(57)【要約】改変蛍光タンパク質、これをコードする核酸、およびその用途。
2004502410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列がオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）の緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくとも置換Ｔ２０３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２】
アミノ酸配列が、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択されるＳ６５における置換をさらに含む、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
アミノ酸配列が、置換Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｈ；Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｇ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；またはＳ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｗのみ異なる、請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
アミノ酸配列が、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、およびＹ６６Ｗからなる群より選択されるＹ６６における置換をさらに含む、請求項１または２のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項５】
アミノ酸配列が表Ａに記載された変異をさらに含む、請求項１または２のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項６】
アミノ酸配列が折りたたみ変異をさらに含む、請求項１または２のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項７】
タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、哺乳類で好ましいコドンの少なくとも一つとの置換により配列番号：１のヌクレオチド配列とは異なる、請求項１〜３のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項８】
対象ポリペプチドおよび機能性の改変蛍光タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、請求項１〜３のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項９】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともアミノ酸置換Ｔ２０３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に動作可能に連結された発現制御配列を含む発現ベクター。
【請求項１０】
アミノ酸配列が、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択されるＳ６５における置換をさらに含む、請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１１】
アミノ酸配列が、置換Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｈ；Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｇ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ、Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；またはＳ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｗのみ異なる、請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１２】
アミノ酸配列がＹ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、およびＹ６６Ｗからなる群より選択されるＹ６６における置換をさらに含む、請求項１０または１１のいずれか一項記載の発現ベクター。
【請求項１３】
アミノ酸配列が表Ａに記載された変異をさらに含む、請求項１０または１１のいずれか一項記載の発現ベクター。
【請求項１４】
アミノ酸配列が折りたたみ変異をさらに含む、請求項９または１０のいずれか一項記載の発現ベクター。
【請求項１５】
タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、哺乳類で好ましいコドンの少なくとも一つとの置換により配列番号：１のヌクレオチド配列とは異なる、請求項９〜１１のいずれか一項記載の発現ベクター。
【請求項１６】
対象ポリペプチドおよび機能性の改変蛍光タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、請求項９〜１１のいずれか一項記載の発現ベクター。
【請求項１７】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともアミノ酸置換Ｔ２０３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に動作可能に連結された発現制御配列を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１８】
アミノ酸配列が、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択されるＳ６５における置換をさらに含む、請求項１７記載の組換え宿主細胞。
【請求項１９】
アミノ酸配列が、置換Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｈ；Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｇ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；またはＳ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｗのみ異なる、請求項１７記載の組換え宿主細胞。
【請求項２０】
アミノ酸配列が、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、およびＹ６６Ｗからなる群より選択されるＹ６６における置換をさらに含む、請求項１７または１８のいずれか一項記載の記載の組換え宿主細胞。
【請求項２１】
アミノ酸配列が表Ａに記載された変異をさらに含む、請求項１７または１８のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項２２】
アミノ酸配列が折りたたみ変異をさらに含む、請求項１７または１８のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項２３】
タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、哺乳類で好ましいコドンの少なくとも一つとの置換により配列番号：１のヌクレオチド配列とは異なる、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４】
対象ポリペプチドおよび機能性の改変蛍光タンパク質を含む融合タンパク質をコードする、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項２５】
原核細胞である、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項２６】
真核細胞である、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともアミノ酸置換Ｔ２０３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項２８】
アミノ酸配列が、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択されるＳ６５における置換をさらに含む、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項２９】
アミノ酸配列が、置換Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｈ；Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｇ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；またはＳ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｗのみ異なる、請求項２７記載のタンパク質。
【請求項３０】
アミノ酸配列が、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、およびＹ６６Ｗからなる群より選択されるＹ６６における置換をさらに含む、請求項２７または２８のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項３１】
アミノ酸配列が折りたたみ変異をさらに含む、請求項２７または２８のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項３２】
対象ポリペプチドおよび機能性の改変蛍光タンパク質を含む融合タンパク質である、請求項２７〜２９のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項３３】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともアミノ酸置換Ｔ２０３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質に結合させた抗体を含む、蛍光標識された抗体。
【請求項３４】
アミノ酸配列が、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択されるＳ６５における置換をさらに含む、請求項３３記載の蛍光標識された抗体。
【請求項３５】
アミノ酸配列が、置換Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｈ；Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｇ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；またはＳ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｗのみ異なる、請求項３３記載の蛍光標識された抗体。
【請求項３６】
アミノ酸配列が、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、およびＹ６６Ｗからなる群より選択されるＹ６６における置換をさらに含む、請求項３３または３４のいずれか一項記載の蛍光標識された抗体。
【請求項３７】
機能性の改変蛍光タンパク質に融合させた抗体を含む融合タンパク質である、請求項３３〜３５のいずれか一項記載の蛍光標識された抗体。
【請求項３８】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともアミノ酸置換Ｔ２０３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合させた抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３９】
アミノ酸配列が、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択されるＳ６５における置換を含む、請求項３８記載の核酸分子。
【請求項４０】
アミノ酸配列が、置換Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｈ；Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｇ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；またはＳ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｗのみ異なる、請求項３８記載の核酸分子。
【請求項４１】
アミノ酸配列が、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、およびＹ６６Ｗからなる群より選択されるＹ６６における置換をさらに含む、請求項３８または３９のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４２】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともアミノ酸置換Ｔ２０３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質に結合させた核酸プローブを含む蛍光標識された核酸プローブ。
【請求項４３】
アミノ酸配列が、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択されるＳ６５における置換をさらに含む、請求項４２記載の蛍光標識された核酸プローブ。
【請求項４４】
アミノ酸配列が、置換Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｈ；Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｇ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；またはＳ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｗのみ異なる、請求項４２記載の蛍光標識された核酸プローブ。
【請求項４５】
アミノ酸配列が、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、およびＹ６６Ｗからなる群より選択されるＹ６６における置換をさらに含む、請求項４２または４３のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項４６】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＬ４２、Ｖ６１、Ｔ６２、Ｖ６８、Ｑ６９、Ｑ９４、Ｎ１２１、Ｙ１４５、Ｈ１４８、Ｖ１５０、Ｆ１６５、Ｉ１６７、Ｑ１８３、Ｎ１８５、Ｌ２２０、Ｅ２２２ （Ｅ２２２Ｇは除く）、またはＶ２２４におけるアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項４７】
アミノ酸置換が以下である、請求項４６記載の核酸分子：
Ｌ４２Ｘ （ＸはＣ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｖ６１Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｔ６２Ｘ （ＸはＡ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｖ６８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ６９Ｘ （ＸはＫ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される）、
Ｑ９４Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＮからなる群より選択される）、
Ｎ１２１Ｘ （ＸはＦ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｙ１４５Ｘ （ＸはＷ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｈ１４８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、およびＲからなる群より選択される）、
Ｖ１５０Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｆ１６５Ｘ （ＸはＨ、Ｑ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｉ１６７Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ１８３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｅ、およびＫからなる群より選択される）、
Ｎ１８５Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｌ２２０Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、およびＴからなる群より選択される）、
Ｅ２２２Ｘ （ＸはＮおよびＱからなる群より選択される）、または
Ｖ２２４Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）。
【請求項４８】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＬ４２、Ｖ６１、Ｔ６２、Ｖ６８、Ｑ６９、Ｑ９４、Ｎ１２１、Ｙ１４５、Ｈ１４８、Ｖ１５０、Ｆ１６５、Ｉ１６７、Ｑ１８３、Ｎ１８５、Ｌ２２０、Ｅ２２２ （Ｅ２２２Ｇは除く）、またはＶ２２４におけるアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に動作可能に連結された発現制御配列を含む発現ベクター。
【請求項４９】
アミノ酸置換が以下である、請求項４８記載の発現ベクター：
Ｌ４２Ｘ （ＸはＣ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｖ６１Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｔ６２Ｘ （ＸはＡ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｖ６８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ６９Ｘ （ＸはＫ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される）、
Ｑ９４Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＮからなる群より選択される）、
Ｎ１２１Ｘ （ＸはＦ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｙ１４５Ｘ （ＸはＷ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｈ１４８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、およびＲからなる群より選択される）、
Ｖ１５０Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｆ１６５Ｘ （ＸはＨ、Ｑ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｉ１６７Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ１８３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｅ、およびＫからなる群より選択される）、
Ｎ１８５Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｌ２２０Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、およびＴからなる群より選択される）、
Ｅ２２２Ｘ （ＸはＮおよびＱからなる群より選択される）、または
Ｖ２２４Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）。
【請求項５０】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＬ４２、Ｖ６１、Ｔ６２、Ｖ６８、Ｑ６９、Ｑ９４、Ｎ１２１、Ｙ１４５、Ｈ１４８、Ｖ１５０、Ｆ１６５、Ｉ１６７、Ｑ１８３、Ｎ１８５、Ｌ２２０、Ｅ２２２ （Ｅ２２２Ｇは除く）、またはＶ２２４におけるアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に動作可能に連結された発現制御配列を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項５１】
アミノ酸置換が以下である、請求項５０記載の組換え宿主細胞：
Ｌ４２Ｘ （ＸはＣ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｖ６１Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｔ６２Ｘ （ＸはＡ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｖ６８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ６９Ｘ （ＸはＫ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される）、
Ｑ９４Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＮからなる群より選択される）、
Ｎ１２１Ｘ （ＸはＦ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｙ１４５Ｘ （ＸはＷ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｈ１４８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、およびＲからなる群より選択される）、
Ｖ１５０Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｆ１６５Ｘ （ＸはＨ、Ｑ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｉ１６７Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ１８３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｅ、およびＫからなる群より選択される）、
Ｎ１８５Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｌ２２０Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、およびＴからなる群より選択される）、
Ｅ２２２Ｘ （ＸはＮおよびＱからなる群より選択される）、または
Ｖ２２４Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）。
【請求項５２】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＬ４２、Ｖ６１、Ｔ６２、Ｖ６８、Ｑ６９、Ｑ９４、Ｎ１２１、Ｙ１４５、Ｈ１４８、Ｖ１５０、Ｆ１６５、Ｉ１６７、Ｑ１８３、Ｎ１８５、Ｌ２２０、Ｅ２２２ （Ｅ２２２Ｇ）、またはＶ２２４におけるアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項５３】
アミノ酸置換が以下である、請求項５２記載の機能性の改変蛍光タンパク質：
Ｌ４２Ｘ （ＸはＣ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｖ６１Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｔ６２Ｘ （ＸはＡ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｖ６８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ６９Ｘ （ＸはＫ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される）、
Ｑ９４Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＮからなる群より選択される）、
Ｎ１２１Ｘ （ＸはＦ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｙ１４５Ｘ （ＸはＷ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｈ１４８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、およびＲからなる群より選択される）、
Ｖ１５０Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｆ１６５Ｘ （ＸはＨ、Ｑ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｉ１６７Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ１８３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｅ、およびＫからなる群より選択される）、
Ｎ１８５Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｌ２２０Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、およびＴからなる群より選択される）、
Ｅ２２２Ｘ （ＸはＮおよびＱからなる群より選択される）、または
Ｖ２２４Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）。
【請求項５４】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＬ４２、Ｖ６１、Ｔ６２、Ｖ６８、Ｑ６９、Ｑ９４、Ｎ１２１、Ｙ１４５、Ｈ１４８、Ｖ１５０、Ｆ１６５、Ｉ１６７、Ｑ１８３、Ｎ１８５、Ｌ２２０、Ｅ２２２ （Ｅ２２２Ｇは除く）、またはＶ２２４におけるアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質に連結された抗体を含む蛍光標識された抗体。
【請求項５５】
アミノ酸置換が以下である、請求項５４記載の抗体：
Ｌ４２Ｘ （ＸはＣ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｖ６１Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｔ６２Ｘ （ＸはＡ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｖ６８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ６９Ｘ （ＸはＫ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される）、
Ｑ９４Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＮからなる群より選択される）、
Ｎ１２１Ｘ （ＸはＦ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｙ１４５Ｘ （ＸはＷ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｈ１４８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、およびＲからなる群より選択される）、
Ｖ１５０Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｆ１６５Ｘ （ＸはＨ、Ｑ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｉ１６７Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ１８３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｅ、およびＫからなる群より選択される）、
Ｎ１８５Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｌ２２０Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、およびＴからなる群より選択される）、
Ｅ２２２Ｘ （ＸはＮおよびＱからなる群より選択される）、または
Ｖ２２４Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）。
【請求項５６】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＬ４２、Ｖ６１、Ｔ６２、Ｖ６８、Ｑ６９、Ｑ９４、Ｎ１２１、Ｙ１４５、Ｈ１４８、Ｖ１５０、Ｆ１６５、Ｉ１６７、Ｑ１８３、Ｎ１８５、Ｌ２２０、Ｅ２２２ （Ｅ２２２Ｇは除く）、またはＶ２２４におけるアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合させた抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項５７】
アミノ酸置換が以下である、請求項５６記載の核酸分子：
Ｌ４２Ｘ （ＸはＣ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｖ６１Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｔ６２Ｘ （ＸはＡ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｖ６８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ６９Ｘ （ＸはＫ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される）、
Ｑ９４Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＮからなる群より選択される）、
Ｎ１２１Ｘ （ＸはＦ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｙ１４５Ｘ （ＸはＷ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｈ１４８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、およびＲからなる群より選択される）、
Ｖ１５０Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｆ１６５Ｘ （ＸはＨ、Ｑ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｉ１６７Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ１８３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｅ、およびＫからなる群より選択される）、
Ｎ１８５Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｌ２２０Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、およびＴからなる群より選択される）、
Ｅ２２２Ｘ （ＸはＮおよびＱからなる群より選択される）、または
Ｖ２２４Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）。
【請求項５８】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＬ４２、Ｖ６１、Ｔ６２、Ｖ６８、Ｑ６９、Ｑ９４、Ｎ１２１、Ｙ１４５、Ｈ１４８、Ｖ１５０、Ｆ１６５、Ｉ１６７、Ｑ１８３、Ｎ１８５、Ｌ２２０、Ｅ２２２ （Ｅ２２２Ｇ）、またはＶ２２４におけるアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質に結合された核酸プローブを含む蛍光標識された核酸プローブ。
【請求項５９】
アミノ酸置換が以下である、請求項５８記載のプローブ：
Ｌ４２Ｘ （ＸはＣ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｖ６１Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｔ６２Ｘ （ＸはＡ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｖ６８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ６９Ｘ （ＸはＫ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される）、
Ｑ９４Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＮからなる群より選択される）、
Ｎ１２１Ｘ （ＸはＦ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｙ１４５Ｘ （ＸはＷ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｈ１４８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、およびＲからなる群より選択される）、
Ｖ１５０Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｆ１６５Ｘ （ＸはＨ、Ｑ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｉ１６７Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ１８３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｅ、およびＫからなる群より選択される）、
Ｎ１８５Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｌ２２０Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、およびＴからなる群より選択される）、
Ｅ２２２Ｘ （ＸはＮおよびＱからなる群より選択される）、または
Ｖ２２４Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）。
【請求項６０】
以下の段階を含む、混合物が標的を含むか否かを判定する方法：
混合物を、プローブおよび請求項２７または５２のいずれか一項記載の機能性の改変蛍光タンパク質を含む蛍光標識されたプローブと接触させる段階；および
標的がプローブに結合しているか否かを判定する段階。
【請求項６１】
標的が固体マトリックスに結合している、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
オワンクラゲ関連緑色蛍光タンパク質の発色団の任意の原子から０．５ ｎｍ以内に位置するアミノ酸を別のアミノ酸と置換することにより、タンパク質の蛍光特性を変化させる段階を含む、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質を作製する方法。
【請求項６３】
アミノ酸置換が発色団の電子環境を変化させる、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
オワンクラゲ関連緑色蛍光タンパク質のループドメインのアミノ酸を、リン酸化またはタンパク質分解のコンセンサス配列が作られるようなアミノ酸と置換する段階を含む、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質を作製する方法。
【請求項６５】
以下の段階を含む、蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる方法：
請求項２７または５２のいずれか一項記載の機能性の改変蛍光タンパク質を含むドナー分子を提供する段階；
蛍光タンパク質に適切なアクセプター分子を提供する段階；および
ドナー分子とアクセプター分子とを十分接近させて蛍光共鳴エネルギー移動を可能にする段階。
【請求項６６】
以下の段階を含む、蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる方法：
請求項２７または５２のいずれか一項記載の機能性の改変蛍光タンパク質を含むアクセプター分子を提供する段階；
蛍光タンパク質に適切なドナー分子を提供する段階；および
ドナー分子とアクセプター分子とを十分接近させて蛍光共鳴エネルギー移動を可能にする段階。
【請求項６７】
ドナー分子が、アミノ酸配列に置換Ｔ２０３Ｉを含む改変蛍光タンパク質であり、アクセプター分子が、アミノ酸配列が置換Ｔ２０３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）を含む変異型蛍光タンパク質であり、該機能性の改変蛍光タンパク質がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくとも改変蛍光タンパク質の発色団から約０．５ ｎｍ以内に位置するアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、該置換は発色団の電子環境を変化させ、それによりオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項６９】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくとも改変蛍光タンパク質の発色団から約０．５ ｎｍ以内に位置するアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、該置換は発色団の電子環境を変化させ、それによりオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御配列を含む発現ベクターであって、置換が発色団の電子環境を変化させる発現ベクター。
【請求項７０】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくとも改変蛍光タンパク質の発色団から約０．５ ｎｍ以内に位置するアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、該置換は発色団の電子環境を変化させ、それによりオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項７１】
アミノ酸配列が配列番号：２と実質的に同一で、結晶が少なくとも２．０〜３．０オングストロームの分解能で回折する蛍光タンパク質を含むタンパク質の結晶。
【請求項７２】
蛍光タンパク質が少なくとも２００アミノ酸を有し、少なくとも８０％の完全性を有し、また単位格子次元の０．５％以内の結晶安定性を有する、請求項７１記載の結晶。
【請求項７３】
アミノ酸配列がＳ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択されるＳ６５における置換を含む、請求項７１記載の結晶。
【請求項７４】
以下のオングストローム単位の単位格子次元を有する、請求項７１記載の結晶：ａ＝５１．８、ｂ＝６２．８、およびｃ＝７０．７で、空間群がＰ２ ２ ２ 、α角が９０．００°、β角が９０．００°、またγ角が９０．００°で、９０％またはそれ以上の潜在的反射が原子座標の決定に用いられる回折限界を有する結晶。
【請求項７５】
以下の段階を含む、コンピュータを利用する、蛍光タンパク質を設計する方法：
リガンドが結合した状態の蛍光タンパク質を含む結晶化した蛍光タンパク質の三次元モデルから、リガンドの少なくとも一つの第１の化学基と相互作用する蛍光タンパク質の少なくとも一つの相互作用性アミノ酸を決定する段階、および
第１の化学基の少なくとも一つの化学的修飾を選択して、相互作用性アミノ酸と第１の化学基との相互作用と比べて相互作用性アミノ酸との間の相互作用が低下または上昇する構造をもつ第２の化学基を生じさせる段階。
【請求項７６】
アミノ酸配列が配列番号：２と実質的に同一な蛍光タンパク質を含む結晶化したタンパク質の三次元モデルを構築する段階をさらに含む、請求項７５記載のコンピュータを利用する方法。
【請求項７７】
選択する段階が、図５−１〜５−２８に挙げた少なくとも一つのアミノ酸と相互作用する第１の化学基を選択する、請求項７５記載のコンピュータを利用する方法。
【請求項７８】
化学的修飾が、第１の化学基と相互作用性アミノ酸とに比べて、第２の化学基と相互作用性アミノ酸との間の水素結合性相互作用、電荷相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、または双極性相互作用を促進する、請求項７５記載のコンピュータを利用する方法。
【請求項７９】
図５−１〜５−２８の原子座標に挙げた少なくとも２個の原子間の三次元関係を決定する段階を含む、蛍光タンパク質の三次元構造をモデル化するコンピュータを利用する方法。
【請求項８０】
決定する段階が、配列番号：２と少なくとも８０％が同一なアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質の三次元構造を決定する段階を含む、請求項７９記載のコンピュータを利用する方法。
【請求項８１】
決定する段階が、配列番号：２と少なくとも９５％が同一なアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質の三次元構造を決定する段階を含む、請求項７９記載のコンピュータを利用する方法。
【請求項８２】
決定する段階が、図５−１〜５−２８に挙げた少なくとも１５００個の原子の三次元関係を決定する段階を含む、請求項７９記載のコンピュータを利用する方法。
【請求項８３】
記憶装置を含み、該記憶装置において図５−１〜５−２８に挙げた原子座標から選択される少なくとも１０の原子座標が記憶されている、装置。
【請求項８４】
記憶装置が、原子座標を入力として受け取るコードを記憶するコンピュータ可読装置である、請求項８３記載の装置。
【請求項８５】
コンピュータ可読装置がフロッピーディスクまたはハードドライブである、請求項８４記載の装置。
【請求項８６】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＱ６９における置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項８７】
Ｑ６９における置換がＫ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される、請求項８６記載の核酸分子。
【請求項８８】
アミノ酸配列がＳ６５における機能性変異をさらに含む、請求項８６記載の核酸分子。
【請求項８９】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＥ２２２における置換（Ｅ２２２Ｇは除く）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項９０】
Ｅ２２２における置換がＮおよびＱからなる群より選択される、請求項８９記載の核酸分子。
【請求項９１】
アミノ酸配列がＦ６４における機能性変異をさらに含む、請求項８９記載の核酸分子。
【請求項９２】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＹ１４５における置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項９３】
Ｙ１４５における置換がＷ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される、請求項９２記載の核酸分子。
【請求項９４】
アミノ酸配列がＹ６６における機能性変異をさらに含む、請求項９２記載の核酸分子。
【請求項９５】
以下の段階を含む、被験化合物を同定する方法：
機能性の改変蛍光タンパク質で標識された生物学的存在、または機能性の改変蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む試料に被験化合物を接触させる段階、および
該機能性の改変蛍光タンパク質の蛍光を検出する段階。
【請求項９６】
被験化合物の存在下における蛍光が、被験化合物の非存在下における蛍光より大きい、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
機能性の改変蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ゲノムのポリヌクレオチドに動作可能に連結された、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
機能性の改変蛍光タンパク質が第２の機能性タンパク質と融合される、請求項９５記載の方法。
【請求項９９】
機能性の改変蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、応答エレメントに動作可能に結合される、請求項９６記載の方法。
【請求項１００】
機能性の改変蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、哺乳類細胞の応答エレメントに動作可能に連結される、請求項９６記載の方法。
【請求項１０１】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、
ｉ） Ｔ２０３位におけるＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される少なくとも一つの第１の置換、および
ｉｉ）Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換
において配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１０２】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒ、Ｈ１４８Ｇ、Ｈ１４８Ｑ、Ｈ１４８Ａ、Ｈ１４８Ｎ、およびＨ１４８Ｋからなる群より選択される、請求項１０１記載の核酸分子。
【請求項１０３】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｑである、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１０４】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｇである、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１０５】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒである、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１０６】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１５０位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１０７】
Ｖ１５０位における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１０６記載の核酸。
【請求項１０８】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１６３位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１０９】
Ｖ１６３位における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１０８記載の核酸。
【請求項１１０】
機能性の改変蛍光タンパク質がＱ６９位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１１１】
Ｑ６９位における少なくとも一つの第３の置換がＮ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群より選択される、請求項１１０記載の核酸。
【請求項１１２】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１５２位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１１３】
Ｖ１５２位における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、およびＮからなる群より選択される、請求項１１２記載の核酸。
【請求項１１４】
機能性の改変蛍光タンパク質がＦ１６５位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１１５】
Ｆ１６５位における少なくとも一つの第３の置換がＹ、Ｌ、およびＷからなる群より選択される、請求項１１４記載の核酸。
【請求項１１６】
機能性の改変蛍光タンパク質がＨ１８１位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１１７】
Ｈ１８１位における少なくとも一つの第３の置換がＫ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、およびＷからなる群より選択される、請求項１１６記載の核酸。
【請求項１１８】
機能性の改変蛍光タンパク質がＬ２０１位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１０１記載の核酸。
【請求項１１９】
Ｌ２０１位における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、およびＩからなる群より選択される、請求項１１８記載の核酸。
【請求項１２０】
以下の段階を含む、試料中の対象陰イオンの存在を判定する方法：
１） オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、Ｔ２０３位におけるＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される少なくとも一つの第１の置換が配列番号：２と異なるアミノ酸配列を含む、改変緑色蛍光タンパク質を試料に導入する段階；
２） 試料中の改変緑色蛍光タンパク質の蛍光を判定する段階。
【請求項１２１】
試料中の改変緑色蛍光タンパク質の蛍光を、対象陰イオンを既知濃度で含む対照試料に導入された対照となる改変緑色蛍光タンパク質の蛍光と比較する段階をさらに含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１２２】
試料が少なくとも１個の生細胞を含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１２３】
対象陰イオンがハロゲン化物である、請求項１２０記載の方法。
【請求項１２４】
改変蛍光タンパク質がＨ１４８位における少なくとも一つの第２の置換を含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１２５】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒ、Ｈ１４８Ｇ、Ｈ１４８Ｑ、Ｈ１４８Ａ、Ｈ１４８Ｎ、およびＨ１４８Ｋからなる群より選択される、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２６】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｑである、請求項１２５記載の方法。
【請求項１２７】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｇである、請求項１２５記載の方法。
【請求項１２８】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒである、請求項１２５記載の方法。
【請求項１２９】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１５０位における少なくとも一つの第３の置換を含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１３０】
Ｖ１５０位における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３１】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１６３位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１３２】
Ｖ１６３位における少なくとも一つの第３の置換がＱ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３３】
機能性の改変蛍光タンパク質がＱ６９位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１３４】
Ｑ６９位における少なくとも一つの第３の置換がＮ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群より選択される、請求項１３３記載の方法。
【請求項１３５】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１５２位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１３６】
Ｖ１５２位における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、およびＮからなる群より選択される、請求項１３５記載の方法。
【請求項１３７】
機能性の改変蛍光タンパク質がＦ１６５位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１３８】
Ｆ１６５位における少なくとも一つの第３の置換がＹ、Ｌ、およびＷからなる群より選択される、請求項１３７記載の方法。
【請求項１３９】
機能性の改変蛍光タンパク質がＨ１８１位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１４０】
Ｈ１８１位における少なくとも一つの第３の置換がＫ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、およびＷからなる群より選択される、請求項１３９記載の方法。
【請求項１４１】
機能性の改変蛍光タンパク質がＬ２０１位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１２０記載の方法。
【請求項１４２】
Ｌ２０１位における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、およびＩからなる群より選択される、請求項１４１記載の方法。
【請求項１４３】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、
ｉ） Ｔ２０３位における、Ｈ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される少なくとも一つの第１の置換、および
ｉｉ）Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換
において配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１４４】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒ、Ｈ１４８Ｇ、Ｈ１４８Ｑ、Ｈ１４８Ａ、Ｈ１４８Ｎ、およびＨ１４８Ｋからなる群より選択される、請求項１４３記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１４５】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｑである、請求項１４４記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１４６】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｇである、請求項１４４記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１４７】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒである、請求項１４４記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１４８】
Ｖ１５０位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１４３記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１４９】
Ｖ１５０位における少なくとも一つの第３の置換がＱ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１４８記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１５０】
Ｖ１６３位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１４３記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１５１】
Ｖ１６３位における少なくとも一つの第３の置換がＱ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１５０記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１５２】
Ｑ６９位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１４３記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１５３】
Ｑ６９位における少なくとも一つの第３の置換がＮ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群より選択される、請求項１５２記載の機能性の改変蛍光タンパク質。
【請求項１５４】
アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、
ｉ） Ｔ２０３位における、Ｈ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される少なくとも一つの第１の置換、および
ｉｉ）Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換
において配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質を含む宿主細胞。
【請求項１５５】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒ、Ｈ１４８Ｇ、Ｈ１４８Ｑ、Ｈ１４８Ａ、Ｈ１４８Ｎ、およびＨ１４８Ｋからなる群より選択される、請求項１５４記載の宿主細胞。
【請求項１５６】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｑである、請求項１５５記載の宿主細胞。
【請求項１５７】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｇである、請求項１５５記載の宿主細胞。
【請求項１５８】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒである、請求項１５５記載の宿主細胞。
【請求項１５９】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１５０位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１４３記載の宿主細胞。
【請求項１６０】
Ｖ１５０位における少なくとも一つの第３の置換がＱ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１５９記載の宿主細胞。
【請求項１６１】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１６３位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１４３記載の宿主細胞。
【請求項１６２】
Ｖ１６３位における少なくとも一つの第３の置換がＱ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１６１記載の宿主細胞。
【請求項１６３】
機能性の改変蛍光タンパク質がＱ６９位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１４３記載の宿主細胞。
【請求項１６４】
Ｑ６９位における少なくとも一つの第３の置換がＮ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群より選択される、請求項１６３記載の宿主細胞。
【請求項１６５】
以下の段階を含む、被験化合物がイオンチャネル活性に及ぼす作用をスクリーニングする方法：
ｉ）　ａ）オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、Ｔ２０３位におけるＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される少なくとも一つの第１の置換が配列番号：２と異なるアミノ酸配列を含む、改変緑色蛍光タンパク質、
ｂ）対象イオンチャネル
を含む細胞を提供する段階；
ｉｉ） 細胞に被験化合物を接触させる段階；
ｉｉｉ）改変緑色蛍光タンパク質に由来する蛍光を決定する段階。
【請求項１６６】
対象イオンチャネルの既知の活性化因子を細胞に接触させる段階をさらに含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１６７】
細胞中の改変緑色蛍光タンパク質の蛍光を、対照細胞に導入された対照となる改変緑色蛍光タンパク質の蛍光と比較する段階をさらに含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１６８】
対照イオンチャネルがハロゲン化物を輸送する、請求項１６５記載の方法。
【請求項１６９】
改変蛍光タンパク質がＨ１４８位における少なくとも一つの第２の置換を含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７０】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒ、Ｈ１４８Ｇ、Ｈ１４８Ｑ、Ｈ１４８Ａ、Ｈ１４８Ｎ、およびＨ１４８Ｋからなる群より選択される、請求項１６９記載の方法。
【請求項１７１】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｑである、請求項１７０記載の方法。
【請求項１７２】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｇである、請求項１７０記載の方法。
【請求項１７３】
Ｈ１４８位における少なくとも一つの第２の置換がＨ１４８Ｒである、請求項１７０記載の方法。
【請求項１７４】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１５０位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７５】
Ｖ１５０位における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１７４記載の方法。
【請求項１７６】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１６３位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７７】
Ｖ１６３位における少なくとも一つの第３の置換がＱ、Ｓ、Ｔ、およびＮからなる群より選択される、請求項１７６記載の方法。
【請求項１７８】
機能性の改変蛍光タンパク質がＱ６９位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１７９】
Ｑ６９位における少なくとも一つの第３の置換がＮ、Ｓ、Ｔ、およびＶからなる群より選択される、請求項１７８記載の方法。
【請求項１８０】
機能性の改変蛍光タンパク質がＶ１５２位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１８１】
Ｖ１５２位における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、およびＮからなる群より選択される、請求項１８０記載の方法。
【請求項１８２】
機能性の改変蛍光タンパク質がＦ１６５位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１８３】
Ｆ１６５位における少なくとも一つの第３の置換がＹ、Ｌ、およびＷからなる群より選択される、請求項１８２記載の方法。
【請求項１８４】
機能性の改変蛍光タンパク質がＨ１８１位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１８５】
Ｈ１８１位における少なくとも一つの第３の置換がＫ、Ｒ、Ｆ、Ｙ、およびＷからなる群より選択される、請求項１８４記載の方法。
【請求項１８６】
機能性の改変蛍光タンパク質がＬ２０１位における少なくとも一つの第３の置換をさらに含む、請求項１６５記載の方法。
【請求項１８７】
Ｌ２０１における少なくとも一つの第３の置換がＡ、Ｃ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｑ、Ｎ、Ｖ、およびＩからなる群より選択される、請求項１８６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
この１９９７年１１月１９日に出願され、許可された一部継続出願第０８／９７４，７３７号、１９９７年８月１５日に出願され、米国特許第６，０５４，３２１号として発行された継続出願第０８／９１１，８２５号、１９９６年８月３０日に出願され、許可された一部継続出願第０８／７０６，４０８号、これらは、１９９６年８月１６日に出願された米国仮出願第６０／０２４，０５０号を先行する出願日の恩典として主張し、各出願は参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、国立科学財団（ＮＳＦ）より供与された助成金番号ＭＣＢ ９４１８４７９の下で政府の支援の一部としてなされた。政府は本発明の権利を有するものとする。
【０００３】
蛍光分子は、感度が高くて定量が容易なため、多くのアッセイ系におけるレポーター分子として魅力ある分子である。最近、蛍光タンパク質には、生物系でインビボで作製可能で、かつ細胞内で起こる過程の追跡にマイクロインジェクションまたは透過化処理による細胞への導入を必要とすることなく使用可能であることから多くの注目を集めつつある。オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質として特に関心が寄せられている。このタンパク質のｃＤＮＡは既にクローン化されている（Ｄ．Ｃ． Ｐｒａｓｈｅｒら、「オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質の一次構造（Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｇｅｎｅ （１９９２） １１１：２２９〜３３）。同タンパク質の一次アミノ酸配列がｃＤＮＡから発現されているだけでなく、発現されたタンパク質は蛍光を発することもできる。これは、同タンパク質が、蛍光発生に必要と考えられる環状化および酸化を受ける可能性があることを示している。オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）は安定であり、タンパク質による分解に耐性をもつ２３８残基の１本鎖からなり、二つの吸収極大を３９５ ｎｍと４７５ ｎｍ付近にもつ。２本のピークの相対的な振幅は、おそらく二つまたはそれ以上の基底状態を反映して、環境因子（Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄ．、「生物発光および化学発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）」（Ｍ．Ａ． ＤｅＬｕｃａおよびＷ．Ｄ． ＭｃＥｌｒｏｙ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ． ２３５〜２４２ （１９８１）；Ｗ．Ｗ． ＷａｒｄおよびＳ．Ｈ． Ｂｏｋｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：４５３５〜４５４０ （１９８２）；Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ３５：８０３〜８０８ （１９８２））、および照度履歴（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｈｉｔｒｏｒｙ）（Ａ．Ｂ． Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２０：４４８〜４５５ （１９９５））に高感度で反応する。３９５ ｎｍの一次吸収ピークで励起すると、５０８ ｎｍにおける、量子収率が０．７２〜０．８５の発光極大が得られる（Ｏ． ＳｈｉｍｏｍｕｒａおよびＦ．Ｈ． Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｃｏｍｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９：２２３ （１９６２）；Ｊ．Ｇ． ＭｏｒｉｎおよびＪ．Ｗ． Ｈａｓｔｉｎｇｓ、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ７７：３１３ （１９７１）；Ｈ． Ｍｏｒｉｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２６５６ （１９７４）；Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄ、「Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． 総説」（Ｓｍｉｔｈ、Ｋ．Ｃ．編） ４：１ （１９７９）；Ａ．Ｂ． Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２０：４４８〜４５５ （１９９５）；Ｄ．Ｃ． Ｐｒａｓｈｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １１：３２０〜３２３ （１９９５）；Ｍ． Ｃｈａｌｆｉｅ、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ６２：６５１〜６５６ （１９９５）；Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄ、「生物発光および化学発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）」（Ｍ．Ａ． ＤｅＬｕｃａおよびＷ．Ｄ． ＭｃＥｌｒｏｙ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ． ２３５〜２４２ （１９８１）；Ｗ．Ｗ． ＷａｒｄおよびＳ．Ｈ． Ｂｏｋｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：４５３５〜４５４０ （１９８２）；Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ３５：８０３〜８０８ （１９８２））。フルオロフォアは、Ｓｅｒ６５残基とＧｌｙ７５残基の間にあるポリペプチド骨格の自己触媒的な環状化、およびＴｙｒ６６のβ結合の酸化によって生じる（Ａ．Ｂ． Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２０：４４８〜４５５ （１９９５）；Ｃ．Ｗ． Ｃｏｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１２１２〜１２１８ （１９９３）；Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１２５０１〜１２５０４ （１９９４））。Ｓｅｒ６５がＴｈｒに変異すると（Ｓ６５Ｔ）、励起スペクトルが振幅の大きい４８８ ｎｍにおける１本のピークだけになり（Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６４〜６６５ （１９９５））、構造異性体の性質を示さなくなる（Ａ．Ｂ． Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２０：４４８〜４５５ （１９９５））。
【０００４】
蛍光タンパク質は、遺伝子発現のマーカー、細胞系列のトレーサー、および生細胞内におけるタンパク質の局在をモニタリングするための融合タグとして用いられている（Ｍ． Ｃｈａｌｆｉｅら、「遺伝子発現のマーカーとしての緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２〜８０５；Ａ．Ｂ． Ｃｕｂｉｔｔら、「緑色蛍光タンパク質の理解、改善、および用途（Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ、ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、ＴＩＢＳ ２０、１９９５年１１月、ｐｐ． ４４８〜４５５、Ｍ． ＣｈａｌｆｉｅおよびＤ． Ｐｒａｓｈｅｒによる米国特許第５，４９１，０８４号。また人為的に作製されたオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質は、励起極大および発光極大の変化、ならびに異なる形状の励起および発光スペクトルを含む、蛍光特性の変化を示すことが明らかにされている（Ｒ． Ｈｅｉｍら、「緑色蛍光タンパク質の波長の変異および翻訳後自己酸化（Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｔｏｔｅｉｎ）」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、 （１９９４） ９１：１２５０１〜０４；Ｒ． Ｈｅｉｍら、「緑色蛍光の改善（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）」、Ｎａｔｕｒｅ、（１９９５） ３７３：６６３〜６６５）。
【０００５】
第２のクラスの応用は、いくつかの細胞特性の特異的インジケーターとしてのＧＦＰに基づいており、したがって、使用される異型の特定のスペクトル特性に依存している。ＧＦＰの異型およびその応用に関する最近の総説は、（ＰａｌｍおよびＷｌｏｄａｗｅｒ、１９９９；Ｔｓｉｅｎ、１９９８）を、また特殊な応用の総説は、（ＳｕｌｌｉｖａｎおよびＫａｙ、１９９９）を参照されたい。バイオセンサーへの応用には、タンパク質間相互作用（Ｈｅｉｍ、１９９９）、またはＣａ２＋濃度（Ｍｉｙａｗａｋｉら、１９９９）をモニタリングするための、およびリガンド結合をモニタリングするための、ＧＦＰ表面ループ内における受容体の挿入（Ｂａｉｒｄら、１９９９；ＤｏｉおよびＹａｎａｇａｗａ、１９９９）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に対する異なる色を発するＧＦＰの使用が含まれる。
【０００６】
いくつかの異型の蛍光放出は、環境の酸性度に対して感度が高い（Ｅｌｓｌｉｇｅｒら、１９９９；Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）。したがって、生細胞内における視覚的レポーターとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の特に成功している応用は、オルガネラまたは細胞質のｐＨの決定である（Ｋｎｅｅｎら、１９９８；Ｌｌｏｐｉｓら、１９９８；Ｍｉｅｓｅｎｂｏｃｋら、１９９８；Ｒｏｂｅｙら、１９９８）。発色団の二種の荷電状態は、完全なタンパク質のｐＨに対する感度と関連することがわかっており、フェノール性末端付近の構造変化に関しては結晶学的に（Ｅｌｓｌｉｇｅｒら、１９９９）、またラマン分光法で分光学的に（Ｂｅｌｌら、２０００）特性が解析されている。中性状態の発色団であるバンドＡは、ほとんどの異型で４００ ｎｍ付近で吸光を示すが、脱プロトンされたフェノール性末端をもつ発色団の陰イオン（バンドＢ）は、発色団付近の特定の変異では青色〜緑色を吸収する。野生型ＧＦＰは、バンドＡとバンドＢの組み合わせ、すなわちｐＨ６〜１０で比較的不変の組み合わせを特徴とする二種の基底状態に一致するスペクトル特性を示す（ＰａｌｍおよびＷｌｏｄａｗｅｒ、１９９９；Ｗａｒｄら、１９８２）。広範囲のｐＨで発色団のフェノレートとＧｌｕ２２２のカルボン酸とでプロトンが共有される内部平衡が存在することが示唆されている（Ｂｒｅｊｃら、１９９７；Ｐａｌｍら、１９９７）。最近実施された静電気力に関する計算では、同モデルが支持されており（Ｓｃｈａｒｎａｇｌら、１９９９）、完全な発色団の脱プロトンの理論的なｐＫａが約１３（ｐＨ １１〜１２における発光強度が倍加するという観察と一致する）と推定されている（ＢｏｋｍａｎおよびＷａｒｄ、１９８１；ＰａｌｍおよびＷｌｏｄａｗｅｒ、１９９９）。
【０００７】
野生型ＧＦＰとは対照的に、大部分の異型の発色団は一つのｐＫａをもつとされている。色の放出および発色団のｐＫａは、周囲のタンパク質によって強く調節される（Ｌｌｏｐｉｓら、１９９８）。Ｇｌｕ２２２はＧＦＰ相同物で完全に保存されており（Ｍａｔｚら、１９９９）、この残基がグルタミンで置換されると、発色団形成の効率が大きく低下することが報告されている（Ｅｌｓｌｉｇｅｒら、１９９９）。Ｓ６５Ｔ、およびＴ２０３Ｙ変異を含むＧＦＰ（ＹＦＰ）のＧｌｕ２２２のプロトン化は、ＧＦＰ Ｓ６５Ｔでは野生型のｐＫａから約５．９へ（Ｅｌｓｌｉｇｅｒら、１９９９；Ｋｎｅｅｎら、１９９８）、またＹＦＰ （ＧＦＰ Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ）では５．２〜５．４（Ｏｒｍｏら、１９９６；ＷａｃｈｔｅｒおよびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、１９９９）への発色団のｐＫａの低下にかかわると一般に考えられている。ＹＦＰでは、発色団とＴｙｒ２０３との結晶学的に同一なスタッキング相互作用がスペクトルの赤色シフトに大きな役割を果たすと考えられている（Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）。
【０００８】
他の異型とは異なり、発明者らは、ＹＦＰの発色団のｐＫａが、塩化物イオンなどのある種の小さな陰イオンの濃度に強く依存すること（ＷａｃｈｔｅｒおよびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、１９９９）、ならびにｐＫａが１４０ ｍＭ ＮａＣｌの存在下で約５．２から７．０へ上昇することを見出した（Ｅｌｓｌｉｇｅｒら、１９９９）。このような感度を利用することで、生細胞内の細胞質または細胞内区画の両方に存在するイオンを測定するバイオセンサーとして新しいＧＦＰを作製することが可能となる（ＷａｃｈｔｅｒおよびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、１９９９）。本発明は、塩化物やヨウ化物などのハロゲン化物を含むさまざまなイオンの蛍光測定を可能とする新しいＧＦＰ異型の作製および用途を含む。このような特性は、生物学的な蛍光インジケーターの利用に多様性および利便性を加える。蛍光特性の変化を介して、さまざまな蛍光特性、およびイオン濃度に反応する能力をもつ改変蛍光タンパク質が求められている。
【０００９】
発明の概要
本発明は、現行の緑色蛍光タンパク質および青色蛍光タンパク質と容易に区別可能な、さまざまな蛍光特性をもつ、機能性の改変蛍光タンパク質を提供する。このような改変蛍光タンパク質では、細胞内における二種またはそれ以上の過程を同時に測定することが可能となり、また蛍光エネルギーのドナーまたはアクセプター、ならびに陰イオンを検出するバイオセンサーとして使用することができる。長波長の改変蛍光タンパク質は、光力学性の毒性および細胞の自己蛍光が、長波長では有意に低いことから特に有用である。特に、置換Ｔ２０３Ｘ （Ｘは芳香族アミノ酸）を導入すると、オワンクラゲ関連蛍光タンパク質の励起波長および発光波長の極大が上昇する。
【００１０】
一つの局面では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、改変蛍光タンパク質の発色団から約０．５ ｎｍ以内に位置する少なくとも１個のアミノ酸の、発色団の電子的環境を変化させる置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００１１】
一つの局面では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＴ２０３における置換（特にＴ２０３Ｘ；ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一つの態様では、アミノ酸配列は、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択される、Ｓ６５における置換をさらに含む。別の態様では、アミノ酸配列は、置換Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｈ；Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｇ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；またはＳ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｗのみが異なる。別の態様では、アミノ酸配列は、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、およびＹ６６Ｗからなる群より選択される、Ｙ６６における置換をさらに含む。別の態様では、アミノ酸配列は、表Ａに記載された変異をさらに含む。別の態様では、アミノ酸配列は、折りたたみ変異をさらに含む。別の態様では、タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１のヌクレオチド配列と少なくとも一つのコドンが、哺乳類で好ましいコドンと異なる。別の態様では、核酸分子は、対象ポリペプチド、および機能性の改変蛍光タンパク質を含む融合タンパク質をコードする。
【００１２】
別の局面では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、Ｌ４２、Ｖ６１、Ｔ６２、Ｖ６８、Ｑ６９、Ｑ９４、Ｎ１２１、Ｙ１４５、Ｈ１４８、Ｖ１５０、Ｆ１６５、Ｉ１６７、Ｑ１８３、Ｎ１８５、Ｌ２２０、Ｅ２２２ （Ｅ２２２Ｇは除く）、またはＶ２２４における少なくとも一つのアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。一つの態様では、アミノ酸の置換には以下のようなものがある：
Ｌ４２Ｘ （ＸはＣ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｖ６１Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｔ６２Ｘ （ＸはＡ、Ｖ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｈ、およびＣからなる群より選択される）、
Ｖ６８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ６９Ｘ （ＸはＫ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される）、
Ｑ９４Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＮからなる群より選択される）、
Ｎ１２１Ｘ （ＸはＦ、Ｈ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｙ１４５Ｘ （ＸはＷ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｈ１４８Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、およびＲからなる群より選択される）、
Ｖ１５０Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｆ１６５Ｘ （ＸはＨ、Ｑ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）、
Ｉ１６７Ｘ （ＸはＦ、Ｙ、およびＨからなる群より選択される）、
Ｑ１８３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｅ、およびＫからなる群より選択される）、
Ｎ１８５Ｘ （ＸはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される）、
Ｌ２２０Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、およびＴからなる群より選択される）、
Ｅ２２２Ｘ （ＸはＮおよびＱからなる群より選択される）、または
Ｖ２２４Ｘ （ＸはＨ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、およびＹからなる群より選択される）。
【００１３】
別の局面では、本発明は、前述の任意の核酸分子に動作可能に連結させた発現制御配列を含む発現ベクターを提供する。別の局面では、本発明は、前述の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【００１４】
別の局面では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、改変蛍光タンパク質の発色団から約０．５ ｎｍ以内に位置する少なくとも１個のアミノ酸の、発色団の電子的環境を変化させる置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質を提供する。
【００１５】
別の局面では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＴ２０３における置換（特にＴ２０３Ｘ；ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質を提供する。一つの態様では、アミノ酸配列は、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｖ、およびＳ６５Ｉからなる群より選択される、Ｓ６５における置換を含む。別の態様では、アミノ酸配列は、置換Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｈ；Ｓ６５Ｔ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｆ６４Ｌ／Ｓ６５Ｇ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ７２Ａ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｑ６９Ｋ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ；またはＳ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｗのみが異なる。別の態様では、アミノ酸配列は、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｆ、およびＹ６６Ｗからなる群より選択される、Ｙ６６における置換をさらに含む。別の態様では、アミノ酸配列は、折りたたみ変異をさらに含む。別の態様では、改変蛍光タンパク質は、対象ポリペプチドおよび機能性の改変蛍光タンパク質を含む融合タンパク質の一部である。
【００１６】
別の局面では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、Ｌ４２、Ｖ６１、Ｔ６２、Ｖ６８、Ｑ６９、Ｑ９４、Ｎ１２１、Ｙ１４５、Ｈ１４８、Ｖ１５０、Ｆ１６５、Ｉ１６７、Ｑ１８３、Ｎ１８５、Ｌ２２０、Ｅ２２２、またはＶ２２４における少なくとも一つのアミノ酸置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質を提供する。
【００１７】
別の局面では、本発明は、前述の任意の機能性の改変蛍光タンパク質に結合させた抗体を含む、蛍光標識された抗体を提供する。一つの態様では、蛍光標識された抗体は、機能性の改変蛍光タンパク質に融合させた抗体を含む融合タンパク質である。
【００１８】
別の局面では、本発明は、本発明の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合させた抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００１９】
別の局面では、本発明は、本発明のアミノ酸配列を有する機能性の改変蛍光タンパク質に結合させた核酸プローブを含む蛍光標識された核酸プローブを提供する。このような融合は、リンカーペプチドを介する場合がある。
【００２０】
別の局面では、本発明は、任意のプローブを含む蛍光標識されたプローブ、および本発明の機能性の改変蛍光タンパク質に任意の混合物を接触させる段階；および任意の標的がプローブに結合しているか否かを判定する段階を含む、混合物が標的を含むか否かを判定する方法を提供する。一つの態様では、標的分子は固体マトリックス上に捕捉される。
【００２１】
別の局面では、本発明は、オワンクラゲ関連緑色蛍光タンパク質の発色団の任意の原子から０．５ ｎｍ以内の位置にあるアミノ酸を別のアミノ酸と置換する、タンパク質の蛍光特性を変化させる段階を含む、蛍光特性がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なる機能性の改変蛍光タンパク質を人工的に作製する方法を提供する。一つの態様では、このようなアミノ酸の置換は、発色団の電子的環境を変化させる。
【００２２】
別の局面では、本発明は、オワンクラゲ関連緑色蛍光タンパク質のループドメインのアミノ酸を、リン酸化またはタンパク質分解のコンセンサス配列が作られるようなアミノ酸と置換する段階を含む、蛍光特性がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なる機能性の改変蛍光タンパク質を作製する方法を提供する。
【００２３】
別の局面では、本発明は、本発明の機能性の改変蛍光タンパク質を含むドナー分子を提供する段階；蛍光タンパク質に適切なアクセプター分子を提供する段階；および、ドナー分子とアクセプター分子とを蛍光共鳴エネルギー移動が生じるように十分近接させる段階を含む、蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる方法を提供する。
【００２４】
別の局面では、本発明は、本発明の機能性の改変蛍光タンパク質を含むアクセプター分子を提供する段階；蛍光タンパク質に適切なドナー分子を提供する段階；および、ドナー分子とアクセプター分子とを蛍光共鳴エネルギー移動が生じるように十分近接させる段階を含む、蛍光共鳴エネルギー移動を生じさせる方法を提供する。一つの態様では、ドナー分子は、アミノ酸配列が置換Ｔ２０３Ｉを含む改変蛍光タンパクで、またアクセプター分子が、置換Ｔ２０３Ｘ （ＸはＨ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される芳香族アミノ酸）を含むアミノ酸配列を含む、蛍光特性がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なる改変蛍光タンパク質である。
【００２５】
別の局面では、本発明は、アミノ酸配列が配列番号：２と実質的に同一の蛍光タンパク質を含む、少なくとも２．０〜３．０オングストロームの分解能で回折するタンパク質の結晶を提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、リガンドの少なくとも１個の第１の化学基と相互作用する蛍光タンパク質の少なくとも１個の相互作用性アミノ酸を、リガンドが結合した蛍光タンパク質を含む結晶化した蛍光タンパク質の三次元モデルから決定する段階、および第１の化学基の少なくとも一つの化学的修飾を選択して、相互作用性アミノ酸と第１の化学基との間の相互作用に比べて、相互作用性アミノ酸と第２の化学基との間の相互作用が低下または上昇する構造を有する第２の化学基を作製する段階を含む、蛍光タンパク質を設計するコンピュータを利用する方法を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、図５−１〜５−２８の原子座標に挙げた少なくとも２個の原子間の三次元関係を決定する段階を含む、蛍光タンパク質の三次元構造をモデル化するコンピュータを利用する方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、記憶装置、および同装置において図５−１〜５−２８に挙げた原子座標から選択される少なくとも１０の原子座標が記憶されている、装置を提供する。一つの態様では、記憶装置は、原子座標を入力として受け取るコードを記憶するコンピュータ可読装置である。別の態様では、コンピュータ可読装置は、フロッピーディスクまたはハードドライブである。
【００２９】
別の態様では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、Ｔ２０３位における、Ｈ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される少なくとも一つの第１の置換、およびＨ１４８位における少なくとも一つの第２の置換が配列番号：２と異なる機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００３０】
別の局面では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、Ｔ２０３位における、Ｈ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される少なくとも一つの第１の置換が配列番号：２と異なるアミノ酸配列を含む改変緑色蛍光タンパク質を任意の試料に導入する段階、および試料中の改変緑色蛍光タンパク質の蛍光を決定する段階を含む、試料中の対象陰イオンの存在を判定する方法を含む。
【００３１】
別の局面では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、Ｔ２０３位における、Ｈ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される少なくとも一つの第１の置換、およびＨ１４８位における少なくとも一つの第２の置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質を含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、Ｔ２０３位における、Ｈ、Ｙ、Ｗ、またはＦからなる群より選択される少なくとも一つ第１の置換、およびＨ１４８位における少なくとも一つの第２の置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質を含む宿主細胞を含む。
【００３３】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される用語と同じ意味をもつ。本明細書に記載した方法および材料と類似しているかまたは同一である任意の方法および材料は、本発明を実施する際または検討する際に使用されるが、好ましい方法および材料について説明する。本発明の目的上、以下の用語を定義する。
【００３４】
「結合ペア」とは、相互に親和性をもつ二つの部分（例えば、化学的部分または生化学的部分）を意味する。結合ペアの例には、抗原／抗体、レクチン／アビジン、標的ポリヌクレオチド／プローブのオリゴヌクレオチド、抗体／抗−抗体、受容体／リガンド、酵素／リガンドなどがある。「結合ペアの一つの成分」とはペアの一つの部分（例えば抗原やリガンド）を意味する。
【００３５】
「核酸」とは、１本鎖または２本鎖の形状をとるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体を意味し、文中で特に限定されない限り、天然のヌクレオチドと同様に機能可能な天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む。核酸分子がＤＮＡ配列である場合、これは、「Ｕ」が「Ｔ」で置換されている対応ＲＮＡ配列を有するＲＮＡ分子も含むように理解される。
【００３６】
「組換え核酸分子」とは、天然ではない核酸分子、および天然の状態で結合した状態にない二種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を意味する。組換え核酸分子は、人工的な組換え法、例えば遺伝子工学的手法や化学的合成法で作製される。
【００３７】
あるポリペプチドを「コードする」ヌクレオチド配列という言及は、その配列が、転写およびｍＲＮＡが翻訳されることでポリペプチドを生じることを意味する。これは、ヌクレオチド配列がｍＲＮＡと同一で同配列が通常配列表で提供されるコード鎖、ならびに、転写の鋳型として用いられる相補鎖の両方を含む。当業者であれば、この表現が、同じアミノ酸配列をコードするすべての縮重ヌクレオチド配列も含むことを理解すると思われる。任意のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含む配列を含む。
【００３８】
「発現制御配列」とは、動作可能に連結されるヌクレオチド配列の発現を調節するヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、同発現制御配列がヌクレオチド配列の転写、および必要に応じて翻訳を制御および調節する場合に、ヌクレオチド配列に「動作可能に連結される」。したがって発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写終結配列、タンパク質コード遺伝子の前にある開始コドン（ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの翻訳を可能とする遺伝子の正確な読み枠の維持、および終止コドンを含む場合がある。
【００３９】
本明細書で用いる、任意の物体について適用される「天然の」とは、ある物体が天然に見出されるという事実を意味する。例えば、天然の供給源から単離可能で、実験室で人によって意図して修飾されない生物体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は天然である。
【００４０】
「使用可能に連結された」とは、このように記載された成分を、意図した様式で機能可能に関連づけるように並置することを意味する。コード配列に「使用可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、適切な分子（例えば、誘導物質およびポリメラーゼ）が制御配列または調節配列に結合したときに、制御配列に適合する条件で達成されるように連結されている。
【００４１】
「制御配列」とは、連結したコード配列および非コード配列の発現に作用するのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。制御配列の性質は宿主生物によって異なる。原核生物では、制御配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み、真核生物では、制御配列は一般に、プロモーター、および転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、存在が発現に影響を及ぼすことがあって存在が有利に作用する他の成分（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）を少なくとも含むことを意図する。
【００４２】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源のポリヌクレオチド、またはこれらの組み合わせのポリヌクレオチドを意味し、その起源によって「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出される細胞と結びついていないか、または（２）天然では連結されていないポリヌクレオチドに使用可能に連結される。
【００４３】
「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも１０塩基の長さの重合体状態のリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾型のいずれかのヌクレオチドを意味する。この用語は、１本鎖状および２本鎖状のＤＮＡを含む。
【００４４】
「プローブ」という用語は、別の物質（「標的」）に特異的に結合する物質を意味する。プローブは例えば、抗体、核酸、受容体、およびそのリガンドを含む。
【００４５】
「調節」とは、生物学的な活性または過程（例えば、酵素活性または受容体結合）の機能特性を促進する能力、または抑制する能力を意味し、このような促進または抑制は、情報伝達経路の活性化などの特定の事象の発生を条件とする場合があり、および／または特定の細胞種でのみ明らかになる場合がある。
【００４６】
「調節因子」という用語は、合成分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチド、または有機分子）などの化学物質（天然または非天然の化学物質）、または細菌、植物、真菌、動物（特に哺乳類）の細胞もしくは組織などの生物材料から作られた抽出物を意味する。調節因子は、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイ法に含めることで、一つの生物学的過程または複数の生物学的過程の阻害物質または活性物質としての潜在的な活性（例えば、作動物質、部分拮抗物質、部分作動物質、逆作動物質、拮抗物質、抗腫瘍物質、細胞毒性物質、腫瘍性形質転換または細胞増殖の阻害物質、細胞増殖促進性物質など）が（直接的または間接的に）評価されうる。調節因子の活性は、既知のものも、未知のものも、または部分的に既知のものもある。
【００４７】
「被験化合物」という用語は、推定調節因子として本発明の一つまたは複数のスクリーニング法でによって検討される化学物質を意味する。被験化合物は通常、対象標的に結合することが不明である。「対照被験化合物」という用語は、標的に結合することが知られている化学物質（例えば、既知の作動物質、拮抗物質、部分作動物質、または逆作動物質）を意味する。通常、さまざまな所定の濃度（０．０１ μＭ、０．１ μＭ、１．０ μＭ、および１０．０ μＭなど）の被験化合物をスクリーニングに用いる。
【００４８】
「標的」という用語は、生物的過程にかかわる生化学的存在を意味する。標的は典型的には、ある生物の生理学的性質または生物学的性質に有用な役割を果たすタンパク質である。治療用化合物は標的に結合して、その機能を変化させたり調節したりする。本明細書で用いる標的は、細胞表面にある受容体、Ｇ−タンパク質、キナーゼ、イオンチャネル、ホスホリパーゼ、および本明細書に記載された他のタンパク質を含む場合がある。
【００４９】
「標識」という用語は、分光光度的、光化学的、生化学的、免疫学的、または化学的な手法で検出可能な組成物を意味する。例えば有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、蛍光タンパク質、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで通常使用される酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体に利用可能なタンパク質などがある。例えば本発明のポリペプチドは、例えば任意のポリペプチドに組み入れることにより検出用標識として作製して、対象ポリペプチドに特異的に反応する抗体を標識する際に使用することができる。標識は、放射能、蛍光、または酵素活性などの測定可能なシグナルを生じることがあり、これを用いて結合状態の標識の量を測定することができる。
【００５０】
「核酸プローブ」という用語は、他の核酸分子の特定の配列またはサブ配列に結合する核酸分子を意味する。プローブは、好ましくは標的核酸の完全配列またはサブ配列に対して相補的塩基対合を介して結合する核酸分子である。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列と完全な相補性を欠く標的配列に結合可能であると理解される。プローブは好ましくは、放射性同位元素、発色団、発光団、色素源、蛍光タンパク質として直接標識されるか、またはストレプトアビジン複合体が後に結合する可能性のあるビオチンなどで間接標識される。プローブの有無を調べることで特定の配列またはサブ配列の有無を検出することができる。
【００５１】
「標識された核酸プローブ」とは、リンカーを介して共有結合的に、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、または水素結合を介して標識に結合して、プローブに結合した標識の存在の検出によってプローブの存在を検出することができる核酸プローブである。
【００５２】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を意味する。これらの用語は、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸、人工的な化学的類似体であるアミノ酸重合体、ならびに天然のアミノ酸重合体に適用される。「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ分子に由来するタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現によって産生されるタンパク質を意味する。
【００５３】
「組換え宿主細胞」という用語は、組換え核酸分子を含む細胞を意味する。したがって例えば、組換え宿主細胞は、対象細胞に由来する、天然では見出されない（非組換え）遺伝子群を発現する場合がある。
【００５４】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という表現は、天然の状態では通常伴うことがわかっている成分を実質的または本質的に含まない材料を意味する。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学的手法で決定される。調製物中に存在する優勢なタンパク質または核酸種であるタンパク質または核酸の分子は実質的に純粋である。一般に、単離されたタンパク質または核酸の分子は、調製物中に存在するすべての巨大分子種の８０％を上回る量を含む。好ましくは、このようなタンパク質は、存在する全巨大分子種の９０％を上回るように精製される。より好ましくは、このようなタンパク質は９５％を上回るように精製され、また最も好ましくは、このようなタンパク質は、他の巨大分子種が従来の手法で検出されない実質的な均一状態に精製される。
【００５５】
任意の物質について適用される「天然の」という表現は、物質が天然に見出されるという事実を意味する。例えば、天然の供給源から単離可能で、実験室で人によって意図して修飾されない生物体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は天然である。
【００５６】
「抗体」という用語は、一つの免疫グロブリン遺伝子、もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの断片に実質的にコードされた、分析物（抗原）に特異的に結合して認識するポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμの定常領域の遺伝子群、ならびに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。抗体は例えば、完全な免疫グロブリンとして、または、さまざまなペプチダーゼによる消化によって生じる特性がよく解析された複数の断片として存在する。これには例えば、Ｆａｂ’断片、およびＦ（ａｂ）’２断片が含まれる。本明細書で用いる「抗体」という用語は、組換えＤＮＡ技術を用いる抗体全体の修飾、またはデノボ合成によって作製される抗体断片も含む。
【００５７】
「イムノアッセイ法」という用語は、抗体を用いて分析物に特異的に結合させるアッセイ法を意味する。イムノアッセイ法は、特定の抗体の特定の結合特性を利用して分析物を単離したり、標的としたり、および／または定量したりすることを特徴とする。
【００５８】
二つの核酸配列またはポリペプチド配列に関して「同一である」という表現は、二つの配列上の残基が、最大の一致をみるように並べたときに同じであることを意味する。配列同一性のパーセンテージをタンパク質またはペプチドについて用いる場合、同一でない残基の位置は、アミノ酸残基が類似の化学的特性（例えば電荷や疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換されることで、したがって対象分子の機能特性を変化しないような、保存的なアミノ酸置換が異なる場合があると認識される。保存的置換の配列が異なる場合、配列同一性のパーセントは、置換の保存的性質を正すために上方に合わせられる場合がある。このような調節を行う手法は当技術分野で周知である。典型的には、これは、完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとして保存的置換を評点化することで配列同一性のパーセンテージを上昇させる段階を含む。したがって例えば、同一なアミノ酸の評点が１で、非保存的置換の評点が０の場合、保存的置換は０と１の間の評点となる。保存的置換の評点化は例えば、既知のアルゴリズムで計算することができる。これについては例えば、マイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ．、４：１１〜１７ （１９８８）；スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）（１９８１）、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２：４８２；ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびワンチ（Ｗｕｎｓｃｈ）（１９７０）、Ｊ． ＭｏＬ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３；ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）（１９８８）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４；ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８８）、Ｇｅｎｅ、７３：２３７〜２４４、ならびにヒギンスおよびシャープ（１９８９）、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３；コルペット（Ｃｏｒｐｅｔ）ら（１９８８）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６、１０８８１〜９０；フアン（Ｈｕａｎｇ）ら（１９９２）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８、１５５〜６５、ならびにピアソンら（１９９４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４、３０７〜３１を参照されたい。アライメントは精査およびマニュアルによるアラインメントで行われることもある。
【００５９】
特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」とは、同一なアミノ酸配列、または実質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は実質的に同一な配列を意味する。遺伝暗号には縮重性があるので、機能が同一の多数の核酸は、任意のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧはいずれもアミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、一つのコドンによってアルギニンが指定されるあらゆる位置において、同コドンは、コードされたポリペプチドを変化させることなく、記載された任意の対応コドンに変えることができる。このような核酸の変異は、「保存的に修飾された変異」の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書に記載されたあらゆる核酸配列は、可能なあらゆるサイレント変異も意味する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常メチオニンのみを表すコドンであるＡＵＧを除く）が修飾されて、標準的な手法で機能的に同一な分子を生じる可能性があることを認識すると思われる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の個々の「サイレント変異」は、個々に記載された配列では表面化しない。また当業者であれば、コードされた配列において１個のアミノ酸またはパーセンテージの小さいアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）を変化、付加、欠失させる個々の置換、欠失、または付加が、変化が化学的に類似のアミノ酸へのアミノ酸置換を生じる「保存的に修飾された変異」であることを認識すると思われる。機能が類似したアミノ酸をもたらす保存的アミノ酸の置換は当技術分野で周知である。以下の６群は、相互に保存的置換の関係にあるアミノ酸をそれぞれ含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６０】
「相補的」という表現は、一つの核酸分子が、他の核酸分子の結合パートナーの配列を有することを意味する。したがって、配列５’−ＡＴＧＣ−３’は、配列５’−ＧＣＡＴ−３’と相補的である。
【００６１】
アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が、任意の比較ウィンドウにおいて標準配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する場合、標準配列に対して「実質的に同一」または「実質的に類似」である。したがって実質的に類似した配列は、例えば少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。相互に同一な二つの配列が実質的に同一であることは言うまでもない。
【００６２】
あるヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列の相補物が標準ヌクレオチド配列と実質的に同一である場合、標準ヌクレオチド配列に対して「実質的に相補的」である。
【００６３】
「ストリンジェントな条件」という表現は、核酸ハイブリダイゼーションに用いられる温度およびイオン条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、また異なる環境パラメータの下では異なる。一般にストリンジェントな条件は、特定のイオン強度およびｐＨにおいて特定配列の融点（Ｔｍ）より約５〜２０℃低い温度が選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブとハイブリッドを形成する（特定のイオン強度およびｐＨにおける）温度である。
【００６４】
「対立遺伝子異型」とは、特定の遺伝子座にある遺伝子、ならび遺伝子のｍＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡ、およびそれがコードするポリペプチドの多型を意味する。
【００６５】
「哺乳類で好ましいコドン」という表現は、以下のリストから選択される、哺乳類細胞で発現されるタンパク質で極めて高頻度で使用される、アミノ酸をコードする一連のコドンにおけるコドンのサブセットを意味する。
【００６６】
2004502410.tif 000003
【００６７】
蛍光分子は、蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）に有用である。ＦＲＥＴには、ドナー分子とアクセプター分子がかかわる。ドナー分子とアクセプター分子間におけるＦＲＥＴの効率および検出率を最適なものとするためには、複数の因子の均衡を図る必要がある。ドナーの発光スペクトルは、重なり積分を最大とするためにアクセプターの励起スペクトルと可能な限り大きく重複すべきである。また、ドナー部分の量子収率、およびアクセプターの吸光係数は、エネルギー移動効率が５０％となる距離であるＲ０を最大とするために同様にできるだけ高くすべきである。しかし、ドナーおよびアクセプターの励起スペクトルは、アクセプターを直接励起させることなくドナーが効率よく励起可能な時点で波長領域が見出されるようにするために重複を可能な限り小さくすべきである。アクセプターの直接的な励起から生じる蛍光は、ＦＲＥＴで生じる蛍光と区別しにくい。同様に、ドナーおよびアクセプターの発光スペクトルは、二つの発光を明らかに区別できるように、可能なかぎりわずかに重複させるべきである。アクセプター部分の高蛍光量子収率は、アクセプターに由来する発光が、唯一の読み値として、または発光比の一部として測定される場合に望ましい。ドナーとアクセプターのペアの選択時に考慮すべき一つの因子は、両者間における蛍光共鳴エネルギー移動の効率である。好ましくは、ドナーとアクセプター間のＦＲＥＴの効率は少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、またさらにより好ましくは少なくとも８０％である。
【００６８】
「蛍光特性」という用語は、適切な励起波長におけるモル吸光係数、蛍光量子効率、励起スペクトルもしくは発光スペクトルの形状、励起波長極大および発光波長極大、二種の異なる波長における励起振幅の比、二種の異なる波長における発光振幅の比、励起状態の寿命、または蛍光異方性を意味する。オワンクラゲの野生型ＧＦＰと変異型との間における上記特性の任意の一つに測定可能な差があることは有用である。測定可能な差は、任意の量的蛍光特性の量、例えば特定波長における蛍光量、または発光スペクトル全体における蛍光の積分値を決定することで決定することができる。異なる二種の波長における励起振幅または発光振幅の比を決定すること（それぞれ、「励起振幅の比の決定」および「発光振幅の比の決定」）は特に有利である。というのは、比の決定過程で内部標準が得られ、励起源の絶対明度、検出装置の感度、および光散乱または試料による消光の変動が相殺されるからである。
【００６９】
ＩＩ．長波長の改変蛍光タンパク質
Ａ．蛍光タンパク質
本明細書で用いる「蛍光タンパク質」という用語は、適切な電磁放射で励起されると蛍光を発することができる任意のタンパク質を意味する。これには、アミノ酸配列が天然の配列または人工的な配列（すなわち類似体または変異体）の蛍光タンパク質が含まれる。多くの刺胞動物は、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）を生物発光におけるエネルギー移動のアクセプターとして用いている。本明細書で用いる「緑色蛍光タンパク質」は、緑色の蛍光を発するタンパク質である。同様に「青色蛍光タンパク質」は青色の蛍光を発し、「赤色蛍光タンパク質」は赤色の蛍光を発する。ＧＦＰは、太平洋の北西部に生息するクラゲの一種、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびコザラクラゲ（Ｐｈｉａｌｉｄｉｕｍ ｇｒｅｇａｒｉｕｍ）から単離されている。ワード（Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄ）ら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ、 Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、３５：８０３〜８０８ （１９８２）；リバイン（Ｌ．Ｄ． Ｌｅｖｉｎｅ）ら、Ｃｏｍｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、７２Ｂ：７７〜８５ （１９８２）を参照されたい。
【００７０】
有用な励起スペクトルおよび発光スペクトルを有するさまざまなオワンクラゲ関連蛍光タンパク質が、オワンクラゲに由来する天然ＧＦＰのアミノ酸配列を修飾することで作製されている（Ｄ．Ｃ． Ｐｒａｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ、１１１：２２９〜２３３ （１９９２）；Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、 ９１：１２５０１〜０４（１９９４）；１９９４年１１月１０日に出願された米国特許出願第０８／３３７，９１５号；１９９５年１１月１０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４６９２）。
【００７１】
本明細書で用いるように、蛍光タンパク質の１５０アミノ酸の任意の隣接配列が、図３の２３８アミノ酸の野生型のオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質に由来する（隣接した、または隣接していない）アミノ酸配列（配列番号：２）と少なくとも８５％の配列同一性をもつ場合、その蛍光タンパク質は「オワンクラゲ関連蛍光タンパク質」である。より好ましくは、蛍光タンパク質の２００アミノ酸の任意の隣接配列が、図３の野生型のオワンクラゲ緑色蛍光タンパク質に由来する（隣接した、または隣接していない）アミノ酸配列（配列番号：２）と９５％の配列同一性を有する場合は、蛍光タンパク質はオワンクラゲ関連蛍光タンパク質である。同様に蛍光タンパク質は、同じ基準を用いてウミシイタケまたはコザラクラゲの野生型の蛍光タンパク質に関連する場合がある。
【００７２】
オワンクラゲ関連蛍光タンパク質は例えば、野生型（天然）のオワンクラゲのＧＦＰ （Ｄ．Ｃ． Ｐｒａｓｈｅｒら、「オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質の一次構造（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ｇｒｅｅｎ ｆｒｕｏｌｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｇｅｎｅ （１９９２） １１１：２２９〜３３）（このヌクレオチド配列（配列番号：１）および推定アミノ酸配列（配列番号：２）は図３に示す）；同配列の対立遺伝子変異体（例えば、８０位のグルタミン残基がアルギニンに置換されたＱ８０Ｒ）（Ｍ． Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９４） ２６３：８０２〜８０５）；本明細書に記載された人工的に作製されたオワンクラゲ関連蛍光タンパク質、例えば表Ａまたは表Ｆにある、アミノ末端の２個のアミノ酸が除去されたオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質などの蛍光性の一種または複数の折りたたみ変異およびそのようなタンパク質の断片を含む異型を含むが、これらに限定されない。このようなもののいくつかは、中心となる発色団の内部に異なる芳香族アミノ酸を含み、野生型の種より明確に短い波長で蛍光を発する。例えば、改変タンパク質Ｐ４およびＰ４−３は（他の変異に加えて）置換Ｙ６６Ｈを含み、Ｗ２およびＷ７は（他の変異に加えて）置換Ｙ６６Ｗを含む。いずれもタンパク質の発色団領域に近く、一次配列では離れている他の変異がＧＦＰのスペクトル特性に影響を及ぼす可能性があり、以下の表の最初の部分に挙げてある。
【００７３】
【表Ａ】
2004502410.tif 000004
2004502410.tif 000005
【００７４】
「折りたたみ変異体」と呼ばれる、オワンクラゲ関連蛍光タンパク質の他の変異では、蛍光タンパク質のもつ、高温における折りたたみ能力、および哺乳類細胞での発現時における、より強い蛍光発生能力が改善されているが、励起および発光のピーク波長にはほとんど影響しないか全く影響しない。これらが、スペクトル特性および折りたたみ特性が変化したタンパク質を生じるようにＧＦＰのスペクトル特性に影響する変異と結びつく場合があることは注目すべき点である。折りたたみ変異には、Ｆ６４Ｌ、Ｖ６８Ｌ、Ｓ７２Ａのほか、Ｔ４４Ａ、Ｆ９９Ｓ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４６Ｉ、Ｍ１５３ＴまたはＡ、Ｖ１６３Ａ、Ｉ１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｓ２０５Ｔ、およびＮ２１２Ｋなどがある。
【００７５】
本明細書で用いる「ループドメイン」という用語は、βバレルまたは中央部のαへリックス（５６〜７２残基）の１１本の鎖の二次構造にかかわるアミノ酸を連結するオワンクラゲ関連蛍光タンパク質のアミノ酸配列を意味する（図１Ａおよび１Ｂ参照）．
【００７６】
本明細書で用いる、蛍光タンパク質の「蛍光タンパク質部分」とは、蛍光タンパク質基質のアミノ酸配列が天然の蛍光タンパク質のアミノ酸配列と最適に並置され、天然の蛍光タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端とカルボキシ末端のアミノ酸の間に存在する（末端を含む）、蛍光タンパク質のアミノ酸配列の部分のことである。
【００７７】
蛍光タンパク質は、遺伝的に他の標的タンパク質と融合可能であり、また、産生された標的タンパク質の位置および量を同定するためのマーカーとして使用可能であることがわかっている。したがって本発明は、蛍光タンパク質部分と付加的なアミノ酸配列を含む融合タンパク質を提供する。このような配列の長さは例えば、最長約１５アミノ酸、最長約５０アミノ酸、最長約１５０アミノ酸、または最長約１０００アミノ酸である。融合タンパク質は、電磁放射で励起されたときに蛍光発生能力をもつ。一つの態様では、融合タンパク質は、対象タンパク質の精製を容易にするためのポリヒスチジンタグを含む。
【００７８】
Ｂ．蛍光特性が変化した変異体を設計するための緑色蛍光タンパク質の結晶構造の用途
Ｘ線結晶解析およびコンピュータ処理により、発明者らは、分子内における原子の相対的な位置を示すオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質の結晶構造モデルを構築した。このような情報は、置換がタンパク質の蛍光特性を変化させるアミノ酸を同定する際に有用である。
【００７９】
オワンクラゲ関連蛍光タンパク質の蛍光特性は、発色団の電子環境に部分的に依存する。一般に、発色団の約０．５ ｎｍ以内にあるアミノ酸は発色団の電子環境に影響を及ぼす。したがって、このようなアミノ酸を置換させると、蛍光特性が変化した蛍光タンパク質が得られる可能性がある。励起状態では、電子密度は発色団のフェノール側からカルボニル末端方向へシフトする傾向がある。したがって、発色団のカルボニル末端付近に強い正電荷を配置すると、励起状態のエネルギーを低下させ、またタンパク質の吸光度および発光波長極大の赤色シフトを引き起す傾向がある。発色団のカルボニル末端付近にある正電荷を減らすと、タンパク質の波長の青色シフトを引き起す反対の作用をもたらす傾向がある。
【００８０】
荷電性アミノ酸（イオン化したＤ、Ｅ、Ｋ、およびＲ）、双極性アミノ酸（Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、および無電荷のＤ、ＥおよびＫ）、ならびに分極性側鎖（例えば、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、ＷおよびＹ）は、特にアミノ酸が無電荷、非極性、または非分極性の側鎖と置換する場合において、発色団の電子環境を変化させる際に有用である。一般に、分極性側鎖をもつアミノ酸は、電子環境をほんのわずか変化させ、最終的には、蛍光特性に比較的小さな変化を引き起すと考えられている。荷電性側鎖をもつアミノ酸は、環境を最も大きく変化させ、最終的には、蛍光特性に比較的大きな変化を引き起すと考えられている。しかし、荷電性側鎖をもつアミノ酸は、発色団付近に埋没した状態の場合に、何ら追加的な溶媒和または塩橋形成なしに、タンパク質の構造を破壊する可能性、および適切な折りたたみを妨げる可能性が高い。したがって荷電性アミノ酸は、既に溶媒和されているか、または塩橋形成がかかわる他の荷電性アミノ酸または極性の高いアミノ酸と置換する際に、寛容性が大きく、有用な作用をもたらす可能性が最も高い。分極性アミノ酸との置換が選択されるような場合は、タンパク質の構造は、大きなアミノ酸（例えばＷ）の選択を不適当なものとする場合がある。あるいは、配向が望ましくない荷電性側鎖または極性側鎖をもつアミノ酸で占められる位置を、荷電性が弱いか、または極性が弱い側鎖をもつアミノ酸と置換することができる。別の方法では、側鎖がタンパク質の一方向に双極性配置されたアミノ酸は、異なる方向に双極性配置されたアミノ酸と置換することができる。
【００８１】
より具体的には、表Ｂに、置換が蛍光特性の変化を生じうる発色団の約０．５ ｎｍ以内に位置する複数のアミノ酸を挙げる。この表では、タンパク質の蛍光特性を変化させる、記載位置における好ましいアミノ酸置換に下線を引いて示してある。このような置換を導入する目的で、この表は、増幅過程がかかわる部位特異的変異導入で使用されるプライマー用のコドンも示している。このようなプライマーは、経済的に好ましいアミノ酸をコードするように選択されているが、図に示すように他のアミノ酸、さらには終止コドン（Ｚで表す）もコードしている。このような縮重プライマーを用いて置換を導入する際に最も効率のよい方法は、集団をスクリーニングして、所望の特性を有する変異体を同定した後に、そのＤＮＡ配列を決定して可能な置換がどれかを見極めることである。コドンを、センス鎖を上にアンチセンス鎖を下にして２本鎖で示す。核酸配列では、Ｒ＝（Ａまたはｇ）；Ｙ＝（ＣまたはＴ）；Ｍ＝（ＡまたはＣ）；Ｋ＝（ｇまたはＴ）；Ｓ＝（ｇまたはＣ）；Ｗ＝（ＡまたはＴ）；Ｈ＝（Ａ、Ｔ、またはＣ）；Ｂ＝（ｇ、Ｔ、またはＣ）；Ｖ＝（ｇ、Ａ、またはＣ）；Ｄ＝（ｇ、Ａ、またはＴ）；Ｎ＝（Ａ、Ｃ、ｇ、またはＴ）を示す。
【００８２】
【表Ｂ】
2004502410.tif 000006
【００８３】
分極性側鎖と置換可能な極性側鎖をもつアミノ酸の例には例えば、表Ｃに記載されたアミノ酸などがある。
【００８４】
【表Ｃ】
2004502410.tif 000007
【００８５】
別の態様では、第２のアミノ酸が発色団の約０．５ ｎｍ以内に近接するアミノ酸は、置換されると第２のアミノ酸の電子特性を変化させて、最終的に発色団の電子環境が変化する。表Ｄは、このような二種のアミノ酸を示す。アミノ酸Ｌ２２０およびＶ２２４はＥ２２２に近接しており、βプレート状シート内で同じ方向を向いている。
【００８６】
【表Ｄ】
2004502410.tif 000008
【００８７】
本発明の一つの態様は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＱ６９における置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。好ましくは、Ｑ６９における置換は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、およびＧからなる群より選択される。Ｑ６９における置換を他の変異（Ｓ６５における機能性変異など）と組み合わせることで、タンパク質の特性を改善することができる。
【００８８】
本発明の一つの態様は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＥ２２２における置換（Ｅ２２２Ｇを除く）が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。好ましくは、Ｅ２２２における置換は、ＮおよびＱからなる群より選択される。Ｅ２２２における置換を他の変異（Ｆ６４における機能性変異など）と組み合わせることで、タンパク質の特性を改善することができる。
【００８９】
本発明の一つの態様は、アミノ酸配列がオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と実質的に同一で、少なくともＹ１４５における置換が配列番号：２と異なる、オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質とは異なった蛍光特性を有する機能性の改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。好ましくは、Ｙ１４５における置換は、Ｗ、Ｃ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、およびＱからなる群より選択される。Ｙ１４５における置換を他の変異（Ｙ６６における変異など）と組み合わせることで、タンパク質の特性を改善することができる。
【００９０】
本発明はまた、新しい蛍光タンパク質の変異を設計用の結晶座標を用いるコンピュータ、および座標を含む結晶データを記憶する装置を利用した方法を含むコンピュータに関連した態様も含む。例えば本発明は記憶装置を含む装置、および図５−１〜５−２８に挙げた原子座標から選択される少なくとも１０の原子座標に関して同装置に記憶されたデータを提供する。多くの座標を、座標を用いる計算の複雑性、または目標に応じて記憶させることができる（例えば、約１００個、１，０００個、またはそれより多くの座標）。例えば大量の座標が、蛍光タンパク質の構造をより詳しく表現する際に望ましい。典型的には、このような記憶装置は、原子座標を入力として受け取るコードを記憶するコンピュータ可読装置である。一方、当技術分野で周知の他の記憶手段も対象となる。コンピュータ可読装置は、フロッピーディスクまたはハードドライブである。
【００９１】
Ｃ．陰イオン結合特性が変化した変異体を設計するためのＹＦＰの結晶構造の用途
別の局面では、本発明は、相対位置、および結合状態のイオンと相互作用するアミノ酸を示すＹＦＰの結晶構造モデルを構築するためのＸ線結晶解析およびコンピュータ処理の使用を含む。このような情報は、置換がさまざまな陰イオンに対する結合部位の特異性および親和性を変化させるアミノ酸を同定する際に有用である。陰イオンの結合は、ＹＦＰの発色団付近で生じるので、結合によって、陰イオンの結合さらには陰イオン濃度のモニタリングに使用可能なＹＦＰの蛍光特性が調節される。
【００９２】
ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑにある陰イオン結合部位は、他のタンパク質のハロゲン化物結合部位に一般に見出される多くの特性を示す。ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの陰イオンを含む空洞の場合、結合部位は天然の状態で両親媒性であり、片側に極性基および荷電性の基（Ｔｙｒ２０３、発色団、Ａｒｇ９６、Ｇｌｎ６９、およびＧｌｎ１８３）が並んでおり、別の側に疎水性の基（Ｉｌｅ１５２、Ｌｅｕ２０１、Ｖａｌ１６３、Ｖａｌ１５０、およびＰｈｅ１６５）が並んでいる。
【００９３】
陰イオン結合の特異性が変化した改変蛍光タンパク質の設計では、いくつかの因子を考慮する必要がある。例えば、陰イオンの親和性および選択性に寄与する最も有意な因子の一つは、結合ポケットの静電気的な配置および構成である。ＹＦＰでは、これらは表Ｅに挙げた基を含む。
【００９４】
【表Ｅ】原位置および推定される役割
Ｓ６５、Ｙ６６、Ｇ６７ 発色団を形成、芳香環の端はイオンと相互作用する
Ｑ６９　イオンとの水素結合
Ｒ９６　イオンとの電荷相互作用
Ｑ１８３　イオンとの電荷相互作用
Ｙ２０３　イオン（Ｙ）との水素結合
【００９５】
一般に陰イオン結合は、より多くの、または、より強い結合相互作用を、結合ポケット内における対象陰イオンと極性基との間に作ることで改善することができる。例えば上記の極性残基を、より極性の大きい残基と直接置換するか、または、より効率的に相互作用する可能性のある異なる大きさの残基を陰イオンと置換することでイオン結合を改善することができる。例えば、発色団の大きさや位置は、Ｓ６５のＧ、Ａ、Ｃ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＴに置換して変えることが可能であり、Ｙ６６はＨ、Ｆ、またはＷに置換することが可能であり、Ｑ６９はＮまたはＫに、Ｒ９６はＫに、Ｑ１８３はＮまたはＫに置換することができる。
【００９６】
水和エネルギー
また、発色団付近の埋没状態の空洞における陰イオンの結合は、イオン−溶媒相互作用とイオン−タンパク質相互作用との置換を必要とする。水和エネルギーに関連する、ＹＦＰ（表Ｊ）およびＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ（Ｊａｙａｒａｍａｎら、２０００）に対する一価の陰イオンの相対的な結合エネルギーは、水和力が、結合に対する重要な寄与因子であることを意味している。一価の陰イオンの水和エネルギーは以下のように弱いものから強いものへ並ぶ：ＣＯ４−＜Ｉ−＜ＮＯ３−＜ＳＣＮ−＜Ｂｒ−＜Ｃｌ−＜Ｆ− （ＷｒｉｇｈｔおよびＤｉａｍｏｎｄ、１９７７）。多原子の一価の陰イオンおよびヨウ化物は、比較的弱い水和エネルギーをもつが、他のハロゲン化物は水とより強固に相互作用する。球対称のハロゲン化物の場合は、水和エネルギーは、原子体積の低下に伴って上昇し（Ｂｏｒｎ、１９２０）、これは、なぜ大きなハロゲン化物が、タンパク質内部のより疎水性の大きな環境に容易に埋め込まれるかということの理由となる。ＹＦＰに対する陰イオンの結合に関してみられる傾向は上記の順序にほぼ従う（表Ｊ）。タンパク質の相互作用は一般に水和エネルギーの低下に伴って上昇するが、大きさが小さいことからタンパク質結合時に完全に脱水しない場合があるフッ素は例外である。
【００９７】
したがって、高親和性の陰イオン結合部位の開発には、例えば、イオン結合ポケットに並んだ、極性のより大きい疎水性残基と、水素結合能力が大きい極性残基との置換による、十分なイオン−タンパク質相互作用の生成が必要である。より大きな、または小さな陰イオンのイオン結合を改善する、このようなタイプの置換の例を表Ｆに示す。
【００９８】
【表Ｆ】
ｉ）ヨウ化物以外のより小さな陰イオンの結合親和性を高めるイオン結合ポケットの周囲のアミノ酸の変異。
2004502410.tif 000009
ｉｉ）ヨウ化物以外のより大きな陰イオンの結合親和性を高めるイオン結合ポケットの周囲のアミノ酸の変異
2004502410.tif 000010
【００９９】
結合ポケットの大きさ
結合のサイズおよび形状も、大きな陰イオンに対して結合部位が埋没した性質をもつことから特に重要である。幾何学的直径の平均が６．２ ÅであるＴＣＡ（Ｈａｌｍ ＆ Ｆｒｉｚｚｅｌｌ、１９９２）は見かけ上大きすぎるのでＹＦＰと測定可能な程度では相互作用できないが、いくぶん小さいＴＦＡでは弱い結合を示す（表Ｊ）。したがって、より大きな陰イオンの結合親和性の改善は、表Ｆに概要が示されているように、結合ポケットに並ぶアミノ酸と小さな残基との置換によって、ならびに後述する溶媒接近性を上昇させることで達成される場合がある。
【０１００】
陰イオン結合に伴う構造変化
ＹＦＰの結合ポケットに並んださまざまな側鎖の一連の構造変化はハロゲン化物の結合に必要である。最も大きい動きはＧｌｎ６９およびＧｌｎ１８３で観察されるが、Ｌｅｕ２０１、Ｉｌｅ１５２、Ｖａｌ１５０、およびＶａｌ１６３の無極性側鎖（図１１）はすべて、結合状態のハロゲン化物の存在下で空洞の大きさを増大させる動きに関与する。したがって、陰イオン結合を強くする別のアプローチは、結合時に極めて大きな構造変化を受ける残基を、より小さな残基と置換することである。このような変化は、結合時の構造再編成の必要性を小さくすることで、陰イオン結合をエネルギー的により望ましい状態にする可能性がある。このような変化には、上の表Ｆに挙げた変化、ならびにＱ６９のＮへの置換が含まれる。
【０１０１】
溶媒の接触性
Ｈｉｓ１４８におけるさまざまな変異の構造決定で得られた結果から、同位置における特定の変異が、溶媒の接触のしやすさと結合ポケットの容積との両方に直接影響を及ぼすことがあるβバレルにおける全体的な構造調節を生じうることが示唆されている。したがって、Ｈｉｓ１４８における、例えばＱ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｖ、およびＩなどの、より小さなアミノ酸への置換は、発色団に対する溶媒の接触性を高めることで、より大きな陰イオンの結合を改善すると予測される。同様にＨｉｓ１４８と、より大きなアミノ酸（ＦまたはＷなど）との置換は、発色団に対する陰イオンの接触性を低める可能性が高い。また同様に、より小さな変化が、１４７位および１４９位における、より小さなアミノ酸、または、より大きなアミノ酸との置換によって達成される可能性がある。
【０１０２】
以上の変異は典型的には、オリゴを用いた部位特異的変異導入によってＹＦＰ鋳型のタンパク質に導入され、典型的には野生型アミノ酸残基を１０％の確率で有する、また、さまざまな変異型残基の一つを９０％の確率で有する、変異型タンパク質のライブラリーが作られる。このような方法を用いて、さまざまな組み合わせの変異体を含むライブラリーのスクリーニングを速やかに行って、特定の対象陰イオンの最良の組み合わせを同定することが可能である。典型的には、この段階を繰り返すことで、結合ポケット周囲の配列空間を、任意の特定の対象陰イオンについて完全に探索することを確実なものとすることができる。
【０１０３】
Ｄ．改変蛍光タンパク質の作製
蛍光タンパク質の組換え体の作製には、対象タンパク質をコードする配列を有する核酸分子を発現させる段階が含まれる。
【０１０４】
一つの態様では、このような核酸は、１本のポリペプチドがより長いポリペプチド中に蛍光タンパク質部分を含む融合タンパク質をコードする。より長いポリペプチドには、ＦＲＥＴパートナーや、第２の機能を有するタンパク質などの第２の機能性タンパク質を含めることができる（例えば、酵素、抗体、または他の結合タンパク質）。蛍光タンパク質をコードする核酸は出発材料として有用である。
【０１０５】
蛍光タンパク質は、組換えＤＮＡ手法で融合タンパク質として作製することができる。蛍光タンパク質の組換え体の作製では、タンパク質をコードする配列を有する核酸を発現させる。蛍光タンパク質をコードする核酸は当技術分野で周知の方法で得られる。蛍光タンパク質は、蛍光タンパク質をコードする他の核酸を対象とした部位特異的変異導入法で、または０．１ ｍＭ ＭｎＣｌ２ およびバランスを欠くヌクレオチド濃度で元のポリヌクレオチドのＰＣＲのエラー発生率を上昇させるランダム変異導入法で作製することができる。これについては例えば、１９９４年１１月１０日に出願された米国特許出願第０８／３３７，９１５号、または１９９４年１１月１０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４６９２を参照されたい。緑色蛍光タンパク質をコードする核酸は、図３に示すオワンクラゲの緑色蛍光タンパク質ＤＮＡ配列に対応するプライマー用いて、オワンクラゲに由来するｃＤＮＡを対象としたポリメラーゼ連鎖反応で単離することができる。ＰＣＲ法は例えば米国特許第４，６８３，１９５号；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、（１９８７） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５１：２６３；およびエールリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）編、「ＰＣＲ技術（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９）で説明されている。
【０１０６】
発現ベクターの構築、およびトランスフェクトされた細胞内における遺伝子の発現には、当技術分野で周知の分子クローニング手法を用いる。これについては、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング−実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、（１９８９）および「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、（「最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．の合弁事業）を参照されたい。発現ベクターは、適切なプロモーター、複製配列、マーカーなどを含めることで、原核生物または真核生物における機能に適合させることができる。
【０１０７】
対象ポリペプチドの発現をコードする配列を細胞にトランスフェクトする際に用いられる核酸は一般に、ポリペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結させた発現制御配列を含む発現ベクターの形状をしている。本明細書で用いる、「（あるポリペプチド）の発現をコードするヌクレオチド配列」という表現は、転写およびｍＲＮＡの翻訳によってポリペプチドを生じる配列を意味する。これは例えばイントロンなどの配列を含む場合がある。発現制御配列は、発現制御配列が核酸配列の転写および、必要に応じて翻訳を制御および調節する際に、核酸配列に動作可能に連結される。したがって発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写終結配列、タンパク質コード遺伝子の前方にある開始コドン（ＡＴＧ）、イントロン用のスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能とする遺伝子の正確な読み枠の維持、および終止コドンを含む場合がある。
【０１０８】
当技術分野で周知の方法を用いて、蛍光タンパク質のコード配列、および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。このような方法には、インビトロ組換えＤＮＡ手法、合成法、およびインビボ組換え／遺伝子組換え法などがある（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「分子クローニング−実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク、１９８９に記載された手法を参照）。
【０１０９】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換法は、当技術分野で周知の従来の手法で実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物の場合、ＤＮＡの取り込みが可能なコンピテント細胞を、指数増殖期の後に回収し、当技術分野で周知の手順によりＣａＣｌ２法で処理した細胞から調製することができる。あるいはＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することもできる。形質転換は、宿主細胞のプロトプラストを形成させた後に実施できるほか、エレクトロポレーション法で実施することもできる。
【０１１０】
宿主が真核生物の場合、カルシウムリン酸共沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどの従来の機械的手法、リポソームに包んだプラスミドの挿入、またはウイルスベクターを用いてＤＮＡをトランスフェクトする方法が用いられる場合がある。真核細胞にはまた、本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と、選択可能な表現型（単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子など）をコードする第２の外来ＤＮＡ分子を同時にトランスフェクトすることができる。別の方法には、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、またはウシパピローマウイルスなどの真核ウイルスベクターを用いて、真核細胞に一過的に感染させ、形質転換してタンパク質を発現させる方法がある（「真核性ウイルスベクター（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ編、１９８２）。好ましくは、真核宿主が本明細書に記載された宿主細胞として用いられる。
【０１１１】
微生物を用いるか、または真核生物で発現させた本発明のポリペプチドを単離および精製する手法は、例えば、予備的なクロマトグラフィー分離法、および免疫学的分離法（モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、または抗原を使用する方法など）などの従来の任意の手法とすることができる。一つの態様では、組換え蛍光タンパク質は、タンパク質をコードする核酸を大腸菌で発現させて作製することができる。オワンクラゲ関連蛍光タンパク質は、約１５〜３０℃で培養された細胞で最も良好に発現されるが、それより高い温度（例えば３７℃）でも発現される。合成後、このような酵素は高温（例えば３７℃）で安定であり、このような温度でアッセイ法に使用することができる。
【０１１２】
さまざまな宿主−発現ベクター系を用いて蛍光タンパク質のコード配列を発現させることができる。これには、蛍光タンパク質のコード配列を含む組換えバクテリオファージのＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；蛍光タンパク質のコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；蛍光タンパク質コード配列を含む、組換え体ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞系、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；蛍光タンパク質のコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；または蛍光タンパク質のコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系、もしくは安定に発現するように作製された形質転換された動物細胞系が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１３】
使用される宿主／ベクター系に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサー配列、転写終結配列などを含む任意の数の適切な転写配列および翻訳配列を発現ベクター中に用いることができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６〜５４４、１９８７を参照）。例えば細菌系でクローン化を行う場合は、バクテリオファージΣのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ （ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などの誘導性プロモーターを使用することができる。哺乳類細胞系でクローン化を行う場合は、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）、または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えばレトロウイルスの末端反復配列（ＬＴＲ）；アデノウイルスの後期プロモーター；ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーター）を使用することができる。組換えＤＮＡ手法または合成手法で作られるプロモーターを用いて、挿入された蛍光タンパク質のコード配列の転写を誘導することもできる。
【０１１４】
細菌系では、数種の発現ベクターを、発現させる蛍光タンパク質について意図した用途に応じて有利に選択することができる。例えば大量の蛍光タンパク質を産生させる場合、精製が容易な高レベルの融合タンパク質産物の発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。蛍光タンパク質の回収を容易にするための切断部分を含むように改変されたベクターが好ましい。
【０１１５】
酵母では、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むいくつかのベクターを用いることができる。総説は「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２巻、アウシュベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第１３章、１９８８；グラント（Ｇｒａｎｔ）ら、「酵母用発現および選択ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ）」、（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、３１９８７、Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、第１５３巻、ｐｐ． ５１６〜５４４、１９８７；グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）、「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、第２巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ、第３章、１９８６；およびビター（Ｂｉｔｔｅｒ）、「酵母における異種遺伝子発現（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｙｅａｓｔ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ編、Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、第１５２巻、ｐｐ． ６７３〜６８４、１９８７；ならびに「出芽酵母の分子生物学（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）」、ストラサム（Ｓｔｒａｔｈｅｍ）ら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、１９８２を参照されたい。ＡＤＨもしくはＬＥＵ２などの酵母の構成的プロモーター、またはＧＡＬなどの誘導性プロモーターを用いることができる（「酵母におけるクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｙｅａｓｔ）」、第３章、Ｒ． Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ：「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」第１１巻、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＤＭ Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ、１９８６）。あるいは、外来ＤＮＡ配列の酵母染色体への統合を促すベクターを用いることができる。
【０１１６】
植物の発現ベクターを用いる場合は、蛍光タンパク質のコード配列の発現は、任意のいくつかのプロモーターで誘導することができる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーターなどのウイルス性プロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１〜５１４、１９８４）、またはＴＭＶのコートタンパク質のプロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７〜３１１、１９８７）を用いることができるほか、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物性プロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４、 ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１〜１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８〜８４３、１９８４）；または例えば、ダイズのｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂなどの熱ショックプロモーター（Ｇｕｒｌｅｙら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：５５９〜５６５、１９８６）を用いることができる。このような構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクターを用いて、また直接的な形質転換法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などで植物細胞に導入することができる。以上の手法の総説は例えば、ワイスバハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）およびワイスバハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）、「植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、第ＶＩＩＩ章、ｐｐ． ４２１〜４６３、１９８８；およびグリアソン（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ）およびコーリー（Ｃｏｒｅｙ）、「植物分子生物学（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ｂｌａｃｋｉｅ、ロンドン、第７〜９章、１９８８などを参照されたい。
【０１１７】
蛍光タンパク質を発現させる際に使用可能な他の発現系が昆虫の系である。一つの昆虫系では、キンウワバの一種（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を外来遺伝子を発現させるベクターとして用いる。このウイルスはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞で増殖する。蛍光タンパク質のコード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば多面体遺伝子）にクローン化して、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば多面体プロモーター）の制御下に配置することができる。蛍光タンパク質のコード配列が良好に挿入されると、多面体遺伝子が不活性化されて、非包埋状の組換えウイルス（多面体遺伝子にコードされたタンパク質性コートを欠くウイルス）が産生される。この組換えウイルスを次にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞に感染させて、そこで挿入遺伝子を発現させる（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ． Ｖｉｏｌ． ４６：５８４、１９８３；Ｓｍｉｔｈ、米国特許第４，２１５，０５１号を参照）。
【０１１８】
真核生物系、好ましくは哺乳類発現系では、発現される哺乳類タンパク質の適切な翻訳後修飾が可能である。一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化、リン酸化、および遺伝子産物を有利に分泌させるための細胞機構を有する真核細胞を、蛍光タンパク質を発現させる宿主細胞として使用することができる。このような宿主細胞系列には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＥＫ−２９３、およびＷＩ３８などがあるがこれらに限定されない。
【０１１９】
組換えウイルスまたはウイルスの配列を用いて発現を誘導する哺乳類細胞系を作製することができる。例えばアデノウイルスの発現ベクターを用いる場合は、蛍光タンパク質のコード配列を、アデノウイルスの転写／翻訳の制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび三成分からなるリーダー配列）に連結することができる。このようなキメラ遺伝子を次に、インビトロ組換え法またはインビボ組換え法でアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）の挿入により、組換えウイルスは、感染宿主で増殖可能となり、また蛍光タンパク質を発現可能となる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１：３６５５〜３６５９、１９８４を参照）。あるいは、ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーターを用いることができる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７９：７４１５〜７４１９、１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ４９：８５７〜８６４、１９８４；Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：４９２７〜４９３１、１９８２を参照）。染色体外因子としての複製能力をもつウシパピローマウイルスを元にしたベクターは特に重要である（Ｓａｒｖｅｒら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １：４８６、１９８１）。ＤＮＡをマウス細胞に導入して短時間後に、プラスミドは細胞１個あたり約１００〜２００コピーに複製される。挿入されたｃＤＮＡの転写は、プラスミドの宿主染色体への組込みを必要としないので、高レベルの発現が達成される。以上のようなベクターを用いて、プラスミド中にｎｅｏ遺伝子などの選択マーカーを含めることで安定な発現が可能となる。あるいは、レトロウイルスのゲノムを修飾して、宿主細胞に導入して蛍光タンパク質遺伝子の発現を誘導可能なベクターとして使用することができる（ＣｏｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１：６３４９〜６３５３、１９８４）。高レベルの発現は、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、および熱ショックプロモーターを含むがこれらに限定されない誘導性プロモーターを用いることで達成できる場合もある。
【０１２０】
本発明は、核局在化配列、小胞体局在化配列、ペルオキシソーム局在化配列、ミトコンドリア局在化配列などの局在化配列、または局在化タンパク質を含む場合もある。局在化配列は、例えばスタイヤー（Ｓｔｒｙｅｒ、Ｌ．）による「タンパク質ターゲティング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」、第３５章、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ、１９９５に記載されているような標的配列となりうる。局在化配列は局在化タンパク質である場合もある。いくつかの重要な局在化配列には、核を標的とする配列（ＫＫＫＲＫ）、ミトコンドリアを標的とする配列（アミノ末端ＭＬＲＴＳＳＬＦＴＲＲＶＱＰＳＬＦＲＮＩＬＲＬＱＳＴ−）、小胞体を標的とする配列（Ｃ末端においてＫＤＥＬ、Ｎ末端に存在すると予想されるシグナル配列）、ペルオキシソームを標的とする配列（Ｃ末端においてＳＫＦ）、プレニル化または形質膜への挿入を標的とする配列（Ｃ末端においてＣａａＸ、ＣＣ、ＣＸＣ、またはＣＣＸＸ）、形質膜の細胞質側を標的とする配列（ＳＮＡＰ−２５との融合）、またはゴルジ器官を標的とする配列（フリン（ｆｕｒｉｎ）との融合）が含まれる。
【０１２１】
組換えタンパク質を長期間、高収量で産生させるためには安定した発現が好ましい。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるより、適切な発現制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写終結配列、ポリアデニル化部位など）で調節された蛍光タンパク質および選択マーカーのｃＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。組換えプラスミドの選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞が、プラスミドをその染色体に安定に組み込ませ、成長させてフォーカスを形成させ、最終的にクローン化して細胞系列内で増殖させることができる。例えば外来ＤＮＡを導入することで、改変された細胞は栄養強化培地で１〜２日間増殖させた後に選択培地に切り換えることができる。単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１１：２２３、１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、 ４８：２０２６、１９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ、２２：８１７、１９８０）の各遺伝子を含むがこれらに限定されない、いくつかの選択系を用いることが可能であり、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞で用いることができる。また、メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７：３５６７、１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８：１５２７、１９８１）；ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ （ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７８：２０７２、１９８１；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ （Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１５０：１、１９８１）；およびハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ、３０：１４７、１９８４）の各遺伝子の選択の基礎として代謝拮抗剤耐性を用いることができる。最近、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを用いることを可能とする他の選択用の遺伝子（例えばｔｒｐＢ）；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようになるｈｉｓＤ （ＨａｒｔｍａｎおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５：８０４７、１９８８）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害物質である２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を付与するＯＤＣ （オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ Ｌ．、「分子生物学の最新情報（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ編、１９８７）についての報告がある。
【０１２２】
本発明の蛍光タンパク質ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主細胞にＤＮＡを輸送することでインビトロで発現させることができる。「宿主細胞」は、ベクターが増殖可能で、かつそのＤＮＡが発現される細胞である。この用語は、対象の宿主細胞の任意の子孫も含む。すべての子孫は、親の細胞と同一であるわけではないと理解されている。これは複製過程で変異が生じるためである。しかし、このような子孫は、「宿主細胞」という用語が用いられる場合に含まれる。安定な輸送法、言い換えると、外来ＤＮＡを宿主で連続して維持する方法は当技術分野で周知である。
【０１２３】
発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトさせて、組換え核酸を発現させることができる。宿主細胞は、蛍光タンパク質の融合タンパク質を精製する目的で、高レベルの発現を指標に選択することができる。大腸菌はこの目的に有用である。あるいは宿主細胞は、細胞が産生する酵素の活性を検討するために選択される原核細胞または真核細胞の場合がある。この場合、リンカーペプチドは、プロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列を含むように選択される。このような細胞は例えば、培養細胞またはインビボの細胞である。
【０１２４】
蛍光タンパク質の融合タンパク質の第１の利点は、これらが通常のタンパク質生合成で調製されるために、有機合成および特注の非天然のアミノ酸類似体の要求性を完全に回避できる点である。このような構築物は、インビトロアッセイ法用に大腸菌で大規模に発現させることができる。細菌からの精製は、配列が、ニッケル−キレートクロマトグラフィーによる一段階精製用のポリヒスチジンタグを含むと単純なものとなる。あるいは、インサイチューアッセイ用に所望の宿主細胞でこのような基質を直接発現させることができる。
【０１２５】
別の態様では、本発明は、蛍光タンパク質をコードする核酸配列を発現するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【０１２６】
本発明の「非ヒト動物」は、蛍光タンパク質をコードする核酸配列を有する任意の非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、両生類、および爬虫類などの脊椎動物を含む。好ましい非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含むげっ歯類ファミリーから選択され、最も好ましくはマウスである。本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は、「導入遺伝子」を非ヒト動物の生殖系列に導入することで作製される。さまざまな発生段階における胚性標的細胞を用いて導入遺伝子を導入することができる。胚性標的細胞の発生段階に応じて他の方法を用いることができる。接合体はマイクロインジェクションに最も適した標的である。マウスの雄性前核は、１〜２ ｐｌのＤＮＡ溶液の再現性ある注入が可能となる直径約２０ μｍの大きさになる。遺伝子輸送の標的としての接合体の使用は、初回分裂前において注入されたＤＮＡが宿主遺伝子に組み込まれる状況の多くで最も利益が大きい（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４４３８〜４４４２、１９８５）。したがってトランスジェニック非ヒト動物のすべての細胞は、組み込まれた導入遺伝子をもつことになる。これは一般に、創始個体の子孫への効率のよい導入遺伝子伝達を反映してもいる。というのは生殖細胞の５０％が導入遺伝子をもつからである。接合体のマイクロインジェクションは、本発明を実施する上で導入遺伝子を組み込ませる好ましい方法である。
【０１２７】
「トランスジェニック」という用語は、外因性遺伝物質をすべての細胞に含む動物を示すものとして用いる。「トランスジェニック」動物は、再生に用いられる細胞内に外因性遺伝物質を含む二匹のキメラ動物を交配することで作製することができる。結果として得られる子孫の２５％がトランスジェニック個体、すなわち外因性遺伝物質をすべての細胞の両対立遺伝子上に含む個体である。結果として得られる個体の５０％が外因性遺伝物質を、１本の対立遺伝子上に含み、２５％は外因性遺伝物質を含まない。
【０１２８】
レトロウイルスの感染も、非ヒト動物への導入遺伝子の導入に用いられる場合がある。発生段階にある非ヒト胚は胚盤胞期になるまでインビトロで培養することができる。この期間中、胚盤胞はレトロウイルス感染の標的となる（Ｊａｅｎｉｃｈ、Ｒ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７３：１２６０〜１２６４、１９７６）。酵素処理によって透明帯を除くと、胚盤胞への感染の効率が高まる（Ｈｏｇａｎら （１９８６）、「マウス胚操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）。導入遺伝子の導入に用いられるウイルスベクター系は典型的には、導入遺伝子を有する複製欠損型のレトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：６９２７〜６９３１、１９８５；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：６１４８〜６１５２、１９８５）。トランスフェクションは、胚盤胞をウイルス産生細胞の単層上で培養することで容易かつ効率的に行われる（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ、前掲；Ｓｔｅｗａｒｔら、ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３８３〜３８８、１９８７）。あるいは感染を後期の段階で実施することができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞は胞胚腔に注入することができる（Ｄ． Ｊａｈｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３〜６２８、１９８２）。創始個体の大部分は、導入遺伝子の組込みが、トランスジェニック非ヒト動物を形成する細胞の一部でのみ生じることから、導入遺伝子についてモザイクとなる。また創始個体では、レトロウイルスにより、子孫では通常分離してしまうゲノム上のさまざまな位置へ導入遺伝子が挿入されることがある。また、妊娠中期の胚の子宮内にレトロウイルスを感染させることで、導入遺伝子を生殖系列に導入することが低効率ながら可能である（Ｄ． Ｊａｈｎｅｒら、前掲）。
【０１２９】
導入遺伝子を導入する際に用いられる第３のタイプの標的細胞は胚幹（ＥＳ）細胞である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養した着床前の胚から得られ、胚と融合させる（Ｍ．Ｊ． Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４〜１５６、１９８１；Ｍ．Ｏ． Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５〜２５８、１９８４；Ｇｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９０６５〜９０６９、１９８６；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５〜４４８、１９８６）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション法やレトロウイルスを用いたトランスダクション法によってＥＳ細胞に効率よく導入することができる。このような形質転換されたＥＳ細胞を後に、非ヒト動物の胚盤胞と結合させることができる。このようなＥＳ細胞はその後、胚のコロニーを形成して、結果として生じる動物個体の生殖系列に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｒ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８〜１４７４、１９８８の総説を参照）。
【０１３０】
「形質転換された」とは、組換え核酸手法によって異種核酸分子が細胞（またはその祖先）に導入されることを意味する。「異種」とは、他の種に起源を有するか、もしくは元の状態、または細胞内で主に発現された状態から修飾される核酸配列を意味する。
【０１３１】
「導入遺伝子」とは、細胞に人工的に挿入されて、細胞から発生する生物体のゲノムの一部となる（すなわち、安定に組み込まれるか、または安定な染色体外因子として存在する）任意のＤＮＡ断片を意味する。このような導入遺伝子は、トランスジェニック生物に対して部分的、または全体的に異種の（すなわち外来の）遺伝子を含む場合があるか、生物体の内因性遺伝子に相同な遺伝子である場合がある。ＤＮＡに転写されてからゲノムに組み込まれるＲＮＡ配列を提供することで作製される導入遺伝子は上記の定義に含まれる。本発明の導入遺伝子は、トランスジェニック非ヒト動物で発現される可能性のある蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。本明細書で用いる「トランスジェニック」という表現は、特定の遺伝子ノックアウトを誘導する、初期胚または受精卵のインビトロ操作により、またはトランスジェニック手法によりゲノムが変化した任意の生物体を追加的に含む。本明細書で用いる「遺伝子ノックアウト」という表現は、当技術分野で一般的な任意のトランスジェニック手法で達成される、完全に機能を喪失させるインビボにおける遺伝子の標的破壊を意味する。一つの態様では、遺伝子ノックアウトを有するトランスジェニック動物は、相同組換えによって非機能性となる遺伝子への標的挿入によって標的遺伝子が非機能状態となった動物である。本明細書で用いる「トランスジェニック」という用語には、導入された導入遺伝子をもつ生物、または非機能状態にされた（または「ノックアウトされた」）内因性遺伝子をもつ生物を作製可能な、当業者に一般的な任意のトランスジェニック手法が含まれる。
【０１３２】
ＩＩＩ．改変蛍光タンパク質の用途
本発明のタンパク質は、蛍光タンパク質を用いる任意の方法に有用である。
【０１３３】
本発明の改変蛍光タンパク質は、蛍光マーカーが既に用いられている多くの方法で蛍光マーカーとして有用である。これには例えば、イムノアッセイ法またはハイブリダイゼーションアッセイ法などの検出アッセイ法に用いる、改変蛍光タンパク質と抗体、核酸、または他の受容体とのカップリングなどが含まれる。
【０１３４】
本発明の改変蛍光タンパク質は、細胞内におけるタンパク質の動きを追跡する際に有用である。この態様では、蛍光タンパク質をコードする核酸分子を、対象タンパク質をコードする核酸分子に発現ベクター上で融合させる。細胞内で対象タンパク質が発現すると、蛍光を手がかりにその局在を決定することができる。別のバージョンでは、二種の対象タンパク質を、蛍光特性が異なる二種の改変蛍光タンパク質と融合させる。
【０１３５】
本発明の改変蛍光タンパク質は、転写の誘導を検出する系で有用である。特定の態様では、改変蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、対象の発現制御配列に融合させ、発現ベクターを細胞にトランスフェクトする。プロモーターの誘導は、蛍光の発現および／または量を検出することで測定することができる。このような構築物を用いることで、受容体からプロモーターに至る情報伝達経路を追跡することができる。
【０１３６】
本発明の改変蛍光タンパク質は、ＦＲＥＴがかかわる応用に有用である。このような応用は、相互に引き合ったり離れたりする蛍光ドナーおよび蛍光アクセプター運動に応じた事象を検出することができる。ドナー／アクセプターペアの一方または両方を蛍光タンパク質とすることができる。ＦＲＥＴをベースとしたアッセイ法に好ましいドナーと受容体のペアは、Ｔ２０３Ｉ変異をもつドナーとＴ２０３Ｘ変異をもつアクセプターである（Ｘは芳香族アミノ酸−３９、特にＴ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｗ、またはＴ２０３Ｈである）。特に有用なペアでは、ドナーは以下の変異を含む：Ｓ７２Ａ、Ｋ７９Ｒ、Ｙ１４５Ｆ、Ｍ１５３Ａ、およびＴ２０３Ｉ （励起ピークが３９５ ｎｍで発光ピークが５１１ ｎｍ）。またアクセプターは以下の変異を含む：Ｓ６５Ｇ、Ｓ７２Ａ、Ｋ７９Ｒ、およびＴ２０３Ｙ。このような特定のペアは、ドナーの励起ピークと発光ピークの広い分離をもたらし、またドナーの発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルとの良好な重なりをもたらす。本明細書に記載されたような他の赤色シフト変異体も、このようなペアにおけるアクセプターとして用いることができる。
【０１３７】
一つの局面では、ＦＲＥＴを用いて、切断部位の反対側に基質に結合したドナーおよびアクセプターを有する基質の切断を検出する。基質が切断されると、ドナー／アクセプターのペアが物理的に分離してＦＲＥＴを放出する。アッセイ法には、基質を試料に接触させる段階、およびＦＲＥＴの量的または質的な変化を決定する段階が含まれる。一つの態様では、改変蛍光タンパク質はβ−ラクタマーゼの基質に用いられる。このような基質の例は、１９９５年３月２０日に出願された米国特許出願第０８／４０７，５４４号、および１９９６年３月２０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０４０５９に記載されている。別の態様では、改変蛍光タンパク質のドナー／アクセプターペアは、タンパク質分解性の切断部位を有するペプチドが結合した融合タンパク質の一部である。このようなタンデム型の蛍光タンパク質は、１９９６年１月３１日に出願された米国特許第０８／５９４，５７５号に記載されている。
【０１３８】
別の局面では、ＦＲＥＴを用いて膜内外の電位変化を検出する。ドナーおよびアクセプターを膜の反対側に配置させて、一方が電位変化に応じて翻訳されて膜を越えるようにする。これにより測定可能なＦＲＥＴが生じる。このような方法は、１９９５年６月７日に出願された米国特許出願第０８／４８１，９７７号、および１９９６年６月６日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９６５２に記載されている。
【０１３９】
本発明の改変蛍光タンパク質は、試料中および生細胞内ならびにトランスジェニック生物に含まれるイオンの濃度決定用のバイオセンサーの作製に有用である。イオンが蛍光タンパク質に結合すると、改変蛍光タンパク質の少なくとも一つの測定可能な蛍光特性の変化が生じ、これが対象イオンの存在を判定する際の基礎となる。
【０１４０】
本発明の改変タンパク質は、タンパク質キナーゼの蛍光基質の作製に有用である。このような基質は、タンパク質キナーゼによって認識されるアミノ酸配列をもつ。リン酸化されると、改変蛍光タンパク質の蛍光特性が変化する。このような基質は、トランスフェクションおよび発現する際に、細胞試料のタンパク質キナーゼ活性を検出および測定する際に有用である。好ましくは、キナーゼ認識部位は、改変蛍光タンパク質の末端の約２０アミノ酸以内に配置される。キナーゼ認識部位は、タンパク質のループドメインに配置することもできる（例えば図１Ｂ参照）。タンパク質キナーゼの蛍光性基質を作製する方法は、１９９６年６月１６日に出願された米国特許出願第０８／６８０，８７７号に記載されている。
【０１４１】
プロテアーゼ認識部位もループドメインに導入することができる。切断されると蛍光基質は測定可能な状態に変化する。
【０１４２】
本発明は、被験化合物を同定する方法も含む。典型的には、このような方法は、機能性の改変蛍光タンパク質、または機能性の改変蛍光タンパク質をコードするポリペプチドで標識された生物学的存在を含む試料に被験化合物を接触させる段階を含む。機能性の改変蛍光タンパク質を含む試料の蛍光（蛍光特性）をモニタリングすることで、被験化合物が活性であるか否かを判定することができる。シグナルの特異性を保証するために対照を含めることができる。このような対照は、被験化合物の非存在下における蛍光特性の測定、予想される活性を有する化合物（例えば既知の調節因子）、または改変された対照（例えば、改変蛍光タンパク質の非存在、使用可能に連結された蛍光タンパク質ポリヌクレオチドの非存在、または改変蛍光タンパク質の使用可能な連結の非存在）の存在下における蛍光特性の測定を含む。
【０１４３】
被験化合物の存在下における蛍光は、同じ被験化合物の非存在下における場合と比べて大きい場合もあれば小さい場合もある。例えば、改変蛍光タンパク質を遺伝子発現のレポーターとして用いる場合、被験化合物は遺伝子発現を上方または下方に制御する可能性がある。このようなタイプのスクリーニングでは、機能性の改変蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ゲノムのポリヌクレオチドに動作可能に連結させる。あるいは、機能性の改変蛍光タンパク質を第２の機能性タンパク質に融合させる。この態様を用いて、エネルギー移動を指標に第２のタンパク質の局在を追跡したり、タンパク質間相互作用を追跡したりすることができる。
【０１４４】
ＩＶ．手順
試料の蛍光は蛍光定量計で測定される。一般的には、第１の波長を有する励起源からの励起放射が、励起光学系を通過する。励起光学系は励起放射を生じて試料を励起させる。これに応じて、試料中の蛍光タンパク質は、波長が励起波長とは異なる光線を放出する。次に収集光学系が試料から発光を集める。この装置は、スキャン中に試料を特定の温度に維持するための温度制御装置を含む場合がある。一つの態様では、多軸トランスレーションステージが、曝露されるさまざまなウェルを配置するために複数の試料を保持するマイクロタイタープレートを動かす。多軸トランスレーションステージ、温度制御装置、オートフォーカス特性、ならびに画像化およびデータ収集に関連した電子装置を適切にプログラムされたデジタルコンピュータで管理することができる。このようなコンピュータは、アッセイ中に収集されたデータの形式を、別の形式に変えて表示させることもできる。この過程を小型化および自動化することで、数千種の化合物のスクリーニングを実施することができる。
【０１４５】
蛍光材料のアッセイ法を実施する方法は当技術分野で周知であり、例えば、ラコビッツ（Ｌａｋｏｗｉｃｚ、Ｊ．Ｒ．）、「蛍光分光学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」、ニューヨーク：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ （１９８３）；ハーマン（Ｈｅｒｍａｎ、Ｂ．）、「培養生細胞の蛍光顕微鏡観察（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」のパートＢの「共鳴エネルギー移動顕微鏡観察（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３０巻、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ、Ｄ．Ｌ．およびワン（Ｗａｎｇ、Ｙ．−Ｌ．）編、サンディエゴ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、ｐｐ． ２１９〜２４３；チュロ（Ｔｕｒｒｏ、Ｎ．Ｊ．）、「最新分子光化学（Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、メンロパーク：Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｌ、Ｉｎｃ． （１９７８）、ｐｐ． ２９６〜３６１に記載されている。
【０１４６】
変異導入およびタンパク質の調製
ＹＦＰの異型および復帰体は、ＰＣＲ法をベースとした「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標） Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホーヤ）を用いて、製造業者の指示書にしたがって、またＹＦＰクローン１０ｃを鋳型として用いて調製された（Ｏｒｍｏら、１９９６）。変異は遺伝子全体の配列を決定して検証し、すべてのＧＦＰ異型は文献に記載された手順で発現させて精製した（Ｏｒｍｏら、１９９６）。
【０１４７】
蛍光の測定
濃縮されたタンパク質の一部を、イオン強度が一定の一連の緩衝液（２０ ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ ６．０、ＭＥＳ ｐＨ ６．５、ＰＩＰＥＳ ７．０、ＨＥＰＥＳ ７．５、およびＴＡＰＳ ８．０）で２５倍に希釈した。緩衝液は、さまざまな濃度の塩化カリウムまたはヨウ化カリウムを含むものを使用し、イオン強度はＤ−グルコン酸カリウムで１５０ ｍＭに調節した。ｐＨおよびハロゲン化物濃度の関数としての蛍光の測定は、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｆ４５００蛍光分光光度計を室温（λｅｘ＝５１４ ｎｍ）に設定して実施し、５２０〜５５０ ｎｍの発光を６０ ｎｍ／分の速度で３回スキャンした。５２８ ｎｍにおける発光極大を平均化し、ハロゲン化物が非存在下における蛍光に対して補正した。
【０１４８】
結晶成長およびデータ収集
ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑを２０ ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ ７．９で１５ ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５ μｌのタンパク質および５ μｌの母液を含むハンギングドロップ中で結晶を成長させた。母液は、２２％ ＰＥＧ １５５０（ｐＨ ５．５、溶媒は１００ ｍＭ 酢酸ナトリウムおよび９０ ｍＭ ＭｇＣｌ２）を含むものを用いた。棒状の結晶は、幅が約０．０４ ｎｍ、長さが１．０ ｍｍで、１．５〜２年間４℃で成長させたものを用いた。１個の結晶を、上述の成分（ＭｇＣｌ２は含まないが１００ ｍＭ ヨウ化カリウム、および２０％ エチレングリコールを含む（凍結防止用））を含む合成母液に浸漬した（ヨウ化物浸漬と呼ぶ）。また別の結晶を、１００ ｍＭ ＭｇＣｌ２、および２０％ エチレングリコールを含む上記の母液に浸漬した（塩化物浸漬と呼ぶ）。いずれの浸漬ともｐＨ ４．６で４時間室温で実施し、その後直ちにデータの収集を行った。この結晶を瞬時に凍結し、Ｘ線回折データを、ミラーを備えたＲｉｇａｋｕ ＲＵＨ３回転陰極型Ｘ線発生装置にマウントしたＲＡＸＩＳ−ＩＩｃイメージプレートを用いて１００ Ｋで収集した。
【０１４９】
ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの構造決定、およびヨウ化物結合部位の同定
二つのデータセットをＤｅｎｚｏ ｖｌ．９で処理し、ＳｃａｌｅＰａｃｋを用いて比較した（ＯｔｗｉｎｏｗｓｋｉおよびＭｉｎｏｒ、１９９７）。空間群Ｐ２１２１２１であり、単位格子パラメータは、ヨウ化物浸漬では、ａ＝５１．２ Å、ｂ＝６２．８ Å、およびｃ＝６８．７ Å、また塩化物浸漬では、ａ＝５１．７ Å、ｂ＝６２．６ Å、およびｃ＝６６．２ Åである。結晶は、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｇ （Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）、およびＧＦＰ Ｓ６５Ｔ （Ｏｒｍｏら、１９９６）の結晶とほぼ同形であり、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｇの座標ファイル２ｙｆｐ （Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）を位相決定のモデルとして使用した。陰イオン性発色団のモデルは、プログラム「ＳＰＡＲＴＡＮ」バージョン４．１に含まれる「ＡＭ１」を用いた半経験的な分子軌道計算で得た（Ｗａｖｅｆｉｍｃｔｉｏｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アーバイン）。
【０１５０】
ヨウ化物浸漬で得られたデータセットから異常差図の計算を行った（異常データの完全性は６５％）。これはヨウ素が、インハウスのＣｕＫα波長（１．５４ Å）で有意に異常なシグナルを発生するためである。重原子の位相は「ＣＣＰ４ ｐｒｏｇｒａｍ ｓｕｉｔｅ」のプログラム「ｓｃａｌｅｉｔ」を用いて、タンパク質の位相計算値から９０°を差引くことで概算した（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎ． ４、１９９４）。異常差図によって二か所のヨウ化物の位置が同定された。一か所はタンパク質内部に埋没しており、一か所はタンパク質の表面であった。
【０１５１】
ヨウ化物結合状態または非結合状態におけるＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの精密化
ヨウ化物浸漬および塩化物浸漬に由来する二つのデータセットを同様の手順で精密化した。４ Åまでの最初の剛体精密化の後に、３．０ Åまでのデータ、さらに分解能限界（表１）までのデータを対象に、プログラムＴＮＴ （Ｔｒｏｎｒｕｄら、１９８７）を用いて位置精密化を行った。精密化の初期サイクルでは、結合状態のハロゲン化物のモデル化は行わず、１４８位のグルタミンをグリシンとしてモデル化を行った。電子密度図（２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃ）を、Ｏを用いて間欠的に精査した（Ｊｏｎｅｓら、１９９１）。Ｆｏ−Ｆｃ図から、それぞれ１１ ｒｍｓおよび５．５ ｒｍｓの偏位における埋没状態のヨウ化物および表面のヨウ化物の位置が、二つの異常差電子密度ピークの中心にあるが、埋没状態の塩化物の結合と一致する正の差電子密度は認められないことがわかった。Ｇｌｎ１４８の側鎖の密度は初期に明瞭に描出されたので、元のヒスチジンとは異なる回転異性体としてのグルタミンのモデリングが可能であった。
【０１５２】
Ｂ因子は、デフォルトのＴＮＴ Ｂ因子相関ライブラリーを用いて精密化を行った。ＨｉｓおよびＰｈｅに由来するＢ因子相関値を用いて発色団原子のモデル化を行った。結合状態の溶媒分子は、水素結合パートナーの差密度および近接性から適切であると判断した場合にモデルに加えた。結合状態のハロゲン化物の占有率を精密化する前に、これらのハロゲン化物のＢ因子を固定した。埋没状態のヨウ化物の温度因子は、それに最も近い１２個の原子のＢ因子の平均値（３０ Å２）に設定し、表面のヨウ化物の温度因子は、タンパク質表面に結合した６個の最も近い溶媒分子のＢ因子の平均値（３９ Å２）に設定した。精密化の最終段階では、２個の埋没状態のハロゲン化物の占有率の精密化を行った。
【０１５３】
吸光度による発色団のｐＫａおよびヨウ化物の結合定数の決定
発色団のｐＫａを、さまざまな陰イオン濃度における吸光度スキャンから決定した。吸光度スキャンは、０．０５ ｍｇ／ｍｌのＹＦＰを対象に、一連の緩衝液（２０ ｍＭ リンゴ酸、ｐＨ ５．８、リンゴ酸、ｐＨ ６．１、ＭＥＳ ｐＨ ６．４、ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．１）から選択された特定の陰イオンに適した二つの異なるｐＨ条件で、２５０〜６００ ｎｍ間で室温で収集した（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ２１０１分光光度計）。緩衝液のｐＨにおける発色団の陰イオンの光学密度（ＹＦＰおよびＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑについて５１４〜５１５ ｎｍ）、ならびに相互作用性陰イオンの非存在下におけるｐＨ ９における光学密度を、ヘンダーソン−ハッセルベルヒ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈ）式を用いて、検討した各条件における発色団のｐＫａを推定した。陰イオンとタンパク質の結合の微視的な結合定数は、陰イオン濃度に対する発色団のｐＫａのカーブフィッティングにより、二種の異なるリガンドが関与する結合平衡の式を用いて求めた。
【０１５４】
以下に挙げる例は、説明目的で提示するものであり、制限する意図はない。
【０１５５】
実施例
ＧＦＰの特性を理解する段階、また特性が変化したＧＦＰの調整を容易にする段階として、発明者らは、オワンクラゲＧＦＰのＳ６５Ｔ変異体（Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６４〜６６５ （１９９５））の三次元構造を１．９ Åの分解能で決定した。この変異体は遍在性のＱ８０Ｒ置換も含む。同置換はＧＦＰ ｃＤＮＡの初期の流通中に偶然生じたものであるが、タンパク質の特性に何らかの作用を及ぼしているかは不明である（Ｍ． Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２〜８０５ （１９９４））。
【０１５６】
ヒスチジンタグを付けたＳ６５Ｔ ＧＦＰ （Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６４〜６６５ （１９９５））を、４ ｌのＹＴブロス＋アンピシリン中で３７℃、４５０ ｒｐｍで、５ ｌ／分のエアフローを送りながらＪＭ１０９／ｐＲＳＥＴＢ中で過剰に発現させた。Ａ５９５が０．３となった時点で温度を２５℃に下げ、次に１ ｍＭのイソプロピルチオガラクトシドで５時間かけて誘導を行った。細胞ペーストを −８０℃で一晩保存した後に、５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．９、０．３ Ｍ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ ｍＭ フェニルメチル−スルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）中に再懸濁し、フレンチプレスに１０，０００ ｐｓｉで一回通し、２０Ｋ ｒｐｍで４５分間遠心した。上清をＮｉ−ＮＴＡ−アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にアプライした後に、２０ ｍＭ イミダゾールで洗浄し、次に１００ ｍＭ イミダゾールで溶出した。緑色のフラクションをプールし、キモトリプシン（Ｓｉｇｍａ）でタンパク質の消化（１：５０、重量比）を室温で２２時間かけて行った。０．５ ｍＭ ＰＭＳＦを添加した後に、消化物をＮｉカラムに再びアプライした。Ｎ末端の配列を決定して、本来のメチオニンが存在することを確認した。２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５で透析を行い、Ａ４９０が２０となるまで濃縮された時点で、５ μｌ タンパク質および５ μｌ ウェル溶液、２２〜２６％ ＰＥＧ ４０００ （Ｓｅｒｖａ）、５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ８．０〜８．５、５０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含むハンギングドロップ中の棒状結晶を室温で５日以内に回収した。結晶は幅が０．０５ ｍｍで、長さが最大１．０ ｍｍであった。空間群は、ａ＝５１．８ Å、ｂ＝６２．８ Å、ｃ＝７０．７ Å、Ｚ＝４のＰ２１Ｐ２１Ｐ２１である。この状態とは無関係の野生型ＧＦＰの二種類の結晶の形状は文献に記載されている（Ｍ．Ａ． Ｐｅｒｒｏｚｏ、Ｋ．Ｂ． Ｗａｒｄ、Ｒ．Ｂ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、およびＷ．Ｗ． Ｗａｒｄ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ、２０３、７７１３〜７７１６ （１９８８））。
【０１５７】
ＧＦＰの構造を、複数の同形置換および異常散乱（表Ｅ）、溶媒平滑化（ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）、位相組み合わせ（ｐｈａｓｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、ならびに結晶学的精密化により決定した。ＧＦＰの折りたたみの最も顕著な特性は、中心的な１本のらせんの周囲を包む１１本鎖（各鎖は約９〜１３残基を含む）のβバレル（図１Ａおよび１Ｂ）である。バレルは長さが４２ Åで直径が２４ Åのほぼ完全な円柱である。ポリペプチドのＮ末端側の半分は、３本の逆平行鎖、中心のらせん、およびさらに３本の逆平行鎖を含む（残基１１８〜１２３の後者は、残基１１〜２３のＮ末端側の鎖と平行）。ポリペプチド骨格は、分子の「ボトム」と交差して、５本の鎖を含むグリークキー（Ｇｒｅｅｋ Ｋｅｙ）モチーフ中におけるバレルのもう半分を形成する。円柱の先端は、３本の短いゆがんだらせん状のセグメントでキャップされており、このうち１本の短くて大きくゆがんだらせん状のセグメントが円柱のボトムをキャップしている。円柱表面に存在する主鎖の水素結合は、タンパク質が変性およびタンパク質分解に対して異常に安定であることを説明する可能性が高い。発色団周囲のシェルの完全性を保存しながら励起されうるポリペプチドの大きなセグメントはない。したがって、大きなパーセントで分子量を低下させるようにＧＦＰを再び作り込むことは困難であると思われる（Ｊ． ＤｏｐｆおよびＴ．Ｍ． Ｈｏｒｉａｇｏｎ、Ｇｅｎｅ １７３：３９〜４３ （１９９６））。
【０１５８】
ｐ−ヒドロキシベンジリデンイミダゾリジノンの発色団（Ｃ．Ｗ． Ｃｏｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１２１２〜１２１８ （１９９３））は、バルク溶媒から完全に保護されており、分子の中心に位置する。全体的、かつおそらく強固に封入されていることが、小さなストークスシフト（励起極大と発光極大の間の波長差）、蛍光の高量子収率、Ｏ２による励起状態の消光不能（Ｂ．Ｄ． Ｎａｇｅｓｗａｒａ Ｒａｏら、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ３２：６３０〜６３２ （１９８０））、および発色団の外部ｐＨ滴定に対する耐性の要因であろう（Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄ、「生物発光および化学発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）」、Ｍ．Ａ． ＤｅＬｕｃａおよびＷ．Ｄ． ＭｃＥｌｒｏｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ． ２３５〜２４２ （１９８１）；Ｗ．Ｗ． ＷａｒｄおよびＳ．Ｈ． Ｂｏｋｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：４５３５〜４５４０ （１９８２）；Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ３５：８０３〜８０８ （１９８２））。また、酵素が基質に接近可能となるしくみを想像することが困難であることから、フルオロフォアの形成が自発的な分子内過程であるはずである（Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１２５０１〜１２５０４ （１９９４））という理由を合理的に解釈することもできる。発色団のこの面は、周囲バレルの対称軸に対してほぼ垂直（６０°）である。発色団の一方の側は驚くべきことに、約１３５ Å３の容積を占める大きな空洞に面している（Ｂ． ＬｅｅおよびＦ．Ｍ． Ｒｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：３７９〜４００ （１９７１））。原子半径は、プローブ半径を１．４ ÅとしてプログラムＭＳで計算されたリー（Ｌｅｅ）およびリチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）の値とした（Ｍ．Ｌ． Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７０９〜７１３ （１９８３））。上記の空洞はバルク溶媒に対して開いていない。４個の水分子は空洞内に位置しており、Ｇｌｕ２２２およびＧｌｎ６９の埋没型の側鎖を連結する水素結合の鎖を形成している。占有されていない場合には、このような大きな空洞は、数ｋｃａｌ／ｍｏｌでタンパク質を不安定化すると推定されている（Ｓ．Ｊ． Ｈｕｂｂａｒｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：６１３〜６２６ （１９９４）；Ａ．Ｅ． Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１７８〜１８３ （１９９２））。空洞容積の一部は、環状化および脱水反応で生じる集密化の結果である可能性がある。また空洞は、Ｔｙｒ６６のα−β結合から水素を除くオキシダント（最も好ましくはＯ２）を一時的に収容する可能性もある（Ａ．Ｂ． Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２０：４４８〜４５５ （１９９５）；Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１２５０１〜１２５０４ （１９９４）；Ｓ． ＩｎｏｕｙｅおよびＦ．Ｌ Ｔｓｕｊｉ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３５１：２１１〜２１４ （１９９４））。発色団、空洞、および発色団に接触する側鎖を図２Ａに示さし、付近の最終的な電子密度図の一部を２Ｂに示す。
【０１５９】
発色団の反対側は、複数の芳香性側鎖および極性側鎖にもたれるように触れている。発色団との極性相互作用の複雑なネットワーク（図２Ｃ）は特に重要である。Ｈｉｓ１４８、Ｔｈｒ２０３、およびＳｅｒ２０５はフェノール性ヒドロキシルと水素結合を形成しており、Ａｒｇ９６およびＧｌｎ９４はイミダゾリジノン環のカルボニルと相互作用しており、またＧｌｕ２２２はＴｈｒ６５の側鎖と水素結合を形成している。Ｔｈｒ６２のカルボニルのＡｒｇ９６、およびＧｌｎ１８３の側鎖のカルボニルとの水素結合などの別の極性相互作用は、埋没状態のＡｒｇ９６をプロトン化された状態で安定化させると考えられる。このような埋没状態の電荷は、過去の報告と同様に、脱プロトンされたフルオロフォアのイミダゾリジノン環のカルボニル酸素の部分的に負の電荷をもつ残基が存在することを示唆している（Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄ、「生物発光および化学発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｈｉｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）」（Ｍ．Ａ． ＤｅＬｕｃａおよびＷ．Ｄ． ＭｃＥｌｒｏｙ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ． ２３５〜２４２ （１９８１）；Ｗ．Ｗ． ＷａｒｄおよびＳ．Ｈ． Ｂｏｋｍａｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：４５３５〜４５４０ （１９８２）；Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ３５：８０３〜８０８ （１９８２））。Ａｒｇ９６はフルオロフォアの形成に極めて重要な役割を果たす可能性が高く、初期の環閉鎖の触媒を促進している可能性がある。最後にＴｙｒ１４５は、ベンジル環との典型的な安定性の端−面（ｅｄｇｅ−ｆａｃｅ）相互作用を示している。ＧＦＰの唯一のトリプトファンであるＴｒｐ５７は、発色団から１３〜１５ Åに位置し、２個の環系の長軸はほぼ平行である。これは後者へのエネルギー移動の効率がよいことを意味しており、別個のトリプトファン発光が観察可能である理由を説明している（Ｄ．Ｃ． Ｐｒａｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ １１１：２２９〜２３３ （１９９２）。ＧＦＰ中の２個のシステインＣｙｓ４８とＣｙｓ７０は２４ Å離れており、距離が大きすぎてジスルフィド結合を形成することはできない。Ｃｙｓ７０は埋没しているが、Ｃｙｓ４８は、スルフヒドリル特異的な試薬が比較的接近可能なはずである。このような試薬５，５’−ジチオビス （２−ニトロ安息香酸）は、ＧＦＰを標識し、また蛍光を消光することが報告されている（Ｓ． ＩｎｏｕｙｅおよびＦ．Ｉ． Ｔｓｕｊｉ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３５１：２１１〜２１４ （１９９４））。この作用は、遊離のスルフヒドリルの必要性に起因していたが、Ｃｙｓ４８に結合する可能性のある５−チオ−２−ニトロベンゾエート部分による特異的な消光を反映している可能性もある。
【０１６０】
電子密度図は、シス［Ｚ−］配置では、その大部分が発色団について提案されている構造と一致する（Ｄ．Ｃ． Ｐｒａｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ １１１：２２９〜２３３ （１９９２）；Ｃ．Ｗ． Ｃｏｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１２１２〜１２１８ （１９９３））が、発色団の二重結合周辺における反対の異性体の何らかの実質的なフラクションについて証拠は得られておらず、差の特性が、完全な非環状ポリペプチドか、またはカルビノールアミン（図２Ｃの左上の図）のいずれかを示していると解釈可能な、最終的な（Ｆｏ−Ｆｃ）電子密度図で＞４σで見出されている。これは、かなりのフラクション、おそらくは結晶中の３０％ほどの分子が最終的な脱水反応を受けていないことを示唆している。脱水が不完全であることの確認はエレクトロスプレー質量分析でなされており、野生型ＧＦＰとＳ６５Ｔ ＧＦＰの両方の平均質量（それぞれ３１，０８６±４ Ｄａと３１，０９９．５±４ Ｄａ）が、完全成熟型タンパク質についての推定値（それぞれ３１，０７９ Ｄａと３１，０９３ Ｄａ）より６〜７ Ｄａ高いことが一貫して示されている。このような相違は、アポタンパク質のフラクションが３０〜３５％モルであること、またはカルビノールアミンが１８もしくは２０ Ｄａ高い分子量をもつことから説明可能と考えられる。１３Ｃおよび２Ｈが天然には豊富に存在し、このような測定を行う際に使用されるヒューレット−パッカード社製の５９８９Ｂエレクトロスプレー質量解析装置の分解能には限界があることから、個々のピークを分解することはできないが、その代わりに、最大値の半分における全体の幅が約１５ Ｄａのである平均質量ピークが得られる。分子量は、配列が
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（配列番号：５）であるＨｉｓタグを含む。フルオロフォアの成熟の効率が高いＧＦＰの変異体は、いくぶん明るい調製物となることがある。アポタンパク質の一つのモデルでは、Ｔｈｒ６５−Ｔｙｒ６６のペプチド結合は、ほぼαらせん構造中に存在するが、Ｔｙｒ６６−Ｇｌｙ６７のペプチドは、Ａｒｇ９６と相互作用するために、らせん軸に対して先端がほぼ垂直であると考えられる。これはＡｒｇ９６が環状化に、そしておそらくはＧｌｙ６７によるＴｈｒ６５のカルボニル炭素への攻撃の促進にも必要な構造の生成に重要な役割を果たしているという推測をさらに支持している（Ａ．Ｂ． Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２０：４４８〜４５５ （１９９５））。
【０１６１】
過去に行われたランダム変位導入の結果は、複数のアミノ酸の側鎖が、スペクトルに実質的な作用を及ぼすことを意味しており、原子モデルでは、このような残基が発色団付近に存在することが確認されている。変異Ｔ２０３ＩおよびＥ２２２Ｇは重要であるが、吸収スペクトルについては反対の結果をもたらす（Ｔ． Ｅｈｒｉｇら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６７：１６３〜１６６ （１９９５））。Ｔ２０３Ｉ （野生型のＳｅｒ６５をもつ）は、陰イオン性発色団に通常結びつけられる４７５ ｎｍの吸収ピークをもたず、中性の発色団を反映すると考えられる３９５ ｎｍのピークのみを示す（Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１２５０１〜１２５０４ （１９９４）；Ｔ． Ｅｈｒｉｇら、ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６７：１６３〜１６６ （１９９５））。実際にＴｈｒ２０３は、発色団のフェノール性酸素と水素結合を形成しており、Ｉｌｅとの置換はフェノール性酸素のイオン化を妨げるはずである。Ｇｌｕ２２２のＧｌｙへの変異（Ｔ． Ｅｈｒｉｇら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３６７：１６３〜１６６ （１９９５））は、例えば３９５ ｎｍのピークを抑えて４７０〜４９０ ｎｍのピークに傾くように、Ｓｅｒ６５のＧｌｙ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、またはＴｈｒとの置換によるものとほぼ同じ分光光度的作用をもつ（Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６４〜６６５ （１９９５）；Ｓ． Ｄｅｌａｇｒａｖｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１５１〜１５４ （１９９５））。実際にＧｌｕ２２２およびＴｈｒ６５の残りは、このような構造では相互に水素結合しており、おそらく、Ｔｈｒ６５の側鎖の酸素に対するドナーとして作用するＧｌｕ２２２の無電荷のカルボキシルをもつ。変異Ｅ２２２Ｇ、Ｓ６５Ｇ、Ｓ６５Ａ、およびＳ６５Ｖは、いずれもこのような水素結合を抑制すると考えられる。なぜ野生型タンパク質のみが両方の励起ピークをもつのかを理由を説明するためには、Ｓｅｒ６５ （Ｔｈｒ６５ではない）を、ヒドロキシルがＧｌｕ２２２への水素結合のドナーとなり、陰イオンとしてＧｌｕ２２２を安定化する構造に選定することができる（この電荷は後に発色団のイオン化を阻害する）。このような構造から、一部の変異が中性と考えられる理由も説明される。例えばＧｌｎ８０は、発色団からかなり離れた表面の残基であり、これは、そのＡｒｇに対する偶然的かつ遍在性の変異が、明瞭な分子内における分光光度的作用を一見もたない理由を説明する （Ｍ． Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２〜８０５ （１９９４））。
【０１６２】
赤色シフトした励起極大および発光極大をもつＧＦＰ変異体の開発は、タンパク質工学における一つの重要な到達点である（Ａ．Ｂ． Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２０：４４８〜４５５ （１９９５）；Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６４〜６６５ （１９９５）；Ｓ． Ｄｅｌａｇｒａｖｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１５１〜１５４ （１９９５））。このような変異体は、二つまたはそれより多い細胞過程の活性を同時に多色的に明らかにする上で、またタンパク質環相互作用のシグナルとしての蛍光共鳴エネルギー移動を用いる際に、細胞による短波長における自己蛍光発生の回避にも有用であると思われる（Ｒ． ＨｅｉｍおよびＲ．Ｙ． Ｔｓｉｅｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ． ６：１７８〜１８２ （１９９６））。ランダム変異導入を用いた多くの試みで、発光極大は最大６ ｎｍ長波長側（５１４ ｎｍ）へシフトしており（Ｒ． ＨｅｉｍおよびＲ．Ｙ． Ｔｓｉｅｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ． ６：１７８〜１８２ （１９９６））、過去には「赤色シフト」変異体が、５０５ ｎｍの発光の何らの有意な赤色化を招くことなく４７５ ｎｍのピークに有利になるように３９５ ｎｍの励起ピークを単に抑制したという報告がある（Ｓ． Ｄｅｌａｇｒａｖｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：１５１〜１５４ （１９９５））。Ｔｈｒ２０３は発色団のフェノール性末端に隣接することがわかっているので、発明者らは、系の分極性を増すことが隣接する発色団の励起状態のエネルギーを低める可能性のあることを期待して、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐなどの極性芳香族残基になるように変異を導入した。三通りの置換はすべて実際に発光ピークを５２０ ｎｍを上回るようにシフトさせた（表Ｆ）。特に魅力的な変異はＴ２０３Ｙ／Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｓ７２Ａで、励起ピークと発光ピークはそれぞれ５１３ ｎｍと５２７ ｎｍであった。これらの波長は既存のＧＦＰ変異体とは十分異なり、蛍光顕微鏡に適切なフィルターセットを使用することで容易に識別することができる。吸光係数は３６，５００ Ｍ−１ｃｍ−１で、量子収率は０．６３であり、Ｓ６５Ｔにおける値と同程度に高い（Ｒ． Ｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６４〜６６５ （１９９５））。
【０１６３】
オワンクラゲのＧＦＰと他のタンパク質色素との比較は有益である。しかし残念ながら特性が最も近い相同物であるウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）のＧＦＰ（Ｏ． ＳｈｉｍｏｍｕｒａおよびＦ．Ｈ． Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｃｏｍｐ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５９：２２３ （１９６２）；Ｊ．Ｇ． ＭｏｒｉｎおよびＪ．Ｗ． Ｈａｓｔｉｎｇｓ、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ７７：３１３ （１９７１）；Ｈ． Ｍｏｒｉｓｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２６５６ （１９７４）；Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄ、「Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． 総説」（Ｓｍｉｔｈ、Ｋ．Ｃ．編） ４：１ （１９７９）；Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄ、「生物発光および化学発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）」（Ｍ．Ａ． ＤｅＬｕｃａおよびＷ．Ｄ． ＭｃＥｌｒｏｙ編） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ． ２３５〜２４２ （１９８１）；Ｗ．Ｗ． ＷａｒｄおよびＳ．Ｈ． Ｂｏｋｍａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：４５３５〜４５４０ （１９８２）；Ｗ．Ｗ． Ｗａｒｄら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ３５：８０３〜８０８ （１９８２））は配列が決定されておらずクローン化もなされていないが、その発色団は、オワンクラゲの野生型ＧＦＰと同じＦＳＹＧ配列に由来する（Ｒ．Ｍ． Ｓａｎ Ｐｉｅｔｒｏら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ５７：６３Ｓ （１９９３））。三次元構造が明らかにされている最も近い類似体が、好塩菌に由来する１４ ｋＤａの光受容体であり、光反応性をもつ黄色タンパク質（ＰＹＰ、Ｇ．Ｅ．Ｏ． Ｂｏｒｇｓｔａｈｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：６２７８〜６２８７ （１９９５））である。天然の暗状態でＰＹＰは４４６ ｎｍに吸収極大があり０．６４の量子収率で光を伝達し、４７５ ｎｍ付近の野生型ＧＦＰの長波長の吸収極大、および０．７２〜０．８５の量子収率にマッチする。両タンパク質の基礎となる発色団は、ＰＹＰのチオエステル結合、およびＧＦＰのヘテロ環イミノラクタム（ｉｍｉｎｏｌａｃｔａｍ）を介してタンパク質に共有結合している陰イオン性のｐ−ヒドロキシシンナミル基である。いずれのタンパク質とも、埋没型の陽イオン性アルギニンおよび中性グルタミン基である、ＰＹＰ中のＡｒｇ５２およびＧｌｕ４６、ならびにＧＦＰ中のＡｒｇ９６およびＧｌｕ２２２の助けを借りて発色団の負電荷を安定化させるが、ＰＹＰ中では、これらの残基は、ＧＦＰでは発色団のカルボニル末端の方により近いオキシフェニル環に近い。しかしＰＹＰには、細胞の走光性反応の仲介を可能とする適切な柔軟性およびシグナル伝達ドメインを有する重複した全体的なα／βの折りたたみがある、一方ＧＦＰは、温度または構造を担う部分としての励起状態エネルギーの寄生的な散逸を最小化する、より正常かつ剛直なβバレルに近い。ＧＦＰは、視覚的訴求性および極めて有用な機能、効率のよい蛍光発生が、凝集性および経済的なタンパク質構造から自発的に生じうる優れた例の一つである。
【０１６４】
Ａ．ＧＦＰ構造の決定の概要
データは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ社のＲ−ａｘｉｓ ＩＩまたはＳａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｍｕｌｔｉｗｉｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ （ＳＤＭＳ）製の検出器（ＣｕＫα）のいずれかを用いて、また後にＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのビームラインＸ４Ａにより、イメージプレートを用いたセレン吸収端（λ＝０．９７９ Å）で、インハウスで室温において収集した。データの評価はＨＫＬパッケージを用いて行った（Ｚ． Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、「ＣＣＰ４ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎｄ 会報：データの収集と処理（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎｄ：Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」、Ｌ． Ｓａｗｙｅｒ、Ｎ． Ｉｓｓａｃｓ、Ｓ． Ｂａｉｌｅｙ編、（Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ （ＳＥＲＣ）、Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗａｍｎｇｔｏｎ、英国、（１９９１））、ｐｐ ５６〜６２；Ｗ． Ｍｉｎｏｒ、ＸＤＩＳＰＬＡＹＦ （Ｐｕｒｄｕｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、インディアナ州ウェストラフィエット、１９９３））またはＳＤＭＳソフトウェア（Ａ．Ｊ． Ｈｏｗａｒｄら Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １１４：４５２〜４７１ （１９８５））。各データセットは１個の結晶から収集した。重原子浸漬は２日間かけて母液中で２ ｍＭとした。最初の電子密度図は、インハウスのデータを用いた三種の重原子誘導体を元にしたものであり、後にシンクロトロンで得られたデータと置き換えた。ＥＭＴＳの差パターソン図を観察して解読した後に、他の誘導体の差フーリエ図の計算に用いた。重原子パラメータの位相誤差（ｌａｃｋ ｏｆ ｃｌｏｓｕｒｅ）の精密化は、「Ｐｒｏｔｅｉｎ」パッケージを用いて行った（Ｗ． Ｓｔｅｉｇｅｍａｎｎ、博士論文（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍｕｎｉｃｈ、１９７４））。ＭＩＲ図は、全体のフィギュアオブメリット（ｆｉｇｕｒｅ ｏｆ ｍｅｒｉｔ）が示唆するよりかなり劣り、またＥＭＴＳの同形差が位相決定で優勢であることは明らかであった。シンクロトロンデータに対する異常占有率の上昇は、問題に対する部分的な解答をもたらした。位相決定パワーが、シンクロトロンデータでは低いが、フィギュアオブメリットは変化しないことに注意されたい。すべての実験的電子密度図は、溶媒接触率を３８％と仮定する、ＣＣＰ４（ＣＣＰ４：「Ａ Ｓｕｉｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」（ＳＥＲＣ Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗａｍｎｇｔｏｎ ＷＡ４ ４ＡＤ ＵＫ、１９７９））パッケージのプログラムＤＭを用いた溶媒平滑化（ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）によって改善された。位相組み合わせは、原子モデルで重量１．０を用いてＰｒｏｔｅｉｎパッケージのＰＨＡＳＣＯ２で行った。重原子パラメータは後に、組み合わされた位相に対する精密化によって改善された。モデル構築をＦＲＯＤＯおよびＯ（Ｔ．Ａ． Ｊｏｎｅｓら、Ａｃｔａ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ａ ４７：１１０ （１９９１）；Ｔ．Ａ． Ｊｏｎｅｓ、「コンピュータ結晶学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）」、Ｄ． Ｓａｙｒｅ編、（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９８２）、ｐｐ． ３０３〜３１７）で進め、また結晶学的精密化はＴＮＴパッケージ（Ｄ．Ｅ． Ｔｒｏｎｒｕｄら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ． Ａ ４３：４８９〜５０３ （１９８７））で行った。発色団の結合の長さと角度は、ＣＨＥＭ３Ｄ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を用いて推定した。最終的な精密化およびモデル構築は、（２Ｆｏ−Ｆｃ）電子密度図を用いてＸ４Ａセレノメチオニンデータセットに対して行った。１．９ Åの分解能を越えるデータは、この段階で使用しなかった。最終モデルは末端残基として残基２〜２２９を含み、これは電子密度図では描出されず、また複数のゆがんだ表面残基の側鎖は省略した。密度は残基１５６〜１５８については弱く、またこれらの残基の座標は信頼性に欠ける。このような無秩序化は、残基１および２３３〜２３８が不必要であるが、さらに切断を進めると蛍光発生が損なわれることを示す過去の分析結果（Ｊ． ＤｏｐｆおよびＴ．Ｍ． Ｈｏｒｉａｇｏｎ、Ｇｅｎｅ １７３：３９〜４３ （１９９６））と一致している。この原子モデルは、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）に登録されている（アクセスコード＝１ＥＭＡ）。
【０１６５】
【表Ｇ】
2004502410.tif 000012
2004502410.tif 000013
注：
（ａ）完全性（ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ）は、観察された反射の理論可能値に対する比をパーセントで表した値である。
（ｂ）シェル（Ｓｈｅｌｌ）は、最高分解能のシェル（通常は幅が０．１〜０．４ Å）を意味する。
（ｃ）
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（＜Ｉ＞は、強度Ｉの個々の観察値の平均）。
（ｄ）
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（ｅ）誘導体は、ＥＭＴＳ＝チメロサール（ｅｔｈｙｍｅｒｃｕｒｉｔｈｉｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）（残基Ｃｙｓ４８とＣｙｓ７０が修飾）、ＳｅＭｅｔ＝セレノメチオニンタンパク質 （Ｍｅｔ１およびＭｅｔ２３３が配置されていない場合がある）；ＨｇＩ４−ＳｅＭｅｔ＝ＳｅＭｅｔバックグラウンドをもつ二重誘導体ＨｇＩ４。
（ｆ） 位相決定パワー＝＜ＦＨ＞／＜Ｅ＞（＜ＦＨ＞＝重原子散乱のｒ．ｍ．ｓ．、＜Ｅ＞＝位相誤差（ｌａｃｋ ｏｆ ｃｌｏｓｕｒｅ）。
（ｇ） ＦＯＭ＝フィギュアオブメリット（ｆｉｇｕｒｅ ｏｆ ｍｅｒｉｔ）の平均
（ｈ）標準的な結晶学的Ｒ因子、
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【０１６６】
Ｂ．Ｓ６５Ｔと比較したときのＴｈｒ２０３ （「Ｔ２０３」）変異体のＳ６５Ｔスペクトル特性
変異Ｆ６４Ｌ、Ｖ６８Ｌ、およびＳ７２ＡはＧＦＰの折りたたみを３７°改善する（Ｂ．Ｐ． Ｃｏｒｍａｃｋら、Ｇｅｎｅ １７３：３３ （１９９６））が、発光スペクトルを有意にシフトしない。
【０１６７】
【表Ｈ】
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【０１６８】
Ｃ．酸性ｐＨおよび中性ｐＨにおけるハロゲン化物センサーとしてのＹＦＰおよびＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ
ＹＦＰの吸収スペクトルはＮａＣｌ濃度の関数であり（図７）、発色団の陰イオンであるバンドＢ（λｍａｘ ５１４ ｎｍ）が、塩化物の付加に伴って中性型（λｍａｘ ３９２ ｎｍ）に変換される。ＹＦＰでは陰イオンのみが蛍光を発するので、蛍光の抑制は［ＮａＣｌ］の上昇と同時に起こる。ＹＦＰでは明瞭な等吸収点が認められる（図７）が、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑでは等吸収点ははっきり決まらない（Ｊａｙａｒａｍａｎら、２０００）。この作用は完全に可逆的である。ＹＦＰ−Ｈ１４８ＱおよびＹＦＰ−Ｈ１４８Ｇでは、バンドＡの吸収極大は、塩の添加に伴い２０ ｎｍ青色側へシフトする（４１５ ｎｍから３９５ ｎｍへ）が、バンドＢの吸収極大は影響を受けない。詳細な結合平衡および陰イオンの特異性については後述する。
【０１６９】
ハロゲン化物センサーとしてのＹＦＰの有用性を、特にＣＦＴＲのポンプ作用がアッセイされた（Ｊａｙａｒａｍａｎら、２０００）細胞質（ｐＨ ７．４）より酸性であるオルガネラについてさらに明らかにするため、ＹＦＰおよびＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの発光強度を一定のイオン強度の条件でｐＨ ６．０〜８．０（図８Ａ、Ｂ）において０〜１５０ ｍＭのＮａＣｌで測定した。その結果、酸性条件下でＹＦＰが優れたプローブであることを発明者らは見出している。ｐＨ ６．０では、蛍光は０ ｍＭ〜２０ ｍＭのＮａＣｌで３９％低下したが、細胞質のｐＨ ７．５では、この低下は同一条件でわずか３．２％に留まった。ＮａＣｌで滴定したＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑでは、蛍光の喪失はｐＨ ６．０でも大きく（４８％）、ｐＨ ７．５ではかなり有意なまま（１１％）であった。中性ｐＨに近い低ミリモル範囲における塩化物濃度の測定では、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑは好ましいプローブであると思われた。ヨウ化物を塩化物に置換すると、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの蛍光損失は、５０％損失が認められるｐＨ ７．５でもかなり大きい（０〜２０ ｍＭ ＮａＩ）（図８Ｂ）。以上の結果は、Ｃｌ−Ｉ−を形質膜ＣＦＴＲチャネルによって交換する最近の研究で、インビボで利用されている（Ｊａｙａｒａｍａｎら、２０００）。上記の異型とは対照的に、オリジナルのＹＦＰでは、ヨウ化物の作用規模は塩化物による作用にほぼ匹敵する（下記の結合データを参照）。
【０１７０】
Ｄ．ハロゲン化物結合部位の結晶学的同定および記述
発明者らは、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの二つの結晶構造を決定した。一つは二か所の結合状態のヨウ化物を含むもの（１００ ｍＭ ヨウ化物浸漬）で、もう一つは結合状態のハロゲン化物を全く含まないものである （２００ ｍＭ 塩化物浸漬）。個々のＲ因子は分解能２．１ Åで１８．８％と２０．４％であり、幾何的性質は妥当に良好である。関連する結晶学的統計値を表Ｉにまとめて示す。ヨウ化物は、インハウスのＣｕＫα波長で異常なシグナルを示すので、異常な差図を重原子の位置を同定する目的でヨウ化物浸漬について計算した。その結果、発明者らは、２本の明瞭な電子密度ピークを見出した（それぞれ７．７と５．５ ｒｍｓの偏位）。１本は発色団付近に位置してタンパク質の内部に埋没しており、もう１本はバレルのキャップにおけるＴｒｐ５７付近のタンパク質表面の小さなへこみの内部にある（データは示していない）。
【０１７１】
１００ ｍＭのヨウ化物における結晶内における結合を示す、３０ Å２に固定された温度因子で０．６０の占有率に精密化された埋没状態のヨウ化物は、結合定数が２．７ ｍＭである溶媒中におけるほど密接していない（下記参照）。ヨウ化物は発色団の複素環のカルボニル酸素から４．３ Å離れて位置し、Ａｒｇ９６との電荷相互作用に関与し、グアニジウム基のＮＥ２までの距離は４．１ Åであり（図９および１０）、埋没状態の正電荷は、陰イオン結合エネルギーの大きなフラクションをもたらす可能性が高い。またヨウ化物は、Ｔｒｐ２０３のフェノール性ヒドロキシルと、Ｇｌｎ６９の側鎖のアミド窒素の両方と水素結合を形成しており、水素結合距離はそれぞれ３．３ Åと３．２ Åである（図９および１０）。このような距離は、酸素または窒素と相互作用するヨウ化物について予測される水素結合距離の範囲内にある。小分子結晶構造の統計データベース分析から、ヨウ化物とフェノール性ヒドロキシル間の平均距離が３．４７ Åであり、ヨウ化物とｓｐ２混成窒素との平均距離が３．６６ Åであることがわかっている（Ｓｔｅｉｎｅｒ、１９９８）。ヨウ化物が結合したハロアルカンデハロゲナーゼの結晶構造では、ヨウ化物が２個のトリプトファンのインドール窒素から３．４ Åおよび３．６ Å離れており、溶媒分子から３．３ Å離れており、チロシンのフェノール性酸素から４．２ Å離れていることがわかっている（Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎら、１９９３）。
【０１７２】
埋没状態のハロゲン化物も、発色団およびＴｙｒ２０３の芳香環と相互作用する（図９）。陰イオンは、芳香環面またはその付近に優先的に位置することがある。これは、芳香環の水素が部分的な正電荷をもつためである（ＢｕｒｌｅｙおよびＰｅｔｓｋｏ、１９８８）。ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑでは、ヨウ化物は二つのπ系のいずれの平面にも存在しないが、二平面からからほぼ等距離に位置し、スタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）相互作用の中心から相殺され、Ｔｙｒ２０３の芳香性ＣＥ１から４．１ Åの位置にあり、また発色団の芳香性ＣＤ２から４．５ Åの位置にある（図９）。結合部位の反対側では、一連の疎水性残基が、Ｉｌｅ１５２、Ｌｅｕ２０１、Ｖａｌ１６３、Ｖａｌ１５０、およびＰｈｅ１６５（いずれもヨウ化物とのファンデルワールス接触に近い）を含むハロゲン化物結合部位に並んでいる。芳香環の端における、チロシンおよびトリプトファンとの相互作用、ならびに疎水性側鎖との無極性相互作用は、ハロアルカンデハロゲナーゼでみられるように、タンパク質中の他のハロゲン化物結合部位に一般に見出されている（Ｐｉｋｋｅｍａａｔら、１９９９）。
【０１７３】
第２の表面結合型ヨウ化物は、Ｔｒｐ５７のアミド窒素、および規則正しく並んだ複数の溶媒分子と水素結合を形成している。このような曝露状態の陰イオンは、発色団のフェノール性酸素から１６ Åの位置にあり、発色団の荷電状態に及ぼす影響は無視できることがわかる。このようなハロゲン化物の占有率は、Ｂ因子を３９ Å２に固定された状態で０．４１で精密化されており、発色団に隣接する一次ヨウ化物と比較して一貫して弱い結合を示す。
【０１７４】
Ｅ．埋没状態のヨウ化物付近における構造変化
発色団付近の陰イオン結合ポケットは、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑのアポ構造では空のようであり、結晶を１８０ ｍＭの塩化物存在下で成長させた後に２００ ｍＭ塩化物に浸漬したという事実とは無関係である。塩化物に対する溶液の結合定数が２８ ｍＭであることは、結晶母液のｐＨが４．６ではポケットの大部分が塩化物で占有されていることを予測させる（下記参照）。ヨウ化物浸漬から明らかなように、結晶中の分子は、おそらく結晶の充填力のために、溶液中におけるほど強く陰イオンと結合しないようである。ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの内部空洞の容積は、半径１．２ Åのプローブを用いて５５ Å３と算出されている（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、１９８５）。
【０１７５】
ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの結合状態の構造中におけるヨウ化物を含む空洞は大きく（９１ Å３）、ファンデルワールス容積が４２ Å３であるかなり大きなヨウ化物を収容する。ポケットに並ぶさまざまな側鎖の一連の構造変化が認められている（図１１）。最も大きな動きはＧｌｎ６９で認められ、側鎖のアミドが空洞の中心から外部に振れており、ハロゲン化物と水素結合を形成するＮＥ２の２．６ Åの動きを生じている（図１１および１２）。Ｇｌｎ１８３ ＮＥ２は１．０ Å動いているが、これがヨウ化物またはＧｌｎ９４に対する水素結合のドナーか否かは明らかではない（ＮＥ２およびＯＥは反対の位置に割り振ることができる）。Ｌｅｕ２０１、Ｉｌｅ１５２、Ｖａｌ１５０、およびＶａｌ１６３の無極性側鎖（図１１）はすべて動いて、ヨウ化物の存在下で空洞の大きさを拡大させており、末端の炭素（ロイシンおよびイソロイシンではＣＤ１、バリンではＣＧ１）は、それぞれ２．４ Å、１．９ Å、１．６ Å、および１．２ Åシフトしている。Ｐｈｅ１６５の芳香環面は約２５°回転している。
【０１７６】
Ｔｙｒ２０３のフェノール性ヒドロキシルは、ヨウ化物を含む空洞方向に０．６ Åシフトしており、ハロゲン化物との水素結合による的相互作用を改善する可能性が高い（図１２）。発色団に隣接するＴｙｒ２０３の側鎖の配置には、ある程度の柔軟性があるようである。これはおそらく、ＧＦＰ Ｓ６５Ｔの構造中で当初同定された水で満たされた大きな空洞内に突出しているためである（Ｏｒｍｏら、１９９６）。ＹＦＰおよびその異型の五つの構造のＣα−炭素の重ね合わせ（Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）から、Ｔｙｒ２０３のＣβは良好に重なるが、フェノール性酸素は最大１．４ Å変動することがわかっている。Ｔｙｒ２０３とハロゲン化物間の水素結合は、妥当に密接した親和性でハロゲン結合部位の生成に極めて重要な役割を果たしているようである（後述する変異分析を参照）。ハロゲン化物に対する発色団シフトは、芳香環の端と陰イオンとの相互作用の改善にかかわる可能性もある。したがって、Ｇｌｕ２２２のカルボン酸は発色団の環の窒素から回転しながら離れ（距離は３．３から３．６ Åへ上昇）、Ｓｅｒ２０５に対する密接な水素結合に関与するようになる（図１２）。
【０１７７】
Ｆ．陰イオン結合と空洞サイズとの関係
ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの埋没型ヨウ化物の部位は小さな空洞であり、過去に検討されたいくつかの構造中に存在して、大きさがあまり変わらない（図１３）。プローブ半径１．２ Åの球体を用いたファンデルワールス容積の計算（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、１９８５）では、空洞の容積は野生型ＧＦＰで２１ Å３であり（Ｂｒｅｊｃら、１９９７）、ＧＦＰ Ｓ６５Ｔで１９ Å３であり（Ｏｒｍｏら、１９９６）、ＹＦＰおよびＹＦＰ−Ｈ１４８Ｇで１６Å３であり（Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）、また５００ ｍＭ ＫＢｒ中に浸漬されたＹＦＰ−Ｈ１４８Ｇ で２１Å３であり、結晶学的分析でも結合部位は空であることがわかっている（未発表データ）。これらの空洞の位置は、上述のＧＦＰにおける位置と本質的に同じであり、Ｖａｌ１５０、Ｖａｌ１６３、Ｌｅｕ２０１、Ｉｌｅ１５２、Ｇｌｎ１８３、およびＧｌｎ６９は中心に近いが、発色団のメチレンブリッジから約６．６ Å、Ａｒｇ９６から６．１ Å離れている。野生型（下記参照）およびＳ６５Ｔ ＧＦＰ（ＷａｃｈｔｅｒおよびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、１９９９）はＮａＣｌと相互作用しないようである。一方、検討されたすべてのＹＦＰは、陰イオンとの相互作用を示し、ＹＦＰでは最も強い結合はＣｌ−で認められた（下記参照）。空洞の大きさと位置が、Ｃｌ−結合と直接相関しないことは明らかである。
【０１７８】
上述の空洞は極めて狭いので、ファンデルワールス容積が２４．８〜５４ Å３の範囲にある塩化物、臭化物、またはヨウ化物と結合することができない。任意の陰イオンとの相互作用を可能とするためには構造変化が明らかに必要である。ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑのアポ構造では、結合状態の陰イオンの非存在下でも空洞はいくぶん広く、その容積は５５ Å３である。この異型では、空洞は発色団方向に広がっており、その容積は、結合部位（Ｇｌｎ６９、Ｔｙｒ２０３、Ｖａｌ１５０、Ｖａｌ１６３、Ｐｈｅ１６５、Ａｒｇ９６、Ｈｉｓ１８１）および発色団そのものに並んだ側鎖の原子の小さな動き（０．４ Åおよび１．２ Å）とともに拡大する。これらの残基の多くは、上述したように、また図６に示すように、ヨウ化物が結合するとさらにシフトする。Ｉｌｅ１５２の末端側鎖の炭素の相殺的な動き（２．１ Å）およびＬｅｕ２０１の末端側鎖の炭素の相殺的な動き（２．３ Å）により、隣接する空洞表面をそれほど変化させることなく、疎水性コアのある程度の再パッキングが生じる。ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの空洞の大きさが広いことは、部分的には、塩化物と比較してヨウ化物の意外なほど強い結合の原因である可能性がある。
【０１７９】
Ｇ．Ｈ１４８Ｑ置換に応じたβバレルの弛緩とヨウ化物の結合
ハロゲン化物非存在下におけるＹＦＰバックグラウンドでのＨ１４８Ｑの導入と、ヨウ化物とＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑとの結合はいずれも、β鎖７（残基１４３〜１５４）およびβ鎖８（残基１６０〜１７１）の構造的な調節を導く。このような調節は、ＹＦＰとＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ のＣαの重ね合わせから明らかであり、ｒｍｓ偏差は０．４２ Åである。またＩ−を含む場合も含まない場合もＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑではｒｍｓ偏差は０．４７ Å（図１４）である。バレルの一方のキャップでは、鎖７と８が、残基１５８の中心にある１本のターンを介して連結されているが、バレルのもう一方のキャップの近傍では、鎖７は、残基１４８の周囲にβバルジを形成し、主鎖のβシートの相互作用は破壊されている（Ｏｒｍｏら、１９９６；Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）。それに代わって、整然と並んだ複数の溶媒分子および側鎖の接触（ＹＦＰのＨｉｓ１４８、ＹＦＰ−Ｈ１４８ＱのＧｌｎ１４８）が、鎖間に水素結合のネットワークを形成している（図１４）。Ｈｉｓ１４８をＧｌｎに置換すると、残基１６６のα炭素はバレルの中心方向に０．９４ Å引かれ、残基１４８のα炭素は０．９４ Å押される。このような動きは、隣接するループ領域内における構造的調節によって相殺される（残基１７２のα炭素の１．４ Åのシフト、および残基１５７のα炭素の０．９４ Åのシフト）。これらの残基は、両構造のいずれにおいても結晶との接触に関与しない。
【０１８０】
ヨウ化物がＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑに結合すると、Ｌｙｓ１６６がバレルの中心から１．０ Å押し戻され、ＹＦＰ内の原位置近くに位置するようになる（図１４）。同様に、このような位置のシフトは、埋没状態の空洞の拡大に応じて生じる。Ｌｙｓ１６６は、両構造のいずれにおいても結晶との接触に関与しない。この場合、近傍のＡｒｇ１６８は、ヨウ化物の結合に応じてＡｒｇ１４９と分子間の塩橋を多少形成する。Ｇｌｎ１４８の側鎖とＬｙｓ１６６の骨格の酸素の間の水素結合は、上記の動きで破壊されていない。相殺性のシフトは鎖の末端でも認められており、骨格のループの残基１７２と１７３が最大１．７ Å引かれるが、同領域における密度は詳細に決められていない。ハロゲン化物とＹＦＰの結合が、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑでみられるようにβバルジ領域に類似の作用を及ぼすか否かは不明である。１４８位で骨格が動くことはＹＦＰ−Ｈ１４８Ｇで既に認められており（Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）、バレルの同部分における柔軟性が上昇することと矛盾がない。
【０１８１】
Ｈ．ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ中の発色団の溶媒接触性
ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの構造から、発色団のヒドロキシルと水素結合が形成されている変異導入前のヒスチジンイミダゾールとは異なり（Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）、Ｇｌｎ１４８の側鎖がタンパク質の外面に向かって振れていて（図９）、バルク溶媒に対する障壁となっていることがわかる。構造が明らかになる以前から、発明者らは、Ｇｌｎ１４８が溶媒中に反転する可能性があると予想していた（Ｅｌｓｌｉｇｅｒら、１９９９）。これは、外部溶媒に対する発色団の部分的な曝露が、ＹＦＰ−Ｈ１４８ＱのｐＫａがＹＦＰと比べて高いことを説明する可能性があるからである（表Ｋ参照）。アポ構造およびヨウ化物結合型構造のいずれにおいても、Ｇｌｎ１４８の側鎖のアミド窒素ＮＥ２は、Ｌｙｓ１６６の骨格のカルボニル酸素、およびＡｓｎ１４９の骨格の窒素に対するアミド酸素ＯＥ１と水素結合を形成しており（図１２および１４）、発色団から十分離れている。ＭｉｄａｓＰｌｕｓ（登録商標）で実行されるように、プローブ球半径１．４ Åを用いた溶媒接触面の計算（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、１９８３）から、Ｈｉｓ１４８の野生型のイミダゾールが位置する、タンパク質の表面に浅いくぼみが形成されることがわかる（図１３）。このような溶媒ポケットは、発色団のファンデルワールス表面とほぼ接触している。タンパク質のゆらぎ運動を考慮する際は、結晶構造中で観察されないある程度の溶媒接触が生じる可能性が高い。溶媒チャネルが発色団の空洞と直接接触するＹＦＰ−Ｈ１４８Ｇ （Ｗａｃｈｔｅｒら、１９９８）と比べて、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑのチャネルは欠けており、発色団は水相消光剤に曝露されていないことを示唆した三重項状態の光退色実験（Ｊａｙａｒａｍａｎら、２０００）と一致している。
【０１８２】
Ｉ．陰イオンとプロトン結合間のエネルギー分析
発色団のｐＫａが特定の陰イオン結合に強く依存することは、二つの異なるリガンド間における相互作用の存在を伺わせる関連した結合平衡、陰イオンがＡｒｇ９６と隣接して結合すること、およびプロトンが発色団のフェノール性末端と結合することから説明可能である。陰イオンの結合がプロトンの結合を促して発色団のｐＫａを上昇させるという事実から、正の協同作用が存在することがわかる。したがって陰イオン結合に対する結合定数はプロトン結合の量の影響を受ける。これは逆もあてはまる。したがって、一つの結合部位が二種の異なるリガンドに対応するという単純な系では、二つの微視的な結合接触を決定することができる。一つは、プロトンが存在する状態における陰イオン結合のｋ１であり、もう一つは、プロトンが存在しない状態における陰イオン結合のｋ２である。発明者らの実施した、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑを対象とした結晶学的解析の結果は、陰イオンに対する一つの重要な結合部位が存在することと矛盾がなく、またＳ６５Ｔを対象に実施された結晶学的解析の結果は、発色団上に一か所のプロトン結合部位があることと矛盾しない（Ｅｌｓｌｉｇｅｒら、１９９９）。認められた陰イオン結合度はｐＨの関数であるので、巨視的な結合定数はｋ１とｋ２の制限値の間にある。
【０１８３】
数学的な記述はワイマン（Ｊ． Ｗｙｍａｎ）（１９６４）によってなされており、カンター（Ｃａｎｔｏｒ）およびシメール（Ｓｃｈｉｍｍｅｌ）による「生物物理学化学（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第ＩＩＩ部」、（ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、１９８０）に記載されている。本明細書では、発明者らは、各リガンドに対して一つの結合部位を有する特別の場合に一般的な式１５−７９を用いる（ｐＫａ°は、結合性陰イオンの非存在下における発色団のｐＫａを示す）：
ｐＫａ＝ｌｏｇ｛（ｋ１＋［塩化物］）／ｋ１｝−ｌｏｇ｛（ｋ２＋［塩化物］）／ｋ２｝＋ｐＫａ°
式（１）
【０１８４】
ｐＨ ６．５およびｐＨ ７．０における吸光度測定により、ＹＦＰのｐＫａを、多数の異なるイオンに対する陰イオン濃度の関数として決定した。対象となる特定の陰イオンの濃度は０ ｍＭから少なくとも１５０ ｍＭ（ハロゲン化物では最高で４００ ｍＭ、図１５）の間を変動し、イオン強度はＹＦＰ群と相互作用しないグルコン酸カリウムを添加して制御した（ＷａｃｈｔｅｒおよびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、１９９９）。相互作用性陰イオンに関する結果は式（１）に合致し、可能な微視的結合定数ｋ１およびｋ２をカーブフィッティングから求めた（図１５および表Ｊ）。一般に、小さな一価の陰イオンはＹＦＰとある程度の相互作用を示すようである。結合はフッ化物で最も強くなり、ｋ１は０．２１４ ｍＭである。他のハロゲン化物を含む、相互作用することがわかっている他の陰イオンは、低ミリモル範囲の微視的結合定数を有し、中でもトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が最も弱い相互作用を示す（ｋ１＝２１．２ ｍＭ）。
【０１８５】
このような相互作用に対する何ら特定の分子形状依存性は存在しないようである。というのは、三原子の直鎖状（例えばチオシアナート）、方形平面型分子（例えば過塩素酸塩）、三方晶（例えば硝酸塩）、および球状（例えばハロゲン化物）の各分子も結合することがわかっている。ギ酸塩も発色団のｐＫａを調節した（ｋ１＝７．４７ ｍＭ）が、過去に実施された、蛍光によるいくぶん予備的な実験では、相互作用が存在しないことが報告されている（ＷａｃｈｔｅｒおよびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、１９９９）。陰イオン性発色団と陰イオンの結合は予想通り望ましくなく、高ミリモルまたはモル範囲におけるｋ２は測定範囲外のことが多い（表Ｊ）。
【０１８６】
【表Ｊ】ＹＦＰ発色団に対する陰イオンの結合（相互作用の強度が低下する順序に記載）ａ
2004502410.tif 000018
ａ 共役塩基（ｐＨ ６〜７における主要イオン）を相互作用の強度が低下する順に記載。
ｂ 括弧内の数字は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（商標）で決定された標準偏差の低い方の推定値。
ｃ 測定範囲外（おそらくモル範囲）にあったために決定できなかった結合定数。
【０１８７】
リン酸や硫酸などの二価の陰イオン、およびグルコン酸、グッド緩衝液（Ｇｏｏｄ ｂｕｆｆｅｒ）（例えば、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ）、イセチオン酸（２−ヒドロキシエタンスルホン酸）、およびＴＣＡ （トリクロロ酢酸）などの大きな一価の陰イオンは相互作用しない（表Ｊ）。これはＹＦＰの定数ｐＫａが約５．４であり、測定が塩を添加することなく低イオン強度の緩衝液中で行われた場合と本質的に同じであることからわかる（ＷａｃｈｔｅｒおよびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、１９９９）。相互作用しない、ある程度小さな一価の陰イオンには、リン酸、重炭酸、および酢酸などがある。水和エネルギーは、陰イオンを識別する際に重要な役割を果たす可能性がある。これは酢酸は強く溶媒和されるが、ＴＣＡは水性溶媒中で弱くしか水和されないことに基づく（Ｍａｒｃｈ、１９９２）。表ＪでＹＦＰについて示した一連の結果は、ｐＨ ７．５における蛍光を元にＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑについて決定された結果（Ｊａｙａｒａｍａｎら、２０００）と極めて似ており、順序にわずかな差があるだけである。例えば、ＹＦＰ−Ｈ１４８ＱはＣｌ−よりＢｒ−に強く結合するが、ＹＦＰではこの順序は逆となる。これはＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの結合部位が大きいためである可能性が高い。
【０１８８】
Ｊ．陰イオン結合に重要な役割を果たす残基の変異分析による同定
ＹＦＰのどの置換（Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ）が、発色団付近における特定の陰イオン結合に対する寄与因子であるかを同定するために、発明者らは変異分析を行って四種の置換を一つずつ野生型に戻した。次に発明者らは、これら復帰体のｐＫａを、相互作用性陰イオンの非存在下で決定し、ハロゲン化物濃度の関数としてのｐＫａを決定して塩化物およびヨウ化物に対する親和性を測定した後に、式（１）に対してカーブフィッティングを行った。復帰体１ （Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ）および復帰体２ （Ｓ６５Ｇ／Ｖ６８Ｌ／Ｓ７２Ａ）は、ＹＦＰで認められるような良好に挙動するｐＨおよびハロゲン滴定挙動を示し、また塩化物およびヨウ化物の結合に関するｐＫａおよびｋ１を、表Ｋに記載されたＹＦＰについて得られた値と比較した。残基６８または残基２０３の復帰は、発色団のｐＫａをそれぞれ５．８と６．４に上昇させる。残基６８の復帰では、塩化物に対する親和性がわずかに低下する（ｋ１＝１３．２ ｍＭ、ＹＦＰでは４．６９ ｍＭ）が、残基２０３の復帰では、相互作用が極めて大きく減じる（ｋ１＝１５３ ｍＭ）。表Ｋから明らかなように、塩化物に対する親和性は発色団のｐＫａと強く結びついており、ｐＫａが上昇すると陰イオンとの相互作用は弱くなる。
【０１８９】
【表Ｋ】ＹＦＰおよびその復帰体における塩化物およびヨウ化物との結合の微視的解離定数
2004502410.tif 000019
ａ 標準偏差の低い方の推定値（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（商標）による値）を括弧内に示す。
ｂ 塩化物 （ＨＥＰＥＳまたはＰＥＰＥＳ、１５０ ｍＭ グルコン酸のいずれかで緩衝）など任意の干渉性陰イオンの非存在下における吸光度から決定された発色団のｐＫａ。
【０１９０】
上記規則の唯一の例外は復帰体２なので、Ｔ２０３Ｙが存在する場合にのみ相関は完全であると思われる。このような差し引きは、強い陰イオン性相互作用に不可欠であると思われる。
【０１９１】
ヨウ化物の結合は、検討されたすべての異型について塩化物の結合よりかなり強いようである（表Ｋ）。発色団のｐＫａとの相関は最高でも弱い。塩化物に対するヨウ化物の相対的な選択性はＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑで最も強く、次にＹＦＰ−Ｈ１４８Ｇで強い。これは、ヨウ化物が塩化物より大きくて柔らかいイオンであり、特定の異型でβバレル構造の弛緩を可能としない限り、小さな空洞に適合させることが難しいという事実を反映している可能性がある（上記参照）。
【０１９２】
復帰体３ （Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙ）と復帰体４ （Ｔ２０３Ｙ）は分析が困難であった。これは、滴定挙動が野生型ＧＦＰと似ているためである。これらの吸収スペクトルはバンドＡおよびＢの混合型の基底状態を示しており、ｐＨ ６．５以上ではｐＨにほとんど依存しない。バンドＡまたはバンドＢのいずれかが励起すると、上記復帰体で緑色の蛍光が発する。これは、野生型ＧＦＰについて報告されている励起状態の脱プロトンと似ている（Ｃｈａｔｔｏｒａｊら、１９９６）。ｐＨ ６．５で、２５０ ｍＭのＮａＣｌを復帰体３および復帰体４に添加すると二つの吸収バンドの比がわずかながら変化し、バンドＢはバンドＡに対して約２０％低下する。ｐＨ ６．５における野生型ＧＦＰでは、一定のイオン強度の条件下で２５０ ｍＭのＮａＣｌを添加してもスペクトルに変化は認められない。これは、イオン強度に対する感度（Ｗａｒｄら、１９８２）と矛盾しないが、特定の陰イオン結合とは一致しない。
【０１９３】
本発明は、新しい長波長の改変蛍光タンパク質を提供する。特定の実施例を提供したが、上記の記述は例示的なものであり、限定されるものではない。本発明の多くの変形例は、本明細書を検討することで当業者に明らかになる。したがって本発明の範囲は、上記の記述に関して決定されるのではなく、むしろ同等物の範囲とともに添付の特許請求の範囲に関して決定されるべきである。
【０１９４】
出版物
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【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）モルスクリプト（Ｍｏｌｓｃｒｉｐｔ）（Ｊ．Ｐ． Ｋｒａｕｌｉｓ、Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔ．、２４：９４６ （１９９１））で作製されたＧＦＰ骨格の略図。発色団は球棒モデルで示されている。（Ｂ）ＧＦＰ全体の折りたたみの略図。二次構造配列の開始端と終端の位置を示す残基番号を示す。
【図２】（Ａ）発色団と、すぐ近傍の残基の立体図。炭素原子を白い円で示し、酸素を黒い円で示し、窒素を斜線を付けた円で示す。溶媒分子は別に黒い円で示す。（Ｂ）発色団周囲の電子密度を示す、１．０σで描かれた最終的な２Ｆｏ−Ｆｃの電子密度図の一部。（Ｃ）発色団の配位の第１および第２の球を示す略図。水素結合を点線で示し、長さをオングストローム（Å）で示す。挿入図は、発色団形成時に形成されると考えられているカルビノールアミン（ｃａｒｂｉｎｏｌａｍｉｎｅ）中間体について提案されている構造を示す。
【図３】オワンクラゲの緑色蛍光タンパク質のヌクレオチド配列（配列番号：１）、および推定アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図４】哺乳類で好ましいコドン、および最適なコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を用いた、改変オワンクラゲ関連蛍光タンパク質Ｓ６５Ｇ／Ｓ７２Ａ／Ｔ２０３Ｙのヌクレオチド配列（配列番号：３）、および推定アミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
【図５】オワンクラゲ関連緑色蛍光タンパク質Ｓ６５Ｔ結晶構造の座標を示す。
【図６】改変蛍光タンパク質２０Ａおよび１０Ｃ（表Ｆ）の蛍光の励起スペクトルおよび発光スペクトルを示す。５２８ ｎｍのところにある縦線は１０Ｃの発光極大（線の左側）と２０Ａの発光極大（線の右側）を対比させている。
【図７】２０ ｍＭ ＭＥＳで緩衝作用をもたせた、さまざまなＮａＣｌ濃度（ｐＨは６．４で固定）におけるＹＦＰの吸収スキャンの結果を示す（−○− ０ ｍＭ ＮａＣｌ、−▽− １５ ｍＭ ＮａＣｌ、−□− ５０ ｍＭ ＮａＣｌ、−◇− １００ ｍＭ ＮａＣｌ、および−△− ４００ ｍＭ ＮａＣｌ）。バンドＡは発色団の中性状態に対応し（λｍａｘ＝３９２ ｎｍ）、バンドＢは発色団の陰イオン（λｍａｘ＝５１４ ｎｍ）に対応する。
【図８】一定のイオン強度（１５０ ｍＭ）におけるｐＨおよび［Ｃｌ−］の関数としての、（ａ）ＹＦＰ、および（ｂ）ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの規格化された蛍光発光を示す。ｐＨは、２０ ｍＭ ＴＡＰＳ ｐＨ ８．０（○）、２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５（△）、２０ ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ ７．０（◇）、ならびに２０ ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ ６．５（▽）およびｐＨ ６．０（□）で調節した。図８（ｂ）は、ｐＨ ７．５（＊）における［Ｉ−］の関数としてのＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの蛍光発光も含む。塩化カリウム（またはヨウ化物）を記載濃度で添加し、イオン強度はグルコン酸カリウムで１５０ ｍＭに調節した。約０．０１ ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む試料は、５１４ ｎｍで励起が認められ、発光強度は５２８ ｎｍで決定された。
【図９】ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ発色団のＴｙｒ２０３、Ａｒｇ９６、Ｇｌｎ６９、および埋没状態のヨウ化物の、精密化後における２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度図の立体図。２．１ Å分解能マップは＋１の標準偏差で描いた。この図はプログラムＢＯＢＳＣＲＩＰＴで作製した。
【図１０】ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ （ヨウ化物浸漬）の結晶構造において、埋没状態のヨウ化物の５ Å以内にある原子を含む全ての残基を示す略図。
【図１１】ヨウ化物のある場合とない場合における、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの陰イオン結合空洞（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｖｉｔｙ）に並んだ一群の残基を重ね合わせた立体図（ヨウ化物が結合したときの構造＝灰、アポ構造＝黒）。ヨウ化物を中心にある球で示す。この図はプログラムＭＯＬＳＣＲＩＰＴで描いた（Ｋｒａｕｌｉｓ、１９９１）。
【図１２】（ａ）アポ構造、および（ｂ）ヨウ化物が結合した状態の構造における、ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの発色団のすぐ近傍の環境を示す略図。
【図１３】ヨウ化物が結合した状態のＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ構造の溶媒接触可能表面の立体図（１．４ Å プローブ半径で計算）。表面は、すべての水分子およびヨウ化物を除いた後に計算した。発色団、および発色団に接触する全ての表面セグメントも示す。タンパク質の外側表面は図の左側に沿っている。この図はプログラムＭｉｄａｓＰｌｕｓ（商標）（ＵＣＳＦ、１９９４）で作製した。
【図１４】ＹＦＰのβ鎖７および８の骨格原子トレース、ＹＦＰ−１４８Ｑのアポ構造、およびヨウ化物が結合した状態のＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑの構造を示す。Ｈｉｓ１４８ （ＹＦＰ）およびＧｌｎ１４８ （ＹＦＰ−Ｈ１４８Ｑ）の側鎖、および数個の水分子も示す。点線は形成可能な水素結合を示す。
【図１５】ハロゲン化物濃度の関数としての、ＹＦＰ発色団のｐＫａを示す（−◇− フッ化物、−▽− ヨウ化物、−△− 塩化物、−○− 臭化物）。発色団のｐＫａは、さまざまなハロゲン化物濃度における吸収スキャンから推定した（「材料および方法」を参照）。このデータは方程式１に従ってカーブフィッティングを行った（本文参照）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
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【図５Ｐ】
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【図５Ｑ】
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【図５Ｒ】
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【図５Ｓ】
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【図５Ｔ】
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【図５Ｕ】
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【図５Ｖ】
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【図５Ｗ】
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【図５Ｘ】
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【図５Ｙ】
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【図５Ｚ】
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【図５ＡＡ】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＡＣ】
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【図５ＡＤ】
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【図５ＡＥ】
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【図５ＡＦ】
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【図５ＡＧ】
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【図５ＡＨ】
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【図５ＡＩ】
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【図５ＡＪ】
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【図５ＡＫ】
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【図５ＡＬ】
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【図５ＡＭ】
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【図５ＡＮ】
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【図５ＡＯ】
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【図５ＡＰ】
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【図５ＡＱ】
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【図５ＡＲ】
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【図５ＡＳ】
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【図５ＡＴ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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2004502410.tif 000268
2004502410.tif 000269
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502410.tif 000270
2004502410.tif 000271
【国際調査報告】
2004502410.tif 000272
2004502410.tif 000273
2004502410.tif 000274
2004502410.tif 000275
2004502410.tif 000276