(57)【要約】本発明は、それ以上の延長を阻害し、それらが付着した塩基を一意的に識別する切断可能タグによって、３’末端が標識化されているｄＮＴＰを利用する、核酸分子の塩基配列を決定するための新規なシステムを提供する。次回の延長のためにタグを除去することによって、延長生成物の３’末端は解放される。関連する実施形態では、塩基配列に関連した切断可能タグを有するオリゴヌクレオチドを連結反応に用いて、特定のＤＮＡサンプルの塩基配列を決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（ａ）一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的なオリゴヌクレオチドを前記一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズするステップと、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと、他のｃｄＮＴＰとそれを区別する切断可能タグ（ｃｄＮＴＰ）によってそれぞれ３’末端が標識化されている、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰからなる４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）とを設けるステップと、
（ｃ）末端が標識化されている相補的な１つのｃｄＮＴＰを付加することによって、前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている前記一本鎖ＤＮＡを、ポリメラーゼ延長反応において延長させるが、延長ｃｄＮＴＰのタグによって、ＤＮＡポリメラーゼによるさらなる延長が阻害されるステップと、
（ｄ）前記相補的ｃｄＮＴＰからタグを切断するステップと、
（ｅ）前記タグを検出し、それによって、前記相補的ｄＮＴＰを同定するステップと、
を包含する方法。
【請求項２】
前記一本鎖ＤＮＡ上に延長していない過剰のｃｄＮＴＰを除去するステップをさらに包含する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一本鎖ＤＮＡサンプルに対し、ステップ（ａ）〜（ｅ）を繰り返すステップをさらに包含する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記切断可能タグが、化学的切断によって切断可能である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記切断可能タグが、酸で切断可能なタグである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記切断可能タグが、塩基で切断可能なタグである請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記タグが、光で切断可能である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タグが、蛍光タグである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タグが、質量タグである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
核酸の塩基配列を決定する方法であって、
（ａ）それを他のオリゴヌクレオチドとは区別する１つ以上の切断可能タグによって３’末端が標識化されている相補的オリゴヌクレオチドを、前記一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズさせるステップと、
（ｂ）前記連結している相補的オリゴヌクレオチドから前記１つ以上のタグを切断するステップと、
（ｃ）前記１つ以上のタグを検出するステップと、
を包含する方法。
【請求項１１】
前記相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイズが、プライマーに隣接して起こる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを前記プライマーに連結することをさらに包含する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一本鎖ＤＮＡに連結されていない過剰のオリゴヌクレオチドを除去するステップをさらに包含する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記一本鎖ＤＮＡに対して、ステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すステップをさらに包含する請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のタグが、化学的切断によって切断される請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記切断可能タグが、酸で切断可能なタグである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記切断可能タグが、塩基で切断可能なタグである請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記タグが、光で切断可能である請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記タグが、蛍光タグである請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記タグが、質量タグである請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＤＮＡ塩基配列決定は、生物体からの遺伝情報を構築するのに不可欠な重要な分析技法である。迅速かつ正確なＤＮＡ塩基配列決定の有効性が増したことによって、ヒトゲノムを含む、ゲノム全体のＤＮＡ塩基配列の決定が可能になった。ＤＮＡ塩基配列決定によって、分子生物学研究の分野に革命がもたらされた。加えて、ＤＮＡ塩基配列決定は、臨床において重要な診断ツールになってきており、例えば、単一のＤＮＡ塩基の変化またはいくつかの塩基の変化の迅速な検出を利用して、遺伝病または癌を検出することが可能である。
【０００２】
現在のＤＮＡ塩基配列決定法の大部分は、サンガー法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３（１９７７））に基づくものである。この方法は、プライマーの重合延長反応が放射性標識化されたジデオキシヌクレオチドトリホスフェートの混入によって停止される場合に生じる一本鎖核酸断片のゲル電気泳動に依存するものである。ＤＮＡポリメラーゼとデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）を利用して可変長のＤＮＡを生じる条件下において、短鎖のＤＮＡが合成される。少量のジデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）をＤＮＡ合成混合物に添加すると、連鎖停止ｄｄＮＴＰが成長鎖に取り込まれる場合もある。典型的に、それぞれ少量の１つのｄｄＮＴＰを含む、４つの異なる延長反応が並行して実施される。各延長反応によって、既知のｄｄＮＴＰによって終端されている種々の長さをもつＤＮＡ混合物が得られる。ある特定の延長反応におけるＤＮＡ断片の集団内に、関連ｄｄＮＴＰによって終端されているあり得べき全ての長さの（ある最大値までの）断片が含まれるように、ｄｄＮＴＰ対ｄＮＴＰの比は選択されている。核酸断片は、ゲル内で、典型的には検出される４つの終端ヌクレオチド塩基のそれぞれについてポリアクリルアミドゲル内の異なるレーンを利用して、長さに基づいて分離される。しかしながら、こうしたサイズ排除クロマトグラフィは、一般的に、短い塩基配列の読み取りに制限される低分解能な方法である。
【０００３】
この方法のバリエーションでは、放射能ではなく色素を用いてｄｄＮＴＰを標識化する。異なる色素を用いて、異なるｄｄＮＴＰの各々に固有の標識を付す（即ち、異なる色素と、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ終端の各々を関連づけることが可能である）（Ｓｍｉｔｈら及びＰｒｏｂｅｒらによる、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：３３６−３４１，１９８７）。Ｓｍｉｔｈの方法では、ｄＮＴＰの３’末端に蛍光色素を結合させて、ｄｄＮＴＰに転換する。４つの異なる色素標識を用いることによって、配列決定反応全体を単一反応器において実施可能になり、結果として、種々のＤＮＡ断片に関する信号応答がより均一になる。色素終端ｄＮＴＰはまた、単一レーン内で電気泳動させることも可能である。キャピラリ電気泳動法の出現によって、さらに、この方法の分離効率は増し、実施時間は短縮され、読み取りは長くなり、感度は高められた。
【０００４】
これらの進歩にもかかわらず、電気泳動法に依存し、ＤＮＡ断片をそれらのサイズに基づいて区別するＤＮＡ配列決定は、電気泳動法の速度及びゲルで検出可能な塩基数によって制限を受ける。さらに、ゲルのリアルタイムイメージングは不可能である。従って、配列決定反応の速度及び信頼性を高めるため、多大の努力を傾注して、これらのステップの自動化が行われてきた。現在では、ゲノム配列決定用途及び日常的な臨床用途の両方に関して高処理量の配列決定を可能にする、自動化ＤＮＡ配列決定装置が利用可能である。しかしながら、これら最近の技法は、依然として面倒であり、特殊化学製品及び熟練した技術者による集中的な労働が必要になる。
【０００５】
最近のＤＮＡ配列決定方法の１つである、ＷＯ９８／１３５２３に開示の「パイロシーケンシング」または「合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」は、ポリメラーゼ反応において遊離する無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）を検出するというコンセプトに基づくものである。サンガー法におけるように、配列決定プライマは、一本鎖ＤＮＡテンプレートとハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼを用いて培養される。その反応には、ポリメラーゼ以外に、酵素であるＡＴＰスルフリラ−ゼ、ルシフェラーゼ、及びアピラーゼと、基質であるアデニン５’ホスホサルフェート（ＡＰＳ）及びルシフェリンが加えられる。次いで、個々のヌクレオチドが加えられる。加えられるヌクレオチドがテンプレート鎖において次に利用可能な塩基に対して相補的である場合、延長生成物に取り込まれる。こうした相補的な塩基の取り込みはピロホスフェート（ＰＰｉ）の遊離を伴い、該ピロホスフェートは、アデノシン５’ホスホサルフェートの存在下で、取り込まれるヌクレオチドの量に対して等モル量のアピラーゼによってＡＴＰに転換される。アピラーゼとの反応で生成されたＡＴＰによって、さらにルシフェラーゼによって媒介されるルシフェリンからオキシルシフェリンへの転換が生じ、ＡＴＰの量、即ち成長ＤＮＡテンプレートに取り込まれるヌクレオチド数、に比例した量の可視光が発生する。ルシフェラーゼ触媒反応によって生じた光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、パイログラム（商標）におけるピークとして検出される。
【０００６】
パイロシーケンシング反応において、反応に付加される第１のヌクレオチドが成長ＤＮＡ鎖において次に利用可能なヌクレオチドに対して相補的でない場合は、光は発生しない。第１のヌクレオチドの付加によって光が発生しない場合には、次いで４つのｄＮＴＰのうちの第２のヌクレオチドを反応に付加して、相補的ヌクレオチドであるか否かがテストされる。このプロセスは、相補的ヌクレオチドが付加され、陽性の光読み取りによって検出されるまで継続される。陽性の光反応が生じるか否かにかかわらず、ヌクレオチド分解酵素であるアピラーゼによって、反応混合物内の取り込まれなかったｄＮＴＰ及び過剰のＡＴＰは引き続き分解される。分解が完了すると、別のｄＮＴＰが付加される。
【０００７】
パイロシーケンシングは、比較的単純に質の高いデータを生成することができるが、この方法にはいくつかの欠点がある。第１に、この方法の生産性は高くなく、１００秒当たり約１つの塩基しか読み取れない。４つのｄＮＴＰのそれぞれを別個にテストしなければならない必要性に加えて、ｄＮＴＰを付加する毎に、新たな酵素を付加しなければならない必要性があるため、反応速度が制限される。さらに、鎖延長反応に用いられるｄＡＴＰが、ルシフェラーゼ酵素の基質として作用することによって、後続のルシフェラーゼに基づく検出反応において妨げになることが分った。最後に、これらの反応は、実施コストが高い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
パイロシーケンシングはＤＮＡ配列決定の簡便さと速度を改善するものの、より迅速な検出を可能にする改良された配列決定法が必要とされている。望ましい技法は、自動化し易く、鎖延長反応と同時に、又はそのすぐ後に、塩基配列情報を明らかにし得るものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、核酸分子を配列決定する新規なシステムを提供する。詳細には、本発明では、当該ｄＮＴＰを他のｄＮＴＰと区別する切断可能タグによって３’末端が標識化されているｄＮＴＰを利用する（例えば、タグを当該ｄＮＴＰに固有のものにすることが可能である）。切断可能タグは、限定はしないが、化学的切断条件あるいは光への露出を含む任意の適切な方法によって、後に除去することが可能な官能基である。切断可能タグにより標識化されているｄＮＴＰは、プライマ延長反応によって一本鎖核酸分子に取り込まれると、それ以上の延長を阻害するため、終端ｄＮＴＰ（ｃｄＮＴＰ）として機能する。しかし、タグを除去すると、ｃｄＮＴＰは転換されて延長可能ヌクレオチドに戻される。
【００１０】
本方法によれば、配列決定プライマは、例えば一本鎖ＤＮＡテンプレートのような核酸テンプレートとハイブリダイズされ、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）及び４つのｃｄＮＴＰ（タグによって終端されているｄＡＴＰ（ｃｄＡＴＰ）、ｄＣＴＰ（ｃｄＣＴＰ）、ｄＧＴＰ（ｃｄＧＴＰ）、及びｄＴＴＰ（ｃｄＴＴＰ））を用いて培養される。ＤＮＡポリメラーゼは、テンプレート鎖上の次に利用可能な塩基に対して相補的なのがどのｃｄＮＴＰであろうと、付加することによってプライマを延長させる。ｃｄＮＴＰはそれ以上延長できないので、取り込まれるｃｄＮＴＰは一本だけである。
【００１１】
単一の塩基の付加が完了すると、反応しなかった（過剰の）ｃｄＮＴＰは、延長プライマ、ＤＮＡポリメラーゼ、及び一本鎖ＤＮＡテンプレートを含む反応混合物から除去される。除去ステップは、当業者には明らかな各種手段のうちの任意の１つによって実施可能である。例えば、反応混合物が、膜（例えば、水、塩、及びｃｄＮＴＰのような小さい分子の通過は許すが、一本鎖ＤＮＡのような大きい分子の通過は許さない限外濾過膜）の取り付けられているチャンバに収容されている場合は、この膜を介して、過剰ｃｄＮＴＰを洗い流すことが可能である。あるいはまた、一本鎖ＤＮＡが固体支持体に付着している場合には、ハイブリダイズされた延長プライマを取り除くことなく、一本鎖ＤＮＡから過剰ｃｄＮＴＰを洗い流すことが可能である。
【００１２】
除去ステップが完了すると、一本鎖ＤＮＡテンプレートに延長しているｃｄＮＴＰからタグが切断される。ある実施形態では、切断は、露光による延長一本鎖ＤＮＡテンプレートからのタグの光切断によって実施し得る。あるいはまた、他の望ましい実施形態では、切断は、例えば酸もしくは塩基のような化学的切断剤に一本鎖ＤＮＡテンプレートをさらすことにより実施される。どちらの切断法が用いられるとしても、結果として、さらなる延長のために、延長生成物の３’末端が解放される。
【００１３】
次に、切断されたタグは膜を介して洗い落とされ、同定のために検出器内に送り込まれ、その結果、一本鎖ＤＮＡテンプレートにおける相補的塩基が同定され、ＤＮＡ配列が決定される。タグの同定に用いられる検出器は、用いられる切断可能タグの種類に応じて選択される。当業者には明らかなように、本発明では、各種タグのうちの任意のものを用いることが可能であり、本明細書において、こうしたタグが説明される。タグの切断が済むと、４つのｃｄＮＴＰが、もとのプライマ延長反応混合物に付加され、延長、タグ切断、及び識別というサイクルが繰り返される。
【００１４】
他の望ましい実施形態では、連結反応に短いオリゴヌクレオチドを用いて、特定のＤＮＡサンプルの配列が決定される。ＤＮＡサンプルの塩基配列は、ＤＮＡポリメラーゼを用いる代わりに、ＤＮＡリガーゼを用いて、プライマに隣接する一本鎖ＤＮＡテンプレートに「Ｘ」相補的塩基（例えば、２ｍｅｒ、３ｍｅｒ、あるいはそれ以上）を一度に取り込むことによって決定される。各オリゴヌクレオチドは切断可能タグを用いてタグ付け及び標識化され、それによって、オリゴヌクレオチド配列内における各塩基の位置が識別できる。さらに、タグによって、オリゴヌクレオチド相互間の連結が阻害される。
【００１５】
本発明のこの形態によれば、テンプレートＤＮＡをオリゴヌクレオチドにさらしてオリゴヌクレオチドをテンプレートＤＮＡとハイブリダイズさせ、それによって、ＤＮＡテンプレートに連結反応を生じさせて、相補的オリゴヌクレオチドの１つを、アニールされたプライマに隣接するＤＮＡテンプレートに取り込むことができる。連結の後、取り込まれなかったオリゴヌクレオチドをＤＮＡサンプルから洗い落とし、タグを切断して解析し、核酸配列を決定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、塩基を同定するために用いられる異なる切断可能タグによりそれぞれ標識化されているアデニン、チミン、グアニン、及びシトシンのデオキシヌクレオチドトリホスフェートを利用する、ＤＮＡ分子の塩基配列を決定するためのシステムを提供する。望ましい実施形態においては、切断可能タグはさらに、取り込まれた塩基から除去されるまで、ポリメラーゼ延長反応中の一本鎖ＤＮＡテンプレートの延長に対し、終結部位としても機能する。除去されると、タグは単離されて同定され、塩基付加及び切断プロセスが繰り返される。即ち、延長、切断、及び検出ステップは、一本鎖ＤＮＡテンプレートの十分な塩基配列が決定されるまで繰り返される。
【００１７】
いくつかの望ましい実施形態によれば、核酸の塩基配列を決定する本発明の方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズするステップ、ここでオリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡの少なくとも一部に対して相補的である、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼと４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ）とを設けるステップ、ここで各ｄＮＴＰの３’末端は、他のｄＮＴＰとそれを区別する切断可能タグ（ｃｄＮＴＰ）により標識化されている、（ｃ）ポリメラーゼ延長反応において相補的ｃｄＮＴＰの１つを付加することによって、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされている一本鎖ＤＮＡを延長するステップ、ここで延長ｃｄＮＴＰのタグによって、ＤＮＡポリメラーゼによるさらなる延長は阻害される、（ｄ）任意選択の、一本鎖ＤＮＡ上に延長されていない過剰のｃｄＮＴＰを除去するステップ、（ｅ）延長ｃｄＮＴＰからタグを切断するステップ、（ｆ）タグを検出し、それによって取り込まれた塩基を検出できるステップ、を包含する。いくつかの望ましい実施形態においては、当該方法に、一本鎖ＤＮＡのサンプルに対してステップ（ａ）〜（ｆ）を繰り返すステップが包含されている。
【００１８】
上述のように、ＤＮＡテンプレート上の延長塩基からタグを切断する前に、取り込まれていない過剰のｃｄＮＴＰを延長反応から除去するのが望ましい。本発明によれば、組み込まれていない過剰のｄＮＴＰを延長ＤＮＡテンプレートから分離する、各種洗浄もしくはすすぎ手順のうちの任意の１つによって、タグを除去することができる。望ましい一実施形態では、延長反応混合物は、例えば、水、塩、及びｃｄＮＴＰのような小さい分子の通過は許すが、ｓｓＤＮＡのような大きい分子をとどめておく限外濾過膜のような濾過膜が取り付けられたチャンバ内に収容されている。この特定の実施形態によれば、洗浄溶液、例えばホスフェート緩衝塩のような緩衝塩溶液が、オリゴヌクレオチドプライマ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｃｄＮＴＰ、及び延長ＤＮＡを収容しているチャンバの限外濾過膜に通され、過剰のｃｄＮＴＰをすすぎ落とす。あるいはまた、ＤＮＡテンプレートが固体支持体に付着している場合には、洗浄液を固体支持体上に流して、固体支持体から過剰のｃｄＮＴＰをすすぎ落とすことが可能である。
【００１９】
関連実施形態では、本発明の配列決定法は、オリゴヌクレオチド連結による配列決定も容易にできる。この技法では、先ずタグ付けされているオリゴヌクレオチドの集団（例えば、タグ付けされているオリゴヌクレオチドは、短いランダム化されたオリゴヌクレオチドの集団とし得る）にＤＮＡテンプレートをさらすことが必要とされる。３’タグによって、オリゴヌクレオチドの３’末端における前記集団内の他のオリゴヌクレオチドとの連結が阻害されるのが望ましい。しかしながら、オリゴヌクレオチドの３’末端以外の位置にタグがある場合には、例えば別の官能基を用いて、オリゴヌクレオチドの３’末端をさらに保護する必要があると判断されるであろう。ＤＮＡテンプレートとタグ付きオリゴヌクレオチドとの混合が済むと、オリゴヌクレオチドプライマに隣接した位置で、オリゴヌクレオチドがＤＮＡテンプレートとハイブリダイズされ、オリゴヌクレオチドとプライマの連結が可能になる。次に、連結されていないオリゴヌクレオチドをＤＮＡテンプレートからすすぎ落とし、連結しているオリゴヌクレオチドからタグを切断し、連結しているオリゴヌクレオチドの塩基を表す切断されたタグを検出する。このサイクルは、上述のように、反復可能であり、各反復毎に、オリゴヌクレオチド混合物の付加が行われる。
【００２０】
いくつかの望ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’末端に付着しているタグ数は、オリゴヌクレオチドの塩基配列長に基づき得る。例えば、塩基３つ分の長さのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの塩基配列順に一致する塩基配列順にて付着している３つのタグによって３’末端が標識化されている。
【００２１】
ポリメラーゼ反応の場合と同様、オリゴヌクレオチド連結反応においても、ＤＮＡテンプレートは、プライマ延長のためにプライマとアニールされる一本鎖ＤＮＡテンプレートである。「一本鎖ＤＮＡテンプレート」とは、任意の一本鎖ＤＮＡテンプレートか、又は部分的に一本鎖の、即ち部分的に二本鎖とし得る一本鎖ＤＮＡテンプレートである。望ましい一実施形態では、３’末端の保護されている、プライマに隣接した塩基配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡテンプレートとアニールし、リガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）を介して隣接プライマと結合する。次に、検出及び同定のため、相補的オリゴヌクレオチドのタグが除去され、次回の連結のために、相補的オリゴヌクレオチドの３’末端が解放される。こうした後続の回では、リガーゼによって、次の保護されいる相補的なオリゴヌクレオチドが延長済みプライマの３’末端に連結され、当該サイクルが繰り返される。
【００２２】
上述のように、オリゴヌクレオチドの集団は、短いランダム化されたオリゴヌクレオチドを含み得る。当業者には明らかなように、オリゴヌクレオチドが長くなるほど、オリゴヌクレオチドの各位置における４塩基間の無作為性に応じて、可能性のある全てのランダムオリゴヌクレオチドの塩基配列を包含するためにより多くのオリゴヌクレオチドを生成しなければならない。例えば、可能性のある全ての２ｍｅｒを包含する２ｍｅｒ集団の生成には１６のオリゴヌクレオチド塩基配列が必要になり、可能性のある全ての３ｍｅｒを包含する３ｍｅｒ集団の生成には６４のオリゴヌクレオチド塩基配列が必要になり、４ｍｅｒの生成には２５６のオリゴヌクレオチド塩基配列が必要になる。最適なオリゴヌクレオチド長の識別に必要とされるのは、ただ単に、短いランダムオリゴヌクレオチド混合物を試験して、オリゴヌクレオチド連結によって最も迅速かつ正確なＤＮＡ配列決定結果をもたらすのがどれであるかを判定することだけである。当然、オリゴヌクレオチドが長くなるほど、同時に検出される、取り込まれている塩基数が増えるため、配列決定反応の進行がより速くなる。この研究方法を利用すると、配列決定反応の各回毎に、プライマに連結されるオリゴヌクレオチド塩基配列が検出され同定される。
【００２３】
いくつかの望ましい実施形態では、例えば、ＤＮＡテンプレートの塩基配列が部分的に決定されている場合、配列決定反応には、可能性のある全オリゴヌクレオチドのうちほんの少数だけしか利用する必要がないものと考えられる（即ち、オリゴヌクレオチドのいくつかの位置が固定されている場合には、ランダム化する必要のある塩基位置が減少し、可能性のある全順列を包含するために必要となるオリゴヌクレオチド数が制限される）。この特定の実施形態の場合、オリゴヌクレオチドをさらに長くすることが可能である（例えば、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ、８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、あるいは１５ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、３０ｍｅｒ以上）。また、状況によっては、同数のタグを利用する必要がない、即ち、塩基毎に１つのタグを利用する必要がないようにもできる。例えば、１つの固有のタグを利用して、オリゴヌクレオチド塩基配列全体を同定することが可能である。
【００２４】
他の望ましい実施形態では、２つ以上の固有のタグを利用して、オリゴヌクレオチド配列全体を同定することが可能であり、タグの総数は、オリゴヌクレオチド内の総塩基数より少なくなる（例えば、各タグによって、オリゴヌクレオチド塩基配列全体内におけるオリゴヌクレオチドの短い順次延長（例えば、３ｍｅｒあるいは４ｍｅｒ等）を同定することが可能である）。関連実施形態では、オリゴヌクレオチド、特に本発明の連結形態において用いられるオリゴヌクレオチドは、全ての位置においてはランダム化されていない場合があり（例えば、いくつかのヌクレオチド位置が固定されている場合）、例えば１-２、１-３、１-４、あるいは１-５位置といった、１あるいは複数の位置においてのみランダム化されていることさえある。これらの状況下においては、可能性のあるバリエーションのうちの少数のみが問題となる。
【００２５】
オリゴヌクレオチド塩基配列長に応じて、オリゴヌクレオチド塩基配列の同定に必要なタグ数が増す実施形態の場合には、多くの固有の質量タグの有効性によって、質量分析法がとりわけ検出に役立つシステムとなる。短いランダムオリゴヌクレオチドの各々を固有のタグにより標識化しなければならないので、短いランダムオリゴヌクレオチドは特定の状況下で最大長になり得る（例えば、オリゴヌクレオチド集団内のオリゴヌクレオチドの長さと数は、種々の固有タグの有効性によって制限され得る）。しかしながら、質量タグは、同じ公称質量で、形態が変化するため、利用可能なタグの多様性は増すことが可能である。
【００２６】
質量分析システムにおいて利用可能な多様性のレベルは、独自のＭＳ／ＭＳ断片化を可能にするのに十分であるが、当業者には明らかなように、取り込まれているオリゴヌクレオチドの同定はＭＳ／ＭＳ親／子遷移（parent/daughter transition）に基づくので、ＭＳ／ＭＳアプローチが用いられる場合、ターゲットＤＮＡサンプルの多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）は不可能である。ＭＳ／ＭＳアプローチは、単一質量を単離し、次いで断片化と質量分析を行う必要がある。多重化は、分離及び断片化が現実的でなくなるほど、あまりにも多い質量をもたらす。しかし、ＭＳ／ＭＳアプローチは、連結反応に用いられるオリゴヌクレオチドのコード化に必要な潜在的質量タグ数を増すのに役立つであろう。
【００２７】
従って、本発明のオリゴヌクレオチド連結形態によれば、一本鎖ＤＮＡテンプレートの塩基配列は、（ａ）相補的オリゴヌクレオチドを、プライマに隣接した一本鎖ＤＮＡテンプレートとハイブリダイズさせること、ここでオリゴヌクレオチドの３’末端は、当該オリゴヌクレオチド塩基配列に固有の１つ以上の切断可能タグにより標識化されている、（ｂ）ハイブリダイズされた相補的オリゴヌクレオチドをプライマに連結すること、ここで、延長したｃｄＮＴＰ上の１つ以上のタグは、ＤＮＡリガーゼによるそれ以上の連結を阻害する、（ｃ）任意選択的に、連結されていない過剰のオリゴヌクレオチドを除去すること、（ｄ）連結されている相補的オリゴヌクレオチドから１つ以上のタグを切断すること、（ｅ）１つ以上のタグを検出すること、によって決定し得る。いくつかの望ましい実施形態では、一本鎖ＤＮＡに対して、ステップ（ａ）〜（ｅ）が繰り返される。
【００２８】
ポリメラーゼ反応の場合と同様に、連結反応においても、ＤＮＡテンプレート上の延長オリゴヌクレオチドからタグを切断する前に、過剰のオリゴヌクレオチドを除去するのが望ましい。オリゴヌクレオチドは、取り込まれていないオリゴヌクレオチドを延長ＤＮＡテンプレートから洗い落とすか、あるいはすすぎ落とすことを包含し得る各種分離手順のうちの任意の１つによって除去することが可能である。ポリメラーゼ反応の場合と同様に、望ましい一実施形態では、連結反応混合物は、短いオリゴヌクレオチドの通過は許すが、ＤＮＡテンプレートのような大きい分子はとどめる濾過膜が取り付けられたチャンバに収容されている。あるいはまた、ＤＮＡテンプレートが固体支持体に付着している場合には、固体支持体上に洗浄液を流して、取り込まれていないタグ付きオリゴヌクレオチドを除去することが可能である。
【００２９】
当業者には明らかなように、塩基配列決定反応で、ＤＮＡポリメラーゼを用いるか、ＤＮＡリガーゼを用いるかに関係なく、本発明では、化学的手段又は光によって切断可能な任意のタグを利用することが可能である。いくつかの望ましい実施形態では、タグは、酸あるいは塩基にさらして切断される。他の望ましい実施形態では、タグは、露光、即ち光切断反応によって切断することもできる。切断可能タグ自体に、タグが付けされるオリゴヌクレオチドもしくは塩基に固有の識別点を付与する任意の官能基が含まれている。本発明によれば、有効なタグには、例えば、蛍光タグ、質量タグ、ＩＲタグ、ＵＶタグ、電位差タグ等が含まれる。例えば、蛍光タグは、プライマの延長反応前に、ｄＮＴＰに付着させ、ｄＮＴＰが延長ＤＮＡ鎖に取り込まれた後、酸、塩基、あるいは光に延長ＤＮＡ鎖をさらすことによって、ｄＮＴＰから切断し、蛍光分光測定を用いて分析することが可能である。単なる別の例として、酸、塩基、あるいは光で切断可能な質量タグは、ＤＮＡテンプレートに取り込まれた後、適切な切断剤を用いて、延長ＤＮＡ鎖から切断することが可能であり、その後、質量分析法を利用して分析することが可能である。
【００３０】
本発明のＤＮＡ配列決定法は、ゲル上のｃＤＮＡ断片を分離する必要がなく、結果として塩基配列の読み取りが長くなるので、既存のサンガー法に基づく方法よりも有利な点を提供する。本方法は、迅速であり、且つ完全自動化可能である。さらに、４つの塩基のうちの１つを選択することと分析することが同時に実施される。
【００３１】
あるいはまた、同定ステップは、反応のサイクルと同時に実施される必要はない。例えば、各サイクルからのタグを収集して、蓄えておくことが可能である（例えば、９６ウェルプレートに）。あるいはまた、各サイクルからのタグを空間的に配列して（例えば、チップ上に）、その位置情報を同定に利用することが可能である。いずれの方法を利用する場合にも、サイクル反応後に、当分野において利用可能な手段によってタグの分析が実施される。こうした収集及び分析は、塩基配列決定反応の速度を高め、当該方法の処理量を増すことが可能である。当然、収集されたタグの分析には、適合する計装器が必要になることは、当業者には理解されよう。
【００３２】
以下、本発明のいくつかの形態に関して、さらに詳述する。
【００３３】
核酸調製
本発明のいくつかの望ましい実施形態では、ＤＮＡサンプルは、一本鎖ＤＮＡテンプレートである。あるいはまた、ポリメラーゼ延長反応において、耐熱ＤＮＡポリメラーゼ酵素が用いられる場合には、ＤＮＡサンプルは、二本鎖とすることが可能である。
【００３４】
本発明のＤＮＡサンプルは、例えば、生体（例えば、哺乳類、魚、バクテリア、寄生体、ウイルス、菌類等）あるいは環境（例えば、水、空気、あるいは固体サンプル）から得られるサンプルだけではなく、人工的にあるいは合成によって生成し得る生体材料（例えば、ファージライブラリ、有機分子ライブラリ、ゲノムクローンプール等）も含めた生体サンプルを含む、任意の利用可能なＤＮＡ供給源から得ることが可能である。生体サンプルの典型的な例には、生体液（例えば、血液、精液、脳脊髄液、尿）、生体細胞（例えば、基幹細胞、ＢもしくはＴ細胞、線維芽細胞等）、及び生体組織がある。あるいはまた、ＤＮＡは、ＲＮＡサンプル（例えば、天然または合成供給源からの）から合成されるｃＤＮＡとすることも可能である。こうしたｃＤＮＡ合成は、逆転写を利用して実施可能であり、こうしたシステムは容易に利用可能である。
【００３５】
ＤＮＡサンプルは、生体供給源からのものか、合成供給源からのものかに関係なく、とりわけ、サンプルＤＮＡ量が少ない場合には、さらに増幅することが可能である。増幅は、例えば、ＰＣＲまたは自立塩基配列複製（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、又はベクターを利用したｉｎ  ｖｉｖｏでの、任意の当該技術で利用可能な方法によって実施することが可能である。あるいはまた、所望の場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの増幅を組み合わせて利用することも可能である（例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎによる、「ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１参照）。本発明の他の実施形態の中には、例えば、連結または切断反応によって、本発明のＤＮＡサンプルを生成することが可能なものもある。
【００３６】
本発明によれば、増幅された又は増幅されていないＤＮＡサンプルは、いずれも固体支持体上あるいは溶液中において固定化されている。増幅ＤＮＡサンプルの場合には、増幅ＤＮＡサンプルを固体支持体に付着させ得るように、増幅手順に修正を施し得ることは、当業者には認識されよう。例えば、選択されたＰＣＲプライマは、固体支持体に固定化することもできるし、又は固体支持体に付着するための手段を付与することも可能である。固定化は、ＰＣＲ増幅の一部として、例えば、支持体に１つ以上のプライマを付着させる場合に行うことが可能である。あるいはまた、１つ以上のプライマが、後続のＤＮＡサンプルの固定化を可能にする、ビオチン基あるいはチオール基のような官能基を有し得る。例えば５’プライマを介する、サンプル中におけるＤＮＡの５’末端の固定化によって、ＤＮＡを固体支持体に付着させ、支持体から遠い、後続の延長プライマとのハイブリダイズ及びポリメラーゼ（又はリガーゼ）による延長に利用可能な、その３’末端を残すことが可能である。あるいはまた、ベクター又は生体サンプルのような非増幅ＤＮＡは、固体支持体への付着を可能にする官能基を含むこともできるし、又は含むように修飾することも可能である。関連実施形態では、ベクターは、サンプルＤＮＡの挿入部位に隣接した固体支持体に付着するための手段を含み、それによって増幅ＤＮＡサンプル及び付着手段を共に排除できる。
【００３７】
固体支持体は、便宜上、例えば、マイクロタイターウェル、ポリスチレンによって活性化されＤＮＡサンプル（例えば、プライマＤＮＡ）と結合する固体支持体、粒子、ビーズ（例えば、ナイロンビーズ、ポリスチレンマイクロビーズ、あるいはガラスビーズ）（ポリサイエンス社、ペンシルバニア州ウェリントン）、ガラス表面、プレート、皿、フラスコ（コーニンググラスワークス社、ニューヨーク州コーニング）、メッシュ（ベクトロンディッキンソン社、カニフォルニア州マウンテンビュー）、膜（ミリポアコーポレーテッド社、マサチューセッツ州ベッドフォード）、ディップスティック、毛細管、中空繊維（アミコンコーポレーション社、マサチューセッツ州デンバー）、金網、及びソリッドファイバ（Ｅｄｅｌｍａｎらによる、米国特許第３、８４３、３２４号明細書、及びＫｕｒｏｄａらによる、米国特許第４、４１６、７７７号明細書参照、参照することでその全てを本明細書に取り入れることとする）、又は例えばアガロース、セルロース、アルギネート、テフロン、あるいはポリスチレンから製造される針、の形態とし得る。磁気粒子、例えば磁気ビーズを固体支持体として利用することも可能であり、こうした材料は、市販されている（ロビンサイエンティフィック社、カリフォルニア州マウンテンビュー）。
【００３８】
固体支持体は、代わりに、又はさらに、例えば、増幅反応に用いられる修飾オリゴヌクレオチドプライマを用いて適切に修飾されているＤＮＡを付着させるための、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アルデヒド基、あるいはアミノ基のような官能基、又はアビジンもしくはストレプトアビジンのような他の成分を有し得る。これらは、一般に、支持体に処理を加えて、例えば、ポリグリコールと共に、ヒドロキシ基を供給するポリウレタン、又はヒドロキシ基を供給するセルロース誘導体、カルボキシ基を供給するアクリル酸もしくはメタクリル酸の重合体や共重合体、又はアミノ基を供給するアミノアルキル化重合体といった、こうした官能基の１つを有する重合体による表面被覆を施すことによって得ることができる。他のさまざまな支持体、及びリンカーを利用したもしくはリンカーを利用しない支持体への／からの核酸分子の付着／分離方法が、米国特許第５、７８９、１７２号明細書に記載されており、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする。
【００３９】
上述のように、ＤＮＡサンプルは、固体支持体に付着させる必要がない。例えば、ポリメラーゼ延長反応は、オリゴヌクレオチドプライマ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｃｄＮＴＰ、及び一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡテンプレートの付加に適応する緩衝剤を有する、プライマ延長反応に関する文脈内にて調製した溶液内で、ＤＮＡサンプルに対して実施される。連結延長反応は、同様に、オリゴヌクレオチドプライマ、ＤＮＡリガーゼ、タグ付きオリゴヌクレオチド、及び一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡテンプレートの存在下で、適合する緩衝液内で実施することが可能である。
【００４０】
延長
適切なＤＮＡサンプルが調製されると、ＤＮＡサンプルは、オリゴヌクレオチドプライマ、ＤＮＡポリメラーゼ、及び４つのｃｄＮＴＰを付加され、プライマ延長反応し、それによって、塩基の１つがＤＮＡテンプレートに取り込まれた後、取り込まれている塩基上の切断可能タグによって延長が阻害される。あるいはまた、上述のように、オリゴヌクレオチド連結反応を利用して、テンプレートＤＮＡサンプルを延長させる。こうした延長反応は、ＤＮＡテンプレート、反応条件等の変動に適応するように修正し得ることは、当業者には理解されよう。さらに、選択されたオリゴヌクレオチドプライマは、ターゲットＤＮＡ塩基配列との適切なハイブリダイズを可能にするのに十分なほど大きくなければならないのは明らかである。さらに、オリゴヌクレオチドプライマは、５’をターゲット塩基配列と直接ハイブリダイズするのが望ましい。プライマ及びプライマ延長反応を選択するための指針については、化学文献、例えばＭａｎｉａｔｉｓらによる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）において見出すことが可能である。
【００４１】
プライマ延長反応におけるポリメラーゼは、ｄＮＴＰ、好ましくはｃｄＮＴＰを一本鎖ＤＮＡテンプレートに取り込む任意のポリメラーゼとし得る。容易に利用することができ、多くが当分野において既知であり、文献において報告されている、適切なポリメラーゼの例として、Ｔ７ポリメラーゼ、クレノウ、及びシーケナーゼが挙げられる。例えば、Ｔ７ポリメラーゼのような一部のポリメラーゼは、オリゴヌクレオチドプライマの配列に含まれている可能性のある、ＤＮＡにおける特異的なリーダー配列を認識することは、当業者には周知であろう。ポリメラーゼ延長反応において、二本鎖ＤＮＡテンプレートが用いられることになる場合には、各回の延長毎に追加のポリメラーゼを付加する必要なく熱サイクルの反復を可能にするため、Ｔａｑポリメラーゼのような耐熱ポリメラーゼを選択するのが望ましい。
【００４２】
周知のように、多くのポリメラーゼは、時には延長に利用可能な３’末端の消化に帰着する、校正又はエラー検査能力を備えている。本発明の方法では、こうした消化によって、結果として、バックグラウンドノイズのレベルが高くなる可能性がある。この問題を回避するため、非校正ポリメラーゼ、例えばエキソヌクレアーゼを欠く（エキソ）クレノウポリメラーゼを利用することができる。さもなければ、延長反応混合物に、ポリメラーゼによる３’消化を抑制するフッ化物イオンあるいはヌクレオチドモノホスフェートを付加することも可能である。さらに、延長される自由な３’末端の数を最大にするため、プライマ／テンプレート上に過剰量のポリメラーゼを用いるのが有利な場合がある。選択に応じて、厳密な反応条件及び反応物濃度を各方式に関して容易に決定し得ることは、当業者には理解されよう。
【００４３】
プライマは、上述の方法により、単一の塩基（又は、単一のオリゴヌクレオチド）により延長させられるため、延長プライマは、反復手順において、後続の塩基（又は、オリゴヌクレオチド）の各付加毎に、全く同じように機能し、配列内の次の１つの塩基あるいは複数の塩基を決定し、サンプル全体の配列決定を可能にする。
【００４４】
分離
ポリメラーゼ延長反応においては、延長ＤＮＡテンプレートからタグを切断する前に、反応混合物から過剰のｃｄＮＴＰを除去して、切断生成物が他の取り込まれていない塩基からの信号によって汚染されないようにしなければならない。上述のように、この分離は、水、塩、及びｃｄＮＴＰのような小さい分子の透過は許すが、ポリメラーゼ及びＤＮＡテンプレートのような大きい分子の透過は許さない薄膜フィルタによって、ｃｄＮＰＴを洗い落とすことによって実施可能である。
【００４５】
リガーゼ延長反応の場合では、延長ＤＮＡテンプレート上のオリゴヌクレオチドからタグを切断する前に、取り込まれていないタグ付きオリゴヌクレオチドを反応混合物から除去して、切断生成物が取り込まれていないタグ付きオリゴヌクレオチドからの信号によって汚染されないようにしなければならない。ＤＮＡテンプレートが溶液内において自由か、又は固体支持体に付着しているかに応じて、それぞれ濾過又は固体支持体の洗浄によって、過剰な取り込まれていないタグ付きオリゴヌクレオチドを除去することが可能である。ＤＮＡリガーゼが、タグ付きオリゴヌクレオチドと共に延長反応混合物から除去される場合には、後続工程において、ＤＮＡリガーゼを延長反応混合物に付加することが必要になることは、当業者には理解されよう。これは、当然、ポリメラーゼがｃｄＮＰＴと共に分離ステップにおいて延長反応混合物から除去される、ポリメラーゼを利用する配列決定反応においても当てはまる。
【００４６】
さらに、当該技術では、多種多様な薄膜フィルタを利用し得ることは、当業者には理解されよう。例えば、限外濾過としても知られる分子濾過は、分子量及び分子サイズに応じて物質を分離するために用いられる膜分離法である。分子濾過は、塩及び他の低分子量の溶質を高分子量の化学種から分離するのにこの上なく適している。分子濾過は、半透膜を横切る圧力差に基づいて、透過可能物質を膜中に移動させる。このため、分子濾過によれば、一般に、溶質が分離され、保留された物質はより迅速に濃縮される。本発明における利用に適した分子濾過膜は、マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポアコーポレーテッド社から購入可能である。
【００４７】
他の望ましい一実施形態では、フロースルーセルを用いて、一本鎖ＤＮＡの分析が行われる。この実施形態においては、タグは、洗い落とされ、検出器に直接送られる。多重化になじみやすいフロースルーセル法のバリエーションの一例は、限外濾過膜がウェルに組み込まれている９６ウェルプレートを利用することである。過剰な試薬は、圧力によって洗い落とされるか、又は遠心分離される。そして次に、タグが延長ヌクレオチド塩基から切断され、濾過膜を介して洗い落とされ、同定すべきタグの種類に適した方法により、分析のために収集される。いくつかの望ましい実施形態では、種々のウェルにタグをプールしておき、同時に分析することによって、さらに大規模なサンプル多重化、並びにさらなる大量処理がもたらされる。
【００４８】
ＤＮＡテンプレートが固体支持体上に固定化されている場合では、分離は、ただ単に、ｃｄＮＴＰ（又は、タグ付きオリゴヌクレオチド）を固体支持体から洗い落とすだけで達成される。例えば、分析のためにＤＮＡを保持する基本的方法の１つは、限外濾過膜の裏側でターゲットＤＮＡを捕獲するのではなく、吸着質の表面にそれを吸着させることである。過剰の試薬は、洗浄液で吸着質の表面をすすぐことによって、吸着しているＤＮＡから洗い落とされる。洗浄ステップに用いられる溶剤は、洗浄ステップ中におけるＤＮＡの損失を回避するように選択しなければならない。
【００４９】
洗浄ステップにおいて、膜を利用して、ＤＮＡから過剰の試薬を洗い落とすのを可能にするという基本概念と、さらに、マイクロ流体チップに膜を組み込むことによって、表面にＤＮＡを吸着させるという概念とを組み合わせることも可能である。溶剤の付加又は洗浄は、電気浸透流を用いて実施することが可能である。この特定の実施形態においては、反応及びサンプルのプーリングは、全て、チップ上で行われるため、ウェルプレート法に比べると、より低コストで処理量を多くすることが可能である。その他の実施形態の中には、例えば、自動化可能な単一装置において、除去、切断、及び検出ステップを連続して（例えば、連続的な流れとして）実施可能なものもある。
【００５０】
切断可能タグ及び検出
本発明によれば、「タグ」は、核酸分子を一意的に識別するために用いられる化学成分である。いくつかの望ましい実施形態では、核酸分子はヌクレオチド塩基である。他の望ましい実施形態では、核酸分子は、ＤＮＡあるいはＲＮＡのような核酸断片である。「タグ」とは、さらに詳細には、タグ変異成分、並びに、何であれその最も近くに結合し得るものを意味する。
【００５１】
本発明のタグは、さらに、１つ以上のある固有の性質を備えている。タグは、他の全てのタグ、とりわけ特定の反応に用いられる他のタグとは区別可能であることが望ましい。他の化学成分との区別は、タグのクロマトグラフィ的作用（とりわけ、切断反応後の）、その分光学的特性あるいは電位差特性、又はそれらのうちのいくつかの組合せに基づき得る。さらに、タグは、１０−２２〜１０−６モルの範囲で存在する場合に検出可能である。さらに、タグは、直に、あるいはリンカー基を介してタグを核酸分子に付着させ得る「ケミカルハンドル」（米国特許第６、０２７、８９０号明細書参照、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする）を介して、例えばヌクレオチド塩基あるいはオリゴヌクレオチドといった核酸分子に付着可能である。いくつかの望ましい実施形態では、タグによって、プライマの延長が阻害される。タグは、さらに、核酸分子への付着及び核酸分子からの切断を含む、それが受ける全ての操作、及びタグが付着している間に施される、核酸分子に対するいかなる操作に対しても安定であり、またタグが付着している間に核酸分子に対して実施される操作（例えば、ハイブリダイズあるいは酵素的反応）の妨げになることもほとんどない。
【００５２】
本発明のタグは、化学的手段あるいは光によって切断可能な任意のタグを包含し、こうしたタグについては、以下に詳述する。化学的に切断可能なタグには、酸又は塩基によって切断可能なタグが含まれる。光で切断可能なタグには、ある波長の光によって切断可能なタグが含まれる。他の切断方法には、酸化、還元、酵素、電気化学作用、熱等によるものが含まれる。
【００５３】
上述のように、タグは、さらに、プライマの延長反応を停止させることが可能である。いくつかの望ましい実施形態では、タグの停止特性は、例えば、延長生成物に対する追加塩基の付加を阻止するほど、タグの構造が十分に大きいといった、タグ構造のような、タグ自体の特性に起因し得る。代わりに、又はそれに加えて、タグの停止特性は、塩基上のタグの配置に起因し得る。いったんタグ付き塩基が付加されると、成長する延長生成物の３’末端に塩基を付加しても、タグによって、付加塩基による３’末端の延長が阻害されるように、塩基に対してタグを付着させるのが望ましい。延長を阻害すると考えられるタグが塩基に直に付着している場合の、こうしたタグ付き塩基の一例を以下に示す。
【００５４】
【化１】
2004531274.tif 000002
【００５５】
あるいはまた、以下に示すように、タグは１つの不安定な結合（又は、複数の不安定な結合）によって、ｄＮＴＰの３’位置に連結されている。
【００５６】
【化２】
2004531274.tif 000003
式中、Ｌはリンカーである。
【００５７】
本発明によれば、リンカーが用いられる場合にはリンカーを含むタグ、又は他の３’阻害基を除去して、塩基の３’ヒドロキシ基を露出させる。典型的なタグ及びリンカーは、米国特許第６、０２７、８９０号に詳述されており、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする。
【００５８】
数多くのタグの利用可能性に鑑みて、任意の数のタグを、ある特定の反応において同時に利用することもでき、又は１つのアレイにおける異なる反応において利用することもできる。特に、後述する連結生成物の検出に関連するいくつかの望ましい実施形態では、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、あるいは５００を超える種々の固有のタグ付き分子をある特定の反応内において同時に利用することが可能であり、この場合、各タグは、選択される塩基、オリゴヌクレオチド、あるいは他の核酸断片に固有のものとされる。
【００５９】
本発明の塩基及び核酸分子に容易に付着する多数の周知のタグの特性は、米国特許第６、０２７、８９０号に記載されており、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする。こうしたタグは、いったん、延長塩基から切断されると、蛍光光度分析法、質量分析法（ＭＳ）、赤外（ＩＲ）分光測定法、紫外（ＵＶ）分光測定法、あるいあは定電圧電流測定法（例えば、電量分析あるいは電流測定検出器を利用した）によって検出可能である。質量分析法は、特に質量検出の多重化が容易にできる。適切な質量分析技法の典型的な例には、飛行時間型質量分析法、四重極質量分析法、扇形磁場型質量分析法、及び扇形電場型質量分析法が含まれる。こうした技法の特定の実施形態には、イオントラップ質量分析法、電気スプレーイオン化質量分析法、イオンスプレー質量分析法、液体イオン化質量分析法、大気圧イオン化質量分析法、電子イオン化質量分析法、高速原子衝撃イオン化質量分析法、ＭＡＬＤＩ質量分析法、光イオン化飛行時間型質量分析法、レーザドロップレット質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、ＡＰＣＩ質量分析法、ナノスプレー質量分析法、噴霧スプレーイオン化質量分析法、化学イオン化質量分析法、共鳴イオン化質量分析法、二次イオン化質量分析法、及び熱スプレーイオン化質量分析法が含まれる。
【００６０】
以下は、本発明に利用できる分離及び検出テクノロジーに関する代表的な供給業者のリストである。パーキンエルマー／アプライドバイオシステムデビジョン社（ＡＢＩ、カリフォルニア州フォスターシティ）は、蛍光色素（ＡＢＩ３７３）及び（ＡＢＩ３７７）をベースにした半自動化シーケンサーを製造している。アナリティカルスペクトラルデバイシィズ社（コロラド州ボールダー）は、紫外分光計を製造している。日立計測器社（日本、東京）は、原子吸光装置、蛍光分光計、ＬＣ及びＧＣ質量分析計、ＮＭＲ分光計、及び紫外−可視分光計を製造している。パースペクティブバイオシステムズ社（マサチューセッツ州フレーミングハム）は、質量分析計（Ｖｏｙａｇｅｒ（商標））を生産している。ブルカーインストゥルメントインク社（マサチューセッツ州マニングパーク）は、フーリエ変換赤外分光計（Ｖｅｃｔｏｒ  ２２）、フーリエ変換−ラマン分光計、飛行時間型質量分析計（Ｒｅｆｌｅｘ（商標））、イオントラップ質量分析計（Ｅｓｑｕｉｒｅ（商標））、及びＭＡＬＤＩ質量分析計を製造している。アナリティカルテクノロジーインク社（ＡＴＩ、マサチューセッツ州ボストン）は、紫外検出器及びダイオードアレイ検出器を製造している。テレダインエレクトロニックテクノロジー社（カリフォルニア州マウンテンビュー）は、イオントラップ質量分析計３ＤＱ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）及び３ｄＱ  Ａｐｏｇｅｅ（商標）を製造している。パーキンエルマー／アプライドバイオシステムデビジョン社（カリフォルニア州フォスターシティ）は、電気スプレーに適合するＳｃｉｅｘ質量分析計（３種の四重極質量分析計ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＩ１００／３００）を製造している。ヒューレットパッカード社（カリフォルニア州サンタクララ）は、質量選択検出器（ＨＰ  ５９７２Ａ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（ＨＰ  Ｇ２０２５Ａ）、ダイオードアレイ検出器、ＣＥ装置、ＨＰＬＣ装置（ＨＰ１０９０）、並びに紫外分光計を製造している。フィニガンコーポレーション社（カリフォルニア州サンノゼ）は、質量分析計（扇形磁場型質量分析計及び他の４つの類似の質量分析計）を製造している。ラニン社（カリフォルニア州エメリービル）は、ＨＰＬＣ計測器を製造している。
【００６１】
当業者には、本発明の方法にこうした装置の適用法は理解されよう。さらに、パイロシーケンシング反応を検出するために用いられる装置が、本発明の切断タグの検出及び同定に適応可能であることは、当業者には理解されよう。例えば、それぞれ、ＷＯ９９／６６１３１に記載の反応監視システム、ＷＯ００／４０７５０に記載のマイクロ流体装置、ＷＯ００／５６４５５に記載の液体分配装置、米国特許第５、３０２、５０９号の固体支持装置は、本発明の方法と共に使用するために採用し得る。
【００６２】
自動化及び高処理量の塩基配列決定
本発明のＤＮＡ配列決定は、完全に自動化可能である。多数のサンプルを容易に分析することが可能なロボット装置を、タグ分子の迅速な検出及び定量化のために活用し得ることは、当業者には理解されよう。検出されるタグは、例えば、質量分析法あるいは蛍光分光測定法といった、分光光度法によって検出することが可能である。照度計、質量分析計、及び他の分光光度装置の利用は、当該技術において周知であり、文献に記載もある。従って、本発明のＤＮＡ配列決定によれば、リアルタイムで、重合反応の進行を連続測定できるようにする、高処理量の、非電気泳動式の塩基配列決定法に関する自動化アプローチが得られる。
【００６３】
関連実施形態では、複数のサンプルを並行して取り扱うことができるのは明らかであり、こうした並行操作によって、本発明の方法にもう１つの利点がもたらされる。大量の塩基配列読み取り処理を実現するため、複数のＤＮＡ塩基配列反応を並行処理することが可能である。この特定の実施形態によれば、本発明のＤＮＡ配列決定は、種々のアレイ形態のうちの任意の１つの内部で実施可能である。
【００６４】
例えば、単一ウェルにおいて実施され、フローインジェクション分析法（ＦＩＡ）を利用して分析される本発明の単一塩基配列決定反応は、６秒当たり約１つの塩基（毎分約１０の塩基、及び、毎時約１００の塩基に相当する）という速度である。この速度を増すために、ＤＮＡ塩基配列決定反応を多重化することが可能である。例えば、２５の塩基配列に多重化すると、塩基配列決定速度は毎時約５０００の塩基にまで増大する。それは本明細書に記載の任意の検出手段に適用可能であるため、当業者には、多重化の能力が理解されよう。並行分析のために多重化することが可能なＤＮＡサンプル数は、１０〜１００、いくつかの場合では１００〜５００、さらに他のいくつかの場合では１００〜１０００以上のＤＮＡサンプルと範囲を設定し得る。
【００６５】
いくつかの望ましい実施形態では、ＤＮＡサンプルが、例えば微細加工されたチップのような表面全域に分布し、その結果、順序付きのサンプル集合が２次元フォーマットで固定化されているような、アレイフォーマットが分析に利用される。これによって、多数のサンプルを並行分析することが可能になる。本発明の本実施形態によれば、塩基配列決定反応の開始前に、使用可能な各種マイクロチップの任意の１つにＤＮＡサンプルが配置される。ＤＮＡアレイを生産し、分析する方法は、当分野において周知であり、米国特許第６、０２７、７８９号において提供されており、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする。
【００６６】
例えば、プライマの延長後に、アレイフォーマットに本発明の方法を適用して、チップ上のＤＮＡサンプルからタグが切断され、分光測定法または電位差測定法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を用いた分析のためにプールされる。本発明のある特定の実施形態では、参照することでその内容の全てを本明細書に取り入れることとする米国特許第６、０２７、７８９号明細書に記載されているように、ＤＮＡアレイ生成装置、洗浄装置、タグ切断装置、検出装置、及び検出装置からのデータを分析して、タグとサンプルからの核酸断片を相関させるデータプロセッサ及びアナライザを備える、アレイインタロゲーションシステムが提供される。配列されたＤＮＡチップは、その表面に、核酸断片、及び例えば核酸断片に付着している切断可能な質量分析用タグのような切断可能タグからなる選択されたＤＮＡサンプルを有している。配列されたＤＮＡチップは、まだＤＮＡチップ上にある間に核酸断片からタグを切断する光分解性切断装置内を通されるか、又はそれを通り越して通過させられる。
【００６７】
タグが切断された後に、ＤＮＡチップは、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）計測器のような自動化マイクロアレイサンプリングレーザ装置に配置される。ＭＡＬＤＩ計測器は、光を照射しタグの脱離を引き起こすように適合されており、タグは、質量分析計のような検出装置に移送され、分子量の差に基づいて同定される。
【００６８】
検出装置からのデータは、所与のタグのシグネチャーを特定のサンプルにマッピングするソフトウェアプログラムを含む、データプロセッサ及びアナライザに供給される。このソフトウェアは、決定されたＤＮＡ塩基配列を表示し、塩基配列情報をそれぞれのデータベースにロードすることが可能である。
【００６９】
代替実施形態では、ＭＡＬＤＩ計測器には、調整可能な強度にて２５０〜３６０ｎｍの波長範囲にて、ＤＮＡチップ全体を照射し得る追加の光源が備えられており、それによってタグの光分解性切断が引き起こされる。即ち、切断装置は、ＭＡＬＤＩ計測器の構成部分として組み込まれている。タグの切断後、ＭＡＬＤＩ計測器によって、タグは揮発させられ、上述のように検出装置に移送される。
【００７０】
さらに他の一実施形態では、ＤＮＡチップは、ＤＮＡアレイ生成装置からＭＡＬＤＩ計測器に直接移動させられる。ＭＡＬＤＩ計測器には、約２５０〜３６０ｎｍの波長範囲で発光するレーザを備えている。このレーザによって、タグの同時脱離に加え、核酸断片からのタグの同時光分解性切断が引き起こされる。タグは、その後、上述のように、質量分析計又は他の検出装置に移送される。従って、この代替実施形態は、ＭＡＬＤＩ計測器による光切断をもたらし、それによって独立した切断装置は不要でなる。
【００７１】
本発明では、タグの検出に蛍光検知が用いられる場合には、これによって、塩基配列決定速度が１５秒毎に１つの塩基（毎分約４つの塩基に相当する）まで増すことになる。１００の塩基配列決定反応がチップの１００のレーンに割り当てられると、これによって、毎時約２４０００の塩基という速度が得られる。同様の塩基配列決定速度は、種々の切断手段で実現可能である。
【００７２】
蛍光タグは、その吸収及び蛍光発光波長及び強度によってほぼ直接的に同定し、定量化することが可能である。従来の分光光度計は極めて柔軟性に富み、連続した励起及び発光波長範囲（ＩＥＸ、ＩＳ１、ＩＳ２）が得られるが、フローサイトメータ及びレーザ走査顕微鏡のようなより特殊な計測器は、単一固定波長で励起可能なプローブを必要とする。最新の計測器の場合、これは、通常４８８ｎｍのスペクトル線又はアルゴンレーザである。
【００７３】
放射性タグも、本発明に適用可能である。放射性タグは、例えば、ＣＣＤ検出器によって検出可能である。
【００７４】
蛍光タグ及び放射性タグを利用するときは、同時に検出可能な異なる反応の数は、例えば、質量タグよりも制限され得る。例えば、一般に、ＤＮＡ塩基配列分析に用いられるような４つの蛍光分子を利用すると、分析は一度に４つのサンプルに制限される。
【００７５】
いくつかの望ましい実施形態では、サンプル反応を少なくとも１つのアレイにプールし、生成物を同時に検出することが可能である。各反応毎に、異なる分子量または他の物理的性質を有する、本明細書に記載されるもののような切断可能タグを利用することによって、反応生成物の集合全体をまとめて収集し、分析することが可能である。
【００７６】
用途
上述の実施形態の本発明は、単純かつ迅速なＤＮＡサンプルの塩基配列決定法を提供する。本発明のこれらの方法では、延長生成物を分離する必要がなくなり、且つ延長反応の迅速、リアルタイムの分析が可能になる。こららの方法には、当業者であればすぐに分る、数多くの用途がある。
【００７７】
少数例を挙げると、本発明は、法医学（例えば、個人の身元確認及びＤＮＡ塩基配列の変異レベルの鑑定）、腫瘍診断（例えば、患者からの生体サンプル内のウィルス性癌遺伝子及び細胞性癌遺伝子の検出用）、移植分析（生体サンプルからの抗原特異的可変ＤＮＡ塩基配列の同定）、若年性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、リウマチ様関節炎、脳脊髄炎のような自己免疫疾患の診断、ゲノム診断（例えば、精神分裂症、躁鬱病、癲癇、鎌状赤血球貧血、地中海貧血、アルファアンチトリプシン欠乏症、レッシュナイハン症候群、嚢胞性線維症、デュシェンヌ／ベッカー型筋欠損症、アルツハイマー病、Ｘ染色体依存性精神薄弱、及びハンチントン舞踏病といった、例えば新生児または成人における遺伝子的欠陥、又は遺伝的及び後天的遺伝子欠陥の識別）、感染病（例えば、生体サンプル内のウィルスあるいは細菌による感染の検出）、突然変異の検出（例えば、生体または人工的供給源からのＤＮＡサンプル内の突然変異塩基の検出）、単一ヌクレオチド変化の検出（例えば、プライマが既知の単一ヌクレオチド多型に隣接した塩基配列とハイブリダイズし、隣接位置に付加されるｃｄＮＰＴが検出され、識別される）の分野に適用可能である。
【００７８】
上述のように、本発明の方法は、ポリメラーの代わりにリガーゼと共に使用するように適合させることが可能である。この技法の一対応例は、極めて大きく、複雑なゲノム内の既知の塩基配列を同定するために用いられる、オリゴヌクレオチド連結アッセイである。上述のリガーゼ延長反応を簡潔に述べると、本アッセイの基礎は、２つの診断オリゴヌクレオチドがある特定のＤＮＡターゲット上で互いに隣接してハイブリダイズする際、それらを共有接合させることができるというリガーゼの能力である。プローブ接合点における塩基配列が完全な塩基対をなしていない場合は、プローブはリガーゼによって接合されない。タグを用いる場合、タグはオリゴヌクレオチドに付着し、そのオリゴヌクレオチドはＤＮＡサンプルと連結する。連結が完了すると、タグは切断され、本明細書に記載の任意の手段（例えば、質量分析法、赤外分光光度法、定電圧電流測定、あるいは紫外／可視分光光度法）によって検出される。
【００７９】
いくつかの望ましい実施形態では、オリゴヌクレオチド連結アッセイを受ける前に、ＤＮＡサンプルが増幅される。
【００８０】
キット
さらに本発明は、少なくとも以下の試薬を含有している、本発明の方法において使用するためのキットを提供する。ａ）特定のＤＮＡテンプレートのプライマ延長に適したオリゴヌクレオチドプライマ、ｂ）アデニン、グアニン、チミン、及びシトシン塩基の４つのｃｄＮＴＰ、ｃ）ポリメラーゼ、ｄ）取り込まれていないｄＮＴＰを延長ＤＮＡテンプレートから分離するための手段、及びｅ）切断手段。本発明のいくつかの実施形態では、検出手段がもたらされるであろう。しかしながら、検出手段は、購入者によって用意される場合も多い。
【００８１】
代替実施形態において、キットが連結塩基配列決定反応アッセイに用いられる場合、当該キットは、少なくとも、ａ）特定のＤＮＡテンプレートのプライマ延長に適したオリゴヌクレオチドプライマ、ｂ）少なくとも１つのタグ付きオリゴヌクレオチド、ｃ）リガーゼ、ｄ）取り込まれていないオリゴヌクレオチドを延長ＤＮＡテンプレートから分離するための分離手段、及びｅ）切断手段、を包含することができる。当該キットはさらに、検出手段も提供する。しかしながら、検出手段は、購入者が用意することも可能である。
【００８２】
本発明の他の実施形態は、本明細書に開示される本発明の明細書の熟考、又は本発明を実践することによって、当業者には理解されよう。本明細書は、単なる例示とみなされることを意図したものであり、本発明の真の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって示される。
【国際公開パンフレット】
2004531274.tif 000004
2004531274.tif 000005
2004531274.tif 000006
2004531274.tif 000007
2004531274.tif 000008
2004531274.tif 000009
2004531274.tif 000010
2004531274.tif 000011
2004531274.tif 000012
2004531274.tif 000013
2004531274.tif 000014
2004531274.tif 000015
2004531274.tif 000016
2004531274.tif 000017
2004531274.tif 000018
2004531274.tif 000019
2004531274.tif 000020
2004531274.tif 000021
2004531274.tif 000022
2004531274.tif 000023
2004531274.tif 000024
2004531274.tif 000025
2004531274.tif 000026
2004531274.tif 000027
2004531274.tif 000028
2004531274.tif 000029
2004531274.tif 000030
2004531274.tif 000031
2004531274.tif 000032
2004531274.tif 000033
2004531274.tif 000034
2004531274.tif 000035
2004531274.tif 000036
2004531274.tif 000037
2004531274.tif 000038
2004531274.tif 000039
2004531274.tif 000040
【国際調査報告】
2004531274.tif 000041
2004531274.tif 000042