(57)【要約】本発明は融合部分および重要なタンパク質からなる融合タンパク質に関し、この２つのタンパク質の組み合わせは、融合タンパク質の細菌宿主上清への分泌を招来し、しかも重要なタンパク質はその正しい三次元構造で存在する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
−Ｆ−Ａｓｍ−Ｒｎ−Ｙ−
（式中、
Ｆは培養培地中へのタンパク質Ｙの分泌を可能にするアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であり、
Ａｓは化学結合または遺伝子コードによってコード可能なアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、
ｍは０〜１０の整数であり、
Ｒは化学結合またはアルギニンコドンであり、
ｎは０または１であり、
Ｙは重要なタンパク質をコードするＤＮＡであり、正しくフォールディングされたこのタンパク質は、培養培地中の融合タンパク質の一部分である）
で表される融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
発現カセットは、式
Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ａｓｍ−Ｒｎ−Ｙ−Ｔ
（式中、
Ｐはプロモーターであり、
Ｓは至適収率を可能にするシグナル配列をコードするＤＮＡ配列であり、
Ｔは非翻訳発現エンハンシングＤＮＡ配列である）
で表される請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
ＳはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのｏｐｒＦ遺伝子、Ｓ． ｔｙｐｈｉ ｍｕｒｉｕｍ外膜タンパク質のシグナル配列（ｆｉｍ Ｄ）をコードするＤＮＡ、Ｅ． ｃｏｌｉアルカリホスファターゼ前駆体タンパク質のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの主要外膜タンパク質のｏｍｐＡ遺伝子から誘導されるシグナル配列ｓｍｏｍｐａをコードするＤＮＡ配列、主要外膜タンパク質をコードするＥ． ｃｏｌｉ ｏｍｐＣ遺伝子から誘導されるシグナル配列ｅｃｏｏｍｐｃをコードするＤＮＡ配列、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ浸透防御結合タンパク質前駆体（ｏｐｕＣＣ）から誘導されるシグナル配列ａｆ００９３５２をコードするＤＮＡ配列、キシラナーゼＩ前駆体についてＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ ｘｙｎＡ遺伝子から誘導されるシグナル配列ａｅｏｘｙｎａをコードするＤＮＡ配列、または外膜タンパク質Ｓ１についてＳ． ｔｙｐｈｉ遺伝子から誘導されるシグナル配列ｓｔｏｍｐｓ１をコードするＤＮＡ配列である請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
ＤＮＡ配列Ｆはレピルジン、Ｓｅｒ−ヒルジンまたはＡｌａ−−ヒルジンである、請求項２または３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
重要なタンパク質Ｙはプロインスリン、インスリンまたはそれらの誘導体である請求項２〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡによってコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡからなるプラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載のプラスミドからなる宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡからなる宿主細胞。
【請求項１０】
細胞がＥ． ｃｏｌｉ、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからなる群より選択され、請求項７に記載のプラスミドおよび請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡが宿主細胞のゲノムに場合により結合される請求項８または９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を請求項８〜１０のいずれか一項に記載の宿主細胞内で発現させ、そして（ｂ）発現した融合タンパク質を単離する、融合タンパク質の培養による製造方法。
【請求項１２】
上清を宿主細胞から分離して発現したタンパク質を単離し、そして発現したタンパク質を上清から単離する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
沈殿後上清中の発現タンパク質を濃縮する工程は、精密ろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
発現したタンパク質の単離には、培養培地または上清の成分を沈殿させ、一方発現したタンパク質は溶液中に残留させる工程を包含する請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
培養後、メルカプタンまたはシステイン塩酸塩をｐＨ６〜９で培養上清に添加し、遊離ＳＨ基濃度を０．０５〜２．５ｍＭとする請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
宿主細胞から培養上清を分離したのち、宿主細胞を新鮮な培地中で反復培養し、放出された融合タンパク質を培養時に得られた各上清から単離する請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｐＨ６〜９の細胞培養上清にメルカプタンまたはシステイン塩酸塩を、遊離ＳＨ基の濃度が０．０５〜２．５ｍＭに達するように添加する請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法で得られる発現タンパク質から、
（ｂ）重要なタンパク質、特にインスリンまたはインスリン誘導体を酵素的または化学的切断によって放出させ、
（ｃ）それを単離する、
インスリンまたはインスリン誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は融合部分と興味あるタンパク質からなる融合タンパク質に関し、この２つのタンパク質の組み合わせによって、細菌宿主の上清への融合タンパク質の分泌を招来し、興味あるタンパク質はその正しい三次元構造で存在する。融合タンパク質についての遺伝子配列は、細菌宿主内における発現を可能にする発現カセットの一部分である。本発明は、この発現カセットを用いる、このような融合タンパク質の培養、発現および後処理方法、その発現カセットを含有するプラスミド、染色体に結合された発現カセットおよび／またはレプリコンたとえばプラスミドとして発現カセットを含有する細菌宿主細胞、融合部分としてヒルジンまたはその誘導体を有する上記融合タンパク質、ならびにヒルジンまたはその誘導体から融合タンパク質を調製およびインスリンを製造するための方法におけるその発現カセットの使用に関する。
【０００２】
【発明の背景】
組換えタンパク質に基づいて医薬を製造する至適方法の開発は２つの観点から可能な限り正当に評価されなければならない課題である。すなわち第一に、方法はできるだけ費用効果のあるものでなければならず、第二に生成物は最高の純度のものでなければならない。
【０００３】
この関連では発現システムの選択が特定の製造方法のコースを決定し、タンパク質化学における新技術の開発、広範囲の生物化学的可能性および既知の技術の新しい組み合わせが常に、現存の方法の改良を可能にすることは熟練者には自明である。
【０００４】
所望のタンパク質の性質は、その合成のために使用される宿主細胞系の選択を決定的な形で決定する。細菌たとえばＥ． ｃｏｌｉはその助力により、安価な培地中、数グラムの粗収量で、迅速にタンパク質を産生することが可能な細胞系を提供する。この系は、修飾する必要のないタンパク質およびインビトロにおいてそれらの生物学的に活性な型に再生できるタンパク質にとくに有用である。たとえばインスリンのように高品質を要求されるタンパク質では、封入体の形態でタンパク質の細胞内蓄積を導く発現率が目標である。細胞の溶解後、タンパク質が溶解され、さらに工程段階を経由してフォールディングされる。しかしながら、フォールディングのプロセスは定量的ではない。この理由は、細胞溶解時の損傷およびフォールディング時の誤りに対応する封入体形成時の不可逆的な損傷である。「悪い」フォールディングまたは修飾を受けた分子は、更なる分離工程において除去されなければならない。これは、製造コストに悪影響を与える。さらにまた、上記分子の痕跡が、最終製品に再出現することがある。医薬は高い純度基準を条件とすることから、適当に注意深い、経費集約的な精製が必要である。好ましい経費／粗収率比のために、正しくフォールディングされた型での興味あるタンパク質のＥ． ｃｏｌｉによる培養培地中への輸送が可能になるプロセスが望ましい。しかしながら、これは今日まで例外的な場合にしか成功していない。
【０００５】
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／０８５３７にはこのような例外が記述されている。レピルジン、医薬Ｒｅｆｌｕｄａｎ（登録商標）の活性成分の合成および輸送は、輸送のために特定のシグナル配列を用いた場合に、グラム量でのＥ． ｃｏｌｉにより成功した。ドイツ特許出願１００ ３３ １９５．２（未公開）には、ヒルジンおよびヒルジン誘導体とマダニからのファクターＸａインヒビターおよびその誘導体から構成される二官能性タンパク質について記述されている。上記タンパク質は同様に、Ｅ． ｃｏｌｉによる高収率で合成および輸送が可能である。この発見に加えてついで驚くべきことに、ヒルジンは、ＴＡＰとの融合タンパク質としてのみでなく、プロインスリン誘導体のようなポリペプチドとの融合タンパク質の一部分としても高収率に輸送され、それは生物学的に活性であり、しかも融合パートナー、たとえばプロインスリンは、驚くべきことに、正しい三次元構造として存在することが見出されたのである。この予期しなかった結果は、無視できない収率の損失を伴う細胞内における発現後のインビトロ再フォールディング工程を省略でき、より単純なタンパク質精製過程を生じることから、たとえばインスリンの細菌／ベクターシステムによる、さらに経費効率的な産生の可能性を導くものである。他の利点はＥ． ｃｏｌｉにおける従来のインスリンの製造方法において、融合タンパク質を溶解するために添加されるカオトロピックな補助を必要としないことである。生態学的に、これは相当する廃液を回避することによって環境汚染の低下を招来する。
【０００６】
チスイビルの１種であるヒルからは、たとえばトロンビン阻害ヒルジンの様々なアイソフォームが開発されてきた。ヒルジンはその分子の人工的な改変、たとえばＮ−末端アミノ酸の置換により、医薬的要求のために至適化されている（たとえば、ＥＰ−Ａ ０ ３２４ ７１２）。
【０００７】
本発明は、融合タンパク質たとえばシミアンプロインスリンまたはその誘導体の形成のためのヒルジンおよびヒルジン変異体の使用を包含する。本発明の特定の実施態様では天然のヒルジンアイソフォームの一つが使用される（天然のアイソフォームは、ともに「ヒルジン」と呼ばれる）。天然のアイソフォームは、たとえばＶａｌ−Ｖａｌ−ヒルジンまたはＩｌｅ−Ｔｈｒ−ヒルジンである。本発明の他の実施態様では、天然ヒルジンのアイソフォームの改変体が使用される。変異体は天然のヒルジンアイソフォームから誘導されるが、たとえば天然のアイソフォームと比較してアミノ酸の付加および／またはアミノ酸の欠失および／またはアミノ酸の置換が含まれる。ヒルジン変異体には天然のヒルジンアイソフォームとは別のペプチドセグメントおよび新たなアミノ酸を含有していてもよい。ヒルジン変異体は既知であり、たとえばＤＥ ３ ４３０ ５６６に記載されている。ヒルジン変異体はタンパク質の形で市販されている（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ （登録商標）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， カタログ番号３７７−８５３， −９５０−９６０）。
【０００８】
インスリンは５１個のアミノ酸のポリペプチドであり、それらは２つのアミノ酸鎖：２１アミノ酸のＡ鎖および３０アミノ酸のＢ鎖の間に分配されている。この鎖は互いに２つのジスルフィド橋で連結されている。インスリンの組成物は何年も前から糖尿病の治療に使用されてきた。これには、天然に存在するインスリンのみでなく、インスリン誘導体および類縁体の使用も包含される。
【０００９】
インスリン誘導体は、天然に存在するインスリン、すなわち、ヒトインスリンまたは動物インスリンの誘導体である。これらは他の点では天然に存在するインスリンと同じであるが、天然に存在する少なくとも１個のアミノ酸残基の置換および／または少なくとも１個のアミノ酸残基および／または有機残基の付加により対応するインスリンと異なる。
【００１０】
一般に、インスリン誘導体はヒトインスリンに比べてわずかに修飾された作用を有する。
【００１１】
作用の開始が加速されたインスリンは、ＥＰ ０ ２１４ ８２６， ＥＰ ０３５ ４３７およびＥＰ ０ ６７８ ５２２に記載されている。ＥＰ ０１２４ ８２６はとくにＢ２７およびＢ２８の置換に関する。ＥＰ ０ ６７８ ５２２は位置Ｂ２９に様々なアミノ酸、好ましくはプロリン（ただしグルタミン酸ではない）を有するインスリン誘導体が記載されている。ＥＰ ０ ３７５ ４３７にはＢ２８にリジンまたはアルギニンを有し、さらにＢ３および／またはＡ２１において適宜修飾されたインスリン誘導体が包含される。
【００１２】
ＥＰ ０ ４１９ ５０４には、Ｂ３におけるアスパラギンおよび位置Ａ５、Ａ１５、Ａ１８またはＡ２１における少なくとも１個の他のアミノ酸修飾により、化学的修飾に対して保護されているインスリン誘導体が開示されている。
【００１３】
ＷＯ ９２／００３２１には、位置Ｂ１〜Ｂ６の少なくとも１個のアミノ酸がリジンまたはアルギニンによって置換されたインスリン誘導体が開示されている。この種のインスリンはＷＯ ９２／００３２１によれば長期に持続する作用を示すという。
【００１４】
遺伝子工学によってインスリンおよびインスリン誘導体を製造する場合はしばしば、インスリンの前駆体、Ｂ、ＣおよびＡ鎖からなる「プロインスリン」が発現する。上記プロインスリンは、適当な正しいフォールディングおよびジスルフィド橋の形成後に、Ｃ鎖の酵素的または化学的除去によってインスリンまたはインスリン誘導体に変換することができる。プロインスリンは多くの場合、融合タンパク質の形態で発現される。「望ましくない」融合パートナーも、同様に化学的または酵素的に除去する必要がある。
【００１５】
組換え宿主／ベクター系の選択が、組換え細胞の培養、増殖および培養方法を決定することは当業者には自明の通りである。これは同様に本発明の主題である。
【００１６】
融合タンパク質は酸性培地に驚くべき良好な溶解性を示し、これはタンパク質の化学的な処理に関してきわめて有利である。第一に、上清の望ましくない成分の多くは上述の条件下に沈殿し、第二にペプチダーゼまたはプロテアーゼは不活性である。したがって、操作の最後に培養培養液を酸性にすると、融合タンパク質から望ましくない上清タンパク質を宿主細胞とともに直接分離し、更なる工程で上記融合タンパク質を濃縮することができる。これは同様に本発明の主題である。
【００１７】
培養の終わりには、フォールディングの過程はまだ１００％完全ではない。メルカプタンたとえばシステイン塩酸塩の添加がこの過程を完了させる。これは同様に本発明の主題である。
【００１８】
２つのタンパク質が、他の位置では融合タンパク質を効果的には切断しないエンドプロテアーゼによって特異的に認識されるアミノ酸のリンカーを介して融合させると、ついで興味あるタンパク質を直接、活性型で切断することが可能である。インスリンの製造の場合には、ヒルジンとプロインスリンの間のリンカーは好ましくは、カルボキシ末端にアルギニンを含有する。同時プロセッシングではトリプシン変換により融合部分が切断され、プロインスリンは、モノ− またはジ−Ａｒｇ−インスリンに変換することができる。上記リンカーはインスリンのプロセッシングに関連して、ヒルジン部分の切断除去が、インスリンのＢおよびＡ鎖に連結するＣペプチド配列またはその誘導体における切断よりも遅くないように至適化されなければならない。これは同様に本発明の主題である。使用できる発現系の例は、欧州特許 ０ ４６８ ５３９の図１に記載されているベクターｐＪＦ１１８である。
【００１９】
プロインスリンまたはプロインスリン誘導体をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドは、たとえば特許ＥＰ−Ａ ０ ４８９ ７８０およびＰＣＴ／ＥＰ００／０８５３７に記載されている。
【００２０】
ＥＰ−Ａ ０ ３２４ ７１２の記載に従い、ヒルジンの配列を含有するプラスミドｐＫ１５２は、ヒルジンのためのＤＮＡ配列の供給源として使用される。
【００２１】
細菌の内膜を通過する興味あるタンパク質の輸出適合性は分泌に重要である。この関連では、様々なタンパク質に、多かれ少なかれ至適なシグナル配列の選択が重要である。特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／０８５３７には、ＰＣＲ−ベースのシグナル配列のスクリーニング系が記載されている。この系には、驚くべきことに、ヒルジン活性が完全に維持され、したがって、トロンビン阻害アッセイで上清中に容易に検出されるので、Ｎ−末端融合部分としてヒルジンを有する融合タンパク質にも適用することができる。
【００２２】
したがって、本発明は、式：
−Ｆ−Ａｓｍ−Ｒｎ−Ｙ−
（式中、
Ｆは培養培地中へのタンパク質Ｙの分泌を可能にするアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であり、
Ａｓは化学結合または遺伝子コードによってコード可能なアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であり、
ｍは０〜１０の整数であり、
Ｒは化学結合またはアルギニンコドンであり、
ｎは０または１であり、
Ｙは、興味あるタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、正しくフォールディングされたこのタンパク質は、培養培地中の融合タンパク質の一部分であり、
とくにヒルジンまたはその誘導体をコードするＤＮＡ配列（Ｆ）およびプロインスリンまたはその誘導体をコードするＤＮＡ（Ｙ）である）
で表される融合タンパク質をコードするＤＮＡ（別名：発現カセット）に関する。
【００２３】
本発明はさらに、式
Ｐ−Ｓ−Ｆ−Ａｓｍ−Ｒｎ−Ｙ−Ｔ
（式中、
Ｐはプロモーターであり、
Ｓは至適収率を可能にするシグナル配列をコードするＤＮＡ配列であり、
Ｔは非翻訳、発現エンハンシングＤＮＡ配列である）
で表される発現カセット（別名：ＤＮＡ）に関する。
【００２４】
本発明はさらに、上述の発現カセットを含有するプラスミドおよび上述のプラスミドを含有する宿主細胞、または好ましくは宿主ゲノム中に結合された発現カセットを含有する宿主細胞に関し、宿主細胞はＥ． ｃｏｌｉ， Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓからなる群より選択される。
【００２５】
本発明はまた、
（ａ）上述のＤＮＡ分子を上述の宿主細胞内で発現させ、
（ｂ）発現した融合タンパク質を単離する
上述の融合タンパク質の培養による製造方法に関する。
この方法では、とくに、発現したタンパク質を単離するために上清を宿主細胞から分離し、発現したタンパク質を上清から単離する。さらにここで、沈殿後、上清中の発現したタンパク質を濃縮するための工程段階には、マイクロろ過、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーからなる群より選択される。ここでその特定の実施態様では、発現したタンパク質の単離は培養培地または上清の成分を沈殿させ、一方、発現したタンパク質は溶液中に残す工程を含む。さらに好ましい本発明の実施態様においては、培養後、ｐＨ６〜９の培養上清にメルカプタンまたはシステイン塩酸塩を、遊離ＳＨ基の濃度が０．０５〜２．５ｍＭに達するように添加する。
【００２６】
本発明の特定の実施態様は宿主細胞から培養上清を分離し、宿主細胞を新鮮な培地中でさらに培養し、放出された融合タンパク質を上清から単離することからなる。換言すれば、本発明の更なる実施態様は、上述の方法において、宿主細胞から培養上清を分離し、宿主細胞を新鮮な培地中で反復培養し、培養時に得られる各上清から、放出された融合タンパク質を単離する方法である。
【００２７】
本発明はさらに、インスリンまたはインスリン誘導体を製造する方法において、
（ａ）上述の方法で得られる発現したタンパク質から、
（ｂ）興味あるタンパク質、とくにインスリンまたはインスリン誘導体を酵素的または化学的切断により放出させ、
（ｃ）単離する方法に関する。
【００２８】
【実施例】
以下の実施例は本発明を、限定の意図ではなく、さらに詳細に記述するものである。
【００２９】
実施例１：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓからのｏｐｒＦ遺伝子産物のシグナル配列に付加したレピルジン―ＧＮＳＡＲ−シミアンプロインスリン融合タンパク質の構築
特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／０８５３７の実施例２には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓ  ｏｐｒＦ遺伝子産物のシグナル配列（Ｄｅ， Ｅ．ら， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． １２７， ２６３−２７２， １９９５）を介して、Ｅ． ｃｏｌｉのために使用される培地中にＲｅｆｌｕｄａｎの発現および分泌を可能にする発現ベクターを記載している。このベクターは、Ｒｅｆｌｕｄａｎ−ＧＮＳＡＲ−シミアンプロインスリン融合タンパク質（ＧＮＳＡＲ＝配列番号：１）の構築に役立ち、ｐＢｐｆｕ＿ｈｉｒと命名される。
【００３０】
更なる出発原料はｐＪＦ１１８（ＥＰ ０ ４６８ ５３９）およびｐＫ１５２（ＰＣＴ／ＥＰ００／０８５３７）プラスミドＤＮＡである。以下のオリゴヌクレオチドが要求される：
プライマーｐｆｕｆ１
【化１】
2004518444.tif 000002
プライマーｉｎｓｕ１ １ｈｉｎｄＩＩＩ
【化２】
2004518444.tif 000003
プライマーＨｉｒ＿ｉｎｓｆ１
【化３】
2004518444.tif 000004
プライマーＨｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖ１
【化４】
2004518444.tif 000005
プライマーｐｆｕｆ１は、発現ベクター中のシグナル配列とレピルジンの接合部をコードするＤＮＡ領域とハイブリダイズする。
【００３１】
太字で示したプライマーＨｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖ１の部分は、プラスミドｐＩＮＴ９０ｄ中のプレプロインスリンおよびシミアンプロインスリン配列の接合部をコードするＤＮＡ領域、およびプラスミドｐＫ１５２中のヒルジン配列の３’末端の配列とハイブリダイズする。プライマーＨｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖ１はプライマーＨｉｒ＿ｉｎｓｆ１と１００％相補性である。プライマーＩｎｓｕ１１ＨｉｎｄＩＩＩは、ｐＩＮＴ９０ｄ中にクローン化され、シミアンプロインスリン配列をコードするＤＮＡ領域の３’末端をマークし、さらに、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって認識するためのヘキサヌクレオチド配列を有する。
【００３２】
２つの標準ポリメラーゼ連鎖反応は、Ｈｉｒ＿ｉｎｓｆ１／Ｉｎｓｕ１１ＨｉｎｄＩＩＩプライマー対、鋳型としてプラスミドｐＩＮＴ９０ｄ、およびｐｆｕｆ１／Ｈｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖプライマー対、鋳型としてプラスミドｐＢｐｆｕ＿ｈｉｒを使用して実施する。この両反応の生成物を合わせ、アリコートを、プライマーｐｆｕｆ１／Ｉｎｓｕ１１ＨｉｎｄＩＩＩを用いた第三のポリメラーゼ連鎖反応で変換する。この結果物は、配列シグナル（部分的）−レピルジン−ＧＮＳＡＲ−シミアンプロインスリンを含有するＤＮＡ産物である。制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてＤＮＡフラグメントを変換する。ＢａｍＨＩはレピルジン配列で、ＨｉｎｄＩＩＩはプロインスリンコード配列の３’末端で切断する。
【００３３】
平行した反応で２つの酵素を用い、ベクターｐＢｐｆｕを変換し、大きいベクターフラグメントを単離する。両反応の単離生成物をＴ４リガーゼ反応で変換する。Ｅ． ｃｏｌｉ株Ｋ１２Ｍｃ１０６１のコンピテント細胞（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）をリゲーション混合物で形質転換し、２５μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＮＡプレート上に置く。特性解析のために、形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離する。同時に、プラスミド分析において特性を解析した形質転換体を含むプレートを、維持の目的で調製する。ＤＮＡは、制限分析およびＤＮＡ配列分析によって特性を解析する。正しいとして同定されたプラスミドは、ｐＢｐｆｕＨｉｒ＿Ｉｎｓと命名された。
【００３４】
実施例２：Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの外膜タンパク質のシグナル配列（ｆｉｍＤ）に付加されたＳｅｒ−ヒルジン−ＧＮＳＡＲ−シミアンプロインスリン融合タンパク質の構築
この構築は、実施例１に記載の計画に従って実施される。
特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／０８５３７の実施例１０には、Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの外膜タンパク質のシグナル配列を介してレピルジンを輸送するためのベクターの構築が記載されている（Ｒｉｏｕｘ， Ｃ． Ｒ．， Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ， Ｍ． Ｊ． ＆ Ｋａｄｎｅｒ， Ｒ． Ｊ．；Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７２ （１１）， ６２１７−６２２２， １９９０）。得られたプラスミドは実験室目的でｐＢｓｔｙｆｉｍ＿ｈｉｒと命名される。プラスミドｐＫ１５２およびｐｌＮＴ９０ｄのＤＮＡは各場合に鋳型として働く。
【００３５】
この構築には４つのプライマーが必要である。
プライマーｉｎｓｕ１１ＨｉｎｄＩＩＩ， Ｈｉｒ＿ｉｎｓｆ１およびＨｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖ１は実施例１に記載されている。
プライマーｓｔｙｆｉｍｆ１ｓｅｒは新たに合成され、以下の配列を有する：
【化５】
2004518444.tif 000006
【００３６】
太字で示したＤＮＡトリプレットはセリンのコドンを示す。結果として、ヒルジンが産生され、このヒルジンは、アミノ酸配列の１位にロイシンの代わりにセリンを有する。
【００３７】
実施例１に相当して、２つの標準ポリメラーゼ連鎖反応は、Ｈｉｒ＿ｉｎｓｆ１／Ｉｎｓｕ１１ ＨｉｎｄＩＩＩプライマー対、鋳型としてｐＩＮＴ９０ｄ ＤＮＡ、およびｓｔｙｆｉｍｆ１ｓｅｒ／Ｈｉｒ＿ ｉｎｓｒｅｖプライマー対、鋳型としてｐＫ１５２ ＤＮＡを使用して実施される。この両反応の生成物を合わせ、アリコートを、プライマーｓｔｙｆｉｍｆ１ｓｅｒ／Ｉｎｓｕ１１ＨｉｎｄＩＩＩを用いた第三のポリメラーゼ連鎖反応で変換する。この結果は、配列シグナル（部分的）−Ｓｅｒ−ヒルジン−ＧＮＳＡＲ−シミアンプロインスリンを含有するＤＮＡ産物である。制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてＤＮＡフラグメントを変換する。
【００３８】
平行した反応で２つの酵素を用い、ベクターｐＢｓｔｙｆｉｍ＿Ｈｉｒを変換し、大きいベクターフラグメントを単離する。両反応の単離生成物をＴ４リガーゼ反応で変換する。Ｅ． ｃｏｌｉ株Ｋ１２Ｍｃ１０６１のコンピテント細胞をリゲーション混合物で形質転換し、特性解析のために形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離する。同時に、プラスミド分析によって特性を解析した形質転換体を含むプレートを維持の目的で調製する。ＤＮＡは制限分析およびＤＮＡ配列分析によって特性を解析する。正しいとして同定されたプラスミドは、ｐＢｓｔｙｆｉｍ＿ＳｅｒＨｉｒ＿ Ｉｎｓと命名された。
【００３９】
実施例３：Ｅ． ｃｏｌｉアルカリホスファターゼ前駆体タンパク質のシグナル配列に付加されたＡｌａ−ヒルジン−Ｒ−シミアンプロインスリン融合タンパク質の構築
Ｅ． ｃｏｌｉアルカリホスファターゼ前駆体は次のシグナル配列を有する。
【化６】
2004518444.tif 000007
（Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ Ｈ．， Ｔａｙｌｏｒ Ｊ．， Ｍｉｎｔｏｎ Ｎ．； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ８６８９， （１９８６））
ペプチド配列は、Ｅ． ｃｏｌｉ 高コドン使用基準を用いて、ＧＣＧプログラムＢａｃｋ ｔｒａｎｓｌａｔｅ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃ．）によりＤＮＡに逆翻訳される。
これは、以下の配列を生じる。
【化７】
2004518444.tif 000008
【００４０】
この配列を、１位にアミノ酸アラニンを有することによって特性づけられたヒルジンをコードするＤＮＡ配列（ＥＰ−Ａ ０ ４８８ ０９３）にクローン化し、付加するために、上記配列は太字で示した配列によって延長される。
【化８】
2004518444.tif 000009
部分的に重複する２つのオリゴヌクレオチド配列はそれから誘導される。
プライマーｐｈｏａｆ１は以下の配列を有する：
【化９】
2004518444.tif 000010
プライマーｐｈｏａｆ２は以下の配列を有する：
【化１０】
2004518444.tif 000011
【００４１】
発現ベクターの構築には、プライマー ｉｎｓｕ１１ＨｉｎｄＩＩＩ， Ｈｉｒ＿ｉｎｓｆ２およびＨｉｒ＿ ｉｎｓｒｅｖ２ならびにプラスミドｐＫ１５２， ｐＩＮＴ９０ｄおよびｐＪＦ１１８のＤＮＡを要求する。
プライマーＨｉｒ＿ｉｎｓｆ２は以下の配列を有する：
【化１１】
2004518444.tif 000012
プライマーＨｉｒ＿ｉｎｓｒｅｖ２は以下の配列を有する：
【化１２】
2004518444.tif 000013
【００４２】
上の場合の太字レターはプロインスリンとハイブリダイズする配列を指示し、一方、上の場合の普通文字レターはヒルジン配列の３’末端との重複を示している。下の場合の下線を施した太字レターはアルギニンリンカーのコドンを表す。
【００４３】
実施例１に相当して、２つの標準ポリメラーゼ連鎖反応は、Ｈｉｒ＿ｉｎｓｆ１／Ｉｎｓｕ１１ ＨｉｎｄＩＩＩプライマー対を、鋳型としてｐＩＮＴ９０ｄ  ＤＮＡ、およびｐｈｏａｆ１／Ｈｉｒ＿ ｉｎｓｒｅｖプライマー対を、鋳型としてｐＫ１５２ ＤＮＡを使用して実施する。この両反応の生成物を合わせ、アリコートを、プライマーｐｈｏａ／Ｉｎｓｕ１１ＨｉｎｄＩＩＩとともに第三のポリメラーゼ連鎖反応で変換する。結果は、配列シグナル−Ａｌａ−ヒルジン−ＧＮＳＡＲ−シミアンプロインスリンを含有するＤＮＡ産物である。ＤＮＡフラグメントは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて変換される。平行した反応で２つの酵素を用いてベクターｐｊＦ１１８を変換し、大きいベクターフラグメントを単離する。両反応の単離生成物をＴ４−リガーゼ反応で変換する。Ｅ． ｃｏｌｉ株Ｋ１２Ｍｃ１０６１のコンピテント細胞をリゲーション混合物で形質転換し、特性解析のために形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離する。同時に、プラスミド分析によって特性を解析された形質転換体を含むプレートを維持の目的で調製する。ＤＮＡは制限分析およびＤＮＡ配列分析により特性を解析する。正しいとして同定されたプラスミドは、ｐＮＳ２２と命名された。
【００４４】
実施例４：トロンビン阻害アッセイ
ヒルジン濃度はＧｒｉｅｓｓｂａｃｈらの方法（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７， ｐｐ． ３４７−３５０， １９８５）に従って決定される。この目的には、校正曲線を確立するため、特定量のＲｅｆｌｕｄａｎ標準を測定に包含させる。これからｍｇ／Ｌでの収率が直接測定できる。生物学的活性も、融合タンパク質のプロインスリン成分の正しいフォールディングの直接的な指標となる。また正しい −Ｓ−Ｓ− 橋の形成を決定するため、蛋白分解Ｓ． ａｕｒｅｕｓ消化、ついでＲＰ−ＨＰＬＣ系における分析を用いることも可能である。
【００４５】
実施例５：融合タンパク質の発現
組換え細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ＹＴ培地（１Ｌあたり、ペプトン１６ｇ，酵母抽出物１０ｇ，ＮａＣｌ ５ｇ）中、一晩培養する。この一晩培養液を新鮮な培地で１：５０に希釈し、細胞を約０．８ ＯＤ６００の密度まで培養する。
ついで、ＩＰＴＧを濃度０．０５〜２ｍＭが確立されるように加えて発現を誘導する。この方法で誘導された細胞をさらに３〜２６時間インキュベートする。
【００４６】
３時間後、ヒルジンの抗トロンビン作用が上清中に明瞭に測定できる。クマシーブルー染色後のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析によれば、誘導された細胞にのみポリクローナル抗−インスリン抗体とウエスタンブロット分析で反応する新しいバンドが現れることから、上述の作用は所望の融合タンパク質の分泌に帰することができる。培養実験においては、誘導は有意に高い光学密度に培養したのちにのみ開始される。これにより、最小培地に基づく好ましい合成培地が得られる。
細胞の生産性は、細菌ミルキングの原理を使用することにより、すなわち至適誘導時間ののちに上清から細胞を注意深く取り出して、それらをさらに再度イデューサーを加えた新鮮な培地中でインキュベートすることにより向上する。回収された上清から平行してインスリンが製造される。
【００４７】
実施例６：融合タンパク質の精製
誘導の終了後、細胞上清のｐＨを２．５〜３に調整し、細胞および上清成分を遠心分離またはろ過により除去する。沈殿の上清を陽イオン交換カラム（Ｓ−Ｈｙｐｅｒ ＤＦ， Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓ）に適用し、ｐＨ ３．５ において３０％ ２−プロパノールの存在下、１５０〜４５０ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配を用いて分画する。個々の分画をＲＰ− ＨＰＬＣにより分析する。プロインスリン−ヒルジン融合タンパク質は約３００ｍＭ濃度のＮａＣｌで溶出される。十分に純粋な分画を合わせ、０．１％ＴＦＡで希釈し、ポンプによってＲＰカラム（ＰＬＲＰ−Ｓ ７．５×５０ｍｍ）に適用する。溶出は２０〜５０％のアセトニトリル勾配を用いて実施する。２グループの分画をプールする。溶媒を除去したのち、物質を凍結乾燥する。物質の純度をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によりチェックする。精製された融合タンパク質をマススペクトル（ＥＳＩ）によって分析する。融合タンパク質の実験的に測定した分子量は、シグナルペプチド除去後の、その理論的に期待される分子量に相当する。
【００４８】
実施例７：ジスルフィド橋連結の決定
融合タンパク質をトリプシンで消化し、形成されたフラグメントをＲＰ−ＨＰＬＣついでマススペクトルによって分析する。ｄｅ−（Ｂ３０）インスリンとして認識されるフラグメントは、その質量が５７０６Ｄａであることから、成功裡に同定される。この生成物をＳ． ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼ消化に付す。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析では、期待されるペプチドパターンが示される。
【００４９】
トリプシン切断は次のように実施する：
凍結乾燥した融合タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８ に溶解し（１ｍｇ／ｍＬ）、トリプシン（融合タンパク質１ｍｇあたり１μｇ）を加える。トリプシンは反応の終了時にｐＨ３で不活性化する。
【００５０】
Ｓ． ａｕｒｅｕｓ消化は次のように実施する：
単離されたｄｅ−（Ｂ３０）インスリンをｐＨ８の水に溶解し、Ｓ． ａｕｒｅｕｓプロテアーゼ（インスリンの量の１／５０）を添加し、混合物を３７℃で５時間、次に室温で一晩インキュベートする。
【００５１】
実施例８：インスリンの精製
宿主細胞の自然溶解または分泌により上清に見出される大部分の他のポリペプチドとは対照的に、この融合タンパク質は、驚くべきことに、ｐＨ ２．５〜３．５ では沈殿しない。したがって、培養培地を適宜酸性にし、ついで沈殿の完了後に、沈殿および細胞を遠心分離または精密ろ過により除去し、濃縮する。
【００５２】
次に、培地のｐＨを６．８に調整し、分析的ＨＰＬＣ測定と平行して融合タンパク質含量を測定する。測定に続いて、上清にトリプシンを、融合タンパク質１〜１．５ ｍｇあたり約１μｇになるように加える。室温で約４時間インキュベートしたのち、精製は２−プロパノールの存在下、ｐＨ ３．５ において陽イオン交換クロマトグラフィーにより実施する。溶出は０．１５〜０．４５Ｍの勾配を適用して、緩衝液中で実施する。
【００５３】
ジ−Ａｒｇ−インスリンは約０．３Ｍで溶出する。１：１に希釈したのち、１０％濃度のＺｎＣｌ２溶液を添加し、ｐＨ ６．８ においてインスリン含有分画からジ−Ａｒｇ−インスリンを沈殿させる。インスリンをろ過し、ついで０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．５）に溶解し、２ｍｇ／ｍＬの溶液を得る。
ついで、溶液１００ ｍＬあたり約１単位量のカルボキシペプチダーゼＢを加え、穏やかに攪拌しながら反応を実施する。ついでクエン酸でｐＨを５．５に調整し、インスリンをＺｎＣｌ２の存在下に結晶化させる。結晶を取り、溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製したのち、インスリンを再度結晶化により精製する。
【００５４】
実施例９：培養培地中での融合タンパク質の直接プロセシング
発現期の終わりに、培養培地のｐＨを６．８に調整し、トリプシンを攪拌しながら加えて、最終濃度４〜８ｍｇ／Ｌを確立する。約４時間インキュベートしたのち、この方法で処理した培養液のｐＨを２．５〜３に調整する。１〜６時間沈殿させたのち、ｐＨを３．５に上げ、形成されたジ−Ａｒｇ−インスリンを３０％ ２−プロパノールの存在下に陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製する。溶出は０．０５〜０．５ＭのＮａＣｌ塩の勾配を用いて実施する。生成物含有分画をＨ２Ｏで１：１に希釈し、ついで０．１％濃度のＺｎＣｌ２溶液が形成されるようにＺｎＣｌ２を加える。ジ−Ａｒｇ−インスリンをｐＨ ６．８ で沈殿させ、たとえば実施例８に従ってインスリンに変換する。
【００５５】
実施例１０：融合タンパク質の分泌のための更なるシグナル配列
特許出願ＰＣＴ／ＥＰ００／０８５３７によって記述された技術を用いて、ヒルジン−プロインスリン融合タンパク質の分泌を招来する更なるシグナル配列を検出することができる。
Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓの主要外膜タンパク質のｏｍｐＡ遺伝子から誘導される、シグナル配列ｓｍｏｍｐａ（ＧｅｎＥＭＢＬ データベースローカス：ＳＭＯＭＰＡ， １３６４ ｂｐ ＤＮＡ ＢＣＴ ３０−ＭＡＲ−１９９５）
主要外膜タンパク質をコードするＥ． ｃｏｌｉ ｏｍｐＣ遺伝子から誘導される、シグナル配列ｅｃｏｏｍｐｃ（ＧｅｎＥＭＢＬ データベースローカス：ＳＭＯＭＰＡ， １３６４ ｂｐ ＤＮＡ ＢＣＴ ３０−ＭＡＲ−１９９５）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの浸透防御結合タンパク質前駆体（ｏｐｕＣＣ）から誘導される、シグナル配列ａｆ００９３５２（ＧｅｎＥＭＢＬ データベースローカス：ＡＦ００９３５２， ４５００ ｂｐ， ＤＮＡ ＢＣＴ ２３−ＪＵＬ−１９９７）
キシラナーゼＩ前駆体についてのＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ ｘｙｎＡ遺伝子から誘導される、シグナル配列ａｅｏｘｙｎａ（ＧｅｎＥＭＢＬ データベースローカス：ＡＥＯＸＹＮＡ， １１３９ ｂｐ ＤＮＡ ＢＣＴ ０７−ＦＥＢ−１９９９）
外膜タンパク質Ｓ１についてのＳ． ｔｙｐｈｉ遺伝子から誘導される、シグナル配列ｓｔｏｍｐｓ１（ＧｅｎＥＭＢＬ データベースローカス：ＳＴＯＭＰＳ１， １９３８ ｂｐ ＤＮＡ ＢＣＴ ２４−ＡＵＧ−１９９５）
【国際公開パンフレット】
2004518444.tif 000014
2004518444.tif 000015
2004518444.tif 000016
2004518444.tif 000017
2004518444.tif 000018
2004518444.tif 000019
2004518444.tif 000020
2004518444.tif 000021
2004518444.tif 000022
2004518444.tif 000023
2004518444.tif 000024
2004518444.tif 000025
2004518444.tif 000026
2004518444.tif 000027
2004518444.tif 000028
2004518444.tif 000029
2004518444.tif 000030
2004518444.tif 000031
2004518444.tif 000032
2004518444.tif 000033
2004518444.tif 000034
2004518444.tif 000035
2004518444.tif 000036
2004518444.tif 000037
2004518444.tif 000038
2004518444.tif 000039
【国際調査報告】
2004518444.tif 000040
2004518444.tif 000041
2004518444.tif 000042
2004518444.tif 000043