(57)【要約】本発明は、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を見つけ出すアッセイ系を構築するための、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を示すポリペプチドをコードする核酸配列の使用に関する。アンチセンス技法を用いて、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼが除草剤標的となることが初めて明らかにされた。さらに、本発明は、非トランスジェニック植物と比較して、バイオマス生産および／または芳香族アミノ酸含有量が増加している、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ． ４．２．１．１０／Ｅ．Ｃ． １．１．１．２５）活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物の作出方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の核酸配列：
ａ）配列番号１もしくは配列番号３に示した配列を有する核酸配列；または
ｂ）遺伝コードの縮重のために、逆翻訳により配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列から推定することができる核酸配列；または
ｃ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｄ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列の機能的類似体をコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｅ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）の部分；または
ｆ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）の少なくとも３００ヌクレオチド単位；
および少なくとも１つの追加の機能的エレメントを含んでなる発現カセット。
【請求項２】
請求項１に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の発現カセットまたは請求項２に記載のベクターを含む、細菌、酵母、真菌、動物細胞もしくは植物細胞からなる群より選択されるトランスジェニック生物。
【請求項４】
細菌および植物細胞からなる群より選択される、請求項３に記載のトランスジェニック生物。
【請求項５】
除草活性のある物質を同定する方法であって、下記の核酸配列：
ａ）配列番号１もしくは配列番号３に示した配列を有する核酸配列；または
ｂ）遺伝コードの縮重のために、逆翻訳により、配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列から推定することができる核酸配列；または
ｃ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｄ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列の機能的類似体をコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｅ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の部分領域からなる核酸配列；または
ｆ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）の少なくとも３００ヌクレオチドからなる核酸配列；
からなる群より選択される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の遺伝子産物の転写、発現、翻訳もしくは活性に影響を及ぼすこと、および
該物質と共にインキュベートしなかった遺伝子産物と比較して、遺伝子産物の転写、発現、翻訳もしくは活性を低下または阻止する物質を選択すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項６】
細菌、酵母、真菌および植物の群から選択される生物において実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細菌、酵母および真菌の群から選択される生物において実施される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１または配列番号３の配列の条件的もしくは天然の突然変異体である生物を用いる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項３または４に記載のトランスジェニック生物を用いる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの活性を阻害する物質を見出す方法であって、下記のステップ：
ａ）請求項３もしくは４に記載のトランスジェニック生物において酵素活性のある形態でポリペプチドを発現させるか、あるいは、本発明によるタンパク質を含む生物を培養すること；
ｂ）ステップａ）で得られた該ポリペプチドを、酸化還元当量および化合物と共に、静止状態もしくは成長中の生物内において直接、または部分的に精製した形もしくは均質に精製した形の該生物の細胞消化物中において、インキュベートすること；
ｃ）ステップｂ）により、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを阻害する化合物を選択すること；
ｄ）適切な反応時間が経過した後、阻害しなかった酵素の活性と比較して、該ポリペプチドの酵素活性を測定すること；
を含んでなる上記方法。
【請求項１１】
植物において、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を阻害する、除草活性のある物質を同定する方法であって、下記のステップ：
ａ）請求項１に記載の発現カセットもしくは請求項２に記載のベクターによる形質転換の後、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする追加のＤＮＡ配列を含み、かつ、酵素活性のあるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現することができる生物を作出すること；
ｂ）ステップａ）の生物に化学物質を適用すること；
ｃ）該化学物質の適用後、トランスジェニック生物および非形質転換生物の成長または生存能を測定すること；
を含んでなる上記方法。
【請求項１２】
使用するトランスジェニック生物が、トランスジェニック植物、植物細胞、植物組織または植物部分である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記物質をハイスループットスクリーニング法で同定する、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法で同定された物質を植物に適用し、これにより、それらの除草活性を試験して、除草活性を示す物質を選択することを含んでなる方法。
【請求項１５】
請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法で同定された物質。
【請求項１６】
除草剤または成長調節剤としての請求項１５に記載の物質の使用。
【請求項１７】
配列番号１または配列番号３の核酸配列の変異体を作製する方法であって、下記のステップ：
ａ）異種系または無細胞系において配列番号１または配列番号３によりコードされるタンパク質を発現させること；
ｂ）該核酸の改変によりタンパク質のランダムまたは部位特異的突然変異誘発を実施すること；
ｃ）改変された遺伝子産物と除草剤との相互作用を測定すること；
ｄ）相互作用が少ない該タンパク質の誘導体、および該タンパク質をコードする核酸配列を同定すること；
ｅ）除草剤の適用後、該タンパク質の生物活性をアッセイすること；
を含んでなる上記方法。
【請求項１８】
前記生物が細菌、植物または真菌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号１または配列番号３の核酸配列の変異体を作製する方法であって、下記のステップ：
（ａ）請求項１５に記載の物質によって阻害されないか、部分的にしか阻害されない生物を検出すること；
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された生物から、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離して、その特性決定を行うこと；
（ｃ）必要に応じて、ランダムまたは部位特異的突然変異誘発によりステップ（ｂ）で同定された核酸の耐性を最適化すること；
を含んでなる上記方法。
【請求項２０】
前記生物が細菌および真菌の群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項５〜１５のいずれか一項に記載の方法により見出された物質に対して耐性であるトランスジェニック植物、植物組織または植物細胞を作製する方法であって、これらの植物において、配列番号１もしくは配列番号３の核酸配列、または請求項１９、２０、２１もしくは２２のいずれか一項に記載の核酸配列を有する核酸を過剰発現させることを含んでなる上記方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の発現カセットまたは請求項２に記載のベクターを植物に形質転換することを含んでなる、トランスジェニック植物の作出方法。
【請求項２３】
非トランスジェニック植物と比較して、乾燥物質含量が増加している、請求項２１または２２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２４】
非トランスジェニック植物と比較して、芳香族アミノ酸量が増加している、請求項２１または２２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２５】
不要な植物に、請求項１５に記載の物質を適用することを含んでなる、不要な植生の防除方法。
【請求項２６】
不要な植生を防除するための、請求項１５に記載の物質の使用。
【請求項２７】
除草活性成分の標的としての、請求項に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、除草活性がある成分の新しい標的としての、植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＤ／ＳＨＤ）の同定に関する。本発明はさらに、植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を同定するための、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する植物ポリペプチドをコードする配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列、あるいは、配列番号１または配列番号３の機能的同等物、あるいは、配列番号１または配列番号３の部分配列を使用することからなる、アッセイ系を作製する方法に関する。本発明はまた、これらの方法またはこのアッセイ系を用いて同定される物質、ならびに、該物質の除草剤としての使用、または、除草剤の標的としてのデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの使用にも関する。
【０００２】
本発明はさらに、同じタイプの非トランスジェニック植物と比較して、乾燥物質含量および／または芳香族アミノ酸含量が増加していることを特徴とする配列番号１または配列番号３、配列番号１または配列番号３の機能的同等物、あるいは配列番号１または配列番号３の部分領域を含んでなるトランスジェニック植物を作出する方法に関する。
【０００３】
さらに、本発明は、本発明に従う方法により同定された植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤に耐性であるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ変異体の核酸配列を同定する方法に関する。
【０００４】
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼは、コリスミ酸（すなわち、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの前駆物質）の生合成に関与する（図１参照）。
【０００５】
芳香族アミノ酸生成用の前駆物質は、エリトロース−４−リン酸とホスホエノールピルビン酸である。２つの物質は、縮合を経て２つのリン酸を排除することにより、Ｃ７化合物である２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソン酸−７−リン酸をもたらし、これは環化してデヒドロキナ酸を与える。デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１０）による水の排除およびシキミ酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２５）によるカルボニル基の還元後、シキミ酸が形成される。これについては、Ｖｏｅｔ ａｎｄ Ｖｏｅｔ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ， １９９４， Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅを参照されたい。デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼは、Ｃｈｏｒｉｓｍａｔ生合成の第３および第４工程を触媒する二機能性酵素である。これについては、下記も参照されたい：Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ， Ｓ．， Ｄａｖｉｓ， Ｂ．Ｄ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５， （１９５４）、５４−６１；Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｊ． Ｗ．， Ｈａｒｔ， Ｂ．Ａ．， Ｄｏｙ， Ｃ．Ｈ．， Ｇｉｌｅｓ， Ｎ．Ｈ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２８９（１９７２）１−１２；Ｐｏｌｌｅｙ， Ｌ．Ｄ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ５２６（１９７８）２５９−２６６；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ， Ｓ．， Ｃｏｇｇｉｎｓ， Ｊ． Ｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２２６（１９８５）、２１７−２２３。
【０００６】
シキミ酸デヒドロゲナーゼの様々な阻害剤が同定されている。ＺｎＣｌ２、ＣｄＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＨｇＣｌ２、Ｈｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋およびホウ酸塩などの様々な金属化合物および金属イオンはシキミ酸デヒドロゲナーゼに対する阻害作用を有し（Ｌｏｕｒｅｎｃｏ， Ｅ．Ｊ．， Ｎｅｖｅｓ， Ｖ．Ａ．， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３， （１９８４）４９７−４９９；Ｌｅｍｏｓ Ｓｉｌｖａ， Ｇ．Ｍ．， Ｌｏｕｒｅｎｃｏ， Ｅ．Ｊ．， Ｎｅｖｅｓ， Ｖ．Ａ．　Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９ （１９８５）， １０５−１１６）、一方亜ヒ酸、ｐ−クロロ安息香酸水銀およびＮ−エチルマレイミドもこの酵素に対する阻害作用を有することが実証された（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｇ．Ｗ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ９８（１９６６）、２４８−２５２）。また、デヒドロキナ酸デヒドラターゼの阻害剤も同定されている。こうして、酢酸塩、コハク酸塩、Ｄ−（＋）−酒石酸塩およびジエチルカーボネート類は、大腸菌におけるデヒドロキナ酸デヒドラターゼに対する阻害作用を有する（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ， Ｓ．， Ｌａｍｂｅｒｔ， Ｊ．Ｍ．， ＭｃＣｏｌｌ， Ｌ．Ａ．， Ｃｏｇｇｉｎｓ， Ｊ．Ｒ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２３９， （１９８６）， ６９９−７０４；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ， Ｓ．， Ｄｕｎｃａｎ， Ｋ．， Ｃｏｇｇｉｎｓ， Ｊ．Ｒ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １４２（１９８７）， ３２０−３２４）。
【０００７】
植物は、効率的アミノ酸代謝に依存しているため、アミノ酸生合成に関与する酵素は、除草剤の標識タンパク質として適していると考えられる。こうして、植物のｄｅ ｎｏｖｏアミノ酸生合成を阻害する活性成分はすでに記載されている。その一例として、植物におけるアミノ酸生合成を阻害するグリホセートを挙げることができる。
【０００８】
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの植物遺伝子配列は、ダイズ、リクチリメン、トマト、イネ、タバコおよびシロイヌナズナからのものがすでに公知である。
【０００９】
シキミ酸経路は、芳香族アミノ酸の生合成だけではなく、例えば、ユビキノン、葉酸、フラボノイド、クマリン、リグニン、アルカロイド、シアノーゲングルコシド、プラストキノンおよびトコフェロールなど、植物により大量に形成される非常に多種のその他の物質にも役割を果たしている。これらの物質すべての合計は、植物の乾燥分の５０％にも達することがある。
【００１０】
除草剤の標的としての酵素の適性は、酵素活性を低下させることにより、例えば、トランスジェニック植物におけるアンチセンス技法を用いて、確認することができる。植物への特定遺伝子用のアンチセンスＤＮＡの導入により成長が抑制される場合には、その酵素（その活性を低下させる）が除草剤活性成分の作用部位として適している。例えば、トランスジェニックジャガイモ植物におけるアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）のアンチセンス阻害、およびＡＬＳ阻害除草剤による対照植物の処理によって、同等の表現型が得られる（Ｈｏｆｇｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０７（１９９５）、４６９−４７７）。
【００１１】
トランスジェニックという用語は、この方法で用いる核酸が、生物のゲノム中のその元の位置に位置していないことを意味し、その際、核酸は、同種的または異種的に発現させることができる。しかし、トランスジェニックという用語はまた、本発明に従う核酸が、生物のゲノム中のその元の位置に実際に位置しているが、天然の配列と比較して配列が改変されている、および／または天然の配列の調節配列が改変されていることも意味する。好ましくは、トランスジェニックという用語は、ゲノム中の非天然位置での核酸の発現、すなわち、同種的または好ましくは異種的に核酸を発現させること、を意味する。同じことが、本発明に従う核酸構築物またはベクターにも当てはまる。
【００１２】
本発明の目的は、植物におけるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼが、好適な除草剤標的であることを確認し、阻害剤−酵素結合研究を実施するための効果的かつ簡便なデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼアッセイ系を作製することである。本発明の別の目的は、本発明に従って見出される阻害剤に耐性であるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ変異体を同定することである。
【００１３】
本発明者らは、この目的が、植物酵素デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列を単離することにより、さらには、植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのアンチセンスまたは共抑制構築物の作製と、植物におけるそれらの発現により、ならびに、原核または真核細胞における植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの機能的発現により、達成されることを見出した。
【００１４】
センスおよびアンチセンス方向でのデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの発現に用いられるモデル植物は、タバコ（ＮＮ Ｓａｍｓｕｎ変種）であった。
【００１５】
酵素アッセイを実施するための組換え酵素を調製するために、大腸菌にデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを異種的に発現させた。
【００１６】
この目的を達成するために、植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするｃＤＮＡをタバコから単離し、配列決定した。実施例１および配列表の配列番号１、配列番号３ならびにＢｏｎｎｅｒ， Ｃ．およびＪｅｎｓｅｎ， Ｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３０２（１９９４）、１１−１４を参照のこと。この遺伝子は大腸菌、酵母またはバキュロウイルスなどの様々な異種系において機能的に過剰発現させることができ、また、阻害剤を同定するためのアッセイ系に用いることができる。アンチセス植物または共抑制植物を用いて、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼは植物の必須遺伝子を構成することが初めて証明された。
【００１７】
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのアンチセンス構築物を担うタバコ植物（実施例２および３を参照）をさらに詳しく特性決定した。この植物は様々な程度の成長の遅れを示した。野生型およびトランスジェニックＤＨＤ／ＳＨＤ植物を側面図として（図２）、また上方から（図３および４）示す。トランスジェニックＤＨＤ／ＳＨＤ植物では、野生型と比較して、成長が極めて抑制されていることがはっきりとわかる（図２、野生型は左外側）。トランスジェニック系統および第１および第２世代の子孫は、土中で成長の抑制が認められた。成長が抑制された植物では、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのＲＮＡ量をノーザンハイブリダイゼーションにより検出したところ、野生型と比較して低かった（図５Ａ参照）。さらに、酵素活性測定（実施例５）により検出したところ、トランスジェニックＤＨＤ／ＳＨＤ系統におけるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の量は野生型植物と比べて低かった。発現レベルと、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の低下は、成長遅延のレベルと相関している。デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのアンチセンス構築物の導入は、結果的に植物の成長を抑制することがわかった。
【００１８】
野生型タバコ植物およびＤＨＤ／ＳＨＤ共抑制植物において、ＤＨＤ／ＳＨＤ酵素の活性を実施例５に記載した方法により測定した。共抑制植物の場合、ＤＨＤ／ＳＨＤ酵素の活性はゼロであり、野生型植物で測定できる酵素活性は０．０２５〜０．０６ μＭ／分／ｇであることが明らかになった。
【００１９】
この明白な関係により、除草剤活性成分の好適な標的タンパク質として、初めてデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを確認することができる。
【００２０】
植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの有効な阻害剤を見つけ出すには、阻害剤／酵素結合実験に用いることができる好適なアッセイ系を提供する必要がある。
【００２１】
これらのアッセイ系を作製するためには、植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤を同定するための核酸配列を用いることができる。ここで、核酸配列とは、例えば、植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのコード領域を含んでなる配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列、あるいは、配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列とハイブリダイズする核酸配列、あるいは、これらの配列の部分配列、あるいは、これらの配列から挿入、欠失または置換により誘導され、かつ植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの生物活性を有するタンパク質をコードする誘導体を包含し得る。
【００２２】
さらに正確には、本発明はさらに、核酸配列によりコードされるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の使用に基づく新規の除草剤を同定する方法に関し、ここにおいて、上記核酸配列は下記の配列を包含する：
ａ）配列番号１または配列番号３に示した配列を有する核酸配列；または
ｂ）遺伝コードの縮重のために、逆翻訳により配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列から推定することができる核酸配列；または
ｃ）配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１または配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｄ）配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列の機能的類似体をコードする、配列番号１または配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または　ｅ）核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の部分；または
ｆ）核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の少なくとも３００ヌクレオチド単位。
【００２３】
この場合、配列番号２または配列番号４を含むタバコデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼと、２０〜１００％、好ましくは５０〜１００％、特に好ましくは７０〜１００％、非常に好ましくは８０〜１００％、または８５〜１００％、または９０〜１００％、または９５〜１００％、または９６〜１００％、または９７〜１００％、または９８〜１００％、または９９〜１００％のアミノ酸配列相同性を有し、かつデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを用いるのが有利である。
【００２４】
２つの核酸配列またはポリペプチド配列間の相同性は、各々のケースで、配列全長にわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性によって規定され、この同一性は、プログラムアルゴリズムＧＡＰ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、ウィスコンシン大学、遺伝学コンピューターグループ（ＧＳＧ）、米国マジソン）を用いたアラインメントによって、下記のパラメーターを設定して、計算する：
ギャップ重み：１２　　　　　　　　　　　長さ重み：４
平均マッチ：２ ９１２　　　　　　　　　　 平均ミスマッチ：−２ ００３
【００２５】
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする機能的類似体または機能的同等配列は、基準から外れているヌクレオチド配列であるにもかかわらず、所望の機能を保持する配列である。従って、機能的同等物は、本明細書に記載した配列の天然に存在する変異体、さらには、人工の、例えば化学的に合成された、生物のコドン使用頻度に適合している人工のヌクレオチド配列（５０）、さらには、本発明に従う配列とハイブリダイズする配列、あるいは、これらの配列の部分配列も包含する。
【００２６】
ハイブリダイゼーションを実施するためには、例えば、保存領域またはその他の領域の短いオリゴヌクレオチドを用いるのが有利である。このようなオリゴヌクレオチドは、他の関連遺伝子との比較により、当業者に公知の方法で決定することができる。しかし、本発明に従う核酸のこれより長い断片、もしくは完全配列をハイブリダイゼーションに用いてもよい。用いた核酸／オリゴヌクレオチドのより長い断片または完全配列に応じて、あるいは、ハイブリダイゼーションにどのタイプの核酸（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いるかに応じて、これらの標準的条件は変わってくる。こうして、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの融解温度より約１０℃低くなる。
【００２７】
標準的ハイブリダイゼーション条件とは、核酸に応じて、例えば、濃度０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、１５ ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ ７．２）のバッファー水溶液中での４２〜５８℃の温度、さらに、５０％ホルムアミドの存在下では、例えば、５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中での４２℃の温度、を意味するものと理解すべきである。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣおよび約２０〜４５℃、好ましくは約３０〜４５℃の温度が有利である。また、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合には、ハイブリダイゼーション条件は０．１×ＳＳＣおよび約３０〜５５℃、好ましくは約４５〜５５℃の温度が有利である。ここに記載したこれらのハイブリダイゼーション温度は、例示のため、長さが約１００ヌクレオチドで、Ｇ ＋ Ｃ含量が５０％で、ホルムアミドが存在しない核酸について計算した融解温度である。ＤＮＡハイブリダイゼーションの実験条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８９のような遺伝学の専門書に記載されており、当業者が熟知している式を用いて、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドのタイプ、またはＧ ＋ Ｃ含量の関数として、計算することができる。当業者は、以下の文献からハイブリダイゼーションについてのさらに詳しい情報を得ることができよう：Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９８５， ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（編）、１９８５、”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（編）、１９９１、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， オックスフォード。
【００２８】
また、機能的同等物は、特に、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードする最初に単離された配列の天然または人工の突然変異体であって、所望の機能を継続して示すものを意味すると理解すべきである。突然変異体は、１以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、交換または挿入を包含する。従って、本発明は、このヌクレオチド配列の改変により得られるヌクレオチド配列も包含する。このような改変の目的は、例えば、そのヌクレオチド配列が含むコード配列のさらなる境界決定、あるいは、制限酵素のさらなる切断部位の挿入であってよい。
【００２９】
機能的同等物はまた、元の遺伝子または遺伝子断片と比較して、機能が減少または増加した変異体である。
【００３０】
機能的同等物という用語は、本発明に従うヌクレオチド配列が、合成により作製されるか、天然で得られるか、または合成および天然ＤＮＡ成分の混合物を含んでなる可能性も包含する。一般には、対象の宿主生物が好むコドンを含む合成ヌクレオチド配列を作製する。このような好まれるコドンは、最も高いタンパク質出現頻度を有し、かつ対象となる大部分の生物種で発現されるコドンから決定することができる。
【００３１】
核酸配列の機能的類似体または機能的同等物は、ＤＮＡ配列の全長に基づいて、配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列と４０〜１００％、好ましくは６０〜１００％、特に好ましくは７０〜１００％、非常に好ましくは８０〜１００％、または８５〜１００％、または９０〜１００％、または９５〜１００％、または９６〜１００％、または９７〜１００％、または９８〜１００％、または９９〜１００％の配列相同性を有する核酸配列も包含する。
【００３２】
本発明に従う方法は、個々のステップ別に実施することができるが、ハイスループットスクリーニングを実施するのが好ましい。
【００３３】
前記の方法は、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの転写、発現、翻訳もしくは活性を低下または阻止する除草活性のある物質を同定することを可能にする。これらの物質は除草剤の候補物質であり、その作用は従来の化学合成によりさらに改善することができる。
【００３４】
この目的に適したアッセイ系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系である。
【００３５】
植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを阻害する物質を同定する試験系を作製するのに用いることができるタンパク質は、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質であり、該タンパク質は、好ましくは、
ａ）配列番号２または配列番号４に示すアミノ酸配列を含んでなる；または
ｂ）請求項５に記載するような配列番号２または配列番号４の少なくとも１００アミノ酸のアミノ酸部分配列を含んでなる。
【００３６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系に必要な酵素量は、好適な発現系における植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの機能的発現により、特に、タバコのデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼから提供されるのが好ましい。しかし、組換えにより生産された酵素に代わって、植物、好ましくは、タバコから単離された酵素を用いてもよい。
【００３７】
しかし、好ましくは、トランスジェニック生物をｉｎ ｖｉｖｏアッセイ系に用いる。
【００３８】
従って、植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのコード領域を含む配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列などの核酸配列、あるいは、配列番号１または配列番号３のＤＮＡ配列とハイブリダイズする核酸配列、あるいは、これらの配列から挿入、欠失または置換により誘導されかつ植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの生物活性を有する部分配列または誘導体を、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系において原核または真核細胞への導入に用いることができる。この配列は、場合によっては、細胞内での転写および翻訳を確実にし、かつ植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの合成をもたらす翻訳可能なｍＲＮＡを発現させるシグナルエレメントに連結されていてもよい。
【００３９】
本発明はさらに、除草活性のある化合物を見出すアッセイ系を作製するための発現カセットに関し、該発現カセットの配列は、タバコデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ、もしくはその機能的同等物をコードする。この核酸配列は、以下のものでありうる：
ａ）配列番号１または配列番号３に示す配列を含む核酸；または
ｂ）遺伝コードの縮重のために、逆翻訳により配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列から推定できる核酸配列；または
ｃ）配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列番号１または配列番号３に示す核酸配列の機能的類似体；または
ｄ）配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列の機能的類似体をコードする配列番号１または配列番号３に示す核酸配列の機能的類似体；または
ｅ）核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の部分配列；または
ｆ）核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の少なくとも３００ヌクレオチド単位；および
ｇ）場合によっては、さらなる調節エレメント。
【００４０】
その他の好適なものとして、人工ＤＮＡ配列が挙げられるが、それらは、例えば前述のように、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を発現するという所望の特性を付与する必要がある。このような人工ＤＮＡ配列は、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、分子モデリングにより構築されたタンパク質を逆翻訳することにより、さもなければ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択を行うことにより決定することができる。特に、宿主生物に特異的なコドン使用頻度に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することにより得られたコードＤＮＡ配列が適している。特定のコドン使用頻度は、形質転換しようとする生物の他の既知遺伝子をコンピューター評価に付すことにより、遺伝的方法に通じた当業者であれば、容易に決定することができる。この方法はまた、細菌、真菌、植物、昆虫細胞および哺乳動物細胞において標的タンパク質を発現させるのにも用いることができる。
【００４１】
発現カセットを作製する場合は、様々なＤＮＡ断片を操作することにより、正しい方向で適切に読まれ、かつ正しいリーディングフレームを有するヌクレオチド配列を得ることができる。アダプターまたはリンカーを上記断片に付加することにより、ＤＮＡ断片を互いにつなぎあわせることができる。この方法は、標的タンパク質の細菌、真菌、植物、昆虫細胞および哺乳動物細胞における発現にも用いることができる。
【００４２】
すでに述べたように、前記カセットは、場合によって、遺伝子機能エレメント、調節配列、制御配列または制御エレメントとも称される、調節核酸配列として知られるものを追加的に含んでいてもよい。遺伝子機能エレメントとは、宿主細胞におけるコード配列の発現を支配するすべての配列を意味するものとする。好ましい実施形態によれば、本発明に従う発現カセットは、上流（すなわち、コード配列の５’末端）にプロモーターを、また下流（すなわち、３’末端）にターミネーターと任意のポリアデニル化シグナルを、必要に応じて、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする挿入配列と機能的に連結された別の調節エレメントを含んでなる。「機能的に連結」とは、コード配列が発現されるとき、調節エレメントの各々がその目的とする機能を果たすことができるような様式で、プロモーター、コード配列、ターミネーター、ならびに、必要に応じて、別の調節エレメントが連続的に配置されていることを意味するものとして理解される。
【００４３】
このような発現カセットは、好適なプロモーターもしくは遺伝制御配列を、好適なデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼシグナルＤＮＡ配列およびポリアデニル化シグナルと融合させることにより作製する。このような融合は、例えば、下記の文献に記載されている通常の組換え法およびクローニング法を用いて行なう：Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ．Ｆ． ＦｒｉｔｓｃｈおよびＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８９）；Ｔ． Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ， Ｍ． Ｌ． ＢｅｒｍａｎおよびＬ． Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８４）；ならびに、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）。
【００４４】
遺伝制御配列はまた、発現支配特性を改変することができる別のプロモーター、プロモーターエレメントまたは最小プロモーターも包含する。こうして、組織特異的な発現は、遺伝制御配列のために、特定のストレス因子にさらに依存しうる。このようなエレメントは、例えば、水ストレス、アブシジン酸（Ｌａｍ ＥおよびＣｈｕａ ＮＨ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９１；２６６（２６）：１７１３１−１７１３５）および熱ストレス（Ｓｃｈｏｆｆｌ Ｆら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１７（２−３）：２４６−５３， １９８９）について、すでに記載されている。
【００４５】
本発明に従う発現カセットまたはベクターの有利な制御配列の例は、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、１−ＰＲなどのプロモーター、もしくは１−ＰＬプロモーターに存在し、これらはすべて、グラム陰性細菌株においてデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを発現させるのに用いることができる。
【００４６】
別の有利な制御配列は、例えば、プロモーターａｍｙおよびＳＰＯ２に存在し（両者とも、グラム陽性細菌株においてデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを発現させるのに用いることができる）、また、酵母もしくは真菌プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ、ＡＯＸ１およびＧＡＰにも存在する（これらはすべて、酵母株においてデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを発現させるのに用いることができる）。
【００４７】
植物における発現に適したプロモーターは、原則として、植物における外来遺伝子の発現を制御することができるあらゆるプロモーターである。植物プロモーター、または植物ウイルスに由来するプロモーターを用いるのが好ましい。特に好ましいのは、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターであり、Ｆｒａｎｃｋら、Ｃｅｌｌ ２１， ２８５−２９４（１９８０）を参照されたい。このプロモーターは転写エフェクターの様々な認識配列を含み、それらは、全体で、導入しておいた遺伝子の永久かつ構成的な発現をもたらす（Ｂｅｎｆｅｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ８， ２１９５−２２０２（１９８９））。
【００４８】
植物に用いる発現カセットは化学的に誘導できるプロモーターを含んでいてもよく、かかるプロモーターを用いると、植物において外因性デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を特定の時点で制御することができる。このようなプロモーター、例えば、ＰＲＰ１プロモーター（Ｗａｒｄら、Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２， ３６１−３６６（１９９３））、サリチル酸誘導プロモーター（ＷＯ ９５／１９４４３）、ベンゼンスルホンアミド誘導プロモーター（ＥＰ ０ ３８８ １８６）、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｇａｔｚら、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２， ３９７−４０４（１９９２））、アブシジン酸誘導プロモーター（ＥＰ ０ ３３５ ５２８）、またはエタノール−もしくはシクロヘキサノン誘導プロモーター（ＷＯ ９３／２１３３４）が文献に記載されており、とりわけこれらを用いることができる。
【００４９】
その他の有利な植物プロモーターは、ダイズのホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ８７９９９）のプロモーター、またはＥＰ ２４９６７６に記載されているような結節（ｎｏｄｅ）特異的プロモーターである。
【００５０】
特に好ましいプロモーターは、アミノ酸もしくはそれらの前駆体の生合成が起こる組織または植物部分における発現を確実にするものである。中でも、葉特異的発現を確実にするプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターの例として、ジャガイモ細胞質ゾルＦＢＰアーゼプロモーターまたはジャガイモＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら、ＥＭＢＯ Ｊ． ８（１９８９）、２４４５−２４５）を挙げることができる。
【００５１】
外来タンパク質は、トランスジェニックタバコ植物の種子において、種子特異的プロモーターを用いることにより、全可溶性種子タンパク質の０．６７％程度まで安定して発現させることができる（ＦｉｅｄｌｅｒおよびＣｏｎｒａｄ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， １０９０−１０９４（１９９５））。本発明による発現カセットは、従って、例えば、種子特異的プロモーター（好ましくは、ファセオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号）、ＵＳＰプロモーター（ＵＳＰ＝未知の種子タンパク質、Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら、Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ， １９９１， ２２５ （３）：４５９−６７）、ナピンもしくはＬＥＢ４プロモーター、またはシロイヌナズナオレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎ）遺伝子（ＷＯ９８／４５４６１））、ＬＥＢ４シグナルペプチド（Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら、１９９２， Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２（２）：２３３−９）、発現させようとする遺伝子、およびＥＲ保持シグナルを含むことができる。
【００５２】
単子葉および双子葉植物に用いることができるその他の種子特異的プロモーターとして、下記のものを挙げることができる：ナタネナピン遺伝子プロモーター（米国特許第５，６０８，１５２号）、シロイヌナズナオレオシン遺伝子（ＷＯ９８／４５４６１）、インゲンマメファセオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号）、アブラナＢｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）、またはマメ科植物由来のＢ４プロモーター（ＬｅＢ４、Ｂａｅｕｍｌｅｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２， ２， １９９２：２３３−２３９）などのプロモーター、あるいは、単子葉植物に適したプロモーター、例えば、オオムギｌｐｔ２もしくはｌｐｔ１遺伝子のプロモーター（ＷＯ９５／１５３８９およびＷＯ９５／２３２３０）、またはオオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、モロコシカシリン遺伝子またはライムギセカリン遺伝子などのプロモーター（これらはＷＯ９９／１６８９０に記載されている）。
【００５３】
アミノ酸の生合成部位は一般に葉組織であるため、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の葉特異的発現が好ましいといえる。しかし、アミノ酸生合成は葉組織に限定される必要はなく、組織特異的な様式で、残りのあらゆる植物部分、例えば、脂肪種子でも起こり得ることは自明である。
【００５４】
トランスジェニック植物の作出に適した発現カセットを作製する場合、アポプラスト、色素体、液胞、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）へのターゲッティングを確実にする別の調節配列、あるいは、好適な機能配列が存在しないために、産物がその起源のコンパートメント（すなわち細胞質ゾル）中に残るのを確実にする調節配列、特に好ましくは、色素体へのターゲッティングを確実にする調節配列が特に好ましい；Ｋｅｒｍｏｄｅ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． １５（４）， ２８５−４２３（１９９６）。
【００５５】
また、植物における発現のために、発現カセットを構築することも可能であり、そのＤＮＡ配列は、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ融合タンパク質をコードし、該融合タンパク質の一部は、該ポリペプチドの輸送を支配するトランジットペプチドである。好ましいのは、葉緑体特異的トランジットペプチドであり、該ペプチドは、葉緑体へのデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の輸送後に、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ成分から酵素によって切断される。特に好ましいのは、色素体デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼに由来するトランジットペプチド、またはこのトランジットペプチドの機能的同等物（例えば、小さなＲｕｂｉｓｃｏサブユニットまたはフェロドキシンＮＡＤＰオキシドレダクターゼのトランジットペプチド）である。
【００５６】
また、本発明を成功させるために、特定のＥＲ保持シグナルＳＥＫＤＥＬの結合が重要な役割を果たす場合もあり（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ， Ａ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３０， ７８１−７９２（１９９６）参照）、これによって、平均発現レベルが３〜４倍増加する。ＥＲ内に局在する植物および動物タンパク質中にもともと存在する、その他の保持シグナルをカセットの構築に用いることもできる。
【００５７】
例えば、本発明に従う植物発現カセットは、構成プロモーター（好ましくは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）、ＬｅＢ４シグナルペプチド、発現させるべき遺伝子、およびＥＲ保持シグナルを含むことができる。アミノ酸配列ＫＤＥＬ（リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン）をＥＲ保持シグナルとして用いるのが好ましい。さらに、植物発現カセットは、例えば植物形質転換ベクターｐＢｉｎＡＲに組み込むこともできる。
【００５８】
従って、外因性デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の構成的発現は、一般的に有利であり得る。しかし、誘導発現もまた望ましいものである。
【００５９】
さらに、発現させるべき核酸配列に、別のプロモーターを機能的に連結してもよく、その場合、該プロモーターは、他の植物組織または大腸菌などの他の生物における発現を可能にするものである。好適な植物プロモーターは、原則として、前述したすべてのプロモーターである。
【００６０】
ポリアデニル化シグナルを含みうる植物発現カセットにおいて、好ましいポリアデニル化シグナルは、本質的にアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナルに対応するもの、特に、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５（Ｇｉｅｌｅｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ３， ８３５（１９８４））のＴ−ＤＮＡ（オクトピンシンターゼ）の遺伝子３のもの、またはその機能的同等物である。
【００６１】
本発明に従う発現カセットでは、プロモーターおよびターミネーター領域は、転写方向で、この配列を挿入するための１以上の制限部位を含むリンカーまたはポリリンカーを備えていてもよい。概して、リンカーは１〜１０、ほとんどの場合は１〜８、好ましくは２〜６の制限部位を有する。一般に、調節領域内のリンカーのサイズは１００ ｂｐより少なく、多くの場合は６０ ｂｐより少なく、５ｂｐ以上である。本発明に従うプロモーターは、宿主植物に対して天然または同種であっても、外来または異種であってもよい。本発明による発現カセットは、５’−３’の転写方向で、本発明に従うプロモーターと、任意の配列と、転写終結用の領域とを含んでなる。所望であれば、様々な終結領域を相互交換することも可能である。
【００６２】
また、好適な制限切断部位を提供する操作、または過剰なＤＮＡもしくは制限切断部位を排除する操作を実施してもよい。例えば、トランジッションやトランスバージョンなどの挿入、欠失または置換が適している場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、プライマー修復、制限もしくは連結を用いることができる。例えば、制限、平滑末端のための突出部の除去（ｃｈｅｗｉｎｇ−ｂａｃｋ）またはフィルインなどの適切な操作の場合には、断片の相補的末端が連結のために提供され得る。
【００６３】
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡで宿主植物を形質転換するためには、発現カセットを挿入物としてベクター（該ベクターのＤＮＡは、別の機能調節シグナル、例えば、複製または組込み用の配列を含む）に組み込む。
【００６４】
プラスミド以外にも、ベクターは、当業者が熟知しているその他のあらゆるベクターを包含すると理解すべきであり、例えば、ファージや、ＳＶ４０、ＣＭＢ、バキュロウイルス、アデノウイルス、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、ファージミド、コスミド、または線状もしくは環状ＤＮＡを挙げることができる。これらのベクターは、宿主生物における自律複製または染色体複写が可能であり、染色体複写が好ましい。
【００６５】
ベクターの別の実施形態では、核酸構築物は線状ＤＮＡの形態で生物に導入し、異種または相同的組換えにより宿主生物のゲノムに組み込むこともできる。この線状ＤＮＡは、線状化されたプラスミド、またはベクターとしての核酸構築物のみ、あるいは用いた核酸配列からなるものであってもよい。
【００６６】
さらに有利な実施形態では、本発明の方法で用いる核酸配列を単独で生物に導入することも可能である。
【００６７】
核酸配列のほかに、別の遺伝子を生物に導入する場合には、単一のベクターでそれらすべてを一緒に生物に導入するか、あるいは、個々の遺伝子をそれぞれ１つのベクターで生物に導入することができ、各種ベクターは同時に導入しても、順次導入してもよい。
【００６８】
ベクターは、用いた核酸配列および／または本発明に従う核酸構築物の少なくとも１つのコピーを含んでなる。
【００６９】
前述したプロモーター以外にも、本発明に従う発現カセットおよびそれを含むベクターは、すでに示したような別の機能エレメントを含んでもよい。そのようなエレメントの例として、下記のものを挙げることができる：
１．容易に定量可能なタンパク質をコードするリポーター遺伝子。形質転換効率または発現の部位もしくは時期の評価は、これらの遺伝子を用いて、増殖、蛍光、化学発光、生物発光または耐性アッセイにより、あるいは、光度測定（固有色）または酵素活性によって、実施することができる。これに関しては、以下に挙げるようなリポータータンパク質が特に好ましい（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ Ｅ， Ｇｒｏｓｋｒｅｕｔｚ Ｄ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９９；１３（１）：２９−４４）。「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）（Ｇｅｒｄｅｓ ＨＨおよびＫａｅｔｈｅｒ Ｃ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９６；３８９（１）：４４−４７；Ｃｈｕｉ ＷＬら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９６， ６：３２５−３３０；Ｌｅｆｆｅｌ ＳＭら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２３（５）：９１２−８， １９９７）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ（Ｇｉａｃｏｍｉｎ， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ １９９６， １１６：５９−７２；Ｓｃｉｋａｎｔｈａ， Ｊ Ｂａｃｔ １９９６， １７８：１２１；Ｍｉｌｌａｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ １９９２ １０：３２４−４１４）、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子またはβグルコルニダーゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ． １９８７， ６， ３９０１−３９０７）、Ｕｒａ３遺伝子、Ｉｌｖ２遺伝子、２−デオキシグルコース−６−リン酸ホスファターゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、もしくはＢＡＳＴＡ（＝グルホシネート耐性）遺伝子など；
【００７０】
２．複製起点；
３．抗生物質に対する耐性を付与する選択マーカー。これに関する例として、下記のものを挙げることができる：アミノグリコシド系の抗生物質であるネオマイシン（Ｇ ４１８）、カナマイシン、およびパロマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔ遺伝子（Ｄｅｓｈａｙｅｓ Ａら、ＥＭＢＯ Ｊ． ４（１９８５）２７３１−２７３７）；ブレオマイシン抗生物質ゼオシンに対する耐性を付与する、ｈｙｇｒｏ遺伝子（Ｍａｒｓｈ ＪＬら、Ｇｅｎｅ． １９８４；３２（３）：４８１−４８５）、ｓｕｌ遺伝子（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ Ｆら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９０；１５（１）：１２７−１３６）およびＳｈｅ−ｂｌｅ遺伝子。選択マーカー遺伝子のさらに別の例として、２−デオキシグルコース−６−リン酸（ＷＯ ９８／４５４５６）またはホスフィノトリシンなどに対する耐性を付与する遺伝子、あるいは、代謝拮抗物質に対する耐性を付与するもの、例えば、ｄｈｆｒ遺伝子（Ｒｅｉｓｓ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． Ａｄｖ．）１３（１９９４）１４２−１４９）が挙げられる。その他の好適な遺伝子として、ｔｒｐＢまたはｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ ＳＣおよびＭｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ８５（１９８８）８０４７−８０５１）のような遺伝子がある。これら以外の好適な遺伝子としては、下記のものが挙げられる：マンノースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＷＯ ９４／２０６２７）、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）遺伝子（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ， １９８７：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編）もしくはアスペルギルス・テレウスデアミナーゼ（Ｔａｍｕｒａ Ｋ．ら、 Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９（１９９５）２３３６−２３３８）。
【００７１】
４．アフィニティータグとして知られるもの。その核酸配列は、通常のクローニング技法により標的タンパク質をコードする配列と直接、またはリンカーを用いて、融合することができるペプチドまたはポリペプチドをコードする。アフィニティータグは、アフィニティークロマトグラフィーにより（しかし、特定の状況下で）組換え標的タンパク質を単離するために用いられるが、これはまた、発現させた融合タンパク質を検出するためにも用いられる。前記リンカーはプロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビンまたは第Ｘａ因子）を含んでいてもよく、これによって、所望であれば、アフィニティータグを標的タンパク質から切断することができる。既存のアフィニティータグの例として、Ｑｉａｇｅｎ社（Ｈｉｌｄｅｎ）製の「Ｈｉｓタグ」、「Ｓｔｒｅｐタグ」、「Ｍｙｃタグ」、キチン結合性ドメインとインテインからなるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製のタグ、ならびに、Ｎｏｖａｇｅｎ社製のＣＢＤタグとして知られるものがある。
【００７２】
加えて、一般に入手可能な、あるいは、市販されている発現系およびベクターを使用して、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを発現させることも可能である。以下に、その例を挙げるが、これらに限定されるわけではない。
【００７３】
大腸菌における発現のためのベクターの例として、次のものがある：ｐＧＥＸ［Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ， Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０］、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベヴァリー）、ならびに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、またはプロテインＡを含むｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ｐＴｒｃベクター（Ａｍａｎｎら、（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）、Ｑｉａｇｅｎ社（Ｈｉｌｄｅｎ）製の「ｐＱＥ」ベクター、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社（カリフォルニア州パロアルト）製の「ｐＫＫ２３３−２」、ならびに、Ｓｔｏｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）製の「ｐＥＴ」および「ｐＢＡＤ」ベクター系列、さらにはＭ１３ｍｐ系列およびｐＡＣＹＣ１８４。
【００７４】
酵母に使用するベクターの例として、下記のものがある：ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）Ｅｍｂｏ Ｊ． ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ならびに、ｐＹＥＳ誘導体、ｐＧＡＰＺ誘導体、ｐＰＩＣＺ誘導体、ならびに、「ピキア発現キット」のベクター（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州サンジエゴ）製）。
【００７５】
糸状菌に用いるベクターの例は、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ， Ｃ．Ａ，Ｍ．Ｊ．Ｊ． ＆ Ｐｕｎｔ， Ｐ．Ｊ．（１９９１） ”Ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ， ｉｎ： Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｕｎｇｉ”， Ｊ．Ｆ． Ｐｅｂｅｒｄｙら編、ｐ．１−２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００７６】
昆虫細胞発現ベクターの例、例えば、Ｓｆ９細胞における発現用のベクターは、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈら（１９８３） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系列（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）のベクターである。
【００７７】
植物細胞または藻類細胞で発現させるための植物発現ベクターの例は、Ｂｅｃｋｅｒ， Ｄ．ら（１９９２） ”Ｎｅｗ ｐｌａｎｔ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ”， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０：１１９５−１１９７、またはＢｅｖａｎ， Ｍ．Ｗ．（１９８４） ”Ｂｉｎａｒｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ”， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． １２：８７１１−８７２１に報告されている。それ以外にも、好適なベクターが、とりわけ ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， 第６／７章、７１−１１９）に記載されている。
【００７８】
哺乳動物細胞に用いられる発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣであり、これについては、Ｓｅｅｄ， Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０またはＫａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５に記載されている。好ましく用いられるプロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスまたはシミアンウイルス４０のプロモーターなどのウイルス由来のものである。これ以外にも、原核または真核生物発現系について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されている。また、別の有利なベクターが、Ｈｅｌｌｅｎｓら（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ， ５， ２０００）に記載されている。
【００７９】
さらに、発現カセットおよびそれを含むベクターを用いて、ユビキノン、葉酸、フラボノイド、クマリン、リグニン、アルカロイド、シアノーゲングリコシド、プラストキノン、トコフェロールおよび芳香族アミノ酸の含有量を増加させる目的で、細菌、シアノバクテリア、酵母、糸状菌および藻類を形質転換することができる。
【００８０】
細菌の中でも、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）属、エルウィニア属、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属の細菌、または、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属やアナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属のシアノバクテリアが好ましい。この場合、経済的理由および可能な遺伝子操作の多様性から、大腸菌属の細菌が特に好ましい。好ましい酵母はカンジダ属、サッカロミセス属、ハンセヌラ属またはピキア属である。好ましい真菌は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、アシュビア属、モルティエレラ属、水生菌属、腐敗カビ属、パンカビ属、フザリウム属、ハクキョウサン病菌属、あるいは、Ｉｎｄｉａｎ Ｃｈｅｍ Ｅｎｇｒ． Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｂ． 第３７巻、第１、２号（１９９５）に記載されている真菌である。好ましい真核細胞系は、例えば、当業者にはよく知られている通常の昆虫または哺乳動物細胞系である。概して、トランスジェニック動物、例えば、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓも宿主生物として適している。
【００８１】
さらに好ましいのは、本発明に従う機能的または非機能的核酸構築物、あるいは本発明に従う機能的または非機能的ベクターを含むトランスジェニック植物である。本発明が意図する「機能的」とは、上記方法に用いた核酸が単独で、あるいは、核酸構築物またはベクター中で発現すること、および生物学的に活性の遺伝子産物が産生されることを意味する。本発明が意図する「非機能的」とは、上記方法に用いた核酸が単独で、あるいは、核酸構築物またはベクター中で転写または発現されないこと、および／または生物学的に非活性の遺伝子産物が産生されることを意味する。この意味で、アンチセンスＲＮＡとして知られるものは非機能的核酸でもあり、また、核酸構築物またはベクターへの挿入の場合には、非機能的核酸構築物または非機能的ベクターである。トランスジェニック生物（好ましくは、植物）を作出するため、本発明に従う核酸構築物と本発明に従うベクターの両方を有利に用いることができる。
【００８２】
また、組換えデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを発現させるための市販されている系を用いるのも好ましく、その例として、例えば、下記のものが挙げられる：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ）製のバキュロウイルス発現系「ＭａｘＢａｃ ２．０１キット」、またはＣＬＯＮＴＥＣＨ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）製の「ＢａｃＰＡＫバキュロウイルス発現系」、酵母の発現系、例えば、「Ｅａｓｙ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ）製）、またはＳｔａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）製の「Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」。
【００８３】
発現カセットを用いて、発現させる植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系において、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼに特異的な阻害剤を見出すのに特に好適である。このため、例えば、タバコ由来のデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのｃＤＮＡ配列またはデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのｃＤＮＡ配列の好適な断片を、前記の発現ベクターの一つ、例えば、ベクターｐＱＥにクローニングし、前記生物または発現系の一つ、例えば、大腸菌において過剰発現させることができる。その理由は、大腸菌が前述した理由から組換えタンパク質の発現に特に適しているからである。
【００８４】
原則として、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの除草活性のある阻害剤を同定するための本発明の方法は、下記の核酸配列：
ａ）配列番号１または配列番号３に示した配列を含む核酸配列；または
ｂ）遺伝コードの縮重のために、逆翻訳により配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列から推定できる核酸配列；または
ｃ）配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、配列番号１または配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｄ）配列番号２または配列番号４に示したアミノ酸配列の機能的類似体をコードする、配列番号１または配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｅ）核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の部分配列；または
ｆ）核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の少なくとも３００ヌクレオチド単位；
からなる群より選択される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の遺伝子産物の転写、発現、翻訳または活性に影響を及ぼすこと、
遺伝子産物の転写、発現、翻訳または活性を減少または阻止する物質を選択すること、
を含んでなる。
【００８５】
すでに述べたように、ハイスループットスクリーニング系でこれらのアッセイを実施するのが特に有利である。
【００８６】
本発明に従う方法により同定された物質の除草活性を確認するために最適な方法は、植物にその物質を適用して除草活性をアッセイし、本方法で同定された物質と共にインキュベートしていない植物と上記植物とを比較することである。
【００８７】
好ましい実施形態では、本発明の方法を生物において実施するが、その際用いる生物は、細菌、酵母、真菌または植物である。この場合、配列番号１または配列番号３の配列の条件的または天然突然変異体である生物を用いることができる。トランスジェニック生物を用いる方法が特に好ましい。
【００８８】
「トランスジェニック」という用語は、本明細書では、本発明に従う発現カセットまたは本発明に従うベクターで形質転換しておいた生物を意味する。本明細書では、生物のゲノムへの外来遺伝子の導入を形質転換と呼ぶ。
【００８９】
多種多様な生物の形質転換を実施する一連の標準的方法が当業者には知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６）。
【００９０】
植物に用いられる形質転換方法のいくつかについて、以下に簡単に説明する：
植物を形質転換するためには、植物組織または植物細胞を形質転換して、それから植物を再生させるための前記方法を利用して、一過性または安定な形質転換を達成することができる。好適な方法として下記のものが挙げられる：ポリエチレン−グリコール誘導ＤＮＡ取込みによるプロトプラスト形質転換、遺伝子銃によるバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）法、エレクトロポレーション、ＤＮＡ含有溶液中での乾燥胚のインキュベーション、マイクロインジェクションおよびアグロバクテリウム媒介遺伝子導入である。前記方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｂ． Ｊｅｎｅｓら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， ｉｎ： Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ， 第１巻；Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｓ． Ｄ． ＫｕｎｇおよびＲ． Ｗｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）， １２８−１４３およびＰｏｔｒｙｋｕｓ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ４２， ２０５−２２５（１９９１）。当業者には公知である、別のトランスジェニック植物作出方法に、色素体形質転換として知られるものがある。通常の好適な技法について詳しくは、Ａａｒｔ ｖａｎ Ｂｅｌら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｔｅｃｈｍｏｌ（２００１）１２ １４４−１４９に記載されている。
【００９１】
好ましくは、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする本発明の発現カセットをベクター、例えば、ｐＢＩＮＡＲにクローニングする。このベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、例えば、ｐＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２， ８７１１（１９８４））の形質転換に適している。このようなベクターで形質転換したアグロバクテリウムを、植物、特に作物植物、例えば、タバコ植物を形質転換する公知の方法、例えば、表皮処理した葉または葉切片をアグロバクテリウム溶液に浸けた後、適当な培地中で培養する方法に用いることができる。アグロバクテリウムによる植物の形質転換については、とりわけ、下記の文献から知られている：Ｆ． Ｆ． Ｗｈｉｔｅ， Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔｓ； ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ， 第１巻、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ， Ｓ． Ｄ． ＫｕｎｇおよびＲ． Ｗｕ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９３， ｐｐ．１５−３８。デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現用の遺伝子を含むトランスジェニック植物は、公知の方法で表皮処理した葉または葉切片の形質転換細胞から再生させることができる。
【００９２】
発現カセットで形質転換したアグロバクテリウムは、植物、特に、穀類、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、キャノーラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ナタネ、アルファルファ、レタスおよび各種樹木、堅果およびブドウなどの作物植物を形質転換する公知の方法、例えば、表皮処理した葉または葉切片をアグロバクテリウム溶液に浸けた後、適当な培地中で培養する方法に用いることができる。
【００９３】
すでに簡単に述べたように、本発明はさらに、植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの活性を阻害する、除草活性のある物質を同定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。
【００９４】
好ましい実施形態では、本発明に従う方法は、下記のステップ：
ａ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを、トランスジェニック生物の前記実施形態の１つにおいて、酵素として活性な形態で発現させるか、あるいは、本発明に従うタンパク質を含む生物を培養すること；
ｂ）ステップａ）で得られたタンパク質を、酸化還元当量および化合物と一緒に、成長中または静止状態の生物そのものにおいて、あるいは、部分的に精製したまたは均質に精製した形態のトランスジェニック生物の細胞消化物中において、インキュベートすること（その際、この目的のために、当業者には公知の酸化還元当量をすべて用いることができ、その例として、限定するものではないが、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋、およびＦＡＤ／ＦＡＤＨが挙げられる）；
ｃ）ステップｂ）により、上記化合物と一緒にインキュベートしなかったサンプルと比較して、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを阻害する化合物を選択すること；
を含んでなる。
【００９５】
この方法は、ハイスループットスクリーニング法に特に適している。
【００９６】
この方法では、植物デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを、例えば、酵素アッセイに用いることができ、このアッセイでは、アッセイしようとする活性成分の存在下および不在下で、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの活性を測定する。アッセイしようとする活性成分の阻害挙動に関する定性および定量的知見は、２つの活性測定を比較することにより得られる。
【００９７】
本発明のアッセイ系を用いれば、除草特性について、多数の化合物を迅速かつ簡単にアッセイすることができる。この方法により、多数の物質から、特に極めて強力な物質を再現的に選択することが可能になり、これによって、続いてこれらの物質を当業者には公知のさらに綿密な試験に供することができる。
【００９８】
本発明の別の実施形態では、酵素デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの阻害剤は、タンパク質とリガンドとの相互作用を示す技法により検出することができる。この場合、特に、本発明に関するハイスループット方法にも適した３つの好ましい実施形態を以下に挙げる：
ａ）質量に応じた蛍光分子の平均拡散速度を、蛍光相関分光学（ＦＣＳ）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９４）１１７５３−１１５７５）により少量のサンプルで測定することができる。ＦＳＣを用いて、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼと結合したとき必然的に起こる化合物の質量変化、もしくは変化した拡散速度を測定することにより、タンパク質／リガンド相互作用を測定することができる。このようにして同定され、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼと結合した化合物が、阻害剤として好適でありうる。
【００９９】
ｂ）飛行時間質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）と組み合わせた表面活性化レーザー脱着／イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＳＥＬＤＩ）により、支持体上の分子の高速分析が可能であり、これを用いて、タンパク質−リガンド相互作用を分析することができる（Ｗｏｒｒａｌら、（１９９８） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：７５０−７５６）。好ましい実施形態では、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを好適な支持体に固定化し、次いでこれをアッセイしようとする化合物と一緒にインキュベートする。１回以上の好適な洗浄ステップの後、タンパク質と新たに結合した化合物の分子を前記方法により検出することができ、このようにして、阻害剤候補を選択する。この方法で同定され、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼと結合する化合物が、阻害剤として好適でありうる。
【０１００】
ｃ）バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）は、化合物が、表面に固定化したタンパク質と結合する際の、該表面での屈折率の変化に基づくものである。表面での質量濃度の規定変化についての屈折率の変化が、すべてのタンパク質およびポリペプチドについてほぼ同じであるため、この方法は、原則として、あらゆるタンパク質に適用することができる（Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、Ｓｅｎｓｏｒ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ ４（１９８３）２９９−３０４；Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ Ｎａｔｕｒｅ ３６１（１９９３）１８６−１８７）。化合物を用量が２〜５ｍｌのキュベットに注入するが、このキュベットの壁には上記タンパク質が固定化されている。上記タンパク質と当該化合物の結合、従って、阻害剤候補の同定は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、表面が反射したレーザー光の吸収により測定することができる。このようにして同定され、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼと結合する化合物が、阻害剤として好適でありうる。
【０１０１】
ｄ）さらに、Ｘ線構造解析によるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの三次元構造の解明を通じた分子モデリングによって、除草活性成分についてのさらなる候補物質を検出することも可能である。Ｘ線構造解析に必要なタンパク質結晶の調製、ならびに、関連する測定値と、それに続くこれら測定値の評価、そして分子モデリングの方法は、当業者には公知である。原則として、前記方法により同定された化合物の最適化は、分子モデリングによっても可能である。
【０１０２】
本発明はさらに、植物におけるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を阻害する、除草活性のある物質を同定するｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、下記のステップ：
ａ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする追加の核酸配列を含み、かつ、酵素活性のあるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現させることができる、本発明の発現カセットまたはベクターを含むトランスジェニック生物を作出すること；
ｂ）化学物質を上記トランスジェニック生物に適用すること；
ｃ）該化学物質の適用後、トランスジェニック生物および非トランスジェニック生物の成長または生存能を測定すること；
ｄ）化学物質の適用後の、トランスジェニック生物および非トランスジェニック生物の成長または生存能を比較すること；
からなる方法に関する。
【０１０３】
トランスジェニック生物の作出には、下記の生物または細胞タイプを用いることができる：細菌、酵母、真菌、藻類、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞。
【０１０４】
トランスジェニック生物の成長または生存能が影響されなかったのに対し、非形質転換生物の成長または生存能が抑制されていれば、ｂ）の物質が植物におけるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性を阻害し、従って、除草活性を示すことが確認される。
【０１０５】
生物の生物活性、成長または生存能を低下させる化合物とは、生物の生物活性、成長または生存能を少なくとも１０％、有利には少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも７０％、極めて好ましくは少なくとも９０％阻害する化合物を意味するものとして理解される。
【０１０６】
前記方法の好ましい実施形態では、用いるトランスジェニック生物は、トランスジェニック植物、植物細胞、植物組織または植物部分である。
【０１０７】
本発明はさらに、前記アッセイ系で同定することができる除草活性化合物に関する。
【０１０８】
本発明はさらに、前記方法で同定された物質を植物に適用することにより、その除草活性をアッセイした後、除草活性を示す物質を選択することからなる方法に関する。
【０１０９】
同定された物質は、化学合成された物質でも、または微生物が生産した物質でもよく、例えば、植物、動物または微生物の細胞抽出物に見出すことができる。さらに、前記物質は、従来の技術で公知であるが、除草剤としては知られていないものでもよい。反応混合物は、無細胞抽出物でもよいし、あるいは、細胞または細胞培養物を含むものでもよい。好適な方法は、当業者には公知であり、概略は、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｈｅ ｃｅｌｌ、第３版（１９９４）の、例えば、第１７章に記載されている。記載した物質を例えば、反応混合物または培地に添加したり、細胞に注入したり、あるいは、植物に噴霧したりすることができる。
【０１１０】
活性物質を含むサンプルを本発明の方法で検出した後、その元のサンプルから直接物質を分離することが可能である。別の実施形態として、例えば、サンプルが多様な異なる成分からなる場合、サンプルを各種の群に分類し、これによって、サンプル毎の異種物質の数を減らし、元のサンプルのこのような「サブサンプル」を用いて、本発明の方法を繰り返すこともできる。サンプルの複雑性に応じて、好ましくは本発明の方法によって同定したサンプルが、少数の物質、またはただ１つの物質だけを含むまで、前記ステップを何度も繰り返すことができる。さらに、本発明の方法によって同定した物質もしくはその誘導体を、それが、植物育種、植物細胞培養または組織培養での使用に適するように配合するのが好ましい。
【０１１１】
本発明の方法によってアッセイおよび同定された物質は、発現ライブラリー、例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、小さい有機物質、ホルモン、ＰＮＡなどでありうる（Ｍｉｌｎｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎ １（１９９５）， ８７９−８８０；Ｈｕｐｐ， Ｃｅｌｌ． ８３（１９９５）， ２３７−２４５；Ｇｉｂｂｓ， Ｃｅｌｌ． ７９（１９９４）， １９３−１９８、ならびに、これらに引用されている参照文献）。これらの物質はまた、公知の阻害剤またはアクチベーターの機能的誘導体もしくは類似体であってもよい。化学的誘導体もしくは類似体を調製する方法は、当業者には公知である。前記誘導体および類似体は、従来の技術方法に従ってアッセイすることができる。さらに、コンピューター支援設計もしくはペプチド擬似物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を用いて、好適な誘導体および類似体を調製してもよい。本発明の方法に用いることができる細胞または組織は、前記実施形態で述べたように、本発明の宿主細胞、本発明の植物細胞または植物組織である。
【０１１２】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の前記方法で同定された物質であり、該物質は、配列番号１もしくは配列番号３の配列によりコードされたタンパク質、または配列番号１もしくは配列番号３の配列によりコードされたタンパク質の機能的同等物に対する抗体の形態をとる。
【０１１３】
除草活性のあるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤は、落葉剤、乾燥剤、茎除去剤（ｈａｕｌｍ ｋｉｌｌｅｒ）、ならびに、特に雑草除去剤として用いることができる。広義には、雑草とは、それらが望ましくない場所に発生するあらゆる植物を意味するものとして理解される。本発明のアッセイ系を用いて、見出された活性成分が、非選択的または選択的除草剤として作用するか否かは、とりわけ、使用する量に依存する。
【０１１４】
除草活性のあるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤は、例えば、以下に挙げる雑草に対して使用することができる：
下記属に属する双子葉の雑草：
カラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ）、マメグンバイナズナ（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）、ヤエムグラ（Ｇａｌｉｕｍ）、ハコベ（Ｓｔｅｌｌａｒｉａ）、マトリカリア（Ｍａｔｒｉｃａｒｉａ）、アンセミス（Ａｎｔｈｅｍｉｓ）、ハキダメギク（Ｇａｌｉｎｓｏｇａ）、アカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、イラクサ（Ｕｒｔｉｃａ）、セネシオ（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、ヒユ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ）、スベリヒユ（Ｐｏｒｔｕｌａｃａ）、オナモミ（Ｘａｎｔｈｉｕｍ）、サンシキヒルガオ（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｕｓ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ）、タデ（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ）、セスバニア（Ｓｅｓｂａｎｉａ）、ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、キルシウム（Ｃｉｒｓｉｕｍ）、ヒレアザミ（Ｃａｒｄｕｕｓ）、ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）、イヌガラシ（Ｒｏｒｉｐｐａ）、ロタラ（Ｒｏｔａｌａ）、アゼトウガラシ（Ｌｉｎｄｅｒｎｉａ）、オドリコソウ（Ｌａｍｉｕｍ）、クワガタソウ（Ｖｅｒｏｎｉｃａ）、イチビ（Ａｂｕｔｉｌｏｎ）、イメックス（Ｅｍｅｘ）、チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ）、スミレ（Ｖｉｏｌａ）、チシマオドリコソウ（Ｇａｌｅｏｐｓｉｓ）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ）、ヤグルマギク（Ｃｅｎｔａｕｒｅａ）、シャジクソウ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、キンポウゲ（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）。
【０１１５】
下記属に属する単子葉の雑草：
ヒエ（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ）、エノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ヒメシバ（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ）、アワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ（Ｐｏａ）、ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オヒシバ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ）、ビロードキビ（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ）、ライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ）、イヌムギ（Ｂｒｏｍｕｓ）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ）、カヤツリグサ（Ｃｙｐｅｒｕｓ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、カモジグサ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、ミズアオイ（Ｍｏｎｏｃｈｏｒｉａ）、テンツキ（Ｆｉｍｂｒｉｓｔｙｓｌｉｓ）、オモダカ（Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ）、ハリイ（Ｅｌｅｏｃｈａｒｉｓ）、フトイ（Ｓｃｉｒｐｕｓ）、スズメノヒエ（Ｐａｓｐａｌｕｍ）、カモノハシ（Ｉｓｃｈａｅｍｕｍ）、ナガボノウルシ（Ｓｐｈｅｎｏｃｌｅａ）、タツノツメガヤ（Ｄａｃｔｙｌｏｃｔｅｎｉｕｍ）、コヌカグサ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、スズメノテッポウ（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ）、セイヨウヌカボ（Ａｐｅｒａ）。
【０１１６】
有利なことには、適用方法に応じて、本発明の方法で同定される物質、もしくはそれらを含む組成物をさらに多種の作物植物に用いて、望ましくない植物を除去することもできる。好適な作物としては、例えば、下記のものが挙げられる：タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、落花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、サトウダイコンアルチッシマ種（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｓｐｅｃ． ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、サトウダイコンラパ種（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｓｐｅｃ． ｒａｐａ）、セイヨウアブラナ変種ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｖａｒ． ｎａｐｕｓ）、セイヨウアブラナ変種ナポブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｖａｒ． ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ）、アブラナ変種シルベストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｖａｒ． ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、ヒッコリーイリノイネンシス（Ｃａｒｙａ ｉｌｌｉｎｏｉｎｅｎｓｉｓ）、レモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉｍｏｎ）、オレンジ（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、アラビカコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）（ロブスタコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ）、リベリカコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ ｌｉｂｅｒｉｃａ））、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、エゾヘビイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｅｓｃａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、リクチワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、（キワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ）、アジアワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、ワタビチホリウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｖｉｔｉｆｏｌｉｕｍ））、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ）、カシグルミ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、リンゴ種（Ｍａｌｕｓ ｓｐｅｃ．）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、バショウ種（Ｍｕｓａ ｓｐｅｃ．）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ （Ｎ． ｒｕｓｔｉｃａ））、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｕｎａｔｕｓ）、サヤインゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、ヨーロッパトウヒ（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ）、マツ種（Ｐｉｎｕｓ ｓｐｅｃ．）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）、セイヨウミザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、スグリ（Ｒｉｂｅｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （ｓ． ｖｕｌｇａｒｅ））、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、アカツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）、コムギ属アエスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、マカロニコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）。
【０１１７】
さらに、本発明の方法により見出される物質は、組換え方法を含む育種によって、除草剤の作用に耐える作物にも用いることができる。
【０１１８】
本発明の物質もしくはそれらを含む除草剤組成物を、例えば、直接スプレー可能な水溶液、粉末、懸濁液、また非常に高度に濃縮された水性、油性もしくはその他の懸濁液もしくは分散液、エマルジョン、油性分散液、ペースト、倍散剤、散布用材料、または顆粒の形態で、あるいは、噴霧、霧化、散粉、散布または給水といった手段により製剤化することができる。この使用形態は、意図する用途に依存するが、どんな場合でも、本発明の活性成分の最も微細な分布を確実にしなければならない。
【０１１９】
好適な不活性液体および／または固体担体は、以下に挙げるような液体添加剤である：中〜高沸点の鉱油留分、例えば灯油またはディーゼル油、さらには、コールタール油、ならびに、植物または動物油、脂肪族、環状および芳香族炭化水素、例えば、パラフィン、テトラヒドロフタレン、アルキル化ナフタレンもしくはそれらの誘導体、アルキル化ベンゼンもしくはそれらの誘導体、アルコール、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびシクロヘキサノール、シクロヘキサノンのようなケトン、または強い極性溶媒、例えば、Ｎ−メチルピロリドンのようなアミンまたは水。
【０１２０】
本発明の物質および／または組成物のさらに有利な使用形態は、エマルジョン濃縮物、懸濁液、ペースト、可湿性粉末もしくは水分散性顆粒であり、これらは、例えば、水を添加して調製することができる。エマルジョン、ペーストまたは油性分散液を調製するためには、物質および／または化合物、すなわち、基質として知られるものを、湿潤剤、固着剤（ｓｔｉｃｋｅｒ）、分散剤または乳化剤を用いて、そのまま、または油もしくは溶媒中に溶解させて、水中に均質化させることができる。活性物質、湿潤剤、固着剤、分散剤または乳化剤、また必要であれば、溶媒または油からなる濃縮物を調製することも可能であり、これら濃縮物は、水による稀釈に適している。
【０１２１】
好適な界面活性剤は、例えば、芳香族スルホン酸、例えば、リグノスルホン酸、フェノールスルホン酸、ナフタレンスルホン酸およびジブチルナフタレンスルホン酸の、脂肪酸の、アルキル−およびアルキルアリールスルホン酸の、アルキル硫酸の、ラウリルエーテル硫酸および脂肪アルコール硫酸の、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩またはアンモニウム塩；ならびに硫酸化ヘキサ−、ヘプタ−およびオクタデカノールの、および脂肪アルコールグリコールエーテルの塩；ホルムアルデヒドとスルホン化ナフタレンまたはその誘導体との縮合物、フェノールおよびホルムアルデヒドとナフタレンもしくはナフタレンスルホン酸との縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシル化イソオクチル−、オクチル−もしくはノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、イソトリデシルアルコール、脂肪アルコール／酸化エチレン縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセテート、ソルビトールエステル、リグニン−亜硫酸塩廃液またはメチルセルロースである。
【０１２２】
固体担体としての粉末、散布用材料および倍散剤は、固体担体と一緒に活性物質を混合する、もしくは同時に粉砕することにより有利に調製することができる。
【０１２３】
顆粒、例えば、被覆顆粒、含浸顆粒および均質顆粒は、活性成分を固体担体と結合させることにより調製することができる。固体担体の例としては、下記のものが挙げられる：シリカ、シリカゲル、ケイ酸塩、タルク、カオリン、石灰石、石灰、白亜、陶土、黄土、粘土、苦灰石、珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、粉砕した合成材料などの鉱物土類；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などの肥料；穀物ミール、樹皮ミール、木材ミールおよびナッツ殻ミール、セルロース粉末などの植物由来の産物；またはその他の固体担体。
【０１２４】
すぐに使用できる調製物における本発明の物質および／または組成物の濃度は、広い範囲で変動しうる。一般に、製剤は、０．００１〜９８重量％、好ましくは、０．０１〜９５重量％の少なくとも１種の活性成分を含む。活性成分は、９０％〜１００％、好ましくは、９５％〜１００％の純度で用いられる（ＮＭＲスペクトルによる）。
【０１２５】
除草剤組成物または物質は発芽前または発芽後に適用できる。特定の作物植物が、この活性成分に対する耐性が十分にない場合には、スプレー装置を用いて、組成物を噴霧する適用技術を用いることができるが、その際、組成物が、感受性の高い作物植物の葉に接触するとしても、できるだけ少量しか接触しないにようにすると同時に、活性成分が、下方で生育する望ましくない植物の葉、またはむき出しの土壌表面に達するようにする（後管理（ｐｏｓｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）、レイバイ（ｌａｙ−ｂｙ））。
【０１２６】
作用範囲を拡大し、かつ、相乗効果を達成するために、本発明の物質および／または組成物は、多数の典型的な他の群の除草または成長調節活性成分と混合し、これらと一緒に適用してもよい。混合物に好適な成分としては、例えば、下記のものが挙げられる：１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、アミド、アミノリン酸およびその誘導体、アミノトリアゾール、アニリド、（ヘタ）アリールオキシアルカン酸およびそれらの誘導体、安息香酸およびその誘導体、ベンゾチアジアジノン、２−アロイル−１，３−シクロヘキサンジオン、ヘタリールアリールケトン、ベンジルイソオキサゾリジノン、メタ−ＣＦ３−フェニル誘導体、カルバメート、キノリンカルボン酸およびその誘導体、クロロアセトアニリド、シクロヘキサン−１，３−ジオン誘導体、ジアジン、ジクロロプロピオン酸およびその誘導体、ジヒドロベンゾフラン、ジヒドロフラン−３−オン、ジニトロアニリン、ジニトロフェノール、ジフェニルエーテル、ジピリジル、ハロカルボン酸およびそれらの誘導体、尿素、３−フェニルウラシル、イミダゾール、イミダゾリノン、Ｎ−フェニル−３，４，５，６−テトラヒドロフタルイミド、オキサジアゾール、オキシラン、フェノール、アリールオキシ−またはヘテロアリールオキシフェノキシプロピオン酸エステル、フェニル酢酸およびその誘導体、フェニルプロピオン酸およびその誘導体、ピラゾール、フェニルピラゾール、ピリダジン、ピリジンカルボン酸およびその誘導体、ピリミジルエーテル、スルホンアミド、スルホニル尿素、トリアジン、トリアジノン、トリアゾリノン、トリアゾールカルボキサミドおよびウラシル。
【０１２７】
さらに、本発明の物質および／または組成物を単独で、もしくは他の除草剤と組み合わせて、さらに作物保護剤、例えば、害虫または植物病原性真菌もしくは細菌を駆除用薬剤と一緒に適用することは有利でありうる。さらに、栄養および微量元素欠乏を軽減するのに用いられるミネラル塩溶液との混和性も興味深い。また、非植物毒性油および油濃縮物を添加してもよい。
【０１２８】
意図する目的、季節、標的植物および成長期に応じて、活性成分（＝物質および／または組成物）の適用割合は、１ｈａあたり活性物質が０．００１〜３．０ｋｇ、好ましくは、０．０１〜１．０ｋｇとなる。
【０１２９】
本発明の別の目的は、除草剤として、もしくは植物の成長を調節するため、本発明の方法の１つによって同定した物質、もしくはこれら物質を含む組成物の使用である。
【０１３０】
本発明はさらに、配列番号１もしくは配列番号３のＤＮＡ配列またはその機能的同等物を含む発現カセットで形質転換したトランスジェニック生物、好ましくは、植物に関するが、これらの植物は、配列番号１もしくは配列番号３のＤＮＡ配列、または両配列のいずれか１つの機能的同等物のさらなる発現により、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、ならびに、このようなトランスジェニック生物、好ましくは、植物のトランスジェニック細胞、組織、部分および増殖物質に対して、耐性であるようにされている。この場合、特に好ましいものは、例えば、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ナタネ、アルファルファ、レタスおよび各種樹木、堅果およびブドウ種、ならびに、マメ科植物などのトランスジェニック作物植物である。
【０１３１】
従って本発明はさらに、植物、植物細胞、植物組織または植物部分の形質転換のための、配列番号１、配列番号３のＤＮＡ配列、またはこれら配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列を含む発現カセットの使用に関する。この使用の好ましい目的は、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの除草剤耐性形態を有する植物の作出である。
【０１３２】
改変された形態、すなわち、過剰発現を引き起こす形態では、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、阻害剤に対する耐性を賦与することができる。このような遺伝子の発現により、別のコリスミ酸生合成酵素、すなわち、エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸酵素について示されているように、除草剤耐性植物が達成される。
【０１３３】
言い換えれば、さらに除草剤標的を賦与することにより、本発明の阻害剤によって阻害されないデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを同定する方法が可能となる。従って、本発明のデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼとは異なる酵素は、以後、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ変異体と呼ぶ。また、前記の方法も本発明の目的である。
【０１３４】
好ましい実施形態では、配列番号１または配列番号３の核酸配列の変異体を作製する前記方法は、下記のステップからなる：
ａ）異種系または無細胞系における配列番号１または配列番号３によりコードされるタンパク質の発現；
ｂ）核酸の改変によるタンパク質のランダムまたは部位特異的突然変異誘発；
ｃ）改変遺伝子産物と除草剤との相互作用の測定；
ｄ）相互作用が低いタンパク質の誘導体の同定；
ｅ）除草剤を適用した後、タンパク質の生物活性のアッセイ；
ｆ）除草剤に対して、改変された生物活性を示す核酸配列の選択。
【０１３５】
前記方法により選択した配列を生物に導入するのが有利である。従って、本発明はさらに、この方法によって作出した生物にも関する。その際、この生物は、好ましくは、植物である。
【０１３６】
次に、インタクトの植物を再生させ、除草剤に対する耐性をインタクトの植物で確認する。
【０１３７】
植物において、除草剤に対する耐性を賦与することができる改変タンパク質および／または核酸は、部位特異的突然変異誘発として知られる方法によって、配列番号１または配列番号３の配列から作製することができる。例えば、酵素の安定性および／もしくは酵素活性、または本発明の前記阻害剤の結合などの特性は、このような突然変異誘発を用いて、高度の標的様式で、改善または改変することができる。
【０１３８】
例えば、植物において、有利に用いることができる部位特異的突然変異誘発方法は、Ｚｈｕらにより記載されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， 第１８巻、２０００， ５月：５５５−５５８）。
【０１３９】
加えて、改変は、ランダム突然変異誘発にｄＩＴＰを用いるＳｐｅｅら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， 第２１巻、第３号、１９９３：７７７−７８）により記載されたＰＣＲ方法、あるいは、Ｒｅｌｌｏｓら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．， ５， １９９４：２７０−２７７）によりさらに改善された方法によって、達成することができる。
【０１４０】
また、これらの改変タンパク質および／または核酸の作製は、Ｓｔｅｍｍｅｒら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， 第９１巻、１９９４：１０７４７−１０７５１）により記載された分子進化のｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え技法、あるいは、Ｍｏｏｒｅら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第１４巻， １９９６：４５８−４６７）により記載されたＰＣＲと組換え方法の組合せによっても、実施可能である。
【０１４１】
タンパク質の突然変異誘発のための別の経路がＧｒｅｅｎｅｒらによりＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第５７巻、１９９６：３７５−３８５）に記載されている。ＥＰ−Ａ−０ ９０９ ８２１には、微生物大腸菌ＸＬ−１ Ｒｅｄを用いて、タンパク質を改変する方法が記載されている。複製の間に、この微生物は、導入された核酸に突然変異を発生させ、これによって、遺伝情報の改変を引き起こす。これらによってコードされた有利な核酸およびタンパク質は、改変核酸または改変タンパク質を単離し、耐性試験を実施することにより、容易に同定することができる。これらの核酸またはタンパク質を植物に導入すると、これらは、そこで耐性を発揮することができ、従って、除草剤に対する耐性をもたらす。
【０１４２】
別の突然変異誘発および選択方法は、例えば、種子または花粉をｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発し、本発明の阻害剤の存在下で耐性対立遺伝子を選択した後、改変された耐性対立遺伝子の遺伝的および分子同定を行なうことからなるもの；さらには、濃度が連続的に増加する本発明の阻害剤の存在下で、培養物を増殖することにより、組織培養物中の耐性の突然変異誘発および選択を実施することからなるものなどの方法がある。この方法で、化学／物理的突然変異誘発処理による自発的突然変異率の増加を利用してもよい。前述したように、微生物を用いて、改変遺伝子を単離することもでき、その場合、該微生物は、本発明の方法で用いられる核酸によりコードされるタンパク質の外因性または組換え活性を呈示し、かつ、本発明に従い同定された阻害剤に対する感受性を有する。本発明の阻害剤の濃度を増加しながら、培地で微生物を増殖させると、本発明の標的の耐性変異体の選択および進化が可能になる。同様に、突然変異頻度は、突然変異誘発処理によって高めることができる。
【０１４３】
さらに、核酸の標的改変方法も利用可能である（Ｚｈｕら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， 第９６巻、８７６８−８７７３およびＢｅｅｔｈｅｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， 第９６巻、８７７４−８７７８）。
【０１４４】
これらの方法により、タンパク質において、阻害剤との結合に重要なアミノ酸を、機能的に同等であるが、阻害剤の結合を阻止するアミノ酸によって置換することが可能となる。
【０１４５】
本発明はさらに、生物活性が改変された遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を作製する方法に関するが、その際、生物活性は、それが増加するように改変される。「増加した活性」とは、元の生物または元の遺伝子産物と比較して、少なくとも１０％高い、好ましくは、少なくとも３０％高い、特に好ましくは、少なくとも５０％高い、非常に特に好ましくは、少なくとも１００％高い活性を意味するものとして理解される。さらに、本発明の物質および／または組成物が、核酸配列および／またはそれらによってコードされた遺伝子産物と、もはや結合しない、あるいは、もはや正しく結合しないように、生物活性を改変しておくこともできる。本発明が意図する「もはや〜しない」、または「もはや正しく〜しない」とは、上記物質が、元の遺伝子産物または元の核酸と比較して、改変された核酸および／または遺伝子産物と、少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも５０％、特に好ましくは、少なくとも７０％、非常に特に好ましくは、少なくとも８０％少なく結合する、あるいは、まったく結合しないことを意味するものとして理解される。
【０１４６】
従って本発明のさらに別の態様は、本発明の前記方法により遺伝的に改変されたトランスジェニック植物に関する。
【０１４７】
本発明の方法により見出される物質および／またはこれら物質を含んでなる組成物に対して耐性の遺伝的に改変されたトランスジェニック植物は、本発明の方法に用いる配列番号１または配列番号３の核酸を過剰発現させることにより作出してもよい。本発明は従って、本発明の方法によって見出される物質に耐性のトランスジェニック植物を作出する方法であって、これら植物における、配列番号１または配列番号３の配列を有する核酸の過剰発現を含んでなる方法に関する。同様の方法が、例えば、Ｌｅｒｍａｎｔｏｖａら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １２２， ２０００：７５−８３に記載されている。
【０１４８】
耐性植物を作出するための本発明の前記方法により、非選択的除草剤に対して耐性の作物植物の開発と組み合わせて、活性が可能な限り広範で、かつ、植物種とは無関係（いわゆる非選択的除草剤）である新規除草剤の開発が可能になる。非選択的除草剤に対して耐性の作物植物については、すでに何度か説明してきた。この場合、耐性を生み出す原理を次のように分類することができる：
ａ）除草剤の標的として作用するタンパク質を顕著に過剰生産することによる、また、除草剤の標的として作用するタンパク質の大過剰のために、該細胞においてこのタンパク質が果たす機能が除草剤の適用後さえも保持されることによる、突然変異方法または組換え方法を用いた、植物における耐性の発生。
【０１４９】
ｂ）除草剤の標的として作用するタンパク質の改変型を導入し、新しく導入した改変タンパク質の機能が、除草剤の悪影響を受けないような、植物の改変。
【０１５０】
ｃ）新規なタンパク質／ＲＮＡを導入するが、その際、低分子量物質の除草作用に応答する、該タンパク質または核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡなど）の化学的構造を改変し、これにより、改変された構造が除草作用の発生を阻止する、すなわち、除草剤が標的ともはや相互作用できないようにする、植物の改変。
【０１５１】
ｄ）植物に導入される新規な遺伝子で、標的の機能を置換し、これによって、代替経路として知られるものを形成する。
【０１５２】
ｅ）標的の機能を、植物に存在する別の遺伝子、もしくはその遺伝子産物によって引き継がせる。
【０１５３】
従って、本発明は、新規除草剤を開発するため、配列番号１または配列番号３の核酸配列を有するＴ−ＤＮＡの挿入により影響を受ける遺伝子を有する植物を用いることを含んでなる。当業者は、相同的核酸を同定する代替方法について熟知しており、これは、例えば、別の植物において、例えば、トランスポゾンの使用など、類似配列を用いて行なう。従って、本発明はまた、別の植物における、配列番号１または配列番号３の核酸配列、遺伝コードによるこれら配列に由来する配列、および／またはそれらの誘導体への外来核酸の挿入のための、別の挿入突然変異誘発方法の使用に関する。
【０１５４】
本発明の阻害剤に対して耐性のデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを同定する方法のさらなる変法は、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ経路が、植物だけでなく、細菌および真菌においても見出される事実に基づく。これら微生物のいくつかは、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ変異体を含む可能性がある。
【０１５５】
上記デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ変異体の標的検出のための本発明の方法は、本発明の方法により同定される阻害剤と微生物をインキュベートすることに基づく。成長阻害がまったく認められないか、あるいは、部分的成長阻害しか認められない場合には、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを該生物から単離し、その核酸配列に関して特性決定する。部分的成長阻害とは、成長が非インキュベート生物と比較して、５０％、好ましくは、４５％、特に好ましくは、２０％しか低下していないことを意味するものとして理解される。適当であれば、さらなる突然変異により、既存の耐性を増強する。この場合、前記突然変異誘発方法を用いてよい。
【０１５６】
この背景において、シキミ酸経路の酵素を含むあらゆる生物を用いることができる。この背景において、特に好ましいものは、細菌、植物および真菌である。
【０１５７】
本発明はさらに、トランスジェニック生物、好ましくは、植物であって、その増殖物質（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）およびその植物細胞、植物組織または植物部分が、本発明の阻害剤によって阻害されないデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ変異体の配列を含む発現カセットで形質転換されているものに関する。発現カセットは、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの核酸配列の代わりに、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ変異体を含む以外は、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ発現用の発現カセットの前記実施形態と同じである。
【０１５８】
トランスジェニック植物は、これについても前述した通常の形質転換方法により、本発明の発現カセットの前記実施形態の一つを用いて作製される。
【０１５９】
組換えにより発現させたデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現効率は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、苗条分裂組織増殖または発芽試験により測定することができる。さらに、種類およびレベルに関して改変されたデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現、ならびに、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対する耐性に及ぼされるその影響については、試験植物を用いて、温室実験で試験することができる。
【０１６０】
本発明はさらに、植物、植物細胞、植物組織または植物部分を形質転換するための、本発明の発現カセットの使用に関する。この使用の好ましい目的は、植物における、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ含有量、もしくはデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの含有量の増加である。前述したように、本発明の少なくとも１つの発現カセット、または本発明の少なくとも１つのベクターを用いた植物の形質転換によって、トランスジェニック植物を作出する。しかし、発現の増強は、当該天然デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域の標的突然変異誘発によって達成することもできる。
【０１６１】
従って、本発明のデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対する耐性の増強は、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードする、配列番号１もしくは配列番号３の遺伝子配列、またはそれらの機能的同等物を過剰発現させることによって達成することができる。従って、トランスジェニック植物も同様に、本発明の目的である。
【０１６２】
以下に挙げる本発明のさらに別の実施形態も同様に、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの過剰発現に基づく。前述した方法以外に、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの過剰発現は、本発明の発現カセットまたは本発明のベクターを用いて達成でき、両者の各々が、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性が増強されたポリペプチドをコードする前記核酸配列の１つを含んでいる。増強された活性とは、この背景において、配列番号１または配列番号２によってコードされたデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼよりも、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも３０％、特に好ましくは、少なくとも５０％、非常に特に好ましくは、少なくとも１００％高い活性を意味するものとして理解される。
【０１６３】
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現することにより、コリスメートおよび芳香族アミノ酸を増加して、植物の乾燥物含有量を高めることも可能である。これにより、乾燥物が増加し、植物の総収量も増加する。
【０１６４】
さらに、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの過剰発現によって、芳香族アミノ酸フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの生合成を高めることができる。
【０１６５】
この背景において、好ましく用いられる植物は、穀類、トウモロコシ、ダイズ、イネ、ワタ、テンサイ、カノラ、ヒマワリ、アマ、アサ、ジャガイモ、タバコ、トマト、ナタネ、アルファルファ、レタスおよび各種樹木、堅果およびブドウ種、ならびに、マメ科植物などの作物植物である。
【０１６６】
プロモーターの選択に応じて、発現を植物の葉、種子もしくはその他の部分に特異的に起こすことができる。このようなトランスジェニック植物、それらの増殖物質およびそれらの植物細胞、植物組織または植物部分は、本発明のさらに別の目的である。
【０１６７】
以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
【０１６８】
使用例のベースとなる遺伝子操作方法：
一般的クローニング方法
例えば、制限切断、ＤＮＡ単離、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、核酸のニトロセルロースおよびナイロン膜への転写、ＤＮＡ断片の連結、大腸菌細胞の形質転換、細菌培養、ならびに、組換えＤＮＡの配列分析などのクローニング方法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３０９−６に記載されているように、実施した。ＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ（Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １６， （１９８８）９８７７）の方法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換を実施した。アグロバクテリウムをＹＥＢ培地で増殖させた（Ｖｅｒｖｌｉｅｔら、Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ２６（１９７５）， ３３）。
【０１６９】
以下に用いる細菌株（大腸菌、ＸＬ−Ｉ Ｂｌｕｅ）は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅまたはＱｉａｇｅｎから入手した。植物の形質転換に用いるアグロバクテリウム株（プラスミドｐＧＶ２２６０またはｐＧＶ３８５０ｋａｎを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス、Ｃ５８Ｃ１）については、Ｄｅｂｌａｅｒｅらにより、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３（１９８５）、４７７７に記載された。これに代わり、またアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはその他の好適な株を用いてもよい。クローニングに用いることができるベクターは、ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ， Ｇｅｎｅ ３３（１９８５）、１０３−１１９）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＺｅｒ０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２（１９８４）、８７１１−８７２０）およびｐＢｉｎＡＲ（ＨｏｆｇｅｎおよびＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６６（１９９０）、２２１−２３０）である。
【０１７０】
組換えＤＮＡの配列解析
Ｓａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４（１９７７）、５４６３−５４６７）の方法に従い、ＡＢＩレーザー蛍光ＤＮＡシークエンサーを用いて、組換えＤＮＡ分子を配列決定した。ポリメラーゼ連鎖反応によって得られた断片を配列決定した後、発現させようとする構築物にポリメラーゼエラーがないことを確認した。
【０１７１】
別途記載のない限り、用いる化学薬品は、Ｆｌｕｋａ（Ｎｅｕ−Ｕｌｍ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、Ｒｏｔｈ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）、Ｓｅｒｖａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）およびＳｉｇｍａ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）から、分析等級品質のものを入手した。ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｗａｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ水質調節システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）製の水質調節した発熱物質非含有水（以後、本明細書ではＨ２Ｏと呼ぶ）で、溶液を調製した。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ修飾酵素、および分子生物学キットは、ＡＧＳ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、Ｂｉｏｍｅｔｒａ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）、Ｒｏｃｈｅ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｇｅｎｏｍｅｄ（Ｂａｄ Ｏｅｙｎｎｈａｕｓｅｎ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ／Ｔａｕｎｕｓ）、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ）、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）から入手した。別途記載のない限り、これらの製品は、製造者の指示に従って使用した。
【０１７２】
実施例１
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のクローニング
ＲＴ−ＰＣＲ方法に従って、タバコの花に由来するデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼをクローニングした。配列分析により、これが実際にタバコデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼであることを確認した。この方法には下記のプライマーを用いた：
５’ＤＨＤ−ＢａｍＨＩ：ＡＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＧＡ ＴＴＧ ＧＡＴ ＡＧＣ
３’ＤＨＤ−ＢａｍＨＩ：ＡＡＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＣＴＣ ＧＣＴ ＣＧＴ ＴＣＡ ＴＡＧ Ｇ
ＰＣＲ産物は、サイズが１０８８塩基対であり、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンスおよび共抑制阻害のために用いた。
【０１７３】
タンパク質を過剰発現させるために、ＰＣＲ法を用いて、タバコ花ＤＮＡから全長クローンを増幅した。
【０１７４】
この方法には、下記のプライマーを用いた：
５’ ＧＧＧ ＧＡＧ ＧＣＡ ＡＴＧ ＡＣＧ ＡＧＧ ＡＡＣ ＧＡＡ ＡＣＡ ＣＴＡ ３’
５’ ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＣＧ ＡＡＧ ＣＡＣ ＡＡＡ ＴＧＧ ＴＡＧ ＧＧＣ ＡＧＡ ３’
このｃＤＮＡ断片は、長さが１６６８塩基対であり、１６６８塩基のオープンリーディングフレームを含み、５５６アミノ酸のタンパク質をコードする。プレタンパク質に属するトランジットペプチドは、この方法でクローニングされなかった。プログラムＧＣＧ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いたポリペプチドの分析により、データベースに記載されているタバコタンパク質（登録番号：Ｌ ３２７９４）と、核酸およびアミノ酸レベルの１００％同一性が得られた。
【０１７５】
実施例２
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼアンチセンスおよび共抑制構築物の作製
タバコデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの１０８８塩基対断片を３５Ｓプロモーターの制御下で、センス配向およびアンチセンス配向でバイナリーベクターｐＢｉｎＡＲにクローニングした（図６参照）。プライマーにより特定されたＢａｍＨＩ切断部位を用いて、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼをバイナリーベクターにクローニングすることができた。Ｇｅｎｅ−Ｃｌｅａｎｔ−Ｋｉｔ（Ｄｉａｎｏｖａ ＧｍｂＨ、Ｈｉｌｄｅｎ）を用いて、ＰＣＲ産物を洗浄した後、ＢａｍＨＩで消化した。連結のために、ベクターｐＢｉｎＡＲもＢａｍＨＩで切断した。
【０１７６】
アグロバクテリウム媒介形質転換により、上記構築物をタバコに導入した。再生させた植物を、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡのレベルについて試験した。試験の結果、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルが低下したアンチセンスおよびセンス植物はすべて、明白な表現型を示した。表現型とｍＲＮＡレベルの低下との間には厳密な相関が認められた。デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡが低下した植物は、モザイク葉を示し、大きさも小さく（図２〜４を参照）、植物の発育過程で枯れた。
【０１７７】
実施例３
トランスジェニックタバコ植物の作出
トランスジェニックタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ． ｃｖ． Ｓａｍｓｕｎ ＮＮ）を作出するために、タバコ葉の円形切片をデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの配列で形質転換した。タバコ植物を形質転換するため、選択条件下で増殖させたアグロバクテリウム・ツメファシエンスの一晩培養物１０ ｍｌを遠心した後、上清を廃棄して、細菌を同量の抗生物質非含有培地に再懸濁させた。無菌植物の葉円形切片（直径約１ｃｍ）を無菌ペトリ皿中の上記細菌懸濁液に浸した。次に、２％のスクロースと０．８％のＢａｃｔｏ寒天を補充したＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ １５（１９６２）， ４７３）に葉円形切片を載せた。２５℃で、暗所にて２日間インキュベートした後、１００ ｍｇ／ｌのカナマイシン、５００ ｍｇ／ｌのクラフォラン、１ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２ ｍｇ／ｌのナフチル酢酸（ＮＡＡ）、１．６％のグルコースおよび０．８％のＢａｃｔｏ寒天を補充したＭＳ培地に、これらを移した後、培養を継続した（１６時間明所／８時間暗所）。２％のスクロース、２５０ ｍｇ／ｌのクラフォランおよび０．８％のＢａｃｔｏ寒天を補充したホルモン非含有ＭＳ培地に、成長中の苗条（ｓｈｏｏｔ）を移した。
【０１７８】
実施例４
植物組織由来の全ＲＮＡの分析
Ｌｏｇｅｍａｎｎら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６３（１９８７）， ２１に記載されているように、植物組織由来の全ＲＮＡを単離した。分析のため、各々の場合で、ホルムアルデヒド含有の１．５％のアガロースゲル中で２０μｇのＲＮＡを分離した後、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ， Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移行させた。Ａｍａｓｉｎｏ（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １５２（１９８６）， ３０４）により記載されているように、特定の転写物の検出を実施した。プローブとして用いるＤＮＡ断片をランダムプライミングＤＮＡ標識キット（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｄ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で放射標識した後、標準的方法（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ， Ａｍｅｒｓｈａｍ参照）でハイブリダイズさせた。
【０１７９】
Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルムを用いたオートラジオグラフィーにより、ハイブリダイゼーションシグナルを視覚化した。
【０１８０】
図５は、ＤＨＤ／ＳＤＨのｐＢｉｎＡＲアンチセンス構築物で形質転換しておいた５つのタバコ植物（１９−１、１９−４、１９−５、８３−２、８３−５）のノーザン分析を示す。対照として、２つの野生型植物のＲＮＡを加える。トランスジェニックタバコ植物では、ＤＨＤ／ＳＤＨの発現が低下する。
【０１８１】
野生型およびトランスジェニックＤＨＤ／ＳＤＨ植物を側面図（図２）および上から見た図（図３および４）として示す。野生型と比較して、著しい成長阻害が明らかに見てとれる（図２、左が野生型）。成長の低下は、ＤＨＤ／ＳＤＨ遺伝子発現の減少と相関している（図５Ａおよび５Ｂ）。図５Ａは、著しく改変された表現型を示すＴ１世代のトランスジェニックＤＨＤ／ＳＤＨ植物のノーザン分析を示す。この分析から、ＤＨＤ／ＳＤＨ遺伝子発現は、著しく改変された表現型を有する植物において阻害されることがわかる。図５Ｂは、正常の表現型を有するＴ１世代のトランスジェニックＤＨＤ／ＳＤＨ植物のノーザン分析を示す。これら植物の分析から、導入された断片の強力なシグナルが存在しても、これら植物には、ＤＨＤ／ＳＤＨ遺伝子発現の阻害は認められないことが明らかである。結論として、成長が低下した表現型と、ＤＨＤ／ＳＤＨ遺伝子発現の阻害との間に顕著な相関が認められると言うことができる。
【０１８２】
実施例５
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの酵素活性の検出
Ａ．二機能性デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素のシキミ酸デヒドロゲナーゼは、下記の反応を触媒する：
2004502457.tif 000002
ＮＡＤＰＨの形成は、３３４ ｎｍのＯＤで１０分間にわたって測定することができる。この反応は、１マイクロリットルの抽出粗タンパク質を添加することにより開始させる。反応バッファーは下記のものを含む：
１００ ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ：９．９
０．１ ｍＭシキミ酸（Ｓｉｇｍａ）
０．１ ｍＭ ＮＡＤＰ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）
【０１８３】
Ｂ．３−デヒドロシキミ酸の添加により、ＮＡＤＰＨの減少を測光により測定することができ、従って、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼの活性を測定することができる。これは、シキミ酸−３−デヒドロキナ酸からＤＨＤ／ＳＤＨをもたらす逆反応を表すものである。
【０１８４】
Ｃ．連結した逆反応で、２つの酵素を測定することにより、別のデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの酵素アッセイを実施する：
３−デヒドロキナ酸＋ＮＡＤＰ ← ３−デヒドロシキミ酸＋ＮＡＤＰＨ ← シキミ酸＋ＮＡＤＰ
この酵素アッセイでは、３３４のＯＤで、測光により、ＮＡＤＰＨの減少を検出することができる。この反応では、両酵素の酵素活性をアッセイで検出する。
【０１８５】
実施例６
異種発現系の発現ベクターへのタバコデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのクローニング
好適な発現ベクターは、大腸菌における組換えタンパク質の発現用のベクターであるが、昆虫細胞におけるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの発現用のバキュロウイルスベクター（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）でもよい。細菌発現ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２に由来し、かつ、発現用のバクテリオファージＴ７プロモーターを保有している。発現のために、Ｔ７ポリメラーゼ（例えば、ＪＭ１０９（ＤＥ３）；Ｐｒｏｍｅｇａ）用の誘導性遺伝子を保有する大腸菌株において、上記プラスミドを増殖させる。組換えタンパク質の発現は、Ｔ７ポリメラーゼのＩＰＴＧ−媒介誘導により活性化される。Ｎｉ−アフィニティークロマトグラフィーによる精製をより良好にするため、組換えタンパク質にＨｉｓタグを付けようとする場合には、Ｑｕｉａｇｅｎ（ｐＱＥベクター）またはＮｏｖａｇｅｎ（ｐＥＴベクター）のＩＰＴＧ誘導性の系が一般に好まれる系である。利用できる切断部位に応じて、様々なリーディングフレームを有するベクターがある。
【０１８６】
全長デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をｐＱＥベクター（図７）にクローニングし、大腸菌に形質転換させた。この大腸菌株の単一コロニーを、増殖培地「２ｘＹＴ」（１リットル当たり、Ｂａｃｔｏトリプトン１６ ｇ、酵母抽出物１０ ｇ、ＮａＣｌ ５ ｇ、５０ ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび５０ ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む）において３７℃で一晩インキュベートした。翌日、５０ ｍｌの２ｘＹＴに０．５ ｍｌの一晩培養物を接種した後、２５℃でＯＤ６００が０．６となるまで増殖させた。ＩＰＴＧ（最終濃度：０．０５ ｍＭ）の添加により遺伝子発現を誘導し、２５℃で３時間インキュベーションを継続した。８０００ ｒｐｍで１０分の遠心分離により、４℃で細菌を回収した。３ｍｌの抽出バッファー（５０ ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭイミダゾール、１５％のグリセロール、５ｍＭメルカプトエタノール）中に、得られたペレットを溶解させた。このペレットを液体窒素で凍結させ、氷上で再び解凍した。細胞を音波処理（４×４５秒、氷上で１分）により破砕した。細胞を４℃および１５００ ｒｐｍで２０分遠心した後、上清を酵素測定に直接用いた。
【０１８７】
図８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動におけるサイズが約６０ ｋＤの発現したＤＨＤ／ＳＤＨタンパク質を示す。
レーン１（左から右）：タンパク質マーカー、分子量（上から下に）：９７．４ ＫＤ；６６ ＫＤ；４６ ＫＤ；３０ ＫＤ；２１．５ ＫＤおよび１４．３ ＫＤ
レーン２：３７℃、２ｍＭ ＩＰＴＧの存在下で誘導されたＤＨＤ／ＳＤＨタンパク質（粗抽出物、変性）；分子量ＤＨＤ／ＳＤＨ：約６０ ＫＤ
レーン３：非誘導対照
レーン４：２５℃、２ｍＭ ＩＰＴＧの存在下で誘導されたＤＨＤ／ＳＤＨタンパク質（粗抽出物、未変性）
レーン５：誘導ＤＨＤ／ＳＤＨタンパク質（Ｎｉ−ＮＴＡ材料で精製、未変性）
レーン６：レーン５を参照、しかし、２倍量のタンパク質を使用した。
【０１８８】
使用例
実施例５Ａに記載した活性アッセイに基づく総合的スクリーニングで、ＩＣ５０値がμＭ範囲内にある６種の物質を同定した（表１参照）。
【０１８９】
【表１】
2004502457.tif 000003
【０１９０】
ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ Ｌｅｍｎａ ｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａｇ）の成長に対する本発明の除草剤化合物の効果は次の試験結果から明らかである：
１７ ｍｍｏｌ／ｌ ＭＥＳバッファーｐＨ ５．５＋１．５ ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２＋１ ｇ／ｌ 「Ｈａｋａｐｈｏｓ ｓｐｅｚｉａｌ」において、ペトリ皿中で非無菌条件下にてコウキクサを培養した。
試験を実施するため、ウキクサ培養物を洗浄し、１つだけ選び出して４８−ウェルのマイクロタイタープレート中の０．５ ｍｌの新鮮な栄養溶液中に導入した。ＤＭＳＯ中に活性成分を濃度５ ｍｍｏｌ／ｌで溶解し、水で１：５に稀釈する。２５μｌのこの溶液を試験に用いる。
測定したパラメーターは、処理中のクロロフィルの蛍光である。除草効果は、未処理対照と比較することにより検出することができ、表１に記号Ｈで表示する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼがコリスミ酸（すなわち、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの前駆物質）の生合成に関与することを示した図である。
【図２】
野生型（左外側）およびトランスジェニックＤＨＤ／ＳＨＤ植物の成長を示した側面図である。
【図３】
野生型の成長を示す、上から見たときの図である。
【図４】
トランスジェニックＤＨＤ／ＳＨＤ植物では、野生型と比較して、成長が極めて抑制されていることを示す、上から見たときの図である。
【図５】
Ａ：デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼのＲＮＡ量をノーザンハイブリダイゼーションにより検出したところ、成長が抑制された植物では野生型と比較して低かったことを示す。Ｂ：酵素活性測定により検出したところ、トランスジェニックＤＨＤ／ＳＨＤ系統におけるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性の量は野生型植物と比べて低かったことを示す。
【図６】
タバコデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼの断片の、３５Ｓプロモーターの制御下、センス配向およびアンチセンス配向でのバイナリーベクターｐＢｉｎＡＲへのクローニングを示した図である。
【図７】
全長デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のｐＱＥベクターへのクローニングを示した図である。
【図８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動におけるサイズが約６０ ｋＤの発現したＤＨＤ／ＳＤＨタンパク質を示した図である。
【図１】
2004502457.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月4日(2002.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
除草活性のある物質を同定する方法であって、下記の核酸配列：
ａ）配列番号１もしくは配列番号３に示した配列を有する核酸配列；または
ｂ）遺伝コードの縮重のために、逆翻訳により、配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列から推定することができる核酸配列；または
ｃ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｄ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列の機能的類似体をコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｅ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の部分領域からなる核酸配列；または
ｆ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）の少なくとも３００ヌクレオチド単位からなる核酸配列；
からなる群より選択される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の遺伝子産物の転写、発現、翻訳もしくは活性に影響を及ぼすこと、および
該物質と共にインキュベートしなかった遺伝子産物と比較して、遺伝子産物の転写、発現、翻訳もしくは活性を低下または阻止する物質を選択すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
細菌、酵母、真菌および植物の群から選択される生物において実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細菌、酵母および真菌の群から選択される生物において実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１または配列番号３の配列の条件的もしくは天然の突然変異体である生物が使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
下記の核酸配列：
ａ）配列番号１もしくは配列番号３に示した配列を有する核酸配列；または
ｂ）遺伝コードの縮重のために、逆翻訳により、配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列から推定することができる核酸配列；または
ｃ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｄ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列の機能的類似体をコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｅ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の部分領域からなる核酸配列；または
ｆ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）の少なくとも３００ヌクレオチド単位からなる核酸配列；
を含有する発現カセット、または該発現カセットを含有するベクターを含むトランスジェニック生物が使用され、該トランスジェニック生物が細菌、酵母、真菌、動物細胞および植物細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスジェニック生物が細菌および植物細胞からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
下記のステップ：
ａ）　トランスジェニック生物において酵素活性のある形態でポリペプチドを発現させるか、あるいは、本発明によるタンパク質を含む生物を培養すること；
ｂ）ステップａ）で得られた該ポリペプチドを、酸化還元当量および化合物と共に、静止状態もしくは成長中の生物内において直接、または部分的に精製した形もしくは均質に精製した形の該生物の細胞消化物中において、インキュベートすること；
ｃ）ステップｂ）により、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを阻害する化合物を選択すること；
ｄ）適切な反応時間が経過した後、阻害しなかった酵素の活性と比較して、該ポリペプチドの酵素活性を測定すること；
を含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
下記のステップ：
（ａ）下記の核酸配列：
ａ）配列番号１もしくは配列番号３に示した配列を有する核酸配列；または
ｂ）遺伝コードの縮重のために、逆翻訳により、配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列から推定することができる核酸配列；または
ｃ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｄ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列の機能的類似体をコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｅ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の部分領域からなる核酸配列；または
ｆ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）の少なくとも３００ヌクレオチド単位からなる核酸配列；
を含有する発現カセット、または該発現カセットを含有するベクターによる形質転換の後、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする追加のＤＮＡ配列を含み、かつ、酵素活性のあるデヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼを過剰発現することができる生物を作出すること、ここにおいて、該トランスジェニック生物は細菌、酵母、真菌、動物細胞および植物細胞からなる群より選択されること；
（ｂ）ステップ（ａ）の生物に化学物質を適用すること；
（ｃ）該化学物質の適用後、トランスジェニック生物および非形質転換生物の成長または生存能を測定すること；
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
使用するトランスジェニック生物がトランスジェニック植物、植物細胞、植物組織または植物部分である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記物質をハイスループットスクリーニング法で同定する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法で同定された物質を植物に適用し、これにより、それらの除草活性を試験して、除草活性を示す物質を選択することを含んでなる方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法で同定された物質。
【請求項１３】
除草剤または成長調節剤としての請求項１２に記載の物質の使用。
【請求項１４】
配列番号１または配列番号３の核酸配列の変異体を作製する方法であって、下記のステップ：
ａ）異種系または無細胞系において配列番号１または配列番号３によりコードされるタンパク質を発現させること；
ｂ）該核酸の改変により該タンパク質のランダムまたは部位特異的突然変異誘発を実施すること；
ｃ）改変された遺伝子産物と除草剤との相互作用を測定すること；
ｄ）相互作用が少ない該タンパク質の誘導体、および該タンパク質をコードする核酸配列を同定すること；
ｅ）除草剤の適用後、該タンパク質の生物活性をアッセイすること；
を含んでなる上記方法。
【請求項１５】
前記生物が細菌、植物または真菌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
配列番号１または配列番号３の核酸配列の変異体を作製する方法であって、下記のステップ：
（ａ）請求項１２に記載の物質によって阻害されないか、部分的にしか阻害されない生物を検出すること；
（ｂ）ステップ（ａ）で同定された生物から、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離して、その特性決定を行うこと；
（ｃ）必要に応じて、ランダムまたは部位特異的突然変異誘発によりステップ（ｂ）で同定された核酸の耐性を最適化すること；
を含んでなる上記方法。
【請求項１７】
前記生物が細菌および真菌の群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により見出された物質に対して耐性であるトランスジェニック植物、植物組織または植物細胞を作製する方法であって、これらの植物において、配列番号１もしくは配列番号３の核酸配列、または請求項１４、１５、１６もしくは１７に記載の核酸配列を有する核酸を過剰発現させることを含んでなる上記方法。
【請求項１９】
下記の核酸配列：
ａ）配列番号１もしくは配列番号３に示した配列を有する核酸配列；または
ｂ）遺伝コードの縮重のために、逆翻訳により、配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列から推定することができる核酸配列；または
ｃ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｄ）配列番号２もしくは配列番号４に示したアミノ酸配列の機能的類似体をコードする、配列番号１もしくは配列番号３に示した核酸配列の機能的類似体；または
ｅ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）の部分領域からなる核酸配列；または
ｆ）デヒドロキナ酸デヒドラターゼ／シキミ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、核酸配列ａ）、ｂ）、ｃ）もしくはｄ）の少なくとも３００ヌクレオチド単位からなる核酸配列；
を含有する発現カセット、または該発現カセットを含有するベクターを植物に形質転換することを含んでなる、トランスジェニック植物の作出方法。
【請求項２０】
非トランスジェニック植物と比較して、乾燥物質含量が増加している、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
非トランスジェニック植物と比較して、芳香族アミノ酸量が増加している、請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２２】
不要な植物に、請求項１２に記載の物質を適用することを含んでなる、不要な植生の防除方法。
【請求項２３】
不要な植生を防除するための、請求項１２に記載の物質の使用。
【国際調査報告】
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