(57)【要約】母親由来のＤＮＡを含む試料、例えば血液又は膣の試料中の胎児ＤＮＡの同定のための方法であって、（ａ）前記試料からＤＮＡを単離し、（ｂ）前記ＤＮＡの末端領域を除去することができるように酵素によるエキソヌクレアーゼ消化に前記ＤＮＡをかけ、そして（ｃ）前記消化過程の結果として、胎児ＤＮＡに残っているが母親由来のＤＮＡは存在していないＤＮＡ配列の存在を検出することを含んで成る方法。一度同定されると、胎児ＤＮＡは、例えば染色体／ＤＮＡ異常、特に異数性、例えば胎児トリソミー２１を検出するための診断にかけられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
母親由来のＤＮＡを含む試料中の胎児ＤＮＡの同定のための方法であって、（ａ）前記試料からＤＮＡを単離し、（ｂ）前記ＤＮＡの末端領域を除去することができるように酵素によるエキソヌクレアーゼ消化に前記ＤＮＡをかけ、そして（ｃ）前記消化過程の結果として、胎児ＤＮＡに残っているが母親由来のＤＮＡは存在していないＤＮＡ配列の存在を検出することを含んで成る方法。
【請求項２】
前記母親由来のＤＮＡを含む試料が血液又は膣の試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予備的段階において、細胞が最初に母親由来の血漿から単離され、そしてＤＮＡが続いて段階（ａ）のこれらから単離される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ａ）由来のＤＮＡが、制限酵素を用いて段階（ｂ）の前にフラグメントへと切断される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡフラグメントの切断末端が、エキソヌクレアーゼ酵素による消化を受けないようにエキソヌクレアーゼによる消化の前に保護される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡフラグメントを形成するために使用される制限酵素が、保護部分のための結合部位を提供するように切断し、そして保護がその保護部分のライゲーションによって達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
保護部分がアダプターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アダプターが２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドＤＮＡ又はホスホロチオネート連結を含む相補オリゴヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
胎児ＤＮＡが母親由来のＤＮＡから単離される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
胎児ＤＮＡフラグメントが、消化後に胎児ＤＮＡ内に残っているテロメアＤＮＡ配列に特異的なビオチン化プローブを、前記ＤＮＡにハイブリダイズし、そしてその後前記プローブをストレプトアビジンで覆われた支持体に固定化することによって分離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ストレプトアビジンで覆われた支持体が常磁性粒子を含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
胎児ＤＮＡ内に残っている前記ＤＮＡ配列がテロメア配列又はテロメア領域の近位に位置している染色体マーカーである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
胎児ＤＮＡ内に残っている前記ＤＮＡ配列がテロメア配列である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
胎児ＤＮＡ内に残っている前記ＤＮＡ配列がサブテロメア多型性染色体特異的マーカーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ配列が、前記ＤＮＡ配列に特異的な一次標識プローブを用いて検出される、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標識が蛍光標識である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
エキソヌクレアーゼ酵素がＢａｌ３１である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
エキソヌクレアーゼによる消化が、第一段階において３’伸長ＤＮＡが除去され、第二段階において３’−５’ｓｓ領域が切除され、そして第三段階においてｓｓ領域が消化される段階で達成される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
第一段階がＭｕｎｇｂｅａｎヌクレアーゼを用いて達成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第二段階がエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて達成される、請求項１８又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第三段階がＭｕｎｇｂｅａｎヌクレアーゼを用いて達成される、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
試料中の胎児起源のＤＮＡの量が決定される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
試料中の胎児ＤＮＡが増幅される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて達成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＲが試料中の胎児ＤＮＡの量を定量するために使用され、又は増幅された試料が遺伝子解析にかけられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
同定された胎児ＤＮＡが出生前診断にかけられる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記診断が染色体異常を検出する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
段階（ｃ）の前に、ＤＮＡがサイズに応じて分離される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
胎児起源であるとして同定され、分離されたＤＮＡが、特定の染色体又はＤＮＡの診断領域に特異的な標識プライマーを用いて増幅される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第二プライマーが蛍光標識を坦持する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
胎児ＤＮＡが、蛍光標識プライマーを用いて増幅され、そして増幅された配列が、染色体又はＤＮＡの状態について診断されるものである、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記プライマーが、第１８染色体、第２１染色体、第１３染色体、Ｘ染色体又はＹ染色体に特異的な配列を増幅する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
母親の症状の診断に使用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記症状が、予定日前の陣痛の危険性の診断において、そして自己免疫疾患の後期発症において子癇前症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
母親由来の血液又は膣の試料中の胎児ＤＮＡを同定するためのキットであって、血液又は膣の試料からＤＮＡを抽出するための手段、ＤＮＡを消化することができるエキソヌクレアーゼ酵素、及びＤＮＡの末端領域に見られる特異的なＤＮＡ配列を検出するのに適した標識プライマー、を含んで成るキット。
【請求項３６】
酵素消化からＤＮＡフラグメントの切断末端を保護するのに適したアダプターのための、ＤＮＡ上の結合部位を作り出すようにＤＮＡを切断する制限酵素を更に含んで成る、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
酵素消化からＤＮＡフラグメントの末端を保護するのに適したアダプターを更に含んで成る、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
ビオチン化テロメアプローブを更に含んで成る、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
ストレプトアビジンでコーティングした常磁性粒子を更に含んで成る、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
染色体の状態の診断のための標識プライマーを含んで成る、請求項３４〜３９に記載のキット。
【請求項４１】
実質的に本明細書に記載されている、母親由来のＤＮＡを含む試料中の胎児ＤＮＡの同定のための方法。
【請求項４２】
実質的に本明細書に記載されている、母親由来のＤＮＡを含む試料中の胎児ＤＮＡの同定のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、母親由来の試料、例えば血液又は膣の試料における胎児ＤＮＡの同定のための方法に関する。この方法で同定された胎児ＤＮＡは、例えば出生前の診断に使用され得る。
【０００２】
染色体疾患はとりわけヒトにおける最も一般的な遺伝病である。体質性の染色体疾患は、妊娠の最初の三ヶ月の流産と関連した５０％超の死亡率、そして約５％の子宮内死又は周産期死亡に及ぶ。更に、少なくとも０．５％の生産児が、精神的及び／又は肉体的障害と関連した体質的な染色体異常を有する。
【０００３】
染色体異常は、数的なものでも構造的なものであってもよい。数的な異常は、身体の組織における４６の二倍体の染色体数からの変化を意味しており、トリソミー（染色体が１つ過剰）、モノソミー（１つ染色体を欠いている）及び倍数性（染色体の組み合わせ全てが過剰）を含む。染色体の破壊、それに続く、異なる位置における破壊された染色体の末端の治癒によって生じる構造的な再配列には、いわゆる転移、逆位及び挿入がある。構造的な再配列は平衡型で起こることがあり、この場合遺伝子材料は通常正常なものと同一のままである。
【０００４】
平衡型の構造的な染色体の再配列の保因者は肉体的且つ精神的に正常であるが、受精率の低下並びに染色体的に平衡でない子孫についての危険性の増大による生殖の問題に苦しむことがあり、このことは流産、出産の間の又は周産期の死亡並びに／あるいは肉体的及び／又は精神的な障害を有する生産児という結果に至る。
【０００５】
ヒトの個体群において実際に起こる最も一般的な染色体異常は、トリソミー２１であり、これはダウン症と関連している。一般的に、約１／６５０の生産児が、多かれ少なかれ深刻な精神運動性の発育の遅れを特徴とするトリソミー２１のダウン症を有することが認められている。世界中の異なる国々において、トリソミー２１のダウン症の発生率の実質的な差異は存在しない。
【０００６】
子供及び大人におけるトリソミー２１のダウン症の診断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける血液性リンパ球の培養の後の染色体解析によって通常実施される。細胞培養の手順は、染色体が標準的な分染技術によるそれら個々の同定のために十分に凝縮される場合、標準的な染色体細胞周期の中期の細胞を十分蓄積させるために２〜３日かかる。
【０００７】
標準的なトリソミー２１のダウン症を有する子供を持つことについて、唯一明確に文書化された臨床的な危険因子は、母体の年齢に関連している。このように、母体の年齢が進むにつれ、トリソミー２１の子供を有する危険性が増大し、４５歳超の最高齢群においては妊娠の１０％を超すこともあることは、一般に受け入れられている。この状況は、トリソミー２１を有する子供を恐らく持つであろうものを同定する、妊娠女性の強制的なスクリーニングプログラムに至っている。これらのスクリーニングプログラムは、生化学的な特徴についての母体の血液試料の解析並びに、ダウン症及び幾つかの他の一般的な異数性を有する胎児において特徴的に増大する、首の皮膚の下の体液の蓄積を見ることを特に目的とする胎児の超音波検査法、を含む。
【０００８】
尚、ある年齢、通常３５歳以上の年齢の妊娠女性は、染色体解析のために胎児の細胞標本を採取する侵襲的な処置（絨毛膜標本採取及び／又は羊水穿刺）を習慣的に提案される。染色体疾患の出生前の診断を実施するための最も一般的な現在の方法は、羊水試料のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養の後の染色体分析（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ）に関するものである。これは、染色体が十分に凝集している有糸分裂細胞の顕微鏡解析を含む。細胞培養は約１〜３週かかり、そして診断の長期の遅れは、親の多くの不安を伴うと認識される。
【０００９】
更に迅速な出生前の染色体診断のための別の技術として、（１）培養していない羊水試料由来の静止（間期）細胞の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、及び（２）羊水試料から単離し、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びＱ−ＰＣＲ技術によって量が決定された染色体特異的プライマーによって増幅したＤＮＡを用いるＤＮＡ診断、がある。
【００１０】
腹水試料を用いる、染色体疾患のための出生前診断についてのこれら２つの代替法は、報告が、試料が研究室に到着したその日又は次の日のうちに素速く発表されうることを暗示しうる。これまで、それらは最も一般的な染色体異常、すなわちトリソミー２１，１３，１８及び性染色体の異数性、の迅速な診断に限定されていた。
【００１１】
いずれにしても、侵襲的な方法、例えば羊水穿刺及び絨毛膜標本採取は、母親にとって不安なだけでなく、約１〜１．５％の流産の危険性の増大を伴う。従って、その様な侵襲的な標本採取方法に頼ることなく出生前の診断を行う更に効果的な方法を提供する必要性が存在している。
【００１２】
あまり侵襲的でない方法を用いて、妊娠している母親から得られた試料は、一般的に、１／１０，０００〜１／１０，０００，０００の次数で、比較的少数の胎児細胞と一緒に大量の母体細胞を含む。胎児細胞の単離のための現時点での方法には、抗体の使用、勾配分画法、優先的な母親由来の細胞の溶解、磁気活性細胞分離（ＭＡＣＳ）、磁石による磁気流体（ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ）の懸濁、個々の細胞の顕微操作、チャージドフローセパレーション（ｃｈａｒｇｅｄ ｆｌｏｗ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）及び蛍光活性細胞分離（ＦＡＣＳ）がある。しかしながら、母親由来の細胞は、なおも回収された任意な胎児細胞を圧倒する傾向にある。更に、これらの技術の多くは時間がかかり、且つ労働者に厳しい。
【００１３】
母親由来の血液試料、特に血漿又は血清が比較的大量の胎児ＤＮＡを含むことがごく最近になって認識されてきた（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ １９９７， ３５０， ４８５−４８７， ＷＯ ９８／３９４７４）。更に、この胎児ＤＮＡが、ＰＣＲの様な技術によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの増幅の後、胎児特異的配列に関連して同定され得ることも証明されてきた。この技術は、Ｙ染色体特異的プライマーによる胎児の性別の診断及び他の条件、例えば異常ヘモグロビン症の診断のための複数の機会に適用されており、ここでの出生前の診断は胎児ＤＮＡの特異的な変異に基づいている。
【００１４】
尚、胎児染色体の異常、例えばトリソミー２１が、上文で例示したような胎児特異的プライマーを用いて、正常な状態と比較した場合に、母親由来の血清／血漿中での胎児ＤＮＡの増大と関連することが証明されている。更に、妊娠における合併症、例えば子癇前症及び予定日前の陣痛及び自己免疫疾患の分娩後の発生も、胎児母体輸血によって特徴づけられることがあり、これは母親由来の血液中に高レベルの胎児細胞をもたらす（ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｅｒｔｌ ａｎｄ Ｂｉａｎｃｈｉ Ｓｅｍｉｎ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２３， ５， ３９３−４０２， １９９９；Ｂｉａｎｃｈｉ Ｅｕｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ ９２， １， １０３−８， ２０００）。
【００１５】
胎児特異的ＤＮＡプライマー（例えば雄性の胎児のＹ染色体特異的プライマー）によって確かめられた胎児ＤＮＡの量は、胎児の染色体の異数性についての危険性が増大している妊娠の検出についてのスクリーニング方法として使用されることがある。しかしながら、最も重大なことに、胎児の異数性は前記方法だけでは診断することができなかった。このように、これらの方法は、胎児が正常であるか又は異数性であるかを決定するために、胎児ＤＮＡ間の差異を測定するのに十分な感度でない。これらの試験がもたらす様々な結果の例は以下の図１に例示する。図１ａにおいて、胎児は正常であり、そして母親由来の対立遺伝子に相当する２つのピークが存在している。これらのうちの一方（Ｍ２）は、他方のもの（Ｍ１）よりも大きく、そして胎児のＤＮＡ（Ｆ）に由来する追加量のＤＮＡが存在している。このサイズは、父親起源の胎児対立遺伝子（Ｆ−Ｐａｔ）に由来するピークと同一である。
【００１６】
図１ｂにおいて、胎児は、母親由来の対立遺伝子Ｍ１及びＭ２のそれぞれの上にＦの１つのコピーと、それに加えて父系起源の１つのコピー（Ｆ−Ｐａｔ）を持つトリソミー２１を有する。これは、（ａ）で例示されている正常な状況と比較して、対立遺伝子Ｍ１とＭ２との間の、蛍光の差異を減少させる。図１ｃにおいて、胎児は、母親由来の対立遺伝子Ｍ２上にＦの２つのコピーと、それに加えて父系起源の１つのコピー（Ｆ−Ｐａｔ）を持つトリソミー２１を有する。これは、図１ａに例示した正常な状況と比較して対立遺伝子Ｍ１とＭ２との間の蛍光の差異を増大させる。最後に、図１ｄにおいて、胎児は父親起源のＦ−Ｐａｔの２つのコピーを持つトリソミー２１を有する。これは、母性対立遺伝子Ｍ１とＭ２に由来する蛍光に差異を与えないが、父親由来の対立遺伝子の蛍光は重複している。その様な結果は解釈することが非常に困難であり、そして我々が知っている限り、トリソミー２１（又は任意な他の異数性）の出生前診断が、母親由来の血液又は膣の試料を用いてこの様に診断されたことについて文書化されたものは存在していない。
【００１７】
それ故に、母親由来のＤＮＡ含有試料、例えば血液又は膣の試料中の胎児ＤＮＡを同定するための新規方法であって、非侵襲的な出生前診断の新規方法を含んで成るものについての急を要する必要性が存在している。
【００１８】
染色体の末端をキャップする反復ＤＮＡ配列を構成するテロメアが、若い人が老齢の人よりも多くの反復を有するというように変化することは周知である。ＤＮＡの複製はテロメア反復の本当の末端で起こらないと考えられる。このことは、各細胞分割で、テロメアが以前よりも短くなることを意味している。また、この短縮が最終的には細胞死を導くと考えられている。
【００１９】
全てのヒト染色体のテロメアが同一のＤＮＡコアリピートＴＴＡＧＧＧを含む。個体の年齢に伴うテロメアの長さの変化は、全ての染色体上で観察される一般的な現象である。個体の年齢に依存して、テロメアの反復の長さにおける変化はＤＮＡの４〜２００ｋｂ程度であると推定される。
【００２０】
染色体特異的なテロメアの長さは、特別なソフトウェア並びに、テロメアプローブ又は市販のペプチド核酸プローブ（ＰＮＡ， ＤＡＫＯ Ｌｔｄ）とハイブリダイズした染色体の顕微鏡画像解析を用いて測定され得る。これらの研究は、個々の染色体のテロメア含量において、個々の細胞核間に多少の変化があり得ることを示唆している。それにも関わらず、既に言及したように、対象者の年齢と共にテロメアの長さの実質的な減少が存在している。
【００２１】
これに基づくと、胎児細胞内の個々の染色体のテロメアの長さは新生児のものより長く、そして成人のものより遙かに長いはずである。従って、胎児細胞が、母親由来の細胞よりも長いテロメア、すなわち染色体当たりテロメアＤＮＡ反復のより多くのコピー数を有することが潜在している（Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １０５， １３８−１４４， １９９８； Ｋｒｅｊｉ ａｎｄ Ｋｏｃｈ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ １０７， １９８−２０３， １９９８）。
【００２２】
出願人は、この特性が、母親由来のＤＮＡ含有試料、例えば血液（血漿又は血清を含む）又は膣の試料中に存在する母親由来のＤＮＡと胎児ＤＮＡの間の、特にＤＮＡの差異についての基礎として使用され得ることを見出した。
【００２３】
このように、本発明により、母親由来のＤＮＡ含有試料中の胎児ＤＮＡの同定のための方法であって、（ａ）前記試料からＤＮＡを単離し、（ｂ）前記ＤＮＡの末端領域を除去するような酵素によってエキソヌクレアーゼによる消化に前記ＤＮＡをかけ、そして（ｃ）前記消化過程の結果として、胎児ＤＮＡにはあるが、母親由来のＤＮＡにはないＤＮＡ配列の存在を検出すること、を含んで成る方法が提供される。
【００２４】
段階（ａ）及び（ｂ）は任意な順序で実施され得る。例えば、ＤＮＡは最初に細胞から単離され、そして次に段階（ｂ）に従う酵素消化にかけられる。しかし、あるいは消化が細胞内で直接達成され、そして消化されたＤＮＡが、段階（ｃ）での解析のために、例えばＰＣＲ増幅によってそれらから単離されることもある。
【００２５】
適当な場合には、母親由来のＤＮＡ含有試料は血液又は膣の試料である。好ましくは、前記方法は母親由来の血液試料を用いて実施される。「血液試料」の表現は、本明細書で使用される場合、全血、あるいはそれらに由来する血清又は血漿を包含する。
【００２６】
特に好ましい態様において、細胞は最初に母親由来の血漿から単離され、そしてＤＮＡが、前記過程の段階（ａ）として、あるいは、適切な場合には段階（ｂ）の間又はその後、これらから抽出される。極少量の材料が利用可能である場合に有利な、その様なＤＮＡ増幅の例は、例えばＦｉｎｄｌａｙ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ５１ （３）， １６４−１６７， １９９８， Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６ （８）， ４４９４−４４９９， １９９９に記載されている。
【００２７】
しかしながら、本発明が他の出生前試料の型、例えば羊水の解析に便宜的に利用される場合もあり得る。一般に、羊水試料は比較的少ない母親由来のＤＮＡを含み、そして胎児ＤＮＡの同定は困難ではない。しかしながら、ある場合には、当該試料は母親由来の血液が混入しており、そして、例えばＱ−ＰＣＲ法を用いて解析した場合、蛍光パターンを複雑にする。予備的段階として本発明の方法を用いるその様な試料からの胎児ＤＮＡの単離は有用であると思われる。
【００２８】
ＤＮＡは、常用の方法を用いて試料から単離され得る。好ましくは、長いＤＮＡフラグメントの単離をもたらす技術が適用される。その様な方法の例は、Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７， ５， ９２８−９２９；９３２０９３３， １９９４に記載されているアガロースプラグの使用である。
【００２９】
１つの態様において、段階（ａ）由来のＤＮＡは、制限酵素を用いて、段階（ｂ）の前にフラグメントへと切断される。この様に、エキソヌクレアーゼによる消化はＤＮＡフラグメントの末端領域を除去する（以下の図２を参照のこと）。［しかしながら、このことは常に必要であるわけではなく、特に、血漿から単離された細胞がそれ自身直接的にエキソヌクレアーゼによる消化にかけられ、そして生じたＤＮＡが解析前にＰＣＲによって増幅される場合には必要ではない］
【００３０】
特に好ましい態様において、ＤＮＡの切断末端は、エキソヌクレアーゼによる消化にかけられる前に、それらがエキソヌクレアーゼ酵素、例えばＢａｌ３１による消化を受けにくくなるように保護される。このことは、ＤＮＡの末端領域由来のフラグメントの消化が、テロメア領域から内側への一方向であることを意味する。近位末端は、フラグメントがＤＮＡの内部領域に由来するように、消化から保護される。その結果、消化はテロメア領域においてのみ起こる（以下の図３を参照のこと）。
【００３１】
適当な場合には、ＤＮＡフラグメントを形成するために使用される制限酵素は、保護部分、例えばアダプターのために結合部位を提供するように切断するものである。続いて、保護は適当なアダプターのライゲーションによって達成され得る。適当なアダプターは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドＤＮＡ（Ｍｕｋａｉ ｅｔ ａｌ． ＮＵｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ １９， １９９８）又は相補的オリゴヌクレオチド含有ホスホロチオネート連結であってもよい。
【００３２】
段階（ｃ）で検出され得る胎児ＤＮＡに残っている適当なＤＮＡ配列は、テロメア配列又はテロメア領域近くに位置する染色体マーカーであり、そして最も好ましくはサブテロメア配列、特に特異的な染色体に対して独特なものである。
【００３３】
段階（ｃ）の検出は、任意な既知の技術によって達成されうる。しかし、好ましい態様において、胎児ＤＮＡは、磁気分離技術を用いて単離され、そして精製される。これが達成され得る特定の方法は、テロメアに特異的なプローブとしてビオチン化したプライマーの使用を包含する。プライマーのハイブリダイゼーションは、胎児ＤＮＡが、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性粒子（ＰＭＰ）又はビーズを用いて磁気的に単離され得るビオチン標識を有することを意味する（例えば図４を参照のこと）。
【００３４】
本発明の方法に関連して、プライマーがプローブとして機能するために使用され得る場合がしばしば存在する。当業者にとって、これが適用される場合は明確であろう。このように、用語「プライマー」は、本明細書で使用する場合、プローブ機能を有することがある配列、及び増幅反応のために常用のプライマーとして使用される配列を言及するものとして理解されるべきである。
【００３５】
一度この方法で単離されてから、ＤＮＡフラグメントは解析されうる。必要に応じて、それらは最初に増幅にかけられることもある。この方法で得られた純粋な、増幅された胎児ＤＮＡは、非侵襲的な出生前の遺伝子解析及び診断における広範に適用されうる。特に、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡシークエンサー及びＧｅｎｅｓｃａｎ ｓｏｆｔｗａｒｅによる、例えば蛍光Ｑ−ＰＣＲ法、並びにＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ及びＭｉｃｒｏａｒｒａｙｓを含む様な他の方法を用いて定量的な解析を実施することが好ましいことがある。これらの方法の多くが現在完全に自動化され始めている。
【００３６】
事実上、本発明は、母親由来のＤＮＡ含有試料中の胎児ＤＮＡの同定を基礎として、胎児ＤＮＡと母親由来のＤＮＡの、テロメア反復の数の差異を使用する。段階（ｂ）の間、ＤＮＡであって、好ましくはフラグメント、そして最も好ましくは長いフラグメントの形態のものが、好ましくは切断末端の保護の後に、テロメアの末端領域から内側へと一定方向に消化される。
【００３７】
試料中に存在する全染色体のテロメア領域は、最初にこの過程の間に消化される。エキソヌクレアーゼによる消化は、少なくとも全ての母親由来のテロメアＤＮＡ配列を排除するのに十分な期間実施され得る。
【００３８】
消化がこの時点で停止する場合、いくつかの胎児ＤＮＡフラグメントはいくつかのテロメアＤＮＡを保持する（図３ａ）。このＤＮＡは、例えば、結果として胎児ＤＮＡにのみハイブリダイズし得るプライマー、テロメアＤＮＡに特異的な標識プライマーを用いて検出可能なものである。
【００３９】
しかしながら、消化は、サブテロメア配列が母親由来のＤＮＡの全てのフラグメントから除去される様に続けられ得る（図３ｂ）。この場合、より長い胎児テロメアの消化がより長期間かかるので、いくつかの染色体特異的ＤＮＡが胎児ＤＮＡのフラグメントの相当部位に残り、そしてその結果、例えば結果としてマーカーとして働くそのＤＮＡのためのプライマーを用いて検出可能となる。当該プライマーは、これらの環境の下では母親由来のＤＮＡとハイブリダイズしない。
【００４０】
好ましくは、検出に使用されるプライマーは、可視的な標識、例えば蛍光標識で標識される。
【００４１】
段階（ｃ）で検出された配列が染色体マーカーである場合、当該マーカーがそれ自身出生前の診断において直ちに有用なものとなりうる可能性があるので、それがサブテロメア多型性染色体マーカーであることが好ましいと思われる。
【００４２】
いずれにせよ、胎児ＤＮＡの同定は、同定されたＤＮＡの出生前診断に対する予備的な段階として使用され得る。
【００４３】
特に別の態様において、消化後に試料中に存在するＤＮＡは、前記ＤＮＡ配列、例えばテロメア配列及び／又はサブテロメア配列に特異的な最初の標識ＤＮＡプライマーを用いて増幅される。最も好ましくは、最初のプライマーは視覚的な標識、特に蛍光標識で標識され、そして増幅された試料由来の蛍光が検出される。
【００４４】
エキソヌクレアーゼ消化を行うのに適した酵素としてＢａｌ３１がある。更に制御可能な工程を保証するために、前記ＤＮＡの特異的な領域のみを消化する酵素を使用することが好ましい。特に、消化は３つの段階で達成され、ここで、第一段階において３’伸長ＤＮＡが除去され、第二段階において３’−５’ｓｓ領域が切除され、そして第三段階において、ｓｓ領域が消化される。第一及び第三段階を達成するのに適した酵素として、ｍｕｎｇｂｅａｎヌクレアーゼがあり、そして第二段階に適した酵素として、エキソヌクレアーゼＩＩＩがある。
【００４５】
母親由来のＤＮＡと胎児ＤＮＡの間の識別を可能にする信頼性のある消化を提供するために必要とされる条件、例えば酵素濃度、緩衝液系、インキュベーションの温度と時間は慎重な選択を必要とし、そして使用される特定の酵素の様な因子に依存する。
【００４６】
異なるＤＮＡ末端間のテロメアＤＮＡ配列反復の数の変更の結果として、好ましくは染色体特異的に酵素系を最初に「較正（ｃａｌｉｂｒａｔｅ）」することが望ましい。この型の較正は、様々な条件のもと単離されたＤＮＡのエキソヌクレアーゼによるテロメアの消化結果を解析することによって達成されうる。
【００４７】
特定の酵素系を較正する別の手段は、母親由来及び胎児の組織試料中の個々の染色体末端のテロメアの長さについての基準となる情報を得ることである。これは、細胞周期の中期のテロメアＤＮＡ配列の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて行われうる。この段階において、各染色体末端にある個々のテロメアは、テロメア特異的プローブと共に、サブテロメアＤＮＡプローブを組み合わせてＦＩＳＨを用いて強調される。テロメア配列の測定は、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）ソフトウェアプログラムを用いる、顕微鏡映像解析によって実施され得る。
【００４８】
臍帯穿刺術にかけられた胎児由来の血液試料及び出産時に得られる臍帯血試料も、母親由来及び胎児の組織試料中の各染色体の腕についての、テロメアＤＮＡ配列の長さにおける正常な変化についての基準となる追加情報を得る観点で利用されうる。
【００４９】
母親由来のＤＮＡ由来のサブテロメアマーカーを排除するために必要とされる酵素濃度及び曝露時間の条件は、同様の方法で決定されうる。この例において、例えば、ＤＮＡ産物のサブテロメアマーカーのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増幅は、構成的な母親由来のＤＮＡ対立遺伝子と胎児ＤＮＡ対立遺伝子とを識別するために実施され得る。この実験は、適用した各酵素消化条件によるサブテロメア配列の除去の速度に対する基本的な情報を提供する。
【００５０】
好ましいサブテロメアマーカーとして、例えばスモールタンデムリピート（ＳＴＲ）又はマイクロサテライトがある。この目的のために、それらは、エキソヌクレアーゼ消化によるそれらの消失速度の評価のために、且つ構成的母親由来のＤＮＡと胎児ＤＮＡとの間の識別のためにのみ使用されるので、それらは多型性マーカーであっても、そうでなくてもよい。
【００５１】
しかしながら、多型性診断マーカーは、当該解析が引き続き出生前診断に使用される場合に好ましいと思われる。第２１染色体特異的多型性４塩基反復マーカーの例は、Ｄ２１Ｓ１１， Ｄ２１Ｓ１４１２， Ｄ２１Ｓ１４１１及びＤ２１Ｓ１４１４である。２塩基反復であるＩＦＮＡＲも、多くの他のより小さな反復マーカーと比較して単純な増幅パターンを示し、これは断続的な（ｓｔｕｔｔｅｒ）バンドを伴うことがある。多型性マーカーの他の例として一塩基多型（ＳＮＰ）があり、これはヒトゲノムにおいて非常に高頻度で起こり、そして同定されているものが現在増大している。
【００５２】
この場合、胎児マーカーの濃度が、例えば定量的ＰＣＲ法、例えばＴＡＱＭＡＮ（商標）を用いて引き続いて決定され得る。この情報は、あるＤＮＡ配列の量だけが胎児と母親との間で異なるような胎児の状態の出生前診断において有用なことがある。染色体に独特な胎児ＤＮＡの量の信頼性のある定量は、母親由来の血液試料を用いて、異数性、例えばトリソミー２１のダウン症を含む一般的な胎児の状態の非侵襲的な出生前診断に必要とされる。
【００５３】
好ましい選択肢において、問題のサブテロメアマーカーは、各染色体の腕の中において、染色体に独特なＤＮＡ配列間で出来る限り離れて位置するべきである。これらのマーカーは、研究される個体群における多型の位置及び程度に関して各染色体末端別々にあらかじめ選択される。
【００５４】
適当な場合には、選択されるＤＮＡマーカーは、染色体特異的な独特のＤＮＡを含む、サブテロメアがある染色体の位置に戦略的に局在化される。これらの局在は、２つの主な理由から好ましい。
【００５５】
最初に、テロメア付近に局在化されているが、なおも独特な染色体特異的ＤＮＡを含むマーカーは、母親由来の更に近位で中間にあるＤＮＡを選択的に排除するのに必要とされる消化と比較して、わずかに限定されたエキソヌクレアーゼ消化が要求されるように、消化手順を容易にする。これは、一方向の消化が上述の様に保証される場合に特に有用である。
【００５６】
次に、多型性サブテロメア染色体／ＤＮＡマーカーの使用は、数的な染色体異常（例えばトリソミー）だけでなく、不均衡な構造的染色体再配列、例えば不均衡な転位の定量も可能にする。不均衡な転位は、あるサブテロメアマーカーについての遺伝子量の重複として、別のサブテロメアマーカーについての遺伝子量の欠失と一緒に、染色体の転位への関与に依存して同定され得る。更に、他の比較的一般的な染色体異常は、この方法で同定されるはずである。これらは、余分なマーカー染色体、例えば胎児ｉｓｏ １２ｐ，又はｉｓｏ １８ｐを含み、これは共に深刻な胎児の奇形と関連しており、正常な状況に対して余分な二重の遺伝子量をもたらす。
【００５７】
特別なエキソヌクレアーゼ的な手順が、余分な染色体マーカー、例えば１５ ｉｎｖ ｄｕｐの診断に必要とされ得るのは、これが１５ｐテロメアＤＮＡ配列の２つの余分な遺伝量に関与するためである。その様なテロメア配列の重複自身は、胎児の発育に関して有害ではないが、第１５染色体特異的ＤＮＡも含む、ｑ腕の近位部分に位置するマーカーは、深刻なものと考えられ得る、胎児の精神運動性の発育の遅れと関連している。
【００５８】
出生前の胎児の診断において使用されるサブテロメアマーカーの適当な選択によって、胎児の発育障害を導く染色体異常の大部分が、この方法を用いて決定されうる。サブテロメアＤＮＡマーカーのみを利用する当該方法を用いて検出され得ないわずかな染色体異常は、予想外の、更に近位の（中間部の）欠失及び重複であり、それ故にそれらの正確な位置は決定することができない。特別に改良した本方法が、言及した欠失及び重複を診断するのに必要とされ、期待されるのは、どちらかの親が保因者であるためである。
【００５９】
本発明の方法を用いて一度同定されると、胎児ＤＮＡは、例えば染色体異常、例えば異数性、ダウン症、エドワード症候群又はクラインフェルター症候群の存在あるいは他の情報、例えば胎児の性別を決定するために、出生前診断にかけられ得る。
【００６０】
適当な場合には、ＤＮＡは、例えば磁気分離法を用いて、解析前に分離される。特に、ＤＮＡは標識プライマー、例えば特異的なビオチン化プライマーを用いて増幅される。テロメアプライマーがこの時点で使用される場合、テロメア含有、すなわち胎児ＤＮＡフラグメントのみが測定され、そして標識され、全ての相当する母親由来のＤＮＡが消化の間に排除されたことが確認される。
【００６１】
前記ＤＮＡフラグメントは、例えば、ストレプトアビジンでコーティングした常磁性粒子又はビーズを用いて捕捉されうる。上清から磁気粒子を分離した後、標的ＤＮＡは粒子の溶出によって放出されうる（図４）。
【００６２】
一度分離されると、前記ＤＮＡは、特定の染色体又はＤＮＡの診断領域に特異的な標識プライマーを用いて、当該プライマーが試料中でＤＮＡを増幅する条件下で増幅されうる。従って、胎児起源であるとして同定されたＤＮＡにおけるこのプライマーの検出は、その胎児についての情報を提供する。第二プライマーが第１８，第２１又は第１３染色体、あるいはＸ染色体又はＹ染色体に特異的である場合、特定の目的に依存してそれは有用であると思われる。これらの染色体の染色体数の異常（異数性）は、最も一般的である。
【００６３】
本発明の特に好ましい態様において、ＤＮＡは母親由来の血液試料から、例えば、母親由来の血漿中の細胞から単離され、制限酵素でフラグメント化され、そしてアダプターにライゲーションされる。修飾されたフラグメントは、エキソヌクレアーゼ酵素、例えばＢａｌ３１と共に、母親由来のテロメアを完全に消化するが、幾つかの胎児テロメアＤＮＡを残すのに十分な期間インキュベートされる。テロメア含有（胎児）ＤＮＡの更なる精製は、ビオチン化テロメアプローブ又はプローブとして使用されるテロメアプライマー及びストレプトアビジン常磁性粒子（ＰＭＰ）を用いる磁気的な分離によって達成され得る（図４）。
【００６４】
単離されたテロメア含有（胎児）ＤＮＡフラグメントは次に、ＰＣＲのような方法によって、染色体特異的プライマーを用いて増幅される。その後、例えばＤＮＡシークエンサー及びＧｅｎｅｓｃａｎソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用するＯ−ＰＣＲのような蛍光法、リアルタイムＰＣＲ及びＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを用いる解析が実施される。
【００６５】
更に、特に母親由来の試料中の胎児ＤＮＡ濃度の程度に関連する、本発明の方法を用いて得ることができる情報は、出生前スクリーニング／診断並びに母体の各種状態の診断において有用であると思われる。これらは、妊娠の合併症、例えば子癇前症、予定日前の陣痛の予測、及び自己免疫疾患の後期発症を含む。
【００６６】
本発明の更なる観点に従い、母親由来のＤＮＡ含有試料中の胎児ＤＮＡを同定するためのキットであって、ＤＮＡ含有試料、ＤＮＡの末端領域を消化することができるエキソヌクレアーゼ酵素、及びＤＮＡの末端領域にみられる特異的なＤＮＡ配列を検出するための標識プライマーからＤＮＡを単離するための手段を含んで成るキットが提供される。
【００６７】
当該キットは、上述の方法を実施するために必要とされる１又は複数の追加の試薬又は商品を含んでもよい。特に、当該キットは、更に、アダプターのためのＤＮＡ上に結合部位を作り出すようにＤＮＡを切断する制限酵素を、酵素消化からＤＮＡフラグメントの切断末端を保護するのに適したアダプターと一緒に含んで成っていてもよい。
【００６８】
前記方法に依存して当該アッセイは実施され、ビオチン化プライマー及び特にビオチン化テロメアプライマー並びにストレプトアビジン常磁性粒子も含まれることがある。
【００６９】
他の可能性のあるキットの構成要素としては、１又は複数の追加の標識プライマー、例えば異なる蛍光で標識されたプライマーがあり、これは染色体の状態の診断に用いられる。
【００７０】
本発明は、添付図面に関連した例によって特に説明される。
【００７１】
例１
段階１
ＤＮＡ抽出
５ｍｌの母親由来の血液が、１つはＥＤＴＡを含んだ、２つのチューブのそれぞれに入れられた。血液試料は３０００ｇで遠心され、そして血清が、ＥＤＴＡ含有チューブ、そして何も含まないチューブから、それぞれきれいなチューブへと慎重に除去された。血漿及び血清試料は再び３０００ｇで遠心され、そして上清はきれいなチューブへと移された。
【００７２】
ＤＮＡは、製造者の推奨に従い、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｍｐ Ｂｌｏｏｄキットを用いて血漿及び血清から抽出された。
【００７３】
段階２）
アダプター付着部位を提供するための制限酵素消化
抽出されたＤＮＡは、ＮｏｔＩのような酵素により、標準的な制限酵素消化プロトコールを用いて消化される。
【００７４】
段階３）
エキソヌクレアーゼ酵素（例えばＢａｌ３１）による消化からＤＮＡフラグメントの近位末端を保護するためのＤＮＡ鋳型とアダプターのライゲーション
このアプローチは、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼを用いる一方向からのＤＮＡ欠失に関する（Ｍｕｋａｉ Ｓ．， Ｓｈｉｂａｈａｒａ Ｓ．， Ｍｏｒｉｓａｗａ Ｈ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ｎｏ．１９， １９９８）。その原理は、７ｂｐの２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド−ＤＮＡキメラアダプターがより大きな安定性を築き、そして更に立体障害に起因してヌクレアーゼの攻撃を防ぐという事実に基づいている。従って、ＤＮＡフラグメント上のＮｏｔＩ部位へのライゲーションは一方の末端のみに由来する消化を可能にする。
【００７５】
ＤＮＡとアダプターは、リガーゼ及び緩衝液と一緒に１５℃で一晩インキュベートされる。
【００７６】
段階４）
エキソヌクレアーゼ酵素、例えばＢａｌ３１によるライゲーションされたＤＮＡ鋳型とアダプターの消化
ＤＮＡ１μｇ当たり１ユニットのＢａｌ３１は、３０℃で２０分以上の期間、均一な欠失のラダー（＞１ｋｂ）を生成するために使用された。当該反応は、５０ｍＭの終濃度までＥＤＴＡを添加することによって停止した（図３）。ＤＮＡは、Ｂａｌ３１の反応から高いＮａＣｌ濃度を除去するためにエタノール沈殿された。濃度及び曝露のタイミングの変更は、各染色体数を数えるために最適化される。最適化された状況において、全ての母親由来のテロメア配列が消化され、一方、胎児テロメアＤＮＡ配列のいくつかが残る（図３ａ）。このことは、本質的に母親由来のＤＮＡフラグメントと胎児ＤＮＡフラグメントの識別を可能にする。
【００７７】
伸長された消化は、染色体特異的プライマー部位に相当するＤＮＡ配列を除去し（図３ｂ）、これは、Ｑ−ＰＣＲ後に、胎児ＤＮＡのポジティブな同定及び各染色体数を数えることを可能にする。
【００７８】
段階５）
ビオチン化テロメアプローブを用いる胎児ＤＮＡの磁気的精製
ＤＮＡフラグメントは、６５℃で１０分間ＤＮＡを加熱し、ビオチン化プライマーを添加し、そしてその溶液を室温にまで冷却することによって、溶液中でビオチン化テロメアＤＮＡプライマーとハイブリダイズされる。その後、ストレプトアビジン常磁性粒子（ＳＡ−ＰＭＰ）を０．５ｘＳＳＣで洗浄する。アニーリングしたＤＮＡフラグメントとビオチン化テロメアプライマーを加え、そして室温で１０分間インキュベートする。ビオチン化プライマーと結合したＳＡ−ＰＭＰは、磁気スタンドを用いて捕捉され、そして上清が慎重に除去される。粒子は、０．１ｘＳＳＣで４回洗浄される。テロメアポジティブな（胎児の）フラグメントは、脱イオン水中で最後のＳＡ−ＰＭＰ粒子を再懸濁することによって溶出される。
【００７９】
段階６）
染色体特異的多型性マーカーを用いるＱ−ＰＣＲ
定量的ＰＣＲは、我々の刊行物、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５２， ９−１２， １９９８に記載のような、標準的な方法を用いて実施された。
【００８０】
例２
本発明の方法を用いて解析を行うためのプロトコールを以下のスキーム１に例示する。
【００８１】
段階１
パーコールグラジエント上での血液試料の調製
血液試料はパーコールグラジエント上で調製され、そして血漿を除く。血漿細胞は、不連続パーコールグラジエントのための改良した標準的なプロトコールを用いる遠心によって回収される（例えばＶａｎ Ｗｉｊｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４６， ５， ７２９−７３１， ２０００を参照のこと）。
【００８２】
特に、それぞれ３ｍｌの４０％， ４５％及び５０％のパーコール溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）／ＰＢＳのそれぞれにつき、チューブが調製される。３ｍｌのＥＤＴＡ血液は、１５ｍｌのポリスチロールチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ， Ｒｏｈｅｒ １５ｍｌチューブ、カタログ番号６２．５５３．０４２）において３ｍｌのＰＢＳと混合される。３ｍｌの４０％パーコールは、５ｍｌのシリンジに結合したカニューレ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ， Ｆｉｌｔｅｒ Ｓｔｒａｗ，カタログ番号４１５０２０）を用いて下層として導入される。カニューレのチップは血液を通過させるチューブの底に据えられ、そしてパーコール溶液が徐々に排出される。同一のカニューレを用いて、下層での過程は４５％及び５０％のパーコールを用いてそれぞれ二回繰り返される。それぞれの場合において、カニューレのチップはチューブの底に据えられ、そしてグラジエントを乱さないように排出が慎重に行われる。
【００８３】
通常、３〜４のチューブが、試験中に各試料のためにこの方法で調製される。調製されたチューブは、続いて５００ｇで、１８〜２０℃で３０分間遠心される（遠心ブレーキを用いない）。
【００８４】
この後、当該チューブを取り出し、そして血漿（頂上）層を抽出し、そしてきれいなチューブの中に入れる。同一の試料に由来する、異なるチューブ由来の血漿は、各チューブ中に約６ｍｌの液体が存在することを保証するために一緒に添加されうる。これは、再び５００ｇで２０分間遠心され、この際にはブレーキを用いた。生じた細胞のペレットは、続いて６ｍｌのＰＢＳ中で２〜３回洗浄される。
【００８５】
段階２．
高分子量ＤＮＡの抽出
血漿細胞１を、ＰＢＶＳ中で５０μｌ２当たり２ｘ１０５個の細胞となるよう再懸濁した。等量のアガロース溶液（１．９％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ）を、１ｘ１０５個の細胞を含む細胞懸濁物に加える。５０μｌを型に分配し、そして静置する。アガロースプラグを続いて０．５Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．０， １％Ｎ−ラウリルサルコシン、２ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ中で２４〜７２時間、５０℃で処理する（しかし、Ｏ／Ｎインキュベーションは、我々の以下の適用にとって十分であることもある）。この処理は細胞を消化し、後の段階での酵素膜の貫通を可能にする。当該アガロースプラグは、続いて水の中で洗浄され、そして、酵素処理に影響を及ぼし得るあらゆる残りのプロテイナーゼＫを完全に不活性化するためにＰＭＳＦ（プロテアーゼ阻害剤）中で５０℃でインキュベートされる。
【００８６】
注意：
１．３ｍｌの血液は〜２ｘ１０３個の血漿細胞を含む。
２．１ｘ１０５個の細胞＝１μｌ ＤＮＡ
血漿ＤＮＡはフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出され、エタノール沈殿され、７０％エタノール中で二回洗浄され、そして水の中で慎重に再懸濁される。
【００８７】
段階３．
ヌクレアーゼ耐性アダプターのライゲーション
この手順は、アダプターのライゲーションが不必要である場合、アガロースプラグ中に存在するＤＮＡによって影響を受ける唯一の段階であるので省略することが出来る。Ｂａｌ３１消化とＰＣＲ反応は共にアガロースプラグによって影響を受けないであろう。当該プロトコールは、アルコール溶解性のオリゴ糖中にアガロースを溶解させ、これにより、当該ＤＮＡは、ＤＮＡを損傷することなく、又は剪断することなく更に利用しやすいものとなる。アガロースプラグは溶解され、そして等量の５０ｘバッファーが１Ｕのβ−アガラーゼと一緒に添加され、４５℃で６０分間インキュベートされる。残りのオリゴ糖及びβ−アガラーゼはその後の酵素反応を妨害しない。
【００８８】
アダプターのライゲーションのために、ＤＮＡは、ヒトゲノム内でそれぞれ６７０ｋｂ及び３１０ｋｂ毎に切断するＡｓｃＩ又はＮｏｔＩの様なレアカッターで切断されなければならない。これは、ライゲーションするためのアダプターにとって適合可能な末端を作り出し、テロメアとマーカーとの間の制限部位は、これらの酵素がこの領域間を切断しないことを保証するように検討されなければならない。
【００８９】
１０Ｕの酵素を含む１００μｌの１ｘ制限緩衝液中でアガロースプラグを平衡化し、２時間インキュベートし、そして次に水ですすぐ。
【００９０】
ホスホロチオネート連結を含む相補的なオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ消化に対する耐性のあるアダプターを作り出すためにアニーリングされる。それらは、ＤＮＡ試料を開裂するために使用される制限エンドヌクレアーゼと相補的な粘着末端も含む。これらのアダプターは、１ｘライゲーションバッファー、５Ｕリガーゼの添加によってライゲーションされ、そして３７℃で２時間いんきゅべーとされる。
【００９１】
段階４，
テロメア末端のＢａｌ３１ヌクレアーゼ消化
高分子量ＤＮＡを含むアガロースプラグは、５０Ｕの酵素（ＮＥＢＬ）を含む１ｍｌの１ｘＢａｌ３１バッファー中、氷上で３０分間平衡化される。消化は、反応液を３０℃に据え、各時点、すなわち０， ３０， ６０， ９０及び１２０分でプラグを除去し、そして１ｍｌの氷冷したＴＥ中に据えることによって達成される。Ｂａｌ３１は、氷冷した水の中でプラグを３０分間すすぐことによって除去される。Ｂａｌ３１は、ＰＣＲの加熱変性段階の間に完全に不活性化されるはずである。より長いテロメアを有する胎児ＤＮＡの識別を可能にするため、要求されるＤＮＡの長さを除去するために必要な消化時間を確立する時間が最初に採用される。
【００９２】
段階５
ＱＦ−ＰＣＲによる多型性マーカーの増幅
多型性マーカーは、標準的な技術を用いてＱＦ−ＰＣＲによって増幅される（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ， ３５２， ９−１２， １９９８； Ｐｅｒｔｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． １７７， ４， ８９９−９０６を参照のこと）。
【００９３】
Ｘ２２マーカー（テロメアから〜３００ｋｂのもの）は、この方法で増幅されうる特定のマーカーであるが、他のテロメア多型性マーカーも特定の診断目的に依存して選択され得る。例えば、ｃｈｒ１４ Ｄ１４Ｓ１４１９及びＤ１４Ｓ１４２０上の２つの高度に多型性のあるマーカーは、テロメアから〜２１０ｋｂ及び９５ｋｂに位置する。
【００９４】
例３：本発明の方法を用いる胎児トリソミー２１ダウン症の非侵襲的な出生前診断
例３Ａ
１．妊娠及び血液試料
１２ｍｌの血液が、Ｌｏｃａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの倫理的な承認を受けたインフォームドコンセントの書面に従い、１２週の妊娠期間にある妊娠女性から静脈穿刺によって２エデト酸（ＥＤＴＡ）チューブに抜き出された。
【００９５】
２．核区分及び血漿からの細胞の単離
核区分由来の有核細胞及び血漿由来のものは共に、記載通りのプロトコール（Ｇａｎｓｈｉｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， １９９９ Ｒ． −Ｄ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｆｅｔａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ， ｐｐ４０１−４１５）に従い、Ｔｒｉｐｌｅ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔを若干改良して用いて母親由来の血液から単離された。
【００９６】
１２ｍｌのＥＤＴＡ血液を１２ｍｌのリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）に添加し、そしてチューブを反転させることによって混合する。６ｍｌの血液／ＰＢＳ混合物を４つの１５ｍｌポリスチロールチューブ内でピペッテイングする。パーコール（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の３つの層が下層となり、３ｍｌの４５％、そして３ｍｌの５０％パーコールが続く。懸濁液は、続いて５００ｇで３０分間遠心される。血漿層及びリンパ球層が除去され、そしてきれいなチューブに移され、そして再び５００ｇで１０分間遠心される。細胞のペレットはＰＢＳ中で洗浄され、そして５μｌのプロテイナーゼＫ溶液（４００ｍｇ／ｌプロテイナーゼＫ、２０ｍｍｏｌ／ｌジチオスレイトール、１．７μｍｏｌ／ｌドデシル硫酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌトリスバッファー、５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム）を含むマイクロチューブに移される。
【００９７】
３．高分子量ＤＮＡの抽出
血漿細胞は、ＰＢＶＳ中で、５０μｌ当たり２ｘ１０個の細胞となるように再懸濁される。等量のアガロース溶液（１．９％ ＮｕＳｉｅｖｅ ＧＴＧ）を、１ｘ１０５個の細胞を含む細胞懸濁物に加える。５０μｌを型に分配し、そして静置する。アガロースプラグを続いて０．５Ｍ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．０， １％Ｎ−ラウリルサルコシン、２ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ中で２４〜７２時間、５０℃で処理する。当該アガロースプラグは、続いて水の中で洗浄され、そして、酵素処理に影響を及ぼし得るあらゆる残りのプロテイナーゼＫを完全に不活性化するためにＰＭＳＦ（プロテアーゼ阻害剤）中で５０℃でインキュベートされる。
４．ヌクレアーゼ耐性アダプターのライゲーション
アガロースプラグは溶解され、そして等量の５０ｘバッファーが１Ｕのβ−アガラーゼと一緒に添加され、４５℃で６０分間インキュベートされる。アガロースプラグは、１０Ｕの酵素を含む１００μｌの１ｘ制限バッファー中で平衡化され、２時間インキュベートされ、続いて水ですすがれる。
【００９８】
これらのアダプターは、続いて１ｘライゲーションバッファー、５Ｕリガーゼの添加によってライゲーションされ、そして３７℃で２時間インキュベートされる。
【００９９】
５．テロメア末端のＢａｌ３１ヌクレアーゼ消化
高分子量ＤＮＡを含むアガロースプラグは、５Ｕの酵素（ＮＥＢＬ）を含む１ｍｌの１ｘＢａｌ３１バッファー中、氷上で３０分間平衡化される。消化は、反応液を３０℃に据え、各時点、すなわち０， ３０， ６０， ９０及び１２０分でプラグを除去し、そして１ｍｌの氷冷したＴＥ中に据えることによって達成される。Ｂａｌ３１は、氷冷した水の中でプラグを３０分間すすぐことによって除去される。
【０１００】
６．ＱＦ−ＰＣＲによる多型性マーカーの増幅
マルチプレックス蛍光ＰＣＲアッセイが、Ｄ２１Ｓ１４１１及びＤ２１Ｓ１４４６のためのプライマーを用いる慣習的な技術（例えば、Ｐｅｒｔｌ ｅｔ ａｌ １９９７ Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． １７７， ８９９−９０６を参照のこと）によって適用される。各上流プライマーは、ＰＣＲ産物の視覚化及び解析を可能にする蛍光色素で標識される（５’末端）。最初の変性の後、９５℃で４８秒間、６０℃で４８秒間、そして７２℃で１分間のサイクルを２４回、続いて７２℃で１５分間の伸長を実施する。
【０１０１】
７．解析
対立遺伝子フラグメントは６％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ） ３７３ ＤＮＡシークエンサー上で、Ｇｅｎｅｓｃａｎ ６７２ソフトウェアを実行して解析される。増幅産物はサイズが決定され、そしてエレクトロフェログラム上で見られるピーク面積に基づきそれらの蛍光強度を算出する。解析は、（ａ）母親由来の血液試料のリンパ球に直接由来するＤＮＡ、（ｂ）酵素消化後の同一の細胞型に由来するＤＮＡ、及び（ｃ）酵素消化後の母親由来の試料（胎児細胞を豊富濡含むことが予想されるもの）の血漿成分中の細胞に由来するＤＮＡ、を用いて実施される。
【０１０２】
８．結果
（ａ）母親由来の血液試料のリンパ球のＤＮＡのＰＣＲ産物から得られるエレクトロフェログラムは、２つのプライマーＤ２１Ｓ１４１１及びＤ２１Ｓ１４４６のそれぞれについて、２つの等しいサイズを有するピークが発生していることを示す。この結果は正常な雌性から予想されるものである。
【０１０３】
（ｂ）２ユニットのＢａｌ３１を用いる２０分間の酵素的なエキソヌクレアーゼ消化の後、母親由来の血液試料由来のリンパ球のＤＮＡのＰＣＲ産物から得られたエレクトロフェログラムは、最も遠位のマーカーＤ２１Ｓ１４４６についてのシグナルが存在せず、一方、２つの等しいサイズのシグナルが近位のマーカーＤ２１Ｓ１４１１に関する位置で見られることを示す。
【０１０４】
このことは、酵素消化のためのこれらの条件が、母親由来のＤＮＡと胎児ＤＮＡとを識別する我々の目的にとって最適であることを示唆する。
【０１０５】
（ｃ）（ｂ）と同一の条件下での酵素消化の後の、母親由来の血漿中の細胞のＤＮＡから得られたエレクトロフェログラムは、近位マーカーＤ２１Ｓ１４１１については不明瞭なシグナルを示すが、遠位マーカーＤ２１Ｓ１４４６については３つのはっきりとしたシグナルを示す。
【０１０６】
この結果は、まず最初に、テロメアＤＮＡ配列が全体的に除去されたことを示唆する（母親由来のＤＮＡ及び胎児ＤＮＡ両方）。第二に、近位マーカーＤ２１Ｓ１４１１のＤＮＡ配列の不明瞭なシグナルは、母親由来のＤＮＡと胎児ＤＮＡの混合物によって生じるものと解される。第三に、我々は遠位マーカーＤ２１Ｓ１４４６の３つの明確なシグナル（これらのうちの１つは、母体の血液試料のリンパ球に由来するＤＮＡのエレクトロフェログラムに見られたものと同一ではない場所に位置する）は胎児のものであり、そして胎児がトリソミー２１を有する事を示していると結論づけている。
【０１０７】
９．要約
この例は、テロメアＤＮＡ及びサブテロメアＤＮＡ配列の酵素消化の後の、母親由来の血液試料のＤＮＡ解析によって第２１染色体の数を普通に数えることができ、それにより胎児のトリソミー２１ダウン症を同定することが可能であることを例示している。当該方法は、研究室に当該血液試料が到着したその日のうちに結果が得られる迅速なものである。更に、実質的な自動化が可能である。
【０１０８】
例３Ｂ
１．妊娠及び血液試料
１２ｍｌの血液が、Ｌｏｃａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの倫理的な承認を受けたインフォームドコンセントの書面に従い、１２週の妊娠期間にある妊娠女性から静脈穿刺によって２エデト酸（ＥＤＴＡ）チューブに抜き出された。
【０１０９】
２．核区分及び血漿からの細胞の単離
核区分由来の有核細胞及び血漿由来のものは共に、記載通りのプロトコール（Ｇａｎｓｈｉｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ， １９９９ Ｒ． −Ｄ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｆｅｔａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ， ｐｐ４０１−４１５）に従い、Ｔｒｉｐｌｅ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔを若干改良して用いて母体の血液から単離された。
【０１１０】
１２ｍｌのＥＤＴＡ血液を１２ｍｌのリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）に添加し、そしてチューブを反転させることによって混合する。６ｍｌの血液／ＰＢＳ混合物を４つの１５ｍｌポリスチロールチューブ内でピペッテイングする。パーコール（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の３つの層が下層となり、３ｍｌの４５％、そして３ｍｌの５０％パーコールが続く。懸濁液は、続いて５００ｇで３０分間遠心される。血漿層及びリンパ球層が除去され、そしてきれいなチューブに移され、そして再び５００ｇで１０分間遠心される。細胞のペレットはＰＢＳ中で洗浄され、そして５μｌのプロテイナーゼＫ溶液（４００ｍｇ／ｌプロテイナーゼＫ、２０ｍｍｏｌ／ｌジチオスレイトール、１．７μｍｏｌ／ｌドデシル硫酸ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌトリスバッファー、５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム）を含むマイクロチューブに移される。
【０１１１】
３．エキソヌクレアーゼ酵素による消化
ＤＮＡ１μｇ当たり１ユニットのＢａｌ３１は、３０℃で２０分以上の期間、均一な欠失のラダー（＞１ｋｂ）を生成するために使用された。当該反応は、５０ｍＭの終濃度までＥＤＴＡを添加することによって停止した。
【０１１２】
酵素消化は、胎児ＤＮＡと母親由来のＤＮＡとの間の識別を可能にするＤＮＡ配列の最適な除去に必要とされる濃度及び時間を較正するために、リンパ球のＤＮＡで最初に実施される。この場合に選択されるプライマーは、テロメアＤＮＡ配列ＴＴＡＧＧＧのためのプライマーと組み合わせられた、２１ｑ２２．３に位置するＤ２１Ｓ１４４６及びＤ２１Ｓ１４１１である（但し、Ｄ２１Ｓ１４１１はＤ２１Ｓ１４４６に対して近位に位置する）。
【０１１３】
母親由来のシグナルと胎児シグナルを識別するための至適な条件が、母親由来の血液試料（主に母親由来の細胞）のリンパ球のＤＮＡにおけるテロメア＋マーカーＤ２１Ｓ１４４６の除去のために設定された。これは、段階４及び５に記載したように評価した。母親由来の血漿（胎児細胞を豊富に含む母親由来の細胞の混合物）から単離した細胞の酵素消化は、これらの立証された最適条件のもとＢａｌ３１に曝露された。
【０１１４】
４．マルチプレックスＰＣＲ
マルチプレックス蛍光ＰＣＲアッセイが、Ｄ２１Ｓ１４１１及びＤ２１Ｓ１４４６のためのプライマーを用いる慣習的な技術（例えば、Ｐｅｒｔｌ ｅｔ ａｌ １９９７ Ａｍ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． １７７， ８９９−９０６を参照のこと）によって適用される。各上流プライマーは、ＰＣＲ産物の視覚化及び解析を可能にする蛍光色素で標識される（５’末端）。最初の変性の後、９５℃で４８秒間、６０℃で４８秒間、そして７２℃で１分間のサイクルを２４回、続いて７２℃で１５分間の伸長を実施する。
【０１１５】
５．解析
対立遺伝子フラグメントは６％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ） ３７３ ＤＮＡシークエンサー上で、Ｇｅｎｅｓｃａｎ ６７２ソフトウェアを実行して解析される。増幅産物はサイズが決定され、そしてエレクトロフェログラム上で見られるピーク面積に基づきそれらの蛍光強度を算出する。解析は、（ａ）母親由来の血液試料のリンパ球に直接由来するＤＮＡ、（ｂ）酵素消化後の同一の細胞型に由来するＤＮＡ、及び（ｃ）酵素消化後の母親由来の試料（胎児細胞を豊富に含むことが予想されるもの）の血漿成分中の細胞に由来するＤＮＡ、を用いて実施される。
【０１１６】
６．結果
（ａ）母親由来の血液試料のリンパ球のＤＮＡのＰＣＲ産物から得られるエレクトロフェログラムは、２つのプライマーＤ２１Ｓ１４１１及びＤ２１Ｓ１４４６のそれぞれについて、２つの等しいサイズを有するピークが発生していることを示す。この結果は正常な雌性から予想されるものである。
【０１１７】
（ｂ）２ユニットのＢａｌ３１を用いる２０分間の酵素的なエキソヌクレアーゼ消化の後、母性の血液試料由来のリンパ球のＤＮＡのＰＣＲ産物から得られたエレクトロフェログラムは、最も遠位のマーカーＤ２１Ｓ１４４６についてのシグナルが存在せず、一方、２つの等しいサイズのシグナルが近位のマーカーＤ２１Ｓ１４１１に関する位置で見られることを示す。
【０１１８】
このことは、酵素消化のためのこれらの条件が、母親由来のＤＮＡと胎児ＤＮＡとを識別する我々の目的にとって最適であることを示唆する。
【０１１９】
（ｃ）（ｂ）と同一の条件下での酵素消化の後の、母親由来の血漿中の細胞のＤＮＡから得られたエレクトロフェログラムは、近位マーカーＤ２１Ｓ１４１１については不明瞭なシグナルを示すが、遠位マーカーＤ２１Ｓ１４４６については３つのはっきりとしたシグナルを示す。
【０１２０】
この結果は、まず最初に、テロメアＤＮＡ配列が全体的に除去されたことを示唆する（母親由来のＤＮＡ及び胎児ＤＮＡ両方）。第二に、近位マーカーＤ２１Ｓ１４１１のＤＮＡ配列の不明瞭なシグナルは、母親由来のＤＮＡと胎児ＤＮＡの混合物によって生じるものと解される。第三に、我々は遠位マーカーＤ２１Ｓ１４４６の３つの明確なシグナル（これらのうちの１つは、母親由来の血液試料のリンパ球に由来するＤＮＡのエレクトロフェログラムに見られたものと同一ではない場所に位置する）は胎児のものであり、そして胎児がトリソミー２１を有する事を示していると結論づけている。
【０１２１】
要約
この例は、テロメアＤＮＡ及びサブテロメアＤＮＡ配列の酵素消化の後の、母親由来の血液試料のＤＮＡ解析によって第２１染色体の数を普通に数えることができ、それにより胎児のトリソミー２１ダウン症を同定することが可能であることを例示している。この例において、ＤＮＡはほとんど分解されず、そしてそれ故にアダプターの適用無しに診断的な解析を実施することが可能であった。例３Ａのように、当該方法は、研究室に当該血液試料が到着したその日のうちに結果が得られる迅速なものであり、そして実質的な自動化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、常用の方法を用いて実施された、（ａ）胎児が正常である母親由来の血液、並びに（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）胎児がトリソミー２１を有する母親由来の血液試料から抽出されたＤＮＡのＧｅｎｅｓｃａｎ解析の比較例を示す。
【図２】
図２は、Ｂａｌ３１のような、ＤＮＡフラグメントのエキソヌクレアーゼによる消化
を図式的に例示し、ここで、フラグメントは両末端で消化されるが、胎児配列（Ｆ）と比較して少ない、母親由来の配列（Ｍ）のテロメア配列が存在し、そしてそれにより胎児ＤＮＡを同定することができるが、ＭとＦの間の蛍光マーカーシグナルの差異は、これが示した通りに位置している場合には起こり得ない。
【図３】
図３は、本発明の好ましい態様に従い、アダプターを用いるＤＮＡフラグメントの一方向性のエキソヌクレアーゼ消化を図式的に例示し、ここで、最適な時間経過において、当該酵素は全てのＭテロメア配列（図３ａ）、そして更にはＭ蛍光マーカーシグナル（図３ｂ）を排除する。その様な系は、例えばＱ−ＰＣＲによるＤＮＡ増幅後に関係するＦ染色体数を数えることを可能にするＦ蛍光シグナルの選択的な保持によりＭとＦのフラグメントの識別を可能にする。
【図４】
図４は、ビオチン化テロメアプローブを用いる胎児ＤＮＡの磁気的精製を図式的に例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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