(57)【要約】本発明は、アミノ薬物（特に細胞傷害性薬物、例えば、ダウノルビシンまたはドキソルビシン）とペプチドをカップリングさせて、アミノ薬物−ペプチドの複合体を形成させる方法を提供する。この方法は、（例えば、レブリン酸または５−オキソペンタン酸に由来する）アルデヒドカルボニル基またはケトンカルボニル基を含むリンカーを該薬物のアミノ基に結合すること、およびそのカルボニル基をペプチドのＯ−アルキルヒドロキシルアミン誘導体（これは、例えば、ペプチドをアミノオキシ酢酸と反応させることによって得られる）と反応させることによってオキシムを形成させることを含む。記載された方法から得られるアミノ薬物−ペプチド複合体もまた提供され、そしてまた、本発明の複合体を含む薬剤組成物、および治療用医薬品において本発明の複合体を使用する方法も提供される。
2004501106.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ薬物とペプチドをカップリングさせて、アミノ薬物−ペプチド複合体を形成させる方法であって、アルデヒドカルボニル基またはケトンカルボニル基を含むリンカーを該薬物のアミノ基に結合すること、およびそのカルボニル基をペプチドのＯ−アルキルヒドロキシルアミン誘導体と反応させることによってオキシムを形成させることを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法から得られるアミノ薬物−ペプチド複合体。
【請求項３】
アミノ薬物が細胞傷害性薬物である請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
アミノ薬物が、下記に示される式（ＩＩ）の化合物：
【化１】
2004501106.tif 000026
（式中、
Ｒ１は、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２であり、
Ｒ３は、−ＯＣＨ３、−ＯＨまたは−Ｈであり、
Ｒ４は、−Ｈ、ベンジル、シアノメチルまたは−ＣＨ（ＣＮ）ＣＨ２（ＯＭｅ）であり、
Ｒ５は、−ＯＨ、−ＯＴＨＰまたは−Ｈであり、
Ｒ６は−ＯＨまたは−Ｈであるが、Ｒ５が−ＯＨまたは−ＯＴＨＰであるときには、Ｒ６は−ＯＨではない）
であり、かつリンカーが糖部分のアミノ基において結合している請求項２または請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
アミノ薬物がダウノルビシンまたはドキソルビシンである請求項２から４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
リンカーが、下記の式（ＩＩＩ）の基：
【化２】
2004501106.tif 000027
（式中、Ｘは、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＣＯ．Ｏ−、−ＣＯ
．ＮＨ−および−ＣＲ’Ｒ”−（式中、Ｒ’およびＲ”のそれぞれは独立して、水素、および１個〜１０個の炭素原子を含む低級アルキル基から選択される）から選択され、
Ｙは非存在であるか、あるいは置換および／もしくは中断されていてもよい、１個〜６個の炭素原子を含むアルキレン基、置換および／もしくは中断されていてもよい、３個〜７個の炭素原子を含むシクロアルキレン基、または２個〜１０個の炭素原子を含む芳香族環もしくはヘテロ芳香族環であり、かつ
ＲはＨであるか、あるいは１個〜１０個の炭素原子を含む低級アルキル基であって、置換および／または中断を場合によっては有する低級アルキル基である）である請求項２から５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
リンカーが下記の式（ＩＶａ）または式（ＩＶｂ）の基：
【化３】
2004501106.tif 000028
2004501106.tif 000029
である請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
ペプチドのＯ−アルキルヒドロキシルアミン誘導体が下記の式（ＶＩ）の化合物：
【化４】
2004501106.tif 000030
（式中、
【化５】
2004501106.tif 000031
は遊離アミノ基を有する非誘導体化ペプチドであり；基Ｚは、−ＣＯ−（アミドを形成）、−ＳＯ２−（スルホンアミドを形成）、−ＣＯ．Ｏ−（カルバメートを形成）、−ＣＯ．ＮＨ−（ウレアを形成）、および−ＳＯ２．ＮＨ−（スルファミドを形成）から選択され；かつｍは１〜６の整数である）
である請求項２から７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
式（ＶＩ）の化合物が下記：
【化６】
2004501106.tif 000032
から選択される請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
請求項２から９のいずれか一項に記載の複合体を薬剤として許容される担体と一緒に含む薬剤組成物。
【請求項１１】
腫瘍を処置するための医薬品を製造するための、請求項３から９のいずれか一項に記載の複合体の使用。
【請求項１２】
腫瘍を処置するための方法であって、そのような処置を必要とする患者に、請求項３から９のいずれか一項に記載の複合体を有効量投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞傷害性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ｄｒｕｇｓ）などのアミノ薬物（ａｍｉｎｏｄｒｕｇｓ）、特に、アントラサイクリン抗生物質とペプチドとの複合体、その製造方法、および治療におけるそのような複合体の使用に関する。
【０００２】
アントラサイクリン抗生物質には、下記の（Ｉ）に示されるダウノルビシンおよびドキソルビシンが含まれるが、様々なアントラサイクリン抗生物質が腫瘍の処置において抗新生物剤として広く使用されている。しかしながら、腎毒性および心臓毒性などの、用量に関連する毒性副作用により、それらの臨床適用が制限されている。種々の方法が、それらの治療指数を増大させるために取られている。治療用量を減少させる１つの方法は、腫瘍組織に対する親和性を示す担体ペプチドに細胞傷害性化合物を結合することによって得られる腫瘍標的化である（Ｗ．Ａｒａｐ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２７９、３７７〜３８０）。上記の議論を逆にすることによって、ペプチド−アンスラサイクリノン複合体に対する別の注目される適用は、成功の尺度として複合体による細胞殺傷の選択性をモニターすることによって行われる、コンビナトリアルペプチドライブラリーから選択したリガンドの細胞／組織親和性の研究である。
【０００３】
【化７】
2004501106.tif 000003
【０００４】
これらの薬物をペプチドに結合させる方法が今日までにいくつか発表されている：糖のアミノ基におけるアミド結合の形成（Ａ．Ｔｒｏｕｅｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８２、７９、６２６〜６２９）、ドキソルビシンの一級ヒドロキシルにおけるエステル結合の形成（Ａ．Ｎａｇｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９８、９５、１７９４〜１７９９）、還元的アミノ化による糖のアミノ基のアルキル化（Ｄ．Ｆａｒｑｕｈａｒ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、４１、９６５〜９７２）、およびシステイン含有ペプチドとさらに連結させるためのマレイミド部分の導入（生物有機化学に関する第３回ローザンヌ会議（１９９９年）でのポスター発表、Ｍ．Ｌａｎｇｅｒ他）。しかしながら、そのような方法は、反応するペプチドにおけるアミノ酸官能基のすべての種類との適合性を有さず、その結果、その後に生じる溶解性の問題のために、いくつかの残基は避けなければならないか、または選択的に保護しなければならない。さらに、アントラサイクリン類は、酸、塩基、酸化剤および還元剤に対して非常に敏感であるので、ペプチドをアントラサイクリン類に結合するときには特定の様々な問題が伴う。アントラサイクリン類はまた、かなり反応性のフェノール性官能基およびアルコール性官能基を含む。したがって、例えば、Ｎα脱保護（Ｂｏｃ合成）または樹脂切断（Ｆｍｏｃ合成）のために通常的に使用されている酸性条件に対してグリコシド結合が不安定であるために、この問題に対する固相法が不可能になっている。
【０００５】
全く保護されていないペプチドフラグメントをオキシム連結によって結合することが知られている。そのような方法は、例えば、Ｇ．Ｔｕｃｈｓｃｈｅｒｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．、１９９３、３４、８４１９〜８４２２；Ｋ．Ｊ．Ｒｏｓｅ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９４、１１６、３０〜３３；およびＬ．Ｅ．Ｃａｎｎｅ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５、１１７、２９９８〜３００７に記載されている。これらの参考文献に記載されるように、前駆体のＯ−アルキルヒドロキシルアミンが、（Ｂｏｃで保護された）アミノオキシ酢酸をペプチドの遊離アミノ基にカップリングすることによって得られる。
【０００６】
特に、本発明者らは、アミノ薬物（特に、アントラサイクリン類）と任意の配列のペプチドとの複合体を製造する一般的な方法を求めていた。本発明者らは、前駆体のＯ−アルキルヒドロキシルアミンが、アミノオキシ酢酸などのアミノオキシカルボン酸をペプチドの遊離アミノ基にカップリングすることによって容易に得ることができることを理解していた。したがって、本発明者らの努力は、相手となるカルボニル官能基をアミノ薬物部分に導入することに関していた。アントラサイクリン類は既にケトン基を含んでいるが、メチルオキシムを形成させるためにこのカルボニルを修飾することにより、細胞傷害性が劇的に低下することが示されている（Ｋ．Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９７２、１５、８７２〜８７５）。
【０００７】
本発明の１つの態様によれば、アミノ薬物（特に、細胞傷害性薬物）およびペプチドをカップリングさせて、アミノ薬物−ペプチド複合体を形成させる方法が提供される。この方法は、アルデヒドカルボニル基またはケトンカルボニル基を含むリンカーを薬物のアミノ基に結合すること、およびそのカルボニル基をペプチドのＯ−アルキルヒドロキシルアミン誘導体と反応させることによってオキシムを形成させることを含む。
【０００８】
複合体の各成分を下記において幾分より詳しく検討する。
【０００９】
アミノ薬物
アミノ薬物は、少なくとも１つの遊離アミノ基を含む任意のものであり得る。好ましくは、遊離アミノ基は活性のために必須ではない。一般に、好ましいアミノ薬物はケト部分またはアルデヒド部分を含まず、あるいはケト部分またはアルデヒド成分が含まれる場合には、これらは、例えば、選ばれた反応条件のために、リンカーを介して導入されたカルボニル基とは事実上競合し得ない。第１の態様の方法において使用される好ましい薬物は細胞傷害性薬物である。第１の態様の方法において使用される特に好ましい細胞傷害性薬物には、環外ケト基を含有するが、下記に示される式（ＩＩ）のアントラサイクリンがある：
【００１０】
【化８】
2004501106.tif 000004
式中、
Ｒ１は、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３または−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２であり；
Ｒ３は、−ＯＣＨ３、−ＯＨまたは−Ｈであり；
Ｒ４は、−Ｈ、ベンジル、シアノメチルまたは−ＣＨ（ＣＮ）ＣＨ２（ＯＭｅ）であり；
Ｒ５は、−ＯＨ、−ＯＴＨＰまたは−Ｈであり；かつ
Ｒ６は−ＯＨまたは−Ｈであるが、Ｒ５が−ＯＨまたは−ＯＴＨＰであるときには、Ｒ６は−ＯＨではない。
【００１１】
この場合、リンカーは、糖部分のアミノ基において結合する。
【００１２】
アントラサイクリン抗生物質の好ましい例を下記の表１に示す。これらの中で、ダウノルビシンおよびドキソルビシンが最も好ましい。
【００１３】
【表１】
2004501106.tif 000005
【００１４】
これらの化合物は、リンカーでもたらされるカルボニル基と競合することが予想され得る環外ケト部分を含むが、本発明者らは、リンカーを適切に選び、かつオキシム形成に対する反応条件を適切に選ぶことによって、リンカーのカルボニル基における反応の選択性が増大し得ることを見出した。
【００１５】
本発明の方法によってペプチドにカップリングすることができる他の可能な細胞傷害性薬物には、下記が挙げられる：
下記式のメトトレキセート類：
【００１６】
【化９】
2004501106.tif 000006
（式中、
Ｒ１２はアミノまたはヒドロキシであり；
Ｒ７は水素またはメチルであり；
Ｒ８は、水素、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードであり；
Ｒ９は、ヒドロキシル、またはカルボン酸の塩を完成させる成分である）；
下記式のマイトマイシン類：
【００１７】
【化１０】
2004501106.tif 000007
（式中、Ｒ１０は水素またはメチルである）；
下記式のブレオマイシン類：
【００１８】
【化１１】
2004501106.tif 000008
（式中、Ｒ１１は、ヒドロキシル、アミノ、Ｃ１〜Ｃ３アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）アミノ、Ｃ４〜Ｃ６ポリメチレンアミノ、
【００１９】
【化１２】
2004501106.tif 000009
である）；
下記式のメルファラン：
【００２０】
【化１３】
2004501106.tif 000010
および、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９、７、１２７３〜１２８０）に記載されているようなタプシガーギンのアナログ。
【００２１】
リンカー
一般に、薬物とペプチドとの無傷の複合体におけるアミノ薬物の活性、例えば、細胞傷害性薬物の細胞傷害活性は大きく低下しているか、またはないはずである。しかし、複合体が薬物の標的部位で酵素によって切断されたときには、薬物の活性は著しく増大するか、または修飾されていない薬物の活性にまで回復するはずである。したがって、リンカーは好ましくは、薬物を放出するためにインビボでの酵素切断によってリンカーが除かれ得るように選ばれるか、あるいはその結果、リンカーまたはリンカーの一部がインビボでの複合体の切断後に薬物に結合したままであるならば、リンカーは薬物の活性を著しく損なわないように選ばれる。
【００２２】
リンカーと薬物のアミノ基は、様々な方法で、例えば、スルホンアミド結合、ウレタン結合またはウレア結合を形成させることによって結合させることができる。しかし、リンカーとアミノ基を結合させる好ましい方法は、アミド結合を形成させることによる。
【００２３】
アミノ基に結合されるのに好適なリンカーの例には、下記の式（ＩＩＩ）のリンカーがある：
【００２４】
【化１４】
2004501106.tif 000011
式中、Ｘは、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２ＮＨ−、−ＣＯ．Ｏ−、−ＣＯ．ＮＨ−および−ＣＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’およびＲ”のそれぞれが独立して、水素、および１個〜１０個の炭素原子、好ましくは１個〜６個の炭素原子、特に１個〜３個の炭素原子を含む低級アルキル基から選択される）から選択される。
【００２５】
この式において、基Ｙは存在しなくてもよいが、より好ましくは、置換および／もしくは中断されていてもよい、１個〜６個の炭素原子を含むアルキレン基、置換および／もしくは中断されていてもよい、３個〜７個の炭素原子を含むシクロアルキレン基、または２個〜１０個の炭素原子を含む芳香族環もしくはヘテロ芳香族環である。好ましくは、Ｙは、非置換および中断されていないアルキレン基である。置換される場合、置換基は、好ましくは、カルボニル炭素原子の求電子性を高める置換基である。例えば、カルボニル基に対してα位の炭素原子における電子吸引基（フッ素など）が許容され得る。一般に、置換基は、カルボニル基の反応性を著しく低下させない置換基であって、アミノ薬物に対して、そしてアミノ薬物に結合させられるペプチドに対して実質的に反応性を有しない置換基でなければならない。同じような考慮が、中断を場合によっては有する基に適用され、この場合、その性質およびカルボニル基に対する位置は、それらによりカルボニル基の反応性が低下しないように、または望ましくない副反応が生じないようにすべきである。さらに、そのような基は、全身循環などの標的部位から離れた身体内の部位における無傷の複合体の安定性を低下させるべきではない。典型的な中断基には、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮ−（Ｃ１〜６）アルキルが含まれる。
【００２６】
式（ＩＩＩ）におけるＲはＨであるか、あるいは置換および／または中断されていてもよい、１個〜１０個の炭素原子、好ましくは１個〜６個の炭素原子、特に１個〜３個の炭素原子を含む低級アルキル基である。Ｙに関して上記に議論されたのと同様の考慮が、置換基および中断基の選択に適用される。一般に、この基は好ましくは非置換であるが、フッ素などの電子吸引基がカルボニル基のα位において許容され得る。
【００２７】
好適なリンカーは、複合体に含められる薬物に依存して選択され得るが、当業者に十分に知られている方法によって、例えば、アミド結合、スルホンアミド結合、スルファミド結合、ウレタン結合またはウレア結合を形成させることによって薬物のアミン基に結合させることができる。
【００２８】
薬物がアントラサイクリンである場合、Ｙは、好ましくは−ＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−であり、なかでも後者が好ましい。Ｒは、好ましくはメチル基である。Ｘは、好ましくは存在し、カルボニル基である。
【００２９】
したがって、好ましいリンカーは、下記の式（ＩＶａ）および式（ＩＶｂ）のリンカーである。これらのリンカーを含むアントラサイクリン誘導体は、式（ＩＩ）のアントラサイクリンをレブリン酸（リンカーＩＶａ）または５−オキソヘキサン酸（リンカーＩＶｂ）と反応させて、アントラサイクリン誘導体（Ｖａ）および（Ｖｂ）をそれぞれ形成させることによって形成させることができる：
【００３０】
【化１５】
2004501106.tif 000012
式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記に定義される通りである。
【００３１】
ペプチド
複合体に含められるペプチドは特に限定されない。この用語は、短いオリゴペプチドならびにポリペプチドおよびタンパク質を包含するように広く理解しなければならない。治療適用の場合、ペプチドは、治療効果が求められる標的組織に対して親和性を示すペプチドが好ましい。例えば、ペプチドは、組織の表面に発現する抗原と結合することができる抗体または抗体フラグメントであり得る。あるいは、ペプチドは、組織表面の受容体によって認識され、結合するタンパク質であってもよい。さらに別の可能性として、ペプチドは、標的組織内に存在する酵素によって優先的に分解され、その結果薬物が放出されるペプチドであるということである。標的が腫瘍細胞である細胞傷害性薬物の場合、ペプチドは、腫瘍組織と結合するペプチドであり得る。これは、例えば、ペプチドが、腫瘍組織により過剰発現する受容体によって認識されるためであり、あるいは腫瘍組織内に存在する酵素によって優先的に分解され、その結果、細胞傷害性薬物が放出されるためである。多くの可能性が存在するが、細胞傷害性薬物を標的化することに関して前に提案され、そして本発明の方法において用いることができるペプチドの例には、酵素分解を受けるペプチド、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９９／２８３４５、同ＷＯ９８／１８４９３および同ＷＯ９７／１２６２４（これらはすべてＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．が出願人である）に記載されるそのようなペプチドなどの、前立腺特異抗原によるタンパク質分解的切断を受けるペプチド、腫瘍血管系を標的化し得るペプチド、例えば、インテグリン結合ペプチドまたは細胞接着特性を有するペプチド（例えば、Ｗ　Ａｒａｐ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２７９、３７７〜３８０を参照のこと）、およびソマトスタチン（例えば、Ａ．Ｎａｇｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９８、９５、１７９４〜１７９９を参照のこと）が含まれる。プロテアーゼおよびペプチダーゼなどの酵素による分解を受ける薬物−ペプチド複合体が米国特許ＵＳ−Ａ第４７０３１０７号（Ｍｏｎｓｉｇｎｙ他）および国際特許出願公開ＷＯ９６／０５８６３（Ｌａ　Ｒｅｇｉｏｎ　Ｗａｌｌｏｎｎｅ他）に記載されている。それらの参考文献に記載されているペプチドもまた、本発明において有用であり得る。
【００３２】
また、先に言及したように、ペプチドは、その細胞親和性または組織親和性が研究中であるペプチドライブラリーに由来するペプチドであり得る。
【００３３】
さらなる可能性は、ペプチドが、ハプテン薬物に対する担体であるということである。この場合、薬物およびペプチドは上記したようにしてカップリングされる。得られる複合体は、例えば、免疫アッセイまたは親和性化学療法において使用され得る薬物に対する抗体を作製するために使用することができる。
【００３４】
第１の態様の方法において使用されるペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ｔｅｒｔ−ブチル、Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、Ａｌｌｏｃ（アリルオキシカルボニル）およびＴｒｔ（トリチル）などの、アミノ酸残基に対する従来の保護基を含むことができる。しかし、ペプチドは、好ましくは保護されない。
【００３５】
本発明のこの態様において使用されるペプチドはそのＯ−アルキルヒドロキシルアミン誘導体の形態で使用される。これらは下記の式（ＶＩ）によって表すことができる：
【００３６】
【化１６】
2004501106.tif 000013
式中、
【００３７】
【化１７】
2004501106.tif 000014
は遊離アミノ基を有する非誘導体化ペプチドであり；基Ｚは、−ＣＯ−（アミドを形成）、−ＳＯ２−（スルホンアミドを形成）、−ＣＯ．Ｏ−（カルバマートを形成）、−ＣＯ．ＮＨ−（ウレアを形成）、および−ＳＯ２．ＮＨ−（スルファミドを形成）から選択され；かつｍは１〜６の整数であり、好ましくは１である。Ｏ−アルキルヒドロキシルアミン誘導体は、ペプチドの遊離アミノ基を、好ましくは、保護されたアミノオキシ酢酸などの保護されたアミノオキシアルカン酸と反応させることによって形成される。アミノオキシ−ＮＨ２基に対する好適な保護基は当業者には明らかである。ＢｏｃおよびＦｍｏｃが典型的な例である。
【００３８】
アミノオキシアルカン酸と反応して、Ｏ−アルキルヒドロキシルアミンを形成するペプチドの遊離アミノ基は、ペプチドのＮ末端アミノ基であり得るか、あるいはペプチドのアミノ酸残基（例えば、リシン）の側鎖におけるアミノ基であり得る。ペプチドの１つ以上のアミノ基がアミノオキシアルカン酸との反応に利用できる場合、アミノオキシアルカン酸との反応が所望されないそのようなアミノ基を保護することが好ましい。Ｏ−アルキルヒドロキシルアミン誘導体を形成させた後、薬物−リンカー付加物との反応に先立って、すべての保護基を除くことが好ましい。
【００３９】
薬物−リンカー付加物およびペプチドのＯ−アルキルヒドロキシルアミン誘導体は、オキシム連結のための標準的な条件で、例えば、Ｇ．Ｔｕｃｈｓｃｈｅｒｅｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．、１９９３、３４、８４１９〜８４２２；Ｋ．Ｒｏｓｅ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９４、１１６、３０〜３３；およびＬ．Ｅ．Ｃａｎｎｅ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５、１１７、２９９８〜３００７に記載されているような条件で結合させることができる。例えば、オキシムは、ｐＨが約４の水溶液において形成させることができる。しかし、本発明者は、反応性のカルボニル基が薬物およびリンカーに存在するように薬物がアントラサイクリンである場合、リンカーのカルボニル基との反応の選択性が、若干高いｐＨで処理することによって改善され得ることを見出した。これらの化合物に対する好ましいｐＨ範囲は５から７までであり、ｐＨは好ましくは約６である。必要に応じて、所望するオキシム誘導体は、ＨＰＬＣなどの、当業者に公知のクロマトグラフィ技術によって分離することができる。
【００４０】
単なる例示として、ダウノルビシンまたはドキソルビシンとペプチドとをカップリングするための好ましいスキームが下記に例示される。上記で議論されたように反応条件を適切に操作することによって、（Ｂ）として示される所望する生成物の割合を、（Ａ）として示される所望されない生成物に対して最大にすることができる。
【００４１】
【化１８】
2004501106.tif 000015
【００４２】
本発明の第２の態様によれば、第１の態様の方法によって得ることができる、細胞傷害性薬物とペプチドとの複合体が提供される。
【００４３】
このような複合体は、複合体と、それに対する薬剤として許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む薬剤組成物の形態でヒトまたは動物の患者に投与することができる。本明細書中で使用される「薬剤として許容される」は、例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコまたは他の哺乳動物を含む温血動物、ならびにトリまたは他の温血動物の治療または診断において有用なそのような薬剤をいう。好ましい投与様式は非経口であり、具体的には、静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、腹腔内経路またはリンパ管内経路によるものである。そのような配合物は、当業者が熟知している担体、希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。これに関して、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、１９８０、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｓｏｌ他編）を参照のこと。そのような組成物は、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）などのタンパク質、緩衝剤または緩衝化物質（リン酸塩、他の塩または電解質など）などを含むことができる。好適な希釈剤には、例えば、滅菌された水、等張性生理的食塩水、薄いデキストロース溶液、多価アルコール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）またはそのようなアルコールの混合物などを挙げることができる。組成物は、フェネチルアルコール、メチルパラベンおよびプロピルパラベン、チメロサールなどの保存剤を含有することができる。所望する場合には、組成物は約０．０５重量パーセント〜約０．２０重量パーセントの抗酸化剤（メタ重亜硫酸ナトリウムまたは重亜硫酸ナトリウムなど）を含むことができる。
【００４４】
静脈内投与の場合、組成物は、好ましくは、患者への投与量が約０．０１ｇ〜約１ｇの複合体であるように調製される。好ましくは、投与量は約０．２ｇ〜約１ｇの複合体の範囲内である。本発明の複合体は、処置すべき疾患状態または改変すべき生物学的作用、複合体が投与されるべき様式、患者の年齢、体重および状態などの要因、ならびに主治医によって決定される他の要因に依存して広い投薬量範囲にわたって効果的である。したがって、任意の患者に対する投与量は個々に基づいて決定されなければならない。
【００４５】
本発明の様々な実施形態が、単なる例として、そして添付された図面を参照して下記に記載される。
【００４６】
図１Ａはレブリン酸リンカーを使用して試験ペプチドをダウノルビシンにカップリングしたときの、図１Ｂは５−オキソペンタン酸リンカーを使用して試験ペプチドをダウノルビシンにカップリングしたときの、所望する生成物（■）および所望されない生成物（□）の相対的な量を示すグラフである。
【００４７】
図２は、５−オキソペンタン酸リンカーを使用して試験ペプチドをドキソルビシンにカップリングしたときの所望する生成物（■）および所望されない生成物（□）の相対的な量を示すグラフである。
【００４８】
実施例
略号
Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＩＰＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ：Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＯＡｔ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
Ｔｒｔ：トリチル
【００４９】
一般的方法
すべての物質は市販の供給元から入手し、さらに精製することなく使用した。
【００５０】
薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）をシリカゲル６０Ｆ２５４プレコーティングプレート（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）で行った。分析ＨＰＬＣを、ダイオードアレイ検出器およびＢｅｃｋｍａｎｎＣ−１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えたＢｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄクロマトグラフにおいて１ｍｌ／分の操作流量で行った。分取ＨＰＬＣを、ＪａｓｃｏＵＶ−９７５検出器（モニター波長、２５４ｎｍおよび２１４ｎｍ）、Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−１８カラム（１００×２５０ｍｍ、１５μｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ６００Ｅクロマトグラフで行った。操作流量は３０ｍｌ／分であった。溶媒系は、溶離液Ａ：水（０．１％ＴＦＡ）；溶離液Ｂ：ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）であった。ＮＭＲスペクトルを、４００ＭＨｚ（１Ｈ）で操作されるＢｒｕｃｋｅｒ社の装置で記録した。ケミカルシフトは溶媒の残留シグナルに対してｐｐｍ単位で報告される。
【００５１】
ダウノルビシンのＮ−レブリネート（２）の合成
【００５２】
【化１９】
2004501106.tif 000016
ダウノルビシン塩酸塩（５６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、レブリン酸（純度：９７％、１２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（５２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３５μｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（０．５ｍｌ）の溶液を室温で撹拌した。（ＴＬＣ（シリカ、９：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によってモニターして）反応が終了したとき、溶液をＤＣＭ（５ｍｌ）で希釈し、１ＮのＨＣｌａｑ（３回）、ＮａＨＣＯ３飽和溶液およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、赤色のオイルを得た。クロマトグラフィ精製（シリカ、９：１のＤＣＭ−ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により、３５ｍｇ（５６％）の２を得た。
【００５３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−６ｄ）：７．９４（ｍ，２Ｈ）、７．６４（ｍ，１Ｈ）、７．５２（ｄ，１Ｈ）、５．５２（ｓ，１Ｈ）、５．２２（ｄｄ，１Ｈ）、４．９６（ｄｄ，１Ｈ）、４．７２（ｄ，１Ｈ）、４．１７（ｍ，１Ｈ）、３．９９（ｓ，３Ｈ）、３．９９（ｍ，１Ｈ）、３．３７（ｍ，１Ｈ）、３．００（ｍ，３Ｈ）、２．５７（ｍ，２Ｈ）、２．２５（ｓ，３Ｈ）、２．１７（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｓ，３Ｈ）、１．８４（ｍ，１Ｈ）、１．７４（ｍ，２Ｈ）、１．４２（ｍ，１Ｈ）、１．１３（ｄｄ，３Ｈ）。ＥＳ−ＭＳ　分析：［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝６２６，予想値：Ｃ３２Ｈ３５ＮＯ１２　６２５。
【００５４】
ダウノルビシンのＮ−５−オキソペンタノエート（３）の合成
【００５５】
【化２０】
2004501106.tif 000017
ダウノルビシン塩酸塩（５６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、５−オキソペンタン酸（純度：９７％、１５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（５７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３５μｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（０．５ｍｌ）の溶液を室温で撹拌した。（ＴＬＣ（シリカ、９：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によってモニターして）反応が終了したとき、溶液をＤＣＭ（５ｍｌ）で希釈し、１ＮのＨＣｌａｑ（３回）、ＮａＨＣＯ３飽和溶液およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、赤色のオイルを得た。クロマトグラフィ精製（シリカ、９：１のＤＣＭ−ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により、３６ｍｇ（５７％）の３を得た。
【００５６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−６ｄ）：７．８９（ｍ，２Ｈ）、７．６６（ｍ，１Ｈ）、７．４７（ｄ，１Ｈ）、５．５３（ｓ，１Ｈ）、５．２１（ｄｄ，１Ｈ）、４．９５（ｄｄ，１Ｈ）、４．７１（ｄ，１Ｈ）、４．１６（ｍ，１Ｈ）、４．００（ｓ，３Ｈ）、３．３９（ｍ，１Ｈ）、３．３７（ｍ，１Ｈ）、３．００（ｍ，２Ｈ）、２．３７（ｍ，２Ｈ）、２．２６（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｍ，２Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）、１．８４（ｍ，１Ｈ）、１．７４（ｍ，２Ｈ）、１．６３（ｍ，２Ｈ）、１．４２（ｍ，２Ｈ）、１．１５（ｄｄ，３Ｈ）。ＥＳ−ＭＳ　分析：［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝６４０，計算値：Ｃ３３Ｈ３７ＮＯ１２　６３９。
【００５７】
ドキソルビシンのＮ−５−オキソペンタノエート（４）の合成
【００５８】
【化２１】
2004501106.tif 000018
ドキソルビシン塩酸塩（１７４ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１７１ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（６９ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、５−オキソペンタン酸（４５ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１０５μｌ、０．６０ｍｍｏｌ）を含むＤＭＦ（３ｍｌ）の溶液を室温で撹拌した。（ＴＬＣ（シリカ、８：２のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によってモニターして）反応が終了したとき、溶液をＤＣＭ（１５ｍｌ）で希釈し、水、１ＮのＨＣｌａｑ（３回）、ＮａＨＣＯ３飽和溶液およびブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、１４３ｍｇ（７２％）の４を得た。
【００５９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−６ｄ）：７．９５（ｍ，２Ｈ）、７．６７（ｍ，１Ｈ）、７．４９（ｄ，１Ｈ）、５．４７（ｓ，１Ｈ）、５．２４（ｄｄ，１Ｈ）、４．９７（ｍ，１Ｈ）、４．８５（ｄｄ，１Ｈ）、４．７２（ｄ，１Ｈ）、４．５７（ｍ，２Ｈ）、４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．００（ｓ，３Ｈ）、４．００（ｍ，１Ｈ）、３．４０（ｍ，１Ｈ）、３．００（ｍ，２Ｈ）、２．３７（ｍ，２Ｈ）、２．３５〜２．１７（ｍ，４Ｈ）、２．０５（ｓ，３Ｈ）、１．８２（ｍ，１Ｈ）、１．７５（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，２Ｈ）、１．４５（ｍ，１Ｈ）、１．１２（ｄｄ，３Ｈ）。ＥＳ−ＭＳ　分析：［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝６５６，計算値：Ｃ３３Ｈ３７ＮＯ１３　６５５。
【００６０】
モデルペプチド複合体の合成：Ｈ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ２のＮ−アミノオキシアセテート（５）の合成
ペプチドを、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（０．１９ｍｅｑ／ｇ）（ＰＥＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）の０．５ｇにおいてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ９０５０Ｐｌｕｓ合成機でＦｍｏｃ−ｔ−Ｂｕの化学的手法によって合成した。チロシンに対する側鎖保護はＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔｅｒｔ−ブチル）−ＯＨであった。保護されたアミノ酸（１当量）は、ＰｙＢＯＰ（１当量）、ＨＯＢｔ（１当量）およびＤＩＥＡ（２当量）を用いて、樹脂アミノ基に対して５倍過剰のアシラントを使用して予備活性化された。カップリング時間は６０分であった。ＡｌａのＮ末端を、Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸（１当量）、ＤＩＰＣ（１当量）およびＨＯＢｔ（１当量）を用いて２時間反応させた（５倍過剰のアシラント）。合成が終了したとき、樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。ペプチド樹脂を、８８％ＴＦＡ、５％フェノール、２％トリイソプロピルシラン、５％水からなる２０ｍｌ（試薬Ｂ）で２時間処理した。樹脂をろ過し、ＴＦＡで洗浄した。このＴＦＡ溶液を、冷ＭＴＢＥをＴＦＡ／ＭＴＢＥ（１／１０の比）とともに含有するスクリューキャップ遠心分離チューブに滴下して加えた。３２００ｘｇで（３０分間）遠心分離した後、エーテル溶液を除き、ペプチド沈殿物を５０ｍｌのＭＴＢＥに再懸濁した。この操作を２回繰り返した。乾燥した沈殿物をＭｅＣＮ／水に溶解して、凍結乾燥した。
【００６１】
粗製の残渣を、イソクラティック溶離（５％溶離液Ｂ）、その後、５％〜１５％溶離液Ｂの２０分間の直線勾配を使用して分取ＨＰＬＣによって精製した。
【００６２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−６ｄ）（５のトリフルオロアセテート塩について）：１０．５０（ｓ，１Ｈ）、８．２０（ｍ，２Ｈ）、８．０５（ｄ，１Ｈ）、８．００（ｄ，１Ｈ）、７．００（ｄ，２Ｈ）、６．６０（ｄ，２Ｈ）、４．４０（ｍ，１Ｈ）、４．３０（ｍ，１Ｈ）、４．３５（ｄ，２Ｈ）、３．７０（ｓｂｒ，２Ｈ）、２．９０（ｄｄ，１Ｈ）、２．６５（ｄｄ，１Ｈ）、１．１５（ｄ，３Ｈ）。ＥＳ−ＭＳ　分析：［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝３８３，計算値：Ｃ１６Ｈ２３Ｎ５Ｏ６　３８２。
【００６３】
連結の位置選択性のｐＨ依存性を分析するための一般的手順
【００６４】
【化２２】
2004501106.tif 000019
【００６５】
典型的な実験では、２．６μｍｏｌの５および３．９μｍｏｌのケト誘導体（２、３または４）を１ｍｌのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ２．６）または酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４．０、５．０、６．０）に溶解して、反応をＨＰＬＣによってモニターした（ＲＰ　Ｃ−１８カラム、流速：１ｍｌ／分、５％〜７０％溶離液Ｂの２０分間の直線勾配、ＵＶ検出：２１４ｎｍおよび４９０ｎｍ）。
【００６６】
ＭＳフラグメント化パターンを、上記の勾配を使用する粗混合物のＬＣ−ＭＳ（ＥＳ−ＭＳ）によって調べた。各異性体（同じ分子イオンを有することが明らかである）は、構造の帰属を可能する特徴的なフラグメント化パターンを示した。構造の帰属は、その後、単離された異性体の１Ｈ−ＮＭＲ分析によって確認された。
【００６７】
【化２３】
2004501106.tif 000020
【００６８】
２つの位置異性体（７ａおよび７ｂ）の合成および分離
ペプチド５（１０ｍｇ、２６μｍｏｌ）およびダウノルビシン誘導体２（２２ｍｇ、１．３当量）を含む５ｍｌの酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４）の溶液を室温で１２時間撹拌した。溶媒を真空留去して、赤色の残渣を、イソクラティック溶離（５％溶離液Ｂ、５分）、その後、５％〜６０％溶離液Ｂの２５分間の直線勾配を使用する分取ＨＰＬＣに付した（Ｎｕｃｌｅｏｓｙｌ　Ｃ１８カラム：２５０×１００ｍｍ、１５μｍ）。純粋な異性体に対応する画分をまとめた。凍結乾燥後、これらより、３．５ｍｇの７ａおよび３．５ｍｇの７ｂが得られた（総収率：２７％）。
【００６９】
異性体７ａ：１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−６ｄ）：１４．５０（ｓ，１Ｈ）、１３．３０（ｓ，１Ｈ）、８，２５（ｔ，１Ｈ）、８．００（ｄ，１Ｈ）、７．９０（ｍ，２Ｈ）、７．６５（ｍ，１Ｈ）、７．４５（ｍ，２Ｈ）、７．００（ｄ，２Ｈ）、６．６０（ｄ，２Ｈ）、５．５５（ｓ，１Ｈ）、５．２５（ｓｂｒ，１Ｈ）、４．９５（ｄｄ，１Ｈ）、４．７５（ｓｂｒ，１Ｈ）、４．４０（ｍ，１Ｈ）、４．３０（ｍ，４Ｈ）、４．２０（ｍ，１Ｈ）、４．００（ｓ，３Ｈ）、３．７５（ｍ，２Ｈ）、３．４０（ｍ，１Ｈ）、３．００（ｍ，３Ｈ）、２．７０（ｍ，１Ｈ）、２．２５（ｓ，３Ｈ）、２．１５〜２．０５（ｍ，４Ｈ）、１．８０および１．７５（ｓ，３Ｈ）、１．７５〜１．５０（ｍ，５Ｈ）、１．４５（ｍ，１Ｈ）、１．１５（ｍ，６Ｈ）。ＥＳ−ＭＳ　分析：［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝１００４，計算値：Ｃ４９Ｈ５８Ｎ６Ｏ１２　１００３。
【００７０】
異性体７ｂ：１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−６ｄ）：１４．５０（ｓ，１Ｈ）、１３．３０（ｓ，１Ｈ）、８．２０（ｍ，１Ｈ）、８．００（ｍ，１Ｈ）、７．９５（ｍ，２Ｈ）、７．６５（ｍ，１Ｈ）、７．５０（ｍ，２Ｈ）、７．００（ｄ，２Ｈ）、６．６０（ｄ，２Ｈ）、５．２５（ｍ，２Ｈ）、４．９５（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｓｂｒ，１Ｈ）、４．５０〜４．２０（ｍ，５Ｈ）、４．１５（ｍ，１Ｈ）、４．００（ｓ，３Ｈ）、３．７５（ｓｂｒ，２Ｈ）、３．１５〜２．８０（ｍ，４Ｈ）、２．６５（ｍ，１Ｈ）、２．３５（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｓ，３Ｈ）、１．９５（ｓ，３Ｈ）、１．８０（ｍ，１Ｈ）、１．６０（ｍ，２Ｈ）、１．４５（ｍ，１Ｈ）、１．１５（ｍ，６Ｈ）。ＥＳ−ＭＳ　分析：［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝１００４，計算値：Ｃ４９Ｈ５８Ｎ６Ｏ１２　１００３。
【００７１】
【化２４】
2004501106.tif 000021
【００７２】
メチルケトンからのオキシムの生成は、対応する１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいてメチルを高磁場側にシフトさせた。オキシムが生成したときの３におけるＡおよびＢのメチルのシフトを比較することにより、ＬＣ−ＭＳによって以前に行われた構造帰属が確認される：
異性体７ａ：Ｍｅ（Ａ）２．２５ｐｐｍ　Ｍｅ（Ｂ）１．７５ｐｐｍ
異性体７ｂ：Ｍｅ（Ａ）１．９５ｐｐｍ　Ｍｅ（Ｂ）２．０５ｐｐｍ。
【００７３】
オキシム生成における位置選択性のｐＨ依存性
オキシム生成に対する位置選択性をｐＨの関数として調べた。異性体比を、示された実験条件で得られた粗混合物のＨＰＬＣクロマトグラムにおけるピーク面積を積分することによって評価した。
【００７４】
図１から明らかであるように、所望する位置異性体は、ｐＨが高いときに有利である。５−オキソペンタン酸は、レブリン酸よりも良好な結果をもたらす。
【００７５】
ドキソルビシン誘導体４の場合、位置選択性はｐＨ６において最大であり、この場合、所望されない位置異性体は検出できなかった（図２）。
【００７６】
複雑なペプチド複合体の合成
様々な側鎖をすべてが含むより大きいペプチドに対する本方法の適用性の例として、下記の複合体を調製した：ａ）Ｃ末端リシンのε−アミノ基においてアミノオキシ酢酸により誘導体化された３３量体ペプチド９との２および３の複合体、そしてｂ）ジスルフィド架橋を含有するペプチド（１２）との３の複合体。
【００７７】
ＡＥＧＥＦＡＬＳＥＴＡＫＲＷＲＬＬＦＹＲＡＧＶＧＮＡＥＤＰＡＫＧＧＫ（ＣＯＣＨ２ＯＮＨ２）ＣＯＮＨ２（９）の合成
ペプチドを、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（０．１９ｍｅｑ／ｇ）（ＰＥＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ）の０．５ｇにおいてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ９０５０Ｐｌｕｓ合成機でＦｍｏｃ−ｔ−Ｂｕの化学的手法によって合成した。下記の側鎖保護されたアミノ酸誘導体を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（Ｃ末端Ｌｙｓの場合）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。Ｎ末端アラニンはＢｏｃ誘導体として取り込まれた。保護されたアミノ酸（１当量）は、ＰｙＢＯＰ（１当量）、ＨＯＢｔ（１当量）およびＤＩＥＡ（２当量）を用いて、樹脂アミノ基に対して５倍過剰のアシラントを使用して予備活性化された。カップリング時間は６０分であった。
【００７８】
Ｃ末端ＬｙｓのＮεアリルオキシカルボニル保護基の切断
乾燥したペプチド樹脂を、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）の溶液（５％酢酸および２．５％Ｎ−メチルモルホリンを含有するＣＨＣｌ３において０．０７Ｍ）の１０ｍｌを用いて一晩処理した。その後、樹脂を取り出し、ＤＭＦで洗浄し、そして０．５％ジエチルジチオカルバメートおよび０．５％ＤＩＥＡを含むＤＭＦの溶液で繰り返し洗浄した。
【００７９】
Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸のカップリング
Ｃ末端ＬｙｓのＮεアミノ基を、Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸（１当量）、ＤＩＰＣ（１当量）およびＨＯＢｔ（１当量）を用いて２時間反応させた（５倍過剰のアシラント）。その後、樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ジエチルエーテルで洗浄し、真空乾燥した。
【００８０】
樹脂からのペプチドの切断
ペプチド樹脂を、８８％ＴＦＡ、５％フェノール、２％トリイソプロピルシラン、５％水からなる２０ｍｌ（試薬Ｂ）で２時間処理した。樹脂をろ過し、ＴＦＡで洗浄した。このＴＦＡ溶液を、冷ＭＴＢＥをＴＦＡ／ＭＴＢＥ（１／１０の比）とともに含有するスクリューキャップ遠心分離チューブに滴下して加えた。３２００ｘｇで（３０分間）遠心分離した後、エーテル溶液を除き、ペプチド沈殿物を５０ｍｌのＭＴＢＥに再懸濁した。この操作を２回繰り返した。乾燥した沈殿物をＭｅＣＮ／水に溶解し、凍結乾燥した。粗ペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ　Ｃ−４カラム（２５×２００ｍｍ）での分取ＨＰＬＣによって精製した。典型的な操作において、ペプチド（１０ｍｇ）を水／０．１％ＴＦＡに溶解して、３０ｍｌ／分の流速で、分取用カラムに負荷し、２０％〜３５％溶離液Ｂの２０分間の直線勾配で溶離した。所望するペプチド（９８％の純度）を含有する画分をまとめて、凍結乾燥した：収量、３ｍｇ（３０％）。ＥＳ−ＭＳ分析：計算値（平均同位体組成）３７６８．２Ｄａ、実測値：３７６８．４Ｄａ。
【００８１】
ＡＥＧＥＦＡＬＳＥＴＡＫＲＷＲＬＬＦＹＲＡＧＶＧＮＡＥＤＰＡＫＧＧＫ（ＣＯＣＨ２ＯＮ＝Ｑ）ＣＯＮＨ２（１０、Ｑ＝ダウノルビシノン）および（１１、Ｑ＝ドキソルビシノン）の合成
両方の反応は、５倍過剰の３または４を使用して、ｐＨ６の水性緩衝液中であった。目的の複合体は２４時間後に順調に得られ、分取ＨＰＬＣによって単離された（ＲＰ　Ｃ４、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、１０×２５０ｍｍ、１５％〜５０％溶離液Ｂの３０分間の直線勾配）。収率は、１０および１１について、それぞれ４３％および３４％であった。
【００８２】
【化２５】
2004501106.tif 000022
１０：ＥＳ−ＭＳ分析：［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝４３８９、計算値（Ｃ２００Ｈ２９５Ｎ５１Ｏ６１）４３８９。
１１：ＥＳ−ＭＳ分析：［Ｍ＋Ｈ＋］ｍ／ｚ＝４４０６、計算値（Ｃ２００Ｈ２９５Ｎ５１Ｏ１０）４４０５。
【００８３】
ペプチド（１２）の合成
【００８４】
【化２６】
2004501106.tif 000023
ペプチドを、前記の実施例に詳しく記載されるようにＦｍｏｃ−ｔ−Ｂｕ化学によって合成した。下記の側鎖保護されたアミノ酸誘導体を使用した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（Ｃ末端Ｌｙｓ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。Ｎ末端アラニンはＢｏｃ誘導体として取り込まれた。保護されたアミノ酸（１当量）は、ＰｙＢＯＰ（１当量）、ＨＯＢｔ（１当量）およびＤＩＥＡ（２当量）を用いて、樹脂アミノ基に対して５倍過剰のアシラントを使用して予備活性化された。カップリング時間は６０分〜９０分であった。
【００８５】
Ｃ末端ＬｙｓのＮεアリルオキシカルボニル保護基の切断およびＢｏｃ−アミノオキシ酢酸のカップリングを、前記の実施例に記載されるように行った。
【００８６】
樹脂からのペプチドの切断および精製
合成が終了したとき、樹脂を、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ジエチルエーテルで洗浄して、真空乾燥した。ペプチド樹脂を、８８％ＴＦＡ、５％フェノール、２％トリイソプロピルシラン、５％水（試薬Ｂ）で２時間処理し、その後、前記に記載されるように処理した。ジスルフィド架橋を、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、Ｗｕ，Ｃ．−Ｒ．、Ｌｉｕ，Ｗ．およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｗ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９１、１１３、６６５７〜６６６２に記載されるように形成させた。粗ペプチドを、ＤＭＳＯの水性溶液（１５％、ｐＨ７．２）において、０．１０ｍｇ／ｍｌ〜０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度で一晩撹拌し、反応終了後、酸化されたペプチドを分取ＨＰＬＣによって単離した。
【００８７】
粗製ペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ　Ｃ−４カラム（２５×）２００ｍｍ）での分取ＨＰＬＣによって精製した。典型的な操作において、１３０ｍｌの酸化されたペプチドの溶液をＴＦＡ（０．１％）で酸性化して、３０ｍｌ／分の流速で、分取用カラムに負荷し、１５％溶離液Ｂでイソクラティック溶離し、その後、１５％〜２２％溶離液Ｂの２０分間の直線勾配によって溶離した。所望するペプチド（９８％の純度）を含有する画分をまとめて、凍結乾燥した：収量、３ｍｇ（２０％）。ＥＳ−ＭＳ分析：計算値（平均同位体組成）３０２２．４Ｄａ、実測値：３０２２．３Ｄａ。
【００８８】
複合体（１３、Ｑ＝ダウノルビシノン）の合成
【００８９】
【化２７】
2004501106.tif 000024
反応を、６倍過剰の３を使用して、ｐＨ６．０の水性緩衝液中で行った。目的の複合体が５日後に得られ（４：１の位置異性体比）、５ｍｌ／分での２０％〜４５％溶離液Ｂの２０分間の直線勾配を使用するセミ分取ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ４（ＪＵＰＩＴＥＲ）カラム（２５０×１０ｍｍ）でのＨＰＬＣによって単離した（収率：２３％）。別の反応をｐＨ３．７で行い、２４時間後に終了したが、位置異性体比は１：１であった。
【００９０】
【化２８】
2004501106.tif 000025
ＥＳ−ＭＳ分析：計算値（平均同位体組成）３６４３．５Ｄａ、実測値：３６４３．２Ｄａ。
【図面の簡単な説明】
【図１】
Ａはレブリン酸リンカーを使用して試験ペプチドをダウノルビシンにカップリングしたときの所望する生成物（■）および所望されない生成物（□）の相対的な量を示すグラフである。Ｂは５−オキソペンタン酸リンカーを使用して試験ペプチドをダウノルビシンにカップリングしたときの所望する生成物（■）および所望されない生成物（□）の相対的な量を示すグラフである。
【図２】
５−オキソペンタン酸リンカーを使用して試験ペプチドをドキソルビシンにカップリングしたときの所望する生成物（■）および所望されない生成物（□）の相対的な量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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