(57)【要約】本発明は、メラニン濃縮ホルモン２型受容体（ＭＣＨ−２Ｒ）に対して活性なトランケートされたＭＣＨ類似体及びそのような類似体の使用を特徴とする。ここで述べるトランケートされたＭＣＨ類似体は、ＭＣＨ−２Ｒ及びＭＣＨ−１Ｒに対して活性なもの、及びＭＣＨ−２Ｒに対して選択的に活性なものを包含する。ＭＣＨ−２Ｒ類似体は、研究ツールとして使用すること及び治療に使用することを含めて、様々な異なる用途を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造：
【化１】
2004537521.tif 000018
［式中、Ｘ１は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ２は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ３は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ４は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ５は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ６は、存在する場合には、アルギニン又はデス−アミノ−アルギニンである、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ７は、システインであり；
Ｘ８は、メチオニン、アラニン又はノルロイシンであり；
Ｘ９は、ロイシン又はアラニンであり；
Ｘ１０は、グリシン、アラニン、ロイシン、ノルロイシン、セリン、サルコシン、イソ酪酸、γ−アミノ酪酸、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンであり；
Ｘ１１は、アルギニン、アラニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ホモアルギニン、シトルリン、ノルロイシン又はニトロアルギニンであり；
Ｘ１２は、バリン又はアラニンであり；
Ｘ１３は、フェニルアラニン、チロシン、Ｄ−（ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）、（１’）−及び（２’）−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、又は各々の置換基がＯ−アルキル、アルキル、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｆ、Ｉ及びＢｒから成る群より独立して選択される一及び多置換フェニルアラニンであり；
Ｘ１４は、アルギニンであり；
Ｘ１５は、アラニン、プロリン又はサルコシンであり；
Ｘ１６は、システイン又はＤ−システインであり；
Ｘ１７は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｚ１は、存在する場合には、Ｎ−末端アミノ基に共有結合している、任意に存在する保護基であり；
Ｚ２は、存在する場合には、Ｃ−末端カルボキシ基に共有結合している、任意に存在する保護基である］
を有し、
但し、次の群：
Ｘ６はデス−アミノ−アルギニンである；
Ｘ８はアラニンである；
Ｘ１０は、イソ酪酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンである、及び
Ｘ１１は、アラニン、ニトロアルギニン、シトルリン、ノルロイシン又はホモアルギニンである、
の１つ又はそれ以上が存在することを条件とする、
任意に置換されたペプチド、又は前記ペプチドの標識誘導体、又は前記ペプチド若しくは前記標識誘導体の医薬適合性の塩。
【請求項２】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５は存在せず、及びＸ１７は、チロシン又はトリプトファンである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ１７は存在しない、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ６は、アルギニンであり；
Ｘ８は、メチオニンであり；
Ｘ９は、ロイシンであり；
Ｘ１２は、バリンであり；
Ｘ１３は、フェニルアラニン、（２’）ナフチルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン又はシクロヘキシルアラニンであり；及び
Ｘ１５は、プロリン又はサルコシンである、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ１０は、イソ酪酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−セリン又はＤ−アスパラギンである、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
Ｚ１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、及びＺ２は−ＮＨ２である、請求項３に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｚ１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、及びＺ２は−ＮＨ２である、請求項４に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｚ１は−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、及びＺ２は−ＮＨ２である、請求項５に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが、配列番号４、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２５、２６、３４、３５、３６又は４０である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、配列番号１１、１３、１４、１８、１９、３５又は３６である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが配列番号１３である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
化合物が、請求項１から１１のいずれかのペプチドのＭＣＨ−２Ｒへの結合に影響を及ぼす能力を測定する段階を含む、ＭＣＨ−２Ｒに結合することができる化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
前記ペプチドが放射能標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）組換え核酸からＭＣＨ−２Ｒ又はその機能性誘導体を生産する段階、
ｂ）ＭＣＨ−２Ｒを活性化するＭＣＨ−２Ｒ活性化合物及びＭＣＨ−２Ｒに対する被験化合物を提供する段階、
ｃ）前記被験化合物が前記ＭＣＨ−２Ｒ拮抗物質として働く能力の指標として、前記被験化合物がＭＣＨ−２Ｒ活性を阻害する能力を測定する段階、
を含み、
但し、前記ＭＣＨ−２Ｒ活性化合物が、次の構造：
【化２】
2004537521.tif 000019
［式中、Ｘ１は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ２は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ３は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ４は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ５は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ６は、存在する場合には、アルギニン又はデス−アミノ−アルギニンである、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ７は、システインであり；
Ｘ８は、メチオニン、アラニン又はノルロイシンであり；
Ｘ９は、ロイシン又はアラニンであり；
Ｘ１０は、グリシン、アラニン、ロイシン、ノルロイシン、セリン、サルコシン、イソ酪酸、γ−アミノ酪酸、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンであり；
Ｘ１１は、アルギニン、アラニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ホモアルギニン、シトルリン、ノルロイシン又はニトロアルギニンであり；
Ｘ１２は、バリン又はアラニンであり；
Ｘ１３は、フェニルアラニン、チロシン、Ｄ−（ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）、（１’）−及び（２’）−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、又は各々の置換基がＯ−アルキル、アルキル、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｆ、Ｉ及びＢｒから成る群より独立して選択される一及び多置換フェニルアラニンであり；
Ｘ１４は、アルギニンであり；
Ｘ１５は、アラニン、プロリン又はサルコシンであり；
Ｘ１６は、システイン又はＤ−システインであり；
Ｘ１７は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｚ１は、存在する場合には、Ｎ−末端アミノ基に共有結合している、任意に存在する保護基であり；
Ｚ２は、存在する場合には、Ｃ−末端カルボキシ基に共有結合している、任意に存在する保護基である］
を有する化合物であるか、又は前記ペプチドの標識誘導体であるか、又は前記ペプチド若しくは前記標識誘導体の医薬適合性の塩である、
ＭＣＨ−２Ｒ拮抗物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
前記ＭＣＨ−２Ｒ活性化合物が、請求項１から１１のいずれかに記載の任意に置換されたペプチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記機能性ＭＣＨ−２Ｒが配列番号５８のアミノ酸配列から成る、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）ＭＣＨ−２Ｒ又はその機能性誘導体を、ＭＣＨ−２Ｒを選択的に活性化させる化合物及び被験化合物と接触させる、及び
ｂ）ＭＣＨ−２Ｒ活性を測定する、
段階を含む、ＭＣＨ−２Ｒを選択的に活性化させ、ＭＣＨ−２Ｒ活性への前記被験化合物の作用を測定するための方法。
【請求項１８】
前記ＭＣＨ−２Ｒが配列番号５８の配列から成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＭＣＨ−２Ｒを有する被験者に、体重増加を生じさせるために請求項１から１１のいずれかに記載のペプチドの有効量を投与する段階を含み、前記ペプチドがＭＣＨ−２Ｒを活性化する、前記被験者において体重を増加させるための方法。
【請求項２０】
ＭＣＨ−２Ｒを有する被験者に、食欲増進を生じさせるためにＭＣＨ−２Ｒを活性化する請求項１から１１のいずれかに記載のペプチドの有効量を投与する段階を含む、前記被験者において食欲を増進させるための方法。
【請求項２１】
ａ）ＭＣＨ−２Ｒを有する被験者に、体重増加又は食欲増進を生じさせるために請求項１から１１のいずれかに記載のペプチドの有効量を投与し、前記ペプチドがＭＣＨ−２Ｒを活性化する段階、
ｂ）化合物を前記被験者に投与する段階、及び
ｃ）前記被験者において体重又は食欲の変化を測定する段階、
を含む、前記化合物がＭＣＨ−２Ｒを有する被験者において体重又は食欲を低下させる能力を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【背景技術】
【０００２】
本出願の中で引用する参考文献は、特許請求する本発明の先行技術とは認められない。
【０００３】
視床下部に存在する神経ペプチドは、体重の調節を仲介する上で重要な役割を果たす（Ｆｌｉｅｒら、１９９８、Ｃｅｌｌ，９２、４３７−４４０。）。メラニン濃縮ホルモン（ＭＣＨ）は、同様に神経ペプチドＮＥＩ及びＮＧＥをコードする、視床下部内のより大きなプレ−プロホルモン前駆体の一部として合成される環状１９アミノ酸神経ペプチドである（Ｎａｈｏｎら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４、６３２−６３７。）。ＭＣＨはサケの下垂体において最初に特定された。魚においてＭＣＨはメラニンの凝集に影響を及ぼし、それ故皮膚の色素沈着に影響する。マス及びウナギでは、ＭＣＨはストレス誘導性又はＣＲＦ刺激性ＡＣＴＨ放出にも関与することが示された（Ｋａｗａｕｃｈｉら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５、３２１−３２３。）。
【０００４】
ヒトでは、ＭＣＨをコードする２つの遺伝子が脳内で発現されることが特定された（Ｂｒｅｔｏｎら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１８、２９７−３１０。）。哺乳類においては、ＭＣＨは主として、外側視床下部及び不確帯の核周体を含む、食物摂取の制御に関わる視床下部の神経細胞体に局在する（Ｋｎｉｇｇｅら、１９９６、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １７、１０６３−１０７３。）。
【０００５】
薬理的及び遺伝的データは、ＭＣＨの主要作用機構は栄養補給を促進すること（食欲促進、ｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ）であると示唆している。ＭＣＨ  ｍＲＮＡは、絶食マウス及びラット、ｏｂ／ｏｂマウス及び神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）に関する遺伝子を標的破壊したマウスでは上方調節される（Ｑｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０、２４３−２４７、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１、４１５−４１８。）。ＭＣＨの中枢注入（ＩＣＶ）は食物摂取を刺激し、ＭＣＨは、αメラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）で見られる摂食低下作用に拮抗する（Ｑｕら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０、２４３−２４７。）。ＭＣＨ欠損マウスはやせて、摂食低下性であり、高い代謝率を有する（Ｓｈｉｍａｄａら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９６、６７０−６７３。）。
【０００６】
視床下部−下垂体−軸への作用が報告されていることから、ＭＣＨの作用は食物摂取の調節に限定されない（Ｎａｈｏｎ，１９９４、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８、２２１−２６２。）。ＭＣＨは、哺乳類においてストレスが誘発するＡＣＴＨの放出を調節することができる（Ｎａｈｏｎ，１９９４、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．８、２２１−２６２。）。
【０００７】
いくつかの参考文献が、ＭＣＨに結合することが示唆されている受容体（「ＭＣＨ−１Ｒ」）を記述している（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ４００、２６１−２６５、Ｓａｉｔｏら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ４００、２６５−２６９、Ｂａｃｈｎｅｒら、１９９９、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５７：５２２−５２４、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２６１、６２２−６２６。）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、メラニン濃縮ホルモン２型受容体（「ＭＣＨ−２Ｒ」）に対して活性なトランケートされたＭＣＨ類似体を特徴とする。トランケート型ＭＣＨ類似体は、ＭＣＨ−２Ｒ及びＭＣＨ−１Ｒに対して活性な化合物、及びＭＣＨ−２Ｒに対して選択的に活性な化合物を包含する。トランケート型ＭＣＨ類似体は、研究ツールとしての使用及び治療での使用を含めて、様々な用途を備える。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＭＣＨ−２Ｒに選択的なトランケート型ＭＣＨ類似体は、ＭＣＨ−１ＲよりもＭＣＨ−２Ｒに対してより大きな作用を及ぼす。ＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨ−２Ｒに対してＭＣＨの作用は、受容体の結合と受容体の活性化を含む。ＭＣＨ−２Ｒに対して選択的に活性なトランケートされた類似体は、ＭＣＨ−２Ｒに対して高い結合、高い活性、又は高い結合と高い活性の両方を有しうる。好ましくは、ＭＣＨ−２ＲとＭＣＨ−１Ｒに対して活性レベルの差は少なくとも約２倍又は少なくとも３倍である。
【００１０】
受容体の活性化又はＭＣＨ−２Ｒを活性化する能力は、該類似体が、少なくともインビトロ条件下でヒト、フェレット、イヌ又はアカゲザルＭＣＨ−２Ｒの少なくとも１つに関してＭＣＨ−２Ｒ機能的活性を生じさせうることを示唆する。ＭＣＨ−２Ｒのインビトロでの機能的活性を測定するための手法は、Ｇタンパク質活性を測定することを包含する。インビトロで機能的に活性なＭＣＨ類似体はインビボでも何らかの活性を持つことが期待される。
【００１１】
トランケートされたＭＣＨ類似体は、次の構造：
【００１２】
【化１】
2004537521.tif 000002
［式中、Ｘ１は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ２は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ３は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ４は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ５は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ６は、存在する場合には、アルギニン又はデス−アミノ−アルギニンである、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｘ７は、システインであり；
Ｘ８は、メチオニン、アラニン又はノルロイシンであり；
Ｘ９は、ロイシン又はアラニンであり；
Ｘ１０は、グリシン、アラニン、ロイシン、ノルロイシン、セリン、サルコシン、イソ酪酸、γ−アミノ酪酸、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンであり；
Ｘ１１は、アルギニン、アラニン、Ｎ−メチル−アルギニン、ホモアルギニン、シトルリン、ノルロイシン又はニトロアルギニンであり；
Ｘ１２は、バリン又はアラニンであり；
Ｘ１３は、フェニルアラニン、チロシン、Ｄ−（ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）、（１’）−及び（２’）−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、又は各々の置換基がＯ−アルキル、アルキル、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｆ、Ｉ及びＢｒから成る群より独立して選択される一及び多置換フェニルアラニンであり；
Ｘ１４は、アルギニンであり；
Ｘ１５は、アラニン、プロリン又はサルコシンであり；
Ｘ１６は、システイン又はＤ−システインであり；
Ｘ１７は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；
Ｚ１は、存在する場合には、Ｎ−末端アミノ基に共有結合している、任意に存在する保護基であり；
Ｚ２は、存在する場合には、Ｃ−末端カルボキシ基に共有結合している、任意に存在する保護基である］
を有する化合物であるか、又は前記ペプチドの標識誘導体であるか、又は前記ペプチド若しくは前記標識誘導体の医薬適合性の塩である。
【００１３】
特に異なる記載がない限り、キラル中心を有するアミノ酸はＬ−鏡像異性体の中で提供される。「その誘導体」との言及は対応するＤ−アミノ酸、Ｎ−アルキル−アミノ酸、β−アミノ酸、及びω−アミノ酸を指す。
【００１４】
ＭＣＨ−２Ｒに対して選択的に活性なトランケート型ＭＣＨ類似体は、例えばＸ６、Ｘ８、Ｘ１０又はＸ１１を修飾することによって作製することができる。選択的ＭＣＨ−２Ｒ活性を提供する修飾の例は、次の１又はそれ以上を包含する：Ｘ６がデス−アミノ−アルギニンである；Ｘ８がアラニンである；Ｘ１０が、イソ酪酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンである；及びＸ１１が、アラニン、ニトロアルギニン、シトルリン、ノルロイシン又はホモアルギニンである。
【００１５】
本発明の第一の局面は、Ｘ６、Ｘ８、Ｘ１０又はＸ１１の少なくとも１つは、：Ｘ６がデス−アミノ−アルギニンである；Ｘ８がアラニンである；Ｘ１０が、イソ酪酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンである；及びＸ１１が、アラニン、ニトロアルギニン、シトルリン、ノルロイシン又はホモアルギニンである
からなる群より選択されるトランケート型ＭＣＨ類似体を述べる。
【００１６】
本発明のもう１つの局面は、ＭＣＨ−２Ｒに結合することができる化合物をスクリーニングする方法を述べる。この方法は、化合物が、トランケート型ＭＣＨ類似体のＭＣＨ−２Ｒへの結合に影響を及ぼす能力を測定することを含む。
【００１７】
本発明のもう１つの局面は、ＭＣＨ−２Ｒ拮抗物質をスクリーニングする方法を述べる。この方法は、組換えによって生産したＭＣＨ−２Ｒ受容体を、ＭＣＨ−２Ｒを活性化するＭＣＨ−２Ｒ類似体で活性化すること、及び化合物がＭＣＨ−２Ｒ活性を阻害する能力を測定することを含む。
【００１８】
本発明のもう１つの局面は、ＭＣＨ−２Ｒを選択的に活性化し、ＭＣＨ−２Ｒ活性への被験化合物の作用を測定する方法を述べる。この方法は、ａ）ＭＣＨ−２Ｒ又はその機能性誘導体を、ＭＣＨ−２Ｒを選択的に活性化させる化合物及び被験化合物と接触させる段階、および及びｂ）ＭＣＨ−２Ｒ活性を測定する段階を含む。
【００１９】
本発明のもう１つの局面は、被験者において体重を増加させるための方法を述べる。この方法は、体重増加を生じさせるためにＭＣＨ−２Ｒを活性化するトランケートされたＭＣＨ類似体の有効量を被験者に投与する段階を含む。
【００２０】
本発明のもう１つの局面は、被験者において食欲を増進させるための方法を述べる。この方法は、食欲増進を生じさせるためにＭＣＨ−２Ｒを活性化するトランケートされたＭＣＨ類似体の有効量を被験者に投与する段階を含む。
【００２１】
本発明のもう１つの局面は、化合物が被験者において体重又は食欲を低下させる能力を測定するための方法を述べる。この方法は、体重又は食欲増加を生じさせるトランケートされたＭＣＨ類似体の有効量を被験者に投与すること及び化合物の体重又は食欲への作用を測定することを含む。
【００２２】
本発明の他の特徴及び利点は、種々の実施例を含めてここで提供するさらなる説明から明らかである。提供する実施例は、本発明を実施する上で有用な種々の成分及び方法を例示するものである。それらの実施例は特許請求される本発明を限定しない。本開示に基づき、当業者は、本発明を実施するために有用な他の成分及び方法を特定し、使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
ここで述べるＭＣＨ類似体は約１０個から約１７個のアミノ酸又はアミノ酸誘導体を含み、ＭＣＨ−２Ｒに対して活性である。本出願を手引きとして用いて、有意のＭＣＨ−２Ｒ受容体活性を有する、及び一部の場合には天然に生じる哺乳類ＭＣＨに等しい又はそれより良好な活性を有するＭＣＨ類似体を生産することができる。より小さなサイズのトランケート型ＭＣＨ類似体は、合成の容易さ及び／又は生理的緩衝液への高い溶解度のような、完全長ＭＣＨを上回る利点を提供する。
【００２４】
ＭＣＨ−２Ｒに対する有意の活性は、ヒトＭＣＨを使用して得られる活性と比較して少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約１００％の活性である。ＭＣＨ−２Ｒ活性は、下記で提供される実施例の中で述べるような、Ｇタンパク質活性を測定する手法を用いて検定することができる。
【００２５】
トランケート型ＭＣＨ類似体の用途は、研究ツール及び治療適用を包含する。研究ツールとしての適用は一般に、トランケート型ＭＣＨ類似体とＭＣＨ−２Ｒの使用を含む。ＭＣＨ−２Ｒは、哺乳類被験者、全細胞及び膜フラグメントのような様々な環境に存在しうる。トランケート型ＭＣＨ類似体の研究ツール適用の例は、ＭＣＨ−２Ｒに対して活性な化合物をスクリーニングすること、ＭＣＨ−２Ｒが標本又は試料中に存在するかどうかを判定すること、ＭＣＨ及びＭＣＨ−２Ｒ活性の役割又は作用を検討すること、及びＭＣＨ拮抗物質の役割又は作用を検討することを包含する。
【００２６】
ＭＣＨ−２Ｒに対して選択的に活性なトランケート型ＭＣＨ類似体は、選択活性に関連する付加的な用途を有する。付加的な用途の例は、ＭＣＨ−１ＲとＭＣＨ−２Ｒの相違を探索するため及びＭＣＨ−１ＲとＭＣＨ−２Ｒの存在を識別するために使用することを包含する。
【００２７】
トランケート型ＭＣＨ類似体は、ＭＣＨ作用物質とＭＣＨ拮抗物質の両方をスクリーニングするために使用できる。ＭＣＨ作用物質についてのスクリーニングは、例えば、トランケート型ＭＣＨ類似体を被験化合物との競合実験において使用することによって実施できる。ＭＣＨ拮抗物質についてのスクリーニングは、例えば、ＭＣＨ−２Ｒ活性を生じさせるためにトランケート型ＭＣＨ類似体を使用し、その後被験化合物がそのような活性を変化させる能力を測定することによって実施できる。
【００２８】
トランケート型ＭＣＨ類似体の治療適用は、ＭＣＨ−２Ｒを有する被験者への投与を含む。ＭＣＨ−２Ｒを有する被験者は、ヒト、イヌ、フェレット及びアカゲザルを含む。
【００２９】
被験者の言及は、必ずしも疾患又は障害の存在を示唆しない。被験者の語は、例えば、疾患又は障害を緩和するのを助けるために治療されるヒト、及び疾患又は障害の発症を遅延させる又は防ぐために予防的に治療されるヒトを包含する。
【００３０】
ＭＣＨ作用物質は、被験者において有益な作用を達成するために使用できる。例えば、ＭＣＨ作用物質は、体重増加、体重の維持及び／又は食欲増進を促進するために使用できる。そのような作用は、体重減少を伴う、疾患又は障害を有する患者又は治療を受けている患者のために特に有用である。体重減少を伴う疾患又は障害の例は、食欲不振、ＡＩＤＳ、るいそう、悪液質、及び高齢脆弱（ｆｒａｉｌ  ｅｌｄｅｒｌｙ）を包含する。体重減少を伴う治療の例は、化学療法、放射線療法、及び透析を包含する。
【００３１】
ＭＣＨ拮抗物質も、患者において有益な作用を実現するために使用できる。例えば、ＭＣＨ拮抗物質は、体重減少、食欲低下、体重維持、癌（例えば結腸癌、乳癌）の治療、疼痛軽減、ストレスの軽減及び／又は性機能障害の治療を促進するために使用できる。
【００３２】
（トランケートされたＭＣＨ−２Ｒ活性類似体）
トランケートされたＭＣＨ−２Ｒ活性類似体は、次の構造：
【００３３】
【化２】
2004537521.tif 000003
［式中、Ｘ１は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；好ましくは、存在する場合にはＸ１は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；より好ましくは、存在する場合にはＸ１はアスパラギン酸であり；及びより好ましくは、Ｘ１は存在せず；
Ｘ２は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；好ましくは、存在する場合にはＸ２は、フェニルアラニン又はチロシンであり；より好ましくは、存在する場合にはＸ２はフェニルアラニンであり；及びより好ましくは、Ｘ２は存在せず；
Ｘ３は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；好ましくは、存在する場合にはＸ３は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり；より好ましくは、存在する場合にはＸ３はアスパラギン酸であり；及びより好ましくは、Ｘ３は存在せず；
Ｘ４は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；好ましくは、存在する場合にはＸ４は、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリン又はアラニンであり；より好ましくは、存在する場合にはＸ４はメチオニンであり；及びより好ましくは、Ｘ４は存在せず；
Ｘ５は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；好ましくは、存在する場合にはＸ５は、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、バリン又はアラニンであり；より好ましくは、存在する場合にはＸ５はロイシンであり；及びより好ましくは、Ｘ５は存在せず；
Ｘ６は、存在する場合には、アルギニン又はデス−アミノ−アルギニンである、任意に存在するアミノ酸であり；好ましくは、Ｘ６はアルギニンであり；
Ｘ７は、システインであり；
Ｘ８は、メチオニン、アラニン又はノルロイシンであり；好ましくは、Ｘ８はメチオニンであり；
Ｘ９は、ロイシン又はアラニンであり；好ましくは、Ｘ９はアラニンであり；
Ｘ１０は、グリシン、アラニン、ロイシン、ノルロイシン、セリン、サルコシン、イソ酪酸、γ−アミノ酪酸、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンであり；好ましくは、Ｘ１０は、イソ酪酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンであり；より好ましくは、Ｘ１０は、イソ酪酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−セリン又はＤ−アスパラギンであり；
Ｘ１１は、アルギニン、アラニン、Ｎ−メチル−アルギニン、シトルリン、ホモアルギニン、ニトロアルギニン又はノルロイシンであり；好ましくは、Ｘ１１は、アラニン、ニトロアルギニン又はノルロイシンであり；
Ｘ１２は、バリン又はアラニンであり；好ましくは、Ｘ１２はバリンであり；
Ｘ１３は、フェニルアラニン、チロシン、Ｄ−（ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）、（１’）−及び（２’）−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、又は各々の置換基がＯ−アルキル、アルキル、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、Ｆ、Ｉ及びＢｒから成る群より独立して選択される一及び多置換フェニルアラニンであり；好ましくは、Ｘ１３は、フェニルアラニン、（２’）ナフチルアラニン、ｐ−フルオロ−フェニルアラニン又はシクロヘキシルアラニンであり；
Ｘ１４は、アルギニンであり；
Ｘ１５は、アラニン、プロリン又はサルコシンであり；好ましくは、Ｘ１５は、プロリン又はサルコシンであり；
Ｘ１６は、システイン又はＤ−システインであり；
Ｘ１７は、存在する場合には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸又はグルタミン酸、若しくはその誘導体である、任意に存在するアミノ酸であり；好ましくは、存在する場合にはＸ１７は、チロシン又はトリプトファンであり；より好ましくは、Ｘ１７は存在せず；
Ｚ１は、存在する場合には、Ｎ−末端アミノ基に共有結合している、任意に存在する保護基であり；
Ｚ２は、存在する場合には、Ｃ−末端カルボキシ基に共有結合している、任意に存在する保護基である］
を有する場合により修飾されたペプチド、又は前記ペプチドの標識誘導体、又は前記ペプチド若しくは前記標識誘導体の医薬適合性の塩である。
【００３４】
本発明は、ジアステレオマーならびにそれらのラセミ体及び分割された鏡像異性的に純粋な形態を包含する。トランケートされたＭＣＨ類似体は、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、又はそれらの組合せを含みうる。
【００３５】
様々な実施形態において、ＭＣＨ類似体は、１又はそれ以上の異なる位置に１個の好ましい（又はより好ましい）基を含む。より好ましい実施形態は、より多くの異なる位置に複数の好ましい（又はより好ましい）基を含む。
【００３６】
Ｎ−末端アミノ基に共有結合した保護基は、インビボ条件下でアミノ末端の反応性を低下させる。アミノ保護基は、任意に置換された−Ｃ１−１０アルキル、任意に置換された−Ｃ２−１０アルケニル、任意に置換されたアリール、−Ｃ１−６アルキル−任意に置換されたアリール、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１−６−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）−任意に置換されたアリール、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、及び−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−任意に置換されたアリールを含む。好ましくは、アミノ末端保護基は、アセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル又はｔ−ブチルオキシカルボニルである。
【００３７】
Ｃ−末端カルボキシ基に共有結合した保護基は、インビボ条件下でカルボキシ末端の反応性を低下させる。カルボキシ末端保護基は、好ましくは最後のアミノ酸のα−カルボニル基に結合している。カルボキシ末端保護基は、アミド、メチルアミド及びエチルアミドを含む。
【００３８】
「アルキル」は、任意に置換された炭化水素、又は炭素−炭素単結合によって結合される任意に置換された炭化水素基を表わす。アルキル炭化水素基は、直鎖であるか若しくは１又はそれ以上の分枝又は環状基を含んでいてもよい。好ましくは、アルキル基は１−４個の炭素の長さである。アルキルの例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、及びｔ−ブチルを含む。アルキル基は、ハロゲン（好ましくは−Ｆ又は−Ｃｌ）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、１個から６個のハロゲン（好ましくは−Ｆ又は−Ｃｌ、より好ましくは−Ｆ）で置換された−Ｃ１−２アルキル、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、又は−ＯＣＦ３から成る群より選択される１又はそれ以上の置換基で置換されていてもよい。種々の実施形態において、アルキルは置換基を持たないか又は１個の置換基を有する。
【００３９】
「アルケニル」は、１又はそれ以上の炭素−炭素二重結合を含む任意に置換された炭化水素基を表わす。アルケニル炭化水素基は、直鎖であるか若しくは１又はそれ以上の分枝又は環状基を含んでいてもよい。好ましくは、アルケニル基は２個から４個の炭素の長さである。アルケニル基は、ハロゲン（好ましくは−Ｆ又は−Ｃｌ）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、１個から５個のハロゲン（好ましくは−Ｆ又は−Ｃｌ、より好ましくは−Ｆ）で置換された−Ｃ１−２アルキル、−ＣＦ３、−ＯＣＨ３、又は−ＯＣＦ３から成る群より選択される１又はそれ以上の置換基で置換されていてもよい。種々の実施形態において、アルケニルは置換基を持たないか又は１個の置換基を有する。
【００４０】
「アリール」は、２個までの共役又は縮合環系を含む、共役π電子系を有する少なくとも１個の環を備えた、任意に置換された芳香族基を表わす。アリールは、炭素環式アリール、ヘテロ環式アリール及びビアリール基を含む。好ましくは、アリールは５又は６員環であり、より好ましくはベンジルである。アリール基は、−Ｃ１−４アルキル、−Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン（好ましくは−Ｆ又は−Ｃｌ）、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、１個から５個のハロゲン（好ましくは−Ｆ又は−Ｃｌ、より好ましくは−Ｆ）で置換された−Ｃ１−２アルキル、−ＣＦ３、又は−ＯＣＦ３から成る群より選択される１又はそれ以上の置換基で置換されていてもよい。種々の実施形態において、アリール基は３、２、１又は０個の置換基を有する。
【００４１】
標識誘導体は、検出可能な標識の存在を示す。検出可能な標識の例は、蛍光、酵素、及び放射能標識を含む。好ましい放射能標識は１２５Ｉである。標識の種類と標識の位置の両方がＭＣＨ活性に影響を及ぼしうる。標識は、ＭＣＨ−２Ｒに対するトランケート型ＭＣＨ類似体の活性を実質的に変化させる内容に選択すべきである。ＭＣＨ活性への特定標識の作用は、ＭＣＨ活性及び／又は結合を測定するアッセイを用いて判定することができる。
【００４２】
好ましい実施形態では、任意に修飾されたペプチドは次の構造：
【００４３】
【化３】
2004537521.tif 000004
［式中、種々の群及び好ましい群は上述したとおりである］
を有する。好ましい及び／又はより好ましい群の種々の組合せ及び数を有する好ましい実施形態を生産することができる。
【００４４】
（ＭＣＨ−２Ｒに選択的なトランケートされたＭＣＨ類似体）
例えば、次の群：Ｘ６はデス−アミノ−アルギニンである；Ｘ８はアラニンである；Ｘ１０は、イソ酪酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンである；及び／又はＸ１１は、アラニン、ニトロアルギニン、シトルリン、ノルロイシン又はホモアルギニンである、の１つ又はそれ以上が存在する、トランケートされたＭＣＨ類似体の構造を有する、ＭＣＨ−２Ｒに選択的なトランケートされたＭＣＨ類似体を生産することができる。より好ましい群は、高い結合及び高い機能活性を提供する。より好ましい群の例は、Ｘ１０がイソ酪酸、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、又はＤ−セリンである群である。
【００４５】
ＭＣＨ−２Ｒ選択活性トランケート型類似体に関する好ましい実施形態において、該選択活性類似体は次の構造：
【００４６】
【化４】
2004537521.tif 000005
［式中、種々の群及び好ましい群は、次の群：Ｘ６はデス−アミノ−アルギニンである；Ｘ８はアラニンである；Ｘ１０は、イソ酪酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−ノルロイシン、Ｄ−セリン、β−アラニン、フェニルグリシン、２−シクロヘキシル−アラニン又はＤ−フェニルアラニンである；及びＸ１１は、アラニン、ニトロアルギニン、シトルリン、ノルロイシン又はホモアルギニンである、の１つ又はそれ以上が存在することを条件として、トランケートされたＭＣＨ類似体に関して上述したとおりである］
を有する。好ましい及び／又はより好ましい群の種々の組合せ及び数を有するより好ましい実施形態を生産することができる。
【００４７】
選択活性類似体の特定例は、配列番号４、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２５、２６、３４、３５、３６又は４０によって提供される。より好ましい選択活性類似体は、配列番号１１、１３、１４、１８、１９、３５又は３６によって提供される。
【００４８】
（トランケートされたＭＣＨ類似体の生産）
トランケートされたＭＣＨ類似体は、当技術分野において周知の手法を用いて生産することができる。例えば、トランケートされたＭＣＨ類似体のポリペプチド領域は化学的又は生化学的に合成することができ、所望する場合には、保護されたＮ−末端及び／又は保護されたＣ−末端を生じるように修飾することができる。ポリペプチドの化学合成の手法は当技術分野において周知である（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙより、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｋｋｅｒ，１９９０参照。）。細胞内への核酸の導入及び核酸の発現を含む生化学的合成のための手法の例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、及び
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版より、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９の中に認められる。
【００４９】
（ＭＣＨ−２Ｒ）
ＭＣＨ−２Ｒは、ＭＣＨに応答するＧタンパク質共役受容体であり、ＭＣＨ−１Ｒとは別のものである。機能性ＭＣＨ−２Ｒ活性は、天然に生じるヒトＭＣＨ−２Ｒ及びその機能性誘導体から生産することができる。天然に生じるＭＣＨ−２Ｒ及びその機能性誘導体はヒトＭＣＨによって活性化され、少なくとも１２個の隣接アミノ酸の存在により、ヒトＭＣＨ−２Ｒ中に存在するものとして特定される。少なくとも１２個の隣接アミノ酸の参照はＭＣＨ−２Ｒについての標識を提供する。
【００５０】
ヒトＭＣＨ−２Ｒ受容体のアミノ酸配列は配列番号５８によって提供される。ＭＣＨ−２Ｒ機能性誘導体は、配列番号５８からの少なくとも１２個の隣接アミノ酸を備える領域を含み、ＭＣＨ結合によって活性化される。種々の実施形態において、機能性誘導体は、配列番号５８内に存在する少なくとも約３０個の連続アミノ酸を含むか、又は配列番号５８から成る。ヒトＭＣＨ−２Ｒの機能性誘導体の例は、フェレット、イヌ又はアカゲザルにおけるように自然に認められるＭＣＨ−２Ｒ及び非天然に生じる誘導体を包含する。
【００５１】
ＭＣＨ−２Ｒ誘導体は、例えばヒトＭＣＨ−２Ｒから出発することによって生産できる。ＭＣＨ−２Ｒについてのアミノ酸配列及びコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号５８及び５９によって提供される。ＭＣＨ−２Ｒの機能性誘導体は、例えばアミノ酸置換、付加及び欠失を導入することによって生産できる。
【００５２】
本質的に同じ特性を有する誘導体を生産するためのＭＣＨ−２Ｒへの変更は、ＭＣＨ結合ドメインの外側で、及びその三次構造を変えないように実施すべきである。ポリペプチドがＭＣＨ−２Ｒ活性を有する能力は、Ｇタンパク質活性を測定する手法のような手法を用いて確認することができる。
【００５３】
天然に生じるアミノ酸における相違は異なるＲ群によるものである。Ｒ群は、物理的大きさ、電荷及び疎水性のようなアミノ酸の種々の特性に影響を及ぼす。アミノ酸は、次のような様々な群に分けることができる：中性で疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン）；中性で極性（グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン及びグルタミン）；塩基性（リシン、アルギニン及びヒスチジン）；及び酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）。
【００５４】
一般に、種々のアミノ酸を置換する場合、同様の特性を有するアミノ酸を交換することが好ましい。ロイシンをバリンで、リシンをアルギニンで、及びグルタミンをアスパラギンで置換することのような、特定群の中で異なるアミノ酸を置換することは、ポリペプチドの機能性に変化を生じさせないための良好な候補である。
【００５５】
種々のアミノ酸群の外での変更も実施することができる。好ましくは、そのような変更は、該ポリペプチド内での置換するアミノ酸の位置を考慮に入れて行う。例えば、アルギニンは、その長い脂肪族側鎖の故に、グルタミン酸よりも自由にポリペプチドの内部の非極性アミノ酸を置換することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、補足３３、付属物１Ｃ参照。）。
（ＭＣＨ受容体結合アッセイ）
ある化合物がＭＣＨ−２Ｒに結合する能力を測定するアッセイは、ＭＣＨ結合部位を有するＭＣＨ−２Ｒポリペプチドを使用する。ＭＣＨ−２Ｒポリペプチドは、完全長ヒトＭＣＨ−２Ｒ及びその機能性誘導体、ＭＣＨ結合部位を含むトランケートされたＭＣＨ−２Ｒフラグメント、及びそのようなＭＣＨ−２Ｒフラグメントを含むキメラポリペプチドを含む。ＭＣＨに結合するＭＣＨ−２Ｒフラグメントを含むキメラポリペプチドはまた、天然に生じるＭＣＨ−２Ｒでは認められない１又はそれ以上のポリペプチド領域も含む。好ましくは、ＭＣＨ結合を測定するアッセイは、配列番号５８の完全長ＭＣＨ−２Ｒを使用する。
【００５６】
ＭＣＨ結合に関わるＭＣＨ−２Ｒアミノ酸配列は、標識ＭＣＨ又はトランケート型ＭＣＨ類似体と種々の受容体フラグメントを用いて特定することができる。結合領域をしぼるために試験すべきフラグメントを選択するには、様々な戦略が使用できる。そのような戦略の例は、Ｎ−末端から出発して約１５アミノ酸の長さの連続するフラグメントを試験すること、及びより長いフラグメントを試験することを含む。より長いフラグメントを試験する場合は、ＭＣＨ結合領域をさらに限局するために、ＭＣＨに結合するフラグメントを再分するか又は突然変異させることができる。結合試験に使用するフラグメントは、組換え核酸手法を用いて作製することができる。
【００５７】
結合アッセイは、個々の化合物又は種々の数の化合物を含む試料を用いて実施することができる。ＭＣＨ−２Ｒに結合する能力を有する種々の数の化合物を含む試料を、受容体に結合する化合物を特定するために試験することができるより小さな群の化合物に分割することができる。本発明の１つの実施形態では、少なくとも１０個の化合物を含む被験試料を結合アッセイに置いて使用する。
【００５８】
結合アッセイは、種々の環境に存在する、組換えによって生産したＭＣＨ−２Ｒポリペプチドを用いて実施することができる。そのような環境は、例えば、組換え核酸又は天然に生じる核酸から発現されるＭＣＨ−２Ｒポリペプチドを含む細胞抽出物及び精製細胞抽出物を包含し、また例えば、種々の環境に導入される、組換え手段によって又は天然に生じる核酸から生産した精製ＭＣＨ−２Ｒの使用を包含する。
【００５９】
（ＭＣＨ−２Ｒ活性化合物のスクリーニング）
ＭＣＨ−２Ｒ活性化合物のスクリーニングは、ＭＣＨ−２Ｒ活性を有するポリペプチドを発現する組換え核酸を用いて容易に実施される。組換え発現受容体は、受容体活性化合物への応答性が他の受容体に対する応答からより容易に識別できるように規定された細胞系において該受容体を発現する能力のような、受容体活性化合物をスクリーニンする上でいくつかの利点を提供する。例えば、ＭＣＨ−２Ｒは、発現ベクターを使用してＨＥＫ  ２９３、ＣＯＳ  ７及びＣＨＯのような細胞系において発現することができ、その場合、発現ベクターを含まない同じ細胞系が対照として使用できる。
【００６０】
組換え「核酸」は、２つのヌクレオチド配列領域の人工的な組合せを表わす。その人工的な組合せは自然では認められない。組換え核酸は、第一コード領域及び天然では前記第一コード領域には結合しない調節エレメント又は第二コード領域を含む。好ましい組換えヌクレオチド配列は、コード領域が外来性プロモーターの制御下にあり、第二コード領域が選択マーカーであるものである。組換えヌクレオチド配列は、細胞ゲノム内に存在するか又は発現ベクターの一部でありうる。
【００６１】
好ましくは、発現は、発現ベクターを使用して宿主細胞において実現される。発現ベクターは、適切な転写とプロセシングのための調節エレメントと共に、ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む。存在しうる調節エレメントは、組換え核酸と天然で結合するもの及び天然では組換え核酸に結合しない外来性調節エレメントを包含する。外来性プロモーターのような外来性調節エレメントは、特定宿主において組換え核酸を発現するために有用でありうる。
【００６２】
ＭＣＨ−２Ｒ活性化合物のスクリーニングは、アッセイにおいてトランケート型ＭＣＨ類似体を使用することを通して容易になる。トランケート型ＭＣＨ類似体はＭＣＨ−２Ｒ活性を提供する。そのような活性への被験化合物の作用を測定して、例えばアロステリックモジュレーター及び拮抗物質を特定することができる。さらに、そのようなアッセイは作用物質を特定するために使用できる。
【００６３】
（ＭＣＨ受容体活性）
ＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨ−２ＲはＧタンパク質共役受容体である。ＭＣＨ−１ＲはＧｉとＧｑの両方に共役し、一方ＭＣＨ−２ＲはＧｑに共役する。Ｇｉの共役は、アデニル酸シクラーゼの阻害及びその後のｃＡＭＰレベルの低下をもたらす。Ｇｑへの共役は、ホスホリパーゼＣの活性化及びその後の細胞内Ｃａ２＋の上昇を導く。
【００６４】
Ｇｉ、Ｇｓ及びＧｑのような種々のＧタンパク質の活性を測定するための手法は当技術分野において周知である。Ｇｉ及びＧｓ活性は、黒色素胞アッセイ、ｃＡＭＰ産生を測定するアッセイ、ｃＡＭＰ蓄積の阻害を測定するアッセイ、及び３５Ｓ−ＧＴＰの結合を測定するアッセイのような手法を用いて測定できる。ｃＡＭＰは、放射線免疫検定法のような種々の手法を用いて、及びｃＡＭＰ応答性遺伝子レポータータンパク質によって間接的に測定することができる。
【００６５】
Ｇｑ活性は、細胞内Ｃａ２＋を測定する手法のような手法を用いて測定できる。Ｃａ２＋を測定するために使用できる当技術分野で周知の手法の例は、Ｆｕｒａ−２のような染料の使用及びエクオリンのようなＣａ２＋−生物発光感受性レポータータンパク質の使用を含む。Ｇタンパク質活性を測定するためにエクオリンを使用する細胞系の一例は、ＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７である（どちらも参照してここに組み込まれる、Ｂｕｔｔｏｎら、１９９３、Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  １４，６６３−６７１、及びＦｅｉｇｈｎｅｒら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，２１８４−２１８８。）。
Ｇタンパク質に機能的に共役したＭＣＨ結合領域を含むキメラ受容体も、ＭＣＨ受容体活性を測定するために使用できる。キメラＭＣＨ受容体は、Ｎ−末端細胞外ドメイン；膜貫通領域、細胞外ループ領域及び細胞内ループ領域で構成される膜貫通ドメイン；及び細胞内カルボキシ末端を含む。キメラ受容体を作製し、Ｇタンパク質共役応答を測定するための手法は、例えば国際特許願第ＷＯ９７／０５２５２号及び米国特許第５，２６４，５６５号の中で提供される。
【００６６】
（体重又は食欲の変化）
トランケートされたＭＣＨ類似体は、被験者において体重及び／又は食欲を増加させる又は維持するための方法において使用できる。そのような方法は、例えば、ＭＣＨ拮抗物質の作用を検討する実験プロトコールの一部として、被験者において有益な作用を達成するため、又はＭＣＨの生理的作用をさらに検討するために使用できる。
【００６７】
ＭＣＨ拮抗物質の作用を検討する実験プロトコールは、例えば、被験者において体重又は食欲増加を生じさせるのに十分な量のトランケート型ＭＣＨ類似体を使用すること、及びその後被験化合物の作用を検討することによって実施できる。体重及び食欲の変化は、当技術分野で周知の手法を用いて測定することができる。
【００６８】
体重又は食欲の増加は、過少体重の被験者において、若しくは体重又は食欲に影響を及ぼす疾患を有する患者又は体重又は食欲に影響を及ぼす治療を受けている患者において、体重を維持するため又は体重又は食欲増加を生じさせるために有用でありうる。
【００６９】
また、例えば、ＭＣＨ−２Ｒを有する家畜は、体重を増加するよう治療されうる。
【００７０】
過少体重の被験者は、「正常」体重範囲の下限又はボディマス指数（「ＢＭＩ」）よりも約１０％以下、２０％以下、若しくは３０％以下の体重を有する被験者を含む。「正常」体重範囲は当技術分野において周知であり、患者の年齢、身長及び体型などの因子を考慮に入れる。
【００７１】
ＢＭＩは身長／体重の比率を測定する。ｋｇで表わした体重をメーターで表わした身長の二乗で除して算定することによって決定される。ＢＭＩの「正常」範囲は１９〜２２である。
【００７２】
（投与）
トランケートされたＭＣＨ類似体は、当技術分野で周知の手法と共にここで提供する手引きを使用して製剤し、被験者に投与することができる。好ましい投与経路は、有効量の化合物が標的に達することを保証する。一般に薬剤投与についての手引きは、例えば、どちらも参照してここに組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０、及びＭｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  第２版、ＢａｎｋｅｒとＲｈｏｄｅｓ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に述べられている。
【００７３】
トランケートされたＭＣＨ類似体は、酸性又は塩基性塩として調製することができる。医薬適合性の塩（水溶性又は油溶性又は分散性生成物の形態）は、従来の非毒性塩又は、例えば無機又は有機酸又は塩基から生成される第四級アンモニウム塩を包含する。そのような塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモイン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシラート、及びウンデカン酸塩のような酸付加塩；及びアンモニウム塩のような塩基性塩、ナトリウム及びカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩のような有機塩基との塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、及びアルギニン及びリシンのようなアミノ酸との塩を含む。
【００７４】
トランケートされたＭＣＨ類似体は、注射などの様々な経路を用いて投与することができる。注射によって投与するときは、適切な非毒性の、リンガー溶液又は等張食塩水のような非経口的に許容される希釈剤又は溶剤、若しくは合成モノ−又はジグリセリドを含む無菌で無刺激性の不揮発性油及びオレイン酸を含む脂肪酸のような適切な分散剤又は湿潤剤と沈殿防止剤を使用して、注射用溶液又は懸濁液を製剤することができる。
【００７５】
適切な投与プログラムは、好ましくは、投与される被験者の種類；被験者の年齢、体重、性別及び医学的状態；投与経路；被験者の腎及び肝機能；所望効果；及び使用する特定化合物を含む、当技術分野で周知の因子を考慮に入れて決定される。
【００７６】
毒性を伴わずに効力を生じる範囲内の薬剤の至適濃度を厳密に達成するには、標的部位への薬剤のアベイラビリティーの動態に基づく投与プログラムを必要とする。これは、薬剤の分布、平衡及び排出への配慮に関わる。被験者に対する一日量は、０．０１から１，０００ｍｇ／被験者／日と予想される。
【００７７】
トランケート型ＭＣＨ類似体はキットとして提供されうる。そのようなキットは典型的には、投与用剤型中に活性化合物を含有する。剤型は、１日当り１回から６回のような規則正しい間隔で、１日又はそれ以上の日数の期間被験者に投与したとき、体重又は食欲増加が得られるように十分な量の活性化合物を含有する。好ましくは、キットは、体重又は食欲増加のための剤型の用法及び規定された期間にわたって服用すべき剤型の量を示す指示書を含む。
【００７８】
本発明の種々の特徴をさらに例示するために実施例を下記に提示する。実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法も例示する。これらの実施例は、特許請求する本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７９】
ＭＣＨ受容体配列
ヒトＭＣＨ−２Ｒアミノ酸配列とコードするｃＤＮＡ配列、及びＭＣＨ−１Ｒアミノ酸配列とコードするｃＤＮＡ配列は次の通りである：
【００８０】
ＭＣＨ−２Ｒアミノ酸配列（配列番号５８）
【００８１】
【化５】
2004537521.tif 000006
【００８２】
ＭＣＨ−２Ｒ  ｃＤＮＡ配列（配列番号５９）
【００８３】
【化６】
2004537521.tif 000007
2004537521.tif 000008
【００８４】
ＭＣＨ−１Ｒ  アミノ酸配列（配列番号６０）
【００８５】
【化７】
2004537521.tif 000009
【００８６】
ＭＣＨ−１Ｒ  アミノ酸配列（配列番号６１）
【００８７】
【化８】
2004537521.tif 000010
2004537521.tif 000011
【実施例２】
【００８８】
ＭＣＨ類似体の合成
下記に述べる手順を使用し、アミノ酸群の段階的な添加を変化させて、ＭＣＨ類似体を生成した。ペプチドを生成し、修飾するための他の手順は当技術分野において周知である。
【００８９】
４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ樹脂上のペプチジル鎖の身長及び前記ペプチドのＮ−末端アミノ基のアセチル化を４３１Ａ  ＡＢＩペプチドシンセイサイザーで実施した。Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中のアミノ酸のヒドロキシベンゾトリアゾールエステルのカップリングのために、製造者が提供するプロトコールを適用した。フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基を半永久的α−アミノ保護基として使用し、一方側鎖保護基は、アスパラギン酸及びチロシンについてはｔｅｒｔ−ブチル、アルギニンについては２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、及びシステインについてはトリチルであった。
【００９０】
５％のアニソールを含むＴＦＡで樹脂からペプチドを開裂した。室温で２時間後、樹脂をろ過し、ＴＦＡで洗って、併合したろ液を真空中で蒸発乾固させた。その残留物をエーテルで粉砕し、形成された沈殿物をろ取して、エーテルで洗い、乾燥した。
【００９１】
粗ペプチドを５％酢酸水溶液に溶解し、その溶液のｐＨを希薄水酸化アンモニウムで約８．２に調整した。その反応混合物を強く攪拌しながら、反応混合物が約５分間黄色のままになるまで０．０５％ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）水溶液を滴下した。さらに２０分後、酢酸約１ｍｌを加えて酸化を終了させ、その反応混合物を凍結乾燥した。
【００９２】
粗凍結乾燥ペプチドを、自動Ｗｉｓｐ  ７１２インジェクター及び９９１Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ検出器を備えるＷａｔｅｒｓ  ６００Ｅシステムに接続したＣ１８  Ｖｙｄａｃカラムでの分析用逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ  ＨＰＬＣ）によって分析した。３０分間で０％から１００％緩衝液Ｂの標準勾配系を分析に使用した：緩衝液Ａは０．１％トリフルオロ酢酸水溶液であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸であった。ＨＰＬＣプロフィールを２１０ｎｍ及び２８０ｎｍで記録した。半分取Ｃ１８ＲＰ  Ｗａｔｅｒｓカラムを備えるＷａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ  ４０００システムで分取分離を実施した。６０分間で２０％から８０％緩衝液Ｂの勾配中、水及びアセトニトリルの上述した溶媒系を分離に使用した。クロマトグラフィー的に均一な化合物をエレクトロスプレー質量分析法によって分析した。
【実施例３】
【００９３】
エクオリン生物発光機能アッセイ
Ｇｑ及びＧ１１から成るＧαタンパク質サブユニットファミリーを通して共役するＧタンパク質共役受容体の活性を測定するために、エクオリン生物発光アッセイが使用できる。そのような共役は、ホスホリパーゼＣの活性化、細胞内カルシウムの動員及びプロテインキナーゼＣの活性化を導く。
【００９４】
Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  ＲＴルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、エクオリンを発現する安定なレポーター細胞系２９３−ＡＥＱ１７（Ｂｕｔｔｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  １４：６６３−６７１，１９９３）に対するＭＣＨ受容体活性の測定を実施した。２９３−ＡＥＱ１７細胞（トランスフェクションの１８時間前にＴ７５フラスコ中で平板培養した８×１０５細胞）を、リポフェクタミン２６４μｇを使用してヒトＭＣＨ受容体プラスミド２２μｇでトランスフェクトした。ヒトＭＣＨ−２Ｒ又はＭＣＨ−１ＲをコードするオープンリーディングフレームｃＤＮＡ（配列番号５９又は配列番号６１）を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入した。約４０時間の発現後、前記細胞中のアポ−エクオリンに、ＥＣＢ緩衝液（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ［ｐＨ＝７．４］２０ｍＭ、グルコース５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １ｍＭ、ＣａＣｌ２  １ｍＭ、ウシ血清アルブミン０．１ｍｇ／ｍｌ）中、還元条件下で（還元グルタチオン３００μＭ）、コエレンテラジン（１０μＭ）を４時間充填した。
【００９５】
前記細胞を採集し、ＥＣＢ媒質中で１回洗って、５００，０００細胞／ｍｌに再懸濁した。次に細胞懸濁液１００μｌ（５×１０４細胞に相当する）を、ＭＣＨ又はＭＣＨ類似体を含む試験平板に注入し、積算発光を０．５秒単位で３０秒間にわたって記録した。次に溶解緩衝液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００最終濃度）２０μＬを注入し、その積算発光を０．５秒単位で１０秒間にわたって記録した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶解応答を含む総積算発光に対する初期誘発への積算応答の比率を考慮することにより、各々のウエルについての「分別応答」値を算定した。
【実施例４】
【００９６】
放射能標識ＭＣＨ−Ｒ結合アッセイ
トランケートされたＭＣＨ類似体の活性を、該類似体が、ヒトＭＣＨ受容体を安定に発現する細胞から調製した膜への［１２５Ｉ］−ヒトＭＣＨ（Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ１９置換）の結合を阻害する能力を測定することによって検定した。アッセイに使用したヒトＭＣＨ（Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ１９置換）は、１９Ｔｙｒで１２５Ｉにより〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの非活性に放射能標識した（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。
【００９７】
細胞膜を氷上で調製した。各々のＴ−７５フラスコを無酵素細胞分離緩衝液（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｄｉａ，Ｌａｖａｌｌｅｔｔｅ，ＮＪ）１０ｍｌで２回洗い、室温で１０分間のインキュベーションにより、さらに１０ｍｌの無酵素細胞分離緩衝液中で細胞単層を分離した。分離した細胞を遠心分離し（５００×ｇ、４℃で１０分間）、均質化緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ７．４、Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ０．０１ｍＭ、ホスホルアミドン１０μＭ、バシトラシン４０μｇ／ｍｌ）５ｍｌに再懸濁して、その後ガラス製ホモジナイザー（１０ストロークから１５ストローク）を用いて均質化した。ホモジネートを１０分間遠心分離した（４℃で１，０００×ｇ）。次に、生じた上清を３８，７００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。ペレット化した膜を再懸濁し（２５ゲージの針に５回通した）、液体窒素でスナップ凍結して、使用時まで−８０℃で保存した。
【００９８】
ＭＣＨ受容体を発現する安定なＣＨＯ又はＨＥＫ−２９３細胞系からの細胞膜を使用して、９６穴フィルターアッセイ又はシンチレーションプロキシミティアッセイ（ＳＰＡ）に基づく様式において結合を実施した。フィルターアッセイについては、次のものを含む総容量０．２ｍｌ中、２０℃で１時間反応を実施した：膜懸濁液０．０５ｍｌ（〜３μｇタンパク質）、［１２５Ｉ］−ヒトＭＣＨ（Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ１９置換；３０ｐＭ）０．０２ｍｌ、競合物質０．０１ｍｌ及び結合緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、バシトラシン２００μｇ／ｍｌ、ホスホルアミドン１μＭ）０．１２ｍｌ。
【００９９】
結合した放射性リガンドを、１％ポリエチレンイミンで１時完全処理したＧＦ／Ｃフィルターを通して迅速真空ろ過（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ９６穴セルハーベスター）によって分離した。膜懸濁液をフィルターに適用したあと、フィルターを各々３ｍｌの氷冷Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、０．０４％Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗い、フィルター上の結合放射能をシンチレーション計数（ＴｏｐＣｏｕｎｔ装置）によって定量した。特異的結合（＞総結合の８０％）は、非標識ヒトＭＣＨ  １００ｎＭの存在下で為された総結合と非特異的結合の間の差と定義される。
【０１００】
ＳＰＡに基づくアッセイについては、ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を、カルシウム及びマグネシウムを含むダルベッコＰＢＳに再懸濁した（ＰＢＳ  ４ｍｌ中ビーズ５００ｍｇ）。各々の９６穴アッセイ平板について、ビーズ０．１８ｍｌを、ＭＣＨ受容体ＣＨＯ細胞膜０．２ｍｌ（〜０．２−４ｍｇタンパク質）及びＳＰＡアッセイ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、０．１％ＢＳＡ、１２％グリセロール）１．５ｍｌと混合することにより、ＭＣＨ受容体で前被覆した。前記懸濁液を２０分間静かに混合し、アッセイ緩衝液１２．３ｍｌ及びプロテアーゼ阻害因子を加えた（所与の最終濃度）：ロイペプチン２μｇ／ｍｌ、ホスホルアミドン１０μＭ、バシトラシン４０μｇ／ｍｌ、アプロチニン５μｇ／ｍｌ、Ｐｅｆａｂｌｏｃ  ０．１ｍＭ。
【０１０１】
被覆したビーズを使用時まで氷上に保持した。各々の穴について、ビーズ０．１４５ｍｌをＯｐｔｉｐｌａｔｅアッセイ平板（Ｐａｃｋａｒｄ  ６００５１９０）に加え、次いで競合物質０．００２ｍｌから０．００４ｍｌ及び［１２５Ｉ］−ヒトＭＣＨ（Ｐｈｅ１３、Ｔｙｒ１９置換；３０ｐＭ）０．０５ｍｌを加えた。室温で３時間、結合反応を進行させた。シンチレーション計数（ＴｏｐＣｏｕｎｔ装置）によって定量を実施した。
【実施例５】
【０１０２】
ＭＣＨ活性
上記の実施例３及び４で述べた手順を用いて種々のＭＣＨ類似体の活性を測定した。表１から３は、ＭＣＨ−１Ｒ及びＭＣＨ−２Ｒに対する種々のトランケートされたＭＣＨ類似体及び哺乳類ＭＣＨの活性を示す。ここで示す手引きに基づき、ＭＣＨ−２Ｒ及びＭＣＨ−１Ｒに対して活性な、及びＭＣＨ−２Ｒに対して選択的に活性な、さらなるＭＣＨ類似体を得ることができる。
【０１０３】
【表１】
2004537521.tif 000012
2004537521.tif 000013
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
表１から３に示す配列番号１及び２は、次のようなヒトＭＣＨ配列及びヒトＭＣＨのトランケートされた形態を表わす（「＊」は環化（Ｓ−Ｓ）を示す）：
【０１０７】
【化９】
2004537521.tif 000016
【０１０８】
【化１０】
2004537521.tif 000017
【０１０９】
他の実施形態は特許請求の範囲内である。いくつかの実施形態を示し、説明したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく様々な修正を加えることができる。
【国際公開パンフレット】
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2004537521.tif 000079
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004537521.tif 000080
2004537521.tif 000081