(57)【要約】本発明は、特定の態様において、単一細胞の主要本体部分の諸部分を特定の態様において含む、単一細胞のパーツを選択的に処理することが可能で、特定の態様において、単一細胞の細胞レベル以下の領域内に活性物質の長期勾配を確立することが可能な、改善された、小スケールのシステム及び方法へ向けられる。本発明は、ある態様において、生物学的細胞の表面のある部分を、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用への特別な潜在性を担う流体若しくは流体成分と選択的に接触させ、細胞の表面の異なる部分を、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用への異なる潜在性を有する別の流体若しくは流体成分と同時に接触させるための技術を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の表面に対して流体の流動流れを確立する工程であって、該流れには、細胞の第一及び第二部分とそれぞれ接触した少なくとも第一及び第二成分が含まれ、第一成分には、細胞の表面へ結合すること、細胞形質膜を通って細胞の内部へ透過すること、又はその両方をすることが可能な物質が第一濃度でそこに含まれ、該流れの第二成分は、第二濃度の該物質をその中に有する、前記工程；及び、
該物質を細胞の第一部分の表面へ結合させること、細胞の第一部分の細胞形質膜を通って該物質を透過させること、又はその両方を、細胞の第二部分でのそれとは異なる程度で行う工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
物質の第一濃度が流動流れの第一成分の少なくとも一部分で本質的に均一である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一及び第二濃度の両方が、それぞれ、流動流れの第一成分の少なくとも一部分と、流動流れの第二部分の少なくとも一部分で本質的に均一である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、確立及び結合の工程の間に基体の表面へ付く、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
流動流れにより接触される細胞の第一及び第二部分の少なくとも１つが細胞の主要本体部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
流動流れが層流により特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
確立する工程が：
第一成分を第一チャネルに含んでなる流体の流動流れを確立する工程；
第二成分を第二チャネルに含んでなる流体の流動流れを別に確立する工程；及び、
第一成分を含んでなる流体の流動流れと第二成分を含んでなる流体の流動流れを、それらが第三チャネルにおいて互いに平行して、隣接して、及び接触して流動するように一緒に集束させること、それにより第一及び第二成分を含んでなる複合した流動流れを形成させる工程
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞内に活性物質の勾配を確立する工程
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
流動流れの第一成分が、細胞の表面へ結合すること、細胞形質膜を通って細胞の内部へ透過すること、又はその両方のことが可能な物質を第一部分へ供給し、そして流動流れの第二成分が、細胞の表面へ結合すること、細胞形質膜を通って細胞の内部へ透過すること、又はその両方のことが可能な物質を細胞の第二部分から除去する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
流れの第二成分が、細胞の表面へ結合すること、細胞形質膜を通って細胞の内部へ透過すること、又はその両方のことが可能な物質を本質的に含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞内に確立される活性物質の勾配が、第一濃度の活性物質を有する、細胞の外部の第一部分の少なくとも一部分に近接した、細胞内の第一領域の存在と、第二濃度の活性物質を有する、細胞の外部の第二部分の少なくとも一部分に近接した、細胞内の第二領域の存在により特徴付けられ、活性物質の第一濃度は、細胞内の勾配の確立の開始から約５分を超える時点で活性物質の第二濃度からは少なくとも約５％異なる、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
細胞内に確立される勾配が、本質的に定常状態の勾配である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞内に確立される勾配が、細胞内で自由に拡散可能である活性物質の勾配である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
細胞の表面へ結合すること、細胞形質膜を通って細胞の内部へ透過すること、又はその両方のことが可能な物質と活性物質が同一の物質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
第一及び第二領域のそれぞれについて、細胞内にある活性物質の濃度の空間分布を示す少なくとも１つのパラメーターを検出する工程
をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
細胞の形質膜の活性物質に対する相対透過率の測定値を、少なくとも１つの測定されるパラメーターから決定する工程
をさらに含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
選択された場所での細胞の相対厚さの測定値を、少なくとも１つの測定されるパラメーターから決定する工程
をさらに含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
活性物質が受動的に細胞形質膜を通って透過する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
活性物質が能動輸送プロセスにより細胞形質膜を通って透過する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
活性物質が、細胞の細胞骨格を壊すか又は安定化させることが可能な物質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
活性物質が、細胞の細胞レベル以下のオルガネラに局在化することが可能な物質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
細胞レベル以下のオルガネラがミトコンドリアである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
活性物質が抗癌薬である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
活性物質がカルシウムイオンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
物質が、結合する工程の間に、細胞の表面にある選択された型の受容体へ結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
選択された型の受容体へ結合する工程に続いて、物質が細胞の内部へエンドサイトーシスされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
選択された型の受容体への物質の結合が、細胞内で生化学的又は生物物理的な効果を引き起こすシグナルとして作用する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
確立する工程の間に確立される流動流れに、細胞の第一、第二、及び第三部分とそれぞれ接触する第一、第二、及び第三成分が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
流動流れの第一及び第二成分が、互いに隣接してその間に境界を画定し、
生物物理的又は生化学的な相互作用を、該境界に近接した細胞の部分で、該境界に近接しない細胞の部分でのそれとは異なる程度に、選択的に行う工程
をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な物質を含有する第一流動流体を、細胞の外部の第一部分へ選択的に提供する工程；
前記物質を細胞の外部の第二部分から除去する第二流動流体を、細胞の外部の第二部分へ選択的に提供する工程；及び、それにより
細胞内に活性物質の勾配を確立する工程
を含んでなる方法。
【請求項３１】
確立する工程の間に、活性物質の勾配が、第一濃度の活性物質を有する、細胞の外部の第一部分の少なくとも一部分に近接した、細胞内の第一領域の存在と、第二濃度の活性物質を有する、細胞の外部の第二部分の少なくとも一部分に近接した、細胞内の第二領域の存在により特徴付けられ、活性物質の第一濃度は、提供する諸工程の開始から約５分を超える時点で活性物質の第二濃度からは少なくとも約５％異なる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞内に確立される勾配が、本質的に定常状態の勾配である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞内に確立される勾配が、細胞内で自由に拡散可能である活性物質の勾配である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
第一流動流体に含まれる、細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な物質と活性物質が同一である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な物質の濃度が第一流動流体の少なくとも一部分で本質的に均一であり、細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な物質の濃度が第二流動流体の少なくとも一部分で本質的に均一である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な物質を含有する第一流体へ、細胞の外部の第一部分を選択的に曝露する工程であって、細胞の外部の第一部分は、細胞の主要本体の一部分を含んでなる、前記工程；
前記物質を細胞の外部の第二部分から除去する第二流体へ、細胞の外部の第二部分を選択的に曝露する工程；及び、それにより
第一濃度の活性物質を有する、細胞の外部の第一部分の少なくとも一部分に近接した、細胞内の第一領域の存在と、第二濃度の活性物質を有する、細胞の外部の第二部分の少なくとも一部分に近接した細胞内の第二領域の存在により特徴付けられ、活性物質の第一濃度は、曝露する諸工程の開始から約５分を超える時点で活性物質の第二濃度からは少なくとも約５％異なる、活性物質の勾配を細胞内に確立する工程
を含んでなる方法。
【請求項３７】
第一及び第二流体の少なくとも１つが流動している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第一及び第二流体の両方が流動している、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞内に確立される勾配が、本質的に定常状態の勾配である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
第一流体に含まれる物質が細胞の形質膜を通って透過することが可能である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
第一流体に含まれる物質と活性物質が同一である、請求項４０に記載の方法
【請求項４２】
細胞内に確立される勾配が、細胞内で自由に拡散可能である活性物質の勾配である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
第一濃度の活性物質を有する、細胞内の第一領域の存在と、第二濃度の活性物質を有する、細胞内の第二領域の存在により特徴付けられる、自由に拡散可能な活性物質の勾配を細胞内に確立する工程を含んでなる方法であって、活性物質の第一濃度は、勾配の確立の開始から約５分を超える時点で活性物質の第二濃度からは少なくとも約５％異なる、前記方法。
【請求項４４】
選択された細胞型の細胞内に第一領域を創出する工程であって、第一領域は、自由に拡散可能な活性物質を含有し、第一領域は、細胞の主要本体の一部分を含んでなる、前記工程；
自由に拡散可能な活性物質を本質的に含まない第二領域を細胞内に創出する工程；及び、
第一及び第二領域のそれぞれについて、細胞型に対する活性物質での処理の効力を決定する、活性物質に対する細胞の応答を示す少なくとも１つのパラメーターを検出する工程
を含んでなる方法。
【請求項４５】
創出する工程が：
その少なくとも一部分が細胞内の第一領域に近接している、細胞の外部の第一部分を、細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な物質を含有する第一流体へ選択的に曝露する工程；及び
その少なくとも一部分が細胞内の第二領域に近接している、細胞の外部の第二部分を、細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な前記物質を細胞の外部の第二部分から除去する第二流体へ選択的に曝露する工程
を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第一及び第二流体が流動している、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
選択された細胞型の細胞膜の外部の第一領域へ物質が結合することを可能にする工程；
結合した物質を本質的に含まない、細胞膜の外部の第二領域を創出する工程；及び、
第一及び第二領域のそれぞれについて、細胞型に対する物質での処理の効力を決定する、結合した物質に対する細胞の応答を示す少なくとも１つのパラメーターを検出する工程
を含んでなる方法。
【請求項４８】
可能にする工程と創出する工程が：
細胞の外部の第一領域を、物質を含有する第一流体へ選択的に曝露する工程；及び、
細胞の外部の第二領域を、物質を含有しない第二流体へ選択的に曝露する工程を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
第一及び第二流体が流動している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１つの細胞が、その表面上に位置する基体；及び、
該表面と接触した流動流体流れを含んでなる物品であって、該流れには、細胞の第一及び第二部分とそれぞれ接触した第一及び第二成分が少なくとも含まれ、第一成分には、細胞の外部表面へ結合すること、細胞膜を通って細胞の内部へ透過すること、又はその両方をすることが可能な物質が第一の本質的に均一な濃度でそこに含まれ、該流れの第二成分は、第二の本質的に均一な濃度の該物質をその中に有する、前記物品。
【請求項５１】
さらに：
流動流体流れを含有するように構築されて配置された少なくとも１つの微小流体フローチャネルを包含する微小流体ネットワーク
を含んでなる、請求項５０に記載の物品。
【請求項５２】
微小流体ネットワークが少なくとも部分的にエラストマーから構成される、請求項５１に記載の物品。
【請求項５３】
エラストマーがポリ（ジメチルシロキサン）を含む、請求項５２に記載の物品。
【請求項５４】
形質膜を通って透過することが可能である物質を、該物質の細胞内での最大濃度以上の濃度でその中に含有する第一流動流体を、細胞の形質膜の第一部分へ選択的に提供する工程；及び、
形質膜を通って透過することが可能である物質を、該物質の細胞内での最小濃度以下の濃度でその中に含有する第二流動流体を、細胞の形質膜の第二部分へ選択的に提供する工程
を含んでなる方法。
【請求項５５】
細胞の表面に対して流体の流動流れを確立する工程であって、該流れには、細胞の第一、第二、及び第三部分と接触した少なくとも第一、第二、及び第三成分がそれぞれ含まれ、該流れの第二成分は、該流れの第一成分と該流れの第三成分の間に挿入され、該流れの第一成分と該流れの第三成分は、それぞれ、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用について、該流れの第二成分とは異なる潜在性を担う、前記工程；及び、
細胞の第一及び第三部分で、生物物理的又は生化学的な相互作用を、細胞の第二部分でとは異なる程度で行う工程
を含んでなる方法。
【請求項５６】
流れの第一成分が、生物物理的又は生化学的な相互作用について、流れの第三成分とは異なる潜在性を担う、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
流動流れの第一、第二、及び第三成分のそれぞれにその少なくとも一部分が含まれ、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用の潜在性はその部分全体で本質的に均一である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
流動流れの成分の、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用の潜在性が、成分内の物質の濃度に比例する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
物質が細胞の表面と化学的に反応する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
物質が細胞の表面に付いた分子を分解する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
物質が細胞の表面へ結合することが可能である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
物質が細胞の形質膜を通って細胞の内部へ透過することが可能である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
第一成分内の物質が、第二成分内の物質と第三成分内の物質とは異なり、第二成分内の物質が、第三成分内の物質とは異なる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
細胞の第一、第二、及び第三部分のそれぞれについて、生物物理的又は生化学的相互作用に対する細胞の応答を示す少なくとも１つのパラメーターを、細胞の第一、第二、第三部分で検出する工程
をさらに含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
流体の流動流れを確立する工程であって、該流れには、互いに隣接してその間に境界を画定する第一及び第二成分が少なくとも含まれる、前記工程；及び
生物物理的又は生化学的な相互作用を、該境界に近接した細胞の第一部分で、細胞の第二部分でとは異なる程度に、選択的に行う工程
を含んでなる方法。
【請求項６６】
第一及び第二成分に、第一及び第二反応体がそれぞれ含まれる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
化学反応が境界で起こることを可能にする工程をさらに含んでなり、化学反応は、細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な生成物を生成する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
化学反応により生成される生成物が一酸化窒素を含む、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
この非仮出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、本明細書に援用される、係属中の米国仮出願第６０／２２３，１５７号、２０００年９月１８日提出の優先権を主張する。
【０００２】
政府支援の陳述
本出願は、ＮＩＨ研究奨励金ＧＭ３０３６７号；ＮＳＦ研究奨励金ＥＣＳ−９７２９４０５号；ＯＮＲ研究奨励金Ｎ６５２３６−０７−１−５８１４号；ＡＦＯＳＲ／ＳＰＡＷＡＲ　Ｎ６６００１−９８−１−８９１５により支援された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、個々の生物学的細胞の選択領域を選択的に処理するためのシステム及び方法に概して関し、より特定すると、そのような処理に層流チャネルシステムを利用するシステム及び技術に関する。
【０００４】
背景技術
複雑な細胞の行動、例えば、有糸分裂、増殖、運動、代謝、分化、アポトーシスなどは、別々の微小ドメインで起こるプロセスの統合を反映する。そのような行動の研究には、試薬を細胞へ及び／又は細胞の中へ細胞レベル以下の解像度でデリバリーするための方法が必要とされる。細胞の微小操作に今日使用されている現在利用可能な技術、例えば、マイクロインジェクション、機械若しくは光学システムを使用する操作、などは、事例によっては細胞レベル以下の解像度を提供するが、様々な制限を蒙るものである。
【０００５】
例えば、光学ピンセットの使用のような微小操作技術（Ａｓｈｋｉｎ， Ａ． ａｎｄ Ｄｚｉｅｄｚｉｃ， Ｊ． Ｍ．，「赤外レーザートラップを使用する内部細胞操作」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ． ８６， ７９１４−７９１８ （１９８９））は、限定された細胞レベル以下の空間解像度を提供し得るが、そのような技術は、その分子特異性において限定されている。マイクロインジェクション技術は分子特異性を提供し得るが、それは、細胞内での低分子の速い拡散のために空間の制御を欠くものである。さらに、マイクロインジェクションのような技術はまた、細胞の内部へ試薬を提供するために、細胞形質膜の物理的な破壊を必要とする。
【０００６】
多成分の層流流れを利用する微小流体システムは、微小流体センサーシステムを創出するために利用されてきた。そのような微小流体センサーシステムは、例えば、Ｗｅｉｇｌ， Ｂ． Ｈ． ａｎｄ Ｙａｇｅｒ， Ｐ．，「微小流体拡散に基づいた分離及び検出」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３， ３４６−３４７ （１９９９） に記載されている。Ｋｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，「多相層流パターニングを使用する、毛管内の微小製造」Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２８５ （１９９９） は、毛管の中で微小構造体を製作するための層流をベースとした微小流体システムの使用を記載する。Ｔａｋａｙａｍａ， ｅｔ ａｌ．，「多層流体フローと毛管ネットワークを使用する細胞とその環境のパターニング」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ｏｆ Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ． ９６ （１９９９） は、細胞の基体上での空間パターニングを促進し、基体へ付いた細胞へ選択された流体環境を提供するために、同様の層流をベースとした微小流体ネットワークを使用することを記載する。
【０００７】
層流が起こるのは、ある特徴（低レイノルズ数）を有する２つ以上の流れが、やはり低レイノルズ数により特徴付けられる単一の多成分流れの中へ合流し、その諸成分が乱れた混合を伴わずに互いに平行して流れるようにされる場合である。液体の小さな毛管中でのフローは、しばしば層状である。層流とレイノルズ数の定義についての考察には、流体力学の技術分野に関連した多数の学術論文と論説が読者の参考になる。例えば、いずれも本明細書に援用される、Ｋｏｖａｃｓ， Ｇ． Ｔ． Ａ．， 「マイクロマシーン化変換機の論文集」ＷＣＢ／マクグローヒル、ボストン（１９９８）；Ｂｒｏｄｙ， Ｊ． Ｐ．， Ｙａｇｅｒ， Ｐ．， Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｒ． Ｅ． ａｎｄ Ａｕｓｔｉｎ， Ｒ． Ｈ．，「低レイノルズ数でのバイオテクノロジー」Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， ７１， ３４３０−３４４１ （１９９６） ；Ｖｏｇｅｌ， Ｓ．， 「移動流体中の生命」、プリンストン大学、プリンストン（１９９４）；及び、Ｗｅｉｇｌ， Ｂ． Ｈ． ａｎｄ Ｙａｇｅｒ， Ｐ．， 「微小流体拡散に基づいた分離及び検出」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３， ３４６−３４７ （１９９９） を参照されたい。
【０００８】
分析化学の技術は、層流を利用して、流体流れの互いに対する位置決めを制御してきた。米国特許第５，７１６，８５２号（Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）は、サンプル流れ中の分析物の存在を検出する、及び／又はその存在を測定するためのチャネル−細胞システムを包含する化学センサーを記載する。このシステムには、層流チャネルと、この層流チャネルの中へ表示流れと試料流れをそれぞれもたらすための、この層流チャネルと流体連結した２つの入口が含まれる。表示流れには、接触時に分析粒子の存在を検出するための表示物質が含まれる。層流チャネルは、これらの流れの層流を可能にするほど十分に小さい深さと、分析物の粒子が表示流れの中へ拡散して検出域を形成するのに十分な長さを有する。
【０００９】
米国特許第４，９０２，６２９号（Ｍｅｓｅｒｏｌ ｅｔ ａｌ．）は、サンプル中の分析物と検査試薬系との反応を促進するための装置の記載において層流を論じる。このサンプルと試験試薬系の少なくとも一方は液体であり、リザーバ中に置かれ、他方は、リザーバ中へのエントリーへの大きさにした毛管の中に置かれる。この毛管がリザーバ中へエントリーすると、毛管引力により、リザーバから毛管へ液体が吸引され、分析物と検査試薬系が接触し、反応を促進する。
【００１０】
多様な参考文献が、多様な目的のための少量流体フローについて記載する。米国特許第５，２２２，８０８号（Ｓｕｇａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）は、密接にフィットして全体量をしめる混合棒により負わされる設計の束縛を回避しながらも毛管スペース内で混合が起こることを可能にする毛管混合装置について記載する。混合は、チャンバ内で、磁気粒子又は磁気誘導粒子を移動磁場へ曝露することによって促進される。
【００１１】
米国特許第５，３００，７７９号（Ｈｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．）は、検出可能シグナルを提供するシステムに含まれるチャンバ、毛管、及び、試薬を包含する毛管フロー装置について記載する。この装置は、典型的には、サンプルを内部チャンバへ吸引するための毛管力の使用を必要とする。システム中にある分析物の存在に相関して、検出可能な結果が生じる。
【００１２】
Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． により１９９６年３月１５日に公開された、国際特許公報ＷＯ９７／３３７３７号は、毛管流体フローを包含する、小チャネルを通る流体フローによる表面の修飾について記載する。多様な化学、生化学、及び物理的な反応及び蒸着が記載される。
【００１３】
単一細胞を選択的に処理するか又は生物学的細胞の内部へ活性物質を供給するために利用される典型的な先行技術は、特に低分子（例えば、約６００未満の分子量で、細胞内で約１０−６ｃｍ２／ｓより大きい拡散係数を有するもの）の長期細胞内勾配を創出することができない。マイクロインジェクション試験と光脱色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）試験は、そのような低分子が、基体に付いた典型的な哺乳動物細胞（例えば、約１３０μｍの最大広がり面積を有する、付着した哺乳動物細胞）の細胞質又は筋形質の全体に数秒以内に拡散し、約２〜約５分のうちには（それへ結合すると見かけの拡散係数を減少させる性質がある固定化細胞成分への分子の可逆的な結合がいくらか存在しても）、分子の細胞内分布が平衡分布の９５％に達する（即ち、細胞の内部には、細胞の他の領域とは異なる分子の濃度を有する領域が約５％以下しか存在しない）ことを示した（例えば、Ｍａｓｔｒｏ， Ａ． Ｍ．， Ｂａｂｉｃｈ， Ｍ． Ａ．， Ｔａｙｌｏｒ， Ｗ． Ｄ．， ａｎｄ Ｋｅｉｔｈ， Ａ． Ｄ．， 「哺乳動物細胞の細胞質中での低分子の拡散」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ． ８１， ３４１４−３４１８ （１９８４）；及び、Ｂｌａｔｔｅｒ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｗｉｅｒ， Ｗ． Ｇ．， 「蛍光カルシウム指示薬、ｉｎｄｏ−１及びｆｕｒａ−２の細胞内拡散、結合、及びコンパートメント化」Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， Ｖｏｌ． ５８， １４９１−１４９９ （１９９０） を参照されたい）。このように、そのような方法は、そのような分子の長期間を有する細胞内勾配を創出するにはあまり適していない。
【００１４】
Ｂｒａｄｋｅ ａｎｄ Ｄｏｔｔｉ， 「軸索形成における局所アクチン不安定性の役割」Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２８３， １９９９ は、ニューロンの軸索の領域を細胞骨格破壊物質で選択的に処理するマイクロピペッティング技術について記載する。記載の技術は、選択的に位置づけられたマイクロピペットを利用して、細胞骨格破壊物質を含有する液体のフローを方向付け、細胞の主要本体部分から離れて広がる軸索の部分にそれが当たるようにする。この技術を使用することによって、流体が当たる軸索の領域にあるアクチン細胞骨格は、選択的に解重合され得る。しかしながら、記載の技術は、細胞の一部分の上にしか流動流体を創出することができず、細胞の残りは静止流体に浸かったままである。また、マイクロピペット処理された流体には、細胞周囲の静止流体と対流混合を受ける傾向があり、この技術を、細胞の主要本体部分のパーツを選択的に処理するには潜在的にあまり適さないものにする。
【００１５】
上記と他の参考文献は、表面の化学的、生化学的、及び物理的な修飾、分析的な検出、及び単一細胞の所望される物質での処理に有用な技術を記載するが、単一細胞の主要本体部分の諸部分を含む、単一細胞のパーツを選択的に処理することが可能で、単一細胞の細胞レベル以下の領域内に活性物質の長期勾配を確立することが可能な、改善された小スケールのシステム及び方法へのニーズが存在する。
【００１６】
発明の要約
本発明は、特定の態様において、単一細胞の主要本体部分の諸部分を特定の態様において含む、単一細胞のパーツを選択的に処理することが可能で、特定の態様において、単一細胞の細胞レベル以下の領域内に活性物質の長期勾配を確立することが可能な、改善された、小スケールのシステム及び方法へ向けられる。本発明は、ある態様において、生物学的細胞の表面のある部分を、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用への特別な潜在性を担う流体若しくは流体成分と選択的に接触させ、細胞の表面の異なる部分を、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用への異なる潜在性を有する別の流体若しくは流体成分と同時に接触させる技術を提供する。
【００１７】
１つの側面において、ある方法が開示され、該方法は、細胞の表面に対して流体の流動流れを確立する工程を含んでなり、該流れには、細胞の第一及び第二部分と接触した少なくとも第一及び第二成分がそれぞれ含まれる。該流れの第一成分には、細胞の表面へ結合すること、細胞形質膜を通って細胞の内部へ透過すること、又はその両方をすることが可能な物質が第一濃度でそこに含まれる。該流れの第二成分は、第二濃度の該物質をその中に有する。該方法は、さらに、該物質を細胞の第一部分の表面へ結合させること、細胞の第一部分の細胞形質膜を通って該物質を透過させること、又はその両方を、細胞の第二部分でのそれとは異なる程度で行う工程を含む。
【００１８】
別の態様において、ある方法が開示され、該方法は、細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な物質を含有する第一流動流体を、細胞の外部の第一部分へ選択的に提供する工程を含んでなる。該方法は、さらに、前記物質を細胞の外部の第二部分から除去する第二流動流体を、細胞の外部の第二部分へ選択的に提供する工程、それにより、活性物質の勾配を細胞内に確立する工程を含む。
【００１９】
別の態様において、ある方法が開示され、該方法は、細胞内で生化学的又は生物物理的な相互作用をもたらすことが可能な物質を含有する第一流体へ、細胞の外部の第一部分を選択的に曝露する工程（細胞の外部の第一部分は、細胞の主要本体の一部分を含んでなる）、及び前記物質を細胞の外部の第二部分から除去する第二流体へ、細胞の外部の第二部分を選択的に曝露する工程、それにより、活性物質の勾配を細胞内に確立する工程を含んでなる。該勾配は、第一濃度の活性物質を有する、細胞の外部の第一部分の少なくとも一部分に近接した、細胞内の第一領域の存在と、第二濃度の活性物質を有する、細胞の外部の第二部分の少なくとも一部分に近接した、細胞内の第二領域の存在により特徴付けられ、活性物質の第一濃度は、細胞がはじめて第一及び第二流体へ曝露されてから約５分を超える時点で、活性物質の第二濃度からは少なくとも約５％異なる。
【００２０】
さらに別の態様において、ある方法が開示され、該方法は、第一濃度の活性物質を有する、細胞内の第一領域の存在と、第二濃度の活性物質を有する、細胞内の第二領域の存在により特徴付けられる、自由に拡散可能な活性物質の勾配を細胞内に確立する工程を含んでなり、活性物質の第一濃度は、勾配の確立の開始から約５分を超える時点で、活性物質の第二濃度からは少なくとも約５％異なる。
【００２１】
さらに別の態様において、ある方法が開示され、該方法は、選択された細胞型の細胞内に第一領域を創出する工程を含んでなり、第一領域は、自由に拡散可能な活性物質を含有し、第一領域は、細胞の主要本体の一部分を含んでなる。該方法は、さらに、自由に拡散可能な活性物質を本質的に含まない第二領域を細胞内に創出する工程を含む。該方法はまた、第一及び第二領域のそれぞれについて、細胞型に対する活性物質での処理の効力を決定する、活性物質に対する細胞の応答を示す少なくとも１つのパラメーターを検出する工程を含む。
【００２２】
別の態様において、ある方法が開示され、該方法は、選択された細胞型の細胞膜の外部の第一領域へ物質が結合することを可能にする工程、及び、結合した物質を本質的に含まない、細胞膜の外部の第二領域を創出する工程を含んでなる。該方法はまた、第一及び第二領域のそれぞれについて、細胞型に対する物質での処理の効力を決定する、結合した物質に対する細胞の応答を示す少なくとも１つのパラメーターを検出する工程を含む。
【００２３】
さらに別の態様において、ある方法が開示され、該方法は、形質膜を通って透過することが可能である物質を、該物質の細胞内での最大濃度以上の濃度でその中に含有する第一フロー流体を、細胞の形質膜の第一部分へ選択的に提供する工程、及び形質膜を通って透過することが可能である物質を、該物質の細胞内での最小濃度以下の濃度でその中に含有する第二流動流体を、細胞の形質膜の第二部分へ選択的に提供する工程を含んでなる。
【００２４】
別の態様において、ある方法が開示され、該方法は、細胞の表面に対して流体の流動流れを確立する工程を含んでなり、該流れには、細胞の第一、第二、及び第三部分と接触した少なくとも第一、第二、及び第三成分がそれぞれ含まれ、該流れの第二成分は、該流れの第一成分と該流れの第三成分の間に挿入される。該流れの第一成分と該流れの第三成分は、それぞれ、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用について、該流れの第二成分とは異なる潜在性を担う。該方法は、さらに、細胞の第一及び第三部分で、生物物理的又は生化学的な相互作用を、細胞の第二部分でとは異なる程度で行う工程を含む。
【００２５】
さらに別の態様において、ある方法が開示され、該方法は、流体の流動流れを確立する工程を含んでなり、該流れには、互いに隣接してその間に境界を画定する第一及び第二成分が少なくとも含まれる。該方法には、さらに、生物物理的又は生化学的な相互作用を、該境界に近接した細胞の第一部分で、細胞の第二部分でとは異なる程度に、選択的に行う工程が含まれる。
【００２６】
別の側面において、ある物品が開示される。該物品は、少なくとも１つの細胞がその表面上に位置する基体と、該表面と接触した流動流体の流れを含む。該流れには、細胞の第一及び第二部分とそれぞれ接触した第一及び第二成分が少なくとも含まれる。該流れの第一成分には、細胞の外部表面へ結合すること、細胞膜を通って細胞の内部へ透過すること、又はその両方をすることが可能な物質が第一の本質的に均一な濃度でそこに含まれる。該流れの第二成分は、第二の本質的に均一な濃度の該物質をその中に有する。
【００２７】
本発明の他の利点、新規な特徴、及び目的は、概略的であって、正しい尺度で描くことが意図されていない付帯の図面とともに考慮される、以下の本発明の詳細な説明から明らかになるだろう。図では、様々な図に例示されるそれぞれ同一であるか又はほとんど同一である成分が単一の数により表される。明確化の目的のために、どの図でも、あらゆる成分に数字が付されるわけではないし、当業者が本発明を理解するのに例示が必要でない場合に示される、本発明のそれぞれの態様のどの成分にも数字が付されるわけではない。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、生物学的細胞の表面のある部分を、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用への特別な潜在性を担う流体若しくは流体成分と選択的に接触させ、そして同時に、細胞の表面の異なる部分を、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用への異なる潜在性を有する別の流体若しくは流体成分と接触させるための技術へ向けられる。上記のように、２つの流体成分と単一細胞を接触させることだけでなく、複数のそのような流体成分、例えば、３、４、５、又はそれより多いそのような流体成分と細胞を接触させることが可能であることが理解されるべきであり、そのことが以下により詳しく記載される。
【００２９】
細胞内部のある領域若しくは部分、又は細胞の表面で、又はその内側で、別の領域若しくは部分とは異なる程度で起こる生物物理的又は生化学的な相互作用は、少なくとも５％の差異、１０％の差異、２０％、３０％、４０％の差異、又は１００％の差異までの他の比率の差異で起こり得る。
【００３０】
好ましい態様において、上記のように、細胞の一部分と接触する流体若しくは流体成分の少なくとも１つが流体の流動流れであり、最も好ましい態様において、細胞と接触した流体若しくは流体成分のそれぞれが流動流れとして配置される。特に好ましい態様においては、細胞の表面に対して流体の流動流れを確立することによって、細胞が流体の多数の成分へ選択的に曝露され、ここで流動流れには、細胞の第一及び第二部分とそれぞれ接触した、少なくとも第一及び第二成分が含まれ、そしてある態様において、第一及び第二より多い成分が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される「流体」は、液体、気体、及び／又は臨界超過の状態にある本質的に任意の流動材料を意味する。典型的には、流体が生物学的細胞の部分に接触している態様において、流体は、細胞と生理学的に適合する水性の液体、例えば、生理学的な媒体若しくは緩衝液を含む。本明細書で使用される流体の「流れ」は、連続した、物理的に分離していない、湿った断面を有する、流動する流体（即ち、互いに隣接も接触もしない２つ以上の分離した流れとは異なるような、単一の連続した流れとして配置される）を意味する。以下の図１〜３に関連してより詳しく記載される、特に好ましい態様においては、流体の流動流れが、少なくとも１つの細胞、及び、典型的には複数の細胞がその上に付いた、少なくとも１つの表面を有する微小流体フローのシステム若しくはネットワークの導管内に含まれる（例えば、図１Ｃ及び３Ｂを参照されたい）。
【００３２】
平行して、隣接して、そして互いに接触して流れる少なくとも２つのこうした流れに関連して使用される、流体又は流動流体流れの、又は、同等的には、「流体流れ」、又は、同様に、細胞の一部分と接触している流体の物理的に連続した本体の特有の領域を記載する関連で使用される、「第一流体」、「第二流体」などの「成分」は、細胞表面と接触している流体の別の成分の類似したバルク特性とは異なり、それに関して非平衡である、少なくとも１つのバルク特性により特徴付けられる流体若しくは流体流れの領域を意味する。「バルク特性」は、流動流れのフローの方法に対して垂直に切り取った、成分の断面での特殊な特性の平均値として決定される。該特性は、上記のように、細胞との生物物理的又は生化学的な相互作用への潜在性を担うことが可能である、どんな特性でもよい。該特性は、例えば、特殊な溶媒、及び／又は溶けた溶質／物質の存在又は不在；溶質／物質の濃度；温度；速度、などのような化学的及び／又は物理的特性であり得る。
【００３３】
「隣接した」成分、流体、又は流れとは、互いの隣りに位置するか、又は互いに接触したものである。そのような隣接した成分は、典型的には、少なくとも１つの特性の空間分布の不連続領域により特徴付けられ、不連続領域は、成分の間に「界面」又は「境界」を画定する。一例として、流体流れは、第一成分の断面全体では本質的に均一である、第一バルク濃度の物質を有する第一成分と、第二成分の断面内では本質的に等しく、又は均一に分布した第二バルク濃度の物質を有する、隣接した第二成分とを有する可能性があり、この成分間の界面／境界は、この隣接した成分間の拡散混合により引き起こされる物質の勾配により特徴付けられる。
【００３４】
一般に、そして以下により詳しく論じられるように、好ましい態様において、細胞表面と接触した流体流れの成分間の拡散する境界若しくは界面は、細胞表面と接触した流体流れの成分のバルク特性の間に可能な限り鮮明な転移を提供するように、断面積において最小化される。
【００３５】
特に好ましい態様において、流体の流動流れの成分は、層流集束により、互いに関連して配置される。層流を促進する技術は知られている。いくつかの既知の技術は、平行して並んでいる、接触した多数の流動流れ／流動流れの成分を創出することを伴う。その成分は、乱れた混合がないが、最終的には、拡散により成分間の界面で混合され、分析検出が可能になる。本発明のある好ましい態様は、層流を利用して、単一細胞の表面の選択部分の上を流動し、そのような部分を通して乱れた混合がない多成分の流体流れを創出する。そのような層流の流れでは、混合が起こるのは、流体流れの成分の界面での拡散によるだけである。
【００３６】
本発明の技術は、流れの乱れた混合を防止し、その中で層流を維持するためにサイズ取りされて配置される、多種多様な形状及び面積のチャネル内で流体流れを流動させることによって行うことが可能である。流体流れの層流を創出するためのそのような多種多様の技術が知られていて、それには、本発明に関連して有用なもののような、多成分層流の流れを創出するための微小流体システムの使用が含まれる。したがって、こうしたシステムについて本明細書でもっぱら詳しく論じることはないであろう。そうしたシステムと、そのようなシステムで多層流の流れを確立して維持するための技術については、例えば、Ｋｏｖａｃｓ， Ｇ． Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９８９；Ｂｒｏｄｙ， Ｊ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９６；Ｖｏｇｅｌ， Ｓ．， １９９４；及び Ｗｅｉｇｌ， Ｂ． Ｈ．， ｅｔ ａｌ． １９９９（それぞれ、すでに本明細書に援用された）、並びに、Ｋａｍｈｏｌｚ， Ａ． Ｅ．， Ｗｅｉｇｌ， Ｂ． Ｈ．， Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ， Ｂ． Ａ． ａｎｄ Ｙａｇｅｒ， Ｐ．，「微小流体チャネルにおける分子相互作用の定量分析：Ｔ−センサー」Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ７１ （１９９９） ；及び Ｔａｋａｙａｍａ， Ｓ．， ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｊ． Ｃ．， Ｏｓｔｕｎｉ， Ｅ．， Ｌｉａｎｇ， Ｍ． Ｎ．， Ｋｅｎｉｓ， Ｐ． Ｊ． Ａ．， Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ， Ｒ． Ｆ．， ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｇ． Ｍ．， 「毛管ネットワークにおいて多層流体フローとを使用する細胞とその環境のパターニング」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ． ９６ （１９９９）に詳しく記載され、それぞれ本明細書に援用される。当業者は、本開示のリーディングを読めば、無用な実験をせずとも、本発明の技術を行うために、多成分層流の流れを提供するシステムを容易に組み立てることが可能であろう。
【００３７】
特定の好ましい態様において、細胞との生物物理的又は生化学的相互作用の潜在性を創出する流体流れ成分のバルク特性は、細胞の表面と接触した流体内の物質の濃度であって、該物質は、細胞内で、及び／又は細胞の表面上で、生物物理的及び／又は生化学的相互作用を引き起こすことが可能である。例えば、１つの態様において、該物質は、細胞の表面へ結合する。こうした態様において、該物質は、例えば、リガンド、ハプテン、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、などであり得る。こうした物質は、細胞の表面の成分へ選択的に結合することが可能であり、ある態様においては、引き続きエンドサイトーシスされるか、又は他のやり方で細胞の内部へ輸送されることが可能であるか、又は、他の態様においては、膜貫通シグナル伝達、受容体凝集、又は他の既知の現象により細胞の生理学／機能をもたらす（例えば、活性物質の細胞内勾配を確立する）ことが可能である。
【００３８】
別の態様において、該物質は、形質膜を通した受動輸送、及び／又は細胞形質膜を通した能動輸送のいずれかにより、細胞形質膜を通って細胞の内部へ透過することが可能であるように選択される。上記のように、細胞形質膜を通って透過することが可能である物質は、細胞の内部内にそのような物質の長期の細胞内勾配を創出する本発明に関連して有用であり得る。さらに他の態様において、該物質は、細胞表面の一部分、及び／又は細胞表面へ付いたタンパク質又は他の分子、例えば、フィブロネクチンのようなタンパク質を、細胞がシステム内の基体に付いたままでも、分解する、及び／又は解重合することが可能であるように選択され得る。流体流れの成分と細胞の諸部分を選択的に接触させる本発明の技術の使用の特に代表的な応用を以下により詳しく記載するが、当業者は、これまでの考察と以下の開示に照らせば、本発明により提供される技術が、きわめて多様なバルク特性と細胞との生物物理的及び／又は生化学的相互作用に影響を及ぼすことが可能な物質への、きわめて多様な細胞のパラメーター、機能、行動、応答などの、研究、アッセイ、検出、などを可能にする、きわめて広い応用可能性を有することを容易に理解されよう。本発明のこうしたそれぞれの応用及び使用は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００３９】
流体の流動流れの多成分が、該成分の少なくとも１つの内側での物質の濃度に関して互いに異なる、本発明にしたがって提供される技術の好ましい態様において、該物質の濃度は、細胞と接触した該成分の少なくとも１つの少なくとも一部分において本質的に均一であり、好ましくは、細胞と接触した該成分のそれぞれの少なくとも一部分で本質的に均一であり、そして最も好ましくは、細胞の諸部分と接触したそれぞれの成分の本質的に全体で本質的に均一である。成分中の物質の濃度に関連して本明細書で使用される「本質的に均一」は、問題となる物質の濃度が、流れの成分の断面全体で本質的に均一であることを意味し、この濃度は、流れの隣接する成分のそれとは異なる。
【００４０】
流体の流動流れが、層流により特徴付けられる多数の流動成分を有し、この成分が単一細胞の様々な部分と接触している態様では、以下により詳しく論じられるように、安定性、乱れた混合の不足、及び、成分間に鮮明な界面を創出する能力のために、流動流れの様々な成分により接触された細胞の諸部分は、細胞の主要本体部分の諸部分であり得る。本明細書で使用される「細胞の主要本体」は、小径の突起、張出し、隆起などを除く細胞の領域を意味する。細胞の主要本体部分は、本明細書で使用されるように、少なくとも一定の方法に沿って測定される最小断面積を有し、これは、同じ一定方向に沿って測定される細胞の最大断面積の少なくとも１０％である。このように、本発明にしたがって提供される技術により、細胞の主要本体部分の様々な部分を分画して、細胞との生物物理的及び／又は生化学的相互作用をもたらす様々な潜在性を有する流動流れの様々な成分と選択的に接触させることが可能になる。そのような細胞レベル以下の分割と、細胞の選択された領域への流体のデリバリーの制御は、単一細胞を処理するための先行技術では、典型的には利用可能でない。
【００４１】
本発明の技術の別の側面は、細胞内に活性物質の勾配を確立する能力に関わる。本発明に関連して本明細書で使用される「活性物質」は、細胞の内部内に存在して、細胞において生物物理的及び／又は生化学的変化をもたらすことが可能である物質を意味する。本明細書に記載される本発明の技術の特定の態様は、細胞内に活性物質の長期勾配を創出することが可能である。本明細書で使用される、細胞内での活性物質の「長期勾配」は、第一濃度の活性物質を有する細胞内の第一空間領域の存在と、第二濃度の活性物質を有する細胞内の第二空間領域の存在により特徴付けられ、ここで、活性物質の第一濃度は、活性物質の第二濃度とは、細胞内での勾配の確立後、約５分、より好ましくは約１０分、より好ましくは約２０分、最も好ましくは約３０分を超える時点で、少なくとも約５％、より好ましくは１０％、より好ましくは２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは１００％だけ異なる。本発明の技術のある特別に好ましい態様においては、本質的に定常状態の勾配である、換言すると、細胞の内部の第一領域と細胞の内部の第二領域との濃度における上記の差異が際限なく維持されている勾配が確立される。
【００４２】
以下により詳しく論じるように、本技術の特定の態様は、細胞内で自由に拡散可能である活性物質でも、また、その分子のあるものが細胞内で自由に拡散可能である一方、他のものは細胞内の不動の構造へ（実験の時間スケール内で）可逆的又は不可逆的に結合している活性物質でも、活性物質のこうした長期又は定常状態の勾配を細胞内に確立することが可能である。本明細書で使用される、細胞内で「自由に拡散可能」である活性物質、又は活性物質の「自由に拡散可能な」部分（即ち、結合した分子と結合していない他の分子を有する活性物質の未結合分子）は、細胞内で固定化されるように、細胞の内部成分へ可逆的又は不可逆的にも結合していない、そのような物質の成分を意味する；換言すると、そのような物質の分子は、細胞の細胞質全体を自由に拡散する。
【００４３】
細胞内で勾配を形成する活性物質は、ある態様において、細胞の形質膜に関して透過し得ない物質であり得る。そのような態様においては、膜貫通シグナル伝達、又は他の機序により、細胞内活性物質の勾配を確立することが可能である物質、又は他の状態へ細胞の形質膜の外部表面の一部分を曝露することにより、活性物質の勾配を確立することが可能である。
【００４４】
より典型的な態様において、細胞内で勾配を形成する活性物質は、受動輸送と能動輸送の一方若しくは両方により細胞の形質膜を通って透過することが可能である物質である。好ましい態様においては、活性物質の細胞内勾配が、細胞の外部の第一部分を、細胞の内部内での活性物質の濃度若しくは分布に影響を及ぼすことが可能な物質を含有する流体、又は流体流れの成分へ選択的に曝露することによって、そして同時に、細胞の内部内での活性物質の濃度若しくは分布に影響を及ぼすことが可能な物質を細胞の外部の第二部分から除去するために、細胞の外部の第二部分を別の流体、又は流体流れの成分へ曝露することによって、確立される。
【００４５】
特定の好ましい態様において、細胞内で勾配を形成する活性物質は、細胞の形質膜を通って透過可能であり、細胞の形質膜の外部表面の第一部分へ選択的に供給される一方で、細胞の形質膜の外部表面の第二部分から同時に除去され、それにより細胞内に活性物質の勾配を形成する。例えば、細胞の外面が多成分流動流れの２成分と接触しているような態様において、該物質を含有し、細胞の形質膜へそれを供給する流体流れの第一成分は、細胞内での活性物質の最大濃度以上である濃度で該物質を含有すべきであり、形質膜の表面から該物質を除去する流動流れの第二成分は、細胞内での活性物質の最小濃度である（例えば、本質的に該物質を含まない）濃度で該物質を含有すべきである。
【００４６】
図２を参照にして以下により詳しく記載されるように、細胞膜の外部へ供給され、細胞を通って透過することによって細胞内勾配を形成する物質により確立される細胞内勾配については、長期の定常状態の勾配が最も有効に形成されるのは、比較的低分子（例えば、約６００未満の分子量を有する）からなり、細胞の細胞質中でのその拡散定数に比較して、形質膜への高率の透過定数を有する物質を利用する場合である（例えば、図２Ａ〜Ｃを参照されたい）。
【００４７】
一般に、細胞の外部の第一部分を、細胞の外部の第一部分へ物質を供給する第一流体又は流体流れの第一成分へ選択的に曝露すること、及び外部細胞の第二部分を、細胞の外部の第二部分から物質を除去する第二流体又は流体流れの第二成分へ選択的に曝露することによって、活性物質の細胞内勾配が細胞内で形成される場合、細胞内での活性物質の勾配は、細胞の外側の第一部分の少なくとも一部分へ近接した第一領域が細胞内に存在するように確立され、この第一領域は、活性物質の第一濃度を有し、細胞内での第二領域の存在は、細胞の外部の第二部分の少なくとも一部分に近接し、この第二領域は、第一濃度未満の第二濃度の活性物質を有するだろう。また、一般に、細胞表面の物質を供給する第一流体又は第一流体成分における物質の濃度と、細胞表面から物質を除去する第二流体又は第二流体成分における同物質の濃度との差が大きいほど、細胞内勾配を確定する、細胞の第一領域と細胞の第二領域との間の活性物質の細胞内での濃度の差は大きくなる。特に好ましい態様において、細胞表面から物質を除去する流体流れの第二流体又は第二成分は、細胞の外部表面との接触に先立って、該物質を本質的に含んでいない。本明細書に記載の教示による操作パラメーターの慎重な選択、及び定型的な実験により、細胞内で自由に拡散可能であり、細胞の形質膜を通って自由に透過可能である活性物質についても、細胞の内部の特定の選択領域が活性物質を有する一方で、細胞内の他の領域には活性物質が本質的に含まれないように、活性物質の細胞内勾配を細胞内に確立することが可能である。
【００４８】
以下により詳しく記載されるように、活性物質の長期及び定常状態の勾配を細胞内に確立する能力により、これまでは典型的な先行技術及びシステムを使用しても得ることができなかった単一細胞の測定及び観察に基づいた、多種多様な試験、定量、及びアッセイが可能になるだろう。例えば、外部細胞表面の選択部分へ小さな膜透過性分子を選択的に供給し、同じ細胞表面の他の部分からそれを除去することによって細胞内勾配を確立する能力により、細胞内の細胞レベル以下の微小ドメインへそのような小分子を高度に局在化させ、そのような分子の細胞レベル以下の微小ドメインに対する効果を決定すること、及び／又は様々な細胞処理に関する細胞レベル以下の微小ドメインの空間分布及び再分布へ向けられる研究が促進される。例えば、図２と実施例に関連して以下により詳しく記載されるように、細胞内勾配を確立する本発明の技術は、細胞内での活性物質の空間分布の指標となるパラメーター（例、蛍光強度）、細胞の形質膜の活性物質に対する相対透過率の測定値、及び／又は、細胞内の選択位置での細胞（例えば、基体に付着して広がった細胞について）の相対厚さの測定値を検出するために活用され得る。
【００４９】
本発明の技術を使用する細胞内勾配の確立が、厚さや膜透過性のような細胞の物理特性を決定する、及び／又は研究するために活用され得る上記の応用だけでなく、物質を細胞の諸部分へ選択的に搬送する一方で、該物質を細胞の他の部分から除去し、それにより細胞内に長期及び定常状態の活性物質の勾配を確立する能力により、単一細胞を試験検体と対照の両方として活用するアッセイが可能になり得る。そのようなアッセイは、細胞レベル以下の微小ドメインの細胞内移動（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）及び分布を研究すること、並びに、増殖因子又は制癌剤のような様々な薬物である細胞種を処理することの、細胞に対する生物物理的又は生化学的効果な、又は効力を研究するのに有用であり得る。
【００５０】
そのような応用では、活性物質を含有する細胞の内部の１つの領域と、この活性物質を本質的に含まず、好ましくは、活性物質を含有する領域に類似した容積、又はその実質的な分画を有する、細胞の内部の第二領域との存在により特徴付けられる活性物質の細胞内勾配を確立することが好ましい。このようにすると、活性物質を含有する細胞の内部の領域が「試験領域」として機能し、活性物質を実質的に含まない領域は、細胞の組み込まれた「対照領域」として機能する。
【００５１】
１つの例示的な態様において、活性物質は、活性物質を含有する細胞内の領域の細胞骨格を壊すか又は安定化することが可能な薬物又は他の物質である。ある特に好ましい態様においては、細胞骨格を破壊するか又は安定化する物質が抗癌剤（例、タキソール）である。別のこのような態様において、又は細胞骨格を壊すか又は安定化させる物質を伴う上記の態様の一部として、細胞内の部分が、細胞の細胞レベル以下のオルガネラ内で局在化することが可能な物質で選択的に処理され得る。例えば、細胞の細胞レベル以下のオルガネラに局在化することが可能であり、特定の細胞レベル以下のオルガネラへ結合し、オルガネラの位置及び分布を視覚的にモニターするか又は検出することを可能する、蛍光色素若しくは標識であり得る物質を選択することが可能である。選択された細胞レベル以下のオルガネラに局在化することが可能な多種多様なそのような色素と他の物質は容易に入手可能であり、当業者によく知られていて、このうちのいくつかを以下の実施例の部で論じる。
【００５２】
上記のように、ミトコンドリア又はゴルジ体のような特定の細胞レベル以下のオルガネラに局在化することが可能な膜透過性色素で細胞の１つの領域を選択的に処理することによって、細胞の特殊な処理若しくは刺激に応じた標識化された、細胞レベル以下のオルガネラの移動及び分布をモニターすることが可能である。１つの態様において、標識化された、細胞レベル以下のオルガネラの分布若しくは移動に影響を及ぼす処理若しくは刺激は、上記のように、細胞の特定領域における細胞骨格の選択的な安定化若しくは解離であり得る。こうした組合せアッセイは、潜在的に、細胞骨格の完全性が様々な細胞レベル以下のオルガネラの移動と細胞内運動に及ぼす影響に関する重要な情報をもたらす可能性がある。
【００５３】
細胞内勾配を創出する本方法の上記応用に加えて、様々な流体又は流体流れの成分と細胞の外部の選択部分を接触させる本発明の技術により、単一細胞の一部分の選択処理に基づいた多種多様な他の定量及びアッセイが可能になり得る。こうした応用には、限定されないが、例えば、特定の細胞表面受容体へのアフィニティーを有する物質が細胞膜の選択部分でのみ受容体へ結合することの単一細胞に及ぼす効果を決定すること；細胞表面受容体へ結合し、その後、細胞中へエンドサイトーシスされる薬物又は他の物質（例、低密度リポタンパク質）の移動及び行き先を、細胞の外部表面の一部分にのみそのような物質を供給することによって研究すること；及び、細胞イオンチャネルを通したカルシウム流入／流出に影響を及ぼすことが可能である、及び／又は細胞内カルシウムイオン勾配の確立を創出するか又はそれに影響することが可能である、薬物のような物質で細胞の外部の部分を選択処理することの効果を研究すること；などが含まれる。一般に、本技術は、特定の細胞種に対する膜透過性活性物質でのある一定の処理の効果、効力などを、例えば、単一細胞の第一処理領域及び第二未処理領域のそれぞれについて、この細胞種への活性物質での処理の効力を決定する、活性物質に対する細胞の応答の指標となる少なくとも１つのパラメーターを検出することによって決定するための試験検体と対照の両方として、単一細胞を活用することを可能にし得る。他のやり方では、本技術は、特定の細胞種の外部へ結合する物質でのある一定の処理の影響、効果などを、例えば、単一細胞の第一処理領域及び第二未処理領域のそれぞれについて、この細胞種への該物質での処理の効力を決定する、結合した物質に対する細胞の応答の指標となる少なくとも１つのパラメーターを検出することによって決定するための試験検体と対照の両方として、単一細胞を活用することを可能にし得る。
【００５４】
本技術は、典型的な先行技術ではこれまで入手し得ない、細胞内物質及び細胞レベル以下のオルガネラの移動及び輸送のような、細胞行動の様々な測定及び観察を可能にし得る。本技術はまた、様々な物質の細胞に対する処理効果を評価するための様々な分析試験及びアッセイを可能にし得るが、ここでは、単一細胞が試験検体と対照の両方として機能することによって、一定の細胞種の集団内にある個々の細胞、細胞全体に対するそのような処理の影響を研究することに内在する多くの統計上の不確実性を一掃することが可能である。
【００５５】
本明細書に記載される本発明の技術及び物品は、上記のアッセイ、試験、定量、測定、観察など、並びに他の多くのものを、自動化されて完全に制御された形式で行うための自動システムでの使用に容易に適用可能である。図面と実施例に関連して以下に記載するのは、本明細書に記載の本技術を実施するのに適した微小流体装置及びシステムの１つの特定の態様である。
【００５６】
単一細胞が流動流体流れの１以上の成分により接触されることを可能にするように構築された、微小チャネル系（３００）の１つの態様を、図１Ａ〜Ｃと図３Ａ〜Ｂに概略的に例示する。本明細書で使用される「微小チャネル系」又は「微小チャネル装置」又は「微小流動ネットワーク」又は「微小流体系」又は「微小流体装置」は、物品、装置、又はシステムを意味し、流動流体を含有することが可能な少なくとも１つの導管若しくは毛管がそこに含まれ、ここで導管又は毛管は、導管若しくは毛管中の流体フローの方向へ垂直な方向に、約１ミリメートルを超えない、最大断面積を有する。本明細書に開示される技術を実施するのに有用な微小流体ネットワーク又はフロー装置を製作するのに多種多様な技術、基体、及び材料が使用可能であることが当業者に理解されるだろう。そのような装置は、例えば、ミクロファインガラス毛管、マイクロマシーン化した、及び／又は写真平版加工したシリコン又は他の基体、又は、上記のサイズ範囲内にある導管、毛管、又はチャネルを形成することが可能な様々な他の既知の方法から構築され得る。そのような装置のそれぞれの使用は本発明の範囲内にあるとみなされる。
【００５７】
先に論じたように、微小流体システム（３００）の好ましい態様は、該ネットワークシステムの少なくとも１つのチャネルにおいて層流する多成分流体流れの創出及び維持を可能にするように設計され、構築される。層流は、無単位レイノルズ数により特徴付けられ、これは流動流体の密度、特性流体速度、及び、流体が流動するチャネルの特性断面積に比例し、流体の密度に逆比例して、約２０００未満である。そのような望ましい層流を可能にする微小流体と他の流体ネットワークを製作するパラメーターを選択するための技術は、当業者によく知られていて、例えば、いずれもすでに本明細書に援用した、Ｂｒｏｄｙ， Ｊ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ 及び Ｋｏｖａｃｓ， Ｇ． Ｔ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， １９９８；並びに、多くの標準的な流体工学テキスト、例えば、本明細書に援用される、Ｂｉｒｄ Ｒ． Ｂ．， Ｓｔｅｗａｒｔ Ｗ． Ｅ．， ａｎｄ Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ Ｅ． Ｎ．， 「輸送現象（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｐｈｅｎｏｍｅｎａ）」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（１９６０）に記載される。
【００５８】
図１Ａ〜Ｃ及び３Ａ〜Ｂに例示される微小流体システムは、例示の態様において、ポリ（ジメチチルシロキサン）（ＰＭＤＳ）から構築される、エラストマーのミクロ成型スラブ若しくは膜（３０１）を含み、多成分層流流れが形成される本流チャネル（３０２）と、本流チャネル（３０２）に注ぎ込み、合流点（３１８）で集束する３つの入口チャネル（３０６）、（３０８）及び（３１０）を有する。これらのチャネルは、スラブ（３０１）の底面（３０３）に負のレリーフ特性を含んでなる矩形の谷の形態である。入口チャネル（３０６）、（３０８）、及び（３１０）は、それぞれ入口ウェル（３１２）、（３１４）、及び（３１６）と流体でつながっていて、このウェルは、スラブ（３０１）の厚さを貫通し、ＰＤＭＳスラブ（３０１）の上面（３０５）まで満たすために開いている。これらのチャネルとウェルは、スラブ（３０１）の底面（３０３）を、ガラス顕微鏡スライド、ペトリ皿、カバーガラスなどのような基体（３０２）と接触させ、このようにして可逆性の絶縁（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ）シールを形成することによって、流体を漏れなくしている。結果として、基体（３０２）は、このネットワークの微小流体チャネルのそれぞれの底面を形成する。他の態様では、所望されるならば、スラブ（３０１）を不可逆的かつ永久に基体（３０２）へシールしてもよく、又は、完全に閉じたフローチャネルを提供するのに基体への絶縁シーリングが必要でないように、チャネルをスラブ（３０１）本体の内部に完全に形成してもよい。
【００５９】
微小流体システム（３００）を形成するのに適したミクロレプリカ成型技術は先行技術に知られていて、読者には、すでに本明細書に援用した、Ｔａｋａｙａｍａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， １９９９；及び、製作方法の詳細について、いずれも本明細書に援用される、Ｄｕｆｆｙ， Ｄ． Ｃ．， ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｊ． Ｃ．， Ｓｃｈｕｅｌｌｅｒ， Ｊ． Ａ．， ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｇ． Ｍ．， 「ポリ（ジメチルシロキサン）製の微小流体システムの迅速プロトタイピング」 Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ． ７０， ４９７４−４９８４；及び国際特許公報第ＷＯ９７／３３７３７号（Ｋｉｍ．， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， １９９７）が参考になる。
【００６０】
微小流体システム（３００）は、多成分層流が確立される単一の主流チャネル（３０２）と、主流チャネルに注ぎ込み、二分された「Ｙ」形を形成する形式で合流点（３１８）に集束する３つの入口チャネル（３０６）、（３０８）、及び（３１０）を有する。例示の態様において、このチャネルのそれぞれは、チャネル内の流体フロー流れに対して垂直方法で測定される、約３００マイクロメートルのチャネル幅と約５０マイクロメートルのチャネル深さを有する。入口と出口ウェルのそれぞれは約１００マイクロリットルの流体を含有する大きさで作られ、スラブ（３０１）の厚さに等しく、例示の態様では、約５ミリメートルである、流体フローの推進力を創出する静圧ヘッドを提供する。
【００６１】
微小流体システム（３００）は、１〜３の独立した、平行に流動する成分をどこでも含む流体流れを主流チャネル（３０２）に形成させる能力を有する。例えば、少なくとも１つのバルク特性において互いに異なる（又は、隣接ウェル中のそれぞれの流体とは少なくとも異なる）３つの流体を、１つの流体を入口ウェルのそれぞれへ供給することによって、図１Ｃ及び１Ｄに最も明瞭に示される、３つの成分（３３０）、（３３２）、及び（３３４）を含むフロー流れをチャネル（３０２）に確立することが可能である。
【００６２】
図１Ｄは、このような３成分流体流れをメインチャネル（３０２）に創出することの結果を例示する。この図に示されるのは、メインチャネル（３０２）で３成分フローが確立した後の、微小流体システムの区域（３２９）の写真である。成分（３３０）は、成分（３３４）と同様に、蛍光物質をその中に有する流体を含む。成分（３３２）は、３つの成分フローの中央成分を形成し、成分（３３０）及び（３３２）の蛍光物質を欠き、そのためにこの図では暗く見える流体を含む。１〜３成分フローを形成するための３つの入口流れを有する例示の態様は単に例示のためであって、より少ないか又はより多い数の入口を配置して集束させ、メインチャネルに注ぎ込ませて、２成分から大きな数の成分まで、例えば１０より多い成分をどこでも有する多成分流れを産生することが可能である。
【００６３】
微小流体ネットワークシステム（３００）において多成分流体流れを確立するには入口ウェル（３１２）、（３１４）、及び（３１６）をはじめに満たし、例えば、スラブ（３０１）の頂面（３０５）まで完全に満たすが、出口ウェル（３０４）は、例えば、吸引、拭き取りなどにより流体がないままにしておく。例示のシステムでは、入口ウェル（３１２）、（３１４）、及び（３１６）を、類似した密度及び粘度を有する流体で満たし、出口ウェル（３０４）は、本質的に流体がないように維持し、出口ウェルと比べた入口ウェル内の流体高さの差により提供される推進力が、主流チャネル（３０２）において、約０．６ｃｍ／ｓの最大バルク流体速度を創出するのに十分であるとする。水性媒体についてのそのような流速でのレイノルズ数は、ごく小さく（１未満）、それ故に、主流チャネル（３０２）中の流体流れ成分（３３０）、（３３２）、及び（３３４）は、互いに隣り合って混合せずに、拡散による以外は乱れることなく、流動する。また、微小流体ネットワークシステム（３００）は、メインチャネル（３０２）へ注ぎ込む入口チャネルのそれぞれにおける流動フローへの抵抗がほとんど同一であるように配置されているので、成分（３３０）、（３３２）、及び（３３４）のそれぞれの体積流量（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）は同様であろうし、成分のそれぞれは、メインチャネル中のフロー流れへの垂直方向で測定されるように、同様の断面積を有するだろう（例えば、図１Ｃ及び１Ｄを参照されたい）。
【００６４】
一般に、メインチャネル中の流体流れの各成分の幅は、成分流れのそれぞれの体積流量に正比例するが、これはまた、多成分のフロー流れを含有する流体フローメインチャネルへ注ぎ込む吸込チャネルのそれぞれの相対推進力とフロー抵抗に比例する。したがって、メインチャネル中のフロー流れの成分の相対幅とこのフロー流れを分ける界面の特殊な位置は、メインチャネルに注ぎ込む流れの体積流量を制御することによって制御し、予測することが可能である。
【００６５】
個々の入口流れの体積流量は、例示の態様において、１以上の入口ウェルに含まれる液体カラムの、このシステムの他の入口ウェルに対する相対高さを変化させることによって、容易に制御することが可能である。他の態様では、個々の供給流れの体積流量を、１以上の入り口チャネルの図形（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）若しくはチャネルサイズを変えることによって調整し、他の入口流れにより提供されるものと比較して、より大きいか又はより小さいフロー抵抗を創出することが可能である（例えば、「導管摩擦マニュアル」第３版、Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ニューヨーク（１９６１）、及び「工学技術のための流体力学」第３版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， Ｅｎｂｌｅｗｏｏｄ， Ｎ． Ｊ． （１９８９）を参照されたい。いずれも本明細書に援用される）。
【００６６】
別の態様においては、それぞれの入口流れに、ポンプ、例えば可変の小さな体積流量で流体をポンプ注入することが可能なシリンジ若しくはペリスタポンプで直接それぞれの入口流れに供給することによって、それぞれの入口流れの体積流量を調整し、制御することが可能であろう。一般に、流体工学の技術分野の当業者は、主流チャネル中の流動流れの成分が、主流チャネル内にある所望されて再現可能的に得られる位置に位置し、その間の界面とともに所望される面積を有するように本技術を実施するための、微小流体ネットワークのメインチャネルに供給する流れの相対流速を調整して制御する多様な方法を容易に想定することができるだろう。
【００６７】
多成分流体流れの独立した成分の正確な面積とこの成分間の界面の位置も、この装置が、例えば、流体流れの中にある材料、例えば、色素、蛍光物質などを含めて作動している間に、実験的に容易に決定することが可能であり、それにより、例えば図３Ｂに示されるような顕微鏡観察により、そのサイズと主流チャネル内の位置が容易に検出される。
【００６８】
一般に、上記のように設計されて製作される微小流体ネットワークでは、ネットワークのメインチャネル中の多成分流体流れの個別成分の厚さ、したがって、隣接成分を分ける界面間の隙間は、どこでも約１マイクロメートルから主流チャネルの幅に近づく距離までの範囲をとることが可能である。したがって、いくつかのそのような成分と界面を、単一の典型的にサイズ取りされた細胞の外部表面とそれらが接触するように、位置づけることが可能である。
【００６９】
次いで、図１Ｃへ言及し、合流点（３１８）のすぐ下流及び上流のフローチャネルの部分を含む領域（３２９）を、拡大して詳しく示す。単一細胞（３４０）が基体（３２０）に付着し、その外部表面が流体流れのフロー成分（３３０）、（３３２）、及び（３３４）のそれぞれと接触するように、そして、界面（３３６）と（３３８）の両方がこの細胞の外部表面と接触して位置するように、主流チャネル（３０２）の中に位置することが示される。こうした配置を使用すれば、例えば、細胞の領域（３４２）、（３４４）、及び（３４６）を、流体フローの成分のそれぞれの中に含まれる様々な生物活性物質へ曝露し、例えば、細胞表面の上記領域のそれぞれに近接した細胞内の領域へそのような物質を局在化すること、及び／又は細胞の外側及び／又は内側の特定領域に対するそのような物質の影響を研究することが可能になるだろう。
【００７０】
入口流れが合流点（３１８）で集束し、主流チャネルで（即ち、界面（３３６）と（３３８）で）互いに接触した後では、１つ以上の物質の存在、又はバルク濃度の存在に関して互いに異なる流れの隣接成分の間の界面で、拡散混合が起こる傾向にある。拡散混合は、フロー成分の間の界面で起こる傾向があり、この界面を含んでなる拡散領域の相対厚さは、フロー成分が主流チャネル（３０２）の長さに沿って流動するときの成分間の接触時間につれて増加する傾向があり、これにより、個々の成分のバルク特性間の転移が不明瞭になる。したがって、そのようなバルク特性の細胞に対する差別的な効果を研究する、及び／又は細胞内で細胞内勾配を創出するための成分間のバルク特性の差（例えば、１つ以上の物質のバルク濃度の差）を活用するために、様々なバルク特性を有する２つ以上のフロー成分へ単一細胞を曝露することが望まれる好ましい態様では、界面の厚さと界面での拡散的な広がりの程度を、細胞サイズに関して小さい値に維持することが望ましい。
【００７１】
この理由のために、好ましい態様では、多成分流体流れの中に位置づけられた単一細胞の観察、検出、及び／又は研究を実施するために選択される微小流体ネットワークの領域は、流体流れが修飾する合流点（３１８）の下流から約５００マイクロメートル未満の領域へ制限される。この距離は、目的の物質の界面（これは、本質的には界面の有効厚さと拡散広がりの程度に等しい）での拡散により移動する平均二乗正味距離の平方根が研究される細胞のサイズより小さい、好ましくは実質的に小さいように選択される。例えば、第一成分が約５ｘ１０−６ｃｍ２／ｓの拡散係数を有する目的の物質を含み、隣接する流体成分が本質的にこの成分を含まないという、流体流れの２つの成分を含んでなる２つの隣接した水性流体では、２つの成分間の界面の拡散広がりは、接触の０．１秒ごとに約１０マイクロメートルだけ増加するものである。このように、ネットワークシステムのメインチャネルにおける平均バルクフロー速度が細胞の処理の時間全体で約０．５ｃｍ／ｓ（上記に論じた配置を有する微小流体ネットワークシステム（３００）の典型的な値）では、この成分が合流点（３１８）のほぼ５００マイクロメートル下流へ流動するときまでに、フリー成分間にある約１０マイクロメートルの界面の拡散広がりが起こるだろう。したがって、界面の拡散広がりの最大許容量が１０マイクロメートルであるような細胞サイズを有する態様では（例えば、５０μメートル以上の直径を有する広がった細胞を含む態様では）、研究用の細胞が合流点から５００マイクロメートル未満下流の領域内で選択されるべきである。異なった大きさの細胞、例示とは異なる拡散係数を有する物質、異なる流速などでは、成分間の界面での拡散広がりが許容されるほど小さい分画の細胞サイズを含む特定の区域が変化するものであることが明らかである。拡散広がりの速度の推定は、質量輸送と流体力学の当該技術分野でよく知られた標準技術により、そのような技術分野の当業者により所持されている知識及び情報を参照して行うことが可能である。こうした計算は、例えば、本明細書に援用される Ａｔｋｉｎｓ， Ｐ． Ｗ． 「物理化学」フリーマン、Ｎ．Ｙ．（１９９４）：及び、すでに本明細書に援用された Ｋａｍｈｏｌｚ， Ａ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， １９９９ に詳しく記載されている。
【００７２】
図３Ａ〜Ｂは、細胞（３５０）の左手部分を目的の物質で選択的に処理するための、２成分流体流れを主流チャネル（３０２）に創出する微小流体ネットワークシステム（３００）の使用を例示する。はじめに、多成分フロー流れの確立に先立って、カバーガラス基体（３２０）への細胞の付着を促進するように微小流体ネットワーク（３００）を処理し、その基体へ細胞が付着／結合してその上で広がることを可能にするために、細胞の懸濁物で満たすことが可能である。ある態様においては、微小流体ネットワーク（３００）の微小流体ネットワークチャネルを望ましい細胞懸濁物で満たしてもよく、未処理基体（３２０）の上に細胞を定着させて、非特異的に付着して広がることを可能にしてもよい。他の態様においては、基体（３２０）、又はシステム（３００）の微小流体ネットワーク全体を、はじめに非特異的若しくは特異的な細胞の付着／広がりを促進する１つ以上の物質、例えばフィブロネクチンへ曝露するか、又はそれで化学的に処理してもよい。
【００７３】
さらに、ある態様においては、基体（３２０）の部分を、例えば、Ｔａｋａｙａｍａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， １９９９ に記載されるような層流パターニング技術の活用により差別的に処理し、基体（３２０）のパターン化領域を形成して、差別的に細胞結合を促進する、及び／又は微小流体システムの特定領域で特定のタイプの細胞の選択結合を促進することが可能である。このようにして、単一細胞のパーツを選択的に処理する本発明の技術を、Ｔａｋａｙａｍａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， １９９９ に開示されるような選択パターニング技術と組み合わせて、所望の細胞／細胞種を微小流体ネットワークのメインチャネル（３０２）内の特定位置に選択的に位置づけることと、その後、流体処理流れの２つ以上の成分とその間の界面を選択的に位置づけることの両方が可能なセンサー、アッセイ系などの構築を促進し、基体上の細胞のパターン化された配置の選択細胞を通り越して接触させることが可能であり、そうなれば、例えば、本発明により開示されて提供される単一細胞処理を利用して様々な細胞種の細胞を同時的又は連続的に研究することができる。主流チャネル（３０２）内での細胞の選択パターニングとそのようにパターン化されて主流チャネル内に位置づけられた細胞のパーツの選択処理とを組み合わせると、単一細胞研究を実施する本発明のシステムの融通性及び有用性を実質的に高めることが可能である。こうした組合せはまた、様々な細胞種の存在と互いに関する相対位置の研究、細胞の行動／相互作用などに対する様々な基体結合条件の効果、及び、多種多様な他のアッセイ、試験などのさらなる研究を可能にし得るが、ここで様々な細胞種及び／又は細胞種と様々な基体環境との間の相互作用は、当業者に明らかであるように、重要である可能性がある。
【００７４】
図３Ａ〜Ｂに例示されるように、例えばフィブロネクチンの固定化により、細胞結合を促進する微小流体ネットワークの調製に後続し、そして、細胞懸濁液でチャネルを満たし、細胞（例えば、細胞（３５０））が基体（３２０）に付着して広がることを可能にすることに後続して、グリーン蛍光活性物質（図では、「グリーン」と標示される）を含有する流体で入口ウェル（３１２）を満たし、活性物質を含まないこと以外は同様の流体でウェル（３１４）及び（３１６）を満たすことによって、２成分流体流れを創出する。出口ウェル（３０４）は、示されるように、流体を含まないままとし、入口ウェルと出口ウェルの流体の高さの差により創出される推進力により確立されて維持される微小流体システム内でのフローを促進する。
【００７５】
例示の態様においては、研究に適切な細胞を選択し、メインチャネル（３０２）中の流体フロー流れの成分（３５２）に含まれる活性物質での処理の効果を、流体成分（３５２）を含んでなる流体のグリーン蛍光を視覚化することが可能な対物鏡（３５４）を活用して合流点（３１８）のすぐ下流の領域（３２９）（例えば、合流点（３１８）の約５０〜５００マイクロメートル下流の範囲内）を観察することによって検出する。次いで、細胞（３５０）を観察及び研究のために選択し、これを、活性物質を含有する成分（３５２）と活性物質を各フローの成分（３５８）の間の界面（３５６）が細胞の主要本体部分を通り越すように位置づける。先に論じたように、好ましくは、界面（３５６）が細胞の位置づけられる位置で明瞭になり、最小量の拡散広がりを有するように細胞（３５０）を選択する（即ち、合流点（３１８）にごく近接して細胞を位置づける）。図２に関連してすぐ後でより詳細に論じるように、このような細胞は、選択された処理時間の間、微視光学検出システムの対物鏡（３５４）により連続的に観察し、フロー成分（３５２）中の活性物質の細胞に対する効果を決定することが可能である。ある態様においては、図２に関連して以下に記載されるように、成分（３５２）中の細胞へ供給される物質は、細胞（３５０）の形質膜を通って透過する物質であり、フロー成分（３５２）と接触した細胞（３５０）の外部の部分の少なくとも一部分へ近接した領域の細胞（３５０）の細胞内空間内に局在化し、活性物質の細胞内勾配が細胞（３５０）内に確立される。
【００７６】
他の態様においては、活性物質が蛍光又は視覚的に検出可能な物質である必要はないことが理解されるべきである。単一細胞と接触する流体流れの様々な成分の光学特性が本質的に同一である態様では、先に記載したように、活性物質と適合し、そして実施される試験に干渉しない不活性色素を１以上の入口流れへ加え、メインチャネル内に確立される様々なフロー成分間の視覚コントラストを創出し、上記のように、適切な細胞を研究のために選択することが可能である。さらに、例示の光学顕微鏡以外の他の検出手段を適切な状況において活用して、活性物質及び／又は選択された処理に対する細胞の変化／応答を検出してもよい。多種多様なこうした検出システム及び方法、例えば、放射活性検出器、磁気共鳴検出器、伝導性検出器などが当業者によく知られていて、当業者に明らかであるように、本発明の関連及び範囲内で活用することが可能である。
【００７７】
図２Ａ〜Ｃは、図３Ａ〜Ｂに配置されて操作されるような、微小流体ネットワーク（３００）を活用して細胞（３５０）内に活性物質の細胞内勾配を創出するための１つの態様を例示する。図２Ａ〜Ｃに例示される態様において、左端フロー成分（３５２）はグリーン蛍光性（図では、「グリーン」と標示される）、細胞膜透過性の低分子活性物質（例、膜透過性蛍光色素）を含有する。例示の態様において、フロー成分（３５２）に含まれるグリーン蛍光低分子活性物質は、細胞内で自由拡散し続けるか、又は、細胞内の核酸又は他の不動成分へ可逆的に結合することが可能な物質であり得て、細胞の中へ透過すると、物質の一部は細胞内で自由に拡散し、他の部分は細胞内（例えば、細胞の核内）の核酸／不動構造へ可逆的に結合する。例示されるように、グリーン蛍光活性物質を含まないこと以外は同様の緩衝液／媒体で入口ウェル（３１４）及び（３１６）（図３Ａを参照されたい）を満たし、流体流れの第二成分（３５８）を細胞（３５０）の上に位置づける。この成分は本質的に活性物質を含まない。例示されるように、細胞（３５０）を、界面（３５６）がその界面で最小量の拡散広がりを有してきわめて明瞭であるように見えるように選択した。
【００７８】
細胞形質膜を通って透過することが可能で、約５ｘ１０−６ｃｍ２／ｓ以上の次数の典型的な拡散係数を有する低分子である活性物質は、典型的な細胞の最大範囲寸法の数倍の長さにわたり、短い時間（例えば、１分未満）のうちに、細胞内で拡散する性質がある。活性物質を細胞内に局在化させるための典型的な先行技術の方法が長期の細胞内勾配を創出して維持することができないのはこのためである。先に論じたように、物質を細胞内に局在化させるためのこうした先行技術は、細胞内で物質の再分布をもたらし、物質は、数分以内に、その最終平衡分布のほぼ９５％に達する。
【００７９】
本発明にしたがって提供される技術を活用することによって、例えば、図２Ａ〜Ｃに例示されるように、細胞の独立した領域間の有意な細胞内濃度差（例えば、５％を超える濃度差）を、細胞内で自由拡散可能である物質についてさえも、上記に論じるように、長い時間の間維持することが可能である。例示された態様における細胞内勾配の確立及び維持は、細胞の外部表面の部分（３６０）へフロー成分（３５２）との接触により物質を供給することによって細胞の内部へ物質の流入を提供すること（図２Ｃ、上面を参照されたい）、そして処理の間に、細胞（３５０）の外部表面部分（３６２）から、フロー成分（３５８）とその部分を接触させることによって、該物質を除去することによって可能になる。こうした処理は、活性物質が比較的高濃度で存在する細胞内の領域（３６４）とその濃度がより低く、場合によっては活性物質が本質的に含まれ得ない細胞内の領域（３６６）により特徴付けられる細胞内勾配を確立し得る。
【００８０】
細胞内の活性物質の程度、特徴、及び分布は、細胞の物理／生物物理／化学／生化学特性、及び活性物質の特性、及び単一細胞処理を実施する微小流体ネットワークの設計／操作変数の関数として、既知の質量輸送の原理、又はその直接の適用を使用して、評価、モデル化、又は予測され、活性物質の細胞内での空間分布を予測することが可能である（こうした質量輸送のよく知られた原理は、例えば、それぞれすでに参照し、本明細書に援用した Ｂｉｒｄ， Ｒ． Ｂ．， Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｒ． Ｅ．， ａｎｄ Ｌｉｇｈｔｆｏｏｔ， Ｅ． Ｎ．， １９６０；Ａｔｋｉｎｓ， Ｐ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， １９９４；Ｋａｍｈｏｌｚ， Ａ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， １９９９；及び、それぞれ本明細書に援用される、Ｃｒａｎｋ， Ｊ．，「拡散の数学」オックスフォードユニバーシティプレス、オックスフォード（１９７５）；Ｂｌａｔｔｅｒ， Ｌ． Ａ． ａｎｄ Ｗｉｅｒ， Ｗ． Ｇ．，「蛍光カルシウム指示薬、ｉｎｄｏ−１及びｆｕｒａ−２の細胞内拡散、結合、及びコンパートメント化」Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， Ｖｏｌ． ５８， １４９１−１４９９ （１９９０）；及び、Ｂｌｕｍ， Ｊ． Ｊ．， Ｌａｗｌｅｒ， Ｇ．， Ｒｅｅｄ， Ｍ．， ａｎｄ Ｓｈｉｎ， Ｉ．，「細胞骨格ジオメトリーの細胞内拡散に及ぼす効果」Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， Ｖｏｌ． ５６， ９９５−１００５ （１９８９） において論じられている）。
【００８１】
以下に提示する例示は、上記に論じた質量輸送のよく知られた原理を活用して本発明者が開発した、図２Ａ〜Ｃに例示される条件により処理されるモデル細胞（３５０）において生成される細胞内濃度勾配の数学的記述である（即ち、不透過性の基体（３２０）へ付着した矩形の細胞（図２Ｃ上）であり、位置（ｘ）とともに変化し得る、流体フロー方向の寸法（ｗ）、流体フローへ垂直な方向の無限長さ（ｘ）、及び厚さ／高さ（ｈ）を有し、細胞内で自由拡散可能である一様分布した膜透過性活性物質のバルク濃度（Ｃ０）を含有するフロー成分（３５２）と、活性物質を本質的に含まないフロー成分（３５８）へ曝露され、フローの成分の間には無限に薄い界面（３５６）がある）。こうした条件での細胞（３５０）内の活性物質の細胞内濃度勾配は、以下の等式１により近似することが可能である：
【００８２】
【化１】
2004512833.tif 000002
式１において、Ｄ（ｃｍ２／ｓ）は拡散係数であり、ｃは活性物質の濃度であり、Ｐ（ｃｍ／ｓ）は細胞の形質膜を通る物質の透過定数であり、ｈ（ｃｍ）はある位置ｘでの細胞の高さである。
【００８３】
モデル細胞（３５０）を考慮し、ｃ０＝Ｃ０であり、ｃ∞＝０である（即ち、ｘ＝０でｃはいつでもＣ０であり、ｘ＝∞でｃはいつでも０である）という境界条件である、図２Ａに例示されるような特定の態様では、定常状態（例えば、δｃ／δｔ＝０である場合）での濃度勾配についての解析解が：
【００８４】
【化２】
2004512833.tif 000003
により表される。上記の分析は、活性物質の分子が細胞内の不動成分へ結合することによるか、又は幾何学的な障壁により起こり得る、見かけ拡散速度の減少とは無関係である。
【００８５】
等式１は、図２Ａに示される容積要素ｗｈｄｘ（３５７）を考慮することによって導くことが可能である。活性物質の分子の、細胞内拡散によるこの容積要素へのエントリー速度は：
【００８６】
【化３】
2004512833.tif 000004
により表される。活性物質の分子の（水平矢印の方向での）細胞内拡散による、そして形質膜を通した透過による分子の細胞からの流出による、活性物質の分子のこの容積要素からの除去の速度は：
【００８７】
【化４】
2004512833.tif 000005
により表される。活性物質の分子のこの容積要素中の蓄積の速度は、先の２つの関係の差であり：
【００８８】
【化５】
2004512833.tif 000006
により与えられる。濃度の変化の速度（δｃ／δｔ）（即ち、蓄積／溶液（ｗｈｄｘ）の速度）は、上記の等式１に示される表現により与えられる。
【００８９】
ｃ０＝Ｃ０、及びｃ∞＝０の境界条件では、細胞内の濃度プロフィールの進展についての解析解を、定常状態に先立つ時間の関数として得ることが可能である：
【００９０】
【化６】
2004512833.tif 000007
この式を使用して、濃度勾配が、その定常状態値の９０％より多いところに達するのに必要とされる時間を、約０．２〜２００ｓ−１の間に及ぶＰ／ｈ値でのＤ＝５ｘ１０−６ｃｍ２／ｓでは、約１０秒未満であると算定した。
【００９１】
図２Ｂは、モデル細胞（３５０）での典型的な迅速拡散低分子活性物質の定常状態細胞内濃度勾配（Ｄ＝５ｘ１０−６ｃｍ２／ｓ）について、いくつかのＰ／ｈ値に関して上記の等式を使用した計算結果を例示する。これらの計算値は、図２Ａのモデル細胞（３５０）のような、表面付着細胞において広範囲の透過性を有する低分子活性物質の定常状態細胞内勾配及び細胞レベル以下の局在化を確立する本技術の一般的な応用可能性を例示するが、活性物質の透過性に依存して、様々な程度の空間分割と、細胞内の最大及び最小濃度の領域間の濃度の様々な差がある（即ち、透過性（Ｐ）が高いほど、その差が大きくなる）。例えば、約５μｍの高さの広がった細胞（付着して広がった哺乳動物細胞の多くの型は、約５μｍの最大細胞高さを有する）を含む例示の態様では、上記の計算結果は、少なくとも約１〜約１０−４ｃｍ／ｓの範囲内に及ぶ透過性を有する低分子活性物質の定常状態細胞内勾配及び細胞レベル以下の局在化を確立する本技術の応用可能性を示す。細胞の高さが減少するにつれて（例えば、５μｍ未満）、上記の長期若しくは定常状態細胞内勾配を成功裡に形成させるのに必要とされる活性物質の透過性も上記の範囲全体で減少し（図２Ｂを参照されたい）、そして、そのような薄く広がった細胞に対し、低分子活性物質の定常状態細胞内勾配及び細胞レベル以下の局在化を確立する本技術は、上記の範囲から、約１０−８ｃｍ／ｓ以下までの範囲に及び透過性を有する活性物質のそのような勾配を形成するのに成功裡に利用されるだろう。一般に、高濃度の低分子活性物質の区域は、増加する透過性、減少する細胞の厚さ、及び減少する拡散係数に伴ってより大きい分割で、細胞中に空間的に束縛され得る。
【００９２】
上記の等式２は、細胞内でのｘ方向における活性物質の濃度分布の観察及び検出とともに使用され、選択位置での細胞の相対高さに関連した測定値を決定し、細胞形質膜を通した活性物質の透過に関する測定値を決定することが可能である。図２に例示される態様においては、細胞内の蛍光強度を距離ｘの関数として定量的に決定することによってそのような測定を行うことが可能である。
【００９３】
定数ｃでの等式２に言及すると、定数ｃの点での細胞内拡散距離ｘと細胞の高さｈとの関係は：
【００９４】
【化７】
2004512833.tif 000008
を示す。同様に、定数ｃでは：
【００９５】
【化８】
2004512833.tif 000009
である。このように、本発明は、上記の分析及び技術とともに、様々な位置での基体上に広がった細胞の相対高さを決定し、細胞膜を通る様々な活性物質の相対透過性を比較し、又は、ある活性物質に対する細胞膜の透過性に及ぼす様々な細胞処理の効果を研究するために利用することが可能である。
【００９６】
実験の時間尺度以内で、細胞内で不動である成分と活性物質が可逆的に結合し得て、すべての活性物質がある一定の時間で細胞内を自由拡散しているわけではない態様では、等式７のｘ及びｈ、等式８のｘ及びＰの関係は、定常状態でも有効である。例えば、結合した分子の濃度がＳである場合、等式１は：
【００９７】
【化９】
2004512833.tif 000010
になり、これは等式２にやはり与えられる定常状態の解を有する。さらに、Ｓ∝ｃであるので、等式７及び等式８は、結合して細胞内で固定化される活性物質の部分についても、やはり有効である。
【００９８】
１つの流体又は流れの成分が、それが接触している細胞の部分で生物物理的又は生化学的相互作用を行うのに、他の流体又は流動流れの成分とは異なる可能性を有する、２つ以上の流体又は流体流れの成分と細胞を接触させる本発明の技術を使用する上記の応用に加え、本発明の技術はまた、流体又は流体流れ成分間の界面境界（例えば、図１に例示される境界（３３６）及び（３３８））に近接して接触している細胞の部分で生物物理的又は生化学的相互作用を選択的に行うのに有用である。特定の好ましい態様においては、流体又は流体流れ成分間の界面に近接して起こるこうした生物物理的又は生化学的相互作用が、隣接する流体又は流体流れの成分を隣に、互いに接触して位置づけることによって可能になる。ここで、流体／成分の１つには第一反応体として機能する物質が含まれ、第二の隣接流体／成分には第二反応体として機能する物質が含まれ、拡散混合が起こる境界又は界面領域では、第一反応体と第二反応体との間で化学反応が起こり、界面が接触している細胞の部分で生物物理的又は生化学的相互作用をもたらすことが可能な生成物質を産生する。
【００９９】
図１Ｃへ言及すると、１つのこうした態様において、流体流れ成分（３３０）はその中に水溶性カルボジイミドを包含することが可能であり、一方、流体流れの成分（３３２）は、アミン若しくはカルボン酸、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含有する。そのような態様においては、流体流れの成分（３３０）及び（３３２）の間の界面（３３６）で化学反応が起こる場合があり、細胞（３４０）を標識化することが可能な反応生成物を界面の位置で形成する。
【０１００】
流体／流体流れの成分の界面での反応を利用する他の有用な態様においては、界面で生成される反応生成物としての一酸化窒素の、２つの流体／成分間の界面に近接した細胞の部分へのデリバリーが起こり得る。再び図１Ｃへ言及すると、第一の態様において、流体成分（３３０）は、アルギニンと分子状酸素を含有することが可能であり、一方、流体成分（３３２）は一酸化窒素シンターゼを含有する。別の態様において、流体流れの成分（３３０）は、約８より上のｐＨを有するアルカリ媒体であり、流体流れの成分（３３２）には、その中に溶けたＮ−（Ｎ’−アセチルフェニルアラニルメチレニルオキシ）−Ｎ−フェニルジイミドＮ−オキシドが含まれる。界面の一酸化窒素を形成するさらに別の態様において、流体流れの成分（３３０）はキモトリプシンを含有し、一方、流体流れの成分（３３２）はＮ−（Ｎ’−アセチルフェニルアラニルメチレニルオキシ）−Ｎ−フェニルジイミドＮ−オキシドを含有する。界面の一酸化窒素を形成するさらに別の態様において、流体流れの成分（３３０）はチオールを含有する媒体であり、一方、流体流れの成分（３３２）には、３−ハロゲノー３，４−ジヒドロジアゼト１，２−ジオキシドが含まれる。上記の例に加えて、当業者は、界面で反応を行うための多様な他のシステムを容易に想定することが可能であり、この界面は、界面反応の生成物により細胞上で行われる有用な生化学的又は生物物理的相互作用を創出、研究、分析することなどのために単一細胞上に位置する。
【０１０１】
本発明の上記及び他の態様の機能及び利点は、以下の実施例からより完全に理解されるだろう。以下の実施例は、本発明の利益を例示するために意図されているが、本発明の範囲全体を具体化するものではない。
【０１０２】
【実施例】
実施例１　ＤＮＡ／ＲＮＡ結合剤の細胞内勾配の形成と、細胞内拡散の程度を測定することによる、特定位置での細胞の相対厚さの測定
ａ．装置製作
いずれもすでに本明細書に援用された、Ｄｕｆｆｙ， Ｄ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ， １９９８ 及び Ｔａｋａｙａｍａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ． に記載のレプリカ成型法により表面上のフォトレジスト（ＳＵ−８−５０，ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）に形成される毛管チャネルの正レリーフを有するシラン処理化シリコン（Ｓｉ）上でプレポリマー（Ｓｙｌｇａｒｄ　１８４，ダウコーニング）を硬化することによって、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）の負レリーフを形成した。このように形成したＰＤＭＳ膜（３０１）を、負レリーフのミクロチャネルシステムとともに、顕微鏡カバーガラス（３２０）上に置き、流体のフローチャネルとして機能することが可能な毛管チャネルの形成をもたらした。使用前にプラズマ酸化や他の方法によりＰＤＭＳを親水性にする必要はなく、このＰＤＭＳ膜を絶縁接触により顕微鏡カバーガラスに対して密封した。生じたミクロチャネルシステム（３００）（図３Ａに示される）は、出口ウェル（３０４）と、入口ウェル（３１２）、（３１４）、及び（３１６）によりそれぞれ吸込まれる３つの吸込チャネル（３０６）、（３０８）、（３１０）と流体連結した主流チャネル（３０２）を有した。この吸込チャネルは合流点（３１８）で主流チャネル（３０２）へ集束した。このチャネルのそれぞれは、幅約３００μｍで、深さ約５０μｍであった。
【０１０３】
ｂ．細胞の培養及び付着
ウシ副腎毛細管上皮（ＢＣＥ）細胞を培養し、本明細書に援用される、Ｄ． Ｅ．Ｉｎｇｂｅｒ ＆ Ｊ． Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． １０９， ｐｐ． ３１７−３３０， １９８９ に記載のように収穫した。簡潔に言えば、１０％　ＣＯ２下、ゼラチンでコートしたペトリ皿（ファルコン）上で、１０％仔牛血清（ＣＳ）、２ｍＭグルタミン、ストレプトマイシン　１００μｇ／ｍｌ、ペニシリン　１００μｇ／ｍｌ、及び塩基性線維芽球増殖因子（ｂＦＧＦ）１ｎｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ（ギブコ）中において細胞を培養した。トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を培養プレートから解離させ、１％　ｗｔ／ｖｏｌ　ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ（ＢＳＡ／ＤＭＥＭ）中で洗浄した。これらの細胞を、本明細書に援用される Ｄ． Ｅ． Ｉｎｇｂｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ． ８７， ｐｐ． ３５７９−３５８３ （１９９０） に記載のように、化学的に規定される培地（ＢＳＡ／ＤＭＥＭ中、高密度リポタンパク質１０μｇ／ｍｌ；トランスフェリン５μｇ／ｍｌ；ｂＦＧＦ　５ｎｇ／ｍｌ）に懸濁し、入口ウェルから毛管ネットワーク（フィブロネクチン５０μｇ／ｍｌで１時間前処理した）へ導入し、１０％　ＣＯ２下、３７℃で４〜６時間インキュベートして、ミクロチャネルネットワークの底面を形成するカバーガラススリップ上での付着と広がりを可能にした。結合と付着を可能にする上記のインキュベーションの後で、それぞれのフローチャネルを媒体（１％　ｗｔ／ｖｏｌ．ＢＳＡ／ＤＭＥＭ）で約３分間、約０．６ｃｍ／ｓ（Ｒｅ＜１）の最大バルクフロー速度で洗浄することによって、非付着細胞を除去した。
【０１０４】
ｃ．細胞内勾配の形成
次いで、入口ウェル（３１２）を、膜透過性蛍光核酸結合色素−Ｓｙｔｏ９の溶液（ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）中、６０μＭ）で満たした。入口ウェルを、Ｓｙｔｏ９を含まない同様の溶液で満たした。出口ウェル（３０４）中の流体を規則的な間隔で吸引し、チャネル中のフローを推進する水圧ヘッドの差を維持した。
【０１０５】
流動流れと付着ＢＣＥを、図３Ｂに図示されるように、蛍光倒立顕微鏡を利用して視覚化した。メインチャネル中のフローの第一成分（Ｓｙｔｏ９が含まれ、顕微鏡下で蛍光グリーンに見える）と第二の澄明なＳｙｔｏ９フリーの成分を分かつ界面が明瞭で、細胞の主要本体部分上に位置づけられるように位置した細胞を観察用に選択した（図２を参照されたい。ここでは、界面位置が白い点線にほぼ対応する）。Ｓｙｔｏ９の拡散誘導勾配が細胞の外部に存在する、２つの流れ成分間の界面の領域の厚さを最小化するために、細胞を、それが合流点（３１８）から約５００μｍ未満に位置するように選択した。
【０１０６】
細胞内拡散がほぼその定常状態値に達するまで（約１０分間）、フローを維持した。図２Ｃ（下）は、定常状態で観察されたＢＣＥ細胞の外観を図示する蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントを示す。この顕微鏡写真の真上にある細胞の略断面図（図２Ｃ（上））は、フローの様々な領域における細胞の相対厚さと、並びに、細胞内と細胞及び外部媒体の間のＳｙｔｏ９の全体移動の方向（矢印）を示す。上記の理論分析（即ち、上記の等式７で展開した関係：ｘ∝√ｈ）から予測されるように、Ｓｙｔｏ９含有媒体の層流境界（点線）から細胞内移動フロント（細胞内の蛍光グリーン域の右端の広がり、図では「グリーン」と標示される）までの距離は、より薄い部分（３５１）に比較して、細胞のより厚い部分（３５３）においてより大きい。
【０１０７】
実施例２　様々な蛍光団を使用して、単一ＢＣＥ内に２つの空間的に局在化したミトコンドリアの集団を産生すること
装置製作、及び細胞培養、及びＢＣＥ細胞の付着を、上記実施例１に記載のように行った。チャネル中のフローの創出及び維持と主流チャネル（３０２）（図３Ａ）中に確立されたフロー流れの２成分の界面にまたがって位置するＢＣＥ細胞の選択及び観察を、先に実施例１に記載したのと類似のやり方で行った。
【０１０８】
実験の開始時に、チャネルシステム（図３Ａを参照されたい）の右端入口ウェル（３１６）を、膜透過性グリーン蛍光ミトコンドリア特異的色素（Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ　ＧｒｅｅｎＴＭＦＭ、モレキュラープローブス、ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳ中３μＭ）の溶液で満たし、これが観察するＢＣＥ細胞の右部分に流動するようにし、一方、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ　ＧｒｅｅｎＴＭＦＭ色素を含まないこと以外は同様の媒体を、入口ウェル（３１２）及び（３１４）へ加え、観察するＢＣＥ細胞の左部分で５分間流動させた。次いで、チャネルを色素フリー培地で短く洗浄し、ＢＣＥ細胞の顕微鏡写真（４８８ｎｍでの励起、ＦＩＴＣフィルター）（そのグレースケールプリントを図４Ａに示す）を撮影した。図４Ａの白い点線は、蛍光色素を本質的に含まないフリーの成分（左）とＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ　ＧｒｅｅｎＴＭＦＭ色素（右）を含有するフローの成分との間の界面の位置を明示する。
【０１０９】
引き続き、膜透過性Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ　ＲｅｄＴＭＣＭ−Ｈ２ＸＲｏｓ（モレキュラープローブス、ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳ中３μＭ）を細胞の左部分で流動させたが、色素フリー媒体（ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳ）を細胞の右部分で、１分間流動させた。Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ　ＲｅｄＴＭ溶液を入口ウェル（３１２）へ、そして色素フリー媒体を入口ウェル（３１４）及び（３１６）へ加えることを除き、直前の記載と本質的に同じフロー方法を実施した。次いで、上記のように、チャネルを色素フリー培地で短く洗浄し、細胞の蛍光顕微鏡写真（５６０ｎｍでの励起、ＴＲＩＴＣフィルター）（そのグレースケールプリントを図４Ｂに示す）を撮影した。やはり、図中の白い点線は、細胞上のフロー流れの色素含有成分と色素フリー成分との界面の位置を明示する。
【０１１０】
次いで引き続き、細胞全体を、膜透過性蛍光ブルー核染色色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２，モレキュラープローブス、ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳ中１０μＭ）を含有する媒体で洗浄した。次いで、上記のように、細胞を色素フリー培地で短く洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。図４Ｃは、４８８ｎｍ励起、ＦＩＴＣフィルター（グリーン）、５６０ｎｍ励起、ＴＲＩＴＣフィルター（レッド）、及び、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素（ブルー）を可視化するための光学フィルターで観察したＢＣＥ細胞のオーバーレイを、細胞の位相差像と一緒に示す、顕微鏡写真のグレースケールプリントである。レッド染色したミトコンドリアが細胞の左手部分に選好的に隔離され、グリーン染色したミトコンドリアが細胞の右手部分に隔離されていることに注目されたい。
【０１１１】
図４Ｄは、上記の蛍光及び位相差像のオーバーレイを図示する顕微鏡写真のグレースケールプリントであるが、上記のように細胞のパーツを蛍光ミトコンドリア染色で選択処理してから２．５時間後に撮影したものである。この像は、ミトコンドリアが、細胞の基体上の移動方向において、細胞の有意に右手側の方向へ再分布したことを示す（細胞のかなり右端に見える偽足により裏付けられる）。この像は、２．５時間のインキュベーションの後で細胞の左手領域が依然として主にレッド標識ミトコンドリアにより占められているのに対し、細胞の右手領域はレッドとグリーン標識ミトコンドリアが両方含まれることを示す。この観察は、ミトコンドリアが右の方向、偽足の方向へ再分布したことを明示する。上記の方法により、細胞の個別の領域にあるミトコンドリアを様々な蛍光標識で標識化したので、ミトコンドリア運動の全体的なダイナミクスの観察は、ミトコンドリアを均一標識で観察する典型的な先行技術に対して実質的に改善された。
【０１１２】
実施例３　アクチンフィラメントの破壊と、単一ＢＣＥ細胞の処理により誘導されたミトコンドリアを膜透過性アクチン破壊薬で移動させること
装置製作、及び細胞培養、及びＢＣＥ細胞の付着を、上記実施例１に記載のように行った。チャネル中のフローの創出及び維持と主流チャネル中に確立されたフロー流れの２成分の界面にまたがって位置するＢＣＥ細胞の選択及び観察を、先に実施例１に記載したものと類似のやり方で行った。
【０１１３】
この実施例では、単一ＢＣＥ細胞の一部分の細胞透過性破壊剤での選択処理に先立って、微小流体ネットワークへ付着したＢＣＥ細胞を、実施例２に記載のように、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ　ＧｒｅｅｎＴＭＦＭミトコンドリア染色を含有する媒体へ均一に曝露し、微小流体チャネル中のＢＣＥ細胞のそれぞれのミトコンドリアを均一に染色した。ミトコンドリア染色に後続し、アクチン破壊剤での部分的な細胞処理を、ラトルンクリン（ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ）Ａ（ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳ）を含有する媒体で微小流体チャネルネットワークの右端ウェル（３１６）（図３Ａ）を満たすことによって達成した。ラトルンクリンＡを含まないこと以外は同様の媒体を入口ウェル（３１２）及び（３１４）へ加え、先の実施例１に記載のように、実験の間維持した。ラトルンクリンＡ含有媒体が非蛍光性で視覚的に透明であるので、主流チャネル（３０２）中の流体フローのラトルンクリンＡ含有成分とラトルンクリンＡフリー成分との間の界面の位置を決定するために、少量のＤｅｘｔｒａｎ７０，０００−Ｃａｓｃａｄｅ　Ｂｌｕｅ（０．５ｍｇ／ｍｌ，モレキュラープローブ）をラトルンクリンＡ含有培地へ加え、この媒体が、明視野及び位相差顕微鏡で見たときに、ブルーに見えるようにした。
【０１１４】
図５Ａは、ラトルンクリンＡ処理の開始時での３つのＢＣＥ細胞の位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントである。ブルー領域（右−図で「ブルー」と標示）は、ラトルンクリンＡ及びＤｅｘｔｒａｎ７０，０００−Ｃａｓｃａｄｅ　Ｂｌｕｅを含有する媒体のフローを表す。図から見られるように、フロー流れのラトルンクリンＡ含有成分とフロー流れのラトルンクリンＡフリー成分との間の界面を中央細胞上に位置づけた。
【０１１５】
図５Ｂは、図５Ａの中央細胞の蛍光及び位相差像のオーバーレイのグレースケールプリントである。この像は、グリーン染色ミトコンドリア（このうちのいくつかを指摘し、図で「グリーン」と標示する）を示す蛍光顕微鏡写真でオーバーレイした、中央細胞の位相差拡大図である。フロー流れの上記２成分間の界面の位置を白い点線により示す。
【０１１６】
図５Ｃは、図５Ａに示すのと同じ細胞を示すが、２成分フロー流れへ約１０分の間曝露した後のものである。図５Ｄは、ミトコンドリア（グリーン染色、このうちのいくつかを指摘し、図で「グリーン」と標示する）の蛍光顕微鏡写真でオーバーレイした、図５Ｃの中央細胞の位相差拡大図のグレースケールプリントである。図５Ｄ及び５Ｂの比較は、ミトコンドリアの位置が、細胞の右手部分をラトルンクリンＡ含有媒体へ１０分間曝露した後で、細胞の左手（未処理）部分の方へシフトしたことを明示する。図５Ｅは、ラトルンクリンＡでの上記処理の後、アクチン細胞骨格を固定及び染色した（ファロイジン　Ａｌｅｘａ５９４、モレキュラープローブスを用いた−リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドで細胞を１５分間固定化し、０．２％　ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で２分間膜を透過化した後、染料と一緒にインキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄した）後の、図５Ｃに示されるのと同じ３つの細胞の蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントである。図５Ｅは、アクチン細胞骨格が、ラトルンクリンＡへ曝露されなかった左の細胞ではほとんどインタクトであることを示す。対照的に、右端の細胞では、アクチン骨格の実質的な部分が脱ポリマー化されているようである。ラトルンクリンＡ含有媒体へ上記のように部分的に曝露された中央細胞（図５Ｆに最も明瞭に示される）は、その処理された右側部分で明瞭な最高度のアクチン破壊を有し、この部分はまた、（上記の図５Ｄに示されるような）ミトコンドリアの最大の移動を示す領域に対応する。
【０１１７】
このように、本実施例は、細胞のごく一部でアクチンフィラメントを選択的に破壊する本発明の能力を明らかにする。細胞骨格構造は、細胞内での機械的伝達（ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）に重要である。かつては、細胞の細胞骨格の機械特性の研究は、典型的には、細胞に機械的及び局所にストレスをかけるか、又は細胞全体で非識別的に細胞骨格を破壊するかのいずれかの方法を使用した。本実施例で例示されるような本発明とは異なり、典型的な先行技術では、細胞破壊化学品の使用により、単一細胞の一部分だけにおいて細胞骨格を破壊することができない。
【０１１８】
図５Ｄに示されるように、ラトルンクリンＡ含有媒体を細胞の右手部分へ選択的に供給することによって中央細胞の右手領域にあるアクチンフィラメントを破壊すると、ミトコンドリアと核は左方向へシフトしたが、細胞の全体的な周辺形状は比較的不変のままであった。この観察は、細胞の細胞骨格が、アクチンフィラメントが伸張要素であり、微小管が圧縮材として作用するテンセグリティー構造を含むという先行技術での示唆に一致する。細胞の一部分内でのアクチンの局所的な破壊による、主に微小管と会合したミトコンドリアの観察された移動は、この示唆された機序に一致し、その証明となる。
【０１１９】
実施例４　様々な蛍光マーカーへコンジュゲートしたレクチンで標識された、ＢＣＥ細胞の一部にある細胞表面受容体の細胞内輸送の証明
装置製作、及び細胞培養、及びＢＣＥ細胞の付着を、上記実施例１に記載のように行った。チャネル中のフローの創出及び維持と主流チャネル中に確立されたフロー流れの２成分の界面にまたがって位置するＢＣＥ細胞の選択及び観察を、先に実施例１に記載したのと類似のやり方で行った。選択したＢＣＥ細胞の一部を、上記の実施例に記載のように、２成分流動流れの間の界面をこの細胞上に確立することによって、選択したＢＣＥ細胞の一部を選択的に処理した。
【０１２０】
図６Ａ〜Ｃは、蛍光標識した小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）でのＢＣＥ細胞の細胞表面の区域選択的処理の結果を例示する。第一の工程では、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ（ＴＲＩＴＣ−ＷＧＡ、シグマ、ＤＭＥＭ／１％　ＢＳＡ中０．５ｍｇ／ｍｌ）で標識したＷＧＡを含有する媒体を、ＢＣＥ細胞の左手部分で５分間流動させた（図６Ａの蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントにより示されるフロー流れ（左−図で「レッド」と標示されるレッド蛍光域））；そして、第二の工程では、Ａｌｅｘａ４８８で標識したＷＧＡ（Ａｌｅｘａ４８８−ＷＧＡ、モレキュラープローブス、ＤＭＥＭ／１％　ＢＳＡ中０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有する媒体を、同じＢＣＥ細胞の右手部分で５分間流動させた（図６Ａの蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントにより示されるフロー流れ（右−図で「グリーン」と標示されるグリーン蛍光域）；ＢＣＥ細胞の位置を、位相差像のグレースケールプリントにより示す、図６Ｂ（左））。この方法は、細胞表面糖タンパク質の２つの差別的に標識された集団の生成をもたらした（図６Ｂ（右））。図６Ｂ（右）は、フルオレセイン（グリーン）フィルターとローダミン（レッド）フィルターで撮影した偽色彩蛍光顕微鏡写真のオーバーレイのグレースケールプリントである（図では、細胞表面のグリーン及びレッド標識域をそれぞれ「グリーン」及び「レッド」と標示した）。白い点線は、位相差像（図６Ｂ（左））に見られるような細胞の周辺を表す。ＷＧＡは、チャネル床へ吸着した糖タンパク質へも結合し、（細胞の外側の図６Ｂ（右）の染色領域により示されるように）ＷＧＡ含有溶液が流された基体の領域の可視化を可能にした。
【０１２１】
図６Ｃは、図６Ｂに示されるのと同じ領域の、処理後３時間で撮影した蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントを示す。標識化した細胞表面糖タンパク質が細胞内へ輸送された；このことは、前は蛍光がなかった核周囲領域において最も明らかである（図６Ｃ（右）の実線矢印を参照されたい）。図６Ｂ及び６Ｃの２つの位相差像を比較することによって、また、移動細胞により残された非蛍光性「トラック」の存在により、細胞の運動を観察することが可能である（例えば、図６Ｃ（右）の点線矢印を参照されたい）；付着した細胞は、細胞が吸着した基体表面をＷＧＡ溶液が標識することを阻害した（点線矢印により指摘される図６Ｃ（右）のより暗い領域）。
【０１２２】
実施例５　蛍光標識低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を細胞表面の制限部分へ区域選択的にデリバリーすること
装置製作、及び細胞培養、及びＢＣＥ細胞の付着を、上記実施例１に記載のように行った。チャネル中のフローの創出及び維持と主流チャネル中に確立されたフロー流れの２成分の界面にまたがって位置するＢＣＥ細胞の選択及び観察を、先に実施例１に記載したのと類似のやり方で行った。選択したＢＣＥ細胞の一部を、上記の実施例に記載のように、２成分流動流れの間の界面をこの細胞上に確立することによって、選択したＢＣＥ細胞の一部を選択的に処理した。
【０１２３】
図７Ａ〜Ｂは、蛍光標識アセチル化低密度リポタンパク質（Ａｃ−ＬＤＬ）の細胞表面部分への区域選択的デリバリーの結果を示す。媒体流れの２成分を、観察するＢＣＥ細胞の規定領域上に５分間流した。この流れの一方の成分はＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ（過塩素酸１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’、３’−テトラメチルインドカルボシアニン、モレキュラープローブス）を含有し、他方の成分は標識化ＬＤＬを５分間欠いている（１０％　ＣＳ及びＧＰＳ（グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン混合物）を有するＣＯ２非依存性培地（ＧＩＢＣＯ）中５０μｇ／ｍＬ）。
【０１２４】
図７Ａは、ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ含有成分の流れ（右、「グリーン」と標示）と隣接するＬＤＬ−フリー成分の流れ（左）のフローの偽色彩蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントである。この方法は、細胞表面の選択領域上の受容体へ結合するＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬをデリバリーした。細胞表面の受容体への区域選択的な結合の結果を、処理直後の細胞の位相差像及び蛍光顕微鏡写真のオーバーレイのグレースケールプリントである、図７Ｂに示す。本質的にすべての標識受容体が、ＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬを含有する流れの成分へ曝露された部分である、細胞の主要本体の右手側に位置していることに注目されたい。
【０１２５】
予測実施例１：３つの差別的に標識した小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）を単一細胞表面の選択領域へ同時にデリバリーすること
装置製作、及び細胞培養、及びＢＣＥ細胞の付着を、上記実施例１に記載のように行う。
【０１２６】
微小流体チャネル内でのＢＣＥ細胞の付着及び伸展の後で、入口ウェル（３１２）（図３Ａを参照されたい）をテトラメチルローダミンで標識したＷＧＡ（ＴＲＩＴＣ−ＷＧＡ、ＤＭＥＭ／１％　ＢＳＡ中０．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液で満たす。入口ウェル（３１４）を、未標識ＷＧＡを含有すること以外は同じ媒体で満たし、入口ウェル（３１６）を、Ａｌｅｘａ４８８蛍光標識で標識したＷＧＡ（ＤＭＥＭ／１％　ＢＳＡ中０．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液で満たす。主流チャネル（３０２）によりフローを確立し、ＴＲＩＴＣ−ＷＧＡのレッド蛍光とＡｌｅｘａ４８８−ＷＧＡのグリーン蛍光を観察するのに適した光学フィルターの付いた倒立蛍光顕微鏡でフローチャネルを観察する。フローの開始時点で、微小流体ネットワークの合流点（３１８）の約５００μｍ下流にある領域をこの顕微鏡で観察し、適切なＢＣＥ細胞を選択し、該細胞に、フロー流れのＴＲＩＴＣ−ＷＧＡ含有成分と接触した第一左端領域、標識フリーＷＧＡ含有媒体と接触した中央領域、及びＡｌａｘａ４８８−ＷＧＡ−含有媒体と接触した右端領域が含まれるようにする。記載されるように、このフローをＢＣＥ細胞と接触させて約５分間維持する。次いで、場合によっては、ＢＣＥ細胞をＷＧＡフリー媒体で洗浄してもよい。上記のように処理したＢＣＥ細胞の蛍光及び位相差顕微鏡写真のオーバーレイのグレースケールプリントは、細胞表面が、レッドＴＲＩＴＣ−ＷＧＡが結合している左手部分（「レッド」と標示）、Ａｌｅｘａ４８８−ＷＧＡが結合している右手部分（「グリーン」と標示）、及び非蛍光ＷＧＡが結合している中央部分（点線の間）を有する、図８（細胞の左手及び右手部分をそれぞれＴＲＩＴＣ−ＷＧＡ及びＡｌａｘａ４８８−ＷＧＡで連続処理することにより調製した）に図示されるものと同様に標識されると予測されることを示す。
【０１２７】
当業者は、本明細書に記載されるすべての変数及び配置が例示的なものであること、そして実際の変数及び配置は、本発明のシステム及び方法が使用される特定の応用に依存することを容易に理解されよう。当業者は、定型的な実験法を使用するだけで、本明細書に開示される本発明の特定の態様を認識し、確認することができるだろう。したがって、上記の態様が例示のためだけに提示されていること、そして付帯の特許請求項とその同等物の範囲内で、具体的に記載されたものとは異なるやり方で本発明を行うことが可能であることが理解されるべきである。本発明は、本明細書に記載の個別の特性、システム、又は方法にそれぞれ向けられる。さらに、そのような特性、システム、又は方法のいかなる組合せも、そのような特性、システム、又は方法が相互に矛盾しなければ、本明細書の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、微小流体システムの１つの態様の略側面図である。
図１Ｂは、図１Ａの微小流体システムの略正面図である。
図１Ｃは、図１Ｂの微小流体システムの一部分の拡大図である。
図１Ｄは、図１Ｂに示されるような微小流体システムにより確立された三成分流体フローのフロー流れの略正面図である。
図２Ａは、本方法の１つの態様にしたがって処理されるモデル細胞の略透視図である。
図２Ｂは、細胞厚さに対する透過率の様々な比についての、図２Ａのモデル細胞内の位置を関数とした細胞内濃度勾配のグラフである。
図２Ｃは、本発明の１つの態様にしたがって処理された細胞の略断面図（上）を示し、そしてさらに、そのように処理された細胞の正面蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントを示す（下）。
図３Ａは、２成分流体流れを創出するように配置されるような、図１Ｂの微小流体ネットワークの略透視図である。
図３Ｂは、図３Ａの微小流体ネットワークの一部分の拡大図である。
図４Ａは、本発明の１つの態様にしたがって細胞の右手領域にあるミトコンドリアを選択的に染色した後の細胞の正面蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントである。
図４Ｂは、細胞の左手領域にあるミトコンドリアを選択的に染色した後の図４Ａの細胞の正面蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントである。
図４Ｃは、ミトコンドリアを選択的に染色した直後の細胞の右手及び左手領域にある、異なって染色されたミトコンドリアを示す、図Ｂの細胞の正面蛍光顕微鏡写真及び位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントのオーバーレイである。
図４Ｄは、ミトコンドリアに再分布する時間を与えた後で撮影した、図４Ｃの細胞の正面蛍光顕微鏡写真及び位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントのオーバーレイである。
図５Ａは、本発明の１つの態様にしたがって、細胞をアクチン破壊剤で選択的に処理することを開始した時点での３つの細胞の正面蛍光顕微鏡写真及び位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントのオーバーレイである。
図５Ｂは、図５Ａの中央細胞の正面蛍光顕微鏡写真及び位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントのオーバーレイである。
図５Ｃは、細胞をアクチン破壊剤で選択的に処理することが完了した後の、図５Ａの３つの細胞の位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントである。
図５Ｄは、図５Ｃの中央細胞の正面蛍光顕微鏡写真及び位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントのオーバーレイである。
図５Ｅは、細胞の細胞骨格の固定及び染色後の、図５Ｃの３つの細胞の正面蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントである。
図５Ｆは、図５Ｅの中央細胞の正面蛍光顕微鏡写真及び位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントである。
図６Ａは、本発明の１つの態様にしたがって単一細胞を処理するための蛍光標識化レクチンがそれぞれ含まれる、左及び右の流体流れ成分の正面蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントを示す。
図６Ｂは、図６Ａに示されるような標識化レクチンを包含する流体流れ成分で処理した直後の細胞の、位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントと正面蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントを示す。
図６Ｃは、図６Ｂに示される細胞の、３時間後に撮影した、位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントと正面蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントを示す。
図７Ａは、左右の流体流れ成分の正面蛍光顕微鏡写真のグレースケールプリントであり、右成分には、本発明の１つの態様にしたがって単一細胞を処理するための蛍光標識化リポタンパク質が含まれる。
図７Ｂは、図７Ａに示される流体流れに曝露された細胞の正面蛍光顕微鏡写真及び位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントのオーバーレイであり、異なって標識化された細胞形質膜の右手及び左手の領域を示す。
図８は、本発明の１つの態様にしたがって処理された、異なって処理された３つの領域を有する細胞の正面蛍光顕微鏡写真及び位相差顕微鏡写真のグレースケールプリントのオーバーレイである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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