(57)【要約】本発明は、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＧＲＰ）ポリペプチド、及びこれらポリペプチドの使用に関する。本発明は、ＨＲＧＰポリペプチドを投与することによる血管形成を阻害する方法を含む。本発明はまた、ＨＲＧＰポリペプチド、ＨＲＧＰポリペプチドに結合する抗体及び受容体、ＨＲＧＰ欠乏性血漿及びポリヌクレオチド、ＨＲＧＰポリペプチドをコードするベクター及び宿主細胞を含む、製薬的組成物及び製品を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドを含む組成物。
【請求項２】
抗血管形成剤をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗血管形成剤が、アンジオスタチン、トロンボスタチン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン、インターフェロンα、インターフェロン誘導性因子１０、血小板因子４、ＣＯＸ−２阻害剤からなる群から選択される請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドがＨＲＧＰ断片である請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記断片が無処置のＨＲＧＰのアミノ末端ドメインを含む請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記断片が無処置のＨＲＧＰの中央ドメインを含む請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記断片が無処置のＨＲＧＰのＣ末端ドメインを含む請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記断片がペンタペプチド［Ｈ／Ｐ］−［Ｈ／Ｐ］ＰＨＧの少なくとも１つの直列型反復を含む請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
抗腫瘍剤をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
抗血管形成剤をさらに含む請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗腫瘍剤が、タキソール、シクロホスファミド、カルボプラチナ（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、シスプラチナ（ｃｉｓｐｈａｔｉｎｕｍ）、シスプラチン、ガンシクロビル、カンプトセシン、パクリタキセル、ヒドロキシ尿素、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、スラミンからなる群から選択される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがＨＲＧＰ断片である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
包装材料及び前記包装材料内の実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質を含む製品であって、前記包装材料が、血管形成を阻害するために前記ポリペプチドを哺乳動物に投与すべきであることを表示するラベル又は添付文書を含む製品。
【請求項１６】
実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドを含む組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、前記哺乳動物の血管形成が阻害される、哺乳動物の血管形成を阻害する方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物が癌を生じている請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物が、心筋性血管形成、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管新生、不適切な創傷治癒、炎症性疾患からなる群から選択される状態にある請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がマウスである請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物がラットである請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物がヒトである請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドがＨＲＧＰ断片である請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が抗血管形成剤をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗血管形成剤が、アンジオスタチン、トロンボスタチン、エンドスタチン、インターフェロンα、インターフェロン誘導性因子１０、血小板因子４、ＣＯＸ−２阻害剤からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドがＨＲＧＰ断片である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が抗腫瘍剤をさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗腫瘍剤が、タキソール、シクロホスファミド、カルボプラチナ、シスプラチナ、シスプラチン、ガンシクロビル、カンプトセシン、パクリタキセル、ヒドロキシ尿素、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、スラミンからなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドがＨＲＧＰ断片である請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
ＦＧＦ−２で誘発させた一次ウシ副腎皮質毛細血管内皮細胞の遊走に対するＨＲＧＰポリペプチドの効果を測定すること、及び
前記ＦＧＦ−２で誘発させた遊走が前記ＨＲＧＰポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に、前記ＨＲＧＰポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定すること
を含む、抗血管形成ポリペプチドを同定する方法。
【請求項３３】
前記ＨＲＧＰポリペプチドがＨＲＧＰ断片である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ヒヨコ漿尿膜血管形成に対するＨＲＧＰポリペプチドの効果を測定すること、及び
前記ヒヨコ漿尿膜血管形成が前記ＨＲＧＰポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に前記ＨＲＧＰポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定すること
を含む、抗血管形成ポリペプチドを同定する方法。
【請求項３５】
前記ＨＲＧＰポリペプチドがＨＲＧＰ断片である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
血管形成依存性腫瘍の成長に対するＨＲＧＰポリペプチドの効果を測定すること、及び
前記腫瘍の成長が前記ＨＲＧＰポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に、前記ＨＲＧＰポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定すること
を含む、抗血管形成ポリペプチドを同定する方法。
【請求項３７】
前記ＨＲＧＰポリペプチドがＨＲＧＰ断片である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドに結合する抗体。
【請求項３９】
前記抗体が、血管形成を阻害する前記ポリペプチドの能力を中和する請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
前記抗体が血管形成に対して作用性である請求項３８に記載の抗体。
【請求項４１】
前記抗体が血管形成に対して拮抗性である請求項３８に記載の抗体。
【請求項４２】
請求項４０に記載の抗体を前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の血管形成を阻害する方法。
【請求項４３】
請求項４１に記載の抗体を前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の血管形成を刺激する方法。
【請求項４４】
実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドを雌の哺乳動物に投与することを含む避妊の方法。
【請求項４５】
検出可能なマーカーに結合した実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドを投与し、前記検出可能なマーカーに基づいて前記哺乳動物の血管新生を測定することを含む、哺乳動物の血管新生をイメージングする方法。
【請求項４６】
検出可能なマーカーに結合した実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチド。
【請求項４７】
毒素に結合した実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチド。
【請求項４８】
ヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドに結合する実質的に純粋な受容体。
【請求項４９】
ヒスチジンリッチ糖タンパク質が欠乏した血漿。
【請求項５０】
前記血漿がヒト血漿である請求項４９に記載の血漿
【請求項５１】
ＨＲＧＰポリペプチド断片をコードする単離したポリヌクレオチド。
【請求項５２】
請求項５１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５３】
請求項５２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５４】
実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドの抗血管形成剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許（３５ＵＳＣ）第１１９条（ｅ）の下、２００１年２月５日出願の米国特許仮出願第６０／２６６，５０５号の優先権を請求し、その全内容を本明細書中に参照として組み込む。
【０００２】
本発明は、血管形成の阻害に関し、より詳細には、ヒスチジンリッチ糖タンパク質タンパク質（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＨＲＧＰ）の血管形成阻害剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＲＧＰは、Ｈｅｉｍｂｕｒｇｅｒ他によって同定されたヘパリン結合の血漿タンパク質である。Ｈｅｉｍｂｕｒｇｅｒ他、１９７２、生理化学（Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、３５３：１１３３〜１１４０参照。血漿中のＨＲＧＰの平均濃度は約１００μｇ／ｍｌである。Ｄｒａｓｉｎ及びＳａｈｕｄ、１９９６、血栓症の研究（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、８４：１７９〜１８８参照。マウス、ラット、（Ｈｕｌｅｔｔ及びＰａｒｉｓｈ、２０００、免疫学と細胞生物学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、７８：２８０〜２８７）、ウサギ（Ｂｏｒｚａ他、１９９６、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３５：１９２５〜１９３４）、ヒト（Ｋｏｉｄｅ他、１９８６、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２５：２２２０〜２２２５）のＨＲＧＰのアミノ酸配列が決定されている。構造的には、ＨＲＧＰ分子を３つの主なドメインに分けることができる。アミノ末端ドメインは約２５０個のアミノ酸残基を包含し、２つのシステインプロテイナーゼ阻害剤（シスタチン）様ストレッチを含み、このため、ＨＲＧＰはα２ＨＳ糖タンパク質及びキニノーゲンと共にシスタチンスーパーファミリーとして分類される。ＨＲＧＰのアミノ末端部分には、Ｎ結合の糖修飾推定部位が６つある。中央ドメインは、ペンタペプチド［Ｈ／Ｐ］−［Ｈ／Ｐ］ＰＨＧの直列型反復を含む。中央ドメインと１０５アミノ酸のＣ末端ドメインのいずれもが、アミノ末端ドメインのシスタチン様ストレッチにジスルフィド結合している（Ｂｏｒｚａ他、１９９６）。ＨＲＧＰは、ｐＨ依存性の相互作用で（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ他、１９８７、生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６２：７５６７〜７５７４）、ヘパリン／ヘパラン硫酸を結合している（Ｌｉｊｎｅｎ他、１９８３、生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５８：３８０３〜３８０８）。単離したヒスチジンとプロリンリッチな中央ドメインがヘパリン結合を媒介するが（Ｂｏｒｚａ他、１９９６）、ヘパリン結合にはアミノ末端ドメインも関連している。Ｋｏｉｄｅ他、１９８６、ＦＥＢＳレター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）、１９４：２４２〜２４４参照。ＨＲＧＰの先天性欠損は、ＨＲＧＰのＧｌｙ８５がＧｌｕに置き換えられた、単一ヌクレオチドの変異に位置付けされた。この変異により、大部分が細胞内に保持されるこのタンパク質のプロセッシングが不十分になる。その結果、ＨＲＧＰの血清レベルが通常レベルの２５〜３０％に低下する。Ｓｈｉｇｅｋｉｙｏ他、１９９３、血栓症と止血（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）、７０：２６３〜２６５及びＳｈｉｇｅｋｉｙｏ他、１９９８、血液学（Ｂｌｏｏｄ）、９１：１２８〜１３３参照。
【０００４】
血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）をもたらす新しい血管の生成プロセスである血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、胚の発生、排卵、子宮内膜の周期的な発生、創傷治癒、組織及び臓器の成長、炎症及び創傷治癒の期間中に重要である。不均衡な血管新生は、ある種の疾病状態、たとえば関節炎、乾癬、血管腫、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症の病原性に寄与し、腫瘍の成長や転移を引き起こさせると考えられている。米国特許第５，８５４，２０５号参照。腫瘍細胞が局部的に拡大して転移を引き起こすためには、新しい血管を誘引しなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＨＲＧＰを哺乳動物に投与すると血管形成の阻害がもたらされるという発見に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、実質的に純粋なＨＲＧＰポリペプチドを含む組成物を特徴とする。通常、実質的に純粋なＨＲＧＰポリペプチドは抗血管形成活性を有する。いくつかの実施形態では、この組成物は抗血管形成活性を有する別の薬剤を含むこともできる。このような薬剤は、本明細書中では抗血管形成剤（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）と称する。いくつかの実施形態では、この組成物は抗腫瘍活性を有する薬剤を含むこともできる。このような薬剤は、本明細書中では抗腫瘍剤（ａｎｔｉ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）と称する。
【０００７】
一態様では、本発明は、ＨＲＧＰポリペプチドと抗血管形成剤又は抗腫瘍剤を含む薬剤組成物を特徴とする。この組成物は、哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアを含むことができる。ＨＲＧＰポリペプチドは、たとえば無処置（ｉｎｔａｃｔ）のＨＲＧＰ、改変したＨＲＰＧポリペプチド、又は無処置のＨＲＧＰの断片を含むことができる。この無処置のＨＰＧＰの断片は、無処置のＨＲＧＰのアミノ末端ドメイン、中央ドメイン又はＣ末端ドメイン、あるいはペンタペプチド［Ｈ／Ｐ］−［Ｈ／Ｐ］ＰＨＧの１つの直列型反復を含む断片を含むことができるが、それだけに限定されるものではない。抗血管形成剤は、たとえばアンジオスタチン、トロンボスタチン、エンドスタチン、インターフェロンα、インターフェロン誘導因子１０、血小板因子４、ＣＯＸ−２阻害剤でよい。
【０００８】
本発明はまた、ＨＲＧＰのＮ末端ドメイン、中央ドメイン、Ｃ末端ドメインではない、血管形成を阻害する無処置のＨＲＧＰポリペプチドの断片を特徴とする。
【０００９】
本発明はまた、包装材料及び包装材料内のＰＲＧＰポリペプチドを含む製品を特徴とし、包装材料は、血管形成を阻害するためにＨＲＧＰポリペプチドを哺乳動物に投与すべきであることを表示するラベル又は添付文書を含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、哺乳動物の血管形成を阻害する方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物にＨＲＧＰポリペプチドを投与することを含む。哺乳動物は、血管形成依存性の癌を生じている又は血管形成に関連する状態にある可能性がある。血管形成に関連するこのような状態には、心筋血管形成、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管新生、不適切な創傷治癒、炎症性疾患が含まれ得るが、これだけには限定されるものではない。
【００１１】
別の態様では、本発明は、抗血管形成ポリペプチドを同定する方法を特徴とする。この方法は、ＦＧＦ−２で誘発させた一次ウシ副腎皮質毛細血管内皮細胞の遊走に対するＨＲＧＰポリペプチドの効果を測定すること、及び、ＦＧＦ−２で誘発させた遊走がＨＲＧＰポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に、ＨＲＧＰポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定することを含むことができる。あるいは、この方法は、ヒヨコ漿尿膜の血管形成に対するＨＲＧＰポリペプチドの効果を測定すること、及び、ヒヨコ漿尿膜の血管形成がＨＲＧＰポリペプチドの存在下で有意に減少される場合に、ＨＲＧＰポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定することを含むことができる。別の代替方法では、この方法は、哺乳動物の血管形成依存性腫瘍の成長に対するＨＲＧＰポリペプチドの効果を測定すること、及び、腫瘍の成長がＨＲＧＰポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に、ＨＲＧＰポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定することを含むことができる。ＨＲＧＰポリペプチドはＨＲＧＰ断片でよい。血管形成依存性腫瘍は、たとえば、繊維肉腫、神経芽細胞腫、奇形腫でよい。腫瘍は、たとえばマウス又はラット内で成長させることができる。
【００１２】
本発明の別の態様は、ＨＲＧＰポリペプチドを結合する抗体を特徴とする。これら抗体は、ＨＲＧＰポリペプチドのＣ末端ドメイン、中央ドメイン、又はＮ末端ドメインと結合することができる。本発明には、血管形成を阻害するＨＲＧＰポリペプチドの能力を中和させる、血管形成に作用性である、又は血管形成に拮抗性である抗体もまた含まれる。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、ＨＲＧＰポリペプチドに結合する抗体を投与することによって哺乳動物の血管形成を阻害する方法を特徴とする。
【００１４】
本発明は、血管形成に作用性がある抗ＨＲＧＰ抗体を投与することによって哺乳動物の血管形成を増強させる方法も特徴とする。
【００１５】
本発明のさらに別の態様は、ＨＲＧＰポリペプチドを雌の哺乳動物に投与することを含む避妊の方法を特徴とする。
【００１６】
本発明の他の態様は、検出可能なマーカーに結合させた又は毒素に結合させたＨＲＧＰポリペプチド、及び検出可能なマーカーに結合させたＨＲＧＰポリペプチドを哺乳動物に投与することによって哺乳動物の血管新生をイメージングする方法を特徴とする。
【００１７】
本発明の別の態様は、ＨＲＧＰポリペプチドに結合する受容体を特徴とする。
【００１８】
本発明はまた、ヒトＨＲＧＰ欠乏性（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）血漿を含めて、ＨＲＧＰを欠いた（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）血漿も特徴とする。
【００１９】
ＨＲＧＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらポリヌクレオチドを含むベクター、これらベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の特徴である。
【００２０】
別段に定義しない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の技術者に一般的に理解される意味をも持つものとする。本発明の実施及び試験には、本発明書中で説明する方法及び材料に類似する又は相当するものを用いることもできるが、適切な方法及び材料を記載する。本明細書中で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献を、その全体を参照として組み込む。矛盾する場合は、定義を含めて本発明の明細書が支配する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示的なものにすぎず、限定的なものではない。
【００２１】
本発明の１つ又は複数の実施形態の詳細を、添付の図及び下記の説明で示す。本発明の他の特徴、材料、及び利点は、説明及び図、並びに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
精製したヒト血漿ＨＲＧＰが漿尿膜（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＣＡＭ）血管形成、内皮細胞の遊走、及び腫瘍の成長を阻害することが発見された。成長因子たとえば線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）や血管内皮細胞成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を用いたＣＡＭの処置は、ＣＡＭ内の血管形成を刺激する。驚くべきことに、１０倍のモル濃度過剰のＨＲＧＰを適用することが、ＦＧＦ−２又はＶＥＧＦ−Ａを適用することとあいまって、血管形成の抑制をもたらす。一次ウシ毛細血管内皮（ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ、ＢＣＥ）細胞では、ミニボイデンチャンバー（Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ）での基準遊走に比べて、ＦＧＦ−２に向かう遊走が１５０％増加する。この増大した遊走は、ＨＲＧＰとの共インキュベーションによって完全に抑制される。最後に、精製したＨＲＧＰを注入すると、マウスの繊維肉腫腫瘍の成長が著しく低下し、腫瘍の大きさが７５％減少した。実施例９及び図２参照。これらの予想外の発見に基づいて、ＨＲＧＰポリペプチドは、血管形成に媒介される又はこれに関与する疾患又はプロセスを治療する、新しい、新規の治療薬である。ＨＲＧＰポリペプチドは、血管形成依存性癌の治療又はその成長の抑制に特に有用となろう。
【００２３】
本発明のＨＲＧＰポリペプチドは、採取したての血清から精製するか又は周知の組換え手法により生成することができる。ＨＲＧＰポリペプチドは、診断上の応用のために検出可能なマーカーと結合させる又は治療上の応用のために毒素と結合させることができる。ＨＲＧＰポリペプチドを含む製薬的組成物を、血管形成を阻害したい対象に投与することができる。本発明によると、ＨＲＧＰポリペプチドはまた、疾病の治療のために他の組成物や手順と組み合わせて使用することもできる。たとえば、ＨＲＧＰポリペプチドを、他の抗血管形成化合物、抗腫瘍化合物、及び／又は抗炎症化合物をさらに含む製薬的組成物として投与することができる。
【００２４】
本発明は、診断上及び治療上の応用のいずれかに使用することができる、ＨＲＧＰポリペプチドに対する特異的結合アフィニティーを有する抗体を含む。特に有用なのは、ＨＲＧＰポリペプチドの生物活性を阻害又は除去することができる中和抗体である。本発明はさらに、ＨＲＧＰに特異的な受容体を同定する方法、並びに、それにより同定及び単離されたＨＲＧＰ受容体分子を包含する。ＨＲＧＰポリペプチドの拮抗剤、たとえば抗ＨＲＧＰ抗体又は単離したＨＲＧＰ受容体ポリペプチドを、血管形成を促進させたい対象に投与することができる。
【００２５】
本発明はまた、包装材料及び単離したＨＲＧＰポリペプチドを含むキットを含み、包装材料は、血管形成の阻害のためにＨＲＧＰポリペプチドを哺乳動物に投与すべきであることを表示する包装材料はラベル又は添付文書を含む。
【００２６】
ＨＲＧＰポリペプチドの生成
本発明は、実質的に純粋なＨＲＧＰポリペプチドを提供する。ポリペプチドに関して本明細書中で用いる用語「実質的に純粋」とは、ポリペプチドが実質的に、自然には付随している他のポリペプチド、脂質、炭化水素、核酸を含まないことを意味する。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、その自然の環境から取り出された任意のポリペプチドである。本明細書では、実質的に純粋なＨＲＧＰポリペプチドは最低でも６０％の純度であり、少なくとも約６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９パーセントの純度にすることが可能である。通常、実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主バンドをもたらす。
【００２７】
いくつかの異なる種由来のＨＲＧＰのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列が知られている。完全なｃＤＮＣ配列及びアミノ酸配列は、ヒト（Ｋｏｉｄｅ他、１９８６、ＦＥＢＳレター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）、１９４：２４２〜２４４）、ラット及びマウスのＨＲＧＰ（Ｈｕｌｅｔｔ及びＰａｒｉｓｈ、２０００、免疫学と細胞生物学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、７８：２８０〜２８７）で知られている。ウサギのＨＲＧＰは、リーダー配列のコード領域を欠いたｃＤＮＡ配列の一部と、完全長の推論されたアミノ酸配列とが知られている。Ｂｏｒｚａ他、１９９６、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３５：１９２５〜１９３４参照。タンパク質を直接配列決定して導いたウシＨＲＧＰの部分アミノ酸配列も知られている。Ｓｏｒｅｎｓｏｎ他、１９９３、ＦＥＢＳレター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）、３２８：２８５参照。Ｈｅｎｎｉｓ他によって、ヒトＨＲＧＰの５つのアミノ酸多型が同定された。すなわち、Ｉｌｅ１６２、Ｐｒｏ１８６、Ｈｉｓ３２２、Ａｒｇ４３０、Ａｓｎ４７５である。Ｈｅｎｎｉｓ他、１９９５、血栓症と止血（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）、７４：１４９１及びＨｅｎｎｉｓ他、１９９５、血栓症と止血（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）、７４：１４９７参照。Ｓｈｉｇｅｋｉｙｏ他が、追加のＧｌｕ８５多型を同定した。Ｓｈｉｇｅｋｉｙｏ他、１９９８、血液学（Ｂｌｏｏｄ）、９１：１２８参照。
【００２８】
用語「ＨＲＧＰポリペプチド」とは、無処置のＨＲＧＰだけでなく、翻訳後の修飾に関係なく、当分野で既知のＨＲＧＰ配列に由来する任意の部分の、６個以上の任意のアミノ酸残基を含むポリペプチドを含むことを理解されたい。用語「ＨＲＧＰポリペプチド」はまた、１つ又は複数のアミノ酸がＨＲＧＰの一方又は両方の末端、あるいはＨＲＧＰの内部領域に付加された、伸長させたタンパク質又はペプチドを含む。用語「ＨＲＧＰポリペプチド」はまた、検出可能な部分（ｍｏｉｅｔｙ）又は毒素たとえばヒマ毒を用いて標識したＨＲＧＰポリペプチドを含む。
【００２９】
用語ＨＲＧＰポリペプチドは、ＨＲＧＰ分子の３つの主なドメインのうち１つ及びその機能性断片を含むポリペプチドを含む。アミノ末端ドメインは約２５０個のアミノ酸残基を包含し、２つのシステインプロテイナーゼ阻害剤（シスタチン）様ストレッチを含む。ＨＲＧＰのアミノ末端ドメインには、６つのＮ関連の糖修飾推定部位が存在する。中央ドメインは、ペンタペプチド［Ｈ／Ｐ］−［Ｈ／Ｐ］ＰＨＧの直列型反復を含み、Ｃ末端ドメインは１０５個のアミノ酸を含む。中央ドメインとＣ末端ドメインのどちらも、アミノ末端ドメインのシスタチン様ストレッチにジスルフィド結合している（Ｂｏｒｚａ他、１９９６参照）。単離されたヒスチジンとプロリンに富んだ中央ドメインは、ｐＨ依存性のヘパリン結合を媒介する（Ｂｏｒｚａ他、１９９６）。ヘパリン結合にはアミノ末端ドメインも関連している。
【００３０】
用語ＨＲＧＰポリペプチドは、たとえば当分野で既知のＨＲＧＰ配列のうち１つの、任意の６〜２５個のアミノ酸（たとえば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のアミノ酸残基）を含む短縮したポリペプチドを含む。また、用語ＨＲＧＰポリペプチドは、長さが２５アミノ酸残基以上（たとえば、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４個、又はそれ以上のアミノ酸残基）であり、当分野で既知のＨＲＧＰ配列のうち１つの、任意の部分と同じアミノ酸配列を含むタンパク質であることを理解されたい。追加の例には、長さが７５アミノ酸残基以上（たとえば、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２０、３２５、３５０、３９０個又はそれ以上のアミノ酸残基）であり、当分野で既知のＨＲＧＰアミノ酸配列の任意の部分と同じアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれるが、それだけには限定されない。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＨＲＧＰポリペプチドは無処置のＨＲＧＰポリペプチドの抗血管形成活性を保持している。このようなＨＲＧＰポリペプチドは、完全長の無処置のＨＲＧＰの、少なくとも５％（たとえば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％、又はそれ以上）の抗血管形成活性を保持している。抗血管形成活性は、下に記載のように、ＣＡＭ又は内皮細胞遊走検定で検定される。
【００３２】
「ＨＲＧＰポリペプチド」の定義はさらに、「改変したＨＲＧＰポリペプチド」が含まれる。このような改変したＨＲＧＰポリペプチドは、抗血管形成活性を保持している可能性があり、さらに増強された活性を示す可能性がある。改変したＨＲＧＰポリペプチドには、ＨＲＧＰポリペプチドの特定の部位の自然に存在するアミノ酸が、自然に存在する又は自然に存在しないアミノ酸を含むがそれだけに限定されない他分子で置換されたＨＲＧＰポリペプチドが含まれるが、それだけには限定されない。単一挿入、単一欠失、単一置換、複数の挿入、複数の欠失、複数の置換、又はそれらの任意の組合せ（たとえば、単一欠失と複数の挿入）を含むアミノ酸配列を含むＨＲＧＰポリペプチドも、含まれる。これらの様々な改変は、１つ又は複数のアミノ酸の変化を導入するためあるいは事前に決定されたアミノ酸残基の箇所でタンパク質コード配列を切断するために、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）に基づく技法やｉｎ  ｖｉｔｒｏの部位特異的突然変異誘発を含めた当分野で周知の方法を用いて引き起こすことができる。たとえば、Ｋｕｎｋｅｌ他、１９８５、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ）、８２：４８８〜４９２参照。
【００３３】
改変したＨＲＧＰポリペプチドの定義にはさらに、他の化合物たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）重合体に結合したＨＲＧＰポリペプチドが含まれる。ＰＥＧを含む化合物を用いて、ポリペプチドたとえばＨＲＧＰポリペプチド表面のアミノ基を誘導体化させると、このようなポリペプチドの循環寿命を延ばし、その潜在的な血管形成特性を低減させることができる。Ｂｅａｕｃｈａｍｐ他、１９８３、分析生化学（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）、１３１（１）：２５〜３３参照。用いるＰＥＧの分子量に特に限定はないが、通常は３００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１５，０００である。ＰＥＧを改変する方法は、当分野で周知の任意の方法でよい。たとえば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐ他、１９８３、分析生化学（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１３１（１）：２５〜３３参照。
【００３４】
さらに、本発明の範囲に含まれる改変されたＨＲＧＰポリペプチドは、アフィニティーマトリクス上でポリペプチドが捕捉可能にさせるアミノ酸配列を含むように「操作」することができる。たとえば、ポリペプチド精製を支援するためにタグたとえばｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、ポリヒスチジン、Ｆｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ）を使用することができる。このようなタグは、カルボキシル末端及びアミノ末端のいずれかを含めたポリペプチド内の任意の部位に挿入することができる。ＨＲＧＰポリペプチドはまた、ポリペプチドの検出を支援する、アルカリホスファターゼなど酵素との融合体として生成することができる。
【００３５】
実質的に純粋なＨＲＧＰポリペプチドを得るために、任意の方法を使用することができる。たとえば、無処置のＨＲＧＰは、採取したてのヒト血漿から、前記手順に続けて、プロテイナーゼ阻害剤の存在下でホスホセルロース上のクラマトグラフィーによって精製することができる。Ｒｙｌａｔｔ他、１９８１、ヨーロッパ生化学雑誌（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１１９：６４１〜６４６、又はＫｌｕｓｚｙｎｓｋｉ他、１９９７、生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２７２：１３５４１〜１３５４７参照。生じたタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で推定したとおり、９５％の純度であった。Ｎ末端ドメイン、中央ドメイン、Ｃ末端ドメインを含むＨＲＧＰドメインは、Ｂｏｒｚａ他、１９９６、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３５：１９２５〜１９３４に概略が説明されている方法に従ってプラスミン限定加水分解を施してＨＲＧＰから単離することができる。実質的に純粋なポリペプチドを得るために、任意の材料を原料として用いることができる。たとえば、特定の目的ポリペプチドを発現している組織培養細胞を用いて、実質的に純粋なポリペプチドを得ることができる。アフィニティークロマトグラフィーやＨＰＬＣなどのポリペプチド精製技術に加えて、ＨＲＧＰポリペプチドを生成するために、ポリペプチド合成技術を用いることもできる。
【００３６】
ＨＲＧＰポリペプチドはまた、組換え方法によって生成することもできる。ウサギ（Ｂｏｒｚａ他、１９９６、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３５：１９２５〜１９３４）、ラット、マウス（Ｈｕｌｅｔｔ及びＰａｒｉｓｈ、２０００、免疫学と細胞生物学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、７８：２８０〜２８７）、ヒト（Ｋｏｉｄｅ他、１９８６、ＦＥＢＳレター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）、１９４：２４２〜２４４）のＨＲＧＰのｃＤＮＡ配列が知られている。ｃＤＮＡからタンパク質産物を発現させる方法は周知である。たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８９、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州、１６．１〜１７．４４ページ参照。生成したＨＲＧＰポリペプチドは、無処置のＨＲＧＰポリペプチド又はＨＲＧＰの断片のいずれでもよい。適切な発現システムには、組換えバクテリオファージ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換させた微生物たとえば細菌（たとえばＥ．ｃｏｌｉやＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；組換え酵母菌発現ベクターを用いて形質転換させた酵母菌（たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓやＰｉｃｈｉａ）；組換えウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞システム；融合タンパク質ヌクレオチド配列を含んだ組換えウイルス発現ベクター（たとえばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）やタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染させた、又は融合タンパク質ヌクレオチド配列を含んだ組換えプラスミド発現ベクター（たとえばＴｉプラスミド）を用いて形質転換させた植物細胞システム；哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（たとえばメタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（たとえばアデノウイルス後期プロモーターやワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む発現構築体を用いて形質転換させた哺乳動物細胞システム（たとえば、ＨＥＫ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）が含まれるが、それだけには限定されない。哺乳動物から直接得た、プラスミドベクターを用いて形質転換させた、あるいはウイルスベクター（たとえば、とりわけヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス）で感染させた一次細胞又は二次細胞もまた宿主細胞として有用である。
【００３７】
抗血管形成活性の検定
抗血管形成活性は、基本的にＦｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ他及びＤｉｘｅｌｉｕｓ他に記載のようにＣＡＭ検定で検定することができる。Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ他、１９９５、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、５２４１：１５００及びＤｉｘｅｌｉｕｓ他、２０００、血液学（Ｂｌｏｏｄ）、９５：３４０３参照。手短に述べると、殻に１×１ｃｍの窓を作成して、受精したヒヨコ胚のＣＡＭの無血管性領域を露出させる。試験する試料をこの無血管性領域に施用し、窓をテープで塞ぎ、ヒヨコ胚をさらに３日間インキュベートする。この時点で、試験した試料が抗血管形成であることを示す、内皮細胞成長の試料による阻害が起こったかどうかを調べるために、ＣＡＭを光学顕微鏡で検査する。ＣＡＭスコアの、刺激剤のみの場合と比べて統計的に有意な１．０以上の減少は、ＨＲＧＰポリペプチドが抗血管形成活性を有することを示す。
【００３８】
あるいは、ＨＲＧＰポリペプチドの抗血管形成活性は、改良したボイデンチャンバー内で、ＦＧＦ−２で誘発させたウシ毛細血管内皮細胞の遊走の抑制に対する、ＨＲＧＰポリペプチドの効果を検定することによって決定することもできる。Ａｕｅｒｂａｃｈ他、１９９１、薬理学と治療学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、５１：１〜１１参照。ＦＧＦ−２で誘発させる遊走が、ＦＧＦ−２のみの存在下での遊走と比べて統計的に有意である少なくとも５０％の減少を示したことにより、ＨＲＧＰポリペプチドが抗血管形成活性を有することが示された。
【００３９】
ＨＲＧＰポリペプチドの抗血管形成活性はまた、哺乳動物の血管形成依存性腫瘍の成長、たとえば動物内の繊維肉腫の成長に対するポリペプチドの効果を測定することによって決定することができる。腫瘍を有するマウスに投与すると統計的に有意な腫瘍体積の阻害を生じるＨＲＧＰポリペプチドは、抗血管形成活性を有するとみなされる。いくつかの実施形態では、抗血管形成ＨＲＧＰポリペプチドは、腫瘍の成長に対して何の効果もないことが知られているコントロールのポリペプチドに比べて、腫瘍体積を１０％減少させることができる。他の実施形態では、抗血管形成ＨＲＧＰポリペプチドは、腫瘍の成長に対して何の効果もないコントロールのポリペプチドに比べて、腫瘍体積を１５％以上、２０％以上、３０％以上、５０％以上、７５％以上、９０％以上減少させることができる。
【００４０】
ＨＲＧＰポリペプチドの効果を評価するために、差は、適切なパラメトリック又はノンパラメトリック統計を用いたｐ値が≦０．０５で統計的に有意とみなされることを理解されよう。
【００４１】
ＨＲＧＰを含む組成物
本発明の組成物はＨＲＧＰポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、この組成物は抗血管形成剤又は抗腫瘍剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は製薬上許容されるキャリアも含む。
【００４２】
抗血管形成剤には、インターフェロン誘導性タンパク質１０及びインターフェロン誘導性タンパク質１０の断片や類似体、ＴＧＦベータ、トロンボスポンジン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ガンマ及びアルファインターフェロン（ＩＦＮ）、メタロプロテイナーゼ−１（ＴＩＭＰ−１）、血小板因子４（ＰＦ４）、プロタミン、フマギリン、アンジオスタチンなどが含まれるが、それだけには限定されない。
【００４３】
本発明での使用を企図した抗腫瘍剤は、腫瘍細胞に毒性のある化学療法剤として知られている薬剤である。化学療法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物、ホルモンや拮抗剤、生物応答修飾因子（たとえばインターフェロンや造血成長因子）、ブチレート誘導体など分化剤、腫瘍抗原に対する抗体、他の種々の薬剤が含まれる。具体的な例には、タキソール、シクロホスファミド、カルボプラチナ、シスプラチナ、シスプラチン、ガンシクロビル、カンプトセシン、パクリタキセル、ヒドロキシ尿素、５−アザシチジン、５−アザ−２’−デオキシシチジン、スラミン、レチノイドなどが含まれるがそれだけには限定されない。化学療法剤の使用は、治療する哺乳動物が十分に血管形成されている既存の大きな腫瘍塊を有する場合に、特に有用である。化学療法剤は腫瘍塊を減少させるのに役立ち、ＨＲＧＰポリペプチドは腫瘍塊内又は腫瘍塊の周りの血管新生を予防又は阻害する。
【００４４】
併用療法は、ＨＲＧＰポリペプチドを抗血管形成剤又は抗腫瘍剤と組み合わせて使用することだけに限定されるものではない。併用療法は、ＨＲＧＰポリペプチドと抗炎症剤たとえばプレドニゾン、ＣＯＸ−２阻害剤などを組み合わせて使用するものでもよい。適切な抗炎症剤には、イブプロフェンやアスピリンが含まれる。
【００４５】
ＨＲＧＰを含む製薬組成物は、静脈注射によって投与することができ、また皮下、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、肺内、腫瘍内、病巣内に注入することができる。必要とされる用量は、選択した投与経路、製剤の性質、患者の疾病の性質、対象の大きさ、体重、表面積、年齢、性別、投与中の他の薬剤、主治医の判断に依存する。投与経路の多様性を考慮すると、広範囲の必要用量が予想される。これら用量レベルの多様性は、当分野でよく理解されているように、標準の経験的最適化ルーチンを用いて調整することができる。投与は、１回又は複数回（たとえば、２、３、４、６、８、１０、２０、５０、１００、１５０回以上）とすることができる。製薬上許容されるキャリアは、哺乳動物対象たとえばヒトの患者に投与するのに適した生体適合性媒体たとえば生理食塩水である。このような製薬組成物は通常、製薬上許容されるキャリア中に、本発明の治療薬を約０．１〜９０重量％（たとえば１〜２０％又は１〜１０％）含む。注入可能なこの組成物の製剤は様々なキャリア、たとえば植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）を含んでいてもよい。静脈注射では、点滴法により化合物の水溶性異形を投与することができ、それによってＨＲＧＰ及び生理的手段（ｅｘｐｅｄｉｅｎｔ）を含む製薬製剤を注入する。生理的に許容できるキャリアには、たとえば、５％ブドウ糖、０．９％生理食塩水、リンゲル液、他の適切なキャリアが含まれる。筋肉内調製物、たとえば化合物の適切な可溶塩の形の無菌製剤を、製薬用賦形剤たとえば０．９％生理食塩水や５％グルコース液に溶かして投与することができる。化合物の適切な不溶形を調製し、水性基剤又は製薬上許容される油性基剤たとえば長鎖脂肪酸（たとえばオレイン酸エチル）中の懸濁液として投与することができる。外用半固体軟膏製剤は通常、製薬クリーム基剤などキャリア中に約１〜２０％、たとえば５〜１０％の濃度の活性成分を含む。外用用途の様々な製剤には、活性成分と様々な支持体や媒体を含んだ液滴、チンキ、ローション、クリーム、溶液、軟膏が含まれる。各製薬製剤中の治療薬の最適割合は、製剤自体並びに特定病原及び関連する治療療法によって異なる。このような製剤を作成する方法は周知であり、たとえば「レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」に出ている。
【００４６】
治療上有効な量は、処置した哺乳動物たとえばヒトの患者に、医学的に望ましい結果を生じることができる量である。医学分野で周知のように、任意の患者の適用量は、患者の大きさ、身体表面積、年齢、投与する具体的な化合物、性別、投与の時間や経路、身体全体の健康、同時に投与している他の薬剤を含めて多くの要因に依存する。用量は様々であるが、好ましい投与用量は体重１ｋｇあたり約０．０１〜１，０００ｍｇである。たとえば、好ましい用量には、体重１ｋｇあたり０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、５．０、１０、２５、５０、１００、５００、７５０又は１，０００ｍｇが含まれるが、それだけには限定されない。好ましい投与方法が静脈経由であることが期待される。
【００４７】
抗血管形成ＨＲＧＰポリペプチドを、血管形成を阻害するのが望ましい対象に投与することができる。適切な対象には、様々な血管形成依存の癌たとえば横紋筋肉腫、多形性グリア芽腫、平滑筋肉腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、黒色腫、膀胱癌、膵臓癌、腎癌などのうちいずれかを有するものが含まれるが、それだけには限定されない。ＨＲＧＰポリペプチドを用いた治療に敏感に反応する血管形成の疾病には、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管新生、水晶体後線維増殖症、トラコーマ、血管新生緑内障、乾癬、血管繊維腫、免疫性又は非免液性炎症、アテローム硬化症プラーク内の毛細血管形成、心筋血管形成、血管腫、過剰の創傷修復、様々な疾病、過剰の及び／又は調節解除された血管形成によって特徴付けられる任意の他の疾病が含まれるが、それだけには限定されない。
【００４８】
製品
ＨＲＧＰポリペプチドは、１単位又は複数単位の用量形を含む製品として包装することができる。製品は通常、ラベルを有する少なくとも１つの容器を含む。この容器は、たとえばガラス又はプラスチックのボトル又はバイアル、金属又はプラスチックの箔を含んでもよく、また単位用量のブリスター包装も含んでもよい。この容器には、ＨＲＧＰポリペプチドを含む組成物が入っている。この包装は、血管形成の阻害のためにＨＲＧＰポリペプチドを投与すべきことを示すラベル又は添付文書を添えることができ、またｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの使用法を示すこともできる。これらの指示は、ＨＲＧＰポリペプチドを単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用することができることを示してもよい。包装はまた、追加の薬剤たとえば追加の抗血管形成剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤を含んでもよい。製品はまた、適切な希釈剤又は緩衝液を含む第２の容器を含んでもよい。製品は、商業的又は消費者的立場から望ましい他の材料、たとえば緩衝液、フィルター、針、シリンジ、使用指示書を記載した添付文書をさらに含んでもよい。
【００４９】
ＨＲＧＰの抗体
ＨＲＧＰポリペプチドに特異的結合アフィニティーを有する抗体を標準の方法で生成することができる。本発明書中で使用する、用語「抗体」又は「複数の抗体」とは、ＨＲＧＰポリペプチド内のエピトープ決定因子と結合することができる無処置の分子やその断片を含む。用語「エピトープ」とは、抗体のパラトープが結合する、抗体の抗原決定因子である。エピトープ決定因子は通常、化学的に活性のある表面分子たとえばアミノ酸や糖側鎖の集団であり、通常、特異的な３次元構造特性及び特異的電荷特性を有する。エピトープは一般的に少なくとも５つの近接したアミノ酸を有する。用語「抗体」及び「複数の抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化した抗体又はキメラ抗体、単鎖Ｆｖ抗体断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片が含まれる。モノクローナル抗体が特に有用である。
【００５０】
一般的に、目的のポリペプチドは、組換えによって、化学合成によって、又は自然のタンパク質の精製によって生成され、その後動物を免疫化するために使用される。たとえばウサギ、ニワトリ、マウス、モルモット、ラットを含む様々な宿主動物を、目的のポリペプチドを注入することによって免疫化することができる。宿主の種類に応じて免疫応答を増加させるためにアジュバントを使用することができ、これにはフロイントアジュバント（完全及び不完全）、鉱物ゲルたとえば水酸化アルミニウム、表面化成物質たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、キーホールリンペットヘモシアニン）、ジニトロフェノールが含まれる。ポリクローナル抗体は、特定の抗原に特異性を有する抗体分子の異質集合であり、免疫化させた動物の血清内に含まれている。抗原内に含まれる特定のエピトープの抗体の均質集合であるモノクローナル抗体は、標準のハイブリドーマ技法を用いて調製することができる。Ｋｏｈｌｅｒ他、１９７５、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６：４９５参照。特に、モノクローナル抗体は、連続培養中の細胞系によって抗体分子の生成をもたらす任意の技法、たとえばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ他、１９８３、現代免疫学（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ）、４：７２及びＣｏｌｅ他、１９８３、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８０：２０２６参照）やＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ他、１９８３、「モノクローナル抗体及び癌の治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ページ７７〜９６参照）によって得ることができる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含めた任意の免疫グロブリンクラス、及びその任意のサブクラスのものであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｏｒ又はｉｎ  ｖｉｖｏで培養することができる。
【００５１】
キメラ抗体とは、別々の部分が異なった動物種に由来する分子であり、たとえばマウスのモノクローナル抗体に由来する可変部とヒト免疫グロブリン定常部を有する抗体である。キメラ抗体は、標準の技術を用いて生成することができる。
【００５２】
当分野で周知の技法を用いて、マウス抗体の相補性決定領域をヒトフレームワークドメインに置換挿入することによってヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）した形のマウス抗体を作成することができる。また、選択されたマウスフレームワーク残基をレシピエントのヒト免疫グロブリンに置換挿入することもできる。所望する結合特異性を有するモノクローナル抗体を商業的にヒト化させることができる（Ｓｃｏｔｇｅｎｅ、スコットランド；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）。たとえば遺伝子導入動物内で発現される、完全なヒト抗体も、本発明の特徴である。たとえば、Ｇｒｅｅｎ他、１９９４、ネイチャー遺伝学（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、７：１３〜２１、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号参照。
【００５３】
ＨＲＧＰポリペプチドに特異的結合アフィニティーを有する抗体断片を、周知の技術によって作成することができる。たとえば、このような断片には、それだけには限定されないが、抗体分子をペプシン消化することによって生成できるＦ（ａｂ’）２断片や、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって作成できるＦａｂ断片が含まれる。代わりに、Ｆａｂ発現ライブラリを構築することができる。たとえば、Ｈｕｓｅ他、１９８９、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４６：１２７５参照。単鎖Ｆｖ抗体断片は、アミノ酸架橋（たとえば１５〜１８個のアミノ酸）によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片を結合させ、単鎖ポリペプチドを生じさせることによって形成される。単鎖Ｆｖ抗体断片は、標準の技術を用いて生成することができる。たとえば、米国特許第４，９４６，７７８号参照。
【００５４】
生成後、標準の免疫測定法たとえばＥＬＩＳＡ技法やＲＩＡによって、抗体又はその断片の、ＨＲＧＰポリペプチドに対する認識を試験する。「分子生物学の手短なプロトコル（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１１章、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ他編、１９９２参照。適切な抗体は、好ましくは組換えタンパク質と自然のタンパク質に対して同等の結合アフィニティーを有している。
【００５５】
本発明のＨＲＧＰ抗体を、本明細書中に記載のＨＲＧＰ特異的抗体を少なくとも１つ含む診断キットに包装することができ、これを都合良く用いて研究又は診断目的で試料中のＨＲＧＰを検出することができる。ＨＲＧＰに対する抗体は、任意の周知の検定方法たとえば競合的結合検定、直接又は間接サンドイッチ検定、免疫沈降検定で利用することができる。Ｚｏｌａ、「モノクローナル抗体：技法のマニュアル（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、ページ１４７から１５８、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７参照。競合的結合検定は、限られた量の抗体と結合することに対して、標識した標準物質（これはＨＲＧＰポリペプチド又はその免疫学的に反応性のある部分であってよい）が試験する試料分析物（ＨＲＧＰ）と競合する能力に依存する。試験する試料中のＨＲＧＰ量は、抗体に結合する標準物質の量に反比例する。結合する標準物質の量の決定を容易にするために、抗体は一般的に競合前又は後に不溶化され、これにより抗体と結合している標準物質と分析物が、結合していない標準物質と分析物から都合良く分離される。
【００５６】
本発明のＨＲＧＰ抗体は、ＨＲＧＰの生理活性、たとえばＣＡＭ検定で検定されるＨＲＧＰの抗血管形成活性を実質的に阻害又は排除することができる中和抗体であってもよい。本発明のＨＲＧＰ抗体はまた、血管形成に作用性又は拮抗性である可能性がある。
【００５７】
検出可能なマーカーに結合させたＨＲＧＰ
診断上用途のために、検出可能な部分を用いてＨＲＧＰポリペプチドを標識することができる。この検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に生成することができる。たとえば、検出可能な部分は、放射性同位元素、たとえばＨ３、Ｃ１４、Ｐ３２、Ｓ３５、Ｉ１２５；蛍光又は化学発光化合物たとえばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ルシフェリン；又は酵素たとえばアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼであってよい。ポリペプチドを検出可能な部分に結合させる当分野で周知の任意の方法を利用することができる。たとえば、Ｈｕｎｔｅｒ他、１９６２、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１４４：９４５；Ｄａｖｉｄ他、１９７４、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１３：１０１４；Ｐａｉｎ他、１９８２、免疫学的方法雑誌（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．）、４０：２１９；Ｎｙｇｒｅｎ、１９８２、組織化学と細胞科学（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．）、３０：４０７参照。
【００５８】
ＨＲＧＰポリペプチドはまた、血管新生の領域をイメージングするために、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに有用な検出可能な部分と結合させてもよい。ＨＲＧＰポリペプチドを検出可能な部分たとえば放射線不透過性薬剤や放射性同位元素を用いて標識し、宿主の好ましくは血流中に投与し、標識されたＨＲＧＰポリペプチドの存在及び位置を検定する。ＨＲＧＰポリペプチドは、核磁気共鳴、放射化学、当分野で周知の他の検出方法によって、宿主内で検出可能などのような部分を用いて標識してもよい。たとえば、放射性同位元素は１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、１２３Ｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１９９Ａｕ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２４Ｉ、１８Ｆ、１１Ｃ、１９８Ａｕ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１３Ｎ、３４ｍＣｌ、３８Ｃｌ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７６Ａｓ、７２Ｓｅ、７３Ｓｅ又は７５Ｓｅであってよい。
【００５９】
毒素に結合させたＨＲＧＰ
毒素に結合させたＨＲＧＰは、ＨＲＧＰ受容体を標的にするための治療薬として使用することができる。ＨＲＧＰポリペプチドを、当分野で周知の手順によって細胞の細胞質中の細胞毒性効果を媒介する任意の毒素ポリペプチドに結合させることができる。好ましい毒素ポリペプチドには、リボソーム不活性化タンパク質、たとえばＡ鎖毒素（たとえばヒマ毒Ａ鎖）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、アブリン（ａｂｒｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ｐｏｋｅｗｅｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＰＡＰ）など植物性毒素、αサルシン（α−ｓａｒｃｉｎ）、アスペルギリン（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）など真菌性毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）など細菌性毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、胎盤性リボ核酸やアンジオゲニンなどリボ核酸が含まれる。他の有用な毒素ポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド、たとえばＢａｘ、Ｂａｄ、Ｂａｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｋ、Ｂｏｋ、Ｈｒｋである。さらに、１つ以上（たとえば２、３、４又は６）の毒素の複数の機能性断片（たとえば２、３、４、６、８、１０、１５又は２０）をＨＲＧＰに結合させることができる。反復が含まれている場合は、互いにすぐ隣接、１つ又は複数の標的断片によって分離、又は上に記載の結合ペプチドによって分離されていてもよい。本発明はまた、ＨＲＧＰポリペプチドに結合した任意のこれらポリペプチドの機能性断片を含む。
【００６０】
ＨＲＧＰ受容体の単離
本発明はさらに、ＨＲＧＰポリペプチドに特異的な受容体を同定する方法、並びに同定された受容体分子及びそれを単離したものを包含する。当分野で周知の技法を使用して、ＨＲＧＰペプチドを用いて細胞可溶化液からＨＲＧＰ受容体を単離するためのアフィニティーカラムを開発することができる。ＨＲＧＰ受容体の単離に続いて、アミノ酸シーケンシングを行う。このアミノ酸配列情報から、ＨＲＧＰ受容体をコードするポリヌクレオチド配列のクローニングに使用するために、ポリヌクレオチドプローブを開発することができる。
【００６１】
血管形成を阻害するための治療方法
抗血管形成ＨＲＧＰポリペプチドを、血管形成を阻害することが望ましい対象に投与することができる。適切な対象には、様々な血管形成依存の癌たとえば横紋筋肉腫、多形性グリア芽腫、平滑筋肉腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、黒色腫、膀胱癌、膵臓癌、腎癌などのうちいずれかを有するものが含まれるが、それだけには限定されない。ＨＲＧＰポリペプチドを用いた治療に敏感に反応する血管形成の疾病には、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管新生、水晶体後線維増殖症、トラコーマ、血管新生緑内障、乾癬、血管繊維腫、免疫性又は非免液性炎症、アテローム硬化症プラーク内の毛細血管形成、心筋血管形成、血管腫、過剰の創傷修復、様々な疾病、過剰の及び／又は調節解除された血管形成によって特徴付けられる任意の他の疾病が含まれるが、それだけには限定されない。
【００６２】
通常、抗血管形成ＨＲＧＰポリペプチドは製薬的組成物中で投与される。治療上の応用では、ＨＲＧＰポリペプチドを、製薬上許容される剤形で哺乳動物たとえばヒトに投与する。ＨＲＧＰポリペプチドを静脈内に大量瞬時投与として、又は筋肉内、皮下、間接内、滑液内、くも膜下腔内、経口、外用、吸入経路による一定時間をかけた連続的な注入によって、投与することができる。ＨＲＧＰポリペプチドの長期の連続的な局部送達は、マイクロカプセルに封入したＨＲＧＰポリペプチドを分泌する細胞の埋め込みによって行うことができる。Ｒｅａｄ他、２００１、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、１９（１）：２９〜３４及びＪｏｋｉ他、２００１、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、１９（１）：３５〜３９参照。
【００６３】
疾病の予防又は治療のための適切なＨＲＧＰポリペプチドの用量は、治療する疾病の種類、疾病の重症度及び過程、それ以前の治療の過程、患者の既往歴及びＨＲＧＰポリペプチドへの反応、主治医の判断に依存する。患者にＨＲＧＰポリペプチドを、一度に又は一連の治療の期間中に投与する。疾病の種類や重症度に応じて、患者の体重１ｋｇあたり約０．０１〜１０００ｍｇのＨＲＧＰポリペプチドが、患者に投与する初期用量候補であり、これはたとえば一回又は複数回の個別の投与あるいは連続的な注入のいずれかによって行う。数日間以上をかけた反復投与では、状態次第で、疾病症状に対する所望する抑制が起こるまで治療を繰り返す。しかし、他の投与計画（ｒｅｇｉｍｅｎ）も有用な可能性があり、除外はしない。
【００６４】
治療の有効性は、以下を含む様々なパラメーターによって評価することができる。すなわち、皮膚質量、Ｘ線、スキャン、腫瘍の大きさを評価する他の手段によって決定した、腫瘍の大きさの縮小；上記の方法により評価した、腫瘍進行の欠如；表面病変の測定及び評価によって決定した、ケロイド形成の減少；眼底網膜の写真の比較分析又は他の適切な評価方法によって決定した、糖尿病性網膜症に関連した網膜病変の改善；上記の方法により決定した、糖尿病性網膜症の進行の欠如である。血液中のＨＲＧＰポリペプチドの薬理学的レベルは、ＥＬＩＳＡ、捕獲検定、放射性免疫測定法、受容体結合検定などによって決定することができる。
【００６５】
血管形成を促進するための治療方法
抗血管形成ＨＲＧＰポリペプチドの拮抗剤を、血管形成を促進することが望ましい対象に投与することができる。適切な対象には、限定することなしに、ＨＲＧＰ拮抗剤を用いた治療に敏感に反応する任意の様々な疾病を有する対象が含まれ、これには末梢虚血疾患、末梢循環性疾患、糖尿病疾患、不妊症が含まれるが限定しない。治療上の応用には、ＨＲＧＰ拮抗剤たとえば抗ＨＲＧＰ抗体又はＨＲＧＰ受容体を、製薬的に許容される剤形で哺乳動物たとえばヒトに投与する。ＨＲＧＰ拮抗剤を静脈内に大量瞬時投与として、又は筋肉内、皮下、間接内、滑液内、くも膜下腔内、経口、外用、吸入経路による一定時間をかけた連続的な注入によって、投与することができる。適切なＨＲＧＰ拮抗剤の用量は、治療する疾病の種類、疾病の重症度及び過程、それ以前の治療の過程、患者の既往歴及びＨＲＧＰポリペプチドへの反応、主治医の判断に依存する。患者にＨＲＧＰ拮抗剤を、一度に又は一連の治療の期間中に投与する。
【００６６】
避妊の方法
抗血管形成ＨＲＧＰポリペプチドは、胚の着床に必要な子宮の血管新生を減少又は妨げることによって、避妊薬として使用することができる。このような避妊方法では、胚の着床を妨げるのに十分な量のＨＲＧＰポリペプチドを雌の哺乳動物に投与する。この避妊方法の一態様では、性交及び受精が起こる前又は起こった後に、胚の着床をブロックするのに十分な量のＨＲＧＰポリペプチドを投与して、効果的な避妊方法、おそらくは「翌朝」の方法を提供する。投与方法には、錠剤、注入（静脈内、皮下、筋肉内）、坐薬、膣内スポンジ、膣内タンポン、子宮内装置が含まれるが、それだけには限定されない。
【００６７】
ＨＲＧＰ欠乏性血漿
ＨＲＧＰ欠乏性血漿は、当分野で周知の様々な免疫沈降技術で抗ＨＲＧＰ抗体を使用して調製することができる。このような技術には、免疫沈降、免疫親和性ビーズ精製、免疫親和性カラムクロマトグラフィーが含まれるが、それだけには限定されない。ＨＲＧＰ欠乏性血漿はまた、当分野で周知の方法によって、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を用いて調製したＮｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、米国チャッツワース）に血漿を通すことによって調製することもできる。
【００６８】
ＨＲＧＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明の別の態様は、ＨＲＧＰポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を含む。このようなポリヌクレオチドには、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、それらの診断上又は治療上有用な断片が含まれるが、それだけには限定されない。ＨＲＧＰポリペプチドの誘導体又は類似体である断片をコードする、このようなポリヌクレオチドの変異体も含まれる。
【００６９】
本発明の単離した核酸分子は、標準の技法によって生成することができる。本明細書中で使用する「単離した」とは、ＨＲＧＰポリペプチドをコードする遺伝子の一部又はすべてに対応する配列であり、自然に存在するゲノム中の野生型遺伝子の一方又は両方の末端に通常隣接する配列を含まないものをいう。自然に存在しない配列は自然にはなく、自然に存在するゲノムにある直接隣接する配列を有さないので、核酸に関して本明細書中で使用する用語「単離した」とは、任意の自然に存在しない核酸配列も含む。
【００７０】
単離した核酸は、たとえば、自然に存在するゲノム中のＤＮＡ分子に通常直接隣接している核酸配列が取り除かれている又は存在しないことを条件として、ＤＮＡ分子とすることができる。したがって、単離した核酸には、他の配列から独立した分離された分子として存在するＤＮＡ分子（たとえばＰＣＲ又は制限酵素処理によって生成したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）、及びベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス）、原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡが含まれるが、それだけには限定されない。さらに、単離された核酸は、操作した核酸、たとえばハイブリッド核酸又は融合核酸の一部である組換えＤＮＡ分子を含むことができる。たとえばｃＤＮＡライブラリまたはゲノムライブラリ中であるいは制限消化したゲノムＤＮＡを含むゲル切片中で数百から数百万個の他の核酸と一緒に存在する核酸は、単離した核酸と見なすべきでない。
【００７１】
本発明の範囲内にある単離した核酸は、通常の分子クローニング及び核酸の化学合成技術を含むが限定はしない任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、ＰＣＲ技術を用いて、当分野で既知のＨＲＧＰ配列と同一性を共有する核酸配列を含む核酸を単離することができる。ＰＣＲとは、標的核酸配列を増幅させる手順又は技術を意味する。増幅する鋳型と逆の鎖の配列と同一であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するためには、通常、目的領域の末端又はその領域より先の配列情報を使用する。ＰＣＲを用いて、全ゲノムＤＮＡ又は全細胞性ＲＮＡの配列を含めたＤＮＡ及びＲＮＡの特定配列を増幅することができる。プライマーは通常１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド〜数百ヌクレオチド長にわたることもできる。一般的なＰＣＲ技術は、たとえば「ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．及びＤｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５に記載されている。鋳型源としてＲＮＡを使用する場合、逆転写酵素を使用して相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することができる。
【００７２】
単離した本発明の核酸は、単一核酸分子又は一連のオリゴヌクレオチドのどちらかとして化学合成することもできる。たとえば、所望する配列を含む一対又は複数対の長いオリゴヌクレオチド（たとえば＞１００ヌクレオチド）を合成することができ、この場合、各対が、オリゴヌクレオチド対がアニーリングしたときに二重鎖が形成されるように相補性の短いセグメント（たとえば約１５ヌクレオチド）を含んでいる。ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを伸長させると、各オリゴヌクレオチド対あたり１個の二本鎖核酸分子が生じ、その後それをライゲーションによってベクターに挿入することができる。
【００７３】
単離した本発明の核酸は、突然変異誘発によっても得ることができる。たとえば、単離した、当分野で既知のＨＲＧＰ配列と同一性を共有する核酸を、通常の分子クローニング技術（たとえば部位特異的突然変異誘発）を使用して変異させることができる。可能な変異は、欠失、挿入、置換、及び欠失、挿入、置換の組合せである。
【００７４】
さらに、核酸及びアミノ酸のデータベース（たとえばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））を使用して、単離した、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドを得ることができる。たとえば、当分野で既知のＨＲＧＰポリペプチドをコードする核酸配列と相同性を有する配列、又は当分野で既知のＨＲＧＰアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をクエリーとしてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）を検索することができる。既知のＨＲＧＰポリペプチドをコードする核酸の例には、以下のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録番号が含まれる。すなわち、ＮＭ０００４１２（ヒト）、ＡＦ１９４０２８（マウス）、ＡＦ１９４０２９（ラット）、Ｕ３２１８９（ウサギ）である。
【００７５】
さらに、核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して本発明の範囲内にある核酸を単離することができる。手短に述べると、ＨＲＧＰポリペプチドをコードする核酸配列を、中程度から高度の厳密性の条件下でのハイブリダイゼーションによって類似の核酸を同定する、プローブとして使用することができる。中程度の厳密性のハイブリダイゼーション条件は、２５ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、５Ｘ  ＳＣＣ、５Ｘデンハルト液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、５０μｇ／ｍＬの変性させた超音波処理したサケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、１〜１５ｎｇ／ｍＬのプローブ（１μｇあたり約５×１０７ｃｐｍ）を含むハイブリダイゼーション溶液中で、約４２℃でのハイブリダイゼーションを行い、２Ｘ  ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む洗浄液を用いた約５０℃での洗浄ステップを含む。高度な厳密性では、同一のハイブリダイゼーション条件が使用できるが、０．２Ｘ  ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含む洗浄液を用いて、洗浄を約６５℃で行う。
【００７６】
核酸が同定されれば、その後、この核酸が本明細書に記載の本発明の範囲内にあるかどうかを決定するために、核酸を精製し、配列決定し、分析することができる。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を同定するために、それぞれプローブとハイブリッド形成するサザン又はノーザン分析によって行うことができる。プローブを、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素、放射性同位元素たとえば３２Ｐや３５Ｓを用いて標識することができる。分析するＤＮＡ又はＲＮＡをアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で分離し、ニトロセルロース、ナイロン、又は他の適切な膜に移し、当分野で周知の標準技術を使用してプローブをハイブリッド形成させることができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州プレインビューのセクション７．３９〜７．５２参照。
【００７７】
本発明は、単離したＨＲＧＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及びこれらベクターを含む宿主細胞も含む。本発明のベクターは、たとえばクローニングベクター又は発現ベクターを含むこともできる。宿主細胞は、本発明のベクターを用いて遺伝的に操作（形質導入、形質転換、又は形質移入）されていてもよい。操作した宿主細胞を、必要に応じてプロモーターの活性化、形質転換体の選択、本発明の遺伝子の増幅のために改変した従来の栄養培地中で培養することができる。培養条件たとえば温度、ｐＨなどは、発現用に選択された宿主細胞で以前に用いた条件であり、当分野の技術者には明らかであろう。
【００７８】
本発明を以下の実施例中でさらに説明し、これは特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない。
【実施例１】
【００７９】
組織培養
ＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ−１）を過剰発現しているブタ大動脈内皮（ＰＡＥ）細胞系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したハムＦ１２培地中で培養した。Ｗｅｎｎｓｔｒｏｍ他、１９９２、生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６７：１３７４９参照。一次ウシ副腎皮質毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞を、ゼラチンでコーティングした組織培養皿上で、１０％ＦＣＳ及び１ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で補完した改変ダルベッコ培地中で培養した。Ｕ−３４３ヒトグリオーマ細胞を、１０％ＦＣＳで補完した改変ダルベッコ培地中で培養した。スイス３Ｔ３線維芽細胞を、１０％ＦＣＳで補充したＤＭＥＭ中で培養した。ヒト胚性腎（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ、ＨＥＫ）２９３−ＥＢＮＡ細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。
【実施例２】
【００８０】
漿尿膜（ＣＡＭ）検定
準拠したＣＡＭ検定条件は、基本的にＦｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ他及びＤｉｘｅｌｉｕｓ他に記載のとおりである。Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ他、１９９５、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、５２４１：１５００及びＤｉｘｅｌｉｕｓ他、２０００、血液学（Ｂｌｏｏｄ）、９５：３４０３参照。受精したヒヨコ胚を当地で購入し、湿度７０％、３８℃で１０日間プレインキュベートした。卵の一端にある気室の真上に、穴あけ器で小さな穴を開けた。ＣＡＭ上の無血管領域を確認し、その領域の上方の卵殻に第２の穴を開けた。第１の穴に真空をかけることによって殻からＣＡＭを分離した。フィルターディスク（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．）を３ｍｇ／ｍｌの酢酸コルチゾン（Ｓｉｇｍａ）で飽和させ、ＦＧＦ−２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、各フィルター０．２μｇ）、ＶＥＧＦ−Ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、各フィルター０．２μｇ）、精製ＨＲＧＰ（各フィルター３μｇ）を含む又は含まない緩衝液（各フィルター３０μｌ）に浸した。殻に１×１ｃｍの窓を作成してＣＡＭを露出させ、試験する試料をこの無血管性領域に施用した。窓をテープで塞ぎ、ヒヨコ胚をさらに３日間インキュベートした。この時点で、膜をフィルターの周りで切り取り、これを上下逆にして光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ  ３００、倍率２．５又は４）で検査した。
【実施例３】
【００８１】
内皮細胞遊走検定
１００μｇ／ｍｌのタイプ１コラーゲン溶液（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ１００、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）を用いてコーティングした毛細孔ニトロセルロースフィルター（厚さ８μｍ、８μｍ孔）を使用して遊走検定を改変ボイデンチャンバー内で実施した（Ａｕｅｒｂａｃｈ他、１９９１、薬理学と治療学（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、５１：１〜１１参照）。一次ＢＣＥ細胞又はヒトグリオーマ細胞（Ｕ−３４３  ＭＧ）をＨＲＧＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて３０分間プレインキュベートし、トリプシン処理し、０．１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むハムＦ１２培地中、１ｍｌあたり４．０×１０５個の細胞の濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液を上チャンバーに置き、０．１％ＦＣＳと５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２又は５ｎｇ／ｍｌの血小板由来の成長因子ＢＢ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）とを組み合わせた培地、及び１００ｎｇ／ｍｌのＨＲＧＰを含む培地を個別に又は組み合わせて、下チャンバーにフィルターの下方に置いた。１０％のＦＣＳは、ポジティブコントロールとして用いた。３７℃で４時間後、培地を取り除き、フィルターに付着している細胞を純粋なメタノールで固定化し、ギムザ染色で染色した。フィルターの下側の細胞を、スイス、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの画像分析ソフトウェア（Ｅａｓｙ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して３つの個別の顕微鏡視野で数えた。すべての試料を、各処置少なくとも６個のウェルで分析した。
【実施例４】
【００８２】
動物研究
動物研究は、ウプサラ大学のＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ動物施設で実施し、動物実験の地域（ｌｏｃａｌ）委員会の承認を受け、腫瘍実験における動物の福祉に関するＵＫＣＣＣＲ指針に従って実施した。Ｗｏｒｋｍａｎ他、１９８８、実験動物（Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．）、２２：１９５〜２０１参照。６週齢、雌のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（Ｍｏｌｌｅｇａｒｄ／Ｂｏｍｈｕｌｔｇａｒｄ、デンマーク）を気候順応させ５個体ずつの群でケージに入れ、自由に動物用固形試料及び飲料水の食餌を摂食させた。すべての操作中、イソフルラン（Ｆｏｒｅｎｅ、スウェーデン、アボット）を用いてマウスに麻酔した。５０μｌのＤＭＥＭ中に０．５×１０６個のＴ２４１繊維肉腫細胞をマウスの左脇腹に皮下注射した。触知可能な腫瘍を有する動物を無作為に選択し、４ｍｇ／ｋｇ／日のＨＲＧＰ、媒体（ＰＢＳ）、又はコントロールとしてのサーモライシン切断抗トロンビンを用いて１１日間毎日、右脇腹に皮下注射として与え、治療を受けさせた。カリパーを用いて１日１回、二重盲手順で腫瘍を測定し、式π／６×幅２×長さによって体積を計算した。ＡＮＯＶＡを使用して統計分析を実施した。約１１日間の治療後、致死量のペントバルビタールで屠殺し、ミロニヒリン酸緩衝液（Ｍｉｌｌｏｎｉｇ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）中の４％パラホルムアルデヒドで灌流した。その後、標準の組織学手順に従って腫瘍をパラフィンに包埋して、４μｍの厚さの切片にした。
【実施例５】
【００８３】
免疫沈降及びブロッティング
実施例１に記載のＰＡＥ／ＦＧＦＲ−１細胞を一晩血清飢餓させ、ＦＧＦ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＨＲＧＰ（１μｇ／ｍｌ）を個別に又は組み合わせて用い、１０分間３７℃で刺激させ、又は刺激させなかった。細胞をＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を含む緩衝液中で溶解し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＨｙｂｏｎｄ−Ｃ  ｅｘｔｒａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に移した。抗リン酸Ｅｒｋ１／２抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）又は抗リン酸ｐ３８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）を用いて膜を免疫ブロットした。化学発光検出システムを用いて免疫反応性タンパク質を可視化させた。Ｍａｔｔｈｅｗｓ他、１９８５、分析生化学（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１５１：２０５〜２０９参照。
【実施例６】
【００８４】
ＨＲＧＰはＣＡＭ血管形成を阻害する
殻に窓を作成することによって１０日齢のヒヨコ胚のＣＡＭを露出させた。ＣＡＭを成長因子たとえばＦＧＦ−２で処置することで、ＣＡＭの血管形成が刺激された（表１）。ＦＧＦ−２及びＶＥＧＦ−Ａを１０倍モル濃度過剰のＨＲＧＰと一緒にＣＡＭに施用することにより、血管形成の抑制が生じた。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
０（低い）から３（高い）のスコアは、Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ他、１９９５及びＤｉｘｅｌｉｕｓ他、２０００の方法に従った、血管分岐点の数に基づいている。５〜６個の胚の平均値を記録した。ばらつきは１５％未満であった。これらの結果は、漿尿膜検定によって測定されたように、ＨＲＧＰが抗血管形成活性を有することを示す。
【実施例７】
【００８７】
ＨＲＧＰは内皮細胞遊走を阻害する
血管形成とは、血管内皮細胞が新しい血管を形成するために起こすいくつかの変化、たとえば増殖、遊走、分化の集合語である。Ｇｅｒｗｉｎｓ他、２０００、腫瘍学と血液学におけるクリティカルレビュー（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．）、３４：１８５〜１９４参照。実施例３に記載の検定を使用して、内皮細胞の遊走に対するＨＲＧＰの影響を分析した。一次ウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞は、ミニボイデンチャンバー内での基準遊走に比べて、ＦＧＦ−２に向かう遊走が１５０％増強された。この増強された遊走は、ＦＧＦ−２と１００ｎｇ／ｍｌのＨＲＧＰとの共インキュベーションにより、完全に抑制された（図１）。対照的に、ＰＤＧＦ−ＢＢに向かうＵ−３４３  ＭＧヒトグリオーマ細胞の遊走は、ＨＲＧＰに阻害されなかった。この結果は、内皮細胞遊走検定によって測定されたように、ＨＲＧＰが抗血管形成活性を有することを示す。
【実施例８】
【００８８】
シグナル形質導入
内皮細胞で、ＦＧＦ−２で誘発させたシグナル形質導入に対するＨＲＧＰの効果を、実施例５に記載の検定で試験した。ＰＡＥ／ＦＧＦＲ−１細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２又は５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ａを用いて、１ｍｇ／ｍｌのＨＲＧＰの存在下又は非存在下で７分間処理した。全細胞の溶解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロットにより分析した。ＨＲＧＰは、ＶＥＧＦ−Ａ又はＦＧＦ−２で誘発させたＭＡＰキナーゼたとえばＥｒｋ１／２の活性化にも、ＦＧＦ−２で誘発させたｐ３８の活性化にも影響を与えず、これによりＦＧＦ−２に媒介されるＦＧＦＲ−１の活性化及びシグナル導入はＨＲＧＰによって影響されないことが示された。Ｅｒｋ１／２及びｐ３８の活性は、ＨＲＧＰで処理した細胞内で基準レベルがわずかに増加していた。
【実施例９】
【００８９】
マウスにおける繊維肉腫腫瘍の成長の阻害
実施例４に記載の検定では、ＨＲＧＰはマウスの繊維肉腫の成長を阻害した。ヒト血漿から精製したＨＲＧＰを使用して、左脇腹に触知可能な皮下Ｔ２４１繊維肉腫を有するＣ５７／ブラックマウスを処置した。コントロールとして、Ｃ５７／ブラックマウスをＰＢＳで処置した。コントロールの腫瘍の大きさが最大で２．５ｃｍ２（約１１日）になるまで、４ｍｇ／ｋｇの用量を右脇腹に皮下注射する処置を毎日行った。ＨＲＧＰを用いた注入は、腫瘍の成長に劇的な減少をもたらした（図２）。屠殺時には、腫瘍の大きさは約７５％減少していた。それと平行して、腫瘍を有する動物を、サーモリシン切断抗トロンビンを用いて処置した（図２Ｂ）。ＰＢＳで処置した動物と、サーモリシン切断抗トロンビンで処置した動物の腫瘍の大きさには、統計的に有意な差はなかった。これらの結果は、ｐＨＲＧＰの効果は一般的にタンパク質の操作や注入によるものではなく、繊維肉腫腫瘍成長検定によって測定すると、ＨＲＧＰが抗血管形成活性を有することを示す。
【実施例１０】
【００９０】
ＨＲＧＰ発現ベクターの構築
ヒトのヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）完全長のｃＤＮＡを、ｐＣＥＰ−Ｐｕ２発現ベクター内のＥｃｏＲ１／Ｘｈｏ  １部位にクローニングした。Ｈａｌｌｇｒｅｎ他、２０００）。ＨＲＧＰ  ｃＤＮＡのアミノ酸１〜１８はシグナルペプチドをコードし、これはこのタンパク質の細胞外分泌を可能にする。したがって、ｐＣＥＰ−Ｐｕ２内のクローニングカセットの前にあるＢＭ４０シグナル配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎｈｅ１を用いた制限切断によって取り除いた。新しいベクターをｐＣＥＰ−７８５４４と命名し、これはヒスチジンタグなしのＨＲＧＰ（ｒＨＲＧＰ）をコードしている。
【００９１】
ヒスチジンタグした完全長ＨＲＧＰ及びＣ末端で切断された変異体の発現ベクターも、ｐＣＥＰ−Ｐｕ２発現システムを用いて構築した。これらベクターは、ＨＲＧＰの完全長又は完全長より少ない部分のＰＣＲ増幅によって作成した。精製を容易にするために、ＨＲＧＰコード領域のＮ末端にヒスチジンタグ（６個のヒスチジン）を付加した。ヒスチジンタグの除去を可能にするために、エンテロキナーゼ切断部位をヒスチジンタグとＨＲＧＰコード領域の間に導入した。これらベクター内では、ＨＲＧＰシグナル配列を除去した。その代わりに、ＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ−Ｐｕ２の枠内でＢＭ４０シグナル配列に入れた。３つのこのようなベクターを構築し、ｐＣＥＰ−Ｐｕ２／Ｈｉｓ１、３、４と命名した。この３つのベクターは、ヒスチジンタグした完全長ＨＲＧＰ（Ｈｉｓ１）及び２つの切断されたＨＲＧＰポリペプチド（Ｈｉｓ３〜４）をコードしている。図３参照。
【実施例１１】
【００９２】
ＥＢＮＡ−２９３細胞の形質移入及び条件培地の回収
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いて、組換えＨＲＧＰポリペプチドを生成した。形質転換されたプラスミドＤＮＡが染色体に組み込まれるのを防止するために、やはりｐＣＥＰ−Ｐｕ２ベクターで発現されるＥＢＮＡ−１遺伝子を用いてこれらの細胞を安定に形質転換させた。この操作は、細胞の細胞質中のプラスミドが高コピー数であることを可能にし、組換えタンパク質の収量を増大させる。実施例１０に記載のＨＲＧＰ発現ベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者のマニュアルに従って２９３−ＥＢＮＡ細胞系に形質移入させた。形質移入の４８〜７２時間後、ｐＣＥＰ−Ｐｕ２ベクターが取り込まれたものを選択するために２．５μｇ／ｍｌのプロマイシン（Ｓｉｇｍａ）を用い、ＥＢＮＡ−１を発現する細胞を選択するために０．２５ｍｇ／ｍｌ  のＧ４１８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて細胞を選択圧下に置いた。成長中の細胞が拡大し、条件培地を５日目毎に回収した。ウシＨＲＧＰによる汚染を防止するために、条件培地の回収中にＦＣＳを、定義した血清置換培地ＴＣＭ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で交換した。細胞及び細片を、１０分、１２００ｇの遠心分離により取り除いた。
【実施例１２】
【００９３】
血漿からのＨＲＧＰ（ｐＨＲＧＰ）及び組換えＨＲＧＰ（ｒＨＲＧＰ）の精製
採取したてのヒト血漿から、プロテイナーゼ阻害剤の存在下でホスホセルロース上のクロマトグラフィーによってｐＨＲＧＰを精製した（Ｒｙｌａｔｔ他、１９８１、Ｋｌｕｓｚｙｎｓｋｉ他、１９９７）。タグ付けされていないＨＲＧＰ（ｒＨＲＧＰ）を条件培地から精製するために同じ方法を使用した。
【実施例１３】
【００９４】
ヒスチジンタグしたＨＲＧＰの精製
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを使用して、実施例１１に記載のＨｉｓ１、３、４形質移入細胞系から、ヒスチジンタグしたＨＲＧＰポリペプチドを精製した。約５０ｍｌのＨＲＧＰ条件培地を２００μｌの５０％Ｎｉ−ＮＴＡアガローススラリーと一緒に、終夜４℃「回転させながら（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）」インキュベートした。アガロースを遠心沈殿させて、ＰＢＳ  ｐＨ７．０／１Ｍ  ＮａＣｌ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて３〜４回洗浄した。アガロースをカラムに充填し、上記のように再度洗浄した。結合した物質は、１００ｍＭイミダゾール／２０ｍＭトリスｐＨ８．０／０．１Ｍ  ＮａＣｌを使用した分画で溶出された。タンパク質を含む分画を貯留し、ＰＢＳ  ｐＨ７．０に対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でＢＳＡ標準と比較することによって、またＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって最終タンパク質濃度を推定した。
【実施例１４】
【００９５】
ＴＵＮＥＬ検定
末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を用いたｄＵＴＰニック末端標識（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ−ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ、ＴＵＮＥＬ）検定を以下のように実施した。ゼラチンでコーティングしたガラススライドに、ＢＣＥ細胞をＤＭＥＭ／１０％ＮＣＳと２ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２中で播種した。４０時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてアポトーシス細胞を染色した。手短に述べると、この方法の原理は、アポトーシスプロセス中に作成されたフリーの３’−ＯＨを、酵素反応で蛍光ｄＵＴＰを用いて標識することである。すべての細胞が検出されるようにするために、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて二重染色を実施した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合は、各処置から約１５００個ずつの細胞を分析することによって決定した。
【実施例１５】
【００９６】
ＦＧＦＲ活性化の分析
ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）活性化の分析は、Ｆ１２／０．１％ＢＳＡ中で終夜血清飢餓させ、ＦＧＦ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒＨＲＧＰ（１μｇ／ｍｌ）又はその組合せを用いて３７℃で８分間刺激したＰＡＥ／ＦＧＦＲ−１細胞を用いて実施した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液中で細胞を溶解し、チロシンリン酸化されたタンパク質を４Ｇ１０抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｔｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて免疫沈降させた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  ｅｘｔｒａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に移した。Ｐ  Ｍａｈｅｒ博士、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国、カリフォルニア州ｌａ  Ｊｏｌｌａから提供された抗ＦＧＦＲ−１抗体を用いて免疫ブロッティングを実施した。ｐ３８リン酸化の分析は、ＦＧＦ−２を添加する前に１μｇ／ｍｌのｒＨＲＧＰで３０分間プレインキュベーションした、又はしていない、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を用いて３７℃で１０分又は３０分間処置したＰＡＥ／ＦＧＦＲ−１細胞で実施した。細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液中で溶解し、全溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗リン酸ｐ３８抗体又は抗ｐ３９抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて免疫ブロットした。ＥＲＫ１／２リン酸化の分析は、ＦＧＦ−２を添加する前に１μｇ／ｍｌのｒＨＲＧＰで３０分間プレインキュベートした、又はしていない、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を用いて３７℃で１０分又は９０分間処置したＢＣＥ細胞で実施した。細胞をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液中で溶解し、全溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗リン酸ＥＲＫ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）を用いて免疫ブロットした。免疫反応性タンパク質を、化学発光検出システムによって可視化した（Ｍａｔｔｈｅｗｓ他、１９８５）。
【実施例１６】
【００９７】
組換えＨＲＧＰの生成及び特徴付け
ＨＲＧＰの抗血管形成作用をさらに調査し、タンパク質中の活性が一番低い領域を決定するために、組換えＨＲＧＰを生成した（ｒＨＲＧＰ）。ヒスチジンタグを有する又は有さない完全長のＨＲＧＰを構築し、実施例１０〜１３に記載のように単離した。ヒスチジンタグを有する２つのＣ末端切断ＨＲＧＰポリペプチドを生成し、実施例１０〜１１、１３に記載のように単離した。
【００９８】
組換えタンパク質が、おそらくは様々なレベルの糖鎖形成により、わずかに少ない見かけの分子量を示すことが、単離したｐＨＲＧＰポリペプチド及び単離したｒＨＲＧＰポリペプチドのクマシー染色により明らかになった。ＨＲＧＰ特異的抗体を用いたウエスタンブロットにより、完全長タンパク質以外にも、ｐＨＲＧＰ及びｒＨＲＧＰ分画のどちらもで、いくつかのより短い断片の存在が明らかになった。単離したＨｉｓ１、３、４ＨＲＧＰポリペプチドも、クマシー染色及び抗ＨＲＧＰウエスタンブロットで分析した。予測した分子量は予想どおりであり、３つの組換えタンパク質すべてがＨＲＧＰ特異的抗体で認識された。最も短い切断ＨＲＧＰポリペプチド、Ｈｉｓ３は、Ｈｉｓ１及びＨｉｓ４ＨＲＧＰポリペプチドと比べてタンパク質分解切断により感受性があった。
【００９９】
ＨＲＧＰに対するドメイン特異的な抗体は、０１１５、０１１６、０１１９と命名した３つの異なるペプチドを用いてウサギを免疫化させることによって産生させた。ＨＲＧＰタンパク質内のこれらペプチドの位置を、図３に示した。３つの抗ペプチド抗体を用いて、完全長ＨＲＧＰのウエスタンブロットを実施した。その結果、完全長ＨＲＧＰポリペプチドが３つの抗体すべてで検出されることが示された。しかし、より小さなＨＲＧＰ由来の断片に対しては、３つの抗体それぞれで特異的パターンの反応性が観察された。
【実施例１７】
【０１００】
ｒＨＲＧＰは内皮細胞の遊走を阻害する
内皮細胞の遊走に対するｒＨＲＧＰの効果を、実施例３に記載の検定法を使用して測定した。ｐＨＲＧＰで見られた、ＦＧＦで誘発させた遊走に対する阻害効果と同じものが、ｒＨＲＧＰを使用した場合も観察された（図４Ａ）。ｒＨＲＧＰの阻害効果は統計的に有意であった。しかし、ウシ胎児血清で誘発させた遊走は、ｒＨＲＧＰで阻害されなかった。図４Ａ参照。
【０１０１】
また、検定は様々なｒＨＲＧＰ量を用いて実施した。図４Ｂに示すように、基準レベルにまで遊走を阻害するには１００ｎｇ／ｍｌのｒＨＲＧＰが必要であった。ヒスチジンタグの存在は、ＦＧＦで誘発させた遊走の阻害に対するＨｉｓ１ＨＲＧＰの能力に影響を及ぼさなかった。
【０１０２】
成長因子ＶＥＧＦ−Ａ及び血小板因子由来の成長因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）に対するｒＨＲＧＰの効果も分析した。ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−ＢＢもまた、培養物中でＢＣＥ細胞の遊走を誘発させる。ｒＨＲＧＰは、ＶＥＧＦ−Ａ又はＰＤＧＦ−ＢＢのどちらの成長因子で誘発させた遊走も完全に阻止した。ＨＲＧＰとほぼ同じ大きさの任意のヘパリン結合血漿タンパク質がＦＧＦに誘発される遊走に影響を与える可能性を排除するために、本発明者らは、遊走検定中で、タンパク質Ｃ阻害剤（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＰＣＩ）の効果を測定した。ＨＲＧＰが存在しない場合、ＰＣＩの存在はＦＧＦに誘発される遊走に影響を与えなかった。ｒＨＲＧＰ単独の場合の、ＦＧＦで誘発させた内皮細胞遊走に対する効果を、エンドスタチン（ＥＳ）単独の場合の効果と比較した。ｒＨＲＧＰ及びＥＳのいずれも１００ｎｇ／ｍｌで使用し、これは、ＨＲＧＰとＥＳのモル濃度比１：３に対応する。ｒＨＲＧＰとＥＳのどちらもが、ＦＧＦに誘発される遊走を最低でも基準レベルにまで減少させ、ＥＳの方がわずかに効果が高かった。ｒＨＲＧＰの効果の細胞特異性を調査するために、本発明者らは、ＦＧＦに誘発されるスイス３Ｔ３マウス線維芽細胞の遊走を阻害するｒＨＲＧＰの能力を試験した。検定で３Ｔ３細胞をＢＣＥに置き換えた場合、ｒＨＲＧＰは遊走に対して効果を表さず、これにより、ｒＨＲＧＰの生物活性は内皮細胞に特異的であることが示された。
【実施例１８】
【０１０３】
ＨＲＧＰはＦＧＦで誘発させた内皮細胞の生存を阻害する
実施例１４に記載のようにＴＵＮＥＬ検定を実施した。ゼラチンでコーティングしたガラススライドに播種したＢＣＥを、低血清（ＤＭＥＭ／０．５％  ＮＣＳ）培地中に入れ、ＦＧＦ−２及びｒＨＲＧＰを個別に又は組み合わせて添加し、ＦＧＦ−２は１０ｎｇ／ｍｌ、ｒＨＲＧＰは１μｇ／ｍｌとした。各処理中のＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を測定した。
【０１０４】
ＦＧＦ−２では、飢餓培地中でアポトーシス（ＴＵＮＥＬ陽性）細胞を誘発した割合が３倍減少した。ＦＧＦで誘発させた内皮細胞の生存は、ｒＨＲＧＰをＦＧＦ−２と一緒に加えた場合は無効となった。ｒＨＲＧＰ単独では効果がなかった。
【実施例１９】
【０１０５】
シグナル形質誘導
本発明者らは、ＦＧＦ−２に誘発される内皮細胞のシグナル形質導入に対するＨＲＧＰの効果を試験した。ＦＧＦ受容体１（ＦＧＦＲ−１）の活性化に対する効果は、１μｇ／ｍｌのｒＨＲＧＰで３０分間プレインキュベートした、又はしていない、ＰＡＥ／ＦＧＦＲ−１細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２で８分間処理することによって調査した。全細胞溶解物を調製し、チロシンリン酸化タンパク質を免疫沈降した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＦＧＦＲ−１抗体で免疫ブロットした。その結果、ｒＨＲＧＰがＦＧＦ−２で誘発させたＦＧＦＲ１の活性化に影響を与えないことが示された。
【０１０６】
ｐ３８ＭＡＰＫ活性化に対するｒＨＲＧＰの効果をＰＡＥ／ＦＧＦＲ−１細胞で分析した。ｐ３８  ＭＡＰＫは、内皮細胞のアポトーシスに関連している。細胞を、ＦＧＦ−２を添加する前に１μｇ／ｍｌのｒＨＲＧＰで３０分間プレインキュベーションしてから、又はせずに、１０分又は３０分間、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２を用いて処置した。全溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗リン酸化ｐ３８抗体で免疫ブロットした。ＦＧＦ−２に誘発された、１０分又は３０分間のどちらの刺激でもｐ３８のリン酸化が増加したが、ＨＲＧＰの効果はなかった。抗ｐ３８抗体を用いた免疫ブロットにより、各レーンに同量のタンパク質があることが明らかになった。
【実施例２０】
【０１０７】
マウスの腫瘍成長
実施例４に記載の方法と同様の方法で、Ｔ２４１繊維肉腫細胞の代わりに神経芽細胞腫細胞を用いて、動物に対する適切な導入部位を使用して腫瘍を有するマウスを準備した。検出可能な腫瘍を有するマウスを無作為に選択し、ＨＲＧＰ、媒体（ＰＢＳ）単独、又は腫瘍成長に影響のないネガティブコントロールとポリペプチドたとえばサーモリシン切断のＡＴや免疫グロブリンＧを用いた治療を受けさせた。ＨＲＧＰ、媒体、コントロールポリペプチドを毎日投与した。二重盲手順を使用して、腫瘍を１日１回すなわち投与時に測定した。腫瘍体積を、式π／６×幅２×長さによって計算した。統計分析は、ＡＮＯＶＡ又は他の適切な統計手順を用いて実施した。実験の最後に、致死量のペントバルビタール又は他の認められた屠殺方法を用いて屠殺し、ミロニヒリン酸緩衝液ｐＨ７．４中の４％パラホルムアルデヒドで灌流、又は内皮細胞に特異的に結合する標識レクチンを含む緩衝液で灌流した。その後、標準の組織学手順に従って腫瘍をパラフィンに包埋、又は超低温凍結し、４μｍの厚さの切片にした。
【０１０８】
この実験を、隔日の投与計画、週に５日の投与計画を使用して繰り返した。この実験を、神経芽細胞腫細胞の代わりにルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺細胞、奇形腫細胞、他の腫瘍細胞モデルを用いて繰り返した。
【実施例２１】
【０１０９】
切断された形のＨＲＧＰの効果
組換えＨＲＧＰポリペプチドＨｉｓ３及びＨｉｓ４を、実施例１３に記載のように単離した。ヒスチジンタグを有さない、対応するポリペプチドも単離した。
【０１１０】
４つのポリペプチドそれぞれを、実施例２に記載したＣＡＭ検定、実施例３に記載した内皮細胞遊走検定、実施例４に記載した繊維肉腫の腫瘍検定、実施例８に記載のシグナル形質誘導検定、実施例１４に記載のＴＵＮＥＬアポトーシス検定で試験した。
【実施例２２】
【０１１１】
胚様体血管形成
ＬＩＦの使用を中止することによってマウス胚性幹細胞の分化を誘発させた。細胞をハンギングドロップ培養により凝集させ、４日後、非粘着性ペトリ皿（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｐｅｔｒｉ  ｄｉｓｈ）に流し込んだ。凝集体（胚様体、ＥＢ）をペトリ皿内で、ｐＨＲＧＰ、ｒＨＲＧＰ、Ｈｉｓ１、Ｈｉｓ３、Ｈｉｓ４のいずれかを用いて処理した。コントロールとしては、ＥＳで処置したＥＢをポジティブコントロール、ＰＣＩで処置したＰＣＩをネガティブコントロールとした。血管叢の形成は、抗ＣＤ３１抗体を用いた免疫組織化学によって、培養してから６、８、１２、１６日後のＥＢ試料で定性的に分析した。免疫組織化学染色では、ガラススライド上のＥＢを４％パラホルムアルデヒドで固定化し、メタノールで透過化処理した。内在ペルオキシダーゼ活性は、メタノール中の３％Ｈ２Ｏ２でブロックされる。ブロッキング緩衝液キット（ＮＥＬ７００、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用してＴＮＢ非特異的結合部位をブロックし、続いて、ＴＮＢで１：８０００に希釈した一次ラットＣＤ３１抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて終夜インキュベートした。洗浄後、試料を、二次ビオチン標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）、次いでシグナルを増幅させるためにストレプトアビジン結合西洋わさびペルオキシダーゼ及びビオチン標識チラミド（ＮＥＬキットから）インキュベートした。酵素反応には、ＶｅｃｔｏｒのＡＢＣ試薬キットを使用した。同様のプロトコルを用いて３−Ｄコラーゲンゲル中のＥＢを染色したが、インキュベーション及び洗浄時間を長くし、洗浄をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含むＰＢＳで行った。
【０１１２】
内皮細胞プールの大きさを決定するために、胚様体も定性的に分析した。これは、コラゲナーゼ処理、次いで蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）又は抗ＣＤ３１でコーティングした磁気ビーズで捕捉することによる内皮細胞の単離によって行う。
【０１１３】
個々のＥＢをグラススライドに拾い、次いで上に記載のようにＨＲＧＰポリペプチドで処理することによって実験を繰り返す。ＥＢを３次元コラーゲンゲルに播種し、次いで上に記載のようにＨＲＧＰポリペプチドで処理して実験を繰り返す。
【０１１４】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は例示的なものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、添付の特許請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ＦＧＦ−２で誘発させた内皮細胞の遊走に対するＨＲＧＰの効果を示す図である。ミニボイデンチャンバー内で一次ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥ）がＨＲＧＰの存在下又は非存在下でＦＧＦ−２に向かって遊走する能力を分析した。平均値±３つの異なる実験のＳＥＭを示す。
【図２】ＨＲＧＰの投与に伴って阻害される腫瘍の成長を示すグラフである。図２Ａでは、雌のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＴ２４１細胞０．５×１０６個を皮下接種した。腫瘍が触知可能になったら（治療日０）、４ｍｇ／ｋｇ／日のＨＲＧＰ（ｎ＝８）又はＰＢＳ（ｎ＝１０）を皮下注射注入する１１日間の治療を受けるように動物を無作為に割り当てた。図２Ｂでは、触知可能なＴ２４１腫瘍を保有するマウスの平行群にＰＢＳ（Ｎ＝６）又はサーモリシン切断抗トロンビン（Ｎ＝６）を注入した。ＡＴ＝サーモリシン切断抗トロンビンである。
【図３】Ｎ末端シスタチン様部分、ヒスチジン／プロリンに富んだ中央ドメイン、及びＣ末端領域を含む、ＨＲＧＰの主なドメインを示す図である。また、ヒスチジンタグを有する完全長ＨＲＧＰ（Ｈｉｓ１）及び２つのＣ末端で切断されたポリペプチド（Ｈｉｓ３〜４）も示す。６×Ｈｉｓ＝ヒスチジンタグ、ＥＫ＝エンテロキナーゼ切断部位である。数字３９０及び３２０は、切断されたポリペプチドのＣ末端残基を示す。０１１５、０１１６、０１１９と標示したバーは、産生させたウサギ抗体に対するペプチドの位置を示す。
【図４】ＦＧＦ−２及び血清で誘発させた遊走に対するｒＨＲＧＰの効果を示す図である。Ａ．ＢＣＥ細胞に対してＦＧＦで誘発させた遊走は１００ｎｇ／ｍｌのｒＨＲＧＰで阻害された。血清（ＦＣＳ）で誘発させた遊走はＨＲＧＰで阻害されなかった。Ｂ．ＦＧＦで誘発させたＢＣＥ細胞の遊走に対するｒＨＲＧＰの用量応答曲線である。ＦＧＦ−２は５ｎｇ／ｍｌで使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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