(57)【要約】本発明は、前記ペプチドがＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３１、Ｘ３２、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ３９、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４という構造式（Ｉ）に対応し、式中Ｘ１、Ｘ１７、Ｘ２１、Ｘ４３がアミノ酸であり、Ｘ１６、Ｘ４４が小さい極性アミノ酸であり、Ｘ１９が大型極性アミノ酸であり、Ｘ３６が小型又はわずかに疎水性をもつアミノ酸であり、Ｘ３８は、わずかに疎水性又は小型のアミノ酸であり、置換は、Ｘ１、Ｘ１７、Ｘ２１、Ｘ４３のうちの少なくとも１つが塩基性又は極性、有利には大型極性アミノ酸でありかつ／又はアミノ酸Ｘ１６、Ｘ４４のうちの少なくとも１つが塩基性アミノ酸又は大型極性アミノ酸であり、かつ／又はＸ１９が塩基性アミノ酸であり、かつ／又はアミノ酸Ｘ３６、Ｘ３８のうちの少なくとも１つが強い疎水性をもつアミノ酸であるようなものである、ことを特徴とする、単数又は複数のアミノ酸の置換によりヘリオマイシンから誘導されたペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性及び荷電領域が単数又は複数の突然変異を提示しているヘリオマイシンのものにそのアミノ酸配列が対応していること：
及び
2004537960.tif 000018
というアミノ酸配列の中から選択されていることを特徴とする、ヘリオマイシンから誘導されたペプチド。
【請求項２】
疎水性及び荷電領域が単数又は複数の突然変異を提示しているヘリオマイシンのものにそのアミノ酸配列が対応していること
及び
2004537960.tif 000019
というアミノ酸配列の中から選択されていることを特徴とする、ヘリオマイシンから誘導されたペプチド。
【請求項３】
活性作用物質として、請求項１又は２のいずれか１項に記載の少なくとも１つのペプチドを、有利にはその中で受容可能なビヒクルと会合した形で含んでいることを特徴とする、抗真菌性及び／又は抗細菌性組成物。
【請求項４】
ヒト又は動物において利用するための、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
植物において利用するための請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１又は２のいずれか１項に記載のペプチドを発現する能力をもつことを特徴とする核酸配列。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸配列を含んで成ることを特徴とする発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸配列を含んで成ることを特徴とする、植物細胞。
【請求項９】
請求項６に記載の核酸配列を含むこと及び、請求項１又は２のいずれか１項に記載のペプチドを発現することを特徴とする、疾病に対する耐性をもつ植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の目的は、抗細菌及び抗真菌特性をもつ新しいペプチドにある。本発明は同様に、これらのペプチドの調製及びヒト又は動物の治療及び農薬において利用可能なこれらのペプチドを含有する組成物にも関する。
【０００２】
従来の技術では、天然由来の数多くの物質特に抗微生物特性を呈するペプチド、より特定的には殺菌剤又は抗真菌薬について記述されてきた。このようなペプチドは、植物ならびにヒトの両方における真菌性疾患の治療のために有用である（Ｄｅ Ｌｕｃｃａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４３，１−１１）。ヒトの健康に関しては、真菌性日和見感染の罹患率が近年きわめて顕著な上昇を示してきた。侵襲性真菌症は、自然界に広まった菌類によって誘発され免疫低下した対象において病因となるきわめて重症の感染症である。免疫抑制は、ステロイド療法、化学療法、移植、ＨＩＶ感染といった異なる原因の結果であり得る。真菌性日和見感染は、現在ヒトにおける重要な死亡原因となっている。これらの感染は、主としてＣａｎｄｉｄａ属の酵母又は主としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の糸状菌類によってひき起こされる可能性がある。免疫が低下した患者においては、例えばアンフォテリシンＢによる治療といったようにその毒性を理由として、又は例えば窒素誘導体に対するＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの耐性といった耐性菌類の出現を理由として、抗真菌治療が不成功に終わることが多い。従って、新奇の分子から誘導された新しい抗真菌性医薬品の開発が不可欠である。
【０００３】
抗微生物ペプチドの産生は、さまざまな動物及び植物種において、感染に対する不可欠の免疫防御メカニズムである。特に、昆虫は、細菌及び菌類に対するきわめて有効な耐性を示す。この応答は、大部分が、広い活性スペクトルをもつ抗微生物ペプチドのいくつかの系統群の急速な合成に基づいている（Ｂｕｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９９年）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，３２９−３４４）。この合成は、細菌感染のあるけが又は低用量の細菌注入により誘発される（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４、１３１３〜１３１８）。これまでのところ、昆虫の抗微生物性ペプチドは、例えば、双翅目、鱗翅目及び甲虫目といったような発達中に完全変態する昆虫に基づいて特徴づけされてきた。これらの昆虫において誘発された抗微生物ペプチドの中には、以下の４つのグループを区別することができる：
−  ２つの両親媒性αらせんを形成する４ｋＤａのカチオン性ペプチド、このグループの中には特にセクロピンが分類される；
−  プロリンを富有し、ドロソシン、ピロコリシン及びレボシンといったようなグリコシル化されたもの又は例えばアピデシン及びメタルニコビンといったようなグリコシル化されていないものでありうる２ｋＤａと４ｋＤａの間に含まれるサイズのカチオン性ペプチド、
−  例えばアタシン、サルコトキシンＩＩ、ジプテリシン及びコレオプテリシンといったような、大部分がカチオン性で、往々にしてグリシン残基を富有する、８〜２７ｋＤａの分子量をもつ全く異なる複数のポリペプチド；
−  分子内ジスルフィド橋を含むペプチド。このグループには、昆虫デフェンシン（４ｋＤａ、３つのジスルフィド橋）、ドロソマイシン（４ｋＤａ、４つのジスルフィド橋）及びタナチン（２ｋＤａ、１つのジスルフィド橋）が分類される。
【０００４】
その中でも、本発明の対象となっているのは、同じく、ＣＳαβとも呼ばれる３つのジスルフィド橋により連結されたαらせん及び反平行βシートを有するタイプの三次元構造を呈するペプチドである。これらのペプチドは、ヒト及び動物ならびに植物における感染の治療において有用な抗真菌活性を呈する。本発明は特に、鱗翅目Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ の血リンパから単離されたペプチドであるヘリオマイシンに関する。ヘリオマイシンの配列及び特性は、ＷＯ９９５３０５３として公示された国際ＰＣＴ特許出願の中で記述されている。
【０００５】
以下で報告するペプチド配列においては、アミノ酸は、その１文字コードによって表わされているが、これらを以下の用語リストに従ってその３文字コードで表わすこともできる。
Ａ    Ａｌａ    アラニン
Ｃ    Ｃｙｓ    システイン
Ｄ    Ａｓｐ    アスパラギン酸
Ｅ    Ｇｌｕ    グルタミン酸
Ｆ    Ｐｈｅ    フェニルアラニン
Ｇ    Ｇｌｙ    グリシン
Ｈ    Ｈｉｓ    ヒスチジン
Ｉ    Ｉｌｅ    イソロイシン
Ｋ    Ｌｙｓ    リシン
Ｌ    Ｌｅｕ    ロイシン
Ｍ    Ｍｅｔ    メチオニン
Ｎ    Ａｓｎ    アスパラギン
Ｐ    Ｐｒｏ    プロリン
Ｑ    Ｇｌｎ    グルタミン
Ｒ    Ａｒｇ    アルギニン
Ｓ    Ｓｅｒ    セリン
Ｔ    Ｔｈｒ    トレオニン
Ｖ    Ｖａｌ    バリン
Ｗ    Ｔｒｐ    トリプトファン
Ｙ    Ｔｙｒ    チロシン
【０００６】
ヘリオマイシンは、ＣＳαβタイプの三次元構造を示す両親媒性ペプチドである。配列番号１として配列リスト中に表示されたヘリオマイシンのアミノ酸配列は、以下の通りである：
2004537960.tif 000002
【０００７】
出願人は、今回鱗翅目 Ａｒｃｈｅｏｐｒｅｐｏｎａ ｄｅｍｏｐｈｏｏｎの免疫化された幼虫の血リンパから、ヘリオマイシンの相同体を単離した。Ａｒｄ１と呼ばれるこのペプチドは、配列決定及び質量測定によって特徴づけされた。Ａｒｄ１のアミノ酸配列は、配列番号２として配列リスト中に表わされている：
2004537960.tif 000003
【０００８】
Ａｒｄ１の配列は、２つの位置でヘリオマイシンのものと異なっている。すなわち、ヘリオマイシン中の１７の位置にあるアスパラギン酸（Ａｓｐ）は、アスパラギン（Ａｓｎ）によって置換され、２０の位置にあるグリシン（Ｇｌｙ）はアラニン（Ａｌａ）によって置き換えられている。対応するコドンは、ヘリオマイシンｐＳＥＡ２の発現ベクター内で修飾され、ペプチドＡｒｄ１が産生され酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにより分泌された。
【０００９】
ｐＳＥＡ２は、培地内でのペプチド分泌を可能にするＭＦα１のプロ及びＢＧＬ２のプレ配列及びプロモータＭＦα１のキャリヤ酵母の発現ベクターである（Ｌａｍｂｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２７４，９３２０〜９３２６）。
【００１０】
ＨＰＬＣによる精製の後、Ａｒｄ１の抗真菌活性（抗Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ活性及び抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ 活性）をヘリオマイシンの活性と比較した。Ａｒｄ１の抗Ｃａｎｄｉａ ａｌｂｉｃａｎｓ 活性はヘリオマイシンのものより４〜８倍高いものである。Ａｒｄ１の抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ 活性はヘリオマイシンのものよりも２倍高い。
【００１１】
出願人は、ヘリオマイシン及びＡｒｄ１ペプチドの電荷及び疎水性を分析した。補遺の表１に表わされた疎水性プロフィールは、Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５７，１０５〜１３２）の方法により実施された。
【００１２】
ヘリオマイシン及びその相同体Ａｒｄ１は、どちらかというと親水性をもつ１つの領域により分離されたどちらかというと疎水性の２つの領域を有している。末端Ｎ及びＣ領域は、どちらかというと親水性を呈している。その上、親水性をもつ中央領域は、正の正味電荷を呈する。図１は、ヘリオマイシンの配列のアミノ酸の電荷を示している。
【００１３】
天然相同体Ａｒｄ１内のアスパラギン（位置１７）でのヘリオマイシンのアスパラギン酸の置換は、ペプチドのカチオン性を増大させる（ヘリオマイシンに比べ＋１）。正電荷及び疎水性を増加することを目的とするその他の突然変異が、合成フラグメントのクローニング又はＰＣＲによって生成された定方向突然変異誘発によりヘリオマイシン及びその相同体Ａｒｄ１内で実施された。
【００１４】
従って、本発明の枠内で実施された研究作業は、その両親媒性特性を改善しながら又は修飾することなくペプチドの疎水性及び／又は電荷を増大させるような形で荷電された特に疎水性領域内での突然変異を実施すること、かくしてヘリオマイシンに比べ改善された抗生物質の及び／又は抗真菌性の特性をもつペプチドを入手することから成っていた。
【００１５】
この目的は、
2004537960.tif 000004
という配列番号１の配列のヘリオマイシンから誘導されたペプチドによって、単数又は複数のアミノ酸の置換を用いて達成される。本発明のペプチドは：
2004537960.tif 000005
という「Ｘ」がアミノ酸を表わす構造式を満たすものであり、式中、
−  Ｘ１、Ｘ１７、Ｘ２１、Ｘ４３は、酸性アミノ酸であり、
−  Ｘ１６、Ｘ４４は、小型極性アミノ酸であり、
−  Ｘ１９は、大型極性アミノ酸であり、
−  Ｘ３６は、小型又はわずかに疎水性のアミノ酸であり、
−  Ｘ３８は、小型又はわずかに疎水性のアミノ酸であり、
前記置換は、
−  Ｘ１、Ｘ１７、Ｘ３１及びＸ４３のうちの少なくとも１つが塩基性又は極性、有利には大型極性アミノ酸であり、かつ／又は
−  アミノ酸Ｘ１６、Ｘ４４のうちの少なくとも１つが塩基性アミノ酸又は大型極性アミノ酸であり、かつ／又は
−  Ｘ１９が塩基性アミノ酸であり かつ／又は
−  アミノ酸Ｘ３６、Ｘ３８のうちの少なくとも１つが疎水性の強いアミノ酸である、
ようなものであり、
又、その他のアミノ酸（Ｘ）は以下の通りの意味を有する：
−  Ｘ１３、Ｘ３７、Ｘ３９は、大型極性アミノ酸を表わし、
−  Ｘ６、Ｘ１５、Ｘ３４は、小型極性アミノ酸を表わし、
−  Ｘ２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２８、Ｘ３１は、塩基性アミノ酸を表わし、
−  Ｘ３、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ１２は、疎水性アミノ酸を表わし、
−  Ｘ９、Ｘ１４、Ｘ２７、Ｘ３５、Ｘ４１は、芳香族疎水性アミノ酸を表わし、
−  Ｘ５、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ２０、Ｘ２６、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３は、小型アミノ酸を表わし、
−  Ｃ７、Ｃ１８、Ｃ２２、Ｃ３２、Ｃ４０、Ｃ４２はシステインを表わす。
【００１６】
かくして、構造式（Ｉ）の本発明のペプチドにおいて：
−  Ｘ１、Ｘ１７、Ｘ２１、Ｘ４３の全部又は一部が、塩基性又は極性、有利には大型極性のアミノ酸でない場合、これ（これら）は、酸性のアミノ酸であり、
−  Ｘ１６、Ｘ４４の全部又は一部が塩基性又は大型極性アミノ酸でない場合、これ（これら）は、小型極性アミノ酸であり、
−  Ｘ１９が塩基性アミノ酸でない場合、これは、大型極性アミノ酸であり、
−  Ｘ３６が疎水性の強いアミノ酸でない場合、これは、小型又は疎水性の低いアミノ酸であり、
−  Ｘ３８が疎水性の強いアミノ酸でない場合、これは、疎水性の低い又は小型の酸である。
【００１７】
本発明のペプチドは、置換がシステインＣ７、Ｃ１８、Ｃ２２、Ｃ３２、Ｃ４０、Ｃ４２に関わるものでないことから、ヘリオマイシンの構造ＣＳαβを有する。
【００１８】
本発明に従ったペプチドの好ましい第１のグループは、Ｘ１、Ｘ１７、Ｘ４３のうちの少なくとも１つが、塩基性又は極性、有利には大型極性のアミノ酸であり、Ｘ２１が、塩基性アミノ酸であるＸ２３、Ｘ２４及びＸ２５のうちの少なくとも１つとのイオン結合を確立する能力をもつ酸性アミノ酸であるグループである。実際には、これらの結合は、本発明のペプチドの構造ＣＳαβの安定化に参与することができる。
【００１９】
本発明に従ったペプチドの好ましい第２のグループは、Ｘ３６及びＸ３８のうちの少なくとも１つが、芳香族でない疎水性の強いアミノ酸であるグループである。
【００２０】
本発明に従った第３の好ましいペプチドグループは、Ｘ１７がアスパラギン又はアルギニンであり、Ｘ４３がグルタミン酸であり、
−  Ｘ３６がロイシン又はイソロイシンでありかつ／又は
−  Ｘ１９がアルギニンであり、かつ／又は
−  Ｘ１６がアルギニンである、
グループである。
【００２１】
本発明に従った第４の好ましいペプチドグループは、Ｘ１７がアスパラギン酸であり、Ｘ４３がグルタミン酸であり、かつ、
−  Ｘ３６がロイシン又はイソロイシンでありかつ／又は
−  Ｘ１９がアルギニンであり、かつ／又は、
−  Ｘ１６がアルギニンである、
グループである。
【００２２】
本発明に従った第５の好ましいペプチドグループは、Ｘ４３がグルタミンであり、Ｘ１７がアスパラギンであり、
−  Ｘ３６がロイシン又はイソロイシンでありかつ／又は
−  Ｘ１９がアルギニンである、
グループである。
【００２３】
本発明に従った第６の好ましいペプチドグループは、Ｘ４３がグルタミンでありＸ１７がアスパラギン酸であるグループである。
【００２４】
本発明に従った第７の好ましいペプチドグループは、Ｘ４３がグルタミンでありＸ１７がアルパラギン酸であり、
−  Ｘ１がアスパラギンでありかつ／又は
−  Ｘ３６がロイシン又はイソロイシンである、
グループである。
【００２５】
特に、以下の語は次のものを意味する：
−  塩基性アミノ酸； アルギニン、リシン又はヒスチジン、
−  疎水性アミノ酸；
・  非芳香族； メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、当然のことながら、ロイシン及びイソロイシンは、疎水性の強いアミノ酸であり、メチオニン及びバリンは、疎水性の弱いアミノ酸である。
・  芳香族； 疎水性の強いアミノ酸であるフェニルアラニン、テロシン、又はトリプトファン。
【００２６】
−  酸性アミノ酸； アルパラギン酸又はグルタミン酸
−  大型極性アミノ酸； グルタミン又はアルパラギン、
−  小型極性アミノ酸； セリン又はトレオニン、
−  極性アミノ酸； 小型及び大型極性アミノ酸、
−  小型アミノ酸； グリシン又はアラニン。
【００２７】
本発明のペプチドは、当業者にとって周知の技術により、化学合成又は遺伝子工学によって調製することができる。
【００２８】
より特定的に言うと、次の３つのタイプの突然変異が生み出された； すなわち、
−  ＡｓｎへのＡｓｐ１の突然変異、ＡｓｎへのＡｓｐ１７の突然変異、ＧｌｎへのＧｌｕ４３の突然変異といったように、極性アミノ酸によって、酸性アミノ酸が置き換えられた；
−  ＡｒｇへのＡｓｎ１３の突然変異、ＡｒｇへのＳｅｒ１６の突然変異、Ａｒｇ（Ａｒｄ１）へのＡｓｎ１７の突然変異、ＡｒｇへのＡｓｎ１９の突然変異、ＡｒｇへのＴｈｒ４４の突然変異といったように、塩基性アミノ酸により、極性、好ましくは大型極性アミノ酸が置き換えられた；
−  ＬｅｕへのＧｌｙ１０の突然変異、ＬｅｕへのＡｌａ３６の突然変異及びＩｌｅへのＶａ１３８の突然変異といったように、疎水性を増大させることを目的とする突然変異が生み出された。
【００２９】
本発明に従ったヘリオマイシンから誘導された好ましいペプチドは、次のようなアミノ酸配列を呈している：
2004537960.tif 000006
【００３０】
本発明に従ったＡｒｄ１から誘導された好ましいペプチドは、次のようなアミノ酸配列を呈している：
2004537960.tif 000007
【００３１】
本発明は同様に、上述のペプチドの機能的等価物にも関する。これは例えば、上述のペプチドのフラグメント、又はグリコシル化といったような翻訳後のプロセスの結果としての修飾、又はアミド化、アセチル化、アシル化、脂質又は糖とのカップリング、ヌクレオチドとのカップリンクなどといったような化学的修飾のことである。
【００３２】
機能的等価物は、同様に、その単数又は複数のアミノ酸が鏡像異性体、ジアステレオマ、立体配座Ｄの天然アミノ酸、希少アミノ酸特にヒドロキシプロリン、メチルリシン、ジメチルリシン、及び合成アミノ酸、特にオルニチン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニン及びオメガ−アミノ酸である、本発明のペプチドをも含んで成る。本発明は、同様にレトロペプチド及びレトロ逆転ペプチドをも網羅している。
【００３３】
構造式（Ｉ）のペプチドは同様に、そのＮ末端又はＣ末端のうちのいずれかに、構造式（Ｉ）の構造と干渉しない単数又は複数のアミノ酸を含むことができる。実際、本発明は、当然のことながら、ヘリオマイシンのように、３つのジスルフィド橋によって連結されたαらせん及び反平行βシートを有するタイプの３次元構造を呈するペプチドを目的としている。
【００３４】
下表１は、ヘリオマイシンの１、６、１３、１６、１９、３６、３８、４３及び４４の位置でアミノ酸に対し実施された突然変異ならびに得られたペプチドのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃ．ａ）及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（Ａ．ｆ）に対する抗真菌活性を報告するものである。
【００３５】
【表１】
2004537960.tif 000008
【００３６】
下表２は、ペプチドＡｒｄ１の位置１、１０、１６、１７、１９、３６、３８、４３及び４４においてアミノ酸に対し実施された突然変異、ならびに得られたペプチドの、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃ．ａ）及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（Ａ．ｆ）に対する抗真菌活性について報告している。
【００３７】
【表２】
2004537960.tif 000009
【００３８】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母中で異なる突然変異体を産生させ、ＨＰＬＣによって精製し、その抗真菌活性（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ｅｔ Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）をヘリオマイシン又はペプチドＡｒｄ１のものと比較した。
【００３９】
上述の表１及び２は、Ａｒｇ （ｐＥＭ４５）へのＡｓｎ１３の突然変異体を除いて、正の電荷増大突然変異体全てについて、テストされた２つの菌類のうちの少なくとも１つに関し活性の増大を示している。その他の突然変異体は全て、親水性領域内に局在化されている。大部分の突然変異体は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対し増大した活性をもつ（ＡｒｇへのＳｅｒ１６，Ａｒｇ（Ａｒｄ１）へのＡｓｎ１７、ＡｒｇへのＡｓｎ１９、ＡｒｇへのＴｈｒ４４）。唯一つの突然変異（ＧｌｎへのＧｌｕ４３）のみが、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓに対し著しく大きい活性の増加を可能にする。
【００４０】
疎水性増大突然変異に関しては、Ｌｅｕ（ｐＥＭ３５）へのＡｌａ３６の修飾は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ及びＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ に対するより優れた活性増加を可能にする。ＬｅｕへのＧｌｙ１０の突然変異及びＩｌｅへのＶａｌ３８の突然変異は、ヘリオマイシン及びＡｒｄ１の抗真菌活性に対し著しい効果をもっていない。
【００４１】
疎水性増大の最も活性の高い突然変異体は、電荷増大突然変異体に会合された。かくして累積効果が観察された。
【００４２】
本発明は同様に、ヒト及び動物だけでなく植物においても真菌及び／又は細菌感染を予防又は治療するための上述のペプチドの利用をも目的としている。従って、本発明の目的は、有利には受容可能なビヒクルと前記組織中で会合した状態で、前述の通りの少なくとも１つのペプチドを活性作用物質として含む、より特定的には薬学的な抗真菌及び／又は抗菌性組成物にある。
【００４３】
ビヒクルは、薬学用又は農学用としての組成物の利用分野のタイプに応じて選択される。
【００４４】
本発明は、特にヒト及び動物におけるこれらのペプチド及びそれを含有する組成物の薬学的応用に関するが、農学的応用にも関係している。実際、本発明のペプチドは、植物を特に真菌性及び細菌性の疾病に対し耐性あるものにする上で有用である。この農学的応用の第１の実施形態は、植物に対し、ペプチド及びそれを含有する組成物を有効量だけ塗布することから成る。この農学的応用の第２の実施形態は、植物に対し疾病耐性を付与するような形で、本発明のペプチドを発現する能力をもつ核酸配列を用いて、植物細胞又は植物を形質転換することから成る。
【００４５】
本発明のその他の利点及び特徴は、添付図面を参考にした、ペプチドＡｒｄ１及びヘリオマイシン及びＡｒｄ１の類似体の調製及びそれらの抗真菌活性に関する以下の例から明らかになることだろう。
【００４６】
【実施例１】
鱗翅目Ａ．ｄｅｍｏｐｈｏｏｎの免疫化された幼虫において採取された血リンパからのＡｒｄ１の単離
１）  Ａ．ｄｅｍｏｐｈｏｏｎ の血リンパ中での抗真菌性物質の生物学的合成
鱗翅目 Ａ．ｄｅｍｏｐｈｏｏｎ の第４齢の成熟幼虫を、グラム陽性菌（Ｍ． ｌｕｔｅｕｓ 及び Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びグラム陰性菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、糸状菌類の胞子（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） 及び酵母（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を含むＰＢＳ溶液２０μｌの２回の注射によって免疫化した。３７℃で１２時間、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地内で実施した培養から、細菌を調製する。酵母を、３０℃で１２時間サブロー培地内で実施した培養から調製する。−８０℃に冷凍されたストックからＡ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの胞子を採取する。このように感染を受けた動物を２４時間換気された空間内でその宿主植物上に保存した。ヘリオマイシンの採取の前に、幼虫を氷の上で冷却した。
【００４７】
２）  血漿の調製
腹肢を切除することによって血リンパ（合計８１の標本について幼虫１匹あたり約１６０μｌ）を収集し、氷中で冷却されプロテアーゼ阻害物質としてのアプロチニン（最終濃度で２０μｇ／ｍｌ）及びメラニン化阻害物質としてのフェニルチオ尿素（４０μＭの最終濃度）を含む１．５ｍｌ入りのポリプロピレン製マイクロ遠心分離管内に捕集した。免疫化された幼虫からこのように収集した血リンパ（１３ｍｌ）を、血球を除去するべく４℃で１分間８０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離の上清をさらに１２０００ｒｐｍで遠心分離した。血液細胞を含まない血リンパを、利用するまで−８０℃に保存した。
【００４８】
３）  血漿の酸性化
急速解凍後、Ａ．ｄｅｍｏｐｈｏｏｎ の血漿を、アプロチニン（最終濃度で２０μｇ／ｍｌ）及びフェニルチオ尿素（４０μＭの最終濃度）を含む１％（体積対体積）のトリフルオロ酢酸溶液でｐＨ３まで酸性化した。ペプチドの酸性条件下での抽出を、氷水浴中で軽く撹拌しながら３０分間実施した。得られた抽出物を次に１００００ｇで３０分間４℃にて遠心分離した。
【００４９】
４）  ペプチドの精製
ａ）  固相での抽出による予備精製
５ｍｌの血リンパと等価の量の抽出物を、酸性化された水（ＴＦＡ０．０５％）で平衡化した、カートリッジの形で市販されている（Ｓｅｐ−ＰａｋＴＭＣ１８，Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ） ような逆相の２ｇの支持体上に置いた。親水性分子を、酸性化水での単純な洗浄により除去した。ペプチドの溶離を、０．０５％のＴＦＡ中で調製した６０％のアセトニトリル溶液によって実施した。６０％のアセトニトリルで溶離された画分を、アセトニトリル及びＴＦＡを除去する目的で真空下で乾燥させ、次に、第１の精製段階に付す前に無菌酸性化水（ＴＦＡ０．０５％）中でこれを再生させた。
【００５０】
ｂ）  逆相カラム上での高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による精製
第１段階：  調製カラム Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００Ｃ８（ＢｒｏｗｎｌｅｅＴＭ，２２０×１０ｍｍ，３００Å）上での逆相クロマトグラフィにより、ペプチドを含む分画を分析し、２．５ｍｌ／分という定流量で合計１２５分の持続時間で、まずは５分で２％から１０％まで、その後３０分で１０％から２５％まで、次に４０分で２５％から３５％まで、その後５０分で３５％から６０％までの０．０５％のＴＦＡ中のアセトニトリル勾配により溶離を実施した。２２５ｎｍでの吸光度の変動に従いながら手で画分を収集した。捕集した画分を真空下で乾燥させ、超純水で再生させ、以下で記述する試験を用いてその抗真菌活性について分析した。
【００５１】
−  第２段階： ペプチドに対応する２７％のアセトニトリルで溶離された抗真菌性画分を、０．８ｍｌ／分の恒常流量で０．０５％のＴＦＡ中、５分間で２％から２３％そして５０分間で２３％から３１％までのアセトニトリル２相線形勾配を利用して、逆相分析カラムＡｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００Ｃ８（ＢｒｏｗｎｌｅｅＴＭ，２２０×４．６ｍｍ，３００Å）上で分析した。２２５ｎｍでの吸光度の変動に従いながら手で画分を収集した。捕集した画分を真空下で乾燥させ、超純水で再生させ、以下で記述する条件下でその抗真菌活性について分析した。
【００５２】
−  第３段階： ペプチドを含有する抗真菌性画分を、３０℃という制御された温度で０．２５ｍｌ／分の恒常な流量で０．０５％のＴＦＡ中で５分間で２％から２２％までそして５０分間で２２％から３０％のアセトニトリル２相線形勾配を利用して、逆相カラムＮａｒｒｏｗｂｏｒｅ Ｄｅｌｔａ−ＰａｋＴＭＨＰＩＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１５０×２ｍｍ）上で均質になるまで精製した。２２５ｎｍでの吸光度の変動に従いながら手で画分を収集した。捕集した画分を真空下で乾燥させ、ろ過した超純水で再生させ、抗真菌活性について分析した。
【００５３】
【実施例２】
Ａｒｄ Ｉのペプチドの構造的特徴づけ
１）  Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ（マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量分析法
正の線形モードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｆｌｅｘ （Ｂｒｅｍｅｎ， Ａｌｌｅｍａｇｎｅ）上で純度検査を実施した（以下の第３節を参照のこと）。
【００５４】
２）  システイン数の決定： 還元及びＳ−ピリジルエチル化
還元及びＳ−ピリジルエチル化によって、未変性ペプチド上でシステイン残基の数を決定した。２ｍＭのＥＤＴＡ及び６Ｍの塩化グラニジウムを含むｐＨ７．５のトリス／ＨＣｌ ０．５Ｍ緩衝液４０μｌの中で、２μｌのジチオトレイトール（２．２Ｍ）２μｌの存在下で、４００ｐｍｏｌｅｓ の未変性ペプチドを還元した。反応培地を窒素雰囲気下に置いた。暗所で６０分間インキュベートした後、精製したばかりの４−ビニルピリジン２μｌを反応に添加し、それを次に暗所で窒素雰囲気下で４５℃で１０分間インキュベートした。その後、７０分間２〜５２％の０．０５％ＴＦＡの存在下でのアセトニトリル線形勾配を利用して、逆相分析カラムＡｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００Ｃ８（ＢｒｏｗｎｌｅｅＴＭ，２２０×４．６ｍｍ，３００Å）上で逆相クロマトグラフィにより、反応培地の成分から、ピリジルエチル化されたペプチドを分離した。
【００５５】
３）  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリクス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量分析法による、未変性ペプチド、Ｓ−ピリジルエチル化ペプチド及びタンパク質分解フラグメントの質量の決定
質量測定は、正の線形モードでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｆｌｅｘ（Ｂｒｅｍｅｎ， ドイツ）上で実施された。質量スペクトルを、それぞれ２１９９．５Ｄａ、３０４６．４Ｄａ及び４８９０．５Ｄａの既知のｍ／ｚをもつペプチドの標準混合物を用いて外部的に較正した。分析すべき異なる生成物を、アセトン中の飽和溶液の急速蒸発によって得られたα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の薄い結晶層上に置いた。わずかな真空下での乾燥の後、質量分析計の中に導入する前に０．１％のトリフルオロ酢酸一滴で試料を洗浄した。
【００５６】
４）  Ｅｄｍａｎ分解による配列決定
未変性ペプチド、Ｓ−ピリジルエチル化ペプチド及び異なるタンパク質分解分割の後に得られた異なるフラグメントのＥｄｍａｎ分解による自動的配列決定及び、フェニルチオヒダントイン誘導体の検出を、ＡＢＩ４７３Ａシーケンサ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社ＰＥＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ部門）上で実施した。
【００５７】
５）  タンパク質分解による分割
Ｃ末端領域内のペプチド配列の確認。還元されＳ−ピリジルエチル化されたペプチド２００ｐ ｍｏｌｅｓを５ｐ ｍｏｌｅｓのエンドプロテイナーゼ−Ｌｙｓ−Ｃ（ＡｃｒｏｍｏｂａｃｔｅｒプロテアーゼＩ、Ｃ末端側リシン残基特異的分割、Ｔａｋａｒａ Ｏｔｓｕ）の存在下で、供給業者が推奨する条件に従って（０．０１％でＴｗｅｅｎ２０の存在下でｐＨ９のトリス−ＨＣｌ １０ｍＭ）インキュベートした。ＴＦＡ１％で反応を停止した後、ペプチドフラグメントを、０．２ｍｌ／分の流量、３７℃の恒常温度で、ＴＦＡ０．０５％中で８０分で２％から６０％のアセトニトリル線形勾配において、Ｎａｒｒｏｗｂｏｒｅ Ｄｅｌｔａ−ＰａｋＴＭ ＨＰＩＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１５０×２ｍｍ）のカラム上で逆相ＨＰＬＣにより分離した。得られたフラグメントを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析し、Ｃ末端フラグメントに対応するペプチドをＥｄｍａｎ分解によって配列決定した。
【００５８】
【実施例３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母内でのペプチドＡｒｄ１の産生
１）  Ａｒｄ１類似体のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母による発現と分泌を可能にするｐＥＭ２ベクターの構築
Ｌａｍｂｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９年 Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４，９３２０−９３２６）により記述されたｐＳＥＡ２ヘリオマイシン発現ベクターから、Ａｓｐ１７コドンをＡｓｎへ及びＧｌｙ２０コドンをＡｌａへ修飾するためＰＣＲにより定方向突然変異誘発を実施した。プロモータＭＦα１プロモータのキャリヤフラグメント、配列プレＢＧＬ２及びプロＭＦα１及びヘリオマイシンからＳａｃＩＩ部位までのコーディング配列を、オリゴヌクレオチドＥＭ７２及びＥＭ８９を用いてＰＣＲによって増幅させた。コドン１７及び２０の突然変異をオリゴヌクレオチドＥＭ８９の中に導入した。
2004537960.tif 000010
【００５９】
ＰＣＲにより増幅したフラグメントを、制限酵素ＳｐｈＩ及びＳａｃＩＩにより消化させ、同じ酵素により消化されアルカリホスファターゼで処理されたプラスミドｐＳＥＡ２の中でクローニングした。結果として得られたプラスミドｐＥＭ２を制限及び配列決定の分析により検査した。
【００６０】
２）  プラスミドｐＥＭ２によるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母菌株の形質転換
プラスミドｐＥＭ２により、酵母菌株ＴＧＹ４８．１（ＭＡＴα、ｕｒａ３−Δ５、ｈｉｓ、ｐｒａｌ、ｐｒｂ１、ｐｒｃ１、ｃｐｓ１、Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， １９９２，Ｉｎｖｅｒｔ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ．２１，１５−２４）を形質転換した。０．５％のカザミノ酸を補足した選択培地ＹＮＢＧ上で形質転換体を選択した。
【００６１】
【実施例４】
ヘリオマイシン類似体ｐＥＭ２２、ｐＥＭ２４、ｐＥＭ３０、ｐＥＭ３１、ｐＥＭ３４、ｐＥＭ３５、ｐＥＭ３７、ｐＥＭ４６及びｐＥＭ４８の調製
１）  ベクターｐＥＭ２２及びｐＥＭ２４の構築
予めハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドＥＭ２５及びＥＭ２６（１００℃での加熱及び２５℃に至るまでの温度の緩慢な低下）から成る合成フラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩによって消化されたベクターｐＳＥＡ２内でクローニングした（ヘリオマイシンについてコードする配列、コドンＳｅｒ３４から停止コドンまでの３′末端の置換）。この合成フラグメントＢａｍＨＩ−ＳａｌＩは、制限部位ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩを含んでいる。結果として得られたｐＥＧｏｌを、制限分析及び配列決定によって検査した。
2004537960.tif 000011
【００６２】
予め疎水性されたオリゴヌクレオチドＥＭ１１９及びＥＭ１２０で構成された合成フラグメントＢａｍＨＩ−ＳａｌＩを、ベクターｐＥＧｏｌの中でクローニングした。連結反応をＸｈｏＩで消化して、合計フラグメントＥＭ１１９／ＥＭ１２０を挿入しなかったプラスミドを削除した。結果として得られたプラスミドｐＥＭ２２を制限分析及び配列決定により検査した。オリゴヌクレオチド対ＥＭ１２７及びＥＭ１２８を利用することによるｐＥＭ２４の構築のために、同一のクローニング戦略を利用した。
2004537960.tif 000012
【００６３】
２）  ベクターｐＥＭ３０、ｐＥＭ３１、ｐＥＭ３４、ｐＥＭ３５、ｐＥＭ４６及びｐＥＭ４８の構築
予めハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドＥＭ２５及びＥＭ２６（１００℃での加熱及び２５℃に至るまでの温度の緩慢な低下）から成る合成フラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩによって消化されたベクターｐＥＭ２内でクローニングした（Ａｒｄ１についてコードする配列、コドンＳｅｒ３４から停止コドンまでの３′末端の置換）。この合成フラグメントＢａｍＨＩ−ＳａｌＩは、制限部位ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩを含んでいる。結果として得られたｐＥＭ１６を、制限分析及び配列決定によって検査した。
【００６４】
予め疎水性されたオリゴヌクレオチドＥＭ１３５及びＥＭ１３６で構成された合成フラグメントＢａｍＨＩ−ＳａｌＩを、ベクターｐＥＭ１６の中でクローニングした。連結反応をＸｈｏＩで消化して、合計フラグメントＥＭ１３５／ＥＭ１３６を挿入しなかったプラスミドを削除した。結果として得られたプラスミドｐＥＭ３０を制限分析及び配列決定により検査した。ｐＥＭ３１（ＥＭ１１７／ＥＭ１１８）、ｐＥＭ３４（ＥＭ１２７／ＥＭ１２８）、ｐＥＭ３５（ＥＭ１２９／ＥＭ１３０）、ｐＥＭ４６（ＥＭ１５８／ＥＭ１５９）及びｐＥＭ４８（ＥＭ１６２／ＥＭ１６３）の構築のために、同一のクローニング戦略を利用した。
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【００６５】
３）  発現ベクターｐＥＭ３７の構築
ｐＳＥＡ２ヘリオマイシン発現ベクターから、Ａｓｐ１をＡｓｎへ修飾するためＰＣＲにより定方向突然変異誘発を実施した。ＭＦα１のプロ配列の終わり及びヘリオマイシンのコーディング配列の担体フラグメントを、オリゴヌクレオチドＥＭ１３７及びＥＭ５３を用いてＰＣＲによって増幅させた。コドンＡｓｐ１のＡｓｎへの突然変異をオリゴヌクレオチドＥＭ１３７の中に導入した。
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【００６６】
ＰＣＲにより増幅したフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩによって消化させ、ＳｐｈＩとＳａｌＩにより消化されアルカリホスファターゼで処理したベクターｐＴＧ４８１２（Ｍｉｃｈａｕｄ ｅｔ ａｌ．， １９９６年，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ３９５，６−１０）内の部位ＨｉｎｄＩＩＩに至るまでのＭＦα１のプロ配列及びＢＧＬ２のプレ配列そしてプロモータＭＦα１の担体である１．２ｋｂのフラグメントＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩと同時にクローニングさせた。結果として得られたプラスミドｐＥＭ３７を、制限分析及び配列決定によって検査した。
【００６７】
【実施例５】
ヘリオマイシンの類似体上で実施されたスクリーニング試験
１）  培養
ヘリオマイシン及びその類似体の発現プラスミドによって形質転換された酵母クローンを、２９℃で撹拌しながら７２時間、選択培地（ＹＮＢＧ５０ｍｌ＋カザミノ酸０．５％）中で培養した。４℃で３０分間４０００ｇの遠心分離に付した後、上清を酢酸でｐＨ３に酸性化した。
【００６８】
その後、上清を酸性化された水（ＴＦＡ０．０５％）で平衡化された逆相の３６０ｍｇの支持体Ｓｅｐ−ＰａｋＴＭＣ１８（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ） 上に置いた。親和性分子を、酸性化水での単純な洗浄によって削除した。ＴＦＡ０．０５％中で調製された６０％のアセトニトリル溶液によりペプチドを溶離した。６０％のアセトニトリルで溶離された画分を、アセトニトリル及びＴＦＡを削除する目的で真空下で乾燥させ、その後、この画分を、精製に付す前に０．０５％のＴＦＡ水１ｍｌ中で再生させた。
【００６９】
２）  逆相カラム上で高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による精製
各々の類似体について得られた産生レベルに従って、半分取カラムＡｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００℃８（ＢｒｏｗｎｌｅｅＴＭ、２２０×７ｍｍ、３００Å）上での逆相クロマトグラフィによって、予め精製された５−２０ｍｌの上清当量を分析し、１．４ｍｌ／分の恒常流量で、まずは５分で２％から２２％まで、次に２２％での２分間の一定組成溶離の後３０分間で２２％から４０％の０．０５％ＴＦＡ中のアセトニトリル勾配により、溶離を実施した。２７％から３８％のアセトニトリルの間で溶離した画分を、２２５ｎｍでの吸光度の変動に従いながら手で収集した。
【００７０】
３）  類似体の質量検査
１μｌの主要画分を、０．０５％のＴＦＡにより酸性化された水の中で２倍に希釈し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法で分析した。測定上の質量が理論上の質量と対応している画分を真空下で乾燥させ、以下の節で記述される通りに計算された体積の超純水の添加によって再生した。
【００７１】
４）  活性試験を目的とした類似体の定量
５、１０、２０及び２５μｇのヘリオマイシンを注入することによって、半分取カラムＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ−３００Ｃ８の較正曲線を実現した。積分つまり直線の傾き及び面積の計算を、ソフトウェアＭｉｌｌｅｎｉｕｍ（Ｗａｔｅｒｓ）によって実施する。その後、類似体の定量（μｇ単位）を、このソフトウェアによる、類似体に対応するクロマトグラムのピークの自動積分によって算出する。蒸発後の試料の取戻し体積を、ペプチド濃度を１μｇ／μｌに調製するような形で、かくして得られた定量に応じて計算する。
【００７２】
５）  抗Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及び 抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ活性試験
異なる類似体の抗Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ及び抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ活性を、９６ウェルのマイクロプレートで実施した液体培地中での成長阻害試験により評価する。精製したペプチドの活性を、各ペプチドの異なる希釈についてテストし、これを、同じ条件下で定量されたＡｒｄＩ及びヘリオマイシンのものと比較する。
【００７３】
−  抗Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ試験
活性試験は、１５％のグリセロールを含有するサブロー培地内で、−８０℃に冷凍されたストックに由来する酵母について直接実施される。ストック内の酵母の密度は、６００ｎｍで０．４ＤＯの光学密度に調整される。室温までゆっくりと解凍した後、酵母懸濁液を、サブロー培地中６００ｎｍで１ｍＤＯの光学密度まで希釈によって戻し、この希釈液９０μｌを、テストすべき１０μｌの試料の存在下でマイクロ滴定プレートのウェル内に入れる。１０μｌの試料が１０μｌの無菌水で置き換えられている対照培養を、系統的に実施する。培地の無菌性は９０μｌの培地の存在下で無菌水１０μｌをインキュベートすることによって検査される。試料は、弱い撹拌下で４０時間３０℃でインキュベートし、抗真菌活性を、６００ｎｍの光学密度の測定によって数量化する。
【００７４】
−  抗Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ試験
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓの胞子は、２５％のグリセロール溶液中で１０７個の胞子／ｍｌで滴定された−８０℃の冷凍ストックに由来する。ゆっくりと室温に解凍した後、胞子をＰＤＢ培地（脱塩水１ｌあたり１２ｇのポテトデキストロースブロス、Ｄｉｆｃｏ）の中に懸濁させる。（最終濃度１０００胞子／ウェルで）胞子を含み、テトラサイクリン（１００μｇ／ｍｌ）及びセフォタキシム（１μｇ／ｍｌ）で補足されたＰＤＢ培地９０μｌの存在下で、マイクロ滴定プレートのウェルの中に各試料１０μｌを入れる。１０μｌの試料が１０μｌの無菌水で置き換えられている対照培養を、系統的に実施する。培地の無菌性は９０μｌの培地の存在下で無菌水１０μｌをインキュベートすることによって検査される。試料は、湿潤雰囲気内で２４〜４８時間、３７℃でインキュベートし、抗真菌活性を、発芽を考慮に入れて０〜９の評点により数量化し、菌糸のサイズ及び形態を両眼ルーペで決定する。ＣＭＩは、４という評点に対応する。
【００７５】
６）  定量検査
活性試験のために利用されるペプチド溶液を系統的に、２、５、７．５及び１０μｇのヘリオマイシンで予め校正されたＮａｒｒｏｗｂｏｒｅ Ｄｅｌｔａ−ｐａｃｋＴＭ ＨＰＩＣ１８カラム上で、ＨＰＬＣでの１０μｌの注入による定量検査に付す。ウェル内に実際に被着されたペプチドの量は、必要とあらば、結果の解釈の際に再度調整される。
【００７６】
【実施例６】
ｉｎ ｖｉｖｏ での効率
１）  方法−Ｃａｎｄｉｄａ−ａｌｂｉｃａｎｓでの播種性感染モデル
ヘリオマイシン及びその類似体を、マウスにおいて致死的である、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓでの播種性感染モデルにおけるそのｉｎ ｖｉｖｏでの抗真菌活性についてテストした。病因Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（菌株ＩＨＥＭ８０６０）を２．５×１０６ＣＦＵ／マウスの用量で、静脈内投与（ｉ．ｖ．）によって接種する。ペプチドは、感染から６時間、２４時間、４８時間及び７２時間後の４回の注入でｉ．ｖ．経路で投与される。利用される活性評価基準は、７日目の生存率と罹患率の研究である。全身健康状態（毛の状態、易動度、水分補給‥）を考慮に入れる罹患率評点は、各マウスについて、０〜５の間の値によって設定され、次のように定義される；０＝死亡、１＝瀕死、２＝重症、３＝病的、４＝わずかに病的、５＝健康。個々の評点の合計は、各グループについて計算され、１０匹のマウスから成るグループについて５０という評点は、全てのマウスが健康であることを意味している。
【００７７】
２）  播種性ガンジダ症モデルにおけるＡｒｄ１及びヘリオマイシンの活性の比較
１つの標準プロトタイプにおいて、体重１２ｇのＳｗｉｓｓ ＯＦ１雄マウス１０匹のグループを、２．５×１０６ＣＦＵ／マウスの用量でｉ．ｖ．経由で感染させる。ヘリオマイシン及びＡｒｄ１を、感染から６時間、２４時間、４８時間及び７２時間後に、４回の注射でｉ．ｖ．投与する。各ペプチドについて、１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇという２つの用量をテストする。プラシーボグループには、０．９％の塩化ナトリウムのペプチド溶剤を注射する。
【００７８】
添付の図２及び３は、それぞれ、感染後の日数との関係における、生存率と罹患率評点（マウス１０匹）を表わしている。
【００７９】
感染後４日目で１００％致死のこの非常に重度の感染モデルにおいては、プラシーボグループのマウスの６０％が、感染初日から死亡している。
【００８０】
１０及び３０ｍｇ／ｋｇで投与されたヘリオマイシンは、曲線がプラシーボグループに関する曲線よりもつねに上にあるものの、生存率の推移に対する著しい効果はない。中位の死亡率は、それぞれ体重１ｋｇあたり１０ｍｇ及び３０ｍｇのヘリオマイシン用量で処置されたグループについて、感染後４８時間及び６０時間後に介入し、罹患率評点は、７日目に０／５０及び５／５０である。
【００８１】
これらの条件下で、３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたペプチドＡｒｄ１は、最初の死亡の出現を２４時間遅延させる。１０匹のうち５匹のマウスが７日目でなおも生存しており、罹患率は１６／５０である。生存度曲線（Ｍｅｉｅｒ−Ｋａｐｌａｎ）を統計的なログランク検定により比較すると、プラシーボグループと３０ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．００１）でＡｒｄ１で処置されたグループの間の有意な差を結論づけることができる。
【００８２】
１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたＡｒｄ１は、生存率及びマウスの全身状態を改善できず、５０％のマウスが感染２日目に死亡している。
【００８３】
３）  播種性カンジダ症モデルにおけるＡｒｄ１及び類似体ｐＥＭ２４、ｐＥＭ３０、ｐＥＭ３１及びｐＥＭ３５の活性の比較
添付図４及び５は、それぞれ、感染後の日数との関係における生存率と罹患率評点（マウス１０匹）を表わしている。
【００８４】
この実験において、２．５・１０６ＣＦＵ／マウスでのマウスへの接種は、プラシーボ処置を受けたグループの場合、５日目で５０％の致死率である。最初の死亡は、感染後２．５日目に起こり、中央死亡率は、感染後５日目にある。７日目で、５匹のマウスが生きており、罹患率評点は１５／５０である。
【００８５】
１０ｍｇ／ｋｇの用量でＡｒｄ１は、最初の死亡の出現を１．５日遅延させる。接種から７日目に、８匹のマウスがなおも生存している。それでも、生存率曲線は、プラシーボグループのものと統計的に異なっていない（ｐ＝０．２５１６）。
【００８６】
１０ｍｇ／ｋｇの用量でテストされた４つのペプチドすなわちｐＥＭ２４（Ｈ５）、ｐＥＭ３０（Ａ１）、ｐＥＭ３１（Ａ２）及びｐＥＭ３５（Ａ６）はＡｒｄ１よりもさらに活性が高い。それぞれ、最初の死亡の出現期間及び７日目に生きているマウスの数は、ｐＥＭ２４（Ｈ５）で処置されたグループについては３日と７匹、ｐＥＭ３０（Ａ１）で処置されたグループについては４日と７匹、ｐＥＭ３１（Ａ２）で処置されたグループについては５．５日と８匹、ｐＥＭ３５（Ａ６）で処置されたグループについては７日と９匹である。このペプチドの各々は、最初の３日間マウスを良好な状態に維持できるようにし、罹患率評点は、プラシーボを受けたグループについての２２／５０に比べ、３日目で４２〜４８／５０の間にある。４番目の注射から２４時間後に、マウスの状態が悪化する。ｐＥＭ３１で処置されたグループのみが、５日間４０／５０を上回る罹患率評点を保っている。
【００８７】
プラシーボグループのものとの生存度曲線の統計的比較は、０．０４１に等しいｐで、ｐＥＭ３５での処置を受けたグループについて有意な差を明らかにしている。
【００８８】
プラシーボグループのものとの生存度曲線の統計的比較は、０．０１９５に等しいｐで、８日目にｐＥＭ３１での処置を受けたグループについて有意な差を明らかにしている。
【００８９】
ペプチドの相対的活性は、次の通りである： ｐＥＭ３１＞ｐＥＭ３５≧ｐＥＭ３０＞ｐＥＭ２４≧Ａｒｄ１
【００９０】
４）播種性カンジダ症モデルにおける、５ｍｇ／ｍｌで投与されたＡｒｄ１及び類似体ｐＥＭ３１、ｐＥＭ３５、ｐＥＭ３７、ｐＥＭ４６及びｐＥＭ５１の活性の比較
添付図６及び７は、それぞれ、感染後の日数との関係における生存率と罹患率評点（マウス１０匹）を表わしている。
【００９１】
この実験において、３・１０６ＣＦＵのＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓでの１５ｇのＳｗｉｓｓ ＯＦ１マウスの接種は、プラシーボでの処置を受けたグループについて、感染後４日目で５０％の死亡率を誘発する。最初の死亡は、感染後２．５日目に起こり、５．５日目に１００％のマウスが死亡している。
【００９２】
５ｍｇ／ｋｇの用量で３回の静脈注射で投与されたＡｒｄ１ならびにｐＥＭ３１及びｐＥＭ４６による処置は、プラシーボ処置との関係においてマウスの生存度を有意な形で増大させない。それでも、ｐＥＭ４６による処置は、プラシーボグループのマウスについての９／５０に比べ、感染から３日後に、３１／５０の罹患率指数でマウスの健康状態の劣化を遅らせている。
【００９３】
この用量で、ｐＥＭ５１及びｐＥＭ３５による処置は、最初の死亡の出現を１．５日遅らせる。 中央死亡率は、ｐＥＭ５１及びｐＥＭ３５で処置されたグループについてそれぞれ感染後５日目及び６日目に起こる。統計的には、７日目の生存度曲線の分析は、ｐＥＭ５１で処置されたグループについて０．０１５に等しいＰ そしてｐＥＭ３５で処置されたグループについて０．０００４に等しいＰで、プラシーボグループとの関係において有意な差を示している。ｐＥＭ３５により処置されたマウスの全身健康状態は、その他の処置を受けたマウスのものよりも良く、ｐＥＭ５１を受けたマウスについての１１／５０の評点及びプラシーボを受けたマウスについての１／５０の評点に比較して、感染から５日目に至るまで罹患率評点は２８／５０に維持されている。
【００９４】
包括的には、この播種性カンジダ症モデルにおいて、ｐＥＭ３５の抗真菌活性は、それ自体ｐＥＭ４６の活性よりも高いｐＥＭ５１のものよりも高い。利用された５ｍｇ／ｋｇの用量で、Ａｒｄ１及びｐＥＭ３１の分子は有効ではない。
【００９５】
５）  播種性カンジダ症モデルにおける類似体ｐＥＭ３５の活性
添付図８は、感染後の日数との関係における生存率（マウス１０匹）を表わす。この実験においては、２．５・１０６ＣＦＵ／マウスをマウスに接種すると、５日目で５０％は死に至り、プラシーボグループのマウスについては、８日目で１００％が死亡している。最初の死亡は、感染後３日目に発生している。罹患率評点は３０／５０より下に急速に低下する（２．５日目で２５／５０）。
【００９６】
ペプチドｐＥＭ３５を、注射一回あたり１０及び３０ｍｇ／ｋｇの用量で、４日間一日３用量の割合（０日目に感染から１時間、５時間及び１０時間後；１、２及び３日目で８時間、１４時間及び２０時間後）で、つまり３０及び９０ｍｇ／ｋｇの一日用量で投与した。
【００９７】
この投与スキームでは、ｐＥＭ３５は、２用量について、最初の死亡の出現を４日半だけ遅らせることができる。感染後８日目で、３０及び９０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で処理されたマウスについて、それぞれ８０％及び９０％の生存率が観察される。マウスは、７日目まで良好な健康状態を維持し、罹患率評点は４０／５０以上で維持されている。８日目に、評点は３０／５０まで減少する。１日体重１ｋｇあたり３０ｍｇという低い用量及び９０ｍｇという高い用量でｐＥＭ３５による処置を受けたグループの間には、大きな差異は全く見られなかった。
【００９８】
ｐＥＭ３５によって処置されたグループに関係する生存度曲線は、プラシーボグループに関する曲線と統計的に異なっている。（２用量でｐ＜０．００１）
【００９９】
６）  方法−Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ播種性感染モデル
体重２２ｇのＳｗｉｓｓ ＯＦ１マウスを、致死用量のＳｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍ（３７℃で７日間麦芽寒天ゲロース上で培養した。ＦＳＳＰ７９０８菌株）で静脈内（ｉ．ｖ．）経路で感染させる。感染用量は、尾の側静脈から１００μｌの量で注射されて、マウス１匹あたり７・１０６個の胞子である。
【０１００】
ペプチドｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１は、腹腔内で移植された浸透性ポンプＡＬＺＥＴ１００３Ｄ（流量：０．９７μｌ／時；容積：９３μｌ：灌流持続時間：４日）及び１００７Ｄ（流量：０．４７μｌ／時；容積１００μｌ；灌流持続時間：８日半）で連続的に送達される。
【０１０１】
感染を受けた８匹のマウスから成るグループを、以下の処置に付す；
ａ）  腹腔内（ｉ．ｐ．）移植されたポンプ１００７Ｄ内でプラシーボすなわち０．９％のＮａＣｌによる処置；
ｂ）  処置なし；
ｃ）  ０．３μｇ／ｍｌの平衡時理論血漿濃度に対応する８日間３０ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内でポンプ１００７Ｄにより送達されるｐＥＭ５１による処置；
ｄ）  ０．６μｇ／ｍｌの平衡時理論血漿濃度に対応する４日間６０ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内でポンプ１００３Ｄにより送達されるｐＥＭ５１による処置；
ｅ）  ０．３５μｇ／ｍｌの平衡時理論血漿濃度に対応する４日間３５ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内でポンプ１００３Ｄにより送達されるｐＥＭ３５による処置。
【０１０２】
７）  播種性セドスポリウム症モデルにおける連続輸注で送達される類似体ｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１の活性
添付図面９及び１０は、感染後の日数との関係におけるそれぞれ生存率及び罹患率指数（マウス８匹）を表わしている。
【０１０３】
この浸襲性セドスポリウム症モデルにおいて、７・１０６個のＳｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍの胞子用量の接種は、感染から７日目で５０％が死に至る。最初の死亡は、対照マウスグループ（感染しているが処置無し）及びプラシーボグループ（感染し、Ａｌｚｅｔ ポンプと共に移植されている）について、それぞれ感染から５日後と６日後に発生する。対照グループについては１１日目に１００％の死亡率が観察され、プラシーボグループについては、２０日目に７５％の死亡率が見られる。マウスの健康状態は、感染後３日目から急速に低下し、これら２つのグループについて感染後３日目の罹患率評点は２８／４０と３４／４０，７日目では６／４０及び７／４０である。脳炎の兆候は感染後４日目で現われている。
【０１０４】
８日間３０ｍｇ／ｋｇの用量でのｐＥＭ５１による処置により、最初の死亡の出現を９日遅らせることができる。２０日目で、８匹のうち５匹のマウスがなお生きている。罹患率指数は、感染後４日目から減少し（２８／４０），これは脳炎の兆候の出現と対応しており、感染後５日目で１４日目まで２４／４０で安定する。マウスの状態はその後漸進的に悪化し、感染後２０日目で指数は１１／４０である。死亡率曲線は、統計的に、対照グループ及びプラシーボグループに関するものと異なっている（ログランク：ｐ＝０．００２７）。
【０１０５】
４日間６０ｍｇ／ｋｇの用量でｐＥＭ５１により処置すると、最初の死亡の出現を５日遅らせることができる。感染後１２日目で５０％の死亡率が観察され、これはすなわち、対照及びプラシーボグループに比べ５日の遅れである。２０日目で、８匹のうち３匹のマウスがなおも生きている。罹患率指数は、感染後５日目から減少し（３０／４０），これは脳炎の兆候の出現と対応しており、感染後１４日目で６／４０の指数まで漸進的に減少する。死亡率曲線は、統計的に、対照グループ及びプラシーボグループに関するものと異なっている（ログランク：ｐ＝０．０１７６）。
【０１０６】
４日間３５ｍｇ／ｋｇの用量でｐＥＭ３５により処置すると、最初の死亡の出現を４日遅らせることができる。感染後１５日目で５０％の死亡率が観察され、これはすなわち、対照及びプラシーボグループに比べ８日の遅れである。２０日目で、８匹のうち１匹のマウスがなおも生きている。罹患率指数は、感染後５日目から減少し（２８／４０），これは脳炎の兆候の出現と対応しており、感染後１５日目で８／４０の指数まで漸進的に減少する。死亡率曲線は、統計的に、対照グループ及びプラシーボグループに関するものと異なっている（ログランク：ｐ＝０．０１７７）。
【０１０７】
このモデルにおいては、８日間３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたｐＥＭ５１は、生存度に関して非常に優れた治療効果を示している。２分の１の長さの期間にわたり２倍の用量（６０ｍｇ／ｋｇ）を投与すると、ｐＥＭ５１の効力は著しく減少する。ただし、治療の最初の４日間は、３０ｍｇ／ｋｇの用量で処置したグループの罹患率評点は、６０ｍｇ／ｋｇの用量で処置したグループの罹患率評点よりも著しく低いものである。従って、８日間６０ｍｇ／ｋｇの用量を投与すると、ｐＥＭ５１の治療効果はさらに改善されるはずである。
【０１０８】
４日間３５ｍｇ／ｋｇの用量でのｐＥＭ３５は、４日間６０ｍｇ／ｋｇの用量でのｐＥＭ５１と同じ効力を実証した。従ってこのセドスポリウム症モデルにおけるｐＥＭ３５の治療活性は、少なくともｐＥＭ５１のものと等価である。
【０１０９】
８）  マウスにおけるｐＥＭ３５とｐＥＭ５１の急性毒性研究
添付図１１及び１２は、治療を受けた健康なマウスの体重の経時的な推移を表わしている。
【０１１０】
マウスにおける治療効果試験中、３日間３０ｍｇ／ｋｇずつ３回、３０分間隔で注射を繰返し行なってＮａＣｌ０．９％中に溶解させたｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１を静脈内投与した場合でも、急性毒性は全く観察されなかった。
【０１１１】
３日間ｐＥＭ５１を３０ｍｇ／ｋｇずつ３回用いて処置した健康なマウスの体重の推移は、０．９％のＮａＣｌの注入を受けたマウスのものと類似している。
【０１１２】
静脈内経路で唯一回のｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１の急性毒性を、２００，３００及び４００ｍｇ／ｋｇの用量で１７〜１８ｇのＳｗｉｓｓ ＯＦ１雄マウスにおいてテストした。０．９％のＮａＣｌ溶液中でペプチドを可溶化させ、注射量は１５０μｌで、尾の側静脈から４５秒で注入する。
【０１１３】
全てのマウスは、虚脱に付随した血管拡張を提示した。マウスの状態は、用量に応じて注射後２０〜４０分後に再び正常になった。
【０１１４】
４日間にわたる体重推移曲線は、２００及び４００ｍｇ／ｋｇの用量でｐＥＭ３５を受けたか又は２００及び３００ｍｇ／ｋｇの用量で、ＰＥＭ５１を受けたマウスについて約１ｇそして４００ｍｇ／ｋｇの用量でｐＥＭ５１を受けたマウスについて約２ｇというわずかな成長遅延を、注射の翌日に示している。体重の推移はその後、全てのマウスについて正常である。
【０１１５】
【実施例７】
Ａｒｄ１及び類似体 ｐＥＭ３１，ｐＥＭ３５，ｐＥＭ４６，ｐＥＭ４８及びｐＥＭ５１の抗真菌活性のスペクトル
１）  糸状菌類に対する活性・検出試験
抗真菌活性を、液体培地内での成長阻害試験により検出した。
【０１１６】
麦芽寒天傾斜ゲロース （Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）上に、糸状菌類（Ｈ． Ｋｏｅｎｉｇ博士（Ｈｏｐｉｔａｌ Ｃｉｖｉｌ， Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）の寄贈物である Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ， Ａ．ｆｌａｖｕｓ及びＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ；及びＪ．Ｍｅｉｓ及びＪ．Ｍｏｕｔｏｎ博士（Ｈｏｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ， 微生物学部、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ， オランダ）より寄贈されたＳ．ｐｒｏｌｉｆｉｃａｎｓ 及び Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）を播種し、３７℃で７日間インキュベートする。
【０１１７】
その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＹＰＧ培地１０ｍｌで胞子を収獲し、ガーゼを通してろ過する。胞子を１７００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈渣をＹＰＧ（１リットルあたり酵母エキス１ｇ，ペプトン１ｇ，グルコース３ｇ）の中に再び取込む。
【０１１８】
懸濁液を、計数セル（カバースライド）によって計数し、１０４胞子／ｍｌに調整する。
【０１１９】
１００μｌのペプチド希釈液（ペプチド濃度５０〜０．０９７μｇ／ｍｌ）をマイクロ滴定プレート内に入れる。その後、糸状菌類胞子１０４個／ｍｌで１００μｌ，つまり１０００胞子を添加する。
【０１２０】
テストプレートを３７℃で４８時間インキュベートする。
【０１２１】
阻害最小濃度（ＣＭＩ）の決定は、ウェルの被覆百分率を観察することで行なわれる。ＣＭＩは５０％のウェルの被覆について確立される。
【０１２２】
２）  酵母に対する活性検出試験
カンジダ属（Ｈ． Ｋｏｅｎｉｇ博士（Ｈｏｐｉｔａｌ Ｃｉｖｉｌ， Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）の寄贈物である Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ， Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ， Ｃ．ｄｕｂｌｉｅｎｓｉｓ， Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ， Ｃ．ｋｅｆｙｒ， Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ 及び Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ），フルコナゾール耐性 Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ （Ｊ．Ｍｅｉｓ 及び Ｊ．Ｍｏｕｔｏｎ博士（Ｈｏｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｅ， 微生物学部、Ｎｉｊｍｅｇｅｎ， オランダ）の寄贈物である Ｎｏ．２４５９６２，Ｎｏ．２３３２，Ｎｏ．２４６３３５，及びＮｏ．３５５２）及びＣｒｙｐｔｏｃｃｏｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ （Ｈ．Ｋｏｅｎｉｎｇ博士， Ｈｏｐｉｔａｌ Ｃｉｖｉｌ， Ｓｔｒａｎｓｂｏｕｎｇの寄贈物） の酵母を、サブロークロラムフェニコール寒天傾斜ゲロース（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）上に播種し、３０℃で２４時間（Ｃａｎｄｉｄａ． ｓｐ．），３７℃で７２時間（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）インキュベーションに付す。
【０１２３】
２．５・１０６酵母／ｍｌに対応する６００ｎｍで０．１Ｄｏの最終濃度を得るため、液体サブロー培地（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ） 内で、いくつかの酵母コロニーを懸濁させる。
【０１２４】
酵母懸濁液を、サブロー培地中で５・１０３酵母／ｍｌに調整する。
【０１２５】
マイクロ滴定プレート内に、１００μｌのペプチド希釈液（ペプチド濃度５０〜０．０９７μｇ／ｍｌ）を入れる。５・１０３酵母／ｍｌの酵母懸濁液１００μｌつまり５００酵母を添加した後、３０℃で２４時間（Ｃａｎｄｉｄａ属）緩慢な撹拌下で、又は３７℃で７２時間（Ｃｒｙｐｔｏｃｃｕｓ属）、テストプレートをインキュベートする。
【０１２６】
阻害最小濃度（ＣＭＩ）の決定は、マイクロ滴定プレートの読取り用分光光度計を用いて６００ｎｍでの吸光度を測定することによって行なわれる。ＣＭＩは、５０％の成長阻害百分率について算定される。
【０１２７】
３）  植物病原菌 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｏｌａ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ に対する活性検出試験
マイクロ滴定プレート内に１００μｌのペプチド希釈液（ペプチド濃度５０〜０．０９７μｇ／ｍｌ）を入れる。
【０１２８】
Ａ．ｂｒａｓｓｉｃｏｌａ及びＮ．ｃｒａｓｓａ （Ｂｕｌｌｅｔ博士ＩＢＭＣ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇからの寄贈物）の１０４胞子／ｍｌの冷凍胞子１００μｌを添加した後、テストプレートを３０℃で４８時間インキュベートする。
【０１２９】
阻害最小濃度（ＣＭＩ）の決定は、ウェルの被覆百分率を観察することで行なわれる。ＣＭＩは５０％のウェルの被覆について算定される。
【０１３０】
下表３は、酵母及び糸状菌類に対するＡｒｄＩ及びその類似体のＣＭＩを表わしている。下表４及び５は、それぞれ、フルコナゾール耐性Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ酵母菌株及び糸状菌類に対する類似体 ｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１（μｇ／ｍｌ）のＣＭＩを表わしている。
【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
【表４】
2004537960.tif 000016
【０１３３】
【表５】
2004537960.tif 000017
【０１３４】
【実施例８】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＩＨＥＭ８０６０に対するペプチドｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１の抗真菌反応速度
添付図１３は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＩＨＥＭ８０６０に対するペプチドｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１の抗真菌反応速度を表わしている。
【０１３５】
試験は、Ｋｌｅｐｓｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， １９９８年５月、４２（５）；１２０７−１２，「抗真菌性時間−殺菌曲線結果に対する試験条件の影響：標準化された方法の提案）により記述されたプロトコルに沿って実施された。利用されたＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ酵母菌株は、酵母に対する活性の検出試験のために先に利用されたものと同一である（Ｋｏｅｎｉｇ博士（Ｈｏｐｉｔａｌ Ｃｉｖｉｌ， Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）の寄贈物）。
【０１３６】
酵母菌株を、サブロークロラムフェニコールゲロース上に播種し、３０℃で２４〜４８時間インキュベートさせる。液体サブロー培地（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）４ｍｌ中に、いくつかの酵母コロニーを懸濁させ、その後、３０℃で一晩撹拌しながらインキュベートする。
【０１３７】
新鮮なサブローの中で酵母懸濁液を１・１０６〜５・１０６酵母／ｍｌに調整する。規定量のペプチドｐＥＭ３５又はｐＥＭ５１を含む又は含まない（対照）サブロークロラムフェニコール（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）９ｍｌと共に酵母懸濁液１ｍｌを添加することにより、１：１０の希釈液を調製する、出発接種材料中の酵母濃度は、かくして１・１０５〜５・１０５酵母／ｍｌである。
【０１３８】
１μｇ／ｍｌ〜６４μｇ／ｍｌにわたる濃度範囲について、ペプチドｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１をテストする。各溶液を３５℃でインキュベートする。予め定められた時間（０，１，２，３，４，６，８，１０及び２４時間）で、各溶液１００μｌの試料を採取し、無菌水中で１０倍に段階希釈させる。その後、コロニーを数え上げる目的で、サブローゲロース皿（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）の上に３０μｌのアリコートを展延させる。コロニーの数が、推定により１０００酵母／ｍｌ未満になった時点で、３０μｌの試料を試験溶液から直接採取し、予め希釈することなくサブローゲロース皿（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）上に展延させる。皿を３５℃で２４〜４８時間インキュベートする。
【０１３９】
Ｋｌｅｐｓｅｒ ｅｔ ａｌ（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ １９９７年６月；４１（６）；１３９２−１３９５，「Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓに対してテストされたアンフォテリシンＢ及びフルコナゾールの抗真菌薬力学特性」）により記述されたプロトコルに従って並行してアンフォテリシンＢ（ＣＭＩの１倍及び１６倍に対応する濃度）の対照試験を実施する。
【０１４０】
酵母数／ｍｌの検出最小閾値は、ペプチドｐＥＭ３５又はｐＥＭ５１を用いた無菌水中でのＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ酵母懸濁液の調製とその後の０．５のＭｃＦａｒｌａｎｄ 標準懸濁度（濃度１・１０６−５・１０６酵母／ｍｌ）への調整によって決定される。無菌水中の希釈を、それぞれ１００，５０及び３０酵母／ｍｌの濃度の３つの懸濁液を得るような形で実施する。各懸濁液３０μｌを採取しサブローゲロース皿（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）上に展延させて、コロニーを計数する。皿を、３５℃で２４〜４８時間インキュベートする。
【０１４１】
計数値（ｌｏｇ１０  酵母／ｍｌ）は、試験対象のペプチドｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１の各濃度について予め規定された時間的段階にわたって報告されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２年 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， １５７，１０５−１３２）の方法によるヘリオマイシンペプチドの疎水性プロフィールを表わす。
【図２】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの播種性感染モデルにおけるペプチドヘリオマイシン及びＡｒｄ１の活性（感染後の日数との関係における生存率）を表わす。
【図３】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの播種性感染モデルにおけるペプチドヘリオマイシン及びＡｒｄ１の活性（感染後の日数との関係における罹患率評点）を表わす。
【図４】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの播種性感染モデルにおけるペプチドｐＥＭ２４、ｐＥＭ３０、ｐＥＭ３１及びｐＥＭ３５の活性（感染後の日数との関係における生存率）を表わす。
【図５】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの播種性感染モデルにおけるペプチドｐＥＭ２４、ｐＥＭ３０、ｐＥＭ３１及びｐＥＭ３５の活性（感染後の日数との関係における罹患率評点）を表わす。
【図６】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの播種性感染モデルにおけるペプチドｐＥＭ３１、ｐＥＭ３５、ｐＥＭ４６及びｐＥＭ５１の活性（感染後の日数との関係における生存率）を表わす。
【図７】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの播種性感染モデルにおけるペプチドｐＥＭ３１、ｐＥＭ３５、ｐＥＭ４６及びｐＥＭ５１の活性（感染後の日数との関係における罹患率評点）を表わす。
【図８】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの播種性感染モデルにおけるペプチドｐＥＭ３５の活性（感染後の日数との関係における生存率）を表わす。
【図９】
Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍの播種性感染モデルにおけるペプチドｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１の活性（感染後の日数との関係における生存率）を表わす。
【図１０】
Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｆｌａｔｕｍの播種性感染モデルにおけるペプチドｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１の活性（感染後の日数との関係における罹患率指数）を表わす。
【図１１】
ペプチドｐＥＭ５１で処置された健康なマウスの経時的体重推移を表わす。
【図１２】
ペプチドｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１で処置された健康なマウスの経時的体重推移を表わす。
【図１３】
Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＩＨＥＭ８０６０に対するペプチドｐＥＭ３５及びｐＥＭ５１の抗真菌性化学反応速度を表わす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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