(57)【要約】一般式Iの化合物ソルビシルラクトンＡおよびソルビシルラクトンＡ誘導体、ならびにそれらの製造方法に関する。ソルビシルラクトンＡおよびソルビシルラクトンＡ誘導体は、細胞培養モデルにおいて、抗腫瘍性および抗ウイルス性特性を発揮する。更に、ソルビシルラクトンＡは炎症抑制特性を有する。最後に、ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体の合成を記述する。  【化１】2006503049.tif 000019
2006503049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（２）の化合物：
【化１】
2006503049.tif 000016
式中、Ｒ１は−Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ここでアルキルは直鎖または分枝である、（Ｃ３〜Ｃ１０）アルケニル、またはアシル基（例えば、フォルミル、アセチル、トリクロロアセチル、フマリル、マレイル、サクシニル等）から選択され、ここで最終的な遊離−ＣＯＯＨ基はこのアシル基上でエステル型（例えばメチルエステル−ＣＯＯＭｅ）としても存在可能である、または、任意にＲ１は複素環アシル置換体（３）または（４）の中の１でも有り得る、
【化２】
2006503049.tif 000017
Ｒ２は−Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ここでアルキルは直鎖または分枝である、またはアシル基（例えば、フォルミル、アセチル等）から選択される；
Ｒ３は−Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ここでアルキルは直鎖または分枝である、またはアシル基（例えば、フォルミル、アセチル等）から選択される；
Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ここでアルキルは直鎖または分枝である、または（Ｃ３〜Ｃ１０）アルケニル、ここでアルケニル残基は１または数個の二重結合を含むことができる；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＯＨまたはＮＯＲ５から選択され、ここでＲ５は直鎖または分枝鎖の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである；
ＹはＯであるか、またはＹとＸがＮ原子であって互いに結合してピラゾール環を形成する；
そして、ここで該化合物は（Ｒ，Ｒ，Ｒ）立体異性体、（Ｒ，Ｒ，Ｓ）立体異性体、（Ｒ，Ｓ，Ｒ）立体異性体、（Ｒ，Ｓ，Ｓ）立体異性体、（Ｓ，Ｒ，Ｒ）立体異性体、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）立体異性体、（Ｓ，Ｓ，Ｒ）立体異性体および（Ｓ，Ｓ，Ｓ）立体異性体として存在することができる、および（２）の医薬的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項２】
式（１）： 
【化３】
2006503049.tif 000018
を有する、請求項１に記載の化合物（ソルビシルラクトンＡ）またはその誘導体、それらのジアステレオマー、および対応するエナンチオマー、およびこの化合物の医薬的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項３】
ペニシリウム属、特にペニシリウム  クリソジナム属の菌を既知の様式で増殖し、その培養培地および／または菌バイオマスから本発明化合物の少なくとも１を単離することを含む、請求項１または２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
増殖が海洋生物、特に海綿動物イルシニア  ファシクラータ（ポリフェーラ）において行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
単離した化合物を引き続き合成的に誘導体化することを更に含む請求項３または４に記載の方法
【請求項６】
請求項１または２に記載の化合物を生体模倣的に合成する方法であって、
ａ）ソルビシリンおよび／またはその誘導体を準備すること、
ｂ）酸化により脱芳香族化し、続いてアラニンまたは他のアミノ酸およびこれらの類似体を添加すること、および
ｃ）引き続きフマール酸または類似のアシル残基を付加すること
を含む方法。
【請求項７】
疾患治療に使用する請求項１または２に記載の化合物。
【請求項８】
適切な賦形剤または添加剤と共に請求項１または２に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項９】
適切な医薬的に許容される希釈剤または担体物質と共に、該化合物が持続性薬物の形態で、または前駆体として存在することを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該化合物が２０μｇの量で存在することを特徴とする請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
治療時に生体内濃度が０．３〜３．０μｇ／ｍｌの範囲となるような量で存在することを特徴とする請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
化学療法剤が更に含有されることを特徴とする請求項８から１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
錠剤、糖衣剤、カプセル剤、液滴剤、坐剤、経口用、直腸用もしくは非経口用の注入または点滴の製剤の形態である請求項８から１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
腫瘍ならびに／もしくはウイルス性疾患の治療用および／または炎症性状態の治療用の薬剤を製造するための請求項１または２に記載の化合物の使用。
【請求項１５】
適切な医薬的に許容される希釈剤または担体物質と共に、持続性薬物の形態でのまたは前駆体としての請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ＨＩＶ−１の治療のための、０．３〜３．０μｇ／ｍｌの濃度範囲での請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１７】
炎症の治療のための、２μｇ／ｍｌの濃度での請求項１４または１５に記載の使用。
【請求項１８】
浮腫形成の治療のための、２０μｇの量での請求項１４または１５に記載の使用
【請求項１９】
請求項１または２に記載の化合物または請求項８から１３のいずれか1項に記載の医薬組成物を投与することを含む、腫瘍ならびに／もしくはウイルス性疾患および／または炎症性状態から選択された疾患の治療方法。
【請求項２０】
適切な医薬的に許容される希釈剤もしくは担体物質と共に、持続性薬物の形態での、または前駆体として、医薬組成物を投与することを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ウイルス性疾患がＨＩＶ−１であり、該化合物を０．３〜３．０μｇ／ｍｌの濃度範囲で投与する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
炎症を治療し、該化合物を２μｇ／ｍｌの濃度で投与する請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
浮腫形成を治療し、該化合物を２０μｇの量で投与する請求項１９から２２のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソルビシルラクトンＡと指称される、海洋生物由来の新規な生物活性化合物、およびそれらの誘導体に関する。更に本発明は、これらの化合物の製造方法、これらを含有する薬剤、および疾患の治療におけるこれらの使用に関する。更に、ソルビシルラクトンＡとそれらの誘導体の合成を記載する。
【背景技術】
【０００２】
海洋の真核生物、特に海綿類、ヒドロ虫類、ブリオ虫類、被嚢類から生物活性物質の非常に豊富な資源が提供されている（非特許文献１）。これは、これらの多細胞生物は固着生物であって、栄養源を周囲の環境に存在する微生物から得ているためである。したがって、これら生物には、細菌ないし真菌による感染から自分自身を防護するための有効な防衛的メカニズムが必要である。その最も活性な防衛的物質は、これら海洋真核生物の体内に存在している共生生物が産生する二次代謝産物に似ている。そこで、大部分の事例では、この生物活性物質の実際の生産者は宿主（海綿類、ヒドロ虫類、ブリオ虫類、被嚢類）であるのか、あるいはこの宿主にしばしば共生している微生物（真菌類、細菌類）であるのかは、今日に至っても不明である（非特許文献２）。近年、海綿類にはウイルスを排除する防衛メカニズムがあるということも提示された（非特許文献３）。かくして、これら微生物を培地で増殖させて、生物活性物質を生産させることが主要な研究目標である。
【０００３】
現在では、海洋真核生物の体内に存在する細菌類と真菌類の中で培地に保持可能なのは５％未満であると推定できる。したがって、これらの有用物は未だ開発されていない。生物活性のある有用物を首尾よく持続的に開発するためには、培地から高収率で生物活性物質を収得する最適な微生物培養方法を開拓することが必須であり、その目的は効果的な精製と分析の方法によってこれら生物活性物質を同定することである。海洋真核生物が産生する薬物で今日までに臨床治療に導入されているのは、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデノシン［ａｒａＡ］の唯一つだけである（非特許文献４）。
【０００４】
生物活性のある二次代謝産物を商品的に開発する利用範囲は広く、その範囲は神経変性疾患のある腫瘍の治療から細菌類、ウイルス類および／または真菌類による感染症の治療に至る。
【０００５】
特定の腫瘍に対し高度の特異性を発揮すると同時にウイルスによる等の不特定な感染を縮小する生物活性物質が集中的に研究されている。
【非特許文献１】Sarma AS, Daum T,Muller WEG (1993) 海綿からの二次代謝産物. Academy of non-profitsciences in Erfurt, Ullstein-MosbyVerlag, Berlin
【非特許文献２】Althoff et al.(1998) Marine Biol 130:529-536; Wiens et al., MarineBiol.; in press
【非特許文献３】Grebenjuk et al.(2002)Europ.J.Biochem.269: 1382-1392
【非特許文献４】Muller et al. (1977) Ann. New York Acad Sci 284:34-48
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、それ故、海洋生物由来の新規生物活性物質、その製造方法、およびその使用の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、この目的は、まずソルビシルラクトンＡおよびソルビシルラクトンＡ誘導体と指称される生物活性物質の提供によって解決される。ソルビシルラクトンＡは天然化合物であって、今日までそれの記載はない。したがって、その宿主範囲も大部分は未知である。ソルビシルラクトンＡの関連化合物で文献に記載されたものはない。
【０００８】
一般式（１）および（２）のソルビシルラクトンＡおよびソルビシルラクトンＡ誘導体は明確な抗腫瘍および抗ウイルスの特性を発揮することを見出した。すなわち本発明により一般式（２）の化合物が提供される：
【０００９】
【化４】
2006503049.tif 000003
【００１０】
式中、Ｒ１は−Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ここでアルキルは直鎖または分枝、（Ｃ３〜Ｃ１０）アルケニル、またはアシル基（例えば、フォルミル、アセチル、トリクロロアセチル、フマリル、マレイル、サクシニル等）から選択され、最終的にここでこのアシル基には遊離−ＣＯＯＨがエステル型（例えばメチルエステル−ＣＯＯＭｅ）としても存在可能である、または、任意にＲ１は複素環アシル置換体（３）または（４）の中の１でも有り得る、
【００１１】
【化５】
2006503049.tif 000004
【００１２】
Ｒ２は−Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ここでアルキルは直鎖または分枝、またはアシル基（例えば、フォルミル、アセチル等）から選択される；
Ｒ３は−Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ここでアルキルは直鎖または分枝、またはアシル基（例えば、フォルミル、アセチル等）から選択される；
Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、ここでアルキルは直鎖または分枝、または（Ｃ３〜Ｃ１０）アルケニルから選択され、ここでアルケニル残基は１または数個の二重結合を含むことができる；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＯＨまたはＮＯＲ５から選択され、ここでＲ５は直鎖または分枝鎖の（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルである；
ＹはＯであるか、またはＹとＸがＮ元素であって互いに結合してピラゾール環を形成する；
なお、ここで該化合物は（Ｒ，Ｒ，Ｒ）立体異性体、（Ｒ，Ｒ，Ｓ）立体異性体、（Ｒ，Ｓ，Ｒ）立体異性体、（Ｒ，Ｓ，Ｓ）立体異性体、（Ｓ，Ｒ，Ｒ）立体異性体、（Ｓ，Ｒ，Ｓ）立体異性体、（Ｓ，Ｓ，Ｒ）立体異性体および（Ｓ，Ｓ，Ｓ）立体異性体として存在することができる、および（２）の医薬的に許容される塩または溶媒和物。
【００１３】
本発明による好ましい化合物は、式（１）：
【００１４】
【化６】
2006503049.tif 000005
【００１５】
を有する化合物（ソルビシルラクトンＡ）またはその誘導体、それらのジアステレオマー、および対応するエナンチオマー、およびこの化合物の医薬的に許容される塩または溶媒和物である。
【００１６】
本発明において、「誘導体」とは、一般式（２）から誘導される化合物であって、例えばＲ１ないしＲ４およびＸまたはＹとして上に示した各種の残基で置換されたもの、並びにこれら化合物の数種の混合物であって、例えば診断データあるいは治療成功または治療成果に関するデータに基づいて治療対象の疾患に適合したおよび／または患者に適合した「個人別の」薬剤に調製可能なもの、とすることができる。更に、ソルビシルラクトンＡのクラスの化合物とは、他の（例えば）海洋生物から単離可能な誘導体であって、本明細書に（例示的に）挙げたようなものと理解するものとする。
【００１７】
本発明において、「前駆体」として理解される物質とは、一方で治療投与の過程で生体内条件（例えば、胃内ｐＨなど）により変化し、あるいは摂取後に生体を通過する過程で代謝され、その結果本発明化合物またはその誘導体を活性物質として形成するものとする。他方、生物から単離されたソルビシルラクトンＡの誘導体であって、各生物において該化合物が合成される出発物質として機能し、本明細書に示したソルビシルラクトンＡの特性を既に発揮しているものは前駆体として理解されるものとする。
【００１８】
ソルビシルラクトンＡおよびこの物質から誘導したソルビシルラクトンＡ誘導体には明確ながら予測不能な抗腫瘍および抗ウイルス特性があることを見出した。更に驚くべきことに、この新規物質の炎症阻止特性が見出された。これらの特性により、およびソルビシルラクトンＡおよびソルビシルラクトンＡ誘導体は哺乳動物（例えばマウス）に対し、顕著に毒性がないという知見に基づけば、本明細書に記載の当該物質は腫瘍およびウイルス性疾患の治療に適している。適切な医薬的に許容される賦形剤または担体物質と共に、該物質をそのままの形態でまたは持続性薬物の形態または前駆体として使用することが推奨される。
【００１９】
海洋資源、無脊椎動物、および微生物に由来する多数の天然化合物が記述されている。従って、生物学的に活性な新規化合物を求める研究のためには、効果的な重複回避が必要であり、すなわち既知化合物は同定作業の初期段階で前もって発見し明確に同定しなければならない。この目的のためには、数種の分光的検知方法と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が特に適切である。ＨＰＬＣとＮＭＲ、ＭＳ、およびＣＤが結合した「ＬＣトリエード（LC-triade'）」は特に有能である（Bringmann etal. (1998) Anal. Chem. 70:2805-2811; Bringmannet al.(1999) Anal. Chem. 71:2678-2686）。抽出物の成分化合物に関して分光的データが得られれば、個々の化合物を実際に単離しなくても、データベースを調査することにより既知物質を明瞭に同定することができる。更に、状況が適切であれば、予め単離していなくても未知天然化合物の完全な立体構造の解明であっても可能である。
【００２０】
ソルビシルラクトンＡは天然化合物であり、ソルビシルラクトンＡ誘導体はそれから誘導した合成産物であり、これらは今日まで未知であり、その活性は記述されていない。
【００２１】
本発明によれば、これらの化合物は、通常の溶媒、賦形剤および担体物質を使用して錠剤、糖衣剤、カプセル剤、液滴剤、坐剤、注入および点滴用製剤に加工することができ、その目的は経口、直腸または非経口投与のための治療用途を見出すことである。
【００２２】
また、本発明は、上記化合物の製造方法であって、該物質を好ましくは海洋生物、例えば海綿体の体内共生物として増殖しているペニシリウム属の真菌から単離することを特徴とする方法に関する。ペニシリウム属の真菌（好ましくはペニシリウム  クリソジナム）が本発明化合物の生産者であることは本発明において最初に検出された。以下の培養条件の下でソルビシルラクトンＡは培養培地中に分泌され、また特に真菌のバイオマスに蓄積する。真菌は、無性世代のトリココマーケア／デューテロマイセット／マイトスポリックフンジ、コードグループ１．Ａ２．１５として系統的に特徴化されているペニシリウムＬＩＮＫ（１８０９）属のメンバーである。この属の特徴は、注目に値する生化学的な潜在能力を有する種が広範に多数あることである。現存の種は１９１０年以来公知であり、陸上に小さな棲息圏を持つ生物と今日まで説明されてきた。しかし、本真菌単離体（真菌株）は、海洋に棲む環境から誘導され、海綿イルシニア  ファシキュラータ（ポリフェーラ）から単離された。しかし、本発明で行った構造的解明に基づけば、本発明化合物は通常の合成化学によっても製造できるし、あるいは誘導体および前駆体に変更することもできる。この目的には、本発明の別の態様として、本発明化合物を生体模倣的に合成する方法が好ましく、最初にソルビシリンおよび／またはその誘導体を得て、次に酸化的に脱芳香族化し、引き続きアラニン（ソルビシリンＡの場合）または他のアミノ酸およびそれらの同族体（他のソルビシリン誘導体に対して）を公知の方法で添加し、次にフマール酸（ソルビシリンＡの場合）または同族のアシル残基（他のソルビシリン誘導体に対して）を付加する。
【００２３】
本発明の他の態様は上記化合物の少なくとも１を疾患、例えば腫瘍性および／またはウイルス性疾患の治療におよび／または感染状態の治療に使用することに関する。この使用は、例えば適切な医薬的に許容される希釈剤または担体物質と共に持続性薬物の形態でまたは前駆体として行うことができる。ＨＩＶ−１関連疾患の治療の場合には、０．３〜３．０μｇ／ｍｌの濃度範囲での治療が好ましく、感染の治療の場合には、約２μｇ／ｍｌの濃度が好ましい。浮腫形成の治療では、上記化合物の約２０μｇの量を使用する。更なる態様は、１つまたは数個の本発明化合物を腫瘍性ならびに／もしくはウイルス性疾患の治療用、および／または炎症状態の治療用薬剤の製造に使用することである。この製造は、上記と同様な方法でかつ上記の濃度で、そして特に上記使用のために行うことができる。
【００２４】
本発明の他の態様は適切な添加剤または賦形剤と共に本発明化合物を含有する医薬組成物に関する。この医薬組成物の特徴は、適切な医薬的に許容される希釈剤または担体物質と共に該化合物が持続性薬物の形態でまたは前駆体として存在可能であることである。
【００２５】
特に好ましいのは、本発明医薬化合物が（浮腫形成の治療に特に適する）２０μｇの量で存在する医薬組成物、または本発明化合物が、治療中の生体内に（ウイルス性および／または炎症性疾患の治療に特に適する）０．３〜３．０μｇ／ｍｌの濃度範囲で存在するような量で存在する医薬組成物である。
【００２６】
好ましい本発明の医薬組成物は更に化学療法剤を含有する。これら化学療法剤には、癌療法において当業者に周知の化学療法剤（例えばタキソール他）が全て包含される。
【００２７】
本発明によれば、上記医薬組成物は錠剤、糖衣剤、カプセル剤、液滴剤、坐剤、経口用、直腸用または非経口用の注入または点滴の製剤の形態で存在することができる。そのような投与形態およびその製造は当業者に公知である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
一般式（１）および（２）の、本方法の製造物は有益な薬理学的特性を発揮する。特にＬ５１７８ｙマウスリンパ腫細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２２）を使用して抗腫瘍効果が確認された。これらの細胞は以前に既述したような懸濁培地に保持した（Mulleret al. (1979) Cancer Res. 39: 1102-1107）。これら腫瘍細胞株中のソルビシルラクトンＡ（培養：１０，０００細胞／ｍｌ、培養時間：７２時間）のＥＤ５０濃度は２．２±０．３μｇ／ｍｌであった。腫瘍細胞株PC-12（副腎クロム親和性細胞腫，［ラット］；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２１）、肉腫１８０（マウス肉腫；ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  ６６）、およびＨｅＬａ  Ｓ３（上皮癌［頚；ヒト］；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２．２）ではソルビシルラクトンＡの効果は僅かに低くなり、ＥＤ５０濃度は８〜１５μｇ／ｍｌであった。
【００２９】
更に、本発明は、腫瘍性ならびに／もしくはウイルス性疾患および／または炎症性状態から選択される疾患の治療方法であって、本発明化合物を例えば本発明医薬組成物の形態で投与することを特徴とする方法に関する。本発明によれば、この投与は適切な医薬的に許容される希釈剤または担体物質と共に持続性薬物の形態でまたは前駆体として行うことができる。
【００３０】
特に好ましい治療方法は、ウイルス性疾患がＨＩＶ−１感染である場合である。この場合には、化合物の投与を０．３〜３．０μｇ／ｍｌの生体内濃度範囲で行うことができる。この濃度を達成するのに必要な量を得ることは当業者には容易であり、この量は特に個々の患者、疾患、および使用する個々の化合物の生体利用性に依存する。治療対象の別のウイルス性疾患としては、別の典型的なＨＩＶ感染、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）感染、ヘルペスおよび／またはＲＳＶウイルス性疾患が挙げられる。
【００３１】
更に好ましい疾患治療方法は、炎症を治療する場合である。これのためには、ウイルス性疾患での投与と同様に、２μｇ／ｍｌの生体内濃度で行うことができる。可能な更なる治療は浮腫形成への治療である。このためには、本発明化合物を２０μｇの量で投与することができる。
【００３２】
治療の場合に使用する化合物濃度では培地中の非腫瘍細胞は細胞増殖抑制効果を受けないということは、腫瘍性疾患の化学療法および抗ウイルス療法に本方法の生産物を使用する上で特に重要である。リンパ球培地での実験からこの結果が結論された。すなわち、脾臓のリンパ球を６週令のＮＭＲＩマウスから得て、赤血球を塩化アンモニア処理で懸濁液から除去した。脾臓のリンパ球は、２０％ウシ胎仔血清含有ＲＰＭＩ  １６４０培地に２μｇ／ｍｌコンカナバリンＡの存在下に１．５×１０７細胞／ｍｌの密度で７２時間保持された。実験終了１８時間前に［３Ｈ］チミジンを加えた。本方法の生産物１５μｇ／ｍｌと共に培養したが、ＤＮＡ合成の速度に対する逆効果は測定されなかった。２０μｇ／ｍｌの存在下でも、［３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの蓄積速度は２０％阻害されただけであった。
【００３３】
ソルビシルラクトンＡおよびその誘導体を＞＞２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与にて５日以上マウスに処理したところ、毒性は亜急性であったのは非常に有利なことであり、本方法の生産物を癌疾患の化学療法に使用するのは有望である。
【００３４】
本方法の生産物の抗ウイルス効果が大きいことはＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ（ＨＩＶ−１）テスト系で確認された。ウイルスの生産を特異的に阻害することが０．３〜３．０μｇ／ｍｌの濃度範囲で検出された。
【００３５】
更に、ソルビシルラクトンＡおよびソルビシルラクトンＡ誘導体は大きな炎症抑制特性を示す。この効果はインビトロ（モデル：フォスフォリパーゼＡ２［ハチ毒由来］）でもインビボ（モデル：マウスの耳の浮腫）でも測定することができた。フォスフォリパーゼＡ２（ハチ毒由来）を使用した実験において、２μｇ／ｍｌの濃度でほぼ８０％の阻害が得られることを示すことができた。更にソルビシルラクトンＡのマウス浮腫に対する効果が測定された。ＴＰＡ（１０μｇ）でマウス（スイス、約２５ｇ）に浮腫を誘起させた。ＴＰＡをアセトンに溶解し、右側の内耳に局部投与した。左側の内耳はコントロール（アセトンコントロール）とした。４時間後に斬首屠殺して浮腫の領域を切り取り、重量を測定した。処理組織とコントロールとの間の重量比をソルビシルラクトンＡの効果の指標として使用した（CarlsonRP et al. (1985) AgentsActions17: 197-204）。通常、ＴＰＡ処理１０分後に活性物質を処理部位に局所投与した。３時間後にコントロールでは浮腫の展開は１２．３±０．９ｍｇであった。ソルビシルラクトンＡの浮腫形成に対する効果は有意であった（ｐ＜＝０．０１）。すなわち、２０μｇで処理した場合に３９．２±５．３％の阻害率が得られた（ｎ＝５）。
【００３６】
本発明を更に実施例に基づいて以下に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００３７】
生体材料からの物質ソルビシルラクトンＡの取得
最初に、ペニシリウム属（好ましくはペニシリウム  クリソジナム）の真菌を新規天然化合物ソルビシルラクトンＡの生産者として検出した。以下の培養条件でソルビシルラクトンＡが培地中に分泌され、更に特に真菌のバイオマスに蓄積する。真菌は、無性世代のトリココマーケア／デューテロマイセット／マイトスポリックフンジ、コードグループ１．Ａ２．１５として系統的に特徴化されているペニシリウムＬＩＮＫ（１８０９）属のメンバーである。この属の特徴は、注目に値する生化学的な潜在能力を有する種が広範に多数あることである。本種は１９１０年以来公知であり、陸上に小さな棲息圏を持つ生物と今日まで説明されてきた。しかし、本真菌単離体（真菌株）は、海洋に棲む環境から生じ、海綿イルシニア  ファシキュラータ（ポリフェーラ）から単離された。
【００３８】
真菌の単離と培養の一般的な方法の説明
続いて、増殖した菌糸体を含む培養培地を収穫し、培養培地３００ｍｌあたり酢酸エチル４０ｍｌを補充し、−８６℃で凍結した。
【００３９】
抽出には好ましくは、メタノール、ジクロロメタン、および酢酸エステルが使用されるが、他の溶媒、例えばエタノール、プロパノール、ブタノール、エーテル、ｎ−ヘキサン、ベンゼン、トルエン、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸ｔ−ブチルエステルも考えられる。得られた抽出物を減圧で濃縮乾燥し、任意に予備分画した後、１つまたは数個のクロマトグラフ法を援用しながら液−液抽出によって分別した。このためには好ましくは、水／アセトニトリルまたは水／メタノールの濃度勾配がある「逆相」材料（ＲＰ１８）上の予備的ＨＰＬＣを利用する。二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、またはセルロースも固定相として利用できるが、液−液クロマトグラフィー、例えばＨＳＣＣＣを採用することができた。各種画分を集め、ＨＰＬＣまたは薄層クロマトグラフィーによって本発明化合物の含量を調べる。所望の画分を濃縮後、化合物を精製形で取得する。
【実施例２】
【００４０】
本発明化合物の実施例
ソルビシルラクトンＡの単離
イタリア、エルバ島フェトバイア湾（北緯４２°４３´２４´´、東経１０°０９´３１´´）の水深１７．５ｍから採取した海綿イルシニア  ファシキュラータから２００１年５月２日に、本ペニシリウムの真菌株を単離した。採取後直ちに海洋菌学的方法を援用して海綿中の真菌含量を検査した。切開した海綿の小片組織を次の組成の栄養寒天プレート（ＣＹＡＳ，  Ｐｉｔｔ  １９７３）の上に並べて本単離を行った。
【００４１】
ツアペック−酵母抽出物−寒天＋海水：
３０ｇスクロース
５ｇ  酵母抽出物
３ｇ  ＮａＮＯ３
１ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４
１０  ｍｌミネラル溶液：
５ｇ  ＫＣｌ、５ｇＭｇＳＯ４＋７Ｈ２Ｏ、０．１ｇＦｅＳＯ４＋７Ｈ２Ｏ／１００ｍｌＨ２Ｏ
１ｍｌ  微量金属溶液：
１ｇ  ＺｎＳＯ４＋７Ｈ２Ｏ、０．５ｇＣｕＳＯ４＋５Ｈ２Ｏ／１００ｍｌＨ２Ｏ
抗生物質
１０００ｍｌ  海水（３０−３３  ＰＳＵ）
【００４２】
粗製の一次培地を数回の精製工程により、無菌の純粋培地にした。次の組成（ＧＰＹＮＳ，Ｓｃｈａｕｍａｎｎ  １９７４）の傾斜寒天管の上で株化培養を行った。
【００４３】
グルコース−ペプトン−酵母抽出物−硝酸アンモニウム−海水−寒天：
１．０ｇ  グルコース
０．５ｇ  ペプトン
０．１ｇ  酵母抽出物
１．０ｇ  硝酸アンモニウム
１５．０ｇ  寒天
１０００ｍｌ  海水（３０−３３  ＰＳＵ）
ｐＨ  ７．２〜７．４
【００４４】
新規天然化合物ソルビシルラクトンＡを得るための真菌培地の増殖は１リットルのエルレンマイヤービーカーで行い、各ビーカーには次の組成（ＷＳ，Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ  １９５１）の栄養溶液３００ｍｌを充填した。
【００４５】
ウイッカーハム−海水−培地：
３．０ｇ  酵母抽出物
３．０ｇ  麦芽抽出物
５．０ｇ  ペプトン
１０．０ｇ  グルコース
１０００ｍｌ  海水（３０−３３  ＰＳＵ）
ｐＨ  ７．２〜７．４
【００４６】
栄養溶液の滅菌は、１２１℃／１ｂａｒ、１５分の圧熱滅菌で行った。実験的な真菌培養のための接種材料として、各ビーカーの菌糸体（直径５ｍｍ）をスライスした１０片を使用した。これらは、ＷＳ寒天上で７日間予備培養した後、コルク抜きを使って打ち抜き、栄養液中に移した。接種したビーカーでの培養は、室温または２０℃の定温で暗所の静置培地にて１４日以上行った。次に、増殖した菌糸体を含む培養培地を収穫し、培養培地３００ｍｌあたり酢酸エチル４０ｍｌを補充し、−８６℃で凍結した。
【００４７】
三つの３００ｍｌ培地物において、菌糸体を培地から濾過によって分離し、切り分けて小片とし、ジクロロメタン−メタノール混液（１：１）２５０ｍｌで４８時間撹拌しながら抽出した。次に、菌糸体を遠心分離にて分離し、抽出物を減圧で濃縮乾燥した。培地濾液を３回各酢酸エステル２５０ｍｌで抽出し、酢酸エステル相を合わせ、同様に減圧で濃縮乾燥した。培地濾液と菌糸体抽出物をメタノール２００ｍｌと水６ｍｌの混液に一緒に溶解し、石油エーテル２００ｍｌで抽出した。石油エーテル相を捨て、メタノール水相を減圧で濃縮し、ＨＰＬＣ−ＵＶ、ＨＰＬＣ−ＮＭＲおよびＨＰＬＣ−ＭＳによって検査した。このようにして得られた各種成分の分光的データをデータベースと比較することによって、数種の既知化合物、例えばメレアグリンおよびロケフォルチンＣを同定することができた。一つの化合物は新規な未知の天然化合物であることが認められた。抽出物について、二次元のＨＰＬＣ−ＮＭＲ実験、例えばＨＰＬＣ−ＷＥＴ−ＣＯＳＹおよびＨＰＬＣ−ＷＥＴ−ＲＯＥＳＹ実験を行ったところ、この抽出物は極めて興味深い構造に関係していることが判ったので、この化合物を分離用ＨＰＬＣによって単離した。
【００４８】
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＳｙｍｍｅｔｒｙＰｒｅｐ  Ｃ１８，１９ｘ３００ｍｍ
溶出液：アセトニトリル＋０．０５％ＴＦＡ，水＋０．０５％ＴＦＡ
勾配：１０％アセトニトリルから１００％アセトニトリルへ３０分間
流速：１１ｍｌ／分
検出：２５４ｎｍ
【００４９】
ソルビシルラクトンＡは１９分〜２０分で溶出した。対応する画分を集め、減圧で濃縮乾燥した。黄色無晶形の固体６ｍｇが得られ、メタノールに可溶性であった。
【００５０】
化合物の構造解析
得られたソルビシルラクトンＡの分光的特性は以下のごとくであり、表１にまとめてある。
【００５１】
【表１】
2006503049.tif 000006
【００５２】
【化７】
2006503049.tif 000007
【００５３】
単離された化合物は、黄色無晶形固体であり、ＥＳＩ−ＭＳの［Ｍ＋Ｈ］＋シグナルはｍ／ｚ＝４１８に現れ、その結果として分子質量は４１７であることがＦＡＢ−ＭＳ測定によっても確認される。
【００５４】
ＮＭＲデータ、特に−ＨＭＢＣ−およびＣＯＳＹ−関連のデータから、該分子の二つの部分的な構造を導くことができる。二重結合のＥ立体配置を高い結合定数（１５．４Ｈｚ）が占めているフマール酸残基（５）、およびソルビル残基（６）である。後者が該分子の残基にどのように結合しているかは現在不明なままである。Ｃ−１’で測定された化学シフト（１６９．７ｐｐｍ）から、ソルビン酸エステル並びにＣ−Ｃ結合のソルビル残基はエノール形の可能性がある。中央６位の環（７）の置換パターンは、三つのメチル基Ｃ−７、Ｃ−８、およびＣ−１１並びにＨ−６のＨＭＢＣ相互作用により可能である。
【００５５】
【化８】
2006503049.tif 000008
【００５６】
更に、ＴＨＦ−ｄ８中でＮＭＲ測定を行うと、互換可能なプロトンとそれらの相互作用を観察することができる。この場合に二つの別の鋭いシグナルが１Ｈスペクトルで認められ、環のβ結合ケト基に対し水素結合を形成して深い部分に強くシフト（１６．６ｐｐｍ）しているエノール水酸基、および７．６ｐｐｍのアミドのプロトンである。これらプロトンのＨＭＢＣ相互関係を基礎にして三つの部分構造を全て組み合わせれば、全体の構造（８）となる。
【００５７】
【化９】
2006503049.tif 000009
【００５８】
ラクトン環および遊離酸基および水酸基の位置を確定するために、当該天然化合物をジアゾメタンでメチル化して、ジメチル化誘導体を形成した。この際に更にジアゾメタンがフマール酸残基の二重結合に付加して環化が行われた。該誘導体をＮＭＲ測定し構造（９）「ソルビシルラクトンＡ誘導体１（ＳＯＤ−Ｄ１）」が判明した。またこれにより天然化合物の構造（１）が確認される。三つの立体配置の相対的な関連をＲＯＥＳＹ相互作用によって決定することができる。すなわちメチル基７および１１に対するＨ−６の相互関係から、二つのメチル基は共にＨ−６に対しシスの位置にあることが確認される。
【００５９】
【化１０】
2006503049.tif 000010
【００６０】
更に、この新規天然化合物の絶対配置を解明することができた。この化合物は全く新規な構造タイプに関係しているので、そのＣＤスペクトルを立体配置が構造的に判っている物質と比較しても配置を単純に決定することはできなかった。しかし、該配置は最新の量子化学的なＣＤ計算を駆使することによって容易に得られた。すなわち、問題の二つのエナンチオマーに対して予想されるＣＤスペクトルをシミュレートし、計算によって予測されるこれらスペクトルをこの天然化合物について実験で測定した実際のスペクトルと比較した。この戦略により図に示すようなソルビシルラクトンＡの完全絶対立体構造が確立された。
【実施例３】
【００６１】
ソルビシルラクトンＡをピラゾール誘導体に誘導
【００６２】
【化１１】
2006503049.tif 000011
【００６３】
エタノール２ｍｌ中のソルビシルラクトンＡ１００ｍｇの溶液にヒドラジン１０ｍｇを加えた。室温で６時間撹拌後、溶媒を留去した。シリカゲル上のカラムクロマトグラフィー（溶媒：ジクロロメタン−メタノール混液）により残渣を精製し、所望のピラゾール誘導体（１０）を得た。
【実施例４】
【００６４】
該化合物の生物学的特性
【００６５】
ａ）抗腫瘍活性
ソルビシルラクトンＡとその誘導体の一つの抗腫瘍活性（ここでは誘導体ＳＯＡ−Ｄ１を使用して代表例として示した）を腫瘍形質転換細胞シリーズ、例えばＬ５１７８ｙマウスリンパ腫細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７２２）で試験した。既述（Mulleret al. (1979) Cancer Res. 39: 1102-1107）のごとく、細胞を１０％ウシ胎仔血清を加えたＲＰＭＩ培地に培養した。接種濃度として１０，０００細胞／ｍｌを選択した。開始時点で選択した物質を加え、培地を７２時間インキュベートした。その後、比色ＸＴＴ手法で生細胞の数を測定し、ＥＬＩＳＡリーダーで分析した（参照：Scudiero DA, Shoemaker RH, PaullKD, Monks A, Tierney S, Nofziger TH, Currens MJ, Seniff D, Boyd MR(1988)ヒト等の腫瘍細胞株を使用する、培地中での細胞増殖と薬剤感受性についてのテトラゾリウム／フォルマザン測定法の評価.CancerRes 48: 4827-4833; Daum T, Engels J, Mag M, Muth J, Lucking S, Schroder HC, Matthes E, Muller WEG (1992) アンチセンスオリゴヌクレオチド：ヒト免疫不全ウイルスmRNAのスプライシング阻害剤.Intervirology33:65-75）で分析した。コントロールの光学濃度を１００％と定義した。
【００６６】
【表２】
2006503049.tif 000012
【００６７】
結果：ソルビシルラクトンＡとその誘導体ＳＯＡ−Ｄ１の＞０．１μｇ／ｍｌの低濃度で細胞増殖は７２時間後に劇的に減少した。使用したＬ５１７８ｙ細胞に対するＥＤ５０濃度（SachsL. (1984) Applied Statistics.Springer,Berlinにより計算した）は０．１８μｇ／ｍｌであった。
【００６８】
腫瘍形質転換細胞の他に、ヒト包皮繊維芽細胞についても本方法の生産物の影響を検討した。培養の細胞と方法は以前に記述された（参照：Muller WEG, Maidhof A, Zahn RK, Schroder HC, Gasic MJ, Heidemann D, Bernd A, Kurelec B, Eich E, Seibert G (1985) 新規細胞増殖抑制剤アバロンとその同族体のインビトロおよびインビボにおける強力な抗白血病活性.CancerRes. 45: 4822-4827）。実験には６と９継代の間の細胞を使用した。培養をコラーゲン被覆プラスチックフラスコで行った。細胞数は顕微鏡で測定した。実験の結果、３０μｇ／ｍｌの濃度でソルビシルラクトンＡは細胞増殖に影響を及ぼさなかった。
【００６９】
ｂ）抗ウイルス活性
この方法の参考文献と特性を広範囲にリスト化したものは以前の刊行物（Sarin PS, Sun D,Thornton A, Muller WEG(1987) 後天性免疫不全症候群（ヒトTリンパ節性レトロウイルス／リンパ節症関連ウイルス）の病因物質複写をアバロールおよびアバロンにより阻害.JNatl Cancer Inst 78: 663-666; SchroderHC, Sarin PS, Rottmann M,Wenger R, Maidhof A, RenneisenK, Muller WEG(1988) アバロールとAZTのインビトロでの組み合わせによる、宿主細胞及びＨＩＶ遺伝子発現の差分変調BiochemPharmacol37:3947-3952）にまとめられている。
【００７０】
検査パラメータ：細胞増殖
Ｈ９細胞並びにＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ細胞（ＨＩＶ−１）で感染したＨ９細胞を使用し、それぞれ０．２×１，０００，０００細胞／培地ｍｌの濃度で培地に接種した。接種４日後にＨ９細胞の密度は１．３×１，０００，０００細胞／培地ｍｌであった。他方、ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢで感染したＨ９細胞の密度は０．６×１，０００，０００細胞／培地ｍｌにすぎなかった。これら二つの値をコントロール値とした。
【００７１】
次に、Ｈ９−ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ細胞（０．２×１，０００，０００細胞／ｍｌ）の試料を各種濃度のソルビシルラクトンＡで４日間処理した。以下の結果が得られた。
【００７２】
2006503049.tif 000013
【００７３】
結果：濃度０．３と３．０μｇ／ｍｌの間のソルビシルラクトンＡにより、Ｈ９−ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ細胞の増殖速度はコントロール、すなわちＨＴＬＶ−ＩＩＩＢに感染していないＨ９細胞の範囲の値にまで上昇しているのが見られる。
【００７４】
検査パラメータ：逆転写酵素の生産
このアプローチでは、本方法の生産物によってＨ９細胞中でのＨＩＶ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ）ウイルスの産生がどの程度にまで阻害されるかを試験する。ウイルス量のパラメータとして、これら粒子内に存在する逆転写酵素を測定した。
【００７５】
ソルビシルラクトンＡまたはソルビシルラクトンＡ誘導体をＨ９−ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ細胞に４日間投与した後にＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ（ＨＩＶ−１）ウイルスの産生がどの程度にまで減縮されているかを検査した。培地中のウイルス量の指標として逆転写酵素を選択した。すなわち逆転写酵素の産生が阻害されていれば、ウイルスの産生が阻害されていることを示唆するとした。結果は次の表にまとめてある。
【００７６】
【表４】
2006503049.tif 000014
【００７７】
結果：ソルビシルラクトンＡで処理しなかったＨ９−ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ細胞の上澄液には逆転写酵素の活性が顕著に存在したことが判る。ソルビシルラクトンＡまたはソルビシルラクトンＡ誘導体を加えると上澄液中の逆転写酵素の活性は用量依存的に減少している。０．１μｇ／ｍｌの用量で既に顕著な阻害が観察された。本発明の使用のための化合物は、たとえ別のインビトロパラメータ、例えば細胞増殖が実際に影響を受けないような濃度であっても、ウイルスの複製をほぼ完全に阻害することができる。
【００７８】
検査パラメータ：ｐ２４−およびｐ１５−蛋白質の発現
ソルビシルラクトンＡおよびソルビシルラクトンＡ誘導体ＳＯＡ−Ｄ１は、感染したＨ９細胞においてＨＩＶｐ２４（ｇａｇタンパク質）およびｐ１５（Ｇａｇタンパク質）の発現を強力に阻害する効果を有することが示された。標的Ｈ９細胞をＨＩＶ（ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ）単離物と共に、ただしテスト化合物はなしで増殖したところ、ｐ２４およびｐ１５のタンパク質が発現し、間接免疫蛍光測定法によって確認することができた。しかし、Ｈ９−ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ細胞をテスト化合物と共に培養した後では、完全な防護効果が観察された。ｐ２４およびｐ１５のタンパク質発現は２４％まで減少した。以下の結果が得られた。
【００７９】
【表５】
2006503049.tif 000015
【００８０】
結果：ソルビシルラクトンＡおよびソルビシルラクトンＡ誘導体（ＳＯＡ−Ｄ１）がＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ（ＨＩＶ−１）タンパク質の発現を有意に減少させることが見られる。
【００８１】
【実施例５】
【００８２】
ソルビシルラクトンＡの生体内効果
これらの検査のために、雄（異系交配した）ＮＭＲＩマウス（３２〜３６ｇ、８〜９月齢）を使用した。テスト物質ソルビシルラクトンＡをメチルセルロースに溶解し、動物の腹腔内に注入した。２０ｍｇ／ｋｇ（１日当たり）を５日間動物に投与した。処理後、動物の体重を測定した。この期間中、ソルビシルラクトンＡ処理動物の体重（３３±４ｇ）はコントロール（ソルビシルラクトンＡで処理しなかった）の体重（３５±４ｇ）と有意に異ならなかった。テスト動物は一匹も死亡していない。
【００８３】
結果：５日間の腹腔内処理でのソルビシルラクトンＡの亜急性毒性は＞＞２０ｍｇ／ｋｇであることが以上のデータから結論される。
【００８４】
ソルビシルラクトンＡとこれらの誘導体の合成の説明
ソルビシルラクトンＡおよび一連の構造類似体は生体模倣的合成により数工程で製造することができる。すなわちソルビシリンおよび関連化合物から出発し、酸化的に脱芳香族化し、続いてアラニン（ソルビシルラクトンＡの場合）または他のアミノ酸およびそれらの類似体を加え、次にフマール酸（ソルビシルラクトンＡの場合）または類似のアシル残基を付加する。
【国際調査報告】
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