(57)【要約】本発明は、４−β及び６−β結合を含む非セルロース主鎖を有し、全く又はほとんどアセチル化されていず、繰り返し単位当たり少なくとも１本の側鎖を有するキサンタン様構造の細菌細胞外多糖、このような多糖を産生する単離されたＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株、及び様々な食品やペットフード製品における又は食品やペットフード製品を調製するためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−β及び６−β結合を含む非セルロース主鎖を有し、全く又はほとんどアセチル化されておらず、繰り返し単位当たり少なくとも１本の側鎖を有するキサンタン様構造を有する、細菌細胞外多糖。
【請求項２】
非セルロース主鎖が次の構造：｛［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］ｍ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→｝ｎ（式中、ｍは１〜１０の整数であり、ｎは繰り返し単位数を規定する別の整数である）の繰り返し単位を含む、請求項１に記載の多糖。
【請求項３】
ｍが２である、請求項２に記載の多糖。
【請求項４】
側鎖が、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、βＤ−ＧｌｃＡ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ、αＤ−Ｇｌｃ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ、αＬ−Ｒｈａ、又はこれらの誘導体である、請求項１から請求項３までの一項に記載の多糖。
【請求項５】
アセチル化がサイト当たり０．８未満である、請求項１から請求項４までの一項に記載の多糖。
【請求項６】
繰り返し単位当たり少なくとも２本の異なる側鎖を有し、このうち少なくとも１本はアセタン側鎖又はアセタン側鎖の変異体に等しく、１本は異なる、請求項１から請求項５までの一項に記載の多糖。
【請求項７】
３本の異なる側鎖を有し、このうち２本は通常のアセタンに等しく、１本は異なる、請求項１から請求項５までの一項に記載の多糖。
【請求項８】
図１に示す構造を有する、請求項６に記載の多糖。
【請求項９】
少なくとも１本の側鎖が少なくとも１個の残基から削除された、請求項６又は請求項７に記載の多糖。
【請求項１０】
寄託番号ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１の菌株グルコンアセトバクター種（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ．）により得られ得る、請求項１から請求項９までの一項に記載の多糖。
【請求項１１】
４−β及び６−β結合を含む非セルロース主鎖を有し、全く又はほとんどアセチル化されていず、繰り返し単位当たり少なくとも１本の側鎖を有するキサンタン様構造を有する多糖を多量に産生し、セルロースを少量しか又は全く産生しないことを特徴とする単離され精製されたグルコンアセトバクター種（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ．）菌株。
【請求項１２】
多糖が次の構造：｛［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］ｍ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→｝ｎ（式中、ｍは１〜１０の整数であり、ｎは繰り返し単位数を規定する別の整数である）の繰り返し単位を含む非セルロース主鎖を有する、請求項１１に記載の菌株。
【請求項１３】
側鎖がαＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、βＤ−ＧｌｃＡ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ、αＤ−Ｇｌｃ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ、αＬ−Ｒｈａ、又はこれらの誘導体である、請求項１１又は請求項１２に記載の菌株。
【請求項１４】
多糖が図１に示す構造を有する、請求項１１から請求項１３までの一項に記載の菌株。
【請求項１５】
寄託番号がＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１である、請求項１１から請求項１４までの一項に記載のグルコンアセトバクター種（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ．）菌株。
【請求項１６】
請求項１から請求項１０までの一項に記載の多糖及び／又は請求項１１から請求項１５までの一項に記載のグルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株の食品又はペットフード製品の調製への使用。
【請求項１７】
多糖の量が約０．０１〜５％である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株の量が少なくとも１．１０６ｃｆｕ／ｇである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
食品又はペットフード製品の風味・香味レベルを高めることを目的としたラムノースを単離するための中間生成物としての、請求項１から請求項１０までの一項に記載の多糖の使用。
【請求項２０】
請求項１から請求項１０までの一項に記載の多糖及び／又は請求項１１から請求項１５までの一項に記載のグルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株を少なくとも含む食品又はペットフード製品。
【請求項２１】
多糖の量が約０．０１〜５％である、請求項２０に記載の食品又はペットフード製品。
【請求項２２】
グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）菌株の量が少なくとも１．１０６ｃｆｕ／ｇである、請求項２０に記載の食品又はペットフード製品。
【請求項２３】
塩とそれぞれがバイオマス産生用炭素源（Ｓ１）及びアセタン産生用炭素源（Ｓ２）である２つの異なる基質（Ｓ１及びＳ２）とを炭素源として含有する増殖培地中で前記菌株の培養物を撹拌にかけるステップを含むことを特徴とする、請求項５から請求項７までの一項の細菌菌株によるバイオマス及び多糖の発酵方法。
【請求項２４】
バイオマス産生用炭素源として使用される基質が、エタノール、アセテート、グリセロール、コハク酸、クエン酸、及びクレブスサイクル中に産生される解糖及びトリカルボン酸サイクルの２個又は３個の炭素原子を含有する任意の有機酸及び中間体、並びにこれら基質の任意の混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の発酵方法。
【請求項２５】
アセタン産生用炭素源として使用される基質が、グルコース、フルクトース、サッカロース、又は任意の他の糖若しくは糖の混合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２３又は２４に記載の発酵方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞外多糖、特にキサンタン様多糖、及び様々な食品でのその使用、又は食品やペットフード製品の調製のためのその使用に関する。本発明は、このような多糖を産生するグルコンアセトバクター種（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｐ．）菌株にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
微生物細胞外多糖は、多様な異種の細菌によって環境中に分泌される長鎖の高分子量ポリマーである。このような微生物ポリマー、特にキサンタンは、増粘剤、ゲル化剤、食感付与（ｔｅｘｔｕｒｉｓｉｎｇ）剤、懸濁剤、及びカプセル封入（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ）剤として食品工業で広く使用されている（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．等、（１９９６ｂ）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３７：１１５〜１２１；Ｊ．Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ編、Ｅｎｚｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．中のＳｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｉ．Ｗ．及びＴａｉｔ、Ｍ．Ｉ．（１９９２）Ｂｉｐｏｌｙｍｅｒｓ）。
【０００３】
バクテリアによって分泌される多くの細胞外多糖は、複雑な化学的繰り返し単位で構成される規則的な構造をしている。この繰り返し単位は、多様な形式で連結される幾つかの異なる糖を含むことができ、その構造は枝分かれしたものでも、多重に枝分かれしたもの（ｍｕｌｔｉｂｒａｎｃｈｅｄ）でもよい。
【０００４】
セルロースの産生能力は、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｓ（かつてのＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ又はＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｓ）菌株に帰せられていた。また、広範に使用されている多糖のキサンタンに類似し、グルコース、マンノース、グルクロン酸、及びラムノースを４：１：１：１のモル比で含む複雑な酸性の細胞外多糖「アセタン」（ａｃｅｔａｎ）を、幾つかの菌株は産生することができる。アセタンはセルロース主鎖からなり、その主鎖に五糖の分枝が２つのグルコース残基ごとに結合している（図２）。
【０００５】
他のＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｓ菌株は、異なる多糖を産生することが示された。すなわち、Ａ．ｘｙｌｉｎｕｓ　Ｂ４２はセルロースとアセタンの両方を分泌し（Ｐｅｔｒｏｎｉ等、（１９９６）Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．、４２（５）：７５９〜６７）、Ａ．ｘｙｌｉｎｕｓ　Ｂ４２の変異体ＣＲ１／４はアセタンよりも短い側鎖を有する多糖を分泌し（Ｃｏｌｑｕｈｏｕｎ等、（１９９５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ　Ｒｅｓ．、２６９（２）：３１９〜３１）、Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＮＣＩ　１００５はサッカロース上で増殖するときにβ２→６−フルクタン（レバン）を分泌し（Ｔａｊｉｍａ、Ｋ．等、（１９９７）Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｙｍｐ．１２０、１９〜２８）、一方、同じＧ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＮＣＩ　１００５はグルコース上で増殖するときにはアセタンを分泌する（Ｔａｙａｍａ、Ｋ．等、（１９８６）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０　１２７１〜１２７８）。
【０００６】
また、細胞外多糖の機能的諸特性がその１次構造で決まることが一般に知られている。したがって、食品工業用に魅力的な特性を発揮する細胞外多糖の新規構造を提供できれば興味深い。
【０００７】
（発明の概要）
したがって、本発明の第１の態様は、４−β及び６−β結合を含む非セルロース主鎖を有し、全く又はほとんどアセチル化されていず、繰り返し単位当たり少なくとも１本の側鎖を有するキサンタン様構造をした細菌細胞外多糖を提供することを目的とする。
【０００８】
好ましい一実施形態では、非セルロース主鎖は、以下の構造、すなわち、｛［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］ｍ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→｝ｎ（式中、ｍは１〜１０の整数であり、ｎは繰り返し単位数を規定する別の整数である）の繰り返し単位を含むことができる。
【０００９】
側鎖は、同一でも異なっていてもよく、例えば、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｍａｎ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、βＤ−ＧｌｃＡ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ、αＤ−Ｇｌｃ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ、αＬ−Ｒｈａ、βＤ−Ｇｌｃ、又はこれらの誘導体とすることができる。
【００１０】
アセチル化は、サイト当たり０．８未満、好ましくはサイト当たり０．５未満とすることができる。多糖のアセチル化可能なサイトは、側鎖のマンノース又は主鎖のグルコースであり得る。
【００１１】
好ましい一実施形態では、多糖は繰り返し単位当たり少なくとも２本の異なる側鎖を有し、このうち少なくとも１本はアセタン側鎖又はアセタン側鎖の変異体に等しく、１本は異なる。
【００１２】
別の一実施形態では、多糖は繰り返し単位当たり３本の異なる側鎖を有し、このうち２本は通常のアセタン側鎖に等しく、１本は異なる。
【００１３】
最も好ましい一実施形態では、多糖はグルコンアセタン（ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔａｎ）であり、図１に示す構造を有する。
【００１４】
これは、寄託番号ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１の菌株Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種によって得ることができる。
【００１５】
別の態様では、本発明は、上述のように多糖を多量に産生し、セルロースを少量しか又は全く産生しない特徴をもつ、単離され精製されたＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌株を提供して、様々な分野、特に食品やペットフード製品の調製へのその応用、又は食品やペットフード製品へのその混入を可能にすることを目的とする。
【００１６】
Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌株は、寄託番号がＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１のＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種であることが好ましい。
【００１７】
さらに別の一態様では、本発明は、様々な食品やペットフード製品での、或いは様々な食品やペットフード製品を調製するためのこのような多糖及び／又は前記菌株の使用に関する。本発明による多糖は、様々な食品やペットフード製品中の風味・香味レベルを高めるラムノースを単離するための中間生成物としても使用することができる。
【００１８】
本発明は、食品やペットフード製品、少なくとも上述の多糖及び／又は上述の細菌菌株を含む組成物にも関する。
【００１９】
最後の一態様では、本発明は、本発明によるＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株を用いて最適なバイオマス濃度及び多糖濃度を有利に制御できる発酵方法であって、このＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株が、塩と炭素源としてバイオマス産生用炭素源Ｓ１と多糖産生用炭素源Ｓ２の２つの異なる基質Ｓ１及びＳ２とを含有する増殖培地中で撹拌下に維持される発酵方法に関する。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
以下の説明において、以下の略語を使用した。すなわち、ＣＣＤＤ、グリコシド結合を測定するための交差相関（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ）双極子−双極子ＮＭＲ核磁気共鳴実験；Ｇａｌｐ、ガラクトピラノース；ＧｌｃｐＡ、グルクロン酸ピラノース；Ｇｌｃｐ、グルコピラノース；ＨＭＢＣ、異核多重結合相関（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＰＥＰ−ＨＳＱＣ、異核単一量子コヒーレンス（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ　ｓｉｎｇｌｅ−ｑｕａｎｔｕｍ　ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）における等価経路（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｐａｔｈｗａｙｓ）の保存；ＮＭＲ、核磁気共鳴；ＮＯＥＳＹ、核オーバーハウザー効果分光法；Ｒｈａ、ラムノース；ＴＯＣＳＹ、全相関分光法；ＴＰＰＩ、時間比例位相増分（ｔｉｍｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ　ｐｈａｓｅ　ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）である。
【００２１】
第１の態様によれば、４−β及び６−β結合を含む非セルロース主鎖を有し、全く又はほとんどアセチル化されていず、繰り返し単位当たり少なくとも１本の側鎖を有するキサンタン様構造の細菌多糖が関係する。
【００２２】
非セルロース主鎖は、以下の構造、すなわち、｛［→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］ｍ→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→｝ｎ（式中、ｍは１〜１０の整数、好ましくは２であり、ｎは繰り返し単位数を規定する別の整数である）の繰り返し単位を有することができる。
【００２３】
側鎖は、同一でも異なっていてもよく、例えば、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、βＤ−ＧｌｃＡ−（１→２）−αＤ−Ｍａｎ、αＤ−Ｍａｎ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、αＤ−Ｇｌｃ−（１→４）−βＤ−ＧｌｃＡ、βＤ−ＧｌｃＡ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ、βＤ−Ｇｌｃ−（１→６）−αＤ−Ｇｌｃ、αＤ−Ｇｌｃ、αＬ−Ｒｈａ（１→６）−βＤ−Ｇｌｃ、αＬ−Ｒｈａ、βＤ−Ｇｌｃ、又はこれらの誘導体とすることができる。
【００２４】
アセチル化は、サイト当たり０．８未満、好ましくはサイト当たり０．５未満とすることができる。多糖のアセチル化可能なサイトは、側鎖のマンノース又は主鎖のグルコースであり得る。
【００２５】
好ましい一実施形態では、多糖は繰り返し単位当たり少なくとも２本の異なる側鎖を有し、このうち少なくとも１本は通常のアセタン側鎖又はアセタン側鎖の変異体に等しく、１本は異なる。
【００２６】
別の好ましい一実施形態では、本発明による多糖は、繰り返し単位当たり３本の異なる側鎖を有し、細菌多糖としては異常な性質を有する。この側鎖のうち２本は通常のアセタン又はアセタン側鎖の変異体とすることができ、１本は異なってもよい。
【００２７】
最も好ましい一実施形態では、多糖は、図１に示す１次構造を有するグルコンアセタンである。この多糖は、寄託番号ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１の菌株Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種によって得ることができる。
【００２８】
アセタン及びキサンタンとは異なり、主鎖残基はβ１→６結合を含むことが見出された。このことは、線状セルロースのβ１→４結合と比較して、主鎖のコンホメーションに重大な変化をもたらす。実際、アセタン及びキサンタンのレオロジー特性は、その三次元構造においてヘリックスの形成をもたらす多糖主鎖のセルロースの性質によって支配されていると仮定されてきた（Ｋｉｒｂｙ、Ａ．Ｒ等、（１９９５）Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６８、３６０〜３６３）。したがって、主鎖の形状が異なると、測定される多糖のこの特性がかなり異なってくる。
【００２９】
さらに、２本の異なる側鎖のパッキングが、多糖の巨視的なレオロジー特性に直接影響を及ぼすことがある。アセタンとのもう１つの重要な相違は、検出可能なアセチル化がないことであろう。
【００３０】
異なる側鎖が存在することで分子相互作用が増加することもある。例えば、側鎖の鎖長がレオロジー特性に影響することも知られている。実際、化学的突然変異生成から得られるＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ変異体により産生される側鎖糖残基がないアセタン構造の変異体で、側鎖の鎖長が減少すると溶液粘度が増加することが示された（Ｒｉｄｏｕｔ、Ｍ．Ｊ．等、（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．、１６、６、３２４〜３３０）。本発明による多糖は、側鎖の糖残基がない構造をもつこともある。したがって、本発明は、少なくとも１本の側鎖が少なくとも１個の残基から削除された多糖にも関する。
【００３１】
この多糖の溶液のレオロジー特性を測定し、食品工業において使用されている現在主要な食感付与剤の１つであるアセタン及びキサンタンと比較した（実施例参照）。この多糖は、これらとは異なる特性を示し、構造の点でアセチル化及び非セルロース主鎖の欠如した構造に帰せられる可能性が最も高いことがわかった。
【００３２】
この多糖のレオロジー挙動は、低濃度でキサンタンよりもほんのわずかせん断抵抗が低いが、せん断が高くなるとせん断抵抗はより高くなる。想定されるゲル化のメカニズムに関し、この多糖がアセタン及びキサンタンとは異なるタイプの分子間相互作用をするという結果になる可能性が高い。アセタンについて記載されている螺旋構造の形成及びヘリックス−コイル転移とは異なるはずである。さらに、重要な留意点は、その粘度が濃度０．０１〜１ＭのＮａＣｌの影響をほとんど受けなかったことである。
【００３３】
この多糖の構造を、大きな応力に対するその極めて高い抵抗性と考え併せると、側鎖の絡み合いが抵抗性及びゲル化特性（ｇｅｌｌｉｆｙｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）のもとになっている可能性が高い。
【００３４】
この多糖の、食品用細菌によるその産生とその好都合な食感付与特性からもたらされる食感付与食品添加剤としての潜在的可能性が、明確に実証された。
【００３５】
別の態様によれば、４−β及び６−β結合を含む非セルロース主鎖を有し、全く又はほとんどアセチル化されていず、繰り返し単位当たり少なくとも１本の側鎖を有するキサンタン様構造の多糖を多量に産生し、セルロースを少量しか又は全く産生しないことを特徴とする単離され精製されたＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌株が関係する。
【００３６】
実際、Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓの野生株は、アセタン単体を、しかも様々な構造のアセタンを産生することが示されているが、驚くべきことに、
−　４−β及び６−β結合を含む非セルロース主鎖を有し、
−　全く又はほとんどアセチル化されていず、
−　繰り返し単位当たり少なくとも１本の側鎖が存在する
細菌多糖が見出された。
【００３７】
Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌株は、上述の特色を有する多糖を産生することが好ましい。
【００３８】
最も好ましい一実施形態では、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌株は、１９９９年８月６日にＩｎｓｔｉｔｕｔ　Ｐａｓｔｅｕｒ、２８　ｒｕｅ　ｄｕ　Ｄｏｃｔｅｕｒ　Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５０２４　Ｐａｒｉｓ　ｃｅｄｅｘ　１５、ＦＲＡＮＣＥにＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１の番号で寄託されたＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株である。
【００３９】
このＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌株はリンゴ酒から単離される。Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１菌株は、通常の条件下で、不溶性のセルロース及びモル比７．３：１．４：１：１のグルコース（Ｇｌｃ）、ラムノース（Ｒｈａ）、マンノース（Ｍａｎ）及びグルクロン酸（ＧｌｃＡ）からなる高分子量、高溶解性、食感付与性ヘテロ多糖を産生する。増殖温度条件は１５〜３４℃であり、２８℃の増殖温度が好ましい。激しく撹拌しながら、３〜４日の発酵期間中、ｐＨを３．０〜７．０、好ましくは約４．０にすると、その後多糖が産生され、セルロースは産生されない（発酵の間、セルロースは検出されなかった）。ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生される多糖の構造を、化学分析法、質量分析法、核磁気共鳴スペクトル法で決定した。この菌株により産生される多糖の繰り返し単位を図１に示す。
【００４０】
Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株が多糖を多量に産生し、セルロースを少量しか又は全く産生しないことから、様々な分野、特に食品やペットフード製品の調製にそれを応用すること、或いは食品やペットフード製品へそれを混入させることが可能になる。さらに、キサンタンを産生する非食品用植物病原菌Ｘａｎｔｈｏｍａｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓとは異なり、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒは病原性ではなく、アレルギー反応の誘発を示す報告もなかった。
【００４１】
さらに別の一態様によれば、本発明は、様々な食品やペットフード製品への或いは様々な食品やペットフード製品を調製するための、このような多糖及び／又はこのような菌株の使用に関する。
【００４２】
本発明による多糖は、自己濃化（ｓｅｌｆ−ｔｈｉｃｋｅｎｅｄ）酢の調製に使用することができ、サラダドレッシング、ソース、ケチャップ、マスタードなどの調製に適用した様々な例があることが好ましい。
【００４３】
この多糖は、食物繊維分を含み食感の向上したケチャップに使用することができる「それだけで食感の良い」（ｓｅｌｆ−ｔｅｘｔｕｒｅｄ）発酵トマトジュースなどの発酵フルーツ又は野菜ジュース、細胞外多糖を豊富に加えた乳飲料、発酵食品及び野菜（パープ（ｐａｐｅｓ）／砂糖煮の果物、ジュース、アイスクリーム用調製食品など）の調製にも、（スープ及びソースなど）乾燥製品中の増粘剤として利用される、噴霧乾燥して得られる多糖含有粉体として使用することができる。
【００４４】
本発明による多糖は、様々な食品の風味・香味レベルを高めることができるラムノースを単離するための中間生成物として使用することもできる。酸性ｐＨ及び高温で、ラムノースはフラネオール（ｆｕｒａｎｅｏｌ）及び／又はチオフラネオール（ｔｈｉｏｆｕｒａｎｅｏｌ）の前駆体である。ラムノースを遊離するために、極めて温和な条件で、例えば、好ましくは約２〜４のｐＨ及び約９０℃の適度の加熱で、アミノ酸タンパク質及び／又はポリペプチド含有培地中、フラネオール及び／又はチオフラネオールを生成する、繰り返し単位当たり１個のラムノース残基を少なくとも遊離させるのに十分な時間、酵素反応又は酸加水分解によって単離された細胞外多糖を加水分解することができる。図８は、７５℃、ｐＨ３．８での酵素／基質比０、５、２５％のヘスペリニダーゼ（ｈｅｓｐｅｒｉｎｉｄａｓｅ）（Ａｍａｎｏ、ＪＰ）を用いた酵素加水分解中の遊離ラムノースの放出を示している。
【００４５】
本発明による多糖は、食品又はペットフード製品中に、約０．０１％〜約５％、より好ましくは０．１％〜２％の量で含有させることができる。
【００４６】
本発明による菌株は、食品又はペットフード製品中に、少なくとも１．１０６ｃｆｕ／ｇ、より好ましくは１０７〜１０８ｃｆｕ／ｇの量を使用することができる。
【００４７】
本発明は、食品、ペットフード製品、或いは上述の多糖及び／又は上述の細菌菌株を少なくとも含む組成物にも関する。
【００４８】
最後の一態様によれば、本発明は、本発明によるＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株を用いて最適なバイオマス濃度及び多糖濃度を有利に制御できる発酵方法であって、このＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株が、塩及び炭素源としてバイオマス産生用炭素源Ｓ１と多糖産生用炭素源Ｓ２の２つの異なる基質Ｓ１及びＳ２を含有する増殖培地中で撹拌下に維持される発酵方法を提供する。
【００４９】
好ましい一実施形態によれば、バイオマス産生用炭素源として使用される基質Ｓ１は、エタノール、アセテート、グリセロール、コハク酸、クエン酸、解糖及びトリカルボン酸サイクル（クレブスサイクル）の２個又は３個の炭素原子を含有する任意の有機酸及び中間体、及びこれらの基質の任意の混合物からなる群から選択される（Ｓ１と称する）。
【００５０】
別の好ましい一実施形態によれば、アセタン産生用炭素源として使用される基質Ｓ２は、グルコース、フルクトース、サッカロース、又は任意の他の糖若しくは糖の混合物からなる群から選択される（Ｓ２と称する）。
【００５１】
有利には、本発明による、バイオマス及び多糖を高濃度で得るための発酵方法においては、高濃度の基質Ｓ１及びＳ２を、増殖培地中、過剰の溶存酸素中に含有することができる。
【００５２】
本発明による多糖の単離
スクロースとエタノールを含む規定の培地（Ｐｅｔｅｒｓ、Ｈ．Ｕ．等、（１９８９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ、３４、１３９３〜１３９７）上で増殖後、スクロースが消費されてから培地を採取し、遠心分離機にかけて（３０分、５０００ｒｐｍ、４℃）細胞を取り出す。可溶性タンパク質を沈殿させるために、上澄み１リットル当たり２５０ｇのトリフルオロ酢酸を添加し、４℃で１時間撹拌した。遠心分離（３０分、５０００ｒｐｍ、４℃）後、ｐＨをＮａＯＨペレットで中性に調節し、２容の氷冷エタノールを添加した。撹拌し４℃に冷却後、遠心分離にかけて（３０分、５０００ｒｐｍ、４℃）沈殿した細胞外多糖を取り出した。沈殿を蒸留水中に溶解させ、２日間純水に対して透析し（分画分子量６０００〜８０００Ｄａ）、凍結乾燥させた。
【００５３】
本発明による菌株の単離
Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ菌株を産生する細胞外多糖の選択的及び非選択的単離用の以下の培地が文献に記載されている。すなわち、ＲＡＥ（Ｓｏｋｏｌｌｅｋ、Ｓ．Ｊ．及びＨａｍｍｅｓ、Ｗ．Ｐ．（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０）、ＳＨ（Ｈｅｓｔｒｉｎ、Ｓ．及びＳｃｈｒａｍｍ、Ｍ．、（１９５４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｊｏｕｒｎａｌ　５８：３４５〜３５２）、及びＡＪＹＥ（Ｐａｓｓｍｏｒｅ、Ｓ．Ｍ．及びＣａｒｒ、Ｊ．Ｇ．、（１９７４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３８：１５１〜１５８）が単離に最も適している。これらの培地を使用して、発酵中の酢及び混濁した酢からＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の菌株を単離した。静置培養では、この菌株は多量のセルロースと多糖を同時に産生した。振とう培養による研究から、これらの単離菌株のうちの２種類が本発明による多糖を優先的に産生することが明らかとなった。
【００５４】
最適化されていない発酵条件のもとで、約１％の酢酸又はエタノールを補充したブロス中で、培養により８ｇ／ｌを超える全多糖濃度が得られた。
【００５５】
再現性の良い増殖曲線及び再現性の良い多糖産生が幾つかの実験で得られた。撹拌した液体培養物から収集し単離した菌株は、エタノール、酵母エキス、及びサッカロースを含有する培地の寒天板上で多量の多糖を産生する。食品基材中での細胞外多糖産生を最適にするために、選択した菌株をパイロット実験にかけた。
【００５６】
多糖の生成は、栄養素の組成に左右された。多糖の産生速度は、培養ブロスにエタノールを添加すると増加した。グルコースと酵母エキスの比が高いと、細胞外多糖の生合成が促進され、細胞増殖が減少する。
【００５７】
多糖産生の多い株の選択を、以下の非限定的な技法、すなわち
ｉ）細菌細胞を除去するための培養上澄みの遠心分離、
ｉｉ）エタノール又はイソプロピルアルコール添加による細胞外多糖の沈殿、
ｉｉｉ）ろ過及びその後の真空乾燥による沈殿物の分離
を用いて培地中の細胞外多糖を測定することにより実施した。
【００５８】
本発明のＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株の好ましい増殖温度は１５〜３４℃であり、好ましくは２８℃の増殖温度であり、ｐＨは３．０〜７．０、好ましくは約４．０であり、３〜４日の発酵期間中激しく撹拌した。これにより、細胞外多糖を産生し、セルロースを産生させないことが可能になる（発酵の間セルロースは検出されなかった）。
【００５９】
本発明による細菌菌株を用いたバイオマス及び細胞外多糖の産生を制御する発酵条件
増殖培地は、塩と炭素源としてバイオマス産生用炭素源Ｓ１及び細胞外多糖産生用炭素源Ｓ２の２つの異なる基質Ｓ１及びＳ２とを含有する。
【００６０】
バイオマス産生用炭素源として使用される基質Ｓ１は、エタノール、アセテート、グリセロール、コハク酸、クエン酸、及びクレブスサイクル中に産生される解糖及びトリカルボン酸サイクルの２個又は３個の炭素原子を含有する任意の有機酸及び中間体、並びにこれらの基質の任意の混合物からなる群から選択される。
【００６１】
細胞外多糖産生用炭素源として使用される基質Ｓ２は、グルコース、フルクトース、サッカロース、又は任意の他の糖若しくは糖の混合物からなる群から選択される。
【００６２】
培地に含有される塩は、例えば、Ｐｅｔｅｒｓ等によるものである。撹拌条件下で、この菌株、並びに他の菌株（例えば、ＤＳＭ　２００４、ＤＳＭ　６３１５、ＤＳＭ　４６６０４、ＮＲＬＬ　Ｂ４２）を用いると、大部分のバイオマスの生成はＳ１の消費中に起こり、一方、細胞外多糖は続いて糖Ｓ２の消費中に産生されることが判明した。したがって、最終バイオマス濃度は初期のＳ１濃度によって主に決まり、最終細胞外多糖濃度は初期のＳ２濃度によって主に決まり、最大５０ｇ／Ｌの値に達することがあり、セルロースは検出されなかった。高濃度のバイオマス及び細胞外多糖が、培地液体中、過剰な溶存酸素のもとで得られた。これは、培地の十分な撹拌と十分な通気量によって得られたものである。
【００６３】
以下の実施例は、説明の目的で示すものにすぎず、決して本願の内容を限定するものと解釈すべきでない。すべての百分率は特段の指示がない限り重量で示されている。実施例の前に、図を簡単に説明する。
【００６４】
（実施例）
実施例１：Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１によって産生される多糖の化学分析
Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１によって産生される多糖の定量的単糖分析を、酸加水分解後（２Ｎトリフルオロ酢酸、１００℃、２、４、６、及び８時間後に採取した試料）、ＨＰＬＣにより実施した。
【００６５】
メチル化の分析のため、Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１によって産生された多糖をカルボジイミドで活性化された還元法により還元し、次いでヨウ化メチルを用いてパーメチル化した（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ　ｂｙ　ＧＬＣ　ａｎｄ　ＭＳ、Ｂｉｅｒｍａｎ、Ｃ．Ｊ．及びＭｃＧｉｎｎｉｓ、Ｇ．Ｄ．編、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ中のＣａｒｐｉｔａ、Ｎ．Ｃ．、Ｓｈｅａ、Ｅ．Ｍ．、（１９８９）；Ｃｉｕｃａｎｕ、Ｉ．等、Ｒａｐｉｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１３１、２０９〜２１７（１９８４）。得られた部分メチル化アルジトールアセテートを、質量分析器に連結した気液クロマトグラフィーを用いて分析した。
【００６６】
ＮＭＲスペクトル法
試料を９９．９６原子％２Ｈ２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏ−Ｔｏｐ）中に溶解させた。すべての実験を、能動的に遮蔽されたパルスフィールドｚ−勾配逆三重共鳴プローブ（ｐｕｌｓｅｄ−ｆｉｅｌｄ　ｚ−ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｉｎｖｅｒｓｅ　ｔｒｉｐｌｅ−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｐｒｏｂｅ）を装着した３チャンネルＢｒｕｋｅｒ　ＤＲＸ　６００ＭＨｚ分光計で記録した。化学シフトを、外部［１３Ｃ−１］−グルコースのα−アノマーシグナル（Ｈ−１がδＨ−１５．１５及びＣ−１がδＣ−１９２．９０）を基準としたｐｐｍで示す。
【００６７】
ＴＰＰＩ（Ｍａｒｉｏｎ、Ｄ．等、（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１３、９６７〜９７４、混合時間１５ｍｓ〜９０ｍｓのＴＯＣＳＹ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｌｅｒ、Ｌ．等、（１９８３）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．５３、５２１〜５２８）、混合時間５０ｍｓ〜２５０ｍｓのＮＯＥＳＹ（Ｊｅｅｎｅｒ、Ｊ．等、（１９７９）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１１、４５４６〜４５５３；Ａｎｉｌ　Ｋｕｍａｒ、Ｅｒｎｓｔ、Ｒ．Ｒ．等、（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９５、１〜６）、勾配感度強化（ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ−ｅｎｈａｎｃｅｄ）１Ｈ−１３Ｃ異核単一量子コヒーレンス（ＰＥＰ−ＨＳＱＣ）（Ｋａｙ、Ｌ．Ｅ．等、（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４、１０６６３〜１０６６５）、及びグリコシド結合を測定するための１０〜４０ｍｓの定時間（ｃｏｎｓｔａｎｔ−ｔｉｍｅ　ｄｕｒａｔｉｏｎｓ）の交差相関双極子−双極子（ＣＣＤＤ）実験法（Ｖｉｎｃｅｎｔ、Ｓ．Ｊ．Ｆ．及びＺｗａｈｌｅｎ、Ｃ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２、８３０７〜８３０８）により位相敏感２次元実験（Ｐｈａｓｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）を記録した。
【００６８】
マグニチュードモード勾配フィルター（ｍａｇｎｉｔｕｄｅ　ｍｏｄｅ　ｇｒａｄｉｅｎｔ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）１Ｈ−１３Ｃ　ＨＭＢＣ（Ｂａｘ、Ａ．等、（１９８６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８、２０９３〜２０９４）を５０ｍｓのＪ−展開時間で記録した。以下の数のコンプレックスポイントが得られた（Ｆ１、Ｆ２）：１６スキャン（ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹ）、１２８スキャン（ＨＳＱＣ）、又は２５６スキャン（ＣＣＤＤ及びＨＭＢＣ）にわたり平均して５１２×４０９６（ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹ）、２５６×２０４８（ＨＳＱＣ）、及び５１２×４０９６（ＣＣＤＤ及びＨＭＢＣ）。３６００Ｈｚ×３６００Ｈｚ（ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹ）又は３０２０Ｈｚ×３６００Ｈｚ（ＨＳＱＣ、ＣＣＤＤ、及びＨＭＢＣ）のスペクトル幅（ω１、ω２）を用いた。１度ゼロ充填（ｚｅｒｏ−ｆｉｌｌｉｎｇ）した９０°シフト正弦二乗−ベル関数（ｓｑｕａｒｅ　ｓｉｎｅ−ｂｅｌｌ）をすべての場合に用いた。全データをＢｒｕｋｅｒ　ＸＷＩＮＮＭＲ　２．６ソフトウェアで処理した。
【００６９】
結果
Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生される多糖の単糖分析。２Ｎトリフルオロ酢酸を用いた１００℃での酸加水分解により、グルクロン酸の量が、存在するその主要な分解生成物の量から判定して、この操作によって産生されるマンノースの量にほぼ等しいことが示された（１モルのマンノースに対し１．２２モルのグルクロン酸が観測された）。
【００７０】
Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生されたグルコンアセタン多糖のメチル化の分析（表Ｉ）から、モル比５．５：１．４：１のグルコース、ラムノース、及びマンノースが存在することが示された。２つの異なる分枝Ｇｌｃｐ残基が見られたものの、末端Ｒｈａは１つにすぎず、繰り返し単位が複雑に分枝していることが示唆された。
【００７１】
2004512840.tif 000002
【００７２】
ＮＭＲスペクトル法
Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生された多糖の１Ｄ　１Ｈ　ＮＭＲスペクトル（図３）には、相対積分値が３：１．４：０．８：４．４：１．８：２．６：３．６の７個のアノマープロトン共鳴が見られた。線幅は異なるアノマー共鳴間で５Ｈｚから３０Ｈｚと大きく変動し、種々の単糖単位が変動の大きい動的運動をしていることが示唆される。
【００７３】
２次元スペクトルの測定後、繰り返し単位内の９個の単糖成分を同定し、アノマープロトン化学シフトの高い方から低い方へＡからＩと命名した。環状構造（六炭糖又はピラノース）及びアノマーコンフィギュレーションが、ＣＣＤＤスペクトル上に観測されるＨ−１化学シフト及び１結合の（ｏｎｅ−ｂｏｎｄ）Ｃ−１、Ｈ−１スカラーカップリングから推定された。２．０８ｐｐｍ付近にＮ−アセチルメチルのシグナルは観測されず（図４、右上）、アセチル化されていないことが示唆された。このことは、多糖アセタン中でアセチル化され、Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生された多糖中の非置換位にシフトした炭素の位置のシフトから確認された（表ＩＩ参照）。Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により６７℃で産生された多糖について一連の標準の多糖ＮＭＲ実験を記録した。Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により６７℃で産生された多糖に対する１Ｈ及び１３Ｃ　ＮＭＲ帰属を表ＩＩにまとめる。
【００７４】
2004512840.tif 000003
【００７５】
Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生された多糖の１Ｈ帰属を、混合時間を（１５から９０ｍｓへ）増加させながら記録したＴＯＣＳＹスペクトル中のＡ〜Ｉの各残基のアノマー（Ｈ−１）共鳴から始めた。
【００７６】
Ｈ−１からＨ−２、３、４への連結性を９個の残基すべてについて調べたが、数組のアノマープロトン共鳴が重複し（４．８５ｐｐｍのＤ（Ｈ−１）とＥ（Ｈ−１）、４．６０ｐｐｍのＦ（Ｈ−１）とＧ（Ｈ−１）、及び４．４９ｐｐｍのＨ（Ｈ−１）とＩ（Ｈ−１））、その線幅が化学シフト差と同等（ＬＷ約１５Ｈｚ＝Δδ約０．０２ｐｐｍに対し０．０２ｐｐｍ）であるため、ＴＯＣＳＹデータのみから完全な１Ｈ帰属は得られなかった。
【００７７】
Ｈ−２、３、４、５　ＴＯＣＳＹの図により、次に単糖内の強いＮＯＥＳＹ交差ピークにより、最後にＰＥＰ−ＨＳＱＣスペクトル中の１Ｈと１３Ｃの両方の共鳴を帰属させて、さらに確認を行なった。
【００７８】
グリコシド結合中に含まれるアグリコン炭素原子に対応する共鳴を、単糖メチル配糖体リファレンス（Ｂｏｃｋ、Ｋ．等、（１９８２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｐ．ＮＭＲ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．１３、１〜５７；Ｂｏｃｋ、Ｋ．等、（１９８３）Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１、２７〜６６；Ｂｏｃｋ、Ｋ．等、（１９８３）Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２、１９３〜２２５）と比較して差（＞５ｐｐｍ）を同定することにより１３Ｃ化学シフトから推定した。
【００７９】
単糖残基の配列を、１Ｈ−１３Ｃ　ＣＣＤＤ、１Ｈ−１３Ｃ　ＨＭＢＣスペクトル及びＮＯＥＳＹスペクトル中の交差ピークの有無から推定した。関連する交差ピークを表ＩＩＩにまとめる。
【００８０】
2004512840.tif 000004
【００８１】
すべての場合で、同時にメチル化分析データ、１３Ｃ　ＮＭＲ帰属、及び連結性をもとにしてグリコシド結合を帰属させた。単糖単位間の最も重要な結合は、まず「セルロースの」（β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）結合Ｃ−（１→４）−Ｆ、Ｆ−（１→４）−Ｇ、及びＧ−（１→４）−Ｆ、次に「非セルロースの」（β−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→６）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）主鎖結合Ｆ−（１→６）−Ｃ、最後に残基Ａからの２本の結合、すなわち１本は側鎖グルクロン酸Ｈへの結合（α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃｐＡ）、もう１本は主鎖分枝Ｃ残基への結合（α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−β−Ｄ−Ｇｌｃｐ）であった。３本のセルロース主鎖β１４結合は、残基Ｃ、Ｆ及びＧに伴うブロードなピークが直接原因して、最も同定が困難であった。非セルロース主鎖β１６結合は、残基Ｃの化学シフトに加え、ＦのアノマープロトンとＣのアグリコンの６位又はその近くの原子とのＣＣＤＤ、ＨＭＢＣ及びＮＯＥＳＹ交差ピークの有無により明瞭に示された（表ＩＩＩ参照）。炭素Ｃ（Ｃ−６）の化学シフトの分離は、これらのピークが弱いものの、この連結に関しては疑問の余地はない（図４左上参照）。残基Ａからの２本の異なる結合が、幾つかのＮＯＥＳＹ及び対称関係の（ｓｙｍｍｅｔｒｙ−ｒｅｌａｔｅｄ）ＣＣＤＤ及びＨＭＢＣ交差ピークにより示されている（表ＩＩＩ）。
【００８２】
結論として、化学分析及びＮＭＲスペクトル法に基づき、Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により分泌される多糖の繰り返し単位の構造は、図３（上）に示すような式で表すことができる。この構造は、セルロース主鎖と非セルロース主鎖結合の比の変動、すなわち図１の構造中のｍ値の違いに対処できるものである。化学分析に基づき、β１６結合とβ１４結合の比は小さいはずである（表Ｉ）。ラムノースメチルＮＭＲピーク強度によれば、この比は高いはずである。この整合性が最も良いのはｍ＝２のときであり、この場合、繰り返し単位当たり３本の側鎖が存在し、２本はアセタン側鎖（Ｄ−Ｉ−Ａ−Ｈ−Ｂ）と同一で、１本はそれよりも短い側鎖（Ｅ−Ｉ−Ａ）である。
【００８３】
多糖繰り返し単位には、３本の側鎖が存在する。２本は単糖５個の長さであり、その組成はアセタン側鎖と同一である。Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生される多糖においては、それらは主鎖β−Ｄ−Ｇｌｃｐ分枝残基にα１３結合を介して結合している。アセタン及び構造的に近いキサンタン多糖とは異なり、Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生される多糖には、α１→３結合を介してやはり主鎖β−Ｄ−Ｇｌｃｐ分枝残基に結合する３個の単糖単位からなる異なるタイプの側鎖がさらに存在する。この追加の側鎖の内容は、アセタン側鎖の３個の末端残基と同一である。その主鎖中では、β−Ｄ−Ｇｌｃｐが交互に分枝していた。さらに、アセタン及びキサンタンとは対照的に、１個の主鎖残基はβ１６結合をもつことが判明した。このため、直線的なセルロースβ１４結合と比べると、主鎖のコンホメーションが大きく変化する。実際、アセタン及びキサンタンのレオロジー特性は、その三次元構造においてヘリックスの形成をもたらす多糖主鎖のセルロースの性質によって支配されていると仮定されてきた（Ｋｉｒｂｙ、Ａ．Ｒ等、（１９９５）Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６８、３６０〜３６３）。したがって、Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生される多糖で測定されるこの特性が、主鎖の形状が異なるためにかなり違ってくる。さらに、２本の異なる側鎖の密なパッキングが、多糖の巨視的なレオロジー特性に直接影響を及ぼしていることがわかる。アセタンとのもう１つの重要な相違は、検出可能なアセチル化がないことである。
【００８４】
実施例２：多糖のレオロジー
精製した細胞外多糖の試料を純水に慎重に溶解した。キサンタン（Ｒｈｏｄｉｇｅｌ）をＭｅｙｈａｌｌ（ＣＨ）から入手した。直径６ｃｍ、角度１°のコーンを装着した粘度計（ＳＣＬ２　Ｃａｒｒｉ　Ｍｅｄレオメータ、ＴＡ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ　Ｃａｓｔｌｅ、ＵＳＡ）を用いて２５℃で粘度を測定した。ずり速度を０．５から５００　１／ｓに変化させた。Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１により産生された多糖の粘度プロフィールを、ずり速度の関数として図５に示す。
【００８５】
この多糖は、ずり減粘挙動を示す。すなわち、低ずり速度では粘度は高くほとんど一定であり、高ずり速度では粘度は連続的且つ可逆的に低下する（チキソトロピー）。この粘度は、濃度０．０１〜１ＭのＮａＣｌの影響をほとんど受けなかった。
【００８６】
キサンタン溶液と比較して、新規多糖の粘度は高ずり速度でそれより高くなる（図６）。試験したすべてのずり速度で、新規多糖の粘度は、Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　Ｂ４２の培養から単離された多糖の粘度よりもかなり高い（図７）。
【００８７】
実施例３：食物中の粒子又はエマルジョンの安定化剤としての本発明の細胞外多糖の使用
2004512840.tif 000005
【００８８】
代用乳では、水中の乾燥ホエー又は加熱処理した大豆タンパク質の懸濁液を安定化するために０．０５％の細胞外多糖を使用することができる。
【００８９】
実施例４：本発明の細胞外多糖を用いたアイスクリーム組成物
2004512840.tif 000006
【００９０】
実施例５：本発明の菌株を用いた発酵トマトペーストの調製
１００ｇの市販トマトペースト（ＳＴＡＲ、Ｍｉｌａｎ、ＩｔａｌｙのＰｕｍｍａｒｏタイプ）を、大きさ３００ｍｌの無菌ガラス瓶に無菌で移し、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株の洗浄した０．５％細胞懸濁液を（コロニー形成単位として測定して）２×１０６細胞／ｇの初期細胞濃度で接種した。接種前にトマト２０マトリックス（ｔｏｍａｔｏ　２０　ｍａｔｒｉｘ）のｐＨを４．０＋／−０．１に調節した。
【００９１】
続いて、接種したトマトペーストを２８℃で２４時間発酵させ、その間にサンプルを採取し分析する。発酵完了後、このマトリックスを８０℃で３０分間低温殺菌し、室温に冷却する。
【００９２】
Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ種菌株を用いて得られた発酵トマトペーストは、しょう液発生についての優れた特性、及び優れた感覚受容特性を有する。
【００９３】
実施例６：風味・香味反応
実施例１で単離した細胞外多糖を、非常に温和な条件下で、すなわち、ｐＨ約２〜４で約９０℃の適度の加熱で、アミノ酸タンパク質及び／又はポリペプチド含有培地中、フラネオール及び／又はチオフラネオールを生成する、繰り返し単位当たり１個のラムノース残基を少なくとも遊離させるのに十分な時間、酵素反応又は酸加水分解によって加水分解する。
【００９４】
実施例７：ペットフード製品
７３％の鳥がら、豚の肺臓、及び牛レバー（粉末）、１６％の小麦粉、７％の水、２％の色素、フレーバー、ビタミン、及び無機塩から混合物を調製する。この混合物を１２℃で乳状にして、プディング状に加工成型し、次いでそれを９０℃で加熱調理する。３０℃に冷却し、塊に切る。その塊４５％を、９８％の水、１％の色素及び１％の細胞外多糖グルコアセタンから調製したソース５５％と混合する。ブリキ缶に充填し、１２５℃で４０分滅菌する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１によって産生される多糖グルコンアセタンの構造を示す図である。
【図２】
細菌多糖（ａ）キサンタン、（ｂ）アセタン、及び（ｃ）ＣＲ１／４（Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ菌株ＣＲ１／４（Ｒｉｄｏｕｔ、Ｍ．Ｊ．等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．１６（１９９４）３２４〜３３０によって分泌されるアセタン変異体）の化学構造を示す図である。理解し易いように、非炭水化物置換基は省略した。キサンタンは、（１→２）Ｍａｎ上のＣ６での部分的なＯ−アセチル化、及び末端マンノース残基を含んでいる。アセタン及びＣＲ１／４は、分枝→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→残基のＯ−６で、及び→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→残基のＯ−６で部分的にＯ−アセチル化されている（Ｃｏｌｑｕｈｏｕｎ，Ｉ．Ｊ．等、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ　Ｒｅｓ．、２６９（１９９５）３１９〜３３１）。
【図３】
（上）単糖単位がその残基文字コード（Ａ〜Ｉ）によって識別されているＧ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１によって産生されたグルコンアセタン多糖の構造　（下）２Ｈ２Ｏ中６００ＭＨｚ、６７℃で記録したＧ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１によって産生された多糖の１Ｄ　１Ｈ　ＮＭＲスペクトルを示す図である。アノマー（Ｈ−１）共鳴は、対応する残基の文字コードによって識別されている。
【図４】
（上）Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１によって産生されたグルコンアセタン多糖及び（下）Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓ　Ｂ４２菌株によって産生されたアセタン多糖のＰＥＰ−ＨＳＱＣスペクトルの（左）（Ｃ−６、Ｈ−６）領域及び（右）Ｎ−アセチルメチル領域を示す図である。２Ｈ２Ｏ中６００ＭＨｚ、６７℃でスペクトルを記録した。
【図５】
様々な細胞外多糖濃度に対するＧ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１グルコンアセタン多糖溶液の粘度を示す図である。直径６ｃｍ、角度１°のコーンを用いて２５℃で測定した。
【図６】
様々な細胞外多糖濃度に対するＧ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１多糖溶液（太線）及びキサンタン溶液（細線）の粘度を示す図である。直径６ｃｍ、角度１°のコーンを用いて２５℃で測定した。
【図７】
様々な細胞外多糖濃度に対するＧ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１多糖溶液（太線）及びＧ．ｘｙｌｉｎｕｓ　Ｂ４２多糖（細線）の粘度を示す図である。直径６ｃｍ、角度１°のコーンを用いて２５℃で測定した。
【図８】
７５℃、ｐＨ３．８、酵素／基質比０、５、及び２５％におけるＧ．ｘｙｌｉｎｕｓ　ＣＮＣＭ　Ｉ−２２８１多糖のヘスペリニダーゼ（Ａｍａｎｏ、ＪＰ）による酵素加水分解を示す図である。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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