(57)【要約】本発明は、多価のリガンドを提供し、そのリガンドは直接的または間接的に細胞または他の生物的な粒子に結合するための、もしくはさらに一般的に任意の生物的な分子に結合することによって、少なくとも１つの認識エレメント（ＲＥ）、および好ましくは複数の認識エレメントを保有または提示する。提供される多価のリガンドは、細胞凝集、および概して生物的な巨大分子の巨大分子組立てに関して、最も一般的に、任意の生物的な粒子または生物的な分子に結合または標的にするために機能し得、そして特に、細胞または細胞の型またはウイルスを標的にするために機能し得る。本発明の多価のリガンドは、概して化学物質種または生物学的種（抗原、エピトープ、リガンド結合基、細胞レセプターのためのリガンド、種々の巨大分子が挙げられるが、これらに限定されない）の足場（集合）を作製するために適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のレセプターを含む生物系において生物学的応答を誘導するための方法であって、該方法は、該レセプターの少なくとも１つによって認識され、そして分子足場に結合した複数のシグナル認識エレメントを含む多価リガンドを、該生物系に導入する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記生物系が、前記シグナル認識エレメントのうちの少なくとも１つが結合する１つ以上の細胞レセプターを有する細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シグナル認識エレメントの前記レセプターへの結合が、細胞内応答および／または細胞間応答を誘導する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が原核細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多価リガンドが、２成分系によって媒介されるシグナル伝達を調節する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的応答が走化性である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シグナル認識エレメントが糖類であり、そして前記多価リガンドが、分子足場に共有結合した化学誘引物質として機能する複数の該糖類を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記糖類がグルコースまたはガラクトースである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多価リガンドが、前記原核細胞の走化性を増大する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記多価リガンドが、前記原核細胞の走化性を阻害する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的応答が、バイオフィルムの形成である、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記多価リガンドが、バイオフィルム形成を阻害する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多価リガンドが、バイオフィルム形成を増大する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物学的応答が、栄養分の取り込みである、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記多価リガンドが、栄養分の取り込みを防止または阻害する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記多価リガンドが、栄養分の取り込みを増大する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記多価リガンドが、Ｇタンパク質結合レセプターによって媒介されるシグナル伝達を調節する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
シグナル伝達がレセプターによって媒介される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記真核生物細胞が、上皮細胞または内皮細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記真核生物細胞が、免疫系の細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記真核生物細胞が、リンパ球または白血球である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記真核生物細胞が好中球である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記応答が走化性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記シグナル認識エレメントの１つ以上がホルミル化ペプチドであり、そして前記多価リガンドが、分子足場に共有結合した複数のホルミル化ペプチドを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記多価リガンドが、好中球の走化性を阻害する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記多価リガンドが、好中球の走化性を増大する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的応答が、前記細胞による細胞内シグナルの放出である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記多価リガンドが、前記細胞内シグナルの放出を開始または増大する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、Ｂ細胞またはＴ細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記多価リガンドが、前記Ｂ細胞またはＴ細胞が生じる前記生物体に対して外来のエピトープであるシグナル認識エレメントを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記多価リガンドが、Ｂ細胞またはＴ細胞の細胞表面レセプターに結合するシグナル認識エレメントをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記多価リガンドが、前記外来エピトープの免疫原性を増大するように機能する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記多価リガンドが、前記Ｂ細胞またはＴ細胞によって自己のエピトープであると認識されるエピトープであるシグナル認識エレメントを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記多価リガンドが、Ｂ細胞またはＴ細胞の細胞表面レセプターに結合するシグナル認識エレメントをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記多価リガンドが、前記細胞を前記自己エピトープに対して感作するように機能する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記エピトープが、癌細胞に特徴的なエピトープである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記多価リガンドが、前記Ｂ細胞またはＴ細胞によって外来エピトープであると認識される自己エピトープである少なくとも１つのシグナル認識エレメントを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記多価リガンドが、Ｂ細胞またはＴ細胞の細胞表面レセプターに結合するシグナル認識エレメントをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記多価リガンドが、前記細胞を、前記Ｂ細胞またはＴ細胞によって外来エピトープであると認識される前記自己エピトープに対して寛容化するように機能する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記多価リガンドが、前記生物学的応答を調節するために、細胞表面上の前記レセプターを認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞表面上の異なるレセプターの前記相対位置が、前記応答を調節するために変化される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
細胞表面レセプター間の相互作用が、前記応答を調節するために変化される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物学的応答が、前記生物学的系に対して外来である抗原またはエピトープに対する免疫応答である、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記多価リガンドが、前記外来抗原またはエピトープに対する免疫応答を改変し、そして該多価リガンドが、該免疫応答を調節する免疫細胞、細胞または免疫系によって外来であると認識されるエピトープまたは抗原であるシグナル認識エレメントを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物学的応答が、前記生物系において自己であると認識される抗原またはエピトープに対する免疫応答である、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記多価リガンドが、自己であると認識される抗原またはエピトープに対する免疫応答を改変し、そして該多価リガンドが、前記免疫細胞、細胞または免疫系によって自己であると認識されるエピトープまたは抗原であるシグナル認識エレメントを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記生物系が動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物系が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記生物系がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
細菌感染を処置するための方法であって、該方法は、治療有効量の多価リガンドを、細菌感染を有する個体に投与する工程を包含し、ここで、該多価リガンドが、分子足場に共有結合した化学誘引物質シグナルである複数のシグナル認識エレメントを含む、方法。
【請求項５２】
細菌感染を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、該細菌における走化性応答を阻害するのに有効な量の多価リガンドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含み、ここで該多価リガンドは、分子足場に共有結合した化学誘引物質シグナルである複数のシグナル認識エレメントを含む、薬学的組成物。
【請求項５３】
真核生物細胞の走化性応答を調節するための方法であって、該方法は、該真核生物細胞を、該真核生物細胞の化学誘引物質である複数のシグナル認識エレメントを含む多価リガンドに接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５４】
真核生物の病原または寄生生物の感染を処置するための方法であって、該方法は、治療有効量の多価リガンドを、感染を有する個体に投与する工程であって、ここで、該多価リガンドは、分子足場に共有結合した該病原または寄生生物の化学誘引物質である複数のシグナル認識エレメントを含む、工程、を包含する、方法。
【請求項５５】
真核生物の病原または寄生生物の感染を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、該病原または寄生生物における走化性応答を阻害するために有効な量の多価リガンドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含み、該多価リガンドは、分子足場に共有結合した化学誘引物質である複数のシグナル認識エレメントを含む、薬学的組成物。
【請求項５６】
前記応答が、細胞遊走、細胞接着、または細胞−細胞接合部の形成である、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
前記多価リガンドが、細胞遊走、細胞接着、または細胞−細胞接合部の形成を阻害する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が、動物における癌細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記多価リガンドが、１つ以上の認識エレメント、１つ以上の機能的エレメント、またはその両方をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
前記認識エレメントの１つ以上が、タンパク質に結合している請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記機能的エレメントの１つ以上が、標識またはレポーター基である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記シグナル認識エレメントの１つ以上が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、誘導体化されたペプチド、単糖類、二糖類、多糖類、核酸、細胞栄養分、エピトープ、抗原性決定基、ハプテン、または細胞表面レセプターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６３】
前記シグナル認識エレメントの１つ以上が、糖類または誘導体化糖類である、請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
前記シグナル認識エレメントの１つ以上が、ペプチドまたは誘導体化ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６５】
前記シグナル認識エレメントの１つ以上がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
前記シグナル認識エレメントの１つ以上がＮ−ホルミルペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６７】
前記シグナル認識エレメントの１つ以上がエピトープである、請求項１に記載の方法。
【請求項６８】
前記多価リガンドが、規定数のシグナル認識エレメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６９】
前記多価リガンドが、２〜約１０のシグナル認識エレメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７０】
前記多価リガンドが、約１０〜２５のシグナル認識エレメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７１】
前記多価リガンドが、約２５以上のシグナル認識エレメントを含む。請求項１に記載の方法。
【請求項７２】
前記多価リガンドが、約５０以上のシグナル認識エレメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７３】
前記多価リガンドが、約１００以上のシグナル認識エレメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７４】
前記シグナル認識エレメントが、前記分子足場に共有結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項７５】
前記シグナル認識エレメントが、前記分子足場に非共有結合的に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項７６】
前記多価リガンドが、前記足場に共有結合している複数の認識エレメントをさらに含み、ここで、前記シグナル認識エレメントが、次に１つ以上の認識エレメントに非共有結合的に結合している、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記認識エレメントが糖類であり、そして前記シグナル認識エレメントが、該糖類に非共有結合的に結合しているペプチドである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記シグナル認識エレメントがレクチンである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記レクチンがコンカナバリンＡである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記分子足場が、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリメタクリレート、ポリオール、およびポリアミノ酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８１】
前記分子足場がＲＯＭＰ足場である、請求項１に記載の方法。
【請求項８２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記多価リガンドが、以下の構造：
【化１】
2004512258.tif 000026
を有し、ここで：
ｎは、該リガンドにおける括弧内の反復単位の数を表す２以上の整数であり；
破線は、任意の二重結合を表し；
「ＢＢ」は、骨格の反復単位を表し、これは環式であっても非環式であってもよく、そしてランダム配置またはブロック配置で同じであっても異なってもよく、該波線は、ＢＢ単位が、該リガンド骨格においてシス配置またはトランス配置のいずれかであり得ることを示し；
各Ｒ１およびＲ２は、該リガンドにおける他のＲ１およびＲ２とは独立して、Ｈまたは有機基、認識エレメント　−Ｌ２−ＲＥ、機能的エレメント　−Ｌ３−ＦＥまたはシグナル認識エレメント　−Ｌ１−ＳＲＥであり得るか、あるいはＲ１およびＲ２の両方は、−Ｌ１−ＳＲＥ基であり得；
ここで、Ｌ１−３は、独立して、任意のリンカー基を表し、これは異なる反復単位において同じであっても異なっていてもよく；
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、または有機基であり；
Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、有機基または末端基であり；そして
Ｚは、該リガンドにおける他のＺとは独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ８、ＳＨ、ハライド（Ｆ，Ｂｒ，Ｃｌ，Ｉ）、ＮＨ２、またはＮ（Ｒ８）２であり、ここでＲ８は、Ｈまたは有機基であるか、あるいはＺは、任意の二重結合が存在する場合には存在しない、
方法。
【請求項８３】
ＳＲＥが、ペプチドまたは誘導体化ペプチドである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ＳＲＥが、Ｎ−ホルミルペプチドである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ＳＲＥが化学誘引物質である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
ＳＲＥがエピトープである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
ＳＲＥの少なくとも１つがエピトープであり、そして他のＳＲＥの少なくとも１つが、免疫細胞の細胞表面レセプターに結合している、請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
前記少なくとも１つの他のＳＲＥが、Ｂ細胞またはＴ細胞の細胞表面レセプターに結合している、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
少なくとも１つのＲ１またはＲ２が、−Ｌ３−ＦＥ基であり、該基が検出可能な標識またはレポーター基である、請求項８２に記載の方法。
【請求項９０】
少なくとも１つのＲ１またはＲ２が、−Ｌ２−ＲＥ基である、請求項８２に記載の方法。
【請求項９１】
請求項８２に記載の方法であって、ここで、前記多価リガンドが、以下の構造：
【化２】
2004512258.tif 000027
を有し、ここで：
ｍ＋ｎは、２以上であり；
破線は、任意の二重結合の存在を表し；
「ＢＢ」は、骨格の反復単位を表し、これは環式であっても非環式であってもよく、そしてランダム配置またはブロック配置で同じであっても異なってもよく、該波線は、ＢＢ単位が、該反復単位の骨格においてシス配置またはトランス配置であり得ることを示し；
各Ｒ１は、該リガンドにおける他のＲ１とは独立して、Ｈまたは有機基であり得；
Ｌ１およびＬ２は、同じであっても異なってもよく、任意のリンカー基を表し；
ＳＲＥ１およびＳＲＥ２は、２つの異なるシグナル基を表し；
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、有機基または末端基であり；
Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、有機基または末端基であり；そして
Ｚは、該ポリマーにおける他のＺとは独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ８、ＳＨ、ハライド（Ｆ，Ｂｒ，Ｃｌ，Ｉ）、ＮＨ２、またはＮ（Ｒ８）２であり、ここでＲ８は、Ｈまたは有機基であるか、あるいはＺは、二重結合が存在する場合には存在しない、
方法。
【請求項９２】
ＳＲＥ１およびＳＲＥ２の１つまたは両方が、ペプチドまたは誘導体化ペプチドである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の１つまたは両方が、糖類または誘導体化糖類である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の１つまたは両方がエピトープである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の１つがエピトープであり、ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の他方が、免疫細胞の細胞表面レセプターに結合している、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
以下の構造：
【化３】
2004512258.tif 000028
を有し、ここで：
ｎは、該リガンドにおける括弧内の反復単位の数を表す２以上の整数であり；
破線は、任意の二重結合を表し；
各Ｙは、該リガンドにおける他のＹとは独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ８、または−ＣＨ２−基であり、ここでＲ８はＨまたは有機基であり；
各Ｒ１およびＲ２は、該リガンドにおける他のＲ１およびＲ２とは独立して、Ｈ、有機基、シグナル認識エレメント　−Ｌ１−ＳＲＥ、認識エレメント　−Ｌ２−ＲＥまたは機能的エレメント　−Ｌ３−ＦＥであり得、ここで、該リガンドにおけるＲ１およびＲ２基のうち少なくとも１つは、−Ｌ３−ＳＲＥであり；
ここで、Ｌ１−３は、任意のリンカー基を表し；
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、有機基または末端基であり；そして
Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、有機基または末端基である、
多価リガンド。
【請求項９７】
前記リガンドの各反復単位における前記Ｒ１またはＲ２基の１つが−Ｌ１−ＳＲＥである、請求項９６に記載の多価リガンド。
【請求項９８】
前記リガンドの前記Ｒ１またはＲ２基の少なくとも１つが−Ｌ２−ＲＥである、請求項９６に記載の多価リガンド。
【請求項９９】
前記リガンドにおけるＲ１またはＲ２基の少なくとも１つが−Ｌ２−ＦＥである、請求項９６に記載の多価リガンド。
【請求項１００】
前記リガンドにおける少なくとも１つの−Ｌ２−ＦＥ基における該ＦＥが、検出可能な標識またはレポーター基である、請求項９９に記載の多価リガンド。
【請求項１０１】
前記リガンドにおける少なくとも１つの−Ｌ２−ＦＥ基の該ＦＥが酵素である、請求項９９に記載の多価リガンド。
【請求項１０２】
ＳＲＥの少なくとも１つがペプチドまたは誘導体化ペプチドである、請求項９６に記載の多価リガンド。
【請求項１０３】
ＳＲＥの少なくとも１つがＮ−ホルミルペプチドである、請求項１０２に記載の多価リガンド。
【請求項１０４】
ＳＲＥの少なくとも１つがエピトープである、請求項９６に記載の多価リガンド。
【請求項１０５】
ＳＲＥの少なくとも１つが、免疫細胞上の細胞表面レセプターに結合している、請求項１０４に記載の多価リガンド。
【請求項１０６】
ＳＲＥの少なくとも１つが、Ｂ細胞またはＴ細胞の細胞表面レセプターに結合している、請求項１０４に記載の多価リガンド。
【請求項１０７】
以下の構造：
【化４】
2004512258.tif 000029
を有する、請求項９６に記載の多価リガンドであって、ここで：
ｍ＋ｎは、２以上の整数であり、そして各整数は、括弧内の反復単位の数を表し；
各Ｙは、該リガンドにおける他のＹとは独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ８−、または−ＣＨ２−であり；
Ｒ１は、Ｈ、有機基、−Ｌ１−ＲＥ基または−Ｌ３−ＦＥ基であり得；
Ｌ１およびＬ２は、同じであっても異なってもよく、任意のリンカー基を表し；
ＳＲＥ１およびＳＲＥ２は、２つの異なるシグナル認識エレメントを表し；
Ｒ４およびＲ５は、Ｈ、有機基または末端基であり；そして
Ｒ６およびＲ７は、Ｈ、有機基または末端基である、
多価リガンド。
【請求項１０８】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の１つがペプチドまたは誘導体化ペプチドであり、そしてＳＲＥ１またはＳＲＥ２の他方が糖類である、請求項１０７に記載の多価リガンド。
【請求項１０９】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２が、２つの異なるペプチドまたは誘導体化ペプチドである、請求項１０８に記載の多価リガンド。
【請求項１１０】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の１つがエピトープであり、そしてＳＲＥ１またはＳＲＥ２の他方が免疫細胞に結合している、請求項１０７に記載の多価リガンド。
【請求項１１１】
前記免疫細胞が、Ｂ細胞またはＴ細胞である、請求項１１０に記載の多価リガンド。
【請求項１１２】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の１つが、Ｂ細胞またはＴ細胞によって外来であると認識されるエピトープである、請求項１１１に記載の多価リガンド。
【請求項１１３】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の１つが、Ｂ細胞またはＴ細胞によって自己であると認識されるエピトープである、請求項１１２に記載の多価リガンド。
【請求項１１４】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の１つが、Ｂ細胞上のＣＲ２レセプターに結合している、請求項１１３に記載の多価リガンド。
【請求項１１５】
ＳＲＥ１またはＳＲＥ２の１つが、Ｂ細胞上のＣＤ２２レセプターに結合している、請求項１１４に記載の多価リガンド。
【請求項１１６】
１つ以上のタンパク質と請求項９６に記載の多価リガンドとの複合体であって、ここで、該多価リガンドにおいて、少なくとも１つのＳＲＥ基が該タンパク質に結合している、複合体。
【請求項１１７】
前記多価リガンドが、前記タンパク質に結合している複数のＳＲＥ基を含む、請求項１１６に記載の複合体。
【請求項１１８】
前記タンパク質がレクチンである、請求項１１６に記載の複合体。
【請求項１１９】
前記ＳＲＥ基が単糖類である、請求項１１８に記載の複合体。
【請求項１２０】
前記多価リガンドが、２つ以上のレクチン分子と複合体化されている、請求項１１８に記載の複合体。
【請求項１２１】
前記多価リガンドが、２つ以上のコンカナバリンＡ分子と複合体化されている、請求項１２０に記載の複合体。
【請求項１２２】
生物学的粒子の凝集を増大するための方法であって、該方法は、以下の工程：
複数の認識エレメントを含む多価リガンドを提供する工程であって、該認識エレメントの各々は、該生物学的粒子の１つ以上の凝集を誘導する、工程、および
該生物学的粒子を該複合体と接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項１２３】
前記認識エレメントが、抗体またはレクチンである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記生物学的粒子が、細胞、ウイルスまたはビリオンである請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記多価リガンドが、ＲＯＭＰ誘導リガンドである、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２６】
細胞におけるアポトーシスの誘発を誘導または増大するための方法であって、
該方法は、以下の工程：
複数のシグナル認識エレメントを含む多価リガンドを形成する工程であって、該シグナル認識エレメントが、該細胞に結合し、そして該細胞におけるアポトーシスを誘導する、工程、および
該細胞を該多価リガンドと接触させる工程、
を包含する、方法。
【請求項１２７】
前記シグナル認識エレメントの１つ以上が、レクチンである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記多価リガンドが、ＲＯＭＰ誘導リガンドである、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
複数の、２つ以上の異なるＳＲＥを含む、請求項９６に記載の多価リガンド。
【請求項１３０】
前記ＳＲＥが、前記分子足場にランダムに結合している、請求項１２９に記載の多価リガンド。
【請求項１３１】
前記ＳＲＥが、前記分子足場に選択されたパターンで結合している、請求項１２９に記載の多価リガンド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
生物学のプロセスの多様性は、１つの化学物質種または生物学的種、巨大分子または微粒子（例えば、細胞、ウイルスまたはビリオン）の他の化学物質種または生物学的種、巨大分子または微粒子に対する結合によって媒介される。多くの場合において、結合価は、生物学のプロセスの媒介の機構の重要な局面であり得るという証拠がある。本発明は、多価のリガンドを用いている相互作用のような結合価を選択的に変化させるための化合物および方法に関し、このリガンドに関し、多様な化学物質種または生物学的種が、制御された方法に付随した他の化学物質種または生物学的種（概して、本明細書中で認識エレメント（ＲＥ）と称する）と結合することに関連し、ＲＥの数、ＲＥの配置およびＲＥの相対的な方向性の制御を伴う。ある種の認識エレメントは、生物的なシグナル伝達プロセスにおいて直接的または間接的に関与し、他方の認識エレメントは、単に生物的なプロセスに関連した結合に関与するに過ぎない。従って本発明は、概してそのような多価のリガンドの構造を制御することによる生物学的なプロセスの制御に関している。本発明の多価のリガンドは、具体的には細胞のシグナル伝達プロセスにおいて、およびより一般には、生物的なプロセスに関与する認識エレメントの巨大分子の組立てにおいて用途を有する。
【０００２】
細胞は、継続的な感覚を必要とし、そして細胞の環境における変化に応答する。この目的のために、細胞は、多数の細胞表面、膜貫通および細胞質のレセプターを使用する。これらのレセプターは代表的に、タンパク質，ペプチド、サッカリド、核酸または他の低分子を認識するが、いくつかの場合において、レセプターはまた、酸化還元電位、温度および浸透圧における変化を認識し得る。これらのレセプターに対するリガンドの結合は、移行、活性化、代謝、タンパク質生成、分化、増殖および細胞死のような細胞の活動における変化を生じる。これは、細胞生物学の中心概念であり、そしてこれらの細胞応答は、環境変化に適切に応答するための細胞（または多細胞生物）を与える。
【０００３】
リガンドが細胞のプロセスの促進することによる機構は、細胞応答の調節におけるリガンドの役割をはっきりさせるために非常に興味深い。これらの系が調節がされることにおける１つの一般的な方法は、レセプターの配置的な体系によるものである。リガンド結合は、相対的な方向性および／または細胞表面のレセプターの立体構造、応答の活性化を変化し得る。とりわけ免疫認識、細胞結合および細胞移行、ならびに増殖からの生物的な応答範囲は、リガンド結合の際に上に起こる細胞表面のレセプター分布（例えば、局在）における再方向性または変化に依存する。リガンドの再方向性は、シグナルを伝達し、そして細胞応答を促進させる現象であり得る。
【０００４】
この一般的な例は、成長因子レセプターにおいて見い出され、それは細胞増殖を支配する。エリスロポエチン（ＥＰＯ）のようなある種の２価の成長因子は、同時に２つの細胞表面成長因子レセプター（ＥＰＯＲ）に結合し、そして近傍にこれらのレセプターを導く。このリガンド認識は、ダイマーにおいてレセプターの交差リン酸化を包含するシグナル伝達カスケードを誘引する。ＥＰＯの例において、１つのレセプターに唯一結合できるリガンドは、応答を誘発することが不可能である。
【０００５】
いくつかのリガンドの特に興味深い特徴は、結合価であり、それは本明細書中では概して、レセプター（例えば、エピトープ）に結合するためのリガンド中の認識部位の正味の数と密度と、リガンド中の認識部位の配置との間での相互作用をいう。リガンドは、頻繁に多数のレセプター結合部位を保持する。これは、そのリガンドとリガンドに対する生物的な応答の種類と強度を決定し得る複数のレセプターとの間の多価の相互作用を可能にする。これらの系においては頻繁に、１価のリガンドは、任意の生物学的な活性を欠如する。研究者は、少なくとも認識部位の数を増加させるという意味において、結合価において変化するリガンドを探索している。代表的に実験されたリガンドは、小さく、低い結合価の化合物（例えば、抗体もしくはダイマー化因子）、または大きな異質な化合物（例えば、タンパク質結合体、ポリマー、もしくは官能化された表面）のいずれかであった。規定された低い結合価の化合物を用いた研究は、レセプターの方向性における変化による調節の程度の認識を導いており、そして、大きな規定されない多価のリガンドをともなう研究は、認識部位（例えば、エピトープ）の正味の数を増加することが、頻繁に多くの系において増加される影響をもたらし得ることを示した。
【０００６】
細胞は、過剰な刺激または過小の刺激を避けるために、それらの細胞のプロセスに対する明確な制御を必要とする。免疫応答において、例えば、免疫細胞の機能は、好ましくない自己反応性またはクローン不応答を避けるために厳密に調節されなけれえばならない。細胞は、細胞の応答を調節するためのレセプターとリガンドとの相互作用の特徴を利用する。例えば、増加される合成リガンドの密度は、リガンドに対するある種の細胞の応答をさらに効果的に活性化することを示している。自然は、規定された方法において生物的な応答を制御するためにリガンドの結合価を利用し得る。従って、生物的な応答の選択的な制御は、リガンドの結合価の制御を経て達成され得る。しかし、これまでに記載された多価のリガンドは、生物学的な系においてこの微調整された制御の探索を可能にしていない。
【０００７】
本発明は、明確な結合価、および制御された特徴を伴う合成リガンドの生成を提供し、それは細胞表面のレセプターとの結合によって開始または誘引される生物的な制御を体系的に変化および／または制御するために使用され得る。特に、本発明の合成リガンドは、天然のリガンドによって示されるさらに微細な制御に接近することを可能にする。合成リガンドにおけるこれらの特徴への接近は、これらの系の天然機能の本発明者らの理解を拡張するだけでなく、広い多様な生物的な応答を調節するための能力を利用する治療的または治療的でない応用における使用のために選択的に設計されたエフェクター分子（多価のリガンド）をもたらす。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、多価のリガンドを提供し、そのリガンドは直接的または間接的に細胞または他の生物的な粒子に結合するための、もしくはさらに一般的に任意の生物的な分子に結合することによって、少なくとも１つの認識エレメント（ＲＥ）、および好ましくは多数の認識エレメントを保有または提示する。提供される多価のリガンドは、細胞凝集、および概して生物的な巨大分子の巨大分子の組立てに関して、最も一般的に、任意の生物的な粒子または生物的な分子に結合または標的にするために機能し得、そして特に、細胞または細胞の型またはウイルスを標的にするために機能し得る。本発明の多価のリガンドは、概して化学物質種または生物学的種（抗原、エピトープ、リガンド結合群、細胞レセプターのためのリガンド（細胞表面レセプター、膜貫通レセプターおよび細胞質レセプター）、種々の巨大分子（核酸、炭水化物、サッカリド、タンパク質、ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない）の足場（集合）を作製するために適用可能である。これらの足場において、認識エレメントの数、配置、相対的位置および相対的方向性が制御され得る。
【０００９】
さらに具体的な実施形態において、多価のリガンドを提供し、これらのリガンドは、少なくとも１つのシグナル認識エレメント（ＳＲＥ）、そして好ましくは多数のシグナル認識エレメントを保有または提示し、そして生物学的な系における生物的な応答を調整する。シグナル認識エレメントは、細胞表面のレセプターに結合することを提供し、そして単独または他のＳＲＥと組合わせて、生物学的な系における生物的な応答に影響する。ＳＲＥは、細胞によるシグナルとして、つまり、１以上の細胞レセプター、特に１以上の細胞表面のレセプターと結合を通じ、認識される化学物質種または生物学的種を包含する。これらの多価リガンドは、概して生物学的な系において生物的な応答のエフェクターとして作用し得る。提供される多価リガンドは、生物的な応答を活性化、開始または誘引するために、応答を阻害するために、応答を増強または減弱するために、もしくは応答の性質を変化するために機能し得る。本発明の多価のリガンドはまた、細胞表面レセプター（このレセプターに対してリガンド自体は結合しない）を通じて媒介される応答に影響を及ぼす
本発明は、機能的なエレメント（ＦＥ）を有する細胞の標識、またはこの細胞を標的とするための方法を提供する。本発明はまた、細胞凝集を誘導または増強するための、もしくは代わりに細胞凝集を阻害または阻止するための方法を提供する。本発明はさらに、生物学的な系における生物的な応答を誘導、調製、および／または調節するための方法を提供する。これらの各々の方法は、多価のリガンドを用いる。本発明の好ましい多価のリガンドは、結合価を規定または制御しており、そのリガンドの構造的な特徴は、レセプターに結合するための認識エレメント（ＲＥおよびＳＲＥ）の数、密度、配置および方向性を包含し、細胞に単純に結合するために、もしくは所望される生物的な応答の型または応答のレベルを得るために選択または制御される。
【００１０】
本発明の多価のリガンドの足場は、多数のＲＥ、ＳＲＥ、または随意的にＦＥと組合わせて両方を包含し、多様な診断的および臨床的な応用（特に血液型分類および病原体の検出）において用いられ得る。本明細書中の多価リガンドは、多様な生物的な分子および粒子（細胞およびウイルス）の検出ならびに多様なアッセイ方法（とりわけ組織学、ウエスタンブロット、ＰＣＲアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、凝集アッセイ）において用いられ得る。一般に、そのようなリガンドにおいて増加された結合価は、アッセイまたは診断的な感受性における増加と関連される。
【００１１】
多価のリガンドは、１以上の構造基または官能基を含み、その基は、随意的に１以上のシグナル認識エレメント（ＳＲＥ）、または１以上の機能的なエレメント（ＦＥ）、または両方との組合せにおいて、細胞表面のレセプターに結合するための認識エレメント（ＲＥ）として作用する。ＳＲＥは、多価のリガンドにおいて単独または他のＳＥＲ（ＲＥまたＦＥ）と組合わせて、細胞内および／または細胞間の生物的な応答を誘導し得るＲＥの部分集合である。１以上のＳＲＥ（必要に応じて、１以上のＲＥ、１以上の異なるＳＲＥ、または１以上のＦＥとの組合せにおいて）を保有する本発明の多価のリガンドは、細胞において生物的な応答を開始し得る。あるいは、これらの多価のリガンドは、１以上の天然の化学的または生物的シグナルの存在下において、例えば、応答を増強、減少または阻害することによって細胞の応答を調製し得る。具体的な実施形態において、本発明の多価のリガンドは、選択された化学的または生物的なシグナルによって細胞において誘導される応答のレベルまたは型を変化するように設計される。
【００１２】
本発明の多価のリガンドは、最も一般的に、多数のＲＥ，ＳＲＥ、または両方必要に応じてＦＥと組合わせて、共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用のいずれかによって結合されるための分子の足場を包含する。足場の上のＲＥ，ＳＲＥおよびＦＥの数、密度および配置は、代表的に、所望されるリガンドの選択的な合成によって制御され得る。その分子の足場は、細胞に対するＲＥおよび／またはＳＲＥの種々の外形（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）提示を提供する直線状、分枝状または環式であり得る。好ましい実施形態において、分子の足場は、多数のモノマーを包含するポリマーである。本発明の多価のリガンドの分子の足場は、全てのモノマーが、同一モノマーまたは異なるモノマーの混合物を含むポリマーであるポリマーを包含する。分子の足場はまた、足場の異なる領域（または一部）が異なるモノマーから構成されるブロックコポリマーを包含し得る。本明細書中のいくつかの処方において例証されるように、ＲＯＭＰ方法によって調製される分子の足場は好ましい。
【００１３】
分子の足場は、疎水性であり得るが、または−ＯＨのような極性置換基を伴う置換（特にポリマー基幹の置換）によってさらに親水性になり得る。一般的にその足場は、ＲＥまたはＳＲＥの活性（例えば、レセプターへの結合）を干渉しない任意の基で置換され得る。足場の置換は、多価のリガンドの物理的な特性（例えば、溶解度）を調節するために制御され得る。ＲＥ、ＳＲＥおよびＦＥは、直接的に足場に、またはリンカー基を介して足場に結合され得る。そのリンカー基は、足場に結合するための、およびＲＥ，ＳＲＥおよび／またはＦＥに結合するための官能基を提供し、そしてまた多価のリガンドの溶解度に影響し得る。そのリンカーはまた、ＲＥ，ＳＲＥまたはＦＥとの間、もしくは結合されるエレメントと足場との間の所望しない相互作用を最小限にするため、または結合されるエレメントの方向性に関して構造的な自由度を提供するために規定されたスペーサーを提供し得る。
【００１４】
具体的な実施形態において、分子の足場は、多数の繰返し単位（モノマー）を含み、この繰返し単位のそれぞれに対してＲＥまたはＳＲＥが結合される。一般的に、分子の足場は、互いに近接したシグナルを保持するために機能し、そして生物的な応答の調製において直接的に相互作用しない。しかし、多価のリガンドの物理的特性（例えば、溶解度）または化学的特性（例えば、安定度）は、足場の構造を選択することによって、または足場に沿って置換基（例えば、極性、非極性）を導入することによって、変化され得る。
【００１５】
１つの実施形態において、多価のリガンドは、リガンド中にわずか１つの型のＲＥまたはＳＲＥを有する。これらの多価のリガンドは、ダイマー、トリマー、テトラマー、およびポリマー（５以上のモノマーを有する比較的短いオリゴマーを包含する）、または２５、５０、１００以上のモノマーを有する長いポリマーを包含する。１つの型のＲＥまたはＳＲＥを保有する好ましい多価のリガンドは、約１０以上のそのようなＲＥまたＳＲＥを保有する。この実施形態において、多価のリガンドの繰返し単位（または、モノマー）は、好ましくは同一である。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、１つの型のＲＥより多く、１つの型のＳＲＥより多く、またはＲＥとＳＲＥとの組合せを保有する多価のリガンドを提供する。これらの多価のリガンドはまた、ダイマー（各々がＲＥ、もしくはＳＲＥのうち１つ、またはＲＥおよびＳＲＥを保有する）、トリマー、テトラマー、およびブロックポリマー（５以上のモノマーを有する比較的短いオリゴマーを包含する）、または２５、５０、１００以上のモノマーを有する長いポリマーを包含する。これらの多価のリガンドはまた、第二のＲＥまたはＳＲＥを保有する領域から第一のＲＥまたはＳＲＥを保有する領域を分離するために、足場に沿ってスペーサー領域（ＲＥまたはＳＲＥ群を保有しないモノマーを有する）を有し得る。スペーサー領域のモノマーは、機能的なエレメント（ＦＥ）を保有していても、置換されていなくても、非反応性の非官能基応答を保有してもよい。所定の多価のリガンドは、概して異なるＲＥ，ＳＲＥまたは両方をいくらでも包含し得るが、しかし２または３の異なるＲＥまたはＳＲＥを保有するこれらのリガンドは、最も興味深いものである。
【００１７】
他の実施形態において、本発明は、１以上のＲＥまたはＳＲＥを保有する多価のリガンドを提供し、そのリガンドは同一であっても異なっていても良いが、ＲＥまたはＳＲＥ以外の機能的なエレメントを保有し得る。これらの機能的なエレメント（ＦＥ）は、例えば、多様な化学的または生物的な機能（ＲＥまたはＳＲＥの機能は異なる）を示し得る。例えば、機能的なエレメントは、１以上の蛍光または放射性同位元素標識、潜在性反応基を伴う１以上基、または１以上の酵素機能を提供し得る。ＦＥでのモノマーの置換はまた、ＳＲＥの配置を提供し得る。
【００１８】
認識エレメント（ＲＥ）は、任意の化学物質種または生物学的種（例えば、分子またはその一部）であり、単独または１以上の他のＲＥとの組合わせにおいて、細胞表面のレセプターを認識し、そして結合する。ＲＥは、例えば、細胞表面のレセプターに結合するための全てまたは一部の活性なリガンドを包含し得る。シグナル認識エレメント（ＳＲＥ）は、任意の化学物質種または生物学的種であり、単独または１以上の他のＳＲＥとの組合わせにおいて、細胞における、または細胞から生物的な応答を誘導し、そしてこららの種は、生物的な分子（タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、サッカリド、サイトカイン、成長因子、ホルモン、およびそれらの多数の誘導体）を包含し、ならびにより大きな生物学的種（タンパク質フラグメント、エピトープ、抗原決定基等）の一部、および多様な化学物質種（ハプテン、天然に存在する薬物、合成薬物）、および生物学的な分子の機能的な模倣物として作用する種（例えば、ペプトイド、ホスホロチオエート）であり得る。ＳＲＥは、代表的に細胞表面のレセプターに結合するＲＥであるが、ＲＥとは対照的に、ＳＲＥは細胞中の生物的な応答に影響する。
【００１９】
本発明の多価のリガンドは、細胞レセプターを認識および／またはクラスター形成するために機能し得る。この点で、多価のリガンド上のＲＥまたはＳＲＥは、細胞レセプターのリガンドである。ある種の場合において、レセプターのクラスター形成、またはレセプターの認識は、所定のＳＲＥに対する細胞の応答を調製する。本発明の多価のリガンドによるクラスター形成、またはレセプターの認識はまた、別のシグナル、または別のリガンドに対する細胞の応答を調製し得る。細胞表面のレセプターのクラスター形成、または他の構造的な再方向性、またはレセプターの認識を経て、本発明の多価のリガンドは、別のシグナルまたはリガンドに対する細胞の応答を増強または阻害し得る。例えば、本発明の多価のリガンド（化学誘引物質として機能する）は、別の化学誘引物質に対して細胞の応答を増強し得る。
【００２０】
所定の細胞のレセプターは、１を超える生物的な応答を媒介し得る。与えられる細胞のレセプターに結合するが、レセプターによって媒介される生物的な応答を誘導しないリガンドを保有する本発明の多価のリガンドは、生物的な応答を阻害するために用いられ得る。
【００２１】
１を超える型のＳＲＥを保有する多価のリガンドは使用されて、細胞における、または細胞からの１を超える生物的な応答を同時に、または連続的に誘導し得る。あるいは、１つのＳＲＥに対する細胞の応答は、別のＳＲＥに対する細胞応答によって改変され得る。２以上の異なるＳＲＥを保有する多価のリガンドは、例えば、細胞表面上の異なるレセプターを認識するために機能し得、それは１以上のＳＲＥに対する細胞の応答の調製をもたらし得る。同様に、ＦＥを保有する多価のリガンドにおいて、１以上のＳＲＥに加えて、ＳＲＥに対する応答は、ＦＥの存在によって改変され得る。
【００２２】
本発明の多価のリガンドは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるシグナル伝達プロセス（すなわち、生物学的な系において、細胞の外側と内側との間、ならびに細胞と細胞との間の情報の伝達）を調製する方法において用いられ得る。その方法は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボ（細胞は、多細胞生物を包含する自然環境から取り除かれ、そしてその環境に戻させるためにいったん処理されることが意図される）で実行され得た。例えば、ＳＲＥに対する走化性、または遊走性の応答が改変され得る。そのような方法は、原核生物微生物（例えば、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌）または真核生物微生物（哺乳動物を包含する種々の生物の真核生物の寄生体および病原体を包含するが、これらに限定しない）の両方、および哺乳動物の細胞、および特にヒトの細胞を包含する、真核生物細胞より大きな生物、（例えば、白血球、リンパ球、内皮細胞、上皮細胞）に適用可能である。細菌細胞、または真核生物細胞（真核生物の病原体、または寄生体を包含する）における応答を調製する多価のリガンドが使用されて、細菌、または真核生物の病原体または寄生体による増殖、コロニー化、遊走化、または生物膜の形成を阻害し得、結果として、そのような微生物による感染またはコロニー化を阻害し得る。
【００２３】
多価のリガンドはまた、細胞分化、細胞増殖および／または細胞死（例えば、アポトーシス）を促進または阻害するために使用され得る。大きい生物の真核生物細胞において応答を調製する多価のリガンドは、多価のリガンドにおけるＳＲＥおよび他のＦＥの選択に依存し、所望しない細胞増殖、所望しない移行、および所望しない細胞間の接合の形成を阻害するために、もしくは所望される細胞増殖、所望される移行、および所望される細胞接合の形成を促進または増強するために使用され得る。
【００２４】
薬学的に受容可能なキャリアならびに、細胞増殖、コロニー化、細胞移行、細胞間接合の形成、および／または真核生物細胞または原核生物細胞による生物膜の形成を調製するために有効な量の多価のリガンドの量を含む薬学的組成物および治療組成物は、本発明によって包含される。具体的な薬学的組成物または治療組成物は、所望しない細胞増殖、コロニー化、細胞移行、細胞間接合の形成、および／または真核生物細胞または原核生物細胞による生物膜の形成を阻害、もしくは妨害するために有効な量の多価のリガンドを包含するものを包含する。細菌あるいは真核生物の寄生体または病原体による感染を遅延または阻害する薬学的組成物は、特に興味深いものである。本発明の２以上の多価のリガンドは、複合の効果および利益を提供するためにそのような薬学的組成物において組合わされ得る。
【００２５】
細胞移行、細胞接着、および細胞間接合の形成は、癌の成長または癌の転移に関与される。そのようなプロセスを調製する多価のリガンドは、癌の成長または癌の転移の阻害のための方法および薬学的組成物において用いられ得る。再度、そのような薬学的の組成物は、癌細胞増殖、細胞接着または細胞移行を阻害するために有効な量の多価のリガンドを含むものを包含する。本発明の２以上の多価のリガンドは、複合の効果および利益を提供するためにそのような薬学的組成物において組合わされ得る。
【００２６】
本発明の多価のリガンドは、免疫系（例えば、白血球、およびリンパ球）において機能する細胞との結合価依存性相互作用によって、動物（哺乳動物、および特にヒトを包含する）における免疫応答を調製し得る。特に、本発明の多価のリガンドは、化学誘引物質（Ｎ−ホルミルペプチドおよびＮ−アシルペプチドのような誘導体化されたペプチドを包含する）に対する白血球（好中球を包含する）の応答を調製し得、そしてＢ細胞および／またはＴ細胞の活性化および不活性化を調製し得る。Ｂ細胞および／またはＴ細胞の活性化は、インビボ、インビトロ、および／またはエキソビボで実行され得る。
【００２７】
本発明はまた、多価のリガンドのライブラリーを提供し、ライブラリーのメンバーは、例えば、ＲＥまたはＳＲＥの数および／または相対的な位置において、スペーサーの存在および／または位置において、反復単位またはモノマー（例えば、以下の式における、ｎまたはｎ＋ｍ）の数において、ならびにＦＥの存在または数において変化される。規定のサイズ、反復単位またはモノマーの数、ＲＥまたはＳＲＥの数、ＲＥまたはＳＲＥの組合せ、ＲＥ，ＳＲＥおよびＦＥの組合せ、ならびに付随したエレメント（ＲＥ，ＳＲＥおよび任意のＦＥ）の配置の範囲にまたがる多価のリガンドのライブラリーが、特に興味深いものである。ＲＯＭＰ方法を使用して調製されたライブラリーは、特に興味深く、および応用である。当該分野において理解される多様な選択およびスクリーニングを方法を用いて、これらのライブラリーは、与えられる生物的な系において所望される調製を示すライブラリー中の多価のリガンドについて選択またはスクリーニングされ得る。さらになお、そのようなスクリーニングから得られた結果は、すなわち細胞凝集のために必要とされるＲＥの数、誘導または阻害のために必要とされるＳＲＥの数、および他の構造／機能の関係は、さらなる多価のリガンドの設計および合成において使用され得る。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明の多価のリガンドは、生産的な方法において機能的または構造的な基の表示を提示するために、多数の、特にＲＥおよび／またはＳＲＥが結合される分子の足場である。その足場は、一般的に、所望される表示の方向性を提供する任意の化学物質種、または生物学的種から形成され得る。直線状アレイに加えて、その足場は、選択される非直線状の提示を有する官能基のアレイを提供するために選ばれ得る。例えば、図８に例証される多様な非直線状の足場構造を参照のこと。
【００２９】
機能的または構造的な基は、対称または非対称のアレイにおいて、足場に結合され得る。その足場は、芳香族環系（ベンゼン、ナフタレン、および縮合または非縮合の芳香族環を包含する）のような比較的低分子の有機分子を包含し得る。多様な縮合芳香族環系は、環式系において選択される位置に結合される官能基を伴う広い範囲の異なる提示の方向性を提供し得る。あるいは、飽和の環式系（例えば、シクロヘキサン）、ヘテロ環（例えば、炭水化物）、または脂環式化合物（例えば、（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）もまた使用され得る。さらに代表的に分子の足場は、多数の反復単位または分子（例えば、ポリマーまたはオリゴマー）を包含する。次いで、そのモノマーの足場は、多数の反復単位またはモノマーに結合する多数の機能的または構造的な基を保有する。その官能基は、その足場に共有的または非共有的に結合され、そして多数の認識エレメント（ＲＥ）、またはシグナル認識エレメント（ＳＲＥ）を包含し得、および随意的に他の機能エレメント（ＦＥ）を包含し得る。
【００３０】
そのＲＥ，ＳＲＥおよび任意のＦＥは、分子の足場に対して無作為に、または事前に選択されるパターンに結合され得、ここで足場の長さに沿ったＲＥ，ＳＲＥ、およびＦＥの配置は、選択されたパターン（例えば、交互の異なるＳＲＥまたはＲＥ，異なるＳＲＥまたはＲＥの選択された配置など）と適合する。
【００３１】
その分子の足場は、剛性または可撓性、親水性または疎水性、対称または非対称であり得、大きな表面領域または小さな表面領域を有し、そして細胞表面のレセプターとの相互作用するか、または相互作用しない。その分子の足場は、任意の多様なオリゴマーまたはポリマーであり得、これらのオリゴマー、またはポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリメタクリレート、ポリオール、およびポリアミノ酸、ならびに相当するオリゴマーが挙げられるが、これらに限定されない。分子の足場は、一般的に、直線状ポリマー、分枝状ポリマー、または架橋結合のポリマーであり得る。好ましい分子の足場は、生体適合性である。本明細書中のいくつかの式で示されるように、ＲＯＭＰ法によって調製される分子の足場が好ましい。分子の足場は疎水性であり得、または−ＯＨのような極性置換基での置換によってさらに親水性に作され得る。一般的に、その足場は、シグナル活性を干渉しない任意の基で置換され得、この基は所望可能な化学的および物理的特性を提供する。
【００３２】
「認識エレメント」またはＲＥという用語は、細胞レセプターに対して結合するために機能し、特に、細胞表面のレセプターに結合するために機能する化学物質種または生化学的種、基あるいは構造をいうために本明細書中で使用される。ＲＥは、本発明の多価のリガンド中の分子の足場に結合される。ＲＥは、細胞レセプターについてのリガンド、またはそのようなリガンドの一部のであり得、それは、レセプター結合のために機能的であり、そして分子の足場に結合することを可能にするために調製されている。ＲＥは、細胞レセプターのリガンドに対して化学的に同一であり得、またはＲＥは足場に結合する結果として、または足場に結合することを促進するためにこのリガンドから改変され得る。
【００３３】
「シグナル認識エレメント」またはＳＲＥという用語は、化学的または生化学的なシグナル（以下を参照のこと）として機能し、そして本発明の多価のリガンドに結合される化学または生化学の種類、基あるいは構造をいうために本明細書中で使用される。そのＳＲＥは、代表的には多価のリガンドの中に結合することを可能にするために改変されているシグナル（基または分子）である。ＳＲＥは、シグナルと化学的に同一であり得、またはＳＲＥは足場に結合する結果として、または足場に結合することを促進するためにシグナルから改変され得る。そのＳＲＥは、好ましくは、基のシグナル機能が、最小限に影響されるように多価のリガンドの中に結合される。ＳＲＥは細胞によって、代表的に細胞レセプターに結合することによって認識され、そして従ってＲＥもまたそうである。ＲＥと対照的にＳＲＥは、細胞における、または細胞からの応答を誘導する。その応答は、細胞移行のような細胞内の応答、および／または他の細胞のための化学的なシグナルとして機能する細胞による化学物質種類の解放のような細胞間の応答であり得る。シグナル認識は、シグナル（またはシグナル群）が結合するための細胞表面上の細胞レセプターの存在によって媒介される。シグナル（またはＳＲＥ）単独の結合は、生物的な応答を誘導し得る。応答の誘導は、いくつかの場合において、多数のシグナルまたは（ＳＲＥ）の存在を必要とし得る。その生物的な応答は、細胞表面のレセプターの認識、またはレセプターのクラスター形成によって調製され得る。
【００３４】
「化学的または生化学的なシグナル」という用語は、細胞表面のレセプターとの相互作用によって最も代表的に細胞によって認識され、そして細胞における生物的な応答を誘導する多様な型（分子、オリゴマー、部分、基など）から選択される特定の化学物質種、または生化学的種をいうために本明細書中で使用される。シグナル自体は、細胞との相互作用に対して応答を誘導してもよいし、多数のシグナルが、細胞と相互作用するとき（例えば、多価で提示されるとき）応答を誘導するのみでもよい。シグナルは、天然のシグナルを包含し得、それは、細胞における応答または細胞による応答を誘導するための生物学的な系において、インビボで見出されたシグナルの種類である。天然のシグナルとしては、例えば、天然に存在する薬物、ホルモン、抗原、成長因子、サイトカイン、タンパク質、ペプチド、誘導体化ペプチド（例えば、硫酸化ペプチド、リン酸化ペプチド、アシル化ペプチド、またはＮホルミル化ペプチド）、サッカリド、誘導体化サッカリド（例えば、硫酸化、アシル化、シアル化のサッカリド）核酸、多様な細胞栄養物、エピトープ、および多様な低分子有機化合物（それらの全ては、互いに限定的な群を提示し得るとは限らない）が挙げられる。シグナルはまた、天然の化学的なシグナルの機能を模倣することが見出された化学物質種を包含し得る。これらのシグナルの模倣物は、代表的に合成であり、そして例えば、合成薬物、および天然に存在するシグナルの多様な誘導体（例えば、ペプトイド、および核酸アナログ、または誘導体）が挙げられる。もちろん、異なる細胞が、異なるシグナルを認識し得る。異なる細胞は、同一の生物的な応答、または異なる生物的な応答を伴って、同一または類似のシグナルに対して応答し得る。単一の細胞は、同一の生物的な応答、または異なる生物的な応答を与えるための多様な異なるシグナルに応答し得る。シグナルとしては、例えば、相互に限定的な群ではない化学誘引物質、およびエピトープ（抗原決定基）が挙げられる。多価のリガンドに結合されるＳＲＥは、分子の足場に結合するために適合された化学的、または生化学的シグナルを包含し得る。ＳＲＥは、とりわけ、化学誘引物質、エピトープ、サイトカイン、ホルモン、および関連物質である化学物質種、または生化学的種を包含し得る。
【００３５】
化学誘引物質は、細胞移行に向けた化学または生物のシグナルである。その細胞は、化学誘引物質の増加する濃度を感知し、そして高い濃度に向かって移動する。化学誘引物質のための細胞の感知機構は、頻繁に非常に感受性である。あるいは、細胞は、他のシグナルに応答して、シグナルの低い濃度に移動し得る。細菌細胞は、ある種の栄養物（例えば、グルコースまたはガラクトースまたはセリンのようなアミノ酸）に向かって移動する。白血球（白血球細胞）は、Ｎ−ホルミルペプチドおよび他の誘導体化ペプチド、活性化されたＣＳ（ＣＳａ）の成分、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、または化学毒性のサイトカイン（つまり、α−ケモカイン、およびβ−ケモカインを包含するケモカイン）に向かって移動する（６５）。Ｎ−ホルミル化ペプチドは、細菌のタンパク質合成の生成物であり、および細菌感染のシグナルの生成物である。Ｎ−ホルミル化ペプチドについてのレセプターはまた、Ｎ−アシルペプチドのような他の誘導体化ペプチドに結合し得る。従って、Ｎ−ホルミル化ペプチドレセプターの任意のリガンド（レセプター機能のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する種類を包含し得る）は、Ｎ−ホルミル化ペプチドレセプターに関連される適用のために用いられ得る。白血球の１つの型である、好中球は、Ｎ−ホルミル化ペプチドの低いレベルを感知することによって細菌感染の部位に案内される。一度は感染の部位で、食作用が起こり得る。化学誘引物質は、移行または走化性に加えて生物的な応答を誘導し得る。例えば、多様な型の白血球において、化学誘導物質は、毒性種の放出、または炎症性のサイトカイン、転写因子、および順に他の細胞のための化学のシグナルとして機能する他の化学物質種の放出を誘導し得る。
【００３６】
エピトープという用語は、一般には、抗原決定基として機能する任意の化学物質種をいい、そして最も一般には、この用語は全ての抗原を包含するために本明細書中で使用される。エピトープは、抗体分子の上、またはリンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）レセプターの上の抗原結合部位と組合わさる抗原の部分である。エピトープの結合は、例えば、抗体生成またはＴ細胞の応答を刺激し得る。エピトープは、免疫原性の異なるレベルを示し得る。他のものよりさらに免疫原性であり、そして全体の抗原応答に優性であるエピトープを、免疫優性エピトープと称した。ほとんどの非自己のタンパク質、および多くの炭水化物は、抗原であり、そのためにエピトープとしては、限定なくタンパク質フラグメント（例えば、ペプチド）、および炭水化物フラグメント（例えば、サッカリドおよびオリゴサッカリド）を包含する。抗原、エピトープまたは細胞に適用されるように、本明細書中で使用される用語「自己（ｓｅｌｆ）」は、免疫細胞、免疫細胞の組合せ、または免疫系によって自己として認識される実体（ｅｎｔｉｔｙ）である。「自己」という用語はまた、免疫細胞、または細胞、または免疫系によって外来として認識される他の生物的な粒子に適用され得る。外来として認識されるいくつかの抗原、エピトープ、細胞、および粒子は、免疫細胞、細胞または免疫系に対して実際に外来であるが、そのように認識されない。抗原、エピトープまたは細胞に適用されるように、本明細書中で使用される用語「外来の（ｆｏｒｅｉｇｎ）」は、免疫細胞、免疫細胞の組合せ、または外来としての免疫系によって認識される実体である。外来はまた、自己として認識されない任意のものである（つまり、非自己抗原など）。「外来の」という用語はまた、免疫細胞、または細胞、または免疫系によって異質として認識される他の生物的な粒子に適用され得る。異質として認識されるいくつかの抗原、エピトープ、細胞、および粒子は、免疫細胞、細胞または免疫系に実際に対して自己であるが、そのように認識されない。
【００３７】
ハプテンという用語は、低分子のような当該領域において、その一般に認められた意味をとり、抗原の少なくとも１つ決定された基を有し、ハプテンは抗体と結合し得るが、ハプテンが担体分子との接合において作用しなければ、免疫原性ではない。ハプテンとしては、とりわけ、ヘモシアニン、およびニトロ−置換の芳香族環化合物（例えば、ジニトロフェニル基、トリニトロベンゼンスルフォニル基、ジニトロフルオロホニル基）が挙げられる。
【００３８】
本明細書中で使用される抗体という用語は、抗体として機能する任意のタンパク質またはタンパク質フラグメントを包含することが意図され、任意のタンパク質またはタンパク質フラグメントは抗体として機能し、そして具体的には、とりわけ、Ｆａｂフラグメントを含む抗体フラグメントを包含することが意図される。
赤血球凝集タンパク質の大きな群のいづれかのレクチンは、主に植物種子中で見出された。ある種のレクチンは、ある種の血液の赤血球の凝集を起こし、他のものは、リンパ球の増殖を刺激する。
【００３９】
「生物学的な系」という用語は、シグナル伝達エレメント（例えば、応答を発生させるためのシグナルレセプター、および生化学的／生物学的なエレメント）を包含する任意のインビボまたはインビトロの系をいうために本明細書中で使用される。代表的に生物学的な系は、細胞が相互作用する任意の環境の中に少なくとも１つの細胞を含む。本発明の多価のリガンドの使用の状況における生物学的な系は、リガンドと相互作用し得る少なくとも１つのレセプターを含まなければならない。多価のリガンドの大部分の適用において、生物学的な系は、リガンドに応答し得る少なくとも１つの細胞を含まなければならない。リガンドに対する細胞のこの応答は、生物学的な系の中で起こり、そして上記で述べたように、細胞内の応答、細胞間の応答、または両方の応答であり得る。生物学的な系は、例えば、組織における細胞、器官または生物における細胞、細胞の混合物における細胞、組織培養における細胞、組織または生物学的な流体のサンプルにおける細胞であり得、そしてインビボ、およびインビトロの生物学的な系を包含し得る。
【００４０】
「機能的なエレメント（ＦＥ）」は、ＲＥまたはＳＲＥと異なるいくつかの生物的または化学的な機能を示す化学物質種または生物学的種（分子、基、部分など）である。ＦＥは、例えば、多価のリガンドに対して、別の化学基または生物的基を結合するための反応基または潜在的な反応基を提供し得る。例えば、ＦＥは、多価のリガンドを固体表面に付着するために使用され得、その固体表面は、リガンド精製のために、または解析、もしくは診断アッセイに関する適用において有用であり得る。ＦＥは、蛍光標識、放射能標識、およびリガンドに結合される金粒子のような高密度標識（例えば、金粒子で標識したストレプトアビジン）を包含する多様な検出可能な標識、またはレポーター群であり得る。検出可能な標識、またはレポーター群を組み込む多価のリガンドは、例えば、多様な解析または診断アッセイにおいて使用され得る。特別な目的は、可視化アッセイ（例えば、顕微鏡の適用において生物的な粒子または分子の検出のため）において有用である本発明の多価のリガンドである。ＦＥはまた、多様な生物的な機能（例えば、酵素の機能、リガンド結合の機能など）を示し、それは、選択された多価のリガンドの適用を促進または増強し得る。
【００４１】
ＲＥ，ＳＲＥおよび／またはＦＥの付着は、多価のリガンドの分子の足場とシグナル基との間を干渉しているリンカー基の使用によって促進され得る。リンカー基は、所望されるような直線状または分枝状、剛性または可撓性、親水性または疎水性であり得る。当業者は、与えられた適用のための適切な種々の化学物質種からリンカーを選択し得る。さらに、当業者は、当該分野で周知である方法および材料の観点において、所望し得る特性を有するリンカーを用いて多価のリガンドを容易に調製し得る。
【００４２】
本発明の多価のリガンドは、原核生物または真核生物におけるシグナル伝達を調製するために使用され得る。その方法は、多様なシグナル伝達プロセスにおいて機能する。原核生物は、高度に保存された細胞内シグナル伝達のシステム（二成分系（ｔｗｏ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ））を有する。この系の主要な成分は、交互のヒスチジン−アスパラギン酸キナーゼ媒介のリン酸化事象（例えば、毒性、抗生物質に対する抵抗性、環境ストレスに対する応答、および環境感知に対する応答）の数量を変化している。二成分系の成分は、原核生物において高度に保存されている。対照的に、真核生物は、シグナル伝達のための二成分系をほとんど有していないようである。この直交性は、二成分シグナル伝達経路を細菌感染の制御のための治療設計における開発の第一標的とする。真核生物の主要なシグナル伝達系は、Ｇタンパク質結合レセプター、および酵素結合レセプターによって媒介される（レセプターグアニリルシクラーゼ、レセプターチロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連レセプター、レセプターチロシンリン酸化酵素、およびレセプターセリン／スレオニンキナーゼを包含する）。これらの経路においてシグナル伝達を調製または調節するための能力は、真核生物細胞、および真核生物（哺乳動物、特にヒトを包含する）における広く多様な生物的なプロセスの制御を可能にし、そして治療剤の設計のための重要な機会を提供する。
【００４３】
図１は、本発明の多価のリガンドが生物的な応答のエフェクターとして機能し得ることによるいくつかの機構を例証する。多価のリガンドは、シグナル伝達に直接関与し得るので、多価のリガンド上のＳＲＥは、細胞表面レセプターモノマーリガンドに類似に結合し、そして応答を直接的に誘導（または阻害）する。ＳＲＥが、分子の足場に結合される本発明の多価のリガンドの使用は、細胞表面上のレセプターのクラスター形成、または細胞表面上のレセプターの再局在化、セカンドメッセンジャーの局在を増加し得るが、セカンドメッセンジャーの局在を促進し得るが、または単にＳＲＥ（リガンド）の濃度の局所的な増加により親和性を増加し得る。直接的なシグナルを経て機能する多価のリガンドは、多様な適用（生物膜形成の妨害、細胞移行の妨害に基づくものを包含する）において用いられ得、ワクチン、ならびに他の治療剤（癌の処置および抗生物質）のために特に興味深いものである。
【００４４】
本発明の多価のリガンドはまた、別のシグナル、またはリガンドに対する細胞の応答に影響するシグナル伝達（図１を参照のこと）を直接的に関与し得る。多価のリガンドは、別のリガンドに対する増強された応答のために細胞を敏感に、または感作するために機能する。間接的なシグナル伝達効果は、細胞表面のレセプターの他の型の局在または再組織化を効果的にもたらす細胞表面のレセプターの１つの型のクラスター形成または再組織化によって媒介され得る。間接的なシグナル伝達を経て機能する多価のリガンドはまた、多様な適用、特に生物的な応答の増強に基づく適用において有用であり得、そしてワクチンアジュバント、および免疫応答の修飾因子のために特に興味深いものである。
【００４５】
本発明の多価のリガンドはまた、単純に細胞への結合、または細胞の標的化において適用を有する。細胞表面のレセプター（ＲＥ）へ結合し、および機能的なエレメント（ＦＥ）を包含するための少なくとも１つの認識エレメントを包含する多価のリガンドは、そのＦＥを伴う細胞を標的にする。ＦＥが標識群またはレセプター群であるなら、多価のリガンドは細胞を標識するために作用する。ＦＥが生物的な機能を有していたら、多価のリガンドはその機能を伴う細胞を標的にする。多数のＲＥ（ＳＲＥまたは両方）を包含する多価のリガンドは、生物的なシグナル伝達機能を必要としなくてもよい巨大分子の集合において機能し得る。そのような適用において、多価のリガンドは、ＳＲＥを包含する必要がなく、多価のリガンドは、細胞表面のレセプター（認識エレメント、ＲＥ）、および好ましくは多数のＲＥに対して結合するための１を超えるの認識エレメントを包含することのみが必要である。そのような適応において、多価のリガンドは、細胞凝集をもたらす１を超える細胞に直接的、または間接的に結合する。細胞凝集は、それ自体が生物的な応答（例えば、細胞によるシグナル分子の放出）を誘発し得るが、必要としない。多価のリガンドは、細胞凝集をもたらす細胞に順に結合するレクチン（例えば、コンカナバリンＡ）のような多数の生化学的種に対する結合によって細胞凝集を間接的に起こし得る。間接的な細胞凝集に対する多価のリガンドの効果は、リガンドの結合価、および細胞凝集を起こす種類に対する多価のリガンドの相対的な濃度に依存する。高い結合価を伴うより高い濃度の多価のリガンドでは、細胞凝集を起こす種類の結合部位を飽和させ、細胞凝集を阻害し得る。低い濃度の多価のリガンドでは、フリーの結合部位が残り、および細胞凝集が起こり得、そして多価のリガンドによって増強され得る。従って、本発明の多価のリガンドは、細胞凝集を阻害、または促進させるために選択的に設計され得る。巨大分子の集合のために機能する多価のリガンドは、多様な適用、特に細胞凝集に基づく適用に有用であり得、これらの適用としては、診断アッセイ、癌治療、および病原体の浄化が挙げられるが、これらに限らない。
【００４６】
細胞表面の上のレセプターの再組織化は、細胞移行、接着、および細胞間連結の形成を包含する多くの重要な生物的な反応に関与する。本発明の多価のリガンド、上記で議論したように、特にレセプター間の距離にまたがり得るこれらのリガンドは、レセプターを再組織化するために使用するため、およびレセプターとここのシグナルとの相互作用によって応答を調製するために使用される。細胞表面の上のレセプターの再組織化としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：表面上の異なる細胞レセプターの相対的な位置、表面上のレセプターの側方への移動、細胞表面上の異なる部位に対するレセプターの局在を変化させること、レセプターに関連するシグナル伝達の機構の近傍での変化、レセプターに関連する細胞内物質の特性の近傍の変化、レセプター、レセプターのクラスター形成の近傍の変化、レセプターの立体構造の変化、およびレセプター−レセプター相互作用の開始。
【００４７】
具体的な実施形態において、本発明の直線状の多価のリガンドは、環式開口複分解重合（ＲＯＭＰ）によって調製される（例えば、（５４）を参照のこと）。この方法は、細胞機能の多価のインヒビターを調製するために使用されている（２７，２８）。ＲＯＭＰ法は、ポリグリコマーである多価のリガンドに関連する米国特許５，５８７，４２２号により詳細に記載されている。ブロックポリマー（および、オリゴマー）を生成させるため、ならびにＲＯＭＰポリマー（および、オリゴマー）上の末端基を導入するためのＲＯＭＰ法の改善は、両方が１９９９年６月１７日に出願された米国特許出願第０９／３３５，４２０号、および同第０９／３３６，１２１号において記載されている（これらの米国特許文書は、特にＲＯＭＰ法の説明に関して、米国特許文書の全体が、本明細書中に参考として援用される）。スキーム６は、ＲＯＭＰの基幹の改変のための例示的な方法を例証し、その方法は、本発明の多価のリガンドを合成するための上記の列挙される特許、および特許出願において記載される合成方法と組合わせて適用され得る。スキーム６は、ＲＯＭＰの足場の基幹において二重結合を還元するために用いられ得るジイミド還元（２３，９８，９９）を例証する。スキーム６はまた、ＯｓＯ４が触媒したジヒドロキシル化（ｄｉｈｙｄｒｏｙｌａｔｉｏｎ）（１００，１０１）を使用したＯＨ基でのＲＯＭＰの足場の基幹の置換を例証する。当業者は、本明細書中での記載、および当該分野で周知の方法を用いて、本発明の多価のリガンド、特に本明細書中の式で具体的に示される多価のリガンドを調製し得る。
【００４８】
ＲＯＭＰ法により調製される本発明の多価のリガンドは、以下の一般構造によって例示される。
【００４９】
【化５】
2004512258.tif 000002
ここで：
ｎは、２以上である整数であり、そしてリガンド中にある括弧において反復単位の数を示す；
点線は、随意的な二重結合を示す；
「ＢＢ」は、骨格の反復単位を示し、それは、環式または非環式であり得、そして波線は、そのＢＢ反復単位が、骨格においてシス（ｃｉｓ）またはトランス（ｔｒａｎｓ）の立体構造の中にあり得ることを示し、無作為な配置、またはブロック配置において同一であってもよいし、異なっていてもよい；
Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、有機性基、ＦＥ基、もしくは以下の基：−Ｌ−ＲＥ−または−Ｌ−ＳＲＥ−であり得、ここでＦＥは、ＲＥまたはＳＲＥ以外の機能的なエレメントであり、Ｌは随意的なリンカー基を示し、ＲＥは認識エレメントであり、そしてＳＲＥはシグナル認識エレメントである；
Ｒ４およびＲ５は、Ｈまたは有機性基である；
Ｒ６およびＲ７は、Ｈ，有機性基、または末端基である；
Ｚは、ポリマー中の他のＺとは独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ８、ＳＨ、ハライド化合物（Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）、ＮＨ２、またはＮ（Ｒ８）２であり、Ｒ８は、Ｈまたは有機性基であるか、あるいはＡが結合される炭素で二重結合が存在する場合、Ｚは不在である。
【００５０】
整数ｎは、ポリマー中の反復単位の平均数である。代表的に、ｎは、約１０，０００に至るまでの範囲であり得るが、それは実質的な限定ではない。好ましくは、本発明の多価のリガンドにおける反復単位の数は、規定され、そして概して、２から数百、数千に至るまでの範囲であり得る。好ましい多価のリガンドは、１０から約１００までの範囲であるｎを有する。本発明の多価のリガンドはまた、ｎが、１０から約２５までの範囲、ｎが２５以上であるもの、そしてｎが５０以上であるもの、これらを包含する。ＲＯＭＰは、モノマー　対　ＲＯＭＰ触媒（つまり、イニシエーター）の比に依存して、種々の平均の長さ（つまり、種々の重合の程度（ＤＰ））のポリマーを提供し得る。本明細書中で言及される全てのポリマーの長さ（つまり、以下のｎまたはｎ＋ｍ）は、重合反応において使用されるモノマー　対　イニシエーター比によって予測される長さである。
【００５１】
ＢＢは、アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびＢＢの部分における１以上のＣＨ２が、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ９−、または−ＣＯ−で置換され得、ここでＲ９は、Ｈまたは有機性基であり得る。好ましいＢＢは、１０以下の炭素原子を有する。
【００５２】
例示的なＢＢ反復単位としては、とりわけ、以下：
【００５３】
【化６】
2004512258.tif 000003
が挙げられる。
【００５４】
ＲＥは、上記で議論されたような認識エレメントであり、その認識エレメントは、細胞レセプター、特に膜貫通レセプター、および細胞表面レセプターによって認識され、そしてこれらに選択的に結合するる多様な化学物質種、または生化学的種のいずれかであり得る。ＳＲＥは、上記に議論されたようなシグナル認識エレメントであり、そのシグナル認識エレメントは、１以上の細胞によって認識され、そして細胞による生物的な応答を誘導する多様な化学物質種、または生化学的種のいずれかであり得る；「Ｌ」は、ポリマー（オリゴマー）骨格に対するＲＥ、ＳＲＥ，またはＦＥの共有結合のための官能基を提供し得る随意的なリンカー基である。ＦＥは、上記に議論されるように、ＳＲＥ以外の化学的、または生化学的官能基である。他のＲＯＭの足場の例は、スキーム２および３に例証される。
【００５５】
上記の式のその多価のリガンドは、ｎ個のＲＥ，ＳＲＥ，または両方に至るものを包含する。具体的な実施形態において、モノマーの全ては、ＲＥまたはＳＲＥ（ＲＥ＋ＳＲＥの数はｎ）を保有する。他の具体的な実施形態において、ＲＥもＳＲＥも保有しないスペーサーモノマーの領域は、ＲＥまたはＳＲＥを保有するモノマーの領域の間に介在する。異なるモノマーに対して結合されるそのＲＥおよびＳＲＥは、同一であっても異なっていてもよい。１つの実施形態において、多価のリガンドの中のＲＥまたはＳＲＥは、全て同一である。別の実施形態において、多価のリガンドは、ＲＥまたはＳＲＥの１を超える型を包含する。具体的な実施形態において、多価のリガンドは、ＲＥもしくはＳＲＥの２つの異なる型、またはＲＥおよびＳＲＥを含む。この実施形態において、ＲＥおよびＳＲＥは、リガンドにおいて作為的に位置付けされる。好ましくは、同一のＲＥ、または同一のＳＲＥを保有するモノマーは、多価のリガンドの中でブロック（ブロックポリマーにおけるように）へとグループ化され、そしてスペーサーモノマーは、ブロック間に随意的に位置付けされる。他の実施形態において、Ｒ１およびＲ２はともに、ＲＥまたはＳＲＥを形成し得る。
【００５６】
ＲＥおよびＳＲＥは、細胞レセプターに結合するため、またはシグナルとして、それぞれ機能を十分に保持するように、ポリマー（オリゴマー）の骨格に結合される。与えられるＲＥ、またはＳＲＥのために、多価のリガンドの中に結合され得ることにおいて、いくつかの方法が有り得、各々の多価のリガンドは、結合親和性において異なるＲＥ，あるいは結合親和性、または誘導される応答のレベル、もしくは型のいずれかが異なるＳＲＥをもたらし得る。例えば、ペプチドシグナルは、ペプチドのＮ末端、ペプチドのＣ末端を経て、またはリジン側鎖のような、アミノ酸側鎖を介した結合であり得る。多価のリガンドに対するＲＥまたはＳＲＥの結合部位は、好ましくは、結合機能（ＲＥ）の喪失を最小にするか、または結合機能（ＳＲＥ）の喪失を最小にするために選択され、あるいは、結合の部位は、シグナル機能（ＳＲＥ）を最大にするために選択され得る。ＲＥまたはＳＲＥは、遊離のリガンド、または遊離のシグナル（例えば、細胞レセプターに対するＳＲＥの結合親和性は、誘導される、または模倣する遊離のシグナルの結合親和性とは異なり得る）と異なる特性を示し得るにもかかわらず、リガンドとしてのＲＥの機能シグナルとしてのＳＲＥの機能も破壊しない。ＲＥは、多様な公知の細胞レセプターのリガンドを包含し得、そして特にレクチンを包含し得る。ＳＲＥとしては、具体的にモノサッカリド（例えば、グルコース、ガラクトース）、ジサッカリド、ポリサッカリド（２を超える糖残基）、誘導体化サッカリド（例えば、アシル化サッカリド、シアル化サッカリド）、ペプチド、誘導体化ペプチド（例えば、Ｎ−ホルミルペプチド）、ペプトイド、多様な化学誘引物質、および多様なエピトープが挙げられ得る。ここで留意すべきことは、特に化学物質種、または生物学的種が、細胞の１つの型、または細胞の１つの種類に対してＲＥとして，および細胞の別の型、または細胞の別の種類に対してＳＲＥとして機能し得ることである。
【００５７】
リンカーは、骨格からＲＥ基，ＳＲＥ基，またはＦＥ基の配置を提供し得、もしくは構造的な可撓性を提供し得る。リンカーは、ポリマー中の異なるポリマーについて同一であっても異なっていても良い。ＲＥ，ＳＲＥ，またはＦＥに対して結合するためのモノマーの足場において使用されるリンカーはまた、全て同一、または異なり得る。ＲＥ基または、ＳＲＥ基の１つの型を保有する与えられる多価のリガンドにおいて、そのリンカーは、好ましくはポリマーの全体にわたって同一である。リンカーは、概して、多価のリガンドの意図される適用と適合し得るように、そしてシグナル基の機能の干渉を避けるために選択される。そのリンカーは、好ましくは直線状であり、および好ましくは１から約２０の原子の長さにおける範囲である。そのリンカーは、脂環式基（シクロヘキシル基のような）を包含し得る。そのリンカーは、リガンドの骨格、およびシグナルに対して結合するための官能基を保有するアルキル鎖であり得る。そのリンカーはまた、エーテル鎖、エステル鎖、ケトン鎖、アミン鎖、アミド鎖、またはチオエーテル鎖であり得る。具体的な実施形態において、そのリンカーは、長さにおいて１から約２０の炭素原子を有する直線状のアルキル鎖として記載され得、その中で１以上の隣接しないＣＨ２基は、−Ｏ−基、−Ｓ−基、−ＮＨ−基、−ＮＲ１０−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−ＣＯ−基，−Ｏ−ＣＯ−基、−Ｃ＝Ｃ−基、または−Ｃ≡Ｃ−基（Ｒ１０はアルキル基、またはアリル基である）に随意的に置き換えられる。リンカーＣＨ２基は、ハロゲン基、アルコキシ基、またはアルキル基と置換され得る。リンカー基がない場合、そのＲＯＭＰ骨格またはシグナル基自体は、骨格に対するシグナルの共有結合にために官能性を提供しなければならない。例示的なリンカーとしては、スキーム３において例証されるものを包含する。
【００５８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は有機基であり得る。有機基は、アルキル基、アルケニル基、およびアリール基、ならびに置換されたアルキル基、置換されたアルケニル基、および置換されたアリール基が挙げられるが、これらに限定されない。アルキル基、アルケニル基、およびアリール基のための置換は、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ１０）２、−ＳＲ１０、および−ＯＲ１０を包含する（Ｒ１０はアルキル基、またはアリール基）。アリール基はまた、アリキル基置換基またはアルケニル置換基を含み得る。有機基は、代表的に１から約２０の炭素原子を有し、好ましくは、１から約１０の炭素原子を有する。アルキル基は、直鎖、分枝鎖、または環式鎖（または、環式の部分を包含する）であり得る。アルキル基またはアルケニル基の中の１以上の隣接しない−ＣＨ２−基は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＮＲ１０（Ｒ１０はアルキル基、またはアリール基）に置き換わり得る。
【００５９】
Ｒ６およびＲ７は、１９９９年６月１７日に出願された米国特許出願第０９／３３６，１２１号に記載される末端基のような、末端基であり得、この米国特許出願は、ＲＯＭＰ法を使用する末端基を有する多価のリガンドの合成の方法の記載に関して、本明細書中でその全てにおいて援用される。末端基は、この引用した特許出願において記載されるような、潜在的な反応性基、または非反応性官能基を包含し得る。潜在的な反応性基の存在は、末端基でのポリマーの多価のリガンドの後の官能化を可能にする。末端基は、固体表面に対して結合するために官能性を包み得る。末端基は、それ自体が固体の支持材に結合され得る。潜在的な反応性基としては：アジド、ニトロ基、ジスルフィド、シアノ基、アセタール基、ケタール、カルバメート、チオシアネート、活性化エステル、または活性化酸（活性化エステル、および活性化酸は、特に求核攻撃のために活性化される適切な遊離基を包含するためである）が挙げられる。非反応性末端基としては、天然の生成物、またはそれらのアナログ（例えば、ビオチン）、金属キレート（例えば、ニトリロトリ酢酸）、金属（例えば、Ｚｎ）、および蛍光標識（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボロ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニルエチレンジアミドであるアミド誘導体化ＢＯＤＩＰＹＬ　ＦＬ　ＥＤＡ）が挙げられる。末端基はＦＥを包含し得る。
【００６０】
多価のリガンドは、ＳＲＥではない１以上の機能的なエレメントを随意的に包含する。好ましい多価のリガンドは、ＳＲＥと比較して有意により少ないＦＥを包含する。ＦＥは、上記に列挙される、または１９９９年６月１７日に「末端基」として出願された米国特許出願第０９／３３６，１２１号において記載される反応性基、または非反応性基のいずれかであり得、またはこれらを包含し得る。ＦＥはまた、酵素の機能、または他のタンパク質の機能を有し得る。
【００６１】
ＲＯＭＰ法によって調製されたとき、ともに１９９９年６月１７日に出願された米国特許出願第０９／３３５，４２０号、および同第０９／３３６，１２１号において記載されるＲＯＭＰ法のように（それは、多価のリガンドの合成の方法のためにその全体が、本明細書中に参考として援用される）、Ｒ４およびＲ５は、金属カルベン触媒から誘導される（つまり、Ｒ４およびＲ５は、金属カルベン触媒の金属カルベン炭素上の置換置であり、そして具体的な実施形態において、Ｒ４およびＲ５は、Ｈおよびフェニル基である）。ＲＯＭＰを使用するとき、Ｒ６およびＲ７は、代表的にキャッピング因子から誘導される（つまり、Ｒ６およびＲ７は、エチルビニルエーテルの場合における水素のように、電子過多のアルケンキャッピング因子上での置換置である）。
【００６２】
具体的な実施形態において、本発明の多価のリガンドは、以下の式のリガンド：
【００６３】
【化７】
2004512258.tif 000004
を含む。
ここで、ＢＢ、Ｒ１−２、Ｒ４−７は、上記で規定されるとおりである。具体的な実施形態において、Ｒ１またはＲ２のうちの１つはＨであり、およびもう１つはＬ−ＲＥである。具体的な実施形態において、Ｒ１またはＲ２のうちの１つはＨであり、およびもう１つはＬ−ＳＲＥである。具体的な実施形態において、ＲＥは、レクチン、またはレクチンの中に包含される細胞レセプターのリガンドである。具体的な実施形態において、ＳＲＥは、モノサッカリド、ジサッカリド、または約１０糖残基までを有する比較的短いサッカリドである。他の具体的な実施形態において、ＳＲＥは、ペプチドまたは誘導体化ペプチドである（例えば、Ｎ−ホルミルペプチド）。
【００６４】
別の特定の実施形態において、本発明は、以下の式の多価リガンドに関する：
【００６５】
【化８】
2004512258.tif 000005
ここで、破線は、任意の二重結合を示し、そしてここで、Ｙ（他のモノマー中のＹとは独立して）、Ｒ１〜２（他のモノマー中のＲ１〜２とは独立して）、およびＲ４〜７は、上記に定義したとおりである。特定の実施形態において、Ｙは、−ＣＨ２−である。特定の実施形態において、Ｒ１またはＲ２の一方は、Ｈであり、そしてＲ１またはＲ２のもう一方は、−Ｌ−ＲＥである。特定の実施形態において、Ｒ１またはＲ２の一方は、Ｈであり、そしてＲ１またはＲ２のもう一方は、−Ｌ−ＳＲＥである。Ｒ１またはＲ２は、一緒に−Ｌ−ＲＥまたは−Ｌ−ＳＲＥを形成し得る。なお他の実施形態において、ＳＲＥは、ペプチドまたは誘導体化されたペプチドである。二重結合が存在しない場合、環状炭素が、代表的に、さらなる水素を保持するが、これは、他の官能基（例えば、Ｒ１またはＲ２基のいずれの機能をも干渉しない１〜６個の炭素を有するアルキル基またはハロゲン化物）で置換され得る。
【００６６】
なお別の特定の実施形態において、本発明は、以下の式の多価リガンドに関する：
【００６７】
【化９】
2004512258.tif 000006
ここで、ｍは、第一のＳＲＥ（ＳＲＥ１）を保持するモノマーの数であり、ｎは、第二のＳＲＥ（ＳＲＥ２）を保持するモノマーの数である。Ｌ１およびＬ２は、上記のようなリンカーであり、これらは、同じであっても異ってもよい。すべて他の変数は、以前の式で定義されたとおりであり、破線は、任意の二重結合を示す。ｍおよびｎの両方は、最も一般的には、１〜約１０，０００までの範囲にあり得る整数であるが、これらは、より代表的には、１〜数百または数千の範囲にある。ｍの値は、ｎの値と同じであっても異なってもよい。好ましいリガンドにおいて、ｎ＋ｍは、５以上から約２００の範囲にある。本発明の多価リガンドとしては、ｎ＋ｍが、約１０と２５との間の範囲にあるリガンド、ｎ＋ｍが２５以上であるリガンド、ｎ＋ｍが５０以上であるリガンド、およびｎ＋ｍが１００以上であるリガンドが挙げられる。
【００６８】
他の例示的な多価リガンドとしては、以下の式のリガンドが挙げられる：
【００６９】
【化１０】
2004512258.tif 000007
であって、ここで、ｎ、ｍおよびｐは、３より大きい値を有する整数であり、そして他の変数は、上記に定義したとおりである；および
【００７０】
【化１１】
2004512258.tif 000008
であって、
ここで、ｎ、ｍ、ｐおよびｘは、各々１より大きい値を有する整数であり、そして他の全ての変数は、上記に定義したとおりである。これらの式の多価リガンドは、同じＲＥまたＳＲＥを有するモノマー領域の複数のブロックを含む。これらの式の多価リガンドは、１つのＲＥまたはＳＲＥを含むモノマー領域の複数ブロック、および別のＲＥまたはＳＲＥを含むモノマー領域の複数ブロックを含み得る。これらの式の多価リガンドはまた、ＲＥもＳＲＥも保持しない介在するスペーサー領域と共に、ＲＥまたはＳＲＥを保持するモノマー領域の複数のブロックを含み得る。
【００７１】
本発明の多価リガンドは、生物学系における化学シグナルの効果を制御または調節するための方法において有用である。細菌性または真核生物細胞性の走化性、白血球（特に好中球）の移動、Ｂ細胞およびＴ細胞の免疫応答、細胞凝集、およびアポトーシスのシグナル伝達への多価リガンドの適用を、本明細書以下に例示する。
【００７２】
細菌性化学誘引物質（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｓ）を保持する本発明の多価リガンドは、細菌による集落形成または生物膜（ｂｉｏｆｉｌｍ）形成を破壊するために用いられ得る。走化性は、その宿主への細菌集落形成を容易にする毒性因子である。宿主組織の集落形成の破壊は、宿主−細菌の相互作用を妨げ、集落形成を防げ、そして感染を阻害または遅延する。本発明の方法は、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ブドウ球菌感染の処置のため）およびＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラの処置のため）による集落形成の破壊に特異的に適用され得る。細菌の生存機構の一つは、機能的異質性（生物膜）を有する微小群集（ｍｉｃｒｏｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ）の形成を包含する。生物膜の形成および維持は、可溶性の低分子に基づく因子によって調節される。これらの因子は、細菌にそれらの環境を感知させるシグナル伝達経路を制御し、そして生物膜形成への変換は、２成分のシグナル伝達系によって媒介される。生物膜形成の破壊は、細菌に宿主の防御および抗生物質処置に対するより高い感受性を与え、そして感染を阻害または遅延させ得る。生物膜形成を破壊する多価リガンドは、肺の感染の予防または処置（例えば、日和見病原体であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる肺感染を処置または予防するため）に特に有用であり得る。この生物による感染は、嚢胞性線維症を有する患者を死にいたらしめる。細菌生存の別の機構は、細菌細胞密度の増加に際するビルレンス応答の誘導である。このビルレンス応答は、細胞密度の増加が感知される場合に、可溶性因子の放出によって誘導される。本発明の多価リガンドによる細胞密度の増加に対する細菌の応答の破壊は、細菌のビルレンスを制御するために用いられ得る。例えば、この方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのビルレンスの制御に適用可能である。
【００７３】
本発明の多価リガンドは、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ（シャーガス病（ｃｈｕｇａ　ｄｉｓｅａｓｅ））、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｂｒｕｃｅｉ（睡眠病）、サナダムシ、鉤虫、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（マラリア）等を含む、真核生物性の病原菌および寄生生物による感染を破壊するために同様にして用いられ得る。
【００７４】
本発明の多価リガンドは、エピトープおよび抗原に対する免疫応答を（例えばこれらの種の免疫原性を調節することによって）調節するために用いられ得る。例えば、多価リガンドは、白血球の応答（移動を含む）を刺激または阻害するために設計され得る。このような応答の刺激は、感染の除去および処置のために非自己の細胞の認識を増強するために設計され得る。多価リガンドはまた、所望の免疫反応を改善および増強するための化学シグナルに応答してＢ細胞またはＴ細胞の活性化および／または不活性化を調節するために設計され得る。Ｂ細胞およびＴ細胞は、本発明の多価リガンドで、インビトロ、インビボおよびエキソビボで処置され得る。
【００７５】
自己免疫疾患は、自己の細胞が排除に対して誤って標的される、細胞シグナル認識プロセスの異常な機能を含む。免疫系細胞のエピトープに対する細胞応答を調節する本発明の多価リガンドは、自己免疫疾患を阻害または減弱するために使用され得る。特定の実施形態において、「非−自己」として誤って認識される自己エピトープおよび特定のＢ細胞またはＴ細胞エピトープを保持するリガンドが、自己免疫応答を改善するための寛容プロセスに用いられ得る。
【００７６】
本発明の多価リガンドはまた、所望でない細胞増殖（癌）および所望でない細胞移動（転移）の処置への適用も有する。癌細胞は、癌細胞と非癌細胞とを区別する明確な表面の特徴（例えば、エピトープ）を有する。本発明の多価リガンドは、癌細胞が免疫系によって排除されるように、免疫系による非−自己細胞としての癌特異的エピトープの認識を増強するよう設計され得る。癌細胞エピトープおよびＢ細胞またはＴ細胞のエピトープを保持する多価リガンドは、癌細胞の排除を増進するための感作プロセスに用いられ得る。癌転移は、異常な細胞移動である。癌細胞の運動、接着および結合形成は、少なくとも部分的に、癌細胞と多価細胞外マトリックスとの相互作用によって媒介される。多価リガンドは、運動、接着および結合形成を阻害または防止し、従って転移を阻害するように設計され得る。
【００７７】
本発明は、ヒトにまたは獣医学での使用に適応される薬理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤との組み合わせで、治療的利益を提供するように選択されたＳＲＥ基を有する多価リガンドを含む薬学的組成物および治療的組成物を提供する。多価リガンドは、所望の薬学的応答を達成するために互いに合わされ得るか、または他の公知の薬物または治療剤（抗細菌剤および他の抗微生物剤が挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わせて投与され得る。多価リガンドは、所望の治療的利益を得るのに十分な量で薬学的組成物に存在するか、または所望の治療的利益を得るのに十分な組み合わせの量で他のリガンド共に薬学的組成物に存在する。キャリアまたは賦形剤は、所望の投与手段との適合性のために、選択された多価リガンドとの適合性のために、および患者に対する有害な効果を最小化にするために、当該分野で公知のように選択される。
【００７８】
本発明はまた、本明細書中に記載される種々の式および構造の多価リガンドの薬学的に受容可能なエステルおよび塩に関する酸付加塩は、塩基性基をその中に有する化合物を酸と接触させることによって調製され、この酸のアニオンは、ヒトまたは動物の消費に適切であると一般的に考えられている。薬理学的に受容可能な酸添加塩としては、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、および酒石酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。全てのこれらの塩は、従来の手段で、例えば、選択された酸を選択された塩基化合物と反応させることによって調製され得る。塩基付加塩は、酸性基をその中に有する化合物を陽イオンの塩基と接触させることによって同様に調製され、この塩基のカチオンは、ヒトまたは動物の消費に適切であると一般的に考えられている。薬理学的に受容可能な塩基付加塩としては、アンモニウム塩、アミン塩、およびアミド塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明の化合物の薬学的に受容可能なエステルは、従来の方法で、例えば、選択された酸との反応によって調製される。薬学的に受容可能なエステルとしては、カルボン酸エステルＲＥＣＯＯ−Ｄ（ここで、Ｄは、本発明の化合物のカチオン状態であり、そしてＲＥは、Ｈ、アルキルまたはアリール基である）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
本発明はまた、多価リガンドおよび誘導体のプロドラッグに関し、これらは、代謝される際に本発明の任意の多価リガンドを生じる。不安定な置換基は、代謝される際に除去され得る、従来の薬学的に受容可能な保護基を用いて保護され得る。薬学的に活性な化合物は、長期の代謝半減期を提供するために、所定のキャリアにおける溶解度を高めるために、ゆっくりした放出または時限放出（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）を提供するかまたは容易にするために、あるいは他の薬物輸送特性を増強するかまたはこれらに影響を与えるために、従来の方法によって誘導体化され得る。
【００８１】
本発明に従う多価リガンドは、経口投与、口腔投与、非経口投与、局所的投与または直腸投与のために処方され得る。特に、本発明に従うリガンドは、注射または注入のために処方され得、そしてアンプル中にかまたはさらなる保存剤を含む複数回用量の容器中に、単位投薬形態で提示され得る。これらの組成物は、油性または水性ビヒクル中で、懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態を取り得、そして懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に（例えば、滅菌された発熱物質フリーの水）適切なビヒクルで構成するための粉末形態であり得る。
【００８２】
本発明に従う薬学的組成物はまた、抗微生物剤のような他の活性成分または保存剤を含み得る。一般的に、本発明の薬学的組成物は、０．００１（重量）％〜９９（重量）％の本明細書に記載された１以上の多価リガンドを含み得る。
【００８３】
注射または注入による投与のために、およそ７０ｋｇの体重の成体ヒトの処置のために使用される一日の投薬量は、例えば、投与経路および患者の臨床状態に依存して、０．２ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜５ｍｇの範囲であり、これは、１〜４用量で投与され得る。これらの処方物はまた、投薬単位の処方物を包含する。これは、これらの処方物が、例えば、錠剤、糖衣剤、カプセル、キャプレッツ（ｃａｐｌｅｔｓ）、丸剤、座剤またはアンプルのように、個別の薬学単位の形態で存在することを意味する。各単位の活性化合物含量は、１個体の用量の一部かまたは複数の個体用量である。投薬単位は、例えば、１／２、１／３または１／４の個体用量について１、２、３または４個の個体用量を含み得る。個体用量は、好ましくは、一回の投与で与えられ、そして通常には１日の用量の全量、半分、３分の１または４分の１に対応する量の活性化合物を含む。特定の多価リガンドの予防学的または治療学的用量の程度は、勿論、処置される状態の重篤度、特定リガンド化合物およびその投与経路の特性により変化し得る。これはまた、個々の患者の年齢、体重および応答に従って変化し得る。
【００８４】
本発明の化合物は、好ましくは、投与前に処方される。本発明の薬学的処方物は、周知かつ容易に入手可能な成分を用いて公知の方法によって調製される。本発明の組成物を調製する際に、活性成分は、通常、キャリアと混合されるか、またはキャリアで希釈されるか、あるいはカプセル、小包（ｓａｃｈｅｔｓ）、紙または他の容器の形態でなり得るキャリア内に封入される。キャリアが希釈剤として作用する場合は、それは、固体、半固体または液体物質であり得、それらは、活性成分のためのビヒクル、賦形剤または媒体として作用する。この組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、小包、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾル（固体としてかまたは液体溶媒中に）、軟膏剤（例えば、１０重量％までの活性化合物を含む）、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座剤、滅菌注射用溶液および滅菌され密閉された粉末の形態中で存在し得る。
【００８５】
適切なキャリア、賦形剤および希釈剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩およびプロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。これらの処方物はさらに、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、保存剤、甘味剤または香味剤を含み得る。本発明の組成物は、当該分野で周知の手順を用いることによって、患者への投与後に活性成分の迅速な、持続的なまたは遅延された放出を提供するように処方され得る。
【００８６】
組成物は、好ましくは、単位投薬形態で処方され、各投薬量は、約０．５ｍｇ〜約１５０ｍｇ、より通常には約０．１ｍｇ〜１０ｍｇの活性成分を含む。用語「単位投薬形態」とは、ヒト被験体または他の哺乳動物に対する単位投薬量として適切な物理的に別個の単位をいい、各単位は、適切な薬学的キャリアと共に、所望される治療効果を生じるように計算された予め決められた量の活性物質を含む。
【００８７】
本発明はさらに、本発明の薬学的組成物から治療的利点を誘導し得る個体へ、本発明の薬学的組成物を投与する工程を包含する治療方法に関する。
【００８８】
本発明の多価リガンドは、非治療的な適用（例えば、選択された環境における生物付着（ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ）の防止および阻害、または選択された環境での所望でない細胞の排除）に使用され得る。このような非治療的な使用のための本発明の組成物は、所望の機能を得るのに有効な（例えば、サンプルまたは生物学的な系において細菌性もしくは微生物性の走化性に影響を及ぼすのに有効であるか、または細胞を凝集するのに有効である）量あるいは組み合わせの量で、本発明の１以上の多価リガンドを含有する。組成物は、所望される機能が維持される限り、任意の適切な溶媒またはキャリア系（これは、水溶液、凍結乾燥化または噴霧凍結化された物質であり得る）を用いて処方され得る。
【００８９】
以下の実施例は、本発明をさらに例示し、そしてさらに説明するが、本発明を制限することを全く意図されない。
【００９０】
（実施例）
（細菌の走化性の調節）
細菌の走化性へと導く分子的な事象は、十分に研究されており、そしてこのプロセスは、レセプター媒介性応答の一般的なモデルとして使用されてきた［２９〜３２］。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉでの走化性の間、化学誘引物質（例えば、糖およびアミノ酸）ならびに化学忌避物質（ｃｈｅｍｏｒｅｐｅｌｌｅｎｔ）は、この細菌の形質膜上の特異的レセプタによって認識される［３３］。多価リガンド活性のこれらの研究のために、ガラクトースをモデル化学誘引物質として選択した。関連化合物であるβ−メチルガラクトピラノシドもまた化学誘引物質であり、このことは、ガラクトースのアノマー炭素に置換基が結合してもその走化性活性は失われないことを示している［３４］。この観察は、ガラクトース残基がアノマー性リンカーを介して結合され得、多価的な提示を生み出すことを示唆する。ガラクトース媒介性シグナル伝達のために、サッカリドは、ペリプラズムの可溶性グルコース／ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）に結合しなければならず、このタンパク質は、次いでガラクトースを感知するケモレセプターであるＴｒｇと相互作用する［３４、３５］。Ｔｒｇへのガラクトース−ＧＧＢＰの結合は、シグナル経路を開始し、その結果、鞭毛の回転の向きが逆転し、この細菌を栄養素に向かって遊泳させる［２９、３０、３６］。
【００９１】
細菌の走化性は、広い動的範囲を備える極めて高感度な感知系を必要とする。それらのケモレセプターを介して、細菌はかなりの規模にわたってリガンド濃度の非常に小さな変化を検出し得る［３７、３８］。この顕著な特質を説明するためにＢｒａｙらによって提唱された最近の数学的モデルは、シグナル変換がケモレセプターの側方向性のクラスター形成の変化によって調節されていることを示唆する［３９〜４１］。このモデルにおいて、細菌のケモレセプターのクラスターは、レセプターのクラスターが個々のレセプターよりもシグナルの産生において活性となるように、リガンド結合情報を交換する［３９、４１］。異なる原子価を有する本発明の多価リガンドは、このレセプターを示差的に再編成し得、そして、こうして走化性応答の調節を生じ得る側方性のレセプターの組織化を制御する。
【００９２】
規定された種々の原子価を有するガラクトース保有リガンド１〜４は、ＲＯＭＰ法（スキーム１）を用いて生成された。多価リガンドのガラクトース残基は、短いリンカーを介して分子骨格（ポリマー性バックボーン）に結合される。モノマー１の相互作用は、少なくともインビトロの結合アッセイにおけるガラクトースの相互作用と同程度に有利であり、従ってリンカーの結合は、精製されたＧＧＢＰへのガラクトース結合を防止しなかった。
【００９３】
ガラクトースで官能化されたリガンド（例えば、一価リガンド１および多価リガンド３）もまた、誘引物質としてインビボと同じように作用する。これは、これらのリガンドへのＥ．ｃｏｌｉの行動応答をモニターすることによって証明された。Ｅ．ｃｏｌｉの運動行動は、二つの様式（ランニング（ｒｕｎｎｉｎｇ）およびタンブリング（ｔｕｍｂｌｉｎｇ））で生じる。これらは、鞭毛の回転の方向、および、究極的には、ケモレセプターとリガンドとの相互作用に起因するシグナル変換応答によって規定される［４２］。誘引物質の存在下の細菌は、少ないタンブリング頻度で延長されたランニング応答を起こす［４２、４３］。タンブリング頻度に対する合成リガンドの効果を観察するために、Ｓａｇｅｒらの方法［４４］を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉを、ガラクトースまたはガラクトース保有リガンドで処理し、そして細菌の運動を記録および分析した。タンブリング頻度は、誘引物質の添加後初めの５〜１５秒間で得られた経路の平均角速度（ｍｅａｎ　ａｎｇｕｌａｒ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ）を平均化することによって評価された（図２Ａ）。細菌を、漸増濃度のガラクトースで処理する場合、平均角速度は減少し、これはランニング応答を示す。図２ＢからＥは、緩衝液単独、ガラクトース、化合物１および化合物３で処理された代表的な細菌についてのサンプル経路を例示している。一価化合物１による処理は、遊離の化学誘引物質（ガラクトース）の処理と同様の効果を生み出し、このことは、化合物１におけるアノマー性置換基が走化性活性を妨げなかったことを示している。多価化合物３は、一価化合物１または修飾されていないガラクトースよりも活性であった。多価化合物３は、非常に低いサッカリド残基濃度（例えば、０．００１ｍＭ）でさえ低い平均角速度を誘導した。０．１ｍＭのサッカリド残基濃度（約０．００４ｍＭ濃度）での化合物３に対する細菌の応答は、１０倍高い未修飾ガラクトース濃度（１ｍＭ）で得られた応答に匹敵した。モノマー１と多価化合物３との間において最大活性の濃度において観察された差異は、リガンドの原子価が、走化性活性に影響を及ぼすことを証明している。
【００９４】
Ｅ．ｃｏｌｉを毛細管蓄積アッセイ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）［４５］において化合物１〜４の濃度勾配に供し、最大走化性応答が達成される濃度、および、この最大値で蓄積する細菌数を決定した［３４］。
【００９５】
化合物１〜４を、毛細管蓄積アッセイにおける誘引物質として使用した場合、オリゴマー２は、一価化合物１と同様に活性でなかった；両者は、１ｍＭで最大走化性応答を誘発した（図３Ａ）。化合物２は、このレセプターに対してガラクトースの局所的な高濃度を示した。しかし、化合物１および化合物２についての活性の類似性は、誘引物質の局所高濃度が、単独では走化性活性の増加を生じさせないことを示している。化合物３および４について、最大走化性の濃度は、有意に低く、化合物３についての最大は、０．２５ｍＭのガラクトース残基濃度（約０．０１ｍＭのリガンド濃度、遊離のガラクトースの１／１００倍）においてであり、そして化合物４についての最大は、０．１０ｍＭのガラクトース残基濃度（０．０００２ｍＭのリガンド濃度）においてである。化合物３および４の最大走化性の濃度は、それぞれ、遊離のガラクトースの１／１００倍および１／５０００倍であった（図３Ｂ）。従って、より高い原子価を有するリガンド（化合物３および４）は、極めて低濃度で走化性を誘導し得る。
【００９６】
走化性のレセプターは、おおよそ９０Å離れていることが見出された［４６］。分子モデリング研究は、オリゴマー２の最大長は、おおよそ５０Åであることを示している［２３］。オリゴマー２の長さと比べてより長いオリゴマー３および４の有意に高い能力は、長いオリゴマーが走化性レセプターをクラスター化する能力に起因すると考えられる。化合物１は、Ｅ．ｃｏｌｉ変異体であるｇｇｂｐ（ＡＷ５５０およびＡＷ５４３）またはｔｒｇ（ＡＷ７０１）に対する化学誘引物質ではかった。この得られた結果は、リガンド１から４はガラクトース感知機構を介して走化性に影響を及ぼすように特異的に作用することを示した。
【００９７】
化合物１〜４を用いたアッセイで蓄積したＥ．ｃｏｌｉの数（図３Ａおよび３Ｂを参照のこと）は、ビデオアッセイ（図２Ａを参照のこと）において観察されたこれらのリガンドの効力にもかかわらず、ガラクトースが誘引物質として使われた場合の数（１２０，０００細菌［３４］）よりも少ない。毛細管蓄積アッセイは、収集のために毛細管へ移動するための細菌の適切な再配向に依存する。これらのリガンドの効力は、細菌が再配向する能力を破壊し得、蓄積した見かけの細菌数を減少させる。多価リガンドの所定のサッカリド残基濃度において、少数の分子は、レセプターを活性化するように提示される。そして、これらの分子は外膜を横断しなければならない。この系のこれらの特徴はまた、蓄積する細菌数の減少を担い得る。
【００９８】
走化性活性において観察された原子価依存的な差異の普遍性を試験するために、そして本発明者らのリガンドに対する応答における膜透過性の役割を研究するために、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける走化性実験を行った。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、グラム陰性Ｅ．ｃｏｌｉと同様に、サッカリド化学誘引物質に応答し得るグラム陽性細菌である［４７、４８］。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの場合、多価リガンドは、初めに外膜を横切る必要はなく、直接的にサッカリド感知レセプターと相互作用し得る。グルコースは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する化学誘引物質である［４７］が、ガラクトースはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する化学誘引物質ではない。グルコース保有リガンド（化合物５〜７、スキーム１）は、毛細管蓄積アッセイにおいて示されているように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する有効な化学誘引物質であった。さらに、グルコース保有リガンドへの走化性応答は、リガンドの原子価にも依存することが示された。図４で示されているように、モノマー５は１ｍＭで最大活性を誘発し、一方オリゴマー６は、サッカリド残基濃度０．１ｍＭ（遊離グルコースの１／５０倍のリガンド濃度）で最大活性を誘発し、そしてオリゴマー７は、サッカリド残基濃度０．０１ｍＭ（グルコースの１／１２５０倍のリガンド濃度）で最大活性を誘発した。遊離の化学誘引物質シグナルであるグルコースは、０．５ｍＭで化学誘引物質として最大活性を有した。Ｅ．ｃｏｌｉとの観察と類似して、リガンドの原子価の増加とともに、最大走化性でのサッカリド残基濃度は減少する。重要なことに、オリゴマー５〜７に対して蓄積した細菌の数は、未修飾のグルコースが誘引物質として使用された場合に蓄積した数に匹敵した。ガラクトースの活性に関する以前の報告と一致して、ガラクトース保有リガンド（例えば、１）は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対する化学誘引物質ではなかった［４７］。このことはさらに、多価リガンドが特異的に作用したことを示している。観察されたこの結果は、進化的に分岐した細菌であるＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．Ｂｕｔｉｌｉｓにおいて、誘引物質の原子価は走化性応答に影響を及ぼすことを示す。
【００９９】
サッカリド保有リガンドでの処理に際した走化性レセプターの構築化の変化を可視化するために、蛍光顕微鏡実験を行った。これらの実験は、多価リガンドがケモレセプターの再構築に影響を及ぼし得るか否かを直接的に決定し得る。野生型Ｅ．ｃｏｌｉはそれらの極にケモレセプターを局在し、そして構造タンパク質であるＣｈｅＷの不活性化は、細胞におけるケモレセプターのランダムな配置を生じさせることが示された［４９］。ケモレセプターを局在化させるＲＯＭＰ由来のアレイの能力を、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｃｈｅＷ変異体を用いて実験した。細菌を化合物１、３、または４で処理し、固定し、細菌性ケモレセプターに対する抗体（抗Ｔｓｒ）で標識した。一価化合物１は、レセプターの分布に影響を与えなかったが、多価化合物３および４は、ケモレセプターの再組織化することが観察された。予期されたように、ｃｈｅＷ細胞の局在化したレセプターは、見掛け上ランダムな位置で生じた。これは、野生型細菌において観察された極性のある局在化とは対照的である。レセプターのクラスター化は、化合物３よりも長いオリゴマーの４で処理された細胞の場合には、より明確になった。これらの実験の結果は、ＲＯＭＰ由来の多価化合物はレセプターの側方性再構築を誘導し得ることを示している。オリゴマーの長さの関数として多価リガンドの走化性活性において観察された差異、およびＲＯＭＰ由来の多価リガンドがレセプターの側方性の再構築を誘導し得るという観察は、レセプターの再構築が走化性応答の媒介に関与するという結論を支持する。この結果はさらに、レセプター局在化の変化が、走化性応答の変化を生じさせ得ることを示す。
【０１００】
細菌の膜のケモレセプターの組織化を変える多価リガンドの能力を確認するために、Ｅ．ｃｏｌｉを、蛍光標識を有するガラクトース保有多価リガンドである化合物８で処理した（スキーム１）。Ｅ．ｃｏｌｉを化合物８またはフルオレセイン標識−抗Ｔｓｒ抗体で処理した場合、観察された蛍光パターンは類似していた。両物質は細菌の極で結合することが観察され、これは、ＲＯＭＰ由来のリガンドが細菌性のケモレセプターに特異的に結合することを示している。レセプターを再構築するこれらの多価リガンドの能力に直接取り組むために、ＣｈｅＷ変異体を両化合物で処理した。図６で例示するように、化合物８と共存する抗Ｔｓｒ抗体標識化ケモレセプターの斑点を観察した。この結果は、多価リガンド８は細胞レセプター組織化において観察された変化を担うことを示している。
【０１０１】
この得られたデータは、多価リガンドが細胞表面のケモレセプターの組織化を変えることによって、走化性応答に影響を及ぼすことを示す。他の観点は、これらの変化が、多価提示に起因する機能的な親和性の増加に由来するというものである。このメカニズムは可能ではあるが、リガンドの親和性変化と走化性活性とを関連付ける証拠はない。様々なリガンドについての結合平衡定数は、しばしば、細菌の走化性アッセイにおいてリガンド活性と相関しない［３４、３５、５０、５１］。これとは逆に、多くの研究によって、走化性におけるレセプターの局在化が関連付けられている［３８〜４１、４６、５２］。例えば、アセンブルされたケモレセプター四量体Ｔａｒは、個々のレセプターまたは二量体よりもインビトロのシグナル伝達において活性であることが示された［５３］。本データおよびこれらの結果を合わせると、一価化合物１対多価化合物３および４に対する走化性活性の差異は、レセプターのクラスターの原子価を制御するその能力に起因することを示唆する。これらの結果に基づいて、クラスターへさらなるレセプターを（図７Ａ〜Ｄに例示されているように）組み込むことによって、リガンド原子価の系統的な増加が走化性応答の変化を導くというメカニズムが、提唱される。
【０１０２】
リガンドの密度または間隔とは異なり、リガンドの原子価のみ異なる合成分子をＲＯＭＰを使用して作製することによって、リガンドの原子価は、ケモレセプターを組織化するその能力およびこれらのレセプターから走化性応答を引き出すその能力に影響を与えることが、示された。この結果は、本明細書に記載されているような異なる原子価（機能的部分の異なる数または規定された数）を保有する多価リガンドは、レセプターの組織化における変化を通して細胞応答を調整するために使用され得ることを証明する。さらに、リガンドの原子価は、多種の細菌（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓの両方）の走化性応答を調整するために用いられ得、このことは、本発明の方法が一般的に多種の細胞型に適用可能であることを示している。多価アレイへのＲＯＭＰに基づく合成経路は一般的であり［５４］、そしてこれは、様々な多価リガンドまたはアレイを生成するために使用され得る。このアレイは、細胞レセプター（細胞表面レセプター、膜貫通レセプターおよび細胞質レセプター）に結合する種々の型および数の化学シグナルを有し、そしてレセプターの側方性再組織化により媒介されるように、結果的に、生物学的な応答を誘発する。多価リガンドに共有結合したシグナルの型の制御およびこのリガンドに存在するシグナルの間隔および数の制御は、誘発される応答の型および大きさを調整するために使用され得る。
【０１０３】
１種類のレセプターに結合する多価リガンドは、リガンドが別種のレセプターに結合することによって誘導される生物学的応答に影響を与え得ることもまた、見出された。セリンは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌に対する化学誘引物質として作用する（ガラクトースに加えて）別の低分子である。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をガラクトースＳＲＥ保有多価リガンドである化合物２および３と初めに接触させ、２分間の適応期間後、多種の濃度のセリンを加えた。平均中間速度（度（ｄｅｇ）／フレーム（ｆｒａｍｅ））（図５ＡおよびＢを参照のこと）として測定した場合、多価リガンドの非存在下におけるセリンと比べて多価リガンドの存在下において、セリンの化学誘引物質としての効果は、約３０％増強された。多価リガンドによるガラクトース結合細胞レセプターのクラスター化は他の化学誘引物質であるセリンへの細胞応答の増強を引き起こすと、考えられる。図１を参照のこと。
【０１０４】
（好中球の走化性の調節）
好中球の移動は、細胞移動の例である。好中球は、多くの異なる内因性および外因性物質に向かって移動する。Ｎ−ホルミルペプチドは、好中球に対して化学誘引物質［６５］となる一種の外因性物質であり［６５］、これは、産物による細菌性の転写物である。好中球は、化学誘引物質に結合し、かつ化学誘引物質の濃度勾配の漸増を感知し得る細胞表面レセプターを有する。例えば，好中球は、化学誘引物質の高い濃度の方向へ移動することによって、感染部位に好中球を誘導することにより、化学誘引物質に応答する。加えて、そのような化学誘引物質に対する応答においてまた、好中球は、他の細胞、特に免疫系の他の細胞の応答に影響を与える細胞間シグナルを放出する。本発明の多価リガンドは、化学誘引物質に対する好中球の応答を増強するために、および感染性因子の免疫系によるクリアランスを増強するために使用され得る。スキーム２は、好中球の移動を調節する多価リガンドの使用のための、例示的なＮ−ホルミルペプチド２０および例示的なＮ−ホルミルペプチド２１に対する例示的なＳＲＥを例示する。これらのシグナル基（ＳＲＥ）は、スキーム２［化合物２２および２３］に例示されているようなＲＯＭＰ骨格に共有結合的にまたは非共有結合的に結合され得る。スキーム３は、Ｎ−ホルミルペプチド保有多価リガンドに使用され得る例示的なリンカーを提供する。
【０１０５】
（免疫プロセスの調節）
免疫応答の発達は、本発明の多価リガンドと免疫系細胞との原子価依存的な相互作用を介して調節され得る。免疫系によるクリアランスのための外来（非−自己）エピトープ、細胞、ウイルスまたはウイルス粒子の認識は、エピトープ、細胞、ウイルスまたはウイルス粒子を外来物質として認識する細胞レセプターに部分的に基づく。外来シグナルは、クリアランスが生じるために認識されなければならず、そして外来シグナルに対するＢ細胞またはＴ細胞応答がなければならない。適切な免疫応答は、Ｂ細胞およびＴ細胞の活性化とそれに続く不活性化を必要とする。Ｂ細胞およびＴ細胞におけるレセプターのクラスター化は、免疫応答の産生に関連付けられている。
【０１０６】
一以上のＲＥまたはＳＲＥ（これを通してリガンドがＢ細胞、Ｔ細胞または他の免疫細胞に結合し得る）を有し、かつ一以上の抗原、エピトープを有する本発明の多価リガンドは、免疫細胞の応答を調節する（抗原またはエピトープの免疫原性を増強または減少する）ために使用され得る。エピトープまたは抗原が、免疫細胞または免疫細胞が見出される免疫系によって外来物質（非−自己）と認識される場合、多価リガンドは、エピトープまたは抗原に対して免疫細胞または免疫系を寛容化するために使用され得る。この場合、エピトープまたは抗原は、有益な種または臨床的な種（細胞、粒子、核酸）または誤って外来物質（非−自己）として認識される自己細胞（または組織）のものである。これとは逆に、本発明の多価リガンドは、外来エピトープまたは抗原に対する免疫細胞または免疫系の感受性を感作または増加させるために用いられ得る。こうして、その免疫原性が高められ、そして外来エピトープまたは抗原に対する免疫応答を高める。この方法は、有用ではなかった（例えば、病原体に関連した）外来エピトープまたは抗原を用いて使用される。エピトープまたは抗原が、免疫細胞または免疫細胞が見出される免疫系によって自己として認識される場合、多価リガンドが、自己エピトープまたは抗原に対して免疫細胞または免疫系を感作するために使用され得る。この場合、このエピトープまたは抗原は、有用ではない自己細胞または高分子（例えば、癌細胞）のものであり得るか、または誤って自己として認識された外来エピトープまたは抗原であり得る。これと対照的に、本発明の多価リガンドは、誤って外来物質として認識された自己エピトープまたは抗原に対して免疫細胞または免疫系を寛容化するために使用され得る。寛容化および感作化の方法は以下に詳細に例示される。
【０１０７】
Ｃ３ｄ補体フラグメントは、Ｂ細胞のＣＲ２レセプタ−（ＣＤ２１／ＣＤ１９複合体）に結合する。クローン化されたＣ３ｄ遺伝子フラグメントと鶏卵リゾチーム遺伝子のＣ末端領域の融合による融合産物の発現は、免疫原性を、強力なアジュバンドと組み合わせられたリゾチームで達成されたレベルよりも有意に（１，０００倍）増加させ得た［６２］。スキーム４は、異なるシグナルを選択的に共有結合させることによって、ＲＯＭＰポリマー２９から調製された二つの異なるシグナル群３０を含む例示的な多価リガンドを例示する。シグナルの一つは、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）ペプチド（Ａ２０細胞株に特異的）：１０３〜１１７ＮＧＭＮＡＷＶＡＷＲＮＲＣＫＧ（配列番号：１）［６３］であり、もう一方は、ＣＲ２への結合に関与する１６マーのＣ３ｄペプチド：ＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮＶＥＡ（配列番号；２）［６２］である。このＨＥＬペプチドは、このペプチドの末端付近のリジン側鎖［４１］、またはこのペプチドのＮ末端のアミンに位置するこのポリマーの骨格［４０］に結合し得る：
４０：＊ＧＤＧＮＧＭＮＡＷＶＡＷＲＮＲ−ＣＯＮＨ２（配列番号：３）または、
４１：ＤＧＮＧＭＮＡＷＶＡＷＲＮＲＧＫ＊−ＣＯＮＨ２（配列番号：４）
ここで、＊は接着部位を示す。Ｃ３ｄペプチドは、ペプチド（４２および４３）のいずれかの末端に位置するシステインのチオールを介して多価リガンドに結合し得る：
４２：＊ＣＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮＶＥＡ（配列番号：５）または
４３：ＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮＶＥＡＣ＊（配列番号：６）。
【０１０８】
シグナル４１を単独、または４２もしくは４３との組み合わせにおいてか、あるいは４０を単独または４２もしくは４３との組み合わせにおいて含む多価リガンドは、ＨＥＬそれ自体と比較して増強された免疫応答を誘導し得る。ＣＲ２レセプターに対するリガンドである複数のペプチドエレメントを含む多価リガンドは、Ｂ細胞の表面にあるＣＲ２レセプターをクラスター化し得、そして走化性実験において証明された様にＢ細胞の他のリガンド（例えば、抗原）に対する応答を増強し得る。１以上の結合抗原と組み合わせて１以上の結合ＣＲ２リガンドを含む多価リガンドは、抗原を認識するレセプターを有するＣＲ２レセプターをクラスター化し得、そしてそれにより、抗原に対するＢ細胞の応答を増強する。Ｂ細胞表面のＨＥＬ（例として）を認識するレセプターを有するＣＲ２のクラスター化は、ＨＥＬ抗原に対するＢ細胞の応答を増強し得、そしてＨＥＬエピトープに対する免疫応答の増強を生じ得る。この種の多価リガンドの構築において使用され得る別の鶏卵リゾチームペプチドは以下である：
４４：ＥＬＡＡＡＭＫＲＨＧＬＤＮＹＲＧＹＳＬＧＮＷＶＣＡ（配列番号：７）。
【０１０９】
ＣＤ２２は、細胞接着および活性化に関与するＢ細胞表面糖タンパク質である［６４］。ＣＤ２２は、Ｂ細胞抗原レセプターのシグナル伝達において負の調節に重要である［７４］。ＣＤ２２によって認識される構造は、Ｓｉａｌ２ａ６Ｇａｌβ１４ＧｌｃＮＡｃβ（スキーム５、化合物５０）である。このシグナルは、第一チオール基（化合物５１）を介してスキーム５に例示されているようにＲＯＭＰポリマーの骨格に結合され得る。１以上のＨＥＬエピトープと組み合わせてＣＤ２２（例えば、化合物５１）に対する１以上のリガンドを有する多価リガンドは、ＨＥＬエピトープ（例えば、４２または４３）に対する免疫応答を減弱させる。
【０１１０】
（細胞のクロスリンク（凝集））
多くのタンパク質（例えばレクチンおよび抗体）は複数のリガンド結合部位を有する。これらのタンパク質が、隣接した細胞表面に固定されたリガンドに結合する場合、細胞は凝集する。細胞凝集は容易にモニターされ得、そしてこの特質は、病原体検出の診断［７５］、治療［７６から７８］、血液型検査［７９］および他のバイオテクノロジーへの応用［８０から８２］の開発における用途を見出した。多くのレクチンは、レクチンの原子価に依存してマイトジェン活性を有することが示されてきた。これらのマイトジェン性レクチンは、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を含むが、標的細胞の表面にある糖タンパク質をクラスター化し、マイトジェン性シグナルを活性化し、そして細胞増殖を誘導すると考えられている［６７，６８］。レクチンは、シグナル伝達［６９，７０］および細胞増殖［７１、７２］を研究するための有用なツールであり、そしてそれらを用いた研究は、ガレクチン（ｇａｌｅｃｔｉｎ）およびセレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）の様な、哺乳動物のレクチンについての可能性のある機能的な役割を解明した。
【０１１１】
細胞凝集を起こす際の多価タンパク質の有効性は、どれだけ強固にそのタンパク質が細胞表面リガンドに結合するかによって決定される。これらの相互作用のアビディティを高める一つの有効な方法は、リガンドの結合部位数を増加させることである［８３〜８５］。研究努力は、レクチンに対して有利なオリゴマーの形成［８６〜８７］または抗体ｓｃＦｖフラグメントの新規マルチマーの生成［８８］に向けられた。結合部位の数をさらに増加する方法、またはこれらの結合部位の至適な配向を有利にする方法は、多くの適用におけるこれらの物質の有用性を高める。
【０１１２】
レクチンは、サッカリド結合タンパク質の大きなクラスであり、その多くが、同一サブユニットの２個から４個のコピーからアセンブルされたホモオリゴマーである［８９］。レクチンは、それらが、隣接細胞表面の糖タンパク質または糖脂質とクロスリンクする場合に細胞を凝集する。凝集は、レクチンオリゴマー内の活性モノマーの数を変えることで調節され得る。例えば、４価のマンノース結合型植物性レクチンであるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）が赤血球を凝集させる能力は、このレクチンがスクシニル化（ｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ）によって低い原子価である二量体形態にされると著しく低下する［８７］。レクチンの原子価の増加は、反対の効果を有し得る（すなわち、細胞凝集を増強する）；しかし、より高次の原子価を有するレクチン複合体を生成するための方法は、容易で利用可能ではなかった。ＲＯＭＰ由来の物質の原子価は系統的に変えられ得るので、リガンドへ結合するサッカリド基（例えばマンノース）の数が、所定の骨格にアセンブルされるレクチン（例えば、ＣｏｎＡ）の数に及ぼす影響が、研究され得る。
【０１１３】
ＣｏｎＡの沈殿は、ＣｏｎＡテトラマーのクラスター形成に依存し、そしてこの技術を、不溶性ＣｏｎＡ−リガンド複合体の化学量論を決定するために使用し得る［９０］。本発明の多価リガンドとのＣｏｎＡクラスターの形成を調査するために、スキーム１に示される、規定数のマンノース残基、モノマー９およびポリマー１０〜１３（それぞれ、１０、２５、５０、または１００であるｎを有する）を含むＲＯＭＰベースの足場を、ＲＯＭＰ法［５４］を使用して調製した。化合物９〜１３をＣｏｎＡと接触させた。モノマー化合物９は、沈殿を誘導できなかったが、多価化合物１０〜１３は、ＣｏｎＡの濃度依存性沈殿を生じた。沈殿の結果は、１０（１０マー）と複合体化したＣｏｎＡの化学量論が約２：１であること、そして１１および１２とＣｏｎＡとの複合体の化学量論が約４：１であることを、さらに示した。
【０１１４】
対照的に、ダイマースクシニル化ＣｏｎＡは、試験した最高価多価リガンド化合物（例えば、化合物１２）とのみ沈殿し、そして形成した複合体は、その沈殿物において４：１（レセプター：足場）の化学量論を有した。従って、その足場により提示されるマンノース残基の数は、タンパク質−足場複合体の形成において重要である。沈殿の結果を、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）技術を用いて実質的に確認した。この技術において、化合物１０〜１２とのビオチン化ＣｏｎＡのクラスターを、高密度ストレプトアビジン−金粒子で標識した。化合物１０がダイマーのみ形成することを観察した一方、１１は、ダイマーおよびトリマーの両方を形成することができ、そして化合物１２もダイマーおよびトリマーの両方を形成したが、トリマークラスターの方をもう一方の足場よりも好んだ。
【０１１５】
溶液中でのＣｏｎＡクラスターのアセンブリーを、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってモニターし得、このＦＲＥＴにおいて、フルオレセインおよびテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）が、ドナー蛍光団およびアクセプター蛍光団として作用する［９１、９２］。これらの蛍光団が約８０Å内にある場合、フルオレセインシグナルは消光し、その結果、標識ＣｏｎＡがアセンブルしてクラスターになった場合に、フルオレセインの蛍光が減少するはずである［９３］。化合物９〜１２を、フルオレセイン標識ＣｏｎＡおよびＴＭＲ標識ＣｏｎＡの溶液に添加した。フルオレセインの蛍光発光最大値をモニターして、どの足場がＣｏｎＡクラスターの形成を促進するのかを確認した。先の実験と一致して、ＣｏｎＡクラスターは、多価リガンド１０〜１２の存在下で形成したが、モノマー化合物９とは形成しなかった。蛍光消光は、足場価だけではなく、リガンド濃度にも依存した。消光はまず、足場濃度が増加すると増加し、その後、その足場濃度がさらに増加するとまた減少した。高足場（多価リガンド）濃度での消光が存在しないことは、おそらく部位飽和が原因で、ＣｏｎＡクラスターがこれらの濃度では支持されないことを示す。ＣｏｎＡと比較して高濃度の足場は、個々のポリマーによるＣｏｎＡ上の各リガンド結合部位の占拠を好み、複数のレクチンのクラスター形成を排除する。
【０１１６】
ＲＯＭＰ誘導体ポリマー上に形成されたＣｏｎＡクラスターがＪｕｒｋａｔ細胞を凝集する能力を、最初に光学顕微鏡によって試験した（図１０を参照のこと）。ＣｏｎＡ単独では、低濃度（５μｇ／ｍＬ）であってさえ、いくらかのＪｕｒｋａｔ細胞凝集を誘導することができた。単価ＣｏｎＡリガンド（例えば、メチルα−Ｄ−マンノピラノシドまたは９）をＣｏｎＡと予め混合した場合、これらの多価ＣｏｎＡリガンドは、おそらくＣｏｎＡ−細胞相互作用を不安定化することによって、凝集を阻害した。Ｊｕｒｋａｔ細胞について、低濃度（０．５μＭ）の単価リガンドであってさえ、阻害が生じた。興味深いことに、多価化合物１０〜１２は、０．５μＭではＪｕｒｋａｔ細胞凝集を阻害しなかった。０．５μＭは、同様の条件下でＣｏｎＡクラスター形成の最適であることが示された濃度である。多価リガンドの濃度を１０倍（５μＭ）増加させると、部位飽和と一致して、凝集活性を無にした。従って、足場価および多価リガンド濃度を変化させることによって、細胞表面−レクチン相互作用を二者択一的に阻害または促進することが可能である。多価リガンドと複合体化したＣｏｎＡが細胞表面と相互作用する能力は、このようにして変化可能であった。
【０１１７】
赤血球のＣｏｎＡ媒介性凝集を多価リガンド（化合物９〜１３）の添加により制御し得ることを示した、さらなる実験を行った。ＣｏｎＡと多価リガンドとの特定の組み合わせが、図１１に示すように、ＣｏｎＡ自体と比較して増加したこれらの細胞の凝集を示した。特に、ＣｏｎＡテトラマーと多価リガンド（化合物１３）とを濃度比１０：１（テトラマーＣｏｎＡベースおよびマンノース残基の数ベース）で組み合わせると、ＣｏｎＡ単独と比較して有意に増加した凝集を示した。
【０１１８】
複数のＣｏｎＡテトラマーを含む複合体を、中間の多価リガンド濃度を使用した場合に化合物１０〜１３上で容易にアセンブルさせたが、足場の濃度が低すぎる場合または高すぎる場合のいずれかの場合では、複数のＣｏｎＡテトラマーを含む複合体は検出可能ではなかった。このような複合体が形成される濃度範囲は、ＣｏｎＡと多価リガンドの相対濃度（リガンド、ＲＥまたはＳＲＥの数ベース）に依存し、そして多価リガンドの価に依存する。このことは、任意のタンパク質との多価リガンドの任意の複合体について、一般的に真である。１つ以上のＣｏｎＡとの多価リガンドの複合体（または任意のレクチンとのこのような複合体、またはより一般的に任意のタンパク質とのこのような複合体）が形成される濃度範囲を、ＣｏｎＡ（またはより一般的にはそのタンパク質もしくはレクチン）による機能の保持を評価することによって、特定の条件下での特定の適用について、容易に決定し得る。ＣｏｎＡとの多価リガンドの複合体は、そのリガンドの濃度範囲（ＳＲＥ（例えば、マンノース）の数ベース）が約１：１〜１００：１を超えるまでの範囲である場合、その多価リガンドの価および特定の実験条件に依存して、一般的に形成される。
【０１１９】
本明細書中の結果は、一般に、多価リガンドの価および濃度が、これらの多価リガンドの多価足場上へのレクチンのアセンブリーを制御するために変化され得ることを示す。より詳細には、ＲＯＭＰ誘導体物質の価および濃度を、図９Ａ〜Ｃに示されるように、ＣｏｎＡクラスターの形成を制御するために変化させ得る。単価リガンド（および低濃度の多価リガンド）は、レクチンに結合するが、細胞凝集を阻害しない（図９Ａ）。レクチン足場複合体形成を支持する条件（すなわち、中間濃度レベルの多価リガンド）下で、複数のレクチンを、その多価リガンド上にアセンブルさせ得、そしてそのレクチンは、細胞表面と相互作用できる遊離サッカリド結合部位を保持する（図９Ｂ）。多価リガンド濃度を増加させる場合、レクチン結合部位は、複数の多価リガンドへの結合によって飽和され、レクチンアセンブリーは支持されず、そしてレクチンは、細胞表面と相互作用できない（図９Ｃ）。従って、示されるように、足場価およびリガンド濃度を、多価リガンドとのレクチンクラスター（そのレクチンは、細胞結合活性を保持する）をアセンブルするために制御し得る。さらに、足場価およびより重要なことには多価リガンド濃度を、レクチンの細胞凝集機能を阻害するために制御し得る。
【０１２０】
これらの結果は、タンパク質（例えば、レクチン）が、ポリマー足場（例えば、本発明の多価リガンドにより提供されるもの）上にアセンブルされ得ること、およびそのアセンブルされたタンパク質（レクチンを含む）が、生物学的機能を保持することを、示す。本明細書中に記載される方法を、１つ以上レクチンのポリマーアセンブリー、および１つ以上の抗体もしくは抗体フラグメントのポリマーアセンブリー（リガンド（例えば、サッカリドまたはエピトープ）に結合する能力を保持する）を生成するために使用し得る。本明細書中の方法は、一般に、多価リガンド中の認識エレメントおよびシグナル認識エレメントへの結合を介する、種々の化学物質種および生物学的物質種（特に、高分子種（タンパク質、炭化水素、核酸を含む）のアセンブリーの生成に適用可能である。
【０１２１】
（多価リガンドを使用する細胞毒性の増強）
レクチン（例えば、ＣｏｎＡ）ならびに凝集素および植物性赤血球凝集素は一般に、特定の種の細胞において毒性効果を示し得る。サッカリド基を保有する多価リガンドは、上記のように、レクチン（例えば、ＣｏｎＡ）と複合体形成し得る。適切に置換された多価リガンドに対して複合体形成したいくつかのレクチン分子を含む複合体は、そのレクチン上の結合部位がリガンド基への結合によって飽和されていない場合に、細胞を凝集するように機能し得る。より高い多価リガンド濃度（特定の条件および適用に依存し、そしてリガンド価に依存する）が使用される場合、レクチン結合部位が飽和された状態になり得、その後、そのレクチンによる細胞凝集が阻害される。所定の多価リガンドによる所定のレクチンの飽和を、経験的に容易に決定し得る。さらに、所定の多価リガンドによる任意のタンパク質の機能の飽和を、その複合体形成したタンパク質の機能を評価することによって決定し得る。
【０１２２】
多価リガンドとのレクチンの複合体は、そのレクチン自体の細胞毒性を超えて増強された細胞毒性を示すことが見出されている。図１２に示されるように、０．１μＭのＣｏｎＡで（４８時間）処理されたＰＣ１２細胞は、生存能力の明らかな喪失を示さなかった。対照的に、同じ条件下で０．１μＭのＣｏｎＡと４μＭの化合物１１との組み合わせで処理されたＰＣ１２細胞は、ほぼ３０％の生存能力の喪失を示す。レクチンに対するリガンドの濃度の比がそのレクチンのリガンド結合部位を飽和するに十分に高い、本発明の多価リガンドとのレクチンの複合体が、細胞におけるアポトーシスを誘発し得ることを、これらの結果は示す。
【０１２３】
（多価ポリマーの生成）
ＲＯＭＰを使用して、以前に記載された［５５］ように、１をオリゴマー２〜４のシリーズへと変換した。同様の条件を、オリゴマー６および７の合成において使用した［５４］。蛍光ポリマー８を、二官能性キャップ剤を用いる特異的末端標識［スキーム７］、その後の蛍光ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓから市販されている）への結合［５６］によって生成した。化合物９〜１２は、参照にて調製および試験したサンプルである［５４］。各化合物についてのポリマー化の程度（ｄｐ）を、１Ｈ　ＮＭＲによって決定した。価（ｎ）は、ポリマー化の程度（ＤＰ）の近似値であり、ここでＤＰは、ＲＯＭＰ中で使用される触媒に対するモノマーの比である。
【０１２４】
（画像顕微鏡法）
一晩培養からのＥ．ｃｏｌｉ　ＡＷ４０５（野生型走化性応答を示す）を、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ　Ｂｅｒｔａｎｉブロス）においてＯＤ５５０が０．４〜０．６になるまで増殖させ、その後、誘引物質を含まない走化性緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０μＭ　ＥＤＴＡ）で２回洗浄した。ＯＤ５５０が０．１である部分透過性細菌（２５μＭ　ＥＤＴＡで室温で３分間、その後５０μＭ　ＣａＣｌ２でクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ））を、Ｓａｇｅｒらの方法［４４］においてさらなるカバーガラスによって支持されたカバーガラス下に配置した。（透過化は、ガラクトースまたは１への細菌の走化性に対して何の効果も有さなかったが、４への走化性のために必要であった［５７］）。細菌を、ガラス表面と１〜２分間接触するように調整させた。誘引物質を、５μＬ最終体積で示される最終濃度を達成するように添加した。２８℃での細菌の動作を記録し、そして経路を、ＥｘｐｅｒｔＶｉｓｉｏｎシステムを使用して分析した。誘引物質の導入後の最初の５〜１５秒に誘導された経路を、分析した。平均角速度は、異なる日に実施された実験間で約１４％変化した。データを、Ｑ検定およびスチューデント検定を使用して分析した。
【０１２５】
（毛細管蓄積アッセイ）
一晩培養からのＥ．ｃｏｌｉを、ＬＢにおいてＯＤ５５０が０．４〜０．６になるまで増殖させ、Ｅ．ｃｏｌｉ走化性緩衝液で２回洗浄し、その後部分透過化した。細菌を、走化性緩衝液中にＯＤ５５０が０．１になるまで再懸濁し、そしてそれを、以前に記載された［４５］ように、３０℃で６０分間の毛細管蓄積アッセイにおいて使用した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＯＩ１０８５を、１０ｍＭグルコースおよび０．５％グリセロールを補充したＴブロス（１％トリプトン、０．２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．５％　ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ　ＭｎＣｌ２）での一晩培養から増殖させ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ走化性緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１０μＭ　ＥＤＴＡ、０．５％グリセロール、０．３ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４）で洗浄し、そして毛細管アッセイを、３７℃で３０分間、最終ＯＤ５５０　０．０１にて実施した［４７］。蓄積したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの数を、緩衝液単独に対して蓄積した５００の細菌に対して正規化した。毛細管アッセイの結果は、誘引物質の活性以外の要因（例えば、基質の代謝または毒性）により影響され得る［４５、５８］。この可能性を排除するために、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉが１を唯一の炭素源として使用する能力を試験した。これらの実験によって、１〜４が毒性でないこと、およびモノマー１が代謝されないこと（データは示さず）が明らかになった。データを、Ｑ検定およびスチューデント検定を使用して分析した。
【０１２６】
（免疫蛍光顕微鏡法）
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＡＷ４０５またはＲＰ１０７８（ｃｈｅＷ）を、緩衝液単独で事前処理するか、または１０μＬ総容量の走化性緩衝液中５ｍＭの化合物１、３、４、もしくは８で事前処理した。３０℃で１０分間のインキュベーション後、その細菌を固定し（ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中の２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で、３０分間、４℃）、６ウェルプレートの底にあるポリ−Ｌ−リジン処理したカバーガラス上に配置し、メタノールで透過性にし、そしてＭａｄｄｏｃｋおよびＳｈａｐｉｒｏ［４９］の手順に従って、抗Ｔｓｒ抗体（１：２５０）およびフルオレセイン標識ヤギ抗ウサギ抗体（１：５００）で標識した。抗Ｔｓｒ抗体は、保存的化学受容器細胞質ドメインを認識し、したがって複数の化学受容器と交差反応性である。いくつかの結合の排除（極で独占的な５３０ｎｍまたは５９０ｎｍの蛍光）が、抗体および８の両方を使用する二重標識実験にて観察された。蛍光顕微鏡法を、油浸レンズを使用して、１０００×でＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ上で実施した。画像を、ＩＰＬａｂ　Ｓｐｅｃｔｒａ　３．２およびＡｄｏｂｅ　ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ　５．０を使用して捕捉した。
【０１２７】
（定量的沈殿）
定量的沈殿および分析を、Ｋｈａｎら［９０］により以前に記載された方法から改変した方法によって実行した。簡単に述べると、ＣｏｎＡ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）および足場を、沈殿緩衝液（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、９０μＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１ｍＭ　ＭｎＣｌ２）中に溶解し、短くボルテックスして混合し、その後、室温で５時間（またはスクシニル化ＣｏｎＡに関しては４℃で２日間）インキュベートした。ＣｏｎＡテトラマーの最終濃度は、３０μＭであり（モノマー重量が１０４，０００であるＣｏｎＡテトラマーと仮定する）、そしてスクシニル化ＣｏｎＡダイマーは４４μＭであった（質量５２，０００であるダイマーと仮定する）。白色沈殿物を、５０００×ｇで２分間の遠心分離によってペレットにした。上清をピペットにより除去し、そしてペレットを、冷たい緩衝液で２回穏やかに洗浄した。その後、ペレットを、６００μＬの１００ｍＭメチルα−Ｄ−マンノピラノシド（スクシニルＣｏｎＡに関しては１００μＬ）中に再懸濁し、そして室温で１０分間のインキュベーションの後、完全に溶解した。タンパク質含量を、１００μＬ容積水晶キュベットを使用するＶａｒｉａｎ　Ｃａｒｙ　５０　Ｂｉｏ上で、２８０ｎｍでの吸光度をＵＶ−可視分光光度法により測定することによって決定した。測定値は、３回の独立した実験の平均である。
【０１２８】
（透過型電子顕微鏡）
ＴＥＭ法を、本質的に以前に記載された［９６］ように実施した。ＣｏｎＡテトラマーを、１〜２コピーのビオチン残基の付着を支持する条件を使用して、ビオチンで標識した。ビオチン化ＣｏｎＡテトラマーを、溶液中で目的のリガンドと混合し、その後、ストレプトアビジン結合体化した過剰の１０ｎｍ金粒子と接触させた。サンプルを、コントラストを増強するために２％ホスホタングステン酸（ｐＨ７．０）で処理（３０秒）し得る。ランダムな視野の画像を各処理について得、そしてＣｏｎＡ複合体の形成について分析した。互いに２５ｎｍ以下の内にある金粒子は、複合体の一部であると見なした。この距離は、使用した合成多価リガンドのモデル化した長さ「２３］、およびＸ線結晶解析により決定したテトラマーＣｏｎＡの構造［９７］に基づく。
【０１２９】
詳細には、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中のビオチン化ＣｏｎＡ（２．３μＭ）および足場（０．７５μＭ、マンノース濃度）を、ストレプトアビジン−１０ｎｍ金（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を最終濃度３．０μＭまで添加する前に、室温で１５分間インキュベートした。複合体を、１５分間室温でインキュベートし、その後、炭素コートしたＦｏｒｍｖａｒ処理グリッド上に配置した。グリッドを風乾し、そしてＬＥＯ　Ｏｍｅｇａ　９１２　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＥＦＴＥＭ）上で観察した。画像は、１２，５００×の倍率であった。その画像を、ＰｒｏＳｃａｎ　Ｓｌｏｗ　Ｓｃａｎ　ＣＣＤカメラ上で収集し、そしてＡｄｏｂｅ　ＰｈｏｔｏＳｈｏｐ　５．０にて分析した。視野は、平均して５個と５０個との間の金粒子であり、そして１５〜２０個の視野を、各処理について各々の日に収集した。結果は、３つの別個の日に独立したサンプルに対して実施した３つの別個の実験において得られた結果の平均である。各々の日に収集した金粒子の総数は、約８０から４００を超えるまで変動した。
【０１３０】
（蛍光共鳴エネルギー移動）
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）中のフルオレセイン−ＣｏｎＡ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＴＭＲ−ＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、最終濃度４μｇ／ｍＬおよび０．４μｇ／ｍＬをそれぞれ得るまで混合した。足場をＰＢＳ中に、示される最終濃度まで添加し、最終容量２００μＬにした。この溶液を短くボルテックスし、その後、少なくとも１５分間室温でインキュベートした。これらのサンプルのいずれにおいても、沈殿物は観察されなかった。２００μ容積水晶キュベット、励起波長４９２ｎｍ、放射波長５１５ｎｍ、および１０ｎｍスリット幅を使用して、Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｆ−４５００蛍光分光光度計上で、蛍光を決定した。放射強度は、各実験の間に実施した３回のスキャンによる、３〜５回の独立した実験の平均である。化合物９〜１２は、５１５ｎｍにて無視できる蛍光を有した。曲線を、等式：
％Ｆ＝（％Ｆｍａｘ×Ｌ）／（Ｌ＋ＩＣ５０）
を使用してフィットさせた。ここで％Ｆは、未処理に対する蛍光の変化であり、％Ｆｍａｘは、蛍光の最大回復であり、Ｌは、足場のμＭマンノース濃度であり、そしてＩＣ５０は、クラスター形成の半分最大阻害濃度（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）である。
【０１３１】
（Ｊｕｒｋａｔ細胞凝集）
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、以前に記載された［９４］ように培養し、そして維持した。細胞を、冷たいＰＢＳで３回洗浄し、次いで、Ｈｏｅｓｃｈｔ　３３３４２（１００μｇ／ｍＬ）で３０℃にて３０分間処理した。細胞を、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、その後、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の２％パラホルムアルデヒドで４℃にて３０分間固定した。固定した細胞を２回洗浄し、その後、ＣｏｎＡと足場との事前混合溶液で、２００μＬの最終容量にて処理した。ＣｏｎＡおよび足場の２×溶液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中で調製し、短くボルテックスし、その後、細胞に添加する前に２２℃で３０分間インキュベートした。細胞、ＣｏｎＡ溶液、および１００μｇ／ｍＬ　ＤＮＡｓｅ（核酸による細胞凝集を防止するため）を、２２℃で３０分間インキュベートした。細胞を、４００×ｇでペレットにし、５０μＬ　ＰＢＳ中に穏やかに再懸濁し、その後、適切なフィルターセットを備えたＺｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ上で２００×の倍率での可視化のためにスライドに加えた。約１００〜２００の細胞が、各々の日にランダムな視野から計数された。クラスターを、互いに直接接触した少なくとも２つの細胞についてスコア付けし、そして計数した対象物（個々の細胞およびクラスター）の総数のパーセンテージとして表した。結果を、図１０にまとめる。ＲＯＭＰ誘導体リガンド９〜１２単独は、細胞凝集を引き起こすことができなかった。画像を、ＩＰｌａｂ　Ｓｐｅｃｔｒａ　３．２にて捕捉し、そしてＡｄｏｂｅ　Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　５．０にて調製した。
【０１３２】
（赤血球凝集）
ＣｏｎＡ（５３ｎＭ、５μｇ／ｍＬ）およびリガンド化合物１３（５３０ｎＭ；サッカリドベース（ｂａｓｉｓ）につき）を、９６ウェルプレート中で、最終容量１００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に添加した。この複合体を、室温で１５分間インキュベートした。
【０１３３】
（細胞毒性実験）
ＨＢＳ緩衝液は、ｐＨ＝７．４のＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）およびＣａＣｌ２（１ｍＭ）を含んだ。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＣＡ）から入手し、そしてすべての実験について新たに希釈した。このＣｏｎＡストック溶液の濃度を、
【０１３４】
【化１２】
2004512258.tif 000009
（９５）を使用して決定した。その後、ＣｏｎＡの１回希釈物を作製し、そして各サンプル用に分割した。その後、適切なストック溶液から、所望の最終濃度の５倍でリガンドを添加した。すべてのサンプルは、各濃度について６つのレプリカを有した。ＨＢＳ単独、ＨＢＳ中のＣｏｎＡおよびＨＢＳ中に最高濃度のリガンドを含むコントロールサンプルを、各実行において使用した。溶解コントロールを、ＨＢＳ緩衝液単独を添加すること、および４８時間のサンプルインキュべーションの後に溶解緩衝液を添加することによって、作製した。
【０１３５】
（細胞培養）すべての細胞培養試薬を、他のように注記しない限りは、ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬから入手した。８４％（ｖ／ｖ）ＲＰＭＩ　１６４０（Ｌ−グルタミンを含む）、５％（ｖ／ｖ）熱非働化ウシ胎仔血清、１０％（ｖ／ｖ）熱非働化ウマ血清、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００００ユニット／ｍｌ）を含む培地中で、３７℃および５％　ＣＯ２の加湿インキュベーター中で、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）を増殖させた。低血清培地は、９７．５％（ｖ／ｖ）ＲＰＭＩ　１６４０（Ｌ−グルタミンを含む）、０．５％非働化ウシ胎仔血清、１％（ｖ／ｖ）熱非働化ウマ血清、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（１００００ユニット／ｍｌ）を含んだ。細胞を、コラーゲンで処理したＴ型フラスコ中で増殖させ、そしてトリプシン処理（０．０５％トリプシンおよび０．４ｍＭ　ＥＤＴＡ）によりコンフルエントで収集し、その後、新鮮な培地でクエンチした。細胞を濃縮してペレットにし（２１００ｒｐｍで１０分間）、吸引し、その後新鮮な培地中に再懸濁した。その数を、血球計およびトリパンブルーでの処理によって決定し、その後、細胞を、９６ウェルプレート（組織培養処理した）（ＣｏＳｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹから入手した）に約１５，０００細胞／ウェルで配置した。その後、プレートを、３４時間インキュベートして、細胞を接着させた。
【０１３６】
その後、その培地を除去し、そして低血清培地（８０μＬ）で置換した。その後、ＨＢＳ（２０μＬ）中のサンプルおよびコントロールを添加し、そして３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、低血清ＲＰＭＩ培地中５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））溶液１０μＬを、各ウェルに添加した。
【０１３７】
４時間後、１００μＬの溶解緩衝液（ＨＢＳ（ｐＨ＝４．７）中５０％ジメチルホルムアミド／２０％ドデシル硫酸ナトリウム）を添加し、そしてその細胞を一晩インキュベートした。その後、そのプレートを、５７０ｎｍにてプレートリーダー（Ｂｉｏｓｔａｒ）上で読んだ。細胞生存能パーセントを、以下の等式：
【０１３８】
【化１３】
2004512258.tif 000010
を使用して決定した。ここで、Ｇ０は溶解した細胞コントロールであり、Ｇｃｏｎは、ビヒクルでのみ処理したコントロール細胞であり、そしてＧ１は、ペプチドおよびビヒクルで処理したサンプルである。細胞を多価ポリマー化合物１１でまず処理し、その後ＣｏｎＡおよび適切なコントロールで処理した実験からの結果を、図１１に示す。
【０１３９】
本明細書中の記載を考慮して、特に例証されたもの以外の本発明の実施に容易に適用または適合され得る種々の代替的構造、方法、手順および技術が存在することを、当業者は認識する。本明細書中に記載されるような特性を有する多価リガンドの調製のための、広範な種類の設計および方法が存在することが、認識される。ＳＲＥの豊富な提示のために利用可能な広範な種類の分子足場、および本明細書中に記載される方法に適用または適合され得る広範な種類のＳＲＥが存在することもまた、認識される。
【０１４０】
（参考文献）
【０１４１】
【表１】
2004512258.tif 000011
【０１４２】
【表２】
2004512258.tif 000012
【０１４３】
【表３】
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【０１４４】
【表４】
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【０１４５】
【表５】
2004512258.tif 000015
【０１４６】
【表６】
2004512258.tif 000016
【０１４７】
【表７】
2004512258.tif 000017
【０１４８】
【表８】
2004512258.tif 000018
本明細書中に列挙される参考文献の全ては、その全体において、そしてそれらが本明細書中の開示と矛盾しない程度まで、本明細書中で参考として援用される。列挙される参考文献は、特に、多価リガンドの合成、および特にＲＯＭＰ法による合成についての任意の記載について、および所定の用途についてのシグナルグループの選択、特に化学誘引物質またはエピトープについての記載において、本明細書中で参考として援用される。
【０１４９】
【化１４】
2004512258.tif 000019
【０１５０】
【化１５】
2004512258.tif 000020
【０１５１】
【化１６】
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【０１５２】
【化１７】
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【０１５３】
【化１８】
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【０１５４】
【化１９】
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【０１５５】
【化２０】
2004512258.tif 000025
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の多価のリガンドが、巨大分子の集合において、および生物的な応答のエフェクターとして機能し得るいくつかの方法を図解的に例証する。
【図２】
図２Ａは、ビデオ顕微鏡動作解析実験の結果（Ｉ）である。細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を、緩衝液のみ、ガラクトース、または示されたサッカリド濃度で化合物１または３（スキーム１）を用いて処理した。その結果を、３連で実行される少なくとも５回の独立実験からの平均で示す。エラー棒を、１０秒の間隔中での毎秒の平均の間の偏差を示す。
図２Ｂ−Ｅは、緩衝液のみ（Ｂ）；１ｍＭガラクトース（Ｃ）；または１ｍＭ化合物１（Ｄ）；または１ｍＭ化合物３（Ｅ）で処理された細菌（グラム陰性菌、Ｅ．ｃｏｌｉ）のために選択されたサンプル経路である。サンプル経路は、処理された細菌集団からのそれぞれの細菌の運動に由来する。
【図３】
図３Ａおよび３Ｂは、Ｅ．ｃｏｌｉのキャピラリー累積アッセイの結果である。累積した細菌の数を、サッカリド残基上で計算された誘引物（ガラクトースまたは化合物１−４、スキーム１）の濃度に対してプロットした。（Ａ）：結果を、示された濃度で緩衝液のみ（０）、化合物１（１）、および化合物２（２）、または（Ｂ）：緩衝液のみ（０）、化合物３（３）、および化合物４（４）で満たされたキャピラリーに関して示した。１ｍＭでの垂直線は、モノマーの化合物１に関する最大の走化性の濃度を示す。このアッセイにおいて使用される濃度は、運動分析実験（図２Ａを参照のこと）において使用されるこれらと直接的には比較可能でない、なぜならキャピラリーアッセイにおいて形成される勾配は規定されないからである。結果を、２連で実行される３から６回の実験の平均とし、そしてエラー棒を、単一の標準偏差で示した。部分的な透過化処理が、４に対する走化性を得るために必要であり、そして全ての実験に関して利用した［５７］。
【図４】
図４は、ＲＯＭＰ誘導グルコースリガンド（化合物５−７、スキーム１）を使用するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのキャピラリー累積アッセイの結果である。緩衝液のみ、グルコース、またはグルコース伴有化合物５−７を、キャピラリー累積アッセイにおいて誘引物として使用した。結果を、グルコース（Ｇ）、化合物５（５）、化合物（６）、および化合物７（７）で示した。結果を、２連で実行される少なくとも４回の試みの平均とし、エラー棒を、単一の標準偏差で示す。
【図５Ａ】
図５Ａは、（Ａ）：細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を、緩衝液のみ（黒四角）もしくは１０μＭ誘引物：ガラクトース（黒丸）、化合物１（１０マー、黒三角）、または化合物３（２５マー、黒ひし形）を用いた最初の処理（その後、２分の適応期間が続く）後、セリンの漸増濃度（μＭ）で処理した；ビデオ顕微鏡動作解析実験の結果（ＩＩ）である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、（Ｂ）セリン濃度１μＭで図６Ａからとられた角平均速度のデータに関する棒グラフ。化合物３を用いた最初の処理は、セリンに対する細菌応答の有用な増強をもたらす。角平均速度は、異なる日に実行された実験間で約１４％変化したビデオ顕微鏡動作解析実験の結果（ＩＩ）である。
【図６】
図６：多価のリガンドを、特異的に化学レセプターに結合し、そしてレセプターの再組織化を誘導する。図解の例証は、ＧＧＢＰ（１２）を介したＴｒｇ（１１）に結合して蛍光標識された８（１０，５９０ｎｍ発光）を模式的に示す。Ｔｒｇを、抗Ｔｓｒ抗体（１３，５３０ｎｍ発光）で標識した。
【図７】
図７Ａ−Ｄは、合成リガンドによるレセプター認識のモデルである。（Ａ）化学レセプターは、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質膜においてダイマー（またはマルチマー）（２０）を形成することが観察され、そしてそれぞれのダイマーは、単一のペリプラズム結合タンパク質（２１）［５９，６０］と相互作用するようである。ガラクトースおよび化合物１（２２）のような１価のガラクトースのリガンドは、ＧＧＢＰ結合を経てＴｒｇと化学レセプターのダイマーからのシグナル伝達を誘導する；（Ｂ）化合物２のような、多価のガラクトース化合物（レセプターを認識するために必要な距離をまたぐことができない）は、（Ａ）についてのように個々のダイマーからシグナルを発生する；（Ｃ）化合物３または化合物４のような、十分な長さの多価のリガンドは、細胞質膜で分散型のクラスター（２５）へと化学レセプターを再組織化し得る；（Ｄ）多価のリガンドの結合価の拡大（２６）は、再組織化、および、それゆえに細菌の応答の程度をおそらく増加させる。
【図８】
図８は、本発明の多価のリガンドにおいて用いられ得る分子の足場のための種々の設計を示す。こららの型の足場は、例えば、脂環式環、芳香族環（ヘテロ芳香族環を包含する）、およびそららの組合わせを用いることにより構築され得る。足場は、２以上のＲＥ，ＳＲＥ、または両方の提示の外形を提供する。リンカーは、変化する構造を有し得、そして例えば、剛性、可撓性または分枝状であり得る。例証された構造のそれぞれにおいて、任意の強固、可撓性または分枝状リンカーが、用いられ得る。それぞれの分枝状リンカーは、１を超えるＲＥ，ＳＲＥ（またはＦＥ）に結合され得る。それぞれの構造において、１以上のＦＥ（少なくとも１つのＲＥまたＳＲＥがは残存する限り）は、１以上のＲＥまたはＳＲＥと置き換り得る。
【図９】
図９Ａ−Ｃ：結合価依存様式、または濃度依存様式において、細胞凝集を活性化または阻害するための多価のリガンドの能力の例証モデルである；（Ａ）、１価のリガンドが（３１）（９のような）、ＣｏｎＡ（３０）に結合するとき、１価のリガンドは、必然的に阻害性である。；（Ｂ）十分に低濃度、およびＣｏｎＡを伴う随意的な化学量論での多価のリガンド３２（１２のような）は、ＣｏｎＡの結合部位の占有にもかかわらず、細胞凝縮を可能にし得る（３４）；（Ｃ）多価のリガンド３２の増加される濃度（１０−１２の場合において、約５μＭ）で、ＣｏｎＡ部位は飽和になり（３５）、クラスターを分解、および細胞凝集を阻害する。
【図１０】
図１０は、ＲＯＭＰ誘導の足場上で組合されるＣｏｎＡのクラスターがジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞の凝集を形成し得ることを例証する棒グラフである。凝集物で存在するジャーカット細胞の割合を、処理に対してプロットする。１００μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬでのＣｏｎＡは、凝集を形成し得る。凝集形成は、５０ｍＭのメチルα−Ｄ−マンノピラノシド（α　ｍａｎ）の添加によって、阻害され得る。化合物９−１２を、５μｇ／ｍＬのＣｏｎＡの最終の濃度に加えて、最終の０．５μＭまたは５μＭのマンノースの濃度に添加する。結果は、少なくとも３回の独立した実験の平均であり、そしてエラー棒は単一標準偏差で示す。
【図１１】
図１１は、ＣｏｎＡ媒介の赤血球の凝集の制御である。ＣｏｎＡ単独、またはリガンド化合物１３（スキーム１、ｎ＝１００でのマンノース含有リガンド）との組合せにおけるＣｏｎＡとの処理のために、細胞と接触させた後の時間（秒）の関数としての肉眼凝集指標（％ＭＡＩ）のグラフ。使用されるＣｏｎＡの濃度は、５μｇ／ｍＬ（５３ｎＭ　ＣｏｎＡテトラマーに基づく）、およびリガンド（５３０ｎＭ、サッカリドに基づく）であった。従って、実験においてＣｏｎＡテトラマーに対するマンノース（リガンド中）の比率は、１０：１である。多価のリガンドの添加は、有意に赤血球の凝集を増強した。
【図１２】
図１２は、多価のリガンドによるＣｏｎＡの細胞毒性の増強である。多様な関数の機能としてＰＣ１２細胞の細胞生存度割合（％）を示す棒グラフ。「ＨＢＳ」は、培地コントロールであり；「ＣｏｎＡ」は、ＨＢＳ培地において０．１μＭのＣｏｎＡ（ＣｏｎＡテトラマーに基づく）での処理であり、「化合物１１」は、ＨＢＳ中の４μＭの化合物１１（サッカリドに基づく濃度）での処理であり；「ＣｏｎＡ＋化合物１１」は、ＨＢＳ中の０．１μＭのＣｏｎＡおよび４μＭの化合物１１での処理である。ＣｏｎＡに結合する多価のリガンドの添加は、ＣｏｎＡ毒性を有意に増強する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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