(57)【要約】ノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法について述べる。本方法は、候補モジュレーター存在下で免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達を観察する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｄ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する
工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達モジュレーターを検出する方法。
【請求項２】
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｄ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する
工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達モジュレーターを検出する方法。
【請求項３】
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｄ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｅ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する
工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達モジュレーターを検出する方法。
【請求項４】
（ａ）免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｄ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法。
【請求項５】
（ａ）免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｄ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する
工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法。
【請求項６】
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞におけるノッチシグナル伝達を活性化させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｄ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｅ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する
工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法。
【請求項７】
ノッチシグナル伝達の候補モジュレーターに細胞を接触させる工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ノッチシグナル伝達を観察する工程を含む先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
候補モジュレーターがノッチシグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程を含む先行請求項のいずれかに方法。
【請求項１０】
ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達に関して少なくとも２０％の最適性を示す免疫細胞活性を提供することを含む先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達に関して少なくとも７０％の最適性を示す免疫細胞活性を提供することを含む先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
候補モジュレーターが、有機化合物、無機化合物、ペプチド又はポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、抗体断片、サイトカイン及びサイトカイン断片からなるグループから選択されることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ノッチシグナル伝達の観察工程に少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを観察する工程が含まれることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの標的遺伝子がノッチシグナル伝達の内因性標的遺伝子であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1つの標的遺伝子が、ＣＢＦ−１、Ｈｅｓ−１、Ｈｅｓ−５、Ｅ（ｓｐｌ）、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、Ｄｌｘ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ−４、Ｎｕｍｂ、Mastermind及びＤｓｈからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの標的遺伝子がレポーター遺伝子であることを特徴とする請求項１３〜１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの標的遺伝子が、酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、放射標識又は蛍光標識を有する遺伝子、及び所定のポリペプチドエピトープをコードする遺伝子からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの標的遺伝子が、ノッチシグナル伝達に感受性を示すプロモーター領域の転写制御下にあることを特徴とする請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ノッチシグナル伝達に感受性を示すプロモーター領域が、ＣＢＦ−１、Ｈｅｓ−１、Ｈｅｓ−５、Ｅ（ｓｐｌ）、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、Ｄｌｘ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ−４、Ｎｕｍｂ、Mastermind又はＤｓｈプロモーターであることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの標的遺伝子が、
ｉ）ノッチシグナル伝達、及び
ii）第２シグナル、及び／又は、
iii）第３シグナル
に感受性を示すプロモーター領域の転写制御下にあり、第２と第３シグナルが異なることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
第２シグナルが、免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路が活性化する結果生じることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達経路であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路がＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達経路であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路がトール様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
第３シグナルが、免疫系細胞に特異的な共刺激であることを特徴とする請求項２０〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
共刺激が、Ｂ７タンパク質であるＢ７．１−ＣＤ８０、Ｂ７．２−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７ＲＰ２、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド、Ｆａｓリガンド、ＭＨＣクラスII、ＤＥＣ２０５−ＣＤ２０５、ＣＤ２０４−スカベンジャー受容体、ＣＤ１４、ＣＤ２０６（マンノース受容体）、ＴＬＲ１〜９等のトール様受容体（ＴＬＲ）、ＣＤ２０７（Langerin）、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＦＣγ受容体２（ＣＤ３２）、ＣＤ６４（ＦＣγ受容体１）、ＣＤ６８、ＣＤ８３、ＣＤ３３、ＣＤ５４、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、ケモカイン受容体、サイトカイン、成長因子及び成長因子受容体アゴニスト、並びにそれらの変異体、誘導体、アナログ及び断片からなるグループから選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの標的遺伝子の発現をプロテインアッセイにより観察することを特徴とする請求項１３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの標的遺伝子の発現を核酸アッセイにより観察することを特徴とする請求項１３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ノッチを活性化することによりノッチシグナル伝達が活性化され、構成的に活性な剪断形態のノッチをもたらすか、活性ノッチＩＣドメインをもたらすことを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
候補モジュレーターの分子量が約１０００未満であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
候補モジュレーターの分子量が約５００未満であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
免疫系細胞がＴ細胞又はＴ細胞前駆体であることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
Ｔ細胞受容体の活性化によりＴ細胞が活性化されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
抗原又は抗原決定基によりＴ細胞が活性化されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗ＣＤ３抗体又は抗ＴＣＲ抗体によりＴ細胞が活性化されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
抗ＣＤ３抗体又は抗ＴＣＲ抗体が支持体に結合していることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗ＣＤ３抗体又は抗ＴＣＲ抗体が特定の支持体に結合していることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｔ細胞がカルシウムイオノフォアによって活性化されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
Ｔ細胞がプロテインキナーゼＣ又はＭＡＰキナーゼによって活性化されることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
Ｔ細胞が共活性化されることを特徴とする請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
Ｔ細胞がＣＤ２８の活性化によって共活性化されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｔ細胞受容体が抗ＣＤ２８抗体又はＣＤ２８リガンドによって共活性化されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
Ｔ細胞が、抗ＣＤ３抗体又は抗ＴＣＲ抗体によって活性化され、抗ＣＤ２８抗体又はＣＤ２８リガンドによって共活性化されることを特徴とする請求項３３〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
免疫系細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）であることを特徴とする請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
免疫系細胞がＢ細胞であることを特徴とする請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
ノッチ、ノッチの構成的に活性な剪断形態、又はノッチＩＣドメインをコードする発現ベクターを免疫系細胞にトランスフェクトすることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ノッチレポーター構築物を免疫細胞にトランスフェクトすることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
先行請求項のいずれかの方法により同定することが可能なモジュレーター。
【請求項４９】
先行請求項のいずれかの方法により同定されたモジュレーター。
【請求項５０】
免疫系の疾患又は症状、或いは免疫系に関係のある疾患又は症状の治療用薬剤の調製における請求項４８又は４９に記載のモジュレーターの使用。
【請求項５１】
疾患がＴ細胞に介在される疾患であることを特徴とする請求項５０に記載のモジュレーターの使用。
【請求項５２】
疾患がＢ細胞に介在される疾患であることを特徴とする請求項５０に記載のモジュレーターの使用。
【請求項５３】
疾患がＡＰＣに介在される疾患であることを特徴とする請求項５０に記載のモジュレーターの使用。
【請求項５４】
請求項４８又は４９に記載のモジュレーターの少なくとも１つを治療有効量と、薬学上許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５５】
ノッチシグナル伝達がノッチリガンドによって活性化されることを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
ノッチリガンドが細胞又は細胞膜上に提示されることを特徴とする請求項に記載の方法。
【請求項５７】
ノッチリガンドが支持体に結合していることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
特定の支持体マトリックスに結合したデルタＤＳＬドメイン及び少なくとも１つのデルタＥＧＦドメインを有するタンパク質を含む粒子。
【請求項５９】
特定の支持体マトリックスに結合したデルタ細胞外ドメイン又はその活性部分を有するタンパク質を含む粒子。
【請求項６０】
特定の支持体マトリックスがビーズであることを特徴とする請求項５８又は５９の粒子。
【請求項６１】
複数の上記タンパク質が特定の支持体マトリックスに結合していることを特徴とする請求項５８〜６０のいずれかに記載の粒子。
【請求項６２】
（ａ）免疫細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞内におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｃ）遺伝子発現を観察し、また
（ｄ）どの遺伝子がアップレギュレート又はダウンレギュレートされるかを測定する
工程（順不同）からなり、ノッチシグナル伝達活性化及び免疫細胞活性化の併用に反応して免疫細胞内でアップレギュレートされる遺伝子を検出する方法。
【請求項６３】
（ａ）免疫細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞内におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｃ）遺伝子発現を観察し、
（ｄ）上記細胞において遺伝子発現がアップレギュレート又はダウンレギュレートされるかどうかを測定し、また
（ｅ）工程（ｄ）における遺伝子発現を、細胞が活性化されず又はノッチシグナル伝達が活性化されない対照と比較する
工程（順不同）からなり、ノッチシグナル伝達活性化又は免疫細胞活性化いずれか単独の場合に比べ、ノッチシグナル伝達活性化及び免疫細胞活性化の併用に反応して免疫細胞内でより顕著にアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子を検出する方法。
【請求項６４】
マイクロアレイを用いて遺伝子発現を観察することを特徴とする請求項６２又は６３に記載の方法。
【請求項６５】
免疫細胞がＴ細胞であることを特徴とする請求項６２〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
請求項６２〜６５のいずれかに記載の方法により検出される遺伝子。
【請求項６７】
（ａ）免疫細胞の培養物を提供し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達レポーター構築物を上記細胞にトランスフェクトし、
（ｃ）任意で上記細胞に、ノッチ、構成的に活性な剪断形態のノッチ又はノッチＩＣドメインをコードする核酸をトランスフェクトし、
（ｄ）任意でノッチリガンドを提供し、
（ｅ）試験に供する１若しくは２以上の化合物に上記細胞を暴露し、また
（ｆ）試験に供する化合物に暴露した細胞と未暴露の細胞とにおけるノッチシグナル伝達の違いを測定する
工程（順不同）からなるアッセイ。
【請求項６８】
（ａ）免疫細胞の培養物を提供し、
（ｂ）任意でノッチシグナル伝達レポーター構築物を上記細胞にトランスフェクトし、
（ｃ）上記細胞に、ノッチ、構成的に活性な剪断形態のノッチ又はノッチＩＣドメインをコードする核酸をトランスフェクトし、
（ｄ）任意でノッチリガンドを提供し、
（ｅ）試験に供する１若しくは２以上の化合物に上記細胞を暴露し、また
（ｆ）試験に供する化合物に暴露した細胞と未暴露の細胞とにおけるノッチシグナル伝達の違いを測定する
工程（順不同）からなるアッセイ。
【請求項６９】
免疫細胞を活性化する工程を含む請求項６７又は６８に記載のアッセイ。
【請求項７０】
サイトカインの産生を観察することによりノッチシグナル伝達を観察することを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法又はアッセイ。
【請求項７１】
ＩＬ−１０の産生を観察することによりノッチシグナル伝達を観察することを特徴とする請求項７０に記載の方法又はアッセイ。
【請求項７２】
ＴＮＦの産生を観察することによりノッチシグナル伝達を観察することを特徴とする請求項７０に記載の方法又はアッセイ。
【請求項７３】
ＩＦＮγの産生を観察することによりノッチシグナル伝達を観察することを特徴とする請求項７０に記載の方法又はアッセイ。
【請求項７４】
ＩＬ−５の産生を観察することによりノッチシグナル伝達を観察することを特徴とする請求項７０に記載の方法又はアッセイ。
【請求項７５】
ＩＬ−１３の産生を観察することによりノッチシグナル伝達を観察することを特徴とする請求項７０に記載の方法又はアッセイ。
【請求項７６】
（ｉ）ノッチシグナル伝達レポーター構築物、及び
（ii）ノッチ、構成的に活性な剪断形態のノッチ又はノッチＩＣドメインをコードする発現ベクター
にトランスフェクトさせた免疫細胞。
【請求項７７】
（ｉ）ノッチシグナル伝達レポーター構築物、及び
（ii）構成的に活性な剪断形態のノッチをコードする発現ベクター
をトランスフェクトした免疫細胞。
【請求項７８】
（ｉ）ノッチシグナル伝達レポーター構築物、及び
（ii）ノッチＩＣドメインをコードする発現ベクター
をトランスフェクトした免疫細胞。
【請求項７９】
安定にトランスフェクトした請求項７６〜７８のいずれかに記載の免疫細胞。
【請求項８０】
分子量が約１０００未満の候補モジュレーターの存在下及び不在下で免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達を観察し、前記候補モジュレーターがノッチシグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程を含むノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法。
【請求項８１】
（ａ）分子量が約１０００未満の候補モジュレーターに免疫系細胞を接触させ、
（ｂ）ノッチシグナル伝達を観察し、また
（ｃ）前記候補モジュレーターがノッチシグナル伝達を調節するかどうかを測定する
工程からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法。
【請求項８２】
候補モジュレーターの分子量が約５００未満であることを特徴とする請求項８０又は８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法に関する。本発明はまた、かかる方法により同定することが可能な新規モジュレーター及びそれらを療法に使用することにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ノッチシグナル伝達は、脊椎動物及び無脊椎動物の細胞運命決定に重要な役割を果たしている。ノッチはショウジョウバエの胚段階や幼虫発達段階などの多くの段階で、また神経発生における重要な役割及び中胚葉細胞や内胚葉細胞の分化を含む広汎な機能を包含する種々の細胞で発現される。哺乳類ノッチ遺伝子には少なくとも４種類ある（ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４）。脊椎動物及び低級脊椎動物のタンパク質に最も似ているノッチ１は広く発現され、初期発達に重要である。近年、ノッチシグナル伝達が、胸腺における幼弱Ｔ細胞系譜の決定に貢献していることが明らかになっている。
【０００３】
Ｔ細胞は胸腺で成熟する間に、非自己抗原と自己抗原を識別する能力を獲得するが、この過程を「自己寛容」という。しかし、非自己抗原に対する寛容は、特異的条件下において、その抗原を有するペプチド断片で免疫することにより誘導される。多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病などの自己免疫疾患では、寛容の適切な制御が行われない。寛容を再樹立するための改良療法が自己免疫疾患に望まれている。同様にアレルギー症状又はドナー個人からの臓器や組織の移植においても特定の外来抗原又は外来抗原のプロフィールに対する寛容を誘導することが望ましい。
【０００４】
ノッチ及びそのリガンドであるデルタ（Delta）及びセラート（Serrate）が末梢免疫系の成人正常細胞表面で発現されることから、これらのタンパク質がＴ細胞の獲得免疫能力に役割を担っていることが示唆される。Ｔ細胞はノッチ１ｍＲＮＡを構成的に発現する。デルタは、末梢リンパ様組織のＴ細胞サブセットにおいてのみ発現される。セラートは、抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）のサブセットに限定して発現される。これらの観察結果からは、ノッチシグナル伝達が末梢での不応答（寛容又はアネルギー）、連結抑制（linked suppression）及び感染性寛容の誘導に中心的役割を果たし、ノッチ受容体リガンドファミリーが胚発達期以降も継続して免疫系における細胞運命決定を調節しているとの知見を支えるものである（Hoyne et al.）。
【０００５】
従ってＷＯ９８／２０１４２に記載されているように、ノッチシグナル伝達経路を操作して、免疫療法や、Ｔ細胞介在型疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。特に、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、腫瘍に誘発されるＴ細胞系の異常、また例えばマラリヤ病原虫（Plasmodium sp.）、ミクロフィラリア、蠕虫類(Helminths)、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス（Pseudomonas）、トキソプラズマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎又はトキソカラによる感染症が対象となる。
【０００６】
他のＴ細胞に抗原特異的寛容を伝達し得る調節性Ｔ細胞のクラスを創出できることが近年示され、この方法は感染性寛容と呼ばれる（ＷＯ９８／２０１４２）。これらの細胞の機能的活性は、その細胞表面又は抗原提示細胞表面においてノッチリガンドタンパク質を過剰発現させることにより模倣できる。具体的には、調節性Ｔ細胞はノッチリガンドタンパク質のデルタ又はセラートファミリーのメンバーを過剰発現させることにより創出できる。デルタ又はセラートに誘導され、ある抗原エピトープに特異的なＴ細胞は、同じ若しくは関連のある抗原上の他のエピトープを認識するＴ細胞に寛容を伝達することもでき、この現象を「エピトープの拡散」という。
【０００７】
ノッチリガンドの発現は癌においても役割を担っている。実際、腫瘍細胞の中にはノッチリガンド発現のアップレギュレーションが認められるものがある。かような腫瘍細胞は、特異的抗原による再刺激に対しＴ細胞を不応答にすることができるが、それにより腫瘍細胞が如何にして正常Ｔ細胞の応答を阻止するかが説明できる。Ｔ細胞におけるインビボでのノッチシグナル伝達をダウンレギュレーションさせることにより、腫瘍細胞が腫瘍特異的抗原を認識するＴ細胞に免疫寛容を誘発することを回避できる可能性がある。逆に、Ｔ細胞が腫瘍細胞に免疫応答を引き起こすことが可能となる（ＷＯ００／１３５９９０）。
【０００８】
本発明者らによるＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／２０１４２、ＷＯ００／３６０８９、ＷＯ０１３５９９０にノッチシグナル伝達経路及びそれに影響を受ける疾患に関する記載がある。ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８（ＷＯ９８／２０１４２）、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３（ＷＯ００／３６０８９）、ＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１（ＷＯ０１３５９９０）のテキストを参考のため本明細書に添付する。
【０００９】
しかしながら、免疫系の、又は免疫系に関連する疾患や症状、特に（限定はされないが）Ｔ細胞介在型疾患や障害の検出、予防及び治療に有用なさらなる診断又は治療用組成物を提供することが当技術分野で依然として要求されている。本発明では新規なノッチシグナル伝達経路モジュレーターを同定する有効な方法を提供することによりこの問題に対処した。当技術分野では多数のアッセイ法が公知であるが、本発明は、本発明者らのノッチシグナル伝達経路に関する知見に基づき、また新規モジュレーターを検出する上で有効なアッセイは免疫系細胞を用いて実施することが必要であるとの認識に基づいている。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の特徴の１つとして、候補モジュレーターの存在下及び不在下で免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達を観察し、上記候補モジュレーターがノッチシグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程を含むノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫系細胞を候補モジュレーターと接触させ、
（ｂ）ノッチシグナル伝達を観察し、また
（ｃ）上記候補モジュレーターがノッチシグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００１２】
「接触させる」とは、細胞が候補モジュレーターと相互作用することができるように引き合わせることを意味する。かかる接触が水性溶液又は緩衝溶液において行われることが好ましい。
【００１３】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｄ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｄ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞中のノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｄ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｅ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｄ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｄ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｃ）ノッチシグナル伝達の候補モジュレーターに上記細胞を接触させ、
（ｄ）ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を観察し、また
（ｅ）候補モジュレーターがノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程（順不同）からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００１９】
免疫細胞の活性化は、ノッチシグナル伝達又は免疫シグナル伝達に関して少なくとも２０％、好ましくは少なくとも７０％の最適性を示すことが好適である。
【００２０】
候補モジュレーターはいずれの有機化合物又は無機化合物でもよい。候補モジュレーターが、天然型又は合成小分子化合物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体又は抗体断片、サイトカイン又はサイトカイン断片からなるグループから選択されることが好ましい。
【００２１】
好適実施態様においてはノッチシグナル伝達の観察工程に少なくとも１つの標的遺伝子の発現レベルを観察する工程が含まれる。かかる標的遺伝子はノッチシグナル伝達経路の内因性標的遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれでもよい。
【００２２】
ノッチシグナル伝達経路における公知の内因性標的遺伝子には、Deltex、Ｈｅｓ−１、Ｈｅｓ−５、Ｅ（ｓｐｌ）、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、Ｄｌｘ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ−４、Ｎｕｍｂ、Mastermind及びＤｓｈからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【００２３】
当技術分野では多数のレポーター遺伝子が標準的となっており、その中には酵素活性をコードする遺伝子、放射標識又は蛍光標識を有する遺伝子、所定のポリペプチドエピトープをコードする遺伝子が含まれる。
【００２４】
少なくとも１つの標的遺伝子が、ノッチシグナル伝達に感受性を示すプロモーター領域の転写制御下にあることが好ましい。少なくとも１つの標的遺伝子が、ノッチシグナル伝達及び第２シグナル及び／又は第３シグナル（第２と第３シグナルは異なる）に感受性を示すプロモーター領域の転写制御下にあることが、より好ましい。
【００２５】
本発明に用いるシグナルとしては、補助シグナル（当分野でＴ及びＢ細胞受容体シグナル伝達における共刺激シグナルとして知られる）の存在下及び不在下において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達経路、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達経路、トール様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路等の免疫系細胞に特異的なシグナル伝達経路を活性化する結果生じるシグナルが例示できる。
【００２６】
本発明に用いるシグナルの他の例としては、Ｂ７タンパク質であるＢ７．１−ＣＤ８０、Ｂ７．２−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７ＲＰ２、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド、Ｆａｓリガンド、ＭＨＣクラスII、ＤＥＣ２０５−ＣＤ２０５、ＣＤ２０４−スカベンジャー受容体、ＣＤ１４、ＣＤ２０６（マンノース受容体）、ＴＬＲ１〜９等のトール様受容体（ＴＬＲ）、ＣＤ２０７（Langerin）、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＦＣγ受容体２（ＣＤ３２）、ＣＤ６４（ＦＣγ受容体１）、ＣＤ６８、ＣＤ８３、ＣＤ３３、ＣＤ５４、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、ケモカイン受容体、サイトカイン、成長因子及び成長因子受容体アゴニスト、並びにそれらの変異体、誘導体、アナログ及び断片等の免疫系細胞に特異的な共刺激が挙げられる。
【００２７】
一好適実施態様では、本発明の方法は、Ｔ細胞又はＴ細胞前駆体又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）において行われる。ＡＰＣは、ＭＨＣクラスII分子を発現でき、抗原をＣＤ４+Ｔ細胞に対して提示できる細胞である。ＡＰＣが、例えばランゲルハンス細胞等の樹状細胞などの骨髄系統細胞、、単球又はマクロファージ又は一次細胞又はＢ系統細胞であることが好ましい。
【００２８】
少なくとも１つの標的遺伝子の発現はプロテインアッセイ又は核酸アッセイにより観察できる。
【００２９】
本発明の別の特徴に従い、
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞を候補モジュレーターと接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達を観察し、（工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はどの順番で実施してもよい）また、
（ｄ）上記候補モジュレーターがノッチシグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００３０】
少なくとも１つの標的遺伝子の発現をプロテインアッセイ又は核酸アッセイにより観察することが好ましい。
【００３１】
候補モジュレーターの分子量が約１０００未満であることが好適であり、約５００未満であることが好適である。
【００３２】
免疫系細胞がＴ細胞又はＴ細胞前駆体であることが好ましい。
【００３３】
Ｔ細胞受容体の活性化によりＴ細胞が活性化されることが好ましい。
【００３４】
Ｔ細胞受容体は、抗原又は抗原決定基により活性化されることが好ましい。
【００３５】
Ｔ細胞受容体は、支持体に結合していることを好ましくする抗ＣＤ３抗体又は抗ＴＣＲ抗体により、活性化されることが好ましい。抗ＣＤ３抗体又は抗ＴＣＲ抗体が特定の支持体に結合していることが好ましい。
【００３６】
Ｔ細胞が共活性化されることが好ましく、ＣＤ２８によって活性化されることが好適である。
【００３７】
抗ＣＤ２８抗体、又はＢ７の活性ドメイン等のＣＤ２８リガンドでＴ細胞受容体が共活性化されることが好ましい。
【００３８】
Ｔ細胞が、抗ＣＤ３抗体で活性化され、抗ＣＤ２８抗体で共活性化されることが好ましい。
【００３９】
或いはＴ細胞が、カルシウムイオノフォア、又はプロテインキナーゼＣ又はＭＡＰキナーゼのアクチベーターによって活性化されてもよい。
【００４０】
ノッチ、ノッチの構成的に活性な剪断形態、又はノッチＩＣドメインをコードする発現ベクター、また所望の場合はノッチレポーター構築物を免疫系細胞にトランスフェクトすることが好適である。
【００４１】
好適な実施態様において本発明の方法は、
ｉ）免疫細胞におけるノッチシグナル伝達をさらなる作用因子で活性化し、また
ii）候補モジュレーターが、上記ノッチシグナル伝達の活性化及び／又は免疫細胞の活性化を調節するかどうかを測定することからなる。
【００４２】
一実施態様でノッチシグナル伝達は、ノッチリガンド又はノッチリガンドの活性部分、例えばノッチリガンドＥＣドメインで活性化されてもよい。ノッチリガンドは膜又は支持体に結合していることが好適である。
【００４３】
本発明のさらなる特徴として、特定の支持体マトリックスに結合したデルタリガンドの活性部分を有する粒子を提供する。
【００４４】
特定の支持体マトリックスがビーズであることが好ましい。ビーズは例えば磁気ビーズ（例；“Dynal”の商標名で市販）又はセファローズビーズ等のポリマー状ビーズが用いることができる。デルタリガンドの複数の活性部分が特定の支持体マトリックスに結合していることが好適である。
【００４５】
本発明のさらなる特徴として、本発明の方法により同定可能な、又は同定されたモジュレーターを提供する。
【００４６】
本発明のさらに別の特徴として、免疫系の疾患又は症状、或いは免疫系に関係のある疾患又は症状の治療用薬剤の調製における本発明モジュレーターの使用を提供する。疾患がＴ細胞に介在される疾患であることが好ましい。
【００４７】
本発明のさらに別の特徴として、治療有効量の本発明モジュレーター少なくとも１つと、薬学上許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００４８】
ノッチシグナル伝達経路が、ノッチ受容体活性化能を有する作用因子で活性化されることが好ましい。モジュレーターは、ノッチリガンド又はノッチリガンドの生物的に活性な断片又は誘導体であることが好適である。ノッチリガンドは可溶性、又は細胞上に提示された、又は支持体に結合したもののいずれでもよい。
【００４９】
ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターが、融合タンパク質を有するか、コードすることが好適である。例えば、かかるモジュレーターが、ノッチリガンドの細胞外ドメインのセグメント及び免疫グロブリンＦCセグメントを有するか、コードしてもよい。
【００５０】
ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターが、ノッチリガンドのＤＳＬドメイン及び少なくとも１つのＥＧＦドメイン又はそれらの断片、誘導体、ホモログ、アナログ又は対立変異体を含むタンパク質又はポリペプチドを有するか、コードすることが好適である。
【００５１】
ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターが、ノッチリガンドのＤＳＬドメイン、及び少なくとも１〜２０、好適には少なくとも３〜１５、例えば少なくとも３〜８のＥＧＦ反復モチーフを有するか、コードすることが好ましい。かかるＤＳＬ及びＥＧＦ配列は哺乳類配列又はそれに相当する配列であることが好適である。好ましい配列にはヒト配列が含まれる。
【００５２】
本発明のさらなる特徴として、デルタＤＳＬドメイン及び少なくとも１つのデルタＥＧＦドメインを有するタンパク質を含む粒子を提供する。かかるタンパク質に、特定の支持体マトリックスに結合したデルタ細胞外ドメイン又はその活性部分が含まれることが好適である。一実施態様で特定の支持体マトリックスはビーズである。複数のこれらタンパク質が特定の支持体マトリックスに結合していることが好ましい。
【００５３】
或いは、又はさらに、ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターには、ノッチ細胞内ドメイン（Notch IC）又はその断片、誘導体、ホモログ、アナログ若しくは対立変異体、ノッチ細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチド配列又はその断片、誘導体、ホモログ、アナログ若しくは対立変異体が含まれていてもよい。
【００５４】
ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターには、デルタ又はその断片、誘導体、ホモログ、アナログ若しくは対立変異体、或いはデルタをコードするポリヌクレオチド又はその断片、誘導体、ホモログ、アナログ若しくは対立変異体が含まれることが好適である。
【００５５】
或いは、又はさらに、ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターには、セラート／ジャグド又はその断片、誘導体、ホモログ、アナログ若しくは対立変異体、セラート／ジャグドをコードするポリヌクレオチド又はその断片、誘導体、ホモログ、アナログ若しくは対立変異体が含まれていてもよい。
【００５６】
或いは、又はさらに、ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターには、ノッチ又はその断片、誘導体、ホモログ、アナログ若しくは対立変異体、ノッチをコードするポリヌクレオチド又はその断片、誘導体、ホモログ、アナログ若しくは対立変異体が含まれていてもよい。
【００５７】
或いは、又はさらに、ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターには、ノッチシグナル伝達レプレッサーのドミナントネガティブバージョン、又はノッチシグナル伝達レプレッサーのドミナントネガティブバージョンをコードするポリヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００５８】
或いは、又はさらに、ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターには、ノッチリガンド若しくはノッチシグナル伝達経路のダウンストリーム構成因子の発現や活性をアップレギュレートする能力をもつポリペプチド、又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれていてもよい。
【００５９】
ノッチシグナル伝達経路のモジュレーターには、抗体、抗体断片、抗体誘導体、又は抗体、抗体断片、抗体誘導体をコードするポリヌクレオチドが含まれていることが好適である。
【００６０】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞内におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｃ）遺伝子発現を観察し、また
（ｄ）どの遺伝子がアップレギュレート又はダウンレギュレートされるかを測定する工程（順不同）からなり、ノッチシグナル伝達活性化及び免疫細胞活性化の併用に反応して免疫細胞内でアップレギュレートされる遺伝子を検出する方法を提供する。
【００６１】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞内におけるノッチシグナル伝達を活性化し、
（ｃ）遺伝子発現を観察し、
（ｄ）上記細胞において遺伝子発現がアップレギュレート又はダウンレギュレートされるかどうかを測定し、また
（ｅ）工程（ｄ）における遺伝子発現を、細胞が活性化されず又はノッチシグナル伝達が活性化されない対照と比較する
工程（順不同）からなり、ノッチシグナル伝達活性化又は免疫細胞活性化いずれか単独の場合に比べ、ノッチシグナル伝達活性化及び免疫細胞活性化の併用に反応して免疫細胞内でより顕著にアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子を検出する方法を提供する。
【００６２】
実施態様の１つにおいては、マイクロアレイを用いて遺伝子発現を観察し、好ましくは免疫細胞がＴ細胞である。
【００６３】
本発明のさらなる特徴として、上述の方法により検出される遺伝子を提供する。
【００６４】
本発明のさらなる特徴として、上述の方法により検出した遺伝子のモジュレーターを免疫疾患の治療に使用することを提供する。
【００６５】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫細胞の培養物を提供し、
（ｂ）ノッチシグナル伝達レポーター構築物を上記細胞にトランスフェクトし、
（ｃ）任意で上記細胞に、ノッチ、構成的に活性な剪断形態のノッチ又はノッチＩＣドメインをコードする核酸をトランスフェクトし、
（ｄ）任意でノッチリガンドを提供し、
（ｅ）試験に供する１若しくは２以上の化合物に上記細胞を暴露し、また
（ｆ）試験に供する化合物に暴露した細胞と未暴露の細胞とにおけるノッチシグナル伝達の違いを測定する工程（順不同）からなるアッセイを提供する。
【００６６】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）免疫細胞の培養物を提供し、
（ｂ）任意でノッチシグナル伝達レポーター構築物を上記細胞にトランスフェクトし、
（ｃ）上記細胞に、ノッチ、構成的に活性な剪断形態のノッチ又はノッチＩＣドメインをコードする核酸をトランスフェクトし、
（ｄ）任意でノッチリガンドを提供し、
（ｅ）試験に供する１若しくは２以上の化合物に上記細胞を暴露し、また
（ｆ）試験に供する化合物に暴露した細胞と未暴露の細胞とにおけるノッチシグナル伝達の違いを測定する
工程（順不同）からなるアッセイを提供する。
【００６７】
アッセイに、免疫細胞を活性化するさらなる工程が含まれることが好ましい。
【００６８】
サイトカインの産生、例えばＩＬ−１０、ＴＮＦ、ＩＦＮ、ＩＬ−５又はＩＬ−１３の産生を観察することによりノッチシグナル伝達を観察することが好適である。
【００６９】
本発明のさらなる特徴として、
（ｉ）ノッチシグナル伝達レポーター構築物、及び
（ii）ノッチ、構成的に活性な剪断形態のノッチ又はノッチＩＣドメインをコードする発現ベクターをトランスフェクトした免疫細胞を提供する。
【００７０】
本発明のさらなる特徴として、
（ｉ）ノッチシグナル伝達レポーター構築物、及び
（ii）構成的に活性な剪断形態のノッチをコードする発現ベクター
をトランスフェクトした免疫細胞を提供する。
【００７１】
本発明のさらなる特徴として、
（ｉ）ノッチシグナル伝達レポーター構築物、及び
（ii）ノッチＩＣドメインをコードする発現ベクター
をトランスフェクトした免疫細胞を提供する。
【００７２】
免疫細胞は、安定にトランスフェクトすることが好ましい。
【００７３】
本発明のさらなる特徴として、分子量が約１０００未満の候補モジュレーターの存在下及び不在下で免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達を観察し、前記候補モジュレーターがノッチシグナル伝達を調節するかどうかを測定する工程を含むノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００７４】
本発明のさらなる特徴として、
（ａ）分子量が約１０００未満の候補モジュレーターに免疫系細胞を接触させ、
（ｂ）ノッチシグナル伝達を観察し、また
（ｃ）前記候補モジュレーターがノッチシグナル伝達を調節するかどうかを測定する
工程からなるノッチシグナル伝達モジュレーターを検出する方法を提供する。
【００７５】
候補モジュレーターの分子量が約５００未満であることが好ましい。
【００７６】
非限定的実施例及び添付の図面を参照しながら、本発明の種々の好ましい特徴や実施態様をより詳細に以下に述べる。
【００７７】
別途特記しない限り本発明の実施には、当技術分野の専門家であれば実施可能な化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学における常法を採用する。かかる技術は文献に収載されている。J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. を参照のこと。一般的なこれらの教本を参考文献として添付する。
【００７８】
本発明は、ノッチシグナル伝達モジュレーターを検出するアッセイ法に関する。
【００７９】
ノッチシグナル伝達
ここに用いる「ノッチシグナル伝達」なる用語は、「ノッチシグナル伝達経路」なる表現と同義であり、ノッチ受容体の活性化をもたらす、或いは活性化によってもたらされる（又は活性化を含む）１若しくは２以上の上流又は下流のイベントを指す。
【００８０】
ノッチシグナル伝達経路は胚における二細胞期の運命決定を指示する。ノッチはショウジョウバエにおいて2種の異なるリガンドであるデルタとセラートの受容体として機能する膜透過タンパク質として初めて見い出された。脊椎動物は複数のノッチ受容体及びリガンドを発現する。これまでに少なくとも4種類のノッチ受容体（ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４）がヒト細胞で同定されている。
【００８１】
ノッチタンパク質は、Furin様転換酵素により分解する単一のポリペプチド前駆体として合成される。Furin様転換酵素は2本のポリペプチド鎖をもたらし、かかるポリペプチド鎖は成熟受容体を形成すべくさらにプロセシングされる。細胞膜に存在するノッチ受容体には、2つのノッチタンパク質分解産物であるヘテロダイマーが含まれ、その1つには細胞外ドメイン、膜透過ドメイン及び細胞内ドメインの一部からなるＮ末端断片が含まれ、他方には細胞ドメインの大部分が含まれる。受容体を活性化するノッチのタンパク質分解過程が生じ、Furin様転換酵素に促進される。
【００８２】
ノッチ受容体は、３６個までの上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復を有する細胞外ドメインと細胞膜ドメインとを有する膜透過サブユニットからなるジスルフィド様ヘテロダイマー分子として膜に挿入する。ノッチの細胞質ドメインcytoplasmicは、6個のアンキリンankyrin様反復、ポリグルタミンのストレッチ（ＯＰＡ）及びＰＥＳＴ配列を有する。ＲＡＭ２３と名付けられたさらなるドメインがアンキリン反復の近傍に位置し、アンキリン様反復と同様に、ショウジョウバエのHairless［Ｓｕ（Ｈ）］及び脊椎動物のＣＢＦ１（Tamura）の抑制因子として知られる転写因子との結合に関与している。ノッチリガンドはその細胞外ドメインにおいて、全てのノッチリガンドの特徴であるシステインリッチＤＳＬ（Delta-Serrate-Lag2）ドメインと共に複数のＥＧＦ様反復も示す（Atravanis-Tsakonas）。
【００８３】
ノッチ受容体は、デルタ、セラート、スカブロウ（Scabrous）等の細胞外リガンドが、ノッチの細胞外ドメインにおけるＥＧＦ様反復に結合することによって活性化される。デルタが活性化するためには分解が必要である。デルタはＡＤＡＭ ディスインテグリンメタロプロテアーゼ（disintegrin metalloprotease） Kuzbanianによって細胞表面で分解し、この分解現象により可溶性及び活性型のデルタが放出される。ＴＡＮ−１としても知られ、細胞外ドメインが切断されているヒトノッチ1タンパク質の発癌性変異体は構造的に活性であり、Ｔ細胞リンパ性白血病に関与していることが明らかになっている。
【００８４】
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメイン反復は、細胞内シグナル伝達タンパク質との物理的相互作用を促進する。最も顕著には、ｃｄｃ１０／アンキリン反復は、Hairless［Ｓｕ（Ｈ）］のサプレッサーと相互作用を行う。Ｓｕ（Ｈ）は、Ｂ細胞のEpstein-Barr virusに誘導される不死化に関与する哺乳類ＤＮＡ結合タンパク質であるＣプロモーター結合因子−１［ＣＢＦ−１］のショウジョウバエにおけるホモログである。少なくとも培養細胞においてＳｕ（Ｈ）は、細胞質でｃｄｃ１０／アンキリン反復と会合し、ノッチ受容体がそのリガンドであるデルタと隣接細胞上で相互作用するのを受け、核内へと移行することが示されている。Ｓｕ（Ｈ）は、数種の遺伝子のプロモーター内でみられる応答エレメントを有し、ノッチシグナル伝達経路における重要な下流タンパク質であることがわかっている。Ｓｕ（Ｈ）の転写への関与はHairlessによって調節されると考えられている。
【００８５】
ノッチ（NotchIC）の細胞内ドメインもまた直接的な核機能を有している（Lieber）。近年の研究により、ノッチの活性化には、ノッチの細胞内ドメインにおける６個のｃｄｃ１０／アンキリン反復が核に到達して転写活性に参加することが必要であることが実際に示されている。ノッチの細胞内尾部におけるタンパク質開裂部位はｇｌｙ１７４３及びｖａｌ１７４４（部位３又はＳ３と呼ばれる）の間で同定されている（Schroeter）。核への進入のためにNotchICを放出するタンパク質開裂過程はプレセニリン（Presenilin）活性に依存する。
【００８６】
細胞内ドメインは核内で蓄積して、核内においてＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（Hairless、ショウジョウバエのＳｕ（Ｈ）、線虫のＬａｇ−２）と転写活性複合体を形成することが示されている（Schroeter; Struhl）。NotchIC−ＣＢＦ１複合体は次に、ｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（split様のhairyエンハンサー）１及び５等の標的遺伝子を活性化する（Weinmaster）。かかるノッチの機能は哺乳類ノッチホモログについても報告されている（Lu）。
【００８７】
ノッチリガンドのデルタ又はセラート／ジャグド（Jagged）との結合に応答した場合にのみNotchICプロセシングが生じる。ゴルジ（Munro; Ju）における発生期ノッチ受容体における翻訳後修飾は、２種類のリガンドのどちらが細胞表面で発現されるかを少なくとも部分的に制御しているようである。ノッチ受容体は、Notch／Linモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素であるフリンジ（Fringe）により、その細胞外ドメインにおいて修飾される。フリンジは、ＥＧＦ様反復にＯ結合フコース基を付加することによってノッチを修飾する（Moloney; Bruckner）。フリンジによる修飾はリガンド結合を回避するものではないが、リガンドに誘導されるノッチの構造変化に影響する可能性がある。また、フリンジの作用はノッチを修飾してノッチがセラート／ジャグドリガンドと機能的に相互作用を行うことを妨げるが、優先的にデルタと相互作用させることが近年の研究から示唆されている（Panin; Hicks）。ショウジョウバエは単一のフリンジ遺伝子をもつが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている（Radical, Manic and Lunatic Fringes）（Irvine）。
【００８８】
従ってノッチ受容体からのシグナルトランスダクションは種々の経路を介してもたらされる。よりよく定義された経路には、ノッチの細胞内ドメイン（NotchIC）のタンパク質開裂が含まれ、かかるドメインは核まで移動してＣＳＬファミリータンパク質のＣＢＦ１（ショウジョウバエのhairless、Ｓｕ（Ｈ）、線虫のＬａｇ−２の抑制因子）と転写活性複合体を形成する。NotchIC−ＣＢＦ１複合体は次にｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（split様のhairyエンハンサー）１及び５等の標的遺伝子を活性化する。ノッチはまた、細胞質亜鉛フィンガーを有するタンパク質Deltexを伴うＣＢＦ１非依存型様式でシグナルを送ることもできる（図３）。ＣＢＦ１とは異なりDeltexはノッチ活性化を受けて核に移行することはなく、その代わりにＧｒｂ２と相互作用してＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節する。
【００８９】
上述したとおり、ノッチの内因性モジュレーターはいくつか既に知られている。ノッチリガンドのデルタやセラートがその例である。本発明の目的は、新規ノッチシグナル伝達モジュレーターを見い出すことである。
【００９０】
候補モジュレーター
ここにおいて、「調節する」なる用語は、Ｔ細胞シグナル伝達経路又はその標的シグナル伝達経路における生物活性の変化若しくは改変を意味する。「モジュレーター」なる用語は、ノッチシグナル伝達におけるアンタゴニスト又はインヒビターを意味する。すなわち、ノッチシグナル伝達経路の正常な生物活性を阻害する、少なくともある程度まで阻害する化合物を意味する。便宜上かかる化合物を本発明においてはインヒビター又はアンタゴニストと称する。或いは、「モジュレーター」は、ノッチシグナル伝達のアゴニスト、すなわち、ノッチシグナル伝達経路の正常な生物活性を少なくともある程度まで刺激又はアップレギュレーションする化合物を意味する。便宜上かかる化合物をアップレギュレーター又はアゴニストと称する。
【００９１】
「候補モジュレーター」なる用語は、ノッチシグナル伝達モジュレーターとして機能し得る、又はし得ると考えられる１若しくは２以上の分子に言及する場合に用いられる。かかる分子としては例えば有機「小分子」又はポリペプチドがある。これら分子やポリペプチドが候補分子に複数若しくはライブラリーとして含まれることが好適である。これらの分子は公知のモジュレーターに由来していてもよい。「由来する」とは、公知のノッチシグナル伝達モジュレーターである開始配列から完全に又は部分的に無作為抽出したポリペプチドがその候補モジュレーター分子に好ましくは含まれることを意味する。所定のパラメーターを使用するBLASTアルゴリズムを用いた場合に、１若しくは２以上の公知ノッチモジュレーター分子に対する候補分子の相同性を少なくとも４０％有するポリペプチドが含まれることが最も好ましく、かかる相同性が少なくとも６０％あることがより好ましく、少なくとも７５％あることがより一層好ましく、又は例えば８５％若しくは９０％、ひいては９５％を超える相同性を示すことがさらに一層好ましい。
【００９２】
本発明の候補モジュレーターは、有機化合物又は他の化学物資であってよい。本実施態様では、候補モジュレーターは、２又は３以上のヒドロカルビル基をもつ有機化合物である。ここにおいて「ヒドロカルビル基」なる用語は、少なくとも炭素原子又は水素原子を含み、また任意に他の好適置換基を１若しくは２以上含む基を意味する。かかる置換基としては、ハロ基、アルコキシ基、ニトロ基、アルキル基、環式基などが例示される。置換基が環式基である可能性に加え、置換基の組合せが環式基を形成してもよい。ヒドロカルビル基が炭素原子を２個以上有する場合、それら炭素は必ずしも互いに結合していなくてもよい。例えば、炭素のうち少なくとも２個が適切なエレメント又は基を介して結合していてもよい。従ってヒドロカルビル基にヘテロ原子が含まれていてもよい。当業者には好適なヘテロ原子は明らかであり、硫黄、窒素及び酸素が例示される。候補モジュレーターには環式基が少なくとも一つ含まれていてもよい。環式基は、非融合多環式基等の多環式基であってもよい。別のヒドロカルビル基に結合した環式基が作用因子に少なくとも一つ含まれている適用例がいくつかある。
【００９３】
好適実施態様の一つにおいて、候補化合物はアミノ酸配列又はその化学的誘導体、或いはそれらの組合せである。別の好適実施態様においては、候補化合物はヌクレオチド配列であり、かかるヌクレオチド配列はセンス配列若しくはアンチセンス配列のいずれでもよい。候補モジュレーターは抗体であってもよい。
【００９４】
「抗体」なる用語には無処理の分子と共に、エピトープ決定基との結合能を有するＦａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ及びｓｃＦｖ等、上記分子の断片が含まれる。これらの抗体断片には、その抗原又は受容体と選択的に結合する能力が保持され、以下のものが列挙できる。
【００９５】
（ｉ）抗体分子の一価抗原結合断片を含む断片Ｆａｂは、全抗体を酵素パパインで消化し、無処理のＬ鎖及び一本のＨ鎖の一部を得て作製できる。
（ii）抗体分子の断片Ｆａｂ´は、全抗体をペプシン処理し、次いで還元することにより、無処理のＬ鎖及びＨ鎖の一部が作出されて得られる。抗体分子１個から２個のＦａｂ´断片を得る。
（iii）Ｆ（ａｂ´）2は、全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後還元させないで得られる抗体断片である。Ｆ（ａｂ´）2は、２個のジスルフィド結合によって保持されるＦａｂ´断片２個のダイマーである。
（iv）融合１本鎖分子としてＨ鎖及びＬ鎖の可変領域を有する遺伝子工学的に得た断片を含むｓｃＦｖ。
【００９６】
上述の断片を得る一般的な作製法については当技術分野で公知である（例えば本明細書に参考として添付したHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988) を参照のこと）。
【００９７】
モジュレーターは合成化合物であっても自然に単離した化合物であってもよい。
【００９８】
ノッチシグナル伝達に関与するタンパク質とは、ノッチ活性化、ノッチシグナル伝達経路の下流でのイベント、下流標的遺伝子の転写調節及び下流における他の非転写イベント（例えば既存タンパク質の翻訳後修飾）を含むシグナル伝達にノッチ受容体を介して参加する分子を意味する。より具体的には上記タンパク質は、ノッチシグナル伝達経路の標的遺伝子を活性化するドメイン、又はそれをコードするポリヌクレオチド配列である。
【００９９】
ノッチシグナル伝達経路における非常に重要な構成因子はノッチ受容体／ノッチリガンドの相互作用である。従ってノッチシグナル伝達は、ノッチリガンド又は受容体又はそれらの分解産物の発現、性質、活性量の変化に関係している。またノッチシグナル伝達は、ノッチシグナル伝達経路膜タンパク質、Ｇタンパク質、プロテアーゼやキナーゼ（例；セリン／トレオニンキナーゼ）、フォスファターゼ、リガーゼ（例；ユビキチンリガーゼ）、グリコシルトランスフェラーゼの発現、性質、活性量の変化に関係している。或いはノッチシグナル伝達は、転写因子等のＤＮＡ結合エレメントの発現、性質、活性量の変化に関係している。
【０１００】
本発明においてノッチシグナル伝達は特異的シグナル伝達を意味し、これは検出されたシグナルが、サイトカインシグナル伝達などのように有意の妨害若しくは競合要因からよりも、実質的に若しくは少なくともプレドミナントにノッチシグナル伝達経路から、好ましくはノッチ／ノッチリガンド相互作用からもたらされることを意味する。実施態様の１つにおいて「ノッチシグナル伝達」なる用語はサイトカインのシグナル伝達は意味しない。ノッチシグナル伝達経路については以下に詳述する。
【０１０１】
タンパク質やポリペプチドは「成熟」タンパク質の形態でも、又は融合タンパク質や前駆体等の大きなタンパク質でもよい。例えば、分泌配列又はリーダー配列又はプロ配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧ等）を含む付加アミノ酸配列を有することが精製をする上で好都合である。同様にかかる付加配列は、組換えによる作製過程において安定性を増すために望ましい場合がある。かかる場合、最終産物を得るために付加配列が開裂（例えば化学的に又は酵素により）してもよい。しかし場合によっては、付加配列が所望の薬理学的プロフィールをも付与するものであってもよく（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）、その場合、投与する際の最終産物に付加配列が存在するように除去されないことが好ましい。
【０１０２】
一実施態様においてノッチを活性化するノッチリガンドは細胞上又は細胞膜上（細胞由来が好適）で発現されてもよい。
【０１０３】
候補モジュレーターは合成化合物であっても自然に単離した化合物であってもよい。合成又は天然型モジュレーターの種々の例を以下に列挙する。
【０１０４】
候補モジュレーター：アンタゴニスト
ノッチシグナル伝達に対するアンタゴニストには、ノッチ、ノッチシグナル伝達経路又は１若しくは２以上のノッチシグナル伝達経路構成因子に対する阻害能を有する分子が全て含まれる。
【０１０５】
ノッチシグナル伝達を阻害する候補モジュレーターとしては、ノッチシグナル伝達の活性化能又は伝達能を有する化合物のドミナントネガティブ種が挙げられる。或いは、ノッチシグナル伝達の候補モジュレーターは、ノッチシグナル伝達の活性化能又は伝達能を有する化合物を抑制することができる。さらに別の実施態様では、モジュレーターはノッチシグナル伝達のインヒビターである。
【０１０６】
特にある実施態様においてモジュレーターは、ノッチ又はノッチリガンド発現を減少させ又は阻止する能力をもつ。このようなモジュレーターは、ノッチ又はノッチリガンド発現を減少させ又は阻止する核酸配列であってもよい。かかる内因性モジュレーターには、トール様受容体タンパク質ファミリー、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等のサイトカイン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等の成長因子、ＢＭＰ受容体やアクチビン類から選択されるポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる。候補モジュレーターには上記いずれかの誘導体、断片、変異体、模倣体、アナログ及びホモログが含まれる。
【０１０７】
好適実施態様においてモジュレーターは、ノッチリガンドの発現を亢進させる能力をもつ化合物の産生を低減又は阻止するポリペプチド、又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。このタイプの内因性化合物には、Noggin、Chordin、Follistatin、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子が含まれる。候補モジュレーターには、上記いずれかの誘導体、断片、変異体、模倣体、アナログ及びホモログが含まれる。
【０１０８】
或いはかかる核酸配列は、ノッチリガンド、又はNoggin、Chordin、Follistatin、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子、それらの誘導体、断片、変異体及びホモログ等のノッチリガンドの発現をアップレギュレーションさせる能力をもつポリペプチドから選択されるポリペプチドをコードするセンスヌクレオチド配列由来のアンチセンス構築物である。
【０１０９】
別の好適実施態様でノッチシグナル伝達阻害の候補モジュレーターは、ノッチ−ノッチリガンド相互作用の調節能をもつ分子である。ある分子がノッチとそのリガンドの相互作用を、好ましくは治療に奏功するに十分な程度に阻害することができるとき、かかる分子はノッチ−ノッチリガンド相互作用を調節するとみなされる。かかる実施態様でモジュレーターは、トール様受容体、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等のサイトカイン、ＢＭＰ等の成長因子、ＢＭＰ受容体やアクチビン類、それらの誘導体、断片、変異体、模倣体、ホモログ及びアナログから選択されるポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。モジュレーターが、Noggin、Chordin、Follistatin、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子、それらの誘導体、断片、変異体、模倣体、ホモログ及びアナログ等のノッチリガンドの発現を亢進させることができる作用因子の産生を低減又は阻止することが好ましい。
【０１１０】
モジュレーターが、受容体又は受容体をコードする核酸配列の場合、その受容体は活性化されることが好ましい。従って例えば、作用因子が核酸配列の場合、その受容体は発現されると構成的に活性となる。
【０１１１】
ノッチシグナル伝達阻害のモジュレーターには、ノッチシグナル伝達経路のダウンストリームモジュレーター（例；Ｄｓｈ、Ｎｕｍｂ、及びそれらの誘導体、断片、変異体、模倣体、ホモログ、アナログなど）、ノッチ標的遺伝子の発現を回避し、又はノッチシグナル伝達経路に抑制される遺伝子発現を誘導する化合物、及びノッチシグナル伝達分子のドミナントネガティブバージョン（Notch IC、Deltex、及びそれらの誘導体、断片、変異体、模倣体、ホモログ、アナログなど）ノッチシグナル伝達を阻害するタンパク質には、シグナル伝達経路を伝達するよりむしろブロックするように修飾したノッチシグナル伝達経路の野生型構成因子の変異体もまた含めるものとする。かかるモジュレーターの例としては、細胞内ドメインのタンパク質分解が最早不可能となるように修飾されたノッチ受容体が挙げられる。
【０１１２】
候補モジュレーター：アゴニスト
ノッチシグナル伝達のアゴニストには、ノッチ、ノッチシグナル伝達経路、又は１若しくは２以上のノッチシグナル伝達経路構成因子をアップレギュレートできる分子であれば全て含まれる。ノッチシグナル伝達経路をアップレギュレーションする候補モジュレーターには、ノッチシグナル伝達経路の伝達能や活性化能を有する化合物が含まれる。
【０１１３】
ノッチシグナル伝達モジュレーターには、ノッチ活性化、ノッチシグナル伝達経路のダウンストリームイベント、ダウンストリーム標的遺伝子の転写調節及び他の非転写ダウンストリームイベント（例えば既存タンパク質の翻訳後修飾）を含むシグナル伝達にノッチ受容体を介して参加する分子が含まれる。より具体的には、かかるモジュレーターはノッチシグナル伝達経路の標的遺伝子を活性化させる。
【０１１４】
本発明の特徴の１つとしてモジュレーターはノッチのポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、又はノッチ又はノッチアナログのシグナル伝達能を保持する上記ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの断片、変異体、誘導体、模倣体又はホモログであってよい。本発明でノッチという場合、ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４及びこれら以外のノッチのホモログやアナログのことを指す。ノッチのアナログには、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０、ＬＭＰ２Ａ等のEpstein Barr virus（ＥＢＶ）由来のタンパク質が含まれる。特に好適な実施態様では、モジュレーターはノッチ細胞内ドメイン（NotchIC）又はそのサブ断片、変異体、誘導体、模倣体、アナログ又はホモログである。
【０１１５】
ノッチシグナル伝達を活性化するモジュレーターには、ノッチ、ノッチシグナル伝達経路、又はノッチシグナル伝達経路の１若しくは２以上の構成因子を活性化することができる分子が含まれる。
【０１１６】
上記モジュレーターとしては、ノッチシグナル伝達レプレッサーのドミナントネガティブバージョンでもよい。別の実施態様においてモジュレーターは、ノッチシグナル伝達レプレッサーに対する阻害能を有する。さらに別の実施態様ではノッチシグナル伝達活性化のモジュレーターはノッチシグナル伝達のポジティブアクチベーターである。
【０１１７】
ある実施態様においてモジュレーターは、ノッチ又はノッチリガンドの発現を誘導又は亢進する能力を有する。かかる分子としては、ノッチ又はノッチリガンドの発現を誘導又は亢進する能力を有する核酸配列でもよい。
【０１１８】
一実施態様でモジュレーターは、標的細胞においてノッチ又はノッチリガンドをコードする内因性遺伝子の発現をアップレギュレーションすることができる。かかるモジュレーターは特に、標的細胞において内因性ノッチ又はノッチリガンドの発現をアップレギュレーションすることができる免疫抑制サイトカイン、又はこのようなサイトカインをコードするポリヌクレオチドであってよい。免疫抑制サイトカインにはＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β及びＦＬＴ３リガンドが含まれる。従って候補モジュレーターにはさらに上記いずれかの断片、誘導体、変異体、模倣体、アナログ及びホモログが含まれる。
【０１１９】
内因性アゴニストとしては、Noggin、Chordin、Follistatin、Ｘｎｒ３、線維芽細胞成長因子が列挙できる。従って候補モジュレーターには、それらの誘導体、断片、変異体、模倣体、アナログ及びホモログ、或いは上記の１若しくは２以上をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【０１２０】
別の実施態様では、かかるモジュレーターはノッチリガンド、又はノッチリガンドをコードするポリヌクレオチドであってよい。ノッチリガンドには、造血幹細胞を例とする種々の哺乳類細胞の膜上に存在するノッチ受容体ポリペプチドとの結合能を一般的に有する内因性ノッチリガンドが含まれる。これまでに同定されている哺乳類ノッチリガンドの具体例としては、デルタ又はデルタ様１（Genbank Accession No. AF003522-Homo sapiens）、デルタ３（Genbank Accession No. AF084576-Rattus norvegicus）及びデルタ様３（Mus musculus）（Genbank Accession No.NM_016941-Homo sapiens）、及び米国特許第６１２１０４５号（Millennium）、デルタ４（Genbank Accession Nos. AB043894 and AF253468-Homo sapiens）、及び例えばセラート１とセラート２（ＷＯ９７／０１５７１、ＷＯ９６／２７６１０、ＷＯ９２／１９７３４）のセラートファミリー、ジャグド１（Jagged-1）（Genbank Accession No.U73936-Homo sapiens）及びジャグド２（Genbank Accession No. AF029778-Homo sapiens）、及びＬＡＧ−２が挙げられる。ファミリーメンバー間における相同性は高い。
【０１２１】
実施態様の１つにおいてモジュレーターは、構成的に活性なノッチ受容体又はノッチ細胞内ドメイン、又はかかる受容体や細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドである。
【０１２２】
別の実施態様でノッチシグナル伝達のモジュレーターは、ノッチ受容体のダウンストリームで機能する。従って、例えばノッチシグナル伝達のアクチベーターは、構成的に活性なDeltexポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。ノッチシグナル伝達経路の他のダウンストリーム構成因子には、Deltex-1、Deltex-2、Deltex-3、Deltexのサプレッサー（ＳｕＤｘ）、Numb及びそのアイソフォーム、Numb会合キナーゼ（ＮＡＫ）、Notchless、Dishevelled（Ｄｓｈ）、ｅｍｂ５、フリンジ遺伝子（Radical、Lunatic及びManic等）、ＰＯＮ、ＬＮＸ、Disabled、Numblike、Ｎｕｒ７７、ＮＦｋＢ２、Mirror、Warthog、Engrailed-１及びEngrailed-２、Lip-1及びそれらのホモログ、Deltexに調節されるＲａｓ／ＭＡＰＫカスケードに関与するポリペプチド、ノッチのタンパク質分解に関与するプレセニリン（Presenilin）等のポリペプチド、ノッチの標的遺伝子の転写調節に関与するポリペプチドが含まれる。従って本発明に用いる候補モジュレーターには、上記いずれかの構成的に活性な形態、それらのアナログ、ホモログ、誘導体、変異体、模倣体及び断片が含まれる。
【０１２３】
ノッチシグナル伝達を活性化するモジュレーターはまた、ノッチが活性化される結果として発現されるポリペプチド、かかるポリペプチドの発現に関与するポリペプチド、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全てを指す。
【０１２４】
ノッチシグナル伝達の活性化は、ノッチシグナル伝達経路のインヒビターを抑制することによっても達成される。その場合、候補モジュレーターにはノッチシグナル伝達インヒビターを抑制できる分子が含まれる。かかる分子としては、ノッチ、ノッチリガンド又はノッチシグナル伝達経路のダウンストリーム構成因子の発現を減少させることができる化合物の産生や活性を低減又は妨害するポリペプチドや、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。好適実施態様の１つにおいて上記モジュレーターは、トール様受容体タンパク質ファミリー、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等のサイトカイン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等の成長因子、ＢＭＰ受容体やアクチビン類のポリペプチドを抑制する能力をもつ。
【０１２５】
ノッチシグナル伝達に関与するポリペプチド及びポリヌクレオチド
ノッチシグナル伝達経路は胚における二細胞期の運命決定を指示する。ノッチはショウジョウバエにおいて2種の異なるリガンドであるデルタとセラートの受容体として機能する膜透過タンパク質として初めて見い出された。脊椎動物は複数のノッチ受容体及びリガンドを発現する（後述する）。これまでに少なくとも4種類のノッチ受容体（Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4）がヒト細胞で同定されている（例として、GenBank Accession Nos. AF308602, AF308601, U95299 - Homo sapiensを参照）。
【０１２６】
ノッチタンパク質は、フーリン（Furin）様転換酵素により分解する単一のポリペプチド前駆体として合成される。フーリン様転換酵素は2本のポリペプチド鎖をもたらし、かかるポリペプチド鎖は成熟受容体を形成すべくさらにプロセシングされる。細胞膜に存在するノッチ受容体には、2つのノッチタンパク質分解産物であるヘテロダイマーが含まれ、その1つには細胞外ドメイン、膜透過ドメイン及び細胞内ドメインの一部からなるＮ末端断片が含まれ、他方には細胞ドメインの大部分が含まれる。受容体を活性化するノッチのタンパク質分解過程は、ゴルジ装置で生じ、フーリン様転換酵素に促進される。
【０１２７】
ノッチ受容体は、３６個までの上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復［Notch１／２＝３６、Notch３＝３４、Notch４＝２９］を有する細胞外ドメイン、３個のシステインリッチ反復（Lin−Notch（Ｌ／Ｎリピート）、及び細胞膜ドメインを有する膜透過サブユニットからなるジスルフィド結合ヘテロダイマー分子として膜に挿入する。ノッチの細胞質ドメインは、6個のアンキリン（ankyrin）様反復、ポリグルタミンのストレッチ（ＯＰＡ）及びＰＥＳＴ配列を有する。ＲＡＭ２３と名付けられたさらなるドメインがアンキリン反復の近傍に位置し、ショウジョウバエのHairless［Ｓｕ（Ｈ）］及び脊椎動物のＣＢＦ１（Tamura）のサプレッサーとして知られる転写因子との結合に関与している。ノッチリガンドはその細胞外ドメインにおいて、全てのノッチリガンドの特徴であるシステインリッチＤＳＬ（Delta-Serrate Lag2）ドメインと共に複数のＥＧＦ様反復も示す（Artavanis-Tsakonas）。
【０１２８】
ノッチ受容体は、デルタ、セラート、スカブロウ（Scabrous）等の細胞外リガンドが、ノッチの細胞外ドメインにおけるＥＧＦ様反復に結合することによって活性化される。デルタが活性化するためには分解が必要である。デルタはＡＤＡＭ ディスインテグリンメタロプロテアーゼ（disintegrin metalloprotease） Kuzbanianによって細胞表面で分解し、この分解現象により可溶性及び活性型のデルタが放出される。ＴＡＮ−１としても知られ、細胞外ドメインが切断されているヒトノッチ１タンパク質の発癌性変異体は構造的に活性であり、Ｔ細胞リンパ性白血病に関与していることが明らかになっている。
【０１２９】
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメイン反復は、細胞内シグナル伝達タンパク質との物理的相互作用を促進する。最も顕著には、ｃｄｃ１０／アンキリン反復は、Hairless［Ｓｕ（Ｈ）］の抑制因子と相互作用を行う。Ｓｕ（Ｈ）は、Ｂ細胞のEpstein-Barr virusに誘導される不死化に関与する哺乳類ＤＮＡ結合タンパク質であるＣプロモーター結合因子−１［ＣＢＦ−１］のショウジョウバエにおけるホモログである。少なくとも培養細胞においてＳｕ（Ｈ）は、細胞質でｃｄｃ１０／アンキリン反復と会合し、ノッチ受容体がそのリガンドであるデルタと隣接細胞上で相互作用するのを受け、核内へと移行することが示されている。Ｓｕ（Ｈ）は、数種の遺伝子のプロモーター内でみられる応答エレメントを有し、ノッチシグナル伝達経路における重要なダウンストリームタンパク質であることがわかっている。Ｓｕ（Ｈ）の転写への関与はHairlessによって調節されると考えられている。
【０１３０】
ノッチ（NotchIC）の細胞内ドメインもまた直接的な核機能を有している（Lieber）。近年の研究により、ノッチの活性化には、ノッチの細胞内ドメインにおける６個のｃｄｃ１０／アンキリン反復が核に到達して転写活性に参加することが必要であることが実際に示されている。ノッチの細胞内尾部におけるタンパク質開裂部位はｇｌｙ１７４３及びｖａｌ１７４４（部位３又はＳ３と呼ばれる）の間で同定されている（Schroeter）。核への進入のためにｃｄｃ１０／アンキリン反復を放出するタンパク質開裂過程はプレセニリン（Presenilin）活性に依存する。
【０１３１】
細胞内ドメインは核内で蓄積して、核内においてＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（Hairless、ショウジョウバエのＳｕ（Ｈ）、線虫のＬａｇ−２）と転写活性複合体を形成することが示されている（Schroeter; Struhl）。NotchIC−ＣＢＦ１複合体は次に、ｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（split様のhairyエンハンサー）１及び５等の標的遺伝子を活性化する（Weinmaster）。かかるノッチの機能は哺乳類ノッチホモログについても報告されている（Lu）。
【０１３２】
ノッチリガンドのデルタ又はセラート／ジャグド（Jagged）との結合に応答した場合にのみＳ３プロセシングが生じる。ゴルジにおける発生期ノッチ受容体における翻訳後修飾（Munro; Ju）は、２種類のリガンドのどちらが細胞表面で発現されるかを少なくとも部分的に制御しているようである。ノッチ受容体は、Notch／Linモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素であるフリンジ（Fringe）により、その細胞外ドメインにおいて修飾される。フリンジは、ＥＧＦ様反復にＯ結合フコース基を付加することによってノッチを修飾する（Moloney; Bruckner）。フリンジによる修飾はリガンド結合を回避するものではないが、リガンドに誘導されるノッチの構造変化に影響する可能性がある。また、フリンジの作用はノッチを修飾してノッチがセラート／ジャグドリガンドと機能的に相互作用を行うことを妨げるが、優先的にデルタと結合させることが近年の研究から示唆されている（Panin; Hicks）。ショウジョウバエは単一のフリンジ遺伝子をもつが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている（Radical, Manic and Lunatic Fringes）（Irvine）。
【０１３３】
ノッチ受容体からのシグナル伝達は２種類の異なる経路を介してもたらされる（図１）。よりよく定義された経路には、ノッチの細胞内ドメイン（NotchIC）のタンパク質開裂が含まれ、かかるドメインは核まで移動してＣＳＬファミリータンパク質のＣＢＦ１（ショウジョウバエのHairless、Ｓｕ（Ｈ）、線虫のＬａｇ−２の抑制因子）と転写活性複合体を形成する。NotchIC−ＣＢＦ１複合体は次にｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（split様のhairyエンハンサー）１及び５等の標的遺伝子を活性化する。ノッチはまた、細胞質亜鉛フィンガーを有するタンパク質Deltexを伴うＣＢＦ１非依存型様式でシグナルを送ることもできる。ＣＢＦ１とは異なりDeltexはノッチ活性化を受けて核に移行することはなく、その代わりにＧｒｂ２と相互作用してＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節する。
【０１３４】
従ってノッチ受容体からのシグナル伝達は２種類の異なる経路を介して生じる。それらの経路を図１に図示する。ノッチシグナル伝達経路の標的遺伝子にはDeltex、Ｈｅｓファミリー遺伝子（特にＨｅｓ−１）、Splitのエンハンサー［Ｅ（ｓｐｌ）］複合体遺伝子、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、ＣＤ−４及びＤｌｌ−１が含まれる。
【０１３５】
細胞内結合タンパク質のDeltexは、その相互作用部位を離れる際にＳｕ（Ｈ）をノッチの細胞内尾部と置き換える。Deltexは亜鉛フィンガーをもつ細胞質タンパク質である（Artavanis-Tsakonas; Osborne）。Deltexはノッチの細胞内ドメインにおけるアンキリン反復と相互作用を行う。DeltexがＧｒｂ２との相互作用によりＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節し、ノッチ経路活性化を促進することが研究の結果示されている（Matsuno）。DeltexはまたＳｕ（Ｈ）がノッチ細胞内尾部と結合することを阻止する結合タンパク質としても作用する。従ってＳｕ（Ｈ）は核内へと放出され、核内において転写モジュレーターとして作用する。脊椎動物のＢ細胞系においてＳｕ（Ｈ）ホモログのＣＢＦ１よりむしろDeltexの方がＥ４７機能を阻止することに関与していることが近年の研究結果から示唆されている（Ordentlich）。ポジティブフィードバックループにおいてノッチが活性化される結果、Deltexの発現がアップレギュレートされる。ヒトDeltex（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡの配列は、GenBank Accession No. ＡＦ０５３７００に登録されている。
【０１３６】
Ｈｅｓ−１（Split-1のHumpエンハンサー）（Takebayashi）は基本的なへリックス−ループ−へリックス構造を有する転写因子である。Ｈｅｓ−１はＣＤ４サイレンサーにおける重要な機能部位に結合し、ＣＤ４遺伝子発現を抑制する。従ってＨｅｓ−１はＴ細胞の運命決定に深く関与している。Ｈｅｓファミリーの他の遺伝子には、Ｈｅｓ−５（Splitホモログの哺乳類エンハンサー）とＨｅｓ−３が含まれ、Ｈｅｓ−５の発現もまたノッチ活性化によりアップレギュレーションされる。Ｈｅｓ−１の発現はノッチが活性化されることによりアップレギュレートされる。Mus musculus Ｈｅｓ−１の配列はGenBankに登録番号Ｄ１６４６４として登録されている。
【０１３７】
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体［Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ］（Leimeister）には７種の遺伝子が含まれるが、そのうちＥ（ｓｐｌ）とGrouchoだけが変異体となったときに目に見える表現型を示す。Ｅ（ｓｐｌ）は、そのSplit変異を増強する能力から命名され、Splitはノッチの別名である。実際Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子は、achaete−scute複合遺伝子発現を調節することによりデルタを抑制する。Ｅ（ｓｐｌ）の発現は、ノッチが活性化する結果としてアップレギュレーションされる。
【０１３８】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、Ｔｈ１細胞によるサイトカインの産生を抑制する能力をもち、Ｔｈ２細胞が産生する因子として最初にマウスで特徴付けられた。その後、マクロファージ、角化細胞、Ｂ細胞、Ｔｈ０、及びＴｈ１細胞など、他の種々の細胞型によってＩＬ−１０が産生されることが明らかになった。ＩＬ−１０は、ウイルス性ＩＬ−１０と命名されているEpstein-Barr ｂｃｒｆ１遺伝子と高い相同性を示す。ＩＬ−１０の免疫刺激効果は僅かなりとも報告されてはいるが、主として免疫抑制サイトカインとして位置づけられている。ＩＬ−１０によるＴ細胞応答の阻害は、主として抗原提示細胞の補機能が減少することによって促進される。ＩＬ−１０は、マクロファージが多数の前炎症性サイトカインを産生することを抑制し、共刺激分子及びＭＨＣクラスIIの発現を阻害することが明白に報告されている。ＩＬ−１０はまた、好中球及びエオシン好性白血球等の他の脊髄細胞に対して抗炎症効果を発揮する。Ｂ細胞上においてＩＬ−１０はアイソタイプのスイッチング及び増殖に影響する。さらに近年になって、ＩＬ−１０が調節性Ｔ細胞の誘導に関与し、調節性Ｔ細胞の抑制効果に対するメディエーターである可能性が報告された。ＩＬ−１０がノッチシグナル伝達経路にとって直接的なダウンストリーム標的であるか否かは明らかでないが、その発現はノッチの活性化に伴って著しくアップレギュレートされることが見い出されている。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列は、GenBankにＧＩ１０４１８１２として登録されている。
【０１３９】
ＣＤ２３は、ヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）のことであり、Ｂ細胞の活性化及び増殖にとって肝要な分子である。ＣＤ２３はＩｇＥに対し、低親和性受容体である。また、切断化分子が分泌されて潜在的な分裂成長因子として機能する。ＣＤ２３の配列は、GenBankにＧＩ１７８３３４４として登録されている。
【０１４０】
Ｄｌｘ−１（distalless−１）（McGuiness）の発現はノッチ活性化に伴いダウンレギュレートされる。Ｄｌｘ遺伝子の配列は、GenBankにＵ５１０００−３として登録されている。
【０１４１】
ＣＤ４の発現はノッチ活性化に伴いダウンレギュレートされる。ＣＤ４抗原の配列は、GenBankにＸＭ００６９６６として登録されている。
【０１４２】
ノッチシグナル伝達経路に関与する上述以外の遺伝子（例えばNumb、Mastermind、Ｄｓｈ）、及びその発現がノッチ活性化により調節される全ての遺伝子は本発明の範囲に含まれる。
【０１４３】
ノッチシグナル伝達を活性化するポリペプチド及びポリヌクレオチド
これまでに同定されている哺乳類ノッチリガンドの具体例としては、デルタ１（Genbank Accession No. AF003522-Homo sapiens）、デルタ３（Genbank Accession No. AF084576-Rattus norvegicus）及びデルタ様３（Mus musculus）などのデルタファミリー、セラート１及びセラート２（ＷＯ９７／０１５７１、ＷＯ９６／２７６１０、ＷＯ９２／１９７３４）などのセラートファミリー、ジャグド１（Jagged-1）及びジャグド２（Genbank Accession No. AF029778-Homo sapiens）、並びにＬＡＧ−２が挙げられる。ファミリーメンバー間における相同性は高い。例えばヒトジャグド２はセラートに対し、同一性が４０．６％、類似性が５８．７％である。
【０１４４】
標準的手法を用いて既知の哺乳類ノッチリガンドのさらなるホモログを同定してもよい。「ホモログ」なる用語は、例えば上述したもののように既知のノッチリガンドのいずれかとの配列ホモロジー（アミノ酸若しくは核酸配列のホモロジーのどちらか）を示す遺伝子産物を意味する。通常、既知ノッチリガンドのホモログは、かかる既知ノッチリガンドにおいて少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、好適には少なくとも１００アミノ酸長の配列、或いは上記ノッチリガンド配列の全長において、アミノ酸レベルで少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％一致する。２若しくは３以上のアミノ酸若しくは核酸配列間の配列ホモロジーを計算する方法又はソフトウエアは当技術分野で公知である（http:  HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov" www.ncbi.nlm.nih.gov. 及び Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.を参照）。
【０１４５】
これまでに同定されているノッチリガンドには、同タンパク質のアミノ末端に、２０〜２２アミノ酸からなる診断用ＤＳＬドメイン（D. Delta, S. Serate, L. Lag2）が、またその細胞外表面に１４個以下若しくはそれ以上のＥＧＦ様反復が存在する。従って、ノッチリガンドのホモログには、Ｎ末端にＤＳＬドメイン、細胞外表面に１４個以下若しくはそれ以上のＥＧＦ様反復が含まれることが好ましい。
【０１４６】
さらにノッチリガンドの好適ホモログは、ノッチ受容体への結合能を有する。インビトロ結合アッセイ等の当技術分野で公知の種々の方法により結合を調べることができる。
【０１４７】
ノッチリガンドのホモログは多数の方法で同定することができ、例えば中程度から高度なストリンジェンシー下（例えば、約５０℃〜約６０℃にて０．０３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）において、ノッチリガンドをコードする核酸の全部又は一部を含むプローブを用いてゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーをプローブする方法が挙げられる。或いは、保存アミノ酸配列をコードする変異体やホモログ内の配列を標的とするように設計したプライマーを一般に用いる変性ＰＣＲを用いてホモログを得てもよい。かかるプライマーには１若しくは２以上の変性部分が含まれ、既知配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングする際の条件より緩やかなストリンジェンシー条件で使用する。
【０１４８】
ポリペプチド物質は、適当な宿主細胞で組換え発現させて得た哺乳類細胞、又は市販の哺乳類細胞から精製してよい。或いは、ポリペプチドをコードする核酸構築物を用いてもよい。さらなる実施例として、セラートやデルタ遺伝子等の内因性遺伝子を活性化できる核酸構築物を導入することにより、ノッチ、又はデルタやセラート等のノッチリガンドを過剰発現させてもよい。特に、標的細胞のゲノムにおいてセラートやデルタプロモーター等の天然型プロモーターの場所に異種プロモーターを挿入する異種組換えを行うことにより遺伝子を活性化させることができる。
【０１４９】
本発明の活性化分子は、別の実施態様においてノッチタンパク質の発現若しくは細胞膜上での提示、又はシグナル伝達経路を調節する能力をもつ。標的細胞表面において完全に機能的なノッチタンパク質の提示を強化する薬剤には、ショウジョウバエのKuzbanian遺伝子産物及び他のADAMALYSIN遺伝子ファミリーメンバー等のマトリックスメタロプロテイナーゼが含まれる。
【０１５０】
ノッチシグナル伝達を阻害するポリペプチド及びポリヌクレオチド
好適核酸配列には、例えばノッチリガンド発現のアップレギュレーション因子の発現を減少させ若しくは阻害するように設計したアンチセンス構築物と並び、アンチセンスノッチリガンド構築物をコードする核酸配列などのアンチセンス構築物が含まれる（上記を参照）。アンチセンス核酸は合成１本鎖ＤＮＡ等のオリゴヌクレオチドでもよい。しかしアンチセンスが、遺伝的ベクターの導入により患者自身の細胞で産生されるアンチセンスＲＮＡであることがより好ましい。かかるベクターは、宿主細胞へのベクター導入後における所望の特異性をもつアンチセンスＲＮＡの産生に関与している。
【０１５１】
好ましくは本発明に用いる核酸配列はセラート及びデルタ、好ましくは樹状細胞等のＡＰＣｓにおいてデルタ１、デルタ３及びデルタ４の発現と共にセラート１及びセラート２の発現を阻害する能力をもつ。特にかかる核酸配列はＡＰＣｓ又はＴ細胞においてセラートの発現阻害能を有しても、デルタ発現に対する阻害能はもたず、又はデルタの発現阻害能を有しても、セラート発現に対する阻害能はもたない。或いは本発明に用いる核酸配列は、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞等のＴ細胞又はデルタを発現する他の免疫系細胞（例えば細胞表面受容体による刺激に応答して）におけるデルタ発現に対する阻害能を有する。特に、Ｔ細胞において核酸配列はデルタ発現を阻害する能力を有してもよいが、セラート発現を阻害することはできない。特に好適な実施態様では核酸配列が、Ｔ細胞とＡＰＣの両方においてノッチリガンド発現を、例えばＡＰＣｓでセラート発現を、Ｔ細胞においてデルタ発現を阻害できる。
【０１５２】
ノッチシグナル伝達を阻害する分子にも、細胞膜上やシグナル伝達経路におけるノッチタンパク質の発現又は提示を調節する能力をもつポリペプチド又はかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。完全に機能的な細胞膜タンパク質としての提示を低減又は阻止する分子には、ヒドロキシム酸に基づくインヒビター等のＭＭＰ阻害剤が含まれる。
【０１５３】
ノッチとノッチリガンドとの間の相互作用を低減させるのに用いる物質としては他にも外因性ノッチ若しくはノッチリガンド又はそれらの機能的誘導体がある。このようなノッチリガンド誘導体は、Ｎ末端にＤＳＬドメインを有することが好ましく、細胞外表面において約１４個まで、又はそれを超える、例えば約３〜８個のＥＧＦ様反復を有することが好ましい。ヒトジャグド１のデルタ／セラート／ＬＡＧ−２ドメインに相当するペプチド、及びヒトジャグド１の細胞外部分の可溶形態を発現するＣＯＳ細胞から得た上清は、ノッチ１の阻害においてジャグド１の効果を模倣することが判明している（Li）。
【０１５４】
他のノッチシグナル伝達経路アンタゴニストには、ノッチシグナル伝達経路の構成因子間の相互作用を阻害する抗体、例えばノッチリガンドに対する抗体が含まれる。
【０１５５】
ある物質が、ノッチ−ノッチリガンド発現の調節に用いることができるかどうかについては適当なスクリーニングアッセイにより調べられる。
【０１５６】
ノッチシグナル伝達はプロテインアッセイ又は核酸アッセイにより観察できる。ノッチ受容体の活性化により、その細胞質ドメインにタンパク質開裂が生じ、細胞核へと移入する。ここにおける「検出可能なシグナル」とは、ノッチの開裂した細胞内ドメインの存在に起因する検出可能な発現のことである。従ってノッチシグナル伝達の亢進は、開裂したノッチドメインの細胞内濃度を測定することによりタンパク質レベルでの検定が可能である。ノッチ受容体の活性化もまた一連のダウンストリームでの反応を触媒し、よく定義された遺伝子の発現レベルの変化をもたらす。従って、ノッチシグナル伝達の亢進は、例えば特異的ｍＲＮＡの細胞内濃度を測定することにより、核酸レベルで検定することができる。本発明の一好適実施態様で行うアッセイはプロテインアッセイである。本発明の一好適実施態様で行うアッセイは核酸アッセイである。
【０１５７】
核酸アッセイを採用する利点は、このアッセイが高感度であり、小試料の分析も可能だという点にある。
【０１５８】
所定の時間に測定する特定ｍＲＮＡの細胞内濃度は、その時間における相当遺伝子の発現レベルを反映するものである。従って、ノッチシグナル伝達経路のダウンストリーム標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、免疫系Ｔ細胞の間接的アッセイを行うことによって測定できる。例えば、Deltex、ＨＥＳ−１及び／又はＩＬ−１０のｍＲＮＡは例えばアレルギーの誘導を示し、ＩＦＮ−γｍＲＮＡ、又はＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のサイトカインをコードするｍＲＮＡのレベルは応答性の向上を示す。
【０１５９】
本発明において同定した多くの化合物は薬剤開発に有用なリード化合物である。有用なリード化合物には、抗体やペプチドが含まれ、遺伝子療法の意味するところにおいて細胞内で発現される細胞内抗体も含まれ、ペプチド又は低分子量治療薬の開発用モデルとして用いられる。本発明の好適な特徴として、リード化合物において認められた相互作用を模倣する好適低分子量化合物の設計を容易にするため、リード化合物及びノッチ受容体若しくはノッチリガンド、又は他の標的ペプチドを共結晶化してもよい。
【０１６０】
Ｔ細胞シグナル伝達経路の調節能をもつ化合物及び／又は標的分子を種々の薬剤スクリーニング法のいずれかで同定するのに、１若しくは２以上の適切な標的（アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列など）を使用する。かかる試験に使用する標的は、溶液中で遊離の状態、固体支持体に固定させた状態、細胞表面に担持されている状態、又は細胞内に局在する状態のいずれであってもよい。
【０１６１】
本発明はまた、標的への結合能を有する中和抗体が標的に特異的に結合する際に、かかる結合に関して試験化合物と競合させるという競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用も意図するものである。
【０１６２】
ノッチシグナル伝達経路の構成因子に対する結合能及び／又は調節能を有する抗体、ペプチド模倣体及び小有機分子等の薬剤をスクリーニングし開発する方法は当技術分野で公知である。これらの方法には、シグナル伝達タンパク質を発現させるファージ提示系を使用するもの、トランスフェクトさせた大腸菌や他の微生物の培養物を用いて結合能及び／又は調節能をもつ化合物を調べるものが含まれる（例として、G. Cesarini, FEBS Letters, 307 (1): 66-70 (July 1992): H. Gram et al., J. Immunol. Meth., 161: 169-176 (1993); and C. Summer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 3756-3760 (May 1992)を参照）。さらなるライブラリー及びスクリーニング法が例えば米国特許第６２８１３４４号（Phylos）に記載されている。
【０１６３】
ノッチリガンド
上述したとおり、ノッチリガンドは多数の異なるドメインを有する。種々の天然型ヒトノッチリガンドにおける予測／潜在的ドメイン位置（前駆タンパク質のアミノ酸番号に基づく）をいくつか以下に示す。
【０１６４】
【表１】
2004537314.tif 000002
【０１６５】
【表２】
2004537314.tif 000003
【０１６６】
【表３】
2004537314.tif 000004
【０１６７】
【表４】
2004537314.tif 000005
【０１６８】
【表５】
2004537314.tif 000006
【０１６９】
ＤＳＬドメイン
通常のＤＳＬドメインには、以下のコンセンサスアミノ酸配列の殆ど又は全てが含まれていてもよい。
【０１７０】
【表６】
2004537314.tif 000007
ＤＳＬドメインには、以下のコンセンサスアミノ酸配列の殆ど又は全てが含まれていることが好ましい。
【０１７１】
【表７】
2004537314.tif 000008
【０１７２】
【表８】
2004537314.tif 000009
種々のソース由来のノッチリガンドにおけるＤＳＬアラインメントを図３２に示す。
【０１７３】
使用するＤＳＬドメインは、例えばショウジョウバエ、アフリカツメガエル、ラット、マウス、ヒトなど、いかなる好適種に由来するものであってもよい。ＤＳＬは脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトノッチリガンド配列に由来することが好ましい。
【０１７４】
例えば、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトジャグド１のＤＳＬドメインに対し、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することが好適である。
【０１７５】
或いは、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトジャグド２のＤＳＬドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
【０１７６】
或いは、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトデルタ１のＤＳＬドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
【０１７７】
或いは、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトデルタ３のＤＳＬドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
【０１７８】
或いは、本発明に使用するＤＳＬドメインは、ヒトデルタ４のＤＳＬドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。
【０１７９】
ＥＧＦ様ドメイン
ＥＧＦやノッチやノッチリガンドと同様に、ＥＧＦ様モチーフも種々のタンパク質で見い出されており、その中には血液凝固カスケードに関与するものも含まれる（Furie and Furie, 1988, Cell 53: 505-518）。例えばこのモチーフは、血液凝固因子IX及びＸ（Rees et al., 1988, EMBO J. 7: 2053-2061; Furie and Furie, 1988, Cell 53: 505-518）等の細胞外タンパク質、他のショウジョウバエ遺伝子（Knust et al., 1987 EMBO J. 761-766; Rothberg et al., 1988, Cell 55: 1047-1059）、及びトロンボモジュリン等いくつかの細胞表面受容体タンパク質（Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6: 1891-1897）、及びＬＤＬ受容体（Sudhof et al., 1985, Science 228: 815-822）で観察されている。トロンボモジュリンやウロキナーゼのＥＧＦ反復ドメインにタンパク質結合部位がマッピングされている（Kurosawa et al., 1988, J. Biol. Chem 263: 5993-5996; Appella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4437-4440）。
【０１８０】
PROSITEで報告されているようにＥＧＦドメインには、ジスルフィド結合に関与することがわかっている（ＥＧＦにおいて）6個のシステイン残基が通常含まれる。2本鎖βシートからループでＣ末端における2本鎖短シートに続く主要構造が提唱されているが、それは必要条件ではない。以下のＥＧＦ様ドメインの概略図に示すように保存されたシステイン間のサブドメインは、それぞれ長さが大きく異なっている。
【０１８１】
【表９】
2004537314.tif 000010
５番目と６番目のシステインの間の領域には2個の保存されたグリシンが含まれ、少なくともそのいずれか1個は殆どのＥＧＦ様ドメインに普通存在している。
【０１８２】
用いるＥＧＦ様ドメインは、好適な種からであれば何に由来していてもよく、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、ラット、マウス又はヒト等が列挙できる。ＥＧＦ様ドメインは脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトノッチリガンド配列に由来することが好ましい。
【０１８３】
例えば、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトジャグド１のＥＧＦ様ドメインに対し、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０１８４】
或いは、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトジャグド２のＥＧＦ様ドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０１８５】
或いは、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトデルタ１のＥＧＦ様ドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０１８６】
或いは、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトデルタ３のＥＧＦ様ドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０１８７】
或いは、本発明に用いるＥＧＦ様ドメインは、ヒトデルタ４のＥＧＦ様ドメインに対し、例えば少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を示す。
【０１８８】
実際問題として、あるアミノ酸配列が別の配列と少なくともＸ％の相同性を示すかどうかについては、従来用いられている公知のコンピュータープログラムによって決定できる。例えば、全体的配列アラインメント（global sequence alignment）とも言われる照会配列と対象配列との間の最良総合一致性は、Brutlag et al（Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムなどのプログラムを用いて決定できる。配列アラインメントでは照会配列と対象配列は、いずれもヌクレオチド配列であるか、或いはいずれもアミノ酸配列である。全体的配列アラインメントの結果は同一性の割合（％）として得られる。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントに用いる好適なパラメーターは次のとおり。マトリックス＝ＰＡＭ０、k-tuple＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランダム化グループの長さ＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列の長さ、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象アミノ酸配列の長さのいずれか短い方。
【０１８９】
ポリペプチド配列
ここに用いる「ポリペプチド」なる用語は、「アミノ酸配列」及び／又は「タンパク質」なる用語と同義である。「ポリペプチド」なる用語が「ペプチド」とう用語と同義の場合もある。
【０１９０】
「ペプチド」は通常、１０〜４０アミノ酸長、好ましくは１０〜３５アミノ酸長である短いアミノ酸配列を指す。
【０１９１】
ポリペプチド配列は適当なソースから調製し、単離してよく、或いは合成して作製してもよく、また組換えＤＮＡ法を用いて調製してもよい。
【０１９２】
ポリヌクレオチド配列
ここにおいて「ポリヌクレオチド配列」なる用語は、「ポリヌクレオチド」及び／又は「ヌクレオチド配列」という用語と同義である。
【０１９３】
ポリヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成又は組換え起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡでよい。これらはまた標準的手法によってクローニングされたものでもよい。ポリヌクレオチド配列は２本鎖又はセンス若しくはアンチセンス鎖のいずれかを表す１本鎖、或いはそれらの組合せであってよい。
【０１９４】
「ポリヌクレオチド」とは、長さが少なくとも１０塩基から１０００塩基、又は１０００塩基を超えるヌクレオチドのポリマー態のことである。より長いポリヌクレオチド配列は、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）クローニング法を用いる組換え法で作製するのが一般的である。この方法は、クローニングさせたい標的配列の領域にフランキング（隣接）する一対のプライマー（例；約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、それらのプライマーを動物若しくはヒト細胞から得たｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡと接触させ、所望の領域を増幅させる条件下でポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅した断片を単離し（例えば反応混合物をアガロースゲル上で精製することにより）、そして増幅ＤＮＡを回収することからなる。上記プライマーは、増幅ＤＮＡが好適なクローニングベクターにクローニングされるように適切な制限酵素認識部位を有するように設計する。
【０１９５】
核酸はＲＮＡ又はＤＮＡでよく、ＤＮＡが好ましい。ＲＮＡを使用する場合は、ｃＤＮＡ中間体を介して操作を行う。通常は第１領域をコードする核酸配列を調製し、５'及び／又は３'末端に適切な制限部位を設ける。便宜上、pBR322又はpUC19に基づくプラスミドベクターなどの標準的な実験用ベクターにおいて配列を操作する（以下参照）。好適な手法の詳細についてはMolecular Cloning by Sambrook et al. (Cold Spring Harbor, 1989)や、類似の標準的参考文献が参考となる。
【０１９６】
公開文献又はGenBank等のデータベースを参考にして核酸のソースを確定する。所望の第1又は第2配列をコードする核酸は学術用又は商業用のソースからの材料入手が可能であればそこから得ればよく、又は配列データのみが入手可能である場合は適した配列を合成又はクローニングして得られる。この場合は通常、対象遺伝子のクローニングに関する説明がある文献ソースを参考にして実施する。
【０１９７】
或いは限られた配列データしか得られない場合、又は公知の核酸と相同若しくは関連する核酸を発現させることを望む場合、その核酸例は当技術分野で公知の核酸配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列として特徴付けられる。
【０１９８】
ポリヌクレオチド配列には例えば、タンパク質コーディングドメイン、アンチセンス配列、又はタンパク質結合ドメイン等の機能的モチーフが含まれ、それらの変異体、誘導体、アナログ及び断片も含まれる。ポリヌクレオチド配列なる用語は、かかるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドをも指す。
【０１９９】
本発明に有用なＤＮＡポリヌクレオチド等のヌクレオチド配列は、組換え、合成又は当業者が実行可能ないずれの方法によっても作製できる。標準的な手法でクローニングしてもよい。
【０２００】
一般的にプライマーは、所望の核酸配列を１ヌクレオチドずつ作出するステップワイズ手法を含む合成法で作製する。この方法で行うための自動化技術を用いる技術は当技術分野では容易に実現可能である。
【０２０１】
より長いヌクレオチド配列は、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）クローニング法を用いる組換え法で作製するのが一般的である。この方法は、クローニングさせたい標的配列の領域をフランキング（隣接）する一対のプライマー（例；約１５〜３０ヌクレオチド）を作製し、そのプライマーを動物若しくはヒト細胞から得たｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡと接触させ、所望の領域を増幅させる条件下でポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅した断片を単離し（例えば反応混合物をアガロースゲル上で精製することにより）、そして増幅ＤＮＡを回収することからなる。上記プライマーは、増幅ＤＮＡが好適なクローニングベクターにクローニングされるように適切な制限酵素認識部位を有するように設計する。
【０２０２】
組換え作製法では宿主細胞に、本発明の発現系又はポリヌクレオチドを取り込むように遺伝子工学に基づく操作を施すことができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入法としては、Davis et al and Sambrook et al等、多くの標準的実験室マニュアルに記載されている例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic intruduction）、感染等の方法が有効である。これらの方法は、薬物送達系としてインビトロ又はインビボで採用することができる。
【０２０３】
好適な宿主の代表的な例としては、レンサ球菌（streptococci）、ブドウ球菌（staphylococci）、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞や、酵母細胞、アスペルギルス細胞等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ２９３、Bowesメラノーマ細胞等の動物細胞や、植物細胞が挙げられる。
【０２０４】
本発明に有用なポリペプチドの作製には極めて多様な発現系が使用できる。このようなベクターとしては例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来するベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、またバキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス等のウイルス由来のベクター、並びにこれらの組合せに由来するベクター、例えばコスミドやファージミドのようにプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものが含まれる。この発現系構築物は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。宿主内でポリヌクレオチドを保持、増殖又は発現させる、及び／又は宿主内でポリペプチドを発現させるのに適していれば通常いかなる系又はベクターでも発現に使用してよい。例えば、Sambrook et al の方法等、十分公知のルーティンな方法に従って適切なＤＮＡ配列を発現系に挿入してよい。
【０２０５】
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、ペリプラズム空間に、又は細胞外環境に分泌するためには、発現したポリペプチドに適切な分泌シグナルを導入することができる。かかるシグナルは、ポリペプチドに対し内因性でも異種シグナルでもよい。
【０２０６】
本発明に用いる活性作用因子は、広く公知の方法を用いることにより、組換え細胞培養物から回収・精製することができる。これらの方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーなどがある。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチドが単離及び／又は精製の過程で変性した場合は、十分公知の方法によりタンパク質のリフォールディングを行って活性構造を再生する。
【０２０７】
変異体、誘導体、アナログ、ホモログ及び断片
本明細書に記載ある特異的ポリペプチド及びポリヌクレオチド配列に加え、本発明はまたそれらの変異体、誘導体、アナログ、ホモログ、模倣体及び断片をも包含する。
【０２０８】
本発明において、所定の配列の変異体とは、残基（アミノ酸残基であれ、核酸残基であれ）の特異的配列が、目的のポリペプチド又はポリヌクレオチドがその内因性機能を少なくとも１つは保持する形で修飾されている配列のことをいう。変異配列は、天然型タンパク質に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、交換及び／又は変異により修飾できる。
【０２０９】
本発明のタンパク質又はポリペプチドとの関連において用いる「誘導体」なる用語には、その結果得られるタンパク質又はポリペプチドがその内因性機能の少なくとも1つを保持する限りにおいて、配列に対してアミノ酸残基1個（又は2個以上）を置換、変異、修飾、交換、欠失及び／又は付加することを含む。
【０２１０】
ここにおいてポリペプチド又はポリヌクレオチドとの関連で用いる「アナログ」なる用語は、内因性ポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能を少なくとも1つ保持するポリペプチド又はポリヌクレオチドを含むが、通常それらの進化起源は異なる。
【０２１１】
ここにおいてポリペプチド又はポリヌクレオチドとの関連で用いる「模倣体」なる用語は、それが模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内因性機能を少なくとも1つ有する化学化合物のことを指す。
【０２１２】
通常アミノ酸の置換は、ノッチシグナル伝達調節に必要な輸送活性若しくは能力を修飾配列が保持する限りにおいて、例えば１、２若しくは３から１０若しくは２０個の置換を行う。アミノ酸の置換には、人為的アナログを使用してもよい。
【０２１３】
本発明で用いるタンパク質には、サイレントな変化をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換があってもよく、それにより、機能的に同等なタンパク質が得られる。アミノ酸の意図的な置換は、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性における類似性を基にし、輸送又は調節機能が保持される限りにおいて行われる。例えば負電荷アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正電荷アミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ、また同様の親水価をもつ極性ヘッド無電荷グループのアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０２１４】
便宜上、主要な天然型アミノ酸（及びその関連するコドン）に対する１文字コードと３文字コードを以下に記す。
【０２１５】
【表１０】
2004537314.tif 000011
例えば下記の表に基づき、保存的置換を行うことができる。第２カラムの同じブロック内のアミノ酸同士、及び好ましくは第３カラムの同じ行にあるアミノ酸同士は、互いに置換させてもよい。
【０２１６】
【表１１】
2004537314.tif 000012
ここに用いる「タンパク質」なる用語には、個々の構成ポリペプチドが共有若しくは非共有手段によって結合している複数ポリペプチド複合体とともに１本鎖ポリペプチド分子も含まれる。ここに用いる「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、モノマーがアミノ酸であり、かつペプチド結合若しくはジスルフィド結合によって結び付いているものを指す。サブユニット及びドメインなる用語もまた生物機能を有するポリペプチド及びペプチドを指す。
【０２１７】
「断片」もまた変異体であり、この用語は、機能的に目的とするポリペプチド又はポリヌクレオチド、又は例えば結合アッセイにおける目的ポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択領域のことを通常指す。従って「断片」とは、完全長ポリペプチド又はポリヌクレオチドの部分であるアミノ酸配列又は核酸配列のことである。
【０２１８】
かかる変異体は、site-directed mutagenesis等の標準的な組換えＤＮＡ法により調製できる。挿入を行う場所に、挿入部位の片側において天然型配列に相当する５'及び３'フランキング領域と共に挿入物をコードする合成ＤＮＡを挿入する。配列が適当な酵素（１若しくは２以上）で切断され、合成ＤＮＡが切断部に結合するように、フランキング領域には天然型配列における部位に相当する便宜的な制限部位が含まれる。次にこのＤＮＡは、本発明に従って発現され、コードされたタンパク質を産生する。これらの方法は、ＤＮＡ配列操作法として当技術分野で公知の無数の標準的な手法の例であり、他の公知の手法を用いることもできる。
【０２１９】
ポリヌクレオチドの変異体はコドン最適化配列を有することが好ましい。コドン最適化は、ＲＮＡの安定性を、ひいては遺伝子発現を増強する手法として当技術分野で公知である。遺伝子コードの縮重とは、いくつかの異なるコドンが同じアミノ酸をコードすることを意味する。例えばロイシン、アルギニン及びセリンはそれぞれ６種類の異なるコドンによってコードされる。異なるコドンを使用する際の優先順位が異なる生物ごとにみられる。例えばＨＩＶ等のウイルスは希少コドンを数多く用いる。希少コドンを、汎用され相当する哺乳類コドンで代替するようにヌクレオチド配列を変化させることにより、哺乳類標的細胞における配列の発現が増強されることになる。哺乳類細胞や他の種々の生物に関するコドン使用表が当技術分野で公知となっている。配列の少なくとも一部のコドンが最適化されていることが好ましい。配列がその全体にわたってコドン最適化されていることがより好ましい。
【０２２０】
「相同性」なる用語は、「同一性」という言葉と同じ意味をもつ。相同配列には、対象とする配列と、少なくとも７５、８５若しくは９０％の同一性を示し、好ましくは少なくとも９５若しくは９８％の同一性を示すアミノ酸配列が含まれると解される。特に相同性は通常、活性に重要であることが知られている配列中の領域（５１、５６及び５７番目のアミノ酸など）との関連で検討される。相同性は類似性として捉えることもできるが（すなわち、アミノ酸残基が類似の化学特性・機能を有する）、本発明の文脈においては相同性が配列の同一性を表すことが好ましい。
【０２２１】
相同性の比較は、肉眼により、さらに一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これら市販コンピュータープログラムにより、２若しくは３以上の配列間における相同性の割合（％）が計算できる。
【０２２２】
相同性の割合は、隣接する配列を基に計算される。すなわち、一方の配列を他方の配列と並べ、一方の配列中の各アミノ酸を、他方の配列中の対応するアミノ酸と直接、一残基毎に比較するのである。これは、「ギャップなし（ungapped）」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアラインメントは、比較的残基数の少ない場合に行われる。
【０２２３】
この方法は、非常に簡便かつ堅実な方法であるが、１つの挿入部又は欠失部以外は同一な２つの配列において、かかる挿入部又は欠失部以降のアミノ酸残基がアラインメントから外れてしまう結果になるということが考慮されず、その結果、全体のアラインメントが終了したときの相同性の割合が大きく低下してしまう可能性がある。結果的に殆どの配列比較法は、全体としての相同性スコアを不当に損なうことなく、可能性のある挿入部又は欠失部を考慮に入れた最適化アラインメントを作出するように設計されている。これは、局所相同性を最大化することを意図して、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することにより実現される。
【０２２４】
しかしながら、より複雑なこれらの方法は、アラインメントで生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティ」を課すことになり、同数の同一アミノ酸に対し、配列アラインメント内のギャップ数が少なければ少ないほど（比較する２つの配列間における高い関連性を反映して）、ギャップ数の多い場合より高いスコアが得られる。ギャップの存在に対し相対的に高いコストを課し、ギャップ内に続く残基の各々に、より少ないペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が通常使用される。これは最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。当然のことながら高いギャップペナルティは、より少ないギャップで最適化アラインメントをもたらす。殆どのアラインメントプログラムは、ギャッププログラムに修正を加えることを認めている。しかし、そのようなソフトウエアを配列比較に用いる際には、初期値を使用することが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfit packageを使う場合のアミノ酸配列に対する初期ギャップペナルティは、ギャップ１個につき−１２で、各ギャップ延長につき−４である。
【０２２５】
従って相同性割合（％）の最大値を計算するには、まず、ギャップペナルティを考慮した上で最適化アラインメントを作製する必要がある。かかるアラインメントを実現するのに適したコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Bestfit package（Devereux）である。配列比較を行えるソフトウエアの例としては他にも、BLAST package、FASTA（Atschul）、及びGENEWORKの比較ツールセットがあるが、これらに限定されない。BLAST及びFASTAはいずれもオフライン及びオンラインでのサーチに利用できる。しかしGCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。
【０２２６】
最終的な相同性割合は同一性に換算して求められものの、通常アラインメントプロセス自体は、オールオアナッシング（all-or-nothing）という考えに依拠して2つの配列を比較するものではない。その代わり、化学的類似性又は進化論的距離に基づき、２つ１組の比較にスコアを与える類似性スコア拡大縮小マトリックス（scaled similarity score matrix）が一般的に使用される。そのようなマトリックスの中でよく用いられるものとして、BLASTプログラムセットの初期マトリックスであるBLOSUM62 matrixが例示される。GCG Wisconsinプログラムには一般的に公開初期値を、カスタムシンボル比較表（custom symbol comparison table）（詳細はユーザーマニュアルを参照）がある場合は、それらのいずれかを使用する。GCG packageには公開初期値を、また他のソフトウエアには、BLOSUM62などの初期マトリックスを用いることが好ましい。
【０２２７】
ソフトウエアが一旦最適化アラインメントを作製すると、相同性割合、好ましくは配列同一性割合を計算することが可能になる。通常ソフトウエアは配列比較の一部として上記計算を行い、数字で結果を出す。
【０２２８】
本発明に用いる配列の相同ヌクレオチド配列又は変異ヌクレオチド配列は、例えば種々のソースから作製したＤＮＡライブラリーをプローブするなど、数多くの方法により得ることができる。また、他のウイルス性／細菌性、若しくは細胞性ホモログ、特に哺乳類細胞（例：ラット、マウス、ウシ及び霊長類細胞）からの細胞性ホモログを得てもよく、通常かかるホモログやその断片は、本明細書にある配列リストに示す配列と選択的にハイブリダイズすることができる。これら配列は、それが作製されたｃＤＮＡライブラリーから、又は他の動物種のゲノムＤＮＡライブラリーをプローブし、また中程度から高度なストリンジェンシー下で対象ヌクレオチド配列の全部又は一部を含むプローブでかかるライブラリーをプローブすることによって得られる。本発明に有用なアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列の種ホモログ及び対立変異体を得る際にも同様の方法論を適用する。
【０２２９】
変異体及び株／種ホモログもまた、本発明に用いる配列中の保存アミノ酸配列をコードする変異体及びホモログ内の配列を標的とするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲにより得られる。保存配列は、例えばいくつかの変異体／ホモログにおけるアミノ酸配列を整列させることによって予測できる。配列アラインメントは当技術分野で公知のコンピューターソフトウエアを用いて実行できる。例えばGCG Wisconsin PileUp program は広く使われている。縮重ＰＣＲで用いるプライマーには１若しくは２以上の縮重位置があり、公知の配列に対する単一配列プライマーで配列をクローニングするのに用いられるストリンジェンシー条件より低い条件で使用される。
【０２３０】
或いは、特徴付けられた配列にsite-directed mutagenesisを行うことにより上記ヌクレオチド配列を得てもよい。この方法は、例えばヌクレオチド配列が発現している特定宿主細胞に対するコドン優先度を最適化するためにサイレントなコドン変化が配列に要求される場合に有用である。制限酵素認識部位を導入するため、又はポリヌクレオチド若しくはコードされたポリペプチドの活性を改変するために、他の配列変化が必要になる場合もある。
【０２３１】
本発明の第一段階では、上述の候補モジュレーターの１若しくは２以上の免疫系細胞と接触させる。本発明で用いる免疫系細胞については下記に述べる。
【０２３２】
ノッチという場合、本発明者らはノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４及びその他のノッチホモログやアナログを意味する。「NotchIC」なる用語には、ノッチの完全細胞内ドメイン又はかかるドメインの活性部分が含まれる。例えば上記配列は、ヒトノッチ１における第１８４８〜２２０２アミノ酸を少なくとも含むかコードする配列であり、或いは上記配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性又は同一性を示す配列である。上記配列としては、ヒトノッチ２、ヒトノッチ３又はヒトノッチ４に由来するものも好適である。ノッチ配列には、少なくともノッチアンキリン反復ドメインを、また任意でノッチＬＮＲドメイン、ノッチＲＡＭドメイン、ノッチＯＰＡドメイン及び／又はノッチＰＥＳＴ配列が含まれることが好適である。
【０２３３】
免疫系細胞
本発明で使用する細胞は、ノッチシグナル伝達経路を変換する能力を有する免疫系細胞である。
【０２３４】
本発明に用いるのに最適なのはＴ細胞である。Ｔ細胞には、ＣＤ４+及びＣＤ８+成熟Ｔ細胞、末端及び胸腺由来の幼若Ｔ細胞、並びにＮＫ−Ｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３５】
或いは、上記免疫系細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）でもよい。ＡＰＣには、指間状（interdigiting）樹状細胞、濾胞樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球等の樹状細胞（ＤＣ）、或いは上皮細胞や線維芽細胞や内皮細胞のようにその表面にＭＨＣクラスII分子を連続的に発現させる又は発現させるための活性を有する他の細胞型が含まれる。ＡＰＣの前駆体には、ＣＤ３４+細胞、単球、線維芽細胞、内皮細胞が含まれる。培養条件を利用してＡＰＣ又は前駆体を修飾してもよく、或いは１若しくは２以上の遺伝子をトランスフェクトさせるなどの遺伝子修飾を施してもよい。
【０２３６】
Ｔ細胞及びＡＰＣは患者から単離してもよく、又はドナー個体若しくは別の個体から単離してもよい。ヒト細胞やマウス細胞等の哺乳類細胞が好ましい。ヒト由来の細胞であることが好ましい。ＡＰＣ又はＡＰＣ前駆体は、樹立細胞株又は初代細胞培養物等の培養による細胞増殖から得られる。例としてハイブリドーマ細胞株、Ｌ細胞、及びＭＲＣ−５等のヒト線維芽細胞が挙げられる。本発明で用いるのに好適な細胞株には、Jurkat、Ｈ９、ＣＥＭ、ＥＬ４の各Ｔ細胞、ヒトＨＡ１．７やマウスＤ１０細胞等の長期Ｔ細胞クローン、ＤＯ１１．１０細胞等のＴ細胞ハイブリドーマ、Ｕ９３７やＴＨＰ１細胞等のマクロファージ様細胞、Raji、Ａ２０及びＭ１細胞などのＥＢＶ形質転換細胞等のＢ細胞株が含まれる。
【０２３７】
樹状細胞（ＤＣ）は、多様な手法で単離・精製することができ、かかる手法としては、例えばＤＣ細胞を抹消血から直接精製するもの、ＧＭ−ＣＳＦで処理して抹消血に動員した後にＣＤ３４+前駆細胞から作出するもの、或いは骨髄から直接作出するものがある。抹消血から作出する場合は、接着性前駆体をＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４混合物（Inaba et al）で処理することができ、又は骨髄から作出する場合は、非接着性ＣＤ３４+細胞をＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−αで処理することができる（Caux et al）。ＤＣはまた、Sallusto and Lanzavecchia J Exp Med (1994) 179(4) 1109-18 の方法にそのまま習い、精製末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて接着性Ｔ細胞をＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４で２時間処理することにより、ヒトボランティアの末梢血からルーティンで調製できる。必要に応じて、磁気ビーズを用いてＣＤ１９+Ｂ細胞及びＣＤ３+Ｔ細胞、ＣＤ２+Ｔ細胞を上記から除去してもよい（Coffin et al）。培養条件としては、維持のためにＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−４等の他のサイトカインが、及び／又は樹状細胞や他の抗原提示細胞の活性が含まれる。
【０２３８】
本発明に用いるＴ細胞及びＢ細胞は、リンパ腫又は白血病細胞株等の細胞株、Ｔ細胞ハイブリドーマやＢ細胞ハイブリドーマから得ることが好ましいが、免疫系疾患の患者若しくは移植手術の被移植者から、又は関係のある若しくは無関係のドナー個体から単離してもよい。Ｔ細胞及びＢ細胞は、血液若しくは他の材料（リンパ節、脾臓又は骨髄など）から得てもよく、標準的な手法により増強若しくは精製してよい。或いは、全血液を使用してもよく、白血球を増強した血液若しくはＴ細胞の材料としての精製白血球や、他の細胞型を用いてもよい。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+）を使用することが特に好ましい。或いは、ＣＤ８+Ｔ細胞等の他のＴ細胞を用いてもよい。
【０２３９】
本発明で用いる候補モジュレーターを上述の免疫系細胞と接触させる。その後の段階で、候補モジュレーターに誘起されるノッチシグナル伝達調節を検出する。ノッチシグナル伝達における調節を検出するアッセイについて以下に説明する。これらアッセイの多くは、「標的遺伝子」の発現を観察することを含む。
【０２４０】
標的遺伝子
本発明で用いる標的遺伝子は内因性標的遺伝子（すなわちノッチシグナル伝達経路の内因性標的遺伝子）又は合成レポーター遺伝子のいずれでもよい。
【０２４１】
内因性標的遺伝子
ノッチシグナル伝達経路の内因性標的遺伝子にはDeltex、Ｈｅｓファミリー遺伝子（特にＨｅｓ−１）、Splitのエンハンサー［Ｅ（ｓｐｌ）］複合体遺伝子、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、Ｄｌｘ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ−４、Ｄｌｌ−１、Numb、Mastermind、Ｄｓｈが含まれる。ノッチ活性化により発現が調節される遺伝子は全て本発明の目的に用いられるが、好ましい内因性標的遺伝子としては以下のものが挙げられる。
【０２４２】
細胞内結合タンパク質のDeltexは、図１に示すようにその相互作用部位を離れる際にＳｕ（Ｈ）をノッチの細胞内尾部と置き換える。Deltexは亜鉛フィンガーをもつ細胞質タンパク質である（Artavanis-Tsakonas; Osborne）。Deltexはノッチの細胞内ドメインにおけるアンキリン反復と相互作用を行う。DeltexがＧｒｂ２との相互作用によりＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節し、ノッチ経路活性化を促進することが研究の結果示されている（Matsuno）。DeltexはまたＳｕ（Ｈ）がノッチ細胞内尾部と結合することを阻止する結合タンパク質としても作用する。従ってＳｕ（Ｈ）は核内へと放出され、核内において転写モジュレーターとして作用する。脊椎動物のＢ細胞系においてＳｕ（Ｈ）ホモログのＣＢＦ１よりむしろDeltexの方がＥ４７機能を阻止することに関与していることが近年の研究結果から示唆されている（Ordentlich）。ポジティブフィードバックループにおいてノッチが活性化される結果、Deltexの発現がアップレギュレートされる。ヒトDeltex（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡの配列は、GenBank Accession No. ＡＦ０５３７００に登録されている。
【０２４３】
Ｈｅｓ−１（Split-1のHumpエンハンサー）（Takebayashi）は基本的なへリックス−ループ−へリックス構造を有する転写因子である。Ｈｅｓ−１はＣＤ４サイレンサーにおける重要な機能部位に結合し、ＣＤ４遺伝子発現を抑制する。従ってＨｅｓ−１はＴ細胞の運命決定に深く関与している。Ｈｅｓファミリーの他の遺伝子には、Ｈｅｓ−５（Splitホモログの哺乳類エンハンサー）とＨｅｓ−３が含まれ、Ｈｅｓ−５の発現もまたノッチ活性化によりアップレギュレーションされる。Ｈｅｓ−１の発現はノッチが活性化されることによりアップレギュレートされる。ヒト Ｈｅｓ−１の配列はGenBankに登録番号ＡＫ０００４１５及びＡＦ２６４７８５として登録されている。
【０２４４】
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体［Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ］（Leimeister）には７種の遺伝子が含まれるが、そのうちＥ（ｓｐｌ）とGrouchoだけが変異体となったときに目に見える表現型を示す。Ｅ（ｓｐｌ）は、そのSplit変異を増強する能力から命名され、Splitはノッチの別名である。実際Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子は、achaete−scute複合遺伝子発現を調節することによりデルタを抑制する。Ｅ（ｓｐｌ）の発現は、ノッチが活性化する結果としてアップレギュレーションされる。
【０２４５】
ＩＬ−１０（インターロイキン−１０）は、Ｔｈ２ヘルパーＴ細胞が産生する因子である。ＩＬ−１０は、マスト細胞増殖におけるコレギュレーターであり、Epstein-Barr bcrfi遺伝子と高い相同性を示す。ＩＬ−１０がノッチシグナル伝達経路にとって直接的なダウンストリーム標的であるか否かは明らかでないが、その発現はノッチの活性化に伴って著しくアップレギュレートされることが見い出されている。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列は、GenBankにＧＩ１０４１８１２として登録されている。
【０２４６】
ＣＤ２３は、ヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）のことであり、Ｂ細胞の活性化及び増殖にとって肝要な分子である。ＣＤ２３はＩｇＥに対し、低親和性受容体である。また、切断化分子が分泌されて潜在的な分裂成長因子として機能する。ＣＤ２３の配列は、GenBankにＧＩ１７８３３４４として登録されている。
【０２４７】
Ｄｌｘ−１（distalless−１）（McGuiness）の発現はノッチ活性化に伴いダウンレギュレートされる。Ｄｌｘ遺伝子の配列は、GenBankにＵ５１０００−３として登録されている。
【０２４８】
ＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔリンパ球活性化タンパク質４）はＴ細胞表面で見い出される補助分子であり、アレルゲン吸入後における気道での炎症性細胞の動員やＴヘルパー細胞の分化に関与している。ＣＴＬＡ４をコードする遺伝子のプロモーター領域には、ＣＢＦ１応答エレメントがあり、その発現はノッチ活性化によってアップレギュレートする。ＣＴＬＡ４の配列はGenBankにＬ１５００６として登録されている。
【０２４９】
ＣＤ４の発現はノッチ活性化に伴い、ダウンレギュレートする。ＣＤ４抗原の配列は、GenBankにＸＭ００６９６６として登録されている。
【０２５０】
上記以外に有用な標的遺伝子には、下記に列挙するアネルギー会合性遺伝子が含まれる（GenBank登録番号を付記する）。
ＧＲＧ４（groucho関連タンパク質−Ｕ６１３６３）、Ikaros（Ｌ０３５４７）、Jumonji（Ｄ３１９６７）、Caspase 3（Ｕ５４８０３）、ＳＯＣＳ２（Ｕ８８３２７）、Ｔｒａｆ５（Ｄ７８１４１）、ＲＰＴＰσ（Sigma−Ｄ２８５３０）、ＲＰＴＰκ（Kappa−Ｌ１０１０６）、ＰＴＰ−１Ｂ（Ｕ２４７００）、ＡＧＫα（ＡＡ０６６０３２）、ＬＤＨＡα（Ｙ００３０９）、Ｐｇａｍ１（ホスホグリセリン酸ムターゼ−ＡＡ１６１７９９）、ＧＢＰ−３（グアニル酸結合タンパク質３−Ｕ４４７３１）、ＲＧＳ−２（Ｇタンパク質シグナル伝達レギュレーター２−Ｕ６７１８７）、Ｒａｂ１０（ＡＡ１１９１９４）、ＣＤ９８（Ｕ２５７０８）、４−１ＢＢ−Ｌ（Ｌ１５４３５）、ＦａｓＬ（Ｕ０６９４８）、Ｈｉｆ−１（低酸素症誘導因子１−ＡＦ００３６９５）、ＳＡＴＢ１（核マトリックス接着性ＤＮＡ結合タンパク質−Ｕ０５２５２）、Ｅｌｆ−１（Ｕ１９６１７）、ＮＦＩＬ３（Ｕ８３１４８）、ＲＮＦ１９（ＧＥＧ−１５４とも呼ばれる−Ｘ７１６４２）、Ｍｌｐ（Markcks様タンパク質−ＡＡ２４５２４２）、Ｌａｄ／ＴＳＡｄ（p56lck会合性アダプタータンパク質−ＥＴ６２４１９）、ＺＡＰ−７０（Ｕ０４３７９）、Serpin 1b（ＡＡ１２５３１０）、シトスタチンＣ（Ｍ５９４７０）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｘ５７０２４）、ＣＤ３エプシロン（Ｊ０２９９０）、カチオン依存性マンノース−６−リン酸受容体（Ｘ６４０６８）、γ−アミノ酪酸受容体会合タンパク質様タンパク質１（Ｚ３１１３７）、テトラサイクリントランスポーター様タンパク質（Ｄ８８３１５）、ＭＣＳＦ（Ｍ２１９５２）、カルシクリン（Ｍ３７７６１）、ヘムオキシゲナーゼ２ａ（Ｚ３１２０２）及びＯｓｐ９４（浸透圧ストレスタンパク質９４−Ｕ２３９２１）。
標的／レポーター遺伝子がＩＬ−２又はＮＦＡＴではないことが好ましい。
【０２５１】
合成レポーター遺伝子
本発明の他の実施態様では、標的遺伝子はレポーター遺伝子である。好適実施態様においてレポーター遺伝子は、ノッチシグナル伝達に感受性のプロモーター領域又は応答エレメント（１又は２以上）の転写制御下にある。
【０２５２】
本発明のアッセイ法には種々多様なレポーターを用いることができるが（スクリーニング法同様に）、都合よく検出可能な（例えば分光法により）シグナルを発するものが好ましい。例を挙げると、レポーター遺伝子は、吸光性を変化させる反応を触媒する酵素をコードするものでもよい。
【０２５３】
他の手法には、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などがある。互いに干渉しない２つのエピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位（two-site）におけるモノクローナル抗体に基づく免疫測定法を利用してもよい。これらのアッセイ法、或いは他のアッセイ法に関する記載は種々の文献にみられるが、中でもHampton R et al (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) 及びMaddox DE et al (1983) J Exp Med 15(8): 121-1 によく収載されている。
【０２５４】
当技術分野の専門家であれば、特異的レポーター遺伝子のアイデンティティーは、当然種々に異なることを認識している。当技術分野でこれまで使用されてきたレポーター遺伝子には、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、β−ガラクトシダーゼ、インベルターゼ（invertase）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、エキソグルカナーゼ（exo-glucanase）、グルコアミラーゼ、又はアルカリホスファターゼが含まれるが、これらに限定されることはない。或いはレポーター遺伝子は、放射標識、又はＦＩＴＣ、ローダミン、ランタンナイドホスホル（lanthanide phosphor）、グリーン蛍光融合タンパク質等の蛍光標識を有していてもよい（Stauber et alを参照）。或いはレポーター遺伝子は、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン又はエピトープタグのように二次レポーターによって認識され得る規定のポリペプチドエピトープを有していてもよい。当技術分野の専門家であれば、本発明で開示する方法に用いる特異的レポーター遺伝子（１若しくは複数）には色々な種類があり、また採用する個々のモデル系によっても異なるので、本発明で開示する方法は何ら特定のレポーター遺伝子（１若しくは複数）に限定されるものではないことは十分理解するところである。
【０２５５】
さらに例を挙げると、Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)、Promega (Madison,WI)、US Biochemical Corp (Cleveland, OH) 等、数多くの企業がアッセイ用としてキットやプロトコールを市販している。好適なレポーター分子又は標識としては、基質、補因子、阻害剤、磁気ビーズなどと同様に、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤又は発色剤が含まれる。このような標識の使用については、米国特許Ａ３８１７８３７号、同Ａ３８５０７５２号、同Ａ３９３９３５０号、同Ａ３９９６３４５号、同Ａ４２７７４３７号、同Ａ４２７５１４９号、同Ａ４３６６２４１号などに教示がある。
【０２５６】
本発明の方法に用いるレポーター遺伝子は、ノッチシグナル伝達に敏感なプロモーター領域及び／又は応答エレメントの内少なくとも１つの転写制御下にある。ノッチシグナル伝達に敏感なプロモーター領域及び／又は応答エレメントには、ＨＥＳプロモーター、Deltexプロモーター、ノッチプロモーター、ノッチリガンドプロモーター、ＩＬ−１０プロモーター等、内因性ノッチ標的遺伝子の調節エレメントが含まれる。本発明に用いる調節エレメントにはまた、単一の又は複数のＣＢＦ１部位、ＣＴＬＡ４プロモーター及びＡＩＲＥプロモーターが含まれる。かかる調節エレメントは、ノッチシグナル伝達経路の活性化によりレポーター遺伝子の発現が増加するように配置する。
【０２５７】
当技術分野で公知の手法により、レポーター遺伝子の１若しくは２以上の複製を宿主細胞に挿入してもよい。本発明において「宿主細胞」なる用語は、本発明における作用因子の標的を有することができる細胞を全て含むものである。ポリヌクレオチドを原核細胞、又は酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等の真核細胞に導入してもよい。宿主細胞が上述の免疫系細胞であることが好ましい。
【０２５８】
トランスフェクション、形質転換、電気泳動等の当技術分野で公知の種々の方法を用いることにより、本発明のポリヌクレオチドを好適な宿主細胞に導入してもよい。本発明のポリヌクレオチドを動物に投与する場合は、例えばレトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス等の組換えウイルスベクターによる感染、核酸の直接注入、或いは遺伝子銃を用いた形質転換などいくつかの方法が当技術分野で知られている。
【０２５９】
本発明では、宿主細胞は哺乳類細胞であることが好ましく、またポリペプチドは、細胞内において細胞膜上で発現させるか、或いは適切なリーダー配列に先導されるのであれば培養培地中に分泌させる。
【０２６０】
標的遺伝子（内因性であれ、合成レポーター遺伝子であれ）の発現は、ノッチシグナル伝達単独に、又はノッチシグナル伝達と１若しくは２以上のさらなる刺激シグナルとの組合せに依存する。
【０２６１】
刺激シグナル
本発明で使用する標的遺伝子（内因性又はレポーター遺伝子）の発現又は抑制はノッチシグナル伝達に依存する。好適実施態様では、標的遺伝子の発現若しくは抑制はさらに、補助シグナル（又は「共刺激」）の存在下又は不在下で、免疫細胞に特異的な第２刺激に依存する。
【０２６２】
実施態様の１つにおいて第２刺激は、免疫細胞受容体の活性化により生じる。免疫細胞受容体には、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、トール様受容体（ＴＬＲ）などがある。ＴＣＲ又はＢＣＲシグナルを誘発する能力を有する分子としては、上記各受容体に対する特異的抗原、ＴＳＳ１、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、ＳＥＥ等のスーパー抗原や、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2断片、ファージ提示ペプチド、ＳｃＦＶ等のＴＣＲαβ鎖に対する抗体や、ζ及びε鎖を含むＣＤ３タンパク質に対する抗体や、抗ＣＤ２８抗体や、抗ＢＣＲ抗体や、ＬＰＳ及び他の細菌産物や、Ｆｃ受容体、補体受容体、マンノース受容体、他のスカベンジャー受容体等の食作用に関与する細胞受容体や、ＣＤ３６及びαｖβ５等のアポトーシスを起こした細胞の浄化に関与する受容体や、ＤＥＣ２０５及びＤＣ−light等の樹状細胞受容体や、ＰＭＡ、イオノマイシン、キナーゼ阻害剤等のＴＣＲ及び／又はＢＣＲシグナル伝達経路の活性剤が列挙される。これらの分子は単独で又は併用して使用してよく、抗原提示細胞上に提示される。
【０２６３】
本発明の実施態様の１つにおいて、以下の工程からなるノッチシグナル伝達モジュレーターの検出法を提供する。
（ａ）免疫系細胞を活性化し、
（ｂ）上記細胞を候補モジュレーターと接触させ、
（ｃ）ノッチシグナル伝達を観察し、（工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はどの順番で行ってもよい）、また
（ｄ）上記候補モジュレーターがノッチシグナル伝達を調節しているかどうかを測定する。
【０２６４】
上記アクチベーターは、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ２８抗体であることが好ましい。より詳細に述べるとＴ細胞活性化には、細胞表面のＴＣＲ／ＣＤ３複合体に端を発する複数の細胞内シグナル伝達イベントが含まれる。抗ＣＤ３抗体によりＴＣＲ／ＣＤ３複合体が交差結合するとＴ細胞の活性化が誘導され、その結果、ＩＬ−２等のサイトカインが産生される。ＩＬ−２は、その高親和性受容体に結合して細胞増殖を促進する。さらに、ＣＤ２８等の共刺激表面分子は、Ｔ細胞活性化に補助シグナルをもたらし、例えば抗ＣＤ３抗体と結合した場合にＩＬ−２産生を増強する。ＣＤ２８は、Ｔ細胞表面で発現する抗原であり、Ｔ細胞の活性化にも関与している。
【０２６５】
免疫細胞受容体シグナル伝達における補助又は共刺激シグナルには、Ｂ７．１−ＣＤ８０、Ｂ７．２−ＣＤ８６、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７ＲＰ２等のＢ７タンパク質、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＣＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫリガンド、Ｆａｓリガンド、ＭＨＣクラスII、ＤＥＣ２０５−ＣＤ２０５、ＣＤ２０４−スカベンジャー受容体、ＣＤ１４、ＣＤ２０６（マンノース受容体）、ＴＬＲ１〜９等のトール様受容体（ＴＬＲ）、ＣＤ２０７（Langerin）、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＦＣγ受容体２（ＣＤ３２）、ＣＤ６４（ＦＣγ受容体１）、ＣＤ６８、ＣＤ８３、ＣＤ３３、ＣＤ５４、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−３、ＢＤＣＡ−４、ケモカイン受容体、サイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体アゴニスト、並びにこれらの変異体、誘導体、アナログ及びそれらの断片が含まれる。
【０２６６】
実施態様の１つにおいて第２刺激は共刺激である。別の実施態様では、標的遺伝子の発現は、ノッチシグナル伝達、免疫細胞シグナル伝達及び共刺激という３種類の異なる刺激に依存している。これらの刺激については上述した。これらのシグナルは全て同時に、或いは決められた間隔をおいて（数時間ずらして、或いは数日間ずらしてもよい）伝達してもよい。シグナルは実質的に同時に伝達されることが好ましい。
【０２６７】
免疫細胞活性化
免疫細胞の活性化は、当業者に公知の好適な方法であればいずれの方法で観察してもよい。例えば細胞毒性活性を観察する方法がある。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞においては、活性化後４時間以内に細胞毒性活性が増強される。かかる細胞毒性活性は１８時間後に最大となる。
【０２６８】
一旦活性化された白血球は、新たに種々の細胞表面抗原を発現させる。例えばＮＫ細胞は活性化後に、トランスフェリン受容体ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ２５ＩＬ−２受容体を発現させる。従って、これらの抗原の発現を観察することにより活性化のアッセイを行うことができる。
【０２６９】
Hara et al.の「ヒトＴ細胞活性化：III,１２−０−ホルボール−１３−酢酸テトラデカノイルによるリン酸化２８ｋＤ／３２ｋＤジスルフィド結合早期活性化抗原（ＥＡ−１）の迅速な誘導、マイトジェン及び抗原(Human T-cell Activation: III, Rapid Induction of a Phosphorylated 28kD/32kD Disulfidelinked Early Activation Antigen (EA-1) by 12-0-tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate, Mitogens and Antigens)」（J. Exp. Med., 164: 1988 (1986)）、及び Cosulich et al.の「Ｔ細胞活性化初期に関与する抗原（ＭＬＲ３）の機能の特徴化(Functional Characterization of an Antigen (MLR3) Involved in an Early Step of T-Cell Activation)」（PNAS, 84: 4205 (1987)）は、活性化後まもなくＴ細胞上で発現される細胞表面抗原について説明している。これらの抗原ＥＡ−１及びＭＬＲ３は、それぞれ２８ｋＤ及び３２ｋＤの主要構成要素を有する糖タンパク質である。ＥＡ−１とＭＬＲ３はＨＬＡクラスII抗原ではなく、ＭＬＲ３モノクローナル抗体はＩＬ−１との結合を阻止する。これらの抗原は、活性化後１８時間以内に活性化Ｔ細胞上に出現し、４８時間後においても依然として出現が継続している。
【０２７０】
上記の抗原は、白血球の活性化を検出する上でも有用である。白血球活性化はさらに、欧州特許第３２５４８９号（参考のため本明細書に添付）の記載に従って観察してもよい。この方法の概略は、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＨＢ−９６２７と命名されたハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体が認識する細胞抗原と相互作用するモノクローナル抗体（「抗Ｌｅｕ２３抗体」）を用いる方法である。
【０２７１】
抗Ｌｅｕ２３抗体は、活性化され、かつ抗原で刺激された白血球の細胞表面抗原を認識する。Ｌｅｕ２３抗原は、活性化後４時間以内に活性化ＮＫ細胞上で発現し、活性化から７２時間経過してもなお発現が継続している。Ｌｅｕ２３は、Ｎ−結合型糖鎖を少なくとも２つ有し、２４ｋＤのサブユニットからなるジスルフィド結合二量体である。
【０２７２】
ＮＫ細胞上におけるＬｅｕ２３の出現が、細胞毒性の発生と相関していること、また数種のＴ細胞上におけるＬｅｕ２３の出現が、Ｔ細胞抗原受容体複合体の刺激と相関していることから、抗Ｌｅｕ２３抗体は白血球における活性や刺激を観察する上で有用である。
免疫細胞の活性を観察する方法の詳細についてはさらに、'The Natural Killer Cell' Lewis C. E. and J. O'D. McGee 1992. Oxford University Press; Trinchieri G. 'Biology of Natural Killer Cells' Adv. Immunol. 1989 vol 47 pp187-376; 'Cytokines of the Immune Response' Chapter 7 in "Handbook of Immune Response Genes". Mak T. W. and J. J. L. Simard 1998 に記載されており、参考のため本明細書に添付する。
【０２７３】
免疫細胞は、カルシウムシグナル伝達因子（イオノマイシン等のカルシウムイオノフォアなど）及び／又はホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）等のプロテインキナーゼ（例；プロテインキナーゼＣ又はＭＡＰキナーゼ）アクチベーターで活性化されることが好適である。或いは、例えばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）等のレクチンもまたＴ細胞の活性化に用いられる（Nowell, P. C. (1990) Cancer Res. 20: 462-466）。或いは例えば、抗ＣＤ３抗体、抗Ｔ細胞受容体抗体（抗ＴＣＲ抗体）及び／又は抗ＣＤ２８抗体等の抗体も用いられる。Ｂ細胞抗原Ｂ７の共活性化ドメインを有するタンパク質などのＣＤ２８リガンドも用いられる。
【０２７４】
イオノマイシン等のカルシウムイオノフォアをアクチベーターとして用いる場合、約５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは約１０００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは約２５０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で用いる。従って濃度は、例えば約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約５μｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌ、好適には約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌの範囲にある。
【０２７５】
イオノマイシン等のカルシウムイオノフォアをアクチベーターとして用いる場合、約１０μＭ未満、好ましくは約５μＭ未満、好ましくは約２μＭ未満、好ましくは約０．５μＭ未満、好ましくは約０．１μＭ未満の濃度で用いる。約０．００１〜１０μＭ、例えば約０．０１〜０．５μＭの範囲でイオノフォアを用いることが好適である。
【０２７６】
プロテインキナーゼアクチベーターは、カルシウムイオノフォアに加えて、或いはカルシウムイオノフォアに代えて細胞活性化に用いることができる。キナーゼアクチベーターは、ＭＡＰキナーゼアクチベーター（ＭＡＰＫＫＫ、ＭＡＰＫＫ、ＭＡＰＫの各ファミリーにおける１若しくは２以上のメンバー、及びそれらの会合ホスファターゼ（例；p38、Ｅｒｋ及びＪｎｋ経路のアクチベーター））、又はプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えばＰＭＡ又はＴＰＡに対するホルボールエステル）であることが好適である。
【０２７７】
プロテインキナーゼを用いる場合、約５０ｎＭ未満、好ましくは約２０ｎＭ未満、好ましくは約１０ｎＭ未満、好ましくは約１ｎＭ未満、好ましくは約０．１ｎＭ未満の濃度で用いる。例えば約０．００１〜１０ｎＭ、例えば約０．０１〜０．５ｎＭの範囲でイオノフォアを用いることが好適である。
【０２７８】
免疫細胞は、ノッチ又は免疫シグナル伝達のレベルが、少なくとも３０％の最適レベル、好ましくは少なくとも５０％の最適レベル、好ましくは少なくとも７０％の最適レベル、好ましくは少なくとも８０％の最適レベル、好ましくは少なくとも９０％の最適レベル、好ましくは少なくとも９５％の最適レベルを示すように活性化されることが好ましい。「最適」とは、用いる系における応答（例えばレポーターの顕現によって測定する）を最大化する活性レベルを意味する。ｘ％の最適とは、用いる系における最適応答のうち少なくともｘ％をもたらす活性レベルを意味する。
【０２７９】
最適な免疫細胞活性を用いてスクリーニングを行うことが望ましい場合もあるが（例えばノッチシグナル伝達のインヒビターをより簡便に同定するため）、それ以外の場合においては、準最適な免疫細胞活性を用いてスクリーニングを行うことが望ましい（例えばノッチシグナル伝達のアクチベーターをより簡便に同定するため）。
【０２８０】
同様にノッチシグナル伝達活性について、最適なノッチ活性を用いてスクリーニングを行うことが望ましい場合もあるが（例えばノッチシグナル伝達のインヒビターをより簡便に同定するため）、それ以外の場合においては、準最適なノッチ活性を用いてスクリーニングを行うことが望ましい（例えばノッチシグナル伝達のアクチベーターをより簡便に同定するため）。
【０２８１】
ノッチシグナル伝達活性化は、ノッチ又は免疫シグナル伝達が少なくとも３０％の最適レベル、好ましくは少なくとも５０％の最適レベル、好ましくは少なくとも７０％の最適レベル、好ましくは少なくとも８０％の最適レベル、好ましくは少なくとも９０％の最適レベル、好ましくは少なくとも９５％の最適レベルを示すような活性化が好ましい。「最適」とは、用いる系における応答（例えばレポーターの顕現によって測定する）を最大化する活性レベルを意味する。ｘ％の最適とは、用いる系における最適応答のうち少なくともｘ％をもたらす活性レベルを意味する。
【０２８２】
ノッチ活性化
ノッチシグナル伝達は、種々の方法により免疫細胞において活性化される。例えば免疫細胞が既にノッチを発現していてもよく、その場合、例えばノッチリガンド若しくはその活性部分によってノッチを活性化することによりノッチシグナル伝達が活性化される。
【０２８３】
免疫細胞が自然にノッチを発現することがない場合、或いは発現（従ってシグナルも）を亢進させたい場合、かかる免疫細胞にノッチをトランスフェクトし、また例えばノッチリガンド又はその活性部分によってノッチシグナル伝達を活性化する。
【０２８４】
或いは、構成的に活性なノッチの剪断形態を免疫細胞にトランスフェクトする。その場合、ノッチシグナル伝達を樹立するためにノッチリガンド等による活性化は必要ではない。このような剪断型ノッチは例えば参考文献として添付したLu et al, PNAS Vol 93, pp5663-5667 (May 1996)からも知られている。この文献には細胞外ドメインが欠失した剪断型ノッチについての記載がある（Ｎ１（δＥＣ））。
【０２８５】
或いは、ノッチ細胞内ドメイン（NotchIC）又はその活性部分を発現させる発現ベクターを免疫細胞にトランスフェクトしてもよく、それにより、ノッチシグナル伝達を樹立するためのノッチリガンドなどによる活性化はやはり不要となる。
【０２８６】
免疫シグナル伝達
ここに用いる「免疫シグナル伝達」なる用語には、免疫系細胞を活性化するシグナル伝達経路が含まれ、かかる免疫系細胞としては白血球が好ましく、リンパ球がより好ましく、Ｔ細胞がより好ましい。免疫シグナル伝達は、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体又はトール様受容体の活性化によって活性化されるシグナル伝達経路と関連していることが好ましい。免疫シグナル伝達は、Ｔ細胞受容体複合体の活性化によって活性化される細胞内シグナル伝達経路のいずれかに関連していることが好ましく、ここで複合体という用語は、共刺激シグナルを発生する膜タンパク質と並びＴ細胞受容体及びＣＤ３分子の両方のタンパク質鎖をも包含する。これらの免疫シグナル伝達経路は、膜受容体複合体の構成因子に対する生理学的若しくは遺伝子工学的に操作されたリガンドや、他にも細胞質及び／又は核といった細胞内で作用するシグナル伝達経路タンパク質のアクチベーターによって活性化される。
【０２８７】
リンパ球の活性化は、抗原／ＭＨＣ複合体や受容体構成因子に対する抗体によってリンパ球の抗原受容体がクラスター化されることにより刺激される（一般論としては例えば、Immunobiology (4th Edition, 1999）, Janeway, Travers, Walport and Capra, Elsevier Science出版を参照)。
【０２８８】
シグナル伝達は、受容体複合体と会合するタンパク質チロシンキナーゼが活性化されることにより開始される。受容体のクラスター化により酵素同士が、また酵素と受容体構成因子とが極めて接近し、上記キナーゼと、受容体タンパク質鎖の細胞質尾部との双方におけるチロシン残基のリン酸化をもたらす。これらのリン酸化イベントは、シグナル伝達に関与する他のタンパク質のための、また酵素作用の活性化のための相互作用部位をもたらすのに寄与している。チロシン残基からホスホ基を取り除くチロシンホスファターゼもまた活性化イベントと活性化の程度を調節することの双方に関与している。
【０２８９】
ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼは、上記の受容体が仲介する活性化に関与する最初のキナーゼ類を代表するものである。Ｔ細胞においてはｌｃｋ及びｆｙｎが主要な開始機能を有し、ＺＡＰ−７０等、他のチロシンキナーゼの活性化に寄与する。同様にＢ細胞ではｆｙｎ、ｂｌｋ及びｌｙｎが同様の機能を果たしてキナーゼＳｙｋを活性化する。Ｔ細胞受容体複合体（ＣＤ３）又はＢ細胞受容体複合体（Ｉｇα／Ｉｇβ）の受容体シグナル伝達鎖は、ＩＴＡＭｓ（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs；免疫受容体チロシンを基礎とする活性化モチーフ）と呼ばれる配列を有するチロシンにおいてチロシンリン酸化される。ＩＴＡＭは、ＹＸＸ[Ｌ/Ｖ]Ｘ7-11ＹＸＸ[Ｌ/Ｖ]という標準配列を有し、Ｙはチロシン、Ｌはロイシン、Ｖはバリンであり、Ｘはどのアミノ酸を示すものでもよい。これらのＩＴＡＭｓは、ＳＨ２ホスホ−チロシン結合ドメインを介して結合する他のシグナル伝達タンパク質において「ドッキング部位」として機能する。
【０２９０】
数種の異なるクラスのタンパク質が、上述の活性化受容体に動員される。ホスフォリパーゼｃγ（ＰＬＣγ）が動員され、活性化されてイノシトールトリホスファート（ＩＰ3）とジアシルグリセロール（ＤＡＧ）という２種類の主要シグナル伝達メディエーターが産生される。ＩＰ3によって、カルシウムイオン（Ｃａ++）が細胞内の貯蔵部分から細胞質へと放出され、その結果、膜におけるカルシウムチャネルが開き、より多くのＣａ++が細胞内へと流れ込む。核へのシグナル伝達に協働して重要な役割を果たし、遺伝子転写イベントを調節するカルモジュリン及びカルシノイリンを含む多数のカルシウム結合タンパク質が、カルシウム流入により活性化され、特に転写因子のＮＦＡＴファミリーメンバーが活性化される。ＤＡＧは、セリントレオニンキナーゼのプロテインキナーゼｃ（ＰＫＣ）ファミリーにおける種々のメンバー（そのいくつかはＣａ++によっても活性化される）の活性化に関与する。ＰＫＣは、種々のシグナル伝達カスケードにおいて別のタンパク質を多数リン酸化し、特に転写因子のＮＦκＢファミリーメンバーの活性化により、やはり核へのシグナル伝達を促進する。
【０２９１】
小ＧＴＰ結合タンパク質（“小Ｇタンパク質”）もまたチロシンキナーゼによって活性化される受容体からのシグナル伝達に関与している。最もよく知られているのがＲａｓである。
【０２９２】
上記小Ｇタンパク質Ｒａｓは、ＧＴＰに結合するか、或いはＧＤＰに結合するかという２種類の状態で存在している。ＲａｓのＧＴＰ結合型は、このタンパク質の活性型であり、ＧＤＰ結合型は不活型である。Ｒａｓ自体もＧＴＰａｓｅ活性をもっているため、リン酸を除去し、Ｒａｓを不活型に転化することができる。小Ｇタンパク質は通常、不活型で見い出され、その活性化にはＧＤＰのＧＴＰへの交換を促すグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）が必要である。リンパ球では、ＩＴＡＭｓに動員されたアダプタータンパク質によって、Ｒａｓ、及びＲａｃ等の他の小Ｇタンパク質が、活性化された受容体に動員される。ＧＥＦｓもまた上記アダプターに結合し、これらＧタンパク質の活性化に寄与する。
【０２９３】
リンパ球シグナル伝達に関与するアダプタータンパク質としては多数列挙できる。Ｔ細胞に関して主要な２例がＬＡＴ及びＳｌｐ−７６である。チロシンリン酸化によって活性化されるＬＡＴは、膜の脂質ラフトに局在し、Ｇｒｂ２、ＳＯＳ、Ｒａｓ等の多数かつ種々のアダプター・シグナル伝達分子に直接又は間接に結合する。Ｂ細胞においてはＢＬＮＫが同様のアダプター機能を有する。やはりＧタンパク質活性をもち、Ｖａｖと呼ばれる別のアダプタータンパク質はＢ細胞シグナル伝達において重要な役割を担っている。
【０２９４】
Ｒａｓ等の活性化Ｇタンパク質は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼカスケード（ＭＡＰキナーゼ経路）として知られるタンパク質キナーゼカスケード数種の活性化に関与している。これらのカスケードは種々の転写因子のリン酸化及び活性化をもたらし、その結果、シグナルを送達して核内における遺伝子発現イベントを導く。例えば、ｆｏｓ及びｊｕｎのメンバーのヘテロダイマーである転写因子のＡＰ−１ファミリーは、上記ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の重要な標的である。
【０２９５】
ＭＡＰキナーゼシグナル伝達カスケードは、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）と呼ばれるカスケード上の１番目のキナーゼにおける作用を介して活性化された小Ｇタンパク質によって活性化されると一般的に説明される。同様にして次にＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）がリン酸化及び活性化され、次いで単一アミノ酸によって分離したチロシンとトレオニンの２つの部位で作用が生じ、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）タンパク質がリン酸化及び活性化される。２部位でリン酸化したＭＡＰＫはいずれも酵素的に活性となり、核への移行が可能となり、核において転写因子をリン酸化する。これまでに３種類の主要ＭＡＰキナーゼカスケードが定義されており、それらは全てリンパ球において活性であり、ＭＡＰキナーゼであるＥｒｋ（特にリンパ球におけるＥｒｋ１及びＥｒｋ２）、ｐ３８及びＪｎｋ（特にリンパ球におけるＪＮＫ１及びＪＮＫ２）の活性化をもたらす。Ｅｒｋ１及びＥｒｋ２のアクチベーターはＭｅｋ１及びＭｅｋ２と呼ばれる。
【０２９６】
種々の共受容体は、抗原−受容体に仲介されるリンパ球活性化の増強や調節に役割を担っている。Ｔ細胞においてはＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ４５、Ｂ細胞においてはＣＤ１９、ＣＤ２１及びＣＤ８１が例示される。またさらに、共刺激分子もまた免疫シグナル伝達の増強や修飾に機能を果たす。例えばＣＤ２８、ＣＤ４０、ＯＸ４０などは、細胞応答性の質及び量の両方を測定する上で役立つキーシグナルを生じさせることができる。これらの分子はまた、リンパ球抗原受容体／共受容体複合体から拡散するシグナルによって統合されるシグナル伝達経路を活性化し、小Ｇタンパク質仲介カスケードだけでなくチロシン／トレオニンキナーゼ及びセリン／トレオニンキナーゼを有する。
【０２９７】
種々のサイトカイン（例：ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮｇ、ＩＬ−１５等）もまたリンパ球の応答性を調節する上で重要な役割を担っている。これらのサイトカインに対する受容体は、他の経路の中でもJanusキナーゼ（ＪＡＫＳ）と呼ばれ、受容体によって活性化されるキナーゼを含むシグナル伝達経路を用いる。ＪＡＫＳには、ＪＡＫ１、２、３及びＴｙｋ２が含まれる。これらは、シグナルトランスデューサー・転写アクチベーター（ＳＴＡＴＳ）と呼ばれるタンパク質ファミリーをリン酸化する。かかるリン酸化により、ＳＴＡＴＳのホモダイマー化及びへテロダイマー化が、ＳＴＡＴホスフォチロシンモチーフに結合するＳＴＡＴＳ自身のＳＨ２ドメインによって促進される。上記ダイマーはその後核へと移行し、核において種々のサイトカイン反応性遺伝子を活性化する。かかる活性化経路はＳＯＣＳタンパク質（例；ＳＯＣＳ１、２及び３）と呼ばれる阻害タンパク質集団によって調節される。種々のサイトカインが種々のＳＴＡＴＳを活性化する。例えば、ＩＬ−４受容体はＳＴＡＴ６を活性化し、ＳＴＡＴ６はＣＤ２３等のＩＬ−４反応性遺伝子を活性化する機能をもつ。ＩＬ−１２は、ＩＦＮγ遺伝子発現を調節する役割を有するＳＴＡＴ４を活性化する。
【０２９８】
種々のシグナルの統合及びそれらの相対的強度が、転写反応の特徴、遺伝子／タンパク質発現プロフィール、キネティックスを決定し、また、それらが細胞における反応性の全体としての特長を決定する。例えばＴ細胞では、上記統合及び強度が、エフェクターＴ細胞及び記憶Ｔ細胞の反応発生、種々のサイトカインプロフィールや他のエフェクター機能に影響し、或いは不応答性又はアネルギー状態にＴ細胞を誘導する。別型のＴ細胞もまた、それらの異なる潜在反応状態に対して異なる量的及び質的要件を示す。
【０２９９】
ＡＰＣｓにおいては異なる受容体が、ＡＰＣの活性化及び機能を調節するシグナルを伝達することもできる。例えば病理材料に結合させたＦｃ受容体、スカベンジャー受容体及びトール様受容体（ＴＬＲｓ）は、リンパ球が病原体を排除するために最有効な反応を示せるように、リンパ球に正しいシグナルを伝達することを促す反応をＡＰＣに誘導するシグナルを発生させることができる。この点に関してはＴＬＲｓが特に重要である。ＴＬＲｓ（例；ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３など）は、異なる分子集団（病原体由来のことが多い。例；ＬＰＳ、ウイルス性ＲＮＡ、ＣｐＧモチーフ）が結合することにより活性化される。その結果、ＭｙＤ８８と呼ばれるアダプタータンパク質がＴＬＲの細胞質尾部に結合し、さらにその結果、キナーゼカスケードの活性化がもたらされ、転写因子（特にＮＦκＢファミリー）の活性化に至る。然る後に上記の現象は、リンパ球、特にＴ細胞（例；Ｂ７ファミリーの表面タンパク質、ＩＬ−１２等のサイトカインなど）の活性化と分化を促進する分子をコードする遺伝子の発現調節機能を示す。
【０３００】
アッセイ
１若しくは２以上の標的遺伝子の発現を観察するアッセイ、及びノッチシグナル伝達における調節を検出する他の方法について以下に述べる。
【０３０１】
本発明は、化合物のノッチシグナル伝達調節能を調べるスクリーニングに用いるセルベースアッセイ（cell-based assay）を提供することを好ましくする。一実施態様において本発明は、以下の工程からなるアッセイを提供する。
（ａ）免疫細胞培養物を提供し；
（ｂ）上記細胞に任意にレポーター構築物をトランスフェクトし；
（ｃ）上記細胞に任意にノッチ遺伝子をトランスフェクトし；
（ｄ）上記細胞を１若しくは２以上の試験化合物に暴露し；及び
（ｅ）試験化合物に暴露した細胞と、未暴露の細胞におけるノッチシグナル伝達の違いを測定する。
【０３０２】
本発明のアッセイは、免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達に対する候補調節因子による阻害又は増強のいずれかを検出するように設定されている。その方法は、必要に応じて合成レポーター遺伝子で形質転換やトランスフェクションなどを行った免疫系細胞を、適切な緩衝液中で十分量の候補調節因子と混合し、ノッチシグナル伝達を観察するというものである。調節因子としては、小分子、タンパク質、抗体、又は上述したように他のリガンドでもよい。標準的なアッセイ技術及び適切な対照を用いることにより、標的遺伝子（これについても上述した）の活性量を各試験化合物について測定する。検出したシグナルを基準シグナルと比較し、基準シグナルからみて何らかの調節が生じていればそれを測定することが好ましい。
【０３０３】
本アッセイは、ノッチシグナルを救済する能力をもつ化合物を同定するため、ノッチシグナル伝達経路における既知のアンタゴニストの存在下において実施してもよい。
【０３０４】
種々多様な薬剤スクリーニング法のいずれかを用いて、免疫系細胞におけるノッチシグナル伝達経路の調節能を有する化合物を同定する際に、好適標的（アミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列など）の１若しくは２以上を使用してよい。そのような試験に供する標的は、溶液中で遊離の状態、固体支持体に固定させた状態、細胞表面に担持されている状態、又は細胞内に局在する状態のいずれであってもよい。本発明のアッセイは、セルベースアッセイである。
【０３０５】
本発明のアッセイは、多数の作用因子を試験するスクリーニング法である。特徴の１つとして、本発明のアッセイ法は、ハイスループットスクリーニングである。
【０３０６】
薬剤のスクリーニング法は、Geysen（欧州特許第０１３８８５５号、１９８４年９月１３日発行）に記載の方法に基づいたものでもよい。概略を述べると、多数の異なる小ペプチド候補調節因子を、プラスチックピン又は他の物の表面などの固体基質上で合成する。これらのペプチド試験化合物を好適な標的又はその断片と反応させ、洗浄する。その後、当技術分野で公知の方法を適切に実施するなどして、結合した物質を検出する。精製した標的もまた、プレートに直接コーティングして薬剤スクリーニング法に用いることができる。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ；高処理能力スクリーニング）に用いるプレートは、マルチウエルプレートであり、１プレートあたり９６個、３８４個、若しくは３８４個を超えるウエルがあることが好ましい。細胞は「ローン（lawn）」として播種できる。或いは、非中和抗体を使用してペプチドを捕捉し、固体支持体上に固定することができる。合成化合物のスクリーニングに用いる上述のハイスループットスクリーニングはまた、有機候補調節因子の同定にも用いることができる。
【０３０７】
本発明はまた、標的への結合能を有する中和抗体が標的に特異的に結合する際に、かかる結合に関して試験化合物と競合するという競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用も意図するものである。
【０３０８】
本発明によるアッセイ方法は定量アッセイにおけると同様に、試験化合物の小規模及び大規模いずれのスクリーニングにも適していると期待される。
【０３０９】
種々の核酸アッセイもまた知られている。公知の、又は後に開示されている従来法であればどれを採用してもよい。好適な核酸アッセイとしては以下に説明する増幅法、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクション法、ブロット法、分光分析、レポーター遺伝子アッセイ、遺伝子チップアレイ法、またこれら以外のハイブリダイゼーション法などが列挙される。
【０３１０】
標的遺伝子の存在、増幅、及び／又は発現は、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来式サザンブロッティング、標的ｍＲＮＡの転写量を測定するノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はインサイチューハイブリダイゼーションにより試料から直接測定される。当技術分野の専門家であれば、所望する場合、これらの方法に如何なる変更を加えればよいかを容易に構想できる。
【０３１１】
分析を行うために試料から核酸を作製するには、通常核酸増幅を行うことが必要となる。多くの増幅法が、酵素鎖反応（ポリメラーゼ鎖反応、リガーゼ鎖反応、又は自己維持的配列複製）、又はベクター自身がクローニングされたベクターの全体又は部分の複製に依存している。本発明における増幅法は、ポリメラーゼ鎖反応に例示される指数関数的増幅であることが好ましい。
【０３１２】
多くの標的及びシグナル増幅法が文献に記載されており、例えば、Landegren, U., et al., Science 242: 229-237 (1988) 及びLewis, R., Genetic Engineering News 10: 1, 54-55 (1990) に、それらの方法についての概説が見い出せる。これらの増幅法を本発明の方法に用いてもよく、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、インサイチューでのＰＣＲ、リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ；ligase amplification reaction）、リガーゼハイブリダイゼーション、Qbetaバクテリオファージレプリカーゼ法、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ；transcription-based amplification system）、転写産物配列決定によるゲノム増幅（ＧＡＷＴＳ；genomic amplification with transcript sequencing）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ；nucleic acid sequence-based amplification）、インサイチューでのハイブリダイゼーションが含まれる。種々の増幅法に用いるのに適したプライマーは、当技術分野で公知の方法により調製できる。
【０３１３】
ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼが創出するプライマー伸張反応の反復サイクルからなり、特に米国特許第４６８３１９５号及び同４６８３２０２号で説明されている核酸増幅法である。ＰＣＲは元々、不純試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。この技術は反応液を繰り返し熱したり冷却したりの温度サイクルを基礎とし、それによりプライマーを標的配列にアニーリングさせ、これらプライマーを伸張することにより、娘鎖の複製を形成するものである。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素を用いて第１鎖ｃＤＮＡを作製する際にＲＮＡ鋳型を使用する。次にこのｃＤＮＡを標準的なＰＣＲプロトコールに則って増幅する。合成と変性のサイクルを反復して行うことにより、作製する標的ＤＮＡの複製数が指数関数的に増加する。しかし反応成分が限られてくるに従って増幅速度が低下し、やがて停滞期に達し、ＰＣＲ産物における純増加は殆ど或いは全く認められなくなる。反応開始時点における核酸標的の複製数が多いほど、かかる「終点」に早く到達する。ＰＣＲは、診断分野において、あらゆる既知の核酸の増幅に用いることができる（Mok et al., (1994), Gynaecologic Oncology, 52: 247-252）。
【０３１４】
自己維持的配列複製（３ＳＲ）はＴＡＳの変化型であり、酵素カクテル及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーに促進されて逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼ及びヌクレアーゼの各活性が連続的に繰り返し展開する核酸鋳型の等温下での増幅が含まれる（Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874）。ＲＮＡ／ＤＮＡの異種２本鎖におけるＲＮＡの酵素分解を熱変性の代わりに利用する。RNnase H及び他の全酵素を反応に加え、全工程が単一温度の下で行われ、さらに試薬を加えることもしない。この方法に従えば、４２℃１時間で１０6〜１０9の増幅が行われる。
【０３１５】
ライゲーション（連結）増幅反応又はライゲーション増幅系では、ＤＮＡリガーゼ及びオリゴヌクレオチド４個（標的鎖について２個ずつ）を用いる。この技術に関しては、Wu, D. Y. and Wallace, R. B. (1989) Genomics 4: 560 に記載がある。上記４個のオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ上の隣接配列とハイブリダイズしリガーゼによって結合する。この反応は、熱変性及びサイクル反復によって行われる。
【０３１６】
本発明では、他の増幅技術も利用する。例えば、ローリングサークル増幅法（Lizardi et al., (1998) Nat Genet 19: 225）は市販の増幅技術（ＲＣＡＴTM）であり、ＤＮＡポリメラーゼによって実行され、線状又は幾何学状キネティックスのいずれかを有する環状オリゴヌクレオチドプローブを等温条件下で複製できる。
【０３１７】
好適に設計されたプライマー２本の存在下においてＤＮＡ鎖置換及び大量分枝化（hyperbranching）によって幾何学的増幅が生じ、１時間で各環の複製を１０12以上作製する。
【０３１８】
１本のプライマーを使用する場合、ＲＣＡＴでは、標的に共有結合して何千個もがタンデムに結合する、該標的のＤＮＡ複製の線状鎖が数分間のうちに作製される。
【０３１９】
さらに、鎖置換増幅法（ＳＤＡ；strand displacement amplification、Walker et al., (1992) PNAS (USA) 80: 392）という技術は、特定標的に独特な、特異的に定義された配列から開始する。しかし温度サイクルに依拠する他の方法と異なり、ＳＤＡは、一連のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び制限酵素を使用することにより、上述の独特な核酸配列を指数関数的に増幅させる等温法である。
【０３２０】
ＳＤＡは、標的作製期と指数関数的増幅期の両方を有する。
【０３２１】
標的作製においては、２本鎖ＤＮＡを熱変性させて１本鎖の複製を２本得る。特別に作出した一連のプライマー（塩基配列を複製する増幅プライマー及び新たに作成した鎖を置換するバンパープライマー）がＤＮＡポリメラーゼと結び付くことにより、指数関数的増幅が可能な改変型標的が形成される。
【０３２２】
指数関数的増幅の過程は、標的作製期から改変型標的（制限酵素認識部位を有する１本鎖部分ＤＮＡ鎖）により開始する。
【０３２３】
増幅プライマーは、その相補ＤＮＡ配列において各鎖に結合する。次にＤＮＡポリメラーゼは、改変型標的を個々のヌクレオチドを付加するための鋳型として使用し、プライマーをその３´側から伸張させる位置を決める。従って伸張したプライマーは、両末端に完全な制限酵素認識部位を有する２本鎖ＤＮＡセグメントを形成する。
【０３２４】
次に、制限酵素を上記２本鎖ＤＮＡセグメントに、その制限酵素認識部位で結合させる。制限酵素は、上記２重鎖（double-sided）セグメントの一方の鎖だけを開裂してニックを形成した後に上記認識部位から解離する。ＤＮＡポリメラーゼはニックを認識してその部位から鎖を伸張し、既に作製済の鎖を置換する。認識部位はこのように繰り返しニックされ、制限酵素とＤＮＡポリメラーゼとにより標的セグメントを有するＤＮＡ鎖を繰り返し置換しながら修復される。
【０３２５】
次に、置換された各鎖は、上述のように増幅プライマーとのアニーリングに供される。このプロセスは新しいＤＮＡ鎖においてニック形成、伸張及び置換を繰り返しながら連続し、その結果、元のＤＮＡ標的が指数関数的に増幅される。
【０３２６】
別の実施態様で本発明は、ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の検出法を提供する。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する一般的なアッセイフォーマットには、核ラン−オン（run-on）アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（Melton et al., Nuc. Acids Res. 12: 7035）が含まれる。採用可能な検出法には、放射活性標識、酵素標識、化学発光（ケミルミネセンス）標識、蛍光標識、また他の適切な標識法が含まれる。
【０３２７】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグ又は蛍光染色で標識したプローブを使用し、サイクルを規定回数行った後の産物蓄積量の測定というよりむしろ蓄積していくＰＣＲ産物の検出に用いられるという点で、定量アッセイに用いる終点ＰＣＲとは異なる。蛍光が有意な増加を示すことに基づいて標的配列の増幅が最初に検出されたのが、サイクル中のどの時点であるかによって反応が特徴付けられる。
【０３２８】
リボ核酸プロテクション（ＲＮａｓｅプロテクション）アッセイは、溶液中の特異的ＲＮＡの定量法として非常に高感度な方法である。リボ核酸プロテクションアッセイは、標的としての全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）選択性ｍＲＮＡで行うことができる。リボ核酸プロテクションアッセイの感度は、高度に特異的な活性に対して放射標識された相補的インビトロ転写プローブを使用することに基づいている。かかるプローブと標的ＲＮＡを溶液中でハイブリダイズさせた後、この混合物をリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で希釈し、処理し、残存する１本鎖ＲＮＡを全て分解する。プローブのハイブリダイズした部分は分解から保護され、上記混合物を、変性ポリアクリルアミドゲル上における電気泳動後さらにオートラジオグラフィーにかけることにより、ハイブリダイズした部分を視覚化できる。保護された断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるので、リボ核酸プロテクションアッセイはｍＲＮＡの特性を正確にマッピングするために採用できる。標的ＲＮＡに対して過剰なモル下でプローブがハイブリダイズされる場合、得られるシグナルは試料中の相補ＲＮＡ量と正比例する。
【０３２９】
例えば、Sambrook et al., 1989 の第１４章に記載されているように、ＰＣＲ技術では、標的核酸配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用することが必要とされる。オリゴヌクレオチドを選択するストラテジーについて以下に記載する。
【０３３０】
本明細書においてプローブは、例えば、１０〜５０個、好ましくは１５〜３０個、最も好ましくは少なくとも２０個ほどで、均等物と同一の（又は相補の）連続塩基又はそれより多くの連続塩基を含むヌクレオチド配列を有する１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。プローブとして選択される核酸配列は、擬陽性の結果が出ることを最小限にするために十分な長さを有し、十分に明瞭でなければならない。ヌクレオチド配列は通常、保存された又は高度な相同性を有するヌクレオチド配列又はポリペプチド領域に基づいている。プローブとして用いる核酸は、１若しくは２以上の位置において変性していてもよい。
【０３３１】
プローブを構築する領域として好ましいものには、５´及び／又は３´コード配列、リガンド結合部位をコードすることが予測される配列などが含まれる。例えば、本発明で開示している完全長ｃＤＮＡクローンやその断片のいずれもプローブとして使用できる。本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーション後に容易に検出できるように適切な標識手段により標識されていることが好ましい。例えば適切な標識手段としては放射標識がある。ＤＮＡ断片を標識する好適な方法は、当技術分野では十分公知のように、ランダムプライム反応においてＤＮＡポリメラーゼのKlenow断片とともに32Ｐ ｄＡＴＰを取り込むことによる方法である。通常オリゴヌクレオチドは、32Ｐ標識ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼで末端標識されている。しかし、断片又はオリゴヌクレオチドの標識には他の方法（例；非放射標識）も用いられ、酵素標識、適切な蛍光体による蛍光標識、ビオチン化がそれに含まれる。
【０３３２】
好ましいのは、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列やプローブである。
【０３３３】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリッドが安定を保つことができる条件のことを指す。かかる条件は当技術分野の専門家には自明である。当技術分野の専門家には明らかなように、ハイブリッドの安定性は、そのハイブリッドの融点（Ｔｍ）に反映され、配列相同性が１％低下する毎に融点が約１〜１．５℃低下する。一般的にハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度と温度との関係で決まる。通常はさらに高度なストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーション反応を行い、その後、種々のストリンジェンシー条件下で洗浄を行う。
【０３３４】
ここに用いる高度なストリンジェンシーとは、６５〜６８℃下で１ＭのＮａ+において安定ハイブリッドを形成する核酸配列だけがハイブリダイゼーションできる条件のことである。高度なストリンジェンシー条件は、例えば６×ＳＳＣ、５×Denhardt's、１％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）、０．１Ｎａ+ピロリン酸及び非特異的コンペティターとして変性鮭精子ＤＮＡ０．１ｍｇ／ｍｌを含む水性溶液におけるハイブリダイゼーションによって得られる。ハイブリダイゼーション後、高度なストリンジェンシーにおける洗浄を数段階にわけて行い、最終洗浄（約３０分間）は０．２−０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション温度で行う。
【０３３５】
上記の条件は、種々の緩衝液（例；ホルムアミドを基剤とする緩衝液）及び温度を用いて採用し、繰り返し行うものであると理解される。Denhardt's溶液及びＳＳＣは、他の好適ハイブリダイゼーション緩衝液と同様に当業者には広く知られている（Sambrook, et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York or Ausubel, et al., eds. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.を参照）。ハイブリダイズするペアの長さやＧＣ含有量もまた影響するので、最適なハイブリダイゼーション条件は実験的に決定しなければならない。
【０３３６】
遺伝子発現はレポーター系を使用して検出してもよい。かかるレポーター系には、発現系（例えば観察を行っている遺伝子の発現系）の制御下にあって容易に同定できるマーカーが含まれる。ＦＡＣＳによる検出及びソーティングが可能な蛍光マーカーが好ましい。特に好ましいのはＧＦＰとルシフェラーゼである。好ましいレポーターとしては他にも細胞表面マーカー、すなわち細胞表面で発現するので容易に同定できるタンパク質がある。従ってセルベーススクリーニングアッセイは、レポータータンパク質（すなわちβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）又はルシフェラーゼなどの容易にアッセイ可能なタンパク質）の発現がノッチ活性に依存する細胞株を構築することにより設計できる。例えば、上記各種ポリペプチドのいずれか１つをコードするレポーター遺伝子を、ノッチシグナル伝達により特異的に活性化される応答エレメントの制御下に置いてもよい。これ以外のアッセイフォーマットには、生物系における反応を直接評価するアッセイが含まれる。セルベースアッセイを採用する場合は、同定した試験化合物（１若しくは２以上）をさらにインビボで試験して、ノッチシグナル伝達経路に及ぼすその効果を測定する。
【０３３７】
一般的に、レポーター遺伝子を発現させてノッチシグナル伝達を測定する上で有用なレポーター構築物は、Sambrook et al (1989) の一般的教示に従って構築してよい。本発明における構築物は通常、目的とする遺伝子の（すなわち内因性標的遺伝子の）プロモーター、並びにＧＦＰやルシフェラーゼなどの所望のレポーター構築物をコードするコーディング配列を有している。ＧＦＰ及びルシフェラーゼをコードするベクターは当技術分野では公知であり市販もされている。レポーター遺伝子については以下に詳述する。
【０３３８】
標的遺伝子の発現を検出することによる細胞ソーティングは、当技術分野で公知の上記いずれの手法で実施してもよい。例えば細胞をフローサイトメトリーすなわちＦＡＣＳでソーティングしてもよい。全般的な内容に関しては、Flow Cytometry and Cell Sorting: A Laboratory Manual (1992) A. Radbruch (Ed.), Springer Laboratory, New York を参照のこと。
【０３３９】
フローサイトメトリーは、細胞の研究及び精製において強力な手法である。フローサイトメトリーは広範に、特に免疫学や細胞生物学の分野において利用されているが、ＦＡＣＳの能力は、生物学の他の多くの分野において利用できる。頭文字のＦ．Ａ．Ｃ．Ｓ．は、Fluorescence Activated Cell Sorting を表し、「フローサイトメトリー」と互換性のある用語である。ＦＡＣＳの原理は、液体の細い流れに保持された個別の細胞を１若しくは２以上のレーザービームに通すことにより光を散乱させ、種々の頻度で蛍光染色を発光させるというものである。光電子増倍管（ＰＭＴ）は光を電子シグナルに転換し、この電子シグナルをソフトウエアで解析して細胞のデータを作成する。定義付けされた特徴を有する細胞サブ集団が同定され、極めて高純度（〜１００％）にて懸濁液から自動的にソーティングされる。
【０３４０】
ＦＡＣＳは、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡをトランスフェクトした細胞における標的遺伝子の発現を測定するのに用いられる。これは、かかるタンパク質産物を標識することにより直接、或いは構築物中のレポーター遺伝子を使用して間接的に行うことができる。レポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼやグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が例示される。β−ガラクトシダーゼの活性は、フルオレセインジガラクトシダーゼ（ＦＤＧ）等の蛍光基質を用いるＦＡＣＳによる検出が可能である。ＦＤＧは、低張性ショックを与えることによって細胞内に導入され、酵素によって開裂して蛍光産物を作り出す。この蛍光産物は細胞内に留め置かれる。従って１種の酵素で大量の蛍光産物を産出できるのである。ＧＦＰ構築物を発現する細胞は、基質を加えることなく蛍光発色する。励起頻度が異なっても同一チャネルで蛍光発色するＧＦＰ変異体は利用可能である。Two-laserＦＡＣＳ機器では、異なるレーザー光線によって励起される細胞の識別が可能であり、よってトランスフェクション２種類のアッセイを同時に行うことができる。
【０３４１】
別のセルソーティング法を利用してもよい。例えば、本発明には、ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブの使用も含まれる。かかるプローブは、別々にポリペプチドを発現する細胞を同定することに用いられ、それらの細胞はその後マニュアルソーティング法又はＦＡＣＳソーティング法によりソーティングされる。ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブは、Sambrook et al (1989) の一般的なプロトコールを用いる上述の教示に従って調製する。
【０３４２】
好適実施態様において本発明には、ＦＡＣＳセルソーティング法で用いる蛍光体に結合させ、標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子の使用も含まれる。
【０３４３】
所謂遺伝子チップアレイや高密度ＤＮＡアレイを使用して、遺伝子の発現や同一性に関する情報を得る各種方法についての記載もある（Chee）。これらの高密度アレイは、診断及び予防の目的で特に有用である。In Vivo Expression Technology（ＩＶＥＴ）（Camilli）も使用してもよい。ＩＶＥＴでは、例えば治療や疾患の過程において実験培養の場合と比較してアップレギュレートされた標的遺伝子を同定する。
【０３４４】
本発明はまた、ポリペプチドの検出法を提供するものである。プロテインアッセイ（タンパク質測定法）を使用することの利点は、ノッチの活性を直接測定できることである。ポリペプチドレベルを測定するために利用可能なアッセイ技術は、当技術分野の専門家には十分公知である。そのようなアッセイ法には、放射免疫測定法、競合結合測定法、タンパク質ゲル測定法、ウエスタンブロット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出法、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡが含まれる。例えばポリペプチドは、タンパク質ゲル上における微分型電気移動度から、或いは質量分光法等の他のサイズ分析法により検出できる。検出法は配列特異的であってよい。例えば、ポリペプチドを特異的に認識するポリペプチド又はＲＮＡ分子をインビボ又はインビトロで開発することができる。
【０３４５】
例えばＳＥＬＥＸによりＲＮＡアプタマーを作製できる。ＳＥＬＥＸは、標的分子への高度に特異的な結合性を有する核酸分子をインビトロで進化させる方法である。この方法については例えば、米国特許第５６５４１５１号、同５５０３９７８号、同５５６７５８８号、同５２７０１６３号、またＰＣＴ公報ＷＯ９６／３８５７９号に記載されている。
【０３４６】
本発明はいくつかの実施態様において、ポリペプチドを特異的に認識して結合する抗体を含む。
【０３４７】
抗体は免疫した動物の血清から回収できる。モノクローナル抗体は従来法に従い、免疫化動物の細胞から調製してよい。
【０３４８】
本発明の抗体は、観察対象の遺伝子を発現させる細胞を同定するのに有用である。
【０３４９】
本発明による抗体は、ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体等の天然型に分類される全抗体でよいが、ＩｇＧ抗体が好ましい。さらに本発明には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ等の抗体断片が含まれる。Ｆｖ及びＳｃＦｖ等の小断片は、そのサイズの小ささ故に組織における分布性に優れており、診断及び治療への適用に好都合である。
【０３５０】
抗体は標識を含んでいてもよい。特に好適なのは、インビボの神経細胞における抗体の画像化を可能にする標識である。このような標識としては、組織内で容易に視覚化できる放射活性標識又は金属粒子等の放射オペーク（redioopaque）標識を採用してよい。さらに蛍光標識や、組織内における視覚化が可能でセルソーティングに用いられる他の標識でもよい。
【０３５１】
より詳細に述べると、本発明に用いる抗体は標識等のエフェクタータンパク質を含む改変抗体であってもよい。特に好適なのは、インビボでの抗体分布を画像化できる標識である。かかる標識としては、患者の体内で容易に視覚化できる放射活性標識又は金属粒子等の放射オペーク標識がある。さらに蛍光標識や、組織上での視覚化が可能な他の標識でもよい。
【０３５２】
本明細書記載の抗体は、細胞培養から作製することができる。細菌培養や好ましくは哺乳類細胞培養による抗体の作製には、確立した手法に基づいた組換えＤＮＡ技術が利用できる。抗体産物は非分泌細胞から単離できるが、選択した細胞培養系は任意に抗体産物を分泌する。
【０３５３】
ハイブリドーマ細胞又は哺乳類宿主細胞のインビトロでの増殖は、好適な培養培地で行う。かかる培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＲＰＭＩ１６４０培地を例とする通常の標準培養培地であり、それらは哺乳類血清（例えばウシ胎児血清）又は微量元素及び増殖維持補助剤（例えば、正常マウス腹膜滲出細胞等の支持細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸など）を任意に補充されている。細菌細胞や酵母細胞である宿主細胞の増殖も同様に当技術分野で公知の好適培養培地で行われる。細菌の場合は、ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、Terrific Broth、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴ、又はＭ９最小培地等の培地が例示され、酵母の場合は、ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地、又は完全最小Dropout培地等の培地が例示される。
【０３５４】
インビトロで作製すると、比較的純粋な抗体調製物が得られ、所望の抗体を大量に得るためのスケールアップが可能となる。細菌細胞、酵母又は哺乳類細胞の培養技術は当技術分野では公知であり、均一浮遊培養（例；エアリフトリアクター又は連続攪拌リアクターにおいて）、或いは固定化又は封込み（entrapped）細胞培養（例；中空糸やマイクロカプセル中で、アガロースマイクロビーズやセラミックカートリッジ上で）などがある。
【０３５５】
哺乳類細胞をインビボで増殖させることによっても所望の抗体を大量に得ることができる。そのために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳動物に注入して抗体産生腫瘍の増殖を惹起する。この注入に先立ち、任意でこれらの動物を炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）等の鉱物油で初回免疫（プライム）してもよい。１〜３週間後に上記哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、好適骨髄腫細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの抗体産生脾臓細胞と融合させて得たハイブリドーマ細胞、又は所望の抗体を産生するハイブリドーマＳｐ２／０細胞株由来のトランスフェクト細胞を、プリスタンで任意に前処理したＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、１〜２週間後にそれらの動物から腹水を回収する。
【０３５６】
前述の、或いは他の方法について、例えばKohler and Milstein, (1975) Nature 256: 495-497; 米国特許第４３７６１１０号; Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor で検討されており、それらを参考文献として本明細書に添付する。組換え抗体分子の調製法は上記参考文献に収載されており、また例えば、欧州特許第０６２３６７９号、同０３６８６８４号、同０４３６５９７号にも記載があり、これらも本明細書に添付する。
【０３５７】
細胞培養上清を、好ましくは、例えばサンドイッチアッセイ又はドットアッセイ等の酵素免疫測定法、或いは放射免疫測定法によってスクリーニングし、所望の抗体を得る。
【０３５８】
抗体を単離するには、培養上清中又は腹水中の免疫グロブリンを、例えば硫酸アンモニウムと共沈させたり、ポリエチレングリコール等の吸湿性材料に対して透析したり、選択性膜で濾過したりなどして濃縮する。必要に応じて、及び／又は所望する場合には、例えばゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー、及び／又は標的抗原やプロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィー等の（免疫）アフィニティークロマトグラフィーなどの通常のクロマトグラフィー法により抗体を精製する。
【０３５９】
抗体は、抗体の検出法と共に提供されることが好ましく、かかる方法としては酵素法、蛍光法、放射性同位体法や他の手法が可能である。抗体及びその検出法は、同時に、同時かつ別々に、又は連続して用いるようなキットとして提供できる。
【０３６０】
当技術分野で公知のいずれかの手法により、本発明における抗体の免疫特異的結合性のアッセイを行う。採用される免疫測定法には、ウエスタンブロッティング、放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、免疫沈降測定法、沈降反応法、ゲル分散沈降反応、免疫分散測定法、凝集測定法、補体固定測定法、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法等の技術を用いる競合的及び非競合的アッセイ系を含むが、これらに限定はされない。これらのアッセイは当技術分野ではルーティンである（本明細書にその全容を添付したAusubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York を例として参照）。免疫測定法の典型例を簡潔に下述する。
【０３６１】
免疫沈降プロトコールは通常以下の工程で行われる。すなわち、プロテインホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（例；ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を加えたＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０又はTritonＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％トラジロール（Trasylol））等の溶解緩衝液に細胞集団を溶解し、この細胞溶解液に目的抗体を加え、一定時間（例えば１〜４時間）４℃でインキュベーションし、プロテインＡ及び／又はプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解液に加え、およそ１時間強４℃でインキュベーションし、これらビーズを溶解緩衝液中で洗浄してＳＤＳ／試料緩衝液に再懸濁することからなる工程である。目的抗体が、特定抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウエスタンブロット分析により評価できる。
【０３６２】
ウエスタンブロット分析は通常以下の工程で行われる。すなわち、タンパク質試料を調製し、ポリアクリルアミドゲル（例；抗原の分子量に応じて８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において上記タンパク質試料を電気泳動に付し、これらタンパク質試料をポリアクリルアミドゲルから、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ又はナイロン等の膜上に移し、その膜を、ブロッキング溶液（例；３％ＢＳＡ又は無脂肪乳を添加したＰＢＳ）中でブロックし、洗浄緩衝液（例；ＰＢＳ−Tween２０）で洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（目的抗体）に暴露し、洗浄緩衝液で洗浄し、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質（例；ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）や放射活性分子（例；32Ｐ又は125Ｉ）で標識した二次抗体（例えば抗ヒト抗体などの一次抗体を認識するもの）に露出し、洗浄緩衝液で洗浄した後に抗原の存在を検出することからなる工程である。
【０３６３】
ＥＬＩＳＡは通常、抗原を調製し、この抗原で９６ウエルマイクロタイタープレートのウエルをコーティングし、酵素基質（例；ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）等の検出可能な化合物で標識した目的抗体をウエルに加え、一定時間インキュベーションし、抗原の存在を検出する工程からなる方法である。ＥＬＩＳＡでは、目的抗体は必ずしも検出可能な化合物と共役していなくてもよく、代わりに二次抗体（目的抗体を認識するもの）を検出可能な化合物と共役させてウエルに加えることができる。さらに抗原でウエルをコーティングする代わりに、抗体をウエルにコーティングしてもよい。この場合、コーティング済みのウエルに目的抗原を加えた後に、検出可能な化合物と共役させた二次抗体を加えることができる。
【０３６４】
アッセイを行う際に１若しくは２以上の反応物質を固定化しておくことが好都合である。本発明の場合は、候補調節因子、ノッチリガンド、免疫細胞活性化因子、又は免疫細胞共刺激因子（costimulus）のいずれか１若しくは２以上を固定化することが好都合である。固定化する手法には、アミン結合、表面チオール結合、リガンドチオール結合、アルデヒド結合等を用いる共有固定化、或いは固定化した捕捉分子に対するリガンドの高親和結合力に依拠する高親和性捕捉化が含まれる。捕捉分子としては、ストレプトアビジン、抗マウスＩｇ抗体、リガンド特異的抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、タグ特異的捕捉剤が列挙される。一実施態様においては支持体、とりわけビーズ状であることを好ましくする特定の支持体に結合させることにより固定化を図っている。
【０３６５】
臨床適用するための寛容Ｔ細胞の観察又は検出に関係するアッセイでは、細胞内ドメインの開裂により発生するシグナルの検出工程に先立って試料を患者から取り出すことが一般に行われている。
【０３６６】
本発明さらに、ノッチシグナル伝達の候補調節因子を得るためのスクリーニング方法を提供する。この方法は、その開裂を観察するために検出手段で好適に標識された適量のノッチを緩衝液中で候補リガンドの試料と混合し、ノッチにみられる開裂を観察するものである。
【０３６７】
ここに用いる「試料」なる用語は、天然に見い出された（例；生物標本又は他の標本から）、或いは人工的に構築された（実験室で見い出された及び／又は作製された因子）集団における、無機分子、有機分子又は生化学分子を指す。生物試料は生物全体を意味すると捉えてもよいが、より一般的な概念としては、その生物の組織、細胞又は構成部分（例；血液、粘液、唾液、尿を含むがそれらに限定はされない体液）のサブセットを意味する。
【０３６８】
本発明は、ノッチシグナル伝達の新規調節因子の検出方法を提供する。同定した調節因子は治療用薬剤として使用される。すなわち治療に適用される。
【０３６９】
ＴＨ２調節
一般的に免疫系における体液性／ＴＨ２ブランチにおいては、Ｂ細胞が抗体を産生することにより、細菌や寄生虫などの細胞外免疫原に対する防御を指示し、他方、細胞性／ＴＨ１ブランチにおいては、一般的にナチュラルキラー細胞、細胞毒性Ｔリンパ球及び活性化マクロファージの活性化により、ウイルスや癌などの細胞内免疫原を対象とする（米国特許第６０３９９６９号）。ＴＨ２細胞は、好酸球増多症の原因となり得る好酸球の動員、増殖、分化、維持及び生存に関与すると共に、ＩｇＥ抗体の産生を刺激するサイトカインを産生すると考えられている。好酸球増加症は、喘息、アレルギー、アトピー性皮膚炎等の多くのＴＨ２介在型疾患の特徴である。
【０３７０】
ＴＨ２免疫応答、ＩＬ−４／ＩＬ−５サイトカインの誘導、及び／又は好酸球増加症によって実質的に誘発／介在されると考えられる疾患には、喘息、アレルギー性鼻炎、全身性エリテマトーデス、Ommen's症候群（過好酸球増多症候群）、また皮膚及び全身性リーシュマニア症、トキソプラズマ感染症、トリパノソーマ感染症などの寄生虫感染症、またカンジダ症及びヒストプラズマ症などの真菌感染症、ハンセン病及び結核などの細胞内細菌感染症が含まれる。また、ウイルスや癌にそもそも由来するものの、ＴＨ２も大きく病理に関係している疾患もまた本発明により良好な治療が見込まれることは画期的である。
【０３７１】
近年の研究から、免疫系は２本の大きなアーム、すなわち体液性アームと細胞性アームとに分岐することが示されている。体液性アームは、Ｂ細胞によって抗体を産生することにより、細菌及び寄生虫等の細胞外病原を排除する上で重要である。他方、細胞性アームは、ナチュラルキラー細胞、細胞毒性Ｔリンパ球及び活性化マクロファージの活性化によりウイルスなどの細胞内病原を排除する上で重要である。これらの２種類のアームが異なるＴヘルパー細胞（ＴＨ）集団及びそれらの異なるサイトカイン産生プロフィールによって活性化することが近年明らかになっている。Ｔヘルパー１型（ＴＨ１）細胞は、免疫応答の細胞性アームを増強し、サイトカインであるＩＬ−２及びＩＦＮγをプレドミナントに産生すると考えられている。他方、Ｔヘルパー２（ＴＨ２）細胞は免疫応答の体液性アームを増強し、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等のサイトカインを産生すると考えられている。ＴＨ２の場合、ＩＬ−３、ＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦが、好酸球生成を刺激すると考えられている。また、ＩＬ−５は、好酸球の終末分化及び細胞増殖を容易にし、好酸球の生存、バイアビリティー及び移動性を促進する。これに対してＩＬ−４はＩｇＥクラス抗体の産生を刺激する。ＩｇＥはアレルギー及び喘息における重要な要素である。ＩＬ−５もまた好酸球を初回免疫して、それに続く他のメディエーターの作用を引き起こす。
【０３７２】
一方、ＴＨ１サイトカインであるＩＬ−２及びＩＦＮγは、マクロファージ、ＮＫ細胞及びＣＴＬ（細胞毒性Ｔリンパ球）の活性化に重要である。ＩＦＮγもまた、ウイルス感染した細胞を排除するためにＢ細胞を刺激して細胞親和性抗体を特異的に分泌する。マクロファージ由来サイトカインであるＩＦＮαは、ＴＨ２型応答に拮抗することが示されているのは興味深い。ＩＦＮαもまたＴＨ２細胞の増殖やサイトカイン産生を阻害し、ＴＨ１によるＩＦＮγ産生を増強する。ＩＦＮαは、ＩｇＥ産生、並びに抗原に誘導されるＩＬ４ｍＲＮＡレベルの亢進も阻害すると考えられる。
【０３７３】
多くのＴＨ２介在型疾患に共通する特徴は、好酸球増多症と呼ばれる好酸球の蓄積である。例えば、好酸球浸潤を伴う慢性肺炎症は、気管支喘息の極めて特徴的な症状である。喘息患者の血液、気管支肺胞洗浄液及び肺組織から好酸球の増加が認められるが、アレルギーや前炎症反応を起こしている肺組織における好酸球の動員及び調節に関する機構は未だ完全には解明されていない。Ｔリンパ球由来のメディエーター及びサイトカイン、並びに好塩基球、マスト細胞、マクロファージ及び好酸球等のエフェクター細胞は、好酸球の細胞成熟、化学走性及び活性化の増強に関与している。免疫系（特にＣＤ４+Ｔ細胞）と、好酸球及び好酸球動員との間には関係があることが証明されている。このことは、喘息の研究及びアレルギー性肺応答に関する動物モデルの研究の結果から、気道におけるＴ細胞と活性化好酸球の数が密接に相関していることが証明されていることからも支持される。
【０３７４】
本発明に従い、ＴＨ２応答を低減させることにより治療が見込まれる疾患としては、喘息、アレルギー、アトピー性皮膚炎、初期ＨＩＶ疾患、伝染性単核細胞症、全身性エリテマトーデス、また皮膚及び全身性リーシュマニア症、トキソプラズマ感染症、トリパノソーマ感染症などの寄生虫感染症、またカンジダ症及びヒストプラズマ症などの真菌感染症、ハンセン病及び結核などの細胞内細菌感染症が列挙される。
【０３７５】
ＴＮＦ調節
特にＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）及びＴＮＦベータ（ＴＮＦβ若しくはリンホトキシン）という少なくとも２種類のＴＮＦがこれまでに報告されており、それぞれトリマー分子として活性であり、受容体同士を交叉結合させることによって細胞シグナル伝達を開始すると考えられている（Engelmann et al. (1990), J. Biol. Chem., 265: 14497-14504）。
【０３７６】
実証例のいくつかからは、ＴＮＦαとＴＮＦβが主要な炎症性サイトカインであることが示唆されている。これら公知のＴＮＦは、感染や外傷といった種々の刺激に対する炎症応答に関与する多種多様な標的細胞に重要な生理学的効果を及ぼす。これらのタンパク質はいずれも、線維芽細胞及び滑液細胞に潜在的コラゲナーゼ及びプロスタグランジンＥ２を分泌させ、また骨細胞に骨再吸収を刺激させる。またこれらのタンパク質は、好中球に対する上皮細胞の表面接着性を亢進させる。また上皮細胞に凝血活性を分泌させて、血塊を溶解させる能力を低減させる。さらにＴＮＦα及びＴＮＦβタンパク質はいずれも、酵素であるリポタンパク質リパーゼの発現を阻害することにより、脂肪細胞の活性を、脂質を貯蔵することから変更させる。ＴＮＦはまたピロゲン（発熱物質）として視床下部に作用する「急性相反応物質」として知られるタンパク質のクラスを肝細胞に合成させる（Selby et al. (1988), Lancet, 1 (8583): 483; Starnes, Jr. et al. (1988), J. Clin. Invest., 82: 1321; Oliff et al. (1987), Cell, 50: 555; and Waage et al. (1987), Lancet, 1 (8529): 355）。
【０３７７】
本発明により治療が期待できる疾患を以下に列挙する。
（Ａ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、リウマチ脊椎炎、変形性関節症、通風性関節症又は他の関節疾患、甲状腺炎、移植片対宿主疾患、強皮症、糖尿病、グレーブス病、ベーチェット病などの急性及び慢性の免疫及び自己免疫病理。
（Ｂ）敗血症候群、全身敗血症、グラム陰性敗血症、敗血症性ショック、内毒素性ショック、毒性ショック症候群、悪液質、急性又は慢性細菌感染による循環虚脱及びショック、急性及び慢性寄生虫性及び／又はＨＩＶやＡＩＤＳ（悪液質、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ痴呆症候群及び感染症）等の感染性疾患（細菌、ウイルス、真菌）、細菌若しくはウイルス感染症による発熱及び筋痛などの感染症。但しこれらに限定されない。
（Ｃ）サルコイドーシス、慢性炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の慢性炎症性病理、並びに播種性血管内凝固症候群、粥状硬化症及び川崎病等の（これらに限定はされない）血管炎症性病理を含む慢性炎症性病理や血管炎症性病理などの炎症性疾患。
（Ｄ）多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎等の脱髄疾患を含む（限定はされない）神経変性疾患；皮質脊髄路系の病巣等の錐体外路及び小脳の疾患；基底ガングリア又は小脳の疾患；ハンチントン舞踏病及び老年舞踏病等の多動性疾患；ＣＮＳドーパミン受容体を阻止する薬剤に誘発される薬剤誘発性運動障害；パーキンソン病等の運動機能減退症；進行性核上性麻痺；小脳のastructural 病巣等の小脳及び脊髄小脳障害；脊髄小脳変性症（脊髄失調、フリードリッヒ失調症、小脳皮質変性症、多系変性症（Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, Mechadojoseph））；並びに全身性障害（Refsum病、無βリポたんぱく血症、運動失調症、毛細血管拡張症、及びミトコンドリア多系障害）；多発性硬化症、急性横断性骨髄炎等の脱髄部障害；神経性筋萎縮症（筋萎縮性側索硬化症、小児脊髄性筋萎縮症、若年性脊髄性筋萎縮症等の前角細胞変性症）等の運動ユニットの障害；アルツハイマー病；中年期ダウン症候群；びまん性Lewy小体病；Lewy小体型老年痴呆；Wernicke-Korsakoff症候群；慢性アルコール依存症；Creutzfeldt-Jakob 病；亜急性硬化性全脳炎、Hallerrorden-Spatz病；及びパンチドランカー症候群（Dementia pugilistica）、又はそれらいずれかのサブセット。
（Ｅ）ＴＮＦ分泌腫瘍を含む悪性疾患、又は白血病（急性、慢性骨髄性、慢性リンパ性及び／又は骨髄異形成症候群）等の（しかしそれらに限定されない）ＴＮＦが関与する他の悪性疾患、リンパ腫（悪性リンパ腫等（Burkittリンパ腫又は菌状息肉症）のホジキン及び非ホジキンリンパ腫）；癌（大腸癌等）及びその転移；癌性血管形成；小児血管腫。
（Ｆ）アルコール性肝炎
（Ｇ）眼血管新生、乾癬、十二指腸潰瘍、婦人生殖管における血管新生等の血管新生やＶＥＧＦ／ＶＰＦに関連する他の疾患。
（Ｈ）  粥状硬化症、鬱血性心不全、脳卒中及び血管炎等の心血管疾患。或いは、
（Ｉ）成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性肺炎症疾患、珪肺症、アスベスト症及び肺サルコイドーシス等の肺疾患
本発明の一実施態様は、「ＴＮＦ介在型疾患」の治療への使用を意図している。自発的又は実験的疾患が、体液中又は疾患部位隣接組織中又は体内指標におけるＴＮＦレベルの上昇を伴う場合、かかる疾患又は医学症状は「ＴＮＦ介在型疾患」であるとみなされる。
【０３７８】
関節リウマチ及び乾癬性関節炎等の疾患は程度の差はあれ、世界中の何百万人もの人々を苦しめ、障害を残す慢性関節疾患である。関節リウマチは、滑膜由来でパンヌス（pannus）と呼ぶ増殖性かつ浸潤性結合組織によって軟骨と骨が緩やかに磨耗していく関節部の疾患である。この疾患は、皮下、心臓血管系、肺、脾臓、リンパ節、骨格筋、神経系（中枢及び末梢）及び眼等の関節外組織と同様に、滑液胞、腱鞘及び腱等の関節周囲構造に関係があると考えられる（Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissane (ed.), II: 1828）。
【０３７９】
疾患の重症度は多岐にわたるが、多くの患者は一進一退を繰り返しながら、全体としては関節の破壊や変形が徐々に進行していく。臨床所見には、痛み、脆弱さ、腫脹及び罹患関節の機能喪失を伴う末梢関節の対称性多発性関節炎；朝のこわばり；及び軟骨消失、骨質糜爛、及び持続的炎症後の関節亜脱臼が含まれる。関節外の臨床所見には、リウマチ結節、リウマチ血管炎、強膜肺炎症、強膜炎、乾燥症候群、フェルティ症候群（Felty's syndrome）(脾腫及び好中球減少症)、持続的炎症後の関節亜脱臼が含まれる。関節外臨床所見には、リウマチ結節、リウマチ血管炎、強膜肺炎症、強膜炎、乾燥症候群、フェルティ症候群 (脾腫及び好中球減少症)、骨粗鬆症及び体重減少が含まれる（Katz (1985), Am. J. Med., 79: 24 and Krane and Simon (1986), Advances in Rheumatology, Synderman (ed.), 70(2): 263-284）。これらの臨床症状は罹患率が高く、患者の日常生活に困難をもたらす。
【０３８０】
療法
「療法」なる用語には、治療効果、軽減効果、及び予防効果が含まれる。本療法は、ヒト又は動物いずれにも適用される。
【０３８１】
本発明のアッセイ法により同定されたモジュレーターは、免疫系の障害及び／又は疾患の治療に用いられる。特に本発明化合物は、Ｔ細胞介在型疾患又は障害の治療に用いることができる。ノッチシグナル伝達経路及びそれにより影響を受ける疾患については、本発明者らのＷＯ９８／２０１４２、ＷＯ００／３６０８９及びＷＯ／００１３５９９０に詳細に記載がある。
【０３８２】
Ｔ細胞介在型として示される疾患又は感染症としては、喘息、アレルギー、移植片拒絶反応、自己免疫症、腫瘍を原因とするＴ細胞系の異常、並びにマラリヤ病原虫(Plasmodium sp.)、ミクロフィラリア、蠕虫、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎、トキソカラの１若しくは２以上が含まれるが、これらに限定されない。Ｔ細胞が介在する疾患のうち、治療若しくは予防が可能であると思われるものには、多発性硬化症、関節リウマチ、又は糖尿病が含まれる。本発明は臓器移植又は骨髄移植にも用いられる。本発明は自己免疫疾患又は異種移植片移植等の移植拒絶反応等の免疫障害を治療する上で有用である。
【０３８３】
治療が可能と考えられる疾患例には一般的に自己免疫疾患と呼ばれるグループが含まれる。自己免疫疾患の範囲には臓器特異的疾患（甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アジソン病、重症筋無力症など）から関節リウマチやエリテマトーデス等の全身性疾患に及ぶ。他の疾患には、アレルギー反応等の免疫性過敏症が含まれる。
【０３８４】
より詳細には臓器特異的自己免疫疾患には、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、数タイプの貧血（再生不良性、溶血性）、自己免疫性肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）が含まれる。
【０３８５】
全身性自己免疫疾患には、関節リウマチ、若年性関節炎、強皮症及び全身性硬化症、シェーグレン症候群、未分化結合織症候群、抗リン脂質抗体症候群、各種形態の脈管炎（結節性多発動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲネル肉芽腫症、川崎病、過敏性脈管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（Henoch-Schoenlein purpura）、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎）、エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症、本態性（混合）クリオグロブリン血症、尋常性乾癬、及び乾癬性関節炎、好酸球性若しくは非好酸球性の広汎性筋膜炎、多発性筋炎及び他の特発性炎症性筋疾患、再発性脂肪組織炎、再発性多発性軟骨炎、リンパ腫様肉芽腫、結節性紅斑、強直性脊髄炎、ライター症候群（Reiter's syndrome）、種々の病型の炎症性皮膚炎が含まれる。
【０３８６】
障害をさらに詳細に以下列挙する。関節炎（関節リウマチを含む）を含む望ましくない免疫反応及び炎症、過敏症を伴う炎症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患や他の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症を伴う炎症、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性心疾患、再潅流障害、心停止、心筋梗塞、血管性炎症疾患、呼吸窮迫症候群又は他の心肺疾患、消化器潰瘍を伴う炎症、潰瘍性大腸炎や他の消化管疾患、肝硬変や他の肝疾患、甲状腺炎や他の腺疾患、糸球体腎炎や他の腎臓及び泌尿器疾患、耳炎や他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎や他の皮膚疾患、歯周病や他の歯疾患、精巣炎又は副睾丸炎（精巣上体炎）、不妊症、睾丸外傷並びに他の免疫性精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、子癇前症並びに他の免疫及び／又は炎症性婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、網脈絡膜炎、ブドウ膜炎（uveoretinitis）、視神経炎、眼内炎（例；網膜炎又は嚢胞様黄斑腫）、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性眼圧疾患の免疫及び炎症構成要素、眼外傷の炎症構成要素、感染性眼炎症、増殖性硝子網膜症、急性虚血性視神経障害、過剰形成瘢痕（例；緑内障濾過手術後の）、眼組織移植に対する免疫及び／又は炎症反応、並びに他の免疫関連眼疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）又は他の臓器の両方において免疫及び／又は炎症を抑制することが有効である自己免疫疾患若しくは症状若しくは障害に伴う炎症、パーキンソン病、パーキンソン病治療による合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ痴呆症候群、ＨＩＶ脳症、デビック病（Devic's disease）、シデナム舞踏病（Sydenham's chorea）、アルツハイマー病並びに他の変性疾患、中枢神経系の疾患又は障害、脳卒中による炎症構成要素、ポリオ後症候群、精神疾患の免疫及び炎症構成要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、Guillaim-Barre症候群、シデナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症、中枢神経系圧迫又は中枢神経系外傷又は中枢神経系感染による炎症構成要素、筋萎縮症又は筋ジストロフィーによる炎症構成要素、さらに中枢及び末梢神経系における免疫及び炎症疾患又は症状又は障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染症、手術又は臓器移植後の炎症性合併症又は副作用、遺伝子療法による炎症性及び／又は免疫性合併症及び副作用（例；ウイルス担体による感染のため）、或いはＡＩＤＳに伴う炎症、液性及び／又は細胞性免疫反応の抑制又は阻害、単球又はリンパ球を減少させることにより単球又は白血球増殖性疾患（例；白血病）を治療若しくは軽減すること、天然若しくは人工の細胞や、角膜、骨髄、臓器、水晶体、ペースメーカー、天然若しくは人工の皮膚組織等の組織や臓器を移植する場合の移植片拒絶反応の予防及び／又は治療。
【０３８７】
本発明は癌治療にも有用であり、特に上皮細胞が癌へと転化する疾患の治療に有用である。ノッチシグナル伝達のインヒビターを用いて主要サイトカインの産生を調節することにより、癌に対する免疫応答を亢進させるのに本発明は特に有用である。本発明は特に小細胞肺癌、及び腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、乳癌等の腺癌について有用である。従って本出願は悪性かつ前腫瘍性疾患の治療に適用できる。本発明は特に小細胞肺癌、及び腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、乳癌等の腺癌について有用である。例えば本発明によって治療可能となる悪性疾患には、急性及び慢性白血病、リンパ腫、骨髄腫や、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ血管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcom）、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、胸膜中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、鱗細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、甲状腺髄様癌、気管支原性癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌精上皮腫、胎生期癌、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫（グリオーマ）、星細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起膠細胞腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽腫等の肉腫が含まれる。
【０３８８】
医薬組成物
本発明は、本発明の方法により同定された化合物の少なくとも１種を治療有効量と、薬学上許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤（それらを併用することも含めて）とを投与することからなる医薬組成物を提供する。
【０３８９】
上記医薬組成物は、ヒト医学及び獣医学におけるヒト及び動物への使用に供され、通常１若しくは２以上の薬学上許容される希釈剤、担体若しくは賦形剤を含んでいる。治療に使用する上で許容される担体又は希釈剤は薬学分野では十分公知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985) に、それらに関する記載がみられる。医薬担体、賦形剤若しくは希釈剤は、意図する投与経路及び標準的な薬学的運用例に基づいて選択される。医薬組成物には、担体、賦形剤若しくは希釈剤として（或いはそれらに加えて）、（１若しくは２以上の）適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤又は可溶化剤が含まれていてもよい。
【０３９０】
保存料、安定剤、染料、さらには香料が医薬組成物に含まれることもある。保存料としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが例示される。酸化防止剤及び懸濁化剤も用いられる。
【０３９１】
送達系が異なると、異なる組成物／処方要件が必要とされる場合もある。例を挙げると本発明の医薬組成物を、例えば吸入用若しくは摂取可能溶液用の鼻腔スプレー若しくはエアゾールとして、ミニポンプを用いて投与又は粘膜経路から投与すべく処方し、或いは、非経口経路により投与するために、例えば静脈内、筋肉内若しくは皮下経路により送達するために組成物を注入可能な剤型に処方する。或いはこれら両方の経路から送達するような処方を設計することもできる。
【０３９２】
胃腸粘膜から粘膜を通じて化合物を送達する場合、胃腸管を通過する間に化合物の安定性が保たれなければならない。例えばタンパク質分解に耐性であり、酸性ｐＨに対し安定であり、胆汁の洗浄効果に耐性でなければならない。
【０３９３】
本発明医薬組成物は必要に応じて吸入により、又は座剤やペッサリーの剤型で、又はローション、液剤、クリーム、軟膏、又は粉剤の剤型で、又はスキンパッチを用い、局所的に塗布して投与することも可能である。また澱粉又はラクトース等の賦形剤を含む錠剤の剤型で、カプセル剤若しくは胚珠（ovule）剤を単独で又は賦形剤と混合して、或いは香料又は色素を含有するエリキシル剤、液剤又は懸濁剤の剤型で、経口投与することも可能であり、また例えば静脈内、筋肉内、又は皮下へ非経口に注入することもできる。非経口投与の場合は、組成物を無菌水性溶液の剤型で使用することが最適であり、かかる溶液を血液と等張とするために例えば十分量の塩又は単糖類など、他の物質を含んでいてもよい。口腔内又は舌下に投与する場合、常法により処方可能な錠剤又はトローチ剤の剤型で組成物を投与してよい。
【０３９４】
投与
通常医師は、個々の患者にとって最適な実際の投与量を決めるが、それは個別の患者の年齢、体重、反応性によって異なる。以下の投与量は、平均的なケースを挙げたものである。個々の症例に応じて当然平均より高量投与若しくは低量投与が奏功する場合もある。
【０３９５】
本発明の組成物は直接注入することにより投与してもよい。組成物は非経口、粘膜、筋肉内、静脈内、皮下、眼内又は経皮投与用として処方してもよい。
【０３９６】
「投与する」なる用語には、ウイルス又は非ウイルス方法による送達が含まれる。ウイルス送達機構には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。非ウイルス送達機構には、脂質仲介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、カチオン性界面両親媒性物質（ＣＦＡｓ）、及びそれらを組み合わせたものが含まれる。このような送達機構には、粘膜、鼻腔、経口、非経口、胃腸、局所、又は舌下の経路が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０３９７】
「投与する」なる用語には、例えば吸入用若しくは摂取可能溶液用の鼻腔スプレー若しくはエアゾールとして粘膜経路からの送達や、例えば静脈内、筋肉内、皮内、関節内、髄腔内、腹腔内又は皮下経路等、或いは消化管経路（例えばPeyers patchesから）等の非経口経路からの注入による送達が含まれるが、これらに限定されない。
【０３９８】
専門家であれば個々の患者にとって、例えば年齢、体重及び症状に応じて最適な投与経路や投与量を容易に決めることができるので、これまでに説明した投与経路及び投与量は単に指針としてのものである。医薬組成物が単位投与形態であることが好ましい。本発明には、ヒト及び動物の両方への適用が含まれる。
【０３９９】
初回免疫したＡＰＣｓ及びリンパ球の調製
本発明の特徴の１つによれば、免疫細胞を使用して抗原又はアレルゲンを提示し、及び／又は免疫細胞を処理してノッチ、ノッチリガンド若しくはノッチシグナル伝達経路の発現や相互作用を調節する。従って例えば抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）をＤＭＥＭや他の定義された培地等の好適な培養培地において、任意にウシ胎児血清等の血清存在下で培養する。サイトカインの最適濃度は滴定によって決定できる。一般的には次に、ノッチシグナル伝達経路をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることが可能な１若しくは２以上の物質を目的抗原と共に培養培地に加える。この抗原は物質（１若しくは複数）添加の前、後、若しくは実質的に同時に加えてよい。通常、上記物質（１若しくは複数）及び抗原の共存下で細胞を少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、必要に応じて少なくとも１２時間以上３７℃でインキュベーションする。必要に応じ、上述のとおりに少量の細胞を検定して標的遺伝子の調節された発現を調べてもよい。或いはＷＯ９８／２０１４２に記載があるように、表面マーカー、サイトカインの分泌や増殖を観察してＴ細胞活性化の阻害を調べることにより細胞活性を測定してもよい。セラートなどの発現を指示する核酸構築物でトランスフェクトしたＡＰＣｓを対照としてもよい。
【０４００】
上述したとおり、ポリペプチドをコードする核酸構築物／ウイルスベクターを、ＡＰＣにおける該ポリペプチド発現が可能な条件下で細胞に導入することによって該ポリペプチド物質を上記ＡＰＣに投与してもよい。同様に、抗原をコードする核酸構築物をトランスフェクション、ウイルス感染、又はウイルス形質導入によってＡＰＣｓに導入してもよい。その結果得られるノッチシグナル伝達のレベルが上昇したＡＰＣｓは直ちに使用に供すことができる。
【０４０１】
後述する技術はＴ細胞との関連で説明するが、Ｂ細胞にも同じように適用できる。用いる技術は、Ｔ細胞を通常ＡＰＣｓと共培養する以外は基本的にＡＰＣｓ単独に対するものと同じである。しかし、まず初回免疫（初回抗原投与）したＡＰＣｓを調製し、次にそれらのＡＰＣｓをＴ細胞共存下でインキュベートすることが好ましい。例えば、初回免疫したＡＰＣｓを一旦調製した後、新鮮培養培地に再懸濁する前にかかるＡＰＣｓをペレット状にしてＰＢＳで洗浄してよい。この方法は、例えばＡＰＣに用いるものとは異なる、プレセニリンを調節できる物質（１若しくは複数）でＴ細胞を処理することが望まれる場合に利点があり、その場合Ｔ細胞は、ＡＰＣに用いた異なる物質（１若しくは複数）と接触することはない。或いは、ノッチシグナル伝達を調節するためにＴ細胞を第１物質（又は物質のセット）とコインキュベートし、洗浄し、再懸濁して、ＡＰＣ調節に用いる物質（１若しくは複数）及びＴ細胞調節に用いる物質（１若しくは複数）の両方の不在下かつ初回免疫したＡＰＣ共存下にてインキュベーションする。或いはＴ細胞をＡＰＣｓ不在下で、抗ＴＣＲ抗体（例；抗ＣＤ３抗体）等のＡＰＣ代替物を用いて、共刺激分子（例；抗ＣＤ２８抗体）に対する抗体の存在下又は不在下で培養し、初回免疫する。又はＭＨＣ−ペプチド複合体（例；テトラマー）を用いてＴ細胞を活性化する。
【０４０２】
インキュベーションは通常少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３若しくは６時間、３７℃下で好適培地にて行う。次いでＴ細胞を抗原で追加免疫し、ＡＰＣｓに暴露しなかった対照細胞との比較においてＩＬ−２産生量を測定することにより、免疫寛容が誘導されたかどうかを調べる。
【０４０３】
上記の方法で初回免疫したＴ細胞又はＢ細胞を本発明に従って用いることにより、他のＴ細胞又はＢ細胞に免疫寛容を誘導する。
本発明をさらに以下の非限定的実施例を参照しながら説明する。
【実施例１】
【０４０４】
ＣＤ４+細胞の精製
マウス（Balb／ｃ雌、８〜１０週齢、Ｃ５７Ｂ／６雌、８〜１０週齢、ＣＡＲＤ１雌、８〜１０週齢（Ｄ０１１．１０トランスジェニック、ＣＡＲトランスジェニック））から脾臓を摘出し、０．２μＭ細胞ストレイナーを通して２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地（１０％ウシ胎児血清に２ｍM Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５×１０-5Ｍ β−メルカプト−エタノールを加えたＲ１０Ｆ−ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco Cat No 22409））に移した。細胞懸濁液を遠心分離にかけ（１１５０ｒｐｍ、５分間）、培地を除去した。
【０４０５】
脾臓１個毎に５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（二重蒸留水に０．１５Ｍ ＮＨ4Ｃｌ、１．０Ｍ ＫＨＣＯ3、０．１ｍM Ｎａ2ＥＤＴＡ）を用いて上記細胞を４分間インキュベーションした（赤血球を溶解させるため）。これらの細胞をＲ１０Ｆ培地で一度洗浄し、計数した。製造者マニュアルに従い、Magnetic Associated Cell Sorter（ＭＡＣＳ）カラム（Miltenyi Biotec, Bisley, UK: Cat No 130-042-401）上で、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（Miltenyi Biotec Cat No 130-049-201）を用いてポジティブ選択を行い、懸濁液からＣＤ４+細胞を精製した。
【実施例２】
【０４０６】
抗体のコーティング
以下のプロトコールにより、９６ウエルの平底プレートに抗体をコーティングした。
【０４０７】
Ａ）１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Pharmingen, San Diego, US: Cat No 553058, Clone No 145-2C11）と1μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ４抗体（Pharmingen Cat No 555878）を添加したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）をプレートにコーティングした。コーティング混合物１００μｌを各プレートにコーティングした。プレートを一晩４℃でインキュベーションし、ＤＰＢＳで洗浄した。次に各ウエルに、１００μｌＤＰＢＳ、又は１０μｇ／ｍｌノッチリガンド（マウスデルタ１細胞外ドメイン／Ｉｇ４Ｆｃ融合タンパク質；Ｆｃ−デルタ）を加えた１００μｌＤＰＢＳのいずれかを添加した。
上記プレートを３７℃で２〜３時間インキュベーションし、細胞（実施例１同様に調製したもの）を加える前にＤＰＢＳで洗浄した。
【０４０８】
Ｂ）或いは、１μｇ／ｍｌの抗ハムスターＩｇＧ抗体（Pharmingen Cat No 554007）と１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ４抗体を添加したＤＰＢＳでプレートをコーティングした。各ウエルにコーティング混合物を１００μｌ加えた。プレートを一晩４℃でインキュベーションした後にＤＰＢＳで洗浄した。次に、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）を加えた１００μｌのＤＰＢＳ、又は抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）とＦｃ−デルタ（１０μｇ／ｍｌ）を加えた１００μｌのＤＰＢＳのいずれかを各ウエルに添加した。これらのプレートを３７℃で２〜３時間インキュベーションし、細胞（実施例１同様に調製したもの）を加える前にＤＰＢＳで再度洗浄した。
【実施例３】
【０４０９】
初回ポリクローナル刺激
実施例２（Ａ）又は２（Ｂ）に従って事前コーティングした９６ウエルの平底プレートでＣＤ４+細胞を培養した。細胞を計数した後、４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（Pharmingen Cat No 553294, Clone No 37.51）を加えたＲ１０Ｆ培地に２×１０6／ｍｌで再懸濁した。各ウエルに１００μｌの細胞懸濁液を加えた。次に各ウエルにＲ１０Ｆ培地１００μｌを加えて最終容量を２００μｌ（２×１０5細胞／ウエル、抗ＣＤ２８抗体の最終濃度は２μｇ／ｍｌ）とした。これらのプレートを３７℃で７２時間インキュベーションした。
【０４１０】
次に１２５μｌの上清を各ウエルから除去し、R & D Systems（Abingdon, UK）製の抗体ペアを用いるＥＬＩＳＡでＩＬ−１０、ＩＦＮｇ及びＩＬ−１３を調べるまで−２０℃で貯蔵した。次にこれらの細胞を新しいウエルに３等分して（コーティングせず）播き、組換えヒトＩＬ−２（２．５ｎｇ／ｍｌ、Pepro Tech Inc, London, UK: Cat No 200-02）を加えたＲ１０Ｆ培地で培養した。
結果を図７に示す。
【実施例４】
【０４１１】
初回刺激したＣＤ４+細胞のリアルタイムＰＣＲ分析
実施例３においてマウス（Balb／ｃ）で刺激したＣＤ４+Ｔ細胞を４、１６及び２４時間後に回収した。RNeasyTMＲＮＡ単離キット（Qiagen, Crawley, UK）を製造者指針に従って用い、全細胞ＲＮＡを単離した。
【０４１２】
それぞれの場合において、オリゴｄＴ(12-18)又はランダムデカマー（decamer）混合物を用い、製造者指針に従ってSuperScriptTMII Reverse Transcriptase（Invitrogen, Paisley, UK）を使用して全ＲＮＡ１μｇを逆転写した。合成後、オリゴｄＴ(12-18)と、ランダムにデカマーで初回免疫したｃＤＮＡを等量ずつ混合し、リアルタイム定量ＰＣＲ分析に用いる試験用ｃＤＮＡ試料を得た。
【０４１３】
Roche LightcyclerTM system（Roche, UK）及びＳＹＢＲグリーン検出化学法を製造者指針に従って使用し、リアルタイム定量ＰＣＲを行った。ｃＤＮＡ特異的増幅（５´から３´）には、ＨＰＬＣで精製した以下のプライマーペアを用いた。
【０４１４】
【表１２】
2004537314.tif 000013
【０４１５】
リアルタイムＰＣＲ定量に用いた終点（endpoint）であるCrossing Point（ＣP）は、アルゴリズムに定義されるシグナル閾値を交差するＰＣＲサイクル回数として定義される。遺伝子特異的ｃＤＮＡの定量分析は、まず、プラスミドベクター（pCR2.1、Invitrogen社製）に既にクローニングした連続希釈遺伝子特異的増幅産物のセットから、ＣPｓを用いてスタンダードセットを作製して行う。これらの連続希釈物は、ｃＤＮＡ試料のＣPｓの比較対象である標準曲線の範囲内にある。この系を用い、各ｃＤＮＡ試料について１８ＳｒＲＮＡハウスキーピング遺伝子の発現レベルを作製した。次に同様の方法で連続希釈Ｈｅｓ−１特異的スタンダードを用いてＨｅｓ−１を分析し、かかるＨｅｓ−１値を１８ＳｒＲＮＡ値で割り、各ｃＤＮＡ試料におけるＨｅｓ−１の相対的発現を表す値を得た。全てのＣｐ分析には、Lightcyclerシステムソフトウエアに含まれるSecond Derivative Maximum algorithmを用いた。
【０４１６】
図８に結果（Ｆｃ−デルタの存在下及び不在下での１８ＳｒＲＮＡ発現に対するＨＥＳ−１の相対的発現）を示す。
【実施例５】
【０４１７】
分極条件下でのスクリーニング
実施例２（Ａ）と同様にしてプレートをコーティングし、ＣＤ４+細胞を加えた。次に実施例３の手順に従ったが、実施例３では各ウエルに１００μｌのＲ１０Ｆ培地を添加していたのに代え、各ウエルに以下のとおりにして１００μｌの分極カクテルを加えた。
【０４１８】
非分極細胞：Ｒ１０Ｆ培地
Ｔｈ１分極細胞：Ｒ１０Ｆ培地＋抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ、Pharmingen Cat No 554432）＋ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Peprotech 210-12）
Ｔｈ２分極細胞：Ｒ１０Ｆ培地＋抗ＩＬ−１２抗体（１０μｇ／ｍｌ、Pharmingen Cat No 554475）＋抗ＩＦＮｇ抗体（１μｇ／ｍｌ、Pharmingen Cat No 554408）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ、Peprotech Cat No 214-14）
【０４１９】
次に実施例３の記載と同様に、細胞を刺激してサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＦＮγ及びＩＬ−１３）をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図９に示す。
【実施例６】
【０４２０】
可溶性リガンド
実施例２（Ａ）（リガンドをプレートに添加しない点が異なる）及び実施例３（Ｒ１０Ｆ培地に可溶性Ｆｃ−デルタを添加する点が異なる）の手順に従い、可溶性Ｆｃ−デルタとプレートに結合したＦｃ−デルタを対照と比較した。結果を図１０に示す。
【実施例７】
【０４２１】
二次刺激
一次刺激の７日後に全ての細胞を回収して計数し、以下の３通りの方法のいずれか１つの方法によって刺激した。
【０４２２】
再刺激
細胞を一次刺激と全く同様にして再刺激した（実施例３）。
【０４２３】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による追加免疫
１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体を添加したＰＢＳで９６ウエル平底プレートをコーティングした。これらのプレートを一晩４℃でインキュベーションし、ＤＰＢＳで洗浄した。
【０４２４】
上記の細胞を、抗ＣＤ２８抗体（４μｇ／ｍｌ）を添加したＲ１０Ｆ培地に２×１０6／ｍｌで最懸濁した。各ウエルに１００μｌの細胞懸濁液を加えた。次にＲ１０Ｆ培地１００μｌを各ウエルに加え、最終容量を２００μｌとした（２×１０5細胞／ウエル、抗ＣＤ２８抗体の最終濃度は２μｇ／ｍｌ）。次にこれらのプレートを３７℃で７２時間インキュベーションした。実施例３と同様に、７２時間後に上清を除去してＥＬＩＳＡにかけた（一次刺激）。
【０４２５】
ＡＰＣと抗ＣＤ３抗体による再刺激
実施例３において一次刺激を行った細胞を７日後に回収し、同株のＡＰＣｓ（２×１０4／ウエル）と抗ＣＤ３抗体とで再刺激した。
【０４２６】
実施例１と同様にしてマウス脾臓細胞を単離して計数した。次にＴｈｙ−１．２抗体結合細胞をＭＡＣＳカラム上で除去し、フロースルーを回収してミトマイシン−Ｃで４５分間処理し、１００μｌＲ１０Ｆ培地の入った９６ウエルプレートに、実施例３と同数の細胞及び０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体と共に加えた。
【０４２７】
Roche Molecular Biochemicals社製のキットであるCell Proliferation ELISA, BrdU (chemiluminescent) 1 669 915を製造者マニュアルに従って使用し、細胞増殖を測定した。７２時間後にプレートをパルス化し、ルミノメーターで読み取った。
【０４２８】
サイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γ）は実施例３と同様にして測定した。結果を図１１に示す。
【実施例８】
【０４２９】
ＣＨＯ−Ｎ２（Ｎ２７）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ａ）ルシフェラーゼレポータープラスミド10xCBF1-Luc（pLOR91）
BglII及びHindIII凝集性末端をもつアデノウイルス主要後期プロモーターTATA-boxモチーフを以下のようにして作製した。
【０４３０】
【表１３】
2004537314.tif 000014
これをプラスミドpGL3-Basic（Promega社製）にBglIIとHindIII部位との間にクローニングしてプラスミドpGL3-AdTATAを作製した。
【０４３１】
BamH1及びBglII凝集性末端を有するＡＴＰ１プロモーター配列（ＴＰ１；ＣＢＦ１の２回反復に相当）を以下のようにして作製した。
【０４３２】
【表１４】
2004537314.tif 000015
【０４３３】
BglII部位に繰り返し挿入することにより上記配列をペンタマー（５量体）とし、得られたＴＰ１ペンタマー（ＣＢＦ１の１０回反復に相当）をBglII部位においてpGL3-AdTATAに挿入してプラスミドpLOR91を作製した。
【０４３４】
Ｂ）完全長ノッチ2を発現する安定なＣＨＯ細胞レポーター細胞株及び10xCBF1-Lucレポーターカセットの作成
ヒトノッチ2遺伝子（例としてGenBank 登録番号ＡＦ３１５３５６を参照）の完全コーディング配列を網羅するｃＤＮＡクローンを以下のようにして構築した。細胞内ドメインの全体及び細胞外ドメインの一部をコードする３'ｃＤＮＡ断片をヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（OriGene Technologies Ltd., USA）からＰＣＲベーススクリーニング法（PCR-based screening strategy）により単離した。残存５'コーディング配列をＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends；ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）法により単離し、両方の断片に共通の独特な制限部位（ClaＩ）を用いて既存３'断片と結合させた。その結果得られた完全長ｃＤＮＡを次に哺乳類発現ベクターpcDNA3.1−V5−HisA（Invitrogen社製）にストップコドンなしでクローニングし、プラスミドpLOR92を作製した。従って、pLOR92は哺乳類細胞で発現されると、その細胞内ドメインの３'末端にＶ５及びＨｉｓタグを有する完全長ヒトノッチ2タンパク質を発現する。
【０４３５】
Lipfectamine2000TM（Invitrogen社製）を用いて野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（例としてＡＴＣＣ ＮｏＣＣＬ６１）にpLOR92（pcDNA3.1−FLNotch２−V5-His）をトランスフェクトし、完全長ヒトノッチ2（Ｎ２）を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを作製した。トランスフェクトしたクローンは、限界希釈を用いる９６ウエルプレートにおいて、１０％熱不活化ウシ胎児血清（（ＨＩ）ＦＣＳ）とグルタミンとペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｃ）と１ｍｇ／ｍｌＧ４１８（GeneticinTM、Invitrogen社製）を添加したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；Dulbecco's Modified Eagle Medium）から選択した。個々のコロニーを、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓと０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を添加したＤＭＥＭで増殖させた。抗Ｖ５モノクローナル抗体（Invitrogen社製）を用いるウエスタンブロッティングに細胞溶解物を供してＮ２の発現を調べた。陽性クローンをレポーターベクターpLOR91（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）で一時的にトランスフェクションし、完全長ヒトデルタ様リガンド１（ＤＬＬ１；例としてGenBank登録番号ＡＦ１９６５７１号を参照）を発現する安定ＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−デルタ）と共培養することにより試験した。（ＣＨＯノッチ２クローンと同様にしてＣＨＯ−デルタを調製したが、ノッチ２の代わりにヒトＤＬＬ１を使用した。抗Ｖ５モノクローナル抗体を使用し、細胞溶解物をウエスタンブロッティングにかけて著しく陽性を示したクローンを選択した。）
【０４３６】
ＣＨＯ−Ｎ２安定クローンの１つであるＮ２７にpLOR91（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）を一時的トランスフェクションし、完全長ヒトＤＬＬ１を発現する安定ＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−デルタ）と共培養したところ、高レベルな誘導を示したことが明らかになった。BamH1とSal１を用いてヒグロマイシン遺伝子カセット（pcDNA3.1／hygro、Invitrogen社製）をpLOR91（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）に挿入し、このベクター（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ−hygro）をLipfectamine2000（Invitrogen社製）を用いてCHO-N２安定クローン（Ｎ２７）にトランスフェクトした。トランスフェクトしたクローンを、限界希釈を用いる９６ウエルプレートにおいて、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｃと０．４ｍｇ／ｍｌヒグロマイシンＢ（Invitrogen社製）と０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Invitrogen社製）を添加したＤＭＥＭから選択した。１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓと０．２ｍｇ／ｍｌヒグロマイシンＢ（Invitrogen社製）と０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Invitrogen社製）を添加したＤＭＥＭにおいて個々のクローンを増殖させた。
【０４３７】
ＦＬヒトＤＬＬ１を発現する安定ＣＨＯ細胞クローンと共培養することによりクローンを試験した。Ｎ２７＃１１、Ｎ２７＃１７、Ｎ２７＃３６の３種類の安定レポーター細胞株を作製した。ノッチシグナル伝達不在下におけるバックグラウンドシグナルが低く、そのためシグナル伝達が開始されると誘導が高倍率で生じることから、Ｎ２７＃１１を選択した。１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭを１ウエルあたり１００μｌ入れた９６ウエルプレートにおいて、ウエル毎に２×１０4のＮ２７＃１１細胞を播いてアッセイを行った。
【０４３８】
Ｃ）ＣＨＯ-Ｎ２細胞に対する１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃの一時的トランスフェクション
また、一時的トランスフェクションを行うために、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓと０．５ｍｇ／ｍｌＧ１８を添加したＤＭＥＭでＣＨＯ−Ｎ２（クローンＮ２７）細胞を維持し、ＣＨＯ−Ｎ２細胞のＴ80フラスコに対し、以下のようにしてトランスフェクションを行った。細胞上の培地を、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ新鮮培地８ｍｌと交換した。pLOR91（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）が入った無菌小容器（bijou）に、１０μｇのOptiMem（Invitrogen社製）を最終容量が１ｍｌとなるように加え、混合した。２個目の無菌小容器に、２０μｌのLipofectamine2000試薬をOptiMem９８０μｌに加えて混合した。
【０４３９】
各小容器の内容物を混合し、室温で２０分間放置した。トランスフェクション混合物２ｍｌを培地８ｍｌが入った細胞入りのフラスコに加え、得られた混合物を一晩ＣＯ2インキュベーターに放置した後、トランスフェクト細胞を取り出して不動化ノッチリガンドタンパク質の入った９６ウエルプレートに加えた。
【０４４０】
その翌日に０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Sigma社製）を用いてトランスフェクトＣＨＯ−Ｎ２細胞を取り出し、遠心分離して１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。１０μｌ中の細胞数を数え、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加した新鮮ＤＭＥＭにおける細胞密度を２．０×１０5細胞／ｍｌに調整した。マルチチャネルピペットを用いて９６ウエル組織培養プレート（平底）の各ウエルに１００μｌを加え、すなわち１ウエルあたり２．０×１０4個のトランスフェクト細胞とし、このプレートを一晩インキュベーションした。
【０４４１】
Ｄ）９６ウエル組織培養プレートへ直接ノッチリガンドタンパク質を固定する
精製ノッチリガンドタンパク質１０μｇを無菌エッペンドルフ型（Eppendorf）管中の無菌ＰＢＳに加え、最終容量を１ｍｌとした。このうち５００μｌを５００μｌの無菌ＰＢＳが入った無菌エッペンドルフ型管に加え、連続して１：２の希釈液を作り、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、０μｇ／ｍｌの各希釈液を作製した。
【０４４２】
上記プレートの蓋をパラフィルムで密封し、プレートを４℃下で一晩又は３７℃下で２時間放置した。その後タンパク質を除去し、プレートをＰＢＳ２００μｌで洗浄した。
【０４４３】
Ｅ）Ａ２０−デルタ細胞
ＩＶＳ、ＩＲＥＳ、Ｎｅｏ及びｐＡの各エレメントをプラスミドpIRESneo2（Clontech社製、USA）から取り出し、pUCクローニングベクター内のニワトリβ−アクチンプロモーター（例としてGenBank登録番号Ｅ０２１９９を参照）のダウンストリームに挿入した。マウスデルタ１（例としてGenBank登録番号ＮＭ_００７８６５を参照）をアクチンプロモーターとＩＶＳエレメントとの間に挿入し、３つのリーディングフレームの全てに複数のストップコドンが含まれる配列をデルタとＩＶＳエレメントとの間に挿入した。
【０４４４】
その結果得られた構築物をエレクトロポレーションとＧ４１８を用いてＡ２０細胞にトランスフェクトし、マウスデルタ１をその表面に発現するＡ２０細胞を得た（Ａ２０−デルタ）。
【０４４５】
Ｆ）ＣＨＯ及びＣＨＯ−hデルタ1−Ｖ５−Ｈｉｓアッセイ対照
１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭにおいてＣＨＯ細胞を維持し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓと０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を添加したＤＭＥＭにおいてＣＨＯ−hデルタ1−Ｖ５−Ｈｉｓ（クローン＃１０）細胞を維持した。
【０４４６】
０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Sigma社製）を用いて細胞を取り出し、遠心分離にかけ、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。１０μｌ中の細胞数を数え、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加した新鮮ＤＭＥＭにおける細胞密度を５．０×１０5細胞／ｍｌに調整した。５．０×１０5細胞／ｍｌと調整した各細胞株の３００μｌを９６ウエルの組織培養プレートのウエル２個ずつに加えた。１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ１５０μｌを各ウエルの下のウエル５個（縦列に５個）に加えた。細胞１５０μｌを次のウエル４個に連続希釈していき、それぞれ５．０×１０5細胞／ｍｌ、２．５×１０5細胞／ｍｌ、１．２５×１０5細胞／ｍｌ、０．６２５×１０5細胞／ｍｌ、０．３１２５×１０5細胞／ｍｌ、０細胞／ｍｌの細胞密度の希釈液を得た。
【０４４７】
１０ｘＣＢＦ１−ＬｕｃにトランスフェクトさせたＣＨＯ−Ｎ２細胞（２．０×１０4トランスフェクトＣＨＯ−Ｎ２細胞／ウエル）１００μｌを含有する９６ウエルプレートに、上記各ウエルから１００μｌを添加し、このプレートを一晩インキュベーターに静置した。
【０４４８】
Ｇ）細胞共培養
５×１０4ＣＨＯ−Ｎ２細胞を９６ウエルプレート上に播いた。ＣＨＯ−デルタ細胞又はＡ２０−デルタ細胞を必要に応じて滴定した（ＣＨＯ−Ｎ２：ＣＨＯ−デルタの最大比率は１：１で、ＣＨＯ−Ｎ２：Ａ２０−デルタの最大比率は１：２）。上記混合物を一晩インキュベーションした後にルシフェラーゼアッセイを行った。
【０４４９】
Ｈ）ルシフェラーゼアッセイ
全ウエルから上清を除去した。ＰＢＳ１００μｌとSteadyGloTMルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega社製）１００μｌを加え、細胞を５分間室温に放置した。この混合物をピペットで上下に２回操作して取り出し、各ウエルからの細胞溶解物と内容物が白色９６ウエルOptiPlate TM（Packard社製）に確実に移した。化学発光（ルミネセンス）はTopCount TM係数器（Packard社製）で測定した。
【０４５０】
試料アッセイの結果（上述の安定ＣＨＯ−ノッチ２−１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃレポーター細胞株と、（Ａ）プレートに固定したヒトデルタ１／Ｉｇ４Ｆｃ融合タンパク質、（Ｂ）プレートに固定したマウスデルタ１／Ｉｇ４Ｆｃ融合タンパク質、（Ｃ）ＣＨＯ／ＣＨＯ−ヒトデルタ１共培養細胞、及び（Ｄ）対応する対照にたいするアクチベーターとしてＡ２０／Ａ２０−マウスデルタ１共培養細胞とを用いる）を図１２Ａ〜Ｄに示す。
【実施例９】
【０４５１】
ノッチリガンド活性を検出するダイナビーズルシフェラーゼアッセイ法
Ｆｃで標識したノッチリガンドを以下のようにして、ビオチン化α−ＩｇＧ−４（Pharmingen [Cat. No. 555879] のクローンＪＤＣ１４を０．５ｍｇ／ｍｌで）と共にストレプトアビジン−ダイナビーズ（Dynal (UK) Ltd; beadsのCELLection Biotin Binder Dynabeads [Cat. No. 115.21] を４．０×１０8ビーズ／ｍｌ）上に固定した。
【０４５２】
アッセイに供する各試料に、２．５×１０7ビーズ（６２．５μｌのビーズを４．０×１０8ビーズ／ｍｌで）及び５μｇのビオチン化α−ＩｇＧ−４を用いた。上記ビーズにＰＢＳを加えて１ｍｌとし、この混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離にかけた。さらに１ｍｌのＰＢＳで混合物を洗浄し、再度遠心分離にかけた。無菌エッペンドルフ管においてビオチン化α−ＩｇＧ−４を含有する最終容量１００μｌのＰＢＳにビーズを再懸濁し、室温で３０分間振盪器に入れた。ＰＢＳを加えて１ｍｌとした混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離にかけ、ＰＢＳをさらに１ｍｌ加えて２回洗浄した。
【０４５３】
上記混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離にかけ、各試料あたり５０μｌのＰＢＳにビーズを再懸濁した。ビオチン化α−ＩｇＧ−４でコーティングしたビーズ５０μｌを各試料に加え、この混合物を一晩４℃下で回転振盪器においてインキュベーションした。この管を１０００ｒｐｍで５分間、室温にて遠心分離にかけた。
【０４５４】
上記ビーズを１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、無菌エッペンドルフ管に移し、さらに１ｍｌのＰＢＳで２回（２×１ｍｌ）洗浄し、遠心分離し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加した最終容量が２５０μｌのＤＭＥＭに再懸濁した（１．０×１０5ビーズ／μｌ）。
【０４５５】
実施例８における安定Ｎ２７＃１１細胞（Ｔ80フラスコ）を、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Sigma社製）を用いて除去し、遠心分離し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。１０μｌ中の細胞数を計数し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加した新鮮ＤＭＥＭを用いて細胞密度を１．０×１０5細胞／ｍｌに調整した。これら細胞１．０×１０5個を１０％（ＨＩ）ＦＣＳとグルタミンとＰ／Ｓを添加したＤＭＥＭ１ｍｌ容量の２４ウエルプレートの各ウエルに播き、インキュベーターに置き、少なくとも３０分間寝かせた。
【０４５６】
ビーズ１００μｌをウエルの最初の２個にそれぞれ加えて１．０×１０7ビーズ／ウエル（１００ビーズ／細胞）とした。次の（２番目の）ウエル２個にビーズ２０μｌをそれぞれ加えて２．０×１０6ビーズ／ウエル（２０ビーズ／細胞）とした。３番目のウエル２個組にビーズ４μｌをそれぞれ加えて４．０×１０5ビーズ／ウエル（４ビーズ／細胞）とした。また、４番目のウエル２個組みには０μｌのビーズを加えた。このプレートを一晩ＣＯ2インキュベーターに置いた。
【０４５７】
ルシフェラーゼアッセイ
全ウエルから上清を除去し、ＰＢＳ１５０μｌとSteadyGloルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega社製）を加えて得た混合物を室温で５分間置いた。
【０４５８】
上記混合物をピペットで上下に２回操作して取り出し、各ウエルからの細胞溶解物と内容物を確実にエッペンドルフ管に移し、１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ビーズペレットは残して清澄上清を白色９６ウエルOptiPlateTM（Packard社製）に移した。TopCountTM（Packard社製）カウンターでルミネセンスを読み取った。
【実施例１０】
【０４５９】
ノッチリガンド活性を検出するダイナビーズELISAアッセイ法
抗ハムスターＩｇＧ１ビオチン化モノクローナル抗体、抗ヒトＩｇＧ４ビオチン化モノクローナル抗体、又はこれら両方の抗体で、Ｍ４５０ストレプトアビジンダイナビーズをコーティングし、室温で２時間攪拌した。
【０４６０】
上記ビーズをＰＢＳ（１ｍｌ）で３回洗浄した。抗ハムスターＩｇＧ１ビーズを抗ＣＤ３ε鎖モノクローナル抗体の共存下でさらにインキュベーションし、抗ヒトＩｇＧ４ビーズをさらにＦｃ−デルタ共存下でインキュベーションし、両方の抗体でコーティングしたビーズは、抗ＣＤ３ε鎖モノクローナル抗体とＦｃ−デルタ両方の共存下でインキュベーションした。これらのビーズを一晩４℃で攪拌し、ＰＢＳ（１ｍｌ）で３回洗浄して再懸濁した。
【０４６１】
Ｔ細胞アッセイは、ＣＤ４+Ｔ細胞とビーズを用いて行った。７２時間後に上清を除去し、実施例３と同様にしてサイトカインをＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１３に示す。
【実施例１１】
【０４６２】
Dynalマイクロビーズ上に固定したデルタ１−ｈＩｇＧ４存在下におけるヒトＣＤ４+Ｔ細胞によるサイトカイン産生の調節
フィコールパーク分離培地（Pharmacia社製）を用い、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を精製した。簡潔に述べると、血液２８ｍｌをフィコールパーク分離培地２１ｍｌの上に載せ、１８〜２０℃下、４０分間４００ｇで遠心分離にかけた。界面からＰＢＭＣを回収し、３回洗浄してからＣＤ４+Ｔ細胞精製に用いた。
【０４６３】
Miltenyi Biotech社製の抗ＣＤ４マイクロビーズを製造者マニュアルに従って用い、ポジティブ選択を行ってヒトＣＤ４+Ｔ細胞を単離した。
上記ヒトＣＤ４+Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及びβ2−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ培地の入った９６ウエルプレート（平底）のウエル３個において１０5ＣＤ４／ウエル／２００μｌ条件下でインキュベーションした。
【０４６４】
Dynalの抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体Ｔ細胞増殖ビーズを細胞に対して１：１の割合（ビーズ／細胞）で用いて、又はプレートに結合した抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１、BD Biosciences社製、５μｇ／ｍｌ）及び可溶性抗ＣＤ２８抗体（クローンＣＤ２８．２、BD Biosciences社製、２μｇ／ｍｌ）を用いて刺激することにより、サイトカイン産生を誘導した。マウスデルタ１ＥＣドメイン−ｈＩｇＧ４融合タンパク質（上述と同様に調製したが、ヒトＩｇＧ４共存下でのインキュベーションは室温で３０〜４０分間で、デルタ−Ｆｃ共存下でのインキュベーションは室温で２時間だった点が異なる）でコーティングしたビーズ、又は対照ビーズをウエルのいくつかに１０：１の割合（ビーズ／細胞）で加えた。インキュベーションから３又は４日後に、３７℃／５％ＣＯ2／湿気条件下で上清を除去し、製造者マニュアルに従って、Pharmingen社製のキットである OptEIA Set human IL10（catalog No. 555157）、OptEIA Set human IL5（catalog No. 555202）、及びOptEIA Set human IFNg（catalog No. 555142）をそれぞれＩＬ−１０、ＩＬ−５及びＩＦＮｇに用い、R&D Systems社製のhuman TNFa DuoSet（catalog No.DY210）をＴＮＦａに用いるＥＬＩＳＡにより、サイトカインの産生を評価した。
結果を図１４〜図１８に示す。
【実施例１２】
【０４６５】
ビーズ：細胞の割合
実施例１１の手順に従ったが、対照ビーズと細胞の割合及びマウスデルタ１−ｈＩｇＧ４融合タンパク質でコーティングしたビーズと細胞の割合を、１６：１から０．２５：１（１６：１、８：１、４：１、２：１、１：１、０．５：１、０．２５：１）の間で種々に変更した点が実施例１１とは異なり、また比較のために、ヒトデルタ１−ｈＩｇＧ４融合タンパク質でコーティングしたビーズも同じ割合で使用した。
結果を図１９に示す。
【実施例１３】
【０４６６】
ＣＤ４５ＲＯ+（記憶細胞）及びＣＤ４５-（ナイーブ細胞）
刺激前にヒトＣＤ４+Ｔ細胞をＣＤ４５ＲＯ+（記憶細胞）とＣＤ４５ＲＯ-（ナイーブ細胞、データはスライド上に示さず）に分けたこと以外は、実施例１１の手順に従った。磁気による分離は、Miltenyi Biotech社製の抗ＣＤ４抗体Multisortマイクロビーズ(cat. No. 551-01)、続けて抗ＣＤ４５ＲＯ抗体マイクロビーズを用いてMiltenyiのプロトコールに従って行った。
結果を図２０に示す。
【実施例１４】
【０４６７】
分極条件下での刺激マウスＣＤ４+細胞におけるサイトカイン産生量の測定
（ｉ）ＣＤ４+細胞の精製
マウス（Balb／ｃ雌、８〜１０週齢、Ｃ５７Ｂ／６雌、８〜１０週齢、ＣＡＲＤ１雌、８〜１０週齢（Ｄ０１１．１０トランスジェニック、ＣＡＲトランスジェニック））から脾臓を摘出し、０．２μＭ細胞ストレイナーを通して２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地（１０％ウシ胎児血清に２ｍM Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５×１０-5Ｍ β−メルカプト−エタノールを加えたＲ１０Ｆ−ＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco Cat No 22409））に移した。細胞懸濁液を遠心分離にかけ（１１５０ｒｐｍ、５分間）、培地を除去した。
【０４６８】
脾臓１個毎に５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（二重蒸留水に０．１５Ｍ ＮＨ4Ｃｌ、１．０Ｍ ＫＨＣＯ3、０．１ｍM Ｎａ2ＥＤＴＡ）を用いて上記細胞を４分間インキュベーションした（赤血球を溶解させるため）。これらの細胞をＲ１０Ｆ培地で一度洗浄し、計数した。製造者マニュアルに従い、Magnetic Associated Cell Sorter（ＭＡＣＳ）カラム（Miltenyi Biotec, Bisley, UK: Cat No 130-042-401）上で、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（Miltenyi Biotec Cat No 130-049-201）を用いてポジティブ選択を行い、懸濁液からＣＤ４+細胞を精製した。
【０４６９】
（ii）抗体のコーティング
１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Pharmingen, San Diego, US: Cat No 553058, Clone No 145-2C11）と1μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ４抗体（Pharmingen Cat No 555878）を添加したダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）を９６ウエルの平底プレートにコーティングした。コーティング混合物１００μｌを各プレートに用いた。プレートを一晩４℃でインキュベーションし、ＤＰＢＳで洗浄した。次に各ウエルに、１００μｌＤＰＢＳ、又は１０μｇ／ｍｌノッチリガンド（マウスデルタ１細胞外ドメイン／Ｉｇ４Ｆｃ融合タンパク質；Ｆｃ−デルタ）を加えた１００μｌＤＰＢＳのいずれかを添加した。これらのプレートを３７℃で２〜３時間インキュベーションし、細胞（（ｉ）と同様にして調製したもの）を添加する前にＤＰＢＳで再度洗浄した。
【０４７０】
（iii）初回ポリクローナル刺激
上述の（ii）に従って事前コーティングした９６ウエルの平底プレートでＣＤ４+細胞を培養した。細胞を計数した後、４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（Pharmingen Cat No 553294, Clone No 37.51）を加えたＲ１０Ｆ培地に２×１０6／ｍｌで再懸濁した。各ウエルに１００μｌの細胞懸濁液を加えた。次に以下に示すように、各ウエルに１００μｌの分極培地又は対照培地を加えて最終容量を２００μｌ（２×１０5細胞／ウエル、抗ＣＤ２８抗体の最終濃度は２μｇ／ｍｌ）とした。
非分極細胞：Ｒ１０Ｆ培地
Ｔｈ１分極細胞：Ｒ１０Ｆ培地＋抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ、Pharmingen Cat No 554432）＋ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Peprotech 210-12）
Ｔｈ２分極細胞：Ｒ１０Ｆ培地＋抗ＩＬ−１２抗体（１０μｇ／ｍｌ、Pharmingen Cat No 554475）＋抗ＩＦＮｇ抗体（１μｇ／ｍｌ、Pharmingen Cat No 554408）＋ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ、Peprotech Cat No 214-14）
これらのプレートを３７℃で７２時間インキュベーションした。
【０４７１】
次に１２５μｌの上清を各ウエルから除去し、R & D Systems（Abingdon, UK）製の抗体ペアを用いるＥＬＩＳＡでＩＬ−１０及びＴＮＦαを調べるまで−２０℃で貯蔵した。次にこれらの細胞を３等分して新しいウエル３個（コーティングせず）に播き、組換えヒトＩＬ−２（２．５ｎｇ／ｍｌ、Pepro Tech Inc, London, UK: Cat No 200-02）を加えたＲ１０Ｆ培地で培養した。
結果を図２１に示す。
【実施例１５】
【０４７２】
遺伝子発現のプロフィール化
（ｉ）細胞培養、処理及びＲＮＡ抽出
２ｍMグルタミン（GibcoBRL社製）、ペニシリン−ストレプトマイシン５０ユニット／ｍｌ（GibcoBRL社製）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Biochrom KG社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０（GibcoBRL社製）でJurkat細胞を培養した。
【０４７３】
抗Ｖ５抗体（Invitrogen社製）及び抗ＣＤ３抗体（ヒト）、抗ＣＤ２８抗体（ヒト）（全てPharMingen社製）を、５μｇ／ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（Gibco BRL）の入った６ウエル組織培養プレート（１ｍｌＰＢＳ／ウエル）に５μｇ／ｍｌで一晩置いた。各ウエルに抗Ｖ５抗体を加え、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ２８抗体を適用しなかったウエルにマウスＩｇＧ1κアイソタイプ対照を１０μｇ／ｍｌで加えた。翌日ＰＢＳでウエルを３回洗浄し、デルタ−Ｖ５−Ｈｉｓタンパク質を５μｇ／ｍｌのＰＢＳに加えた（１ｍｌ／ウエル）。次にプレートを３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。その後Jurkat細胞を、２×１０6細胞／ｍｌの濃度でプレートに播き、３７℃でインキュベーションした。適当なウエルにイオノマイシン（Sigma社製）を１μｇ／ｍｌの濃度で加えた。２、４、８、１８、２４、３６、４８時間後に細胞を取り出し、ＰＢＳにて４℃で一度洗浄し、３００〜６００μｌＲＬＴ溶解液（Qiagen社製）に回収した。刺激効率を確保するため、ＦＡＣＳ分析により、Ｔ細胞活性マーカーの正確な発現を調べた。この実験で用いた全ての細胞は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による活性化の４８時間後にＣＤ６９（初期活性マーカー）を発現していた。
【０４７４】
RNA Easy miniprep kit（Qiagen社製）を製造者指針に従って用い、ＲＮＡを抽出した。推奨されてはいるが任意のDNase工程も行った。フェノール抽出工程を行って、ＲＮＡにおいてタンパク質が完全に消失していることを確認した。次にMessageAmp aRNA Kit（Ambion社製）を製造者指針に基づいて使用し、ＲＮＡを増幅した。その手順を簡潔に述べると、Ｔ７プロモーターを有するオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写を行い、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて得られたＤＮＡのインビトロ転写を行い、試料中の各ｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡ（αＲＮＡ）の複製を数百、数千と作製するものである。
【０４７５】
ここに用いる用語は以下のとおりである。Ｖ５単独処理したウエルに播いた細胞由来のＲＮＡは「Ｖ５」、抗Ｖ５抗体及びデルタ−Ｖ５−Ｈｉｓで処理したウエルに播いた細胞由来のＲＮＡは「デルタ」と表記した。抗Ｖ５抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体で処理したウエルに播いた細胞由来のＲＮＡは「ＣＤ３ＣＤ２８」、抗Ｖ５抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、デルタ−Ｖ５−Ｈｉｓで処理したウエルに播いた細胞由来のＲＮＡは「ＣＤ３ＣＤ２８デルタ」と表記した。同様に、抗Ｖ５抗体で処理し、さらにイオノマイシンで処理したプレートに播いた細胞由来のＲＮＡは「イオノマイシン」、抗Ｖ５抗体、デルタ−Ｖ５−Ｈｉｓで処理し、さらにイオノマイシンで処理したプレートに播いた細胞由来のＲＮＡは「イオノマイシン−デルタ」と表記した。
【０４７６】
（ii）遺伝子発現プロフィール
精製ＰＣＲ産物をガラススライド上に滴下してマイクロアレイを作製した。ｄＣＴＰ−Ｃｙ３又はｄＣＴＰ−Ｃｙ５で標識したヌクレオチドを取り入れる逆転写反応によりαＲＮＡ２μｇを標識してマイクロアレイプローブを調製した。次にプローブの標識及び精製を、Hedge P, Qi R, Abernathy K, Gay C, Dharap S, Gaspard R, Hughes JE, Snesrud E, Lee N, Quackenbush J: A concise guide to cDNA microarray analysis (2000). Biotechniques 29: 548-50, 552-4, 556 passimに記載されているとおりに通常に行った。
【０４７７】
次に精製したプローブをアレイ上にて４２℃下、１０×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳ溶液中で一晩ハイブリダイゼーションした。スライドを、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳにおいて４２℃で７分２回洗浄し、０．１ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにおいて室温で５分２回洗浄し、最後に０．２％ＳＳＣにおいて室温で１回洗浄した。「Ｖ５」と表記した試料をｄＣＴＰ−Ｃｙ３で標識し、ｄＣＴＰ−Ｃｙ５で標識した「デルタ」と表記した試料と同じスライド上で各時点においてハイブリダイズさせた。同様に、ＣＤ３ＣＤ２８と表記した試料をｄＣＴＰ−Ｃｙ３で標識し、ｄＣＴＰ−Ｃｙ５で標識した「ＣＤ３ＣＤ２８デルタ」と名付けた試料と同じスライド上でハイブリダイズさせた。最後に「イオノマイシン」と名付けた試料をｄＣＴＰ−Ｃｙ３で標識し、ｄＣＴＰ−Ｃｙ５で標識した「イオノマイシンデルタ」と表記した試料と同じスライド上でハイブリダイズさせた（表Ｉを参照）。
【０４７８】
【表１５】
2004537314.tif 000016
【０４７９】
乾燥後スライドをGSI Lumonics共焦点スキャナーにかけ、１００％レーザー出力及び６５〜７５％の光電子増倍管効率（バックグラウンドに依存する）でスキャンした。スライド画像は次のようにして処理した。個々に滴下したクローンに伴うシグナルを示すアレイスポットをQuantarrayアプリケーション（GSI Lumonic社製）により同定し、定量した。遺伝子発現強度を示す数値は上記アプリケーションに搭載のヒストグラム法により計算した。値は、各スポットの画素シグナル分布の積分として計算し、局所バックグラウンド値を減算した（生データ）。
【０４８０】
（iii）データプロセシング
全てのデータ分析にGeneSpring package（Silicon Genetics社製）を使用した。Quantarrayで得た生データをGeneSpringに移し、各遺伝子についてシグナルと対照の強度の比率を各時点において計算した。「デルタ」又は「ＣＤ３ＣＤ２８デルタ」又は「イオノマイシンデルタ」と表記した試料の遺伝子強度を「シグナル」とみなし、「Ｖ５」又は「ＣＤ３ＣＤ２８」又は「イオノマイシン」のいずれかで表記した試料の遺伝子強度を「対照」とみなした。
比率＝「デルタ」における遺伝子のシグナル強度／「Ｖ５」における遺伝子の対照強度
比率＝「ＣＤ３ＣＤ２８デルタ」における遺伝子のシグナル強度／「ＣＤ３ＣＤ２８」における遺伝子の対照強度
比率＝「イオノマイシンデルタ」における遺伝子のシグナル強度／「イオノマイシン」における遺伝子の対照強度
比の値が２を超えるとき、その遺伝子はアップレギュレーションされたとみなし、比の値が０．５未満のとき、その遺伝子はダウンレギュレーションされたとみなした。
【０４８１】
デルタ単独で活性化したプロトコールを示す概略図、及びデルタ活性化のみに反応して発現が亢進する遺伝子の数を示すVennグラフをそれぞれ図２２Ａ及び２２Ｂに示し、対応する経時発現プロフィールを図２３に示す。
【０４８２】
デルタと抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体の両方で活性化するプロトコールを示す概略図、及びデルタによる活性化と抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による活性化を併用したときに反応して発現が亢進するが、デルタによる活性化単独では発現が亢進しなかった遺伝子の数を示すVennグラフをそれぞれ図２４Ａ及び２４Ｂに示し、対応する経時発現プロフィールを図２５に示す。
【０４８３】
デルタによる活性化単独の場合と比較して、デルタによる活性化と抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による活性化を併用したときに反応して発現が亢進する特異的遺伝子のいくつかを図２６に示す。
【実施例１６】
【０４８４】
Jurkat細胞株を用いるレポーターアッセイ
Jurkat細胞は単一の限界希釈液でクローニングすることができないため、メチルセルロース含有培地（ClonaCellTMTCS）を用いた。
【０４８５】
ClonaCellTM Transfected Cell Selection（ＴＣＳ）培地（StemCell Technologies, Vancouver, Canada and Meylan, France）を製造者ガイドラインに従って使用し、Jurkat E6.1細胞（リンパ芽球細胞株；ＡＴＣＣ ＮｏＴＩＢ−１５２）をクローニングした。
【０４８６】
Biorad Gene Pulser II electroporatorを用い、以下のようにしてプラスミドpLOR92（上述のとおりに調製）をJurkat E6.1細胞にエレクトロポレーションした。
活発に分裂している細胞を遠心分離にかけ、１０％熱不活化ＦＣＳとグルタミンとペニシリン／ストレプトマイシンを含有する氷温のＲＰＭＩ培地（完全ＲＰＭＩ）に２．０×１０7細胞／ｍｌで再懸濁した。氷上での１０分後、０．５ｍｌの細胞（すなわち１×１０7細胞）を、２０μｇのプラスミドＤＮＡ（滅菌水に溶かしたEndo-free Maxiprep DNA）を含有する事前冷却済みの４ｍｍエレクトロポレーション用キュベットに移した。これらの細胞に３００ｖ及び９５０μＦでエレクトロポレーションを行い、エッペンドルフ管に入った０．５ｍｌの保温完全ＲＰＭＩ培地に直ちに移した。かかる細胞を小型微量遠心機（microfuge）中にて３０００ｒｐｍで１分間遠心分離にかけ、３７℃で１５分間放置してエレクトロポレーション状態から脱却させた。次に上清を除去し、完全ＲＰＭＩ培地４ｍｌの入った6ウエルディッシュのウエルに移し、３７℃で４８時間放置して抗生物質耐性マーカーを発現させた。
【０４８７】
４８時間後に細胞を遠心分離し、新鮮完全ＲＰＭＩ培地１０ｍｌに再懸濁した。これを１０×１５ｍｌのファルコン管に分割し、事前に温めたClonaCell-TCS培地８ｍｌを加え、続いて選択に用いる抗生物質を１０×最終濃度で１ｍｌ加えた。Ｇ４１８の選択には、Ｇ４１８の最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとしたため、ＲＰＭＩの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を調製し、このうち１ｍｌを各管に加えた。これらの管を反転させてよく混合し、室温で１５分間落ち着かせてから１０ｃｍの組織培養ディッシュに移した。これらを１４日間ＣＯ2インキュベーターに入れ、１４日目に可視コロニーを調べた。
【０４８８】
顕微鏡で視認可能なコロニーをプレートから取り出し、これらのコロニーを９６ウエルプレートから２４ウエルプレートへ、更にＴ２５フラスコへと増殖させた。
【０４８９】
得られたクローンを、リポフェクタミン２０００試薬を用いてそれぞれpLOR91に一時的にトランスフェクトさせ、プレートに結合している不動化ｈＤＬＬ１−Ｆｃ（上述のようにして調製）を含有する９６ウエルプレート上に置いた。状態のよいクローン４個を選択して、さらに調べた。
【０４９０】
次に、プレート結合不動化ｈＤＬＬ１−Ｆｃの存在下及び不在下において、また５０ｎｇ／ｍｌＰＭＡと１μｇ／ｍｌイオノマイシンを最終濃度としたＰＭＡ／イオノマイシン（両方ともSigma社製）の存在下及び不在下において、上記４個のクローンのそれぞれについてルシフェラーゼアッセイを行った。図２７に結果を示す（無処理のJurkat E6.1細胞の結果も比較のために示す）。
【０４９１】
図２８に、選択したクローン２個におけるプレート結合不動化ｈＤＬＬ１−Ｆｃに対する用量反応を示し、無処理のJurkat E6.1細胞の結果も比較のために示す。
【実施例１７】
【０４９２】
種々のイオノマイシン濃度下でのレポーターアッセイ
実施例１６の手順を、１０００、５００、２５０、１２５及び６２．５ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン濃度と対照を用いて繰り返し行った。結果を図２９に示す。
【実施例１８】
【０４９３】
NotchICによるノッチシグナル伝達を用いるレポーターアッセイ
NotchIC構築物
ヒトノッチ１細胞内ドメイン（ＮＩＣ１）を発現ベクターpcDNA3.1（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA and Paisley, UK）にNotI／EcoRI断片としてクローニングした。
【０４９４】
ヒトノッチ１−ＩＣは以下のようにしてクローニングした。
【０４９５】
ヒト胎盤のアレイ化ｃＤＮＡライブラリー（Origene社製）を以下のヒトノッチ１の細胞内ドメインに特異的なプライマーペアを用いるＰＣＲによりスクリーニングした。
【０４９６】
【表１６】
2004537314.tif 000017
【０４９７】
ＰＣＲにはMJ TetradＰＣＲ機器を使用し、HotStar Taqポリメラーゼ（Qiagen社製）と以下のサイクルパラメーターを用いて行った。
９５℃，  １５分
９４℃，  ３０秒
６５℃，  ３０秒
７２℃，  ４５秒
上記の最後３工程を３０サイクル行い、続いて、
７２℃，  １０分
１６℃，  ソーク（soak）
上記の条件下において、プライマーはヒトノッチ１ｃＤＮＡ標的から５００ｂｐの特異的診断用産物を作製する。このＰＣＲスクリーニングプロトコールを用いることにより、ポジティブなヒトノッチ１クローン（＃３）を同定し、配列決定を行い、その同一性を確認した。その後、以下のプライマーを用い、＃３から細胞内ドメインを増幅した。
【０４９８】
【表１７】
2004537314.tif 000018
【０４９９】
ＰＣＲにはMJ TetradＰＣＲ機器を使用し、PfuＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）と以下のサイクルパラメーターを用いて行った。
９４℃，  ２分
９４℃，  ４５秒
５８℃，  ４５秒
７２℃，  ３分
上記の最後３工程を２０サイクル行い、続いて、
７２℃，  １０分
１６℃，  ソーク
これにより、ヒトノッチ１の細胞内ドメインに相当する約２．６ｋｂの特異的産物が作製される。このＰＣＲ産物はBamHI及びXhoI（これらの部位はアンプライマー内に存在する）によって消化させ、哺乳類発現ベクターpcDNA3.1（Invitrogen社製）内に、このベクターの複数クローニング部位に存在するBamHI及びXhoI部位を用いてクローニングした。ヒトノッチ１−ＩＣの配列を配列決定して確認したところ、このクローニング配列がコードするタンパク質配列は以下のとおりである。
【０５００】
【表１８】
2004537314.tif 000019
【０５０１】
上記配列の５´末端に位置するメチオニン及びアラニン残基は内因性残基ではなく、メチオニンは開始配列を形成するため、またアラニンはクローニングを容易にするために取り込まれたものである。
【０５０２】
Jurkatトランスフェクション
１０％ウシ胎児血清とグルタミンとペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地でJurkat E6.1をルーティンに従って培養した。
【０５０３】
構築物（上述の実施例８のpLOR91と上記のＮＩＣ１構築物）を、０．５ｍｌ量の冷温培地において９５０μＦ及び３００Ｖでのエレクトロポレーションにより細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、直ちに細胞を温培地に移し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、３０秒）にかけて静かにペレット化した。これらの細胞をペレットとしてインキュベーターにて２０分間インキュベートし、その後６ウエルディッシュ中の６ｍｌの新鮮培地に移入した。かかる細胞を一晩インキュベーションし、洗浄し、計数して、平底９６ウエルプレートに、約１５００００細胞／ウエルで、５０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ、５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン、５μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＤ３抗体、１μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＤ２８抗体の各刺激の存在下又は不在下で播いた。次にこれらの細胞を再度一晩インキュベーションしてから上述のとおり（Promega社製のSteadyGlo）通常にルシフェラーゼ活性を測定し、Hewlett-Packard社製のTopCountルミノメーターで読み取った。図３０に結果を示す。
【０５０４】
上述の明細書で言及した文献は全て参考文献として本明細書に添付している。当技術分野の専門家にとっては、本発明の範囲や精神から逸脱することなく本発明で記載した方法やシステムに種々の修正や変更を加えることは自明である。本発明は具体的に好適な実施態様との関連で記載しているが、ここにクレームする本発明は、かかる具体的実施態様に不当に限定されるべきではない。実際、本発明を実施するためにここに記載した方法に加える、生化学及びバイオテクノロジー又はそれらの関連分野における専門家にとっては自明の種々の修正は以下に記載する特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０５０５】
【図１】ノッチシグナル伝達経路の代表的な概略図である。
【図２】ノッチシグナル伝達経路の代表的な概略図である。
【図３】ノッチ、及びノッチシグナル伝達における免疫細胞モジュレーターのスクリーニングに用いる免疫細胞シグナル伝達経路の例を示す概略図である。
【図４】実施例１〜９のアッセイの概略を示す図である。
【図５】実施例１〜９のアッセイの概略を示す図である。
【図６】実施例１〜９のアッセイの概略を示す図である。
【図７】実施例３の結果を示す図である。
【図８】実施例４の結果を示す図である。
【図９】実施例５の結果を示す図である。
【図１０】実施例６の結果を示す図である。
【図１１】実施例７の結果を示す図である。
【図１２】実施例８の結果を示す図である。
【図１３】実施例１０の結果を示す図である。
【図１４】実施例１１の結果を示す図である。
【図１５】実施例１１の結果を示す図である。
【図１６】実施例１１の結果を示す図である。
【図１７】実施例１１の結果を示す図である。
【図１８】実施例１１の結果を示す図である。
【図１９】実施例１２の結果を示す図である。
【図２０】実施例１３の結果を示す図である。
【図２１】実施例１４の結果を示す図である。
【図２２】実施例１５の結果を図式化して示す図である。
【図２３】実施例１５の結果を図式化して示す図である。
【図２４】実施例１５の結果を図式化して示す図である。
【図２５】実施例１５の結果を図式化して示す図である。
【図２６】実施例１５の結果を図式化して示す図である。
【図２７】実施例１６の結果を示す図である。
【図２８】実施例１６の結果を示す図である。
【図２９】実施例１７の結果を示す図である。
【図３０】実施例１８の結果を示す図である。
【図３１】ノッチリガンドであるジャグド及びデルタの概略を示す図である。
【図３２】種々のショウジョウバエ及び哺乳類のノッチリガンドにおけるＤＳＬドメインの整列アミノ酸配列である。
【図３３】ヒトデルタ１、デルタ３及びデルタ４のアミノ酸配列である。
【図３４】ヒトジャグド１及びジャグド２のアミノ酸配列である。
【図３５】ヒトノッチ１のアミノ酸配列である。
【図３６】ヒトノッチ２のアミノ酸配列である。
【図３７】ノッチ１−４の概略を表す図である。
【図３８】NotchICの概略を表す図である。
【図１】
2004537314.tif 000020
【図２】
2004537314.tif 000021
【図３】
2004537314.tif 000022
【図４】
2004537314.tif 000023
【図５】
2004537314.tif 000024
【図６】
2004537314.tif 000025
【図７】
2004537314.tif 000026
【図８】
2004537314.tif 000027
【図９】
2004537314.tif 000028
【図１０】
2004537314.tif 000029
【図１１】
2004537314.tif 000030
【図１２】
2004537314.tif 000031
【図１３】
2004537314.tif 000032
【図１４】
2004537314.tif 000033
【図１５】
2004537314.tif 000034
【図１６】
2004537314.tif 000035
【図１７】
2004537314.tif 000036
【図１８】
2004537314.tif 000037
【図１９】
2004537314.tif 000038
【図２０】
2004537314.tif 000039
【図２１】
2004537314.tif 000040
【図２２】
2004537314.tif 000041
【図２３】
2004537314.tif 000042
【図２４】
2004537314.tif 000043
【図２５】
2004537314.tif 000044
【図２６】
2004537314.tif 000045
【図２７】
2004537314.tif 000046
【図２８】
2004537314.tif 000047
【図２９】
2004537314.tif 000048
【図３０】
2004537314.tif 000049
【図３１】
2004537314.tif 000050
【図３２】
2004537314.tif 000051
【図３３】
2004537314.tif 000052
【図３４】
2004537314.tif 000053
【図３５】
2004537314.tif 000054
【図３６】
2004537314.tif 000055
【図３７】
2004537314.tif 000056
【図３８】
2004537314.tif 000057
【国際公開パンフレット】
2004537314.tif 000058
2004537314.tif 000059
2004537314.tif 000060
2004537314.tif 000061
2004537314.tif 000062
2004537314.tif 000063
2004537314.tif 000064
2004537314.tif 000065
2004537314.tif 000066
2004537314.tif 000067
2004537314.tif 000068
2004537314.tif 000069
2004537314.tif 000070
2004537314.tif 000071
2004537314.tif 000072
2004537314.tif 000073
2004537314.tif 000074
2004537314.tif 000075
2004537314.tif 000076
2004537314.tif 000077
2004537314.tif 000078
2004537314.tif 000079
2004537314.tif 000080
2004537314.tif 000081
2004537314.tif 000082
2004537314.tif 000083
2004537314.tif 000084
2004537314.tif 000085
2004537314.tif 000086
2004537314.tif 000087
2004537314.tif 000088
2004537314.tif 000089
2004537314.tif 000090
2004537314.tif 000091
2004537314.tif 000092
2004537314.tif 000093
2004537314.tif 000094
2004537314.tif 000095
2004537314.tif 000096
2004537314.tif 000097
2004537314.tif 000098
2004537314.tif 000099
2004537314.tif 000100
2004537314.tif 000101
2004537314.tif 000102
2004537314.tif 000103
2004537314.tif 000104
2004537314.tif 000105
2004537314.tif 000106
2004537314.tif 000107
2004537314.tif 000108
2004537314.tif 000109
2004537314.tif 000110
2004537314.tif 000111
2004537314.tif 000112
2004537314.tif 000113
2004537314.tif 000114
2004537314.tif 000115
2004537314.tif 000116
2004537314.tif 000117
2004537314.tif 000118
2004537314.tif 000119
2004537314.tif 000120
2004537314.tif 000121
2004537314.tif 000122
2004537314.tif 000123
2004537314.tif 000124
2004537314.tif 000125
2004537314.tif 000126
2004537314.tif 000127
2004537314.tif 000128
2004537314.tif 000129
2004537314.tif 000130
2004537314.tif 000131
2004537314.tif 000132
2004537314.tif 000133
2004537314.tif 000134
2004537314.tif 000135
2004537314.tif 000136
2004537314.tif 000137
2004537314.tif 000138
2004537314.tif 000139
2004537314.tif 000140
2004537314.tif 000141
2004537314.tif 000142
2004537314.tif 000143
2004537314.tif 000144
2004537314.tif 000145
2004537314.tif 000146
2004537314.tif 000147
2004537314.tif 000148
2004537314.tif 000149
2004537314.tif 000150
2004537314.tif 000151
2004537314.tif 000152
2004537314.tif 000153
2004537314.tif 000154
2004537314.tif 000155
2004537314.tif 000156
2004537314.tif 000157
2004537314.tif 000158
2004537314.tif 000159
2004537314.tif 000160
2004537314.tif 000161
2004537314.tif 000162
2004537314.tif 000163
2004537314.tif 000164
2004537314.tif 000165
2004537314.tif 000166
2004537314.tif 000167
2004537314.tif 000168
2004537314.tif 000169
2004537314.tif 000170
2004537314.tif 000171
2004537314.tif 000172
2004537314.tif 000173
2004537314.tif 000174
2004537314.tif 000175
2004537314.tif 000176
2004537314.tif 000177
2004537314.tif 000178
2004537314.tif 000179
2004537314.tif 000180
2004537314.tif 000181
2004537314.tif 000182
2004537314.tif 000183
2004537314.tif 000184
2004537314.tif 000185
2004537314.tif 000186
2004537314.tif 000187
2004537314.tif 000188
2004537314.tif 000189
2004537314.tif 000190
2004537314.tif 000191
2004537314.tif 000192
2004537314.tif 000193
2004537314.tif 000194
2004537314.tif 000195
2004537314.tif 000196
2004537314.tif 000197
2004537314.tif 000198
2004537314.tif 000199
2004537314.tif 000200
2004537314.tif 000201
2004537314.tif 000202
2004537314.tif 000203
2004537314.tif 000204
2004537314.tif 000205
2004537314.tif 000206
2004537314.tif 000207
2004537314.tif 000208
2004537314.tif 000209
2004537314.tif 000210
2004537314.tif 000211
2004537314.tif 000212
2004537314.tif 000213
2004537314.tif 000214
2004537314.tif 000215
2004537314.tif 000216
2004537314.tif 000217
2004537314.tif 000218
2004537314.tif 000219
2004537314.tif 000220
2004537314.tif 000221
2004537314.tif 000222
2004537314.tif 000223
2004537314.tif 000224
2004537314.tif 000225
2004537314.tif 000226
2004537314.tif 000227
2004537314.tif 000228
2004537314.tif 000229
2004537314.tif 000230
2004537314.tif 000231
2004537314.tif 000232
2004537314.tif 000233
2004537314.tif 000234
2004537314.tif 000235
2004537314.tif 000236
2004537314.tif 000237
2004537314.tif 000238
【国際調査報告】
2004537314.tif 000239
2004537314.tif 000240
2004537314.tif 000241