(57)【要約】本発明は、ダイノルフィンＡおよびその類似体のアゴニストまたはアンタゴニストまたはインバースアゴニストとして作用する化合物をスクリーニングするのに用いることができる分析法に係るものである。当該分析法は、ダイノルフィンＡおよびその類似体の、ラットおよびヒトＭＡＳ受容体への結合に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ダイノルフィンＡおよびその類似体、ならびに試験化合物と共に、ＭＡＳ受容体遺伝子を発現する細胞をインキュベートすること；および、
ｂ）上記ダイノルフィンＡおよびその類似体の結合が上記試験化合物でどの程度置き換えらたかを測定すること、
を含む、ラットおよびヒトＭＡＳ受容体に結合する能力に関して試験化合物を分析する方法。
【請求項２】
ラット／ヒトＭＡＳ受容体を発現する細胞は、異種ＭＡＳ受容体遺伝子で形質転換された組換え細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析は放射性リガンド分析であり、ダイノルフィンＡおよびその類似体または試験化合物は放射活性により標識された請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分析が酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）であり、ダイノルフィンＡおよびその類似体または試験化合物のいずれかが酵素に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試験化合物が、細胞のホスホリパーゼＣまたは細胞内カルシウム濃度を顕著に増加または減少させるかどうかを測定することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
試験化合物がダイノルフィンＡおよびその類似体のアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストかどうかを決定する方法であって、
ａ）上記試験化合物と共に、ＭＡＳ受容体を発現する細胞をインキュベートすること；
ｂ）工程ａ）のインキュベーション中における上記細胞の、細胞内のホスホリパーゼＣまたはアデニリルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度を測定すること；
ｃ）工程ｂ）で得られた結果と、上記試験化合物の非存在下でインキュベーションを行った場合に得られた結果とを比較すること；および、
ｄ）ホスホリパーゼＣもしくはアデニルシクラーゼ活性または細胞内のカルシウムのレベルが、上記試験化合物の存在下において、それが存在しない場合よりも顕著に高いならば、上記試験化合物がダイノルフィンＡおよびその類似体のアゴニストであると結論付けること、または、ホスホリパーゼＣまたはアデニルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度のレベルが、上記試験化合物の存在下において、それが存在しない場合よりも顕著に低いならば、上記試験化合物がダイノルフィンＡおよびその類似体のアンタゴニストであると結論付けること、
を含む、上記方法。
【請求項７】
細胞は、異種ＭＡＳ受容体遺伝子（ラットおよびヒト）で形質転換された組換え細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭＡＳ受容体を発現する細胞と試験化合物とが、ダイノルフィンＡおよびその類似体をさらに含む培地中でインキュベートされる、請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、試験化合物が、ヒトＭＡＳ受容体でダイノルフィンＡおよび類似体の結合および活性をモジュレートするのに使用可能かどうかを決定するのに用いることができる分析方法に関する。有効なモジュレーターと同定された化合物は、痛み、神経性の障害および炎症性の障害、学習障害および記憶障害、不安障害、同様に、心臓血管機能の調節を治療する治療剤として使用可能である。
【０００２】
【発明の背景】
Ａ．ダイノルフィンＡ
ダイノルフィンは、内在的に効力のあるオピオイドペプチドとして１９７９年に発見された（ＰＮＡＳ， ＵＳＡ ７６：６６６６−６６７０：１９７９）。ダイノルフィンの薬理学的な作用はきわめて広範である。ダイノルフィンＡおよび関連ペプチドは、ＩＣＶに投与される場合に、非熱的かつ力学的な無痛においてそこそこ有効であることがわかっており（Ｄｕｂｎｅｒ， Ｒ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５：９６−１０３， １９９２）、ガン患者における難治性の痛みを治療する診療所で用いられてきた（Ｗｅｎ， Ｈ．Ｌ．， Ｃｅｎｔｒａｌ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｅｎｄｏｒｐｈｉｎｓ： ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ； １９９３：３１９−３２３）。ダイノルフィンはまた、中枢神経系および末梢神経系を介して心臓血管系に作用することがわかっている（Ｄｕｍｏｎｔ， Ｍ． ３７：１−３３， １９９６）。その上、ダイノルフィンＡは免疫調製活性を有する。マウスに投与した場合、ダイノルフィンＡはマウスの腹腔マクロファージの食細胞活動を増強した。この食細胞作用は、非オピオイド受容体の関与を示唆するナロキソン処理によって阻害されなかった（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． ６０：３７−４３，１９９５）。
【０００３】
ダイノルフィンＡは、κオピオイド受容体に選択性を有する効力のあるオピオイドペプチドとして初めに記載されたにもかかわらず、その病理学的および生理学的な作用のいくつかは、非オピオイド受容体により媒介される、ということが提案されている。従って、本明細書において、ダイノルフィンＡがＭＡＳ受容体を活性化し結合することができるということを、本発明者等が初めて説明した。
【０００４】
ヒトＭＡＳ腫瘍遺伝子受容体が、ヌードマウスの腫瘍形成性分析（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ）によって１９８６年に初めて単離された（Ｙｏｕｎｇ， Ｍ．， Ｃｅｌｌ， ４５：７１１−７１９， １９８６）。この受容体は、７回膜貫通ドメインタンパク質に関してコードしており、例えばＮＰＹモチーフが第７膜貫通ドメイン中にあるように、そのコーディング配列内にホールマーク特徴が存在する。ＭＡＳ受容体は、海馬、皮質、小脳、梨状皮質および嗅球で観察されたｍＲＮＡの最も高いシグナル状態で、腹神経系（ＣＮＳ）において発現される。この受容体に関するｍＲＮＡはまた、精巣、腎臓および心臓などの末梢組織で検出されている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３５７， ２７−３２， １９９５）。ＭＡＳ受容体の発現は、発生およびニューロン活性の際に高度に調節される。興味深いことには、ＭＡＳ癌原遺伝子を欠くマウスは、不安の増強を示しただけでなく、海馬の全般的な形態学に影響を与えることなく長期増強も延長させた（ＪＢＣ， ２７３， １１８６７−１１８７３， １９９８）。
【０００５】
従って、アゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストとしてＭＡＳ受容体を標的にした薬剤は、長期に渡る記憶の神経障害的な病気や炎症性の病気と同様に、心臓血管の機能障害の問題を治療するのに用いられる可能性を秘めている。
【０００６】
Ｂ．Ｇタンパク質共役受容体
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞外のＮ末端、膜貫通ドメインを構成すると推測される７個の疎水性αヘリックス、および、細胞内のＣ末端ドメインを特徴とする共通の構造的機構を共有するタンパク質ファミリーを構成する。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質を変化させる活性化を介して細胞内シグナルを引き起こす多種多様なリガンドと結合する（Ｃａｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃ． Ｐｒｏｇ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． ４８：２７７−２９０（１９９３）；Ｆｒｅｅｄｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃ． Ｐｒｏｇ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． ５１：３１９−３５３（１９９６））。
【０００７】
これまで３００種以上のＧＰＣＲがクローン化されており、一般的に、１，０００種をはるかに上回るこのような受容体が存在すると考えられている。全ての臨床的に適切な薬剤のだいたい５０〜６０％が、様々なＧＰＣＲの機能を調整することによって作用する（Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ７３：５１−６３（１９９５））。多くの臨床的に適切な受容体は中枢神経系に位置する。
【０００８】
同定およびクローン化されたＧＰＣＲのなかでも、ＤＲＲ／ＲＴＡファミリーの受容体と相同なタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。本発明者等は、この受容体をＭＡＳ受容体と呼び、ヒトに存在する場合の遺伝子構造を説明した。しかしながら、この受容体ファミリーに対する内因性のリガンドは、これまで同定されていない（Ｃｅｌｌ： ４５， ７１１−７１９ １９８６， ＪＢＣ ２７３，１１８６７−１１８７３ １９９８， ＷＯ９９／３２５１９）。
【０００９】
【発明の要約】
本発明は、ダイノルフィンＡおよびその類似体（ダイノルフィンＡ−アミドおよびダイノルフィン１〜１３）が、ラットおよびヒトＭＡＳ受容体を活性化するという発見に基づく。ラットまたはヒトＭＡＳ受容体のいずれかを発現する組換え細胞は、アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために設計されたスクリーニング分析において、ダイノルフィンＡおよびその類似体と組み合わせて用いることができる。従って、その第一の観点において、本発明は、ＭＡＳ受容体に結合する能力に関して試験化合物を分析する方法に係るものである。これは、受容体遺伝子を発現する細胞または膜を、ダイノルフィンＡおよびその類似体と、試験化合物と共にインキュベートすることによって達せられる。次に、ダイノルフィンＡおよびその類似体の結合がどの程度置き換えられたかを測定する。放射性リガンドまたは酵素結合免疫吸着分析を行ってもよく、この場合、ダイノルフィンＡおよびその類似体、または試験化合物のいずれかが検出可能なように標識される。ＭＡＳ受容体を発現する細胞ならいずれも使用可能であるが、ラットまたはヒトのいずれかから得られた異種ＭＡＳ受容体遺伝子を発現する組換え細胞が好ましい。本明細書で用いられる「異種」という用語は、細胞にトランスフェクトした全てのＭＡＳ受容体遺伝子を意味し、すなわち、当該用語は、全ての非内因性のＭＡＳ受容体を意味する。
【００１０】
また、本発明は、試験化合物が、ダイノルフィンＡおよびその類似体に結合するアゴニスト、アンタゴニスト、または、インバースアゴニストかどうかを、機能分析に基づき決定する方法を含む。このような分析を実行する一つの方法は、ＭＡＳ受容体を発現する細胞を、試験化合物と共にインキュベートし、次に、細胞内のホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度がモジュレートされているかどうかを測定することである。結果は、通常、試験化合物の非存在下という以外は同様の方法でインキュベーションした場合に得られた結果と比較するべきである。一般的に、このタイプの機能分析は、上述したような結合分析と組み合わせて実行される。当該分析に好ましく用いられる細胞は、ＭＡＳ受容体遺伝子で形質転換された組換え細胞である。アゴニストとして作用する試験化合物は、ホスホリパーゼＣの増加、アデニリルシクラーゼ活性の減少もしくは増加、または、細胞内のカルシウムレベルの増加を生じさせるべきである。特に、定量のダイノルフィンＡおよびその類似体の存在下で分析が行われる場合、インバースアゴニストは、ホスホリパーゼＣ活性または細胞内のカルシウムレベルを減少させ得る。アンタゴニストは、ダイノルフィンＡおよびその類似体の受容体への結合をブロックするべきであるが、インバースアゴニストのホールマークであるホスホリパーゼＣ活性または細胞内のカルシウムの点に関して反対の応答は生じさせない。
【００１１】
【発明の詳述】
本発明は、ダイノルフィンＡおよびその類似体と、ラットおよびヒトＭＡＳ受容体との結合をモジュレートする能力に関して化合物をスクリーニングするのに用いることができる分析に係るものである。ダイノルフィンＡおよびその類似体またはフラグメントの全ての形態を用いることができる（ダイノルフィンＡ：ＹＧＧＦＬＲＲＩＲＰＫＬＫＷＤＮＱ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２）。これらペプチドは、市販品を得てもよいし（例えばＢａｃｈｅｍ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ）、または、当業界周知の標準的な方法論を用いて合成してもよい。当該ペプチドは、検出可能なように１２５Ｉのような放射性同位体で標識してもよく、またあるいは、蛍光性もしくは化学発光法による標識を取り込ませてもよい。また、当該ペプチドは、容易に検出できる酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）に結合させることもできる。
【００１２】
ＭＡＳ受容体は、Ｙｏｕｎｇ， Ｍ．， Ｃｅｌｌ， ４５：７１１−７１９， １９８６で説明された方法を用いて、ラットおよび／またはヒト細胞／組織からクローニングすることができる。実施例の章において、ＭＡＳ受容体のクローニングで用いることができる方法の詳細な説明が提供される。クローニングが完了したら、ＭＡＳ受容体の配列は、哺乳動物細胞において活性なプロモーターを持つ発現ベクターへ組み込まれるべきである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））。用いることができるプロモーターの例としては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． １：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスの前初期およびＴＫプロモーター（Ｙａｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：６２４９−６２５８（１９９５）；ＭｃＫｎｉｇｈｔ， Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０（１９８１））；および、ＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））が挙げられる。また、ベクターは、エンハンサーおよび他の調節要素も含む。
【００１３】
発現ベクターが構築されたら、例えばリン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム導入、ウイルス導入または粒子媒介遺伝子導入のような方法により、当該ベクターを哺乳動物細胞系に導入することができる。他の哺乳動物細胞を用いることができるが、ＨＥＫ−２９３細胞により成功した結果が得られることがわかっており、これらの細胞でＭＡＳ受容体を発現させる方法が、実施例の章で説明される。細胞を選択し、ＭＡＳ受容体の発現に関してそれらを分析する（例えばノーザン分析により）標準的な方法が行われ得る。
【００１４】
ダイノルフィンＡ（または類似体）ペプチド、および、ラットおよびヒトＭＡＳ受容体を発現する細胞が得られたら、試験化合物が結合に作用を有するかどうかを決定するために分析を行うことができる。当業界周知の標準的な方法を用いて、多種多様な異なるタイプの分析が可能である。例えば、放射性リガンド結合分析において、ダイノルフィンＡおよびその類似体と、結合活性に関して試験される化合物と共に、ＭＡＳ受容体を発現する細胞をインキュベートする。ＭＡＳ受容体の好ましい源は、組換えにより形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞である。ダイノルフィンＡおよびその類似体と強く結合する他のタンパク質を発現しないのであれば、他の細胞を用いてもよい。これは、ＭＡＳ受容体で形質転換された細胞における結合分析を行い、それにより得られた結果と、形質転換されていないそれらの対照を用いて得られた結果とを比較することによって、容易に決定することができる。
【００１５】
分析は、インタクト細胞、または当該細胞から調製された膜のいずれかを用いて行うことができる（例えば、Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ：９０：１０２３０−１０２３４（１９９３）を参照）。上記で示したしたように、ダイノルフィンＡおよびその類似体と、試験される化合物の調製物と共に、膜または細胞をインキュベートする。結合が完了した後、受容体を、例えばろ過により、リガンドと試験化合物とを含む溶液から分離し、生じた結合の量を測定する。好ましくは、用いられるリガンドは、放射性同位体（例えば１２５Ｉ）で検出可能なように標識される。しかしながら、必要に応じて、他のタイプの標識も使用可能である。最も一般的に用いられる蛍光性の標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンｏ−フタルアルデヒド、および、フルオレサミンが挙げられる。有用な化学発光法に用いられる化合物としては、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステルのセロマチック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが挙げられる。
【００１６】
非特異的結合は、超過量の標識していないリガンドの存在下での結合反応を行うことによって測定することができる。例えば、１０００倍過量の標識していないダイノルフィンＡおよび／またはその類似体の存在下で、標識したダイノルフィンＡおよびその類似体を、受容体と試験化合物と共にインキュベートすることができる。各試験サンプルに対する特異的結合に到達するためには、非特異的結合は、トータルの結合、すなわち、標識していないリガンドの非存在下での結合から、差し引かれるべきである。必要に応じて、他の工程、例えば洗浄、撹拌、振盪、ろ過などが、分析に含まれてよい。通常、洗浄工程は、溶液中に残留したリガンドから、膜結合リガンドを分離した後、および、例えば放射性同位体を計数することによるリガンド結合量の定量の前に、含まれる。試験化合物の存在下で得られた特異的結合と、標識したリガンド単独の存在下で得られた特異的結合とを比較し、どの程度、試験化合物が受容体結合を置き換えたかを測定する。
【００１７】
結合分析を行う際に、実際に結合が何らかの他のメカニズムで阻害されている場合に、試験化合物が受容体と相互作用しているように思わせることのある人工物（ａｒｔｉｆａｃｔ）が回避されるように注意しなければならない。例えば、試験される化合物は、それ自体が実質的にダイノルフィンＡおよびその類似体の結合を阻害しない緩衝液中にあるべきであり、好ましくは、数種の異なる濃度で試験されるべきである。また、試験化合物の調製物は、タンパク質分解の活性に関して試験されるべきであり、抗タンパク質分解酵素が分析物に含まれることが望ましい。最終的に、ダイノルフィンＡおよびその類似体の結合を置換すると同定された化合物が、結果のスキャッチャード分析を行うのに十分な濃度範囲で再試験されることが、より望ましい。このタイプの分析は当業界周知であり、試験化合物の受容体に対する親和性を測定するのに用いることができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １１．２．１−１１．２．１９ （１９９３）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｏｒｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄ． Ｎ．Ｙ． （１９７８）を参照）。結果の分析において補助するためにコンピュータープログラムを用いることができる（例えば、Ｍｕｎｓｏｎ， Ｐ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９２：５４３−５７７（１９８３））。
【００１８】
ダイノルフィンＡおよびその類似体の受容体への結合を阻害する因子は、受容体の活性へのそれらの影響に応じて、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかで有り得る。多数の様々な方法を用いて、受容体の活性化をモニターすることができる。例えば、マイクロタイタープレートのウェル中で細胞を培養し、次に、試験化合物の存在下または非存在下でそのウェルをインキュベートすることでホスホリパーゼＣ分析を行うことができ、次に、全てのイノシトールリン酸（ＩＰ）を樹脂製カラムで抽出し、分析緩衝液中に再懸濁することができる。次に、ＩＰ濃度を測定する方法のいずれかを用いて、このようにして回収されたＩＰの分析を行うことができる。通常、ホスホリパーゼＣ分析は、結合分析とは別に行われるが、ホスホリパーゼＣ分析を、１回の細胞の調製に併せて行うこともできる。
【００１９】
また、受容体の活性化は、細胞内カルシウム濃度の測定に基づき決定することができ、例えば、形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞を、集合体を形成するまでガラス製カバースライド上で培養することもできる。リンスした後、例えばＦｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４およびＦＵＲＡ−２ＡＭ（モレキュラープローブ社製のＦ−１２２１）のような因子の存在下で、それらをインキュベートすることができる。リンスおよびさらなるインキュベーションの後、カルシウムの置換を光度計を用いて測定することができる。細胞内カルシウム濃度を測定する他のタイプの分析が当業界周知であり、それらを用いることもできる。
【００２０】
インバースアゴニストの活性を測定するために、上記受容体の内在性の活性を測定する分析（例えばイノシトールリン酸測定に基づく分析）を用いることができる。アゴニスト活性をブロックするが、それ自身活性は生じさせないアンタゴニストとは異なり、インバースアゴニストは、アゴニストにより生じる応答とは全く反対の生物学的な応答を生じさせる。例えば、アゴニストが細胞内のカルシウムの増加を促進させた場合、インバースアゴニストは、細胞内のカルシウムレベルを減少させる。
【００２１】
上述した放射性リガンドおよび細胞の活性化分析は、特定の試験化合物がダイノルフィンＡおよびその類似体のヒト／ラットＭＡＳ受容体への結合を改変し、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかどうかを決定するのに用いることができる分析タイプの例を提供する。本発明に適合するこれらの分析に関して多くの改変法がある。このような分析は、受容体へ結合したダイノルフィンＡおよびその類似体を検出する手段として標識抗体を用いることも含み、または、本明細書の実施例の章で述べられた蛍光性のイメージングプレートリーダー分析（ＦＬＩＰＲ）の形態を採用してもよい。
【００２２】
【実施例】
Ｉ．方法
クローンラットおよびヒトＭＡＳ受容体の調製：
Ｃｅｌｌ １９８６ Ｊｕｎ ６； ４５（５）： ７１１−９における記載を参照すること。
【００２３】
発現
ＨＥＫ−２９３細胞を、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（キアゲン社製）を用いて、ラットおよびヒトＭＡＳ受容体をコードした哺乳動物の発現構築物（ｐｃＤＮＡ３．１ベクター、インビトロジェン社製）でトランスフェクトした。ＭＡＳ受容体の安定な受容体プールを選択マーカー（Ｇ４１８、０．９ｍｇ／ｍｌ）を適用することによって展開し、その細胞をこの選択培地中で維持した。ノーザンブロット分析と逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）とによって、クローンＭＡＳ受容体に特異的なｍＲＮＡの存在を評価した。
【００２４】
リガンド
クローンラットおよびヒトＭＡＳ受容体のリガンドを同定するために、ペプチドおよび非ペプチドリガンドのコレクションを市販の源から得た（Ｓｉｇｍａ， ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｂａｃｈｅｍ， ＲＢＩ， Ｐｈｏｅｎｉｘ）。その化合物を３μｍで水／ＤＭＳＯに溶解し、９６ウェルのマイクロプレート中に入れた。総数１０００種の化合物（ペプチドおよび非ペプチド）を調製し、試験した。
【００２５】
分析
１）ＦＬＩＰＲ分析
ＦＬＩＰＲ（蛍光性のイメージングプレートリーダー、モレキュラーデバイス社製）において、９６ウェルのプラットフォーム上で蛍光性カルシウム指示薬のＦｌｕｏ−３（モレキュラープローブ社製）を用いることにより、機能分析を行った。ＨＥＫ−２９３細胞は、受容体を発現するか、または野生型細胞かのいずれかであり、これらに、以下のようにＦｌｕｏ−３をロードした。ラットおよびヒトＭＡＳ受容体を発現する安定なＨＥＫ−２９３クローンまたは親細胞を、９６ウェルプレート中、１ウェルあたり１０，０００個の細胞の濃度に培養した。実験の日に、ＭＡＳ受容体の細胞を、蛍光性溶液（１０％ウシ胎仔血清と、４μＭのＦｌｕｏ−３と、２０％プルロニック酸とを含むダルベッコ改変培地）でロードした。その細胞を、加湿したチャンバー内で３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション工程の後、細胞を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓと０．１％ＢＳＡとを含むハンクス液（ｐＨ７．４）で５回洗浄した。その細胞をＦＬＩＰＲシステムを用いて分析し、異なる化合物に対する応答に関する細胞内のカルシウムの流動（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を測定した。
【００２６】
２）結合分析
ＨＥＫ−２９３細胞の膜は、受容体を発現するか、または野生型細胞かのいずれかであり、これらを上述したように調製し、−８０℃で凍結した。実験の日に、Ｂ  Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて、５０ｍＭのＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＰＭＳＰ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む緩衝液中で、膜をホモジナイズし、異なる１２５Ｉ−ダイノルフィンＡ−ＮＨ２濃度で、１μＭの標識されていないダイノルフィンＡ−ＮＨ２と共に（非特異的結合）、または、それを含まないで（特異的結合）、室温で１時間インキュベートした。
【００２７】
結合した１２５Ｉ−ダイノルフィンＡ−ＮＨ２を、ＰＥＩで予め浸したワットマン社製のＧＦ／Ｂフィルターによりろ過することによって回収した。そのフィルターを２．５ｍｌの冷Ｔｒｉｓ／ＭｇＣｌ２緩衝液で３回リンスし、次に、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（パッカード社製）を用いて計数した。タンパク質をバイオラッド社製の染色試薬を用いて測定した。
【００２８】
ＩＩ．結果
１）ＦＬＩＰＲの結果
ＨＥＫ−２９３細胞は、いくつかのＧＰＣＲ、例えばブラジキニン、およびＰＡＣＡＰ受容体を内在的に発現しており、これらは、分析用の内部コントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いることができる。全ての化合物を用いて、親ＨＥＫ−２９３細胞（トランスフェクトされていない）におけるバックグラウンドシグナルを、ＦＬＩＰＲ分析により作製した。クローンＭＡＳ受容体を発現するＨＥＫ−２９３細胞を、全ての化合物で刺激し、カルシウム応答を、親ＨＥＫ−２９３細胞における応答と比較した。３種の化合物（ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＡ−ＮＨ２およびダイノルフィンＡ１〜１３）は、形質転換された細胞においては、一貫してシグナルを惹起したが、野生型細胞では惹起しなかった。これは、ダイノルフィンＡおよびその類似体が、組換えにより発現した受容体と相互作用することを示す。この結論の確証が、ダイノルフィンＡおよびその類似体を用いた用量反応関係の観察により、ＭＡＳ受容体でトランスフェクトした細胞において得られたが、トランスフェクトされていない細胞、もしくは、他のオーファン受容体でトランスフェクトした細胞においては得られなかった。従って、クローンラットおよびヒトＭＡＳ受容体は、ダイノルフィンＡおよびその類似体に特異的な受容体であることが立証された。ラットおよびヒトＭＡＳ受容体は、ダイノルフィンＡおよびその類似体の作用を模擬する化合物（アゴニスト）、または、ダイノルフィンＡおよびその類似体の作用を拮抗する化合物（アンタゴニスト）のいずれかをスクリーニングするのに用いることができる。スクリーニング分析は、上述のＦＬＩＰＲ分析を用いて行うことができる。
【００２９】
２）結合結果
クローンされたＭＡＳ受容体を発現するＨＥＫ−２９３Ｓの膜は、１２５Ｉ−ダイノルフィンＡ−ＮＨ２に対する特異的結合を示し、トランスフェクトされていないＨＥＫ−２９３Ｓ膜では特異的結合は観察されなかった。
【００３０】
スクリーニング分析は、上述の結合分析を用いて行うことができる。使用可能な他の分析としては、ＧＴＰアーゼ分析、アデニリルシクラーゼ分析、イノシトールリン酸を測定する分析、および、レポーター遺伝子分析（例えば、ルシフェラーゼ、アクエオリン（ａｑｕｅｏｒｉｎ）、アルカリホスファターゼ等を利用した分析）が挙げられる。
【００３１】
ここで引用した全ての参考文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。以上、本発明を完全に説明したが、本発明またはそのいずれかの実施態様の本質や範囲に影響を与えることなく、広くかつ同等な範囲の条件、パラメーター等の範囲内で本発明が行われ得ることは、当業者には理解されるであろう。
【国際公開パンフレット】
2004516036.tif 000002
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【国際調査報告】
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