(57)【要約】本発明は、Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋ＣＤ２７＋細胞のサブ集団を特異的に刺激して、前記細胞からのＴ細胞非依存性抗菌応答をもたらすようにするための、医薬的に許容しうるキャリヤー中の免疫原組成物に関する。多糖細菌（連鎖球菌、髄膜炎菌、肺炎双球菌、またはインフルエンザ菌）によって、またはタンパク質カプシドウイルス（ポリオウイルス、脳心筋炎ウイルス、インフルエンザウイルス）によって感染した、または感染しやすい患者における、Ｔ細胞非依存性抗菌免疫応答の生成のための使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖抗原および／またはウイルスカプシドのタンパク質構造への免疫応答を得るのに適した免疫原組成物において、Ｍ＋Ｄ＋２７＋サブ集団のＢ細胞（これには、胚中心中にないＢ細胞のこのようなサブ集団の細胞も含まれる）に対して特異的な表面の少なくとも１つのマーカーの治療的有効量を、医薬的に許容しうるキャリヤー中に含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
このキャリヤーが、塩溶液、リンゲル液、リン酸塩緩衝塩溶液から成る群から選ばれる、請求項１に記載の免疫原組成物。
【請求項３】
そのほかにアジュバントも含んでいる、請求項１または２に記載の免疫原組成物。
【請求項４】
免疫原性共役体を含むことを特徴とする、請求項１〜３のうちのいずれか１つに記載の免疫原組成物。
【請求項５】
Ｍ＋Ｄ＋２７＋サブ集団のＢ細胞の受容体に対して特異的な表面のマーカー、特にＣＤ２１、ＤＣ２７に会合したＩｇＤ、およびＣＤ１ｃから選ばれるマーカーを含むことを特徴とする、請求項１に記載の免疫原組成物。
【請求項６】
Ｔ細胞非依存性免疫応答を得るのに適した量の、請求項１〜５のうちのいずれか１つに記載の免疫原組成物を含む、Ｔ細胞非依存性抗菌感染に対する保護を得るためのワクチン。
【請求項７】
前記免疫原組成物が共役体を含んでいる、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
Ｔ細胞非依存性免疫応答を得るのに適した作用物質が、リポソームに共有結合によって固定されている、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
細菌多糖抗原およびウイルスカプシドのタンパク質構造への免疫応答を、ヒトを含む恒温動物にもたらすための薬剤の調製のための、請求項１〜５のうちのいずれか１つに記載の免疫原組成物の使用。
【請求項１０】
前記免疫原組成物が、体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜約１０μｇの免疫原剤の用量で個人に投与される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
細菌多糖抗原およびウイルスカプシドのタンパク質構造への免疫応答を、ヒトを含む恒温動物にもたらすための薬剤の調製のための、請求項６〜８のうちのいずれか１つに記載のワクチンの使用。
【請求項１２】
連鎖球菌、肺炎双球菌、髄膜炎菌、またはインフルエンザ菌による感染に対する保護のための薬剤の調製のための、請求項６〜８のうちのいずれか１つに記載のワクチンの使用。
【請求項１３】
請求項１〜５のうちのいずれか１つに記載の免疫原組成物と、医薬的に許容しうるキャリヤーとを含む医薬組成物。
【請求項１４】
ワクチン接種を必要とする状態、あるいは多糖抗原による感染状態に対するワクチン接種の有効性のインビトロ診断方法において、Ｍ＋Ｄ＋２７＋サブ集団のＢ細胞の採血における検出および／または定量化を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
有利には突然変異率のレベルにおいても、該クローン性増殖のレベルにおいても、前記免疫応答に特異的に関わるＶＨ遺伝子の分析を含むことを特徴とする、請求項１４に記載のインビトロ診断方法。
【請求項１６】
免疫不全患者の採血に対して実施し、このテストの結果と、同じ多糖抗原への自然の免疫応答を示す被験者の採血の結果とを比較することを特徴とする、請求項１４または１５に記載のインビトロ診断方法。
【請求項１７】
約１０ｍｌの採血を用いることを特徴とする、請求項１６に記載のインビトロ診断方法。
【請求項１８】
Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞の作用の特異的阻害によって、被験者における自己免疫応答に対して阻害作用を有する薬剤の調製のための、請求項１〜５のうちのいずれか１つに記載の免疫原組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、感染性作用物質に対する、ヒトを含む恒温動物の免疫化の分野に関する。より詳しくは本発明は、多糖ユニットを有するカプセル化された細菌によって、および／またはウイルスカプシドのタンパク質構造によって引き起こされた感染および疾患に対する免疫応答の開始および／または強化のための手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の技術的背景
多糖抗原への免疫応答は、人生の最初の数年の間に徐々に成長し（Ｈｉｄａｌｇｏ，Ｈら、「再発性感染を有する子供における、前および後免疫化抗体滴定（Ｐｒｅ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」、Ａｎｎ．Ａｌｌ．Ａｓｔｈｍａ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６年、第７６巻：３４１〜３４６頁）、主としてＩｇＧ２に関わっている。２歳未満の子供および老人は、多糖ユニットを有するカプセル化された細菌に対して防御することはできないが、一方で、これらの人々は、Ｔ細胞依存性（タンパク質）抗原に応答しうる。臨床的結果をもたらすこの現象は、今日まで完全に解明されているわけではない。
【０００３】
ところで、肺炎双球菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌、および連鎖球菌は、菌株によって様々なユニットを含む多糖カプセルを有する胚である。したがって例えば、肺炎双球菌の様々な８４の血清型が同定された。ところでこの胚は、肺疾患、髄膜炎、副鼻腔炎、および細菌性耳炎の主要原因である。これらの疾患のうち、肺炎双球菌の肺炎では、フランスにおいて毎年約５，０００人が死亡し、そのうちの９０％が６５歳以上の患者であり、５歳未満の子供の場合、世界中で毎年百万人が死亡する（Ｌａｎｃｅｔ、社説、１９９９年、第３５４巻、２０１１頁；Ｓｈａｎｎ，Ｆ、「肺炎双球菌ワクチン：もう１度制御試験をすべき時だ（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ）」、Ｌａｎｃｅｔ、１９９８年、第３５１巻：１６００〜１６０１頁；Ｓｉｂｅｒ，Ｇ．Ｒ．、「肺炎双球菌病：新世代ワクチンへの展望（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、第２６５巻：１３８５〜１３８７頁）。
【０００４】
以前は例外的であった、肺炎双球菌の抗生物質への耐性は、その後ますます頻繁に発生し、最も利用されている抗生物質であるペニシリンおよびマクロライドの菌株の２０〜３５％に達する。このことは、抗肺炎双球菌およびまた抗髄膜炎菌のワクチン接種の問題を、最重要なものにしている。
【０００５】
最初のワクチンは、ウイルスのカプセルの多糖抗原に対して向けられたが、これらは、Ｔ細胞非依存性Ｂ応答を刺激した。血清型の９０％をカバーすることを目指した１４価、ついで２３価のこれらのワクチンは、２０年前は有効であるとして提供されていた。ところで今や（上記Ｓｈａｎｎ、１９９８年）、これらは敗血症型に対して一部しか保護しないこと、およびこれらは、とびぬけて最も頻繁に起こる非敗血症型においても有効性を示さないことさえ知られており、これらは特に２歳未満または５０歳以上の患者の場合不活性であることが分かったこと（Ｏｒｔｑｖｉｓｔ，Ａら、「中年および老年の人々の肺炎の予防における２３価の肺炎双球菌カプセル多糖ワクチンのランダム試験（Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ２３−ｖａｌｅｎｔ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｉｎ  ｍｉｄｄｌｅ−ａｇｅｄ  ａｎｄ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｐｅｏｐｌｅ）」、Ｌａｎｃｅｔ、１９９８年、第３５２巻：３９９〜４０３頁）、および最良の場合でも、作用時間がわずかであることが知られている。その結果、薬効がなく、有効期間が非常に限定され、２歳未満または約５０歳以上の患者の場合、ウイルスのカプセルの多糖抗原に対して向けられた従来のワクチンの場合は、多数回の再ワクチン接種が必要になる。
【０００６】
これらの理由すべてによって、世界中のワクチン行政は混乱したままである。イタリア、スペイン、およびベルギーの衛生当局は、体系的なワクチン接種プログラムを開発したが、ドイツ、オランダ、およびフランスの衛生当局は、フランスがワクチンのヨーロッパでの主要生産者であるにもかかわらず、このことについてほとんど完全に無関心である（上記Ｌａｎｃｅｔ、社説、１９９９年）。
【０００７】
しかしながら、若い患者および老年患者における、特に肺炎双球菌および髄膜炎菌の感染の予防および治療に対するほぼ失敗したこの状況は、公衆衛生の主要な問題になっている。
【０００８】
したがっていくつかの戦略が可能であるように思われる（上記Ｓｉｂｅｒ、１９９４年）。
【０００９】
・  明らかに確立された有効性を有する抗ヘモフィルスＢワクチンのモデルに対する共役ワクチンは、それぞれ抗原タンパク質と組合わされた最も頻繁に起こる７または９血清型に関しており、したがって、Ｔ細胞非依存性Ｂリンパ球を刺激して、はるかに強力な免疫応答を得ることができる。しかしながらこれらは、生産技術および生産費用のかなり大きい問題を提起する。その理由は、各多糖抗原が、適切な濃度で抗原タンパク質と選択的に組合わされなければならず、その結果、このように構成されたワクチンは現実には、複数の、実際には７つの異なるワクチンの混合物であり、このことは、技術的に実施が非常に難しいからである。さらにはこのようなワクチンを用いた場合、ほかの問題も浮上する。したがって、必然的に高いタンパク質抗原の用量が、過酷な反応を誘導しうる。さらには、様々なサブワクチン間の抗原競合の問題にも直面する。しかしながらまた特に、主要な問題は、抗原タンパク質、ジフテリアまたはテタニー毒素、または髄膜炎菌の外部包膜のタンパク質の選択の難しさという問題である（上記Ｓｉｂｅｒ、１９９４年；上記Ｓｈａｎｎ、１９９８年）。
【００１０】
・  これに代わる解決法は、多糖抗原を目指すことをあきらめ、肺炎双球菌酵素またはタンパク質、ニューモリシン、ニューラミニダーゼ、オートリシン、ヒアルロニダーゼ、Ａ表面のタンパク質、Ａ表面の付着因子などを用いることから成る。ところで現在まで、これらの選択に基づく免疫化試験はどれも、その有効性の実験的証明が行なわれていない（上記Ｓｉｂｅｒ、１９９４年；上記Ｓｈａｎｎ、１９９８年）。
【００１１】
・  考察された３つ目の解決法は、従来のワクチンとともに、Ｂポリクローナル活性化をもたらしうる抗−ＣＤ４０抗体を注射することであろう（上記Ｓｈａｎｎ、１９９８年）。
【００１２】
しかしながらこれらのどれも、上に挙げられた衛生上の問題へ十分に満足すべき回答を示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
今や意外にも、次のようにして、多糖抗原およびウイルスカプシドのタンパク質構造への免疫応答を誘導するか、および／または刺激するか、あるいはまたこれを負の調節に付すことができることが発見された。すなわち、Ｂ細胞のサブ集団、すなわちＢ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞（これには、胚中心中にないＢ細胞のこのようなサブ集団の細胞も含まれる）を、刺激するか、またはそれぞれ特異的に阻害し、有利には標的を定めて、これがＴ細胞非依存性抗菌応答をもたらすようにすることによってである。
【００１４】
したがって、固有の免疫応答を欠いているか、または該免疫応答が不十分である（これは２歳未満の子供、ならびに６５歳以上の老人の場合である）患者においてこのような免疫応答を開始させるか、および／または強化するための手段、ならびに自然の免疫応答の作用下でも、本発明にしたがって、すなわち細菌多糖抗原およびウイルスカプシドのタンパク質構造に対しての、免疫応答の誘導および／または刺激の作用下でも、適切な免疫応答が行なわれているかどうかをテストする手段が作製された。
【００１５】
本発明は、新規免疫原およびワクチンの概念、これに関するワクチン、ならびに本発明によるワクチン接種を必要とする状態、あるいはこれに付された患者における本発明のワクチン接種の有効性の診断のためのテストプロトコルを目的とする。本発明はまた、自己免疫応答の阻害手段の調製への、特別な前記免疫原の概念の適用も目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
したがって、多糖ユニットを有するカプセル化細菌によって、および／またはウイルスカプシドのタンパク質構造によって引起こされた感染および疾患に対する、ヒトを含む恒温動物の免疫化のための本発明による手段は、一方で、独創的なワクチン手段、他方で、本発明によるワクチン接種を必要とする状態の評価のため、および／または本発明によるワクチン接種の、ある一定の被験者に対して実施された採血への有効性の評価のための診断手段を含んでいる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、添付図面を参照して、次にさらに詳細に例証される。
【００１８】
本発明の基本となる理論的原理は、従来のＴ−Ｂ相互作用の不存在下に規定されたＢサブ集団のＩｇの遺伝子の突然変異である。
【００１９】
Ｂリンパ球集団は、ヒトの場合、次の４つのサブ集団を含む（Ｋｌｅｉｎ，Ｕら、１９９８年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８８巻；１６７９〜１６８９頁）：
・  第一のサブ集団はナチュラル（ｎａｉｆ）細胞から成り、これらは常にＣＤ２７−およびＩｇＭ＋ＩｇＤ＋（Ｍ＋Ｄ＋２７−）であり、これらは骨髄に由来し、Ｂリンパ球の約６０％を占める。これらは、ＣＤ５＋（約１５％について）またはＣＤ５−（約４５％について）であってもよい。
【００２０】
・  その他の３つのものは、記憶細胞から成る。これらは残りの４０％を占め、すべてＣＤ２７＋であり、約１５％の細胞がアイソタイプ交換（Ｍ−Ｄ−２７＋）を行なっており、約２５％がこれを行なっていない（約１５％についてはＭ＋Ｄ＋２７＋、約１０％についてはＭ＋Ｄ−２７＋）。
【００２１】
したがってＢリンパ細胞の約４０％を占めるこの記憶区画が、マウスの場合数パーセントにすぎないことに注目することは興味深い。マウスとは逆に、ヒトは、その胚中心において、すべてのＢ  Ｍ＋２７＋細胞、Ｄ＋もＤ−も変異しうる。
【００２２】
一方で、ＣＤ４０リガンド（Ｌ）が、Ｔ細胞依存性応答におけるＴ−Ｂ相互作用の鍵分子であることは知られている。Ｘ染色体上に位置するＣＤ４０Ｌ上の断節性突然変異を伴なう、高ＩｇＭ症候群に冒されたヒト男性患者およびこの遺伝子に対してノックアウトされたマウスは、胚中心を形成せず、Ｔ−Ｂ相互作用がないので、重鎖のアイソタイプを交換せず、免疫グロブリンのこれらの遺伝子を変異せず、循環ＩｇＧをほとんど有していない。
【００２３】
他方で、本発明の発明者らは、高ＩｇＭ症候群に冒されたこのようなヒト男性患者のＭ＋Ｄ＋２７＋集団を既知の技術によって単離し、これらの体細胞突然変異の頻度は、そこでは患者によって多少なりとも正常であったことを証明した。非常に驚くべきこれらの結果に直面して、本発明者らは、正常な成人において変異された細胞の約４０％を占めるこのＭ＋Ｄ＋２７＋集団が、成長し、胚中心の不存在にもかかわらず多様化するという仮説をうち出した。
【００２４】
さらにもう一方で、本発明の発明者らはまた、Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞は、ヒトの場合、誕生の時には臍帯のＢ細胞の約１％を占め、約３００ｂｐの１配列あたり約０．５の突然変異率を示すことがあり（可変）、一方成年被験者の場合、これらはその免疫グロブリン遺伝子を多様化し、Ｂ細胞区画の約５〜２５％を占め、１配列あたり５〜１０突然変異（可変）を伴なうことも考慮に入れた。
【００２５】
したがって本発明によれば、この集団の成長は、Ｔ細胞非依存性抗原への応答の出現と平行していることが確立された。これから次のような仮説が生じる。すなわち、これらの細胞は、多糖カプセルを有する細菌、連鎖球菌、肺炎双球菌、髄膜炎菌、またはインフルエンザ菌、およびＣＭＨの分子によって示すことができない糖残基を有する多糖カプセル化細菌への免疫応答の原因でありうるという仮説、およびこれらはまた、本質的にＴ細胞非依存性応答を開始させる反復カプシド構造を有するウイルス、例えばポリオウイルス、インフルエンザウイルス、脳心筋炎ウイルス、およびその他のウイルスへの応答の基礎でもありうるという仮説である（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．ら、「ウイルス構造の、抗体応答およびウイルス血清型形成への影響（Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｓ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１９９６年、第１７巻（１２）：５５３〜５５８頁）。
【００２６】
実際に、本発明者らは、高い率の突然変異を伴なって、Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞集団の強い膨張を示す患者の人々が、様々な種類の肺感染症、またはＩｇＧ置換された免疫不全症患者において一般に見られるＯＲＬ感染症に対して、ほかの人々よりもさらに良く保護されることを発見した。
【００２７】
最後に、抗細菌多糖ワクチンへの応答が、脾臓摘出された患者において現れないかぎり（Ｍｏｌｒｉｎｅ，Ｄ．ら、「無脾症患者における多糖ワクチンへの正常なＩｇＧおよび損傷ＩｇＭ応答（Ｎｏｒｍａｌ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＩｇＭ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ａｓｐｌｅｎｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．、１９９９年、第１７９巻：５１３〜５１７頁）、脾臓、特にその辺縁ゾーンは、これらのＭ＋Ｄ＋２７＋細胞が生産または貯蔵される場所になりうると認めることができる。
【００２８】
なんらかの理論によって縛られたいわけではないが、該被験者が生涯に出会う様々な種類の外的攻撃に対応する２つの区画において、ヒトを含む恒温動物のＢ細胞の成長モデルが、納得しうるものであると考えられる。したがってとりわけヒトは、次の２つのＢ細胞系を成長させたのであろう。１つは、胸腺依存性ペプチド抗原への強い親和性を伴なって応答するために、胚中心において多様化しうるものであり、もう１つは、腸と組合わされたリンパ組織（通常ＧＡＬＴと呼ばれている）のものと類似しており、多くの種（特にウサギ、ヒツジ、ウシ）における個体発生の間に成長し、胚中心とは独立して多様化可能であり、このような細胞が活性である被験者に、Ｔ細胞非依存性抗原に対する保護を確保しうるものである。
【００２９】
これを行なうために、本発明の実施によって得られた結果を考慮に入れた。これらの結果によれば、高いＭ＋Ｄ＋２７＋細胞率を有し、かつ多様化Ｉｇ受容体を有する高ＩｇＭ患者は、非高ＩｇＭであるにもかかわらずＩｇＧ置換を規則的に受けているその他の患者よりも、感染に対してよりよく抵抗する。
【実施例１】
【００３０】
下記の関連実験は、本発明のいくつかの側面を例証するために用いられているものであり、本発明を限定するものと考えるべきではない。
Ｂ  ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋ＣＤ２７＋細胞フラックスの分離およびの血球計算
ミニマクス（ＭｉｎｉＭＡＣＳ）（ミルテニー・ビオテック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））装置を用いて、および次の反応体：１）抗ヒト−ＦＩＴＣ（カルタグ（Ｃａｌｔａｇ））ＩｇＤおよびビオチニル化抗ヒト−ＣＤ２７（アンセル（Ａｎｃｅｌｌ））プラスストレプトアビジン−トリカラー（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ−ＴｒｉＣｏｌｏｒ）（カルタグ）；および２）抗ＩｇＤ−ＦＩＴＣ、抗ヒト−ＰＥ  ＣＤ２７（コールター−イムノテック（Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ））のうちの１つを用いて、これらの細胞の磁気分離によって９５〜９８％でＢ細胞リッチにされた、フィコール−イソパック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｉｓｏｐａｑｕｅ）で精製された細胞の懸濁液に対する２色染色によって、Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞の選別が実施された。本発明者ら自身の観察によれば、低いパーセンテージで存在するＣＤ２７＋集団の染色が、時にはＣＤ２７−トリカラーを用いて人工的に強化されていることから考えて、ＸＨＩＭ患者の細胞の選別に対しては、この後者の組合わせが好ましいであろう。
【００３１】
Ｂ記憶ＩｇＤ−ＣＤ２７＋細胞の不存在は、抗ＣＤ１９−ＰＣ５（コールター−イムノテック）、抗ＩｇＤ−ＦＩＴＣ、および抗ＣＤ２７−ＰＥを用いる染色によって、フィコールで精製されたＰＢＭＣに対して追跡された。３色分析が、ＣＤ１９−ＰＣ５にポジティブなＢ細胞に対して実施された。もう１つの特徴決定は、抗ＩｇＤ−ＦＩＴＣ、抗ヒト−ＰＥ  ＩｇＭ（カルタグ）、およびビオチニル化抗ＣＤ２７で染色された、ＣＤ１９リッチにされたＢ細胞に対して実施され、ついでストレプトアビジン−トリカラーが行なわれた。３色分析は、バリヤーＣＤ２７−トリカラーに対してポジティブな細胞に対して実施された。細胞ＩｇＤ＋ＣＤ２７＋がＩｇＭとともに実験されていることから考えて（データは示されていない）、この集団は、ＩｇＭ＋ＩｇＤ＋ＣＤ２７＋（または省略形Ｍ＋Ｄ＋２７＋）と名付けられる。
再配列ＶＨ３−２３遺伝子セグメントの配列の分析
ゲノムＤＮＡから、Ｋプロテイナーゼによる消化によって選別されたＢ  Ｄ＋２７＋細胞が抽出された。再配列ＶＨ３−２３遺伝子セグメントは、約３，０００細胞から、Ｐｆｕ  ターボ（Ｔｕｒｂｏ）（スタタジーン（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ））ポリメラーゼによって、半ネスト（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）ＡＣＰ戦略にしたがって増幅された。１回目の増幅のために、ＶＨ３−２３の頭部プライマー（５’−ＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＧ−３’）および３’ＪＨプライマー混合物（３：１の比における５’−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧ−３’および５’−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧ−３’）が用いられた（９５℃で４５秒、６４℃で６０秒、７２℃で９０秒、２５サイクルで）。２回目の増幅は、同じ３’ＪＨプライマー混合物およびＶＨ３−２３イントロンプライマー（５’−ＧＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＧＴＧＡ−３’）を用いて、第一反応混合物の１／１０に対して実施された（９５℃で４５秒、５５℃で６０秒、７２℃で９０秒、２５サイクルで）。基本的なＡＣＰの誤差の値は、臍帯血に由来するＢ  Ｄ＋２７−細胞に対して、同じ実験条件において、同じ試料サイズ（すなわち３，０００細胞）を用いて測定された。ゲル上で精製されたＡＣＰ生成物は、ＡＣＰ生成物のクローンキットゼロブラントトポＰＣＲ（Ｚｅｒｏ  ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてクローンされた。ＶＨ３−２３に対して陽性なコロニーの配列は、サイクル配列決定キットビッグダイ（ＢｉｇＤｙｅ）（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を用いて得られ、遺伝子分析器ＡＢＩ３１０を用いて分析された。得られた配列は、２８８塩基対（ｂｐ）（Ｇｌｕ１〜Ｃｙｓ９２）上の胚系統の遺伝子ＶＨ３−２３と比較された。
【００３２】
これらの材料および方法を用いて、Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞のゲノムＤＮＡから増幅された、再配列ＶＨ３−２３配列上の体細胞突然変異を分析した。患者（Ｚ．Ａ．）は、Ｍ＋Ｄ＋２７−集団に対して同じ条件下において測定された、ベースに近い突然変異レベルを示した。この患者は、今回の血液サンプリングの３年前に骨髄移植を受け、拒絶反応を示したことから考えて、特別な医療的過去を有している。その他の患者はすべて、年齢にかかわらず、下記のような一人を除いて、対照幼児において観察されたものと同様な突然変異レベルを示した（総配列について０．５〜１．７％、変異配列について０．９〜１．９％、Ｖ配列１つあたり０〜１５の突然変異を伴なう）。すなわちこの人は、その幼い年齢から考えて（Ｃ．Ｑ．５歳）かなり驚くべきことに、対照成人のものに近い突然変異の頻度を示した（総配列について２．２％、変異配列について３．２７％、Ｖ配列１つあたり０〜１８の突然変異を伴なう）（表１および図１参照）。配列全体の分析は、グループ分けおよび集合を伴なう突然変異の正常な分布、およびＣＤＲにおける置換の突然変異への選択を明らかにした。すべての患者において、配列の大部分は、様々なＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合を示した。このことは、特異的ＶＨ３−２３クローン性増殖の不存在を示した。
【００３３】
【表１】
2004529083.tif 000002
【００３４】
Ｍ＋Ｄ＋２７＋集団において得られた、変異されていない配列の様々な割合（５〜６０％）は、これが低い頻度で存在する時に選別された集団の様々な純度に対応しうるであろう。この集団は、Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞が多数存在する時にかなり減少した（例えば６０％のＢ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞を有する患者Ｆ．Ｆ．は、９５％の変異Ｖ配列を有していた。表１参照）。対照臍帯血の３つの試料によれば、Ｍ＋Ｄ＋２７＋集団における突然変異の頻度は、２つのケースにおいてベースに近く、１つのケースではわずかに上回った（ベースレベルの２倍）。
【００３５】
したがってＢ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞のこの特別な集団は、これに固有の分化経路を有することが証明された。この集団は、独特でかつこれ自体が特異的に用いられうるあるいくつかの受容体を有する。当業者は、本明細書に含まれている教示および当業者の固有の知識に基づいて、必要に応じて反復試験を実施して、Ｂ細胞のこのサブ集団に固有の表面のマーカーを選択することができる。本発明の手段によるこれの動態化および／または刺激によって、該患者に有益な治療をもたらすことができる。
【００３６】
非限定的な例として、このようなマーカーは、ＣＤ２１、およびＣＤ２７に会合したＩｇＤであってもよい。同様に、もう１つのマーカー、すなわちこれらの細胞上に強力に発現されたＣＤ１ｃは、ワクチン刺激に役立ちうることも発見された。
【００３７】
この集団が独立してそのＩｇの遺伝子を変異するという決定的な観察事項から考えて、本発明による免疫化技術において用られるワクチン接種手段は、該クローンの特異的増殖を誘導し、このようにして突然変異率を増すことによって、生成された抗体をかなり改良することができる。
【００３８】
本発明によるワクチンは、共役体を含む免疫原組成物を含んでいてもよい。前記ワクチンの１つの実施態様によれば、Ｔ細胞非依存性免疫応答をもたらしうる作用物質は、リポソームに共有結合によって固定されうる。
【００３９】
このようにして用いられる免疫原組成物は、医薬組成物中において、医薬的に許容しうるキャリヤーと組合わされてもよい。
【００４０】
他方、本発明に基づいた診断手段によって、血中に存在する特別なＢ細胞のこの集団の同定および／または定量化が可能になり、ワクチン接種の有効性をテスト／診断することが可能になる。実際には、これを行なうために、突然変異率のレベルでも、該クローン性増殖のレベルでも、これらの応答に特異的に関わるＶＨ遺伝子の分析を実施する。
【００４１】
このような診断の実施のために、白血球が抽出された非凝固血約１０ｍｌの採取に対して操作を行なうことができ、一方、殺菌試験または検査は、当業者に知られている方法にしたがって実施される。
【００４２】
さらにはここで考察されている抗菌および／または抗ウイルス応答において特異的なＢ細胞のこの集団の役割から考えて、Ｂ細胞のこの集団の異常な増殖が、あるいくつかの自己免疫の出現において観察される。さらにこの場合、血液細胞のこの集団の定量化によって、これらの異常な集団の存在および／または重要性を非常に簡単に診断することができる。
【００４３】
今度は、ワクチン接種の枠内で考察されているＢ細胞のこのサブ集団の増殖を誘導する代わりに、この集団に対して特異的な阻害分子を用いて、これらの病理学におけるこれらの細胞の増殖を阻害することも同様に可能である。当業者は、その選択を行なうために、Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞のサブ集団のこのような特異的阻害分子を追求し、テストすることができる。この点に関して、さらに、ある割合のＢリンパ腫が、これらの自己免疫症候群の間に出現し、これらのリンパ腫の表現型は、多くの場合Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞の表現型に対応することが分かったということにも注目しなければならない。したがって本発明はまた、過形成期間中、あるいは腫瘍期間中にこれらの細胞の成長を調節するための手段も目的とする。これらの手段は、Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞のサブ集団の特異的阻害剤に基づく。
【００４４】
本発明はしたがってまた、細菌多糖抗原およびウイルスカプシドのタンパク質構造への自己免疫応答を阻害するか、または負の調節をするための組成物であって、Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞のサブ集団に特異的な有効量の阻害分子を含む組成物も目的とする。
【００４５】
刺激または動態化のためにも、前記特異的Ｂ細胞の本発明による阻害のためにも、例えば前記Ｍ＋Ｄ＋２７＋集団を特異的に刺激することができる分子とともに、髄膜炎菌、肺炎双球菌等の細菌多糖の皮内注射を実施することができる。
【００４６】
実際に、専ら例としてのみであるが、治療される個人の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜約１０μｇの免疫原組成物の用量が適切である。
【００４７】
この免疫原組成物のキャリヤーは、なんであってもよく、特に塩溶液、リンゲル液、またはリン酸塩緩衝塩溶液であってもよい。実際、この免疫原組成物は、有利にはアジュバントを含んでいる。
【００４８】
前記免疫原組成物は、免疫原共役体を含んでいてもよく、これは、例えば体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜約１０μｇの免疫原剤の用量で個人に投与されてもよい。
【００４９】
２〜６０歳のヒトの患者の場合でさえ、本発明にしたがって作製された注射可能な組成物によって、用いられる特異的受容体に応じて、刺激または動態化、あるいは治療される患者において免疫応答を誘導するＢ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞の阻害を有効に強化することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明による概念の独創性は、上記の抗菌および一部抗ウイルス応答の原因であるＢ細胞が実際、非常に多様化された受容体とともに、最も若い年齢（幼児の場合、１歳前）から既に存在しており、これらの集団の特異的マーカーによって、これらを刺激することができ、したがって組合わされていない多糖抗原を用いて非常に幼い子供を保護することができると考えることから成っている。これは、今まで無かったことである。
【００５１】
さらには、本発明によるこれらの生成物および手段に特有の毒性を疑う理由はない。
結論として、本発明によって、ヒトを含む恒温動物、特に２歳未満の幼児、および６５歳以上の老人において、Ｂ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞を特異的に動態化しうる適切なワクチン量をこれらの人々に投与することによって、Ｔ細胞非依存性抗菌免疫応答を誘導または強化することができることが証明された。本発明による免疫化手段の投与は、当業者がベクターまたはキャリヤー、ならびに用いられるアジュバントを、ケースバイケース適応させるかぎり、従来の経路、特に非限定的に静脈内、腹膜腔内、皮内、筋肉内の注射によって、ならびにその他の従来の投与経路によって実施されてもよい。当業者は、これを行なうために自分自身の知識に頼り、投与方法および推奨される量を調整するために試験を実施することができるようになる。
【００５２】
本発明によって同様に、所望であれば、これらのＢ  Ｍ＋Ｄ＋２７＋細胞の作用を特異的に阻害することもできる。
【００５３】
インビトロで、Ｂ細胞のこの同じサブ集団は、多糖抗原による感染状態を診断するために用いることができ、同様に、例えばＥＬＩＳＡ法にしたがって、これらのテストの結果を、平行してテストされた同じ多糖抗原に自然の免疫応答を示す被験者の採血と比較する
ことによって、本発明にしたがって治療された免疫不全患者の採血に対する、上記のようなワクチン接種の有効性をテストするためにも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】対照ドナーおよびＸＨＩＭ患者に由来する再配列ＶＨ３−２３遺伝子セグメントにおける突然変異の分布を表わす。
【００５５】
この図面において各ヒストグラムは、一定の間隔において示された突然変異数を現わすＶＨ３−２３の配列のパーセンテージを表わしている。顕著な突然変異プロフィールから考えて、患者Ｃ．Ｑ．は、その他のＸＨＩＭ患者から分けて考察された。一方、ベースレベルに近い突然変異の頻度を有する患者Ｚ．Ａ．は、この分析には含まれなかった。各グループにおいて分析されたＶ配列数は、子供、ｎ＝３３；対照成人、ｎ＝３７；ＸＨＩＭ患者、ｎ＝１２５；患者Ｃ．Ｑ．、ｎ＝２８であった。
【図２】Ｉｇの遺伝子の超変異を生じるヒトＢ細胞の成長に対して提案された図式を表わす。
【００５６】
この図面において、経路Ｉは、胚中心（ＣＧ）において生成されるＴ細胞依存性応答に対応し、一方、経路ＩＩは、ＮＫまたはＴ細胞の通常でない補助を含みうるＴ細胞非依存性応答に対応するものとして提案されている。脾臓辺縁ゾーン（ＺＭ）またはパイエル板中の同等の部位、またはリンパ節は、Ｂ細胞の活性化部位であろう。Ｉｇの遺伝子の超変異は、これら２つの経路の各々において起こる。
【国際公開パンフレット】
2004529083.tif 000003
2004529083.tif 000004
2004529083.tif 000005
2004529083.tif 000006
2004529083.tif 000007
2004529083.tif 000008
2004529083.tif 000009
2004529083.tif 000010
2004529083.tif 000011
2004529083.tif 000012
2004529083.tif 000013
2004529083.tif 000014
2004529083.tif 000015
2004529083.tif 000016
2004529083.tif 000017
2004529083.tif 000018
2004529083.tif 000019
2004529083.tif 000020
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529083.tif 000021
【国際調査報告】
2004529083.tif 000022
2004529083.tif 000023
2004529083.tif 000024
2004529083.tif 000025
2004529083.tif 000026
2004529083.tif 000027
2004529083.tif 000028
2004529083.tif 000029
2004529083.tif 000030
2004529083.tif 000031
2004529083.tif 000032
2004529083.tif 000033