(57)【要約】ステロイド受容体リガンド結合ドメイン変異体、及びこれらの受容体に対する特異的な結合親和性を有する合成リガンドが提供される。これらＬＢＤリガンドの組み合わせの選択的な「分子遺伝子スイッチ」の構築への使用が開示される。これらのスイッチを用いる遺伝子機能の調節方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
領域１における少なくとも一つのアミノ酸修飾、領域２における少なくとも一つのアミノ酸修飾、又は、領域１及び２の両方の夫々における少なくとも一つのアミノ酸修飾を有する修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインであって、前記少なくとも一つのアミノ酸修飾の結果、該リガンド結合ドメインが非内在性リガンドと相互作用する、前記ドメイン。
【請求項２】
修飾ヒトエストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインである、請求項１記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項３】
領域１における少なくとも一つのアミノ酸修飾を有する、請求項１記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項４】
少なくとも一つのアミノ酸修飾が配列番号５５における、３８８、３９１、４２１、４２４及び４２８の一つ又はそれ以上に対応する位置で生起する、請求項３記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項５】
配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンが他のアミノ酸と置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項６】
配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがアラニンと置換されている、請求項５記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項７】
配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがファニルアラニンと置換されている、請求項５記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項８】
配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがバリンと置換されている、請求項５記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項９】
配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがトリプトファンと置換されている、請求項５記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１０】
配列番号５５における３９１に対応する位置のロイシンが他のアミノ酸と置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１１】
配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンが他のアミノ酸と置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１２】
配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンがバリンと置換されている、請求項１１記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１３】
配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンが他のアミノ酸と置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１４】
配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがアラニンと置換されている、請求項１３記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１５】
配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがメチオニンと置換されている、請求項１３記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１６】
配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがフェニルアラニンと置換されている、請求項１３記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１７】
配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがロイシンと置換されている、請求項１３記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１８】
配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがバリンと置換されている、請求項１３記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項１９】
配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがチロシンと置換されている、請求項１３記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２０】
配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンが他のアミノ酸と置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２１】
配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２２】
配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがバリンと置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２３】
配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンが他のアミノ酸と置換され、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンが他のアミノ酸と置換され、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンが他のアミノ酸と置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２４】
配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがバリンと置換され、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがチロシンと置換され、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換されている、請求項２３記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２５】
配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンが他のアミノ酸と置換され、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンが他のアミノ酸と置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２６】
配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンがバリンと置換され、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換されている、請求項４記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２７】
領域２における少なくとも一つのアミノ酸修飾を有する、請求項１記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２８】
少なくとも一つのアミノ酸修飾が配列番号５５における、５２１及び５２４の一つ又はそれ以上に対応する位置で生起する、請求項２７記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項２９】
配列番号５５における５２１に対応する位置のグリシンが他のアミノ酸と置換されている、請求項２８記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項３０】
配列番号５５における５２１に対応する位置のグリシンがアルギニンと置換されている、請求項２９記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項３１】
配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンが他のアミノ酸と置換されている、請求項２８記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項３２】
配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンがグリシンと置換されている、請求項２８記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項３３】
配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンがアラニンと置換されている、請求項２８記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインと機能的に結合した核酸結合ドメインを有する融合受容体タンパク質。
【請求項３５】
該核酸結合ドメインがＣ２Ｈ２結合ドメイン、ＧＡＬ４結合ドメイン、ウィルスＤＮＡ結合ドメイン、昆虫ＤＮＡ結合ドメイン、又は、非哺乳動物ＤＮＡ結合ドメインである、請求項３４記載の融合受容体タンパク質。
【請求項３６】
更に、トランス活性化ドメインを含む、請求項３４記載の融合受容体タンパク質。
【請求項３７】
トランス活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＴＡＦ−１、ＴＡＦ−２、ＴＡＵ−１、ＴＡＵ−２及びｐ６５及びＳＴＡＴファミリーのメンバーからの活性化ドメインから成る群から選択される、請求項３６記載の融合受容体タンパク質。
【請求項３８】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項３９】
請求項３４又は３５記載の融合受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４０】
請求項３６又は３７記載の融合受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４１】
請求項３９記載の核酸分子に機能的に結合したプロモーターを含むキメラ構築物。
【請求項４２】
請求項４０記載の核酸分子に機能的に結合したプロモーターを含むキメラ構築物。
【請求項４３】
請求項４１記載のキメラ構築物を含有するプラスミド。
【請求項４４】
請求項４２記載のキメラ構築物を含有するプラスミド。
【請求項４５】
請求項４１記載のキメラ構築物を含有する細胞。
【請求項４６】
請求項４２記載のキメラ構築物を含有する細胞。
【請求項４７】
対象となる核酸配列に転写可能に結合したプロモーターの発現を調節するための分子スイッチであって、
（ａ）請求項３６又は３７記載の融合受容体タンパク質であって、該融合受容体タンパク質の核酸結合ドメインが該プロモーターに結合し、該プロモーターに該融合受容体タンパク質が結合したときに該融合受容体タンパク質のトランス活性化ドメインがプロモーターからの転写を引き起こすもの、及び、
（ｂ）該融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインに優先的に結合するリガンドであって、この結合によって転写ドメインが活性化され、対象となる核酸配列の転写が引き起こされるもの、を含む前記分子スイッチ。
【請求項４８】
修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが野生型エストロゲン受容体アルファに対しては実質的に非活性であるような濃度のリガンドによって活性化される、請求項４７記載の分子スイッチ。
【請求項４９】
リガンドがタモキシフェン誘導体である請求項４８記載の分子スイッチ。
【請求項５０】
融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、１）ＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノール；２）ＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル；３）ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル；４）ＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノール；及びそれらの非ヒドロキシル化形態から成る群から選択される化合物に結合する、請求項４７記載の分子スイッチ。
【請求項５１】
融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域１における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがバリンと置換、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがチロシンと置換、及び、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換を有し、リガンドがＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノールである、請求項５０記載の分子スイッチ。
【請求項５２】
融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域１における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンがバリンと置換、及び、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換を有し、リガンドがＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル、又は、ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステルである、請求項５０記載の分子スイッチ。
【請求項５３】
融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域２における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンがグリシンと置換を有し、リガンドがＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノールである、請求項５０記載の分子スイッチ。
【請求項５４】
対象となる核酸配列の発現を活性化する方法であって、
（ａ）請求項４２記載のキメラ構築物及び対象となる核酸配列をを含む標的発現カセットで細胞を形質転換し、
（ｂ）該形質転換細胞において融合受容体タンパク質を発現させ、
（ｃ）該形質転換細胞を、該融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインに優先的に結合するリガンドであって、この結合によって該融合受容体タンパク質の転写ドメインが活性化され、対象となる核酸配列の転写が活性化されるリガンドと接触させることから成る、前記方法。
【請求項５５】
修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが野生型エストロゲン受容体アルファに対しては実質的に非活性であるような濃度のリガンドによって活性化される、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
リガンドがタモキシフェン誘導体である請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、１）ＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノール；２）ＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル；３）ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル；４）ＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノール；及びそれらの非ヒドロキシル化形態から成る群から選択される化合物に結合する、請求項５４記載の方法。
【請求項５８】
融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域１における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがバリンと置換、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがチロシンと置換、及び、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換を有し、リガンドがＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノールである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域１における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンがバリンと置換、及び、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換を有し、リガンドがＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル、又は、ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステルである、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域２における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンがグリシンと置換を有し、リガンドがＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノールである、請求項５７記載の方法。
【請求項６１】
形質転換細胞がヒト又は動物であり、及び、形質転換細胞とリガンドとの接触が該リガンドの薬理学的投与量をヒト又は動物に投与することから成る、請求項５４記載の方法。
【請求項６２】
キメラ構築物及び標的発現カセットが別個のDNA分子上にあり、細胞に共形質転換される、請求項５４記載の方法。
【請求項６３】
以下の構造式：
【化１】
2004537293.tif 000019
を有する化合物ＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノール。
【請求項６４】
有効量の請求項６３記載の化合物又はその医薬上許容可能な塩を、一種又はそれ以上の医薬キャリア、希釈剤及び／又は添加物とともに含有する医薬組成物。
【請求項６５】
以下の構造式：
【化２】
2004537293.tif 000020
を有する化合物  ＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノール。
【請求項６６】
有効量の請求項６５記載の化合物又はその医薬上許容可能な塩を、一種又はそれ以上の医薬キャリア、希釈剤及び／又は添加物とともに含有する医薬組成物。
【請求項６７】
以下の構造式：
【化３】
2004537293.tif 000021
を有する化合物  ＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル。
【請求項６８】
有効量の請求項６７記載の化合物又はその医薬上許容可能な塩を、一種又はそれ以上の医薬キャリア、希釈剤及び／又は添加物とともに含有する医薬組成物。
【請求項６９】
以下の構造式：
【化４】
2004537293.tif 000022
を有する化合物  ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル。
【請求項７０】
有効量の請求項６９記載の化合物又はその医薬上許容可能な塩を、一種又はそれ以上の医薬キャリア、希釈剤及び／又は付加物とともに含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、参照によってその全体にここに組み入れられて、2001年5月31日に出願された米国仮出願第60/294,839号の利益を要求する。
【０００２】
本発明は、分子内分泌学及び受容体薬物学の分野へ一般的に関連するものである。より具体的には、本発明は、エストロゲン受容体の新規な変異、及び、これらの受容体に選択的に結合し、活性化するか又はブロックする化合物に関係がある。それは、さらに遺伝子治療用の分子スイッチに関係がある。
【背景技術】
【０００３】
ヒトを含む遺伝子組み換え動物において生体内の遺伝子発現を調節する能力は、遺伝子機能の調査、及び、動物又はヒトの遺伝子治療における治療遺伝子発現のコントロール及び有用性の両方に非常に重要である。
【０００４】
生体内遺伝子発現制御用の信頼できるシステムを開発するために様々なアプローチが試みられた。最初の試みは、熱ショック(Wurm F.M., Gwinn K.A. Kingston R.E., 「哺乳類細胞におけるマウスc-mycタンパク質の誘導可能な過剰生産」
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5414-5418(1986))、又は、重金属イオン(Mayo K.E., Warren R
Palmiter R.D., 「マウスメタロチオネイン-１遺伝子は、ヒト又はマウスの細胞へトランスフェクションに続くカドミウムによって転写上調節される」、Cell
29:99-108(1982)のような制御可能な刺激に応じて内因性転写調節因子によって誘導することができたプロモーターの使用に基づいていた。しかしながら、誘導比が低かったことは知られた。また、誘導物質はそれ自身しばしば多くの望まれない内因性遺伝子を活性化した。
【０００５】
これらの問題を克服するために、哺乳類、バクテリア、酵母及びウイルスの転写因子からの要素を組み合わ細胞キメラな転写調節因子を使用する誘導可能なシステムを開発する試みがなされた（Gossen M., Bonin A.L. Bujard H., 「原核生物の調節要素によるより高い真核細胞中の遺伝子活性のコントロール」,
Trends in Biochem. Sci. 18 471-475(1993)）。
【０００６】
これらシステムを使用する一つの例はlac リプレッサーの使用である。それはイソプロピルD-チオガラクトピラノシド
(IPTG)によって誘導される(Baim S.B., Labow M.A., Levine A.J.及びShenk T.,「温度及びイソプロピルD-チオガラクトピラノシドによって調節されるlacリプレッサーに基づいたキメラな哺乳類トランスアクチベーター」Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5072-5076(1991))。このシステムは、動物中のLPTGの毒性によってかなり制限される。
【０００７】
別のシステムでは、E.ccliからのテトラサイクリン(tet)リプレッサーのDNA結合ドメインを単純ヘルペスウィルスタンパク質VP16の活性化ドメインと結合させる (Gossen M. M.及びBujard
H.,「テトラサイクリン応答性プロモーターによる哺乳類細胞の遺伝子発現の厳格なコントロール」Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
89:5547-555 1(1992)) 。対象となる遺伝子は、多数のtetオペレーター配列の下流に置かれる。テトラサイクリンがない状態で、tet/VPl6アクチベーターはオペレーター配列と結合し、下流の遺伝子を活性化するだろう。テトラサイクリンがある状態では、tetIVPl6アクチベーターの結合が阻害されるので、対象となる遺伝子は転写されないだろう。このシステムはトランスジェニックマウスにおいて生体内のリポーター遺伝子発現をコントロールする能力を持つことが示された(Furth,P.A.、St.
Onge L.,Boger H.,Gruss P., Gossen M., Kistner A.,Bujard H.及びHennighausen L.,「テトラサイクリン応答性プロモーターによるトランスジェニックマウス中の遺伝子発現の一時的なコントロール」Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9302-9306(1994))。しかしながら、このシステムとその変異体は、テトラサイクリンがリプレッサーとして使用され、それを対象となる下流の遺伝子を暗黙させておくために常に存在させなければならないという重大な欠点がある。さらに、バクテリアのタンパク質成分はヒトにおいて免疫原かもしれない。
【０００８】
上に記載されたシステムの欠点は、例えば遺伝子治療での治療遺伝子発現のコントロールへの完全に異なるアプローチを誘因することとなった。このアプローチはステロイドホルモン受容体のホルモン結合ドメイン(HBD)あるいはリガンド結合ドメイン(LBD)をあるタンパク質に融合させることにより誘導可能な遺伝子コントロールシステムを作成する
(Wang Y., O’Malley B.W., Jr.., Tsai S.Y.及びO’Malley B.W.,「遺伝子導入で使用される調節システム」Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:8180-8184(1994))。そのような融合産物では、多くのタンパク質はホルモンがない状態で不活性になるが、この領域で結合するホルモン又はホルモン変異体がある状態では正常な活性を再び発揮するだろう。
【０００９】
そのようなシステムの中で使用されるタンパク質は多くの種類の制御可能な活性を持っているかもしれない。例えば、これらのタンパク質は、特定の導入遺伝子の転写のコントロールに特異的な調節タンパク質かもしれない。このタイプの多くのコントロールシステムが、エストロゲン受容体(ER)のHBDを使用して構築物された(Hollenberg S.M., Cheng P.F.及びWeintraub H.,「MyoDトランス活性化及び筋肉決定に関する条件付きのMyoD転写調節因子使用の研究」Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:
8028-8032(1993)；Brasehnann S., Graninger P.及び
Busslinger M.,「GAL4エストロゲン受容体融合タンパク質に基づいた哺乳類細胞用の選択的な転写誘導システム」Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 90:1657-1661(1993);  Roemer K. 及びFriedman T.,「p53-エストロゲン受容体のハイブリッドのタンパク質による細胞増殖及び遺伝子発現の調節」Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 9252-9256(1993);Superti-Furga G., Bergers G.,
Picard D.及び Busslinger M.,「Fosステロイド受容体融合タンパク質によるホルモン依存の転写調節及び細胞の形質転換」Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:
5114-5118(1991)。ERのリガンドである７β-エストラジオールが容易に入手可能であり、比較的安く、多くの細胞タイプが内因性エストロゲン受容体を欠く。しかしながら、野生型エストロゲン受容体のHBDを使用するシステムは、誘導可能なシステムをコントロールするホルモンの使用がさらに内因性ステロイドホルモン受容体を活性化し、そのために、内因性遺伝子の活性を変異するだろうという点で潜在的に不利である。更に、このシステムは内因性β-エストラジオールのレベルによって影響を受けるだろう。
【００１０】
導入遺伝子発現の調節し、且つ、内因性で望まれない遺伝子の活性化を回避する一つのアプローチは、ステロイドホルモン受容体のようなキメラな核ホルモン受容体の修飾及び使用だった。ステロイドホルモン受容体は、転写を含む複雑な細胞の事象の調節を担う。卵巣ホルモンであるエストロゲン及びプロゲステロンは、女性の生殖組織の分化、成長及び機能に関連した複雑な細胞の事象の調節を一部分担っている。これらのホルモンは、さらに生殖の内分泌系の悪性腫瘍の成長及び進行に重要な役割を果たす。
【００１１】
ステロイドホルモンの生物学的活性は、ホルモン及び組織に特異的な細胞内の受容体によって直接媒介される。ステロイド受容体の生理学上不活性な形態は、熱ショック蛋白質(hsp)90、hsp70及びhsp56のようなタンパク質とのオリゴマー複合体として存在するかもしれない。その特異的なリガンドと結合する際、受容体はコンフォメーションを修飾し、阻害性ヘテロオリゴマーな複合体から解離する。その後の二量化によって、受容体が標的遺伝子プロモーターの調節領域の特異的なDNA部位に結合することが可能になる。DNAへの受容体の結合に続き、ホルモンは、受容体が転写装置と特異的に相互作用することを可能にする第二の機能を媒介することを担う。追加の阻害性タンパク質の置換及びDNA依存の燐酸化は、この活性化経路の最終ステップを組成物するかもしれない。
【００１２】
ステロイド受容体ファミリーのいくつかのメンバーのクローニングによって、異種起源の細胞システムでのホルモン依存性転写の再組成物が促進された。続いて、突然変異体及びキメラな受容体を備えた生体内（インビボ）及び生体外（インビトロ）での研究は、ステロイドホルモン受容体が構造的及び機能的に定義されたドメインへ組織される調節（モデュラー）タンパク質であることを実証した。十分に定義された66-68アミノ酸のDNA結合ドメイン(DBD)は遺伝学及び生化学的アプローチを使用して、特異的に同定され研究された。受容体のカルボキシル末端半分にあるリガンド(ホルモン)結合ドメイン(LBD)は約300のアミノ酸から成る。したがって、エストロゲン受容体(ER)のようなこれらのオルモン結合ドメイン(HBD)をを含んでいる、リガンド活性化された転写因子である。LBDはさらに、受容体の受容体二量化、hsp相互作用を担う配列及び受容体の二つのトランス活性化配列の一つを含んでいる。参照によってここに組込まれた、例えば、Nilsson
et al.,「エストロゲン・アクションのメカニズム」Physiol. Rev. 81(4):1535-1565(2001)）を参照されたし。
【００１３】
これらの要素をできるだけ適応可能で有用に利用してシステムを作るために、これらのキメラな調節タンパク質は、好ましくは、それらを所望の導入遺伝子のコントロールに特異的にするために、それらのDNA結合特異性を修飾される(WO 0l/30843A1(それはすべての目的のために参照によってここに組込まれる)を参照)。また、他の内因性遺伝子の修飾された活性を引き起こさないように、それらは好ましくはリガンド結合特異性を修飾される。
【００１４】
例えば、キメラなレギュレーターのLBDのための好ましい薬理学的特性は次の特徴を含むだろう:
1) ヒトで通常見つかる生理学的レベルの内因性ホルモンは受容体を活性化しない;
2)毒性なしで生体内で達成することができるレベル(投与量)の、カスタム設計された合成化合物によって受容体が活性化することができる;そして
3) 導入遺伝子調節のための要求された投与量では、合成化合物は不活性である、つまり、それは天然の内因性ホルモン受容体上に対してアゴニストでもアンタゴニストでもない。
【００１５】
遺伝子組み換え治療は、身体の外からのトランスフェクションした遺伝子の発現のレベルをコントロールする能力を要求する。そのような「分子スイッチ」は、好適には次の特性:特異性、選択性、正確性、安全性、及び迅速なクリアランスを含んでいる。遺伝子調節蛋白質のステロイド受容体ファミリーはそのような分子の理想的なセットである。これらのタンパク質は、ステロイドからレチノイド、脂肪酸、ビタミン、甲状腺ホルモン及び他の特異的にデザインされた小さな分子までに亘るリガンドに活性化される転写調節因子である。これらの化合物は受容体に結合し、アップ調節するかダウン調節する。化合物は現存するメカニズムによって身体から取り除かれる。また、化合物は無毒である。
【００１６】
リガンドの効能は受容体との相互作用の結果である。この相互作用は、受容体を活発に(アゴニスト)するか、受容体が不活性にさせる(アンタゴニスト)ような接触を含むことができる。DNA対するアンタゴニストに活性化された受容体のアフィニティ（親和力）はアゴニストに結合された受容体のそれに似ている。しかしながら、アンタゴニストの存在下で、受容体は転写を効率的に活性化することができない。したがって、この経路によってアップ調節及びダウン調節の両方が可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
修飾ステロイドホルモン受容体は、LBDのリガンド特異性の修飾により、導入遺伝子の調節された発現に使用するために開発されている(例えば、米国特許第5,874,534及び第5,935,934及びPCT公開第WO 98/18925(それは米国仮出願第60/029,964号への優先権を要求する)
を参照)。さらに、受容体のDNA結合ドメインは、酵母GAL4 DBD、ウイルスDBD、及び昆虫DBD結合ドメインから選ばれた哺乳類以外のDNA結合ドメインと置換され、哺乳類以外のDBDによって認識される領域を含む共投与された遺伝子の調節発現を提供する。しかしながら、これら構築物はいくつかの潜在的な欠点及び一般に柔軟性を欠いている。哺乳類以外のDBDは潜在的に免疫原である。また、これらのDBDによって認識される配列のアレイは限られている。したがって、用途が広く有効な遺伝子レギュレーターが依然として必要がとされている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明では、核酸配列の発現を調節することができる新規な修飾ステロイドホルモン受容体の構築物が記載される。これら構築物は修飾ステロイドホルモン受容体のトランス活性化機能のコントロールを可能にする。これら構築物は予想外に修飾受容体が、これら受容体に対する天然のリガンドと構造が実質的に異なる様々なリガンドに結合することを可能にする。更に、タモキシフェン誘導体である合成リガンドが本発明で提供される。しかしながら、これらの合成リガンドは、野生型のヒトエストロゲン受容体アルファで重要なアゴニストあるいはアンタゴニスト活性を欠く。この特性によって、合成物であって天然のリガンド(例えば天然のホルモン・エストロゲン)とは構造において十分に異なっている上記リガンド及び他のリガンドに応答するよう組織化することができる「分子スイッチ」を構築することが可能となり、その結果、天然のリガンドが生理的濃度で存在しえいる状態でさえ問題となるような影響がなく該スイッチを使用することができる。従って、これらの修飾スイッチは標的遺伝子をコントロールするか調節するこれまでの試みに関する本質的な改良を提供する。
【００１９】
したがって、本発明の一つの態様に従って、修飾ステロイドホルモン受容体タンパク質が提供される。この修飾ステロイドホルモン受容体タンパク質は様々な合成リガンドへ特異的に結合することができる。
【００２０】
好ましい一具体例において、本発明は、領域１における少なくとも一つのアミノ酸修飾、領域２における少なくとも一つのアミノ酸修飾、又は、領域１及び２の両方の夫々における少なくとも一つのアミノ酸修飾を有する修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインであって、少なくとも一つのアミノ酸修飾の結果、該リガンド結合ドメインが非内在性リガンドと相互作用する、前記ドメインを提供する。
【００２１】
一好適具体例では、少なくとも一つのアミノ酸修飾が配列番号５５における、３８８、３９１、４２１、４２４及び４２８の一つ又はそれ以上に対応する位置で生起する。
【００２２】
一好適具体例では、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンが他のアミノ酸と置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがアラニンと置換されている。配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがファニルアラニンと置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがバリンと置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがトリプトファンと置換されている。
【００２３】
一好適具体例では、配列番号５５における３９１に対応する位置のロイシンが他のアミノ酸と置換されている。
【００２４】
一好適具体例では、配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンが他のアミノ酸と置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンがバリンと置換されている。
【００２５】
一好適具体例では、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンが他のアミノ酸と置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがアラニンと置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがメチオニンと置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがフェニルアラニンと置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがロイシンと置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがバリンと置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがチロシンと置換されている。
【００２６】
一好適具体例では、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンが他のアミノ酸と置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがバリンと置換されている。
【００２７】
特に好適な具体例では、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンが他のアミノ酸と置換され、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンが他のアミノ酸と置換され、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンが他のアミノ酸と置換されている。特別に好適な具体例では、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがバリンと置換され、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがチロシンと置換され、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換されている。
【００２８】
特に好適な具体例では、配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンが他のアミノ酸と置換され、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンが他のアミノ酸と置換されている。特別に好適な具体例では、配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンがバリンと置換され、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換されている。
【００２９】
本発明の別の好適態様では、少なくとも一つのアミノ酸修飾が配列番号５５における、５２１及び５２４の一つ又はそれ以上に対応する位置で生起する。
【００３０】
一好適具体例では、配列番号５５における５２１に対応する位置のグリシンが他のアミノ酸と置換されている。一好適具体例では、配列番号５５における５２１に対応する位置のグリシンがアルギニンと置換されている。
【００３１】
特に好適な具体例では、配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンが他のアミノ酸と置換されている。特別に好適な具体例では、配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンがグリシンと置換されている。別の好適具体例では配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンがアラニンと置換されている。
【００３２】
本発明の別の態様によれば、本発明の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインと機能的（operatively）に結合した核酸結合ドメインを有する融合受容体タンパク質が提供される。好適具体例では、該核酸結合ドメインがＣ２Ｈ２結合ドメイン、ＧＡＬ４結合ドメイン、ウィルスＤＮＡ結合ドメイン、昆虫ＤＮＡ結合ドメイン、又は、非哺乳動物ＤＮＡ結合ドメインである。特に好適な具体例では、核酸結合ドメインはＣｙｓ２／Ｈｉｓ２亜鉛フィンガーペプチドの由来のモデュュラーユニットから成る。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、本発明の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインと機能的（operatively）に結合した核酸結合ドメイン、及び、更に、トランス活性化ドメインを含む融合受容体タンパク質が提供される。好適具体例では、トランス活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＴＡＦ−１、ＴＡＦ−２、ＴＡＵ−１、ＴＡＵ−２及びｐ６５、及び、例えばＳＴＡＴ−６を含むＳＴＡＴファミリーのメンバー由来の活性化ドメインから成る群から選択される。
【００３４】
本発明の別の態様によれば、本発明の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様によれば、本発明の融合受容体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子が提供される。
【００３６】
本発明の別の態様によれば、本発明の核酸分子に機能的に結合したプロモーターを含むキメラ構築物が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様によれば、本発明ののキメラ構築物を含有するプラスミドが提供される。
【００３８】
本発明の別の態様によれば、本発明ののキメラ構築物を含有する細胞が提供される。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、対象となる核酸配列に転写可能に結合したプロモーターの発現を調節するための分子スイッチであって、
（ａ）本発明の融合受容体タンパク質であって、該融合受容体タンパク質の核酸結合ドメインが該プロモーターに結合し、該プロモーターに該融合受容体タンパク質が結合したときに該融合受容体タンパク質のトランス活性化ドメインがプロモーターからの転写を引き起こすもの、及び、
（ｂ）該融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインに優先的に結合するリガンドであって、この結合によって転写ドメインが活性化され、対象となる核酸配列の転写が引き起こされるもの、を含む前記分子スイッチ、が提供される。
【００４０】
好適具体例によれば、修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが野生型エストロゲン受容体アルファに対しては実質的に非活性であるような濃度のリガンドによって活性化される。より好適な具体例では、リガンドがタモキシフェン誘導体である。特に好適な具体例では、融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、１）ＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプー１−エニル］フェノール；２）ＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル；３）ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル；４）ＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノール；及びそれらの非ヒドロキシル化形態から成る群から選択される化合物に結合する。
【００４１】
特別に好適な具体例では、融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域１における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがバリンと置換、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがチロシンと置換、及び、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換を有し、リガンドがＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノールである。
【００４２】
別の特別に好適な具体例では、融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域１における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンがバリンと置換、及び、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換を有し、リガンドがＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル、又は、ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステルである。
【００４３】
別の特別に好適な具体例では、融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域２における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンがグリシンと置換を有し、リガンドがＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノールである。
【００４４】
本発明の別の態様によれば、対象となる核酸配列の発現を活性化する方法であって、
（ａ）本発明のキメラ構築物及び対象となる核酸配列をを含む標的発現カセットで細胞を形質転換し、
（ｂ）該形質転換細胞において融合受容体タンパク質を発現させ、
（ｃ）該形質転換細胞を、該融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインに優先的に結合するリガンドであって、この結合によって該融合受容体タンパク質の転写ドメインが活性化され、対象となる核酸配列の転写が活性化されるリガンドと接触させることから成る、前記方法が提供される。
【００４５】
本発明方法の好適具体例としては、修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが野生型エストロゲン受容体アルファに対しては実質的に非活性であるような濃度のリガンドによって活性化される。より好適な具体例では、リガンドがタモキシフェン誘導体である。特に好適な具体例では、融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、１）ＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノール；２）ＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル；３）ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニルー２−プロペニル］−、メチルエステル；４）ＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノール；及びそれらの非ヒドロキシル化形態から成る群から選択される化合物に結合する。
【００４６】
本発明方法の特別に好適な具体例では、融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域１における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における３８８に対応する位置のメチオニンがバリンと置換、配列番号５５における４２４に対応する位置のイソロイシンがチロシンと置換、及び、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換を有し、リガンドがＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノールである。
【００４７】
本発明方法の別の特別に好適な具体例では、融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域１における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における４２１に対応する位置のメチオニンがバリンと置換、及び、配列番号５５における４２８に対応する位置のロイシンがアラニンと置換を有し、リガンドがＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル、又は、ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステルである。
【００４８】
本発明方法の別の特別に好適な具体例では、融合受容体タンパク質の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインが、領域２における以下のアミノ酸置換、配列番号５５における５２４に対応する位置のヒスチジンがグリシンと置換を有し、リガンドがＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプ−１−エニル）フェノールである。
【００４９】
本発明方法の好適具体例では、形質転換細胞がヒト又は動物であり、及び、形質転換細胞とリガンドとの接触が該リガンドの薬理学的投与量をヒト又は動物に投与することから成る。
【００５０】
本発明方法の好適具体例では、キメラ構築物及び標的発現カセットが別個のDNA分子上にあり、細胞に共形質転換される。
【００５１】
本発明の別の態様によれば、化合物ＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノールが提供される。
【００５２】
本発明の別の態様によれば、有効量の  化合物ＬＢＢ９３８  ４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェノール又はその医薬上許容可能な塩を、一種又はそれ以上の医薬キャリア、希釈剤及び／又は添加物とともに含有する医薬組成物が提供される。
【００５３】
本発明の別の態様によれば、化合物  ＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノールが提供される。
【００５４】
本発明の別の態様によれば、有効量の化合物  ＬＢＦ５８０  ４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプー１−エニル）フェノール又はその医薬上許容可能な塩を、一種又はそれ以上の医薬キャリア、希釈剤及び／又は添加物とともに含有する医薬組成物が提供される。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、化合物  ＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステルが提供される。
【００５６】
本発明の別の態様によれば、有効量の化合物  ＬＢＢ５５１  カルバミン酸、［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル又はその医薬上許容可能な塩を、一種又はそれ以上の医薬キャリア、希釈剤及び／又は添加物とともに含有する医薬組成物が提供される。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、化合物  ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステルが提供される。
【００５８】
本発明の別の態様によれば、有効量の化合物  ＬＢＣ０８１  カルバミン酸、［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−、メチルエステル又はその医薬上許容可能な塩を、一種又はそれ以上の医薬キャリア、希釈剤及び／又は付加物とともに含有する医薬組成物が提供される。
【００５９】
本発明の分子スイッチはヒトと動物における遺伝子治療での核酸配列の発現の調節のため使用することができる。さらに、それは、植物及び遺伝子組み換え（トランスジェニック）動物中の分子スイッチとして有用である。分子スイッチの好ましい具体例では、未修飾の形態における元のDNA結合ドメインが使用される。また、リガンド結合ドメインは、非天然リガンド、合成リガンド及び元のリガンドから成るグループから選ばれた化合物にのみ結合するように修飾される。
【００６０】
本発明のさらなる具体例では、遺伝子治療での核酸カセットの発現を調節する方法を含んでいる。この方法は、分子スイッチを遺伝子治療にしようされる核酸カセットに結合させるステップを含む。結合した分子スイッチを備えた核酸カセットは十分な投与量で、治療される動物かヒトへ導入することができる。その後、動物かヒトに修飾結合部位に結合するリガンドを投与することにより、分子スイッチはアップ調節（up-regulation）又はダウン調節（down-regulation）される。
【００６１】
他のさらなる特徴及び利点は、添付図面と共に開示のために与えられる本発明の現時点での好適具体例の記載から明白になるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
本発明は、新規な突然変異エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン(LBD)及び対応する非天然の小さな分子リガンドを提供する。これらの突然変異体ER-LBD−リガンド・ペアは理想的な分子スイッチ制御システムの基準の多くを満たすものである。ER-LBD及び小さな分子リガンドのこのような組み合わせは、ER-LBD及びリガンドの両方における構造に基づいた修飾によって作られた。このアプローチはＥＲ含むいくつかのシステムでの小さな分子−タンパク質相互作用の特異性を変更するためんい用いられる「衝突及び穴（bumps
and holes）」戦略に関連されたする（Belshaw 及び  Schreiber, J. Am. Chem Soc. 119: 1805-1806,
1997 及び Tedesco et．Al. Chem & Biol.8:277-287, 2001 参照)。本発明の具体例によって実証されるような結果は、合理的な設計及び領域の（部分的な）突然変異の組み合わせが小さな分子リガンドに対する新規で機能的な受容体標的を同定する効率的なアプローチであることを実証する。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン(ER-LBD)中の選択的なアミノ酸置換の生産により構築される。ヒトのエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン
(LBD)の三つの断片が使用された。これらは、F領域を備えた又はその領域のない、断片A、B及びC(図２参照)だった。本明細書において、F領域を備えたLBD断片を短形態（short
form）、及びLBD断片を備えたLBD断片を長形態（long form）と呼ばれる。即ち、ここに引用されたLBDの６個の断片がある:3つの短形態、LBDAS、LBDBS及びLBDCS、及び、3つの長形態、LBDAL、LBDBL及びLBDCL。
【００６４】
融合タンパク質であるC7LBDA及びC7LBDB(実施例４)の突然変異生成は、ER−LBDの上の様々な部位で選択されたアミノ酸を置換するためにオリゴヌクレオチドを媒介とした部位指定突然変異生成を使用して行なわれた(Stratagene;Quikchange, Site-directed Mutagenesis Kit)。これは、突然変異生成に使用されたオリゴヌクレオチドの配列を含めて実施例４に特異的に記載される。
【００６５】
融合タンパク質C7-LBD-Aは、ER LBDの具体的な断片であるLBD-Aと結合したC7と定義された具体的なCys2
His2ジンクフィンガー配列からできている。３個のER-LBD断片が定義される:A=ERアミノ酸283-554、断片B＝ERアミノ酸258-554、断片C=ERアミノ酸212-554。ER-LBDの突然変異体への言及はすべてヒトのエストロゲン受容体命名法を使用するだろう。例えば、G
521 Rは、野生型のER-LBDの中のアミノ酸位置521でグリシンの代わりにアルギニンを用いる突然変異体ER-LBDを意味する。
【００６６】
好ましい具体例では、突然変異させられたER LBDタンパク質は、アミノ酸212-554、258-554あるいは283-554の領域内に、突然変異したエストロゲン受容体リガンドを含んでいる。
【００６７】
「衝突及び穴」アプローチとして参照される蛋白工学及び薬設計の戦略を使用した結合エストロゲン受容体リガンド結合に関する突然変異生成研究によって、受容体リガンド結合ポケットのいくつかの大きく別個の領域が示された。Ruff et al. 「エストロゲン受容体のDNA及びリガンド結合ドメインの中の構造-機能関係」, Berast Cancer
Res. 2:353-359(2000)、及び、Eier et al.,「元のERa LBDの過剰発現、精製及び結晶構造」Protein Expr.
Purif.22:165-173(2001)(それらの両方は参照によってここに組込まれる)。
【００６８】
ER-LBDタンパク質−タモキシフェン結晶構造の分析に基づき、「領域１」は4-OH−タモキシフェンのエチル側鎖に隣接しているか近いエリアとして広く定義される。より特異的には、領域１は、ERリガンド結合ドメイン内のアミノ酸で組成物される。その任意の部分は、4-OH-Tamの位置ClOとしても知られる4-OH-Tamの中のエチル側鎖の末端炭素のおよそ９オングストローム以内にある。領域１は例えば、アミノ酸M388、L391、M421、I424及びL428含むがこれらに限定されない。
【００６９】
「領域２」はエストロゲンのDリングが位置するエリアとして広く定義される。より特異的には、領域２は、ERリガンド結合ドメイン内のアミノ酸で組成物される。その任意の部分は、4-OH-Tamの位置Cl4としても知られる、エストロゲンのDリングに対応する4-OH-Tamの中のエチル側鎖のパラ炭素のおよそ９オングストローム以内にある。領域２は例えばアミノ酸残基G521及びH524を含んでいるが、これらに制限されていない。
【００７０】
ER-LBDの中のこれらのアミノ酸部位の１つ以上で、野生型のアミノ酸をより大きいか若しくはより小さな物理的なサイズのアミノ酸、、異なる疎水性他の物理的特性を備えたアミノ酸を置換することによって、リガンド結合ドメインに変更されたリガンド反応性あるいは選択性が付与される。
【００７１】
したがって、発明の一つの具体例は、異なる物理的特性を備えた別のアミノ酸と置き換えられた結果、該タンパク質の結合特異性が変異したステロイドホルモン受容体タンパク質である。
【００７２】
好ましい具体例では、ステロイドホルモン受容体は、ER-LBD、あるいはそれのある部分、つまりヒトのエストロゲン受容体アルファである。
【００７３】
一つの好ましい具体例では、置換されたアミノ酸はER LBDの中の位置388、424及び428にある。
【００７４】
特に好ましい具体例では、アミノ酸置換は次のとおりである:wt ER LBDの中のメチオニンの代わりの位置388でのバリン;wt
ER LBDの中のイソロイシンの代わりの位置424でのチロシン;及び、wt ER LBDの中のロイシンの代わりの位置428でのアラニン。この突然変異体ER
LBDは「388V/424Yの/428A」と呼ばれる。
【００７５】
本発明の別の具体例では、置換されたアミノ酸はER-LBDの中の位置421及び428にある。
【００７６】
特に好ましい具体例では、アミノ酸置換は次のとおりである:wt ER LBDの中のメチオニンの代わりの位置421でのバリン、及びwt
ER LBDの中のロイシンの代わりの位置428でのアラニン。この突然変異体ER LBDは「421V/428A」と呼ばれる。
【００７７】
本発明の別の具体例では、位置524で単一のアミノ酸置換が作られる。
【００７８】
特に好ましい具体例では、これは野生型のER-LBD中のヒスチジンとER-LBDの位置524でのグリシンとの置換である。この突然変異体は「H524G」と呼ばれる。
【００７９】
位置388、391、421、424、428、521及び524の１つ以上でアミノ酸を置換することにより作成された野生型のER
LBDの突然変異体は、野生型のER LBDとは著しく異なるリガンド結合親和性を示す。これらの突然変異体は、エストロゲン又はタモキシフェンに対してほとんどない又は全く反応しないかもしれないが、本発明の注文仕様(custom-made)の新規な合成化合物によって特異的に活性化される。
【００８０】
例えば、下記の表１に示されるように、C7 ER 388V/424Yの/428Aのトランス活性化に関する生体外の薬理学的特性が、エストロゲン(E2)、4-水酸基のタモキシフェン(4-OHT)及び新規な合成化合物LBB
938で比較される。そこで見ることができるように、E2に対するEC50(nM)は216.5、4-OHTに対するEC50(nM)は157.7で、LBB 938い対するEC50(nM)は28.4である。
【００８１】
【表１】
2004537293.tif 000002
【００８２】
ヒーラ(HeLa)細胞は、pC7ERLBD 388V/424Y/428A及びp6x2C7Lucリポーター・プラスミドで共形質転換され、実施例１に記載されるような化合物0.1〜1000のnMで投与された。実施例５(wt
ERに対する薬物活性化)に記載されるように、各化合物にはふさわしいS字状曲線の用量応答曲線が見られた。EC5O価値は、２つ以上の実験からの平均を表わす。
＊p＜0.05（4-OHTあるいはエストラジオールと比較して、EC5O値の差は統計的に有意である）
【００８３】
したがって、突然変異体ER LBD 388V1424Y1428Aは、エストロゲンのような野生型受容体の通常のリガンドに比べて、LBB
938に対しておよそ８倍も感度が高い。
【００８４】
本発明の具体例において、化合物LBB 938は分子スイッチの一部としてER LBD
388V/424Yの/428Aを活性化するためにリガンドとして使用することができる。LBDを活性化するために必要なLBB 938のレベルは生体外か生体内で得ることが出来るものである。さらに、ヒトを含む動物における正常な内因性レベルのエストロゲンはレベルがナノモル以下であるので、これらは分子スイッチの機能にほとんど効果を持たない。
【００８５】
したがって、本発明の一つの態様は、分子スイッチのLBD中の388V/424Y/428A突然変異体、及びスイッチの活性化をコントロールする新規な化合物LBB
938の使用である。
【００８６】
本発明の別の態様は、スイッチを活性化するために使用されるリガンドとしての合成のLBB
551あるいはLBC 081のいずれかの使用とともに、分子スイッチの一部として突然変異体LBD 421V/428Aの使用である。以下の表２中で示されるように、C7
ER 421V/428Aに対するカーバメートタモキシフェントランス活性化の薬理学的プロフィール、LBB
551及びLBC 081両方のEC50(nM)は、E2のそれにそれぞれ似ている(つまり、4.89、11.66及び7.23)。しかしながら、エストロゲンの7.23
nMという濃度はヒト中の正常な内因性エストロゲン濃度よりはるかに高い。したがって、421V/428Aの突然変異体を含んでいるLBDを活性化するエストロゲンの内因性レベルの能力は無視できる。しかしながら、LBD突然変異体421V/428A
を含む分子スイッチを活性化するのに十分な濃度のLBB 551あるいはLBC 081は対象へ薬剤を投与することによって容易に得ることができる。更に、421V/428Aのスイッチを活性化するのに必要なLBB
551あるいはLBC 081のレベルは、野生型ERに対するこれら化合物のいずれの1C50以下である(表４を参照)。
【００８７】
【表２】
2004537293.tif 000003
【００８８】
ヒーラ(HeLa)細胞は、pC7ERLBD 388V/424Y/428A及びp6x2C7Lucリポーター・プラスミドで共形質転換され、実施例１(細胞に基づいたリポーター分析)に記載されるような化合物0.003〜1000のnMで投与された。EC5O値は、２つ以上の実験からの平均を表わす。
【００８９】
したがって、本発明の別の態様は、化合物LBB 551あるいはLBC 081のいずれかの投与によってコントロール又は活性化される分子スイッチのLBD中の421V/428A突然変異体の使用である。
【００９０】
本発明の別の態様は、スイッチを活性化するために使用されるリガンドとしての新規な化合物LBF
580の使用とともに分子スイッチの一部として突然変異体LBD H524Gを使用することである。図６は、10 nMの濃度で様々なリガンドによるH524Gの折り畳み誘導（fold
induction）を示す。この濃度では、エストロゲンと比較して、LBF 580はH524Gの誘導の程度がほとんど９倍の能力がある。下記の表３は、H524G突然変異体に対するエストロゲンのEC5Oがエストロゲンの正常な内因性レベルよりはるナノモル以下の濃度では有意に活性化されない。しかしながら、下記の表４は、野生型のエストロゲン受容体に対するこの化合物の1C50が252.3であることを示す。これは、野生型のエストロゲン受容体にほとんど影響がない一方で、H524G突然変異体を活性化するために使この化合物を用することができる大きな濃度範囲を実証するものである。
【００９１】
【表３】
2004537293.tif 000004
【００９２】
更に、生体内で中の分子スイッチを活性化するリガンドとして使用することができる本発明の新規な化合物の能力は以下の表４中で示される。表４は、それは野生型のERへのE2 トランス活性化に対する４つの新規な修飾タモキシフェン誘導体の低い阻害活性を示す。野生型のERに対するこれらの化合物の阻害活性は、それらの化合物である4-水酸基のタモキシフェンと比較して最小である。
【表４】
2004537293.tif 000005
【００９３】
実施例５(wt ERの上の薬活性化)に記載されるように、COS-7細胞はpHEGOとpERETkLucのリポーター・プラスミドで共形質転換され、E2＋0.1-1000nMの化合物で投与された。1C50値は、２以上実験からの平均を表わす。
＊p＜0.05（4-OHTと比較して1C50値の差は統計的に有意である。
【００９４】
したがって、分子スイッチで、ER LBDの特異的な突然変異体及び特異的な新規なタモキシフェン誘導体の組み合わせを使用することの有用性は、突然変異体ER
LBDが生理的濃度にエストロゲンに完全ではないにしても最小の応答しかせずに、従って、これら変異体のいずれも、内因性エストロゲン・レベルからの問題となるような妨害を受けずに分子スイッチ中で使用できる点に見出される。さらに、新規なリガンドは野生型のER受容体に対しては最小の活性を持っている。この特性によって、ヒトを含む動物へのエストロゲンの薬理学的に有効な抑制剤の投与によって生じる副作用を回避することができる。
【００９５】
本発明は更に、変異ステロイドホルモン受容体タンパク質を含んでいるプラスミドを提供する。
本発明のプラスミドは、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーにおけるいずれかのホルモンの突然変異体タンパク質を含んでいても良い。
【００９６】
本発明は、さらにそこに挿入された変異ステロイドホルモン受容体タンパク質を有するプラスミドを含有するトランスフェクションされた細胞を提供する。トランスフェクション用の有用な細胞は酵母、哺乳類及び昆虫細胞を含んでいる。
【００９７】
本発明は、さらに本発明のプラスミドで形質転換された安定した細胞ライン（細胞系）を提供する。
【００９８】
本発明の別の具体例は、遺伝子治療での異種起源の核酸配列の発現を調節するための分子スイッチである。
【００９９】
本発明における遺伝子治療での異種起源の核酸カセットの発現を調節するための分子スイッチの態様の一つの具体例では、修飾リガンド結合ドメインに結合した天然のステロイド受容体DNA結合ドメインを含んでいる修飾ステロイド受容体を含む。
【０１００】
分子スイッチの好ましい具体例では、修飾リガンド結合ドメインはヒトのエストロゲン受容体アルファからで、非天然のリガンド、合成リガンドあるいは非天然のリガンドであるリガンド化合物だけを結合する。当業者であれば、修飾リガンド結合ドメインは内因性エストロゲンのような天然のリガンドに結合するかもしれないが、それは些細な結合であり、そしてもしあったとしても僅かな調節である。
【０１０１】
好ましい具体例では、修飾ステロイド受容体は、次のものから成るグループから選ばれたDNA結合ドメインと置換されたDNA結合ドメインを備えたヒトのエストロゲン受容体アルファである:Cys2His2タイプ(C2H2)、GAL-4
DNA、ウィルスDNA結合ドメイン、昆虫DNA結合ドメイン及び哺乳類以外のDNA結合ドメイン。
【０１０２】
分子スイッチはトランス活性化ドメインの追加によってさらに修飾することができる。通常使用されるトランス活性化ドメインとしては、VPl6、TAF-l、TAF-2、TAU-l、及びTAU-2及びp65を含んでいる。当業者は、様々な他のトランス活性化ドメインが利用可能であることを容易に認識するだろう。
【０１０３】
好ましい具体例では、分子スイッチは、変異ヒトエストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメイン、Cys2His2ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、及びTA2のようなトランス活性化ドメインを含む。
【０１０４】
当業者であれば、適当なトランス活性化ドメイン、リガンド結合ドメイン及びDNA結合ドメインの選択により、分子スイッチが組織特異的になることを容易に認識するだろう。特に、当業者であれば、或る組織に特異的なトランス活性化ドメインを加えることによって、分子スイッチがその組織でのみ働くだろうということを認識する。さらに、標的遺伝子への組織特異的シス要素の追加によって、組織特異的発現を提供する助けとなるであろう。
【０１０５】
本発明は、さらに遺伝子治療での核酸カセットの遺伝子発現を調節する方法の構想を描く。この方法は、遺伝子治療の中で使用される核酸カセットに分子スイッチを付ける（結合させる）ステップを含む。好ましい具体例では、発現される核酸配列は異種起源である。組み合わせられた核酸カセット/分子スイッチは、治療される動物若しくはヒトへ、又は遺伝子組み換え動物若しくは植物中へ、薬理学的投与量で投与される。
【０１０６】
当業者であれば、生体内及び生体外の両方のいて、様々な方法で細胞へ結合した核酸カセット/分子スイッチを導入することができることを容易に理解する。その導入はトランスフェクション又は形質導入によることができる。核酸カセット/分子スイッチが細胞へ導入された後に、修飾リガンド結合部位を結合する薬理学的投与量のリガンドをヒト又は動物に導入することにより、得られた形質転換細胞におけるカセットをアップ調節するかダウン調節することができる。
【０１０７】
本発明の一つの具体例では、分子スイッチを核酸カセットに結合するステップを含む、遺伝子治療での核酸カセット発現を調節する方法がある。この分子スイッチ/核酸カセットは形質転換細胞を形成するために細胞へ導入される。その後、形質転換細胞は、遺伝子治療のためにヒトか動物へ薬理学的投与量で適用される。
【０１０８】
別の具体例では、分子スイッチ/核酸カセットは、遺伝子治療のために生体内の標的細胞に直接注入される。
【０１０９】
リガンド活性化転写レギュレーターとして機能するポリペプチド、及び、このようなポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。ポリペプチドは、任意の所望の内因性又は外来性の遺伝子を穂標的とすることができるリガンド活性化転写レギュレーターである融合タンパク質である。
【０１１０】
融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸を含んでいる発現ベクター、及び発現ベクターを含んでいる細胞が提供される。融合タンパク質、又は融合タンパク質をコードする核酸(特にベクター)は細胞へ導入することができ、細胞の中で発現されたとき、リガンド依存のやり方で遺伝子発現を調節する。
【０１１１】
融合タンパク質
ここに提供された融合タンパク質は、細胞内の受容体からのリガンド結合ドメイン(本明細書において「LBD」という)、好ましくはLBDが由来する元の細胞内の受容体と比較して修飾されたリガンド特異性を有しているLBD、及び、任意の所望の特異性に適合可能な核酸結合ドメイン(本明細書において「DBD」という)を含んでいる。融合タンパク質はさらに転写調節ドメイン(本明細書において「TBD」という)、
特にリプレッサーあるいはアクチベータードメインを含むことが出来る。これらのドメインは、機能可能なように結合され、それによって生じる融合タンパク質がリガンドに調節されターゲットとされた転写調節因子として機能する。
【０１１２】
細胞に核に運搬された時、上記ドメイン(それらは機能可能なように結合される)はターゲットとされた、細胞の元の遺伝子、あるいは細胞に運搬される遺伝子の発現を調節する(modulate) ために共に作用する。従って、ターゲットとされた遺伝子は内因性細胞の遺伝子あるいは外来から供給された組み換えポリヌクレオチド構築物であり得る。融合タンパク質は、さらにターゲットとされた遺伝子の転写を活性化するか、増強するか、抑えるために選択されている転写調節する領域を含むことができる。
【０１１３】
別の具体例では、融合タンパク質は天然の遺伝子に結合し、リガンド依存の様式で天然の遺伝子の転写を調節する。別の具体例では、融合タンパク質は外来から供給された組み換え構築物に結合し、リガンド依存の様式で該外来から供給された組み換え構築物の転写を調節する。
【０１１４】
好ましい具体例では、ポリヌクレオチドと結合したときに、分離された組み換えの融合タンパク質は二量体を形成する。二量体はホモダイマー又はヘテロダイマーでありえる。一つの具体例では、二量体は少なくとも一つのDNA結合ドメインを含んでいる、少なくとも一つ、好ましくは２つのリガンド結合ドメイン及び少なくとも一つの転写調節ドメインを有している。
【０１１５】
リガンド結合ドメイン(LBD)
好ましい具体例では、LBDは細胞内の受容体、特にステロイドホルモン受容体に由来する。LBDが由来する受容体としては、これらに制限されないが、グルココルチコイド受容体、無機質コルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、レチノイドＸ受容体、ビタミンＤ受容体、COUPTF受容体、エクジソン受容体、Ｎｕｒｒ−１受容体、無名（オーファン：orphan
）受容体、及びそれらの変異体が含まれる。これらのタイプの受容体には、制限されないが、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、グルココルチコイドα受容体、グルココルチコイドβ受容体、アンドロゲン受容体及び甲状腺ホルモン受容体が含まれる。LBDは内因性リガンドと比較して、それらが、薬のような外来のリガンドに優先的に結合するように、リガンド特異性が修飾されていることが好ましい。
【０１１６】
ヒトの遺伝子治療を意図した時、実質的な免疫応答を避けるためにヒトリガンド結合ドメインとの十分な同一性、好ましくは少なくとも約90%配列同一性、より好ましくは少なくとも約95%配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を保持する。
【０１１７】
LBDが由来する受容体用の内因性リガンドには結合しないが、ターゲットとされた遺伝子の精密に調整された調節を可能にするように選択されたリガンドに結合するように、LBDは好ましくは修飾される。従って、ある具体例では、リガンド結合ドメインは元の受容体の選択性と比較してそのリガンド選択性を修飾される。好ましくは、修飾リガンド結合ドメインは、内因性リガンドによって実質的に活性化されない。系統的な配列変更及び特異性のためにテスト、及び選択プロトコルを含む、任意のリガンド選択性変更方法を使用することができる(参照、例えば、米国の特許の第5,874,534号、Wang
et al., (1994)Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.91:8180-8184)。
【０１１８】
核酸結合ドメイン（DBD）
ターゲットとされ特異的な転写調節を達成するために、DBDは少なくとも一つのジンクフィンガー・モジュラー・ユニットを含んでおり、ターゲットとされた遺伝子に結合するために設計される。ジンクフィンガー核酸結合ドメインは、選択されたヌクレオチド配列に結合する少なくとも二つのジンクフィンガー・モジュールを含んでいる。任意のジンクフィンガーあるいはそのモジュール部分を使用することができる。DBDは、リガンド結合ドメインが由来する受容体中の天然のジンクフィンガー領域を置換するか又は補足することができる。
【０１１９】
核酸結合ドメイン(DBD)は少なくとも一つ、好ましくは、少なくとも二つのジンクフィンガー核酸結合ポリペプチドのモジュラー・ユニット(各モジュラー・ユニットは塩基の３つのヌクレオチド配列を特異的に認識する)を含んでいる。生じるDBDは、3から約18個のヌクレオチドの連続する配列に結合する。注意されるように、DBDはモジュールのジンクフィンガー・ユニットを含んでいる。そこでは、各ユニットはそれぞれトリヌクレオチドに特異的である。生じるドメインが任意のターゲットとされた配列（一般的にはＤＮＡ）に特異的に結合するように、モジュールの亜鉛タンパク質ユニットは組み合わせることができ、ターゲットとされた配列に融合タンパク質が結合すると、ターゲットとされた配列の転写が調節される。
【０１２０】
融合タンパク質のジンクフィンガー・ヌクレオチド結合部分は、切断又は伸長によって、あるいは部位特異的突然変異プロセスによる野生型由来のポリペプチドの変異体として、若しくは、様々なモジュラー・ユニットの組み合わせ、又はそれら各方法の組み合わせによって、野生型のジンクフィンガー・タンパク質に由来するか又はそれから生産することができる。
【０１２１】
Cys2His2(C2H2)タイプ・ジンクフィンガー・タンパク質は、ステロイド受容体中のC4-C4タイプドメインのような細胞内受容体中の天然DNA結合ドメインと置換することができ、機能的なリガンド応答性転写調節因子融合タンパク質を形成するためのジンクフィンガーの典型例である。ジンクフィンガーによって、生じる融合タンパク質は未修飾の細胞内の受容体と比較して変更されたDNA結合特異性を示す。
【０１２２】
ステロイド受容体のためにここに実施例として挙げられるように、使用する受容体のリガンド結合領域(LBD)、ジンクフィンガー配列及び範囲、並びにDNA結合の化学量論及びオリエンテーションのの最適の部分は経験的に決定することができる。
【０１２３】
好ましい具体例では、融合タンパク質のジンクフィンガー部分は、式(GNN)nのヌクレオチド配列（Gがグアニジン、Nは任意のヌクレオチド、nは1〜6までの整数、典型的にnは3〜6である）に結合する。好ましくは、ジンクフィンガー・モジュラー・ユニットはC2H2ジンクフィンガー・ペプチドに由来する。
【０１２４】
転写調節ドメイン（TRD)
融合タンパク質は、さらに転写調節ドメインを含むことができる。好ましい具体例では、転写調節ドメインは転写活性化ドメインを含んでいる。好ましくは、転写調節ドメインは、融合タンパク質がヒトの遺伝子治療を意図する場合には、不適当な免疫学反応を誘導しないようにするために、ヒトを含む哺乳類転写調節ドメインに対して少なくとも約90%の配列同一性を持っている。より好ましくは、この配列同一性は少なくとも約95%である。また、最も好ましくは、この配列同一性は少なくとも約99%である。
【０１２５】
転写調節ドメインは、真核生物の転写を調節すると知られているか又はそのように調製された任意のそのようなドメインであり得る。そのようなTRDは知られており、以下のものに制限されないが、VPl6、VP64、TM、STAT-6、p65、若しくはこれらに由来した部、又は、転写調節特性を示すようなこれらの誘導体、多量体（マルチマー）、及び組み合わせを含む。転写調節ドメインは、核ホルモン受容体転写活性化(あるいは抑制)ドメインのような細胞内の受容体に由来する場合ことができ、好ましくはステロイドホルモン受容体転写活性化ドメインか、又は、転写調節特性を示すその変異体である。転写調節ドメインは、これらに制限されないが、TAF-1、TAF-2、TAU-1、TAU-2、及びそれらの変異体を含む。
【０１２６】
転写調節ドメインはウイルスの転写活性化ドメイン又はその変異体でも良い。好ましくは、ウイルス転写活性化ドメインはVP16転写活性化ドメイン又はその変異体を含む。
【０１２７】
転写調節ドメインは転写抑制ドメインを含むことができる。そのようなドメインは知られており、これらに制限されないが、ERD、KRAB、SID、デアセチラーゼ、並びに、KRAB-ERD、SID-ERD、(KRAB)2、 (KRAB)3
、(KRAB-A)、 (KRAB-A) 2、 (SID) 2 (KRAB-A)-SID、及びSID-(KRAB-A)のような、それらの組み合わせ、多量体、及び誘導体の中から選択された転写抑制ドメインが含まれる。
【０１２８】
核酸構築物
さらに、得られる融合タンパク質をコードする核酸分子が提供される。核酸は、タンパク質発現に適当なベクター、及び／又は遺伝子治療にふさわしいベクターに含むことができる。ベクターを含んでいる細胞も提供される。典型的には細胞は真核細胞である。他の具体例では、細胞は原核細胞である。
【０１２９】
更に、特に、リガンドが融合タンパク質のLBD に結合したときに、ここに提供した融合タンパク質が結合して調節する核酸配列のような、転写調節領域又は応答要素に機能的に結合された、対象となる遺伝子、特に血液造成阻害剤のような治療用生産物をコードする遺伝子を含有する発現カセットが提供される。そのような発現カセットは、遺伝子治療のためのベクターに含むことができ、融合タンパク質又はそれをコードする核酸の投与と共に、その前に、又は、その後に投与されることが意図される。外来運搬の対象となる遺伝子は、典型的には成長因子、成長因子抑制剤あるいはアンタゴニスト、腫瘍壊死因子(TNF)抑制剤、抗腫瘍物質、血管形成物質、抗血管形成物質、凝固因子のような治療用タンパク質、又はアポトーシス及びその他の自殺遺伝子をコードする。
【０１３０】
組成物、組み合わせ及びキット
さらに、融合タンパク質、又は融合タンパク質をコードしたベクターを含んでいる組成物が提供される。融合タンパク質による活性化のために選ばれた調節領域とターゲットとされる遺伝子をコードする核酸、及び、融合タンパク質あるいは該融合タンパク質をコードする核酸の組み合わせも提供される。
【０１３１】
組成物、特に、医薬上許容可能なキャリアーに融合ポリペプチドを含んでいる医薬組成物も提供される。さらに、組成物、特に、本発明の合成リガンドを含んでいる医薬組成物が提供される。
【０１３２】
発現カセット及び融合ポリペプチドあるいは核酸分子の組み合わせ、特に、融合ポリペプチドをコードする発現ベクターが提供される。該組み合わせは個別の組成物あるいは両方の要素を含んでいる単一の組成物を含むことができる。このような組み合わせ、及び、適宜、それの投与に関する指示、及び組み合わせを調製し投与するのに使用される他の試薬を含むキットも提供される。
【０１３３】
従って、融合タンパク質をコードする核酸、典型的には遺伝子治療にふさわしいベクターを含む、遺伝子治療にふさわしい組成物が提供される。好ましいベクターはウイルスのベクター、好ましくはアデノウイルスのベクター及びレンチウィルスベクターを含んでいる。他の具体例では、DNAリガンド複合体、アデノウイルス・リガンドDNA複合体、DNAの直接注射、CaPO4沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、リポソーム及びリポフェクションを含む非ウイルスの運搬システムが提供される。
【０１３４】
遺伝子発現を調節するのにふさわしい組成物は有効な量の融合タンパク質、又は、リガンド活性化転写調節融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び医薬上許容可能な補助剤を含んでいる。そのような組成物は、遺伝子、及び、融合ポリペプチドのヌクレオチド結合ドメインによって認識される該遺伝子用の少なくとも一つの反応要素をコードする調節可能な発現カセットをさらに含むことができる。
【０１３５】
調節可能な発現カセットは、リガンド活性化転写調節融合タンパク質の核酸結合ドメインと相互作用する核酸配列を含むように設計されている。それは、さらに好ましくは、融合タンパク質のTRDによって調節可能なように機能可能に結合した転写調節配列を含んでいる。典型的には、調節可能な発現カセットは３〜６つの反応要素を含んでいる。
【０１３６】
方法
内因性・外来性の遺伝子の発現を調節する方法が提供される。この方法は細胞へ、有効な量又は濃度の融合タンパク質、又は、該融合タンパク質をコードするベクターのような核酸分子を投与することによって実施される。融合タンパク質の核酸結合ドメイン(DBD)は、細胞のゲノム中の、あるいは外来性に投与された核酸分子中のターゲットとされた核酸配列に結合するように選択され、転写調節ドメイン(TRD)は、典型的にはターゲットとされた核酸を機能可能に結合したものであるように選択されたプロモーターからの転写を調節するために選択されている。外来的に投与された核酸分子は、対象となる遺伝子をコードし、機能可能なようにプロモーター及び反応要素のような要素に結合された発現カセットを含む。
【０１３７】
ターゲットとされた調節領域及び対象となる遺伝子が細胞中に内生的に存在しているか、又は、対象となる遺伝子をコードする発現カセットの一部として別々に投与されても良い。もし別々に投与されれば、それは、遺伝子、及び、融合タンパク質のヌクレオチド結合領域によって認識される該遺伝子用の少なくとも一つの反応要素を含んでいる調節可能な発現カセットの一部として投与される。
【０１３８】
同時にあるいは後で、融合タンパク質の結合ドメインをリガンドに結合するリガンドを含んでいる組成物も投与される。リガンドは、融合タンパク質(あるいは、コードする核酸分子)と同じ組成物中で、あるいは個別の組成物中で投与することができる。リガンド及び融合タンパク質は、連続して、同時にあるいは断続的に投与することができる。
【０１３９】
従って、遺伝子治療は、融合タンパク質のLBDに結合するリガンドの投与により達成される。好ましくは、リガンドは非天然又は合成リガンドである。また、優先的に選択的に非天然のリガンドと相互作用するために、LBDは元の細胞内の受容体の中にある元の形態から修飾されている。投与されると、リガンドは、融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合し、それによって、モノマー又は二量体のどちらかである、融合タンパク質のDBDがターゲットとされた遺伝子と相互作用し、ターゲットとされた遺伝子の転写が抑制されるか活性化される。記載したように、ターゲットとされた遺伝子は内因性遺伝子あるいは外来的に投与された遺伝子でありえる。
【０１４０】
他の具体例では、細胞の遺伝子発現を調節する方法は、リガンド活性化転写調節融合タンパク質をコードする、有効な量の核酸分子、該核酸分子にコードされるポリペプチドの核酸結合ドメインによって認識される遺伝子の少なくとも一つの応答要素に結合する該遺伝子を含んでいる調節可能な発現カセット、及び、医薬上許容可能な補形薬を含む組成物を投与し；そして、細胞へコードされたポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合するリガンドを投与し、ここで、コードされたポリペプチドのヌクレオチド結合ドメインは応答要素に結合し、遺伝子の転写を活性化するか又は抑制する。
【０１４１】
ここに例証された結果は、哺乳類細胞へ導入された導入遺伝子の発現のリガンド依存のコントロールを得る目的で、ターゲットとされた遺伝子の転写をリガンド活性化すること、及び、哺乳類のC2H2 DNA結合ドメインのようなジンクフィンガーDNA結合ドメイン、エストロゲン受容体のような細胞内の受容体からから修飾又は変更させられたリガンド結合ドメイン、及び、適宜、異種起源の転写調節ドメインを含んでいる融合タンパク質の有用性を実証する。従って、ターゲットとされた遺伝子のリガンド依存の遺伝子発現を達成するために、様々な変異させられた細胞内の受容体と異種起源のジンクフィンガーヂメインが結合することができることが本明細書において示される。
【０１４２】
本発明は、受容体は、その構造が天然のリガンドと劇的に異なる様々なリガンドと結合するように修飾されることが可能であることを示す。本発明のER突然変異体の作成方法に関しては実施例４を参照されたし。特異的な部位での野生型のアミノ酸の代わりに特異的なアミノ酸の置換及び切断を含む野生型のアミノ酸配列配列の選択的な置換によって、リガンドの親和性及び機能が変更される結果となる。受容体突然変異体をスクリーニングすることによって、宿主細胞自身の受容体を活性化しないリガンドに応答するように、受容体をカスタマイズすることができる。したがって、カスタマイズされた受容体に結合し調節するリガンドを使用して、所望の導入遺伝子の調節を達成することができる。
【０１４３】
ステロイド受容体及び他の哺乳類転写レギュレーターは酵母中で機能することができる。この事実は酵母の遺伝子操作の容易さと結び付けられ、ステロイドホルモン・アクションのメカニズムを検討する為にかかるシステムが有用であるものになる。
【０１４４】
定義
もし他の方法で定義されなかったならば、ここに使用される技術的・ファミリー学用語はすべて、本発明が属する技術における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を持っている。本明細書の開示のいかなる場所においても参照した、特許、出願、公開された出願、及びGenBank及び他のデータベースからな配列はすべて、参照されて、それら全体として、及びすべての目的のために組み入れられる。
【０１４５】
本明細書において、用語「不活性な」又は「実質的に不活性な」は、突然変異受容体対野生型の受容体上の合成リガンドの活性を比較する情況中で、これら受容体／薬剤の組み合わせが、野生型の受容体上においてその結果如何なる活性がない状態で導入遺伝子の選択的な調節を可能にすることを意味する。そのため、受容体/薬剤の組み合わせは次の特性を持っている:合成リガンドはEC5O(ナノモル濃度中)を有している[EC50=最大活性の50%を提供する濃度]で、それは野生型の受容体上での化合物1C50(50%の活性阻害を生じるナノモル濃度)より少なくとも１０倍低い。例えば:LBB
938は、およそ28nMのその好ましい標的388V1424Y1428A上のEC5O、及び380nM以上の野生型ER上の1C50を持っている。化合物が1C50濃度の1/10以下の投与量で使用される場合、野生型ER上の妨害作用は、一般に野生型の受容体上での全活性の10%以下である。そのような化合物は野生型ERに対して不活発か実質的に不活発だろう、と考えられる。
【０１４６】
本明細書において、「リガンド結合ドメイン」(LBD)は、ここに提供された融合タンパク質の選択されたリガンドに結合することに関与する融合タンパク質の部分を意味する。LBDは、適宜好ましくは二量化と不活性化の機能を含んでいる。タンパク質中のLBDは、細胞内の受容体、特にステロイドホルモン核受容体スーパーファミリーのメンバーのおよそ300のアミノ酸カルボキシル末端側のの半分に由来する。それは、リガンドと相互作用して、活性化された受容体と標的遺伝子の調節要素との特異的な会合に結びつく事象（イベント）のカスケードを誘導する、受容体タンパク質の部分である。これらの受容体では、LDBはホルモン結合機能、熱ショック蛋白質(hsp)との相互作用によるような不活性化機能、及び二量化機能を含む。本明細書におけるLBDは、このようなLBD及びその修飾誘導体(特に変更されたリガンド特異性を備えた形態)を含んでいる。
【０１４７】
本明細書において「転写調節ドメイン」(TRD)は、遺伝子転写を調節する機能を有し、本発明で提供された融合ポリペプチドの部分である。転写活性化ドメインの好適な例としては、制限されないものとして、VP16、VP64、TA2、STAT-6、p65、あるいはこれらに由来する部分及び誘導体を挙げることが出来る。転写抑制（リプレッサー）ドメインの好適な例としては、制限されないものとして、ERD、KLRAB、SD、デアセチラーゼ、及び、SID-ERD、（KRAB）2、(KRAB)3、KRAB-A、(KRAB-A) 2、 (SID) 2 (KRAB-A)-SID及びSID(KRAB-A)のようなそれらの誘導体、多量体（マルチマー）及び組み合わせを挙げることが出来る。
【０１４８】
本明細書において「転写調節領域」は、標的細胞の中で遺伝子発現を駆り立てる領域を参照する。
本発明において適当な転写調節領域としては、制限されないが、ヒトのサイトメガロウイルス(CMV)前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０前初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウィルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＰＧＫ、及びＣＭＶエンハンサーと結合したαアクチンプロモーターを挙げることが出来る。
【０１４９】
本明細書における用語「核酸カセット」は、細胞内に一時的に、永久に又はエピゾームとして取り込まれた後に、タンパク質、ペプチド、又はRNAを発現することができる、対象の遺伝物質を指す。カセット中の核酸が転写することができ、必要な場合、細胞の中で翻訳することができるように、核酸カセットは他の必要な要素とともにベクター中で位置及び順序を指示される。
【０１５０】
キメラ遺伝子/キメラ構築物:プロモーター又は調節DNA配列が、mRNAをコードするか又はタンパク質として発現されるＤＮＡに機能可能に結合するか、又は関連（会合）させられている組み換えDNA配列であって、調節（レギュレーター）DNA配列が関連するDNA配列の転写あるいは発現を調節することができるもの。キメラ遺伝子/キメラ構築物のレギュレーターDNA配列は、自然状態では、通常は関連するDNA配列に機能可能なように結合されていない。
【０１５１】
対応（する）:本発明において「対応（する）」は、照会される（クエリー）エストロゲン受容体のアミノ酸配列と主題のエストロゲン受容体(例えば配列番号Ｘで与えられたヒトのERa配列)のアミノ酸配列配列とを整列(align)させた場合、配列番号Ｘのある番号位置に「対応する」照会されるエストロゲン受容体配列のアミノ酸は配列番号Ｘのこれらの位置で整列するが、必ずしも、主題のエストロゲン受容体アミノ酸最列の同じ番号位置を有するものではない、ことを意味する。
【０１５２】
本明細書において「DNA結合ドメイン」(DBD)、又は、「核酸(あるいはヌクレオチド)結合ドメイン」は、特異的な核酸結合能力を提供する、本発明で提供される融合ポリペプチドの部分を意味する。DBDという省略の使用は、それをDNA結合ドメインに制限するのが目的でなく、RNAにも結合するポリペプチドも含むように意図される。核酸結合ドメインは、プロモーター内へ操作された特異的なDNA配列に結合するべき能力によって、特異的な遺伝子へタンパク質をターゲットさせる機能を有する。DBDは、選択されたターゲットとされた内因性又は外来性の遺伝子又は遺伝子群へ、融合タンパク質をターゲットさせる（向かわせる）。
【０１５３】
関連した（会合した）された/機能的に（機能可能なように）結合された（operably
linked）:物理的にあるいは機能的に関連する２つのDNA配列を意味する。例えば、プロモーター又は調節DNA配列は、RNA又はタンパク質をコードするDNA配列と機能可能に結合するか、又は、調節DNA配列がコードするか構造DNA配列の発現レベルに影響するような状況である場合には、該DNA配列に「関連する」といわれる。本明細書において、「機能的に（機能可能なように）結合された（結合した）」とは、融合ポリペプチドの要素が、例えば、夫々が意図されたように実施されるか又は機能するように結合されることを意味する。例えば、活性剤は、結合ドメイン経由で標的ヌクレオチドに結び付けられたときに活性剤は転写を促進すべく機能するような仕方で、結合ドメインへ結合される。各要素間のリンケージは直接、又はリンカーを介するような間接的でも良い。要素は必ずしも隣接していない。従って、TRDのリプレッサードメインは当該技術において周知な任意のリンク手段を用いてDNA結合ドメインに結合することができる。２つのドメイン間のリンカー部分を含むことが必要かもしれない。そのようなリンカー部分は、典型的には、ドメイン間に間隔を提供するアミノ酸残基の短い配列である。リンカーが、結合ドメインあるいはリプレッサードメインの機能のうちのどれにをも干渉しない限り、どのような配列も使用することができる。
【０１５４】
本明細書において「融合タンパク質」は、融合タンパク質を構成するように機能可能なように結合されたか又はリンクした２つ以上の天然タンパク質の部分あるいは断片を含むタンパク質であり、各断片が天然のタンパク質によって発揮される機能あるいは修飾機能を保持する。天然のタンパク質からの断片はオリジナルの特性を変更するのに修飾されていても良い。
【０１５５】
本明細書における「受容体ポリペプチド」は、ポリペプチド(例えば融合タンパク質)を意味し、それは、適用された化学的リガンドに応じて標的核酸配列の発現を活性化するか、阻害することができる。受容体ポリペプチドは、リガンド結合ドメイン、DNA結合ドメイン及びトランス活性化（transactivation）ドメインで構成される。リガンド結合ドメインは、その構造が相補的な化学的リガンドと非共有結合で結合するアミノ酸配列を含む。従って、リガンド結合ドメイン及びその化学的リガンドは相補的な結合ペアを形成する。DNA結合ドメインは応答要素(RE)として知られている特異的なヌクレオチド配列と非共有結合で結合するアミノ酸配列を含む。１つ以上の応答要素が標的発現カセットの5'調節領域に位置する。各REはそれぞれ１ペアの半分部位（half
site）を含む。各半分部位は５−６個の塩基対コアを有し、一つのDNA結合ドメインが一つの半分部位を認識する。半分部位は、一方の直接の繰り返しとして、回文（パリンドローム）の繰り返し、又は逆の繰り返しのように、互いへの相対的な線形の配向（オリエンテーション）で配列されている。半分部位のヌクレオチド配列、間隔及び線形のオリエンテーションによって、どのDNA結合ドメイン（一つ又は複数）が応答要素と相補的な結合ペアを形成するかが決まる。トランス活性化ドメインは、TATAボックスにおける前開始（preinitiation）及び集合（assembly）中の転写因子のオペレーションに影響するサブドメインの役割をする１つ以上のアミノ酸配列を含む。トランス活性化ドメインの影響は、転写開始の事象が繰り返されることを可能にし、遺伝子発現レベルをよい大きくすることである。
【０１５６】
「受容体発現カセット」は、受容体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能可能に結合された、5'調節領域、及び非翻訳3'終了領域(停止コードン及びポリアデニレーション配列)を含む。5'調節領域は、形質転換細胞における発現を促進することができる。
【０１５７】
「標的発現カセット」は、標的核酸配列に機能可能に結合された5'調節領域のヌクレオチド配列を含み、標的核酸配列は化学的リガンドがある状態でその発現が受容体ポリペプチドによって活性化されるか阻害されるタンパク質をコードしてもよい。標的発現カセットの5'調節領域は中核（コア）プロモーター配列、転写配列の開始、及び、受容体ポリペプチドとの相補的結合のために必要な一つ又は複数の応答要素を含む。5'調節領域は形質転換細胞での発現を促進することができる。標的発現カセットはさらに3'終了領域(停止コードン及びポリアデニレーション配列)
を有する。
【０１５８】
本明細書における「調節（modulating）」は、プロモーターからの発現が過度に活性化される場合にプロモーターからの発現の活性化、阻害、又は抑制を意図し、あるいは、プロモーターからの発現の活性化が低い場合にそれを増強することを意図している。
【０１５９】
本明細書における「ステロイドホルモン受容体スーパーファミリー」はステロイド受容体である細胞内の受容体のスーパーファミリーを指す。そのような受容体の代表的な例には、制限されるものではないが、エストロゲン(アルファとベータの両方)、プロゲステロン、グルココルチコイド−α、グルココルチコイド-β、無機質コルチコイド、男性ホルモン（アンドロゲン）、甲状腺ホルモン、レチノイン酸、レチノイドＸ、ビタミンD、COUIP-TF、エクジソン、Nurr-l、及び、リガンド不明（orphan）の受容体を挙げることが出来る。
【０１６０】
本明細書におけるアミノ酸(それらは、本明細書において様々なアミノ酸配列配列において現れる)は、それらの有名な略語である３文字あるいは１個の文字の略語によって識別される。ヌクレオチド(それらは様々なDNA断片に現れる)は、当該技術分野で慣用的に使用される標準の単一文字指示で表記される。
【０１６１】
ペプチドかタンパク質では、アミノ酸の適切な保存的置換はこの技術分野における技術者（当業者）に知られており、生じる分子の生物的活性を変更せずに、一般的に作成することが出来る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非本質的な領域の単一のアミノ酸の置換によっては生物学的活性は実質的に変わらないことを認識している。（例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition
1987, The Bejamin/Cummings Pub. Co., p224 参照)。
【０１６２】
本明細書における、「運搬（delivery）プラスミド」は、治療産物あるいはそれの前駆体をコードする、治療の遺伝子、調節遺伝子をコードする核酸、又は、細胞ライン（細胞系）、例えば、パッケージング細胞ライン内に生体内で運搬されたときに治療効果を奏功する他の因子コードする核酸を運ぶか運搬し、治療用のウイルスベクターを増殖させるプラスミド・ベクターである。
【０１６３】
本明細書における「組み換え発現ベクター」あるいは「発現ベクター」は、本発明の融合タンパク質又は本発明で提供される発現カセットをコードする核酸のような、異種起源のDNAの挿入あるいは組み込みによって操作された当該技術分野で公知のプラスミド、ウィルスあるいは他のビークルを意味する。そのような発現ベクターは、細胞に挿入された核酸の効率的な転写のためのプロモーター配列を含んでいる。発現ベクターは典型的には複製起点、プロモーター、さらに形質転換細胞の発現型の選択を可能にする特異的な遺伝子を含んでいる。
【０１６４】
本明細書におけるDNA又は核酸「同族体（ホモログ）」は治療用ポリペプチドをコードする配列のような、あらかじめ選ばれた保存されたヌクレオチド配列を含んでいる核酸を意味する。「実質的に同族の」という用語によって、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のホモロジーを有するか、又は、相同性若しくは同一性がより少ない割合であるが、生物学的活性又は機能が保存されていることを意味する。
【０１６５】
本明細書における「宿主細胞」はベクターが増殖することができ、そのDNAが発現することが出来る細胞である。この用語は、さらに対象となる宿主細胞のどんな子孫（娘細胞）も含んでいる。複製中に変異が生じるかもしれないので、すべての子孫が親細胞と同一だとは限らないかもしれないことが理解される。用語「宿主細胞」が使用される場合、そのような子孫が包含される。外来性のDNAが宿主中で連続的に維持されるような安定した移入（トランスファー）の方法は、当該技術分野で知られている。
【０１６６】
用語「相同性」及び「同一性」はしばしば互換的に使用される。この点では、パーセント相同性あるいは同一性は、例えばGAPコンピュータ・プログラムを使用して、配列情報を比較することにより決定することができる。GAPプログラムは、スミス(Smith)及びウォーターマン(Waterman)(1981)(Adv.Appi.Math. 2:482)によって改訂された、Needleman及びWunsh(1970)(J.Mol.Biol. 48:443)の整列（Alignment）方法を使用する。簡潔に述べると、GAPプログラムは、類似性を、類似しているシンボルの整列した（即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸）数を、２つの配列のより短いものにおける全シンボル数で割ったものとして定義する。GAPプログラムの好適なデフォルト・パラメーターはには以下のものが含まれる：(1)
単項の比較マトリックス(同一性に対する１、非同一性に対する０の値を含んで)、及び加重された比較マトリックス（Schwartz 及び Dayhoff  編集
ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE、国立生物医学研究 pp.353-358(1979)に記載されているようなGribskov
et al.(1986) Nuc. Acids. Res.14:6745）；(2) 各ギャップに対する3.0のペナルティ、及び各ギャップ中の各シンボルに対する追加の0.10のペナルティ;及び(3)終了ギャップに対するペナルティはない。
【０１６７】
２つのいずれかの核酸分子が、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の「同一性」であるヌクレオチド配列を有しているか否かは、Pearson
et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 におけるようなデフォルト・パラメーターを用いる「FAST A」プログラムのような既知のコンピューター・アルゴリズムを使用することによって決定することができる。あるいは、バイオテクノロジー情報のナショナル・センター（National
Cancer Center for Biotechnology Information）データベースのBLAST機能を用いて同一性を決定することもできる。
【０１６８】
一般に、最も高いオーダー・マッチが得られるように配列を整列させる。「同一性」はそれ自身は当該技術分野で認識された意味を持っており、公表された技術を使用して計算することができる（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University
Press New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith,D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data,Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New  Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinj, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer. Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M Stickton Press, New York, 1991を参照）。2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列間の同一性を測定する多くの方法が存在しているが、用語「同一性」は、当業者に周知である(Carillo
et al. (1988) SIAMJ Applied Math 48:1073)。２つの配列間の同一性あるいは類似性を決定するために一般に使用される方法としては、以下のものに制限されないが、Guide
to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and
Carillo et al. (1988) SIAMJ Applied Math 48:1073 に記載されているものを挙げることが出来る。同一性と類似性を決定する方法はコンピュータ・プログラム中で限定される。２つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータ・プログラム方法としては、限定されるものではないが、GCGプログラムパッケージ(Devereux,J. et al., Nucleic Acid Research 12 (I):387 (1984), BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F. et al., J Molec Biol 215:403(1990)) を挙げることが出来る。
【０１６９】
したがって、本明細書における用語「同一性」はテスト及び参照のポリペプチド又はポリヌクレオチドの間の比較を表わす。例えば、テストポリペプチドは、参照ポリペプチドと90%以上同一であるすべてのポリペプチド定義することが出来る。本明細書において、少なくとも「90%同一」とは、参照ポリペプチドに比べて90〜99.99のパーセント同一性を意味する。90%以上レベルの同一性は、例証のために仮定し、100のアミノ酸のテストと参照のポリヌクレオチドの長さが比較されることを示している。テストポリペプチド中の高々10%(つまり100のうち10)のアミノ酸が参照ポリペプチドのそれと異なる。同様にテスト及び参照ポリヌクレオチドとを比較してもよい。そのような差は、アミノ酸配列の全長に亘って任意に分布した点突発変異として表わされるかもしれない。あるいは、それらは、許容しうる最大、例えば10/100のアミノ酸差(およそ90%の同一性)までの変異する長さの１つ以上の位置におけるクラスターであるかもしれない。違いは核酸又はアミノ酸の置換又は欠失として定義される。
【０１７０】
本明細書における「プライマー」は、２つ以上、好ましくは３つ以上のデオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチドを意味する。それからよりプライマー伸長物の合成が開始される。本発明の目的のために、対象となるプライマーはジンクフィンガー・ヌクレオチド結合タンパク質ストランドへ実質的に相補的なだけでなく、選択された残基部位で増幅産物へ変異を導入することができるものである。合成を実施する実験条件は、ヌクレオシド三リン酸、及びDNAポリメラーゼのような重合及び伸長のための物質、及び適切なバッファー(温度とpH)の存在が必要である。
【０１７１】
本明細書における、「遺伝治療」あるいは「遺伝子治療」は、そのような治療に求められる疾患又は病状のある、哺乳動物、特にヒトのある細胞(標的細胞)への異種起源のDNAの移送を含んでいる。DNAは、異種起源のDNAが発現されコードされた治療産物が発現されるような方法で、選択された標的細胞へ導入される。あるいは、異種起源のDNAは、ある方法で治療産物をコードするDNAの発現を媒介することができる。あるいは、それは、ある方法で治療産物の発現を直接あるいは間接的に媒介するペプチドかRNAのような産物をコードしても良い。遺伝治療も、導入される細胞又は哺乳動物産生される遺伝子産物を補足するか、又は欠陥遺伝子に取って代わる遺伝子産物をコードする核酸を運搬ためにも使用することが出来る。導入された核酸は、哺乳類宿主の中で通常生産されないか、又は、治療上有効な量若しくは治療上有効な時期に生産されないような、成長因子若しくはその成長抑制剤、腫瘍壊死因子若しくはその阻害剤、その受容体のような治療化合物をコードすることが出来る。治療産物をコードする異種起源のDNAは、その産物か発現を増強するかそうでなければ修飾するために、被災宿主細胞の中への導入に先立って修飾することも出来る。遺伝治療は、さらに遺伝子発現の抑制剤、リプレッサーあるいは他のモデュレーターの運搬を含むことが出来る。
【０１７２】
本明細書における「異種起源のDNA」は、それが発現される細胞によって通常生体内で生産されないRNA及びタンパク質をコードするDNAか、転写、翻訳あるいは他の調節可能な生化学過程への影響により、内因性DNAの発現を変更するメディエーターを媒介するかコードするDNAである。異種起源のDNAを外来性のDNAと呼ぶことも出来る。それが発現される細胞にとって異種又は外来性であるものとして当業者が認識するか考慮する如何なるDNAも異種起源のDNAに包含される。異種起源のDNAの例としては、以下に制限されないが、薬物耐性を付与するタンパク質のような追跡可能なマーカータンパク質をコードするDNA、抗癌剤、酵素及びホルモンのような治療上有効な物質をコードするDNA、及び抗体のような他のタイプのタンパク質をコードするDNAを挙げることが出来る。異種起源のDNAによってコードされる抗体は、異種起源のDNAが導入された細胞の表面上で発現されるか又は分泌される。
【０１７３】
従って、異種起源のDNAあるいは外来性のDNAは、ゲノムで見つかる対応DNA分子と全く同じオリエンテーション及び位置にないDNA分子を含んでいる。さらに、それは別の生物又は種(つまり、外来)由来のDNA分子を意味することもある。
【０１７４】
本明細書における「治療上有効な産物」は、異種起源の核酸、典型的にはDNA、によってコードされる産物である。宿主の中へ核酸が導入した後、産物は発現され、それは症状、遺伝しているか獲得した疾病の徴候を改善するか除去し、或いは、疾病を治療する。
【０１７５】
典型的には、所望の遺伝子産物をコードするDNAはプラスミド・ベクターへクローニングされ、リン酸カルシウム媒介ＤＮＡ取り込み( (1981)Somat. Cell. Mol.Genet. 7:603-616参照)又はマイクロインジェクションのように通常の方法でパッケージ細胞のような産生細胞（プロデューサー細胞）へ導入される。産生細胞の増幅の後、異種起源のDNAを含んでいるベクターは選択された標的細胞へ導入される。
【０１７６】
本明細書において、発現ベクター又は運搬ベクターは外来性又は異種起源のDNAが適切な宿主細胞における発現のために挿入される任意のプラスミドあるいはウィルスを意味する。即ち、該DNAによってコードされたタンパク質又はポリペプチドは宿主細胞系で合成される。１つ以上のタンパク質をコードするDNAセグメント(遺伝子)の発現を指図することができるベクターは、本明細書中で「発現ベクター」と呼ばれる。さらに、逆転写酵素を使用して生産されたmRNAからcDNA(相補的DNA)のクローニングを可能にするベクターが含まれる。
【０１７７】
本明細書において「遺伝子」は、そのヌクレオチド配列がRNAかポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。遺伝子はRNAかDNAのいずれかでありえる。遺伝子は、個々のコードするセグメント(エクソン)間の介在配列(イントロン)、」並びに、コード領域に先行し及びそれに続く領域(リーダーとトレーラー)を含むことが出来る。
【０１７８】
本明細書において、核酸分子、ポリペプチド、又は他の生体分子に関して「分離」されたとは、ポリペプチドか核酸が得られた遺伝環境から該核酸かポリペプチドが分離されていることを意味する。それは、人の手によって天然状態から変更した形態であることも意味する。例えば、この用語が本明細書で使用されるとき、生きている動物の中に当然あるポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは「分離」されていない。しかし、その天然の状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドあるいはポリペプチドは「分離」されている。したがって、組み換え宿主細胞内に生産され、及び／又は含まれているポリペプチド又はポリヌクレオチドは分離されていると見做される。さらに、「分離されたポリペプチド」あるいは「分離されたポリヌクレオチド」で意図されるものは、組み換え宿主細胞から、あるいは天然源から、部分的又は実質的に精製されたポリペプチドあるいはポリヌクレオチドである。
【０１７９】
したがって、「分離された」核酸は、典型的には、天然のゲノム中で対象となる核酸をコードする遺伝子に連結している遺伝子のコード配列を含まないものである。分離されたDNAは一本鎖又は二本鎖（二重らせん）構造でもよい。又、ゲノムDNA、cDNA、組み換えハイブリッドDNA、若しくは合成DNAでも良い。それは元のDNA配列と同一かもしれないし、あるいは１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加あるいは置換によってそのような配列と異なるものであり得る。
【０１８０】
生物学的細胞又は宿主から作成された調製物について言及するとき、精製された、とは、対象となるDNAかタンパク質の粗抽出物を含む示されたDNAかタンパク質を含有する印意の細胞抽出物を意味する。例えば、タンパク質の場合には、精製された調製物は、個々の技術、一連の調製又は生化学的技術に従って得ることができる。対象となるタンパク質及びDNAはこれらの調製物での精製の様々な程度に存在することができる。この操作はには、例えば、制限されないものとして、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換修飾クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、及び電気泳動を挙げることが出来る。組み換えにより生産された化合物は、Smith
et al. (1988) 遺伝子67:31-40 に記載されたワンステップ方法により実質的に精製することができる。
【０１８１】
「実質的に純粋な」DNAあるいはタンパク質の調製物は、そのようなDNAあるいはタンパク質が自然界において通常関係している天然の物質がない調製物を意味するものと了解されるべきである。「本質的に（ssentially）純粋な」とは、対象となるDNAかタンパク質の少なくとも95%を含んでいる「高度に」精製された調製物を意味するものと解されるべきである。
【０１８２】
本明細書において「修飾」又は「（突然）変異」は、人の手によってその天然状態から変更された形態を意味する。領域１及び２の両方又はその一方に修飾を有している、本発明の修飾エストロゲン受容体アルファリガンド結合ドメインでは、アミノ酸変異、置換、挿入及び欠失を包含するように意図される。
【０１８３】
対象となるDNAかタンパク質を含んでいる細胞抽出物は、タンパク質を発現するか又は対象となるDNAを含んでいる細胞から得られたホモジェネート調製物か細胞を含まない調製物を意味するものと了解されるべきである。「細胞抽出物」という用語は、培養培地(特に細胞が除去された消費された培養培地)を含むものと意図される。
【０１８４】
本明細書において「調節する（modulate）」は、機能の抑制、増強あるいは誘導を意味する。例えば、ジンクフィンガー核酸結合ドメイン及びそれの変異体は、増強して、プロモーター内のモチーフに結合することによりプロモーター配列を調節し、プロモーター細胞ヌクレオチド配列に機能可能なように結合した遺伝子の転写を増強又は抑えることができる。あるいは、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ドメインポリペプチド変異体が構造遺伝子に結合し、遺伝子の読み通しからのDNA依存性RNAポリメラーゼをブロックすることによって遺伝子の転写を阻害する場合には、調節は遺伝子転写の阻害を含むものでありえる。構造遺伝子は、例えば、正常な細胞の遺伝子あるいは癌遺伝子かもしれない。あるいは、調節は、転写物の翻訳の阻害を含むこともある。
【０１８５】
本明細書における「阻害」は、プロモーターに機能可能に結合された構造遺伝子の転写の活性化のレベルの抑制を意味する。
【０１８６】
本明細書において遺伝子の「プロモーター」領域は、分子スイッチ、つまり調節可能なプロモーター、発現カセットにおいて、定義されたCys2-His2ジンクフィンガー配列結合部位の１以上の繰り返しに機能可能なように結合されたいわゆる最小のプロモーターの組み合わせを意味する。最小のプロモーターは典型的にはTATAボックス及び転写開始部位を含んでいるが大部分あるいはすべてのエンハンサー要素が欠けている、任意の細胞又はウイルスのプロモーターを意味するものと了解される。そのため、最小のプロモーターは、十分なプロモーター領域に対して低い塩基の転写レベルを持っている。本明細書において、使用される最小のプロモーターの例として、SV4Oプロモーターからの短い断片、及びc-fos 遺伝子からのTATAボックスを含んでいるおよそ40bp領域がある。
【０１８７】
本明細書における、用語「基礎活性（basal activity）」は特異的な刺激がない状態で観察された遺伝子発現のレベルを意味する。分子スイッチ及び調節された発現カセットの場合には、基礎活性が、活性剤リガンドがない状態で観察された導入遺伝子発現のレベルを意味する。遺伝子が活性化されることになっている場合、転写（調節）因子として知られているタンパク質が遺伝子のプロモーター領域に結合する。これは全体として、酵素がDNAからRNAへの別の遺伝セグメントを転写することを可能にすることにより、「オンスイッチ（on
switch）」に似ている。ほとんどの場合、生じるRNA分子は、特異的なタンパク質の合成用のテンプレートとして機能し、時々、RNAはそれ自身が最終生産物である。
【０１８８】
合成リガンドの投与の文脈中で使用された時の用語「有効な量」は、使用される分子スイッチのリガンド結合ドメインを活性化するのに十分な濃度を生産するためにリガンドの量を意味する。
【０１８９】
本明細書において、ポリペプチド「変異体」又は「誘導体」は、ポリペプチドが突然変異した形態、又は、組換えによって生産されたが、まだリガンドあるいは核酸分子に結合するか、若しくは転写を調節する能力のような所望の活動を保持するポリペプチドを指す。
【０１９０】
本明細書において、リガンド結合ドメインの「突然変異体」、「修飾」、「修飾」、「変異体」あるいは、「誘導体」、又は他のものは、天然、又は野生型のリガンド結合ドメインからのアミノ酸置換によって生産された問題となる該領域の変更を意味する。したがって、「突然変異体」、「変異体」あるいは、「誘導体」は、１つ以上の野生型のアミノ酸が交互のアミノ酸と置換されたリガンド結合ドメインを含んでおり、一次配列修飾を含んでいる。同様な用語は、「突然変異体」、「変異体」あるいは「誘導体」転写エフェクター領域を参照する際に使用される。
【０１９１】
本明細書において、「ジンクフィンガー・ヌクレオチド結合モチーフ」とは、ジンクフィンガー・ヌクレオチド結合誘導体ポリペプチドが特異的に結合するヌクレオチド・セグメントの任意の２次元又は３次元の特徴を意味する。この定義内に含まれているのは、通常５つ以下のヌクレオチドから成るヌクレオチド配列、及び、例えば、これに限られるものではないが、深い溝（major groove）及び浅い溝（minor groove）及びヘリックス表面のような、ＤＮＡ二重らせんの３次元の態様である。モチーフは典型的にはジンクフィンガー・ポリペプチドが結合することができる適切な長さの任意の配列である。例えば、３つのフィンガーポリペプチドは、典型的には約９〜約１４の塩基対を持っているモチーフに結合する。好ましくは、ゲノム内の特異性を確保するために認識配列は約１６個の塩基対である。したがって、任意の特異性のジンクフィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドが提供される。ジンクフィンガー結合モチーフは、経験的にあるいはジンクフィンガー・タンパク質が結合するように設計された任意の配列でありえる。モチーフは、調節配列、エクソン、イントロンあるいは任意の非コード配列を含む任意のDNA又はRNAの配列で見けることができるものである。
【０１９２】
本明細書において用語「薬学的に許容可能で」、「生理的に認容可能な」は、それらが組成物、キャリア、希釈剤及び試薬に言及するときは文法上の変化であり、相互交換できて使用され、組成物の投与を阻害する程度まで、物質が、吐き気、めまい、異常亢進等の適当な生理学の影響を生起させることなく、ヒトへの投与ができると意味する。
【０１９３】
本明細書における用語「ベクター」は、異なる遺伝環境間でそれに機能可能なように結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。好ましいベクターは、それらが機能可能なように結合されるDNAセグメントの中にある構造遺伝子産物の自己複製及び発現が可能なものである。ベクターは、したがって、好ましくは以前に記載されたレプリコン（複製起点）と選択マーカーを含んでいる。
【０１９４】
DNA断片を含む核酸分子に関してここに使用される場合に、「機能可能なように結合された」という文節は、配列又はセグメントが共有結合、好ましくは従来の燐酸ジエステル結合によって、一本鎖又は二本鎖の形態であろうと、機能可能なようにリンクした部分が作用するようにＤＮＡの一つの鎖内に結合されたことを意味する。本発明で提供される転写ユニットあるいはカセットが機能可能なように結合されるベクターの選択は、当該技術分野で周知のとおり、所望の機能的な特性(例えばベクター複製、タンパク質発現、形質転換される宿主細胞、組み換えDNA分子を構築物する技術における固有の制限であるもの)に直接依存する。
【０１９５】
本明細書における、方向性の結合に適応されたヌクレオチドの配列 (つまり、「ポリリンカー」)とは、 (1)複製及び輸送のために、上流及び下流に翻訳可能なDNA配列を機能可能なように結合し、(2)ベクターへDNA配列の方向性の結合のための部位あるいは手段を提供する、DNA発現ベクターの領域である。典型的には、方向のあるポリリンカーは、２つ以上の、制限酵素認識配列を規定するヌクレオチド配列、即ち、制限部位である。制限開裂に際して、２つの部位は、翻訳可能なDNA配列がDNA発現ベクターに結合することができる、粘着性末端（cohesive
termini）を生み出す。好ましくは、２つの制限部位は、制限開裂で非相補的な粘着性末端を提供し、それによって、カセットへ翻訳可能なDNA配列の方向性のある挿入を可能にする。一つの具体例では、方向性のある結合手段は、翻訳可能なDNA配列上流に、翻訳可能なDNA配列下流、又は、その両方にあるヌクレオチドによって提供される。別の具体例では、方向性のある結合に適応されたヌクレオチドの配列は、多数の方向のあるクローニング手段を規定するヌクレオチドの配列を含む。方向のある結合に適応されたヌクレオチドの配列が多数の制限部位を規定する場合、それは複数のクローニング部位と言われる。
【０１９６】
本明細書における、「分泌シグナル」は、グラム陰性菌のペリプラズマ膜へのタンパク質をターゲットとするタンパク質のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルはpelB分泌シグナルである。Erwinia carotovaからの2つのpeiB遺伝子産物変異体からの分泌シグナルドメインの予想アミノ酸残基配列は、Lei
et al. (Nature 331: 543-546、1988年)に記載されている。pelBタンパク質のリーダー配列は、分泌シグナルとして以前に融合タンパク質(Better,et al., (1988)Science, 240:1041-1043; Sastry et al.(1989) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86:5728-5732;  Mullinax wt al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:8095-8099)に使用された。大腸菌からの他の分泌シグナルポリペプチド領域のためのアミノ酸残基配列は知られている (例えば、Oliver, In
Neidhard、F.C.(ed.),Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American
Society for Microbiology, Washington,D.C.,1:56-69(1987) 参照) 。
【０１９７】
本明細書における「リガンド」は、受容体のリガンド結合ドメインと相互作用し、その活性を調節する任意の化合物を指す。リガンドは典型的には受容体を活性化する。リガンドは、さらに結合なしで受容体を活性化する化合物を含むことができる。天然のリガンドは受容体と通常相互作用する化合物である。
【０１９８】
本明細書において、「非天然」リガンド、あるいは「合成」リガンドは、通常はヒトのような哺乳動物で見つからないが、受容体のリガンド結合ドメインに結合するか相互作用する化合物を意味する。従って、用語「非天然リガンド」は、遺伝子治療が熟考される特異的な有機体(人又は動物)で当然見つからないリガンドを指す。例えば、合成リガンドは完全に化学合成によって作られるかもしれないし、あるいはタモキシフェンのような化学上修飾された天然の化合物かもしれない。
【０１９９】
本明細書における、「細胞増殖性疾患」は、細胞集団が形態学的に周囲の組織と異なるように見える、悪性及び非悪性疾患（傷害）を意味する。細胞増殖の障害は、遺伝子発現レベルの増加あるいは減少に帰着する転写障害であっても良い。障害の原因は細胞の起源かウイルスの起源であるかもしれない。治療は植物細胞を、例えば、ウィルス耐性とするような予防的なものであるか、又は、ウイルス産物の生産を防ぐことにより細胞内の確立している感染を改善するためにのものであり得る。
【０２００】
本明細書における「細胞のヌクレオチド配列」は、細胞内に存在するヌクレオチド配列を指す。該配列は細胞の天然の配列である必要はない。例えば、宿主細胞のDNAの内に組み込まれたレトロウイルスのゲノムは「細胞のヌクレオチド配列」と考えられるだろう。細胞のヌクレオチド配列はDNA又はRNAでありえ、イントロン及びエクソン、DNA及びRNAを含んでいる。細胞及び(又は)細胞のヌクレオチド配列は、酵母、ウィルスあるいは植物ヌクレオチド配列を含む、原核生物又は真核生物のものであり得る。
【０２０１】
本明細書において、治療組成物の「投与」は任意の手段によって達成することができ、これらに制限されないが、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、注入（infusion）、腹腔内投与、及び非経口投与を含む。
【０２０２】
調節可能カセット
ターゲットとされた遺伝子が外来の遺伝子、特に治療産物をコードする遺伝子の具体例では、融合タンパク質が特に相互作用するプロモーターと調節領域に機能可能なように結合された発現カセット内のものとして遺伝子は提供される。
【０２０３】
カセットは、外来の遺伝子の転写を指図するために、融合タンパク質中にある対応するジンクフィンガードメインによって認識される少なくとも一つのポリヌクレオチド領域及び適切なプロモーターを含む。
【０２０４】
典型的には、調節可能な発現カセットは３〜６つの反応要素を含んでおり、リガンドにより活性化した転写調節融合タンパク質の核酸結合ドメインと相互作用する。
【０２０５】
典型的に、外来の遺伝子は、成長因子のような治療産物コードし、それは内因性の発現遺伝子にコードされるペプチド、ポリペプチドあるいはタンパク質を補充することが出来、それによって有効な治療を提供する。いくつかの具体例では、遺伝子は、適切な直接又は間接の手段によって検知することができる適切なリポーター分子をコードする。カセットは、細胞の中への導入にふさわしい運搬手段に挿入することができる。そのようなビークルとしては、以下のものに制限されないが、ヒトのアデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、マウス又はレンチウィルス由来のレトロウイルスのベクターを、リポソーム、ポリマー、及び共役物を含む他のDNAを含む様々な非ウイルス性組成物が含まれる。
【０２０６】
遺伝子調節用融合タンパク質の使用
核酸の運搬
標的細胞中への核酸分子の導入に適切な多数のウイルス性及び非ウイルス性の方法を当業者が利用できる。細胞の遺伝子変異は、遺伝子治療分野(Human Gene Therapy, April,Vol.5, p.543-563; Mulligan, R.C.1993)で周知の１つ以上の技術を使用して遂行することが出来る。さらに、こ本明細書に記載された技術のうちのいくつかは、生体外システムでの、あるいは動物モデルでの遺伝子発現に関する研究に適用可能である。
【０２０７】
実施例中で定義されるように、導入遺伝子発現を調節する能力は遺伝子治療のための種々様々の用途に適用することができる。外来性の導入された導入遺伝子の発現をコントロールする能力は、構想された細胞及び遺伝子治療の大部分あるいはすべての安全性及び効能にとって重要である。導入遺伝子発現のコントロールは、治療のタンパク質レベルの調節、所望の細胞集団、ベクター含有細胞又は他のものの除去、又は、形質転換された細胞内のベクター機能のコントロールを引き起こすレコンビナーゼ又は他の機能の活性化を達成するために使用することができる。さらに必要ならば、そのようなコントロールは、遺伝子治療の終了を可能にする。
【０２０８】
遺伝子治療に役立つ多くのベクター・システムは、本明細書中で既に記載された。遺伝子治療のためのベクターは、当業者に公知の任意のものを含んでおり、動物ウィルスと人工染色体に由来するどんなベクターも含んでいる。ベクターは宿主細胞の染色体への組み込み、又は、染色体外の要素として残るように設計される。そのようなベクターには、以下に制限されないが、ヒトのアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、ネズミファミリーのレトロウイルスのベクター及びレンチウィルス由来レトロウイルスのベクターのようなレトロウイルスのベクターが含まれる。
【０２０９】
例えば、本発明のER LBD突然変異体は複製欠失アデノウイルスベクター(Av3)骨格DNA配列内へ構築され、その結果、この調節イシステムが臨床用途及び試験用に細胞へ運搬される。SV4Oの最小のプロモーター及びルシフェラーゼ導入遺伝子(C7-SV4O-luc)に結合された一連のC7結合部位を含んでいるAv3ベクターも構築物され、各Av3ER LBD突然変異体ベクターと同時に運搬された。その後、その対応するリガンドに応答してルシフェラーゼ導入遺伝子の転写を媒介するアデノウイルスのベクターにより運搬されたER突然変異体の能力をテストするために、細胞はそれらの対応するリガンドに暴露された。結果は図５の中で示される。Av3-388V/424Y/428AはLBB938に応答した。また、ルシフェラーゼ活性は基礎レベルの１６倍に増強された。Av3H524G構築物はLBF 580の処理に応答し、ルシフェラーゼ活性は基礎レベルの１９倍に増強された。これらの２つのER突然変異体の反応性のレベルは、反応性Av3-bs521のレベルに匹敵した。それは、Av3ベクターによってマウスへ全身運搬の後にタモキシフェンに誘導された導入遺伝子発現を媒介するためのプロタイピカルなレギュレーターである。Xu
et al. Molecular Therapy, 3:262-273、2000。LBC 081で処理されたときのAv3-42 1/428の反応は基礎レベルの３倍であった。
【０２１０】
さらに本発明においては、遺伝物質の運搬又はターゲットとする為の任意の非ウイルス性組成物、例えば、以下のものに制限されないが、リポソーム、ポリマー、及び他のDNAを含んでいる組成物、並びに、抗体及び成長因子に結合された核酸のようなターゲットされた複合体も包含する。融合ポリペプチド及びターゲットとされた外来の遺伝子をコードする核酸構築物の運搬に、任意の運搬システムを使用することが出来る。そのようなベクター・システムは、ベクター・システムに依存して、融合タンパク質、及びインビボ又はインビトロで誘導可能な導入遺伝子カセットを運搬（輸送）ために使用することができる。アデノウイルスで、例えば、ベクターは、肝臓及び他の器官に導入するために静脈内で投与され、又は、結合あるいは他の方法によって、肺若しくは一時的に局在化した血管のコンパートメントへ直接導入される。そのようなベクターを構築物する方法、及びその使用方法は遺伝子治療分野の熟練している人々（当業者）に公知である。
【０２１１】
一つの具体例では、一つのベクターは融合タンパク質レギュレーターをコードする。また、別のベクターは誘導可能な導入遺伝子カセット(標的発現カセット)をコードする。ベクターは適切な量で混合されるか、又は、レギュレーターと導入遺伝子を細胞内に取り込ます為に連続して運搬することができる。標準的な経路によるその後のリガンドの投与及びその有効な量は導入遺伝子の活性化を引き起こすであろう。
【０２１２】
別の具体例では、融合タンパク質及び誘導可能な導入遺伝子をコードする核酸は、同じベクター構築物中へ含めることが出来る。この実施例、融合タンパク質をコードするは、ベクター内に位置し、それが導入遺伝子カセットの基礎的発現及び誘導性を邪魔しないような方法でプロモーターから発現されるであろう。さらに、融合タンパク質を発現するための細胞又は組織特異的プロモーターを使用することによって、本発明システムに更なるレベルの特異性を付与することになる。遺伝子治療のための二重のコンポーネント・ベクター及び使用は知られている (例えば、Burcin et al.,(1999)Proc. Nattl. Acad. Sci., 96:33 5-360 参照。それらはウイルスの骨格遺伝子が完全に欠失されたアデノウイルスベクターについて記載する。)。
【０２１３】
別の具体例では、遺伝子治療は上に記載されたベクターの組み合わせを使用して遂行することができる。例えば、レトロウイルスのベクターは、インビトロ(エキソビボ)又はインビボである細胞集団へ、安定的に組み込まれた誘導可能な導入遺伝子カセットを伝えることができる。続いて、組み込まれた導入遺伝子は、融合タンパク質を発現することができるアデノウイルスベクターのような第二のベクターで同じこの細胞集団を消し津導入し、その後に特異的なリガンド誘発剤を投与することによって活性化することができる。これは、例えば、細胞の自殺メカニズムのように、導入遺伝子の「１回の」活性化が望まれる場合に特に有用である。この応用の例は、単純性疱疹ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV
Tk)を含んでいる誘導可能な導入遺伝子カセットの安定した組み込みである。その後の該遺伝子の活性化は、ガンシクロビルへの感受性を与え、この修飾細胞の除去を可能にする。
【０２１４】
ウィルス運搬システム
細胞へ核酸構築物を伝運搬するウイルス形質導入方法が検討される。使用にふさわしいDNAウイルスベクターの例として、以下に限定されないが、アデノウイルス(Ad)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス又はポリオ・ウィルスがある。使用にふさわしいRNAウイルスベクターの非限定例として、レトロウイルス又はシンドビスウィルス（Sindbis
virus）を挙げることが出来る。本発明での使用に適当であるようないくつかのDNAとRNAのウィルスが存在することは、当業者には理解されることである。アデノウイルスベクターは、真核細胞への遺伝子導入に特に有用であると分かっており、当業者に広く利用可能であり、本発明での使用に適切である。
【０２１５】
アデノ随伴ウイルス(AAV)は遺伝子治療において応用される遺伝子導入システムとして使用されてきた。米国特許第5,139,941号及び第5,436,146号、及び、第5,622,856号を参照のこと。単純性疱疹ウィルスタイプ-l(HSV-1)ベクターは利用可能で、その神経向性の特性のために神経系に特に役立つ。米国特許第5,288,641号を参照のこと。ポックスウィルスファミリーのワクシニアウイルスも発現ベクターとして開発されている。上記ベクターの各々は広く利用可能で、本発明における使用に適切である。
【０２１６】
レトロウイルスのベクターは、大きな割合で標的細胞に感染して、細胞ゲノムへ組み込むことができる。好ましいレトロウイルスはレンチウィルスを含んでおり、これには非限定的に、HIV、BIVとSIV が含まれる。米国特許第5,665,577号、第5,994,136号、第6,013,516号、第5,672,510号、第5,707,865号及び第5,817,491号を参照のこと。
【０２１７】
ここに挙げられるような遺伝子治療に使用することができる様々なウイルスのベクターには、アデノウイルス(米国特許第5,935,935号を参照)、ヘルペスウィルス、牛痘、アデノ随伴ウイルス(AAV)、又は好ましくは、レトロウイルスのようなRNAウィルスを含んでおり、更に、「弱い」ベクターとして知られている、アデノウイルスのような修飾ウイルスのベクターが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターはマウス又は鳥類ファミリーのレトロウイルス誘導体か、あるいはレンチウィルスベクターである。好ましいレトロウイルスベクターはレンチウィルスベクターである。単一の外来性の遺伝子が挿入することができるレトロウイルスのベクターの例として、次のものに制限されないが、モロニーマウス白血病ウィルス(MoMuLV)、ハーヴェイのマウス肉腫ウィルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウィルス(MuMTV)、SlV、BIV、HIV及びラウス肉腫ウィルス(RSV)が挙げられる。多くのその他のレトロウイルスベクターは多数の遺伝子を組込むことができる。形質転換細胞を識別し製造することができるように、これらのベクターはすべて選択可能なマーカー用遺伝子を運搬するか組込むことができる。対象となる亜鉛フィンガー由来ＤＮＡ結合ポリペプチド配列を、特異的な標的細胞上の受容体用のリガンドをコードする別の遺伝子に加えることによって、ベクターは標的特異的になる。
【０２１８】
レトロウイルスのベクターは、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより標的特異的になることができる。好ましいターゲッティングは、レトロウイルスベクターをターゲットとするために抗体を使用することにより遂行される。当業者は、ジンクフィンガー・ヌクレオチド結合蛋白質ポリヌクレオチドを含んでいるレトロウイルスのベクターの標的特異的な運搬を可能にするためにレトロウイルスのゲノムに挿入することができる特異的なポリヌクレオチド配列を知っているか、あるいは過度の実験なしに容易に確認することができる。
【０２１９】
組み換えのレトロウイルスが不完全であるので、それらは感染性のベクター粒子を生じるために助け（援助）を必要とする。この援助は、例えば、LTR内の調節配列のコンオロール下でレトロウイルスのすべての構造遺伝子をコードするプラスミドを含んでいるヘルパー細胞ラインの使用により提供することができる。これらのプラスミドは、パッケージング・メカニズムがキャプシドに包むためにRNA転写物を認識することができるヌクレオチド配列を欠いている。パッケージング信号を欠失するヘルパー細胞ラインの非限定的な例として、Ψ2、PA317及びPAl2 を挙げることが出来る。ゲノムがパッケージされないので、これらの細胞ライン（細胞系）は空のビリオンを生産する。レトロウイルスベクターが、パッケージング信号が完全であるが、しかし、構造遺伝子は他の対象となる遺伝子と置換されているような細胞へ導入される場合、ベクターはパッケージされることができ、ベクター・ビリオンが生産される。その後、この方法によって生産されたベクター・ビリオンは大量のキメラなレトロウイルスのビリオンを生産するためにNIH
3T3細胞のような組織細胞ラインを感染させるために使用することができる。
【０２２０】
弱いウィルスベウター（Gutles viral vectors）
本発明の特に好ましい具体例では、使用されるウイルスベクターは「弱い」アデノウイルスベクターである。そのようなベクターはすべてのウイルスのコード領域が欠けていて、本質的なアデノウイルス・パッケージング信号及び導入遺伝子発現カセットだけを含んでいる。(実施例6を参照)。それらは、当業者に既知の技術によって調製することができる（Sandig et al., PNAS
97:1002-1007(2000)）。
【０２２１】
非ウィルス運搬システム
遺伝子治療用の非ウイルス運搬技術には、DNAリガンド複合体、アデノウイルス・リガンドDNA複合体、DNAの直接注射、CaPO4沈殿、遺伝子銃技術、エレクトロポレーション、リポソーム及びリポフェクションが含まれる。これらの方法のうちのどれでも当業者に利用可能で、本発明での使用に適当である。他の適切な方法は当業者に利用可能であり、トランスフェクションの利用可能な方法のうちのどれでも使用しても本発明は遂行される。
【０２２２】
別のターゲットとされた運搬システムはコロイド分散系である。コロイドの分散系は巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油型の乳剤のような脂質に基づいたシステム、ミセル、混合ミセル、及び好適なリポソームを含む。リポソームは、インビトロ及びインビボにおける運搬手段として有用な人工膜小胞（ベシクル）である。大きな単層小胞 (LUV)(それらのサイズは0.2-4.0μｍの範囲である)は、大きな巨大分子を含んでいる水溶性緩衝液の実質的な割合をカプセル化する（包み込む）ことができることが示されている。RNA、DNA及び完全なビリオンは水溶性内部に包み込まれ、生物学的に活性な形態で細胞に運搬することができる（Fraley
et al., Trends Biochem. Sci., 6:77、1981)。
【０２２３】
リポフェクションは、リポソーム粒子内に分離された核酸分子をカプセル化して、該リポソーム粒子を標的細胞膜と接触することにより遂行される。  リポソームは自己集合性（self-assembling）であり、フォスファチジルセリン又はフォスファチジルコリンのような両新媒性（amphiphilic）分子からできている脂質二分子膜が、周囲の媒体の一部をカプセルに入れたコロイド粒子であって、脂質二分子膜が親水性の内部を囲むようなものである。内部に所望の化学剤、薬、あるいは本明細書のように、分離された核酸を含む、分子単層又は多層のリポソームを構築することができる。
【０２２４】
リポソームは、哺乳類細胞、植物、酵母及びバクテリアにおいてポリヌクレオチドの運搬に使用されてきた。リポソームが効率的な遺伝子導入ビークルであるために、下記中の特性は存在するべきである:(１)対象となる遺伝子の生物学的活性を危険にさらさずに高い効率でのカプセル化; (２) 非標的細胞に比較して、標的細胞への優先的実質的な結合、（３）高効率での小胞の水溶性内容物の標的細胞細胞質への運搬;そして(４)遺伝子情報の正確で有効な発現（Mannino
et al., Biotechniques、6682 1988)。
【０２２５】
リポソームの組成物は、通常、ステロイド、特にコレステロールと、リン脂質 、特に高い相転移温度のリン脂質との組み合わせである。他のリン脂質あるいは他の脂質も使用されてもよい。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度及び二価の陽イオンの存在に依存する。
【０２２６】
リポソーム生産に役立つ脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシードのようなホスファチジル化合物を含んでいる。特に有用なものは、脂質部分が14-18、特に16-18の炭素原子を含んでおり飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールである。例示されるとなるリン脂質は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンを含んでいる。
【０２２７】
リポソームのターゲットすることは解剖・機構的の要因に基づいて分類される。例えば、解剖の分類は選択性のレベル、例えば、器官特異的で、細胞特異的、細胞器官に特異的等に基づく。機構的にターゲットすることはそれが受動的か能動的かに基づいて識別されるかもしれない。受動的にターゲットすることは、洞様毛細血管（sinusoidal capillaries）を含んでいる器官で、細網内皮系(RES)の細胞に運搬するリポソームの自然の傾向を利用する。一方、能動的にターゲットすることは、天然に生じる局在化部位以外の器官または細胞へのターゲットすることを達成するために、単クローン抗体、糖、糖脂質、あるいはタンパク質のような特異的なリガンドにリポソームを結合することよるリポソームの変更か、又は、リポソームの組成かサイズを修飾することを含む。
【０２２８】
ターゲットとされた運搬システムの表面は様々な方法で修飾することが出来る。リポソームのターゲットとされた運搬システムの場合には、脂質グループは、リポソーム二分子層からの安定した連携でターゲットするリガンドを維持するためにリポソームの脂質二分子膜に組み入れることができる。様々な結合するグループが、ターゲットするリガンドに脂質鎖をつなぐために使用することができる。
【０２２９】
一般に、ターゲットとされた運搬システムの表面に結合された化合物は、ターゲットとされた運搬システムが所望の細胞を見つけ、その目的に向かうことを可能にするリガンドと受容体である。リガンドは、受容体のような別の化合物と相互作用する任意の対象化合物でよい。
【０２３０】
一般に、特異的なエフェクター分子に結合する表面の膜蛋白質は受容体と呼ばれる。抗体は好ましい受容体である。抗体は特異的な細胞表面リガンドへのリポソームをターゲットするために使用することができる。例えば、腫瘍関連抗原(TAA)と呼ばれる、特に腫瘍細胞上で発現されたある抗原は、抗体ジンクフィンガー・ヌクレオチド結合蛋白質を含んでいるリポソームを直接悪性腫瘍にターゲットとする目的で開発することができる。ジンクフィンガー・ヌクレオチド結合蛋白質遺伝子産物がその作用に関して細胞タイプに関して無差別かもしれないので、ターゲットとされた運搬システムは任意に非特異性のリポソームを注入することに比べて著しい改良を提供する。共有結合でリポソーム二分子層にポリクローナル抗体あるいは単クローン抗体のいずれかを結合するためにいろいろな操作を使用することが出来る。抗体でターゲットされたリポソームは、標的細胞上の抗原エピトープに効果的に結合する限り、単クローンあるいはポリクローナル抗体か、又は、Fab,F(ab’)2のようなそれらの断片を含むことができる。リポソームは、ホルモンあるいは他の血清因子用受容体を発現する細胞へターゲットされることも可能である。
【０２３１】
投与
細胞への構築物の運搬（輸送）
細胞は生体内（インビボ）、生体外（エキソビボ）、又は試験管内（インビトロ）でトランスフェクションさせることができる。細胞は、患者から分離された初代細胞としてあるいは該初代細胞に由来した細胞ライン（細胞系）としてトランスフェクションされることができる。これらは、該細胞が最終的に投与される患者に対して必ずしも自己的（autologous）ではない。生体外（エキソビボ）又は試験管内（インビトロ）でのトランスフェクションに続いて、細胞は宿主へ注入される。細胞の遺伝修飾は遺伝子治療分野で周知な１つ以上の技術を使用して実施することができる（例えば、Human
Gene Therapy 5:543-563 参照)。
【０２３２】
本発明で提供される核酸分子の生体内での標的細胞への投与は、当業者に周知のな様々な技術のうちの任意のものを使用して実施することができる。本発明のベクターは、従来の医薬上許容可能なキャリアー、補助剤及びビークルを含んでいる投与ユニット調剤の形態で、経口、非経口、吸入スプレーによって、直腸経由であるいは局所的に投与することが出来る。薬の直腸投与用坐薬は、通常の温度で固体であるが、直腸温で液体であり直腸の中で溶けて薬剤を放出することができるココア・バッファー及びポリエチレングリコールのような、適当な非刺激性賦形剤（excipient）と薬剤を混合することにより調製することができる。
【０２３３】
提供されたベクター及び(又は)組成物で病気又は疾病を治療するための投与摂生法（dosage
regimen）は、疾病のタイプ、年齢、体重、性別、患者の病状、状態の厳しさ、投与ルート及び使用される特別の化合物を含む様々な要因に基づく。したがって、投与摂生法は広く変わるかもしれないが、標準分析法を使用して経験的に決定することができる。
【０２３４】
薬学的に活性な化合物(つまりベクター又はリガンド)は、ヒト及び他の哺乳動物を含む患者への投与のための医薬物質を生産するために従来の薬理学的方式に従って加工調製することができる。経口投与用には、医薬組成物は、例えばカプセル、タブレット、懸濁液、あるいは液体の形態とすることが出来る。医薬組成物は好ましくは所定量のDNAかウイルスベクター粒子(まとめて、「ベクター」という)を含んでいる投与ユニットの形態として作られる。例えば、これらは、約１０３〜１０１５ベクター粒子、好ましくは約１０６〜１０１２ベクター粒子のベクター量を含むことが出来る。ヒトあるいは他の哺乳動物にふさわしい毎日の投与量は患者及び他の要因の条件に広く依存して変わるかもしれないが、これもルーチン方法を使用して決定することができる。ベクターも、食塩水、ブドウ糖あるいは水等の適切なキャリアを含む組成物として注入によって投与することが出来る。
【０２３５】
核酸及びベクターを唯一の活性医薬物質としてここに投与することができるが、さらに、それらは１つ以上のベクターあるいは他の物質と組み合わせて使用することができる。組み合わせとして投与されるとき、治療物質は、同時に若しくは異なる時に与えられる個別の組成物として調製することもでき、又は、治療物質を単一の組成物として与えることもできる。
【０２３６】
リガンドも同様に、経口、非経口、静脈内、筋肉内、及び公知の他のルートを含む任意の適切な投与モードによって輸送することが出来る。公知の任意の医薬製剤が可能である。
【０２３７】
リガンド
注記されるように、リガンドは天然のリガンドでも良いが、LBDが修飾されてそれと特異的に相互作用するように、好ましくは非天然のリガンドである。LBDを修飾する方法が知られており、そのようなリガンドの選別方法も公知である。リガンドとしては、非天然のリガンド、ホルモン、抗ホルモン、合成ホルモン、合成化合物あるいは化学的修飾された天然化合物、及びその他のこのような化合物が含まれる。合成リガンドの例として、以下のものに制限されないが、下記:1)
LBB938 4-(lZ)-3-ビシクロ[ヘプタ-2-イル―1-{4-[2-(ジメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-フェニルプロプ-l -エニル]フェノール;2)
LBB551カルバミン酸、[(2Z)-3-[4-[2-(ジメチルアミノ)エトキシ]フェニル]-3-(4-ヒドロキシフェニル)-2-フェニル-2-プロペニル]-、メチルエステル;3)
LBCO81カルバミン酸、[(2E)-3-[4-[2-(ジメチルアミノ)エトキシ]フェニル]-3-(4-ヒドロキシフェニル)-2-フェニル-2-プロペニル]
]-、メチルエステル、及び、4)LBF58O 4-((lE) -l-{4-[2-(ジメチルアミノ)エトキシ]フェニル}-2-(4-モルホリン-4-イルフェニル)プロプ-l-エニル)フェノール。
追加の非天然のリガンドとしては、一般に、タモキシフェンの合成誘導体を含む合成の非ステロイド性の化合物が含まれる。
【０２３８】
医薬組成物及び組み合わせ
更に、治療上有効な量の融合タンパク質又は該タンパク質をコードする核酸分子を医薬上許容可能なキャリア中に含んでいる医薬組成物が提供される。異なるリガンド結合ドメインを有する１つ以上の融合タンパク質を含んでいる医薬組成物が考慮される。さらに、発現カセットを含んでいる医薬組成物が提供される。また、さらに、リガンドを含んでいる組成物が提供される。多くの組成物を含んでいる組み合わせも提供される。さらに、例えば合成リガンドなどの、様々なリガンドを含んでいる医薬組成物が提供される。
【０２３９】
組成物の調製
溶解されたか分散した有効成分を含んでいる薬理学的組成物の調製は周知である。典型的に、そのような組成物は、水溶性又は非水溶性の溶液又は懸濁液である無菌の注射可能なものとして調製されている。しかし、使用に先立って液体における溶液又は懸濁液にふさわしい固体形態も調製することができる。その調製物は乳化される場合がある。タブレット及び他の固体形態が考慮される。
【０２４０】
有効成分は、ここに記載された治療の方法で使用するにふさわしい量で、薬学的に受理可能で有効成分と相性がよい（compatible）賦形剤と混合することが出来る。適切な賦形剤には、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールあるいはその他同種のもの、及びそれらの組み合わせである。さらに、もし望まれれば、組成物は、少量の加湿剤（wetting
agent）又は乳化剤のような補助物質、及び、有効成分の有効性を増強するｐＨ緩衝剤及び同種のものを含むことが出来る。
【０２４１】
治療用医薬組成物は、成分の医薬上許容可能な塩類を含むことができる。医薬上許容可能な塩類には、例えば塩化水素あるいはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸によって形成される酸付加塩類(ポリペプチドのフリーなアミノ基で形成される)が含まれる。フリーなカルボキシル基で作られた塩類も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムあるいは水酸化鉄のような無機塩基、及び、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン及び他のもののような有機塩基に由来する場合がある。
【０２４２】
生理学上許容可能なキャリアは当該技術分野において周知である。液体キャリアの例として、有効成分と水以外の物質を含んでいない無菌の水溶液か、生理学のｐＨ値のリン酸ナトリウム、生理的塩類あるいは燐酸塩緩衝食塩水のようなその両者を含む無菌の水溶液である。まだ更に、水溶性のキャリアーは、ナトリウム及び塩化カリウム、ブドウ糖、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及び他の溶質のような塩類と同様に１つ以上の緩衝塩を含むことができる。
【０２４３】
液体の組成物は更に、水に加えて又はそれを除いた液体の相を含むことができる。そのような追加の液体相として典型的なものは、グリセリン、綿実油のような植物油、オレイン酸エチルのような有機エステル及び水-油乳濁液である。
【０２４４】
遺伝子調節法
内因性及び外来遺伝子の発現を調節する方法が提供される。特に、リガンド依存性の方法が提供される。方法を実施する際に、融合タンパク質の核酸結合ドメインと相互作用する配列を含んでいる標的核酸分子は、有効な結合量のリガンド（それは融合タンパク質と同時に又はその後に添加することができる）の存在下で有効な量の融合タンパク質に暴露（接触）される。融合タンパク質の核酸結合ドメインは標的核酸分子の部分に結合し、リガンドは融合タンパク質のリガンド結合ドメインに結合する。暴露はインビトロ、インサイト（その場）、又はインビボで生じる場合がある。
【０２４５】
治療
遺伝子治療のための方法が提供される。融合タンパク質は、タンパク質として、あるいは該タンパク質をコードする核酸として投与され、ヒトのような哺乳動物中の細胞あるいは組織に運搬される。融合タンパク質は、ゲノム(内因性遺伝子)中の特異的な配列に、あるいは、発現カセットの一部として投与された外来性の追加遺伝子にターゲットされる。融合タンパク質の投与に先立って、それと同時に、又はその後に続いて、融合タンパク質中のLBDと特異的に相互作用するリガンドが投与される。ターゲットとされた遺伝子が外来性である具体例では、ベクターの中にあり得る発現カセットが、融合タンパク質の投と同時に、又はその後に投与される。
【０２４６】
これらの方法は、任意の遺伝的疾患の治療、後天性疾病及び他の病状の治療を意図している。疾患（病気、疾病）には、癌のような細胞の増殖障害が含まれる。そのような治療は、障害がある動物の細胞へ、融合タンパク質のいずれかとして、ジンクフィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドを融合タンパク質として又は該細胞の中で発現される核酸分子にコードされて含んでいる融合タンパク質を導入することによってその治療効果を達成する。ここに記載された方法を含む当該技術分野における熟練者に公知の任意の方法によって、融合タンパク質又は核酸分子の運搬を達成することができる。例えば、それは、キメラウィルスあるいはコロイド分散系のような組み換えの発現ベクターを使用して達成することができる。
【０２４７】
本発明で提供される融合タンパク質は、様々な疾患の治療に使用することができる。例えば、タンパク質は、例えば、肺、胸、リンパ系、胃腸、及び尿生殖路のアデノカルシノーマ、及び、ほとんどの結腸癌、腎臓部の細胞の癌、前立腺癌、肺の非小細胞癌、小腸癌及び食道癌のようなその他の悪性腫瘍の治療に使用することができる。さらに、ジンクフィンガー・ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、また脂質性組織球増殖症のような非悪性の細胞増殖性疾病を治療するのに役立つ。
【実施例】
【０２４８】
本発明をさらに以下の詳細な実施例によって説明する。これらの実施例は説明の目的のためであって、特に記載がない限り制限するものではない。ここに使用する標準的組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当業者には公知のものであって、例えばアウスユーベル（Ausubel）（編集）、最新分子生物学実験法（Current Protocols in Molecular Biology）、ジョンウィリー・アンド・ソンズ社（John
Wiley and Sons,Inc.）（１９９４）；サムブルック・アンド・ラッセル（J.Sambrook and D.W.Russell）著、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular
Cloning：A Laboratory Manual）：第３版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・ハーバー・、ＮＹ（２００１）；バーマン・アンド・エンキスト（T.J.Berman
and L.W.Enquist）、遺伝子融合実験（Experiments with Gene Fusions）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ．（１９８４）に記載されている。
（実施例１）
【０２４９】
細胞をベースにしたレポーター アッセイ
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白による導入遺伝子発現のリガンド依存性調節
融合蛋白類Ｃ７ＬＢＤ  Ａ、Ｂ、及び関連するＬＢＤ突然変異体類の、導入遺伝子発現を調節する能力を評価するために、標準的コトランスフェクション
レポーター アッセイを実施した。ＳＶ４０プロモーター断片の上流に挿入された直接反復されるＣ７結合部位の６個のコピー（６ｘ２Ｃ７）と、ホタル ルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子（ｐＧＬ３Ｐｒｏ；プロメガ（Promega））とを含むレポーター構成物（以後６ｘ２Ｃ７ｐＧＬ３Ｌｕｃとしてあらわされる）を、指示された融合蛋白と共にトランスフェクトし、下記のように試験した。コンセンサスＣ７結合部位は５’−ＧＣＧ
ＴＧＧ ＧＣＧ−３'であることに留意されたい。
【０２５０】
培養細胞（Ｈｅｌａ、Ｃｏｓ、Ｈｅｐ３Ｂ等）を５×１０4細胞／ウェルの割合で２４ウェルプレートに植え付け、後日、Ｌ−グルタミン及び５％（ｖ／ｖ）のチャコール／デキストラン処理ウシ胎児血清（ｓＦＢＳ）を補充した無フェノールＤＭＥＭ培地にトランスフェクトした。キアゲンスーパーフェクト トランスフェクション法（Quiagen Superfect Transfection Method）を使用して細胞をトランスフェクトした。各ウェルについて、０.５μｇのルシフェラーゼレポーター プラスミド（６Ｘ２Ｃ７ｐＧＬ３Ｌｕｃ）、０.１μｇのキメラアクチベータＤＮＡ（例えばＣ７ＬＢＤＡ、Ｃ７ＬＢＤＢ、またはこれらの突然変異体）及び０.４μｇの不活性キャリヤープラスミドＤＮＡ（ｐ３Ｋｐｎ）を含む１μｇの総ＤＮＡを、ＤＭＥＭ無フェノール／無血清培地６０μＬ及びスーパーフェクト試薬５μＬと混合した。通常、各ウェルで約１０ｎｇないし約０.５μｇのキメラアクチベータＤＮＡを使用した。
【０２５１】
混合物を１０秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートし、その後無フェノールＤＭＥＭ５％ ｓＦＢＳ培地３５０μＬを加えた。細胞をダルベッコ燐酸緩衝食塩液（ＤＰＢＳ）で一回洗い、トランスフェクション混合液をそれら細胞に加えた。３７℃で２.５時間インキュベーション後、細胞をＤＰＢＳで一回洗い、ＤＭＥＭ無フェノール５％ｓＦＢＳ培地を再供給した。
【０２５２】
トランスフェクションの約２４時間後に指示された試験化合物類、１７β−エストラジオールまたは４ＯＨ−タモキシフェン等の誘導剤で細胞を処理した。誘導剤の濃度は無フェノールＤＭＥＭ５％
ｓＦＢＳ中、最終濃度が１ないし１０００ｎＭの範囲になる濃度であった。２４時間後、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、２００μＬの１Ｘレポーター溶解緩衝液（プロメガ）を加えるというやり方で細胞を処理した。プレートを−８０℃で凍結し、試験当日にオービタルシェーカーを使用して（１００ＲＰＭ）室温で１.５時間融解した。細胞くずを沈殿させた後、溶解液を新しいチューブに移し、１Ｘレポータ溶解緩衝液で１：１０に希釈し、１０μＬを９６ウェル不透明プレートに移した。ルシフェラーゼアッセイはメーカーの指示（プロメガ）にしたがって行われ、プレートをＴｒｏｐｉｘ
ＴＲ７１７マイクロプレート ルミノメータで分析した。
（実施例２）
【０２５３】
アデノウイルスベクター類
アデノウイルスベクターにおけるＣｙｓ2−Ｈｉｓ2ジンク・フィンガーＤＢＤ−ＥＲ ＬＢＤレギュレータの構成及び評価
調節系の２つのコンポーネントをｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物細胞に運び込むために、アデノウイルスベクターの一系列を構成した。これらのベクターは前記のように、ＣＭＶ最初期プロモーターに結合したＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白レギュレータ、或いはＣ７結合部位の６ｘ２Ｃ７アレーに結合した調節可能導入遺伝子のいずれかを、ＳＶ４０またはｃ−ｆｏｃ
ＴＡＴＡからの最小プロモーターと共に含んでいた。上記融合蛋白調節ベクター及び調節可能導入遺伝子ベクターを種々の比率で混合し、標準的方法によって細胞または動物に運び込んだ。ここに記載する方法を使用して、本出願の目的である突然変異した全てのＬＢＤ変異体を構成し、評価することができる。
【０２５４】
アデノウイルスベクターの構成は日常的であり、通常、その方法は主要三段階を含む：先ず第一に、ウィルス左ＩＴＲと、ウィルスパッケージングシグナルと、プロモーター要素と、上記プロモーター要素に結合し、その後ポリアデニル化配列に結合する所望の導入遺伝子と、組換えに必要な幾つかの追加的ウィルス性または非ウィルス性ＤＮＡ配列とを含むシャトルプラスミドを作製する。第二に、この左端シャトルプラスミドをウィルスゲノムの残り部分（すなわちベクターの右端）と共にホスト細胞にトランスフェクトし、ＤＮＡ組換えによって接合し、完全なベクターゲノムを形成する。この組換え段階は２つの半ベクター間の配列相同性によって起こり、またはＣｒｅのような部位特異的リコンビナーゼ類やそれらに対応するＬｏｘＰ組換え配列の使用によって促進される。最後に、新しく形成されたウィルスを増殖し、一連のプロセスによって精製する。これらのベクターの構成の詳細を以下に短く記載する。
【０２５５】
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白レギュレータのための左端シャトルプラスミド構成物
左ウィルスＩＴＲと、ＣＭＶ最初期プロモーターと、ＺＦＰ−ＬＢＤレギュレータとを含むシャトルプラスミド類をプラスミドｐＡｖＣＶ１ｘにおいて作製した。図７を参照されたい。このベクターはポリアデニレーション配列のすぐ下流にｌｏｘＰ組換え部位を含むことに注目されたい。キメラレギュレータＣ７ＬＢＤ
Ｂｓ（Ｇ５２１Ｒ）、Ｃ７ＬＢＤ Ｂｓ（３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２４８Ａ）、Ｃ７ＬＢＤ Ｂｓ（５２４Ｇ）及びＣ７ＬＢＤ Ｂｓ（４２１Ｖ−４２８Ａ）のための完全なリーディングフレームをコードするＤＮＡを、適切なｐＣＤＮＡから、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによる消化によって切り取った。ＺＦＰ−ＬＢＤ
ＤＮＡ断片類をクレノウ断片で修飾して制限部位のオーバーハング配列を充填し、平滑末端（blunt end）をｐＡｖＣｖ１ｘのｂｐ１３９３部位でＥｃｏＲＶに結合して、ｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ
Ｂｓ（Ｇ５２１Ｒ）、ｐＡｖＣｖ-Ｃ７ＬＢＤ Ｂｓ（３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８Ａ）、ｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ Ｂｓ（５２４Ｇ）及びｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ Ｂｓ（４２１Ｖ−４２８Ａ）を作製した。
【０２５６】
調節可能導入遺伝子カセットを含む左端シャトルプラスミドの構成
ｐＧＬ３ ６ｘ２Ｃ７−Ｌｕｃ（上の実施例に記載されている）におけるように、６ｘ２Ｃ７結合部位と、ルシフェラーゼ導入遺伝子に結合したＳＶ４０最小プロモーター断片とを含む調節可能導入遺伝子カセットを作製した。
【０２５７】
これらのベクターは２段階で作製された。第一に、ＣＭＶプロモーターと、ｐＡｖＣＶ１ｘ（図７）の３重構造の先導配列（ＴＰＬ）とを含む断片をＭｌｕＩ消化及びＢＧ１ＩＩ消化によって切り取った；これらの消化はそれぞれｂｐ４７３及び１３７５を切断する。制限部位のオーバーハング配列をクレノウ断片で充填した。既述のレポータプラスミドの６ｘ２Ｃ７−ＳＶ４０エンハンサー／プロモーター領域を含む平滑末端ＤＮＡ断片をこの主鎖に結合し、ｐＡＶ−６ｘ２Ｃ７ＳＶ４０シャトルプラスミドを作製した。次に、ルシフェラーゼ導入遺伝子を含むＤＮＡ断片を上記シャトルプラスミドのＥｃｏＲＶに結合して、ｐＡｖ６ｘ２Ｃ７ＳＶ４０−Ｌｕｃ（ｌｏｘ）が生成した。
【０２５８】
右端ベクタープラスミドの構成
ベクターの構成を完了するためにはウィルスベクターゲノムの残りの部分を含むプラスミドが必要である。ｐＳＱ３と呼ばれるこのプラスミドは（図８）、Ａｄ５
ｂｐ３３２９から始まって右ＩＴＲに至り、ｐＢＲ３２２−誘導主鎖、アンピシリン耐性遺伝子及びアデノウィルス血清型５ゲノムを含み、Ｅ２ａ及びＥ３領域は前にも述べたように欠失している（ゴルジグリア（Gorziglia）ら（１９９６）J.Virol.７０巻：ｐ．４１７３−４１７８）。さらにこのプラスミドは次のような二つの重要な特徴を有する：Ａｄ５配列のすぐ上流のＢａｍＨＩ部位（ｂｐ３１５６９）に挿入されたｌｏｘＰ部位、及びウィルス５’ＩＴＲの端にあるＣｌａＩ部位である。ベクター構成中に、このＣｌａＩ部位を用いてプラスミドを線状にし、右ＩＴＲを露出させる。
【０２５９】
ベクターの組立て及び増幅
融合蛋白レギュレータをコードするアデノウィルスベクター類、Ａｖ３ＣＶ−Ｃ７ＬＢＤＢＳ（Ｇ５２１Ｒ）、Ａｖ３ＣＶ−Ｃ７ＬＢＤＢＳ（５２４Ｇ）、Ａｖ３ＣＶ−Ｃ７ＬＢＤＢＳ（３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８Ａ）及びＡｖ３ＣＶ−Ｃ７ＬＢＤＢＳ（４２１Ｖ−４２８Ａ）、及び調節可能ルシフェラーゼ導入遺伝子を含むベクター、Ａｖ３ＳＶ−ＬＵＣ、を作製した。各ベクターは標準的方法によって作製された。つまり、各ベクター構成物について、３種類のプラスミド、すなわちｐＳＱ３（ＣｌａＩであらかじめ消化されている）、ＮｏｔＩ及びＡｆｌＩＩで予備消化された適切な左端シャトルプラスミド（例えばｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ
Ｂｓ（Ｇ５２１Ｒ）またはｐＡｖ６Ｘ２Ｃ７ＳＶ４０-Ｌｕｃ（ｌｏｘ））、及びＣｒｅリコンビナーゼのための発現プラスミド（ｐＣＭＶ−ＣＲＥ）を、プロメガのプロフェクションキットを使用して、３：１：１の重量比でデキサメタゾン誘導ＡＥ１−２ａ細胞（ゴルジグリアら）内に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの約１週間後に、細胞を採取し、４サイクルの凍結／融解によって溶解した。生成した細胞溶解物を新鮮なデキサメタゾン誘導ＡＥ１−２ａ細胞に移し、培養培地を約１週間、すなわち細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められるまで維持した。このプロセスを数サイクル繰り返して十分な材料を得、ＣｓＣｌ平衡密度遠心分離によってこのベクターを精製した。精製後、ベクターを１０ｍＭトリス、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、０.１％ＳＤＳを含む緩衝液中で５６℃で１５分間溶解することによって定量し、冷却し、波長２６０ｎｍで吸光度を読み取る（ＯＤ２６０）。１
ＯＤ２６０単位＝１.１×１０12粒子／ｍｌの換算式を使用して、ＯＤ２６０の読みをウィルス粒子濃度に変換する。
【０２６０】
結果
アデノウィルスベクターによるin vitro調節
アデノウィルスベクターによって運び込まれた導入遺伝子の発現調節能力を下記の実験によって証明した。ＨｅＬａ細胞に２種類のアデノウィルスベクターの混合物を感染させた：一つは融合蛋白レギュレータを含むベクター（例えばＡｖ３−Ｃ７ＬＢＤＢ（Ｇ５２１Ｒ））、他は６ｘ２Ｃ７ＳＶ４０−ｌｕｃカセットを含むベクター。上記２種類のベクターはそれぞれ１細胞あたり５０のベクター粒子及び１細胞あたり２５０のベクター粒子という量が使用された。ベクターの形質導入後２４時間経ってから、細胞に必要に応じて試験化合物１００ｎＭを加えた。さらに２４時間インキュベーション後に細胞を溶解し、前記のようにルシフェラーゼ活性を測定した。この実験の結果を図５にまとめる。
【０２６１】
これらのデータは、３種類全ての突然変異体ＬＢＤと試験した新規化合物との組み合わせが薬剤依存的にルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を刺激し得たことを示す。４２１Ｖ−４２８Ａ突然変異体のＬＢＣ０８１に対する応答は誘導倍率が３程度のものではあったが、３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８Ａ及び５２４Ｇは両方とも、Ｇ５２１Ｒ突然変異体で４−ＯＨＴによって得られた誘導レベルに匹敵するレベルでそれらそれぞれの化合物に応答した。
【０２６２】
結論
これらのin vitro結果は、ＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白類がアデノウィルスベクターによって効率的に運搬され、細胞内において導入遺伝子が薬剤依存性調節をもたらすのに十分な量が発現されることを明らかにしている。さらに、データによると、アデノウィルスベクターに組込んで試験した６ｘ２Ｃ７最小プロモーター構成物類で得られる基礎的発現レベルは、上記融合蛋白が同じ細胞内で発現する際にも、比較的低レベルの発現を与えることがわかる。
（実施例３）
【０２６３】
レンチウィルスベクター
レンチウィルスベクターにおけるＣｙｓ2−Ｈｉｓ2ジンク・フィンガーＤＢＤ−ＥＲ ＬＢＤレギュレータの構成及び評価
組込み型ベクター系におけるコントロールされた遺伝子発現を明らかにするために、これまでのアデノウィルスベクターの例（実施例２）に記載したものと同様な調節系（例えばＣ７ＬＢＤ−Ａｓ（Ｇ５２１Ｒ））を使用して一連のレンチウィルスベクターを開発することができる。これらのベクターはＣＭＶ最初期プロモーターに結合したＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白、またはＣ７結合部位の６Ｘ２Ｃ７アレーに結合した調節可能導入遺伝子（ｅＧＦＰまたはルシフェラーゼ）のいずれかと、ＳＶ４０からの最小プロモーターかＣ−ｆｏｓ遺伝子最小ＴＡＴＡボックス領域のいずれかを含むのが好ましい。融合蛋白をコードするベクター及び調節可能導入遺伝子ベクターを使用してレンチウィルスベクター上澄液を生成することができる。この上澄液を使用して、ヒト細胞に別々にまたは平行して安定的に形質導入することができる。組込み型ベクターを含む安定した細胞系をその後適切な活性剤（例えば４−ＯＨ−タモキシフェン）で誘導することができ、遺伝子発現が薬剤の存在するときと存在しないときの誘導倍率として測定される。
【０２６４】
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白または調節可能導入遺伝子をコードするレンチウィルスベクターの構成
レンチウィルスベクター及びベクター上澄液の生成には主要３段階が含まれる：第一に、対象の遺伝子または領域を、転写、パッケージング、逆転写、及び組込みのためのウィルス性シス−要素の全てを含むシャトルベクター主鎖プラスミドに挿入する。第二に、レンチウィルスベクターシャトルプラスミドを、パッケージング機能を与えるプラスミド（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）と共にヒト２９３細胞に同時トランスフェクトする。一般的にはそのトランスフェクションは１０μｇのベクタープラスミド、１０μｇのパッケージングプラスミド及び１μｇのエンベローププラスミド（水疱性口内炎ウィルスＧエンベロープ）を含み、プロフェクション・燐酸カルシウム・トランスフェクションキットを使用する。第三に、レンチウィルスベクターを含む培養培地の上澄液を採取し（トランスフェクション後２４時間から４８時間までの間に）、これを用いてナイーブなヒト標的細胞に形質導入する。
【０２６５】
ＨＩＶ−１をベースにするベクター類の構成
内部ＣＭＶプロモーターを含むＨＩＶ−１−ベース−ベクター系を感染性ＨＩＶ−１IIIBプロウィルスｃＤＮＡ（ＰＨＩＶ−ＩＩＩＢ）から構成した。感染性プロウィルスｃＤＮＡは、ＨＩＶ−１IIIBに慢性感染したＨ−９細胞から分離したＤＮＡからＰＣＲによって作製された。ｐＨＩＶＩＩＩＢのｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖ配列を、ＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片の消化及び切断によって除去した。ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖに代わるものは独特な多クローニング部位を含むＰｓｔＩ−Ｋｐｎポリリンカーで、これは中間ベクターｐ２ＸＬＴＲを形成した。正しいベクターＲＮＡ操作のために必要とされる、ＨＩＶＩＩＩＢからのＲｅｖ反応要素（ＲＲＥ）を、ｐ２ＸＴＲの短縮ｇａｇ配列の下流に挿入し、構成物ｐＨＩＶｅｃを形成した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（クローンテク（Clontech）、パロ・アルト、カリフォルニア）から誘導されたＡｓｅＩ−ＸｂａＩ ＣＭＶ−ｅＧＦＰレポータ断片をｐＨＩＶｅｃのＮｄｅＩ−Ｘｂａ部位にクローン化し、ｐＨＩＶＣＭＶＧＦＰを作製した。ｐＨＩＶＣＭＶ−ＸはＫｐｎＩ消化及び再結合によるｒＧＦＰの除去によって生成した。
【０２６６】
ｐＨＩＶＣＭＶ−Ｃ７ＬＢＤ／Ａ（Ｇ５２１Ｒ）の構成
Ｃ７ＬＢＤ／Ａ（Ｇ５２１Ｒ）コーディング断片を適切な発現プラスミドから消化によって切取り、ＣＭＶプロモーターの下流のｐＨＩＶＣＭＶ−Ｘにクローン化する。誘導のための対照として、構成的トランスアクチベータ及びＤＢＤキメラを含むＨＩＶベクター、ｐＨＩＶＣＭＶ−Ｃ７ＶＰ１６を作製する。Ｃ７ＶＰ１６コーディング断片を含むｐＣＤＮＡ３−Ｃ７ＶＰ１６からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ制限断片をＣＭＶプロモーターの下流、ｐＨＩＶＣＭＶｅｃＣＭＶ−ＸのＳｍａ部位に挿入する。
【０２６７】
ｐＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７Ｓｖ及びｐＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡルシフェラーゼベクターの構成
６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡルシフェラーゼ断片を含むＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ制限断片をｐＴＡＴＡ６Ｘ２Ｃ７Ｌｕｃから分離し、ＲＲＥの下流、ＳｐｅＩ−ＸｂａＩ制限部位にクローニングする。６Ｘ２Ｃ７Ｓｖルシフェラーゼ断片を含むＭｌｕＩ−ＢｓｔＢＩ制限断片をｐＧＬ３−６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｃから分離し、ＲＲＥの下流、Ｓｐｅ−ＸｂａＩ制限部位にクローニングする。
【０２６８】
ＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白及び調節可能レンチウィルスベクターの評価
誘導性レンチウィルスベクターによるＨｅＬａ細胞の形質導入
融合に近い状態のＨｅＬａ細胞にＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｃまたはＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡＬｕｃベクター上澄液で２４時間形質導入し、その後ＨＩＶＡＳ５２１Ｒレンチウィルスベクター上澄液で形質導入する。細胞を新鮮培養培地中で２４時間感染から回復させ、その後４−ＯＨ−タモキシフェン（１００または１０００ｎＭ）をさらに２４時間培養培地に加えた。細胞を標準ルシフェラーゼ溶解緩衝液中で溶解し、凍結−融解し、ルシフェラーゼ・アッセイ・キット（プロメガ）を使用してルシフェラーゼ活性を分析した。その結果、ＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｃまたはＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡＬｕｃを感染させ、その後ＨＩＶＣＭＶＡＳ５２１Ｒで形質導入した細胞は、４−ＯＨ−タモキシフェンを与えると、それぞれ１３.１倍及び１１.７倍のルシフェラーゼ活性増加を示すことが判明した。
【０２６９】
レンチウィルスに組込まれた標的ベクター群のレンチウィルス形質導入
ＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｃまたはＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡＬｕｃのいずれかであらかじめ形質導入されたＨｅＬａ細胞を培養培地に移し、ＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白にさらすことなく９回継代培養を行った。１０次の継代培養において、細胞をＨＩＶＡＳ５２１Ｒで２４時間形質導入し、その後１００ｎＭタモキシフェンをさらに２４時間加える。その結果は、組込み型ＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｓまたはＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡＬｕｓベクター内の導入遺伝子はＣ７ＬＢＤ−Ａｓ（Ｇ５２１Ｒ）によって、タモキシフェン依存的にアップレギュレートし得ることを示す。組込み型ＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＳｖＬｕｃまたはＨＩＶ６Ｘ２Ｃ７ＴＡＴＡＬｕｃベクターの誘導はそれぞれ３１.４倍及び２２.５倍である。これらのデータは、ホスト細胞染色体に安定的に組み込まれた導入遺伝子の発現をコントロールするためにＣ２Ｈ２−ＬＢＤレギュレータが有効であることを証明するものである。
（実施例４）
【０２７０】
エストロゲン受容体リガンド結合ドメインの修飾はリガンド選択性を改善する
エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン内のある種のアミノ酸残基の修飾は、合成リガンド類による上記受容体の選択的活性化を可能にする。野生型ＥＲがエストラジオールと相互作用する際の構造−活性の関連性（ＳＡＲ）は比較的よく知られており、修飾をデザインして被修飾受容体上のエストラジオール活性を低下または排除することができる。例えば、ＥＲ残基５２１のグリシンからアルギニンへの単点突然変異が報告されており、これはエストラジオールの野生型ＥＲへの結合親和性を劇的に減らす。だがこの突然変異は合成抗エストロゲン４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）の結合にはほとんど影響を与えない［ダニエリアン（Danielian,P.S.）、ホワイト（White,R.）、ホア（Hoare,S.A.）、ファウェル（Fawell,S.E.）、パーカー（Parker,M.G.）著（１９９３）“エストロゲン及びヒドロキシタモキシフェンに差別的感受性を伝えるエストロゲン受容体残基の確認（Identification
of Residues in the estrogen receptor that confer differential sensitivity to
estrogen and hydroxytamoxifen）”。Mol.Endo．７巻：ｐ．２３２−２４０］。
【０２７１】
同様に、ＥＲ残基４００のグリシンからバリンへの突然変異はエストラジオールに対する野性型ＥＲの反応性を著しく低下させるが、この突然変異は４−ＯＨＴ結合にほとんど影響を与えない［トラ（Tora,L.）、ムリク（Mullick,A）、メツガー（Metzger,D）、ポングリキトモンゴル（Ponglikitmongkol,M.）、パーク（Park,I.）、チャンボン（Chambon,P.）著（１９８９）“クローン化ヒトエストロゲン受容体はそのホルモン結合特性を変える突然変異を含む（The
cloned human oestrogen receptor contains a mutation which alters its hormone
binding properties）”Embo J．８巻：ｐ．１９８１−１９８６］。ＥＲ Ｍ４２１の単点突然変異もエストラジオールに対する受容体の反応を低下させることを最後につけ加えておく（ミラー（N Miller）＆ ホェラン（J Whelan）、
J.Steroid Biochem.Molec.Biol．６４巻：ｐ．１２９−１３５、１９９８）。
【０２７２】
より最近になって、アゴニストであるエストラジオールまたはアンタゴニストであるラロキシフェンまたはタモキシフェンと錯体を形成するＥＲ
ＬＢＤを明らかにするＸ線結晶構造が得られるようになった［アンドレジ（Andrej,M.）、ブゾゾウスキー（Brzozowski）ら。“エストロゲン受容体におけるアゴニズム（作用性）及びアンタゴニズム（遮断性）の分子的基礎（Molecular
basis of agonism and antagonism in the estrogen receptor）”Nature １９９７ ３８９巻：ｐ．７５３−７５８；アンドリューＫ．シオー（Andrew K.Shiau）、ダニエル バルスタッド（Danielle Barstad）、ポーラ Ｍ．ロリア（Paula M.Loria）、リン
チェン（Lin Cheng）、ピーターＪ．クシュナ（Peter J.Kushner）、デイビド Ａ．アガード（David A.Agard）、ジョフリーＬ．グリーン（Geoffrey
L.Greene）著“エストロゲン受容体／コアクチベータ認知の構造的基礎、及びこの相互作用のタモキシフェンによる拮抗作用（The Structural
Basis of Estrogen Receptor/Coactivator Recognition and the Antagonism of This
Interaction by Tamoxifen）”セル（Cell）１９９８ ９５巻：ｐ．９２７］。このことはリガンド−受容体相互作用の分子的理解に大きく貢献した。ステロイド類及び非ステロイド類とＥＲ−ＬＢＤとの相互作用の構造的情報及びＳＡＲ両方が与えられれば、今や十分な情報を利用して、特異的に修飾された受容体ＬＢＤに対して高度な選択性を有する新規の合成化合物をデザインできることになる（テデスコ（Tedesco）ら、ケミストリー・アンド・バイオロジー、２００１、８巻：ｐ．２７７−２８７）。
【０２７３】
領域１の修飾
ＥＲ−タモキシフェン及びＥＲ−エストラジオール複合体結晶構造の分析によって（前記を参照されたい）、蛋白及びリガンドの同時修飾を受けやすいＥＲ
ＬＢＤ内の幾つかの領域が確認された。第一の領域（ここでは領域１（Ｒ１）とする）は広義に、タモキシフェンのエチル側鎖に隣接する、またはその近くの領域と定義される。より詳細に述べれば、領域１はＥＲリガンド結合ドメイン内のアミノ酸を含んでなり、これらアミノ酸のいずれかの部分は４−ＯＨ−Ｔａｍのエチル側鎖の末端炭素（４−ＯＨ−ＴａｍのＣ１０の位置としても知られる）の約９オングストローム内にある。領域１内の重要な残基は、非制限的に、Ｍ３８８、Ｌ３９１、Ｍ４２１、Ｉ４２４、及びＬ４２８を含む。通常、領域１内の残基は修飾されてより小さいアミノ酸側鎖になり、タモキシフェンのエチル側鎖に付加する大きな置換基のための空間をつくる。
【０２７４】
一実施例において、オリゴヌクレオチド介在性部位特異的変異誘発を融合蛋白ＥＲ−ＬＢＤ−Ｃ７ＬＢＤａ及びＣ７ＬＢＤｂをコードするプラスミド上で行い(ストラタジーン（Stratagene）；クィックチェンジ部位特異的変異誘発キット)、残基４２１のメチオニンをバリンに、残基４２８のロイシンをアラニンに置換した。４２１Ｖ／４２８Ａ変異誘発のために使用したオリゴヌクレオチドの配列を次に示す：
コード鎖では
ＧＴＡＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣ（配列番号：１７）
非コード鎖では
ＧＡＴＧＴＡＧＣＣＡＧＧＧＣＣＡＴＧＴＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣ（配列番号：１８）
上記配列中、太い下線を引いたヌクレオチドは野生型配列から変化したものをあらわす。
【０２７５】
各反応ごとに１０ｎｇないし５０ｎｇのテンプレートを、各プライマー１２５ｎｇと共に、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０.１％トリトンＸ−１００、０.１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、ｄＮＴＰミックス、及び２.５Ｕフターボ（PfuTurbo）（商標）ＤＭＡポリメラーゼに加えた。反応はパーキンエルマー・遺伝子増幅装置ＰＣＲシステム９６００サーマルサイクラーで３０秒間初期温度９４℃にしてテンプレートを変性させ、その後１５サイクルを９５℃で３０秒間、５３℃で１分間、６８℃で６分間行い、伸長させるために１ラウンドを７２℃で２.５分間行った。ＰＣＲサンプルを３０℃で１時間、１０Ｕ
ＤｐｎＩで処理し、突然変異を誘発しなかった親テンプレートを消化した。
【０２７６】
ＤＨ５αスーパーコンピテント エピキュリーン コリ（Epicurean Coli）（商標）ＸＬ−１細胞を次のようにして形質転換した；冷却ファルコン２０５９チューブ中でＤｐｎＩで処理したＰＣＲサンプル１μＬと上記細胞５０μＬとを一緒にし、氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で４５秒間熱ショックを与え、氷上で２分間冷却した。４２℃に予備加熱したＳＯＣ培地の５００μＬ部分を形質転換反応体に加え、３７℃で振とうしながら１時間インキュベートした。形質転換した細胞を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレート上に置き、少なくも１６時間インキュベートした。
【０２７７】
また別の実施例では、残基３８８、４２４及び４２８の修飾を組み合わせることによって領域１突然変異のコレクションを作った。ＥＲ−ＬＢＤ３８８／４２４／４２８突然変異体コレクションは、先ず最初に、残基４２８にバリンまたはアラニンを含むように突然変異したプラスミドＤＮＡクローンを選択することによってつくられた。４２８Ａ及び４２８Ｖをテンプレートとして使用し、天然Ｍ３８８及びＩ４２４残基を種々様々のサイズ及び疎水性を有する残基に置換した。メチオニン３８８はバリン（ＶまたはＶａｌ）、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）またはトリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）のいずれかで置換され；イソロイシン４２４はアラニン、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）またはフェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）で置換された。特異的オリゴヌクレオチドプライマー類が、突然変異体を組み込むようにデザインされた。これらのオリゴヌクレオチドプライマー類の配列は表５に列挙される。特に興味深い一突然変異体ＥＲ−ＬＢＤ３８８Ｖ／４２４Ｙ／４２８Ａを得るために使用したオリゴヌクレオチドの配列を以下に記す：
３８８ＶではＧＣＴＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣ（配列番号：１９）
４２４ＹではＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＣ（配列番号：２０）
４２８ＡではＧＡＴＣＴＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣ（配列番号：２１）
【０２７８】
３８８及び４２４のアミノ酸は次のようにin vitro部位特異的変異誘発システム（プロメガ
ジーンエディター（商標）キット）を使用して同時に置換される。反応ごとに０.２μｇのテンプレートを０.２５ｐｍｏｌセレクション オリゴヌクレオチド及び１.２５ｐｍｏｌの各変異原オリゴヌクレオチドと共に、２００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１００ｍＭ
ＭｇＣｌ2、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｕ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ及び３ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼに加えた。突然変異体鎖の合成及びリゲーションを３７℃で９０分間行った。
【０２７９】
ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔＳ細胞を次のようにして形質転換した：冷却ファルコン２０５９チューブ中で変異誘発反応体１.５μＬと上記細胞１００μＬとを一緒にし、氷上で１０分間インキュベートし、４２℃で４５秒間熱ショックを与え、氷上で２分間冷却した。４２℃に予備加熱したＳＯＣ培地の９００μＬ部分を形質転換反応体に加え、３７℃で振とうしながら１時間インキュベートした。突然変異効率はＢＭＨ細胞への初期形質転換によって高まる（プロメガジーンエディター ユーザーのマニュアル）。ＤＮＡをキアゲン・ミニ・プレパレーションカラムを使用して分離し、１０ｎｇＤＮＡを使用してジーンエディター・アンチバイオティック・セレクション・ミックス中のＪＭ１０９細胞を形質転換し、突然変異体を分離した。形質転換した細胞を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレート上に培養し、少なくも１６時間インキュベートした。ＤＮＡを分離し、配列を決定して突然変異を確認した。
【０２８０】
第一ラウンドの突然変異体の活性化を、一連のエチル側鎖修飾−４−ＯＨＴ誘導体によって試験した；その際実施例１に記載したように細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを使用した。この突然変異体コレクションのＳＡＲにより、位置３８８及び４２８の小さいアミノ酸側鎖及び残基４２４のより大きい側鎖が試験化合物による活性化のために好ましいことが示唆された。薬剤の活性及び特異性をさらに最適化するために、第二ラウンドの突然変異誘発を実施した。３８８Ｖ／４２８Ａまたは３８８Ａ／４２８Ａを含むプラスミドから始まって、極性のある大きい側鎖を含む種々のアミノ酸、特にＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ及びＴｙｒが、残基４２４において置換された。さらに４２４におけるこれら同じ置換が４２１Ｖ／４２８Ａに関しても行われ、これら２つの突然変異体コレクションの活性化パターンが比較された。変異誘発反応は上記のようにＰＣＲをベースとしたオリゴヌクレオチド介在性部位特異的変異誘発を用いて行った（ストラタジーン；クィックチェンジ部位特異的変異誘発キット）。残基４２４を修飾するために使用したオリゴヌクレオチド
プライマーの配列を表６に列挙する。
【０２８１】
【表５】
2004537293.tif 000006
【０２８２】
【表６】
2004537293.tif 000007
【０２８３】
変異はアミノ酸番号及びその後に置換した残基によって命名した。アミノ酸側鎖の大きさは、Ａｌａ＜Ｖａｌ＜Ｍｅｔ＜Ｐｈｅ＜Ｔｙｒ＜Ｔｒｐである。下線太字は変異したヌクレオチドを示す。
【０２８４】
領域２の修飾
修飾に適したＥＲ−ＬＢＤの第二領域は広義に、エストラジオールのＤ環に最も近い領域と定義づけられる。より詳細に述べれば、この領域（ここでは領域２と呼ぶことにする）はＥＲリガンド結合ドメイン内のアミノ酸類を含んでなり、これらアミノ酸のいずれかの部分は、エストロゲンのＤ−環に対応する４−ＯＨ−Ｔａｍの環にあるパラ位置の炭素（４−ＯＨ−Ｔａｍの位置Ｃ１４としても知られている）の約９オングストローム内に入る。領域２は非制限的に、残基５２４のヒスチジン及び位置５２１のグリシンを含む。蛋白結晶の画像に基づくと、エストラジオールＤ環のパラ−位置の修飾、または上記Ｄ環位置に存在するタモキシフェン内の環のパラ位置の修飾は、残基Ｈ５２４に直接影響を与える。これまでの研究はＥＲ上のエストロゲン活性にとってＨ５２４が重要であることを確認している（カークエケナ（Kirk Ekena）ら、１９９６、J.Biol.Chem.２７１巻：ｐ．２００５３−５９）。しかし好ましい実施形態において、我々の出願はこれまでの研究からは得られなかった２つの追加的パラメータを含む：すなわち前記突然変異体は合成リガンドによって活性化されるのが好ましく、その合成リガンドは野生型ＥＲ上では弱いかまたは不活性であるのが好ましい。
【０２８５】
突然変異体Ｈ５２４Ｇ及びリガンドＬＢＦ５８０
また別の実施例において、オリゴヌクレオチド介在性部位特異的変異誘発を融合蛋白ＥＲ−ＬＢＤ−Ｃ７ＬＢＤａ及びＣ７ＬＢＤｂをコードするプラスミド上で上記のように行い（ストラタジーン：クィックチェンジ部位特異的変異誘発キット）、残基５２４のヒスチジンをアラニンまたはグリシンに置換した。
【０２８６】
Ｈ５２４Ｇ修飾のために使用するオリゴヌクレオチドの配列はコード鎖ではＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧ（配列番号：５２）、非コード鎖ではＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＴＧＣ（配列番号：５３）であった。突然変異したプラスミドを分離し、それらの配列を確認した。新しい突然変異体の機能を、実施例１に記載したように細胞ベース−レポータ遺伝子アッセイを使用して評価した。１０ｎＭで誘導倍率を調べるアッセイでは、化合物ＬＢＦ５８０はＨ５２４Ｇ突然変異体では高度に活性であったが、Ｈ５２４Ａ突然変異体では非常に弱く、活性化倍率の比は１３８：４であった。これは５２４ＧとＬＢＦ５８０との間に高度に選択的相互作用があることを示すものである。さらに、ＬＢＦ５８０は野生型ＥＲでは非常に弱く、３００ｎＭに近いＩＣ５０を有する。５２４Ｇ突然変異体はちょうど１０ｎＭのＬＢＦ５８０によって誘導倍率１４０を示すから（図６）、ＬＢＦ５８０が野生型ＥＲに対して不活性である条件のもとで、この組合わせを使用することができる。５２４Ｇは１０ｎＭエストラジオールによって幾分誘導される（誘導倍率１６）とはいえ、この反応は０.３ｎＭという生理的レベルでは些細なものであり、この突然変異体受容体の in vivo 適用の可能性を制限するものではないことを最後に付け加える。
【０２８７】
【表７】
2004537293.tif 000008
【０２８８】
（実施例５）
【０２８９】
野生型ＥＲ（ｐＨＥＧＯ）に対する薬剤活性
試薬
野生型ＥＲプラスミド（ｐＨＥＧＯ）（登録番号Ｍ１２６７４（配列番号：５４及び配列番号５５）、参考として本明細書に組み込まれる）はピー・シャンボーズ
ラボラトリー（P.Chambow's lab）、ストラスバーグ、フランス、から得た。スーパーフェクト及び無フェノールＤＭＥＭはそれぞれキアゲン社（Qiagen
Inc.）（バレンシア、カリフォルニア）及びバイオホィッテカー（Biowhittaker）（ウォーカースヴィル、メリーランド）から得た。ルシフェラーゼアッセイキットはプロメガから入手し、ルミネッセンスをルミノメータ（トロピックス、ベッドフォード、マサチューセッツ）によって定量した。試験化合物は室内で合成した。
【０２９０】
方法
選択された化合物類によるＥ２誘導活性化の阻害。ＣＯＳ−７細胞を、トランスフェクションの前日に、２４ウェルプレートに５×１０4細胞／ウェルの濃度で培養し、５％の処理ずみＦＢＳ及びＬ−グルタミンを補充した無フェノールＤＭＥＭ（以後、無ステロイド培地とする）を再供給した。トランスフェクションのために、ｐＥＲＥ２ｔｋｌｕｃレポータープラスミド
０.５マイクログラム、ｐＨＥＧＯ ２０ｎｇ、及びｐＣＩｎｅｏ不活性担体ＤＮＡ ０.５マイクログラムを無血清ＤＭＥＭ ６０マイクロリットル及びキアゲン・スーパーフェクト・トランスフェクション試薬
５マイクロリットルと一緒にして１０秒間ボルテックスし、室温で１０分間静置した。各サンプルを無ステロイド培地３５０マイクロリットルで希釈し、混合し、各ウェルに加えた。３７℃で２時間３０分間インキュベーション後、細胞をダルベッコの燐酸緩衝食塩液（ＤＰＢＳ）で一度洗浄し、無ステロイド培地を再供給した。トランスフェクション後約２４時間経ってから、細胞を種々濃度のタモキシフェン、３ｎＭ
Ｅ2、および／または０.１ｎＭないし１０００ｎＭの最終濃度になる量の適切な試験化合物で処理した。処理後約２４時間経ってから、細胞をＤＰＢＳで一回洗い、その後各ウェルにレポーター溶解緩衝液２００マイクロリットルを加え、−８０℃で凍結した。細胞をオービタルシェーカーで室温で１時間３０分間融解した。溶解物の１０マイクロリットル部分を９６ウェル不透明プレートに移し、適切なホタルルシフェラーゼ基質を使用してルミノメータで相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を測定した。
【０２９１】
種々の試験化合物によるＥ2誘導性活性化の阻害パーセントを測定するために、次の式を使用した：
【０２９２】
％阻害＝（Ｔ−特定量の試験化合物におけるＲＬＵ）／比活性
【０２９３】
式中、Ｔは３ｎＭ Ｅ2におけるＲＬＵの最大活性であり、比活性はＴ―非特異的活性（３ｎＭ
Ｅ2の存在のもとでの１０００ｎＭタモキシフェンのＲＬＵ）である。非特異的活性はこのアッセイシステムでは比較不可能の要素であることに注意されたい。
【０２９４】
試験化合物類の合成
Ｒ１化合物類をＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭの保存溶液をつくった。それらを完全に溶解するために、全ての溶液を使用前に５５℃または沸騰水浴中で１０ないし２０分間温めた。細胞培養培地中のＤＭＳＯは、全ての被験薬剤濃度に対してもビヒクル対照に対しても０.０１％に保持された。
【０２９５】
タモキシフェンによるＥＣ５０及びＩＣ５０の計算
グラフ パッド プリズム（グラフ パッド ソフトウェアー社、サンジエゴ、ＣＡ）を使用して非線型曲線フィッティングを利用し、ＥＣ５０及びＩＣ５０の数値を出した。
（実施例６）
【０２９６】
弱（gutless）型アデノウィルスベクター
“gutless型”アデノウィルスベクターにおけるＣｙｓ2−Ｈｉｓ2ジンク-フィンガーＤＢＤ−ＥＲ
ＬＢＤレギュレータの構成
調節系の２つのコンポーネントを生体外または生体内で哺乳動物に効率的に運び込むために、一連のgutless型アデノウィルスベクター類を構成した。これらのベクターは既述のベクター（実施例２）に似ており、ＣＭＶ最初期プロモーターに結合したＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白レギュレータ或いはＣ７結合部位の６ｘ２Ｃ７アレーに結合した調節可能の導入遺伝子のどちらかと、そしてＳＶ４０
ＴＡＴＡからの最小プロモーターとを含んでいた。融合蛋白レギュレータベクター及び調節可能導入遺伝子ベクターをその後種々の比率で混合し、標準的方法によって細胞または動物に運び込んだ。
【０２９７】
gutless型アデノウィルスベクター類にはアデノウィルス コーディング領域がなく、必須アデノウィルスパーッケージングシグナル類、ＩＴＲｓ、及び導入遺伝子発現カセット（類）だけを含む。gutless型アデノウィルスベクター類は、マウス（シードナー（Schiedner）ら“高能力アデノウィルスベクターを有するゲノムＤＮＡトランスファーはin
vivo遺伝子発現の改善及び毒性低下をもたらす（Genomic DNA transfer with a high capacity adenovirus
vector results in improved in vivo gene expression and decreased toxicity）”ネイチャージェネティックス（Nature
Genetics）１８巻：ｐ．１８０−１８３（１９９８）；モラル（Morral）ら、“多量のヘルパー依存性アデノウィルスベクター投与は、生理的レベルを超えた低毒性アルファ−１−アンチトリプシンをもたらす（High
doses of a helper-dependent adenoviral vector yields supraphysiological levels
of alpha-1-antitrypsin with negligible toxicity）”Hum.Gene Ther.９巻：ｐ．２７０９−２７１３（１９９８）；レディー（Reddy）ら、“gutless型アデノウィルスベクターの全身的送達後の血友病Ａマウスにおける持続的ヒトＶＩＩＩ因子発現（Sustained
human factor VIII expression in hemophilia A mice following systemic delivery
of a gutless adenoviral vector）”Mol.Ther.５巻：ｐ．６３−７３（２００２））、及び非ヒト霊長類における（モラルら、“ヒヒにおけるヘルパー依存性アデノウィルスベクターの投与及び長期肝特異的遺伝子伝達のための異なるベクター血清型の逐次的送達（Administration
of helper-dependent adenoviral vectors and sequential delivery of different
vector serotype for long-term liver-directed gene transfer in baboons）”
Proc.Natl.Acad.Sci.USA ９６巻：ｐ．１２８１３−１２８２１（１９９９））導入遺伝子発現の持続期間の延長、及びベクターの毒性及び免疫原性の低下（シードナーら、１９９８；モラルら、１９９８；１９９９；レディーら、２００２）によって、第一世代ベクターより進歩していることが証明された。
【０２９８】
gutless型ベクター類は複製及びパッケージングのために必要な構造蛋白を供給するヘルパーウィルスの存在のもとで増幅する。ヘルパーウィルスよりむしろgutless型ベクターを好んでパッケージングするように差別的パッケージング戦略が使用される。ヘルパーウィルスのパッケージングシグナルはｌｏｘ部位によって包囲されている。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下ではパッケージングシグナルは除去される。これに対してgutless型ベクターは機能的パッケージングシグナルを含む。そのため産生細胞において、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下ではgutless型ベクターが優先的にパッケージングされる。成熟ベクター粒子の大部分はgutless型ベクターである。gutless型ベクターのヘルパーウィルス汚染の大部分はＣｓＣｌ勾配精製によって除去される。
【０２９９】
先ず最初にベクタープラスミドをつくる。それは既述のように（実施例２）融合蛋白レギュレータまたは調節可能の導入遺伝子のどちらかを含む。これらの２つの発現カセットはgutless型ベクターの主鎖プラスミドに組み込まれる。このプラスミドは複製及びパッケージングのために必要なアデノウィルス配列（ＩＴＲｓ及びパッケージングシグナル）並びにＤＮＡスタファー配列を含み、ベクターサイズをアデノウィルスパッケージング限度内で増加させる（２８−３８ｋｂ；パークス（Parks RJ）、グラハム（Graham FL）著、“アデノウィルス生産のためのヘルパー依存性システムは効率的ＤＮＡパッケージングの下限の決定に役立つ（A
helper-dependent system for adenovirus vector production helps define a low
limit for efficient DNA packaging）”J.Virol.７１巻：ｐ．３２９３−８（１９９７））。gutless型ベクターは、ヘルパーウィルスの存在下でアデノウィルス産生細胞系にトランスフェクトされたこのプラスミドからつくられる。産生細胞系は、ヘルパーウィルスを補足するのに必要なアデノウィルス遺伝子であって、そのヘルパーウィルスからの機能的アデノウィルスパッケージングシグナルの切取りを仲介するリコンビナーゼも発現させるアデノウィルス遺伝子を、全て供給する。このヘルパーウィルスは、リコンビナーゼ認識部位が側面に付いた機能的アデノウィルスパッケージングシグナルを含む。このヘルパーウィルスでは、上記補足細胞系がこれらの欠失を補足できる場合に限り、必須アデノウィルス遺伝子が一つ以上欠失してもよい。
【０３００】
操作法
gutless型アデノウィルスプラスミドの構成
これらプラスミドはウィルス性左ＩＴＲ、ウィルス性パッケージングシグナル、ＣＭＶ最初期プロモーターに結合したＺＦＰ−ＬＢＤ融合蛋白レギュレータかＣ７結合部位の６ｘ２Ｃ７アレーに結合した調節可能導入遺伝子、及びＳＶ４０またはｃ−ｆｏｃＴＡＴＡからの最小プロモーター（既述のもの）、幾つかの追加的“スタファー”ＤＮＡ配列（２００１年１２月２８日に提出された“アデニン及びチミン量を高めたスタファーＤＮＡ配列を含むアデノウィルスベクター類（Adenoviral Vectors Including Stuffer DNA Sequences With Increased
Amount of Adenine and Thymine）”と題する米国特許出願第６０／３４４,０７３号）、及び右ＩＴＲを含む。ＩＴＲはこの構成物の側面をかためている。詳細に述べれば、転写因子Ｇ５２１Ｒ
gutless型ベクタープラスミドは、既述のｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ（Ｇ５２１Ｒ）から誘導されたＧ５２１Ｒ誘導遺伝子発現を（クー（Xu）ら、“リガンド依存性、導入遺伝子特異的転写因子をデザインするための多目的構造（A
versatile framework for the design of ligand-dependent,transgene-specific
transcription factors）”Mol.Ther.３巻：ｐ．２６２−２７３（２００１））、Ｎｒｕｌ及びＢａｍＨＩ消化によって分離し、Ｓｍａｌ及びＢａｍＨＩで消化したｐＢＬＳＶ２に挿入するというやり方で作製された。プラスミドｐＢＬＳＶ２は２つのポリリンカーを付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）から誘導された（図９）。生成したプラスミド、ｐＢＬＳＶ２ａｓ５２１、をＢｓｐｅｌで消化し、Ｘｍａｌで消化したｐＧＴＩ．２４ａＰＬ２（図１０）に結合し、ｐＧＴＩ２４ａｓ５２１を作製した。最終的gutless型ベクタープラスミドを構成するために、ｐＧＴＩ２４ａｓ５２１をＰａｃＩで消化し、プラスミド主鎖を遊離し、ＰｍｅＩ／ＭｌｕＩ消化ｐＢＶ２と組み合わせた（図１１）。その後、トイエッタ（Toietta）らが記載したように（トイエッタら“相同組換えによるヘルパー依存性アデノウィルスベクターの生成（Generation
of helper-dependent adenoviral vectors by homologous recombination）”Mol.Ther．５巻：ｐ．２０４−２１０（２００２）)ＢＪ５１３８大腸菌（E.Coli）における相同組換えによって、最終的gutless型ベクタープラスミドが生成する。
【０３０１】
新規の転写因子３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８Ａ、５２４Ｇ、または４２１Ｖ−４２８Ａをコードするgutless型ベクタープラスミドは、適切なプラスミド（例えば既述のｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤ ３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８Ａなど）から、Ｎｒｕｌ及びＢａｍＨＩ消化によって転写因子発現カセットを分離し、端を充填し、ＳｍａＩで消化したｐＧＴＩ２４．ａＰＬ２に結合してｐＧＴＩ２４ＶＹＡ、ｐＧＴＩ２４−５２４、またはｐＧＴＩ２４−４２１／４２８を生成するというやり方で構成される。その後転写因子をコードするｐＧＴＩ２４．ａＰＬ２プラスミドをＰａｃＩで消化してプラスミド主鎖を遊離し、ｐＧＴＩ２４ＶＹＡ及びｐＧＴＩ２４−４２１／４２８プラスミドをＰｍｅＩ及びＭｌｕＩ消化ｐＢＶ２と組み合わせるか（図１１）、またはｐＧＴＩ２４−５２４プラスミドをＰｍｅＩ及びＭｌｕＩ消化ｐＢＶ３と組み合わせる（図１１）。その後トイエッタら（２００２）が記載したようにＢＪ５１３８大腸菌における相同組換えによって最終的gutless型ベクタープラスミドが生成する。
【０３０２】
調節可能プロモーター／エンドスタチン導入遺伝子gutless型ベクターを構成するために、プラスミドｐａｖ−６Ｘ２Ｃ７ｔａｔａｍｅｎｄｏ（シューら、２００１）をＡｓｃＩで消化し、端を充填し、ＢａｍＨＩで消化し、ＳａｍＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＢＬＳＶ２（図９）に挿入してｐＢＬＳＶ２Ｃ７ｅｎｄｏを作製する。プラスミドｐＢＬＳＶ２Ｃ７ｅｎｄｏをその後ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、端を充填し、ＳａｍＩで消化したｐＧＴＩ２４．ａＰＬ２に結合してｐＧＴＩ２４Ｃ７ｅｎｄｏを作製する。それからｐＧＴＩ２４Ｃ７ｅｎｄｏをＰａｃＩで消化してプラスミド主鎖を遊離し、ＰｍｅＩ及びＭｌｕＩ消化ｐＢＶ４と組み合わせる（図１１）。トイエッタら（２００２）が記載したようにＢＪ５１３８大腸菌中における相同組換えによって最終的gutless型ベクタープラスミドが生成する。
【０３０３】
“gutless型”アデノウィルスプラスミドで産生細胞系をトランスフェクトする
gutless型アデノウィルスプラスミドを、gutless型アデノウィルスベクターＤＮＡの外側で且つ各ＩＴＲにできるだけ近い部位を切断する一種類以上の制限酵素と共に消化することが好ましい。トランスフェクション後、細胞にヘルパーウィルスを感染させる。この感染は好ましくは上記トランスフェクションの２０時間後に行われ、ヘルパーウィルスを１細胞あたり１００ないし２００粒子の割合で感染させる。完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められるまで（感染後約２−３日）細胞をインキュベートする。プレートを掻きとり、上澄液及び細胞を適切なチューブに移すというやり方で細胞及び培地を集める。細胞及び培地を３ラウンドの凍結（−７０℃またはドライアイス）及び融解（３７℃）にかけて細胞を溶解し、ウィルスを遊離させる。この粗ウィルス溶解物（ＣＶＬ）を使用してgutless型ベクターをさらに増幅する。このＣＶＬを使用して、産生細胞の別の培養物にも感染させ、引き続きヘルパーウィルスを感染させる。ヘルパーウィルスは１細胞あたり１００ないし２００粒子の割合で感染させるのが好ましい。このＣＶＬｓ継代は、ＣｓＣｌ平衡密度遠心分離によって精製するのに十分な量のgutless型ウィルスが得られるまで続けることができる。最後のＣＶＬは当業者には公知の標準的方法による最終的精製を施す。一つの方法は標準法を使用するＣｓＣｌ遠心分離による精製である。ヘルパーウィルス汚染レベルをさらに下げるために平衡密度遠心分離を１回より多く行ってもよい。
【０３０４】
融合蛋白転写因子及び調節された導入遺伝子が２つの別々のgutless型アデノウィルスベクターに含まれる前記の実施例に加えて、両発現カセットを一つのベクターに組み込み、上記のように運び込むこともできる。このようなベクターがデザインされており、２例が記載されている（図１２）。或いは別の実施形態において、導入遺伝子を含むgutless型ベクター、または転写因子を含むgutless型ベクターを、ある種のその他のベクター、例えば非制限的にアデノウィルスベクターまたはレンチウィルスベクターなどに組み込まれた共調系コンポーネントと共に使用することができる。その他のベクター系を使用して転写因子または調節された導入遺伝子コンポーネントを運び込むこともできる。
【０３０５】
結果
gutless型アデノウィルスベクターによるin vitro調節
アデノウィルスベクターによって運び込まれる導入遺伝子の発現を調節できることが下記の実験によって証明された。Ｈｅｌａ細胞を既述のように（クーら、２００１）Ａｖ３ベクター主鎖中の２種類のアデノウィルスの混合物、すなわち融合蛋白レギュレータを含むものと（図１３）、調節されたルシフェラーゼ発現カセットを含むものとの混合物で感染させた。２種類のベクターを、６Ｘ２Ｃ７−ＳＶ４０−ルシフェラーゼ導入遺伝子カセットをコードするＡｖ３ベクターでは１細胞あたり５０ベクター粒子、gutless型転写因子ベクターでは１細胞あたり７５０ベクター粒子の量で使用した。ベクターの形質導入から２４時間経過した後、細胞を適切な時に１００ｎＭ試験化合物で処理した。さらに２４時間インキュベーション後、細胞を溶解し、既述のようにルシフェラーゼ活性を測定した。この実験の結果を表８にまとめる。
【０３０６】
【表８】
2004537293.tif 000009
【０３０７】
これらのデータは、試験した３種類全ての突然変異体ＬＢＤと新規化合物との組み合わせが薬剤依存的にルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を刺激することを示している。ＬＢＧ５５１に対する４２１Ｖ−４２８Ａ突然変異体の反応は誘導倍率が５であった。ＬＢＦ５８０に対する５２４Ｇの反応は誘導倍率８であった。４−ＯＨＴに対するＧ５２１Ｒの反応は誘導倍率３３であった。これらに比較して３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８Ａ突然変異体は誘導倍率９０でＬＢＢ９３８に反応した。これらのデータは、図５に示したＡｖ３ベクター類を使用して得たデータに類似しており、gutless型アデノウィルスベクターに関する限りこの調節系の機能を確認するものである。
【０３０８】
導入遺伝子発現のin vivo調節
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス類に、１×１０11粒子／マウスのエンドスタチン標的ベクター及びＧ５２１Ｒ転写因子をコードするgutless型ベクター（総ベクター量２×１０11粒子）を尾静脈注射によって投与した（図１４、黒色矢印によって示される）。タモキシフェン（５０ｕｇ／マウス）は指示された日時に腹腔内注射によって投与された（灰色矢印によって示される）。タモキシフェン投与の翌日にマウスを瀉血し、血清中のエンドスタチン濃度をマウスエンドスタチン特異的ＥＬＩＳＡ法によって測定した。エンドスタチン発現をタモキシフェンで４回誘導した。タモキシフェンの４回連続投与後、非常に高濃度のエンドスタチン濃度が観察された。それは動物によっては２０ｕｇ／ｍｌにも達した。null
gutlessベクター処理群、及びタモキシフェン投与を受けなかったgutless型ベクター組では低いエンドスタチン基礎濃度が観察され、リガンドが存在しないと発現は低いかまたは全く発現しないことが証明された（図１４）。
【０３０９】
in vivo調節系をさらに評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに１×１０11粒子／マウスのエンドスタチン標的ベクター及び転写因子３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８ＡまたはＧ５２１Ｒをコードするgutless型ベクター（総ベクター量２×１０11粒子）を尾静脈注射によって投与した（Ｎ＝２０）。対照として別の一群のマウス（ｎ＝６）に２×１０11粒子の導入遺伝子欠損gutless型ベクター、ＡＧＶＮｕｌｌ（レディー（Reddy）ら、２００２）を投与した。３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８Ａベクターを投与したマウスに、ベクター投与後１週間目に新規リガンドＬＢＧ６１２（ＬＢＢ９３８の非ヒドロキシル化型）、５０ｕｇ／マウス、を腹腔内注射によって投与し（ｎ＝１０）、Ｇ５２１Ｒベクターを投与したマウスには同量のタモキシフェンを投与した（ｎ＝１０）。翌日、マウスを瀉血し、血清中エンドスタチン濃度をマウスエンドスタチン特異的ＥＬＩＳＡ法によって測定し、両方のベクターを受けたが適切なリガンドは投与されなかったマウス集団（ｎ＝１０）の濃度と比較した。両マウス群でエンドスタチン発現が高レベルに誘導された（表９）。
【０３１０】
【表９】
2004537293.tif 000010
【０３１１】
両方の系で約１００の誘導倍率が認められた。null gutless型ベクター処理群も、リガンドのないgutless型ベクター組、すなわちＧ５２１Ｒ及び３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８Ａ転写因子をもたないgutless型ベクター組も、同様に低いエンドスタチン基礎濃度を示し、リガンドがないときは発現は低いかまたは発現しないことが証明された。これらのデータはgutless型アデノウィルスベクターに関してはin
vivo調節系の機能を証明するものである。だが誘導の時間的経過を比較すると、Ｇ５２１Ｒ系では誘導後１週間以内にベースラインを下回るが、３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８Ａ群は１回の誘導後２週間経ってもベースラインより十分高いエンドスタチン濃度を示すことが判明した。しかしこのエンドスタチン濃度も減少していき、１日目から１４日目までに２５分の１になった（表Ｂ）。
【０３１２】
この持続的誘導の問題に取り組むために、第二のin vivo研究を行った。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１匹につき５×１０10粒子のエンドスタチン標的ベクター及び３８８Ｖ−４２４Ｙ−４２８ＡまたはＧ５２１Ｒ転写因子をコードするgutless型ベクター（総ベクター量１×１０11粒子）を尾静脈注射した。ｎ＝３とする。ベクター投与後１週間目に、新規リガンド、ＬＢＧ６１２（ＬＢＢ９３８の非ヒドロキシル化型）、またはＬＢＢ９３８、５０ｕｇ／マウス量、を腹腔内注射した。ベクター投与後１、３及び７日目にマウスを瀉血し、血清中のエンドスタチン濃度をマウスエンドスタチン特異的ＥＬＩＳＡ法によって測定した。データを表１０に示す。
【０３１３】
【表１０】
2004537293.tif 000011
【０３１４】
ヒドロキシル化ＬＢＢ９３８化合物を投与した動物は非ヒドロキシル化ＬＢＢ９３８化合物を投与した動物に比べてより速くエンドスタチン発現のピークを示し、減少もより速かった。これらのデータは、ＬＢＧ６１２もＬＢＢ９３８も両方ともエンドスタチン発現を誘導することを示している。
（実施例７）
【０３１５】
ＬＢＢ９３８の製法
【０３１６】
【化１】
2004537293.tif 000012
【０３１７】
４−（（１Ｚ））−３−ビシクロ［ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル）フェノール
【０３１８】
化合物ＬＢＢ９３８は、図式１に概略示される経路によって合成される。その経路はその後に詳細に説明される。
【０３１９】
【化２】
2004537293.tif 000013
【０３２０】
段階Ａ：窒素気流下、室温で、ジ−４−ヒドロキシフェニルケトン（１２.４ｇ、５８ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦに加える。１.２等量の水素化ナトリウム（２.７０ｇ、７０ｍｍｏｌ）を少しづつ加え、１時間撹拌する。その溶液を０℃に冷やし、１.１等量のトリメチル塩化アセチル（７.８ｍｌｓ、６４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、０℃で３０分間撹拌し、その後室温で３時間撹拌した。水を加えて反応を鎮め、有機物を酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を蒸発した後、モノ−アセチル化及びジ−アセチル化生成物の混合物を分離し、シリカゲル−カラム上で溶出液５％メタノール／塩化メチレンで精製すると、４−［（４−ヒドロキシルフェニル）カルボニル］フェニル２，２−ジメチルプロパノエートが白色粉末として得られる。
【０３２１】
段階Ｂ：４等量の塩化チタン（１.１ｍｌｓ、１０ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ中８等量の亜鉛（１.３ｇ、２０ｍｍｏｌ）スラリーに滴下し、９０℃で２時間還流する。１等量の段階Ａ生成物（０.７５ｇ、２.５ｍｍｏｌ）及び１等量のケトン２−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−イル−１−フェニルエタン−１−オン（１.６ｇ、７.５ｍｍｏｌ）を一緒に、一度に反応混合物に加え、さらに５時間還流する。２０％炭酸カリウム溶液を添加して反応を鎮め、ガラス濾過器を通して濾過する。有機物を酢酸エチルに抽出し、ブラインで洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮した。粗生成物をシリカゲル−カラム上で、溶出液２０％酢酸エチル／ヘキサンで精製すると、４−［（１Ｚ）−３−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−イル−１−（４−オキシフェニル）−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェニル２，２−ジメチルプロパノエートと４−［（１Ｅ）−３−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−イル−１−（４−オキシフェニル）−２−フェニルプロプ−１−エニル］フェニル２，２−ジメチルプロパノエートとの混合物が白色粉末として得られる。
【０３２２】
段階Ｃ：段階Ｂの生成物（１.０ｇ、２.１ｍｍｏｌ）を、２等量の（２−クロロエチル）ジメチルアミン（０.６ｇ、４.２ｍｍｏｌ）及び１.２等量の炭酸カリウム（０.３５ｇ、２.５ｍｍｏｌ）と共に、アセトン：水の１９：１混合物中で還流下で加熱する。混合物を塩化メチレンで希釈し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を真空下で留去すると、黄色固体が得られる。粗生成物をシリカゲルカラム上で４％ないし３０％メタノール／塩化メチレンという溶出勾配で精製すると、４−（（１Ｚ）−３−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル）フェニル２，２−ジメチルプロパノエートと、４−（（１Ｅ）−３−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−イル−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−フェニルプロプ−１−エニル）フェニル２，２−ジメチルプロパノエートとの混合物が白色粉末として得られる。
【０３２３】
段階Ｄ：段階Ｃの生成物（０.２７ｇ、０.４９ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦに溶解し、０℃に冷却する。１.３等量の１.６Ｍメチルリチウム−エーテル溶液（０.４ｍｌｓ、０.６ｍｍｏｌ）を加え、溶液を０℃で１時間撹拌し、ゆっくりと室温まで温める。水を加え、有機物を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮すると白色固体が得られる。表題の化合物がメタノールからの再結晶によって白色固体として分離される。ＭＳ、ｍ／ｚ４６８（ｍ＋１）；ｍ．ｐ．１７１−１７２℃、式Ｃ32Ｈ37ＮＯ2として計算すると：Ｃ
８２.１９；Ｈ ７.９７；Ｎ ３.００。分析値：Ｃ ８２.０８；Ｈ ７.９２；Ｎ ２.９４。（実施例８）
【０３２４】
ＬＢＦ５８０の製法
４−（（１Ｅ）−１−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−２−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）プロプ−１−エニル）フェノール
【０３２５】
【化３】
2004537293.tif 000014
【０３２６】
化合物ＬＢＦ５８０は図式２に概略示される経路によって合成される。その経路はその後詳細に説明される。
【０３２７】
【化４】
2004537293.tif 000015
【０３２８】
段階Ａ：ジ４−ヒドロキシフェニルケトン（１２.４ｇ、５８ｍｍｏｌ）を、１.０等量の（２−クロロエチル）ジメチルアミン塩酸（８.３０ｇ、５８ｍｍｏｌ）及び２.５等量の炭酸セシウム（４７.２ｇ、１４５ｍｍｏｌ）と共に、無水ＤＭＦ中で２４時間還流加熱する。混合物を水で希釈し、生成物を酢酸エチル中に抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を真空下で留去するとオフホワイトの固体が得られる。粗生成物をアセトンと共にすりつぶして精製すると、４−（｛４−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝メチル）フェノールが白色粉末として得られる。
【０３２９】
段階Ｂ：４等量の塩化チタン（１.１ｍｌｓ、１０ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ中８等量の亜鉛（１.３ｇ、２０ｍｍｏｌ）スラリーに滴下し、９０℃で２時間還流する。１等量の段階Ａ生成物（０.５１ｇ、２.５ｍｍｏｌ）及び１等量のケトン１−（４−モルフォリン−４−イルフェニル）エタン−１−オン（０.７１ｇ、２.５ｍｍｏｌ）を一緒に一度に反応混合物に加え、さらに５時間還流する。２０％炭酸カリウム溶液を加えて反応を鎮め、ガラス濾過器を通して濾過する。有機物を酢酸エチルに抽出し、ブラインで洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濃縮する。粗生成物をシリカゲル−カラム上で２０％酢酸エチル／ヘキサンの溶出液で精製すると生成物が淡黄色粉末として得られる。
（実施例９）
【０３３０】
化合物ＬＢＣ０８１の製法
ＬＢＣ０８１，カルバミン酸，［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロフェニル］−，メチルエステル
【０３３１】
【化５】
2004537293.tif 000016
【０３３２】
ＴＨＦ３５ｍＬ中、亜鉛（１.８３ｇ、２８.０ｍｍｏｌ）、四塩化チタン（２.６５ｇ、１４.０ｍｍｏｌ）の懸濁液を２時間還流した。この混合物に、ＴＨＦ６０ｍＬ中、プロパン酸、２，２−ジメチル−,４−（４−ヒドロキシベンゾイル）フェニルエステル（１.０ｇ、３.５ｍｍｏｌ）及びカルバミン酸，（２−オキソ−２−フェニルエチル）−，メチルエステル（２.０ｇ、１０.３６ｍｍｏｌ）を加える。混合物を５時間還流し、冷却し、１０％Ｋ2ＣＯ3に注入する。乳濁液を濾過し、酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、濃縮し、シリカゲル上でクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチル／ヘキサン（１：３）で溶出すると、プロパン酸，２，２−ジメチル−，４−［（１Ｚ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−３−［（メトキシカルボニル）アミノ］−２−フェニル−１−プロペニル］フェニルエステル
１が得られる。
【０３３３】
１（０.６０ｇ、１.３１ｍｍｏｌ）、アセトン（２０ｍＬ）、水（１ｍＬ）、Ｋ2ＣＯ3（０.２３ｇ、１.６８ｍｍｏｌ）、及びジメチルアミノ塩化エチル（０.２８ｍＬ、２.６３ｍｍｏｌ）を５時間還流し、冷却し、ＭｇＳＯ4を加え、濾過し、濃縮し、シリカゲル−クロマトグラフィーにかけ、１０％ＣＨ3ＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2で溶出すると、プロパン酸,２，２−ジメチル−，４−［（１Ｚ）−１−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−［（メトキシカルボニル）アミノ］−２−フェニル−１−プロペニル］フェニルエステル
２が得られる。
【０３３４】
ＴＨＦ１０ｍＬ中、２（０.３２ｇ、０.６０３ｍｍｏｌ）の０℃溶液に、１.５Ｍメチルリチウム（１.６１ｍＬ、２.４１ｍｍｏｌ）を加える。混合物を３時間撹拌し、飽和ＮＨ4Ｃｌ３ｍＬで鎮め、酢酸エチルで抽出する。有機層をブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、濃縮する。エーテルから結晶化するとカルバミン酸,［（２Ｅ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシルフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−，メチルエステル
３が得られた。融点１６１−１６２℃；ＭＳ、ｍ／ｚ４４７.５（ｍ＋１）。Ｃ27Ｈ30Ｎ2Ｏ4の計算値：Ｃ
７２.６２；Ｈ ６.７７；Ｎ ６.２７。分析値：Ｃ ７２.４８；Ｈ ６.７１；Ｎ ６.２１。
（実施例１０）
【０３３５】
化合物ＬＢＢ５５１の製法
【０３３６】
【化６】
2004537293.tif 000017
【０３３７】
カルバミン酸，［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロフェニル］−メチルエステル。または（Ｎ−（（２Ｚ）−３−｛４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル｝−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニルプロプ−２−エニル）メトキシカルボキサミド）
【０３３８】
ＴＨＦ２０ｍＬ中、亜鉛（１.４４ｇ、２２.０ｍｍｏｌ）、四塩化チタン（１.２１ｍＬ、１１.０ｍｍｏｌ）の懸濁液を２時間還流する。この混合物に、ＴＨＦ４０ｍＬ中、メタノン,［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］（４−ヒドロキシフェニル）−（０.７８４ｇ、２.７５ｍｍｏｌ）及びカルバミン酸，（２−オキソ−２−フェニルエチル）−メチルエステル（１.５９ｇ、８.２５ｍｍｏｌ）を加える。この混合物を５時間還流し、冷却し、１０％Ｋ2ＣＯ3に注入する。乳濁液を濾過し、酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗い、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、濃縮し、シリカゲル−クロマトグラフィーにかけ、１０％ＣＨ３ＯＨ（ＮＨ４ＯＨ）／ＣＨ２Ｃｌ２で溶出すると４と３との混合物が得られる。エーテルから結晶させるとカルバミン酸,［（２Ｚ）−３−［４−［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］フェニル］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−２−プロペニル］−,メチルエステル
４が得られた。融点１２２−１２３℃；ＭＳ、ｍ／ｚ４４７.５（ｍ＋１）。Ｃ27Ｈ30Ｎ2Ｏ4の計算値：Ｃ７２.６２；Ｈ ６.７７；Ｎ ６.２７。分析値：Ｃ ７２.４８；Ｈ ６.６１；Ｎ ６.１７。
（実施例１１）
【０３３９】
ＢＩＶレンチウィルスベクター
クーらによって記載された（“リガンド依存性、導入遺伝子特異的転写因子のデザインのための多目的構造”Mol.Ther.３巻（２号）：ｐ．２６２−７３（２００１））タモキシフェン誘導性遺伝子発現系をＢＩＶベクターにおいて試験した。ＢＩＶベクター系は、２００２年２月４日に提出され、譲渡された“組換えウシ免疫不全ウィルスに基づく遺伝子トランスファー系（Recombinant
Bovine Immunodeficiency Virus Based Gene Transfer Systems）”と題する米国特許出願、及びマツコニス（Matukonis）らの“ウシ免疫不全ウィルスをベースにする遺伝子トランスファー系の第二及び第三世代の発生（Development
of Second and Third Generation of Bovine Immunodeficiency Virus Based Gene
Transfer Systems）”ヒューマン・ジーン・テラピー（Human Gene Therapy）（印刷中）（２００２）、に記載されている。４個の異なるＤＮＡ構成物がつくられた：（１）ＳＶ４０最小プロモーターの上流の６タンデムＣ７結合部位（リュー（Liu）ら、“複合ゲノム内の特異的アドレッシングのためのポリダクチル ジンク−フィンガー蛋白の設計（Design
of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes）”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９４巻（１１号）：ｐ．５５２５−３０（１９９７））と、ＢＩＶトランスファーベクター構成物のＳｔｕＩ部位に挿入されたｅＧＦＰ導入遺伝子とを含んでなるレポーター構成物、ｐＢＩＶＣ２Ｈ２ＥＧＦＰ；（２）ｃ−ｆｏｓ遺伝子から誘導される４５−ｂｐ最小ＴＡＴＡ−ボックスプロモーターフラグメントの上流にある６タンデムＣ７結合部位（フルーマン（Fluhmann）ら、“骨芽細胞様ＵＭＲ−１０６細胞における環状ＡＮＰ−、血清−及びホルボールエステル−反応性レポーター遺伝子の副甲状腺ホルモン反応（Parathyroid
hormone responses of cyclic AMP-,serum-,and phorbol ester-responsive reporter
genes in osteoblast-like UMR-106 cells）”Mol. Cell Endocrinol.１３９巻（１−２号）：ｐ．８９−９８（１９９８））とＢＩＶトランスファーベクター構成物のＳｔｕＩ部位に挿入されたｅＧＦＰ導入遺伝子とを含んでなるレポーター構成物、ｐＢＩＶＣ２Ｈ２ＦＯＳｅＧＦＰ；（３）ＢＩＶトランスファーベクターのＳｔｕＩ部位に挿入されるＬＢＤ／Ｂキメラ転写因子（クーら、２００１）をコードするｃＤＮＡを、ＬＢＤ／Ｂをプロモートする内部プロモーターとしてのＭＮＤと共に含んでなるアクチベータ構成物、ｐＢＩＶＭＮＤＣ７；及び（４）ＢＩＶトランスファーベクター構成物のＳｔｕＩ部位に挿入されたＬＢＤ／Ａキメラ転写因子（クーら、２００１）をコードするｃＤＮＡを、ＬＢＤ／Ａをプロモートする内部プロモーターとしてのＭＮＤと共に含んでなるアクチベータ構成物、ｐＢＩＶＭＮＤ２ＡＳ。
【０３４０】
前記のレポーター構成物の一つが、ＢＩＶ ４コンポーネントパッケージング系のその他のコンポーネント類と共に、ＣａＰＯ４介在性一過性トランスフェクションによって、３×１０６２９３Ｔ細胞に個々に導入された（２００２年２月４日に提出されたルオ（Luo）らの“組換えウシ免疫不全ウィルスに基づく遺伝子トランスファー系（Recombinant Bovine Immunodeficiency
Virus Based Gene Transfer Systems）”と題する米国特許出願（Atty事件整理番号２０４８−１２７、出願番号は譲渡されている；及びマツコニス（Matukonis）らの“ウシ免疫不全ウィルスをベースにする遺伝子トランスファー系の第二及び第三世代の発生”ヒューマン・ジーン・テラピー（印刷中）(２００２)）。トランスフェクションの１８時間後に、培地を、１０％ＦＢＳ及び２００ｍＭ酪酸を含む新鮮ＤＭＥＭ培地に取り代えた。４８時間後、トランスフェクトされた細胞からコンディションド培地を集めた。６ウェル組織培養プレートの個々のウェルにおいて、各トランスフェクションからの条件培地２ｍｌプラスＤＭＥＭ／ＦＢＳ ２ｍｌを２×１０５２９３Ｔ細胞に加えた。さらに、いずれかのｐＢＩＶＣ２Ｈ２ＦＯＳｅＧＦＰトランスフェクションから得られた条件培地２ｍｌをｐＢＩＶＭＮＤＣ７またはｐＢＩＶＭＮＤ２ＡＳトランスフェクションからのコンディションド培地２ｍｌと合わせ、２×１０５２９３Ｔ細胞に加えた。８μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを各形質導入反応に加えた。４時間後、コンディションド培地を形質導入した細胞から除去し、新鮮ＤＭＥＭ／ＦＢＳにとり代えた。融合に達したとき、各ウェルからの細胞にトリプシンを加え、６ウェル組織培養プレートの２つのウェルに分けた。細胞を一晩静置した後、４−ＯＨ−タモキシフェン（１００ｎＭ最終濃度）を、形質導入した細胞の各サンプルを含む上記２つのウェルの一つに加えた。タモキシフェン誘導の４８時間後に、デジタルフォトグラフィー及びＦＡＣＳ分析によってＥＧＦＰ発現を分析した（表１１）。
【０３４１】
【表１１】
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【０３４２】
本明細書に記載される全ての参考文献は、個々の各出版物または特許または特許出願が特異的かつ個々に記載され参考としてそのままあらゆる目的のために組み込まれるのと同様に、そのまま、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書に記載の全てのジーンバンク登録番号、ユニジーン・クラスター番号及び蛋白登録番号は、そのような各番号が特異的にかつ個々に記載され参考としてそのままあらゆる目的のために組み込まれるのと同様に、参考としてそのままあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０３４３】
本発明は本出願に記載される特定の実施形態の範囲に制限されるものではなく、上記の特定の実施形態は本発明の個々の局面の一つの例としてとらえられるものである。当業者には明らかなように、本発明の多くの変形及び変化は本発明の精神及び範囲から逸脱することなく実施され得る。本明細書に列挙される方法及び装置の他にも、本発明の範囲内の機能的に同等の方法及び装置は前記の説明及び添付の請求によって当業者には明らかである。本発明は添付の請求項、並びにこのような請求によって権利を与えられる同等物の全範囲によってのみ制限されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０３４４】
【図１】参照によってここに含まれるWhite, John H. 「遺伝子治療用の遺伝スイッチとしての修飾ステロイド受容体及びステロイド誘導可能なプロモーター」Advancesin Pharmacology, Volume 40, Academic Press (1997) の中で図３から得られた、ヒトのエストロゲン受容体(ER)の機能的なドメイン(A-F)の概要の描写である。
【図２】DNA結合ドメインは置換される、組換え分子構築物用のクローニング戦略の概要の描写である。
【図３】プラスミドpCDNA3.1(配列番号１)ヌクレオチド配列、(配列番号２) アミノ酸配列に基づいたC7LBDASのための発現ベクターの概要地図である。
【図４】プラスミドpCDNA3.1(配列番号３)ヌクレオチド配列、(配列番号４) アミノ酸配列に基づいたC7LBDBSのための発現ベクターの概要地図である。
【図５】アデノウイル運搬されるER変異体上のランス活性化を示す。
【図６】各々の３つの突然変異体ER LBDに対する、エストロゲン、４−ヒドロキシタモキシフェン及び特異的な合成リガンドの１０nMにおける倍誘導（foldinduction）を示す。
【図７】プラスミドpAvCVLxの制限地図を示す。これはアデノウイルスベクター構築物用の「左端」シャトルプラスミドである。プラスミド用の制限地図がpSQ3を指定したことを示す。
【図８】プラスミドpSQ3の制限地図を示す。これはアデノウイルスベクター構築物用の「右端」シャトルプラスミドである。
【図９】pBLSV2の模式図を示す。
【図１０】弱い(gutless) ベクター・クローニング・プラスミド、pGTI.24aPL2の模式図を示す。
【図１１】プラスミドpBV2、pBV3及びpBV4の模式図を示す。
【図１２】夫々、新規な転写調節因子及び調節可能なエンドスタチンコード配列の両方をコードする、弱いアデノウイルスベクターの２つの例を示す。
【図１３】新規な転写調節因子(TF)あるいは調節可能なエンドスタチン導入遺伝子のいずれかをコードする弱いアデノウイルスベクターの模式図を示す。各TFベクターに対する同系のリガンドも表示される。
【図１４】C57BL16のオスのマウスに、1×1011粒子/マウスのエンドスタチン標的ベクター及びG521R転写調節因子をコードする弱いベクターの尾静脈注入(2×1011粒子のベクター投与量の合計(黒い矢によって示された))によって投与された時の結果を示す。タモキシフェン(50ug/マウス)は示された時(灰色の矢)においてIP 運搬された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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2004537293.tif 000194
2004537293.tif 000195
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537293.tif 000196
【国際調査報告】
2004537293.tif 000197
2004537293.tif 000198