(57)【要約】本発明は、少なくとも一部分、細胞の増殖およびアポトーシス状態を、ＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドの発現および／または活性を調節する因子を用いて調節する方法に関する。さらに、本発明は、ＴＲＡＤＥファミリー分子の２つの新規メンバーを提供する。本発明は、細胞増殖を調節するための方法であって、該方法は、細胞をＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの発現を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、該細胞の増殖が調節される、方法に関する。
2004501604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖を調節するための方法であって、該方法は、細胞をＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの発現を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、細胞の増殖が調節される、方法。
【請求項２】
細胞増殖を調節するための方法であって、該方法は、細胞をＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの活性を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、細胞の増殖が調節される、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、上皮細胞、管上皮細胞、または気管支上皮細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、癌または腺癌である、方法。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、肺細胞、肝臓細胞、脳細胞、および前立腺細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法であて、ここで、前記因子が、ＴＲＡＤＥポリペプチド細胞外ドメインを含むＴＲＡＤＥポリペプチドの可溶性形態である、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、ここで、前記ＴＲＡＤＥポリペプチドの可溶性形態が、ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質である、方法。
【請求項８】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記因子が、本質的にＴＲＡＤＥポリペプチド細胞外ドメインからなる、方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記因子が、ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの発現を調節する核酸分子である、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記因子が、ＴＲＡＤＥαポリペプチドもしくはＴＲＡＤＥβポリペプチドまたはこれらの一部をコードする核酸分子である、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、ここで、前記因子が、核酸分子であり、該核酸分子は、ＴＲＡＤＥαポリペプチドもしくはＴＲＡＤＥβポリペプチドまたはこれらの一部をコードする核酸分子に対してアンチセンスである、方法。
【請求項１２】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記因子が、ＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドを認識する抗体である、方法。
【請求項１３】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記活性が、ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化、ＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化、およびアポトーシスの活性化からなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
細胞増殖を調節する方法であって、該方法は、前立腺細胞、肝臓細胞、または肺細胞を、ポリペプチドの活性を調節する因子と接触させる工程を包含し、該ポリペプチドは、ＴＲＡＤＥαポリペプチド、ＴＲＡＩＮポリペプチド、αＯＡＦ０６５ポリペプチド、およびＴＲＡＤＥβポリペプチドからなる群より選択される、方法。
【請求項１５】
細胞増殖を調節する方法であって、該方法は、細胞をＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドの発現を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、該細胞の増殖が調節され、ここで、該細胞は、上皮細胞、管上皮細胞、癌、および腺癌からなる群より選択される工程、方法。
【請求項１６】
細胞増殖を調節する方法であって、該方法は、細胞をＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドの活性を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、該細胞の増殖が調節され、ここで、該細胞は、上皮細胞、管上皮細胞、癌、および腺癌からなる群より選択される、方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法であって、ここで、前記ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドが、ＴＲＡＤＥα、ＴＲＡＤＥβ、Ａｐｏ４、ＴＲＡＩＮ、αＯＡＦ０６５、およびβＯＡＦ０６５からなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
請求項１５または１６に記載の方法であって、ここで、前記因子が、ＴＲＡＤＥ細胞外ドメインを含むＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの可溶性形態である、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの可溶性形態が、ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質である、方法。
【請求項２０】
請求項１５または１６に記載の方法であって、ここで、前記因子が、本質的にＴＲＡＤＥファミリーの細胞外ドメインからなる、方法。
【請求項２１】
請求項１５または１６に記載の方法であって、ここで、前記因子が、ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの発現を調節する核酸分子である、方法。
【請求項２２】
請求項１５または１６に記載の方法であって、ここで、前記因子が、ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドまたはその一部をコードする核酸分子である、方法。
【請求項２３】
請求項１５または１６に記載の方法であって、ここで、前記因子が、核酸分子であり、該核酸分子は、ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドまたはその一部をコードする核酸分子に対してアンチセンスである、方法。
【請求項２４】
請求項１５または１６に記載の方法であって、ここで、前記因子が、ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドを認識する抗体である、方法。
【請求項２５】
請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記活性が、ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化、ＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化、およびアポトーシスの活性化からなる活性の群より選択される、方法。
【請求項２６】
細胞増殖を調節する方法であって、該方法は、細胞をＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドの発現を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、該細胞の増殖が調節され、ここで、該細胞は、脳細胞、肝臓細胞、前立腺細胞、腸細胞、または肺細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項２７】
細胞増殖を調節する方法であって、該方法は、細胞をＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドの活性を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、該細胞の増殖が調節され、ここで、該細胞は、脳細胞、肝臓細胞、前立腺細胞、腸細胞、または肺細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記ＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドは、ＴＲＡＤＥαポリペプチド、ＴＲＡＩＮポリペプチド、αＯＡＦ０６５ポリペプチド、およびＴＲＡＤＥβポリペプチドからなる群より選択される、方法。
【請求項２９】
ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの発現調節によって利益を得る障害を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの発現を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、該障害の処置がもたらされる、方法。
【請求項３０】
ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの活性調節によって利益を得る障害を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体に、ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの活性を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、処置がもたらされる、方法。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載の方法であって、ここで、前記障害は、炎症および新形成からなる群より選択される増殖疾患または増殖障害である、方法。
【請求項３２】
前記新形成が癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記新形成が肺組織または前立腺組織に存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記新形成が腺癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
癌または腺癌を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体にＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの活性を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、該癌または該腺癌が処置される、方法。
【請求項３６】
癌または腺癌を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体にＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの発現を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、癌または腺癌が処置される、方法。
【請求項３７】
肺、肝臓、脳、および腸からなる群より選択される組織の癌または腺癌を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、該被験体にＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの活性を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、該癌または該腺癌が処置される、方法。
【請求項３８】
ＴＲＡＤＥ関連障害を検出する方法であって、該方法は、生物学的サンプルを被験体から得る工程、およびＴＲＡＤＥ関連障害を検出するために該サンプル中のＴＲＡＤＥポリペプチドの存在について試験する工程を包含し、ここで、該サンプルは、肺細胞、肝臓細胞、脳細胞、または腸細胞からなる群より選択される細胞型を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２０００年２月１１日付で出願されたＵＳＳＮ６０／１８１，９２２、および２０００年２月１４日付で出願されたＵＳＳＮ６０／１８２，１４８に対する優先権を主張する。これらの内容全体は特に、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーのメンバーは、細胞の生存および死の決定の調節において重要な役割を果たす（ＢａｋｅｒおよびＲｅｄｄｙ、１９９８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１７：３２６１−３２７０）。特に、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーのメンバーは、リンパ球の活性化、炎症およびアポトーシスにおけるその役割について、広範に研究されてきた（ＧｒａｖｅｓｔｅｉｎおよびＢｏｒｓｔ、１９９８、Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１０：４２３−４３４）。ＴＮＦ−Ｒファミリーの既知のメンバーはすべて、その細胞外領域において少なくとも２コピーの特徴的なシステインリッチドメインを有する。システイン残基のこのパターンは、バイオインフォマティクスを使用した、発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）ライブラリーにおける新たなファミリーメンバーの発見を促進した。このファミリーの中の少なくとも１９（おそらく、２２）のメンバーが、ここに報告される。
【０００３】
大部分について、ＴＮＦリガンドファミリーの三量体形態は、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーのオリゴマー形成を誘導し（Ｎａｔｏｌｉら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　５６：９１５−９２０）、レセプターの細胞内シグナル伝達ドメインの並置、および下流シグナルの活性化へと導く。この下流シグナルは、ＩκＢキナーゼおよびＪＮＫキナーゼを活性化するシグナル伝達メディエイタを通して、それぞれ、転写因子であるＮＦκＢおよびＡＰ１の活性化へと導き得る（Ｗａｌｌａｃｈら、１９９９、Ａｎｎ　Ｒｅｖ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１７：３３１−３６７）。これらのレセプターのいくつかは、その細胞内領域において十分に特徴付けられた死ドメイン（ｄｅａｔｈ　ｄｏｍａｉｎ）を含み、これらは、プログラムされた細胞死を生じるカスパーゼ活性化カスケードへと導くアダプター分子と相互作用する（ＯｒｌｉｎｉｃｋおよびＣｈａｏ、１９９８、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ　１０：５４３−５５１）。いくつかのレセプターは、ＮＦκＢ活性化（例えば、ＴＮＦ−ＲＩＩ（Ｎｇら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ　２４４：７５６−７６２））またはアポトーシス誘導（例えば、ＤＲ４（Ｍｕｚｉｏ、１９９８、Ｉｎｔ　Ｊ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｒｅｓ　２８：１４１−１４７）のいずれかにおいて独占的に機能するが、いくつかは、ＮＦκＢ活性化およびアポトーシス（例えば、ＤＲ３（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：９９０−９９２））の両方でシグナル伝達し得る。プログラムされた細胞死をシグナル伝達することはＴＮＦレセプターファミリーの重要な役割であり、その結果、いくつかのメンバーは、調節因子として十分に規定されたデコイ（ｄｅｃｏｙ）レセプターメンバーと共に、この役割において独占的に機能すると規定された（ＡｓｈｋｅｎａｚｉおよびＤｉｘｉｔ、１９９９、Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１１：２５５−２６０）。これらのメンバー間で共通する構造的特徴は、細胞内領域において十分に保存された死ドメインである（Ｂａｎｔｅｌら、１９９８；Ｂｏｔｈｗｅｌｌ、１９９６、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｎｅｔｗｏｒｋ　９：６８１−６８４）。デコイレセプターは、特定の死ドメイン含有レセプターとリガンド結合について競合すると推測され、そしてそれらは、非機能的な部分的死ドメイン（例えば、ＤｃＲ２（Ｍａｒｓｔｅｒｓら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　７：１００３−１００６））を含むか、または死ドメインを含まないか（例えば、ＤｃＲ３（Ｐｉｔｔｉら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ　３９６：６６９−７０３））のいずれかであるのでデコイとして機能すると推測される。Ｉ型膜貫通タンパク質に加えて、このファミリーは、可溶性分泌タンパク質、例えば、ＯＰＧ（Ｅｍｅｒｙら、１９９８、Ｊ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７３：１４３６３−１４３６７）およびｇｐｉ−結合タンパク質、ＤｃＲ１（Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ、１９９９、Ｊ　ｏｆ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　６５：５３５−５４２）を含む。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、少なくとも一部、新規なＴＲＡＤＥ分子が、種々の細胞プロセス（特に、上皮細胞においてＮＦκＢおよびＪＮＫシグナル伝達経路を介してシグナル伝達することによる細胞増殖の調節（例えば、増殖またはアポトーシスのいずれかを誘導することによる）を含む）を調節するにおける調節因子として有用であるという発見に基づく。
【０００５】
従って、１つの局面では、本発明は、細胞増殖を調節するための方法を提供する。この方法は、細胞をＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの発現を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、細胞の増殖が調節される。
【０００６】
別の局面では、本発明は、細胞増殖を調節するための方法を提供する。この方法は、細胞をＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの活性を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、細胞の増殖が調節される。
【０００７】
１つの実施形態では、この細胞は、以下からなる群から選択される：上皮細胞、管上皮細胞、または気管支上皮細胞。別の実施形態では、この細胞は癌または腺癌である。別の実施形態では、この細胞は、以下からなる群から選択される：肺細胞、肝臓細胞、脳細胞、および前立腺細胞。
【０００８】
さらに別の実施形態では、この因子は、ＴＲＡＤＥポリペプチド細胞外ドメインを含むＴＲＡＤＥポリペプチドの可溶性形態である。別の実施形態では、このＴＲＡＤＥポリペプチドの可溶性形態は、ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質である。１つの実施形態では、この因子は、本質的にＴＲＡＤＥポリペプチド細胞外ドメインからなる。
【０００９】
１つの実施形態では、この因子は、ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの発現を調節する核酸分子である。１つの実施形態では、この因子は、ＴＲＡＤＥαポリペプチドもしくはＴＲＡＤＥβポリペプチドまたはこれらの一部をコードする核酸分子である。別の実施形態では、この因子は、ＴＲＡＤＥαポリペプチドもしくはＴＲＡＤＥβポリペプチドまたはこれらの一部をコードする核酸分子に対してアンチセンスである核酸分子である。別の実施形態では、この因子は、ＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドを認識する抗体である。なお別の実施形態では、この活性は、ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化、ＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化、およびアポトーシスの活性化からなる群より選択される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、細胞増殖を調節する方法に関し、この方法は、前立腺細胞、肝臓細胞、または肺細胞を、ポリペプチドの活性を調節する因子と接触させる工程を包含し、このポリペプチドは、ＴＲＡＤＥαポリペプチド、ＴＲＡＩＮポリペプチド、αＯＡＦ０６５ポリペプチド、およびＴＲＡＤＥβポリペプチドからなる群より選択される。
【００１１】
なお別の実施形態において、本発明は、細胞増殖を調節する方法に関し、この方法は、細胞をＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドの発現を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、この細胞の増殖が調節され、ここで、この細胞は、上皮細胞、管上皮細胞、癌、および腺癌からなる群より選択される。
【００１２】
なお別の局面において、本発明は、細胞増殖を調節する方法に関し、この方法は、細胞をＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドの活性を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、この細胞の増殖が調節され、ここで、この細胞は、上皮細胞、管上皮細胞、癌、および腺癌からなる群より選択される。
【００１３】
１つの実施形態において、このＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドは、ＴＲＡＤＥα、ＴＲＡＤＥβ、Ａｐｏ４、ＴＲＡＩＮ、αＯＡＦ０６５、およびβＯＡＦ０６５からなる群より選択される。１つの実施形態において、この因子は、ＴＲＡＤＥ細胞外ドメインを含むＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの可溶性形態である。１つの実施形態において、このＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの可溶性形態は、ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質である。別の実施形態において、この因子は、本質的にＴＲＡＤＥファミリーの細胞外ドメインからなる。１つの実施形態において、この因子は、ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの発現を調節する核酸分子である。１つの実施形態において、この因子は、ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドまたはその一部をコードする核酸分子である。１つの実施形態において、この因子は、核酸分子であり、この核酸分子は、ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドまたはその一部をコードする核酸分子に対してアンチセンスである。１つの実施形態において、この因子は、ＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドを認識する抗体である。
【００１４】
１つの実施形態において、この活性は、ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化、ＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化、およびアポトーシスの活性化からなる活性の群より選択される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、細胞増殖を調節する方法に関し、この方法は、細胞をＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドの発現を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、この細胞の増殖が調節され、ここで、この細胞は、脳細胞、肝臓細胞、前立腺細胞、腸細胞、または肺細胞からなる群より選択される。
【００１６】
別の局面において、本発明は、細胞増殖を調節する方法に関し、この方法は、細胞をＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドの活性を調節する因子と接触させる工程を包含し、その結果、この細胞の増殖が調節され、ここで、この細胞は、脳細胞、肝臓細胞、前立腺細胞、腸細胞、または肺細胞からなる群より選択される。
【００１７】
１つの実施形態において、このＴＲＡＤＥファミリーメンバーのポリペプチドは、ＴＲＡＤＥαポリペプチド、ＴＲＡＩＮポリペプチド、αＯＡＦ０６５ポリペプチド、およびＴＲＡＤＥβポリペプチドからなる群より選択される。
【００１８】
別の局面において、本発明は、ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの発現調節の利益を得る、障害を有する被験体を処置するための方法に関し、この方法は、この被験体に、ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの発現を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、この障害の処置がもたらされる。
【００１９】
別の局面において、本発明は、ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの活性調節の利益を得る、障害を有する被験体を処置するための方法に関し、この方法は、この被験体に、ＴＲＡＤＥαポリペプチドまたはＴＲＡＤＥβポリペプチドの活性を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、処置がもたらされる。
【００２０】
１つの実施形態において、この障害は、炎症および新形成からなる群より選択される増殖疾患または増殖障害である。１つの実施形態において、この新形成は癌である。１つの実施形態において、この新形成は肺組織または前立腺組織に存在する。１つの実施形態において、この新形成は腺癌である。
【００２１】
別の局面において、本発明は、癌または腺癌を有する被験体を処置するための方法に関し、この方法は、被験体にＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの活性を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、この癌またはこの腺癌が処置される。
【００２２】
別の局面において、本発明は、癌または腺癌を有する被験体を処置するための方法に関し、この方法は、該被験体にＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの発現を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、癌または腺癌が処置される。
【００２３】
別の局面において、本発明は、肺、肝臓、脳、および腸からなる群より選択される組織の癌または腺癌を有する被験体を処置するための方法に関し、この方法は、この被験体にＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドの活性を調節する因子を投与する工程を包含し、その結果、この癌またはこの腺癌が処置される。
【００２４】
なお別の局面において、本発明は、ＴＲＡＤＥ関連障害を検出する方法に関し、この方法は、生物学的サンプルを被験体から得る工程、およびＴＲＡＤＥ関連障害を検出するためにサンプル中のＴＲＡＤＥポリペプチドの存在について試験する工程を包含し、ここで、このサンプルは、肺細胞、肝臓細胞、脳細胞、または腸細胞からなる群より選択される細胞型を含む。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＴＲＡＤＥ分子が種々の細胞プロセス（増殖を含む）を調節すること（例えば、増殖またはアポトーシスを調節することにより）において調節薬剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）として有用であり、そしてこれらの分子がＮＦＫβおよびＪＮＫシグナル伝達経路を通じて（特に、上皮細胞において）シグナル伝達するという知見に少なくとも一部基づく。本発明はまた、新規なＴＲＡＤＥ分子、すなわち、ＴＲＡＤＥα（配列番号１および２に示される）およびＴＲＡＤＥβ（配列番号３および４に示される）を同定する。マウスＴＲＡＤＥは、配列番号５および６に示される。本発明は、ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβを、関連するＴＲＡＤＥ分子のファミリーのメンバーとし、そしてこのファミリーのメンバー全ての新規な用途を同定する。本発明はさらに、特定のＴＲＡＤＥドメイン、例えば、配列番号２の残基１９３〜４１７もしくは配列番号４の残基１９３〜４２３に対応するアミノ酸残基を含む細胞内ドメイン、配列番号２もしくは４の残基１〜１６８に対応するアミノ酸残基を含む細胞外ドメイン、配列番号２もしくは４の残基１６９〜１９２に対応するアミノ酸残基を含む膜貫通ドメイン、配列番号２もしくは４の残基２９〜６３に対応するアミノ酸残基を含む第１のシステインリッチドメイン、配列番号２もしくは４の残基７２〜１１４に対応するアミノ酸残基を含む第２のシステインリッチドメイン、配列番号２もしくは４の残基１１４〜１３９に対応するアミノ酸残基を含む第３のシステインリッチドメイン、配列番号２もしくは４の残基１３７〜１６８に対応するアミノ酸残基を含むセリン／スレオニン／プロリンリッチドメイン、および配列番号２の残基２１８〜４１７もしくは配列番号４の残基２１８〜４２３に対応するアミノ酸残基を含むＴＲＡＤＥ関連細胞死エフェクター（ｄｅａｔｈ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ドメインを同定する。ＴＲＡＤＥαおよびβは、配列番号２もしくは４の残基１０５〜１０８に対応する残基にＮグリコシル化部位、配列番号２もしくは４の残基２００〜２０３に対応する残基にｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、配列番号２もしくは４の残基２３８〜２４１に対応する残基にｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位、配列番号２もしくは４の残基２０５〜２０７に対応する残基にプロテインキナーゼＣリン酸化部位、配列番号２もしくは４の残基２１９〜２２２に対応する残基にカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、および配列番号２もしくは４の残基３２５〜３２８に対応する残基にカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、配列番号２もしくは４の残基２０７〜２１３に対応する残基にチロシンキナーゼリン酸化部位、ならびに配列番号２もしくは４の残基２１５〜２２０に対応する残基にＮ−ミリストイル化部位を含む。さらに、ＴＲＡＤＥファミリーのタンパク質のメンバーは、ＴＲＡＤＥペプチドの細胞内部分にＴＮＦレセプター細胞死ドメイン（ｄｅａｔｈ　ｄｏｍａｉｎ）コンセンサス配列がないことにより認識され得る。しかし、ＴＮＦレセプター細胞死ドメインコンセンサス配列を欠いているにも拘らず、ＴＲＡＤＥペプチドはまた、添付の実施例に示されるように、細胞死エフェクタードメ���ンの活性を通じてアポトーシスを誘導し得る。さらに、本発明は、図４に示されるように、ヒトおよびマウスのＴＲＡＤＥオルソログ間で保存されたＴＲＡＤＥコンセンサスドメインを同定する。
【００２６】
ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、５’末端で同一であるが、これらの分子の最後のＣ末端アミノ酸をコードする領域でわずかに異なる。ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβともに２５アミノ酸の同一の推定Ｎ末端シグナル配列、１４３アミノ酸配列の成熟細胞外領域およびシグナル膜貫通ドメインを有する。この細胞外領域は、ＴＮＦ−Ｒファミリーのシステインリッチドメインに相同な２つのドメインを含む（図３を参照のこと）。第２のドメインに続いて、コンセンサスシステインリッチドメインに完全には適合しないと思われるシステインリッチドメインがある。このような不完全な適合は、ＴＮＦＲＩ（Ｗｙｌｌｉｅ、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，７３：１８９−１９７）およびＨＶＥＭ（Ｈａｒｒｏｐら、１９９８、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２７３：２７５４８−２７５５６）のようないくつかの他のファミリーのメンバーにおいて見出される。さらに、４−１ＢＢおよびＣＤ２７（Ｇｒａｖｅｓｔｅｉｎら、１９９３、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３：９４３−９５０）のようないくつかの他のファミリーメンバーにおいて見出されるように、細胞外膜近傍（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）領域においてセリン／スレオニン／プロリンリッチストレッチが存在する。ＴＲＡＤＥαの細胞内領域は２３４アミノ酸（明らかな相同性はない（細胞死ドメインの欠如を含む（Ｋｉｓｔｏｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ，３８４：３７２−３７５）））および他のファミリーメンバー（例えば、ＴＮＦ−ＲＩ）に含まれる成分からなる。ＴＲＡＤＥβの細胞内領域は、ＴＲＡＤＥαとこの配列を共有するが、２アミノ酸だけＴＲＡＤＥαと異なり、そのＣ末端に６つのさらなるアミノ酸を含む（図２を参照のこと）。
【００２７】
添付の実施例により詳述されるノザン分析により、種々の組織および器官においてヒトＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβ発現が示され、成人前立腺、肺、卵巣、ならびに胎児肺および肝臓において最高レベルであった。より重要なことには、免疫組織化学法を用いて、ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβが前立腺、耳下腺および精巣から管上皮組織に主に位置することが示された。ＴＲＡＤＥの腺癌における発現もまた検出された。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の小節においてさらに詳細に記載される。
【００２９】
（Ｉ．定義）
本明細書中で用いられる場合、用語「ＴＲＡＤＥ」とは、細胞死タンパク質と関連するＴＮＦレセプターファミリーメンバータンパク質（ＴＮＦ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＤＥａｔｈ　ｐｒｔｅｉｎ）をいう。２つの新規なＴＲＡＤＥ分子が本明細書中に記載される。「ＴＲＡＤＥα」分子のヌクレオチド配列は、配列番号１に示され、ＴＲＡＤＥαのアミノ酸配列は、配列番号２に示される。「ＴＲＡＤＥβ」のヌクレオチド配列は、配列番号３に示され、ＴＲＡＤＥβのアミノ酸配列は、配列番号４に示される。ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、５’末端で同一であるが、これらの分子の最後のＣ末端アミノ酸配列をコードする領域でわずかに異なる（ＴＲＡＤＥβは、より長い細胞質ドメインを有する）。本明細書中で用いられる場合、用語「ＴＲＡＤＥ」は、ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβ分子（または他の特定の配列番号）をいうために具体的に用いられるのでなければ、以下に記載されるように、ＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをいうことが理解される。
【００３０】
「ＴＲＡＤＥファミリーポリペプチド」とは、ＴＲＡＤＥ構造ドメインもしくはモチーフを有し、そして本明細書中で規定されるように、ＴＲＡＤＥαもしくはＴＲＡＤＥβ分子と十分なアミノ酸配列同一性またはヌクレオチド配列同一性を有するタンパク質または核酸分子を含むことが意図される。このようなファミリーメンバーは、天然に存在してもよいし、天然に存在しなくてもよく、同じ種由来であってもよいし、異なる種由来であってもよい。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第１のタンパク質、ならびに他のヒト起源の異なるタンパク質を含んでいてもよいし、あるいは、非ヒト起源のホモログを含んでいてもよい。ファミリーの好ましいメンバーはまた、共通する機能的特徴を有し得る。例示的なＴＲＡＤＥファミリー分子としては、以下が挙げられる：ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβ（本明細書中に記載）、Ａｐｏ４（ＷＯ９９／１１７９１）、ＴＲＡＩＮ（ＷＯ９９／１３０７８）、ＡＸ９２＿３（ＷＯ９８／０１５５４、ＷＯ９９／２０６４４）、αＯＡＦ０６５およびβＯＡＦ０６５（ＷＯ９８／３８３０４）。
【００３１】
好ましいＴＲＡＤＥポリペプチドは、以下のＴＲＡＤＥのドメインのうちの１以上を含む：細胞内ドメイン（例えば、配列番号２の残基１９３〜４１７もしくは配列番号４の残基１９３〜４２３を含む）、細胞外ドメイン（例えば、配列番号２もしくは４の残基１〜１６８を含む）、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号２もしくは４の残基１６９〜１９２を含む）、第１のシステインリッチドメイン（例えば、配列番号２もしくは４の残基２９〜６３を含む）、第２のシステインリッチドメイン（例えば、配列番号２もしくは４の残基７２〜１１４を含む）、第３の部分的システインリッチドメイン（例えば、配列番号２もしくは４の残基１１４〜１３９を含む）、セリン／スレオニン／プロリンリッチドメイン（例えば、配列番号２もしくは４の残基１３７〜１６８を含む）、ＴＲＡＤＥ関連細胞死エフェクタードメイン（例えば、配列番号２の残基２１８〜４１７もしくは配列番号４の残基２１８〜４２３を含む）、Ｎグリコシル化部位（例えば、配列番号２もしくは４の残基１０５〜１０８を含む）、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位（例えば、配列番号２もしくは４の残基２００〜２０３を含む）、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼリン酸化部位（例えば、配列番号２もしくは４の残基２３８〜２４１を含む）、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣリン酸化部位（例えば、配列番号２もしくは４の残基２０５〜２０７を含む）、第１のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えば、配列番号２もしくは４の残基２１９〜２２２を含む）、第２のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えば、配列番号２もしくは４の残基３２５〜３２８を含む）、チロシンキナーゼリン酸化部位（例えば、配列番号２もしくは４の残基２０７〜２１３を含む）、Ｎ−ミリストイル化部位（例えば、配列番号２もしくは４の残基２１５〜２２０を含む）、ＴＲＡＦ結合ドメイン（例えば、配列番号２もしくは４の残基１〜３２８を含む；好ましくは、残基２１８〜３２８を含む）、キナーゼ会合ドメイン（例えば、配列番号２もしくは４の残基１〜３６８を含む；好ましくは、残基３２８から３６８を含む）、またはＮＦκＢ活性化シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号２もしくは４の残基１〜３６８を含む；好ましくは、ＴＲＡＤＥの細胞内ドメインにある残基を含む）。ＴＲＡＤＥ分子はまた、ＴＲＡＤＥペプチドの細胞内部分におけるＴＮＦレセプター細胞死ドメインコンセンサス配列を欠如している。ＨＭＭ検索について規定されるように、ＴＮＦレセプター細胞死ドメインコンセンサス配列は、ＰＦＡＭ登録番号ＰＦ００５３１（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）に列挙されたコンセンサス配列により例示される。
【００３２】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＴＲＡＤＥ活性」または「ＴＲＡＤＥポリペプチドの活性」は、細胞増殖を調節する能力（例えば、増殖またはアポトーシスを増強することにより）、および／またはＮＦκＢシグナル伝達経路を調節する能力、および／または細胞（例えば、上皮細胞）におけるＪＮＫシグナル伝達経路を調節する能力を含む。本明細書中で用いられる場合、用語「調節する」は、記載されている特定のパラメーター（例えば、ＴＲＡＤＥ活性）を増加または減少させることによる変化を含む。添付の実施例に記載されるように、ＴＲＡＤＥが過剰発現される場合、ＴＲＡＤＥは、ＮＦκＢおよびＪＮＫ経路の活性化を生じる。これらの経路の活性化は、細胞増殖応答と関連する。この実施例はまた、ＴＲＡＤＥの過剰発現が、細胞死シグナル伝達を生じ、アポトーシスを導き得ることを実証する。１つの実施形態において、ＴＲＡＤＥ活性は、例えば、ＴＲＡＤＥ−標的分子または結合パートナーの会合のような直接的な活性である。本明細書中で用いられる場合、「標的分子」または「結合パートナー」は、ＴＲＡＤＥタンパク質が天然で結合または相互作用し、その結果、ＴＲＡＤＥが媒介する機能が達成される分子である。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、用語「アポトーシス」は、当該分野で公知の技術を用いて特徴付けられ得るプログラムされた細胞死を含む。アポトーシス性の細胞死は、例えば、細胞収縮、膜水泡形成、およびクロマチン凝縮（最後には細胞断片化に達する）により特徴付けられ得る。アポトーシスを受けている細胞はまた、ヌクレオソーム内ＤＮＡ切断の特徴的パターンを提示する。本明細書中で用いられる場合、用語「アポトーシスを調節する」は、細胞（例えば、上皮細胞）におけるプログラムされた細胞死を調節することを包含する。本明細書中で用いられる場合、用語「アポトーシスを調節する」は、細胞におけるアポトーシスのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを含む。アポトーシスの調節は、以下により詳細に議論され、そして種々の障害（例えば、神経学的障害）を改善することにおいて有用であり得る。
【００３４】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＮＦκＢシグナル伝達経路」とは、当該分野で公知のシグナル伝達経路の任意の１つをいう。この経路は、転写因子ＮＦκＢの活性化または不活化に関連し、そしてＮＦκＢ因子により少なくとも一部媒介される（Ｋａｒｉｎ、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ　Ｊ　ｆｒｏｍ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａ，４：９２−９９；Ｗａｌｌａｃｈら、１９９９，Ａｎｎ　Ｒｅｖ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７：３３１−３６７）。一般に、このようなＮＦκＢシグナル伝達経路は、多くの細胞外の影響（例えば、マイトジェン、サイトカイン、ストレスなど）に応答する。ＮＦκＢシグナル伝達経路は、一定範囲の細胞プロセスに関連し、これらの細胞プロセスとしては、アポトーシスの調節が挙げられるが、これに限定されない。これらのシグナル伝達経路は、しばしば、ＮＦκＢのインヒビターペプチド（ＩκＢ）のリン酸化状態を介する活性化または不活化、従って、ＮＦκＢの間接的活性化または不活化に関する機構を含むが、これらに限定されない。
【００３５】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＪＮＫシグナル伝達経路」とは、Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）（Ｋａｒｉｎ、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ　Ｊ　ｆｒｏｍ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａ，４：９２−９９；Ｗａｌｌａｃｈら、１９９９，Ａｎｎ　Ｒｅｖ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７：３３１−３６７））を含む、当該分野で公知のシグナル伝達経路の任意の１つをいう。このキナーゼは、一般に、多くの細胞外シグナル（例えば、マイトジェン、サイトカイン、ストレスなど）に応答する。ＪＮＫシグナル伝達経路は、一定範囲の細胞プロセスを媒介し、これらの細胞プロセスとしては、アポトーシスの調節が挙げられるが、これに限定されない。好ましい実施形態において、これらのシグナル伝達経路は、そのリン酸化状態を介して転写因子ｃ−Ｊｕｎの活性化のＪＮＫ媒介性調節に関する機構を含む。さらなる実施形態において、ＪＮＫ活性化は、ＴＲＡＦ（ＴＮＦ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｆａｃｔｏｒ；例えば、Ｗａｊａｎｔら、１９９９、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｖ　１０：１５−２６を参照のこと）タンパク質ファミリーの１以上のメンバーの活性化を介して生じる。
【００３６】
「ＴＲＡＦ」ファミリーとしては、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの多くのメンバーおよびインターロイキン−１レセプターからのシグナル伝達を媒介する細胞質アダプタータンパク質のファミリーが挙げられる（例えば、Ａｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、１９９８、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１２：２８２１−２８３０を参照のこと）。今日まで、哺乳動物種において６つの異なるＴＲＡＦ分子が存在する（ＴＲＡＦ１からＴＲＡＦ６と呼ばれる）。これらのタンパク質のカルボキシ末端領域は、自己会合およびレセプターとの相互作用を要する。このドメインは、推定コイルドコイル領域、続いて、高度に保存されたＴＲＡＦ−Ｃドメインを含む。ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、およびＴＲＡＦ３は、この保存されたＣ末端ＴＲＡＦドメインを共有する。ＴＲＡＦタンパク質はまた、多くのさらなる推定される構造的特徴（例えば、アミノ末端ＲＩＮＧフィンガードメインおよびこのＲＩＮＧフィンガードメインの下流に位置する推定ジンクフィンガーのストレッチ）を共有する。これらのタンパク質は、細胞生存を促進するか、またはプログラムされた細胞死を開始することが示された（例えば、Ａｒｃｈ，Ｒ．Ｈ．ら、１９９８、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１２：２８２１−２８３０を参照のこと）。
【００３７】
「単離された」核酸分子は、この核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものをいう。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、用語「単離された」は、ゲノムＤＮＡが天然に関連する染色体から分離した核酸分子をいう。好ましくは、「単離された」核酸分子は、この核酸分子が由来している生物のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する配列（すなわち、この核酸分子の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたＴＲＡＤＥ核酸分子は、この核酸が由来している細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術により生成される場合、他の細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学的合成された場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。しかし、「単離された」ＴＲＡＤＥ核酸分子は、ゲノムＤＮＡにおいてＴＲＡＤＥ配列に通常は隣接しない他のヌクレオチド配列に連結され得る（例えば、ＴＲＡＤＥヌクレオチド配列が、ベクター配列に連結され得る）。特定の好ましい実施形態において、「単離された」核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）はまた、他の細胞物質を含まないかもしれない。しかし、ＴＲＡＤＥ核酸分子が他の細胞物質を含まないことが、必ずしも「単離された」とみなされるわけではない（例えば、他の哺乳動物ＤＮＡから分離され、そして細菌細胞に挿入されたＴＲＡＤＥ　ＤＮＡ分子は、「単離された」とみなされる）。
【００３８】
本明細書中で用いる場合、「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」とは、細胞から単離されるかまたは組換えＤＮＡ技術により産生される場合に、他のタンパク質、ポリペプチド、細胞物質、および細胞培地を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない、タンパク質またはポリペプチドをいう。「単離された」または「精製された」タンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、ＴＲＡＤＥタンパク質が誘導される細胞源もしくは組織源に由来する細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学的合成される場合に、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」とは、タンパク質が、それが単離されるかまたは組換え産生される細胞の細胞成分から分離されるＴＲＡＤＥタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態では、用語「細胞物質を実質的に含まない」とは、非ＴＲＡＤＥタンパク質（本明細書中で「夾雑タンパク質」ともいう）の約３０（乾燥重量）％未満、より好ましくは、非ＴＲＡＤＥタンパク質の約２０％未満、なおより好ましくは、非ＴＲＡＤＥタンパク質の約１０％未満、そして最も好ましくは、非ＴＲＡＤＥタンパク質の約５％未満を有するＴＲＡＤＥタンパク質の調製物を含む。ＴＲＡＤＥタンパク質またはその生物学的に活性な部分が、組換え産生される場合、好ましくは、培養培地を実質的に含まない（すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の、約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、そしてより好ましくは、約５％未満を表す）。
【００３９】
用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、タンパク質がタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離される、ＴＲＡＤＥタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態では、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、化学前駆体または非ＴＲＡＤＥ化学物質の約３０（乾燥重量）％未満、より好ましくは、化学前駆体または非ＴＲＡＤＥ化学物質の約２０％未満、なおより好ましくは、化学前駆体または非ＴＲＡＤＥ化学物質の約１０％未満、そして最も好ましくは、化学前駆体または非ＴＲＡＤＥ化学物質の約５％未満を有するＴＲＡＤＥタンパク質の調製物を含む。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、用語「上皮細胞」とは、上皮（血管または他の小腔の裏打ちを含む、身体の内部表面または外部表面の被覆）の一部である全ての細胞を含む。上皮の細胞は、一般に、接合物質と互いに強固に結合され、そして表面の層の形状および層の数の深さに基づいて分類され得る。上皮のこのような細胞の分類は、本明細書中で用いられる場合、用語上皮細胞の分類に入ると理解される。さらに、本明細書中で用いられる場合、用語上皮細胞は、身体内の任意の器官または組織由来の上皮の細胞を含むことがさらに理解され得る。好ましい実施形態では、用語「上皮細胞」とは、肺、前立腺、または耳下腺の上皮の細胞をいう。好ましい実施形態では、用語「上皮」は、前立腺の管上皮細胞を含む。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合、「新形成」とは、非制御型細胞分裂または異常な細胞分裂から生じる増殖疾患または障害をいう。用語新形成は、悪性および非悪性の障害を含む。本明細書中で用いられる場合、用語「腺癌」とは、一般に、腺上皮細胞の癌のことをいい、そして「癌腫」とは、悪性上皮腫瘍のことをいう。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＴＲＡＤＥの活性または発現を調節する」とは、細胞における（例えば、転写または翻訳のレベルでの）ＴＲＡＤＥ活性またはＴＲＡＤＥ発現のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを含む。
【００４３】
本明細書中で用いられる場合、用語「相互作用」は、例えば、酵母ツーハイブリットアッセイを用いて検出され得るような、分子間の検出可能な相互作用を含むことを意味する。用語相互作用はまた、分子間の「結合」相互作用を含むことを意味する。相互作用は、天然においてタンパク質−タンパク質またはタンパク質−核酸であり得る。
【００４４】
本明細書中で用いられる場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子のことをいう。
【００４５】
本明細書中で用いられる場合、「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的（例えば、二重鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的か、ｍＲＮＡ配列に相補的か、または遺伝子のコード鎖に相補的）である、ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合し得る。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合、用語「コード領域」とは、アミノ酸残基へと翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいい、一方、用語「非コード配列」とは、アミノ酸へと翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’の非翻訳領域）をいう。
【００４７】
本明細書中で用いられる場合、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムへと連結され得る。特定のベクターは、導入される宿主細胞内で自動的に複製し得る（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞へと導入される際に宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結されるゲノムの発現を検出し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクター、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書中で、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に用いられ得る。なぜならば、プラスミドがベクターの最も一般に用いられる形態であるからである。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウィルス、アデノウィルス、およびアデノ随伴ウイルス）（これらは、等価な機能を果たす）のような、発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
【００４８】
本明細書中で用いられる場合、用語「宿主細胞」は、本発明の核酸分子（例えば、本発明の組換え発現ベクター）が導入されている、細胞をいうことが意図される。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に用いられる。このような用語は、特定の目的の細胞のみならず、このような細胞の子孫または潜在的子孫のこともいうことを理解すべきである。特定の修飾は、変異または環境の影響のいずれかに起因して、連続生成を生じ得るので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一でないかもしれないが、本明細書中で用いられる用語の範囲内にまだ含まれる。好ましくは、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。とくに好ましい実施形態では、これは上皮細胞である。
【００４９】
本明細書中で用いられる場合、「異種ＤＮＡ」または「異種核酸」は、天然で存在する位置とは異なるゲノムのある位置に存在するかまたは見出されるか、あるいは天然では通常連結されないＤＮＡ（すなわち、異種プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子）に作動可能に連結される、ゲノムの一部として天然に存在しないＤＮＡを含む。異種ＤＮＡは、その位置には天然で存在しないか、または導入される細胞に対して内在性ではなく別の細胞から得れている。異種ＤＮＡは、同じ種または異なる種に由来し得る。１つの実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）である。当業者が、発現される細胞に対して異種または外来性であると認識するかまたは理解するＤＮＡは、本明細書中で、用語異種ＤＮＡに含まれる。
【００５０】
用語「異種タンパク質」、「組換えタンパク質」、および「外因性タンパク質」は、本明細書中を通じて交換可能に用いられ、そして組換えＤＮＡ技術により産生されるポリペプチドをいい、ここで、一般に、このポリペプチドをコードするＤＮＡは、次いで、異種タンパク質を生成するために、宿主細胞を形質転換するのに用いられる、適切な発現ベクターへと挿入される。すなわち、ポリペプチドは、異種核酸から発現される。
【００５１】
本明細書中で用いられる場合、「トランスジェニック動物」とは、動物の１つ以上の細胞が、「導入遺伝子」を含む、非ヒト動物（好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウス）をいう。用語「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムへと組み込まれ、そして成熟動物のゲノムに保持される外因性ＤＮＡ（例えば、トランスジェニック動物の細胞型または組織の１つ以上におけるコードされる遺伝子産物の発現を指向する）をいう。
【００５２】
本明細書中で用いられる場合、「相同組換え動物」とは、トランスジェニック非ヒト動物（好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス）の型をいい、ここで、内因性遺伝子は、動物の発生の前に、内因性遺伝子と動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）へと導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えにより変化している。
【００５３】
本明細書中で用いられる場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性部分（すなわち、例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、または他のフラグメントのような、抗原を結合する（これらと免疫反応する）抗原結合部位を含む、分子）を含むことを意図する。好ましくは、本発明の抗体は、ＴＲＡＤＥ分子に特異的にか、または実質的に特異的に結合する（すなわち、非ＴＲＡＤＥ分子との交叉反応を殆ど有さない）。用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書中で用いられる場合、抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１つの種のみを含む、抗体分子の集団をいい、一方、用語「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用し得る抗原結合部位の複数の種を含む、抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、免疫反応する特定の抗原に対する単一の結合親和性を表する。
【００５４】
本明細書中で用いられる場合、用語「ＴＲＡＤＥの活性または発現の調節からの恩恵を受ける障害」または「ＴＲＡＤＥ関連障害」は、ＴＲＡＤＥ活性が異常であるか、またはＴＲＡＤＥ活性の調節から恩恵を受ける非ＴＲＡＤＥ活性が異常である、障害を含む。好ましくは、ＴＲＡＤＥ関連障害は、細胞の異常な増殖（例えば、細胞の過剰な増殖もしくは望ましくない増殖、または細胞の不十分な増殖）に関与する。１つの実施形態では、ＴＲＡＤＥ関連障害は、新形成または炎症などを含む。ＴＲＡＤＥ関連障害の例としては、以下が挙げられる：細胞の異常な増殖または望ましくない増殖に関与する障害（例えば、炎症、新形成、アポトーシス、または壊死）。好ましくは、ＴＲＡＤＥ関連障害における望ましくない増殖を受ける細胞は、例えば、肺、肝臓、脳、小腸、または前立腺の、上皮細胞である。ＴＲＡＤＥ関連障害のさらなる例としては、癌腫、腺癌、および他の新形成を含む。ＴＲＡＤＥ関連障害はまた、一般に、異常なＴＮＦレセプター活性または機能（クーロン病（ＢａｅｒｔおよびＲｕｔｇｅｅｒｔｓ，１９９９，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　Ｄｉｓ，　１４：４７−５１）および特定の心血管疾患（Ｆｅｒｒａｒｉ，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｒｅｓ，４０：９７−１０５）を含む）に関連している障害を含む。これらはまた、アポトーシスの非制御されたレベルまたは異常なレベル（例えば、骨髄カテクシス（ｍｙｅｌｏｋａｔｈｅｘｉｓ）（Ａｐｒｉｋｙａｎら、２０００，Ｂｌｏｏｄ，９５：３２０−３２７））、および自己免疫リンパ増殖症候群（ａｏｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＪａｃｋｓｏｎおよびＰａｃｋ，１９９９，Ｃｕｒｒ　Ｏｐ　Ｐｅｄｉａｔｒ，１１：５２１−５２７；Ｓｔｒａｕｓら、１９９９，Ａｎｎ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ，１３０：５９１−６０１））により特徴付けられる。
【００５５】
（使用方法）
本明細書中に記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、および抗体は、以下の方法の１つ以上に用いられ得る：ａ）細胞の増殖を調節する方法、ｂ）被検体における増殖を、例えば、上方−または下方−調節する、障害を処理する方法；ｂ）スクリーニングアッセイ；（ｃ）予防医学（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、または臨床試験をモニタリングする）。１つの実施形態では、被検体は、ＴＲＡＤＥ関連障害を有するという事実に基づいて、事前に選択され得る。
【００５６】
本発明の方法は、例えば、ＴＲＡＤＥポリペプチドの発現および／または活性を調節する薬剤を用いて、実施され得る。このような薬剤としては、本明細書中で以下に記載されるような、例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質を（例えば、遺伝子治療適用において宿主細胞中の組換え発現ベクターを介して）発現するため、（例えば、生物学的サンプルにおいて）ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはＴＲＡＤＥ遺伝子における遺伝子変化を検出するため、およびＴＲＡＤＥ活性を調節するために用いられる核酸が挙げられる。薬剤はまた、例えば、ＴＲＡＤＥインヒビターの不十分な産生または過剰産生により特徴付けられる障害を処置するために用いられるＴＲＡＤＥタンパク質を含む。さらに、ＴＲＡＤＥタンパク質は、天然に存在するＴＲＡＤＥ結合タンパク質をスクリーニングするため、ＴＲＡＤＥ活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため、ならびに、例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質の不十分な産生もしくは過剰な産生、またはＴＲＡＤＥ野生型タンパク質と比較して低下した活性または異常な活性を有するＴＲＡＤＥタンパク質形態の産生により特徴付けられる、ＴＲＡＤＥの調節から恩恵を受ける障害を処置するために、用いられ得る。さらに、抗ＴＲＡＤＥ抗体は、ＴＲＡＤＥタンパク質を検出および単離するため、ＴＲＡＤＥタンパク質のバイオアベイラビリティーを調節するため、そしてＴＲＡＤＥ活性を調節する（例えば、増殖を調節する）ために、用いられ得る。好ましい実施形態では、本発明の方法（例えば、ＴＲＡＤＥの検出、調節など）は、上皮細胞中で行われる。１つの実施形態では、上皮細胞は、管上皮細胞である。別の実施形態では、上皮細胞は、ｔｒａｄｅが発現される組織由来である。好ましくは、この組織は、以下からなる群から選択される：肝臓、脳、前立腺、肺、または精巣。１つの実施形態では、検出法は、新形成状態（例えば、癌腫または腺癌）が存在するか否かを決定するために行われる。本発明の１つの実施形態では、本発明の方法は、ＴＲＡＤＥファミリーメンバー分子を（例えば、調節または検出するために）用いられる。別の実施形態では、このような方法は、ＴＲＡＤＥファミリーのメンバーの１つ以上に特異的であるが、ＴＲＡＤＥファミリーの全てにメンバーに作用しない。例えば、好ましい実施形態では、ＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドの発現または活性の調節は、Ａｐｏ４、ＴＲＡＩＮ、ＡＸ９２＿３、αＯＡＦ０６５、またはβＯＡＦ０６５の１つ以上を調節しない。例えば、１つの実施形態では、ＴＲＡＤＥαまたはＴＲＡＤＥβのポリペプチドは、Ａｐｏ４、ＴＲＡＩＮ、ＡＸ９２＿３、αＯＡＦ０６５、またはβＯＡＦ０６５の１つ以上を調節しない。
【００５７】
（Ａ．ＴＲＡＤＥを調節する方法）
本発明は、（例えば、細胞において、またはＴＲＡＤＥ発現および／もしくは活性を調節する薬剤を同定する目的のためにインビトロで）ＴＲＡＤＥ活性を調節する方法、ならびに、障害の危険性のある（障害が疑わしい）被検体、あるいは異常なＴＲＡＤＥ発現もしくは活性に関連する障害、またはＴＲＡＤＥ発現および／もしくは活性の調節から恩恵を受ける障害を有する被検体を処置する予防的方法および治療的方法の両方、を提供する。
【００５８】
本発明のなおべつの局面は、細胞におけるＴＲＡＤＥ発現および／または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、ＴＲＡＤＥ発現および／または活性を調節する薬剤と細胞を接触させて、その結果、細胞におけるＴＲＡＤＥ発現および／または活性を調節することに関する。この薬剤は、細胞中のＴＲＡＤＥタンパク質の活性を調節することによるか、またはＴＲＡＤＥ遺伝子またはＴＲＡＤＥｍＲＮＡの翻訳の転写を調節することにより、作用し得る。
【００５９】
従って、１つの実施形態では、薬剤は、ＴＲＡＤＥ活性を阻害する。阻害剤は、例えば、ＴＲＡＤＥ前増殖または前アポトーシス活性を直接阻害することによるか、またはＴＲＡＤＥ活性を調節するシグナル伝達経路を調節することにより、機能し得る。別の実施形態では、薬剤は、ＴＲＡＤＥ活性を刺激し得る。刺激剤は、例えば、ＴＲＡＤＥ前増殖または前アポトーシス活性を直接刺激することによるか、またはＴＲＡＤＥ活性を調節するシグナル伝達経路を調節することにより、機能し得る。
【００６０】
例示的阻害剤としては、（例えば、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための）アンチセンスＴＲＡＤＥ核酸分子、（例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質の活性を阻害するための）細胞内抗ＴＲＡＤＥ抗体、およびＴＲＡＤＥタンパク質の優性の陰性変異体が挙げられる。ＴＲＡＤＥタンパク質の活性を阻害するために用いられ得る他の阻害剤は、ＴＲＡＤＥ−前増殖活性または前アポトーシス活性を阻害する化学的化合物である。このような化合物は、本明細書中に記載されるように、このような化合物を選択するスクリーニングアッセイを用いて同定され得る。さらに、あるいは、ＴＲＡＤＥ−前増殖活性または前アポトーシス活性を阻害する化合物は、当該分野で公知のアプローチを用いて設計され得る。
【００６１】
本発明の別の調節方法に従って、ＴＲＡＤＥ活性は、刺激剤と細胞を接触させることにより細胞内で刺激される。このような刺激剤の例としては、ＴＲＡＤＥタンパク質および細胞内のＴＲＡＤＥ活性を増加させるために細胞内に導入されるＴＲＡＤＥをコードする核酸分子が挙げられる。好ましい刺激剤は、ＴＲＡＤＥタンパク質をコードする核酸分子であり、一方、この核酸分子は、細胞内の活性ＴＲＡＤＥタンパク質の発現に適切な形態で細胞内に導入される。細胞内でＴＲＡＤＥタンパク質を発現させるために、代表的には、ＴＲＡＤＥ　ｃＤＮＡが、初めに、本明細書中に記載されるような、標準的な分子生物学的技術を用いて組換え発現ベクターに導入される。ＴＲＡＤＥ　ｃＤＮＡは、本明細書中に記載されるような、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増殖によるか、または適切なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、得られ得る。ＴＲＡＤＥ　ｃＤＮＡの単離または増幅の後、ＤＮＡフラグメントは、本明細書中に記載されるような標準的方法により、発現ベクターへと導入され、そして標的細胞へとトランスフェクトされる。ＴＲＡＤＥタンパク質の活性および／または発現を刺激するために用いられ得る他の刺激剤は、ＴＲＡＤＥ前アポトーシス活性を増強する化合物のような、細胞内でのＴＲＡＤＥ活性および／または発現を刺激する化学的化合物である。このような化合物は、本明細書中で詳細に記載されるような、このような化合物を選択するスクリーニングアッセイを用いて同定され得る。
【００６２】
本発明の調節方法は、インビトロ（例えば、細胞を薬剤と共に培養することによってかまたは薬剤を培養物中の細胞に導入することによって）、またはあるいは、インビボ（例えば、被験体に薬剤を投与することによってかまたは被験体の細胞に薬剤を導入することによって（例えば、遺伝子治療によって））行われ得る。インビトロでの調節方法を実施するために、細胞を、標準的な方法によって被験体から得て、そして本発明の調節薬剤と共にインビトロでインキュベート（すなわち、培養）して、その細胞中のＴＲＡＤＥ活性を調節する。
【００６３】
核酸を含む刺激薬剤または阻害薬剤（ＴＲＡＤＥタンパク質をコードする組換え発現ベクター、アンチセンスＲＮＡ、細胞内抗体またはドミナントネガティブインヒビターを含む）については、これらの薬剤は、核酸（例えば、ＤＮＡ）をインビボの細胞に導入するための当該分野で公知の方法を使用して、被験体の細胞内に導入され得る。このような方法の例は、以下を含む、非ウイルス性およびウイルス性の方法を包含する。
【００６４】
（直接注入）：裸のＤＮＡは、そのＤＮＡを細胞に直接注入することによってインビボで細胞内に導入され得る（例えば、Ａｃｓａｄｉら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ　３３２：８１５−８１８；Ｗｏｌｆｆら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６５−１４６８を参照のこと）。例えば、インビボでＤＮＡを細胞に注入するための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）が使用され得る。このような装置は、市販されている（例えば、ＢｉｏＲａｄより）。
【００６５】
（カチオン性脂質）：裸のＤＮＡは、そのＤＮＡをカチオン性脂質で複合体化することによってかまたはＤＮＡをカチオン性リポソーム中にカプセル化することによって、インビボで細胞内に導入され得る。適切なカチオン性脂質処方物の例としては、Ｎ−［−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）ならびに１：１のモル比の１，２−ジミリストイルオキシ−プロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる（例えば、Ｌｏｇａｎ，Ｊ．Ｊ．ら、１９９５、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２：３８−４９；Ｓａｎ，Ｈ．ら、１９９３、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　４：７８１−７８８を参照のこと）。
【００６６】
（レセプター媒介性ＤＮＡ取り込み）：裸のＤＮＡはまた、細胞表面レセプターに対するリガンドに結合されたカチオン（例えば、ポリリジン）にＤＮＡを複合体化することによって、インビボで細胞内に導入され得る（例えば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；および米国特許第５，１６６，３２０号を参照のこと）。レセプターへのＤＮＡ−リガンド複合体の結合は、レセプター媒介エンドサイトシスによるＤＮＡの取り込みを促進する。アデノウイルスキャプシド（これは、天然でエンドソームを破壊し、それによって、物質を細胞質に放出する）に結合されたＤＮＡ−リガンド複合体を使用して、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避し得る（例えば、Ｃｕｒｉｅｌら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：２１２２−２１２６を参照のこと）。
【００６７】
（レトロウイルス）：欠損性レトロウイルスは、遺伝子治療目的のための遺伝子移入における使用のために十分特徴付けられている（概要については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，１９９０，Ｂｌｏｏｄ　７６：２７１を参照のこと）。組換えレトロウイルスは、目的のヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノム内へ組み込むことによって構築される。さらに、レトロウイルスゲノムの部分を取り除いて、そのレトロウイルスを複製欠損にし得る。次いで、この複製欠損レトロウイルスを、ビリオン中にパッケージングし、このビリオンを使用して、標準的な技術によるヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞を感染し得る。組換えレトロウイルスを産生するためのプロトコルおよびインビトロまたはインビボでこのようなウイルスを細胞に感染させるためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９８９，Ｓｅｃｔｉｏｎｓ　９．１０−９．１４および他の標準的な実験マニュアルに見出され得る。適切なレトロウイルスの例としては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭが挙げられ、これらは、当業者に周知である。適切なパッケージングウイルスの例としては、ψＣｒｉｐ、ψＣｒｅ、ψ２およびψＡｍが挙げられる。レトロウイルスは、インビトロおよび／またはインビボで多くの異なる細胞型（上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む）へ種々の遺伝子を導入するために使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ　Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙら、１９９２　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　３：６４１−６４７；Ｄａｉら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノム（およびそれに挿入された外来核酸）が宿主ゲノムに組み込まれ、細胞内に核酸を安定に導入するために、標的細胞の分���を必要とする。したがって、標的細胞の複製を刺激することが必要であり得る。
【００６８】
（アデノウイルス）：アデノウイルスのゲノムは、それが、目的の遺伝子産物をコードしそして発現するが、正常な溶解性ウイルスの生活環において複製する能力が不活化されるように、操作され得る。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、Ｃｅｌｌ　６８：１４３−１５５を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、それらが、効果的な遺伝子送達ビヒクルであるために分裂細胞を必要とせず、そして広範な種々の細胞型（気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、前出）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：２８１２−２８１６）および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：２５８１−２５８４）を含む）を感染するために使用され得るという点で、有利である。さらに、導入されるアデノウイルスＤＮＡ（およびそれに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれず、エピソームのままであり、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム内に組み込まれた状況（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）での挿入性の変異誘発の結果として生じ得る潜在的な問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡのアデノウイルスゲノムの保持能力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（８ｋｂまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前出；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ，１９８６、Ｊ．Ｖｉｒｏ．５７：２６７）。現在使用されている多くの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全てまたは部分を欠失するが、アデノウイルスの遺伝物質の８０％程度の多くを保持する。
【００６９】
（アデノ随伴ウイルス）：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、天然に存在する欠損性のウイルスであり、これは、効率的な複製および生産的な生活環のためのヘルパーウイルスとして、別のウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を必要とする（概要については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２、１５８：９７−１２９を参照のこと）。これはまた、非分裂細胞へそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの１つであり、そして高頻度の安定な組み込みを示す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照のこと）。３００塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターが、パッケージングされ得そして組み込み得る。外因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂまでに制限される。ＡＡＶベクター（例えば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記載のようなベクター）は、細胞内にＤＮＡを導入するために使用され得る。種々の核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照のこと）。
【００７０】
細胞内に核酸を導入するための特定の発現ベクター系のおよび方法の効率は、当該分野で慣用的に使用される標準的アプローチによって評価され得る。例えば、細胞内に導入されたＤＮＡは、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロッティング）によって検出され得、そして導入されたＤＮＡの転写によって産生されたＲＮＡは、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出され得る。この遺伝子産物は、適切なアッセイ（例えば、産生されたタンパク質の免疫学的検出（例えば、特異的抗体を用いる）またはその遺伝子産物の機能的活性を検出するための機能アッセイ）によって検出され得る。
【００７１】
本発明のＴＲＡＤＥ調節薬剤が処置において使用され得る、広範に種々の病理学的状態が存在する。１つの実施形態において、このような薬剤は、細胞の増殖を下方調節し得るかまたはアポトーシスを上方調節し得る。さらなる実施形態において、この方法は、アポトーシスの上方調節から利益を受ける障害に罹患している被験体を処置するために使用され得る。好ましい実施形態において、ＴＲＡＤＥを調節して、上皮細胞のアポトーシスを増強し、例えば、癌細胞（例えば、肺、肝臓、脳、腸または前立腺における）におけるアポトーシスを促進する。
【００７２】
別の実施形態において、例えば、アルツハイマー病または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者における上皮細胞生存の促進において、ＴＲＡＤＥを調節して、細胞の増殖を上方調節するかまたはアポトーシスを下方調節する（Ｌｅｅ，Ｍ．、１９９１、Ｊ．ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ　＆　Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　５７８：４５９；Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ，Ｐ．およびＬｅｄｏｕｘ，Ｓ、１９９８、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔｅｒｓ．２４４：６９；Ｙｏｓｈｉｈｉｓａら、１９９８、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７８０：２６０）。ＴＲＡＤＥ分子は、脳において発現される。ＴＲＡＤＥの調節が処置において使用される他の例示的障害としては、他の神経系の障害が挙げられる。用語障害とは、ＴＲＡＤＥの活性および／または発現における変更から利益を受ける正常状態および種々の疾患状態の両方を含むことを意味する。
【００７３】
（１．予防的方法）
１つの局面において、本発明は、ＴＲＡＤＥ活性および／または発現の調節から利益を受ける疾患または状態（例えば、異常なＴＲＡＤＥの発現または活性に関連する障害）を、被験体において予防するための方法を提供する。これは、その被験体に、ＴＲＡＤＥポリペプチドを投与することによるか、あるいはＴＲＡＤＥポリペプチド発現または少なくとも１つのＴＲＡＤＥ活性を調節する薬剤を投与することによる。異常なＴＲＡＤＥの発現または活性によって引き起こされるかまたは寄与される疾患の危険性にある被験体は、例えば、本明細書中に記載のような診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたはそれらの組み合わせによって同定され得る。予防薬剤の投与は、ＴＲＡＤＥ異常に特徴的な症状の発生前に行い得、その結果、疾患または障害を、その進行前に予防あるいは遅延する。ＴＲＡＤＥ異常の型または状態に依存して、例えば、ＴＲＡＤＥポリペプチド、ＴＲＡＤＥアゴニストまたはＴＲＡＤＥアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用される。適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【００７４】
（２．治療方法）
本発明の別の局面は、治療目的のためにＴＲＡＤＥの発現または活性を調節する方法に関する。従って、例示的な実施形態において、本発明の調節方法は、細胞に、ＴＲＡＤＥポリペプチドまたはその細胞に関連するＴＲＡＤＥタンパク質の１以上の活性を調節する薬剤を接触させる工程を包含する。ＴＲＡＤＥタンパク質活性を調節する薬剤は、本明細書中に記載されるような薬剤（例えば、核酸またはタンパク質、ＴＲＡＤＥタンパク質の天然に存在する標的分子（例えば、ＴＲＡＤＥ結合タンパク質）、ＴＲＡＤＥ抗体、ＴＲＡＤＥアゴニストまたはアンタゴニスト、ＴＲＡＤＥアゴニストまたはアンタゴニストのペプチド模倣物、または他の小分子）であり得る。１つの実施形態において、薬剤は、１以上のＴＲＡＤＥ活性を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＴＲＡＤＥタンパク質および細胞内に導入されたＴＲＡＤＥポリペプチドをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、薬剤は、１以上のＴＲＡＤＥ活性を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、例えば、アンチセンスＴＲＡＤＥ核酸分子、抗ＴＲＡＤＥ抗体、およびＴＲＡＤＥインヒビターが挙げられる。これらの調節方法は、インビトロ（例えば、細胞を薬剤と共に培養することによる）またはインビボ（例えば、薬剤を被験体に投与することによる）で行われ得る。それ自体で、本発明は、ＴＲＡＤＥタンパク質の調節から利益を受ける疾患または障害（例えば、免疫応答の上方調節または下方調節から利益を受ける障害、あるいはＴＲＡＤＥタンパク質または核酸分子の異常な活性または発現によって特徴付けられる障害）に罹患する個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＴＲＡＤＥの発現または活性を調節（例えば、上方調節または下方調節）する薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）または薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、減少されたかまたは異常なＴＲＡＤＥの発現または活性を補うための治療剤として、ＴＲＡＤＥタンパク質または核酸を投与する工程を包含する。
【００７５】
ＴＲＡＤＥ活性の刺激は、ＴＲＡＤＥが異常に下方調節されている状況および／またはＴＲＡＤＥ活性の増加が有利な効果を有するであろう状況（例えば、細胞の増殖またはアポトーシスを増加することが望ましい場合）において望ましい。同様に、ＴＲＡＤＥ活性の阻害は、ＴＲＡＤＥが異常に上方調節されている状況および／またはＴＲＡＤＥ活性の減少が有利な効果を有するであろう状況（例えば、細胞の増殖またはアポトーシスを減少することが望ましい場合）において望ましい。ＴＲＡＤＥ調節が望ましい例示的状況は、ＴＲＡＤＥ関連障害（細胞の異常なまたは望ましくない増殖を含む障害（例えば、炎症または癌））の処置にある。好ましくは、この望ましくない増殖を起こしている細胞は、例えば、肺または前立腺の上皮細胞である。ＴＲＡＤＥ関連障害のさらなる例としては、癌腫、腺癌および他の新生物が挙げられる。ＴＲＡＤＥ障害はまた、異常なＴＮＦレセプターの活性または機能に一般に関連付けられている障害（クローン病（ＢａｅｒｔおよびＲｕｔｇｅｅｒｔｓ、１９９９、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　Ｄｉｓ、１４：４７−５１）および特定の心臓血管疾患（Ｆｅｒｒａｒｉ、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｒｅｓ、４０：９７−１０５）を含む）を含み得る。これらはまた、制御されていないかまたは異常なレベルのアポトーシスによって特徴付けられる障害（例えば、ミエロカテクシス（ｍｙｅｌｏｋａｔｈｅｘｉｓ）（Ａｐｒｉｋｙａｎら、２０００、Ｂｌｏｏｄ、９５：３２０−３２７）および自己免疫リンパ球増殖症候群（ＪａｃｋｓｏｎおよびＰｕｃｋ、１９９９、Ｃｕｒｒ　Ｏｐ　Ｐｅｄｉａｔｒ、１１：５２１−５２７；Ｓｔｒａｕｓら、１９９９、Ａｎｎ　Ｉｎｔｅｒｎ　Ｍｅｄ、１３０：５９１−６０１））を含み得る。
【００７６】
ＴＮＦレセプターファミリーの他のメンバーと同様に、ＴＲＡＤＥ分子の調節は、他の因子に依存して、異なる下流の結果を有し得る。ＴＲＡＤＥは、新規オーファンレセプターであり、これは、必要とされる生理学的状況に依存して、有糸分裂シグナルまたはアポトーシスシグナルを生成する能力を有する。活性化およびアポトーシスを誘導する二重の能力は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのリガンドの共通の特性である（Ｐｉｍｅｎｔｅｌ−ＭｕｉｎｏｓおよびＳｅｅｄ、１９９９、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１１：７８３）。例えば、ＣＤ９５の凝集は、細胞死を誘発するが（Ｉｔｏｈら、１９９１、Ｃｅｌｌ　６６：２３３）、増殖およびＮＦ−κＢ活性化もまた誘導する（Ａｌｄｅｒｓｏｎら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２２３１；Ｓｍｉｔｈら、１９９３、Ｃｅｌｌ．７３：１３４９）。ＣＤ４０もまた、アポトーシスならびにＢ細胞の分化および生存の両方を媒介する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７０；ＨｅｓｓおよびＥｎｇｅｌｍａｎｎ、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１５９）。１つの実施形態において、外部の薬剤の存在は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーレセプター（Ｍａｃｋａｙら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：２４９３４）の調節の結果に影響を及ぼすために使用され得る。当業者は、特定の状況におけるＴＲＡＤＥ調節のどのような結果が、細胞の特定の状況において存在するかを、問題の細胞型に対するＴＲＡＤＥの上方調節または下方調節の効果をアッセイすることによって決定し得る。このようなアッセイは、当該分野で公知の方法（例えば、本明細書中に例示される方法）を使用して過度の実験なく行われ得る。
【００７７】
（ＩＩＩ．ＴＲＡＤＥ調節薬剤）
（Ａ．ＴＲＡＤＥまたはその部分をコードする単離された核酸分子）
本発明の方法の実施において、種々の薬剤が、細胞におけるＴＲＡＤＥの活性および／または発現を調節するために使用され得る。１つの実施形態において、薬剤は、ＴＲＡＤＥポリペプチドまたはその部分をコードする核酸分子である。このような核酸分子は、以下により詳細に記載される。
【００７８】
ＴＲＡＤＥポリペプチドの分析は、ＪＮＫまたはＮＦκＢシグナル伝達経路におけるポリペプチドとＴＲＡＤＥの相互作用（たとえば、ＴＲＡＤＥポリペプチドの細胞内ドメイン（例えば、ＴＲＡＦ相互作用ドメイン）中のアミノ酸を介する）を媒介するタンパク質の領域を同定した。従って、１つの局面において、本発明は、ＴＲＡＤＥ結合パートナー（例えば、ＴＲＡＦタンパク質）と相互作用するＴＲＡＤＥポリペプチドの部分をコードする核酸分子に関する。ＴＲＡＦタンパク質は、ＴＲＡＤＥペプチドと直接的に相互作用し得る少なくとも１つのドメインを有する。ファミリーとして、ＴＲＡＤタンパク質は、種々のタンパク質−タンパク質相互作用に関与する、いくつかの異なる構造的特徴（そのサインである約２３０アミノ酸のＣ末端ＴＲＡＤドメイン（Ｒｏｔｈｅら、１９９４、Ｃｅｌｌ、７８：６８１−６９２）を含む）によって定義される。このＣ末端ＴＲＡＦドメインはさらに、ＴＲＡＦ−ＮサブドメインおよびＴＲＡＦ−Ｃサブドメインに分けられ得る（Ｃｈｅｎｇら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７：１４９７−１４９８）。いくつかのＴＲＡＦ分子が、ＴＮＦスーパーファミリーのレセプターのメンバーと相互作用するためにホモダイマーおよびヘテロダイマーを形成し得ることが、知られている。Ｃ末端ＴＲＡＦドメインは、自己会合およびレセプター相互作用の両方に十分である（Ｒｏｔｈｅ、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：１４２４−１４２７；Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９９６、ＪＢＣ、２７１：１９９３５−１９９４２）。
【００７９】
遺伝暗号（以下に示した）によって規定されるように、特定のタンパク質のアミノ酸配列とこのタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間に、公知かつ明確な対応が存在する。同様に、遺伝暗号によって規定されるように、特定の核酸分子のヌクレオチド配列とこのヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列との間に、公知かつ明確な対応が存在する。
【００８０】
（遺伝暗号）
【００８１】
【表１】
2004501604.tif 000003
この遺伝暗号の重要かつ周知の特徴は、その重複性である。それによって、タンパク質を作製するために使用されるアミノ酸のほとんどについて、１以上のコードヌクレオチドトリプレットが、使用され得る（上に例示した）。従って、多数の異なるヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列をコードし得る。このようなヌクレオチド配列は機能的に等価であると考えられる。なぜなら、これらは、全ての生体において（特定の生体は、他の生体が行うよりもより効率的にいくつかの配列を翻訳し得るが）同じアミノ酸配列の生成を生じるからである。さらに、時折、プリンまたはピリミジンのメチル化された改変体が、所定のヌクレオチド配列中に見出され得る。このようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響しない。
【００８２】
前出の観点において、本発明のＴＲＡＤＥポリペプチド（またはその一部）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をアミノ酸配列に翻訳する遺伝暗号を使用して、ＴＲＡＤＥアミノ酸配列を誘導するために使用され得る。同様に、任意のＴＲＡＤＥアミノ酸配列について、ＴＲＡＤＥタンパク質をコードし得る対応するヌクレオチド配列は、遺伝暗号から推論され得る（その重複性に起因して、任意の所定のアミノ酸配列について複数の核酸配列を生成する）。従って、本明細書中のＴＲＡＤＥヌクレオチド配列の記載および／または開示はまた、このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の記載および／または開示を含むと考えられるべきである。同様に、本明細書中のＴＲＡＤＥアミノ酸配列の記載および／または開示はまた、このアミノ酸配列をコードし得る全ての可能なヌクレオチド配列の記載および／または開示を含むと考えられるべきである。
【００８３】
本発明の１つの局面は、ＴＲＡＤＥタンパク質またはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子、およびＴＲＡＤＥをコードする核酸（例えば、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用のために十分な核酸フラグメントならびにＴＲＡＤＥ核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントに関する。ＴＲＡＤＥ核酸分子（例えば、配列番号１または３に示されるような）あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の使用の考察において、このような核酸分子のフラグメントならびに全長のＴＲＡＤＥ核酸分子が使用され得ることが理解される。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用して作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むと意図される。この核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００８４】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド配列を有する核酸分子あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドまたはその一部をコードするヌクレオチド配列）は、標準的な分子生物学技術および本明細書中に提供される配列情報を使用して単離され得る。例えば、配列番号１または３の核酸配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の全てまたは部分をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ＴＲＤＡＥ核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載のように）。
【００８５】
さらに、配列番号１または３の全てまたは一部を含む核酸分子あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１または３の配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に基づいてそれぞれに設計された、合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離され得る。
【００８６】
他のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸配列は、ＴＲＡＤＥと同一な核酸および／またはアミノ酸、ＴＲＡＤＥドメインの保有、ならびに／あるいは本明細書中に定義されるようなＴＲＡＤＥ活性の保有に基づいて同定され得る。さらに、一般的な機能的および構造的特徴を有するいくつかのＴＲＡＤＥファミリーメンバーが、当該分野で公知である。これらとしては：Ａｐｏ４（ＷＯ９９／１１７９１）、ＴＲＡＩＮ（ＷＯ９９／１３０７８）、ＡＸ９２＿３（ＷＯ９８／０１５５４、ＷＯ９９／２０６４４）、αＯＡＦ０６５およびβＯＡＦ０６５（ＷＯ９８／３８３０４）が挙げられる。
【００８７】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、そして標準的なＰＣＲ増幅技術に従った適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローニングされ得、そしてＤＮＡ配列決定分析によって特徴付けられる。さらに、ＴＲＡＤＥヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば、自動化されたＤＮＡ合成機を使用して調製され得る。
【００８８】
好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列、別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００８９】
別の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１もしくは３に示されるヌクレオチド配列または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいはこれらのヌクレオチド配列の任意の一部の相補体である核酸分子を含む。配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相補的な核酸分子はそれぞれ、配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に十分に相補的なものの１つであり、その結果、これはそれぞれ、配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それによって安定な二重鎖を形成し得る。
【００９０】
なお別の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１または３に示されるヌクレオチド配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドまたはその一部（例えば、細胞内ドメイン（例えば、配列番号１のヌクレオチド５７７〜１２５１または配列番号３のヌクレオチド５７７〜１２６９を含む）、細胞外ドメイン（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド１〜５０４を含む）、膜貫通ドメイン（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド５０５〜５７６を含む）、第一のシステインリッチドメイン（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド８５〜１８９を含む）、第二のシステインリッチドメイン（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド２１４〜３４２を含む）、第三の部分的なシステインリッチドメイン（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド３４０〜４１７を含む）、セリン／スレオニン／プロリンリッチドメイン（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド４０９〜５０４を含む）、ＴＲＡＤＥ関連デスエフェクター（ｄｅａｔｈ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ドメイン（例えば、配列番号１のヌクレオチド６５２〜１２５１または配列番号３のヌクレオチド６５２〜１２６９を含む）、Ｎ−グリコシル化部位（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド３１３〜３２４を含む）、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド５９８〜６０９を含む）、ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位（例えば、配列番号２または３のヌクレオチド７１２〜７２３を含む）、少なくとも１つのタンパク質キナーゼＣリン酸化部位（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド６１３〜６２１を含む）、第一のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド６５５〜６６６を含む）、第二のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド９７３〜９８４を含む）、チロシンキナーゼリン酸化部位（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド６１９〜６３９を含む）、Ｎ−ミリストイル化部位（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド６４３〜６６０を含む）、キナーゼ活性化ドメイン（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド１〜１１０４を含む）、ＴＲＡＦ結合ドメイン（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド１〜９８４を含む；あるいは配列番号１または３のヌクレオチド１〜１１０４を含む）、またはＮＦｋＢ活性化ドメイン（例えば、配列番号１または３のヌクレオチド１〜１１０４を含む））をコードするヌクレオチド配列に対して（例えば、このヌクレオチド配列の全長に対して）少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上相同なヌクレオチド配列を含む。ＴＲＡＤＥ分子はまた、ＴＲＡＤＥ核酸の細胞内部分に、ＴＮＦレセプターデス（ｄｅａｔｈ）ドメインコンセンサス配列を欠く。
【００９１】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１または３の核酸配列、別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子の一部のみ（例えば、プローブまたはプライマーとして使用され得るフラグメントあるいはＴＲＡＤＥタンパク質の生物学的に活性な一部をコードするフラグメント）を含み得る。ＴＲＡＤＥ遺伝子のクローニングから決定されたこのヌクレオチド配列は、なお別のＴＲＡＤＥファミリーメンバー、ならびに多種由来のＴＲＡＤＥファミリーホモログの同定および／またはクローニングにおける使用のために設計されたプローブまたはプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、代表的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、配列番号１もしくは３または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のセンス配列の、あるいは配列番号１もしくは３または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子改変体もしくは変異体のセンス配列の少なくとも約１２または１５、好ましくは約２０または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５または１００の連続するヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。別の実施形態において、本発明の核酸分子は、長さが少なくとも約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列、およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１もしくは３の核酸分子または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいはその相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
他の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号１または３あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子の、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００以上の連続するヌクレオチドを含む。
【００９３】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号１または３あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子の、少なくとも約３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００または約１５００ヌクレオチド以上を含む核酸分子と、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、そしてさらにより好ましくは９０％の同一性を有する。
【００９４】
ＴＲＡＤＥヌクレオチド配列に基づくプローブは、このタンパク質または相同なタンパク質をコードする転写産物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。好ましい実施形態において、このプローブはさらに、それに連結された標識基を含む（例えば、この標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。このようなプローブは、細胞または組織、特に上皮細胞または組織、特にＴＲＡＤＥタンパク質を誤って発現する上皮細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として、例えば、被験体由来の細胞のサンプルにおいてＴＲＡＤＥをコードする核酸のレベルを測定することによって（例えば、ＴＲＡＤＥｍＲＮＡレベルを検出し、またはゲノムＴＲＡＤＥ遺伝子が変異されているかもしくは欠失されているかを決定することによって）使用され得る。
【００９５】
「生物学的に活性なＴＲＡＤＥタンパク質の一部」をコードする核酸フラグメントは、配列番号１または３のヌクレオチド配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部を単離することによって調製され得る。これは、ＴＲＡＤＥの生物学的活性（例えば、増殖、アポトーシス、および／またはＮＦｋＢもしくはＪＮＫシグナル伝達経路を通じたシグナル伝達を調節する能力）を有し、ＴＲＡＤＥタンパク質のコードされた部分を発現し（例えば、インビトロでの組換え体の発現によって）、そしてＴＲＡＤＥタンパク質のコードされた部分の活性を評価するポリペプチドをコードする。
【００９６】
配列番号１または３あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子とは異なる核酸分子は、遺伝暗号の同義性に起因して、従って、本発明によって含まれる配列番号１または３あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子によってコードされるものと同じＴＲＡＤＥタンパク質をコードする。従って、別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２または４に示されたアミノ酸配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００９７】
配列番号１または３に示されたＴＲＡＤＥヌクレオチド配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に加えて、ＴＲＡＤＥタンパク質のアミノ酸配列における変化を導くＤＮＡ配列の多型性が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが、当業者によって理解される。ＴＲＡＤＥ遺伝子におけるこのような遺伝的な多型性は、天然の対立遺伝子改変体に起因して、集団内の個体間に存在し得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＴＲＡＤＥタンパク質、好ましくは哺乳動物ＴＲＡＤＥタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、そしてさらに非コード調節配列およびイントロンを含み得る核酸分子をいう。このような天然の対立遺伝子改変体は、機能的なＴＲＡＤＥタンパク質および非機能的なＴＲＡＤＥタンパク質の両方を含み、そして代表的に、ＴＲＡＤＥ遺伝子のヌクレオチド配列において１〜５％の変化を生じ得る。天然の対立遺伝子改変体の結果であり、そしてＴＲＡＤＥタンパク質の機能的活性を変更しない、ＴＲＡＤＥ遺伝子における任意のおよび全てのこれらのヌクレオチド改変体および得られるアミノ酸の多型性は、特許請求された方法において使用され得る。
【００９８】
さらに、他のＴＲＡＤＥファミリーメンバーをコードし、従って配列番号１または３のＴＲＡＤＥファミリー配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であることが意図される。さらに、他種由来のＴＲＡＤＥタンパク質をコードし、従って配列番号１または３のＴＲＡＤＥ配列あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、特許請求された方法において使用され得る。
【００９９】
本発明のＴＲＡＤＥ分子の天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応する核酸分子は、（例えば、本明細書中に開示されたＴＲＡＤＥ核酸に対する相同性に基づいて、本明細書中に開示されるｃＤＮＡまたはその部分を、標準的なハイブリダイゼーション技術に従ったハイブリダイゼーションプローブとして使用して）単離され得る。例えば、ＴＲＡＤＥ　ＤＮＡは、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、配列番号１または３あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、そして標準的なハイブリダイゼーション技術を使用して単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載のように）。さらに、ＴＲＡＤＥ遺伝子の全てまたは一部を含む核酸分子は、配列番号１または３あるいは他のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離され得る。例えば、ｍＲＮＡは、細胞から単離され得（例えば、Ｃｈｒｉｇｗｉｎら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：５２９４−５２９９のグアニジニウム−チオシアナート抽出手順によって）、そしてｃＤＮＡは、逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから利用可能なモロニーＭＬＶ　逆転写酵素；またはＳｅｉｋａｇａｋｕ　Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬから利用可能なＡＭＶ逆転写酵素）を使用して調製され得る。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１または３に示されるかあるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡ、あるいは、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、そして標準的なＰＣＲ増幅技術に従った適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローニングされ、ＤＮＡ配列決定分析によって特徴づけられ得る。さらに、ＴＲＡＤＥヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば、自動化されたＤＮＡ合成機を使用して調製され得る。
【０１００】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸は、数学的アルゴリズムを使用して、共有ヌクレオチド配列同一性に基づいて同定され得る。そのようなアルゴリズムは、以下（例えば、第ＩＩＩ節を参照のこと）により詳細に概説される。
【０１０１】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸は、少なくとも１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、３０ヌクレオチド以上の長さであり、そして配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列あるいはその相補鎖を含む核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。他の実施形態において、その核酸分子は、少なくとも３０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、３５０ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、４５０ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、５５０ヌクレオチド長、または６００ヌクレオチド長である。本明細書において使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、互いに対して少なくとも３０％、４０％、５０％、または６０％相同なヌクレオチド配列が代表的には互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載するように意図される。好ましくは、その条件は、互いに対して少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％もしくは９０％相同である配列が、互いにハイブリダイズしたままであるようである。そのようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８６）、６．３．１〜６．３．６中に見出され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましく非限定的な例は、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、その後、約５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。好ましくは、配列番号１もしくは３または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子の配列またはその相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然で存在するヌクレオチド配列を有する（例えば、天然のタンパク質をコードする）、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。配列番号１もしくは３に示されるＴＲＡＤＥヌクレオチド配列または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子に加えて、ＴＲＡＤＥのヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列における些細な変化をもたらすＤＮＡ配列多型が、集団中に存在し得ることが、当業者によって認識される。ＴＲＡＤＥ遺伝子におけるそのような遺伝的多型が、天然の対立遺伝子変化に起因して、集団中の個体の間に存在し得る。そのような天然の対立遺伝子変化は、代表的には、その遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜２％の変動を生じる得る。天然の対立遺伝子変化の結果でありかつＴＲＡＤＥポリペプチドの機能的活性を変化しない、ＴＲＡＤＥにおけるそのようなヌクレオチド変化および生じるアミノ酸多型が、本発明の範囲内にある。
【０１０３】
その集団中に存在し得るＴＲＡＤＥ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、ヌクレオチド配列中（例えば、配列番号１もしくは３のヌクレオチド配列中または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子中）への変異によって、些細な変化が導入され得、それにより、ＴＲＡＤＥタンパク質の機能的活性を変化することなく、コードされるタンパク質のアミノ酸配列中に変化をもたらし得ることを、当業者はさらに認識する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を生じるヌクレオチド置換が、配列番号１もしくは３または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子の配列中になされ得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＴＲＡＤＥ核酸分子の野生型配列（例えば、配列番号１もしくは３または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子の配列）から、ＴＲＡＤＥ分子の機能的活性を変化することなく変化され得る残基である。非必須であり、従って置換を受けやすい、例示的残基は、ＴＲＡＤＥ関連分子のアミノ酸アラインメントを実施し、そして保存されていない残基を決定することによって、当業者により同定され得る。そのような残基は、保存されていなかったので、より置換をうけやすい可能性がある。
【０１０４】
従って、本発明の別の局面は、ＴＲＡＤＥ活性に必須ではないアミノ酸残基中に変化を含む、ＴＲＡＤＥタンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなＴＲＡＤＥタンパク質は、配列番号２もしくは４からのアミノ算配列または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドのアミノ酸配列と異なるが、なお固有のＴＲＡＤＥ活性を保持する。ＴＲＡＤＥタンパク質の非天然改変体をコードする単離された核酸が、配列番号１もしくは３または別のＴＡＲＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列中に１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入し、そのコードされるタンパク質中に１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失が導入されるようにすることによって、作製され得る。標準的技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって、配列番号１もしくは３または別のＴＡＲＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子中に、変異が導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１つ以上の非必須アミノ酸残基でなされる。「保存的アミノ酸置換」は、そのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されおり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。従って、ＴＲＡＤＥにおける非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。
【０１０５】
あるいは、別の実施形態において、ＴＡＲＤＥコード配列のすべてまたは一部の沿ってランダムに、例えば、飽和（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）変異誘発によって、変異が導入され得、そして生じた変異体が、ＤＮＡに結合する能力および／または転写を活性化する能力についてスクリーニングされ得、機能的活性を保持する変異体が同定され得る。変異誘発後、コードされるＴＡＲＤＥ変異体タンパク質が、宿主細胞において組換え発現され得、そしてその変異体タンパク質の機能的活性が、ＴＡＲＤＥ活性を評価するために当該分野で利用可能なアッセイを使用して決定され得る。
【０１０６】
本発明のなお別の局面は、ＴＲＡＤＥ融合タンパク質をコードする核酸分子を単離することに関する。そのような核酸分子（非ＴＡＲＤＥタンパク質、非ＴＲＡＤＥポリペプチドまたは非ＴＲＡＤＥペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ＴＲＡＤＥ活性を有する全長ＴＲＡＤＥタンパク質、全長ＴＲＡＤＥポリペプチドまたは全長ＴＲＡＤＥペプチドをコードする少なくとも第１のヌクレオチド配列を含む）が、標準的組換えＤＮＡ技術によって調製され得る。
【０１０７】
好ましい実施形態において、改変体または変異体のＴＲＡＤＥタンパク質が、本明細書中に記載されるようにＴＲＡＤＥ活性についてアッセイされ得る。
【０１０８】
上記のＴＲＡＤＥタンパク質をコードする核酸分子に加えて、本発明の別の局面は、その核酸分子に対してアンチセンスである核酸分子を単離することに関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸と相補的（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖と相補的またはｍＲＮＡ配列と相補的）である、ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸分子は、センス核酸分子に水素結合し得る。このアンチセンス核酸分子は、ＴＲＡＤＥコード鎖全体に相補的であり得るか、またはその一部にのみ相補的であり得る。１つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＴＲＡＤＥをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基へと翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態において、そのアンチセンス核酸分子は、ＴＲＡＤＥをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸への翻訳されないコード領域に隣接する、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいう）。
【０１０９】
本明細書中に開示されるＴＲＡＤＥをコードするコード鎖配列を考慮すると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン−クリック塩基対形成の規則に従って設計され得る。このアンチセンス核酸分子は、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡのコード領域全体と相補的であり得るが、より好ましくは、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスである、オリゴヌクレオチドである。例えば、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域と相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸分子は、当該分野で公知の手順を使用して化学合成および酵素連結反応を使用して、構築され得る。例えば、アンチセンス核酸分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドを使用して化学合成され得るか、またはその分子の生物学的安定性を増加するようにかもしくはそのアンチセンス核酸分子とセンス核酸分子との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加するように設計された、種々に改変されたヌクレオチドを使用して化学合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）。このアンチセンス核酸分子を生成するために使用され得る改変されたヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡが、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）にサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に作製され得る（以下の小節でさらに記載される）。
【０１１０】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には、被験体に投与されるかまたはインサイチュで生成されて、その結果、それらが、ＴＲＡＤＥタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合して、それによりそのタンパク質の発現を、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、阻害する。このハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、その二重鎖へリックスの主溝における特異的相互作用を介して、であり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接注入が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択した細胞を標的とするように改変され得、その後全身投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが、選択した細胞表面上に露出したレセプターまたは抗原に特異的に結合するように、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体へそのアンチセンス核酸分子を連結することによって、改変され得る。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを使用して、細胞に送達され得る。このアンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、そのアンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に配置されたベクター構築物が、好ましい。
【０１１１】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常のβ単位とは対照的に、それらの鎖が互いに並行に走っている、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２１５：３２７〜３３０）を含み得る。
【０１１２】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有する一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得る、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５〜５９１）に記載される）が、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡ転写物を触媒切断し、それによりＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために、使用され得る。ＴＲＡＤＥコード核酸についての特異性を有するリボザイムが、配列番号１もしくは３または別のＴＡＲＤＥファミリーポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。例えば、その活性部位のヌクレオチド配列が、ＴＲＡＤＥコードｍＲＮＡにおいて切断されるヌクレオチド配列と相補的である、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　Ｌ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡの誘導体が、構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡは、特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択するために使用され得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０１１３】
あるいは、遺伝子発現が、標的細胞中のＴＡＲＤＥ遺伝子の転写を妨げる三重へリックス構造を形成するようにＴＲＡＤＥの調節領域（例えば、ＴＲＡＤＥプロモーターおよび／またはエンハンサー）と相補的であるヌクレオチド配列を標的とすることによって、阻害され得る。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．１９９１、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．６（６）：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｃｅ，Ｃ．ら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．、１９９２、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　１４（１２）：８０７〜５を参照のこと。
【０１１４】
なお別の実施形態において、本発明のＴＡＲＤＥ核酸分子は、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または可溶性を改善するために、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格にて改変され得る。例えば、その核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格が、ペプチド核酸を生成するように改変され得る（Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．ら、１９９６、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　＆　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４（１）：５〜２３を参照のこと。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格がプソイドペプチド骨格によって置換され、４つの天然の核酸塩基のみが保持されている、核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＲＮＡの天然の骨格は、低イオン強度条件下でのＤＮＡとＲＮＡとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＲＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．ら、１９９６、前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１４６７０〜６７５に記載される、標準的固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施され得る。
【０１１５】
ＴＲＡＤＥ核酸分子のＰＮＡは、治療適用および診断適用にて使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写もしくは翻訳の停止を誘導することによってかまたは複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス剤またはアンチジーン剤として使用され得る。ＴＲＡＤＥ核酸分子のＰＮＡはまた、（例えば、ＰＮＡ指向的ＰＣＲクランピング（ＰＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ＰＣＲ　ｃｌａｍｐｉｎｇによる）遺伝子中の一塩基対変異の分析においてか；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．１９９６、前出））と組み合わせて使用した場合に人工制限酵素としてか；またはＤＮＡ配列決定もしくはハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．ら、１９９６、前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、前出）、使用され得る。
【０１１６】
別の実施形態において、ＴＲＡＤＥのＰＮＡは、（例えば、その安定性または細胞取込みを増強するために）ＰＮＡに親油性基または他のヘルパー基を結合することによってか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によってか、またはリポソームの使用もしくは当該分野で公知の他の薬物送達技術の使用によって、改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得る、ＴＲＡＤＥ核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラが、作製され得る。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮアーセＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がそのＤＮＡ部分と相互作用することを可能にしつつ、そのＰＮＡ部分が高い結合親和性および結合特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数、および方向に関して選択された適切な長さのリンカーを使用して、連結され得る（Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．１９９６、前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ　Ｂ．１９９６、前出およびＦｉｎｎ　Ｐ．Ｊ．ら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２４（１７）３３５７〜６３に記載される。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的ホスホルアミダイト結合化学を使用して、固体支持体上で合成され得、そして改変型ヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ５’−デオキシ−チミジンホスホロアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間として使用され得る（Ｍａｇ，Ｍ．ら、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成するように、段階様式で結合される（Ｆｉｎｎ　Ｐ．Ｊ．ら、１９９６、前出）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子が、合成され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら、１９７５、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４）。
【０１１７】
他の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を促進する因子を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション標的化切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８〜９７６）またはインターカレート剤（例えば、ＺＯｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘導架橋剤、輸送因子、またはハイブリダイゼーション誘導切断剤）と結合体化され得る。
【０１１８】
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞において異種発現カセットから生成され得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、外部環境（インビトロで培養培地中にか、またはインビボで循環系にもしくは間質性液にのいずれか）に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含み得る。外部環境に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質に対するアクセスを得るおよび特定のｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが示されている。
【０１１９】
（Ｂ．単離されたＴＲＡＤＥタンパク質、そのフラグメント、および抗ＴＲＡＤＥ抗体）
単離されたＴＲＡＤＥタンパク質およびその生物学的に活性な部分はまた、調節剤として、ならびに抗ＴＲＡＤＥ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適切なポリペプチドフラグメントとして用い得る。１つの実施形態において、ネイティブなＴＲＡＤＥタンパク質は、標準的タンパク質精製技術を用いて適切な精製スキームによって細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＴＲＡＤＥタンパク質は、組み換えＤＮＡ技術によって生成され得る。組み換え発現に代わって、ＴＲＡＤＥタンパク質またはポリペプチドは、標準的ペプチド合成技術を用いて、化学的に合成され得る。ＴＲＡＤＥタンパク質（例えば、配列番号２もしくは配列番号４、または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするアミノ酸配列）の使用を考察するにおいて、全長ＴＲＡＤＥポリペプチドではないこのようなタンパク質のフラグメント（例えば、１つ以上のＴＲＡＤＥドメイン（例えば、配列番号２の残基１９３〜４１７、または配列番号４の１９３〜４２３に対応するアミノ酸残基を含む細胞内ドメイン、配列番号２または４の残基１〜１６８に相当するアミノ酸残基を含む細胞外ドメイン、配列番号２または４の残基１６９〜１９２に相当するアミノ酸残基を含む膜貫通ドメイン、配列番号２または４の残基２９〜６３に相当するアミノ酸残基を含む第一のシステインリッチドメイン、配列番号２または４の残基７２〜１１４に相当するアミノ酸残基を含む第二のシステインリッチドメイン、配列番号２または４の残基１１４〜１３９に相当するアミノ酸残基を含む第３のシステインリッチドメイン、配列番号２または４の残基１３７〜１６８に相当するアミノ酸残基を含むセリン／トレオニン／プロリンリッチドメイン、配列番号２の残基２１８〜４１７または配列番号４の残基２１８〜４２３に相当するアミノ酸残基を含むＴＲＡＤＥ関連死エフェクタードメイン、配列番号２または４の残基１０５〜１０８に相当する部位のＮグリコシル化部位、配列番号２または４の残基２００〜２０３に相当する部位のｃＡＭＰ−ｃＧＣＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、配列番号２または４の残基２３８〜２４１に相当する部位のｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、配列番号２または４の残基２０５〜２０７に相当する部位のプロテインキナーゼＣリン酸化部位、配列番号２または４の残基２１９〜２２２に相当する部位のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、および配列番号２または４の残基３２５〜３２８に相当する部位、配列番号２または４の残基２０７〜２１３に相当する部位のチロシンキナーゼ部位、あるいは配列番号２または４の残基２１５〜２２０に相当する部位のＮ−ミリストイル化部位を含むもの）がまた本発明の範囲内であることが理解される。
【０１２０】
本発明の別の局面は、単離されたＴＲＡＤＥタンパク質に関する。好ましくは、ＴＲＡＤＥタンパク質は、配列番号１または３、または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドもしくはその部分をコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態において、このタンパク質は、配列番号２もしくは４のアミノ酸配列、または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドもしくはその部分のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、このタンパク質は、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列、または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドもしくはその部分（例えば、上記のコンセンサスドメイン）のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、より好ましくは７０％アミノ酸同一性、より好ましくは８０％、そしてなおより好ましくは、９０％もしくは９５％のアミノ酸同一性を有する。
【０１２１】
ＴＲＡＤＥポリペプチド分子の好ましい部分は、生物学的に活性であり、すなわち、ＮＦｋＢおよび／またはＪＮＫを活性化し、それによって増幅を調節する能力を有し、ならびに／あるいは細胞中のアポトーシスを調節する能力を有するＴＲＡＤＥポリペプチドの一部をコードする。好ましくは、この細胞は、上皮細胞（例えば、延性の上皮細胞）である。
【０１２２】
ＴＲＡＤＥタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＴＲＡＤＥタンパク質のアミノ酸配列と実質的に相同であるかまたはそのアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドを含む。このＴＲＡＤＥタンパク質のアミノ酸配列は、全長ＴＲＡＤＥタンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、そしてＴＲＡＤＥタンパク質の少なくとも１つの活性を示す。
【０１２３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の間の同一性パーセントを決定するため、この配列を至適比較目的で整列させる（例えば、ギャップは、至適整列のため第一および第二のアミノ酸配列または第一および第二の核酸配列の１つまたは両方において誘導され得る）。好ましい実施形態において、比較目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％、そしてなおより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％の長さである。次いで、対応する位置の残基を比較し、そして１つの配列中の位置が、他の配列における対応する位置と同じ残基によって占有される場合、この分子は、その位置で同一である。従って、２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列の間の同一性パーセントは、この配列によって共有される同一の位置の数の関数である。この数は、２つの配列の至適整列（アラインメント）のために導入されるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する。本明細書において用いる場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である。
【０１２４】
配列の比較および２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３のように改変されている）である。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施され得る。比較目的のためにギャップアラインメントを得るために、ギャップ化ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５（１７）：３３８９に記載のように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォールトパラメーターが用いられ得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。配列の比較に利用される、別の好ましい、非限定的アルゴリズムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残表（ｗｅｉｇｈｔ　ｒｅｓｉｄｕｅ　ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４が使用され得る。
【０１２５】
タンパク質配列のアラインメントのために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的実施例は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズム（ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ，１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７：１４３５）である。Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムを用いる場合、ＰＡＭ２５０ウェイト残表、ギャップ長ペナルティー１２、ギャップペナルティー４およびＫｕｔｐｌｅ２が使用され得る。核酸配列のアラインメントのために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的実施例は、Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズム（ＷｉｂｕｒおよびＬｉｐｍａｎ，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：７２６）である。Ｗｉｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズムを用いる場合、ウインドウ２０、ペナルティー３、Ｋｔｕｐｌｅ３を用い得る。Ｌｉｐｍａｎ−ＰｅｒｓｏｎアルゴリズムおよびＷｉｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎアルゴリズムの両方が、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ配列分析ソフトウェアパッケージの一部であるＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（例えば、バージョン３．１．７）に取り込まれている。
【０１２６】
配列分析のためのさらなるアルゴリズムは当該分野で公知であり、そしてＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ（ＴｏｒｅｌｌｉおよびＲｏｂｏｔｔｉ，１９９４、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：３に記載）およびＦＡＳＴＡ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：２４４４に記載）を含む。
【０１２７】
好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定する。これには、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量および１、２、３、４、５、または６の長さ重み（レングスウェイト）を用いる。別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列の間の同一性パーセントを、ＮＷＳｇａｐｄｎａを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定する。ＣＭＰマトリックスおよびギャップウェイト：４０、５０、６０、７０または８０、そして長さ重み（レングスウェイト）：１、２、３、４、５、または６。
【０１２８】
タンパク質アラインメントはまた、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ全体的タンパク質アラインメントプログラム（ｇｌｏｂａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｐｒｏｇｒａｍ）（例えば、バージョン２．５．１）を用いてなされ得る。このプログラムでは、コスト対オープンギャップセット５、コスト対長さギャップセット５、最小対角線長さセット４、最大対角線オフセットセット１３０、コンセンサスカットオフセット５０％であり、Ｐａｍ　２５０マトリックスを利用する。
【０１２９】
本発明の核酸およびタンパク質配列はさらに、公的データベースに対する検索を実施するための、「問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として用いられ、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連の配列を同定し得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施され得る。ＢＬＡＳＴ核酸検索は、本発明のＴＲＡＤＥ核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のＴＲＡＤＥタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施され得る。比較目的でギャップ化アラインメントを得るために、ギャップ化ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載のように利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォールトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を用い得る。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、デフォールトＢＬＡＳＴＮマトリックス１−３（ギャップペナルティーセット：存在１１および伸長１）を用いて分析され得る。本発明のアミノ酸配列は、デフォールト設定：Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス（ギャップペナルティーセット：存在１１および伸長１）を用いて分析され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。
【０１３０】
本発明はまた、ＴＲＡＤＥのキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において用いる場合、ＴＲＡＤＥの「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＴＲＡＤＥポリペプチドに作動可能に連結したＴＲＡＤＥポリペプチドを含む。「ＴＲＡＤＥポリペプチド」とは、ＴＲＡＤＥポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、一方「非−ＴＲＡＤＥポリペプチド」とは、ＴＲＡＤＥタンパク質に実質的に相同でないタンパク質（例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質とは異なるタンパク質、および同じまたは異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＴＲＡＤＥ融合タンパク質において、ＴＲＡＤＥポリペプチドは、ＴＲＡＤＥタンパク質の全てまたは一部に相当し得る。好ましい実施形態において、ＴＲＡＤＥ融合タンパク質は、ＴＲＡＤＥタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分（例えば、ＴＲＡＤＥコンセンサスドメイン）を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結した」とは、ＴＲＡＤＥポリペプチドおよび非ＴＲＡＤＥポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すことを意図する。非ＴＲＡＤＥポリペプチドは、ＴＲＡＤＥポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０１３１】
例えば、１つの実施形態において、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＴＲＡＤＥメンバーの融合タンパク質であり、ここでＴＲＡＤＥメンバー配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合されている。別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＴＲＡＤＥ−ＨＡ融合タンパク質であり、ここでＴＲＡＤＥメンバーヌクレオチド配列は、ｐＣＥＰ４−ＨＡベクターのようなベクターに挿入されており（Ｈｅｒｒｓｃｈｅｒ、Ｒ．Ｆ．ら、１９９５、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．９：３０６７〜３０８２）、その結果、ＴＲＡＤＥメンバー配列は、インフルエンザ血球凝集素エピトープタグにインフレームで融合されている。このような融合タンパク質は、組み換えＴＲＡＤＥメンバーの精製を容易にし得る。
【０１３２】
組み換え技術によって精製される融合タンパク質およびペプチドは、タンパク質またはペプチドを含む、細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、タンパク質またはペプチドは、細胞内に保持され得、そしてこの細胞が回収され、溶解され、そしてタンパク質が単離される。細胞培養物は代表的に宿主細胞、培地および他の副生成物を含む。細胞培養のための適切な培地は、当該分野で周知である。タンパク質およびペプチドは、タンパク質およびペプチドを精製するための、当該分野で公知の技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離され得る。宿主細胞をトランスフェクトする技術ならびにタンパク質およびペプチドを精製する技術は当該分野で公知である。
【０１３３】
好ましくは、本発明のＴＲＡＤＥ融合タンパク質は、標準的組み換えＤＮＡ技術によって生成される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、例えば、連結のための平滑末端またはずれた末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、必要に応じて粘着性末端の充填、所望されない接続を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーション（連結）を使用して、従来の技術に従ってインフレームで一緒に連結される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成器を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの保存的遺伝子フラグメントの間の相補的オーバーハングを生じる、アンカープライマーを用いて実行され得る。この遺伝子フラグメントは、引き続いてキメラ遺伝子配列を生成するためにアニーリングおよび再増幅され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、編、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ：１９９２、を参照のこと）。さらに、既に融合部分をコードしている多くの発現ベクターが、市販されている（例えば、ＧＳＴポリペプチドまたはＨＡエピトープタグ）。ＴＲＡＤＥコード核酸は、融合部分がＴＲＡＤＥタンパク質にインフレームで連結されるように、このような発現ベクター中にクローニングされる。
【０１３４】
別の実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端で異種シグナル配列を含むＴＲＡＤＥタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＴＲＡＤＥの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて増大され得る。本発明のＴＲＡＤＥ融合タンパク質は、薬学的組成物中にとく込まれ、そしてインビボで被験体に投与され得る。ＴＲＡＤＥ融合タンパク質の使用は、例えば、ＴＲＡＤＥリガンドの可溶性アンタゴニストとして、障害の処置に治療上有用であり得る。このような処置によって利点となる障害としては、例えば、癌またはアルツハイマー病が挙げられる。このようなＦｃ融合タンパク質は、ＴＲＡＤＥリガンドの可溶性アンタゴニストとして用いられ得る。さらに、本発明のＴＲＡＤＥ融合タンパク質は、被験体中で抗ＴＲＡＤＥ抗体を産生するための免疫原として用いられ得る。
【０１３５】
好ましくは、本発明のＴＲＡＤＥキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的組み換え方法によって生成され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、例えば、連結のための平滑末端またはずれた末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、必要に応じて粘着性末端の充填、所望されない接続を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーション（連結）を使用して、従来の技術に従ってインフレームで一緒に連結される。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成器を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの保存的遺伝子フラグメントの間の相補的オーバーハングを生じる、アンカープライマーを用いて実行され得る。この遺伝子フラグメントは、引き続いてキメラ遺伝子配列を生成するためにアニーリングおよび再増幅され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、編、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ：１９９２、を参照のこと）。さらに、既に融合部分をコードしている多くの発現ベクターが、市販されている（例えば、ＧＳＴポリペプチド）。ＴＲＡＤＥコード核酸は、融合部分がＴＲＡＤＥタンパク質にインフレームで連結されるように、このような発現ベクター中にクローニングされ得る。
【０１３６】
１つの実施形態において、ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、当該分野において公知の技術を使用して作製され得る。例えば、本実施例において教示されるように、可溶性ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＲＡＤＥの細胞外領域をコードするｃＤＮＡ配列を、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に結合させることによって、構築され得る。任意のアイソタイプが、このような構築物を作製する際に使用され得る（例えば、Ｆｃγ１、γ２、γ３、εまたはα）。細胞は、ＴＲＡＤＥ−Ｉｇ構築物を保有するプラスミドでトランスフェクトされ得、培養され得、そして馴化培地採取され得る。次いで、この融合タンパク質は、例えば、固定されたプロテインＡのカラムを使用して、精製され得る。
【０１３７】
別の実施形態において、グリシン残基とセリン残基とのスペーサーが、ＴＲＡＤＥとＦｃ配列との間に組み込まれ得る。例えば、ＴＲＡＤＥ融合タンパク質のＴＲＡＤＥ部分は、通常はＴＲＡＤＥ細胞外領域（ＳＴＡＳＳＰＲＤＴ（配列番号９））のＣ末端配列で；または第２のシステインリッチドメインと膜貫通ドメインとの間の他の残基において終結し得、そしてＩｇγ１ヒンジの残基は、ＤＫＴＨＴＣＰ（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔにおける登録中の番号Ｐ０１８５７のポリペプチド配列の残基１０４で開始する）であり得る。これに続いてＣＨ２−ＣＨ３ドメイン残基が存在し得るか、またはグリシン残基とセリン残基とのスペーサーが、ＴＲＡＤＥ配列とＦｃ配列との間に組み込まれ得る。
【０１３８】
別の実施形態において、Ｆｃ配列のアロタイプ改変体を使用して、Ｆｃ融合タンパク質を構築し得る。別の実施形態において、エフェクター機能をブロックする変異（例えば、相補的なＦｃレセプターの結合のような）（Ａｒｍｏｕｒら、１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：２６１３；Ｍｏｒｇａｎら、１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８６：３１９；Ｌｕｎｄら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７）が、融合タンパク質に組み込まれ得る。
【０１３９】
本発明はまた、ＴＲＡＤＥアゴニスト（模倣物）またはＴＲＡＤＥアンタゴニストのいずれかとして機能する、ＴＲＡＤＥタンパク質の改変体に関する。ＴＲＡＤＥタンパク質の改変体は、変異誘発（例えば、別個の点変異またはＴＲＡＤＥタンパク質の短縮）によって生成し得る。ＴＲＡＤＥタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＴＲＡＤＥタンパク質の生物学的活性と実質的に同じか、またはそのサブセットの活性を維持し得る。ＴＲＡＤＥタンパク質のアンタゴニストは、例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質の細胞活性を競合的に調節することによって、天然に存在する形態のＴＲＡＤＥタンパク質の活性の１つ以上を阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、制限された機能の改変体での処理によって、惹起され得る。１つの実施形態において、天然に存在する形態のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する改変体での、被検体の処置は、天然に存在する形態のＴＲＡＤＥタンパク質での処置と比較して、被験体における副作用がより少ない。１つの実施形態において、本発明は、酸化、還元、または当該分野において公知の他の誘導体化プロセスによって、ＴＲＡＤＥの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変することによって形成され得る、ＴＲＡＤＥの誘導体に関する。
【０１４０】
１つの実施形態において、ＴＲＡＤＥアゴニスト（模倣物）またはＴＲＡＤＥアンタゴニストのいずれかとして機能する、ＴＲＡＤＥタンパク質の改変体は、ＴＲＡＤＥタンパク質の変異体（例えば、短縮変異体）のコンビナトリアルライブラリーを、ＴＲＡＤＥタンパク質のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって、同定され得る。１つの実施形態において、ＴＲＡＤＥ改変体の異型ライブラリーが、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして異型遺伝子ライブラリーによってコードされる。ＴＲＡＤＥ改変体の異型ライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結し、その結果、潜在的なＴＲＡＤＥ配列の変成のセットが、個々のポリペプチドとしてか、またはＴＲＡＤＥ配列のセットを含むより大きな融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイに関して）のセットとして表現可能であるようにすることによって、作製され得る。変性オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＴＲＡＤＥ改変体のライブラリーを作製するために使用され得る、種々の方法が存在する。変性遺伝子配列の化学合成が、自動化ＤＮＡ合成機において実施され得、次いで合成遺伝子が、適切な発現ベクターに連結され得る。遺伝子の変性セットを使用することによって、１つの混合物において、所望のセットの潜在的なＴＲＡＤＥ配列をコードする配列の全てを提供することが、可能となる。変性オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野において公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．，１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８：１０５６；Ｉｋｅら、１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【０１４１】
さらに、ＴＲＡＤＥタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを使用して、ＴＲＡＤＥタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のための、ＴＲＡＤＥフラグメントの異型集団を生成し得る。１つの実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＴＲＡＤＥコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ヌクレアーゼで、ニックが１分子あたり約１回のみ起こる条件下で処理し、この二本鎖ＤＮＡを変性し、このＤＮＡを再生して異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって、再形成した二重鎖から一本鎖部分を除去し、そして得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することによって、生成され得る。この方法によって、ＴＲＡＤＥタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および種々の大きさの内部フラグメントをコードする、発現ライブラリーが誘導され得る。
【０１４２】
点変異または短縮によって作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、いくつかの技術が当該分野において公知である。このような技術は、ＴＲＡＤＥタンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために、適合可能である。高スループット分析に耐え得る、大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技術は、代表的に、この遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングする工程、適切な細胞を得られるベクターのライブラリーで形質転換する工程、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、以下の条件で発現させる工程を包含する：所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件。反復的な集団変異誘発（ＲＥＭ）（ライブラリーにおける機能的な変異体の頻度を増強する技術）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＴＲＡＤＥ改変体を同定し得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　６（３）：３２７−３３１）。
【０１４３】
１つの実施形態において、細胞に基づくアッセイを開発して、異型のＴＲＡＤＥライブラリーを分析し得る。例えば、発現ベクターのライブラリーが、ＴＲＡＤＥを通常合成および分泌する細胞株にトランスフェクトされ得る。次いで、トランスフェクトした細胞が、ＴＲＡＤＥおよび特定の変異ＴＲＡＤＥが分泌されるように培養され、そして細胞上清におけるＴＲＡＤＥ活性に対する変異体の発現の効果が決定され得る（例えば、多数の酵素アッセイのいずれかによって）。次いで、プラスミドＤＮＡが、ＴＲＡＤＥ活性の阻害または相乗作用に関してスコア付けされた細胞から収集され得、そして個々のクローンがさらに特徴付けられる。
【０１４４】
天然に存在するアミノ酸のみからなるＴＲＡＤＥポリペプチドに加えて、ＴＲＡＤＥペプチド模倣物もまた、提供される。ペプチドアナログは、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬物として、製薬産業において通常使用される。これらの型の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（”ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｉｍｅｔｉｃｓ”ｏｒ”ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ”）」と称され（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ　Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，ＴＩＮＳ　３９２頁；ならびにＥｖａｎｓら、１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ　３０：１２２９、これらは、本明細書中に参考として援用される）、そして通常、コンピュータ化された分子モデル化の補助によって開発される。治療的に有用なペプチドと構造が類似しているペプチド模倣物は、等価な治療または予防の効果を生じるために使用され得る。一般に、ペプチド模倣物は、典型的なポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的な活性を有するポリペプチド）（例えば、ヒトＴＲＡＤＥ）と構造的に類似するが、当該分野において公知の方法によって、１つ以上のペプチド結合が、必要に応じて、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群より選択される結合によって置き換えられており、この技術は、以下の参考文献にさらに記載されている：Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，２６７頁（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ　Ｄａｔａ（１９８３年３月），第１巻，Ｉｓｓｕｅ　３、「Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｂａｃｋｂｏｎｅ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」（一般的概説）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．，１９８０，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｃｉ　４６３−４６８頁（一般的概説）；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら、１９７９，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｅｐｔ　Ｐｒｏｔ　Ｒｅｓ　１４：１７７−１８５（−ＣＨ２ＮＨ−，ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．ら、１９８６，Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ　３８：１２４３−１２４９（−ＣＨ２−Ｓ）；Ｈａｎｎ，−Ｍ．Ｍ．１９８２，Ｊ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ　Ｉ　３０７−３１４（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｇ．ら、１９８０，Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　２３：１３９２−１３９８（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．ら、１９８２，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅ，Ｍ．ら、１９８２，欧州出願番号ＥＰ　４５６６５　ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ，Ｍ．Ｗ．ら、１９８３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　２４：４４０１−４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；ならびにＨｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．，１９８２，Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ　３１：１８９−１９９（−ＣＨ２−Ｓ−）；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、−ＣＨ２ＮＨ−である。このようなペプチド模倣物は、ポリペプチドの実施形態より優れた有意な利点（例えば、より経済的な生成、より大きな化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効能、効力など）、変化した特異性（例えば、広いスペクトルの生物学的活性）、減少した抗原性などが挙げられる）を有し得る。ペプチド模倣物の標識は、通常、定量的な構造−活性データおよび／または分子モデル化によって予測された、ペプチド模倣物における非妨害位置に、直接かまたはスペーサー（例えば、アミド基）を介して、１つ以上の標識を共有結合させることを包含する。このような非妨害位置は、一般に、ペプチド模倣物が結合して治療効果を生じる高分子との直接的な接触を形成しない位置である。ペプチド模倣物の誘導体化（例えば、標識）は、そのペプチド模倣物の所望の生物学的活性または薬理学的活性を実質的に妨害しないべきである。
【０１４５】
ＴＲＡＤＥアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸の、同じ型のＤ−アミノ酸での系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）は、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。さらに、ＴＲＡＤＥアミノ酸配列を含む拘束されたペプチドまたは実質的に同一の配列改変体は、当該分野において公知の方法によって生成し得る（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ，１９９２，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７、本明細書中に参考として援用される）；例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成し得る、内部システイン残基を付加することによる。
【０１４６】
本明細書中において同定されるＴＲＡＤＥポリペプチドのアミノ酸配列によって、当業者は、ＴＲＡＤＥペプチド配列およびその配列改変体に対応するポリペプチドを生成し得る。このようなポリペプチドは、原核生物または真核生物の宿主細胞において、ＴＲＡＤＥペプチド配列を頻繁にはより大きなポリペプチドの一部としてコードするポリヌクレオチドの発現によって、生成し得る。あるいは、このようなペプチドは、化学的方法によって合成され得る。組換え宿主における異種タンパク質の発現、ポリペプチドの化学的合成、およびインビトロ翻訳のための方法は、当該分野において周知であり、そしてＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８９），第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．，１９６９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１：５０１；Ｃｈａｉｋｅｎ　Ｉ．Ｍ．，１９８１，ＣＲＣ　Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２５５；Ｋａｉｓｅｒら、１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３：１８７；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２：３４２；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．，１９８８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７；ならびにＯｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．，１９８０，Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（これらは、本明細書中に参考として援用される）にさらに記載されている。
【０１４７】
ペプチドは、代表的に、直接的な化学合成によって生成し得、そして例えば、ＴＲＡＤＥ／ＴＲＡＤＥ結合タンパク質相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして使用され得る。ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端に共有結合によって結合した非ペプチド部分を有する、改変されたペプチドとして生成し得る。特定の好ましい実施形態において、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれか、あるいは両方が、化学的に改変される。末端アミノ基およびカルボキシル基の最も通常の改変は、それぞれアセチル化およびアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）のようなアミノ末端改変、およびアミド化のようなカルボキシ末端改変、ならびに他の末端改変（環化を含む）が、本発明の種々の実施形態に組み込まれ得る。特定のアミノ末端および／またはカルボキシ末端の改変ならびに／あるいはコア配列へのペプチド伸長は、物理的、化学的、生化学的、および薬理学的な有利な特性（例えば、増強した安定性、増加した効能および／または効力、血清プロテアーゼに対する耐性、所望の薬物速度論的特性など）を提供し得る。ペプチドは、疾患を処置するために、治療的に使用され得る（例えば、患者の細胞集団における細胞増殖またはアポトーシスのプロセスを変化させることによって）。
【０１４８】
単離されたＴＲＡＤＥタンパク質、またはその部分もしくはフラグメントはまた、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製のための標準的な技術を使用して、ＴＲＡＤＥを結合する抗体を生成するために、免疫原として使用され得る。全長ＴＲＡＤＥタンパク質が使用され得るか、あるいは本発明は、免疫原として使用するためのＴＲＡＤＥの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＴＲＡＤＥの抗原性ペプチドは、少なくとも８つのアミノ酸残基を含み、そしてＴＲＡＤＥのエピトープを含み、その結果、このペプチドに対して惹起される抗体は、ＴＲＡＤＥと特異的な免疫複合体を形成する。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも１０のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは、少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。
【０１４９】
あるいは、ＴＲＡＤＥポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントは、免疫原として使用され得る。ＴＲＡＤＥポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントは、代表的に、配列番号２または４に示すアミノ酸配列、あるいは別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドのアミノ酸配列の、少なくとも８のアミノ酸残基を含み、そしてＴＲＡＤＥポリペプチドのエピトープを含み、その結果、このペプチドに対して惹起される抗体は、ＴＲＡＤＥ分子と免疫複合体を形成する。抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、ＴＲＡＤＥの、このタンパク質の表面に位置する領域（例えば、親水性領域）である。１つの実施形態において、抗体は、ＴＲＡＤＥ分子に実質的に特異的に結合する。別の実施形態において、抗体はＴＲＡＤＥポリペプチドに特異的に結合する。
【０１５０】
好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも約１０のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも約１５のアミノ酸残基、なおより好ましくは少なくとも約２０のアミノ酸残基、そして最も好ましくは少なくとも約３０のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、ＴＲＡＤＥポリペプチドの、このタンパク質の表面に位置する領域（例えば、親水性領域）であって、ＴＲＡＤＥポリペプチドに独特の領域である。１つの実施形態において、このようなエピトープは、１つの種（例えば、マウスまたはヒト）由来のＴＲＡＤＥタンパク質に対して特異的であり得る（すなわち、種にわたって保存されないＴＲＡＤＥポリペプチドの領域にまたがる抗原性ペプチドが免疫原として使用される；このような非保存的残基は、本明細書中に提供されるもののようなアラインメントを使用して、決定され得る）。タンパク質の標準的な疎水性分析を実施して、親水性領域を同定し得る。
【０１５１】
ＴＲＡＤＥ免疫原は、代表的に、免疫原で適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫することによって、抗体を調製するために使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え的に発現されたＴＲＡＤＥタンパク質または化学的に合成されたＴＲＡＤＥペプチドを含み得る。この調製物は、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバントのようなアジュバント、あるいは類似の免疫刺激剤をさらに含有し得る。適切な被験体の、免疫原性ＴＲＡＤＥ調製物での免疫は、ポリクローナル抗ＴＲＡＤＥ抗体応答を誘導する。
【０１５２】
従って、本発明の別の局面は、抗ＴＲＡＤＥファミリーポリペプチド抗体の使用に関する。このような抗体は、ＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドのアゴニストおよび／またはアンタゴニストとして使用され得る。好ましい実施形態において、抗体は、具体的には、ＴＲＡＤＥαまたはβと認識され、他のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドでないと認識される。ポリクローナル抗−ＴＲＡＤＥ抗体は、ＴＲＡＤＥ免疫原を有する適切な被験体を免疫することによって、上記のように調製され得る。免疫した被験体中の抗−ＴＲＡＤＥ抗体タイターを、例えば、免疫したＴＲＡＤＥポリペプチドを使用する、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いる標準的な技術によって、経時的にモニタリングし得る。所望される場合、ＴＲＡＤＥポリペプチドに対して特異的な抗体分子は、哺乳動物から単離され得、そしてＩｇＧ画分を得るために、タンパク質Ａクロマトグラフィーのような周知の技術によってさらに精製され得る。免疫後の適切な時間に、例えば、抗ＴＲＡＤＥ抗体タイターが最も高い場合に、抗体産生細胞は、被験体から得られ得、そして以下のような標準的な技術によってモノクローナル抗体を調製するために使用され得る：ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって本来記述されたハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７）（Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８１，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａＬ，１９８０，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９７６，Ｐｒｏｄ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７６：２９２７−３１；およびＹｅｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９８２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　２９：２６９−７５をまた参照のこと）、より最新のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７．９６）またはトリオーマ技術。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するための技術は、周知である（一般に、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ，１９８１，Ｙａｌｅ　Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９７７，Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ．，３：２３１−３６を参照のこと）。簡潔には、不死細胞株（代表的には、黒色腫）は、上記のようなＴＲＡＤＥ免疫原を用いて免疫した哺乳動物からリンパ球（代表的に脾細胞）に融合され、そして得られたハイブリドーマ細胞の培地上清をスクリーニングし、ＴＲＡＤＥポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０１５３】
リンパ球および免疫した細胞株を融合するために使用される任意の多くの周知のプロトコールは、抗ＴＲＡＤＥモノクローナル抗体を産生する目的のために適用され得る（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９７７，Ｎａｔｕｒｅ　２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ．，（上述）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ　Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，（上述）；Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（上述））。さらに、当業者は、有用であるこのような方法の多くの改変体が存在することを理解する。代表的に、不死の細胞株（例えば、黒色腫細胞株）は、リンパ球として同一の哺乳動物種から誘導される。例えば、マウスのハイブリドーマは、不死化マウス細胞株を有する本発明の免疫原調製物を用いて免疫したマウスからリンパ球を融合することによって達成され得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノタンパク質およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含む細胞培地に対して感受性であるマウス黒色腫細胞株である。任意の複数の黒色腫細胞株は、標準的な技術に従って融合パートナーとして使用され得る（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４黒色腫株）。これらの黒色腫株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，Ｍｄから利用可能である。代表的に、ＨＡＴ感受性マウス黒色腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾細胞に融合される。次いで、この融合から得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を使用して選択し、これにより、非融合黒色腫細胞および非生産的な融合黒色腫細胞（形質転換していないので、死の数日後の非融合脾細胞）を死滅させる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用するＴＲＡＤＥ分子と結合する抗体に関して、ハイブリドーマ培地上清をスクリーニングすることによって検出する。
【０１５４】
モノクローナル抗体−スクリーニングハイブリドーマを調製するための代わりとして、モノクローナル抗−ＴＲＡＤＥ抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ）をＴＲＡＤＥを用いてスクリーニングすることによって、同定および単離して、これにより、ＴＲＡＤＥポリペプチドと結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離し得る。ファージディスプレイライブラリを生成およびスクリーニングするためのキットは、市販されている（ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｈａｇｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ．２７−９４００−０１；およびｔｈｅ　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ　Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｋｉｔ，Ｃａｔａｌｏｇ　Ｎｏ．２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリを生成およびスクリーニングするのに使用するために特に受け入れ可能な方法および薬剤の例としては、例えば、以下に見出され得る：Ｌａｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．国際特許出願ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ．国際特許出願ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．国際特許出願ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．国際特許出願ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．国際特許出願ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ．国際特許出願ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．国際特許出願９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．国際特許出願ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ　ｅｔ　ａｌ．１９９２，Ｈｕｍ　Ａｎｔｉｂｏｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　３：８１−８５；Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ．１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　ｅｔ　ａｌ．１９９３，ＥＭＢＯ　Ｊ　１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ　ｅｔ　ａＬ，１９９２，Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ　３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ　１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ　３４８：５５２−５５４。
【０１５５】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む、組換え抗−ＴＲＡＤＥ抗体（例えば、キメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体）（これは、組換えＤＮＡの標準的な技術を使用して作製される）は、本発明の範囲内である。このようなキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、例えば、以下に記載される方法を使用して、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって産生され得る：Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ，ｅｔ　ａｌ．欧州特許出願１８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願１７１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．欧州特許出願１７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ．米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ．欧州特許出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９．３５２１−３５２６；Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ　米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１９８８，Ｊ　Ｉｉｎｉｎｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０。
【０１５６】
さらに、ヒト化抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に記載されるもののような標準的なプロトコールに従って作製され得る。別の実施形態において、抗体鎖または特定の結合対メンバーは、特定の結合対メンバーのポリペプチド鎖の融合物をコードする核酸分子を含むベクターと、当該分野で公知の技術（米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，８７１，９０７号、または同第５，７３３，７４３号）を使用する単結合対メンバーの第２ポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターとの間で、組換えによって産生され得る。
【０１５７】
抗−ＴＲＡＤＥ抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用して、標準技術（例えば、親和性クロマトグラフィーまたは免疫沈降）によるＴＲＡＤＥポリペプチドを単離し得る。抗ＴＲＡＤＥ抗体は、細胞からの天然のＴＲＡＤＥポリペプチドの精製および宿主細胞中で発現された組換えにより産生されたＴＲＡＤＥポリペプチドの精製を容易にし得る。さらに、抗ＴＲＡＤＥ抗体を使用して、ＴＲＡＤＥタンパク質（細胞溶解物または細胞上清）を検出し得る。検出は、抗体を検出可能な物質に結合する（例えば、物理学的に連結する）ことにより容易となり得る。従って、１実施形態において、本発明の抗ＴＲＡＤＥは、検出可能な物質で標識され得る。検出可能な例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシラーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソシオシアネート、ローダミン、ジクロロチロアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；そして放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０１５８】
従って、１実施形態において、抗ＴＲＡＤＥ抗体を、例えば、細胞内でタンパク質の活性を阻害するために使用し得る。細胞内でタンパク質の機能を阻害するための細胞内抗体の使用は、当該分野で公知である（例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２６３８−２６４６；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，１９９０，ＥＭＢＯ　Ｊ．９：１０１−１０８；Ｗｅｒｇｅ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ，１９９０，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２７４：１９３−１９８；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：７４２７−７４２８；Ｍａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：７８８９−７８９３；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１２：３９６−３９９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：５９５−６０１；Ｄｕａｎ，Ｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：５０７５−５０７９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：５９３２−５９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３９３１−２３９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：６６６−６７２；Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，Ａ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯ　Ｊ．１４：１５４２−１５５１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．），１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：３１３７−３１４１；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０２６１０（Ｍａｒａｓｃｏ　ｅｔ　ａｌ．；およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／０３８３２（Ｄｕａｎ　ｅｔ　ａｌ．））。
【０１５９】
１実施形態において、抗体さをコードする組換え発現ベクターが、調製され、細胞中へのベクターの導入の際に、この抗体は、細胞の細胞内コンパートメント中の機能的抗体として発現される。本発明の阻害方法に従ってＴＲＡＤＥ活性の阻害のために、ＴＲＡＤＥタンパク質と特異的に結合する細胞内抗体は、細胞の細胞質中で発現される。細胞内抗体の発現ベクターを調製するために、目的の標的タンパク質（例えば、ＴＲＡＤＥ）に対して特異的な抗体鎖をコードする、抗体の軽鎖および重鎖ｃＤＮＡが、ＴＲＡＤＥタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマから代表的に単離される。抗ＴＲＡＤＥモノクローナル抗体または組換え抗ＴＲＡＤＥモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、上記のように調製され得る。一旦、ＴＲＡＤＥタンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体（例えば、ハイブリドーマ由来モノクローナル抗体またはコンビナトリアルライブラリ由来の組換え抗体）が、同定されると、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが、標準的な分子生物学技術によって単離される。ハイブリドーマ由来の抗体に関して、軽鎖ｃＤＮＡおよび重鎖ｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡライブラリスクリーニングによって得られ得る。組み合わせ抗体に関して、例えば、ファージディスプレイライブラリより、軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、ライブラリスクリーニングプロセスの間に単離されるディスプレイパッケージ（例えば、ファージ）から回収され得る。ＰＣＲプライマーまたはｃＤＮＡライブラリのプローブが調製され得る、抗体の軽鎖および重鎖遺伝子のヌクレオチド配列は、当該分野で公知である。例えば、このような多くの配列は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ−６３−Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ．９１−３２４２に開示されている。
【０１６０】
一旦得られると、抗体の軽鎖および重鎖配列は、標準方法を使用して、組換え発現ベクター中にクローニングされる。軽鎖および重鎖の細胞質発現を可能にするために、軽鎖および重鎖の疎水性リーダーをコードするヌクレオチド配列が、除去される。細胞内抗体の発現ベクターは、いくつかの異なる形態の一つで細胞内抗体をコードし得る。例えば、１実施形態において、このベクターは、全長抗体が細胞内で発現されるように、全長抗体の軽鎖および重鎖をコードする。別の実施形態において、このベクターは、全長軽鎖（しかし、重鎖はＶＨ／ＣＨ１領域のみ）をコードし、Ｆａｂフラグメントは、細胞内で発現される。最も好ましい実施形態において、このベクターは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）をコードし、ここで、軽鎖および重鎖の可変領域は、可撓性ペプチドリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）によって連結され、そして単鎖分子として発現される。細胞中でＴＲＡＤＥ活性を阻害するために、この抗ＴＲＡＤＥ細胞内交代をコードする発現ベクターは、本明細書に記載されるように、標準的なトランスフェション方法によって細胞内に導入される。
【０１６１】
本発明の抗体または抗体部分は、別の機能分子（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）に誘導体化または連結され得る。従って、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載される抗ＴＲＡＤＥ抗体の誘導体化形態および他の改変形態を含むことが意図され、これには、例えば、他の分子に結合する抗体（例えば、他の細胞マーカーに結合する抗体またはポリペプチド）が挙げられる。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、１以上の分子実体（例えば、別の抗体（例えば、二特異的な抗体またはジアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ））、検出可能な因子、細胞毒性因子、薬学的因子、および／または別の分子（例えば、ストレプトアビジンもしくはポリヒスチジンタグ）と抗体もしくは抗体部分との結合を媒介するタンパク質もしくはペプチド）に機能的に（例えば、化学的結合、遺伝子的融合、非共有結合などにより）連結され得る。
【０１６２】
誘導体化された抗体の１つの型は、例えば、二特異的抗体を作製するために、２以上の抗体（同一の型または異なる型の抗体）を架橋することによって産生される。適切な架橋剤としては、適切なスペーサーによって分離される２個の明確な反応基を有するヘテロ二特異的な架橋剤（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二特異的な架橋剤（例えば、ジスクリンイミジルスベリン酸塩）が挙げられる。このようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから市販されている。
【０１６３】
本発明の抗体または抗体部分が誘導体化され得る有用な検出可能な因子は、蛍光性化合物を含む。例示的な蛍光性検出可能因子としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、ピコエリトリンなどが挙げられる。抗体はまた、検出可能な酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなど）を用いて誘導体化され得る。抗体が検出可能な酵素を用いて誘導体化される場合、検出可能な反応産物を産生するために使用するさらなる試薬を添加することによって検出される。例えば、検出可能な薬剤であるホースラディシュペルオキシダーゼが存在する場合に、過酸化水素およびジアミノベンジンの添加により、検出可能である染色された反応産物に導く。抗体はまた、ビオチンを用いて誘導体化され得、そしてアビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的な測定を介して検出される。
【０１６４】
１実施形態において、抗−ＴＲＡＤＥ抗体を使用して、ＴＲＡＤＥ分子を発現する細胞を標的する。例えば、ＴＲＡＤＥファミリー分子を認識する抗体、または単一のＴＲＡＤＥファミリー分子（別のＴＲＡＤＥ分子ではない）を特異的に認識する抗体（例えば、ＴＲＡＤＥβを認識する抗体）が、使用され得る。１実施形態において、このような抗体および毒素を含む、抗体−毒素結合体を使用して、ＴＲＡＤＥファミリーまたは特定のＴＲＡＤＥ分子を有する細胞を（例えば、切断によって）使い果たし得る。好ましい実施形態において、抗ＴＲＡＤＥ免疫毒性を使用して、腫瘍細胞を（例えば、インビボまたはエキソビボにおいて）標的し得る。本明細書中で使用される場合、用語「毒素」は、細胞に対して毒性である分子（例えば、化学療法剤および細胞毒素）を含むことを意味する。
【０１６５】
広範の毒素は、当該分野で公知であり、そして本発明の抗体に結合され得る（ＨｅｒｔｌｅｒおよびＦｒａｎｋｅｌ、１９８９、Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ．７：１９３２−１９４２を参照のこと）。例えば、毒素は、内在化なしで細胞膜を分裂させ、毒素は、非特異的な機構を介して内在化され得るか、または例えば、細胞において特定のレセプターとの直接的な相互作用によって、特異的に内在化され得る。特許請求される発明の使用のための毒素は、例えば、天然に存在するか、合成され得る。毒素は、タンパク質様または非タンパク質様（例えば、オリゴサッカリド）であり得る。例としては、多数の有用な、植物、真菌またはさらに細菌誘導毒素を含み、これには、種々のＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖、タンパク質を活性化するリボソーム（例えば、サポリンまたはゲロニン）、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ（例えば、胎盤リボヌクレアーゼ）、血管形成毒素、ジフテリア毒素、およびシュードモナスエキソトキシン、ならびにカリヘアマイシンが挙げられ、そして以下でより詳細に議論される。
【０１６６】
例えば、１実施形態において、例示的な毒素は、「リボソーム不活性タンパク質（ＲＩＰ）」を含み、定義によると、リボソーム翻訳機構を直接的に阻害し得る。ヘテロダイマーペプチドリシンは、トウゴマ植物（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）から誘導され、そしてこのような毒素の例である。リシンの毒素活性は、そのサブユニット（リシンＡ鎖）の一つにおいて、全体的に見出される。１実施形態において、特許請求される本発明に使用される毒素は、毒素分子の活性サブユニットである。リシンＡ鎖は、２８Ｓ　ｒＲＮＡの位置４３２４において、単一のアデニンを特異的に脱プリン化することによってリボソームの機能を不活性化すると考えられている（Ｃｈｅｎら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７：１１６０５、Ｋｏｅｈｌｅｒら、１９９４、Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　１３：５７１−５７５；Ｄｕｋｅ−Ｃｏｈａｎｒａ，１９９３，Ｂｌｏｏｄ，８２：２２２４−３４）。別の二連のＲＩＰ毒素は、アブリンであり、これは、ジェクイリティービーン（ｊｅｑｕｉｔｉｒｙ　ｂｅａｎ）（Ａｂｒｕｓ　ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓ）から誘導され、そしてリシンＡと同一の機構によってタンパク質翻訳を不活性化することで知られている（Ｋｒｕｐａｋａｒら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ３３８：２７３−２７９）。本発明と関連して使用され得る他のＲＩＰは、植物毒性サポリンおよびゲロニンを含む。微生物Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ由来のＳｈｉｇａＡ毒素はまた、カビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（Ｌａｃａｄｅｎａら、１９９９、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３７：４７４−４８４）由来のサルシンＡ毒素のように、ＲＩＰとして機能する（Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．Ｅ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１：５９−６４）。リシンＡおよび同様の毒素を含む、抗体−毒素結合体は、米国特許第４，５９０，０１７号、同４，９０６，４６９号、同４，９１９，９２７号、および５，９８０，８９６号において先に記載されている（これらは、本明細書中で参考として援用されている）。
【０１６７】
タンパク質延長因子２（ＥＦ−２）（例えば、細菌性ジフテリア毒素（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ由来））をＡＤＰリボシル化し、そしてタンパク質合成を阻害する毒素（Ｆｏｌｅｙら、１９９５、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，２７０：２３２１８−２３２２５）はまた、本発明の抗体−毒素結合体において使用され得る。ＥＦ−２をＡＤＰリボシル化する抗体−毒素結合体（ジフテリア毒素または関連の毒素を含む）は、例えば、米国特許第４，５４５，９８５号において以前に記載されている。
【０１６８】
他のタンパク質毒素は、微小管機能を妨害し、従って、有糸分裂の停止を引き起こすことにより、真核生物細胞死をもたらし得る（Ｉｗａｓａｋｉ、１９９８，Ｙａｋｕｇａｋｕ　Ｚａｓｓｈｉ　１１８：１１２−１２６）。このような毒素の例は、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）化合物であり（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２０：５３−５９）、これは特定のコケ（例えば、ｍａｙｔｅｎｕｓ　ｂｕｃｈａｎａｎｉｉ；Ｌａｒｓｏｎら、１９９９、Ｊ．ｏｆ　Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．６２：３６１−３６３を参照のこと）において見出される。メイタンシノイドを含む抗体−毒素結合体は、米国特許第５，２０８，０２０号において以前に記載されている。
【０１６９】
さらに他の毒素は、アデニル酸シクラーゼｃＡＭＰ系を活性化し得、膜を通るアニオンおよびカチオンの制御されていない輸送を生じる。このタイプの毒素の例は、Ｖｉｂｒｉｏ　Ｃｈｏｌｅｒａｅ由来のコレラ毒素（流動分泌および腸細胞の出血を生じ得る微生物）（ｄｅ　Ｈａａｎら、１９９８　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，７６：２７０−２７９）である。
【０１７０】
細菌性百日咳毒素（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来）は、サイトカインおよびホルモンレセプターにより刺激される複合体を含む真核生物Ｇタンパク質複合体（多くの細胞外シグナル経路の形質転換において重要なエレメント）を特異的に標的化し得る。この百日咳毒素は、Ｇタンパク質複合体のサブユニットをＡＤＰリボシル化し、その制御活性の解放を生じ得る（ＬｏｃｈｔおよびＡｎｔｏｉｎｅ、１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７７：３３３−３４０）。
【０１７１】
一実施形態において、本発明の抗体−毒素結合体において使用するための毒素は、オリゴ糖である。例えば、このオリゴ糖カリチェアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）は、ＤＮＡの浅い方の溝に優勢に結合する炭水化物のクラスの１つとして同定された細菌産物である（Ｋａｈｎｅ，１９９５，Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ，２：７−１２）。カルチェアマイシンは、ＤＮＡデオキシリボース基の４’炭素から水素原子を非特異的に取り出し、正常な細胞修復機構に対して抵抗性の末端３’ホスホグリコレート基を有する二重鎖ＤＮＡ切断物を生じることが知られている（Ｃｈａｕｄｈｒｙら、１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５７：５３１−５３８）。カリチェアマイシンは、本発明と共に使用するために好ましい毒素部分である。抗体のカルチェアマイシン結合体が記載されている（Ｓｉｅｖｅｒｓら、１９９９，Ｂｌｏｏｄ，９３：３６７８−３６８４；Ｌｏｄｅら、１９９８，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８：２９２５−２９２８）。他の合成細胞障害性化合物（例えば、ＣＣ−１０６５）は、カルチェアマイシンと類似のＤＮＡ断片化機構を有し、そしてまた当該分野で公知である（ＧｕｎｚおよびＮａｅｇｅｌｉ、１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５２：４４７−４５３）。カルチェアマイシンがジスルフィド結合を介して抗体に共有結合される、抗体−毒素結合体は、米国特許第５，７７３，００１号および同第５，７３９，１１６号において以前に記載されている。
【０１７２】
別の代表的なクラスの毒素は、真核生物膜内に致死的な穴を形成し、従ってエンドサイトーシス内部移行の必要なく、細胞死を生じ得る細菌性毒素である。アエロリシン（ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）は、このような毒素の一例である。アエロリシンは、細胞表面に結合すると、膜を通して肝臓癌チャネルを形成し得る（Ｐａｒｋｅｒら、１９９６　Ｍｏｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１９：２０５−２１２；Ｂｕｃｋｌｅｙ，１９９１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ　４７：４１８−４１９）。エアロリシンを含む細胞結合体は、米国特許第５，８２４，７７６号および同第５，８１７，７７１号において以前に記載されている。
【０１７３】
毒素の活性が、抗体が細胞に結合した際に適切に送達されるように、毒素を抗体に結合するための多数の方法が、当該分野で公知である（ＧｈｏｓｅおよびＢｌａｉｒ，１９８７，Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｔｈｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔ，３：２６３−３５９；ＨｅｒｍｅｎｔｉｎおよびＳｅｉｌｅｒ，１９８８，Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．，８２：１９７−２１５）。例えば、細胞傷害因子がタンパク質であり、第２の成分がインタクトな免疫グロブリンである場合、この結合は、ヘテロ二官能性架橋（例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなど）により得る。様々な免疫毒素の産生は、当該分野で周知であり、そして例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｉｍｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍａｇｉｃ　Ｂｕｌｌｅｔ」、Ｔｈｏｒｐｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１６８−１９０頁（１９８２）（これは本明細書中で参考として援用される）に見出され得る。これらの成分はまた、遺伝学的に結合され得る（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３９４（これは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０１７４】
例えば、一実施形態において、共有結合は抗体と毒素との間に形成され得る。いくつかの場合において、毒素の現存の細胞結合部分は初めに、その非特異的活性を抑制するように除去または変更されるべきである（ＨｅｒｔｌｅｒおよびＦｒａｎｋｅｌ、１９８９，Ｊ．Ｃｌｉｎ　Ｏｎｃｏｌ　７：１９３２−１９４２）。毒素に対する抗体の共有結合は、一般的に、チオエステル結合またはジスルフィド結合の形成を包含する。例えば、結合化合物は、Ｎ−スクシンイミジル−３−２（ピリジルジチオ）プロピオネートを使用することによって調製され得、これは、抗体と毒素との間のジスルフィド結合を生成し得る（Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉら、１９８３，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３１：３０９１−３０９５）。リンカーを含む多数のタイプのジスルフィド結合が公知であり、この結合は、毒素部分をポリペプチドに結合するために首尾良く用いられ得る。一実施形態において、インビボにおいてより大きな安定性を有し、従って、作用部位における結合の前の毒素部分の放出を防止することに起因して、立体的に「妨害された」ジスルフィド結合を含むリンカーが好ましい。これらの間に共有結合を形成する他の方法は、米国特許第４，８９４，４４３号、同第５，２０８，０２１号、同第４，３４０，５３５号およびＥＰ　４４１６７に記載される。
【０１７５】
本発明の別の局面は、新規のＴＲＡＤＥモジュレーターの同定に関する。多くの技術が当該分野で公知であり、そして新規のモジュレーターを同定するために使用され得る。例えば、ゲル電気泳動を使用する移動度シフトＤＮＡ結合アッセイは、粗抽出物中の配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の検出のための、簡単で、迅速な非常に高感度な方法である。このアッセイはまた、ＤＮＡ結合タンパク質の親和性、存在比、会合速度定数、解離速度定数および結合特異性の定量的決定を可能にする。末端標識ＤＮＡフラグメントに特異的に結合するタンパク質は、電気泳動の間にフラグメントの移動度を遅らせ、個々のタンパク質−ＤＮＡ複合体に対応する別個のバンドを生じる。簡単には、特定のタンパク質結合部位を含む本発明の末端標識ＤＮＡプローブは、タンパク質混合物に結合され、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、これは次いで、乾燥され、そしてオートラジオグラフにかけられる。
【０１７６】
（ＩＶ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ベクター、好ましくは、ＴＲＡＤＥタンパク質（またはその一部）をコードする核酸を含む、発現ベクターに関する。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で本発明の核酸を含み、これは、この組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味し、これは発現される核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクター内において、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列（単数または複数）に連結されていることを意味する（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される場合には、宿主細胞において）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが当業者によって理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それにより、本明細書中で記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質、ＴＲＡＤＥタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
【０１７７】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＴＲＡＤＥタンパク質またはタンパク質フラグメントの発現のために設計され得る。例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡでさらに議論される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１７８】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最も頻繁に行われる。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、ここでコードされるタンパク質、通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現の増加；２）組換えタンパク質の溶解性の増加；および３）親和性精製においてリガンドとして作用することによる組換えタンパク質の精製の補助。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組み替えタンパク質を分離することを可能にするために、タンパク質分解切断部位が融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入される。このような酵素、およびそれらの同族認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，１９８８，Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を融合するｐＲＩＴ５（Ｐａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａ（それぞれ、標的タンパク質に対する）が挙げられる。
【０１７９】
精製された融合タンパク質は、例えば、ＴＲＡＤＥ活性アッセイ（例えば、直接アッセイまたは以下に詳述される競合アッセイ）において、またはＴＲＡＤＥタンパク質に特異的な抗体を作製するために使用され得る。
【０１８０】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、１９８８，Ｇｅｎｅ　６９：３０１−３１５）、およびｐＥＴ　１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、１９９０，Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，６０−８９）が挙げられる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合タンパク質からの宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写に依存する。ｐＥＴ　１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７　ｇｎ１）により媒介されるＴ７　ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ　５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７　ｇｎ１遺伝子を含む常在性プロファージ由来の宿主株のＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【０１８１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大にするための１つの方法は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する障害性能力を有する宿主細菌においてタンパク質を発現することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，１９９０，Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５，Ａｃｅｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１１９−１２８）。別の方法は、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を、各アミノ酸の個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優勢に利用されるように変更することである（Ｗａｄａら、１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１９）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって行われ得る。
【０１８２】
別の実施形態において、ＴＲＡＤＥ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら，１９８７，Ｅｍｂｏ　Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２，Ｃｅｌｌ　３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７，Ｇｅｎｅ　５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびｐｉｃＺ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
【０１８３】
あるいは、ＴＲＡＤＥタンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞において発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ　９細胞）におけるタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈら、１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）、およびｐＶＬ系（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１８４】
さらに別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７，ＥＭＢＯ　Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用する場合、この発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方に適切な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．の第１６および１７章、ならびにＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと。
【０１８５】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントは、核酸を発現するために使用される）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ球特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ，１９８８，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプターのロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９，ＥＭＢＯ　Ｊ．８：７２９−７３３）、および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３，Ｃｅｌｌ　３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３，Ｃｅｌｌ　３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：９１２−９１６）、ならびに哺乳動物腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６および欧州出願公開第２６４，１６６）が挙げられる。発生的に調節されたプロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３７４−３７９）およびαフェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ，１９８９，Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．３：５３７−５４６））もまた包含される。
【０１８６】
あるいは、ＴＲＡＤＥポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞において発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、Ｓｆ　９細胞）におけるタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈら、１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬ系（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．；１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７０：３１−３９）が挙げられる。
【０１８７】
さらに別の実施形態において、本発明の核酸分子は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ　３２９：８４０）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎｒａ，１９８７，ＥＭＢＯ　Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来である。
【０１８８】
さらに、哺乳動物細胞において使用するための以下の誘導性調節系が、当該分野で公知である：例えば、遺伝子発現が重金属イオン（例えば、Ｍａｙｏら、１９８２，Ｃｅｌｌ　２９：９９−１０８；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２，Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２；Ｓｅａｒｌｅら、１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９を参照のこと）、熱ショック（例えば、Ｎｏｕｅｒら、１９９１，Ｈｅａｔ　Ｓｈｏｃｋ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１６７−２２０頁を参照のこと）、ホルモン（例えば、Ｌｅｅら、１９８１，Ｎａｔｕｒｅ　２９４：２２８−２３２；Ｈｙｎｅｓら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：２０３８−２０４２；Ｋｌｏｃｋら、１９８７，Ｎａｔｕｒｅ　３２９：７３４−７３６；ＩｓｒａｅｌおよびＫａｕｆｍａｎ，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４；およびＰＣＴ公開ＷＯ　９３／２３４３１を参照のこと）、ＦＫ５０６関連分子（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ　９４／１８３１７を参照のこと）またはテトラサイクリン（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：２２４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら、１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６８：１７６６−１７６９；ＰＣＴ公開ＷＯ　９４／２９４４２；およびＰＣＴ公開ＷＯ　９６／０１３１３を参照のこと）によって調節される系。従って、別の実施形態において、本発明は、ＴＲＡＤＥ　ＤＮＡが誘導性真核生物プロモーターに作動可能に連結された組換え発現ベクターを提供し、それにより、真核生物細胞におけるＴＲＡＤＥタンパク質の誘導性発現を可能にする。
【０１８９】
本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクター中にクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、このＤＮＡ分子は、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の（このＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。アンチセンス配向でクローン化された核酸に作動可能に連結された調節配列が選択され得、これらは、種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指向する。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的または細胞型特異的な発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得、ここでアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ　ａｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第１巻（１）　１９８６を参照のこと。
【０１９０】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中において交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変が継承世代において起こり得るので、このような子孫は、実際、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書において使用される場合の用語の範囲内には含まれる。
【０１９１】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１９２】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術により原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、種々の当該分野で認識される、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための技術（リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む）をいうことが意図される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェエクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、およびその他の実験マニュアルに見出され得る。
【０１９３】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランフェクション技術に依存して、わずかな細胞しか外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込まないことが公知である。これらの構成要素を同定かつ選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般的に目的の遺伝子と共に宿主細胞中に導入される。好ましい選択マーカーとしては、薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン（ｈｙｄｒｏｍｙｃｉｎ）およびメトトレキサート）に対する耐性を付与する選択マーカーが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、ＴＲＡＤＥタンパク質をコードするベクターと同じベクターで宿主細胞中に導入され得るかまたは別個のベクターで導入され得る。導入された核酸で安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択により同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、他の細胞は死ぬ）。
【０１９４】
培養物中の本発明の宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）を使用して、ＴＲＡＤＥタンパク質を産生（すなわち、発現）し得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＴＲＡＤＥタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、本発明の宿主細胞（この細胞にＴＲＡＤＥタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、適切な培地中で培養する工程を包含し、その結果ＴＲＡＤＥタンパク質が産生される。別の実施形態において、この方法は、この培地または宿主細胞からＴＲＡＤＥタンパク質を単離する工程をさらに包含する。
【０１９５】
本発明の特定の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を産生し得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＴＲＡＤＥコード配列が導入されている、受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いでこのような宿主細胞を使用して、外因性ＴＲＡＤＥ配列がそのゲノムに導入されている非ヒトトランスジェニック動物、または内因性ＴＲＡＤＥ配列が変更されている相同組換え動物を作製し得る。このような動物は、ＴＲＡＤＥポリペプチドの機能および／または活性を研究するため、およびＴＲＡＤＥ活性のモジュレータを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）であり、ここでこの動物の１つ以上の細胞が、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み込まれ、かつ成熟動物のゲノムに残っている外因性ＤＮＡであり、それにより、このトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織におけるコードされる遺伝子産物の発現が指向される。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」は、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはマウスであり、この動物において、内因性ＴＲＡＤＥ遺伝子は、内因性遺伝子とこの動物の発生の前にこの動物の細胞（例えば、この動物の胎児性細胞）中に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えにより変更されている。
【０１９６】
本発明のトランスジェニック動物は、ＴＲＡＤＥをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核に、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により導入し、そしてその卵母細胞を偽妊娠雌性代理動物において発生させることにより作製され得る。配列番号１または３のＴＲＡＤＥ配列、別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドもしくはその部分をコードする核酸分子は、非ヒト動物のゲノム中に導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ＴＲＡＤＥ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＴＲＡＤＥ遺伝子またはラットＴＲＡＤＥ遺伝子）は、導入遺伝子として使用され得る。あるいは、ＴＲＡＤＥ遺伝子ホモログ（例えば、別のＴＲＡＤＥファミリーメンバー）は、配列番号１もしくは３のＴＲＡＤＥファミリーｃＤＮＡ配列または別のＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、この導入遺伝子に含まれて、導入遺伝子の発現効率を増加させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、ＴＲＡＤＥ導入遺伝子に作動可能に連結されて、ＴＲＡＤＥたんぱく質の発現を特定の細胞に指向する。胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物（特にマウスのような動物）を作製するための方法は、当該分野で慣例となっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号（両方ともＬｅｄｅｒらによる）、米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒらによる）ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）に記載される。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の産生のために使用される。トランスジェニック創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、そのゲノムにおけるＴＲＡＤＥ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞におけるＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡ発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック創始動物を使用して、導入遺伝子を保有するさらなる動物を生産し得る。さらに、ＴＲＡＤＥタンパク質をコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を保有するほかのトランスジェニック動物へとさらに育成され得る。
【０１９７】
相同組換え動物を作製するために、ＴＲＡＤＥ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターが調製され、このＴＲＡＤＥ遺伝子には、欠失、付加または置換が導入されて、それによりＴＲＡＤＥ遺伝子を変更（例えば、機能的に破壊する）する。例えば、マウスＴＲＡＤＥ遺伝子を使用して、マウスゲノムにおける内因性ＴＲＡＤＥ遺伝子を変更するために適切な相同組換えベクターを構築し得る。好ましい実施形態において、ベクターは、相同組換えの際に、内因性ＴＲＡＤＥ遺伝子が機能的に破棄されるように（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）設計される。あるいは、ベクターは、相同組換えの際に、内因性ＴＲＡＤＥ遺伝子が変異誘発されるか、そうでなければ変更されるが機能的タンパク質をなおコードするように設計され得る（例えば、上流調節領域を変更してそれにより内因性ＴＲＡＤＥタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＴＲＡＤＥ遺伝子の変更された部分は、ＴＲＡＤＥ遺伝子のさらなる核酸配列によりその５’末端および３’末端に隣接されて、相同組換えを、胚性幹細胞においてベクターにより運ばれる外因性ＴＲＡＤＥ遺伝子と内因性ＴＲＡＤＥ遺伝子との間で起こさせる。さらなる隣接ＴＲＡＤＥ核酸配列は、内因性遺伝子との首尾良い相同組換えのために十分な長さである。代表的には、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方）がこのベクターに含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明については、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，１９８７，Ｃｅｌｌ　５１：５０３を参照のこと）。ベクターは胚性幹細胞株中に（例えば、エレクトロポレーションにより）導入され、そしてこの導入されたＴＲＡＤＥ遺伝子が内因性ＴＲＡＤＥ遺伝子と相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ら，１９９２，Ｃｅｌｌ　６９：９１５を参照のこと）。選択された細胞は、次いで動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入されて凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）１１３−１５２頁を参照のこと）。キメラ胚は、次いで適切な偽妊娠雌性代理動物中に移植され得、そしてその胚が分娩される。その生殖細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、導入遺伝子の生殖細胞系伝達により、その動物の全ての細胞が相同組換えＤＮＡを含む動物を育て得る。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築するための方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．，１９９１，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２：８２３−８２９ならびにＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ　９０／１１３５４（Ｌｅ　Ｍｏｕｅｌｌｅｃら）；ＷＯ　９１／０１１４０（Ｓｍｉｔｈｉｅｓら）；ＷＯ　９２／０９６８（Ｚｉｊｌｓｔｒａら）；およびＷＯ　９３／０４１６９（Ｂｅｒｎｓら）にさらに記載される。
【０１９８】
前述に加えて、当業者は、相同組換えについての当該分野で公知の他のアプローチが本発明に適用され得ることを理解する。酵素補助部位特異的組込み系は、当該分野で公知であり、そしてＤＮＡ分子を第２の標的ＤＮＡ分子における所定の位置にＤＮＡ分子を組み込むため適用され得る。このような酵素補助組込み系の例としては、以下が挙げられる：Ｃｒｅ　リコンビナーゼ−ｌｏｘ標的系（例えば、Ｂａｕｂｏｎｉｓ，Ｗ．ａｎｄ　Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：２０２５−２０２９；およびＦｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．およびＳａｕｅｒ，Ｂ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：７９０５−７９０９に記載される）およびＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ標的系（例えば、Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．およびＰｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．，１９９２，Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３６７−３７５；ならびにＦｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．ら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：８４６９−８４７３に記載される）。テトラサイクリン調節誘導相同組換え系（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２９４４２およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０１３１３に記載される）もまた、使用され得る。
【０１９９】
例えば、別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含むトランスジェニック非ヒト動物が、産生され得る。このような系の一例は、ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系のバクテリオファージＰ１である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えば、Ｌａｋｓｏら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質との両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要とされる。このような動物は、例えば、２つのトランスジェニック動物（一方は、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む）を交配することによる「二重（ｄｏｕｂｌｅ）」トランスジェニック動物の構築により提供され得る。
【０２００】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ　３８５：８１０−８１３ならびにＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載される方法に従って産生され得る。手短に言うと、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）が単離され得、そして増殖周期を終了し、そしてＧＯ期に入るように誘導され得る。次いで、休止細胞は、例えば、電気パルスの使用により、その休止細胞が単離された動物と同じ種由来の摘出された卵母細胞に融合され得る。次いで、再構築された卵母細胞は、培養され、その結果その細胞は、桑実胚または未分化胚芽細胞へと発達し、次いで偽妊娠雌性代理動物に移される。この雌性代理動物由来の子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
【０２０１】
（他のＴＲＡＤＥ調節因子の同定）
本発明は、モジュレータ（すなわち、候補化合物もしくは試験化合物または因子（例えば、ペプチド、ペプチドミメティック、低分子またはその他の薬物））を同定するための方法（本明細書中では「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供し、このモジュレータは、ＴＲＡＤＥを調節（例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質に結合）し得、例えば、ＴＲＡＤＥ発現またはＴＲＡＤＥ活性に対して刺激効果または阻害効果を有する。さらに、アッセイは、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイを使用して、ＴＲＡＤＥ発現または活性に対するＴＲＡＤＥモジュレータの効果を試験するため（例えば、アポトーシスまたは発現が細胞特異的な状況で所望の方向に調節されるか否かを決定するため）に使用され得る。
【０２０２】
本発明の試験化合物は、当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数のアプローチのいずれかを使用して得られ得る。これらのライブラリーとしては、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並行固相または溶液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、その他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２０３】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において例えば、ＤｅＷｉｔｔら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｎｃｉ．ＵＳＡ　９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら，１９９４，Ｊ　Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出され得る。
【０２０４】
化合物のライブラリーは、溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ　ＵＳＰ　５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ　ＵＳＰ　’４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら，１９９２，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１８６５−１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ前出）に存在し得る。
【０２０５】
調節因子のライブラリーおよび天然抽出物を試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、ハイスループットアッセイは、所定の期間で調査される調節因子の数を最大限にするために望ましい。無細胞系で実行されるアッセイ（例えば、精製されたタンパク質または半精製されたタンパク質を用いて誘導され得る）は、「一次（ｐｒｉｍａｒｙ）」スクリーンとしてしばしば好ましく、ここでこれらの系は、試験調節因子によって媒介される分子標的における変更の迅速な発達および比較的容易な検出を可能にするように作製され得る。さらに、試験調節因子の細胞毒性および／またはバイオアベイラビリティの効果は、一般的にインビトロの系では無視され得、その代わりこのアッセイは、分子標的に対する薬物の効果（上流エレメントまたは下流エレメントとの結合親和性の変更で現れ得る）に対して主に注目される。
【０２０６】
１つの実施形態において、本発明は、ＴＲＡＤＥタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたはその活性を調節する（例えば、ＴＲＡＦ分子または関連するキナーゼのような、ＮＦｋＢもしくはＪＮＫシグナル伝達経路における分子の相互作用に関与するＴＲＡＤＥポリペプチドの活性表面に結合するかまたは影響を及ぼすことにより、ＮＦｋＢもしくはＪＮＫシグナル伝達経路を活性化するＴＲＡＤＥポリペプチドの能力を調節する）、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０２０７】
アッセイは、制御因子（ＴＲＡＤＥホモログを含む）をスクリーニングするために使用され得る。ここで、このホモログは、目的のＴＲＡＤＥポリペプチドの正常な細胞機能のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。例えば、本発明は、ＴＲＡＤＥ活性を有するＴＲＡＤＥタンパク質を有する指標組成物が提供される方法を提供する。指標組成物は、試験化合物と接触させられ得る。次いで、指標組成物における変化によって測定されるＴＲＡＤＥ活性での試験化合物の効果は、決定されて、それによりＴＲＡＤＥタンパク質の活性を制御する化合物を同定し得る。試験化合物の存在下でのＴＲＡＤＥ活性のレベルにおける統計的に有意な変化（例えば、減少または増加）（試験化合物の非存在下で検出されるものと比較して）は、試験化合物がＴＲＡＤＥ制御因子であることを示す。指標組成物は、例えば、細胞または細胞抽出物で有り得る。１つの実施形態において、ＴＲＡＤＥ活性は添付の実施例に記載されるように評価される。
【０２０８】
本発明の例示的なスクリーニングアッセイにおいて、目的の制御因子は、この制御因子によって陽性に調節されるかまたは陰性に調節されるかにかかわらず、上流で機能し得るインタラクター分子（例えば、タンパク質）（その活性のアクチベーターおよびリプレッサーの両方を含む）またはＴＲＡＤＥタンパク質の下流で機能し得る分子と接触される。次いで、制御因子および上流エレメントまたは下流エレメントの混合物に、ＴＲＡＤＥタンパク質を含む組成物を添加する。ＴＲＡＤＥとその上流エレメントまたは下流エレメントとの相互作用の検出および定量は、ＴＲＡＤＥとＴＲＡＤＥ結合エレメントとの間の複合体形成の阻害（または、潜在化）での制御因子の効果を決定する手段を提供する。例示的な相互作用分子としては、ＴＲＡＤＥ分子（例えばＴＲＡＦ３（細胞内ドメインに、好ましくはアミノ酸１９３〜３２８の領域に結合する）、およびＴＲＡＦ６が挙げられる。
【０２０９】
別の例示的なスクリーニングアッセイにおいて、本発明の欠失構築物は、本発明におけるキー結合部位を決定するため、およびまたこれらの結合部位に対する新規の結合タンパク質の同定のために使用される。例えば、（１）Ｃ末端からアミノ酸３２８の欠失、（２）Ｃ末端からアミノ酸２１８の欠失、および（３）Ｃ末端からアミノ酸３６８の欠失を保有する構築物が、使用され得る。これらの構築物は、当該分野で予め記載されるような、移動度変位ＤＮＡ結合アッセイおよび酵母ツーハイブリッド系などの技術において利用され得る。
【０２１０】
別の実施形態において、これらの構築物はまた、使用されて、本発明の特異的活性（例えば、キナーゼと相互作用する本発明の能力）を決定し得る。簡単には、インビトロのキナーゼアッセイは、宿主細胞における欠失構築物を発現する工程、発現されたタンパク質を単離する工程、発現されたタンパク質を抗体で免疫沈降する工程、および免疫複合体を３２Ｐ標識されたＡＴＰと共にインキュベートする工程を包含する。次いで、この反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で走らされ、オードラジオグラフィーされる。この方法は、当業者にとって周知である。
【０２１１】
本発明の別の局面は、これらの構築物を使用して、本発明の領域が結合のために公知のタンパク質を必要とすることを決定する。例えば、欠失構築物は宿主細胞において発現され、そしてタンパク質溶解産物が調製され得る。次いで、このタンパク質は、タンパク質溶解産物がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されるウェスタンブロット分析に供され、膜（すなわちニトロセルロースまたはナイロン）に移動され、そして目的のタンパク質に対する抗体を用いてプローブ化され得る。検出のこの方法は、当該分野で周知である。
【０２１２】
本発明の別の局面は、これらの欠失構築物を使用して、シグナル伝達タンパク質の活性化に必要である本発明の一部分を同定する工程を含む。例えば、本発明の選択された構築物は、ルシフェラーゼレポーター構築物（目的のシグナル伝達タンパク質のプロモーターを有するように操作される、すなわちＮＦｋＢプロモーター）を用いて宿主細胞において同時発現され得る。所定の時間後、目的のシグナル伝達タンパク質と相互作用する構築物は、比ルシフェラーゼ活性を計算することでアッセイされ得る。
【０２１３】
調節因子の効果は、種々の濃度の試験制御因子を使用して得られたデータから用量応答曲線を作成することによって評価され得る。さらに、コントロールアッセイもまた、実施されて、比較のためのベースラインを提供し得る。コントロールアッセイにおいて、単離され、かつ精製されたＴＲＡＤＥタンパク質は、ＴＲＡＤＥ結合エレメントを含む組成物に添加され、そして複合体の形成が試験制御因子の非存在下で定量される。
【０２１４】
さらに別の実施形態において、本発明のアッセイは、ＴＲＡＤＥタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分が試験化合物に接触され、そして試験化合物がＴＲＡＤＥタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分に結合する能力が、決定される無細胞アッセイである。試験化合物のＴＲＡＤＥタンパク質への結合は、上記のように直接的にかまたは間接的にのいずれかで決定され得る。好ましい実施形態において、このアッセイとしては、ＴＲＡＤＥタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分を、公知の化合物（ＴＲＡＤＥを結合してアッセイ混合物を形成する）に接触する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触する工程、および試験化合物のＴＲＤＥタンパク質と相互作用する能力を決定する工程、が挙げられる。ここで、この試験化合物のＴＲＤＥタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、試験化合物の優先的にＴＲＡＤＥポリペプチドまたは生物学的に活性なそれらの部分に結合する能力を公知の化合物と比較して決定する工程を包含する。
【０２１５】
別の実施形態において、アッセイは、ＴＲＡＤＥタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分が試験化合物に接触され、そしてＴＲＡＤＥタンパク質または生物学的に活性なそれらの部分の活性を制御する（例えば、刺激する、または阻害する）試験化合物の能力が決定される無細胞アッセイである。ＴＲＡＤＥタンパク質は、ＴＲＡＤＥを発現する細胞の溶解産物として、精製されたもしくは半精製されたポリペプチドとして、または組換え的に発現されたポリペプチドとして提供され得る。１つの実施形態において、無細胞アッセイ系はさらに、細胞抽出物または細胞の単離された成分（例えば、ミトコンドリア）を含む。このような細胞成分は、当該分野で公知の技術を使用して単離され得る。好ましくは、無細胞アッセイ系はさらに、ＴＲＡＤＥが相互作用する少なくとも１つの標的分子を含み、ＴＲＡＤＥと標的分子との相互作用を制御する試験化合物の能力がモニターされて、それによって試験化合物をＴＲＡＤＥのモジュレーターとして同定する。ＴＲＡＤＥタンパク質の活性を制御する試験化合物の能力を決定する工程は、例えば、直接結合を決定するために上記の方法の１つによってＴＲＡＤＥ標的分子に結合するＴＲＡＤＥタンパク質の能力を決定することで達成され得る。ＴＲＤＥ標的分子に結合するＴＲＡＤＥタンパク質の能力を決定する工程もまた、リアルタイムＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）などの技術を使用して達成され得る。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏら，１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５。本明細書中で使用される場合、「ＢＩＡ」は、いずれの相互作用因子（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔ）（例えば、ＢＩＡコア）も標的化せずにリアルタイムで生物特異的相互作用を研究するための技術である。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象における変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の表示として使用され得る。
【０２１６】
さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＴＲＡＤＥタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＴＲＡＤＥタンパク質を結合してアッセイ混合物を形成する公知の化合物とを接触させる工程、アッセイ混合物と試験化合物とを接触させる工程、およびＴＲＡＤＥタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程を包含する。ここで、ＴＲＡＤＥタンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、ＴＲＡＤＥ標的分子に好ましく結合するかまたは、ＴＲＡＤＥ標的分子の活性を制御するＴＲＡＤＥタンパク質の能力を決定する工程を包含する。
【０２１７】
本発明の無細胞アッセイは、タンパク質（例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質もしくはＴＲＡＤＥが結合する細胞内ドメインを有するレセプター）の可溶性形態および／または膜結合形態の両方を使用できる。タンパク質の膜結合形態が使用される無細胞アッセイの場合、タンパク質の膜結合形態が溶液中で維持されるように可溶化剤を利用することが所望され得る。このような可溶化剤の例としては、非イオン性洗浄剤（例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド（ｄｏｄｅｃｙｌｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ）（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ（ａｍｍｉｎｉｏ）］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ（ａｍｍｉｎｉｏ）］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート）が挙げられる。
【０２１８】
ＴＲＡＤＥ標的分子は、タンパク質またはＤＮＡ配列であり得る。タンパク質−タンパク質相互作用の検出を可能にする適切なアッセイ（例えば、免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイなど）、またはＤＮＡ結合タンパク質と標的ＤＮＡ配列との間の相互作用の検出を可能にする適切なアッセイ（例えば、電気泳動移動度シフトアッセイ、ＤＮＡｓｅ　Ｉフットプリントアッセイなど）は、当該分野で公知である。試験化合物の存在下および非存在下で、このようなアッセイを実施することによって、これらのアッセイは、使用されて、ＴＲＡＤＥと標的分子の相互作用を制御（例えば、阻害または促進）する化合物を同定し得る。
【０２１９】
ＴＲＡＤＥ分子のリガンドに結合するかまたは相互作用するＴＲＡＤＥタンパク質の能力を決定することは、例えば、直接結合によって達成され得る。直接結合アッセイにおいて、ＴＲＡＤＥタンパク質は、このＴＲＡＤＥタンパク質のＴＲＡＤＥ標的分子への結合が複合体中の標識化ＴＲＡＤＥタンパク質を検出することで決定され得るように放射性同位体または酵素ラベルで結合され得る。例えば、ＴＲＡＤＥ分子（例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質）は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識化され得、そして放射性同位体は、放射性放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出され得る。あるいは、ＴＲＡＤＥ分子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを用いて酵素的に標識化され得、そして酵素的標識が、適切な基質の産物への転化を決定することで検出され得る。
【０２２０】
代表的には、ＴＲＡＤＥまたはその結合タンパク質のいずれかを固定して、このタンパク質の１つまたは両方の非複合体形態からの複合体の分離を容易にすること、およびアッセイの自動化に適応することが所望される。ＴＲＡＤＥの上流結合エレメントまたは下流結合エレメントへの結合は、候補因子の存在または非存在で、反応物を含むために適切な任意の容器において達成され得る。例として、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心分離チューブが挙げられる。１つの実施形態において、タンパク質をマトリックスに結合させ得るドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＴＲＡＤＥ（ＧＳＴ／ＴＲＡＤＥ）融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで細胞溶解物（例えば、３５Ｓ−標識化および試験制御因子）と組み合わせられ、そしてこの混合物は、複合体形成につながる条件（例えば、塩およびｐＨに対する生理学的条件）下でインキュベートされ得るが、わずかによりストリンジェントな条件が所望され得る。インキュベーション後、ビーズは洗浄されて、任意の未結合標識を除去し、そしてマトリックスが固定され、そして放射性標識が直接決定される（例えば、シンチレーションに置かれるビーズ）か、または、複合体が実質的に解離された後、上清において決定される。あるいは、この複合体は、マトリックスから解離され得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、そしてビーズ画分に見出されるＴＲＡＤＥ結合タンパク質のレベルが標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量される。
【０２２１】
タンパク質を行列に固定化する他の技術もまた、本アッセイにおける使用のために入手可能である。例えば、ＴＲＡＤＥまたはその同族結合タンパク質のいずれかは、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化を利用して固定され得る。例えば、ビオチン化ＴＲＡＤＥ分子は、当該分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され得、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレートのウェル（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に固定され得る。あるいは、ＴＲＡＤＥと反応性の抗体であるが、上流エレメントまたは下流エレメントの結合を妨げない抗体は、プレートのウェルへ誘導体化され、そしてＴＲＡＤＥは抗体結合体化によってウェルにトラップされ得る。上のように、ＴＲＡＤＥ結合タンパク質および試験制御因子の調製物は、プレートのＴＲＡＤＥ存在ウェルにおいてインキュベートされ、そしてウェルにトラップされた複合体の量が定量され得る。ＧＳＴ固定複合体について上記された方法に加えて、このような複合体を検出する例示的な方法として、ＴＲＡＤＥ結合エレメントに反応性の抗体、またはＴＲＡＤＥタンパク質に反応性でありそして結合エレメントと競合する抗体を使用する複合体の免疫検出；および結合エレメントに関連する酵素学的な活性、内因性活性または外因性活性のいずれかの検出に依存する酵素連結アッセイが挙げられる。後者の例において、酵素は、化学的に結合体化され得るか、またはＴＲＡＤＥ−ＢＰを有する融合タンパク質として提供され得る。説明するため、ＴＲＡＤＥ−ＢＰは、化学的に架橋されるか、または一般的に西洋ワサビペルオキシダーゼと融合され得、そして複合体中にトラップされたタンパク質の量が、酵素の色素基質（例えば、四塩酸３，３’−ジアミノ−ベンジジン（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏ−ｂｅｎｚａｄｉｎｅ　ｔｅｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）または４−クロロ−１−ナフトール（４−ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａｐｔｈｏｌ））を用いて評価され得る。同様に、タンパク質およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質が提供され得、そして複合体形成が１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（Ｈａｂｉｇら、１９７４、Ｊ．Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２４９：７１３０）を使用してＧＳＴ活性を検出することによって定量され得る。
【０２２２】
複合体にトラップされるタンパク質の１つを提供するための免疫検出に依存するプロセスについて、このタンパク質に対する抗体（例えば、抗ＴＲＡＤＥ抗体）が、使用され得る。あるいは、複合体において検出されるべきタンパク質は、ＴＲＡＤＥ配列に加えて、抗体が容易に入手可能（例えば、商業的な供給源から）である第２のタンパク質を含む融合タンパク質の形態における「エピトープタグ」であり得る。例えば、上記のＧＳＴ融合タンパク質はまた、ＧＳＴ部分に対する抗体を使用する結合の定量のために使用され得る。他の有用なエピトープタグとして、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基配列を含むｍｙｃ−エピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら、１９９１、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６６：２１１５０−２１１５７を参照のこと）およびｐＦＬＡＧ系（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）またはｐＥＺＺ−プロテインＡ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）が挙げられる。
【０２２３】
任意の相互作用因子の標識化なしにＴＲＡＤＥとその標的分子との相互作用を制御する化合物の能力を決定することもまた、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）が使用されて、ＴＲＡＤＥとその標的分子との相互作用をＴＲＡＤＥまたはその標的分子のいずれかの標識化なしに検出し得る。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍら、１９９２、Ｓｉｅｎｃｅ　２５７：１９０６−１９１２。本明細書中で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、細胞が、その環境を酸性化する速度を、光位置付け可能電位差センサー（ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ　ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ　ｓｅｎｓｏｒ）（ＬＡＰＳ）を使用して測定する分析機器である。この酸性化速度における変化は、化合物とレセプターとの間の相互作用の指標として使用され得る。
【０２２４】
無細胞アッセイに加えて、本発明によって供給されるＴＲＡＤＥタンパク質の容易に入手可能な供給源もまた、低分子アゴニスト／アンタゴニストなどを同定するための細胞ベースアッセイの生成を容易にする。例えば、細胞は、試験因子によって媒介される標的細胞によるＴＲＡＤＥ応答における制御をスコア付けするアッセイを用いて、目的の試験制御因子の存在または非存在で組換えＴＲＡＤＥタンパク質の発現または過剰発現をもたらし得る。例えば、無細胞アッセイと用いた場合、ＴＲＡＤＥ依存応答において統計的に有意な変化（増加または減少のいずれか）を生成する制御因子が、同定され得る。
【０２２５】
ＴＲＡＤＥの発現のために使用され得る組換え発現ベクターは、当該分野で公知である（上の議論を参照のこと）。１つの実施形態において、発現ベクター内のＴＲＡＤＥコード配列は、指標細胞においてＴＲＡＤＥの本質的な発現または誘導可能な発現を可能にする調節配列に作動可能に連結される。細胞においてＴＲＡＤＥの本質的な発現または誘導可能な発現を可能にする組換え発現ベクターの使用は、ＴＲＡＤＥの活性を高めるかまたは阻害する化合物の同定のために好ましい。代替の実施形態において、発現ベクター中のＴＲＡＤＥコード配列は、内因性のＴＲＡＤＥ遺伝子の調節配列（すなわち、内因性遺伝子由来のプロモーター調節領域）に作動可能に連結される。ＴＲＡＤＥ発現が内因性の調節配列によって制御される組換え発現ベクターの使用は、ＴＲＡＤＥの転写発現を高めるかまたは阻害する化合物の同定のために好ましい。
【０２２６】
１つの実施形態において、アッセイは、ＴＲＡＤＥ標的分子（または別のＴＲＡＤＥ細胞内相互作用分子）を発現する細胞と試験化合物を接触させる工程、およびＴＲＡＤＥ標的分子の活性を制御（例えば、刺激または阻害）する試験化合物の能力を決定する工程を包含する細胞ベースアッセイである。ＴＲＡＤＥ標的分子の活性を制御する試験化合物の能力を決定する工程は、例えば、ＴＲＡＤＥ標的分子もしくはそのリガンドに結合するかまたは相互作用するＴＲＡＤＥタンパク質の能力を決定することによって達成され得る。
【０２２７】
例示的な実施形態において、ＴＲＡＤＥの発現または活性は、細胞において制御され、そして目的の読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）上の目的の制御因子の効果（例えば、アポトーシス）が測定される。１つの実施形態において、ＴＲＡＤＥ発現または活性における制御によってその翻訳が変更される遺伝子の調節領域（例えば、５’フランキングプロモーターおよびエンハンサー領域）は、容易に検出され得る遺伝子産物をコードするマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）に作動可能に連結される。
【０２２８】
別の実施形態において、ＴＲＡＤＥ発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と接触され、そして細胞中のＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定される方法で同定される。候補化合物の存在下におけるＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルは、候補化合物の非存在下におけるＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルと比較される。次いで、この候補化合物は、この比較に基づいて、ＴＲＡＤＥ発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも存在下において多い場合（例えば、統計学的に有意により多い）、この候補化合物は、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも存在下において、少ない（例えば、統計学的に有意により少ない）場合、この候補化合物は、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。細胞におけるＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、本明細書中に記載されたＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための方法によって決定され得る。
【０２２９】
好ましい実施形態において、ＴＲＡＤＥタンパク質が、ＴＲＡＤＥ標的分子に結合または相互作用する能力を決定することは、ＴＲＡＤＥまたは標的分子の活性の読み出しを測定することによって達成され得る。例えば、ＴＲＡＤＥまたは標的分子の活性は、標的の細胞性二次メッセンジャー（例えば、ＮＦｋＢまたはＪＮＫ経路の活性化によって調節される二次メッセンジャー）の誘導を検出することによって、適切な基質を用いて、標的の触媒作用的／酵素学的活性を検出することによって、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結された標的応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出することによって、または、標的調節性細胞性応答（例えば、アポトーシス）を検出することによって、決定され得る。例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質が、ＴＲＡＤＥ標的分子と結合または相互作用する能力を決定することは、好ましくは、上皮細胞において、例えば、増殖および／またはアポトーシスを調節する化合物の能力を測定することによって達成され得る。アポトーシスの特徴は、ＤＮＡの分解である。このプロセスの初期において、この分解は、ヌクレオソーム間のＤＮＡリンカー領域において発生する。このＤＮＡ切断は、二重鎖および一重鎖ＤＮＡの破損を生じ得る。アポトーシスは、標準的な技術を使用して、細胞において測定される。例えば、細胞集団のゲノムＤＮＡの分解は、アガロースゲル電気泳動または３Ｈ−チミジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジンに基づいたＤＮＡフラグメント化アッセイによって分析され得る。
【０２３０】
個々の細胞におけるアポトーシスを分析するために、アポトーシス細胞は、核クロマチン濃縮およびフラグメント化の特徴的な出現のために、顕微鏡的に認識され得る。アポトーシスは、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ株を使用し、そして、添付の実施例において記載されるように、核濃縮を有する細胞を探すことによって、個々の細胞において測定され得る。あるいは、二重鎖および一重鎖ＤＮＡ破損は、酵素反応中で、遊離の３’−ＯＨ末端を改変されたヌクレオチド（例えば、ビオチン−ｄＵＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ）で標識することによって、検出され得る。末端のデオキシヌクレオチドイルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、ＤＮＡの３’末端へのデオキシリボオリゴヌクレオチドの鋳型独立性の重合を触媒する。この方法は、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介性ｄＵＴＰ−Ｘニック末端標識）といわれる。あるいは、遊離３’ＯＨ基は、ニック翻訳によって、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、標識され得る。ＴＵＮＥＬ染色を使用して、二重鎖ＤＮＡ破損を有する細胞を同定し得る。標識されたｄＵＴＰを取り込んだ標識された遊離３’ＯＨ基は、フローサイトメトリーおよび／または蛍光顕微鏡によって可視化され得る。これらのアッセイを行なうための試薬は、例えば、Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＵＳＡ（Ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ）から入手可能である。さらに、アネキシン（例えば、Ｒｏｃｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＵＳＡから市販されているＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＡｌｅｘａＴＭ５６８）は、この目的のために使用され得る。アポトーシスを起こす細胞に関連する初期の原形質膜の変化の１つは、原形質膜の内側のリーフレットから外側の層へのホスファチジルセリンの転位置であり、それにより、細胞の表面でホスファチジルセリンを曝露する。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖは、ホスファチジルセリンに結合するリン脂質結合タンパク質であり、そして、細胞表面上のホスファチジルセリンについてのプローブとして使用され得る。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖは、ＤＮＡ染色（例えば、ＢＯＢＯＴＭ−１）と組み合わせて使用され、アポトーシス細胞を壊死細胞と区別し得る。
【０２３１】
本発明は、モジュレーター（すなわち、ＴＲＡＤＥタンパク質に結合する候補化合物もしくは試験化合物または候補因子もしくは試験因子（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物））（これは、例えば、ＴＲＡＤＥ発現またはＴＲＡＤＥ活性に対して刺激性または阻害性効果を有する）を同定するための方法（または「スクリーニングアッセイ」として本明細書中で参照される）を提供する。
【０２３２】
本発明の試験化合物は、以下を含む当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法における多数のアプローチのいずれかを使用して、得られ得る：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固体相または溶液相ライブラリー；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されないが、他の４つのアプローチが、ペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは低分子化合物のライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０２３３】
分子ライブラリーの合成のための方法の例としては、例えば、以下において、当該分野で見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら、１９９４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０２３４】
化合物のライブラリーは、溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ，１９９１、Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ　ＵＳＰ　５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ　ＵＳＰ　’４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１８６５−１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ、前出）に提示される。
【０２３５】
因子および天然抽出物を調節するライブラリーを試験する多数の薬物スクリーニングにおいて、ハイスループットアッセイが、所定の期間で調査された調節因子の数を最大にするために、所望である。無細胞系において行なわれるアッセイ（例えば、精製されたかまたは半精製されたタンパク質に由来し得る無細胞系）は、しばしば、それらが、試験調節因子によって媒介される分子標的における変更の迅速な開発および比較的容易な検出を可能にするように産生され得るという点で、「一次（Ｐｒｉｍａｒｙ）」スクリーンといわれる。さらに、試験調節因子の細胞傷害性および／またはバイオアベイラビリティーの効果が、一般に、インビトロ系において無視され得、上流または下流エレメントとの結合親和性の変更において明らかであり得るように、代わりに、アッセイは、分子標的に対する薬物の効果に主に焦点が当てられる。
【０２３６】
１つの実施形態において、本発明は、ＴＲＡＤＥタンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的活性な部分に結合するか、あるいはＴＲＡＤＥタンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、ＴＲＡＤＥポリペプチドがＴＲＡＤＥ結合パートナーと相互作用する能力を調節する）、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０２３７】
アッセイは、調節因子（ＴＲＡＤＥホモログを含む）をスクリーニングするために使用され得、この調節因子は、対象のＴＲＡＤＥポリペプチドの正常な細胞性機能のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかである。例えば、本発明は、ＴＲＡＤＥ活性を有するＴＲＡＤＥタンパク質を有する指標組成物が提供される方法を提供する。指標組成物は、試験化合物と接触され得る。次いで、試験化合物のＴＲＡＤＥ活性に対する効果は、指標化合物における変化によって測定されるように、決定され、それにより、ＴＲＡＤＥタンパク質の活性を調節する化合物を同定する。試験化合物の存在下でのＴＲＡＤＤＥ活性のレベルにおける統計学的に有意な変化（例えば、減少または増加）（試験化合物の非存在下において検出されたものと比較して）は、ＴＲＡＤＥ調節因子である試験化合物を示している。この指標組成物は、例えば、細胞または細胞抽出物であり得る。１つの実施形態において、ＴＲＡＤＥ活性は、添付の実施例において記載されるように評価される。
【０２３８】
本発明の例示的なスクリーニングアッセイにおいて、目的の調節因子は、上流で機能し得る相互作用タンパク質（その活性の活性化因子およびリプレッサーの両方を含む）と接触されるか、またはＴＲＡＤＥタンパク質の下流で機能し得るタンパク質に接触される（調節因子が、相互作用タンパク質によって、ポジティブまたはネガティブに調節されるかに関わらず）。次いで、調節因子および上流または下流エレメントの混合物に、ＴＲＡＤＥタンパク質を含む組成物を添加した。ＴＲＡＤＥとその上流または下流エレメントとの相互作用の検出および定量化は、ＴＲＡＤＥとＴＲＡＤＥ結合エレメントとの間の阻害性（または増強性）複合体で、調節因子の効力を決定するための手段を提供する。
【０２３９】
調節因子の効力は、種々の濃度の試験調節因子を使用して、得られたデータから用量応答曲線を作成することによって評価され得る。さらに、コントロールアッセイがまた行なわれ、比較のためのベースラインを提供する。コントロールアッセイにおいて、単離および精製されたＴＲＡＤＥタンパク質は、ＴＲＡＤＥ結合エレメントを含む組成物に添加され、そして、複合体の形成は、試験調節因子の非存在下で定量化される。
【０２４０】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、ＴＲＡＤＥタンパク質またはその生物学的に活性な部分が試験化合物と接触され、そして試験化合物がＴＲＡＤＥタンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力が決定される、無細胞系である。試験化合物のＴＲＡＤＥタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的に決定され得る。好ましい実施形態において、このアッセイは、ＴＲＡＤＥタンパク質またはその生物学的に活性な部分と、ＴＲＡＤＥと結合してアッセイ混合物を形成する公知の化合物とを接触させる工程、アッセイ混合物と試験化合物とを接触させる工程、および試験化合物が、ＴＲＡＤＥと相互作用する能力を決定する工程であって、ここで、試験化合物がＴＲＡＤＥタンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、試験化合物が、公知の化合物と比較してＴＲＡＤＥポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する、工程を包含する。
【０２４１】
別の実施形態において、アッセイは、ＴＲＡＤＥタンパク質またはその生物学的に活性な部分が試験化合物と接触され、そして試験化合物がＴＲＡＤＥタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激または阻害する）能力が決定される無細胞系アッセイである。ＴＲＡＤＥタンパク質は、ＴＲＡＤＥを発現する細胞の溶解物として、精製または半精製されたポリペプチドとして、または組換え的に発現されたポリペプチドとして、提供され得る。１つの実施形態において、無細胞アッセイ系は、細胞抽出物または細胞の単離された成分（例えば、ミトコンドリア）をさらに含む。このような細胞性成分は、当該分野で公知の技術を使用して単離され得る。好ましくは、無細胞アッセイ系は、ＴＲＡＤＥが相互作用する少なくとも１つの標的分子をさらに含み、そして、試験化合物が、ＴＲＡＤＥと標的分子との相互作用を調節する能力がモニターされ、それにより、ＴＲＡＤＥ活性のモジュレーターとして試験化合物を同定する。試験化合物がＴＲＡＤＥタンパク質の活性を調節する能力を決定することは、例えば、直接的な結合を決定するための上記の方法の１つによって、ＴＲＡＤＥタンパク質がＴＲＡＤＥ標的分子（例えば、増殖および／またはアポトーシス）と結合する能力を決定することによって、達成され得る。ＴＲＡＤＥタンパク質がＴＲＡＤＥ標的分子に結合する能力を決定することはまた、リアルタイムＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）のような技術を使用して達成され得る（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏら、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）。本明細書中で使用される場合、「ＢＩＡ」は、いずれの反応体（例えば、ＢＩＡコア）も標識することなく、リアルタイムで生物特異的相互作用を研究するための技術である。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象における変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として、使用され得る。
【０２４２】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＴＲＡＤＥタンパク質またはその生物学的に活性な部分と、ＴＲＡＤＥタンパク質と結合してアッセイ混合物を形成する公知の化合物とを接触させる工程、アッセイ混合物と試験化合物とを接触させる工程、および試験化合物が、ＴＲＡＤＥタンパク質と相互作用する能力を決定する工程であって、ここで、試験化合物がＴＲＡＤＥタンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、ＴＲＡＤＥタンパク質がＴＲＡＤＥ標的分子と優先的に結合するかまたはＴＲＡＤＥ標的分子の活性を調節する能力を決定する工程を包含する、工程を包含する。
【０２４３】
本発明の無細胞アッセイは、タンパク質の可溶性形態および／または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる（例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質またはＴＲＡＤＥが結合する細胞内ドメインと有するレセプター）。膜結合形態のタンパク質が使用される無細胞アッセイの場合では、タンパク質の膜結合形態が溶液で維持されるように可溶化剤を利用することが所望であり得る。このような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ヂメチルアミニオ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏ）］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２４４】
ＴＲＡＤＥ標的分子は、タンパク質またはＤＮＡ配列であり得る。タンパク質−タンパク質相互作用の検出（例えば、免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイなど）を可能にするか、またはＤＮＡ結合タンパク質と標的ＤＮＡ配列との間の相互作用の検出（例えば、電気泳動移動性シフトアッセイ、ＤＮＡｓｅＩフットプリントアッセイなど）を可能にする適切なアッセイが、当該分野で公知である。試験化合物の存在下または非存在下において、このようなアッセイを実施することによって、これらのアッセイを使用して、ＴＲＡＤＥと標的分子との相互作用を調節する（例えば、阻害または強化する）化合物を同定し得る。
【０２４５】
ＴＲＡＤＥタンパク質が、ＴＲＡＤＥ分子のリガンドと結合または相互作用する能力を決定することは、例えば、直接的な結合によって達成され得る。直接的な結合アッセイにおいて、ＴＲＡＤＥタンパク質は、放射性同位体または酵素学的標識と結合され得、その結果、ＴＲＡＤＥタンパク質のＴＲＡＤＥ標的分子への結合は、複合体中の標識されたＴＲＡＤＥタンパク質を検出することによって決定され得る。例えば、ＴＲＡＤＥ分子（例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質）は、直接的または間接的のいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識され得、そして、放射性同位体は、放射性放出の直接的カウンティングまたはシンチレーションカウンティングによって検出され得る。あるいは、ＴＲＡＤＥ分子は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼを用いて酵素学的に標識され得、そして、酵素標識は、適切な基質の産物への変換を測定することによって検出され得る。
【０２４６】
代表的に、ＴＲＡＤＥまたはその結合タンパク質の１つまたは両方の非複合体形態からの複合体の分離を容易にするため、ならびにアッセイの自動化に適応するために、ＴＲＡＤＥまたはその結合タンパク質のいずれかを固定することが望ましい。候補因子の存在下または非存在下で、ＴＲＡＤＥを上流または下流結合エレメントに結合することは、反応物を含むのに適切な任意の容器中で達成され得る。例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、このタンパク質がマトリックスに結合されるのを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が、提供される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＴＲＡＤＥ（ＧＳＴ／ＴＲＡＤＥ）融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート（これらは、次いで、細胞溶解物（例えば、３５Ｓ標識）および試験調節因子と組み合わせられる）上に吸着され得、そして、混合物は、わずかによりストリンジェントな条件が望ましくあり得るが、複合体形成の助けになる条件下（例えば、塩およびｐＨについての生理学的条件で）でインキュベートされ得る。インキュベーション後、ビーズを洗浄し、いずれの未結合の標識も除去し、そして、マトリックスを固定し、放射性標識を直接（例えば、シンチラント中に配置されたビーズ）か、または複合体が引き続き解離される後の上清中で測定される。あるいは、複合体は、マトリックスから解離され得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され得、そしてビーズ画分中に見出されるＴＲＡＤＥ結合タンパク質のレベルを、標準的な電気泳動技術を使用してゲルから定量化した。
【０２４７】
マトリクス上にタンパク質を固定化するための他の方法もまた、本アッセイにおける使用のために利用可能である。例えば、ＴＲＡＤＥまたはその同族の結合タンパク質のいずれかは、ビオチンとストレプトアビジンの結合体化を利用して固定化され得る。例えば、ビオチン標識ＴＲＡＤＥ分子は、当該分野で周知の技術（例えば、ビオチン標識キット、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化され得る。あるいは、ＴＲＡＤＥと反応性であるが、上流または下流のエレメントの結合を妨げない抗体が、プレートのウェル、および抗体結合体化によりウェルにトラップされたＴＲＡＤＥに誘導体化し得る。上記のように、ＴＲＡＤＥ結合タンパク質の調整および試験調節因子を、プレートのＴＲＡＤＥ提示ウェルにおいてインキュベートし、そしてウェルにトラップされた複合体の量を定量化し得る。ＧＳＴ固定化複合体についての上述の方法に加えて、このような複合体を検出するための例示的な方法として、ＴＲＡＤＥ結合エレメントと反応性の抗体か、またはＴＲＡＤＥタンパク質と反応性であり、そしてこの結合エレメントと競合的である抗体を用いた複合体の免疫検出；ならびにこの結合エレメントと関連する酵素活性（内因性酵素か外因性酵素のいずれか）を検出することに依存する酵素結合アッセイが挙げられる。最近の例では、酵素はＴＲＡＤＥ−ＢＰと結合体化されるかまたはＴＲＡＤＥ−ＢＰ融合タンパク質として提供される。ＴＲＡＤＥ−ＢＰは、化学的に架橋され得るか、または西洋ワサビペルオキシダーゼと遺伝子的に融合され得、そしてこの複合体中にトラップされたタンパク質の量は、酵素の発色性基質（例えば、３，３−ジアミノ−ベンザジン−テトラヒドロクロリドまたは４−クロロ−１−ナフトール）によって評価され得る。同様に、このタンパク質およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質が提供され得る。そして１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンを用いてＧＳＴ活性を検出することにより、定量化された（Ｈａｂｉｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９７４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ　２４９：７１３０）。
【０２４８】
この複合体にトラップされたタンパク質の１つを定量化するための免疫検出に依存するプロセスについて、このタンパク質に対する抗体（例えば、抗ＴＲＡＤＥ抗体）が、用いられ得る。あるいは、この複合体において検出されるタンパク質は、ＴＲＡＤＥ配列に加えて抗体が容易に入手可能な第２のタンパク質（例えば、市販品）を含む、融合タンパク質の形態で「エピトープタグ化」され得る。例えば、上述のＧＳＴ融合タンパク質もまた、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いる、結合の定量化に有用であり得る。他の有用なエピトープタグとして、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基配列を含むｍｙｃ−エピトープ（例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９１，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６６：２１１５０−２１１５７）、およびＦＬＡＧシステム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）、またはｐＥＺＺタンパク質Ａシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＮＪ）が挙げられる。
【０２４９】
いずれの相互作用因子も標識することなく、ＴＲＡＤＥとその標的分子との間の相互作用を調節する化合物の能力を決定することもまた、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターが、ＴＲＡＤＥもその標的分子も標識することなく、ＴＲＡＤＥとその標的分子の相互作用を検出するために用いられ得る。Ｍｃｃｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：１９０６−１９１２。本明細書中で用いられる場合、「マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）」（例えば、サイトセンサー（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、ｌｉｇｈｔ−ａｄｒｅｓｓａｂｌｅ　ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ　ｓｅｎｓｏｒ（ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸性にする速度を測定する分析機器である。この酸性化速度における変化は、化合物とレセプターとの間の相互作用の指標として用いられる。
【０２５０】
無細胞アッセイに加えて、本発明によって提供されるＴＲＡＤＥタンパク質の容易に入手可能な供給源もまた、低分子アゴニスト／アンタゴニストなどを同定するための無細胞アッセイの作製を容易にする。例えば、細胞は、目的の試験調節因子の存在下または非存在下で組換えＴＲＡＤＥタンパク質を発現または過剰発現するよう誘導され得、このアッセイは、標的因子により媒介される標的細胞によるＴＲＡＤＥ応答における調節についてのスコアをつける。例えば、無細胞アッセイにより、無細胞アッセイＴＲＡＤＥ依存性の応答（増加または減少のいずれか）における統計的に有意な変化を生じる調節因子が、同定され得る。
【０２５１】
ＴＲＡＤＥの発現に用いられ得る組換え発現ベクターは、当該分野において公知である（上述の議論を参照のこと）。１つの実施形態において、この発現ベクター内で、ＴＲＡＤＥコード配列は、指標細胞においてＴＲＡＤＥの構成的な発現または誘導性の発現を許容する調節配列と作動可能に連結される。細胞におけるＴＲＡＤＥの構成的な発現または誘導性の発現を許容する組換え発現ベクターの使用は、ＴＲＡＤＥの活性を増強または阻害する化合物の同定に好ましい。代替の実施形態において、この発現ベクター内で、ＴＲＡＤＥコード配列は、内因性ＴＲＡＤＥ遺伝子の調節配列（すなわち、内因性遺伝子由来のプロモーター調節領域）に作動可能に連結される。ＴＲＡＤＥの発現が、内因性の調節配列により制御される組換え発現ベクターの使用は、ＴＲＡＤＥの転写的な発現を増強または阻害する化合物の同定に好ましい。
【０２５２】
１つの実施形態において、アッセイは、ＴＲＡＤＥ標的分子（または別のＴＲＡＤＥの細胞内相互作用分子）を発現する細胞と、試験化合物を接触させる工程、およびＴＲＡＤＥ標的分子の活性を調節する（例えば、刺激するかまたは阻害する）試験化合物の能力を決定する工程を包含する、細胞ベースのアッセイである。ＴＲＡＤＥ標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を決定する工程は、例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質が、ＴＲＡＤＥ標的分子またはそのリガンドと結合または相互作用する能力を決定することにより、達成され得る。
【０２５３】
例証的な実施形態において、ＴＲＡＤＥの発現または活性は細胞内で調節され、そして目的の読み出しに対する目的の調節因子の効果（例えば、増殖またはアポトーシス）が測定される。１つの実施形態において、ＴＲＡＤＥの発現または活性における調節によりその転写が変化される遺伝子の調節領域（例えば、５’隣接プロモーターおよびエンハンサー領域）が、容易に検出され得る遺伝子産物をコードするマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）に作動可能に連結される。
【０２５４】
別の実施形態において、細胞が候補化合物と接触され、そして細胞中でのＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定されるような方法において、ＴＲＡＤＥ発現のモジュレーターが同定される。候補化合物の存在下でのＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで候補化合物は、この比較に基き、ＴＲＡＤＥ発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも存在下でより大きい（例えば、統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激因子として同定される。あるいは、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の非存在下よりも存在下でより小さい（例えば、統計的に有意に小さい）場合、この候補化合物は、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。細胞におけるＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、本明細書中に記載されるＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための方法により決定され得る。
【０２５５】
好ましい実施形態において、ＴＲＡＤＥ標的分子と結合または相互作用するＴＲＡＤＥタンパク質の能力の決定は、ＴＲＡＤＥの活性の読み出しかまたは標的分子の読み出しを測定することにより、達成され得る。例えば、ＴＲＡＤＥまたは標的分子の活性は、標的の細胞のセカンドメッセンジャー（例えば、ＪＮＫまたはＮＦｋＢシグナル伝達経路の活性化により調節されるセカンドメッセンジャー）の誘導を検出すること、標的の適切な基質の触媒／酵素活性を検出することにより、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結された標的応答性の調節エレメントを含む）の誘導を検出することにより、または標的に調節される細胞応答（例えば、アポトーシス）を検出により、決定され得る。例えば、ＴＲＡＤＥ標的分子と結合または相互作用するＴＲＡＤＥタンパク質の能力の決定は、アポトーシス（好ましくは、上皮細胞）を調節する化合物の能力を測定することにより、達成され得る。アポトーシスの特徴は、ＤＮＡの切断である。このプロセスの初期において、この切断は、ヌクレオソーム間のＤＮＡリンカー領域において生じる。ＤＮＡ切断は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡ切断物を生じ得る。アポトーシスは、標準的な技術を用いて、細胞において測定され得る。例えば、細胞集団のゲノムＤＮＡの切断が、アガロースゲル電気泳動により分析され得るか、または３Ｈ−チミジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジンに基づくＤＮＡのフラグメンテーションアッセイが、用いられ得る。
【０２５６】
個体の細胞においてアポトーシスを分析するために、アポトーシス細胞は、核クロマチンの縮合およびフラグメンテーションの特徴的な外見が理由で、顕微鏡検査により認識され得る。アポトーシスは、個体細胞において測定され得る；例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ株を用いること、および添付の実施例に記載されるようなピクノーゼの核を有する細胞を探索すること。あるいは、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ切断物は、酵素反応において修飾された部分（例えば、ビオチン−ｄＵＴＰ、ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ）を有する遊離の３’−ＯＨ末端を標識することにより、検出され得る。末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、テンプレート非依存的なＤＮＡの３’末端へのデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。この方法は、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−媒介性ｄＵＴＰ−Ｘニック末端標識化）と呼ばれる。あるいは、遊離のＯＨ基が、ニックの翻訳によりＤＮＡポリメラーゼを用いて標識され得る。トンネル染色は、二本鎖ＤＮＡ切断物を有する細胞を同定するために用いられ得る。標識されたｄＵＴＰを組み込んだ標識された遊離の３’ＯＨ基は、フローサイトメトリーおよび／またはフルオレセイン顕微鏡検査により可視化され得る。これらのアッセイを実施するための試薬は、例えば、Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＵＳＡから入手可能である（インサイチュ細胞死検出キット）。さらに、アネキシン（例えば、Ｒｏｃｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＵＳＡから市販されているＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＡｌｅｘａＴＭ５６８）は、この目的のために用いられ得る。アポトーシスを受けている細胞に関連する初期の細胞膜の変化の１つは、細胞膜の内側リーフレットから外側リーフレットへのホスファチジルセリンの転座であり、これによって、細胞表面でホスファチジルセリンが晒される。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖは、ホスファチジルセリンに結合するリン脂質結合タンパク質であり、細胞表面のホスファチジルセリンのためのプローブとして用いられ得る。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖは、ＤＮＡ染色（例えば、ＢＯＢＯＴＭ−１）と組み合わせて用いられて、壊死細胞からアポトーシス細胞を区別し得る。
【０２５７】
本発明のさらに別の局面において、ＴＲＡＤＥタンパク質またはその一部は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質（ｂａｉｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）」として用いられ得（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ　７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ　ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＴＲＡＤＥ（「ＴＲＡＤＥ結合タンパク質」または「ＴＲＡＤＥ−ｂｐ」）と結合するかまたは相互作用する他のタンパク質、およびＴＲＡＤＥ活性に関連する他のタンパク質を同定し得る。このようなＴＲＡＤＥ結合タンパク質はまた、ＴＲＡＤＥタンパク質またはＴＲＡＤＥ標的（例えば、ＴＲＡＤＥ媒介性シグナル伝達経路の下流のエレメント）によるシグナルの伝播に関連するようである。あるいは、このようなＴＲＡＤＥ結合タンパク質は、ＴＲＡＤＥインヒビターであり得る。
【０２５８】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなるほとんどの転写因子の調節性の性質に基づく。簡単に言うと、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を用いる。１つの構築物において、ＴＲＡＤＥタンパク質をコードする遺伝子は、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合されている。他の構築物において、同定されていないタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードする、ＤＮＡ配列のライブラリー由来のＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合されている。「ベイト」タンパク質および「プレイ」タンパク質は、インビボで相互作用して、ＴＲＡＤＥ依存的な複合体を形成し、そしてこの転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、近位に運ばれる。この近位は、この転写因子と応答性の転写調節部位に作動可能に連結されているレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を許容する。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能性の転写因子を含むコロニーが単離され得、そしてＴＲＡＤＥタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化された遺伝子を獲得するために用いられ得る。
【０２５９】
本発明はまた、（１）ＴＲＡＤＥおよび転写活性ドメインを含む第１のハイブリッドタンパク質（２）ＴＲＡＤＥ結合パートナーおよびＤＮＡ結合ドメインを含む第２のハイブリッドタンパク質を有するツーハイブリッドシステム、宿主細胞、および説明書を含むキットを提供する。あるいは、ＴＲＡＤＥポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインに融合された結合パートナーに融合され得る。このようなキットは、第１のハイブリッドタンパク質と第２のハイブリッドタンパク質との間の分子間結合を変化させる能力を試験するための試薬のパネルを必要に応じて含み得る。
【０２６０】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規の因子に関連する。従って、本明細書中に記載されたようにして同定された因子をさらに適切な動物モデルにおいて使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書中に記載されたようにして同定された因子（例えば、ＴＲＡＤＥ調節因子、アンチセンスＴＲＡＤＥ核酸分子、ＴＲＡＤＥ特異的抗体、またはＴＲＡＤＥ結合パートナー）は、このような因子の処置の有効性、毒性、または副作用を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書中に記載されたようにして同定された因子は、このような因子の作用機構を決定するために、動物モデルにおいて使用され得る。さらに、本発明は、上記のスクリーニングアッセイにより同定された、本明細書中に記載される処置のための新規の因子の使用に関する。
【０２６１】
（Ｂ．合理的な薬物設計方法）
ＴＲＡＤＥおよびＴＲＡＤＥ結合ポリペプチド、特にＴＲＡＤＥ／結合パートナーヘテロダイマーの直接的な接触を形成するそれらの部分は、候補ＴＲＡＤＥ調節因子（例えば、アポトーシスの増殖または誘導のダウンレギュレーションにおける使用のための抗腫瘍性因子）の合理的な薬物設計に用いられ得る。実質的に純粋なＴＲＡＤＥポリペプチド／結合パートナー複合体およびタンパク質Ｘ線結晶学または他の構造分析方法に用いられ得る計算評価上のモデル（例えば、ＤＯＣＫプログラム（Ｋｕｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９；Ｋｕｎｔｚ　ＩＤ，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：１０７８））およびそれらの改変体の生成。したがって、強力な治療用薬物は、提供される構造情報に基づき合理的に設計され得る。１つの実施形態において、このような薬物は、ＴＲＡＤＥポリペプチド：結合パートナー複合体の形成を防止または増強するために設計される。従って、本発明は、ＴＲＡＤＥの結合パートナー（例えば、ＴＲＡＦ分子）への結合を阻害または推進する効力を有する薬物を含む薬物を設計するために用いられ得る。
【０２６２】
（Ｖ．本発明の他の使用および方法）
本明細書中に記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、および抗体は、以下の１つ以上の方法において用いられ得る：ａ）処置方法（例えば、好ましくは上皮細胞における増殖および／またはアポトーシスの上方調節または下方調節）；ｂ）スクリーニングアッセイ；ならびにｃ）予測的な医薬（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験、または薬理遺伝学）。本発明の単離された核酸分子は、例えば、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプル中の）またはＴＲＡＤＥ遺伝子中の遺伝的変化を検出するために、および本明細書でさらに記載されるようなＴＲＡＤＥ活性を調節するために、ＴＲＡＤＥタンパク質（例えば、遺伝子治療の適用における宿主細胞における組み換え発現ベクターを介して）を発現させるために用いられ得る。ＴＲＡＤＥタンパク質は、ＴＲＡＤＥインヒビターの不十分な産生かまたは過剰な産生により特徴付けられる障害を処置するために用いられ得る。さらに、ＴＲＡＤＥタンパク質は、天然に存在するＴＲＡＤＥ結合タンパク質をスクリーニングするために、ＴＲＡＤＥ活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングするために、ならびに、例えば、ＴＲＡＤＥタンパク質の不十分かもしくは過剰な産生か、またはＴＲＡＤＥ野生型タンパク質と比較して減少した活性かまたは異常な活性を有するＴＲＡＤＥタンパク質形態の不十分かもしくは過剰な産生により特徴付けられる、ＴＲＡＤＥの調節により利益を受ける障害を処置するために用いられ得る。さらに、本発明の抗ＴＲＡＤＥ抗体は、ＴＲＡＤＥタンパク質を検出および単離するため、ＴＲＡＤＥタンパク質の生物学的利用能を調節するために、およびＴＲＡＤＥ活性を調節するために用いられ得る。本発明の方法の好ましい実施形態において、例えば、ＴＲＡＤＥの検出、調節などは、上皮細胞（例えば、管の上皮細胞）において用いられ得る。好ましい実施形態において、この細胞は、例えば、ＴＲＡＤＥが、肝臓、肺、前立腺、脳、または腸からなる群より選択される組織発現される組織由来である。
【０２６３】
（Ａ．検出アッセイ）
サンプル中のＴＲＡＤＥ分子の存在を検出し得る因子（例えば、本明細書中で同定されたｃＤＮＡ配列（および対応する完全遺伝子配列）の一部またはフラグメント）、ＴＲＡＤＥファミリーポリペプチドまたは特異的なＴＲＡＤＥポリペプチドを認識する抗体）は、ＴＲＡＤＥ核酸またはポリペプチド分子を検出する多くの方法において用いられ得る。例えば、ＴＲＡＤＥ分子は、以下の順序で検出され得る：（ｉ）染色体上のそれらの遺伝子座をマップする；従って、遺伝的疾患に関連する遺伝子領域の位置を示す；（ｉｉ）わずかな生物学的サンプルから個体を同定する（組織タイピング）；（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的な同定を手助けする；または（ｉｖ）細胞においてＴＲＡＤＥが発現するか否かを検出するかまたは細胞におけるＴＲＡＤＥ発現のレベルを定量化するために検出する。
【０２６４】
例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、およびモニタリング臨床試験は、ＴＲＡＤＥ関連障害の処置により利益を受けるかまたはＴＲＡＤＥ関連障害を発症する危険にあり得る個体を同定するために用いられる。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織（好ましくは上皮細胞または組織））において、ＴＲＡＤＥタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＴＲＡＤＥ活性を決定し、個体が、疾患または障害に罹患しているか否か、または異常なＴＲＡＤＥ発現または活性に関連する障害を発症する危険にあるか否かを決定するための診断／予後アッセイに関する。本発明はまた、個体が、ＴＲＡＤＥタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害を発症する危険があるか否かを決定するための予後（予測的な）アッセイを提供する。例えば、ＴＲＡＤＥ遺伝子における変異は、生物学的サンプル中でアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的で用いられ、それによってＴＲＡＤＥタンパク質、核酸の発現、活性により特徴付けられるか、またはそれらに関連する障害の発症の前に個体を予防的に処置し得る。
【０２６５】
本発明の別の局面は、臨床試験におけるＴＲＡＤＥの発現または活性に対する因子（例えば、薬物、化合物）の影響のモニタリングを可能にする。
【０２６６】
好ましくは、ＴＲＡＤＥが発現される組織サンプル（または、組織サンプル由来の細胞）において、（例えば、肝臓細胞、前立腺細胞、肺細胞、脳細胞、または腸細胞のような上皮細胞において、）インスタントな診断アッセイ、予後アッセイ、または臨床アッセイが行われる。
【０２６７】
生物学的サンプル中のＴＲＡＤＥタンパク質または核酸の存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを獲得する工程、およびこの生物学的サンプルと、ＴＲＡＤＥタンパク質またはＴＲＡＤＥタンパク質をコードする核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物または因子を接触させ、その結果ＴＲＡＤＥタンパク質または核酸分子の存在が、生物学的サンプルにおいて検出される工程を包含する。ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための好ましい因子は、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号１もしくは配列番号３の核酸または別のＴＲＡＤＥファミリーのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、あるいはその一部（例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下でＴＲＡＤＥのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡもしくはＴＲＡＤＥαまたはＴＲＡＤＥβのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分であるオリゴヌクレオチド）のような、ＴＲＡＤＥ核酸であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブが、本明細書中に記載されている。
【０２６８】
ＴＲＡＤＥタンパク質を検出するための好ましい因子は、ＴＲＡＤＥタンパク質に結合し得る抗体、好ましくは検出可能な標識を備える抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が、用いられ得る。プローブまたは抗体に関する限り、用語「標識された」は、プローブまたは抗体と検出可能物質をカップリング（すなわち、物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接的な標識、ならびに直接的に標識された別の因子との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識を含むことが意図される。間接的な標識の例として、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出、蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るような、ビオチンを有する末端標識されたＤＮＡプローブの検出が挙げられる。用語「生物学的サンプル」は、被験体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞（好ましくは上皮細胞または上皮組織）、および液体から単離された組織、細胞、および生物学的な液体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法は、生物学的サンプル中のＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡをインビトロおよびインビボで検出するために用いられ得る。例えば、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術として、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＴＲＡＤＥタンパク質を検出するためのインビトロ技術として、酵素連結イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。ＴＲＡＤＥゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術として、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＴＲＡＤＥタンパク質を検出するためのインビボ技術として、抗ＴＲＡＤＥ抗体の被験体への導入が挙げられる。例えば、この抗体は、被験体におけるその存在および位置が、標準的な画像化技術により検出され得る放射線マーカーで標識され得る。
【０２６９】
１つの実施形態において、生物学的サンプルは、試験被験体由来のタンパク質分子を含む。あるいは、生物学的サンプルは、試験被験体由来のｍＲＮＡ分子または試験被験体由来のゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、従来の手段によって被験体から単離された血清サンプルである。
【０２７０】
別の実施形態において、この方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、コントロールサンプルとＴＲＡＤＥタンパク質、ｍＲＮＡ、もしくはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または薬剤とを接触させ、その結果、生物学的サンプル中のＴＲＡＤＥタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在が検出される工程、およびコントロールサンプル中のＴＲＡＤＥタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在と試験サンプル中のＴＲＡＤＥタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０２７１】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＴＲＡＤＥの存在を検出するためのキットを包括する。例えば、このキットは、生物学的サンプル中のＴＲＡＤＥタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る標識された化合物または薬剤；サンプル中のＴＲＡＤＥの量を測定するための手段；およびサンプル中のＴＲＡＤＥの量を標準と比較するための手段を備え得る。この化合物または薬剤は、適切な容器にパッケージングされ得る。このキットはさらに、ＴＲＡＤＥタンパク質または核酸の検出にこのキットを使用するための説明書を備え得る。
【０２７２】
本明細書中で記載される診断方法を使用してさらに異常なＴＲＡＤＥ発現もしくは活性と関連する疾患または障害を発症する危険性を有するか、またはそのような危険性にある被験体を同定し得る。例えば、本明細書中で記載されるアッセイ（例えば、前述の診断的アッセイまたは以下のアッセイ）を使用して、ＴＲＡＤＥタンパク質、核酸の発現もしくは活性に関連する障害を発症する危険性を有するか、またはそのような危険性にある被験体を同定し得る。従って、本発明は、異常なＴＲＡＤＥ発現もしくは活性に関連する疾患または障害を同定するための方法を提供し、ここで試験サンプルは被験体から得られ、そしてＴＲＡＤＥタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここでＴＲＡＤＥタンパク質または核酸の存在は、異常なＴＲＡＤＥ発現または活性に関連する疾患もしくは障害を発症する危険性を有するか、またはこのような危険性にある被験体について診断的である。本明細書中で使用される場合、「試験サンプル」は、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的液体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０２７３】
さらに、本明細書中で記載される予測的アッセイを使用して、異常なＴＲＡＤＥ発現または活性に関連する疾患もしくは障害を処置するために被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の候補薬物）を投与し得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、異常なＴＲＡＤＥ発現もしくは活性に関連する障害について薬剤で被験体が有効的に処置され得るか否かを決定するための方法を提供し、ここで試験サンプルが得られ、そしてＴＲＡＤＥタンパク質または核酸の発現もしくは活性が検出される（例えば、ここでＴＲＡＤＥタンパク質もしくは核酸の発現または活性の発生量は、異常なＴＲＡＤＥ発現もしくは活性に関連する障害を処置するための薬剤を投与され得る被験体について診断的である）。
【０２７４】
また、本発明の方法を使用してＴＲＡＤＥ遺伝子における遺伝子の変化を検出し得、これによって変化した遺伝子を有する被験体が、ＴＲＡＤＥ遺伝子に関連する障害についての危険性にあるか否かが決定される。好ましい実施形態において、この方法は、被験体由来の細胞サンプル中のＴＲＡＤＥタンパク質をコードする遺伝子の完全な状態に影響する変化もしくはＴＲＡＤＥ遺伝子の誤発現の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝子変化の存在または非存在を検出する工程を包含する。例えば、このような遺伝子の変化は、以下の少なくとも１つの存在を確かめることによって検出され得る：１）ＴＲＡＤＥ遺伝子由来の１以上のヌクレオチドの欠損；２）ＴＲＡＤＥ遺伝子への１以上のヌクレオチドの付加；３）ＴＲＡＤＥ遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換；４）ＴＲＡＤＥ遺伝子の染色体再配置；５）ＴＲＡＤＥ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルにおける変化；６）ＴＲＡＤＥ遺伝子の異常な改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターン）；７）ＴＲＡＤＥ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型スプライシングパターンの存在；８）ＴＲＡＤＥタンパク質の非野生型レベル；９）ＴＲＡＤＥ遺伝子の対立遺伝子欠損、および１０）ＴＲＡＤＥタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書中で記載されるように、当該分野で公知の多数のアッセイ技術が存在し、これらはＴＲＡＤＥ遺伝子の変化を検出するために使用され得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来的な手段で単離された組織サンプルまたは血清サンプル（例えば、神経組織サンプル）である。
【０２７５】
特定の実施形態において、変化の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ　ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）、あるいはまたライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７〜１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：３６０〜３６４）におけるプローブ／プライマーの使用に関連し、後者は特に、ＴＲＡＤＥ遺伝子の変異点の検出に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３：６７５〜６８２を参照のこと）。本方法は、患者から細胞サンプルを収集する工程、このサンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ，またはその両方）を単離する工程、ＴＲＡＤＥ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でＴＲＡＤＥ遺伝子に特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと核酸サンプルを接触させる抗体、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出するか、または増幅産物の大きさを検出してコントロールサンプルに対して長さを比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲが、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかと組み合わせて予備的な増幅工程としての使用が所望され得ることが予測される。
【０２７６】
代替的な増幅方法として以下：自己維持配列複製（ｓｅｌｆ　ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１８７４〜１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１１７３〜１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、１９８８、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１１９７）、または任意の他の核酸増幅方法が挙げられ、続いて当業者に周知の技術を使用して増幅された分子が検出される。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合にこのような核酸分子を検出するために特に有用である。
【０２７７】
代替的な実施形態において、サンプル細胞由来のＴＲＡＤＥ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変化によって同定され得る。例えば、サンプルＤＮＡおよびコントロールＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１以上の制限エンドヌクレアーゼで分解され、そしてゲル電気泳動によってフラグメント長サイズが決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡ間のフラグメント長サイズにおける差異は、サンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的リボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照のこと）は、リボザイム切断部位の発生または欠失によって特定の変異の存在について記録するために使用され得る。
【０２７８】
他の実施形態において、ＴＲＡＤＥにおける遺伝子の変化は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズすることによって同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら、１９９６、Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　７：２４４〜２５５；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２：７５３〜７５９）。例えば、ＴＲＡＤＥにおける遺伝子の変異は、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（前出）に記載されるような光発生（ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）ＤＮＡプローブを含む二次元的なアレイにおいて同定され得る。簡単には、連続的なオーバーラッピングプローブの線状アレイを作製することによって、プローブの第一のハイブリダイゼーションが配列間の塩基変化を同定するためのサンプルおよびコントロール中の長いＤＮＡストレッチを介するスキャンするために使用され得る。この工程は、変異点の同定を可能にする。この工程に続いて、特定の変異の特徴付けを可能にする第二のハイブリダイゼーションが、検出される改変体または変異体全てに相補的な特殊化したより小さなアレイを使用することによって、行われる。各変異アレイは、パラレルプローブセットから構成され、一方は野生型遺伝子に相補的であり、他方は変異遺伝子に相補的である。
【０２７９】
なお別の実施形態において、当該分野で公知である任意の種々の配列決定反応を使用して、ＴＲＡＤＥ遺伝子を直接的に配列決定し、そしてサンプルＴＲＡＤＥの配列とその対応する野生型（コントロール）配列を比較することによって変異を検出し得る。配列決定反応の例として、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（Ｓａｎｇｅｒ、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５４６３）によって開発された技術に基づく配列決定反応が挙げられる。任意の種々の自動化された配列決定手順が、質量分析による配列決定を含む診断的アッセイ（Ｌｅｆｅｖｒｅ，ＣＫ，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１９：４４８）を実施する場合に利用され得ることがまた意図される（例えば、ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら、１９９６、Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７〜１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら、１９９３、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７〜１５９）。
【０２８０】
ＴＲＡＤＥ遺伝子における変異を検出するための他の方法として、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖におけるミスマッチの塩基を検出する方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２）。一般的に、「ミスマッチ切断」の技術は、組織サンプルから得られた変異の可能性のあるＲＮＡまたはＤＮＡを有する野生型ＴＲＡＤＥ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡをハイブリダイズすることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供することによって開始する。二本鎖の二重鎖は、二重鎖のうちの一本鎖領域（例えば、これは、コントロール鎖とサンプル鎖間の塩基対ミスマッチに起因して存在する）を切断する薬剤で処理で処理される。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅで処理され得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはミスマッチ領域を酵素的に分解するＳ１ヌクレアーゼで処理される。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかが、ミスマッチ領域を分解するためにヒドロキシアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理され得る。ミスマッチ領域の分解後、次いで、生じた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズによって分離し、変異部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６〜２９５を参照のこと。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡは検出のために標識化され得る。
【０２８１】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、細胞サンプルから得られたＴＲＡＤＥにおける変異点を検出しそしてマッピングするための規定された系における二本鎖ＤＮＡのミスマッチ塩基対を認識する１以上のタンパク質（いわゆる、「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら、１９９４、Ｇａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　１５：１６５７〜１６６２）。例示的な実施形態に従って、ＴＲＡＤＥ配列（例えば、野生型ＴＲＡＤＥ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、そして存在する場合には、その切断産物は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０２８２】
他の実施形態において、電気泳動移動度における変化を使用してＴＲＡＤＥ遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖コンホメーション多型性（ＳＳＣＰ）を使用して、変異核酸および野生型核酸間の電気泳動移動度における差異を検出し得る（Ｏｒｉｔａら、１９８９、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ：８６：２７７６、Ｃｏｔｔｏｎ、１９９３、Ｍｕｔａｔ　Ｒｅｓ　２８５：１２５〜１４４；およびＨａｙａｓｈｉ、１９９２、Ｇｅｎｅｔ　Ａｎａｌ　Ｔｅｃｈ　Ａｐｐｌ　９：７３〜７９もまた参照のこと）。サンプルＴＲＡＤＥ核酸およびコントロールＴＲＡＤＥ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生させられる。一本鎖核酸の二次構造は、配列によって変化し、生じる電気泳動度の変化は、単一塩基の変化の検出さえ可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識されたプローブで標識されるかまたは検出され得る。アッセイの感度は、ＲＮＡ（ＤＮＡよりもむしろ）を使用して高められ、ここで二次構造が配列における変化に対してより感受性である。好ましい実施形態において、本方法は、電気泳動移動度における変化に基づいて、二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するヘテロ二重鎖分析を使用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ　７：５）。
【０２８３】
なお別の実施形態において、変性剤勾配を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異フラグメントまたは野生型フラグメントの移動度は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる（Ｍｙｅｒｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　３１３：４９５）。ＤＧＧＥが分析方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高融点のＧＣに富むＤＮＡのＧＣクランプを添加することによって完全に変性されないことを保証されて改変される。さらなる実施形態において、温度勾配が変性勾配に代わって使用されてコントロールＤＮＡとサンプルＤＮＡの移動度における差異が同定される（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ、１９８７、Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｃｈｅｍ　２６５：１２７５３）。
【０２８４】
変異点を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで完全な一致が見出された場合にのみハイブリダイザーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされ得る（Ｓａｉｋｉら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２４：１６３；Ｓａｉｋｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする膜に結合されて標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多数の異なる変異体にハイブリダイズされる。
【０２８５】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅による対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と組み合わせて使用され得る。特異的な増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に目的の変異を保有し得るか（結果として、増幅は、示差的ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８）または１つのプライマーの極３’末端でこの分子を保有する（ここで、適切な条件下、ミスマッチは、ポリメラーゼ伸長を阻害または減少し得る）（Ｐｒｏｓｓｎｅｒら、１９９３、Ｔｉｂｔｅｃｈ　１１：２３８）。さらに、切断に基づく検出を作成するために変異領域に新規な制限部位を導入することが所望され得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｂｅｓ　６：１）。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される（Ｂａｒａｎｙ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８８：１８９）。このような場合において、５’配列の３’末端で完全な一致が存在する場合にのみ連結が生じ、増幅の存在または非存在を見つけることにより特異的な部位での既知の変異の存在を検出可能にする。
【０２８６】
本明細書中で記載される方法は、例えば、本明細書中に記載されたプローブ核酸または抗体試薬の少なくとも１つを備える予めパッケージングされた診断的キットを使用することによって実施され得る。これは、例えば、ＴＲＡＤＥ遺伝子に関連する疾患もしくは病気の症状または家族歴を示す患者を診断するための臨床的設定において簡便に使用され得る。
【０２８７】
さらに、ＴＲＡＤＥが発現される任意の細胞型または組織は、本明細書中で記載される予後アッセイに使用され得る。
【０２８８】
（ＶＩ．ＴＲＡＤＥ調節剤の投与）
本発明のＴＲＡＤＥ調節剤は、Ｔ細胞媒介免疫応答を増強するかまたは抑制するいずれかのために、インビボでの薬学的投与に適切な生物学的に適合性の形態で被験体に投与される。「インビボでの投与に適切な生物学的に適合性の形態」によって、任意の毒性効果がタンパク質の治療効果よりも上回らないタンパク質の投与されるべき形態が意味される。用語「被験体」は、免疫応答が惹起され得る生きている生物（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。被験体の例として、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびこれらのトランスフェニック種が挙げられる。本明細書中に記載される薬剤の投与は、治療的活性量の薬剤を単独でまたは薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む任意の薬理学的形態であり得る。
【０２８９】
本発明の治療的組成物の治療的に活性な投与量は、投薬時の有効量および所望の結果を達成するために必要な期間についての有効量として規定される。例えば、ＴＲＡＤＥ調節剤の治療的活性量は、疾患状態、年齢、性別、個体の体重、および所望される応答を惹起するペプチドのその個体中での能力のような因子によって変化し得る。投薬レジメンは、最良の治療応答を提供するように調整され得る。例えば、いくつかに分けられた用量は、毎日投与され得るか、またはその用量は、治療状況の緊急性によって示されるように比例的に減少させ得る。
【０２９０】
本発明の治療組成物または薬学的組成物は、当該分野で公知の適切な経路（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、経皮投与、髄腔内投与、または大脳内投与）匂いて、または細胞に、エキソビボ処置プロトコールにおいて投与され得る。投与は、注射によって急速にか、またはゆっくりとした注入または徐放剤の投与によって、しばらくの時間に渡ってかのいずれかであり得る。中枢神経系における組織の処置のための投与は注射または脳脊髄液（ＣＳＦ）への注入であり得る。ＴＲＡＤＥポリペプチドが、中枢神経系における細胞へ投与されることが意図される場合、投与は、血液脳関門を通ってのＴＲＡＤＥポリペプチドの貫入を促進し得る１つ以上の因子と共にされ得る。
【０２９１】
ＴＲＡＤＥ分子はまた、所望される薬学的特性または薬物動態学的特性を提供する因子と結合、抱合、または投与され得る。例えば、ＴＲＡＤＥは、貫入を促進、または血液脳関門を通る輸送を促進することが当該分野で公知の任意の物質（例えば、トランスフェリンレセプター）に結合され得、そして静脈内投与され得る（例えば、参考として援用される、Ｆｒｉｄｅｎら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：３７３〜３７７を参照）。さらに、ＴＲＡＤＥは、所望される溶解特性、安定特性、半減期、および他の薬学的に利点のある特性を得るためのポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）に安定に結合され得る（例えば、参考として援用される、Ｄａｖｉｓら、１９７８、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｅｎｇ　４：１６９〜１７３；Ｂｕｒｎｈａｍ、１９９４、Ａｍ　Ｊ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　５１：２１０〜２１８を参照）。
【０２９２】
さらに、ＴＲＡＤＥ分子は、細胞の細胞質内への送達を援助する組成物中にあり得る。例えば、ＴＲＡＤＥ分子は、細胞の細胞質内にペプチドを送達し得るキャリアー成分（例えば、リポソーム）に結合され得る。このような方法は、当該分野で周知である（例えば、参考として援用される、Ａｍｓｅｌｅｍら、１９９３　Ｃｈｅｍ　Ｐｈｙｓ　Ｌｉｐｉｄｓ　６４：２１９〜２３７を参照）。あるいは、ＴＲＡＤＥ分子は、特定の輸送ペプチドまたは細胞内にＴＲＡＤＥ分子を送達し得る輸送ペプチドを有するよう修飾し得る。さらにこの分子は、マイクロインジェクションによって細胞に直接送達され得る。
【０２９３】
この組成物は、通常薬学的調製物の形態で用いられる。このような調製物は、薬学分野で周知の様式において作製される。特定の好まれる調製物は、生理食塩水溶液のビヒクルを利用するが、しかし他の薬学的に受容可能なキャリアー（例えば、生理学的濃度の他の非毒性の塩、５％グルコース水溶液、滅菌水など）もまた使用され得る。本明細書で使用される「薬学的に受容可能なキャリアー」とは、任意のまたは全ての溶液、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒質および薬物の使用は、当該分野で周知である。活性な化合物に不適合である任意の従来の媒質または薬物の範囲を除外すれば、治療化合物においてのこれらの使用は、適合する。補充性の活性化合物はまた、組成物に含まれ得る。適切な緩衝液が組成物中に存在することが所望され得る。必要とされる場合、この溶液は、凍結乾燥され、そして滅菌注射用水の添加により再構成される、滅菌アンプルに保存され得る。主な溶媒は、水溶性または非水溶性であり得る。ＴＲＡＤＥはまた、処置が必要な組織に移植され得る個体または半個体の生物学的適合性の基質に含まれ得る。
【０２９４】
キャリアーはまた、処方物のｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色、無菌、安定性、不溶性の割合、または匂いを修飾または維持するための薬学的に受容可能な他の賦形剤を含む。同様に、キャリアーは、放出または吸収または血液脳関門を通る輸送を修飾または維持するための薬学的に受容可能な他の賦形剤をなお含む。このような賦形剤は、これらの物質が、単回用量形態または複数回用量形態のいずれかにおいての非経口投与のため、もしくは連続的または周期的な注入による直接の注入のための投与処方に、通常かつ慣用的に用いられる。
【０２９５】
投与は、投与される処方物の薬物動態学的パラメーターおよび使用される投与経路に依存して繰り返され得る。ＴＲＡＤＥ分子を含む特定の処方物またはこれらのフラグメントが、経口的に投与されることが提供される。このような処方物は、好ましくはカプセル化され、そして固体投与形態中の適切なキャリアーに処方される。適切なキャリアー、賦形剤、および希釈剤のいくつかの例は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン（ｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウム、ステアリン酸塩、水、鉱油などを含む。処方物は、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、保存剤、甘味剤、または、矯味矯臭剤をさらに含む。当該分野で周知の手順を用いて患者に投与した後に、組成物は、迅速に提供され、維持、または活性な成分の放出が遅延されるよう処方され得る。処方物はまた、タンパク質分解を減少する物質および／または　例えば、表面活性因子吸収を促進する物質を含み得る。
【０２９６】
投与および用量の一定化を簡単にするため、用量単位形態で非経口組成物を処方することは、特に有用である。本明細書で用いられる用量単位形態は、処置される哺乳動物対象に対する用量単位として適切な、物理的な解離単位を反映し；所望の薬学的キャリアーに関する所望の治療効果を生成するよう計算された活性化合物の各規定の用量である。本発明の用量単位形態の特徴は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、および（ｂ）個体における処置の感受性のために活性化合物のような当該分野の配合物を固有に制限すること、に支持されそして、直接依存する。特異的用量は、当業者によって簡単に計算され得る（例えば、患者のおよその体重または体表面積または身体の占める体積に従う）。用量はまた、選択される特定の投与経路に依存して、計算される。さらに、処置のための適切な用量を決定するために必要な計算の改良点は、当業者によって慣用的になされる。標的細胞のアッセイ調製においての本明細書に開示される活性の見地において、このような計算は、当業者による過度の実験を伴わずになされ得る。正確な用量は、標準用量−応答研究との組み合わせにおいて決定される。実際に投与される組成物の用量は、熟練者によって決定され、関連する状況（処置されるべき状況、投与されるべき組成物の選択、年齢、体重、および個々の患者の応答、患者の症状の重症度、および選択された投与経路を含む）によって決定される。
【０２９７】
このような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養物または、実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死の量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な量）を決定する）。毒性と治療効力の間の用量比は、治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比として現れされ得る。大きな治療指数を示す化合物が、好まれる。毒性の副作用を有する化合物が用いられ得る場合、非感染細胞への潜在的損傷を最小にし、副作用を減少するため、このような化合物を発症した組織部位に標的化する送達システムを設計することに関心が持たれる。
【０２９８】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方することに利用され得る。この化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどないか、まったくないＥＤ５０を含む循環中濃度の範囲にある。用量は、用いられる用量形態および利用される投与経路に依存する範囲内で変化し得る。本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効量は、細胞培養アッセイからはじめに推定される。用量は、ＩＣ５０（すなわち、症状の阻害を最大の半分にする試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲に達するように、動物モデルにおいて計算され得る。このような情報は、ヒトにおける使用用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィによって測定され得る。
【０２９９】
本発明の１つの実施形態において、生物学的に活性なＴＲＡＤＥ形態またはＴＲＡＤＥの前駆体（すなわち、体内においてＴＲＡＤＥの生物学的活性形態に容易に変換され得る分子）を生成し得るベクターまた細胞を患者に移植することによってＴＲＡＤＥ分子は、治療的に投与され得る。１つのアプローチにおいて、ＴＲＡＤＥを分泌する細胞は、患者に移植するために半透性膜内にカプセル化され得る。細胞は、通常ＴＲＡＤＥを発現する細胞か、もしくはこれらの前駆体であり得るか、またはＴＲＡＤＥを発現するよう形質転換された細胞であり得るか、またはこれらの生物学的に活性なフラグメントもしくはこれらの前駆体であり得る。患者がヒトである場合、細胞がヒト由来であることおよびＴＲＡＤＥ分子がヒトＴＲＡＤＥであることが好ましい。しかし、本明細書の処方物および方法が、ヒトの適用と同様に獣医学のために使用され得、本明細書において使用される用語「患者」または「被験者」は、ヒトおよび獣医学的患者を含むことが　意図される。
【０３００】
ＴＲＡＤＥタンパク質の発現または活性における因子（例えば、薬物または化合物）の効果をモニターすることは、基本的な薬物スクリーニングにおいてのみならず、臨床試験においても適用され得る。例えば、本明細書に記載のようにスクリーニングアッセイによって決定される、増大したＴＲＡＤＥ遺伝子発現、タンパク質レベル、またはＴＲＡＤＥ活性の上方制御に対する因子の効果は、減少したＴＲＡＤＥ遺伝子発現、タンパク質レベル、またはＴＲＡＤＥ活性の下方制御を呈する被験者の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される、減少したＴＲＡＤＥ遺伝子発現、タンパク質レベル、またはＴＲＡＤＥ活性の下方制御に対する因子の効果は、増大したＴＲＡＤＥ遺伝子発現、タンパク質レベル、またはＴＲＡＤＥ活性の上方制御を呈する被験者の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験においてＴＲＡＤＥ遺伝子、および好ましくは、障害において関連する他の遺伝子の発現または活性は、特定の細胞の表現型の「出力」またはマーカーとして使用され得る。
【０３０１】
例えば、ＴＲＡＤＥ活性（例えば、本明細書において記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される）を修飾する因子（例えば、化合物、薬物または小分子）を用いた処置によって、細胞内で修飾される遺伝子（ＴＲＡＤＥを含む）が同定され得る。したがって、例えば、臨床試験において、障害に関するＴＲＡＤＥにおける因子の効果の研究するために、細胞は単離され得て、ＲＮＡを調製し、ＴＲＡＤＥまたは他の遺伝子の発現レベルについての分析は、ＴＲＡＤＥに関する障害において関連している。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書において記載されるようにノザンブロット解析またはＲＴ−ＰＣＲによって定量され得るか、または本明細書に記載の方法の１つにより、生成されたタンパク質の量を定量することによってか、またはＴＲＡＤＥもしくは他の遺伝子の活性レベルを測定することによって定量され得る。この方法において、遺伝子発現パターンは、マーカーとして役立ち、因子に対する細胞の生理学的応答を示す。したがって、この応答状態は、因子を用いた個体の処置の前および、その間の様々な時点において決定され得る。
【０３０２】
好ましい実施形態において、本発明は、因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模擬物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または本明細書において記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補）を用いた被験者の処置の効果のモニタリングの方法を提供し、これは、以下の工程を含む；（ｉ）因子の投与の前に患者から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）投与前サンプルのＴＲＡＤＥタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルの検出する工程；（ｉｉｉ）被験者から１つ以上の投与後のサンプルを得る工程；（ｉｖ）投与後のサンプルにおけるＴＲＡＤＥタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）投与前サンプル中のＴＲＡＤＥタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを投与後サンプル中のＴＲＡＤＥタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較する工程；および（ｖｉ）患者にしたがって因子の投与を変える工程。例えば、因子の投与を増大することは、ＴＲＡＤＥの発現または活性を検出されるよりも高いレベル（すなわち、因子の効果の増大）に増大するために望まれ得る。あるいは、因子の投与を減少することは、ＴＲＡＤＥの発現または活性を検出されるよりも低いレベル（すなわち、因子の効果の減少）に減少するために望まれ得る。このような実施形態にしたがって、ＴＲＡＤＥの発現または活性は、観察可能な表現型の応答が不在の場合においても、因子の効果の指標として用いられる。
【０３０３】
好ましい実施形態において、ＴＲＡＤＥの発現および／または活性の修飾に由来する、被験者の上皮細胞におけるアポトーシスを修飾するＴＲＡＤＥ修飾因子の能力は、因子の投与後の患者の状況の改善を検出することによって測定され得る。患者の特定の状況に適切な指標を用いて、このような改善は、当業者によって簡単に測定され得る。生検材料の収集が、患者に対する増大したリスクおよび／または有害性を示す場合、患者の状態の変化を測定することによって、患者の応答をモニターすることが好ましい。
【０３０４】
ＴＲＡＤＥのレベルは、種々の状況において変化し得、そしてＴＲＡＤＥレベルの定量は、臨床的に有用な情報を提供する。さらに細胞によって発現されるＴＲＡＤＥの増大したレベルが、生存度の減少した細胞を細胞死制御機構へ導くため、細胞（例えば、細胞、組織、または新形成などの群においての）におけるＴＲＡＤＥレベルの定量は、細胞のアポトーシス状態に関する有用な情報を提供する．さらに、ＴＲＡＤＥ−相互作用ポリペプチドの細胞内レベルの決定がまた必要とされ得る。
【０３０５】
さらに、疾患状態の処置において、ＴＲＡＤＥを含む組成物は、外因的に投与され得、そして血清中、任意の所望される組織区画中または発症した組織中のＴＲＡＤＥポリペプチドが特定の標的レベルに達することが必要とされる。したがって、患者または患者から得た組織生検サンプルを含む生物学的サンプル中のＴＲＡＤＥポリペプチドのレベルをモニタリングし得る利点があり、そしていくつかの場合、ＴＲＡＤＥのレベルをモニタリングし、いくつかの状況においてＴＲＡＦまたは別のＴＲＡＤＥ−相互作用ポリペプチドをモニタリングする利点がある。したがって、本発明はまた、患者由来のサンプル中のＴＲＡＤＥの存在を検出する方法を提供する。
【０３０６】
（ＶＩＩ．本発明のキット）
本発明の別の局面は、スクリーニングアッセイ（本発明の方法または診断アッセイの修飾）を実施するキットに関する。例えば、本発明のスクリーニングアッセイを実施するキットは、ＴＲＡＤＥポリペプチド、ＴＲＡＤＥポリペプチド活性を検出する手段、およびＴＲＡＤＥ活性の修飾因子を同定するキットの使用のための説明書を備える。別の実施形態において、本発明のスクリーニングアッセイを実施するキットは、ＴＲＡＤＥポリペプチド、ＴＲＡＤＥ活性を検出する手段、およびＴＲＡＤＥ活性の修飾因子を同定するキットの使用のための説明書を備える。
【０３０７】
別の実施形態において、本発明は、本発明の修飾方法を実施するためのキットを提供する。このキットは、例えば、ＴＲＡＤＥ活性を修飾する修飾因子の使用のための説明書を備えた、適切なキャリアー中および適切な容器に包装された、本発明の修飾因子（例えば、ＴＲＡＤＥ阻害因子または刺激因子）を含む。
【０３０８】
本発明の別の局面は、患者における異常なＴＲＡＤＥ発現および／または活性に関する障害を診断するためのキットに関する。このキットは、ＴＲＡＤＥの発現を決定するための試薬（例えば、ＴＲＡＤＥ　ｍＲＮＡを検出するための核酸プローブまたはＴＲＡＤＥタンパク質を検出するための１つ以上の抗体）、被験者の結果と比較するコントロール、および診断目的のためのキットを使用するための説明書を含む。
【０３０９】
全ての引用される参考文献（本出願（背景を含む）を通して引用された印刷物文献、公布された特許、公開された特許出願を含む）のコンテンツは、本明細書中に明確に参考として援用される。本発明の実行は、他に指示がなければ、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学（これらは当該分野の範囲である）の従来の技術を使用する。このような技術は、この文献において十分に説明される。例えば、以下を参照のこと：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｉｔｓｈｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｔａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ（Ｒ．Ｉ．Ｆｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌ　ＡｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；学術論文、Ｍｅｔｈｏｄ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ）；Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｔａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｔａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）。
【０３１０】
（実施例）
本発明を、以下の実施例によってさらに例示するが、これはいかなる方法によっても制限として作成されるものではない。
【０３１１】
（実施例１．ＴＲＡＤＥの分子クローニングおよび遺伝子マッピング）
酵母ベースのシグナル配列トラップ（ｔｒａｐ）を使用して、ヒト骨髄間質細胞株ＨＡＳ３０３（Ｊａｃｏｂｓら、１９９７、Ｇｅｎｅ、１９８：２８９〜２９６）由来の分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡを同定した。これらのｃＤＮＡのコンピューター分析は、クローンＯＡＦ０６５（これはＴＮＦレセプターファミリー（図１）のシステインの豊富なドメイン特徴と相同性を有する）を同定した。このレセプターをコードする全長ヒトｃＤＮＡ（後にＴＲＡＤＥと呼ばれる）は、３’ｃＤＮＡ末端迅速増幅（３’ＲＡＣＥ）を使用してＨＡＳ３０３細胞およびＨＵＶＥＣ細胞から単離された。
【０３１２】
２つの明確なＴＲＡＤＥｃＤＮＡ（ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβ）が単離された。これらのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、５’末端で同一であるが、しかしＴＲＡＤＥの最後のＣ末端アミノ酸をコードする領域の近くが異なる（図２）。ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβの両方は、２５アミノ酸の同一な推定Ｎ末端シグナル配列、１６８アミノ酸の成熟細胞外領域および単一の膜貫通ドメインを有する。この細胞外領域は、ＴＮＦ−Ｒファミリーのシステインの豊富なドメインと相同な２つのドメインを含む（図３）。保存されたシステインは四角で囲まれ、そして最適な整列のために導入された間隔は点で示される（図３）。この第２ドメインは、一致するシステインの豊富なドメインと不完全に適合し得るシステインの豊富な領域に続く。ＨＭＭ調査について規定されたシステインの豊富なドメインは、ＰＦＡＭ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＰＦ０００２０（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）を割当てられる。このような不完全な適合は、いくつかの他のファミリーメンバー（例えばＴＮＦＲＩ（Ｗｙｌｌｉｅ、１９９７、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、７３：１８９〜１９７）およびＨＶＥＭ（Ｈａｒｒｏｐら、１９９８、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２７３：２７５４８〜２７５５６））において見出される。さらに、いくつかの他のファミリーメンバー（例えば、４−１ＢＢおよびＣＤ２７（Ｇｒａｖｅｓｔｅｉｎら、１９９３、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３：９４３〜９５０））において見出されるような、セリン／スレオニン／プロリンの豊富な伸展が細胞外膜近傍領域に存在する。ＴＲＡＤＥαの細胞内領域は、２３４アミノ酸からなり、他のＴＮＦファミリーメンバーとの明確な相同性は存在せず、死亡ドメイン（ｄｅａｔｈ　ｄｏｍａｉｎ）の欠失を含む（例えば、ＴＮＦ−ＲＩ（Ｋｉｔｓｏｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ、３８４：３７２〜３７５）。ＴＲＡＤＥβの細胞内領域は、ＴＲＡＤＥαとこの配列を共有するが、しかし２アミノ酸においてＴＲＡＤＥαと異なり、そしてそのＣ末端において６のさらなるアミノ酸を有する（図２）。
【０３１３】
ＴＲＡＤＥのマウスオルソログを、ランダムプライムによって３２Ｐで標識したヒトＴＲＡＤＥｃＤＮＡプローブと、減少したストリンジェンシーでハイブリダイゼーションによって単離した。ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡで、１６時間５７℃で実行した。洗浄を、１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで５７℃で行った。１つの交差ハイブリダイズクローンが、総量のＣ５７／ＢＬ６　ｅｍｂｒｙｏ　ｄａｙ　１７　ｃＤＮＡライブラリーの１×１０６λＺｉｐｌｏｘプラーク中に見出された。このＤＮＡによってコードされるこの推定アミノ酸配列は、成熟細胞外領域および成熟膜貫通領域において、ヒトＴＲＡＤＥαと８４％の同一性（８７％の類似性）を有し、そして細胞内領域において、６１％の同一性（６５％の類似性）を有する（図４）。保存されたドメインを棒で示し、これは２つのシステインの豊富なドメイン（ＣＤＲ１およびＣＤＲ２）ならびに膜貫通領域（ＴＭ）を含む。Ｎ−グルコシル化の予測部位を、矢印で示す（図４）。
【０３１４】
マウスＴＲＡＤＥｃＤＮＡの３’非翻訳領域の部分を増幅するプライマーを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＭ．ｓｐｒｅｔｕｓとの間の単一鎖配位多型（ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）を検出した。これは以前に記載される（Ｂｅｉｅｒら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：９１０２〜９１０６；Ｂｅｉｅｒ、１９９３、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ、４：６２７〜６３１）技術である。このマウスｔｒａｄｅ遺伝子を、ＸマイクロサテライトマーカーのＬＯＤ尤度（ｌｉｋｌｉｈｏｏｄ）スコアを用いて、染色体１４をマッピングして見出した。以下のプライマーの対（Ａ）５’−ｄＡＧＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＴＧ−３’（配列番号７）および（Ｂ）５’−ｄＣＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧ−３’（配列番号８）で、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＭｕｓ　ｓｐｒｅｔｕｓとの間の多型を同定し、次いでこれを使用して（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１　Ｘ　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ戻し交配のＤＮＡを試験した。この系統分布データを、Ｍａｐ　Ｍａｎｅｇｅｒプログラム（Ｍａｎｌｅｙ、１９９１、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ、４：３０）を使用して分析した。
【０３１５】
（実施例２．ＴＲＡＤＥｍＲＮＡの組織分布）
ヒトおよびマウスの複数組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手）を、α−３２ＰｄＣＴＰの組込みによってランダムプライムにより標識されたヒトｃＤＮＡでプローブした。ブロットを、ＱｕｉｋＨｙｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）においてハイブリダイズし、次いで２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で室温３０分をそれぞれ２回、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ中で６５℃３０分で洗浄し、Ｋｏｄａｋ　ＢｉｏＭａｘ　ＭＲ　フィルム（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に露光した。ノーザンブロットハイブリダイゼーション分析で、成体ヒト心臓、肺、脾臓、腎臓、甲状腺、骨髄、卵巣、子宮、子宮頸、胎盤、精巣、前立腺および膵臓のポリＡ＋ＲＮＡにおける、およそ４．４ｋｂの重要なＴＲＡＤＥｍＲＮＡ転写産物を明らかにした。一連の、ヒト胃腸管由来のポリＡ＋ＲＮＡの分析で、空腸、回腸、結腸および直腸における低レベルの発現、そして胃におけるより高いレベルの発現を明らかにした。さらに、４．４ｋｂＴＲＡＤＥｍＲＮＡに対する非常に強いノーザンブロットハイブリダイゼーションシグナルを、胎児腎臓および脳のポリＡ＋ＲＮＡにおけるより低いレベルと比較して、ヒト胎児肺および肝臓のポリＡ＋ＲＮＡにおいて検出した。４．４ｋｂの転写産物を、脳、肺、骨格筋および肝臓由来のマウスポリＡ＋ＲＮＡにおいて検出した。転写産物はまた、マウス胚ＲＮＡにおいて、１５日目よりも前は比較的高い発現で、検出された。
【０３１６】
インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、成体マウス組織切片におけるＴＲＡＤＥの発現についての原因である細胞集団を同定し、そしてマウス胚の発育の間のＴＲＡＤＥ発現の部位を決定した。（１２９ＳＶ　Ｘ　Ｃ５７／ＢＬ６）Ｆ１系統の胚および成体マウス切片に対するインサイチュハイブリダイゼーションを、センスおよびアンチセンス３５Ｓ−ＵＴＰ標識プローブ（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して、実質的に（Ｌｙｏｎｓら、１９９０、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１１１：１４６５〜１４７６）に記載されるように行った。インビトロＲＮＡ合成のために使用されるこのＴＲＡＤＥｃＤＮＡテンプレートは、３’非翻訳領域の４００ｂｐからなった。使用したこのハイブリダイゼーションプローブは、マウスＴＲＡＤＥｃＤＮＡの３’非翻訳領域の４００ｂｐからなる放射標識されたＲＮＡ転写産物であった。Ｅ９．５日目、Ｅ１２．５日目、およびＥ１５．５日目のマウス胚の切片、ならびに成体前立腺、肺および脳を、このプローブで分析した。センスプローブコントロールとのハイブリダイゼーションを、平行連続切片において行った。このセンスプローブは、低水準のバックグラウンドハイブリダイゼーションを提供した。
【０３１７】
Ｅ９．５において、この胚がおよそ２５の体節を有する場合、ＴＲＡＤＥ発現は、神経系の発育において検出され得た。この段階において、正常胚は明確な頭を有し、そして脳の小領域が目に見えて形成される。このＴＲＡＤＥ転写産物を、脳の感覚上皮および神経管の背側の領域（ここは感覚ニューロンが発育する）に局在化した。転写産物をまた、神経管の隣接領域における沿軸中胚葉において検出した。これは筋肉が発育する部位である。
【０３１８】
Ｅ１２．５において、成体において見られる多くの中枢神経系構造が、分化し始める。この時点で、ＴＲＡＤＥの発現を、子宮頚および前脳の海馬領域、中脳の視床および小丘において、ならびに発育する眼茎において観察し得た。発現をまた、蝸牛、歯蕾、顎および肺において検出し得た。この段階での筋肉において検出される発現は、前にＥ９．５日で検出された沿軸中胚葉発現と関連があり得た。ＴＲＡＤＥの発現をまた、全体の外胚葉において観察し得た。ＴＲＡＤＥの転写産物は、他の脳の領域および器官（例えば、肝臓）には存在しなかった。
【０３１９】
Ｅ１５と比較してＥ１７でＴＲＡＤＥのより低い発現を示すノーザンブロットの結果と一致して、検査した前の段階よりも、存在するＴＲＡＤＥ転写産物がＥ１５．５でより少なかった。ＴＲＡＤＥの発現を、海馬および歯蕾および肺の気管支において観察した。Ｅ１２．５において見られたように、ＴＲＡＤＥ転写産物は、肝臓、腎臓および心臓のような器官で存在しないかまたは非常に少なかった。
【０３２０】
成体マウスの前立腺切片において、ＴＲＡＤＥの発現を、腺上皮において観察し得た。この成体肺は、気管支の腺上皮に局在すべきＴＲＡＤＥ発現が観察される器官における胎仔器官に似ていた。成体の脳における発現は、非常に低く、そして海馬に限定して現れた。
【０３２１】
ノーザンブロット分析が、ヒト前立腺における高いレベルのＴＲＡＤＥ発現を明らかにしたので、ヒト前立腺切片の免疫組織化学染色を、ｍＡＢ＃８およびｍＡｂ＃１６を用いて行った（実施例３を参照のこと）。さらに、免疫組織化学を使用して、小腸および肝臓における、ノーザンブロットによって検出されたＴＲＡＤＥ発現のより低いレベルの原因である細胞を局在化した。
【０３２２】
パラフィン包埋したヒト組織切片を、アルコールで蝋を取り除き、そして外因性ペルオキシダーゼを、メタノール中の０．５％（ｗ／ｖ）過酸化水素でブロックした。このｍＡｂを、１０％（ｗ／ｖ）正常ブタ血清を有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）で、この切片と１時間インキュベートした。非肝臓切片において、一次ｍＡｂを、ＴＢＳ中のビオチン結合ヤギ抗マウス／ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ）で３０分間検出した。着色を、ＴＢＳで１：１００に希釈したストレプトＡＢＣ複合体／西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ）を用いて３０分間検出し、その後ＤＡＢで５分間インキュベートし、そしてマイヤーのヘマトキシリンにおいて対比染色した。ヒト肝臓切片において、第２工程を、１０％（ｗ／ｖ）正常ブタ血清）を含むＴＢＳで希釈したペルオキシダーゼ−ウサギ抗マウス−ＩｇＧおよびペルオキシダーゼ−ブタ抗ウサギＩｇＧと置き換えた。
【０３２３】
針生検または掻爬によって収集された８つのヒト前立腺標本を、上記に記載されるように処理をした後に検査した。これらのうちの４つが、悪性腫瘍の証拠を示さない良性の前立腺であり、４つが前立腺癌を含んだ。ｍＡＢ＃８およびｍＡｂ＃１６の両方を個々に試験し、そして観察された染色を、０（何もない）から３＋（強い／拡散）まで記録した。この得られた結果を、表１および表２に示した。それぞれのｍＡｂは、実質的に同一の結果を示した。マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールは、これらの試料の特異的な染色を示さなかった。良性前立腺サンプルにおいて、中程度から強度の拡散した染色は、４つの標本のそれぞれの腺上皮において存在した。病巣の免疫応答をまた、平滑筋において見出し、そして２つの事例は、より弱い上皮の染色を示した。この４つの前立腺癌標本は、同様の、腺上皮における強く、拡散した染色の結果を示した。このシグナルは、おそらく腺癌の悪性増殖の結果として、より強かった。
【０３２４】
【表２】
2004501604.tif 000004
【０３２５】
【表３】
2004501604.tif 000005
３つのさらなる検体を調べた：１）ドナーから取り出した、移植のために使用する正常な肝臓；２）この疾患の生化学的特徴、血清学特徴および組織学的特徴を有する移植患者由来の肝切除検体から得られた原発性胆汁性肝硬変（ｐｒｉｍａｒｙ　ｂｉｌｌｉａｒｙ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）；および３）よく分化した癌を有する肝臓から、外科的切除において得られた肝細胞癌。＃８および＃１６のｍＡｂｓの両方が、各検体に類似の結果を与えた。正常な肝臓において、胆管の強い染色（３＋）が存在し、肝細胞（２＋）の中程度の汎細葉性細胞質染色（ｐａｎａｃｉｎａｒ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）が存在し、そして肝臓の動脈、門脈、および肝静脈における、微弱な内皮の染色（１＋）が存在した。原発性胆汁性肝硬変において、胆管の強い染色（３＋）がまた存在し、そして肝細胞の強い汎細葉性細胞質染色（３＋）が存在した。肝細胞癌検体において、両方のｍＡｂｓを用いた、腫瘍細胞の強い染色が存在した。
【０３２６】
ＴＲＡＤＥの発現プロファイルは、このレセプターが、作用する潜在能力を有する、細胞の状況を規定する。分析によって、成人の、前立腺、肺、卵巣、ならびに胎児の、肺および肝臓での最も高いレベルを伴った様々な組織および器官における、ヒトＴＲＡＤＥの発現を示した。さらに重要なことには、免疫組織化学を使用して、ＴＲＡＤＥが、前立腺、耳下腺および精巣の管の上皮組織に主に局在していることを示した。胆管について観測された強い染色はまた、ＴＲＡＤＥの上皮の発現に起因し得る。インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、マウスの成体精巣おいて、ＴＲＡＤＥ発現の優勢な部位がまた、腺上皮であり、そして成体の肺において、ＴＲＡＤＥ発現の優勢な部位は気管上皮であることを示した。さらに、このＴＲＡＤＥ遺伝子はまた、胚の別個の部位で発現し、この部位は、胎児の肺における発生している気道の内層、および発達している神経系における内層を含む。ＴＮＦ−Ｒファミリメンバー、外胚葉性形成異常レセプター（これの欠失は、マウスダウンレス（ｄｏｗｎｌｅｓｓ）変異体で見出された毛胞（ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ）の特異化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の欠損の原因となる（ＨｅａｄｏｎおよびＯｖｅｒｂｅｅｋ、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２２：３７０〜３７４））の現在のポジショナルクローニングが、発生過程でのこのレセプターファミリーの重要性の根底にある。
【０３２７】
さらに、ＴＲＡＤＥが、前立腺および腺癌細胞系における管の上皮細胞から生じる原発性腺癌にて見出された。ＴＲＡＤＥ、ＣＤ４０およびｐ７５ＮＧＦＲの各々は、上皮細胞で発現される（ＤｅｌｓｉｔｅおよびＤｊａｋｉｅｗ、１９９９、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、４１：３９〜４８；Ｙｏｕｎｇら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、１９：５０２〜５０６）。これは、この細胞型におけるＴＮＦレセプターファミリーについての、新規の生理学的役割の根底にあり得る。ｐ７５ＮＧＦＲの発現は、前立腺上皮細胞において特異的に記述されてきた（ＤｅｌｓｉｔｅおよびＤｊａｋｉｅｗ、１９９９、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、４１：３９〜４８）．しかし、ＴＲＡＤＥとは違って、ｐ７５ＮＧＦＲ発現が、悪性の検体において消失していると報告されており、そして、これは、前立腺由来の転移性腫瘍系においては発現されない。腫瘍細胞における、ＣＤ４０リガンドが介在する増殖阻害は、治療上の価値を有し得る（Ｈｉｒａｎｏら、１９９９、Ｂｌｏｏｄ、９３：２９９９〜３００７）。同様に、ＴＲＡＤＥの発現およびこれのアポトーシスを誘導する能力は、腺癌の処置に対する新たなアプローチを開始し得る。
【０３２８】
（実施例３：ＴＲＡＤＥの免疫化学的分析）
ＴＲＡＤＥの細胞外ドメインに特異的な、２０のマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルを、ＴＲＡＤＥタンパク質発現の分析のために調製した。
【０３２９】
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢）を、サイトメガロウイルス前初期プロモーターからヒトＴＲＡＤＥを発現するプラスミドベクターを３μｇ使用する遺伝子銃照射技術（Ｂａｒｒｙら、１９９４、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：６１６〜６２０）を使用して免疫化した。マウスを、２週間で５〜６回の間隔で、同一のプラスミドＤＮＡを用いて、再播種した。融合前に３日間、マウスを、１０μｇのＴＲＡＤＥ−Ｆｃ、つまりヒトＩｇＧｌのヒンジ（ｈｉｎｇｅ）−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに融合したヒトＴＲＡＤＥの細胞外領域からなる精製融合タンパク質を用いて脾臓内（ｉｎｔｒａｓｐｌｅｎｉｃａｌｌｙ）でブーストした。免疫化したマウス由来の脾細胞を、従来のハイブリドーマ技術を用いて、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３ＮＳｌ骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）と融合した。融合細胞を、ＨＡＴ含有ＲＰＭＩ　１６４０ハイブリドーマ選択培地で、２週間培養した。
【０３３０】
ハイブリドーマ培養物上清を、他のＦｃ融合タンパク質ではなく、免疫化したＴＲＡＤＥ−Ｆｃへの結合について、ＥＬＩＳＡを用いてスクリーニングした。抗体特異的ハイブリッド細胞を、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹハイブリドーマ選択培地（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，　ＢＣ）によってサブクローン化し、そして腹水中で増殖するように適用させた。免疫化タンパク質Ａ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を有する親和性カラムを、腹水からモノクローナル抗体を精製するために使用した。抗体のクラスおよびサブクラスを、製造者の指示書　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によりＭｏｕｓｅ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇキットを用いて試験した。
【０３３１】
３つのＩｇＧｌ　ｍＡｂｓが、最も強い細胞表面染色シグナルを与えるようであり、そして記載した実験においてこれらを使用した。これら３つのｍＡｂｓ、つまり＃８，＃１２および＃１６の特異性を、ＴＲＡＤＥを発現する一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞の細胞表面染色により試験した。図５（上）で示したように、コントロールとしてｍＩｇＧｌで染色され、ヒトＴＲＡＤＥαでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞、抗ＴＲＡＤＥα＃８、および抗ＴＲＡＤＥα＃１６を表す。抗ＴＲＡＤＥα＃８および抗ＴＲＡＤＥα＃１６の両方が、細胞を染色した。ＩｇＧｌ　ｍＡｂｓ＃８および＃１６は、ヒトＴＲＡＤＥα発現ＣＯＳ細胞の表面に結合した。抗ＴＲＡＤＥ　ｍＡｂｓのいずれかの、偽トランスフェクトされた（ｍｏｃｋ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）細胞に対する結合は、検出されなかった。同じ結果が、ＴＲＡＤＥβ発現細胞において得られた。さらに、ｍＡｂｓ＃８および＃１６の結合は、ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ、ヒトＩｇＧＩに融合したＴＲＡＤＥ細胞外領域の可溶性形態と共に同時インキュベーションすることによって消失し、従って、ｍＡｂｓ＃８および＃１６ｍＡｂｓが、ヒトＴＲＡＤＥの細胞外ドメインに特異的に結合することを確立する。
【０３３２】
＃８および＃１６のｍＡｂｓを、フローサイトメトリーによって、ヒト細胞系をＴＲＡＤＥ発現についてスクリーニングするために使用した。細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。細胞を、抗ＴＲＡＤＥまたは、アイソトープ適合コントロールモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌで用いて染色した。一次抗体の結合を、ビオチンに結合されたヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ、その後、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を用いて検出した。細胞を、ａＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｃａｎ（Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて分析した。
【０３３３】
３つの細胞系の各々が、抗ＴＲＡＤＥ　ｍＡｂｓに結合することを見出した：前立腺の腺癌、ＰＣ−３；星状細胞腫、Ｕ３７３　ＭＧ（図５、下端のパネル、点線）；および結腸の腺癌、ＣａＣｏ２。具体的には、下端のパネルによって、ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質の存在下、または非存在下での、両抗体を用いたヒト星状細胞腫細胞系の処置の結果を示す。点線は、抗ＴＲＡＤＥα＃８および＃１６　（それぞれ、左下端および右下端のパネル）を表す。実線は、ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質存在下でのコントロールｍＩｇＧｌおよび抗体（＃８または＃１６のいずれか）を表す。特異性を、既出の過剰な可溶性ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質を使用することでＦＡＣＳ染色を競合させることににより（図５、ｂｏｔｔｏｍパネル、実線）を確認した。これらの細胞系の各々でのＴＲＡＤＥの発現をまた、ＴＲＡＤＥ特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって確認した。２つの他の前立腺腫瘍細胞系、ＬＮＣａＰ．ＦＧＣおよびＤＵ１４５、ならびに他の結腸腫瘍系、ＨＣＴ１１６およびＨＴ−２９は、これらのｍＡｂｓを用いたフローサイトメトリーよる、ＴＲＡＤＥ発現について陰性であった。一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を、ＴＲＡＤＥの異種発現（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）について４８時間後に分析した。ＴＲＡＤＥを放射性標識するために、１００ｍｍ組織培養ディッシュ中の細胞の単層を、１５分間、メチオニンまたはシステインなしの培地中で飢餓状態にし、その後、Ｐｒｏ−ｍｉｘ　Ｌ−３５Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、最終濃度を３００μＣｉ／ｍＩとした。３７℃で１時間後、この培地を、標識してないメチオニンおよびシステインを含む新鮮な培地で置換えた。この細胞単層を、氷冷（ｉｃｅ−ｃｏｌｄ）１％（ｗ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２５％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中に、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）プロテイナーゼインヒビター混合物を伴って、可溶化した。
【０３３４】
免疫沈降を、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ（＃１６または＃１２のいずれか）を用いて、一晩、４℃で実施し、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、４℃で、２時間添加した。免疫沈降物（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｓ）を、ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ＰＡＧＥ、その後のＡｍｐｌｉｆｙＡｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ　ＩＬ）、および蛍光間接撮影法を用いた処置によって調べた。この分析によって、ＴＲＡＤＥを発現する細胞の抽出物からは、推定サイズ約５５，０００Ｍｒのタンパク質種が示され、そして偽トランスフェクションされた細胞の抽出物からは、示されなかった。ＰＮＧａｓｅ　Ｆを用いた免疫沈降物の消化によって、未消化の重複したサンプルに対して、ＴＲＡＤＥポリペプチドの可動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）が増加した。従って、ＴＲＡＤＥが、残基Ｎ１０５にある単一のコンセンサス部位において、Ｎ−グリコシル化されたようである。
【０３３５】
（実施例４．ＴＲＡＤＥの異所性の発現による、ＮＦｋＢ活性化およびＪＮＫ活性化）
いくつかのＴＮＦレセプターファミリーメンバーは、細胞生存シグナル経路の強力なアクチベーターであることが示されてきた（ＧｒａｖｅｓｔｅｉｎおよびＢｏｒｓｔ、１９９８、Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１０：４２３〜４３４；Ｗａｒｚｏｃｈａ　ａｎｄ　Ｓａｌｌｅｓ，１９９８，Ｌｅｕｋｅｍｉａ＆Ｌｙｍｐｈｏｍａ　２９：８１〜９２）。ＮＦｋＢシグナル経路およびＪＮＫシグナル経路の両方が、ＴＮＦファミリーの、細胞保護的（ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果および炎症的効果と関係する（Ｗａｌｌａｃｈら、１９９９、Ａｎｎ　Ｒｅｖ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７：３３１−３６７）。転写因子ＮＦｋＢは、一旦活性化されると、核に入り、そして細胞生存および細胞増殖のチェックポイントに関連するいくかの重要な遺伝子からの転写を活性化する（Ｋａｒｉｎ，　１９９８，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊｆｒｏｍ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、４：９２〜９９）。Ｔｈｅ　ＪＮＫキナーゼが、ｃ−Ｊｕｎの活性化ドメイン、ＡＰ　１転写因子複合体の構成要素中にある重要なセリン残基をリン酸化する（Ｕｉら、１９９８、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、４２９：２８９〜２９４）。
【０３３６】
アゴニストとしての使用に対して同定されたリガンドの非存在化で、レセプターの広い範囲の過剰発現が、構成的活性化（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）の原因となるという観測を、利用し得る（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９９０〜９９２）。このレセプターの細胞表面発現のより高いレベルは、リガンド誘導レセプター活性化を模倣する様式で、おそらくは、レセプターのオリゴマー化（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の原因となる。他方では、このレセプターのより低い細胞表面発現は、レセプターのオリゴマー化を、リガンドの非存在下で引き起こすにはおそらくは不充分であり、従って、シグナルの事象（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｅｖｅｎｔｓ）を開始するには不適切である。
【０３３７】
ＮＦｋＢおよびＪＮＫ経路のＴＲＡＤＥ−媒介活性化を評価するために、ヒト胚腎臓の２９３細胞および２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ならびにＣＯＳ−１（クローンＭ６）細胞を、（ＡＴＣＣにより推奨されるような）適切な培地中で培養した。ＣＯＳ−１（クローンＭ６）細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を使用して、プラスミド　ＤＮＡでトランスフェクトした。２９３細胞および２９３Ｔ細胞を、ＤＮＡトランスフェクション方法のリン酸カルシウム共沈澱を使用して、指示された発現プラスミドおよびレポータープラスミドと共に一時的にトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞を、製造者の指示書によってＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ　Ｐｌｕｓ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）試薬を使用して、指示されたプラスミドおよびｐＣＭＶｐｇａｌプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で、一時的にトランスフェクトした。細胞を、実施したアッセイに依存してトランスフェクション後１８〜３６時間で収集した。ＴＲＡＤＥ　ｃＤＮＡを、アデノウイルス主要後期（ｍａｊｏｒ　ｌａｔｅ）プロモーター駆動発現プラスミドｐＥＤ（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：４４８５）、またはＣＭＶプロモーター駆動発現プラスミドｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから市販されている）中へサブクローニングした。
【０３３８】
指示された発現プラスミド、ＮＦｋＢ結合部位含有プロモーター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により駆動されるルシフェラーゼ遺伝子およびｐＣＭＶｐｇａｌプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＮＦｋＢ活性化アッセイに使用した。この細胞を、トランスフェクションの３６時間後に収集し、溶解し、そして製造者の指示書によってルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することによりルシフェラーゼ活性についてアッセイした。アッセイされたルシフェラーゼ活性を、次に、ｐ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイすることによりトランスフェクション効率について調整し、そして相対ルシフェラーゼ活性として報告した。ＪＮＫ活性化アッセイについて、指示された発現プラスミドを、ｐＣＭＶｐｇａｌプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得られるｃ−ｊｕｎトランスレポーターおよびトランスアクチベータープラスミドを用いて同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼアッセイを、ＮＦｋＢアッセイについて実施し、そして、上記のトランスフェクション効率について調整した後に、相対ルシフェラーゼ活性として報告した。全ての実験を、三連で（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）で実施し、そして結果は、少なくとも３回再現した。
【０３３９】
２９３Ｔ細胞中のＮＦｋＢ駆動ルシフェラーゼレポーター構築物と共に、ＴＲＡＤＥαまたはＴＲＡＤＥβを過剰発現した際、ＮＦｋＢ活性化経路におけるＴＲＡＤＥ発現の効果を分析し得た。図６の最上のパネルは、ヒトＴＲＡＤＥαおよびｐ７５ＮＧＦＲが、ＮＦｋＢシグナル経路を、比較し得るレベルで活性化し得たことを示す。ヒトＴＲＡＤＥα発現プラスミド、もしくはｐ７５ＮＧＦＲ発現プラスミドまたは単独のベクターを、ルシフェラーゼレポータープラスミド（０．５μｇ）およびｐＣＭＶｐｇａｌ（０．ｌμｇ）を用いて同時トランスフェクトした。細胞を回収して、そして相対的ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクト後３６時間の実験手順に記載されているように定量化し得た。ＮＦｋＢ活性化レベルを、ＴＲＡＤＥβについて観測した。
【０３４０】
ｐ７５ＮＧＦＲに関する以前の研究は、主に、神経細胞における役割に焦点を置いていた。しかし、これは、リンパ球（Ｂａｒｋｅｒ、１９９８、Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、５：３４６〜３５６）を含む他の細胞の範囲において発現される。ＴＲＡＤＥによるＮＦｋＢの活性化を、ｐ７５ＮＧＦＲにより誘導された活性化と並べて比較した。ＴＲＡＤＥαは、ＮＦｋＢ活性化を、緩やかに、しかしｐ７５ＮＧＦＲを過剰発現することから観察されるようなシグナルのような比較可能なレベルで示す（図６、上）。このＤＮＡ結合および転写活性化機能において、活性化されたＮＦｋＢのレベルは、ｐ７５ＮＧＦＲの生理学的効力を達成するために十分であり得る。ｐ７５ＮＧＦＲにより誘導されるＮＦｋＢ活性化応答が、細胞ストレスの条件に限定され得る（Ｂａｒｋｅｒ、１９９８、Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、５：３４６〜３５６）。
【０３４１】
ＴＲＡＤＥと同様に、ｐ７５ＮＧＦＲよるＮＦｋＢ活性化が、他のＴＮＦレセプターファミリーメンバーとの比較において緩やかであると報告された（Ｂａｒｋｅｒ、１９９８、Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、５：３４６〜３５６）、そしてこのシグナルは、ＴＲＡＦ６によって媒介される（Ｋｈｕｒｓｉｇａｒａら、１９９９、Ｊ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７４：２５９７〜２６００）。ｐ７５ＮＧＦＲはまた、アポトーシスを刺激し、そして新規のジンクフィンガー含有タンパク質、ＮＲＩＦ（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）が、このシグナルを媒介する（Ｃａｓａｄｅｍｕｎｔら、１９９９、ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ、１８：６０５０〜６０６１）。ＮＲＩＦは、７５ＮＧＦＲの細胞内領域の中の２つのモチーフに、ＴＲＡＦ６結合ドメインおよび死ドメインとしてこれまで示されてきた膜近傍領域（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｇｉｏｎ）で結合する。これは、協同的相互作用により、または二量体として起こることが示唆されており、すなわち、これはさらに、ＴＮＦレセプターと死ドメインを含むシグナル因子との間の死ドメイン／死ドメイン相互作用と比べて、構造的に大変異なっていることを示唆する。ｐ７５ＮＧＦＲは、第１のα−ヘリックスにおける相同性および他のヘリックスに対して記述された空間的な差異（Ｂａｒｋｅｒ、１９９８、Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、５：３４６〜３５６）に基いた、構造的に異なった死ドメインを有する。この特徴は、ｔｈｅＦａｓおよびＴＮＦ−ＲＩの中に見出される細胞内ドメインの間での凝集を否認することが提案されてきた。
【０３４２】
ｃ−Ｊｕｎ転写アクチベーターに融合されたＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を使用する、トランスレポートアッセイ系を、ＪＮＫ活性をアッセイするために使用した。具体的には、ヒトＴＲＡＤＥα発現プラスミド（図６）に示される量において）、またはＭＲＫＫ発現プラスミドあるいはベクター単独を、ルシフェラーゼレポーター構築物、ｃ−ｊｕｎトランスアクチベータープラスミドおよびｐＣＭＶβｇａｌと共にトランスフェクションした。細胞を回収し、そして上記のトランスフェクションの３６時間前に分析した。この場合において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を、ＧＡＬ４タンパク質結合部位を含むプロモーターによって駆動する。従って、レポーター遺伝子からの基礎的な発現を、ｃ−Ｊｕｎリン酸化の結果として誘導された転写と比較する。ＴＲＡＤＥαの過剰発現が、ＪＮＫの活性化の結果としてルシフェラーゼ活性の増大を導くことを見出した（図６、下）。ＪＮＫシグナル伝達経路のこの活性化は、用量依存性であることが見出された。ＪＮＫ活性化を、ＪＮＫリン酸化を導くＭＡＰキナーゼカスケードにおけるＪＮＫの上流のＭＡＰキナーゼキナーゼである（ＸｕおよびＣｏｂｂ，１９９７，Ｊ　ｏｆ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７２：３２０５６−３２０６０）、陽性コントロールＭＥＫＫと平行して比較した。ＪＮＫ活性化で誘導されたＴＮＦレセプターは、ＴＮＦレセプター関連因子、ＴＲＡＦ２によって最初に媒介されることを示されている（Ｌｅｅら，１９９７，ｌｍｍｕｎｉｔｙ，　７：７０３−７１３）。
【０３４３】
ＪＮＫ活性化は、アポトーシスに誘導される神経増殖因子欠乏が、ドミナントネガティブｃ−Ｊｕｎによって抑制されることを示すレポート（Ｈａｍら，１９９５，　Ｎｅｕｒｏｎ，１４：９２７−９３９）によって、交感神経の細胞死において関連する。ｐ７５ＮＧＥＲ誘導細胞死からのニューロトロフィンレセプターＴｒｋＡ媒介レスキューは、ＪＮＫ活性化に誘導されるｐ７５ＮＧＥＲの阻害に関連するが、ＮＦｋＢ活性化に誘導されるｐ７５ＮＧＥＲに影響を与えない（Ｙｏｏｎら，１９９８，Ｊ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１８：３２７３−３２８１）。
【０３４４】
ｐ７５ＮＧＥＲの場合は、ＮＲＩＦ結合間の決定またはＴＲＡＦ６結合間の決定が、レセプターが死または生存を伝達するかどうかを決定し得る。この決定の結果は、細胞により受け取られた他のシグナルに依存し得る。ＣＤ４０は、免疫活性における役割について広く研究されている（ＧｒｅｗａｌおよびＦｌａｖｅｌｌ，１９９８，Ａｎｎ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６：１１１−１３５；Ｌａｍａｎら，１９９８，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：２１５−２２２；Ｍａｃｋｅｙら，１９９８，Ｊ　ｏｆ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，６３：４１８−４２８；Ｔｏｅｓら，１９９８，Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０：４４３−４４８）。しかし、ＣＤ４０連結は、上皮細胞において増殖阻害を伝達し（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓら，１９９６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１３：２２４３−２２５４）、そして、間葉細胞種かつ上皮の起源のトランスフェクション細胞においてアポトーシス細胞死を伝達する（ＨｅｓｓおよびＥｎｇｅｌｍａｎｎ，１９９６，Ｊ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８３：１５９−１６７）。ＴＲＡＦ３のドミナントネガティブバージョンが、増殖阻害のシグナルに誘導されるＣＤ４０をブロックし（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓら，１９９６，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１３：２２４３−２２５４）、これは、ＣＤ４０のメディエータとしてＴＲＡＦ３が上皮増殖阻害を誘導したことに関連する。ＴＲＡＤＥは、死ドメインを含まない、従って、特定の細胞内の関係においてアポトーシスを誘導し得るが、また、死ドメインを有しないＣＤ３０およびＣＤ４０のようなファミリーメンバーに類似する（Ｇｒｅｌｌら，１９９９，ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１８：３０３４−３０４３；ＨｏｒｉｅおよびＷａｔａｎａｂｅ，１９９８，　Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０：４５７−４７０）。２つのイソフォームはＣ末端の８アミノ酸残基４１６から４２３が異なっており、その結果、ＴＲＡＤＥαは、４１７アミン酸残基を有し、そしてＴＲＡＤＥβは、４２３アミノ酸残基を有する。さらに、２つのイソフォームの正確な細胞内発現の関係は特定の細胞運命（ｃｅｌｌ　ｆａｔｅ）に規定され得る。
【０３４５】
（実施例５．ＴＲＡＤＥ誘導細胞死）
いくつかのＴＮＦレセプターファミリーメンバーは、生存シグナル伝達経路と死シグナル伝達経路の両方を活性化することが実証されている（Ｃａｓａｃｃｉａ−Ｂｏｍｌｅｆｉｌら，１９９９，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　＆　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，４５：２１７−２２４；Ｗａｌｌａｃｈら，１９９６，Ａｎｎ　Ｒｅｖ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７：３３１−３６７）。従って、実験を、ＴＲＡＤＥの過剰発現が、保存されている死ドメインを含まない、いくつかのＴＮＦレセプターファミリーメンバーについて記載されるように、細胞死シグナルを生じるかどうかを確かめるために設計した。
【０３４６】
細胞死アッセイを、望まれる発現プラスミドおよびｐＣＭＶβｇａｌプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してトランスフェクションの前の１５時間か、１８時間かまたは２４時間かのいずれかにおいて実行した。この細胞を、ＰＢＳ中の０．５％のグルタルアルデヒドで固定し、そして色素産生性の基質Ｘｇａｌ（Ｓｉｇｍａ）を使用して５〜１２時間染色した。位相差顕微鏡法を使用してβガラクトシダーゼ発現に対して陽性の染色されたトランスフェクション細胞ならびに代表的な生きている細胞および死んでいる細胞の集団の３通りを計測した。少なくとも４００個のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞を、各トランスフェクション（ｎ＝３）に対して計測し、そして膜小疱形成、濃縮されている、およびプレート表面からの剥離を含むアポトーシスを起こしている接着細胞の典型的な形態変化に基づいてアポトーシス細胞または非アポトーシス細胞として同定した。アポトーシスのパーセントを、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞の総数を使用してアポトーシスを起こしている細胞数を決定することによって計算した。
【０３４７】
Ｘ−ｇａｌ染色後にトランスフェクションされた細胞の形態を研究することによってトランスフェクションされた細胞における細胞死を評価する能力を与えられた、ＴＲＡＤＥをβ−ガラクトシダーゼと共にＨｅＬａ細胞において過剰発現した。プログラムされた細胞死を起こす細胞は、小疱を形成した表面形態、濃縮された核、および完全に剥離する前にプレート表面から離れて球状化を示す。これは、意図される構造（固く接着した）、そして明瞭な核濃縮を有さない生存可能な細胞の形態とは非常に異なる。アポトーシスを、示される形態に基づいて死んでいるまたは生きているとしてＸ−ｇａｌ染色された細胞の代表的な場所を計数することによって評価した。ＴＲＡＤＥαかまたはＴＲＡＤＥβかのいずれかを発現するＨｅＬａ細胞におけるアポトーシスのパーセントを計算することによって、有意な細胞死が、観察された。具体的に、ＨｅＬａ細胞におけるＴＲＡＤＥα発現は、ＴＮＦ−ＲＩと比較可能な用量依存様式においてプログラムされた細胞死を生じる（図７，上のパネル）。望まれる量の発現プラスミドまたはベクター単独を、ｐＣＭＶβｇａｌプラスミドと共に同時トランスフェクションし、そして細胞死アッセイを実験手順に記載されるように実施した。この実験は、トランスフェクションの１５時間前に見られる細胞死を表す。アポトーシスのレベルは、使用したＴＲＡＤＥ発現ＤＮＡの量に比例し、これはおそらくＴＲＡＤＥ活性化の達成されるレベルに関連する。ＴＲＡＤＥが、トランスフェクションの１５時間前程早くアポトーシスの開始を誘導することが観察された。これは、トランスフェクションの１８時間前において有意に変化せず、そしてトランスフェクションの２４時間前のおいてそのままであった。ＴＮＦ−ＲＩおよびｐ７５ＮＧＥＲのアポトーシスの効果と比較可能なＴＲＡＤＥのアポトーシスの効果も、２９３細胞における発現によって証明した。膜に近い１００アミノ酸（ＴＲＡＤＥ（１−２１８））のみを保持するＴＲＡＤＥ細胞内ドメインの重度の欠失は、有意に死シグナルを弱めた（図７、下）。これは、ＴＲＡＤＥ細胞内ドメイン（残基２１８−４２３）が、ＴＲＡＤＥの死エフェクター（ｄｅａｔｈ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ）機能に決定的な寄与を有することを示した。
【０３４８】
（実施例６：可溶性ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質の構築）
可溶性ＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質を、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃγ１、γ２、γ３、εまたはαのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に、ＴＲＡＤＥの細胞外領域をコードするｃＤＮＡ配列に加えることによって構築した。ヒトＴＲＡＤＥの細胞外ドメインのヌクレオチド配列に基づくＰＣＲプライマーを、使用して、完全ＴＲＡＤＥ細胞外領域のフラグメントを産生した。ＸｂａＩ部位を３’末端に組み込み、その結果、フラグメントをヒトＩｇγ１ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ｃＤＮＡを含むプラスミドベクターに連結し得る。この構築物は、ｐＥＤ（Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ら，１９９１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：４４８５）に基づき、そしてアデノウイルス主要後期プロモーターおよびＴＲＡＤＥ−Ｆｃ融合タンパク質のＳＶ４０エンハンサー指向転写を含む。ＳＶ４０起点は、ＣＯＳ−１（クローンＭ６）細胞における複製を可能にする。このベクターはまた、安定な選択およびメトトレキセートを使用してＣＨＯｄｈｆｒ細胞におけるプラスミドの増幅のためのＥＭＣ−ＤＨＥＲカセットを含んだ。
【０３４９】
ＣＯＳ細胞を、このプラスミドと共にトランスフェクションし、培養しそして馴化培地を回収した。この融合タンパク質を、固定化プロテインＡのカラムを使用して精製した。図８は、還元条件および非還元条件における、プロテインＡカラムからの溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。このゲルを、クーマシーブルーで染色した。還元条件下において、５０−６０，０００Ｍｒの広汎性の種に留意して、ＴＲＡＤＥ−αモノマーを示した。非還元条件下において、約１２０，０００Ｍｒの種に留意して、ＴＲＡＤＥ−Ｆｃのジスルフィド結合ダイマー形態を例示した。このダイマー形態によって、ＴＲＡＤＥリガンドの強力な、可溶性アンタゴニストであることが予期される。
【０３５０】
（実施例７．ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβ関連キナーゼ活性）
ＴＮＦレセプターサブファミリーの他のメンバーは、セリン−トレオニンキナーゼファミリーのメンバーのシグナル伝達経路における構成成分としてセリン−トレオニンキナーゼファミリーのメンバーに関連することが報告されている。ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβがキナーゼに関連するかどうかを調べるために、ＴＲＡＤＥ関連キナーゼ活性を、免疫沈降されたＴＲＡＤＥの複合体をインビトロキナーゼアッセイに供することによって分析した。具体的には、Ｆｌａｇ−タグ化タンパク質（またはベクターコントロール）をコードするｃＤＮＡを、２９３Ｔ細胞に発現させ、そして溶解し、抗Ｆｌａｇ抗体またはコントロール抗体を使用して免疫沈降した。免疫複合体を、３２Ｐ標識化ＡＴＰを使用してキナーゼアッセイを供して、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験した。このゲルを乾燥し、そしてオートラジオグラフィーによって分析した。この結果は、両方のイソフォームが、関連キナーゼ活性によってリン酸化されたことを示した（図１０）。
【０３５１】
（実施例８．ＴＲＡＤＥの欠失分析および関連キナーゼ機能）
どのドメインが、関連キナーゼ活性に本質的であるかを位置付けるために、種々の欠失構築物を開発し、そしてＴＲＡＤＥの生化学的かつ機能的な分析に使用した。ＴＲＡＤＥの生化学的な分析に使用された欠失構築物の説明図を、図９に示す。欠失構築物ＴＲＡＤＥ１−３６８（すなわち、アミノ酸１−３６８からなる）および欠失構築物ＴＲＡＤＥ１−３２８を使用するインビトロキナーゼアッセイは、欠失構築物ＴＲＡＤＥ１−３６８が、キナーゼの関連する機能を保持するが、欠失構築物ＴＲＡＤＥ１−３２８は、キナーゼの機能を失ったことを示す（図１１Ａ）。この結果は、Ｃ末端からアミノ酸残基３２８までの連続したセクションを欠失することが、関連キナーゼ活性を消滅させるので、関連キナーゼの機能は、ＴＲＡＤＥ細胞内領域内の内部のドメインに位置することを示す。図１１Ｂは、全ての構築物の当量の発現を示す図１１Ａにおいて使用される免疫沈降物のウエスタンブロッティングである。
【０３５２】
（実施例９．ＴＲＡＦ２ではなく、ＴＲＡＦ６が、ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβに結合する）
ＴＮＦレセプターサブファミリーのメンバーのシグナル活性を、ＴＲＡＦ細胞内アダプター分子に結合することによって媒介する。これらの分子が、ＴＲＡＤＥに関連するかどうかを評価するために、ＨＡ−ＴＲＡＦ６ΔＮおよびそれぞれのＦｌａｇタグ化ＴＲＡＤＥ構築物を２９３Ｔ細胞に同時発現した。この細胞溶解物を、コントロール免疫沈降物、抗−ＨＡ免疫沈降物、および抗−Ｆｌａｇ免疫沈降物に均等に分割し、そして抗−Ｆｌａｇ（図１２Ａ，上のパネル）、続いて抗−ＨＡ（図１２、下のパネル）を使用してウエスタンブロティングした。これらの結果は、ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβが、ＴＲＡＦ２を結合するのではなく、ＴＲＡＦ６を結合することを示す（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。アスタリスクは免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖か（図１２Ａ，上のパネル）またはＩｇ軽鎖（図１２Ａ，下のパネル）かのいずれかを示す。抗−ＨＡ免疫複合体におけるＨＡ−ＴＲＡＦ６ΔＮと共沈するＦｌａｇ−タグ化ＴＲＡＤＥタンパク質を、図１２Ａの上のパネルに示す。
【０３５３】
ＨＡ−ＴＲＡＦ２およびそれぞれのＦＬａｇｇ−タグ化ＴＲＡＤＥ構築物を同時発現させ、そして上記の記載されるように関連について解析した。具体的には、ＨＡ−ＴＲＡＦ２は、Ｆｌａｇ−標識化ＴＲＡＤＥタンパク質と共に共沈しなかった（図１２Ｂ、上のパネル）。図１２Ｂ（下のパネル）は、使用した構築物の適切かつ当量の発現レベルを示すウエスタンブロティングである。両方のパネルのアスタリスクは、免疫複合体において示すＩｇ重鎖を示す。
【０３５４】
（実施例１０．ＴＲＡＦ３は、ＴＲＡＤＥに結合する）
ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβはまた、ＴＲＡＦに結合する。設計されたＦｌａｇタグ化ＴＲＡＤＥ構築物およびＨＡ−ＴＲＡＦ３のｃＤＮＡを発現する２９３Ｔ細胞由来の細胞溶解液を、３つの免疫沈降物（コントロール（Ｃ）および抗−Ｆｌａｇ（Ｆ）に同等に分割した。両方のＴＲＡＤＥは、それぞれ、抗−ＨＡブロットおよび抗Ｆｌａｇブロットを示す上のパネルを伴う、ＴＲＡＦ３に結合した（図１３，上のパネル）。
【０３５５】
欠失変異体と結合するＴＲＡＤＥの分析は、ＨＡ−ＴＲＡＦ３構築物が、欠失構築物ＴＲＡＤＥ１−２１８との共沈に失敗したが、全長ＴＲＡＤＥ、欠失構築物ＴＲＡＤＥ１−３６８および欠失構築物ＴＲＡＤＥ１−３２８と首尾よく結合したこと実証した（図１３，下のパネル）。これらの結果は、ＴＲＡＤＥにおけるＴＲＡＦ３結合部位が、ＴＲＡＦ３に結合するのに欠失構築物ＴＲＡＤＥ１−２１８が失敗したことよって示されたように、アミノ酸残基３２８までの細胞内ドメインが、必要であることを示す（図１３，下のパネル）。下の２つのパネルは、それぞれ抗−Ｆｌａｇブロットおよび抗−ＨＡブロットを示す。
【０３５６】
（実施例１１．ＴＲＡＤＥの欠失分析およびＮＦｋＢ活性シグナル）
シグナル伝達のためのＴＲＡＤＥにおける細胞内ドメインの重要性を、ＮＦｋＢプロモーター駆動ルシフェラーゼアッセイにおける種々の欠失構築物を使用して、機能的分析によって規定される。設計されたＴＲＡＤＥ構築物を２９３Ｔ細胞においてＮＦｋＢプロモーター駆動ルシフェラーゼ構築物（およびＣＭＶ駆動β−ガラクトシダーゼ構築物）と共に同時発現し、そしてトランスフェクションの３６時間前にルシフェラーゼ活性をアッセイした。相対的なルシフェラーゼ活性は、トランスフェクション効率をコントロールとしてβ−ガラクトシダーゼ活性に関して計算された。アミノ酸残基３６８までＣ末端（キナーゼ機能およびＴＲＡＦ３結合ドメイン）に関連する領域）は、ＮＦｋＢ活性シグナルを有意に弱めた（図１４Ａ）。細胞内アミノ酸残基のさらなる欠失は、ＮＦｋＢ活性の完全な消失を導く。ＴＲＡＤＥ　ＥＣに関連するＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβ細胞内ドメイン（αＩＣおよびβＩＣ）からのＮＦｋＢ活性化シグナルは、図１４Ｂに示される。ＮＦｋＢプロモーター駆動ルシフェラーゼ活性を、設計された発現構築物に応答においてアッセイし、そしてＴＲＡＤＥ細胞内ドメイン（ＴＲＡＤＥ　ＥＣ）と比較して折り畳み活性としてプロットされる。従って、ＮＦｋＢシグナル機能は、ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβの細胞内ドメインに全体的に存在する。これらの結果は、細胞内ＴＲＡＤＥ配列内のキナーゼ活性およびＴＲＡＦ結合に対する潜在的なシグナルを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２つの本発明のヒトＴＲＡＤＥタンパク質（αおよびβ）と、関連するＴＮＦレセプターファミリータンパク質ＴＲＡＩＮおよびＡｐｏ４との間のアミノ酸配列比較を示す。
【図２】図２は、ヒトＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβのＣ末端の比較を示す。
【図３】図３は、ヒトＴＲＡＤＥαおよびβの２つの全長システインリッチドメインと、関連タンパク質であるヒトｐ７５ＮＧＦＲ、ヒトＯＸ４０およびヒトＣＤ４０のシステインリッチドメインとの整列を示す。
【図４】図４は、ヒトＴＲＡＤＥαのアミノ酸配列と本発明のマウスＴＲＡＤＥのアミノ酸配列との間の配列比較を示す。
【図５】図５は、フローサイトメトリーを用いたＴＲＡＤＥの免疫化学的分析を示す。
【図６】図６は、ヒトＴＲＡＤＥαの異所性発現がＮＦκＢおよびＪＮＫシグナル経路を活性化し得ることを示すトランスフェクション実験の結果を示す。
【図７】図７は、ＴＲＡＤＥの発現により誘導されたアポトーシスを示す。
【図８】図８は、トランスフェクトしたヒトＣＯＳ細胞の馴化培地から精製した可溶性ＴＲＡＤＥ−Ｆｃタンパク質の還元条件下および非還元条件下の両方でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図９】図９は、ＴＲＡＤＥの生化学的分析において用いられた欠失構築物の模式図を示す。
【図１０】図１０は、ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβと関連するキナーゼ活性を示す。
【図１１】図１１Ａは、ＴＲＡＤＥの欠失分析およびキナーゼ活性に対する効果を示す。図１１Ｂは、全構築物の等価な発現を示す、図１１Ａで用いた免疫沈降物のウェスタンブロットである。
【図１２】図１２ＡおよびＢは、ＴＲＡＦ２ではなく、ＴＲＡＦ６のＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβへの結合を示す。
【図１３】図１３は、ＴＲＡＦ３のＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβへの結合を示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＴＲＡＤＥαおよびＴＲＡＤＥβの欠失分析およびＮＦκＢに対する効果を示す。
【図１】
2004501604.tif 000006
2004501604.tif 000007
【図４】
2004501604.tif 000008
【図５】
2004501604.tif 000009
【図６】
2004501604.tif 000010
【図７】
2004501604.tif 000011
【図８】
2004501604.tif 000012
【図９】
2004501604.tif 000013
【図１１】
2004501604.tif 000014
【図１２】
2004501604.tif 000015
【図１３】
2004501604.tif 000016
【図１４】
2004501604.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2004501604.tif 000018
2004501604.tif 000019
2004501604.tif 000020
2004501604.tif 000021
2004501604.tif 000022
2004501604.tif 000023
2004501604.tif 000024
2004501604.tif 000025
2004501604.tif 000026
2004501604.tif 000027
2004501604.tif 000028
2004501604.tif 000029
2004501604.tif 000030
2004501604.tif 000031
2004501604.tif 000032
2004501604.tif 000033
2004501604.tif 000034
2004501604.tif 000035
2004501604.tif 000036
2004501604.tif 000037
2004501604.tif 000038
2004501604.tif 000039
2004501604.tif 000040
2004501604.tif 000041
2004501604.tif 000042
2004501604.tif 000043
2004501604.tif 000044
2004501604.tif 000045
2004501604.tif 000046
2004501604.tif 000047
2004501604.tif 000048
2004501604.tif 000049
2004501604.tif 000050
2004501604.tif 000051
2004501604.tif 000052
2004501604.tif 000053
2004501604.tif 000054
2004501604.tif 000055
2004501604.tif 000056
2004501604.tif 000057
2004501604.tif 000058
2004501604.tif 000059
2004501604.tif 000060
2004501604.tif 000061
2004501604.tif 000062
2004501604.tif 000063
2004501604.tif 000064
2004501604.tif 000065
2004501604.tif 000066
2004501604.tif 000067
2004501604.tif 000068
2004501604.tif 000069
2004501604.tif 000070
2004501604.tif 000071
2004501604.tif 000072
2004501604.tif 000073
2004501604.tif 000074
2004501604.tif 000075
2004501604.tif 000076
2004501604.tif 000077
2004501604.tif 000078
2004501604.tif 000079
2004501604.tif 000080
2004501604.tif 000081
2004501604.tif 000082
2004501604.tif 000083
2004501604.tif 000084
2004501604.tif 000085
2004501604.tif 000086
2004501604.tif 000087
2004501604.tif 000088
2004501604.tif 000089
2004501604.tif 000090
2004501604.tif 000091
2004501604.tif 000092
2004501604.tif 000093
2004501604.tif 000094
2004501604.tif 000095
2004501604.tif 000096
2004501604.tif 000097
2004501604.tif 000098
2004501604.tif 000099
2004501604.tif 000100
2004501604.tif 000101
2004501604.tif 000102
2004501604.tif 000103
2004501604.tif 000104
2004501604.tif 000105
2004501604.tif 000106
2004501604.tif 000107
2004501604.tif 000108
2004501604.tif 000109
2004501604.tif 000110
2004501604.tif 000111
2004501604.tif 000112
2004501604.tif 000113
2004501604.tif 000114
2004501604.tif 000115
2004501604.tif 000116
2004501604.tif 000117
2004501604.tif 000118
2004501604.tif 000119
2004501604.tif 000120
2004501604.tif 000121
2004501604.tif 000122
2004501604.tif 000123
2004501604.tif 000124
2004501604.tif 000125
2004501604.tif 000126
2004501604.tif 000127
2004501604.tif 000128
2004501604.tif 000129
2004501604.tif 000130
2004501604.tif 000131
2004501604.tif 000132
2004501604.tif 000133
2004501604.tif 000134
2004501604.tif 000135
2004501604.tif 000136
2004501604.tif 000137
2004501604.tif 000138
2004501604.tif 000139
2004501604.tif 000140
2004501604.tif 000141
2004501604.tif 000142
2004501604.tif 000143
2004501604.tif 000144
2004501604.tif 000145
2004501604.tif 000146
2004501604.tif 000147
2004501604.tif 000148
2004501604.tif 000149
2004501604.tif 000150
2004501604.tif 000151
2004501604.tif 000152
2004501604.tif 000153
2004501604.tif 000154
2004501604.tif 000155
2004501604.tif 000156
2004501604.tif 000157
2004501604.tif 000158
2004501604.tif 000159
2004501604.tif 000160
2004501604.tif 000161
2004501604.tif 000162
2004501604.tif 000163
2004501604.tif 000164
2004501604.tif 000165
2004501604.tif 000166
2004501604.tif 000167
2004501604.tif 000168
2004501604.tif 000169
2004501604.tif 000170
2004501604.tif 000171
2004501604.tif 000172
2004501604.tif 000173
2004501604.tif 000174
2004501604.tif 000175
2004501604.tif 000176
2004501604.tif 000177
2004501604.tif 000178
2004501604.tif 000179
2004501604.tif 000180
2004501604.tif 000181
2004501604.tif 000182
2004501604.tif 000183
2004501604.tif 000184
2004501604.tif 000185
2004501604.tif 000186
2004501604.tif 000187
2004501604.tif 000188
2004501604.tif 000189
2004501604.tif 000190
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501604.tif 000191
2004501604.tif 000192
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004501604.tif 000193
2004501604.tif 000194
2004501604.tif 000195
2004501604.tif 000196
2004501604.tif 000197
2004501604.tif 000198
2004501604.tif 000199
2004501604.tif 000200
2004501604.tif 000201
2004501604.tif 000202
2004501604.tif 000203
2004501604.tif 000204
2004501604.tif 000205
2004501604.tif 000206
2004501604.tif 000207
2004501604.tif 000208
2004501604.tif 000209
2004501604.tif 000210
2004501604.tif 000211
2004501604.tif 000212
2004501604.tif 000213
2004501604.tif 000214
2004501604.tif 000215
2004501604.tif 000216
2004501604.tif 000217
2004501604.tif 000218
2004501604.tif 000219
2004501604.tif 000220
2004501604.tif 000221
2004501604.tif 000222
2004501604.tif 000223
2004501604.tif 000224
2004501604.tif 000225
2004501604.tif 000226
2004501604.tif 000227
2004501604.tif 000228
2004501604.tif 000229
2004501604.tif 000230
2004501604.tif 000231
2004501604.tif 000232
2004501604.tif 000233
2004501604.tif 000234
2004501604.tif 000235
2004501604.tif 000236
2004501604.tif 000237
2004501604.tif 000238
2004501604.tif 000239
2004501604.tif 000240
2004501604.tif 000241
2004501604.tif 000242
2004501604.tif 000243
2004501604.tif 000244
2004501604.tif 000245
2004501604.tif 000246
2004501604.tif 000247
2004501604.tif 000248
2004501604.tif 000249
2004501604.tif 000250
2004501604.tif 000251
2004501604.tif 000252
2004501604.tif 000253
2004501604.tif 000254
2004501604.tif 000255
2004501604.tif 000256
2004501604.tif 000257
2004501604.tif 000258
2004501604.tif 000259
2004501604.tif 000260
2004501604.tif 000261
2004501604.tif 000262
2004501604.tif 000263
2004501604.tif 000264
2004501604.tif 000265
2004501604.tif 000266
2004501604.tif 000267
2004501604.tif 000268
2004501604.tif 000269
2004501604.tif 000270
2004501604.tif 000271
2004501604.tif 000272
2004501604.tif 000273
2004501604.tif 000274
2004501604.tif 000275
2004501604.tif 000276
2004501604.tif 000277
2004501604.tif 000278
2004501604.tif 000279
2004501604.tif 000280
2004501604.tif 000281
2004501604.tif 000282
2004501604.tif 000283
2004501604.tif 000284
2004501604.tif 000285
2004501604.tif 000286
2004501604.tif 000287
2004501604.tif 000288
2004501604.tif 000289
2004501604.tif 000290
2004501604.tif 000291
2004501604.tif 000292
2004501604.tif 000293
2004501604.tif 000294
2004501604.tif 000295
2004501604.tif 000296
2004501604.tif 000297
2004501604.tif 000298
2004501604.tif 000299
2004501604.tif 000300
2004501604.tif 000301
2004501604.tif 000302
2004501604.tif 000303
2004501604.tif 000304
2004501604.tif 000305
2004501604.tif 000306
2004501604.tif 000307
2004501604.tif 000308
2004501604.tif 000309
2004501604.tif 000310
2004501604.tif 000311
2004501604.tif 000312
2004501604.tif 000313
2004501604.tif 000314
2004501604.tif 000315
2004501604.tif 000316
2004501604.tif 000317
2004501604.tif 000318
2004501604.tif 000319
2004501604.tif 000320
2004501604.tif 000321
2004501604.tif 000322
2004501604.tif 000323
2004501604.tif 000324
2004501604.tif 000325
2004501604.tif 000326
2004501604.tif 000327
2004501604.tif 000328
2004501604.tif 000329
2004501604.tif 000330
2004501604.tif 000331
2004501604.tif 000332
2004501604.tif 000333
2004501604.tif 000334
2004501604.tif 000335
2004501604.tif 000336
2004501604.tif 000337
2004501604.tif 000338
2004501604.tif 000339
2004501604.tif 000340
2004501604.tif 000341
2004501604.tif 000342
2004501604.tif 000343
2004501604.tif 000344
2004501604.tif 000345
2004501604.tif 000346
2004501604.tif 000347
2004501604.tif 000348
2004501604.tif 000349
2004501604.tif 000350
2004501604.tif 000351
2004501604.tif 000352
2004501604.tif 000353
2004501604.tif 000354
2004501604.tif 000355
2004501604.tif 000356
2004501604.tif 000357
2004501604.tif 000358
2004501604.tif 000359
2004501604.tif 000360
2004501604.tif 000361
2004501604.tif 000362
2004501604.tif 000363
2004501604.tif 000364
2004501604.tif 000365
2004501604.tif 000366
2004501604.tif 000367
【国際調査報告】
2004501604.tif 000368
2004501604.tif 000369
2004501604.tif 000370
2004501604.tif 000371
2004501604.tif 000372