(57)【要約】本発明は、遺伝性ヘモクロマトーシスに関連するフェロポルチン１をコードする遺伝子における突然変異、および、そのような突然変異の同定に基づく遺伝性ヘモクロマトーシスの診断のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンの突然変異を含むことを特徴とするフェロポルチン１をコードする核酸。
【請求項２】
ｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
ｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
ゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記アミノ酸がアラニンであることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
前記突然変異が、異なる立体的および／または静電的特徴を有するアミノ酸による前記アミノ酸の置換を引き起こすことを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
異なる立体的および／または静電的特徴を有する前記アミノ酸が、アルギニン、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸を含む群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
前記アミノ酸がアスパラギン酸であることを特徴とする請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
前記突然変異が、ＧＡＣまたはＧＡＵコドンによるＧＣＣコドンの置換にあることを特徴とする請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記突然変異は、ＧＡＣコドンによるＧＣＣコドンの置換にあることを特徴とする請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸の配列と相補的な配列を有する核酸。
【請求項１２】
請求項１に記載の核酸によってコードされる突然変異フェロポルチン１。
【請求項１３】
配列番号２の７７位に相当するアミノ酸を含む、請求項１２に記載のフェロポルチンの少なくとも６個のアミノ酸の配列を有するペプチド。
【請求項１４】
配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む、請求項１に記載の核酸のフラグメント。
【請求項１５】
ラベルされていることを特徴とする請求項１４に記載のフラグメント。
【請求項１６】
請求項１に記載の核酸の少なくとも９個のヌクレオチドの配列を有し、かつ、配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
前記配列が、少なくとも１５個のオリゴヌクレオチドのものであることを特徴とする請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ラベルされていることを特徴とする請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１４に記載のフラグメントの配列と相補的な配列を有するフラグメント。
【請求項２０】
請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドの配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１４に記載のフラグメントによって、または請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドによってコードされるペプチド。
【請求項２２】
請求項１に記載の核酸の、または請求項１４に記載のフラグメントのヌクレオチド配列を含む組み換え型ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組み換え型ベクターによってトランスフェクトされたか、または形質転換された細胞。
【請求項２４】
請求項１２に記載の蛋白質をコードする導入遺伝子を含む真核生物細胞、組織、または非ヒト動物。
【請求項２５】
以下の段階を含む、哺乳動物における遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法：
ａ）前記哺乳動物から得られた生物学的試料からのゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの単離；
ｂ）前記ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡにおける、請求項１に記載の突然変異の存在に関する試験（ここで、前記突然変異の存在は、前記哺乳動物が、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である）。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的試料が、血液、血漿、唾液、尿、糞便、羊膜液または組織の試料であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
単離されたゲノムＤＮＡが、前記試験前に増幅されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記ＤＮＡのセグメントの増幅に適したオリゴヌクレオチドの対を用いるＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡが増幅されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号５および配列番号６のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＮＡが、前記試験前にｃＤＮＡに形質転換されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ｃＤＮＡが、前記試験前に増幅されることを更に特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記ＤＮＡのセグメントの増幅に適したオリゴヌクレオチドの対を用いるＰＣＲによって、ｃＤＮＡが増幅されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試験が、制限酵素の使用に基づく技術、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション技術、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ミスマッチ修復検出、一本鎖構造多形分析、変性剤勾配におけるゲル電気泳動、熱切断、ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的プライマー伸張、遺伝的ビット分析、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、対立遺伝子特異的ライゲーションチェーン反応、ならびに配列決定技術を含む群から選択される技術を用いて行われることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記試験が、制限酵素の使用に基づく技術、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、または配列決定技術を用いて行われることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試験が、以下の段階を含むことを特徴とする請求項３６に記載の方法：
ａ）配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記ＤＮＡのセグメントの選択的増幅に適したオリゴヌクレオチドの対による、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅、および、本発明の突然変異とともに、そうでなければ存在しない、制限部位に対するコンセンサス配列を生み出す、そのような突然変異の増幅されたＤＮＡへの同時導入；
ｂ）前記制限部位を認識し得る酵素との、増幅されたＤＮＡのインキュベーション；ならびに、
ｃ）消化産物の大きさの分析（ここで、消化が起こることは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおける請求項１に記載の突然変異の存在のサインである）。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号６および配列番号７のヌクレオチド配列を有し、かつ、前記酵素がＭｂｏ ＩＩであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号３、４、５、６、または７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
配列番号６および配列番号７のヌクレオチド配列を含むヌクレオチドならびにＭｂｏ ＩＩ酵素を含む、各人における、請求項１に記載の突然変異の決定のための診断用キット。
【請求項４１】
哺乳動物における、前記哺乳動物から得られた生物学的試料における請求項１２に記載のフェロポルチン１蛋白質の存在に関する試験を含む、遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法であって、前記蛋白質の存在が、前記哺乳動物が遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である方法。
【請求項４２】
前記同定が、前記突然変異フェロポルチン１を特異的に認識し得る抗体を用いて行われる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１２に記載の突然変異フェロポルチン１を特異的に認識し得るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
【請求項４４】
請求項１２に記載の突然変異フェロポルチン１の特異的不活性化のための抗体。
【請求項４５】
請求項４４に記載の抗体を含む薬学的組成物。
【請求項４６】
請求項１２に記載の突然変異フェロポルチン１の特異的不活性化のためのポリペプチド。
【請求項４７】
請求項４６に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
【請求項４８】
請求項１２に記載の突然変異フェロポルチン１をコードする遺伝子の発現を停止させ得るオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項４８に記載のオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、遺伝性ヘモクロマトーシスに関連するフェロポルチン（ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ）１をコードする遺伝子における突然変異、および、遺伝性ヘモクロマトーシスのための診断法としてのそのような突然変異の同定に関する。
【０００２】
従来技術
ヘモクロマトーシスは、生物における鉄の過剰蓄積を特徴とする、遺伝性の病状であり、長期にわたると、異なる器官および組織、特に、肝臓、心筋層、膵臓、腎臓、脾臓、性腺、および皮膚、の損傷を引き起こす。突発性ヘモクロマトーシスは、西洋の人々には最も一般的な遺伝性疾患であり（発生率 １：３００）、劣性の遺伝を特徴とする。近年、このタイプのヘモクロマトーシスは、染色体６の短腕に位置する、ＨＦＥ遺伝子の突然変異と関連付けられている。実際に、この病状を患っている患者において行われた研究において、分析された被験者の８３％が、この遺伝子（Ｃ２８２Ｙ）において、一点突然変異を有することが観察された（フェダー（Ｆｅｄｅｒ）ら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９６、１３： ３９９−４０８）。
【０００３】
しかし、より最近の研究により、地中海人種の人々では、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っている患者の６４％のみが、Ｃ２８２Ｙに関するホモ接合体であることが示された。このことは、特に南ヨーロッパの人々では、ＨＦＥ以外の他の遺伝子が、突発性ヘモクロマトーシスの原因であり得ることを示唆している（ピペルノ（Ｐｉｐｅｒｎｏ）ら、ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ） １９９８、１１４： ９９６−１００２およびボロト（Ｂｏｒｏｔ）ら、イムノゲンティクス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｔｉｃｓ） １９９７、４５： ３２０−３２４）。
【０００４】
遺伝性ヘモクロマトーシスの原因である遺伝的突然変異の同定は、診断および治療に非常に重要である。現在まで、ヘモクロマトーシスの診断は、非常に遅れており、かつ、しばしば取り返しのつかない組織の損傷の結果として進行する、臨床的症状に基づいている。その上、この病状の診断は、その症状が、鉄ホメオスタシスの変化を特徴とする他の病状のものと類似することがあるという事実により、困難になる。
【０００５】
遺伝性ヘモクロマトーシスの、症状が起こる前の段階での早期診断のための遺伝的スクリーニング方法の開発は、器官および組織へのダメージが起こる前の、適時の静脈切開介入（ｔｉｍｅｌｙ ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｙ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）を可能にし得る。
【０００６】
さらに、遺伝性ヘモクロマトーシスに関連する遺伝的変化の同定および症状の進行においてそれらが果たす役割の理解は、新たな改良された治療的ストラテジーの準備のために、きわめて重要である。
【０００７】
発明の要約
本発明者は、常染色体に優性な遺伝パターンによって、非ＨＦＥ依存性ヘモクロマトーシスの状態を患っている群を、あらかじめ同定し、かつ特徴付けした（ピエトランゲロ（Ｐｉｅｔｒａｎｇｅｌｏ）ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ １９９９， ３４１： ７２５−７３２）。
そこで、本発明者は、驚くべきことに、この症状の遺伝子座は、染色体２（２ｑ３２）の長腕上にあること、および、このタイプのヘモクロマトーシスを患っている被験者は、同じ染色体領域に位置する、フェロポルチン１をコードする遺伝子のヘキソン３に位置するコドンに、その症状を患っていない被験者では観察されない突然変異を有することを見出した。この突然変異は、フェロポルチン１分子において、アミノ酸の置換を引き起こす。
【０００８】
従って、本発明は、配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンの突然変異を特徴とする突然変異フェロポルチン１をコードする核酸、前記核酸によってコードされた突然変異フェロポルチン１蛋白質、および、前記核酸または前記蛋白質の同定に基づく遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法に関する。
【０００９】
図面の説明
図１：実施例３に記載のＭｂｏｌｌによる酵素消化による突然変異の同定のためのストラテジーのアウトライン。
【００１０】
詳細：
図１ａは、診断方法におけるゲノムＤＮＡ配列を示し、枠で囲んだＧＣＣ配列は、野生型フェロポルチンの７７位のアミノ酸アラニンをコードするコドンであり、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っている人々において、ＧＡＣコドンに突然変異される。二本線（／／）は、ヘキソン３とイントロン３のセグメントとの間の分離を示す。
【００１１】
図１ｂは、実施例３ｂに記載の診断方法のＰＣＲ反応において使用されるプライマーおよびターゲットゲノムＤＮＡ配列（Ｎは、ＣまたはＡヌクレオチドを意味する）である。フォワードプライマーは、アンダーラインを付した、ミスマッチなプライマーを有する（Ｇの代わりにＡ）。
【００１２】
図１ｃは、突然変異を含まない、対照の人々からの増幅された配列を示す。
【００１３】
図１ｄは、代わりに、症状を患っている人々からの増幅されたＤＮＡ配列を示し、対立遺伝子の１つにおいて、ＧＣＣコドンがＧＡＣコドンに突然変異させられ、かつ、Ｍｂｏ ＩＩ酵素に対するコンセンサス部位の出現を引き起こす。
【００１４】
図２：健康な群のメンバーまたはヘモクロマトーシスを患っている群のメンバーにおける診断的分析の結果。
【００１５】
詳細：
図２ａは、分析された人々（家系）の間の関係を示す。ヘモクロマトーシスを患っている被験者は、黒で表されており、一方、健康な被験者は、白で表されている。丸は、女性の被験者を表し、四角は男性を表す。
【００１６】
図２ｂは、それぞれの各人から増幅されたＤＮＡの制限プロファイル、その後のＭｂｏ ＩＩによる消化を示す。
【００１７】
図２ｃに示すように、野生型配列のみを有し、その後にＭｂｏ ＩＩによる消化が行われる、健康な被験者の場合、１３１塩基対が増幅された（１３１ ｂａｓｅ ｐａｉｒ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）ＤＮＡは、消化されない。症状を患っているすべての被験者は、突然変異に対するホモ接合体であるので、これらの患者から増幅されたＤＮＡは、１３１塩基対のバンド（正常な対立遺伝子）、ならびに、９４および３７塩基対の２つのバンド（後者は、図２ｂには示されていない）で消化される。
【００１８】
発明の詳細な説明
以下の実施例に詳細に示されるように、本発明者らは、フェロポルチン１遺伝子のヘキソン３に位置する特定のコドンの突然変異が、ＨＦＥ遺伝子に依存しない、遺伝性ヘモクロマトーシスの状態に関連することを同定した。
同定された突然変異は、配列番号２（添付の配列表）の７７位に相当する位置にあるアミノ酸アラニンが置換されている、突然変異フェロポルチン１の発現を引き起こす。
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らは、上記の突然変異が、ＨＦＥ遺伝子に関連しない遺伝性ヘモクロマトーシスの存在の十分な徴候であること、および、そのために、その徴候が、この症状の早期診断に有用であることを見出した。その上、本発明者らは、遺伝性ヘモクロマトーシスが、フェロポルチン１の機能の低下に関連することを見出した。
【００２０】
従って、第一の態様によれば、本発明は、配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンの突然変異を含むことを特徴とする、突然変異フェロポルチン１をコードする核酸に関する。“フェロポルチン１をコードする核酸”という語は、配列番号２のアミノ酸配列をコードするか、または、前記アミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％相同性であるアミノ酸配列をコードする、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、例えば、ＰＣＲから得られたＤＮＡ、もしくはｍＲＮＡを意味する。核酸がＤＮＡの場合、これは、一重または二重らせんであり得る。
【００２１】
また、本発明は、前記核酸に相補的な配列を有するアミノ酸を含む。例えば、この配列は、細胞中の遺伝子またはｍＲＮＡの発現を停止させるために使用されるアンチセンス配列であり得る。
【００２２】
本発明による突然変異は、７７位に相当するアミノ酸の野生型フェロポルチン１（ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号：ＡＦ２３１１２１）の分子中の置換を引き起こす。
“野生型フェロポルチン１”という語は、特に、その機能性を変える突然変異をもたない、その正常な生理学的役割を果たすフェロポルチン１を表す。その上、アミノ酸の位置（ｎｕｍｅｒｉｃａｌ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、それを同定する目的のみを有し、かつ、蛋白質のアミノ酸配列の変化があることによって、例えば、考慮される種の変化により、または、突然変異の存在もしくは前記アミノ酸の上流の領域における欠落によって変わり得る。
【００２３】
本発明者は、アスパラギン酸の分子による、７７位のアラニンの置換により、例えば、蛋白質二次構造の予想プログラム、いわゆる、“ＰＨＤｓｅｃ” （ロスト（Ｒｏｓｔ）ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３２： ５８４−５９９、１９９３）および“ＪＲＥＤ”（クフ（Ｃｕｆｆ）ら、プロテインズ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）： ストラクチャー（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、ファンクション・ジェネティクス（Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）アンド（ａｎｄ） ３４： ５０８−５１９） によって示され得る、フェロポルチン１における構造的修正が起こることを見出した。特に、前記置換は、アルファ−へリックスからベータ層構造への、アミノ酸５８からアミノ酸８１にわたる蛋白質領域（ＬＬＬＴＡＶＹＧＬＶＶＡＧＳ ＶＬＶＬＧＸＩＩＧＤ、配列番号８）の継代（ｐａｓｓａｇｅ）を決定する。
【００２４】
フェロポルチン１の二次構造の決定における、７７位のアミノ酸の重要性も、異なる動物種間での、その高い保存性（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）によって立証される。
【００２５】
帯電している、より大きな分子、例えば、アスパラギン酸による、小さな帯電していないアミノ酸であるアラニンの置換により、アルファへリックス水素結合を不安定にする、立体的静電相互作用が生じる。同様に、例えば、アルギニン、リジン、もしくはグルタミン酸のような、帯電したアミノ酸、または、より大きな立体障害を有するアミノ酸、例えば、ヒスチジンによる、アラニンの置換は、同様の分子のひずみを引き起こし得る。
【００２６】
その上、配列番号８に相当するフェロポルチン１領域は、本発明による突然変異蛋白質において変えられる、蛋白質の形質導入後修正部位（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、ミリスチン化部位ＧＡＩＩＧＤを含む。知られているように、ポリペプチドと膜リン脂質との相互作用を助ける際に、ミリスチン化は重要である。
【００２７】
従って、第二の態様によれば、本発明は、配列番号２の７７位に相当する位置におけるアミノ酸の置換を特徴とする、上記のアミノ酸によってコードされる、突然変異フェロポルチン１に関する。
【００２８】
前記の置換は、アラニンとは異なる立体的および／または静電的性質を有するアミノ酸による、７７位に相当する位置におけるアミノ酸アラニンの置換である。好ましくは、前記アミノ酸は、アルギニン、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸を含む群から選ばれ、中でも、アスパラギン酸が好ましい。
【００２９】
従って、特に好ましい適用によれば、本発明の核酸に存在する突然変異は、ＧＡＣおよびＧＡＵを含む群から選ばれるコドン、好ましくはＧＡＣによる、配列番号２の７７位に相当する位置におけるアミノ酸をコードするコドン、好ましくはＧＣＣの置換にある。
【００３０】
本発明の更なる態様は、配列番号２の７７位に相当するアミノ酸、ならびに、このすぐ下流および／または上流のアミノ酸を含む、少なくとも６個のアミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドに関する。そのようなペプチドの長さおよび配列は、所望の適用により、例えば、突然変異に特異的な抗体のホスト動物における生成を刺激するために、または、突然変異エピトープと特異的に相互作用するペプチドおよび／もしくは抗体を得るために、当業者に既知の規準に基づいて選択される。
そのようなペプチドの好ましい態様は、配列番号８に相当するペプチドであり、Ｘａａは、アスパラギン酸であることが好ましい。
【００３１】
本発明は、更に、突然変異コドン、および、前記コドンを含む前記核酸の、少なくとも９個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドの配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、前記核酸のヌクレオチドフラグメントに関する。
前記フラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであることができ、後者の場合は、一重または二重らせんであることができる。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、一重らせんである。
【００３２】
更に、本発明は、前記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドのものと相補的な配列を有するヌクレオチドフラグメントおよびオリゴヌクレオチドを含む。本発明によれば、“ヌクレオチドフラグメント”とは、１００塩基対を超える長さを有する本発明の核酸の部分的な配列に相当する配列を有する核酸を意味する。
【００３３】
本発明によれば、“オリゴヌクレオチド”とは、１００塩基対の最大長さの本発明の核酸のフラグメントを意味する。
本発明のヌクレオチドフラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲによる増幅による、本発明の核酸の消化によって得られ得るか、または、当分野で既知の技術を用いて合成され得る。
【００３４】
本発明のオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡフラグメントは、例えば、キメラ蛋白質もしくは抗体の生成、診断目的のための本発明の突然変異の決定、または、治療目的のための突然変異遺伝子の不活性化のような、異なる目的のために使用される。当業者は、所望の使用に適した配列および長さを有するフラグメントおよびオリゴヌクレオチドを選択することができる。例えば、前記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション技術による、本発明の突然変異の決定のために使用されるべきであり、それらは、突然変異コドンを含む核酸配列において、ストリンジェントな条件下で、特定の方法においてハイブリダイズし得るような長さおよび配列を有さなければならない。
【００３５】
好ましい態様によれば、本発明のフラグメントおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、放射性同位体、酵素、ビオチン−アビジン、または、特定のアッセイによってそれらを視覚化し得る他の分子によって、ラベルされる。
更に、本発明は、そのようなフラグメントおよびオリゴヌクレオチドによってコードされるペプチドに関する。
【００３６】
本発明の核酸、突然変異を含むそのフラグメント、または、そのようなフラグメントを含む核酸は、例えば、例えば競争研究による、突然変異蛋白質の機能的特徴の研究のために、または、抗体の生成のために、組み換え型の突然変異フェロポルチン１、そのフラグメント、またはこのフラグメントを含むキメラ蛋白質の生成のために有利に使用され得る。この目的のために、前記核酸またはフラグメントは、トランスフェクション、形質転換、感染、または核内注入のような、当分野で周知の技術を用いて、原核生物または真核生物細胞に順番に導入される、発現ベクターに挿入される。
この目的に適したベクターには、プラスミド、ウイルス起源のベクター、および酵母または哺乳動物人工染色体が含まれる。
【００３７】
従って、更なる態様において、本発明は、本発明による核酸またはＤＮＡフラグメントを含む組み換え型ベクター、ならびに、前記ベクターを含む真核生物細胞または原核生物細胞に関する。
【００３８】
本発明による核酸は、本発明の突然変異フェロポルチン１をコードする導入遺伝子を含む、真核生物細胞、組織、または非ヒト（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ）動物の調製のために使用され得る。導入遺伝子は、細胞、組織、または動物のゲノムに永続的に挿入され得るか、または、染色体外の状態で存在し得る。
【００３９】
前記細胞、組織、または非ヒト動物は、遺伝子および本発明の突然変異を含む蛋白質の機能、ならびに、遺伝性ヘモクロマトーシスの発症におけるそれらの役割を研究するためのモデルとして有用である。この研究は、遺伝性ヘモクロマトーシスの治療のための、新たな治療的アプローチの開発のために、特に重要である。
【００４０】
更なる態様において、本発明は、以下の段階を含む、哺乳動物、好ましくはヒトにおける遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法に関する：
ａ）前記哺乳動物から得られた生物学的試料からのゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの単離；
ｂ）前記ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡにおける、本発明による突然変異の存在に関する試験、
ここで、前記突然変異の存在は、前記哺乳動物が、遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である。
好ましくは、前記生物学的試料は、血漿、唾液、尿、糞便、羊膜液または組織の試料である。
試験前に、逆転写反応によって、ＲＮＡを、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に形質転換することが好ましい。
【００４１】
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、直接、または、インビトロ増幅ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３９： ４８７−４９１、１９８８）もしくは、他の技術、例えば、リガーゼ・チェーン反応（ＬＣＲ）（ウー（Ｗｕ）ら、ゲノミクス（ｇｅｎｏｍｉｃｓ） ４： ５６０−５６９、１９８９）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９： ３９２−３９６）、もしくは自立的（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（３ＳＲ）（ファイ（Ｆａｈｙ）ら、ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １： ２５−３３、１９９２）の後に分析される。
好ましくは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記ＤＮＡのセグメントの増幅に適したオリゴヌクレオチド（プライマー）対を用いるＰＣＲによって増幅される。
例えば、ｃＤＮＡの増幅に使用され得るプライマー対は、配列番号３および配列番号４のヌクレオチド配列を有するものであるのに対し、ゲノムＤＮＡの増幅に適したプライマーは、配列番号５および配列番号６のヌクレオチド配列を有するものである。
【００４２】
当分野で周知の多くの技術は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡにおいて、本発明による突然変異の有無を決定するために使用され得る。適当な技術は、例えば、制限酵素の使用に基づく技術（カン（Ｋａｎ）ら、Ｌａｎｃｅｔ： ９１０−９１２、１９７８）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション技術（ワランス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ６： ３５４３−３５５７、１９７８）であり、中でも、例えば、フィルター（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６： ６２３０−６２３４、１９８９）もしくはマイクロチップ（チー（Ｃｈｅｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２７４： ６１０−６１４、１９９６）に固定されたオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーション、および、オリゴヌクレオチドアレイ（マスコス（Ｍａｓｋｏｓ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１： ２２６９−２２７０、１９９３）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １７： ２５０３−２５１６、１９８９）、ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）（ファハム（Ｆａｈａｍ）およびコックス（Ｃｏｘ） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ： ４７４−４８２、１９９５）、一本鎖構造多形分析（ラブニク−グラバク（Ｒａｖｎｉｋ−Ｇｌａｖａｃ）ら、Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． ３： ８０１、１９９４）、変性剤勾配（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ）におけるゲル電気泳動（グルドバーグ（Ｇｕｌｄｂｅｒｇ）ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ８８０、１９９４）、熱切断（Ｈｏｔ Ｃｌｅａｖａｇｅ）（コットン（Ｃｏｔｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｋｉ ＵＳＡ ８５： ４３９７， １９８８）， ＤＮＡｓｅ （ユイル（Ｙｏｕｉｌ）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２： ８７−９１、１９９５）およびＲＮＡｓｅ保護アッセイ（ウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｋｉ． ＵＳＡ， ８２： ７５７５、１９８５； メイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３０： １２４２、１９８５）、対立遺伝子特異的プライマー伸張（シバネン（Ｓｙｖａｎｅｎ）ら、ゲノミクス（ｇｅｎｏｍｉｃｓ） ８： ６８４−６９２、１９９０、およびシバネン（Ｓｙｖａｎｅｎ）ら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ １３： １−１０、１９９９）、遺伝的ビット分析（ＧＢＡ）（ニキフォロフ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２２： ４１６７−４１７５、１９９４）、プライマーライゲーションアッセイ（ＯＬＡ） （ランデルゲン（Ｌａｎｄｅｒｇｅｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２４１： １０７７、１９８８）、対立遺伝子特異的ライゲーションチェーン反応（ＬＣＲ） （バラニー（Ｂａｒｒａｎｙ） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８： １８９−１９３、１９９１）、ギャップ−ＬＣＲ（アブラバヤ（Ａｂｒａｖａｙａ）ら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３： ６７５−６８２、１９９５）、ならびに配列決定技術である。本発明の突然変異の決定のために特に好ましい技術は、制限酵素の使用に基づく技術、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションおよび配列決定技術である。
【００４３】
従って、第一の好ましい適用によれば、分析されるＤＮＡにおける、本発明による突然変異の存在に関する試験は、制限酵素の使用に基づく技術を用いて行われ、かつ、以下の段階を含む：
ａ）配列番号２の７７位に相当するアミノ酸をコードするコドンを含む前記ＤＮＡのセグメントの選択的増幅に適したオリゴヌクレオチド対による、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅、および、本発明の突然変異の存在下において、そうでなければ存在しない（ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ ｎｏｔ ｐｒｅｓｅｎｔ）、制限部位に対するコンセンサス配列を生み出す、そのような突然変異の増幅されたＤＮＡへの同時導入；
ｂ）前記制限部位を認識し得る酵素との、増幅されたＤＮＡのインキュベーション；ならびに、
ｃ）消化産物の大きさの分析；ここで、消化が起こることは、ゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡにおける本発明の突然変異の存在のサインである。
【００４４】
消化産物の大きさの分析は、例えば、分子量のマーカーを用いるゲル電気泳動、その後の、例えば、臭化エチジウムを用いるＤＮＡバンドの視覚化によって行われ得る。例えば、アスパラギン酸分子をコードするＧＡＣコドンによる、７７位のアラニンをコードするＧＣＣコドンの置換の存在を試験するために、配列番号６および配列番号７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドが使用され得る。後述の実施例で示されるように、前記置換の存在下で、これらのオリゴヌクレオチドは、野生型ＤＮＡ（図１ｃ）から増幅されるＤＮＡのフラグメントには存在しない、Ｍｂｏ ＩＩ酵素に対するコンセンサス部位、ＧＡＡＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴ、を含む、図１ｄに示す配列を有する増幅されたＤＮＡのフラグメントを生じる。Ｍｂｏ ＩＩによる増幅反応の産物のその後のインキュベーションにより、本来の配列に突然変異が存在する場合にのみ消化されるフラグメントが生じる。更に好ましい適用によれば、本発明による突然変異の決定は、本発明の核酸のフラグメントまたは本発明による突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドが使用される、ハイブリダイゼーション技術によって行われる。
【００４５】
前記フラグメントまたはオリゴヌクレオチドは、突然変異コドンを含む本発明の核酸の配列において、前記配列が、多くの他の配列と共に存在する場合にも、特定の方法においてハイブリダイズし得る。
当業者は、ハイブリダイゼーション条件、ならびに、使用される特別なハイブリダイゼーション技術に最も適したフラグメントまたはオリゴヌクレオチドの長さおよび配列、ならびに、分析されるＤＮＡ（適当なベクターにおいて増幅またはクローニングされるゲノムまたは相補的ＤＮＡ）の種類を、毎回選択することができる。
【００４６】
更に好ましい適用によれば、診断法は、ゲノムＤＮＡまたは相補的ＤＮＡが、突然変異コドンを含む前記ＤＮＡのセグメントを選択的に増幅し得るが、野生型コドンを含む対応するセグメントを増幅しないオリゴヌクレオチドが使用されるＰＣＲ反応に付される、対立遺伝子特異的ＰＣＲの使用を予想する。
また、本発明は、前記方法において使用されるべき、本発明による核酸フラグメントおよびオリゴヌクレオチドにも関する。特に、それは、配列番号３、４、５、６、および７に相当するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００４７】
本発明の範囲内には、各人における、本発明による突然変異の同定のための診断用キットも含まれる。特に好ましい適用によれば、前記診断用キットは、配列番号６および７に相当するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドならびにＭｂｏ ＩＩ酵素を含む。
【００４８】
本発明はまた、哺乳動物における、前記哺乳動物からの生物学的試料中の、本発明による突然変異フェロポルチン１蛋白質の存在に関する試験を含む、遺伝性ヘモクロマトーシスのインビトロ診断のための方法であって、前記蛋白質の同定が、その人が遺伝性ヘモクロマトーシスを患っていることの徴候である方法に関する。
好ましくは、前記試験は、本発明による突然変異フェロポルチンの分子と野生型フェロポルチンの分子とを識別し得るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が使用される、免疫学的アッセイによって行われる。
【００４９】
従って、本発明はまた、本発明による突然変異フェロポルチン１の分子を特異的に認識し得るモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、または、突然変異を含むそのエピトープに関する。そのような抗体は、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）によって、アンチボディズ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ラボラトリー・マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） １９８８に記載されているもののような、当分野で周知の方法を用いて得られる。
【００５０】
その上、本発明の抗体は、蛋白質の特徴の研究において、または、治療目的のために、診断薬として特に有用である。例えば、前記抗体は、その生化学的特徴の研究または免疫親和力によるその精製のために、突然変異蛋白質の正確な組織または細胞局在化を決定するために使用され得る。
【００５１】
更に、各人における、本発明の突然変異を有する遺伝子およびそれによってコードされるフェロポルチン１の存在は、遺伝性ヘモクロマトーシスの発症と相関するので、遺伝子の発現を停止するか、または、蛋白質を不活性化するための手段を有することは、非常に重要である。
【００５２】
従って、本発明はまた、本発明の突然変異フェロポルチン１をコードする遺伝子の発現の阻害に適したオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに、本発明の突然変異フェロポルチン１の機能性を特異的に変え得る抗体およびポリペプチドに関する。
また、本発明は、薬学的に許容され得る添加剤と混合した、前記オリゴヌクレオチド、抗体、またはペプチドを含む薬学的組成物に関する。
【００５３】
【実施例】
実施例１
非ＨＦＥ依存性遺伝性ヘモクロマトーシスに関連する染色体および染色体の位置の同定
キアゲン・ブラッド・エクストラクション・キット（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を用いて、発端者（ｐｒｏｂａｎｄ）および症状を患っている群のメンバーの末梢血から、ＤＮＡ試料を抽出した。
次いで、抽出されたＤＮＡを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ リンケージ・マッピング・セット（Ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｓｅｔ）（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、米国）を用いることによって行われる、ゲノムの広範な研究のために使用した。製造者から提案された条件下で、蛍光性オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ反応のために使用した。次いで、各ＰＣＲ反応のアリコートを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ シーケンサーにおいて配列決定し、得られた結果を、ＧＥＮＥＳＣＡＮソフトウェアを用いて分析した。対立遺伝子の指定（ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）は、ゲノタイパー（Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒ）（商標）ソフトウェアを用いて行った。完全浸透度（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅ）による優性常染色体疾患に基づく統計分析を行った。遺伝子疾患の頻度を、０．０１２で固定し、すべてのマーカー対立遺伝子を、同じ頻度とみなした。表１は、ロッドスコア（ｌｏｄ ｓｃｏｒｅ）、即ち、特異的マーカーと病気との関連の最大確率、を含む。
【００５４】
【表１】
2004516018.tif 000002
【００５５】
対数で表されたスコアが高いほど、病気と使用される特異的マーカーとの関連が偶然である（ｃａｓｕａｌ）確率が低い。例えば、１．０のロッド・スコアは、その結果が偶然である確率が１０分の１であること（１ ｃｈａｎｃｅ ｉｎ １０）を意味し、２のロッド・スコアは、１００分の１の確率であることを意味し、以下同様である。マーカーＤ２Ｓ１１８（５．９９）およびＤ２Ｓ１５２（５．８８）により、非常に高いスコアが得られるという事実は、病気に関連する遺伝子が、これらマーカーによって範囲を定められる領域に位置していることを示す。フェロポルチン１は、この染色体領域に位置する。他の染色体領域では、同様の結果は得られなかった。
【００５６】
実施例２
突然変異の同定
発端者から、１５人の症状を患っている群のメンバーから、および、２５人の症状を患っていない群のメンバーから、血液試料を採取した。グアニジン−イソチオシアネートにおける抽出によって各試料から得られたマクロファージから、全ＲＮＡを単離し、次いで、相補的ＤＮＡを、標準プロトコルによって調製した（４００ ｎｇの全ＲＮＡ、１μｇのオリゴｄＴ、１ｍＭのｄＮＴ、２０ Ｕの逆転写されたＡＭＶを含む２０μｌの反応バッファー； プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））。次いで、以下のオリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲ反応によって、完全なフェロポルチン１配列を、ｃＤＮＡから増幅した：
フォワードプライマー  ５’−ＧＣＴＣＡＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＴＡＧＧＣＴ−３’
（配列番号３）
リバースプライマー  ５’−ＧＧＣＴＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴ−３’
（配列番号４）
【００５７】
詳細には、逆転写反応の生成物１０ｍｌを、５０μｌ（最終容量）の１×反応バッファー（２００μＭ ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５μｇのそれぞれの上記オリゴヌクレオチド、２．６単位の酵素を含む）中で増幅した。増幅反応のために、それぞれが、以下の加熱プロファイル：
９４℃、１分、
５８℃、４０秒、
７５℃、５分
を特徴とする、３０サイクルのプログラムを使用した。
次いで、増幅されたフェロポルチン１ｃＤＮＡから、４つの部分的に上に重なっているＤＮＡフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、新たなＰＣＲによって得た：
１°フラグメント：
フォワードプライマー：５’−ＧＣＴＣＡＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＴＡＧＧＣＴ−３’
リバースプライマー：５’−ＣＡＧＡＣＡＣＣＧＣＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＡ−３’
２°フラグメント：
フォワードプライマー：５’−ＡＣＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＧ−３’
リバースプライマー：５’−ＣＣＧＣＡＡＧＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧ−３’
３°フラグメント：
フォワードプライマー：５’−ＧＧＴＧＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＴＴ−３’
リバースプライマー：５’−ＡＧＡＣＧＴＡＣＴＣＣＡＣＧＣＡＣＡ−３’
４°フラグメント：
フォワードプライマー：５’−ＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＴＧＴＧＧＣＡ−３’
リバースプライマー：５’−ＧＧＣＴＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴ−３’
【００５８】
次いで、増幅から得られた４つのフラグメントを、アガロースゲル上で電気泳動によって分離し、ジェット・ソーブ・キット（Ｊｅｔ Ｓｏｒｂ ｋｉｔ）（ジェネンコ（Ｇｅｎｅｎｃｏ））を用いて精製し、そして、ローダミン・シーケンス・キット（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｋｉｔ）（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、米国）を用いて直接配列決定した。配列決定により、症状を患っている被験者において、対照のどの被験者でも見られなかった、配列番号１の２３０位における、ＣのＡによる置換の存在が明らかになった（ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号：ＡＦ２３１１２１を有する配列の５３４位におけるヌクレオチド）。この置換は、フェロポルチン１遺伝子のヘキソン３に位置しており、それにより、フェロポルチン１の７７位でのアスパラギン酸によるアラニンの置換が起こった。
【００５９】
実施例３
診断法
ａ）発端者、１５人の症状を患っている群のメンバー、ならびに、１００人の健康なボランティアおよび２５人の症状を患っていない群のメンバーを含む１２５人の対照の人々のゲノムＤＮＡを、血液ＤＮＡ抽出キット（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を用いて分析されるべき被験者の血液試料からの白血球から抽出した。
次いで、ヘキソン３を側面に有し（ｆｌａｎｋｉｎｇ）、かつ、以下の配列を有するイントロン領域と相補的なオリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲによって、得られたＤＮＡを増幅した：
フォワードプライマー：５’−ＣＣＴＴＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣ−３’
（配列番号５）
リバースプライマー：５’−ＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＧＧＴＣＣ−３’
（配列番号６）
【００６０】
詳細には、２００ｎｇのゲノムＤＮＡを、５０μｌの１×反応バッファー（２００μＭ ｄＮＴＰ類、 １．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド、および２．６ Ｕの酵素を含む）中で増幅させた。
それぞれが、以下の加熱プロファイル：
９４℃、１分、
６０℃、１分、
７２℃、４５秒
を特徴とする、３０サイクルのプログラムを、増幅反応のために使用した。
【００６１】
次いで、得られたＤＮＡを、ＰＣＲウィザード・キット（Ｗｉｚａｒｄ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて精製し、ＰＣＲ反応のために使用した、同じオリゴヌクレオチド対を用いて、自動ＡＢＩ プリズム（Ｐｒｉｓｍ） ３７７シーケンサー（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、米国）において配列決定した。
ヘキソン３におけるＣによるＡの置換が、症状を患っている被験者において見られたが、対照の被験者では見られなかった。
【００６２】
ｂ）発端者から、１５人の症状を患っている群のメンバーから、および実施例２に記載の１２５人の対照被験者から、血液試料を得て、血液ＤＮＡ抽出キット（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ））を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。
観察される突然変異は、制限部位の出現または消滅を何ら引き起こさないので、突然変異を含むヘキソン３の一部が、以下の配列を有するオリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲによって増幅された：
フォワードプライマー： ５’−ＧＴＧＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＧ−３’
（配列番号７）
リバースプライマー：５’−ＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＣＡＧＧＣＡＴＴＧＧＴＣＣ−３’
（配列番号６）
【００６３】
図１ｂに示すように、フォワードプライマーは、ミスマッチのヌクレオチドを有する（Ｇの代わりにＡ、アンダーラインを付した）。前記オリゴヌクレオチドによる増幅は、突然変異の存在下で、図１ｄに示す配列を有する、Ｍｂｏ ＩＩ酵素に対するコンセンサス部位、ＧＡＡＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴ、を含む、増幅されたフラグメントを生じる。それに対して、突然変異がない場合は、図１ｄに示す配列を有する、そのような制限部位（図１ｃ）を含まないＤＮＡフラグメントが得られる。
【００６４】
従って、Ｍｂｏ ＩＩ酵素による増幅反応の生成物のその後のインキュベーションにより、本来の配列が突然変異を含んでいた場合にのみ、フラグメントが消化される。
詳細には、１０μｌの抽出されたゲノムＤＮＡが、最終的に５０μｌの１×反応バッファー（２００μＭ ｄＮＴＰ類、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ ｐｍｏｌｅの各オリゴヌクレオチド、および２．６単位の酵素を含む）中で増幅される。それぞれのサイクルが、以下の加熱プロファイル：
９４℃、１分、
５８℃、１分、
７２℃、４５秒
を特徴とする、３０サイクルのプログラムが、増幅反応のために使用された。
【００６５】
次いで、増幅から得られた生成物１０μｌを、Ｍｂｏ ＩＩ酵素（ジェネコ（Ｇｅｎｅｃｏ））を用いて、１×反応バッファー中で、３時間、３７℃で消化した。
次いで、消化から得られたフラグメントを、１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。症状を患っている患者から得られた試料から、１３１、９４、および３７塩基対のバンドが得られた。それに対して、得られたすべての対照試料は、たった１つの１３１塩基対のバンドを有していた。図２は、発端者から、４人の症状を患っている群のメンバーから、および３人の健康な群のメンバーから得られた結果を示す。図からわかるように、１３１塩基対のフラグメントの、９４塩基対および３７塩基対の２つのフラグメントへの消化は、症状を患っている被験者でのみ観察された。
【００６６】
本発明には、野生型遺伝子による突然変異遺伝子の置換を含む、何らかの治療操作も含まれる。従って、突然変異フェロポルチン１分子は、突然変異遺伝子の置換を目的とする、すべての遺伝的治療操作のための治療的ターゲットである。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３に記載のＭｂｏｌｌによる酵素消化による突然変異の同定のためのストラテジーのアウトライン。
【図２】健康な群のメンバーまたはヘモクロマトーシスを患っている群のメンバーにおける診断的分析の結果。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004516018.tif 000044
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516018.tif 000071
【国際調査報告】
2004516018.tif 000072
2004516018.tif 000073