(57)【要約】本発明は、プローブ・アレイを利用して一定の分子ターゲットを定性的および／または定量的に検出する方法に関する。本発明の検出方法は、特定の溶解度積を有する生成物をもたらす反応を含む。溶解度積は、プローブとターゲットとの相互作用が起こったプローブ・アレイのアレイ要素上に、生成物の沈殿または沈殿物形成を引き起こす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）所定の部位に固定されたプローブを有するプローブ・アレイの作成；
ｂ）プローブ・アレイ上に配置されたプローブとターゲットとの相互作用；
ｃ）相互作用が起こったアレイ要素における沈殿形成をもたらす反応の遂行；
ｄ）アレイ要素上における沈殿形成の時間経過の信号強度としての検出；
ｅ）沈殿形成を時間の関数として描く曲線関数に基づく、実質的信号強度の決定
から成る、プローブ・アレイ上でのプローブとターゲットとの分子相互作用による試料中のターゲットの定性的および／または定量的検出方法。
【請求項２】
沈殿形成を時間の関数として描く回帰線の傾きに依存してアレイ要素の実質的信号強度を決定することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アレイ要素上における沈殿形成の時間経過が指数関数的増加を示す領域において回帰線を決定することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
所定の時点で検出された信号強度、好ましくは最後の測定での信号強度に、そのアレイ要素について決定された回帰線の傾きとその所定時点までの測定時間を乗じることにより、アレイ要素の実質的信号強度を決定することを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
プローブ・アレイ中の少なくとも１つのプローブと相互作用する基準ターゲットが試料中に既知濃度で存在することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
アレイ要素上の沈殿形成を検出する信号強度を少なくとも１分ごと、好ましくは３０秒ごと、より好ましくは１０秒ごとに記録することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
アレイ要素上の沈殿形成をもたらす反応が、ターゲットに結合する触媒の存在下に可溶性基質を不溶性生成物に転換するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
触媒が酵素であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
可溶性基質が、３，３’−ジアミノベンジジン、４−クロロ−１−ナフトール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ｐ−フェニレンジアミン−ＨＣｌ／ピロカテコール、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ナフトール／ピロニン、ブロムクロルインドイルホスフェート、ニトロテトラゾリウムブルーおよびフェナジンメトスルフェートからなる群より選択されることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
アレイ要素上の沈殿形成をもたらす反応が、可溶性基質を金属析出物に転換するものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
アレイ要素上の沈殿形成をもたらす反応が、銀化合物、好ましくは硝酸銀、乳酸銀、酢酸銀または酒石酸銀、を銀に転換する化学的な還元反応であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
還元剤が、ホルムアルデヒドおよびヒドロキノンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
可溶性基質の金属析出物への転換が、ターゲットに結合した金属クラスタまたはコロイド状金属粒子の存在下に起こることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
可溶性基質の金属析出物への転換が、金クラスタまたはコロイド状金粒子の存在下に起こることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
可溶性基質の金属析出物への転換が、ターゲットに結合したポリアニオンの存在下に起こることを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
触媒もしくはコロイド状金属粒子またはポリアニオンが、プローブとの相互作用の前、その間、または前後にターゲットに結合することを特徴とする請求項７〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
酵素、金クラスタ、コロイド状金属粒子またはポリアニオンが、直接またはターゲットに結合するアンカー分子を介してターゲットに結合することを特徴とする請求項７〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
アンカー分子が、ストレプトアビジンまたは抗体からなる群より選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アレイ要素上に沈殿形成をもたらす反応が、ターゲットと結合するアンカー分子に対する特異的結合パートナーの結合であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
結合パートナー−アンカー分子対が、ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジンもしくは抗ビオチン抗体、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン免疫グロブリン、ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ免疫グロブリンおよびＤＮＰ／抗ＤＮＰ免疫グロブリンからなる群より選択されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ターゲットが直接に標識を施されることを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ターゲットの標識化を、ターゲットと標識された化合物の両方と相互作用するプローブを用いたサンドウィッチ反応またはサンドウィッチ・ハイブリダイゼーションによって行うことを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ターゲットの標識化を、ホモポリマーヌクレオチド配列をターゲットに付加して連続配列を形成した後、このホモポリマーヌクレオチド配列と相補的な標識オリゴヌクレオチドとのサンドウィッチ・ハイブリダイゼーションによって行うことを特徴とする請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ターゲットとプローブとの相互作用が、２つのヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ターゲットとプローブとの相互作用が、抗原構造と対応する抗体またはその超可変領域との相互作用であることを特徴とする請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ターゲットとプローブとの相互作用が、受容体と対応するリガンド間の反応であることを特徴とする請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
アレイ要素上の沈殿の存在の検出を、光ビーム、好ましくはレーザ・ビームまたは発光ダイオードの反射、吸収または散乱により行うことを特徴とする請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
アレイ要素上の沈殿の存在の検出を電気的に行うことを特徴とする請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
電気的検出を導電率、容量または電位の測定によって行うことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
アレイ要素上の沈殿の存在をオートラジオグラフィ、フルオログラフィおよび／または間接的オートラジオグラフィにより検出することを特徴とする請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
アレイ要素上の沈殿の存在を、走査型電子顕微鏡法、電子プローブ・マイクロアナリシス（ＥＰＭＡ）、磁気光学カー（Ｋｅｒｒ）顕微鏡法、磁気力顕微鏡法（ＭＦＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、蜃気楼効果測定法、走査型トンネル顕微鏡法（ＳＴＭ）および／または超音波反射断層撮影法により検出することを特徴とする請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
・アレイ要素上での沈殿形成の時間経過をカメラでの写真撮影によって検出するステップ、
・画像に含まれるアナログ情報をディジタル形式に変換するステップ、
・各アレイ要素について、沈殿形成を時間の関数として描く曲線関数に基づいて実質的信号強度を計算するステップ、および
・実質的信号強度を変換して、すべてのアレイ要素の実質的信号強度を表わす人工的な画像とするステップ
から成る請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ａ）プローブ・アレイを備えたアレイ基板、
ｂ）反応チャンバ、
ｃ）ターゲットとプローブとの間の相互作用が起こったアレイ要素上での沈殿形成を検出する装置、および
ｄ）以下のようにプログラムされたコンピュータ
・検出装置によって記録された信号強度を集める
・連続的に記録された信号強度を処理し、アレイ要素上の沈殿形成の時間経過の決定、および沈殿形成を時間の関数として描く曲線関数に基づく実質的信号強度決定を保証する
・必要であれば、実質的な信号強度のアナログ写真への変換を保証する
から成る請求項１〜３３に記載の方法を実行するための装置。
【請求項３５】
検出装置がカメラであることを特徴とする請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
カメラがＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラであることを特徴とする請求項３５に記載の装置。
【請求項３７】
装置が光源を含むことを特徴とする請求項３４〜３６のいずれかに記載の装置。
【請求項３８】
光源がレーザ、発光ダイオード（ＬＥＤ）および高圧ランプからなる群より選択されることを特徴とする請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
高度に統合された自律的装置であることを特徴とする請求項２４〜３８のいずれかに記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、プローブ・アレイを利用して所定の分子ターゲットを定性的および／または定量的に検出するための装置および方法に関する。
【０００２】
生物医学的試験は、多くの場合、特定の位置に存在する既知量の分子（分子プローブ）と検出対象である分子（分子ターゲット）との分子相互作用の検出に基づいている。現行の試験は、通常、１つの試料についていくつかのプローブを併用して行われる（Ｄ．Ｊ．ロッカート（Ｄ．Ｊ．Ｌｏｃｋｈａｒｔ）、Ｅ．Ａ．ウィンツラー（Ｅ．Ａ．Ｗｉｎｚｅｌｅｒ）；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ａｒｒａｙｓ；Ｎａｔｕｒｅ（２０００）、第４０５巻、８２７〜８３６頁）。従来技術では、この際に、ＷＯ００／１２５７５に記載されているように、プローブが所定の方法で適当な基質上に固定されるか（例えば、米国特許第５，４１２，０８７号、ＷＯ９８／３６８２７参照）、合成によって作成される（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、米国特許第５，６５８，７３４号、ＷＯ９０／０３３８２参照）。
【０００３】
この種の相互作用は、通常、以下のようにして検出される。所定の基質に１または複数のプローブを所定の方法で付着させる。ターゲット溶液をプローブと接触させ、所定の条件下でインキュベートする。インキュベートした結果、プローブとターゲットとの間で特異的相互作用が発展する。この結果生じた結合は、プローブに対して特異的ではない分子との結合に比べ、明らかに安定性が強い。次いで、この系を適当な溶媒で洗い、特異的に結合していない分子を除去する。
【０００４】
現在、ターゲットとプローブとの間の相互作用を検出するために多くの方法が用いられている。これらの方法のうちいくつかについて以下に述べる。
Ｅ．リデル（Ｅ．Ｌｉｄｅｌｌ）およびＩ．ウィークス（Ｉ．Ｗｅｅｋｓ）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９５）は、ターゲットを染料または蛍光染料で標識し、これをそれぞれ光度計または蛍光光度計を用いて検出する。
【０００５】
また、Ｆ．ロッツペイヒ（Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ）、Ｈ．ゾルバス（Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ）、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ　Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９８）は、予め蛍光マーカで標識したターゲットの蛍光を光学的に検出することについて記載している。
【０００６】
Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）、第１６巻、７２５〜７２７頁には、ターゲット−プローブ共役体の質量分光分析による検出が記載されている。表面プラズマ共鳴などの質量感受的方法も用いられる（Ｊ．Ｍ．ブロックマン（Ｊ．Ｍ．Ｂｒｏｃｋｍａｎ）ら、Ａ　ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｔｏ　ｃｒｅａｔｅ　ＤＮＡ　ａｒｒａｙｓ　ｏｎ　ｇｏｌｄ　ｓｕｒｆａｃｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｉｍａｇｉｎｇ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）、第１２１巻、８０４４〜８０５１頁）。米国特許第５，６０５，６６２号は、相互作用の直接的な電気的検出方法を開示している。ドイツ特許公報１９５４３２３２号には、検出用ビーズを用いてターゲットを標識することが記載されている。この方法では、ターゲットとプローブとの間で相互作用させた後、その存在を光学的に検出する。
【０００７】
欧州特許公報００６３８１０号は、抗原または免疫グロブリンの形式のターゲットを多孔質固体基質に固定する方法を開示している。次いで、慣用の免疫学的手法、特にＥＬＩＳＡ法により、その同定と定量が検討される。
【０００８】
プローブ・アレイを用いて分子相互作用を検出する様々な手法が記載されている。古典的なシステムは、ターゲット分子を蛍光発色団で標識し、次いで、特定の波長でターゲット分子を選択的に励起し、その蛍光強度を比較することに基づくものである。光学的な構成や成分の異なる様々な技術的解決策がこのために実現可能である。こうしたアプローチの問題点や限界は、信号ノイズ（バックグラウンド）に起因する。これは、おおまかに言えば、用いる染料の増白や消光、媒体、アセンブリ要素および光学部品の自己蛍光、ならびに光学システム内での散乱、反射光や外部光などの効果によって生ずるものである。
【０００９】
この結果、プローブ・アレイの定性的および定量的比較のための高感度蛍光検出器のアセンブリでは技術的要求が高度のものとなる。また、中間体のスクリーニングや高スループットを実現するためには、ある程度の自動化が要求されるため、特別なシステムが必要である。
【００１０】
標準的なπ蛍光アセンブリを最適化するものとして、ＣＣＤ型検出器が知られている。これは、入射光および透過光による暗視野での蛍光発色団の励起を、散乱や反射などの光学的影響から識別することができる（例えば、Ｃ．Ｅ．フーパー（Ｃ．Ｅ．Ｈｏｏｐｅｒ）ら、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｐｈｏｔｏｎ　Ｉｍａｇｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｄ　ＣＣＤ　Ｃａｍｅｒａｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（１９９０）、３３７〜３４４頁参照）。次いで高解像度光学システムを用いて、照明またはスクリーニング下に検定結果のマッピングを行う。多重スペクトル光源を使用すれば、励起フィルタを種々組み合わせて用いることにより、様々な蛍光発色団が比較的簡単に利用できるようになる。しかし、自己蛍光や照明の不均一などの全体的な光学的影響のため、複雑な照明光学システムやフィルタシステムが必要となるという問題点がある。
【００１１】
例えば、米国特許第５，３０４，８１０号に記載された共焦点走査システムは、２つのピンホールを用いて光軸上で蛍光信号を選別することに基づくものである。この場合、試料の調整が困難になるか強力な自動焦点システムが必要となる。こうしたシステムの技術的解決策は非常に複雑である。レーザやピンホール、あるいは冷却した検出器（例えば、ＰＭＴ、アヴァランシュ・ダイオード、ＣＣＤ）などの必要な部品を、複雑で高度に正確な機械的伝導要素や光学システムと組み合わせて最適な状態に組み立てなければならず、大変な努力が必要となる（例えば、米国特許第５，４５９，３２５号；米国特許第５，１９２，９８０号；米国特許第５，８３４，７５８号参照）。部品点数が多さやその機能から、小型化や価格の程度には限界がある。
【００１２】
現状では、プローブ・アレイによる分析は、通常、蛍光の光学的測定による（Ａ．マーシャル（Ａ．Ｍａｒｓｈａｌｌ）およびＪ．ホジソン（Ｊ．Ｈｏｄｇｓｏｎ）、ＤＮＡ　Ｃｈｉｐｓ：Ａｎ　ａｒｒａｙ　ｏｆ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１６巻（１９９８）、２７〜３１頁；Ｇ．ラムジー（Ｇ．Ｒａｍｓａｙ）、ＤＮＡ　Ｃｈｉｐｓ：Ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒｔ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８年１月１６日）、４０〜４４頁参照）。信号バックグラウンドの高さがこの方法の欠点であり、正確さにも限界がある。技術的要求が高い場合が多く、検出方法のコストが高くつくこともさらなる欠点である。
【００１３】
したがって、プローブとターゲットとの相互作用を、定性的および／または定量的に、かつ低い技術的コストで、極めて正確に測定し得る高度に組み立てられたアレイが必要である。
【００１４】
選択性が増し代替部品の利用が可能となれば、従来に代わる画像化技術、例えば、蛍光偏光法や固相結合検定のための時間分解蛍光法を確立するための動機付けともなる。しかし、こうした解決策は、特に高度に組み立てられた分析に対しては、現状ではアイデア段階である。偏光により励起された蛍光発色団による偏光軸回転効果はマイクロタイター形式での定量に用いられている。また、高スループットなシステム（ＨＴＳ−ｓｙｓｔｅｍｅ）を適当に修飾された高分子フィルムを偏光フィルタとして用いることにより、廉価に組み立てる試みもなされている（Ｉ．グリスジンスキー（Ｉ．Ｇｒｙｃｚｃｙｎｓｋｉ）ら、「Ｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｖｉｓｕａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）、第７１巻、１２４１〜１２５１頁参照）。しかし、利用可能な光強度と検出器の点で、マイクロアッセイへの適用は困難である。このタイプのシステムでは、光源（例えば、レーザ、ＬＥＤ、高圧ランプ）、偏光フィルタ（おそらくはコーティングした高分子フィルム）および検出器（ＣＣＤ、ＣＭＯＳ−カメラ）を統合する必要があり、解決策は目下わかっていない。
【００１５】
最近の展開としては、ランタニド（Ｍ．クウィアトウスキー（Ｍ．Ｋｗｉａｔｏｗｓｋｉ）ら、Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｃｈｅｌａｔｅ−Ｉａｂｅｌｌｅｄ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｒｉｐｌｅ−ｃｏｌｏｕｒ　ｌｉｇａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）、第２２巻、１３頁）や量子ドット（Ｍ．Ｐ．ブルチェス（Ｍ．Ｐ．Ｂｒｕｃｈｅｚ）ら、Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ　ａｓ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｅｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）、第２８１巻、２０１３頁）などの無機材料の蛍光を用いるものがある。蛍光の持続時間がナノ秒域の特異的蛍光を利用して選択的定量を行うことも考えられており、部位レベルでの解像度を有する特異性が実現できるが、非常にコストが高く、商業レベルでは用いられていない。ゲル化ランタニドなどの、発光持続時間がマイクロ秒域の染料は、染料を可動相に転換する必要があり、部位特異的な検出ができない。
【００１６】
微粒子はブラウン管での使用でなじみ深いものであり（Ｆ．ファン・デ・ライケ（Ｆ．ｖａｎ　ｄｅ　Ｒｉｊｋｅ）ら、Ｕｐ−Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ＥＣ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｎ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０００、イタリア、バーリにて開催）参照）、生物学的マーカとしての使用は、検出技術において、感度および小型化の点、特に励起光源がデータ伝送に使用されるものである（９８０ｎｍレーザ・ダイオード）ことから、大きな潜在的可能性を有している。しかし、こうした技術は、アレイでターゲット／プローブ相互作用を検出するためのものとしては商業的に利用可能なものではない。検出器は、発光用部品（例えば、レーザ、ＬＥＤ、高圧ランプ）、励起および検出光の変調システム（例えば、チョッパ・ブレード、電子シャッタ）ならびに時間遅延信号の検出システム（例えば、ＣＣＤ−、ＣＭＯＳ−カメラ）を含むであろう。しかし、粒子と生体試料との間の適合性が低いと考えられる点に基本的問題がある。
【００１７】
プローブ・アレイを使用する場合に対し、ターゲットを固定したアレイを使用した場合は、既知の複数のプローブを１バッチで組合せ可能とするために、調べようとする物質を付けたアレイを分析を行う度に製造しなければならないという根本的問題がある。それゆえ、頻繁にアレイを作成する必要があるため、これを診断用途には用いるには大きな限界がある。そうした物質は生体起源であるため、バッチごとに差ができるのは避けられない。多孔質基質を用いた場合は、塗布する液体が横方向に広がり得るため、製造されるアレイで実現できる最大解像度に限界がある。現状の定着技術では、多孔質材料上の個々の要素を２００μｍより小さくすることはほとんど不可能である。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、上記の従来技術の問題点、特に検出システムの複雑な構造、高い信号バックグラウンド、特に信号の増白や検定対象物と試験システムとの整合性が適切でないことによる問題点を解消することを目的とする。
【００１９】
特に、本発明の目的は、プローブ・アレイ上のプローブ−ターゲット間の分子相互作用を高精度で、簡単かつ廉価に定性的および／または定量的に検出可能とする方法および装置を提供することにある。
【００２０】
さらに本発明の目的は、プローブ−ターゲット間の弱い相互作用を強い信号強度で信頼性をもって検出し得るように、検出についての高い動的分解能を実現することにある。
【００２１】
本発明のこうした目的あるいは他の目的は、請求の範囲に記載された特徴を有する実施形態により達成される。
驚くべきことに、プローブ分子（以下、プローブという）とターゲット分子（以下、ターゲットという）との分子相互作用が、プローブ・アレイ上で、単純かつ廉価な方法によって高精度に検出し得ることが見出された。本発明の方法による検出は、所与の溶解度を有する生成物をもたらす反応を用いて、プローブ−ターゲット間相互作用が起こったプローブ・アレイのアレイ要素上に生成物を沈殿させることにより行われる。
【００２２】
好ましくは、結合したターゲットには、プローブ−ターゲット間相互作用が起こるアレイ要素上への低溶解度沈殿物を形成する可溶性基質の反応を触媒するか、可溶性基質を転換してプローブ−ターゲット間相互作用が起こるアレイ要素上の低溶解度沈殿物とする結晶核として機能する標識を施す。
【００２３】
このようにして、非多孔質担体上のプローブ・アレイを用いることにより、多くのプローブ−ターゲット間相互作用の定性的および定量的分析を同時に行うことができる。この際、プローブサイズは１０００μｍ以下、好ましくは１００μｍ以下、特に好ましくは５０μｍ以下を達成することができる。
【００２４】
酵素標識の使用が、免疫細胞化学および免疫学的マイクロタイター・プレートを用いた試験（Ｅ．リデル（Ｅ．Ｌｉｄｅｌｌ）およびＩ．ウィークス（Ｉ．Ｗｅｅｋｓ）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９５）参照）で知られている。例えば、酵素は、基質を、通常、着色物質である低溶解度生成物への転換を触媒することができる。アレイでの分子相互作用を検出する別の方法としては、金属標識を用いる方法があり得る。その場合、コロイド状の金または所定の金クラスタを、任意選択でストレプトアビジンなどの中間分子を介して、ターゲットに結合する。次いで、銀などのより活性な金属を用いた後続する反応により、生成物を増強する。
【００２５】
本発明の方法に従い、沈殿の検出を行うことにより、プローブ・アレイに結合したターゲットの濃度を相対的に定量する。その方法は、ターゲットに結合した標識の濃度を検出することから成り、ここで標識は、プローブ−ターゲット間相互作用が起こるアレイ要素上への低溶解度沈殿物を形成する可溶性基質の反応を触媒するか、この種の反応の結晶核として機能する。例えば、ナノ金粒子で標識したＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドの場合、結合ターゲットと金粒子との比は１：１である。本発明の他の実施形態では、この比は１を超える値でもよいし小数でもよい。
【００２６】
ターゲットと結合したマーカまたは標識の濃度（ｃ（Ｌ））はアレイ要素上の沈殿の濃度（ｃ（Ｐ））と以下の関係にある：
ｃ（Ｌ）＝［Ｆ＊ｃ（Ｐ）］／ｔ
式中、Ｆは沈殿形成反応の時間経過を特徴付ける曲線の関数であり、ｔは時間である。
【００２７】
Ｆは反応の時間経過から測定できる。時間経過が線形的（Ｆが定数）な場合、形成される沈殿と結合した標識の濃度との関係は一義的な対応関係にあり、この場合、ｃ（Ｐ）／ｔはｃ（Ｌ）、したがって標識されたターゲットの濃度の測定に対応する。したがって、沈殿形成反応の時間経過が既知の場合にのみ、対応するアレイ要素に結合したターゲットの濃度を一義的に相対的に決めることができる。
【００２８】
従来法では、ターゲットがアレイ上に配置されたプローブと相互作用した後でかつ相互作用が起こるアレイ要素上の沈殿形成に至る反応の開始後、一定時間経過した時点で、写真撮影するか画像を取り、測定されたグレー値（沈殿の形成程度に依存して決まる）に濃度を割り当てる。しかし、この方法は各アレイ要素について非常に狭い濃度範囲でしか満足の行く結果を与えず、したがって、反応の特異性を評価するには問題がある。その理由は沈殿形成が著しく非線形だからである。すなわち、沈殿形成は時間経過に従って指数関数的に増加し、その後、飽和して水平な不変状態（プラトー）に達する。この指数関数的な増加部分ついてのみ、グレー値と結合ターゲット量とは対応関係にある。アレイ要素の飽和−不変状態化は、関係するプローブ−ターゲット相互作用に依存しており、したがって、アレイ要素ごとに飽和に達する時間は異なっている。これは沈殿反応終了後の定量を妨げる。アレイを構成するどの要素も確実に水平の不変域に至らないように実験パラメータを決定することは不可能である。反応速度は、温度、光、塩濃度、ｐＨその他の要因に強く依存しているからである。
【００２９】
したがって、１枚の写真を撮っただけでは、すべてのアレイ要素で、沈殿が、沈殿形成の対時間依存性が指数関数領域にあるという保障はない。このため、既に沈殿形成反応が水平の飽和域に達しているアレイ要素からの信号と、沈殿形成反応が未だ指数関数領域にあるアレイからの信号とでは、グレー値などの信号強度間の比較を行っても結果は歪んだものになる。
【００３０】
上記の問題を解消すべく、本発明は以下のステップを含む、プローブ・アレイ上でのプローブとターゲットとの分子相互作用による試料中のターゲットの定性的および／または定量的検出方法を提供する。
ａ）所定の部位に固定されたプローブを有するプローブ・アレイの作成；
ｂ）プローブ・アレイ上に配置されたプローブとターゲットとの相互作用；
ｃ）相互作用が起こったアレイ要素での沈殿形成反応の遂行；
ｄ）アレイ要素上における沈殿形成の時間経過の信号強度としての検出；
ｅ）沈殿形成を時間の関数として描く曲線関数に基づく、アレイ要素の実質的信号強度の決定。
【００３１】
本発明を説明するために以下の定義を用いる。
本発明に関連して、分子プローブとは、ある特徴的な結合性または所定の反応性に基づいて他の分子を検出するために使用される分子を意味する。
本発明に関連して、プローブ・アレイとは、各プローブの位置が個別に定められている複数の分子プローブを表面上に配置したアレイを意味する。
【００３２】
本発明に関連して、アレイ要素とは、分子プローブを定着させるための表面上の所定領域を意味する。すべての占有アレイ要素の合計がプローブ・アレイである。
【００３３】
本発明に関連して、マイクロタイター・プレートとは、所定グリッド上に配置された反応容器アレイを意味し、これは、様々な生物学的、化学的、診断化学的試験の自動化を可能にする。
【００３４】
本発明に関連して、ターゲットとは分子プローブとによって検出される分子を意味する。
本発明に関連して、ＨＴＳ（英語：ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）とは、活性物質を高スループットでシステマティックに探索することを意味する。
【００３５】
本発明に関連して、基質とは、適当な反応媒体に溶解し、触媒、結晶核および還元剤の作用の結果として局所的に析出する分子または複数の分子の組合せを意味する。
【００３６】
本発明に関連して、担体とは、その上にプローブ・アレイが構築される固体を意味する。
本発明に関連して、標識とは、ターゲットと結合し、可溶性基質の低溶解度沈殿形成反応を触媒するか、可溶性基質が低溶解度沈殿に転換する際の結晶核として機能する基を意味する。
【００３７】
本発明に関連して、実質的信号強度とは、アレイ要素上でのプローブとターゲットとの間の相互作用、したがって、結合したターゲットの定量値を意味し、それは沈殿形成を時間の関数として描く曲線関数に基づいて決定される。
【００３８】
本発明の方法の本質的特徴は、沈殿形成の時間経過によってアレイ要素の実質的信号強度を決定することにある。本発明によれば、時間の関数としてのアレイ要素上の沈殿形成は、好ましくは曲線関数として記述され、これに基づいて実質的な信号強度が決定される。沈殿形成の時間経過を考慮しているため、この実質的な信号強度は、結合ターゲット量を正しく示す尺度である。
【００３９】
特に、本発明によれば、沈殿形成の時間経過の一部または全体は、回帰線として記述してもよい。この実施形態では、実質的な信号強度は回帰線の傾きに依存して描かれる。この傾きは、結合したターゲットの濃度の直接の尺度であり、すなわち、回帰線の傾きが大きければ大きい程、より多くのターゲットが結合している。すべてのアレイ要素を同一条件下に監視すれば、各アレイ要素における沈殿形成の時間的増加は濃度の特性値となり、本実験の場合、支配的条件に対して正規化されている。このため、結合したターゲットの相対量が確実に正確に決定される。
【００４０】
本発明の特に好ましい実施形態では、沈殿形成の時間経過が指数関数的増加領域にある回帰線は、１つのアレイ要素に対して決定される。
本発明の１つの実施形態では、回帰線は、沈殿形成を時間の関数として描くことができる曲線関数の変曲点を通って引かれる接線に対応する。曲線関数の変曲点は曲線関数の一次導関数の最大値から決定される。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、回帰線は、沈殿形成を時間の関数として描くことができる曲線関数の頂点を線でつなぐことにより決定される。曲線関数の頂点は、曲線関数の二次導関数の最大値から決定される。
【００４２】
沈殿形成の時間経過によって各アレイ要素に対する実質的な信号強度を決定し、その後、これらの実質的な信号強度をアナログ・イメージに変換することにより、測定のダイナミック・レンジを拡大することができる。つまり、検出可能な範囲が広がる。測定のダイナミック・レンジを拡大できるのは、もはや検出システムの色深度が決定的な要素ではなく、プローブ・アレイの各要素の表面に析出した沈殿の時間経過によるからである。沈殿反応の増加量を評価することにより、グレー値分布の実質的信号強度を決定することが可能になり、したがってダイナミック・レンジが広がるのである。
【００４３】
本発明の方法はさらに、簡単な構成で廉価な検出システムが使用できるという利点を有する。例えば、グレー値深度を測定するのに、わずか８ビット、すなわち２５６グレー値のカメラを用いることができる。これで、計算および実質的なマッピング後、２４ビット（１６７７７２１６グレー値）または４８ビット（３３５５４４３２グレー値）の実焦点深度が得られる。このため、プローブ・アレイ上でのターゲットとプローブの相互作用が弱いものと強いものを同時に検出する可能性を明瞭に高めることができる。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、調べようとする試料中に既知濃度の基準ターゲットを含有させる。基準ターゲットはプローブ・アレイの少なくとも１つのプローブと相互作用をする。この基準ターゲットとプローブとの相互作用は沈殿形成の時間的増加量に依存して測定され、他のターゲットの濃度を（プローブとターゲットとの相互作用によって生じるその実質的信号強度の基準ターゲット濃度との相対値に従って）定量するための基準として機能する。
【００４５】
調べるターゲットはどのような種類のものでもよいが、好ましくは、生体試料である。ターゲットは好ましくは分離、精製し、複製および／または増幅した後、本発明の方法に従って検出および定量する。
【００４６】
本発明に関連して、プローブ・アレイとは、プローブを所定部位に固定したものであり、従来法に従って製造される。本発明によれば、プローブ・アレイはプローブ・アレイをその表面に形成し得る担体を含む。この種類の担体は、ガラス、フィラー、電子デバイス、高分子、金属材料などおよびこれらの組合せの群から選択される材料で形成し得る。アレイは、画定部位、いわゆるアレイ要素を含むのが好ましく、アレイ要素は、各アレイ要素が１種類のプローブのみを含む特定のパターンで形成されていることが特に好ましい。
【００４７】
本発明のさらに別の実施形態では、アレイ要素中で沈殿の時間経過を検出するのに用いられる信号強度は、毎分、好ましくは３０秒ごと、より好ましくは１０秒ごとに記録する。沈殿形成の時間依存が一義的に測定可能であり、例えば、指数領域にある回帰線の傾きが、結合したターゲットの濃度の尺度として導出できるならば、信号記録のためには他の時間間隔を取ってもよい。
【００４８】
アレイ要素の実質的信号強度は、例えば、ある時点で検出された信号強度、好ましくは最後の測定での信号強度に、そのアレイ要素についての回帰線の傾きとその時点までの測定継続時間を乗じることにより決定される。この実施形態では明らかに、信号強度の検出時点がすべてのアレイ要素で等しいという相対的定量化が必要である。
【００４９】
本発明に従って沈殿の検出により、プローブ・アレイ上における結合したターゲットの濃度を相対的に定量するためのさらなる条件は、プローブ−ターゲット間相互作用が起こったアレイ要素上への低溶解度沈殿物を形成する可溶性基質の反応を触媒するか、この種の反応の結晶核として機能する標識をターゲットに施すことである。
【００５０】
本発明の１つの実施形態では、ターゲットにはこの種の標識を直接に施すことができる。
あるいは、ターゲットの直接的標識ではなく、ターゲットと標識された化合物の両方と相互作用するプローブを用いたサンドウィッチ・ハイブリダイゼーションまたはサンドウィッチ反応を行ってもよい。この種の反応の例としては、以下のものがある。
【００５１】
・ターゲット配列に相補的な配列と標識したオリゴヌクレオチドとのサンドウィッチ・ハイブリダイゼーション。
・ターゲット配列と鎖状にハイブリダイズする標識したオリゴヌクレオチドのサンドウィッチ・ハイブリダイゼーション（本発明に関連して、ターゲット配列と鎖状にハイブリダイズするとは、その少なくとも一部にターゲット配列と他のオリゴヌクレオチドとの両方に相補性を示す標識した一群のオリゴヌクレオチドが存在することである。他のオリゴヌクレオチドは自己相補的であるか互いに相補的であり、これにより、ハイブリダイゼーションの際にターゲット配列と結合した標識されたオリゴヌクレオチド鎖が生成する）。
【００５２】
・例えば、ＷＯ９９／１０３６２に記載されているような、ターゲット配列と相補的でありデンドリマーなどの多重標識構造と結合するオリゴヌクレオチドとのサンドウィッチ・ハイブリダイゼーション。
【００５３】
ターゲットの標識との結合の可能性としてさらに好ましいものは、ホモポリマー領域、例えばポリＡ配列を、合成によりまたは酵素作用によりターゲットに導入することであり、これにより、米国特許第６，１０３，４７４号に記載されているような連続配列を形成する。この実施形態では、標識化は好ましくは、上述の様々な変法で、ホモポリマー配列と相補的な標識されたオリゴヌクレオチドとのサンドウィッチ・ハイブリダイゼーションによって実行される。
【００５４】
本発明の他の好ましい実施形態では、ターゲットに付加されたホモポリマー配列部分を増幅する際に、標識された塩基を同時に取り込ませることにより信号増幅が行われる。特に好ましい実施形態は環状の１本鎖テンプレート（これはホモポリマー配列との相補性を示す）を用いたＲＣＡ機構を使用することである。
【００５５】
次に示す表１は、ターゲットとプローブとの相互作用が起こったアレイ要素上での沈殿形成に適する可能性として考えられる一連の反応をまとめたものである（但し、これはそうした反応の完全なリストとして示すものではない）。
【００５６】
【表１】
2004501667.tif 000002
生体試料を酵素や金、特にナノ結晶金で標識することについては、文献に十分に記載されている（例えば、Ｆ．ロッツペイヒ（Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ）およびＨ．ゾルバス（Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ）、Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ　Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９８）；Ｅ．リデル（Ｅ．Ｌｉｄｅｌｌ）およびＩ．ウィークス（Ｉ．Ｗｅｅｋｓ）、Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９５）参照）。
【００５７】
本発明による方法で利用できる不溶性沈殿による他のプローブ−ターゲットの相互作用の検出法としては、以下に記載のものが挙げられる。Ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ−Ｓｉｌｖｅｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｄｓ：Ｍ．Ａ．ヘイヤット（Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ）、１９９５、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ；Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ　１９９１　Ｆｅｂ−Ａｐｒ；１８（１−２）：３３−５５　ＨＬＡ−ＤＲ，ＤＱ　ａｎｄ　ＤＰ　ｔｙｐｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｐｒｏｂｅｓ．エーリッヒ　Ｈ（Ｅｒｌｉｃｈ　Ｈ）、ブガワン　Ｔ（Ｂｕｇａｗａｎ　Ｔ）、ベゴヴィッチ　ＡＢ（Ｂｅｇｏｖｉｃｈ　ＡＢ）、シャーフ　Ｓ（Ｓｃｈａｒｆ　Ｓ）、グリフィス　Ｒ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ　Ｒ）、サイキ　Ｒ（Ｓａｉｋｉ　Ｒ）、ヒグチ　Ｒ（Ｈｉｇｕｃｈｉ　Ｒ）、ウォルシュ　ＰＳ．（Ｗａｌｓｈ　ＰＳ．）Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　９４６０８；Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　１９９３　Ｊｕｎ；７（３）：１９９−２０７　Ａ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｄｏｔ−ｂｌｏｔ　ａｎｄ　ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ．Ｂｓａｔ　Ｎ，Ｂａｔｔ　ＣＡ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃｏｍｅｌｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ　１４８５３．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　１９９０；３２（４）：２３１−４１　Ｅｒｒａｔｕｍ　ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　１９９１；３４（６）：４１３　Ｒａｐｉｄ　ＨＬＡ−ＤＰＢ　ｔｙｐｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｏｂｅｓ．ブガワン　ＴＬ（Ｂｕｇａｗａｎ　ＴＬ）、ベゴヴィッチ　ＡＢ（Ｂｅｇｏｖｉｃｈ　ＡＢ）、エーリッヒ　ＨＡ．（Ｅｒｌｉｃｈ　ＨＡ．）Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ　９４６０８．Ｈｕｍ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１９９２　Ｄｅｃ；３　５（４）：２１５−２２　Ｇｅｎｅｒｉｃ　ＨＬＡ−ＤＲＢ　１　ｇｅｎｅ　ｏｌｉｇｏｔｙｐｉｎｇ　ｂｙ　ａ　ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｄｏｔ−ｂｌｏｔ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．エリアオウ　ＪＦ（Ｅｌｉａｏｕ　ＪＦ）、パーナード　Ｆ（Ｐａｌｍａｄｅ　Ｆ）、アヴィネンス　Ｏ（Ａｖｉｎｅｎｓ　Ｏ）、エドゥアール　Ｅ（Ｅｄｏｕａｒｄ　Ｅ）、バラゲール　Ｐ（Ｂａｌｌａｇｕｅｒ　Ｐ）、ニコラス　ＪＣ（Ｎｉｃｏｌａｓ　ＪＣ）、クロット　Ｊ．（Ｃｌｏｔ　Ｊ．）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｉｎｔ　Ｅｌｏｉ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＣＨＵ　Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９８４　Ｎｏｖ　３０；７４（２）：３５３−６０　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｄｏｔ　ａｎｄ　ｂｌｏｔ　ｉｍｍｕｎｅ　ｏｖｅｒｌａｙ　ａｓｓａｙｓ　ｗｉｔｈ　ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ／ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．メールマンス　Ｍ（Ｍｏｅｒｅｍａｎｓ　Ｍ）、ダネエルス　Ｇ（Ｄａｎｅｅｌｓ　Ｇ）、ヴァン・ダイク　Ａ（Ｖａｎ　Ｄｉｊｃｋ　Ａ）、ランガンジェ　Ｇ（Ｌａｎｇａｎｇｅｒ　Ｇ）、デ・メイ　Ｊ．（Ｄｅ　Ｍｅｙ　Ｊ．）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９８７；８６（６）：６０９−１５　Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ａ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｕｓｉｎｇ　ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ−ｃｏｎｔｒａｓｔ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｎ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．クレメンス　ＡＦ（Ｃｒｅｍｅｒｓ　ＡＦ）、ヤンセン・イン・デ・ヴァル　Ｎ（Ｊａｎｓｅｎ　ｉｎ　ｄｅ　Ｗａｌ　Ｎ）、ウィーガント　Ｊ（Ｗｉｅｇａｎｔ　Ｊ）、ダークス　ＲＷ（Ｄｉｒｋｓ　ＲＷ）、ヴァイスベーク　Ｐ（Ｗｅｉｓｂｅｅｋ　Ｐ）、ヴァン・デア・プレーグ　Ｍ（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｌｏｅｇ　Ｍ）、ランドジャン　ＪＥ（Ｌａｎｄｅｇｅｎｔ　ＪＥ）。
【００５８】
本発明に関連して、不溶性沈殿によるプローブ−ターゲットの相互作用の考えられる検出法の変法としては、以下のものが挙げられる。
本発明の１つの実施形態では、標識に、可溶性基質を不溶性生成物に転換する触媒、好ましくは酵素を付与する。アレイ要素上で沈殿形成をもたらす反応は、この場合、ターゲットに結合した触媒（好ましくは、酵素）存在下での可溶性基質の不溶性生成物への転換である。酵素は好ましくは、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼからなる群から選択される。可溶性基質は、好ましくは、３，３’−ジアミノベンジジン、４−クロロ−１−ナフトール、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ｐ−フェニレンジアミン−ＨＣｌ／ピロカテコール、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ナフトール／ピロニン、ブロムクロルインドイルホスフェート、ニトロテトラゾリウムブルーおよびフェナジンメトスルフェートを含む群から選択される。例えば、３，３’−ジアミノベンジジンなどの無色の可溶性水素供与体は、過酸化水素の存在下に不溶性の有色生成物に転換される。酵素ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼは、供与体の水素イオンを過酸化水素に転移させて水を形成する。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、アレイ要素上で沈殿形成をもたらす反応は、金属沈殿形成反応である。特に、アレイ要素上での沈殿形成反応は、銀化合物（好ましくは硝酸銀、乳酸銀、酢酸銀または酒石酸銀など）を銀に転換する化学的還元反応であることが好ましい。好ましい還元剤はホルムアルデヒドおよび／またはヒドロキノンである。
【００６０】
金属化合物の沈殿析出が、金属クラスタまたはコロイド状金属粒子、特に金クラスタまたはコロイド状金粒子で標識されたターゲット化合物の存在下で起こるならば特に好ましい。すなわちこの場合、金属クラスタまたはコロイド状金属粒子は、ターゲットに結合する標識である。例えば、硝酸銀は銀原子に転換されるが、この過程では、溶液からの銀イオンが結晶核である金の上に析出し、次いで、第２ステップでホルムアルデヒドなどの還元剤の作用により還元される。このようにして不溶性の銀原子が生じる。
【００６１】
別の実施形態としては、金属化合物の沈殿析出は、ターゲットに結合したポリアニオンの存在下に起こる。ターゲット自身がポリアニオンでない場合は、ポリアニオンを結晶核として用いることもあり得る。例えば、ポリアニオンで標識されたターゲットを硝酸銀溶液に曝す。すると銀カチオンはポリアニオン上に選択的に析出していく。次いで銀イオンは還元剤によって銀原子に転換される。
【００６２】
酵素、触媒、コロイド状金属粒子またはポリアニオンは、直接またはターゲットに結合するアンカー分子を介してターゲットに結合させることができる。基本的に上記標識はターゲットに直接結合させる必要はない。標識は第２ステップで、それ自体がターゲットに結合するストレプトアビジンなどのアンカー分子を用いて結合させることができる。
【００６３】
関連する触媒または結晶核とアンカー分子用の特異的結合パートナーからなる共役体を利用することによっても、上記手順の効果を実現することができる。その場合、アレイ要素上に沈殿形成をもたらす反応は、ターゲットと結合するアンカー分子に対する特異的結合パートナーの結合である。
【００６４】
結合パートナー−アンカー分子対は、好ましくは、ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジンもしくは抗ビオチン抗体、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン免疫グロブリン、ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ免疫グロブリンおよびＤＮＰ／抗ＤＮＰ免疫グロブリンからなる群から選択される。
【００６５】
上記のいずれの実施形態でも、可溶性触媒は触媒反応によって不溶な沈降生成物に転換される。この生成物は表面近くにあるため、表面に直接析出し、様々な方法で洗浄しても除去されない固相沈殿を形成する。
【００６６】
さらに本発明においては、標識、特に酵素、金属クラスタ、コロイド状金属粒子またはポリアニオンを、プローブとの相互作用の前、その間または後に、ターゲットに結合させることが可能である。
【００６７】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、ターゲットとプローブとの相互作用は、２種類のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションである。ターゲットとプローブ・アレイ中のプローブのハイブリダイゼーションは、既知の標準的プロトコルの１つに従って行う（特にロッツペイヒ（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ）およびゾルバス（Ｚｏｒｂａｓ）、１９９８参照）。得られたハイブリッドは、例えば、ソラレン挿入とこれに続く「架橋」によって共有結合で安定化するか、あるいは米国特許第４，５９９，３０３号に記載されているように、例えば、挿入剤の結合により非共有結合により安定化することができる。
【００６８】
ターゲットをプローブ・アレイ中のプローブとハイブリダイズさせた後、あるいはハイブリダイズしたターゲットを標識した後、通常は洗浄を行い、非特異的な、従ってより弱い結合成分を除去する。
【００６９】
代替として、ターゲットとプローブの相互作用は、抗原構造と対応する抗体またはその超可変領域との反応または受容体と対応するリガンドとの間の反応である。
【００７０】
特異的プローブによるターゲットの結合すなわち認識は、通常、最適条件下では自発的な非共有反応である。これには非共有化学結合を含まれる。媒体組成や他の化学的および物理的因子は結合の速度および強度に影響を与える。例えば、核酸の認識では、ストリンジェンシーが低く高温であれば、それだけ２本のストランド（これらは完全には相補的ではない）間の結合の速度および強度は低くなる。結合条件の最適化は、抗原−抗体またはリガンド−受容体の相互作用でも必要である。もっとも、通常、結合条件はそれ程特異的なものではない。
【００７１】
本発明の１つの実施形態では、アレイ要素上の沈殿の存在は、光ビーム、好ましくはレーザ・ビームまたは発光ダイオードの沈殿による反射、吸収または散乱により検出される。沈殿は顆粒状であるため光ビームは変化して反射される。沈殿はまた強い光散乱をもたらすので、これを従来の検出システムで記録することができる。沈殿が銀の沈殿のように暗色の表面として現れる場合、光吸収を検出し記録することができる。検出解像度はカメラの画素数による。
【００７２】
例えば、特異的反応によって強度の増した領域は、透過光中（影を伴うコントラスト）または入射光中（反射を伴うコントラスト）の非常に単純な光学的構造としての検出することができる。検出された陰影領域の強度は金粒子などの標識の存在度や粒子の核形成状態に正比例している。
【００７３】
電気伝導性を有する沈殿や誘電率が周囲と異なる沈殿が用いられる場合は、別の実施形態として電気的に反応を検出してもよい。
電気的測定は、微小電極アレイによる導電率測定や微小容量（キャパシティ）センサあるいは電界効果トランジスタ・アレイ（ＦＥＴアレイ）による電圧測定に基づいて行うことができる。電気伝導度が微小電極で測定される場合、沈殿後に２つの電極間の電気抵抗が変化する（Ｅ．ブラウン（Ｅ．Ｂｒａｕｎ）、Ｙ．アイヒェン（Ｙ．Ｅｉｃｈｅｎ）、Ｕ．シルヴァン（Ｕ．Ｓｉｖａｎ）、Ｇ．ベン−ヨーゼフ（Ｇ．Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｐｈ）、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、７７５頁（１９９８））。誘電率が微小容量（キャパシティ）センサで測定される場合、２つの並置した電極間の容量の変化が測定される（Ｍ．マドウ（Ｍ．Ｍａｄｏｕ）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ（１９９７））。電位がＦＥＴアレイで測定される場合、センサ表面の電位の変化が測定される（Ｍ．マドウ（Ｍ．Ｍａｄｏｕ）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ（１９９７））。
【００７４】
放射性基質または放射同位体で標識された基質が用いられる場合、アレイ要素上での沈殿の存在はオートラジオグラフィ、フルオログラフィおよび／または間接的オートラジオグラフィによって検出することができる。オートラジオグラフィでは、放射性の沈殿で覆われた表面をＸ線フィルムに接触させる。フルオログラフィでは、放射性沈殿と接触した表面にサリチル酸ナトリウムなどの蛍光化学物質（これは放射性物質の放射線エネルギーを蛍光に変換する）を重ねる。増強用スクリーンを用いた間接的オートラジオグラフィでは、β線を放射する沈殿で覆われた表面を増強スクリーン上に置く。これにより放射線は青色光に転換される（上記Ｆ．ロッツペイヒ（Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ）、Ｈ．ゾルバス（Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ）参照）。しかし、放射能に基づく検出は、健康および安全上の危険があり、このためこれらに関する規制要件を充足しなければならず、望ましくない場合が多い。
【００７５】
本発明のさらに別の実施形態では、アレイ要素上の沈殿は走査型電子顕微鏡法、電子プローブ・マイクロアナリシス（ＥＰＭＡ）、磁気光学カー（Ｋｅｒｒ）顕微鏡法、磁気力顕微鏡法（ＭＦＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、蜃気楼効果測定法、走査型トンネル顕微鏡法（ＳＴＭ）および／または超音波反射断層撮影法によって検出する。
【００７６】
ＳＥＭおよび／またはＥＰＭＡによる反応の検出は、基質の種類にはほとんど依存しない。走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）では、焦点を結んだ電子ビームが試料上を走査する（Ｊ．ゴールドスタイン（Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）ら、Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ａｎｄ　Ｘ−Ｒａｙ　Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８１）。電子プローブ・マイクロアナリシス（ＥＰＭＡ）では、焦点を結んだ電子ビームによってトリガされた２次プロセスが、部位分解分析のために用いられる（Ｊ．ゴールドスタイン（Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）ら、Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　ａｎｄ　Ｘ−Ｒａｙ　Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｉｓ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８１）。
【００７７】
磁気を有するか、磁性体粒子によって標識された基質を用いる場合は、反応を磁気光学カー顕微鏡法やＭＦＭによって検出することができる。磁気光学カー顕微鏡法では磁場による偏光面の回転（カー−ファラデー効果）を利用している（Ａ．ヒューバート（Ａ．Ｈｕｂｅｒｔ）、Ｒ．シェーファー（Ｒ．Ｓｃｈａｆｅｒ）、Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｄｏｍａｉｎｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９８）。
【００７８】
反応の結果、表面上の基質の光学密度が変化し、これは蜃気楼効果により検出することができる。蜃気楼効果では、焦点を結んだ光ビームによって表面が局所的に温められ、これが屈折率変化として測定される。表面を走査することにより、表面の局所的吸収特性イメージが得られる（Ａ．マンデリス（Ａ．Ｍａｎｄｅｌｉｓ）、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ　１、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２））。相互作用反応の検出を行うための基質から熱を利用した別の部位分解法としては、マイクロサーモフィル・アレイがあり、これは基質の結晶化または沈殿形成の際のエンタルピーを測定するものである（Ｊ．Ｍ．ケーラー（Ｊ．Ｍ．Ｋｏｈｌｅｒ）、Ｍ．ツィーレン（Ｍ．Ｚｉｅｒｅｎ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍｉｃａ　ａｃｔａ（１９９８）、第３１０巻、２５頁）。
【００７９】
ＳＴＭおよびＡＦＭも基質の反応を検出するのに適している。原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）では、マイクロチップまたはナノチップで表面を走査し、表面のトポグラフィを測定する（Ｅ．ブラウン（Ｅ．Ｂｒａｕｎ）、Ｙ．アイヒェン（Ｙ．Ｅｉｃｈｅｎ）Ｕ．シヴァン（Ｕ．Ｓｉｖａｎ）、Ｇ．ベン−ヨーゼフ（Ｇ．Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｐｈ）、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、７７５頁（１９９８））。磁気力顕微鏡法（ＭＦＭ）は、ナノチップを用いて局所的な磁気感受率の違いを検出するものである（Ａ．ヒューバート（Ａ．Ｈｕｂｅｒｔ）、Ｒ．シェーファー（Ｒ．Ｓｃｈａｆｅｒ）、Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｄｏｍａｉｎｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９８）。走査型トンネル顕微鏡法（ＳＴＭ）では、ナノチップを用いてトンネル電流を測定し、ナノ・レベルでの表面トポグラフィを決定する（Ｏ．Ｍａｒｔｉ、Ｍ．Ａｍｒｅｉｎ、ＳＴＭ　ａｎｄ　ＳＦＭ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、１９９３）。
【００８０】
より変わった方法、例えば、超音波反射断層撮影法などを用いることもできる。断層撮影法は断面に基づいて３次元画像を形成する方法である（Ｆ．Ｎａｔｔｅｒｅｒ、Ｍａｔｈｅｍａｔｉｓｃｈｅ　Ｍｅｔｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｅ、Ｗｅｓｔｄｔ．Ｖｌｇ．、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９７）。超音波反射断層撮影法は、断面画像を生成するのに超音波断層撮影法を用いるものである（Ｖ．Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ、Ｆ．Ｂｅｒｇｎｅｒ、ＤＧＺｆＰ　ＮＤＴ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　Ｄｒｅｓｄｅｎ　１９９７）。
【００８１】
本発明の具体的実施形態では、以下のステップを含む方法が利用できる。
・アレイ要素上での沈殿形成の時間経過をカメラでの写真撮影によって検出する。
・画像に含まれるアナログ情報をディジタル形式に変換する。
・各アレイ要素について、沈殿形成を時間の関数として描く曲線関数に基づいて実質的信号強度を計算する。
・実質的信号強度を変換して、すべてのアレイ要素の実質的信号強度を表わす人工的な写真とする。
【００８２】
本発明に関連して、写真とは、プローブ・アレイについて測定された信号強度を表現する一群の画素であり、例えば、直接にスクリーンに映したり記録のためにプリンタに送れたりするものを意味する。
【００８３】
本発明に関連して、人工的な写真とは、プローブ・アレイについて所定実質的信号強度をを表現する一群の画素であり、例えば、直接にスクリーンに映したり記録のためにプリンタに送れるものを意味する。
【００８４】
本発明の別の形態は、本発明に従って上記の方法を遂行するための装置に関する。これは以下のものを含む。
ａ）プローブ・アレイを備えたアレイ基板
ｂ）反応チャンバ
ｃ）ターゲットとプローブとの間の相互作用が起こったアレイ要素上での沈殿形成を検出する装置、および
ｄ）以下のようにプログラムされたコンピュータ
・検出装置によって記録された信号強度を集める。
・連続的に記録された信号を処理し、アレイ要素上の沈殿形成の時間経過の決定、および沈殿形成を時間の関数として描く曲線関数に基づく実質的信号強度決定を保証する。
・必要であれば、実質的な信号強度のアナログ写真への変換を保証する。
【００８５】
検出装置は、好ましくはカメラ、特にＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラあるいは同様のカメラであり、通常はプローブ・アレイの全領域を記録する。
既に述べたように、本発明に従って、沈殿（例えば、結晶核として機能する金粒子上への銀原子）の析出を通じた増強プロセスにおいて時間分解検出を行い、時間経過から相対的な占有率を計算することにより、たとえ８ビットの検出法を用いたとしても、測定データの動的解像度は著しく増大する。この目的のための装置構成は、反応チャンバを機械的に含むことと修正された取得ソフトウェアによって特徴付けられる。ソフトウェアは、連続的な記録を処理し得るという特徴を有する。この目的のため、プローブ・アレイの各要素について各時点でのグレー値が測定される。すべてのアレイ要素に対して、実質的な信号鏡度が沈殿形成の時間経過に依存して計算される。この値に基づいて、例えば最後の測定でのグレー値が速度と測定時間の積に関連付けられ、これにより測定範囲が拡大される。このようにして、たとえ廉価な８ビットのカメラを用いたとしても、弱いプローブ−ターゲット間相互作用と強いプローブ−ターゲット間相互作用との間での優れた解像度、および結合したターゲットの正確な定量が保証される。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明の装置は、好ましくは特にレーザ、発光ダイオード（ＬＥＤ）および高圧ランプから選択される光源を含む。
沈殿を光学的に検出する本発明装置の構成例における部品は、均一に照明するための低出力（５００ｍｃｄ）光源、例えば、ＬＥＤ、および検出器、例えば、ＣＣＤカメラを含む。基質の触媒的な析出から得られる増強効果のため、特に金／銀システムを使用した場合、システムの光学特性の変化は非常に大きく、単純なフラット・ベッド型スキャナ、円形スキャナおよび同様な装置でも沈殿を測定するのに適している。
【００８７】
典型的な検出時間は１秒以下であるが、蛍光検出用の比較的感度の良いＣＣＤシステムでは約１０秒〜８０秒であり、ビデオ規格に対応した信号転送率を有する廉価な消費者向けカメラも使用できる。
【００８８】
このシステムは小型化に大変適している。システム全体は、現場で使用可能な独立携帯装置として設計可能である。また、本発明の好ましい実施形態では、高度に統合された自律的装置として製品化できる。このため、医学的な診断、法医学、最近のスクリーニングなどに用いるマイクロアレイとして高感度な応用が可能であり、それらを、医学的または生物学的な実験施設に頼ることなく素人でも迅速に行うことができる。
【００８９】
以下、本発明の方法の利用可能な応用として、移植医療における組織分類における例について述べる。移植や自己免疫性では、免疫学的に関係のある遺伝子の構造、発現および遺伝の分析が特に関心を集めている。というのも、特異的抗原認識（組織適合性抗原、Ｔリンパ球受容体）についても、エフェクタ機構（抗体、Ｆｃ−受容体）についても非常に多型的なシステムが存在し、これらは非常に複雑な遺伝的調節機構に服しているからである。弱い移植抗原、また、強い移植抗原は特に、いずれも移植拒絶に大きな影響を及ぼす。これらの強い抗原は主要組織適合性抗原と呼ばれ、一般に遺伝子としては主要組織適合性抗原共役体（ＭＨＣ）内にコードされている。ＭＨＣはまだ脊椎で検出されたのみであり、ヒトではＨＬＡ（ヒト白血球抗原）と呼ばれている。ＨＬＡ共役体はヒトの第６染色体の短腕に位置しており（６ｐ２１．１〜６ｐ２１．３）、約３５００キロ塩基の部分を含む。ＨＬＡ分子は極めておおまかに言えば２つのクラス（クラスＩとクラスＩＩ）に分類でき、これらはさらにサブグループに分けられる。ＨＬＡ遺伝子産物は、その全体がその生物の対応する遺伝的特性の原因となっている。それらの遺伝子の位置は、非常に多数の変異対立遺伝子に受継がれており、既知となったその対立遺伝子の数は益々多くなっている。ＨＬＡシステムの対立遺伝子型分類は、生物について血清学的および分子生物学的分析で正確に行うことができる。移植すべき細胞種の医学的関連および研究で必要な詳細さに応じて、遺伝子型分類は様々に行うことができる。分類が詳細であり、これによる供与者と受容者との一致が良好であればあるほど、組織の不寛容や移植拒絶などの予測される問題は少なくなる。移植の種類が様々あることに加え、一義的な個体識別は、輸血、疾病関連、および法医学においても重要である。
【００９０】
本発明の実施形態の例には、検出限界の原理の証明および発現モニタリングの例が含まれる。しかし、用いられている固有の原則は他の応用例にも適用できる。生物の発現モニタリングなどの定量的分析の他に、多数の定性的分析が可能である。
【００９１】
例えば、ＨＬＡ遺伝子産物は、その全体がその生物の対応する遺伝的特性の原因となっている。その遺伝子の位置は、非常に多数の対立遺伝子の組合せにおいて遺伝子しており、既知となったその対立遺伝子の数は益々多くなっている。移植すべき細胞種の医学的関連および研究で必要な詳細さに応じて、対立遺伝子型分類は様々に行うことができる。分類が詳細であり、これによる供与者と受容者との一致が良好であればあるほど、組織の不寛容や移植拒絶などの予測される問題は少なくなる。ＭＨＣ分子の発見以来、これらの分子やその遺伝子の多型の同定のために様々な方法が開発され用いられてきた。一方には、生化学的な細胞および血清学的手法があり、他方には分子生物学的手法があり、これらは根本的な違いがある。前者は発現産物を例えば、特異的抗体の使用により排他的に分析するものであるが、第２の群はコード領域と非コード領域の配列の相違を、ハイブリダイゼーションや核酸増幅技術を用いて検出する（ビドウェル　Ｊ．（Ｂｉｄｗｅｌｌ　Ｊ．）、１９９４　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ　ＨＬＡ−ｔｙｐｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ、１５（７）：３０３〜７頁）。ここに記載した発明の結果、単離後、適当な標識および可能な増幅を行って診断上関連のある対立遺伝子構造を個体のゲノムＤＮＡの配列バックグラウンド中で強調し、プローブ・アレイ（ＤＮＡチップ）を用いて多量のハイブリダイゼーションを平行して行う。ＨＬＡタイピングを可能な限り詳細に行うことも可能になろう。他の方法と比較して、ここに記載したハイブリダイゼーションの検出と信号の増強は、既知の対立遺伝子特異的プローブを用いるならば、簡単な検出器との組合せで最小の診断時間で最大のゲノム・タイピングが可能な非常に経済的な方法を提供する。
【００９２】
他の応用分野としては医薬および診断の領域が挙げられる。生物における内在および外来性物質（例えば薬品）の代謝において、一連の遺伝的多型、変異、欠失など、およびこれに伴うタンパク質レベルでの効果が根本的役割を果たす。これらのＤＮＡ配列における個体の遺伝子型の分布は、ある種の診断的描像と関連する表現型をもたらす（例えば、ｐ５３遺伝子と哺乳類の癌やミトコンドリア遺伝子のＤループ、１６−Ｓ−ｒＲＮＡ、ＮＤ３−５、ＣｙｔＢ、ｔＲＮＡＴｒｐ、ｔＲＮＡＬｅｕにおける変種と肺癌および膀胱癌（フリス　ＭＳ（Ｆｌｉｓｓ　ＭＳ）ら、（２０００）Ｆａｃｉｌｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ＤＮＡ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｕｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　ｂｏｄｉｌｙ　ｆｌｕｉｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１７；２８７（５４６０）：２０１７−９）または生物中での生体異物の様々な作用）。後者は、例えば、チトクロームＰ４５０遺伝子（ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｅ１）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子（ＧＳＴＭ１、ＧＳＴＴ１）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＡＴ２）、アポリポプロテインＥ遺伝子（ＡｐｏＥ）その他多数において示されてきた。これらの研究結果すべてをまとめることで、配列の違いを平行して検出するＤＮＡプローブを有するアレイを構成することができる。上記のハイブリダイゼーションの増強検出法と簡単な光学システムにより、定性的な遺伝子型分類を迅速かつ廉価に行うことができる。これは、いずれも、個体識別マーカとしての個人個人に特定された薬剤の使用および診断の両方に関係がある。
以下の実施例および図面は本発明を説明するためのものであり、限定的に理解されるべきではない。
【００９３】
（実施例）
実施例１：核酸のハイブリダイゼーションの検出（定量分析）
担体の調製
アミノ修飾した以下の２０ヌクレオチドの配列
５’−ＮＨ２−ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’
をエポキシ化した３×３ｍｍのガラス表面上の所定位置に共有結合により固定した。この目的のために、０．５Ｍリン酸塩バッファに溶解したオリゴヌクレオチド５μＭ溶液０．１μｌをガラス表面上に塗り３７℃で乾燥した。プローブ・アレイを３０分間６０℃に加熱することにより、塗られたオリゴヌクレオチドとガラス表面のエポキシ基との共有結合を固定した。次いで、プローブ・アレイを蒸留水で激しく洗浄し、その後、１００ｍｍＫＣＩで３０分間洗浄した。さらに１００ｍｍＫＣＩで短時間洗浄し、蒸留水で洗浄した後、プローブ・アレイを３７℃で１０分間乾燥した。
【００９４】
相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションを行うために、ビオチンで標識した５’−Ｂｉｏ−ＧＴＡＡＴＡＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧＧ−３’の配列を有する２０ｂｐ長のオリゴヌクレオチドを用いた。反応混合物を全量５０μｌの緩衝液（０．２５Ｍ　ＮａＰＯ４、４．５％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡの１×ＳＳＣ溶液）に取り、段階的に以下の濃度とした：１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ、１Ｍ。
【００９５】
準備したプローブ・アレイを各濃度段階のハイブリダイゼーション混合物中に置いた。得られたハイブリダイゼーション混合物を９５℃で５分間、次いで５０℃で６０分間インキュベートした。この後、プローブ・アレイを２×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ、２×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣ（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８９））内でそれぞれ１０分間振とうし、洗浄後、圧縮空気を吹き付けて乾燥した。
【００９６】
ハイブリダイゼーションの検出
ストレプトアビジン−金共役体の６×ＳＳＰＥ（５２．５ｇ　ＮａＣｌ、２６．４ｇ　ＮａＨ２ＰＯ４×Ｈ２Ｏ、２．２２ｇ　ＮａＯＨを水で全量１容積としたもの）の１：５０希釈液をプローブ・アレイ＋０．００５％Ｔｒｉｔｏｎ溶液に塗り３０℃で１５分間インキュベートした。次いで、プローブ・アレイを２×ＳＳＣ（１７．５ｇ　ＮａＣｌと８．８ｇクエン酸ナトリウム１ｌ水溶液を１０Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整したもの）＋０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、２×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣでそれぞれ１０分間振とう洗浄し、圧縮空気を吹き付けて乾燥した。金−ストレプトアビジン共役体の代わりに金粒子で直接修飾したターゲットも用いた。
【００９７】
次に、金粒子をプローブ・アレイ上に固定する。これを０．１％硝酸銀の３％炭酸ナトリウム溶液および０．０２％ホルムアルデヒド溶液で増強した。その混合物を反応の少し前に新たに調製した。１５分間インキュベートし、この間、赤色光下に２２℃で反応を監視した。図１に示す装置で連続的に記録した。
【００９８】
検出限界は１０ｐＭ未満であることがわかった。
図３はハイブリダイゼーションの結果を示す。
Ａ−濃度１０ｎＭの場合のターゲットのハイブリダイゼーション、
Ｂ−濃度１ｎＭの場合のターゲットのハイブリダイゼーション、
Ｃ−濃度１００ｐＭの場合のターゲットのハイブリダイゼーション、
Ｄ−濃度１０ｐＭの場合のターゲットのハイブリダイゼーション。
【００９９】
実施例２：発現プロファイリング法原理の証明−プローブ・アレイ（プローブ数：３５６個）に対するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のゲノムＲＮＡのハイブリダイゼーション検出
【０１００】
ＤＮＡ−アレイは細胞の全生理学的状態を測定するためにしばしば用いられる（発現プロファイリング）。この目的のために対応する細胞からＲＮＡを単離し、適当な方法で標識し、相補的プローブを有するプローブ・アレイとハイブリダイズさせた。以下の実施形態では、本発明の方法を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の細胞ＲＮＡの検出に用いた。
【０１０１】
プローブ・アレイの調製
アミノ修飾した２５または３０塩基長の様々なオリゴヌクレオチドおよび様々な長さのｃＤＮＡを３５６個含むプローブ・アレイを用い、クローンディグ・チップ・テクノロジーズ（ＣＬＯＮＤＩＡＧ　Ｃｈｉｐ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（ドイツ、イエーナ（Ｊｅｎａ）所在）から販売されている標準タイプのエポキシ化顕微鏡用スライドガラスをアレイ用基板としてプローブ・アレイを作成した。すべてのオリゴヌクレオチドは、ａｃｅＡ−遺伝子およびｉｃｄ−遺伝子の部分配列と相補的である。プローブ・アレイはバイオロボティックス（Ｂｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ）社（英国）のＭｉｃｒｏ−Ｇｒｉｄ　Ｉ　Ａｒｒａｙｅｒを用い、メーカーの取扱説明書に従って配列して作成した。取扱説明書に従い、アミノ修飾したＤＮＡは、０．５Ｍリン酸塩バッファ中最終濃度５μＭで顕微鏡スライドガラスに塗布し、次いで乾燥した。顕微鏡用スライドガラスを６０℃で３０分間加熱することにより、アミノ修飾オリゴヌクレオチドとガラス表面上のエポキシ基との間で共有結合を形成した。次いで、スライドガラスを蒸留水で激しく洗浄し、次いで１００ｍＭ　ＫＣｌで３０分間洗浄した。さらに短時間洗浄した後、最初は１００ｍＭＫＣｌで、次いで蒸留水で洗浄し、３７℃で１０分間、プローブ・アレイを乾燥した。
【０１０２】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの全ＲＮＡの調製
Ｆａｓｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ（Ｂｉｏ　１０１社）を用い、メーカー取扱説明書に従いＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから全ＲＮＡを単離した。５０μｇのＲＮＡをＢｉｏｔｉｎ　Ｃｈｅｍ　Ｌｉｎｋ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社、ドイツ）を用いメーカー取扱説明書に従い８５℃で３０分かけてビオチン化した。次いで、メーカー取扱説明書に従いＲＮＡをＭｉｃｒｏｃｏｎ−３０−カラム（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社）で濃縮し、次いでＲＮアーゼを含まない脱イオン水で数回洗浄した。次いで、溶出液を真空乾燥して５μｌとした。
【０１０３】
ＲＮＡのハイブリダイゼーション
ビオチン化ＲＮＡを１００μｌのハイブリダイゼーション用バッファ（０．２５Ｍ　ＮａＰＯ４、４．５％　ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡの１×ＳＳＣ溶液）に取り、６５℃３分間で変性した。ＤＮＡコートしたスライドガラスの表面をハイブリダイゼーション・チャンバ（Ｈｙｂｒｉｓｌｉｐ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、ドイツ、ダイセンホーフェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）所在）で覆った。次いで、このスライドガラスをマイクロタイター・プレート用挿入部を備えたサーモスタット・シェーカ（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）社、ドイツ、ハンブルグ所在）上で５０℃まで加熱した。次いでチャンバを変性ハイブリダイゼーション溶液で満たし、メーカーの取扱説明書に従いハイブリダイゼーション・チャンバを閉じた。５０℃で６０分間インキュベーションを続けた。次いでハイブリダイゼーション溶液を取り除きハイブリダイゼーション・チャンバを取り外した。次いで、スライドガラスを振とうし３０℃で２×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳで１０分間、室温で２×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣ洗浄し（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）、圧縮空気で乾燥した。
【０１０４】
ハイブリダイゼーションの検出
ストレプトアビジン−金共役体（ＥＭ．ＳＴＰ５、ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社）の６×ＳＳＰＥ＋０．００５％　Ｔｒｉｔｏｎ１：５０希釈液（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）をスライドガラスに塗り、次いでこれを３０℃で１５分間インキュベートした。次いで、プローブ・アレイを２×ＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳ、２×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣでそれぞれ１０分間振とう洗浄し、圧縮空気を吹き付けて乾燥した。プローブ・アレイ上に固定された金粒子をＬＭ／ＥＭ　Ｓｉｌｖｅｒ　Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＳＥＫＬ１５、ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社）を用いて増強した。メーカーの取扱説明書に従い、開始液と増強剤溶液各２滴を混合し、その１５μｌをプローブ・アレイ表面にピペットで載置した。１５分間インキュベートし、この間、赤色光下に２２℃で反応を監視し、図１に示す装置で連続的に記録した。最終的な変化の評価は、１５分間のインキュベーション後に行った（図４参照）。
【０１０５】
実施例３：核酸ハイブリダイゼーションの検出および特異性
各々１６ヌクレオチド長の１６個のアミノ修飾オリゴヌクレオチド（プローブ）をＭｉｃｒｏＧｒｉｄ　ＩＩ−Ａｒｒａｙｅｒ（バイオロボティクス（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）社）を用いて所定部位に塗布し、ガラス表面を有するエポキシ化３Ｄ−顕微鏡スライドガラス（７５ｍｍ×２５ｍｍ）（エリプサ（Ｅｌｉｐｓａ）社）上に共有結合により固定した（アレイ要素）。オリゴヌクレオチド配列は以下の通りである（いずれも３’−ＮＨ２−修飾あり）：
【０１０６】
１：    ３’−    ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  Ｃ    −５’
２：    ３’−    ＡＴＧ  ＣＣＧ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＡＴＣ  Ｃ    −５’
３：    ３’−    ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＡＡＣ  Ｃ    −５’
４：    ３’−    ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  Ｃ    −５’
５：    ３’−    ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  Ｇ    −５’
６：    ３’−    ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＡＴＣ  Ｇ    −５’
７：    ３’−    ＡＣＧ  ＴＣＡ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  Ｇ    −５’
８：    ３’−    ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  Ｇ    −５’
９：    ３’−    ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  Ａ    −５’
１０：   ３’−    ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  Ａ    −５’
１１：   ３’−    ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  Ａ    −５’
１２：   ３’−    ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  Ａ    −５’
１３：   ３’−    ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  Ｔ    −５’
１４：   ３’−    ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  Ｔ    −５’
１５：   ３’−    ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  Ｔ    −５’
１６：   ３’−    ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  Ｔ    −５’
【０１０７】
スライドガラス表面上の１個の完全な（正方形）プローブ・アレイは、合計で１０×１０＝１００個の塗布したプローブを含んでいる。各オリゴヌクレオチド・プローブをプローブ・アレイ上に少なくとも５回塗布した（アレイ構成は図５参照）。プローブは０．２ｍｍ離し、プローブ・アレイ全体で２ｍｍ×２ｍｍの領域を覆った。このようにして、１００枚以上の同一のプローブ・アレイを各スライドガラス上に製造することができた。
【０１０８】
プローブを各オリゴヌクレオチドの０．１Ｍリン酸塩バッファ／５％硫酸ナトリウム溶液１０μＭとして塗布した。塗布乾燥後、６０℃で３０分間加熱することによりガラス表面のエポキシ基にプローブを結合させた。次いで、スライドガラスを洗浄し、以下の順序でブロックした。
【０１０９】
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６００μｌ　Ｔｒｉｔｏｎ×１００中５分間
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６０μｌ濃塩酸中２×２分間
１００ｍＭ　ＫＣｌ溶液中３０分間
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間洗浄
ガラス皿上、二回蒸留Ｈ２Ｏ７５ｍｌ＋２５ｍｌ　エチレングリコール＋２０μｌ濃塩酸中で５０℃で１５分間インキュベート
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間洗浄
圧縮空気で乾燥
【０１１０】
洗浄乾燥後、スライドガラスを３．２５ｍｍ×３．２５ｍｍの大きさのピース（以下、「チップ」と呼ぶ）に切断した。各チップ上には、２ｍｍ×２ｍｍのプローブ・アレイがちょうど１個載っていた。
【０１１１】
プローブ・アレイのハイブリダイゼーション
ビオチン標識した１６ｂｐ長の相補的オリゴヌクレオチドが、プローブ・アレイの１６個の各オリゴヌクレオチド・プローブに対してハイブリダイゼーション・ターゲットとして利用できた。
【０１１２】
オリゴヌクレオチド・プローブ９に対する相補的ターゲット「９ｂ」は以下の配列を有し、ここでは唯一の例として挙げられる。
５’− ビオチン    ＴＣＣ  ＣＧＡ  ＡＡＡ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  Ｔ    −３’
【０１１３】
ハイブリダイゼーション反応は６×ＳＳＰＥ−バッファ（５２．５９ｇ  ＮａＣｌ、８．２８ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４×Ｈ２Ｏ、２．２２ｇ　ＥＤＴＡ×２Ｈ２Ｏを含む二回蒸留Ｈ２Ｏの１ｌ溶液。ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）／０．１％ＳＤＳをターゲット濃度が１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭとなるように全量７０μｌとして行った。各濃度の段階で、プローブ・アレイを有するチップをハイブリダイゼーション溶液に加え、９５℃で５分間加熱し、３０℃で６０分間振とうしインキュベートした。次いで、チップを５００μｌのハイブリダイゼーション・バッファ（ターゲット含まず）を入れた新しい反応容器に移し、５５℃または６０℃で１０分間振とう洗浄した。次いで、チップをさらに、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（５００μｌ、３０℃）、２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）および０．２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）中１０分間振とう洗浄し乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
【０１１４】
ハイブリダイゼーションの検出（共役体形成および銀染色）
ハイブリダイズし乾燥させたチップをストレプトアビジン−金共役体の６×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ−バッファ溶液をμｌ入れた新しい反応容器に移し、３０℃で１５分間インキュベートした。ストレプトアビジン−金共役体には５ｎｍの金粒子（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、ＥＭ．ＳＴＰ５）を用いた。共役体は溶液中に５００ｐｇストレプトアビジン／μｌの濃度で含まれていた。
【０１１５】
共役体形成後、チップを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（５００μｌ、３０℃）、２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）および０．２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）で１０分間振とう洗浄し、次いで乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
【０１１６】
この方法の別法として、ストレプトアビジン−金共役体の結合をハイブリダイゼーション溶液中で直接に行った。この目的のために、６０分間のハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体を直接にハイブリダイゼーション溶液に添加し、次いで、３０℃で１５分間インキュベートした。この後、チップを５００μｌのハイブリダイゼーション・バッファ（ターゲット含まず）を入れた新しい反応容器に移し、５５℃または６０℃で１０分間振とう洗浄した。この後、チップを、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（５００μｌ、３０℃）、２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）および０．２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）中１０分間振とう洗浄し乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
【０１１７】
銀による増強のため、チップを新しい反応容器に移し、２５℃で１０分間振とうし約１００μｌの銀増強溶液（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、ＳＥＫＬ１５）中でインキュベートした。インキュベーション用溶液は、開始液と増強剤溶液各１滴から製造した。次いで、チップを、０．２×ＳＳＣ（５００μｌ）中で２分間洗浄し乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
ハイブリダイゼーションおよび検出の２例を、図６ａおよび図６ｂに示す（透過光写真）。
【０１１８】
実施例４：核酸ハイブリダイゼーションの検出および特異性
ＣＦＴＲ遺伝子については、嚢胞性線維症を引き起こし得る８００以上の変異例が文献に記載されている。ＣＦＴＲ遺伝子の変異には３つのタイプがある。
・塩基交換（ここでは点変異）
・挿入
・欠失
【０１１９】
これら３つの変異タイプすべてについて、銀増強検出で野生型（ｐｍ）を変異（ｍｍ）から識別することができる。プローブおよびターゲットはオガム（Ｏｇｈａｍ）社（ドイツ、ミュンヘン）によって調製された。
【０１２０】
プローブ・アレイの調製
アミノ修飾した１６〜２２ヌクレオチド長の１０個のオリゴヌクレオチドを、ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ　ＩＩ−Ａｒｒａｙｅｒ（バイオロボティックス（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）社）を用いて、エポキシ化３Ｄ−顕微鏡スライドガラス（７５ｍｍ×２５ｍｍ）（エリプサ（Ｅｌｉｐｓａ）社）のガラス表面上の所定部位に塗布し、共有結合により固定した（アレイ要素）。１０個のプローブは５対に分けられ、うち一方は常に野生型であり、他方が変異型である。プローブ対１と２は点変異であり、プローブ対３と４は欠失、プローブ対５／６、７／８および９／１０は挿入である。オリゴヌクレオチド配列は以下の通りである：
【０１２１】
配列は５’−３’の方向であり３’−ＮＨ２修飾がある。
１：    ＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＡＣＴＧ         ｐｍ
２：    ＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＣＴＧ         ｍｍ
３：    ＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡ        ｐｍ
４：    ＧＡＡＡＣＡＣＣ ＧＡＴＧＡＴＡ          ｍｍ
５：    ＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡ ＴＴＴＧＧＴＡＴＧＴ     ｐｍ
６：    ＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＴ     ｍｍ
７：    ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡ ＴＴＴＧＧ     ｐｍ
８：    ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧ     ｍｍ
９：    ＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡ Ｔ    ｐｍ
１０：   ＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴ    ｍｍ
【０１２２】
プローブ対３（野生型）と４（欠失）は嚢胞性線維症をコードする最も頻度の高い変異を含んでいる（全症例の７０％）。
スライドガラス表面上の１個の完全な（正方形）プローブ・アレイは、合計で１０×１０＝１００個の塗布したプローブを含んでいる。１０個のオリゴヌクレオチド・プローブをそれぞれプローブ・アレイ上に８〜１０回塗布した（アレイ構成は図７参照）。プローブは０．２ｍｍ離し、プローブ・アレイ全体で２ｍｍ×２ｍｍの領域を覆った。このようにして、１００枚以上の同一のプローブ・アレイを各スライドガラス上に製造することができた。
【０１２３】
プローブを各オリゴヌクレオチドの０．１Ｍリン酸塩バッファ／５％硫酸ナトリウム溶液１０μＭとして塗布した。塗布乾燥後、６０℃で３０分間加熱することによりガラス表面のエポキシ基にプローブを共有結合させた。次いで、スライドガラスを洗浄し、以下の順序でブロックした。
【０１２４】
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６００μｌ　Ｔｒｉｔｏｎ×１００中５分間
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６０μｌ濃塩酸中２×２分間
１００ｍＭ　ＫＣｌ溶液中３０分間
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間洗浄
ガラス皿上、二回蒸留Ｈ２Ｏ７５ｍｌ＋２５ｍｌ　エチレングリコール＋２０μｌ濃塩酸中で５０℃で１５分間インキュベート
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間洗浄
圧縮空気で乾燥
【０１２５】
洗浄乾燥後、スライドガラスを３．２５ｍｍ×３．２５ｍｍの大きさのピース（以下、「チップ」と呼ぶ）に切断した。各チップ上には、２ｍｍ×２ｍｍのプローブ・アレイがちょうど１個載っていた。
【０１２６】
プローブ・アレイのハイブリダイゼーションおよび共役体形成
ビオチン標識した３個の相補的ターゲットが、１０個のオリゴヌクレオチド・プローブと完全一致（ｐｍ）ハイブリダイゼーション用に利用できた。ターゲット１はプローブ対１と２を、ターゲット２はプローブ対３と４を、ターゲット３はプローブ対５／６、７／８および９／１０をカバーした。これらのターゲットの配列は以下の通りである。
ターゲット１：    ５’−ビオチン−ＣＴＣＡＧＴＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＴ−３’
ターゲット２：    ５’−ビオチン−ＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴ−３’
ターゲット３：    ５’−ビオチン−ＧＡＡＣＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＣＡ−３’
【０１２７】
ハイブリダイゼーション反応は、６×ＳＳＰＥバッファ（５２．５９ｇ  ＮａＣｌ、８．２８ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４×Ｈ２Ｏ、２．２２ｇ　ＥＤＴＡ×２Ｈ２Ｏを二回蒸留Ｈ２Ｏの１ｌ水溶液としＮａＯＨでｐＨ７．４に調整したもの）／０．１％ＳＤＳの全量７０μｌで種々のターゲット濃度としたものにおいて行った。この目的のためにプローブ・アレイを有するチップをハイブリダイゼーション溶液に入れ、９５℃で５分間加熱し、次いで３０℃で６０分間振とうしインキュベートした。
【０１２８】
６０分間ハイブリダイゼーションをした後、ストレプトアビジン−金共役体をハイブリダイゼーション溶液に直接添加し、次に更に１５分間３０℃でインキュベートした。ストレプトアビジン−金共役体には５ｎｍの金粒子（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、ＥＭ．ＳＴＰ５）を用いた。この実験における共役体濃度は５００ｐｇストレプトアビジン／μｌであった。
【０１２９】
ハイブリダイゼーションおよび共役体形成後、チップを５００μｌのハイブリダイゼーション・バッファ（ターゲット含まず）を入れた新しい反応容器に移し、５５℃で１０分間振とう洗浄した。この後、チップを、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（５００μｌ、３０℃）、２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）および０．２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）中１０分間振とう洗浄し、次いで乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
【０１３０】
銀増強
銀による増強のため、チップを新しい反応容器に移し、２５℃で１０分間振とうし約１００μｌの銀増強溶液（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、ＳＥＫＬ１５）中でインキュベートした。インキュベーション用溶液は、開始液と増強剤溶液各１滴を混合することにより製造した。次いで、チップを、０．２×ＳＳＣ（５００μｌ）中で２分間洗浄し乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
【０１３１】
３例のハイブリダイゼーションおよびその検出結果を、図８、９および１０に示す（透過光像）。点変異（図８）と欠失（図９）は、野生型（ｐｍ）および変異型（ｍｍ）と明瞭に区別できるが、これは挿入（図１０）には当て嵌まらない。この場合、変異（プローブ１０）さえ、野性型（プローブ９）より強い信号を与える。この実験の設計では、ハイブリダイゼーションの検出限界はターゲット濃度１０ｐＭである。
【０１３２】
実施例５：オリゴヌクレオチド金共役体を用いた方法の有用性の原理の証明
プローブ・アレイの調製
１６ヌクレオチド長の１６個のアミノ修飾オリゴヌクレオチド（プローブ）をＭｉｃｒｏＧｒｉｄ　ＩＩ−Ａｒｒａｙｅｒ（バイオロボティックス（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）社）を用いて所定部位に塗布し、３Ｄ−顕微鏡スライドガラス（７５ｍｍ×２５ｍｍ）（エリプサ（Ｅｌｉｐｓａ）社）のエポキシ化ガラス表面上に共有結合により固定した（アレイ要素）。オリゴヌクレオチドはいずれも３’修飾がなされており、その配列は以下の通りである：
【０１３３】
１：    ３’−    ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  Ｃ    −５’
２：    ３’−    ＡＴＧ  ＣＣＧ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＡＴＣ  Ｃ    −５’
３：    ３’−    ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＡＡＣ  Ｃ    −５’
４：    ３’−    ＡＴＧ  ＡＣＧ  ＴＣＴ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  Ｃ    −５’
５：    ３’−    ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＴＴ  ＡＧＴ  ＡＣＣ  Ｇ    −５’
６：    ３’−    ＡＣＧ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＡＴＣ  Ｇ    −５’
７：    ３’−    ＡＣＧ  ＴＣＡ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  Ｇ    −５’
８：    ３’−    ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  Ｇ    −５’
９：    ３’−    ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  Ａ    −５’
１０：   ３’−    ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  Ａ    −５’
１１：   ３’−    ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  Ａ    −５’
１２：   ３’−    ＡＧＧ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  Ａ    −５’
１３：   ３’−    ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  Ｔ    −５’
１４：   ３’−    ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  Ｔ    −５’
１５：   ３’−    ＡＡＧ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  Ｔ    −５’
１６：   ３’−    ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  Ｔ    −５’
【０１３４】
スライドガラス表面上の１個の完全な（正方形）プローブ・アレイは、合計で１０×１０＝１００個の塗布したプローブを含んでいた。１６個のオリゴヌクレオチド・プローブをそれぞれプローブ・アレイ上に少なくとも５回塗布した（アレイ構成は図１１参照）。プローブは０．２ｍｍ離し、プローブ・アレイ全体で２ｍｍ×２ｍｍの領域を覆った。このようにして、１００枚以上の同一のプローブ・アレイを各スライドガラス上に製造することができた。
【０１３５】
プローブを各オリゴヌクレオチドの０．１Ｍリン酸塩バッファ／５％硫酸ナトリウム溶液１０μＭとして塗布した。塗布乾燥後、６０℃で３０分間加熱することによりガラス表面のエポキシ基にプローブを結合させた。次いで、スライドガラスを洗浄し、以下の順序でブロックした。
【０１３６】
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６００μｌ　Ｔｒｉｔｏｎ×１００中５分間
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６０μｌ濃塩酸中２×２分間
１００ｍＭ　ＫＣｌ溶液中３０分間
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間洗浄
ガラス皿上、二回蒸留Ｈ２Ｏ７５ｍｌ＋２５ｍｌ　エチレングリコール＋２０μｌ濃塩酸中で５０℃で１５分間インキュベート
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間洗浄
圧縮空気で乾燥
洗浄乾燥後、スライドガラスを３．２５ｍｍ×３．２５ｍｍの大きさのピース（以下、「チップ」と呼ぶ）に切断した。各チップ上には、２ｍｍ×２ｍｍのプローブ・アレイがちょうど１個載っていた。
【０１３７】
オリゴヌクレオチド−金共役体の調製
オリゴヌクレオチド−金共役体を調製するため、５’−チオール−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（「Ｔ２０−チオール」）の配列を有する修飾オリゴヌクレオチド５．４ｎｍｏｌ（二回蒸留Ｈ２Ｏ８０μｌ中に溶解）を６ｎｍｏｌのモノマレイミドナノ金（ナノプローブス（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）社）と混合し４℃で２４時間インキュベートした。ナノ金は、２０μｌイソプロパノールおよび１８０μｌの二回蒸留Ｈ２Ｏ中に溶解した。
【０１３８】
プローブ・アレイのハイブリダイゼーションおよび共役体形成
３６ｂｐの各相補的オリゴヌクレオチドが、プローブ・アレイ中の１６個のすべてのオリゴヌクレオチド・プローブに対してターゲットとして利用できた。これらのターゲットを３’−ポリＡテールで修飾した。この１つの例は、オリゴヌクレオチド・プローブ９に相補的なターゲット「９ｃ」である、これは以下の配列を有する。
【０１３９】
５’−ＴＣＣＣＧＡＡＡＡＴＣＧＴＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’
ハイブリダイゼーション反応は、６×ＳＳＰＥ−バッファ（５２．５９ｇ  ＮａＣｌ、８．２８ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４×Ｈ２Ｏ、２．２２ｇ　ＥＤＴＡ×２Ｈ２Ｏを二回蒸留Ｈ２Ｏの１ｌ溶液としＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）／０．１％　ＳＤＳをターゲット濃度を段階的に調整して全量７０μｌとして行った。各濃度段階でプローブ・アレイを有するチップをハイブリダイゼーション溶液に加え、９５℃で５分間加熱し、３０℃で６０分間振とうしインキュベートした。この後、Ｔ２０ナノ金共役体の種々の溶液をハイブリダイゼーション溶液に加え、さらに３０℃で３０分間インキュベートした。
【０１４０】
この後、チップを５００μｌのハイブリダイゼーション・バッファ（ターゲットおよびＴ２０ナノ金を含まず）を入れた新しい反応容器に移し、５５℃または６０℃で１０分間振とう洗浄した。最後に、チップを２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（５００μｌ、３０℃）、２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）および０．２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）中１０分間振とう洗浄し乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
【０１４１】
銀増強
銀による増強のため、チップを新しい反応容器に移し、２５℃で１０分間振とうし約１００μｌの銀現像溶液（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、ＳＥＫＬ１５）中でインキュベートした。インキュベーション用溶液は、開始液と増強剤溶液各１滴を混合することにより製造した。次いで、チップを、０．２×ＳＳＣ（５００μｌ）中で２分間洗浄し乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
【０１４２】
実施例６：核酸ハイブリダイゼーションの検出および特異性
診断上嚢胞性線維症の外見につながり得る８００以上のＣＦＴＲ遺伝子変異が文献上知られている。ＣＦＴＲ遺伝子の変異には３つのタイプがある。
・塩基交換（ここでは点変異）
・挿入
・欠失
これら３つの変異タイプすべてについて、銀増強検出で野生型（ｐｍ）を変異（ｍｍ）から識別できることを確認するため試験を行う。
プローブおよびターゲットはオガム（Ｏｇｈａｍ）社によって調製された。
【０１４３】
プローブ・アレイの調製
アミノ修飾した１６〜２２ヌクレオチド長の１０個のオリゴヌクレオチド（プローブ）をＭｉｃｒｏＧｒｉｄ　ＩＩ−Ａｒｒａｙｅｒ（バイオロボティクス（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）社）を用いて、エポキシ化３Ｄ−顕微鏡スライドガラス（７５ｍｍ×２５ｍｍ）（エリプサ（Ｅｌｉｐｓａ）社）のガラス表面上の所定部位に塗布し、共有結合により固定した（アレイ要素）。１０個のプローブは５対に分けられ、うち一方は常に野生型であり、他方が変異型である。プローブ対１と２は点変異であり、プローブ対３と４は欠失、プローブ対５／６、７／８および９／１０は挿入である。オリゴヌクレオチド配列は以下の通りである：
【０１４４】
配列は５’−３’の方向であり３’−ＮＨ２修飾がある。
１：    ＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＡＣＴＧ         ｐｍ
２：    ＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＣＴＧ         ｍｍ
３：    ＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡ        ｐｍ
４：    ＧＡＡＡＣＡＣＣ ＧＡＴＧＡＴＡ          ｍｍ
５：    ＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡ ＴＴＴＧＧＴＡＴＧＴ     ｐｍ
６：    ＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＴ     ｍｍ
７：    ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡ ＴＴＴＧＧ     ｐｍ
８：    ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧ     ｍｍ
９：    ＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡ Ｔ   ｐｍ
１０：   ＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴ   ｍｍ
【０１４５】
プローブ対３（野生型）と４（欠失）は嚢胞性線維症をコードする最も頻度の高い変異に対応している（全症例の７０％）。
【０１４６】
スライドガラス表面上の１個の完全な（正方形）プローブ・アレイは、合計で１０×１０＝１００個のプローブを含んでいる。オリゴヌクレオチド・プローブをそれぞれプローブ・アレイ上に８〜１０回塗布した（アレイ構成は図１３参照）。プローブは０．２ｍｍ離し、プローブ・アレイ全体で２ｍｍ×２ｍｍの領域を覆った。このようにして、１００枚以上の同一のプローブ・アレイを各スライドガラス上に製造することができた。
【０１４７】
プローブを各オリゴヌクレオチドの０．１Ｍリン酸塩バッファ／５％硫酸ナトリウム溶液１０μＭとして塗布した。塗布乾燥後、６０℃で３０分間加熱することによりガラス表面のエポキシ基にプローブを結合させた。次いで、スライドガラスを洗浄し、以下の順序でブロックした。
【０１４８】
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６００μｌ　Ｔｒｉｔｏｎ×１００中５分間
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６０μｌ濃塩酸中２×２分間
１００ｍＭ　ＫＣｌ溶液中３０分間
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間リンス
ガラス皿上、二回蒸留Ｈ２Ｏ７５ｍｌ＋２５ｍｌ　エチレングリコール＋２０μｌ濃塩酸中で５０℃で１５分間インキュベート
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間リンス
圧縮空気で乾燥
【０１４９】
洗浄乾燥後、スライドガラスを３．２５ｍｍ×３．２５ｍｍの大きさのピース（以下、「チップ」と呼ぶ）に切断した。各チップ上には、２ｍｍ×２ｍｍのプローブ・アレイがちょうど１個載っていた。
【０１５０】
プローブ・アレイのハイブリダイゼーションおよび共役体形成
ビオチン標識した３個の相補的ターゲットが、１０個のオリゴヌクレオチド・プローブと完全一致（ｐｍ）ハイブリダイゼーション用に利用できた。ターゲット１はプローブ対１と２を、ターゲット２はプローブ対３と４を、ターゲット３はプローブ対５／６、７／８および９／１０をカバーした。これらのターゲットの配列は以下の通りである。
ターゲット１：  ５’−ビオチン−ＣＴＣＡＧＴＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＴ−３’
ターゲット２：  ５’−ビオチン−ＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴ−３’
ターゲット３：  ５’−ビオチン−ＧＡＡＣＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＣＡ−３’
【０１５１】
ハイブリダイゼーション反応は、６×ＳＳＰＥバッファ（５２．５９ｇ  ＮａＣｌ、８．２８ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４×Ｈ２Ｏ、２．２２ｇ　ＥＤＴＡ×２Ｈ２Ｏを二回蒸留Ｈ２Ｏの１ｌ水溶液としＮａＯＨでｐＨ７．４に調整したもの）／０．１％ＳＤＳの全量７０μｌで、３種のターゲットのいずれも１００ｐＭ濃度として行った。この目的のためにプローブ・アレイを有するチップをハイブリダイゼーション溶液に入れ、９５℃で５分間加熱し、次いで３０℃で６０分間振とうしインキュベートした。
【０１５２】
６０分間のハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体を直接にハイブリダイゼーション用溶液に加え、３０℃でさらに１５分間インキュベートした。ストレプトアビジン−金共役体には５ｎｍの金粒子（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、ＥＭ．ＳＴＰ５）を用いた。この実験における共役体は、５００ｐｇストレプトアビジン／μｌの濃度で用いた。
【０１５３】
ハイブリダイゼーションおよび共役体形成後、チップを５００μｌのハイブリダイゼーション・バッファ（ターゲット含まず）を入れた新しい反応容器に移し、５５℃で１０分間振とう洗浄した。この後、チップを、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ（５００μｌ、３０℃）、２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）および０．２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）中１０分間洗浄し乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
【０１５４】
銀増強、検出および評価
銀による増強のため、チップを閉じた反応容器（図１参照）に固定し、銀増強溶液（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、ＳＥＫＬ１５）を塗布した。インキュベーション用溶液は、開始液と増強剤溶液各１滴を混合することにより製造した。２１℃で３０分間インキュベートし、この間、銀増強の時間経過を毎分１枚の写真撮影で記録した（このための光源としては赤色ＬＥＤを使用した）。
【０１５５】
次いで、写真を、写真評価ソフトウェアＩｃｏｎｏＣｌｕｓｔ（クローンディアグ（Ｃｌｏｎｄｉａｇ）社）を用いて評価した。
例として、図１４ａと１４ｂは、銀増強開始後５分と１０分のチップ写真を示す。ハイブリダイゼーションはターゲット２を用いて行った。図１５はこの反応の時間経過を示す。
【０１５６】
実施例７：核酸ハイブリダイゼーションの検出および特異性−時間経過の測定
嚢胞性線維症の症状につながり得る８００以上のＣＦＴＲ遺伝子変異が文献上知られている。ＣＦＴＲ遺伝子の変異には３つのタイプがある。
【０１５７】
・塩基交換（ここでは点変異）
・挿入
・欠失
これら３つの変異タイプすべてについて、銀増強検出で野生型（ｐｍ）を変異（ｍｍ）から識別できることを確認するため試験を行う。
プローブおよびターゲットはオガム（Ｏｇｈａｍ）社（ドイツ、ミュンヘン所在）から提供を受けた。
【０１５８】
プローブ・アレイの調製
アミノ修飾した１６〜２２ヌクレオチド長の１０個のオリゴヌクレオチド（プローブ）をＭｉｃｒｏＧｒｉｄ　ＩＩ−Ａｒｒａｙｅｒ（バイオロボティックス（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）社）を用いて、エポキシ化３Ｄ−顕微鏡スライドガラス（７５ｍｍ×２５ｍｍ）（エリプサ（Ｅｌｉｐｓａ）社）のガラス表面上の所定部位に塗布し、共有結合により固定した（アレイ要素）。１０個のプローブは５対に分けられ、うち一方は常に野生型であり、他方が変異型である。プローブ対１と２は点変異であり、プローブ対３と４は欠失、プローブ対５／６、７／８および９／１０は挿入である。オリゴヌクレオチド配列は以下の通りである：
【０１５９】
配列は５’−３’の方向であり３’−ＮＨ２修飾がある。
１：    ＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＡＣＴＧ         ｐｍ
２：    ＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＣＴＧ         ｍｍ
３：    ＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡ        ｐｍ
４：    ＧＡＡＡＣＡＣＣ ＧＡＴＧＡＴＡ          ｍｍ
５：    ＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡ ＴＴＴＧＧＴＡＴＧＴ     ｐｍ
６：    ＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＴ     ｍｍ
７：    ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡ ＴＴＴＧＧ    ｐｍ
８：    ＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧ    ｍｍ
９：    ＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡ Ｔ   ｐｍ
１０：   ＴＴＴＴＡＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴ   ｍｍ
【０１６０】
プローブ対３（野生型）と４（欠失）は、嚢胞性線維症をコードする最も高頻度の変異を含む（全症例の７０％）。
スライドガラス表面上の１個の完全な（正方形）プローブ・アレイは、合計で１０×１０＝１００個のプローブを含んでいる。１０個のオリゴヌクレオチド・プローブをそれぞれプローブ・アレイ上に８〜１０回塗布した（アレイ構成は図１６参照）。プローブ間の間隔は０．２ｍｍとし、プローブ・アレイ全体で２ｍｍ×２ｍｍの領域を覆った。このようにして、１００枚以上の同一のプローブ・アレイを各スライドガラス上に製造することができた。
【０１６１】
プローブを各オリゴヌクレオチドの０．１Ｍリン酸塩バッファ／５％硫酸ナトリウム溶液１０μＭとして塗布した。塗布乾燥後、６０℃で３０分間加熱することによりガラス表面のエポキシ基にプローブを共有結合させた。次いで、スライドガラスを洗浄し、以下の順序でブロックした。
【０１６２】
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６００μｌ　Ｔｒｉｔｏｎ×１００中５分間
６００ｍｌ二回蒸留Ｈ２Ｏ＋６０μｌ濃塩酸中２×２分間
１００ｍＭ　ＫＣｌ溶液中３０分間
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間洗浄
ガラス皿上、二回蒸留Ｈ２Ｏ７５ｍｌ＋２５ｍｌ　エチレングリコール＋２０μｌ濃塩酸中で５０℃で１５分間インキュベート
二回蒸留Ｈ２Ｏ中１分間洗浄
圧縮空気で乾燥
洗浄乾燥後、スライドガラスを３．２５ｍｍ×３．２５ｍｍの大きさのピース（以下、「チップ」と呼ぶ）に切断した。各チップ上には、２ｍｍ×２ｍｍのプローブ・アレイがちょうど１個載っていた。
【０１６３】
プローブ・アレイのハイブリダイゼーションおよび共役体形成
ビオチン標識した３個の相補的ターゲットが、１０個のオリゴヌクレオチド・プローブと完全一致（ｐｍ）ハイブリダイゼーション用に利用できた。ターゲット１はプローブ対１と２を、ターゲット２はプローブ対３と４を、ターゲット３はプローブ対５／６、７／８および９／１０をカバーした。これらのターゲットの配列は以下の通りである。
ターゲット１：    ５’−ビオチン−ＣＴＣＡＧＴＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＴ−３’
ターゲット２：    ５’−ビオチン−ＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴ−３’
ターゲット３：    ５’−ビオチン−ＧＡＡＣＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＣＡ−３’
【０１６４】
ハイブリダイゼーション反応は、６×ＳＳＰＥバッファ（５２．５９ｇ  ＮａＣｌ、８．２８ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４×Ｈ２Ｏ、２．２２ｇ　ＥＤＴＡ×２Ｈ２Ｏを二回蒸留Ｈ２Ｏの１ｌ水溶液としＮａＯＨでｐＨ７．４に調整したもの）／０．１％ＳＤＳの全量７０μｌで、３種のターゲットのいずれも１００ｐＭ濃度として行った。この目的のためにプローブ・アレイを有するチップをハイブリダイゼーション溶液に入れ、９５℃で５分間加熱し、次いで３０℃で６０分間振とうしインキュベートした。
【０１６５】
６０分間のハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体を直接にハイブリダイゼーション用溶液に加え、３０℃でさらに１５分間インキュベートした。ストレプトアビジン−金共役体には５ｎｍの金粒子（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、ＥＭ．ＳＴＰ５）を用いた。この実験における共役体は、１２５ｐｇストレプトアビジン／μｌの濃度で用いた。
【０１６６】
ハイブリダイゼーションおよび共役体形成後、チップを５００μｌのハイブリダイゼーション・バッファ（ターゲット含まず）を入れた新しい反応容器に移し、５５℃で１０分間振とう洗浄した。この後、チップを、２×ＳＳＣ／０．２％　ＳＤＳ（５００μｌ、３０℃）、２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）および０．２×ＳＳＣ（５００μｌ、２０℃）中１０分間洗浄し乾燥した（エッペンドルフ濃縮器）。
【０１６７】
銀増強、検出および評価
銀による増強のため、チップを閉じた反応容器（図１参照）に固定し、銀増強溶液（ブリティッシュ・バイオセル・インターナショナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ　ＢｉｏＣｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、ＳＥＫＬ１５）を塗布した。インキュベーション用溶液は、開始液と増強剤溶液各１滴を混合することにより製造した。２７℃で２０分間インキュベートし、この間、銀増強の時間経過を１０秒ごとに１枚の写真撮影で記録した（このための光源としては赤色ＬＥＤを使用した）。次いで、写真を、写真評価ソフトウェアＩｃｏｎｏＣｌｕｓｔ（クローンディアグ（Ｃｌｏｎｄｉａｇ）社）を用いて評価した。
【０１６８】
結果を図１７〜２０および表２に示す。各プローブについて、各曲線の指数関数的増加領域において直線状回帰線を決定し、これらは各ターゲット濃度に典型的である。これに基づいて未知のターゲット濃度を評価することができる。このための同一の共役体量、同一の固定プローブ濃度、同一の実験パラメータである。
【０１６９】
【表２】
2004501667.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】
プローブ−ターゲット間相互作用の定性的および／または定量的検出装置を示す図である。
【図２】
図３に示すハイブリダイゼーション結果の時間経過の記録を示すグラフである。
【図３】
ハイブリダイゼーション結果を表示する図であり、
Ａ−ターゲット濃度１０ｎＭでのハイブリダイゼーション
Ｂ−ターゲット濃度１ｎＭでのハイブリダイゼーション
Ｃ−ターゲット濃度１００ｐＭでのハイブリダイゼーション
Ｄ−ターゲット濃度１０ｐＭでのハイブリダイゼーション
である。
【図４】
プローブ・アレイ（３５６プローブ）に対するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のゲノムＲＮＡのハイブリダイゼーション検出−１５分間インキュベーション後のパターンを示す図である。
【図５】
大きさ２ｍｍ×２ｍｍで１０×１０＝１００個のプローブを含むアレイアセンブリを示す図であり、数字１〜１６は、それぞれアレイ上に５または６回塗布したオリゴヌクレオチド・プローブを表わし、「Ｍ」は、固定化したビオチン標識オリゴヌクレオチドを含むマーカ混合物を表わす（なお、アレイ上の＋とした場所（１箇所）は使用していない）。
【図６】
ハイブリダイゼーション、共役体形成および銀増強後のプローブ・アレイ（アレイアセンブリ。図５参照）を示す図である。
ａ）左図：ターゲット９ｂ（１００ｎＭ）−３０℃でのハイブリダイゼーション；１洗浄ステップ（６０℃）；ストレプトアビジン−金共役体形成（５００ｐｇ／μｌ）；銀増強（１０分間２５℃）。
特異的プローブ９（およびマーカ）の他に、プローブ１３からの弱い非特異的信号が見られる。
ｂ）右図：ターゲット９ｂ（１００ｐＭ）−３０℃でのハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体の直接添加（５００ｐｇ／μｌ）；１洗浄ステップ（６０℃）；銀増強（１０分間２５℃）。
【図７】
大きさ２ｍｍ×２ｍｍで１０×１０＝１００個のプローブを含むアレイアセンブリを示す図であり、数字１〜１０は、それぞれアレイ上に８〜１０回塗布したオリゴヌクレオチド・プローブを表わし、「Ｍ」は、固定化したビオチン標識オリゴヌクレオチドを含むマーカ混合物を表わす。
【図８】
ハイブリダイゼーション、共役体形成および銀増強後のプローブ・アレイ（アレイアセンブリ。図７参照）を示す図である。
ターゲット１（１００ｐＭ）−３０℃でのハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体の直接添加（５００ｐｇ／μｌ）；１洗浄ステップ（５５℃）；銀増強（１０分間２５℃）。
【図９】
ハイブリダイゼーション、共役体形成および銀増強後のプローブ・アレイ（アレイアセンブリ。図１参照）を示す図である。
ターゲット２（１００ｐＭ）−３０℃でのハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体の直接添加（５００ｐｇ／μｌ）；１洗浄ステップ（５５℃）；銀増強（１０分間２５℃）。
【図１０】
ハイブリダイゼーション、共役体形成および銀増強後のプローブ・アレイ（アレイアセンブリ。図１参照）を示す図である。
ターゲット３（１００ｐＭ）−３０℃でのハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体の直接添加（５００ｐｇ／μｌ）；１洗浄ステップ（５５℃）；銀増強（１０分間２５℃）。
【図１１】
大きさ２ｍｍ×２ｍｍで１０×１０＝１００個のプローブを含むアレイアセンブリであり、数字１〜１６は、それぞれアレイ上に５または６回塗布したオリゴヌクレオチド・プローブを表わし、「Ｍ」は、固定化したビオチン標識オリゴヌクレオチドを含むマーカ混合物を表わす（なお、アレイ上の１箇所は使用していない）。
【図１２】
ハイブリダイゼーション、共役体形成および銀増強後のプローブ・アレイ（アレイアセンブリ。図１１参照）を示す図である。
ターゲット９ｃ（１ｎＭ）−３０℃、６０分間ハイブリダイゼーション後、Ｔ２０ナノ金（１：１００希釈）の添加；さらに３０℃３０分間インキュベーション；１洗浄ステップ（５５℃）；銀増強（１０分間２５℃）。
プローブ９（およびマーカ）の特異的強い信号の他に、他のプローブが弱い信号を与える。いくつかのスポットは染み状で不均一である。これはプローブ塗布時のアレイ中の不純物によるものであった。
【図１３】
大きさ２ｍｍ×２ｍｍで１０×１０＝１００個のプローブを含むアレイアセンブリであり、数字１〜１０は、それぞれアレイ上に５または６回塗布したオリゴヌクレオチド・プローブを表わし、「Ｍ」は、固定化したビオチン標識オリゴヌクレオチドを含むマーカ混合物を表わす。
【図１４】
ハイブリダイゼーション、共役体形成および銀増強後のプローブ・アレイ（アレイアセンブリ。図１参照）を示す図である。
ターゲット２（１００ｐＭ）−３０℃でのハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体の直接添加（５００ｐｇ／μｌ）；１洗浄ステップ（５５℃）
ａ）左写真：銀増強開始後５分。
ｂ）右写真：銀増強開始後１０分。
【図１５】
銀増強後の時間経過（図１３および１４参照）を示すグラフである。
毎分測定、各測定点は１０回の繰り返しスポットの平均
ｐｍ：完全一致プローブ（プローブ番号３）
ｍｍ：不一致プローブ（プローブ番号４）
ターゲット２（１００ｐＭ）−３０℃でのハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体の直接添加（５００ｐｇ／μｌ）。
【図１６】
大きさ２ｍｍ×２ｍｍで１０×１０＝１００個のプローブを含むアレイアセンブリを示す図であり、数字１〜１０は、それぞれアレイ上に８〜１０回塗布したオリゴヌクレオチド・プローブを表わし、「Ｍ」は、固定化したビオチン標識オリゴヌクレオチドを濃度１０μＭで含むマーカ混合物を表わす。
ハイブリダイズしたターゲット３は、プローブ５，７，９（それぞれ完全一致）およびプローブ６，８，１０（１個の欠失でそれぞれ不一致）に相補的であった。
【図１７】
ハイブリダイゼーションおよび共役体形成後のプローブ・アレイ（アレイアセンブリ。図１６参照）を示す図である。
写真は左から右に銀増強開始後５分，１０分，２０分。
上：ターゲット３（１ｎＭ）−ハイブリダイゼーション
下：ターゲット３（１００ｎＭ）−ハイブリダイゼーション
【図１８】
相異なる２種類のターゲット濃度における銀増強後様々な時点での信号強度（図１７中の写真参照）を示すグラフである。
【図１９ａ】
例としてプローブ５と６を用いた銀増強の時間経過（図１６〜１８参照）を示すグラフである。
プローブの各測定点は７〜１０回の繰り返しスポットの平均。
ｐｍ：完全一致プローブ（プローブ番号５）
ｍｍ：不一致プローブ（プローブ番号６）
ａ：ターゲット３（１ｎＭ）−５５℃でのハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体形成（１２５ｐｇ／μｌ）。
【図１９ｂ】
例としてプローブ５と６を用いた銀増強の時間経過（図１６〜１８参照）を示すグラフである。
プローブの各測定点は７〜１０回の繰り返しスポットの平均。
ｐｍ：完全一致プローブ（プローブ番号５）
ｍｍ：不一致プローブ（プローブ番号６）
ｂ：ターゲット３（１００ｎＭ）−５５℃でのハイブリダイゼーション後、ストレプトアビジン−金共役体形成（１２５ｐｇ／μｌ）。
【図２０】
プローブ・アレイ上の２つの選択したプローブについてのターゲット３（１００ｎＭおよび１ｎＭ）によるハイブリダイゼーション後の直線状回帰線（計算値）を示すグラフであり、銀増強開始後４〜１３分が有効である。
【図１】
2004501667.tif 000004
【図２】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
2004501667.tif 000009
【図２０】
2004501667.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004501667.tif 000011
2004501667.tif 000012
2004501667.tif 000013
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2004501667.tif 000099
2004501667.tif 000100
2004501667.tif 000101
2004501667.tif 000102
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501667.tif 000103
【国際調査報告】
2004501667.tif 000104
2004501667.tif 000105
2004501667.tif 000106
2004501667.tif 000107
2004501667.tif 000108
2004501667.tif 000109