(57)【要約】表面に細胞死受容体のリガンドを固定化したポリマーの投与により、後発白内障を抑制する。このリガンドは、好ましくは、白内障術後にスペーサーにより水晶体嚢に連結する。このリガンドは、好ましくは、Ｆａｓリガンドである。スペーサーは、好ましくは、ポリエチレングリコールである。このポリマーは、好ましくは、眼内レンズを構成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物の治療用組成物の生産における、ポリマーと共有結合する細胞死受容体リガンドを含む生成物の使用方法。
【請求項２】
前記ポリマーが、固形基質の表面に存在することを特徴とする請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
前記リガンドが、スペーサーを介して前記ポリマーに結合することを特徴とする請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項４】
前記リガンドが、Ｆａｓを認識することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項５】
前記リガンドが、二価以上のＦａｓ抗体であるか、またはＦａｓリガンドであることを特徴とする請求項４に記載の生成物。
【請求項６】
前記ポリマーが、ヒドロゲルであるか、またはエラストマー状であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項７】
前記ポリマーが、シリコーンであることを特徴とする請求項６に記載の使用方法。
【請求項８】
前記生成物が、眼内レンズであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項９】
前記生成物が、創傷被覆材であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１０】
治療方法で、前記ポリマーが、対応する細胞死受容体を発現している細胞の表面に接触することを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１１】
前記細胞が、上皮細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の使用方法。
【請求項１２】
ポリマーと共有結合している細胞死受容体リガンドを含む生成物が、対応する細胞死受容体を発現している細胞の表面にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白内障術後に生じる合併症である後発白内障の治療に関する。特に、本発明は、白内障手術の際に移植される眼内レンズ（ＩＯＬ）表面に、細胞死受容体リガンドを結合させることにより、術後の上皮細胞の増殖および遊走を阻止することに関する。好ましくは、このリガンドはＦａｓ受容体と結合する。
【背景技術】
【０００２】
眼の水晶体の混濁、すなわち白内障は、視力障害の主要な原因である。世界中で、２千万人が白内障により両眼ともに盲目である。高齢化社会を迎え、この数字は２０２０年までには倍増すると考えられる１。白内障手術は、選択的手術としては最も一般的なものである。英国内だけでも、手術数は毎年１７５，０００例を越えている。
【０００３】
白内障手術では、通常、４〜５ｍｍの円形をした水晶体前嚢片が除去される（前嚢切開）。この円形の開口部から、混濁した水晶体の超音波液化および吸引を行い、嚢（水晶体嚢）の残部はそのままにしておく。水晶体嚢内に人工眼内レンズを埋め込む。この処置に反応して瘢痕化が起こることが後発白内障（ＰＣＯ）であり、現在行われている白内障手術による最も一般的な合併症である。
【０００４】
天然の水晶体では、水晶体前嚢の内側は単層立方上皮で裏打ちされており、水晶体後嚢には細胞はない。ＰＣＯは、術後の水晶体上皮細胞（ＬＥＣ）の増殖、後方遊走、および線維芽細胞様細胞への形質転換によって仲介される（例えば、非特許文献１：Ａｐｐｌｅ  ＤＪ，  Ｓｏｌｏｍｏｎ  ＫＤ，  Ｔｅｔｚ  ＭＲ．  Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｏｐａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．（「後発白内障」）  Ｓｕｒｖ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９９２；  ３７：  ７３−１１６参照）。
ＬＥＣを破壊するための確実な方法が提供されれば、ＰＣＯを予防することができるだろう。また、ＬＥＣの破壊は、正常な嚢組織の伸展性の維持に役立ち、自然の遠近調節力、すなわち老眼鏡なしで近くの指標に焦点を合わせる能力を回復させるため、柔軟な「形状記憶」ＩＯＬ用材料を用いる可能性が高くなるだろう（例えば、非特許文献２：Ａｌｌａｎ  ＢＤＳ．  Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｌｅｎｓ  ｉｍｐｌａｎｔｓ．（「眼内レンズ」）  ＢＭＪ２０００；  ３２０：  ７３−７４参照）。
【０００５】
概して、ＰＣＯ治療のために２年以内にレーザーによる嚢切開が、２５％の患者で必要となる（例えば、非特許文献３：Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ  ＤＡ，  Ｄａｎａ  ＭＲ，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎ  ＷＧ，  Ｇｌｙｎｎ  ＲＪ．  Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｏｐａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．（「後発白内障発生の系統的概要」Ｏｐｈｔｈｌａｌｍｏｌｏｇｙ  １９９８；  １０５：  １２１３−２１参照）。新しい眼内レンズ用アクリル材料により、ＰＣＯは減ってはいるが、完全になくなってはいない。ある種の現代のアクリル製ＩＯＬを用いた時のレーザーによる嚢切開の実施率はわずか５％であると考えられる（例えば、非特許文献４：Ｕｒｓｅｌｌ  ＰＧ，  Ｓｐａｌｔｏｎ  ＯＪ，  Ｐａｎｄｅ  ＭＶ，  Ｈｏｌｌｉｃｋ  ＥＪ，  Ｂａｒｍａｎ  Ｓ，  Ｂｏｙｃｅ  Ｊ，  Ｔｉｌｌｉｎｇ  Ｋ．  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｌｅｎｓ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｏｐａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．（「眼内レンズ医用材料と後発白内障との関係」Ｊ  Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ  Ｓｕｒｇ  １９９８；  ２４：  ３５２−６０参照）。しかし、この介入率はおそらく、ＬＥＣ増殖による術後の視力低下の多様な段階の最も進んだ段階を反映しているに過ぎない。また、ＬＥＣがより新しいＩＯＬ材料と接触することで、浸潤しているＬＥＣの退行が起こると考えられるメカニズムは、未だ明らかにされていない（例えば、非特許文献５：Ｄｕｎｃａｎ  Ｇ．  Ｌｅｎｓ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｏｐａｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ．  （「水晶体細胞の増殖と後発白内障：ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの観察結果」）Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９９８；  ８２：  １１０２−１１０３参照）。
【０００６】
細胞毒性薬剤を輸送することによりＬＥＣを破壊することへの様々な薬理学的アプローチが検討されている。例としては、ＬＥＣエピトープを標的とするリシン結合モノクローナル抗体の術中注射（例えば、非特許文献６：Ｔａｒｓｉｏ  ＪＥ，  Ｋｅｌｌｅｈｅｒ  ＰＪ，  Ｔａｒｓｉｏ  Ｍ，  Ｅｍｅｒｙ  ＪＭ，  Ｌａｍ  ＤＭ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｌｅｎｓ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｂｙ  ４１９７Ｘ−ｒｉｃｉｎ  Ａ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｎｇａｔｅ．  （「４１９７Ｘ−リシンＡ免疫複合体による水晶体嚢細胞増殖の阻害。」）Ｊ  Ｃａｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ  Ｓｕｒｇ  １９９７；  ２３：  ２６０−６６参照）およびポリメチルメタクリレート製水晶体の表面からのタブシガーギンの術後拡散（例えば、非特許文献７：Ｄｕｎｃａｎ  Ｇ，  Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ  ＩＭ，  Ｌｉｕ  ＣＳＣ．  Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ  ｃｏａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｌｅｎｓｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｎｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．  （「タプシガーギンをコーティングした眼内レンズは、ヒト水晶体上皮細胞の増殖を阻害する。」）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １９９７；  ３：  １０２６−１０２８参照）が挙げられる。いかなる流体相アプローチの場合も避けられない問題は、水晶体上皮に送達されない薬剤画分に起因する副次的損傷である。
【０００７】
白内障手術、およびその他、創傷被覆材や上皮癌治療のための治療用被覆材（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）を含む多くの適用において、組織や体液と接触する際に細胞死が起こるように、材料表面を改変することが望ましいだろう。
【０００８】
ある種の材料は、細胞の癒着および増殖がおこらないような抵抗性をもつことが知られている。ＩＯＬ表面には、細胞の癒着および生体適合性をコントロールするための処理が施されてきた。ＩＯＬ等の基質には、血小板の吸着および活性化に対する基質の抵抗性を高めるため、へパリンを結合させてきた。抗体およびその他の特異的な結合タンパク質（ビオチンやアビジン等）を、表面または可溶性ポリマー基質に結合させることで、基質に望ましい性質を付与することができることが知られている。また、ペプチドリガンドまたはタンパク質リガンドを結合させる際、リガンドの活性部位を、その受容体と相互作用するようにフリーな状態にしておくために、リガンドとリガンドを結合させる基質の間にスペースを設けて結合させることが望ましい場合もあることも知られている。スペーサーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をはじめとする合成ポリマー（オリゴマーを含む）、およびオリゴペプチドが用いられてきた。リガンドはまた、アフィニティークロマトグラフィーで使用するために合成ポリマーに結合させられる。
【０００９】
アポトーシスは、細胞が高度に組織化されたシステムによってプログラムされた死を迎える細胞自殺のメカニズムである。このシステムでは、炎症を引き起こすことなく除去されるように、細胞の構成成分が凝縮する。多くの細胞が、細胞死受容体（ＤＲ）として知られている一群の膜貫通タンパク質を発現する。あるいは、発現するよう誘導可能である。ＤＲが特異的な細胞外リガンド（ＤＲリガンド）と結合すると、その結果、細胞内アポトーシス機構へ膜をはさんでシグナルを送り、アポトーシスを惹起する。ＤＲを発現する腫瘍細胞は多いが、正常な細胞の多くもまた、ＤＲを構成的に発現しているので、ＤＲリガンドによる化学療法は、正常な細胞に対してはあまりに有毒であり、臨床的に有用ではなかった。
【００１０】
最もよく特徴が調べられているＤＲの１つがＦａｓであり、これはＣＤ９５またはＡｐｏｌとしても知られている。Ｆａｓの細胞外ドメインに対する抗体（Ｆａｓ抗体）およびＦａｓリガンドは、アップステート・バイオテクノロジー社、アレクシス・バイオケミカルズ社、およびＤＮＡＸ分子細胞生物学研究所から市販されている。Ｆａｓ抗体の１つは、五量体ＩｇＭであり、機能的Ｆａｓリガンドとして作用し、Ｆａｓを発現することが知られている細胞系においてアポトーシスを活性化する。Ｆａｓは眼の前部に広く発現し（例えば、非特許文献８：Ｗｉｌｓｏｎ  ＳＥ，  Ｌｉ  Ｑ，  Ｗｅｎｇ  Ｊ，  Ｂａｒｒｙ−Ｌａｎｅ  ＰＡ，  Ｊｅｓｔｅｒ  ＪＶ，  Ｌｉａｎｇ  Ｑ，  Ｗｏｒｄｉｎｇｅｒ  ＲＬ．  Ｔｈｅ  Ｆａｓ−Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｒｎｅａ．  （「Ｆａｓ−Ｆａｓリガンドシステムおよびその他の角膜におけるアポトーシスのモジュレーター」Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  １９９６；  ３７：  １５８２−１５９２参照）、発生途上のヒヨコ水晶体においては、ＴＮＦ誘発アポトーシスが同定された（例えば、非特許文献９：Ｗｒｉｄｅ  ＭＡ，  Ｓａｎｄｅｒｓ  ＥＪ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｌｅｎｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＴＮＦａｌｐｈａ．  「水晶体発生における核の変性およびＴＮＦアルファによるその調節」Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  １９９８；  ６６：  ３７１−３８３参照）。様々な環境損傷から細胞が十分に保護されなければ、ＬＥＣアポトーシスによる白内障発生の原因となる可能性がある（例えば、非特許文献１０及び１１：Ｌｉ  ＤＷ−Ｃ，  Ｋｕｓｚａｋ  ＪＲ，  Ｄｕｎｎ  Ｋ，  Ｗａａｎ  Ｒ−Ｒ，  Ｍａ  Ｗ，  Ｗａｎｇ  Ｇ−Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｅｎｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  ｂｅ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｃａｔａｒａｃｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌｓ．  （「水晶体上皮細胞アポトーシスは、ヒトおよび動物の非先天性白内障発生の一般的な細胞学的成因であると考えられる。」）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９５；  １３０：  １６９−１８１  及び  Ｈａｒｏｃｏｐｏｓ  ＧＪ，  Ａｌｖａｒｅｓ  ＫＭ，  Ｋｏｌｋｅｒ  ＡＥ，  Ｂｅｅｂｅ  ＤＣ．  Ｈｕｍａｎ  ａｇｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｃａｔａｒａｃｔ  ａｎｄ  ｌｅｎｓ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．  （「老人性白内障および水晶体上皮細胞死」）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  １９９８；  ３９：  ２６９６−２７０５参照）。
【００１１】
Ｎｉｓｈｉ，Ｏらは、Ａｔａｖａｓｈｉｉ  Ｇａｎｋａ誌  （１９９８年１５巻１０号、１４４５〜１４５０頁中；非特許文献１２）で、白内障手術により除去された白内障水晶体上皮細胞におけるＦａｓ、Ｆａｓリガンド、および細胞内アポトーシスのモジュレーターをはじめとするアポトーシス因子の転写を研究している。Ｎｉｓｈｉ，Ｏらはまた、Ｆａｓを刺激する抗体のＬＥＣアポトーシスに対する効果を研究し、Ｆａｓ刺激抗体がアポトーシスを誘発することを示し、これがＰＣＯを予防する可能性があると推察している。
【００１２】
しかし、白内障術後のＬＥＣにおけるアポトーシス性のシグナル伝達については、未だ調べられていない。
【００１３】
欧州特許出願公開第０，７１６，０９５号（特許文献１）では、Ｆａｓ細胞内ドメインに対する抗体が作成されている。この抗体は、プレートに固定した、Ｆａｓ細胞外ドメインに対する市販のモノクローナル抗体（ＤＮＡＸ研究所製ＤＸ−３）と、Ｆａｓを含むと思われる試料と、Ｆａｓの細胞内ドメインに対する抗体とを使用することによるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いられるものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明によれば、ポリマーと共有結合する細胞死受容体リガンドを含む生成物を、ヒトまたは動物の治療用組成物の生産に用いる新しい使用方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
この新しい方法において、ポリマーは、好ましくは、固形基質の表面に存在する。例えば、ポリマーは、基質のバルク材料を形成してもよいし、また別の材料で形成した本体上のコーティングであってもよいが、安定したコーティングであることが好ましい。本発明はまた、ポリマーが、流体、例えば液体中に溶解されるか、または懸濁されて存在する使用方法であってもよい。
【００１６】
治療方法において、リガンドが結合する表面は、一般に、対応する細胞死受容体を発現している細胞の表面と接触する。リガンドは、細胞死受容体の細胞外ドメインに対する特異的認識部位を有する。リガンドは、細胞死受容体を活性化するような方法でポリマーと結合する必要がある。リガンドは、ＩｇＧまたはＩｇＭ等の抗体であってもよい。この抗体は、天然のＤＲリガンドか、またはＤＲ活性化断片もしくはその誘導体であることが好ましい。細胞は、水晶体上皮細胞や皮膚上皮細胞のような上皮細胞、特に皮膚癌細胞であることが適切である。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、ポリマーと共有結合するＤＲリガンドが提供されるが、スペーサーを介して結合することが好ましい。
【００１８】
ＤＲリガンドを含む表面は、好ましくは、眼内レンズまたはその他の眼内装置の片面または両面である。その装置が、嚢内で光線の経路にある場合、基質ポリマーは、可視光を含む放射線に対して十分に透明である必要がある。基質がレンズである場合、ｉｎ  ｓｉｔｕで適切な屈折率を有する必要がある。ポリマーは、好ましくは、界面接触する連続したリングを形成するために水晶体嚢の内部表面と接触する必要があるが、特に赤道部の周囲で接触するのが好ましい。ポリマーは、水晶体嚢の内部表面と接触するための、連続するリング形状を成すレンズのハプティック（ｈａｐｔｉｃ）を形成してもよいし、または、水晶体に挿入され、赤道部周囲の衰弱もしくは損傷した水晶体嚢を解剖学的に支持する水晶体嚢伸長リングであってもよい。あるいは、ポリマーは、水晶体嚢の裏打ち（ｌｉｎｉｎｇ）を成し、硬化性液体を導入することによって形成されてもよい。硬化性液体はｉｎ  ｓｉｔｕで硬化してポリマーを形成し、嚢内部表面と誘導体化ポリマーとの全面的な界面を提供するものである。また別の方法では、ポリマーは、ゲルであってもよいし、もしくは実質的に嚢をふさぐｐｈａｃｏ−ｅｒｓａｔｚ  ｌｅｎｓ（Ｐａｒｅｌ，  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈ．，  Ｏｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  （１９８６）  ２２４，  １６５  ｅｔ  ｓｅｑ）形成用のエラストマー材料であってもよい。適切なポリマーは、シリコーンオイルおよびシリコーンエラストマー、天然のポリマー等の架橋親水性ポリマー、ポリウレタン、親水性および疎水性ポリアクリル化合物である。このようなすべての適用において、ＤＲリガンドは、ポリマー表面に事実上永続的に結合（固定）することが必要である。そしてその表面は生物学的に安定した結合により結合し、細胞による取込みが行われないようにする。
【００１９】
その表面は、上記のほか、埋め込み材や義眼や、薬物送達用具、創傷被覆材、抗腫瘍インプラント等の、生物学的流体または哺乳動物の器官と接触して使用される医療用具であってもよい。
【００２０】
本発明において、ＤＲリガンドは、任意の既知のＤＲの細胞外結合ドメインと結合することができるリガンドであってよい。さらに言えば、本願出願日以降に発見されたＤＲであってもよい。本発明において、細胞死受容体（ＤＲ）とは、細胞のアポトーシス機構に直接関与できる細胞表面受容体である。細胞死受容体は、細胞表面でリガンドと適切に結合すると、細胞死のカスパーゼを活性化する。リガンドは、腫瘍壊死因子受容体、トリＣＡＲｌ  （Ｂｒｏｊａｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）、細胞死受容体３（Ａｐｏ３、ＷＳＬ−１、ＴＲＡＭＰ、またはＬＡＲＤとしても知られているＤＲ３  （Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９６）  ２７４，  ９９０  ｅｔ  ｓｅｑ．）、細胞死受容体４すなわちＤＲ４（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  （１９９７）  ２７６，  １１１  ｅｔ  ｓｅｑ．）、細胞死受容体５（Ａｐｏ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２  、および  ＫＩＬＬＥＲとしても知られているＤＲ５）（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９７）２７７，  ８１５  ｅｔ  ｓｅｑ．）、およびＦａｓから選ばれるＤＲに結合するのに適していることが好ましい。このうち、Ｆａｓとの結合が最も好ましい。このことからわかるように、リガンドは、ＴＮＦスーパーファミリーに属する化合物であることが好ましい。リガンドは、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌとしても知られている）、Ｆａｓを活性化するＦａｓ抗体およびその活性断片、ＴＮＦ、リンホトキシンα、Ａｐｏ３Ｌ（ＴＷＥＡＫとしても知られている。Ｍａｒｓｔｅｒｓ    ｅｔ  ａｌ．    Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９８）  ５，  ５２５    ｅｔ  ｓｅｑ．）、およびＡｐｏ２Ｌ  （ＴＲＡＩＬとしても知られている。Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  （１９９５）３，  ６７３  ｅｔ  ｓｅｑ．）のほか、それぞれの受容体と結合し、これを活性化することができる、これらのリガンドの活性断片および／または誘導体から選ばれることが好ましい。
【００２１】
われわれの研究によって、ある細胞株の水晶体上皮細胞のアポトーシスが、Ｆａｓ抗体により誘導されることが示された。これまでの研究により、ヒヨコ胎児水晶体におけるＴＮＦ受容体の発現が明らかにされている（Ｗｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｏｐ．  ｃｉｔ）。医療用具がＩＯＬである場合、リガンドは、好ましくは、上記に挙げたＤＲと結合することが知られているリガンドである。このような医療用具に対して最も好ましいのは、リガンドが、Ｆａｓ抗体またはＦａｓリガンドであることである。
【００２２】
結合リガンドの活性を最適化するためには、結合リガンドがスペーサーを介して任意の表面または他のポリマー基質と結合し、しかも、どの結合も、その結合リガンドの活性結合部位から遠く離れていることが望ましいだろう。スペーサーはオリゴペプチドリンカーであってもよいが、合成ポリマーリンカーであるのが好ましく、特に、ポリエチレングリコールで形成されているような親水性のポリマーであってもよい。ポリエチレングリコールの分子量は、例えば、２００〜２０，０００  Ｄの範囲であり、好ましくは、５００〜５，０００  Ｄの範囲であってよい。
【００２３】
官能性ＰＥＧが市販されている。様々な基質の官能基と結合するための官能基が利用できる。出発材料として使用することができるヘテロ二官能性ＰＥＧが入手可能である。２種類の官能基を用いて、リガンドおよび表面と連続的に反応させてもよい。官能性ＰＥＧが最初にリガンドと反応する場合、後に続くポリマーとの結合のため有用な中間体であるＰＥＧベースのスペーサーを付加した生体分子の結合体が形成される。この反応性結合体は、このようなヘテロ二官能性ＰＥＧとリガンドから形成される反応性中間体であり、基質と反応するためのもう１つの官能基を有するが、通常、その反応は脱保護および／または活性化後である。
【００２４】
好ましくは、ポリマーが、まず二官能性のスペーサー前駆体と反応し、次にポリマーとスペーサーとの結合体が、リガンドと反応する。
【００２５】
ＰＥＧまたはその他のポリマーをＤＲリガンドに結合させるために用いることができる官能基は、例えば、ヒドロキシル、チオール、アミノ、活性アミノ、カルボキシル、活性エステル、カルボキシル基イミド、炭酸ベンズトリアゾール、グリシジルエーテル、オキシカルボニルイミダゾール、Ｐ−ニトロフェニルカルボネート基、アルデヒド、イソシアネート、Ｎ‐マレイミド、ビニル等である。これらの官能基が反応するリガンド上の官能基は、通常、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、またはチオールというような基である。反応は、ＰＥＧの生体分子との結合に用いられる条件のような適切な条件下で行い、潜在的に反応性を有する他の官能基を適切に保護して、副産物が生成しないようにする。
【００２６】
ポリマー表面上にあって、ＤＲリガンドと反応する官能基、すなわち、場合により中間結合体またはスペーサー前駆体上の反応性基は、そのポリマー上に本来存在するものであってもよいし、あるいは、前活性化ステップによって導入されたものでもよい。前活性化ステップは、例えば米国特許第４，８０６，３８２号、同第５，３２６，５８４号、または同第５，３７６，４００号に基づく技術によるもので、まず、ガンマ、紫外線、高周波、プラズマ、グロー放電、または電子ビーム照射を用いてもよく、次いでオプションとして、融合しうる化合物のような活性剤により反応させてもよい。一例として、米国特許第５，３７６，４００号の方法によれば、ポリメチルメタクリレートで形成されたポリマー表面をグロー放電プラズマ処理し、エチレン不飽和化合物のラジカル重合開始部位を生じさせる。本発明における使用方法に適するエチレン不飽和化合物は、その不飽和基から遠い分子の末端に、引き続き起こるＤＲリガンドとの反応に適する反応性基を有するモノアクリレート系またはモノビニル系ポリエチレングレコールか、または非不飽和ＰＥＧと前結合するリガンドのいずれかであるだろう。また、ＩＯＬであるポリマーの表面に、ポリエチレンオキシド分子を結合させたものもある。これは、エチレン不飽和第一級アミン基を含有するモノマーをＩＬＯの表面に融合させ、アルデヒド末端ＰＥＧを、その融合させた表面に反応させたることにより行われた。表面を活性化するための他の方法としては、水蒸気プラズマ接触法において、表面をヒドロキシイオンに曝露させ、ヒドロキシ基質を付加する方法、またはセリウムＩＶイオンにより処理しラジカルを生成する方法がある。
【００２７】
Ｆａｓ抗体は、そのＦｃ部に、反応性オリゴマーまたはポリマーにより誘導体化され生体安定性のあるペプチド結合を生成し、Ｆａｓと相互作用できるように活性Ｆａｓ結合部位をフリーな状態にしておく反応性ペンダント基を有する。
【００２８】
天然のＦａｓリガンド、またはその誘導体は、好ましくは、Ｃ−末端残基、通常はカルボキシル基を通して結合する。
【００２９】
本発明において、ＤＲリガンドは、ポリマーと結合すると、この結合体が投与される動物において、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞表面に発現するそれぞれのＤＲと相互作用し、かつこれを活性化することができる。好ましい実施態様におけるように、リガンドがＩＯＬの表面に結合する場合、そのリガンドが水晶体上皮細胞の表面に発現するＤＲと結合することによりアポトーシスが起き、その結果後発白内障が予防される。別の実施態様では、白内障手術に対する瘢痕化反応を抑制することを目的とし、水晶体嚢内部裏打ち用補装具（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｌｉｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｅｎｓ  ｃａｐｓｕｌｅ）、嚢内リング、または遠近調節力を維持するよう設計された軟性ＩＯＬ  （Ｐａｒｅｌ  Ｊ−Ｍ，  Ｇｅｌｅｎｄｅｒ  Ｈ，  Ｔｒｅｆｅｒｓ  ＷＦ，  Ｎｏｒｔｏｎ  ＥＷＤ．  Ｐｈａｃｏ−Ｅｒｓａｔｚ：  ｃａｔａｒａｃｔ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｔｏ  ｐｒｅｓｅｒｖｅ  ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｏｎ（「遠近調節力を維持するよう計画された白内障手術」Ｇｒａｅｆｅ’ｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １９８６；  ２２４：  １６５  ｅｔ  ｓｅｑ）を含んでもよい。さらに別の実施態様では、基質は、創傷被覆材、または上皮癌のための治療用被覆材（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）、または湿疹や乾癬等の過剰増殖状態のための治療用被覆材（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）、またはウイルス性病変、特にウイルス性皮膚病変のための治療用被覆材（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）であってもよい。このような治療用被覆材（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）の表面にリガンドを供給すると、ＤＲを発現することが知られている腫瘍細胞や炎症細胞が選択的に死ぬだろう。ＤＲリガンドを表面に固定するメリットは、アポトーシスを引き起こす必要がある細胞が位置する体内部位に、リガンドを限局できることである。固定化によって、リガンドが、望ましくない有毒な副作用を引き起こす他の部位に運ばれることを予防できるのである。
【００３０】
リガンドを結合するポリマーは、概して、合成ポリマーにより生成するが、ある実施態様においては、天然ポリマーまたはその誘導体を使用してもよい。使用してもよい天然ポリマーは、例えば、多糖、タンパク質、核酸、またはこれらを組み合わせたものである。合成ポリマーは、医療用具において使用されるものなら何でもよいが、生体安定性のあるポリマーが好ましい（生体安定性は、生物分解性や生物腐食性とは対立する性質である）。例としては、シリコーン、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリアクリル化合物またはこれらを組み合わせたものである。ＩＯＬの素材は、通常、シリコーンまたはポリアクリラートである。リガンドをポリマーに組み込む際、上述のように表面を活性化しペンダント基を得た後に、オプションとして、ポリマーを生成するモノマーの１つとして、重合できるリガンドを用いるか、あるいは予め生成したポリマーを誘導体化してもよい。
【００３１】
ポリマーはまた、薬剤輸送のための媒体として機能してもよい。例えば、ポリマーに薬学的に活性な化合物を予め入れておき、長期間にわたり放出するための貯蔵庫の役割をもたせてもよい。適する活性物質は、細胞毒性化合物、または副腎皮質ステロイド等の抗癌剤である。ポリマーの薬剤輸送用インプラントに導入されている副腎皮質ステロイドの一例が、デキサメサゾンである。本発明において、このような薬剤は、増殖細胞のアポトーシス性シグナル伝達に対する感受性を高め、相乗的に作用すると思われる。（Ｅｖａｎｓ．  Ｓｔｏｒｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ    Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９５）  ５３．１８）。
【００３２】
本発明のまた別の態様において、オリゴマーとＤＲリガンドとの反応性結合体が提供される。この反応性結合体は、オリゴマーが生体安定性のある結合によりＤＲリガンドと結合しており、ＤＲリガンド上の結合部位では、そのリガンドのＤＲ結合ドメインが生物学的活性を保ち、かつ、そのＤＲ結合がさまたげられないようになっている。このことは、結合試験によって確認することができる。反応性基は、結合体のオリゴマー部分に存在し、結合体を、通常は医療用具等の固形ポリマーの表面である基質に付着させるのに適するものである。
【００３３】
本発明を、以下の実施例により説明する。
材料：液相での実施例において用いるＦａｓリガンドは、アップステート・バイオテクノロジー社製抗Ｆａｓ  ＩｇＭ抗体クローンＣＨ  ＩＩである。ポリマー上に固定するＦａｓリガンドは、天然のＦａｓリガンドの誘導体であり、アレクシス・バイオケミカルズ社より入手可能である。
【実施例１】
【００３４】
（参考例）
目的：  細胞死受容体により仲介されるヒト水晶体上皮細胞（ＨＬＥ）アポトーシスを調べる。
【００３５】
方法：  水晶体上皮細胞の表面にＦａｓ受容体が存在するかどうかを決定する方法は、組織免疫化学およびＷｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｏｐ．  ｃｉｔ．に基づくウエスタンブロット法である。ウエスタンブロット法は、一般に次のような方法で行う。細胞抽出物をゲル電気泳動で大きさにより分離し、電気的にニトロセルロースメンブレンにトランスファーする。次にこのメンブレンをＦａｓに対する抗体でインキュベートし、結合した酵素が酵素結合吸着検定法によって検出される。（Ｇｅｒｓｈｏｎｉ  ＪＭ，  Ｐａｌａｄｅ  ＧＥ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（「タンパク質ブロット法：原理と応用」Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８３；  １３１：  １−１５）．  ＤＲ発現の空間的分布を決定するため、ＬＥＣの組織学的標本に対し蛍光標識した抗ＤＲ抗体を結合させる。細胞死受容体（Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＩＮＦ−Ｒ１、およびＤＲ−４）の発現は、樹立した上皮細胞株（ＳＲＡ  ０１／０４））を用いて、ウエスタンブロット法で評価した。次にＬＥＣの単層（各処理ごとに、ｎ＝６）を、抗ＦａｓＩｇＭ  （ＣＨ１１）５０ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌ、コントロールＩｇＭ  ５０ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌで処理するか、あるいは処理しないようにした。ＬＥＣ単層はまた、５−フルオラシル  １２．５ｍｇ／ｍｌで処理した。これは、ＬＥＣアポトーシスを誘導するための陽性コントロールとしての役割を果たした。４８時間後、ＬＥＣの死を乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）により定量した。細胞死の状態は、細胞形態のためのサイトスピン標本を光学顕微鏡法により評価して確認した。
【００３６】
結果：  ＬＥＣ単層を抗ＦａｓＩｇＭで４８時間処理した結果、コントロールＩｇＭまたは無処理のコントロールと比較して、有意な細胞死が引き起こされた。光学顕微鏡法により、アポトーシス細胞死の特徴である核クロマチンの凝縮と断片化が生じていることが明らかにされた。
【表１】
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【００３７】
４８時間で、抗ＦａｓＩｇＭおよび５−フルオラシルは、無処理のコントロールと比較して、有意に高いレベルのＬＥＣの死をもたらした（２２．４％  ＋／−  ５．３  Ｐ＜０．０１）。コントロールＩｇＭは、無処理のコントロールと比較して、細胞の生存度に影響を及ぼしていなかった（１．２％  ＋／−２．９）。抗ＦａｓＩｇＭおよび５−フルオラシルは、アポトーシス死の証明である核クロマチンの凝縮と断片化を誘導した。Ｆａｓ受容体の発現が、ウエスタンブロット解析により確認された。ＴＮＦ−Ｒ１およびＤＲ−４は検出することができなかった。以上のことから、活性Ｆａｓリガンドは、本ＬＥＣ細胞株においてアポトーシスを誘導すると結論する。
【実施例２】
【００３８】
ＩＯＬに用いられるものと同じ種類のポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート−リンカー）メンブレンをＦａｓリガンドで活性化し、Ｆａｓ感受性細胞として知られているＪｕｒｋａｔｔ  Ｔ細胞（Ｐｏｎｔｏｎ，  Ａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１，  ８９９１−８９９５）に対する影響について試験した。まず、ｐＨＥＭＡメンブレンをヘテロ二官能基性ＰＥＧリンカー前駆体と反応させることにより、活性化した。この前駆体は、その反応性基の片方を保護された形態で有しており、もう一方は活性化され、表面でヒドロキシル基に結合していた。次に中間体である、ポリマーとリンカーとの結合体を活性化し、Ｆａｓリガンド（アレクシス・バイオケミカルズ社製）に結合させた。次いで、表面の過剰な反応性基を不活性化した。
【００３９】
Ｊｕｒｋａｔｔ  Ｔ細胞を、９６ウエルプレートに、フェノールレッドを含まず０．１％の脂肪酸フリーのＢＳＡを含むＭＥＭ（最小必須培地）で、１ウエルあたり２×１０４個接種した。細胞は、無処理、ＣＨ１１（アップステート・バイオテクノロジー社製抗ＦａｓＩｇＭ）により１００ｎｇ／ｍｌで処理、またはウエルの底に置された、固定したＦａｓリガンドの１片とともにインキュベート、のいずれかを行った。ＬＤＨの放出をアッセイするため、培養液試料を遠心してペレットと上清に分離し、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）を用い、メーカーの使用説明書に従って、上清をＬＤＨ放出についてアッセイした。全ＬＤＨ放出量は、遠心分離およびＬＤＨアッセイを行う前に、１％のＴＸ１００で細胞を可溶化することにより測定した。
【００４０】
死の表面（ｄｅａｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ）（ヒドロゲル−ＰＥＧ−Ｆａｓリガンド）は、無処理のコントロールと比較して、Ｊｕｒｋａｔｔ  Ｔ細胞（広く認められたＦａｓ感受性のコントロール）の細胞死を増加させた（図１参照）。非結合Ｆａｓ刺激抗体は、より大きな効果をもたらした。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】時間の経過による乳酸デヒドロゲナーゼ放出を百分率で表したものである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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