(57)【要約】本発明は、ウシ副腎髄質ドコサペプチド（ＢＡＭ−２２Ｐ）のアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストとして作用する化合物をスクリーニングするのに用いることができるアッセイに関する。このアッセイは、ラットおよびヒトＤＲＲ受容体へのＢＡＭ−２２Ｐの結合をベースとしたものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の哺乳類ＤＲＲ受容体への結合能をアッセイする方法であって、
ａ） ウシ副腎髄質ドコサペプチド（ＢＡＭ−２２Ｐ）と共に哺乳類ＤＲＲ受容体を発現する細胞と、前記の試験化合物とをインキュベートすること、次いで
ｂ） 前記ＢＡＭ−２２Ｐの前記ＤＲＲ受容体への結合が前記の試験化合物によって置換されている程度を測定すること
からなる方法。
【請求項２】
哺乳類のＤＲＲがラットまたはヒトのＤＲＲである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＲＲを発現している細胞が非相同なＤＲＲ遺伝子で形質転換された組換え細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アッセイが放射性リガンドアッセイであり、そしてＢＡＭ−２２Ｐまたは試験化合物が放射性物質で標識されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
アッセイが酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）であり、そしてＢＡＭ−２２Ｐまたは試験化合物が酵素に結合するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
さらに、試験化合物が細胞のホスホリパーゼＣの濃度または細胞内カルシウムの濃度のいずれかを顕著に増加または減少するか否かを測定することを含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
試験化合物がＢＡＭ−２２Ｐのアゴニスト、アンタゴニストまたはインバースアゴニストであるかを測定する方法であって、
ａ）ＤＲＲを発現する細胞を前記試験化合物と一緒にインキュベートすること、
ｂ）工程ａ）のインキュベーションの間、前記細胞の細胞内ホスホリパーゼＣまたはアデニルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度を測定すること、
ｃ）工程ｂ）で得られた結果と、インキュベーションが前記試験化合物の不存在下で実施する場合に得られた結果とを比較すること、次いで
ｄ）前記試験化合物の不存在下よりも存在下にて、ホスホリパーゼＣまたはアデニルシクラーゼ活性または細胞内カルシウムのレベルが顕著に高い場合は、前記の試験化合物がＢＡＭ−２２Ｐのアゴニストであると推断すること、または、ホスホリパーゼＣまたはアデニルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度が前記試験化合物の不存在下よりも存在下にて顕著に低い場合には、試験化合物がＢＡＭ−２２Ｐのアンタゴニストであると推断すること
からなる上記の方法。
【請求項８】
細胞が非相同ＤＲＲ遺伝子（ラットおよびヒト）で形質転換された組換え細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＤＲＲを発現している細胞および試験化合物をさらにＢＡＭ−２２Ｐを包含する培地中でインキュベーションする請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、試験化合物が、ラットおよびヒトのＤＲＲにおいてＢＡＭ−２２Ｐの結合および活性のモジュレータとして活性を有するか否かを測定することに使用されることができるアッセイ方法に関する。有効なモジュレータであるとして同定された化合物は、疼痛、神経障害疾患および炎症疾患における治療薬として、将来使用することができる。
【０００２】
【発明の背景】
Ａ． ウシ副腎髄質ドコサペプチド
ＢＡＭ２２ペプチド：ＹＧＧＦＭＲＲＶＧＲＰＥＷＷＭＤＹＱＫＲＹＧ−ＯＨ
プレプロエンケファリンＡ（ＰＰＡ）ｃＤＮＡは、１９８３年にクローン化された（Ｎａｔｕｒｅ ２９７： ４３１−４３４， １９８２）。ＰＰＡ遺伝子は、そのコーデイング配列内にいくつかの塩基性アミノ酸を含み、タンパク質分解酵素による開裂を受けると、いくつかのペプチドを生じる。このようなペプチド開裂産物には、ＢＡＭ１２Ｐ、ＢＡＭ２０Ｐ、ＢＡＭ２２Ｐ、ＭＥＡＧＬ、ＭＥＡＰおよびペプチドＥおよびペプチドＦ（ウシ副腎髄質）を含む。これらのペプチドには、神経の生存、および痛覚脱失症に関係するものもある（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｄｅｖｌ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １０， Ｎｏ２． ｐｐｌ７１−１７９， １９９２， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ８５， ３５５−３５６， １９８２）。
【０００３】
ＢＡＭ−２２Ｐは、Ｍｅｔ−エンケファリンのペプチド前駆体である（Ｍｉｚｕｎｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ９７ （４） ： １２８３−９０ （１９８０））。哺乳類において、ＢＡＭ−２２Ｐは、末梢組織、例えば、副腎髄質、ランゲルハンス島（Ｔｉｍｍｅｒｓ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ． ； ３５ （１）： ５２−７ （１９８６））、および多くの海馬および視床下部核および視床核、脚間核、黒質、丘、中脳水道周囲灰白質、傍小脳脚核、三叉運動神経および脊髄核、大縫線核および他の縫線核、傍巨細胞網様核（ｎｕｃｌｅｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｒｉｓ ｐａｒａｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、前庭神経核、いくつかのノルアドレナリン細胞群、孤束核を含む中枢神経系に、並びに、脊髄後角に存在することが（免疫活性によって）示されている（Ｋｈａｃｈａｔｕｒｉａｎ， Ｊ． Ｃｏｍｐ， Ｎｅｕｒｏｌ． ２２０ （３）： ３１０−２０ （１９８３））。
【０００４】
哺乳類におけるＢＡＭ−２２Ｐの正確な生理学的活性は知られていないが、運動協調および痛覚脱失症に関係するとされている（Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ １９８６ Ｓｅｐ ； ２３８ （３）： １０２９−１０４４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ８５， ３５５−３５６，１９８２）。
【０００５】
ＢＡＭ−２２Ｐはみなしごペプチド（ｏｒｐｈａｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）であって、その特異的な受容体は、μ、δおよびκオピオイド受容体へ結合するその既知の能力にかかわらず、同定されていない。本発明者等は、ＢＡＭ−２２ＰがラットおよびヒトのＤＲＲ受容体を含む、哺乳類の後根受容体（ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｒｅｓｅｐｔｏｒｓ）（ＤＲＲ）を活性化することが可能であることを発見した。
【０００６】
Ｂ．Ｇタンパク質結合型受容体
Ｇタンパク質結合型受容体（ＧＰＣＲ）は、膜貫通ドメインおよび細胞内Ｃ−末端ドメインから構成されていると推定される細胞外Ｎ−末端に存在する７つの疎水性α−へリックスによって特徴付けられている共通の構造的組織を共有するタンパク質ファミリーを構成する。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質の変換の活性化を通して細胞内シグナルを誘発する多種多様なリガンドに結合する（Ｃａｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃ． Ｐｒｏｇ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． ４８ ： ２７７−２９０ （１９９３）； Ｆｒｅｅｄｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃ． Ｐｒｏｇ． Ｈｏｒｍ． Ｒｅｓ． ５１ ： ３１９−３５３ （１９９６））。
【０００７】
これまでに３００以上のＧＰＣＲがクローン化された。そして、通常１，０００以上のこのような受容体が存在すると推定されている。概略で、臨床的に関連する全ての薬剤の５０〜６０％が、多様なＧＰＣＲの機能を調節することによって作用する（Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ７３： ５１−６３ （１９９５））。臨床的に関連した受容体の多くが中枢神経系に存在する。
【０００８】
同定およびクローン化がなされたＧＰＣＲの中には、ＤＲＲと言う既知のタンパク質をコードする遺伝子があり、それはｍａｓがん遺伝子ファミリーの受容体に相同である。ＤＲＲのラットの対照体は、相同であることが見出され、ＤＲＲ ｍＲＮＡを発現する細胞の存在に基づいて、該受容体が痛みの伝達の役目を担うものと提案された。しかし、この受容体のファミリーに対する内在性のリガンドは、これまでは確認されていなかった（Ｃｅｌｌ ： ４５， ７１１−７１９ １９８６， ＪＢＣ ２７３，１１８６７−１１８７３ １９９８， ＷＯ ９９／３２５１９）。
【０００９】
【発明の要約】
本発明は、ＤＲＲ受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである潜在的な治療用化合物を同定することが可能であるアッセイ方法を提供する。ラットまたはヒトのＤＲＲのいずれかを発現している組換え細胞をアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためにデザインされたスクリーニングアッセイにおいてＢＡＭ−２２Ｐと併せて用いることができる。従って、その最初の実施態様において、本発明は、ＤＲＲ受容体に結合するその能力について、試験化合物をアッセイする方法に関する。これは、ＢＡＭ−２２Ｐと共に該受容体遺伝子を発現している細胞と、試験化合物とをインキュベーションすることによって達成される。次いでＢＡＭ−２２Ｐの結合が置換される程度が測定される。ＢＡＭ−２２Ｐまたは試験化合物のいずれかを検出可能に標識する放射性リガンドアッセイ方法または固相酵素免疫検定法を実施することができる。ＤＲＲを発現する細胞はいずれも使用することができるが、ラットまたはヒトのいずれか由来の非相同のＤＲＲ遺伝子を発現する組換え細胞が好ましい。本明細書において使用された「非相同」という用語は、細胞にトランスフェクトされた任意のＤＲＲ遺伝子に関する。即ち、その用語は、任意の非相同ＤＲＲに関する。
【００１０】
また、本発明は、試験化合物が、機能アッセイに基づいて、ＢＡＭ−２２Ｐに結合するアゴニスト、アンタゴニスト、またはインバースアゴニストであるかどうかを測定する方法を含む。このようなアッセイを実施する一つの方法は、ＤＲＲを発現する細胞と試験化合物をインキュベートすること、次いで細胞内ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ活性または細胞内カルシウム濃度が調節されるかどうかを測定することである。一般的に、その結果は、同様な方法ではあるが、試験化合物が存在しないでインキュベーションを実施する場合に得られた結果と比較すべきである。一般的に、このタイプの機能アッセイは、上記の種類の結合アッセイと一緒に実施される。アッセイの使用に好ましい細胞は、非相同なＤＲＲ遺伝子で形質転換された組換え細胞である。アゴニストとして作用する試験化合物は、ホスホリパーゼＣを増加させ、アデニルシクラーゼ活性を増加または減少させるか、またはカルシウムの細胞内レベルを増加させる。インバースアゴニストは、特に、アッセイがＢＡＭ−２２Ｐの固定した量の存在下で実施される場合には、ホスホリパーゼＣ活性または細胞内カルシウムレベルを減少させることができる。アンタゴニストは、インバースアゴニストの顕著な特徴である、ホスホリパーゼＣ活性または細胞内カルシウムについては、反対の応答をせずに、受容体に対するＢＡＭ−２２Ｐの結合を遮断する。
【００１１】
【発明の詳述】
本発明は、ラットおよびヒトのＤＲＲ受容体へのＢＡＭ−２２Ｐの結合を調節する能力について化合物をスクリーニングするのに使用され得るアッセイに関する。報告されているＢＡＭ−２２Ｐの任意の形態が使用されうるが、好ましいペプチドは、長さが２２アミノ酸であり、次の配列を有する。ＢＡＭ２２ペプチド： ＹＧＧＦＭＲＲＶＧＲＰＥＷＷＭＤＹＱＫＲＹＧ−ＯＨ（配列番号１）。このペプチドは、市販（Ｂａｃｈｅｍ）されているか、または当該分野で周知の標準方法を用いて合成することができる。該ペプチドは、１２５Ｉのようなラジオアイソトープによって検出可能に標識することができるか、または蛍光標識または化学発光法標識を組み入れることもできる。また、該ペプチドは、西洋ワサビペルオキシダーゼのような簡単に検出可能な酵素に結合することができる。
【００１２】
ＤＲＲ受容体は、ＷＯ９９／３２５１９に記載のような既知の方法を用いて、ラットおよび／またはヒト細胞からクローン化することができる。実施例の部分には、ＤＤＲのクローニングに使用され得る方法の詳細な説明を提供する。一旦得ることができれば、ＤＲＲ配列は、哺乳類細胞において活性なプロモーターを有する発現ベクターに組み込まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））。使用することができるプロモーターの例には、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎ． ２７３−２８８ （１９８２））； ヘルペスウイルスの前初期遺伝子およびＴＫプロモーター（Ｙａｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９ ： ６２４９−６２５８ （１９９５）； ＭｃＫｎｉｇｈｔ， Ｃｅｌｌ ３１ ： ３５５−３６５ （１９８２））； ＳＶ ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９０ ： ３０４−３１０ （１９８１））； および、ＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４１ ： ５２１−５３０ （１９８５））が含まれる。また、ベクターはエンハンサーおよび他の調節エレメントを含んでもよい。
【００１３】
一旦、発現ベクターが構築されると、例えばリン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション法、エレクトロポーレーション法、リポソーム導入法、ウイルス導入法またはパーティクル仲介遺伝子導入法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）のような方法によって、哺乳類の細胞系に導入され得る。他の哺乳類細胞を使用してもよいが、ＨＥＫ−２９３細胞は成功した結果が得られることが分かっており、これらの細胞においてＤＲＲを発現するための方法が実施例の箇所に記載されている。細胞の選択のための標準方法、およびＤＲＲの発現のためのそれらのアッセイのための標準方法（例えば、ノーザンブロットの解析によるもの）を実施してもよい。
【００１４】
一旦、ラットおよびヒトのＤＲＲ受容体を発現するＢＡＭ−２２Ｐペプチドおよび細胞が得られたならば、試験化合物が結合になんらかの影響を与えるか否かを測定するためのアッセイを実施してもよい。多種多様な異なったタイプのアッセイを、当業者に周知の標準方法を用いて実施することができる。例えば、放射性標識リガンド結合アッセイにおいて、ＤＲＲを発現する細胞は、ＢＡＭ−２２Ｐと一緒に、並びに結合活性の試験をする化合物と一緒に、インキュベートされる。好ましいＤＤＲの供給源は、遺伝子組換え的に形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞である。また、ＢＡＭ−２２Ｐに強く結合する他のタンパク質を発現しないことを条件として、その他の細胞を使用し得る。これは、ＤＲＲで形質転換された細胞における結合アッセイを実施し、そしてさらに得られた結果と形質転換されていない対照体を用いて得られた結果とを比較することによって簡単に測定することができる。
【００１５】
アッセイは、そのままの細胞、または細胞から調製された膜を用いて実施することができる（例えば、Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０： １０２３０−１０２３４ （１９９３） を参照されたい）。上記で示唆されたように、膜、または細胞は、ＢＡＭ−２２Ｐと一緒に、さらに試験された化合物の調製物と一緒に、インキュベートされる。結合が完了した後、受容体はリガンドおよび試験化合物を含有する溶液から（例えば濾過によって）分離され、生じた結合量が測定する。好ましくは、使用されたリガンドは、放射性同位体（例えば１２５Ｉ）を用いて検出可能なように標識される。しかし、所望ならば、他のタイプの標識もまた使用してもよい。最も共通に用いられる蛍光標識化合物は、フルオロセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニンｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンである。有用な化学発光性化合物には、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが含まれる。
【００１６】
非特異的結合は、過剰量の非標識リガンドの存在下で結合反応を実施することによって測定され得る。例えば、標識されたＢＡＭ−２２Ｐは、千倍過剰の量の非標識ＢＡＭ−２２Ｐの存在下にて受容体および試験化合物とインキュベートされることができる。非特異的結合は、総結合即ち、非標識リガンドの不存在下における結合から差し引いて、試験された各サンプルに対する特異的な結合に到達する。洗浄、かくはん、振とう、濾過のような他の工程は、必要ならば、本アッセイに含むこともできる。溶液に残存している膜結合型リガンドの分離後、且つ、リガンドが結合した量を（例えば、放射活性同位体をカウントすることによって）定量化する前に、通常、洗浄の工程が含まれる。試験化合物の存在下に得られた特異的結合は、試験化合物が受容体結合を置換した程度を測定するために、標識されたリガンドのみの存在下に得られた結合と比較される。
【００１７】
結合アッセイを実施する際に、実際に、結合がいくつかの他の機構によって阻害されている場合には、試験化合物が受容体と相互作用していることを明らかにし得るという人為的な結果は避けるように注意しなければならない。例えば、試験化合物は、それ自体がＢＡＭ−２２Ｐの結合を実質的に阻害しない緩衝液中に存在しなければならず、また、好ましくは、いくつかの異なる濃度で試験されなければならない。また、試験化合物の調製物は、タンパク質分解の活性を測定しなければならず、そして抗タンパク質分解酵素がアッセイ中に含まれることが望ましい。最後に、化合物は、結果についてスキャッチャード解析を実施するのに十分な濃度範囲で、ＢＡＭ−２２Ｐの結合を置換しているものとして同定された化合物を再検討することが大変望ましい。このタイプの解析は当分野で周知であり、受容体に対する試験化合物のアフィニティーを測定するのに使用することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １１．２．１−１１．２．１９ （１９９３）； Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｏｒｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄ． Ｎ．Ｙ． （１９７８）を参照されたい。）。コンピュータープログラムを、本結果の解析の助けとして使用してもよい（例えば、Ｍｕｎｓｏｎ， Ｐ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９２ ： ５４３−５７７ （１９８３））。
【００１８】
受容体の活性に対するそれらの効果を基にして、受容体に対するＢＡＭ−２２Ｐの結合を阻害する薬剤は、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであることができる。受容体の活性化は、多数の異なる方法を用いてモニターすることができる。例えば、ホスホリパーゼＣアッセイは、マイクロタイタープレートのウェル上の細胞を増殖させ、次いで試験化合物の存在下または不存在下にてウェルをインキュベートすることによって実施することができる。次いで、総イノシトールホスファターゼ（ＩＰ）は、樹脂カラム中に抽出し、そしてアッセイバッファー中に再懸濁することができる。このように回収されたＩＰのアッセイは、ＩＰ濃度を測定するための任意の方法を用いて実施することができる。典型的に、ホスホリパーゼＣアッセイは結合アッセイとは別に実施されるが、それもまた、単一の細胞調製物でホスホリパーゼＣの結合アッセイを実施することが可能である。
【００１９】
受容体の活性化は、細胞内カルシウムの濃度の測定値に基づいて測定され得る。例えば、形質転換されたＨＥＫ−２９３細胞は、コンフルエントになるまでガラス製のカバースライド上で増殖され得る。リンスした後、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４およびＦＵＲＡ−２ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ Ｆ−１２２１）のような薬剤の存在下でインキュベートされ得る。リンスして、さらにインキュベーションした後、カルシウム置換は、光度計を用いて測定されることができる。細胞内カルシウム濃度を測定するための他のタイプのアッセイは、当業者に周知であって、それもまた使用してもよい。
【００２０】
受容体の固有の活性を測定するアッセイ、例えばイノシトールリン酸測定に基づいたアッセイは、インバースアゴニストの活性を測定する目的で使用されることができる。アゴニストの活性を遮断するが、それ自身の活性は有さないアンタゴニストとは異なって、インバースアゴニストは、アゴニストによって産生される応答に対して全く反対の生物学的応答を生じる。例えば、あるアゴニストが細胞内カルシウムの増加を促進する場合には、インバーズアゴニストが細胞内カルシウムレベルを減少させるのである。
【００２１】
前文で議論された、放射性リガンドおよび細胞活性化アッセイは、単に特定の試験化合物がヒト／ラットＤＲＲ受容体に対するＢＡＭ−２２Ｐの結合を変更するか否か、そしてアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか否か、を測定するのに使用し得るアッセイのタイプの例を提供するに過ぎない。本発明と両立し得るこれらのアッセイにおいては多くのバリエーションがある。このようなアッセイには、受容体に結合したＢＡＭ−２２Ｐを検出するための手段として標識された抗体の使用を包含するか、または本明細書の実施例に記載された蛍光イメージングプレートリーダーのアッセイの形態を取り得る。
【００２２】
【実施例】
Ｉ． 方法
クローンラットおよびヒトＤＲＲの調製：
特許ＷＯ ９９／３２５１９の明細書を参照されたい。
発現
ＨＥＫ−２９３細胞は、スーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたラットおよびヒトＤＲＲ（ｐｃＤＮＡ ３．０ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコード化する哺乳類発現構築物でトランスフェクトされた。ＤＲＲの安定な受容体のプールは、選択マーカー（Ｇ４１８、０．９ｍｇ／ｍｌ）を適用することによって開発され、該細胞はこの選択培地にて維持された。ＤＲＲクローンに特異的なｍＲＮＡの存在は、ノーザンブロット分析によって、さらに逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、評価された。
【００２３】
リガンド
クローンラットおよびヒトのＤＲＲのリガンドを同定するために、ペプチドおよび非ぺプチドのリガンドのコレクションは、市販品（Ｓｉｇｍａ， ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｂａｃｈｅｍ， ＲＢＩ， Ｐｈｏｅｎｉｘ）から得られた。化合物を３μＭにて水／ＤＭＳＯに溶解し、９６ウェルマイクロプレートに置いた。総計して１０００化合物（ペプチドおよび非ペプチド）が調製され、試験された。
【００２４】
アッセイ
機能アッセイは、９６ウェルプラットホームにて、蛍光カルシウム指示薬Ｆｌｕｏ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてＦＬＩＰＲ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて実施された。ＨＥＫ−２９３細胞は、受容体を発現しているか、または野生型の細胞のいずれかであり、次のようにしてＦｌｕｏ−３をローディングした。ラットおよびヒトＤＲＲを発現する安定なＨＥＫ−２９３クローンまたは親細胞を、９６ウェルプレートにて１０，０００細胞／ウェルの濃度でプレートに播種した。実験を実施した日に、ＤＲＲ細胞に（４μＭ Ｆｌｕｏ−３および２０％プルロニック・アシド（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含有する１０％ウシ胎児血清を用いたダルベッコ改変培地と一緒に）蛍光溶液をローディングした。細胞は、加湿されたチャンバーにて１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション工程の後に、細胞を２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび０．１％ ＢＳＡ（ｐＨ ７．４）含有 Ｈａｎｋｓ液 にて５回洗浄した。細胞をＦＬＩＰＲシステムを用いて解析し、異なる化合物に応答した細胞内カルシウムの流動を測定した。
【００２５】
ＩＩ． 結果
ＨＥＫ−２９３細胞は、アッセイの内部標準として用いられ得るいくつかのＧＰＣＲ（例えば、ブラジキニンおよびＰＡＣＡＰ受容体）を内生的に発現する。バックグラウンドのシグナルは、ＦＬＩＰＲアッセイを用い、親のＨＥＫ−２９３細胞（トランスフェクトしていない）にて化合物の全てで確立した。クローンＤＲＲを発現するＨＥＫ−２９３細胞を全ての化合物で刺激し、カルシウム応答を親のＨＥＫ−２９３細胞におけるそれらと比較した。唯一の化合物ヒト副腎髄質ドコサペプチド（ＢＡＭ−２２Ｐ）のみが、野生型の細胞ではなくて、形質転換された細胞におけるシグナルを一貫して引き出すことができる。これは、ＢＡＭ−２２Ｐが遺伝子組換えによって発現された受容体と相互作用しているということを示している。この結論の確認は、形質転換されていない細胞または他のオーファン受容体をトランスフェクトされた細胞ではなくて、ＤＲＲを用いてトランスフェクトされた細胞において、ＢＡＭ−２２Ｐによって用量反応関係が観察されたことによって得られた。このようにして、クローンラットおよびヒトＤＲＲはＢＡＭ−２２Ｐに対する特異的な受容体であるということが確立された。ラットおよびヒトのＤＲＲ受容体は、ＢＡＭ−２２Ｐの作用を模擬する化合物（アゴニスト）か、またはＢＡＭ−２２Ｐの作用に拮抗する化合物（アンタゴニスト）かのいずれかをスクリーニングするのに使用することができる。
【００２６】
スクリーニングアッセイは、上記のＦＬＩＰＲアッセイを用いて実施されることができる。また、ＢＡＭ−２２Ｐはヨウ素化して、全細胞または膜にて、放射性リガンド結合アッセイにおけるトレーサーとして、使用されることができる。使用され得る他のアッセイとしては、ＧＴＰア−ゼアッセイ、アデニルシクラーゼアッセイ、イノシトールリン酸を測定するアッセイ、およびレポーター遺伝子アッセイ（例えば、ルシフェラーゼ、アクエオリン、アルカリホスファターゼなどを利用するアッセイ）が含まれる。
【００２７】
本明細書の全ての引例は、全て参照によって組み込まれる。本発明は本明細書に完全に記載してきたので本発明は、発明または任意のそれの実施態様の精神または範囲に影響することなく、条件、パラメータなどの広範で均等な範囲内で、実施し得ることが当業者に理解される。
【国際公開パンフレット】
2004511806.tif 000002
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2004511806.tif 000013
【国際調査報告】
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