃ）二次構造（例えば、βターン、γターン、βシートもしくはαへリックス配座）を誘導もしくは安定させる残基。ポリペプチドは、ポリペプチドの残基の全てもしくは幾つかがペプチド結合以外の化学結合で連結されている場合に擬似体として特性付けることができる。個々のペプチド擬似体残基を、ペプチド結合、他の化学結合またはカップリング手段、例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二機能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）もしくはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）によって連結することができる。ペプチド結合に代わる連結基としては、ケトメチレン（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−に代わって−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステルが挙げられる（Ｓｐａｔｏｌａ （１９８３） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， 第７巻， ｐｐ２６７−３５７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹ）。
【００８５】
本発明の擬似体を含めたポリペプチド、ペプチド、他の機能的誘導体の構造は、ＣＲＴ、好ましくはヒトＣＲＴの構造とアミノ酸配列に基づくものであることが好ましい（ＭｃＣａｕｌｉｆｆｅ （１９９０） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８６：３３２−３３５；Ｂｕｒｎｓ （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６７：４７６−４８０；Ｃｏｐｐｏｌｉｎｏ （１９９８） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３０：５５３−５５８）。ヒトＣＲＴタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ 登録番号ＮＭ ００４３４３）（配列番号２）を以下に示す：
2004527213.tif 000006
【００８６】
個々の合成残基および擬似体を組込むポリペプチドは、当技術分野で周知の種々の方法および方法論を用いて合成することができる（例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ Ｖｏｌｕｍｅｓ， Ｇｉｌｍａｎら， （ｄｄｓ） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ＮＹ）。また擬似体を組込むポリペプチドを、固相合成方法を用いて作製することもできる（例えば、米国特許第５，４２２，４２６号）。また本発明のペプチドおよびペプチド擬似体を、コンビナトリアル方法論を用いて合成することもできる。ペプチドおよびペプチド擬似体ライブラリーの生成に対する様々な技法が周知であり、例えばマルチピン、ティーバッグ（ｔｅａ ｂａｇ）およびスプリットカップルミックス（ｓｐｌｉｔ−ｃｏｕｐｌｅ−ｍｉｘ）技法が挙げられる（ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ （１９９８） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：２０５−２２３；Ｈｒｕｂｙ （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １：１１４−１１９；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ （１９９７） Ｍｏｌ． Ｄｉｖｅｒｓ． ３：１７−２７；Ｏｓｔｒｅｓｈ （１９９６） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６７：２２０−２３４）。さらに改変ポリペプチドおよびペプチドは、化学修飾によって生産することができる（Ｂｅｌｏｕｓｏｖ （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ （１９９５） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６）。
【００８７】
またペプチドを、従来の化学合成を完全にもしくは部分的に用いて合成することもできる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ２１５−２２３；Ｈｏｒｎ （１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ． ２２５−２３２；Ｂａｎｇａ， Ａ．Ｋ．， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （１９９５） Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， ＰＡ）。例えば、ペプチド合成を様々な固相技法（Ｒｏｂｅｒｇｅ （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ （１９９７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２８９：３−１３）および自動化合成（例えば、製造業者使用説明書に従いＡＢＩ ４３１Ａ ペプチド合成機を使用して）を用いて実施することができる。
【００８８】
本発明の一実施形態において、ペプチド結合性断片またはＣＲＴの「部分配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」を用いる。別の実施形態において、ＭＨＣタンパク質、好ましくはＭＨＣクラスＩタンパク質に結合する他のペプチドを用いる。そのようなペプチドは、任意のポリペプチド、特に公知の病原体から誘導することができ、または完全に合成であることができる。ペプチドがＣＲＴもしくはＣＲＴ断片またはＭＨＣタンパク質に結合するか否か、そしてどの程度結合するかを決定する方法は、当技術分野で慣例である（Ｊｅｎｓｅｎ （１９９９） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １７２：２２９−２３８；Ｚｈａｎｇ （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８１：９２９−９４７；Ｍｏｒｇａｎ （１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ６：１７７１−１７７３；Ｆｕｇｇｅｒ （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ２：１８１−１８８；Ｓｅｔｔｅ （１９９４） Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１：８１３−８２２；Ｅｌｖｉｎ （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５８：１６１−１７１；米国特許第６，０４８，５３０号；第６，０３７，１３５号；第６，０３３，６６９号；第６，００７，８２０号）。
【００８９】
医薬組成物の製剤化および投与
本発明の様々な実施形態において、ポリペプチド、核酸、発現カセット、細胞および粒子を薬理学的組成物として個体に、個体において抗原特異的免疫応答（例えばＣＴＬ応答、下記の実施例を参照されたい）を誘導するのに十分な量で投与する。
【００９０】
核酸、ペプチドおよびポリペプチドのための製薬上許容される担体および製剤は、当業者には公知であり、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版；Ｂａｎｇａ；Ｐｕｔｎｅｙ （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：１５３−１５７；Ｐａｔｔｏｎ （１９９８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：１４１−１４３；Ｅｄｗａｒｄｓ （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１８６８−１８７１；米国特許第５，７８０，４３１号；第５，７７０，７００号；第５，７７０，２０１号を参照されたい。
【００９１】
本発明の方法に使用する核酸およびポリペプチドを、単独で、または医薬組成物として、当技術分野で公知の任意の手段、例えば全身、局所または局部に；動脈内、髄腔内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、非経口、胸膜腔内、局所、経口または局部投与によって、皮下、気管内（例えば、エアロゾルによって）または経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）（例えば、頬側粘膜、膀胱粘膜、膣粘膜、子宮粘膜、直腸粘膜、鼻粘膜）のように送達することができる。実際の組成物の送達方法は、当業者には公知であるかまたは明らかであろうし、科学文献および特許文献に詳細に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓを参照されたい。
【００９２】
医薬組成物は、任意のプロトコールによって、そして投与の方法および経路および頻度、他の薬物を投与しているか否か、個体の応答などに応じて種々の単位剤形で投与することができる。典型的な核酸、ペプチドおよびポリペプチド医薬組成物の用量は、当業者には周知である。そのような用量は、種々の要因、例えば、初期応答（例えば、誘導されたＣＴＬの数および活性、腫瘍縮小など）、特定の治療状況、患者の健康状態および耐性に応じて調節することができる。所望の応答を誘導するのに十分な医薬組成物量は、「治療上有効な用量」として規定される。投薬計画およびこの使用に有効な量、すなわち「投薬処方計画」は、種々の要因（例えば、免疫感作によって治療または予防される疾患または症状、患者の健康状態の一般的状態、患者の身体的状態、年齢、医薬製剤および医薬組成物の濃度などが挙げられる）に依存するだろう。また、投薬処方計画は、薬物動力学、すなわち医薬組成物の吸収速度、生物学的利用能、代謝、クリアランスなどを考慮する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）。用量は、経験的に、例えば症状の寛解もしくは改善を評価することによって、または客観的な基準、例えば抗原特異的ＣＴＬレベルを測定することによって決定することができる。上記で述べたように、単一もしくは複数回の投与は、患者に必要であり、かつ許容される用量および頻度に応じて投与することができる。医薬組成物は、単独でまたは他の治療的処置と一緒に、あるいは予防的免疫感作として投与することができる。
【００９３】
ＡＰＣのｅｘ ｖｉｖｏ処置および再投与
本発明の様々な実施形態において、本発明の核酸およびポリペプチドを個体に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をｅｘ ｖｉｖｏで処置した後、操作されたＡＰＣを投与することによって導入する。一実施形態において、ＡＰＣを本発明の融合タンパク質コード核酸で形質導入（トランスフェクト）するかまたは感染させ；その後、ＡＰＣを個体に投与する。別の実施形態において、ＡＰＣを本発明の融合タンパク質（精製したもの、またはトランスフェクトし、ｉｎ ｖｉｖｏで組換え融合タンパク質を発現する細胞からの細胞溶解物として）で刺激する。この「パルス」後に、ＡＰＣを個体に投与する。
【００９４】
融合タンパク質は、例えば精製もしくは合成ポリペプチド、粗細胞溶解物（組換え融合タンパク質を作製するトランスフェクト細胞由来）などのようないずれの形態であってもよい。ＡＰＣは、ＭＨＣ適合（ＭＨＣ−ｍａｔｃｈｅｄ）細胞（組織タイピングした（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅｄ）細胞）であってよい。ＡＰＣは、組織培養細胞であっても、または治療しようとする個体から単離され、かつｅｘ ｖｉｖｏ刺激後に再投与されるＡＰＣであってもよい。上記のようにいずれのＡＰＣも使用できる。ＡＰＣの単離方法、培養におけるｅｘ ｖｉｖｏ処置方法および再投与方法は、当技術分野で周知である（米国特許第５，１９２，５３７号；第５，６６５，３５０号；第５，７２８，３８８号；第５，８８８，７０５号；第５，９６２，３２０号；第６，０１７，５２７号；第６，０２７，４８８号）。
【００９５】
キット
本発明は、本発明の方法を実施するための上記の本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。別の実施形態において、キットは、ＥＲシャペロンポリペプチドを含む第１ドメインと抗原性ペプチドを含む第２ドメインとを含む組換えもしくは合成キメラポリペプチド（例えば、ＣＲＴ−クラスＩ結合性ペプチドエピトープ融合タンパク質）；または例えば裸のＤＮＡ（例えばプラスミド）、ウイルス（例えばシンドビスウイルスレプリコンを含むアルファウイルスに由来する「レプリコン」）などの形態にある上記キメラポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。キットは、方法論を教示する説明的な資料、例えば本発明を実施するために使用する組成物の投与手段、細胞または患者または動物に本発明の核酸もしくはポリペプチドを注射または感染させるための手段、得られた免疫応答をモニターし、組成物を投与した個体の応答を評価するための手段などを含むことができる。
【００９６】
本明細書で説明する実施例および実施形態は、単に説明を目的にするものであり、その観点において様々な改変と変更は当業者には示唆されるだろうし、そしてこの出願の精神および権限ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることは理解される。
【００９７】
実施例
以下の実施例は、請求される発明を限定するのではなく、説明するために提供される。
【００９８】
実施例１
ＣＲＴ−クラスＩ結合性ペプチドエピトープの投与は抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の発生を増強する
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増強することに有効であることを実証する研究を説明する。
【００９９】
これらの研究は、カルレティキュリン（ＣＲＴ）とクラスＩポリペプチド結合性ペプチドエピトープの双方を含む融合タンパク質のコード配列を含むＤＮＡワクチンを使用した。この場合、エピトープはモデル抗原、ヒトパピローマウイルス−１６ Ｅ７ポリペプチド（ＨＰＶ−１６ Ｅ７）であった。Ｅ７特異的免疫応答によって媒介される抗腫瘍効果およびワクチン接種したマウスにおけるワクチン刺激抗脈管形成効果を評価した。キメラカルレティキュリン／Ｅ７（ＣＲＴ／Ｅ７）融合遺伝子を含むＤＮＡワクチンで皮内にワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスは、野生型Ｅ７もしくはＣＲＴ遺伝子を単独で含むＤＮＡワクチンと比較して、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）前駆体の劇的な増大、腫瘍防御および腫瘍処置を示した。さらに、ＣＲＴ ＤＮＡまたはキメラＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡのいずれかを用いたＣ５７ＢＬ／６もしくはヌードマウスにより、肺転移性結節が低減され、そして肺結節内の脈管形成が阻害された。これらの結果は、抗原遺伝子へのＣＲＴ遺伝子の連結はＤＮＡワクチンの効力を大いに増強し、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）免疫応答と抗脈管形成効果の双方の有意な増強を介して抗腫瘍効果を引き出すことができることを示すものである。
【０１００】
プラスミドＤＮＡ構築物および調製：
ＨＰＶ−１６ Ｅ７発現ｐｃＤＮＡ３プラスミドの生成は、Ｃｈｅｎ （２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０：１０３５−１０４２に記載のように行われた。また、Ｃｈｅｎ （２０００） Ｖａｃｃｉｎｅ １８：２０１５−２０２２；Ｊｉ （１９９９） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １０：２７２７−２７４０；Ｃｈｅｎ （１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６：１９７２−１９８１；Ｊｉ （１９９８） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７８：４１−４５を参照されたい。また、例えばＳｅｅｄｏｒｆ （１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１３９−１４４；米国特許第５，６２９，１６１号；第５，５０１，９４７号；第５，５４７，８４６号；第５，１８０，８０６号；第４，７７７，２３９号を参照されたい。完全ＨＰＶ−１６ゲノムおよび以下の配列（配列番号５）：
2004527213.tif 000007
を有するＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質を示すＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２５６７３（１９９９年６月１日）を参照されたい。
【０１０１】
ウサギカルレティキュリン（ウサギ、ヒト、マウスおよびラットカルレティキュリンの間には９０％を上回る相同性がある）の全長をコードするプラスミド、ｐｃＤＮＡ３−ＣＲＴの生成においては、まずこのタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、Ｃｈｅｎ （２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，前掲に記載の条件を用いたＰＣＲで、ウサギカルレティキュリンｃＤＮＡ鋳型（Ｍｉｃｈａｌａｋ （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ３４４ Ｐｔ２：２８１−２９２）（Ｍａｒｅｋ Ｍｉｃｈａｌａｋ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌｂｅｒｔａ， Ｅｄｍｏｎｔｏｎ， Ｃａｎａｄａ）によって提供された）ならびにプライマーセット：５’−ｃｃｇｇｔｃｔａｇａａｔｇｃｔｇｃｔｃｃｃｔｇｔｇｃｃｇｃｔ−３’（配列番号６）および５’−ｃｃｇｇａｇａｔｃｔｃａｇｃｔｃｇｔｃｃｔｔｇｇｃｃｔｇｇｃ−３’（配列番号７）を用いて増幅した。次いで増幅産物を制限消化酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、さらにｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位にクローニングした。ｐｃＤＮＡ３−ＣＲＴ／Ｅ７の生成においては、Ｅ７ ＤＮＡを、ＤＮＡ鋳型としてｐｃＤＮＡ３−Ｅ７ならびにプライマーセット：５’−ｇｇｇｇａａｔｔｃａｔｇｇａｇａｔａｃａｃｃｔａ−３’（配列番号７）および５’−ｇｇｔｇｇａｔｃｃｔｔｇａｇａａｃａｇａｔｇｇ−３’（配列番号８）を用いたＰＣＲによって増幅した。次いで増幅Ｅ７ ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで消化し、さらにｐｃＤＮＡ３−ＣＲＴベクターのＢａｍＨＩクローニング部位にクローニングした。これらの構築物の配向と精度をＤＮＡ配列決定分析によって確認した。
【０１０２】
ＣＲＴ、Ｅ７またはＣＲＴ／Ｅ７遺伝子インサートを有するプラスミドＤＮＡおよび「空の」プラスミドベクターを、サブクローニング効率のよいＤＨ５（商標）細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）にトランスフェクトした。次いで、ＤＮＡを増幅し、二重ＣｓＣｌ精製（ＢｉｏＳｅｒｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｌａｕｒｅｌ， ＭＤ）を用いて精製した。各調製物中のプラスミドＤＮＡの完全性および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡもしくはＲＮＡの不在を、１％のアガロースゲル電気泳動を用いてチェックした。ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍで測定する光学密度で決定した。挿入されたＥ７断片の存在を、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって確認した。
【０１０３】
細胞系：
ＴＣ−１細胞の生産と維持は、Ｌｉｎ （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：２１−２６に記載のように行われた。腫瘍チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の日に、ＴＣ−１細胞をトリプシン処理によって回収し、１Ｘ Ｈａｎｋｓ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、最後に１Ｘ ＨＢＳＳ中に再懸濁して、指定された注射用濃度にした。ＤｂおよびＫｂを発現するヒト胎児腎２９３細胞系（２９３ Ｄｂ，Ｋｂ）（Ｂｌｏｏｍ （１９９７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５：４５３−４５９）は、ＪＣ Ｙａｎｇ博士（ＮＣＩ， ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）によって提供された。この細胞系は、１０％の熱非働化ウシ胎児血清、０．３％のグルタミン、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、Ｇ４１８ １００μｇを含有するＤＭＥＭ培地中で増殖した。
【０１０４】
マウス：
６〜８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスをＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）から購入し、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ）の腫瘍学動物施設で飼育した。抗脈管形成効果を特性付けるために、免疫エフェクター不在におけるｉｎ ｖｉｖｏ 腫瘍処置実験を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）からのＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ ６週齢メスマウスを用いて実施した。全ての動物手順は、認可されたプロトコールおよび実験室動物の適切な使用と注意についての推奨に従って実施した。
【０１０５】
ＤＮＡワクチン接種：
ＤＮＡコーティング金粒子の調製および遺伝子銃粒子媒介ＤＮＡワクチン接種を、ヘリウム駆動遺伝子銃（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を用いてＣｈｅｎ （２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，前掲の記載に従って実施した。簡単に言えば、ＤＮＡコーティング金粒子（ＤＮＡ １もしくは４μｇ／弾丸）を、約４００ｐ．ｓ．ｉ．の発射圧でヘリウム駆動遺伝子銃を用いてマウスの毛を剃り落とした腹部領域に送達した。
【０１０６】
細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析：
無傷のマウス群またはワクチン接種したマウス群を、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体を検出するためにＭＨＣクラスＩエピトープを含むＥ７ペプチド（アミノ酸（ａａ）４９−５７残基）（Ｆｅｌｔｋａｍｐ （１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：２２４２−２２４９）とともにインキュベートするか、またはＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞前駆体を検出するためにＭＨＣクラスＩＩペプチドを含むＥ７ペプチド（ａａ３０−６７）（Ｔｉｎｄｌｅ （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：５８８７−５８９１）とともにインキュベートした。Ｅ７ペプチドは、ａａ４９−５７については１μｇ／ｍｌの濃度で、そしてａａ３０−６７については１０μｇ／ｍｌの濃度で２０時間添加された。Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（商標）（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を培養物から細胞を回収する６時間前に添加した。次いで細胞をＦＡＣＳｃａｎ（商標）バッファー中で１回洗浄して、フィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスＣＤ８もしくはＣＤ４抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で染色した。細胞を、製造業者の使用説明書（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットを用いて細胞内サイトカイン染色に供した。ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ＩＦＮ−γおよび抗ＩＬ−４抗体ならびに免疫グロブリンアイソタイプ対照抗体（ラットＩｇＧ１）は、全てＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入した。フローサイトメトリー分析は、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウエアを用いるＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）において行った。
【０１０７】
抗Ｅ７抗体に対するＥＬＩＳＡ：
血清中の抗ＨＰＶ １６ Ｅ７抗体を、Ｗｕ （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：１１６７１−１１６７５に記載のように直接的ＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に言えば、９６マイクロウエルプレートを、１０．５μｇ／ｍｌの細菌に由来するＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質でコーティングし、４０℃で一晩インキュベートした。次いで、ウエルを２０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳでブロッキングした。血清を、免疫感作後１４日目にマウスから調製し、１Ｘ ＰＢＳ中に連続希釈し、ＥＬＩＳＡウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１Ｘ ＰＢＳで洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ−コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）の１／２０００希釈物で室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。プレートを６回洗浄し、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で顕色し、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを、標準的ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。
【０１０８】
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍防御実験：
腫瘍防御実験において、マウス（１群あたり５匹）に２μｇのＣＲＴ ＤＮＡ、Ｅ７ ＤＮＡ、ＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡを遺伝子銃を介してワクチン接種するか、またはワクチン接種しなかった。１週間後、マウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。最後のワクチン接種の１週間後、マウスを、右脚中に５ ｘ １０４ ＴＣ−１細胞／マウスで皮下にチャレンジした。マウスを６０日目に屠殺するまで、マウスを１週間に２回、触診と検査で腫瘍増殖の形跡についてモニターした。
【０１０９】
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍処置実験：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群５匹）を、０日目に尾静脈を介して１ ｘ １０４細胞／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞で静脈内にチャレンジした。ＴＣ−１腫瘍細胞を用いたチャレンジの３日後に、マウスに遺伝子銃を介して２μｇのＣＲＴ ＤＮＡ、Ｅ７ ＤＮＡ、ＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡを与えるか、またはワクチン接種しなかった。１週間後、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。マウスを１週間に２回モニターし、２１日目に屠殺した。各マウスの肺転移性結節数は、サンプルの正体が分からない実験者によって評価および計数された。
【０１１０】
ヌード（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）マウス（各群５匹）を、０日目に尾静脈を介して１ ｘ １０４細胞／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞で静脈内にチャレンジした。ＴＣ−１腫瘍細胞を用いたチャレンジの２日（Ｄ２）後に、マウスに遺伝子銃を介して１６μｇのＣＲＴ ＤＮＡ、Ｅ７ ＤＮＡ、ＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡまたはインサートを含まない空のプラスミドを与えた。９日目と１６日目に、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。マウスを２１日目に屠殺した。各マウスの肺結節は、サンプルの正体が分からない実験者によって評価および計数された。
【０１１１】
ｉｎ ｖｉｖｏ抗体枯渇実験：
ｉｎ ｖｉｖｏ抗体枯渇は、Ｌｉｎ （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：２１−２６に記載のように行われた。簡単に言えば、マウスを遺伝子銃を介してＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡ ２μｇでワクチン接種し、１週間後に追加免疫し、５ ｘ １０４細胞／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍チャレンジの１週間前に枯渇を開始させた。ＭＡｂ ＧＫ１．５（Ｄｉａｌｙｎａｓ （１９８３） Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ７４：２９−５６）をＣＤ４枯渇に使用し、ＭＡｂ ２．４３（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ （１９８０） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２５：２６６５）をＣＤ８枯渇に使用し、そしてＭＡｂ ＰＫ１３６（Ｋｏｏ （１９８６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３７４２−３７４７）をＮＫ１．１枯渇に使用した。フローサイトメトリー分析により、適切なリンパ球サブセットの＞９９％が枯渇され、一方、他のサブセットの正常レベルが維持されたことが明らかとなった。
【０１１２】
樹状細胞の生成：
樹状細胞（ＤＣ）を、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ （１９９９） Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：４０５−４１１に記載のようにＧＭ−ＣＳＦの存在下で骨髄細胞を培養することによって生成した。簡単に言えば、骨髄をマウスの大腿骨および脛骨から回収した。赤血球を溶解し、残りの細胞をナイロンメッシュを通過させることで小片の骨およびデブリを除去した。細胞を回収し、そして１ Ｘ １０６細胞／ｍｌを、５％のＦＣＳ、２ｍＭ メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）および１００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を補足したＲＭＰＩ １６４０を含む２４ウエルプレートに配置した。培地の３／２を２日ごとに入れ替え、非接着細胞を７日目に回収した。回収した細胞を、すでに記載したようにＤＣマーカーについてのフローサイトメトリー分析を用いて特性付けた（２５）。
【０１１３】
Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞系の生成：
Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞系を、ワクシニアＥ７発現ベクター（Ｊｉ （１９９９） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １０：２７２７−２７４０に論じられているように、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）コード配列をＨＰＶ−Ｅ７コード配列に融合させてＳｉｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１と呼ばれるキメラＤＮＡを構築した）の腹腔内注射によってメスＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスを免疫感作することによって生成した。脾細胞を８日目に回収した。最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激については、脾細胞を２０Ｕ／ｍｌ濃度のＩＬ−２および１ ＴＭ Ｅ７ペプチド（配列番号４のアミノ酸４９−５７）で６日間パルスした。Ｅ７特異的ＣＴＬ細胞系の増殖を、Ｅ７特異的ＣＴＬを含む１ ｘ １０６脾細胞と３ ｘ １０６の放射線照射した（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）脾細胞とを混合し（２ｍｌ／ウエル）、それらに２０Ｕ／ｍｌ濃度のＩＬ−２および１ ＴＭ Ｅ７ペプチド（アミノ酸４９−５７）をパルスすることによって、２４ウエルプレート中で実施した。この方法を６日ごとに繰り返した。Ｅ７ＣＴＬ系の特異性を、ＣＴＬアッセイによって特性付けた。フローサイトメトリーを実施して、ＣＤ８マーカーの発現を示した。
【０１１４】
トランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞を標的細胞として用いたＣＴＬアッセイ：
ＣＴＬアッセイを、Ｃｏｒｒ （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：４７２１−４７２７に記載のように９６ウエル丸底プレート中で実施した。細胞溶解を、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の定量的測定によって測定した。トランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞を標的細胞として用い、一方、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はエフェクター細胞として機能した。５ ｘ １０６の２９３ＤｂＫｂ細胞を２０ＴｇのｐｃＤＮＡ３（空のプラスミド）、Ｅ７、ＣＲＴもしくはＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡワクチンで、製造業者のプロトコールに従いリポフェクタミン２０００（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を介してトランスフェクトした。２９３ＤｂＫｂ細胞をトランスフェクションの４０〜４４時間後に回収した。ＥＬＩＳＡによって測定されるＥ７タンパク質発現のレベルは、Ｅ７およびＣＲＴ／Ｅ７でトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂにおいて類似していた。ＣＴＬアッセイを、様々な比率（１：１、３：１、９：１および２７：１）で一緒に混合したエフェクター細胞と標的細胞（ウエルあたり１ ｘ １０４）を用いて最終容量２００Ｔｌ中で実施した。３７℃で５時間のインキュベーション後、培養培地を回収し、製造業者のプロトコールに従いＣｙｔｏＴｏｘ（商標）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて培養培地中のＬＤＨ量を評価した。溶解の割合を以下の等式から計算した：１００ Ｘ （Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）（式中、Ａは実験のエフェクターシグナル値の読み取り値（ｒｅａｄｉｎｇ）であり、Ｂはエフェクターの自発的なバックグラウンドシグナル値であり、Ｃは標的細胞からの最大シグナル値であり、Ｄは標的の自発的なバックグラウンドシグナル値である）。
【０１１５】
トランスフェクトした２９３細胞の溶解物をパルスしたＤＣを標的細胞として用いたＣＴＬアッセイ：
細胞溶解物をパルスした樹状細胞（ＤＣ）を標的細胞として用いたＣＴＬアッセイを、Ｕｇｅｒ （１９９８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０：１５９８−１６０５に記載のプロトコールに類似したプロトコールを用いて実施した。簡単に言えば、まず５ ｘ １０６の２９３ＤｂＫｂ細胞を２０ＴｇのｐｃＤＮＡ３（空のプラスミド）、Ｅ７、ＣＲＴもしくはＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡワクチンで、製造業者のプロトコールに従いリポフェクタミン２０００（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を介してトランスフェクトした。トランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞をトランスフェクションの４０〜４４時間後に回収し、次いで３サイクルの凍結融解で処理した。タンパク質濃度は、販売業者のプロトコールに従いＢｉｏＲａｄプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を用いて測定された。Ｅ７タンパク質量をＥＬＩＳＡを用いて測定し、Ｅ７もしくはＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞に由来する細胞溶解物をＥ７タンパク質濃度について標準化した。ＤＣを標的細胞として用い、１００万個のＤＣに様々な濃度の細胞溶解物（５０Ｔｇ／ｍｌ、１０Ｔｇ／ｍｌ、２Ｔｇ／ｍｌおよび０．４Ｔｇ／ｍｌ）を最終容量２ｍｌ中で１６〜２０時間パルスすることで調製した。Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。ＣＴＬアッセイを、Ｅ／Ｔ（９／１）の比率を固定して１ ｘ １０４の調製したＤＣと混合した９ ｘ １０４のＥ７特異的Ｔ細胞を用いて最終容量２００Ｔｌ中で実施した。細胞溶解を、上記で記載したようにＬＤＨの定量的測定によって測定した。
【０１１６】
組織学的および免疫組織化学的研究：
ワクチン接種したマウス由来の肺結節のパラフィンブロックを作製し、６Ｔｍの切片に切断し、脱パラフィン化した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色を、慣例の光学顕微鏡検査について実施し、未染色の切片を免疫組織化学的研究のために調製した。マウス抗ＣＤ３１モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ， Ｃａｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）を、腫瘍内微小血管の検出に用いた。免疫組織化学的染色を、Ｈｕａｎｇ （１９９９） Ｈｕｍ． Ｐａｔｈｏｌ． ３０：５８７−５９１に記載のプロトコールを用いて双方の検体に由来する切片において実施した。微小血管密度（ＭＶＤ）を、Ｃｈｅｎｇ （１９９９） Ｃａｎｃｅｒ ８５：６５１−６５７に記載のように測定した。簡単に言えば、染色したスライドを低い倍率（４０ｘ および１００ｘの合計倍率）で検査し、各腫瘍中で最も高い新生血管形成領域（いわゆるホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ））を同定した。各切片において、３ヶ所の最も血管新生した領域を選択した。微小血管計数は、２００ｘ倍率（２０ｘ対物レンズおよび１０ｘ接眼レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＨ−２顕微鏡）、接眼ミクロメーターで測定した視野サイズが視野あたり０．７４ｍｍ２）で得られ、各腫瘍について３ヶ所の視野の平均数を計算して、微小血管密度（ＭＶＤ）計数と呼んだ。適当な８個の血液細胞よりも大きい厚い筋肉壁および内腔を有する大血管を、計数から除外した。全ての測定は、サンプルの正体が分からない１人の病理学者によって実施された。
【０１１７】
ＣＲＴ／Ｅ７融合ＤＮＡワクチンの生成と特性付け：
カルレティキュリン（ＣＲＴ）、Ｅ７およびカルレティキュリン／Ｅ７（ＣＲＴ／Ｅ７）の構築物の概略図を図１に示す。全ての構築物は、ＤＮＡ配列決定分析によって確認されている。Ｅ７含有構築物中のＥ７タンパク質の発現を示すために、様々なＥ７含有ＤＮＡ構築物でトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の溶解物を用いたウエスタンブロット分析を実施した。野生型Ｅ７でトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞は、ＨＰＶ−１６ Ｅ７に対応する３０ｋＤバンドを示した。加えて、ＣＲＴ／Ｅ７でトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞は、キメラＣＲＴ／Ｅ７タンパク質に対応するバンドを示した。陰性対照である、カルレティキュリンまたは空のプラスミドでトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂにおいては、目に見えるバンドは全く観察されなかった。
【０１１８】
ＣＲＴ／Ｅ７融合ＤＮＡを用いたワクチン接種はＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数を有意に増強する：
ＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、抗腫瘍免疫の誘導において最も重要なエフェクターの１つである。本発明のＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡワクチンのｉｎ ｖｉｖｏ投与（マウスに対して）後に誘導されるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の量を決定するために、細胞内サイトカイン染色を、Ｊｉ （１９９９） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２７２７−２７４０に記載のように使用した。細胞内サイトカイン染色は、単一細胞レベルでＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−Ｋ）産生を測定するために用いられる感度の高い機能的アッセイであり、従ってこれを適用して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を定量化することができる。フローサイトメトリー分析（上記で論じたように実施）の結果を図２Ａに二次元ヒストグラムで示す。図２Ｂに要約したように、ＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡでワクチン接種したマウスは、最も高い数のＥ７特異的ＩＦＮ−γ発現／ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体（２０４／３．５ ｘ １０５脾細胞）を誘導したが、Ｅ７ ＤＮＡでワクチン接種したマウスは、より少ない前駆体（４７／３．５ ｘ １０５脾細胞）しか誘導しなかった（ｐ＜０．０１）。ＣＲＴ／Ｅ７キメラ構築物の免疫感作により、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体数が５倍増大した。またこれらの結果より、２種のベクター（Ｅ７のみを発現するベクターと混合したＣＲＴのみを発現するベクター）（図２Ｂにおける「ＣＲＴ＋Ｅ７」）を用いたワクチン接種はＣＤ８＋Ｔ細胞活性の増強を誘導しなかったので、ＣＲＴへのＥ７の融合（すなわち、融合タンパク質としての発現）がＣＤ８＋Ｔ細胞活性の増強には必要であることが示された。
【０１１９】
ＣＲＴ／Ｅ７融合 ＤＮＡを用いたワクチン接種はＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介免疫応答を増強しない：
これらの各ワクチンによって誘導されるＥ７特異的ＣＤ４＋（「ヘルパー」）Ｔ前駆体細胞の生成およびサイトカインプロフィールを検査するために、本発明者らは免疫感作したマウス由来の脾細胞におけるＣＤ４表面マーカーおよび細胞内ＩＦＮ−Ｋ＋に対する二重染色を実施し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。免疫感作したマウス由来の脾細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ７ペプチド（ａａ３０−６７）とともに一晩培養し、ＣＤ４および細胞内ＩＦＮ−Ｋ＋の双方について染色した。Ｅ７ペプチド（ａａ３０−６７）は、ＨＰＶ−１６のＥ７オープンリーディングフレームタンパク質中の主要なＴヘルパーエピトープを含む（Ｔｉｎｄｌｅ （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：５８８７−５８９１）。ＩＦＮ−Ｋ＋分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。ＣＲＴ／Ｅ７キメラ構築物でワクチン接種したマウスは、野生型Ｅ７ ＤＮＡ（２５／３．５ ｘ １０５脾細胞 対 ２０／３．５ ｘ １０５脾細胞、ｐ＞０．０５）または他のＤＮＡ群でワクチン接種したマウスと比較して、類似のＣＤ４＋ＩＦＮＫ＋二重陽性細胞数を誘導した。フローサイトメトリー染色を用いて観察されたＥ７特異的ＣＤ４＋ＩＦＮＫ＋細胞数に、無傷のマウスまたは空のプラスミド、ＣＲＴ、Ｅ７、ＣＲＴ＋Ｅ７もしくはＣＲＴ／Ｅ７構築物でワクチン接種したマウスの間に有意な差異はなかった。
【０１２０】
また様々なＤＮＡワクチンでワクチン接種したマウス中のＩＬ−４分泌性Ｅ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞数を評価した。ＩＬ−４分泌活性化マウス脾細胞（ＭｉＣＫ−２（商標）、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を陽性対照として使用し、この研究における細胞内ＩＬ−４染色の成功を確認した。ＩＬ−４染色の特異性を、ＩＬ−４抗体を除いた場合のＣＤ４＋ＩＬ−４＋Ｔ細胞の不在によって示した。ＣＲＴ／Ｅ７、ＣＲＴ、野生型Ｅ７ ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡでワクチン接種したマウスまたはワクチン接種していない無傷のマウスにおいて、有意なＣＤ４＋ＩＬ−４＋二重陽性細胞は同定されなかった。さらに、異なるワクチン接種群に由来するＩＬ−４分泌ＣＤ４＋ＩＬ−４＋Ｔ細胞の頻度に有意な変化は観察されなかった。
【０１２１】
ＣＲＴ／Ｅ７を用いたワクチン接種はより高い力価のＥ７特異的抗体を誘導した：
ワクチン接種したマウスの血清中の抗ＨＰＶ １６ Ｅ７抗体量を、最後のワクチン接種の２週間後に直接的ＥＬＩＳＡによって測定した。図３に示すように、ＣＲＴ／Ｅ７ワクチン接種群は、他のワクチン接種群と比較してマウス血清中において最も高い力価の抗Ｅ７抗体を誘導した（Ｐ＜０．０１）。この結果より、本発明のＣＲＴ／Ｅ７キメラ構築物で接種したマウスは有意により高いＥ７特異的抗体応答を誘導したことが示された。
【０１２２】
ＣＲＴ／Ｅ７キメラ構築物を用いたワクチン接種はＴＣ−１腫瘍の増殖に対するマウスの防御を増強する：
様々なＤＮＡワクチン構築物を用いたワクチン接種はＥ７発現腫瘍に対してマウスを防御するか否かを決定するために、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍防御実験を実施した。マウスを、遺伝子銃を介して裸のＤＮＡ ２Ｔｇ／マウスでワクチン接種し、１週間後に同じ用量で追加免疫した。次いで、最後のワクチン接種の７日後にマウスを、右脚中に５ ｘ １０４ ＴＣ−１／マウスで皮下にチャレンジした。図４に示すように、ＣＲＴ／Ｅ７キメラ構築物ワクチン接種を受けたマウスの１００％が、ＴＣ−１チャレンジの６０日後に腫瘍のない状態のままであった。それに反して、ワクチン接種していないマウスおよび空のプラスミド、ＣＲＴ、野生型Ｅ７もしくは野生型Ｅ７＋ＣＲＴ ＤＮＡを受けたマウスの全てが、腫瘍チャレンジ後１５日以内に腫瘍増殖を生じた。またこれらの結果より、Ｅ７のみを発現する構築物と混合したカルレティキュリンのみを発現する構築物（図４における「ＣＲＴ＋Ｅ７」）は抗腫瘍免疫の増強を誘導しなかったので、カルレティキュリンへのＥ７の融合が抗腫瘍免疫には必要であったことが示された。従って、本発明のＣＲＴ／Ｅ７キメラ構築物は、ＴＣ−１腫瘍の増殖に対する防御を有意に増強した。
【０１２３】
ＣＲＴ／Ｅ７キメラ構築物を用いたワクチン接種は肺において確立されるＥ７発現腫瘍を根絶する：
肺のＴＣ−１腫瘍転移の処置においてキメラＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡ構築物の治療的潜在性を決定するために、まずＣ５７ＢＬ／６マウスを、静脈内尾静脈注射を介してマウス１匹あたり１ ｘ １０４のＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジした（肺転移モデル）（Ｊｉ （１９９８） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７８：４１−４５）。次いで、マウスを７日後に遺伝子銃を介して裸のＤＮＡ ２Ｔｇで処置し、１週間後に同じ用量で追加免疫した。次いで、マウスを腫瘍チャレンジの３０日後に屠殺した。図５に示すように、ＣＲＴ／Ｅ７キメラ構築物でワクチン接種したマウスは、野生型Ｅ７ ＤＮＡのみ（７７．６＋９．８）またはカルレティキュリンＤＮＡのみ（２６．４＋４．９）でワクチン接種したマウスと比較して肺結節の最も低い平均数（４．０＋１．６）を示した（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ， Ｐ＜０．００１）。データは、肺転移性腫瘍結節の平均数＋ＳＥＭとして表している。興味深いことに、野生型カルレティキュリンＤＮＡでワクチン接種したマウスは、野生型Ｅ７ ＤＮＡを受けたマウスまたはワクチン接種を受けていないマウスよりも低い結節の平均数を示した（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ， Ｐ＜０．００１）。ＣＲＴ単独でワクチン接種したマウスはＥ７特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導しなかったので、ＣＲＴ単独で観察された治療的効果（肺転移性結節のより低い数）は、ＣＲＴ媒介抗脈管形成効果によって引き起こされたものでありうる。
【０１２４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞ではなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞が本発明のＣＲＴ／Ｅ７キメラＤＮＡワクチンによって誘導される抗腫瘍効果に必須である：
Ｅ７陽性腫瘍細胞の排除に重要なリンパ球サブセットを決定するために、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏ抗体枯渇実験を実施した。リンパ球サブセットの枯渇を、腫瘍注入の日およびその後毎週、脾細胞のフローサイトメトリー分析によって評価した。適切なサブセットの９９％を上回る枯渇が達成され、他のリンパ球サブセットは正常レベルであった。全ての無傷のマウスおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇した全てのマウスにおいて、腫瘍チャレンジ後の約１４日以内に腫瘍が増殖した。それに反して、枯渇していない全てのマウスおよびＣＤ４＋Ｔ細胞もしくはＮＫ１．１細胞を枯渇した全てのマウスが腫瘍チャレンジの６０日後に腫瘍のない状態のままであった。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が本発明のＣＲＴ／Ｅ７キメラワクチンによって誘導される抗腫瘍免疫に必須であることを示すものである。
【０１２５】
ＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡでトランスフェクトした細胞におけるＭＨＣクラスＩ経路を介したＥ７の提示の増強：
上記で論じたように、本発明のＣＲＴ／Ｅ７キメラ構築物でワクチン接種したマウスは、最も高い数のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体を誘導した。この効果の原因となる機構を決定するために、標的細胞においてＥ７のＭＨＣクラスＩ提示の増強が存在するか否かを決定した。この場合、標的細胞は、ＣＲＴ／Ｅ７融合タンパク質コードキメラＤＮＡでトランスフェクトしたＤｂとＫｂとを発現するヒト胎児腎２９３細胞であった。エフェクター細胞としてＤｂ制限Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたＣＴＬアッセイを用いて、ＣＲＴ／Ｅ７構築物でトランスフェクトした標的細胞（２９３ＤｂＫｂ細胞）は、野生型Ｅ７のみでトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞よりも効果的に死滅されうるか否かを決定した。２９３ＤｂＫｂ細胞は安定したトランスフェクション効率を有することが示されいるが、樹状細胞はｉｎ ｖｉｖｏで容易にはトランスフェクトされないので、２９３ＤｂＫｂ細胞を標的細胞として用いた。さらに、２９３ＤｂＫｂ細胞におけるＥ７発現レベルは、様々なＥ７含有ＤＮＡ構築物でトランスフェクトした細胞間で類似している。ＣＴＬアッセイを、無傷の２９３ＤｂＫｂ細胞および空のプラスミド、ＣＲＴ、Ｅ７もしくはキメラＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞を用いて、Ｅ７特異的Ｔ細胞系を用いる様々なエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比率（１：１、３：１、９：１、２７：１）で実施した。図６に示すように、ＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞は、野生型Ｅ７ ＤＮＡワクチンのみでワクチン接種したマウスと比較して、９：１（２０．５＋１．０％ 対 １０．４３＋０．９％、Ｐ＜０．００１）および２７：１（４７．１＋５．５％ 対 １５．１＋３．０％、Ｐ＜０．００１）のＥ／Ｔ比率で有意により高い割合の特異的溶解を誘導した。これらの結果より、本発明のキメラＣＲＴ／Ｅ７構築物でトランスフェクトした細胞は、野生型Ｅ７ ＤＮＡでトランスフェクトした細胞よりも効率的な方法でＭＨＣクラスＩ経路を介して「直接的プライミング」を経てＥ７抗原を提示することができたことが示された。
【０１２６】
キメラＣＲＴ／Ｅ７タンパク質をパルスした樹状細胞におけるＭＨＣクラスＩ経路を介したＥ７の提示の増強：
ｉｎ ｖｉｖｏでＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強する別の潜在的な機構は、様々なＤＮＡ構築物を発現する溶解した細胞の取込みを介して、抗原提示細胞によるＭＨＣクラスＩ経路を介したＥ７の提示であり、「クロスプライミング」とも呼ばれる。クロスプライミング実験は、空のプラスミド、カルレティキュリン、Ｅ７もしくはＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の細胞溶解物をパルスした樹状細胞におけるＥ７のＭＨＣクラスＩ提示を特性付けるために実施された。Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクター細胞として機能した。既に述べたように、２９３ＤｂＫｂ細胞は安定したトランスフェクション効率、および様々なＥ７含有ＤＮＡ構築物でトランスフェクトした細胞間で類似したＥ７発現を有することが示された。トランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の溶解物を、凍結融解のサイクルから得た。骨髄由来ＤＣに、トランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の溶解物の連続希釈物（５０Ｔｇ／ｍｌ、１０Ｔｇ／ｍｌ、２Ｔｇ／ｍｌおよび０．４Ｔｇ／ｍｌ）をパルスした。ＤＣを標的細胞として用い、一方、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はエフェクター細胞として機能した。ＣＴＬアッセイを、Ｅ／Ｔ比率（９／１）を固定して実施した。図７に示すように、ＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡでトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の溶解物をパルスしたＤＣは、他のＤＮＡ構築物でトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の溶解物をパルスしたＤＣおよび無傷のＤＣと比較して有意により高い割合の特異的溶解を誘導した（Ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＣＲＴ／Ｅ７融合タンパク質（トランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の細胞溶解物中に存在）をパルスした樹状細胞は、野生型Ｅ７タンパク質コード構築物のみでトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の溶解物をパルスした樹状細胞よりも効率的な方法でＭＨＣクラスＩ経路を介してＥ７抗原を提示できることを示した。このデータは、Ｅ７へのＣＲＴの融合、すなわちカルレティキュリンとの融合タンパク質としてのＥ７ポリペプチドの発現が、直接的およびクロスプライミング効果の双方を経てＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強することを示すものである。
【０１２７】
ＣＲＴもしくはキメラＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡワクチンを用いた処置はヌードマウスの肺において確立される腫瘍を根絶する：
上記で論じたように、野生型ＣＲＴ ＤＮＡで処置したマウスは、野生型Ｅ７ ＤＮＡのみを受けたマウスまたはワクチン接種していないマウスよりも肺結節の低い平均数を示した（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ， Ｐ＜０．００１）。ＣＲＴでワクチン接種したマウスは、Ｅ７特異的Ｔ細胞免疫応答を誘導しなかったので（図２を参照されたい）、ＣＲＴを単独で発現する構築物を投与した場合に観察される治療的効果（転移性肺結節数の低減）は、抗腫瘍免疫応答（すなわち、抗原特異的ＣＴＬの増大）に関連しないと考えられる。いずれの免疫エフェクター細胞も存在しない肺におけるＴＣ−１腫瘍転移の処置において、Ｅ７もしくはＣＲＴポリペプチド単独と比較したＣＲＴ／Ｅ７融合ポリペプチドの役割を評価するために、まずヌード（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）マウス（Ｔヘルパーおよびキラー（ＣＴＬ）リンパ球の双方を欠き、体液性もしくは細胞性免疫応答のいずれも誘導することできない動物）を、上記で論じたように静脈内尾静脈注射を介してマウス１匹あたり１ ｘ １０４のＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジした。ＴＣ−１腫瘍細胞を用いたチャレンジの２日後、マウスに遺伝子銃を介して１６ＴｇのＣＲＴコードＤＮＡ、Ｅ７コードＤＮＡもしくはＣＲＴ／Ｅ７コードＤＮＡまたはインサートを含まない空のプラスミドを与えた。９日目と１６日目に、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。マウスを２１日目に屠殺した。各マウスの肺結節を評価および計数した。図８に示すように、ＣＲＴを単独で発現する構築物もしくはＣＲＴ／Ｅ７融合タンパク質を発現する構築物で処置したヌードマウスは、野生型Ｅ７ ＤＮＡのみ（３６．０＋２．８）、ベクターのみ（３５．５＋１２．０）でワクチン接種したマウスまたは無傷の群（４７．５＋２．１）と比較して、肺結節のより低い平均数（ＣＲＴについては６．０＋２．８、ＣＲＴ／Ｅ７については２．５＋０．７）を示した（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．００１）。これらのデータより、ＣＲＴもしくはＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡワクチンによって誘導される抗腫瘍効果は、抗腫瘍免疫応答に非依存的であったことが示された。
【０１２８】
ＣＲＴもしくはキメラＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡワクチンを用いた処置はヌードマウスの肺における腫瘍の微小血管密度を有意に低減した：
免疫エフェクター不在下でのＣＲＴもしくはＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡのこの抗腫瘍効果は抗脈管形成経路を介するものか否かを決定するために、様々なＤＮＡワクチンで処置したヌードマウスの肺腫瘍における微小血管密度（ＭＶＤ）を測定した。内皮細胞を、上記したように抗ＣＤ３１抗体で染色した。全ての測定は、計数前には処置データを何も知らない１人の病理学者によって実施された。ＣＲＴもしくはＣＲＴ／Ｅ７ ＤＮＡワクチンのいずれかでワクチン接種したヌードマウス（機能的免疫系を欠く）は、野生型Ｅ７で処置したヌードマウスまたは対照ベクター群よりも肺腫瘍において非常に小さいＭＶＤを示した（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．００１）。これらのデータより、ＣＲＴ発現ワクチンもしくはＣＲＴ／Ｅ７融合タンパク質発現ワクチンで処置したマウスは腫瘍において抗脈管形成効果を導くことができたことが示された。
【０１２９】
実施例２
自己複製ＲＮＡウイルスは抗原特異的ＣＴＬ応答の増強を誘導する
一実施形態において、本発明は本発明のキメラタンパク質（小胞体（ＥＲ）シャペロンポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインと少なくとも１種の抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインとを含むタンパク質）を発現することができる自己複製ＲＮＡレプリコンを提供する。以下の実施例は、本発明の方法を用いて、これらの構築物がｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増強するのに効果的であることを示す研究を説明するものである。モデル系として、ＨＰＶ−１６ Ｅ７とマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨＳＰ７０とを含む融合タンパク質を、シンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクター、ＳＩＮｒｅｐ５においてｉｎ ｖｉｖｏで発現させた。このベクターによって誘導される抗原特異的免疫の効力を決定した。またこれらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏでシンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクターにおいて発現させたＥＲシャペロンポリペプチドと抗原性ペプチドとを含む融合タンパク質がｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的ＣＴＬ応答を増強するのに効果的であることを示す。
【０１３０】
これらの実験により、Ｅ７／ＨＳＰ７０融合遺伝子を含むＲＮＡレプリコンワクチンは野生型Ｅ７遺伝子を含むワクチンよりもワクチン接種したマウスにおいて有意に高いＥ７特異的Ｔ細胞媒介免疫応答を誘導したことが示された。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究により、Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞に由来するＥ７抗原は骨髄由来樹状細胞によって取り込まれ、野生型Ｅ７ ＲＮＡレプリコンでトランスフェクトしたアポトーシス細胞よりも効率的にＭＨＣクラスＩ経路を介して提示されうることが示された。より重要なことには、Ｅ７へのＨＳＰ７０の融合は、あまり効果的でないワクチンをＥ７発現腫瘍に対する有意な効力を有するワクチンへと変えたことであった。この抗腫瘍効果は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に依存的であった。これらの結果より、抗原遺伝子へのＨＳＰ７０の融合が自己複製ＲＮＡワクチンの効力を大いに増強したことが示された。これらの結果より、ＨＳＰ７０にＥ７を連結するシンドビスＲＮＡワクチンはＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の拡大と活性化を劇的に増大し、ＣＤ４力を完全に回避し、Ｅ７発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じたことが示された。
【０１３１】
さらに抗腫瘍効果を促進するシンドビスＲＮＡワクチンの機構を調査した。シンドビスＥ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡワクチンは宿主細胞のアポトーシス死を誘導し、これらの細胞を貪食するように樹状細胞を促進することができ、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大と活性化を劇的に増大したことを見出した。このＣＤ８応答の増強により、Ｅ７発現腫瘍細胞系に対する有力な抗腫瘍免疫が生じた。
【０１３２】
ＨＰＶ−１６ Ｅ７をワクチン開発におけるモデル抗原として選択した。なぜならば、ＨＰＶ、特にＨＰＶ−１６は、上記で論じたようにほとんどの子宮頸癌と関連するからである。
【０１３３】
プラスミドＤＮＡ構築物と調製：
ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＳＰ７０、ｐｃＤＮＡ３−Ｅ７およびｐｃＤＮＡ３−Ｅ７／ＨＳＰ７０を、Ｃｈｅｎ （２０００）前掲に記載のように作製した。シンドビスウイルスＲＮＡレプリコンベクター、ＳＩＮｒｅｐ５はＢｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，前掲に記載されている。ベクターＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０を、ｐｃＤＮＡ３−ＨＳＰ７０、ｐｃＤＮＡ３−Ｅ７およびｐｃＤＮＡ３−Ｅ７／ＨＳＰ７０をそれぞれＸｂａ ＩおよびＰｍｅ Ｉ制限酵素で切断することでマイコバクテリウム・ツベルクローシスＨＳＰ７０、ＨＰＶ−１６ Ｅ７およびキメラＥ７／ＨＳＰ７０をコードするＤＮＡ断片を単離することによって作製した。消化産物を、ゲルを用いて単離した。さらにこれらの単離されたＤＮＡ断片をＳＩＮｒｅｐ５ベクターの対応するＸａｂＩおよびＰｍｌ Ｉ部位にクローニングして、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０構築物を誘導した。これらの構築物の精度を、ＤＮＡ配列決定分析によって確認した。
【０１３４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ調製：
ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０およびＳＩＮｒｅｐ５に由来するＲＮＡ転写産物の生成を、Ｍａｎｄｌ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ４：１４３８−１４４０に記載のプロトコールを用いて実施した。ＳｐｅＩは、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０およびＳＩＮｒｅｐ５に由来するＲＮＡレプリコン合成のためのＤＮＡ鋳型を線状化するために用いられた。ＲＮＡワクチンをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、販売業者のマニュアルに従って、標準的ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）からのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼおよびキャッピング類似体を用いてキャッピングした。合成後、ＤＮＡをＤＮアーゼＩを用いた消化によって除去した。合成されたＲＮＡを定量化し、変性ホルムアルデヒドアガロースゲルを用いて分析した（Ｍａｎｄｌ （１９９８）前掲）。精製ＲＮＡをアリコートに分け、動物におけるワクチン接種とＢＨＫ２１細胞系のトランスフェクションに用いた。転写産物のタンパク質発現を、エレクトロポレーションを用いたＢＨＫ２１細胞へのＲＮＡのトランスフェクションによって評価した。
【０１３５】
細胞系：
ベビーハムスター腎（ＢＨＫ２１）細胞をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手し、５％のＦＢＳ、１０％のトリプトースホスフェートブロス（ｔｒｙｐｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｒｏｔｈ）、２ｍＭ グルタミンおよび抗生物質を補足したＧｌａｓｇｏｗ ＭＥＭで増殖させた。細胞を加湿した５％のＣＯ２空気下中３７℃で維持し、２日ごとに継代した。ＴＣ−１細胞の生産と維持は、Ｌｉｎ （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６：２１−２６に記載のように行われた。腫瘍チャレンジの日に、ＴＣ−１細胞をトリプシン処理によって回収し、１Ｘ Ｈａｎｋｓ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、最後に１Ｘ ＨＢＳＳ中に再懸濁して、指定された注射用濃度にした。
【０１３６】
ＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡワクチンのＥ７タンパク質発現に対するＥＬＩＳＡ：
ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡからのＥ７タンパク質の発現を、間接的ＥＬＩＳＡ方法によって測定した。Ｅ７タンパク質量を、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７もしくはＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０でトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞由来の細胞溶解物を用いて測定した。簡単に言えば、１０００万個のＢＨＫ２１細胞を、Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ （１９９１） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：４１０７−４１１３に記載のようにエレクトロポレーションを介してそれぞれ４μｇのＳＩＮｒｅｐ５、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０もしくはＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０のＲＮＡ転写産物でトランスフェクトした。トランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞を、エレクトロポレーションの１６〜２０時間後に回収した。９６マイクロウエルプレートを、様々なＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞の溶解物で、最終容量１００μｌにおいてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。細菌に由来するＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質を、陽性対照として用いた。次いで、ウエルを２０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳでブロッキングした。希釈した抗Ｅ７Ａｂ（Ｚｙｍｅｄ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）をＥＬＩＳＡウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ−コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）の１／２０００希釈物とともに、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１−Ｓｔｅｐ（商標） Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で顕色し、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを、標準的ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。次いで、細胞溶解物のＥ７タンパク質量を標準化したＥ７タンパク質と比較することによって計算し、決定した。
【０１３７】
マウス：
６〜８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスをＮａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）から購入し、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ）の腫瘍学動物施設で飼育した。全ての動物手順は、認可されたプロトコールおよび実験室動物の適切な使用と注意についての推奨に従って実施された。
【０１３８】
ＲＮＡワクチン接種：
全てのＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡワクチンを、上記のようにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて生成した。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍで測定する光学密度によって決定した。さらにＲＮＡ転写産物の完全性と量を変性ゲル電気泳動を用いてチェックした。マウスを、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０（これは、０．１、１および１０μｇの量で投与された）を除いて様々なＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡ １０μｇで右後脚の筋内にワクチン接種した。
【０１３９】
Ｅ７抗体に対するＥＬＩＳＡ：
血清中の抗ＨＰＶ １６ Ｅ７抗体を、Ｗｕ （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：１１６７１−１１６５に記載のように直接的ＥＬＩＳＡによって測定した。９６マイクロウエルプレートを、５μｇ／ｍｌの細菌に由来するＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質１００μｌでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ウエルを２０％のウシ胎児血清を含有するＰＢＳでブロッキングした。血清を、免疫感作後１４日目にマウスから調製し、ＰＢＳ中に連続希釈し、ＥＬＩＳＡウエルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼ−コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）の１／２０００希釈物とともにＲＴで１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１−Ｓｔｅｐ（商標） Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で顕色し、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを、標準的ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。
【０１４０】
ＩＮＦ−γに対する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）：
脾細胞をワクチン接種の２週間後に回収し、ＭＨＣクラスＩエピトープを含むＥ７ペプチド（ａａ４９−５７）（Ｆｅｌｔｋａｍｐ （１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：２２４２−２２４９）とともに、またはＭＨＣクラスＩＩペプチドを含むＥ７ペプチド（ａａ３０−６７）（Ｔｉｎｄｌｅ，前掲）とともに、２４ウエル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎児血清、５０ユニット／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ非必須アミノ酸を補足したＲＰＭＩ １６４０ ２ｍｌの全容量中で６日間培養した。上清を回収し、製造業者のプロトコールに従ってＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）を用いてＩＦＮ−γの存在についてアッセイした。
【０１４１】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ：
ＣＴＬアッセイを、Ｃｏｒｒ （１９９９） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：４７２１−４７２７に記載のように９６ウエル丸底プレート中で実施した。細胞溶解を、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の定量的測定によって測定した（Ｃｏｒｒ （１９９９） 前掲）。脾細胞をＲＮＡワクチン接種の２週間後に回収し、Ｅ７ペプチド（ａａ４９−５７）とともに、２４ウエル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎児血清、５０ユニット／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ非必須アミノ酸を補足したＲＰＭＩ １６４０ ２ｍｌの全容量中で６日間培養し、エフェクター細胞とした。ＴＣ−１腫瘍細胞を標的細胞として用いた。ＴＣ−１細胞は、様々なエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比率で脾細胞と混合した。３７℃で５時間のインキュベーション後、培養培地５０μｌを回収し、ＣｙｔｏＴｏｘ（商標）アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）の製造業者のプロトコールに従って培養培地中のＬＤＨ量を評価した。溶解の割合を以下の等式から計算した：１００ Ｘ （Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）（式中、Ａは実験のエフェクターシグナル値の読み取り値であり、Ｂはエフェクターの自発的なバックグラウンドシグナル値であり、Ｃは標的細胞からの最大シグナル値であり、Ｄは標的の自発的なバックグラウンドシグナル値である）。
【０１４２】
細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析：
無傷のマウス群またはワクチン接種したマウス群由来の脾細胞を、Ｅ７特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞前駆体を検出するためにＭＨＣクラスＩＩペプチドを含むＥ７ペプチド（ａａ３０−６７）（Ｔｉｎｄｌｅ （１９９９） 前掲）とともにインキュベートした。Ｅ７ペプチドは、１０μｇ／ｍｌの濃度で２０時間添加された。Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（商標）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を培養物から細胞を回収する６時間前に添加した。次いで細胞をＦＡＣＳｃａｎ（商標）バッファー中で１回洗浄して、フィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスＣＤ４抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で染色した。細胞を、製造業者の使用説明書（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットを用いて細胞内サイトカイン染色に供した。ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ＩＦＮ−γ抗体および免疫グロブリンアイソタイプ対照抗体（ラットＩｇＧ１）は、全てＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入した。分析は、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウエアを用いるＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）において行われた。
【０１４３】
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍防御実験：
腫瘍防御実験において、マウス（１群あたり５匹）に異なる用量のＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０および空のＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡワクチンを筋内に（ＩＭ）免疫感作した。免疫感作の１４日後に、マウスに、１ ｘ １０４ 細胞／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞を尾静脈に静脈内（ＩＶ）注射した。３週間後、マウスを安楽死させた。各マウスにおける肺重量および肺結節数は、分からない様式にある実験者によって評価および計数された。
【０１４４】
ｉｎ ｖｉｖｏ抗体枯渇実験：
ｉｎ ｖｉｖｏ抗体枯渇の手順は、例えばＬｉｎ （１９９６） 前掲；Ｗｕ （１９９５） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：１４１５−１４２１に既に記載されている。簡単に言えば、マウスを自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡ １μｇで筋内にワクチン接種し、尾静脈注射を介して１ ｘ １０４細胞／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍チャレンジの１週間前に枯渇を開始させた。ＭＡｂ ＧＫ１．５（Ｄｉａｌｙｎａｓ （１９８３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３１：２４４５）をＣＤ４枯渇に使用し、ＭＡｂ ２．４３（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ （１９８０） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２５：２６６５）をＣＤ８枯渇に使用し、そしてＭＡｂ ＰＫ１３６（Ｋｏｏ （１９８６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：３７４２）をＮＫ１．１枯渇に使用した。フローサイトメトリー分析により、適切なリンパ球サブセットの＞９５％が枯渇され、他のサブセットは正常レベルであったことが明らかとなった。枯渇を腫瘍チャレンジ後２１日目に終了した。
【０１４５】
細胞表面マーカー染色およびフローサイトメトリー分析：
無傷のマウス群またはワクチン接種したマウス群から取り出した脾細胞を直接細胞表面マーカー染色で、Ｊｉ （１９９９） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２７２７−２７４０に記載のように処理した。次いで細胞をＦＡＣＳＣＡＮ（商標）バッファー中で１回洗浄して、ＰＥ−コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスＮＫ１．１抗体およびＦＩＴＣ−コンジュゲートモノクローナルラット抗マウスＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で染色した。ＮＫ細胞集団は、抗ＮＫ１．１抗体で染色されるが、抗ＣＤ３抗体では染色されなかった。様々な自己複製ＲＮＡワクチンで免疫感作したマウス中のＮＫ細胞の割合をフローサイトメトリーを用いて分析した。
【０１４６】
骨髄からの樹状細胞（ＤＣ）の生成と培養：
ＤＣを、Ｌｕ （２０００） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１：５４１−５５０に記載のようにＧＭ−ＣＳＦの存在下で骨髄細胞を培養することによって生成した。簡単に言えば、骨髄をマウスの脛骨から回収した。赤血球を溶解し、残りの細胞をナイロンメッシュを通過させることで小片の骨およびデブリを除去した。細胞を回収し、そして１ Ｘ １０６細胞／ｍｌを、５％のＦＣＳ、２ｍＭ β−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）および１００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を補足したＲＭＰＩ １６４０を含む２４ウエルプレートに配置した。培地の３／２を２日ごとに入れ替え、非接着細胞を７日目に回収した。回収した細胞を、ＤＣマーカーについてのフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって特性付けた。
【０１４７】
Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞系の生成：
Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞系の生成を、Ｓｉｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１ワクシニアの腹腔内（ＩＰ）注射によってメスＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスを免疫感作することによって行った。脾細胞を８日目に回収した。最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激については、脾細胞を２０Ｕ／ｍｌ濃度のＩＬ−２および１μＭ Ｅ７ペプチド（アミノ酸４９−５７）で６日間パルスした。Ｅ７特異的ＣＴＬ細胞系の増殖を、Ｅ７特異的ＣＴＬを含む１ ｘ １０６脾細胞と３ ｘ １０６の放射線照射した脾細胞とを混合し（２ｍｌ／ウエル）、それらに２０Ｕ／ｍｌ濃度のＩＬ−２および１μＭ Ｅ７ペプチド（アミノ酸４９−５７）をパルスすることによって、２４ウエルプレート中で実施した。この方法を６日ごとに繰り返した。Ｅ７ ＣＴＬ系の特異性を、ＣＴＬアッセイによって特性付けた。フローサイトメトリーを実施して、ＣＤ８マーカーの発現を示した。
【０１４８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞死分析：
１０００万個のＢＨＫ２１細胞を、初期に述べたように４μｇのＳＩＮｒｅｐ５、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０もしくはＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡ転写産物でトランスフェクトした。無傷のＢＨＫ２１細胞またはＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡなしでエレクトロポレーションを行ったＢＨＫ２１細胞を対照として用いた。ＢＨＫ２１細胞を回収し、２４時間ごとに７２時間まで評価した。アポトーシスおよびネクローシスＢＨＫ２１細胞の割合を、製造業者のプロトコールに従ってアネキシンＶアポトーシス検出キット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて分析し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。
【０１４９】
アポトーシス細胞をパルスしたＤＣを標的細胞として用いたＣＴＬアッセイ：
アポトーシス細胞をパルスしたＤＣを標的細胞として用いたＣＴＬアッセイを、Ａｌｂｅｒｔ （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９２：８６−８９；Ａｌｂｅｒｔ （１９９８） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：１３５９−１３６８に記載のプロトコールに類似し、改変を加えたプロトコールを用いて実施した。簡単に言えば、まず１０００万個のＢＨＫ２１細胞を、エレクトロポレーションを介して様々な自己複製ＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡ ４μｇでトランスフェクトした。ＢＨＫ２１細胞をエレクトロポレーションの１６〜２０時間後に回収した。ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７もしくはＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡ転写産物でトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞中のＥ７タンパク質発現レベルは、ＥＬＩＳＡで測定した場合には類似していた。次いで３ ｘ １０５のトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞を、１ ｘ １０５の骨髄由来ＤＣとともに３７℃で４８時間同時インキュベートした。次いでこれらの調製したＤＣを標的細胞として用い、Ｄｂ制限Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として用いた。ＣＴＬアッセイを、様々な比率（１：１、３：１、９：１および２７：１）で一緒に混合したエフェクター細胞と標的細胞（１ウエルあたり１ ｘ １０４）を用いて最終容量２００μｌ中で実施した。３７℃で５時間のインキュベーション後、培養培地５０μｌを回収し、上記のように培養培地中のＬＤＨ量を評価した。トランスフェクトしていないＢＨＫ２１細胞、トランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞単独、未処理のＤＣ単独、およびＣＤ８＋Ｔ細胞系単独を陰性対照として含めた。
【０１５０】
自己複製ＲＮＡ構築物の構築と特性付け：
プラスミドＤＮＡ構築物の生成と続く自己複製ＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡ構築物の調製は、上記のように実施された。ＳＩＮｒｅｐ５ベクターは、シンドビスウイルスＲＮＡレプリカーゼをコードする遺伝子およびＳＰ６プロモーターを含む（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ （１９９３） 前掲）。ＳＩＮｒｅｐ５、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０のＤＮＡ構築物の概略図を図９Ａに示した。さらに、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてこれらのＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ転写産物の概略図を図９Ｂに示した。メチル化Ｍ７Ｇ「キャップ」はｍＲＮＡの５’末端に位置し、自己複製において機能する配列（レプリカーゼ）、目的の遺伝子（すなわち、ＭＨＣクラスＩペプチドエピトープ、Ｅ７、ＨＳＰ７０、Ｅ７／ＨＳＰ７０など）およびポリアデニル化テイル（ｔａｉｌ）（ＡＡＡＡ）が続く。ＥＬＩＳＡを実施して、様々な自己複製ＲＮＡ構築物でトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞によるＥ７タンパク質の発現を示した。ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０は、類似した量のＥ７タンパク質を発現させた。
【０１５１】
自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡを用いたワクチン接種はＥ７特異的細胞傷害性免疫応答を増強する：
ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、抗腫瘍免疫の誘導において最も重要なエフェクターの１つである。ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡワクチンによって誘導されるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の量を決定するために、ＣＴＬアッセイを用いた。マウスを、筋内注射を介して様々なＳＩＮｒｅｐ５自己複製ＲＮＡワクチンで免疫感作した。脾細胞および血清サンプルを１４日後に回収した。細胞傷害性アッセイを実施するために、様々な自己複製ＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡワクチンにより誘導された脾細胞を、ＭＨＣクラスＩエピトープを含むＥ７ペプチド（ａａ４９−５７）とともに６日間培養し、エフェクター細胞とした。ＴＣ−１腫瘍細胞を標的細胞とした。様々なＥ／Ｔ（エフェクター／標的比率）でＴＣ−１細胞を脾細胞と混合した。細胞溶解をＬＤＨの定量的測定によって決定した。本明細書で示すＣＴＬアッセイは、実施された２回のうちの１回の代表的実験からのものである。
【０１５２】
自己複製ＲＮＡ Ｅ７／ＨＳＰ７０ワクチンは、他のＲＮＡワクチンと比較して、有意により高い割合の特異的溶解を誘導した（＊：Ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０は、他のＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡワクチンでワクチン接種したマウスと比較して、有意により高い割合の特異的溶解を誘導した（Ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。特異的溶解を誘導するＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡの能力は、自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７ ＲＮＡの約４倍であることが見出された（３２．７％ 対 ８．８％、Ｅ／Ｔ比率４５／１、Ｐ＜０．００１）。
【０１５３】
自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡを用いたワクチン接種はＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増強することで高いレベルのＩＮＦ−γを分泌させる：
自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡによって誘導されるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫学的応答の程度を決定するために、ＥＬＩＳＡを用いて、脾細胞の培養上清中のＩＮＦ−γ濃度を検出した。マウスを、筋内注射を介して様々な自己複製ＲＮＡワクチンで免疫感作した。脾細胞および血清サンプルを１４日後に回収した。様々な自己複製ＲＮＡワクチンにより誘導された脾細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＨＣクラスＩエピトープを含むＥ７ペプチド（ａａ４９−５７）とともに（またはいずれのペプチドも含まずに）６日間培養した。また陰性対照として、ペプチドを含まずにＥＬＩＳＡを実施した。培養培地中の上清を回収し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＮＦ−γ濃度を検出した。
【０１５４】
Ｅ７ペプチド（ａａ４９−５７）で刺激した自己複製Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡ群に由来する脾細胞は、他のＲＮＡワクチンと比較して、最も高いＩＮＦ−γ濃度を分泌した（Ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。またこれらの結果により、Ｅ７へのＨＳＰ７０の融合はＩＮＦ−γ分泌Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性を有意に増強することが示された。従って、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＥ７のＭＨＣクラスＩエピトープによって誘導することができた。注釈：Ｅ７ペプチド（ａａ４９−５７）で刺激した自己複製Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡ群に由来する脾細胞は、他のＲＮＡワクチンと比較して、最も高いＩＮＦ−γ濃度を分泌した（＊：Ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。
【０１５５】
自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡを用いたワクチン接種は有意なＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介免疫応答を誘導しない：
これらの各ＲＮＡワクチンによるＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔ前駆体細胞の生成およびサイトカインプロフィールを調べるために、本発明者らは免疫感作したマウスから得た脾細胞におけるＣＤ４表面マーカーおよび細胞内ＩＦＮ−γに対する二重染色を実施し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。脾細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥ７ペプチド（ａａ３０−６７）とともに一晩培養し、ＣＤ４および細胞内ＩＦＮ−γの双方について染色した。Ｅ７ペプチド（ａａ３０−６７）は、ＨＰＶ−１６のＥ７オープンリーディングフレームタンパク質中の主要なＴヘルパーエピトープを含む（Ｔｉｎｄｌｅ （１９９１）前掲）。ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【０１５６】
ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡでワクチン接種したマウスは、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７ ＲＮＡ （１５／３ ｘ １０５脾細胞 対 １２／３ ｘ １０５脾細胞、ｐ＞０．０５）または他のＲＮＡ群でワクチン接種したマウスと比較して、類似のＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞数を誘導した。フローサイトメトリー染色を用いて観察されたＥ７特異的ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋細胞数に、無傷のマウスまたは空のプラスミド、Ｅ７、ＨＳＰ７０もしくはＥ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡでワクチン接種したマウスの間に有意な差異はなかった。Ｓｉｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１ ＤＮＡでワクチン接種したマウス由来の脾細胞（Ｊｉ （１９９９）前掲）を、この研究の細胞内ＩＦＮ−γ染色に対する陽性対照として用いた。
【０１５７】
ワクチン接種したマウスの血清中の抗ＨＰＶ １６ Ｅ７抗体量を、ワクチン接種の２週間後に様々な希釈物（１：１００、１：５００、１：１０００）で直接的酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０は、他のＲＮＡワクチン構築物によって誘導された力価と比較して、ワクチン接種したマウスの血清におけるより高い力価のＥ７特異的抗体を誘導しなかった。
【０１５８】
自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡを用いたワクチン接種はＴＣ−１腫瘍の増殖に対してマウスを防御する：
自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡを用いたワクチン接種はＥ７発現腫瘍に対してマウスを防御するか否かを決定するために、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍防御実験を、右後脚に筋内投与される異なる用量の自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡを用いて実施した。マウスを、１０μｇの自己複製ＳＩＮｒｅｐ５、 ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７ ＲＮＡで同様にワクチン接種した。また０．１μｇ、１μｇおよび１０μｇを含む異なる用量の自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡをマウスに注射した。ワクチン接種の１週間後に、マウスを、静脈内尾静脈注射を介して２ ｘ １０４ 細胞／マウスの用量のＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジした。マウスを１週間に２回モニターし、腫瘍チャレンジ後２１日目に屠殺した。肺結節を、腫瘍チャレンジの２１日後に評価した。肺をマウスから、空のＳＩＮｒｅｐ５（１０μｇ）、 ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０（１０μｇ）、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７（１０μｇ）およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡ（０．１μｇ、１μｇもしくは１０μｇ）を用いたワクチン接種の３５日後に切断した。肺病巣の平均数を、ＨＰＶ−１６ Ｅ７発現腫瘍増殖を制御する上での様々な自己複製ＲＮＡワクチンの有効性の測定値として用いた。
【０１５９】
自己複製Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡワクチン（０．１μｇ、１μｇおよび１０μｇ）でワクチン接種したマウスの平均肺結節は、他のＲＮＡワクチンでワクチン接種したマウスと比較して非常により小さかった（Ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。これらの結果より、自己複製ＲＮＡ ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ワクチンは０．１μｇの低い用量でさえも静脈内腫瘍チャレンジからマウスを防御し、一方、インサートなしのＳＩＮｒｅｐ５ １０μｇ、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７ １０μｇまたはＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０ １０μｇ由来のＲＮＡでワクチン接種したマウスはＴＣ−１腫瘍チャレンジから多数の肺結節を生じたことが示された。
【０１６０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞がＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡワクチンを用いたワクチン接種によって誘導される抗腫瘍効果に重要である：
Ｅ７発現腫瘍細胞に対する防御に重要なリンパ球タイプを決定するために、（ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の）ｉｎ ｖｉｖｏ抗体枯渇実験を実施した（自己複製ＲＮＡワクチンで免疫感作したマウスの脾細胞に由来するＮＫ細胞の割合は免疫感作なしのマウスよりも高く、様々な自己複製ＲＮＡワクチン間でＮＫ細胞の割合に有意な差異はなかった）。抗体枯渇を腫瘍チャレンジの１週間前に開始し、腫瘍チャレンジ後２１日目に終了した。
【０１６１】
ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ１．１細胞を枯渇したマウスに由来する平均肺結節は、枯渇していない群のマウスよりも有意に高かった。さらに、ＮＫ１．１細胞の枯渇により、ＣＤ８＋枯渇マウスよりも腫瘍肺結節の平均数が高かった。
【０１６２】
比較すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞を枯渇したマウスに由来する平均肺結節は、枯渇していないマウスから得られた結果と似ており、このことによりＣＤ４＋Ｔ細胞がこの効果の発生に重要ではなかったことが示された。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡワクチンによって誘導される抗原特異的抗腫瘍免疫に必須であり、Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡワクチンに限定されないが、ＮＫ細胞も同様に重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１６３】
またＮＫ細胞効果はＥ７／ＨＳＰ７０ワクチンに限定されたものか否か、またはそれは用いるベクターの結果であるかを調査した。ＣＤ３（−），ＮＫ１．１（＋）細胞のフローサイトメトリー分析により、それらの存在が無傷のマウスに対して全ての構築物（Ｅ７／ＨＳＰ７０、Ｅ７、ＨＳＰ７０および対照プラスミド）において著しく増大したことが明らかになり、このことにより、ＮＫ細胞はＥ７／ＨＳＰ７０ワクチンに限定されない抗腫瘍効果の重要なエフェクターであったことが示された。
【０１６４】
自己複製ＲＮＡワクチンはアポトーシスを誘導する：
様々なプラスミドＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡワクチンからｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡを、エレクトロポレーションを介してＢＨＫ２１細胞にトランスフェクトした。ＲＮＡなしでエレクトロポレーションを行ったＢＨＫ２１細胞および未処理ＢＨＫ２１細胞を対照として用いた。アポトーシスおよびネクローシスＢＨＫ２１細胞の割合を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって染色し、次いでフローサイトメトリー分析を行った。
【０１６５】
ＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡワクチンでトランスフェクトした場合には、２４〜７２時間後にはアポトーシスＢＨＫ２１細胞の割合は統計的下降を示した（ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０を例にとると、２４時間で７０．３±３．６％、４８時間で４９．３±４．２％、７２時間で１８．０±３．１％、Ｐ＜０．００１、ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。ＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡワクチンでトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞は、他の２つの対照群と比較すると２４時間、４８時間または７２時間後にはより高い割合を誘導した。様々なＳＩＮｒｅｐ５ ＲＮＡワクチンのアポトーシス割合には統計的差異を見出すことができなかった。
【０１６６】
ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡでトランスフェクトした細胞をパルスした樹状細胞におけるＭＨＣクラスＩ経路を介したＥ７の提示の増強：
ｉｎ ｖｉｖｏでＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強する潜在的な機構は、様々なＥ７構築物を発現する細胞からのアポトーシス小体の取込みによるＭＨＣクラスＩ経路を介したＥ７の提示であり、「クロスプライミング」とも呼ばれる。クロスプライミング実験は、様々な自己複製ＲＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞からのアポトーシス小体をパルスした樹状細胞におけるＥ７のＭＨＣクラスＩ提示を特性付けるために実施された。既に述べたように、ＢＨＫ２１細胞は安定した高いトランスフェクション効率、および異なるＥ７含有自己複製ＲＮＡでトランスフェクトした細胞間で類似したＥ７発現を有することが示されている。トランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞を、骨髄由来ＤＣとともに同時インキュベートした。ＤＣを標的細胞として用い、一方、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞はエフェクター細胞として機能した。様々なＥ／Ｔ比率でのＣＴＬアッセイを実施した。
【０１６７】
ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ ＲＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞とともに同時インキュベートしたＤＣ標的細胞は、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７ ＲＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞とともに同時インキュベートしたＤＣと比較して有意により高い割合の特異的溶解を誘導した（Ｐ＜０．００１）。これらの結果は、Ｅ７／ＨＳＰ７０融合タンパク質を含有するアポトーシス小体をパルスした樹状細胞は、野生型Ｅ７タンパク質を含有するアポトーシス小体をパルスした樹状細胞よりも効率的にＭＨＣクラスＩ経路を介してＥ７抗原を提示したことを示唆した。従って、Ｅ７へのＨＳＰ７０の融合はＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強し；そして、本発明はいずれの特定の機構によっても限定されないが、この増強は「クロスプライミング」を介するものであると考えられた。
【０１６８】
多数の本発明の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、様々な改変が本発明の精神と範囲から逸脱することなく行われうることが理解されるだろう。従って、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、実施例１で論じるように、カルレティキュリン（ＣＲＴ）、ＨＰＶポリペプチドＥ７および本発明の融合タンパク質カルレティキュリン／Ｅ７（ＣＲＴ／Ｅ７）をコードする組換えＤＮＡ構築物の概略図を示す。
【図２】
図２Ａは、実施例１で論じるように、陰性対照、ならびにＣＲＴを単独で発現するＤＮＡ、Ｅ７を単独で発現するＤＮＡおよび本発明のＣＲＴ／Ｅ７融合タンパク質を発現するＤＮＡでワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、ＣＤ８およびＩＮＦ−γに対する抗体で染色したＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）分析を要約する二次元ヒストグラムを示す。図２Ｂは、ヒストグラムデータの要約図を示す。
【図３】
図３は、実施例１で論じるように、構築物単独、およびＣＲＴを単独でコードする構築物、Ｅ７を単独でコードする構築物、ＣＲＴ／Ｅ７融合タンパク質をコードする構築物、ならびにＣＲＴとＥ７を個別に発現する２種の構築物の混合物を用いた最後のワクチン接種の２週間後に直接的ＥＬＩＳＡによって測定した、ワクチン接種したマウスの血清中の抗ＨＰＶ１６ Ｅ７抗体量を示すデータの要約図を示す。
【図４】
図４は、実施例１で論じるように、マウスを様々なＤＮＡワクチン構築物でワクチン接種し、その後にＥ７発現腫瘍でチャレンジした、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍防御実験データの要約図を示す。
【図５】
図５は、実施例１で論じるように、まずマウスに腫瘍細胞を注射し、次いで様々な裸のＤＮＡ構築物でワクチン接種し（ワクチン接種１日目の後の１週間の追加免疫を含む）；その後に肺結節の平均数を評価した実験からのデータの要約図を示す。データは、腫瘍細胞チャレンジ後の日数との相関関係として肺転移性腫瘍結節の平均数＋ＳＥＭとして表している。
【図６】
図６は、実施例１で論じるように、様々な裸のＤＮＡ構築物でトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ標的細胞に対するエフェクター細胞としてＤｂ制限Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いたＣＴＬアッセイのデータの要約図を示す。
【図７】
図７は、様々な裸のＤＮＡ構築物でトランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の細胞溶解物をパルスした樹状細胞におけるＥ７のＭＨＣクラスＩ提示を特性付けるためのクロスプライミング実験からのデータの要約図を示す。Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクター細胞として機能した；骨髄由来のＤＣに、トランスフェクトした２９３ＤｂＫｂ細胞の溶解物の連続希釈物をパルスした（５０ ｍｇ／ｍｌ、１０ ｍｇ／ｍｌ、２ ｍｇ／ｍｌおよび０．４ ｍｇ／ｍｌ）；実施例１で論じるように、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がエフェクター細胞として機能する一方、ＤＣは標的細胞として使用された。
【図８】
図８は、いずれの免疫エフェクター細胞も含まない肺への（すなわち、ヌードマウスへの）ＴＣ−１腫瘍転移処置における、Ｅ７もしくはＣＲＴポリペプチド単独と比較したＣＲＴ／Ｅ７融合ポリペプチドの役割を評価するために設計した実験からのデータの要約図を示す。まずヌードマウスを腫瘍細胞でチャレンジし、２日後にＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジした；その後に、マウスに様々な裸のＤＮＡ構築物をワクチン接種した。９日目および１６日目に、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じ処方計画で追加免疫した。実施例１で論じるように、マウスを２１日目に屠殺し、各マウスの肺結節を評価および計数した。
【図９】
図９Ａは、ＳＩＮｒｅｐ５、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０のＤＮＡ構築物の概略図を示す。図９Ｂは、実施例２に詳細に説明するように、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてこれらのＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ転写産物の概略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004527213.tif 000159
2004527213.tif 000160
【国際調査報告】
2004527213.tif 000161
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