(57)【要約】本発明は液体（１４）中に懸濁された生物学的細胞（１１）と電気接触させるための装置であって、少なくとも１つの開口を有する基板と、該開口上に細胞（１１）を静止させる手段とを具備する装置に関する。更に静止させた細胞（１１）に電気接触させる電極が設けられる。接触ポイント（２３）をもった接触ユニットが上記開口に配置され、その上端が静止させた細胞（１１）の細胞膜に接触するように開口内に突出する。接触ポイント（２３）は上記上端が開口している接触チャンネルを有し、これにより流体力学的真空が細胞膜に付与され、電極が接触チャンネルと電気接触する。更に本発明は流体中に懸濁された生物学的細胞と電気接触させるための方法にも係わり、細胞が基板の開口の上に静止され、この細胞が少なくとも１つの電極によって接触される。静止された細胞（１１）と接触するために、開口を通して延びる接触ポイント（２３）が細胞（１１）の細胞膜上に流体力学的真空を生じさせ、しかして、上記接触ポイント（２３）により電極が細胞（１１）と電気接触をする。
2004502936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体（１４）中に懸濁された生物細胞（１１）に電気接触させるための装置であって、少なくとも１つの開口（３２）を有する基板（３１）と、細胞（１１）を上記開口（３２）上に静止させる手段（３５，３３）と、上記開口（３２）で終り、上記開口（３２）上に上記細胞（１１）を静止させるために流体力学的低圧力が上記開口（３２）に発生させることができる吸引チャンネル（３３）と、静止した細胞（１１）に電気接触させるための電極（４３）とを具備する装置において、
接触ユニット（３６）が上記開口（３２）に配置され、そして接触チップ（３７）を有し、接触チップの上端（３８）は、該上端が細胞（１１）の細胞膜（３９）に当るように上記開口（３２）内に突出し、上記接触チップ（３７）は上端（３８）で終わる接触チャンネル（４１）を有し、この接触チャンネル（４１）を通じて流体力学的低圧を上記細胞膜（３９）に及ぼすことができ、上記電極（４３）が上記接触チャンネル（４１）と電気接続されることを特徴とする、液体（１４）中に懸濁された生物細胞（１１）に電気接触させるための装置。
【請求項２】
上記接触ユニット（３６）が開口（３２）に取り外し可能に配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
接触チップ（２３，３７）は、交換することができるように構成されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
上記吸引チャンネル（３３）が上記基板（３１）の内側に延びることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
吸引チャンネル（３３）の少なくともいくらかの部分が接触ユニット（３６）の内部に進入することを特徴とする、請求項１乃至３に記載の装置。
【請求項６】
接触ユニットが、接触チップ３７を具備する交換可能な上部分５１を有し、再使用可能な下部分（５２）が電極（４３）と接触チャンネル（４１）の第１部分（５４）とを具備することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載の装置。
【請求項７】
接触ユニット（３６）が開口（３２）の領域で基板（３１）の外側に当り、そして上記開口（３２）をその外側で液密にシールすることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
上部分（５１）が基板（３１）の外側に圧接し、下部分（５２）が上部分（５１）に圧接することを特徴とする、請求項１乃至７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
シール材（４７）が基板（３１）と上部分（５１）との間、及び又は上部分（５１）と下部分（５２）との間に設けられることを特徴とする、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
シール材（４７）がシリコーンペースト、２成分エラストマ、及びポリヂメチールシロキサンの群から選ばれることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
チャンバ（５３）が上記下部分（５２）に設けられ、電極（４３）が上記チャンバ（５３）内に突出し、接触チャンネル（４１）の第１セクション（５４）が上記チャンバで終わることを特徴とする、請求項６乃至１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
接触チャンネル（４１）の漏斗形の第２のセクション（５５）が上部分（５１）に配置され、この第２のセクションがチェンバ（５３）に取り付けられ、接触チップ（３７）の中を延びることを特徴とする、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
環状スペース（５８）が接触チップ（３７）の周りで上部分（５１）と基板との間に形成され、この環状スペース（５８）が下部分（５２）の方に面する穴（５９）を有し、この穴（５９）は下部分（５１）の吸引チャンネル（３３）の第１のセクション（６１）に接続されることを特徴とする、請求項６乃至１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
上記環状スペース（５８）が、基板（３１）の方向に、膜（６２）でシールされ、この膜は接触チップ（３７）を或る距離で取り囲むギャップ（６３）を有するすることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
膜（６２）が上部分（５１）に固定されていることを特徴とする、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
基準電極（４４）が開口（３２）の区域で液体（１４）内に突出することを特徴とする、請求項１乃至１５のいずれかに記載の装置。
【請求項１７】
細胞（１１）を静止させる手段として、機能的コーティング（３５）が開口（３２）の周りで基板（３１）に設けられていることを特徴とする、請求項１乃至１６のいずれかに記載の装置。
【請求項１８】
上記機能的コーティングがポリアニオン、ポリカチオン、ポリエチレンアイミン、インテグリン（例えばフイブロネクチン）、或いはレクチンのような、細胞表面分子に対する抗体、或いは磁気コーティングの群から選ばれることを特徴とする、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
細胞（１１）を開口（３２）上に位置決めするための位置決めユニット（２１）を特徴とする、請求項１乃至１８のいずれかに記載の装置。
【請求項２０】
位置決めユニット（２１）がレーザピンセットからなることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
位置決めユニット（２１）が磁界を確立することを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２２】
位置決めユニット（２１）が流体力学的力を発生することを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２３】
基板（３１）がフローチャンネル（１６）に配置され、好ましくは該フローチャンネル（１６）の壁と一体部分であり、該チャンネル（１６）を通して、液体（１４）が一定の及び或いは調節可能な搬送流（２６）と共に開口（３２）に差し向けられることを特徴とする、請求項１乃至２２のいずれかに記載の装置。
【請求項２４】
センサユニット（１８）が細胞（１１）のパラメータに反応し、且つ位置決めユニット（２１）及び又は吸引チャンネル（３３）を制御することを特徴とする、請求項１乃至２３のいずれかに記載の装置。
【請求項２５】
パラメータが蛍光、吸収、反射、屈折、回折等の光学的パラメータ、寸法、長さ、直径、形状等の幾何学的パラメータ、容量、抵抗などの電気的パラメータ、生物学的、化学的、物理的細胞パラメータの群から選ばれることを特徴とする、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
センサユニット（１８）が開口（３２）の上流に配置されていることを特徴とする、請求項２４又は２５に記載の装置。
【請求項２７】
静止させた細胞（１１）にテスト物質を付与するためのマイクロ灌流ユニット（１９）が開口（３２）の上流に配置されていることを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項２８】
マイクロシステム技術を用いて少なくとも部分的に生産されることを特徴とする、請求項１乃至２７のいずれかに記載の装置。
【請求項２９】
液体（１４）中に懸濁された生物細胞（１１）に電気接触させるための方法であって、
細胞（１１）を、好ましくは流体力学的低圧力を発生させることによって基板（３１）に設けられた開口（３２）上に静止させるステップと、
少なくとも１つの電極（４３）により、静止させた細胞（１１）に接触させるステップと、よりなる方法において、
開口（３２）内へ突出する接触チップ（３７）を通して細胞（１１）の膜（３９）に流体力学的低圧力を付与することによって、静止させた細胞（１１）に接触させ、電極（４３）が接触チップ（３７）を通して細胞（１１）に電気的に接触し、そして静止により、細胞（１１）が接触チップ（３７）に圧力を及ぼすことを特徴とする液体（１４）に懸濁された生物細胞（１１）に電気接触させるための方法。
【請求項３０】
接触チップ（３７，２３）が接触前毎に交換されることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
液体（１４）がフローチャンネル（１６）を通る調節可能な搬送流（２６）と共に開口（３２）に差し向けられることを特徴とする、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞（１１）が開口（３２）の周りで基板（３１）に配置された機能的コーティング（３５）に付着させることによって静止されることを特徴とする、請求項２９乃至３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
細胞（１１）が位置決めユニット（２１）によって開口（３２）の上に位置決めされることを特徴とする、請求項２９乃至３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
細胞（１１）を位置決めする前に細胞（１１）のパラメータが測定され、そして細胞（１１）が該パラメータに基いて位置決めのために選択されることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞（１１）は、位置決めユニット（２１）により機能的コーティング（３５）の上に位置決めすることによって選択され、次いで位置決めユニットは、機能的コーティング（３５）に反応した細胞のみが静止されたままであるように細胞を解放することを特徴とする、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３６】
細胞が機能的コーティング（３５）に加えて、流体力学的低圧力によって静止されることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞は、静止のために付与された低圧力を高圧力に上昇させることによって開口（３２）から除去される、請求項２９乃至３６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は液体中に懸濁された生物学的細胞に電気接触させるための装置に関し、該装置は、少なくとも一つの開口を有する基板と、該開口に細胞を静止させる手段、好ましくは、開口に細胞を静止させるために、流体力学的低圧力を発生させることができる、開口の中へ突出する吸引チャンネルと、静止させた細胞に電気接触させるための少なくとも一つの電極とを具備する。
更に本発明は液体中に懸濁された生物細胞に電気接触させる方法にも係わり、次のステップ、即ち、好ましくは流体力学的低圧力を発生させることによって基板に設けられた開口の上に細胞を静止させ、そして少なくとも一つの電極を経て静止させた細胞に接触させる、ステップを含む。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ＤＥ１９７１２３０９Ａ１号にはこのような形式の装置及び方法が開示されている。
公知の装置はマイクロ電極構造を具備し、このマイクロ電極構造では、底に電極を設置したマイクロキュベット内に細胞が捕捉される。この電極は中央吸引チャンネルを持ち、電極の下に延びる適当な接続チャンネルを経てこの吸引チャンネル内に低圧力を発生させることができる。このようにして、個々の細胞を電極に選択的に引きつけ、ある接触圧で前記電極上に細胞を静止させる事が出来る。
従ってこの公知の装置は細胞膜の外側からではあるが細胞の測定に用いる事が可能である。
【０００３】
この形式のマイクロ電極構造は生物細胞を研究するのに一般に用いられる。このマイクロ電極構造は、例えば、細胞を刺激し、或いは電位を取り出すのに役立つ。研究は生物学的環境或いは人工的環境出行われる。これに関して、この構造は、支持要素に、即ち基板上に、寸法がほぼ細胞の大きさ程度、即ち数ミクロンから数十ミクロンの範囲にある複数個の微小電極を具備する。
従来のマイクロ電極構造においては、細胞がどうにかこうにか特定の電極に着くのは多少偶然に依存する。実際には、細胞は一般に部分的な範囲でのみ電極に着き、細胞の刺激又は細胞電位の取り出しがこの小さな領域に限られる。
【０００４】
冒頭に述べたＤＥ１９７１２３０９Ａ１に開示された装置は、特にどのマイクロ電極にもたった１個の細胞が着くようにすることによってこれらの欠点の大部分を除去するけれども、この装置は、マイクロキュベットに細胞が捕捉されたかどうか、またどの細胞が捕捉されたかについてやはり、依然として偶然の問題である。更に、液体中に存在する粒子がマイクロキュベット内に吸い込まれことを除外することはできず、粒子が吸い込まれると、測定は行えるが、その結果は使用出来ない。
公知の装置及び公知の方法の他の欠点は細胞膜の外側についてだけ測定を行うことができるに過ぎない事実である。細胞内測定は不可能である。
【０００５】
然し、このような細胞内測定は「膜パッチクランプ」を使用する 「パッチクランプ」技術を用いて行うことが出来る。例えばＮｅｈｅｒ 及びＳａｋｍａｎｎ著，「Ｄｉｅ Ｅｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｖｏｎ Ｚｅｌｌｓｉｇｎａｌｅｎ ｍｉｔ ｄｅｒ Ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ Ｔｅｃｈｎｉｋ．」誌， １９９２年５月発行， ４８頁の記事を参照されたい。
この技術では、導電性液体で充たされたマイクロピペットを付着性細胞に選択的に近づけ、且つ細胞膜上に下げ、その結果、細胞膜は内方に僅かに膨らむ。次いで、ピペットチップで囲まれた膜パッチが低圧力によってわずかに吸引され、それによって、膜パッチをシールして膜パッチを周りの液体から電気的に隔絶する。この隔絶はギガシールとも称される。
【０００６】
このようにして、例えば膜の外側のイオンチャンネルの測定を行うことが可能である。
然し若しシールされた膜が更に吸い込まれると、膜パッチに穴が明けられるので、ピペットオリフィスを通して細胞内部にアクセスする。細胞内部は、周りの液体から流体力学的に且つ電気的にシールされ、細胞内部の測定や刺激を可能にする（”全細胞パッチ”）。
【０００７】
欠点として、このパッチクランプ技術は、付着した、さもなければ静止した細胞にしか実施することが出来ない。それは、各々の場合、壊れ易いガラスピペットをマイクロマニピュレータによって静止した細胞に近づけなければならないからである。このため同時に接触できる細胞の数が極端に限られ，多数の細胞が処理出来るのはシーケンス方式によってのみである。
従ってこの方法は例えば薬物スクリーニング、物質スクリーニング等の分野で必要とされるような大量研究には不適当である。
従来のパッチクランプ技術の他の欠点は、自動化することができず多くの経験と手作業の熟練をもつ作業者によって手動で行われる事実である。
【０００８】
ＤＥ１９８２７９５７Ａ１によれば、細胞の付着性を改善する為に表面がリング構造の輪郭を有するガラス支持体上に細胞を静止させる事が知られている。細胞内部測定を意図し、先鋭なリング状チップが細胞膜を切り込む円錐形に突出した電極がほぼ細胞支持領域でガラス支持体上に配置される。この電極は中空チャンネルを有する筒状電極として設計され、中空チャンネルを通して低圧力が細胞膜に与えられ、細胞を固定し及び又は細胞膜に穴をあける。
細胞が支持領域に達する過程は説明されてない。公知装置はリング状電極チップの電気シールが有形表面に及ぼされる細胞の付着力によってのみ決定されると言う欠点を有する。公知装置で大量研究を行うことはできない。
【０００９】
この背景に対し、本発明は冒頭に述べた種類の方法及び装置を、上述の欠点を回避する様に改善する目的に基く。特に、本発明は、膜の外側の測定と細胞内部の測定の両方を行うことができるようにするために、細胞に電気的に接触するための、自動化でき、効率的で汎用的に有用な解決策を提供することにある。この新規な方法は簡単な自動化方法で実施することが可能でなければならず、またこの新規な装置は簡単に方法で構成されなければならない。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
冒頭に述べた装置では、この目的は開口内に接触ユニットを配置し、接触ユニットが接触チップを有し、このチップの上端が静止した細胞の細胞膜に当たるように上記開口の中へ突出し、この接触チップがその上端で終わる接触チャンネルを有し、これを通して流体力学的低圧力が細胞膜に及ぼされ、電極が上記接触チャンネルと電気接触することによって達成される。
冒頭に述べた方法では、この目的は、静止した細胞に接触するために開口の中へ突出する接触チップを通して細胞膜に流体力学的低圧力を及ぼし、電極が接触チップを通じて細胞に電気的に接触し、上記静止により、細胞を該接触チップに押しつける事になることによって達成される。
このようにして、本発明による目的が完全に達成される。
【００１１】
接触チップ上での細胞の静止により、同時に細胞膜を内方に膨らませる。静止の手段、好ましくは、吸引チャンネル内の低圧力により、静止に加えて、細胞膜と接触チップとを接触させ、更に細胞膜が接触チップに圧力を及ぼすことになる。パッチクランプチップが開口の中へ突出し、このチップを通して電気信号を膜の外側で及び又は細胞内で測定するすることができ及び又は印加することができる。
【００１２】
静止手段によって引き起こされる付着圧力は接触圧力とは無関係で別物であるから、接触チップの直径を非常に小さすることができ、信頼できるギガシール及び良好な穴あけを可能にする。開口の直径は接触チップの直径より明らかに大きく、その結果、付着圧力が大変高く、細胞を吸引チャンネルに吸い込むことなく、或いは接触チャンネルにすら吸い込む事がない。
このようにして、電極を介して再び記録されことになっている特定の細胞反応を生じさせるために、物質が細胞の外側に沿って流れるような灌流によって安定した長期間の測定も可能である。
【００１３】
接触チップが開口の中へ突出するから、吸引チャンネルによって細胞を開口に吸い付けることにより、接触チップの領域で細胞膜を内方に膨らませ、これは接触チャンネルを通して僅かに低い圧力が膜パッチに及ぼされた時に良好なギガシールを作るため、手操作のパッチクランプ技術においても望ましい。従って、短時間パルスの形態の接触チャンネルの低圧力を増す事によって本来公知の再現可能な方法で膜パッチに穴を明ける事が可能である。
【００１４】
本出願の発明者は吸引チャンネルと接触チャンネルの分離が開口の上に細胞の信頼性のある自動位置決め及びパッチクランプ技術に続く細胞の接触を可能にすることが分かった。
優先権主張日は早いが先行技術の公開ではないＤＥ１９９４８４７３Ａ１には、細胞が吸引チャンネルで基板の開口に吸引され、そして電極が吸引チャンネル内で下流に配置され、この吸引チャンネルに囲まれた膜パッチが短い圧力パルスによって灌流されていれば、吸引チャンネル内の導電性液体を通じて細胞膜の外側と細胞内の両方の測定が出来る装置が開示されている。
【００１５】
この装置は吸引及び接触チャンネルとして働くたった１つのチャンネルを含み、従って、このチャンネルは適当な付着力を細胞に及ぼすことができるようにするため比較的大きな内径を有する事が必要である。ここで低圧力を付与する事はギガシールをも生じるが、これは本発明者の見解によれば、本発明の装置の様に信頼に足るものではない。その上、吸引された細胞の膜は内方に膨らまず、反対に外方に膨らみ、吸引チャンネルへ吸い込まれるので、効果的な膜領域は時間と共に変化し、長期の安定した測定は不可能となる。
【００１６】
本発明による装置の改良点では、接触ユニットが取り外し可能に開口に配置されるようにし、更に接触チップが取り替え可能に配置されるようにする。
便利には、接触ユニット及び又は接触チップを容易に取り替えることが可能であり、この新規な装置の他の構成部品は再使用可能である。このやり方はパッチクランプチップが１回だけしか使えない事、そして２回目以降はギガシールが最早十分でなく、膜の穿孔が最早信頼できないと言う見解に基く。
【００１７】
これについて、基板の内側に吸引チャンネルが延びるようにし、他方では、この吸引チャンネルの少なくともあるセクションが接触ユニットの内側に延びることも可能である。
吸引チャンネルが基板の内側に延びるならば、接触ユニットを非常に簡単且つ安価に構成することの可能性は有利である。然し、吸引チャンネルのあるセクションが接触ユニットの内側に延びる場合には、吸引チャンネルと接触チャンネルの両方の外部接続が接触ユニット自体において簡単な仕方で行われ、それによって、取り扱い及び構造を単純化する。
【００１８】
接触チップを含む交換可能な上部分と電極及び接触チャンネルの第１セクションを含む再使用可能な下部分を有する接触ユニットに更に優位性が与えられ、この接触ユニットは開口の領域で基板の外側に接し、開口をその外側で液密にシールするのが好ましく、更に上部分は基板の外側に圧接し、下部分は上部分に圧接するのが好ましい。
この対策は次の利点を有する。接触チップを交換するために接触ユニットの上部分のみを取り替えれば良い。下部分と上部分が互いに圧接し、且つ基板に圧接するから、ネジ止め或いは同様の作業は不要であり、交換は例えばマイクロマニュプレータを使用して自動化された簡単な仕方で行うことが出来る。
【００１９】
これに関して、基板と上部分との間、及び又は上部分と下部分との間にシール材を設けるようにする。このシール材はシリコーンペースト、２成分エラストマ、及びポリヂメチールシロキサン・エラストマ（ＳＹＬＧＡＲＤ 商品名）の群から選ばれるのが好ましい。
この対策は基板と、上部分と下部分との間に小さい圧力でも良好な液密シールが起り、正確度と及ぼす圧力の両方について、マイクロマニュプレータになされる要求は、例えばシールのためにワッシャが使用されたとした場合よりも低い。　更に、電極が突出し、接触チャンネルの第１のセクションが終わるチャンバを下部分に設けるようにする。
【００２０】
ここで電極及び接触チャンネルの第１セクションは有利には再使用可能な下部分に配置されるので、測定を行うためのコストが接触チップと接触チャンネルの第２セクションだけを支持する交換可能な頂部分のみによって決定される。
これに関して、漏斗状の第２接触チャンネルセクションがこれはチャンバに取り付けられ、そして上部分に配置された接触チップの中を延びるようにする。
更に、リングを上部分と接触チップのまわりの基板との間に設けるようにし、このリングは、下部分の方向に穴を有し、この穴は下部分の吸引チャンネルの第１セクションに接続される。
【００２１】
この簡単な方法では、吸引チャンネルを接触ユニットに一体化することが出来る。この吸引チャンネルは下部分から穴を経て接触チップのまわりの環状スペースへ延び、そして細胞を開口に、そして接触チップに吸い付ける。ここでもっと有利なことは、マイクロシステム技術によって、即ち微小構造形態で他のすべての部品と同様に作ることができる非常に簡単に構成されるが上部分のみを交換すればよいことである。
【００２２】
改良では、環状スペースが接触チップを或る距離で取り囲むギャップが設けられた膜で基板の方向にシールされるようにしている。
ここで、基板の開口は、有利には、吸引チャンネルがこの開口に細胞を吸引するギャップよりも明確に大きくできる。このようにして、開口の領域にギャップを配置するようにすれば良いから、マイクロマニュプレータの操作正確度の要求が低くてすみ、外側に向かうシールが、有利には頂部分に固定される膜によってなされる。
【００２３】
一般に、基準電極が開口の領域で液体内に突出するようにしている。
有利には、このやり方は電極と基準電極の空間的な接近により、細胞膜上或いは細胞内の電位を非常に信頼をもって再現的に測定することを可能にする。
一般的には、細胞を静止させる手段として、基板に開口のまわりに機能的コーティングを設けるようにしている。
この方策は接触させるべき細胞を選択するのに有利に役立つ。一般的な装置及び一般的な方法に対して、上記方策はそれ自身でも新規で創造性がある。機能的コーティングを用いることは、今や色々な細胞の懸濁物から特定型の細胞を選択してこれに接触することを可能にする。細胞自身に適合させた機能的コーティング上に静止される細胞だけが測定に用いられる。
【００２４】
これに関して、機能的コーティングはポリアニオン、ポリカチオン、ポリエチレンイミン，イングリン（例えばフィブロネクチン）又はレクチンのような細胞表面分子に対する抗体、及び磁性コーティングの群から選択される。
ポリアニオン、ポリカチオン、ポリエチレンイミンを選ぶ事により適当な化学的静止化が得られるが、機能的コーティングの適当な抗体による静止化が所望な細胞表面分子について特異性を生じさせることができる。
【００２５】
機能的コーティングが磁性コーティングからなる場合は、細胞懸濁物に前もって加えられ、特定の細胞表面分子にくっ付けた磁性抗体を捕捉する事が可能である。特定の磁性抗体を選択する事は、細胞懸濁物から、この方法で正確に決定することができる細胞を静止させることを可能にする。磁性粒子に結合された抗体は先行技術で知られており、マサツセッツ、ケンブリッジのＰｅｒ Ｓｅｐｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄによって販売されている。“Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ”１９９５年、Ｖｏｌｕｍｅ９，１８−１９頁， Ａｈｅｒｎ著 ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｍａｋｉｎｇ Ｔｈｅｉｒ Ｗａｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ” の論文を参照。
【００２６】
吸引チャンネルのような静止手段は、更に静止それ自体の結果、細胞膜と接触チップとを接触させ、接触チップに差し向けられた力が細胞膜に与えられると言う作用を有する。
これに関して、開口の上に細胞を位置決めする為に、位置決めユニットを設けるようにし、該位置決めユニットはレーザピンセットからなっても良いし、電磁界を確立しても良いし或いは流体力学的力を発生させても良い。
【００２７】
しかして、一方では、位置決めユニットは流体力学的力を発生させる吸引チャンネルでまさに代表され、さもなければ、吸引チャンネルとは無関係に、或いはこの吸引チャンネルに加えて、例えばレーザピンセット或いは電磁界を設けても良い。
レーザピンセットはこの技術においては良く知られており、これらの光学的ピンセットは運動量保存の法則に基く光学的マニュプレータである。
【００２８】
レーザ光に対して実質的に透過性である物体は如何なるエネルギーをも殆ど吸収せず、屈折の法則に基きビームをもとの方向からそらす。この屈折は細胞に対しこれを動かす衝動を与える。このようにして、１対の対称のレーザビームは細胞を保持するトラップを形成する。細胞はビームを動かす事により動かされる。Ｓｐｅｋｔｙｕｍ ｄｅｒ ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ誌 １９９８年７月号、５６頁、 Ｂｅｒｎｓ 著、表題”Ｍｉｔ Ｌａｓｅｒｗｅｒｋｚｅｕｇｅｎ ｉｎｓ Ｚｅｌｌｉｎｎｅｒｅ” の論文参照。
【００２９】
この位置決めユニットにより、例えば機能的コーティングの上に細胞を置くことが可能である。その後、もし位置決めユニットが細胞を解放するならば、細胞は、これをコーティング機能的により静止させることができる場合にのみ開口上に留まる。この事は簡単に細胞を選択することを可能にする。若し細胞が位置決めユニットによって解放された後、装置の搬送流によって移動されるならば、ネガティブな選択がなされ、さもなければ、選択はポジティブである。
このようにして、種々細胞の懸濁物から、特に、装置と接触されることになる細胞を取り上げる事が可能である。一般的な装置、及び一般的な方法におけるこの選択も新規にして創造性がある。
【００３０】
これについて、基板がフローチャンネルに配置され、好ましくは、液体が一定及び／又は調節可能な搬送流で開口に差し向けられるフローチャンネルの壁と一体の部品であり、そして細胞のパラメータに作用し、且つ位置決めユニット及び／又は吸引ユニットを制御するセンサユニットが設けられるのが好ましい。
基板は、例えばフローチャンネルの壁に垂直な、従って、流れに垂直な位置にあり、かくして、流れは、基板に向かって流れることが出来る。
センサユニットも細胞を選択するのに役立ち、機能的コーティングと同様に、一般的な装置及び一般的な方法においてこれ自体新規にして創造的である。
【００３１】
これについて、パラメータは蛍光、吸収、反射、回折、屈折、のような光学的パラメータ、寸法、長さ、直径、形状、のような幾何学的パラメータ、容量、抵抗、などの電気的パラメータ、及び生物的、化学的、物理的細胞パラメータの群より選択される。
【００３２】
センサユニットはなるべく開口の上流に配置される。
このセンサユニットは、細胞を、特に、調節可能な搬送流及び又は位置決めユニットに関して、選択することを可能にする。若しセンサユニットが、接触されるべき細胞を、測定したパラメータに基いて認識するならば、これは位置決めユニット及び／又は吸引チャンネルにリレーされ、そしてこれは、センサユニットで選択された細胞がその領域にある時に設定された既知の搬送流に従い作用する。吸引チャンネルのすぐ上流に別のセンサユニットを設けることも可能であり、これは細胞を探し、其の瞬間にその場所を吸引チャンネル及び又は位置決めユニットに報告するのに役立つ。
【００３３】
センサユニット及び、場合により設けられる別のセンサユニットは機能的コーティングよりも遥かに効果的な選択を可能とするが、センサユニット、位置決めユニット及び機能的コーティングの組み合わせは接触されるべき細胞の非常に正確な選択を可能にする。
一般に、テスト物質が静止した細胞のまわりに流れるようにするために開口の上流にマイクロ灌流ユニットを配置するようにし、装置の部品はマイクロシステム技術を用いて作られるのが好ましい。
このようにして、少量の物質が静止した細胞に流れることが可能である。費用効果の作動を与える。
【００３４】
新規な方法では、接触の前毎に接触チップを取りかえるようにする。
新しい接触チップを新たな接触ごとに用い、若し望まれるならば、ギガシールの信頼性のある形成、及び包囲された膜パッチの信頼性のある穿孔を確保する事が有利である。
その上、調節可能な搬送流で液体をチャンネルを通して開口に差し向けるようにする。
【００３５】
ここで、懸濁した細胞は既知の時間シーケンスで開口を通り越して浮くので、プロセス制御装置が正確な時間で吸引チャンネルを扱うことができる。
更に、開口のまわりで基板に配置された機能的コーティングに付着することによって細胞を静止させるようにし、位置決めユニットは開口の上に細胞を位置づけるのが好ましく、更に細胞を位置決めする前に該細胞のパラメータの測定及びこのパラメータに基づき位置決めするための細胞を選択するのがもっと好ましい。
有利には、ここでは全く純粋な細胞で働らく必要はなく、むしろ、混合した細胞懸濁物から、接触のための所望な細胞型を選び出す事も可能である。
【００３６】
これに関連して、位置決めユニットによって機能的コーティングに細胞を位置決めすることによって細胞を選択するようにし、次いで、位置決めユニットは細胞を解放し、その結果、機能的コーティングに付着された細胞だけが静止されたままである。
原則として、位置決めユニットを通り越して浮いているどんな細胞をも、細胞に接触させるべきか、さもなければ、細胞を解放することができるかについて機能的コーティングによりテストするのが好ましい。
【００３７】
これに関して、機能的コーティングに加えて、流体力学的低圧力で細胞を静止させるようにする。
この手段は、機能的コーティングにより選択された細胞に加えられる信頼性のある付着力が選択され、その結果、この細胞を長時間の測定中、たとえば灌流によりしっかりと抑えることが可能である利点を有する。
【００３８】
最後に、静止の為に与えられた低圧力を高圧力に増加することによって開口から細胞を除去するようにする。
有利には、測定と刺激段階の終わった後に細胞を再び能動的に押し離すことが可能である。
【００３９】
要するに、新規な装置、及び新規な方法は少なくとも１つの基準、即ち細胞パラメータにより、懸濁物から個々の細胞を選択し、測定部で、即ち開口で懸濁物から選択された個々の細胞を位置決めし且つ静止させる可能性を提供する。この静止は吸引チャンネルにより、即ち流体力学的低圧力を用いて及び又は機能的コーティングにより行われる。
【００４０】
伝統的なパッチクランプ技術の方法によれば、高抵抗シールを形成する目的の為接触チャンネルによって細胞が吸引され、ここで圧力パルスによって吸引され且つシールされた膜に任意に孔を明けることが可能である。
静止され且つ接触された細胞がテスト物質を含んだ液体で灌流されるので、自動的な方法で、同時に伝統的なパッチクランプ技術を利用して、多数の細胞に連続的に研究を続ける事が可能である。
更なる利点は詳細な説明及び添付図面から理解することができる。
【００４１】
上記の特徴及び以下に示す特徴は本発明の範囲から外れる事なく、ここに説明した組み合わせの各々ばかりでなく、他の組み合わせ或いはそれ自体にも用いることができることは明らかである。
本発明の実施形態を図面に示し、そして以下の説明でより詳細に示す。
【００４２】
【発明の実施の形態】
図１において、数字１０は、貯溜槽１２に貯えられた液体１４内に懸濁された細胞１１に電気的に接触するための装置を示す。
貯溜槽１２は切り替えバルブ１５と接続され、これを通して液体１４がフローチャンネル１６に流されるがここで細胞１１が後述する様に電気的に接触される。
切り替えバルブ１５には洗浄溶液用の流入部１７も接続され、細胞１１が分析された後、フローチャンネル１６を洗浄溶液で洗い流すことが出来る。
フローチャンネル１６には、先ずセンサユニット１８が配置され、これにより細胞１１のパラメータが測定される。
センサユニット１８に続いてマイクロ灌流ユニット１９があり接触された細胞を灌流するために、即ち、テスト物質が細胞に流れるようにするために、この灌流ユニット１９を通して灌流溶液２０をフローチャンネル１６に導入することができる。
このマイクロ灌流ユニット１９に続いて、位置決めユニット２１があり、これにより細胞１１を接触及び測定ユニット２２に位置決めして、そこに静止させることができる。
この位置決めユニット２１は、例えば、センサユニット１８の出力信号に基いて制御される。
【００４３】
図１は接触及び測定ユニット２２における従来のパッチクランプチップ２３を更に示し、これにより後述するよう細胞１１の膜の外側の測定を、又細胞内測定も自動的に行うことが可能である。
パッチクランプチップ２３の上流には、別のセンサユニット１８’が配置され、図１に示す実施形態では、接触、及び測定ユニット２３内に配置される。この別のセンサユニット１８’はフローチャンネル１６内の個々の細胞を光学的方法及びその他の方法で探して、測定チャンネルを介して前記個々の細胞の吸引を制御することができるが、これについては以下に詳述する。
【００４４】
センサユニット１８は吸引されるべき細胞を選択する働きをし、別のセンサユニット１８’は、細胞を位置決めユニット２１及び又は吸引によりパッチクランプチップ２３と接触させることができるような方法で、その瞬間に、個々の細胞の場所を決定する仕事を有する。
接触及び測定ユニット２２に続いて、第２のセンサユニット２４があり、センサユニットに続いて、フローチャンネル１６内の液体１４の搬送のための制御器２５があり、この流れを２６で示す。最終的には、フローチャンネル１６は液体１４と洗浄液１７とを集める容器２７で終わる。
【００４５】
最後に、図１はプロセス制御及びデータ処理機２８もを示し、これにより装置の個々の構成部品が制御され、互いに機能的にリンクされる。
搬送流２６はプロセス制御及びデータ処理機２８で調節され、各々の場合に、センサユニット１８を１つの細胞が通流し、特定のパラメータについてここで分析され、そして位置決めユニット２１によって選択された場合には、接触及び測定ユニットに位置決めされる。
【００４６】
位置決めユニット２１は、例えば、レーザピンセットであっても良いし、さもなければ磁界を確立しても良く、磁気粒子に結合され且つ細胞１１の表面にある抗体が磁界により測定部に送られる。
更に、位置決めユニット２１に加え或いはこれに代えて、図２と関連して後述するように接触及び測定ユニット２２に細胞１１を静止させる為の流体力学的低圧力を用意する事も可能である。
【００４７】
センサユニット１８はここでは、光学的、電気的、幾何学的或いはその他生物学的、化学的又は物理的な細胞パラメータを記録し、このパラメータをプロセス制御及びデータ処理機２８に報知することの目的で設計され、そしてプロセス制御及びデータ処理機はそのパラメータに基き適当であると分かった細胞が既知の搬送流２６により接触及び測定ユニット２２の領域に達した時に位置決めユニット２１及び又は接触及び測定ユニット２２に適切に扱う。
接触及び測定ユニット２２はマイクロシステム技術を用いてマイクロ構造部品として設計され、かくして小さい寸法を有する。
【００４８】
図２は図１の装置１０の一部分を拡大して概略側面図で示す。フローチャンネル１６は基板３１の形態の壁を有しこれに開口３２が設けられ、接触されるべき細胞１１がこの開口に位置決めされる。吸引チャンネル３３が開口３２で終わり、この吸引チャンネルはポンプ３４に接続され、細胞１１を吸い付けるために、これを経て流体力学的圧力を開口３２内に設定することができる。
吸引チャンネル３３に加えて細胞１１を静止させるように働く機能的コーティング３５が細胞１１に面して開口３２の周りで基板３１上に設けられる。細胞１１が開口３２上に位置決めされたならば、ポンプ３４の低圧力が遮断され、細胞１１が機能的コーティング３５に引き付けられるならば、細胞１１が該コーティングに付着するに過ぎず、さもなければ搬送流６によって洗い流される。然し、次いでポンプ３４が実際の測定の為再び起動されるので、細胞１１は開口３２上にしっかりと静止される。
【００４９】
しかして、開口３２上の最初の位置決めは細胞１１が化学的静止又はそれ自体で静止される抗体による静止をもたらす機能的コーティング３５に引き付けられるかどうかをテストするのに役立つに過ぎない。
機能的コーティング３５はそれ自身細胞１１上に位置する磁気粒子に結合される抗体を引き留める磁気皮膜であっても良い。
この開口３２上の細胞１１の最初の位置決めは吸引っチャンネル３３によらずに、図１の位置決めユニット２１によって行われても良い。
【００５０】
交換可能な接触チップ３７が配置されている取り外し可能な接触ユニット３６が細胞１１から離れて基板３１上に配置される。接触チップ３７の上端３８は細胞１１の細胞膜に当り、その結果、膜がやや内方へ膨らむ。
接触チャンネル４１が接触チップ３７の中を延びてチップ３７の上端３８で終わる。他端では接触チャンネル４１はポンプ４２に接続され、これにより、流体力学的低圧力を調節することができる。
接触チャンネル４１に存在する導電性液体を経て細胞膜３９に電気的に接続される電極４３が上記接触チャンネル４１内に突出する。適当な対向電極は基準電極４４であり、開口３２の領域でフローチャンネル１６内に突出する。
【００５１】
吸引チャンネル３３は細胞１１を開口３２に静止させるだけでなく、細胞膜３９を接触チップの上端３８に押しつけるが、この接触は従来のパッチクランプ技術におけるように接触チャンネル４１に僅かな低圧力を付与する事により起る。接触チャンネル４１に圧力パルスが発生されると、接触チップ３７により囲まれた膜パッチが穿孔され、かくして細胞測定及び刺激を可能にする。
【００５２】
灌流チャンネル４５もフローチャンネル１６で終わり、テスト物質が上記細胞の周りに流れるようにするため、又該テスト物質に対する細胞１１の反応を測定するため、チャンネルを通して静止され且つ接触された細胞１１に灌流液２０を差し向けることができる。
【００５３】
図３の概略イメージシーケンスは細胞１１の接触及び測定 ／ 刺激の過程を示す。
第１列の最初のイメージでは、細胞１１を運んでいる液体１４がフローチャンネル１６の中を流れる。同様に液体１４は吸引チャンネル３３を通ってフローチャンネル１６の内部に流入する。
細胞１１が開口３２の領域に達したとき、流体力学的低圧力が吸引チャンネル３３により発生され、第１列の第２イメージに示す様に、細胞が開口３２に吸引される。
【００５４】
第１列の最後のイメージは、膜３９を内方に膨らませて、従来のパッチクランプ技術の場合の様に接触チップ３７の上端３８に静止させた細胞１１を示す。しかしながら、この従来技術に対し、新規な本装置及び方法における接触は、接触チップに運ばれ、其処に自動的に静止され、接触チップ３７に押しつけられる細胞１１によって起る。
【００５５】
第２列の最初のイメージは通常のパッチクランプ技術の方法で静止した細胞に接触するように低圧力が接触チャンネル４１に付与されることを示す。接触チャンネルの低圧力がパルス状に増加すると第２列の第２イメージに示すように、膜パッチが破られ、細胞内測定を可能にする。吸引チャンネル３３の吸引圧力と接触チャンネル４１の低圧との組み合わせの結果、従来のパッチクランプ技術におけるように、細胞膜３９と接触チップ３７の上端３８との間にギガシールが作られる。然し、ここではギガシールは細胞膜３９と上端３８の小領域との間に形成され、ＤＥ１９８２７９５７Ａ１の冒頭記載の様に大きな支持領域ではない。
測定 ／ 刺激が終わった後、接触チャンネル４１内の低圧力は遮断され、高圧が吸引チャンネル３３内に付与され、その結果、細胞１１が搬送流２６の中へ再び解放され、搬送流は細胞を除去する。
【００５６】
第３列の左のイメージは接触チップが開口３２から取り除かれ、第３列の第２イメージに示す様に、新しい接触チップ３７が取り付けられることを示す。
接触チップ３７が交換された後、フローチャンネル１６と吸引チャンネル３３と接触チャンネル４１は先ず液体で洗浄されシステムを新たな細胞１１に接触させるための準備をする。
接触チップはマイクロマニュプレータにより自動的に交換されるので、新規な本装置１０を用いて、多数の細胞を自動シーケンス方法で接触及び測定 ／ 刺激する事が可能である。
【００５７】
図４は交換可能な接触チップ３７の非常に簡単に構成された第１の実施形態を示す。
図示した実施形態では、接触チップは図１から既に知られるように、従来のパッチクランプチップ２３である。このパッチクランプチップ２３は、基板３１に外側から押しつけられるプラスチックブロック４６内に埋め込まれるので、パッチクランプチップ２３が開口３２内に突出する。好ましくは、シルガード（ＳＹＬＧＡＲＤ 商品名）を用いて調製されるシール材４７が外面から開口３２を液密状態にシールする。
図示の実施形態では、パッチクランプチップ２３は基板３１を通り越してフローチャンネル１６内に僅かに突出するから、吸引チャンネル３３により開口に吸引して開口に押しつけられた細胞１１の膜３９が４８で示す様に膨らみ、これは手作業で行なわれるパッチクランプ技術の場合でもそうである。
【００５８】
図４の上方イメージはフローチャンネル１６に当っているプラスチックブロック４６を示し、下方イメージは電極４３を接触チャンネル４１内に配置したプラスチックブロック４６を示す。略示に過ぎないマイクロマニュプレータはプラスチックブロック４６に作用する。このマイクロマニュプレータ４９はプラスチックブロック４５を基板３１に押しつけ、プラスチックブロック４５を基板３１に圧力で引き留め、既述した液密シールを生じる。
図４に示す接触ユニット３６は非常に簡単に構成され、そして本質的には、プラスチックブロック４６に埋め込まれた従来のパッチクランプチップ２３よりなる。
【００５９】
図５は接触ユニット３６の他の実施形態を示す。図５の接触ユニット３６は交換されるべき上部分５１と再使用可能の下部分５２とを有する。接触チャンネル４１を持った接触チップ３７は上部分５１に配置され、電極４３が突出するチャンバ５３は下部分５２に設けられる。第２の漏斗状セクション５５が上部分５１に配置された接触チャンネル４１の第１のセクション５４は同様にチャンバ５３に通じている。
図４から既に知られたシール材４７は上部分と下部分との間に置かれ、そして上部分と基板との間にも設けられる。
図５の接触ユニット３６は非常に簡単な構造を持ち、容易に位置決めすることができ、接触チップ３７の交換は上部分５１を外すだけで良い。
この目的の為、接触ユニット３６全体はマイクロマニュプレータを用いて基板３１から取り外され、続いて上部分５１を交換し、新しい上部分５１と共に下部分５２を基板３１に再び押し付ける。この交換は自動化も出来、手動の交換に比し相当な時間の節約になる。
【００６０】
図６の接触ユニット３６の実施形態では、接触チップ３７を取り囲む環状スペース５８は上部分５１と基板３１との間にある。この環状スペース５８は上部分５１の穴５９を経て、この実施形態における接触ユニット３６にも配置されている吸引チャンネル３３の第１のセクション６１に通じている。
下部分５２を上部分５１に押しつけることによって、上部分５１が基板３１に押しつけられた時、既に知られたシール材４７が再び液密シールを行う。
図６による実施形態では、すべての流体力学的な接続が下部分５２に設けられ、吸引チャンネル３３が公知の態様で開口で終る。
【００６１】
図６の実施形態に比し、図７の接触ユニット３６の形態における環状チャンネル５８は、接触チップ３７のまわりにギャップ６３を形成する膜６２によりここでは非常に薄い基板３１に対してシールされる。
図６に比し、基板３１の開口３２は相当に大きく、従って接触ユニット３６を基板に非常に容易に位置決めすることができる。其の他、図７の接触ユニット３６は図６の接触ユニット３６に相当する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本新規装置の概略を示す図である。
【図２】図１の装置の接触、及び測定ユニットの部分の拡大図である。
【図３】細胞の電気的接触の過程と接触チップの交換過程を図解した図である。
【図４】吸引チャンネルが基板に配置された、交換可能な接触チップの第１の実施形態を示す図である。
【図５】接触ユニットが交換可能の上部分と再使用可能な下部分とに分割された、図４の実施形態と同様な実施形態を示す図である。
【図６】吸引チャンネルが接触ユニットに置かれている、図５の接触ユニットと同様な接触ユニットを示す図である。
【図７】基板に大きな開口を有する、図６の接触ユニットと同様な接触ユニットを示す図である。
【国際公開パンフレット】
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2004502936.tif 000004
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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