(57)【要約】【課題】分子などのサンプルの要素の拡散速度や流れ速度の方向依存する測定をそれぞれ可能にする走査顕微鏡を提案する。【解決手段】本発明は蛍光相関分光法のための装置を有する走査顕微鏡に関する。走査顕微鏡は、照明光の強度及び／又は検出感度が測定容積内で空間的に調整されることを特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光の強度及び／又は検出感度が測定容積内で空間的に調整されることを特徴とする、蛍光相関分光法のための装置を有する走査顕微鏡。
【請求項２】
測定容積が少なくとも１つの画像点により定められることを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【請求項３】
照明光の強度及び／又は検出感度が空間的・周期的に調整されることを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【請求項４】
照明光の強度及び／又は検出感度の調整が時間的に変化することを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【請求項５】
異なる調整で取られた同じ測定容積の蛍光相関スペクトルが互いの比較により解析されることを特徴とする請求項４に記載の走査顕微鏡。
【請求項６】
照明光の強度及び／又は検出感度の調整がスイッチでオン・オフにされることを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【請求項７】
調整がスイッチでオンにされる際及び調整がスイッチでオフにされる際に取られた同じ測定容積の蛍光相関スペクトルが、互いの比較により解析されることを特徴とする請求項６に記載の走査顕微鏡。
【請求項８】
調整がスイッチでオンにされる際及び調整がスイッチでオフにされる際に取られた同じ測定容積の蛍光相関スペクトルが、他方により分割されることを特徴とする請求項６に記載の走査顕微鏡。
【請求項９】
照明光の強度及び／又は検出感度の調整が干渉により作られることを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【請求項１０】
干渉に寄与する光波が互いに調節可能な位相関係を示すことを特徴とする請求項９に記載の走査顕微鏡。
【請求項１１】
照明光の強度の調整が、反対の伝播方向の２つの照明光ビームによる干渉により作られることを特徴とする請求項９に記載の走査顕微鏡。
【請求項１２】
検出感度の調整が、反対の伝播方向の２つの検出光ビームによる干渉により作られることを特徴とする請求項９に記載の走査顕微鏡。
【請求項１３】
走査顕微鏡が４π配置であることを特徴とする請求項９に記載の走査顕微鏡。
【請求項１４】
照明光の強度及び／又は検出感度の調整を作る振幅フィルタが設けられることを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【請求項１５】
照明光の強度及び／又は検出感度の調整を作る位相フィルタが設けられることを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【請求項１６】
照明光の強度及び／又は検出感度の調整を作るレンズ配置及び／又はビームスプリッタが設けられることを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【請求項１７】
測定容積内の試料が多光子励起により光学的に励起されることを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【請求項１８】
照明光がパルスであることを特徴とする請求項１７に記載の走査顕微鏡。
【請求項１９】
走査顕微鏡が共焦点走査顕微鏡であることを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光相関分光法のための走査顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査顕微鏡法では、試料で放出された反射光又は蛍光ライトを観測するために、試験すべき対象が光ビームで照射される。照明光ビームの焦点は、制御可能なビーム偏向装置を用いて、一般的には対象物面内で２つのミラーを傾けることで対象物面内で動かされる。偏向軸はたいてい互いに垂直に位置しており、それで１つのミラーはｘ方向及び他方でｙ方向に偏向する。例えば、ミラーはガルバノメトリックポジショナーを用いて傾けられる。対象物から来る光のパワーの測定は照明光ビームの走査位置に依存する。
【０００３】
特に共焦点走査顕微鏡法では、対象物は光ビームのフォーカスにより３次元で走査される。一般的に共焦点走査顕微鏡は、光源、光源からの光がピンホール開口（いわゆる、励起開口）にフォーカスされるフォーカスのための光学系、ビームスプリッタ、ビームを制御するビームデフレクター、顕微鏡光学系、検出開口、及び検出光又は蛍光ライトを検出する検出器を有する。照明光はビームスプリッタを介して１つになる。対象物から来る蛍光ライト又は反射光は、ビームデフレクターを介してビームスプリッタに戻り、そこを通り、最終的に検出開口に焦点が合う。この開口の後ろに検出器がある。焦点領域から直接生じない検出光は別な光路をとり、検出開口を通らない。それで、対象物の連続走査の結果、３次元画像を生じるピクセル情報が得られる。たいていの場合、３次元画像は階層データイメージングにより実行される。理論的には、走査光ビームの経路は対象物上又は対象物内で蛇行する（一定のｙ位置でｘ方向に線を走査し、次いで走査すべき次の線へのｘ走査及びｙ再位置決めが中断され、次いで一定のｙ位置で負のｘ方向にこの線を走査する、など）。階層データイメージングを可能にするために、層を走査した後試料テーブル又は対物レンズが再位置決めされ、走査すべき次の層が対物レンズの焦点面に運ばれる。
【０００４】
例えば、光軸方向の解像度の増加は、「二重共焦点走査顕微鏡」というタイトルの特許文献１に記載されたような二重の対物レンズ配置（４π配置）を用いることにより実現される。照明系から来る光は２つの部分ビームに分けられる。これらビームは、鏡像対称に配置された２つの対物レンズを通って互いに反対方向に延びるように、同時に試料を照射する。２つの対物レンズは共通の対象物面の異なる面に配置される。この干渉計照明の結果、強め合う干渉の間に１つの主な最高値と幾つかの２次的な最高値を示す干渉パターンが対象物点に形成される。ここで、２次的な最高値は一般的に光軸に沿って配置される。干渉計照明による従来の走査顕微鏡と比較して二重共焦点走査顕微鏡を用いて、軸の解像度の増加が実現される。
【０００５】
共焦点走査顕微鏡は蛍光相関分光法（ＦＣＳ）においても用いられる。ここで、効率的な測定容積（測定ボリューム）は主に共焦点容積によりセットされる。ＦＣＳは好ましくは解決法において分子動力学の解析を可能にする。例えば反応速度又は拡散時間に関する結論を出すために、１つ又は複数の蛍光染料によりマークされたでたらめな分子の通路は測定容積を介して検出される。
【０００６】
拡散速度が決定される共焦点走査顕微鏡によるＦＣＳ測定は、とりわけ、点広がり関数（ＰＳＦ）−焦点容積における照明光の強度分布−が円筒状に対称であり、ｚ方向と横方向の両方に同様の分布（プロフィール）を有するという問題が生じる。ゆえに、相関信号は様々な方向の拡散及び流れ速度に関して明白な結果をもたらさない。観察されたサンプルの反応の相関曲線への影響は、解析をより困難にする。
【０００７】
【特許文献１】EP0491289
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ゆえに、本発明の根底にある目的は、分子などのサンプルの要素の拡散速度や流れ速度の方向依存する測定をそれぞれ可能にする走査顕微鏡を提案することである。理論的には、これは、相関曲線の反応動力学と運動の影響を容易に区別するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は走査顕微鏡により解決され、照明光の強度及び／又は検出感度は測定容積内で空間的に調整（変調）される。
【００１０】
本発明には、適切な空間調整では、異なる方向の運動が互いに区別され、このような測定の適切な組み合わせにより別な動力学により引き起こされる効果から区別されるという利点がある。結局、ｘ、ｙ及びｚ空間軸に沿う運動に加えて、全ての想定できる方向の運動が解析され、例えば拡散はダイレクトな輸送と区別される。
【００１１】
好ましくは、測定容積は少なくとも１つの画像点によって定められ、いわゆる当業者であれば、どのようにして測定容積内で所与の蛍光分子に蛍光を発させ、組み合わせた確率の適切な標準的な空間分布を作るか分かり、またこの蛍光をどのように検出するか分かる。用語「画像点」は数学的意味の次元のない位置を意味しない。
【００１２】
測定容積は複数の画像点を有してもよく、画像点で放出される検出光が同時に−平行に−好ましくは複数の検出器で検出される。
【００１３】
好ましい実施形態では、照明光の強度及び／又は検出感度は空間的・周期的に調整される。
【００１４】
好ましくは、照明光の強度及び／又は検出感度の調節はスイッチでオン・オフにされ、又は空間的に変えられてもよい。これは、異なる調整でイメージ化された同じ測定容積の蛍光相関スペクトルが互いの比較により解析されるという利点を有する。好ましくは、補正（例えば、バックグラウンドの補正）が行われた後、調整をオン及びオフにしてイメージ化された同じ測定容積の蛍光相関スペクトルがその場合他方により分割される。
【００１５】
ある変形例では、照明光の強度及び／又は検出感度の調整は時間的に変えられる。この場合、異なる調整でイメージ化された同じ測定容積の蛍光相関スペクトルは互いの比較により解析される。強度と検出感度を同時に調整することにより（ロックイン法）、「効率的な」測定容積の空間調整が作られる。
【００１６】
好ましくは、照明光の強度及び／又は検出感度の調整は干渉により作られる。好ましい実施形態では、干渉に寄与する光波は互いに調節できる位相関係を示し、それで空間調整は位相関係を変えることで変化する。
【００１７】
特に好ましい実施形態では、照明光の強度及び／又は検出感度の調整は、反対の伝播方向の２つの照明光ビームの干渉により作られる。好ましくは、走査顕微鏡は互いに向き合う２つの対物レンズのために４π配置であり、その間に試料が配置される。照明光は好ましくは２つの部分の照明ビーム束に分かれ、そのそれぞれは干渉計のアームを通過し、対物レンズの１つを介して試料に達する。同様に、試料により放出される検出光は対物レンズを通過し、先ず２つの検出光ビーム束でビームコンバイナーに入り、次いで一緒に検出器に向かう。好ましくは、ビームスプリッタは検出光ビーム束のためにビーム結合機として働く。
【００１８】
干渉計のアームを通過する光の位相関係は時間的に一定に変化するので、この実施形態は軸方向の流速を測定するのに特に適する。時間変化の速さは、例えばそれが流速に適合するまで変化する。
【００１９】
好ましい変形例では、照明光の強度及び／又は検出感度の調整を行う振幅フィルタが設けられる。好ましくは、幾つかのサイドローブが測定容積内で作られる。サイドローブは互いに同様に形成される。
【００２０】
別の変形例では、照明光の強度及び／又は検出感度の調整を作るために、位相フィルタ又は、位相フィルタと振幅フィルタを有する組み合わせが設けられてもよい。
【００２１】
別な変形例では、照明光の強度及び／又は検出感度の調整を作るために、レンズ配置（例えば、マイクロレンズ配置）又は複数のビームスプリッタの組み合わせが設けられる。
【００２２】
走査顕微鏡は好ましくは共焦点走査顕微鏡として設計される。
【００２３】
本発明のサブジェクトは線図に概略的に示され、図面に基づいて以下に記述する。同様に機能する要素は同じ参照番号を付されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図１は、特に指示された相関関数を測定するのに適する走査顕微鏡を示す。入射レーザビームはビームスプリッタ（図示せず）により２つのビームに分かれる。部分ビームの１つは４π共振器に直に向かう。ここで別なビームスプリッタ（ＢＳ）は２つのビームを作る。これらビームは２つの対物レンズ（ＯＬ）を通って試料の同じ位置にフォーカスされ、そこで干渉により軸パターンを作る。
【００２５】
それに代えて、マイクロレンズスキャナー（ＬＡ）により複数の隣接ビームに分かれた他方の部分ビームも用いられる。ビームの位置はビームプロフィール内で変化する。結局、付加的な移動可能な横パターンが試料内で作られる。
【００２６】
４π共振器の２つの側面の１つのスイッチを切ることで純粋な横パターンが作られる。
【００２７】
ここでは、光軸回りのパターンを回転させる多くの可能性の１つとして、ドーププリズム（ＤＰ）が示されている。
【００２８】
図２ａが、４８８ｎｍの励起光、１．２の開口数、浸水及びエアリーディスクのサイズの検出ピンホール開口と算定された１光子４π共焦点顕微鏡の点広がり関数（ＰＳＦ）を示す。小さい図は、干渉ビームの相対位相が変化するときのパターンの変化を示す。
【００２９】
図２ｂは、移動パターンの時間的な平均強度分布を示す。それは共焦点ＰＳＦと一致する。
【００３０】
図３ａは、ｘ軸上の２００ｎｍの距離に配置された複数の励起焦点のコヒーレントな重ね合わせから生じる横調整ＰＳＦを示す。隣接する焦点の位相は互いに対してπだけシフトする。それらの振幅は、ガウス形包絡面の中心までの距離に依存し、４００ｎｍの後は１／ｅ２倍まで減少する。ＰＳＦは、焦点面（ｘｙ）及びｘｚ方向で表される。下の小さい図面は、焦点が包絡面内で移動する際のパターン変化を示す。
【００３１】
図３ｂは時間的な移動パターンの平均を示す。
【００３２】
図４ａ及び４ｂは、励起調整と検出調整の間の２つの異なる位相シフトφのために表された図２ａ及び３ｂのパターンの組み合わせからロックイン検出法により作られた有効なＰＳＦを示す。
【００３３】
図５ａは、横パターンと軸パターンの組み合わせから生じたＰＳＦを示す。軸パターンと横パターンは、この例では小さい図に示された周波数ω２＝９ω１／１０で変化する。完全な円はφ＝２πで決定される。時間平均から生じる包絡面がｂに示されている。
【００３４】
図６ａは、ω１−ω２の周波数の差でロックイン検出法を用いて、図５に示されたパターンの組み合わせから生じた有効なＰＳＦを示す。斜め構造が座標系の二等分線に沿う運動を認識するために用いられ、例えば、拡散テンソルを完全に決定する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】特に指示された相関関数を測定するのに適する走査顕微鏡を示す。
【図２】１光子４π共焦点顕微鏡の点広がり関数（ＰＳＦ）を示す。
【図３】時間的な移動パターンの平均を示す。
【図４】励起調整と検出調整の間の２つの異なる位相シフトｆのために表された図２ａ及び３ｂのパターンの組み合わせからロックイン検出法により作られた有効なＰＳＦを示す。
【図５】横パターンと軸パターンの組み合わせから生じたＰＳＦを示す。
【図６】ω１−ω２の周波数の差でロックイン検出法を用いて、図５に示されたパターンの組み合わせから生じた有効なＰＳＦを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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