(57)【要約】培養線維細胞の分化経路、線維細胞のインビボの創傷部位への遊走のためのシグナルの特徴決定、及び創傷拘縮における線維細胞の可能性のある役割が開示される。本発明は、ＣＤ１４＋細胞を主に含むヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を自己Ｔ細胞又はある型のＴＧＦβ、好ましくはＴＧＦβ１と接触させ、それによりＰＢＭＣ集団中の前駆細胞からの線維細胞の分化を誘導することを含む、線維細胞を作製する方法に関するものである。これらの線維細胞は、線維細胞を、好ましくはＴＧＦ１と組み合わせて対象へ投与することにより、哺乳動物対象における創傷を処置するために有用である。創傷の部位又はその近傍において、ＳＬＣ又はもう一つのＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストを投与することにより、創傷へ線維細胞を誘引又は標的化する方法、及び線維細胞活性を阻害することにより望まれない創傷繊維症を減少させる方法も、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約４０％のＣＤ１４＋細胞を含むヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を自己Ｔ細胞と接触させ、それによりＰＢＭＣ集団中の前駆細胞から線維細胞の分化を誘導することを含む、線維細胞を作製する方法。
【請求項２】
該接触が、約７〜１０日間である、請求項１の方法。
【請求項３】
該少なくとも約４０％のＣＤ１４＋細胞を含む集団が、固体基質上での接着性ＰＢＭＣ集団の培養により提供される、請求項１の方法。
【請求項４】
該集団が、少なくとも約７０％のＣＤ１４＋細胞を含む、請求項３の方法。
【請求項５】
該ＣＤ１４＋細胞を含む集団が、細胞表面抗原に対する抗体を用いるＴ又はＢ細胞集団の除去により精製される、請求項１の方法。
【請求項６】
該ＰＢＭＣ集団をある型のＴＧＦβと接触させることを含む、ＰＢＭＣ集団からの線維細胞の分化を誘導することにより線維細胞を作製する方法。
【請求項７】
該ＴＧＦβの型が、ＴＧＦβ１である、請求項６の方法。
【請求項８】
該ＰＢＭＣ集団が、少なくとも約３日間、１〜１０ng/mlのＴＧＦβ１と共に培養される、請求項７の方法。
【請求項９】
ある型のＴＧＦβとの該接触の間、該ＰＢＭＣ集団が、Ｔ細胞と接触している、請求項６の方法。
【請求項１０】
ある型のＴＧＦβと組み合わせて線維細胞を投与することを含む、哺乳動物対象における創傷を処置するための方法。
【請求項１１】
該ＴＧＦβの型が、ＴＧＦβ１である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
該線維細胞及びＴＧＦβ１が、単一組成物において投与される、請求項１０の方法。
【請求項１３】
該線維細胞及びＴＧＦβ１が、別々の組成物において投与される、請求項１０の方法。
【請求項１４】
該線維細胞が、全身投与又は局所投与される、請求項１０の方法。
【請求項１５】
線維細胞を含有している混合細胞集団をＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストの勾配に曝露し、該アゴニストへの走化応答により混合細胞集団中の他の細胞型から線維細胞が分離されるようにすることを含む、線維細胞を精製又は豊富化する方法。
【請求項１６】
該ＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストが、二次リンパケモカイン（ＳＬＣ）である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
創傷の部位又はその近傍において、対象へＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストを投与することを含む、哺乳動物対象における創傷へ線維細胞を誘引又は標的化する方法。
【請求項１８】
該ＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストが、ＳＬＣである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
該ＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストが、非露出創傷の部位又はその近傍において、局所投与、皮内投与、皮下投与、又は腹腔内投与される、請求項１７の方法。
【請求項２０】
該ＳＬＣが、少なくとも１日１回、約１００ng〜約１mg／回の単位投与量で、少なくとも約３日間、又は所望の治癒が得られるまで投与される、請求項１８の方法。
【請求項２１】
該創傷を有する対象へ、該対象へのＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストの投与の前に、後に、又はそれと同時に、線維細胞を投与することをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２２】
哺乳動物対象へ線維細胞活性の阻害物質を投与することを含む、線維細胞の望まれない効果を減少させる方法であって、該阻害物質が、Ｔ細胞による線維細胞分化の刺激を妨害する物質、ＴＧＦβ１による線維細胞分化の刺激を妨害する物質、及びＳＬＣによる線維細胞の誘引を妨害する物品からなる群より選択されるか、又は該群より選択された物品の組み合わせである方法。
【請求項２３】
該線維細胞の望まれない効果が、望まれない創傷繊維症を含み、該対象が、望まれない繊維症を示すか又はそれを示すと予想される創傷を有している、請求項２２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年６月４日出願の米国仮出願第６０／２９４，９８８号に基づく優先権を主張するものである。その仮出願の全体が、参照によりここに組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の領域
本発明は、線維細胞（fibrocytes）の作製、使用及び阻害のための方法及び組成物に関するものであり、特にＴ細胞又はＴＧＦβを使用したｅｘ  ｖｉｖｏの線維細胞の作製；ＣＣＲ７ケモカイン受容体のリガンド、特に二次リンパケモカイン（secondary lymphoid chemokine）（ＳＬＣ）を使用したｉｎ  ｖｉｖｏの創傷への線維細胞の標的化；及び特にＳＬＣ活性の阻害物質を使用することにより線維細胞活性を妨害することによる、線維細胞の効果、例えば望まれない創傷繊維症における効果の減少を含む。
【０００３】
技術の背景
繊維芽細胞は、組織起源及び活性化のための刺激に依って別個の機能を示す不均一な細胞型の集団である。創傷に見い出される繊維芽細胞は、治癒過程にとって重要であると考えられている。創傷繊維芽細胞が末梢血細胞に起因するという概念は、ほぼ１００年前に生まれた（１に概説）。それ以降、多数の研究が、末梢単核細胞の繊維芽細胞様細胞への分化を報告している。
【０００４】
１９９４年、組織損傷の部位へ迅速に侵入する、血液由来の繊維芽細胞様細胞の別個の集団が記載された（２）。「線維細胞」と名付けられたこれらの細胞は、末梢血中の非赤血球細胞の０．１〜０．５％を占め、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された場合、接着性の紡錘形の形態学を示す。培養線維細胞は、繊維芽細胞産物であるコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、及びフィブロネクチンのみならず、白血球共通抗原（ＣＤ４５ＲＯ）、汎骨髄系抗原（ＣＤ１３）、及び造血幹細胞抗原（ＣＤ３４）も発現する。さらに、線維細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ及び共刺激分子（ＣＤ８０及びＣＤ８６）を発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで抗原を提示する能力を有する（３、４）。形態学、増殖特性及び細胞表面マーカーによると、線維細胞は、単球／マクロファージ、樹状細胞及びその他の既知の抗原提示細胞型とは別個のものであるらしい。培養線維細胞は、（ＣＤ１４、ＣＤ１６又はＣＤ１９のような）典型的な単球／マクロファージ特異的マーカー又はＢ細胞マーカーを発現せず、（ＣＤ１ａ、ＣＤ１０、ＣＤ２５及びＣＤ３８のような）樹状細胞又はそれらの前駆細胞の典型的な表面タンパク質も発現しない。さらに、末梢血から単離され、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養された線維細胞は、独特のプロファイルのサイトカイン、増殖因子及びケモカインを分泌する（５）。
【０００５】
創傷における存在、並びに炎症促進性のサイトカイン、ケモカイン及び細胞外マトリックスタンパク質の分泌に基づき、線維細胞は、創傷治癒及び結合組織形成において役割を果たしていると仮定されている。性不一致骨髄キメラマウスにおいて実施された初期の研究は、線維細胞が、比較的放射線抵抗性の祖先集団から発生することを示したが（２）、これらの細胞の正確な起源、及び定方向の遊走に関係している創傷輸送シグナルは、未だ不明である。
【０００６】
セラミ（Cerami）らの米国特許第５，８０４，４４６号は、線維細胞を含む「血液由来間葉細胞」、及びそのような細胞を作製し使用する方法を開示している。アッペルバウム（Appelbaum）らの米国特許第６，１５３，４４１号は、分泌型ヒトタンパク質、ケモカインＣＫβ−９（二次リンパケモカイン（ＳＬＣ）、Ｅｘｏｄｕｓ−２、６Ｃｋｉｎｅ及びＴＣＡ−４としても既知）と、その細胞受容体、ヒトＣＣＲ７（ＥＢＩ１及びＢＬＲ２としても既知）との相互作用のアゴニスト及びアンタゴニストを発見するためのスクリーニング法を開示している。
【０００７】
発明の概要
線維細胞は、独特の細胞表面表現型（コラーゲンＩ＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１３＋／ＣＤ３４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋／ＭＨＣクラスＩＩ＋／ＣＤ８６＋）を示し、強力な免疫刺激活性を示す、血液由来細胞の別個の集団である。本発明は、培養線維細胞の分化経路の同定、ｉｎ  ｖｉｖｏの創傷部位への線維細胞遊走のためのシグナルの特徴決定、及び創傷拘縮における線維細胞の可能性のある役割の解明に一部基づいている。
【０００８】
ここに報告されるように、ｅｘ  ｖｉｖｏ培養線維細胞は、ＣＤ１４＋豊富化単核細胞集団から分化することができ、この過程はＴ細胞との接触を必要とする。さらに、創傷治癒に関与している重要な繊維形成性かつ増殖制御性のサイトカインＴＧＦβ１（１〜１０ng/ml）が、培養線維細胞の分化及び機能的活性を増加させる。これらの所見は、培養線維細胞の分化経路のためのメカニズムを提供し、そして免疫細胞活性化のためのシグナル伝達及び補助機能に関係していることが以前に示されていたＴＧＦβを、天然の線維細胞分化因子として同定する。
【０００９】
従って、本発明の一つの面は、ＣＤ１４＋細胞を主に含むヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団を、好ましくは７〜１０日間、自己Ｔ細胞と接触させ、それによりＰＢＭＣ集団中の前駆細胞からの線維細胞の分化を誘導することを含む、線維細胞を作製する方法に関する。この方法において、主にＣＤ１４＋細胞の集団は、例えば、固体基質上での接着性ＰＢＭＣ集団の生育により提供される。ＣＤ１４＋細胞は、例えば細胞表面抗原に対する抗体を使用したＴ又はＢ細胞集団の除去により、Ｔ細胞との接触の前又は後に、さらに精製され得る。
【００１０】
本発明の別の方法において、場合によりＴ細胞と接触していてもよいＰＢＭＣ集団、好ましくは主にＣＤ１４＋細胞の集団を、ある型のＴＧＦβ、好ましくはＴＧＦβ１と接触させることにより、集団からの線維細胞の分化を誘導することにより、線維細胞が作製される。好ましくは、ＰＢＭＣ集団は、数日間、例えば１週間、１〜１０mg/mlのＴＧＦβ１と共に培養される。場合により、ＣＤ１４＋細胞は、ＴＧＦβ１との培養の後に、ＰＢＭＣ集団から精製されてもよい。
【００１１】
線維細胞及びこれらの細胞により産生された因子の多様な使用、特に、以下に限定はされないが、身体的な擦過傷、切傷、熱傷、慢性潰瘍、炎症状態等、及び任意の外科的手技に起因する、皮膚の創傷、角膜の創傷、上皮で裏打ちされた器官の創傷を含む創傷の治癒を改良するための使用が、ここに記載された本発明に包含される。本発明の一つの実施態様において、本発明の方法により作製された線維細胞は、例えば、本発明により作製された線維細胞を対象へ投与することを含む、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象における創傷を処置する方法において有用である。好ましくは、線維細胞は、ＴＧＦβ１と組み合わせてそのような対象へ投与され、その際、線維細胞及びＴＧＦβ１は、細胞及びＴＧＦβ１を含む組成物に含まれて、又は別々の組成物に含まれて、又はその両方で投与される。本発明の方法により調製された線維細胞、及び場合によりＴＧＦβ１は、例えば静脈注射のような非経口投与により全身投与されるか、又は例えば露出創傷への局部投与もしくは皮下投与もしくは腹腔内投与により局所投与される。
【００１２】
ここにさらに報告されるように、線維細胞が組織損傷の部位へホーミングする理由を研究する中で、ＣＣＲ７ケモカイン受容体のリガンドである二次リンパケモカイン（ＳＬＣ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの線維細胞走化性、及びｉｎ  ｖｉｖｏの注射された線維細胞の皮膚組織損傷の部位へのホーミングのための強力な刺激として作用することが発見された。
【００１３】
従って、本発明は、線維細胞を含有している混合細胞集団をＳＬＣの勾配に曝し、混合細胞集団中の他の細胞型から線維細胞が分離されるようにすることを含む、線維細胞を精製又は豊富化する方法に関する。
【００１４】
もう一つの面において、本発明は、創傷の部位又はその近傍において、対象へＳＬＣ又はもう一つのＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストを投与することにより、哺乳動物対象、好ましくはヒト対象における創傷へ線維細胞を誘引又は標的化する方法に関する。ＳＬＣ又はその他のＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストは、例えば、露出創傷への局部投与、又は非露出創傷の部位もしくはその近傍における皮内投与、皮下投与もしくは腹腔内投与により、局所投与される。好ましくは、ＳＬＣは、少なくとも１日１回、より好ましくは１日数回、約１００ng〜１mg／回、好ましくは約１〜１００μgの単位投薬量で、所望の創傷治癒が得られるまで投与される。従って、ＳＬＣは、どの程度迅速に所望の治癒が得られるかに依って、少なくとも約３日〜１週間、又は数週間もしくはそれ以上の期間にわたり投与され得る。
【００１５】
ＳＬＣ以外のＣＣＲ７ケモカイン受容体のアゴニストは、既知のＣＣＲ７ケモカイン受容体、及び受容体アゴニストを単離するための当分野において既知の方法を使用して、例えば、当分野において既知の方法を使用した、ＳＬＣの系統的突然変異分析、又はケモカインＳＬＣのようなポリペプチドの低分子模倣体を同定するための既知のアプローチにより、単離され得る。
【００１６】
線維細胞を創傷へ誘引又は標的化するための本発明の方法は、創傷部位又はその近傍におけるＳＬＣの投与の前に、後に、又はそれと同時に、本発明により作製された線維細胞を、場合によりＴＧＦβ１と組み合わせて、創傷を有する対象へ投与することにより、本発明の方法により作製された線維細胞を使用して創傷を処置する上記の方法と、場合により組み合わせられてもよい。
【００１７】
もう一つの面において、本発明は、線維細胞活性を阻害することにより、望まれない創傷繊維症のような望まれない線維細胞の効果を減少させる方法に関する。望まれない創傷繊維症を阻害するこの方法の一つの実施態様において、線維細胞活性の阻害物質は、望まれない繊維症を示すか又はそれを示すと予想される創傷を有している哺乳動物対象、好ましくはヒト対象へ投与される。線維細胞活性の阻害物質は、例えば静脈注射のような非経口投与により全身投与されるか、好ましくは、例えば腹腔内投与、露出創傷への局部投与、皮内投与、又は皮下投与により、創傷の部位又はその近傍において局所投与される。本発明のこの面において使用される線維細胞活性の阻害物質は、Ｔ細胞による線維細胞分化の刺激を妨害する薬剤、ＴＧＦβ１による線維細胞分化の刺激を妨害する薬剤、及びＳＬＣによる線維細胞の誘引を妨害する薬剤からなる群より選択される。場合により、本発明の望まれない線維細胞の効果を減少させる方法は、Ｔ細胞もしくはＴＧＦβ１による線維細胞分化の刺激を妨害する薬剤、及び／又はＳＬＣによる線維細胞の誘引を妨害する薬剤１個以上の組み合わせを利用してもよい。
【００１８】
Ｔ細胞による線維細胞分化の刺激を妨害する薬剤は、例えば、ここに開示された方法に基づき、Ｔ細胞による線維細胞分化の刺激に関する細胞培養アッセイを使用して同定され得、以下に限定はされないが、線維細胞分化の刺激を妨害するＴ細胞に対する抗体を含む。ＴＧＦβ１による線維細胞分化の刺激を妨害する薬剤は、非制限的な例として、ＴＧＦβ１の線維細胞受容体とＴＧＦβ１が結合することを防止することにより、線維細胞分化の刺激を阻害する抗体を含み、例えば、以下に限定はされないが、ＴＧＦβ１又はＴＧＦβ１の線維細胞受容体のいずれかと結合する抗体を含む。
【００１９】
ＳＬＣによる線維細胞の誘引を妨害する薬剤は、ＳＬＣの産生を妨害する薬剤、及びＳＬＣの活性を妨害する薬剤を含み、例えば、ＳＬＣ又はＳＬＣの線維細胞受容体のいずれかと結合する抗体のような、ＳＬＣの線維細胞（ＣＣＲ７ケモカイン）受容体とＳＬＣが結合することを防止することにより、線維細胞の誘引を阻害する抗体を含む。本発明の方法において使用され得るＳＬＣの活性を妨害する薬剤は、可溶性ＳＬＣ受容体又はＳＬＣと結合するその断片、及び線維細胞ＳＬＣ受容体との結合に関してＳＬＣと競合するが、その受容体を活性化しないか、又はＳＬＣより低い程度にその受容体を活性化するＳＬＣのアンタゴニスト又は競合的阻害物質も含む。
【００２０】
詳細な説明
従来の研究は、末梢血のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物中に発生する区別可能な間葉細胞型である線維細胞が、単球様の特徴及び繊維芽細胞様の特徴の両方を示すことを示した（２１に概説）。線維細胞は、最初、マウスにおいて、血液から皮下に埋め込まれた創傷チャンバーへの迅速かつ特異的な動員により同定された（２）。次いで、ヒト線維細胞が、１又は２週間後に、全血のＰＢＭＣ画分の培養物から出現することが示された（２）。培養線維細胞は、繊維症（５）、抗原提示及び免疫（３、４）、並びに血管形成（ＣＮＭ、未公開データ）を媒介することが示されている。当研究においては、末梢血線維細胞の分化経路が調査され、創傷修復における線維細胞の役割が探究された。
【００２１】
ＤＭＥＭ及びＦＢＳの中で培養された場合、ＣＤ１４＋豊富化末梢血細胞の接着性集団から、線維細胞が（付加的な増殖因子なしに）分化した。下記実施例を参照のこと。この分化過程は、Ｔ細胞相互作用により有意に増強された。
【００２２】
興味深いことに、組織修復及び繊維症において中心的な役割を果たしている多機能性サイトカインであるＴＧＦβ１の、「粗」の線維細胞へ進化する培養物への添加は、線維細胞分化を助長した。繊維芽細胞増殖及びコラーゲン産生に対する外因性ＴＧＦβの役割は、よく証明されている（２８に概説）。ＴＧＦβは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの皮膚繊維芽細胞（２９）、筋繊維芽細胞（３０）によるコラーゲン発現のみならず、ｉｎ  ｖｉｖｏの増殖性斑痕異種移植片によるコラーゲン発現も有意にアップレギュレートする（３１）。多くの研究室が、ＴＧＦβが天然の創傷治癒過程において役割を果たしていること、及びＴＧＦβが創傷治癒の初中期（４〜７日目）にげっ歯動物創傷チャンバーにおいて発現されることを確認した（３２）。さらに、ラットの皮膚へのＴＧＦβ１  ｃＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入は、創傷修復の速度を有意に増強した（３３）。これらの従来の観察と一致して、本発明者らは、循環血中の線維細胞前駆細胞が、活性化Ｔ細胞と相互作用し、それが、（線維細胞表現型への）初期の分化を許容し、次いで、それらが創傷部位へ遊走すると仮定する（図７）。創傷部位において、これらの「初期の」分化した線維細胞は、動員されたＴ細胞とさらに相互作用し、そしてＴＧＦβに曝された後、完全に分化及び成熟し得る。これらの完全に分化し成熟した線維細胞は、増加したレベルのαＳＭＡを発現し、創傷治癒及び拘縮を促進するコラーゲン及びその他の細胞外マトリックスタンパク質を産生する。
【００２３】
繊維芽細胞は、ある種の繊維症性疾患状態において増加したコラーゲン発現及びその他のマトリックス成分を示すことが示されている（３４に概説）。研究者らは、以前に、皮膚（３５）及び肺（３５、３６）の繊維症にＴＧＦβ過剰発現が関係していることを示した。さらに、ＴＧＦβ過剰発現は、肺線維症の動物モデルにおける増強された筋繊維芽細胞活性と関連付けられている（３７）。ＴＧＦβ１が培養線維細胞の増殖、コラーゲン産生及びαＳＭＡ発現を増強したという本発明者らの所見は、この循環血中の細胞型が、ｉｎ  ｖｉｖｏのＴＧＦβ依存性繊維症性応答に関係していることを示している可能性がある。
【００２４】
創傷治癒及び接続瘢痕組織形成における線維細胞の役割は、創傷部位におけるそれらの蓄積に基づき仮定された（２）。しかしながら、創傷への線維細胞の輸送を媒介する分子シグナルは、未だ調査されていない。本発明者らは、培養「豊富化」線維細胞調製物によるケモカイン受容体発現（ｍＲＮＡ及びタンパク質）を調査し、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４の存在、並びにＣＣＲ４、ＣＣＲ６及びＣＸＣＲ３の欠如を明らかにした。さらなる研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの、ＣＣＲ７のリガンド、ＳＬＣ（６Ｃｋｉｎｅ、Ｅｘｏｄｕｓ−２及びＴＣＡ−４としても既知）に応答して起こる、培養「豊富化」線維細胞調製物からの細胞の定方向の走化性を示した。Ｃ−ＣケモカインファミリーメンバーであるＳＬＣは、Ｔ細胞及び成熟樹状細胞の誘引により発生中のリンパ組織の構成に関与していることが示されている（３８）。ＳＬＣ発現は、炎症の部位に観察されている（３９）。本発明者らは、創傷部位内の血管内皮によるＳＬＣ発現を観察した。これらの観察に基づき、ＳＬＣ発現を欠く変異マウスを使用して、創傷応答における線維細胞の役割を調査することは興味深いであろう（４０〜４２）。
【００２５】
創傷治癒における線維細胞の機能は、従来調査されていない。ＴＧＦβは、ＴＧＦβに応答して増加したαＳＭＡ染色、上昇したコラーゲン分泌（１９に概説）、及び増加したストレスファイバー（１７）を示す収縮性創傷筋繊維芽細胞への繊維芽細胞の分化転換のための最も重要なサイトカインであることが示されている。筋繊維芽細胞は、「初中期」創傷組織に一時的に見出され、創傷を閉鎖するために必要な重要な収縮力を発揮することが提唱されている。筋繊維芽細胞の起源も、組織損傷の部位における筋繊維芽細胞蓄積に必要な輸送シグナルも、よく理解されない。筋繊維芽細胞は、祖先幹細胞、常在性組織繊維芽細胞、又は組織平滑筋細胞のいずれかに由来すると仮定されてきた。しかしながら、有力な代案は、常在性のものではなく、循環血中の前駆細胞型から筋繊維芽細胞が分化するというものである。
【００２６】
この開示において、本発明者らは、血液由来のｅｘ  ｖｉｖｏで培養された前駆線維細胞が、創傷治癒中の筋繊維芽細胞と類似した特徴を示すαＳＭＡ＋ＴＧＦβ１応答性線維細胞へ分化する能力を有することを示す。分化した線維細胞及び筋繊維芽細胞は、創傷における一時的な存在、多数の炎症促進性サイトカイン及び増殖因子の産生、コラーゲン及びその他の細胞外マトリックスタンパク質の分泌、並びにＴＧＦに応答して増強されるコラーゲン産生という多くの共通の特質を共有している。さらに、本発明者らは、培養線維細胞が、筋繊維芽細胞と同様に、ＴＧＦβ１処理により増強されるαＳＭＡタンパク質を発現すること、さらに、培養された単離された線維細胞が、創傷を負った組織の表皮剥脱表面積の量を減らすために適した収縮力を発揮することを観察した。従って、循環血中前駆細胞集団に由来する線維細胞は、創傷治癒の回復及び修復の過程で重要な役割を果たしている。
【００２７】
実施例
ＣＤ１４＋細胞から主になる末梢血集団はｉｎ  ｖｉｔｒｏで線維細胞を生成させるが、ＣＤ１４−細胞集団はそれらを生成させない
線維細胞の起源を決定するため、本発明者らは、プラスチック上で培養された接着性ヒト末梢血単核細胞の増殖及び表現型を分析した（図１Ａ参照）。標準的なフィコール（Ficoll）（商標）分離の後、得られた集団は、およそ４０〜５０％がＣＤ１４＋細胞であった。一晩の接着工程後の接着細胞集団（「全」）は、フローサイトメトリーにより評価されたように、＞７０％がＣＤ１４＋細胞であり、検出可能なコラーゲンＩ染色を示さなかった（データは示さず；５）。本発明者らは、以前の研究において、２週間後に、これらの培養物中の細胞が、もはやＣＤ１４を発現していないがコラーゲンＩは発現していることを示した（５）。重要なこととして、本発明者らは、「ＣＤ１４＋」細胞に関して豊富化された細胞集団（即ち、磁性ビーズにより全てのＴ又はＢ細胞を枯渇させたＰＢＭＣ）が、１週間の培養後、極めて少数のコラーゲンＩ＋／ＣＤ１１ｂ＋の紡錘形の線維細胞を生成させることを見出した（データは示さず）。
【００２８】
トランスウェル（Transwell）（商標）培養チャンバーを使用して、本発明者らは、循環血中血液細胞画分からのｉｎ  ｖｉｔｒｏの線維細胞分化（ＣＤ１１ｂ／ＣｏｌＩ＋）のための細胞要件を調べた（図１Ｂ）。１週間、「ＣＤ１４−」細胞画分をトランスウェル（商標）プレートの下方ウェルで培養し、全ＰＢＭＣを上室で培養した場合、線維細胞は下室に出現しなかった。同様に、１週間、「ＣＤ１４＋」細胞単独を下室で培養し、「ＣＤ１４＋」細胞又は全ＰＢＭＣを上室で培養した場合にも、線維細胞は下室に出現しなかった。対照的に、「全」ＰＢＭＣをトランスウェル（商標）チャンバーの下ウェルで培養し、「ＣＤ１４−」細胞又は「ＣＤ１４＋」細胞（又は培地単独／データは示さず）を上室で培養した場合には、多数の紡錘形の線維細胞（ＣＤ１１ｂ＋／ＣｏｌＩ＋）が１週間以内に観察された。これらのデータは、培養ＰＢＭＣからの線維細胞成長が、豊富化ＣＤ１４＋細胞の集団ともう一つの末梢血細胞型との細胞相互作用を必要とすること、又は線維細胞前駆細胞が、ＰＢＭＣ画分にのみ存在することを示唆している。
【００２９】
次いで、細胞相互作用の要件を調査するため、本発明者らは、精製された自己Ｔ又はＢ細胞のいずれかを「ＣＤ１４＋」細胞培養物へ様々な比率（ＣＤ１４＋：Ｔ；０：１、１：０、３：１、１：１及び１：３）で７〜１０日間添加し、「ＣＤ１４＋」細胞とＴ細胞との共培養が線維細胞（ＣＤ１１ｂ＋／ＣｏｌＩ＋）を生成させることを見出した（図１Ｃ）。本発明者らは、３：１というＣＤ１４＋細胞：Ｔ細胞比が、線維細胞の培養にとって最適であることを観察した（図１Ｃ）。対照的に、Ｔ細胞を単独で培養した場合、又はＢ細胞と「ＣＤ１４＋」細胞との共培養物中、又は「ＣＤ１４＋」細胞をＴ細胞条件培地と共に培養した場合には、線維細胞は出現しなかった（データは示さず）。線維細胞はＴ細胞マーカー（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）、又は典型的なＴ細胞サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮγ）を発現しないため、Ｔ細胞が線維細胞を生成させるという可能性は低い。
【００３０】
ＴＧＦβ１はｉｎ  ｖｉｔｒｏで線維細胞分化を加速する
次に、本発明者らは、繊維芽細胞増殖及び細胞外マトリックス産生にとって重要なサイトカインであるＴＧＦβ１が、ＰＢＭＣ培養物中の線維細胞の分化及び蓄積を促進し得るか否かを調べた。３〜１０日目のＰＢＭＣ培養物へのＴＧＦβ（１〜１０ng/ml）の添加は、紡錘形の形態学を有する細胞の増強された蓄積により示されたように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの線維細胞分化を促進した（図２Ａ〜Ｃ）。ＴＧＦβ１によるこれらの培養物の処理は、用量依存的にこれらの培養物中の線維細胞によるコラーゲンＩの発現を増加させた（図２Ｄ）。コラーゲンＩ発現に関する平均蛍光強度は、０、１及び１０ng/ml  ＴＧＦβ１により処理された培養物における線維細胞に関して、それぞれ１１、２４及び６３であった（図２Ｄ）。これらのＣｏｌＩ＋細胞は、ＣＤ１１ｂ染色も陽性であった（データは示さず）。さらに、培養物中のコラーゲンＩ染色陽性細胞の数は、ＴＧＦβ１に応答して用量依存的に増加し、１０ng/ml  ＴＧＦβ１に応答して起こった、未処理の培養物と比較した増加は、ほぼ４０％であった。３人の他のドナーに由来する線維細胞調製物を用いても類似した結果が観察され、各々、０〜１０ng/ml  ＴＧＦβ１で３０〜４５％のコラーゲンＩ発現の増加を示した。
【００３１】
ｅｘ  ｖｉｖｏ培養線維細胞は創傷部位へ遊走する
次に、本発明者らは、マウスモデル系を使用して、移植された培養「豊富化」線維細胞の創傷部位への遊走を定量することを求めた。蛍光色素で標識された培養「豊富化」マウス線維細胞調製物（＞９６％純粋）を、マウスの尾静脈へ注射した（５×１０５個／匹）。直ちに、数匹のマウスにおいて、背側肩甲区域に完全な厚さの皮膚パンチ生検創傷（直径５mm）を作成した。創傷部位（及び比較可能な未処理の皮膚組織）を４日後に切除し、標識された線維細胞の存在に関して生検標本を調査した。図３Ａに示されるように、４日目の創傷組織の顕微鏡分析により、多数の蛍光性細胞が見出された。標識された線維細胞は、創傷縁において新たに形成された血管の近傍に位置しているようであった。もう一つのマウス群（各群ｎ＝３）を使用して、切除された創傷組織又は正常組織（２５０μg／個）から単一細胞懸濁物を調製し、標識された線維細胞をフローサイトメトリーにより定量した。遊走した標識された線維細胞の計算は、創傷を負った組織が、同一マウスから採取された正常皮膚の類似した区域より有意に多く、標識された線維細胞を含有していることを明らかにした（図３Ｂ）。
【００３２】
線維細胞は、機能性ケモカイン受容体を発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで二次リンパケモカイン（ＳＬＣ）に応答して遊走する
好中球、単球及びＴ細胞のような多数の循環血中の細胞が、皮膚創傷部位へ遊走することが既知である。この過程は、ケモカインとそれらの受容体との特異的な相互作用により、一部、構成されている。本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲにより、ケモカイン受容体ｍＲＮＡ発現に関して培養「豊富化」線維細胞調製物を検討し、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４のｍＲＮＡを見出したが（図４Ａ）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６又はＣＸＣＲ３のｍＲＮＡ発現は見出さなかった。本発明者らは、フローサイトメトリーにより、ヒト細胞「豊富化」線維細胞培養物の表面におけるＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４タンパク質発現を確認した（図４Ｂ）。マウス血液から単離された培養「豊富化」線維細胞調製物からの細胞は、細胞蛍光測定分析により分析されたように、ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４も発現していた（図４Ｃ）。
【００３３】
線維細胞に関して「豊富化」された集団による、ＳＬＣの受容体であるＣＣＲ７及びＳＤＦの受容体であるＣＸＣＲ４の発現に基づき、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ走化性アッセイにおいてＳＬＣ及びＳＤＦを使用した。図５Ａに示されるように、ＳＬＣは線維細胞の遊走を有意に誘導したが、ＳＤＦは誘導しなかった。チェッカーボード分析は、細胞調製物培養物及び「豊富化」線維細胞のＳＬＣに対する走化応答（化学運動応答ではない）を確認した（図５Ｂ）。これらの観察に基づき、本発明者らは、ＳＬＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、そのケモカインのｉ．ｄ．注射の後に、培養「豊富化」線維細胞調製物から移植された細胞の遊走を促進しうるか否かを調査した。１μgの用量で投与されたＳＬＣは、ＰＢＳ単独と比較した場合、ｉ．ｄ．注射部位の周囲の皮膚区域における予め標識されたｅｘ  ｖｉｖｏ培養線維細胞の蓄積を劇的に誘導した（図５Ｃ）。対照的に、ＳＤＦ注射はｉｎ  ｖｉｖｏの線維細胞走化性を促進しなかった（図５Ｃ）。２日目の創傷部位の免疫染色は、血管内皮によるＳＬＣケモカイン発現を明らかにした（データは示さず）。これらの結果は、一部、血管内皮由来ＳＬＣと線維細胞ＣＣＲ７との相互作用によって、線維細胞が初期創傷部位へ遊走することを示唆している。
【００３４】
線維細胞はコラーゲンゲルを収縮させる
コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型の創傷における存在及び発現に基づき、本発明者らは、線維細胞が創傷治癒及び繊維症を媒介すると仮定した。ガビアニ（Gabbiani）及び共同研究者らは、以前に、ＴＧＦβの存在下で「筋繊維芽細胞」へ分化する創傷繊維芽細胞の集団を記載した（１７、１８に概説）。これらの細胞は、αＳＭＡの発現、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでコラーゲンゲルを収縮させる活性、並びに創傷閉鎖、炎症及び繊維症におけるそれらの提唱された役割を特徴とする（１９に概説）。ＴＧＦβ１が培養線維細胞によるコラーゲンＩ発現を増強すること（図２Ｄ）及び線維細胞が数日間創傷組織に存在すること（２０）を認識した本発明者らは、次に、培養「豊富化」線維細胞調製物がαＳＭＡを発現し、収縮力を示すか否かを調査した。図６Ａに示されるように、未刺激の培養「豊富化」線維細胞調製物は、αＳＭＡ  ｍＲＮＡを発現するが、新鮮に単離されたＰＢＭＣはそれらを発現しないことが見出された。未刺激の培養「豊富化」線維細胞調製物は、αＳＭＡタンパク質も発現しており、ＴＧＦβ１（１０ng/ml）の添加は、約４倍、αＳＭＡレベルを増加させた（図６Ｂ）。次に、本発明者らは、単離された培養「豊富化」線維細胞集団の収縮活性を調査した。本発明者らは、未処理の培養「豊富化」線維細胞集団が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでおよそ２０％有意にコラーゲンゲルを収縮させるが、ＰＢＭＣはそれらを収縮させないことを見出した（図６Ｃ）。アッセイ前７日間のＴＧＦβ１（１０mg/ml）による線維細胞の前処理は、収縮活性をさらに増加させた（図６Ｃ）。このＴＧＦβ１により処理された線維細胞培養物によるゲル収縮の増加は、ＴＧＦβ１に応答して増強される線維細胞によるαＳＭＡの発現と相関していた。
【００３５】
方法
マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、８〜１２週）は、ジャクソン研究所（The Jackson Laboratory）（Bar Harbor、ＭＥ）より購入した。全ての動物手法を、承認されたプロトコルの下で、ノースショア大学病院（North Shore University Hospital）の動物の管理及び使用に関する委員会（the Institutional Animal Care and Use Committee）の指針に従い実施した。
【００３６】
抗体、サイトカイン及びケモカイン
ＦＩＴＣ−抗αＳＭＡ  ｍＡｂはシグマ（Sigma）（St. Louis、ＭＯ）より購入した。ビオチン化ウサギ抗コラーゲンＩ及びビオチン化ウサギＩｇＧは、ロックランドイムノケミカルズ（Rockland Immunochemicals）（Gilbersville、ＰＡ）より購入した。抗マウスＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７又はＣＸＣＲ４ポリクローナル抗体及びＦＩＴＣ−抗ヤギＩｇＧ抗体は、サンタクルーズバイオテクノロジー社（Santa Cruz Biotechnology Inc.）（Santa Cruz、ＣＡ）より購入した。他のすべての抗体は、ＢＤファーミンゲン（PharMingen）（San Diego、ＣＡ）より購入した。ＴＧＦβ１（活性）、二次リンパケモカイン（ＳＬＣ）及び間質由来細胞因子（stromal-derived cell factor）（ＳＤＦ）は、Ｒ＆Ｄシステムズ（Systems）（Minneapolis、ＭＮ）より購入した。
【００３７】
細胞
線維細胞（ヒト及びマウス）は、以前に記載されたようにして（２、５）、末梢血から精製し、培養した。簡単に説明すると、製造業者のプロトコルに従い、フィコールパック（Ficoll／Paque）（商標）（ファルマシア（Pharmacia））での遠心分離により、ヒトロイコパックス（Leukopaks）（登録商標）（ロングアイランドブラッドセンター（Long Island Blood Center）より購入）から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。２０％ＦＢＳ（ハイクローン（HyClone））、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンが補足されたＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ（Life Technologies)、Gaithersburg、ＭＤ）中での組織培養フラスコでの２日間の培養の後、非接着細胞を温和な吸引により除去し、培地を交換した。１０〜１２日後に、接着細胞を、氷冷（ＰＢＳ中）０．０５％ＥＤＴＡ中でのインキュベーションにより剥離した。次いで、「粗線維細胞」調製物（コラーゲンＩ／ＣＤ１１ｂ染色に基づき、およそ７０〜８０％純粋）から、それぞれ汎Ｔ、抗ＣＤ２ダイナビーズ（Dynabeads）（商標）（ダイナル（Dynal）、Great Neck、ＮＹ）；汎Ｂ、抗ＣＤ１９ダイナビーズ（商標）；及び抗ＣＤ１４ダイナビーズ（商標）を使用した免疫磁気的選択により、混入しているＴ細胞（およそ１３％）、Ｂ細胞（およそ３％）、及び単球（およそ１１％）を枯渇させた。得られた培養「豊富化線維細胞」集団は、コラーゲンＩ／ＣＤ１１ｂ染色に基づき≧９５％純粋であり、Ｔ細胞及び単球が、それぞれおよそ３％及び２％寄与していた。典型的には、ヒト血液１ml当たり０．４〜５×１０４個の線維細胞が単離された。
【００３８】
マウス末梢血単核細胞は、ＣＯ２窒息の後、心臓穿刺により得られた（ヘパリン処理された）ＢＡＬＢ／ｃマウス血液から単離した。マウス血液をＰＢＳと混合し（２：１）、製造業者のプロトコルに従い、フィコールパック（商標）（ファルマシア）に重層し（フィコール３０mlに血液１５ml）、遠心分離した。以前に記載されたようにして（４）、１０％ＦＢＳ及び１０％マウス血清（シグマ）、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ−グルタミンが補足されたＤＭＥＭ中で、単離されたバフィーコートからマウス線維細胞を培養した。１０〜１２日後、接着性「粗」線維細胞調製物（コラーゲンＩ／ＣＤ１１ｂ染色に基づきおよそ７５％純粋）をＰＢＳ中０．０５％ＥＤＴＡを使用して剥離し、それぞれ汎Ｔ（抗ＣＤ９０）ダイナビーズ（商標）；汎Ｂ（抗Ｂ２２０）ダイナビーズ（商標）；及びダイナビーズ（商標）に付着した抗マウスＣＤ１４を使用した免疫磁気的選択により、混入しているＴ細胞、Ｂ細胞及び単球を枯渇させた。免疫枯渇の後、培養「豊富化」線維細胞調製物が、フローサイトメトリーにより確認されたように、コラーゲンＩ＋／ＣＤ１１ｂ＋染色により≧９５％純粋であることを確認した。マウス血液（マウス１匹当たりおよそ１〜１．２mlの血液）１ml当たりおよそ０．８〜４×１０４個の線維細胞が精製された。
【００３９】
ヒト成人皮膚繊維芽細胞は、クローンティクス（Clonetics）（San Diego、ＣＡ）より購入し、製造業者の推奨に従い培養した。ヒト腸平滑筋細胞系ＨＩＳＭは、ＡＴＣＣ（Manassas、ＶＡ）より入手し、推奨された手法に従い生育させた。
【００４０】
線維細胞分化の分析
初期の研究は、末梢血に由来する線維細胞の細胞起源の解明を目標としていた。従って、本発明者らは、（図１Ａに示される）ロイコパックス（登録商標）として供給された全血を分画し、様々な画分をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。ヒトＰＢＭＣの一晩培養物から接着細胞を収集し（「全」）、Ｔ及びＢ細胞の枯渇によりＰＢＭＣ画分からＣＤ１４＋細胞を豊富化した（「ＣＤ１４＋」）。（ＣＤ１４＋細胞を除く全てのＰＢＭＣを含む）「ＣＤ１４−細胞」は、ＣＤ１４＋細胞の枯渇により全ＰＢＭＣ調製物から精製した。トランスウェル（商標）ツーチャンバーシステム（分離膜の孔サイズ０．４μm）（コーニングコスター（Corning Costar）、Cambridge、ＭＡ）を使用して、「ＣＤ１４＋」細胞、「ＣＤ１４−」細胞、又は「全」細胞（ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ中３×１０６個/ml）を、示されたように上室又は下室のいずれかで培養した。７日間の培養後、下方ウェルで増殖する細胞を収集し、フローサイトメトリーで、操作上、コラーゲンＩ／ＣＤ１１ｂ染色により定義された「線維細胞」分化に関して分析した。他の３人のドナーから調製された細胞を用いても、類似した結果が観察された。
【００４１】
線維細胞分化におけるＴ細胞の必要性を調べる研究については、「ＣＤ１４＋」細胞画分（上記参照）を、購入したロイコパックス（登録商標）から精製し、Ｔ細胞豊富化カラム（Ｒ＆Ｄ）を使用して単離された自己Ｔ細胞と共に培養した。Ｔ細胞純度は、抗ＣＤ３抗体（ファーミンゲン）を使用したフローサイトメトリーにより評価されたように≧９５％であった。７日間の共培養の後、得られた集団を、コラーゲンＩ／ＣＤ１１ｂ染色及びフローサイトメトリーにより線維細胞の割合（％）に関して分析した。３人の異なるドナーから単離された線維細胞を使用しても、類似した結果が観察された。
【００４２】
フローサイトメトリー分析
単一抗体染色に関しては、細胞（１０５個に等分したもの）を、３％ＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含有しているＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）に再懸濁させ、４℃で３０分間、示された抗体（又は標識されたアイソタイプ対照抗体）と共にインキュベートした。一次抗体を標識しなかった場合には、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳバッファーで希釈された可視化抗体と共にインキュベートした。ＦＡＣＳバッファーで細胞を洗浄した後、ファックスキャリバー（FACSCalibur）（登録商標）フローサイトメーター（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、San Jose、ＣＡ）で蛍光データを取得し、セルクエスト（CELLQuest）（商標）ソフトウェア（ベクトンディッキンソン）を使用して分析した。各条件について少なくとも５，０００個の細胞を分析した。コラーゲンＩ／ＣＤ１１ｂ染色に関して調製物を分析する場合には、前記と同様に細胞を調製し、まず、ビオチン化コラーゲンＩ抗体（又はビオチン化ウサギ対照ＩｇＧ）を含有しているＦＡＣＳバッファー中でインキュベートし、次いで洗浄し、続いてＦＩＴＣ−ストレプトアビジン（ファーミンゲン）及びＰＥ−ＣＤ１１ｂ（ファーミンゲン）を含有しているＦＡＣＳバッファー中でインキュベートした。αＳＭＡに関する細胞内染色は、以前に記載されたようにして実施した（６、７）。簡単に説明すると、細胞を固定し、製造業者の推奨に従いサイトパーム／サイトフィックス（Cytoperm／Cytofix）（商標）キット（ファーミンゲン）を使用して透過性化し、ＦＩＴＣ−抗αＳＭＡ  ｍＡｂ（シグマ）と共にインキュベートした。
【００４３】
創傷モデルを使用したｉｎ  ｖｉｖｏの線維細胞遊走
培養「豊富化」末梢血由来マウス線維細胞（＞９６％純粋）を、製造業者のプロトコルに従い、膜挿入赤色色素ＰＫＨ−２６（シグマ）で染色した。フローサイトメトリーにより算定された標識効率、及びトリパンブルー排除により算定された生存率は、＞８５％であった。ＰＢＳ１００μl中のＰＫＨで標識された細胞調製物（５×１０５個）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈へ（ｉ．ｖ．）投与した（各群ｎ＝２）。標識された「豊富化」線維細胞調製物の注射の後、直ちに、以前に記載されたようにして（８）、各レシピエントマウスの背側肩甲下区域に、皮膚パンチ装置による切除により、完全な厚さの丸形の皮膚創傷（直径５mm）を作成した。４日後に創傷部位を除去し、薄い凍結切片の顕微鏡分析、及び生検材料のタンパク質分解による消化の後の定量的フローサイトメトリー分析により、蛍光性線維細胞の存在に関して調査した。定量的フローサイトメトリー分析については、切除した皮膚（１匹当たり２５０μgの生検材料）を小片へと切り刻み、次いで１０％ＦＢＳ、２mg/mlコラゲナーゼ及び２０μg/ml  ＤＮａｓｅＩを含有しているＲＰＭＩ中で３７℃で１時間インキュベートした。以前に記載されたようにして（１５）、較正ビーズを使用して、存在する蛍光性線維細胞の数を決定するため、得られた単一細胞懸濁物を、フローサイトメトリーにより調べた。
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡｚｏｌＢ（テルテスト（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）、Friendswood、ＴＸ）を使用して、培養「豊富化」線維細胞調製物（＞９５％純粋）から全ＲＮＡを単離した。製造業者（ギブコ（Gibco））により供給されたプロトコルに従い、オリゴ（ｄＴ）１２−１８０．２５ng及びＭＭＬＶ逆転写酵素を使用して、ＲＮＡ  １．０μgからｃＤＮＡを調製した。以前に記載されたようにして、２μlに等分したｃＤＮＡを、特異的プライマーを使用してパーキンエルマー（Perkin Elmer）モデル９６００サーマルサイクラーにおいてスーパーミックス（Supermix）（商標）（ギブコ）を使用したＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ対は以前に記載された通り：αＳＭＡ（９）；ＣＣＲ３（１０）；ＣＣＲ４、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ３（１１）；ＣＣＲ６（１２）；ＣＣＲ７（１３）；ＣＸＣＲ４（１４）；β−アクチンのセンスプライマーは、５’−ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ−３’であり、アンチセンスプライマーは、５’−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ−３’であった。サーマルサイクリング（２５〜３０サイクル；２５μl）は、以下のように実施した：９４℃における０．５分間の変性；５５℃における０．５分間のアニーリング；及び７２℃における１分間の伸張。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色の後にＵＶ光下で観察した。可能性のあるゲノムＤＮＡ混入をコントロールするため、ＰＣＲ反応をＲＴ工程なしで実施したところ、ＤＮＡ増幅産物は検出されなかった。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ線維細胞走化性アッセイ
走化性アッセイは、製造業者のプロトコルに従い、コスタートランスウェル（商標）インサート（８μm孔サイズ）を使用して実施した。培養「豊富化」線維細胞（≧９５％純粋）を、０．１％ＢＳＡを含有しているＤＭＥＭに１×１０６個/mlで再懸濁させた。培地単独（陰性対照）又はＳＬＣもしくはＳＤＦ（示されたような２．５〜２５０ng/mlの最終ケモカイン濃度を提供するための６００μl）を含有している培地を、２４穴プレートの個々のウェルに添加した。次いで、トランスウェル（商標）装置を挿入し、線維細胞（１００μl）を膜の上に重層した（各条件ｎ＝３ウェル）。３時間後、以前に記載されたようにして（１５）、遊出した細胞を収集し、較正ビーズ（コウルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）を使用してフローサイトメトリーにより計数した。２人の付加的なドナーを用いても、類似した結果が観察された。線維細胞のＳＬＣへ向かう走化性のチェッカーボード分析については、図５Ｂに示されるように、上室又は下室のいずれか単独、そして上室及び下室の両方に、１００ng/ml  ＳＬＣを添加した。
【００４６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ線維細胞走化性アッセイ
ＰＫＨで標識された「豊富化線維細胞調製」（＞９４％純粋；５×１０５個／匹）の尾静脈注射の後、直ちに、ＢＡＬＣ／ｃマウスの背肩甲部（毛剃り済み）に、ＳＬＣ、ＳＤＦ（５０μl中０．１又は１μg）又はＰＢＳ単独のｉ．ｄ．注射を与えた。４時間後に注射部位を切除し、（前記と同様に）タンパク質分解により消化して単一細胞懸濁物を得た。生検試料１個（２５０μg）当たりの標識された線維細胞の数を、較正ビーズを使用して、フローサイトメトリーにより推定した（１５）。この実験を２回繰り返し、類似した結果を得た。
【００４７】
コラーゲン格子収縮アッセイ
以前に記載されたようにして（１６）、細胞コラーゲンゲル収縮アッセイを実施した。一晩接着性ＰＢＭＣ培養物、ＴＧＦβ１（実験前７日間、１０mg/ml）の非存在下又は存在下で事前に培養された１０日目「豊富化線維細胞調製物」（≧９５％純粋）、又は正常ヒト皮膚繊維芽細胞を、冷ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液を使用して剥離した。ＤＭＥＭ中のコラーゲン溶液を、製造業者の指示に従い、ラット尾コラーゲンＩ型から調製し、２×１０５個/ml（各細胞型ｎ＝３）の細胞と合わせた。コラーゲン／細胞混合物（４００μl／ウェル）を培養プレートへ分配し、３０分間３７Ｃで重合させた。重合直後、１０％ＦＢＳを含有しているＤＭＥＭ２mlを各ウェルに添加した。次いで、様々な時点（０、２４、４８及び７２ｈ）で穏和に培養プレートを振とうすることにより、ゲルをウェルから剥がし、各ゲルの最長及び最短の直径を測定した。各時点においてとられた線形測定（各試料ｎ＝３）の平均を、細胞の収縮性を推定するために使用した。データはゲル収縮率（％）として提示されている。この実験を異なるドナーから得られた細胞を使用して２回繰り返し、類似した結果を得た。
【００４８】
本発明の領域の当業者には明らかであるように、上記の教示を考慮すれば本発明の多数の修飾及び変形が可能である。従って、本発明が、ここに具体的に記載されたのとは別の様式でも実施され得ることを理解されたい。
【００４９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】線維細胞が、血液由来ＣＤ１４＋集団からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化し、直接的なＴ細胞相互作用を必要とすることを示す。（Ａ）実験設計の概略図。全血から単離されたヒトＰＢＭＣ画分から、一晩のインキュベーションの後、接着細胞を収集した（「全」と表記）。ＣＤ１４＋豊富化集団を、Ｔ及びＢ細胞の枯渇により「全」画分から単離し（「ＣＤ１４＋」と表記）、ＣＤ１４−豊富化集団を、ＣＤ１４＋単球の枯渇により「全」画分から単離した（「ＣＤ１４−」と表記）。
【図１Ｂ】線維細胞が、血液由来ＣＤ１４＋集団からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化し、直接的なＴ細胞相互作用を必要とすることを示す。（Ｂ）トランスウェル（商標）培養システム（０．４μm）を使用して、全接着性ＰＢＭＣ（「全」）、ＣＤ１４＋豊富化細胞又はＴ及びＢ細胞が枯渇した全ＰＢＭＣ（「ＣＤ１４＋」）、並びにＣＤ１４＋細胞が枯渇した全ＰＢＭＣ（「ＣＤ１４−」）を、示されたように上室及び下室で７日間培養した。下室の細胞を剥離し、フローサイトメトリーによりＣＤ１１ｂ＋／コラーゲンＩ＋染色を使用して線維細胞表現型に関して分析し、データを線維細胞の割合（％）として表した。
【図１Ｃ】線維細胞が、血液由来ＣＤ１４＋集団からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化し、直接的なＴ細胞相互作用を必要とすることを示す。（Ｃ）ＣＤ１４＋豊富化細胞（Ｔ及びＢ細胞の両方が枯渇したＰＢＭＣ）を、様々な比率の自己Ｔ細胞と共にインキュベートし、７日間の培養後に得られた「粗」線維細胞培養物を、フローサイトメトリーにより線維細胞マーカーに関して分析した。データは、ＣＤ１１ｂ＋／コラーゲンＩ＋染色に基づく線維細胞の割合（％）を示している。
【図２Ａ】ＴＧＦβ１が線維細胞の分化を促進することを示す。ヒト血液からの単離後４日目、「粗」線維細胞培養物を、様々な濃度のＴＧＦβ１により処理した。次いで、７日後、培養物を、紡錘形の形態学に関して調査した。２００×で撮影された代表的な培養物が示される：（Ａ）添加なし。
【図２Ｂ】ＴＧＦβ１が線維細胞の分化を促進することを示す。ヒト血液からの単離後４日目、「粗」線維細胞培養物を、様々な濃度のＴＧＦβ１により処理した。次いで、７日後、培養物を、紡錘形の形態学に関して調査した。２００×で撮影された代表的な培養物が示される：（Ｂ）ＴＧＦβ１、１ng/ml。
【図２Ｃ】ＴＧＦβ１が線維細胞の分化を促進することを示す。ヒト血液からの単離後４日目、「粗」線維細胞培養物を、様々な濃度のＴＧＦβ１により処理した。次いで、７日後、培養物を、紡錘形の形態学に関して調査した。２００×で撮影された代表的な培養物が示される：（Ｃ）ＴＧＦβ１、１０ng/ml。
【図２Ｄ】ＴＧＦβ１が線維細胞の分化を促進することを示す。ヒト血液からの単離後４日目、「粗」線維細胞培養物を、様々な濃度のＴＧＦβ１により処理した。次いで、７日後、培養物を、紡錘形の形態学に関して調査した。２００×で撮影された代表的な培養物が示される：（Ｄ）ＴＧＦβ１で処理された（０〜１０ng/ml）「粗」線維細胞培養物を剥離し、コラーゲンＩに関して染色し、フローサイトメトリーにより分析した。細胞のアイソタイプ対照染色が、陰付きのヒストグラムとして示される。Ｙ軸は、相対細胞数を表し、Ｘ軸は、平均蛍光強度（コラーゲンＩ染色）を表す。
【図３Ａ】線維細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで創傷部位へ遊走することを示す。培養「豊富化」マウス線維細胞調製物（純度＞９６％）を蛍光色素ＰＫＨ−２６で標識した。標識された細胞（５×１０５個）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈へ注射した。線維細胞の注射後、直ちに、各マウスの背側肩甲下区域に、単一の完全な厚さの丸形の皮膚創傷を作成した。４日後、マウスを屠殺し、創傷部位を除去した。標識された線維細胞の遊走を、（Ａ）創傷の薄い凍結切片の蛍光顕微鏡検（左パネル）（右パネルは、同様の創傷部位のＨ＆Ｅ染色を示す）の生検材料に見出される蛍光性線維細胞の数の定量的細胞蛍光測定分析により評価した。
【図３Ｂ】線維細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで創傷部位へ遊走することを示す。培養「豊富化」マウス線維細胞調製物（純度＞９６％）を蛍光色素ＰＫＨ−２６で標識した。標識された細胞（５×１０５個）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈へ注射した。線維細胞の注射後、直ちに、各マウスの背側肩甲下区域に、単一の完全な厚さの丸形の皮膚創傷を作成した。４日後、マウスを屠殺し、創傷部位を除去した。標識された線維細胞の遊走を、（Ｂ）生検部位２５０μgのタンパク質分解による解離の後、創傷を負った皮膚及び創傷を負っていない皮膚（蛍光性線維細胞をｉ．ｖ．注射した場合及びしない場合）の生検材料に見出される蛍光性線維細胞の数の定量的細胞蛍光測定分析により評価した。
【図４Ａ】ヒト線維細胞調製物が、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４のｍＲＮＡ及びタンパク質を発現することを示す。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲを使用して、培養「豊富化」ヒト線維細胞調製物による様々なケモカイン受容体のｍＲＮＡの発現を決定した。
【図４Ｂ】ヒト線維細胞調製物が、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４のｍＲＮＡ及びタンパク質を発現することを示す。（Ｂ）培養「豊富化」ヒト線維細胞を、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ７抗体又は抗ＣＸＣＲ４抗体により表面発現に関して染色し、次いでフローサイトメトリーにより分析した。陰付きの領域は、アイソタイプ対照染色を表す。
【図４Ｃ】ヒト線維細胞調製物が、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７及びＣＸＣＲ４のｍＲＮＡ及びタンパク質を発現することを示す。（Ｃ）培養「豊富化」マウス線維細胞調製物を抗ＣＣＲ７抗体及び抗ＣＸＣＲ４抗体により表面発現に関して染色し、次いでフローサイトメトリーにより分析した。
【図５Ａ】線維細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＳＬＣに応答して遊走することを示す。（Ａ）ＤＭＥＭ１％ＢＳＡで希釈されたＳＬＣ及びＳＤＦケモカイン、又はバッファー単独を、示された最終濃度で２４穴プレートの個々のウェルに添加した。その直後、コスタートランスウェル（商標）装置を挿入し、培養し、「豊富化」マウス線維細胞調製物（ＤＭＥＭ１％ＢＳＡ中１０６個/ml、４００μl）を、膜（８μm孔サイズ）の上に重層した。細胞を、３７℃で３時間、膜を通して遊走させた。遊出した細胞を収集し、フローサイトメトリーにより計数した。下室へ遊走した細胞の数が、上方ウェルへ添加された線維細胞の総数の割合（％）として提示される。＊、（示された濃度における）実験と、培地単独（示されていない；＜２％）とを比較したスチューデントｔ検定により決定されたようなｐ＜０．０５。
【図５Ｂ】線維細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＳＬＣに応答して遊走することを示す。（Ｂ）チェッカーボード型分析のため、ＳＬＣ（１００ng/ml）を、示されたように上方及び／又は下方のウェルへ添加し、線維細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ走化性を、前記と同様に実施した。
【図５Ｃ】線維細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＳＬＣに応答して遊走することを示す。（Ｃ）ＰＫＨ−２６で標識された培養「豊富化」マウス線維細胞（５×１０５個）の尾静脈注射の後、直ちに、ＳＬＣもしくはＳＤＦ（０．１もしくは１μg、５０μl）又はＰＢＳ媒体のｉ．ｄ．注射をマウスに与えた。４時間後に注射部位（２５０μg）を外科的に除去し、タンパク質分解により消化し、単一細胞懸濁物を得た。注射部位１個当たりの標識された線維細胞の数を、フローサイトメトリーにより定量し、尾静脈へ注射された蛍光性線維細胞の総数の割合（％）として表した。＊、１μgで注射されたＳＬＣと媒体注射とを比較したスチューデントｔ検定により決定されたようなｐ＜０．０５。
【図６Ａ】線維細胞がα−平滑筋アクチン（smooth-muscle actin）（αＳＭＡ）を発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでコラーゲンゲルを収縮させることを示す。ＲＴ−ＰＣＲにより分析されたような、接着性ヒトＰＢＭＣ、培養「豊富化」線維細胞（ＦＣ）、及びヒト腸平滑筋（ＨＩＳＭ）細胞によるαＳＭＡ  ｍＲＮＡの発現。Ｓｔｄｓ＝ＤＮＡ  ｂｐラダー。
【図６Ｂ】線維細胞がα−平滑筋アクチン（smooth-muscle actin）（αＳＭＡ）を発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでコラーゲンゲルを収縮させることを示す。ＲＴ−ＰＣＲにより分析されたような、接着性ヒトＰＢＭＣ、培養「豊富化」線維細胞（ＦＣ）、及びヒト腸平滑筋（ＨＩＳＭ）細胞によるαＳＭＡ  ｍＲＮＡの発現。Ｓｔｄｓ＝ＤＮＡ  ｂｐラダー。（Ｂ）フローサイトメトリーにより決定されたような、未刺激の、及びＴＧＦβ１処理（１０ng/ml）された培養「豊富化」ヒト線維細胞調製物による細胞内αＳＭＡ発現の発現。
【図６Ｃ】線維細胞がα−平滑筋アクチン（smooth-muscle actin）（αＳＭＡ）を発現し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでコラーゲンゲルを収縮させることを示す。ＲＴ−ＰＣＲにより分析されたような、接着性ヒトＰＢＭＣ、培養「豊富化」線維細胞（ＦＣ）、及びヒト腸平滑筋（ＨＩＳＭ）細胞によるαＳＭＡ  ｍＲＮＡの発現。Ｓｔｄｓ＝ＤＮＡ  ｂｐラダー。（Ｃ）コラーゲンゲル収縮アッセイ。ＰＢＭＣ（白三角）、培養「豊富化」線維細胞調製物［未処理（黒三角）及びＴＧＦβ１処理（黒四角）］、又は皮膚線維細胞（白丸）を、コラーゲンＩ型溶液に１０５個/mlで再懸濁させた。材料及び方法に記載されたようにして、収縮アッセイ（ｎ＝３）を実施した。データは、（実験開始からの）ゲル収縮率（％）±ＳＥを表す（いくつかのエラーバーは記号より小さい）。＊各時点における実験とＰＢＭＣ（白三角）とを比較したスチューデントｔ検定により決定されたようなｐ＜０．０５。挿入図は、ＰＢＭＣ及び培養線維細胞（未処理及びＴＧＦβ１処理）とのインキュベーションの後の代表的な収縮したゲルを示す。
【図７】提唱された循環血中前駆細胞集団からの線維細胞の分化経路を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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