(57)【要約】本発明は、抗菌性に優れたラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株 ＣＳＫ ０１の製造方法に関し、（１）豚の胃粘膜由来の乳酸菌を胃炎及び小腸炎に罹った患者に服用させ、（２）病気の回復した患者の大便から再び乳酸菌を分離し、（３）これから菌株を１６Ｓ ｒＲＮＡ 序列分析及びＲＡＰＤ重合酵素の連鎖反応（ＰＣＲ）を行って同定する過程からなる、本発明のラクトバシラス菌株は、胃と腸の粘膜付着性及び増殖性に優れることだけでなく、耐酸性と耐胆汁性に優れるため、胃粘膜に常在できる乳酸菌株であり、新薬として適用できるばかりでなく、機能性食品や健康増進添加剤等に活用できる。
2004516842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗菌性に優れたラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株 ＣＳＫ ０１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ：寄託番号：ＫＣＴＣ ０９０７ＢＰ）。
【請求項２】
前記抗菌性はヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｒｏｌｉ）と大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に対する抗菌性を含む請求項１記載のラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株 ＣＳＫ０１。
【請求項３】
耐酸性、耐胆汁性に優れて、胃粘膜及び小腸粘膜に付着し増殖することができる請求項１記載のラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株 ＣＳＫ ０１。
【請求項４】
（１）豚の胃粘膜由来の乳酸菌を胃炎及び小腸炎に罹った患者に服用させ、（２）病気の回復した患者の大便から再び乳酸菌を分離し、（３）これから菌株を１６Ｓ ｒＲＮＡ 序列分析及びＲＡＰＤ重合酵素の連鎖反応（ＰＣＲ）を行って同定する過程からなる請求項１記載のラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株の製造方法。
【請求項５】
ヘリコバクター・ピロリ及び大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を死滅させるかまたその増殖を抑制する請求項１記載のラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株 ＣＳＫ ０１から分離・精製された抗菌物質。
【請求項６】
請求項１記載の菌株の有効成分を含むヘリコバクター・ピロリによる胃炎、胃潰瘍及び大腸菌とその他の腸内病原性細菌による腸炎を予防及び治療する機能性食品。
【請求項７】
請求項１記載の菌株の有効成分を含むヘリコバクター・ピロリによる胃炎、胃潰瘍及び大腸菌とその他の腸内病原性細菌による腸炎を予防及び治療する医薬品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、新しい乳酸菌、その抗菌物質及びそれらの製造方法に関する。より詳しくは、本発明は、豚の胃粘膜由来の乳酸菌を胃炎及び腸炎の患者に服用させ回復された患者の大便から分離した乳酸菌ラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＳＫ ０１）及びこれを精製して得た抗菌物質に関することであり、前記乳酸菌株は胃と腸の粘膜付着性、増殖性、耐酸性、耐胆汁性及び抗菌性に優れ、多様な医薬品や機能性食品や健康増進添加剤等に有効に使うことができる。
【０００２】
（背景技術）
ラクトバシラス属の菌は、消化器官の上皮細胞の表面にレクチン（ｌｅｃｔｉｎ）物質が多く含まれた部位に親和性が高いが、外部から体内に到達した乳酸菌はこのような部位に付着・増殖して体内に土着化した乳酸菌もまたこの親和性部位に集落を形成する。
【０００３】
上皮細胞に土着化したラクトバシラス属の菌は多様な種類があるし、乳酸菌相互間の生存に役に立ちながら共存し、宿主に有益な機能で一貫するが、菌種によって役割が異なって、Ａ菌は集落化、Ｂ菌は抗菌性物質の分泌、Ｃ菌は強酸性乳酸物質の分泌、Ｄ菌は消化活性を図る等、菌種により各々特性を有するプロバイオチックス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）作用があることと知られている。
【０００４】
前記のような特性を有するラクトバシラス属の菌と関連し、国際的に多くの研究が競争的に行われた結果、食品製造、医薬品など多様な分野に適用されて実用化されているが、いままで国際的な研究の結果から得られた機能性ラクトバシラス属の菌は腸、大便、食品、食品の原料等から由来されたため、小腸及び大腸に親和性を有する反面、ラクトバシラス属の菌種で製造した食品を服用した場合、胃液によりほとんど死滅するため乳酸菌としての機能性効果に対し疑問が提起されている。
【０００５】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであり、胃と腸の粘膜付着性、増殖性、耐酸性、耐胆汁性及び抗菌性に優れた新しい乳酸菌株を得るため、本発明者等は豚の胃由来の乳酸菌を胃炎及び腸炎に罹った患者に服用させ、病気の回復された患者の大便から菌株を分離し、分離された菌株の形態的、生理学的、培養学的な特性を調査し、この菌株がラクトバシラスパラカゼイの新しい菌株であることを確認することにより本発明を完成した。
【０００６】
本発明は、抗菌性に優れたラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供することを目的とする。望ましくは、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｒｏｌｉ）及び大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７等に対する抗菌性を含む。
また、本発明は、耐酸性に優れたラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、耐胆汁性の優れたラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供することを目的とする。
また、本発明は、胃粘膜に付着し増殖することができるラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供することを目的とする。
また、本発明は、小腸粘膜に付着し増殖することができるラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、（１）豚の胃粘膜由来の乳酸菌を胃炎及び小腸炎に罹った患者に服用させ、（２）病気の回復された患者の大便から再び乳酸菌を分離し、（３）これから菌株を同定する過程からなる前記ラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株の製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は、前記の製造方法において、菌株の同定のため序列番号１と２（表２）のプライマーを利用し、１６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析を行うことを特徴とする。また、本発明は菌株の同定のためＲＡＰＤ重合酵素の連鎖反応（ＰＣＲ）を行って公知の菌株と比較することを特徴とする製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、ヘリコバクター・ピロリ及び大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を死滅させるかまたその増殖を抑制するラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株 ＣＳＫ ０１から分離・精製された抗菌物質を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記菌株の有効成分を含むヘリコバクター・ピロリによる胃炎、胃潰瘍及び大腸菌とその他の腸内病原性細菌による腸炎を予防及び治療する機能性食品を提供することを目的とする。
【００１１】
また、本発明は、前記菌株の有効成分を含むヘリコバクター・ピロリによる胃炎、胃潰瘍及び大腸菌とその他の腸内病原性細菌による腸炎を予防及び治療する医薬品を提供することを目的とする。
【００１２】
（発明の開示）
上記の目的を達成するために、本発明は、抗菌性に優れたラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供する。望ましくは、ヘリコバクター・ピロリ及び大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７等に対する抗菌性を含むラクトバシラス パラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供する。
【００１３】
本発明は、前記抗菌性を有する乳酸菌株を得るため、豚の胃粘膜由来の乳酸菌を胃炎及び小腸炎に罹った患者に服用させ、病気が回復されると患者の大便から再び乳酸菌を分離する。
【００１４】
また、本発明の菌株は（１）ＡＰＩ ＫＩＴ ５０ ＣＨＬ各種糖分解、（２）菌体脂肪酸（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）の構成成分の分析、（３）代謝指紋 （ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）の炭素源利用性の分析等を利用し分析する。その結果、前記菌株はラクトバシラス パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）またはラクトバシラスラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ）に同定される。
【００１５】
また、本発明は、菌株の同定のため序列番号１と２（表２）のプライマーを利用し、１６Ｓ ｒＲＮＡ序列分析を行い、その以外にもＲＡＰＤ重合酵素の連鎖反応（ＰＣＲ）等を行って公知の菌株と比較する。
【００１６】
具体的に、前記菌株は１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）及びブラスト（ＢＬＡＳＴ）を用いる塩基序列の分析等から９９．９％以上ラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属することと認められ、ラクトバシラスパラカゼイグルプ特異プライマー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）を用いるＰＣＲ反応で前記菌株及び対照ラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｐａｒａｃａｓｅｉ）全部３００ｂｐ分画が同一に確認されることにより、ＣＳＫ ０１がラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイであることが立証された。
【００１７】
また、本発明の菌株とラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ； ＪＣＭ ８１３０）は１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による比較から下のような塩基序列の差異がある。
８６１ ：ＣＳＫ ０１の場合Ｇ；ＪＣＭ ８１３０の場合 Ｔ
１４５１ ：ＣＳＫ ０１の場合Ａ；ＪＣＭ ８１３０の場合 Ｇ
【００１８】
それ以外にもラクトバシラスパラカゼイ亜種（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｐ．）のＲＰプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）ＰＣＲ反応で試験菌及び対照菌で全部約８５０ｂｐ位置は一致したが、以外のバンド（ｂａｎｄ）では相互に異なり、ＣＳＫ ０１菌株はラクトバシラスパラカゼイ属ＣＲＡ ２５プライマー（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｐ．ＣＲＡ２５ ｐｒｉｍｅｒ）ＰＣＲ反応で約９８０ｂｐ、５５０ｂｐ大きさの二個のバンド（ｂａｎｄ）が認められたが、対照菌はこれと一致しないため、ＣＳＫ ０１菌株のみの特異性が認められる。
【００１９】
また、本発明は、前記菌株の安全性を立証するため、菌株の培養液（５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）をＢａｌｂ／ｃ鼠に０．３ｍｌ及びその２倍の０．６ｍｌを口腔に１日１回、１０日間投与し、２ヶ月以上安全性を調査する。その結果、試験鼠の全部肉眼で見て健康を維持したし、各臓器の全部が正常であったし、胃・小腸粘膜を含む消化器官も対照菌と類似であることが認められた。
【００２０】
本発明は、耐酸性の優れたラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供する。具体的に、１０％脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）に塩酸を添加し、ｐＨを４．０から１．０に調節した溶液に本発明の菌株を接種し、２日及び４日間の培養で各々ｐＨ１．５でも増殖能力があるため、耐酸性の優れたことを認められた。
参考に、ＣＳＫ ０１菌株は ｐＨ１．５で 乳酸菌が１０１ｃｆｕ／ｍｌ以下、ｐＨ２．０で１０４〜５ｃｆｕ／ｍｌの水準に分離される。
【００２１】
また、本発明は、前記に加えて耐胆汁性の優れたラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供する。具体的に、１０％脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）に豚の胆汁を添加し、４．０〜４．５％に調節した溶液に本発明の菌株を接種し、２日及び４日間の培養で、各々４．５％でも増殖能力があるため、耐胆汁性の優れたことを認められた。参考に、ＣＳＫ ０１ 菌株は胆汁４．０〜４．５％で乳酸菌が１０２〜３ｃｆｕ／ｍｌ以下の水準に分離される。
【００２２】
また、本発明は、前記に加えて胃粘膜に付着し増殖することができるラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供する。具体的に、試験鼠に菌株培養液０．３ｍｌを１日１回１０日間口腔に投与し、２ヶ月の経過後、胃粘液１ｇを切り取って菌を分離し７×１０８ｃｆｕ／ｇの結果を得たし、電子顕微鏡の観察でも胃粘膜に無数なＣＳＫ ０１ 菌株の付着及び増殖が認められる。
【００２３】
また、本発明は、前記に加えて小腸粘膜に付着し増殖することができるラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供する。具体的に、試験鼠に菌株培養液０．３ｍｌ（７×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を１日１回１０日間口腔に投与し、２ヶ月の経過後、小腸粘液を切り取って菌を分離し７×１０６ｃｆｕ／ｇの結果を得たし、電子顕微鏡の観察でも小腸粘膜に無数なＣＳＫ ０１ 菌株の付着及び増殖が認められる。
【００２４】
また、本発明は、前記に加えてヘリコバクター・ピロリを死滅させるラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供する。具体的に、ヘリコバクター・ピロリ培養液０．３ｍｌを鼠に１日１回５日間口腔に投与し、３日の経過後、感染状態で菌株の培養液０．３ｍｌを１日１回１０日間口腔に投与した後、胃粘液ではヘリコバクター・ピロリは分離されないし ＣＳＫ ０１ 菌株のみが回収され、電子顕微鏡の観察で胃粘膜に無数なＣＳＫ ０１ 菌株のみが分布されたことが認められる。
【００２５】
また、本発明は、大腸菌を死滅させるかまたその増殖を抑制するラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株を提供する。具体的に、大腸菌培養液０．３ｍｌを試験鼠に１日１回５日間口腔に投与し、３日の経過後、感染状態で ＣＳＫ ０１ 菌株の培養液０．３ｍｌを１日１回１０日間口腔に投与し、２ヶ月の経過後、小腸粘液では大腸菌が分離されないし、ＣＳＫ ０１ 菌株のみが回収され、電子顕微鏡の観察でも小腸粘膜組織に無数なＣＳＫ ０１ 菌株のみが分布されているため大腸菌の死滅性が認められる。
【００２６】
この時、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐ）は７×１０９ｃｆｕ／ｍｌ、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（Ｅ．ｃ）は３×１０９ｃｆｕ／ｍｌを１日１回５日間投与し、３日の経過後、胃及び小腸粘膜で胃粘膜のヘリコバクター・ピロリは７×１０７ｃｆｕ／ｇ、小腸粘膜の大腸菌は７×１０４ｃｆｕ／ｇに感染されたし、このような鼠にＣＳＫ ０１菌株の培養液（５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を１日１回１０日間０．３ｍｌ投与し、２ヶ月の経過後、ヘリコバクター・ピロリと大腸菌は分離されない反面、ＣＳＫ ０１ 菌株は胃粘液１ｇ当り７×１０９ｃｆｕ、 小腸粘液１ｇ当り４×１０６ｃｆｕの水準に分離される。
【００２７】
それ以外にも本発明の菌株と大腸菌の菌数を類似な範囲に調節した２個の菌株培養液を共に１０％脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）に接種し、５日間培養する中、増殖様態が培養７０時間以内に大腸菌は完全に死滅する反面ＣＳＫ ０１ 菌株は 大腸菌に全然影響を受けなく、増殖することが認められる。
【００２８】
本発明者は、この菌株をラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ ＣＳＫ ０１（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＳＫ ０１）と命名し、韓国科学技術研究院（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に付設の生命工学研究所の遺伝子銀行に２０００年１２月８日付けで寄託した（寄託番号： ＫＣＴＣ ０９０７ ＢＰ）。
【００２９】
前記ラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ ＣＳＫ ０１のサンプル（ｓａｍｐｌｅ）は微生物寄託の国際的認識に対するブダペスト（Ｂｕｄａｐｅｓｔ）条約及び条約下に公表された規定に関連する特許法施行令第４条の規定によりこれらを受ける権限が法的に受けられた産業財産権関連官庁（特許庁）及び個人が購入できる。
【００３０】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ及び大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を死滅させるかまたその増殖を抑制するラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ菌株 ＣＳＫ ０１から分離・精製された抗菌物質を提供する。
具体的に、ヘリコバクター・ピロリ培養液を培地全面に塗抹し、ＣＳＫ ０１菌株の前記抗菌物質を吸収したディスク（ｄｉｓｃ）を中央に位置させ、４日間嫌気的な培養でディスクの周囲のヘリコバクター・ピロリが完全に死滅したことが認められる。その以外にも、ＣＳＫ ０１菌株と大腸菌を混合培養した状態で大腸菌の死滅性を実験した結果、培養４０時間以後から大腸菌が顕著に死滅することが認められる。
【００３１】
また、本発明は、前記菌株及び抗菌物質の有効成分を含むヘリコバクター・ピロリによる胃炎、胃潰瘍、十二指腸炎及び大腸菌とその他の腸内病原性細菌による小腸炎、大腸炎及び直腸炎等に対する予防及び治療する機能性食品を提供する。
また、本発明は、前記菌株及び抗菌物質の有効成分を含むヘリコバクター・ピロリによる胃炎、胃潰瘍、十二指腸炎及び大腸菌とその他の腸内病原性細菌による小腸炎、大腸炎及び直腸炎等に対する予防及び治療する医薬品を提供する。
【００３２】
それ以外にも、本発明の菌株と抗菌物質は機能性食品として乳酸菌醗酵乳各種液状製品、乳酸菌の生菌及び不活化乳酸菌の各種粉末製品、乳酸菌の生菌及び不活化乳酸菌を添加した各種粉乳製品、乳酸菌醗酵各種チーズ製品、乳酸菌の生菌及び不活化乳酸菌を添加した各種アイス製品、乳酸菌の生菌及び不活化乳酸菌を添加した各種飲料製品、乳酸菌の抽出液を添加した各種飲料製品及びアイス製品等の有効成分で有用に使用することができる。
【００３３】
また、塗布性製品として大腸菌性肌炎の塗布に適用する乳酸菌の生菌及び不活化乳酸菌の各種水溶剤、粉末剤、クリーム剤等と、乳酸菌の生菌及び不活化乳酸菌からの抗菌成分の抽出、精製液を利用した各種水溶剤、粉末剤、クリーム剤等ＣＳＫ ０１菌株またはその有効成分で有用に使用することができる。
【００３４】
また、本発明は、菌株とその有効成分を医薬品としてヘリコバクター・ピロリによる胃炎、胃潰瘍、十二指腸炎等と大腸菌による小腸炎、大腸炎及び直腸炎等に適用する乳酸菌の生菌及び不活化乳酸菌の各種水溶剤、粉末剤、錠剤等と乳酸菌の生菌及び不活化乳酸菌から抗菌性成分の抽出、精製液を利用した各種水溶剤、粉末剤、錠剤等で有用に使用することができる。
【００３５】
本発明は、豚の胃由来の乳酸菌を胃炎及び小腸炎に罹った患者に服用させ、病気の回復された患者の大便から菌株を再分離された乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＳＫ ０１）に関することであり、菌株の性状に対する同定実験、実験動物を用いる胃と小腸の粘膜付着性の実験、実験動物及び試験管内実験等により、本発明の乳酸菌株ＣＳＫ ０１の耐酸性、耐胆汁性及びヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（Ｅ． ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７）に対する死滅性等が下の実施の形態のように認められる。
【００３６】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、本発明の好適な実施の形態について、より詳しく説明する。
実施例１：豚の胃から乳酸菌の分離
１９８８〜１９９８年（１０年）の期間に屠殺場（Ｐｕｓｎａｎ、 Ｃｈｉｎｊｕ、Ｓｕｗｏｎ、Ｊｅｏｎｊｕ等）で、屠殺される豚の胃部位を採取（３、２７０頭）し、４℃で保管しながら、試料を試験に適用した。
豚の胃の粘液１ｇをＭＲＳ培地（ｂｒｏｔｈ）に浮遊し、３７℃で２４時間の間培養した培養液をＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ）に塗抹した後、３７℃で３日間培養した後寒天培地（ａｇａｒ）の上に現れた集落を取ってグラム（ｇｒａｍ）染色状の形態、糖分解能等の菌株の性状に対する同定実験を下のような方法で実施した結果、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）であることを認められた。
【００３７】
実施例２：乳酸菌を服用した人の大便から乳酸菌の再分離
前記実施の形態１から分離された乳酸菌の人体内での親和性と抗菌性を調べるため慢性胃炎と腸炎を伴った患者５名に朝の起床直前と夜の就寝３０分前の空腹時間に各々前記乳酸菌１００ｍｌを２ヶ月間服用した結果、服用１ヶ月前・後で経過が好転し、服用後２ヶ月過ぎた後には服用患者の全部が回復された。
この時点で、服用患者５名の大便から前記実施の形態１と同一な方法で乳酸菌を再分離し３〜５×１０７ｃｆｕ／ｇの菌を得たし、前記実施の形態１から分離された菌と同一な方法で菌株の性状に対する同定実験をした結果、服用乳酸菌（実施例１から分離された菌）と特性が一致したし、これをＣＳＫ ０１と略称する。
前記乳酸菌株ＣＳＫ ０１は脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）１０％が添加された菌液状態で凍結乾燥させた後−２０℃に保管し、各種特性調査に適用した。
【００３８】
実施例３：分離乳酸菌（ＣＳＫ ０１）のグラム（ｇｒａｍ）染色状の形態
ＣＳＫ ０１をグラム染色し染色状の形態を調べた結果、図１ａ及び図１ｂに図示したようにグラム陽性を現れたし、無胞子かん菌で１．０〜１．５μｍの大きさの典型的な乳酸かん菌のラクトバシラス属の形態であった。
また、培養特性はＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ）にて灰白色光沢の直径２〜３ｍｍ大きさの集落を構成し、３０℃より３７℃での増殖が良好であると現れた。
【００３９】
実施例４：ＣＳＫ ０１のＡＰＩ ＫＩＴ ５０ＣＨＬ試験分析
ＣＳＫ ０１をＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ）にて３７℃の温度で４８時間の間嫌気的に培養した菌を取って、マクファーランド２（ＭｃＦａｒｌａｎｄ ２）と同一な濁り度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）でサスペンション ミーディアム（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁し、ＡＰＩ ５０ ＣＨＬストリップ チューブ（ｓｔｒｉｐ ｔｕｂｅ）に接種した後、鉱油（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）で上層を覆った後、３７℃で４８時間の間培養しながら４９種の糖分解能を分析した。
標準酸菌ラクトバシラスラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）とＣＳＫ ０１の 糖分解能の分析結果、ラクトバシラスラムノサスの場合β−ゲンチオビオーズ（β−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）とグルコン酸（ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）に各々８５％である反面、ＣＳＫ ０１は５％と４５％であることと現れた。
また、標準酸菌ラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）とＣＳＫ ０１の糖分解能の分析結果、ラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイの場合 α−メチル−ディ−グルコシド（α−ｍｅｔｈｙｌ−ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）８５％、アミグダリン（ａｍｙｇｄａｌｉｎｅ）９９％、サッカローズ（ｓａｃｃｈａｒｏｓｅ）９３％、 β−ゲンチオビオーズ（β−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）８５％、グルコン酸（ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）８５％で陽性である反面、ＣＳＫ ０１は各々４０％、４０％、４５％、５０％、４５％で陰性であった。
従って、各種糖分解能をＡＰＩアイデンティフィケーション ソフトウェア プログラム（ＡＰＩ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ）で分析した結果、図２に図示したようにＣＳＫ ０１はラクトバシラスラムノサスと９９．２％、ラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）と９７．１％の類似性を有することと現れた。
【００４０】
実施例５：菌体脂肪酸の構成成分（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉ ｔｉｏｎ）の分析
ＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ）にて３７℃で４８時間の間培養したＣＳＫ ０１約５０ｍｇ（水分が含まれた重量）を取って乾燥洗浄（ｄｒｙ ｃｌｅａｎ）した１３×１００ｍｍのテフロン（登録商標）− ラインド スクリュー キャップ チューブ（ｔｅｆｌｏｎ−ｌｉｎｅｄ ｓｃｒｅｗ ｃａｐ ｔｕｂｅ）に入れて、下の試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）１を１ｍｌ添加し、１００℃で３０分間加水分解（ｓａｐｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）し、下の試薬２を２ｍｌ添加し、８０℃で１０分間メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）した後、１．２５ｍｌの下の試薬３で脂肪酸を抽出（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）した後、実温に定置した後、反応液が２個の層に分離されると下層液を除去し、３ｍｌの下の試薬４を添加し５分間塩基洗浄（ｂａｓｅ ｗａｓｈ）し、相等液２／３程度をセプタム キャップト サンプル瓶（ｓｅｐｔｕｍ ｃａｐｐｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｖｉａｌ；１２×３２ｍｍ，Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．，ＩＬ， ＵＳＡ）に移して密閉し試料で使った。
【００４１】
試薬
試薬 １：加水分解試薬（Ｓａｐｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）イオン（Ｉｏｎ）が除去された蒸留水１５０ｍｌとメタノール１５０ｍｌの混合液に水酸化ナトリウム（ＡＣＳ公認）４５ｇを入れて全部溶けるまでかぎ混ぜて加水分解試薬を製造した。
試薬 ２：メチル化試薬（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ）
６．００Ｎ塩酸３２５ｍｌとメタノール（試薬等級）２７５ｍｌを混合しメチル化試薬を製造した。
試薬 ３：抽出溶媒（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｖｅｎｔ）
核酸（ＨＰＬＣ等級）２００ｍｌにメチル−三次ブチルエーテル（Ｍｅｔｈｙｌ−ｔｅｒｔｉａｒｙ ｂｕｔｙｌ Ｅｔｈｅｒ）２００ｍｌを混合し抽出溶媒を製造した。
試薬 ４：塩酸洗浄液（Ｂａｓｅ ｗａｓｈ）
イオンが 除去された蒸留水９００ｍｌに 水酸化ナトリウム（ＡＣＳ公認）１０．８ｇを溶解させ塩酸洗浄液を製造した。
【００４２】
前記の実施例５の脂肪酸の分析では、ヒューレット パッカード シリーズ ＩＩガス クロマトグラフィー モデル（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ｓｅｒｉｅｓ ＩＩ ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｏｄｅｌ ６８９０；Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＩＤ， Ｉｎｃ．，Ｄｅｌａｗａｒｅ， ＵＳＡ）を利用したし、セパレーション カラム（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ）は２５ｍｌ×０．２２ｍｍ×０．３３ｍｍのメチル シリカ ヒューズド シリカ 毛管カラム（ｍｅｔｈｙｌ ｓｉｌｉｃａ ｆｕｓｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃｏｌｕｍｎ；ＨＰ １９０９１Ｂ−１０２０）を使用した。
また、ファメｓ プロファイル（ＦＡＭＥｓ ｐｒｏｆｉｌｅ）は微生物アイデンティフィケーション システム ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ； Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＩＤ，Ｉｎｃ．， Ｄｅｌａｗａｒｅ， ＵＳＡ）を利用したし、スタンダード キャリブレーション（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）溶液（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＩＤ．，Ｄｅｌａｗａｒｅ， ＵＳＡ）との比較によりピーク（ｐｅａｋ）を同定し、保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ），ピーク（ｐｅａｋ）の面積比率を求めた。
この時、前記ガスクロマトグラフィーの分析条件は、キャリヤー ガス（Ｃａｒｒｉｅｒ Ｇａｓ）、水素（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ）； カラム ヘッド 圧力（Ｃｏｌｕｍｎ Ｈｅａｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、１０ｐｓｉ；スピルト レイシオ（Ｓｐｉｌｔ Ｒａｔｉｏ）、１００：１、スピルト ベント（Ｓｐｉｌｔ Ｖｅｎｔ）、５０ｍｌ／ｍｉｎ； セプタム パージ（Ｓｅｐｔｕｍ Ｐｕｒｇｅ）、５ｍｌ／ｍｉｎ；ＦＩＤ水素（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ）、３０ｍｌ／ ｍｉｎ ；ＦＩＤ窒素（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ）、３０ｍｌ／ｍｉｎ ；ＦＩＤエア（Ａｉｒ）、４００ｍｌ／ｍｉｎ；初期温度（Ｉｎｉｔｉａｌ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、１７０℃；プログラム速度（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｒａｔｅ）、５℃／ｍｉｎ；最終温度（Ｆｉｎａｌ Ｔｅｍｐ．）、２７０℃；ＦＩＤ温度、３００℃ ；インジェクション ポ−ト（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｐｏｒｔ）、２５０℃； Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ かさ（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ）、２μｌであった。
ＭＩＳガスクロマトグラフィーで分析した結果、図３及び図４に図示したように主要脂肪酸として、Ｃ １６：０ 、Ｓｕｍ ｉｎ ｆｅａｔｕｒｅ ７（Ｃ１８：１ ｗ７ｃ）、 Ｃ１８：１ ｗ９ｃ、Ｓｕｍ ｉｎ ｆｅａｔｕｒｅ ９（Ｃ１９：０ ｃｙｃｌｏ ｗ１０ｃ）等が分析されて、乳酸菌ラクトバシラス属に（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）に属することと現れた。
【００４３】
実施例６：代謝指紋（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）の分析（ＢＩＯＬＯＧ）
ＣＳＫ ０１をＢＬＡ（Ｂｉｏｌｏｇ Ｌａｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇａｒ）培地（ｍｅｄｉｕｍ）（Ｃａｔ．＃７０００４）にて２８〜３５℃で２４時間の間培養した後、培養された菌体を０．８５％ＮａＣｌ２０ｍｌに懸濁し５９０ｎｍで光密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｃｉｔｙ）が３５〜４２％の範囲に含むようにした後、１５０ μｌずつバイオログ ＧＰ マイクロ プレイト（Ｂｉｏｌｏｇ ＧＰ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ； Ｂｉｏｌｏｇ Ｃａｔ．＃１００４）の９６ ウエル（ｗｅｌｌ）に分株した後２８〜３５℃で２４時間の間培養した。
また、４時間と２４時間の間培養した後の反応をリ−ダ（ｒｅａｄｅｒ）を利用して測定し、マイクロ リリース３．５０ ソフトウェア（Ｍｉｃｒｏ ｒｅｌｅａｓｅ ３．５０ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を利用し９５個の炭素源利用パターンを分析した。
前記バイオログ システムは９５個の炭素源利用性を分析し微生物の同定と 分類に応用する自動化システムであり、乳酸菌の中でラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ）、ラクトコクス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｕｓ ）、ペヂオコクス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｕｓ ）菌の同定と分類に利用できる方法であり、このような炭素源利用パターンの分析によるＣＳＫ ０１の代謝特性を分析した結果、図５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄに図示したようにラクトバシラスラムノサス（ Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ）またはラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌ． ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）に分析された。
【００４４】
実施例７：
（７−１）トータル ゲノムのＤＮＡ（Ｔｏｔａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）
試験菌と対照菌の染色体ＤＮＡ分離をハンター（Ｈｕｎｔｅｒ ；１９８５）の方法に基づいて実施した。
即ち、保存菌株を１０ｍｌの培地に接種し３７℃で２〜３日培養した後、１００ｍｌの培地にてレイト エクスポンシャル（ｌａｔｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）まで培養した後、約５ｇ程度の菌体に１０ｍｇのリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）を含む１０ｍｌのＴＥ緩衝液を入れて完全に溶菌になるまで（２〜３時間）３０℃で処理した。
溶菌された溶液に１ｍｌの２０％ＳＤＳを入れて徐々に混合した後、１．５ｍｌの５Ｍ塩化ナトリウムとフェノールを添加し、２０分間常温で徐々に揺した後、３．５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上層液を取って、同量のクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）を入れて１０分間徐々に揺した後、上層液を滅菌された１００ｍｌのビーカー（ｂｅａｋｅｒ）に移して同量のイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を入れた。
常温で５分程度放置した後、イエロー チップ（ｙｅｌｌｏｗ ｔｉｐ）で二層の間に形成された染色体ＤＮＡを分離した後、分離されたＤＮＡを小量のＴＥで溶けた後、リボ核酸分解酵素（ＲＮａｓｅ）２０μｇ／ｍｌを入れて、５０℃で１時間の間反応させプロテアーゼ Ｋ（ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋ）１００μｇ／ｍｌと、１００ｍＭ塩化ナトリウムと０．４％ＳＤＳを入れて３７℃で１時間の間反応させた。
前記フェノール処理以後の過程からＴＥで溶ける過程まで繰り返した後、２６０ｎｍの吸光度でＤＮＡ濃度を定量した。
【００４５】
（７−２） １６Ｓ ｒＲＮＡ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）分析
前記の第１段階で定量された試験菌株のゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を重合酵素の連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施した。
この時、ＰＣＲは既に分離した下記の表１のラクトバシラス属（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ）１０μｇ／μｌをテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）で利用した。
【００４６】
【表１】
2004516842.tif 000003
【００４７】
また、 ＰＣＲの組成は全体かさ１００μｌに１×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、即ち１００ｍＭのトリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ）（ｐＨ８．３）、５００ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、２ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、 ０．２ｍＭ ｄＮＴ、表２に示したセンス（ｓｅｎｓｅ）Ｆ９（序列番号 １）とアンチセンス プライマー（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）１５４２Ｒ（序列番号 ２）を各々２００ｐｍｏｌ、タク ポリメラーゼ （Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）２．５ ユニット（Ｕｎｉｔ）を使用した。
【００４８】
【表２】
2004516842.tif 000004
【００４９】
ＰＣＲに対する反応条件は９５℃で５分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）した後、９５℃で１分間変性（ｄｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）し、６０℃で１分間アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）した後、７２℃で２分間エクステンション（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）する過程で３０サイクル（ｃｙｃｌｅ）を行い、最終に、７２℃で１０分間ポスト エクステンション（ｐｏｓｔ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）した後、１５℃で保管した。
ＰＣＲ 産物の確認は１％のアガロースーゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）電気泳動を利用し、臭素エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色した。
【００５０】
予想される ＰＣＲ 産物（１５００ｂｐ）は キアキック ゲル エクストラクション キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ； Ｑｉａｇｅｎ）を利用し、アガロースー ゲル （ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）から回避（ｅｌｕｓｉｏｎ）した後、ｐＧＥＭ−Ｔ イーズィ ベクター（Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ）にクロニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）（ＬＡ１５００／ｐＧＥＭ−Ｔ）した。
１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基序列分析はＰＣＲにより生成されたＣＳＫ ０１の１６Ｓ ＤＮＡ（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ９−１５４２）を使用した。
【００５１】
即ち、約１５００塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）であるＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔイーズィ ベクター（Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ）にクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）した後、塩基序列の分析により確保した。
遺伝子塩基序列の決定は得られた塩基序列を確認するためＬＡ１５００／ｐＧＥＭ−Ｔはウィザァド プラス ミヂプレプス ＤＮＡ ピュリフィケーション システム（Ｗｉｚａｒｄ ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ）を利用して分離し、ＬＡ１５００ｂｐフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）をバイオネックス株式会社（Ｂｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にある自動序列分析機（ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｅｒ，ＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓＴＭ ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で確認したし、この結果は図６（序列番号 ３）と同一である。
【００５２】
実施例８：ブラスト（ＢＬＡＳＴ）を利用した塩基序列データ分析
遺伝子塩基序列決定により得たブラスト プログラム（ ＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０； ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｒ／ＢＬＡＳＴ）を利用して、既に知られたラクトバシラス属（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のいくらの種及び他の属の代表的な属等の１６Ｓ ｒＲＮＡ塩基序列を比較・分析し、相同な値を決定した。
系統数はブラスト ソフトウェア（ＢＬＡＳＴ ｓｏｆｔｗａｒｅ）から得られた距離（ｄｉｓｔａｎｃｅ）値からネイバ−ジョイニング（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ）方法により作成した。
得られたＣＳＫ ０１の１６Ｓ ｒＲＮＡ序列（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は 図７と同一であり、これに基づいた分子系統分類学的方法に基づいて本発明ＣＳＫ ０１がラクトバシラスカゼイグループ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ｇｒｏｕｐ）に属し、特に９９．９％の相同性からラクトバシラス パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ）（Ｄ７９２１２）に一番高い類縁関係を示すことと現れた。
【００５３】
実施例９：マルチプレックス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＲＡＰＤ−ＰＣＲを利用した分析
約１０の塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）のアービトラリ プライマー（Ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｐｒｉｍｅｒ）を利用しラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の間のタイピング（ｔｙｐｉｎｇ）が出来るＲＡＰＤ−ＰＣＲ（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用し試験菌株を分析した。
また、ラクトバシラスパラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ）のみを特異に探索できるプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を制作し、ラクトバシラスパラカゼイの８種と試験菌株を分析・比較した。
既に、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ）１０μｇ／μｌをテンプレートで利用しＲＡＰＤ−ＰＣＲを行った。
ＰＣＲの組成は全体かさ５０μｌに１×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、即ち１００ｍＭのトリス 塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ；ｐＨ８．３）、５００ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、３ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、表 ３に示したＲＰプライマー（序列番号 ４）とＣＲＡ２５プライマー（序列番号 ５）を各々１０ｐｍｏｌ、タク ポリメラーゼ （Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１ ユニット（Ｕｎｉｔ）を使用した。
【００５４】
【表３】
2004516842.tif 000005
【００５５】
ＰＣＲに対する反応条件は９４℃で３分、４５℃で４５秒、７２℃で１分、１サイクル（ｃｙｃｌｅ）；９４℃で４５ 秒 、４５℃で４５秒、７２℃で１分、３０サイクル（ｃｙｃｌｅ）；最終的に９４℃で４５ 秒 、４５℃で４５秒、７２℃で５分、１サイクル（ｃｙｃｌｅ）；７２℃で８分間ポスト エクステンション（ｐｏｓｔ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）した後、４℃で保管した。
【００５６】
ＰＣＲ 産物の確認は１．５％のアガロースーゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）電気泳動を利用し、臭素 エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）で染色し、バンド（ｂａｎｄ）の様相でタイピング（ｔｙｐｉｎｇ）した。
ワード（Ｗａｒｄ；１９９９）の方法により、ラクトバシラスパラカゼイ及びラクトバシラスラムノサス等の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基序列中これらの種のみを特異に検討できるラクトバシラス パラカゼイ―グルプ― 特異プライマー（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ―ｇｒｏｕｐ―ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）を製造しＰＣＲを行った。
【００５７】
ラクトバシラスパラカゼイのみが有している唯一な塩基序列をプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として、ＰＣＲを行った結果、図８で図示したように（Ｌａｎｅ １、 １７；１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ，Ｌａｎｅ ２；試験菌株、 Ｌａｎｅ３−１０；ラクトバシラスパラカゼイ、 Ｌａｎｅ１１−１６；ラクトバシラスラムノサス）試験菌株、標準菌株とラクトバシラスパラカゼイから約３００ｂｐのバンド（ｂａｎｄ）が同一に確認され、ＣＳＫ ０１はラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）種であることが立証された。
【００５８】
以上のように前記実施の形態 ３〜９の本発明ＣＳＫ ０１の生化学的性状、１６Ｓ ｒＲＮＡ序列（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＰＣＲ反応同定分析等の実験結果、本発明のＣＳＫ ０１はラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ ＣＳＫ ０１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ）であることが立証された。
【００５９】
実施例１０：ＣＳＫ ０１ ＤＮＡとラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ（ＪＣＭ ８１３０）ＤＮＡ塩基序列の比較
ＣＳＫ ０１ ＤＮＡとＪＣＭ ８１３０ＤＮＡ塩基序列の比較分析の結果、図９に図示したように ＣＳＫ ０１塩基序列（ＪＣＭ ８１３０塩基序列）８６１→Ｇ（Ｔ）、１４５１→ Ａ（Ｇ）で相違した。
【００６０】
実施例１１：ＲＰ プライマー（ ｐｒｉｍｅｒ）利用ＣＳＫ ０１とラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ）のＲＡＰＤ−ＰＣＲ反応
試験菌株と対照群の菌株をＲＰプライマー（ ｐｒｉｍｅｒ）を利用しＲＡＰＤ−ＰＣＲを実施した結果、図１０で図示したように（Ｌａｎｅ １、 １７；１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ，Ｌａｎｅ ２；試験菌株、 Ｌａｎｅ３−１０；ラクトバシラスパラカゼイ、 Ｌａｎｅ１１−１６；ラクトバシラスラムノサス）ワード（Ｗａｒｄ；１９９９）の結果と一致する約８５０ｂｐのバンド（ｂａｎｄ）を標準ラクトバシラスパラカゼイと試験菌株から確認されて、同じ菌種であることが立証されたが、８５０ｂｐ以外の試験菌株から現れたバンド（ｂａｎｄ）と標準菌株バンドの様相が互いに異なるので、ＣＳＫ ０１の特異性が認められた。
【００６１】
実施例１２：ＣＲＡ２５ プライマー（ ｐｒｉｍｅｒ）利用ＣＳＫ ０１とラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ）のＲＡＰＤ−ＰＣＲ反応
試験菌株と標準菌株を各々 ＣＲＡ２５ プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）利用しＲＡＰＤ−ＰＣＲを実施した結果、図１１で図示したように（Ｌａｎｅ １、 １７；１００ｂｐ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ，Ｌａｎｅ ２；試験菌株、 Ｌａｎｅ３−１０；ラクトバシラス パラカゼイ、 Ｌａｎｅ１１−１６；ラクトバシラスラムノサス）試験菌株から現れた約９８０ｂｐ、５５０ｂｐのバンド（ｂａｎｄ）は標準菌株ラクトバシラスパラカゼイに現れていないためＣＳＫ ０１の固有性が認められた。
以上のように前記の実施の形態１０〜１２から本発明ＣＳＫ ０１の１６Ｓ ｒＲＮＡ序列（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＲＰ及びＣＲＡ２５プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）利用ＰＣＲ 反応分析から既存菌株と一致されない遺伝子分画を有するＣＳＫ ０１のみの特異性が立証された。
【００６２】
実施例１３：ＣＳＫ ０１の鼠（Ｂａｌｂ／ｃ）に対する安全性
韓国の国立獣医科学検疫院で無菌的に飼育している２週齢（Ｂａｌｂ／ｃ）鼠にＣＳＫ ０１の１０％ 脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）培養液（５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を適正給与液の．３ｍｌとその２倍の０．６ｍｌを口腔に１日１回１０日間投与した後、２ヶ月間安全性を調査した。
培養液０．３ｍｌ、０．６ｍｌを給与した試験群の全部が生存し、肉眼的な観察で正常に現れた。
また、剖検の結果、試験群の実質臓器（肝臓、心臓、肺、腎臓等）と消化器官（胃、小腸、大腸）は 対照群と差異がなく、調査した臓器の全部が正常に現れた。
給与群の胃、小腸、大腸粘液をＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ）に塗抹した後、３７℃で４８時間の間培養した結果、下の表４に示したように無数な乳酸菌が分離されたし、反面対照群からは分離されなかった。
【００６３】
【表４】
2004516842.tif 000006
【００６４】
実施例１４：ＣＳＫ ０１の耐酸性
１０％ 脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）１００ｍｌ（ｐＨ６．２）に１０Ｎ塩酸を添加し各々ｐＨ１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０に調節した培地にＣＳＫ ０１培養液１ｍｌ（５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を接種した後、４日間培養し２日目と４日目の培養液のｐＨと菌数を調査し、下の表５に示した。
ｐＨ１．０培地の場合２日培養でｐＨ１．０〜０．８４に変化されたし、菌は分離されなかった。
ｐＨ１．５培地は２日培養でｐＨは１．５〜２．０であり、菌数は１０１ｃｆｕ／ｍｌ以下に分離された。
ｐＨ２．０培地は２日培養でｐＨは２．２〜２．５であり、分離された菌数は１０４〜５ｃｆｕ／ｍｌであり、ｐＨ２．５の場合は２日培養でｐＨは２．７〜３．０であり、菌数は１０５〜６ｃｆｕ／ｍｌであった。
ｐＨ３．０は２日培養した後、ｐＨ３．４〜３．６であり、菌数は１０６〜７ｃｆｕ／ｍｌに分離された。
ｐＨ３．５は２日培養した時、ｐＨは３．６〜３．７であり、分離された菌数は１０７〜８ｃｆｕ／ｍｌであった。
ｐＨ４．０の場合、ｐＨは４．５〜５．０、菌数は１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上であった。
ｐＨ別に４日培養した場合、ｐＨと分離された菌数は２日培養したものとほとんど類似な水準に現れた。
【００６５】
【表５】
2004516842.tif 000007
【００６６】
実施例１５：ＣＳＫ ０１の 耐胆汁性
ＣＳＫ ０１の耐胆汁性試験は１０％ 脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）１００ｍｌに豚の胆汁（ｓｉｇ Ｂ８６３１、ｐｒｏｃｉｎｅ）を１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５％の濃度に調節し、ＣＳＫ ０１培養液１ｍｌ（５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を接種した後、２日及び４日培養別にＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ）上で各々４℃に保管中の ＭＲＳ培地（ｂｒｏｔｈ）にて培養液を１０ｘ階段希釈し、希釈液１ｍｌを塗抹し菌数を測定した。
菌数は１．０、１．５、２．０、２．５％の胆汁を添加した培養液の場合ｍｌ当たり１０７〜９ｃｆｕ水準であり、３．０、３．５％はｍｌ当たり１０５〜６ｃｆｕであり、４．０、４．５％の場合、ｍｌ当たり１０２〜３ｃｆｕ以下に減少され耐胆汁性が確認された。
胆汁添加比率別に４日培養した場合、下の表６に示したように２日培養したものと菌数がほとんど類似に現れた。
【００６７】
【表６】
【００６８】
2004516842.tif 000008
実施例１６：ＣＳＫ ０１のＢａｌｂ／ｃ鼠の胃粘膜付着及び増殖性
韓国の国立獣医科学検疫院で無菌的に飼育している２週齢のＢａｌｂ／ｃ鼠２０匹にＣＳＫ ０１の４８時間培養液（７×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）０．３ｍｌを１０日間１日１回口腔に投与した。
給与後２ヶ月の経過後、胃を切り取って胃粘液１ｇを４℃で保管中のＭＲＳ培地（ｂｒｏｔｈ）に１０Ｘ階段希釈し、希釈液１ｍｌをＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ）に塗抹し、３７℃で４８時間の間培養で現れた菌数は７×１０８ｃｆｕ／ｇであった。
また、電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察するため胃の一部を切り取って１Ｍ ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ；ｐＨ７．２〜７．４）で迅速に洗浄し、２〜３％のグルタル アルデヒド（Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）／０．１Ｍ ＰＢＳ固定、２〜３時間４℃で保管した後、同一な洗浄液で洗浄し、１％オスミウム四酸化物（ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ）／０．１Ｍ ＰＢＳに後固定（４℃で２時間）し、エタノール５０、７０、８０、９０％に各々５分また１００％に２０分間脱水した。
その後、置換剤イソアミル アセテート（ｉｓｏａｍｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）に置換しクリチカル ポイント ドライア（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｏｉｎｔ ｄｒｙｅｒ）で乾燥し、イオン（Ｉｏｎ）にコーティングさせ電子顕微鏡（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｓ−５７０）で観察した結果、図１２に図示したようにＣＳＫ ０１が胃粘膜に付着及び増殖していることが認められた。
【００６９】
実施例１７：ＣＳＫ ０１の小腸粘膜の付着及び増殖性
ＣＳＫ ０１の小腸粘膜の付着及び増殖性は胃粘膜で前述した菌分離及び電子顕微鏡の利用法に基づいて実施した。
その結果、図１３ａ、１３ｂに図示したように小腸粘液のＣＳＫ ０１の乳酸菌数はｇ当たり３×１０６ｃｆｕで分離されたし、電子顕微鏡の観察でも小腸粘膜に付着及び増殖していることを確認した。
以上のように前記の実施例１３〜１７で本発明のＣＳＫ ０１のＢａｌｂ／ｃ鼠の胃及び腸粘膜に付着及び増殖能力を有するＣＳＫ ０１の耐酸性、耐胆汁性が糾明された。
【００７０】
実施例１８：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｒｏｌｉ）のＢａｌｂ／ｃ鼠に対する感染性
ヘリコバクター・ピロリはＢｕｓａｎ Ｂｏｋｅｕｍ 病院（Ｂｏｋｅｕｍ ｈｏｓｐｉｔａｌ）の微生物学室で患者から分離し保管中であるヘリコバクター・ピロリ １２１を分譲し利用した。
ヘリコバクター・ピロリの培養時には１０％のカルプ血清（ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）を添加した ミューラ−ヒントン培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ）、嫌気性（Ｇａｓ ｐａｃｋ利用Ｊａｒ）で４日間培養した後、１０％羊血液培地に塗抹し嫌気性の状態で４日間培養した後、グラム（ｇｒａｍ）陰性、屈曲形・螺旋形の特性を確認し、４℃で保管中の１０％ミューラ−ヒントン培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ；ＭＨＢ）とガラス玉でハーベスト（ｈａｒｖｅｓｔ）し、Ｂａｌｂ／ｃ鼠の口腔に ｍｌ当たり２×１０９ｃｆｕ菌液０．３ｍｌを１日１回５日間投与した後、３日経過後Ｂａｌｂ／ｃ鼠の胃を切り取った。
胃粘液１ｇを４℃で保管中のＭＨＢで１０Ｘ階段希釈した希釈液１ｍｌを１０％培養血液培地に塗抹した結果、菌数は７×１０７ｃｆｕの水準で分離された。
また、前述した方法に処理された組織を電子顕微鏡で観察した結果、図１４に図示したように胃粘膜が無数な菌に感染されたことと現れた。
【００７１】
実施例１９：ＣＳＫ ０１の Ｂａｌｂ／ｃ鼠の感染ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ）の死滅性
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ）に感染されたＢａｌｂ／ｃ鼠にＣＳＫ ０１の菌液（５×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を口腔に１日１回０．３ｍｌを１０日間投与し、２ヶ月経過後、胃粘膜にヘリコバクター・ピロリ菌の存在を前述した方法で調査した結果、ヘリコバクター・ピロリは分離されなかったし、ＣＳＫ ０１を前述した方法に分離した結果、１ｇ当たり１×１０９ｃｆｕの水準であった。
また、前記の胃粘膜を電子顕微鏡で観察した結果、図１５に図示したようにヘリコバクター・ピロリは観察されなかったし、給与乳酸菌のみが胃粘膜に無数に存在することと現れた。
【００７２】
実施例２０：ＣＳＫ ０１ 抗菌物質のヘリコバクター・ピロリの死滅性
１０％ 脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）に３７℃で４８時間の間培養したＣＳＫ ０１培養液１００ｍｌをソニケータ（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）容器に５０ｍｌを各々分株した後、４℃を維持しながら３０秒間５回繰り返しソニケーティング（ｓｏｎｉｃａｔｉｎｇ；Ｓｏｎｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ，Ｖｃ×３７５）した後、超遠心分離機１０、０００Ｇで３０分間遠心分離した後、上層液を回収した。
続いて、硫酸アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ）の飽和溶液８０％に浮遊し、４℃で２４時間の間放置した後、遠心分離し沈殿液を回収し、４℃保管滅菌種類に２倍希釈し、投石膜（ＰＧＣ ２９−０５９３−３７，ＭＷＣＯ． １０Ｋ）に分株し、蒸留水を利用し４℃で４８時間の間投石した。
前記で製造した精製液をもう一度硫酸アンモニウム飽和溶液４０％に分株し４℃で２４時間の間放置した後、１０、０００Ｇで遠心分離した後、沈殿液を回収し、同じ方法で２倍希釈し、４℃で４８時間の間投石した精製液を凍結乾燥した。
凍結乾燥した抗菌物質はＣＳＫ ０１の１０％ 脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）培養液をソニケーティング（ｓｏｎｉｃａｔｉｎｇ）した後、１０、０００Ｇで遠心分離した上層液に２倍希釈した。
ヘリコバクター・ピロリ培養菌液を１０％カルプ血清（ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）を添加したミューラ−ヒントン寒天培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ａｇａｒ）の全面に塗抹し、抗菌物質を吸収したディスク（Ｄｉｓｃ）を中央に位置させ嫌気的に培養し抑制範囲を調査した結果、図１６に図示したようにディスク（Ｄｉｓｃ）の周囲に完全にヘリコバクター・ピロリ増殖が抑制されたことと現れた。
【００７３】
実施例２１：大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７のＢａｌｂ／ｃ鼠の小腸粘膜の感染性
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７はギョンサング国立大学校（ＧｙｅｏｎｇＳａｎｇ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）獣医科学の微生物学室で分譲し利用した。
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７をＢＨＩ培地（ｂｒｏｔｈ）に接種し３７℃で１８時間 の間培養し滅菌生理食塩水を寒天培地（ａｇａｒ）上に分株、ガラス玉でハーベスト（ｈａｒｖｅｓｔ）し、滅菌生理食塩水で１０Ｘ階段希釈し菌数（３×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）を確認した。
菌液をＢａｌｂ／ｃ鼠の口腔に０．３ｍｌずつ１日１回５日間投与し、３日経過後、鼠の小腸部位を切り取った。
小腸粘液１ｇを滅菌生理食塩水で１０Ｘ階段希釈した希釈液１ｍｌを７％の培養血液培地に塗抹し、３７℃で１８時間の間培養した結果、１ｇ当たり６×１０５ｃｆｕの水準で菌が分離されたし、グラム（ｇｒａｍ）陰性、かん状菌（ｒｏｄ ｓｈａｐｅｄ）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７抗血清陽性反応等により大腸菌であることを確認した。
一方、小腸粘膜の大腸菌の生存を電子顕微鏡で確認した結果、図１７に図示したように小腸粘膜に多い大腸菌が付着・増殖していることが証明された。
【００７４】
実施例２２：ＣＳＫ ０１の Ｂａｌｂ／ｃ鼠の感染大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の死滅性
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に感染されたＢａｌｂ／ｃ鼠にＣＳＫ ０１を１日１回１０日間口腔に給与し、２ヶ月経過後、小腸部位を切り取って菌を分離し、電子顕微鏡で大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の死滅性を調査した。
小腸粘液１ｇを滅菌生理食塩水で１０Ｘ階段希釈した希釈液１ｍｌをＢＨＩ寒天培地（ａｇａｒ）に塗抹し、３７℃で２０時間の間培養し、菌の存在可否を調査した結果、大腸菌は分離されなかったし、前述した方法でＣＳＫ ０１の乳酸菌は１ｇ当たり４×１０５ｃｆｕ の水準で分離された。
一方、電子顕微鏡で前記小腸部位を観察した結果、図１８に図示したように大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は現れなく、ＣＳＫ ０１の乳酸菌のみが観察された。
【００７５】
実施例２３：ＣＳＫ ０１と大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７混合培養による大腸菌の死滅性
ＣＳＫ ０１ＭＲＳ培養液１ｍｌ（２〜６×１０８ｃｆｕ ）と大腸菌ＢＨＩ培地（ｂｒｏｔｈ）培養液１ｍｌ（２〜６×１０８ｃｆｕ）に含まれた菌数を相互類似な水準に調節し、共に滅菌１０％脱脂乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）溶液に接種し、３７℃で５日間培養しながら培養２０時間以後からＣＳＫ ０１と大腸菌の菌数を調査した。
ＣＳＫ ０１はＭＲＳ寒天培地（ａｇａｒ）で、大腸菌はマクコンキ寒天培地（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ ａｇａｒ）で各々培養菌液１ｍｌずつ取って寒天培地（ａｇａｒ）上に塗抹し菌数を調査した。
その結果、図１９に図示したように大腸菌の菌数は培養３０時間以後から減少し４０時間にはほとんど死滅される傾向があり、培養７０時間になっては完全に 死滅されたことと現れた。
反面、ＣＳＫ ０１は培養７０時間以後にも菌数（４×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）がほとんど変化されなかった。
【００７６】
実施例２４：ＣＳＫ ０１抗菌物質の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の死滅性
硫酸アンモニウム飽和溶液で沈殿・精製、凍結乾燥した抗菌物質を前述した方法で希釈（３００ｍｇ／ｍｌ）し、ディスク（ｄｉｓｃ）に２０μｌ吸収した。
ＢＨＩ培地（ｂｒｏｔｈ）に培養した大腸菌の菌液をトリップチック ソイ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ａｇａｒ）に塗抹し、中央に抗菌物質を吸収したディスク（ｄｉｓｃ）を位置した後、３７℃で２４時間の間培養した結果、図２０に図示したようにディスク（ｄｉｓｃ）の周囲に大腸菌の増殖抑制性が確認された。以上のように前記の実施の形態１８〜２４で本発明ＣＳＫ ０１のＢａｌｂ／ｃ鼠の胃炎菌ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｒｏｌｉ）及び腸炎菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７に対し死滅性を有する抗菌能力が立証された。
【００７７】
（産業上の利用可能性）
本発明は豚の胃粘膜由来の乳酸菌を胃炎及び腸炎に罹った患者に服用させ、病気の回復された患者の大便から再分離した乳酸菌株であるラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイＣＳＫ ０１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ ＣＳＫ ０１）株に関することにおいて、ＣＳＫ ０１は胃と腸の粘膜付着性及び増殖性に優れることだけでなく、耐酸性と耐胆汁性に優れるため胃粘膜に常在できる乳酸菌株であり、健胃・整腸の効果及びヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７等に対する抗菌性が高いので、多様な分野に最も有効に活用できる。
【００７８】
即ち、国際的に胃と腸の粘膜に付着性が強く、胃炎菌であるヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ）を死滅できる乳酸菌の開発がまだ進まない状態で本発明は多方面の実用的な活用と多様な応用研究の適用面で大きい役割りが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａ及び図１ｂは、本発明の乳酸菌株（ＣＳＫ ０１）のグラム（ｇｒａｍ）染色状形態の画像である。
【図２】
本発明の乳酸菌株のＡＰＩ ＫＩＴ ５０ＣＨＬ糖の分解・分析表である。
【図３】
本発明の乳酸菌株の 微生物 アイデンティフィケーション システム（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ； Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＩＤ，Ｉｎｃ．， Ｎｅｗａｒｋ， ｄｅｌ．、ＵＳＡ）の自動 ガス クロマトグラフィー （Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）利用し現れた菌体脂肪酸の構成成分の図である。
【図４】
本発明の乳酸菌株の自動 ガス クロマトグラフィー利用し現れた菌体脂肪酸の構成成分の結果分析表図である。
【図５】
図５ａ、図５ｂ、図５ｃ及び図５ｄは、本発明の乳酸菌株のバイオログ ＧＰ マイクロ プレイト（Ｂｉｏｌｏｇ ＧＰ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ； Ｂｉｏｌｏｇ Ｃａｔ．＃１００４）利用９５個の炭素源に対する代謝指紋（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）の分析表図である。
【図６】
本発明の乳酸菌株のＤＮＡ塩基序列表図である。
【図７】
本発明の乳酸菌株の１６ｓ ｒＤＮＡのＤＮＡ塩基序列によるブラスト（ＢＬＡＳＴ）結果表である。
【図８】
ラクトバシラスパラカゼイ−グルプ−特異プライマー（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ−ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）利用本発明の乳酸菌株とラクトバシラス属（ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＣＲ反応比較図である。
【図９】
本発明の乳酸菌株ＤＮＡとラクトバシラスパラカゼイ亜種パラカゼイ（ＪＣＭ ８１３０）ＤＮＡ の塩基序列比較表図である。
【図１０】
ＲＰ プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）利用本発明の乳酸菌株とラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のＲＡＰＤ−ＰＣＲ反応比較図である。
【図１１】
ＣＲＡ ２５プライマー利用本発明の乳酸菌株とラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のＲＡＰＤ−ＰＣＲ反応比較図である。
【図１２】
図１２（ａ）及び図１２（ｂ）は、本発明の乳酸菌株の胃粘膜の付着性及び増殖性を示す図である。
【図１３】
図１３（ａ）及び図１３（ｂ）は、本発明の乳酸菌株の小腸粘膜の付着性及び増殖性を示す図である。
【図１４】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ）のＢａｌｂ／ｃ鼠の胃粘膜の感染性を示す画像である。
【図１５】
本発明の乳酸菌株（ＣＳＫ ０１）のＢａｌｂ／ｃ鼠の感染ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ）の死滅性を示す画像である。
【図１６】
本発明の乳酸菌株の抗菌物質のヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｒｏｌｉ）の死滅性を示す画像である。
【図１７】
Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７のＢａｌｂ／ｃ鼠の小腸粘膜の感染性を示す画像である。
【図１８】
本発明の乳酸菌株のＢａｌｂ／ｃ鼠の感染 Ｅ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７の死滅性を示す画像である。
【図１９】
本発明の乳酸菌株とＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７混合培養による Ｅ．ｃｏｌｉの死滅性を示す画像である。
【図２０】
本発明の乳酸菌株の抗菌物質のＥ．ｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７死滅性を示す画像である。
【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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