(57)【要約】胃幽門洞粘膜タンパク質と呼ばれる、新規グループのガストロカインが特徴付けられる。このグループの１つのメンバーは、ＡＭＰ−１８と呼ばれる。ＡＭＰ−１８のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＡＭＰ−１８タンパク質は、ヒト、マウスおよびブタについて配列決定されている。ＡＭＰ−１８タンパク質およびこのＡＭＰ−１８タンパク由来の活性ペプチドは、細胞増殖因子である。驚くべきことに、完全なタンパク質の効果を阻害し得るペプチドもまた、ＡＭＰ−１８タンパク質由来である。哺乳動物の胃腸組織の増殖および修復（回復）の細胞保護および制御は、このタンパク質の使用によって促進され、このタンパク質を炎症性腸疾患および胃潰瘍の治療の候補とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のインヒビターであって、該タンパク質は、ガストロカインと呼ばれる、単離された相同な細胞増殖刺激タンパク質の群から選択され、該タンパク質は、胃上皮細胞によって産生され、そして以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、該インヒビターは、ＫＫＴＣＩＶＨＫＭＫＫおよびＫＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶＫＥＫＫからなるアミノ酸配列を有するペプチドの群から選択される、インヒビター。
【請求項２】
胃腸障害の処置に使用される薬学的組成物であって、該組成物が、ガストロカインタンパク質由来の増殖刺激ペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項３】
前記ガストロカインタンパク質が、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
以下のアミノ酸配列：
ＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ、ＬＤＡＬＶＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ、およびＬＤＡＬＶＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫＧＬＭＹからなる群より選択される増殖刺激ペプチドを含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
胃上皮の過剰増殖に関連する疾患を処置するための医薬品組成物であって、該組成物が、請求項１に記載のインヒビターを含む、薬学的組成物。
【請求項６】
前記疾患が、結腸および小腸の疾患であり、該疾患が、潰瘍性大腸炎およびクローン病からなる群より選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
ヒトタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子であって、該タンパク質が図２に示されるアミノ酸配列を有する、単離されたｃＤＮＡ分子。
【請求項８】
マウス由来のＤＮＡ中に見出されるゲノム配列を含む単離されたＤＮＡ分子であって、ヌクレオチド配列が図４に示される、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項９】
欠失無しに発現した場合、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含むガストロカインタンパク質群のタンパク質をコードするマウスゲノムのヌクレオチド配列中に、標的化された欠失を有する、マウス。
【請求項１０】
ガストロカインタンパク質由来のペプチドまたはタンパク質を作製するための方法であって、該ガストロカインタンパク質は、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、該方法は、以下：
（ａ）該タンパク質またはペプチドをコードする配列を含む、単離されたｃＤＮＡ分子を得る工程；
（ｂ）組み換えＤＮＡ発現ベクター中に該分子を配置する工程；
（ｃ）該組換えＤＮＡ発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする工程；
（ｄ）トランスフェクトされた宿主細胞が、該ｃＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質を産生するのを可能にする環境条件を提供する工程；および
（ｅ）該宿主細胞から該タンパク質を精製する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
ガストロカインタンパク質由来のタンパク質の細胞増殖刺激活性を阻害する方法であって、該ガストロカインタンパク質は、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよびＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、該方法は、以下：
（ａ）該タンパク質をインヒビターと接触させる工程；および
（ｂ）該タンパク質の細胞増殖刺激活性に適切な環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記インヒビターが、前記タンパク質の少なくとも１つのエピトープに対する抗体であり、該エピトープは、図３の推定アミノ酸配列の７８位から１１９位までのアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インヒビターが、ＫＫＴＣＩＶＨＫＭＫＫおよびＫＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶＫＥＫＫからなるインヒビターペプチドの群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物の胃腸管上皮に対する、ガストロカインタンパク質の異なるレベルの発現の影響を試験する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項９に記載のマウスを得る工程；
（ｂ）該マウスにおける該タンパク質の欠如の影響を決定する工程；
（ｃ）該マウスに漸増レベルのタンパク質を投与する工程；および
（ｄ）該胃腸管上皮の変化を、該上皮中の該タンパク質のレベルと関連付ける工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
哺乳動物の胃腸管への損傷後に上皮細胞の遊走を刺激する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該上皮細胞を、ガストロカインタンパク質由来のタンパク質、または該タンパク質由来のペプチドを含む組成物と接触させる工程；および
（ｂ）該上皮細胞の遊走を可能にする環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
哺乳動物の胃腸管の損傷した上皮細胞の細胞保護のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該損傷した上皮細胞を、以下：
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ、
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＬＱＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫおよび
ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫ
からなる群より選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含むガストロカインタンパク質を含む組成物と接触させる工程；および
（ｂ）該上皮細胞の修復を可能にする環境条件を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記損傷した細胞が潰瘍である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
胃幽門洞粘膜タンパク質の新規グループであるガストロカイン（ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ）が特徴付けられる。ガストロカイングループの１つのメンバーは、ＡＭＰ−１８と呼ばれる。ＡＭＰ−１８ゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡ分子は、ヒトおよびマウスで配列決定され、そしてタンパク質配列がヌクレオチド配列から予測される。ブタＡＭＰ−１８のｃＤＮＡ分子が配列決定され、そして天然タンパク質の部分的配列決定によって確認される。ＡＭＰ−１８タンパク質およびその配列から得られる活性ペプチドは、細胞増殖因子である。驚くべきことに、完全なタンパク質の効果を阻害し得るペプチドも、ＡＭＰ−１８タンパク質配列から得られる。哺乳動物胃腸組織の増殖および修復の調節は、そのタンパク質またはペプチドの使用によって促進され、そのタンパク質および誘導ペプチドは治療の候補となる。
【０００２】
哺乳動物胃腸（ＧＩ）管に影響する因子の探索は、診断的および治療的薬剤の必要性によって動機付けられる。タンパク質はムチン層の一部に留まり、下にある組織の機械的（例えば潤滑剤またはゲル安定化剤）および化学的（例えば胃酸に対して、おそらく粘液ｐＨ勾配および／または疎水性バリアを維持するのを助ける）保護を提供し得る。トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ペプチドファミリーは、そのような一般的な細胞保護の役割を有すると示唆された（ＳａｎｄｓおよびＰｏｄｏｌｓｋｙ、１９９６を参照のこと）。あるいは、サイトカイン様の活性が、傷ついた上皮の修復を助け得る。トレフォイルペプチドが他の因子と共同で作用して、上皮を維持および修復し得るという示唆は、胃腸管で起こる相互作用の複雑さをさらに強調する（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、１９９７）。ＧＩ上皮の完全さの維持は、哺乳動物の持続した安寧のために必要不可欠であり、そして損傷後の創傷閉鎖は通常非常に迅速に起こり（Ｌａｃｙ、１９８８）、その後すぐに増殖および分化が続いて起こって上皮の完全さを再確立する（Ｎｕｒｓａｔら、１９９２）。従って、保護および回復は、健康な胃腸管の２つの重要な特徴であり、そして胃の比較的厳しい細胞外環境において重要であり得る。
【０００３】
ＧＩタンパク質の探索は、いくらかの成功をおさめた。ヒトおよびブタ胃細胞から単離したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列が、他の発明者と共に研究した本発明者の一人による、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｐｈ．Ｄ．論文、「新規メッセンジャーＲＮＡの特徴付けおよびブタ胃粘膜からのそのタンパク質の免疫化学的検出」１９８７年１２月において記載された。しかし、いくつかのｃＤＮＡ配列決定の誤りがあり、それは本明細書中で開示されるＡＭＰ−１８タンパク質から有意なアミノ酸変化を引き起こした。タンパク質自身は、本発明の１つの局面としてのみ単離および精製され、そして有用性を決定するために機能的分析を行なった。核酸配列が探索された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（本発明の概要）
幽門洞粘膜タンパク質１８（「ＡＭＰ−１８」）と呼ばれる新規遺伝子産物は、ガストロカインである。そのタンパク質は、ヒト、ブタ、およびマウスから得られたｃＤＮＡクローンの分析によって、胃幽門洞粘膜細胞で発見された。そのタンパク質は細胞増殖因子またはサイトカイン、より具体的にはガストロカインのグループのメンバーである。ＡＭＰ−１８ｃＤＮＡ配列は、ブタおよびヒトの両方で、長さが１８５アミノ酸のタンパク質を予測する。ヌクレオチド配列はまた、分泌タンパク質のための２０アミノ酸のＮ−末端シグナル配列を予測する。前駆体（プレＡＭＰ−１８）からのこのＮ−末端ペプチドの切断は、ブタタンパク質で確認された；この切断は長さが１６５アミノ酸、そして大きさが約１８，０００ダルトン（１８ｋＤ）の分泌タンパク質を産生する。ヒトおよびマウスゲノムＤＮＡ配列も得られ、そして配列決定された。ヒトゲノムＤＮＡは、大きさがそれぞれ１．６ｋｂ、３ｋｂ、３．３ｋｂ、および１．１ｋｂの４つの互いに重なる断片で単離された。マウスゲノムＤＮＡ配列は、単一のＢＡＣクローンで単離された。
【０００５】
ＡＭＰ−１８タンパク質と呼ばれるガストロカインは、胃幽門洞の細胞で高レベルに発現される。そのタンパク質は胃の他の部分または十二指腸でほとんど検出されず、そして試験した他の体組織で見出せないか、または低レベルで見出された。ＡＭＰ−１８は管腔表面粘膜細胞で合成され、そしてムチン顆粒と共に分泌される。
【０００６】
ヒトにおける研究によって、ヒト胃粘膜におけるＡＭＰ−１８ペプチドの位置および発現を確認される。
【０００７】
マウスおよびブタ幽門洞組織から単離されたＡＭＰ−１８の組成物は、培養中のコンフルエントな胃、腸、および腎臓上皮細胞の増殖を刺激する；ヒト、サル、イヌおよびラット細胞も反応することが示される。この分裂促進的（増殖刺激）効果は、ＡＭＰ−１８に対する特異的抗血清（抗体）によって阻害され、ＡＭＰ−１８、またはその産物、例えばタンパク質の断片の単離または合成によってタンパク質から得られたペプチドは、増殖因子であるという結論を支持する。実際、アミノ酸配列がＡＭＰ−１８タンパク質の中央領域に相当するある合成ペプチドも、増殖因子活性を有する。そのペプチドはまた、組織培養アッセイにおいて創傷修復を速め、胃粘膜損傷の回復を媒介する過程である、細胞遊走に対する刺激効果を示す。従って、そのタンパク質およびその活性ペプチドは、細胞遊走促進因子である。予期しないことに、親分子のサブドメインから得られたペプチドが、生物活性合成ペプチド、および胃抽出物に存在するそのままの天然タンパク質の分裂促進効果を阻害し得る。
【０００８】
本発明のガストロカインタンパク質およびペプチドの３つの活性が存在する。それらは細胞が遊走するのを刺激するので、そのタンパク質は細胞遊走促進因子である。それらは細胞分裂を刺激するので、分裂促進因子である。それらは上皮の完全さを維持するので（酸化剤または非ステロイド性抗炎症剤、ＮＳＡＩＤのような損傷を与える薬剤で処理した組織培養における、電気抵抗上皮細胞層に与えられる保護によって示されるように）、細胞保護剤として機能する。
【０００９】
ＡＭＰ−１８の合成は、ヒトおよび他の哺乳動物の、胃幽門洞の管腔粘膜裏打ち上皮細胞に限られる。細胞内で、タンパク質は分泌顆粒のムチンと同時局在しており、そして先端の原形質膜の上にある粘液へ分泌されるようである。Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えヒトＡＭＰ−１８は、成熟タンパク質の中央から得た増殖促進ペプチドよりも、１オーダー低い程度の濃度で、その分裂促進性効果を発揮する。最も強力な分裂促進ペプチドである、ペプチド７７−９７は、アミノ酸配列特異的なＡＭＰペプチドであり、それは線維芽細胞またはＨｅＬａ細胞の増殖を刺激しないので、細胞型特異的であるようである。活性な分裂促進因子でないあるペプチドが、濃度依存的な様式で、ペプチド５８−９９および幽門洞細胞抽出物の増殖刺激効果を競合的に阻害し得るので、特異的ＡＭＰペプチドによる分裂促進は、細胞表面レセプターによって媒介されるようである。ＡＭＰ−１８およびその誘導ペプチドは、胃および腸上皮細胞に対して多様な効果を示し、それはそれらが胃粘膜損傷後の修復に決定的な役割を果たし得ることを示唆する。これらは、細胞保護、分裂促進、回復、および酸化剤および／またはインドメタシンによる損傷後のバリア機能の成熟を含む。ＡＭＰ−１８またはそのペプチド誘導体がその多面発現性の効果を媒介する、可能性のあるメカニズムは、タンパク質チロシンキナーゼ活性の刺激、細胞ストレス後の熱ショックタンパク質発現の延長、および密着結合関連タンパク質ＺＯ−１およびオクルディンの蓄積の増強を含む。これらの生理学的効果のあるものは、トレフォイルペプチドまたはα−デフェンシン、クリプトジン３（ｃｒｙｐｔｄｉｎ３）（＞１００μＭ）のような他の胃ペプチドメディエーターの濃度と比較して、ｒｈＡＭＰ−１８（＜５０ｎＭ）で比較的低い濃度で起こり得る。免疫反応性ＡＭＰ−１８は、明らかにインドメタシン胃管栄養後にマウス幽門洞細胞によって、およびフォルスコリンに接触させた一次培養中のイヌ幽門洞細胞によって放出され、そのタンパク質は調節を受けることを示唆する。これらの結果は、ＡＭＰ−１８は、インビボにおける胃粘膜上皮の創傷治癒のような生理学的および病理学的過程で役割を果たし得ることを意味する。
【００１０】
本発明は、ガストロカインと呼ばれる単離された相同的細胞増殖刺激タンパク質のグループに関連し、それは胃上皮細胞によって産生され、そしてコンセンサスアミノ酸配列ＶＫＥ（Ｋ／Ｑ）ＫＸＸＧＫＧＰＧＧ（Ｐ／Ａ）ＰＰＫを含む。ここでＸＸはＬＱまたは空白であり得る。そのグループの単離されたタンパク質は、図７に示したようなアミノ酸配列を有する。シグナルペプチド配列を構成する２０アミノ酸を欠く、処理された形式でブタ胃上皮に存在するタンパク質は、１６５アミノ酸およびポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された約１８ｋＤの推定分子量を有する。シグナルペプチドは、小胞体（ＥＲ）を通過した後に切断される。そのタンパク質は分泌され得る。図３に示したアミノ酸配列は、ヒトｃＤＮＡ配列から導かれた。そのタンパク質の１つの実施態様を、マウスＲＮＡおよびＤＮＡから予測される配列である、図６のアミノ酸配列で示す。
【００１１】
増殖刺激（生物活性）ペプチドを、ガストロカイングループのタンパク質から得ることができる。生物活性ペプチドは、より小さく、従ってタンパク質全体よりそれらを合成するコストが低いために、タンパク質より使用に好ましい。
【００１２】
さらに、以下の方法によって修飾ペプチドを産生し得る：
（ａ）アミノ酸置換または欠失によって、未修飾ペプチドアミノ酸配列の主要なプロテアーゼ部位を排除する；および／または
（ｂ）未修飾ペプチド中のアミノ酸の修飾アミノ酸アナログを導入する。
【００１３】
本発明の１つの局面は、図３に示した位置７８から１１９までのアミノ酸配列を有する、合成増殖刺激ペプチドである。
【００１４】
別のペプチドは、図３に示した位置９７から位置１１７までのアミノ酸配列を有する。
【００１５】
別のペプチドは、図３に示した位置９７から位置１２１までのアミノ酸配列を有する。
【００１６】
別のペプチドは、図３に示した位置１０４から位置１１７までのアミノ酸配列を有する。
【００１７】
単離された生物活性ペプチドの１つの実施態様は、以下の配列のうち１つを有する：ＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ、ＬＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫ、またはＬＤＡＬＶＫＥＫＫＬＱＧＫＧＰＧＧＰＰＰＫＧＬＭＹ。ガストロカイングループのタンパク質のインヒビターの１つの実施態様は、アミノ酸配列ＫＫＴＣＩＶＨＫＭＫＫまたはＫＫＥＶＭＰＳＩＱＳＬＤＡＬＶＫＥＫＫを有する（表１も参照のこと）。
【００１８】
本発明はまた、少なくとも１つの増殖刺激ペプチドを含む薬学的組成物に関連する。
【００１９】
胃上皮の過剰増殖に関連する疾患を治療するための薬学的組成物は、ガストロカインのグループのタンパク質、またはガストロカインタンパク質から得られた増殖刺激ペプチドのインヒビターを含む。
【００２０】
結腸および小腸の疾患を治療するための薬学的組成物は、少なくとも１つの本発明の増殖刺激ペプチドを含む。そのような疾患の例は、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む。
【００２１】
細菌で発現されるヒトｃＤＮＡによってコードされるタンパク質産物ＡＭＰ−１８に対する抗体を、ウサギで産生した；これらの抗体は試験した全ての哺乳動物種（ヒト、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラットおよびマウス）の１８ｋＤの幽門洞抗原と反応し、ガストロカインを検出する有用な方法を提供する。グループのタンパク質に対する抗体は、タンパク質のペプチド内のエピトープを認識し、それは図３の位置７８から位置１１９までのアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本発明はまた、図１で示したヒトのヌクレオチド配列を有する単離されたゲノムＤＮＡ分子、およびヌクレオチド配列が図２で示された、ヒトタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子にも向けられる。
【００２３】
本発明の別の局面は、図４で示したような、マウス由来のＤＮＡで見出されるゲノム配列を有する単離されたＤＮＡ分子である。
【００２４】
ゲノムＤＮＡは、遺伝子の胃発現のために調節エレメントを含むので重要であり、従って調節エレメントを単離し、そして胃組織でガストロカイン以外の遺伝子配列を発現するために使用し得る。
【００２５】
本発明の１つの局面は、欠失無しに発現した場合、本発明のガストロカイングループのタンパク質をコードする、マウスゲノムのヌクレオチド配列に標的化された欠失を有するマウスである。
【００２６】
本発明の１つの局面は、ガストロカインタンパク質またはガストロカインタンパク質から得られるペプチドを作成する方法である。その方法は以下のものを含む：
（ａ）図２に示したような配列を有する単離ｃＤＮＡ分子を得る；
（ｂ）組換えＤＮＡ発現ベクターにその分子を配置する；
（ｃ）組換えＤＮＡ発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトする；
（ｄ）トランスフェクトされた宿主細胞がｃＤＮＡ分子によってコードされるタンパク質を産生するのを可能にする環境条件を提供する；および
（ｅ）宿主細胞からタンパク質を精製する。
【００２７】
発現が成功した宿主細胞は、バキュロウイルスを含み、それは商業的および研究使用のために大量のガストロカインを提供することを可能にする。例えば、シグナルペプチドを持たないヒトＡＭＰ−１８タンパク質を産生した。
【００２８】
Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換えヒトタンパク質ＡＭＰ−１８は、図１４、左パネルの配列を有する。
【００２９】
本発明の１つの局面は、哺乳動物の胃腸管において上皮細胞の増殖を刺激する方法である。その方法は、以下の工程を含む：
（ａ）上皮細胞を、ガストロカインタンパク質またはそのグループのタンパク質から得られたペプチドを含む組成物と接触させる；および
（ｂ）上皮細胞の増殖を刺激する環境条件を提供する。
【００３０】
そのグループのタンパク質の細胞増殖刺激活性を阻害する方法は、以下の工程を含む：
（ａ）タンパク質をインヒビターと接触させる；および
（ｂ）タンパク質の細胞増殖刺激活性に適当な環境条件を提供する。
【００３１】
インヒビターは、タンパク質の少なくとも１つのエピトープ、例えば図３の推定アミノ酸配列の位置７８から位置１１９までのアミノ酸配列を有するエピトープに対して産生された抗体、または表１のもののようなインヒビターペプチドであり得る。
【００３２】
哺乳動物胃腸管上皮に対するタンパク質の異なるレベルの発現の影響を試験する方法は、以下の工程を含む：
（ａ）不活性なまたは空白のガストロカインタンパク質を有するマウスを得る；
（ｂ）マウスにおけるタンパク質の欠如の影響を決定する；
（ｃ）マウスに増加するレベルのタンパク質を投与する；および
（ｄ）胃腸管上皮の変化を、上皮中のタンパク質レベルと関連付ける。
【００３３】
ガストロカインに対する抗体を使用して、定量的免疫学によってそのレベルを測定するキットが企図される。レベルを、疾患の状態および治療効果と関連付け得る。
【００３４】
哺乳動物の胃腸管に対する損傷後の上皮細胞の遊走を刺激する方法は、以下の工程を含む：
（ａ）上皮細胞を、タンパク質から得られたペプチドを含む組成物と接触させる；および
（ｂ）上皮細胞の遊走を可能にする環境条件を提供する。
【００３５】
哺乳動物の胃腸管の傷ついた上皮細胞の細胞保護の方法は、以下の工程を含む：
（ａ）損傷した上皮細胞を、ガストロカイングループのタンパク質またはタンパク質から得られたペプチドを含む組成物と接触させる；および
（ｂ）上皮細胞の修復を可能にする環境条件を提供する。
【００３６】
傷ついた細胞は、潰瘍を形成し得る。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
（１．概要）
新規遺伝子産物、ガストロカイングループのメンバーを、ブタ胃の異なる領域から得たｃＤＮＡライブラリーの差次的スクリーニングによって、哺乳動物の胃幽門洞粘膜において検出した。ｃＤＮＡ配列は、シグナルペプチドリーダー配列を含む１８５アミノ酸のタンパク質を予測した。ｃＤＮＡをヒトライブラリーからも単離した。ブタおよびヒト間の、予測されたアミノ酸配列同一性は７６．３％である。その配列は、分泌タンパク質に特徴的な２０アミノ酸のシグナルペプチドを予測した。このＮ−末端シグナルペプチドの切断は、ブタタンパク質で確認された。細菌で発現したヒトｃＤＮＡの産物に対する抗体を、ウサギで産生した；これらの抗体は、試験した全ての哺乳動物種（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラットおよびマウス）の１８−２０ｋＤ幽門洞抗原と反応した。ｍＲＮＡレベルと一致して、ＡＭＰ−１８タンパク質は、胃幽門洞においてのみ高レベルに発現する；胃の残りの部分または十二指腸ではほとんど検出されず、そして様々な他の試験した組織では検出されなかった。ＡＭＰ−１８は、管腔表面粘膜細胞で合成される；免疫電子顕微鏡検査は、これらの細胞の分泌顆粒中にＡＭＰ−１８の位置を突きとめる。マウスおよびブタの幽門洞組織由来の部分的に精製されたＡＭＰ−１８調製物は、培養細胞においてコンフルエントな胃および腎臓上皮細胞に対して分裂促進性である；この効果は、特異的抗血清によって阻害され、ＡＭＰ−１８、すなわちその産物は増殖因子であることを意味する。
【００３８】
ＡＭＰ−１８は、おそらく粘液とともに分泌され、おそらくペプチド誘導体として、粘液ゲル中で機能して上皮の完全さを直接的に維持する、そしておそらく病原体に対して作用する。培養中で上皮細胞系統に対して観察される増殖因子活性を考慮して、ＡＭＰ−１８またはそのペプチド誘導体は、胃上皮のオートクリン（そしておそらくパラクリン）因子として作用するようである。ＡＭＰ−１８の機能は、単純に分裂促進因子としてだけでなく、それに加えて成熟管腔表面細胞を補充するシグナルを提供する分化因子として作用し得る。ＡＭＰ−１８タンパク質またはその誘導体は、高度に機能的な胃粘膜の正常な維持におそらく重要であり、および損傷後の幽門洞上皮の回復に決定的な役割を果たしているようである。このタンパク質はどの出版物においても特徴付けられていないが、関連する核酸配列がＥＳＴとしておよび同様の全長遺伝子として報告された。ＥＳＴデータの限界が、本発明で開示されたような、開始配列、シグナルペプチド、または生物活性を担うタンパク質の配列についての情報を産生できない。多くのこれらＥＳＴが哺乳動物の胃ｃＤＮＡに関して報告されたが、関連するＥＳＴが膵臓および妊娠子宮のライブラリーに関しても報告された。これら他の組織におけるＡＭＰ−１８ＲＮＡの発現は低いようであるが（膵臓に関してＰＣＲ分析によって示されたように）、これらの結果は、この増殖因子は胃で見出される特異的な高レベルの発現によって示されるよりも広い発達的役割および生理学的役割を有し得ることを示唆する。
【００３９】
ＡＭＰ−１８タンパク質は、胃腸（ＧＩ）管の細胞層の表面に発現しているようである。発現細胞は、貯蔵された増殖因子を必要な場所−表面損傷に起因して、細胞修復が必要なＧＩ管の陰窩および割れ目に放出し得る。
【００４０】
ＡＭＰ−１８は、漿膜側の基底外側細胞表面レセプターを通して作用するプロスタグランジンおよび他の増殖因子と共同で、上皮細胞の粘膜、先端表面に作用し得る。そのタンパク質またはその誘導体は、おそらく胃の機械的ストレスおよび高酸性にもかかわらず、高度に活動的な胃粘膜の正常な維持に重要である。ＡＭＰ−１８は、アルコール、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、または病原体、特に、主に幽門洞に優勢に感染しそして胃潰瘍およびおそらく癌の原因であるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉのような因子による損傷後の胃上皮の修復に決定的な役割を果たし得る。
【００４１】
（２．生物活性）
ＡＭＰ−１８アミノ酸配列の中央領域に相当する合成ペプチド（４２アミノ酸、「４２マー」）も、増殖因子活性を有し、それは特異的抗血清によって阻害される；いくつかの関連するより短いペプチドも刺激活性を有するが、他は４２マーの活性を阻害し得る。この結果は、飽和可能な上皮レセプターがＡＭＰ−１８のために存在し、そしてタンパク質の生物活性領域を分析し、そして推定レセプターを同定する直接的な道を開く。ＡＭＰ−１８は、公知のサイトカインまたは細胞保護タンパク質（トレフォイルペプチドのような）のいずれとも構造が類似していないので、タンパク質、ならびにその活性および阻害性の関連ペプチドの、細胞との相互作用の分析は、細胞増殖調節に関与する新規分子相互作用を明らかにする機会を提供する。
【００４２】
ＢＳＣ−１細胞の増殖は、ゲル画分ブタ幽門洞抽出物によって刺激された；ブタ抽出物タンパク質（２５０μｇ）を、２つのレーンそれぞれに負荷し、そしてポリアクリルアミドゲル（１２．５％）で電気泳動を行なった；Ｍｒ１４ｋＤａおよび２１．５ｋＤａの間の各領域から５つの薄切片（２−３ｍｍ）を、実験的レーンから切り取った。切片の各対を、２００μｌの滅菌ＰＢＳ、３％のアセトニトリル、および１％のＢＳＡを含むシラン処理マイクロチューブに入れ、そして浸軟した；タンパク質を２２℃で１８時間、激しく振とうしてゲルから溶出した；試料を次いでマイクロ遠心し、そして上清の試料を、ＢＳＣ−１細胞のコンフルエントな培養物に加えた；細胞数を４日後に計測した；最大の増殖刺激が、約１８ｋＤａのＭｒに対応するゲル切片から溶出された抽出物を加えた培養物で観察された；培養培地に加えた組換えヒトＡＭＰ−１８に対する抗血清は、１８ｋＤａ画分による増殖刺激を完全に阻害した（＋Ａｂ）；値は２つの培養の平均である；ＳＥは平均の１０％より少ない。
【００４３】
ＡＭＰ−１８の生物活性（胃腸管の上皮細胞に関して分裂促進性）は、タンパク質のＣ−末端側の半分に位置する。エピトープ配列は、分裂促進性配列のすぐＮ−末端側にあるようである。
【００４４】
増殖因子である生物活性は、全長タンパク質配列の位置７８位から１１９位までの少なくとも４２アミノ酸からなるペプチドによって示される。この領域に対する抗体は、分裂促進活性を阻害した。１０４から１１７までのアミノ酸配列を有するペプチドは分裂促進活性を有していたが、この領域に対する抗体はその活性を阻害（阻害）しなかった。位置９７位−１１７位までのアミノ酸配列を有するペプチドは、４２アミノ酸配列を有するペプチドと同じ分裂促進活性を有するが、合成ペプチドとして産生するのにより安価である。
【００４５】
（３．生物活性の阻害）
マウスまたはブタ幽門洞細胞抽出物によって刺激された上皮細胞の増殖は、完全、組換えヒトＡＭＰ−１８前駆体タンパク質に対するウサギ抗血清によって阻害された；ＢＳＣ−１細胞のコンフルエントな培養物を調製した；マウスまたはブタの幽門洞細胞抽出物を調製し、そしてそのタンパク質濃度を測定した；細胞抽出物単独および異なる希釈の抗血清、または抗血清単独（１：１００希釈）を培養培地に加え、そして細胞数を４日後に計測した。マウス幽門洞ガストロカインによる増殖刺激は、１：４００の希釈の抗血清によって最大阻害され（９３％）、一方ブタ幽門洞タンパク質抽出物による刺激は１：１００の希釈で完全に阻害された。記録した値は３つの培養の平均であった；平均の標準誤差（ＳＥ）は平均の１０％より低かった。
【００４６】
ＡＭＰ−１８タンパク質に対する抗体は、インビボで胃腸管における異なるレベルのタンパク質を決定する診療的な使用法を有する。もし通常より低いレベルのＡＭＰ−１８タンパク質が存在するなら、潰瘍が発達する可能性がある。当業者に公知の技術によって正常値を決定する、すなわち試験する人々の代表的な試料を得て（年齢、性別、臨床状態カテゴリー）、そしてタンパク質定量の標準的な技術を適用する。ＡＭＰ−１８レベルに対するアスピリンおよびインドメタシンの効果も、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）を含む薬物の有害なレベルをモニターするために有用である。胃癌細胞系統は、少なくとも本明細書中で開示される検出方法によっては、ＡＭＰ−１８タンパク質を発現しない。
【００４７】
（４．ゲノムＤＮＡ）
おそらく遺伝子が活性であり得る組織における遺伝子発現レベルの大きな違いを決定する、遺伝子調節エレメントの分析に対する前置きとして、ゲノムＡＭＰ−１８ＤＮＡ配列が、ヒトおよびマウスでクローニングされた。上流および下流側面配列を、遺伝子ノックアウトの準備としてマウスゲノムＤＮＡから単離した。側面ゲノム配列が、おそらく胃およびそれが発現し得る少数の他の組織における非常に異なる遺伝子発現レベルを決定する。異なる調節エレメントの関与によって、ガストロカイン遺伝子は他の組織において増殖因子として発現され得る。
【００４８】
（５．本発明のガストロカインの使用）
ＡＭＰ−１８タンパク質およびそれ由来のあるペプチドは、胃および腸上皮細胞（および腎臓）による増殖および創傷修復を刺激し得るので、これらのガストロカイン分子は、薬剤学的介入、放射線治療、または手術の後の損傷されたＧＩ管の修復を速める治療的薬剤の候補である。それに加えて、ガストロカインに対して発達させた抗体を、多様な病理学的状態における血液組織のＡＭＰ−１８タンパク質またはペプチドのレベルを測定するためにキットで使用し得る。これらの新規分子は、胃潰瘍、および炎症性腸疾患の治療において大きな治療的可能性を有し、一方その機能を阻害する新規薬剤は、ＧＩ管の癌の治療に有用であることを示し得る。
【００４９】
胃は、多くの細菌にとって生来の場所ではなく、そして酸性で生存し得る細胞はそこに定着しない（Ｒｏｔｉｍｉら、１９９０）。従って、幽門洞領域が、ヒト人口の大部分に感染し（７０年目までに＞６０％）、そして胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍（Ｇｏｏｄｗｉｎら、１９８６；Ｂｌａｓｅｒ、１９８７）、および胃腺癌（Ｎｏｍｕｒａら、１９９１；Ｐａｒｓｏｎｎｅｔら、１９９１）に関連する原因である、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉの接着、侵入、および細胞溶解効果の好ましい部位であることは興味深い。従って上皮細胞増殖因子として、ＡＭＰ−１８は細菌の侵入および細胞溶解によって引き起こされた損傷を改善するために作用し得る。ＡＭＰ−１８の特異的幽門洞発現およびＨ．ｐｙｌｏｒｉの好ましい結合部位を合わせて考慮すれば、その細菌はＡＭＰ−１８を刺激因子（ｔｒｏｐｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）として使用することが可能である。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉはフコースを含むムチン顆粒を有する幽門洞細胞に結合する（Ｆａｌｋら、１９９３；Ｂａｃｚａｋｏら、１９９５）。これらの顆粒はまた、ＡＭＰ−１８も含み得る。両生類Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓの胃で、抗菌ペプチドが発見された（Ｍｏｏｒｅら、１９９１）。ＡＭＰ−１８構造のいくつかのドメインは、マガイニンのものと類似しており、そしておそらくＡＭＰ−１８は腸細菌と相互作用する。
【００５０】
（６．ブタＡＭＰ−１８の単離）
ヒトＡＭＰ−１８タンパク質に対する抗血清を使用して、ブタ幽門洞粘膜の抽出物からタンパク質を精製するのを補助した。全組織抽出物に適用した免疫親和性方法はあまり効果的でないことが判明したが、細胞画分をモニターするためのイムノブロット、勾配遠心分離およびゲル電気泳動を使用することによって、十分な量のブタ１８ｋＤａポリペプチドを精製して、天然Ｎ−末端は、シグナルペプチドの除去のために正確に予測されるアラニン−アスパラギン酸部位における、ＯＲＦのＮ−末端からの２０アミノ酸の切断によって予測されるものであることを、配列決定によって確認した。成熟タンパク質におけるアスパラギン残基が豊富さにもかかわらず、糖鎖付加に特徴的なコンセンサスな状況に合うものは存在しない。タンパク質のかなり長い領域が、両親媒性ヘリックス（ｈｅｌｉｘ）形成傾向を有し得る。後者は、処理後に生物活性ペプチドを産生するタンパク質内のユニットに相当し得る。円二色性を用いて、ヒトプレＡＭＰ配列（図３）のアミノ酸１２６−１４３に相当する合成ペプチドは、マガイニン型の抗菌ペプチドを含むいくつかの生物活性ペプチドのヘリックス傾向を評価するために使用される、中程度のトリフルオロエタノール濃度の条件で、容易にヘリックスになるよう誘導される（例えばＰａｒｋら、１９９７を参照のこと）。
【００５１】
（７．Ｅ．ｃｏｌｉにおける活性組換えヒトＡＭＰ−１８の調製）
２０アミノ酸の疎水性シグナルペプチド配列を、６ヒスチジン残基のスターチ（ｓｔａｒｃｈ）を含むＮ−末端１２アミノ酸ペプチドで置換した、ヒトＡＭＰ−１８をコードするｃＤＮＡを設計した（図１３、左のパネル）。この改変ｃＤＮＡ配列の発現は、１７７アミノ酸タンパク質産物（Ｍｒ１９，６５３）を産生することが予測され、それをＨｉｓ−６タグに結合するＮｉ−ＮＴＡ樹脂を用いて容易に精製し得る。Ｎ−末端シグナルペプチドをコードする領域を欠くｃＤＮＡ配列（図１４を参照のこと）を、ＱＥ３０発現ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）のＢａｍＨＩ部位へ産物を挿入する適当なリンカーを提供するオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによって増幅した；組換えベクターの配列を確認した。Ｈｉｓ−６タグで操作した組換えヒト（ｒｈ）ＡＭＰ−１８を、続いてＥ．ｃｏｌｉ細胞で発現した。それを回収するために、細菌を溶解し、そして可溶性および不溶性画分のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後ｒｈＡＭＰ−１８前駆体に対する特異的ウサギ抗血清を用いてイムノブロットを行なった。発現したタンパク質は、溶解物の可溶性画分にはほとんど検出されなかった。
【００５２】
尿素（６Ｍ）を採用して、不溶性画分からタンパク質を放出し、Ｈｉｓ６−タグを含むｒｈＡＭＰ−１８を可溶化し、そしてＮｉ２＋荷電樹脂への結合に利用可能にして、続いてそれからイミダゾールの勾配（０〜２００ｍＭ）で溶出した。溶出されたｒｈＡＭＰ−１８の量を、ＢＣＡアッセイを用いて測定し、そして予測された１９−２０ｋＤａの大きさにおける単一バンドの出現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてイムノブロッティングによって確認した。溶出されたｒｈＡＭＰ−１８が復元して分裂促進性の構造をとるかどうか決定するために、溶出物のアリコートを（透析によって尿素およびイミダゾールを除去した後）、ＩＥＣ−１８細胞の培養物に加え、そして細胞数を４日後に計測した。図１３（右のパネル）は、組換えタンパク質は、分裂促進性ＡＭＰペプチド７７−９７（または図１１に示したブタ由来の可溶性幽門洞組織抽出物）を刺激するのと同じ最大程度細胞の増殖を刺激するが、ペプチド７７−９７より１オーダー低い程度の最大半減濃度で刺激することを示す。ＡＭＰペプチド７７−９７は成熟タンパク質を指す；ヒト前駆体タンパク質のペプチド９７−１１７と同じである：表１。これらの観察は、多様な臨床的状況で利用し得る生物学的に活性な組換えヒトＡＭＰ−１８が入手可能であることを示す。ｒｈＡＭＰ−１８の分裂促進能力は、インビボで胃の維持および修復に関与するネイティブな胃細胞増殖因子で予測されるナノモルの範囲である。
【００５３】
（８．ＡＭＰ−１８および誘導ペプチドによる胃および腸上皮細胞の増殖および回復の刺激）
ＡＭＰ−１８に反応する胃および腸細胞の能力を特徴付けるために、ＡＧＳ胃腺癌細胞、ＳＶ４０ラージＴ抗原で形質転換したＨＡＥヒト胃幽門洞粘膜初代培養物、ＩＥＣ−６（図１５）およびＩＥＣ−１８系統のラット二倍体小腸上皮細胞、ＮＣＩＮ−８７胃癌腫細胞、およびＳＫ−ＧＴ５胃食道腺癌細胞を研究した；ヒトＷＩ−３８線維芽細胞およびＨｅＬａ細胞を非ＧＩコントロール細胞系統として扱った。細胞を目的の薬剤に曝露して３〜４日後に細胞数計測を行ない、単一細胞を調製するために培養をトリプシン処理し、そして血球計算器でそれらを計測しながらこれを確認することによって、分裂促進をアッセイした。
【００５４】
ＡＭＰ−１８を含む幽門洞抽出物、ペプチド７７−９７、またはＥＧＦはそれぞれＡＧＳ細胞の増殖を刺激し、そして予測されたように、組換えヒトＡＭＰ−１８前駆体タンパク質に対するウサギ抗血清は、幽門洞抽出物の活性を阻害したが、エピトープを欠くペプチド７７−９７の活性は阻害しなかった（図１１）。ペプチド７７−９７による増殖刺激は、ＥＧＦのものと相加的であった。ＡＧＳ細胞の増殖は、スクランブルペプチド７７−９７またはペプチド６７−８５によって刺激されず、そしてペプチド６７−８５はペプチド５８−９９による増殖刺激を完全に阻害する。ＨＡＥ細胞を使用して、ＡＭＰ−１８がその合成の局所環境に存在する上皮細胞に対して効果を発揮し得るかどうかを試験した。Ｄｒ．Ｄｕａｎｅ  Ｓｍｏｏｔ、Ｈｏｗａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって提供されたこれらの細胞は、完全に不死化されておらず、そして従って限られた継代数を有する。ペプチド７７−９７によるＨＡＥ細胞の増殖刺激は、明らかにＥＧＦのものと相加的である（図１６、左のパネル）。ＡＭＰペプチドは増殖を刺激するだけでなく、遊走促進因子としても作用し、コンフルエントな培養物において作られた引っかき傷に、より迅速な細胞の遊走（回復）を引き起こす。この創傷回復の増強も、ＥＧＦと高い相加性を示した（図１６、右のパネル）。相乗作用が存在するかどうかにかかわらず、観察された相加性は、ＡＭＰ−１８がインタクトなまま胃粘膜上皮の維持、および損傷後の修復の促進に重要な役割を果たし得ることを支持する。ラット二倍体ＩＥＣ−６細胞の増殖もまた、幽門洞抽出物、ペプチド７７−９７、およびＥＧＦによって刺激されたが、ペプチドはＥＧＦより強力な分裂促進因子であるようであった（図１５）。最大に近い増殖刺激が、０．５μｇ／ｍｌ（０．２３μＭ）のＡＭＰペプチド濃度で検出され（図１５、中央のパネル）、それは培養物中でその効果を発揮するのにトレフォイルペプチド（１μｇ／μｌ）（約１５０μＭ）またはα−デフェンシン、クリプトジン３（ｃｒｙｐｔｄｉｎ３）（６６０μｍ／ｍｌ）（約１４０μＭ）で必要な濃度よりも非常に低い値であった。ＩＥＣ−１８細胞に対するｒｈＡＭＰ−１８の最大分裂促進効果は、５ナノモルで観察された（図１８）。ペプチド７７−９７の分裂促進効果を、ＩＥＣ−６細胞における［３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの組込みを測定することによって確証し、それはペプチドによって１６，６６８±６１６から２８，０３６±８８２まで６８％（Ｐ＜０．００１）刺激された。創傷回復の刺激は、ＥＧＦと匹敵し、そして明らかにそれと相加性であった。スクランブルペプチド７７−９７は、８μｇ／ｍｌまでの濃度で、ＩＥＣ−１８細胞またはＢＳＣ−１細胞の増殖を刺激しなかった。胃ＮＣＩＮ−８７細胞および胃ＳＫ−ＧＴ５細胞もまた、ペプチド７７−９７、幽門洞抽出物、またはＥＧＦによって濃度依存的な様式で刺激された。ＡＭＰ−１８抗血清は、幽門洞抽出物またはＥＧＦの分裂促進効果を、濃度依存的な様式で阻害した。ＡＭＰ−１８抗血清は、これら２つの胃上皮細胞系統に対する幽門洞抽出物の分裂促進効果を阻害したが、ペプチド７７−９７またはＥＧＦの増殖効���は阻害しなかった。免疫前の血清は、増殖に影響しなかった。これらの結果は、ＡＭＰ−１８およびそのペプチド誘導体は、インビボで機能して損傷後の修復の間に増殖および回復を刺激し得ることを示唆する。ＡＭＰペプチド７７−９７は、８μｇ／ｍｌまでの濃度において、ヒト線維芽細胞（ＷＩ−３８）または類表皮細胞（ＨｅＬａ）の増殖を刺激せず、その分裂促進効果は比較的上皮細胞特異的であることを示唆する。
【００５５】
（９．ＡＭＰ誘導ペプチドによるＩＥＣ−１８細胞増殖の競合的阻害）
細胞表面におけるＡＭＰペプチドおよびその結合部位の間の相互作用についてさらなる情報を得るために、非形質転換ラットＩＥＣ−１８細胞を研究した。非分裂促進性ペプチド６７−８５の濃度を徐々に増加させることは、もしこの分裂促進性４２マーがレセプターによるメカニズムによってその効果を発揮するならば、ペプチド５８−９９による増殖刺激を阻害する。３日間のアッセイで、ペプチド５８−９９は、ビヒクルによる２９０％と比較して、細胞数の４０７％の増加を刺激した。ペプチド６７−８５の濃度を約０．１μｇ／ｍｌまで徐々に増加させると、ペプチド５８−９９の増殖刺激効果はほとんど消失した（図１７）。この結果は、その２つのペプチドは同じ表面「レセプター」部位に対して競合することを示唆する。
【００５６】
（１０．ＡＭＰ−１８に対する抗血清は、ｒｈＡＭＰ−１８の分裂促進効果を中和化する）
進行中の研究は、ＡＭＰ−１８前駆体に対するウサギ抗血清は、イムノブロットでｒｈＡＭＰ−１８を認識することを明らかにする。その抗血清はまた、ブタ幽門洞組織抽出物（図１１）およびＡＭＰペプチド５８−９９の分裂促進効果も阻害し、そしてヒトおよびマウスの胃幽門洞組織の細胞においてＡＭＰ−１８を免疫学的局在決定する。図１８は、抗血清がＩＥＣ−１８細胞のコンフルエントな培養物において、ｒｈＡＭＰ−１８の分裂促進効果を中和化することを示し、それによってネイティブなタンパク質と同様に組換え体を研究するためにその有用性を広げる。
【００５７】
ＧＩ上皮細胞を用いて、結果は、ｒｈＡＭＰ−１８の細胞保護効果は、密着結合（ＴＪ）タンパク質の蓄積を促進する能力によって媒介され得ること、およびそれは強力な分裂促進因子であることを示唆する。その結果はまた、ＡＭＰペプチド７７−９７は、その生理的効果を発揮するのに比較的より高い濃度を必要とするが、そのペプチドはｒｈＡＭＰ−１８の適切な代理であることを意味する（図１３）。
【００５８】
ｒｈＡＭＰ−１８の収率を改善するために、ＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテルを使用し、リゾチームを加えてＥ．ｃｏｌｉ細胞の破片を消化し、そして組換えタンパク質を１ＭのイミダゾールでＮｉ２＋ビーズから溶出する。
【００５９】
（１１．ＡＭＰペプチドは、引っかいて傷つけた後の胃および腸の上皮細胞の回復を刺激する）
図１９に示したデータは、分裂促進効果が細胞数の増加によって検出され得る前の時間、ＡＭＰペプチドへの曝露の２４から４８時間後に得られた。その結果は、ＡＭＰペプチドが引っかき傷をつけたＨＡＥ系統のヒト胃腺癌由来の細胞、およびＩＥＣ−１８系統の非形質転換ラット腸細胞における回復を刺激することを示す。従ってＡＭＰペプチドは、培養物中で胃および腸の上皮細胞の回復を迅速に刺激し、そしておそらくインビボで損傷した胃粘膜の再舗装（ｒｅｓｕｒｆａｃｅ）を速め得る。
【００６０】
（１２．ＡＭＰペプチドはチロシンキナーゼ活性を誘導し、このことは、その機能的効果が細胞表面レセプターによって媒介されることを示唆する）
ＡＭＰ−１８の生理学的効果は特異的であり、そしてレセプター媒介性であるという証拠を得るために、ＡＭＰペプチドを試験して、それがＧＩ上皮細胞においてチロシンリン酸化を誘導するかどうかをみた。
【００６１】
ＩＥＣ−１８細胞をＡＭＰペプチド７７−９７で、以前に、６０分までの異なる時間で最大増殖刺激のために必要なものより多いことが示された濃度で処理した。次いで細胞を溶解し、タンパク質を抽出し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、ブロットし、そしてブロットを４Ｇ１０抗ホスホチロシンモノクローナル抗体でプローブした。そのブロットは、細胞をＡＭＰペプチド（８μｇ／ｍｌ）に曝露させることが、２分後に、いくつかのタンパク質（４２ｋＤａおよび５５ｋＤａの分子量を有するものを含む）のチロシンリン酸化を引き起こすことを示し、このことは、ＡＭＰ−１８シグナル伝達における活性化ＥＲＫ１および活性化ＥＲＫ２の役割を示唆する。５分後に、いくつかのタンパク質のチロシンリン酸化の程度が減少し、そして他は６０分まで持続した。
【００６２】
ＡＭＰペプチドおよびおそらくＡＭＰ−１８は、その分裂促進、遊走促進、および細胞保護効果を、細胞表面レセプターを通してシグナル伝達し、そして特異的細胞タンパク質のチロシンリン酸化を刺激する可能性がある。
【００６３】
（１３．ＡＭＰペプチド７７−９７は、上皮細胞のバリア機能の発達を増強し、そして細胞保護的である）
バリア機能の維持は、胃管腔から外来性の抗原および細菌の侵入を防ぐために、および電解質、水および栄養素の特定の方向への輸送のような他の機能のために必要不可欠である。単独でまたは他の薬剤と協同で作用して、ＡＭＰ−１８は粘膜損傷後の迅速なバリア機能の復帰を媒介し得る。ＡＭＰペプチド７７−９７がバリア機能の発達を促進し得るかどうか、および反応性酸素代謝物、インドメタシン、またはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）が、粘膜の透過性を増加させ、そして上皮密着結合を維持するために必要な細胞の完全さを傷つけた場合に、機能の損失を防止する細胞保護剤として作用し得るかどうかを決定するために、上皮密着結合のマーカーとして比較的高い値のＴＥＲを示すことが知られている細胞系統を使用した。最初に、ペプチド７７−９７は、よく特徴づけされた、非形質転換ＭＤＣＫ細胞の単層培養においてＴＥＲの成熟を調節する。図２０は、ペプチドへの曝露は、２４時間までに、そしてその後より高い程度まで単層におけるＴＥＲを増加させることを示す。この観察は、ＡＭＰ−１８またはＡＭＰペプチドが損傷後のＧＩ上皮の回復を速め、そしてバリア機能の発達を増強し得ることを示唆する。
【００６４】
ＡＭＰペプチドが、粘膜酸化損傷の組織培養モデルにおいてバリア機能を保護するかどうかを決定するために、細胞単層に、モノクロラミンを用いて反応性酸素代謝物損傷を与えた。図２１の結果（パネルＡ）は、モノクロラミンに曝露し６０分後、ビヒクルまたはＥＧＦで処理したＭＤＣＫ細胞は、ＴＥＲのかなりの損失を示し、一方ペプチド７７−９７で処理した培養物のＴＥＲは、損傷していない単層と同様であることを示す。それは、ＡＭＰペプチドはこのセットの条件下で細胞保護的であるがＥＧＦはそうではないことを示唆し、一方以前に、これら２つの分子は胃および腸の上皮細胞に同等および相加的な分裂促進因子および遊走促進因子であることが見出されたので、これらの結果は非常に興味深い。ペプチド７７−９７の細胞保護効果はまた、酸化剤（図２２、パネルＢ）またはインドメタシン媒介性（パネルＣ）損傷の設定で、ヒト結腸腺癌系統由来のＣａｃｏ２／ｂｂｅ（Ｃ２）細胞においても明らかであった。
【００６５】
（１４．ＤＤＳ損傷後のＡＭＰペプチドの細胞保護効果）
ＡＭＰペプチドの、インビボで大腸炎において細胞保護効果を発揮する潜在的な能力を評価するために、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）の溶液を、結腸上皮のモデルに使用したＣ２細胞単層の培養培地に加えた。バリア機能のＤＳＳ媒介損傷を、これらの単層培養におけるＴＥＲを測定することによって定量した。図２２は、ＤＳＳ（４％）が４５分後にＴＥＲをコントロール値の約３０％に抑制したこと、そしてＡＭＰペプチドが細胞保護的であったことを示す。この観察は、ＡＭＰペプチドを、ＤＳＳ媒介大腸炎のマウスモデルにおいて治療薬として評価する、強力な生理学的原理を提供する。
【００６６】
ＡＭＰペプチドが、ＩＢＤを治療するために設計された薬剤の非常に求められている機能的特徴である、ＤＳＳ誘導結腸細胞損傷後のＴＥＲの回復を速め得るかどうか決定するために、Ｃ２細胞単層をＤＳＳ（５％）に１０分間接触させ、これは、ＴＥＲをコントロール値の３３±６％に抑制した。ＤＳＳを、培地を吸引し、そして新しい培地と交換することによって除去した。ＡＭＰペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）またはビヒクルを培養培地に加え、そして１８時間後にＴＥＲを測定した。ビヒクルの存在下で、ＴＥＲはコントロール値の３３％から６６±７％まで増加し、一方ＡＭＰペプチドに曝した細胞はコントロールの１１２±４％の値に達した。ＤＳＳ媒介大腸炎の組織培養モデルにおけるその有益な結果は、ＡＭＰペプチドがインビボで損傷結腸上皮におけるバリア機能の回復を速め得ることを示唆する。
【００６７】
（１５．結腸上皮細胞におけるＡＭＰペプチドの細胞保護効果は、増加した密着結合タンパク質の蓄積によって媒介され得る）
図２１Ｂは、ＡＭＰペプチド７７−９７が、酸化損傷後のＣａｃｏ２／ｂｂｅ（Ｃ２）細胞における経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）の減少を鈍らせることを示す。そのペプチドがどのようにその細胞保護効果を発揮するのか調査するために、Ｃ２細胞単層を、ＡＭＰペプチドで処理し、そして１８時間後にモノクロラミンで酸化損傷を誘発した。特異的密着接合（ＴＪ）タンパク質のレベルの変化をチェックした。細胞を溶解し、そして不溶性／微粒子画分のタンパク質を、イムノブロッティングによって研究した。図２３は、０時、および酸化剤誘発損傷の６０分後において、ビヒクルで処理した細胞よりもＡＭＰペプチドで処理した細胞においてより多くの免疫反応性ＺＯ−１およびオクルディンが存在することを示し、これらＴＪタンパク質がより豊富にあり、それによって単層におけるＴＥＲの損失を鈍らせ、そしてバリア機能を保持することを示唆する。これらの観察は、ＡＭＰペプチドは、細胞が酸化損傷を受ける前の１８時間にＴＪタンパク質の蓄積を増強したことを示した。非損傷細胞を研究し、そしてＡＭＰペプチド（またはｒｈＡＭＰ−１８）は、未処理細胞と比較して、免疫反応性ＺＯ−１およびオクルディンの量を迅速に増加させたことを示した（図２４）。これらの変化は、いくつかの他のＴＪタンパク質（ＺＯ−２、クローディン−１、クローディン−２、クローディン−５）または熱ショックタンパク質（ＨＳＣ）７３で観察されなかったので、ＺＯ−１およびオクルディンに比較的特異的なようである。
【００６８】
（１６．ｒｈＡＭＰ−１８の細胞保護効果）
十分な量の精製ｒｈＡＭＰ−１８を調製して、モノクロラミン媒介酸化損傷後のＣａｃｏ２／ｂｂｅ（Ｃ２）細胞における経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）の減少を鈍らせたＡＭＰペプチド７７−９７と比較して、ｒｈＡＭＰ−１８が細胞保護的であるかどうかを試験した（図２１Ｂ）。図２５は、モノクロラミンへの曝露が、４５分でＴＥＲを約３５％に抑制し、一方ｒｈＡＭＰ−１８またはペプチド７７−９７で前処理した細胞が約１０％のＴＥＲの減少しか示さなかったことを示す。図２６は、８時間のｒｈＡＭＰ−１８によるＣ２細胞の処理が、ビヒクルで処理した細胞と比較して、免疫反応性ＺＯ−１およびオクルディンの量を増加させることを示す。これらの結果は、ＡＭＰ−１８はその細胞保護効果を、特異的ＴＪタンパク質の蓄積を増強することによって媒介し得、そしてそれによって粘膜損傷後のＧＩ管に沿ったバリア機能を保持し得ることを示唆する。
【００６９】
（１７．ＡＭＰペプチドの投与は、ＤＳＳ誘発大腸炎を有するマウスにおいて糞中の血液の出現を遅らせ、そして体重減少を抑制する）
ＡＭＰペプチドの治療的有効性を評価するために、マウス（各１２−１５グラム）に飲料水中３％のＤＳＳ（Ｍｒ３６−４４ｋＤａ）を与えることによって、ＤＳＳ大腸炎をＣ５７／ＢＬ６オスマウスで誘発した。大腸炎の証拠（糞中の血液）は、早くて１日目に（図２７、左のパネル）、そして４日目までに全ての動物で見出された。毎日皮下（ｓ．ｃ．）注射によって投与されたＡＭＰペプチドは、潜血（ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ）−陽性糞の出現を遅らせ、そしてまた体重減少の程度も抑制した（図２７、右のパネル）。これらの肯定的な発見は、大腸炎およびＧＩ管の粘膜表面を傷つける他の疾患における有用な治療薬としてのＡＭＰペプチドを強力に支持する。
【００７０】
ＡＭＰ−１８の合成は、ヒトおよび他の哺乳動物の、胃幽門洞の管腔粘膜裏打ち上皮細胞に限られている。細胞内で、そのタンパク質は分泌顆粒中でムチンと同時局在しており、そして先端の原形質膜の上にある粘液に分泌されるようである。Ｅ．ｃｏｌｉで調製された組換えヒトＡＭＰ−１８は、成熟タンパク質の中央由来の増殖促進ペプチドよりも１オーダー低い程度の濃度で分裂促進効果を発揮する。最も強力な分裂促進ペプチドであるペプチド７７−９７は、アミノ酸配列特異的であり、そしてそれは線維芽細胞またはＨｅＬａ細胞の増殖を刺激しないので、細胞型特異的であるようである。特異的ＡＭＰペプチドによる分裂促進は、活性分裂促進因子ではないあるペプチドが、ペプチド５８−９９および幽門洞細胞抽出物の増殖刺激効果を、濃度依存的な様式で競合的に阻害し得るので、細胞表面レセプターによって媒介されるようである。ＡＭＰ−１８およびその誘導ペプチドは、胃および腸上皮細胞に対して多様な効果を示し、それはそれらが胃粘膜損傷後の修復に決定的な役割を果たし得ることを示唆する。これらは細胞保護、分裂促進、回復、および酸化剤、ＤＳＳ、および／またはインドメタシン媒介損傷後のバリア機能の成熟を含む。ＡＭＰ−１８またはそのペプチド誘導体がその多面発現性の効果を媒介する可能性のあるメカニズムは、タンパク質チロシンキナーゼ活性の刺激、細胞ストレス後の熱ショックタンパク質発現の延長、ならびに／または密着結合関連タンパク質ＺＯ−１およびオクルディンの増強された蓄積を含む。これら生理学的効果のあるものは、トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）ペプチドまたはα−デフェンシン、クリプトジン３（＞１００μＭ）のような他の胃ペプチドメディエーターの濃度と比較して、ｒｈＡＭＰ−１８（＜５０ｎＭ）で比較的低い濃度で起こり得る。免疫反応性ＡＭＰ−１８が、明らかにインドメタシン胃管栄養後にマウス幽門洞の細胞によって、およびフォルスコリンに接触させた一次培養中のイヌ幽門洞細胞によって放出され、これは、そのタンパク質は調節を受けることを示唆する。ＡＭＰ−１８は、インビボで胃粘膜上皮における創傷治癒のような生理学的過程および病理学的過程で役割を果たしているようである。マウス大腸炎のＤＳＳモデルにおいて血液性糞の出現を遅らせ、そして体重減少の程度を抑制するＡＭＰペプチドの能力は、ＧＩ管の粘膜を損傷する多様な疾患（炎症性腸疾患、胃潰瘍等）における治療的有効性を示唆する。
【００７１】
（材料および方法）
（１．幽門洞特異的ｃＤＮＡクローンの単離）
胃酸分泌ならびに粘膜および膵臓細胞の増殖を調節する（Ｙｏｏら、１９８２）胃腸（ＧＩ）ペプチドガストリンのｃＤＮＡクローンを単離した。これらのスクリーニングから、胃の幽門洞において比較的特異的に発現されるいくつかの他のｍＲＮＡを発見した。これらＲＮＡの１つにおけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ブタおよびヒトの間で高度に保存されており、そしてすぐに明らかな機能を持たない新規保存タンパク質を予測した。特異的抗体を使用して、同様のタンパク質種が、試験した全ての哺乳動物の胃幽門洞粘膜に存在することを示した。これらの配列の発現に組織特異性が存在し、そしてそれらは明らかに哺乳動物種の幽門洞粘膜に普遍的に存在する。
【００７２】
（２．ＲＮＡ発現）
ｃＤＮＡクローンの単離が、胃幽門洞の粘膜における選択的な発現について予測され、そしてこれは、最初にｃＤＮＡ配列でプローブした様々な組織由来のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションによって、そして続いてタンパク質分析によって確認された。ノーザンブロットは、ブタの胃腸管内におけるｍＲＮＡ発現の特異性を示した。最も高いｍＲＮＡ発現は、幽門洞粘膜であり、隣接する体の粘膜では変動する量、そして底、食道および十二指腸では検出不可能なレベルであった。幽門洞および体の非粘膜組織は、ｃＤＮＡプローブに反応するＲＮＡをほとんど含んでいなかった。
【００７３】
（３．発現されたタンパク質に対する抗体）
ヒトおよびブタｃＤＮＡクローンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、非常によく似た比較的低分子量（ＭＷ）のタンパク質を予測し、それはコンピューターデータベースの公知のタンパク質と近いホモログを有さず、そして従って可能性のある機能についてほとんど示さない。推定タンパク質の生物学的役割を研究するアプローチとして、Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグもコードするベクターを用いて、全ｃＤＮＡ配列をＥ．ｃｏｌｉで発現させた。不運なことに、細菌で発現した場合、そのポリペプチド産物は不溶性であり、そして生化学的研究のために容易に分析できない。しかし、ヒトｃＤＮＡの細菌産物を、抗血清を誘発するためにウサギで免疫原として使用したドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルで分離した。その血清を、多くの哺乳動物種由来の幽門洞組織のタンパク質抽出物に対してスクリーニングした。この手順は、免疫原と試験した哺乳動物の幽門洞に発現する約１８ｋＤａのタンパク質とのどちらも認識し得る、いくつかの高力価、低バックグラウンドの抗血清を産生するのに成功した。細菌で発現したタンパク質は、シグナルペプチド配列およびＨｉｓ６タグを含むので、よりゆっくり移動する。免疫前血清は、有意な１８ｋＤａ反応性を示さなかった。ヒトｃＤＮＡクローンから発現したタンパク質に対して産生された抗血清の、様々な哺乳動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラットおよびマウス；最後はＳＤＳゲルにおいて常にわずかにより速く移動する）由来の幽門洞抽出物の非常によく似たＭＷのタンパク質との交差反応性は、ヒトおよびブタｃＤＮＡのＯＲＦの比較によって予測されたアミノ酸配列の保存のレベルを支持する（図１０を参照のこと）。続く実験において、シグナルペプチドを有するヒトＡＭＰ−１８を細菌で産生した。
【００７４】
免疫前血清は、全ての組織抽出物のウェスタンブロットでわずかな反応を与えるが、２つの免疫血清（１：５００００希釈までで）はどちらも１８−２０ｋＤａの主なバンドのみを与え、それらは胃幽門洞抽出物においてのみであり、そして隣接する体抽出物においてはより少ない程度である。その血清は、細菌で発現したタンパク質に対して産生したので、動物起源の他の外来性免疫原の可能性は存在しない。
【００７５】
イムノブロットによって決定されたように、幽門洞に対する発現の特異性は、ノーザンブロットが示唆するよりも大きく、そして幽門洞抽出物からのシグナルの強度は、タンパク質が比較的豊富にあることを意味するが、定量的推定は行なわなかった。試験した非胃組織において有意な抗原は検出されなかった。
【００７６】
免疫組織化学は、両方の免疫前血清による幽門洞組織のわずかな染色を示し、一方両方の免疫血清は、表面粘膜細胞をかなりの希釈で非常に強力に染色した。免疫前血清は、免疫電子顕微鏡研究における免疫金染色を引き起こさなかった。幽門洞抽出物の増殖因子活性は、両方の免疫血清によって阻害されるが、免疫前血清によって阻害されない。最後に、増殖因子活性を有し、免疫血清によって阻害されるが免疫前血清によって阻害されず、そして免疫血清によって認識されるが免疫前血清によって認識されないエピトープを有する合成ペプチドの結果は、これら試薬の特異性をさらに確認する。
【００７７】
（４．ブタ胃粘膜組織由来のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション）
全ＲＮＡを電気泳動し、膜に移動させてそして標識したブタＡＭＰ−１８ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。各レーンのＲＮＡ試料の供給源は以下の通りである：１．遠位十二指腸；２．近位十二指腸；３．幽門洞；４．隣接する体；５．底；６．食道。等量のＲＮＡを負荷した。幽門洞に隣接する体のＲＮＡからのシグナルは変動した。サイズマーカー（ヌクレオチド）を、比較のために同じゲルに流した。
【００７８】
（５．ヒト幽門洞特異的ｃＤＮＡクローンによって指示された、細菌で発現したタンパク質に対して産生されたウサギ抗血清を用いたイムノブロット）
全組織タンパク質を、ＳＤＳ緩衝液に溶解し、電気泳動し、そして膜に移動させて免疫血清（１：５００００）と反応させた。結合した抗体分子を、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を用いて検出した。免疫前血清は、１：２００希釈で同時に行なったブロットの特異的染色を与えなかった。レーン：１、６、１３、１７はマーカーを含んでいた。２ＨｅＬａ細胞。３マウスＴＬＴ細胞。４発現ヒトタンパク質＋ＨｅＬａ細胞。７マウス体。８マウス幽門洞。９マウス十二指腸。１０マウス腸。１１マウス肝臓。１２発現ヒトタンパク質＋ＴＬＴ細胞。１４マウス幽門洞。１５マウス脳。１６マウス腎臓。１８ブタ幽門洞。１９マウス幽門洞。
【００７９】
高パーセントアクリルアミドゲルのイムノブロットは、抗血清が合成ペプチド７８−１１９のエピトープを認識したことを示した。配列のこの領域は、タンパク質の表面に露出しており、そして抗原性であることが予測されたので、ペプチド７８−１１９の抗体との反応は予期しないものではなかった。これは、ＡＭＰ−１８またはその直前の前駆体が上皮細胞の増殖因子であるという考えをさらに実証するだけでなく、ＡＭＰ−１８の生物活性（および抗原性）領域の分析の基礎、および細胞レセプター数および同一性を評価する道具を提供する。ペプチドの化学合成はまた、さらなる細胞研究のために、かなりの量の精製「野生型」および「変異」試薬の簡便および迅速な供給源を利用可能にする。それらの最大効果は相加的でないので、合成ペプチド７８−１１９は、明らかに幽門洞タンパク質と同じメカニズムで作用する。
【００８０】
（６．プレＡＭＰオープンリーディングフレームの配列および予測される構造）
ヒトおよびブタの予測アミノ酸配列は７６％同一である。予測されるシグナルペプチドは目立たない；天然ブタＡＭＰのＮ−末端は、アスパラギン酸であることが示された（図１０）。
【００８１】
（７．天然タンパク質の構造）
ヒトおよびブタｃＤＮＡのＯＲＦは、同様の一般的構造を有するポリペプチドを予測した（図１０）。他に未修飾のヒトおよびブタタンパク質の予測される分子量は、それぞれ１８．３および１８．０であった；これらの値は、本発明の抗血清と反応する幽門洞タンパク質のＳＤＳにおける電気泳動移動度とよく一致する。
【００８２】
抗血清を使用して、ブタ幽門洞粘膜の抽出物からのタンパク質の精製を助けた。全組織抽出物に適用した免疫親和性方法は、あまり有効でないことが示されたが、細胞分画をモニターするためのイムノブロット、勾配遠心、およびゲル電気泳動を使用することによって、十分な量のブタ１８ｋＤａポリペプチドを精製し、配列決定によって、天然Ｎ−末端が、正確にシグナルペプチドの除去のために予測されるアラニン−アスパラギン酸部位におけるＯＲＦのＮ−末端から約２０アミノ酸の切断によって予測されたものであることを確認した。アスパラギン残基は豊富にあるが、糖鎖付加のコンセンサスコンテキストにあうものはなかった。両親媒性ヘリックス形成傾向を有し得るかなり長い領域。後者は、タンパク質内のユニットまたは処理後のペプチドに相当し得る。円二色性を用いて、ヒトプレＡＭＰ配列（図３）のアミノ酸１２６−１４３に相当する合成ペプチドは、マガイニン型の抗菌ペプチドを含むいくつかの生物活性ペプチドのヘリックス傾向を評価するために使用される、トリフルオロエタノール条件の中程度の濃度においての、ヘリックスになるよう容易に誘導される（例えばＰａｒｋら、１９９７を参照のこと）。
【００８３】
（８．ＡＭＰ−１８の位置推定）
ＡＭＰ−１８に対する抗血清は、マウス幽門洞領域の切片と強力に反応するが底、十二指腸、または腸と反応せず、優れた組織化学的プローブであることが証明され、イムノブロットの結果を確認した。免疫前血清はより高い濃度ででもわずかな反応を与える。ＡＭＰ−１８タンパク質は、胃管腔を裏打ちする粘膜上皮細胞に集中しているようであるが、組織のより深部の細胞および上部陰窩領域におけるより少ないシグナルは、細胞が、管腔層に向けて移動するにつれてタンパク質を発現し始め得ることを示唆する。組織化学的調製物のより高い倍率は、このレベルの解像度では、一般的な細胞質染色しか示さない；光学顕微鏡の、電子顕微鏡（ＥＭ）によって見られるいくつかの管腔表面細胞の顆粒が詰まった領域と同じものであり得る、強力な染色のパッチがいくつか存在する。従って幽門洞粘膜におけるＡＭＰ−１８の局在は、粘膜層の深部にあるガストリンを合成する細胞とは非常に異なっている。
【００８４】
（９．マウス胃幽門洞粘膜細胞におけるＡＭＰ−１８抗原の免疫電子顕微鏡位置推定）
組織片を４％のホルムアルデヒドで固定し、そしてＵｎｉｃｒｙｌにおける包埋のために処理した。薄片をウサギ抗ヒトＡＭＰ−１８抗血清（１：２００）と反応させた；結合した抗体を、１０ｎｍの金コロイドに結合したプロテインＡによって検出した。反応した切片を見る（２０，０００×）前にクエン酸鉛で染色した。金粒子は半透明の分泌顆粒の上に見え、それは免疫反応性の必要条件のために、標準的なグルタルアルデヒド−オスミウム−エポン（ｅｐｏｎ）手順（１１，４００×）よりもここで半透明であるようであった。他の細胞質構造に対してわずかなバックグラウンドが見えた。
【００８５】
タンパク質の一般的な構造は、潜在的な分泌役割を示すので、正確な細胞内局在化が貴重である。これはＥＭ免疫細胞化学手順を必要とする。標準的な包埋および染色方法が、以前に他の多くによって報告されたように、幽門洞領域（例えばＪｏｈｎｓｏｎおよびＭｃＭｉｎｎ、１９７０）は分泌顆粒が非常に豊富である粘膜上皮細胞を含むことを明らかにする。予備的な免疫ＥＭデータは、１：２００−１：８００の希釈で使用された免疫血清が、分泌顆粒と特異的に反応することを示す。後者は、いくらか膨張して、そして標準的固定条件よりも電子不透明ではないようであり、そして密度の違いは識別困難であるが、全体として細胞構造は、免疫反応性を保存するために必要なよりストリンジェントでない条件下で固定および包埋した胃組織でかなりよく保存される。１：１００の希釈で、免疫前血清は、分泌顆粒に選択的でなくわずかなバックグラウンドを示した。
【００８６】
（１０．上皮細胞培養における増殖因子活性）
ＡＭＰ−１８の機能は、それが幽門洞およびおそらく胃の他の場所における機能的粘膜上皮の維持を少なくとも部分的に司る増殖因子であるということである。最初に、胃上皮細胞系統はすぐに入手可能でなかったが、腎臓上皮細胞システム（Ｋａｒｔｈａら、１９９２；Ａｉｔｈａｌら、１９９４；Ｌｉｅｓｋｅら、１９９４）を使用した。分画した幽門洞粘膜細胞抽出物を、これらの実験のために使用した。分画をフォローするためにプローブとしてイムノブロッティングを使用して、ブタまたはマウス幽門洞のいずれかからけずった粘膜細胞の溶解時に、ＡＭＰ−１８抗原はスクロース密度勾配の３５Ｓ画分に回収された。そのような高速上清画分が、細胞増殖に関する研究のための開始材料となった。予期しないことに、これらの抽出物は、コンフルエントなサルの腎臓上皮細胞（ＢＳＣ−１細胞）において５０％の増加を刺激したが、ＨｅＬａまたはＷＩ−３８線維芽細胞に影響を及ぼさなかった。ＢＳＣ−１細胞の刺激は、少なくともその最適な濃度でアッセイした、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、およびバソプレシンを含む多様なポリペプチド分裂促進因子で観察されるものと同じくらい有効であった。ＤＮＡ合成を、［３Ｈ］チミジンの酸不溶性物質への組込みを測定することによって評価した場合、幽門洞抽出物による同様の増殖刺激が観察された。幽門洞抽出物の生物学的活性は、６５℃で５分間の加熱、およびほとんどのオリゴペプチドを除去する１０ｋＤａのＭｒカットオフを有する膜を用いた透析を耐える；この処理は６０−７０％のポリペプチド物質を除去するが、イムノブロットによってアッセイしたようにＡＭＰ−１８を容赦した。より重要なことに、マウスまたはブタ幽門洞抽出物によるＢＳＣ−１細胞の分裂促進刺激は、ヒト組換えプレＡＭＰ−１８（細菌で発現した）に対する２つの異なる抗血清のいずれかを培養培地に加えた場合に阻害される。免疫前血清（１：１００から１：８００）は、細胞増殖に影響を与えず、幽門洞抽出物の分裂促進効果も変化させなかった。これらの観察は、胃粘膜細胞ＡＭＰ−１８は、通常このタンパク質を発現しない腎臓上皮細胞の強力な分裂促進因子として機能することを示唆する。
【００８７】
部分的に分画した幽門洞抽出物における増殖促進活性は、ＡＭＰ−１８タンパク質によって媒介されたというさらなる証拠を得るために、マウス抽出物のアリコートを、以前に天然タンパク質のＮ−末端配列を決定するために使用した方法である、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルを２ｍｍの切片に切断し、そして各切片を、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水中３％のアセトニトリルで抽出した。抽出上清を、分裂促進活性に関してアッセイした。その結果は、１６−１９ｋＤａの範囲のタンパク質を含む１つの切片が、増殖促進活性を有することを示した。有意に、この増殖反応は免疫血清によって阻害されたが免疫前血清では阻害されなかった。タンパク質の比較的低い沈降速度とあわせて、これらの発見は、ＡＭＰ−１８は上皮細胞分裂促進因子であり、そしてそれはモノマーとして、またはおそらく同型ダイマーとして機能するという結論を支持するさらなる証拠を提供する。それはまた、タンパク質の構造が、ＳＤＳ−ゲル電気泳動の変性条件後にネイティブなコンフォメーションを容易に再獲得し得るような構造であることを意味する。
【００８８】
幽門洞増殖因子活性と他のサイトカインとの相互作用を評価するために、その活性を試験して、それが上皮細胞培養においてＥＧＦと相加的であるかどうかを決定した。未処理マウス幽門洞抽出物（１０μｇ／ｍｌ）、または加熱、透析ブタ抽出物（１０μｇ／ｍｌ）と共に加えたＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は、細胞数の静止レベルから７４％の増加まで、分裂促進の相加的刺激を示した；それはＢＳＣ−１細胞アッセイを用いたあらゆる因子で今までに観察された最も大きい刺激であった。この相加性の例を図１１にＡＧＳ細胞に対するＡＭＰペプチドおよびＥＧＦに関して示す。この観察は、ＡＭＰ−１８およびＥＧＦが、異なる細胞表面レセプターに作用することによって増殖を開始することを示唆する。それはまたＡＭＰ−１８増殖因子活性が、上皮の維持および回復において、通常他のオートクリンおよびパラクリン因子と協同作用し得ることを意味する。ＥＧＦの結果を考慮して、他の因子（ＥＧＦがその例となり得る）は基底表面から作用するが、ＡＭＰ−１８は上皮細胞層の先端面（すなわち胃管腔面）で分泌され、そしてそこで作用するようである。
【００８９】
（１１．ガストロカイン（ＡＭＰ−１８）関連ペプチドの生物活性）
本発明の合成ペプチドの活性は予期しないものである。ヒトｃＤＮＡクローンペプチドのＯＲＦに基づくペプチドを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで合成し、そこで産物の配列および質量スペクトルをチェックする。ペプチドをＨＰＬＣによってさらに精製した。シグナルペプチドを含まずに、およそタンパク質の長さに広がる５つの比較的大きなオリゴペプチド（それぞれ約４０アミノ酸）を分析した。予測されるヘリックスおよびグリシン−プロリン（ＧＰ）ターンを含む、プレＡＭＰ配列のアミノ酸ｌｙｓ−７８からｌｅｕ−１１９まで広がる４２アミノ酸長の１つのペプチド（タンパク質の成熟型のペプチド５８−９９；表１を参照のこと）は、高い分裂促進活性を有していた。この反応は、特異的抗血清によって阻害されたが、免疫前血清によって阻害されなかった。
【００９０】
（表１：プレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）の配列に基づく合成ペプチドの生物活性）
【００９１】
【表１】
2004537284.tif 000002
表１：ヒトおよびマウスプレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）配列から得た分裂促進ペプチドの分析。１４アミノ酸の分裂促進ドメインは太字である。＊ペプチドはプレ−ガストロカイン（プレＡＭＰ−１８）のアミノ酸配列におけるその位置によって同定される。＃ＡＡ；ペプチド中のアミノ酸の数。Ｋ１／２；最大半減増殖刺激の濃度。
【００９２】
重複する不活性ペプチドが、分裂促進ペプチドの活性を阻害し得る：すなわち、ヒトペプチド７８−８８および８７−１０５は、ペプチド７８−１１９の活性を阻害し、そしてペプチド８７−１０５はペプチド１０４−１１７の活性を阻害するが、ペプチド７８−８８は阻害しない。ペプチド７８−８８および８７−１０５は胃抽出物中のタンパク質の活性を阻害する。
【００９３】
＊＊スクランブル
（１２．ガストロカイン（ＡＭＰ−１８）の増殖刺激ドメイン）
新規幽門洞粘膜細胞タンパク質ＡＭＰ−１８の中央領域に相当する４２アミノ酸ペプチドが、ブタおよびマウス幽門洞抽出物中のそのままのタンパク質と特徴が同様の分裂促進活性を有する（表１）という発見は、分子の生物活性領域の特徴付けを促進した。７８位−１１９位のアミノ酸を含むペプチドが、組織抽出物によって与えられるものと同様の、ＢＳＣ−１上皮細胞系統の増殖の最大刺激を与え、そして細菌で発現した完全幽門洞タンパク質に対してウサギで惹起されたいくつかの異なる抗血清によって同様に阻害された。ペプチド「７８−１１９」に関連する多くの合成「欠失」ペプチドの分裂促進活性を、表１にまとめる。増殖活性の決定は、今まで腎臓上皮細胞系統およびいくつかの胃および腸系統で達成された。
【００９４】
ペプチド７８−１１９のもとの４２アミノ酸配列を、リシン（Ｋ）残基が境界となる３つの部分に分割した；Ｎ−末端からＣ−末端へ、これらは７８位−８８位、８７位−１０５位、および１０４位−１１７位のアミノ酸を有するペプチドである。これらのうちペプチド１０４−１１７のみが、同様の増殖刺激のプラトーを与えるが、もとのペプチド「７８−１１９」より高いモル濃度を必要とする分裂促進活性を有していた；これはより高いＫ１／２値に反映され、それは、１４アミノ酸ペプチドが４２アミノ酸ペプチドの活性の３０−４０％を有することを示唆する。
これからの結論は、より小さいペプチドは、おそらく正しいコンフォメーションを形成する能力が低いために、またはあるいは補助的な結合領域の喪失のために、細胞レセプターに関してより低い結合親和性を有するということである。後者の考えは、ペプチド「７８−８８」および「８７−１０５」が、インタクトな４２マーペプチド７８−１１９の活性に拮抗し得るという観察によって支持される；これらのペプチドは幽門洞抽出物の活性にも拮抗し、新規タンパク質の生物学的機能を分析する手段としての合成ペプチドの妥当性をさらに支持する。本発明のさらなる局面は、ペプチド８７−１０５はペプチド１０４−１１７の活性に拮抗するが、６８−８８はしないことである；ペプチド８７−１０５は隣接する１０４−１１７配列と２残基重複することに注意する。
【００９５】
まとめると、これらの結果は、ＡＭＰ−１８の増殖刺激領域の比較的単純な直線モデルを示唆する；すなわち、Ｎ−末端の拡大した結合ドメイン（大部分がヘリックスであることが予測され、それの相対的な剛性が、細胞増殖研究で決定されたような関連配列の直線的構成を説明し得る）、次にターンの可能性の他は予測される構造を持たないグリシンおよびプロリンの豊富な領域が続く。増殖刺激の引き金を含むのはこの後者の領域である。ペプチド７８−８８および８７−１０５による拮抗の特異性は、それらがアゴニストペプチド７８−１１９および１０４−１１７と重複するかどうかに基づき得る；例えば７８−８８は７８−１１９と重複および阻害するが、１０４−１１７と重複または阻害しない。７８−１１９スクランブルペプチドの不活性と合わせて、これらのペプチドによる競合の特異性は、ＡＭＰ−１８が特異的な細胞成分と相互作用するという結論を強化する。レセプター結合領域はペプチド１０４−１１７からＮ−末端に伸びるというさらなる証拠が、１０４−１１７の７アミノ酸のＮ−末端延長を含むペプチド９７−１１７の増強された活性によって提供される。Ｃ−末端方向へ４アミノ酸の延長を有するペプチド（ペプチド１０４−１２１）は、親１０４−１１７よりわずかに低い活性を有するようであるが、天然チロシンを含み、それは放射活性ヨウ素による標識を可能にし、それはまず結合部位の数の評価、および続いてレセプタータンパク質の検出によって、細胞に対するＡＭＰ−関連ペプチドの結合の決定を可能にする。
【００９６】
その活性（４２マーと同等）およびその相対的経済性（２１アミノ酸の長さ）のために、ペプチド９７−１０７をほとんどの試験で使用した。しかし、ｔｙｒ−１２１までのＣ−末端延長は、おそらくそれは二次構造を安定化させるために、今までで最も活性なペプチドを与える。このペプチドは例えばＥＧＦのナノモル活性に匹敵しないが、トレフォイルペプチドで報告されたものより非常に強力である（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ、１９９７）。インタクトなＡＭＰタンパク質の推定活性は約１−１０ｎＭである。
【００９７】
（１３．組換えタンパク質の発現）
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ。組換え構築物を、一般的に、ＰＴ／ＣＥＢＰベクター中の全長ｃＤＮＡ配列の適当な領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、遺伝子工学で操作し、そして標準的なベクターポリリンカーへの容易な挿入を可能にするのに便利な制限酵素部位まで延長する。細菌システムにおけるＡＭＰ  ＯＲＦの発現を用いた最初の実験は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）における発現タンパク質の精製の促進を意図して、Ｎ−末端Ｈｉｓ６タグを含む（Ｊｅｏｎら、１９９４）、発現ベクターＰＴ／ＣＥＢＰを採用した。宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳにおけるこのベクター中の全長ヒトｃＤＮＡの発現は、不溶性タンパク質の高い収率を与え、それは変性条件下の電気泳動後に、特異的高力価抗体を得るためにウサギで免疫原として使用するために適当であったが、それはそのタンパク質の天然構造および機能を分析するために有用ではなかった。この不溶性は、おそらく発現タンパク質における、疎水性シグナルペプチドの上流にＨｉｓ６タグを有する、非天然Ｎ−末端の存在のためである。疎水性シグナルペプチド配列なしにＯＲＦを発現するエンジニアリングベクターも有用である。これらをＮ−またはＣ−末端Ｈｉｓタグありおよびなしで、細菌発現ベクターを用いて構築する。２０アミノ酸のシグナルペプチドを欠き、そしてＨｉｓ６タグを含むヒトＡＭＰ−１８配列も、細菌で発現させた。
【００９８】
（ｂ）Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ。単純な真核生物の中で、発芽酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓが、機能的組換えタンパク質の産生および分泌のために選択される発現システムとして広く知られている（Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２；Ｃｒｅｇｇら、１９９３）。このシステムにおいて、外来性タンパク質の分泌は、それ自身のシグナルペプチドか、または高度に適合性の酵母接合型アルファシグナルのいずれかを利用し得る。この有機体は、ＡＭＰ−１８タンパク質を正しく処理および分泌および少なくとも部分的に修飾する。外来性遺伝子の構成的および調節性発現のためのベクターが、Ｐｉｃｈｉａで開発された（Ｓｅａｒｓら、１９９８）。ポリリンカークローニング部位に加えて、これらのベクターは、高発現構成的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）またはメタノール調節アルコールオキシダーゼプロモーター（ＡＯＸ１）のいずれかを含む。後者は、正常培養条件下で不十分な産物を産生するが、メタノールの存在下で、細胞タンパク質の３０％までに達する、試験したベクターの最も高い発現を与える非常にストリンジェントなプロモーターである。酵母Ｐｉｃｈｉａが哺乳動物および昆虫の代替物に対して有する利点は、それが無タンパク質培地で連続的に増殖し、従って発現タンパク質の精製を単純化し、そして血清または宿主動物細胞由来の無関係の生物活性を排除することである。ｐＩＢ４構築物（メタノール含有培地によって誘導可能）は、完全ヒトプレＡＭＰ−１８ｃＤＮＡ配列を含む。
【００９９】
（ｃ）バキュロウイルス／昆虫細胞。代替の、多くの場合成功する、非哺乳動物真核生物発現システムは、昆虫細胞培養システムにおいてＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａのような組換えバキュロウイルスを使用するものである。Ｐｉｃｈｉａと同様に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＨｉｓ６タグ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を両方含む、簡便なベクターの大きなレパートリーがこのシステムにおいて利用可能である。トランスフェクションをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞に対して行なう；これらの細胞を、分泌タンパク質の精製に有利なように、タンパク質を含まない培地にゆっくりと適応させ得る。内因性のシグナルペプチドがこれらの細胞で機能しない場合は、クローニング部位の上流にウイルスｇｐ６７分泌シグナルを含むベクターを用いて、外来性タンパク質の分泌を強要し得る。組換えタンパク質を、全細胞タンパク質の０．１−５０％の範囲のレベルで発現し得る。いくつかのタンパク質修飾が、酵母と比較してこの昆虫細胞システムにおいて有利であり得るが、依然として哺乳動物システムを再現し得ない。昆虫発現システムはＰｉｃｈｉａよりいくらか面倒であり、そして哺乳動物細胞における発現の完全な代用にはならないようである。２０アミノ酸のシグナルペプチドを欠き、そしてＨｉｓ６タグを含むヒトＡＭＰ−１８配列を、バキュロウイルスで発現した。
【０１００】
（ｄ）哺乳動物細胞。イムノブロット分析によって検出できない修飾が、哺乳動物細胞において起こり得、それは他の真核生物の細胞で再現されない。原核生物および単純な真核生物システムと同じくらい簡便ではないが、哺乳動物細胞は今や外来性タンパク質の一過性および持続的発現の両方にしばしば使用される。いくつかの増殖因子が、これらのシステムを使用して有意な量で発現および分泌された。
【０１０１】
プラスミドｐｃＤＮＡ３／ヒト腎臓２９３システム：ｐｃＤＮＡ３は、強力な構成的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＶ４０ポリＡシグナルに隣接するポリリンカークローニング部位を含む（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。実験室での経験では、６０−９０％の一過性トランスフェクションレベルを達成し得る。このために、ヒトプレＡＭＰｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅を、開始コドンおよびネイティブリボソーム結合部位（コザック配列）およびｐｃＤＮＡ３への正しい方向性のために適当な制限酵素リンカーを含むオリゴヌクレオチドを用いて行なう。強力な抗生物質ブラストサイジンＳおよび耐性遺伝子を含むベクターを用いた一過性アッセイにおいて好ましい構築物を同定し、安定な哺乳動物トランスフェクタント細胞株を「１週間以内に」確立し得る（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。利用可能なベクターはまた、構成的ＣＭＶプロモーター、ポリリンカークローニング部位、選択的Ｖ５−エピトープ／Ｈｉｓ６タグおよびＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルを含む（ＰｃＤＮＡ６／Ｖ５−Ｈｉｓ）。
【０１０２】
（１４．ＡＭＰ−１８の変化した（修飾）形式の発現および分析）
「野生型」ＡＭＰ−１８の産生の効率的な発現システムが与えられれば、欠失または置換のいずれかを含む一連の変異タンパク質を作成し得、それは機能的ドメインの分析を可能にする。両親媒性ヘリックス、保存されたシステイン（Ｃ）残基および切断部位であり得る塩基性アミノ酸ダブレットが、魅力的な標的である。酵素アッセイと同じくらい単純ではないが、有糸分裂誘発アッセイは慣用的かつ反復可能であり、そしてそれらが構築されるのと同じくらい迅速な「変異体」の特徴付けを可能にする。ドミナントネガティブ（またはポジティブ）「変異体」は、潜在的な細胞レセプターを含む他の因子との相互作用を示すので、機能の単純な喪失を示す変異体と同じくらい重要である。
【０１０３】
（１５．発現したおよびネイティブガストロカイン（ｇａｓｔｒｏｋｉｎｅ）タンパク質の生化学的および免疫親和性分画）
ガストロカインＡＭＰ−１８のいくつかの発現形式の場合に、組換えタンパク質は、可溶性タンパク質の迅速な精製を可能にするペプチドタグを含む。これらのタグの存在は、もしそれらがタンパク質の通常の機能を著しく阻害しなければ、他の関連する高分子との相互作用の分析も可能にする。Ｈｉｓ６タグは、組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂ビーズへ結合させることによって精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１；ＱｉａｇｅｎのＮｉ−ＮＴＡ樹脂）。タグ化タンパク質は、ほとんどの抗原−抗体複合体よりも高い親和性で結合し、そしてＮｉ２＋−ヒスチジンキレート化複合体を過剰なイミダゾールで分裂させて精製タンパク質を放出する前に激しく洗浄され得る。ＧＳＴ−タグ化組換えタンパク質を、グルタチオン−アガロースで精製し、洗浄し、次いで還元グルタチオンで溶出する（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８）。全ての提案された発現システムと同様に、各タンパク質調製物を、その増殖因子活性に関してできるだけ早い段階で試験し得る。
【０１０４】
従来の分画手順は、特に組織から天然タンパク質を単離する場合に、望ましい純度を達成するために使用される。後者に関してブタ幽門洞粘膜が好ましい開始点であり、最初に遠心および熱処理プロトコールを用いて、続いてサイズ排除カラムを使用する：１８ｋＤａタンパク質は、抽出物中でおそらくモノマーとして存在するという証拠を考慮して、ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ６０が適当である。溶出物を、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａで精製した抗ＡＭＰ抗体を、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に架橋することによって作成した免疫親和性マトリックスに負荷する。過去に有用であることが証明されたマトリックスに対するリンカーの延長によるか（Ａｉｔｈａｌら、１９９４）、または抗体を固定化プロテインＡに架橋することによる、免疫親和性マトリックスのさらなる修飾が有用であり得る。活性タンパク質をＳＤＳ−ゲル溶出によって回収し得るので、活性タンパク質を抗原−抗体複合体からも回収し得る。さらなる分画を、Ｃ８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムによって達成し得る。最終的な工程は、Ｎ−末端配列決定による性質の確認を伴う、ＳＤＳ−ゲル溶出技術の使用である。これらの工程の全てにおいて、免疫検出可能なＡＭＰ−１８および増殖因子活性は、一緒に分画される。
【０１０５】
（１６．ＡＭＰ−１８関連合成ペプチド）
ＡＭＰ−１８は、１つまたはいくつかの生物活性ペプチドの前駆体であり得る。合成ペプチドは、タンパク質の機能を調査する簡便な道を提供する；ペプチドは機能の局面を模倣し得るか、またはそれに拮抗し得る。ペプチドがタンパク質の活性を再現または阻害するならば、それはもとのタンパク質の機能的ドメインのアイデンティティーを示唆し、そしてタンパク質−細胞相互作用を調査するために特異的にタグ化したプローブを合成する可能性も提供する。
【０１０６】
ヒトタンパク質の中央領域に相当する合成４２アミノ酸ペプチドは、部分的に分画された幽門洞粘膜抽出物の増殖因子活性を模倣し得るという発見は、ＡＭＰ−１８機能の分析に近道を提供した。リシン対におけるいくつかの潜在的なタンパク質処理部位に加えて、このペプチド（ペプチド５８−９９と呼ばれる；アミノ酸は、シグナルペプチドを除去した後の成熟タンパク質の５８位−９９位である）は、拡大したヘリックス形成可能な領域の１つおよびグリシン−プロリンループを含む。このペプチドのさらなる利点は、それは本明細書中で開示される抗血清の両方によって認識されるエピトープを含むことである。この配列由来のいくつかのより小さいペプチドを合成し、生物活性領域に焦点をあわせた。それらはこの領域の抗原性によって見られるように、タンパク質の表面に露出されることによって、タンパク質構造内の区別できるドメインを示し得るので、およびインビボで生物活性ペプチドへの切断部位であり得るので、まずリシン残基が境界となる配列を研究した。グリシン−プロリン領域が重要である（ＡＭＰ−１８の生物活性ドメインを示す表１を参照のこと）。グリシン−プロリン配列は、ＳＨ３（ｓｒｃ相同性ドメイン３型）リガンドに関与することが知られている（Ｃｏｈｅｎら、１９９５；Ｎｇｕｙｅｎら、１９９８）；ＳＨドメインはタンパク質−タンパク質相互作用に関与するので、ＡＭＰ−１８のＧＰ領域はタンパク質の細胞表面レセプターとの相互作用に関与し得る。ＡＭＰ−１８で見出される正確なＧＰＧＧＰＰＰ配列は、細胞内で作用するＳＨ３ドメインで報告されていないので、それは細胞外リガンドのための新規タンパク質相互作用ドメインに相当するという興味深い可能性が存在する。成熟配列の９７位−１１７位のアミノ酸から得られた２１マーは、４２マーと同様の活性を有する。このより短いペプチドは、様々な上皮細胞系統における増殖アッセイに有用である。このペプチドは、本明細書中で開示される抗血清によって認識されるエピトープを発現しない。
【０１０７】
ＡＭＰ−１８誘導ペプチドの全ては、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＣｈｉｃａｇｏのＣａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで合成され、そこでＨＰＬＣによって単離された精製ペプチドの分子量およびアミノ酸配列も確認した。ペプチド７８−１１９の生物学的活性は、有糸分裂誘発活性を有するより小さなペプチドを探索する基礎を与えるだけでなく、正のまたは負の影響を有するアミノ酸置換を迅速に発見するのを可能にする。不活性なペプチドを、活性ペプチドまたはインタクトのＡＭＰ−１８の機能を阻害する能力に関して試験した。ペプチドにおける潜在的なＤ−アミノ酸の含有（通常のまたは逆の順序で）は、生物学的機能の保持を可能にしながら、分解に対してそれらを安定化し得る。さらに活性ペプチドを合成する能力は、細胞レセプターの性質、組織分布、および数の研究を促進するタグを可能にする。そのようなタグは、Ｈｉｓ６ビオチンまたはペプチド配列に追加したヨウ化チロシン残基を含む（いくつかの生物活性ペプチドは、Ｃ−末端に天然に存在するチロシンを有する）。
【０１０８】
合成ペプチドはまた、機能に対する潜在的な２次構造の役割の評価を可能にする。インタクトのＡＭＰ−１８配列のものと同様のヘリックスを促進することが予測される、活性ペプチド９７−１１７の４アミノ酸Ｃ−末端延長は、より活性なペプチド９７−１２１を生じたという発見は興味深い。これら活性ペプチド、例えば抗菌性マガイニンペプチドと類似したペプチド１２６−１４３のヘリックス傾向は、有用な情報を提供する。抗菌性ペプチドに関して、マガイニンの種類の機能は、両親媒性ヘリックスを形成する能力に関連する（Ｂｏｍａｎ、１９９５）。ラクタム橋によってヘリックス形式に固定し得る合成ペプチドは（Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９９６）、生物学的活性を増強した；ラクタム形成のために少なくとも１対の適当な酸性および塩基性アミノ酸残基が、ＡＭＰ−１８の潜在的なヘリックス領域に既に存在する。
【０１０９】
ペプチド研究の別の同様に重要な局面は、その生物学的機能に拮抗する、特異的抗ＡＭＰ−１８ペプチドの潜在的な利用可能性である。組織培養研究は、増殖促進ペプチド７８−１１９のサブペプチドが、インタクトなペプチドの活性に拮抗し得ることを示す（表１を参照のこと）。細胞結合部位を占有し得るが活性に必要不可欠ないくつかの残基を欠くペプチドは、ＡＭＰ−１８およびその活性ペプチドの作用を阻害し得る。これは、細胞レセプターの分析、およびレセプター−リガンド親和性定数の評価のために別の試薬のセットを利用可能にする。規定されたペプチドアンタゴニストの利用可能性は、動物全体の研究において有用であり、そして最終的にはヒトにおける天然タンパク質の活性を調節するために役立ち得る。
【０１１０】
（１７．ＡＭＰ−１８および関連ペプチドの細胞との相互作用：細胞増殖の評価）
非形質転換サル腎臓上皮細胞株ＢＳＣ−１および他の上皮細胞株を使用して、増殖に対する影響を評価した。一般的に、増殖のために最小限のウシ（または胎児）血清を添加した増殖培地中で、プラスチックディッシュでコンフルエントになるまで細胞が増殖するように、各株に関して条件を選択した（Ｌｉｅｓｋｅら、１９９７）；ＢＳＣ−１細胞は１％ウシ血清を含む６０ｍｍディッシュあたり１０６でコンフルエントになった。増殖アッセイの開始時に、コンフルエントな培養の培地を吸引および細胞の生存可能性を維持するために最小限の血清（ＢＳＣ−１に関しては０．０１％）を含む新しい培地と交換した。ＡＭＰ−１８調製物を培地に加え、そして４日後に細胞単層を洗浄し、トリプシンで分離し、そして細胞を、血球計算器を用いて計測した。ＡＭＰ−１８のＤＮＡ合成を開始する能力の決定を、［３Ｈ］チミジンの組込みによって測定した（Ｔｏｂａｃｋ、１９８０）；ＤＮＡ合成アッセイを確認するために、平らにした細胞のオートラジオグラムを計測した（ＫａｒｔｈａおよびＴｏｂａｃｋ、１９８５）。
【０１１１】
タンパク質ＡＭＰ−１８は、幽門洞粘膜および隣接する体粘膜により少ない程度発現する。しかし、幽門洞抽出物および活性合成ペプチドはいずれも最も単純な上皮細胞株の増殖を刺激する。ＡＭＰ−１８またはそのペプチドの天然の標的であり得る細胞の他に、使用した主な基準は、増殖の制御、特に細胞密度制限のものであった。ヒト癌患者由来の多くの形質転換胃株が、様々な供給源から入手可能であるが、これらのほとんどは増殖制御を示さない。例えば、Ｄｒ．Ｄｕａｎｅ  Ｓｍｏｏｔ（Ｈｏｗａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）からの胃ＡＧＳ腺癌細胞サブ亜株は、より高い程度の接触阻害を示し、そしてＡＭＰ−１８およびその誘導ペプチドによく反応した。これらの細胞は天然にはＡＭＰ−１８を合成しない。同様の反応が、非形質転換ラットＩＥＣ腸上皮細胞（Ｄｒ．Ｍａｒｋ  Ｍｕｓｃｈ、Ｄｅｐｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏによって提供された）で観察された；後者は、培養中ですぐれた上皮細胞の特徴を示す（Ｑｕａｒｏｎｉら、１９７９；Ｄｉｇａｓｓら、１９９８）。
【０１１２】
（１８．上皮細胞表面のＡＭＰ−１８レセプター）
ＡＭＰ−１８の標的細胞レセプターの特徴付けは、このタンパク質に接触することが予期されない細胞におけるレセプターの明らかな存在のために、興味深い。最初の増殖反応アッセイを、胃因子によく反応する腎臓由来の上皮細胞系統で行なった。胃細胞株、および非形質転換ラット腸上皮ＩＥＣ−６細胞を使用して、幽門洞抽出物の真の生理学的標的であろう細胞上のレセプターに注意を向けた。インビボにおけるこのタンパク質の作用の特異性は、おそらくそのレセプターよりも、その発現の非常な組織特異的性質から生ずる。ＡＭＰ−１８が他の増殖因子と共通のレセプターと相互作用し得ることが可能である。しかし、ＥＧＦおよび幽門洞抽出物の相加的増殖刺激は、ＡＭＰ−１８が新規レセプターを有し得ることを示唆する。
【０１１３】
ＡＭＰ−１８と相互作用する細胞膜中のタンパク質分子を、いくつかの異なる方法で探索し得る。例えばビオチンまたは放射活性ヨウ素で標識した純粋ＡＭＰ−１８または関連ペプチドを使用して、細胞表面の飽和可能な部位の数を推定する。結合値のスキャッチャード分析を使用して、レセプターの数および親和性を決定した。定量的研究に関しては、結合を増加するＡＭＰリガンドの濃度で測定し、そして非特異的成分を過剰な非標識因子の存在下で結合を測定することによって同定する。ヨウ化増殖因子を細胞レセプターと架橋し、その同定を可能にした（Ｓｅｇａｒｉｎｉら、１９８７）。標識ＡＭＰリガンドを細胞とインキュベートし、そして結合したリガンドをジスクシンイミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｅｒａｔｅ）によってレセプターと架橋する。標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてオートラジオグラフィーを使用して架橋した複合体を視覚化し、レセプターのＭＷの推定を可能にする。合成ペプチド模倣物およびアンタゴニストは、細胞レセプターの研究を可能にし、そしてその性質は、おそらくクローニング技術による将来の決定的な同定の前に、正当に推測される。
【０１１４】
架橋研究に加えて、抗体、またはｈｉｓ６タグ化ＡＭＰ−１８またはペプチドを使用して、ＡＭＰ−１８に結合する細胞または粘液タンパク質を単離する。さらなるアプローチとして、固定化ＡＭＰ−１８親和性マトリックスを、ＣＮＭＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いることによって作成し得る。あらゆる細胞レセプターによって媒介されるシグナル伝達経路を分析する簡単な発端として、親和性単離物におけるタンパク質チロシンキナーゼ活性をアッセイする試験が利用可能である（ＹａｒｄｅｎおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９８８；ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９９２）。
【０１１５】
（１９．ＡＭＰ−１８は生物活性ペプチドに処理されるか）
ＡＭＰ−１８の機能的分子形式は未知である。確かに、約１８ｋＤａは幽門洞粘膜細胞に蓄積するタンパク質形式であり、そしてそれらは約１０ｋＤａまでのペプシン断片および生物活性ペプチド７８−１１９（４２アミノ酸しか有さない）とも反応するが、実質的な量のより低いＭＷのポリペプチドは抗血清で検出されない。標識またはタグ化ＡＭＰ−１８の利用手段を有することは、タンパク質が幽門洞粘膜抽出物中で処理されるのか、またはそれに反応する上皮細胞によるのかという質問を調査することを可能にする。
【０１１６】
（２０．ヒトおよびマウスにおけるＡＭＰ−１８の遺伝子）
ヒトｃＤＮＡクローンの配列に基づくプライマーを用いたＰＣＲ技術を用いて、ヒトおよびマウスプレＡＭＰ−１８のゲノムクローンを得た。エキソン／イントロン構造（図１３）は完全である。マウスＡＭＰエキソンは、マウス遺伝子の配列を組み立てるのを可能にするために十分ヒトおよびブタのものと類似している。ヒトおよびマウス遺伝子は、非常に類似した構造を有し、マウス遺伝子はわずかに小さい。マウス遺伝子のエキソンに含まれるＯＲＦは、ヒトおよびブタタンパク質に対して６５％の同一性を有するタンパク質を予測する。２ｋｂの配列はヒト遺伝子の上流である。
【０１１７】
（２１．マウスにおけるＡＭＰ−１８遺伝子のノックアウト）
マウスマップから標的構築物を設計する。構築物は、好ましくは［５’−ＴＫ（機能的チミジンキナーゼ遺伝子）−ＡＭＰ−１８ＤＮＡの５’末端の約５ｋｂ−ホスホグリセリン酸塩キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの調節下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子−遺伝子の３’末端の約３ｋｂ−３’］を含む。内在性ＡＭＰ−１８遺伝子と構築物のかなり長い相同性が、効率的な標的化のために必要である。全体の相同性を１．７から６．８ｋｂに増加させることは、ｈｒｐｔ遺伝子の相同的標的化の効率を約２００倍増加させる（Ｈａｓｔｙら、１９９１）。その全体の長さを超えても、効率はわずかにしか増加しない。ＰＣＲ反応による相同的成分の検出を促進するために、ベクターの一端の近くにｎｅｏ遺伝子を有することが有用である。できた形質転換体を、２つのプライマー（１つはｎｅｏ遺伝子中、そして他はＡＭＰ−１８遺伝子座中標的化ベクターのすぐ外側）を用いてＰＣＲによって提供し得る。マウス遺伝子の４ｋｂ５’および４．５ｋｂ３’に伸びる隣接配列を得た。完全な遺伝子のノックアウトが既にクローニングされたことを保証するために、相同的組換えによって、コード領域をｎｅｏ遺伝子と置換する。プラスミド配列を切断した後、標的化カセットをＥＳ細胞にトランスフェクトして、ネオマイシンのアナログであるＧ４１８およびガンシクロビルによる選択によって安定なトランスフェクタントを得る（Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８）。隣接配列由来のプローブを用いたサザンブロットを使用して、標的化相同的組換え体をスクリーニングする。正しく標的化されたＥＳ細胞クローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に注入する。
【０１１８】
少なくとも５０％の野ねずみ色の毛皮（胚幹（ＥＳ）細胞由来）を有する代理母から得たオスの子孫を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと交配する。野ねずみ色であるＦ１マウスは、ＥＳ細胞由来の父性成分を有する（野ねずみ色は黒色より優性である）。これらのマウスの５０％は、ノックアウトプレＡＭＰ−１８対立遺伝子を有する。これらのヘミ接合体マウスを、減少した遺伝子供与量のあらゆる影響に関してモニターする。ホモ接合体ノックアウトが好ましい。ＡＭＰ−１８の唯一の機能が誕生後の胃におけるものならば、生存可能なホモ接合体が予想される。もしそれらが得られなければ、胎児致死性の欠損が示され、そして流産の胎児の段階を確かめる。この結果は、正常な発達におけるタンパク質の予期しない役割を示唆する。
【０１１９】
ホモ接合体ＡＭＰ−１８ノックアウトマウスは、胃の形態学および機能の調査に有用である。そのようなノックアウトは、ＡＭＰ−１８が必要不可欠であるかどうか、そして胃腸発達のどの段階でそれが生物活性であるか示すことが期待される。ＡＭＰ−１８ノックアウトヘミ接合体マウスが既に表現型を示している可能性がある。タンパク質の抑制された供与量がその機能を抑制または消去するならば、または父性インプリンティングまたは無作為単一対立遺伝子発現が重要な影響を有するならば、これが起こり得る。マウスにおけるＡＭＰ−１８ノックアウトの可能性のある結果の範囲は以下を含む：ｉ）生存可能なホモ接合体なし、予期しない必要不可欠な発達的役割を意味する；ｉｉ）生存可能なホモ接合体、しかし明らかに胃腸機能が損なわれている；ｉｉｉ）強力な表現型なし、すなわちタンパク質は実験室マウスの発達および生命に重要ではない。もし適当なら、過剰発現マウスにおけるＡＭＰ−１８の産生を追究する。マウスにおいて産生される短縮ＡＭＰ−１８タンパク質は、潜在的にドミナントネガティブ表現型を作成し得る；実験から得られた知識が、タンパク質の機能的ドメインをさらに規定する。
【０１２０】
（アミノ酸略号）
【０１２１】
【表２】
2004537284.tif 000003
【０１２２】
【表３】
2004537284.tif 000004
2004537284.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１−１】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−２】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−３】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−４】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−５】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−６】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図１−７】図１は、プレ−ガストロカインのヒトゲノムヌクレオチド配列である；配列の特徴を、ｃＤＮＡおよびヒトゲノムＤＮＡ  ａｍｐｈ−ｇｅ８．ｓｅｑのＰＣＲから決定した。長さ：７９９５；予測プロモーター：１４０５；エキソン１：１４３６−１４９０；エキソン２：４２９２−４３４５；エキソン３：４４３４−４５７１；エキソン４：５６６８−５７７８；エキソン５：６７０９−６８５６；エキソン６：７５２５−７７７０；ポリＡ部位：７７５１。
【図２】図２は、ヒトｃＤＮＡ配列である；ＤＮＡクローンをヒト胃ｃＤＮＡライブラリーから差次的発現クローニングによって得た。
【図３】図３は、Ｐｏｗｅｌｌ（１９８７）に基づき、そして本発明者によって修正された、ｃＤＮＡクローンから予測されたヒトプレＡＭＰ−１８タンパク質配列である；Ｎ−２１は、成熟タンパク質の予期されるＮ−末端である。
【図４−１】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−２】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−３】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−４】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−５】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−６】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図４−７】図４は、ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよびマウスゲノムＤＮＡ配列のＢＡＣクローンのＰＣＲから決定されたマウスプレＡＭＰ−１８配列である；  予測プロモーター：１８７４  実験的転写開始部位：１９０６  翻訳開始部位：１９４５  ＣＤＳ１：１９０６−１９５６；ＣＤＳ２：３５３２−３５８２；ＣＤＳ３：３６７３−３８１３；ＣＤＳ４：４５９５−４７０５；ＣＤＳ５：５６０８−５７４９；ＣＤＳ６：６４４５−６５４２；ポリＡ部位：６６３６。
【図５】図５は、プレＡＭＰ−１８のマウスｃＤＮＡ配列である。
【図６】図６は、マウスプレＡＭＰ−１８アミノ酸配列である；マウス胃幽門洞から単離されたＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行なった；Ｙ−２１は、成熟タンパク質の予期されるＮ−末端である；．．によって示される空間は、図１１の他の配列と整列するヌクレオチドがそこに存在しないことを意味する。
【図７】図７は、ブタＡＭＰ−１８を発現するｃＤＮＡである。
【図８】図８は、Ｐｏｗｅｌｌ（１９８７）に基づいてｃＤＮＡクローンから予測されたブタプレ−ガストロカイン（プレ−ＡＭＰ−１８）タンパク質配列である。Ｄ−２１は、成熟タンパク質のＮ−末端である−ブタ胃から単離されたタンパク質の配列決定によって確認された。
【図９】図９は、ヒト  対  ブタにおける、プレ−ガストロカインのアミノ酸配列の比較である。
【図１０】図１０は、ヒトおよびブタＡＭＰ−１８のｃＤＮＡクローンの配列決定から、そしてマウスＲＮＡおよびＤＮＡのプレＡＭＰ−１８特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって決定された、ヒト、ブタおよびマウス予測タンパク質配列のコンピューターによる整列比較を示す；各場合において、最初の２０アミノ酸はシグナルペプチドを構成し、小胞体膜の通過後切断される。
【図１１】図１１は、ブタ胃幽門洞粘膜抽出物、成熟ペプチドのヒトＡＭＰペプチド７７−９７（ヒト前駆体タンパク質のペプチド９７−１１７と同じ：表１）、およびＥＧＦの、胃上皮細胞の増殖に対する効果を示す；ＡＧＳ細胞を、６０ｍｍディッシュで胎児ウシ血清（５％）を含むＤＭＥＭ中で増殖させた；異なる量のブタ幽門洞抽出物、ＨＰＬＣ精製ペプチド７７−９７、および／またはＥＧＦを加えた；４日後細胞を分散し、そして血球計算器で計測した；幽門洞抽出物およびペプチドはそれぞれ濃度依存的な様式で細胞増殖を刺激した；棒グラフは飽和用量でペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）は分裂促進性であったことを示す；あわせるとそれらは相加的であり、２つの分裂促進因子は異なるレセプターおよび／またはシグナル伝達経路を使用して作用することを示唆した；抗ＡＭＰ抗体は幽門洞抽出物を阻害したがペプチド７７−９７は阻害しなかった。
【図１２】図１２は、ヒトおよびマウスプレＡＭＰ−１８遺伝子の構造を示す；イントロン中の塩基対の数をバーの上に示す；エキソンはＥ１−Ｅ６およびイントロンはＩ１−Ｉ５で示す；イントロンの長さにわずかな違いが存在する。
【図１３】図１３は以下のものを示す。左のパネル。Ｅ．ｃｏｌｉで発現した組換えヒトＡＭＰ−１８のアミノ酸配列。Ｎ−末端の１２アミノ酸ドメイン内のＨｉｓ６タグが推定疎水性シグナルペプチドを置換したことに注意する。右のパネル。ＩＥＣ−１８細胞のコンフルエントな培養の増殖に対するｒｈＡＭＰ−１８およびＡＭＰペプチド７７−９７の効果。最大の増殖刺激は同様であるが、ｒｈＡＭＰ−１８（〜３０ｎＭ）の最大半減濃度（Ｋ１／２）はペプチド（〜３００ｎＭ）より約１オーダー程度低い。
【図１４】図１４は以下のものを示す。左のパネル。ヒトおよびブタ幽門洞の前駆体タンパク質のＡＭＰ−１８ｃＤＮＡクローンから得られたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の整列。類似性は７８．５０％、および同一性は７５．２７％であった。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（ＧＣＧ）のＧＡＰおよびＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥプログラムを用いてコンピューター分析を行なった。右のパネル。ヒトプレＡＭＰ  ＯＲＦの予測された二次構造のモデル。アスパラギンリッチなＮ−末端ドメイン、短いトリプトファン（Ｗ）−リッチおよびグリシン−プロリン（ＧＰ）領域、および４つのシステイン（Ｃ）残基の保存された位置に留意のこと。可能性のある両親媒性ヘリックスが示される。
【図１５】図１５は、ブタ幽門洞細胞抽出物、ペプチド７７−９７、およびＥＧＦの腸上皮細胞の増殖に対する効果を示す。ＩＥＣ−６細胞を６０ｍｍディッシュで増殖させた。幽門洞細胞抽出物（左のパネル）およびペプチド７７−９７（中央のパネル）はそれぞれ濃度依存的な様式で増殖を刺激した。ペプチド７７−９７（１μｇ／ｍｌ）は、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）より強力であるようであった（右のパネル）。値は３つの培養の平均±ＳＥである。
【図１６】図１６は、ＡＭＰペプチド７７−９７およびＥＧＦの、ヒト幽門洞上皮細胞による増殖および創傷回復に対する効果を示す。増殖（左のパネル）を測定するために、ＨＡＥ細胞を６０ｍｍディッシュにまいた。ペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）、またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、または両方を培地に加え、そして４日後に細胞の数を計測した。ペプチド７７−９７およびＥＧＦはそれぞれ増殖を刺激し、そして相加的であるようであった。値は３つの培養の平均±ＳＥである。遊走（右のパネル）を測定するために、細胞を６０ｍｍディッシュに増殖させてコンフルエントな単層を調製した。培地を吸引、および０．０１％の子牛血清（ＣＳ）を含む新しい培地と交換した。単層を、剃刀の刃でひっかくことによって機械的に傷つけた。分離した細胞を、培地を吸引し、そして残った細胞を０．０１％のＣＳを含む新しい培地で２回洗浄することによって除去した。ＣＳ（０．０１％）およびインスリン（１００Ｕ／Ｌ）を含む新しい培地（５ｍｌ）を、傷つけた培養に加えた。ペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、または両方のいずれかを加えて培養を２倍にした。顕微鏡接眼レンズの網線（１０ｍｍの長さ；０．１ｍｍのしるし）を用いて、細胞が傷の端から遊走した距離（ｍｍ）を測定することによって、創傷後２４、４８、および７２時間後に遊走を評価した。０．２５ｍｍの長さの傷の端にそって無作為に選択した１２の部位の遊走細胞を、４０倍の倍率で測定した。２つの異なる部位の遊走を、各培養で作成した２つの別々の傷それぞれで測定した。値は２つの培養における４つの異なる傷の端から露出した領域へ細胞が移動した平均距離±ＳＥである。ペプチド７７−９７に接触させた細胞は、７２時間で、ビヒクルに接触させたものよりも傷の端から遠くへ遊走した。ＥＧＦも細胞の移動を刺激し、そして２つの薬剤は一緒に作用して著しく遊走を増強した。
【図１７】図１７は、ＡＭＰペプチド６７−８５の、ペプチド５８−９９によって刺激された腸上皮細胞の増殖に対する効果を示す。ＩＥＣ−１８細胞のコンフルエントな培養を調製した。１日後、培地を吸引し、そして分裂促進性ペプチド５８−９９（８μｇ／ｍｌ）なし（コントロール）、またはそれと共に、ＣＳ（０．５％）およびインスリンを含む５ｍｌのＤＭＥＭと交換した。１ｍｌの培地および異なる量のペプチド６７−８５を加えた姉妹プレートを、ＣＯ２インキュベーターで、３８℃で１時間インキュベートし、そして次いでさらに４ｍｌの培地を各ディッシュに加えた。ペプチド５８−９９を、ペプチド６７−８５の各濃度で４つの姉妹プレートのうち２つに加え、そして細胞の数の計測した。次の３日間の間に、ペプチド６７−８５の非存在下では、細胞数は２９０％増加し、一方ペプチド５８−９９に接触させた細胞は数が４０７％増加し、そしてＥＧＦで処理した（５０ｎｇ／ｍｌ）細胞は４０２％（示していない）増加した。分裂促進性ペプチド５８−９９による細胞増殖の刺激は、細胞を０．２５μｇ／ｍｌのペプチド６７−８５とプレインキュベーションすることによって完全に消失した。単独で加えた場合、ペプチド６７−８５（０．２５から８μｇ／ｍｌ）は分裂促進因子ではなかった。培養あたりの細胞数の値は、同じ期間にビヒクルと接触させた細胞の増加と相対的に示す。
【図１８】図１８は、ＡＭＰ−１８に対するウサギ抗血清の、コンフルエントなＩＥＣ−１８細胞に対するｒｈＡＭＰ−１８の分裂促進効果に対する効果を示す。ｒｈＡＭＰ−１８（５０ナノモル）を抗血清（１：１００希釈）およびＡｂと３０分間プレインキュベートした場合、増殖刺激は〜９５％抑制された；免疫前血清は細胞増殖に影響しなかった。この最近精製されたｒｈＡＭＰ−１８の増殖刺激の最大半減濃度（Ｋ１／２）は、約５ナノモルである。
【図１９】図１９は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、ヒト幽門洞（ＨＡＥ）およびラット腸（ＩＥＣ−１８）上皮細胞の創傷回復に対する効果を示す。コンフルエントな単層培養を、剃刀の刃でひっかくことによって機械的に傷つけ、そして傷の端から細胞が遊走した距離を顕微鏡接眼レンズの網腺を用いて測定した。細胞は、調査した各時点で、ＡＭＰペプチドの存在下でより遠くに遊走した（Ｐ＜０．００５）。
【図２０】図２０は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、ＴＥＲの成熟に対する効果を示す。ＭＤＣＫ細胞の単層培養を、透過可能なポリカーボネートフィルター（０．４μｍの孔サイズ）（Ｔｒａｎｓｅｌｌ）上に、ペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）なし（コントロール）またはありでＦＢＳ（２％）を含むＤＭＥＭ中で８日間増殖させた。ＴＥＲを、細胞をまいてから２４時間後、およびその後指定の時間に上皮電圧抵抗計（ＥＶＯＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定した。各測定の後、ペプチドなしまたありでＦＢＳを含む培地を交換し（０、４８、および１４４時間）、そしてさらなるペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）を３０および７２時間に加えた。７２時間に、ペプチド７７−９７を加えた培養におけるＴＥＲは、コントロール培養の２倍高かった。値は３つの培養の平均である；分散は平均の＜１０％である。ＴＥＲをフィルターの３つの異なる領域から測定した。
【図２１】図２１は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、酸化剤モノクロラミンまたはインドメタシンで損傷した単層におけるＴＥＲに対する効果を示す。パネルＡ：ＭＤＣＫ細胞単層で安定なＴＥＲ（３３０Ω・ｃｍ２）に達したら、培地を、ＦＢＳ（０．２％）およびペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを含むＤＭＥＭに交換した。１８時間後、ペプチド７７−９７またはＥＧＦを、指定のウェルに加えた。１時間後、モノクロラミン（０．１ｍＭ）を、他の薬剤と同様に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの先端および基底区画に加えた。ビヒクルまたはＥＧＦで処理したモノクロラミン損傷培養は、酸化剤への接触から９０分後に〜３０−４０％のＴＥＲの損失を維持したが、ペプチド７７−９７で処理した酸化剤損傷細胞のＴＥＲは、酸化剤に接触させていないコントロール培養と同様であった。パネルＢ、Ｃ：Ｃａｃｏ２／ｂｂｅ（Ｃ２）サブクローン単層を、コラーゲンでコートしたポリカーボネートフィルターに、安定なＴＥＲに達するまで（２２５Ω・ｃｍ２）増殖させた。消費した培地をＦＢＳ（０．１％）単独またはペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）とともに含む新しい培地と交換した。１８時間後、モノクロラミン（０．３ｍＭ、Ｂ）またはインドメタシン（０．１ｍＭ、Ｃ）をＴｒａｎｓｗｅｌｌの両方の区画に加えた。０時間に、ビヒクル（コントロール）、ビヒクルプラス酸化剤またはインドメタシン、またはペプチド７７−９７および酸化剤またはインドメタシンを培養に加えた。ビヒクルで処理した損傷培養のＴＥＲは、９０分で〜３５％減少したが、ペプチドで処理した培養は〜１０％減少した。ペプチドは、非損傷細胞のＴＥＲを変化させなかった（示していない）。
【図２２】図２２は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、ＤＳＳによる損傷後のＴＥＲに対する効果を示す。Ｃ２細胞単層を、ＦＢＳ（５％）およびトランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中で、コラーゲンでコートしたポリカーボネートフィルター上に、安定なＴＥＲに達するまで（２２５Ωｃｍ２）増殖させた。０時に、細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌの上部区画においてＤＳＳに曝露させない（コントロール）、またはＤＳＳ（４％）に曝露させた。ＡＭＰペプチド７７−９７（８μｇ／ｍｌ）を、０時にＤＳＳを加える１日前に、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの上部および下部区画に加えた。ビヒクルで処理したＤＳＳ−損傷培養物のＴＥＲは、４５分で約７０％減少したが、ペプチドで処理した培養物はその時点で約１０％減少した。ペプチドは非損傷細胞のＴＥＲを変化させなかった。値は≧６の培養物の平均である。
【図２３】図２３は、ＡＭＰペプチド７７−９７の、Ｃ２細胞の酸化剤損傷後のＺＯ−１およびオクルディンに対する効果を示す。このイムノブロットは、不溶性画分のタンパク質レベルが、細胞のビヒクルに対するよりもＡＭＰペプチドに対する曝露後の方が約２倍より高いことを示す。
【図２４】図２４は、ＡＭＰペプチドのＣ２細胞に対する効果を示す。培養物を異なる時間、ペプチドに曝露させ、そして不溶性画分を得た。タンパク質を分離し、イムノブロットを特異的抗血清でプローブし、そして各タンパク質の量を、レーザーデンシトメトリーを用いて定量した。
【図２５】図２５は、ｒｈＡＭＰ−１８の、酸化剤損傷を受けた単層のＴＥＲに対する効果を示す。コンフルエントなＣ２細胞単層を、安定なＴＥＲが確立するまでＴｒａｎｓｗｅｌｌに調製した。培地を、ＦＢＳ（０．１％）単独（コントロール）またはｒｈＡＭＰ−１８（１００ナノモル）またはペプチド７７−９７（３．７マイクロモル）のいずれかとともに含む新しい培地と交換した。１８時間後、モノクロラミン（０．３ｍＭ）をＴｒａｎｓｗｅｌｌの両方の区画に加え、そして培養物にビヒクル（コントロール）、ビヒクルプラス酸化剤、ｒｈＡＭＰ−１８および酸化剤、またはペプチド７７−９７および酸化剤を加え、その後ＴＥＲを測定した。
【図２６】図２６は、ｒｈＡＭＰ−１９の、Ｃ２細胞におけるＺＯ−１およびオクルディンのレベルに対する効果を示す。単層培養を、ｒｈＡＭＰ−１９（１００ナノモル）またはビヒクルで８時間処理した。細胞溶解の後、細胞膜および細胞骨格結合ＴＪタンパク質に相当する不溶性（微粒子）画分を調製し、そして次いでイムノブロッティングを行なった。免疫反応性ＺＯ−１およびオクルディンの量は、同じイムノブロットのレーザーデンシトメトリーによって推定されるように、ビヒクルで処理した（１）細胞よりもｒｈＲＭＰ−１８で処理した（＋）細胞で約２倍より高い。各レーンにおける同量のタンパク質の装填は、これらの細胞で恒常的に発現される熱ショックタンパク質７３に対する抗体を用いてブロットを再プローブすることによって証明した。
【図２７】図２７は以下のものを示す。左のパネル。マウス（ｎ＝１０）に３％のＤＳＳを与え、そして糞を毎日アッセイした。ビヒクルよりもＡＭＰペプチド（３ｍｇ／ｋｇ体重／日、ｓ．ｃ．）を与えたより少ない動物およびホモカルト（ｈｏｍｏｃｕｌｔ）陽性糞。右のパネル。動物にＤＳＳを４日間与えた後、水に切り換えた（グラフの０日）。ＡＭＰペプチドを毎日与えたマウスは、５日までにビヒクルを与えたマウスよりも体重減少が少なかった（Ｐ＜０．０４）。ペプチドで処理した４日目および５日目の動物の体重は増加したようであった；ビヒクルを与えたものは減少した。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図１４】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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