(57)【要約】生きている生物材料を冷却液のタンクに材料を浸漬し、材料を冷凍するために実質的に一定の所定速度で材料を過ぎて冷却液を循環させることによって低温保存する。材料は、冷凍前に、処理なしで冷却液に直接浸漬するか又は化学的処理する。本発明の方法は、細胞構造内で氷結晶の形成を回避するのに十分迅速に生体材料を冷凍し、試料についてその解剖学的構造を維持し、冷凍後の生化学活性を残す。冷却液の温度は、応力破壊の発生及び熱変動による細胞膜におけるアーティファクトの形成を最小にするのに十分暖かい温度である−２０℃から−３０℃の間であるのが好ましい。本発明の方法を用いて冷凍した細胞は、病理的及び組織的手法で用いる他の低温保存によって冷凍された細胞より、かなり細胞及び細胞間のダメージが少なかった。本発明は材料がガラス化するように生体材料を冷凍することができるので、細胞内の生化学活性は冷凍後にも消失せず、本発明の種々の実施形態は、研究及び患者のケアの分野において、低温組織学及び免疫組織化学の新しい手法に対する生体材料を準備するための装置に用いてもよい。
2004537035.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生化学活性組織試料を冷凍する段階であって、該冷凍には、冷却液に組織試料を浸漬することと、組織試料がガラス化するように組織試料を冷凍するために実質的に一定の所定の速度及び温度で組織試料を過ぎて循環させることとを含み、ここで、組織試料はその解剖学的構造を維持し、解凍後にも生化学活性を残しているところの段階と；
組織試料を解凍する段階と；
解凍された試料を検査する段階と；を備えた方法。
【請求項２】
さらに、組織試料を断片化する段階を備えた請求項１に記載の方法。
【請求項３】
解凍された試料を検査する段階が組織学的検査を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
解凍された試料を検査する段階が超構造検査を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
検査する段階が免疫組織化学検査を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
免疫組織化学には、蛍光標識化抗体染色が含まれる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組織試料の約５５％以上は細胞解剖学的構造にダメージはなく、解凍後に生化学活性を残している請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組織試料の約４５％以上は細胞解剖学的構造にダメージはなく、解凍後に生化学活性を残している請求項１に記載の方法。
【請求項９】
組織試料の約８５％以上はその解剖学的構造を維持し、解凍後にダメージのないままである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
冷却液が約−２０℃から−３０℃の間の温度で維持されている請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
組織試料を過ぎる冷却液の流速は、約２４インチ幅でかつ約４８インチ深さよりは大きくない面積を冷却液１フィート当たり及び１分当たり約３５リットル通過する速さである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
冷却液は、冷却液に浸漬するモータ／インペラアセンブリによって循環する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、冷却液に浸されたマルチパス熱交換コイルを過ぎて冷却液を循環させる段階を備え、ここで、冷却液が組織試料から除去されるときに、熱交換コイルは冷却液から少なくとも同じ量の熱を除去することができる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
冷却液に生化学活性組織試料を浸漬する段階と；
組織試料がガラス化し、組織試料がその解剖学的構造を維持し、組織試料が解凍後に生化学活性を残するように、実質的に一定の所定の速度及び温度で組織試料を過ぎて冷却液を循環させることによって、約−３０℃より高い温度まで直接組織試料を冷凍する段階と；を備えた検査のために組織試料を準備するのに用いる方法。
【請求項１５】
さらに、組織試料を断片化する段階を備えた請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、組織試料を解凍する段階を備えた請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
検査には、組織学的検査が含まれる請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
検査には、超構造検査が含まれる請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
検査には、免疫組織化学検査の使用が含まれる請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
免疫組織化学には、蛍光標識化抗体染色が含まれる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組織試料の約４０％以上はその細胞解剖学的構造を維持し、解凍後に生化学活性を残している請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
組織試料の約８０％以上はその細胞解剖学的構造を維持し、解凍後に生化学活性を残している請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
組織試料の約８５％以上はその解剖学的構造を維持し、解凍後にダメージのないままである請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
冷却液が約−２０℃から−３０℃の間の温度で維持されている請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
組織試料を過ぎる冷却液の流速は、約２４インチ幅でかつ約４８インチ深さよりは大きくない面積を冷却液１フィート当たり及び１分当たり約３５リットル通過する速さである請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
冷却液は、冷却液に浸漬したモータ／インペラアセンブリによって循環する請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、冷却液に浸されたマルチパス熱交換コイルを過ぎて冷却液を循環させる段階を備え、ここで、冷却液が組織試料から除去されるときに、熱交換コイルは冷却液から少なくとも同じ量の熱を除去することができる請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
冷却液に浸漬するために生化学活性組織試料を受容するように構成された冷却液溜まりと；
前記冷却液を循環させるように構成された一又は二以上の冷却液サーキュレータと；
前記冷却液から熱を除去する熱交換コイルと；
前記熱交換コイルから熱を除去するように構成された冷蔵ユニットと；を備え、
前記冷却液溜まりと、前記一又は二以上のサーキュレータと、前記冷蔵ユニットとが協力して、組織試料がガラス化し、組織試料がその解剖学的構造を維持し、組織試料が解凍後に生化学活性を残するように、実質的に一定の所定の速度及び温度で組織試料を過ぎて冷却液を循環させることによって、約−３０℃以上高い温度で組織試料を冷凍する検査用の組織試料を準備するのに用いる装置。
【請求項２９】
検査には、組織学的検査が含まれる請求項２８に記載の装置。
【請求項３０】
検査には、超構造検査が含まれる請求項２８に記載の装置。
【請求項３１】
検査には、免疫組織化学検査の使用が含まれる請求項２８に記載の装置。
【請求項３２】
免疫組織化学には、蛍光標識化抗体染色が含まれる請求項３１に記載の装置。
【請求項３３】
組織試料の約４０％以上はその細胞解剖学的構造を維持し、解凍後にも生化学活性を残している請求項２８に記載の装置。
【請求項３４】
組織試料の約８０％以上はその細胞解剖学的構造を維持し、解凍後にも生化学活性を残している２８に記載の装置。
【請求項３５】
組織試料の約８５％以上はその解剖学的構造を維持し、解凍後にもダメージのないままである請求項２８に記載の装置。
【請求項３６】
冷却液が約−２０℃から−３０℃の間の温度で維持されている請求項２８に記載の装置。
【請求項３７】
組織試料を過ぎる冷却液の流速は、約２４インチ幅でかつ約４８インチ深さよりは大きくない面積を冷却液１フィート当たり及び１分当たり約３５リットル通過する速さである請求項２８に記載の装置。
【請求項３８】
冷却液は、冷却液に浸漬したモータ／インペラアセンブリによって循環する請求項２８に記載の装置。
【請求項３９】
さらに、冷却液に浸されたマルチパス熱交換コイルを過ぎて冷却液を循環させる段階を備え、ここで、冷却液が組織試料から除去されるときに、熱交換コイルは冷却液から少なくとも同じ量の熱を除去することができる請求項２８に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低温保存に関し、特に、検査及び診断目的で保存する方法に関する。
本出願は、“組織学的検査及び病理学的検査用の組織の試料を作成する方法及び装置（Method And System For Preparing TIssues Samples For Histological And Pathological Examinations）”の発明の名称で、２００１年１月２日に出願した米国仮出願シリアル番号60/259,418を基礎として、合衆国法典第３５巻１１９条に基づいて優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
組織のような生体材料は、組織学実験室において種々の処理が施されて、顕微鏡で観察するためにスライド上に標本（試料）として準備される。病理学者はスライドを慎重に調べ、病気の診断又は病気の過程において内科医の助けになるように所見を報告する。組織病理学は従来、一又は二以上の基礎的な方法によって準備（作成）された試料の検査に依存している。第１の組織学的方法では、試料は実験室において、組織を保存するための固定、組織から水分を除去するための脱水、パラフィンのような包埋剤での浸潤、包埋、スライド上に載置するための組織の断片化又は断片への切断、断片の載置、詳細を強調するための断片の染色等の重要な処理が施される。第２の方法、低温保存には通常、冷却液（冷却媒体）又は冷却環境でのスナップ冷凍、断片化、載置及び染色が含まれ、これによって、第１の方法の過程を大きく減少する。
【０００３】
第１の方法は非常に優れた可視化をもたらすが、通常最低でも１８時間から２４時間の長い処理時間を要する。従って、この方法では、例えば、手術中のような病理学的過程の迅速な診断を要する状況に適用することはできない。また、用いられる処理技術によって、組織の生物活動の全て又はその一部が破壊され得る。
【０００４】
第２の方法は、速度（３０分又は１時間）の点で有利であるが、低温作成を用いて準備した組織の標本はしばしば氷の結晶化によって細胞が損傷を受け、組織内の興味の対象である分子の生物的機能の損失、及び、劣化した解剖学的構造として明らかとなる組織の完整性（integrity）の完全なる損失を引き起こし得る。多くの商業的な病理学実験室は、特別な環境を除いて、免疫組織化学のための冷凍組織の使用には向かない。というのも、保存された組織における氷の結晶の形成によって、試料内に多くの異常なアーティファクト（人工物）が発生して、診断の解釈が極めて困難になり、又は、場合によっては不可能にさえなるからである。
【０００５】
ポリクロナール抗体及びモノクローナル（単クローン）抗体の出現によって、従来の微視的な組織学及び病理学のいずれの焦点も、単純な主観的観察から直接対象染色処置へシフトしてきた。これらの最新の免疫組織化学（ＩＨＣ）技術は、病理学だけでは決定的でないときに、診断を決定づけるのに役立つ。しかしながら、ＩＨＣ技術は、適当な染色用の試料内の生物学的無処置のレセプターに依存する。従って、準備が完了した後に存在する活性な（アクティブな）生体材料の量を制限しない組織試料の作成方法を利用するのが望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、必要なことは、現在使用できる方法に固有の問題の少なくとも一部を回避する、生存可能な単一の細胞、組織、器官、核酸、又は他の生物活性分子を低温保存する方法の改善である。従って、本発明は、冷却液に試料を浸漬し、かつ、冷却液を試料を通り過ぎて循環させることによって生化学活性組織試料を冷凍するための低温保存の方法を提供する。冷却液は、実質的に一定の所定の速度及び温度で組織試料を通過して循環することによって、組織試料はガラス化（ガラス状に）するが、その解剖学的構造を維持し、解凍後に生化学活性のままであるように組織試料を冷凍する。少なくとも一の実施形態では、冷却液は約−２０℃と約−３０℃との間の温度に維持し、組織試料を通過する冷却液の流速は、約２４インチ幅でかつ約４８インチ深さよりは大きくない領域を１フィートの冷却液及び１分当たり約３５リットル通過する速さである。また、本発明の少なくとも一の実施形態では、生物活性組織試料を冷却液に浸漬して、試料を直接約−３０℃より高い温度にまで冷凍する。本発明の他の実施形態では、冷却液に浸したマルチパス熱交換コイルを通過させて冷略液を循環することを備える。ここで、熱交換コイルは、冷却液が組織試料から除去されるときに、冷却液から少なくとも同じ量の熱を除去することができるものである。少なくとも一の実施形態は、上述の方法を実施する装置を提供する。
【０００７】
本発明の少なくとも一の実施形態の目的は、生体材料の冷凍方法への応用であって、その方法において氷の結晶の形成及び応力破壊を回避し、冷凍後に細胞の生化学機能を維持するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の少なくとも一の実施形態の利点は、生体材料が冷凍中にガラス化するために、低温保存の回復率が非常に増大することである。
【０００９】
本発明の少なくとも一の実施形態の他の利点は、生体材料が十分な高温においてガラス化して細胞膜内での応力破壊の発生を回避するために、低温保存の回復率が非常に増大することである。
【００１０】
本発明の少なくとも一の実施形態の他の利点は、低温保存の回復率が、現在利用されている方法に比べて、生体材料のかなり高い割合が解剖学的構造を維持し、解凍後に生化学活性が維持されているような値であることである。
【００１１】
本発明の少なくとも一の実施形態のさらなる利点は、低温保存の回復率が、生体材料試料を、伝統的な病理学的手法より短い時間で、断片化、処理、その後の組織学的、超構造及び免疫組織化学検査への応用に使用されるような値であることである。
【００１２】
本発明の少なくとも一の実施形態のさらなる利点は、一旦冷凍されると、現存の低温保存格納設備と機構とを用いて冷凍した生体材料を保存することができることである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
方法、作用、関連する構成要素の機能、部分の組合せ及び製造における経済性と共に、本発明の他の目的、利点、特徴は、図面を参照して以下の詳細な説明と特許請求の範囲とから明らかになるだろう。図面は本明細書の一部を形成し、同符合の部材は同部材を示す。
【００１４】
好適な実施形態についての以下の詳細な説明は、この出願の一部を成すと共に本発明が実施される特定の好適な実施形態について図示する図面を参照して行う。それらの実施形態は、当業者が本発明を実施することができるのに十分詳細に説明されており、他の実施形態を利用してもよいし、本発明の精神又は範囲を逸脱することなく論理的、機械的、化学的及び電気的変更を行ってもよいことは理解されたい。当業者が本発明を実施するのに必要とされないほどの詳細さを回避するために、説明の中で当業者に公知の情報は省略している。従って、以下の詳細な説明は限定的な意味でとってはならないし、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって画定される。
【００１５】
図１及び図２に、本発明の少なくとも一の実施形態による方法を実施するのに適した冷却装置について、冷却ユニット１００と称して示している。冷却ユニット１００は好適には、冷却液１４０を収容するタンク１１０を備えている。インペラ（羽根車）１３２、熱交換コイル１２０、ラック１５０を有するモータのようなサーキュレータ１３４であって、一の実施形態では、冷凍される生体材料を支持するトレイ１５５を備えたものが冷却液１４０に浸漬されている。生体材料は、限定するものではないが、生きている単一細胞、組織、器官、核酸及びその他の生物活性分子を含んでもよい。生体材料は特定の種類であることは要求されない。タンク１１０の外部には、熱交換コイル１２０に接続されて冷蔵ユニット１９０を備えている。
【００１６】
タンク１１０は、生体材料を冷却液１４０中で冷凍するために浸漬するのに要する寸法であればよく、１２インチ×２４インチ×４８インチの倍数である。他のタンクの寸法もここに教示した内容に合致するものであれた使用できる。例えば、（図示しない）一の実施形態では、タンク１１０はちょうど冷却液１４０を保持する寸法であり、そのため、ガラス瓶、試験官、ビーカー、メスシリンダー等のような容器が、生体材料及び凍結防止剤を含む懸濁液の迅速冷凍のためのタンク１１０に載置することができる。他の実施形態では、タンク１１０は全器官及び／又は生物を迅速に冷凍するために完全に浸漬するのに十分な大きさである。タンク１１０は、冷凍される種々の寸法及び量の生体材料を効率的に収容する際の必要に応じて大きくしたり小さくしたりすることができることは利点である。生体材料は、タンク１１０に浸漬する前に凍結防止剤によって処理してもよい。
【００１７】
タンク１１０は冷却液１４０を収容できる。一の実施形態では、冷却液は食品グレードの溶質である。食品グレード品質の流体の好適な例は、プロピレングリコール、塩化ナトリウム溶液等にもとづくものである。他の実施形態では、冷却液はそれ自体が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の凍結防止剤である。場合によっては、凍結防止剤はそれ自体が食品グレード品質の流体である。他の実施形態では、他の流体及び好適には溶質を冷却液として用いてもよい。生体材料を収容するために種々の容器を使用してもよいが、本発明の実施形態によっては、迅速かつ有効な冷凍のために生体材料を冷却液に直接浸漬する。このような直接的な浸漬によって、組織、器官によっては低温保存を単純化する。
【００１８】
氷結晶の形成を回避しつつ生体材料を冷凍にするために、本発明の一の実施形態では、約２４インチ幅で４８インチ深さより大きくない領域に収容される冷却液の１フィート当たりかつ１分当たり３５リットルの比較的一定の流量で、冷凍する生体材料を通り過ぎて冷却液１４０を循環させる。必要な循環は、モータ１３０のような一又は二以上のサーキュレータ１３４によって行われる。本発明の少なくとも一の実施形態では、浸漬したモータ１３０はインペラ１３２を駆動して、冷却液１４０を冷凍される生体材料を過ぎて循環させる。（図示しない）種々のポンプを含む他のサーキュレータ１３４も、本発明の目的に合致するように使用することができる。本発明の少なくとも一の実施形態は、モータ１３０と少なくとも一のサーキュレータ１３４とを利用することによって冷却液が循環する面積及び体積を増加する。複数のサーキュレータ１３４を使用する実施形態では、冷却液循環の面積及び体積は、使用される付加された各サーキュレータに比例して増加する。例えば、好適な実施形態では、約２４インチ幅及び４８インチ深さより大きくない面積を通って循環する１フィートの冷却液に対して一の付加サーキュレータを用いる。
【００１９】
好適には、モータ１３０は、保存される生体材料を通って流れる一定の所定の冷却液の速度を維持するように制御でき、つまり、同時刻に、タンク１１０内の全ポイントで±0.5℃内の冷却液温度の分散で維持する。生体材料を通って循環する冷却液の実質的に一定の所定速度によって、一定の計測される熱の除去がなされ、冷凍中の生体材料のガラス化が可能となる。一の実施形態では、粘度、温度等の冷却液の特性を測定し、処理し、制御信号はモータ１３０に送られ、必要に応じてインペラ１３２の回転速度又はトルクを増大又は減少する。他の実施形態では、モータ１３０は流体の条件の全範囲にわたって所定の回転速度を維持するように構成されている。このような場合には、モータ１３０によって付与されたインペラ１３２のトルク又は回転速度は外部から制御されない。本発明の好適な実施形態を実施するのに、外部のではないポンプ、シャフト又はプーリが必要となる。モータ１３０又は他のサーキュレータ１３４を冷却液１４０に直接浸漬する。結果として、冷却液１４０はタンク１１０に配置された生体材料を冷凍するだけでなく、冷却液１４０はモータ１３０も冷却する。
【００２０】
熱交換コイル１２０は好適には“マルチパスコイル”であり、冷媒が通常一又は二以上の連続的なパス（経路）に制限されている従来の冷却コイルに対して、冷媒がマルチパス（すなわち、３又は４以上のパス）を通って流れることができる。また、コイルの寸法は、測定された量の冷却液１４０を含む断面積に直接関係する。例えば、好適な実施形態では、タンク１１０は１フィート長、２フィート深さ、４フィート幅であり、１フィート×２フィートの熱交換コイル１２０を用いる。タンク１１０の長さは２０フィートまで大きくなると、熱交換コイル１２０の長さも２０フィートまで大きくなる。結果として、熱交換コイル１２０は、同じ熱負荷を扱うのに要する従来のコイルの寸法の約５０％に作製できる。モータ１３０のようなサーキュレータ１３４は、冷凍される生体材料全体にわたって冷却された冷却液１４０を循環し、次いで、冷却液１４０に浸漬された熱交換コイル１２０へ暖かくなった冷却液を輸送する。少なくとも一の実施形態では、熱交換コイル１２０は、熱交換コイル１２０とシステムから熱を除去する冷蔵ユニット１９０に接続されている。
【００２１】
好適な実施形態では、冷蔵ユニット１９０は、熱交換コイル１２０の負荷条件に合致するように構成され、それによって熱は調和され効率的なやり方でシステムから除去され、材料が制御されて迅速に冷凍される。冷蔵ユニット１９０の効率は、効率的な供給又は熱交換コイル１２０及び冷蔵ユニット１９０で使用されるコンプレッサの効率的な出力による吸引圧を制御するための方法に直接関係する。この方法論は、冷媒温度と冷却液１４０の温度の間、及び、凝縮温度と周囲温度との間で維持するために、非常に近い許容度を要する。これらの温度の基準と熱交換コイル１２０の構成とによって、熱交換コイル１２０をより効率的に供給することが可能となり、コンプレッサメーカーの標準規格として受け入れられているものよりコンプレッサから２５％程度越える大きなパフォーマンスを達成する調整されかつ厳しく制御された方法でコンプレッサを供給することができる。
【００２２】
図１で示した実施形態では、冷蔵ユニット１９０はは外部に離れて配備された冷蔵システムである。しかしながら、（図示しない）他の実施形態では、冷蔵ユニット１９０はタンク１１０の他のセクションに関連する。冷蔵ユニット１９０についての種々の構成が冷却液１００の所定の配置に対して大なり小なり適当であることは利点である。例えば、タンク１１０が極端に大きければ、独立した冷蔵ユニット１９０は望ましいが、携帯型の実施形態も集積型冷蔵ユニット１９０の恩恵を受ける。このような集積は、ここに記載したような構成を備えることによって達成される効率と、特に、小型化された熱交換コイルの使用とによって可能となる。
【００２３】
冷蔵ユニット１９０及び熱交換コイル１２０のために、好適な実施形態では、冷却液は、約±０．５℃以下の冷却液の温度のばらつきを伴って、−２０℃から−３０℃の間の温度まで冷却される。他の実施形態では、冷却液を、物質が冷凍される速度（率）を制御するために、−２０℃から−３０℃の間の温度範囲外の温度まで冷却する。他の実施形態では、冷却液の循環速度を制御して所望の冷凍速度を達成する。また、冷却液の体積を特定の冷凍速度を容易にするために変えてもよい。冷却液の循環速度と、冷却液の体積と、冷却液の温度との種々の組合せを用いて所望の冷凍速度を達成することができることは利点である。
【００２４】
図２において、図１で示した冷却装置の断面図について、比較的大きな量の生体材料を冷凍するのに適した冷却システム；比較的大きな量の生体材料を冷凍するのに適した冷却システム１００の実施形態について説明する。図１の符合と同じ図２の符合は、同一の構成を示している。タンク１１０は、ラック１５０が下がて入っていく冷却液１４０を収容している。ラック１５０はラック支持部２１０に可動に結合されており、それによって、ラック１５０は上昇し又は下降して、物質のタンク１１０への配置を容易にしている。
【００２５】
使用に際して、冷凍される生体材料をラック１５０のトレイ１５５に配置する。好適には、トレイ１５５は、ワイヤ、メッシュ等から成り、それによって、冷却液１４０はそれが載置される部材の上方、下方及び／又はその回りに自由に循環してよい。好適には、一旦冷却液を所望の温度に冷却すると、ラック支持部２１０は、冷却液１４０にトレイ１５５を浸漬するために、ラック１５０を下降してタンク１１０へ入れる。ラック１５０の下降は、手動で、又は、当業者に公知の種々のギヤ、チェーン及び／又はプーリ構成を用いて行う。サーキュレータ１３４は、迅速かつ制御された冷凍を行うために、トレイ１５５に載置された物質を過ぎて冷却液１４０を循環する。生体材料をタンク１１０に浸漬する他の構成を用いてもよいし、自動下降装置の使用が全環境における使用に対して必ずしも好適ではないことは利点である。
【００２６】
図２Ａに、多段らせん状パスコンベヤシステムを利用する本発明の実施形態を示す。図示したように、らせん状コンベヤ２００は、生体材料を冷却液１４０に浸漬するためにタンク１１０を内部にフィットさせる構成であってもよい。使用に際しては、一旦、冷却液を所望の温度まで冷却すると、冷凍される材料をコンベヤ１７０上でとられる入力フィード１６０に供給する。材料は、入力フィード１６０から下方らせん１７５上の冷却液１４０へ、上方らせん１７６上の冷却液１４０から出て、出力フィード１８０でらせんコンベヤから出る。すでに述べたように、冷却液１４０は一定の所定温度に維持され、冷凍される材料の迅速で安全な冷凍を保証する流速で循環するのが好ましい。材料が冷却液１４０に浸漬されている時間は、駆動ユニット２３０を調整することによって又は他の適当な手段によって変更することができる。理想的には、コンベヤベルト１７０の速度は、冷却液１４０の温度と循環速度（流速）とを組み合わせて調整され、それによって、正確に所望量の熱が多段らせんパスコンベヤシステム２００上のタンク１１０を通って流れて、材料から除去される。
【００２７】
図３には、符合３００によって、本発明の一の実施形態による方法を示している。示した方法は、冷却液が熱交換コイルを通って循環するという段階３１０から始まる。熱交換コイルは上述のように冷却システムに作動可能に結合され、それを用いて、冷却液が熱交換コイルを通って循環するときに冷却液の温度が下げられる。段階３２０では、冷却液の温度を測定し、次いで、段階３３０に進んで、冷却液の温度が最適温度範囲か否かが決定される。この最適冷却液温度の範囲は異なる用途について異なっているが、多くの用途についての好適な最適温度範囲は−２０℃から−３０℃の間である。
【００２８】
冷却液が最適温度範囲内でないように決定されると、段階３３５が実施される。段階３３５では、熱交換コイルを冷蔵ユニット１９０によって冷却し、次に段階３１０に進み、冷却液は、冷却液の温度を下げるために熱交換コイルを通って循環する。好適には、段階３１０，３２０，３３０及び３３５を、冷却液が最適温度範囲に達するまで連続して実施する。
【００２９】
生体材料を冷凍するのに用いられる冷却液の温度は本発明の少なくとも一の実施形態では重要な要素である。従来のプロセスを用いてガラス化を達成するために、生体材料は通常、−１９６℃の温度の液体窒素でクエンチされる。このような非常に短い時間での温度の急峻な変化は細胞構造内の水を冷凍にし、それによって、氷結晶が形成する機会がなくなる。しかしながら、液体窒素でのクエンチングによる生体材料の冷凍によって、細胞膜における応力破壊が生じ、それによって、低温保存のために液体窒素でのクエンチングの有用性が制限される。本発明の好適な実施形態で用いられる温度は−２０℃から−３０℃の範囲であるので、温度変化による応力破壊が最小化され、ガラス化が細胞膜へのダメージが少なく行うことができる。
【００３０】
冷却液を適当な温度まで冷却している間、冷凍される材料は段階３０５での冷凍のために化学的処理を施してもよい。病理学のための使用される材料は通常、化学的処理は必要とされず、冷凍される材料を冷却液に入れることによって段階３０５を行うことはここでの教示と合致する。先述のように、生体材料は限定されないが、生きている単一の細胞、組織、器官、核酸、及び他の生物活性分子を含む。生体材料は、特定の種類でなくてもよい。生体材料を化学的に処理することには、細胞の成長又は死の間、細胞に保持されていた有害物質が除去されることによって細胞の生存可能性を大きくする添加剤（安定剤）によって生体材料を前処理することを含んでもよい。有効な安定剤にはこれらの化学物質及び化学化合物を含み、その多くは当業者には公知であり、酸素ラジカルのような高い反応性を有しかつ損傷を与える分子を隔離しする。
【００３１】
生体材料を化学的に処理することには、順応段階（図示せず）を含んでもよい（図示せず）。前処理中またはその後、保存される生体材料は、培養温度から低下した温度まで順応されてもよいが、まだ冷凍のままである。これは、細胞の新陳代謝を遅延させること、及び、急な温度の遷移のショックを低減することによって低温保存のための生体材料の準備（処置）を支援するものである。しかしながら、順応段階は本発明の実施に必要というわけではないことに留意されたい。
【００３２】
好適な実施形態では、冷凍するために生体材料を化学的に処理することには、生体材料に凍結防止剤を装填することが含まれる。装填には通常、一又は二以上の凍結防止剤の溶液における生体材料を平衡させることも含まれる。装填中に利用される物質は装填剤と称してもよい。有効な装填剤は一又は二以上の脱水剤、透過及び非透過剤、浸透剤を含んでもよい。ＤＭＳＯやエチレングリコールのような透過剤、フルクトース、スクロース、グルコースのような透過及び非透過浸透剤の組合せのいずれも使用することができる。本発明の目的に合致する他の適当な凍結防止剤を使用してもよい点は利点である。
【００３３】
冷却液が適温に達した後、化学的に処理された生体材料を冷却液に浸漬する段階３１５を実施する。先述のように、生体材料を容器に配置してもよいし、冷却液の中に直接載置してもよい。次いで、浸漬したモータ／インペラアセンブリ又はポンプのようなサーキュレータを用いて、浸漬された生体材料を通って先述したような速度で冷却液を循環させる。冷却液は生体材料のそばを通るので、冷却液より高温で材料から熱が除去され、冷却液へ熱が移送され、熱を冷凍される生体材料から運びさられる。本発明の少なくとも一の実施形態では、冷凍される生体材料を通る冷却液の実質的に一定の循環は、準備された材料がガラス化されるように準備された生体材料を冷凍するために維持すべきである。
【００３４】
冷却液は冷凍される生体材料を通り過ぎて循環した後、段階３３９を実施する。段階３３９は冷却液の粘度、温度等の変化を説明するのに要するように冷却液の速度を調節する。冷却液の速度は、一又は二以上のサーキュレータによる力を調整することによって一定に保持されるのが好ましい。一旦生体材料が所望の冷凍状態に到達すると、段階３４０で示したようにそれが除去される。材料は、段階３４０において先述の手段によって冷却液から除去された後、蛍光標識化された抗体染色のような組織学的、超構造、免疫組織化学検査のために、断片化され、解凍されてもよい。
【００３５】
図３で示した段階を順に説明する。しかしながら、図示した方法は段階のうちのいくつか又は全てを連続的に実施してもよいし、異なる順で実施してもよい。例えば、本発明の少なくとも一の実施形態は単一の循環モータを用いて冷却液を循環する。このような実施形態では、冷却液は段階３１０におけるように熱交換コイルを過ぎて循環すると同時に、段階３３７で保存される生体材料を過ぎて循環する。また、本発明の一の実施形態では、冷却液の温度、粘度及び他の流体特性を連続して、かつ、システム内で多数の位置で測定する。
【００３６】
他の実施形態では、冷却液のいくつかの特性は直接は測定されない。すなわち、冷却液の特性の変化は循環モータの回転速度から間接的に決定される。モータはより遅い速度で回転すれば、モータを所望の回転速度に戻すようにさらなるパワーをモータに供給することができ、それによって、冷却液の特性の変化を補償する。少なくとも一の実施形態では、モータは回転を実質的に一定の速度に維持するように構成されている。この実質的に一定の回転速度によって、冷却液の循環が実質的に一定の流速となる。
【００３７】
本発明の一の実施形態のテストを実施したら、５ｍｌの水がフラスコで凍っていた。冷凍は、全体積の１％以下の増加であり、従来の冷凍の場合よりより少ない。他のテストでは、従来のフリーザー、及び、本発明の好適な方法による冷却システムにおいて、シート状に氷が形成した。冷凍後、氷は暗視野顕微鏡で調べた。期待されたように、従来の氷は結晶パターンを示しており、他方、本発明の原理を用いた方の凍った氷は明白な変位は示しておらず、氷の結晶が形成していないことが明らかとなった。
【００３８】
図４に、種々の低温保存法を比較した実験結果を示す。棒グラフ４００は、対照グループＡに対して４つの異なる低温保存法Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを用いることによってダメージ（損傷）を受けた個々の細胞の数を比較している。対照グループＡでは低温保存は実施せず、方法Ａでは従来のフリーザーを用いて−２０℃の温度まで細胞を冷凍し、方法Ｃでは超低温のフリーザーを用いて−８０℃の温度まで細胞を冷凍し、方法Ｄでは液体窒素を用いて−１９６℃の温度まで細胞を冷凍し、方法Ｃでは本発明の好適な実施形態を用いて−２５℃の温度まで細胞を冷凍した。
【００３９】
棒グラフ４００で示した実験結果は、いかなる処理又は凍結防止剤なしで、本発明による方法と共に、先述の従来の方法によって凍らせた植物の細胞（種なしグレープ）を用いた。凍った植物の組織を解凍し、薄片に切断し、位相差顕微鏡を用いて調べた。実験で植物の組織を用いたのは、氷の結晶形成による組織の大きな乱れ又は冷凍に起因した水の膨張が組織の細胞壁構造を壊し、容易に観察ができるからである。図４で示した結果は、明らかに本発明の好適な実施形態による方法の優位性を示している。予想されたように、対照グループＡは細胞のダメージがなかった。方法Ｂ（−２０℃フリーザー）の場合は、細胞壁構造の約４５％にダメージを示しており；方法Ｃ（−８０℃フリーザー）の場合は、細胞壁構造の約５５％にダメージを示しており；方法Ｄ（液体窒素）の場合は、細胞壁構造の約５９％にダメージを示していた。しかしながら、本発明の好適な実施形態による方法では、細胞のダメージは約１２．５％しかなかった。
【００４０】
本発明の好適な実施形態による方法の優位性は、図５において、液体窒素方法及び本発明の好適な実施形態の冷凍方法の以下の冷凍−解凍サイクルの非凍結防止されたグレープの外観の組織位相差顕微鏡写真で示す。図５から、細胞壁のダメージを示す組織の変化した構造は、液体窒素を用いた方法で冷凍−解凍サイクルを行った組織より、本発明の好適な実施形態による冷凍−解凍方法の方がかなり小さいことがわかる。
【００４１】
図６に、標準の低温処理の手法を用いた冷凍後、及び、本発明の好適な実施形態による方法の適用後の心臓組織の外観の顕微鏡写真を示す。図６は、マウス及び犬の解剖用屍体から死後に収集した組織の試料において実施した異なる実験の結果を示すものである。組織の試料は５つの器官系から収集した：卵巣、心臓、肝臓、腎臓及び肺である。組織は、標準の冷凍手法を用い、さらに、以下に記載する本発明の好適な実施形態の方法による冷凍を用いて、従来の組織学、凍結切片、又は超構造検査について準備した。できた断片は経験ある臨床病理学者が評価した。予想されたように、決して冷凍しなかった試料は組織学的評価の際に優れた外観を示した。しかしながら、病理学者は、本発明の好適な実施形態による方法で冷凍した組織が少なくとも標準の低温処理手法を用いた組織と同様に保存されていたこと、及び、さらに複数の種類の組織、多くの注目すべき腎臓及び筋肉（心臓）が本発明による方法で冷凍したときに組織の完整性において顕著な改善を証明した報告している。図６は、標準の低温保存の手法は、本発明の実施形態による方法で処理された心臓の筋肉の試料と比較して、心臓の筋肉の試料内において“経本（アコーディオン）折り”６０５のような多くのアーティファクト（人工物）を有することを明らかにしている。
【００４２】
図７に、全く冷凍しなかった対照物と比較して、本発明の好適な実施形態による方法の適用後に見られる細胞のミトコンドリア７０５のおうな複雑な超構造を示した電子顕微鏡写真を示す。図７で示した電子顕微鏡写真は、本発明の好適な実施形態による方法によって冷凍した組織と全く冷凍されなかった対照組織との間の差はほとんどないことを明示している。また、液体窒素の標準的手法又は（図示していない）機械的な冷凍によって凍らせた組織の検査の際のダメージは、本発明の好適な実施形態による方法によって凍らせた組織のダメージよりかなり大きいということを示した。
【００４３】
先述のように、現在の技術を用いて作成した冷凍断片に関する主要な問題は、冷凍の際の特定の化学反応の損失である。この活動の損失は、抗体の染色に基づいた免疫組織化学の最新の手法に対して本質的に無用な試料を与えるものである。蛍光標識化抗体を用いて行った実験（５．１Ｈ１１、特定の筋肉に特定した人ＮＣＡＭ）は、蛍光のために前に染色した主要な豚に付随する細胞はこの抗体と共に、本発明の好適な実施形態の方法で準備したときの冷凍後、蛍光を発し続けることを証明した。しかしながら、液体窒素で冷凍された細胞は解凍後に蛍光を発し続けることができなかった。この実験の結果は、好適な方法によって、低温病理学及び免疫組織化学の最新手法を研究および患者の看護の分野に適用できることを示している。
【００４４】
本発明は、材料がガラス化するように生体材料を冷凍できるので、細胞膜の応力破壊の発生を最小にし、細胞内の化学的活動を冷凍後に損失せず、本発明の種々の実施形態は、皮膚移植、角膜貯蔵、血管貯蔵、移植組織の冷凍及び不妊処置のような適当な化学的処置と共に他の医療分野においても、分子再生の病気（癌）の研究におけると共に応用可能である。
【００４５】
本発明の実施形態を変形例と共にここに詳細に示したが、本発明の教示を組み込んだ他の多くの変形の実施形態が当業者によって容易に構築されるだろう。従って、本発明はここに記載した特定の形態に限定されるものでなく、逆に、本発明の精神及び範囲内に道理にかなって含むことができるような変形、変更、均等物をカバーすることを意図したものである。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の少なくとも一の実施形態による方法を実施する冷却装置の側面図である。
【図２】比較的大きな量の生体材料を冷凍するのに適した冷却装置の構成を示す図１で図示した冷却装置の断面図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態によるらせん状コンベヤを用いる構成の図１に示した冷却装置の断面図である。
【図３】本発明の少なくとも一の実施形態による装置の実施を示すフロー図である。
【図４】従来の冷凍方法と本発明の好適な実施形態による冷凍方法との実験比較の結果を示す棒グラフである。
【図５】液体窒素による方法と本発明の好適な実施形態による冷凍方法の冷凍−解凍サイクル後の非低温保存されていないグレープの組織の外観の顕微鏡写真であって、（ａ）対照物、（ｂ）新技術、（ｃ）液体窒素、の場合である。
【図６】標準の低温保存手法を用いた冷凍後と本発明の好適な実施形態による方法の適用後の心臓の組織の外観の顕微鏡写真であって、（ａ）標準凍結防止技術、（ｂ）新システム、の場合である。
【図７】本発明の好適な実施形態による方法の適用後に見られる細胞のミトコンドリアのような複雑な超構造を示す電子顕微鏡写真であって、（ａ）対照（非凍結）、（ｂ）新システム、の場合である。
【符号の説明】
【００４７】
１００  冷却ユニット
１１０  タンク
１２０  熱交換コイル
１３０  モータ
１３２  インペラ
１３４  サーキュレータ
１４０  冷却液
１５０  ラック
１５５  トレイ
１９０  冷蔵ユニット
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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