(57)【要約】【課題】非造血前駆細胞を含む前駆細胞集団及びその増殖方法を提供する。【解決手段】記載されていることは、非静止条件下で懸濁培養することにより、ヒト前駆細胞を増殖する方法である。前記培養方法は、望ましい前駆細胞の急速な培養のための三次元空間を提供する。この方法により、分化条件下で、骨芽細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、含脂肪細胞及び他の非造血細胞種を包含する子孫を生じる、多型潜在性の前駆細胞の新規なコンパートメントが同定される。細胞及び組織に基づくエンジニアリングにおける用途が記載されている。
2004531256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄から採取可能な非造血前駆細胞(non-hematopoietic progenitor cells)を含む富まされた前駆細胞集団(enriched progenitor cell population) であって、実質的に少なくとも１種の造血前駆細胞を欠いている、富まされた前駆細胞集団。
【請求項２】
ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ６６、ＣＤ１１９から選択された表面マーカー(surface marker)を有するものである少なくとも１種の造血前駆細胞種が、存在しないことを特徴とする、請求項１に記載の富まされた前駆細胞集団。
【請求項３】
前記集団が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱから選択されたＭＨＣデターミナント(MHC determinant) を持つ少なくとも１種の前駆細胞種を実質的に欠いている、請求項１に記載の富まされた前駆細胞集団。
【請求項４】
前記集団が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱから選択された何れかのＭＨＣデターミナントを持つ前駆細胞種を実質的に欠いている、請求項２に記載の富まされた前駆細胞集団。
【請求項５】
ヒト非造血前駆細胞の増殖方法であって、非造血前駆細胞を含む前駆細胞集団を、前記前駆細胞を増殖させるために有効な期間、適する媒体中で、非静止懸濁培養(non-static suspension culturing) せしめる段階を含む方法。
【請求項６】
前記前駆細胞集団が、ヒト間葉前駆細胞(human mesenchymal progenitor cells)からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記前駆細胞集団が、請求項１ないし４の何れか１項に記載の富まされた前駆細胞集団である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記成長媒体が、ヒト間葉前駆細胞のための成長因子を含む、請求項５ないし７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記成長媒体が、造血前駆細胞の成長に対して特異的な少なくとも１つの因子を排除している、請求項５ないし７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記成長因子がサイトカインである、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインが幹細胞因子とインターロイキン−３との混合物である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記懸濁物が、前記の有効期間中撹拌される、請求項５ないし１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記懸濁物が、前記の有効期間中、約３７℃の温度にて保持される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
増殖されたヒト前駆細胞の集団であって、
１）分化のために適する条件下で培養されるとき、骨細胞、繊維芽細胞及び神経細胞を包含する分化された細胞種を産生し得、
２）該集団は懸濁培養液中で増殖されており、
３）該集団中の前駆細胞は、付着性(adherence) に基づいて選択されておらず、
４）集団表現型はＳＨ４−陰性(SH4-negative)であり、そして
５）該集団は造血前駆細胞の維持に対して特異的な、少なくとも１種の培養サプリメントの不存在下における培養から生じる
ことを特徴とする、増殖されたヒト前駆細胞の集団。
【請求項１５】
請求項１ないし４の何れか１項に記載の富まされた前駆細胞集団の懸濁培養により製造された、増殖されたヒト前駆細胞の集団。
【請求項１６】
非造血前駆細胞を、それから分化される細胞の形成を誘発する環境に移送するために有用な組成物であって、請求項１ないし４、１４及び１５の何れか１項に記載の増殖されたヒト前駆細胞の集団と、前記環境に前記細胞を移送するためのビヒクルを含む組成物。
【請求項１７】
請求項１ないし４、１４及び１５の何れか１項に記載の前駆細胞集団の分化を誘発するための１種又はそれより多くの因子と組み合わせた、請求項１ないし４、１４及び１５の何れか１項に記載の前駆細胞集団。
【請求項１８】
非造血前駆細胞を含む前駆細胞集団を、前記前駆細胞を増殖させるために有効な期間、適する媒体中で、非静止懸濁培養せしめる段階と、その後、増殖した前駆細胞又はその小集団を、望ましい細胞種へのその分化を誘発する環境に移送する段階とからなる、非造血細胞を製造するための方法。
【請求項１９】
間葉前駆細胞からの分化された細胞を供給する方法であって、間葉前駆細胞を含む前駆細胞集団を、前記前駆細胞を増殖させるために有効な期間中、適する媒体中で、非静止懸濁培養せしめる段階と、その後、増殖した前駆細胞又はその小集団を、間葉細胞種へのその分化を誘発する環境に移送する段階とからなる方法。
【請求項２０】
増殖した前駆細胞又はその小集団が、骨細胞へのその分化を誘発する環境に移送される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
増殖した前駆細胞又はその小集団が、軟骨細胞へのその分化を誘発する環境に移送される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
増殖した前駆細胞又はその小集団が、筋芽細胞へのその分化を誘発する環境に移送される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
増殖した前駆細胞又はその小集団が、神経細胞へのその分化を誘発する環境に移送される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
増殖した前駆細胞又はその小集団が、含脂肪細胞へのその分化を誘発する環境に移送される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
増殖した前駆細胞又はその小集団が、内皮細胞へのその分化を誘発する環境に移送される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前駆細胞の新規コンパートメントを示す細胞集団であって、分化条件下にて、骨芽細胞、含脂肪細胞及び筋芽細胞を包含する種々の非造血細胞種を生じる前駆細胞を含み、細胞付着性(cell adherence)に基づく事前選択無く得られる投入前駆細胞集団の非静止懸濁培養から得られる細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２００１年４月２４日に出願されたアメリカ合衆国分割出願第６０／２８５７０１号、及び２００１年１０月１１日に出願されたアメリカ合衆国分割出願第６０／３２８１１０号（これらの開示の全体は、言及により、本明細書中に取り込まれている）を根拠とする優先権を主張している。
【０００２】
本発明は、分化により、とりわけ骨、軟骨、脂質(fat) 、筋肉、内皮、動物性脂肪(adipose) 及び神経細胞を包含する組織を形成する広範な細胞種を産生する、前駆細胞の新規コンパートメントの同定及びその後の増殖に関するものである。本発明はまた、このような細胞集団を増殖させる方法に関するものである。更に、本発明は、このような細胞種及び組織を形成する方法、それから得られる細胞種及び組織種、並びに、細胞に基づく治療及び組織工学における、このような前記細胞及び分化された細胞の用途に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
細胞に基づく治療及び組織工学の戦略の一つの挑戦は、組織の修復及び／又は再生部位に対してできる限り都合良く、多数の適切な前駆細胞をもたらすことである。骨髄コンパートメント、及び特に骨髄柔組織は、このような前駆細胞のための魅力的な母集団を提供する。骨髄柔組織は、種々の種類の血液細胞に分化する造血前駆細胞を含む。骨髄柔組織はまた、間葉細胞種及び他の細胞種に分化し、それから種々の構造及び結合ヒト組織が生じる非造血前駆細胞及び幹細胞をも含む。更に特別には、骨髄柔組織内の間葉前駆細胞及び幹細胞は、分化を通して、骨を形成する骨形成原細胞種を、軟骨組織からの軟骨形成性細胞種を、そして筋肉及び骨髄支質のような他の結合組織からの筋原性細胞種を産生する。実質性前駆細胞は更に、他の非造血前駆細胞種及び組織を生じる細胞を包含し、脂肪組織を形成する含脂肪細胞、神経組織を形成する神経及び他の神経細胞、並びに内皮及び関連する脈管構造を生じ得る細胞を包含する。
【０００４】
従って本発明は、例えば、骨髄柔組織から採取可能であり、且つ非造血前駆細胞種を生じる種類の前駆細胞及び幹細胞に関するものである。これらの細胞は、非造血前駆細胞、又はＮＨＰ細胞として言及され得る。記載の如く、ＮＨＰ細胞は間葉前駆細胞（ＭＰＣ）及び他の非血液細胞種を生じる前駆細胞を包含し、従って、分類として、神経組織、結合組織、筋肉、腱／靱帯、骨、軟骨組織、脂肪組織及び血管内皮を包含する、治療上興味深い広範な細胞種及び組織を生じる。
【０００５】
ＭＰＣを包含するＮＨＰは、分化すること無く増殖され得ることが立証されている。この経路により、分化するか又は特別な細胞系統に向かって発展することに捧げられるようになる細胞を付随的に含むこと無く、細胞集団は、先ず骨髄柔組織又は他の母集団から誘導される少数から、それらの医学的な用途のために必要とされる多数に増大され得る。医学的用途のために充分な量でこれらの細胞を提供するために、研究は、それ故、ＭＰＣを包含する前駆細胞の生体外増殖のための新規なアプローチを見出すことに集約された。今までのアプローチは、組織培養処理された基質に対する付着性に基づいて単離された［フリーデンシュタイン(Friedenstein)他、１９９２年；カストロ−マラスピナ(Castro-Malaspina)他、１９８０年］細胞を低頻度で含む全骨髄柔組織を培養し、そして増殖を達成するために、付着層を複数回通過させる［コルター(Colter)他、２０００年；オグシ(Ohgushi) 他、１９９９年；ブルダー(Bruder)他、１９９７年；カプラン(Caplan)他、１９９７年；ジャイスワル(Jaiswal) 他、１９９７年］ことを包含している。しかしながら、このアプローチの結果、ｉ）付着性の細胞集団は真正な間葉幹細胞であること、ii）この細胞集団は、適切な時間枠にて臨床応用に適する多数に増殖され得ること、そしてiii)それぞれの継代において、骨のような、形態論的に又は組織学的に同定可能な成熟した間葉細胞又は組織を形成するために、この細胞集団の能力をまだ維持すること、は明確に説明されなかった。
【０００６】
表題“ヒト間葉幹細胞のためのモノクローナル抗体”にて、２０００年７月１１日に発行されたアメリカ合衆国特許第６０８７１１３号明細書（特許文献１）は、モノクローナル抗体を使用して検出可能な特異的な細胞表面抗原の増殖に基づいて、間葉細胞由来の種々の組織を生じ得る細胞に富まされている、ヒト細胞の集団の単離方法を記載している。この特許明細書は、このようなモノクローナル抗体への陽性結合により、間葉幹細胞が同定され且つ単離され得ることを特許請求しているけれども、これらの細胞が付着性の表面上で培養され、その後、陽性として選択されており、骨髄由来の細胞集団の表現型特性及び機能特性の両方を変化させる可能性を有するプロセスは考慮されていない。この付着性に基づくアプローチは、いわゆる間葉前駆細胞を単離することのみならず、その増殖をも達成するための、細胞基質の接触を必要とする。付着依存性細胞を培養する他の方法が記載されている。これらは、中空繊維膜の表面上に細胞を成長させること［ジャックス(Jacques) 他、１９７６年］、半透膜内で細胞をカプセル化し、その後このカプセルを成長媒体中に懸濁すること［ジャーヴィス(Jarvis)他、１９８５年］、及びコラーゲンのような三次元マトリックス上で［ナウトン(Naughton)他、１９９０年］又は、その後懸濁液中に保持される微小球上で［フー(Hu)他、１９９２年］、細胞を培養することを包含する。
【特許文献１】
アメリカ合衆国特許第６０８７１１３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
間葉組織及び他の組織を分化し得る前駆細胞を増殖することを目的とする前記アプローチは、従って、固体表面上で、すなわち二次元的に投入細胞集団を培養し、付着依存性の細胞の集団をゆっくりと増殖させることに依存している。ザンドストラ(Zandstra)他（１９９４年）により報告されているように、造血前駆細胞の増殖のために、異なるアプローチが用いられた。造血細胞は、撹拌された懸濁培養液中で増殖され得ることが示された。しかしながら、そして細胞に基づく組織工学における使用における興味の増大にも関わらず、間葉前駆細胞を包含する非造血幹細胞及び前駆細胞をより迅速に増殖することができる技術に対する要求が残る。
【０００８】
この要求は、排他的にではないけれども、骨の分野において特に生じている。骨を修復するために組織工学原理を使用するために提案された戦略の一つは、患者から骨髄由来の細胞を採取し、生体外にて骨形成能を有する細胞集団を増殖し、増殖した集団を三次元キャリアに植え付け、その後、細胞を植え付けた骨格を、標準骨移植の代わりに患者に移植することである。種々の研究グループがこの手続の流れに達したけれども、前記戦略はまだ、臨床的に成功裏に用いられていない。これについての複数の理由が存在し得るけれども、主な障害は、骨髄採取体から骨形成性細胞を産生することができる細胞を適切な数生じさせることに関連する困難性であった。
【０００９】
従って、必要に応じて異なる機能的な組織を成長させるために以後使用可能な、増殖した細胞集団を提供するために、多数の非造血前駆細胞を増殖させる経済的な方法を提供することは非常に利点がある。
【００１０】
広範な所望の組織に分化することができる細胞集団を提供することもまた有用である。
【００１１】
ヒト組織の再生及び修復のために医学的に有用な形態にて、このような細胞を提供することもまた望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
非造血前駆細胞は、特にしかし排他的にではなく、間葉前駆細胞は非静止懸濁培養液中で有効に増殖され得ることが今や見出された。より特別には、骨髄及び類似する源から採取可能な種類の非造血前駆細胞は、撹拌された懸濁バイオリアクター中で著しく増殖され得ることが見出された。更に、非静止懸濁培養液中で培養された前駆細胞は、神経及び内皮筋肉組織並びに、骨、軟骨、結合組織、筋肉、腱及び脂肪組織を含む間葉組織を包含する血液細胞以外の種々の細胞種に分化する能力を保持している。
【００１３】
前駆細胞の増殖のための懸濁培養に非静止アプローチを採用したことにより、本方法は組織培養プレート及び組織フラスコ表面のような二次元表面上に依存し且つそれに限定される既知の増殖技術を遥かに凌ぐ速度及び効率にて、前駆細胞の増殖を可能にする。更に、採取された前駆細胞を懸濁液中にて培養する本方法は、増殖する予定の前駆細胞が先ず選択され、次いで、細胞（既知の技術により増殖され得る）の表現型に影響を及ぼし且つそれを制限する付着依存性の環境中に保持される既知の技術を回避する。
【００１４】
より特別には、非静止懸濁培養の技術は、固定又は付着に基づいて投入細胞を予め選択すること無く、初めて、広範なコンパートメントされた細胞の子孫を生じ得る、今まで知られていない多型潜在性の前駆細胞の新規なコンパートメントを実現すると信じられている。
【００１５】
本発明の一つの目的は、非造血前駆細胞を含む投入細胞集団を最初に得、そして該投入細胞集団を、投入集団の性質を持つ細胞を増殖するために充分な期間、非静止懸濁培養液中に保持する段階により増殖する方法を提供することである。
【００１６】
投入細胞集団は、種々の類又は型からなる非造血前駆（ＮＨＰ）細胞を含み得、そして特に、間葉前駆細胞（ＭＰＣ）を含む。従って、特別な目的において、本発明は、
１）投入細胞と、適する成長媒体とからなる細胞懸濁液を用意し、そして
２）非静止培養条件下にて、投入集団内の細胞を増殖させるために有効な期間、前記細胞懸濁液を保持する
段階からなる、ＮＨＰ細胞を含む投入細胞集団を増殖する方法を提供する。
【００１７】
別の、より特別な本発明の目的は、
１）間葉前駆細胞と、適する成長媒体とからなる細胞懸濁液を用意し、そして
２）非静止培養条件下にて、前記細胞を増殖させるために有効な期間、前記細胞懸濁液を保持する
段階からなる、間葉細胞を含む投入細胞集団を増殖する方法を提供する。
【００１８】
本発明の前記方法に従って、投入細胞集団には、付着又は固定依存性細胞のための予備選択を行わない。
【００１９】
本発明の別の目的において、本発明は、非静止懸濁培養により増殖し易い投入細胞集団であって、非造血前駆細胞が富まされた細胞集団からなる投入細胞集団を提供する。望ましくは、前記投入集団は、骨髄実質性細胞前躯体、そしてとりわけ間葉前駆細胞が富まされている。本発明の前記目的の実施態様において、このような富まされた前駆細胞集団は、少なくとも１種の造血細胞種、すなわち、造血細胞に対して特異的な表面マーカーを持つ細胞種を実質的に欠いていることを特徴とする。特別な実施態様において、前記投入集団は、間葉前駆細胞について前駆細胞集団を富ませることにより産生される。別の実施態様において、前記投入集団は、間葉前駆細胞以外の非造血骨髄実質性前駆細胞を富ませることにより産生される。
【００２０】
前記投入細胞集団は、骨髄、特に、死体の骨髄から、又はより望ましくは新鮮な源から、又は胎芽、臍帯血などのような何れかの類似する源から、前駆幹細胞について確率された採取技術に基づいて採取され得る。前記投入集団を産生するために、採取液は好適には、例えば、商標名フィコール−パック(Ficoll-Paque)［シグマ(Sigma) 社製］のような、商業的に入手可能な密度勾配媒体を使用して分別せしめられる。
【００２１】
もう一つの方法として、懸濁培養による増殖のため、富まされた投入集団を産生するために、採取された前駆細胞に、採取液から、造血前駆細胞表現型のような望ましくない表現型を有する細胞の除去（又は減少）を行う、選別手法を用いることができる。このような富化は、例えば、蛍光により活性化する細胞選別装置及び技術を使用することにより、又は、確立されたロゼッティング技術(rosetting technique) の応用により、達成され得る。双方の技術とも、注目する細胞種に特異的な表面マーカーを付けられた抗体を用いる。基本的に、双方の技術とも、前記細胞表現型の細胞を、増殖している細胞集団から採取することを可能にするために、抗体とマーカーとの間の相互結合の作用を用いる。
【００２２】
これらの技術及び、細胞の選別を容易になし得る関連する技術は、本発明の非静止懸濁培養による増殖のために適する、種々の投入細胞集団を提供するために有用である。特別な態様において、前記投入集団は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ６６及びＣＤ１１９から選択された少なくとも１種の表面マーカーの存在を特徴とする、少なくとも１種の造血細胞種が実質的に存在しない、前駆細胞の富まされた投入集団からなる。本発明の別の態様において、前記投入集団は、主な組織適合性錯体種Ｉ（ＭＨＣ−Ｉ）と結合した１種又はそれより多くの表面マーカーを欠く、及び／又は主な組織適合性錯体種II（ＭＨＣ−II）と結合した１種又はそれより多くの表面マーカーを欠く、細胞種が富まされている。特に、前記投入集団は、望ましくは、以下の表面マーカー：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱの１種又はそれより多く、そして望ましくは、その全てを欠く細胞にて富まされている。
【００２３】
従って、本発明の目的の一つにおいて、本発明は、増殖された細胞集団を提供するための懸濁培養のための新規な投入細胞集団であって、該増殖された細胞集団から非造血及び特に間葉細胞種及び組織が成長され得、また該投入細胞集団は、付着により選択されておらず、且つ非造血前駆細胞について富まされた前駆細胞集団からなる、投入細胞集団を提供する。実施態様において、このような富まされた投入前駆細胞集団は、１種又はそれより多くの造血前駆細胞表面マーカーを発現する細胞を実質的に欠くことを特徴とする。特別な実施態様において、前記の新規な投入細胞集団は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ６６及びＣＤ１１９から選択された少なくとも１種の表面マーカーを持つ細胞を実質的に欠くことを特徴とする。他の実施態様において、前記の新規な投入細胞集団は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ及びＨＬＡ−ＤＱから選択されたＭＨＣからなる少なくとも１種のマーカーを持つ細胞を実質的に欠くことを特徴とする。特別な実施態様において、前記の新規な投入細胞集団は、ＭＨＣマーカーを持つ全ての細胞を実質的に欠くことを特徴とする。
【００２４】
前記の投入細胞集団又は前記の富まされた投入細胞集団は、非静止懸濁培養の技術により増殖される。前記の投入細胞集団は、懸濁培養液中に種投与された投入細胞の数に対して、投入集団が繁殖され、且つ投入集団の機能的及び表現型的性質の一つ又はそれより多くを持つ細胞数が増加したとき、“増殖された”と考えられる。非静止条件下での懸濁培養は、バイオリアクター又は、増殖に従う温度、圧力及び栄養摂取の条件下で、液体媒体中で細胞の三次元培養を可能にする他の適する環境中で行われる。非静止懸濁培養は更に、増殖の間、個々の細胞として、懸濁液中に培養された細胞を維持するための手段として、培養環境のかき混ぜを含む。このようなかき混ぜは、典型的には、撹拌のような機械的かき混ぜを伴うが、しかし、浸透、吸引などのような他の流動化技術をもまた用いてよい。培養中の付着をできる限り少なくするため、前記バイオリアクターは、好適には、例えば、該バイオリアクターの内表面への付着を防止するために、シリコン化処理される。
【００２５】
実施態様において、適する媒体は造血培養環境であってよく、そして懸濁液は、撹拌されたバイオリアクター中にあってよい。他の実施態様において、前記媒体は、造血前駆細胞を培養するために典型的に必要とされ、且つ、このような造血細胞の維持のためのみに必要である種類の栄養物を排除するために適合されてよい。例えば、典型的には、栄養液体媒体はヒドロコルチゾンを必要とせず、そして、造血細胞の維持のために主に用いられてきた同様のサプリメントも必要としない。
【００２６】
望ましくは、投入細胞集団の投入細胞集団の機能能力の増大化は、培養期間にわたり細胞の生存能力を維持するために有用なサイトカイン及び／又は成長因子、或いはその細胞源を補足された媒体中で行われる。特に有用なサプリメントは、ＩＬ−３及び幹細胞因子（ＳＣＦ，スチール因子（ＳＦ）としても知られている）を包含する。また特に有用なものは、血小板に由来する成長因子（ＰＤＧＦ）及び繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のような成長因子であり、これらは、神経細胞種を産生し得る投入細胞集団を増殖する際に役立つ。まだ他の成長因子及びサイトカイン及び他のサプリメントを、特に興味のある細胞種に対して確立された培養方法に基づいて用いることができる。
【００２７】
投入細胞集団の機能能力の増大化は、約数日間の非静止懸濁培養の後に達成され得、そして１〜３週間及び更に長期の培養期間もまた適している。
【００２８】
前記の如く、懸濁液中に維持された前駆細胞は多型潜在性であり、そして間葉及び他の前駆細胞を包含する。従って、増殖された集団は、骨、軟骨細胞、含脂質細胞、内皮細胞、神経細胞、筋芽細胞血小板細胞及び軟骨を包含する分化された表現型を形成するために使用され得る。本発明の目的に従って、一旦、前駆細胞の投入集団が繁殖、すなわち増殖された場合、幾分かの又は全ての細胞は、望ましい組織を成長させるために適する分化環境に置かれ得る。
【００２９】
本発明は更に、増殖されたヒト前駆細胞の集団であって、
１）分化のために適する条件下でその後培養されるとき、骨細胞、繊維芽細胞及び神経細胞を包含する分化された細胞種を産生し得、
２）該集団は非静止懸濁培養液中で増殖されており、
３）該集団中の前駆細胞は、粘着性(adherence) に基づいて選択されておらず、
４）集団表現型はＳＨ４−陰性(SH4-negative)であり、そして
５）該集団は、少なくとも１種の、造血幹細胞に特異的な培養サプリメントの不存在下における培養から生じる
ことを特徴とする、増殖されたヒト前駆細胞の単離された集団を提供する。
【００３０】
別の本発明の目的において、本発明は、上記の如く、非造血前駆細胞が富まされた投入集団の非静止懸濁培養から得られるヒト間葉前駆細胞の増殖された集団を提供する。
【００３１】
別の本発明の目的において、本発明は、ヒト間葉前駆細胞を、それから分化される細胞の形成に役立つ環境に移送するために有用な治療用組成物であって、上記のヒト前駆細胞の集団又は小集団及び、前記環境に前記細胞を移送するための生理学的に許容され得るビヒクルを含む組成物を提供する。
【００３２】
本発明の実施態様において、前記ビヒクルは、前記細胞を、修復又は再生が望まれてい
る骨部位に移送するために適するものである。特別な実施態様において、前記細胞を移送するために使用される前記ビヒクルは、骨と適合性であり、且つそれ自体、骨誘発性材料であるマトリクス材料である。
【００３３】
別の本発明の目的において、本発明は、前駆細胞集団の分化を誘発するために適する因子と組み合わせた、上記のような増殖された前駆細胞集団を提供する。このような組み合わせは、分析環境として、組織の修復又は再生用に提供するため、移植用の組織を産生するために使用される種類の、或いは、ヒトの又は他の患者の治療を行うために確立された種類の、組織成長環境として、明らかである。
【００３４】
また別の本発明の目的において、本発明は、上記種類の増殖された前駆細胞集団、又はその小集団を得、その後、前記細胞集団を、それ自体又は適する移送ビヒクル中にて、望ましい細胞種への分化を支持する環境に移送する段階からなる、分化された、非造血細胞種を産生する方法を提供する。本発明の実施態様において、細胞は、実質性細胞又は、骨、軟骨、筋肉、脂質、腱及び神経から選択された組織への分化を誘発するために適する環境に移送される。特別な実施態様において、間葉前駆細胞が、骨を修復又は再生する目的のために増殖され、それ故、このような目的が望まれている骨部位に移送される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
図面を参照して、実施例としてのみ、本発明の実施態様をここに記載する。
【００３６】
図１Ａは、撹拌された懸濁バイオリアクター中に維持された、密度勾配分離されたヒト骨髄由来の細胞からの投入数に関する、全細胞数の経時的な変化を説明する図的表現である（図８もまた参照）；図１Ｂは、ＣＦＵ−Ｆ分析における平板培養において各々の処理群に維持された細胞から生じたコロニー形成性ユニット（ＣＦＵ）の増殖様式を示す。
【００３７】
図１Ｃは、撹拌された懸濁バイオリアクター中で成長された細胞（パネルＡ〜Ｃ）及び静止対照培養にて成長された細胞（パネルＤ〜Ｆ）から計算された全細胞増殖（パネルＡ，Ｄ）、ＣＦＵ−Ｆ増殖（パネルＢ，Ｅ）及びＣＦＵ−Ｏ増殖（パネルＣ，Ｆ）の図的表現である。バーは、三つの異なる実験例の平均値±標準偏差値（図８もまた参照）を示す。
【００３８】
図１Ｄは、所定のサイトカインカクテルの存在下で成長された、実質性前駆細胞集団から誘発された種々の種類の分化された細胞を示す。使用されたサイトカインカクテルの濃度は、幹細胞因子（ＳＣＦ）１０ｎｇ／ｍＬ、インターロイキン−３（ＩＬ３）２ｎｇ／ｍＬ、マクロファージ・コロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）１００ｎｇ／ｍＬ及び血小板から誘導される成長因子（ＰＤＧＦ）３０ｎｇ／ｍＬであった。テトラサイクリンで標識された培養液（Ａ）（本明細書中に示された骨形成性条件にて１週間、ＳＣＦ＋ＩＬ３にて培養された、バイオリアクターから誘導される細胞）の紫外線蛍光励起により検出された骨小結節の形成に加えて、脂肪小球を含む細胞（Ｂ）（ＦＷ：２．５５ｍｍ）が、選択されたバイオリアクター培養処理物から除去された細胞を用いて初期化された骨小結節分析において生成した（表に結果を示す）。イメージ（Ｃ）は、１週間後に、撹拌されたバイオリアクターのＳＣＦ＋ＩＬ３処理群から除去された細胞を用いて初期化されたＣＦＵ−Ｆ分析にて成長した典型的な細胞を示す（ＦＷ：２．８５ｍｍ）。ＣＦＵ−Ｆ培養液は、α−ナフチルアセテートエステラーゼを用いて染色され、その後、ヘマトキシリン溶液を用いて２週間、対比染色した。イメージ（Ｄ）（ＦＷ：２．８５ｍｍ）は、ＰＤＧＦの存在下で培養された、バイオリアクターから誘導される細胞を用いて初期化されたＣＦＵ−Ｆ分析を成した典型的な細胞を示す。
【００３９】
図２Ａ−２Ｄは、異なるサイトカインの組み合わせを用いて、５日目にバイオリアクターから単離された懸濁細胞のＣＦＵ−Ｆ培養液を撮影した光学顕微鏡写真である。
【００４０】
図２Ｅ−２Ｈは、異なるサイトカインの組み合わせを用いて、２０日目に懸濁バイオリアクターから除去された細胞のＣＦＵ−Ｆ分析結果である。
【００４１】
図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄは、種々のサイトカインの存在下にて維持された５日目及び１０日目の懸濁細胞の、テトラサイクリンで標識された骨形成性培養液を表わす。３週間後に、無機物化した小結節性の領域が最初に現れ、そして５週間目に、培養は停止された。蛍光強度は、無機物化した領域にキレート化したテトラサイクリンに対応していた。イメージ（Ａ〜Ｂ）は、５日目及び１０日目に、種々のサイトカインカクテルで補足された懸濁バイオリアクターから除去された細胞から形成された、小結節状の構造に対応するテトラサイクリンのシグナルを示す。全ての骨小結節分析は、１×１０4 細胞／ｃｍ2 を用いて開始された。バイオリアクター実験例から誘導される細胞を用いて開始された各々の骨小結節培養液からのテトラサイクリンのシグナルは、カナダ国、サン  リーンドロのアルファ  イノテック  コーポレイション(Alpha Innotech Corporation)製のケミイメイジャー５５００ソフトウェア(ChemiImager 5500 software) を使用して定量した。
【００４２】
図３Ｆは、図３Ａ−図３Ｄで与えられた条件下にて、前記期間にわたり骨小結節コロニーとして検出されたＣＦＵ−Ｏ前駆細胞の増殖を説明している。
【００４３】
図４Ａ及び図４Ｂは、懸濁培養７日後に、サイトカインなし及びＳＣＦ＋ＩＬ３バイオリアクター処理群から誘導される細胞から生じた、発展している小結節領域（３週間目）の暗視野の顕微鏡写真を示す。
図４Ｃ及び図４Ｄは、ＳＣＦ＋ＰＤＧＦ処理から取り出された細胞に関連した小結節領域を示さない。
【００４４】
図４Ｅは、５日目及び１０日目に培養懸濁液から除去された細胞を用いて開始された骨小結節培養の入力シグナルについて定量化及び標準化された図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄの無機物化された領域に関連した、テトラサイクリンのシグナルを示す図的表現である。図４Ｆ及び図４Ｇもまた、バイオリアクター実験例及び静止対照（Ｉ型）実験例の双方から誘導される細胞を用いて開始された各々の骨小結節培養からのテトラサイクリンのシグナルを示す図的表現である（静止対照Ｉ型の記載に関しては、図８の記載参照）。パネルＦ及びパネルＧは、ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦの組み合わせを用いた結果を包含する定量的な結果を示し、ここで、テトラサイクリンの陽性シグナルは、累積された密度値（ＩＤＶ）として表わされる。全ての骨小結節分析は、１×１０4 細胞／ｃｍ2 を用いて開始された。各々のバーは、各々のサイトカイン条件に対する、三つの骨小結節培養液からのテトラサイクリンの陽性シグナルの平均値±標準偏差値を示す。
【００４５】
図５Ａ−図５Ｄは、検討された種々の処理群中で成長された５日目懸濁細胞の骨小結節培養液から撮影された走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）の画像であり、そして図５Ｆは、培養皿に貼着しているマトリックスが、セメント線マトリックス(cement line matrix)を形成する球形の付着を含むことを示す透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）の画像である。図５Ｅは、セメント線マトリックスを形成する球形の付着を隠している、分化している骨形成性細胞を示す。図５Ｇ及び図５Ｈは、３週間後にバイオリアクターから除去された細胞を用いて開始された培養から撮影された画像である。領域の幅（ＦＷ：図Ｇ及び図Ｈにおいて、１７μｍ）。
【００４６】
図６は、懸濁培養を通じて、異なる時点における種々の細胞集団のフローサイトメトリック(flow cytometric) ドットプロットを提供する。図６Ａは、ＣＤ３４及びＣＤ４５表現型並びに、サイトカインの存在又は不存在下での培養時間におけるドットプロットの進行を示す。投入集団は、ＣＤ４５  ６５％そしてＣＤ３４  ０．５％の集団を含んでいた。図６Ｂは特に、細胞表面マーカーに対する種々の抗体と共に培養された、商標名フィコール−パック骨髄から発生したドットプロットを示す。前記ドットプロットは、商標名フィコール−パックにて加工されたヒト骨髄は、ＣＤ４５+ 、ＣＤ３４low 、ＣＤ５０+ 、ＳＨ２low 、ＳＨ４- 及びＳＴＲＯ−１である細胞集団を含むことを示している。前記の- 細胞集団はまた、ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−ＤＰ，ＨＬＡ−ＤＱ，ＨＬＡ−ＤＲに対する抗体と共に培養されたとき、二重の陰性集団（１７％まで）をも包含する。図６Ｃは、ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−ＤＰ，ＨＬＡ−ＤＱ，ＨＬＡ−ＤＲの各マーカー（これらは、ＭＨＣ分類Ｉ及びＭＨＣ分類IIの各々に対応する）の発現に対するフローサイトメトリックプロットを示す。プロットされているのは、培養２１日後の、商標名フィコール−パックにて加工された骨髄細胞について上記にて論じたマークの増殖（Ａ，Ｂ及びＣ）、ＳＣＦ＋ＩＬ３の存在下で成長させた細胞集団（Ｄ，Ｅ及びＦ）及びサイトカインの不存在下で成長させた細胞集団（Ｇ）である。プロットＨは、前記投入集団に対する陰性対照であり、そしてプロットＩは、ＳＣＦ＋ＩＬ３でサイトカインなしの実験例に対する陰性対照である。
【００４７】
図７は、１週間目、２週間目及び３週間目にバイオリアクター中に存在する細胞のフローサイトメトリック分析により決定された、計算されたＣＤ４５- 及びＣＤ４５+ 細胞増殖を示す。より大きなＣＤ４５- 及びＣＤ４５low 細胞増殖は、ＳＣＦ＋ＩＬ３の存在下で達成される。各バーは、１週間目、２週間目及び３週間目にバイオリアクターから誘導される細胞の、三つの独立したフローサイトメトリック分析から計算されたＣＤ４５- 及びＣＤ４５+ 細胞数の平均値を表わす。
【００４８】
図８は、撹拌された懸濁バイオリアクター中での全細胞増殖を、カイトカイン補足の関数として示す。（Ａ）全細胞増殖への、単独の又は組み合わせた、幹細胞因子（ＳＣＦ，１０ｎｇ／ｍＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ３，２ｎｇ／ｍＬ）及び血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ，３０ｎｇ／ｍＬ）の影響を研究するための予備的な検討（各処理群においてｎ＝１）。３週間で全細胞数の５倍又はそれを越える増加を達成した培養液を更に分析した。（Ｂ）は、懸濁培養を３週間継続した細胞成長の範囲を、カイトカイン添加に関連付けて示す。２種類の静止対照実験を行った：静止対照Ｉ（Ｃ）及び静止対照II（Ｄ）。双方の対照は、バイオリアクター培養と平行して実施された。第一の種類の対照（静止対照Ｉ）は、バイオリアクター培養に対する対照として機能させるために計画され、それ故、同一数の細胞を用いて開始化され、同一の成長媒体中に懸濁され、そして媒体の１／３の交換（付着性細胞及び懸濁細胞の双方を包含する）が毎週行われた。静止対照IIもまた、バイオリアクター培養と同一数の細胞で開始された培養液を含むが、しかし、前記培養は、約８０〜９０％密集度にて継代され、その後、１：２に分けた。（Ｃ及びＤ）は、２種類の静止培養液から達成された細胞成長の範囲を示している。Ｂと比較したＣ及びＤにおけるｙ軸（横軸）の尺度の相違に着目すべきである。各点は、三つの独立した実験例（誤差バーは標準偏差を示す）の平均値を示す。３週間目にて、各々の群の間で、全細胞（Ｂ及びＣの双方）における有意差（ｐ＜０．０５）が観察された。
【００４９】
図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれ、懸濁バイオリアクター処理群から誘導される細胞及び、０．１％トリプシン処理により静止対照（Ｉ型）から除去された付着性細胞からの投入に対するＣＦＵ−Ｆ数における増加倍率の図的表現である。３週間目（＊が付記されている）におけるサイトカインなしの処理群と他の処理群との間のＣＦＵ−Ｆ増殖について、図９Ａにおいて、有意差（ｐ＜０．０５）が観察された。小結節領域が数えられ、そしてバイオリアクター培養液から誘導される細胞（図９Ｃ）及び静止対照（Ｉ型）実験例の付着性フラクションから除去された細胞（図９Ｄ）からの投入に対するＣＦＵ−Ｏ数における増加倍率を計算するために使用された。図９Ｃ及び図９Ｄにおいて、３週間目（処理群間を、＊及び＊＊で示している）におけるサイトカインなしの処理群とＳＣＦ＋ＩＬ３処理群との間に、ＣＦＵ−Ｏ増殖における有意差（ｐ＜０．０５）が観察された。図９Ｅは、１週間目、２週間目及び３週間目にて、ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦが補足されたバイオリアクターから除去された細胞を用いて初期化された２週令ＣＦＵ−Ｆ培養液のＮｅｕＮ発現細胞に関する陽性発現の図的表現を示す。前記培養液は、マウス抗−ＮｅｕＮモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を用いて培養され、そして陽性発現は、アレクサ  フルア(Alexa Fluor) ５９４に結合した抗−マウスＭｏＡｂを使用して、バックグラウンド上の蛍光シグナルとして検出された。１週間目、２週間目及び３週間目のバイオリアクターで成長した細胞を用いて開始された、２週令ＣＦＵ−Ｆ培養液の、各培養処理群から１０個のランダム画像が撮影された。前記画像は、１週間、２週間及び３週間の懸濁培養後にＮｅｕＮ発現した細胞数の増加を定量するために使用された。各バーは、三つの独立した実験例からの３０フィールド（処理群あたり１０フィールド）の結果±標準偏差値を示す。
【００５０】
図１０Ａは、ＳＣＦ＋ＩＬ３の存在下及び非存在下での、撹拌された懸濁バイオリアクター中の、商標名ロゼットセプ(RosetteSep)から誘導されるヒト骨髄から誘導される細胞の成長の図的表現を示す。図１０Ｂは、７日目にＳＣＦ＋ＩＬ３バイオリアクター処理群から誘導される細胞を用いて開始された、テトラサイクリン培養された骨小結節分析（５週間）を示し、そして図１０Ｃは、無機物化された小結節領域を示す、暗視野の顕微鏡写真（倍率５０倍）である。
【００５１】
本発明は、種々の非造血細胞種が分化し得るヒト前駆細胞に関するものである。種々の非造血細胞が本前駆細胞集団から分化し得るので、該集団は本明細書にて、非造血前駆（ＮＨＰ）細胞の集団として言及されている。このような集団は、間葉前駆細胞（ＭＰＣ）並びに、他の非造血前駆細胞を含む。このような前駆細胞は、“先駆体”細胞としてもまた言及されており、そしてこれらの用語は、前駆体及び先駆体の双方が、分化された細胞種を産生し得るという理由のため、本明細書中において等価であると考えられる。
【００５２】
本前駆細胞集団は、本明細書の実施例に更に詳細に記載されている技術を使用して、骨髄から得られる細胞種の非静止懸濁培養から得られる。上記本明細書中に記載の如く、このような前駆細胞の他の類似し且つ既知の源、特に、臍帯及び胎盤血、末梢血、皮膚、脂肪及び筋肉を包含する源もまた使用され得ることを記憶すべきである。
【００５３】
細胞集団内で前駆細胞を増殖させるため、本発明は培養に対して非静止アプローチを用いる。これは、静止アプローチである確立された方法と区別され、そして、増殖の増殖の進行を妨げないように設定されている。本発明の方法においては、むしろ、かき混ぜを導入している非静止条件下で細胞が培養され、それにより、細胞が個々の非付着性細胞として存在し、そして大きな塊も、また膠着した層もない培養液を産生する。かき混ぜ源は、典型的には、培養媒体内に直接、又は、設置されている培養容器の表面を通して外部的に、動きを導入する機械的かき混ぜ手段である。本実施態様において、非静止条件は、バイオリアクターに配置されておりそして外的な磁気化手段により誘発される磁気な撹拌パドルを包含し得る撹拌手段により、導入される。もう一つの方法として、かき混ぜは、細胞集団を介して適する培養環境を移動させることを介してかき混ぜを導入する流動培養床を包含する、他の手段により導入され得る。
【００５４】
かき混ぜ強度は、懸濁液中にて、培養栄養物の望ましい循環と共に、細胞を、実質的に個別に増殖し得る細胞として維持するためには充分であるが、しかし、細胞溶解をもたらす剪断応力を導入するためには不充分な、強度であることを記憶し得る。最適な撹拌速度は、本明細書中に記載された実験条件下で、約４０ｒｐｍである。
【００５５】
一つの実施態様において、培養系は、ｉ）軸流を維持するため、インペラがバイオリアクターの中央に、溶液表面に対して９０度の角度で配置されている、ii) 懸濁液中に細胞を維持するため、４０ｒｐｍの一定混合速度が使用される、iii)均質な混合を確実にするため、かき混ぜ機が、容器の、下に向かって３／４の位置に配置されている、ように構成された。
【００５６】
非静止アプローチと共に、本方法は、細胞培養のために三次元環境を導入し、そして、前駆細胞が増殖され得る環境容積を飛躍的に上昇させ、それにより、所定時間にて増殖され得る細胞数を増加させるのみならず、細胞が長期にわたり増殖され得る速度もまた加速し得る。本方法において、適する培養容積は、数ミリリットルないし数リットルの範囲であり得、例えば、約０．１Ｌないし２００Ｌを越え、例えば、０．５Ｌないし１００Ｌ、例えば１Ｌないし１０Ｌである。
【００５７】
本方法において使用するために適する培養媒体、並びに培養の温度及び雰囲気は、前駆細胞の培養のためにこの分野で既に充分確立されたものである。温度は、好適には、生理学的な範囲内にある。培養雰囲気は、望ましくは、Ｏ2 とＣＯ2 との適当なブレンド、例えば、加湿された５％ＣＯ2 の空気中である。培養媒体は、特に、望ましくは、非造血前駆細胞の増殖に有用な作用物質、例えば、種々の成長因子及び栄養サプリメント、を補足されている、商業的に入手可能な長期培養媒体（ＬＴＣ）を包含する、何れかの適する液体媒体である。本明細書中に例示した初期の検討において、各培養液は、下記の組み合わせ：サイトカインなし、ＳＣＦ、ＩＬ３、ＭＣＳＦ、ＳＣＦ＋ＩＬ３、ＳＣＦ＋ＰＤＧＦ及びＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦを包含する、異なるサイトカイン処理を受けた。これらの成長因子の選択は、繊維芽細胞及び間葉細胞から誘導される他の関連する細胞の成長に関する影響が記載されたこれまでのレポートに基づいた［例えば、ワン(Wang)他、Exp.Hematol.18,341-347(1990); ヒラタ(Hirata)他、Acta Haematol.74,189-194(1985); 及びヤマダ(Yamada)他、J.Cell Physiol 184,351-355(2000)参照］。
【００５８】
適する培養期間は、増殖プロセスから要求された前駆細胞の数に主に基づいて決定される。本実施例に記載された条件下で、前駆細胞の数は、初期の種細胞の植え付けから１週間で、容易に５〜１０倍に増殖することができ、更に長期間培養すると、前駆細胞の数は更に増加する。
【００５９】
本前駆細胞集団は、骨髄由来の投入細胞集団又は富まされたその小集団の非静止懸濁培養から得られ、そして、この分野においてより一般的であり、且つそれ自体、本細胞集団に考慮されていない先行技術の細胞集団に、特定の表現型の特性を与えると信じられている、細胞付着性又は固定依存性に基づく選択の段階が介在することなく、産生される。本集団はまた、内皮細胞及び、ニューライトの発芽後成長を呈している神経組織を含む神経組織を形成する細胞を包含する、分化された細胞の子孫を産生するその能力において、均質な間葉幹又は前駆細胞集団とも区別される。更に、本前駆細胞集団は、ヒドロコルチゾンのような、造血幹細胞の培養において一般的に使用される１種又はそれより多くの人為的な媒体サプリメントを欠く培養媒体中に維持され得る。
【００６０】
前述の投入細胞集団に加えて、本発明はまた、採取された集団に対して、非造血細胞が富まされた前駆細胞集団を提供する。このような富まされた投入細胞集団は、１種又はそれより多くの造血細胞種が除去された細胞集団、及び１種又はそれより多くの非造血前駆細胞種が添加された前記投入細胞集団を包含する。本発明の実施態様において、富まされたヒト間葉前駆細胞は、１種又はそれより多くの造血表現型が除去された細胞集団により示される。本発明の富まされた集団に到達するために除去され得る細胞表現型の特別な例は、１種又はそれより多くの下記のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ６６、ＣＤ１１９を持つ細胞、並びに、主な組織適合性錯体Ｉ型及びII型を持ち、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ（ＭＨＣ−Ｉに対応）そしてＨＬＡ−Ｄ、ＨＬＡ−Ｅ及びＨＬＡ−Ｆ（ＭＨＣ−IIに対応）を含む細胞を包含する。
【００６１】
このような富まされた前駆細胞集団の発生は、除去すべき細胞種に関するマーカーに対する抗体と組み合わせたＦＡＣＳ手法を使用して達成され得る。このような抗体、並びに手法及びこのような除去を行う装置は、商業的に入手可能である。
【００６２】
前記手法は、細胞採取後で且つ懸濁培養の前に適用することができるか、或いは、前記手法はまた、分化環境に置かれる前、例えば、その生成又はその後の組織産生のための使用前に、増殖された集団に適用することもできる。
【００６３】
投入前駆細胞集団から発生した細胞集団は、該集団が分化し得る何れかの種類の組織を修復又は再生するために計画された種々の治療において医学的に有用である。従って、医学的用途において、増殖された間葉前駆細胞集団は、治療を受ける者及び製剤化された細胞の存続性の双方に対して生理学的に耐性である何れかの移送ビヒクルを使用して、分化が望まれている部位に移送するために製剤化され得る。特別な製剤及び適する移送ビヒクルはこの分野で既知であり、そして意図された治療の性質から明らかである。望ましくは、前記製剤は、投与された細胞の存続性及び／又は分化を向上させる成長因子及びサイトカインのような作用物質を更に含む。
【００６４】
本発明はまた、特異的に分化された細胞を、その細胞を必要としている患者に投与することからなる治療のために特異的に分化された細胞を使用する方法をも提供する。本発明は更に、内生遺伝子又は導入遺伝子の選択的な発現のための、遺伝子工学設計された多能幹細胞の使用、並びに、病気を治療するため動物への移植／投与のための、それ自体又は生体内で増殖された形態での前駆細胞の使用を提供する。組織特異性構造又は他の機能を修復又は補正するため、前記細胞は哺乳類に、自系の、異質遺伝子型の又は異種の細胞を投与することにより、前記細胞を哺乳類と合体させるため使用することができる。前記細胞は、細胞種の生体内での分化を起こし、そして前駆細胞又は分化された細胞を哺乳類に投与するため、前記細胞を哺乳類と合体させるため使用することができる。細胞、生体外又は生体内で分化されたそれらの子孫は、遺伝子疾患又は変性疾患、神経性又は腫瘍性疾患プロセスを治すために、使用することができる。それらは、歯周病の治療のため歯肉様物質を産生するために、使用することができる。それらは、例えば心臓内にて筋肉を増強させるために、使用することができる。遺伝子工学設計された前駆細胞、又はその分化された子孫は、ＣＮＳ欠損又は損傷を伴う疾患を治療するために使用することができる。更に、前駆細胞又は神経的に関連する分化された子孫は、なかでも、しかし限定的でなく、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ＡＩＤＳに伴う痴呆、脊髄損傷、脳又は他の神経に影響を及ぼす代謝疾患を包含する、神経欠損又は変性疾患を伴う疾患を治療するために使用することができる。
【００６５】
前駆細胞、又は軟骨組織に分化された子孫は、軟骨開裂、軟骨薄化及び変形性関節症のような関節組織又は軟骨の疾患を治療するために使用することができる。更に、細胞又はその骨芽細胞に分化された子孫は、骨粗鬆症、パジェット病及び骨髄炎における組織再生のための外科手術又は腫瘍により生じた骨折、変形性関節症、骨の空洞のような骨の障害又は状態を治療するために使用することができる。
【００６６】
記載の如く、前駆細胞及び増殖されたその類似体の分化を誘発することは、望まれる分化された細胞種に従って変化する、この分野で確立された技術を使用して達成される。軟骨組織に分化させるため、デキサメタゾン、β−グリセロホスフェート及びアスコルビン酸のようなサプリメント、並びに所望により、種々の骨の成長因子を含む培養媒体中で約１４〜２１日間、前駆細胞を培養することができる。軟骨組織の存在は、フォン・コッサ染色(Von Kossa staining)、又は、骨シアロプロテイン、オステオネクチン、オステオポンチン及びオステオカルシンのような骨細胞マーカーに対する抗体により確認することが
できる。
【００６７】
軟骨芽細胞への分化のため、約１４日間又はそれより多く、懸濁培養にて、ＴＧＦ−βを補足した血清を含まないＤＭＥＭ中で、前駆細胞を成長させることができる。
【００６８】
含脂肪細胞への分化を誘発するため、デキサメタゾン及びインシュリン、又は約２０％ウマ血清を補足した媒体を使用することができる。含脂肪細胞への分化は、オイル−レッドを用いて染色する光顕微鏡を用いた検査、又は、リポプロテイン・リパーゼ（ＬＰＬ）、含脂肪細胞脂質結合性プロテイン（αＰ２）若しくはペルオキシソーム増殖体で活性化されたレセプター・ガンマ（ＰＰＡＲ）の検出により検出することができる。含脂肪細胞はII型糖尿病の治療のために、及び再建的又は美容的な外科手術、例えば、乳房切除後の乳房再生のため、又は、他の外科手術の結果としての欠損した組織の再建のために使用することができる。
【００６９】
骨格筋細胞分化を誘発するため、一定期間、増殖媒体中で、５−アザサイチジンを用いて前駆細胞を処理し、その後、ＬＴＣ媒体に移すことができる。分化は、免疫組織化学的又はウェスターンブロット分析により、Ｍｙｆ−５、Ｍｙｏ−Ｄ、Ｍｙｆ−６、ミオゲニン、デスミン、骨格アクチン及び骨格ミオシンの逐次的な活性化を検出することにより、確認することができる。平滑筋細胞もまた、成長因子を含まず血清を含まない媒体に血小板由来の高濃度の成長因子（ＰＤＧＦ）を補足した媒体中で前駆細胞を培養することにより、誘発され得る。最終的に分化された平滑筋細胞は、標準的な方法により、デスミン、平滑筋特異性アクチン及び平滑筋特異性ミオシンの発現を検出することにより同定することができる。心筋分化は、成長因子を含まない標準的な血清なしの培養媒体に基本的な繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を添加することにより、行うことができる。
【００７０】
従って、本発明の前駆細胞、その増殖した類似体及びその分化した子孫を、種々の症状を治療するため、細胞置換治療及び／又は遺伝子治療で使用し得ることが判る。更に、普遍的なドナー細胞として、遺伝的な又は他の疾患を修復するための細胞及び遺伝子治療に役立てるために、細胞を操作することができる。ドナー細胞として特に有用なものは、ＨＬＡ抗体類を発現せず、従って、移植されたとき、ＮＫ−媒介致死を避ける前駆細胞である。
【００７１】
本発明により提供された細胞は、移植用の組織又は器官を産生するために使用され得ることが判る。オーバーペニング(Oberpenning) 他［Nature Biotechnology(1999)17;149-155］は、犬の膀胱の外部からの筋肉細胞を培養し、そして犬の膀胱の内部からの細胞を貼着し、これら培養物から組織シートを産生し、そして外側に、筋肉細胞と一緒に微小ポリマー球をコートし、そして内側に、細胞を貼着することによる、実用的な膀胱の生成を報告した。この球体はその後、犬の泌尿器系内に挿入され、そこで、それは膀胱として機能し始めた。ニックラソン(Nicklason) 他［Science(1999)284;489-493］は、培養された平滑筋及び内皮細胞からの、いろいろの長さの血管移植材料の産生を報告した。培養された細胞から組織層を形成する他の方法は、この分野の当業者に知られている［例えば、ヴァカンチ(Vacanti) 他、アメリカ合衆国特許第５８５５６１０号明細書参照］。これらの方法は、とりわけ、広範な分化を有する本発明の細胞と組み合わせて使用されるとき、有効であり得る。
【００７２】
本明細書に記載された目的のため、本発明の自系の又は異質遺伝子型の前駆細胞を、分化された又は非分化の状態で、遺伝子的に変性された又は未変性の状態で、組織部位への直接注射により、全身的に、許容され得るマトリックスと共に、又は薬学的に許容され得るキャリアと共に、患者に投与することができる。
【００７３】
前記細胞を、冷凍された貯蔵物として、単独又は予め包装された媒体及びその培養のためのサプリメントと組み合わせて提供することができ、そして更に、別に包装された、特異的な細胞種への分化を誘発するための有効濃度の適する因子と組み合わせて、提供することができる。
【００７４】
本発明の特別な実施態様において、増殖された前駆細胞及び特に、増殖された間葉前駆細胞は、骨の治療において用いられる。この目的のために、前記細胞を、それ自体で又は適するマトリックス、例えば液体若しくはゼラチン状物質と一緒に、注射又はペーストとして用いることにより、骨の形成が望まれている部位に移送することができる。もう一つの方法として、前記細胞を、本明細書中でＣＦＵ−Ｏ条件により例示される分化環境において、生体外に置き、その後、骨組織への分化がほぼ完成された段階に達したとき、意図する部位に移植することができる。
【００７５】
本発明の他の実施態様は、下記の実験方法及び結果の開示から明らかである。
【００７６】
ヒト骨髄由来の細胞の獲得
ヒト骨髄由来の細胞（ｈＢＭＤＣ）は、健常なドナー（年齢１８〜５５歳）の同意を得て得た。前記細胞を、室温で４５分間１７５０ｒｐｍで商標名フィコール−パック(Ficoll-Paque)［シグマ(Sigma) 社製］密度勾配操作にて、分画した。細胞は、前記の勾配界面から単離され、そして骨髄長期培養（ＬＴＣ）媒体に添加する前に、加熱により不活性された胎児の子牛の血清を２％補足したイスコブの媒体(Iscove's medium) を用いて２回洗浄した。この媒体は、１２．５％ＦＣＳ、１２．５％ウマ血清、０．１ｍＭ  Ｂ−２メルカプトエタノール、２ｍＭ  １−グルタミン、０．１６ｍＭ  １−イノシトール及び０．０１６ｍＭ葉酸を補足した媒体［商標名ミエロカルト(MyeloCult) として言及される媒体であり、そしてカナダ国、ＢＣ、ＶＡ、ステムセル・テクノロジー(StemCell Technologies;SCT) 社から入手可能である］を含んでいる。
【００７７】
非造血前駆細胞はまた、骨髄から誘導される細胞と同様な発展能力、例えば、懸濁液中及び適切な培養条件下で増殖し得る間質性及び間葉性の潜在能力、を示し得る細胞を含むことが示された、ヒト臍帯血又は他の組織からも誘導され得ることが、この分野の当業者に明らかである。
【００７８】
更に、以下に記載されたラインに沿った実験例は、採取されたヒト骨髄細胞を、分画する前に、例えば、前記のフィコールに基づくプロセスにより、先ず実質性前駆細胞に富ませるとき、同様な結果を得ることもまたできることを示した。適する富化技術は、採取された細胞において、例えば、造血前駆細胞の表面マーカー特性を持つ細胞を除去する抗体を用いるプロセスにより、少なくとも１種の造血細胞種を減少させる技術である。特に有用な技術の一つは、間葉前駆細胞を富ませるために設計されている商業的に入手可能な商標名ロゼットセプ(RosetteSep)法である。
【００７９】
商標名ロゼットセプ(RosetteSep)（ＳＣＴ）は、マウス腹水又はハイブリドーマ培養液の浮遊物から精製された、マウスとラットのモノクローナル抗体の組み合わせを含む。これらの抗体は、ヒト造血細胞（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３８及びＣＤ６６ｂ−以下の表１中の詳細な記載を参照）上の細胞表面抗原及び赤血球細胞上のグリコホリンＡに対して導かれる、特定の二重特異性抗体錯体に結合している。マウスのモノクローナル抗体の下位分類はＩｇＧ1 である。
【００８０】
表１
2004531256.tif 000003
2004531256.tif 000004
【００８１】
要するに、商標名ロゼットセプ(RosetteSep)カクテルは、下記の細胞：抹消血リンパ球、抹消血胸腺細胞、単球、マクロファージ、分化されているＢ細胞、活性化されたＴ細胞、形質細胞、樹木状細胞、幾つかの上皮細胞及び顆粒球、を除去することにより、間葉前駆細胞を富ませる。
【００８２】
間葉前駆細胞のための商標名ロゼットセプ(RosetteSep)による富化は、全骨髄細胞１ｍＬ当たり商標名ロゼットセプ(RosetteSep)カクテル［カナダ国、ステムセル・テクノロジー(StemCell Technologies) 社から入手可能である］５０μＬを添加し、そして良く混合し、その後、室温で２０分間培養することを包含する。その後、この試料を、等容量の燐酸塩で緩衝化した生理的食塩水（ＰＢＳ）＋２％ＦＢＳを用いて希釈し、その後、穏やかに混合する。この希釈された試料を、密度媒体［商標名フィコール−パック(Ficoll-Paque)］の表面に、前記の密度媒体と試料との混合を最小限にしながら、層状に塗布する。チューブを室温で１７５０ｒｐｍにて２０分間、ブレーキをかけることなく遠心分離する。富まされた細胞は、血漿界面に集められ、そして除去される。
【００８３】
撹拌された懸濁培養の開始
１００ｍＬの撹拌された懸濁スピネルフラスコ［アメリカ合衆国、ニュージャージー州、バインランドのベルコ(Bellco)社製、カタログナンバー：1965-0010 ］を使用した。このフラスコを、使用前に、付着性細胞の付着を防ぐため、シリコン化［樹脂：シグマ(Sigma) 社製］した。懸濁培養液を、ＬＴＣ媒体中の約５×１０5 ないし１×１０6 細胞／ｍＬを用いて、種々の可溶性因子、例えば、２ｎｇ／ｍＬの高度に精製された組み換えヒトインターロイキン３(rhIL-3)［カナダ国、Ｖａ、ステムセル・テクノロジー(StemCell Technologies;SCT) 社製］、１０ｎｇ／ｍＬの高度に精製された組み換えヒトスチール因子(rhSF)［異なる表現にて、幹細胞因子又はＳＣＦとしてもまた言及されている］［ステムセル・テクノロジー(StemCell Technologies;SCT) 社製］、或いは、３０ｎｇ／ｍＬのヒト組み換えの血小板由来の成長因子(rhPDGF)［シグマ(Sigma) 社製］を添加して又は添加することなく、開始した。培養液を、空気中にＣＯ2 ５％を含む、加湿された環境中で、４０ｒｐｍの一定撹拌で、３７℃にて維持した。５日後、１０日後及び２０日後に、前記溶媒の半分を、或いは、７日後、１４日後及び２１日後に、前記溶媒の１／３を、新鮮なＬＴＣ媒体で置換した（開始時と同様に、サイトカインを添加したか、又は添加しなかった）。細胞の計数及び機能分析は、それぞれ媒体を変えた時の細胞を使用して行った。生存能力のある細胞の数は、投入及び全てのその後の経時点にて、血球計算板を使用するトリパンブルー排除により決定した。この数を、懸濁液中の細胞増殖の程度を説明するために記録した。
撹拌された懸濁培養に対する対照として、静止細胞培養もまた、行われた。
【００８４】
静止細胞培養（撹拌された懸濁バイオリアクターの対照としてのもの）の開始
静止細胞培養（静止対照Ｉ）を、Ｔ−７５ｃｍ2 フラスコ中で、撹拌された懸濁バイオリアクター実験例に対する対照として機能させるために開始した。各フラスコに、それと対照とする撹拌された懸濁バイオリアクター培養液と同じ濃度の細胞（例えば、１×１０6 細胞／ｍＬ）を用いて培養を開始した。７日目、１４日目及び２１日目に、媒体及び、０．０１％トリプシン処理により分離された付着細胞の１／３を含む懸濁細胞の１／３を除去し、そして、可溶性因子が添加されている又は添加されていない新鮮なＬＴＣ媒体を、開始時と同じに置換した。懸濁液及び媒体交換により除去された付着細胞の双方を、フローサイトメトリーにより計数し且つ分析したが、付着細胞のみを前駆細胞分析の開始の際に使用した。残りの細胞培養液（新鮮な媒体を用いた）の２／３を、新しいＴ−７５ｃｍ2 フラスコ中に移した。
【００８５】
慣用の静止細胞培養
慣用の静止細胞培養（静止対照II）実験例を、Ｔ−７５ｃｍ2 フラスコ中で、商標名メセンカルト(MesenCult) 媒体（ＳＣＴ）に懸濁され、且つ８０％密集度にて連続的に継代された１×１０6 細胞／ｍＬを用いて開始した。媒体を、１週間に３回交換した。培養液を、空気中にＣＯ2 ５％を含む、加湿された環境中で、３７℃に維持した。細胞計数及び前駆細胞分析を、各時点における細胞を使用して行った。
【００８６】
Ａ）機能分析
ＣＦＵ−Ｆ分析
ＣＦＵ−Ｆ分析を、継続的な撹拌により懸濁状態にて保持された培養液中の髓間葉細胞先駆体の数、並びに産出ＣＦＵ−Ｆコロニー数及び細胞組成に影響を及ぼす、添加されたサイトカインの起こり得る影響を評価するために使用した。ＣＦＵ−Ｆ数を、カストロ−マラスピナ(Castro-Malaspina)他により、１９８０年に記載された方法の変法を使用して決定した。先に記載の如く同一の基本的なミネラル／ビタミン及び血清を有するけれども、本プロトコルは、以下に記載された、１０％抗生物質溶液を補足された媒体を用いた。毎週媒体を交換することにより得られた細胞懸濁液を、２％ＦＣＳ［カナダ国、ＶＡ、ステムセル・テクノロジー(StemCell Technologies) 社製］を含むイスコブの媒体(Iscove's medium) 中で２回洗浄した。遠心分離した後、適切な細胞数を、商標名メセンカルト(MesenCult) 媒体［ＳＣＴから入手可能であり、そして、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）が補足されたマッコイの５Ａ媒体(McCoy's 5A medium) （変性されている）中に胎児のウシ血清（１０％）を含む］に再懸濁した。商標名メセンカルト(MesenCult) 媒体（ＳＣＴ）に懸濁した細胞を１×１０4 細胞／ｃｍ2 にて平板培養し、その後１４日間、撹乱することなく、培養した。２週間後、媒体を除去し、そして皿を固定し、そしてα−ナフチルアセテートエステラーゼを用いて染色し、その後、ヘマトキシン溶液［シグマ(Sigma) 社製］を用いて対比染色した。繊維芽細胞状の形態を持つ細胞５０個より多くを含む付着性コロニーを、１０倍として計数した。
【００８７】
骨小結節分析（ＣＦＵ−Ｏ）
毎週の媒体交換にて得られた細胞懸濁液を、バイオリアクターから誘導された細胞の無機物化された小結節領域を形成する能力を決定するため及びコロニー形成性ユニット［骨形成性（ＣＦＵ−Ｏ）前駆細胞］の数を計算するため、骨小結節分析に付した。洗浄段階及び遠心分離段階の後、ペレットを、α−ミニマル(minimal) 基本媒体、胎児ウシ血清１５容量％、抗生物質溶液１０容量％及びデキサメタゾン１容量％（１０-8Ｍ）及びＬ−アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を含む骨形成性に再懸濁し、そして、１×１０4 細胞／ｃｍ2 の細胞植え付け密度にて、組織培養ポリスチレン皿上で平板培養した。位相差顕微鏡を使用して、一旦、細胞形状における形態的に同定可能変化が観察された後、濃度３．５ｍＭのβ−グリコホスフェートを培養液に添加した。停止まで毎週、フラスコに新鮮な媒体を再供給した。無機物化された小結節領域が観察されるときまで、培養液を維持し、その後、培養液を固定し、そして分析のために準備した。
【００８８】
Ｂ）データ分析
テトラサイクリン染色
テトラサイクリン（９μｇ／ｍＬ）を、停止前に培養液に添加した。停止時に、細胞をカルノボスキーの媒染剤(Karnovosky's fixative) 中に一晩固定し、その後、小結節領域の無機物成分のテトラサイクリン標識化について、紫外線で励起された蛍光画像により観察した。
【００８９】
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
骨小結節培養液の代表的な試料を、先ずそれらを７０％、８０％、９０％及び９５％エタノール中に１時間放置し、その後、１００％エタノール中に３時間浸漬することにより、ＳＥＭのために調製した。その後、それらを、臨界点乾燥した。約３ｎｍ層の金層を、ポラロン SC515 SEM  コーティングシステム(Polaron SC515 SEM Coating System)を用いて、試験片上にスパッターによりコートし、その後、これを、加速電圧１５ｋＶで、日立Ｓ−２０００走査電子顕微鏡中で、種々の倍率にて検査した。得られた画像を、形態的に同定可能な骨マトリックスの存在を証明するために使用した。
【００９０】
フローサイトメトリー分析及び表現型の発現
種々のマーカーの細胞表面発現を、図６中に記載した時点で、細胞懸濁液について分析した。分析されたマーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＳＨ２、ＳＨ４及びＳＴＲＯ−１を包含していた。分析のため、１×１０5 細胞／ｍＬの単一細胞懸濁液を調製し、そして飽和濃度の下記の結合したモノクローナル抗体：ＣＤ３４−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）、ＣＤ４５−ＰＥ（フィコエリトリン）、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＳＨ２−ＦＩＴＣ及びＳＨ４−ＦＩＴＣ、を単独又は２色実験例にて、４℃又は氷上で用いて、培養した。生存可能性染色液(viability stain) ７ＡＡＤの添加の前に、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳを用いて、細胞懸濁液を２回洗浄した。
【００９１】
ＳＴＲＯ−１抗体染色のための手法は、細胞懸濁液（１×１０5 細胞）を、４℃又は氷上で３０分間、飽和濃度のマウスＩｇＭモノクローナル抗体ＳＴＲＯ−１  ２００μｌに再懸濁することを含む。この段階は、１％ヒト、ヤギ及びマウス血清を用いて１０分間、細胞懸濁液をブロックすることに先行した。次いでこの細胞を、ＰＥに結合したラット抗マウスＩｇＭモノクローナル抗体［カナダ国のＢＤバイオサイエンシーズ(BD Biosciences)社製］３μｌ／１０5 細胞又は１００μｌを添加する前に、２％ＦＢＳを含むＰＢＳを用いて２回洗浄した。細胞懸濁液を、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳを用いて２回洗浄し、その後、７ＡＡＤを最終懸濁物に添加した。ベクトン・デッキンソン・イムノサイトメトリー・システム(Becton Dickinson Immunocytmetry System)を使用する細胞分析を用いた。適切な対照は、陽性及び陰性クワドランツ(positive and negative quadrants) を確立するための適合するアイソトープ抗体、並びに補正のための単色染色を含んでいた。各試料において、少なくとも１００００個のリストモード部分が集められた。
【００９２】
本発明の態様を、下記の特定の例にて記載する。これら実施例は例示であり、そして如何なる意味においても、本発明の範囲を限定することを意図していないと理解される。
【００９３】
実施例１−全細胞及びコロニー形成性ユニット（ＣＦＵ）増殖
撹拌された懸濁バイオリアクターを、２０日間、商標名［ミエロカルト媒体(MyeloCult medium)  中に懸濁された８．５×１０6 細胞を用いて始動した。各バイオリアクターは、サイトカインなし、ＳＣＦ＋ＩＬ３、ＳＣＦ＋ＰＤＧＦ又はＰＤＧＦを含む異なる処理を受けた。５日目、１０日目、１５日目及び２０日目に、半分の媒体を除去し、そして、適切なサイトカイン補足を含む新鮮な媒体で置換した。細胞を計数し、そして１×１０4 細胞／ｃｍ2 の植え付け密度でＣＦＵ−Ｆ中で平版培養し、そして骨小結節分析した。図１Ａは、撹拌された懸濁バイオリアクター中に維持されたヒト骨髄由来の細胞からの投入数に関する、全細胞数の経時的な変化を説明する図的表現である。図１Ｂは、各処理群に維持された細胞から生じたコロニー形成性ユニット（ＣＦＵ）の増殖プロフィルを示す。増殖した細胞群から生じたコロニーは、投入細胞群から生じたコロニーの数について正常化されていた。これらの結果から、サイトカインなし及びＳＣＦ＋ＩＬ３の処理群は、全細胞数の網状増殖(net expansion) を支持し、そして同じ群は、１５日目において、ＣＦＵ−Ｆ数の５〜１０倍の膨張を示すことは明らかである。
【００９４】
同様に、図１Ｃは、前駆細胞集団の培養における、そして重要なことには、繊維芽細胞及び骨細胞コロニーに分化する間葉前駆細胞の産生における、静止対照培養に対する撹拌された懸濁バイオリアクターの利点を示す。  図１Ｄは、培養された前駆細胞から分化された細胞の形態を示す。
【００９５】
同様に、図８は、週間隔で測定した種々のサイトカインの組み合わせの、増殖に対する効果を示す。３週間の培養により、特定の処理群はより大きな全細胞増殖を得、他方、他のものは、投入細胞数を維持することにさえ失敗したことが判る（図８Ａ）。３週間の培養後に、５倍よりも大きい細胞増殖を持つ群は、すなわち、ＳＣＦ＋ＩＬ３及びＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦであった。骨髄由来の細胞を培養するために撹拌された懸濁バイオリアクターを使用することの長所を評価するため、２種の異なる静止対照実験：静止対照Ｉ（図８Ｃ）及び静止対照II（図８Ｄ）を、撹拌された懸濁バイオリアクターと平行して行った。双方の種類の静止培養物構成において達成された全細胞成長は、懸濁培養を通して達成された成長に比較して非常に小さいことが判る（図８Ｃと図８Ｄ：図８Ａとは尺度が異なることに注目）。
【００９６】
図９は、骨マトリックス及び神経芽細胞状の細胞のコロニーを形成するための、本発明のバイオリアクターにて成長した細胞の機能を試験した結果を示す。神経芽細胞状の細胞のコロニーは、ＣＦＵ−Ｆ分析の際に接種された、バイオリアクターから誘導された細胞から計数し、そしてＣＦＵ−Ｆ数に関する増加倍率を、投入に対して計算した（図９Ａ）。骨小結節培養物のテトラサイクリン標識化を、骨の新規に形成された生物学的無機物層を標識するために及び検討した期間にわたるＣＦＵ−Ｏ増殖の程度を決定するためのＣＦＵ−Ｏ細胞を計数する方法として使用した。図９Ｃは、投入に対する、計算されたＣＦＵ−Ｏ数の増殖倍率の図的表現を示す。ＳＣＦ＋ＩＬ３及びＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦ補足は、より大きなＣＦＵ−Ｏ増殖を支持したが、ここで、ＣＦＵ−Ｏ増殖における最大８±１．５倍の増加が、ＳＣＦ＋ＩＬ３処理群において、３週間目に達成された。図９Ｂ及び図９Ｄは、静止対照Ｉ  ＣＦＵ−Ｆ及びＣＦＵ−Ｏ増殖結果である。懸濁培養を通して、より大きな程度のこれら前駆細胞培養の増殖が達成されたことが判る。ＰＤＧＦ処理された培養物のＣＦＵ−Ｆ分析の際に生じた細胞の光学顕微鏡写真は、形態に基づいて、細胞は神経系のものである可能性を示唆した。この仮説を検討するため、ＰＤＧＦを補足されたバイオリアクターから成長した細胞を用いて開始された２週令のＣＦＵ−Ｆ培養物を、神経特異性マーカー、ＮｅｕＮ、神経結合プロテイン6 と共に培養した。ＮｅｕＮは、細胞体の核領域に局在化することが、この領域の染色強度に見られる如く判った。１週目、２週目及び３週目に、バイオリアクターから除去した懸濁培養細胞を用いて開始されたＣＦＵ−Ｆ分析に存在するＮｅｕＮ陽性細胞は、懸濁培養の時間と共に明らかに増加した（図９Ｅ）。
【００９７】
実施例２−ＣＦＵ−Ｆコロニー及びＣＦＵ−Ｏコロニーの光学顕微鏡写真
図２Ａ−２Ｄは、５日目にバイオリアクターから単離された懸濁細胞のＣＦＵ−Ｆ培養物を撮影した光学顕微鏡写真である。１４日目に、α−ナフチルアセテートエステラーゼを用いて染色し、その後、ヘマトキシリン溶液を用いて対比染色した。図２Ｅ−２Ｈは、２０日目に懸濁バイオリアクターから除去された細胞のＣＦＵ−Ｆ分析結果である。５日目の懸濁細胞及び２０日目の懸濁細胞からのコロニーからなる細胞におけるＳＣＦ＋ＰＤＧＦ処理を用いた群が残りの処理群と著しく異なる細胞組成及び形態を有することにそして類似性に注目すべきである。
【００９８】
ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦ処理された培養物のＣＦＵ−Ｆ分析から得られた光学顕微鏡写真は、特定の細胞が神経細胞に類似する形態的特徴に基づき神経系のものであることを示した（例えば、図１ＤのパネルＤ参照）。ａ−ツブリン(a-tubulin) 及びＮｅｕＮに対して免疫標識化した場合、細胞体に由来する神経突起の副産物であると思われるものにおいて、ツブリン発現の程度が観察され、他方、ＮｅｕＮ陽性染色は、細胞体の核領域に局在化していた。同様の細胞が、２週目及び３週目にバイオリアクターから除去した細胞からのＣＦＵ−Ｆ培養物中に観察された。
【００９９】
実施例３−ＣＦＵ−Ｏ培養物のテトラサイクリン標識化
培養物のテトラサイクリン標識化を、骨の生物学的無機物相に関連して新たに形成されたリン酸カルシウムの標識化のために使用した。培養物のテトラサイクリン標識化は、無機物化された小結節領域と一致し、これは、培養物を紫外線に暴露することにより視認化される。図３Ａ−３Ｄは、種々のサイトカイン条件に維持された５日目及び１０日目の懸濁細胞のテトラサイクリン標識化した骨小結節培養物を表わす。これらの画像は、紫外線励起による蛍光画像化により得られた。ＣＦＵ−Ｏコロニーを前記方法により計数した。図４Ｆは、図３Ａ−３Ｄに記載された処理条件での期間にわたる、ＣＦＵ−Ｏコロニーの増殖を説明している。見られるように、サイトカインなし及びＳＣＦ＋ＩＬ３処理群は、定量化可能なレベルの増殖を示し、他方、ＳＣＦ＋ＰＤＧＦ及びＰＤＧＦ処理群は、如何なる骨コロニーも生成しなかった。図４Ａ及び図４Ｂは、サイトカインなし及びＳＣＦ＋ＩＬ３群に関連した、発展している小結節領域の暗視野の顕微鏡写真を示す。図４Ｃ及び図４Ｄは、ＳＣＦ＋ＰＤＧＦ処理から取り出された細胞に関連した小結節領域を示さない［このような結果は、ＰＤＧＦ処理に対してもまた観察された（データは示さず）］。無機物化された領域に関連したテトラサイクリンシグナルを、定量化し、そして、図４Ｅに示されるように、投入ＣＦＵ−Ｏシグナルに対して標準化した。見られるように、ＳＣＦ＋ＰＤＧＦ及びＰＤＧＦ群はテトラサイクリンシグナルを示すが、しかし、このシグナルは、異栄養性無機物化(dystrophic mineralization) として記載し得る、培養皿の全体にわたる無機物の堆積に関連している。同様の実験を、サイトカインなし、ＳＣＦ＋ＩＬ３、ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦ懸濁バイオリアクターについて行い、これにより、細胞は代わりに１週目、２週目及び３週目に除去した。ＳＣＦ＋ＩＬ３条件及びＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦ条件（図４Ｆ）は、対照（図４Ｇ）と比較したとき、３週目にて、より多いテトラサイクリンシグナルを示したことが判る。
【０１００】
実施例４−ＣＦＵ−Ｏ培養物のＳＥＭ画像及びＴＥＭ画像
図５Ａ−図５Ｄは、検討された種々の処理群中で成長された５日目懸濁細胞の骨小結節培養液から得たＳＥＭ画像である。図５Ａ及び図５Ｂは、横たわる下層を被覆するセメント線マトリックス(cement line matrix)を示す。このマトリックスは、骨形成性細胞を分化することにより敷設された最初のマトリックスである（図５Ｅ）。図５Ｃ及び図５Ｄに、小結節領域を含む、無機物化されたコラーゲンを示す。透過電子顕微鏡（図５Ｆ）は、培養皿に貼着しているマトリックスが、セメント線マトリックス(cement line matrix)を形成する球形の付着を含むことを確認した。３週間懸濁培養した後、バイオリアクターから誘導した細胞は、図５Ｇ（サイトカインなし）及び図５Ｈ（ＳＣＦ＋ＩＬ３条件）に見られるように、セメント線マトリックスを形成する能力を維持し、そしてコラーゲンを無機物化した。
【０１０１】
抗コラーゲンＩ型蛍光染色もまた、骨形成性条件にて、バイオリアクターから誘導した細胞に対して行った。骨小結節培養を、サイトカインなし又はＳＣＦ＋ＩＬ３及びＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦを補足されたバイオリアクターから成長した細胞を用いて開始した。５週間後、骨小結節培養を停止し、そして、第一抗マウスコラーゲンＩ型抗体を用いて染色し、その後、アレックス・フロア(Alex Flour)４８８ヤギ抗マウス抗体を用いて第二染色した。光学顕微鏡中でのビビッドグリーンにより確認した結果、ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦを補足されたバイオリアクターから除去された細胞（Ｃ，Ｅ）はそれぞれ、コラーゲンＩ型物質を産生していた。
【０１０２】
ＰＤＧＦ処理された培養物のＣＦＵ−Ｆ分析の際に生じた細胞の光学顕微鏡写真は、形態に基づいて、該細胞が神経系のものである可能性を示唆した。その後、ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦの存在下で成長した細胞においてＣＦＵ−Ｆ分析を開始し、そして２週間目に、培養物をＰＢＳ中で洗浄し、その後、２．５％パラホルムアルデヒド中に固定した。この細胞を、０．１％トリトン−Ｘ１００溶液を用いて浸透し、その後、ＮｅｕＮ［マウス抗ＮｅｕＮモノクローナルＩｇＧ1 ＭｏＡｂ，１：５００希釈；カナダ国、テメクラのケミコン(Chemicon)社製］の添加の前に、非特異性ヤギ血清（ＰＢＳ中、２％）を用いてブロックした。アレクサ・フルア(Alexa Fluor) ５９４に結合したヤギ抗マウスＩｇＧ  ＭｏＡｂ［１：２００希釈、ＯＲ、オイゲンのモレキュラー・プルーブズ(Molecular Probes)社製］を用いて、抗体を検出した。陽性発現しているＮｅｕＮ細胞を定量するため、１０個のランダムフィールドを、倒立顕微鏡［オリンパス(Olympus) ＣＫ４０；カナダ国、オンタリオ州のカーソン・グループ・インコーポレイテッド(Carson Group Inc.) 製］を使用して、２０倍にて画像化し、そして平均計数を、得られたフィールド領域の表面領域について標準化した。陰性対照［第二抗体のみを用いて培養された培養物］を、ＮｅｕＮ染色を確認するため、平行して操作した。ＮｅｕＮは、細胞体の核領域において、この領域が強く赤色に染色されることにより見出されるように、局在化していることが判った。
【０１０３】
サイトカインなし、ＳＣＦ＋ＩＬ３及びＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦからの、バイオリアクターから誘導された７日目の細胞を、筋芽細胞の成長及び分化を支持する、媒体中に放置した。細胞内筋肉プロテイン、デスミンの存在を、筋芽細胞のコロニーを同定するために使用した。抗マウス・デスミン・モノクローナル抗体を用いて培養物を培養し、その後、アレクサ・フルア(Alexa Fluor) ４８８ヤギ抗マウス抗体を用いて染色した。その結果、互いに接近して並ぶ細長い細胞の細胞体全体にわたり、強い緑色の染色が見られた。
【０１０４】
実施例５−表現型の発現
図６及び図７は、培養期間の全体にわたり、投入細胞群から生じた細胞の特異的集団の型及び分布を示している。記載の如く、造血ＣＤ４５細胞の分布の移動が、この種の細胞の徐々の減少として、期間の全体にわたり、生じている（図７）。前駆細胞集団がＳＨ４陰性表現型を有することが注目される。ＳＨ４マーカーは、間葉幹細胞を定義付けるものとされ、本前駆細胞集団がこの細胞種において均質でないことを示唆している。
【０１０５】
また図６に記載の如く、ＨＬＡマーカーのためにドットプロットが用意された。これらの表面マーカーを持つ細胞は、移植組織の拒絶反応に関係する。これらのマーカーを発現する細胞に関する懸濁培養の影響は、図６Ｃに詳しく記載されている。明らかに、図６Ｂの投入集団は、集団の１７％を示す“二重陰性”表現型含む、不均質なＨＬＡ細胞集団を示す。
【０１０６】
ＳＣＦ＋ＩＬ３の存在下又は非存在下での２１日間の培養の後に、二重陰性細胞のフラクション中における増加があることは明らかである（図６ＣのパネルＤ及びパネルＧ）。更に、ＳＣＦ及びＩＬ３の存在下で成長したプロットＥ及びプロットＦから、プロットＤ中に観察された二重陰性集団のフラクションが、ＣＤ４５発現細胞であることが決定された。外生的に添加されたサイトカインの非存在下において、二重陰性集団のより大きなフラクションが、懸濁培養２１日後に、培養体中に存在した。
【０１０７】
図６が、に懸濁培養により増殖した細胞が、内皮細胞に関連するマーカー、ＣＤ５０を発現しているものを含むことにもまた、注目すべきである。
【０１０８】
従って、本発明の態様に基づいて、非静止懸濁培養は、ＨＬＡ二重陰性表現型である前駆細胞の増殖のための実行可能な方法であることが判る。このような細胞は、移植を受ける者により“自己”として認識された系統に、これからまたわたらなければならないが、外生異質遺伝的組織の、生体外で又は生体内での操作に非常に有用であろう。
【０１０９】
本明細書中に記載された結果は、間葉前駆細胞を包含し、そして特に骨芽細胞及び含脂肪細胞の前駆細胞を包含する髓実質組織の非造血前駆細胞は、それらのＣＦＵ−Ｆ及びＣＦＵ−Ｏを形成する能力により決定されるように、長期間、撹拌された懸濁リアクター中に維持された培養環境中に存在し且つ生存して残ることを説明している。増殖のための強力な有糸分裂促進剤であるサイトカイン及びサイトカインの組み合わせを含む、主要な因子に関して設定された実験例は、サイトカイン添加は、産生コロニー数並びにユニットを形成するコロニーを含む細胞に影響を及ぼし得ることを説明している。加えて、サイトカイン補足は、適切な骨形成性培養環境に置かれたとき、生体外にて骨マトリックスを形成するために懸濁にて維持された細胞の潜在能力に影響を示す。
【０１１０】
懸濁にて維持された前駆細胞は多型潜在性であり、すなわち、それらは、骨、軟骨細胞、含脂肪細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、神経細胞、骨髄、筋芽細胞及びヒト軟骨組織を包含する、他の分化された表現型を形成することができる。一旦、ヒト前駆細胞が繁殖したとき、増殖した細胞集団の幾分か又は全部は、望まれる細胞又は組織種への分化が望まれている部位に移送するための適するビヒクルと共に製剤化することができる。例えば、及び直前に記載の如く、前記細胞は、分析のために又は移植のための小さな規模にて、ヒト組織若しくは細胞の成長のために、適する規模にされた組織形成性環境内に導入することができる。増殖バイオプロセスにて培養される投入集団は、髓実質組織又は類似する源から採取された前駆細胞の投入集団であってよいか、或いは、前記投入集団は、１種又はそれより多くの造血細胞表現型が除去されている、富まされた、その小集団であってよい。本発明はそれ自体、人間に限定されず、そして、ヒト以外の用途において、間葉及び他の髓実質性前駆細胞を産生するために使用し得ると理解すべきである。
【０１１１】
本発明の好ましい態様の先の記載は、本発明の原理を説明するために与えられたのであり、そして説明された特別な態様に本発明を限定するものではない。本発明の範囲は、本書に添付された本請求項の範囲内に示されている全ての態様及びその均等物により定義されていると信じる。
【０１１２】
参考文献
ブルーダー  エスピー(Bruder SP) 、ジャイスワル  エヌ(Jaisawal N)、ハイネスワース  エスイー(Haynesworth SE)、「広範な継代培養及びその後のサイロプリザベーションの間の精製されたヒト間葉前駆幹細胞の成長動力学、自己再生及び骨形成性能力(Growth kinetics,self-renewal,and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive Subcultivation and cyropreservation) 」、J Gellular Biochemistry,1997:64:278-294 。
【０１１３】
キャプラン  エイアイ(Caplan AI) 、ブルーダー  エスピー(Bruder SP) 、「骨再生の細胞及び分子工学。組織工学の原理について。(Cell and molecular engineering of bone regeneration. In Principles of Tissue Engineering.」、ランザ  アール(Lanza R) 、ランガー  ティー(Langer T)、シック  ダブリュ(Chick W) 編集、アール．ジー．ランズ(R.G.Landes)社、1977,603-617.
【０１１４】
カストロ−マラスピナ  エイチ(Castro-Malaspina H)、ゲイ  アールイー(Gay RE)、レスニック  ジー(Resnick G) 、カッパー  エヌ(Kappor N)、マイヤーズ  ピー(Meyers P)、シアリー  ディー(Chiariere D) 、マッケンジー  エス(McKenzie S)、ブロキシマイヤー  エイチイー(Broxmeyer HE)、モーア  エムエイエス(Moore MAS) 、「ヒト骨髄繊維芽細胞コロニー形成性細胞（ＣＦＵ−Ｆ）及びその子孫の特徴付け(Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells(CFU-F) and their progeny 」、Blood,1980;56(2):289301.
【０１１５】
コルター  ディーシー(Colter DC) 、クラス  アール(Class R) 、ディジロラモ  シーエム(DiGirolamo DJ) 、プロッコプ  ディージェイ(Prockop DJ)、「ヒト骨髄からの可塑性−付着細胞の培養液中の再生幹細胞の急速増殖(Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow)」、PANS 2000;97(7):3213-3218.
【０１１６】
デービス  ジェイエイー(Davies JE) 、チャーネッキー  アール(Chernecky R) 、ローウェンバーグ  ビー(Lowenberg B) 、シガ  エイ(Shiga A) 、「ラット髓細胞による生体内の自石灰化したマトリックスの堆積及び再吸収(Deposition and resorption of calcified matrix in vitro by rat marrow cells 」、Cell Master 1991;1:3-15.
【０１１７】
デービス  ジェイエイー(Davies JE) 、「骨／移植界面の生体外モデリングについて(In vitro modeling of the bone/implant inte4rface)」、Anat Rec 1996;245:426-445.
【０１１８】
フリーデンシュタイン  エイジェイ(Friedenstein AJ) 、ラトジンキク  エヌダブリュ(Latzinkik NV)、ゴースカヤ  ワイエフ(Gorskaya YF) 、ユリー  イーエイ(Lurie EA)、モスクヴィナ  アイエル(Moskvina IL) 、「骨髄間質性コロニー形成は造血細胞による刺激を必要とする(Bone marrow stromal colony formation requires stimulation by hematopoietic cells)」、Bone and Mineral 1992;18:199-213.
【０１１９】
グロントス  エス(Gronthos S)、グラヴェス  エスイー(Graves SE) 、オータ  エス(Ohta S)、シモンス  ピージェイ(Simmons PJ)、「成人のヒト骨髄のＳＴＲＯ−１フラクションは骨形成性先駆体を含む(The STRO-1 fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors) 」、Blood,1994;84(12):4164-4173.
【０１２０】
ヒュー  ダブリュ(Hu W)、「小さい微小球を用いて細胞を凝集する方法(Method of aggregation cells ith amall microspheres)」、１９９２年５月１９日発行のアメリカ合衆国特許第５１１４８５５号明細書。
【０１２１】
ジャックス  ジェイ(Jacques J) 、「細胞の生体外増殖及び維持のための方法(Method for the in vitro propagation and maintenance of cells)」、１９７６年１２月１４日発行のアメリカ合衆国特許第1973000376038 号明細書。
【０１２２】
ジャヴィス  エイピー(Javis AP)及びリム  エフ(Lim F) 、「足場依存性細胞の増殖方法(Method of culturing anchorage dependent cells) 」、１９８５年１月２２日発行のアメリカ合衆国特許第４４９５２８８号明細書。
【０１２３】
オグシ  エイチ(Ohgushi H) 、キャプラン  エイ(Caplan A)、「幹細胞技術及びバイオセラミックス：細胞から遺伝子工学まで(Stem cell technology and bioceramics:From cell to gene engineering 」、J Biomed Mater Res(Appl Biomater)1999;48:913-927.
【０１２４】
パーカー  イー(Parker E)、シガ  エイ(Shiga A) 及びデービス  ジェイイー(Davies JE) 、「生体外でのヒトの骨の成長。“骨工学”の第６章(Growing human bone in vitro. Chapter 6 in：“Bone Engineering”」、ジェイイー  デービス(JE Davies) 編集、EM squared In.,Toronto,2000.
【０１２５】
ノートン  ジーケイ(Naughton GK) 及びノートン  ビーエイ(Naughton BK) 、「三次元細胞及び組織培養系(Three-dimensional cell and tissue culture system)」、１９９０年１０月１６日発行のアメリカ合衆国特許第４９６３４８９号明細書。
【０１２６】
シモンス  ピージェイ(Simmons PJ)、「トロック−ストーブＢ。健常なヒトの成人骨髄中での間質性先駆体によるＣＤ３４発現(Torok-Storb B. CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow)」、Blood 1991;78(11):2848-2853.
【０１２７】
ザンドストラ  ピーダブリュ(Zandstra PW) 、アーヴェス  シージェイ(Eaves CJ)、ピレット  ジェイエム(Piret JM)、「健常なヒトの骨髄細胞の、撹拌された懸濁バイオリアクター中での造血前駆細胞集団の増殖(Expansion of hematopoietic progenitor cell population in stirred suspension bioreactors of normal human bone marrow cells) 」、Bio/technology 1994;12:909-914.
【０１２８】
ザンドストラ  ピーダブリュ(Zandstra PW) 、「幹細胞に基づく技術の開発に含まれた挑戦：造血、骨形成及びその彼方に。“骨工学”の第８章(Challenges Involved in the Development of Stem Cell-Based Technologies:Hematopoiesis,Osteogenesis and Beyond. Chapter 8 in:“Bone Engineering”」、ジェイイー  デービス(JE Davies) 編集、EM squared In.,Toronto,2000.
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａは、撹拌された懸濁バイオリアクター中に維持された、密度勾配分離されたヒト骨髄由来の細胞からの投入数に関する、全細胞数の経時的な変化を説明する図である。  図１Ｂは、ＣＦＵ−Ｆ分析における平板培養において各々の処理群に維持された細胞から生じたコロニー形成性ユニット（ＣＦＵ）の増殖様式を示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、撹拌された懸濁バイオリアクター中で成長された細胞（パネルＡ〜Ｃ）及び静止対照培養にて成長された細胞（パネルＤ〜Ｆ）から計算された全細胞増殖（パネルＡ，Ｄ）、ＣＦＵ−Ｆ増殖（パネルＢ，Ｅ）及びＣＦＵ−Ｏ増殖（パネルＣ，Ｆ）を示す図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、所定のサイトカインカクテルの存在下で成長された、実質性前駆細胞集団から誘発された種々の種類の分化された細胞を示す図である。
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａ−２Ｄは、異なるサイトカインの組み合わせを用いて、５日目にバイオリアクターから単離された懸濁細胞のＣＦＵ−Ｆ培養液を撮影した光学顕微鏡写真を示す図である。
【図２Ｅ−２Ｈ】図２Ｅ−２Ｈは、異なるサイトカインの組み合わせを用いて、２０日目に懸濁バイオリアクターから除去された細胞のＣＦＵ−Ｆ分析結果を示す図である。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄは、種々のサイトカインの存在下にて維持された５日目及び１０日目の懸濁細胞の、テトラサイクリンで標識された骨形成性培養液を表わす図である。  図３Ｆは、図３Ａ−図３Ｄで与えられた条件下にて、前記期間にわたり骨小結節コロニーとして検出されたＣＦＵ−Ｏ前駆細胞の増殖を説明している図である。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、懸濁培養７日後に、サイトカインなし及びＳＣＦ＋ＩＬ３バイオリアクター処理群から誘導される細胞から生じた、発展している小結節領域（３週間目）の暗視野の顕微鏡写真を示す図である。  図４Ｃ及び図４Ｄは、ＳＣＦ＋ＰＤＧＦ処理から取り出された細胞に関連した小結節領域を示さない図である。  図４Ｅは、５日目及び１０日目に培養懸濁液から除去された細胞を用いて開始された骨小結節培養液の入力シグナルについて定量化及び標準化された図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ及び図３Ｄの無機物化された領域に関連した、テトラサイクリンのシグナルを示す図である。  図４Ｆ及び図４Ｇもまた、バイオリアクター実験例及び静止対照（Ｉ型）実験例の双方から誘導される細胞を用いて開始された各々の骨小結節培養液からのテトラサイクリンのシグナルを示す図である。
【図５】図５Ａ−図５Ｄは、検討された種々の処理群中で成長された５日目懸濁細胞の骨小結節培養液から誘導される走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）の画像を示す図である。  図５Ｅは、セメント線マトリックスを形成する球形の付着を隠している、分化している骨形成性細胞を示す図である。  図５Ｆは、培養皿に貼着しているマトリックスが、セメント線マトリックス(cement line matrix)を形成する球形の付着を含むことを示す透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）の画像を示す図である。  図５Ｇ及び図５Ｈは、３週間後にバイオリアクターから除去された細胞を用いて初期化された培養液から誘導される画像を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、ＣＤ３４及びＣＤ４５表現型並びに、サイトカインの存在又は不存在下での培養時間の進行を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは特に、細胞表面マーカーに対する種々の抗体と共に培養された、商標名フィコール−パック骨髄から誘導されるドットプロットを示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−ＤＰ，ＨＬＡ−ＤＱ，ＨＬＡ−ＤＲの各マーカー（これらは、ＭＨＣ分類Ｉ及びＭＨＣ分類IIの各々に対応する）の発現に対するフローサイトメトリックプロットを示す図である。
【図７】図７は、１週間目、２週間目及び３週間目にバイオリアクター中に存在する細胞の血球計算のフローにより決定された、計算されたＣＤ４５- 及びＣＤ４５+ 細胞増殖を示す図である。
【図８】図８は、撹拌された懸濁バイオリアクター中での全細胞増殖を、カイトカイン補足の関数として示す図である。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれ、懸濁バイオリアクター処理群から誘導される細胞及び、０．１％トリプシン処理により静止対照（Ｉ型）から除去された付着性細胞からの投入に対するＣＦＵ−Ｆ数における増加倍率を示す図である。  図９Ａ及び図９Ｂは、それぞれ、懸濁バイオリアクター処理群から誘導される細胞及び、０．１％トリプシン処理により静止対照（Ｉ型）から除去された付着性細胞からの投入に対するＣＦＵ−Ｆ数における増加倍率を示す図である。  図９Ｃは、バイオリアクター培養液から誘導される細胞を表わす図である。  図９Ｄは、静止対照（Ｉ型）実験例の付着性フラクションから除去された細胞を表わす図である。  図９Ｅは、１週間目、２週間目及び３週間目にて、ＳＣＦ＋ＩＬ３＋ＰＤＧＦが補足されたバイオリアクターから除去された細胞を用いて開始された２週令ＣＦＵ−Ｆ培養液のＮｅｕＮ発現細胞に関する陽性発現を示す図である。
【図１０】図１０Ａは、ＳＣＦ＋ＩＬ３の存在下及び非存在下での、撹拌された懸濁バイオリアクター中の、商標名ロゼットセプ(RosetteSep)から誘導されるヒト骨髄から誘導される細胞の成長を示す図である。  図１０Ｂは、７日目にＳＣＦ＋ＩＬ３バイオリアクター処理群から誘導される細胞を用いて初期化された、テトラサイクリン培養された骨小結節分析（５週間）を示す図である。  図１０Ｃは、無機物化された小結節領域を示す、暗視野の顕微鏡写真（倍率５０倍）を示す図である。
【図１Ａ−１Ｂ】
2004531256.tif 000005
【図１Ｃ】
2004531256.tif 000006
【図１Ｄ】
2004531256.tif 000007
【図２Ａ−２Ｄ】
2004531256.tif 000008
【図２Ｅ−２Ｈ】
2004531256.tif 000009
【図３】
2004531256.tif 000010
【図４】
2004531256.tif 000011
【図５】
2004531256.tif 000012
【図６Ａ】
2004531256.tif 000013
【図６Ｂ】
2004531256.tif 000014
【図６Ｃ】
2004531256.tif 000015
【図７】
2004531256.tif 000016
【図８】
2004531256.tif 000017
【図９】
2004531256.tif 000018
【図１０】
2004531256.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2004531256.tif 000020
2004531256.tif 000021
2004531256.tif 000022
2004531256.tif 000023
2004531256.tif 000024
2004531256.tif 000025
2004531256.tif 000026
2004531256.tif 000027
2004531256.tif 000028
2004531256.tif 000029
2004531256.tif 000030
2004531256.tif 000031
2004531256.tif 000032
2004531256.tif 000033
2004531256.tif 000034
2004531256.tif 000035
2004531256.tif 000036
2004531256.tif 000037
2004531256.tif 000038
2004531256.tif 000039
2004531256.tif 000040
2004531256.tif 000041
2004531256.tif 000042
2004531256.tif 000043
2004531256.tif 000044
2004531256.tif 000045
2004531256.tif 000046
2004531256.tif 000047
2004531256.tif 000048
2004531256.tif 000049
2004531256.tif 000050
2004531256.tif 000051
2004531256.tif 000052
2004531256.tif 000053
2004531256.tif 000054
2004531256.tif 000055
2004531256.tif 000056
2004531256.tif 000057
2004531256.tif 000058
2004531256.tif 000059
2004531256.tif 000060
2004531256.tif 000061
2004531256.tif 000062
2004531256.tif 000063
2004531256.tif 000064
【国際調査報告】
2004531256.tif 000065
2004531256.tif 000066
2004531256.tif 000067
2004531256.tif 000068