(57)【要約】本発明は、医薬組成物の製造のための、外来性ＤＮＡを含有する、微生物、殊に細菌性微生物で負荷されている細胞の使用に関し、その際前記外来性ＤＮＡは定義された作用物質をコードし、かつ、前記医薬組成物は、前記作用物質で阻害可能及び／又は処置可能である疾病の予防又は処置用である。
2006526396.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾病の予防又は治療のための、細菌で負荷した哺乳類の細胞であって、その際前記細胞は、自己由来であるか、同種であるか、又は異種であり、かつマクロファージ、樹状細胞、顆粒球、リンパ球、腫瘍細胞及び組織細胞からなるグループから選択されている細胞。
【請求項２】
照射又はその他の方法によって不活化されている、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
細菌は、生きているか、毒性でないか、毒性が減毒されているか、又は死んでいる、請求項１又は２記載の細胞。
【請求項４】
細菌は、マイコバクテリウム  ツベルクローシス、Ｍ．ボビス、Ｍ．ボビス株ＢＣＧ、ＢＣＧ亜系、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．アフリカヌム、Ｍ．カンサシィ、Ｍ．マリヌム、Ｍ．ウルセランス、Ｍ．アビウム亜種パラツベルクローシス、ノカルジア  アステロイデス、その他のノカルジア種、レジオネラ  ニューモフィラ、その他のレジオネラ種、サルモネラ  チフィ、Ｓ．チフィムリウム、その他のサルモネラ種、シゲラ種、エルシニア  ペスティス、パスツレラ  ヘモリチカ、パスツレラ  ムルトシダ、その他のパスツレラ種、アクチノバシラス  プリューロプニューモニエ、リステリア  モノサイトゲネス、Ｌ．イバノビ、ブルセラ  アボルツス、その他のブルセラ種、クラミジア  ニューモニエ、クラミジア  トラコマチス、クラミジア  シッタシ、及びコクシエラ  バーネッティイからなるグループから選択される、請求項１から３までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項５】
細菌は組換えＤＮＡを有し、その際前記ＤＮＡは、少なくとも１つの作用物質をコードする、請求項１から４までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項６】
少なくとも１つの作用物質は、適したプロモーターを用いて細菌自体により産生されるか、又はその発現は真核プロモーターの制御下にある、請求項１から５までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項７】
産生は、細胞内で起こるか、膜で起こるか、又は分泌されて起こる、請求項１から６までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項８】
作用物質は、感染病原体、例えばウィルス、細菌、マイコプラズマ、寄生体の抗原、腫瘍に特異的な抗原、殊に、癌遺伝子によりコードされるタンパク質、抗体、抗体のエピトープ結合フラグメント、及び抗体のエピトープ結合フラグメントを少なくとも１つ含有する融合タンパク質（これらは例えば腫瘍細胞、リンパ球、例えばＴリンパ球、又は内皮細胞、例えば腫瘍内皮細胞上の抗原に対して指向している）、酵素、殊に医薬品の不活性型前駆体の活性化のための酵素、例えばβ−グルクロニダーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、リパーゼ、免疫抑制サイトカイン、例えばＩＬ−１０、免疫賦活性サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３又はＩＬ−６、ケモカイン、インターフェロン、成長因子、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ：ＶＥＧＦ又はＥＧＦ、又はサイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、又は成長因子に対する阻害性タンパク質からなるグループから選択される、請求項１から７までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項９】
作用物質は、腫瘍組織中でネガティブに制御する要素を遮断する、疾病の予防又は治療のための、請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞の使用。
【請求項１０】
細菌は炎症誘発性刺激剤として、腫瘍組織中で用いられる、疾病の予防又は治療のための、請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞の使用。
【請求項１１】
樹状細胞又はマクロファージは、接種抗原のためのキャリアーとして同時に使用される、疾病の予防又は治療のための、請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞の使用。
【請求項１２】
作用物質及び／又は接種抗原は、ｅｘ  ｖｉｖｏで樹状細胞又はマクロファージに負荷される、疾病の予防又は治療のための、請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞の使用。
【請求項１３】
接種抗原は、定義されたペプチドからなる、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
細胞は、組織の抗原又は腫瘍抗原を発現するその他の細胞と融合している、請求項１０記載の使用。
【請求項１５】
融合した細胞は、自己由来の腫瘍細胞である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
疾病の予防又は治療のための、請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞の使用。
【請求項１７】
医薬組成物を製造するための、外来性ＤＮＡを含有する、微生物、殊に細菌性微生物で負荷されている、請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞の使用。
【請求項１８】
外来性ＤＮＡは定義された作用物質をコードし、かつ、医薬組成物は、前記作用物質で阻害可能及び／又は処置可能である疾病の予防又は処置用である、請求項１７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の範囲
本発明は、細菌で感染させた細胞、並びに医薬組成物、殊に癌の処置のための医薬組成物の製造のためのその使用に関する。
【０００２】
本発明の背景及び公知技術
これまで治療不可能であったか又は不十分にしか治療可能でなかった疾病の治療の新規のアプローチには、遺伝子治療及び免疫治療の様々な可能性が必要である。
【０００３】
遺伝子治療の場合には、所望のタンパク質をコードする核酸配列は、適したキャリアーによって標的組織中に輸送され、そこで細胞中に入り込み、所望のタンパク質の発現のためにこれらを形質導入する。遺伝子治療に対する、多数の様々な技術的アプローチが開発され、試験されてきた。全体的にはしかし、様々なアプローチの前記試験の臨床的な結果は総じて、特に腫瘍の疾病の際にはむしろ失望するものであるように見える。これは大部分、技術的な問題が原因としてある。核酸配列のためのキャリアーは、あまりに低い標的細胞特異性を有するので、形質導入される細胞の数はあまりに少なく、所望のタンパク質の発現の強度及び期間は、治療の効果のためには少なすぎる。
【０００４】
免疫治療の確立した形は、抗原を用いた免疫化、いわゆるワクチン接種である。抗原を用いた免疫化により、体内には特異的な抗体及び／又は特異的な細胞毒性リンパ球が生じ、これは予防的に又は治療的に作用し、例えば感染性病原体に対して作用する。数十年にわたって、様々なアプローチを用いて、これまで不十分にしか処置可能でなかったか又は治療不可能な疾病をもワクチン接種によって処置するために試みられた。この際、腫瘍ワクチン接種による腫瘍疾病の治療が重要である。目的は、腫瘍ワクチンにより腫瘍に対する免疫応答を引き起こすことであり、これは腫瘍細胞の溶解及び最後には全ての腫瘍組織の除去を導く。これまで試験された様々な腫瘍ワクチンを用いても、これまでに腫瘍治療におけるブレークスルーは達成されていない。根本的な理由は、いわゆる、腫瘍に対する腫瘍キャリアーの免疫寛容にある。従って、多数の免疫治療アプローチによって、比較的良好に、腫瘍特異的なＴ細胞応答を誘導することは成功するが、これらはしかし、殺腫瘍性の作用とはしばしば相関しない（例えば、Thurner et al., J Exp Med 190 : 1669-1678 (1999)）。新規の知見は、様々な原因を指し示す。これには、特異的なＴ細胞による腫瘍組織のわずかな浸透（Mukai et al., Cancer Research 59 : 5245-5249 (1999)）及び／又は腫瘍内でのＴ細胞の不活化（例えば、ＴＦＧ−β又は腫瘍組織中でのネガティブに制御するマーカー、例えばＢ７−Ｈ１の発現、又は免疫抑制的に作用する調節Ｔ細胞の刺激による）が属する（概要：Bach, Nature Reviews, 3 : 189-198 (2003)）。
【０００５】
様々な臨床相において、最近では、樹状細胞をしばしばベースとする、腫瘍ワクチン接種のための方法が使用されている（要約、Bancherau et al., Cell, 106 : 271-4(2001)）。樹状細胞での免疫化の最も頻度の高い方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞の活性化、抗原（例えば精製されたタンパク質、腫瘍抽出物、又は決まったペプチド）でのその負荷（「パルシング」）、及びその引き続く適用を含む。又は、細胞の融合を含む方法も使用される。この場合には例えば、樹状細胞を有する、照射された腫瘍細胞は、適した方法、例えば電場によって融合され、引き続き適用される（Kugler etal., Nat Med 6 : 332-6(2000)）。
【０００６】
選択された腫瘍抗原のためのキャリアーとして、組換えて減毒化した、細菌、例えばサルモネラ及びリステリアを用いた新規の方法が開発され、これは患者の腫瘍に対する、患者の免疫寛容を打破する（DE 102 08 653 ; DE 102 06 325、まだ開示されていない）。前記免疫寛容が打破される機構は、これまでその全ての詳細において未だ理解されていない。しかし、ここでは、注射の後に起こる、細菌、例えばサルモネラ又はリステリアの、腫瘍組織中での蓄積及びそこで前記細菌によって引き起こされた炎症が、重大な役割を果たしているようである。サルモネラのｉ．ｖ．投与によって、腫瘍組織中で前記細菌の蓄積が起こることは公知である。動態な研究はしかし、細菌のｉ．ｖ．注射後の初期の時間点で、腫瘍組織中でわずかな細菌のみが検出可能であり、かつこれらは特に腫瘍組織中で、巣状に増殖することが可能であることを示した。従って、ｉ．ｖ．注射によって、大量の細菌が腫瘍中で観察される場合には、これは比較的少ない前駆体から派生する（Mei et al., Anticancer Res 22 : 3261-6 (2002)）。しかし、治療的な適用、例えば遺伝子キャリアーとしてサルモネラを用いる遺伝子治療の意図のための治療的な適用にとっては、これは不利であり、というのは、この場合には腫瘍の均一な定着は起こらず、しかし少ない巣のみが多くの細菌数でもって生じるからである。
【０００７】
腫瘍は、本来の腫瘍細胞及び結合組織の他に、多数の白血球、殊に多数のリンパ球（腫瘍浸潤リンパ球；ＴＩＬ）及び多数のマクロファージ（腫瘍関連マクロファージ；ＴＡＭ）を含有する。白血球の腫瘍局在化は、腫瘍細胞の発現産物によって、殊にサイトカイン、エンドセリン並びに低酸素状態によって影響されることが仮定されている（Sica et al., Int Immunpharmacol, 2 : 1045-1054 (2002) ; Grimshaw et al., Eur J Immunol, 32 : 2393-2400 (2002)）。
【０００８】
腫瘍中に局在化した白血球の機能は矛盾している。殊にＴＡＭに対しては、抗腫瘍性（抗原提示；細胞毒性；Funada et al., Oncol Rep, 10 : 309-313(2003) ; Nakayama et al., AntiCancer Res 22 : 4291-4296 ; Kataki et al., J Lab Clin Med, 140 : 320-328(2002)）と同様に腫瘍成長を促進する活性（成長因子の分泌；血管形成及び転移の促進；Leek und Harris J., Mammary Gland Biol Neoplasia, 7 : 177-189 (2002) ; 細胞毒性サイトカイン、例えばＩｌ−１アルファ；Ｉｌ−ベータ；Ｉｌ−６；ＴＮＦアルファ；の減少した分泌 Kataki et al., J LabClin Med, 140 : 320-328 (2002)）が検出された。
【０００９】
長い間、細胞毒性リンパ球、ＴＩＬ、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ又は樹状細胞の投与により、腫瘍成長を影響することが試みられてきた。臨床的な効果はしかし、再度矛盾するものであった（Faradji et al., Cancer Immunol Immunotherap, 33 : 319-326 (1991) ; Montovani et al., Immunology Today, 13 : 265-270 (1992) ; Ravaud et al., British J of Cancer, 71 : 331-336 (1995) ; Semino et al., Minerva Biotec, 11 : 311-317,(1999)）。実験的に、少し活性化したマクロファージの注射は腫瘍成長の促進に、強く活性化したマクロファージの注射は腫瘍成長の阻害に導くことが可能であることが、示された（Mantovani etal.,Immunology Today 13 : 265-270 (1992)）。この際、活性化マクロファージの適用は、腫瘍局在化を促進するようであった（Fidler, Adv Pharmacol, 30 : 271-326 (1974) ;Chokri et al.,Int J Immunol,1:79-84,(1990)）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗腫瘍性のタンパク質をコードする遺伝子配列で形質導入された白血球の注射も、これまでに臨床的に、腫瘍の処置においてブレークスルーをもたらしていない（Hege and Roberts, Current Opinion in Biotechnology ,7:629-634(1996)）。これらの試みの枠内において、しかし、白血球、その他の細胞、殊に腫瘍細胞も、ｉ．ｖ．注射により腫瘍組織に到達することが可能（Shao J. et al., Drug Deliv 2(2001) ）であること、しかし適用された細胞のはるかに大部分は、通常の組織、例えば肺、脾臓、及び肝臓中で定着すること（Adams J, Clin Pathol Mol Path 49:256-267(1996)）が示された。
【００１０】
本発明の技術的な課題
本発明は、作用物質をコードする外来性ＤＮＡを含有する微生物により、標的細胞局在、殊に腫瘍局在を改善させる手段を提供するという技術的な課題に基づく。
【００１１】
本発明の知見及び特性並びに実施態様
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細菌によって感染させられた、即ち負荷されたマクロファージ又は樹状細胞を、静脈内投与によって腫瘍組織中に輸送し、腫瘍中に局在した細菌の量はｉｎ  ｖｉｔｒｏで細菌で負荷したマクロファージのｉ．ｖ．注射の後、遊離の細菌の相応する量のｉ．ｖ．注射の後よりも明らかに高く、自体感染した異種性腫瘍細胞は腫瘍中で蓄積し、かつ前記効果は、感染した細胞が前もって照射によって不活化された場合にも存続するという知見に基づく。
【００１２】
マクロファージが例えば、サルモネラのためのキャリアーとして使用される場合には、２つの異なるトランスジェニック腫瘍モデル中（肺腫瘍モデル：Ｒａｆトランスジェニックマウス、Kerkhoff et al., Cell Growth Differ, 11 : 185-90 (2000), 乳房腫瘍モデル：Ｈｅｒ−２トランスジェニックマウス、Bouchardet al., Cell, 57 : 931-6 (1989)）で、サルモネラで負荷したマクロファージのｉ．ｖ．適用１８時間後に、腫瘍組織中には、遊離サルモネラの相応する量のｉ．ｖ．注射の後よりも１０倍多いサルモネラが検出された。
【００１３】
異種の腫瘍系の使用の際にも同じことが示された。腫瘍細胞系４Ｔ１（ＡＴＣＣ  Ｎｒ．ＣＲＬ−２５３９）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺組織の腫瘍に由来し、減毒したリステリアを用いた感染の後で、前述のＲａｆ−腫瘍モデル（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）中に適用された。ここでも、感染した細胞の使用の際に腫瘍組織中で細菌のより多い数を示し、これは、細胞の前もった照射の場合にも存続する。
【００１４】
根本的に、この意外な観察は従って、前記細胞が細菌によって感染されるか、又は前記細菌にしっかりと付着し、かつこれにより前記の細菌のためのキャリアーである限りは、任意の細胞に拡張される。例えば、前述の腫瘍モデル中では、腫瘍組織中でのサルモネラの局在化が、サルモネラで感染させた腫瘍細胞のｉ．ｖ．注射後、遊離のサルモネラの相応する量のｉ．ｖ．注射後よりもはるかに多いことが示された。
【００１５】
細菌は殊に、細菌性成分、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）、細胞壁成分、鞭毛、免疫賦活性のＣｐｇモティーフを有する細菌性ＤＮＡ（これらは全て、抗原提示細胞上の、様々ないわゆるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と相互作用し、従ってこれを刺激することが可能）によって強力なアジュバント効果を有する。従って、細菌を用いた細胞の感染及び前記細胞の投与は、腫瘍に対して細菌の改善した蓄積をもたらすだけでなく、前記感染は、全身的な並びに局所的な炎症及び免疫応答の増強をもたらす。これにより前記方法は、免疫治療の範囲内の局所的な免疫応答の上昇のためにも用いられる。
【００１６】
本発明の対象は従って、細菌で負荷された哺乳類の細胞、及び疾病の予防又は処置のための前記細胞の使用である。
【００１７】
本発明の趣旨において細胞は、例えば、自己由来の、同種の、又は異種の、マクロファージ、リンパ球、樹状細胞又は腫瘍細胞であってよい。腫瘍細胞の使用の際には、これは有利には、その分裂能力がブロックされているように、照射されるか又は細胞分裂抑制剤で処理されている。前記細胞は有利には、血液又は腫瘍から当業者に公知の方法で単離される。しかし、通常の組織からの又は腫瘍からの、培地で樹立された、自己由来の、同種の、又は異種の細胞、いわゆる細胞系も使用される。前記細胞系は例えば、細胞バンク、例えばｄｅｒ  ａｍｅｒｉｋａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｇｅｗｅｂｅｚｅｌｂａｎｋ（ＡＴＣＣ）から、任意の数及び種類において入手可能である。更に、当業者に公知の方法で改変された細胞も使用してよい。改変はここでは、殊に遺伝子の改変を含むが、例えばペプチド、タンパク質、薬理学的な作用物質又はウィルス粒子を用いた細胞の付加的な負荷をも含む。本発明の趣旨において負荷は、細胞への細菌の吸着、細胞による細菌の食作用及び／又は細胞の感染である。
【００１８】
本発明の趣旨において細菌は、例えばグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌、有利には、通性細胞内細菌、有利にはサルモネラ又はリステリア、有利には、分裂能力はあるが、しかし受け取り体に対する病原性を有しないか、又はその毒性が減毒されているか、又は死んでいる細菌である。毒性が減毒された細菌は、例えば、前記細菌の少なくとも１つの染色体中で、物質代謝酵素のための少なくとも１つの遺伝子が欠失しているか、又は前記物質代謝酵素が欠損しているように変異していることを特徴とする。前記細菌において、ｉ）芳香族アミノ酸合成のための酵素のための１つの遺伝子、例えば芳香族アミノ酸の生合成において、最初の酵素をコードするａｒｏＡ遺伝子が、染色体中で欠失していてよく、その結果、前記細菌はその成長において芳香族アミノ酸の存在に依存する、ｉｉ）細菌の運動性を可能にするタンパク質は損なわれずに発現されてよく、例えばｉａｐ及びａｃｔＡ遺伝子の機能能力は維持されている、ｉｉｉ）トリプトファニル−ｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子ｔｒｐＳは染色体中で欠失されていてよく、この際前記細菌中にプラスミドが導入されている、ｉｖ）その複製は、適した「複製起点」によって、例えばｏｒｉ  ｐＡＭβ１（Simon and Chopin, 1988）安定化されている、ｖ）トリプトファニル−ｔＲＮＡ−合成酵素をコードするｔｒｐｓ遺伝子を含有してよく、ｖｉ）細胞質中で哺乳類細胞によって活性化可能なプロモーター、例えばａｃｔＡプロモーター（ＰａｃｔＡ、Dietrich et al., 1998）の制御下にある、エンドリシンのための遺伝子、例えばファージＡ１１８(ply 118 ; Loessner et al., 1995)の溶解遺伝子を含有してよく、及びｖｉｉ）細菌中又は哺乳類細胞中で活性可能なプロモーターの制御下にある、少なくとも１つの作用物質をコードする核酸配列少なくとも１つを含有してよく、その際プロモーターの活性化は細胞非特異的に、細胞特異的に、細胞周期特異的に、細胞機能特異的に又は代謝産物、医薬品に依存して、又は酸素濃度に依存して行われる。
【００１９】
前記種類の細菌は、必須代謝タンパク質のための少なくとも１つの遺伝子の損失のために、その毒性の劇的な減少（例えばｉｎ  ｖｉｖｏの増殖能力に関して測定される）を示し、及びにもかかわらず、著しく上昇したバクトフェクション（Ｂａｃｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、細胞質中での細菌の溶解、細菌中に含有されるプラスミドの放出、及びプラスミドによってコードされた作用物質の安定な発現を示す。前記細菌性微生物は、非常に一般的に、外来核酸配列（これは作用物質をコードする）を含有し、かつ選択的に、制御性の核酸配列の制御下にあり、この際微生物の染色体ＤＮＡ中で、天然でかつ細菌の酵素の発現をコードする、細菌の核酸配列は欠失しているか、又は、それから生じる翻訳産物は機能性でなく、かつその際微生物は前記酵素をコードする外来核酸配列を含有しないという条件付きで変異されている。
【００２０】
細胞内細菌の例は以下である：マイコバクテリウム  ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、Ｍ．ボビス（M. bovis）、Ｍ．ボビス株ＢＣＧ、ＢＣＧ亜系、Ｍ．アビウム（M. avium）、Ｍ．イントラセルラーレ（M. intracellailare）、Ｍ．アフリカヌム（M. africanum）、Ｍ．カンサシィ（M. kansasii）、Ｍ．マリヌム（M. marinum）、Ｍ．ウルセランス（M. ulcerans）、Ｍ．アビウム亜種パラツベルクローシス（M. avium subspecies paratuberculosis）、ノカルジア  アステロイデス（Nocardia asteroides）、その他のノカルジア（Nocardia）種、レジオネラ  ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、その他のレジオネラ（Legionella）種、サルモネラ  チフィ（Salmonella typhi）、Ｓ．チフィムリウム（S. typhimurium）、その他のサルモネラ（Salmonella）種、シゲラ（Shigella）種、エルシニア  ペスティス（Yersinia pestis）、パスツレラ  ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica）、パスツレラ  ムルトシダ（Pasteurella multocida）、その他のパスツレラ（Pasteurella）種、アクチノバシラス  プリューロプニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）、リステリア  モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、Ｌ．イバノビ（Ｌ．ivanovii）、ブルセラ  アボルツス（Brucella abortus）、その他のブルセラ（Brucella）種、クラミジア  ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、クラミジア  トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、クラミジア  シッタシ（Chlamydia psittaci）、及びコクシエラ  バーネッティイ（Coxiella burnetii）。
【００２１】
サルモネラの減毒のための例は以下である：ｐａｂ遺伝子、ｐｕｒ遺伝子、ａｒｏ遺伝子、ａｓｄ、ｄａｐ遺伝子中、ｉｎｎａｄＡ，ｐｎｃＢ、ｇａｌＥ、ｐｍｉ、ｆｕｒ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｃｄｔ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｄａｍ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ、ｇａｌＵ、ｍｅｔＬ、ｍｅｔＨ、ｍｖｉＡ、ｓｏｄＣ、ｒｅｃＡ、ｓｓｒＡ、ｓｓｒＢ、ｓｉｒＡ、ｓｉｒＢ、ｓｉｒＣ、ｉｎｖ、ｈｉｌＡ、ｈｉｌＣ、ｈｉｌＤ、ｒｐｏＥ、ｆｌｇＭ、ｔｏｎＢ又はｓｌｙＡ中及びこれらの組み合わせにおける不活性な変異。例示的に挙げられた遺伝子の不活性な変異は、サルモネラの減毒のために当業者に公知である。
【００２２】
本発明の対象は、細菌のキャリアーである更なる細胞であって、その際前記細菌中には核酸配列が導入されていて、これはタンパク質をコードし、その際前記タンパク質は有利には疾病の予防又は処置のための作用物質である。
【００２３】
前記タンパク質は例えば以下である：感染病原体、例えばウィルス、細菌、マイコプラズマ、寄生体の抗原、腫瘍に特異的な抗原、殊に、癌遺伝子によりコードされるタンパク質、抗体、抗体のエピトープ結合フラグメント、及び抗体のエピトープ結合フラグメントを少なくとも１つ含有する融合タンパク質（これらは例えば腫瘍細胞、リンパ球、例えばＴリンパ球、又は内皮細胞、例えば腫瘍内皮細胞上の抗原に対して指向している）、酵素、殊に医薬品の不活性型前駆体の活性化のための酵素、例えばβ−グルクロニダーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、リパーゼ、免疫抑制サイトカイン、例えばＩＬ−１０、免疫賦活性サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３又はＩＬ−６、ケモカイン、インターフェロン、成長因子、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ：ＶＥＧＦ又はＥＧＦ、又はサイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、又は成長因子に対する阻害性タンパク質。
【００２４】
細菌中での前記遺伝子の発現の制御は、適したプロモーターによって行われ、その際これらは細菌又はウイルス、又は真核生物由来であってよく、かつ非特異的に、細胞特異的に、又は機能特異的に、活性化可能であってよい。
【００２５】
更なる有利な、本発明の実施態様において、遺伝子に核酸配列が取り付けられていてよく、これは前記遺伝子によってコードされるタンパク質の膜貫通発現又は分泌を、細菌を介して可能にする。そのようないわゆるシグナル配列は文献ＥＰ１０４２４９５、ＥＰ１０１５０２３及び Hess et al., PNAS USA 93 : 1458-1463 (1996)に記載されている。
【００２６】
本発明の対象は更に、本発明による細胞の、疾病の予防又は処置のための使用である。有利には、本発明による細胞は、腫瘍疾病又は免疫疾病を処置するために使用される。このために、細菌中に導入された遺伝子は、タンパク質をコードし、これはｉ）腫瘍溶解性である、ｉｉ）炎症誘発性に作用する、ｉｉｉ）ネガティブに制御する免疫細胞を阻害する、例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−Ｈ１又はＣＤ２５又はＴＧＦβの阻害によって阻害する、ｉｖ）免疫抑制性に作用する、又はｖ）細胞毒性、免疫調節性、又は免疫抑制性物質の不活性な前駆体を、活性作用物質に変換することが可能である。
【００２７】
疾病の予防又は処置のためには、有利には、１００〜１０＾９個の細胞が投与され、これは有利には、約０．１（統計的平均）〜１００細菌を１細胞当り有する。前記細胞は局所的に、皮膚に、循環器中に、体孔中に、組織中に、器官中に、又は経口的に、直腸に、又は気管に、少なくとも一回投与される。
【００２８】
本発明による細胞が使用される疾病は、例えば腫瘍疾病、自己免疫疾病、慢性的な炎症及び臓器移植である。
【００２９】
以下に、本発明は実施例を元に、より詳細に説明される。
【００３０】
本発明を明らかにするための実施例
実施例１：感染した自己由来の骨髄マクロファージによるサルモネラ  チフィムリウム７２０７の供給
１．１：骨髄マクロファージ（ＭΦ）の単離
ＢｘＢ２３マウス約２〜３ヶ月齢、又はＭＭＴＶ／ｎｅｕトランスジェニックマウス約２ヶ月齢を、骨髄マクロファージを単離するために使用した。前記マクロファージの単離は、以下のプロトコルに従って行った：ｉ）マウスの大腿骨を除去、ｉｉ）ペトリ皿中の骨から軟部組織を除去し、両面で切開した、ｉｉｉ）骨髄をＤＭＥＭ  １０（１０％ＦＣＳ  Ｇｉｂｃｏ、２ｍＭ  Ｌ―グルタミン  Ｇｉｂｃｏ、５０μＭ  β−メルカプトエタノール  Ｇｉｂｃｏを有するＤＭＥＭ  Ｇｉｂｃｏ）２ｍｌで、シリンジを用いてＤＭＥＭ１０を有するブルーキャップ中で洗浄する、ｉｖ）１２００ｒｐｍで５´の間遠心分離し、吸引し、分化培地５ｍｌ中に収容する。分化培地（ＤＭＥＭ１０＋１０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（組換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ  型番４１５−ＭＬ）中で１×１０＾５細胞／ｍｌの細胞カウントに合わせ、Ｎｕｎｃ培養皿（NUNCLONTM, 58mm, NUNC Nr. : 16955）中で５ｍｌに分注する、ｖ）３７℃及び１０％ＣＯ２で８日間インキュベートする、ｖｉ）
１．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのサルモネラ  チフィムリウム７２０７（ＳＬ７２０７）でのマクロファージの感染
Ｎｕｎｃ細胞培養皿に付着しているＭΦを、ＤＭＥＭで洗浄し、次に付着細胞をセルスクレーパーを用いて回収し、カウントし、分化培地中に収容した。ＳＬ７２０７（Hoiseth S. K. et al., Nature 291 : 238-239(1981)）での感染は以下のプロトコルに従って行われた：ｉ）インキュベーター中３７℃、１ｈ：ＭＯＩ（感染多重度）１：２０、ｉｉ）１０＾６マクロファージを、Ｎｕｎｃ細胞培地皿中の培地２ｍｌ中に蒔き、細菌（ＭＯＩ＝２０）２×１０＾７と共に、３７℃で１ｈインキュベートした、ｉｉｉ）次に洗浄し、ｉｖ）ゲンタマイシン（終濃度１００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ））で１ｈ、３７℃でインキュベートし、ｖ）洗浄し、細胞数を決定し、細菌のコロニー形成ユニット（ＣＦＵｓ）をカウントするために、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ）プレート（Ｇｉｂｃｏ）上に蒔いた。
【００３１】
１．３：マクロファージの負荷の結果
ＭＯＩ  ２０及び一時間の負荷時間の際には、コンスタントに約１０＾４のサルモネラがマクロファージ１０＾５中に検出される。負荷密度は、負荷後１２時間の間ほぼ一定なままで、細菌の増殖を全く示さなかった。
【００３２】
１．４：「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」でＳＬ７２０７で感染させたマクロファージのＢｘＢ２３及びＭＭＴＶ／ｎｅｕマウス中での適用
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染させた骨髄マクロファージ５×１５＾５をＰＢＳ１００μｌ中に懸濁し、マウス一匹につきＢｘＢ２３及びＭＭＴＶ／ｎｅｕ腫瘍マウスの尾の静脈中にｉ．ｖ．注射した（使用した実験動物は促進された腫瘍発達を示した、齢１２ヶ月、ＢｘＢ２３マウスでは肺の重量は肺腫瘍のために、０．７５〜１．２５ｇであった）。それぞれの実験に応じて（ＣＦＵｓのカウントによって決定される）、Ｓ．チフィムリウム７２０７、細菌数３〜５×１０＾４がマウス一匹につき注射された。コントロールとして、ＢｘＢ２３及びＭＭＴＶ／ｎｅｕ腫瘍マウスは、Ｓ．チフィムリウム７２０７（細菌２．５×１０＾５をマウス一匹につき１００μｌＰＢＳ中で懸濁した）が、ｉ．ｖ．適用された。１８時間後に、前記マウスを殺し、ＣＦＵ（ＢＨＩプレート上に蒔いた）を、肺（ＢｘＢ２３）又は腫瘍（ＭＭＴＶ）中で決定した。感染の進行を、コントロール群中でＳ．チフィムリウム  ａｒｏＡ  ７２０７のｉ．ｖ．注射後検査した。このために、同様のプロトコルを用いて、様々な時間点でＣＦＵの決定により細菌数を検査した。
【００３３】
１．５：ｉ．ｖ．注射後の腫瘍中でのＳ．チフィムリウム７２０７の蓄積：
ＢｘＢ２３マウスの腫瘍を有する肺中及びＭＭＴＶ／ｎｅｕマウスの乳房の腫瘍中では、サルモネラで感染させたマクロファージの投与後には、遊離のサルモネラで処理したコントロール群中の動物に比較して、感染の１８時間後、サルモネラに関して１０倍量より多く検出された。細菌負荷したマクロファージの注射後、細菌の蓄積は、注射の１８時間後に既にコントロール群（即ち、細菌のみの注射後）で比較すると数日間（感染後５日）後にはじめて達成可能であった蓄積と同じ位多かった（細菌のみの注射の場合よりも１０倍高かった、図１及び付属の表）。本発明による細菌負荷した細胞によって従って、純粋な細菌の懸濁液の注射によって可能であったのよりも、著しくより多い量の細菌を、大幅により短い時間で蓄積することが可能であった。肺及び器官中での、本発明による細胞の注射後１、７、１４日目にＣＦＵｓが決定される場合には、腫瘍を有するＢｘＢ２３マウスの肺中で、ＣＦＵは一定して高いままで、又は上昇し、その一方でＣ５７／ＢＬ６コントロールマウスの肺中でも、ＢｘＢ２３マウス及びＣ５７／ＢＬ６マウスの脾臓中でもＣＦＵｓは、それぞれの肺中の値より著しく低いか、又はもはや検出可能でなかった（図２及び図３、及び付属する表参照；図２は、（肺）腫瘍を有するＢｘＢ２３マウスの肺中とＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスの肺中との、ＣＦＵｓの比較を示す、図３は、ＭＭＴＶ／ｎｅｕマウスの乳房腫瘍中と、脾臓中との、Ｓ．チフィムリウム５×１０＾５のｉ．ｖ．注射後の比較）。
【００３４】
実施例２：感染した異種の細胞によるＬ．モノサイトゲネスの供給
ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺腫瘍からの腫瘍系４Ｔ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３９）を、減毒したＬ．モノサイトゲネス株で、ＭＯＩ１０で、１ｈの間感染させた。前記細胞を次に洗浄し、遊離の細菌を、ゲンタマイシンの存在下での１時間のインキュベーションによって殺した。ＣＦＵｓの決定は、１つの細胞につき０．１５個の細菌での細胞の負荷をもたらした。前記細胞数を、ＰＢＳ中で１ｍｌにつき５×１０＾６個の細胞に調節した。更に、前記感染細胞の一部を、放射により不活化した。腫瘍を有するＢｘＢ２３マウス（齢＞１０ヶ月）又は同齢のＣ５７ＢＬ／６マウス中に、マウス１匹に対して前記懸濁液（即ち５×１０＾５感染細胞（測定されたＣＦＵ、リステリア：７．３×１０＾４）、３．５×１０＾５感染かつ放射細胞、又は（カウントしたＣＦＵｓ）３．５×１０＾５遊離リステリア、それぞれＰＢＳ１００μｌ中）０．１ｍｌを、ｉ．ｖ．注射した。使用した放射量の際には、ＣＦＵの決定にわたって、遊離の細菌の検出された減少は、最大で２５％だけ起こり、これによって放射された細胞の場合には、計算により約３．８×１０＾４の感染量が生じる。
【００３５】
感染１７ｈ後、細菌のＣＦＵｓは、肺中及び脾臓中で、ＢＨＩプレート（Ｇｉｂｃｏ）上への連続的な播種により決定された（検出限度、１器官につき１０細菌）。
【００３６】
この際、検出可能なＣＦＵｓに相応して全ての動物は脾臓中で成功した感染を示した。
腫瘍を有するＢｘＢ２３マウスの肺及びＣ５７ＢＬ／６コントロールマウスの肺中で、ＣＦＵｓの数は本発明による生細胞又は放射された細胞の注射後では、細菌懸濁液の注射後よりも明らかに高く、この際、本発明による細胞の注射後の細菌数は、腫瘍を有するＢｘＢ２３マウスの肺中で、Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウスの肺中の細菌数に比較して、明らかに高まっていた（１０倍）。脾臓中で、全ての群において、肺中より著しく多い細菌のＣＦＵｓが検出可能であったが、しかし本発明による細胞又は細菌懸濁液の注射後の、細菌のＣＦＵｓの数の明らかな差異は、腫瘍を有するＢｘＢ２３マウスの際にも、Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウスの際にも検出可能ではなかった（図４及び、付属する表参照）。
【００３７】
既に、毒性を減毒したＳ．チフィムリウム７２０７で負荷したマクロファージでの試みに対する前記コントロール群において示したように、毒性を減毒したＬ．モノサイトゲネスの際にも、約５日間以内に、最大で１４日間以内に、本発明による細胞の注射後にも、純粋な細菌懸濁液の注射後にも、細菌のＣＦＵｓの数は、脾臓中でも、その他の腫瘍負荷していない器官中でも、腫瘍を有するＢｘＢ２３マウスの場合も、Ｃ５７ＢＬ／６コントロールマウスの場合にも、（肺）腫瘍を有するＢｘＢ２３の肺中のＣＦＵｓの値を明らかに下回る値に減少する。
【００３８】
これとは対照的に、（肺）腫瘍を有するＢｘＢ２３マウスの肺中では、細菌のＣＦＵｓの最初に高かった数は、本発明による注射後に、全ての時間にわたって、少なくともそのままであるか、又は初期であっても上昇し、より長期の平坦な段階の後でようやく再度減少する。
【００３９】
表１：感染したマクロファージ又は遊離のサルモネラのｉ．ｖ．注射１８時間後の感染マウスの肺又は腫瘍中の細菌数
【００４０】
【表１】
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【００４１】
表２：（肺）腫瘍を有するＢ×Ｂ２３マウスの肺と、コントロールマウスＣ５７ＢＬ／６の肺中とのＣＦＵｓの比較
【００４２】
【表２】
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【００４３】
表３：ＭＭＴＶ／ｎｅｕマウスの乳房腫瘍中及び脾臓中の、Ｓ．チフィムリウム ａｒｏＡ  ５×１０５のｉ．ｖ．注射後のＣＦＵｓの比較
【００４４】
【表３】
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【００４５】
表４：２５グレイで放射あり（ｉｒｒａｄ．Ｃｅｌｌｓ）又は放射なし（ｉｎｆ．Ｃｅｌｌｓ）で、又は遊離リステリアを用いて、感染した４Ｔ１乳房腫瘍細胞での感染１７時間後の感染マウス中の細菌数
【００４６】
【表４】
2006526396.tif 000006
【００４７】
表５：２５グレイで放射あり（ｉｒｒａｄ．Ｃｅｌｌｓ）又は放射なし（ｉｎｆ．Ｃｅｌｌｓ）で、又は遊離リステリアを用いて、感染した４Ｔ１乳房腫瘍細胞での感染１７時間後の感染マウスの脾臓中の細菌数
【００４８】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、感染したマクロファージ又は遊離のサルモネラのｉ．ｖ．注射１８時間後の感染マウスの肺又は腫瘍中の細菌数を示す図である。
【図２】図２は、（肺）腫瘍を有するＢ×Ｂ２３マウスの肺と、コントロールマウスＣ５７ＢＬ／６の肺中とのＣＦＵｓの比較を示す図である。
【図３】図３は、ＭＭＴＶ／ｎｅｕマウスの乳房腫瘍中及び脾臓中の、Ｓ．チフィムリウム  ａｒｏＡ  ５×１０５のｉ．ｖ．注射後のＣＦＵｓの比較を示す図である。
【図４】図４は、２５グレイで放射あり（ｉｒｒａｄ．Ｃｅｌｌｓ）又は放射なし（ｉｎｆ．Ｃｅｌｌｓ）で、又は遊離リステリアを用いて、感染した４Ｔ１乳房腫瘍細胞での感染１７時間後の感染マウスの肺又は脾臓中の細菌数を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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