(57)【要約】本発明は、本質的に以下の構成因子、ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、ii）１つから５つのＥＦＧリピートドメイン、iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及びiv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドを投与することによって、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、免疫応答を改変する方法を提供する。
2006515177.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから５つのＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項２】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項３】
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから４つのＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項４】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから４つ（かつ、４つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項５】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つ（かつ、１つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項６】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）２つ（かつ、２つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項７】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）３つ（かつ、３つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項８】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）４つ（かつ、４つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項９】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
【請求項１０】
前記Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドが、ヒトＮｏｔｃｈ受容体を活性化する請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記異種アミノ酸配列が、免疫グロブリンＦｃドメインの全体又は一部を含むか、又はコードする請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質、ポリペプチド又はポリヌクレオチドが、哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンド配列の少なくとも一部を含むか、又はコードする請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質、ポリペプチド又はポリヌクレオチドが、ヒトＮｏｔｃｈリガンド配列の少なくとも一部を含むか、又はコードする請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質、ポリペプチド又はポリヌクレオチドが、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ若しくはＪａｇｇｅｄ由来のＮｏｔｃｈリガンドドメイン、又はこれらに対して少なくとも３０％のアミノ酸配列類似性を有するドメインを含むか、又はコードする請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質、ポリペプチド又はポリヌクレオチドが、Ｄｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１若しくはＪａｇｇｅｄ２由来のＮｏｔｃｈリガンドドメイン、又はこれらに対して少なくとも３０％のアミノ酸配列類似性を有するドメインを含むか、又はコードする請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから５つのＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなる単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１７】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含む単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１８】
本質的に、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから４つのＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなる単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１９】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから４つ（かつ、４つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含む単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２０】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つ（かつ、１つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含む単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２１】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）２つ（かつ、２つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含む単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、
各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２２】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）３つ（かつ、３つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含む単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２３】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）４つ（かつ、４つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含む単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって：
各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２４】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含む単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド。
【請求項２５】
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから３つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２７】
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）３つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項２９】
疾患治療における使用のための、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから５つのＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３０】
疾患治療における使用のための、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
疾患治療における使用のための、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから４つのＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３２】
疾患治療における使用のための、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから４つ（かつ、４つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３３】
疾患治療における使用のための、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つ（かつ、１つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３４】
疾患治療における使用のための、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）２つ（かつ、２つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
疾患治療における使用のための、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）３つ（かつ、３つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３６】
疾患治療における使用のための、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）４つ（かつ、４つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
疾患治療における使用のための、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３８】
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから５つのＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法。
【請求項３９】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法。
【請求項４０】
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから４つのＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法。
【請求項４１】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つから４つ（かつ、４つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法。
【請求項４２】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）１つ（１より多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法。
【請求項４３】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）２つ（かつ、２つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法。
【請求項４４】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）３つ（かつ、３つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法。
【請求項４５】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）４つ（かつ、４つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法。
【請求項４６】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ii）５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン、
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部、及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法。
【請求項４７】
請求項２５から３７のいずれか一項に記載のＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４８】
請求項４７に記載のベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞。
【請求項４９】
請求項２５から３７のいずれか一項に記載のＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをその表面に提示する細胞、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質移入された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＮｏｔｃｈシグナル伝達の変調（modulation）に関し、また、好ましくは免疫機能の変調に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第９８／２０１４２号は、免疫治療において、また、Ｔ細胞介在性疾患の予防及び／又は治療において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の操作をどのように使用できるかを記載する。詳細には、アレルギー、自己免疫、移植片拒否反応、腫瘍誘発性のＴ細胞系異常、及び、例えば、マラリア種、ミクロフィラリア、蠕虫、ミコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコッカス、ヘモフィルスインフルエンザＢ型、麻疹、Ｃ型肝炎、又はトキソカラによって引き起こされる感染症が治療されうる。
【０００３】
また、抗原特異的免疫寛容を他のＴ細胞に伝達できる、あるクラスの調節性Ｔ細胞を生成することが可能なことも示されており、この過程は感染性免疫寛容（infectious  tolerance）と呼ばれている（国際公開第９８／２０１４２号）。これらの細胞の機能活性は、それらの細胞表面又は抗原提示細胞表面にＮｏｔｃｈリガンドタンパク質を過剰発現することで模倣できる。具体的には、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質であるＤｅｌｔａファミリー又はＳｅｒｒａｔｅファミリーのメンバーを過剰発現することで、調節性Ｔ細胞を生成することができる。
【０００４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、及びそれによって影響を受けた状態に関する記載は、例えば、我々による以下の公開ＰＣＴ出願に見出すことができる。即ち、ＰＣＴ出願第ＧＢ９７／０３０５８号（１９９７年１１月６日出願、国際公開第９８／２０１４２号として公開；１９９６年１１月７日出願の英国特許出願９６２３２３６．８号、１９９７年７月２４日出願の英国特許出願９７１５６７４．９号、及び１９９７年９月１１日出願の英国特許出願９７１９３５０．２号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ９９／０４２３３号（１９９９年１２月１５日出願、国際公開第００／３６０８９号として公開；１９９９年１２月１５日出願の英国特許出願９８２７６０４．１号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ００／０４３９１号（２０００年１１月１７日出願、国際公開第０１３５９９０号として公開；１９９９年１１月１８日に出願の英国特許出願９９２７３２８．６号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ０１／０３５０３号（２００１年８月３日出願、国際公開第０２／１２８９０号として公開；２０００年８月４日に出願の英国特許出願００１９２４２．７号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０２４３８号（２００２年５月２４日出願、国際公開第０２／０９６９５２号として公開；２００１年５月２５日に出願の英国特許出願０１１２８１８．０号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３３８１号（２００２年７月２５日出願、国際公開第０３／０１２１１１号として公開；２００１年７月２５日に出願の英国特許出願０１１８１５５．１号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３３９７号（２００２年７月２５日出願、国際公開第０３／０１２４４１号として公開；２００１年７月２５日に出願の英国特許出願０１１８１５３．６号、２００２年４月５日に出願の英国特許出願０２０７９３０．９号、２００２年５月２８日に出願の英国特許出願０２１２２８２．８号、及び２００２年５月２８日に出願の英国特許出願０２１２２８３．６号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３４２６号（２００２年７月２５日出願、国際公開第０３／０１１３１７号として公開；２００１年７月２５日に出願の英国特許出願０１１８１５３．６号、２００２年４月５日に出願の英国特許出願０２０７９３０．９号、２００２年５月２８日に出願の英国特許出願０２１２２８２．８号、及び２００２年５月２８日に出願の英国特許出願０２１２２８３．６号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０４３９０号（２００２年９月２７日出願、国際公開第０３／０２９２９３号として公開；２００１年９月２８日に出願の英国特許出願０１２３３７９．０号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０５１３７号（２００２年１１月１３日出願、国際公開第０３／０４１７３５号として公開；２００１年１１月１４日に出願の英国特許出願０１２７２６７．３号、２００２年７月２５日に出願のＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３４２６号、２００２年９月７日に出願の英国特許出願０２２０８４９．４号、２００２年９月１０日に出願の英国特許出願０２２０９１３．８号、及び２００２年９月２７日に出願のＰＣＴ出願第ＧＢ０２／００４３９０号からの優先権を主張）；ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０５１３３号（２００２年１１月１３日出願、国際公開第０３／０４２２４６号として公開；２００１年１１月１４日に出願の英国特許出願０１２７２７１．５号、及び２００２年９月１０日に出願の英国特許出願０２２０９１３．８号からの優先権を主張）である。
【０００５】
これにより、ＰＣＴ出願第ＧＢ９７／０３０５８号（国際公開第９８／２０１４２号）、ＰＣＴ出願第ＧＢ９９／０４２３３号（国際公開第００／３６０８９号）、ＰＣＴ出願第ＧＢ００／０４３９１号（国際公開第０１３５９９０号）、ＰＣＴ出願第ＧＢ０１／０３５０３号（国際公開第０２／１２８９０号）、ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０２４３８号（国際公開第０２／０９６９５２号）、ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３３８１号（国際公開第０３／０１２１１１号）、ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３３９７号（国際公開第０３／０１２４４１号）、ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３４２６号（国際公開第０３／０１１３１７号）、ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０４３９０号（国際公開第０３／０２９２９３号）、ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０５１３７号（国際公開第０３／０４１７３５号）、及びＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０５１３３号（国際公開第０３／０４２２４６号）のそれぞれを、参照により本明細書に組み込む。
【０００６】
また、Hoyne G. F. et al (1999) Int Arch Allergy Immunol 118:122-124; Hoyne etal. (2000) Immunology 100: 281-288; Hoyne G. F. et al (2000) Intl Immunol 12: 177-185; Hoyne, G. et al. (2001) Immunological Reviews 182:215-227も参照し、これらのそれぞれも参照により本明細書に組み込む。
【特許文献１】国際公開第９８／２０１４２号パンフレット
【特許文献２】ＰＣＴ出願第ＧＢ９７／０３０５８号明細書
【特許文献３】英国特許出願９６２３２３６．８号明細書
【特許文献４】英国特許出願９７１５６７４．９号明細書
【特許文献５】英国特許出願９７１９３５０．２号明細書
【特許文献６】ＰＣＴ出願第ＧＢ９９／０４２３３号明細書
【特許文献７】国際公開第００／３６０８９号パンフレット
【特許文献８】英国特許出願９８２７６０４．１号明細書
【特許文献９】ＰＣＴ出願第ＧＢ００／０４３９１号明細書
【特許文献１０】国際公開第０１３５９９０号パンフレット
【特許文献１１】英国特許出願９９２７３２８．６号明細書
【特許文献１２】ＰＣＴ出願第ＧＢ０１／０３５０３号明細書
【特許文献１３】国際公開第０２／１２８９０号パンフレット
【特許文献１４】英国特許出願００１９２４２．７号明細書
【特許文献１５】ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０２４３８号明細書
【特許文献１６】国際公開第０２／０９６９５２号パンフレット
【特許文献１７】英国特許出願０１１２８１８．０号明細書
【特許文献１８】ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３３８１号明細書
【特許文献１９】国際公開第０３／０１２１１１号パンフレット
【特許文献２０】英国特許出願０１１８１５５．１号明細書
【特許文献２１】ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３３９７号明細書
【特許文献２２】国際公開第０３／０１２４４１号パンフレット
【特許文献２３】英国特許出願０１１８１５３．６号明細書
【特許文献２４】英国特許出願０２０７９３０．９号明細書
【特許文献２５】英国特許出願０２１２２８２．８号明細書
【特許文献２６】英国特許出願０２１２２８３．６号明細書
【特許文献２７】ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０３４２６号明細書
【特許文献２８】国際公開第０３／０１１３１７号パンフレット
【特許文献２９】ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０４３９０号明細書
【特許文献３０】国際公開第０３／０２９２９３号パンフレット
【特許文献３１】英国特許出願０１２３３７９．０号明細書
【特許文献３２】ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０５１３７号明細書
【特許文献３３】国際公開第０３／０４１７３５号パンフレット
【特許文献３４】英国特許出願０１２７２６７．３号明細書
【特許文献３５】英国特許出願０２２０８４９．４号明細書
【特許文献３６】英国特許出願０２２０９１３．８号明細書
【特許文献３７】ＰＣＴ出願第ＧＢ０２／０５１３３号明細書
【特許文献３８】国際公開第０３／０４２２４６号パンフレット
【特許文献３９】英国特許出願０１２７２７１．５号明細書
【非特許文献１】Hoyne G. F. et al (1999) Int Arch Allergy Immunol 118:122-124
【非特許文献２】Hoyne et al. (2000) Immunology 100:281-288
【非特許文献３】Hoyne G. F. et al (2000) Intl Immunol 12:177-185
【非特許文献４】Hoyne, G. et al. (2001) Immunological Reviews 182:215-227
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を変調するための、さらに別の方法、構築体、及び組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドを投与することによって、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、免疫応答を改変する方法が提供される。
【０００９】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドを投与することによって、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、免疫応答を低下させる方法が提供される。
【００１０】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で，１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドを投与することによって、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、免疫寛容を増強する方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドを投与することによって、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｔ細胞の活性を改変する方法が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドを投与することによって、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）又は細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）の活性を減弱する方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドを投与することによって、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、調節性Ｔ細胞の活性を増強する方法が提供される。この調節性Ｔ細胞には、Ｔｒ１調節性Ｔ細胞が適当である。
【００１４】
このタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドは、患者に生体内で投与されるのが適切である。代わりに、このタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドは、患者からの細胞にｅｘ  ｖｉｖｏに投与してもよい。この細胞は、タンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドの投与後に患者に適切に投与することができる。
【００１５】
本発明の別の態様によると、疾患治療における使用のための、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００１６】
本発明の別の態様によると、免疫応答を低下させるための薬物の製造における、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様によると、免疫応答を改変するための薬物の製造における、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様によると、免疫応答を低下させるための薬物の製造における、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様によると、免疫寛容を増強するための薬物の製造における、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様によると、Ｔ細胞の活性を改変するための薬物の製造における、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様によると、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）又は細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）の活性を減弱させるための薬物の製造における、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様によると、調節性Ｔ細胞の活性を増強するための薬物の製造における、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００２３】
このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドは、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるか、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが適切である。
【００２４】
別法として、このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドは、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるか、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００２５】
別法として、このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドは、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）３つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるか、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００２６】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、また、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物であって、任意選択で、薬学的に許容される担体を共に含む医薬組成物が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００２８】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００２９】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００３０】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）３つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が提供される。
【００３１】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（好ましくは１つから４つ、好ましくは１つから３つ）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなる単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００３２】
本発明の別の態様によると、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含む単量体を含む多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドであって、各単量体が同一でも、異なっていてもよい多量体Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００３３】
本発明の別の態様によると、疾患治療における使用のための、
本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つのＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド、又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）、又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００３４】
本発明の別の態様によると、疾患治療における使用のための、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド；又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）；又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００３５】
本発明の別の態様によると、本質的に以下の構成因子、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つのＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
からなるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド；又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）；又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法が提供される。
【００３６】
本発明の別の態様によると、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ii）１つから５つ（かつ、５つより多くない数）のＥＧＦリピートドメイン；
iii）任意選択で、ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインの全体又は一部；及び
iv）任意選択で、１つ又は複数の異種アミノ酸配列
を含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチド；又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドの多量体（この場合、各単量体は、同一でも、異なっていてもよい）；又はそのようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を治療的に変調する方法が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様によると、上述のような、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。本発明の別の態様によると、そのようなベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞が提供される。
【００３８】
本発明の別の態様によると、上述のようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを表面に提示する細胞、及び／又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質移入された細胞が提供される。
【００３９】
このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドは、細胞に結合しないものが適当である。別法として、このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドは、細胞に結合したものでもよい。
【００４０】
一実施形態では、このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドのＮｏｔｃｈリガンドエレメントは、免疫グロブリンＦＣセグメントの全体又は一部に対応する配列などの異種アミノ酸配列に融合することができる。一実施形態において、特に、このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドが２つのＥＧＦリピートドメインを含む場合には、この異種アミノ酸配列は、ＴＳＳＴ配列でも、又は超抗原配列でもない。
【００４１】
このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドは、哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンド配列、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列の少なくとも一部を含むことが好ましい。
【００４２】
このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドは、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ若しくはＪａｇｇｅｄ由来のＮｏｔｃｈリガンドドメイン、又は、これらに対して少なくとも３０％（好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％）のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するドメインを含むものが適当である。
【００４３】
このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドは、Ｄｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１、若しくはＪａｇｇｅｄ２由来のＮｏｔｃｈリガンドドメイン、又は、これらに対して少なくとも３０％（好ましくは、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％）のアミノ酸配列類似性又は同一性を有するドメインを含むものが適当である。
【００４４】
このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈ受容体（好ましくは、ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４）を活性化するものが適当である。別法として、このタンパク質又はポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈ受容体を抑制するものでもよい。
【００４５】
このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のアゴニスト又は部分アゴニストであるものが適当である。別法として、このタンパク質又はポリペプチドは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のアンタゴニストであってもよい。
【００４６】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本発明の別の態様によると、そのようなポリヌクレオチドを含むベクターと、そのようなベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞とが提供される。
【００４７】
本発明の別の態様によると、上述のようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを表面に提示する細胞、及び／又はそのようなタンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質移入された細胞が提供される。
【００４８】
そのような細胞としては、少なくとも１つの抗原又は抗原決定基、例えば腫瘍抗原又は抗原決定基をさらに提示するものが適当である場合がある。
【００４９】
免疫系の変調は、喘息、アレルギー、移植片拒否反応、自己免疫、癌、腫瘍誘発性免疫系異常、又は感染症を含む。
【００５０】
一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の変調因子は、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメイン由来のドメインと、免疫グロブリンＦＣセグメント（例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ又はＩｇＧ４  Ｆｃ）とを含有する融合タンパク質、又はそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。そのような融合タンパク質を調製するのに適当な方法は、例えば、国際公開第９８／２０１４２号の実施例２に記載されている。ＩｇＧ融合タンパク質は、例えば米国特許第５４２８１３０号（Genentech）の記載のように、当技術分野で公知な方法で調製することができる。
【００５１】
本発明の一実施形態では、このＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドとして、担体、好ましくは粒子状担体に結合したものが適当である場合がある。したがって、本発明の別の態様によると、粒子状担体マトリクスに結合した、上述のようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを含む粒子が提供される。一実施形態では、この粒子状担体マトリクスがビーズであってもよい。このビーズは、例えば、磁性ビーズ（例えば、「Ｄｙｎａ１」という商標で市販されているもの）、又はセファロースビーズなどの重合体ビーズであってもよい。
【００５２】
本発明の別の態様によると、粒子状担体マトリクスに、複数の、上述のようなＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドが結合した粒子が提供される。
【００５３】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによってＴＮＦα発現を減少させる方法が提供される。
【００５４】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによってＩＬ−１０発現を増強する方法が提供される。
【００５５】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによってＩＬ−５発現を減少させる方法が提供される。
【００５６】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによってＩＬ−１３発現を低下させる方法が提供される。
【００５７】
このタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドは、白血球（リンパ球やマクロファージなど）、線維芽細胞、若しくは上皮細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞若しくは組織特異的派生細胞におけるサイトカイン発現を改変するものが適当である。
【００５８】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによって、ＩＬ−１０発現の増強と、ＴＮＦα発現の減弱とを示す免疫変調性サイトカインプロフィールを生成する方法が提供される。
【００５９】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによって、ＩＬ−１０発現の増強と、ＩＬ−５発現の減弱とを示す免疫変調性サイトカインプロフィールを生成する方法が提供される。
【００６０】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによって、ＩＬ−１０発現の増強と、ＩＬ−１３発現の減弱とを示す免疫変調性サイトカインプロフィールを生成する方法が提供される。
【００６１】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによって、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦα発現の減弱を示す免疫変調性サイトカインプロフィールを生成する方法が提供される。
【００６２】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによって、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦα発現の減弱を示す免疫変調性サイトカインプロフィールを生成する方法が提供される。
【００６３】
このサイトカインプロフィールは、ＩＬ−１０発現の増強も示すものが適当である。
【００６４】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによってＴＨ２免疫応答を低下させる方法が提供される。
【００６５】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによってＴＨ１免疫応答を低下させる方法が提供される。
【００６６】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによって炎症又は炎症状態を治療する方法が提供される。
【００６７】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与して、ＴＮＦα発現を低下させることによって、炎症、又は自己免疫状態、若しくは炎症状態を治療する方法が提供される。
【００６８】
本発明の一実施形態では、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドが患者に生体内投与される。別法として、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の変調因子は、細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで投与してもよく、その後、この細胞を患者に投与してもよい。
【００６９】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによって、ＩＬ−５の過剰産生に関連した疾患を治療する方法が提供される。
【００７０】
本発明の別の態様によると、上述のようなタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドを投与することによって、ＩＬ−１３の過剰産生に関連した疾患を治療する方法が提供される。
【００７１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の変調因子は、多量体形態にあることが好ましいであろう。この多量体中の単量体の数は、少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個以上、例えば少なくとも約３個から１００個以上、例えば少なくとも約１０個から５０個以上であってもよい。
【００７２】
Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質／ポリペプチドが重合体担体に結合された形態にあるＮｏｔｃｈシグナル伝達変調因子は、Lorantis社による同時係属中のＰＣＴ出願第ＧＢ２００３／００３２８５号（２００３年８月１日出願、英国特許出願０２１８０６８．５号からの優先権を主張）に記載されており、この開示の本文を参照により本明細書に組み込む（例えば、デキストラン複合体が開示されている実施例５を特に参照されたし）。
【００７３】
別の実施形態における、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質／ポリペプチドがビーズなどの粒子状担体に結合された形態にあるＮｏｔｃｈシグナル伝達変調因子は、国際公開第０３／０１１３１７号（Lorantis）、及びLorantis社による同時係属中のＰＣＴ出願第ＧＢ２００３／００１５２５号（２００３年４月４日に出願）に記載されており、この開示の本文を参照により本明細書に組み込む（例えば、ＰＣＴ出願第ＧＢ２００３／００１５２５号の実施例１７、１８、１９を特に参照されたし）。
【００７４】
本明細書において、「本質的に、．．．からなる」という用語は、その構築体が特定された配列及びドメインを含むが、他の配列及びドメインを実質的に含まず、詳細には、他のいかなるＮｏｔｃｈ配列若しくはドメイン、又はＮｏｔｃｈリガンド配列若しくはドメインも実質的に含まないことを意味する。
【００７５】
疑念を避けるために述べると、「を含む」という用語は、いかなる付加的な特徴又は構成因子が存在していてもよいことを意味する。
【００７６】
本発明の構築体は、天然に存在するＮｏｔｃｈリガンドと比較して、それらの大きさが全般的に小さいので、有効な生物活性を依然として保持しながら、より簡単な製造及び／又は投与を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を、これより、添付図面を参照しながら、非限定的な例示によってさらに詳細に記載する。
【００７８】
本発明の実施には、別段の指示がない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学における従来の技法が用いられ、それらは当業者の能力の範囲内にあるものである。そのような技法は、文献に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 及び定期補充; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O’D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; 並びに、J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober (1992 及び定期補充; Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY)を参照されたし。これら一般的実験書のそれぞれを、参照により本明細書に組み込む。
【００７９】
本明細書において、「変調」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路又は標的シグナル伝達経路における生物活性の変化又は改変を指す。本明細書において、「変調因子」という用語は、好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達のアゴニスト、即ちＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の正常な生物活性を、少なくともある程度、刺激又はアップレギュレートする化合物を指す。便宜的に、そのような薬剤をアップレギュレーター又はアゴニストと呼ぶことができる。
【００８０】
本発明のタンパク質、ポリペプチド、又はポリヌクレオチドは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のアゴニストであるか、又はそれをコードするものが好ましく、さらに、Ｎｏｔｃｈ受容体のアゴニスト／活性物質（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ１受容体、Ｎｏｔｃｈ２受容体、Ｎｏｔｃｈ３受容体、及び／又はＮｏｔｃｈ４受容体のアゴニスト／活性物質）であるか、それをコードするものが適当である。
【００８１】
当業者であれば、当技術分野で周知のアッセイで所与の物質をテストすることによって、その物質がＮｏｔｃｈシグナル伝達のアゴニストであるか、又はアンタゴニストであるかを容易に判定することができる。
【００８２】
アゴニスト活性は、アゴニストアッセイ、例えば本明細書の実施例６及び７に記載されるようなＮｏｔｃｈシグナル伝達レポーターアッセイを用いて、適切に判定することができる。
【００８３】
アンタゴニスト活性は、アンタゴニストアッセイ、例えば本明細書の実施例１０に記載されるようなアンタゴニストアッセイを用いて、適切に判定することができる。
【００８４】
本発明において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達とは、好ましくは特異的なシグナル伝達を意味し、それは、このシグナル伝達が実質的に、又は少なくとも主として、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の結果、好ましくはＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用の結果生じるものであって、サイトカインシグナル伝達など、他のいかなる有意な干渉要因又は競合要因の結果生じるものではないことを意味する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に関しては、以下にさらに詳細に記載する。
【００８５】
タンパク質又はポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態でも、又は融合タンパク質若しくは前駆体などのより大きなタンパク質の一部であってもよい。例えば、精製における補助のために、分泌配列若しくはリーダー配列、又はプロ配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなど）を含有する追加（異種）アミノ酸配列を含めば、しばしば有利となる。同様に、そのような追加配列は、組換え体産生中における安定性を追加提供するために、時として望ましいことがある。そのような場合、追加配列は、最終産物を産するために、切断されてもよい（例えば、化学的に又は酵素的に）。しかし、場合によっては、この追加配列は望ましい薬理学的特性を付与するもの（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）でもよく、この場合、この追加配列は、投与される通りの最終産物に存在するように、除去されないものが好ましいことがある。
【００８６】
Ｎｏｔｃｈ依存性の転写活性化による主要な標的は、Enhancer of split複合体（Ｅ［ｓｐｌ］）遺伝子である。さらに、これらの遺伝子は、Ｓｕ（Ｈ）タンパク質による結合の直接標的であること、及びＮｏｔｃｈシグナル伝達に応答して転写が活性化されることが示されている。Ｓｕ（Ｈ）の哺乳動物ホモローグであるＣＢＦ１と相互作用して、これを転写抑制因子から転写活性化因子に変換するウイルス性コアクチベータタンパク質であるＥＢＮＡ２から類推すると、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインは、おそらく他のタンパク質と共同してＳｕ（Ｈ）と結合することによって、Ｓｕ（Ｈ）がＥ（ｓｐｌ）及び他の標的遺伝子の転写を活性化できるようにする活性化ドメインの形成に参加するのかもしれない。Ｎｏｔｃｈ依存性の決定すべてにＳｕ（Ｈ）が必要であるわけではないことに留意するべきであり、これはＮｏｔｃｈが他のＤＮＡ結合転写因子と結合するか、又は細胞外シグナルを伝達する他の機構を用いることによって、何らかの細胞運命の選択を媒介することを示すものである。
【００８７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化するタンパク質又はポリペプチドとは、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、又は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の構成因子のうちいずれの１つ又は複数でも活性化することができる分子を意味する。
【００８８】
一実施形態では、活性化物質が、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈリガンドをコードするポリヌクレオチドであってもよい。本発明で使用されるＮｏｔｃｈリガンドには、様々な哺乳動物細胞、例えば造血幹細胞の膜中にあるＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドに通常結合できる内在性Ｎｏｔｃｈリガンドが含まれる。
【００８９】
本明細書において、「Ｎｏｔｃｈリガンド」という用語は、Ｎｏｔｃｈ受容体と相互作用して、生物学的作用を引き起こすことができる物質を意味する。したがって本明細書において、この用語には、Ｄｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄなどの天然に存在するタンパク質リガンド、同様にＮｏｔｃｈ受容体に対する抗体、天然リガンドに相当する生物学的作用を有するペプチドミメティック及び小分子が含まれる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、結合することによってＮｏｔｃｈ受容体と相互作用するものが好ましい。
【００９０】
現在までに同定されている哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンドの具体例には、例えば、Ｄｅｌｔａ−１又はＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３５２２−ヒト（Homo sapiens））、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８４５７６−ラット（Rattus norvegicus））、Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ３（マウス（Mus musculus））（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６９４１−ヒト（Homo sapiens））、米国特許第６１２１０４５号（Millennium）、Ｄｅｌｔａ−４、（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４３８９４とＡＦ２５３４６８−ヒト（Homo sapiens））などのＤｅｌｔａファミリーと、例えば、Ｓｅｒｒａｔｅ−１及びＳｅｒｒａｔｅ−２（国際公開第９７／０１５７１号、第９６／２７６１０号、及び第９２／１９７３４号）、並びにＪａｇｇｅｄ−１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ７３９３６−ヒト（Homo sapiens））及びＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２９７７８−ヒト（Homo sapiens））などのＳｅｒｒａｔｅファミリーと、ＬＡＧ−２とが含まれる。ファミリーメンバー相互の相同性は、広範囲にわたるものである。
【００９１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のポリペプチドとは、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果発現されるいかなるポリペプチドも、また、そのようなポリペプチドの発現に必要な、いかなるポリペプチド又はそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも意味するものである。
【００９２】
抑制物質が受容体、又は受容体をコードする核酸配列である場合、この受容体が活性化されていることが好ましい。したがって、例えば、この抑制物質が核酸配列である場合、この受容体は、発現された際、構成的に活性であることが好ましい。
【００９３】
どの１つ又は複数の適当な標的（アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列など）も、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を変調できる化合物、及び／又は様々な薬物スクリーニング技術のうちのどの技術における標的分子を同定するのにも用いることができる。そのようなテストに用いられる標的は、溶液中に遊離されていても、固形担体に固定されていても、細胞表面にあっても、又は細胞内に位置してもよい。
【００９４】
薬物スクリーニングの技法は、Geysen、１９８４年９月１３日に公開の欧州特許第０１３８８５５号に記載された方法に基づいてもよい。要約すると、多数の異なった小ペプチド候補変調因子又は標的分子を、プラスチックのピン、又は他の何らかの表面などの固体基板上に合成する。これらのペプチドテスト化合物を適当な標的又はそのフラグメントと反応させ、洗浄する。結合した実体を次に検出する（当技術分野で周知の方法を適切に適合することなどによって）。精製された標的は、薬物スクリーニング技法で使用するために、直接プレート上にコーティングすることもできる。高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）で使用されるプレートは、マルチウェルプレートであるだろう。そのようなマルチウェルプレートは１プレート当たり９６ウェル、３８４ウェル、又は３８４ウェルを超えるものが好ましい。細胞は、「ローン」として広げることもできる。別法として、ペプチドを捕捉して、固形担体上にそれを固定するのに非中和抗体を用いることもできる。合成化合物に関して上述した高スループットスクリーニングは、有機化合物の候補変調因子又は標的分子を同定するのに用いることもできる。
【００９５】
本発明では、競合薬物スクリーニングアッセイの使用も考慮されるが、そのようなアッセイにおいては、標的に結合できる中和抗体が、標的に結合するために、テスト化合物と特異的な競合を行う。
【００９６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の構成因子に結合できる抗体、ペプチドミメティック、及び小有機分子などの物質をスクリーニングし、開発する技法は、当技術分野で周知である。これらの技法には、シグナル伝達タンパク質を発現するためのファージ提示システムの使用と、潜在的結合化合物の結合試験に用いるタンパク質を生成するように形質移入した大腸菌（E. coli）又は他の微生物の培養の使用とが含まれる（例えば、G. Cesarini, FEBS Letters, 307(1): 66-70（１９９２年７月）; H. Gram et al., J. Immunol. Meth., 161: 169-176(1993);及び、C. Summer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 3756-3760（１９９２年５月）を参照）。さらに別のライブラリー及びスクリーニング技術に関しては、例えば米国特許第６２８１３４４号（Phylos）に記載されている。
【００９７】
本発明における有用な「タンパク質」の定義の範囲内では、問題のタンパク質がその内在性機能の少なくとも１つを保持するような様式で、特定のアミノ酸残基を改変してもよく、そのような改変タンパク質を「変種」と呼ぶ。変種タンパク質は、天然に存在するタンパク質中にある少なくとも１つのアミノ酸を添加、欠失及び／又は置換によって改変したものでありうる。
【００９８】
通常、アミノ酸置換は、改変された配列が必要な標的活性又はＮｏｔｃｈシグナル伝達を変調する能力を保持するという条件で、例えば、１、２、又は３箇所から、１０又は２０箇所の置換を導入することができる。アミノ酸置換は、天然には存在しない類似体の使用を含むものでもよい。
【００９９】
本発明で使用されるタンパク質は、改変の影響がサイレントであり、機能上同等なタンパク質の生成を導くアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を有するものでもよい。標的機能又は変調機能が保持される限り、残基の極性、電荷量、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性に基づいて、慎重なアミノ酸置換を導入することができる。例えば、陰電荷のアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ；陽電荷のアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ；そして、同程度の親水性値をもつ無荷電の極性頭部を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０１００】
参照が容易となるように、天然に存在するアミノ酸の主要なものの１字及び３字表記（及び、それらに伴うコドン）を以下に示す。
記号  ３文字        意味                コドン
-----  -----------  ------------------  -----
A    Ala          アラニン            GCT、GCC、GCA、GCG
B    Asp、Asn     アスパラギン酸、
アスパラギン        GAT、GAC、AAT、AAC
C    Cys          システイン          TGT、TGC
D    Asp          アスパラギン酸      GAT、GAC
E    Glu          グルタミン酸        GAA、GAG
F    Phe          フェニルアラニン    TTT、TTC
G    Gly          グリシン            GGT、GGC、GGA、GGG
H    His          ヒスチジン          CAT、CAC
I    Ile          イソロイシン        ATT、ATC、ATA
K    Lys          リジン              AAA、AAG
L    Leu          ロイシン            TTG、TTA、CTT、CTC、CTA、CTG
M    Met          メチオニン          ATG
N    Asn          アスパラギン        AAT、AAC
P    Pro          プロリン            CCT、CCC、CCA、CCG
Q    Gln          グルタミン          CAA、CAG
R    Arg          アルギニン          CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG
S    Ser          セリン              TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC
T    Thr          トレオニン          ACT、ACC、ACA、ACG
V    Val          バリン              GTT、GTC、GTA、GTG
W    Trp          トリプトファン      TGG
X    Xxx          未知
Y    Tyr          チロシン            TAT、TAC
Z    Glu、Gln     グルタミン酸、
グルタミン          GAA、GAG、CAA、CAG
*    End          ターミネーター      TAA、TAG、TGA
【０１０１】
保存的置換は、例えば、以下の表に従って導入することができる。第２列の同一ブロックにあるアミノ酸、そして好ましくは第３列の同一行にあるアミノ酸は、相互に置換することができる。
【０１０２】
【表１】
2006515177.tif 000003
【０１０３】
本明細書において、「タンパク質」という用語には、一本鎖ポリペプチド分子と共に、個々の構成ポリペプチドが共有結合か、又は共有結合以外の方法で連結されている複数のポリペプチドの複合体も含まれる。本明細書において、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、単量体がアミノ酸であり、ペプチド結合又はジスルフィド結合を介して連結されている重合体を指す。サブユニット及びドメインという用語は、生物学的機能を有するポリペプチド及びペプチドを指すこともある。本発明で有用なペプチドは、少なくとも、標的変調能力又はシグナル伝達変調能力を有するものであろう。「フラグメント」は変種でもあり、また、この用語は、結合アッセイの対象であるタンパク質の中で選択され、かつ結合パートナーが既知であるか、又は決定可能である領域を指す。したがって、「フラグメント」は、完全長ポリペプチドの一部であるアミノ酸配列を指し、好ましくは長さが約８アミノ酸から約７４５アミノ酸の間、好ましくは約８アミノ酸から約３００アミノ酸、より好ましくは約８アミノ酸から約２００アミノ酸、そしてさらにより好ましくは長さが約１０アミノ酸から約５０又は１００アミノ酸である。「ペプチド」は、長さが１０アミノ酸から４０アミノ酸、好ましくは１０アミノ酸から３５アミノ酸である短いアミノ酸配列を指す。
【０１０４】
そのような変種は、部位特定的変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて調製することができる。挿入を行う場合、挿入配列と、挿入部位の各サイドの天然に存在する配列に対応する５’及び３’フランキング領域とを共にコードする合成ＤＮＡを用いる。このフランキング領域は、天然に存在する配列中の制限部位に対応した好都合な制限部位を含有し、この配列を適当な酵素で切断し、合成ＤＮＡをその切断部位に挿入できるようなものであろう。このＤＮＡは、本発明に従って発現され、コードされたタンパク質を生成する。これらの方法は、ＤＮＡ配列を操作するための、当技術分野で公知の多数の標準的な技法を例示するだけのものであり、他の公知の技法も用いてよい。
【０１０５】
ヌクレオチド配列の変種も生成できる。そのような変種は、コドンを最適化した配列を含むものが好ましいであろう。コドンの最適化は、ＲＮＡの安定性を促進し、さらに、それによって遺伝子発現も促進する方法として当技術分野で公知である。遺伝コードの重複性とは、同一のアミノ酸がいくつかの異なったコドンによってコードされる場合があることを意味する。例えば、ロイシン、アルギニン、及びセリンは、それぞれ６つの異なったコドンによってコードされている。異なった生物は、コドンの使用に際して、異なったコドンに対する優先性を示す。例えば、ＨＩＶなどのウイルスは、多数のまれなコドンを用いる。まれなコドンが、それに対応した通常に使用される哺乳動物コドンに置換されるようにヌクレオチド配列を改変することによって、哺乳動物標的細胞中における、この配列の発現増加を実現することができる。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞はもとより、他の様々な生物についても、当技術分野で公知である。
【０１０６】
活性物質がヌクレオチド配列である場合、この配列は、コドンが哺乳動物細胞中での発現に最適化されたものであってもよく、かつ適当である。好ましい実施形態では、そのような配列は、その全体が最適化される。
【０１０７】
「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも１０塩基であり、かつ１００００塩基まで、又はそれより長いヌクレオチドの重合形態であって、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの変形形態であるヌクレオチドの重合形態を指す。この用語には、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡ、並びにタンパク質核酸（ＰＮＡ）などの誘導体化バージョンも含まれる。
【０１０８】
これらは、標準的な組換えＤＮＡ手法を用いることで構築できる。核酸は、ＲＮＡでも、ＤＮＡでもよいが、好ましくはＤＮＡである。核酸がＲＮＡである場合には、ｃＤＮＡを中間体として操作を行ってもよい。一般的には、第１の領域をコードする核酸配列を調製し、適当な制限部位を５’末端及び／又は３’末端に導入するであろう。この配列は、ｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１９（下記参照）に基づいたプラスミドベクターなど、標準的な実験室ベクター中で操作すると便利である。適切な技法の正確な詳細に関しては、Sambrook et al.によるMolecular Cloning (Cold Spring Harbor, 1989)又は、同様の標準的な参考図書を参照することができる。
【０１０９】
第２の領域をコードする核酸も、類似性のベクターシステムで同様にして提供できる。
【０１１０】
核酸の供給源は、出版された文献、又はＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクを参照することにより確認できる。所望の第１の配列及び第２の配列をコードする核酸は、学術的又は商業的供給源にその核酸を提供する意志がある場合には、そのような供給源から入手できるし、配列データのみが入手可能である場合には、適当な配列を合成又はクローニングすることによって入手できる。これは、一般的には、問題の遺伝子のクローニングについて記載する文献情報源を参照することで、実施できる。
【０１１１】
別法として、利用可能な配列データが限定されている場合、又は既知の核酸に対して類似性を有する核酸、若しくは他の方法で関連した核酸を発現することが望ましい場合、当技術分野で公知の核酸配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列として例示的核酸の特徴付けを行うこともできる。
【０１１２】
当業者ならば、遺伝コード縮重の結果として、多数の異なったヌクレオチド配列が本発明で使用される同一のタンパク質をコードできることを理解するであろう。さらに、当業者ならば、通常の技法を用いて、本発明のヌクレオチド配列でコードされたタンパク質に影響を与えることなく、標的タンパク質、又はＮｏｔｃｈシグナル伝達を変調する本発明のタンパク質が発現されるべき、いかなる特定の宿主生物のコドン使用頻度も反映するように、ヌクレオチド置換を導入することができることを理解するであろう。
【０１１３】
一般的には、本発明で使用されるヌクレオチド配列に関する場合、「変種」、「ホモローグ」、又は「誘導体」という用語には、ある配列に、又はある配列から、１つ（又は複数）の核酸を、置換、変異、改変、置換、欠失、又は添加したいかなるものも含まれるが、該配列によって提供される、結果として得られるヌクレオチド配列は、標的タンパク質、又はＴ細胞シグナル伝達を変調するためのタンパク質をコードするものである。
【０１１４】
上述のように、配列相同性に関しては、参照配列に対して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性があることが好ましい。より好ましくは、相同性が少なくとも９５％あり、より好ましくは少なくとも９８％ある。ヌクレオチド相同性の比較は、上述のように実施できる。好ましい配列比較プログラムは、上記のＧＣＧ Wisconsin Bestfitプログラムである。デフォルトのスコア計算行列は、同一性を示すヌクレオチド当たり１０、そして各ミスマッチ当たり−９のマッチ得点を有する。デフォルトのギャップ生成ペナルティーは−５０であり、デフォルトのギャップ伸長ペナルティーは各ヌクレオチド当たり−３である。
【０１１５】
参照配列であっても、又はそのいかなる変種、フラグメント、若しくは誘導体であっても、或いは上記のいずれに対する相補体であっても、それにハイブリッド形成できるヌクレオチド配列は、本発明に包含される。ヌクレオチド配列は、好ましくは長さが少なくとも１５ヌクレオチドあり、より好ましくは長さが少なくとも２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチドある。
【０１１６】
本明細書において、「ハイブリッド形成」という用語には、「それによって核酸の一ストランドが、塩基対合を介して相補的ストランドと結合する過程」が含まれ、同様にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法で実行される増幅過程も含まれる。
【０１１７】
本明細書に提示されたヌクレオチド配列に、又はそれらの相補体に選択的にハイブリッド形成可能な、本発明で有用なヌクレオチド配列は、通常、本明細書に提示される対応ヌクレオチド配列に対して、連続した少なくとも２０ヌクレオチドにわたる領域、好ましくは少なくとも２５又は３０ヌクレオチドにわたる領域、例えば、少なくとも４０、６０、若しくは１００ヌクレオチドにわたる領域、又はそれより長い領域で、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は９８％相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、このヌクレオチド配列に対して相同な領域を含み、好ましくはこのヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％相同な領域を含む。
【０１１８】
「選択的にハイブリッド形成可能」という用語は、プローブとして使用されるヌクレオチド配列を、本発明の標的ヌクレオチド配列がこのプローブにバックグラウンドより有意に高いレベルでハイブリッド形成することがわかっている条件下で、使用することを意味する。バックグラウンドハイブリッド形成は、例えば、スクリーニングされるｃＤＮＡライブラリー、又はゲノムＤＮＡライブラリー中に存在する他のヌクレオチド配列が原因で起きることがある。このイベントでは、バックグラウンドとは、プローブとライブラリーの非特異的なＤＮＡメンバーとの相互作用によって生成されるシグナルのレベルを意味し、このシグナルのレベルは、標的ＤＮＡとの特異的相互作用で観測されるシグナル強度の１０分の１未満、好ましくは１００分の１未満である。相互作用の強度は、例えば、３２Ｐでプローブを放射能標識することで測定できる。
【０１１９】
ハイブリッド形成の条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular CloningTechniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)で教示されているように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づくものであり、下記に説明されるように特定の「ストリンジェンシー」を与える。
【０１２０】
最大ストリンジェンシーは、通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い温度）；高ストリンジェンシーは、Ｔｍより約５℃から１０℃低い温度；中程度ストリンジェンシーは、Ｔｍより約１０℃から２０℃低い温度；そして、低ストリンジェンシーは、Ｔｍより約２０℃から２５℃低い温度で得られる。当業者には理解されるであろうように、最大ストリンジェンシーでのハイブリッド形成は、同一のヌクレオチド配列を同定又は検出するのに用いることができ、一方、中程度（低）ストリンジェンシーでのハイブリッド形成は、類似性又は近縁のポリヌクレオチド配列を同定又は検出するのに用いることができる。
【０１２１】
好ましい態様では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０））でハイブリッド形成できるヌクレオチド配列も包含する。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖である場合には、二本鎖分子の両ストランドが、個別に、又は組み合わせて、本発明に包含される。本発明のヌクレオチド配列が一本鎖である場合には、そのヌクレオチド配列の相補配列も本発明の範囲に包含されることを理解するべきである。
【０１２２】
本発明の配列に対する類似性が１００％ではないが、本発明の範囲に包含されるヌクレオチド配列は、いくつかの方法で得ることができる。本明細書に記載する配列の他の変種は、例えば、様々な供給源で作製されたＤＮＡライブラリーを探索することで得ることができる。さらに、他のウイルス／細菌ホモローグ又は細胞性ホモローグ、特に哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ、及び霊長類細胞）で発見された細胞性ホモローグを得ることもでき、そのようなホモローグ及びそれらのフラグメントは、総じて、本明細書の配列リストに示された配列に選択的にハイブリッド形成することができるだろう。そのような配列は、他の動物種から作製したｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリーを探索することで、さらに、中程度から高ストリンジェンシーの条件下で、参照ヌクレオチド配列の全体又は一部を含むプローブを用いて、そのようなライブラリーを探索することで得ることができる。同様の条件は、本発明で有用なアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列の種ホモローグ及びアレル変種を取得するのにも適用される。
【０１２３】
変種及び系統／種のホモローグも、その変種及びホモローグ内にある、本発明の複数の配列間で保存されているアミノ酸配列をコードする標的配列に対して設計されたプライマーを用いるであろう縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。保存配列は、例えば、いくつかの変種／ホモローグからのアミノ酸配列を整列させることによって予測することができる。当技術分野で公知のコンピュータソフトウェアを用いて、配列アラインメントを行うことができる。例えば、ＧＣＧ Wisconsin PileUpプログラムが広く使用されている。縮重ＰＣＲで使用されるプライマーは、１つ又は複数の縮重位置を含有しているであろう。また、そのようなプライマーは既知の配列に対して、単一の配列プライマーで、配列をクローニングするのに用いられる条件より低いストリンジェンシー条件で使用されるであろう。
【０１２４】
別法として、そのようなヌクレオチド配列は、特徴付けされた配列に対して部位特定突然変異誘発を行って得ることもできる。これは例えば、配列を、そのヌクレオチド配列が発現される特定の宿主細胞のコドン優先性に合わせて最適化するのに、サイレントなコドン改変が必要とされる場合有用であることがある。他の配列改変は、制限酵素認識部位を導入するためか、又は標的タンパク質、若しくはそのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質がもつ、Ｔ細胞シグナル伝達を変調する活性を改変するために、望ましいことがある。
【０１２５】
配列相同性、類似性、及び同一性
本明細書において、「相同性」という用語は、「同一性」という用語と同等と見なすことができる。相同な配列とは、少なくとも７５、８５、又は９０％同一でありうるアミノ酸配列、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であるアミノ酸配列が含まれると解釈される。詳細には、相同性とは、通常、その配列において、活性に必須であることが公知の領域（位置５１、５６、及び５７のアミノ酸など）に関して考慮されるべきである。相同性は、類似性（即ち、類似性の化学特性／官能基を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるが、本発明のコンテクストでは、配列同一性の観点で相同性を表すことが好ましい。
【０１２６】
相同性比較は、目視によって、又は、より一般的には、容易に利用できる配列比較プログラムの補助を用いて行うことができる。これら市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の％相同性を計算することができる。
【０１２７】
パーセント相同性は、連続した配列に関して計算すること、即ち１つの配列をもう片方の配列と整列させ、１つの配列中の各アミノ酸が、もう片方の配列中の対応するアミノ酸と直接比較される（一度に１残基ずつ）。これは「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、そのようなギャップなしアラインメントは、比較的少ない数の残基に関してのみ行われる。
【０１２８】
これは非常に単純かつ一貫した方法であるが、例えば、そうでなければ同一である一対の配列に１回の挿入又は欠失が起こることによって、それ以降のアミノ酸残基に、アラインメントからの排除が引き起こされ、それによって、全体的なアラインメントを行った際、％相同性に大幅な低減をもたらす可能性があることを考慮に入れない。この結果、ほとんどの配列比較法は、起こりうる挿入及び欠失を考慮して、全体の相同性スコアに過度にペナルティーを与えない最適のアラインメントを生成するように設計されている。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して、局所的相同性を最大にしようと試みることによって実現される。
【０１２９】
しかし、これらのより複雑な方法は、同一のアミノ酸が同数である場合、ギャップが可能な限り少ない配列アラインメント（比較されている２つの配列間の関連性がより高いことを反映している）が、多数のギャップを有する配列アラインメントより高いスコアを獲得するであろうように、アラインメント中に起こる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てる。通常、「アフィンギャップコスト」が用いられるが、これはギャップの存在に比較的高いコストを負荷し、ギャップ中で後続する各残基にはより小さいペナルティーを負荷するものである。これが最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。ギャップペナルティーが高いことによって、当然ながら、より少ないギャップをもつ最適化アラインメントが生成するであろう。ほとんどのアラインメントプログラムでギャップペナルティーの変更が可能になっている。しかし配列比較にそのようなソフトウェアを用いる際には、デフォルト値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧ Wisconsin Bestfitパッケージ（下記参照）を用いる際には、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップ１つ当たり−１２であり、そして各伸長当たり−４である。
【０１３０】
したがって、最大の％相同性を計算するには、まず、ギャップペナルティーを考慮して、最適アラインメントを生成する必要がある。そのようなアラインメントを実行するのに適当なコンピュータプログラムがＧＣＧ Wisconsin Bestfitパッケージである（ウィスコンシン大学、米国；Devereux）。配列比較を実行できる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 403-410 (Atschul)）、及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳスーツの比較ツールが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは、両方ともオフライン及びオンライン探索で利用可能である（Ausubel et al, 1999, 同上、7-58から7〜60を参照）。しかし、ＧＣＧ Bestfitプログラムを用いることが好ましい。
【０１３１】
５つのＢＬＡＳＴプログラムがhttp://www．ncbi．nlm．nih．gov  で利用可能であり、以下のタスクを行う。
【０１３２】
ｂｌａｓｔｐ：１つのアミノ酸クエリー配列をタンパク質配列データベースと比較する。
【０１３３】
ｂｌａｓｔｎ：１つのヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較する。
【０１３４】
ｂｌａｓｔｘ：１つのヌクレオチドクエリー配列（両ストランド）に対する６つのリーディングフレームによる概念上の翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較する。
【０１３５】
ｔｂｌａｓｔｎ：１つのタンパク質クエリー配列を、動的に６つのリーディングフレーム（両ストランド）すべてで翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較する。
【０１３６】
ｔｂｌａｓｔｘ：１つのヌクレオチドクエリー配列に対する６つのリーディングフレームによる翻訳産物を、ヌクレオチド配列データベースの６つのリーディングフレームによる翻訳産物と比較する。
【０１３７】
ＢＬＡＳＴは以下の検索パラメータを用いる。
【０１３８】
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ：各検索に関するスコアのヒストグラムを表示する；デフォルトはｙｅｓである。（ＢＬＡＳＴマニュアルでパラメータＨを参照）。
【０１３９】
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ：報告される一致配列の短い記述の数を指定した数に制限する；デフォルトの制限は１００記述である。（マニュアルページのパラメータＶを参照）。
【０１４０】
ＥＸＰＥＣＴ：データベース配列に対する一致を報告するかどうかに関する統計的有意性閾値；デフォルト値は１０であり、これは、Karlin and Altschul（1990）の確率モデルによると、単なる偶然から１０個の一致が発見されると予想される値である。ある一致に与えられている統計的有意性が、ＥＸＰＥＣＴ閾値より大きい場合には、その一致は報告されないであろう。ＥＸＰＥＣＴ閾値が低いほど、ストリンジェンシーが高く、偶然によって一致が報告される数が少なくなる。分数値も許容される。（ＢＬＡＳＴマニュアルでパラメータＥを参照）。
【０１４１】
ＣＵＴＯＦＦ：高スコアセグメントペアを報告する際のカットオフスコアである。デフォルト値は、ＥＸＰＥＣＴ値（上記参照）から計算される。１つのデータベース配列に対して複数のＨＳＰが報告されるのは、それらに与えられた統計的有意性が、カットオフ値と等しいスコアを有する単独のＨＳＰに与えられるであろう統計的有意性と比べて、少なくとも同程度に高い場合にのみである。カットオフ値が高いほど、ストリンジェンシーが高く、偶然によって一致が報告される数が少なくなる。（ＢＬＡＳＴマニュアルでパラメータＳを参照）。通常、有意性閾値は、ＥＸＰＥＣＴを用いることでより直観的に管理できる。
【０１４２】
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ：高スコアセグメントペア（ＨＳＰ）が、それらに対して報告されるデータベース配列の数を制限する；デフォルト制限値は５０である。この値より多い数のデータベース配列が、報告されるのに十分な統計的有意性（下記のＥＸＰＥＣＴ及びＣＵＴＯＦＦを参照）を有することとなった場合、最大の統計的有意性が与えられた一致のみが報告される。（ＢＬＡＳＴマニュアルでパラメータＢを参照）。
【０１４３】
ＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、及びＴＢＬＡＳＴＸ用の代替スコアリングマトリクスを指定する。デフォルトマトリクスはＢＬＯＳＵＭ６２（Henikoff & Henikoff, 1992）である。有効な代替選択肢には、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０、及びＩＤＥＮＴＩＴＹが含まれる。ＢＬＡＳＴＮに関しては、いかなる代替スコアリングマトリクスも利用できない；ＢＬＡＳＴＮリクエストでマトリクス指示を指定すると、エラー応答が返ってくる。
【０１４４】
ＳＴＲＡＮＤ：ＴＢＬＡＳＴＮ検索を、データベース配列の上側ストランド又は下側ストランドのみに制限する；或いは、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、又はＴＢＬＡＳＴＸ検索をクエリー配列の上側ストランド又は下側ストランド上のリーディングフレームのみに制限する。
【０１４５】
ＦＩＬＴＥＲ：クエリー配列のセグメントのなかで、Wootton & Federhen（1993）、Computers and Chemistry 17: 149-163のＳＥＧプログラムによって判定されるような、組成の複雑さが低いセグメント、又は、Claverie & States（1993）、Computers and Chemistry 17: 191-201のＸＮＵプログラムによって判定されるような、短い周期の内部反復から成るセグメント、或いは、ＢＬＡＳＴＮでは、Tatusov and LipmanのＤＵＳＴプログラム（http://www．ncbi．nlm．nih．govを参照）で判定されるようなセグメントをマスクして除外する。フィルタリングによって、統計的に有意ではあるが生物学的興味に乏しい報告（例えば、通常の高酸性アミノ酸領域、高塩基性アミノ酸領域、及び高プロリン領域）を、ＢＬＡＳＴの結果から排除することができ、クエリー配列中の、生物学的により興味深い領域は、データベース配列に対する特異的一致検索に利用可能なまま維持される。
【０１４６】
フィルタプログラムで発見された複雑さの低い配列は、ヌクレオチド配列中では、文字「Ｎ」を用いて置換され（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）、またタンパク質配列中では、文字「Ｘ」を用いて置換される（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）。
【０１４７】
フィルタリングはクエリー配列（又は、その翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮではＤＵＳＴ、そして他のプログラムではＳＥＧである。
【０１４８】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ中の配列に適用した場合、ＳＥＧ、ＸＮＵ、又はそれら両方によってマスクされるべき配列がまったくないことも珍しくなく、したがって、フィルタリングが常に効果を生むと期待するべきではない。さらに、場合によっては、配列が全体にわたってマスクされることもあり、これは、フィルタリングされていないクエリー配列に対して報告されたいかなる一致に関しても、その統計的有意性を疑ってみるべきであることを示している。
【０１４９】
ＮＣＢＩ−ｇｉ：アクセッション番号及び／又は遺伝子座名に加えて、ＮＣＢＩ  ｇｉの識別子も結果に示されるようにする。
【０１５０】
配列比較は、http://www．ncbi．nlm．nih．gov／ＢＬＡＳＴで提供される単純ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムを用いて行うことが最も好ましい。
【０１５１】
本発明の態様によっては、配列同一性を決定する際、いかなるギャップペナルティーも使用されない。
【０１５２】
最終的な％相同性は、同一性の観点から判定できるが、アラインメント処理自体は、通常、全か無かのペア比較に基づくものではない。代わりに、通常は、化学的類似性又は進化距離に基づいて、各ペアワイズ比較にスコアを与える段階的な類似性スコアマトリクスが用いられる。一般的に使用されるそのようなマトリクスの例には、ＢＬＡＳＴプログラムスーツのデフォルトマトリクスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスがある。通常、ＧＣＧ Wisconsinプログラムは、公開デフォルト値か、又は、供給されている場合には、カスタムシンボル比較表のどちらかを用いる（より詳細に関しては、利用者マニュアルを参照）。ＧＣＧパッケージには、公開デフォルト値を使用することが好ましく、また、他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリクスを使用することが好ましい。
【０１５３】
いったんソフトウェアが最適アラインメントを生成すれば、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能となる。ソフトウェアは、通常、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を導出する。
【０１５４】
クローニングと発現
本発明で有用な、ＤＮＡポリヌクレオチドなどのヌクレオチド配列は、組換え法によって、合成によって、又は当業者に利用可能ないかなる方法によって生成してもよい。また、それらを標準的な技法でクローニングしてもよい。プライマーは、通常、合成による方法で生成され、これは、所望の核酸配列を一度に１ヌクレオチドずつ段階的に製造するものである。これを自動化法を用いて実施する技法は、当技術分野で容易に利用できる。
【０１５５】
さらに長いヌクレオチド配列は、通常、組換えによる方法を用いて、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を用いて、生成されるであろう。これは、１対のプライマー（例えば、約１５から３０ヌクレオチド）をクローニングが所望される標的配列を含む領域に隣接して作製すること、動物又はヒト細胞から得たｍＲＮＡ又はｃＤＮＡにプライマーを接触させること、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うこと、増幅されたフラグメントを単離する（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）こと、及び増幅されたＤＮＡを回収することを実施するものであろう。プライマーは、増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクターにクローニングできるように、適当な制限酵素認識部位を含有するように設計してもよい。
【０１５６】
組換えによる生成を行うには、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明の発現系又はポリヌクレオチドを組み込むことができる。宿主細胞内へのポリヌクレオチドの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、摩擦導入法（scrape loading）、弾道導入法（ballistic introduction）、及び感染など、Davis et alによるものやSambrook et alによるものなどの多数の標準的実験室マニュアルに記載された方法で実施することができる。そのような方法は、生体外で、又は薬物送達システムとして生体内で利用できることが理解されるだろう。
【０１５７】
適当な宿主の代表例には、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、放線菌、枯草菌細胞などの細菌細胞；酵母細胞、アスペルギルス細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２、ヨトウガ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、ボウメラノーマ細胞などの動物細胞；及び植物細胞などが含まれる。
【０１５８】
本発明で有用なポリペプチドは、極めて多様な発現系を用いて生成することができる。そのようなベクターには、染色体由来、エピソーム由来、及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスなどのウイルス由来のベクター；並びに、コスミド及びファージミドなど、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝エレメント由来のベクターなど、これらを組み合わせて得られたベクターが含まれる。発現系構築体は、発現を引き起こすだけでなく調節も行う制御領域を含有してもよい。概して、宿主で、ポリヌクレオチドを維持、伝播、又は発現するため、及び／又はポリペプチドを発現するために適当ないかなる系又はベクターも、この点では、発現に用いることができる。適当なＤＮＡ配列は、例えばSambrook et alによる文献に記載されているものなど、様々な周知かつ日常的な技法のいずれによってでも発現系に挿入することができる。
【０１５９】
翻訳されたタンパク質を小胞体ルーメンに、ペリプラスム間げきに、又は細胞外環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを発現されるポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに内在するものでも、又は異種シグナルでもよい。
【０１６０】
本発明での使用に供する活性物質は、組換え体細胞培養から、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含めた周知の方法で、回収及び精製することができる。精製には、高速液体クロマトグラフィーを用いるのが最も好ましい。単離及び／又は精製中にポリペプチドが変性された場合、活性立体配座を再形成するために、タンパク質をリフォールディングする周知の技法を用いることができる。
【０１６１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のポリペプチド及びポリヌクレオチド
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、胚内で二元的な細胞運命決定を指示する。Ｎｏｔｃｈは、当初、ショウジョウバエ（Drosophila）で、２つの異なったリガンド、即ちＤｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅの受容体として機能する膜貫通タンパク質として記載された。脊椎動物は、複数のＮｏｔｃｈ受容体及びリガンドを発現する（下記で論じる）。現在までに、少なくとも４つのＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、及びＮｏｔｃｈ−４）がヒト細胞で同定されている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３０８６０２、ＡＦ３０８６０１、及びＵ９５２９９−ヒト（Homo sapiens）を参照）。
【０１６２】
Ｎｏｔｃｈタンパク質は、シングルペプチド前駆体として合成され、ｆｕｒｉｎ様転化酵素を介した切断を行って、２本のポリペプチド鎖を生じ、これらがさらにプロセシングされて成熟受容体を形成する。原形質膜中にあるＮｏｔｃｈ受容体は、ヘテロダイマー、即ち２つのＮｏｔｃｈタンパク質分解性切断産物を含み、その１つは、細胞外ドメインの一部分、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなるＮ末端フラグメントを含み、もう一方は、細胞外ドメインの大部分を含む。Ｎｏｔｃｈのタンパク質分解性切断ステップは、この受容体を活性化するものであり、ゴルジ装置でｆｕｒｉｎ様転化酵素に媒介されて行われる。
【０１６３】
Ｎｏｔｃｈ受容体は、最大３６の上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様リピート［Ｎｏｔｃｈ  １／２＝３６、Ｎｏｔｃｈ  ３＝３４、そしてＮｏｔｃｈ  ４＝２９］、３つのシステインリッチリピート（Ｌｉｎ−Ｎｏｔｃｈ（Ｌ／Ｎ）リピート）を含有する細胞外ドメインと、細胞質領域を含有する膜貫通サブユニットとから成るヘテロダイマー分子として原形質膜中に挿入される。Ｎｏｔｃｈの細胞質領域は、６つのアンキリン様リピート、ポリグルタミンストレッチ（ＯＰＡ）、及びＰＥＳＴ配列を含有する。ＲＡＭ２３と呼ばれる別のドメインがアンキリンリピートの近傍にあり、ショウジョウバエ（Drosophila）ではSuppressor of Hairless［Ｓｕ（Ｈ）］として、脊椎動物ではＣＢＦ１（Tamura）として知られる転写因子に結合する際に必要である。Ｎｏｔｃｈリガンドも、それらの細胞外ドメイン中に複数のＥＧＦ様リピートと、それらと共に、システインに富むＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ  Ｌａｇ２）ドメインとを示すが、このＤＳＬドメインは、Ｎｏｔｃｈリガンド（Artavanis-Tsakonas）すべてに特徴的なドメインである。
【０１６４】
Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＳｃａｂｒｏｕｓなどの細胞外リガンドが、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインのＥＧＦ様リピートに結合することによって活性化される。Ｄｅｌｔａは、活性化に切断を必要とする。Ｄｅｌｔａは、ＡＤＡＭジスインテグリンメタロプロテアーゼであるKuzbanianによって、細胞表面で切断され、この切断イベントによって、可溶性の活性型Ｄｅｌｔａが放出される。ヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質の発癌性変種は、ＴＡＮ−１とも呼ばれ、切断型の細胞外ドメインをもつが、構成的に活性であり、Ｔ細胞リンパ芽球白血病に関与していることが判明している。
【０１６５】
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメインリピートは、細胞内シグナル伝達タンパク質との物理的相互作用を媒介する。極めて重要なことは、ｃｄｃ１０／アンキリンリピートがSuppressor of Hairless［Ｓｕ（Ｈ）］と相互機能することである。Ｃプロモーター結合因子１［ＣＢＦ−１］は、エプスタインーバーウイルス誘発性のＢ細胞不死化に関与する哺乳動物ＤＮＡ結合タンパク質であるが、Ｓｕ（Ｈ）は、ＣＢＦ−１のショウジョウバエ（Drosophila）ホモローグである。Ｓｕ（Ｈ）は、少なくとも培養細胞中において、ｃｄｃ１０／アンキリンリピートと細胞質で相互作用し、Ｎｏｔｃｈ受容体が、隣接細胞上にある、そのリガンドＤｅｌｔａと相互作用する際に、核に移行することが実証されている。Ｓｕ（Ｈ）は、いくつかの遺伝子のプロモーター中に見出されている応答エレメントを含有し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路における極めて重要な下流タンパク質であることが判明した。転写におけるＳｕ（Ｈ）の関与が、Hairlessによって変調されると考えられている。
【０１６６】
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）も、直接的な核機能を有する（Ｌｉｅｂｅｒ）。実際、最近の研究によって、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの６つｃｄｃ１０／アンキリンリピートが核に到達して、転写活性化に参加することが、Ｎｏｔｃｈ活性化に必要であると示された。Ｎｏｔｃｈの細胞内テール部分にあるタンパク質分解性切断部位は、ｇｌｙ１７４３とｖａｌ１７４４との間（部位３又はＳ３と呼ばれる）であると同定された（Schroeter）。核内移行に至る、ｃｄｃ１０／アンキリンリピートの遊離を引き起こすタンパク質分解性切断ステップは、プレセニリン活性に依存すると考えられている。
【０１６７】
この細胞内ドメインは、核に蓄積されることが示されており、核において、それはＣＳＬファミリータンパク質であるＣＢＦ１（ショウジョウバエ（Drosophila）では、Suppressor of Hairless、Ｓｕ（Ｈ）、C．elegansでは、Ｌａｇ−２）（Schroeter;Struhl）と転写活性化因子複合体を形成する。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、その後、ｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（hairy-enhancer of split like）１及び５などのように標的遺伝子を活性化する（Weinmaster）。Ｎｏｔｃｈのこの核機能は、哺乳動物Ｎｏｔｃｈホモローグに関しても示されている（Ｌｕ）。
【０１６８】
Ｓ３プロセシングは、ＮｏｔｃｈリガンドであるＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄの結合に対する反応としてのみ起こる。ゴルジにおける新生Ｎｏｔｃｈ受容体の翻訳後修飾（Munro;Ju）は、２つのタイプのリガンドのうち、どちらが細胞表面に発現されるかを、少なくとも部分的に制御するようである。Fringeは、Ｌｉｎ／Ｎｏｔｃｈモチーフに結合するグリコシル転移酵素であるが、Ｎｏｔｃｈ受容体は、その細胞外ドメインを、Fringeによって修飾される。Fringeは、ＥＧＦ様リピートにＯ結合型フコース基を付加することによってＮｏｔｃｈを修飾する（Moloney;Bruckner）。Fringeによるこの修飾は、リガンド結合を阻止するものではないが、Ｎｏｔｃｈにおけるリガンド誘導性配座転移に影響を与えるものかもしれない。さらに、Fringeのこの機能は、Ｎｏｔｃｈを修飾してそれがＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄリガンドと機能的に相互作用するのを阻止するが、Ｄｅｌｔａに対しては、選択的な結合を可能にするものであることが最近の研究によって示唆されている（Panin;Hicks）。ショウジョウバエ（Drosophila）には、ただ１つのFringe遺伝子しかないが、脊椎動物は多重遺伝子（Radical、Manic、及びLunatic  Fringes）を発現することが公知である（Irvine）。
【０１６９】
Ｎｏｔｃｈ受容体からのシグナル伝達は、２つの異なった経路で起こりうる（図１）。より詳細に判明している経路は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（Ｎｏｔｃｈ  ＩＣ）のタンパク質分解性切断を行い、これが核に移行して、ＣＳＬファミリータンパク質であるＣＢＦ１と転写活性化因子複合体を形成するものである（ショウジョウバエ（Drosophila）では、Suppressor  of  Hairless、Ｓｕ（Ｈ）、C．elegansでは、Ｌａｇ−２）。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、その後、ｂＨＬＨタンパク質であるＨＥＳ（hairy-enhancerof split like）１及び５などの標的遺伝子を活性化する。Ｎｏｔｃｈは、ＣＢＦ１に依存しない様式でもシグナル伝達することができ、これには、細胞質ジンクフィンガー含有タンパク質であるＤｅｌｔｅｘが関与する。ＣＢＦ１とは異なり、Ｄｅｌｔｅｘは、Ｎｏｔｃｈ活性化に続いて核に移行しないが、代わりにＧｒｂ２と相互作用して、Ｒａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を変調することができる。
【０１７０】
したがって、Ｎｏｔｃｈ受容体からのシグナル伝達は、２つの異なった経路で起こりうるものであり、それら両方を図１に図示する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の標的遺伝子には、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓファミリー遺伝子（特に、Ｈｅｓ−１）、Enhancer of Split［Ｅ（ｓｐｌ）］複合体遺伝子、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、ＣＤ−４、及びＤｌｌ−１が含まれる。
【０１７１】
細胞内ドッキングタンパク質であるＤｅｌｔｅｘは、Ｓｕ（Ｈ）が、Ｎｏｔｃｈの細胞内テール部分との相互作用部位を離れる際に、これを置換する。Ｄｅｌｔｅｘは、ジンクフィンガーを含有する細胞質蛋白質であり（Artavanis-Tsakonas；Osborne）、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインのアンキリンリピートと相互作用する。研究によって、Ｄｅｌｔｅｘは、Ｇｒｂ２と相互作用して、Ｒａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を変調することによって、Ｎｏｔｃｈ経路の活性化を促進することが示されている（Ｍａｔｓｕｎｏ）。Ｄｅｌｔｅｘは、Ｓｕ（Ｈ）がＮｏｔｃｈ細胞内テール部分に結合するのを阻止するドッキングタンパク質としても機能する（Matsuno）。それによって、Ｓｕ（Ｈ）が核に放出され、核で転写変調因子として機能する。最近の証跡は、脊椎動物のＢ細胞系において、Ｄｅｌｔｅｘは、Ｓｕ（Ｈ）ホモローグであるＣＢＦ１ではなく、Ｅ４７の機能阻害の原因であることも示唆している（Ordentlich）。Ｄｅｌｔｅｘの発現は、正のフィードバックループにおけるＮｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。ヒト（Homo sapiens）Ｄｅｌｔｅｘ（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５３７００で見出すことができる。
【０１７２】
Ｈｅｓ−１（Hairy-enhancer of Split−１）（Takebayashi）は、塩基性ヘリックスループヘリックス構造をもつ転写因子であり、ＣＤ４サイレンサ中の重要な機能部位に結合して、ＣＤ４遺伝子発現の抑制を導く。したがって、Ｈｅｓ−１はＴ細胞運命の決定に強く関与するものである。Ｈｅｓファミリーの他の遺伝子には、Ｈｅｓ−５（哺乳動物Enhancer of Splitホモローグ）及びＨｅｓ−３が含まれ、Ｈｅｓ−５の発現もＮｏｔｃｈ活性化によってアップレギュレートされる。Ｈｅｓ−１の発現も、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果、アップレギュレートされる。マウス（Mus musculus）Ｈｅｓ−１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ１６４６４で見出すことができる。
【０１７３】
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体［Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ］（Leimeister）は、７つの遺伝子を含むが、これらのうち、変異体となった際に目に見える表現型を示すのは、Ｅ（ｓｐｌ）及びGrouchoのみである。Ｅ（ｓｐｌ）は、Ｓｐｌｉｔ変異を促進する能力にちなんで名付けられたが、Ｓｐｌｉｔは、Ｎｏｔｃｈの別名である。実際、Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子は、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体遺伝子の発現調節を介してＤｅｌｔａを抑制する。Ｅ（ｓｐｌ）の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果、アップレギュレートされる。
【０１７４】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、当初、マウスにおいて、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン産生を抑制できる、Ｔｈ２細胞によって産生される因子として特徴付けされた。その後、ＩＬ−１０は、マクロファージ、角質細胞、Ｂ細胞、Ｔｈ０、及びＴｈ１細胞を含めた、他の多くの細胞型によっても産生されることが示された。ＩＬ−１０は、エプスタイン−バールウイルスのｂｃｒｆ１遺伝子と広範な相同性を示し、ｂｃｒｆ１遺伝子は、現在、ウイルス性ＩＬ−１０と呼ばれる。いくらかの免疫活性化効果も報告されているが、ＩＬ−１０は、主として免疫抑制性サイトカインであると見なされている。ＩＬ−１０によるＴ細胞応答の阻害は、主に、抗原提示細胞のアクセサリー機能を減弱させることで媒介される。重要なことに、ＩＬ−１０は、マクロファージによる多数のプロ炎症サイトカインの産生を抑制し、また、共起刺激分子及びＭＨＣクラスIIの発現を阻害すると報告されている。ＩＬ−１０は、好中球及び好酸球などの他の骨髄細胞にも抗炎症効果を与える。Ｂ細胞では、ＩＬ−１０は、イソタイプ転換及び増殖に影響を与える。さらに最近では、ＩＬ−１０は、調節性Ｔ細胞の誘導における機能と、それらの抑圧的効果の潜在的な媒介物質としての機能とを有すると報告されている。ＩＬ−１０がＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の直接的下流標的であるかどうかは明確でないが、その発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化と同時に、著しくアップレギュレートされていることが判明した。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ１０４１８１２で見出すことができる。
【０１７５】
ＣＤ−２３は、ヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）であり、Ｂ細胞の活性化及び増殖に関する主要分子である。ＣＤ−２３は、ＩｇＥの低親和性受容体である。さらに、その切断型分子は、分泌されて、強力なミトーゲン性成長因子として機能することができる。ＣＤ−２３の配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ１７８３３４４で見出すことができる。
【０１７６】
Ｄｌｘ−１（distalless-1）（McGuiness）の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果、ダウンレギュレートされる。Ｄｌｘ遺伝子の配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５１０００−３で見出すことができる。
【０１７７】
ＣＤ−４の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果、ダウンレギュレートされる。ＣＤ−４抗原の配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ００６９６６で見出すことができる。
【０１７８】
Ｎｕｍｂ、Mastermind、及びＤｓｈなど、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路に関与する他の遺伝子及び、その発現がＮｏｔｃｈ活性化で変調されるすべての遺伝子も、本発明の範囲に含まれる。
【０１７９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のためのポリペプチド及びポリヌクレオチド
現在までに同定された哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンドの例には、Ｄｅｌｔａファミリー、例えば、Ｄｅｌｔａ−１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３５２２−ヒト（Homo sapiens））、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８４５７６−ラット（Rattus norvegicus））、及びＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ３（マウス（Mus musculus））、Ｓｅｒｒａｔｅファミリー、例えば、Ｓｅｒｒａｔｅ−１、Ｓｅｒｒａｔｅ−２（国際公開第９７／０１５７１号、国際公開第９６／２７６１０号、及び国際公開第９２／１９７３４号）、Ｊａｇｇｅｄ−１、及びＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２９７７８−ヒト（Homo sapiens））、並びにＬａｇ−２が含まれる。ファミリーメンバー間の相同性は広範である。
【０１８０】
公知の哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンドのさらに別のホモローグは、標準的技法を用いることで同定できる。「ホモローグ」という用語は、公知のＮｏｔｃｈリガンド、例えば上述のＮｏｔｃｈリガンドのうちいずれの１つにでも、アミノ酸配列相同性又は核酸配列相同性のいずれかの配列相同性を示す遺伝子産物を意味する。通常、公知のＮｏｔｃｈリガンドのホモローグは、対応する公知のＮｏｔｃｈリガンドに対して、少なくとも１０アミノ酸配列、好ましくは少なくとも２０アミノ酸配列、好ましくは少なくとも５０アミノ酸配列、適当なものとしては少なくとも１００アミノ酸配列にわたって、又は、そのＮｏｔｃｈリガンドの全長にわたって、アミノ酸レベルで少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％同一であるだろう。２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列相互の配列相同性を計算する技法及びソフトウェアは、当技術分野で周知である（例えば、http://www．ncbi．nlm．nih．gov及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sonsを参照）。
【０１８１】
現在までに同定されたＮｏｔｃｈリガンドは、そのタンパク質のアミノ末端に、２０から２２アミノ酸を含む特徴的なＤＳＬドメイン（Ｄ．Ｄｅｌｔａ、Ｓ．Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｌ．Ｌａｇ２）と、細胞外表面に最大１４、又はそれより多くのＥＧＦ様リピートとを有する。したがって、Ｎｏｔｃｈリガンドのホモローグも、Ｎ末端のＤＳＬドメインと、細胞外表面における最大１４又はそれより多くのＥＧＦ様リピートとを含むことが好ましい。
【０１８２】
加えて、適当なホモローグは、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合することができるだろう。結合のアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイを含めた、当技術分野で公知の様々な技法によって行うことができる。
【０１８３】
Ｎｏｔｃｈリガンドのホモローグは、いくつかの方法によって、例えば、中程度から高ストリンジェンシー条件下（例えば、約５０℃から約６０℃の０．０３Ｍ塩化ナトリウム及び０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）で、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを、Ｎｏｔｃｈリガンドをコードする核酸の全体又は一部を含むプローブを用いて探索することによって、同定することができる。別法として、ホモローグは縮重ＰＣＲを用いて得てもよく、縮重ＰＣＲは、通常、保存されたアミノ酸配列をコードする変種及びホモローグ中の標的配列に対して設計されたプライマーを用いる。これらのプライマーは、１つ又は複数の縮重位置を含有し、既知の配列に対して単一配列のプライマーで配列をクローニングするのに用いられる条件より低いストリンジェンシー条件で使用されるであろう。
【０１８４】
ポリペプチド物質は、哺乳動物細胞から精製して得ても、適当な宿主細胞の中で組換え体発現で得ても、又は商業的に得てもよい。別法として、ポリペプチドをコードする核酸構築体を用いてもよい。さらに別の例としては、Ｎｏｔｃｈ、又は、Ｄｅｌｔａ若しくはＳｅｒｒａｔｅなどのＮｏｔｃｈリガンドの過剰発現を、Ｓｅｒｒａｔｅ若しくはＤｅｌｔａ遺伝子などの内在遺伝子を活性化できる核酸構築体を導入して引き起こしてもよい。詳細には、相同組換えを用いて、標的細胞のゲノム中にある、Ｓｅｒｒａｔｅ若しくはＤｅｌｔａプロモーターなどの天然プロモーターの場所に異種プロモーターを挿入することによって、遺伝子活性化を実現することができる。
【０１８５】
代替の実施形態では、本発明の活性化分子は、細胞膜におけるＮｏｔｃｈタンパク質の発現若しくは提示、又はシグナル伝達経路を改変することができる。標的細胞表面における完全に機能的なＮｏｔｃｈタンパク質の提示を促進する物質には、ショウジョウバエ（）のKuzbanian遺伝子産物（Ｄｋｕｚ）及び他のＡＤＡＭＡＬＹＳＩＮ遺伝子ファミリーメンバーなどのマトリクスメタロプロテイナーゼが含まれる。
【０１８６】
Ｎｏｔｃｈリガンドドメイン
上記で論じたように、Ｎｏｔｃｈリガンドは、通常、多くの特徴的なドメインを含有する。天然に存在する様々なヒトＮｏｔｃｈリガンドにおけるいくつかの予測／潜在的ドメイン位置（前駆体タンパク質中のアミノ酸番号に基づく）を以下に示す。
【０１８７】
ヒトＤｅｌｔａ  １
成分        アミノ酸            提案された機能／ドメイン
シグナル    １〜１７            シグナル
鎖          １８〜７２３        Ｄｅｌｔａ−様タンパク質１
ドメイン    １８〜５４５        細胞外
膜貫通      ５４６〜５６８      膜貫通
ドメイン    ５６９〜７２３      細胞質
ドメイン    １５９〜２２１      ＤＳＬ
ドメイン    ２２６〜２５４      ＥＧＦ−様１
ドメイン    ２５７〜２８５      ＥＧＦ−様２
ドメイン    ２９２〜３２５      ＥＧＦ−様３
ドメイン    ３３２〜３６３      ＥＧＦ−様４
ドメイン    ３７０〜４０２      ＥＧＦ−様５
ドメイン    ４０９〜４４０      ＥＧＦ−様６
ドメイン    ４４７〜４７８      ＥＧＦ−様７
ドメイン    ４８５〜５１６      ＥＧＦ−様８
【０１８８】
ヒトＤｅｌｔａ  ３
成分        アミノ酸            提案された機能／ドメイン
ドメイン    １５８〜２４８      ＤＳＬ
ドメイン    ２７８〜３０９      ＥＧＦ−様１
ドメイン    ３１６〜３５０      ＥＧＦ−様２
ドメイン    ３５７〜３８８      ＥＧＦ−様３
ドメイン    ３９５〜４２６      ＥＧＦ−様４
ドメイン    ４３３〜４６４      ＥＧＦ−様５
【０１８９】
ヒトＤｅｌｔａ  ４
成分        アミノ酸            提案された機能／ドメイン
シグナル    １〜２６            シグナル
鎖          ２７〜６８５        Ｄｅｌｔａ−様タンパク質４
ドメイン    ２７〜５２９        細胞外
膜貫通      ５３０〜５５０      膜貫通
ドメイン    ５５１〜６８５      細胞質
ドメイン    １５５〜２１７      ＤＳＬ
ドメイン    ２１８〜２５１      ＥＧＦ−様１
ドメイン    ２５２〜２８２      ＥＧＦ−様２
ドメイン    ２８４〜３２２      ＥＧＦ−様３
ドメイン    ３２４〜３６０      ＥＧＦ−様４
ドメイン    ３６２〜４００      ＥＧＦ−様５
ドメイン    ４０２〜４３８      ＥＧＦ−様６
ドメイン    ４４０〜４７６      ＥＧＦ−様７
ドメイン    ４８０〜５１８      ＥＧＦ−様８
【０１９０】
ヒトＪａｇｇｅｄ  １
成分        アミノ酸            提案された機能／ドメイン
シグナル    １〜３３            シグナル
鎖          ３４〜１２１８      ＪＡＧＧＥＤ  １
ドメイン    ３４〜１０６７      細胞外
膜貫通      １０６８〜１０９３  膜貫通
ドメイン    １０９４〜１２１８  細胞質
ドメイン    １６７〜２２９      ＤＳＬ
ドメイン    ２３４〜２６２      ＥＧＦ−様１
ドメイン    ２６５〜２９３      ＥＧＦ−様２
ドメイン    ３００〜３３３      ＥＧＦ−様３
ドメイン    ３４０〜３７１      ＥＧＦ−様４
ドメイン    ３７８〜４０９      ＥＧＦ−様５
ドメイン    ４１６〜４４７      ＥＧＦ−様６
ドメイン    ４５４〜４８４      ＥＧＦ−様７
ドメイン    ４９１〜５２２      ＥＧＦ−様８
ドメイン    ５２９〜５６０      ＥＧＦ−様９
ドメイン    ５９５〜６２６      ＥＧＦ−様１０
ドメイン    ６３３〜６６４      ＥＧＦ−様１１
ドメイン    ６７１〜７０２      ＥＧＦ−様１２
ドメイン    ７０９〜７４０      ＥＧＦ−様１３
ドメイン    ７４８〜７７９      ＥＧＦ−様１４
ドメイン    ７８６〜８１７      ＥＧＦ−様１５
ドメイン    ８２４〜８５５      ＥＧＦ−様１６
ドメイン    ８６３〜９１７      フォンビルブラント因子Ｃ
【０１９１】
ヒトＪａｇｇｅｄ  ２
成分        アミノ酸            提案された機能／ドメイン
シグナル    １〜２６            シグナル
鎖          ２７〜１２３８      ＪＡＧＧＥＤ  ２
ドメイン    ２７〜１０８０      細胞外
膜貫通      １０８１〜１１０５  膜貫通
ドメイン    １１０６〜１２３８  細胞質
ドメイン    １７８〜２４０      ＤＳＬ
ドメイン    ２４９〜２７３      ＥＧＦ−様１
ドメイン    ２７６〜３０４      ＥＧＦ−様２
ドメイン    ３１１〜３４４      ＥＧＦ−様３
ドメイン    ３５１〜３８２      ＥＧＦ−様４
ドメイン    ３８９〜４２０      ＥＧＦ−様５
ドメイン    ４２７〜４５８      ＥＧＦ−様６
ドメイン    ４６５〜４９５      ＥＧＦ−様７
ドメイン    ５０２〜５３３      ＥＧＦ−様８
ドメイン    ５４０〜５７１      ＥＧＦ−様９
ドメイン    ６０２〜６３３      ＥＧＦ−様１０
ドメイン    ６４０〜６７１      ＥＧＦ−様１１
ドメイン    ６７８〜７０９      ＥＧＦ−様１２
ドメイン    ７１６〜７４７      ＥＧＦ−様１３
ドメイン    ７５５〜７８６      ＥＧＦ−様１４
ドメイン    ７９３〜８２４      ＥＧＦ−様１５
ドメイン    ８３１〜８６２      ＥＧＦ−様１６
ドメイン    ８７２〜９４９      フォンビルブラント因子Ｃ
【０１９２】
ＤＳＬドメイン
典型的なＤＳＬドメインは、以下のコンセンサスアミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことがある。
Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ
【０１９３】
ＤＳＬドメインは、以下のコンセンサスアミノ酸配列の大部分又はすべてを含みうることが好ましい。
Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  ＡＲＯ  ＡＲＯ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  ＢＡＳ  ＮＯＰ  ＢＡＳ  ＡＣＭ  ＡＣＭ  Ｘａａ  ＡＲＯ  ＮＯＰ  ＡＲＯ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  ＮＯＰ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  ＮＯＰ  ＡＲＯ  Ｘａａ  ＮＯＰ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ
ここで、
ＡＲＯは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はヒスチジンなどの芳香族アミノ酸残基であり；
ＮＯＰは、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、又はバリンなどの非極性アミノ酸残基であり；
ＢＡＳは、アルギニン又はリジンなどの塩基性アミノ酸残基であり；
ＡＣＭは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はグルタミンなどの酸性又はアミドアミノ酸残基である。
【０１９４】
ＤＳＬドメインは、以下のコンセンサスアミノ酸配列の大部分又はすべてを含みうることが好ましい。
Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ａｓｘ  Ａｓｐ  Ｘａａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｈｉｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓ
（ここで、Ｘａａはいかなるアミノ酸でもよく、Ａｓｘはアスパラギン酸又はアスパラギンのいずれかである）。
【０１９５】
様々な供給源からのＮｏｔｃｈリガンドに由来するＤＳＬドメインのアラインメントを図に示す。
【０１９６】
使用されるＤＳＬドメインは、例えば、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、ラット、マウス、又はヒトを含めた、いかなる適当な種から得てもよい。このＤＳＬドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列から得たものが好ましい。
【０１９７】
本明細書において、「ＤＳＬドメイン」という用語には、天然に存在するドメインに相当する活性を有する配列変種、フラグメント、誘導体、及びミメティックが含まれることが理解されるであろう。
【０１９８】
例えば、本発明における使用に供するＤＳＬドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうるものが適当である。
【０１９９】
別法として、本発明における使用に供するＤＳＬドメインは、例えば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２００】
別法として、本発明における使用に供するＤＳＬドメインは、例えば、ヒトＤｅｌｔａ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２０１】
別法として、本発明における使用に供するＤＳＬドメインは、例えば、ヒトＤｅｌｔａ３のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２０２】
別法として、本発明における使用に供するＤＳＬドメインは、例えば、ヒトＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２０３】
ＥＧＦ様ドメイン
ＥＧＦ様モチーフは、ＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈ、及びＮｏｔｃｈリガンドと同様に、血液凝固カスケードに関与するタンパク質を含めた、様々なタンパク質中に見出されている（Furie and Furie, 1988, Cell 53: 505-518）。例えば、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸ及びＸ（Rees et al., 1988, EMBO J. 7: 2053-2061; Furie and Furie, 1988, Cell 53: 505-518）などの細胞外タンパク質、他のショウジョウバエ（Drosophila）遺伝子（Knust et al., 1987 EMBO J. 761-766; Rothberg et al., 1988年, Cell 55: 1047-1059）、並びにトロンボモジュリン（Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6: 1891-1897）、及びＬＤＬ受容体（Sudhof et al., 1985, Science 228: 815-822）などのいくつかの細胞表面受容タンパク質中に見出されている。タンパク質結合部位は、トロンボモジュリン及びウロキナーゼ中のＥＧＦリピートドメインでマッピングされた（Kurosawa et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 5993-5996; Appella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4437-4440）。
【０２０４】
ＰＲＯＳＩＴＥで報告されているように、典型的なＥＧＦドメインは、６つのシステイン残基を含むことができ、これらは、ジスルフィド結合に用いられることが示されている（ＥＧＦ）。主要構造は、二本鎖ベータシートと、それに続くループと、Ｃ末端の短い二本鎖シートとであることが提案されているが、これらは必ずしも必要であるというわけではない。保存されているシステイン間のサブドメインは、下記の模式図に示す典型的なＥＧＦ様ドメインのように、長さに大きな相違を有する。
【０２０５】
【化１】
2006515177.tif 000004
ここで、
「Ｃ」：ジスルフィド結合に用いられる保存されているシステイン、
「Ｇ」：しばしば保存されているグリシン、
「ａ」：しばしば保存されている芳香族アミノ酸、
「＊」：両パターンの位置、
「ｘ」：任意の残基である。
【０２０６】
第５のシステインと第６のシステインとの間の領域は、２つの保存されたグリシンを含有し、これらのうち少なくとも１つは、通常、ほとんどのＥＧＦ様ドメインに存在する。
【０２０７】
ＥＧＦ様ドメインは、例えば、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、ラット、マウス、又はヒトを含めた、いかなる適当な種に由来するものを用いてもよい。このＥＧＦ様ドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列から得たものが好ましい。
【０２０８】
本明細書において、「ＥＧＦドメイン」という用語には、天然に存在するドメインに相当する活性を有する配列変種、フラグメント、誘導体、及びミメティックが含まれることが理解されるであろう。例えば、本発明における使用に供するＥＧＦ様ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうるものが適当である。
【０２０９】
別法として、本発明における使用に供するＥＧＦ様ドメインは、例えば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２１０】
別法として、本発明における使用に供するＥＧＦ様ドメインは、例えば、ヒトＤｅｌｔａ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２１１】
別法として、本発明における使用に供するＥＧＦ様ドメインは、例えば、ヒトＤｅｌｔａ３のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２１２】
別法として、本発明における使用に供するＥＧＦ様ドメインは、例えば、ヒトＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２１３】
実際問題として、いかなる特定のアミノ酸配列でも、別の配列に対して少なくともＸ％同一であるかどうかは、従来の公知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。例えば、クエリー配列と対象配列との間の最良の全体的一致は、全域配列アラインメントとも呼ばれるが、これは、Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6: 237-245）のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムなどのプログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントでは、クエリー配列及び対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるか、又は両方ともアミノ酸配列であるかのどちらかである。全域配列アラインメントの結果は、パーセント同一性として与えられる。
【０２１４】
「ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン」という用語は、Ｎｏｔｃｈリガンド配列のＮ末端からＤＳＬドメインの開始点までの部分を意味する。この用語には、天然に存在するドメインに相当する活性を有する配列変種、フラグメント、誘導体、及びミメティックが含まれることが理解されるであろう。
【０２１５】
例えば、本発明における使用に供するＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうるものが適当である。
【０２１６】
別法として、本発明における使用に供するＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、例えば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２１７】
別法として、本発明における使用に供するＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、例えば、ヒトＤｅｌｔａ１のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２１８】
別法として、本発明における使用に供するＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、例えば、ヒトＤｅｌｔａ３のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２１９】
別法として、本発明における使用に供するＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、例えば、ヒトＤｅｌｔａ４のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものでもよい。
【０２２０】
本明細書において、「異種アミノ酸配列」又は「異種ヌクレオチド配列」という用語は、自然の配列には見出されない配列（例えばＮｏｔｃｈリガンド配列の場合には、自然のＮｏｔｃｈリガンド配列に見出されない配列）か、又はそれをコードする配列を意味する。通常、例えば、そのような配列は、ＩｇＦｃドメイン、又は、Ｖ５Ｈｉｓタグなどのタグであってもよい。
【０２２１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、タンパク質分析又は核酸アッセイを介してモニターすることができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化は、その細胞質領域のタンパク質分解性切断と、細胞核への移行を導く。本明細書で言及される「検出可能なシグナル」は、Ｎｏｔｃｈの切断された細胞内ドメインの存在に起因するいかなる検出可能な徴候であってもよい。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増強は、切断されたＮｏｔｃｈドメインの細胞内濃度をタンパク質レベルで測定することで評価できる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化は、一連の下流反応も促進し、明確に特定された一群の遺伝子の発現レベルに変化を引き起こす。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増強は、例えば、特定のｍＲＮＡの細胞内濃度を核酸レベルで測定することで評価できる。本発明の好ましい一実施形態では、このアッセイは、タンパク質分析である。本発明の別の好ましい実施形態では、このアッセイは、核酸アッセイである。
【０２２２】
核酸アッセイを用いる利点は、それらの感度が良く、少量の試料でも分析できることにある。
【０２２３】
特定のｍＲＮＡの細胞内濃度は、いつ測定されても、その時の対応遺伝子の発現レベルを反映するものである。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路における下流標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、免疫系のＴ細胞を間接的にアッセイすることで測定できる。詳細には、例えば、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓ−１、及び／又はＩＬ−１０ｍＲＮＡレベルの増大は、アネルギーの誘導を示すものであり、一方、Ｄｌｌ−１又はＩＦＮ−γｍＲＮＡレベルの増大、或いは、ＩＬ−２、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３などのサイトカインをコードするｍＲＮＡレベルの増大は、応答性の向上を示すことのあるものである。
【０２２４】
様々な核酸アッセイが公知である。公知であるか、又は以下に開示されるいかなる従来法も利用できる。適当な核酸アッセイの例は以下に言及されており、それらには、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ブロッティング、分光法、レポーター遺伝子アッセイ、ＤＮＡチップアレイ、及び他のハイブリダイゼイション法が含まれる。
【０２２５】
詳細には、遺伝子の存在、増幅、及び／又は発現は、適切に標識されたプローブを用いて、例えば、従来のサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロット、ドットブロット（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成法によって、試料中で直接測定できる。当業者ならば、必要に応じて、これらの方法をどのように改変できるかを容易に予見するであろう。
【０２２６】
ＰＣＲは、元来、純度の低い試料からＤＮＡを増幅する方法として開発された。この技法は、反応溶液を繰り返して加熱し、冷却する温度サイクルに基づくが、この温度サイクルは、プライマーが標的配列にアニールして、これらのプライマーが伸長して複製娘ストランドを形成するのを可能にするものである。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素による第１ストランドｃＤＮＡの生成に、ＲＮＡテンプレートを用いる。このｃＤＮＡは、その後標準的なＰＣＲプロトコールで増幅される。合成及び変性のサイクルが反復される結果、標的ＤＮＡのコピー数が指数関数的に増加する。しかし、反応構成成分が限定されてくるのに従って、増幅の速度が減少し、最後にはプラトーに達してＰＣＲ産物の純増加がなくなるか、又はほとんどない状態になる。核酸標的の開始コピー数が多いほど、より早くこの「エンドポイント」に達する。
【０２２７】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光標識又は蛍光色素で標識されたプローブを用い、この方法は、一定数のサイクル後に産物の蓄積を測定するのではなく、ＰＣＲ産物が蓄積しているときにそれらを検出するのに用いられるという点において、定量分析のためのエンドポイントＰＣＲとは異なるものである。この反応は、サイクルの実施中において、蛍光の有意な増加によって、標的配列の増幅が最初に検出されるときのタイムポイントによって特徴付けられる。
【０２２８】
リボヌクレアーゼプロテクション（ＲＮアーゼプロテクション）アッセイは、溶液中における特定のＲＮＡを定量するための非常に感度の高い技法である。リボヌクレアーゼプロテクションアッセイは、細胞内全ＲＮＡ又はポリ（Ａ）選別されたｍＲＮＡを標的として実施できる。リボヌクレアーゼプロテクションアッセイが高感度であるのは、相補的な生体外転写産物プローブを使用し、これを高比放射能まで放射性同位元素標識するためである。これらのプローブ及び標的ＲＮＡは、溶液中でハイブリッド形成し、その後、この混合物が希釈され、さらにリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）で処理されることにより、残っていたすべての一本鎖ＲＮＡが分解される。プローブ中のハイブリッド形成した部分は、消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上で混合物を電気泳動した後、オートラジオグラフィを行うことで可視化できる。保護されたフラグメントは、高分離度ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析されるので、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイは、ｍＲＮＡの特性を正確にマッピングするのに利用することができる。プローブが標的ＲＮＡに対してモル過剰でハイブリッド形成する場合、結果として得られるシグナルは、試料中の相補的なＲＮＡの量に正比例するであろう。
【０２２９】
遺伝子発現は、レポーターシステムを用いて検出してもよい。そのようなレポーターシステムは、容易に同定可能なマーカーを、発現系、例えば、モニターされる遺伝子の発現系の制御下に含んでいてもよい。蛍光標識が好ましく、これらはＦＡＣＳによって検出及び選別することができる。ＧＦＰ及びルシフェラーゼが特に好ましい。別のタイプの好ましいレポーターとしては、細胞表面マーカー、即ち細胞表面で発現され、そのため容易に同定可能なタンパク質がある。
【０２３０】
一般的には、レポーター遺伝子を発現することによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の検出に有用なレポーター構築体は、Sambrook et al（1989）の一般的な教示に従って構築できる。通常、本発明に従った構築体は、対象遺伝子のそばのプロモーターと、所望のレポーター構築体、例えばＧＦＰ又はルシフェラーゼをコードするコード配列とを含む。ＧＦＰ及びルシフェラーゼをコードするベクターは、当技術分野で公知であり、また、市販されている。
【０２３１】
遺伝子発現の検出に基づく細胞選別は、上記に例示したような、当技術分野で公知のいかなる技法で行ってもよい。例えば、フローサイトメトリー又はＦＡＣＳによって細胞を選別してもよい。概説としては、A．Radbruch (Ed.), Flow Cytometry and Cell Sorting: A Laboratory Manual, 1992, Springer Laboratory, New Yorkを参照されたし。
【０２３２】
フローサイトメトリーは、細胞の研究及び精製を行うための強力な方法である。フローサイトメトリーは、特に免疫学及び細胞生物学において、広範な適用が見出されているが、ＦＡＣＳの性能は、生物学における他の多くの分野で適用することができる。Ｆ．Ａ．Ｃ．Ｓ．という頭字語は、蛍光活性化細胞選別を表し、「フローサイトメトリー」と互換性を持って使用できる。ＦＡＣＳの原理は、流体の細流中に保持された個々の細胞に、１本又は複数本のレーザビームの中を通過させ、光の散乱と、蛍光色素による様々な周波数の発光とを引き起こすものである。光電子増倍管（ＰＭＴ）が光を電気信号に変換し、この電気信号がソフトウェアで解釈されて、細胞に関するデータを生成する。特定の特性を有する細胞亜集団を同定し、それらを自動的に、懸濁液から非常に高い純度（〜１００％）で選別することができる。
【０２３３】
ＦＡＣＳは、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡで形質移入された細胞における遺伝子発現を測定するのに使用できる。これは、そのタンパク質産物を標識することで直接的に、又は構築体中のレポーター遺伝子を用いることで間接的に実施できる。レポーター遺伝子の例には、β−ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）がある。β−ガラクトシダーゼ活性は、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）などの蛍光発生基質を用いることで、ＦＡＣＳによって検出することができる。ＦＤＧは、低張ショックで細胞に導入され、β−ガラクトシダーゼで切断されて蛍光産物を生成し、この蛍光産物が細胞内に捕捉される。したがって、１つの酵素で多量の蛍光産物を生成することができる。ＧＦＰ構築体を発現する細胞は、基質を添加しないでも蛍光を発するであろう。ＧＦＰの変異体が利用可能であり、これらは、異なった励起周波数を有するが、同一のチャネルで蛍光を発する。２レーザＦＡＣＳ装置は、異なったレーザで励起される細胞を識別して、それによって、２つのトランスフェクションを同時に検査することができる。
【０２３４】
細胞選別の代替法も利用することができる。例えば、本発明は、ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブの使用を含む。そのようなプローブは、ポリペプチドを発現する細胞を個別に同定するのに用いることができ、これらの細胞は、その後人力か、又はＦＡＣＳソーティングを用いて選別することができる。ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブは、上記の教示に従い、Sambrook et al（1989）によって記載された一般手法を用いて調製できる。
【０２３５】
好ましい実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡに相補的な、ＦＡＣＳ細胞選別で使用できる蛍光発色団に結合されたアンチセンス核酸分子の使用を含む。
【０２３６】
遺伝子の発現及びアイデンティティに関する情報を取得するのに、ＤＮＡチップアレイ又は高密度ＤＮＡアレイ（Chee）を用いる方法も記載されている。これらの高密度アレイは、診断上及び予防上の目的に特に有用である。生体内発現技法（In Vivo Expression Technology）（ＩＶＥＴ）（Camilli）も使用できる。ＩＶＥＴは、実験室培養と比較した際、例えば、治療中又は疾患中にアップレギュレートされている遺伝子の同定を行う。
【０２３７】
タンパク質分析を用いる利点は、Ｎｏｔｃｈ活性化を直接的に測定できる点にある。ポリペプチドのレベルを決定するのに使用できるアッセイ技法は、当業者に周知である。そのようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、結合タンパク競合測定法、ウェスタンブロット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出、ＦＡＣＳ、及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【０２３８】
上述したように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の変調因子は、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現又は相互作用を変調するように処置された免疫細胞でもよい。そのような細胞は、例えば、Lorantis社の国際公開第００／３６０８９号の記載に従って、容易に調製でき、この開示の本文を参照により本明細書に組み込む。
【０２３９】
化学架橋
多量体は、例えば、化学架橋でも、又は汎用工学技法でも調製できることが理解されるであろう。
【０２４０】
化学的に結合した（架橋された）配列は、個々のタンパク質又はポリペプチド配列から調製でき、結合は、公知の化学結合技法を用いて行うことができる。例えば、従来の液相又は固相ペプチド合成法を用いて結合体を組み立てることができ、完全に保護されて、末端のアミノ基だけが脱保護された反応性形態となる前駆体が供給される。この官能基は、その後、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を変調するためのタンパク質又はその適当な反応誘導体と、直接反応させることができる。別法として、このアミノ基は、積荷部分又はリンカーとの反応に適した別の官能基に変換してもよい。したがって、例えば、アミノ基と無水コハク酸との反応は、選択的に指定可能なカルボキシル基を提供するであろうし、一方、システイン誘導体を用いてペプチド鎖をさらに伸張させれば、選択的に指定可能なチオール基をもたらすであろう。適当な、選択的に指定可能な官能基が、送達ベクター前駆体中にいったん得られれば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を変調するためのタンパク質又はその誘導体を、例えば、アミド、エステル、又はジスルフィド結合の形成を介して結合させることができる。利用可能な架橋試薬に関しては、例えば、Means, G. E. and Feeney, R. E., Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, 39-43で論じられている。
【０２４１】
上記で考察したように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を変調するための重合体及びタンパク質又はポリペプチドは、直接的に、又はリンカー部分を介して適切かつ間接的に連結させることができる。直接的連結は、チオール、ヒドロキシ、カルボキシ、又はアミノ基など、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を変調するためのタンパク質上にあるどんな好都合な官能基を介して生じてもよい。時には、間接的な連結が好ましい場合があり、これはリンキング部分を介して起こるだろう。適当なリンキング部分は、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体及びスクシンイミド誘導体など、二官能基及び多官能基アルキル、アリール、アラルキル、又はペプチド部分、アルキル、アリール、又はアラルキルアルデヒド酸エステル及び無水物、スルフィドリル基、又はカルボキシル基を含み、或いは臭化又は塩化シアヌール酸、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステル、又はスルホン酸ハロゲン化物などから派生したものでもよい。リンカーとＮｏｔｃｈシグナル伝達を変調するためのタンパク質との間の共有結合を形成するのに使用する、リンカー部分上の官能基は、例えば、アミノ基、ヒドラジノ基、ヒドロキシル基、チオール基、マレイミド基、カルボニル基、及びカルボキシル基などのうちの２つ以上であることがある。リンカー部分は、例えば１から４のアミノ酸残基の短い配列を含んでもよく、この短い配列は、このリンカー部分と、標的タンパク質又はポリペプチドとの結合を媒介するシステイン残基を任意選択で含む。
【０２４２】
治療適用
Ａ．本発明の免疫学的使用
好ましい実施形態では、本発明の構築体は、ヒトなどの哺乳動物の免疫系における免疫応答を改変するのに使用してもよい。免疫系のそのような変調は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、好ましくは末梢Ｔ細胞の活性制御によって作用する。
【０２４３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路及びそれによって影響される状態の詳述は、我々の国際公開第９８／２０１４２号、第００／３６０８９号、及びＰＣＴ出願第ＧＢ００／０４３９１号に見出すことができる。
【０２４４】
Ｔ細胞によって媒介されるものとして記載されることのある病的状態又は感染状態には、喘息、アレルギー、移植片拒否反応、自己免疫、腫瘍誘発性のＴ細胞系異常、及びマラリア種、ミクロフィラリア、蠕虫、ミコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコッカス、ヘモフィルスインフルエンザＢ型、麻疹、Ｃ型肝炎、又はトキソカラなどによって引き起こされる感染症のうちのいずれの１つ又は複数が含まれるが、これらに限定されるものではない。したがって治療又は予防されうるＴ細胞介在性の特定の状態には、多発性硬化症、リウマチ関節炎、及び糖尿病が含まれる。本発明は、臓器移植又は骨髄移植で使用されてもよい。
【０２４５】
上述のように、本発明は、自己免疫疾患、又は、同種移植拒絶反応などの移植片拒否反応などの免疫不全の治療において有用である。
【０２４６】
自己免疫疾患
治療されうる障害の例には、通常、自己免疫疾患と呼ばれるグループが含まれる。自己免疫疾患の範囲は、器官特異的疾患（甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ぶどう膜炎、精巣炎、肝炎、アジソン病、重症筋無力症など）から、リウマチ関節炎又は紅斑性狼瘡などの全身性疾患まで及ぶ。他の障害には、アレルギー反応などの免疫反応亢進が含まれる。
【０２４７】
より詳細には、器官特異的自己免疫疾患には、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、貧血のいくつかの形態（再生不良性貧血、溶血性貧血）、自己免疫性肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、鞏膜炎、ぶどう膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）が含まれる。
【０２４８】
全身性自己免疫疾患には、リウマチ関節炎、若年性関節炎、強皮症及び全身性硬化症、シェーグレン症候群、未分化結合組織症候群、抗リン脂質抗体症候群、様々な形態の脈管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫症、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェーグナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホシェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞動脈炎、閉塞性血栓性血管炎）、紅斑性狼瘡、リウマチ性多発筋痛、特発性（混入）クリオグロブリン血症、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎、好酸球性筋膜炎、多発性筋炎及び他の特発性炎症ミオパシー、再発性脂肪織炎、再発性多発性軟骨炎、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、様々な形態の炎症性皮膚炎が含まれる。
【０２４９】
さらに広範な障害リストには、下記のものを含めた望ましくない免疫反応及び炎症が含まれる。即ち、リウマチ関節炎を含めた関節炎、超感受性関連の炎症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病及び他の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化関連の炎症、動脈硬化、アテローム性心臓疾患、再潅流損傷、心臓停止、心筋梗塞、血管炎症障害、呼吸困難症候群又は他の心肺疾患、消化性潰瘍関連の炎症、潰瘍性大腸炎及び他の胃腸管疾患、肝繊維症、肝硬変又は他の肝臓疾患、甲状腺炎又は他の腺疾患、糸球体腎炎又は他の腎疾患及び泌尿器疾患、耳炎又は他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎又は他の皮膚疾患、歯周疾患又は他の歯科疾患、精巣炎若しくは睾丸副睾丸炎、不妊症、睾丸外傷又は他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能不全（placental dysfunction）、胎盤機能不全（placental insufficiency）、習慣性流産、子癇、子癇前症及び他の免疫関連及び／又は炎症性関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、例えば、網膜炎若しくは嚢腫様黄斑浮腫、交感性眼炎、鞏膜炎、網膜色素変性症、変性眼底疾患の免疫及び炎症コンポーネント、眼外傷の炎症コンポーネント、感染によって引き起こされた眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、過度の瘢痕、例えば緑内障濾過手術の後、眼内移植に対する免疫及び／又は炎症反応並びに他の免疫関連及び炎症性関連の眼疾患、自己免疫疾患、状態、若しくは障害関連の炎症、この場合中枢神経系（ＣＮＳ）又は他の任意の器官の両方において免疫及び／又は炎症の抑制が有益であるだろう、パーキンソン病、パーキンソン病の治療による合併症及び／又は副作用、エイズ関連の痴呆複合症ＨＩＶ関連の大脳障害、ドヴィック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病及び他のＣＮＳ変性疾患、状態、若しくは障害、ストークスの炎症コンポーネント、ポリオ後症候群、精神障害の免疫及び炎症コンポーネント、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経症、亜急性神経症、慢性神経症、ギラン−バレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫症若しくはＣＮＳ外傷若しくはＣＮＳ感染の炎症コンポーネント、筋萎縮及び萎縮の炎症コンポーネント、並びに中枢及び末梢神経系の免疫及び炎症関連の疾患、状態、若しくは障害、ポスト外傷性の炎症、敗血症ショック、感染症、手術又は臓器移植による炎症性合併症若しくは副作用、遺伝子療法における炎症性及び／又は免疫性の合併症及び副作用、例えば、ウイルス性担体への感染による、又はエイズ関連の炎症による、体液性及び／又は細胞性免疫応答を抑制若しくは阻害するための、例えば白血病などの単球又は白血球増殖性疾患を治療又は改善するための、単球又はリンパ球の量を減少させることによる、角膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカー、自然若しくは人工の皮膚組織などの自然若しくは人工の細胞、組織、及び器官を移植する場合には移植片拒否反応の防止及び／又は治療のための、遺伝子療法における炎症性及び／又は免疫性の合併症及び副作用である。
【０２５０】
移植拒絶反応
本発明は、例えば、臓器移植（例えば、腎臓、心臓、肺、肝臓又は膵臓移植）、組織移植（例えば、植皮用の皮膚片）、又は細胞移植（例えば、骨髄移植又は輸血）の治療に使用してもよい。
【０２５１】
最も一般的なタイプの器官及び組織移植の簡潔な概要を以下に示す。
【０２５２】
ｉ）腎移植：
腎臓は最も一般的に移植される器官である。腎臓は、死体ドナーによって提供されたものも、生体ドナーによって提供されたものも両方とも利用でき、腎移植は、多数の臨床徴候（糖尿病、様々なタイプ腎炎及び腎不全を含める）を治療するのに用いることができる。腎移植のための外科手術は比較的単純である。しかし、移植片拒否反応を回避するためには、血液型及び組織適合性遺伝子グループを一致させることが望ましい。第１の移植を拒絶した後には、多くの患者が「感作」される可能性があるので、移植が許容されることは実に重要である。感作は抗体の形成を引き起こし、腎臓抗原に対して向けられた細胞機序を活性化する。そのため、最初の移植と共通の抗原を含有するいかなる後続移植も拒絶される可能性が高い。その結果、多くの腎移植患者が一生の間、何らかの形態の免疫抑制療法を継続しなければならないこととなり、感染及び代謝性骨疾患などの合併症がもたらされる。
【０２５３】
ii）心臓移植
心臓移植は、非常に複雑であり、かつリスクの高い操作である。ドナー心臓は、それらがレシピエントの体内に配置された際に、鼓動を開始するであろう様式で維持しなければならず、したがって、それらは、非常に特殊な条件下で、限定された時間の間でのみ生存可能な状態に維持できる。また、ドナー心臓は、脳死状態の臓器提供者からしか取得できない。心臓移植は、様々なタイプの心臓疾患及び／又は損傷の治療に用いることができる。ＨＬＡマッチングは、当然望ましいが、心臓の供給が限定されていること、及び操作が緊急であることのため、しばしば不可能である。
【０２５４】
iii）肺移植
肺移植は、嚢胞性繊維症や肺の急性損傷などの疾患（例えば、気道熱傷によって引き起こされる）を治療するのに用いられる（それ単独で、又は心臓移植と併用して）。移植で使用するための肺は、通常、脳死状態の臓器提供者から回収する。
【０２５５】
iv）膵臓移植
膵臓移植は、主として、真性糖尿病を治療するために用いられる。真性糖尿病は、インスリンを産生する膵臓中の小島細胞の機能不全によって引き起こされる疾患である。移植用の膵臓は、死体からしか回収できないが、管理された方法でインスリンを産生するために必要となる機能を回復するためには、完全な膵臓の移植が必要でないことに留意するべきである。実際のところ、小島細胞の移植だけで十分であるかもしれない。腎不全が進行糖尿病で頻繁な合併症であるため、腎臓移植及び膵臓移植は、しばしば同時に行われる。
【０２５６】
ｖ）皮膚移植
ほとんどの皮膚移植は、自家組織を用いて行う。しかし、重度の火傷（例えば）の場合には、外来組織の移植が必要となることもある（但し、これらの移植は、通常、生物学的な包帯として用いられることに留意するべきである。これは、移植片が宿主で成長しないであろうし、また、一定の間隔をおいて交換されなければならないであろうからである）。真の同種皮膚移植の場合には、免疫抑制療法を用いて拒絶を防止してもよい。しかし、これは、感染リスクの増大に通じ、したがって火傷の犠牲者においては重大な欠点となる。
【０２５７】
vi）肝移植
肝移植は、肝炎などのウイルス病、又は有害な化学物質への露出（例えば慢性アルコール中毒）によって引き起こされた臓器障害を治療するのに用いられる。肝移植は、先天性異常を治療するのにも用いられる。肝臓は、大きくて複雑な器官であり、これは、当初、移植に技術的問題が生じたことを意味する。しかし、現在では、ほとんどの移植片（６５％）が１年以上生存し、単一のドナーからの肝臓を２人のレシピエントに分けて、与えられることも見出されている。肝臓移植患者による移植片拒否反応は発生率が比較的低いが、血液型に不一致がある場合には、ドナー臓器中の白血球が抗血液型抗体と共に、レシピエント赤血球の抗体依存的溶血反応を媒介することもある。さらに、ドナー及びレシピエントに血液型適合性がある場合でさえ、肝移植においてＧＶＨＤの発症が起きている。
【０２５８】
ワクチン及び癌ワクチン
本発明の構築体は、癌ワクチンや病原菌ワクチンなどのワクチン組成物中でも用いることができる。
【０２５９】
ワクチン組成物
本発明による、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する結合体は、ワクチン組成物中（病原菌又は癌ワクチンなど）で用い、経口経路、口腔粘膜経路、経腸経路、腟経路、直腸経路、又は鼻腔経路などの粘膜経路で上記ワクチンを投与することによって、疾患にかかりやすい哺乳動物、又は疾患を患っている哺乳動物を保護又は治療するために使用してもよい。そのような投与は、例えば、液滴、スプレー、又は乾燥粉末形態であってもよい。適切な場合には、噴霧ワクチン製剤又はエアロゾル化ワクチン製剤も使用できる。
【０２６０】
耐胃性カプセル（gastro resistant capsule）などの腸溶性製剤、経口投与用顆粒、直腸投与又は腟投与用坐剤も使用できる。本発明は、例えば、皮内送達、又は経皮送達（transdermal or transcutaneous delivery）によって、皮膚に適用された抗原の免疫原性を促進するために使用してもよい。さらに、本発明のアジュバントは、例えば、筋肉内投与又は皮下投与で非経口送達させてもよい。
【０２６１】
投与経路に応じて、様々な投与装置を用いることができる。例えば、鼻腔内投与用には、市販のAccuspray（Becton Dickinson）などのスプレー装置を用いてもよい。
【０２６２】
鼻腔内使用用の好ましいスプレー装置は、装置の性能が、利用者によって加えられる圧力に依存していない装置である。これらの装置は、圧力閾値装置（pressure threshold device）として知られている。液体は、閾値圧力に達したときにのみ、ノズルから放出される。これらの装置によって、スプレーにおける液滴寸法の定常化が、より簡単に実現できるようになった。本発明で使用するのに適した圧力閾値装置は、当技術分野で公知であり、例えば、国際公開第９１／１３２８１号及び欧州特許第３１１８６３Ｂ号に記載されている。そのような装置は、Pfeiffer GmbHから購入可能である。
【０２６３】
特定のワクチン製剤では、製剤中に他のワクチン構成因子を含有することがある。例えば、本発明のアジュバント製剤は、胆汁酸又はコール酸誘導体を含むことがある。このコール酸誘導体は、その塩、例えば、そのナトリウム塩が適当である。胆汁酸の例には、コール酸自体、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、タウロデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、及び上記胆汁酸の糖鎖誘導体、タウロ誘導体、アミドプロピル−１−プロパンスルホン酸誘導体、及びアミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸誘導体などの誘導体、又はＮ，Ｎ−ビス（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコールアミドが含まれる。
【０２６４】
好適には、本発明のアジュバント製剤は、水溶液形態又は非ベシクル懸濁液形態であってもよい。そのような製剤は、製造及び無菌化（例えば４５０ｎｍ又は２２０ｎｍの細孔膜を通した最終濾過による）するのに好都合である。
【０２６５】
好適には、投与経路は、皮膚経由、筋肉内、鼻粘膜などの粘膜表面経由でもよい。鼻粘膜経由で混合物を投与する場合には、例えば、スプレーとして混合物を投与してもよい。免疫応答を促進する方法は、ワクチンを初回刺激投与、又は追加免疫投与することでもよい。
【０２６６】
本明細書において、「アジュバント」という用語には、抗原又は抗原決定基に対する脊椎動物対象の免疫系における免疫応答を促進する性能を有する薬剤が含まれる。
【０２６７】
「免疫応答」という用語には、対象の免疫系による抗原又は抗原決定基に対するいかなる反応も含まれる。免疫応答は、例えば、体液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）及び細胞性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が含まれる。
【０２６８】
「細胞性免疫応答」という用語には、Ｔ細胞リンパ球がそれらの犠牲細胞の近傍まで来た際に提供する防御など、リンパ球によって提供される免疫防御が含まれる。
【０２６９】
「リンパ球増殖」が測定される際には、リンパ球が特定の抗原に応答して増殖する能力が測定されてもよい。リンパ球増殖には、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、又はＣＴＬ細胞の増殖が含まれる。
【０２７０】
本発明の組成物は、広範な供給源に由来する抗原を含有するワクチンを処方するのに使用してもよい。例えば、抗原は、ヒト、細菌、又はウイルス性の核酸、病原体由来の抗原又は抗原性試料、ＧｎＲＨ及びＩｇＥペプチドと、組換え生成されたタンパク質又はペプチドと、キメラ融合タンパク質とを含めた宿主由来の抗原を含むことがある。
【０２７１】
本発明のワクチン製剤は、ヒト病原体に対して免疫応答を引き起こすことができる抗原又は抗原組成物を含有することが好ましい。この１つ又は複数の抗原は、例えば、ペプチド／タンパク質、多糖、及び脂質でもよく、以下のウイルス、細菌、寄生生物／菌類などの病原体に由来するものでもよい。
【０２７２】
ウイルス抗原
ウイルス抗原又は抗原決定基は、例えば、下記のウイルスに由来するものでもよい。即ち、サイトメガロウイルス（特にヒトサイトメガロウイルス、ｇＢ及びその誘導体など）；エプスタインバールウイルス（ｇｐ３５０など）；フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）；Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、欧州特許第４１４３７４−Ａ号、欧州特許第０３０４５７８−Ａ号、及び欧州特許第１９８４７４−Ａ号に記載のＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２、及びＳ抗原などのＢ型肝炎表面抗原）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及びＥ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス；ＨＩＶ−１（ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０、又はｇｐ１６０など）；ｇＤ若しくはその誘導体など、ヒトヘルペスウイルス、又はＨＳＶ１若しくはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７などの前初期タンパク質；ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８）；インフルエンザウイルス（卵若しくはＭＤＣＫ細胞、若しくはＶｅｒｏ細胞若しくはインフルエンザウイロソーム全体中で増殖する（Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920によって記載されている通り）、全菌体生菌若しくは不活化ウイルス、分割インフルエンザウイルス、又はＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、若しくはＭタンパク質など、精製タンパク質若しくはその組み換え型タンパク質）；麻疹ウイルス；ムンプスウイルス；パラインフルエンザウイルス；狂犬病ウイルス；呼吸器合胞体ウイルス（Ｆ及びＧタンパク質など）；ロタウイルス（生菌弱毒ウイルスを含める）；天然痘ウイルス；水痘帯状疱疹ウイルス（ｇｐＩ、II、及びＩＥ６３など）；並びに子宮頚部癌の原因となるＨＰＶウイルス（例えば、タンパク質Ｄ担体と融合してタンパク質Ｄ−Ｅ６若しくはＥ７融合体を形成したＨＰＶ１６由来の初期タンパク質Ｅ６若しくはＥ７、又はこれらの組合せ；或いはＥ６若しくはＥ７とＬ２との組合せ（例えば国際公開第９６／２６２７７号を参照））である。
【０２７３】
細菌性抗原
例えば、細菌性抗原又は抗原決定基は下記の細菌に由来するものでもよい。即ち、B. anthracia（例えば、ボツリヌス毒素）を含めたバシラス属全種；B. pertussis（例えば、ペルタクチン、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）を含めたボルデテラ属全種；B. burgdorferi（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. garinii（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. afzelii（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. andersonii（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. hermsiiを含めたボレリア属全種；C. jejuni（例えば、毒素、付着因子、及びインバシン）及びC. coliを含めたカンピロバクタ属全種；C. trachomatis（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合性タンパク質）、C. pneumonie（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合性タンパク質）、C. psittaciを含めたクラミジア属全種；C. tetani（破傷風毒素など）、C. botulinum（例えば、ボツリヌス毒素）、C. difficile（例えば、紡錘状菌毒素Ａ又はＢ）を含めたクロストリジウム属全種；C. diphtheriae（例えば、ジフテリアトキシン）を含めたコリネバクテリウム属全種；E. equi及びヒト顆粒球性エールリヒア症物質を含めたエーリキア属全種；R．rickettsii含めたリケッチア属全種；E. faecalis、E. faeciumを含めた腸球菌属全種；腸毒性E. coli（例えば、定着因子、熱不安定毒素、その誘導体、又は熱安定性毒素）、腸出血性e. Coli、腸病原性e. coli（例えば、志賀毒素様毒素）を含めたエシェリキア属全種；H. influenzae B型（例えば、ＰＲＰ）、型別不能H. influenzae、例えば、ＯＭＰ２６、高分子量付着因子、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄ、リポタンパク質Ｄ、並びにフィンブリン及びフィンブリン誘導ペプチド（例えば米国特許第５８４３４６４号を参照）を含めたヘモフィルス属全種；H. pylori（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、液胞化毒素）を含めたヘリコバクター属全種；P. aeruginosaを含めたシュードモナス属全種；L. pneumophilaを含めたレジオネラ属全種；L. interrogansを含めたレプトスピラ属全種；L. monocytogenesを含めたリステリア属全種；Branhamella catarrhalisとしても知られるM. catarrhalis（例えば、高分子量及び低分子量付着因子、並びにインバシン）、Morexella Catarrhalis（その外膜小胞及びＯＭＰ１０６（例えば、国際公開第９７／４１７３１号を参照））を含めたモラクセラ属全種；M. tuberculosis（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂ、又は−Ｃ）、M. bovis、M. leprae、M. avium、M. paratuberculosis、M. smegmatisを含めたミコバクテリア属全種；N. gonorrhea及びN. meningitidis（例えば、莢膜多糖及びその結合体、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、付着因子）、Neisseria mengitidis B（その外膜小胞及びＮａｐＡ（例えば、国際公開第９６／２９４１２号を参照）を含めたナイセリア属全種；S typhi、S. paratyphi、S. choleraesuis、S. enteritidisを含めたサルモネラ属全種；S. sonnei、S. dysenteriae、S. flexneriiを含めた赤痢菌属全種；S. aureus、S. epidermidisを含めたブドウ球菌属全種；S．pneumonie（例えば、莢膜多糖及びその結合体、ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質）、及びタンパク質抗原ニューモリシン（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）、及びその変異体無毒化誘導体（例えば、国際公開第９０／０６９５１号、第９９／０３８８４号を参照）を含めた連鎖球菌全種；T. pallidum（例えば、外膜タンパク質）、T. denticola、T. hyodysenteriaeを含めたトレポネーマ全種；V. cholera（例えば、コレラトキシン）を含めたビブリオ全種；並びにY. enterocolitica（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、Y. pestis、Y. pseudotuberculosisを含めたエルシニア（Yersinia）全種である。
【０２７４】
寄生生物／真菌抗原
寄生生物又は真菌の抗原又は抗原決定基は、例えば、下記の生物に由来するものでもよい。即ち、B. microtiを含めたバベシア全種；C. albicansを含めたカンディダ全種；C. neoformansを含めたクリプトコッカス全種；E. histolyticaを含めたエントアメーバ属全種；G. lambliaを含めたジアルジア属全種；L. majorを含めたLeshmania全種；Plasmodium faciparum（ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、Sequestrin、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０、及びプラスモディウム属全種におけるそれらの類似体）；P. cariniiを含めたニューモシスティス属全種；S. mansoniを含めたSchisostoma属全種；T. vaginalisを含めたトリコモナス全種；T. gondii（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含めたトキソプラズマ全種；T. cruziを含めたトリパノソーマ属である。
【０２７５】
承認又は認可されたワクチンには、例えば、Biothrax（BioPort）などの炭そ菌ワクチン；ＴＩＣＥ  ＢＣＧ（Organon Teknika）及びMycobax（Aventis Pasteur）などの結核（ＢＣＧ）ワクチン；Tripedia（Aventis Pasteur）、Infanrix（GlaxoSmithKline）、及びＤＡＰＴＡＣＥＬ（Aventis Pasteur）などのジフテリア、破傷風トキソイド、及び無細胞百日咳（ＤＴＰ）ワクチン；ヘモフィルスｂ結合ワクチン（例えば、Lederle Lab Div, American Cyanamid社によるHibTITERなどのジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質結合体；Merck社によるPedvaxHIBなどの髄膜炎菌タンパク質複合体；Aventis Pasteur社によるActHIBなどの破傷風トキソイド結合体）；Havrix（GlaxoSmithKline）及びＶＡＱＴＡ（Merck）などのＡ型肝炎ワクチン；Twinrix（GlaxoSmithKline）などのＡ型及びＢ型肝炎（組換え型）結合ワクチン；Recombivax HB（Merck）及びEngerix−B（GlaxoSmithKline）などの組換え型Ｂ型肝炎ワクチン；Fluvirin（Ｅvans Vaccine）、FluShield（Wyeth Laboratories）、及びFluzone（Aventis Pasteur）などのインフルエンザウイルスワクチン；ＪＥ−Ｖａｘ（大阪大学微生物研究所）などの日本脳炎ウイルスワクチン；Attenuvax（Merck）などの麻疹ウイルスワクチン；Ｍ−Ｍ−Ｖａｘ（Merck）などの麻疹及び流行性耳下腺炎ワクチン；Ｍ−Ｍ−ＲII（Merck）などの麻疹、流行性耳下腺炎、及び風疹ウイルス生ワクチン；Menomune−Ａ／Ｃ／Ｙ／Ｗ−１３５（Aventis Pasteur）などの髄膜炎菌多糖ワクチン（グループＡ、Ｃ、Ｙ、及びＷ−１３５結合）；Mumpsvax（Merck）などの流行性耳下腺炎ワクチン；Pneumovax（Merck）、Pnu−Imune（Lederle Lab Div, American Cyanamid）などの肺炎球菌ワクチン；肺炎球菌７価結合ワクチン（例えば、Lederle Lab Div, American Cyanamid社によるPrevnarなどのジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質複合体）；Poliovax（Aventis Pasteur）などのポリオウイルスワクチン；IPOL（Aventis  Pasteur）などのポリオウイルスワクチン；Imovax（Aventis Pasteur）及びRabAvertなどの狂犬病ワクチン（Chiron Behring GmbH）；Meruvax IIなど（Merck）の風疹ウイルス生ワクチン；TYPHIM Viなど（Aventis Pasteur）の腸チフスＶｉ多糖ワクチン；Varivax（Merck）などの水痘ウイルスワクチン；並びにYF−Vax（Aventis Pasteur）などの黄熱ワクチンが含まれる。
【０２７６】
癌／腫瘍抗原
本明細書において、「癌抗原又は抗原決定基」又は「腫瘍抗原又は抗原決定基」という用語は、好ましくは、癌細胞に存在（又は付随）しており、通常、正常細胞には存在（又は付随）しない抗原又は抗原決定基、或いは癌細胞において正常（非発癌）細胞より多量に存在している抗原又は抗原決定基、或いは癌細胞において正常（非発癌）細胞に見出される形態とは異なった形態で存在している抗原又は抗原決定基を意味する。
【０２７７】
癌抗原には、例えば、ヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧベータ）抗原のベータ鎖、癌胎児抗原、ＥＧＦＲｖIII抗原、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ抗原、ＧＭ２抗原、ＧＰ１００抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、ＫＳＡ抗原、Ｌｅ（ｙ）抗原、ＭＵＣＩ抗原、ＭＡＧＥ１抗原、ＭＡＧＥ２抗原、ＭＵＣ２抗原、ＭＵＣ３抗原、ＭＵＣ４抗原、ＭＵＣ５ＡＣ抗原、ＭＵＣ５Ｂ抗原、ＭＵＣ７抗原、ＰＳＡ抗原、ＰＳＣＡ抗原、ＰＳＭＡ抗原、Thompson-Friedenreich抗原（ＴＦ）、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、ＴＲＰ１抗原、ＴＲＰ２抗原、腫瘍特異的免疫グロブリン可変領域、及びチロシナーゼ抗原が含まれる（が、これらに限定されるものではない）。
【０２７８】
本発明のこの態様に従った抗原又は抗原決定基は、多くの異なった形態で使用してもよいことが理解されるだろう。例えば、抗原又は抗原決定基は、単離されたタンパク質又はペプチド（例えば、いわゆる「サブユニットワクチン」）として、或いは、例えば、細胞随伴又はウイルス随伴抗原又は抗原決定基（例えば、生菌又は死菌病原体系統）として存在してもよい。生菌病原体は、公知の方法で弱毒化されることが好ましい。別法として、抗原又は抗原決定基は、抗原又は抗原決定基をコードするポリヌクレオチドを使用して、対象中で生体内原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）に生成してもよい（いわゆる「ＤＮＡワクチン接種」として、但し、このアプローチで使用されうるポリヌクレオチドは、ＤＮＡに限定されず、上記で論じたようにＲＮＡ及び改変ポリヌクレオチドを含んでもよいことが理解されるであろう）。
【０２７９】
Ｂ．本発明の非免疫学的使用
細胞運命／癌の指標
しかし、本発明の構築体は、例えば、その本文が参照により本明細書に組み込まれている国際公開第９２／０７４７４号、第９６／２７６１０号、第９７／０１５７１号、米国特許第５６４８４６４号、米国特許第５８４９８６９号、及び米国特許第６００４９２４号（Yale大学／Imperial Cancer Technology）に記載されるように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の変調因子として、部分的又は完全に非免疫学的な作用様式で（例えば、一般的な細胞運命、分化、又は増殖を改変するのによって）、Ｎｏｔｃｈ経路の機能を細胞内で変化させることによって、細胞、組織、又は器官タイプの運命を変化させるのに使用してもよいことが理解されるであろう。
【０２８０】
したがって、本発明の結合体も、Ｎｏｔｃｈ経路の機能を細胞内で変化させることによって、いかなる細胞、組織、又は器官タイプの運命も変化させる方法に有用である。したがって、例えば、本発明の構築体は、悪性疾患及び新生物発生前障害の治療にも、例えば、免疫学的機序ではなく反増殖的機序による適用がある。例えば、癌の分野では、本発明の結合体は、小細胞肺癌、並びに腎臓、子宮、前立腺、ぼうこう、卵巣、結腸、及び乳房の癌などの腺癌に対して特に有用である。例えば、本発明に従って、治療可能でありうる悪性疾患には、急性及び慢性白血病、リンパ腫、骨髄腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑液膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、へん平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、絨毛膜癌、腎細胞腫、ヘパトーム、輸胆管癌腫、セミノーマ、胎児性癌、子宮頚部腫瘍、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、ぼうこう癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、及び網膜芽細胞腫などの肉腫が含まれる。
【０２８１】
本発明は、神経系障害の治療にも適用できる。本発明に従って治療されうる神経系障害には、身体傷害から生じる外傷性損傷を含めた神経損傷；虚血性損傷；悪性損傷；ＨＩＶ、帯状疱疹、又は単純ヘルペスウイルスに引き起こされたものなどの感染病巣、ライム病、結核、又は梅毒；変性損傷、疾患、及び脱髄性損傷が含まれる。
【０２８２】
本発明は、例えば、糖尿病（糖尿病性神経障害、顔面麻痺を含める）、全身性紅斑性狼瘡、サルコイドーシス、多発性硬化症、ヒト免疫不全症ウイルス関連の脊髄障害、横断性脊髄症又は様々な病因、進行性多巣性白質脳症、中心性橋脱髄症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脳梗塞又は虚血症、脊椎梗塞又は虚血症、進行性脊髄性筋萎縮、進行性球麻痺、原発性側索硬化、乳児及び若年性筋萎縮、幼年期進行性球麻痺（ファチオ‐ロンデ病）、灰白髄炎及びポリオ後症候群並びに遺伝性運動知覚神経症（シャルコー・マリー・トゥース病）を治療するのに用いてもよい。
【０２８３】
本発明は、さらに、例えば分化過程が改変することによって、組織再生及び修復を促進するのにも有用でありうる。したがって、本発明は、例えば、肝硬変、肥厚性瘢痕形成、及び乾せんなど、欠陥組織修復及び再生に関連した疾患の治療に使用することもできる。本発明は、好中球減少症又は貧血の治療、並びに器官再生、再生医工学、及び幹細胞治療の技法においても有用でありうる。
【０２８４】
医薬組成物
本発明の活性薬は、医薬組成物の形態で投与することが好ましい。これらの医薬組成物は、医学及び獣医学における、ヒト又は動物への使用に供するものでもよく、通常、１つ又は複数の活性物質に加えて、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤のいずれの１つ又は複数をも含むであろう。治療適用用に許容される担体又は希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985）に記載されている。製剤担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は、意図された投与経路、及び標準的な薬務を考慮して選択することができる。これらの医薬組成物は、いかなる適当な担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、又は可溶化剤を含んでもよい（単独で、又は追加として）。そのような医薬組成物には、保存剤、安定化剤、色素、及び、ひいては着香料も、提供される場合がある。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びパラ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。また、酸化防止剤及び懸濁剤も使用できる。
【０２８５】
投与
通常、個々の対象に最も適しているであろう実際の用量は、医師によって決定されるものであり、特定の患者の年齢、体重、及び反応によって異なるであろう。以下の用量は、平均的なケースを例示するものである。当然ながら、個々の事例によっては、さらに高い、又は低い用量範囲が有利となりうる。
【０２８６】
一実施形態では、本発明で使用される治療薬は、患者に直接生体内投与することができる。その代わりに、又はそれに加えて、ｅｘ  ｖｉｖｏの方法でこの薬剤を細胞（Ｔ細胞、及び／又はＡＰＣ若しくは幹細胞若しくは組織細胞など）に投与してもよい。例えば、Ｔ細胞又はＡＰＣなどの白血球を公知の方法で患者又はドナーから採取し、本発明の方法においてｅｘ  ｖｉｖｏで処置又はインキュベートし、その後患者に投与してもよい。
【０２８７】
一般的には、治療上有効な日用量は、治療されるべき対象の体重当たり、例えば０．０１から５００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．０１から５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１から２０ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。本発明の結合体は、静脈注入でも投与してよく、その用量は、おそらく、例えば０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲である。
【０２８８】
熟練した医療従事者ならば、いかなる特定の患者に最適な投与経路及び用量も、例えば、その患者の年齢、体重及び状態に応じて、容易に決定できるであろう。この医薬組成物は、単位用量形態であることが好ましい。
【０２８９】
本発明の薬剤は、限定されるものではないが、例えば、経口経路、直腸経路、鼻腔経路、局所経路（皮内経路、経皮経路、エアゾール経路、口腔経路、及び舌下経路を含める）腟経路、及び非経口経路（皮下経路、筋肉内経路、静脈内経路、及び皮内経路を含める）による投与を含めたいかなる適当な方法でも投与できる。
【０２９０】
活性物質は、「医薬組成物」の見出しの下に上述した薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせて投与されるのが適切である。薬学的に許容される担体又は希釈剤は、例えば、無菌等張食塩水、又はリン酸緩衝食塩水などの他の等張溶液でもよい。本発明の結合体は、いかなる適当な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を用いても適切に混合することができる。
【０２９１】
一実施形態では、活性物質が経口で有効な形態の化合物に製剤されることが望ましい場合がある。したがって、適用によっては、活性薬は、デンプン又は乳糖などの賦形剤を含有する錠剤の形態で、又はカプセル若しくはオービュール（ovule）中に単独で若しくは賦形剤と混合して、又は着香料若しくは着色剤を含有するエリキシル剤、溶液、若しくは懸濁液の形態で経口投与してもよい。結合体を含む錠剤又はカプセルなどの用量は、必要に応じて、単独で投与しても、又は一度に２つ以上を投与してもよい。結合体は徐放製剤として投与することも可能である。
【０２９２】
その代わりに、又はそれに加えて、活性物質は、吸入によって、鼻腔内経路で、若しくはエアゾール形態で、又は坐剤若しくは腟坐剤の形態で投与してもよく、また、ローション、溶液、クリーム、軟膏剤、又は散布剤の形態で局所的に適用してもよい。経皮投与の代替方法としては、皮膚用パッチ剤を使用するものがある。例えば、それらをポリエチレングリコール又は流動パラフィンの水性エマルションから成るクリームに組み入れることができる。活性物質は、白ロウ又は白色ワセリンベースから成る軟膏剤に、必要でありうる安定剤及び保存剤と共に、例えば１重量％から１０重量％までの濃度で組み入れることもできる。
【０２９３】
ポリヌクレオチド又はタンパク質／ポリペプチドなどの活性物質は、ウイルス性又は非ウイルス性の技法で投与してもよい。ウイルス性の送達機構には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス性（ＡＡＶ）ベクター、疱疹ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。非ウイルス性送達機構には、脂質媒介形質移入、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性面両親媒性試薬（cationic facial amphiphile）（ＣＦＡ）、及びこれらの組合せが含まれる。そのような送達機構に用いる経路には、粘膜経路、鼻腔経路、経口経路、非経口経路、胃腸経路、局所経路、又は舌下経路が含まれるが、これらに限定されるものではない。活性物質は、表皮若しくは真皮、又は粘膜表面などの他の部位に送達するためのパーティクルにおけるバリスチック送達などのニードルレスシステムで投与してもよい。
【０２９４】
活性物質は、非経口注入、例えば、空腔内注入、静脈内注入、筋肉内注入、又は皮下注入してもよい。
【０２９５】
非経口投与用には、活性物質は、例えば、無菌水溶液の形態で用いてもよく、そのような無菌水溶液は、他の物質、例えば、この溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖を含有してもよい。
【０２９６】
口腔又は舌下投与には、活性物質は、例えば、錠剤又はトローチの形態で投与してもよく、これらは従来の方法で製剤できる。
【０２９７】
対象（患者など）への経口、非経口、口腔及び舌下投与には、活性物質、並びにその薬学的に許容される塩及び溶媒和物の用量レベルは、通常、１０から５００ｍｇ（単一用量又は全割量中）であってもよい。したがって、一例として、錠剤又はカプセルは、５から１００ｍｇの活性物質を含有し、必要に応じて、単独で、又は一度に２つ以上を投与することができる。上述のように、個々の患者に最適であろう実際の用量は、医師によって決定されるものであり、特定の患者の年齢、体重、及び反応によって異なるであろう。上述の用量は、平均的なケースを例示するものであることに留意されたい。当然ながら、個々の事例によっては、さらに高い、又は低い用量範囲が有利となることがあり、そのような用量範囲も、本発明の範囲に包含される。
【０２９８】
熟練した医療従事者ならば、いかなる特定の患者にも最適な投与経路及び用量を、例えば、その患者の年齢、体重及び状態に応じて、容易に決定できるであろうから、記載された投与経路及び用量はガイドとしてのみ意図されるものである。
【０２９９】
本明細書において、処置又は治療という用語は、診断上及び予防上の適用も包含すると解釈するべきである。
【０３００】
本発明の治療には、ヒトへの適用、及び獣医学適用の両方が含まれる。
【０３０１】
本発明の活性物質は、例えば、免疫抑制剤、ステロイド、又は抗癌剤などの他の活性物質と共に投与してもよい。
【０３０２】
抗原及びアレルゲン
一実施形態では、本発明の活性物質は、抗原又は抗原決定基に対する免疫応答を改変（増強又は減弱）するために、そのような抗原又は抗原決定基（或いは、それらをコード化するポリヌクレオチド）と組み合わせて、同時に、別々に、又は順次に投与してもよい。
【０３０３】
本発明での使用に適した抗原は、免疫系が認識できるいかなる物質であってもよく、通常、抗原受容体によって認識される。本発明で用いられる抗原は、免疫原であることが好ましい。アレルギー反応は、宿主が、以前に遭遇した抗原に再度、曝露された際に起こる。
【０３０４】
抗原に対する免疫応答は、通常、細胞性（Ｔ細胞介在殺作用）か、又は体液性（抗原全体の認識を介した抗体産生）である。免疫応答を行うＴＨ細胞によるサイトカイン産生のパターンは、これらの反応タイプのどれが優性となるかに影響を与えることができる。即ち、細胞性免疫（ＴＨ１）は、ＩＬ−２及びＩＦＮγの産生が高く、ＩＬ−４産生が低いことで特徴付けられ、一方、体液免疫（ＴＨ２）におけるパターンでは、ＩＬ−２及びＩＦＮγの産生が低く、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３の産生が高い。これら分泌パターンは、二次リンパ系器官又は細胞のレベルで変調されるため、特定のＴＨサイトカインパターンの薬理学的操作は、生成される免疫応答のタイプ及び程度に影響を与えることができる。
【０３０５】
ＴＨ１−ＴＨ２バランスとは、ヘルパーＴ細胞におけるこれら２つの異なった形態の相対的提示を指す。これら２つの形態は、免疫系に対して、広範かつ対立的な影響をもつ。免疫応答においてＴＨ１細胞が優性なら、これらの細胞が細胞応答を駆動するであろうし、一方、ＴＨ２細胞は、抗体を主とした反応を駆動するであろう。いくつかのアレルギー反応の原因となる抗体タイプは、ＴＨ２細胞によって誘導される。
【０３０６】
本発明で使用される抗原又はアレルゲン（或いは、それらの抗原決定基）は、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、タンパク質、糖タンパク、或いは、タンパク質複合体、細胞膜試料、全細胞（生細胞又は非生細胞）、細菌細胞、又はウイルス／ウイルス成分など、複数の抗原エピトープを含有するさらに複雑な物質であってもよい。詳細には、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症関連）、膠原（リウマチ関節炎関連）、及びインスリン（糖尿病）など、自己免疫性疾患との関連が公知の抗原、又はＭＨＣ抗原若しくはその抗原決定基などの非自己組織に対する拒絶に関連した抗原を用いることが好ましい。準備刺激された、本発明のＡＰＣ及び／又はＴ細胞が組織移植操作で使用される場合には、組織提供者から抗原を得てもよい。抗原又は抗原決定基をコードするポリヌクレオチドを使用して、これを対象中で発現してもよい。
【０３０７】
本発明の様々な好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例を示すことによって、下記により詳細に説明する。
【実施例１】
【０３０８】
Ｄｅｌｔａ１  ＤＳＬドメイン＋ＥＧＦリピート１〜２
ＤＳＬドメインと、最初の２つのみの、天然に存在するＥＧＦリピート（即ち、ＥＧＦリピート３〜８をすべて除去する）とをコードするヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失変異体を、ＤＬＬ−１細胞外（ＥＣ）ドメイン／Ｖ５Ｈｉｓクローン（ヒトＤＬＬ−１  ＥＣドメインの配列に関しては、図４と、例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３５２２とを参照）から、以下に示すプライマーペアを用いて、ＰＣＲで生成した。即ち、
ＤＬａｃｌ３：ＣＡＣＣＡＴ  ＧＧＧＣＡＧ  ＴＣＧＧＴＧ  ＣＧＣＧＣＴ  ＧＧ、及び
ＤＬＬ１ｄ３−８：ＧＴＡＧＴＴ  ＣＡＧＧＴＣ  ＣＴＧＧＴＴ  ＧＣＡＧ。
【０３０９】
ＰＣＲ条件は、
９５℃／３分間の１サイクル；
（９５℃／１分間、６０℃／１分間、７２℃／２分間）の１８サイクル；及び
７２℃／２分間の１サイクルであった。
【０３１０】
その後、このＤＮＡを１％アガロースゲルから１×Ｕ／Ｖ−Ｓａｆｅ  ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（MWG−Biotech, Ebersberg, 独国）を用いて単離し、以下のプライマーによるＰＣＲに、テンプレートとして用いた。即ち、
ＦｃＤＬ．４：ＣＡＣＣＡＴ  ＧＧＧＣＡＧ  ＴＣＧＧＴＧ  ＣＧＣＧＣＴ  ＧＧ、及び
ＦｃＤＬＬｄ３−８：ＧＧＡＴＡＴ  ＧＧＧＣＣＣ  ＴＴＧＧＴＧ  ＧＡＡＧＣＧ  ＴＡＧＴＴＣ  ＡＧＧＴＣＣ  ＴＧＧＴＴＧ  ＣＡＧ。
【０３１１】
ＰＣＲ条件は、
９４℃／３分間の１サイクル；
（９４℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／２分間）の１８サイクル；及び
７２℃／１０分間の１サイクルであった。
【０３１２】
このフラグメントをｐＣＲｂｌｕｎｔII．ＴＯＰＯ（Invitrogen）中に連結し、ＴＯＰ  １０細胞（Invitrogen）中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを、Qiagen  Minprepキット（QIAprep（商標））を用い、メーカーの指示に従って生成し、ＰＣＲ産物のアイデンティティをシーケンシングによって確認した。
【０３１３】
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（Lonza Biologics, 英国）を、ＡｐａＩ及びＨｉｎｄIIIで切断し、その後シュリンプアルカリホスファターゼ（Roche）で処理し、さらにゲル精製した。
【０３１４】
ｐＣＲｂｌｕｎｔIIにクローニングされたＤＬＬ−１欠失変異体を、ＨｉｎｄIIIで（そして、後で所望のＤＮＡ産物を選択する補助に、ＥｃｏＲＶで）切断し、続いて、ＡｐａＩ部分制限を行った。その後、この配列をゲル精製し、ｐＣＯＮγベクター中に連結し、これを、ＴＯＰ  １０細胞にクローニングした。
【０３１５】
プラスミドＤＮＡを、Qiagen Minprepキット（QIAprep（商標））を用い、メーカーの指示に従って生成した。
【０３１６】
この結果得られた構築体（ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−２）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧ  Ｆｃドメインと、これに融合した、以下のＤＬＬ−１アミノ酸配列（配列番号１）をコードしていた。
ＭＧＳＲＣＡＬＡＬＡＶＬＳＡＬＬＣＱＶＷＳＳＧＶＦＥＬＫＬＱＥＦＶＮＫＫＧＬＬＧＮＲＮＣＣＲＧＧＡＧＰＰＰＣＡＣＲＴＦＦＲＶＣＬＫＨＹＱＡＳＶＳＰＥＰＰＣＴＹＧＳＡＶＴＰＶＬＧＶＤＳＦＳＬＰＤＧＧＧＡＤＳＡＦＳＮＰＩＲＦＰＦＧＦＴＷＰＧＴＦＳＬＩＩＥＡＬＨＴＤＳＰＤＤＬＡＴＥＮＰＥＲＬＩＳＲＬＡＴＱＲＨＬＴＶＧＥＥＷＳＱＤＬＨＳＳＧＲＴＤＬＫＹＳＹＲＦＶＣＤＥＨＹＹＧＥＧＣＳＶＦＣＲＰＲＤＤＡＦＧＨＦＴＣＧＥＲＧＥＫＶＣＮＰＧＷＫＧＰＹＣＴＥＰＩＣＬＰＧＣＤＥＱＨＧＦＣＤＫＰＧＥＣＫＣＲＶＧＷＧＲＹＣＤＥＣＩＲＹＰＧＣＬＨＧＴＣＱＱＰＷＱＣＮＣＱＥＧＷＧＧＬＦＣＮＱＤＬＮＹ
（配列中、１本のアンダーラインが引かれた太字部分がＤＳＬドメインであり、２本のアンダーラインが引かれた太字部分がそれぞれＥＧＦリピート１及び２である）。
【実施例２】
【０３１７】
Ｄｅｌｔａ１  ＤＳＬドメイン＋ＥＧＦリピート１〜３
ＤＳＬドメインと、最初の３つのみの、天然に存在するＥＧＦリピート（即ち、ＥＧＦリピート４から８をすべて除去する）とをコードするヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失変異体を、ＤＬＬ−１  ＤＳＬ＋ＥＧＦリピート１〜４クローンから、以下に示すプライマーペアを用いて、ＰＣＲで生成した。即ち、
ＤＬａｃｌ３：ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＧ、及び
ＦｃＤＬＬｄ４−８：ＧＧＡ  ＴＡＴ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＴＣＧ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＣＡＧ。
【０３１８】
ＰＣＲ条件は、
９４℃／３分間の１サイクル；
（９４℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／２．５分間）の１８サイクル；及び
７２℃／１０分間の１サイクルであった。
【０３１９】
その後、このＤＮＡを１％アガロースゲルから１×Ｕ／Ｖ−Ｓａｆｅ  ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（MWG−Biotech, Ebersberg, 独国）を用いて単離し、ｐＣＲｂｌｕｎｔII．ＴＯＰＯ中に連結し、ＴＯＰ  １０細胞にクローニングした（Invitrogen）。プラスミドＤＮＡを、Qiagen Minprepキット（QIAprep（商標））を用い、メーカーの指示に従って生成し、このＰＣＲ産物のアイデンティティをシーケンシングによって確認した。
【０３２０】
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（Lonza Biologics, 英国）を、ＡｐａＩ及びＨｉｎｄIIIで切断し、その後シュリンプアルカリホスファターゼ（Roche）で処理し、さらにゲル精製した。
【０３２１】
ｐＣＲｂｌｕｎｔII中にクローニングされたＤＬＬ−１欠失変異体を、ＨｉｎｄIIIで切断し、続いて、ＡｐａＩ部分制限を行った。その後、この配列をゲル精製し、ｐＣＯＮγベクター中に連結し、これを、ＴＯＰ  １０細胞にクローニングした。
【０３２２】
プラスミドＤＮＡを、Qiagen Minprepキット（qiaprep（商標））を用い、メーカーの指示に従って生成し、このＰＣＲ産物のアイデンティティをシーケンシングによって確認した。
【０３２３】
この結果得られた構築体（ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−３）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧ  Ｆｃドメインと、これに融合した、以下のＤＬＬ−１配列（配列番号２）をコードしていた。
ＭＧＳＲＣＡＬＡＬＡＶＬＳＡＬＬＣＱＶＷＳＳＧＶＦＥＬＫＬＱＥＦＶＮＫＫＧＬＬＧＮＲＮＣＣＲＧＧＡＧＰＰＰＣＡＣＲＴＦＦＲＶＣＬＫＨＹＱＡＳＶＳＰＥＰＰＣＴＹＧＳＡＶＴＰＶＬＧＶＤＳＦＳＬＰＤＧＧＧＡＤＳＡＦＳＮＰＩＲＦＰＦＧＦＴＷＰＧＴＦＳＬＩＩＥＡＬＨＴＤＳＰＤＤＬＡＴＥＮＰＥＲＬＩＳＲＬＡＴＱＲＨＬＴＶＧＥＥＷＳＱＤＬＨＳＳＧＲＴＤＬＫＹＳＹＲＦＶＣＤＥＨＹＹＧＥＧＣＳＶＦＣＲＰＲＤＤＡＦＧＨＦＴＣＧＥＲＧＥＫＶＣＮＰＧＷＫＧＰＹＣＴＥＰＩＣＬＰＧＣＤＥＱＨＧＦＣＤＫＰＧＥＣＫＣＲＶＧＷＱＧＲＹＣＤＥＣＩＲＹＰＧＣＬＨＧＴＣＱＱＰＷＱＣＮＣＱＥＧＷＧＧＬＦＣＮＱＤＬＮＹＣＴＨＨＫＰＣＫＮＧＡＴＣＴＮＴＧＱＧＳＹＴＣＳＣＲＰＧＹＴＧＡＴＣＥＬＧＩＤＥ
（配列中、１本のアンダーラインが引かれた太字部分がＤＳＬドメインであり、２本のアンダーラインが引かれた太字部分がそれぞれＥＧＦリピート１から３である。）。
【実施例３】
【０３２４】
Ｄｅｌｔａ１  ＤＳＬドメイン＋ＥＧＦリピート１〜４
ＤＳＬドメインと、最初の４つのみの、天然に存在するＥＧＦリピート（即ち、ＥＧＦリピート５から８をすべて除去する）とをコードするヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失変異体を、ＤＬＬ−１  ＥＣドメイン／Ｖ５Ｈｉｓクローンから、以下に示すプライマーペアを用いて、ＰＣＲで生成した。即ち、
ＤＬａｃｌ３：ＣＡＣＣＡＴ  ＧＧＧＣＡＧ  ＴＣＧＧＴＧ  ＣＧＣＧＣＴ  ＧＧ、及び
ＤＬＬ１ｄ５−８：ＧＧＴＣＡＴ  ＧＧＣＡＣＴ  ＣＡＡＴＴＣ  ＡＣＡＧ。
【０３２５】
ＰＣＲ条件は、
９５℃／３分間の１サイクル；
（９５℃／１分間、６０℃／１分間、７２℃／２．５分間）の１８サイクル；及び
７２℃／１０分間の１サイクルであった。
【０３２６】
その後、ＤＮＡを１％アガロースゲルから１×Ｕ／Ｖ−Ｓａｆｅ  ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（MWG−Biotecｈ, Ebersberg, 独国）を用いて単離し、以下のプライマーによるＰＣＲに、テンプレートとして用いた。即ち、
ＦｃＤＬ．４：ＣＡＣＣＡＴ  ＧＧＧＣＡＧ  ＴＣＧＧＴＧ  ＣＧＣＧＣＴ  ＧＧ、及び
ＦｃＤＬＬｄ５−８：ＧＧＡＴＡＴ  ＧＧＧＣＣＣ  ＴＴＧＧＴＧ  ＧＡＡＧＣＧ  ＧＴＣＡＴＧ  ＧＣＡＣＴＣ  ＡＡＴＴＣＡ  ＣＡＧ。
【０３２７】
ＰＣＲ条件は、
９４℃／３分間の１サイクル；
（９４℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／２．５分間）の１８サイクル；及び
７２℃／１０分間の１サイクルであった。
【０３２８】
このフラグメントを、ｐＣＲｂｌｕｎｔII．ＴＯＰＯ中に連結して、ＴＯＰ  １０細胞（Invitrogen）中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを、Qiagen Minprepキット（Qiaprep（商標））を用い、メーカーの指示に従って生成し、このＰＣＲ産物のアイデンティティをシーケンシングによって確認した。
【０３２９】
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（Lonza Biologics, 英国）を、ＡｐａＩ及びＨｉｎｄIIIで切断し、その後シュリンプアルカリホスファターゼ（Roche）で処理し、さらにゲル精製した。
【０３３０】
ｐＣＲｂｌｕｎｔIIにクローニングされたＤＬＬ−１欠失変異体を、ＨｉｎｄIIIで（そして、後で所望のＤＮＡ産物を選択する補助に、ＥｃｏＲＶで）切断し、続いて、ＡｐａＩで部分制限を行った。その後、この配列をゲル精製し、ｐＣＯＮγベクター中に連結し、これを、ＴＯＰ  １０細胞にクローニングした。
【０３３１】
プラスミドＤＮＡを、Qiagen Minprepキット（Qiaprep（商標））を用い、メーカーの指示に従って生成し、このＰＣＲ産物のアイデンティティをシーケンシングによって確認した。
【０３３２】
この結果得られた構築体（ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−４）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧ  Ｆｃドメインと、これに融合した、以下のＤＬＬ−１配列（配列番号２）をコードしていた。
ＭＧＳＲＣＡＬＡＬＡＶＬＳＡＬＬＣＱＶＷＳＳＧＶＦＥＬＫＬＱＥＦＶＮＫＫＧＬＬＧＮＲＮＣＣＲＧＧＡＧＰＰＰＣＡＣＲＴＦＦＲＶＣＬＫＨＹＱＡＳＶＳＰＥＰＰＣＴＹＧＳＡＶＴＰＶＬＧＶＤＳＦＳＬＰＤＧＧＧＡＤＳＡＦＳＮＰＩＲＦＰＦＧＦＴＷＰＧＴＦＳＬＩＩＥＡＬＨＴＤＳＰＤＤＬＡＴＥＮＰＥＲＬＩＳＲＬＡＴＱＲＨＬＴＶＧＥＥＷＳＱＤＬＨＳＳＧＲＴＤＬＫＹＳＹＲＦＶＣＤＥＨＹＹＧＥＧＣＳＶＦＣＲＰＲＤＤＡＦＧＨＦＴＣＧＥＲＧＥＫＶＣＮＰＧＷＫＧＰＹＣＴＥＰＩＣＬＰＧＣＤＥＱＨＧＦＣＤＫＰＧＥＣＫＣＲＶＧＷＱＧＲＹＣＤＥＣＩＲＹＰＧＣＬＨＧＴＣＱＱＰＷＱＣＮＣＱＥＧＷＧＧＬＦＣＮＱＤＬＮＹＣＴＨＨＫＰＣＫＮＧＡＴＣＴＮＴＧＱＧＳＹＴＣＳＣＲＰＧＹＴＧＡＴＣＥＬＧＩＤＥＣＤＰＳＰＣＫＮＧＧＳＣＴＤＬＥＮＳＹＳＣＴＣＰＰＧＦＹＧＫＩＣＥＬＳＡＭＴ
（配列中、１本のアンダーラインが引かれた太字部分がＤＳＬドメインであり、２本のアンダーラインが引かれた太字部分がそれぞれＥＧＦリピート１から４である）。
【実施例４】
【０３３３】
Ｄｅｌｔａ１  ＤＳＬドメイン＋ＥＧＦリピート１〜７
ＤＳＬドメインと、最初の７つの、天然に存在するＥＧＦリピート（即ち、ＥＧＦリピート８を除去する）とをコードするヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失変異体を、ＤＬＬ−１  ＥＣドメイン／Ｖ５Ｈｉｓクローンから、以下に示すプライマーペアを用いて、ＰＣＲで生成した。即ち、
ＤＬａｃｌ３：ＣＡＣＣＡＴ  ＧＧＧＣＡＧ  ＴＣＧＧＴＧ  ＣＧＣＧＣＴ  ＧＧ、及び
ＤＬＬ１ｄ８：ＣＣＴＧＣＴ  ＧＡＣＧＧＧ  ＧＧＣＡＣＴ  ＧＣＡＧＴＴ  Ｃ。
【０３３４】
ＰＣＲ条件は、
９５℃／３分間の１サイクル；
（９５℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／３分間）の１８サイクル；及び
７２℃／１０分間の１サイクルであった。
【０３３５】
その後、ＤＮＡを１％アガロースゲルから１×Ｕ／Ｖ−Ｓａｆｅ  ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（MWG−Biotech, Ebersberg, 独国）を用いて単離し、以下のプライマーによるＰＣＲに、テンプレートとして用いた。即ち、
ＦｃＤＬ．４：ＣＡＣＣＡＴ  ＧＧＧＣＡＧ  ＴＣＧＧＴＧ  ＣＧＣＧＣＴ  ＧＧ、及び
ＦＣＤＬＬｄ８：ＧＧＡＴＡＴ  ＧＧＧＣＣＣ  ＴＴＧＧＴＧ  ＧＡＡＧＣＣ  ＣＴＧＣＴＧ  ＡＣＧＧＧＧ  ＧＣＡＣＴＧ  ＣＡＧＴＴＣ。
【０３３６】
ＰＣＲ条件は、
９４℃／３分間の１サイクル；
（９４℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／３分間）の１８サイクル；及び
７２℃／１０分間の１サイクルであった。
【０３３７】
このフラグメントを、ｐＣＲｂｌｕｎｔII．ＴＯＰＯ中に連結して、ＴＯＰ  １０細胞（Invitrogen）中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを、Qiagen Minprepキット（Qiaprep（商標））を用い、メーカーの指示に従って生成し、このＰＣＲ産物のアイデンティティをシーケンシングによって確認した。
【０３３８】
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（Lonza Biologics, 英国）を、ＡｐａＩ及びＨｉｎｄIIIで切断し、その後シュリンプアルカリホスファターゼ（Roche）で処理し、さらにゲル精製した。
【０３３９】
ｐＣＲｂｌｕｎｔIIにクローニングされたＤＬＬ−１欠失変異体を、ＨｉｎｄIIIで（そして、後で所望のＤＮＡ産物を選択する補助に、ＥｃｏＲＶで）切断し、続いて、ＡｐａＩで部分制限を行った。その後、この配列をゲル精製し、ｐＣＯＮγベクター中に連結し、これを、ＴＯＰ  １０細胞にクローニングした。
【０３４０】
プラスミドＤＮＡを、Qiagen  Minprepキット（Qiaprep（商標））を用い、メーカーの指示に従って生成し、このＰＣＲ産物をシーケンシングした。
【０３４１】
この結果得られた構築体（ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−７）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧ  Ｆｃドメインと、これに融合した、以下のＤＬＬ−１配列（配列番号３）をコードしていた。
ＭＧＳＲＣＡＬＡＬＡＶＬＳＡＬＬＣＱＶＷＳＳＧＶＦＥＬＫＬＱＥＦＶＮＫＫＧＬＬＧＮＲＮＣＣＲＧＧＡＧＰＰＰＣＡＣＲＴＦＦＲＶＣＬＫＨＹＱＡＳＶＳＰＥＰＰＣＴＹＧＳＡＶＴＰＶＬＧＶＤＳＦＳＬＰＤＧＧＧＡＤＳＡＦＳＮＰＩＲＦＰＦＧＦＴＷＰＧＴＦＳＬＩＩＥＡＬＨＴＤＳＰＤＤＬＡＴＥＮＰＥＲＬＩＳＲＬＡＴＱＲＨＬＴＶＧＥＥＷＳＱＤＬＨＳＳＧＲＴＤＬＫＹＳＹＲＦＶＣＤＥＨＹＹＧＥＧＣＳＶＦＣＲＰＲＤＤＡＦＧＨＦＴＣＧＥＲＧＥＫＶＣＮＰＧＷＫＧＰＹＣＴＥＰＩＣＬＰＧＣＤＥＱＨＧＦＣＤＫＰＧＥＣＫＣＲＶＧＷＱＧＲＹＣＤＥＣＩＲＹＰＧＣＬＨＧＴＣＱＱＰＷＱＣＮＣＱＥＧＷＧＧＬＦＣＮＱＤＬＮＹＣＴＨＨＫＰＣＫＮＧＡＴＣＴＮＴＧＱＧＳＹＴＣＳＣＲＰＧＹＴＧＡＴＣＥＬＧＩＤＥＣＤＰＳＰＣＫＮＧＧＳＣＴＤＬＥＮＳＹＳＣＴＣＰＰＧＦＹＧＫＩＣＥＬＳＡＭＴＣＡＤＧＰＣＦＮＧＧＲＣＳＤＳＰＤＧＧＹＳＣＲＣＰＶＧＹＳＧＦＮＣＥＫＫＩＤＹＣＳＳＳＰＣＳＮＧＡＫＣＶＤＬＧＤＡＹＬＣＲＣＱＡＧＦＳＧＲＨＣＤＤＮＶＤＤＣＡＳＳＰＣＡＮＧＧＴＣＲＤＧＶＮＤＦＳＣＴＣＰＰＧＹＴＧＲＮＣＳＡＰＶＳＲ
（配列中、１本のアンダーラインが引かれた太字部分がＤＳＬドメインであり、２本のアンダーラインが引かれた太字部分がそれぞれＥＧＦリピート１から７である）。
【実施例５】
【０３４２】
トランスフェクション及び発現
ｉ）実施例１、３、及び４の構築体のトランスフェクション及び発現
以下の通りに、上記実施例１、３、及び４で得た各発現構築体（即ち、ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−２、ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−４、ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−７）と、コントロールであるｐＣＯＮχとを用い、別々に、Ｃｏｓ１細胞を形質移入した。
【０３４３】
その都度、３×１０６の細胞を１０ｃｍディッシュ中のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）にプレーティングし、オーバーナイト静置して、細胞をプレートに付着させた。この細胞の単層を、５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄し、細胞を８ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ（商標）培地（Gibco／Invitrogen）中に静置した。１２μｇの適切な構築体ＤＮＡを、８１０μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地中に希釈し、１４μｌのLipofectamine2000（商標）陽イオン性脂質トランスフェクション試薬（Invitrogen）を、８１０μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地中に希釈した。その後、ＤＮＡを含有し、かつLipofectamine2000試薬を含有する溶液を混和し、室温で最低２０分間インキュベートし、その後、細胞に添加した。その際、トランスフェクション混合物は、ディッシュ中で、確実に均等に分布するようにした。細胞を６時間トランスフェクション試薬でインキュベートし、その後、培溶液を除去して、２０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで置換した。５日後に、分泌タンパク質を含有する上清を細胞から収集し、上清中に懸濁した死亡細胞を遠心（４５００ｒｐｍ、５分間）によって除去した。この結果得られた発現産物を、ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−２  Ｆｃ（ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−２より）、ｈＤＬＬ１  ＥＧＦＩ−４  Ｆｃ（ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−４より）、及びｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−７  Ｆｃ（ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−７より）と名付けた。
【０３４４】
Ｆｃ融合タンパク質の発現は、ウェスタンブロットで評価した。１０μｌの上清中にあるタンパク質を、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、セミドライ装置を用いて、Hybond（商標）-ＥＣＬ（Amersham Pharmacia Biotech）ニトロセルロース膜（１７Ｖ、２８分間）上にブロッティングした。Ｆｃ融合タンパク質の存在は、ブロッキング溶液（Ｔｗｅｅｎ２０界面活性剤を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水中の５％固形無脂乳；ＴＢＳ−Ｔ）中に１：５００で希釈したＪＤＣ１４抗ヒトＩｇＧ４抗体を用いて、ウェスタンブロットで検出した。ブロットをこの溶液中で１時間インキュベートし、その後、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。各５分間、３回の洗浄の後、マウス抗ヒトＩｇＧ４抗体の存在を、ブロッキング溶液中に１：１００００で希釈された抗マウスＩｇＧ−ＨＰＲＴ結合抗血清を用いて検出した。ブロットをこの溶液中で１時間インキュベートし、その後、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した（各５分間、３回の洗浄）。Ｆｃ融合タンパク質の存在は、その後、ＥＣＬ（商標）検出試薬（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、可視化した。
【０３４５】
１０ｍｌの上清中に存在するタンパク質の量は、１０ｎｇ（７）、３０ｎｇ（８）、及び１００ｎｇ（９）のタンパク質を含有するカッパ鎖標準と比較することで評価した。
【０３４６】
ブロット結果を図７に示す。
【０３４７】
ii）実施例２の構築体のトランスフェクションと発現
以下の通りに、実施例２で得られた発現構築体（即ち、ｐＣＯＮχｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−３）でＣｏｓ１細胞を形質移入した。
【０３４８】
７．１×１０５の細胞をＴ２５フラスコ中のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）にプレーティングし、オーバーナイト静置して、細胞をプレートに付着させた。この細胞の単層を５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞を１．１４ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ（商標）培地（Gibco／Invitrogen）に静置した。２．８５μｇの適切な構築体ＤＮＡを、１４３μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地中に希釈し、１４．３μｌのLipofectamine2000（商標）陽イオン性脂質トランスフェクション試薬（Invitrogen）を、１２９μｌのＯＰＴＩＭＥＭ培地中に希釈し、室温で４５分間インキュベートした。その後、ＤＮＡを含有し、かつLipofectamine2000試薬を含有する溶液を混和し、室温で１５分間インキュベートし、その後、細胞に添加した。その際、トランスフェクション混合物は、フラスコ中で、確実に均等に分布するようにした。細胞を１８時間トランスフェクション試薬でインキュベートし、その後、培溶液を除去して、３ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで置換した。４日後に、分泌タンパク質を含有する上清を細胞から収集し、上清中に懸濁した死亡細胞を遠心（１２００ｒｐｍ、５分間）によって除去した。この結果得られた発現産物を、ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−３  Ｆｃ（ｐＣＯＮχ  ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−３より）と名付けた。
【実施例６】
【０３４９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性アッセイに用いるための構築体
Ａ）ルシフェラーゼレポータープラスミド１０×ＣＢＦ１−Ｌｕｃ（ｐＬＯＲ９１）の構築
以下のような、ＢｇｌII及びＨｉｎｄIII付着端を有するアデノウイルス主要後期プロモーターＴＡＴＡボックスモチーフを生成した。
ＢｇIII                                          ＨｉｎｄIII
ＧＡＴＣＴＧＧＧＧＧＧＣＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＧＧＴＡ
ＡＣＣＣＣＣＣＧＡＴＡＴＴＴＴＣＣＣＣＣＡＴＴＣＧＡ
【０３５０】
この配列をプラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Promega）のＢｇｌII部位とＨｉｎｄIII部位との間にクローニングして、プラスミドｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡを生成した。
【０３５１】
以下のような、ＢａｍＨＩ及びＢｇｌII付着端を有するＴＰ１プロモーター配列（ＴＰ１；２つのＣＢＦ１リピートと等価）を生成した。
BamH1                                                    Bg1II
-----------------------------------------------------------------
5'  GATCCCGACTCGTGGGAAAATGGGCGGAAGGGCACCGTGGGAAAATAGTA  3'
3'  GGCTGAGCACCCTTTTACCCGCCTTCCCGTGGCACCCTTTTATCATCTAG  5'
【０３５２】
この配列をＢｇｌII部位に反復挿入して五量体にし、その結果得られたＴＰ１五量体（１０ＣＢＦ１リピートと等価）を、ＢｇｌII部位でｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡに挿入して、プラスミドｐＬＯＲ９１を生成した。
【０３５３】
Ｂ）完全長Ｎｏｔｃｈ２及び１０×ＣＢＦ１−Ｌｕｃレポーターカセットを発現する安定したＣＨＯ細胞レポーター細胞系の作製
ヒトＮｏｔｃｈ２遺伝子の完全コード配列（例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３１５３５６を参照）にまたがるｃＤＮＡクローンを以下の通りに構築した。全細胞内ドメインと細胞外ドメインの一部とをコードする３’ｃＤＮＡ断片を、ＰＣＲベースのスクリーニングストラテジーを用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（OriGene Technologies, 米国）から単離した。残りの５’コード配列を、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡの迅速増幅は終わる）ストラテジーを用いることで単離し、既存の３’フラグメントに、両フラグメントに共通のユニーク制限部位（Ｃｌａ  Ｉ）を用いて連結した。この結果得られた完全長ｃＤＮＡを、その後、停止コドンなしで哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−ＨｉｓＡ（Invitrogen）中にクローニングして、プラスミドｐＬＯＲ９２を生成した。したがって、ｐＬＯＲ９２は、哺乳動物細胞で発現されると、細胞内ドメインの３’末端に、Ｖ５タグ及びＨｉｓタグを有する完全長ヒトＮｏｔｃｈ２タンパク質を発現する。
【０３５４】
Lipfectamine2000（商標）（Invitrogen）を用いて、野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（例えば、受託番号ＡＴＣＣ−ＣＣＬ  ６１を参照）をｐＬＯＲ９２（ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＮｏｔｃｈ２−Ｖ５−Ｈｉｓ）で形質移入し、完全長ヒトＮｏｔｃｈ２（Ｎ２）を発現する安定したＣＨＯ細胞クローンを作製した。形質移入体クローンを、９６ウェルプレート中のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％熱不活性化牛胎児血清（（ＨＩ）ＦＣＳ）＋グルタミン＋ペニシリンストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）＋１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Geneticin（商標）、Invitrogen）中で、限界希釈を用いて選択した。個々のコロニーをＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ＋０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８で拡張した。抗Ｖ５モノクローナル抗体（Invitrogen）を用いた、細胞溶解液のウェスタンブロットによって、クローンのＮ２の発現をテストした。その後、陽性のクローンを、レポーターベクターｐＬＯＲ９１（１０×ＣＢＦ１−Ｌｕｃ）で一過性形質移入し、完全長ヒトＤｅｌｔａ様リガンド１（ＤＬＬ１；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１９６５７１を参照）を発現する安定したＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ）と共培養することによってテストした。（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａは、ＣＨＯ  Ｎｏｔｃｈ２クローンと同様に、但し、Ｎｏｔｃｈ２の代わりにヒトＤＬＬ１を用いて調製した。陽性の強いクローンを、抗Ｖ５  ｍＡｂを用いた、細胞溶解液のウェスタンブロットによって選択した。）
【０３５５】
ｐＬＯＲ９１（１０×ＣＢＦ１−Ｌｕｃ）で一過性形質移入し、完全長ヒトＤＬＬ１（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ１）を発現する安定したＣＨＯ細胞クローンと共培養させた際、１株の安定したＣＨＯ−Ｎ２クローン、即ちＮ２７が高レベルの誘導を与えることが判明した。ハイグロマイシン遺伝子カセット（ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、Invitrogen社から入手可能）を、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを用いて、ｐＬＯＲ９１（１０×ＣＢＦ１−Ｌｕｃ）に挿入し、このベクター（１０×ＣＢＦ１−Ｌｕｃ−ｈｙｇｒｏ）を、Lipfectamine2000（Invitrogen）を用いて安定したＣＨＯ−Ｎ２クローン（Ｎ２７）に形質移入した。形質移入体クローンを、９６ウェルプレート中のＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ＋０．４ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Invitrogen）＋０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Invitrogen）中で、限界希釈を用いて選択した。個々のコロニーをＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ＋０．２ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ＋０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Invitrogen）で拡張した。
【０３５６】
完全長ヒトＤＬＬ１を発現する安定したＣＨＯ細胞クローンと、共培養することによってクローンをテストした。３株の安定したレポーター細胞系、即ちＮ２７＃１１、Ｎ２７＃１７、及びＮ２７＃３６が作製された。Ｎ２７＃１１は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達非存在下におけるバックグラウンドシグナルが低く、したがってシグナル伝達が開始された際の誘導が高倍率であったため、その後に使用するために選択した。９６ウェルプレートに、１ウェル当たり１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓを入れ、その中に１ウェル当たり２×１０４細胞のＮ２７＃１１細胞を入れて、アッセイをセットアップした。
【実施例７】
【０３５７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を検出するためのルシフェラーゼアッセイ
実施例５で得られたＦｃタグ付きＮｏｔｃｈリガンド発現産物（ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−２  Ｆｃ、ｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−４  Ｆｃ、及びｈＤＬＬ１  ＥＧＦ１−７  Ｆｃ）を、それぞれ別々に、ビオチン化されたα−ＩｇＧ−４（０．５ｍｇ／ｍｌのクローンＪＤＣ１４、Pharmingen社［カタログ番号５５５８７９］）と併せて、ストレプトアビジン−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（４．０×１０８ビーズ／ｍｌのCELLection Biotin Binder Dynabeads［カタログ番号１１５．２１］、Dynal（英国）；「ビーズ」）上に、以下の通りにして固定した。
【０３５８】
アッセイされた各試料当たり、１×１０７個のビーズ（４．０×１０８ビーズ／ｍｌのビーズを２５μｌ）と、２μｇのビオチン化されたα−ＩｇＧ−４を用いた。ＰＢＳを１ｍｌまでビーズに添加し、混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心した。１ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、混合物を再度遠心した。ビーズは、その後、ビオチン化されたα−ＩｇＧ−４を含有する最終体積１００μｌのＰＢＳ中に、無菌エッペンドルフチューブ中で再懸濁した。これをシェーカー上に室温で３０分間置き、ＰＢＳを１ｍｌまで添加し、混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、１ｍｌのＰＢＳでさらに２回洗浄した。
【０３５９】
その後、混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心し、ビーズを１試料当たり５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。ビオチン化α−ＩｇＧ−４でコーティングされたビーズ５０μｌを、各試料に添加し、混合物を回転振盪機上、４℃でオーバーナイトインキュベートした。その後、チューブを１０００ｒｐｍ、室温で、５分間遠心した。その後、ビーズを１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、スピンダウンし、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、無菌エッペンドルフチューブに移し、さらに２×１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、スピンダウンし、最終体積１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓに再懸濁した。これは、即ち、１．０×１０５ビーズ／μｌである。
【０３６０】
安定したＮ２７＃１１細胞（Ｔ８０フラスコ）を、０．０２％のＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて取り出し、スピンダウンし、１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓに再懸濁した。１０μｌの細胞を計数し、新鮮なＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓで細胞濃度を１．０×１０５細胞／ｍｌに調整した。２４ウェルプレート中で、１ウェル当たり１．０×１０５の細胞を、体積１ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ中にプレーティングし、細胞が沈下するまで、少なくとも３０分間、インキュベーター中に静置した。
【０３６１】
その後、２０μｌのビーズをデュプリケートで１対のウェルに添加して、２．０×１０６ビーズ／ウェル（１００ビーズ／細胞）とし、プレートをＣＯ２インキュベーターにオーバーナイト静置した。
【０３６２】
その後、すべてのウェルから上清を取り出し、１００μｌのSteadyGlo（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）を添加し、この結果得られた混合物を室温に５分間静置した。
【０３６３】
その後、細胞溶解を確実なものとするために、混合物を上下に２回ピペッティングし、各ウェルからの内容物を９６ウェルプレート（Ｖ字形ウェルを有する）に移し、プレートホルダー中、１０００ｒｐｍ、室温で、５分間遠心した。
【０３６４】
その後、ビーズペレットを後に残し、透明になった上清１７５μｌを白い９６ウェルプレート（Nunc）に移した。
【０３６５】
その後、TopCount（商標）（Packard）カウンターを用いて、ルミネッセンスのリーディングを行った。結果を図８に示す（図には、完全長ＤＬＬ１  ＥＣドメインを含有する構築体から得られた活性も、比較のために示す）。
【実施例８】
【０３６６】
Ｊａｇｇｅｄトランケーション
ヒトＪａｇｇｅｄ１（ｈＪａｇ１）ＤＳＬドメインと、それぞれ最初の２、３、４、及び１６の天然に存在するＪａｇｇｅｄ  ＥＧＦリピートをコードするヌクレオチド配列を、ＰＣＲでヒトＪａｇｇｅｄ−１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６１２７６を参照）ｃＤＮＡから生成した。その後、この配列を精製し、免疫グロブリンＦｃドメインをコードするｐＣＯＮγ発現ベクター中に連結し、発現させ、ミクロビーズ上にコーティングした。発現されたタンパク質は、ＤＳＬドメインと、ｐＣＯＮγベクターによってコードされたＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合した、それぞれ、最初の２（ｈＪａｇ１  ＥＧＦ１−２）、３（ｈＪａｇ１  ＥＧＦ１−３）、４（ｈＪａｇ１  ＥＧＦ１−４）、及び１６（ｈＪａｇ１  ＥＧＦ１−１６）リピートのＪａｇｇｅｄ  ＥＧＦリピートとを含んでいた。その後、上述の通りに、それぞれの発現されたタンパク質でコーティングされたビーズの活性を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達レポーターアッセイでテストした。得られた活性データを図９に示す。
【０３６７】
より容易な比較をするために、類似性のアッセイを、実施例５で得られた対応するＤｅｌｔａ蛋白質と共に、この実施例で得られた発現Ｊａｇｇｅｄタンパク質を用いて実施した。結果を図１０に示す。
【実施例９】
【０３６８】
Ｊａｇｇｅｄ  ＥＧＦ１〜２の感度強化アッセイ
別の実験では、実施例７で得られた、ヒトＪａｇｇｅｄ１  ＤＳＬドメインと、最初の２つのＥＧＦリピート（ｈＪａｇ１  ＥＧＦ１−２）とを含有する精製されたタンパク質をビーズ上にコーティングし、その活性を、上述の通りに、Ｎｏｔｃｈレポーターアッセイでテストした。この場合、タンパク質ロードがより高く、この結果、より高い感度が得られる。得られた活性データを図１１に示す。
【実施例１０】
【０３６９】
ＣＨＯ−Ｎ２細胞において、可溶性ｈＪａｇｇｅｄ１［２ＥＧＦ］−Ｆｃは、Ｎｏｔｃｈ活性化をアンタゴナイズする
ｉ）ｈＪａｇｇｅｄ１［２ＥＧＦ］−Ｆｃの調製
ヒトＪａｇｇｅｄ１（第２のＥＧＦ様ドメインの終わりまで）の切断型細胞外ドメインと、これに融合したヒトＩｇＧ４のＦｃドメインとを含む融合タンパク質（「ｈＪａｇｇｅｄ１［２ＥＧＦ］−Ｆｃ」）は、対応するＪａｇｇｅｄ１ｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＯＮγ（Lonza  Biologics, Slough, 英国）に挿入することによって調製し、この結果得られた構築体をＣＨＯ細胞中で発現させた。
【０３７０】
ii）ｈＤＬＬ１−ＦｃでコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓからのＮｏｔｃｈシグナル伝達のアンタゴニストアッセイ
必要とするＤｙｎａｂｅａｄｓビーズの総数に相当する体積を、４．０×１０８ビーズ／ｍｌのストックから取り出した。これを１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、無菌エッペンドルフチューブ中で、ビオチン化された抗ＩｇＧ４抗体（０．５ｍｇ／ｍｌのＪＤＣ１４クローン、Pharmingen社［カタログ番号５５５８７９］）を含有する最終体積１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、シェーカーの上に室温で３０分間置いた。ビーズをコーティングするのに必要なビオチン化された抗ＩｇＧ４抗体の量は、１×１０７ストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓが、最大２μｇの抗体に結合するという事実と比較して計算した。
【０３７１】
抗体でビーズをコーティングした後、それらを１ｍｌのＰＢＳで３回で洗浄し、最終的に、ＰＢＳ中に希釈されたｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃ精製タンパク質中に再懸濁した。ビーズをコーティングするのに用いられたｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃの量は、以下の実験の結果から計算された。この実験では、１×１０７個の抗ＩｇＧ４でコーティングされたビーズと共に、ｈＤＬＬ１−Ｆｃ濃度の希釈シリーズをセットアップしたところ、２〜５μｇのｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃが、体積１ｍｌのＰＢＳ中にある１×１０７個の抗ＩｇＧ４でコーティングされたビーズをコーティングするのに十分であり、かつレポーター細胞に添加された際に、良好なシグナルを与えることが判明した。したがって、通常、コーティングされるビーズ１０７当たり５μｇのｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃタンパク質を添加し、１ｍｌの体積、室温で２時間（又は４℃でオーバーナイト）回転振盪機上に置いて、ビーズを懸濁液中に保持することによって、リガンドをビーズに結合させる。ｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃでビーズをコーティングした後、ビーズを１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、最後に、完全ＤＭＥＭ中に１ｍｌ当たり２×１０７個のビーズを再懸濁した。この結果、２×１０４のレポーター細胞を含むウェルに、この懸濁液１００μｌを添加すると、１００ビーズ：細胞の比率が得られる。
【０３７２】
ビーズアンタゴニストアッセイをセットアップするために、０．０２％のＥＤＴＡ溶液（Sigma）を用いて、Ｎ２７＃１１細胞（Ｔ８０フラスコ）を取り出し、スピンダウンし、１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓに再懸濁した。１０μｌの細胞を計数し、新鮮なＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓで細胞濃度を２．０×１０５細胞／ｍｌに調整した。レポーター細胞を、９６ウェルプレート中にウェル当たり１００μｌプレーティングし（即ち、１ウェル当たり２×１０４の細胞）、沈下するまで少なくとも３０分間、インキュベーター中に静置した。
【０３７３】
精製された可溶性リガンド、即ちｈＪａｇｇｅｄ１［２ＥＧＦ］−Ｆｃ又はｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃのいずれかを、アッセイに必要な最終濃度の５倍にとなるように完全ＤＭＥＭ中に希釈し、希釈されたリガンド５０μｌを９６ウェルプレート中のＮ２７＃１１細胞１００μｌに添加した。その後、シグナル伝達を開始させるために、２×１０７ビーズ／ｍｌのｈＤｅｌｔａｌ−Ｆｃ−Ｄｙｎａｂｅａｄｓ１００μｌを添加し、各ウェル当たりの最終の体積を２５０μｌとした。その後、プレートは、３７℃のインキュベーター中にオーバーナイト静置した。
【０３７４】
翌日、すべてのウェルから１５０μｌの上清を取り出し、１００μｌのSteadyGlo（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）を添加し、この結果得られた混合物を室温に５分間静置した。その後、細胞溶解を確実なものとするために、混合物を上下に２回ピペッティングし、各ウェルからの内容物を９６ウェルプレート（Ｖ字形ウェルを有する）に移し、プレートホルダー中、１０００ｒｐｍ、室温で、５分間遠心した。その後、ビーズペレットを後に残し、透明になった上清を白い９６ウェルプレート（Nunc）に移した。その後、TopCount（商標）（Packard）カウンターでルミネッセンスのリーディングを行った。
【０３７５】
ii）ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞からのＮｏｔｃｈシグナル伝達のアンタゴニストアッセイ
ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞（上述の通り）は、ＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ＋０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８中に維持した。使用の直前に、０．０２％のＥＤＴＡ溶液（Sigma）を用いて、細胞をＴ８０フラスコから取り出し、スピンダウンし、１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓに再懸濁した。１０μｌの細胞を計数し、新鮮なＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓで細胞濃度を５．０×１０５細胞／ｍｌに調整した。
【０３７６】
ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａアンタゴニストアッセイをセットアップするために、０．０２％のＥＤＴＡ溶液（Sigma）を用いて、Ｎ２７＃１１細胞（Ｔ８０フラスコ）を取り出し、スピンダウンし、１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓに再懸濁した。１０μｌの細胞を計数し、新鮮なＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓで細胞濃度を２．０×１０５細胞／ｍｌに調整した。レポーター細胞を、９６ウェルプレート中にウェル当たり１００μｌプレーティングし（即ち、１ウェル当たり２×１０４の細胞）、沈下するまで少なくとも３０分間、インキュベーター中に静置した。
【０３７７】
精製された可溶性リガンド、即ちｈＪａｇｇｅｄ１［２ＥＧＦ］−Ｆｃ又はｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃのいずれかを、アッセイに必要な最終濃度の５倍にとなるように完全ＤＭＥＭ中に希釈し、希釈されたリガンド５０μｌを９６ウェルプレート中のＮ２７＃１１細胞１００μｌに添加した。その後、シグナル伝達を開始させるために、５×１０５細胞／ｍｌのＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞１００μｌを添加し、各ウェル当たりの最終の体積を２５０μｌとした。その後、プレートは、３７℃のインキュベーター中にオーバーナイト静置した。
【０３７８】
翌日、すべてのウェルから１５０μｌの上清を取り出し、１００μｌのSteadyGlo（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）を添加し、この結果得られた混合物を室温に５分間静置した。その後、細胞溶解を確実なものとするために、混合物を上下に２回ピペッティングし、各ウェルからの内容物を白い９６ウェルプレート（Nunc）に移した。その後、TopCount（商標）（Packard）カウンターでルミネッセンスのリーディングを行った。
【０３７９】
結果を図１２に示す。２つのみのＥＧＦリピート（ｈＪａｇｇｅｄ１［２ＥＧＦ］−Ｆｃ）を有する切断型Ｊａｇｇｅｄタンパク質は、これに対応する完全長ヒトＤｅｌｔａ１細胞外ドメイン（ｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃ）を含有するタンパク質と、実質的に同程度の阻害を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に与えることがわかる。
【実施例１１】
【０３８０】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ
（ｉ）ＣＤ４＋細胞精製
脾臓をマウス（多様に、Ｂａｌｂ／ｃ雌、８〜１０週間、Ｃ５７Ｂ／６雌、８〜１０週間、Ｄ０１１．１０トランスジェニック雌、８〜１０週間）から取り出し、０．２μＭの細胞濾過器を通して２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地中に移した（Ｒ１０Ｅ−ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社カタログ番号２２４０９）＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％牛胎児血清中の５×１０−５Ｍβメルカプトエタノール）。細胞懸濁液を遠心し（１１５０ｒｐｍ、５分）、培地を除去した。
【０３８１】
脾臓当たり５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（二重蒸留水中の０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０Ｍ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）中で細胞を４分間インキュベートした（赤血球を溶解するため）。その後、細胞をＲ１０Ｆ培地で１回洗浄し、計数した。ＣＤ４＋細胞は、メーカーの指示に従って、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（Miltenyi Biotec社カタログ番号１３０−０４９−２０１）を用い、磁気関連細胞選別機（ＭＡＣＳ）カラム（Miltenyi Biotec, Bisley, 英国：カタログ番号１３０−０４２−４０１）上で、ポジティブセレクションによって懸濁液から精製した。
【０３８２】
（ii）抗体コーティング
以下のプロトコールを、抗体で、９６ウェル平底プレートをコーティングするのに用いた。
【０３８３】
Ａ）プレートは、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）＋１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（Pharmingen, San Diego、米国：カタログ番号５５３０５８、クローン番号１４５−２Ｃ１１）＋１μｇ／ｍｌ抗ＩｇＧ４抗体（Pharmingen社カタログ番号５５５８７８）でコーティングした。１ウェル当たり１００μｌのコーティング混合物を用いた。プレートを４℃でオーバーナイトインキュベートし、その後、ＤＰＢＳで洗浄した。その後、各ウェルに１００μｌ  ＤＰＢＳ、又は１００μｌ  ＤＰＢＳ＋１０μｇ／ｍｌ  ｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃを添加した。
【０３８４】
プレートを３７℃で２〜３時間インキュベートし、その後再度ＤＰＢＳで洗浄し、その後細胞（上述の通りに調製される）を添加した。
【０３８５】
Ｂ）別法として、プレートをＤＰＢＳ＋１μｇ／ｍｌ抗ハムスターＩｇＧ抗体（Pharmingen社、カタログ番号５５４００７）＋１μｇ／ｍｌ抗ＩｇＧ４抗体でコーティングした。１ウェル当たり１００μｌのコーティング混合物を添加した。プレートを４℃でオーバーナイトインキュベートし、その後、ＤＰＢＳで洗浄した。その後、各ウェルに１００μｌ  ＤＰＢＳ＋抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）、又は１００μｌ  ＤＰＢＳ＋抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）＋ｈＤｅｌｔａ１−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。プレートを３７℃で２〜３時間インキュベートし、その後再度ＤＰＢＳで洗浄し、その後細胞（上述の通りに調製される）を添加した。
【０３８６】
（iii）初回ポリクローナル活性化及びＥＬＩＳＡ
上記のプロトコールＡ又はＢに従って、ＣＤ４＋細胞をプレコーティングされた９６ウェル平底プレート中で培養した。計数の後、細胞を２×１０６／ｍｌでＲ１０Ｆ培地＋４μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８抗体（Pharmingen社、カタログ番号５５３２９４、クローン番号３７．５１）中に再懸濁した。１ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液を添加した。その後、１００μｌのＲ１０Ｆ培養液を各ウェルに添加し、最終体積を２００μｌとした（２×１０５細胞／ウェル、抗ＣＤ２８最終濃度２μｇ／ｍｌ）。その後、プレートは、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０３８７】
その後、各ウェルから１２５μｌの上清を取り出し、R & D Systems（Abingdon、英国）からの抗体対を用いて、ＥＬＩＳＡで、ＩＬ−１０、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−１３に関してテストするまで、−２０℃で保存した。その後、細胞を新しいウェル（コーティングされていない）に１対３で分割し、Ｒ１０Ｆ培地及び組換え型ヒトＩＬ−２（２．５ｎｇ／ｍｌ、PeproTech, London, 英国：カタログ番号２００−０２）を添加した。
【実施例１２】
【０３８８】
ｉ）重合体カップリングのための遊離システインテール部分を有するＮｏｔｃｈリガンド細胞外性ドメイン断片形態にあるＮｏｔｃｈシグナル伝達変調因子の調製
ヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１；配列に関しては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３５２２を参照）のアミノ酸１〜３３２（即ち、ＤＳＬドメイン及び最初の３つのＥＧＦリピートを含む）を含み、遊離システイン残基（「Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ」）の末端を有するタンパク質フラグメントを以下の通りに調製した。
【０３８９】
ヒトＤＬＬ−１（２箇所のサイレント突然変異をもつ）の細胞外（ＥＣ）ドメインの全コード配列を含有するテンプレートを、ＰＣＲクローニングストラテジーによって、胎盤ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから作製された胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Clontech；カタログ番号６５１８−１）から調製し、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Invitrogen、英国）中のＣ末端Ｖ５ＨＩＳタグに結合にした。テンプレートをＨｉｎｄIII及びＰｍｅＩで切断して、ＥＣドメインをコードするフラグメントを取得し、これを、以下のプライマーによるＰＣＲのテンプレートとして用いた。即ち、
５’プライマー：ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＣＧＣ  ＧＣＴ  ＧＧ（配列番号３８）、及び
３’プライマー：ＧＴＣ  ＴＡＣ  ＧＴＴ  ＴＡＡ  ＡＣＴ  ＴＡＡ  ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ（配列番号３９）。
【０３９０】
ＰＣＲは、Ｐｆｕターボポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla CA、米国）を用い、以下サイクリング条件で実施した。即ち、９５℃５分間、９５℃１分間、４５〜６９℃１分間、７２℃１分間を２５サイクル、７２℃１０分間である。
【０３９１】
５８℃、６２℃、及び６７℃での産物を、１×ＴＡＥ中の１％アガロースゲルから、メーカーの指示に従って、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製し、ｐＣＲIIｂｌｕｎｔベクター（InVitrogen TOPO−bluntキット）中に連結し、その後ＴＯＰ１０細胞（InVitrogen）中に形質転換した。この結果得られたクローン配列の確認を行ったところ、元来の２箇所のサイレント突然変異のみが親クローンに存在しているのが判明した。
【０３９２】
この結果得られた「Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ」をコードする配列を、ＰｍｅＩ及びＨｉｎｄIIIを用いて切除し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、１％のアガロースゲル、１×ＴＡＥから精製し、ＰｍｅＩ及びＨｉｎｄIII部位の間でｐＣＤＮＡ３．１  Ｖ５ＨＩＳ（Invitrogen）に連結し、これにより、Ｖ５ＨＩＳ配列を除去した。得られたＤＮＡをＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。得られたクローンは、それらの配列を３’ライゲーション部位で確認した。
【０３９３】
Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓをコードするフラグメントを、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミドからＰｍｅＩ及びＨｉｎｄIIIを用いて切り出した。その後、ｐＥＥ１４．４ベクタープラスミド（Lonza Biologics, 英国）をＥｃｏＲＩを用いて制限し、クレノウ断片ポリメラーゼを用いて５’オーバーハングを埋めた。ベクターＤＮＡーをＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製カラムで浄化し、ＨｉｎｄIIIを用いて制限し、その後、シュリンプアルカリホスファターゼで処理した（Roche）。ｐＥＥ１４．４ベクター及びＤ１Ｅ３ｃｙｓフラグメントを、１×ＴＡＥ中の１％のアガロースゲルでＱｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて精製し、その後ライゲーション（Ｔ４リガーゼ）を行って、プラスミドｐＥＥ１４．４  ＤＬＬΔ４−８ｃｙｓを得た。この結果得られたクローンの配列を確認した。
【０３９４】
Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓコード配列は以下の通りである。
1    atgggcagtc  ggtgcgcgct  ggccctggcg  gtgctctcgg  ccttgctgtg
51   tcaggtctgg  agctctgggg  tgttcgaact  gaagctgcag  gagttcgtca
101  acaagaaggg  gctgctgggg  aaccgcaact  gctgccgcgg  gggcgcgggg
151  ccaccgccgt  gcgcctgccg  gaccttcttc  cgcgtgtgcc  tcaagcacta
201  ccaggccagc  gtgtcccccg  agccgccctg  cacctacggc  agcgccgtca
251  cccccgtgct  gggcgtcgac  tccttcagtc  tgcccgacgg  cgggggcgcc
301  gactccgcgt  tcagcaaccc  catccgcttc  cccttcggct  tcacctggcc
351  gggcaccttc  tctctgatta  ttgaagctct  ccacacagat  tctcctgatg
401  acctcgcaac  agaaaaccca  gaaagactca  tcagccgcct  ggccacccag
451  aggcacctga  cggtgggcga  ggagtggtcc  caggacctgc  acagcagcgg
501  ccgcacggac  ctcaagtact  cctaccgctt  cgtgtgtgac  gaacactact
551  acggagaggg  ctgctccgtt  ttctgccgtc  cccgggacga  tgccttcggc
601  cacttcacct  gtggggagcg  tggggagaaa  gtgtgcaacc  ctggctggaa
651  agggccctac  tgcacagagc  cgatctgcct  gcctggatgt  gatgagcagc
701  atggattttg  tgacaaacca  ggggaatgca  agtgcagagt  gggctggcag
751  ggccggtact  gtgacgagtg  tatccgctat  ccaggctgtc  tccatggcac
801  ctgccagcag  ccctggcagt  gcaactgcca  ggaaggctgg  gggggccttt
851  tctgcaacca  ggacctgaac  tactgcacac  accataagcc  ctgcaagaat
901  ggagccacct  gcaccaacac  gggccagggg  agctacactt  gctcttgccg
951  gcctgggtac  acaggtgcca  cctgcgagct  ggggattgac  gagtgttaa
【０３９５】
Ｌｏｎｚａ  ＧＳシステムにおける安定細胞系トランスフェクション／セレクションで用いるため、このＤＮＡをQiagen endofree maxi-prepキットを用いて調製した。
【０３９６】
ii）Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓの発現
ＤＮＡの線状化
上記（ｉ）で得られたｐＥＥ１４．４  ＤＬＬΔ４−８ｃｙｓプラスミドＤＮＡをＰｖｕＩによる制限酵素消化で線状化し、その後、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール（ＩＡＡ）を用いて浄化し、これに続いてエタノール沈殿を行った。プラスミドＤＮＡの線状化をアガロースゲルで検査し、調製の量と質を２６０／２８０ｎｍのスペクトルで測定した。
【０３９７】
トランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、トランスフェクションの２４時間前に、３ｍｌの培地（ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ）中に１ウェル当たり７．５×１０５細胞で、６つのウェルに播種し、トランスフェクションの日には９５％の集密状態となるようにした。この細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、線状化されたＤＮＡ５μｇで形質移入した。トランスフェクション混合物は、細胞シート上に５時間半放置し、その後、３ｍｌの準選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ｄＦＣＳ、ＧＳ）で置換して、オーバーナイトインキュベーションを行った。トランスフェクションの２４時間後に、培地を完全選択培地（ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、１０％ｄＦＣＳ（牛胎児血清）、ＧＳ（グルタミンシンターゼ）、２５μＭ  Ｌ−ＭＳＸ（メチオニンスルホキシミン））に換え、さらにインキュベートした。
【０３９８】
トランスフェクション後４日目及び１５日目に、１ウェル当たり１０５細胞を、９６のウェルにプレーティングした。
【０３９９】
９６ウェルプレートは、クローンとなるようにプレーティングした２週間後に、増殖しているクローンを得るために顕微鏡下でスクリーニングした。シングルコロニーを同定し、％集密状態を記録した。コロニーサイズが＞３０％となったときに培地を除去し、発現しているクローンを得るために、抗ヒトＤｅｌｔａ１抗血清に対するドットブロットによってスクリーニングを行った。陽性の強いクローンは、培地のＰＡＧＥウェスタンブロットを行って、抗ヒトＤｅｌｔａ１抗血清に反応する３６ｋＤａバンドの存在によって確認した。
【０４００】
細胞は、９６ウェルから６ウェル、６ウェルからＴ２５フラスコに継代培養することによって拡張し、その後凍結させた。最も速い増殖を行った陽性クローン（ＬＣ０９  ０００１）を、タンパク質発現を行うために拡張した。
【０４０１】
Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓの発現及び精製
１×１０７細胞をＴ５００フラスコ中の８０ｍｌ選択培地に播種した。４日間のインキュベーションの後に、培地を除去し、細胞シートをＤＰＢＳでリンスし、各フラスコにＧＳを補足した３２５培地１５０ｍｌを添加した。フラスコをさらに７日間インキュベートし、その後、収集を行った。収集した培地は、０．６５〜０．４５μｍフィルタを通して濾過し、透明にして凍結させた。凍結された収集培地は、以下のＦＰＬＣによって精製した。
【０４０２】
凍結させた収集培地は、解凍して、濾過した。１７ｍｌのＱセファロースカラムを、１０倍カラム体積の０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８緩衝液で平衡化した。収集培地を、Ｐ１ポンプセットを用いて、３ｍｌ／分でカラムにロードし、フロースルーを別の容器に集めた（これがリバース精製である−多くのＢＳＡ夾雑物はＱセファロースＦＦに結合するが、我々の標的タンパク質は結合せず、したがって、フロースルー中に残存する）。１０ｋＤａカットオフフィルタカートリッジを用いて、フロースルーをＴＦＦ装置中に濃縮し、この濃縮中に、フロースルーは０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７緩衝液で３回洗浄された。５００ｍｌを３５ｍｌまで濃縮し、最終濃度が３ｍｇ／ｍｌとなった。
【０４０３】
試料の還元及び非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥを行った（図１３にゲルを示す）。
【０４０４】
この結果得られた、発現されたＤ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質のアミノ酸配列は以下の通りであった。
ＭＧＳＲＣＡＬＡＬＡＶＬＳＡＬＬＣＱＶＷＳＳＧＶＦＥＬＫＬＱＥＦＶＮＫＫＧＬＬＧＮＲＮＣＣＲＧＧＡＧＰＰＰＣＡＣＲＴＦＦＲＶＣＬＫＨＹＱＡＳＶＳＰＥＰＰＣＴＹＧＳＡＶＴＰＶＬＧＶＤＳＦＳＬＰＤＧＧＧＡＤＳＡＦＳＮＰＩＲＦＰＦＧＦＴＷＰＧＴＦＳＬＩＩＥＡＬＨＴＤＳＰＤＤＬＡＴＥＮＰＥＲＬＩＳＲＬＡＴＱＲＨＬＴＶＧＥＥＷＳＱＤＬＨＳＳＧＲＴＤＬＫＹＳＹＲＦＶＣＤＥＨＹＹＧＥＧＣＳＶＦＣＲＰＲＤＤＡＦＧＨＦＴＣＧＥＲＧＥＫＶＣＮＰＧＷＫＧＰＹＣＴＥＰＩＣＬＰＧＣＤＥＱＨＧＦＣＤＫＰＧＥＣＫＣＲＶＧＷＱＧＲＹＣＤＥＣＩＲＹＰＧＣＬＨＧＴＣＱＱＰＷＱＣＮＣＱＥＧＷＧＧＬＦＣＮＱＤＬＮＹＣＴＨＨＫＰＣＫＮＧＡＴＣＴＮＴＧＱＧＳＹＴＣＳＣＲＰＧＹＴＧＡＴＣＥＬＧＩＤＥＣ
（この配列中で、イタリック体の配列はリーダーペプチドであり、アンダーラインを引かれた配列はＤＳＬドメインであり、太字の配列は３つのＥＧＦリピートであり、端末のＣｙｓ残基はアンダーラインが引かれた太字で示されている）。
【０４０５】
iii）Ｄ１Ｅ３ｃｙｓタンパク質の還元
（ii）で得られた４０μｇのＤ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質は、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するように、１００μｌに調製した。２倍体積の固定されたＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン塩酸；Pierce, Rockford、ＩＬ、米国、カタログ番号７７７１２；あらかじめ１ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で３回洗浄した）を添加し、混合物を回転しながら室温で３０分間インキュベートした。
【０４０６】
樹脂を室温で微量遠心機（１３０００回転／分、５分間）で沈殿させ、上清を清潔なエッペンドルフチューブに移し、氷上に保存した。タンパク質濃度は、Warburg-Christianホウで測定した。
【０４０７】
このフラグメントは、上述のような、デキストラン又はＰＥＧなどの重合体に連結されて、最終結合体を提供する。
【実施例１３】
【０４０８】
Ｄ１Ｅ３ｃｙｓのアミノ−デキストランへのカップリングによる結合体を提供
ｉ）発現されたＤ１Ｅ３ＣｙｓのＨＩＣによる精製
上記実施例１２で得られた収集培地を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製し、その後溶出液を濃縮し、緩衝液をメーカーの指示に従って遠心濃縮器を用いることで交換した。産物の純度をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定した。試料ゲルを図１４に示し、試料ゲル及び精製トレースを図１５に示す。
【０４０９】
ii）アミノデキストラン（重合体活性化）のマレイミド置換
３．２ｍｇ／ｍｌ、分子質量５０００００Ｄａのアミノデキストラン（デキストラン、アミノ、９８モルアミン／モル、Molecular Probes社、参照番号Ｄ−７１４４）を、スルフォＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル  ４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボン酸；Pierce社、参照番号２２３２２）を用いて、１モルアミノデキストラン当たり７３モルのスルフォＳＭＣＣで、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０中、２２℃で、１時間、誘導体化／活性化した。
【０４１０】
デキストランのアミノ含有量及びマレイミド置換のレベルを、ニンヒドリンアッセイを用いて測定した。デキストラン誘導体又はＢ−アラニン（Sigma、Ａ−７７５２）のアリコートを、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で５０μｌとして、２５０μｌに水で希釈した。ニンヒドリン試薬溶液（Sigma、Ｎ１６３２）を１倍体積添加し、試料を１００℃で１５分間加熱した。氷上で冷却後、１倍体積の５０％エタノールを添加し、混合した後、溶液を遠心で透明にした。５７０ｎｍにおける吸収を記録した。
【０４１１】
この結果得られたマレイミドデキストランを、Vivaspin ６ｍｌ濃縮器（VivaScience、ＶＳ０６１２）を用いた、３×５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０の緩衝液交換によって、精製及び濃縮した。
【０４１２】
デキストランの濃度を、エタノール沈殿／混濁度アッセイを用いて測定した。デキストラン誘導体の５０μｌアリコートを、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で調製した。水を添加して最終体積を５００μｌとし、１倍体積の絶対エタノールを添加してデキストランを沈殿し、６００ｎｍにおける吸収を記録した。
【０４１３】
iii）Ｄ１Ｅ３ｃｙｓの部分還元
１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０中で１ｍｇ／ｍｌのＤｌＥ３ｃｙｓタンパク質（上記（ｉ）のように精製される）を、ＴＣＥＰ．ＨＣｌ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸；Pierce、２０４９０）を用い、還元剤を１０倍モル過剰として、２２℃で１時間還元した。このタンパク質を、セファデックスＧ−２５、ＰＤ−１０カラム（Amersham biosciences、１７−０８５１−０１）を用いた、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０への緩衝液交換と、これに続くVivaspin ６ｍｌ濃縮器における濃縮によって精製した。タンパク質濃度は、Warburg-ChristianのＡ２８０／Ａ２６０法を用いて推算した。
【０４１４】
還元の効率は、Ellmanアッセイを用いて推算できる。供給されたＤ１Ｅ３ｃｙｓタンパク質は遊離チオール基をもたないが、部分還元されたＤ１Ｅ３ｃｙｓは１モルタンパク質当たり単一遊離チオール基を有すると予測される。９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて、Ｄ１Ｅ３ｃｙｓタンパク質又はＬ−システインヒドロクロリド（Sigma、Ｃ−１２７６）の１９６μｌアリコートを１００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．０で調製し、４μｌの４ｍｇ／ｍｌ  Ellman試薬（１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０中）を添加した。反応を２２℃で１５分間インキュベートし、４０５ｎｍにおける吸収を記録した。
【０４１５】
iv）還元したＤ１Ｅ３ｃｙｓのマレイミドデキストランへのカップリング
誘導体化したマレイミドデキストランを、濃縮された還元Ｄ１Ｅ３ｃｙｓに、デキストラン対Ｄ１Ｅ３ｃｙｓのモル比１：７５で添加した。カップリング反応を４℃で１８時間進行させた。
【０４１６】
この結果得られたＤ１Ｅ３ｃｙｓ−デキストラン重合体（Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ−デキストラン結合体；ＳＭＣＣリンカーを介して、それぞれ多数のＤ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質と結合したアミノデキストランを含む）を、ＡＫＴＡ精製装置ＦＰＬＣ（Amersham Biosciences）に装着された、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０中にあるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（Amersham Biosciences社、１７−１０４３−１０）カラムを用いてゲル透過クロマトグラフィーによって精製した。流速１ｍｌ／分で、各１ｍｌの分画を収集した。その後、タンパク質複合体をVivaspin ６ｍｌ濃縮器で濃縮し、タンパク質濃度を、Warburg-ChristianのＡ２８０／Ａ２６０法を用いて測定した。
【０４１７】
すべての刊行物を参照により本明細書に組み込む。記載された方法、及び本発明のシステムの様々な修正形態及び変形形態は、本発明の範囲及び精神から逸脱せずに、当業者にとって明白のものであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されたが、請求の範囲に示されるように、本発明がそのような特定の実施形態に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、本発明を実施するために記載された態様の多数の修正形態は、生化学分野及びバイオテクノロジー分野又は関連分野の当業者には明白であろうものであり、本発明の請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０４１８】
【図１】Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を示す模式図である。
【図２】ＮｏｔｃｈリガンドであるＪａｇｇｅｄ及びＤｅｌｔａを示す模式図である。
【図３】ショウジョウバエ（Drosophila）及び哺乳動物の様々なＮｏｔｃｈリガンドに由来するＤＳＬドメインのアミノ酸配列を整列させたものを示す図である。
【図４】ヒトＤｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−３、及びＤｅｌｔａ−４のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】ヒトＪａｇｇｅｄ−１及びＪａｇｇｅｄ−２のアミノ酸配列を示す図である。
【図６】本発明の様々な実施形態に従ったＮｏｔｃｈリガンドタンパク質構築体及びポリペプチド構築体を示す模式図である。
【図７】実施例５の結果を示す図である。
【図８】実施例７の結果を示す図である。
【図９】実施例８の結果を示す図である。
【図１０】実施例７及び８の結果を示す図である。
【図１１】実施例９の結果を示す図である。
【図１２】実施例１０の結果を示す図である。
【図１３】実施例１２の結果を示す図である。
【図１４】実施例１３（ｉ）の結果を示す図である。
【図１５】実施例１３（ｉ）の結果を示す図である。[参考文献（参照により本明細書に組み込む）]  Altman JD et al Science 1996 274: 94-6. Artavanis-Tsakonas S, et al. (1995) Science 268: 225-232.   Artavanis-Tsakonas S, et al. (1999) Science 284: 770-776.   Brucker K, et al. (2000) Nature 406: 411-415.   Camilli et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA91 : 2634-2638.   Chee M. et al. (1996) Science 274: 601-614.   Hemmati-Brivanlou and Melton (1997) Cell 88: 13-17.   Hicks C, et al. (2000) Nat. Cell. Biol.2 : 515-520.   Iemura et al. (1998) PNAS 95: 9337-9345.   Irvine KD (1999) Curr. Opin. Genet. Devel. 9: 434-441.   Ju BJ, et al. (2000) Nature 405: 191-195.   Leimeister C. et al. (1999) Mech Dev 85 (1-2) : 173-7.   Li et al. (1998) Immunity 8(1) : 43-55.   Lieber, T. et al. (1993) Genes Dev 7 (10) : 1949-65.   Lu, F. M. et al. (1996) Proc Natl Acad Sci 93(11) : 5663-7.   Matsuno K, et al. (1998) Nat. Genet. 19: 74-78.   Matsuno, K. et al. (1995) Development 121 (8) : 2633-44.   Medhzhitov et al. (1997) Nature 388: 394-397.   Meuer S. et al (2000) Rapid Cycle Real-time PCR, Springer-Verlag Berlin and Heidelberg GmbH & Co. Moloney DJ, et al. (2000) Nature 406: 369-375. Munro S, Freeman M. (2000) Curr. Biol. 10: 813-820. Ordentlich et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18: 2230-2239. Osborne B, Miele L. (1999) Immunity 11 : 653-663. Panin VM, et al. (1997) Nature387 : 908-912. Sasai et al. (1994) Cell 79: 779-790. Schroeter EH, et al. (1998) Nature 393: 382-386. Schroeter, E. H. et al. (1998) Nature 393(6683) : 382-6. Struhl G, Adachi A. (1998) Cell 93: 649-660. Struhl, G. et al. (1998) Cell 93 (4) : 649-60. Takebayashi K. et al. (1994) J Biol Chem 269 (7) : 150-6. Tamura K, et al. (1995) Curr. Biol. 5: 1416-1423. Valenzuela et al. (1995) J. Neurosci. 15: 6077-6084. Weinmaster G. (2000) Curr. Opin. Genet. Dev. 10: 363-369. Wilson and Hemmati-Brivanlou (1997) Neuron 18:699-710. Zhao et al. (1995) J. Immunol. 155: 3904-3911.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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