(57)【要約】肝細胞の双極性接着用基質の固定相に細胞外基質成分を添加し、これらの物質が濃縮されさらに単純な塩基基質（たとえば、タイプ  コラーゲン）から構成された特定の塩基基質に結合されることを可能にする方法。たとえば、フィブロネクチンをが添加する場合の一つの利点は、正常な形態と機能を維持しつつ完全な無血清培養を提供できることである。その結果、以前は肝細胞の無血清培養に適さなかった普通の培養媒体が今では比較的長期の無血清培養にも適していることである。さらに、トライアル結果の再現性と機械的安定性が通常の形の基質重層化により実質的に改良されている。この方法は特別にあつらえたキットを用いて適用される。他の基質成分もこの方法により添加することができ、したがって、濃縮と結合は塩基基質がゲル化した後に筋原線維の基質骨格内で行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基基質に細胞外基質成分（Ｆ）の特定成分を利用する際に、分極濃縮とこれらの因子の結合が肝細胞（１）の固定基質接触領域において行われることを特徴とする、
前記肝細胞（１）が肝細胞に分極した方法で添加された基質（２）と２つの折曲面に接触している、特にサンドイッチ法による双極性接着肝細胞（１）の培養方法。
【請求項２】
前記塩基基質として、たとえば、タイプ  コラーゲンを使用することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
細胞外基質（Ｆ）としてフィブロネクチン（４）、コラーゲン類（たとえば、タイプ  またはタイプ）、ラミニン類、ビトロネクチン、糖タンパク類、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸）脂質類、リノレン酸、リポ多糖類あるいはそれらの混合物を使用することを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
【請求項４】
機械的安定化成分を使用することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項の一つに記載の方法。
【請求項５】
機械的安定化成分としてアルギン酸カルシウム、フィブリノゲン、ｋ−カラゲーン、寒天、アガロース、樹脂類、ポリウレタン、ゼラチンおよびｃａｒｂｏｐｏｌ（ポリアクリル酸）、骨にかわ（ゼラチン）またはウサギにかわなどのゲル形成物質を使用することを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】
いわゆるサンドイッチ技法あるいはゲルトラップ技法のいずれかにより可能になった、細胞外基質（２）と２つの折曲面に接触している肝細胞の同時または後続の培養および接着段階の間に培養媒体（３）とともに基質に添加した特定間接混合物として細胞外基質成分を用いることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項の一つに記載の方法。
【請求項７】
栄養媒体濃縮液のような濃縮液または緩衝溶液からなる触媒混合物に細胞外基質成分（Ｆ）および／または機械的安定化成分を添加することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項８】
双極性接着肝細胞（１）の培養とこれらの混合物により改良された塩基基質（２）を用いたプロトコルに必要な試薬類が、塩基基質（２）と触媒混合物、すなわちこれらの物質のいずれか一つまたは両方が請求の範囲第３項に記載の細胞外基質成分および／または請求の範囲第４項または第５項に記載の安定化成分を含有する塩基基質（２）と触媒混合物からなるキットに集められていることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第７項の一つに記載の方法。
【請求項９】
双極性接着肝細胞（１）の培養と前記細胞外基質成分により改良されうる塩基基質（２）を用いたプロトコルに必要な試薬類が、塩基基質（２）と触媒混合物、すなわちこれらの物質がいずれも前記成分を含有せずそして前記キットの３成分として別々に提供されている、塩基基質（２）と触媒混合物からなる前記キットに集められていることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第８項の一つに記載の方法。
【請求項１０】
前記キット用に集められる塩基性試薬が、ラットの尾、軟骨組織または皮膚コラーゲンから作られ、かつ触媒混合物がある種の媒体、すなわち肝細胞の無血清培養に合わない媒体の１０倍濃縮液に相当することを特徴とする請求の範囲第８項または第９項に記載の方法。
【請求項１１】
双極性接着肝細胞（１）の無血清共生培養を前記サンドイッチ技法または前記ゲルトラップ技法およびフィブロネクチン（４）の混合物による細胞培養を用いたさらに別の細胞タイプにより行うことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
本発明は双極性接着肝細胞の基質状態の改良方法並びに対応して設計された細胞培養キットの製造方法に関する。
肉腫（ｍａｔｒｉｇｅｌ）に由来する基質のような、本来複雑な基質物質を用いると、これら複雑な基質物質は基質を形成する細胞において、形態学あるいはシトクローム発現のような定性的変化を生ずるので、肝細胞の培養に不利であり、また生体内の状況を究明する研究の場合は感知できない。
さらに、この種の系においては肉腫からの基質成分の抽出では、ＤＮＡとＲＮＡを分離する汚染酵素（ＲＮＡｓ）のかなりの部分が必ず培養モデルに持ち込まれるので、分子生物学的研究を十分行うことができない。
たとえこの種の本来複雑な基質が使われなかったとしても、これらの基質成分はこれまでもシングルゲル法により培養された肝細胞の培養上澄み液に添加されてきたし、あるいはシングルゲル系の基質内でも使用されてきた。このような努力がなされてきたのにもかかわらず、このケースで用いられた肝細胞培養技法は生体外系の肝細胞の必要条件を満たしていなかったので、肝細胞のポテンシャルに合った効果は達成されなかった。生体外肝細胞は、生体内ではＤｉｓｓｅ腔内で模造されうる、細胞外基質への双極性接着を必要とする。このような努力によっていわゆるサンドイッチ状の発現、すなわちこれら２つの方法の共通した特徴は、肝細胞が２層により囲まれた単層に包埋されている点にあることを見いだした。この包埋はラットの尾のコラーゲンから作られたタイプコラーゲンに基づく単純な塩基基質を用いて予め作られた。しかしこれらの技法は細胞外基質の組成を可能な限り生体内の状態に近づけるという現実的な目的についてはなお欠陥がある。
この型の方法は、たとえば、ドイツ特許４２０６５８５号に記載されている。
これが、たとえば、培養媒体によりこの種の基質内にさらに外部因子を添加しないとこれらの細胞を無血清では培養できないといった、一連のかなりの不利益を生ずる。したがって欠けている因子を、ＦＣＳ（うし胎児血清）または特別にあつらえた培養媒体を介してさらに培養媒体に添加しなければならない。さらにこれら単純な塩基基質は、生体内で重要な役割を果たしている接着基質が欠如している。そのため肝細胞で機能上の変化が生じる。
肝細胞の無血清培養は、接着済みの細胞あるいは接着が進行中の細胞に上澄み液として添加された特殊な培養媒体を用いてすでに達成されていた。これら特別に開発された培養媒体は部分的に非常に高価な成分を含有しており、その高価な成分の濃度は、培養媒体によって必要以上に希釈されており、その上一定間隔で必要な培養媒体の変更のため再三にわたり培養媒体が添加される。たとえば、一次肝細胞の場合２４時間〜４８時間毎に媒体を変える必要がある。これらの培養媒体は比較的長期の無血清培養では必要としないので、歴史的な理由と無知によりこれらの培養媒体は因子に追加されたようである。これらには、たとえば、トランスフェリン、ホルモン類、下垂体エキス類等が挙げられる。
問題の基質成分が接着領域において双極性接着肝細胞に直接導かれる普遍的方法は、培養を容易にしかつ細胞内のミクロ環境においてより有利な状態を創る。
この種の普遍的方法の利点ははコストと資源を節約できることである。しかし、サンドイッチ技法のみではこれらの細胞の無血清培養には十分ではない。特別にあつらえた媒体に結びつけることを指図されることなく、肝細胞の無血清培養を可能にするサンドイッチ技法またはゲルトラップ技法により産生する方法はこれまでの文献では知られていなかった。これらは無血清培養に適した媒体としてこの業界でも指摘されている。さらにこれまでは、一次肝細胞自体に対しサンドイッチ技法を可能とする細胞培養キットは知られていなかった。
ラットの尾またはうしの皮から通常の方法で作られるタイプ  コラーゲンは、普通サンドイッチ技法またはゲルトラップ技法の塩基基質として役立つ。製造工程の最終段階でこのコラーゲン溶液のｐＨを約４に設定し、この状態で４℃にて貯蔵する。コラーゲン凍結乾燥物の製造は通常の方法でもできる。サンドイッチ技法またはゲルトラップ技法では、酸基質を塩基性媒体濃縮液（普通１０倍濃縮液）と１：１０の比で混合する。この媒体濃縮液は基質をゲル化する触媒として働きそしてゲル化工程で塩基基質に結合される。サンドイッチ技法をさらにフォローすると、この混合物は培養に用意された表面に塗布される。ゲル化後これらの細胞を塗布し、さらに接着終了後、非接着性の死んだ細胞も含まれている上澄み液を除去し、さらに第２の基質層をこれに塗布する。この第２の層がゲル化した後、培養媒体（普通は２−４ｍｌ，２８ｃｍ２）を硬化した上部基質層に装入する。一つは上澄み液内の測定を適切に行うため、第２に代謝生成物の濃縮が上澄み液で起きるために、この培養媒体は定期的に取り替える必要がある。ゲルトラップ技法を用いると、これらの細胞は直ちに冷えてまだ液体の基質に装入され、この状態で培養に用意された表面に注入される。この細胞基質層の硬化後、サンドイッチ技法の場合と同様、培養媒体は頂部に装入される。初めに述べた媒体濃縮液はまず固体（固定）相に結合され、したがって、液相として添加される培養媒体と混同されることはない。ピペットで除去することによりこれは簡単かつ迅速に交換される。
サンドイッチ技法とゲルトラップ技法（不動化技法）の両方が培養中の肝細胞の機能を安定化する。本発明者らの未発表の研究では、本来は無血清培養のために企図されたものではなく、たとえばＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅのような標準的な培養媒体を用いた場合でさえも、少なくともこれらの細胞が細胞外基質への接着段階にある数時間の間、血清が培養媒体（上澄み液）に加えられる場合は、サンドイッチ技法またはゲルトラップ技法における無血清培養も可能である。しかしこれは、ＦＣＳが普通の方法で媒体に添加される通常の技法に相当している。ＦＣＳを用いず、たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ  やＤＭＥＭのような標準媒体を用いた場合、これらの細胞は自身の機能を速やかに失う。
血清は通常数種類の動物から集められるが、その装入量によっては、培養時に生存時間と機能上の能力に関して負の効果が表れる。これは普通うしから得られている厳密には確認できない血清の成分やエンドトキシン含有量に依存しているが、他の動物種からの血清の利用も可能である。定義づけが明確でないためにテスト結果の再現性が不十分になる。したがって、ＦＣＳを用いることにより、サンドイッチ技法により比較的長期の培養が実現できるが、本発明者のデータによるとこの研究は特にレセプターにより伝達された場合装入量依存性が強い。組み換え上皮増殖因子（ＥＧＦ）を用いたサンドイッチ技法の増殖刺激に関する研究では、これが２年間に約５０−６０％の失敗研究をもたらした。
サンドイッチ技法に関する以前の報告では、この種の問題は論議されておらず、ただアルブミン分泌のような肝細胞の内因性の進行過程が提示されているにすぎない。ＦＣＳの成分により、アルブミン分泌は初期低速度（細胞分離により生ずる分離後外傷状態によって生じた）の後サンドイッチ技法にとって安定な状態へ増大する。ＦＣＳなしでサンドイッチ技法を用いた場合は、分泌速度は最初の数日の培養期間内では差がない。これは、基質重層化肝細胞の短期の培養についてはフィブロネクチンの成分は必要なく、したがって、アルブミン分泌速度については知覚できるような利点は達成されないことを意味している。
ＦＣＳ有無いずれの場合およびＦＣＳなしでフィブロネクチンがある場合は、非重層肝細胞（通常の培養方法）は無血清でも培養できる。しかし前述の３つの変形態様はいずれの場合も短期培養の場合のみに適している。というのはコラーゲン層がないことは肝細胞の細胞骨格、したがって、これらの細胞の形態の崩壊（または変化）を意味している。培養における肝細胞の形態と機能の密接な関係により、この種の培養系は短期的に使用されるだけで長期的には全く使用されない。
双極性接着肝細胞１に関する細胞外基質のさらに別の問題は、せん断力に関連して安定性が低いことである。静的培養条件下でさえも、特に上部コラーゲン被覆層は水相（培養媒体）に接している時は切り離される。細胞を微孔性膜で培養するならば、微孔性膜は適当なところで下部基質層を置換しサンドイッチの一部を形成し、肝細胞１の剥離が下部からも起きる。これはこれらの細胞が直接微孔性構造に接着している場合もあるいはこの膜が予め基質で被覆されている場合にも起こりうる。
肝細胞の培養は、酸素の供給が培養媒体３を介して行われるプラスチック製またはガラス製の小皿における標準培養、または各ケースにおいて基質２がサンドイッチ法におけるガス透過膜に層状に配置されたバイオリアクターの態様で大規模に行われる。この種の"バイオリアクター"はドイツ特許４２０６５８５号に記載されている。
したがって、本発明の目的は、標準培養媒体に血清や他の成分を全く添加しなくても、サンドイッチ技法またはゲルトラップ技法における肝細胞にとって典型的な機能の維持を可能にする合理的方法を創ることである。さらに、機械的かつ生物化学的に安定で、より再現性の高い結果をともなう培養モデルを確立することである。
この目的は本発明によればクレーム１に記載されている特徴により達成される。
したがって、本発明の方法は本質的な成分に限定する単純化に特徴がある。
本発明によればサンドイッチ技法またはゲルトラップ技法に使用される塩基基質または触媒（濃縮媒体）として使用される緩衝液への、フィブロネクチンまたはコラーゲン類（たとえば、タイプ  またはタイプ）、ラミニン類、ビトロネクチン、糖タンパク類、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸、脂質類、リノレン酸あるいはリポ多糖類の組み合わせが行われる。
細胞外基質成分はこれらが肝細胞に対して持っているよりよい"生体内効果"を生じる。
実際は単純な塩基基質から一つの成分が生じ、他の成分がモジュール様式で生じた後で、一つの物質に付加する。多くの場合フィブロネクチンの付加で十分である。
この塩基基質は、主としてタイプ  コラーゲンからなり、ラットの尾のコラーゲン、皮膚または軟骨組織から作られる。
本発明の方法は多大な利点があり、たとえば本発明者らの以前の研究では、特に長期の機能維持に関しても、サンドイッチ技法またはゲルトラップ技法を用いて完全に無血清培養を可能にするまだ欠けている因子の一つとしてフィブロネクチンが同定された。サンドイッチ技法またはゲルトラップ技法に使われた基質にフィブロネクチンが直接添加されるならば、これらの分子は、細胞すなわち細胞の折曲面に接触している肝細胞の両側の接着基質内に直接位置している。ゲル化中に始まるコラーゲン原線維の架橋プロセスにより、フィブロネクチン分子はコラーゲン原線維の内側に引き止められる。フィブロネクチンが単に上澄み液に添加されるならば、通常行われている媒体取り替えの間に再びかなりの程度まで除去されるのは避けられない。それにもかかわらず、この方法も１回量については十分であり、比較的高濃度のフィブロネクチンは、細胞外基質へ双極性接着の技法を用いた場合、肝細胞の安定な無血清培養を可能にする。フィブロネクチン含有分散媒体は第２の基質層が塗布される前に細胞とともに装入されるので、サンドイッチ技法の方がゲルトラップ技法よりこれによく合っている。たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＥやＤＭＥＭのような通常の培養媒体の便用は、無血清培養媒体においても可能である。
本発明の実施態様の利点の一つは、したがって、比較的長期の無血清培養の塩基類の安定性が極めて高いことである。
本質的に高価なフィブロネクチンが双極性基質の内側に結合され、１回だけ使用されるので、これがコストの節減をもたらす。第２に本発明による実施方法のさらなる利点は、その後の研究がいかなる媒体を用いてもできることである。種々の研究に対して目的に合わせた特殊な媒体が開発された。たとえば、肝細胞の糖新生を研究する場合はグルコースを含有しない媒体が使用された。これらの研究が現在も無血清系で行われるならば、このために特に規定された媒体を再度調合し、さらにいわゆる無血清媒体に再度頼らねばならないであろう。しかし無理からぬことであるが、これらの媒体はこのような特別な研究のために企図されたものではなく、できるだけ広く使えるものとして作られた。サンドイッチ技法またはゲルトラップ技法の中で接着基質について本発明の構成により無血清培養がを可能になることから、研究者は一見してかなり簡単なものに見えかつ単純化されている培養条件を用いて自身の研究についてより高度の柔軟性を得る。フィブロネクチンの接着促進作用はよく知られている。しかしフィブロネクチンを普通に使っても利点はないかあるいはせいぜい肝細胞との関係で短期の利点があるにすぎない。
シングルゲル塩基類では培養媒体（血清有無の両ケース）または基質（フィブロネクチン有無の両ケース）の組成に関わりなく肝細胞はその正常な形態と機能を数日間で失う。この場合無血清という用語を使うことは、塩基類が比較的長期の無血清培養を可能にするというよりむしろＦＣＳが存在しないことを意味する。
次の表１は肝細胞の培養における培養時間に対する影響についてＦＣＳ（うし胎児血清）とフィブロネクチン（ＦＮ）の使用結果をまとめている。サンドイッチ培養系は、短期培養（数日）と長期培養（複数の週）両方について、少なくとも接着段階に制限されねばならないＦＣＳ成分の使用に適している。
フィブロネクチンの結合と完全無血清サンドイッチ技法のみが比較的長期にわたり安定しかつ再現性のよい培養系をもたらす。この種のモデルは、かなり信頼できる培養モデルを確立できるので周知のサンドイッチ技法より優れている。規定成分の混合物を用いた基質組成の変更により達成される改良は、成長ホルモンの研究のような再現性の向上のみに限定されるわけではない。サンドイッチ技法を用いたこの種の調製を結合しかつ可能にすることにより、他のすべての調製（以前のサンドイッチ技法を含めて）より優れたモデルが作られる。培養品質の敏感なパラメーターである、シトクローム  Ｐ４５０  の発現が、アルブミン分泌の安定化にもかかわらず、サンドイッチ技法の通常の調製、特に初期に低下する。本発明において、フィブロネクチンの混合物により基質組成が変わる場合、比較的長期の研究においてさえ１００％レベルの新鮮な肝臓組織と比較してＰ４５０発現の安定化をもたらす。
表１
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（  ）は増殖因子などのレセプター伝達プロセスの研究の再現性が不十分なためである。
したがって、本発明の特徴は部分的に知られたいくつかの方法や物質（サンドイッチ技法／ゲルトラップ技法／フィブロネクチン）の結合およびこれら一次肝細胞培養に関する技法を、敏感でこれまで知られていない総体に特に順応させることにある。
本発明によるとフィブロネクチンはサンドイッチ技法／ゲルトラップ技法により培養された肝細胞の上澄み液にも添加される。この場合、通常の培養媒体（たとえば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ）を用いて安定な無血清媒体を実現するには約４時間程度の反応で十分である。上述の固定段階へのフィブロネクチンの添加の場合とは対照的に、フィブロネクチンを用いた媒体は接着段階に対し作られねばならないので、この方法は使用者にとってより高価なものになる。２成分（コラーゲン、触媒濃縮液）からなる培養キットは、したがって、第３の成分により補完される。
シングルゲル系におけるこれら補助因子の情報内容により肝細胞機能の交換／誘導を実現しようと試みた以前の方法とは対照的に、本発明の方法の基礎は、これらの補助因子の位置が肝細胞と関連して肝細胞についてさらに重要な情報内容を含有する知識によって形成されている。サンドイッチ技法／ゲルトラップ技法の場合に規定された単純な塩基基質（たとえば、タイプコラーゲン）を用いることにより、結果としては多様な複雑性を持つ固定した二重基質系を系統的に確立できる。
本発明によるとサンドイッチ技法に必要な材料はすぐ使用できるキットとして集められている。これは対応して設計された肝細胞培養キットの製造へのこの知識の適用に関係している。これは約４℃の２つの無菌容器に別々に貯蔵されている、標準培養系のコラーゲン溶液と濃縮媒体からなる。フィブロネクチンは基質または触媒緩衝液のいずれかに添加すればよい。試薬はすべて粉末の形で用意されている。
本発明によると双極性接着肝細胞間の無血清共生培養は、肝細胞を被覆している基質層の上で培養されている細胞を用いて行われる。これは、これらのタイプの細胞間の無血清媒体における相互作用の研究を遂行する際に役立つ。これらの研究には、毒性研究と変異原性テストが含まれている。
本発明のさらに別の利点は、基質組成が培養の安定性を改善するために使用された種の機能に適合させることができるので、異種肝細胞たとえば、ヒト肝細胞の有用性にある。
本発明の４つの具体的な実施例を以下に原理的に説明する。
図１  塩基基質または触媒混合物へ基質成分の直接添加およびサンドイッチ技法と組み合わせる場合の好ましい実施例を示す；
図２ａ  サンドイッチ技法の調製および媒体へのフィブロネクチン分子の添加の間の状況を示す；
図２ｂ  固定相として第２の上部マトリックス層を有する図２ａによるサンドイッチ技法を示す；
図３  塩基基質または触媒混合物へ基質成分の直接添加およびゲルトラップ技法と組み合わせる場合の１実施例を示す；
図４  ゲルトラップ技法を利用し塩基基質の硬化後媒体へフィブロネクチン分子を添加する場合の状況を示す。図１によると、肝細胞１は細胞外基質２への双極性（上下両面の）接着を備えた固定相内に位置している。塩基基質に添加された基質分子Ｆはこの基質内に結合されている。たとえば、基質分子としてはフィブロネクチン分子４が用意されている。このため肝細胞１の周りの筋原線維基質２の内側にフィブロネクチン分子が濃縮される。また２の固定相に包埋されている、フィブロネクチン分子４のような結合基質成分の上には培養媒体３が存在する。
図２ａによると、フィブロネクチン分子４は少なくとも接着段階の間は肝細胞１に直接作用するが、その後もしこれらの分子が基質２の中へ拡散しなければ、第２の基質層と重層化する時に除去される（図２ｂを見よ）。培養媒体３はサンドイッチの上にある。
図３に表現されているように、肝細胞１は細胞外基質２への双極性（上下両面の）接着を備えた固定相内に位置している。塩基基質に添加された基質分子（Ｆ）はこの基質内に結合されている。このため肝細胞１の周りの筋原線維基質２の内側にフィブロネクチン分子４が濃縮される。
図４を見れば分かるように、フィブロネクチン分子４は肝細胞１と間接的に接しており、もしこれらの分子が基質２の中へ拡散しなければ、その後の媒体交換の際に除去される。フィブロネクチン分子４は基質の上にある培養媒体にも存在している。
上記実施例で表示されたフィブロネクチン分子４の代わりまたはそれ以外に、他のタイプの細胞外基質成分もコラーゲンまたは基質層２に導入することができる。
本発明によると、アルギン酸カルシウム、フィブリノゲン、ｋ−カラゲーン、寒天、樹脂類、ゼラチンなどの機械的安定因子、ｃａｒｂｏｐｏｌ（ポリアクリル酸）などのゲル形成物質、およびおそらく光重合性樹脂やポリウレタンも、さらにコラーゲン基質に添加することができる。さらにゼラチン、ウサギにかわまたは他の生物的や非生物的材料の基材への接着剤の添加も、これらが非毒性物質であれば可能である。
ここで唯一重要な因子は、被覆基質層の重合または硬化は肝細胞単層（サンドイッチ技法／ゲルトラップ技法）の構成後にのみ起こることである。したがって、ゲルトラップ技法では肝細胞は２層内の単層として埋包される。したがって、このデバイスはサンドイッチ技法と修正ゲルトラップ技法の原理により肝細胞と基質の層配列が厳格に分離されていることに特徴がある。これらの技法では肝細胞は一つの操作で基質内に装入され、さらに基質内では基質の重合が起きる前に基質が沈降し単層を形成する。これが他の細胞被包法と対比した場合の重要な特徴である。すなわち、他の細胞被包法では細胞を単にアグリゲート、球状あるいは分離された細胞として被包するだけである。
本発明のさらに有利な方法では、接着に必要な基質は、たとえば、共有結合あるいは細胞培養材料（ポリプロピレン、ポリエステルなどの膜またはポリスチレン、ｖｉｃｒｙ１．、ポリカーボネートまたは他のプラスチック類、ガラスなどの他の基材類）を予めイオン化する等の、安定な方法でも結合できる。この場合、コラーゲンとフィブロネクチンの混合物は特に有利である。したがって、無機系サブストレートと有機分子の間に非常に安定した接合（数ヶ月〜数年）が、サンドイッチ技法／ゲルトラップ技法に対し用意できる。アルギン酸カルシウムの有無とは関係なしに、コラーゲン−フィブロネクチン混合物あるいはアルギン酸カルシウムそのものも、重層化の際に再度装入できる。
基質の状態と培養条件を改良する周知の方法とは対照的に、本発明によると単純な塩基基質へ肝細胞を双極性接着する技法とさらに特定因子の混合物を組み合わせることにより、肝細胞の比較的長期の培養にとって大きな利点を可能にする方法がある。大きな利点にはたとえば、機械的、生化学的安定性が向上した培養系による肝細胞の完全無血清培養の可能性がある。
本発明によると、生体外での完全な機能維持により肝細胞の無血清培養に標準培養媒体を使用でき、また通常の媒体を用いた無血清培養用の対応して設計された細胞培養キットの製造に適した、単純な利用方法がある。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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