(57)【要約】免疫調節抗体、特に抗−Ｂ７、抗−ＣＤ２３、または抗−ＣＤ４０Ｌ抗体及びＢ細胞消滅抗体、特に抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２２または抗−ＣＤ３７抗体を使用するＢ細胞悪性疾患の抗体併用療法が提供された。望ましくは、この併用療法は抗−Ｂ７及び抗−ＣＤ２０抗体投与を含むであろう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４０Ｌに結合してＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用またはＣＤ４０シグナリングを阻害する抗体または抗体フラグメントの治療有効量を投与することからなるＣＤ４０＋悪性疾患の治療方法。
【請求項２】
ＣＤ４０＋悪性疾患がＢ細胞リンパ腫またはＢ細胞白血病である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｂ細胞リンパ腫がホジキン病（ＨＤ）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＨＬが低度、中等度及び高度である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＮＨＬが、小リンパ球性、濾胞性及び小型縦隔細胞優位、濾胞性及び小型縦隔及び大細胞混合型、濾胞性及び大細胞優位、びまん性小縦隔細胞、びまん性小細胞及び大細胞混合型、びまん性大細胞型、大細胞免疫芽球性、リンパ芽球性、小型非縦隔バーキット及び非バーキット型、エイズ関連リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、マントル細胞リンパ腫、及び単球性Ｂ細胞リンパ腫からなるサブタイプグループから選択されている請求項３に記載の方法。
【請求項６】
Ｂ細胞白血病が慢性Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞系の急性リンパ芽球性白血病、またはＢ細胞系リンパ球性白血病である請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤ４０Ｌに結合する抗体または抗体フラグメントがＩＤＥＣ−１３１，３Ｅ４，２Ｈ５，２Ｈ８，４Ｄ９−８，４Ｄ９−９，２４−３１，２４−４３，８９−７６または８９−７９である請求項２に記載の方法。
【請求項８】
抗体または抗体フラグメントがキメラ、二重特異性、ヒトまたはヒト化である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗体フラグメントがＦａｂ，Ｆａｂ’，ｓｃＦｖまたはＦ（ａｂ’）２である請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
さらに第二の抗体またはそのフラグメント、化学療法剤、化学療法剤及び／または放射線療法の併用の治療有効量を投与する請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
放射線療法が外部放射線治療であるかまたは放射標識抗体である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
放射標識抗体が放射標識ＩＤＥＣ−１３１、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ、またはＢ１またはそのフラグメントである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
放射標識抗体が１２３Ｉ，１２５Ｉ，１３１Ｉ，１１１Ｉｎ，１３１Ｉｎ，３２Ｐ，６４Ｃｕ，６７Ｃｕ，２１１Ａｔ，１７７Ｌｕ，９０Ｙ，１８６Ｒｅ，２１２Ｐｂ，２１２Ｂｉ，４７Ｓｃ，１０５Ｒｈ，１０９Ｐｄ，１５３Ｓｍ，１８８Ｒｅ，１９９Ａｕ，２１１Ａｔ，及び２１３Ｂｉで放射標識されている請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＤを治療するための化学療法剤が次の：アルキル化剤、ビンカアルカロイド、プロカルバジン、メトトレキサートまたはプレドニゾン、のいずれか一つまたはそれ以上である請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＨＬを治療するための化学療法剤が次の：アルキル化剤、シクロホスファミド、クロランブシル、２−ＣＤＡ、２’−デオキシコフォルマイシン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、シスプラチン、エトポシドまたはイフォスファミド、のいずれか一つまたはそれ以上である請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＤを治療するための化学療法剤の併用が；ＭＯＰＰ，ＡＢＶＤ，ＣｈｌＶＰＰ，ＣＡＢＳ，ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ，ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ，ＢＣＶＰＰ，ＶＡＢＣＤ，ＡＢＤＩＣ，ＣＢＶＤ，ＰＣＶＰ，ＣＥＰ，ＥＶＡ，ＭＯＰＬＡＣＥ，ＭＩＭＥ，ＭＩＮＥ，ＣＥＭ，ＭＴＸ−ＣＨＯＰ，ＥＶＡＰまたはＥＰＯＣＨ、である請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
ＮＨＬを治療する化学療法剤の併用が：ＣＶＰ，ＣＨＯＰ，Ｃ−ＭＯＰＰ，ＣＡＰ−ＢＯＰ，ｍ−ＢＡＣＯＤ，ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ，ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ，ＭＡＣＯＰ−Ｂ，ＩＭＶＰ−１６，ＭＩＭＥ，ＤＨＡＰ，ＥＳＨＡＰ，ＣＥＰＰ（Ｂ），またはＣＡＭＰ、である請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
Ｂ細胞白血病を治療するための化学療法剤が次の：アントラサイクリン、シクロホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ及びプリン同族体、の少なくとも一つである請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
Ｂ細胞白血病を治療するための化学療法剤の併用が：ビンクリスチン、プレドニゾン、アントラサイクリン及びシクロホスファミドまたはアスパラギナーゼ；ビンクリスチン、プレドニゾン、アントラサイクリン、シクロホスファミド及びアスパラギナーゼ；ＣＨＯＰ；ＣＭＰ；ＣＶＰ；ＣＯＰまたはＣＡＰ、である請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
第二の抗体が抗−ＣＤ２０抗体、抗−ＣＤ１９抗体、抗−ＣＤ２２抗体及び抗−ＣＤ４０抗体からなる群から選択されている請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
抗−ＣＤ２０抗体がＲＩＴＵＸＡＮＴＭまたはそのフラグメントまたはＢ１またはそのフラグメントである請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用またはＣＤ４０シグナリングを阻害する抗−ＣＤ４０Ｌ抗体またはそのフラグメントを投与し；そして抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ１９、及び抗−ＣＤ２２抗体またはそのフラグメントからなる群から選択された第二の抗体またはフラグメントを投与する段階を含むＣＤ４０＋悪性疾患の治療方法。
【請求項２３】
ＣＤ４０＋悪性疾患がＢ細胞リンパ腫またはＢ細胞白血病である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤ４０Ｌ拮抗剤及び以下の（ａ）化学療法剤または化学療法剤の併用、（ｂ）放射線療法、（ｃ）抗−ＣＤ２０抗体またはそのフラグメント、（ｄ）抗−ＣＤ４０抗体またはそのフラグメント、（ｅ）抗−ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、及び（ｆ）抗−ＣＤ２２抗体またはそのフラグメント、の少なくとも一つを含むＣＤ４０＋悪性疾患を治療するための併用療法。
【請求項２５】
放射線療法が外部放射線治療または放射標識抗体である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
放射標識抗体が１２３Ｉ，１２５Ｉ，１３１Ｉ，１１１Ｉｎ，１３１Ｉｎ，３２Ｐ，６４Ｃｕ，６７Ｃｕ，２１１Ａｔ，１７７Ｌｕ，９０Ｙ，１８６Ｒｅ，２１２Ｐｂ，２１２Ｂｉ，４７Ｓｃ，１０５Ｒｈ，１０９Ｐｄ，１５３Ｓｍ，１８８Ｒｅ，１９９Ａｕ，２１１Ａｔ，及び２１３Ｂｉで放射標識されている請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤ４０＋悪性疾患がＢ細胞白血病またはＢ細胞リンパ腫である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
Ｂ細胞リンパ腫がＨＤまたはＮＨＬである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＮＨＬが低度、中等度または高度である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＨＬが、小リンパ球性、濾胞性及び小型縦隔細胞優位、濾胞性及び小型縦隔及び大細胞混合型、濾胞性及び大細胞優位、びまん性小縦隔細胞、びまん性小細胞及び大細胞混合型、びまん性大細胞型、大細胞免疫芽球性、リンパ芽球性、小型非縦隔バーキット及び非バーキット型、エイズ関連リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、マントル細胞リンパ腫、及び単球性Ｂ細胞リンパ腫からなるサブタイプグループから選択されている請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
Ｂ細胞白血病が慢性Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞系の急性リンパ芽球性白血病、またはＢ細胞系の慢性リンパ球性白血病である請求項２８に記載の併用療法。
【請求項３２】
ＣＤ４０Ｌ拮抗剤が抗−ＣＤ４０Ｌ抗体またはそのフラグメントである請求項２４に記載の併用療法。
【請求項３３】
抗−ＣＤ４０Ｌ抗体がＩＤＥＣ−１３１またはそのフラグメントである請求項３２に記載の併用療法。
【請求項３４】
抗−ＣＤ４０ＬフラグメントがＦａｂ，Ｆａｂ’，ｓｃＦｖまたはＦ（ａｂ’）２である請求項３２に記載の併用療法。
【請求項３５】
抗−ＣＤ２０抗体がＲＩＴＵＸＡＮＴＭまたはそのフラグメントまたはＢ１またはそのフラグメントである請求項２４に記載の併用療法。
【請求項３６】
ＨＤを治療するための化学療法剤が次の：アルキル化剤、ビンカアルカロイド、プロカルバジン、メトトレキサートまたはプレドニゾン、のいずれか一つまたはそれ以上である請求項２８に記載の併用療法。
【請求項３７】
ＮＨＬを治療するための化学療法剤が次の：アルキル化剤、シクロホスファミド、クロランブシル、２−ＣＤＡ、２’−デオキシコフォルマイシン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、シスプラチン、エトポシドまたはイフォスファミド、のいずれか一つまたはそれ以上である請求項２８に記載の併用療法。
【請求項３８】
ＨＤを治療するための化学療法剤の併用が；ＭＯＰＰ，ＡＢＶＤ，ＣｈｌＶＰＰ，ＣＡＢＳ，ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ，ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ，ＢＣＶＰＰ，ＶＡＢＣＤ，ＡＢＤＩＣ，ＣＢＶＤ，ＰＣＶＰ，ＣＥＰ，ＥＶＡ，ＭＯＰＬＡＣＥ，ＭＩＭＥ，ＭＩＮＥ，ＣＥＭ，ＭＴＸ−ＣＨＯＰ，ＥＶＡＰまたはＥＰＯＣＨ、である請求項２８に記載の併用療法。
【請求項３９】
ＮＨＬを治療する化学療法剤の併用が：ＣＶＰ，ＣＨＯＰ，Ｃ−ＭＯＰＰ，ＣＡＰ−ＢＯＰ，ｍ−ＢＡＣＯＤ，ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ，ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ，ＭＡＣＯＰ−Ｂ，ＩＭＶＰ−１６，ＭＩＭＥ，ＤＨＡＰ，ＥＳＨＡＰ，ＣＥＰＰ（Ｂ），またはＣＡＭＰ、である請求項２８に記載の併用療法。
【請求項４０】
Ｂ細胞白血病を治療するための化学療法剤が：アントラサイクリン、シクロホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、プリン同族体、である請求項２８に記載の併用療法。
【請求項４１】
Ｂ細胞白血病を治療するための化学療法剤の併用が：ビンクリスチン、プレドニゾン、アントラサイクリン及びシクロホスファミドまたはアスパラギナーゼ；ビンクリスチン、プレドニゾン、アントラサイクリン、シクロホスファミド及びアスパラギナーゼ；ＣＨＯＰ；ＣＭＰ；ＣＶＰ；ＣＯＰまたはＣＡＰ、である請求項２８に記載の併用療法。
【請求項４２】
（ｉ）抗−ＣＤ４０Ｌ抗体またはその抗体フラグメント及び少なくとも次の一つ： （ｉｉ）ＣＤ４０Ｌ，ＣＤ１９，ＣＤ２２，またはＣＤ２０に結合する放射標識抗体、（ｉｉｉ） 抗−ＣＤ２０，抗−ＣＤ１９，抗−ＣＤ２２抗体またはそのフラグメント、または（ｉｖ）化学療法剤または混合化学療法剤、を含むＣＤ４０＋悪性疾患治療用組成物。
【請求項４３】
悪性疾患がＢ細胞リンパ腫またはＢ細胞白血病である請求項４２に記載のＣＤ４０＋悪性疾患治療用組成物。
【請求項４４】
Ｂ細胞白血病がホジキン病またはＮＨＬである請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
放射標識抗体が放射標識ＩＤＥＣ−１３１、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ、またはＢ１である請求項４２に記載の組成物。
【請求項４６】
放射標識抗体が１２３Ｉ，１２５Ｉ，１３１Ｉ，１１１Ｉｎ，１３１Ｉｎ，３２Ｐ，６４Ｃｕ，６７Ｃｕ，２１１Ａｔ，１７７Ｌｕ，９０Ｙ，１８６Ｒｅ，２１２Ｐｂ，２１２Ｂｉ，４７Ｓｃ，１０５Ｒｈ，１０９Ｐｄ，１５３Ｓｍ，１８８Ｒｅ，１９９Ａｕ，２１１Ａｔ，及び２１３Ｂｉで放射標識されている請求項４６に記載の組成物。
【請求項４７】
ＮＨＬが低度、中等度または高度である請求項４４に記載の組成物。
【請求項４８】
ＮＨＬが、小リンパ球性、濾胞性及び小型縦隔細胞優位、濾胞性及び小型縦隔及び大細胞混合型、濾胞性及び大細胞優位、びまん性小縦隔細胞、びまん性小細胞及び大細胞混合型、びまん性大細胞型、大細胞免疫芽球性、リンパ芽球性、小型非縦隔バーキット及び非バーキット型、エイズ関連リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、マントル細胞リンパ腫、及び単球性Ｂ細胞リンパ腫からなるＮＨＬサブタイプグループから選択されている請求項４４に記載の組成物。
【請求項４９】
抗−ＣＤ４０Ｌ抗体がＩＤＥＣ−１３１またはそのフラグメントである請求項４２に記載の組成物。
【請求項５０】
抗−ＣＤ２０抗体がＲＩＴＵＸＡＮＴＭまたはそのフラグメントまたはＢ１またはそのフラグメントである請求項４２に記載の組成物。
【請求項５１】
ＨＤを治療するための化学療法剤が次の：アルキル化剤、ビンカアルカロイド、プロカルバジン、メトトレキサートまたはプレドニゾン、のいずれか一つまたはそれ以上である請求項４３に記載の組成物。
【請求項５２】
ＮＨＬを治療するための化学療法剤が次の：アルキル化剤、シクロホスファミド、クロランブシル、２−ＣＤＡ、２’−デオキシコフォルマイシン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、シスプラチン、エトポシドまたはイフォスファミド、のいずれか一つまたはそれ以上である請求項４４に記載の組成物。
【請求項５３】
ＨＤを治療するための化学療法剤の併用が；ＭＯＰＰ，ＡＢＶＤ，ＣｈｌＶＰＰ，ＣＡＢＳ，ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ，ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ，ＢＣＶＰＰ，ＶＡＢＣＤ，ＡＢＤＩＣ，ＣＢＶＤ，ＰＣＶＰ，ＣＥＰ，ＥＶＡ，ＭＯＰＬＡＣＥ，ＭＩＭＥ，ＭＩＮＥ，ＣＥＭ，ＭＴＸ−ＣＨＯＰ，ＥＶＡＰまたはＥＰＯＣＨ、である請求項４４に記載の組成物。
【請求項５４】
ＮＨＬを治療する化学療法剤の併用が：ＣＶＰ，ＣＨＯＰ，Ｃ−ＭＯＰＰ，ＣＡＰ−ＢＯＰ，ｍ−ＢＡＣＯＤ，ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ，ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ，ＭＡＣＯＰ−Ｂ，ＩＭＶＰ−１６，ＭＩＭＥ，ＤＨＡＰ，ＥＳＨＡＰ，ＣＥＰＰ（Ｂ），またはＣＡＭＰ、である請求項４４に記載の組成物。
【請求項５５】
Ｂ細胞白血病を治療するための化学療法剤が：アントラサイクリン、シクロホスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、プリン同族体、である請求項４３に記載の組成物。
【請求項５６】
Ｂ細胞白血病を治療するための化学療法剤の併用が：ビンクリスチン、プレドニゾン、アントラサイクリン及びシクロホスファミドまたはアスパラギナーゼ；ビンクリスチン、プレドニゾン、アントラサイクリン、シクロホスファミド及びアスパラギナーゼ；ＣＨＯＰ；ＣＭＰ；ＣＶＰ；ＣＯＰまたはＣＡＰ、である請求項４３に記載の組成物。
【請求項５７】
抗−ＣＤ２３，抗−Ｂ７，抗−ＣＤ４０，抗−ＣＤ４０Ｌ，及び抗−ＣＤ４抗体からなる群から選択された免疫調節または免疫修飾抗体の少なくとも一つ及び少なくとも一つのＢ細胞消滅抗体の治療有効量を該抗体投与を別々に、組合わせて、そしていずれかの投与順序で行なうことを含む治療を必要とする患者におけるＢ細胞悪性疾患を治療する方法。
【請求項５８】
Ｂ細胞消滅抗体が抗−ＣＤ１９，抗−ＣＤ２０，抗−ＣＤ２２及び抗−ＣＤ３７抗体からなる群から選択されている請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
Ｂ細胞悪性疾患が非ホジキンリンパ腫である請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
該ＮＨＬが、小リンパ球性、濾胞性及び小型縦隔細胞優位、濾胞性及び小型縦隔及び大細胞混合型、濾胞性及び大細胞優位、びまん性小縦隔細胞、びまん性小細胞及び大細胞混合型、びまん性大細胞型、大細胞免疫芽球性、リンパ芽球性、小型非縦隔バーキット及び非バーキット型、エイズ関連リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、マントル細胞リンパ腫、及び単球性Ｂ細胞リンパ腫からなるＮＨＬサブタイプグループから選択されている請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該ＮＨＬが高度、低度または中等度である請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
該Ｂ細胞消滅抗体が抗−ＣＤ２０または抗−ＣＤ２２抗体である請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
該抗−ＣＤ２０抗体がＲＩＴＵＸＡＮＴＭである請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
該抗−ＣＤ２０抗体がヒトまたはヒト化抗体である請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
Ｂ細胞悪性疾患がＢ細胞リンパ腫である請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
Ｂ細胞悪性疾患が白血病である請求項１に記載の方法。
【請求項６７】
該白血病が慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病または慢性Ｂ細胞白血病である請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
治療が抗−Ｂ７抗体及び抗−ＣＤ２０抗体を投与することを含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６９】
抗−ＣＤ２０がＲＩＴＵＸＡＮＴＭである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
抗−Ｂ７抗体が霊長類化ＴＭ抗体である請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
抗−Ｂ７抗体が癌細胞のアポトシスを誘導する請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
免疫調節抗体をＢ細胞消滅抗体の後に投与する請求項５７に記載の方法。
【請求項７３】
免疫調節抗体をＢ細胞消滅抗体の前に投与する請求項５７に記載の方法。
【請求項７４】
Ｂ細胞消滅抗体及び免疫調節抗体をそれぞれの約１ヶ月以内に投与する請求項５７に記載の方法。
【請求項７５】
Ｂ細胞消滅抗体及び免疫調節抗体をそれぞれの約１週間以内に投与する請求項５７に記載の方法。
【請求項７６】
Ｂ細胞消滅抗体及び免疫調節抗体をそれぞれの約１日以内に投与する請求項５７に記載の方法。
【請求項７７】
再発ホジキン病、高度抵抗性ホジキン病、低度及び中等度非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性／Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＳＬＬ／Ｂ−ＣＬＬ）、前リンパ球性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、エイズ関連リンパ腫、単球性リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、小型リンパ球性；濾胞性、びまん性大細胞；びまん性小縦隔細胞；大細胞免疫芽球性リンパ芽球腫、小型非縦隔；バーキット及び非バーキット；濾胞性、大細胞優位；濾胞性小縦隔細胞優位；及び濾胞性、小縦隔及び大細胞混合型リンパ腫からなる群から選択されたＢ細胞悪性疾患を治療するために使用される請求項５７に記載の方法。
【請求項７８】
Ｂ細胞悪性疾患がホジキン病である請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
一方または両方の抗体が放射標識に結合している請求項５７に記載の方法。
【請求項８０】
さらに化学療法または放射線療法を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項８１】
ＣＤ４０ＬまたはＢ７に特異的な非抗体拮抗剤を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項８２】
Ｂ７に対する抗体及びＢ細胞消滅抗−ＣＤ２０または抗−ＣＤ２２抗体の治療有効量を別々にまたは組合わせて投与することを含む非ホジキンリンパ腫の治療方法。
【請求項８３】
該抗−ＣＤ２０抗体がＲＩＴＵＸＡＮＴＭである請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
該抗−Ｂ７抗体がＢ７抗原とＣＴＬＡ４の相互作用を阻害しない請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
Ｂ７に対する該抗体がヒト、ヒト化、霊長類化または霊長類抗体である請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
該ＮＨＬが高度、低度または中等度である請求項８２に記載の方法。
【請求項８７】
放射標識抗体の投与を含む請求項８２に記載の方法。
【請求項８８】
抗−Ｂ７抗体及びＣＤ２０またはＣＤ２２に特異的なＢ細胞消滅抗体の治療有効量の投与を含む白血病の治療方法。
【請求項８９】
抗−ＣＤ２０抗体がＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（ＡＴＣＣ６９１１９によって提供される抗体）である請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
該白血病が慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病または慢性Ｂ細胞白血病である請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
該抗体の一方または療法がキメラ、二重特異性、ヒトまたはヒト化抗体である請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
抗−Ｂ７抗体が抗体を減少させる請求項５７に記載の方法。
【請求項９３】
抗−Ｂ７抗体が抗体を減少させない請求項５７に記載の方法。
【請求項９４】
抗−Ｂ７抗体が特異的にＢ７．１（ＣＤ８０）に結合する請求項５７に記載の方法。
【請求項９５】
抗−Ｂ７抗体が特異的にＢ７．２（ＣＤ８６）に結合する請求項５７に記載の方法。
【請求項９６】
放射標識抗−ＣＤ２２または抗−ＣＤ２２抗体の投与を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項９７】
該放射標識がイットリウムである請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
放射標識抗−ＣＤ２０がイットリウム標識ＲＩＴＵＸＡＮＴＭまたはイットリウム標識２Ｂ８である請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
抗−Ｂ７抗体が非消滅抗体である請求項８２に記載の方法。
【請求項１００】
抗−Ｂ７抗体が消滅抗体である請求項８２に記載の方法。
【請求項１０１】
非ホジキンリンパ腫が、小リンパ球性、濾胞性及び小型縦隔細胞優位、濾胞性及び小型縦隔及び大細胞混合型、濾胞性及び大細胞優位、びまん性小縦隔細胞、びまん性小細胞及び大細胞混合型、びまん性大細胞型、大細胞免疫芽球性、リンパ芽球性、小型非縦隔バーキット及び非バーキット型、エイズ関連リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、マントル細胞リンパ腫、及び単球性Ｂ細胞リンパ腫から選択されている請求項８２に記載の方法。
【請求項１０２】
化学療法を含む請求項５７に記載の方法。
【請求項１０３】
化学療法を含む請求項８２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国出願番号 ６０／２１７，７０６、出願日２０００年７月１２日、及び米国出願番号 ０９／７７２，９３８、出願日２００１年１月３１日から優先権を主張すると共に、これらの全体を参照として引用した。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｂ細胞悪性疾患、特にＢ細胞リンパ腫及び白血病、を治療するための相乗的抗体併用療法に関するものである。この相乗的抗体併用は実質的にＢ細胞を消滅させる活性を有する抗体（例えば、抗−ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２またはＣＤ３７抗体）の少なくとも一つ及び例えば、Ｂ細胞／Ｔ細胞相互作用及び／またはＢ細胞の活性、分化または増殖を変化させることにより免疫系を変化させるかあるいは調節する抗体（例えば、抗−Ｂ７、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ２３または抗−ＣＤ４０Ｌ）を含んでいる。特に、本発明は、ＣＤ４０に結合することによるＣＤ４０Ｌを阻害する抗−ＣＤ４０Ｌ抗体の使用を含むＣＤ４０＋悪性疾患の抗体併用療法を包含している。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの相互作用を阻害し得るこれらの抗体またはその他の薬物はさらに、化学療法剤、放射線治療及び／または他の抗体、望ましくはＢ細胞消滅抗体、例えば、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２２及び／または抗−ＣＤ４０抗体、またはそのフラグメントを併用することができる。
【０００３】
発明の背景
脊椎動物（例えば、ヒト、類人猿、サルなどを含む霊長類）の免疫系は多数の器官及び細胞型から構成されており、それらは次のようなことを行っている：脊椎動物宿主に侵入する外来微生物（「抗原」）を正確にそして特異的に認識する；その外来微生物に特異的に結合する；そして、その外来微生物を排除／分解する。リンパ球は他の型の細胞と同様に免疫系及び外来微生物の排除及び破壊のために重要である。リンパ球は胸腺、脾臓及び骨髄（成人）で造られ、そしてヒト（成人）の循環系に存在する全白血球細胞の約３０％を占めている。リンパ球には二種類の大きな集団がある：Ｔ細胞及びＢ細胞。Ｔ細胞は細胞性免疫を担当し、一方Ｂ細胞は抗体生産（液性免疫）を担当している。しかし、Ｔ細胞及びＢ細胞は相互依存的であると考えられる――典型的な免疫反応において、抗原提示細胞の表面上の主要組織適合性複合体（「ＭＣＨ」）糖タンパクに結合する抗原のフラグメントにＴ細胞受容体が結合した時にＴ細胞は活性化される；その活性化は、本質的に、Ｂ細胞に分化と抗原に対する抗体（「免疫グロブリン」）を生産させるように刺激する生物学的メディエーター（「インターロイキン」または「サイトカイン」）を生じる。
【０００４】
宿主中の各Ｂ細胞はその表面に異なる抗体を発現する――そうして一つのＢ細胞は一つの抗原に特異的な抗体を発現し、一方他のＢ細胞は違う抗原に特異的な別の抗体を発現する。したがって、Ｂ細胞は極めて多様であり、この多様性が免疫系には重要である。ヒトでは各Ｂ細胞は膨大な数の抗体分子を生産することができる（すなわち、約１０７から１０８）。その抗体生産は、外来抗原が中和された時に、最も典型的には停止する（または実質的に減少する）。しかし、特別なＢ細胞の増殖は衰えずに継続することがある；そのような増殖は「Ｂ細胞リンパ腫と呼ばれる癌になる。
【０００５】
非ホジキンリンパ腫は、Ｂリンパ球の悪性増殖が特徴であるリンパ腫の一つの型である。米国癌協会によれば、推定５４，０００例の新規患者が発見され、その６５％は中程度または高度リンパ腫に分類されている。中等度リンパ腫と診断された患者の平均生存は２から５年であり、そして高度リンパ腫と診断された患者の平均生存は診断後６ヶ月から２年である。
【０００６】
通常の治療は、化学療法及び照射であるが、可能であれば、自己移植またはもしも採取時に骨髄に腫瘍細胞が非常に多い場合には、適当なドナーがいれば、同種移植または幹細胞移植を伴う。患者は多くの場合に通常の治療に反応するが、通常数ヶ月以内に再発する。
【０００７】
Ｂ細胞悪性疾患、例えば、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病は、Ｂ細胞消滅活性を有するＢ細胞抗原に特異的な抗体を使用して有効に治療することができる。Ｂ細胞悪性疾患の治療に実際に使用されまたは使用し得る可能性が報告されているＢ細胞抗体の例は、ＣＤ２０，ＣＤ１９，ＣＤ２２，ＣＤ３７及びＣＤ４０に特異的な抗体である。
【０００８】
また、Ｂ細胞消滅活性をもつ抗−ＣＤ３７抗体を使用することによりＢ細胞リンパ腫を治療する可能性が報告されている。例えば、Ｐｒｅｓｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ７（８）： １０２７−１０３８ （１９８９年８月）； Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８（４）： ８６３−８７６ （１９９２年８月１５日）．
【０００９】
Ａ．　抗−ＣＤ２０抗体
ＣＤ２０はＢ細胞リンパ腫の９０％以上に発現する細胞表面抗原であり、新生物性細胞において脱落したり、変化したりしない（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １６： ２８２５−２８３３ （１９９８ｂ））。ＣＤ２０抗原はグリコシル化さておらず、細胞内シグナル伝達、Ｂ細胞分化及びカルシウムチャネル動員系に関係する３５ｋＤａのＢ細胞膜タンパクである（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２： ８１−１４９ （１９８９）； Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １５： ４５０−４５４ （１９９４））。この抗原はヒトＢ細胞系の初期マーカーとして現れ、そして正常及び悪性のいずれのＢ細胞群にも種々の抗原密度で広く発現する。しかし、この抗原は充分に成熟したＢ細胞（例えば、形質細胞）、初期Ｂ細胞群及び幹細胞上には存在しないので、それが抗体による治療の適切な標的となる。
【００１０】
抗−ＣＤ２０抗体は研究用及び治療用に使用するために作製されてきた。抗−ＣＤ２０抗体の一つはモノクロナールＢ１抗体である（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８４３，３９８）。また、抗−ＣＤ２０抗体はＢ細胞リンパ腫を治療するために放射性核種を含む形でも（例えば、１３１Ｉ−標識抗−ＣＤ２０抗体）、並びに前立腺及び乳腺癌の転移により生じる骨の痛みを緩和するための８９Ｓｒ−標識の形でも調製されている（Ｅｎｄｏ， Ｇａｎ Ｔｏ Ｋａｇａｋｕ Ｒｙｏｈｏ ２６： ７４４−７４８ （１９９９））。
【００１１】
ネズミモノクロナール抗体、１Ｆ５（抗−ＣＤ２０抗体）をＢ細胞患者持続静脈注射により投与したことが報告されている。しかし、循環する腫瘍細胞を消滅するには著しく高レベル（＞２グラム）の１Ｆ５が必要であったと報告されており、そして結果は「一過性」であったと記述されている（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ６９： ５８４−５９１ （１９８７））。治療にモノクロナール抗体を使用する潜在的な問題点は、非ヒトモノクロナール抗体（例えば、ネズミモノクロナール抗体）が典型的にヒトエフェクター機能を欠如していることである、例えば、特に、補体依存傷害性または抗体依存性細胞毒性またはＦｃ受容体誘発食作用によるヒト標的細胞の分解をすることができない。さらに、非ヒトモノクロナール抗体はヒト宿主により外来タンパクと認識される；したがって、そのような外来抗体を反復注射すると有害な過敏反応に至る免疫応答を誘発し得る。ネズミ由来モノクロナール抗体に関しては、これはしばしばヒト抗−マウス抗体応答、すなわち「ＨＡＭＡ」応答といわれている。さらに、この「外来」抗体は、その標的部位に到達する前に有効に中和されるように宿主の免疫系の攻撃を受けてしまう。
【００１２】
ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ．ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（リツキシマブ、ＭａｂＴｈｅｒａＴＭ，ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８及びＣ２Ｂ８としても知られている）は最初にＦＤＡの承認を得たモノクロナール抗体であり、ヒトＢ細胞リンパ腫の治療用に（Ｒｅｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８３： ４３５−４４５ （１９９４））ＩＤＥＣ薬品において開発された（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８４３，４３９； ５，７７６，４５６及び５，７３６，１３７を参照）。ＲＩＴＵＸＡＮＴＭはキメラ、抗−ＣＤ２０モノクロナール（ＭＡｂ）であり、増殖抑制及びある種のリンパ腫細胞をインビトロにおいて化学療法剤に対するアポトーシスについて感受性にすると報告されている（Ｄｅｍｉｄｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒｑｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １２： １７７− （１９９７））。ＲＩＴＵＸＡＮＴＭはネズミ異種移植動物モデルを使用してインビボで試験した時に抗腫瘍活性も示す。ＲＩＴＵＸＡＮＴＭはヒト補体に効率よく結合し、ＦｃＲと強く結合し、そして補体依存（ＣＤＣ）機序及び抗体依存（ＡＤＣＣ）機序の両者によりインビトロにおいてヒトリンパ球を効率よく殺すことができる（Ｒｅｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８３： ４３５−４４５ （１９９４））。マカクにおいて、この抗体は選択的に正常Ｂ細胞を血液及びリンパ節から消滅させた。
【００１３】
ＲＩＴＵＸＡＮＴＭは軽度または濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の患者の治療に推奨されてきた（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （Ｈｕｎｔｉｎｇｔ） １２： １７６３−１７７７ （１９９８ａ）； Ｍａｌｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２： ６３−７６ （１９９８）； Ｌｅｇｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １０： ５４８−５５１ （１９９８））。ヨーロッパでは、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭは濾胞性リンパ腫の再発段階ＩＩＩ／ＩＶの治療に対して承認され（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ２： ９５−１０１ （１９９９））、そして濾胞性中心細胞リンパ腫（ＦＣＣ）に対して有効であると報告されている（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ ６２： ７６−８２（１９９９））。その他のＲＩＴＵＸＡＮＴＭで治療される疾患としては、濾胞性中心細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、及び小リンパ球リンパ腫／慢性リンパ球性白血病（ＳＬＬ／ＣＬＬ）がある（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。難治性のＮＨＬの患者がＲＩＴＵＸＡＮＴＭ及びＣＨＯＰ（つまり、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン及びドキソルビシン）療法の併用に反応したと報告されている（Ｏｈｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇａｎ Ｔｏ Ｋａｇａｋｕ Ｒｙｏｈｏ ２５： ２２２３−８ （１９９８））。ＲＩＴＵＸＡＮＴＭは低度非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）における第１相及び第２相臨床試験においてわずかな毒性及び有意な治療効果を示した（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ． ９： ９９５−１００１ （１９９８））。
【００１４】
ＲＩＴＵＸＡＮＴＭは、単独で再発または難治性軽度または濾胞性ＮＨＬのＢ細胞ＮＨＬの治療に典型的には毎週３７５ｍｇ／Ｍ２の用量で４週間使用され、耐容性はよくそして有意な臨床効果を有している（Ｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ． １０： ６５５−６１ （１９９９）； Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）； 及びＣｏｉｆｆｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９２： １９２７−１９３２ （１９９８））。しかし、この抗体を使用する試験では４週間用量として５００ ｍｇ／Ｍ２の用量まで投与されている（Ｍａｌｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９０： ２１８８−２１９５ （１９９７））。ＲＩＴＵＸＡＮＴＭは、低度または濾胞性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の患者を治療するために、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソン）のような化学療法剤とも併用されている（Ｃｚｕｃｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １７： ２６８−７６ （１９９９）； 及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９８ａ））。
【００１５】
さらに、Ｂ細胞リンパ腫の治療に抗−Ｂ７抗体を使用することがＩＤＥＣ薬品会社に付与された特許に言及されている。しかし、この特許の焦点は免疫抑制が治療上必要な疾患の治療に使用することに有る。例としては、アレルギー、自己免疫及び移植などの適応である。Ｂ細胞リンパ腫の治療に検討中の抗−Ｂ７抗体を使用することも言及されている（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，１１３，１９８）。
【００１６】
Ｂ．　ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ
ＣＤ４０は成熟Ｂ細胞、並びに白血病性及びリンパ球性Ｂ細胞、及びホジキン病（ＨＤ）のホジキン及びリード−スターンベルク（ＲＳ）細胞の細胞表面に発現する（Ｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９： １４６３−１４６７ （１９８９）； 及びＧｒｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋ． Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２４： ３９３−４２２ （１９９７））。ＣＤ４０は正常及び非ホジキン濾胞性リンパ腫のような悪性Ｂ細胞の活性化及び生存を導くＢ細胞受容体である（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８２： １８４８−１８５７ （１９９３）； 及びＭｅｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４７： １０４ （１９９８））。ＣＤ４０受容体を介するシグナル伝達はＩｇＭ−またはＦａｓ−誘導アポトーシスから未成熟Ｂ細胞及びＢ細胞リンパ腫を防御している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５５： ３７２２−３７２５ （１９９５））。同様に、マントル細胞リンパ腫細胞は高レベルのＣＤ４０を有しており、外来性ＣＤ４０Ｌの添加はその生存力を増強し、フルダラビン誘導アポトーシスを免れさせている（Ｃｌｏｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． １０３： ２１７−２１９ （１９９８））。これに反して、ＣＤ４０刺激はインビトロにおいても（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８３： ２７８７−２７９４ （１９９４））インビボにおいても（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８６： １９４６−１９５３ （１９９５））新生物Ｂ細胞の増殖を阻害すると報告されている。
【００１７】
抗−ＣＤ４０抗体（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８７４，０８２及び５，６６７，１６５を参照）をマウスに投与すると、ヒトＢ細胞リンパ腫を持つマウスの生存を増加させる（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）； 及びＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１： ３１７６−３１８５ （１９９８））。ＣＤ４０Ｌの効果を真似てそしてそれにより死信号を供給する抗−ＣＤ４０抗体を使用してＢ細胞リンパ腫及びＥＢＶ誘導リンパ腫を含む新生物を治療する方法がＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，６７４，４９２ （１９９７）に記述されており、この全体を参考文献に取り入れた。ＣＤ４０のシグナル伝達はＣＤ２０との相乗相互作用にも関係している（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃ． Ｓｈｏｃｋ ４４： ６７−７２ （１９９４））。抗−ＣＤ４０抗体の調製及び使用について記述している追加の参考文献としては、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８７４，０８５ （１９９９）， ５，８７４，０８２ （１９９９）， ５，８０１，２２７ （１９９８）， ５，６７４，４９２ （１９９７）及び５，６６７，１６５ （１９９７）があり、これらの全体を参考文献として取り入れた。
【００１８】
ＣＤ４０リガンド、ｇｐ３９（ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０ＬまたはＣＤ１５４とも呼ばれる）、は活性化ＣＤ４＋ Ｔｈ細胞上に発現するが、静止状態では発現しない（Ｓｐｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６： １５４３−１５５０ （１９９２）； Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２： ２５７３−２５７８ （１９９２）； 及びＲｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１： １−１４ （１９９３））。ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ共にクローン化されそして性質が明らかにされている（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ８： １４０３−１４１０ （１９８９）； Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５７： ８０−８２ （１９９２）； Ｌｅｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５： １０９１−１１０１ （１９９２）； ａｎｄ Ｈｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １１： ４３１３−４３２１ （１９９２））。ヒトＣＤ４０ＬもＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９４５，５１３に記述されている。ＣＤ４０Ｌ遺伝子を導入されそしてその表面にＣＤ４０Ｌタンパクを発現する細胞はＢ細胞の増殖を引き起こすことができ、又他の刺激シグナルと共に、抗体生産を誘導することができる（Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．， （１９９２）； 及びＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９４５，５１３）。ＣＤ４０Ｌはホジキン病分野において新生濾胞性またはリード−スターンベルク細胞（ＣＤ４０＋）内の腫瘍Ｂ細胞（ＣＤ４０＋）の細胞接触依存相互作用に重要な役割を演じているであろう（Ｃａｒｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４７： ９１２−９２２（１９９５））。抗−ＣＤ４０Ｌモノクロナール抗体はＬＰ−ＢＭ５感染マウスにおけるネズミＡＩＤＳ（ＭＡＩＤＳ）の誘発阻止に使用して有効であったと報告されている（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４１： ２６０−２６８ （１９９８））。しかし、悪性Ｂ細胞を生存させたりあるいは細胞死応答を誘導したりするＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０信号伝達の機序は明らかでない。例えば、濾胞性リンパ腫細胞において、ＴＲＡＩＬ分子（ＡＰＯ−２Ｌ）を誘導するアポトーシスの下方調節（Ｒｉｂｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． １０３： ６８４−６８９ （１９９８））及びＢＣＬ−２の過剰発現、及びＢ−ＣＬＬの場合に、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）の下方調節（Ｌａｙｔｒａｇｏｏｎ−Ｌｅｗｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ６１： ２６６−２７１ （１９９８））が生存の機序として提案されている。これに対して、濾胞性リンパ腫において、ＣＤ４０活性化はＴＮＦ（Ｗｏｒｍ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６： １８８３−１８９０ （１９９４））及びＣＤ９５分子（Ｐｌｕｍａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９１： ２８７５−２８８５ （１９９８））の上方調節を生じている証拠が有る。
【００１９】
抗−ＣＤ４０抗体は、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８７４，０８２（１９９９）に記述されているようにアレルギー及び自己免疫疾患のような抗体による疾患の予防または治療のために調製されてきた。抗−ＣＤ４０抗体は、抗−ＣＤ２０抗体と併用して細胞培養において非ホジキンＢ細胞リンパ腫の増殖抑制に追加的効果を生じることが報告されている（Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３５： １２９−１３９ （１９９６））。マウスにおけるインビボ試験では、全てではなく一部のリンパ腫系を持つマウスの生存を延長する有効性は別々に投与された抗−ＣＤ４０抗体よりも抗−ＣＤ２０抗体の方が優れていることが示されたと報告されている（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９： ９３−１０１ （１９９６））。抗−ＣＤ１９抗体は二つの同系マウスＢ細胞リンパ腫、ＢＣＬ１及びＡ３１の治療においてインビボで有効であったと報告されている（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８））。ＣＤ４０Ｌに対する抗体もＢ細胞活性化による病気の治療に使用することが記述されている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５５５，８８０ （１９９３））。抗−ＣＤ４０Ｌ抗体には、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７４７４，０３７ （１９９８）に記述されているように、モノクロナール抗体３Ｅ４，２Ｈ５，２Ｈ８，４Ｄ９−８，４Ｄ９−９，２４−３１，２４−４３，８９−７６及び８９−７９及びＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８７６，７１８ （１９９９）に記述されている移植片対宿主病の治療に使用される抗−ＣＤ４０Ｌ抗体が含まれる。
【００２０】
Ｃ．　抗−ＣＤ２２抗体
ＣＤ２２に対するモノクロナール抗体の合成及び治療に使用する方法も報告されている。ＣＤ２２は、ホモタイプまたはヘテロタイプの相互作用に働くＢ細胞接着に関係するＢ細胞特異的分子である（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３４４： ７４ （１９９０）； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３： １３７ （１９９１）； Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ６６： １１３３ （１９９１））。ＣＤ２２タンパクは前駆Ｂ及びプレＢ細胞の細胞質中に発現する（Ｄｏｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６： ４４７０ （１９８６）； Ｄｏｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ，”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＣＤ２２ ｉｎ Ｂ−ｃｅｌｌ ｏｎｔｏｇｅｎｙ． Ｉｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ， Ｗｈｉｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ． ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐ． ４７４ （１９８７）； Ｓｃｈｗａｒｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ ６５： ９７４ （１９８５）； Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ ６９： ８３６ （１９８７））が、しかし成熟Ｂ細胞の表面にのみ見出され、同時に表面ＩｇＤとして存在する（Ｄｏｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６： ４４７０ （１９８６））。ＣＤ２２発現は活性化により増加し、そしてさらに分化が進むにしたがって消失する（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３： １３７ （１９９１）； Ｄｏｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６： ４４７０ （１９８６））。リンパ組織では、ＣＤ２２は濾胞性マントル及び境界領域Ｂ細胞により発現されるがしかし胚中心Ｂ細胞によっては週に一度のみである（Ｄｏｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６： ４４７０ （１９８６）； Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，”Ｂ−ｃｅｌｌ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ａｎｔｉｇｅｎｓ： ｎｅｗ ａｎｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｓ”Ｉｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ ＩＩＩ． Ｗｈｉｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ， ＭｃＭｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ， ｅｄｓ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐ． ３０２ （１９８７））。しかし、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、胚中心ではＣＤ２２ ｍＲＮＡの強い発現がありそしてマントル帯では発現が弱いことが明らかとなった（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３： １３７ （１９９１））。ＣＤ２２ ｍＡｂのＢ細胞への結合はインビトロで細胞内遊離カルシウムの増加及び表面Ｉｇの交差結合により誘導される増殖を増大するので、ＣＤ２２はＢ細胞活性化の調節に関係すると推測されている（Ｐｅｚｚｕｔｔｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８： ９８ （１９８７）； Ｐｅｚｚｕｔｔｏ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０： １７９１ （１９８８））。しかし、他の研究では抗−Ｉｇ誘導増殖の増大は中程度であることを明らかにした（Ｄｏｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６： ４４７０ （１９８６））。ＣＤ２２��構成的にリン酸化されているが、ＰＭＡで細胞を処理するとリン酸化のレベルは増大する（Ｂｏｕｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０： １９２ （１９９８））。さらに、可溶型のＣＤ２２はヒトＴ細胞のＣＤ３仲介活性化を阻害するので、ＣＤ２２はＴ細胞‐Ｂ細胞相互作用に重要であることを示唆している（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ６６： １１３３ （１９９１））。
【００２１】
ＣＤ２２受容体に特異的に結合するリガンドは、種々の病気、特にＢ細胞リンパ腫及び自己免疫疾患の治療に適用し得ることが報告されている。特に、そのような病気の治療に標識化及び非標識抗−ＣＤ２２抗体を使用することが報告されている。
【００２２】
例えば、Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，４８４，８９２、は高い親和性でＣＤ２２と結合しそしてＣＤ２２と他のリガンドとの相互作用を阻害すると主張している。これらのモノクロナール抗体は、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、壊死性脈管炎、リンパ節炎、結節性動脈周囲炎、全身性紅斑性狼瘡、関節炎、血小板減少性紫斑病、顆粒細胞減少症、自己免疫溶血性貧血のような自己免疫疾患の治療に、また妊娠、重症筋無力症、インスリン抵抗性糖尿病、グレーブス病及びアレルギー反応の際の致死性抗原のような外来性抗原に対する免疫反応を抑制するのに、有用であることが開示されている。
【００２３】
また、Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，７８９，５５７，はＣＤＲグラフティングにより作製したキメラ及びヒト化抗−ＣＤ２２モノクロナール抗体及びそのコンジュゲート型及び非コンジュゲート型をＢ細胞リンパ腫及び白血病の治療と診断に使用することを開示している。参考文献は特に化学療法剤、トキシン、重金属及び放射性元素のような細胞傷害性物質とコンジュゲートした抗体を開示している（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，７８９，５５４， １９９８年８月４日Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌに交付、そしてＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓに譲渡、を参照）。
【００２４】
さらに、ＰＣＴ申請ＷＯ ９８／４２３７８， ＷＯ ００／２０８６４，及びＷＯ ９８／４１６４１にはＣＤ２２に特異的なモノクロナール抗体、コンジュゲート及びフラグメント及びその治療上の使用、特にＢ細胞関連疾患の治療への使用が記述されている。
【００２５】
また、自己免疫疾患及び癌の治療に抗−ＣＤ２２抗体を使用することも示されている。例えば、診断と治療、特にウイルス及び細菌感染症、心血管疾患、自己免疫疾患及び癌の治療に使用する抗−ＣＤ２２イムノコンジュゲートを記述したＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，４４３，９５３，１９９５年８月２２日Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌに交付、そしてＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ Ｉｎｃ．に譲渡、及び特に自己免疫疾患の治療に有用なＣＤ２２の接着機能の阻止または阻害により病気を治療するためのＣＤ２２を指向する種々のモノクロナール抗体を記述しているＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，４８４，８９２， １９９８年１月１６日Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌに交付そしてＤａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｉｎｃ．に譲渡、を参照。これらの参考文献は、フラグメントの抗−ＣＤ２２抗体が直接的にまたは間接的に目的とするエフェクター基、例えば、インビトロ免疫検定またはインビボ画像解析における酵素、蛍光発生基、放射性元素、電子伝達物質のような検出できる標識、または治療に役立つエフェクター基、例えば、トキシン、薬物または放射性同位元素とコンジュゲートさせる得ることを示している。
【００２６】
さらに、ＩｇＧ１イソタイプの抗−ＣＤ２２ヒトモノクロナール抗体はＬｅｉｎｃｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されており、Ｂ細胞リンパ腫及び有毛細胞白血病を含む白血病の治療に有用であると報告されている（Ｃａｍｐａｎａ， Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３４： １５２４ （１９８５））。さらに、Ｄｏｒｋｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０： ４７１９ （１９９３）及びＥｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０： ４５１９ （１９９３）は共にＣＤ２２に特異的なモノクロナール抗体を記述している。
【００２７】
Ｄ．抗−ＣＤ１９抗体
抗−ＣＤ１９抗体及びそのフラグメントをリンパ腫の治療に使用することも文献に報告されている。例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，６８６，０７２， １９９７年１１月１１日Ｕｈｒ ｅｔ ａｌに交付、そしてテキサス大学に譲渡、には抗−ＣＤ１９抗体及び抗−ＣＤ２２抗体及びイムノトキシンを白血病及びリンパ腫の治療に使用することが記述されている。この特許の全体を参考文献に取り入れた。
【００２８】
さらに、白血病の状態を分類及び診断するために抗−ＣＤ１９抗体を使用することが報告されている。
【００２９】
この様に、前述に基づいて、多数の抗体がＢ細胞悪性疾患の治療に効果を有する可能性が報告されてきたことは明らかである。これらの事実に妨げられることなく、本発明の目的はＢ細胞リンパ腫の治療のために新規抗体使用法を提供することである。
【００３０】
本発明の簡単な説明と目的
本発明の目的は、いずれの程度のホジキン及び非ホジキンリンパ腫も含めたＢ細胞悪性疾患を治療するための新規改良抗体療法を提供することにある。
【００３１】
特に、本発明の目的は、少なくとも一つのＢ細胞消滅抗体及び少なくとも一つの免疫調節または免疫修飾抗体を含むＢ細胞悪性疾患治療のための新規抗体療法を提供することである。
【００３２】
さらに特異化すると、本発明の目的は、望ましくは抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２２または抗−ＣＤ３７抗体から選択された少なくとも一つのＢ細胞消滅抗体及び望ましくは抗−Ｂ７、抗−ＣＤ２３、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ４０Ｌまたは抗−ＣＤ４抗体から選択された少なくとも一つの免疫修飾抗体を投与することを含むＢ細胞悪性疾患治療のための新規抗体療法を提供することである。
【００３３】
本発明のもう一つの目的は、ＣＤ２０に対する抗体（望ましくはＲＩＴＵＸＡＮＴＭ）及びＢ７またはＣＤ４０Ｌ（それぞれ望ましくはＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌに対するＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ６，１１３，１９８に報告されている霊長類化抗−Ｂ７抗体、またはＩＤＥＣ薬品会社に譲渡されたＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ６，００１，３５８に報告されているヒト化抗−ＣＤ４０Ｌ抗体）を投与することによる非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を治療するための新規治療基準を提供することである。
【００３４】
本発明のその他の目的は、少なくとも一つの免疫修飾または免疫調節抗体及び少なくとも一つのＢ細胞消滅抗体を含む、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病におけるＢ細胞悪性疾患治療の新規組成物及びキットを提供することである。望ましくは、免疫修飾または免疫調節抗体は抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ４０Ｌまたは抗−Ｂ７抗体を含み、またＢ細胞消滅抗体はＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２またはＣＤ３７に特異的である。最も望ましいのは、それ等の組成物が抗−ＣＤ４０Ｌまたは抗−Ｂ７抗体及び抗−ＣＤ２０抗体を含んでいる。
【００３５】
本発明のその他の目的は、抗−ＣＤ４０Ｌまたは抗体フラグメントまたはＣＤ４０Ｌ拮抗剤及び、次の中の少なくとも一つ、（ａ）化学療法剤または化学療法剤の組合せ、（ｂ）放射線療法、（ｃ） 抗−ＣＤ２０抗体またはそのフラグメント、（ｄ） 抗−ＣＤ４０抗体またはそのフラグメント、（ｅ） 抗−ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、（ｆ） 抗−ＣＤ２２抗体またはそのフラグメント、（ｇ）抗体がトキシンまたは放射標識とコンジュゲートしているか、またはヒト抗体エフェクター機構が働くように、すなわち、標的細胞のアポトーシスまたは死滅に至るように、ヒト定常領域を操作されている場合には、サイトカインまたはその組み合わせ、を併用する、Ｂ細胞リンパ腫またはＢ細胞白血病を治療するための併用療法を提供することである。
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明は新規な抗体併用方法を提供する、この方法は少なくとも一つの免疫調節抗体または免疫修飾抗体、例えば、抗−Ｂ７または抗−ＣＤ４０または抗−ＣＤ４０Ｌ抗体及び少なくとも一つのＢ細胞消滅抗体、例えば、実質的にＢ細胞を消滅させる活性を有する抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２２または抗−ＣＤ３７抗体、を含んでいる。
【００３７】
そのような併用は、治療効果を示す抗体による異なる機序に基づく相乗効果をもたらすと考えられている。理論的には、相補的作用機序により臨床的反応は、抗−Ｂ７または抗−ＣＤ４０Ｌ抗体のような免疫調節または免疫修飾抗体の作用に抵抗する活性化Ｂ細胞をＢ細胞消滅抗体が消滅させるよりも、より持続し、そして強力であろう。そのような活性化Ｂ細胞はそうでなければ、Ｔ細胞に対する効果的な抗原提示細胞並びに抗体生産細胞として働く。Ｂ細胞悪性疾患においては、そのような活性化Ｂ細胞は、根絶させなければ、新たな癌細胞及び腫瘍を生じる悪性細胞を含んでいる。
【００３８】
本発明の検討に先立って、以下の定義を提供する：
ここに使用されている用語「抗体」は、指定されたタンパクまたはそのペプチドに特異的に反応する免疫グロブリン及びそのフラグメントを含むことを意味している。抗体には、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパクまたは放射標識と融合した抗体、及び抗体フラグメントが含まれる。
【００３９】
ここに使用された「抗体」は、広い意味においてまた特異的に、完全なモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、少なくとも二つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び必要な生物学的活性を示す抗体フラグメントを包含する。
【００４０】
「抗体フラグメント」は完全な抗体の部分を含み、望ましくは抗原結合領域またはその可変領域を含んでいる。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，　Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント；二重特異性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体フラグメントは通常の技術を使用して単離することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは抗体をペプシンで処理することにより発生させることができる。生成したＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して、Ｆａｂ’フラグメントを造ることができる。
【００４１】
「天然の抗体」は通常約１５０，０００ダルトンの異種４量体糖タンパクであり、二つの同一軽（Ｌ）鎖及び二つの同一重（Ｈ）鎖から構成されている。各軽鎖は一つのジスルフィド共有結合によって重鎖に結合しており、一方重鎖間のジスルフィド結合の数は種々のイムノグロブリンアイソタイプによって異なる。各重鎖及び軽鎖は一定間隔で鎖内のジスルフィド架橋を有している。各重鎖は一端に多数の定常ドメインに続く可変ドメイン（ＶＨ）を有している。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そして他端に定常ドメインを有している；軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと並列し、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列している。個々のアミノ酸残基は軽鎖及び重鎖可変ドメインの間で接触面を形成していると考えられている。
【００４２】
用語「可変」とは、可変ドメインのある部分は抗体毎に配列が著しく異なっておりそして個別の抗原に対するそれぞれの抗体の結合と特異性に利用されているという事実のことである。しかし、可変性は抗体の可変ドメインに均一に分布してはいない。軽鎖及び重鎖両者の可変ドメインの超可変領域と呼ばれる３個所の部分に集中している。可変ドメインのより保存性の高い部分は骨格領域（ＦＲ）と呼ばれている。本来の重鎖及び軽鎖それぞれの可変ドメインは４個のＦＲを含み、主にβ−シート構造を取り、３個の超可変領域により結合されており、これらはループ構造を、そしてある場合にはβ−シート構造の部分を形成する。それぞれの鎖の超可変領域は互いにＦＲにより、また他の鎖の超可変領域と近接して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ． （１９９１））。定常ドメインは抗体を抗原に結合させるのに直接は関係していないが、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）における抗体の寄与のような種々のエフェクター機能を発揮する。
【００４３】
抗体のパパイン消化により２個の同一抗原結合フラクションを生じ、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれ、それぞれは単一の抗原結合部位及び残りの「Ｆｃ」フラグメントを有しており、これらの名称はその結晶化の能力を反映している。ペプシン処理により、２個の抗原結合部位を有して抗原と交差結合することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００４４】
「Ｆｖ」は完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は１個の重鎖及び１個の軽鎖可変ドメインが緊密に、非共有結合で会合した２量体からなる。各可変ドメインの３個の超可変領域が相互作用してＶＨ−ＬＨ２量体の表面上に抗原結合部位を定めるような構造をとっている。まとめると、６個の超可変領域が抗体に抗原結合特異性を与えている。しかし、単一可変ドメイン（すなわち、抗原に特異的な３個の超可変領域のみを含むＦｖの半分）であっても抗原を認識し、結合する能力を、完全な結合部位よりは低い親和性であるが、有している。
【００４５】
またＦａｂフラグメントは軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨＩ）を含んでいる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の１以上のシステインを含む重鎖ＣＨＩドメインのカルボキシ末端に数個の残基が加わっている点がＦａｂと異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨはここでは、定常ドメインのシステイン残基の少なくとも一つが遊離チオールであることを示す。Ｆ（ａｂ’）Ｚ抗体フラグメントは最初ヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として作製されたものである。その他の抗体フラグメントの化学的結合も知られている。
【００４６】
いずれの哺乳動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２種の明らかに異なるタイプ、カッパ及びラムダと呼ばれる、の一つに分類することができる。
【００４７】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体を異なるクラスに分類することができる。完全な抗体の主要５クラスがある：ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，及びＩｇＭ、そしてこれらのいくつかはさらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４，ＩｇＡ，及びＩｇＡ２、に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューとそれぞれ呼ばれる。望ましくは、重鎖定常ドメインはガンマ−１、ガンマ−２、ガンマ−３及びガンマ−４定常領域を完備している。望ましくは、これらの定常ドメインは、ここにその全体を参考に取り入れたＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，０１１，１３８に開示されているＰ及びＥ修飾のような抗体安定性を増強する修飾も含んでいる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【００４８】
「単鎖−Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントはＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖の中に存在している。望ましくは、ＦｖポリペプチドはさらにｓｃＦｖが抗原結合のために必要な構造をとることができるようにＶＨ及びＶＬの間にポリペプチドリンカーを含んでいる。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）を参照。
【００４９】
用語「ダイアボディー」とは二つの抗原結合部位を有する小さな抗原フラグメントのことであり、このフラグメントは同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでいる。同一鎖上の２個のドメインの間にペアを造るには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインとペアを形成させられ、そして二つ抗原結合部位を創り出す。ダイアボディーについては、例えば、ＥＰ ４０４，０９７； ＷＯ ９３／１１１６１； 及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ６４４４−６４４８ （１９９３）に詳細に記述されている。
【００５０】
ここに使用されている用語「モノクロナール抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体のこと、すなわち、集団を構成する個々の抗体が少量存在し得る自然発生突然変異を除いて同一であること、を意味する。モノクロナール抗体は高度に特異性があり、単一の抗原部位を指向する。さらに、種々の決定基（エピトープ）を指向する種々の抗体を典型的に含む通常の（ポリクロナール）抗体標品と異なり、各モノクロナール抗体は抗原上の単一決定基を指向する。特異性に加えて、モノクロナール抗体は、他の免疫グロブリンの混入を避けて、ハイブリドーマ培養により合成される点で優れている。修飾語「モノクロナール」は実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体の性質を示すものであり、何か特別な方法により必要な抗体の生産を行なったと解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクロナール抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５ （１９７５）によって記述されたハイブリドーマ法により作られるか、または組換えＤＮＡ法（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８１６，５６７を参照）により作ることができる。「モノクロナール抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２： ６２４−６２８ （１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１−５９７ （１９９１）に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００５１】
「ヒト化抗体」によって、典型的にはネズミ抗体から誘導され、親抗体の抗原結合性を保持または実質的に保持しているが、ヒトにおける免疫原性は少ない抗体を意味する。これは種々の方法により行われ、それらは（ａ）非ヒト可変ドメインをヒト定常領域上に移植してキメラ抗体を作製する；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のみをヒト骨格及び重要な骨格残基を持つか持たない定常領域中に移植する；及び（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基を置換してヒト類似セクションでそれを「被う」。これらの方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１： ６８５１−５ （１９８４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４４： ６５−９２ （１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： １５３４−１５３６ （１９８８）； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ． ２８： ４８９−４９８ （１９９１）； 及びＰａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎ． ３１： １６９−２１７ （１９９４）に記述されており、これらの全てを参考文献として引用した。ヒト化抗−ＣＤ４０Ｌ抗体は、その全体を参考文献に引用したＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ申請番号０８／５５４，８４０、１９９５年１１月７日出願、の記述に従って調製することができる。
【００５２】
「ヒト抗体」は完全にヒトの軽鎖及び重鎖並びに定常領域を含む抗体を意味し、既知標準的方法のいずれかにより作られる。
【００５３】
「霊長類化抗体」は、サル（またはその他の霊長類）抗体、特にカニクイザル抗体、の可変重鎖及び軽鎖ドメインを含むように操作された組換え抗体を意味する、そしてヒト定常ドメイン配列、望ましくはヒト免疫グロブリンガンマ１またはガンマ４定常ドメイン（またはＰＥ変異体）を含んでいる。その抗体の調製は、その全体を参考文献に引用したＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０： １４５８−１４６０ （１９９２）； ０８／３７９，０７２， ０８／４８７，５５０，または０８／７４６，３６１に記述されている。これらの抗体はヒト抗体と高度の相同性、すなわち８５−９８％、を示し、ヒトエフェクター機能を発揮し、免疫原性が少なく、そしてヒト抗原に高い親和性を示すと報告されている。
【００５４】
「抗体フラグメント」はＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’及びｓｃＦｖのような抗体のフラグメントを意味する。
【００５５】
「キメラ抗体」は、典型的には異なる動物種からの、二つの異なる抗体から由来する配列を含む抗体を意味する。最も典型的には、キメラ抗体はヒト及びネズミ抗体フラグメントを含んでおり、そして一般的にはヒト定常及びネズミ可変領域を含んでいる。
【００５６】
「Ｂ細胞消滅抗体」は投与した際に明らかなＢ細胞消滅を生じる抗体またはフラグメントである。典型的には、そのような抗体はＢ細胞の表面に発現するＢ細胞抗原またはＢ細胞マーカーに結合する。望ましくは、投与した後、そのような抗体は典型的に数日以内に約５０％またはそれ以上のＢ細胞数の消滅を生じる。望ましい態様において、Ｂ細胞消滅抗体はＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（キメラ抗−ＣＤ２０抗体）または実質的に同じかまたは少なくともＲＩＴＵＸＡＮＴＭの２０−５０％の細胞消滅活性を有する抗体である。
【００５７】
「Ｂ細胞表面マーカー」または「Ｂ細胞標的」または「Ｂ細胞抗原」は、それに結合する拮抗剤の標的となり得るＢ細胞の表面に発現する抗原である。代表的なＢ細胞表面マーカーとしては、ＣＤ１０，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２１，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ２４，ＣＤ３７，ＣＤ５３，ＣＤ７２，ＣＤ７３，ＣＤ７４，ＣＤｗ７５，ＣＤｗ７６，ＣＤ７７，ＣＤｗ７８，ＣＤ７９ａ，ＣＤ７９ｂ，ＣＤ８０，ＣＤ８１，ＣＤ８２，ＣＤ８３，ＣＤｗ８４，ＣＤ８５及びＣＤ８６白血球表面マーカーがある：特別に関心が有るＢ細胞表面マーカーは哺乳動物の非Ｂ細胞組織に比較してＢ細胞上に優先的に発現し、そして前駆Ｂ細胞及び成熟Ｂ細胞の両者に発現する。一態様において、マーカーは幹細胞段階から形質細胞へ最終的分化をする直前までの系統の分化の間Ｂ細胞上に認められる、ＣＤ２０またはＣＤ１９のようなものである。望ましいＢ細胞表面マーカーはここではＣＤ１９及びＣＤ２０である。
【００５８】
「免疫調節抗体」とは、Ｂ細胞消滅とは異なる機序、例えば、ＣＤＬ及び／またはＡＤＣＣ、により免疫系に影響を及ぼす抗体である。その例としてはＴ細胞免疫、Ｂ細胞免疫を抑制する、例えば、耐性を誘導することによる抗体（抗−ＣＤ４０Ｌ、抗−ＣＤ４０）またはその他の免疫抑制抗体、例えばＢ７細胞信号伝達を抑制する（抗−Ｂ７．１，抗−Ｂ７．２，抗−ＣＤ４，抗−ＣＤ２３など）がある。一部の例では、免疫調節抗体がアポトーシスを促進する能力を持つこともある。また、通常はＢ細胞消滅抗体である抗体を操作して、ヒト定常領域を他のエフェクター機序に役立つようにして免疫を調節することもできる。
【００５９】
「Ｂ細胞表面マーカー」はここではこれに結合する拮抗剤の標的となり得るＢ細胞表面上に発現する抗原である。代表的Ｂ細胞表面マーカーとしては、ＣＤ１０，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２１，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ２４，ＣＤ３７，ＣＤ５３，ＣＤ７２，ＣＤ７３，ＣＤ７４，ＣＤｗ７５，ＣＤｗ７６，ＣＤ７７，ＣＤｗ７８，ＣＤ７９ａ，ＣＤ７９ｂ，ＣＤ８０（Ｂ７．１），ＣＤ８１，ＣＤ８２，ＣＤ８３，ＣＤｗ８４，ＣＤ８５及びＣＤ８６（Ｂ７．２）白血球表面マーカーがある。特別に関心が有るＢ細胞表面マーカーは哺乳動物の非Ｂ細胞組織に比較してＢ細胞上に優先的に発現し、そして前駆Ｂ細胞及び成熟Ｂ細胞の両者に発現する。一態様において、マーカーは幹細胞段階から形質細胞へ最終的分化をする直前までの系統の分化の間Ｂ細胞上に認められる、ＣＤ２０またはＣＤ１９のようなものである。望ましいＢ細胞表面マーカーはここではＣＤ１９， ＣＤ２０，ＣＤ２３，ＣＤ８０及びＣＤ８６である。
【００６０】
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血またはリンパ組織のＢ細胞の９０％以上の表面に認められる３５ｋＤａ、非グリコシル化ホスフォプロテインである。ＣＤ２０は初期前Ｂ細胞発生の間に発現し、形質細胞に分化するまで残存する。ＣＤ２０は正常Ｂ細胞並びに悪性Ｂ細胞の両者に存在する。文献中のＣＤ２０の別名は、「Ｂリンパ球限定抗原」及び「Ｂｐ３５」である。ＣＤ２０抗原はＣｌａｒｋ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） ８２： １７６６ （１９８５）に記述されている。
【００６１】
「ＣＤ１９」抗原とは、ＨＤ２３７−ＣＤ１９またはＢ４抗体により同定される９０ｋＤａ抗原のことである（Ｋｉｅｓｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＩ， １２： １１１９ （１９８７））。ＣＤ２０のように、ＣＤ１９は幹細胞段階から形質細胞へ最終的分化をする直前までの系統の分化の間細胞上に認められる。ＣＤ１９に拮抗剤が結合するとＣＤ１９抗原のインターナリゼーションを生じる。
【００６２】
「ＣＤ２２」抗原とは、Ｂ細胞に発現する抗原のことであり、「ＢＬ−ＣＡＭ」及び「ＬｙｂＢ」としても知られており、Ｂ細胞信号伝達及び接着に関係している（Ｎｉｔｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ７： １３３ （１９９７）； Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４５： ７４ （１９９０）を参照）。この抗原は膜免疫グロブリン関連抗原であり、膜Ｉｇが結合するとチロシンがリン酸化される（Ｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｔｙｐ． Ｍｅｄ． １８１（４）： １５２１−１５８６ （１９９５））。この抗原をコードする遺伝子はクローン化されており、そのＩｇドメインも分析されている。
【００６３】
Ｂ７抗原はＢ７．ｌ（ＣＤ８０），Ｂ７．２（ＣＤ８１）及びＢ７．３を含み、Ｂ細胞に発現する膜貫通抗原である。ヒトＢ７．１及びＢ７．２抗原を含むＢ７抗原に選択的に結合する抗体は当業者に既知である。望ましいＢ７抗体には、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，１１３，１９８， ＩＤＥＣ薬品会社に譲渡、のなかにＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．により開示されている霊長類化ＴＭＢ７抗体、並びにヒト及びヒト化Ｂ７抗体が含まれる。
【００６４】
ＣＤ２３はＢ及びその他の細胞が発現するＩｇＥに対する低親和性受容体のことである。本発明において、ＣＤ２３はヒトＣＤ２３抗原であることが望ましいであろう。ＣＤ２３抗体も同業者に既知である。本発明において最も望ましいのは、ＣＤ２３抗体が、ヒトＩｇＧＩまたはＩｇＧ３定常ドメインを含むヒトまたはキメラ抗−ヒトＣＤ２３抗体であろう。
【００６５】
Ｂ細胞「拮抗剤」は、Ｂ細胞表面マーカーに結合して、哺乳動物のＢ細胞を破壊しそして消滅するそして／または一つ以上のＢ細胞機能、例えば、Ｂ細胞により発生する液性応答を阻止する分子である。この拮抗剤はこれで処置した哺乳動物のＢ細胞を消滅させ（すなわち、循環Ｂ細胞レベルを低下させ）得ることが望ましい。その消滅は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｂ細胞増殖阻害及び／またはＢ細胞死（例えば、アポトーシス）の誘導、のような種々の機序により行なうことができる。本発明の範囲内に含まれる拮抗剤としては、任意に細胞傷害性物質と結合または融合した、抗体、合成または天然の配列ペプチド及びＢ細胞マーカーに結合する小分子拮抗剤、が含まれる。
【００６６】
ＣＤ４０Ｌ拮抗剤は、特異的にＣＤ４０Ｌに結合しそしてＣＤ４０ＬとＣＤ４０の相互作用に拮抗することが望ましい分子である。その例としては、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する抗体及び抗体フラグメント、可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ４０融合タンパク、及びＣＤ４０Ｌに結合する小分子が含まれる。本発明に望ましい拮抗剤はＣＤ４０に特異的な抗体または抗体フラグメントである。
【００６７】
「抗体依存性細胞性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、次いで標的細胞の分解を引き起こす、細胞介在反応のことである。ＡＤＣＣを仲介する主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃｙＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃｙＲＩ， ＦｃｙＲＩＩ及びＦｃｙＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はＲａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９： ４５７−９２ （１９９１）、頁４６４の表３に要約されている。関心分子のＡＤＣＣ活性を評価するには、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５００，３６２または５，８２１，３３７に記述されているようなインビトロＡＤＣＣ検定により行なうことができる。その検定に有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞がある。その他に、あるいは加えて、関心分子のＡＤＣＣ活性はインビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） ９５： ６５２−６５６ （１９９８）に開示されているような動物モデルで評価することができる。
【００６８】
「ヒトエフェクター細胞」は一つ以上のＦｃＲを発現しそしてエフェクター機能を発揮する白血球である。望ましくは、細胞は少なくともＦｃｙＲＩＩＩを発現しそしてＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含む；ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が望ましい。エフェクター細胞は天然資源、例えば、血液またはここに記述したＰＢＭＣ、から単離することができる。
【００６９】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。望ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、望ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）結合するもの、及びこれらの受容体の対立変異体及び選択的スプライシング型を含むＦｃｙＲＩ，　ＦｃｙＲＩＩ及びＦｃｙＲＩＩサブクラスの受容体を含んでいる。ＦｃｙＲＩＩはＦｃｙＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃｙＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）を含んでおり、これらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似アミノ酸配列を有している。活性化受容体ＦｃｙＲＩＩＡはその細胞質ドメインに免系受容体チロシン含有活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有している。抑制性受容体ＦｃｙＲＩＩＢはその細胞質ドメインに免疫受容体チロシン含有抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有している（Ｍ． ｉｎ Ｄａｅｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５： ２０３−２３４ （１９９７）の総説を参照）。ＦｃＲについては、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９： ４５７−９２ （１９９１）； Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４： ２５−３４ （１９９４）； 及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２６： ３３０−４１ （１９９５）に総説されている。その他のＦｃＲ、将来同定されるものも含めて、この用語「ＦｃＲ」に包含される。この用語は新生児受容体、ＦｃＲｎもふくむ、これは母体ＩｇＧを胎児に移転するのに役立っている（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７： ５８７ （１９７６） ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４： ２４９ （１９９４））。
【００７０】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下に標的を分解する分子の能力のことである。補体活性化経路は補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）が同系抗原と複合体を形成した分子（例えば、抗体）と結合することにより開始する。補体活性化を評価するためのＣＤＣ検定は、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２： １６３ （１９９６）の記述に従って、行なうことができる。
【００７１】
「増殖抑制性」拮抗剤は拮抗剤が結合する抗原を発現する細胞の増殖を阻止または減少させるものである。例えば、拮抗剤はインビトロ及び／またはインビボにおいてＢ細胞の増殖を阻止または減少させる。
【００７２】
「アポトーシスを誘導する」拮抗剤は例えば、Ｂ細胞の、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞萎縮、小胞体の拡大、細胞の断片化、及び／または膜小体（アポトーシス小体と呼ばれる）形成によって定義されるプログラムされた細胞死を誘導するものである。
【００７３】
用語「超可変領域」とは、ここに使用された場合は、抗原結合に必要な抗体のアミノ酸残基のことである。超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの２４−３４（Ｌ１），５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）残基及び重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１），５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）残基；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ． （１９９１））及び／または「超可変ループ」の残基（例えば、軽鎖可変ドメインの２６−３２（Ｌ１），５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）残基及び重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１），５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ−３）残基；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ．１． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６： ９０１−９１７ （１９８７））を含む。「骨格」または「ＦＲ」残基はここに定義した超可変領域以外の可変ドメイン残基である。
【００７４】
関心の抗原、例えばＢ細胞表面マーカー、に「結合する」拮抗剤は、充分な親和性をもってその抗原と結合し、抗原を発現する細胞、つまりＢ細胞、を標的とする治療剤として有用であり得る拮抗剤である。
【００７５】
ここでの「抗−ＣＤ２０抗体」は、特異的にＣＤ２０抗原、望ましくはヒトＣＤ２０、に結合し、測定し得るＢ細胞消滅活性、望ましくはＲＩＴＵＸＡＮＴＭのＢ細胞消滅活性の少なくとも約１０％を有している（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７３６，１３７、その全体を参考文献として引用した、を参照）。
【００７６】
ここでの「抗−ＣＤ２２抗体」は特異的にＣＤ２２抗原、望ましくはヒトＣＤ２２、に結合し、測定し得るＢ細胞消滅活性、望ましくはＲＩＴＵＸＡＮＴＭのＢ細胞消滅活性の少なくとも約１０％を有している（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７３６，１３７、その全体を参考文献として引用した、を参照）。
【００７７】
ここでの「抗−ＣＤ１９抗体」は特異的にＣＤ１９抗原、望ましくはヒトＣＤ１９、に結合し、測定し得るＢ細胞消滅活性、望ましくはＲＩＴＵＸＡＮＴＭのＢ細胞消滅活性の少なくとも約１０％を有している（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７３６，１３７、その全体を参考文献として引用した、を参照）。
【００７８】
ここでの「抗−ＣＤ３７抗体」は特異的にＣＤ３７抗原、望ましくはヒトＣＤ３７、に結合し、測定し得るＢ細胞消滅活性、望ましくはＲＩＴＵＸＡＮＴＭのＢ細胞消滅活性の少なくとも約１０％を有している（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７３６，１３７、その全体を参考文献として引用した、を参照）。
【００７９】
ここでの「抗−Ｂ７抗体」は特異的にＢ７．１，Ｂ７．２またはＢ７．３、より望ましくはヒトＢ７．３、に結合し、Ｂ７／ＣＤ２８相互作用を阻害する抗体であり、それはＢ７／ＣＴＬＡ−４相互作用は実質的に阻害せず、さらに望ましくは、ここにその全体を参考文献として引用した、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ６，１１３，８９８に記述されている特別な抗体である。これらの抗体はアポトーシスを促進することが報告されている。したがって、抗新生物適用によく合致するであろう。
【００８０】
「抗−ＣＤ４０Ｌ抗体」は、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４，ｇｐ３９，ＴＢＡＭとしても知られている）に特異的に結合し、望ましくはアゴニスト作用を有するものである。望ましい抗−Ｃｄ４０Ｌ抗体は、ここに参考文献として引用した、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，０１１，３５８（ＩＤＥＣ薬品会社に譲渡）に開示されているヒト化抗体の特異性を有するものである。
【００８１】
「抗−ＣＤ４抗体」は、ＣＤ４、望ましくはヒトＣＤ４、に特異的に結合する抗体であり、より望ましくは霊長類化またはヒト化抗−ＣＤ４抗体である。
【００８２】
「抗−ＣＤ４０抗体」は、ＣＤ４０、望ましくは、全部を参考文献としてここに引用した、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，８７４，０８５， ５，８７４，０８２， ５，８０１，２２７， ５，６７４，４４２及び５，６６７，１６５に記述されているようなヒト化ＣＤ４０に特異的に結合する抗体である。
【００８３】
望ましくは、Ｂ細胞消滅抗体及び免疫調節抗体の両者ともヒト定常ドメインを含んでいる。適当な抗体にはＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇＧ４イソタイプが含まれる。
【００８４】
ＣＤ２０抗原に抗体の特種な例には以下が含まれる：「リツキシマブ」（「ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ」）（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７３６，１３７，明白に参考文献に引用した）；イットリウム−［９０］−標識２Ｂ８ネズミ抗体「Ｙ２Ｂ８」（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７３６，Ｂ７，明白に参考文献に引用した）；任意に１３１Ｉで標識したネズミＩｇＧ２ａ「Ｂ１」、《１３１Ｉ Ｂ１》抗体（ＢＥＸＸＡＲＴＭ）（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５９５，７２１， 明白に参考文献に引用した）；ネズミモノクロナール抗体「１Ｆ５」（Ｐｒｅｓｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ６９（２）： ５８４−５９１ （１９８７））；及び「キメラ２Ｈ７」抗体（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，６７７，１８０， 明白に参考文献に引用した）。
【００８５】
ＣＤ２２に結合する抗体の特別な例にはＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓにより報告されているＬｙｍｐｈｏｃｉｄｅＴＭがあり、現在非ホジキンリンパ腫を対照とした臨床試験を実施中である。Ｂ７抗原に結合する抗体の例としては、Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌに与えられたＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，８８５，５７７に報告されている抗−Ｂ７抗体、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌに与えられ、Ｃｈｉｒｏｎ社に譲渡されたＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ５，８６９，０５０に報告されている抗−Ｂ７抗体、及びＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌに与えられたＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ６，１１３，１９８に開示されている霊長類化ＴＭ抗−Ｂ７抗体があり、それら全てのの全体を参考文献に引用した。
【００８６】
ＣＤ２３に結合する抗体の特別な例はよく知られており、望ましくは、１９９９年７月４日に交付され、ＩＤＥＣ薬品会社及び日本のＳｅｉｋａｋａｇｕ社に譲渡されたＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ６，０１１，１３８の中でＲｅｆｆ ｅｔ ａｌ．が報告しているヒトＣＤ２３に特異的な霊長類化ＴＭ抗体；Ｂｏｎｎｅｆｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｏ． ９６ １２７４１； Ｒｅｃｔｏｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５５： ４８１−４８８ （１９８５）； Ｆｏｒｅｓ−Ｒｕｍｅｏ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： １０３８−１０４６ （１９９３）； Ｓｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４２： ４８１−４８９ （１９８９）； 及びＰｅｎｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ＵＳＡ ８５： ６８２０−６８２４ （１９８８）に記載されているものである。それらの抗体はアレルギー、自己免疫疾患、及び炎症性疾患の治療に有用であると報告されている。
【００８７】
用語「リツキシマブ」または「ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ」とはここではＣＤ２０抗原を指向する遺伝子操作したキメラネズミ／ヒトモノクロナール抗体のことであり、明白にここに引用したＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７３６，Ｂ７中では「Ｃ２Ｂ８」と命名されている。この抗体はネズミ軽鎖及び重鎖可変領域配列及びヒト定常例用域配列を含むＩｇＧＩカッパー免疫グロブリンである。リツキシマブは約８．０ ｎＭのＣＤ２０抗原に対する結合親和性を有している。
【００８８】
「単離した」抗体は自然環境から同定し、分離及び／または取出したものである。自然環境における混入成分は拮抗剤を診断及び治療に使用する際に妨害をする物質であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク性または非タンパク性の溶質であり得る。望ましい態様において、拮抗剤は次のように精製される （１）ローリー法により測定して９５重量％以上に、そして最も望ましくは９９重量％以上に、（２）スピンニングカップアミノ酸配列分析装置を使用してＮ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分な程度に、または （３）クマシーブルーまたは望ましくは銀染色を使用する還元または非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性。単離拮抗剤は組換え細胞の中にある拮抗剤を含んでいる、何故なら拮抗剤の自然環境の少なくとも１成分は存在しないであろうから。しかし、通常は単離拮抗剤は少なくとも１つの精製段階を経て調製されるであろう。
【００８９】
治療の対照である「哺乳動物」とは、ヒト、及びイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような家畜及び畜産動物、動物園、スポーツ、またはペット用の動物、を含む哺乳動物に分類される動物のことである。望ましい哺乳動物はヒトである。
【００９０】
「治療」とは治療処置及び予防手段の両者のことである。治療が必要なものには、既に病気や異常のあるもの並びに病気や異常を予防すべきものを含む。したがって、哺乳動物は病気や異常を持つと診断されてきたし、または病気になりやすい。
【００９１】
Ｂ細胞悪性疾患
本発明によると、いずれのＢ細胞悪性疾患、例えば、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病、も含んでいる。望ましい例としては、ホジキン病（全ての型、例えば、再発ホジキン病、抵抗性ホジキン病）、非ホジキンリンパ腫（低度、中等度、高度、及びその他の型）がある。例としては、小リンパ球性／Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＳＬＬ／Ｂ−ＣＬＬ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症、小リンパ球、濾胞性、びまん性大細胞、びまん性小細胞縦隔細胞、大細胞免疫芽球性リンパ芽球腫、小、非縦隔、バーキット及び非バーキット、濾胞性、大細胞優位；濾胞性、小細胞優位；及び濾胞性、小縦隔及び大細胞混合型リンパ腫がある。Ｇａｉｄｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，”Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ”， ＩＮ ＣＡＮＣＥＲ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＆ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＯＮＣＯＬＯＧＹ， Ｖｏｌ． ２： ２１３１−２１４５ （ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， ５ｔｈ ｅｄ． １９９７ ）を参照。
【００９２】
リンパ腫分類のその他の型としては、免疫細胞性ワルデンストロームＭＡＬＴ−型／単球性Ｂ細胞、マントル細胞リンパ腫Ｂ−ＣＬＬ／ＳＬＬ、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫及び前駆Ｂ−ＬＢＬがある。
【００９３】
知られているように、Ｂ細胞悪性疾患としてはさらにＡＬＬ−Ｌ３（バーキット型白血病）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性白血球性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、単球性白血病、骨髄性白血病、及び前骨髄球白血病及び単球性細胞白血病がある。
【００９４】
「治療有効量」という表現は問題のＢ細胞悪性疾患を予防し、改善しまたは治療するのに有効な拮抗剤の量のことである。
【００９５】
ここでは補助療法のために使用されている用語「免疫抑制剤」とは治療される哺乳動物の免疫系を抑制または阻止するように働く物質のことである。これにはサイトカイン生産を抑制する、自己抗原発現を下方調節または抑制する、またはＭＨＣ抗原を隠す物質が含まれる。そのような物質の例としては次のようなものがある、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミヂン（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，６６５，０７７、その開示内容をここに引用した、を参照）、アザチオプリン；シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，１２０，６４９に記述されているように、ＭＨＣ抗原を隠蔽する）；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣフラグメントに対する抗−イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；グルココルチコイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾンのようなステロイド；抗−インターフェロン−α、β、またはδ抗体、抗−腫瘍壊死因子−α抗体、抗−腫瘍壊死因子−β抗体、抗−インターロイキン−２抗体及び抗−ＩＬ−２受容体抗体を含むサイトカインまたはサイトカイン受容体拮抗剤；抗−ＣＤ１ １ａ抗体及び抗−ＣＤ１８抗体を含む抗−ＬＦＡ−１抗体；及び抗−Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗−リンパ球グロブリン；汎Ｔ抗体、望ましくは抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ−３結合ドメインを含む可溶性ペプチド（ＷＯ ９０／０８１８７公布７／２６／９０）、ストレプトラナーゼ；ＴＧＦ−β；ストレプトドマーゼ；宿主のＲＮＡまたはＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞受容体（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，１１４，７２１）；Ｔ細胞受容体フラグメント（Ｏｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１： ４３０−４３２ （１９９１）； ＷＯ ９０／１１２９４；ｌａｎｅｗａｙ， Ｎａｔｕｒｅ， ３４１： ４８２ （１９８９）； 及びＷＯ ９１／０１１３３）；及びＴ１０Ｂ９のようなＴ細胞受容体抗体（ＥＰ ３４０，１０９）。
【００９６】
ここに使用されている用語「細胞傷害剤」は細胞の機能を妨害しそして／または細胞の破壊を生じる物質のことである。この用語は放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１ Ｉ１３１ Ｉ１２５ Ｙ９０ Ｒｅ１８６ Ｒｅ１８８ Ｓｍ１５３ Ｂｉ２１２ Ｐ３２及びＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤、小分子トキシンまたは細菌、菌、植物または動物起源の酵素活性トキシン、またはそのフラグメントのようなトキシンを含むことを意図している。
【００９７】
「化学療法剤」は癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮＴＭ）のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルフォン酸エステル；ベンゾドーパ、カルボコン、メチュレドーパ、及びウレドーパのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンリン酸アミド、トリエチレンチオリン酸アミド及びクロランブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロスファミド、ウラシルマスタードのようなトリメチロロメラミンナイトロジェンマスタードを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；カアルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンのようなニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラバシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ぺプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンのような抗生物質；メトトレキザート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような代謝拮抗剤；デノプテリン、メトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートのような葉酸同族体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン同族体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カロモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン、５−ＦＵのようなピリミジン同族体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン、のようなアンドローゲン；アミノグルテチイミド、ミトタン、トリロスタンのような抗−副腎剤；フロリン酸のような葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫＴＭ；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；デカルバジン；マンオムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬＴＭ、ブリストル‐マイヤースクイブ腫瘍学、プリンストン、ＮＪ）及びドキセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ、ローヌ‐プーランローラー、アントニー、フランス）；クロランブシル；ジェムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンのような白金同族体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；セローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び医薬として受容し得る塩、酸または上記のいずれかの誘導体。また、この定義の中には、例えばタモキシフェン、ラロキフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）；及びフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンのような抗アンドロゲンを含む抗−エストロゲンのような腫瘍のホルモン作用を調節または阻害する抗−ホルモン剤及び医薬として受容し得る塩、酸または上記のいずれかの誘導体も含まれる。
【００９８】
用語「サイトカイン」は１つの細胞集団から放出されるタンパクに対する一般的な用語であり、他の細胞に対して細胞間伝達物質として働く。そのようなサイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、及び古典的なポリペプチドホルモンがある。サイトカインに含まれるものとして、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のようなグリコプロテインホルモン；肝成長因子；繊維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミューラー管抑制物質；マウス性腺刺激関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−１３のような神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポイチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、及び−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１， ＩＬ−１ａ， ＩＬ−２， ＩＬ−ｇ， ＩＬ−４， ＩＬ−５， ＩＬ−６， ＩＬ−７， ＩＬ−８， ＩＬ−９， ＩＬ−１１， ＩＬ−１２， ＩＬ−１５のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含むその他のポリペプチド因子がある。ここに使用されたときには、用語サイトカインは、天然資源からのタンパクまたは組換え細胞培養のタンパク及び天然サイトカインの生物学的に活性な同等物を含んでいる。
【００９９】
この出願に使用した用語「プロドラッグ」とは、母体薬物に比較して腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低く、そして酵素的に活性化またはより活性な母体の型に変換され得る医薬品として活性な物質の前駆体または誘導体のことである。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ， １４， ｐｐ． ３７５−３８２， ６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ （１９８６）及びＳｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ： Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．， （ｅｄ．）， ｐｐ． ２４７−２６７， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （１９８５）を参照。本発明のプロドラッグに含まれるのは、これに限るものではないが、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意置換フェノキシアセタミド含有プロドラッグまたは任意置換フェニルアセタミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及びその他の５−フルオロウリジンプロドラッグであり、これらはより細胞傷害性の活性が高い遊離薬物に変換され得る。本発明に使用するためにプロドラッグの形に変換し得る細胞傷害性薬物の例には、これに限るものではないが、上記化学療法剤が含まれる。
【０１００】
「リポソーム」は種々のタイプの脂質、リン脂質及び／または表面活性剤からなる小胞体であり、薬物（例えば、ここに開示した拮抗剤及び、任意に、化学療法剤）を哺乳動物に搬送するのに有用である。リポソームの成分は一般的には、生物の膜の脂質構造に類似して、２相を形成するように調製される。
【０１０１】
用語「能書」は医薬製品の市販包装中に習慣的に入れられている説明書をいうために使用され、その治療薬の使用に関する効能、用法、用量、投与法、禁忌及び／または警告についての情報が記載されている。
【０１０２】
ＩＩ．　抗体の作製
本発明の方法及び製品は免疫調節活性を有する抗体、例えば、抗−Ｂ７、抗−ＣＤ２３、抗−ＣＤ４０Ｌ、抗−ＣＤ４または抗−ＣＤ４０抗体、及びＢ細胞表面マーカーに結合してＢ消滅活性を持つ抗体、例えば、抗−ＣＤ２０、抗−ＣＤ２２、抗−ＣＤ１９、または抗−ＣＤ３７抗体、を使用または包含している。したがって、そのような抗体を創り出す方法をここに記述する。
【０１０３】
抗原を作製、またはスクリーニングするために使用される分子は、例えば、必要な抗原決定基を含む抗原の可溶型またはその部分、である。その他に、またはさらに、その細胞表面に抗原を発現する細胞は拮抗剤を創る、またはスクリーニングするために使用することができる。拮抗剤を創るために有用なその他のＢ細胞表面マーカーの型は当業者には明らかであろう。本発明に記載の抗体を作製するためのＣＤ４０Ｌ，ＣＤ４０，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ２３，ＣＤ３７，ＣＤ４及びＢ７抗原（例えば、Ｂ７．１，Ｂ７．２）の適当な抗原資源はよく知られている。その他には、ペプチドをアミノ酸配列に基づいて合成的に調製することができる。例えば、ＣＤ４０Ｌに関して、Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９９２）が記述している。
【０１０４】
望ましくは、ＣＤ４０Ｌ抗体または抗−ＣＤ４０Ｌ抗体は、１９９９年６月１４日に交付され、ＩＤＥＣ薬品会社に譲渡されたＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ６，００１，３５８に開示されているヒト化抗−ＣＤ４０Ｌ抗体であろう。
【０１０５】
望ましいＣＤ４０Ｌ拮抗剤は抗体であるが、抗体以外の拮抗剤も投与することができる。例えば、拮抗剤に含まれ得るものとして、可溶性ＣＤ４０、（ここに記述したような）細胞傷害性物質と任意に融合、またはコンジュゲートしたＣＤ４０融合タンパクまたは小分子拮抗剤がある。その抗原に結合する小分子を同定するために、関心のＢ細胞表面マーカーを使用して小分子ライブラリーをスクリーニングすることができる。小分子はさらに拮抗作用をスクリーニングしそして／または細胞傷害性物質とコンジュゲートすることができる。
【０１０６】
拮抗剤は、例えば、合理的設計によりまたはファージディスプレー（ＷＯ ９８／３５０３６， １９９８年８月１３日公開）により創り出されたペプチドでもあり得る。一態様において、選択した分子は、例えば、抗体のＣＤＲに基づいて設計された「ＣＤＲ類似体」または抗体同族体でもあり得る。ペプチドはそれ自身拮抗作用を持つが、ペプチドを任意に細胞傷害性物質とまたは免疫グロブリンＦｃ領域と（例えば、ペプチドにＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣを付与するように）融合させることができる。
【０１０７】
本発明に従って使用される抗体拮抗剤を作製するための代表的技術を記述する。
【０１０８】
（ｉ）　ポリクロナール抗体
ポリクロナール抗体は、望ましくは関係抗原及びアジュバントを皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）に複数投与することにより動物内で作られる。関係抗原と免疫する動物種において免疫原となるタンパク、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビター、を２価性または誘導体形成剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルフォサクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲおよびＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを使用してコンジュゲートすることは有用である。
【０１０９】
動物を抗原、免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して、例えば、タンパクまたはコンジュゲートの１００μｇまたは５μｇ（それぞれウサギまたはマウスに対して）と３容量のフロイント完全アジュバントを混合して、複数の部位に皮内注射して免疫する。１ヶ月後動物にペプチドまたはコンジュゲートの最初の量の１／５から１／１０をフロイント完全アジュバントに入れて複数部位に皮下注射して追加免疫する。７から１４日後動物から採血し血清の抗体力価を測定する。力価が一定になるまで動物に追加免疫する。動物の追加免疫は、異なるタンパクとコンジュゲート及び／または異なる交差結合剤でコンジュゲートした抗体でなく、同一抗体のコンジュゲートで追加免疫することが望ましい。コンジュゲートはタンパク融合のように組換え細胞培養中で作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤も免疫応答を増強するために適宜使用される。
【０１１０】
（ｉｉ）　モノクロナール抗体
モノクロナール抗体は実質的に均一な抗体の集団から得る、すなわち、個々の抗体は少量存在する自然発生突然変異以外は同一である集団を構成する。したがって、修飾語「モノクロナール」は異なる抗体の混合物ではない抗体の性質を示す。
【０１１１】
例えば、モノクロナール抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６； ４９５ （１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法を使用して作るか、または組換えＤＮＡ法（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８１６，５６７）により作ることができる。
【０１１２】
ハイブリドーマ法では、マウスまたはハムスターのような適当な宿主動物を、免疫に使用したタンパクに特異的に結合する抗体を生産または生産できるリンパ球を生じるように前述のように免疫する。その他には、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いでリンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ． ５９−１０３ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。
【０１１３】
このようにして調製されたバイブリドーマ細胞は、望ましくは融合しない元の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻止する物質を１つ以上含む適当な培地に接種し、増殖する。例えば、もし元の骨髄腫細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を持っていなければ、ハイブリドーマの培地は典型的にヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻止する。
【０１１４】
望ましい骨髄腫細胞は、効率よく融合し、選択した抗体生産細胞により安定した高レベルの抗体生産を維持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である。その中でも望ましい骨髄腫細胞系はネズミ骨髄腫細胞系であり、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡから入手できるＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍から由来した細胞系、及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ， ＵＳＡから入手できるＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もヒトモノクロナール抗体を生産するために記述されている（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３： ３００１ （１９８４）； Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ． ５１−６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７））。
【０１１５】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を抗原を指向するモノクロナール抗体の生産について検定する。望ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクロナール抗体の結合特異性は免疫沈降法または放射線免疫検定法（ＲＩＡ）または固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合検定により測定する。
【０１１６】
モノクロナール抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７： ２２０ （１９８０）の３０スキャッチャード解析により決定する。
【０１１７】
ハイブリドーマ細胞が必要な特異性、親和性、及び／または活性を持つ抗体を生産することを同定した後、クローンは限界希釈法によりサブクローニングして、標準的な方法により増殖する（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ｐｐ． ５９−１０３ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６））。この目的のために適した培地は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＬ−１６４０培地である。さらに、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍としてインビボで増殖することができる。
【０１１８】
サブクローンによって分泌されたモノクロナール抗体は培地、腹水、または血清から、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製方法により適切に分離される。
【０１１９】
モノクロナール抗体をコードするＤＮＡは通常の方法を使用して（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの望ましい資源となる。ひとたび単離されれば、このＤＮＡは発現ベクター中に配置することができ、これは次いで、そうしない場合には免疫グロブリン分子を生産しない、Ｅ． ｃｏｌｉ細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞に導入され、組換え宿主細胞中にモノクロナール抗体の合成を生じる。抗体をコードするＤＮＡを細菌中に組換え発現することに関する総説としては、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５： ２５６−２６２ （１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖｓ．， １３０： １５１−１８８ （１９９２）がある。
【０１２０】
ＣＤ４０Ｌ，ＣＤ１９，ＣＤ２２，ＣＤ２０、またはＣＤ４０タンパクまたはペプチド（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９４５，５１３に記述されているｇｐ３９融合タンパクのような）に特異的に反応する抗体または抗体フラグメントのその他の作製方法は、ＣＤ４０Ｌ，ＣＤ１９，ＣＤ２０、またはＣＤ２２タンパクまたはペプチドで細菌中に発現させた免疫グロブリン遺伝子またはその部分をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることである。例えば、完全なＦａｂフラグメント、ＶＨ領域及びＦｖ領域はファージ発現ライブラリーを使用して細菌中に発現することができる。例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１： ５４４−５４６ （１９８９）； Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６： １２７５−１２８１ （１９８９）； 及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８： ５５２−５５４ （１９９０）を参照。そのようなライブラリーを、例えば、ＣＤ４０Ｌ，ＣＤ２２，ＣＤ１９，またはＣＤ２０ペプチドでスクリーニングすると、ＣＤ４０Ｌ，ＣＤ２２，ＣＤ１９，またはＣＤ２０に反応する免疫グロブリンフラグメントを同定することができる。その他には、ＳＣＩＤ−ｈｕマウス（Ｇｅｎｐｈａｒｍから入手可能）を抗体またはそのフラグメントを生産するために使用することができる。
【０１２１】
さらに他の態様において、抗体または抗体フラグメントをＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８： ５５２−５５４ （１９９０）に記述されている技術を使用して作製した抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２： ６２４−６２８ （１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１−５９７ （１９９１）はファージライブラリーを使用して、ネズミ及びヒト抗体をそれぞれ単離したことを記述している。次の出版物では鎖の入れ替えにより高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の作製（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｂｙ， １０： ７７９−７８３ （１９９２））、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築する戦略としてコンビナトリアル感染及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， ２１： ２２６５−２２６６ （１９９３））を記述している。この様に、これらの技術はモノクロナール抗体を単離するための古典的モノクロナール抗体ハイブリドーマ技術の代替方法である。
【０１２２】
ヒトＣＤ４０Ｌ及びマウスＣＤ４０Ｌを含むＣＤ４０Ｌを指向するモノクロナール抗体（ＭＡｂ）、及び本発明の方法に使用するために適したモノクロナール抗体を作製する方法論は、ここにその全体を参考文献に引用した「抗−ｇｐ３９抗体及びその使用法」と題するＰＣＴ特許出願番号ＷＯ ９５／０６６６６に記述されている。特に望ましい本発明の抗−ヒトＣＤ４０Ｌ抗体は、それぞれハイブリドーマ２４−３１及び８９−７６によって生産されたＭＡｂ２４−３１及び８９−７６である。８９−７６及び２４−３１抗体をそれぞれ生産する８９−７６及び２４−３１ハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定に従って１９９４年９月２日Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９ ，に寄託した。８９−７６ハイブリドーマにはＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１１７１３が付与されそして２４−３１ハイブリドーマにはＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１１７１２が付与された。
【０１２３】
ＤＮＡは、例えば、相同的ネズミ配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８１６，５６７； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： ６８５１ （１９８４））、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または部分を共有結合することにより、修飾することができる。
【０１２４】
典型的に、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは抗体の定常ドメインと置換されるか、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換して、１つの抗原結合部位は１つの抗原に特異性をもち、もう１つの抗原結合部位は別の抗原に特異性を持つ、キメラ２価抗体を創り出す。
【０１２５】
（ｉｉｉ）　ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は既に記述されている。望ましくは、ヒト化抗体は、非ヒト資源から一つまたはそれ以上のアミノ酸残基をその中に導入している。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と呼ばれ、典型的には「輸入」可変ドメインから取られたものである。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ （Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１： ５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２： ３２３−３２７ （１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： １５３４−１５３６ （１９８８）の方法に従って、ヒト抗体の相当する配列を超可変領域配列で置換することにより行なうことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的に完全なヒト可変ドメインが非ヒト動物種の相当する配列によりより少なく置換されているキメラ抗体である（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８１６，５６７）。実際上は、ヒト化抗体は典型的に、一部の超可変領域残基及び可能な一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位の残基で置換されているヒト抗体である。
【０１２６】
ヒト化抗体を作るのに使用されるヒト可変ドメイン、軽鎖及び重鎖いずれも、の選択は抗原性を減少させるために非常に重要である。いわゆる「ベスト−フィット」法によると、げっ歯類抗体の可変ドメインの配列を既知ヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリーに対してスクリーニングする。げっ歯類の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のためのヒト骨格領域（ＦＲ）として受け入れる（Ｓｕｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１： ２２９６ （１９９３）； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， １９６： ９０１ （１９８７））。その他の方法は軽鎖または重鎖の特別なサブグループの全てのヒト抗体に共通の配列から誘導した特別の骨格領域を使用する。同じ骨格をいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９： ４２８５ （１９９２）； Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１： ２６２３ （１９９３））。
【０１２７】
抗体は抗体に対する高親和性及びその他の好ましい生物学的性質を維持してヒト化されることがさらに重要である。この目的を達成するために、望ましい方法に従い、親及びヒト化配列の３次元モデルを使用して親配列及び種々の理論的ヒト化抗体を分析する過程を経て、ヒト化抗体は調製される。３次元免疫グロブリンモデルは誰でも入手することができ、当業者にはよく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列の可能な３次元立体構造を描画及び表示するコンピュータプログラムは入手することができる。この表示を検討することにより候補免疫グロブリン配列の機能における残基のあり得る役割を分析することができる、すなわち、抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析。このようにして、ＦＲ残基をレシピエントから選択することができ、そして望む抗体の性質を標的抗体に対する親和性を増加するように輸入配列と結合することができる。一般的に、超可変領域の残基は直接的にそして実質的に抗体結合に影響している。
【０１２８】
（ｉｖ）　霊長類化抗体
組換え抗体を作製するその他の効率の高い手段がＮｅｗｍａｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０： １４５５−１４６０ （１９９２）によって開示されている。特に、この技術はサル可変ドメイン及びヒト定常配列を含む霊長類化抗体を作製するものである。この参考文献の全体をここに引用する。さらに、この技術は、米国特許出願番号０７／７３５，０４６， １９９１年７月２５日出願の部分的継続である米国特許出願番号０７／８５６，２８１， １９９２年３月２３日出願の部分的継続である米国特許出願番号０７／９１２／２９２， １９９２年７月１０日出願の継続である、広く譲渡されている米国特許出願番号０８／３７９，０７２， １９９５年１月２５日出願にも記述されており、この親出願の全部をここに参考文献として引用した。
【０１２９】
この技術はヒトに投与された時に抗原として拒否されないように抗体を修飾するものである。この技術はカニクイザルをヒト抗体または受容体で免疫することに基づいている。この技術はヒト細胞表面抗体に対する高親和性モノクロナール抗体を創るために開発された。
【０１３０】
ヒトＣＤ４０Ｌ，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ４０またはＣＤ１９に対するサル抗体を、ファージディスプレーライブラリーまたはＣＤ４０Ｌ，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ４０またはＣＤ１９で免疫したサルのＢリンパ球を使用して得たサルヘテロハイブリドーマをスクリーニングして同定することは、広く譲渡されている米国特許出願番号０８／４８７，５５０，１９９５年６月７日出願、その全体を参考文献に引用、に記述の方法を使用して行なうことができる。
【０１３１】
これらの出願に記述されている方法を使用して作製した抗体は、ヒトエフェクター機能を発現し、免疫原性が少なく、そして長い血清半減期を持つと既に報告されている。この技術は、カニクイザルが系統発生的にはヒトに近いが、多くのヒトタンパクを異物と認識し、そのため免疫応答を演じる。さらに、カニクイザルが系統発生的にヒトに近いために、これらのサルで作られた抗体はヒトで作られた抗体と高度なアミノ酸相同性を持つことが判明した。事実、サル免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子の配列決定をしたところ、各遺伝子ファミリーはヒト対応物に対して８５−９８％相同であることが明らかとなっている（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。この方法により作られた最初の抗体、抗−ＣＤ４抗体、はヒト免疫グロブリン骨格領域の共通配列に対して９１−９２％の相同性であった（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【０１３２】
上述のように、本発明は一部、ヒトＣＤ４０Ｌ抗原に特異的であり、そしてＣＤ４０シグナリングまたはＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を阻害することができるモノクロナール抗体またはその霊長類化型を使用することに関するものである。同定した抗体（または治療効果があるそのフラグメント）によりＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌの間の主要活性化部位を阻害することは、一方で陽性刺激に対する拮抗作用と陰性シグナリングに対するアゴニスト効果を組合わせることができるので、再発型の悪性疾患、特にＢ細胞リンパ腫及び白血病、に介入するには有用な治療方法であろう。同定した抗体の機能活性は、生存を維持しそしてＩｇＭ−またはＦａｓ−誘導アポトーシスを免れさせるＣＤ４０のシグナルを阻害することと定義される。
【０１３３】
ヒトＣＤ４０Ｌに特異的に結合するモノクロナール抗体、ならびにそれから誘導した霊長類化抗体、の製造は、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，００１，３５８または５，７５０，１０５，いずれもＩＤＥＣ薬品会社に譲渡、またはその他の既知の方法を使用して行なうことができる。望ましくは、その抗体はＣＤ４０Ｌに高親和性を有し、それ故にＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０経路を阻害する免疫抑制剤として使用することができる。類似技術によりＣＤ２０，ＣＤ１９，ＣＤ２２またはＣＤ４０に特異的な抗体が得られるであろう。
【０１３４】
サルモノクロナール抗体の調製は望ましくはファージディスプレーライブラリーのスクリーニングによるか、またはＣＤ４０Ｌ（例えば、ヒトＣＤ４０Ｌ）免疫サルから得たＢリンパ球を使用したサルヘテロハイブリドーマを作製することにより行われるであろう。ヒトＣＤ４０はＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９４５，５１３に記述の融合タンパクからも得ることができる。
【０１３５】
言及したように、抗−ＣＤ４０Ｌ，ＣＤ１９，ＣＤ２０， ＣＤ２２またはＣＤ４０抗体を作製するための最初の方法は組換えファージディスプレー技術を必要とする。この技術は上に一般的に記述されている。
【０１３６】
本質的に、これは標的、すなわち、繊維状ファージの表面に展示されたＣＤ１９，ＣＤ２２，ＣＤ２０，ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ抗原に対する組換え免疫グロブリンライブラリーの合成及びＣＤ４０Ｌに対する高親和性を有する抗体を分泌するファージの選択からなる。上記のように、望ましい抗体はヒトＣＤ４０Ｌ及びＣＤ４０に結合するものが選択される。その方法を実施するために、本発明者らは組換えの可能性を減少しそして安定性を改善したサルライブラリーのための独特のライブラリーを創り出した。
【０１３７】
本質的に、サルライブラリーを使用するためのファージディスプレーを利用するために、このベクターはサル免疫グロブリン遺伝子をＰＣＲ増幅するための特別なプライマーを含んでいる。これらのプライマーは、霊長類化技術及びヒト配列を含むデタベースを開発している間に得られたサル配列に基づいている。
【０１３８】
適当なプライマーは広く譲渡され、ここに参考文献に引用した０８／３７９，０７２に開示されている。
【０１３９】
第２の方法は目的とする抗原標的、つまり、ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ、に対してサル、つまり、マカク、を免疫することを必要とする。モノクロナール抗体を作製する上でマカクの本質的利点は既に検討した。特に、そのサル、つまりカニクイザル、はヒト抗原または受容体に対して免疫することができる。さらに、生成した抗体は、Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２），及びＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， 広く譲渡され、その全体を参考文献に引用した、米国特許出願番号０８／３７９，０７２、１９９５年１月２５日出願、の方法に従って、霊長類化抗体を作るために使用することができる。
【０１４０】
カニクイザルから得た抗体の有意義な利点は、このサルは多くのヒトタンパクを異物と認識し、そのため一部は目的とするヒト抗原に対して高い親和性を有する抗体の生産を行なうことである。さらに、系統発生的にヒトに近いことから、生成した抗体はヒトにおいて生産された抗体に高度のアミノ酸相同性を示す。上記のように、マカク免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域遺伝子の配列決定の結果、各遺伝子の配列はヒトの対応物に対して８５−８８％相同である（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
【０１４１】
本質的に、カニクイザルにヒト、ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ抗体を投与し、その動物からＢ細胞を単離し、例えば、リンパ節バイオプシーにより採取し、次いでＢリンパ球をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用してＫＨ６／Ｂ５（マウスｘヒト）ヘテロ骨髄腫細胞と融合する。その後、ヒトＣＤ４０Ｌ抗原と結合する抗体を分泌するヘテロハイブリドーマを同定する。
【０１４２】
ＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０に結合する抗体の場合には、その抗体はＣＤ４０ＬとＣＤ４０の相互作用を阻害するために使用される可能性があるので、その対抗受容体でＣＤ４０シグナリングを阻止または調節するようにすることが望ましい。もし抗体がＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０上の一つ以上の抗原性決定基に対して開発することができるならば、その抗体を一緒に用いて、その組み合わせた活性が相乗効果を発揮する可能性がある。
【０１４３】
開示した発明は、特別な抗体を生産する準備が調っている動物（例えば、オランウータン、バブーン、マカク及びカニクイザルのような霊長類）を使用することが必要である。ヒトＣＤ４０Ｌに対する抗体を作るために使用できるその他の動物としては、これに限るものではないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ブタ、ヤギ及びウサギが含まれる。
【０１４４】
ヒトＣＤ４０Ｌ抗原に特異的に結合する抗体を発現する細胞系は、次いでＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２）及びＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， 米国特許出願番号３７９，０７２，１９９５年１月２５日出願、両者ともここに参考文献に引用した、に本質的に記述されているように霊長類化抗体の製造用可変ドメイン配列をクローン化する為に使用される。本質的に、これはＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、Ｉｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を伴っている。適当なプライマーはＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， 及び米国特許出願番号３７９，０７２に記述されている。類似の技術によりＣＤ４０，ＣＤ１９，ＣＤ２０，またはＣＤ２２に特異的な抗体を発現する細胞系を得るであろう。
【０１４５】
ヒトＣＤ４０Ｌ抗原に特異的に結合する抗体を発現する細胞系は、次いでＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２）及びＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， 米国特許出願番号３７９，０７２，１９９５年１月２５日出願、両者ともここに参考文献に引用した、に本質的に記述されているように霊長類化抗体の製造用可変ドメイン配列をクローン化する為に使用される。本質的に、これはＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、Ｉｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を伴っている。適当なプライマーはＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， 及び米国特許出願番号３７９，０７２に記述されている。類似の技術によりＣＤ４０，ＣＤ１９，ＣＤ２０，またはＣＤ２２に特異的な抗体を発現する細胞系を得るであろう。
【０１４６】
ヒトＣＤ４０Ｌ抗原に特異的に結合する抗体を発現する細胞系は、次いでＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９２）及びＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， 米国特許出願番号３７９，０７２，１９９５年１月２５日出願、両者ともここに参考文献に引用した、に本質的に記述されているように霊長類化抗体の製造用可変ドメイン配列をクローン化する為に使用される。本質的に、これはＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、Ｉｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を伴っている。適当なプライマーはＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， 及び米国特許出願番号３７９，０７２に記述されている。類似の技術によりＣＤ４０，ＣＤ１９，ＣＤ２０，またはＣＤ２２に特異的な抗体を発現する細胞系を得るであろう。
【０１４７】
クローン化サル可変遺伝子は次いで、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子を含む発現ベクターに挿入される。望ましくは、これはＩＤＥＣ社が製造販売権を有する発現ベクター、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれる、を使用して行なう。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロブリンメジャープロモーター、ＳＶ４０起源の複製、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンリン酸転移酵素エクソン１及びエクソン２、ヒト免疫グロブリンカッパまたはラムダ定常領域、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ヒト免疫グロブリンガンマ１またはガンマ４ＰＥ定常領域及びリーダー配列を含む。このベクターは、サル可変領域遺伝子を取り込み、ＣＨＯ細胞に導入し、Ｇ４１８含有培地で選別し、そしてメトトレキサート増幅することにより、霊長類化抗体の高レベルの発現をすることが認められている。
【０１４８】
例えば、この発現系は、ＣＤ４及びその他のヒト細胞表面受容体に対して高活性（Ｋｄ＜１０−１０Ｍ）を持つ霊長類化抗体を生じることが既に開示されている。さらに、この抗体は元のサル抗体と同じ親和性、選択性及び機能活性を示すことが認められている。このベクター系は実質的に広く譲渡され、ここに参考文献に引用した米国特許出願番号３７９，０７２，ならびに、参考文献に引用した、米国特許出願番号０８／１４９，０９９，１９９３年１１月３日出願、に開示されている。この系は高い発現レベル、すなわち、＞３０ ｐｇ／細胞／日、を提供する。勿論、ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ２２，またはＣＤ４０に特異的な抗体を生産する細胞系を作る為にも使用することができる。
【０１４９】
（ｖ）　ヒト抗体
ヒト化する代わりに、ヒト抗体を作ることができる。例えば、内在性免疫グロブリンを作らずに、免疫することにより、ヒト抗体の全種を作ることができる形質転換動物（例えば、マウス）を創り出すことが今や可能である。例えば、キメラ及び生殖系突然変異マウスにおいて抗体重鎖結合領域（ＰＨ）遺伝子のホモ接合性欠失により内在性抗体生産が完全に阻害されることが記述されている。ヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子の配置を生殖系突然変異マウスに導入すると、抗原をチャレンジすることによりヒト抗体を生産する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｍａｄ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ２５５１（１９９３）； Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２： ２５５−２５８ （１９９３）； Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｒ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏ．， ７： ３３ （１９３３）； 及びＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５９１，６６９， ５，５８９，３６９及び５，５４５，８０７を参照。
【０１５０】
その他には、免疫したドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロにおいてヒト抗体及び抗体フラグメントを作るために、ファージディスプレー技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８： ５５２−５５３ （１９９０））を使用することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子をＭ１３またはｆｄのような繊維状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク遺伝子のインフレームにクローン化し、そしてファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして展示させる。繊維状粒子はファージゲノムの１本鎖ＤＮＡコピーを含んでいるので、抗体の機能特性に基づく選択はこの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択となる。このように、ファージはＢ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレーは種々の形式で実施することができる；その総説としては、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋｅｖｉｎ Ｓ． ａｎｄ Ｃｈｉｓｗｅｌｌ， Ｄａｖｉｄ Ｊ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３： ５６４−５７１ （１９９３）を参照。Ｖ遺伝子のいくつかの資源がファージディスプレー用に使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２： ６２４−６２８ （１９９１）は免疫したマウスの脾臓から誘導したＶ遺伝子の小さな無作為コンビナトリアルライブラリーから抗−オキサゾロン抗体の多様な配置を単離している。非免疫ヒトドナーのＶ遺伝子レパートリーは構築することができそして多様な配置の抗原（自己抗原を含め）に対する抗体を、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２２２： ５８１−５９７ （１９９１）， またはＧｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １２： ７２５−７３４ （１９９３）により記述されている技術により本質的に単離することができる。また、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５６５，３３２及び５，５７３，９０５も参照。
【０１５１】
ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞によっても作製することができる（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ２０ ５，５６７，６１０及び５，２２９，２７５を参照）。ＳＣＩＤマウスを使用するヒト抗体の望ましい作製手段は、広範に所有され、同時係属出願に開示されている。
【０１５２】
（ｖｉ）　抗体フラグメント
種々の技術が抗体フラグメントの作製の為に開発されてきた。古典的には、これらのフラグメントは完全な抗体をタンパク分解酵素消化することにより誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４： １０７−１１７ （１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９： ８１ （１９８５）を参照）。しかし今ではこれらのフラグメントは組換え宿主細胞により直接生産される。例えば、抗体フラグメントは上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。その他には、Ｆａｂ’フラグメントはＥ． ｃｏｌｉから直接取出すことができそして化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを作ることができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： １６３−１６７ （１９９２））。その他の方法に従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体フラグメントを作製するためのその他の方法は当業者には明らかであろう。その他の態様において、選択される抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ ９３／１６１８５； ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５７１，８９４； 及びＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５８７，４５８を参照。抗体フラグメントは「線状抗体」、例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，６４１，８７０に記述されているような、でもあり得る。そのような線状抗体フラグメントは単特異性または二重特異性であり得る。
【０１５３】
（ｖｉｉ）　二重特異性抗体
二重特異性抗体は少なくとも二つの抗原決定基に特異的に結合する抗体である。代表的な二重特異性抗体はＢ細胞表面マーカーの二つの異なる抗原決定基に結合できる。その他のその抗体は第一のＢ細胞マーカー及び第二のＢ細胞表面マーカーとさらに結合することができる。その他には、抗−Ｂ細胞マーカー結合腕が、Ｂ細胞の細胞防御機構に焦点を当てるように、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）のような白血球上の引き金分子、またはＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４），ＦｃｙＲＩＩ（ＣＣＤ３２）及びＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃｙＲ）に結合する腕と組合されている。二重特異性抗体はＢ細胞に対する細胞傷害性物質を局在化させるためにも使用することができる。これらの抗体はＢ細胞マーカー結合腕及び細胞傷害性物質（例えば、サポリン、抗−インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射活性同位元素ハプテン）を結合する腕を持っている。二重特異性抗体は全長抗体としてまたは抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）２二重特異性抗体）として調製することができる。
【０１５４】
二重特異性抗体の作製方法は同業者には既知である。全長二重特異性抗体の古典的製法は二つの鎖が異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖‐軽鎖対の同時発現に基づいている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５： ５３７−５３９ （１９８３））。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の無作為の組合せとなる為、これらのハイブリドーマ（クワドローマ）は可能性として１０個の異なる抗体分子を生産し、そのうちの１個が正しい二重特異性構造である。通常アフィニティークロマトグラフィーにより行われる正しい分子の精製は面倒なものであり、収率は低い。類似の方法がＷＯ ９３／０８８２９，及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １０： ３６５５−３６５９ （１９９１）に開示されている。
【０１５５】
異なる方法によると、必要とする結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体‐抗原結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。融合は少なくともヒンジの部分、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行なうことが望ましい。軽鎖結合の為に必要な部位を含む第一重鎖定常領域（ＣＨＩ）を少なくとも融合の一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合及び、必要があれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、そして適当な宿主生物体に同時導入する。この方法は構築に使用される３種のポリペプチド鎖の異なる比率が最適収量を与える態様において、３種のポリペプチドフラグメントの相対比率を調節する大きな柔軟性を提供する。しかし、少なくとも２種のポリペプチド鎖を高収量で同比率で発現する場合または比率が特別な意義を持たない場合には、１つの発現ベクターの中に２種または３種全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。
【０１５６】
この方法の望ましい態様において、二重特異性抗体は、一つの腕に第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖及びもう一つの腕にハイブリッド免疫グロブリン重鎖‐軽鎖対（第二結合特異性を提供）から構成されている。この二重特異性の半分にのみ存在する免疫グロブリン軽鎖は容易な分離手段を提供するので、不必要な免疫グロブリンの組合せから必要とする二重特異性化合物を分離するのにこの非対称構造が役立つことが認められている。この方法は、ＷＯ ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体作製の詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１： ２１０ （１９８６）を参照。
【０１５７】
ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，７３１，１６８に記述されているその他の方法によると、抗体分子対の間の接触面を操作して、細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。望ましい接触面は少なくとも抗体定常ドメインのＣＨ３の一部を含む。この方法において、第一抗体分子の接触面の１またはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。大きな側鎖と同じかまたは類似の大きさの代償的「窪み」が、第二抗体分子の接触面上に大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）に置換して作られる。これにより他の不必要なホモダイマーのような産物以上にヘテロダイマーの収量を増加させる機序が提供される。
【０１５８】
二重特異性抗体には交差結合または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートしている抗体の一つはアビジンと結合し、もう一つはビオチンと結合している。例えば、そのような抗体は免疫系細胞に望ましくない細胞を標的にさせる（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，６７６，９８０）、そしてＨＩＶ感染症の治療用（ＷＯ ９１／００３６０， ＷＯ ９２／２００３７３，及びＥＰ ０３０８９）に使用することが提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は通常の交差結合方法を使用して作ることができる。適当な交差結合試薬は当業者によく知られており、また多数の交差結合技術とともに、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，６７６，９８０に開示されている。
【０１５９】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製する技術も文献に記述されている。例えば、二重特異性抗体は化学的結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９： ８１ （１９８５）は、完全な抗体をタンパク分解酵素で切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する方法を記述している。これらのフラグメントは、ジチオール錯体形成試薬亜ヒ酸ナトリウムの存在下に隣接ジチオールは安定化し、分子間ジスルフィド形成を防ぐため、減少する。生成したＦａｂ’フラグメントは次いでチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つは次いでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに変換され、そして等量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化試薬として使用することができる。
【０１６０】
最近の進歩は、化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができるＥ． ｃｏｌｉのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接回収を容易にしている。Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７５： ２１７−２２５ （１９９２）は完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製を記述している。各Ｆａｂ’フラグメントはＥ． ｃｏｌｉから別々に分泌されそして二重特異性抗体を形成するようにインビトロで直接化学的に結合される。このように作製された二重特異性抗体はＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合することができるとともに、ヒト乳癌標的に対してヒト細胞傷害性リンパ球の分解活性を発現することができた。
【０１６１】
組換え細胞培養から直接二重特異性抗体フラグメントを作製及び単離する種々な技術も記述されている。例えば、二重特異性抗体が累進ジッパーを使用して作製されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）： １５４７−１５５３ （１９９２）．Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパクのロイシンジッパーペプチドは遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合している。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されモノマーを形成しそして次いで再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は抗体ホモダイマーの作製にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ６４４４−６４４８ （１９９３）により記述されている「ダイアボディー」技術は二重特異性抗体フラグメントを作製するためのもう一つの方法を提供する。このフラグメントは同じ鎖上の二つのドメインの間に対を形成するには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでいる。したがって、一つのフラグメントのＶＨ及びＶＬは他のフラグメントの相補的ＶＬ及びＶＨと構成的に対を形成し、それにより２個の抗原結合部位を生じる。１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用することにより二重特異性抗体フラグメントを作製するその他の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２： ５３６８ （１９９４）を参照。
【０１６２】
２価以上の抗体も考慮している。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７： ６０ （１９９１）．
【０１６３】
ＩＩＩ．　拮抗剤のコンジュゲート及びその他の修飾
本方法に使用されるかまたはこの製造項目に含まれる抗体は任意に細胞傷害性物質にコンジュゲートしている。
【０１６４】
そのような抗体‐細胞毒性コンジュゲートの作製に有用な化学療法剤は既に記述した。
【０１６５】
抗体及び１またはそれ以上の小型分子トキシン、例えば、カリケアミシン、メイタイシン（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，２０８，０２０）、トリコテン、及びＣＣ１０６５、もここでは考慮されている。本発明の望ましい一態様において、拮抗剤は１またはそれ以上のメイタンシン分子とコンジュゲートしている（例えば、拮抗剤分子当たり約１対約１０メイタンシン分子）。例えば、メイタンシンＭａｙ ＳＳ−Ｍｅに変換され、これはＭａｙ−ＳＨ３に還元されそして修飾拮抗剤（Ｃｈａｒｍ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２： １２７−１３１ （１９９２））と結合してメイタンシノイド−拮抗剤コンジュゲートを生じる。
【０１６６】
その他には、抗体は１またはそれ以上のカリケアミシン分子とコンジュゲートすることができる。抗生物質のカリケアミシンファミリーはピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡの切断を生じることができる。使用し得るカルケアミシンの構造同族体には、これに限定されないが、γ１Ｉ，α２Ｉ，α３Ｉ，Ｎ−アセチル−γ１Ｉ，ＰＳＡＧ及びＯＩ１がある（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ３３３６−３３４２ （１９９３）及びＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８： ２９２５−２９２８ （１９９８））。
【０１６７】
使用できる酵素活性トキシン及びそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク、ディアンチンタンパク、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク（ＰＡＰＩ，ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが含まれる。例えば、ＷＯ ９３／２１２３２，１９９３年１０月２８日公開、を参照。
【０１６８】
本発明はさらに核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅのようなＤＮＡエンドヌクレアーゼ）とコンジュゲートした抗体を考慮している。
【０１６９】
種々の放射活性同位元素は放射性コンジュゲート拮抗剤の製造に有用である。例としてはＡｔ２１１，Ｉ１３１，Ｉ１２５，Ｙ９０，ＲＥ１８６，Ｒｅ１８８，Ｓｍ１５３，Ｂｉ２１２，Ｐ３２及びＬｕの放射性同位元素がある。
【０１７０】
抗体及び細胞毒性物質のコンジュゲートは種々の２価タンパクカップリング試薬、例えば、Ｎ−コハク酸イミジル−３−（２−ピリイルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、コハク酸イミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２価誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジコハク酸イミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルデヒド）、ビス−アゾ化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアナート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作ることができる。例えば、リシンイムノトキシンはＶｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８： １０９８ （１９８７）の記述にしたがって調製することができる。炭素１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、拮抗剤に放射性核種をコンジュゲートするための代表的なキレート剤である。ＷＯ ９４／１１０２６を参照。リンカーは細胞に細胞傷害性薬物を放出しやすくした「切断可能リンカー」である場合もある。例えば、酸不安定リンカー、タンパク分解酵素−感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｍ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２： １２７−１３１ （１９９２））を使用することができる。
【０１７１】
その他には、抗体及び細胞傷害性物質を含む融合タンパクを、例えば、組換え技術またはペプチド合成により、作ることもできる。
【０１７２】
その他の態様において、抗体を腫瘍先行ターゲティングに使用する「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）にコンジュゲートし、この拮抗剤−受容体コンジュゲートを患者に投与し、次いで消去剤を使用して循環系から非結合コンジュゲートを除去し、そして細胞傷害性物質（例えば、放射性核種）とコンジュゲートしている「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
【０１７３】
本発明の抗体は、プロドラッグ（例えば、ペプチド性化学療法剤、ＷＯ ８１／０１１４５参照）を活性抗−癌薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートすることもできる。例えば、ＷＯ ８８／０７３７８及びＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，９７５，２７８を参照。
【０１７４】
そのようなコンジュゲートの酵素成分にはプロドラッグに作用してより活性が高く、細胞傷害性の強い形に変換することができる酵素はすべて含まれる。
【０１７５】
本発明の方法に有用な酵素に含まれるのは、これに限定しないが、リン酸基含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；硫酸基含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；無毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物、フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、テルモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）、これらはペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用である；Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ、Ｄ−アミノ酸置換基を有するプロドラッグを変換するのに有用；カルボキシハイドレート切断酵素、例えば、グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；βラクタムで修飾されている薬物を遊離薬物に変換するβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えば、そのアミン窒素にフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基が結合している薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ。その他には、酵素活性を有する抗体、当業者には「アブザイム」としても既知、を本発明のプロドラッグを変換して活性薬物を遊離させるために使用することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ３２８： ４５７−４５８ （１９８７）を参照）。この中に記述されているようにアブザイムを腫瘍細胞集団へ搬送するために拮抗剤−アブザイムコンジュゲートを調製することができる。
【０１７６】
本発明の酵素を、上述のヘテロ２価交差結合試薬を使用するような既知方法により拮抗剤に共有結合することができる。その他には、本発明の酵素の少なくとも１つの機能活性部位と結合した本発明の拮抗剤の少なくとも１つの抗原結合領域を含む融合タンパクを当業者には既知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１２： ６０４−６０８ （１９８４）を参照）。
【０１７７】
抗体のその他の修飾もここに考慮している。例えば、抗体を種々の非タンパク性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールの共重合体、のひとつと結合することができる。
【０１７８】
ここに開示した抗体はリポソームとして製剤化することができる。拮抗剤を含むリポソームは当業者既知の方法により調製される、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８ （１９８５）； Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０ （１９８０）； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ４，４８５，０４５及び４，５４４，５４５；及びＷＯ ９７／３８７３１， １９９７年１０月２３日公開。循環時間を延長したリポソームはＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，０１３，５５６に記述されている。
【０１７９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成の逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは微細口径のフルターから押し出され、望む径のリポソームを生じる。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントはＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ２８６−２８８ （１９８２）の記述に従ってジスルフィド交換反応によりリポソームにコンジュゲートすることができる。化学療法剤を任意にリポソームの中に含めることができる。Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（１９） １４８４ （１９８９）を参照。
【０１８０】
ここに記述したタンパクまたはペプチド拮抗剤のアミノ酸配列の修飾も考慮されている。例えば、抗体の結合親和性及び／またはその他の生物活性を改善することは望ましいであろう。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体コード核酸の中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、またはペプチド合成により調製することができる。そのような修飾に含まれるのは、例えば、拮抗剤のアミノ酸配列内の残基の、欠失、及び／または挿入、及び／または置換。欠失、挿入及び置換の組合せは、必要な性状を持つ最終的構造を得るために行われる。アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数と位置の変化のような拮抗剤の翻訳後過程も変化させるであろう。
【０１８１】
突然変異の望ましい位置は抗体のどの残基または領域であるかを同定する有用な方法はＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９）により「アラニンスキャンニング突然変異」と記述されている。残基または標的残基のグループが同定され（例えば、アルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リシン及びグルタミン酸のような荷電残基）そして抗原とアミノ酸の相互作用に影響するように中性または陰性荷電アミノ酸（最も望ましいのはアラニンまたはポリアラニン）により置換する。置換に対して機能的に感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は次いで更に置換を行なうかまたはその他の変異体により詳しく調べられる。このように、アミノ酸配列変化の位置が予定されるが、変異の性質それ自体は決定するとは限らない。例えば、所与の位置における突然変異の発生を分析するために、アラニンスキャンニングまたは無作為突然変異を標的コドンまたは領域に行ない、そして発現する拮抗剤変異体を目的活性でスクリーニングする。
【０１８２】
アミノ酸配列挿入のなかには、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ−及び／またはカルボキシ−末端融合、並びに１または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端挿入の例には、Ｎ−末端メチオニル残基を有する拮抗剤または細胞傷害性ポリペプチドと融合した拮抗剤がある。その他の拮抗剤分子の挿入変異体には、拮抗剤のＮ−またはＣ−末端に酵素または拮抗剤の血清中半減期を延長するポリペプチドの融合がある。
【０１８３】
その他の変異体のタイプはアミノ酸置換変異体である。この変異体は、拮抗剤分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基を異なる残基で置換している。抗体拮抗剤の置換変異に関して最も重要な部位は超可変領域であるが、ＦＲの変更も考慮している。保存的置換は表１の「望ましい置換」の標題欄に示した。もしその置換が生物学的活性に変化を生じるならば、さらに表１の「代表的置換」に指定されているか、あるいは後述引用文献に記述されているアミノ酸クラスへ置換した物質変化を導入し、そして生成物のスクリーニングを行なう。
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【０１８４】
抗体の生物学的性質の物質的修飾は、（ａ）置換基周辺領域のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたは螺旋状立体構造のような、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の容積を維持する効果が著しく異なる置換基を選択することにより達成される。天然に存在する残基は共通の側鎖の性質に基づいて分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
（２）中性親水性：システイン、セチン、トレオニン；
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン；
（５）鎖方向性に影響する残基：グリシン、プロリン；及び
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０１８５】
非保存的置換はあるクラスのメンバーと他のクラスのメンバーの入れ替えを生じるであろう。
【０１８６】
拮抗剤の立体構造の維持に関係していないシステイン残基もまた置換することができ、一般的にはセリンと置換し、分子の酸化に対する安定性を改善しそして異常な交差結合を防止する。逆に、システインを拮抗剤に導入して、安定性を改善することができる（特に拮抗剤がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。
【０１８７】
特に望ましいタイプの置換変異体は母体抗体の超可変領域残基の１つまたはそれ以上の置換を必要とする（例えば、ヒト化またはヒト抗体）。一般的に、さらに開発するために生成した変異体は、それが創り出された母体の抗体より生物活性が改善されている。そのような置換変異体を作る便利な方法はファージディスプレーを使用する親和性成熟である。簡単にいうと、いくつかの超可変領域部位（例えば、６−７部位）は突然変異を生じて、各部位に可能な全てのアミノ置換を生じる。このようにして生じた抗体変異体は、各粒子に詰まったＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物に融合して繊維状ファージ粒子から１価状態で提示される。次いでファージディスプレー変異体はここに開示したようにその生物活性（例えば、結合親和性）でスクリーニングする。修飾用の候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異を行ない、抗原結合に著しく寄与している超可変領域残基を同定する。その他には、またはさらに、抗体と抗原の接触点を同定するために抗原−抗体複合体の結晶構造解析を行なうのも有用である。そのような接触点残基及び近隣残基はここに記述した技術に従う置換の候補である。ひとたびそのような変異体が作製されれば、変異体の集団はここに記述したスクリーニングを行ない、そして１またはそれ以上の関係検定において優れた性質を有する抗体がその後の開発のために選択される。
【０１８８】
抗体のその他のタイプのアミノ酸変異体は拮抗剤のグリコシル化パターンを変える。変化により拮抗剤に認められた炭水化物基の一つかそれ以上が欠失し、そして／または拮抗剤に存在しなかった一つかそれ以上のグリコシル化部位が加わることを意味する。
【０１８９】
ポリぺプチドのグリコシル化は典型的にＮ−結合かまたはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合とは炭水化物基がアスパラギン残基の側鎖に結合していることである。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン、このＸはプロリン以外のいずれかのアミノ酸、がアスパラギン側鎖に炭水化物基が酵素的に結合するための認識配列である。このように、ポリペプチド中にこのトリペプチド配列のいずれかが存在することにより潜在的なグリコシル化部位が創り出される。Ｏ−結合グリコシル化とは糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシローズの一つがヒドロキシアミノ酸、最も普通にはセリンまたはトレオニン、時には５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用されることがあるが、に結合することである。
【０１９０】
抗体にグリコシル化部位を添加することは、上述のトリペプチド配列（Ｎ−結合グリコシル化部位に対する）の一つかまたはそれ以上を含むようにアミノ酸配列を変更することにより通常は行われる。一つまたはそれ以上のセリンまたはトレオニン残基を元の拮抗剤の配列に追加、または置換によりこの変更（Ｏ−結合グリコシル化部位に対して）をすることもできる。
【０１９１】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当業者既知の多様な方法により調製される。これらの方法に含まれるのは、これに限定するものではないが、天然資源からの抽出（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合には）またはオリゴヌクレオチド−仲介（または位置指向性）突然変異誘起、ＰＣＲ突然変異誘起、及び初期に調製された変異体または拮抗剤の非変異種のカセット突然変異誘起による調製がある。
【０１９２】
本発明に使用される抗体を、例えば、抗体の抗原依存性細胞仲介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強するように、エフェクター機能を改善することは望ましいことである。これは抗体拮抗剤のＦｃ領域に１またはそれ以上のアミノ酸置換を導入することにより達成することができる。その他にはまたはさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、それによりこの領域に鎖間ジスルフィド結合生成をすることができる。このようにして作製したホモ二量化抗体は内部能力を改善し及び／または補体依存性細胞傷害作用及び抗原依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強することができる。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １７６： １１９１−１１９５ （１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ， Ｂ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： ２９１８−２９２２ （１９９２）を参照。抗−腫瘍活性を増強したホモ二量体抗体がＷｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ２５６０−２５６５ （１９９３）に記述されているヘテロ２価機能性交差リンカーを使用して調製されている。その他に、抗体を操作して、二つのＦｃを持たせ、それにより補体による細胞分解及びＡＤＣＣ能力を増強している。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３： ２１９−２３０ （１９８９）を参照。
【０１９３】
抗体の血清半減期を延長するために、例えば、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，７３９，２７７に記述されているように拮抗剤（特に抗体フラグメント）にサルベージ受容体結合抗原性決定基を導入することができる。ここに使用された用語「サルベージ受容体結合抗原性決定基」とは、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を延長させるのに重要なＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧＩ， ＩｇＧ２， ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域の抗原性決定基のことである。
【０１９４】
ＩＶ．　医薬製剤
本発明に従って使用される拮抗剤を含む医療用製剤は必要な純度を有する拮抗剤を医薬品として受容し得る担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０））と任意に混合して保存するために凍結乾燥製剤または水溶液の形に調製される。受容し得る担体、賦形剤、または安定剤はレシピエントに対して使用する投与量及び濃度において毒性がないものであり、そしてそれに含まれるのは、リン酸、クエン酸、及びその他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド；タンパク、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含むその他の糖類；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成イオン、例えば、ナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク複合体）；及び／または非イオン性表面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ，　ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０１９５】
免疫調節抗体及びＢ細胞消滅抗体は同一製剤に入れることもできるし、または異なる製剤で投与することもできる。組成物はさらに他の非抗体拮抗剤、例えば、ＣＤ４０ＬまたはＢ７拮抗剤、を含むこともできる。その例は可溶性ＣＤ４０、Ｂ７及びその融合体を含んでいる。投与は同時にまたは続けて行なうことができ、いずれの順序でも有効であろう。
【０１９６】
代表的抗−ＣＤ２０抗体製剤はＷＯ ９８／５６４１８に記述されており、これを明白に参考文献に引用した。この文献の記述は、液体複数回投与製剤は４０ ｍｇ／ｍＬリツキシマブ、２５ ｍＭ酢酸塩、１５０ ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ５．０を含んでおり、２−８℃において最低保存期間は２年である。関心のその他の抗−ＣＤ２０抗体製剤は、１０ ｍｇ／ｍＬリツキシマブ、９．０ ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ ｍｇ／ｎｉＬポリソルベート８０、及び注射用滅菌水、ｐＨ６．５、を含んでいる。
【０１９７】
皮下注射に適する凍結乾燥製剤がＷＯ ９７／０４８０１に記述されている。その凍結乾燥製剤は適当な希釈剤を加えることにより高いタンパク濃度に再構成され、この再構成製剤を治療すべき哺乳動物の皮下に投与することができる。
【０１９８】
この製剤は治療される個別の適応に対して必要とする活性化合物を１以上含むことができる、互いに妨害作用をしない相補的な活性を持つことが望ましい。例えば、化学療法剤、サイトカインまたは免疫抑制剤（例えば、一つは、シクロスポリンのようにＴ細胞に作用し、またはＴ細胞に結合する抗体、例えば、一つはＬＦＡ−１に結合する）を提供することが望ましいであろう。そのような他の物質の有効量は製剤の中に存在する拮抗剤の量、疾患または異常または治療のタイプ、及び上記のその他の因子によるであろう。これらは一般的に以前に使用されたのと同じ用量および投与経路で、または以前使用した投与量の約１から９９％を投与する。
【０１９９】
活性成分を、例えば３０コアセルベーション技術により、または界面重合、により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン‐マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、それぞれ、コロイド状薬物輸送システムに（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ−パーティクル、及びナノカプセル）、またはマクロエマルジョンの中に封入することができる。そのような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）に開示されている。
【０２００】
持続放出製剤を作ることができる。持続放出製剤の適当な例に含まれるのは、拮抗剤を含有する固体疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスであり、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品である。持続放出マトリックスの例に含まれるのは、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、分解性エチレン−ビニル酢酸、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマー及びリュープロリド酢酸からなる注射用マイクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸である。インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過膜を通すことにより容易に達成することができる。
【０２０１】
Ｖ．　Ｂ細胞消滅抗体及び免系調節抗体による治療
Ｂ細胞消滅抗体及び／または免疫調節抗体を含む組成物を製剤化し、１回量に分け、治療実施規範にしたがって投与する。この流れの中で考慮すべき因子としては、治療する個々のＢ細胞悪性疾患または異常、治療する個々の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患または異常の原因、薬物を搬送する部位、投与方法、投与スケジュール、その他の医師には既知の因子である。投与すべき拮抗剤の治療有効量はこれらを考慮して決定される。
【０２０２】
すでに記述したように、Ｂ細胞消滅抗体及び免疫調節抗体は同じかまたは異なる製剤に入れることができる。これらの拮抗剤製剤は別々にまたは続けて、いずれの順序でも、投与することができる。望ましくは、Ｂ細胞抗原標的に特異的なＢ細胞消滅抗体、例えば、ＣＤ２０，ＣＤ１９，ＣＤ２２，またはＣＤ３７、は免疫調節抗体、例えば、抗−ＣＤ４０Ｌ抗体、抗−ＣＤ４０抗体、または抗−Ｂ７抗体、とは分離して投与されるであろう。望ましくは、ＣＤ４０Ｌ抗体はＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ ６，００１，３５８に開示されているヒト化抗−ＣＤ４０Ｌ抗体でありそして抗−Ｂ７抗体はＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ６，１１３，８９８に開示されている霊長類化抗体であろう。記述したように、この抗体はアポトーシス活性を有することが最近示されている。また望ましいＣＤ４０Ｌ抗体はＴ及びＢ両細胞の自己免疫疾患の治療に有効であることが示されている。また、Ｂｉｏｇｅｎにより報告されている他のヒト化抗−ＣＤ４０Ｌ抗体（５ｃ８）と異なり、この抗体は副作用の発生が知られていない。
【０２０３】
一般的問題として、１回に非経口的に投与される抗体の治療有効量は典型的に１日当たり０．１から５００ ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲であり、典型的な抗体の開始量は２から１００ ｍｇ／ｋｇであろう。
【０２０４】
望ましいＢ細胞消滅抗体はＲＩＹＵＸＡＮＴＭである。その抗体の適当な１回投与量は、例えば、約２０ ｍｇ／ｍ２から約１０００ ｍｇ／ｍ２の範囲である。抗体の１回投与量は非ホジキンリンパ腫の治療に現在推奨されているＲＩＴＵＸＺＮＴＭの投与量と同じか異なっている。例えば、患者に実質的に３７５ ｍｇ／ｍ２以下、例えば、１回量が約２０ｍｇ／ｍ２から約２５０ｍｇ／ｍ２の範囲の場合には、例えば、約５０ｍｇ／ｍ２から約２００ｍｇ／ｍ２、の抗体を１回またはそれ以上投与する。
【０２０５】
さらに、抗体の初期用量を１回またはそれ以上投与することができ、次いで継続量の抗体のｍｇ／ｍ２用量が初期投与量の抗体のｍｇ／ｍ２用量を超える継続量を１回かそれ以上投与することができる。例えば、初期投与量は約２０ｍｇ／ｍ２から約２５０ｍｇ／ｍ２（例えば、約５０ｍｇ／ｍ２から２００ｍｇ／ｍ２）及び継続用量は約２５０ｍｇ／ｍ２から１０００ｍｇ／ｍ２の範囲であろう。
【０２０６】
しかし、上記のように、免疫調節及びＢ細胞消滅の両抗体について示した量はかなりの程度治療上の判断に左右される。適当な投与量を選択するのに重要な要素は上に示したように得られる成績である。例えば、進行性及び急性疾患の治療には比較的高用量が初期に必要になるであろう。最も有効な成績を得るためには、個々のＢ細胞悪性疾患によって、病気または異常の最初の兆候、診断、発現または存在がわかったらできるだけ早くまたは病気または異常が緩解している間に拮抗剤を投与する。
【０２０７】
抗体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻内及びもし必要があれば局所免疫抑制治療、傷害部位内投与、を含む適当な手段により投与する。非経口注射には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与がある。さらに、抗体をパルス注射、例えば、抗体の用量を減少させながら、で適当に投与することができる。望ましくは投与は注射により行ない、部分的に投与が短期か慢性かによるが、静脈内または皮下注射が最も望ましい。
【０２０８】
追加して化学療法剤、免疫抑制剤及び／またはサイトカインのような他の化合物を抗体と共に投与することができる。この併用投与には、別製剤または同一医薬製剤を使用する同時投与、及び両者（または全部）の活性物質が同時にその生物活性を発現する望ましい時間間隔でいずれかの順序での連続投与、が含まれる。
【０２０９】
患者に抗体を投与することの他に、本特許出願は遺伝子治療による抗体の投与を考慮している。抗体をコードする核酸の投与は「拮抗剤の治療有効量の投与」という表現に包含されている。例えば、細胞内抗体作製のための遺伝子治療の使用に関するＷＯ ９６／０７３２１，１９９６年３月１４日公開、を参照。
【０２１０】
核酸（任意にベクターにいれて）を患者の細胞に入れるには主要な２つの方法がある；インビボ及びエクスビボ。インビボ輸送としては、核酸を直接患者に、通常は拮抗剤を必要とする部位に、注射する。エクスビボ処置では、患者の細胞を取出し、核酸をこの単離細胞に導入して、そして修飾した細胞を患者の体内に直接投与するか、または例えば、多孔性膜に封じ込んで患者の体内に移植する（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８９２，５３８及び５，２８３，１８７を参照）。種々の細胞に核酸を導入するのに適した種々の技術が存在する。技術は核酸が培養細胞にインビトロで導入されるのかまたは目的とする宿主の細胞にインビボで導入するかにより異なる。インビトロで哺乳動物細胞へ核酸を導入する適当な技術としては、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＦ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、などがある。広く使用されている遺伝子のエクスビボ輸送用のベクターはレトロウイスルである。
【０２１１】
現在の望ましいインビボ核酸導入技術としては、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイスル、またはアデノ随伴ウイルス）及び脂質に基づく系（例えば、遺伝子の脂質による導入のための脂質はＤＯＴＭＡ，ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）による導入がある。ある状況では、細胞表面膜タンパクまたは標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上の受容体に対するリガンドのような標的細胞を指向する物質を持つ核酸資源を供給することが望ましい。リポソームが使用された場合には、エンドサイトーシスに関係して細胞表面膜タンパクに結合するタンパクがターゲティングに使用されそして／または取り込みを増強する、例えば、特別な細胞型に反応するキャプシドタンパクまたはそのフラグメント、循環しつつ内部化するタンパクに対する抗体、及び細胞内局在化及び細胞内半減期を延長するタンパク。受容体仲介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， ｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６２： ４４２９−４４３２ （１９８７）； 及びＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｒｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： ３４１０−３４１４ （１９９０）により記述されている。現在知られている遺伝子作製及び治療プロトコールの総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）を参照。またＷＯ ９３／２５６７３も参照、そしてこれをここに引用した。
【０２１２】
ＶＩ．　製品
本発明のその他の態様において、上記疾患または異常の治療に有用な物質を含む製品を提供する。
【０２１３】
製品は容器及びラベルまたは能書を含むかまたは容器に貼付してある。適当な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、などである。容器はガラスまたはプラスチックのような種々の材料で作ることができる。容器は選択した疾患または異常を治療するために有効な成分を含有し、そして滅菌採取部を有している（例えば、容器は皮下注射針で刺し通すことができるゴム栓の付いた静脈内注射液を入れたバッグまたはバイアルである）。全体として一つまたはいくつかの組成物があり得る。この一つの組成物中の少なくとも一つの活性物質はＢ細胞消滅活性を有する抗体であり、そして少なくとも一つの抗体は抗−ＣＤ４０Ｌ、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ２３、抗−ＣＤ４または抗−Ｂ７抗体のような免疫調節抗体である。ラベルまたは能書は、組成物が既に表示したようなＢ細胞悪性疾患であるかその傾向がある患者を治療するために使用することを示している。製品は、さらに、医薬品として受容し得る緩衝液、例えば、注射用滅菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸バッファー食塩液、リンガー液及びデキストロース溶液、を入れた第二の容器を包含している。さらに、その他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含め商業的及びユーザーの立場から望ましいものを含むことがある。
【０２１４】
本発明のさらに詳細を以下の限定的でない例によって説明する。明細書に引用した全ての出版物はここに明白に参考文献として引用する。
【０２１５】
本発明の抗体をヒトまたはその他の動物に治療的または予防的程度の有効性を生じるのに充分な量で前述の治療法に従って投与することができる。本発明のその抗体を、本発明の抗体及び通常の医薬品として受容し得る担体または希釈剤と既知技術により組合わせて通常の１回投与量形態としてヒトまたはその他の動物に投与することができる。医薬品として受容し得る担体または希釈剤の形態及び性質は混合される活性成分の量、投与経路及びその他のよく知られた変数により指示されることは、当業者にはよく認識されていることであろう。
【０２１６】
本発明の抗体（またはそのフラグメント）の投与経路は、経口、非経口、吸入または局所であり得る。ここに使用した用語非経口には、静脈内、筋肉内、皮下、直腸内、または膣内投与を含む。非経口投与の皮下及び筋肉内の形態は一般的に望ましい。
【０２１７】
本発明の化合物の、予防的にまたは治療的に免疫抑制を誘導するため、または癌性腫瘍を治療するための非経口または経口１日用量は、一般的に約０．０５から１００、しかし望ましくは０．５から１０、１日当たり体重ｋｇ当たりのｍｇであろう。
【０２１８】
本発明の抗体を吸入により投与することもできる。「吸入」によるとは、鼻腔内または口腔内吸入投与のことである。エアゾル形成または定量吸入器のようなその投与に適した投与形態が通常の技術で調製される。本発明の化合物の望ましい投与量は一般的に約１０から１００ミリグラムの範囲内である。
【０２１９】
本発明の抗体を局所的に投与することもできる。局所的投与は非全身的投与を意味しており、本発明の抗体（またはそのフラグメント）化合物を表皮の外側に、口腔に適用、及び耳、眼、及び鼻に滴下することを含み、著しくは血流中に入らない。全身投与は、経口、静脈内、腹腔内及び筋肉内投与を意味する。治療または予防効果に必要な抗体の量は勿論選択した抗体、治療する病気の性質及び重篤度及び動物により異なる。
【０２２０】
例
例１
Ｂリンパ腫細胞、ＤＨＴ−４細胞の性質
抗−ＣＤ４０Ｌ抗体は化学療法誘導細胞傷害／アポトーシスから悪性Ｂ細胞を生存させるＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０相互作用を阻害することができるという仮説を、ＩＤＥＣ−１３１及びアドリアマイシン（ＡＤＭ）に曝露したＢリンパ腫細胞系、ＤＨＬ−４（Ｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋ． Ｒｅｓ． １０： １９５−２０２ （１９８６））を使用してインビトロで試験した。ＩＤＥＣ−１３１はネスミ、モノクロナール抗−ヒトＣＤ４０Ｌ抗体、２４−３１、のヒト化体である。
【０２２１】
最初に、ＤＨＬ−４細胞を４時間異なる濃度のＡＤＭに曝露することによりＤＨＬ−４細胞に対するＡＤＭ細胞毒性の最低濃度を決めた。５日間培養後のＤＨＬ−４細胞の細胞傷害性はＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ，肝細胞による色素還元検定により測定した（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ２０２： １６３−１７１ （１９９７）を参照）。簡単に記述すると、１ｘ１０５ＤＨＬ−４細胞を増殖培地（ＲＭＰＩ−１６４０＋１０％ウシ胎児血清）中で種々の濃度のＡＤＭ（１ｘ１０−６Ｍから１ｘ１０−８Ｍ）と細胞培養試験管中３７℃４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗い、増殖培地に１ｘ１０５細胞／ｍｌに再懸濁し、そして２００μｌの細胞懸濁を９６−ウエル平底プレートの各ウエルに加えた。プレートを３７℃でインキュベートし、異なる時間における細胞傷害性を試験した。１８時間のインキュベーションの間、５０μｌのレドクス色素Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｃａｔ．＃ＤＡＬ １１００）を各ウエルに加えた。インキュベーションの後、プレートをシェーカー上で室温１０分間インキュベートして冷却し、そして細胞内色素還元を測定した。蛍光を９６−ウエル蛍光測定器で５３０ｎｍ励起そして５９０ｎｍ発光で測定した。成績は相対蛍光単位（ＲＦＵ）で示した。細胞傷害性パーセントを次のように計算した：
［１‐（被検サンプルの平均ＲＦＵ÷対照細胞の平均ＲＦＵ）］ｘ１００％．
ＡＤＭの細胞傷害性の滴定曲線が明確となり、細胞傷害性の薬物の最小濃度は次の検定に利用した。
【０２２２】
図１に示した成績は、培養の４時間前にＡＤＭ（２ｘ１０−７Ｍ及び４ｘ１０−８Ｍ）に曝露した後５日間培養したＤＨＬ−４細胞の細胞傷害性を示している。細胞は曝露後一回洗い、そして５日間増殖培地で培養し、そしてＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ色素取り込み検定により細胞傷害性を測定した。さらに、ＤＨＬ−４細胞を選択的ＣＤ分子の膜発現をフローサイトメトリーにより分析した。ＤＨＬ−４細胞にはＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ４０分子の発現が認められたが、ＣＤ４０Ｌの発現は検出されなかった。
【０２２３】
例２
抗−ＣＤ４０Ｌ抗体はリンパ腫細胞のアドリアマイシンによる殺作用に対するＣＤ４０Ｌによる抵抗を凌駕する
図２Ａは、ＡＤＭにより誘導される細胞死に対するＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０仲介による抵抗に対する抗−ＣＤ４０Ｌ抗体の影響を示したものである。ＤＨＬ−４細胞（０．５ｘ１０６細胞／ｍｌ）を１０μｇ／ｍｌの可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ， Ｐ．Ａ． Ｂｒａｍｓ， Ｅ． Ａ． Ｐａｄｌａｎ， Ｋ． Ｈａｒｉｈａｒａｎ， Ｋ． Ｓｌａｔｅｒ， Ｊ． Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｒ． Ｎｏｅｌｌｅ， ａｎｄ Ｒ． Ｎｅｗｍａｎ，“Ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ１５４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｓ ＣＤ１５４−ＣＤ４０ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”（投稿中））と１時間３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、低濃度のＡＤＭ（２ｘ１０−７Ｍ‐４ｘ１０−８Ｍ）を加えそしてＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下にさらに４時間インキュベートした。ＡＤＭに曝露後、細胞を洗い、そして０．５ｘ１０６細胞／ｍｌ濃度に増殖培地に再懸濁し、１００μｌの細胞懸濁を９６ウエル平底プレートの各ウエルに入れ、ｓＣＤ４０Ｌを加えた系と加えない系について重複試験した。ｓＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）をＡＤＭ処理中連続的にｓＣＤ４０Ｌに曝露されるように培養に加え、そしてＡＤＭ曝露中ｓＣＤ４０Ｌを存在させない培養には加えなかった。さらに、１０μｇ／ｍｌのＩＤＥＣ−１３１を培養に加えてｓＣＤ４０Ｌ及びＡＤＭと共にインキュベートしたＤＨＬ−４細胞に対する影響を調べた。５日後、細胞傷害性を、記述したように、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ色素取り込み検定により測定した。
【０２２４】
データは、ｓＣＤ４０ＬはＡＤＭ処理後のＤＨＬ−４細胞の生存を延長することを示しているが、一方、期待したように、ｓＣＤ４０Ｌの非存在下にＡＤＭに曝露された細胞において細胞傷害性の増加が観察された。さらに、抗−ＣＤ４０Ｌ抗体（ＩＤＥＣ−１３１）の添加はＣＤ４０Ｌ介在細胞生存を逆転し、細胞傷害性の増加を生じた（図２Ａ）。
【０２２５】
ＩＤＥＣ−１３１単独の添加ではｓＣＤ４０Ｌで処理したＤＨＬ−４細胞に対して作用がなかったことは、抗体それ自体ではＤＨＬ−４細胞に対して直接の阻害または細胞傷害活性を持たないことを示している（図２Ｂ）。ｓＣＤ４０Ｌと共にまたはそれ無しに予備インキュベートしたＤＨＬ−４細胞を種々の濃度のＩＤＥＣ−１３１、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ、抗−ＣＤ２０抗体ＣＥ９．１、及び抗−ＣＤ４抗体（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ＆ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． ８４： ７３−８４ （１９９７））の存在下に培養した。５日後、ＤＨＬ−４細胞の細胞傷害性／増殖を、上述のように、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ検定で測定した。図２ＢはＩＤＥＣ−１３１によりＤＨＬ−４細胞の増殖及び細胞傷害には影響がないことを示したが、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭは予想通り細胞増殖を抑制し、細胞傷害を誘導した。抗−ＣＤ４抗体と培養したＤＨＬ−４細胞には影響が認められなかった。
【０２２６】
例３
ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０シグナリングは抗−ＣＤ２０抗体、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭによるＢリンパ腫細胞のアポトーシスを阻止する
抗−ＣＤ２０抗体誘導Ｂリンパ腫細胞のアポトーシスに対するＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０介在シグナリングの効果を、ＤＨＬ−４細胞及び表面交差結合ＲＩＴＵＸＡＮＴＭを含むインビトロの系を使用して測定した。ＤＨＬ−４細胞（０．５から１ｘ１０６細胞／ｍｌ）をｓＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）と３７℃で培養した。終夜培養した後、細胞を採り、１０μｇ／ｍｌのＲＩＴＵＸＡＮＴＭまたは対照抗体（ＣＥ９．１；抗−ＣＤ４抗体）とｓＣＤ４０Ｌ（１０μｇ／ｍｌ）と共にまたはそれ無しに氷上でインキュベートした。１時間インキュベーション後、細胞を遠心分離して結合していない抗体を除去し、そして増殖培地（５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ）に１ｘ１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、そして組織培養試験管中培養した。細胞表面に結合した抗体は、１５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇ−Ｆｃγ特異抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントの打ち込みにより交差結合し、アポトーシスの検定を行なうまで３７℃でインキュベートした。アポトーシスの検出はフローサイボメトリーカスパーゼ−３検定を使用して行なった。培養細胞を４及び２４時間に採取し、洗い、そしてＣｙｔｏｆｉｘ（Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭ Ｋｉｔ， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｃａｔ． ＃２０７５ＫＫ）を使用して４℃で固定した。２０分間固定した後、細胞を洗い、そして１５μｌのアッフィニティー純度ＰＥ−コンジュゲートポリクロナールウサギ抗−カスパーゼ−３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｃａｔ．＃６７３４５）及び５０μｌのｃｙｔｏｐｅｒｍ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ； Ｃａｔ．＃２０７５ＫＫ）を加えた。細胞を氷上暗所で３０分間インキュベートした。インキュベーション後細胞を一度洗い、ｃｙｔｏｐｅｒｍに再懸濁した。フローサイトメトリーのデータはＦＡＣＳｃａｎ上で得られ、そしてＶｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＨｏｕｓｅのＷｉｎＬｉｓｔソフトウエアを使用して解析した。
【０２２７】
表ＩはＤＨＬ−４リンパ腫細胞におけるＲＩＴＵＸＡＮＴＭ誘導アポトーシスのｓＣＤ４０Ｌ曝露による抵抗を示している。この試験において、カスパーゼ−３の活性化を、我々の以前の試験においてカスパーゼ−３とＴｕｎｅｌ検定の間に良好な相関関係を示したので、代理指標として使用した。ｓＣＤ４０Ｌ存在下におけるＤＨＬ−４細胞表面のＲＩＴＵＸＡＮＴＭの交差結合はアポトーシスのレベルを低下したが、ｓＣＤ４０Ｌに曝露されなかった細胞はアポトーシスを増加した。これと比較して、同じイソタイプの抗体、対照抗体（ＣＥ９．１）の存在下に培養した細胞ではアポトーシスを生じなかった。したがって、データは、ｓＣＤ４０Ｌ誘導ＣＤ４０経路のシグナリングはＲＩＴＵＸＡＮＴＭ介在Ｂリンパ腫細胞殺傷効果を導き得ることを示している。
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【０２２８】
例４
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞の生存に及ぼすＩＤＥＣ−１３１の影響
Ｂ−ＣＬＬ細胞の増殖及び生存に対するＩＤＥＣ−１３１の効果をインビトロで調べるために、Ｂ−ＣＬＬ細胞をＣＤ４０Ｌの存在下にＩＤＥＣ−１３１と共に及びそれ無しでインビトロ培養した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジエント遠心分離を使用してＣＬＬ患者血液から分離した。生存能力をトリパンブルー色素排除により測定して＞９８％であった。フローサイトメトリー解析により、リンパ球の＞７０％はＣＤ１９＋／ＣＤ２０＋であった。ＣＬＬ細胞（ＰＢＭＣ）をＣＬＬ増殖培地（例えば、５％ＦＣＳまたは２％ドナー自己血漿を添加、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０）中で培養した。さらに、一部の実験では、ＣＤ１９＋Ｂ細胞をＣＤ１９＋ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ（Ｄｙｎａｌ，Ｃａｔ．＃１１１．０３／１１１．０４）をメーカー説明書にしたがって使用して精製し、上記のように培養した。増殖培地で培養したＣＬＬまたは精製Ｂ−ＣＬＬ細胞は大部分自発的アポトーシス細胞死に至った。しかし、ｓＣＤ４０Ｌの存在下に培養した細胞は培養中の生存能力を延長した。表ＩＩはｓＣＤ４０Ｌ（５μｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下に増殖したＣＤ１９＋Ｂ−ＣＬＬ細胞の異なる時間における生存能力を示し、そしてＣＬＬ細胞の生存延長を示している。患者＃１のｓＣＤ４０Ｌと共に培養したＢ−ＣＬＬ細胞は２週間以上＞６０％の生存能力であったが、ｓＣＤ４０Ｌが存在せずに増殖した細胞の生存は１０％以下であった。
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【０２２９】
図３Ａは、７日間培養後のＢ−ＣＬＬ細胞の増殖及び生存に対するＩＤＥＣ−１３１の影響を示している。ＣＬＬ患者の精製Ｂ−ＣＬＬ細胞（２ｘ１０６細胞／ｍｌ）を二本の培養試験管に分割する。一方の試験管の細胞に同容量の増殖培地に入れたｓＣＤ４０Ｌ（５μｇ／ｍｌ）を加え、他方には対照として同容量の増殖培地を加えた。３７℃で１時間インキュベーション後、細胞を穏やかに混合し、１００μｌの細胞懸濁を９６ウエル平底プレートの各ウエルに種々の濃度のＩＤＥＣ−１３１（１０μｇ／ｍｌから０．３μｇ／ｍｌ）と共に加えた。数日後、細胞の生存／死亡を、上記のように、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ検定によって測定した。データはｓＣＤ４０Ｌとの培養により細胞の生存を示した。培養にＩＤＥＣ−１３１を添加することにより細胞死を増加した。さらに、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭをＩＤＥＣ−１３１と同じ濃度で投与した場合には細胞死に対するＩＤＥＣ−１３１の効果よりも低いものであった。（図３Ｂ）
【０２３０】
例５
Ｂ−ＣＬＬにおけるＨＬＡ−ＤＲ分子のＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０介在上方調節
ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０シグナル伝達経路が完全であるか否かを調べるために、ＣＬＬ患者のＣＬＬ細胞を５μｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌと共にまたはそれ無しで３７℃で培養した（５ｘ１０５細胞／ｍｌ）。４８時間及び１４４時間で、クラスＩＩ分子、ＨＬＡ−ＤＲ発現、を標準的方法を使用するフローサイトメトリーよりＣＤ１９＋細胞上で測定した。簡単に言うと、培養リンパ球を種々の時間に採取し、単または二重染色用のフルオレッセイン（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）のいずれかに結合した抗体を使用し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターを使用して分子の表面発現を解析した。フローサイトメトリー用に染色するには、培養試験管中の１ｘ１０６細胞を適当な抗体と以下のようにインキュベートする；スキャッタープロット上のリンパ球集団を集める抗−ＣＤ４５−ＦＩＴＣ； ＣＤ１９＋及び／またはＣＤ２０＋Ｂ細胞を決定するための抗−ＣＤ１９−ＰＥ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｃａｔ．＃３０６５５）または抗−ＣＤ２０−ＦＩＴＣ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ； Ｃａｔ．＃３３２６４）；Ｔ細胞を除外する抗−ＣＤ３−ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ； Ｃａｔ．＃３０１０４）；ＣＤ１９＋細胞上のクラスＩＩは発現を確認するために抗−ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ； Ｃａｔ．＃３２３８４）。細胞を一度２ｍｌ冷ＰＢＳで遠心（２００ｘｇ，６分間）して洗い、氷上３０分間抗体とインキュベートし、その後、細胞を一度洗い、０．５％パラホルムアルデヒドで固定し、分析するまで４℃で保存した。フローサイトメトリーのデータはＦＡＣｓａｎでとり、ＷｉｎＬｉｓｔ（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ）を使用して解析した。装置はＲＰＥまたはＦＩＴＣのいずれかの単染色か、無染色または二重染色の細胞が含まれる象限を検査するようにセットした。図４はｓＣＤ４０Ｌと共に培養したＣＤ１９＋ＣＬＬ細胞とｓＣＤ４０Ｌと培養しなかった細胞におけるＨＬＡ−ＤＲは発現の比較を示している。ｓＣＤ４０Ｌの存在下に培養したＢ−ＣＬＬ細胞における高レベルのＨＬＡ−ＤＲ発現が検出された（表ＩＩＩ）。
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【０２３１】
例６
ＩＤＥＣ−１３１及びＲＩＴＵＸＡＮＴＭの調製
ＣＤ４０＋悪性疾患を治療するために、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．０２％ポリソルベート８０、ｐＨ６．５の製剤中ＩＤＥＣ−１３１約１０から約５０ｍｇ／ｍｌで患者に静脈内（ｉｖ）注射した。ＩＤＥＣ−１３１はＲＩＴＵＸＡＮＴＭの前に、後に、または同時に投与した。ＲＩＴＵＸＡＮＴＭの注射投与量は約３から約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲である。
【０２３２】
例７
ＩＤＥＣ−１３１及びＣＨＯＰの調製
ＣＨＯＰに反応するＣＤ４０＋悪性疾患（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫及び慢性リンパ球性白血病、並びに細胞がＣＤ４０＋である悪性疾患のサルベージ治療）を治療するために、ＣＨＯＰサイクルを開始する直前にＩＤＥＣ−１３１を約３から約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲の投与量で注射する。ＩＤＥＣ−１３１は合計４から８回のＣＨＯＰサイクルの各回に先立って繰り返し投与される。
【０２３３】
例８
患者におけるＢ細胞リンパ腫を治療するために抗−ＣＤ４０Ｌまたは抗−Ｂ７をＲＩＴＵＸＡＮＴＭと併用して投与する
ＣＤ４０＋悪性疾患（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫及びＣＬＬ）の再発または進行型のサルベージ治療または治療するために併用療法は特に有用である。ＩＤＥＣ−１３１がＣＨＯＰ及びＲＩＴＵＸＡＮＴＭと併用投与する場合には、ＩＤＥＣ−１３１は上記例６に記述したように、例７におけるＣＨＯＰ−ＩＤＥＣ−１３１投与で特定したようなスケジュールに従って投与する。その他には、ＩＤＥＣ−１３１（抗−ＣＤ４０Ｌ）は実質的に抗−Ｂ７抗体の範囲内にあるように同じ方法で行われる。
【０２３４】
上述した参考文献はその全体をここに引用した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
４時間アドリアマイシンに曝露した後のＢリンパ腫細胞の感受性。
【図２】
（パネルＡ）ＡＤＭによるリンパ腫細胞の殺細胞作用に対するＣＤ４０Ｌ介在耐性を抗−ＣＤ４０Ｌ（ＩＤＥＣ−１３１）は凌駕する。（パネルＢ）正常及びｓＣＤ４０Ｌ前処理ＤＨＬ−４細胞に対するＲＩＴＵＸＡＮＴＭの影響。
【図３】
（パネルＡ）Ｂ−ＣＬＬのＣＤ４０Ｌ介在細胞生存に対する抗−ＣＤ４０Ｌ（ＩＤＥＣ−１３１）の阻害効果。（パネルＢ）ＣＤ４０Ｌ介在Ｂ−ＣＬＬ生存のＲＩＴＵＸＡＮＴＭによる阻害。
【図４】
ｓＣＤ４０Ｌと培養したＣＤ１９＋ＣＬＬ細胞及びｓＣＤ４０Ｌと培養しない細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現を含むＦＡＣＳ解析。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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