(57)【要約】本発明はバイオ支持体及びその製造方法に関し、さらに詳しくはバイオチップの製造時スライドガラスにバイオポリマーを固定させることができる方法に関する。バイオ支持体の製造方法は（ａ）シリレイテッドスライドガラス上のアルデヒド基とデンドリマーアミノ基間にシッフ塩基を形成してデンドリマー単一層を形成し、（ｂ）テトラヒドロほう酸ナトリウム（ＮａＢＨ４）で（ａ）のスライドの反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させることを含む。本発明の支持体は３次元構造を提供してバイオポリマーを効果的に固定させることができる。また、バイオ支持体はバイオポリマー間の相補的結合を促進させる。
2004511804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）表面にアルデヒド基を含むスライドガラス及び
（ｂ）（ａ）のアルデヒド基に結合されたデンドリマーを含むバイオ支持体。
【請求項２】
前記バイオ支持体はデンドリマーのアミノ基にリンカーをさらに含むものである、請求項１に記載のバイオ支持体。
【請求項３】
前記リンカーは化学式１の化合物、化学式２の化合物、化学式３の化合物及びｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテートからなる群より選択するものである、請求項２に記載のバイオ支持体。
【化１】
2004511804.tif 000004
【請求項４】
前記デンドリマーはデンドリマー１乃至８世代である、請求項１に記載のバイオ支持体。
【請求項５】
（ａ）シリレイテッドスライド上のアルデヒド基とデンドリマーアミノ基間にシッフ塩基を形成してデンドリマー単一層を形成し、
（ｂ）テトラヒドロほう酸ナトリウム（ＮａＢＨ４）で（ａ）のスライドの反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させることを含むバイオ支持体製造方法。
【請求項６】
前記方法は変換後にデンドリマーのアミノ基にリンカーを結合させることをさらに含む、請求項５に記載のバイオ支持体製造方法。
【請求項７】
前記リンカーは化学式１の化合物、化学式２の化合物、化学式３の化合物及びｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート（ＮＩＡ）からなる群より選択するものである、請求項６に記載のバイオ支持体製造方法。
【化２】
2004511804.tif 000005
【請求項８】
請求項１に記載のバイオ支持体に核酸、蛋白質、ペプチド、抗体及び化学物質からなる群より選択されるバイオポリマーを固定したバイオチップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明に属する技術分野】
本発明はバイオ支持体及びその製造方法に関し、さらに詳しくはバイオチップ製造時にスライドガラス上にバイオポリマーを固定させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に基づいたマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）分析法は最近最も多く使用されている技術で、様々な応用性を有している。多くの分野において使われているマイクロアレイ分析法は標識化された核酸分子が固体表面に固定されている核酸分子を検出するのに用いることができるという基本概念から次第に発展している。
【０００３】
現在ＤＮＡチップに関連した主な研究は米国で行われており、一部研究はヨーロッパで行われている。また、ＤＮＡチップ製作と応用に関する幾多のベンチャー企業が合併しており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｍｏｔｏｒｏｌａなど大手企業がこれを支援している。１９９８年まで、一般研究者が購入できるアレイ（ａｒｒａｙ）は遺伝子をフィルターに固定した形態のものであった。ＮＥＮ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅではスライドガラス上に２，４００個のヒトｃＤＮＡを固定した製品を市場に発表した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＩｎｃｙｔｅなどではヒトのＥＳＴ、マウス、酵母、バクテリアなどのＤＮＡチップを商品化し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社もスライド形態のｃＤＮＡアレイを市場に発表した。このような製品は全て二次元的な平面にオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を固定する方式で製作されたものである。つまり、ポリ−リジン（ｐｏｌｙ−ｌｙｓｉｎｅ）をガラス表面に処理した後、ＤＮＡをＵＶ−架橋結合（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）などを通じてガラス上のポリ−リジンに固定するものである。他の方法としては、ガラス表面にアルデヒド基やアミノ基からなるＳＡＭ（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成させた後、ＤＮＡを前記ガラスに結合させることがある。前記方法では短いＤＮＡオリゴヌクレオチドから長いｃＤＮＡまで固定できるが、付着された核酸の表面密度及び目的核酸とプローブ間のハイブリダイゼーション効率性によって適用には限界がある。
【０００４】
表面密度とハイブリダイゼーション効率の制限要因を解決するために、多くの研究がアクリルアミドゲルパッド、ゼラチンパッド、寒天フィルムのような様々な固体支持体を開発するために行われており、ポリアクリルアミドゲルは優れた固定力を有する三次元固体支持体であるが（Ｒｅｈｍａｎ， Ｆ． Ｎ．， Ａｕｄｅｈ， Ｍ．， Ａｂｒａｍｓ， Ｅ． Ｓ．， Ｈａｍｍｏｎｄ， Ｐ． Ｗ．， Ｋｅｎｎｅｙ， Ｍ．， ａｎｄ Ｂｏｌｅｓ， Ｔ． Ｃ． （１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２７， ６４９−６５５； Ｇｕｓｃｈｉｎ， Ｄ．， Ｙｅｒｓｈｏｖ， Ｇ．， Ｚａｓｌａｖｓｋｙ， Ａ．， Ｇｅｍｍｅｌｌ， Ａ．， Ｓｈｉｃｋ， Ｖ．， Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖ， Ｄ．， Ａｒｅｎｋｏｖ， Ｐ．， ａｎｄ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ， Ａ． （１９９７） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２５０， ２０３−２１１）、固体支持体とオリゴヌクレオチド間の空間不足のためにハイブリダイゼーション効率が低い。ハイブリダイゼーション効率を高めるために、固定された核酸と固体支持体との間を連結する様々なリンカー（連結体）の導入が試みられている（Ｇｕｏ， Ｚ．， Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ， Ｒ． Ａ．， Ｔｈｉｅｌ， Ａ． Ｊ．， Ｗａｎｇ， Ｒ．， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｌ． Ｍ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２， ５４５６−５４６５； Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ， Ｍ． Ｓ．， Ｃａｓｅ−Ｇｒｅｅｎ， Ｓ． Ｃ．， ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ． Ｍ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５， １１５５−１１６１）。しかし、修飾物質を含む大部分の方法は非常に複雑であるだけでなく、特定の条件下でのみ適用が可能なのが実情である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、核酸、蛋白質、抗体などのバイオポリマーを固定することができるバイオ支持体を提供することにある。
【０００６】
また、本発明の目的は、核酸、蛋白質、抗体などのバイオポリマーを固定することができるバイオ支持体製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために本発明は、（ａ）表面上にアルデヒドを含むスライドガラス及び（ｂ）前記（ａ）のアルデヒド基に結合されているデンドリマーを含むバイオ支持体を提供する。
【０００８】
また、本発明は（ａ）シリレイテッドスライド上のアルデヒド基とデンドリマーのアミノ基を反応させてシッフ塩基を製造することにより、デンドリマー単一層を形成する段階及び（ｂ）テトラヒドロほう酸ナトリウムでスライド（ａ）上の反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させる段階を含むバイオ支持体の製造方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は前記支持体に核酸、蛋白質、ペプチド、抗体、及び化学物質からなる群より選択されたバイオポリマーを固定したバイオチップを提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明をさらに詳細に説明する。
【００１１】
疾患診断用マイクロアレイチップシステムの開発において、本発明者はバイオチップ製造の核心であるポリマー（核酸、蛋白質など）をガラス表面上に固定させる方法について研究し、バイオ支持体及びバイオチップを開発した。
【００１２】
本発明のバイオ支持体はスライドガラスの表面上に３次元構造でバイオポリマーを固定させることができるデンドリマーを含む。デンドリマーはスライドのアルデヒド基に結合させた後、バイオポリマーをデンドリマーに固定させる。前記デンドリマーは８０年代中端から研究されており、合成方法と物理的、化学的特性に対する研究が進められている。デンドリマーに対する大部分の研究は可塑剤、液晶、レイヤー（ｌａｙｅｒｓ）及び薬物伝達体に関するもので、デンドリマーはまだ商業的に商品化されてはいない。
【００１３】
本発明のポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは図１に示されているように、求核性（ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ）または求電子性（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｉｃ）中心部から始まってアミドアミノ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）基で分岐した放射形を有し、球形に近い３次元的な構造をしている。図１のＰＡＭＡＭデンドリマー３世代は直径が約４０Åであり、３２個のアミノ基を含んでいる。
【００１４】
ＰＡＭＡＭデンドリマーのアミノ基は一世代当り二倍に増加し、直径は約１０Åずつ増加する。図２はまた６４個のアミノ基を含むＰＡＭＡＭデンドリマー４世代を示す。本発明のデンドリマーは固有な構造と分岐したアミノ基からなる３次元的構造を提供する。デンドリマーは楕円形の形態であると推定される（Ｔｏｋｕｈｉｓａ， Ｈ．， Ｚｈａｏ， Ｍ．， Ｂａｋｅｒ， Ｌ． Ａ．， Ｐｈａｎ， Ｖ． Ｔ．， Ｄｅｒｍｏｄｙ， Ｄ． Ｌ．， Ｇａｒｃｉａ， Ｍ． Ｅ．， Ｐｅｅｚ， Ｒ． Ｆ．， Ｃｒｏｏｋｓ， Ｒ． Ｍ．， ａｎｄ Ｍａｙｅｒ， Ｔ． Ｍ． （１９９８） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２０， ４４９２−４５０１； Ｂｌｉｚｎｙｕｋ， Ｖ． Ｎ．， Ｒｉｎｄｅｒｓｐａｃｈｅｒ， Ｆ．， ａｎｄ Ｔｓｕｋｒｕｋ， Ｖ． Ｖ． （１９９８） Ｐｏｌｙｍｅｒ， ３９， ５２４９−５２５２）。
【００１５】
本発明の好ましいデンドリマーはデンドリマー１乃至８世代であり、さらに好ましくはデンドリマー２乃至６世代であり、最も好ましくはデンドリマー３乃至４世代である。
【００１６】
デンドリマーに固定されるバイオポリマーは核酸、蛋白質、ペプチド、化学物質及び抗体からなる群より選択することができ、好ましくは核酸及び蛋白質であり、最も好ましくは核酸である。
【００１７】
本発明のバイオ支持体のモデルは図３（ｄ）で示すことができ、スライドガラスの表面に付着されたアルデヒド基に結合しているデンドリマーを含む。
【００１８】
また、本発明のバイオ支持体はデンドリマーのアミノ基にリンカーがさらに連結されているものを含む。前記リンカーはバイオポリマーが固体支持体に容易に連結されるようにする連結体であって、前記の化学式１の化合物、化学式２の化合物（１，４−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ； ＰＤＣ）、化学式３の化合物及びｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート（ＮＩＡ）からなる群より選択することができる。
【化３】
2004511804.tif 000003
【００１９】
リンカーを含むバイオ支持体は図４に示す。図４（ａ）は化学式１のリンカーを含むバイオ支持体であり、図４（ｂ）は化学式２のＰＤＣを含むバイオ支持体であり、図４（ｃ）は化学式３のリンカーを含むバイオ支持体であり、図４（ｄ）はＮＩＡリンカーが連結されたバイオ支持体である。図４のバイオ支持体は核酸、蛋白質、ペプチド、抗体などを固定することができる。
【００２０】
デンドリマーの直径はＰＤＣとのカップリングによって約１７Å増加する。このような事実とデンドリマーの優れたカバー力により、活性形チオシアネート基の表面密度は約０．０６ｎｍｏｌ／ｃｍ２であり、近接したチオシアネート基間の平均距離は約１８Åである。前記１８Åは１８乃至２０ÅであるＤＮＡ螺旋の直径とほとんど同一である。これは既存の２次元構造の固体支持体で０．３ｎｍｏｌ／ｃｍ２の表面密度を有する末端作用基間の距離が５乃至１０Åであることとは対照的である（Ｇｕｏ， Ｚ．， Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ， Ｒ． Ａ．， Ｔｈｉｅｌ， Ａ． Ｊ．， Ｗａｎｇ， Ｒ．， ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｌ． Ｍ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２， ５４５６−５４６５；Ｍａｔｓｏｎ， Ｒ． Ｓ．， Ｒａｍｐａｌ， Ｊ． Ｂ．， ａｎｄ Ｃｏａｓｓｉｎ， Ｐ． Ｊ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２１７， ３０６−３１０）。これは本発明のデンドリマーバイオ支持体が核酸を固定するのに適していることを示す。
【００２１】
本発明のバイオ支持体は末端作用基（ＰＤＣ−デンドリマーを含むバイオ支持体の場合にはチオシアネート基の数）が２次元構造の他の支持体に比べて少ないが、本発明のバイオ−支持体はチオシアネートの３次元的な配列と理想的な作用基間の距離によってオリゴヌクレオチドを高効率で固定することができる。
【００２２】
また、本発明はバイオ支持体の製造方法を提供する。本発明のバイオ支持体製造方法は図３に示しており、これを詳細に説明する。
【００２３】
表面にアルデヒド基を有するスライドを本発明のバイオ支持体の基質として用いた。前記スライドはシリレイテッドスライド（ｓｉｌｙｌａｔｅｄ ｓｌｉｄｅ）が好ましい。市販されるシリレイテッドスライドは表面に反応性のアルデヒド基を含んでいる。まず、シリレイテッドスライドのアルデヒド基はデンドリマーと反応をしてアルデヒド基とデンドリマーの間にシッフ塩基が形成される。したがって、表面にデンドリマー単一層が形成されたスライドが製造される。次に、スライドにＮａＢＨ４で水素化反応を行って反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させる。このような方法でバイオ支持体を製造する。
【００２４】
また、バイオ支持体製造方法は前記変換段階後にリンカーを連結させる段階をさらに含む。
【００２５】
デンドリマー単一層形成段階において、スライドガラスを０．５％デンドリマーを含むメタノールと反応させると、スライドガラス上のアルデヒド基はデンドリマーと反応する。図３（ｂ）に示したデンドリマーとアルデヒド基間の反応後に、シッフ塩基は図３（ｃ）の脱水反応によって形成される。
【００２６】
変換段階では、反応しないアルデヒド基がアルコールに転換され、図３（ｄ）のバイオ支持体が形成される。
【００２７】
リンカーの連結段階はデンドリマーのアミノ基にリンカーを結合させる。前記リンカーは下記の化学式１の化合物、化学式２の化合物、化学式３の化合物及びｎ−ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート（ＮＩＡ）からなる群より選択するのが好ましい。リンカーの連結方法は公知の方法で実施するのが好ましい（Ｃｈｒｉｓｅｙ， Ｌ． Ａ．， Ｌｅｅ， Ｇ． Ｕ． ａｎｄ Ｏ Ｆｅｒｒａｌｌ， Ｃ． Ｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９９６） ２４， ３０３１−３０３９， Ｓｉｎｇｈ， Ｐ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． （１９９８）９， ５４−６３ Ｓｉｎｇｈ， Ｐ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． （１９９８）９， ５４−６３）。図４はリンカーを含むバイオ支持体を示す。
【００２８】
また、本発明は前記バイオ支持体を利用したバイオチップを提供する。前記バイオチップはＤＮＡチップ、蛋白質マイクロアレイ、抗体支持体、バイオセンサー（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）及び化学物質を固定した組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）アレイが好ましい。
【００２９】
本発明のバイオチップは本発明のバイオ支持体及び前記バイオ支持体に固定されたバイオポリマーを含む。さらに詳しくは、バイオポリマーはスライドガラスのアルデヒドに結合されているデンドリマーのアミノ基に固定されている。バイオチップの製造方法は通常のＵＶ−架橋反応または熱反応で実施するのが好ましい。図５にＤＮＡチップ製造過程を示す。
【００３０】
本発明はリンカーをさらに含むバイオ支持体を利用したバイオチップを提供する。前記バイオチップは下記の段階を含む：（ａ）デンドリマーにスライドガラス上のアルデヒド基を反応させ、（ｂ）スライド上の反応しないアルデヒド基をアルコール基に変換させ、（ｃ）リンカーを（ｂ）のデンドリマーアミノ基に反応させ、（ｄ）バイオポリマーを（ｃ）のリンカーに固定させる。ＤＮＡチップは図５（ａ）及び（ｂ）で示したＵＶ−架橋反応または図５（ｃ）に示した反応で製造することができる。
【００３１】
図５（ｃ）はＤＮＡチップ製造過程で、リンカーと５’または３’末端をアミノまたはチオール基に交換されたオリゴヌクレオチドを利用したＤＮＡチップ製造過程を示したものである。オリゴヌクレオチドの大きさはＤＮＡチップで一般に用いられるオリゴヌクレオチドの大きさであるのが好ましい。チオールに交換されたオリゴヌクレオチドを使用する場合、ＤＮＡチップはＰＤＣ以外の他の種類のリンカーを使用してオリゴヌクレオチドをバイオ支持体に固定させることによって製造することができる。
【００３２】
また、本発明の蛋白質チップの場合、図６に蛋白質チップ製造過程を一例として示した。蛋白質チップは蛋白質をデンドリマーバイオ支持体に直接的（図６（ａ））にまたはリンカー（図６（ｂ、ｃ、ｄ））を使用して固定させて製造することができる。
【００３３】
本発明は下記の実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明が下記の実施例に限られるわけではない。
【００３４】
実施例１
全ての試薬は特に断らない限り、シグマ−アルドリッチ（米国）社から購入したものであり、シリレイテッドスライドガラスはＣｅｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＵＳＡ）社から購入した。オリゴヌクレオチドはジェノテック（大田、韓国）で合成し、３世代及び４世代デンドリマーはシグマ−アルドリッチ社から購入した。
【００３５】
バイオ支持体の製造
シリレイテッドスライドを洗浄し、０．５％ＰＡＭＡＭデンドリマー（３世代；図１）を含むメタノール溶液に１乃至２日間浸漬させておいた。これにデンドリマーアミノ基とスライド表面のＳＡＭ（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成するアルデヒド基間のシッフ塩基形成でスライドガラスの表面にはデンドリマー単一層が製造された。スライドガラス上に残存して反応しないアルデヒド基はテトラヒドロほう酸ナトリウムを添加してアルコール基に変換させた。反応後、スライドガラスは３回洗浄し、真空で３０分間乾燥させた。
【００３６】
実施例２
オリゴヌクレオチドを３Ｘ ＳＳＣ（ＳＳＣ：１５０ｍＭ ＮａＣｌ， １５ ｍＭ 酢酸ナトリウム， ｐＨ７．０）に溶解し、実施例１と同様な方法で製造したバイオ支持体に点滴（滴下）した。点滴した溶液は乾燥させた後、ＵＶ−架橋剤（６０ｍＪ）で架橋した。
【００３７】
実施例３
実験は実施例１と同様な方法で実施したが、デンドリマーは３世代の代りに４世代を使用した。
【００３８】
実施例４
実施例１と同様な方法でバイオ支持体を製造した後、リンカーを含むバイオ支持体をさらに製造した。まず、リンカーをデンドリマーに接合させるために、乾燥したスライドガラスを１０％ピリジン／ジメチルホルムアミド溶媒中の０．２％の１，４−フェニレンジイソチオシアネート（ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＰＤＣ， Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液にアルゴン条件下で３時間処理した。反応が終わった後、スライドガラスをメタノールで洗い、使用前まで真空乾燥器に保管した。
【００３９】
実施例５
実施例３と同様な方法でバイオ支持体を製造した後、実施例４と同様な方法でリンカーを含むバイオ支持体を製造した。
【００４０】
比較例
スライドガラス表面にアルデヒドＳＡＭがあるシリレイテッドスライドをＤＮＡチップ用支持体として使用した。
【００４１】
実験
オリゴヌクレオチドの固定化
実施例４、実施例５及び比較例で製造したバイオ支持体を使用した。オリゴヌクレオチドとして５’−ＣＣＧＡＣＣＧＧＡＡＴＡＡＡＴ−ＮＨ２−３’を使用しており、これは３’末端にアミノ基を有する。オリゴヌクレオチドの固定効率を確認するためにオリゴヌクレオチドの５’末端に３２Ｐで標識をつけた。オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌに［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（＞６，０００Ｃｉ／ｍｏｌ、１０ｍＣｉ／ｍｌ）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを３７℃で３０分反応させた。９５℃で２分間加熱して反応を中止した後、標識されたオリゴヌクレオチドをＧ−５０スピンコラムで精製した。オリゴヌクレオチドは０．００５、０．００１及び０．０３ｐｍｏｌ／μｌの濃度にした。各濃度別に０．５μｌ溶液を実施例４、実施例５、比較例で準備したバイオ支持体に点滴した後、常温で約１６時間乾燥させた。乾燥されたバイオ支持体は水、３ＮのＮＨ４ＯＨ及び０．２％のＳＤＳを含む１Ｘ　ＳＳＰＥ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で洗浄して固定化されないオリゴヌクレオチドを除去した。その後、バイオ支持体に固定されたオリゴヌクレオチドの表面密度はスライドをＢＡＳ１５００（ＦＵＪＩ、ＪＡＰＡＮ）スキャンして確認した。
【００４２】
図７はデンドリマーバイオ支持体にオリゴヌクレオチドを固定した後、測定したオートラジオグラフィー（ａ）及び棒グラフ（ｂ）である。放射性はオリゴヌクレオチドの濃度に対応することが確認された。実施例４と実施例５のバイオ支持体の表面密度は比較例の支持体表面密度に比べて２〜３倍高かった。このような結果はオリゴヌクレオチドは高密度のアルデヒド基からなるＳＡＭを有する支持体よりバイオ支持体にさらによく固定化されるということを意味する。また、実施例４と実施例５を比較した時、実施例５のバイオ支持体が実施例４のバイオ支持体より約２倍多いオリゴヌクレオチドを固定すると予想していたが、実施例４及び実施例５の固定化効率はほとんど同一であった。
【００４３】
ハイブリダイゼーション効率分析
オリゴヌクレオチドを実施例４、実施例５及び比較例の支持体に固定させ、相補的なオリゴヌクレオチドを利用してハイブリダイゼーション効率を確認した。
【００４４】
標識されていない目的オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＧＡＣＣＧＧＡＡＴＡＡＡＴ−ＮＨ２−３’をバイオ支持体に固定させ、相補的なオリゴヌクレオチド５’−ＡＴＴＴＡＴＴＣＣＧＧＴＣＧＧ−３’は［γ−３２Ｐ］ＡＴＰの５’末端を標識化してプローブ（ｐｒｏｂｅ）として使用した。目的オリゴヌクレオチドが固定されたスライドガラスを０．２％のＳＤＳを含む５Ｘ　ＳＳＰＥに２時間予備ハイブリダイズさせ、ここにプローブを最終濃度２ｐｍｏｌ／ｍｌで４２℃１６時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション反応の後、ハイブリダイズしていないプローブは０．２％ＳＤＳを含む１Ｘ　ＳＳＰＥ及び０．２％ＳＤＳを含む０．１Ｘ　ＳＳＰＥで各々３８乃至４０℃で３０分間洗浄し除去した。ハイブリダイゼーション効率はスライドをＢＡＳ１５００でスキャンして測定した。
【００４５】
図８はバイオ支持体を利用して製造したＤＮＡチップのハイブリダイゼーション効率を示すオートラジオグラフィー（ａ）及び棒グラフ（ｂ）である。実施例４及び５のバイオ支持体は比較例の支持体に比べてハイブリダイゼーション効率が最大８倍高かった。このような結果は実施例４及び５のバイオ支持体が比較例に比べてオリゴヌクレオチド固定率が２乃至３倍高かったことを考慮すれば、実施例４及び５のバイオ支持体がオリゴヌクレオチド固定効率が向上しただけでなく、ハイブリダイゼーション効率もやはり優れていることを示す。優れたハイブリダイゼーション効率は本発明のバイオ支持体が固定されたオリゴヌクレオチドでハイブリッドを形成するためにプローブが入れるように充分な３次元空間を提供するためであると解釈することができる。また、デンドリマーとオリゴヌクレオチドの間に位置したＰＤＣリンカーの柔軟性もハイブリダイゼーション効率に貢献することができる。
【００４６】
固定された核酸の表面密度を高めるために変形されたスライドガラスを使うＤＮＡマイクロアレイの場合、活性化した表面に非特異的に結合したバックグラウンドシグナル（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ）が多くなる。このような多量のバックグラウンドシグナルはマイクロアレイ分析時に感度を低下させる。
【００４７】
本発明のデンドリマー支持体は陽電荷性アミノ基を含み、陰電荷を有する核酸との電気的な力によって相互結合することができる。しかし、図７と図８で実施例４及び実施例５のバイオ支持体表面では非特異的な結合が観察されなかった。これはバイオ支持体のデンドリマーにある全てのアミノ基がＰＤＣと反応してチオシアン酸塩基に変わったということを意味する。つまり、デンドリマーの全てのアミノ基がオリゴヌクレオチドを固定することができる状態になってオリゴヌクレオチドを効果的に固定させ、非特異的な結合も減少させることができた。
【００４８】
【発明の効果】
前記の通り、本発明のバイオ支持体はスライドガラス上のアルデヒドに接合されたデンドリマーを含み、バイオ支持体は３次元的な構造を有していてバイオポリマーを高効率に固定させる。また、バイオ支持体はバイオチップ製作用として一般に用いることができる。バイオ支持体を利用して製造したＤＮＡチップは相補的な結合を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のバイオ支持体に含まれるデンドリマー３世代を示す。
【図２】本発明のバイオ支持体に含まれるデンドリマー４世代を示す。
【図３】デンドリマーバイオ支持体の製造過程を示す。
【図４】本発明のデンドリマーバイオ支持体を示す。
【図５−１】本発明のＤＮＡチップ製造工程を示す。
【図５−２】本発明のＤＮＡチップ製造工程を示す。
【図６】蛋白質チップ製造工程を示す。
【図７】デンドリマーバイオ支持体にオリゴヌクレオチドを固定した後に測定した密度計写真及びオートラジオグラフィーである。
【図８】デンドリマーバイオ支持体のハイブリダイゼーション効率を示す写真及びオートラジオグラフィーである。
【図３】
2004511804.tif 000006
【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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2004511804.tif 000014
2004511804.tif 000015
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【国際調査報告】
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