(57)【要約】本発明は、ｐＨがＶＲ１受容体に対するＲＴＸの親和性を変えるアッセイを記述する。ＲＴＸの親和性は、ｐＨを４．１から８．６まで増大させることに伴い増大された。ＲＴＸの親和性およびＲＴＸ結合部位の見かけの数の双方が、ｐＨを８．６から１０．６まで増大させることに伴い減少された。高いｐＨは細胞膜を変性させるかもしれない。これらのｐＨ条件（ｐＨ８．０ないしｐＨ９．０）は、高いＳ／Ｎ比を提供し、より確固たるアッセイを与え、そしてより少ない実験材料の使用を必要とする。
2004511803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）約７．５ないし約１０．０の範囲のｐＨを有する水性溶液中で、試験化合物、標識リガンドおよびバニロイド受容体タンパク質の少なくともリガンドと相互作用する部分を含んで成る液体組成物を形成すること；
（ｂ）試験化合物および標識リガンドをバニロイド受容体と接触させるのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートすること；
（ｃ）タンパク質に結合された標識リガンドの量を測定すること；ならびに
（ｄ）期待される標識リガンドの量の減少を観察することにより、試験化合物が受容体に結合したかどうかを決定すること
の段階を含んで成る、バニロイド受容体へのリガンド結合の測定方法。
【請求項２】
バニロイド受容体タンパク質のリガンドと相互作用する部分が、無傷のバニロイド受容体タンパク質である、請求項２記載の方法。
【請求項３】
バニロイド受容体がヒトバニロイド受容体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ｐＨが約８．０ないし約９．５の範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ｐＨが約８．１ないし約９．１の範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項６】
標識リガンドが放射標識リガンドである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
放射標識リガンドがトリチウム化レシニフェラトキシンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
結合されない標識リガンドを溶液から除去すること；および受容体タンパク質を単離すること
の、インキュベート段階後の段階を付加的に含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項９】
水性緩衝液が、
（ａ）約１ないし約５ｍＭの間の最終濃度のマグネシウム；および
（ｂ）約０．１ｍＭないし約２ｍＭの最終濃度のカルシウム
よりなる群から選択される二価陽イオンをさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
マグネシウム濃度が約２ｍＭである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
カルシウム濃度が約０．８ｍＭである、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
バニロイド受容体がヒトバニロイド受容体である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
除去段階が、十分な量のα１酸糖タンパク質を水性溶液に添加して結合されない標識リガンドを吸着させることを含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
段階が順序正しく実施される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
単離段階が除去段階の前に実施される、請求項９記載の方法。
【請求項１６】
正しい順序の段階
（ａ）約７．５ないし約１０．０の範囲のｐＨを有する水性溶液中で、試験化合物、標識リガンドおよびバニロイド受容体タンパク質（前記タンパク質は細胞膜の一部と会合される）を組合せること；
（ｂ）試験化合物およびリガンドがバニロイド受容体と接触するのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートすること；
（ｃ）十分な量のα１糖タンパク質を該溶液に添加して結合されない標識リガンドを吸着させること；
（ｄ）水性溶液から膜を単離すること；
（ｅ）膜中のタンパク質に結合された標識リガンドの量を測定すること；ならびに
（ｆ）期待される標識リガンドの量の減少を観察することにより、試験化合物が受容体に結合したかどうかを決定すること
を含んで成る、バニロイド受容体へのリガンド結合の測定方法。
【請求項１７】
正しい順序の段階
（ａ）約８．６のｐＨを有する水性溶液中で、試験化合物、放射標識レシニフェラトキシンおよびヒトバニロイド受容体−１（ＶＲ１）タンパク質（前記タンパク質は細胞膜の一部である）を組合せること；
（ｂ）試験化合物およびレシニフェラトキシンがバニロイド受容体と接触するのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートすること；
（ｃ）十分な量のα１酸糖タンパク質を該溶液に添加して結合されないレシニフェラトキシンを吸着させること；
（ｄ）膜を水性溶液から単離すること；
（ｅ）膜中のタンパク質に結合されたレシニフェラトキシンの量を測定すること；ならびに
（ｆ）期待されるレシニフェラトキシンの量の減少を観察することにより、試験化合物が受容体に結合したかどうかを決定すること
を含んで成る、バニロイド受容体への化合物の結合の測定方法。
【請求項１８】
緩衝液が、
（ａ）約２ｍＭの最終濃度のマグネシウム；および
（ｂ）約０．８ｍＭの最終濃度のカルシウム
よりなる群から選択される二価陽イオンもまた含有する、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、２０００年１０月１６日に出願されかつ“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｌｉｇａｎｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｓｓａｙｓ　ｆｏｒ　Ｖａｎｉｌｌｏｉｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（バニロイド受容体についての改良リガンド結合アッセイ）”と題された米国仮出願第６０／２４０，６２８号明細書からの優先権を主張する。
【０００２】
有害な化学的、熱的および機械的刺激は、知覚神経節（例えば後根、節状および三叉神経節）中の小径の知覚ニューロン（侵害受容器）の末梢神経末端を興奮させ、そして疼痛として認識されるシグナルを発する。これらのニューロンは、炎症もしくは虚血状態の間に細胞外間隙中で変化を生じさせる、有害なもしくは潜在的に有害な刺激（例えば熱）、局所組織アシドーシスにより引き起こされる組織損傷、および物理的動き（例えば組織伸長）の検出に決定的に重要である（ＷａｌｌとＭｅｌｚａｃｋ、１９９４）。
【０００３】
「辛い」トウガラシ中の主刺激成分、カプサイシン（８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド）およびその類似物は、バニロイド受容体と呼ばれる特定の膜認識部位で相互作用する。これらの受容体は侵害受容および神経因性炎症に関与する一次知覚ニューロンによりほとんど独占的に発現される（ＢｅｖａｎとＳｚｏｌｃｓａｎｙｉ、１９９０）。カプサイシンは、薄くもしくは無鞘の侵害受容求心体（ａｆｆｅｒｅｎｔ）の非常に選択的な活性化物質である（Ｓｚｏｌｃｓａｎｙｉ、１９９３；Ｓｚｏｌｃｓａｎｙｉ、１９９６）。カプサイシンは選択的アンタゴニスト、カプサゼピンにより封鎖されることができる。別のリガンドは、ナノモル濃度の親和性でカプサイシン結合部位で結合する分子、強力な三環性ジテルペン、レシニフェラトキシン（ＲＴＸ）（Ｓｚｏｌｃｓａｎｙｉら、１９９１）である。
【０００４】
最近、カプサイシンの１受容体（ＶＲ１）がラットからクローン化され（Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９７）、そしてＨ＋（低ｐＨ）および熱の同時検出体（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｓｅ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）であることが示された（Ｔｏｍｉｎａｇａら、１９９８）。ＶＲ１は後根神経節の小型の侵害受容ニューロン中で発現され、末梢疼痛の調節におけるその役割と矛盾しない（Ｔｏｍｉｎａｇａら、１９９８）。ＶＲ１は、顕著な外への整流性を示すリガンド依存性の非選択的陽イオンチャンネルである（Ｃａｔｅｒｉｎａら、１９９７）。バニロイド（「カプサイシン」）受容体ＶＲ１はカプサイシンおよびＲＴＸにより活性化され、また、ＶＲ１の活性化はアンタゴニスト、カプサゼピン（ＣＰＺ）；（Ｂｅｖａｎら、１９９２）およびルテニウムレッド（ＲＲ；（Ｗｏｏｄら、１９９８））により封鎖される。最近、ラットＶＲ１およびＶＲ２、ならびにヒト配列の部分的ｃＤＮＡ配列が、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ　９９／０９１４０号明細書に開示された。
【０００５】
ＶＲ１受容体の密度は、［３Ｈ］ＲＴＸ結合アッセイ（ＳｚａｌｌａｓｉとＢｌｕｍｂｅｒｇ、１９９０；ＳｚａｌｌａｓｉとＢｌｕｍｂｅｒｇ、１９９３）を使用して試験することができる。事実、ＶＲ１受容体の高発現がラットおよびヒトの脊髄および後根神経節で観察された（Ｓｚａｌｌａｓｉら、１９９３；ＳｚａｌｌａｓｉとＧｏｓｏ、１９９４；Ａｃｓら、１９９４）。プロトンはＶＲ１受容体への［３Ｈ］ＲＴＸ結合を阻害した（Ｓｚａｌｌａｓｉら、１９９５）。
【０００６】
ＶＲ−１受容体を使用する以前のリガンド結合アッセイは、ｐＨが生理学的条件に近いはずであることを教示する。これらのアッセイにおいて、リガンド結合は、ｐＨ８．０およびｐＨ９．０でそれぞれ５０％および７０％だけ低下された（ＳｚａｌｌａｓｉとＢｌｕｍｂｅｒｇ、１９９３）。
【０００７】
（発明の要約）
当該技術分野で示唆されるものと対照的に、本発明は、バニロイド受容体のある種のリガンドの結合能力がｐＨ７．４より大きいｐＨ値で増大するという驚くべき発見を提供する。本発明は、約７．５〜１０．０の範囲のｐＨの水性緩衝液中で結合する既知の放射標識リガンドおよび試験化合物の競争的バニロイド受容体結合を測定するための改良アッセイを提供する。本発明はまた、二価陽イオンもまたバニロイド受容体のある種のリガンドの結合能力を増大させるという発見も提供する。従って、本発明の方法に使用される水性溶液は、一成分として二価陽イオンを有利に包含してよい。
【０００８】
本発明の方法はバニロイド受容体に結合する化合物を見出すのに有用である。
【０００９】
（発明の詳細な記述）
カプサイシンは、式：
【００１０】
【化１】
2004511803.tif 000003
【００１１】
の化合物である。
【００１２】
カプサゼピンは、式：
【００１３】
【化２】
2004511803.tif 000004
【００１４】
の化合物である。
【００１５】
レシニフェラトキシンは、式：
【００１６】
【化３】
2004511803.tif 000005
【００１７】
の化合物である。
【００１８】
本発明は、段階
（ａ）約７．５ないし約１０．０の範囲のｐＨを有する水性溶液中で、試験化合物、標識リガンドおよびバニロイド受容体タンパク質の少なくともリガンドと相互作用する部分を含んで成る液体組成物を形成すること；
（ｂ）試験化合物および標識リガンドをバニロイド受容体と接触させるのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートすること；
（ｃ）タンパク質に結合された標識リガンドの量を測定すること；ならびに
（ｄ）期待される標識リガンドの量の減少を観察することにより、試験化合物が受容体に結合したかどうか決定すること
を含んで成る、バニロイド受容体への化合物の結合を測定するための改良アッセイを提供する。
【００１９】
該方法は、場合によっては、結合されない標識リガンド溶液からを除去する段階、およびまた場合によっては受容体タンパク質を単離する段階も包含することができる。
【００２０】
本発明の水性溶液は、適するｐＨを提供するいかなる緩衝種より構成されてもよい。適するｐＨを提供する緩衝剤の選択は当該技術分野で公知である。本発明の方法に適するｐＨは、約７．５ないし約１０．０の範囲、好ましくは約ｐＨ８．０から約９．５まで、より好ましくは約ｐＨ８．１から約９．１まで、そしてとりわけ約ｐＨ８．６である。
【００２１】
本発明の方法に使用することができる、当該技術分野で公知の多様な緩衝剤が存在する。好ましい緩衝剤は、約７．５５のｐｋａをもつＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸である。他の緩衝剤は、限定されるものでないがＭＥＳ（モルホリノエタンスルホン酸、ｐｋａ約６．２）；ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸、ｐｋａ約７．２）；ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸、ｐｋａ約６．８）；およびＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、ｐｋａ約７．５）を挙げることができる。
【００２２】
該溶液は、溶液を含有する容器の表面上へのタンパク質吸着を最小限にする作用物質を含有してよい。こうした作用物質は公知であり、かつ、例えばウシ血清アルブミンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質、またはグリシンのようなアミノ酸を包含する。
【００２３】
有利には、該溶液は二価陽イオンを含有してよい。二価陽イオンの使用は、バニロイド受容体とのリガンド相互作用を高めるためにここで立証されている。とりわけ好ましい二価陽イオンはマグネシウムおよびカルシウムである。他の二価陽イオンを、過度の実験なしにこれらのアッセイで試験かつ使用することができる。二価陽イオンは、好ましくは約０．１ｍＭないし約１０ｍＭの範囲の濃度で使用する。ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡのような二価陽イオンをキレート化する作用物質は、好ましくは該水性溶液中で使用しない。
【００２４】
「試験化合物」という用語は、標識リガンドおよびバニロイド受容体のリガンドと相互作用する部分の結合を妨害する潜在的能力を有する候補分子を指すのに本明細書で使用する。
【００２５】
本発明のアッセイに関連して本明細書で使用されるところの「標識リガンド」という用語は、限定されるものでないが蛍光分子もしくは放射活性標識を挙げることができる検出可能な標識を有するバニロイド受容体タンパク質に結合することが既知のリガンドである。本発明での使用に適する蛍光分子の例は、限定されるものでないが、クマリン、フルオレセインのようなキサンテン色素、ロドールおよびローダミン、レソルフィン、シアニン色素ビマン、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、ルミノールおよびイソルミノール誘導体のようなアミノフタル酸ヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジカノヒドロキノン（ｄｉｃａｎｏｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅｓ）、ならびにユーロピウムおよびテルビウム錯体、ならびに関連化合物を挙げることができる。リガンドを標識するのに使用される放射活性標識の型は、［３Ｈ］、［１４Ｃ］、［３５Ｓ］、［３３Ｐ］、［３２Ｐ］、［１２５Ｉ］および［１３１Ｉ］を包含する多様な既知のβ−粒子放射体もしくはオージェ電子のいずれかを包含し、［３Ｈ］がその相対的安全性のため一般に好ましい。本発明の最も好ましい一態様において、使用される標識リガンドの濃度は、その受容体に対する天然のリガンドの親和性（Ｋｄ）に緊密に合致される。好ましい一標識リガンドは、レシニフェラトキシンもしくはＲＴＸであり、そのトリチウム化された形態は公知である。
【００２６】
「バニロイド受容体タンパク質のリガンドと相互作用する部分」という用語は、該アッセイで使用されているリガンドと相互作用するバニロイド受容体タンパク質の領域（１個もしくは複数）を指す。タンパク質は、典型的には、膜貫通領域、１個もしくはそれ以上の結合ドメイン、細胞内領域、細胞外領域、特定のフォールディングの特徴を包含する領域などを包含する機能領域に分割される。当業者は、これらの機能領域を定義するのに使用することができる、短縮されたフラグメント、変えられた配列をもつ受容体タンパク質、およびキメラタンパク質を創製することが可能である。この場合、該アッセイは、該アッセイで使用されるリガンドに結合するバニロイド受容体の少なくともその部分を組み込むことを企図している。
【００２７】
本発明の方法に適するバニロイド受容体は、いずれかの哺乳動物、とりわけヒト、マウス、ラットおよびサル由来の受容体を包含する。多様なバニロイド受容体タンパク質をコードするいくつかの別個の遺伝子が存在する。それらの多数が本明細書で引用される刊行物で言及されている。好ましいバニロイド受容体は、限定されるものでないがＶＲ−１を挙げることができる、レシニフェラトキシンを結合するものを包含する。ＶＲ−１受容体はヒトＶＲ−１配列（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＮＭ＿０１８７２７として提供されるような）を使用することを包含する当該技術分野で公知の方法を使用して得てよい。
【００２８】
バニロイド受容体は多数の供給源から得ることができる。一例において、バニロイド受容体は、限定されるものでないが、ＳｚａｌｌａｓｉとＢｌｕｍｂｅｒｇ、１９９３により記述されたようなバニロイド受容体を発現する後根神経節を挙げることができる天然の細胞から単離される。別の態様において、バニロイド受容体は、組換えバニロイド受容体をコードするｃＤＮＡを発現する細胞から得られる。好ましくは、バニロイド受容体タンパク質の少なくともリガンドと相互作用する部分を使用する。しかしながら、タンパク質全体を使用してよいか、もしくは、受容体タンパク質のリガンドと相互作用する部分を他のタンパク質の他の部分、例えば他のタンパク質からの１種もしくはそれ以上の膜結合ドメインと組合せてよい。これらのキメラタンパク質は、それでもなおバニロイド受容体タンパク質のリガンド結合特性を保持する。
【００２９】
段階（ａ）の水性溶液の形成後に、リガンドおよびバニロイド受容体、もしくは試験化合物およびバニロイド受容体を接触させるのに十分な時間の間、該溶液をインキュベートする。適するインキュベーション時間の決定方法は、本明細書に記述されるところの実施例を使用して決定することができる。
【００３０】
次に、好ましい一態様においては、結合されない標識リガンドを溶液から除去する。溶液からの結合されない標識リガンドの除去方法は、適する吸着戦略、バニロイド受容体タンパク質が膜結合型である場合は膜分離技術のような当該技術分野で既知の多様な技術のいずれかを使用して、もしくはα１酸糖タンパク質のような分子の使用などにより実施することができる。
【００３１】
本発明のアッセイのさらなる一段階においては、受容体タンパク質を水性溶液から単離する。一態様において、バニロイド受容体タンパク質のリガンド結合ドメインは、細胞膜もしくは人工的膜調製物のような膜と会合する。別の態様においては、バニロイド受容体を可溶性タンパク質として創製する。膜の除去方法もしくは受容体タンパク質の単離方法は当該技術分野で既知であり、そして例えば選択的遠心分離法、吸着段階、カラムクロマトグラフィー、抗体に媒介される沈殿などを包含する。
【００３２】
好ましくは、本発明のアッセイ方法は順序正しく実施するが、しかしながら、当業者は、一例として除去段階および単離段階を一段階として組合せてよいか、もしくは標識された受容体タンパク質からの結合されない標識の除去を助長するいずれかの適する順序で実施してよいことを理解するであろう。従って、一アッセイにおいて、除去段階を単離段階の前に実施してよい一方、別のアッセイにおいては、単離段階および除去段階が単一段階として組合せられる場合にアッセイの形式がより良好に実施されるかもしれな。
【００３３】
本発明のアッセイにおける最終段階として、試験化合物がバニロイド受容体のリガンドと相互作用する部分に結合したかどうかを決定するために、適切な対照などを使用して適する計算および比較がなされる。好ましい一例においては、適する対照が、試験化合物を包含しないアッセイに包含され、そして試験化合物を包含しない対照と試験化合物を包含するサンプルとの間の比較を可能にする。期待される標識リガンドの量の減少が試験化合物の結合を暗示する。
【００３４】
本発明の好ましい一アッセイにおいては、バニロイド受容体タンパク質のリガンドと相互作用する部分が細胞膜と会合され、そして受容体タンパク質を単離する段階は水性溶液から膜を除去することを含んで成る。
【００３５】
本発明は以下の実施例によってより良好に理解することができる。これらの例は好ましい態様の代表であるが、しかし、本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきでない。
【００３６】
実施例１
材料
レシニフェラトキシン、カプサイシンおよびカプサゼピンはリサーチ　バイオケミカル　インターナショナル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（マサチューセッツ州ナティック）から購入した。ＨＥＰＥＳおよびＣＡＳＰＯはシグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス）から購入した。［３Ｈ］レシニフェラトキシン（ＲＴＸ）はＮＥＮ（マサチューセッツ州ボストン）から購入した。ＨＥＫ２９３細胞はヒトバニロイド受容体（ＶＲ１）でトランスフェクトした。
方法
細胞培養。ＨＥＫ２９３細胞は、３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気を含むインキュベータ中、１０％ウシ胎児血清および１×ＰＳＡ（カスケード　バイオロジックス（Ｃａｓｃａｄｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））を含有するＤＭＥＭ（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））中で単層として成長させた。ＨＥＫ２９３−ｈＶＲ１細胞は２００μｇ／ｍｌのゼオシン（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有する同一培地中で成長させた。
膜調製。細胞をハンクス液で洗浄し、解離緩衝液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で解離させ、そしてその後１０００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、５．８ｍＭ　ＮａＣｌ、３２０ｍＭショ糖、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．７５　ＣａＣｌ２および５ｍＭ　ＫＣｌを含有する冷２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中でホモジェナイズし、そして１０００×ｇで１５分間遠心分離した。その後、結果として生じる上清を４０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットにされた膜は−８０℃の冷凍庫中に保った。
［３Ｈ］ＲＴＸ結合アッセイ。アッセイ手順は以前に記述された（ＳｚａｌｌａｓｉとＢｌｕｍｂｅｒｇ、１９９３）ものから改変した。膜からの約１２０μｇタンパク質／ｍｌを、０．２５ｍｇ／ｍｌの脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含有する０．５ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ４．１ないしｐＨ８．６）もしくはＣＡＳＰＯ緩衝液（ｐＨ８．６ないしｐＨ１０．６）中で、示された濃度の［３Ｈ］ＲＴＸとともに３７℃で６０分間インキュベートした。その後、反応混合物を４℃に冷却し、そして０．１ｍｇのα１−酸糖タンパク質を各サンプルに添加し、そして４℃で１５分間インキュベートした。サンプルを１８５００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを含有する微小遠心管の先端を切り離した。非特異的結合は２００ｎＭの未標識ＲＴＸの存在下で試験した。結合された放射活性はシンチレーション計数により定量した。
結果
ｈＶＲ１受容体への［３Ｈ］ＲＴＸ結合に対するｐＨの影響。プロトンはＶＲ１受容体を介するカルシウム流入を刺激することが既知である。プロトンが［３Ｈ］ＲＴＸ結合に影響を及ぼすかどうかを研究するため、膜を、４．２から１０．６までの多様なｐＨ値で［３Ｈ］ＲＴＸとともにインキュベートした。結果は二相性の影響を示した（図１）。［３Ｈ］ＲＴＸ結合はｐＨ４．２からｐＨ８．６までで増大したが、しかしｐＨ８．６からｐＨ１０．６まで減少した。非特異的結合は有意に変化しなかった。
［３Ｈ］ＲＴＸ結合に影響を及ぼすｐＨの機構。観察されたｐＨ変化が結合親和性もしくは結合部位の見かけの密度の変化から生じたかどうかを検討するため、われわれは、ｐＨ５．２、ｐＨ７．４、ｐＨ８．６およびｐＨ９．６で［３Ｈ］ＲＴＸの飽和結合を実施した（図２）。データは各点を二重でアッセイした２回の実験の代表である。該結果は、ｈＶＲ１受容体に対する［３Ｈ］ＲＴＸの親和性（Ｋｄ値）が、結合部位の数（Ｂｍａｘ）の変化を伴わずに５．２から８．６までの増大するｐＨとともに増大した一方、親和性は、結合部位の数の減少を伴い８．６から９．６までの増大するｐＨをとともに減少したことを立証した。
【００３７】
［３Ｈ］ＲＴＸのＫｄ値およびＢｍａｘ値を表１に要約する。
【００３８】
【表１】
2004511803.tif 000006
【００３９】
ＫｄおよびＢｍａｘ値は図２から得た。ＮＤ：決定可能でない。
ｈＶＲ１受容体へのバニロイドリガンドの結合に対するｐＨの影響。多数のバニロイドリガンドを、ｐＨ７．４およびｐＨ８．６の緩衝液中でのｈＶＲ１受容体への［３Ｈ］ＲＴＸの結合を阻害するそれらの能力について試験した。ｐＨ７．４の緩衝液中で、［３Ｈ］ＲＴＸについての競争は、順序：ＲＴＸ＞＞カプサイシン＝カプサゼピンにあった（図３ａ）。同様に、ｐＨ８．６の緩衝液中では、［３Ｈ］ＲＴＸについての競争は、順序：ＲＴＸ＞＞カプサイシン＞カプサゼピンであった（図３ｂ）。ＲＴＸおよびカプサイシンのＩＣ５０値はｐＨ７．４からｐＨ８．６までわずかに減少した（表２）。カプサゼピンのＩＣ５０値はｐＨ７．４からｐＨ８．６まで有意に増大した（表２）。黄色が、ｐＨ８．６のカプサゼピンからの膜ペレット中で見られ、カプサゼピンがその二重（ｄｏｕｂｌｅ）フェノール構造から二重キノール構造まで酸化されたかもしれないことを示唆する。
【００４０】
【表２】
2004511803.tif 000007
【００４１】
ＩＣ５０値は図３から得た。
［３Ｈ］ＲＴＸ結合に対するカルシウムおよびマグネシウムの影響。アッセイへのカルシウムおよびマグネシウムの添加は結合を増大させることが見出され、そしてアッセイをさらに至適化するのに使用した。結合アッセイを、二価陽イオンの包含もしくはキレート化を伴い、ｐＨ８．０の緩衝液を使用して以前に記述されたとおり実施した。図４に見られるとおり、０．７５ｍＭ　ＣａＣｌ２もしくは２ｍＭ　ＭｇＣｌ２のいずれかの存在は、非特異的リガンド結合を増大させることなく、二価陽イオンを欠く緩衝液に比較して総リガンド結合を増大させた。双方の陽イオンの存在はリガンド結合を増大させた。対照的に、二価陽イオンキレート化剤ＥＧＴＡの存在は、リガンド結合の総量を減少させた。
【００４２】
当業者に明白であろう開示された発明の多様な改変、改良および応用が存在することができ、また、本開示はこうした態様を包括することを意図している。本発明はある好ましい態様の情況で記述されたとは言え、該開示の完全な範囲は以下の請求の範囲への参照により判断されることを意図している。
【００４３】
【表３】
2004511803.tif 000008
【００４４】
【表４】
2004511803.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、ｈＶＲ１受容体への［３Ｈ］ＲＴＸ結合に対するｐＨの影響。細胞膜（６０μｇタンパク質／ｍｌ）を、異なるｐＨをもつ緩衝液サンプル中で［３Ｈ］ＲＴＸ（０．４ｎＭ）とともに２５℃で６０分間インキュベートした。結果は、各点を三重でアッセイした２回の実験の代表である。
【図２】
発明にかかる、ｐＨはｈＶＲ１受容体への［３Ｈ］ＲＴＸの親和性を変える。図２Ａ　細胞膜（６０μｇタンパク質／ｍｌ）を、異なるｐＨをもつ緩衝液サンプル中で、変動する濃度の［３Ｈ］ＲＴＸとともに２５℃で６０分間インキュベートした。（ｐＨ５．２、ｐＨ７．４およびｐＨ８．６）
図２Ｂ：細胞膜（６０μｇタンパク質／ｍｌ）を、異なるｐＨをもつ緩衝液サンプル中で、変動する濃度の［３Ｈ］ＲＴＸとともに２５℃で６０分間インキュベートした。（ｐＨ７．４、ｐＨ８．６およびｐＨ９．６）。
【図３】
発明にかかる、ｐＨ７．４およびｐＨ８．６でのｈＶＲ１受容体への［３Ｈ］ＲＴＸ結合に対するバニロイド類似物の影響。膜を、［３Ｈ］ＲＴＸ（０．４ｎＭ）および変動する濃度のバニロイド類似物とともに３７℃で６０分間インキュベートした。データは各点を二重でアッセイした２回の実験の代表である。結果は、この研究で使用されたバニロイド類似物が、ｐＨ７．４（図３Ａ）およびｐＨ８．６（図３Ｂ）双方で［３Ｈ］ＲＴＸ結合を用量依存的に阻害したことを立証する。ＲＴＸおよびカプサイシンのＥＣ５０値はｐＨ７．４からｐＨ８．６までわずかに減少した。対照的に、カプサゼピンのＥＣ５０値は有意に増大した。
【図４】
発明にかかる、カルシウムおよびマグネシウムは［３Ｈ］ＲＴＸ結合を増大させた。膜をｐＨ８で［３Ｈ］ＲＴＸ（０．２５ｎＭ）とともにインキュベートした。カルシウムおよびマグネシウムなしではシグナルが２０％だけ低下した。ＥＧＴＡ（１０ｍＭ）は［３Ｈ］ＲＴＸ結合を７０％だけ阻害した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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