(57)【要約】本発明は、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネルを構成するタンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネルを構成するタンパク質。
【請求項２】
前記哺乳動物のＫ＋チャネルがヒトＫ＋チャネルである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列リストの配列番号２のアミノ酸配列で構成される、またはこのアミノ酸配列を含む、請求項１または２のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４】
高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネル、またはこのような哺乳動物のＫ＋チャネルの断片をコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸配列からなる、核酸分子。
【請求項５】
前記哺乳動物のＫ＋チャネルがヒトＫ＋チャネルである、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
付表の配列リストの配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する、請求項４または５のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項７】
付表の配列リストの配列番号１の配列で構成されるか、またはこの配列を含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の哺乳動物のＫ＋チャネルに対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、前記抗体の誘導体または断片。
【請求項９】
改変された調節配列と都合よく関連した、請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸の少なくとも１分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸の１分子で形質転換された細胞宿主。
【請求項１１】
請求項９に記載のベクターで形質転換された細胞宿主。
【請求項１２】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の核酸の１分子から調製された、核プローブおよびオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１３】
麻酔薬特性を有する生物学的に活性な化合物を同定する方法であって、
（ａ）前記化合物を、高対称Ｋ＋条件で僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネルを表面上に発現する細胞宿主と接触させるステップと、
（ｂ）前記哺乳動物のＫ＋チャネルのＫ＋輸送活性を決定するステップであって、Ｋ＋輸送の活性化が、麻酔薬特性を有する前記化合物を示すステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物のＫ＋チャネルがヒトＫ＋チャネルである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物のＫ＋チャネルが、配列リストの配列番号２のアミノ酸配列で構成されるか、このアミノ酸配列を含む、請求項１３または１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法で同定される、麻酔薬特性を有する生物学的に活性な化合物を含む医用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＴＲＥＫ２と呼ばれる、２ポアドメイン（ｔｗｏ　ｐｏｒｅ　ｄｏｍａｉｎ）を有する、Ｋ＋チャネルファミリーの、新規な哺乳動物メンバーのＤＮＡおよびペプチド配列に関する。本発明は、様々な化合物のスクリーニング方法における、このチャネルの使用にも関する。
【０００２】
２ポアドメインを含有するカリウムチャネルサブユニットは、新規なクラスのバックグラウンドＫ＋チャネルを形成する。これらのＫ　２Ｐチャネルは、独特の薬理学的特性および機能的特性を有する（１−１０）。全ての膜ポテンシャルで活性であり、また、非常に急速な活性化および非活性化の反応速度を示し、不活性化は示さない。Ｋ　２Ｐチャネルの広範囲に及ぶ組織分布から、それらの主要な生理的役割の１つは、多くの異なる細胞型における静止膜電位の設定であることが示唆される。しかし、特定の機能特性および調節特性、ならびに独特の組織分布を有するバックグラウンドＫ＋チャネルが、今ではクローニングされている。これらのチャネルは、上皮Ｋ＋輸送、およびニューロンおよび筋肉の興奮性の調節等の、より特異的な機能に関与している可能性がある（１１）。
【０００３】
脂肪酸感受性のバックグラウンドＫ＋電流のサブファミリーを形成する、ニューロン細胞、心細胞および平滑筋細胞から、様々なＫ＋電流がｉｎ　ｖｉｖｏで記録されている（１２−１５）。最近、マウスおよびヒトから、脂肪酸活性化Ｋ＋チャネルがクローニングされた（２，６，１６）。ＴＲＥＫ１（ＴＷＩＫ関連Ｋ＋チャネル：ＴＷＩＫ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｋ＋　チャネル）およびＴＲＡＡＫ（ＴＷＩＫ関連アラキドン酸刺激Ｋ＋チャネル：ＴＷＩＫ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｋ＋チャネル）と名づけられたこれらのチャネルは、生理的Ｋ＋勾配において外向き整流性準瞬時電流を生じさせる。これらのチャネルは、ＴＡＳＫバックグラウンドチャネルに比べて低い基礎活性を有する（３−５）。しかし、これらのチャネルは、アラキドン酸を加えることによって、強力に活性化することができる。この作用は、不飽和脂肪酸特有のものである。
【０００４】
オレイン酸、リノール酸、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸は全て、ＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫを強力に活性化するが、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキドン酸等の飽和脂肪酸は無効である（６，１７）。これらのチャネルを活性化する別の能率的な方法は、細胞膜に伸張を加えることである（１７，１８）。両チャネルとも、剪断応力、細胞腫脹および陰圧によって活性化される。両チャネルは、メカノ感受性（ｍｅｃｈａｎｏ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）Ｋ＋チャネルである。ＴＲＡＡＫに比して、ＴＲＥＫ１は、さらなる特徴を有する。
【０００５】
ＴＲＥＫ１は、プロテインキナーゼＣおよびＡ（ＰＫＣ、ＰＫＡ）のアクティベーターによって阻害される。ＰＫＡリン酸化に関する部位は、このチャネルの細胞質カルボキシ末端に定位されている（１７）。ＴＲＥＫ１は、内部酸性化によって開放されるが、ＴＲＡＡＫは開放されない（１９）。ｐＨｉが下がると、圧力−活性化関係が正の数値の方にシフトし、大気圧でチャネル開放をもたらす。ＴＲＥＫ１は、ト全身麻酔で使用される濃度の、吸入全身麻酔薬、ハロタンおよびイソフルランによって活性化されるが、ＴＲＡＡＫは活性化されない（１６）。最後に、ＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫは異なる組織分布を有し、ＴＲＡＡＫの発現は、ＴＲＥＫ１より、ニューロン細胞に限定されている（２，６，２０）。
【０００６】
本研究は、２ポアドメインを有する新規なヒトＫ＋チャネルのクローニング、ゲノム構成、定位および機能特性決定について述べるものである。分子の性質および機能性から、このチャネルは、メカノ感受性および不飽和脂肪酸活性化Ｋ＋チャネルの独特のサブクラスに属することが分かる。ＴＲＥＫ２は、ＴＲＡＡＫよりＴＲＥＫ１に関係があり、また、ＴＲＥＫ１と同様、臨床濃度の全身麻酔薬によって活性化される。さらに、ＴＲＥＫ２は、異なるタイプの神経伝達物質受容体によって調整される。高対称Ｋ＋条件で、ＴＲＥＫ２は、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる。
【０００７】
従って、本発明は、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネルを構成する、新規なタンパク質に関する。本発明は、さらに詳細には、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有するヒトＫ＋チャネルに関する。さらに詳細には、本発明の２ポアドメインを有するヒトＫ＋チャネルは、配列リストの配列番号２のアミノ酸配列で構成されるか、または配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【０００８】
本発明は、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネルまたはこのような哺乳動物のＫ＋チャネルの断片をコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸配列で構成される、核酸分子に関する。本発明は、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有するヒトＫ＋チャネルまたはこのようなタンパク質の断片をコードする核酸配列を含むか、またはこの核酸配列で構成される、核酸分子にも関する。
【０００９】
本発明は、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有するヒトＫ＋チャネル、またはこのタンパク質の断片をコードし、付表の配列リストに配列番号２で示されているアミノ酸配列を有する、核酸分子にも関する。本発明は、さらに詳細には、付表の配列リストの、配列番号１の配列で構成されるか、またはこの配列を含む、核酸分子に関する。明らかに、本発明は、上記配列から、たとえば、遺伝暗号の縮重により誘導され、且つ高対称Ｋ＋条件で僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する、２ポアドメインを含む哺乳動物のＫ＋チャネルの特徴および性質を示すタンパク質をコードするヌクレオチド配列にも関する。
【００１０】
本発明のもう１つの目的は、高対称Ｋ＋条件で僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する哺乳動物のＫ＋チャネルに対する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、これらの誘導体または断片である。これらの抗体は、文献に記載の方法で作製することができる。従来技術によれば、ポリクローナル抗体は、上皮から抽出されるか、または、宿主遺伝子の形質転換によって産生される、タンパク質を動物に注入し、次いで、抗血清、および抗血清から抗体を、たとえば、アフィニティクロマトグラフィで回収することによって作られる。モノクローナル抗体は、骨髄腫細胞を、本発明の受容体を使用して予め免疫化しておいた動物の脾細胞と融合させることにより、産生することができる。これらの抗体は、２ポアドメインを有する新規な哺乳動物のＫ＋チャネルの検索、または他の哺乳動物におけるヒトＴＲＥＫ２チャネルホモログの検索に有用である。
【００１１】
本発明は、本発明の、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネル、またはその断片の、細胞宿主における産生または発現過程と共に、改変された調節配列と都合よく関連した、上記核酸の少なくとも１つの分子を含むベクターにも関する。これらのベクターの作製、ならびに本発明のタンパク質宿主における産生または発現は、専門家に周知の分子生物学および遺伝子工学技術によって、行うことができる。
【００１２】
高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネルをコードする核酸分子、または本発明によるベクターを使用して、動物を形質転換し、トランスジェニック動物の系を樹立することができる。使用するベクターは、ベクターが移入される宿主との関係で選択され、プラスミド等の、任意のベクターであってもよい。従って、本発明は、先の方法に準拠して得られる、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネルを発現する細胞宿主にも関する。
【００１３】
本発明は、本発明による核酸の分子から作製される核酸プローブおよびオリゴヌクレオチドプローブにも関する。これらのプローブは、極めて好都合なことに、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有する、類似した哺乳動物のＫ＋チャネルを、他の個体または種で、ハイブリダイゼーション検出するのに有用である。従来技術によれば、これらのプローブを生物サンプルと接触させる。ドット・ブロット（Ｄｏｔ−ｂｌｏｔ）ハイブリダイゼーションまたはレプリカハイブリダイゼーション（サザン技術）等の、異なるハイブリダイゼーション技術、または他の技術（ＤＮＡチップ）を使用することもできる。このようなプローブは、これらのタンパク質の存在、起源および保存に関する研究を可能にする、哺乳動物のＫ＋チャネルをコードする遺伝子における、類似した配列の迅速な検出を可能にする道具を構成する。オリゴヌクレオチドプローブは、たとえば、他の種で、または診断目的で、、遺伝子を検索するためのＰＣＲ実験に有用である。
【００１４】
ＴＲＥＫ２は、臨床濃度の全身麻酔薬によって活性化される。結果として、本発明は、麻酔薬特性を有する生物学的に活性な化合物を同定する方法においても、有用な可能性がある。従って、本発明は、麻酔薬特性を有する生物学的に活性な化合物を同定する方法であって、
（ａ）上記化合物を、高対称Ｋ＋条件で僅かに内向き整流である電流電圧を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有する哺乳動物のＫ＋チャネルを、表面上に発現する細胞宿主と接触させるステップと、
（ｂ）Ｋ＋輸送の活性化が、上記麻酔薬特性を有する化合物を示す、上記哺乳動物のＫ＋チャネルのＫ＋輸送活性を決定するステップと、
を含む方法にも関する。
【００１５】
この方法は、高対称Ｋ＋条件で、僅かに内向き整流である電流−電圧関係を有する電流を生じさせる、２ポアドメインを有するヒトＫ＋チャネルを用いて実現されることが好都合であり、配列リストの配列番号２のアミノ酸配列によって構成されるか、またはこのアミノ酸配列を含む、ヒトＫ＋チャネルを用いて実現されることがさらに好ましい。本発明の方法は、表面上に、本発明の哺乳動物のＫ＋チャネルを一時的または構成的に発現する細胞宿主で、実行することができる。細胞宿主は、Ｋ＋輸送を可能にする適切な立体配座にあるタンパク質を発現することができるいずれのタイプであってもよい。このような細胞宿主としては、哺乳動物細胞、脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞などがある。
【００１６】
本発明は、上述の方法で同定される、麻酔薬特性を有する生物学的に活性な化合物を含む、医用組成物に関する。
【００１７】
本発明の他の利点および特徴は、ヒトＴＲＥＫ２のクローニング、ゲノム構成、染色体のマッピング、組織分布、および異種組織発現に関し、また添付の図面に言及する、以下の実施例を読むことによって、明白になるであろう。
【００１８】
Ｉ．実験手順
Ｉ．１．ＴＲＥＫ２のクローニング
ｔＢｌａｓｔｎアラインメントプログラムおよびクエリー配列としてのＴＲＥＫ１を使用することにより、２ＰドメインＫ＋チャネルの配列を使用して、公的ＤＮＡデータベース中のホモログを検索した（２１）。この結果、ＴＲＥＫ１と顕著な類似性を示したゲノム配列（ＥＭＢＬアクセッション番号ＡＬ１３３２７９．１）が同定されるに至った。対応する全長ｃＤＮＡを特性決定するために、アダプターとライゲートした成人脳ｃＤＮＡに、ｃＤＮＡ末端の５′−および３′−急速増幅（ＲＡＣＥ　ＰＣＲ）を実施した（２２）。５′−ＲＡＣＥ用の２つのアンチセンスプライマー（５′−ＡＣＴＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴ−３′［付表の配列リストの配列番号３］および５′−ＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＣＡＡＡＧＧＧＣＴＧＣＴ−３′［付表の配列リストの配列番号４］）および３−ＲＡＣＥ用の２つのセンスプライマー（５′−ＧＡＣＧＡＴＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＴＣＴＴ−３′［付表の配列リストの配列番号５］および５′−ＴＴＧＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＧＡＴＣＧ−３′［付表の配列リストの配列番号６］）は、ゲノム配列から誘導した。
【００１９】
アンカープライマー５′−ＴＡＧＡＡＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣ−３′［付表の配列リストの配列番号７］および５′−ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＣＧＡ−３′［付表の配列リストの配列番号８］を使用して、２つの逐次的ＲＡＣＥ反応を実施した。この増幅産物をｐＧＥＭｔ　ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングし、各産物の８クローンを配列決定した（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　モデル３７３Ａ）。低エラー率ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲで、ヒト脳ｃＤＮＡからの全コード配列を増幅し、次いで、ｐＩＲＥＳ−ＣＤ８ベクターにサブクローニングして、ｐＩＲＥＳＣＤ８．ＴＲＥＫ２を得た。両鎖上の、２つの異なる独立したＰＣＲ−ライゲーション実験からの挿入物を配列決定し、同一であることを確認した。
【００２０】
Ｉ．２．ＴＲＥＫ１、ＴＲＥＫ２およびＴＲＡＡＫ分布の解析
ＲＴ−ＰＣＲ実験では、製造業者のプロトコール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従って、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃＤＮＡパネルを鋳型として使用した。プライマーは以下の通りであった：ＴＲＥＫ２、センスプライマー５′−ＣＡＧＣＣＣＴＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧＣＣ−３′［付表の配列リストの配列番号９］、アンチセンスプライマー５′−ＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＣＧＴＣ−３′［付表の配列リストの配列番号１０］、ＴＲＡＡＫ、５′−ＧＡＧＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＴＧ−３′［付表の配列リストの配列番号１１］および５′−ＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧ−３′［付表の配列リストの配列番号１２］、およびＴＲＥＫ１、５′−ＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＴＣＴＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＡ−３′［付表の配列リストの配列番号１３］および５′−ＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＴＣ−３′［付表の配列リストの配列番号１４］。ＰＣＲ条件は、３２サイクルの、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒および７２℃にて３０秒であった。ＰＣＲ産物を電気泳動で分離し、ナイロン膜上に移動させ、３２Ｐ−標識プライマー（ＴＲＥＫ２、５′−ＡＣＴＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴ−３′［付表の配列リストの配列番号１５］；ＴＲＡＡＫ、５′−ＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧ−３′［付表の配列リストの配列番号１６；ＴＲＥＫ１、５′−ＴＡＧＣＴＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＡＧＣＣＡＡＧ−３′［付表の配列リストの配列番号１７］で精査した。）ノーザンブロット解析では、Ｃｌｏｎｔｅｃｈからの多組織ノーザンブロットを、ｐＩＲＥＳ−ＣＤ８の３２Ｐ−標識挿入物で精査した。Ｕｌｔｒａｈｙｂハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中、５０℃にて１８時間後、ＴＲＥＫ２を、０．２×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳの最終ストリンジェンシーまで、５５℃にて段階的に洗浄した。次いで、製造業者のプロトコールに従って、ブロットをハイブリダイズし、同じ手順に従って、ＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫで再精査した。ｐＣＤ８．ｈＴＲＥＫｌからの０．７ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片およびｐＩＲＥＳ−ＣＤ８．ｈＴＲＡＡＫからの挿入物をプローブとして使用した。Ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎ−ＨＥ　Ｉｎｔｅｎｓｉｆｙｉｎｇ　Ｓｃｒｅｅｎ（Ｋｏｄａｋ）を使用することにより、オートラジオグラムを、−７０℃にて２４時間、ＢｉｏＭａｘフィルム上で感光させた。
【００２１】
Ｉ．３．トランスフェクトＣＯＳ細胞における電子生理学
トランスフェクションの２４時間前に、３５ｍｍの皿当たり２０，０００細胞の密度で、ＣＯＳ細胞を播種した。ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２または５ＨＴ４ｓＲ発現ベクター（Ｄｒｓ　ＪＰ　Ｐｉｎ　および　Ａ　Ｄｕｍｕｉｓ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅの心広い寄贈）を含むまたは含まない、０．２μｇのｐＩＲＥＳ−ＣＤ８．ＴＲＥＫ２を用いて、古典的ＤＥＡＥ−デキストラン法により、細胞を一時的にトランスフェクトした。
【００２２】
トランスフェクションの４８時間後、抗ＣＤ８抗体被覆ビーズ法を使用してトランスフェクト細胞を可視化した。ホールセル実験では、パッチ電極溶液（ＩＮＴ）は、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５ｍＭ　ＥＧＴＡおよびＫＯＨでｐＨ７．３に調整した、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含んでおり、外液（ＥＸＴ）は、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＫＣｌ、３ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＣａＣｌ２およびＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した１０ｍＭＨＥＰＥＳを含んでいた。アウトサイド・アウトパッチ記録の場合、ピペット液はＩＮＴ溶液であり、外液は、ＥＸＴ溶液（５ｍＭ　Ｋ＋）か、または１５０ｍＭ　ＮａＣｌの代わりに１５０ｍＭ　ＫＣｌを含む、Ｋ＋リッチＥＸＴ溶液のいずれかであった。
【００２３】
インサイド・アウトパッチ記録の場合、ピペットをＥＸＴ溶液で満たし、また、浸漬液は、内部アシドーシス実験で、ｐＨ７．３またはｐＨ５．６のいずれかにて緩衝させたＩＮＴ溶液であった。室温で行った実験中ずっと、微小灌流システムで、細胞を絶えず灌流した（０．２ｍｌ／分）。ＲＫ４００パッチ−クランプ増幅器を、ホールセルおよびシングルチャネル記録に使用した（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ，Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）。シングルチャネルデータを、５ＫＨｚにて低域濾過し、ＤＡＴレコーダーを使用して、５０ＫＨｚにてデジタル化した（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ，Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）。ｐＣｌａｍｐソフトウェアを使用して、ホールセルデータを解析しＢｉｏｐａｔｃｈソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ）を使用して、シングルチャネルデータを解析した。
【００２４】
揮発性麻酔薬の濃度を、飽和溶液（イソフルラン、１５．３ｍＭ；ハロタン、１７．５ｍＭおよびクロロホルム、６６．６ｍＭ）から、室温の食塩水で調整した（１６）。開ループ圧発生システムで機械的刺激を加え、較正圧センサーで、パッチピペットレベルにてモニタリングした（１７）。
【００２５】
ＩＩ．結果
ＩＩ．１．ＴＲＥＫ２の分子クローニング
ヒトゲノムシークエンシングプログラムの枠内で作られたＤＮＡ配列が、公的ハイスループット−ゲノム配列（ＨＴＧＳ）データベースに、急速に蓄積している。Ｂｌａｓｔ配列アラインメントプログラム（２１）を使用して、このデータベースを検索した結果、１つのゲノムコンティグに拘束されたヒト配列が同定されるに至った。これらの配列の解析から、新規なＫ２Ｐサブユニットをコードする遺伝子を形成するイントロンおよびエキソンの存在が示唆される。潜在的エキソン配列からオリゴヌクレオチドを推定し、ｃＤＮＡ末端の急速増幅（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤＮＡ　Ｅｎｄｓ；ＲＡＣＥ−ＰＣＲ）を使用した、ヒト脳からのｃＤＮＡ断片へのクローニングに使用した。これらのｃＤＮＡから推定される配列は２７３０ｂｐ長であり、１６１７ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、５３８アミノ酸ポリペプチドが予測される（図１Ａ）。このタンパク質は、先にクローニングされたＫ　２Ｐサブユニットと同じ重複構造を有する。このタンパク質は、４つの膜貫通セグメント（Ｍｌ〜Ｍ４）、２Ｐドメイン（Ｐ１およびＰ２）およびＭ１とＰ１との間の伸長ループを示す。図１Ｃに示すデンドログラムから、このサブユニットが、他のＫ　２Ｐサブユニットよりも、ＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫに関連があることが明らかに分かる。そこで、この新規なＫ２Ｐサブユニットは、ＴＲＥＫ２と名づけられた（ヒトゲノム機構（ＨＵＧＯ）命名法における遺伝子ＫＣＮＫ１０）。ＴＲＥＫ２は、ＴＲＥＫ１と、６３％の同一性および７８％の相同を共有する。相同レベルは、ＴＲＡＡＫとは６９％に、また、他のＫ２Ｐサブユニットとは５０〜５５％に低下する。
【００２６】
ＩＩ．２．ＴＲＥＫ２遺伝子機構および位置
ＨＴＧＳ　ＤＮＡデータベースで入手できるゲノム配列を含むクローン化ｃＤＮＡのアラインメントから、ＴＲＥＫ２のゲノム構成を推定した。ＯＲＦは、６イントロンおよび７エキソンを含む。ＴＲＥＫ２のアミノ末端は、エキソン１にコードされ、Ｍ１ドメインはエキソン２に、Ｍ２はエキソン４に、Ｍ３はエキソン５に、またＭ４はエキソン６にコードされる。第３のエキソンは、Ｍ１Ｐ１インタードメインのカルボキシ末端部分をコードし、第７のエキソンは、このチャネルの大カルボキシ末端をコードする（図１Ａ）。イントロン２〜６の長さは、１．８ｋｂ〜３５ｋｂまで様々である（Ｆｉｇ．１Ｂ）。第１のエキソンは、ゲノムコンティグ外であり、第１のイントロンのサイズは不詳である。この時点で、５′未翻訳配列が１つより多いエキソンに対応することを除外することはできない。
【００２７】
この構成は、ＴＷＩＫ１遺伝子構成およびＴＡＳＫ３遺伝子構成と異なる。ＴＷＩＫ１は、２つの大きいイントロンで隔てられた３つのエキソンを含み（２３）、ＴＡＳＫ３は、１つの短いイントロン（１０）を含む。しかし、ＴＲＥＫ２のゲノム構成は、ＴＲＡＡＫ（２４）およびＴＲＥＫ１チャネル（未発表の結果）の両ゲノム構成に非常によく似ている。イントロン２〜６は、同じ位置に見られる。この観察結果から、これらの３つのチャネルは、密接に関連していることが確認され、共通の祖先からの遺伝子複製によって発生したことが示唆される。ＴＷＩＫ１、ＴＡＳＫ１、ＴＲＥＫ１、ＴＲＥＫ２、ＴＲＡＡＫ、ＴＡＳＫ２およびＴＡＳＫ３遺伝子でみられる独特の特徴は、ＰＩドメインをコードする配列に保存されたイントロン（ＴＲＥＫ２遺伝子における第３のイントロン）が存在することである。イントロン部位は、ポアサイン配列Ｇ−Ｙ／Ｆ／Ｌ−Ｇの第１グリシン残基をコードするコドンの第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチドとの間である。最近公開されたゲノム配列を解析することによって決定するとき、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　Ｅｌｅｇａｎｓ（２５）では、潜在的Ｋ　２Ｐチャネルをコードする、試験した３６遺伝子のうち２０遺伝子で、また、ショウジョウバエでは、１１遺伝子のうち８遺伝子で、同じ位置にイントロンが確認された。この保存イントロン位置の意味は不詳であるが、このイントロンが、哺乳動物に保存されており、そこで、最終的に線虫の場合と同じ役割を有する可能性があることは、注目に値する。ＴＲＥＫ２遺伝子を担持するゲノムコンティグの解析は、この配列が、２つの配列タグ部位（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ　Ｓｉｔｅ（ＳＴＳ））、Ｄ１４Ｓ１０５８およびＷＩ−６７１０を含むことを示した。ＷＩ−６７１０は、Ｃｈｒｌ４関連群の先端部から、ＷＩＣＧＲ放射能ハイブリッド地図３０８．５３ｃＲに載せられ、Ｄ１４Ｓ１０５８は、ＧｅｎｅｔｈｏｎによりＣｈｒｌ４関連群の先端部から、８６．３ｃＭにマッピングされている。以上の結果は、ＴＲＥＫ２遺伝子の染色体位置が、１４ｑ３１であることと一致し、また、１４ｑ３１であることを示す。この位置は、ＴＲＥＫ１（ｌｑ４１）（２６）およびＴＲＡＡＫ（ｌｌｑｌ３）の位置と異なる（２４）。
【００２８】
ＩＩ．３．ＴＲＥＫ２の組織分布
様々な成人組織におけるＴＲＥＫ２の発現を、ＲＴ−ＰＣＲ分析で試験した。図２Ａから分かる通り、ＴＲＥＫ２は、腎臓および膵臓に豊富に発現され、精巣、脳、結腸および小腸では控えめに発現される。肝臓、心臓、前立腺および胸腺では、非常に弱いシグナルのみが得られた。この発現パターンは、ＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫの組織分布と対照的である（図２Ａ）。一部の組織は、これらのチャネルの１つだけを発現する：たとえば、膵臓および結腸（ＴＲＥＫ２）、胎盤（ＴＲＡＡＫ）および卵巣（ＴＲＥＫ１）。他の組織は、これらのチャネルを発現しないか、控えめなレベルまで発現するに過ぎない：心臓、骨格筋、肺、ＰＢＬおよび脾臓。最後に、一部の組織は、これらの関連したチャネルの２つまたは３つを発現する：脳、精巣および小腸。ヒト脳の異なる野領におけるＴＲＥＫ１、ＴＲＥＫ２およびＴＲＡＡＫの分布を、ノーザンブロットで解析した。図２Ｂから分かる通り、ＴＲＥＫ２プローブで、４ｋｂおよび７．５ｋｂの２つの転写物が検出された。ＴＲＥＫ２は、主として、小脳、後頭葉、被殻および視床で発現され、ｓｉｎｔｈｅ他の試験した野領では低いレベルまで発現される。扁桃体および脊髄では、発現は認められなかった。後頭葉および小脳では、４ｋｂの転写物が、７．５ｋｂ転写物より高いレベルで発現される。囓歯類中枢神経系におけるＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫ発現に関する以前の研究（２，６，２０）から予測される通り、これらの２つのチャネルは、ヒト脳において、広範囲に及ぶ分布を有する。２ｋｂのＴＲＡＡＫ転写物および２．７ｋｂおよび３．３ｋｂのＴＲＥＫ１転写物は、ＴＲＥＫ２が主として発現される野領でよく発現される：被殻および視床。脳皮質（後頭葉、前頭葉および側頭葉）では、ＴＲＡＡＫも高度に発現される。最後に、ＴＲＥＫ１は、脊髄で発現されるこのファミリーの唯一のチャネルである。
【００２９】
ＩＩ．４．ＴＲＥＫ２の生物物理学的特性
ＴＲＥＫ２トランスフェクトＣＯＳ細胞は、対照細胞には存在しない（表示せず）非活性化電流を示す（図３Ａ）。ＴＲＥＫ２電流の活性化反応速度論は、急速である。脱分極パルスは、瞬時成分および遅延成分を含む２段階電流を誘導する（図３Ａ）。
【００３０】
電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係は外向き整流であり、５ｍＭ　Ｋ＋を含む外媒体で、内向き電流はほとんど全く記録されなかった（図３Ｂ）。細胞をＫ＋リッチ溶液（１５０ｍＭ）に浸漬するとき、内向き電流が明らかになり、Ｋ＋選択的チャネルで予測される通り、逆転電位は０ｍＶになる。しかし、Ｉ−Ｖ関係は線状ではなく、開放Ｋ＋選択的ポアの場合、厳密にはＧＨＫ式に当てはまらない。電流は、非常に負の電位で飽和する傾向がある。２段階活性化反応速度論および対称的Ｋ＋条件における外向き整流もＴＲＥＫ１電流で確認されている（２，１７）。さらに、＋５０ｍＶより高い脱分極の場合、ＴＲＥＫ２外向き電流は、ＴＲＥＫ１と同様、５ｍＭ　Ｋ＋より１５０ｍＭ　Ｋ＋で重要である。外的Ｋ＋の増加は外向きＫ＋流れに対する化学的推進力を低下させ、電流を増加させるよりむしろ減少させると予測されるため、この作用は異例である。ＴＲＥＫ１の場合、この作用は、他のタイプのＫ＋チャネルで見られるような、外的Ｋ＋の刺激作用に原因があると考えられる（２７，２８）。加えて、ＴＲＥＫ１は、外的Ｎａ＋（Ｎａ＋ｅ）に敏感であることが証明されている。Ｎａ＋ｅをＮＭＤＧに代えたとき、ＴＲＥＫ１活性はひどく低下した（２）。ＴＲＥＫ２は、Ｎａ＋ｅを除去することによって部分的に阻害されるに過ぎない（２３％の阻害、ｎ＝５、表示せず）。ＴＲＥＫ２のシングルチャネル特性を図３、ＣおよびＤに示す。アウトサイド・アウトパッチにおける基礎チャネル活性は、ゆらめくバースト動作を特徴とする（図３Ｃ）。生理的Ｋ＋条件では、Ｉ−Ｖ関係は向き整流であり、ホールセル記録で、内向き電流はほとんど全く記録されなかった。対称的条件では、外向き電流に加えて、内向き電流が記録され、シングルチャネルコンダクタンスは、−４０ｍＶにて１２８ｐＳ、＋４０ｍＶにて１００ｐＳであった（ｎ＝５）（図３、ＣおよびＤ）。負の電位では、シングルチャネルコンダクタンスが増加するため、シングルチャネルＩ−Ｖ関係が内向き整流であることに注目することは興味深い。しかし、負の電位におけるチャネル開放蓋然率は、正の電位における蓋然率より低く（−４０ｍＶにてＰｏ＝０．２６、＋４０ｍＶにてＰｏ＝０．４５、ｎ＝５）、これが、ホールセル配置では、電流が外向き整流である理由である。
【００３１】
ＩＩ．５．ＴＲＥＫ２電流の伸張感受性およびｐＨ感受性
ポリ不飽和脂肪酸による調整に加えて、ＴＲＥＫ２は、ＴＲＥＫ１と同様、膜の伸張ならびに細胞内媒体の酸性化によって刺激される。図４Ａは、インサイド・アウト立体配置で陰圧を加えることにより、可逆的であるＴＲＥＫ２活性の強力な活性化を誘導することを示す。活性化は、印加した圧力の関数で変化する（図４Ｂ）。ＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫについて示した通り（１７，１８）、負の電位でも正の電位でも、伸張誘導性ＴＲＥＫ２チャネル活性を誘発することができ、活性化のレベルは、脱分極と共に上昇する（図４Ｃ）。図４Ｄから、細胞内酸性化は、ＴＲＥＫ２チャネル活性を強力に増強させることがわかる。この作用は可逆的であり、全ての膜ポテンシャルで認められる（図４Ｅ）。類似した作用が、ＴＲＥＫ１で以前に記載されている（１９）。細胞外媒体の酸性化は、ホールセルＴＲＥＫ２電流に対して何の作用も示さなかった（ｐＨ６．５にて、２０％未満の阻害）（表示せず）。
【００３２】
ＩＩ．６．薬理学的特性
ＴＲＥＫ２電流は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ、１０ｍＭ）およびＢａ２＋（１ｍＭ）に非感受性である。キニジンは、電流を阻害する（１００μＭで５０％阻害）（表示せず）。ＴＲＥＫ２は、ＴＲＥＫ１と同様、吸入麻酔薬クロロホルム、ハロタンおよびイソフルランの適用によって刺激される（図５、ＡおよびＢ）。ハロタンの臨床用量（２９）で、ＴＲＥＫ２は著明に活性化される（＋１００ｍＶにて、０．２５ｍＭで１．４±０．１倍増強、ｎ＝１０）。０．５ｍＭで、ハロタンの最大作用がほぼ得られる（＋１００ｍＶにて、２．６±０．３倍増強、ｎ＝１０）。ＴＲＥＫ１とＴＲＥＫ２との間で、麻酔薬の効率が異なる。ＴＲＥＫ２の場合、ハロタン（０ｍＶにて、１ｍＭで２．３±０．３倍増強、ｎ＝６）は、イソフルラン（１ｍＭで１．９±０．１倍増強、ｎ＝６）およびクロロホルム（１ｍＭで１．８±０．１倍増強、ｎ＝７）より効率がよい。ＴＲＥＫ１の場合、同濃度（１ｍＭ）で、クロロホルムは、ハロタンおよびイソフルランより効率がよい（１６）。図５、ＣおよびＤから、ＴＲＥＫ２は、神経保護薬リルゾールの適用によっても活性化されることがわかる。ＴＲＥＫ１では、この活性化は一過性であり、阻害に対応する活性の低下が続く。ＴＲＥＫ１の場合、これは、細胞内ｃＡＭＰの増加およびＰＫＡによるチャネルのリン酸化に起因する（３０）。
【００３３】
ＩＩ．７．脂肪酸によるＴＲＥＫ２の活性化および細胞内ｃＡＭＰによる阻害
図６Ａは、ＴＲＥＫ２電流に対する１０μＭアラキドン酸の強力な刺激作用を示す（０ｍＶにて８．４±１．９倍増強、ｎ＝６）。この作用は可逆的である（表示せず）。
【００３４】
ＴＲＥＫ２は、ＴＲＥＫ１と同様、他のポリ不飽和脂肪酸、ドコサヘキサエン酸およびリノレン酸によって、また、リソホスファチジルコリンによって活性化されるが、飽和脂肪酸パルミチン酸では活性化されない（図６、ＢおよびＣ）（１７，３１）。ＴＲＥＫ２は、１０μＭリソホスファチジルイノシトールでも活性化される（０ｍＶにて５．１±０．６倍増強、ｎ＝８）。浸透性ＣＰＴ−ｃＡＭＰ（５００μＭ）を適用することにより、０ｍＶにて、ＴＲＥＫ２活性の５０％阻害を招く（５０±５、ｎ＝８）（図６Ｄ）。３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、１ｍＭ）／ホルスコリン（１０μＭ）の混合物を適用して、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させることにより、類似した阻害が得られる（７２±１０％の阻害、ｎ＝８）。このことから、ＴＲＥＫ２は、ＴＲＥＫ１と同様、ＰＫＡリン酸化によって阻害されることが示唆される（１６）。
【００３５】
ＩＩ．８．Ｇｓ−、Ｇｉ−およびＧｑ−結合した神経伝達物質受容体との共発現による、ＴＲＥＫ２の制御
ＴＲＥＫ２を、５ＨＴ４ｓＲ（Ｇｓ−結合受容体）と一緒に共発現させた。アデニル化シクラーゼに確実に結合した受容体で予測される通り、５−ＨＴの適用による受容体の刺激は、ＴＲＥＫ２活性の低下を伴う（図７Ａ）。逆に、共発現したＧｉ−結合ｍＧｌｕＲ２受容体の、グルタミン酸による活性化は、ＴＲＥＫ２活性の刺激を招く（図７Ｂ）。５ＨＴ４ｓＲの刺激による、ＴＲＥＫ２活性の低下は、洗浄後、急速に逆転するが（図７Ａ）が、ｍＧｌｕＲ２に関連したＴＲＥＫ２増強は、逆転がはるかに遅い（１０分超）（図７Ｂ）。第３のタイプのＧ−タンパク質結合受容体を、ＴＲＥＫ２と一緒に共発現させた。この受容体は、Ｇｑ−結合ｍＧｌｕＲ１受容体である。グルタミン酸の適用によるｍＧｌｕＲ１の活性化は、洗浄によって急速に逆転する、ＴＲＥＫ２活性の阻害を招く（図７Ｃ）。Ｇｑ−タンパク質は、一般に、ホスホリパーゼＣの活性化、およびその結果としてのジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−トリホスフェート（ＩＰ３）の産生を伴う。最終的に、ＤＡＧは、ＰＫＣおよびＩＰ３を活性化して、細胞内Ｃａ２＋の増加を招く。しかし、記録ピペット（１μＭ）で、ＰＫＣアクティベーターＰＭＡ（１００ｎＭ）を適用しても、Ｃａ２＋を加えても、ＴＲＥＫ２の阻害を誘導することができなかった（表示せず）。
【００３６】
ＩＩＩ．結果に関する考察
ＩＩＩ．１．新規なチャネルの特性決定
ＴＲＥＫ２は、ＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫを含む、脂肪酸活性化、メカノ感受性Ｋ＋チャネルファミリーの新規なメンバーである。これらのチャネルと同様、ＴＲＥＫ２は、ＴＥＡおよびＢａ２＋でブロックされず、また、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸およびリノレイン酸等のポリ不飽和脂肪酸、リソリン脂質、および細胞膜への陰圧の印加によって刺激される。加えて、ＴＲＥＫ２は、これらのチャネルと同じ遺伝子構成を共有し、３遺伝子は、共通祖先の遺伝子に由来する公算が高いことを示す。しかし、ＴＲＥＫ２は、ＴＲＡＡＫよりＴＲＥＫ１に関係がある。ＴＲＥＫ２およびＴＲＥＫ１は、ＴＲＡＡＫと共有しない、独特の機能特性および薬理学的特性を有し、ＰＫＡを活性化する因子によってマイナスに制御され、内部媒体の酸性化によってプラスに制御され、また、揮発性全身麻酔薬によって強力に活性化される。ＴＲＥＫ１と同様、ＴＲＥＫ２もリルゾールで一時的に活性化されるが、ＴＲＡＡＫは永久的に活性化される。ＴＲＥＫ１の場合、リルゾールによる活性化に続く阻害は、細胞内ｃＡＭＰの増加、およびその結果としてのチャネルの阻害性ＰＫＡ−リン酸化と関係づけられてきた（３０）。分子の観点で、総体的配列相同性のみならず、この配列に沿った相同性の分布を考える場合、ＴＲＥＫ２は、やはりＴＲＥＫ１とより多く関連している。ＴＲＡＡＫ、ＴＲＥＫ１およびＴＲＥＫ２は、Ｍ１からＭ４までに及ぶ保存ドメインを有する。ＴＲＥＫ１とＴＲＥＫ２との間で、Ｍ４の後の相同レベルは高いままであり、５０以上の残基が続く。このＭ４後カルボキシ末端部分は、脂肪酸および伸張のみならず、ＰＫＡおよびｐＨｉに対しても、ＴＲＥＫ１チャネル感受性に極めて重要である（１７，１６，１９）。これらのチャネルが密接に関連した制御機構を有する理由は、このドメインが、ＴＲＥＫ１とＴＲＥＫ２との間で、高レベルで保存されていることにある。興味深いことに、ＴＲＥＫ１のリン酸化による負の制御に関与するＰＫＡ部位（１７）は、ＴＲＥＫ２（セリン３５９）に保存されており、ＴＲＥＫ２は、ＴＲＥＫ１と同じ方式で、ＰＫＡによって負に制御されることが示唆される。ＴＲＥＫ１の場合、細胞質アミノ末端は、チャネル活性およびその機械的制御および化学的制御に重要ではない（１７，１６，１９）。これは、メチオニン５５で開始する切頭ＴＲＥＫ２は、突然変異誘発によって、最初の５４残基を除去した後、その特性を明らかに保存するため、ＴＲＥＫ２にも当てはまる（表示せず）。ラットからの新規なチャネルのクローニングは、オンラインで発表された（３２）。このチャネルは、明らかに、ヒトＴＲＥＫ２のラットオルソログである。ＴＲＥＫ２が、ラットでは発現されず、ヒトでは高度に発現される、腎を除いて、これらのチャネルは、類似した組織分布を有する。加えて、これらのチャネルは、シングルチャネルコンダクタンス、およびポリ不飽和脂肪酸および伸張に対する感受性等の、多くの共通した機能特性を共有する。しかし、配列同一性が高い（７０％超）にもかかわらず、第１のエキソン（図１Ａ）によってコードされる細胞質アミノ末端部は、これらの２つのチャネルの間で明らかに関係がなく、１つの遺伝子からの交互スプライシングが示唆される。
【００３７】
ＩＩＩ．２．ＴＲＥＫ２の生理的役割は何か？
ラット脳の中脳野領および視床下部野領から培養したニューロンにおいて、数種の、アラキドン酸活性化、メカノ感受性Ｋ＋電流が特性決定されている（１５）。それらの機能特性は、ＴＲＥＫ関連チャネルの特性と非常に似ている。
【００３８】
３つの異なる固有の電流がニューロンで同定されており、そのＩ−Ｖ関係は、高対称Ｋ＋条件で、僅かに外向き整流か、線形か、僅かに内向き整流である。同一条件で、ＴＲＥＫ１のＩ−Ｖ関係は、僅かに外向き整流であり、ＴＲＡＡＫのＩ−Ｖ関係は線形である。以上の結果は、ＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫが、固有の電流を発現するニューロンを含む脳野領で発現されることとあいまって、両クローン化チャネルが、これらの固有の電流に寄与することを示唆する。今までにクローニングされたチャネルの中で、内向き整流を有する第３のタイプの電流に相当するものはない。ノーザンブロット解析から、ＴＲＥＫ２は、ＴＲＥＫ１と同じ脳野領で発現されると考えられる。ＴＲＥＫ２は、僅かに内向き整流であるＩ−Ｖ関係を有する電流を生じさせるため、我々は、ＴＲＥＫ２が、内向き整流を有する、この第３のタイプの、固有のアラキドン酸活性化、メカノ感受性電流を形成し得る、あるいは形成に寄与することを提案する。これらのチャネルは、ｉｎ　ｖｉｖｏで静止時に活性であれば、ニューロン興奮性の調節において、特に、静止膜電位の調節において、ある役割を果たすことが予測される。ＴＲＥＫ２活性のレベルは、受容体に結合した３種の異なるタイプのＧ−タンパク質によって制御することができる。このことから、ニューロンにおけるＴＲＥＫ２活性は、様々な神経伝達物質によって微調整される公算が高く、また、ＴＲＥＫ２は、Ｋ　２ＰチャネルＴＡＳＫ１の役割と似た役割を果たし得ることがわかる。小脳顆粒細胞および舌下運動ニューロンでは、、ＴＡＳＫ１は、細胞興奮性の調節、および静止膜電位および興奮性の両者を著しく変えるＧｑ−結合受容体を介して作用する様々な神経伝達物質による、その活性の調整において、中心的重要性を有する（３３，３４）。ＴＲＥＫ２でもやはり確認されるが、Ｇｑ結合受容体がＴＡＳＫ１を阻害するシグナル形質導入経路は、ＰＫＣまたはＣａ２＋を含まない（３３，３４）ことに注目することは興味深い。ＴＡＳＫ１とＴＲＥＫ２との間の主要な違いは、ＴＲＥＫ２は、Ｇｉ−およびＧｓ結合受容体でも制御されることである。ＴＲＥＫ２は、様々な神経伝達物質およびホルモン類に応答した、ニューロンの興奮性の調整を担当する重要なチャネルになる公算が高い。ＴＲＥＫ２は、揮発性麻酔薬（（１６）および本論文）および神経保護薬リルゾール（６，３０）の標的であるため、医療において重大な影響を有する可能性があり、ＴＲＥＫ２の単離および特性決定は、脳および他の組織において多種多様の重要な生理的役割を果たす公算が高い（１１）、この特定のクラスのＫ＋チャネルの理解に向けたさらなるステップとなる。
【００３９】
【参考文献】
2004501627.tif 000002
2004501627.tif 000003
2004501627.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＴＲＥＫ２の配列およびゲノム構成に関する。ＴＲＥＫ２、ＴＲＥＫ１およびＴＲＡＡＫチャネルのアラインメント。イントロンの相対的位置を矢印で示す。Ｍ１〜Ｍ４膜貫通セグメント、Ｐ１ポアドメインおよびＰ２ポアドメインを示す。星印は、ラットおよびヒトからのＴＲＥＫ２チャネル配列間の相違点を示す。
【図１Ｂ】ＴＲＥＫ２の配列およびゲノム構成に関する。境界エキソン−イントロンにおける配列。エキソン配列は、大文字で示してある。イントロンのサイズを示す。
【図１Ｃ】ＴＲＥＫ２の配列およびゲノム構成に関する。ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＴｒｅｅｖｉｅｗで樹立された、ヒトでクローニングされたＫ　２Ｐチャネルのデンドログラム。
【図２Ａ】成人における、ＴＲＥＫ２の発現に関する。ＲＴ−ＰＣＲによる組織分布分析解析。特異的内部プライマーをプローブとして使用して、増幅産物をサザンブロットで解析した。ｃＤＮＡの完全性を確認するために、ＧＡＰＤＨ断片を増幅した。ｓｋ．ｍｕｓｃｌｅ、骨格筋；ｓｍ　ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、小腸；ＰＢＬ、末梢血液白血球。
【図２Ｂ】成人における、ＴＲＥＫ２の発現に関する。ノーザンブロット解析による、脳における定位。ブロットを、高ストリンジェンシーで、特異的プローブとハイブリダイズさせた。各レーンは、２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを含む。
【図３Ａ】ＴＲＥＫ２電流の生物物理学的特性に関する。ホールセル配置。２０ｍＶの増分による、−１５０ｍＶ〜＋７０ｍＶの電圧ステップで誘発された、重畳電流トレース。
【図３Ｂ】ＴＲＥＫ２電流の生物物理学的特性に関する。生理的（５ｍＭＫ＋）および対称的（１５０ｍＭＫ＋）Ｋ＋勾配（−８０ｍＶの保持電位から、−１３０ｍＶから＋１００ｍＶまで、８００ミリ秒（ｍｓ）の電圧ランプ）における、電流電圧（Ｉ−Ｖ）関係。
【図３Ｃ】ＴＲＥＫ２電流の生物物理学的特性に関する。表示の電位における、定常状態シングルチャネル活性。生理的（左トレース）および対称的（右トレース）Ｋ＋条件における、アウトサイド・アウトパッチモード。
【図３Ｄ】ＴＲＥＫ２電流の生物物理学的特性に関する。生理的（■）および対称的（○）Ｋ＋条件で、アウトサイド・アウトパッチにより得られたＴＲＥＫ２のシングルチャネルＩ−Ｖ曲線。５回試験したパッチの平均値。対称的Ｋ＋条件で測定したとき、シングルチャネルコンダクタンスは、−４０ｍＶで１２８ｐＳ、＋４０ｍＶで１００ｐＳであった。
【図４Ａ】膜の伸張および内部アシドーシスによるＴＲＥＫ２の活性化に関する。＋５０ｍＶで低基礎活性を示す、インサイド・アウトパッチにおける、膜伸張によるＴＲＥＫ２の可逆的活性化。
【図４Ｂ】膜の伸張および内部アシドーシスによるＴＲＥＫ２の活性化に関する。０ｍＶに保持されたマルチチャネル・インサイド・アウトパッチにおける、伸張刺激増加（ｍｍＨｇで表示）がＴＲＥＫ２活性化に及ぼす作用。
【図４Ｃ】膜の伸張および内部アシドーシスによるＴＲＥＫ２の活性化に関する。マルチチャネルインサイド・アウトパッチ。同一膜伸張（−７５ｍｍＨｇ）による、膜電圧（表示の通り）がＴＲＥＫ２活性化に及ぼす作用。
【図４Ｄ】膜の伸張および内部アシドーシスによるＴＲＥＫ２の活性化に関する。低基礎活性を示すパッチにおける、内部アシドーシス（ｐＨｉ５．６）によるＴＲＥＫ２の可逆的活性化。最大ＴＲＥＫ２活性化は、脱分極状態で得られる。
【図４Ｅ】膜の伸張および内部アシドーシスによるＴＲＥＫ２の活性化に関する。マルチチャネルインサイド・アウトパッチ。ｐＨ５．６における内部アシドーシスによる活性化の電圧依存性。ＡおよびＢでは、ｐＨｉの対照値を７．３に保った。
【図５Ａ】揮発性麻酔薬およびリルゾールによるＴＲＥＫ２の活性化に関する。ハロタン（１ｍＭ）は、ホールセル配置で誘発されるＴＲＥＫ２チャネル活性を刺激する。−８０ｍＶの保持電位から開始する、８００ｍｓ持続時間の電圧ランププロトコールを用いて、Ｉ−Ｖ曲線を得た。
【図５Ｂ】揮発性麻酔薬およびリルゾールによるＴＲＥＫ２の活性化に関する。クロロホルム（ＣＨＣｌ３）、イソフルラン（Ｉｓｏ）およびハロタンによる、ＴＲＥＫ２チャネル活性の活性化。各実験条件における細胞数を、上のバーで示す。
【図５Ｃ】揮発性麻酔薬およびリルゾールによるＴＲＥＫ２の活性化に関する。リルゾールによるＴＲＥＫ２の一過性の活性化。対照条件下（１）、リルゾールを２０秒加えた後（２）、リルゾールを３分加えた後（３）および１分洗浄した後（４）の電流の放出。電圧−クランププロトコールは、１０秒ごとに印加される、Ａの場合と同じランプからなる。＋１００ｍＶで、電流をモニタリングした。
【図５Ｄ】揮発性麻酔薬およびリルゾールによるＴＲＥＫ２の活性化に関する。Ｃで示した実験の、対応するＩ−Ｖ曲線。
【図６Ａ】ＴＲＥＫ２の、ポリ不飽和脂肪酸およびリソホスファチジルコリン活性化、およびｃＡＭＰによる阻害に関する。ホールセルＴＲＥＫ２電流の、アラキドン酸（ＡＡ）による活性化。Ｉ−Ｖ曲線は、−８０ｍＶの保持電位から開始する、８００ｍｓ持続時間の電圧ランププロトコールで得た。
【図６Ｂ】ＴＲＥＫ２の、ポリ不飽和脂肪酸およびリソホスファチジルコリン活性化、およびｃＡＭＰによる阻害に関する。リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）による活性化。Ａと同一プロトコール。
【図６Ｃ】ＴＲＥＫ２の、ポリ不飽和脂肪酸およびリソホスファチジルコリン活性化、およびｃＡＭＰによる阻害に関する。ＴＲＥＫ２に対する脂肪酸の作用。ＡＡ、アラキドン酸；ＤＨＡ、ドコサヘキサエン酸；ＬＡ、リノレン酸；ＰＡ、パルミチン酸；ＬＰＣ、リソホスファチジルコリン。
【図６Ｄ】ＴＲＥＫ２の、ポリ不飽和脂肪酸およびリソホスファチジルコリン活性化、およびｃＡＭＰによる阻害に関する。ｃＡＭＰによる、ＴＲＥＫ２チャネル活性の制御。５００μＭ　ＣＰＴ−ｃＡＭＰの外的適用後の、電流の抑制。Ａと同一の電圧プロトコール。
【図７Ａ】Ｇ−タンパク質結合受容体による、ＴＲＥＫ２の制御に関する。左：対照条件（１）、受容体活性化後の定常状態の作用（２）および洗浄後（３）の、ホールセルＴＲＥＫ２電流の放出。電圧−クランププロトコールは、１０秒ごとに印加される−８０ｍＶの保持電位から開始する、８００ｍｓ持続時間の電圧ランプからなる。＋１００ｍＶで電流をモニタリングした。右：左に示した実験の、対応するＩ−Ｖ曲線。５ＨＴ４ｓＲ受容体と一緒に、ＴＲＥＫ２チャネルを共発現させた。５ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）を適用することにより、受容体を活性化させた。ＴＲＥＫ２のみをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞では、５ＨＴの適用後、ＴＲＥＫ２電流に対する作用は全くみられなかった。
【図７Ｂ】Ｇ−タンパク質結合受容体による、ＴＲＥＫ２の制御に関する。左：対照条件（１）、受容体活性化後の定常状態の作用（２）および洗浄後（３）の、ホールセルＴＲＥＫ２電流の放出。電圧−クランププロトコールは、１０秒ごとに印加される−８０ｍＶの保持電位から開始する、８００ｍｓ持続時間の電圧ランプからなる。＋１００ｍＶで電流をモニタリングした。右：左に示した実験の、対応するＩ−Ｖ曲線。ｍＧｌｕＲ２受容体と一緒に、ＴＲＥＫ２チャネルを共発現させた。グルタミン酸を適用することにより、受容体を活性化させた。ＴＲＥＫ２のみをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞では、グルタミン酸の適用後、ＴＲＥＫ２電流に対する作用は全くみられなかった。
【図７Ｃ】Ｇ−タンパク質結合受容体による、ＴＲＥＫ２の制御に関する。左：対照条件（１）、受容体活性化後の定常状態の作用（２）および洗浄後（３）の、ホールセルＴＲＥＫ２電流の放出。電圧−クランププロトコールは、１０秒ごとに印加される−８０ｍＶの保持電位から開始する、８００ｍｓ持続時間の電圧ランプからなる。＋１００ｍＶで電流をモニタリングした。右：左に示した実験の、対応するＩ−Ｖ曲線。ｍＧｌｕＲ１受容体と一緒に、ＴＲＥＫ２チャネルを共発現させた。グルタミン酸を適用することにより、受容体を活性化させた。ＴＲＥＫ２のみをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞では、グルタミン酸の適用後、ＴＲＥＫ２電流に対する作用は全くみられなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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