(57)【要約】本発明は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるための組成物および方法に関する。本発明はさらに、動物組織や植物材料などの生物材料から核酸分子を精製および単離するための組成物および方法に関する。本発明の方法は、複数の試料の迅速な処理に容易に適合させることができる。したがって本発明はさらに、数多くの試料から核酸分子を精製するための自動化法を提供する。本発明はまた、固体マトリックスから核酸分子を除去するためのキットにも関する。2004518421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を固体マトリックスに接触させる段階を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去する方法。
【請求項２】
固体マトリックスが、弱塩基、キレート化剤、および陰イオン性表面活性剤または陰イオン性界面活性剤を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
固体マトリックスが、尿酸または尿酸塩をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
固体マトリックスがセルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
固体マトリックスが濾紙である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
固体マトリックスがＦＴＡ（登録商標）紙である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
開放性試薬が複数のエタノールアミンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
開放性試薬がエタノールアミンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
エタノールアミンがモノエタノールアミンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
エタノールアミンがジエタノールアミンである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
エタノールアミンがトリエタノールアミンである、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
解放性試薬が水溶液である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
開放性試薬のｐＨが約８．３〜約１３である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
開放性試薬のｐＨが約１０〜約１２である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
開放性試薬のｐＨが約１１である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約５％（容積／容積）である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約３％（容積／容積）である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約１％（容積／容積）である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
アルカノールアミンの濃度が約０．１％〜約１％（容積／容積）である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
固体マトリックスを解放性試薬と約１〜約１８０分間インキュベートする、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
固体マトリックスを解放性試薬と約１〜約１２０分間インキュベートする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
固体マトリックスを解放性試薬と約１０〜約６０分間インキュベートする、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
固体マトリックスを解放性試薬と約１０〜約３０分間インキュベートする、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
固体マトリックスを解放性試薬と約６５℃〜約１００℃でインキュベートする、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
固体マトリックスを解放性試薬と約９０℃〜約１００℃でインキュベートする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
核酸分子を解放性試薬から分離する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
核酸分子がＤＮＡを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
核酸分子がベクターを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
ベクターがプラスミドまたは人工染色体を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
核酸分子が細胞またはウイルスに由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
以下の段階を含む、核酸分子を単離する方法：
（ａ）核酸分子を固体マトリックスに、核酸分子を固体マトリックスに固着、付着、会合、および／または結合させる条件下で接触させる段階；ならびに
（ｂ）結合状態の核酸分子を含む固体マトリックスに、１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから核酸分子を解放させる条件下で接触させる段階。
【請求項３２】
解放された核酸分子を含む解放性試薬を収集する段階をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
固体マトリックスが弱塩基、キレート化剤、および陰イオン性表面活性剤または陰イオン性界面活性剤を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
固体マトリックスが尿酸または尿酸塩をさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
固体マトリックスがセルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
固体マトリックスが濾紙である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
固体マトリックスがＦＴＡ（登録商標）紙である、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
開放性試薬が複数のエタノールアミンを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
開放性試薬がエタノールアミンを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
解放性試薬が水溶液である、請求項３１記載の方法。
【請求項４１】
開放性試薬のｐＨが約８．３〜約１３である、請求項３１記載の方法。
【請求項４２】
開放性試薬のｐＨが約１０〜約１２である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
開放性試薬のｐＨが約１１である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約５％（容積／容積）である、請求項３１記載の方法。
【請求項４５】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約３％（容積／容積）である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約１％（容積／容積）である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
アルカノールアミンの濃度が約０．１％〜約１％（容積／容積）である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
固体マトリックスを解放性試薬と約１〜約１８０分間インキュベートする、請求項３１記載の方法。
【請求項４９】
固体マトリックスを解放性試薬と約１〜約１２０分間インキュベートする、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
固体マトリックスを解放性試薬と約１０〜約６０分間インキュベートする、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
固体マトリックスを解放性試薬と約１０〜約３０分間インキュベートする、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
固体マトリックスを解放性試薬と約６５℃〜約１００℃でインキュベートする、請求項３１記載の方法。
【請求項５３】
固体マトリックスを解放性試薬と約９０℃〜約１００℃でインキュベートする、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
核酸分子を解放性試薬から分離する段階をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項５５】
核酸分子がＤＮＡを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項５６】
核酸分子がベクターを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項５７】
ベクターがプラスミドまたは人工染色体を含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
核酸分子が細胞またはウイルスに由来する、請求項３１記載の方法。
【請求項５９】
請求項３１記載の方法で単離される核酸。
【請求項６０】
核酸分子がＰＣＲで増幅される、請求項３１記載の方法。
【請求項６１】
請求項６０記載の方法で作製される核酸を含む、組換え宿主細胞。
【請求項６２】
核酸がベクターを含む、請求項６１の宿主細胞。
【請求項６３】
請求項６０記載の方法で作製された核酸を宿主細胞に導入する段階を含む、組換え宿主細胞を作製する方法。
【請求項６４】
以下の段階を含む、ＲＮＡをＤＮＡから分離する方法：
（ａ）固体マトリックスにＲＮＡおよびＤＮＡを含む試料を接触させる段階；
（ｂ）ＤＮＡを保持しながらＲＮＡを十分除去する条件下で、（ａ）の固体マトリックスに洗浄液を接触させる段階；ならびに
（ｃ）洗浄後の固体マトリックスに、１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスからＤＮＡを解放させる条件下で接触させる段階。
【請求項６５】
洗浄液が水または１０  ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．３）のいずれかを含む、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
固体マトリックスに１秒〜９０分間の洗浄時間で洗浄液を接触させる、請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
洗浄時間が以下からなる群より選択される、請求項６６記載の方法：
（ａ）約５秒；
（ｂ）約２０秒；
（ｃ）約３０秒；
（ｄ）約４５秒；
（ｅ）約１分；
（ｆ）約５分；
（ｇ）約１０分；および；
（ｈ）約３０分。
【請求項６８】
以下の段階を含む、閉環状核酸分子を直鎖状核酸分子から分離する方法：
（ａ）閉環状核酸分子および直鎖状核酸分子を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階：
（ｂ）直鎖状核酸分子を保持しながら閉環状核酸分子を十分除去する条件下で、（ａ）の固体マトリックスに洗浄液を接触させる段階；ならびに
（ｃ）固体マトリックスから直鎖状核酸分子を解放させる条件下で、１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。
【請求項６９】
洗浄液が水または１０  ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．３）のいずれかを含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
固体マトリックスに１秒〜９０分間の洗浄時間で洗浄液に接触させる、請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
洗浄時間が以下からなる群より選択される、請求項７０記載の方法：
（ａ）約５秒；
（ｂ）約２０秒；
（ｃ）約３０秒；
（ｄ）約４５秒；
（ｅ）約１分；
（ｆ）約５分；
（ｇ）約１０分；および
（ｈ）約３０分。
【請求項７２】
以下の段階を含む、核酸分子を大きさで分離する方法：
（ａ）固体マトリックスに、大きさの異なる核酸分子を含む試料を接触させる段階；
（ｂ）より大きい核酸分子を保持しながら、より小さい核酸分子を十分除去する条件下で、（ａ）の固体マトリックスに洗浄液を接触させる段階；ならびに
（ｃ）固体マトリックスから、より大きい核酸分子を解放させる条件下で、１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。
【請求項７３】
洗浄液が水または１０  ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．３）のいずれかを含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
固体マトリックスに１秒〜９０分の洗浄時間で洗浄液を接触させる、請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
洗浄時間が以下からなる群より選択される、請求項７４記載の方法：
（ａ）約５秒；
（ｂ）約２０秒；
（ｃ）約３０秒；
（ｄ）約４５秒；
（ｅ）約１分；
（ｆ）約５分；
（ｇ）約１０分；および
（ｈ）約３０分。
【請求項７６】
より小さい核酸分子の平均サイズが約１ｋｂ〜約５０ｋｂで、より大きい核酸分子の平均サイズが約１００ｋｂ〜約１，０００ｋｂである、請求項７２記載の方法。
【請求項７７】
より小さい核酸分子の平均サイズが約５０ｋｂ〜約１００ｋｂで、より大きい核酸分子の平均サイズが約２５０ｋｂ〜約５００ｋｂである、請求項７２記載の方法。
【請求項７８】
より小さい核酸分子の平均サイズが約５０ｋｂ〜約１００ｋｂで、より大きい核酸分子の平均サイズが約１，０００ｋｂ〜約４，０００ｋｂである、請求項７２記載の方法。
【請求項７９】
核酸分子、固体マトリックス、および１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を含む組成物。
【請求項８０】
固体マトリックスが弱塩基、キレート化剤、および陰イオン性表面活性剤または陰イオン性界面活性剤を含む、請求項７９記載の組成物。
【請求項８１】
固体マトリックスが尿酸もしくは尿酸塩をさらに含む、請求項７９記載の組成物。
【請求項８２】
固体マトリックスがセルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである、請求項７９記載の組成物。
【請求項８３】
固体マトリックスが濾紙である、請求項８２記載の組成物。
【請求項８４】
固体マトリックスがＦＴＡ（登録商標）紙である、請求項８２記載の組成物。
【請求項８５】
開放性試薬が複数のエタノールアミンを含む、請求項７９記載の組成物。
【請求項８６】
開放性試薬がエタノールアミンを含む、請求項７９記載の組成物。
【請求項８７】
エタノールアミンがモノエタノールアミンである、請求項８６記載の組成物。
【請求項８８】
エタノールアミンがジエタノールアミンである、請求項８６記載の組成物。
【請求項８９】
エタノールアミンがトリエタノールアミンである、請求項８６記載の組成物。
【請求項９０】
溶液が水溶液である、請求項８６記載の組成物。
【請求項９１】
開放性試薬のｐＨが約８．３〜約１３である、請求項７９記載の組成物。
【請求項９２】
開放性試薬のｐＨが約１０〜約１２である、請求項９１記載の組成物。
【請求項９３】
開放性試薬のｐＨが約１１である、請求項９２記載の組成物。
【請求項９４】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約５％（容積／容積）である、請求項７９記載の組成物。
【請求項９５】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約３％（容積／容積）である、請求項９４記載の組成物。
【請求項９６】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約１％（容積／容積）である、請求項９５記載の組成物。
【請求項９７】
アルカノールアミンの濃度が約０．１％〜約１％（容積／容積）である、請求項９６記載の組成物。
【請求項９８】
核酸分子がＤＮＡを含む、請求項７９記載の組成物。
【請求項９９】
核酸分子がベクターを含む、請求項７９記載の組成物。
【請求項１００】
ベクターがプラスミドまたは人工染色体を含む、請求項９９記載の組成物。
【請求項１０１】
核酸分子が細胞またはウイルスに由来する、請求項７９記載の組成物。
【請求項１０２】
（１）１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬、および（２）以下からなる群より選択される１種もしくは複数の成分を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去するためのキット：
（ａ）固体マトリックス；
（ｂ）試料を固体マトリックスにアプライするための装置；
（ｃ）固体マトリックスを切断して、試料を含む切片にする装置；ならびに
（ｄ）洗浄液．
【請求項１０３】
固体マトリックスが弱塩基、キレート化剤、および陰イオン性表面活性剤または陰イオン性界面活性剤を含む、請求項１０２記載のキット。
【請求項１０４】
固体マトリックスが尿酸または尿酸塩をさらに含む、請求項１０２記載のキット。
【請求項１０５】
固体マトリックスがセルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである、請求項１０２記載のキット。
【請求項１０６】
固体マトリックスが濾紙である、請求項１０５記載のキット。
【請求項１０７】
固体マトリックスがＦＴＡ（登録商標）紙である、請求項１０５記載のキット。
【請求項１０８】
開放性試薬が複数のエタノールアミンを含む、請求項１０２記載のキット。
【請求項１０９】
開放性試薬がエタノールアミンを含む、請求項１０２記載のキット。
【請求項１１０】
エタノールアミンがモノエタノールアミンである、請求項１０９記載のキット。
【請求項１１１】
エタノールアミンがジエタノールアミンである、請求項１０９記載のキット。
【請求項１１２】
エタノールアミンがトリエタノールアミンである、請求項１０９記載のキット。
【請求項１１３】
溶液が水溶液である、請求項１０２記載のキット。
【請求項１１４】
開放性試薬のｐＨが約８．３〜約１３である、請求項１０２記載のキット。
【請求項１１５】
開放性試薬のｐＨが約１０〜約１２である、請求項１１４記載のキット。
【請求項１１６】
開放性試薬のｐＨが約１１である、請求項１１５記載のキット。
【請求項１１７】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約５％（容積／容積）である、請求項１０２記載のキット。
【請求項１１８】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約３％（容積／容積）である、請求項１１７記載のキット。
【請求項１１９】
アルカノールアミンの濃度が約０．０１％〜約１％（容積／容積）である、請求項１１８記載のキット。
【請求項１２０】
アルカノールアミンの濃度が約０．１％〜約１％（容積／容積）である、請求項１１９記載のキット。
【請求項１２１】
核酸分子がベクターを含む、請求項１０２記載のキット。
【請求項１２２】
ベクターがプラスミドまたは人工染色体を含む、請求項１２１記載のキット。
【請求項１２３】
核酸分子が細胞またはウイルスに由来する、請求項１０２記載のキット。
【請求項１２４】
試料を固体マトリックスにアプライするための装置がマイクロピペットを含む、請求項１０２記載のキット。
【請求項１２５】
試料を固体マトリックスにアプライするための装置が、複数の試料を固体マトリックスに一度にアプライ可能な、請求項１０２記載のキット。
【請求項１２６】
試料を固体マトリックスにアプライするための装置によって、固体マトリックスの表面に破砕される試料が得られる、請求項１０２記載のキット。
【請求項１２７】
装置が固体マトリックスを円形、正方形、長方形、または不定形の切片に切断する、請求項１０２記載のキット。
【請求項１２８】
洗浄液が１０  ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．３）を含む、請求項１０２記載のキット。
【請求項１２９】
洗浄液が界面活性剤をさらに含む、請求項１０２記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるための組成物および方法に関する。本発明はさらに、動物組織や植物材料などの生物材料から核酸分子を精製および単離するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
集団内の数多くの個体および／または生物から得られる核酸分子試料を調製して解析することは多くの状況で望ましい。このような試料は、同じ地域または異なる地域に存在する個体の遺伝子型の判定に用いられることが少なくない。したがって試料の収集および解析は、集団内の個体の遺伝子型を判定する際に使用されることがある。このような解析を行うことで一般に、試料が由来する個体、および集団全体の両方に関連するデータが得られる。
【０００３】
生物集団に由来する核酸分子を含む試料の収集および解析は、ウイルス、植物、および動物の集団の遺伝子型のデータを得るために行われることがある。集団内の多数の個体の遺伝子型解析が一般に行われる状況の一例では、ある地域における植物の遺伝子型に関するデータが考慮される。このようなデータは、特定の植物系統の拡散速度を決定する際に、または農業従事者に販売された種子から成長させた遺伝子組換え植物、または、このような種子から成長させた植物体の子孫を判定する際に得られる場合がある。
【０００４】
いくつかの企業が現在、遺伝子組換え植物、およびこのような植物の種子を販売している。状況によっては、このような種子は、購入者（一般に農業従事者）が、購入した種子を成長させて得た植物体から得た種子から植物体を成長させる代わりに、種子をその供給者から再購入する条件で販売されている。さらにまた、一部の消費者団体ならびに政府機関は、遺伝子組換え植物から調製した農産物の販売に反対している。
【０００５】
上述の個々の状況において、遺伝子型解析を行うことで遺伝子組換え植物か否かを判定することができる。このような解析は、農村地方で得られる多数の植物試料の収集から開始されることが多い。したがって、後に遺伝子型解析に使用可能な植物に由来する核酸分子を含む多数の試料の収集および簡便な保存を可能とする方法が求められている。
【０００６】
他の状況では、遺伝子型解析は、動物（例えばヒト）に由来する試料を対象に行われ、これも各個体、または個体が集まった集団のいずれかに関連したデータが得られる。また動物または植物のいずれかに由来する試料を対象とした遺伝子型解析により、これらの生物に関連した成分に関連したデータが得られる場合がある。このような関連する成分の例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのウイルスが含まれる。特にＨＩＶ集団の遺伝子型解析は、ヒト血液試料から得られる核酸分子を用いて行うことができる。ＨＩＶがそのゲノムを変化させる速度は速いので、さまざまなウイルス系列の拡散および地域における優勢度を追跡するために遺伝子型解析が行われている。
【０００７】
濾紙（例えばＷｈａｔｍａｎ  ３ＭＭ濾紙）の使用は、核酸分子（例えばＲＮＡ、プラスミド、ウイルスベクター、および染色体ＤＮＡ）を含む試料を収集し、出荷し、また保存するための安価な方法である。これは特に、冷凍設備の整わない遠隔地で試料が採取される場合にあてはまる。
【０００８】
血液試料の収集、出荷、および保存に用いる、濾紙をベースとした媒体の一例が、（ｉ）一価の弱塩基；（ｉｉ）キレート化剤；（ｉｉｉ）陰イオン性界面活性剤；また選択的に（ｉｖ）尿酸または尿酸塩、を含浸させたセルロース材料を含むＦＴＡ（登録商標）紙である。ＦＴＡ（登録商標）紙を使用することで、ヒトのゲノムＤＮＡは例えば、細胞を紙と接触させることで溶解する、全血の乾燥スポットの状態で保存可能となる。室温で保存されたＦＴＡ（登録商標）紙上のゲノムＤＮＡは少なくとも７．５年間は安定であることが報告されている（Ｂｕｒｇｏｙｎｅら、ＣＯＮＶＥＮＴＩＯＮＡＬ  ＤＮＡ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ：ＤＩＳＰＯＳＡＢＬＥ  ＴＯＯＴＨＢＲＵＳＨＥＳ  ＡＮＤ  ＦＴＡ（登録商標）  ＰＡＰＥＲ  ＡＳ  Ａ  ＮＯＮ−ＴＨＲＥＡＴＩＮＧ  ＢＵＣＣＡＬ−ＣＥＬＬ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ  ＫＩＴ  ＣＯＭＰＡＴＩＢＬＥ  ＷＩＴＨ  ＡＵＴＯＭＡＴＡＢＬＥ  ＤＮＡ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ、８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１９９７年９月１７〜２０日）。したがって核酸試料を濾紙（例えばＦＴＡ（登録商標）紙）上に保持することは、高価な冷凍庫に保管するガラスバイアルやプラスチックチューブと比較してコンパクトなアーカイブシステムとなる。
【０００９】
血液スポットに由来するＤＮＡは、複数の疾患に関連した遺伝子変異を判定する、新生児を対象としたスクリーニングプログラムに、また軍事関係者を同定する方法に用いられている（例えばＳｅｌｔｚｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．Ｍｅｔａｂ．Ｂｉｏｌ．  ４６：１０５−１０９  （１９９１）；Ｊｉｎｋｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．  ８１：３６３−３６６  （１９８９）；Ｓｋｏｇｅｒｂｏｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．  ３７：４５４−４５８  （１９９１）；ＭｃＥｗｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．  ５５：１９６−２００  （１９９４）を参照）。
【００１０】
血液試料を乾燥濾紙上で保存することには、病原体を不活性化するいう別の利点がある。具体的には、ＨＩＶを始めとする数種の感染源は乾燥すると生存能を失うと考えられている。また核酸分子を含む、このような乾燥血液スポット、ならびに他の乾燥試料から得られる核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ  （ｍＲＮＡ）の単離および逆転写に使用することもできる。
【００１１】
細菌の核酸を濾紙上にスポットすることは、試料の保存および検索システムの一部として使用することもできる。ＲｏｇｅｒｓおよびＢｕｒｇｏｙｎｅは最近、ＦＴＡ（登録商標）紙上に保存されたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の複数の細菌株の試料の特性をＰＣＲ−リボタイピング法で判定した（Ｒｏｇｅｒｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４７：２２３  （１９９７））。
【００１２】
濾紙に捕捉した核酸を解析する前に、洗浄段階を通常設け、安定化用の化合物（存在する場合）、および細胞由来の酵素反応阻害物質を除去する必要がある。ＤＮＡは、洗浄段階後に大部分が濾紙上に残るので、このような核酸を精製する操作は単純化され、また自動化に適している。
【００１３】
ＦＴＡ（登録商標）紙などの材料から核酸を解放させる複数の方法が開発されている。例えばＢｕｒｇｏｙｎｅは、ポリスチレンケース内の濾紙上に保存された精製プラスミドＤＮＡが、尿酸溶液を用いることで回収可能なことを報告している（全体が参照として本明細書に組み入れられるＢｕｒｇｏｙｎｅ、米国特許第５，４９６，５６２号）。核酸を解放させる別の方法には、水溶液中にキレート化剤を含む緩衝液が用いられる（例えば参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第９９／３９０１０号、国際公開公報第９９／３８９６２号、および国際公開公報第９９／３９００９号を参照）。
【００１４】
本発明は、現在当技術分野で用いられている方法と比較して比較的単純な、固体マトリックスからＤＮＡを解放させる方法を提供する。また本発明の方法で解放されたＤＮＡは、いくつかの過程（例えば遺伝子型解析）に直接使用することができる。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明は、固体マトリックスから核酸分子（例えばＤＮＡ）を除去するための組成物および方法に関する。特に本発明の方法では、核酸分子の解放を促す解放性試薬が使用される。本発明はさらに、このような方法に関連する組成物を提供する。
【００１６】
本発明は、核酸分子の精製法および／または単離法にも関する。
【００１７】
１つの一般的な局面では、本発明は、１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を固体マトリックスに接触させる段階を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去する方法を提供する。
【００１８】
別の一般的な局面では、本発明は、以下の段階を含む核酸分子の精製法および／または単離法を提供する：（ａ）核酸分子を固体マトリックスに、核酸分子が固体マトリックスに固着、付着、会合、および／または結合（共有結合的もしくは非共有結合的に）しやすい条件下で接触させる段階；ならびに（ｂ）結合状態の核酸分子を含む固体マトリックスに、１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから核酸分子を解放させる条件下で接触させる段階。関連する局面では、本発明の方法は、固体マトリックスから解放された核酸分子を含む解放性試薬を回収する段階をさらに含む。
【００１９】
特定の態様では、本発明の方法に使用される固体マトリックスは、１種もしくは複数の弱塩基、１種もしくは複数のキレート化剤、１種もしくは複数の陰イオン性表面活性剤、１種もしくは複数の陰イオン性界面活性剤、尿酸、および／または１種もしくは複数の尿酸塩などの、核酸分子の分解を防いだり抑えたりする化合物を含む。
【００２０】
他の特定の態様では、本発明の方法に使用される固体マトリックスは、セルロースをベースとしたマトリックス、またはマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスである。本発明の特定の態様では、固体マトリックスは濾紙（例えばＷｈａｔｍａｎ  ３ＭＭ濾紙）、またはＦＴＡ（登録商標）紙のいずれかである。
【００２１】
さらに他の特定の態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬中に存在するアルカノールアミンはエタノールアミンを含む。特にエタノールアミンは、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、またはトリエタノールアミンの場合がある。
【００２２】
関連する態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬は、複数のエタノールアミン（例えば２種もしくは３種のエタノールアミン）を含む。
【００２３】
ある態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬は水溶液である。
【００２４】
特定の態様では、本発明の方法で使用される解放性試薬のｐＨは約８．３〜約１３、または約１０〜約１２の範囲である。本発明の特定の態様では、解放性試薬のｐＨは約１１である。
【００２５】
本発明の他の特定の態様では、１種または複数のアルカノールアミンが、解放性試薬中に約０．０１％〜約５％（容積／容積）、約０．０１％〜約３％（容積／容積）、約０．０１％〜約１％（容積／容積）、または約０．１％〜約１％（容積／容積）の濃度で存在する。
【００２６】
別の態様では、核酸分子を含む固体マトリックスを、約１〜約１８０分間、約１〜約１２０分間、約１０〜約６０分間、または約１０〜約３０分間かけて解放性試薬とインキュベートする。
【００２７】
他の態様では、核酸分子を含む固体マトリックスを解放性試薬と約６５℃〜約１００℃、または約９０℃〜約１００℃でインキュベートする。
【００２８】
ある態様では、本発明の方法は、解放された核酸分子を解放性試薬から分離する段階を含む。
【００２９】
別の態様では、本発明の方法で固体マトリックスから解放された核酸分子は、ベクター（例えばプラスミド、人工染色体など）を含む。同様に、本発明の方法で固体マトリックスから解放された核酸分子は、細胞またはウイルスの核酸分子（例えば細胞またはウイルスのゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡなど）を含む場合がある。
【００３０】
別の局面では、本発明は、本発明の方法で精製および／または単離された核酸分子を含む。特定の態様では、本発明の方法で精製および／または単離された核酸分子は、分子生物学的処理（例えばＰＣＲによる増幅）に使用することができる。関連する局面では、本発明はさらに、本発明の方法で作製された核酸分子を導入する段階を含む、組換え宿主細胞を作製する方法に関する。
【００３１】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、ＲＮＡをＤＮＡから分離する方法を提供する：（ａ）ＲＮＡおよびＤＮＡを含む試料を固体マトリックスに接触させる段階；（ｂ）（ａ）の固体マトリックスに洗浄液を、ＤＮＡを保持しながらＲＮＡを十分除去する条件下（例えば固体マトリックスの１秒〜９０分間の洗浄）で接触させる段階；および（ｃ）１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスからＤＮＡを解放させる条件下で、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。
【００３２】
さらに別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、閉環状核酸分子を直鎖状核酸分子から分離する方法を提供する：（ａ）閉環状核酸分子および直鎖状核酸分子を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階；（ｂ）（ａ）の固体マトリックスに洗浄液を、直鎖状核酸分子を保持しながら閉環状核酸分子を十分除去する条件下（例えば固体マトリックスの１秒〜９０分間の洗浄）で接触させる段階；ならびに（ｃ）１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから直鎖状核酸分子を解放させる条件下で、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階
【００３３】
別の局面では、本発明は、以下の段階を含む、大きさを元に核酸分子を分離する方法をさらに提供する：（ａ）異なる大きさの核酸分子を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階；（ｂ）（ａ）の固体マトリックスに洗浄液を、大きい核酸分子を保持しながら小さい核酸分子を十分除去する条件下（例えば固体マトリックスの１秒〜９０分間の洗浄）で接触させる段階；および（ｃ）１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を、固体マトリックスから、より大きい核酸分子を解放させる条件下で、洗浄後の固体マトリックスに接触させる段階。
【００３４】
特定の態様では、本発明の方法で使用される洗浄液は、１０  ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．３）、水、またはＦＴＡ（登録商標）  精製用試薬（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号１０８７６−０１９）を含む。関連する特定の態様では、これらの洗浄液は、１種または複数の界面活性剤をさらに含む。
【００３５】
他の特定の態様では、固体マトリックスを、約１秒間、約３秒間、約５秒間、約２０秒間、約３０秒間、約４５秒間、約１分間、約５分間、約１０秒間、および約３０分間からなる群より選択される時間をかけて洗浄する。
【００３６】
核酸分子を相互の大きさを元に分離する別の特定の態様では、平均サイズが約１ｋｂ〜約５０ｋｂの核酸分子を、平均サイズが約１００ｋｂ〜約１，０００ｋｂの核酸分子から分離し；平均サイズが約５０ｋｂ〜約１００ｋｂの核酸分子を、平均サイズが約２５０ｋｂ〜約５００ｋｂの核酸分子から分離し；または平均サイズが約５０ｋｂ〜約１００ｋｂの核酸分子を、平均サイズが約１，０００ｋｂ〜約４，０００ｋｂの核酸分子から分離する。
【００３７】
本発明はさらに、核酸分子、固体マトリックス、および１種または複数のアルカノールアミンを含む解放性試薬を含む組成物を提供する。
【００３８】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための、ならびに本発明の組成物を調製するためのキットにも関する。したがって１つの一般的な局面では、本発明は、（１）本発明の１種または複数の解放性試薬、および（２）以下からなる群より選択される１種または複数の成分を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去するためのキットを提供する：（ａ）少なくとも１種の固体マトリックス；（ｂ）試料を固体マトリックスにアプライするための少なくとも１種の装置；（ｃ）固体マトリックスを切断して、試料を含む切片にする少なくとも１種の装置；ならびに（ｄ）少なくとも１種の洗浄液。
【００３９】
特定の態様では、試料を固体マトリックスにアプライするための装置は、ピペット（例えばピペットマン（Ｐｉｐｅｔｍａｎ）（商標）  モデルＰ−２、Ｐ−１０、Ｐ−２０、Ｐ−１００、Ｐ−２００など、Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．、Ｒａｉｎｉｎ  Ｒｏａｄ、Ｂｏｘ  ４０２６、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、０１８８８）を含む。関連する態様では、試料を固体マトリックスにアプライするための装置（例えばピストンを用いる装置であるハンマーなど）によって、試料を粉砕して固体マトリックスの表面に押しつける。このような装置は、試料が植物から得られた材料を含む場合に特に有用である。別の関連する特定の態様では、試料をアプライするための装置は、複数の試料を固体マトリックスに一度にアプライすることができる。
【００４０】
別の態様では、固体マトリックスを切片に切断する装置によって、さまざまな形状（例えば円形、正方形、長方形、不定形など）のマトリックスの小片が得られる。
【００４１】
さらに別の特定の態様では、本発明のキットの洗浄液は、１０  ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．３）、水、またはＦＴＡ（登録商標）  精製用試薬（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号１０８７６−０１９）を含む。関連する特定の態様では、本発明のキットの洗浄液は、１種もしくは複数の界面活性剤をさらに含む。
【００４２】
本発明の他の態様は、当技術分野で周知の知見、以下の図面、および本発明の説明、ならびに請求項を考慮して、当業者に明らかになると思われる。
【００４３】
好ましい態様の詳細な説明
Ｉ．定義
以下の定義は、本発明の主題を明確にするために提供する。
【００４４】
固体マトリックス：
本明細書で用いられる「固体マトリックス」という表現は、核酸分子が、セルロースをベースとした材料（例えばセルロースをベースとした濾紙）、およびマイクロメッシュ状の合成プラスチックマトリックスを含むがこれらに限定されない材料に固着し、（共有結合的もしくは非共有結合的に）結合し、付着し、および／または会合する、任意の固相支持体を意味する。このような材料の一例はＦＴＡ（登録商標）紙である（Ｆｉｔｚｃｏ  Ｉｎｃ．、５６００  Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｃｒｅｅｋ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｐｌｅ  Ｐｌａｉｎ、ＭＮ  ５５３５９  ＵＳＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、９８００  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ２０８５０  ＵＳＡ、カタログ番号１０７８６−０３６）。他の例には、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌのグレード９０３、７０４Ｅ、４０２、４０４、および５７７の濾紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、１０  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｋｅｅｎｅ、Ｎ．Ｈ．  ０３４３１  ＵＳＡ）；Ｗｈａｔｍａｎ  ＢＦＣ１８０、Ｎｏ．１、Ｎｏ．４０、Ｎｏ．４２、Ｎｏ．５０、および３ＭＭ濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｋｅｎｔ、ＵＫ）；ニトロセルロース：ならびにセルロースアセテートなどがある。
【００４５】
本発明の多くの態様では、使用される固体マトリックスは、セルロースをベースとした濾紙、または他の種類の濾紙（例えば植物繊維などのパルプ繊維から得られる層状集塊（ｌａｍｉｎａｒ  ｃｏｎｇｌｏｍｅｒａｔｅ））である。このような種類の固体マトリックスは、比較的安価で、また本発明の方法で通常良好に機能することから本質的に有用である。
【００４６】
本発明の用途に適した固体マトリックスには、病原体（例えば単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなど）を不活性化するマトリックスが含まれる。この特徴は、固体マトリックスにアプライされる試料が、ヒト（例えば唾液、口腔スワブ、全血など）から得られる場合に特に有利である。
【００４７】
固体マトリックスには、細胞の溶解を誘導する薬剤を含浸させることもできる。このような薬剤の例には、陰イオン性界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、陽イオン性界面活性剤（例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ミリスチルトリメチルアンモニウム（ＭＴＡＢ）、塩化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＯＤＭＡＣ））、非イオン性界面活性剤（例えばツイーン（ＴＷＥＥＮ）  ８０、トライトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００）、酵素、塩類、カオトロピック剤（例えば塩酸グアニジン）などがある。
【００４８】
特定の態様では、固体マトリックスは、ガラス（例えば多孔性ガラスビーズ）、およびプラスチック（例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンなど）を含む場合がある。
【００４９】
本発明の用途に適した固体マトリックスは、ビーズ、フィルター、膜、シート、カラムなどの任意の形状または構造をとりうる。
【００５０】
アルカノールアミン：
本明細書で用いられる「アルカノールアミン」という用語は、少なくとも１個のアミノ基、および少なくとも１個のアルコール基を含むＣ２−Ｃ５０化合物を意味する。このような化合物の例には、Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ−メチルジエタノールアミン、３−アミノプロピルジエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、Ｎ−メチルエタノールアミン、２−（ジブチルアミノ）エタノール、２−（ジイソプロピルアミノ）エタノール、２−（イソプロピルアミノ）エタノール、２−（プロピルアミノ）エタノール、２−（ｔｅｒｔ−ブチルアミノ）エタノール、２−ベンジルアミノエタノール、２−ブチルアミノエタノール、Ｎ−フェニルエタノールアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミン、ならびにさまざまなアルカノールアミンの混合物などがある。上記のアルカノールアミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（３０５０  Ｓｐｒｕｃｅ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ６３１０３  ＵＳＡ）などの業者から入手することができる。ある態様では、アルカノールアミンは、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、タンパク質、および／または分子量が１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００を越える分子を含まない。
【００５１】
解放性試薬：
本明細書で用いられる「解放性試薬」は、固体マトリックスからの核酸分子の解放を誘導する本発明の試薬を意味する。本発明の解放性試薬は、１種または複数のアルカノールアミンを含む。解放性試薬の他の特徴については後述する。
【００５２】
核酸分子：
本明細書で用いられる「核酸分子」という表現は、ＤＮＡなどの、プリン塩基およびピリミジン塩基に連結されたリン酸とデオキシリボースが交互に出現する鎖を含む分子（例えばＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、二重微小染色体、人工染色体、染色体外因子、合成ＤＮＡなど）を意味する。核酸分子の代表例には、ベクター（例えばプラスミド、酵母人工染色体、哺乳類人工染色体、細菌人工染色体など）、ならびに原核生物、真核生物、およびウイルス（例えばエプスタイン・バーウイルス、１型ウシパピローマウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、マイコプラズマウイルスＰ１など）のゲノム核酸分子などがある。
【００５３】
精製された：
本明細書で用いられる、生物分子（例えば核酸）に関して用いられる「精製された」という用語は、分子が周囲の分子群および／または材料から分離されることを意味する。したがって「精製された」とは、精製対象分子の近傍に存在する分子および／または材料に関する条件の変化に基づく相対的な用語である。したがって例えば、細胞溶解後に固体マトリックスに固着し、付着し、（共有結合的もしくは非共有結合的に）結合し、および／または会合するゲノム核酸分子は、少なくとも数種の細胞片、タンパク質、および／または糖質が洗浄段階で除去される場合に精製されたとみなされる。このような同じゲノム核酸分子は、固体マトリックスから本発明の方法で解放される場合にも精製される。この用語は、すべての除去対象物が精製対象分子から除去されることを意味することを意図しない。したがって、ある程度の量の混入物が、精製後の分子と共存する場合がある。
【００５４】
実際の応用に関して、水、塩類、および緩衝物などの材料の濃度は、生物分子が精製されているか否かを判定する際には考慮されない。したがって一例として、カラムクロマトグラフィーで他の生物分子から分離されているが、同過程で水性緩衝液で希釈された状態にある核酸分子は未だ、クロマトグラフィーによる分離プロセスで精製された状態にあるとみなされる。
【００５５】
単離された：
本明細書で用いられる、生物分子（例えば核酸）に用いられる「単離された」という用語は、分子が生物系（例えば細胞内）に結合していた場合に、分子の周囲に存在する実質的にすべての分子群および／または材料から分子が分離されていることを意味する。生物分子が精製されているか否かを判定する際には、水、塩類、および緩衝物などの材料の濃度は、生物分子が「単離されている」か否かを判定する際に考慮されない。
【００５６】
平均サイズ：
本明細書で用いられる「平均サイズ」という表現は、集団中の少なくとも８５％の分子の大きさが、この値の約±１０％であることを意味する。例えば、この値が１００ｋｂで、集団中の９０％の核酸分子が９０〜１１０ｋｂの範囲内にあるとき、集団の平均サイズは１００ｋｂである。同じことが、核酸分子集団の９８％が９０〜１１０ｋｂの範囲内にあるときにあてはまることは言うまでもない。
【００５７】
１種または複数：
本明細書で用いられる「１種または複数」という表現は、１種もしくは２種以上を意味する。当業者であれば理解するように、２種以上という意味は特定の文脈では変わる場合がある。例えば、１種または複数のエタノールアミンの用途について言う場合、当業者は、この表現が一定数のエタノールアミン、１種、２種、もしくは３種のエタノールアミン、またはこれらのエタノールアミンの混合物を意味すると認識すると思われる。しかし、１種または複数の核酸分子について言う場合、当業者であれば、このような分子の集団中に存在する場合がある核酸分子のさまざまな数から、「１種または複数」という表現が１種、２種、３種、４種、５種、１０種、２０種、３０種、５０種、１００種、１，０００種、または１，０００，０００種を意味すると理解すると思われる。したがって特定の状況では、「１種または複数」という表現は例えば、１種、２種、３種、４種、５種、１０種、１５種、２０種、３０種、５０種、１００種、２００種、１，０００種、２，０００種、５，０００種、１０，０００種、１００，０００、１，０００，０００種、５，０００，０００種、１０，０００，０００種、５０，０００，０００種、１００，０００，０００種、１，０００，０００，０００種などを意味する。
【００５８】
ベクター：
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有する核酸分子を意味する。ベクターは、このような分子が、本質的な生物学的機能を失うことなく切断されて、核酸分子内にスプライスされて複製およびクローニングが行われる少数のエンドヌクレアーゼ制限酵素切断部位を有することを特徴とする場合もある。ベクターの例には、プラスミド、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、コスミド、フォスミド、ファジミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）などがある。ベクターはさらに、ＰＣＲ用、転写および／または翻訳用のプライマー結合部位、および／または制御部位、組換えシグナル、レプリコンなどを提供する場合がある。またベクターは、これらのベクターで形質転換した細胞、またはトランスフェクトした細胞の同定における使用に適した、１種もしくは複数の選択可能なマーカー（例えばカナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性などをもたらす核酸分子）をさらに含む場合がある。
【００５９】
本発明の特定の態様では、「ベクター」という用語は、約５０ｋｂ未満、約７５ｋｂ未満、約１００ｋｂ未満、約１２５ｋｂ未満、約１５０ｋｂ未満、約１７５ｋｂ未満、約２００ｋｂ未満、または約２５０ｋｂ未満の核酸分子を含まない。本発明の他の特定の態様では、「ベクター」という用語はプラスミドを含まない。
【００６０】
本発明によれば、任意のベクターを使用することができる。特に、当技術分野で周知で、また市販されているベクター（およびベクターの変異体または誘導体）を本発明で使用することができる。このようなベクターは例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＢ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓから入手することができる。このようなベクターは次に例えば、対象核酸分子のクローニングまたはサブクローニングに使用することができる。一般的なクラスの特定の対象ベクターには、原核生物および／または真核生物のクローニングベクター、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッドベクター、またはリバースツーハイブリッドベクター、異なる宿主に使用されるシャトルベクター、変異誘発ベクター、転写用ベクター、大きな挿入を取り込むベクターなどが含まれる。
【００６１】
他の対象ベクターには、ウイルス起源のベクター（Ｍ１３ベクター、バクテリオファージλベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター）、コピー数の程度を高、中、低に調節可能なベクター、１種類の宿主の併用に互換性のあるレプリコンを有するベクター（ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）、ならびに真核生物のエピソーム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）などがある。
【００６２】
試料：
本明細書で用いられる「試料」という用語は、核酸分子を含み、固体マトリックスにアプライされる材料を意味する。試料の例には、細菌細胞、細菌細胞ホモジネート、真菌細胞、原生生物細胞、プレートから得られるウイルスプラーク、塩化セシウム遠心法で単離されるウイルス材料（例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ）、ヒト口腔スワブ、ヒト血液、精製ヒト血液細胞、血液細胞ホモジネート、ならびに植物材料（葉、根、茎、および果実など）が含まれる。したがって「試料」という用語は、核酸分子を含み、固体マトリックスにアプライ可能な状態の任意の材料を含む。
【００６３】
後述するように、固体材料は固体マトリックスに直接アプライすることが可能であるほか、このような材料の溶液もしくは懸濁物をアプライする前に調製することができる。
【００６４】
保存：
本明細書で用いられる「保存」という用語は、試料がアプライされた固体マトリックスを一定期間維持することを意味する。固体マトリックスは例えば、一定の湿度で約２０℃〜３０℃で５年間保存することができる。低い保存温度は、約０℃〜２０℃、−２０℃〜０℃、および−８０℃〜−２０℃の場合がある。
【００６５】
本明細書で用いられる、組換えＤＮＡ技術、ならびに分子生物学および細胞生物学の分野で用いられる他の用語は一般に、適用可能な分野の当業者であれば理解することができる。
【００６６】
ＩＩ．本発明の組成物および方法
上述したように、核酸分子が固着する、付着する、（共有結合的もしくは非共有結合的に）結合する、および／または会合する固体マトリックスは、当技術分野で、保存を含むさまざまな応用に使用されている。また、固体マトリックスに結合した状態の核酸分子は生化学反応（例えばＰＣＲ）に使用することができる。
【００６７】
本発明は、固体マトリックスから核酸分子を除去するための新しい組成物および方法に関する。特に本発明の方法は、核酸分子を結合させる固体マトリックスに、１種もしくは複数（例えば１種、２種、３種など）のアルカノールアミンを含む溶液を接触させる段階に関する。
【００６８】
１つの比較的具体的な局面では、本発明は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるための、以下の過程および試薬に関する。水溶液中に核酸分子を含む試料を固体マトリックス（例えばＷｈａｔｍａｎ  ３ＭＭ濾紙、ＦＴＡ（登録商標）紙など）上にスポットする。次に、試料を含む固体マトリックスを乾燥させる。乾燥した固体マトリックスを次に、１種または複数のアルカノールアミン（例えばエタノールアミン）を含む解放性試薬中に配し、３０分間沸騰させる。結果として得られた溶液を次に室温まで冷却して固体マトリックスを除去する。この溶液を次に、５０倍容のＰＣＲ緩衝液で希釈し、標準的なプロトコルで核酸分子をＰＣＲで増幅する。
【００６９】
エタノールアミンは、緩衝剤として使用されることの多いアルカノールアミン類の１種である。水素結合および疎水的相互作用が強いため、エタノールアミンは通常、室温で粘稠な液体である。またエタノールアミンは、ＯＨ基およびＨ＋基に対して強い親和性を有する。エタノールアミンはまた、溶液中で数種の金属イオンと複合体を形成する。このような複数の特性のすべてによって、エタノールアミンは、固体マトリックスから核酸を解放させる優れた試薬と言える。
【００７０】
エタノールアミンはｐＨ  １０あたりでかなりの緩衝能を示す。ｐＨ  １０では、多くの固体マトリックスは、−ＣＯＯＨ基、および−Ｓｉ−ＯＨ基が存在するために負に帯電している。理論に拘泥されることは望まれないが、ある塩基性ｐＨにおける固体マトリックスの負電荷は、核酸分子の荷電性表面からの解放を招くと考えられる。
【００７１】
またエタノールアミンは、核酸分子と水素結合を介して強く相互作用すると考えられている。この相互作用は、固体マトリックスからの核酸分子の抽出を促すと考えられている。またエタノールアミンは、金属イオンを核酸分子と共有する場合がある。というのは両化合物とも、可溶性の金属イオン複合体を形成可能であるからである。これは、エタノールアミンと核酸分子の可溶性複合体の形成につながると考えられている。
【００７２】
後述するように、任意の核酸分子を保存して、本発明の方法および組成物を用いて後に回収することができる。また核酸分子は、固体マトリックスと固着、付着、（共有結合的もしくは非共有結合的に）結合、および／または会合した後に、固体マトリックスから解放される能力を元に、他の材料から分離することができる。特に本発明の方法および組成物は、核酸分子（例えば染色体ＤＮＡ、ベクター、ウイルスの核酸分子など）を固体マトリックス（例えばＦＴＡ（登録商標）紙、またはこの誘導体、バリアント、もしくは修飾物）に接触させ、解放性試薬を用いて放出させる単純かつ効率の良い過程に関する。また詳しく後述するように、解放された核酸分子は、これも解放性試薬で解放される他の細胞材料から分離することもできる。したがって本発明は、核酸分子を精製および／または同定する方法をさらに提供する。
【００７３】
本発明の用途に適した固体マトリックスには、セルロースをベースとした吸収性のマトリックス（例えばセルロースをベースとした紙）、または合成プラスチック材料のマイクロメッシュ（参照として全体が本明細書に組み入れられる米国特許第５，４９６，５６２号に記載されているものなど）を含む固体マトリックスなどが含まれる。また固体マトリックスは、弱塩基、キレート化剤、陰イオン性表面活性剤、または陰イオン性界面活性剤、および選択的に、尿酸もしくは尿酸塩を含む組成物の場合がある。ＦＴＡ（登録商標）紙およびこの誘導体、変形体、および修飾物は、このような固体マトリックスに含まれる。
【００７４】
一般に、試料が短期間（例えば１か月未満など）の保存だけを意図される場合、固体マトリックスは通常、核酸分子を安定化させる薬剤（例えばキレート化剤、界面活性剤、および尿酸もしくは尿酸塩などの薬剤）を含まない。また試料が長期間（例えば１か月以上）の保存たけを意図される場合、固体マトリックスは、核酸分子を安定化させる薬剤を含む場合がある。
【００７５】
本発明の用途に適した固体マトリックスは、任意の数の形状または状態の場合がある。例えば固体マトリックスは、平面シート、またはチューブ内に充填された状態の場合がある。多数の分離後の試料を使用する場合に、平面シート状の固体マトリックスを使用することは通常有利である。平面シート、およびチューブ内に充填された状態の固体マトリックスは、加圧、遠心、または重力を利用した試料および試薬の流れを用いる、核酸の精製および単離のプロトコルに使用することができる。
【００７６】
本発明の組成物および方法は、（１）精製された核酸分子、または（２）核酸分子を含む粗調製物とともに使用することができる。したがって本発明は、核酸分子を試料（例えばヒト血液、植物細胞ホモジネート、葉、種子、細菌細胞、ウイルス、ウイルスプラークなど）から精製および／または単離する方法を提供する。
【００７７】
本発明の用途に適した試料は数多くの供給源から得られる。本発明の用途に適した試料の供給源は、口腔スワブ、植物細胞抽出物、植物組織、種子、動物体液、動物組織、器官、細菌培養物、真菌培養物、原生動物培養物；およびウイルスプラークなどから得られる。
【００７８】
上述したように、固体マトリックスにアプライされる１つの一般的な試料がヒト血液である。ヒト血液中に存在するＤＮＡの大部分は、白血球のミトコンドリアＤＮＡおよび核ＤＮＡである。例えば、ヒト血液をＦＴＡ（登録商標）紙にアプライすると血液細胞が溶解し、核酸分子が紙に固着し、多くの病原体が不活性化される。
【００７９】
状況によっては、固体マトリックスは、これに結合した状態の核酸分子の分解を防ぎ、また病原体を不活性化する。このような機能を発揮させるために使用可能な多数の薬剤が当技術分野で周知であり、界面活性剤、キレート化剤、抗生物質、ならびに酵素（例えばプロテイナーゼ、リパーゼ、およびヌクレアーゼ）などが含まれる。
【００８０】
固体マトリックスに使用される薬剤は一般に、後にマトリックスから解放される核酸分子の質を実質的に低下させない濃度で選択されたり使用されたりする。例えば固体マトリックスからＤＮＡを回収したい場合、ＲＮＡを選択的に分解する薬剤でマトリックスを処理する。このような薬剤の例には、ＲＮＡｓｅや強塩基などが含まれる。当技術分野で周知の通り、ＤＮＡとは異なりＲＮＡはアルカリ条件下で加水分解を受ける。アルカリ条件は、多くの微生物の成長を阻害することも知られている。したがって固体マトリックスのｐＨは、ＲＮＡを分解するために、また微生物の成長を阻害するために調節することができる。
【００８１】
本発明の解放性試薬を用いて核酸分子を解放させる前に、核酸分子が結合した状態の固体マトリックスを処理して、溶媒、界面活性剤、タンパク質、他の核酸分子（例えばＤＮＡが対象となる場合はＲＮＡ）、塩類などを除去することができる。タンパク質を例えばＦＴＡ（登録商標）紙から除去する際に当技術分野で現在用いられている１つの方法はフェノール抽出法である（例えばＢｕｒｇｏｙｎｅ、米国特許第５，４９６，５６２号を参照）。また水溶性化合物（例えば界面活性剤や塩類など）は、マトリックスを水溶液（例えば脱イオン水）で処理することで除去できる。同様に揮発性薬剤は、マトリックスを空気または真空に曝露することで除去できる。
【００８２】
試料をアプライした後、核酸を解放させる前の固体マトリックスの処理は、特定の応用によって変わる。例えば試料がタンパク質や脂質などのかなりの量の混入物質を含む状況では、このような材料を除去したり分解したりする薬剤で固体マトリックスを処理することには利点がある場合がある。また上述したように、タンパク質は固体マトリックスからフェノール抽出法で、また選択的にＥＤＴＡなどの金属イオンキレート化剤を添加してフェノールを安定化させることで除去することができる（Ｐｅｒｌｍａｎによる米国特許第５，０９８，６０３号を参照）。同様に、脂質および他の疎水性分子は、有機溶媒もしくは界面活性剤（例えば陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤）で洗浄することで抽出することで除去できる。
【００８３】
固体マトリックスは、存在する薬剤を試料添加前に除去するように処理することもできる。例えばＦＴＡ（登録商標）紙は、試料に含まれる細胞の溶解を促す界面活性剤を含む。状況によっては、核酸を解放させる前に界面活性剤を除去することが有利な場合がある。このような界面活性剤を除去する１つの方法では、ＦＴＡ（登録商標）紙を水で洗浄する。特定の状況では、適切な他の洗浄液は、水のほかに１０  ｍＭ  トリス、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．３または８．０）、およびＦＴＡ（登録商標）  精製用試薬（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号１０８７６−０１９）を含む。
【００８４】
本発明の方法は、大きさ、および／または種類（例えばＲＮＡかＤＮＡか、プラスミドＤＮＡか染色体ＤＮＡか）などの物理的特性に基づいて核酸分子を分離する際にも用いることもできる。例えば大きい核酸分子は小さい核酸分子と比較して、固体マトリックスにより強く結合する。また核酸分子の大きさが増すと、このような分子は、より強く固体マトリックスに結合すると考えられる。したがって小さい核酸分子（例えばプラスミド）は、大きい核酸分子（例えば染色体ＤＮＡ）より容易に固体マトリックスから除去される。またプラスミドなどの閉環状核酸分子は、洗浄段階で固体マトリックスから解放されることが少なくない。これは直鎖状核酸分子が閉環状核酸分子と比べて、固体マトリックスと強く結合すると考えられているためである。またＤＮＡはＲＮＡと比較して固体マトリックスと強く結合すると考えられている。
【００８５】
上述したように、本発明は、一連の物理的特性の任意の１つを元に、核酸分子を他の核酸分子から分離する方法をさらに提供する。例えば本発明は１つの局面で、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階と、これに続く、洗浄液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、ＤＮＡをＲＮＡから分離する方法を提供する。固体マトリックスに結合したままの核酸分子（例えばＤＮＡ）は次に、洗浄後の固体マトリックスに本発明の解放性試薬を接触させることで解放させることができる。
【００８６】
当業者であれば理解するように、例えばプラスミドＤＮＡの場合は、試料を含む固体マトリックスを解放性試薬で、洗浄段階を分断することなく、または極めて短い洗浄段階（例えば約３秒間）処理することが有利な場合がある。また例えば真核生物のゲノムＤＮＡ（例えば植物細胞や動物細胞のゲノムＤＮＡ）の場合、試料を含む固体マトリックスを１種もしくは複数の洗浄液で洗浄すること、または解放性試薬をマトリックスに接触させる段階に先立つ段階が有利な場合がある。
【００８７】
１つの局面では、本発明は、直鎖状核酸分子（例えば剪断された染色体ＤＮＡ）を閉環状核酸分子（例えばプラスミド）から分離する方法を提供する。したがって本発明は、直鎖状核酸分子と閉環状核酸分子の両方を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階と、これに続く、洗浄液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、直鎖状核酸分子を閉環状核酸分子から分離する方法をさらに提供する。固体マトリックスに結合したままの核酸分子は次に、洗浄後の固体マトリックスに本発明の解放性試薬を接触させることで解放させることができる。
【００８８】
また、より大きい核酸分子は、より小さい核酸分子と比較して強く固体マトリックスと結合するので、本発明は、大きさが異なる核酸分子を分離する方法をさらに提供する。したがって本発明は、より小さい核酸分子と、より大きい核酸分子の両方を含む試料を固体マトリックスに接触させる段階、およびこれに続く、洗浄液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、より小さい核酸分子を、より大きい核酸分子から分離する方法をさらに提供する。固体マトリックスに結合状態で留まる核酸分子は次に、洗浄後の固体マトリックスに本発明の解放性試薬を接触させることで解放させることができる。
【００８９】
洗浄条件は例えば、より大きい核酸分子をマトリックスに固着、付着、（共有結合的もしくは非共有結合的に）結合、および／または会合させたまま、特定の大きさの、より小さい核酸分子を解放を促すように調節することができる。調節可能な洗浄条件の一例が洗浄時間の長さである。例えば固体マトリックスは、洗浄液で約１秒間、約５秒間、約１０秒間、約２０秒間、約３０秒間、約４５秒間、約１分間、約２分間、約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約３０分間、約４５分間、約６０分間、約７５分間、または約９０分間洗浄することができる。当業者であれば理解するように、さまざまな洗浄条件が、さまざまな大きさの核酸分子の解放に及ぼす作用は、例えばゲル電気泳動法で容易に調べることができる。したがって当業者であれば、特定の大きさの核酸分子を、洗浄して固体マトリックスから除去し、また特定の大きさの核酸分子を同マトリックスに結合させたままとするように、洗浄条件を容易に調節することができる。また上述したように、このようなマトリックスに会合状態で留まる核酸分子は、本発明の解放性試薬を用いて後にマトリックスから除去することができる。
【００９０】
上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約５０ｋｂまたはこれ以上（例えば約５０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１５０ｋｂ、約２００ｋｂ、約２５０ｋｂ、約３００ｋｂ、約３５０ｋｂ、約４００ｋｂ、約４５０ｋｂ、約５００ｋｂ、約６００ｋｂ、約７００ｋｂ、約８００ｋｂ、約９００ｋｂ、約１，０００ｋｂ、約１，５００ｋｂ、約２，０００ｋｂ、約２，５００ｋｂ、約３，０００ｋｂ、または約４，０００ｋｂ）の場合がある。また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約５０ｋｂ未満（例えば約１ｋｂ、約５ｋｂ、約１０ｋｂ、約２０ｋｂ、または約４０ｋｂ）の場合がある。
【００９１】
同様に、上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約１５０ｋｂまたはこれ以上（例えば約１５０ｋｂ、約２００ｋｂ、約２５０ｋｂ、約３００ｋｂ、約３５０ｋｂ、約４００ｋｂ、約４５０ｋｂ、約５００ｋｂ、約６００ｋｂ、約７００ｋｂ、約８００ｋｂ、約９００ｋｂ、約１，０００ｋｂ、約１，５００ｋｂ、約２，０００ｋｂ、約２，５００ｋｂ、約３，０００ｋｂ、または約４，０００ｋｂ）の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約１５０ｋｂ未満（例えば約１ｋｂ、約５ｋｂ、約１０ｋｂ、約２０ｋｂ、約４０ｋｂ、約８０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１２０ｋｂ、または約１４０ｋｂ）の場合がある。
【００９２】
また、上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約２５０ｋｂもしくはこれ以上（例えば約２５０ｋｂ、約３００ｋｂ、約３５０ｋｂ、約４００ｋｂ、約４５０ｋｂ、約５００ｋｂ、約６００ｋｂ、約７００ｋｂ、約８００ｋｂ、約９００ｋｂ、約１，０００ｋｂ、約１，５００ｋｂ、約２，０００ｋｂ、約２，５００ｋｂ、約３，０００ｋｂ、または約４，０００ｋｂ）の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約２５０ｋｂ未満（例えば約１ｋｂ、約５ｋｂ、約１０ｋｂ、約２０ｋｂ、約４０ｋｂ、約８０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１２０ｋｂ、約１４０ｋｂ、約１６０ｋｂ、約１８０ｋｂ、約２００ｋｂ、約２２０ｋｂ、または約２４０ｋｂ）の場合がある。
【００９３】
また上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約５００ｋｂもしくはこれ以上（例えば約５００ｋｂ、約６００ｋｂ、約７００ｋｂ、約８００ｋｂ、約９００ｋｂ、約１，０００ｋｂ、約１，５００ｋｂ、約２，０００ｋｂ、約２，５００ｋｂ、約３，０００ｋｂ、または約４，０００ｋｂ）の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約５００ｋｂ未満（例えば約１ｋｂ、約５ｋｂ、約１０ｋｂ、約２０ｋｂ、約４０ｋｂ、約８０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１２０ｋｂ、約１４０ｋｂ、約１６０ｋｂ、約１８０ｋｂ、約２００ｋｂ、約２２０ｋｂ、約２４０ｋｂ、約２５０ｋｂ、約３００ｋｂ、約３５０ｋｂ、約４００ｋｂ、または約４５０ｋｂ）の場合がある。
【００９４】
また、上述の「より大きい核酸分子」は、平均サイズが約１，０００ｋｂもしくはこれ以上（例えば約１，０００ｋｂ、約１，５００ｋｂ、約２，０００ｋｂ、約２，５００ｋｂ、約３，０００ｋｂ、または約４，０００ｋｂ）の場合があり、また上述の「より小さい核酸分子」は、平均サイズが約１，０００ｋｂ未満（例えば約１ｋｂ、約５ｋｂ、約１０ｋｂ、約２０ｋｂ、約４０ｋｂ、約８０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１２０ｋｂ、約１４０ｋｂ、約１６０ｋｂ、約１８０ｋｂ、約２００ｋｂ、約２２０ｋｂ、約２４０ｋｂ、約２５０ｋｂ、約３００ｋｂ、約３５０ｋｂ、約４００ｋｂ、約４５０ｋｂ、約５００ｋｂ、約５５０ｋｂ、約６５０ｋｂ、約７５０ｋｂ、約８５０ｋｂ、または約９５０ｋｂ）の場合がある。
【００９５】
また本発明の方法で用いられる解放性試薬が、固体マトリックスから除去されることが望まれる実質的な量の細胞混入物、または核酸分子を可溶化しない場合は、固体マトリックスの中間処理（例えば洗浄）が、解放性試薬による処理を行う前に必要な場合がある。このような状況の一例が、試料を種子材料から得る場合である。種子は多量の糖質を含む。本発明の解放性試薬では、固体マトリックスから実質的な量の種子糖質は解放されない。したがって試料が種子材料を含む多くの場合は、試料を固体マトリックスに直接アプライした後に、中間処理を行うことなく解放性試薬で処理することができる。結果として固体マトリックスから核酸分子が解放され、種子糖質の大部分はマトリックスに結合した状態で留まる。
【００９６】
本発明の解放性試薬は水性または非水性の場合がある。当業者であれば理解するように、解放性試薬の用途に適したさまざまなアルカノールアミンは、水溶液と非水溶液中で異なる溶解性を示す。また溶媒系の選択は、特定の応用、試料、および固体マトリックスによって変わる場合がある。本発明の解放性試薬に使用可能な非水性溶媒の例には、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などが含まれる。
【００９７】
本発明の方法の１つの特定の態様では、核酸分子を結合させる２  ｍｍのＦＴＡ（登録商標）紙のパンチを、１％  モノエタノールアミンの水溶液（ｐＨ  １１．０）を含む解放性試薬中に９０〜１００℃で２０分間浸す。この態様では、実施例２で詳述するように、実質的な量の核酸分子がＦＴＡ（登録商標）パンチから解放される。当業者であれば理解するように、このような方法は、特定の応用に適するように修正することができる。したがって１つの一般的な局面では、本発明は、特定の条件下で一定の期間、アルカノールアミンを含む溶液を固体マトリックスに接触させる段階を含む、固体マトリックスから核酸分子を除去する方法に関する。
【００９８】
特定の態様では、解放性試薬中のアルカノールアミン（例えばエタノールアミン）の濃度は、約０．０１％〜約５．０％（容積／容積）、約０．０１％〜約４．０％（容積／容積）、約０．０１％〜約３．０％（容積／容積）、約０．０１％〜約２．０％（容積／容積）、約０．０１％〜約１．０％（容積／容積）、約０．０１％〜約０．９％（容積／容積）、約０．０１％〜約０．８％（容積／容積）、約０．０１％〜約０．５％（容積／容積）、約０．１％〜約５．０％（容積／容積）、約０．１％〜約４．０％（容積／容積）、約０．１％〜約３．０％（容積／容積）、約０．１％〜約２．０％（容積／容積）、約０．１％〜約１．０％（容積／容積）、約０．１％〜約０．９％（容積／容積）、約０．１％〜約０．８％（容積／容積）、約０．１％〜約０．５％（容積／容積）、約０．２％〜約５．０％（容積／容積）、約０．２％〜約４．０％（容積／容積）、約０．２％〜約３．０％（容積／容積）、約０．２％〜約２．０％（容積／容積）、約０．２％〜約１．０％（容積／容積）、約０．２％〜約０．９％（容積／容積）、約０．２％〜約０．８％（容積／容積）、約０．２％〜約０．５％（容積／容積）、約０．４％〜約５．０％（容積／容積）、約０．４％〜約４．０％（容積／容積）、約０．４％〜約３．０％（容積／容積）、約０．４％〜約２．０％（容積／容積）、約０．４％〜約１．０％（容積／容積）、約０．４％〜約６．９％（容積／容積）、約０．４％〜約０．８％（容積／容積）、約０．４％〜約０．７％（容積／容積）、約０．８％〜約５．０％（容積／容積）、約０．８％〜約４．０％（容積／容積）、約０．８％〜約３．０％（容積／容積）、約０．８％〜約２．０％（容積／容積）、または約０．８％〜約１．０％（容積／容積）である。本発明は、約０．０１％（容積／容積）、約０．１％（容積／容積）、約０．２％（容積／容積）、約０．４％（容積／容積）、約０．７％（容積／容積）、約０．８％（容積／容積）、約０．９％（容積／容積）、約１．０％（容積／容積）、約１．１％（容積／容積）、約１．２％（容積／容積）、約１．４％（容積／容積）、約１．６％（容積／容積）、約１．８％（容積／容積）、約２．０％（容積／容積）、約２．５％（容積／容積）、約３．０％（容積／容積）、約３．５％（容積／容積）、約４．０％（容積／容積）、約４．５％（容積／容積）、または約５．０％（容積／容積）を含む解放性試薬をさらに含む。
【００９９】
使用されるアルカノールアミンの濃度は、特定のアルカノールアミン、試料中に存在する非核酸化合物の溶解度、解放性試薬のｐＨ、インキュベーション条件（例えばインキュベーション時間の長さ、およびインキュベーション温度）、ならびに使用される固体マトリックスを含む因子の数によって変わる。当業者であれば、特定の応用に適したアルカノールアミン濃度の決定法を理解すると思われる。同様に当業者であれば、特定の応用に適したアルカノールアミンの選択法を理解すると思われる。
【０１００】
本発明の解放性試薬のｐＨは例えば以下の範囲とすることができる：約８．０〜約１４．０、約８．５〜約１４、約９．０〜約１４．０、約９．５〜約１４．０、約１０．０〜約１４．０、約１０．５〜約１４．０、約１１〜約１４．０、約７．５〜約１３．５、約７．５〜約１３．０、約７．５〜約１２．５、約７．５〜約１２．０、約７．５〜約１１．５、約７．５〜約１１．０、約７．５〜約１０．５、約７．５〜約１０．０、約７．５〜約９．５、約８．０〜約１２．０、約８．０〜約１１．５、約８．０〜約１１．０、約８．５〜約１４．０、約８．５〜約１３．０、約８．５〜約１２．５、約８．５〜約１２．０、約８．５〜約１１．５、約８．５〜約１１．０、約９．０〜約１２．０、約９．０〜約１１．５、約９．０〜約１１．０、および約９．０〜約１０．５。本発明は、ｐＨが約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５、約１１．０、約１１．５、約１２．０、約１２．５、約１３．０、約１３．５、または約１４．０の解放性試薬をさらに含む。
【０１０１】
本発明の用途に適したアルカノールアミンは緩衝剤として作用しうる場合がある。したがって条件によっては、本発明の実施に使用されるアルカノールアミンを溶媒（例えば水）で希釈し、酸または塩基で直接ｐＨを調整することができる。他の状況では、解放性試薬中に緩衝剤（例えばトリス、２−［（トリス（ヒドロキシメチル）メチル）アミノ］−１−エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、メチルアミン、ＣＡＰＳ、４−シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、またはビシン（Ｂｉｃｉｎｅ））を含めることが求められたり、望ましい場合があったりする。本発明の解放性試薬の用途に適した緩衝剤は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（３０５０  Ｓｐｒｕｃｅ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ６３１０３  ＵＳＡ）などの業者から入手することができる。
【０１０２】
本発明の方法は、固体マトリックスを解放性試薬とさまざまな温度で、またさまざまなインキュベーション時間でインキュベートすることで実施できる。例えばインキュベーションは、約６５℃〜約１００℃、約７０℃〜約１００℃、約８０℃〜約１００℃、約９０℃〜約１００℃、約６５℃〜約９０℃、約７０℃〜約９０℃、約８０℃〜約９０℃、約６５℃〜約８０℃、または約７０℃〜約８０℃の温度範囲で実施することができる。またインキュベーションは、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、または約１００℃などの温度で実施することができる。
【０１０３】
上述したように、核酸を解放させることが望まれる固体マトリックスは、解放性試薬とさまざまな時間インキュベートすることができる。当業者であれば理解するように、長いインキュベーション時間は、解放性試薬中の核酸分子の濃度と、固体マトリックスに結合状態の核酸分子の濃度が平衡に至るまで核酸分子の解放をもたらす。
【０１０４】
固体マトリックスは解放性試薬と、１〜６０分間、５〜５０分間、１０〜４０分間、２０〜３０分間、２０〜４０分間、３０〜５０分間、４０〜６０分間、または４０〜９０分間などのさまざまな時間インキュベートすることができる。またインキュベーションは、約１分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、６０分間、６５分間、７０分間、７５分間、８０分間、８５分間、９０分間、１２０分間、１８０分間、または２４０分間実施することができる。このようなインキュベーション時間は、シート状の固体マトリックスから核酸分子を放出させる場合に有用な場合が少なくない。
【０１０５】
インキュベーション時間の長さが特定の条件で変わることは言うまでもない。比較的長いインキュベーション時間（例えば８時間、１日間、２日間、３日間、５日間、７日間）が望ましい条件の例には、固体マトリックス上の核酸分子の濃度が低く、アルカノールアミン濃度が低く（例えば０．１％のエタノールアミン）、および／またはインキュベーション時間が短い（例えば７０℃またはそれ以上）といった条件が含まれる。
【０１０６】
また、インキュベーション時間の長さを始めとする他のインキュベーション条件は、試料に含まれる核酸分子の特定の量またはパーセンテージが解放性試薬中に解放されるように変えることができる。例えばインキュベーション条件は、固体マトリックス上に存在する核酸の０．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が解放性試薬中に解放されるように調節することができる。当業者であれば、特定の応用に適したインキュベーション条件を決定する方法を理解すると思われる。
【０１０７】
本発明の方法の用途に適したチューブ状／カラム状の固体マトリックスは例えば以下の属性を有する。固体マトリックスは、チューブ内に、その一端から別の端にかけて、一端（先端）の空間に試料が収容されるように配することができる。このような態様では、固体マトリックスは一般にチューブ内において側壁から側壁へ広がる。したがって、チューブを通過する液体の大部分は、必然的に固体マトリックスを通過することになる。このような状況では、固体マトリックスおよびチューブは、クロマトグラフィーに使用されるカラムに似た構造をとる場合がある。したがって、このような固体マトリックス／チューブフォーマットは、「固体マトリックスカラム」と呼ばれる。上述したように固体マトリックスは、このようなカラム内に密な状態または緩い状態で充填される場合がある。
【０１０８】
本発明の平面シートの態様に関しては、固体マトリックスカラムにアプライされた試料を、上述の溶液で洗浄することができる。また、固体マトリックスカラムからの核酸分子の解放は、解放性試薬をカラムに通すことで誘導することができる。本発明の１つの特定の局面では、固体マトリックスカラム中のマトリックスを室温で洗浄して混入物質を除去する。次にカラムの底に栓をして液体が漏れないようにし、カラムを９５℃で加熱した後に、解放性試薬（これも９０℃に加熱）をカラムに注入する。カラムの底の栓を十分な時間開放して、解放性試薬をカラム内に行き渡らせてから再び栓を閉める。３０分間の９５℃におけるインキュベーション後に、カラムの栓を再び外して、解放性試薬を核酸分子とともにカラムから排出させる。具体的な１つの局面では、固体マトリックスカラムは、遠心装置内に収容可能なスピンカラムであり、解放性試薬をカラムから遠心除去する。
【０１０９】
当業者であれば理解するように、インキュベーション条件は、上述のインキュベーション条件と同様に変えることができる。また特定のインキュベーション時間も、試料、固体マトリックスから解放される核酸分子、および固体マトリックスそのものによって変わる。当業者であれば、特定の応用に適したインキュベーション条件を決定する方法を理解すると思われる、
【０１１０】
固体マトリックスから解放された核酸分子は、核酸合成、制限酵素による切断、ハイブリダイゼーション反応、他の核酸分子との連結、配列決定、増幅（例えばＰＣＲ）、形質転換、およびトランスフェクションなどの、１つもしくは複数の標準的な分子生物学的方法で使用することができるほか、操作することができる。一般に、解放された核酸分子は、別の溶媒（例えばトリス−ＥＤＴＡ）で希釈して、意図した用途（例えばＰＣＲ）に適した解放核酸分子／可溶化核酸分子とした後に使用される。
【０１１１】
本発明の組成物および方法は、固体マトリックスから比較的低塩量の溶液中へ核酸分子が解放されるように設計することができる。また上述したように、核酸分子を含む解放性試薬の塩濃度は、希釈することで低下させることができる。塩含量が望ましい量と比較して高い状況では、核酸分子を標準的な方法で使用前に脱塩処理することができる（例えば核酸分子をアルカノールアミンから分離することができる）。
【０１１２】
本発明は、本発明の方法で調製された核酸分子を含む組換え宿主細胞、ならびにこのような核酸分子を含む組換え宿主細胞の調製法をさらに提供する。適切な宿主の代表例には、細菌細胞（例えば大腸菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、真菌細胞（例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））、昆虫細胞（例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞）、動物細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞）、および植物細胞などがある。上述の宿主細胞の適切な培地および培養条件は当技術分野で周知である。
【０１１３】
本発明の方法で調製された核酸分子は、標準的な実験マニュアル（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．  （１９８９）、第９章；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｈ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（１９９７）、第１６章を参照）に記載された、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、微粒子銃による導入、および感染などを含む方法で宿主細胞に導入することができる。核酸分子を宿主細胞に導入する方法は例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら、米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。
【０１１４】
本発明の方法で調製される核酸分子は、ベクター配列の染色体への組込みを可能とする遺伝因子を含む場合もある。このような因子は、異種配列の安定な維持に有用であり、部位特異的な組込み、および部位に依存しない組込みの両方をもたらす配列を含む。部位特異的な組込み（例えば相同的組込み）、および部位に依存しない組込み（「ランダムな組込み」と呼ばれることもある）は、異種対象配列の宿主細胞染色体への導入に用いることができる。遺伝材料の真核生物の染色体への挿入に関する記述および方法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら編（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．  （１９８９））を始めとする多くの情報源に記載されている。
【０１１５】
ＩＩＩ．試料処理の自動化
本発明は、個々の個々の試料からの核酸分子の精製および／または単離に加えて、いくつかの応用に適した組成物、方法、および試薬を提供する。このような応用の一例は、集団の構成要素を代表する試料の収集物に由来する核酸分子の精製および／または単離である。
【０１１６】
１つの態様では、プレート上にウイルスプラーク（例えばＴ４ファージのプラーク）を含む試料を固体マトリックスに移す。特定の応用では、次に固体マトリックスを、後に使用するまで保存するか、または解放性試薬で処理して、ウイルスの核酸分子を解放させる。多くの場合、固体マトリックスを、さまざまな核酸分子を含む切片に切断する。固体マトリックスの断片化はランダムな場合があるほか、例えば特定のウイルスプラークに対応する核酸分子を含む個々の小片を生じる場合がある。
【０１１７】
同様に、さまざまな非ウイルス供給源に由来する試料を固体マトリックスに移して、個々の核酸分子の調製に使用することができる。例えば、さまざまな核酸分子を含む試料（例えば細菌培養物）を９６ウェルプレート（例えば９６ウェルマイクロプレート（９６  ｗｅｌｌ  ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ）の各ウェル内で調製することができる。このような試料の一部を次にＤＮＡカードレジストレーションツール（ＤＮＡ  Ｃａｒｄ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ）（カタログ番号ＶＰ３８２ＣＳ）、およびスロットピンスポッター（Ｓｌｏｔ  Ｐｉｎ  Ｓｐｏｔｔｅｒ）（カタログ番号ＶＰ４０８Ｓ５）（Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．、９８２３  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｈｅｉｇｈｔｓ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｓｕｉｔｅ  Ｔ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１  ＵＳＡから入手可能）を用いて固体マトリックスに移すことができる。この装置を用いて、９６試料ウェルのそれぞれから５  μｌをＦＴＡ（登録商標）  クローンセーバー９６カード（ＣｌｏｎｅＳａｖｅｒ  ９６  Ｃａｒｄ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、９８００  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒｉｖｅ、ＲｏｃｋｖｉＩＩｅ、ＭＤ  ２０８５０  ＵＳＡから入手可能）に一度に移すことができる。選択的に色素（例えばブロモフェノールブルー）を各試料ウェルに添加して、ＦＴＡ（登録商標）  クローンセーバー９６カード（ＣｌｏｎｅＳａｖｅｒ  ９６  Ｃａｒｄ）へアプライした後に試料位置をマークすることができる。
【０１１８】
ＦＴＡ（登録商標）  クローンセーバー９６カード（ＣｌｏｎｅＳａｖｅｒ  ９６  Ｃａｒｄ）などの固体マトリックスに試料をアプライしたら、固体マトリックスを小片に切断して、各試料がアプライされたマトリックスの部分を分離する。試料が特定のパターンでアプライされた状況（例えばＤＮＡカードレジストレーションツール（ＤＮＡ  Ｃａｒｄ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ）、スロットピンスポッター（Ｓｌｏｔ  Ｐｉｎ  Ｓｐｏｔｔｅｒ）、およびＦＴＡ（登録商標）  クローンセーバー９６カード（ＣｌｏｎｅＳａｖｅｒ  ９６  Ｃａｒｄ）が上述のように使用される状況）では、各試料を分離するために固体マトリックスを切断するための装置を容易に設計することができる。ＦＴＡ（登録商標）  クローンセーバー９６カード（ＣｌｏｎｅＳａｖｅｒ  ９６  Ｃａｒｄ）を例にとると、試料を含む９６か所の一部もしくは全体に対応するカードの部分にパンチを開けるように装置を設計することができる。このような各カード片を次に９６ウェルプレートの各ウェル内に配し、さまざまな試薬で処理して混入物質を除いて核酸分子を解放させる。例えば試薬（例えば洗浄液）は、各ウェルに添加した後に吸引除去することができる。また解放性試薬を各ウェルに添加後に、吸引除去して別の容器に移すことができる。これに代わる１つの方法として、固体マトリックス（例えばカード片）を、インキュベーション後にウェルから除去して核酸分子を残すことができる。別の代替法として、固体マトリックスを、解放された核酸分子とともにウェル内に残すことができる。最適な作用過程は、核酸分子が使用される特定の応用によって変わる。
【０１１９】
本発明の自動化法の１つの特定の応用は、ＰＣＲによる核酸分子の高スループットの増幅と、これに続く増幅産物の配列決定である。系は、固体マトリックスにアプライされる各試料が、さまざまな核酸分子を含む細胞またはプラークを含むように設計することができる。
【０１２０】
また、本発明の組成物および方法で核酸分子を解放することができる核酸試料は、利便性を考慮して調製、保存、および販売するか、または本発明の方法で使用するために個人もしくは組織に移される場合がある。
【０１２１】
本発明の他の特定の態様では、ロボットシステムで、試料を用いた遺伝子型の判定に必要な本質的にすべての段階を行うことができる。このような応用では、９６個の試料を収容して、補強用基材を有するように設計された試料カードを使用することができる。このような補強用基材は、カードの耐久性を増すことで、ロボットシステムによるカードの取扱いが容易になる点で有利である。液体ハンドリングシステムは、試料カード（例えばＦＴＡ（登録商標）  クローンセーバー９６カード（ＣｌｏｎｅＳａｖｅｒ  ９６  Ｃａｒｄ））上のおおよその位置に試料（例えば各５  μｌ）を含む液体を蓄積するために使用される。試料を乾燥させた後に、同じ装置または別の装置が、各試料を含む、カードの部分を切断する（例えば２  ｍｍの円がカードから打ち抜かれる）。このようなカードの部分は次に、同装置によって９６ウェルプレートのウェル内に配される。試薬は、液体取扱い装置によってウェルに添加および除去される。熱サイクリングは例えばプレート上で実施することもできる。また、可溶化状態の核酸分子を含むウェルに由来する液体の一部を除去して別の容器内に配し、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）解析またはサザンブロット解析を行うことができる。
【０１２２】
本発明の過程は、多数の試料を用いて遺伝子型データを得る際に特に有用である。例えば多数の個体の遺伝子型解析は、本発明の過程でヒト血液を対象に実施した後に、蛍光プライマーを用いてＰＣＲを行い、また自動配列決定装置で配列を決定することができる。
【０１２３】
本発明の過程はまた、植物、微生物、および非ヒト動物から得られた多数の試料の遺伝子型解析にも有用である。植物を例にとると、多数の植物試料を調製し、１つまたは複数の遺伝子型に関与する遺伝特性を対象にスクリーニングを行うことができる。これは特に、特定の地域で成長させた植物の特定の遺伝子型を判定する際に有用である。例えばダイズに由来する材料（例えば葉または種子）は、特定の地域の農場から採取することができる。植物材料は、固体マトリックスに直接アプライするか、または溶液中に分散させてから試料を添加することができる。
【０１２４】
植物材料、または他の任意の固体材料を固体マトリックスに直接アプライする場合は、圧縮力を用いて材料をマトリックスにアプライすることが通常有利である。言い替えると、固体材料を固体マトリックスの表面に押しつけて破砕させる場合がある。
【０１２５】
固体材料を固体マトリックスにアプライするには装置を使用することができる（例えばハンマー）。１つの態様では、このような装置は、核酸分子を含む固体材料を最初に収容するチャンバーを含む。ピストン、またはピストン様物体をチャンバーの一端に配し、固体マトリックスをもう一端に配する。したがって、ピストンまたはピストン様物体が、固体マトリックスへ向かって動くことで、固体材料が、固体マトリックスの表面に押しつけられる。固体材料に由来する核酸分子は、この過程中に固体マトリックス上に蓄積する。装置は選択的に、固体マトリックスの裏側を支持して固体材料がマトリックスを強制的に通過しないようにする固体部分を有する。この固体部分は、固体マトリックスが、ピストンまたはピストン様物体によって加えられて構造の全体性が損なわれる圧力に耐えるほど十分硬い場合には、必ずしも必要ではない。
【０１２６】
上記の装置は特に、特定の地域で植物材料試料を収集する際に有用である。このような装置は一般に比較的小型で、携帯性に優れ、またマニュアルで圧力を加えながら操作することができる。また、このような装置を使うことで、固体マトリックスへアプライするための試料溶液を調製する必要はなくなる。同装置ではまた、固体マトリックスの表面に均一に試料をアプライすることができる。したがって別の局面では、本発明は、試料を固体マトリックスにアプライするための装置を提供し、この装置は（１）核酸分子（すなわち試料）を含む固体材料を収容するチャンバー、（２）チャンバーの一端にあるピストンまたはピストン様物体、および（３）チャンバーの別の端に固体マトリックスを固定する結合部分を有する。
【０１２７】
本発明の方法に使用可能な植物には、ダイズ、トウモロコシ、ライムギ、コムギ、ソルガム、イネ、ピーマン、トウガラシ、エンドウマメ、マツ、アメリカハリモミ（ｂｌｕｅ  ｓｐｒｕｃｅ）、カエデ、草本（例えばＫｅｎｔｕｃｋｙ  Ｂｌｕｅ  Ｇｒａｓｓ）、およびワタが含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法に使用可能な植物の部分には、茎、根、種子、葉、花弁、および萼片が含まれる。
【０１２８】
本発明の遺伝子型解析の方法は、地域を越えた植物系列および遺伝子マーカーの拡散のモニタリングに有用である。このような方法は、遺伝子組換え生物（Ｇ．Ｍ．Ｏ．）検出にも有用である。Ｇ．Ｍ．Ｏ．の一例は、別のＧ．Ｍ．Ｏ．の種子から成長させた植物である。したがって本発明は、植物から試料を得る段階、試料を固体マトリックスにアプライする段階、固体マトリックスに結合した状態の核酸分子を解放させる段階、および核酸分子を解析して、試料の供給元となった植物のある遺伝形質を関連する遺伝子型を判定する段階を含む、Ｇ．Ｍ．Ｏ．を同定する方法を提供する。関連する態様では、複数の形質に関連する遺伝子型（例えば２種、３種、４種、または５種）を判定することができる。
【０１２９】
植物材料をスクリーニングして、Ｇ．Ｍ．Ｏ．ならびに特定の植物系列を同定／検出する際には、分子マーカー検出法が一般に用いられる。例えばＰＣＲを行うことで、１コピー遺伝子である核酸分子を増幅することができる。増幅された核酸分子を次に、配列決定、ＲＦＬＰ解析、またはハイブリダイゼーション解析などの方法で解析し、特定の植物がＧ．Ｍ．Ｏ．か否かを判定することができる。
【０１３０】
ＩＶ．キット
本発明の他の態様は、固体マトリックスから核酸分子を解放させるためのキット、ならびに核酸分子を精製および／または単離するためのキットを含む。キットは例えば、ひとまとめにされた複数の成分および試薬を提供することで、本発明の方法の実施を容易にする。また、このようなキットの試薬は、方法の精度および信頼性を高めるために、事前に測定された単位で供給される場合がある。
【０１３１】
固体マトリックスから核酸分子を除去するための本発明のキットは一般に、箱などのカートン、箱、チューブ、アンプル、ジャー、バッグ、プレートなどの１個または複数の容器、および１種類または複数の解放性試薬、ならびに以下からなる群より選択される１種または複数の成分を含む：（ａ）少なくとも１種類（例えば１種類、２種類、３種類、４種類、５種類、１０種類、２０種類、５０種類、１００種類）の固体マトリックス；（ｂ）試料を固体マトリックスにアプライするための少なくとも１つの装置；（ｃ）固体マトリックスを切断して、試料を含む切片にする少なくとも１つの装置；ならびに（ｄ）少なくとも１種類の洗浄液。
【０１３２】
固体マトリックスに試料をアプライするための装置は、試料のアプライに使用可能な任意の装置を本質的に含む。このような装置の１例は、上述したような、９６種の試料を固体マトリックスに一度にアプライする際に使用されるＤＮＡカードレジストレーションツール（ＤＮＡ  Ｃａｒｄ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ）、およびスロットピンスポッター（Ｓｌｏｔ  Ｐｉｎ  Ｓｐｏｔｔｅｒ）である。他の例には、ミクロキャピラリーチューブ、およびピペット（例えばピペットマン（Ｐｉｐｅｔｍａｎ）（商標）などのマイクロピペット）、ならびに液体の移送に使用可能な他の装置が含まれる。さらに他の例には、実施例１で説明する、また固体材料を固体マトリックスにアプライする段階について上述した両方の装置などが含まれる。
【０１３３】
試料を含む切片に固体マトリックスを切断する装置は、紙やカードなどの材料を切断する装置を含む。このような装置の例には、はさみ、剃刀、ナイフ、およびハリスマイクロパンチ（ＨＡＲＲＩＳ  ＭＩＣＲＯ  ＰＵＮＣＨ）（商標）  装置などが含まれる。ハリスマイクロパンチ（ＨＡＲＲＩＳ  ＭＩＣＲＯ  ＰＵＮＣＨ）（商標）  装置のような装置が特に有用である理由は、固体マトリックスの、比較的均一な大きさ（例えば１．２  ｍｍや２  ｍｍなど）の円形片への切断に使用可能なためである。
【０１３４】
本発明のキットに供給される洗浄液は、キットが対象とする特定のアプライ法によって変わる。１例として、高濃度の脂肪および脂質を含む試料（例えば脂肪組織）からの高分子量の核酸分子の精製および／または単離用にキットが設計される場合、キットに含まれる１種もしくは複数の洗浄液は一般に界面活性剤（例えばトライトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００）を含む。
【０１３５】
またキットに複数の洗浄液が含まれる場合、洗浄過程の初期段階に使用される溶液は、後の洗浄段階で除去される薬剤を含む場合がある。例えば２つの洗浄段階を行う場合、第１の洗浄段階で使用される洗浄液は界面活性剤を含む場合がある。しかし、第２の洗浄段階で使用される洗浄液は界面活性剤を含まない場合があり、また第１の洗浄液によって固体マトリックスに添加された界面活性剤を除去するために部分的に使用される場合がある。
【０１３６】
本発明のさまざまな態様に使用可能な洗浄液の例には、１０  ｍＭ  トリス、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．３）；水；および界面活性剤を含む溶液が含まれる。
【０１３７】
試料容器および容器の固体マトリックスも本発明のキットに含まれる場合がある。本発明のいくつかの態様における用途に適した容器の１例が、ＦＴＡ（登録商標）  ９６ウェルマイクロプレート（９６  ｗｅｌｌ  ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ）  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号１０７８６−０２８）である。このようなプレートは例えば、固体マトリックスにアプライする前の試料と、試料を含む固体マトリックスの小片の両方を収容するために使用することができる。
【０１３８】
カラムも、本発明のキット（例えば遠心処理（例えば微量遠心）に適したカラム）に含まれる場合がある。このようなカラムは例えば、試料を脱塩処理したり、より大きい核酸分子と、より小さい分子（ヌクレオチド、タンパク質、ＲＮＡなど）を分離したりする際に使用される。このようなカラムは当技術分野で周知であり、例えば、分子量に基づく分離用に設計された材料（セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（登録商標）  Ｇ−５０など）を含む場合がある。
【０１３９】
関連する技術分野の当業者であれば、本明細書に記載された方法および応用の他の適切な修正および変更が、当業者に既知の情報に鑑みて、本明細書に含まれる本発明の記述から容易に明らかになること、また本発明の範囲もしくは本発明の任意の態様から解離することなくなされることを理解すると思われる。本発明について詳細に説明したが、同内容は、説明のみを目的として本発明を制限する意図のないように含まれる以下の実施例を参照することで、さらに明瞭に理解されると思われる。
【０１４０】
実施例
実施例１
個々の木（Ｐｉｎｕｓ  ｐｉｎｕｓ）に由来する松葉を、シェナンドー国立公園のさまざまなな場所から集める。個々の木の松葉を、ＦＴＡ（登録商標）  クローンセーバー９６カード（ＣｌｏｎｅＳａｖｅｒ  ９６  Ｃａｒｄ）の表面に配し、ハンマーを用いてカード上で押しつぶす。松葉は、カード上の各位置が１本の木にのみ由来する試料材料を含むようにカード中に配される。各試料をカードにアプライする際には、試料を特定の木に関連づけるために記録をつけておく。試料をカード上のすべての試料位置にアプライしたら、解析目的で実験室にカードを移すまで常温で保存する。
【０１４１】
実験室では、試料をＦＴＡ（登録商標）カードから、マット付きのハリスマイクロパンチ（ＨＡＲＲＩＳ  ＭＩＣＲＯ  ＰＵＮＣＨ）（商標）  装置を用いて「打ち抜く」。結果として得られる２  ｍｍのパンチを次に、９６ウェルプレートのウェル内に移し、トリス−ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ７．３）で洗浄する。次に、ＫＯＨでｐＨ  １１．０に調節した５０  μｌのエタノールアミンを各ウェルに添加する。９０℃で３０秒間インキュベートした後に、解放された核酸分子を含む各ウェルの液体を吸引除去して０．５  ｍｌの微量遠心チューブに移し、後にＰＣＲ反応で使用するまで凍結保存する。
【０１４２】
実施例２
方法
２５  μｌの新鮮な血液を、ＦＴＡ（登録商標）  クローンセーバー９６カード（ＣｌｏｎｅＳａｖｅｒ  ９６  Ｃａｒｄ）の各位置に、モデルＰ−２００のピペットマン（Ｐｉｐｅｔｍａｎ）（商標）（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．、Ｒａｉｎｉｎ  Ｒｏａｄ、Ｂｏｘ  ４０２６、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、０１８８８）を用いてスポットした。カードは使用するまで室温で保存した。
【０１４３】
解放性試薬は水で０．０１％〜１％の濃度に希釈したエタノールアミンを含むものを用いた。ｐＨ範囲は８．３〜１３とした。ｐＨはＫＯＨ水溶液を添加して調節した。最高の結果はｐＨ  １１で１％の濃度で得られた。エタノールアミン試薬を、１５  ｍＭおよび３０  ｍＭのＣＡＢＳ  ［４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸］緩衝液、ＣＡＰＳ［３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸］緩衝液、ジェントラ溶出緩衝液２（Ｇｅｎｔｒａ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２）  （ジェネレーション（ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ）（商標）  キャプチャーカラム（ＣＡＰＴＵＲＥ  ＣＯＬＵＭＮ）（商標）キット（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１３３５５  １０ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ  Ｎ．、Ｓｕｉｔｅ  １２０、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ  ５５４４１、ＵＳＡ）とともに使用）、およびアンプダイレクト（ＡｍｐＤｉｒｅｃｔ）  （Ｓｈｉｍａｄｚｕ，  Ｉｎｃ．、１、Ｎｉｓｈｉｎｏｋｙｏ  Ｋｕｗａｂａｒａｃｈｏ、Ｎａｋａｇｙｏｕ−ｋｕ、Ｋｙｏｔｏ  ６０４−８５１１、Ｊａｐａｎ）と比較した。
【０１４４】
試料をアプライした後に、ＦＴＡ（登録商標）のパンチを、ＦＴＡ（登録商標）  精製用試薬（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号１０８７６）、およびＴＥ緩衝液を用いて業者の推奨手順で洗浄した。
【０１４５】
解放性試薬は２  ｍｍのパンチあたり５０  μｌを添加した。次にパンチを９０〜１００℃で１〜３０分間加熱した。最良の結果は、ＰＣＲ解析では１０〜２０分間で得られた。この結論は、図１および図３で得られた結果に基づく。図１は、１００  ｐｇ／ｍｌが１０分後に解放されることを示す。２０分後の時点では、約１  ｎｇ／ｍｌが解放性試薬によって解放されている。図４は、解放されたＤＮＡを用いて得られたＰＣＲの結果が、１０分、１５分、または２０分の加熱後の結果と同等であることを示している。しかしＰＣＲ産物を１：１０に希釈すると、産物量の差は顕著となる。ジェントラ溶出緩衝液２（Ｇｅｎｔｒａ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２）  およびエタノールアミン解放性試薬は、検討した他の試薬と比較して良好に機能した。ＰＣＲ反応において、１５分間および２０分間の加熱で明瞭に視認可能となったＰＣＲ産物を１：１０に希釈してゲルにロードする。
【０１４６】
解放されたＤＮＡの濃度は、アセス（ＡＣＥＳ）（商標）２．０＋ヒトＤＮＡ定量システム（２．０＋  Ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて決定した。この系では、１０  μｌの解放ＤＮＡを定量に用いる。定量後、解放された各ＤＮＡの挙動を、遺伝子型を判定するＰＣＲアッセイ法で使用時の増幅産物を産生する能力について検討した。これは、標準的な遺伝子型ＰＣＲアッセイ法を準備した後に、１  μｌの解放されたＤＮＡを添加して検討した。各ＰＣＲアッセイ法は、総容量１５  μｌで行った。ＰＣＲ産物は、１．５％  アガロースゲルを用いた電気泳動で解析した。電気泳動は１００ボルトで１時間かけて行った。次にゲルを臭化エチジウムで染色し、写真を撮影した。
【０１４７】
理解を助ける目的で、図および実施例を挙げて本発明をある程度詳しく説明したが、同内容が、本発明の範囲、または任意の特定の態様に影響を与えることなく、条件、剤形、および他のパラメータの広範囲で等価な範囲内で本発明を修正または変更することで実施されうること、また、このような修正または変更が、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることは当業者に明らかである。
【０１４８】
本明細書で言及されたすべての出版物、特許、および特許出願は、本発明が属する技術分野の程度を示し、個々の出版物、特許、特許出願が具体的に、また個別に参照として組み入れられるのと同程度に本明細書に参照として組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】アセス（ＡＣＥＳ）（商標）２．０＋ヒトＤＮＡ定量システム（２．０＋  Ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、カタログ番号１０２９４−０１５）を用いて実施したＤＮＡ定量アッセイ法の結果。図１に示したナイロンメンブレンは、同システムで提供されるプローブを用いて製造業者の指示書にしたがって調製した。この結果から、さまざまな試薬が、１００℃で１０〜２０分間加熱することで、ＦＴＡ（登録商標）紙の２  ｍｍの血液パンチからＤＮＡを解放させる能力をもつことがわかる。検討したすべての試薬が、２０分間の加熱後に２  ｍｍのパンチあたり５０〜１００  ｎｇのＤＮＡを解放した。加熱時間は３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液にほとんど影響を及ぼさず、すべての加熱時間で解放されたＤＮＡはほぼ同量であった。
【図２】濃度およびｐＨが、エタノールアミンによるＦＴＡ（登録商標）紙からのＤＮＡを解放させる能力に及ぼす作用を示す、図１に記載されたように実施したアセス（ＡＣＥＳ）定量アッセイ法の結果。図の左側に示すＤＮＡ濃度は、０．２  ｎｇ、０．４  ｎｇ、１  ｎｇ、２  ｎｇ、４  ｎｇ、１０  ｎｇ、２０  ｎｇ、および４０  ｎｇである。パンチは、５０  μｌのエタノールアミン溶液中で１００℃で１０分間インキュベートした。１０  μｌの解放されたＤＮＡを定量に用いた。０．０２５％〜０．２％の濃度のエタノールアミン（いずれもｐＨ  １１）は、ＤＮＡのＦＴＡ（登録商標）紙からの解放にそれほど大きな影響を及ぼさなかった。しかしｐＨの変化はＤＮＡの解放に影響を与えた。ｐＨ  ８．３では、パンチあたり０．５  ｎｇのＤＮＡ  が解放されている。ｐＨ  ９．７およびｐＨ  １３では、パンチあたり２  ｎｇのＤＮＡが解放されている。ｐＨ  １１では、パンチあたり１０  ｎｇのＤＮＡが解放されている。したがって実施例２で説明するように、解放されたＤＮＡの量に関する最大収量はｐＨ  １１で得られた。
【図３】エタノールアミン濃度が、ＦＴＡ（登録商標）紙からのＤＮＡの解放に及ぼす作用を示す、図１に記載されたように実施したＡＣＥＳ定量アッセイ法の結果。１０  μｌの解放されたＤＮＡを、このアッセイ法に用いた。すべてのエタノールアミン溶液のｐＨは１１とした。エタノールアミン濃度を０．０００２５％から０．０２５％に上昇させると、より多くのＤＮＡがパンチから解放される。ほとんどのＤＮＡ  （約５０  ｎｇ）は１％の濃度で解放された。０．２％では約１０  ｎｇのＤＮＡが解放された。試験の目的上、エタノールアミン濃度は０．２％および１％とした。
【図４】さまざまな試薬を用いてＦＴＡ（登録商標）紙から解放された核酸分子を対象に行われたＰＣＲを示すアガロースゲル。パンチを、０．２％  エタノールアミン（ｐＨ  １１）中で１０分間、１５分間、または２０分間加熱した。ＰＣＲは以下の手順で行った。各１５  μｌのＰＣＲ反応を、１  μｌの解放されたＤＮＡを用いて行った。ＰＣＲ反応緩衝液は、２０  ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．４）、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００  μＭ  ｄＮＴＰ、５  μｌ  プライマー、０．０４単位のプラチナ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、９８００  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ２０８５０  ＵＳＡ、カタログ番号１０９６６−０１８）、およびＤ１Ｓ１９７マイクロサテライトマーカーＤＮＡ増幅用のプライマー対を含むものを使用した。熱サイクリングは以下の温度変化で行った：８０℃で１０分間、および９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間を１０サイクル；８９℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間を２０サイクル；ならびに７２℃で１０分間の最終伸長。ＰＣＲ反応産物は分析を実施するまで４℃で保存した。５  μｌのＰＣＲ反応物をアガロースゲルにロードした。また、１：１０に希釈した５  μｌのＰＣＲ反応物も、各検討試薬で得られた産物の量に差があるか否かを判定するためにゲルにロードした。このアガロースゲルから、０．２％  エタノールアミンがジェントラ溶出緩衝液２（Ｇｅｎｔｒａ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２）  と同程度の性能を有することがわかった。両試薬とも１：１０の希釈率でＰＣＲ産物が検出された（ゲルの写真上の短い境界線の右側）。
【図５】解放性試薬であるエタノールアミンの濃度（％）およびｐＨがＰＣＲ産物の形成に及ぼす作用を示すアガロースゲル。ＰＣＲは、１  μｌの解放されたＤＮＡを１５  μｌのＰＣＲ反応物中に用いて図４に記載された通りに実施した。５  μｌのＰＣＲ反応物を電気泳動用アガロースゲルにロードした。以上の結果から、エタノールアミン濃度を上昇させたときに増幅量が若干上昇することがわかる。ｐＨのもつ作用も、この場合はっきりしている。ＰＣＲ産物はｐＨ  ８．３〜１１で得た。ｐＨ  ６．２およびｐＨ  １３ではＰＣＲ産物の生成は認められない。以上のデータは、エタノールアミンの濃度およびｐＨを検討したＡＣＥＳ定量キットで過去に得られたデータを支持する（図３を参照）。
【図６】解放性試薬のｐＨがＰＣＲ産物の形成に及ぼす作用を示すアガロースゲル。ＰＣＲは、１  μｌの解放されたＤＮＡを１５  μｌのＰＣＲ反応物中に用いて図４に記載された通りに実施した。５  μｌのＰＣＲ反応物を電気泳動用アガロースゲルにロードした。ＰＣＲ産物はｐＨ  ６．２およびｐＨ  １３では生じなかった。生じたＰＣＲ産物の量はｐＨとともに上昇した。以上のデータは、解放性試薬のｐＨを８．３から１１に上昇させると大量のＤＮＡが解放されることを示す、図２に示したデータを支持する。この結果から、ＦＴＡ（登録商標）紙からＤＮＡを解放させる最も有効なｐＨが１１であると結論づけられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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