(57)【要約】本発明は、５’−イノシン酸を生産する微生物及びそれを用いた５’−イノシン酸の生成方法に関するもので、更に具体的にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（従前のブレビバクテリウム）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ−６８７２）の変異株であって、本発明の微生物はアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）を要求する反面、キサンチン（Ｘａｎｔｈｉｎｅ）またはグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）は要求しないが、これを添加することにより生育が促進し、ウレアを蔗糖化できるウレアーゼが欠損し、細胞内に生成された多量の５’−イノシン酸を細胞の外に良く分泌できるように細胞壁合成能力が部分的に欠損したものと見なされる細胞壁分解酵素のリソチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）に対する感受性が高く、発酵過程中に発生する汚染に効果的に対応するために抗生剤のストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に対する耐性を与え、培養過程で添加された高濃度のブドウ糖及び多様な炭素源により、もしくは培養後半における５’−イノシン酸が培養液内に蓄積されると、菌体外部の浸透圧が増加し、５’−イノシン酸の生産微生物の正常的な生理活性が阻害されて菌体成長が鈍化し、５’−イノシン酸の生成が低下することを防止することができる浸透圧耐性形質を強化するための目的で、菌体外部に蓄積された高濃度溶質について細胞内部で濃度が増加し、浸透圧調節に重要な役割をするプロリン（Ｌ−プロリン）の細胞内濃度を増加させるために、その類似体に対する耐性を与え、より効率的に浸透圧による影響を排除させ、また、プリン系合成システムで必須的に要求するグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）の類似体に対する耐性を与え、５’−イノシン酸を高収率、高濃度で培養液中に直接蓄積させる微生物に関する発明である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直接発酵法で発酵培養液に高濃度、高収率の５’−イノシン酸を蓄積させ、
Ｌ−グルタミンの類似体であるアザセリン、ＤＯＮ（６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）に対する耐性と、
プロリンの類似体である３，４−デヒドロプロリン、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、（Ｓ）−２，２−ジメチル−４−オキサゾリドカルボン酸、（Ｓ）−５，５−ジメチル−４−チアゾリドカルボン酸、（４Ｓ，２ＲＳ）−２−エチル−４−チアゾリジン−カルボン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−２−ピロリン−カルボン酸、２−ピペリジンカルボン酸、及び２，５−ピロリジンジオンに対する耐性とを有することを特徴とするコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの変異株ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）。
【請求項２】
請求項１において、アデニン要求性であり、グアニンまたはキサンチン漏出型（Ｌｅａｋｙ）であることを特徴とするコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの変異株ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）。
【請求項３】
請求項１において、細胞壁分解酵素であるリソチームによる最低生育抑制濃度が８μｇ／ｍｌであることを特徴とするコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの変異株ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）。
【請求項４】
請求項１において、発酵過程中に発生する汚染に対応するためにストレプトマイシンに対して耐性を有することを特徴とするコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの変異株ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）。
【請求項５】
請求項１に記載のコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの変異株ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）を培養した後、培養された物を収集することを特徴とする５’−イノシン酸の生産方法。
【請求項６】
請求項５において、請求項１に記載の微生物のコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの変異株ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）を種培地で３０℃、２４時間振蘯培養し、発酵槽種培地で２８〜３４℃、９００ｒｐｍ、ｐＨ ７．２で１〜２日間振蘯培養して活性化させた後、発酵本培地で３０℃、９００ｒｐｍ、ｐＨ ７．２で５〜６日間振蘯培養すると共に、培養液内に還元糖が２％になったとき、１次、２次、３次及び４次の追加糖を果糖、ブドウ糖及び糖蜜を混合して最終還元糖がそれぞれ３２％となるように添加して培養することを特徴とする５’−イノシン酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
〔発明の目的〕
〔発明の属する技術分野及びその分野の従来技術〕
本発明は、５’−イノシン酸を生産する微生物及びそれを用いた５’−イノシン酸の生産方法に関するもので、更に具体的にコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（従前のブレビバクテリウム）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ−６８７２）の変異株であって、従来の５’−イノシン酸を生産するアデニン漏出型変異株（Ｌｅａｋｙ Ｍｕｔａｎｔ）［Ａｇｒ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．４７（５）， ｐ１０３５−１０４１， １９８３，（ＫＹ１３１０２， ＫＹ１３１７１， ＫＹ１３１８４など）］、またはアデニンとキサンチンあるいはグアニンの同時要求性微生物とは異なり、本発明の微生物はアデニンを要求する反面、キサンチンまたはグアニンは要求しないが、添加することにより生育が促進し、ウレアを蔗糖化できるウレアーゼが欠損し、細胞内に生成された多量の５’−イノシン酸を細胞の外に良く分泌できるように細胞壁合成能力が部分的に欠損したものと見なされる細胞壁分解酵素のリソチームに対する感受性が高く、発酵過程中に発生する汚染に効果的に対応するために抗生剤のストレプトマイシンに対する耐性を与え、培養過程で添加された高濃度のブドウ糖及び多様な炭素源により、もしくは培養後半における５’−イノシン酸が培養液内に蓄積されると、菌体外部の浸透圧が増加し、５’−イノシン酸の生産微生物の正常的な生理活性が阻害されて菌体成長が鈍化し、５’−イノシン酸の生成が低下することを防止することができる浸透圧耐性形質を強化するための目的で、菌体外部に蓄積された高濃度溶質について細胞内部で濃度が増加し、浸透圧調節に重要な役割をするプロリンの細胞内濃度を増加させるために、その類似体である３，４−デヒドロプロリン、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、（Ｓ）−２，２−ジメチル−４−オキサゾリドカルボン酸、（Ｓ）−５，５−ジメチル−４−チアゾリドカルボン酸、（４Ｓ，２ＲＳ）−２−エチル−４−チアゾリジン−カルボン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−２−ピロリン−カルボン酸、２−ピペリジンカルボン酸、２，５−ピロリジンジオンに対する耐性を与え、より効率的に浸透圧による影響を排除させ、また、プリン系合成システムで必須的に要求するグルタミンの類似体であるアザセリン、ＤＯＮ（６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）に対する耐性を与え、５’−イノシン酸を高収率、高濃度で培養液中に直接蓄積させる微生物に関する発明である。
【０００１】
５’−イノシン酸は核酸生合成代謝系の中間物質として動植物の体内で生理的に重要な意味を有しているだけでなく、食品、医薬品及び各種医療的利用など、多方面で用いられており、特に、グルタミン酸ナトリウムと共に使用すると、味の上昇効果が大きくて正味性調味料として脚光を帯びている核酸系調味料中の一つである。
【０００２】
現在、直接発酵法で５’−イノシン酸を生産する方法が公知となっているが、最も重要な事項は経済的に高濃度、高収率の５’−イノシン酸を生産することにある。従って、本発明は、５’−イノシン酸を生産する微生物に関するもので、直接発酵法で高濃度、高収率の５’−イノシン酸を生産する微生物を開発して本発明を完成した。
【０００３】
〔発明がなそうとする技術的課題〕
発明の微生物はアデニンを要求する反面、キサンチンまたはグアニンは要求しないが、添加することにより生育が促進し、ウレアを蔗糖化できるウレアーゼが欠損した微生物から始める。また、細胞内に生成された多量の５’−イノシン酸を細胞の外に良く分泌できるように細胞壁合成能力が部分的に欠損したものと見なされる細胞壁分解酵素のリソチームに対する感受性が高い微生物を選別した。
【０００４】
ロジアのＢａｌａｂｕｓｈｅｖｉｃｈ， Ｍ． Ｉ．とＫａｚａｒｉｎｏｖａ， Ｌ． Ａ．（Ｐｒｉｋｌ． Ｂｉｏｋｈｉｍ． Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．，１９（５）， ５９０−５９８， １９８３）は、ストラプトマシンとカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を発酵培地中に添加して透過性を増進させ、培地中の５’−イノシン酸の蓄積を助けるとした。これに着案して、既存の微生物にストレプトマイシンンの耐性を与えると、微生物の膜透過性を増進させて高濃度、高収率の５’−イノシン酸を生産する変異株を発見することができるものと思われ、また、この変異株を利用すると、発酵培地中にストレプトマイシンを添加して発酵で頻繁に生じる汚染を防止することができると思われて、高濃度のストレプトマイシン耐性株を求めてその特性を調査した。実際に、高濃度のストレプトマイシンン耐性を与えた結果、発酵中に発生することができる汚染を防止するのに効果的に利用可能であることを確認した。
【０００５】
一方、大部分の細菌は菌体外部の浸透圧下で浸透的脱水現象を防ぐために、菌体内部の浸透圧を増加させる方法でカリウムイオンと浸透圧調節物質（ｏｓｍｏｌｙｔｅｓ）という有機性溶質を蓄積させる。この浸透圧調節物質としてはプロリン、Ｌ−グルタメート、砂糖、Ｎ−メチル化アミノ酸誘導体（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）などが知られており、そのうち、プロリンは浸透圧調節の重要な因子として菌体外部の増加した５’−イノシン酸による浸透圧の条件でプロリン生合成経路の重要な酵素であるピロリン−５−カルボキシレート還元酸素の活性が増加すると、菌体内部にプロリンを蓄積させることをＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍを通じて報告［Ａｇｒ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．５３（９）， ｐ２４７５−２４７９， １９８９］した。その他に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓなどにおいても菌体内部にプロリンが蓄積され、これは外部浸透圧により調節されることを報告［Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， Ｖｏｌ．１６３， ｐ２９６， １９８５］した。従って、高濃度、高収率の５’−イノシン酸を生産する微生物を開発するためには、プロリンの合成能力を増加させることにより浸透圧耐性形質を強化し、また菌体内部のプロリンの合成増加による生育と生化学的代謝過程の阻害を防止するためにプロリン類似体の抵抗性微生物を獲得することが重要であると思われる。
【０００６】
また、プリン系列核酸の先駆物質であるＰＲＰＰ（５−ホスホリボシル−α−１−ピロホスフェート）から５’−イノシン酸を合成するためには二つの分子のグルタミンを必要とする。ところが、グルタミン酸ナトリウムからグルタミンを合成する酵素であるグルタミン合成酵素（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）はグリシン、アラニン、ヒスチジンなどのアミノ酸及びＣＴＰ、ＡＭＰによりかなり精巧に調節（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， １９８７， ｐ３０２−３２０）を受けるので、５’−イノシン酸を合成するにおいて、グルタミンの円滑な供給は必須である。また、生成されたグルタミンはいろいろな反応の前駆体として非常に多く使用されている。５’−イノシン酸の合成においても、ＰＲＰＰ アミドトランスフェラーゼ及びＦＧＡＲ（５−ホスホリボシル−Ｎ−ホルミルグリシンアミド）アミドトランスフェラーゼの二つの酵素（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，１９８７， ｐ４４５−４７３））がグルタミンを基質として用いている。従って、５’−イノシン酸の合成がより効果的になされるためには、グルタミン酸の円滑な合成及びグルタミンを要求する多様な反応中でも、５’−イノシン酸を合成するのに関与するＰＲＰＰ アミドトランスフェラーゼ及びＦＧＡＲ アミドトランスフェラーゼの二つの酵素が他の酵素よりもグルタミンに対する親和力（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を高めることが非常に重要であると思われる。
【０００７】
従って、本発明者らは、多様なアミノ酸が直接発酵法による５’−イノシン酸を生産するにおいていかなる効果を示すのかに関する実験を行ってみた結果、Ｌ−グルタミンを５’−イノシン酸の発酵培地に添加して発酵実験を行った結果、Ｌ−グルタミンを添加すると、５’−イノシン酸の発酵濃度が増加することを確認し、現菌株でＬ−グルタミンの適切な供給が５’−イノシン酸の生産における速度調節段階（ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐ）であることを確認し、Ｌ−グルタミンの類似体（Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）であるアザセリン、ＤＯＮ（６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）に対する耐性といろいろなプロリン類似体（Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）である３，４−デヒドロプロリン、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、（Ｓ）−２，２−ジメチル−４−オキサゾリドカルボン酸、（Ｓ）−５，５−ジメチル−４−チアゾリドカルボン酸、（４Ｓ，２ＲＳ）−２−エチル−４−チアゾリジン−カルボン酸、及び（２Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−２−ピロリン−カルボン酸、２−ピペリジンカルボン酸、２，５−ピロリジンジオンに対する耐性を与えた微生物が直接発酵法により、５’−イノシン酸を既存に比べて高濃度、高収率で生産できることを発見して本発明を完成した。
【０００８】
〔発明の構成及び作用〕
次に、本発明についてより具体的に説明する。
【０００９】
まず、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ−６８７２）（従前のブレビバクテリウム）の変異株である本発明の微生物はアデニンを要求した反面、キサンチンまたはグアニンは要求しないが、添加することにより生育が促進し、ウレアを蔗糖化できるウレアーゼが欠損し、細胞内に生成された多量の５’−イノシン酸を細胞の外に良く分泌できるように細胞壁合成能力が部分的に欠損したものと見なされる細胞壁分解酵素のリソチームに対する感受性が高く、発酵過程中に発生する汚染に効果的に対応するために抗生剤であるストレプトマイシンに対する耐性を与え、培養過程で添加された高濃度のブドウ糖及び多様な炭素源により、もしくは培養後半における５’−イノシン酸が培養液内に蓄積されると、菌体外部の浸透圧が増加し、５’−イノシン酸の生産微生物の正常的な生理活性が阻害されて菌体成長が鈍化し、５’−イノシン酸の生成が低下することを防止することができる浸透圧耐性形質を強化するための目的で、菌体外部に蓄積された高濃度溶質について細胞内部で濃度が増加し、浸透圧調節に重要な役割をするプロリンの細胞内濃度を増加させるために、その類似体である３，４−デヒドロプロリン、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、（Ｓ）−２，２−ジメチル−４−オキサゾリドカルボン酸、（Ｓ）−５，５−ジメチル−４−チアゾリドカルボン酸、（４Ｓ，２ＲＳ）−２−エチル−４−チアゾリジン−カルボン酸、（２Ｓ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−２−ピロリン−カルボン酸、２−ピペリジンカルボン酸、２，５−ピロリジンジオンに対する耐性を与え、より効率的に浸透圧による影響を排除させ、また、プリン系合成システムで必須的に要求するグルタミンに対する類似体であるアザセリン、ＤＯＮ（６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン）に対する耐性を与え、５’−イノシン酸を生成するのにグルタミンの円滑な供給をもたらして、高収率、高濃度で培養液中に５’−イノシン酸を直接蓄積させるための目的で耐性株を得ようとした。
【００１０】
本発明の変異株はブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ ６８７２）からアデニンを要求する反面、ザンチンまたはグアニンは要求しないが、添加することにより生育が促進し、ウレア（Ｕｒｅａ）を蔗糖化することができるウレアーゼ（Ｕｒｅａｓｅ）が欠損した微生物（ＣＪ１１２）を親株として、Ｘ−線、紫外線またはＮ−メチル−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニン、ジエチルスルフェート、エチルアミンなどの化学変異有機剤で処理した後、最小培地（註２）に寒天（Ａｇａｒ）を１．７％含有し、それぞれ類似体を濃度別に含有した培地に適切に稀釈した後、塗末してコロニーを得た。それぞれのコロニーを栄養培地（註１）で培養し、種培地（註３）で２４時間培養後、発酵培地（註４）で５〜６日間培養した結果、発酵培養液に蓄積される５’−イノシン酸（５’−ｉｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ）の生成量が優れた微生物をそれぞれの類似体に対して段階的に選別した。この後、最終段階の微生物中に発酵培養液に蓄積される５’−イノシン酸の生成量が最も優れた菌株を選別し、この菌株をＣＪＩＰ００９と名付け、第３者に一般分譲できるようにソウル西大門区弘済洞所在の韓国微生物保存センターに２０００年１１月２０日付で受託番号第ＫＣＣＭ−１０２２６号として寄託した。
【００１１】
（註 １）栄養培地：ペプトン １％、肉汁 １％、塩化ナトリウム ０．２５％、酵母エキス １％、寒天 ２％、ｐＨ ７．２
（註 ２）最小培地：ブドウ糖 ２％、硫酸ナトリウム ０．３％、燐酸第１カリウム ０．１％、燐酸第２カリウム ０．３％、硫酸マグネシウム ０．３％、塩化カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄 １０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛 １ｍｇ／Ｌ、塩化マンガン ３．６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ２０ｍｇ／Ｌ、カルシウムパントテネート １０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 ５ｍｇ／Ｌ、ビオチン ３０μｇ／Ｌ、アデニン ２０ｍｇ／Ｌ、グアニン ２０ｍｇ／Ｌ、ｐＨ ７．３
（註 ３）種培地：ブドウ糖 ５％、ペプトン ０．５％、肉汁 ０．５％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム ０．２５％、アデニン １００ｍｇ／Ｌ、グアニン １００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ ７．２
（註 ４）フラスコ発酵培地：グルタミン酸ナトリウム ０．１％、塩化アンモニウム １％、硫酸マグネシウム １．２％、塩化カルシウム ０．０１％、硫酸鉄 ２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン ２０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛 ２０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅 ５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ２３ｍｇ／Ｌ、アラニン ２４ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸 ８ｍｇ／Ｌ、ビオチン ４５μｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 ５ｍｇ／Ｌ、アデニン ３０ｍｇ／Ｌ、燐酸（８５％）１．９％、果糖、ブドウ糖及び糖蜜を混合し還元糖で８％となるように添加して使用（ｐＨ ７．２）
（註 ５）発酵槽種培地：ブドウ糖 ５．４％、ペプトン １％、酵母エキス ２％、燐酸第１カリウム ０．１％、燐酸第２カリウム ０．１％、硫酸マグネシウム ０．１％、硫酸アンモニウム ０．５％、硫酸鉄 ８０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛 ４０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン ４０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ８０ｍｇ／Ｌ、カルシウムパントテネート ６０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 ２０ｍｇ／Ｌ、ビオチン ２４０μｇ／Ｌ、アデニン １２００ｍｇ／Ｌ、グアニン １２００ｍｇ／Ｌ（ｐＨ ７．２）
（註 ６）発酵槽本培地：塩化カルシウム １２０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅 ８ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム １．５％、硫酸鉄 ２４ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛 ２４ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン ２４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ２６．４ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム ０．１２％、チアミン塩酸塩 ６ｍｇ／Ｌ、ビオチン ４０μｇ／Ｌ、ニコチン ５０ｍｇ／Ｌ、アラニン １４５ｍｇ／Ｌ、アデニン ２００ｍｇ／Ｌ、燐酸（８５％） ４．３％、果糖、ブドウ糖及び糖蜜を混合し還元糖で３２％となるように添加して使用（ｐＨ ７．２）。
【００１２】
本発明で選別して新規の変異株 ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）の代表的な類似体に対する生化学的特性は、表１の記載の通りである。（本発明が下記の特性にのみ局限されるのでない）
【００１３】
【表１】
2004516833.tif 000002
【００１４】
本発明で用いられる５’−イノシン酸の培養方法は、次の通りである。
【００１５】
即ち、コリネバクテリウム属に属し、５’−イノシン酸を生産することができる微生物を適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含む通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨを調節しながら培養する。
【００１６】
炭素源としては、グルコース、プラクトース、殺菌された全処理糖蜜（即ち、還元糖に転換された糖蜜）のような炭水化物が用いられることができ、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムのような各種の無機窒素源及びペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、トウモロコシ沈漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキ、またはその分解生成物などの有機窒素源が用いられ得る。無機化合物としては、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが用いられることができ、その他に必要に応じてビタミン及び栄養要求性塩基が添加され得る。培養は好気的条件下で、例えば、振蘯培養または通気撹拌培養により、望ましくは２０〜４０℃で行われる。培地のｐＨは培養する間に中性近傍で維持するのが望ましく、５〜６日間培養し、直接発酵法により蓄積された５’−イノシン酸を常法により分析した。
【００１７】
次の実施例で本発明を具体的に説明する。しかし、本発明がこれらの実施例にのみ局限されるのではない。
【００１８】
〔実施例〕
〔実施例１〕リソチーム感受性微生物（ＬＹ００２）の選別
本実施例の変異株は、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（ＡＴＣＣ−６８７２）からアデニンを要求する反面、キサンチンまたはグアニンは要求しないが添加することにより生育が促進し、ウレアを蔗糖化できるウレアーゼが欠損した微生物（ＣＪ１１２）を親株として、ホスフェート緩衝液（ｐＨ ７．０）またはシトレート緩衝液（ｐＨ ５．５）に１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁させ、Ｎ−メチル−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを最終濃度が１０〜５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた後、２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、寒天を１．７％含有する最小培地（註２）で適切に稀釈後、塗末してコロニーを得た。この後、それぞれのコロニーを、寒天を１．７％含有した最小培地（註２）とリソチーム４０μｇ／ｍｌに寒天を１．７％含有する最小培地（註２）でツースピッキング（ｔｏｏｔｈ ｐｉｃｋｉｎｇ）して寒天を１．７％含有する最小培地では生育し、リソチーム４０μｇ／ｍｌを含有する最小培地では生育しないリソチーム感受性微生物を１次選別し、これを母株として前記のような突然変異を連続誘発させてリソチームが１６μｇ／ｍｌ含まれた最小培地で生育しない感受性微生物を２次選別した。そして、前記の方法によりリソチーム８μｇ／ｍｌを含有する最小培地でリソチーム高感受性微生物を最終選別し、それぞれのコロニーを（註１）栄養培地で培養した後（註３）、種培地で２４時間培養し（註４）、発酵培地で３〜４日間培養してから、発酵培養液に蓄積される５’−イノシン酸の生成量が最も優れるＬＹ００２を選別した。表２は本微生物のリソチーム感受性濃度を表示した。
【００１９】
【表２】
2004516833.tif 000003
【００２０】
〔実施例２〕ストレプトマイシン耐性株ＣＩＳＭ１０の選別
本実施例の変異株は、実施例１のＬＹ００２を親株としてホスフェート緩衝液（ｐＨ ７．０）またはシトレート緩衝液（ｐＨ ５．５）に１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁させ、Ｎ−メチル−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを最終濃度が１０〜５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた後、２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、寒天を１．７％含有する最小培地（註２）にストレプトマイシンがそれぞれ１０００μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ含有する培地で適切に稀釈した後、塗末してコロニーを得た。それぞれのコロニーを（註１）栄養培地で培養した後（註３）、種培地で２４時間培養し（註４）、発酵培地で３〜４日間培養してから、発酵培養液に蓄積される５’−イノシン酸の生成量が最も優れたＣＩＳＭ１０を選別した。表３は本微生物のストレプトマイシン耐性濃度を表示した。
【００２１】
【表３】
2004516833.tif 000004
【００２２】
〔実施例３〕３，４−デヒドロプロリン耐性株ＣＳ１０１の選別
本実施例の変異株は、実施例２のＣＩＳＭ１０を親株としてホスフェート緩衝液（ｐＨ７．０）またはシトレート緩衝液（ｐＨ ５．５）に１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁させ、Ｎ−メチル−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを最終濃度が１０〜５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた後、２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、寒天を１．７％含有する最小培地（註２）に３，４−デヒドロプロリンがそれぞれ１５００μｇ／ｍｌ、２５００μｇ／ｍｌ、３５００μｇ／ｍｌ含有された培地で適切に稀釈した後、塗末してコロニーを得た。それぞれのコロニーを栄養培地（註１）で培養し、種培地（註３）で２４時間培養してから、発酵培地（註４）で３〜４日間培養した結果、発酵培養液に蓄積される５’−イノシン酸の生成量が最も優れたＣＳ１０１を選別した。表４は本微生物の３，４−デヒドロプロリン耐性濃度を表示した。
【００２３】
【表４】
2004516833.tif 000005
【００２４】
〔実施例４〕Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸耐性株ＣＩＡＣ１２の選別
本実施例の変異株は、実施例３のＣＳ１０１を親株としてホスフェート緩衝液（ｐＨ ７．０）またはシトレート緩衝液（ｐＨ ５．５）に１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁させ、Ｎ−メチル−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを最終濃度が１０〜５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた後、２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、寒天を１．７％含有する最小培地（註２）にＬ−アゼチジン−２−カルボン酸がそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ含有された培地で適切に稀釈した後、塗末してコロニーを得た。それぞれのコロニーを栄養培地（註１）で培養し、種培地（註３）で２４時間培養してから、発酵培地（註４）で３〜４日間培養した結果、発酵培養液に蓄積される５’−イノシン酸の生成量が最も優れたＣＩＡＣ１２を選別した。表５は本微生物のＬ−アゼチジン−２−カルボン酸耐性濃度を表示した。
【００２５】
【表５】
2004516833.tif 000006
【００２６】
〔実施例５〕Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸耐性株ＣＩＴＰ１３の選別
本実施例の変異株は、実施例４のＣＩＡＣ１２を親株としてホスフェート緩衝液（ｐＨ７．０）またはシトレート緩衝液（ｐＨ５．５）に１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁させ、Ｎ−メチル−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを最終濃度が１０〜５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた後、２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、寒天を１．７％含有する最小培地（註２）にＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸がそれぞれ２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ含有された培地で適切に稀釈した後、塗末してコロニーを得た。それぞれのコロニーを栄養培地（註１）で培養し、種培地（註３）で２４時間培養してから、発酵培地（註４）で３〜４日間培養した結果、発酵培養液に蓄積される５’−イノシン酸の生成量が最も優れたＣＩＴＰ１３を選別した。表６は本微生物のＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸耐性濃度を表示した。
【００２７】
【表６】
2004516833.tif 000007
【００２８】
〔実施例６〕アザセリン耐性株ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）の選別
本実施例の変異株は、実施例５のＣＩＴＰ１３を親株としてホスフェート緩衝液（ｐＨ７．０）またはシトレート緩衝液（ｐＨ ５．５）に１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌで懸濁させ、Ｎ−メチル−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニンを最終濃度が１０〜５０μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温または３２℃で２０〜４０分間処理して突然変異を誘発させた後、２回にかけて０．８５％食塩水で洗浄し、寒天を１．７％含有する最小培地（註２）にアザセリンがそれぞれ５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ含有された培地で適切に稀釈した後、塗末してコロニーを得た。それぞれのコロニーを栄養培地（註１）で培養し、種培地（註３）で２４時間培養してから、発酵培地（註４）で３〜４日間培養した結果、発酵培養液に蓄積される５’−イノシン酸の生成量が最も優れたＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）を選別した。表７は本微生物のアザセリン耐性濃度を表示した。
【００２９】
【表７】
2004516833.tif 000008
【００３０】
〔実施例７〕三角フラスコの発酵力価実験
使用菌株：ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）
種培地：ブドウ糖 ５％、ペプトン ０．５％、肉汁 ０．５％、酵母エキス １％、塩化ナトリウム ０．２５％、アデニン １００ｍｇ／Ｌ、グアニン １００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ ７．２。
【００３１】
フラスコ発酵培地：グルタミン酸ナトリウム ０．１％、塩化アンモニウム １％、硫酸マグネシウム １．２％、塩化カルシウム ０．０１％、硫酸鉄 ２０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン ２０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛 ２０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅 ５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ２３ｍｇ／Ｌ、アラニン ２４ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸 ８ｍｇ／Ｌ、ビオチン ４５μｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩 ５ｍｇ／Ｌ、アデニン ３０ｍｇ／Ｌ、燐酸（８５％） １．９％、果糖、ブドウ糖及び糖蜜を混合して還元糖として８％となるように添加して使用（ｐＨ ７．２）。
【００３２】
発酵方法：前記種培地３ｍｌをφ１８ｍｍの試験管に分株し、常法により加圧殺菌後に使用菌株を接種し、３０℃で２４時間振蘯培養して種培養液として使用した。発酵培地２７ｍｌを５００ｍｌ振蘯用三角フラスコに分株し、１２０℃で１０分間加圧殺菌して種培養液３ｍｌを接種した後、５〜６日間培養した。回転数は分当り２００回、温度３０℃、ｐＨ ７．２に調節した。
【００３３】
培地内の５’−イノシン酸の蓄積量は１９．１ｇ／Ｌであった。
【００３４】
〔実施例８〕５Ｌ発酵槽における発酵力価の実験
使用菌株：ＣＪＩＰ００９（ＫＣＣＭ−１０２２６）
種培地：実施例７と同一
発酵槽種培地：ブドウ糖 ５．４％、ペプトン １％、酵母エキス ２％、燐酸第１カリウム ０．１％、燐酸第２カリウム ０．１％、硫酸マグネシウム ０．１％、硫酸アンモニウム ０．５％、硫酸鉄 ８０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛 ４０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン ４０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ８０ｍｇ／Ｌ、カルシウムパントテネート ６０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩２０ｍｇ／Ｌ、ビオチン ２４０μｇ／Ｌ、アデニン １２００ｍｇ／Ｌ、グアニン １２００ｍｇ／Ｌ（ｐＨ ７．２）。
【００３５】
発酵槽本培地：塩化カルシウム １２０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅 ８ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム １．５％、硫酸鉄 ２４ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛 ２４ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン ２４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン ２６．４ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム ０．１２％、チアミン塩酸塩 ６ｍｇ／Ｌ、ビオチン ４０μｇ／Ｌ、ニコチン ５０ｍｇ／Ｌ、アラニン １４５ｍｇ／Ｌ、アデニン ２００ｍｇ／Ｌ、燐酸（８５％） ４．３％、果糖、ブドウ糖及び糖蜜を混合して還元糖として３２％となるように添加して使用（ｐＨ ７．２）。
【００３６】
発酵方法：前記種培地５０ｍｌを５００ｍｌ振蘯用三角フラスコに分株し、常法により加圧殺菌後に使用菌株を接種し、３０℃で２４時間振蘯培養して種培養液として使用した。発酵槽培地１０００ｍｌを２．５Ｌ発酵槽に入れ、１２０℃で１５分間加圧殺菌して種培養液５０ｍｌを接種した後、１〜２日間培養した。回転数は分当り９００回、温度２８〜３４℃、ｐＨ ７．２に調節した。また、発酵槽本培地１２５０ｍｌを５Ｌ発酵槽に入れ、温度１２０℃で１５分間加圧殺菌して発酵槽種培養液２５０ｍｌを接種した後、培養すると共に培養液内に還元糖が２％になったとき、１次、２次、３次及び４次の追加糖を果糖、ブドウ糖及び糖蜜を混合して最終還元糖としてそれぞれ３２％となるように添加し、５〜６日間培養した。回転数は分当り９００回、温度３０℃、ｐＨ ７．２に調節した。
【００３７】
このとき、培地内の５’−イノシン酸の蓄積量は７０．３ｇ／Ｌであった。
【００３８】
〔発明の効果〕
本発明は、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ， ＡＴＣＣ ６８７２）の変異株で、本発明の微生物はアデニンを要求する反面、キサンチンまたはグアニンは要求しないが、添加することにより生育が促進し、ウレアを蔗糖化できるウレアーゼが欠損し、細胞内に生成された多量の５’−イノシン酸を細胞の外に良く分泌できるように細胞壁合成能力が部分的に欠損したものと見なされる細胞壁分解酵素のリソチームに対する感受性が高く、発酵過程中に発生する汚染に効果的に対応するために抗生剤のストレプトマイシンに対する耐性を与え、培養過程で添加された高濃度のブドウ糖及び多様な炭素源により、もしくは培養後半における５’−イノシン酸が培養液内に蓄積されると、菌体外部の浸透圧が増加し、５’−イノシン酸の生産微生物の正常的な生理活性が阻害されて菌体成長が鈍化し、５’−イノシン酸の生成が低下することを防止することができる浸透圧耐性形質を強化するための目的で、菌体外部に蓄積された高濃度溶質について細胞内部で濃度が増加し、浸透圧調節に重要な役割をするプロリンの細胞内濃度を増加させるために、その類似体に対する耐性を与え、より効率的に浸透圧による影響を排除させ、また、プリン系合成システムで必須的に要求するグルタミンの類似体に対する耐性を与え、公知の技術より直接発酵法で高濃度、高収率の５’−イノシン酸を生産する菌株を開発して、より経済的に５’−イノシン酸を生産する方法を開発した。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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