(57)【要約】本発明は、特定有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎａｎｔ ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、その製造方法及び用途に関するものである。詳細には、ヘパリンに高分子及び疎水性物質を共有結合させた疎水性多重複合ヘパリン結合体、その製造方法及び用途に関するものである。本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、優秀な抗血栓性を示しながらも疎水性を帯び、水溶液には溶解しないためすべての医療機器または人工臓器の表面改質のためのコーティング剤として有用に使用できる。
2004512397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンに高分子及び疎水性物質が結合された疎水性ヘパリン結合体。
【請求項２】
疎水性ヘパリン結合体が、ヘパリンに高分子及び疎水性物質が多重複合方法により結合された疎水性ヘパリン多重複合結合体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）である、請求項１記載の疎水性ヘパリン結合体。
【請求項３】
高分子が、合成高分子、蛋白質、生体高分子及びこれらの混合体からなる群から選択される、請求項１記載の疎水性ヘパリン結合体。
【請求項４】
合成高分子が、ポリジエン系（ｐｏｌｙ［ｄｉｅｎｅｓ］）、ポリアルケン系（ｐｏｌｙ［ａｌｋｅｎｅｓ］）、ポリアセチレン系（ｐｏｌｙ［ａｃｅｔｙｌｅｎｅｓ］）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙ［ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ］）及びその誘導体、ポリα−置換アクリル酸（ｐｏｌｙ［α−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ］）及びその誘導体、ポリビニルエーテル系　（ｐｏｌｙ［ｖｉｎｙｌ ｅｔｈｅｒｓ］）、ポリビニルアルコール系（ｐｏｌｙ［ｖｉｎｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ］）、ポリビニルハライド系（ｐｏｌｙ［ｖｉｎｙｌ ｈａｌｉｄｅｓ］）、ポリスチレン（ｐｏｌｙ［ｓｔｙｒｅｎｅ］）及びその誘導体、ポリオキシド系（ｐｏｌｙ［ｏｘｉｄｅｓ］）、ポリエーテル系（ｐｏｌｙ［ｅｔｈｅｒｓ］）、ポリエステル系（ｐｏｌｙ［ｅｓｔｅｒｓ］）、ポリカルボナート系（ｐｏｌｙ［ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ］）、ポリアミド系（ｐｏｌｙ［ａｍｉｄｅｓ］）、ポリアミノ酸系（ｐｏｌｙ［ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ］）、ポリウレア系（ｐｏｌｙ［ｕｒｅａｓ］）、ポリウレタン系（ｐｏｌｙ［ｕｒｅｔｈａｎｅｓ］）、ポリイミン系（ｐｏｌｙ［ｉｍｉｎｅｓ］）、ポリスルファイド系（ｐｏｌｙ［ｓｕｌｆｉｄｅｓ］）、ポリホスファート系（ｐｏｌｙ［ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ］）、ポリシロキサン系（ｐｏｌｙ［ｓｉｌｏｘａｎｅｓ］）、ポリシルセスキオキサン系　（ｐｏｌｙ［ｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅｓ］）、ポリ複素環系（ｐｏｌｙ［ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃｓ］）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）及びその誘導体、及びこれらの共重合体または誘導体からなる群から選択される、請求項３記載の疎水性ヘパリン結合体。
【請求項５】
蛋白質が、プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、ポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）及びこれらの誘導体または共重合体からなる群から選択される、請求項３記載の疎水性ヘパリン結合体。
【請求項６】
生体高分子が、多糖質（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、カラギナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）及びこれらの誘導体または共重合体からなる群から選択される、請求項３記載の疎水性ヘパリン結合体。
【請求項７】
疎水性物質が、高分子と結合した後の水に対する溶解度が１００ｍｇ／ｍｌ以下で、一つ以上の反応可能な官能基を持つ、請求項１記載の疎水性ヘパリン結合体。
【請求項８】
疎水性物質が、オクタデシルアミン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ， ＯＤＡ）、アルカンアミン（ａｌｋａｎｏｉｃ ａｍｉｎｅ）、胆汁酸（ｂｉｌｅ ａｃｉｄ）、ステロール（ｓｔｅｒｏｌ）、アルカン酸（ａｌｋａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）及びこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項７記載の疎水性ヘパリン結合体。
【請求項９】
ヘパリンが、ヘパリン、組換えヘパリン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｅｐａｒｉｎ）、ヘパリン誘導体（ｈｅｐａｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）及びヘパリン類似体（ｈｅｐａｒｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅ）からなる群から選択される、請求項１記載の疎水性ヘパリン結合体。
【請求項１０】
１） ヘパリンに高分子を結合させる段階、および
２） ヘパリンに結合された高分子の官能基に疎水性物質を結合させる段階を含む請求項１記載の疎水性ヘパリン結合体の製造方法。
【請求項１１】
段階１のヘパリンと高分子の結合が、ヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）、カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）、アミン基、チオール基（ｔｈｉｏ ｇｒｏｕｐ）及びアジド基（ａｚｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）からなる群から選択される反応基を利用した共有結合である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
段階２の高分子と疎水性物質の結合が、ヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）、カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）、アミン基、チオール基（ｔｈｉｏ ｇｒｏｕｐ）及びアジド基（ａｚｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）からなる群から選択される反応基を利用した共有結合である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１３】
段階１及び段階２の共有結合が、アミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）、ウレタン結合（ｕｒｅｔｈａｎｅ ｂｏｎｄ）のような非分解性結合（ｎｏｎ−ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｂｏｎｄ）及びエステル結合（ｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）、アンハイドライド結合（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｂｏｎｄ）のような分解性結合（ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｂｏｎｄ）からなる群から選択される結合である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１４】
請求項１の疎水性ヘパリン結合体を利用してすべての医療機器及び人工臓器の表面を改質する際に使用するコーティング剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、特定の有機溶媒には溶解するが、水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、その製造方法及び用途に関するものである。より詳細には、患者の治療において注射用抗血栓剤として広く使用されているヘパリンに高分子及び疎水性物質を共有結合させ、ヘパリンを疎水性化させることによって特定有機溶媒に対する溶解度は増加した反面、水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体、その製造方法及び用途に関するものである。
【０００２】
従来の技術
血管壁（ｖａｓｃｕｌａｒ ｗａｌｌ）の血栓抵抗性（ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ）は、血小板及び血漿凝固システム（ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）と両立可能な内皮性内膜（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｌｉｎｉｎｇ）を必要とする。人工血管物質とは異なり、内皮性内膜は、一般的に凝固過程でセリンプロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）の活性を誘導しない。しかし、血液の凝固能力（ｃｏａｇｕｌａｂｉｌｉｔｙ）が増加すると、内皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）はトロンビンのような凝固因子（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）を不活性化させる。一般的に、トロンビンの流入部位は内皮細胞表面であると明らかにされていて（ビー．アウブレイ（Ｂ． Ａｗｂｒｅｙ）等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９７９年、第２５４巻、Ｐ．４０９２−４０９５）、内皮細胞に存在するグリコースアミノグリカン層（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｌａｙｅｒ）もまたトロンビンの結合部位を持っていると報告されている。上記のトロンビンの結合部位にセリンプロテアーゼ等の酵素が結合すると血漿内の抗トロンビンＩＩＩ（ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ）の作用によって不活性化されると報告されている（シー．ブッシュ（Ｃ． Ｂｕｓｃｈ）等， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １９８２年、第６９巻、Ｐ．７２６−７２９ ；エム．ドライジスキ（Ｍ． Ｄｒｙｊｓｋｉ）等， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， １９８３年、第３２巻、Ｐ．３５５−３６３）。
【０００３】
また、抗トロンビンＩＩＩ結合による類似構造がヘパリン分子に存在すると報告された（ジェー．エイ．マルクム（Ｊ．Ａ． Ｍａｒｃｕｍ）等， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １９８４年、第７４巻、Ｐ．３４１−３５０ ；ジェー．エイ．マルクム（Ｊ．Ａ． Ｍａｒｃｕｍ）等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １９８５年、第１２６巻、Ｐ．３６５−３７２）後、これらを利用して、内皮様血栓抵抗性（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｌｉｋｅ ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｓｉｓｔｅｎｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を付与するために固体表面内にまたは表面上にヘパリンを導入する方法が開発され、すでに商用化されている。このようにヘパリンを利用した効果的な抗血栓抵抗性人工表面の利用可能性は、医療技術の発展に広範囲に利用されるものと期待されている。
【０００４】
このような研究の一環として、ヘパリンを使用して高分子表面の血液適合性（ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）を向上させるための方法が多様に開発された。グローデ（Ｇｒｏｄｅ）等は、 塩化シアヌル（ｃｙａｎｕｒｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）と放射線結合方法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｇｒａｆｔｉｎｇ）を利用してヘパリン−シリコンゴム（ｈｅｐａｒｉｎ−ｓｉｌｉｃｏｎ ｒｕｂｂｅｒ）を合成した（グローデ（Ｇｒｏｄｅ）等， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ．， １９７２年、第３巻、Ｐ．７７−８４）。メリル（Ｍｅｒｒｉｌｌ）等もまたグルタアルデヒド交差結合（ｇｌｕｔａｌｄｅｈｙｄｅ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）を通してヘパリンと共有結合を形成するポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）を合成した（メリル（Ｍｅｒｒｉｌｌ）等， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １９７０年、第２９巻、Ｐ．７２３−７２８）。エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）及びギレルグ（Ｇｉｌｌｅｒｇ）は、ポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）表面に付着した交差結合されたヘパリン単層（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を開発した（エリクソン及びギレルグ（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｅｒｇ）， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， １９６７年、第１巻、Ｐ．３０１−３１２）。これは、陰イオンヘパリン（ａｎｉｏｎｉｃ ｈｅｐａｒｉｎ）を連続したヘパリン交差結合でつないだ後、陽イオン界面活性剤（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）によりポリプロピレン表面に吸着させたものである。
【０００５】
ゴーセン（Ｇｏｏｓｅｎ）及びセフトン（Ｓｅｆｔｏｎ）は、ヘパリン化されたスチレン−ブタジエン−スチレン エラストマー（ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ ｓｔｙｒｅｎｅ−ｂｕｔａｄｉｅｎｅ−ｓｔｙｒｅｎｅ ｅｌａｓｔｏｍｅｒ）を合成した（ゴーセンとセフトン（Ｇｏｏｓｅｎ ａｎｄ Ｓｅｆｔｏｎ）， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， １９８０年、第２０巻、Ｐ．５４３−５５４）。また、ミユラ（Ｍｉｙｕｒａ）等は、ヘパリンをセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）またはポリヒドロキシメタクリレート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）に固定させることによって血漿の再石灰化（ｐｌａｓｍａ ｒｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）期間を延長させる方法を考案した（ミユラ（Ｍｉｙｕｒａ）等， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．，１９８０年、第１４巻、Ｐ．６１９−６３０）。
【０００６】
この他にも、ジャコブス（Ｊａｃｏｂｓ）等は、ヘパリンとプロスタグラジンＥ１（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ１）の共有結合複合体を合成した（ジャコブス（Ｊａｃｏｂｓ）等， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， １９８９年、第２３巻、Ｐ．６１１−６３０）。上記ヘパリン複合体は、ジアミノ−終結ポリエチレン酸化物（ｄｉａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅｓ）を通してウレタン（ｕｒｅｔｈａｎｅ）に固定され、このように固定された複合体がトロンビン形成過程を抑制するのにとても効果的であることを確認した。ヘンニンク（Ｈｅｎｎｉｎｋ）等は、人間血漿アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）とヘパリンの共有結合複合体を開発した（ヘンニンク（Ｈｅｎｎｉｎｋ）等， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， １９８３年、第２９巻、Ｐ．１−１３）。上記複合体は、前吸着（ｐｒｅａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）または血液と接触する表面との共有結合により高分子表面の血液適合性を向上させる。
【０００７】
ナガオカ（Ｎａｇａｏｋａ）等は、高分子表面に付着したポリエチレンオキシド親水性スペーサー（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ ［ＰＥＯ］ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｓｐａｃｅｒ）が血漿蛋白質の吸着と動力学的反発（ｄｙｎａｍｉｃ ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）による血小板の付着抑制効果を示す３０回余りの動物実験結果を発表した（ナガオカ（Ｎａｇａｏｋａ）等， Ｔｒａｎｓ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ａｒｔｉｆ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｏｒｇａｎｓ．， １９８７年、第１０巻、Ｐ．７６−７８）。ヘパリン化された表面での上記スペーサーの血小板付着抑制効果は、キム（Ｋｉｍ）及びエベルト（Ｅｂｅｒｔ）により証明された（キム及びエベルト（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｅｂｅｒｔ），Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， １９８２年、第２６巻、Ｐ．４３−５７）。これらは、固定化されたヘパリンの抗凝固（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ）活性がスペーサーの長さが長くなるほど増加することを明らかにした。
【０００８】
また、タイ（Ｔａｙ）等は、１） ＰＥＯのように長さの長いスペーサーの使用は、ヘパリンをポリビニルアルコールに対する強い結合より抗トロンビンＩＩＩ及びトロンビンにさらに結合しやすくする。 ２） 末端基（ｅｎｄ ｇｒｏｕｐｓ）を通してポリビニルアルコールに連結されたヘパリンがヘパリン大分子（ｈｅｐａｒｉｎ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の非末端性ユニット（ｎｏｎｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｎｉｔｓ）上のアミノ基（ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐｓ）により結合された場合よりさらに結合することが容易である。 ３） 表面上のヘパリンユニットのかたまりが抗トロンビンＩＩＩ及びトロンビンの接近を制限する。ことを明らかにした（タイ（Ｔａｙ）等， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， １９８９年、第１０巻、Ｐ．１１−１５）。
【０００９】
スチマー（Ｓｃｈｍｅｒ）は、ヘパリンをチオホスゲン（ｔｈｉｏｐｈｏｓｇｅｎｅ）またはカルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）のようなスペーサーを利用してアガロースに共有結合させ（スチマー（Ｓｃｈｍｅｒ）， Ｔｒａｎｓ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ａｒｔｉｆ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｏｒｇａｎｓ．， １９７２年、第１８巻、Ｐ．３２１−３２４）、スペーサー固定ヘパリンは、抗トロンビンＩＩＩに対する向上された結合能力を持っていた。ダニシェフスカイ（Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ）及びツゼング（Ｔｚｅｎｇ）は、アミノエチルスペーサー（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｓｐａｃｅｒ）を利用してヘパリン−アガロース（ａｇａｒｏｓｅ）高分子を製造した（ダニシェフスカイ及びツゼング（Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ ａｎｄ Ｔｚｅｎｇ）， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ．， １９７４年、第４巻、Ｐ．２３７−２４６）。また、パーク（Ｐａｒｋ）等は、ＰＥＯ スペーサーを利用してヘパリンをバイオマ（Ｂｉｏｍｅｒ）に固定させた（パーク（Ｐａｒｋ）等， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， １９８８年、第２２巻、Ｐ．９７７−９９２）、彼らは、固定されたヘパリンの抗凝固活性を最適化させるためには、スペーサーの長さが３，４００ダルトン程度でなければならないと報告した。リン（Ｌｉｎ）等（リン（Ｌｉｎ）等， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， １９９１年、第２５巻、Ｐ．７９１−７９５）及びピアノ（Ｐｉａｏ）等（ピアノ（Ｐｉａｏ）等， Ｔｒａｎｓ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ａｒｔｉｆ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｏｒｇａｎｓ．， １９９２年、第３８巻、Ｐ．６３８−６４３）は、スペーサーの表面密度（ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ）を増幅させ抗凝固活性を最適化させるためにスペーサーの表面にヘパリンを固定化させた。
【００１０】
さらに、ヘパリンを利用したスペーサーシステムは、共重合体の合成にも使用されてきた。グレインジャー（Ｇｒａｉｎｇｅｒ）等は、ＰＥＯ−ＰＤＭＳ−ヘパリン及びＰＤＭＳ−ＰＥＯ−ヘパリンのトライブロック共重合体（ｔｒｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）を合成した（グレインジャー（Ｇｒａｉｎｇｅｒ）等， Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， １９８８年、第２２巻、Ｐ．２３１−２４９）。細分化されたポリウレタン表面（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ ｓｕｒｆａｃｅ）にコーティングされた上記トライブロック共重合体は、低流量下でも非血栓形成能（ｎｏｎｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を向上させた。ブリック（Ｖｕｌｉｃ）等は、ポリウレタン−ＰＥＯ−ヘパリンを合成する方法を報告した（ブリック（Ｖｕｌｉｃ）等， Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． Ａ， Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ．， １９８８年、第２６巻、Ｐ．３８１−３９１）、上記方法は、ヘパリンをポリウレタン及びポリエチレングリコールと結合させ有機溶媒に溶解させた後、溶媒キャスティング方法（ｓｏｌｖｅｎｔ ｃａｓｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）で表面を改質する方法である。この方法は、コーティングが簡便な長所があるが、ヘパリンがポリウレタン及びポリエチレングリコールと結合した物質を合成する方法が容易ではない短所がある。また、上記の物質を合成する過程で、ヘパリンの架橋を抑制するためには、過量のポリエチレンを使用しなければならないため効率が低く、過量の溶媒を使用しなければならない問題点がある。
【００１１】
以上のことを鑑みて、本発明者らは、このような問題点を克服するために、ヘパリンを多官能基を持った高分子と結合させた後、上記高分子に疎水性物質を結合させることによってヘパリンを疎水性高分子と結合した形態の物質に合成する方法を開発した。上記方法を利用して有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体を合成した。上記疎水性多重複合ヘパリン結合体が溶媒蒸発法により高分子や金属からなる全ての医療機器表面に手軽にコーティングでき、高い抗血栓性を示すことを確認して本発明を完成した。
【００１２】
発明の概要
本発明の目的は、血液と接触する全ての物質の表面を改質して抗血栓性を向上させるために、特定有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しない疎水性多重複合ヘパリン結合体、その製造方法及び用途を提供することである。
【００１３】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、ヘパリンに高分子及び疎水性物質を結合させ、疎水性多重複合ヘパリン結合体を提供する。
【００１４】
また、本発明は、上記疎水性多重複合ヘパリン結合体の製造方法を提供する。
【００１５】
あわせて、本発明は、全ての医療機器または人工臓器の表面改質のためのコーティング剤としての疎水性多重複合ヘパリン結合体の用途を提供する。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、ヘパリンに疎水性高分子物質を結合させ、疎水性多重複合ヘパリン結合体を提供する。
【００１８】
本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、多重官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）を含有した高分子をヘパリンに化学的に結合させたものである。この時、ヘパリンと高分子物質の結合比は多様に調節することができ、ヘパリンの官能基中、アミン基（ａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ）を使用して高分子物質を結合させる。
【００１９】
ヘパリンは、カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）、ヒドロキシル基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）、スルホン酸基（ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｇｒｏｕｐ）及びアミン基の官能基を持っていて、この中でアミン基を除外した全ての官能基は、ヘパリンが抗血栓性を示す活性部位に存在するため、万一これらの官能基を高分子物質との化学結合に使用すればヘパリン−高分子結合体は抗血栓性特性を失うことになる。
【００２０】
上記多重官能基を含有した高分子は、合成高分子、蛋白質、生体高分子及びこれらの混合体が使用でき、合成高分子としては、ポリジエン系（ｐｏｌｙ［ｄｉｅｎｅｓ］）、ポリアルケン系（ｐｏｌｙ［ａｌｋｅｎｅｓ］）、ポリアセチレン系（ｐｏｌｙ［ａｃｅｔｙｌｅｎｅｓ］）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙ［ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ］）及びその誘導体、ポリα−置換アクリル酸（ｐｏｌｙ［α−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ］）及びその誘導体、ポリビニルエーテル系（ｐｏｌｙ［ｖｉｎｙｌ ｅｔｈｅｒｓ］）、ポリビニルアルコール系（ｐｏｌｙ［ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ］）、ポリビニルハライド系（ｐｏｌｙ［ｖｉｎｙｌ ｈａｌｉｄｅｓ］）、ポリスチレン（ｐｏｌｙ［ｓｔｙｒｅｎｅ］）及びその誘導体、ポリオキシド系（ｐｏｌｙ［ｏｘｉｄｅｓ］）、ポリエーテル系（ｐｏｌｙ［ｅｔｈｅｒｓ］）、ポリエステル系（ｐｏｌｙ［ｅｓｔｅｒｓ］）、ポリカルボナート系（ｐｏｌｙ［ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ］）、ポリアミド系（ｐｏｌｙ［ａｍｉｄｅｓ］）、ポリアミノ酸系（ｐｏｌｙ［ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ］）、ポリウレア系（ｐｏｌｙ［ｕｒｅａｓ］）、ポリウレタン系（ｐｏｌｙ［ｕｒｅｔｈａｎｅｓ］）、ポリイミン系（ｐｏｌｙ［ｉｍｉｎｅｓ］）、ポリスルファイド系（ｐｏｌｙ［ｓｕｌｆｉｄｅｓ］）、ポリホスファート系（ｐｏｌｙ［ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ］）、ポリシロキサン系（ｐｏｌｙ［ｓｉｌｏｘａｎｅｓ］）、ポリシルセスキオキサン系（ｐｏｌｙ［ｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅｓ］）、ポリ複素環系（ｐｏｌｙ［ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃｓ］）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）及びその誘導体、ポリサッカライド系（ｐｏｌｙ［ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ］）及びこれらの共重合体または誘導体等が使用できる。蛋白質としては、プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、ポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）及びこれらの誘導体または共重合体が使用できる。また、生体高分子としては、多糖質（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、カラギナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）及びこれらの誘導体または共重合体等が使用できる。この他にも、多重官能基を含有した全ての高分子が使用できる。
【００２１】
本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、ヘパリンに多重官能基を持った高分子を結合した後、未反応の高分子の官能基に疎水性物質を結合して製造する。結果的に、ヘパリン分子は、多重官能基を持ったいろいろな高分子と結合し、そこに疎水性物質が再び結合する形態を持つようになる。したがって、ヘパリンのアミン基と結合した高分子の官能基を除外した残りの結合に参与しない多量の官能基は、疎水性物質と反応するようになりこれによってヘパリンは、疎水性を持った巨大分子と結合するようになり本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体が疎水性を持つようになるのである。
【００２２】
本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）とＤＭＡＣ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）等の特定有機溶媒には溶解するが、水溶液には溶解しないという特性を持っている。したがって、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、有機溶媒にだけ溶解するため溶媒蒸発法による合成が容易なだけではなく、浸漬被覆（ｄｉｐ ｃｏａｔｉｎｇ）方法またはスプレー方法等によって、高分子や金属表面に容易にコーティングできる。また、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、水溶液には溶解しないため、コーティング後に臨床的に使用される過程で安定的に使用できる。
【００２３】
合わせて、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体においてヘパリンは、基質にコーティングされた後にも固有の抗血栓性を維持するため、コーティングされた基質の表面で起きる可能性がある血液凝固を抑制し、コーティングされた表面の抗血栓性を高める効果を示す。一方、ヘパリンは多量の陰イオンを持っていてコーティングされた表面の摩擦係数を顕著に減少させ、表面の水分吸収能力を増加させるため、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされた基質が良く湿潤（ｗｅｔｔｉｎｇ）されるように誘導する特性を持っている。このように、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティングされた基質の表面特性は、カテーテル、挿入チューブ等の血液と接触する医療機器及び人工臓器の表面を改質して性能をより向上させ、血栓による副作用を抑制できる長所を持っている。
【００２４】
また、本発明は、上記疎水性多重複合ヘパリン結合体の製造方法を提供する。上記製造方法には、
１） 高分子を活性化させる段階、
２） ヘパリンに上記活性化された高分子を結合させる段階、
３） ヘパリンに結合された高分子の官能基に疎水性物質を結合させる段階が含まれる。
【００２５】
上記製造方法は、既存の先行技術のヘパリンにポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎ）及びポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）が結合されたトライブロックコポリマー（ｔｒｉｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を製造する方式とは異なり、多重融合方法（ｍｕｌｔｉｇｒａｆｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を利用してヘパリン−高分子−疎水性物質が結合した融合高分子（ｇｒａｆｔ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を製造する方法であり、多段階工程（ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ ｐｒｏｃｅｓｓ）で構成されている。また、疎水性高分子を利用する上記トライブロックコポリマーの製造方法とは異なり本発明の製造方法は、１個以上の官能基を持った多重官能性（ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｎａｏｌ）高分子でありながら疎水性物質と結合後に疎水性をあらわすことができれば、高分子自体が疎水性を帯びるべき必要はない。構造的にも、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、上記トライブロックコポリマーと異なる形態を持っている。トライブロックコポリマーがポリウレタン鎖にＰＥＧを結合させた後、ＰＥＧ鎖端にヘパリンが結合された構造を持っている反面、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、ヘパリン自体に多重官能基を持った高分子を結合させた後、高分子の官能基に疎水性物質が結合された構造を持っている。
【００２６】
段階１の高分子には、合成高分子、蛋白質、生体高分子及びこれらの混合体が使用でき、１個以上の官能基を含む多重官能基を持った高分子が好ましい。上記多重官能基を含有した高分子としては、ポリジエン系（ｐｏｌｙ［ｄｉｅｎｅｓ］）、ポリアルケン系（ｐｏｌｙ［ａｌｋｅｎｅｓ］）、ポリアセチレン系（ｐｏｌｙ［ａｃｅｔｙｌｅｎｅｓ］）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙ［ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ］）及びその誘導体、ポリα−置換アクリル酸（ｐｏｌｙ［α−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ］）及びその誘導体、ポリビニルエーテル系（ｐｏｌｙ［ｖｉｎｙｌ ｅｔｈｅｒｓ］）、ポリビニルアルコール系（ｐｏｌｙ［ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ］）、ポリビニルハライド系（ｐｏｌｙ［ｖｉｎｙｌ ｈａｌｉｄｅｓ］）、ポリスチレン（ｐｏｌｙ［ｓｔｙｒｅｎｅ］）及びその誘導体、ポリオキシド系（ｐｏｌｙ［ｏｘｉｄｅｓ］）、ポリエーテル系（ｐｏｌｙ［ｅｔｈｅｒｓ］）、ポリエステル系（ｐｏｌｙ［ｅｓｔｅｒｓ］）、ポリカルボナート系（ｐｏｌｙ［ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ］）、ポリアミド系（ｐｏｌｙ［ａｍｉｄｅｓ］）、ポリアミノ酸系（ｐｏｌｙ［ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ］）、ポリウレア系（ｐｏｌｙ［ｕｒｅａｓ］）、ポリウレタン系（ｐｏｌｙ［ｕｒｅｔｈａｎｅｓ］）、ポリイミン系（ｐｏｌｙ［ｉｍｉｎｅｓ］）、ポリスルファイド系（ｐｏｌｙ［ｓｕｌｆｉｄｅｓ］）、ポリホスファート系（ｐｏｌｙ［ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ］）、ポリシロキサン系（ｐｏｌｙ［ｓｉｌｏｘａｎｅｓ］）、ポリシルセスキオキサン系（ｐｏｌｙ［ｓｉｌｓｅｓｑｕｉｏｘａｎｅｓ］）、ポリ複素環系（ｐｏｌｙ［ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃｓ］）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）及びその誘導体、ポリサッカライド系（ｐｏｌｙ［ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ］）及びこれらの共重合体または誘導体等の高分子、プロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）、ポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）及びこれらの誘導体または共重合体等の蛋白質、多糖質（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、アルギン酸塩（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、カラギナン（ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、ペクチン（ｐｅｃｔｉｎ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）及びこれらの誘導体または共重合体等の生体高分子が使用できる。この他にも、多重官能基を含有した全ての高分子が使用できる。
【００２７】
上記高分子物質を活性化させるために、本発明では好ましい実施例としてＮ，Ｎ−ジクロロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ， ＤＣＣ）を使用して高分子のカルボキシル基（ＣＯＯＨ）を活性化させ、この他にも１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド ［１−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ＥＤＣ］または４−ｐ−アジドサリチルアミド−ブチルアミン［４−（ｐ−ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｏ）−ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ， ＡＳＢＡ］が使用できる。
【００２８】
段階２で、ヘパリンの分子量は、１，０００ないし１，０００，０００ダルトンであることが好ましい。組換えヘパリン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｅｐａｒｉｎ）、ヘパリン誘導体（ｈｅｐａｒｉｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）及びヘパリン類似体（ｈｅｐａｒｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ）もまた、同様な方法で使用できる。ヘパリンに活性化された高分子を結合させる方法は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基、チオール基及びアジド基（ａｚｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）を利用した共有結合を利用する。上記共有結合は、アミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）及びウレタン結合（ｕｒｅｔｈａｎｅ ｂｏｎｄ）のような非分解性結合（ｎｏｎ−ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｂｏｎｄ）またはエステル結合（ｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）、アンハイドライド結合（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ｂｏｎｄ）のような分解性結合（ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｂｏｎｄ）であることが好ましい。
【００２９】
段階３で疎水性物質は、高分子と結合した後、水に対する溶解度が１００ｍｇ／ｍｌ以下で、一つ以上の反応可能な官能基を持っている物質が好ましい。上記疎水性物質としては、オクタデシルアミン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ， ＯＤＡ）、アルカンアミン（ａｌｋａｎｏｉｃ ａｍｉｎｅ）、胆汁酸（ｂｉｌｅ ａｃｉｄ）、ステロール（ｓｔｅｒｏｌ）またはアルカン酸（ａｌｋａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）等が使用できる。官能基を持ちながら官能基の結合後、疎水性を持っている物質はすべて使用できる。また、ヘパリンに結合した高分子の官能基に疎水性物質を結合させる方法は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミン基、チオール基及びアジド基を利用した共有結合を利用する。上記共有結合は、アミド結合及びウレタン結合のような非分解性結合またはエステル結合、アンハイドライド結合のような分解性結合であることが好ましい。
【００３０】
さらに、本発明は、疎水性多重複合ヘパリン結合体の用途を提供する。前述したように、上記製造方法により合成した本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、特定有機溶媒には溶解するが水溶液には溶解しないため溶媒蒸発法、浸漬被覆（ｄｉｐ ｃｏａｔｉｎｇ）方法またはスプレー方法等により高分子や金属表面に手軽にコーティングでき、水溶液には溶解しないためコーティングした後に臨床的に使用される過程で安定的に使用できる。
【００３１】
また、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされた基質は、血液凝固が抑制されコーティングされた表面の抗血栓性が優秀なだけではなく、コーティングされた表面の摩擦係数が顕著に減少し表面の水分吸収能力が増加する特性を持っている。
【００３２】
ゆえに、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、カテーテル、挿入チューブ等の血液と接触する医療機器及び人工臓器の表面を改質し、性能をより向上させ血栓による副作用を抑制可能なコーティング剤として有用に使用できる。
【００３３】
実施例
以下、本発明を実施する為の最良の態様を実施例により詳細に説明する。
【００３４】
但、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
＜実施例 １＞ ヘパリン、ポリアクリル酸及びオクタデシルアミン結合体の合成
＜１−１＞ ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ， ＰＡＡ）の活性
５ｇのポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ， 以下「ＰＡＡ」と略称する）を２５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄ， 以下「ＤＭＦ」と略称する）に加えて溶解させた後、これを氷水槽に浸けて冷却させた。上記混合溶液に１５．５ｇのＮ，Ｎ−ジクロロヘキシルカルボジイミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ， 以下「ＤＣＣ」と略称する）が溶解した２５ｍｌのＤＭＦ溶液を迅速に添加した。これを５分間撹拌してＤＣＣを活性化させた後、８．７ｇのＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｌｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ， 以下「ＨＯＳＵ」と略称する）が溶解した２５ｍｌのＤＭＦ溶液を迅速に添加した。反応が進行するにつれて徐々にＮ，Ｎ−ジクロロヘキシルウレア（Ｎ，Ｎ−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｕｒｅａ， 以下「ＤＣＵｒｅａ」と略称する）が発生しながら沈殿が起きた。２４時間反応を進行後、目の大きさ（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）０．２μｍの膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）でろ過（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）してＤＣＵｒｅａを除去し、５℃で１２時間上記混合溶液を放置した後、残存する微量のＤＣＵｒｅａ再度同じ条件でろ過して完全に除去した。ＤＭＦを室温状態で溶媒蒸発（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ， ３０℃）させて除去した上記混合溶液に５００ｍｌのメタノールを添加して５時間撹拌させた後、０．２μｍの膜でろ過して未反応のＤＣＣとＨＯＳＵを完全に除去した。上記混合溶液を室温で６時間真空乾燥させてメタノールを除去して８．７ｇの白色粉末の生成物を得た。
【００３６】
＜１−２＞ ヘパリン−ポリアクリル酸−オクタデシルアミン結合体の合成（ヘパリン／ＰＡＡ／ＯＤＡ＝ １：１：２０， モル比）
上記実施例＜１−１＞から得た０．１１ｇの活性化されたＰＡＡを１００ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、ここに０．３ｇのヘパリンが溶解した５０ｍｌの蒸溜水を５分間にわたって滴下して混合した。反応が始まってから３０分以内にヘパリンと活性化されたＰＡＡが結合した中間生成物の沈殿物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。５時間経過後、０．１３ｇのオクタデシルアミン（ｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ， 以下「ＯＤＡ」と略称する）が溶解した３５０ｍｌのＴＨＦ溶液を５分間にわたってゆっくり添加して室温で５時間反応させた。これから白色の沈殿物が生成された。３０分以内に上記沈殿物の発生は完了した。反応が終結後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて４００ｍｌのＴＨＦと蒸溜水を除去した。アセトン溶媒条件でセルロースエステル膜（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｓｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を使用した透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）を実施し、未反応のＯＤＡを除去した。以後、アセトン溶媒を水で置換して０．４５μｍのろ過膜（ｆｉｌｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ）でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を１２時間真空乾燥させて０．４５ｇの白色粉末の生成物を得た。
【００３７】
＜１−３＞ ヘパリン−ＰＡＡ−ＯＤＡ結合体の合成（ヘパリン／ＰＡＡ／ＯＤＡ＝１：５：１００， モル比）
上記実施例＜１−１＞から得た０．５５ｇの活性化されたＰＡＡを１００ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、ここに０．３ｇのヘパリンが溶解した５０ｍｌの蒸溜水を５分間にわたって滴下して混合した。反応が始まってから３０分以内にヘパリンと活性化されたＰＡＡが結合した中間生成物の沈殿物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。５時間経過後、０．６７ｇのＯＤＡが溶解した３５０ｍｌのＴＨＦ溶液を５分間にわたってゆっくり添加して室温で５時間反応させた。これから白色の沈殿物が生成された。３０分以内に上記沈殿物の発生は完了した。反応が終結後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて４００ｍｌのＴＨＦと蒸溜水を除去した。アセトン溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施し未反応のＯＤＡを除去した。以後、アセトン溶媒を水で置換して０．４５μｍの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を１２時間真空乾燥させて１．１ｇの白色粉末の生成物を得た。
【００３８】
＜１−４＞ ヘパリン−ＰＡＡ−ＯＤＡ結合体の合成（ヘパリン／ＰＡＡ／ＯＤＡ＝１：１０：２００， モル比）
上記実施例＜１−１＞から得た１．１１ｇの活性化されたＰＡＡを１００ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、ここに０．３ｇのヘパリンが溶解した５０ｍｌの蒸溜水を５分間にわたって滴下して混合した。反応が始まってから３０分以内にヘパリンと活性化されたＰＡＡが結合した中間生成物の沈殿物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。５時間経過後、１．３５ｇのＯＤＡが溶解した３５０ｍｌのＴＨＦ溶液を５分間にわたってゆっくり添加して室温で５時間反応させた。これから白色の沈殿物が生成された。３０分以内に上記沈殿物の発生は完了した。反応が終結後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて４００ｍｌのＴＨＦと蒸溜水を除去した。アセトン溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施し未反応のＯＤＡを除去した。以後、アセトン溶媒を水で置換して０．４５μｍの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を１２時間真空乾燥させて２．０ｇの白色粉末の生成物を得た。
【００３９】
＜実施例 ２＞ ヘパリン、プロタミン及びデオキシコール酸結合体の合成
＜２−１＞ デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ， ＤＯＣＡ）の活性
１１．８ｇのデオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ， 以下「ＤＯＣＡ」と略称する）を１００ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、氷水槽に浸けて冷却した。上記混合溶液に７．４ｇのＤＣＣを溶解した２５ｍｌのＤＭＦ溶液を迅速に添加した。５分間撹拌してＤＣＣを活性化させた後、上記混合溶液に４．１４ｇのＨＯＳＵが溶解した２５ｍｌのＤＭＦ溶液を迅速に添加した。反応の進行にしたがって徐々にＤＣＵｒｅａが沈殿した。２４時間反応を進行させた後、０．２μｍの膜でろ過してＤＣＵｒｅａを除去し、５℃で１２時間上記反応溶液を放置した後、残存する微量のＤＣＵｒｅａを再度同様な条件でろ過して完全に除去した。ＤＭＦを室温状態で溶媒蒸発させて除去した反応溶液に１００ｍｌのアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）を添加して白色の固形物を沈殿させた。これを０．２μｍの膜でろ過して白色の固形物を得た後、室温で５時間真空乾燥させて１２．５ｇの活性化されたＤＯＣＡを得た。
【００４０】
＜２−２＞ 疎水性プロタミン（プロタミン−ＤＯＣＡ）の合成
０．５ｇのプロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）を５０ｍｌの蒸溜水に溶解させた後、上記実施例 ＜２−１＞から得た活性化された０．２７ｇのＤＯＣＡを溶解させた５０ｍｌのＤＭＦ溶液をゆっくり添加した。これを室温で５時間放置して結合反応（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を進行させた。上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とＤＭＦを除去した後、１００ｍｌの蒸溜水で３回洗浄して未反応のプロタミンを除去して白色の固形沈殿物を得た。上記固形沈殿物を１００ｍｌのメタノールで洗浄して０．４５μｍの膜でろ過して未反応の活性化ＤＯＣＡを除去した後、真空乾燥させて白色粉末を得た。プロタミンに残存する未反応アミノ基は、１００ｍｌの１．０ｗｔ％アセトアルデヒド（ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液と１００ｍｌの５０％メタノール水溶液で１時間のブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）反応を遂行させて除去した。反応が終結後、蒸溜水で３回洗浄して未反応のアセトアルデヒドを除去してこれを真空乾燥させてＤＯＣＡがプロタミンに部分的に結合した０．５５ｇの疎水性プロタミン（プロタミン−ＤＯＣＡ）を得た。
【００４１】
＜２−３＞ プロタミン−ＤＯＣＡのエステル化反応（ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
上記実施例＜２−２＞から得た０．５ｇの活性化されたプロタミン−ＤＯＣＡを８０ｍｌのＤＭＦに加えて溶解させた後、これを１．５ｇのＤＣＣが溶解した１０ｍｌのＤＭＦ溶液に迅速に添加した。５分間撹拌してＤＣＣを活性化させた後、０．８４ｇのＨＯＳＵが溶解した１０ｍｌのＤＭＦ溶液を再び添加した。反応が進行するにしたがって微量のＤＣＵｒｅａが沈殿した。室温で２４時間反応させた後、０．２μｍの膜でろ過してＤＣＵｒｅａを除去した後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させてＤＭＦを除去した。これから得られた白色粉末を１００ｍｌのメタノールで２回洗浄して０．２μｍの膜でろ過して白色の固形物を得た。上記白色の固形物を室温で５時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化された疎水性プロタミン（プロタミン−ＤＯＣＡ）０．４５ｇを得た。
【００４２】
＜２−４＞ ヘパリン−プロタミン−ＤＯＣＡ結合体の合成
上記実施例＜２−３＞から得た０．５ｇの活性化されたプロタミン−ＤＯＣＡを１００ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、０．９２ｇのヘパリンが溶解した５０ｍｌの蒸溜水を５分間にわたって滴下しながら混合した。反応が始まって３０分以内に縮合反応によって結合した生成物が沈殿した。白色の沈殿物生成は、３０分程度で完了した。５時間反応が進行した後、上記反応溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とＤＭＦを除去して白色の粉末を得た。メタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化プロタミン−ＤＯＣＡを除去した。メタノール溶媒を水で置換して０．４５μｍの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を室温で１２時間真空乾燥させて１．０５ｇの白色粉末の生成物を得た。
【００４３】
＜実施例 ３＞ ヘパリン， プロタミン及びグリココール酸結合体の合成
＜３−１＞グリココール酸（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＧＯＣＡ）の活性
９．３ｇのグリココール酸（ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ， 以下「ＧＯＣＡ」と略称する）を１００ｍｌのＤＭＦに加えて溶解させた後、ここに６．６ｇのＤＣＣが溶解した２５ｍｌのＤＭＦ溶液を迅速に添加した。５分間撹拌してＤＣＣを活性化させた後、３．７ｇのＨＯＳＵが溶解した２５ｍｌのＤＭＦ溶液を上記混合溶液に添加した。エステル化反応が進行しながら徐々にＤＣＵｒｅａが発生し沈殿した。室温で２４時間反応を進行させた後、０．２μｍの膜でろ過してＤＣＵｒｅａを除去し、５℃で１２時間放置して残存する微量のＤＣＵｒｅａを再結晶させ、これを同様な条件でろ過して完全に除去した。上記混合溶液を室温で１５ｍｌ程度に濃縮した後、ここに１００ｍｌのアセトニトリルを添加して白色の固形物を沈殿させた。これを０．２μｍの膜でろ過して白色の粉末を得た後、室温で５時間真空乾燥させて７．０ｇの活性化したＯＣＡを得た。
【００４４】
＜３−２＞ 疎水性プロタミン（プロタミン−ＧＯＣＡ）の合成
０．５ｇのプロタミンを５０ｍｌの蒸溜水に溶解させた後、上記実施例＜３−１＞から得た活性化された０．３１ｇのＧＯＣＡが溶解した５０ｍｌのＤＭＦ溶液をゆっくり添加した。室温で５時間結合反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とＤＭＦを除去し、１００ｍｌの蒸溜水で３回洗浄して未反応のプロタミンを除去して白色の固形沈殿物を得た。１００ｍｌのメタノールで洗浄して０．４５μｍの膜でろ過して未反応の活性化ＧＯＣＡを除去した後、真空乾燥させて白色粉末を得た。上記白色粉末を１．０ｗｔ％アセトアルデヒドを含有した１００ｍｌの５０％メタノール水溶液で１時間ブロッキング反応を遂行して、プロタミンに残存する未反応のアミノ基を除去した。反応が終結した後、蒸溜水で３回洗浄して真空乾燥し、ＧＯＣＡがプロタミンに部分的に結合した０．６ｇの疎水性プロタミン−ＧＯＣＡを得た。
【００４５】
＜３−３＞ プロタミン−ＧＯＣＡのエステル化反応
上記実施例＜３−２＞から得た０．５ｇのプロタミン−ＧＯＣＡを８０ｍｌのＤＭＦに加えて溶解させた後、ここに１．５ｇのＤＣＣが溶解した１０ｍｌのＤＭＦ溶液を迅速に添加した。５分間撹拌してＤＣＣを活性化させた後、０．８４ｇのＨＯＳＵが溶解した１０ｍｌのＤＭＦ溶液を再び添加した。反応が進行するにしたがって微量のＤＣＵｒｅａが沈殿した。室温で２４時間反応を進行させた後、０．２μｍの膜でろ過してＤＣＵｒｅａを除去して上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させてＤＭＦを除去した。これから得た白色粉末を１００μｍのメタノールで２回洗浄して０．２μｍの膜でろ過して白色の固形物を得た後、室温で５時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化された疎水性プロタミン−ＧＯＣＡ ０．４ｇを得た。
【００４６】
＜３−４＞ ヘパリン−プロタミン−ＧＯＣＡ結合体の合成
上記実施例＜３−３＞から得た０．５ｇの活性化されたプロタミン−ＧＯＣＡを１００ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、ここに０．７８ｇのヘパリンが溶解した５０ｍｌの蒸溜水を５分間にわたって滴下して混合した。反応が始まって３０分以内に縮合反応で結合された生成物が沈殿した。白色の沈殿物生成は、３０分程度で完了した。室温で５時間反応を進行させた後、上記混合溶液を溶媒蒸発させて蒸溜水とＤＭＦを除去した。これから得た白色の粉末をメタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化プロタミン−ＧＯＣＡを除去した。メタノールを水で置換して ０．４５μｍの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去して得た白色沈殿物を室温で１２時間真空乾燥させて０．９ｇの白色粉末の生成物を得た。
【００４７】
＜実施例 ４＞ ヘパリン、ポリリジン及びＤＯＣＡ結合体の合成
＜４−１＞ ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ， ＰＬＬ）及びＤＯＣＡの結合体（ＰＬＬ−ＤＯＣＡ）合成
１．０ｇのポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ， 以下「ＰＬＬ」と略称する）を５０ｍｌの蒸溜水に溶解させた後、そこに上記実施例＜２−１＞から得た０．９８ｇの活性化されたＤＯＣＡが溶解した５０ｍｌのＤＭＦ溶液をゆっくり添加した。室温で５時間結合反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とＤＭＦを除去した。これを１００ｍｌの蒸溜水で３回洗浄して未反応のＰＬＬを除去し、白色の固形沈殿物を得た。上記固形沈殿物を１００ｍｌのメタノールで洗浄して０．４５μｍの膜でろ過して未反応の活性化ＤＯＣＡを除去した。これを再び真空乾燥させて白色粉末を得た。ＰＬＬに残存する未反応のアミノ基は１．０ｗｔ％アセトアルデヒドを含有した１００ｍｌの５０％メタノール水溶液で１時間のブロッキング反応を遂行して除去した。反応が終結した後、蒸溜水で３回洗浄して未反応のアセトアルデヒドを除去した。これを再び真空乾燥させてＤＯＣＡがＰＬＬに部分的に結合した１．５ｇの疎水性ＰＬＬ−ＤＯＣＡを得た。
【００４８】
＜４−２＞ ＰＬＬ−ＤＯＣＡのエステル化反応
上記実施例＜４−１＞から得た１．０ｇのＰＬＬ−ＤＯＣＡを８０ｍｌのＤＭＦに加えて溶解させた後、２．０ｇのＤＣＣが溶解した１０ｍｌのＤＭＦ溶液を迅速に添加した。５分間撹拌してＤＣＣを活性化させた後、１．１２ｇのＨＯＳＵが溶解した１０ｍｌのＤＭＦ溶液を再び添加した。反応が進行するにつれて微量のＤＣＵｒｅａが発生した。室温で２４時間反応を進行させた後、上記混合溶液を０．２μｍの膜でろ過してＤＣＵｒｅａを除去した後、室温で溶媒蒸発させてＤＭＦを除去した。これから得た白色粉末を１００ｍｌのメタノールで２回洗浄して０．２μｍの膜でろ過して白色の固形物を得た。これを再び室温で５時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化されたＰＬＬ−ＤＯＣＡ ０．９ｇを得た。
【００４９】
＜４−３＞ ヘパリン−ＰＬＬ−ＤＯＣＡ 結合体の合成
上記実施例＜４−２＞から得た０．７ｇの活性化されたＰＬＬ−ＤＯＣＡを１００ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、そこに０．９５ｇのヘパリンが溶解した５０ｍｌの蒸溜水を５分間にわたって滴下して混合した。反応が始まって３０分以内に縮合反応で結合された生成物が沈殿した。白色の沈殿物生成は３０分程度で完了した。室温で５時間反応を進行させた後、上記混合溶液を溶媒蒸発させて蒸溜水とＤＭＦを除去して白色の粉末を得た。メタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化ＰＬＬ−ＤＯＣＡを除去した。メタノールを水で置換して０．４５μｍの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去して白色沈殿物を得た。上記白色沈殿物を室温で１２時間真空乾燥させて１．１ｇの白色粉末の生成物を得た。
【００５０】
＜実施例 ５＞ ヘパリン、ＰＬＬ及びＧＯＣＡ結合体の合成
＜５−１＞ ＰＬＬ及びＧＯＣＡ結合体（ＰＬＬ−ＧＯＣＡ）の合成
１．０ｇのＰＬＬを５０ｍｌの蒸溜水に溶解させた後、そこに上記実施例＜３−１＞から得た０．９８ｇの活性化されたＧＯＣＡが溶解した５０ｍｌのＤＭＦ溶液をゆっくり混合した。室温で５時間結合反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とＤＭＦを除去した。１００ｍｌの蒸溜水で３回洗浄して未反応のＰＬＬを除去して白色の固形沈殿物を得た。上記固形沈殿物を１００ｍｌのメタノールで洗浄して０．４５μｍの膜でろ過して未反応の活性化ＧＯＣＡを除去した。これを再び真空乾燥させて白色粉末を得た。ＰＬＬに残存する未反応のアミノ基は、１．０ｗｔ％アセトアルデヒドを含有した１００ｍｌの５０％メタノール水溶液で１時間のブロッキング反応を遂行して除去した。反応が終結した後、蒸溜水で３回洗浄して未反応のアセトアルデヒドを除去した。これを再び真空乾燥させてＧＯＣＡがＰＬＬに部分的に結合した１．５ｇの疎水性ＰＬＬ−ＧＯＣＡを得た。
【００５１】
＜５−２＞ ＰＬＬ−ＧＯＣＡのエステル化反応
上記実施例＜５−１＞から得た１．５ｇのＰＬＬ−ＧＯＣＡを１００ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、そこに１．４５ｇのＤＣＣが溶解した１０ｍｌのＤＭＦ溶液を迅速に添加した。５分間撹拌してＤＣＣを活性化させた後、１．６７ｇのＨＯＳＵが溶解した１０ｍｌのＤＭＦ溶液を再び添加した。反応の進行につれて微量のＤＣＵｒｅａが発生した。室温で２４時間反応を進行させた後、上記混合溶液を０．２μｍの膜でろ過してＤＣＵｒｅａを除去し、これを室温で溶媒蒸発させてＤＭＦを除去した。これから得た白色粉末を１００ｍｌのメタノールで２回洗浄して０．２μｍの膜でろ過して白色の固形物を得た後、室温で５時間真空乾燥させてエステル化反応により活性化されたＰＬＬ−ＧＯＣＡ １．３ｇを得た。
【００５２】
＜５−３＞ ヘパリン−ＰＬＬ−ＧＯＣＡ結合体の合成
上記実施例＜５−２＞から得た１．０ｇの活性化されたＰＬＬ−ＧＯＣＡを１００ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、そこに０．９５ｇのヘパリンが溶解した５０ｍｌの蒸溜水を５分間にわたって滴下して混合した。反応が始まって３０分以内に縮合反応により結合した生成物が発生しながら反応溶液の透明度が減少した。このような白色の沈殿物生成は、３０分程度で完了した。５時間反応を進行させた後、上記混合溶液を室温で溶媒蒸発させて蒸溜水とＤＭＦを除去して白色の粉末を得た。上記白色の粉末をメタノール溶媒条件でセルロースエステル膜を使用した透析を実施して未反応の活性化 ＰＬＬ−ＧＯＣＡを除去した。メタノールを水で置換して０．４５μｍの膜でろ過して未反応のヘパリンを除去した。これから得た白色沈殿物を室温で１２時間真空乾燥させて１．６ｇの白色粉末の生成物を得た。
【００５３】
＜実施例 ６＞ 疎水性多重複合ヘパリン結合体分析
＜６−１＞ ＦＴ−ＩＲ スペクトルを利用した構造分析
上記のように合成した疎水性多重複合ヘパリン結合体の構造を分析するために、ＦＴ−ＩＲスペクトル（Ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ， Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｔｄ．）を調査した結果、実施例＜１−３＞で合成したヘパリン／ＰＡＡ／ＯＤＡ結合体は、結合過程に存在するアミド（ａｍｉｄｅ）結合であるＣ＝Ｏ二重結合が赤外線分光分析スペクトルの１７２０ｃｍ−１で強く現れた。ヘパリンのヒドロキシ基は、３５００ｃｍ−１で、ＯＤＡのメチル基は、２８００ないし２９００ｃｍ−１で吸収波長が確認された。
【００５４】
＜６−２＞ 疎水性多重複合ヘパリン結合体のコーティング
上記実施例＜１−３＞で合成した２５ｍｇの疎水性多重複合ヘパリン結合体に１．０ｍｌの混合溶媒（ｃｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ， ＴＨＦ：Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ， １：１ ｖ／ｖ％）を加えて全体濃度が２．５ｗｔ％になるように溶解させた後、上記混合溶液を４０℃で１時間超音波処理して透明な溶液を製造した。２５℃でポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）で製造された血管カテーテル（ａｎｇｉｏｃａｔｈｅｔｅｒ， 直径２．５ｃｍ， 長さ５ｃｍ）及びガラス（０．５ｃｍ×０．５ｃｍ）を浸漬被覆（ｄｉｐｐｉｎｇ ｃｏａｔｉｎｇ）方法を利用して上記溶液で各々１回ずつ表面をコーティングした。疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティングされたカテーテル及びガラスを３０分間室温で乾燥させた後、５時間室温で真空乾燥させ残存する溶媒を完全に除去した。この時、コーティングされたガラスやカテーテルの表面状態は、透明度が若干低下したが沈殿現象は何も観察されなかった。
【００５５】
＜６−３＞ コーティングされた疎水性多重複合ヘパリン結合体の水溶液での剥離実験（Ｐｅｅｌｉｎｇ ｔｅｓｔ）
上記実施例＜６−２＞と同様な方法で実施例＜１−３＞の疎水性多重複合ヘパリン結合体をコーティング（２．５ｗｔ％）した各々のガラスとカテーテルを１０ｍｌのＰＢＳ 緩衝溶液（ｐＨ＝７．５， Ｉ＝０．１５）が入ったチューブ（ｆａｌｃｏｎ ｔｕｂｅ）に入れ３７℃、１００ｒｐｍの条件で１２時間、揺しながら反応させた。反応が終結した上記溶液に、アズールＡ（ａｚｕｒｅ Ａ）溶液（１０ｍｇ／ｍｌｗａｔｅｒ）を添加して染色反応（ｄｙｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った結果（Ｈ．Ｊ． Ｃｏｎｎ，「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｓ」， Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．， ＭＤ， ｐ９６−１０５， １９６１）、染色溶液の色相変化は、発生しなかった。ゆえに、コーティング剤に使用した本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体ヘパリン／ＰＡＡ／ＯＤＡは、ガラスや高分子のような基質に対して優れた吸着性を持っているだけではなく、水溶液での膨張（ｓｗｅｌｌｉｎｇ）現象による剥離（ｐｅｅｌｉｎｇ）現象がまったく発生しないことを確認した。
【００５６】
＜６−４＞ アズール Ａ 実験
上記実施例＜６−３＞で剥離実験を経たガラスとカテーテルを５ｍｌのアズール Ａ溶液（１０ｍｇ ａｚｕｒｅ Ａ／ｍｌ ｗａｔｅｒ）に各々浸漬（ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ）させた後、室温で５時間放置した。その結果、時間が経過するにしたがって本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされた基質表面で色相変化が進行し、５時間後には染色溶液が赤紫色に変化した。しかし、疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされていない対照群の場合には、いかなる色相変化も発生しなかった。したがって、基質の表面に疎水性多重複合ヘパリン結合体が安定的に吸着していてヘパリンの固有の抗血栓特性が維持されていることを確認した。
【００５７】
＜６−５＞ 接触角（ｃｏｎｔａｃｔ ａｎｇｌｅ）分析
１０ｍｌの蒸溜水に上記実施例＜６−２＞と同様に疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティング（２．５ｗｔ％）処理したカテーテル（５ｃｍ）及びコーティングされていないカテーテルを各々室温で５分間浸漬した。その結果、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティング処理されたカテーテルでは水分分散現象（ｗａｔｅｒ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）が観察されたが、対照群に使用したコーティングされていないカテーテルでは、上記現象が減少し水分接触角が増加した。
【００５８】
＜６−６＞ 血小板付着実験
血小板付着実験を行なうためにウサギから血小板欠乏血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｐｏｏｒ−ｐｌａｓｍａ， 以下「ＰＰＰ」と略称する）を分離した。詳細には、体重が２．５ ｋｇないし３．０ｋｇのニュージーランド産ウサギ（日出科学商社）をエチルエーテル（ｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）で痲酔した後、心臓穿孔方法（ｃａｒｄｉａｃ ｐｕｎｃｈｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）で３６ｍｌの血液を採取した。この時、５０ｍｌ注射器を使用した。血液凝固を抑制するために注射器内に３．８％クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）４ｍｌを前もって入れておいた。これから採取した血液を４℃、１４４０ｒｐｍで１０分間遠心分離して新鮮なウサギのＰＰＰを得た。血漿内血小板の濃度は、コールターカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ， Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｌｔｄ， ＵＫ）を利用して測定し、血小板の濃度が４．２×１０５ｃｅｌｌｓ／μｌになるようにした。分離されたＰＰＰは、製造後 ３時間以内に実験に使用した。
【００５９】
このように分離された１ｍｌの新鮮なウサギのＰＰＰが入ったチューブに上記実施例＜６−２＞と同様に本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティング（２．５ｗｔ％）されたガラス（０．５×０．５ｃｍ）及びコーティングされていない対照群ガラスを各々入れた後、３７℃撹拌水槽に１時間放置した。１時間経過後、チューブからＰＰＰを除去して各々のガラスをＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄してＰＰＰを完全に除去した。上記各々のガラスに３ｍｌの２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）を処理して血小板固定（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｉｘｉｎｇ）を４時間遂行後、エタノール（ＥｔＯＨ）水溶液を利用して下記のように３段階に分けて洗浄した。１段階； ５ｍｌ ５０％ＥｔＯＨ １時間、２段階； ５ｍｌ ８０％ ＥｔＯＨ １時間、及び３段階； ５ｍｌ １００％ ＥｔＯＨ １時間。エタノールを除去した各々のガラスを液化窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した後、６時間冷凍乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）した。各々のガラスをＳＥＭで観察して血小板の吸着を確認した結果、対照群ガラスに比べて本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされたガラスの血液的合成が大きく改善されたことを確認した。
【００６０】
＜６−７＞ 血液凝固実験
血液凝固実験を行なうためにラットから全血溶液（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）を分離した。詳細には、体重が２５０ないし３００ｇのスプラグ−ダウリーラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ， 大韓バイオリンク）をエチルエーテルで痲酔した後、心臓穿孔方法で３．６ｍｌの血液を摂取した。この時、５０ｍｌ注射器を使用し、血液凝固を抑制するために注射器内に３．８％クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）０．４ｍｌを前もって入れておいた、摂取した血液は即時実験に使用した。
【００６１】
上記実施例＜１−３＞で合成した２５ｍｇの疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティング（２．５ｗｔ％）された血管カテーテル（長さ１ｃｍ）及びコーティングされていない対照群血管カテーテルを各々上記のように分離されたラットの全血溶液に１時間浸けておいた後、１次蒸溜水で軽く洗浄してこれを即時写真撮影した。その結果、１時間経過後、対照群カテーテルの場合には、血液成分の凝塊現象（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が強く発生したが、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体でコーティング処理されたカテーテルではこのような凝塊現象が全く発生しなかった。
【００６２】
産業上の利用の可能性
上記で詳しく見てきたように、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、特定有機溶媒にだけ溶解するため溶媒蒸発法、浸漬被覆（ｄｉｐ ｃｏａｔｉｎｇ）方法またはスプレー方法等によって高分子や金属表面に簡単にコーティングすることができ、水溶液には溶解しないためコーティングした後、臨床的に使用される過程で安定的に使用できる。また、上記疎水性多重複合ヘパリン結合体は、基質にコーティングした後にも固有の抗血栓性を維持し、コーティングされた基質表面の血液凝固を抑制することによってコーティングされた表面の抗血栓性を高める反面、コーティングされた表面の摩擦係数を顕著に減少させ、表面の水分吸収能力を増加させコーティングされた基質が良く湿潤（ｗｅｔｔｉｎｇ）されるように誘導する特性を持っている。したがって、本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体は、カテーテル、挿入チューブ等の血液と接触する医療機器及び人工臓器の表面を改質して性能をより向上させ、血栓による副作用を抑制できるコーティング剤として有用に使用できる。
【００６３】
本発明と同じ目的を実施するための他の態様を修正または設計する基礎として、上記の説明における発想及び特定の態様が容易に利用されうることは、同業者に理解されると思われる。このような同等の態様が添付の特許請求の範囲に記載されるような本発明の精神及び範囲から逸脱しないこともまた、同業者に理解されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体を利用して表面改質されたガラスの血小板付着実験結果を示したもので、対照群のガラスである。
【図１Ｂ】本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体を利用して表面改質されたガラスの血小板付着実験結果を示したもので、疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされたガラスである。
【図２】本発明の疎水性多重複合ヘパリン結合体を利用して表面改質された血管カテーテル（ａｎｇｉｏｃａｔｈｅｔｅｒ）の血液的合成実験結果を示したものである。
（ａ） 対照群カテーテル
（ｂ） 疎水性多重複合ヘパリン結合体がコーティングされたカテーテル
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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