(57)【要約】本発明は、細胞分裂に影響を及ぼす反応性酸素中間体の発生に関与した新規ｎｏｘ酵素タンパク質の産生をコードする新規遺伝子に関する。本発明はまた、これらの遺伝子を含むベクター、これらのベクターでトランスフェクトした細胞、これらの新規タンパク質に対して産生される抗体、これらの遺伝子およびタンパク質の検出、位置の突止めならびに測定用のキット、および本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼす薬剤の活性を決定する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スーパーオキシド産生を刺激することが可能なタンパク質であって、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列、それらの断片、またはそれらの保存的置換物を含むタンパク質。
【請求項２】
スーパーオキシド産生を刺激することが可能なタンパク質であって、該タンパク質は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列、該アミノ酸配列の約２０％以下のそれらの欠失物もしくはそれらへの付加物、またはそれらの保存的置換物を含み、該保存的置換物は、以下の置換を含むタンパク質：
ａ）互いに関して、アラニン、セリン、またはスレオニン、
ｂ）互いに関して、アスパラギン酸、またはグルタミン酸、
ｃ）互いに関して、アスパラギン、またはグルタミン、
ｄ）互いに関して、アルギニン、またはリシン、
ｅ）互いに関して、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、またはバリン、あるいは
ｆ）互いに関して、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質、それらの断片、またはそれらの保存的置換物をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列は、配列番号１、それらの断片、もしくはそれらの保存的置換物、または配列番号３、それらの断片、もしくはそれらの保存的置換物を含む、請求項４に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質、それらの断片、またはそれらの保存的置換物をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列は、配列番号１もしくは配列番号３、それらの断片、またはそれらの保存的置換物を含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
請求項１に記載のタンパク質、それらの断片、またはそれらの保存的置換物に結合することが可能な抗体。
【請求項９】
薬学的に許容可能なキャリア中の、請求項１に記載のタンパク質、それらの断片、またはそれらの保存的置換物を含む組成物を、インビトロまたはインビボで投与することを含む、スーパーオキシドの形成を刺激する方法。
【請求項１０】
薬学的に許容可能なキャリア中の、請求項５に記載のベクターを含む組成物を、インビトロまたはインビボで投与することを含む、スーパーオキシドの形成を刺激する方法。
【請求項１１】
薬剤または化学物質の活性を決定する方法であって、該薬剤または該化学物質の投与後に、請求項１に記載のタンパク質、それらの断片、またはそれらの保存的置換物が、スーパーオキシドの産生を刺激する活性を測定することを含む方法。
【請求項１２】
配列番号５の配列、それらの保存的置換物、またはそれらの断片を含む単離ヌクレオチド配列。
【請求項１３】
レポーター構築物中に、請求項１２に記載の配列を含む組換え宿主細胞。
【請求項１４】
薬剤または化学物質の活性を決定する方法であって、該薬剤または該化学物質の投与後に、請求項１３に記載のレポーター構築物が、スーパーオキシドの産生を刺激することが可能なタンパク質を生産する活性を測定することを含む方法。
【請求項１５】
動物またはヒトへ投与された後に、該動物または該ヒトにおいてスーパーオキシドの形成を刺激するのに有用である薬剤を調製するための、請求項１に記載の単離タンパク質の使用。
【請求項１６】
動物またはヒトへ投与された後に、該動物または該ヒトにおいてスーパーオキシドの形成を刺激するのに有用である薬剤を調製するための、請求項３に記載のヌクレオチド配列の使用。
【請求項１７】
薬剤または化学物質の活性を決定するための、請求項１に記載の単離タンパク質の使用であって、該薬剤または該物質の投与後に、請求項１に記載のタンパク質、それらの断片、またはそれらの保存的置換物が、スーパーオキシドの産生を刺激する活性を測定することを含む使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
米国政府は、本発明に関する支払い済みのライセンスを有し、国立衛生研究所交付ＨＬ３８２０６、ＨＬ５８０００、およびＣＡ８４１３８によって定められた相応の条件によって、一定の場合には他人にライセンスを与えるよう特許所有者に要請する権利を有する。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、特定のマイトジェン調節における、正常および異常細胞成長の分野に関する。本発明は、マイトジェン調節因子である酵素の産生をコードするヌクレオチド配列、これらの酵素のアミノ酸配列、これらのヌクレオチド配列を含むベクター、これらの酵素を産生するベクターで細胞をトランスフェクトする方法、トランスフェクトした細胞、腫瘍形成を誘発するためにこれらのトランスフェクトした細胞を動物に投与する方法、これらの酵素レベルを検出および測定するのに有用な、およびこれらの酵素の細胞外エピトープを有する細胞に結合するのに有用なこれらの酵素に対する抗体、ならびにこれらの酵素のエフェクタについてスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【０００３】
［発明の背景］
反応性酸素中間体（ＲＯＩ）は、細胞障害性かつ変異原性である。ＲＯＩは、ＤＮＡおよび脂質を含む重要な生体分子を改変し、損傷を与える。ＲＯＩは、酸素の部分的還元生成物である：Ｏ２を１電子還元して、スーパーオキシド（Ｏ２−）を形成し、Ｏ２を２電子還元して、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を形成する。ＲＯＩの細胞障害特性は、食細胞において利用されており、食細胞は、食細胞の殺菌メカニズムの手段の一部として、大量のスーパーオキシドおよび過酸化水素を生成する。ＲＯＩは、代謝、特にミトコンドリア呼吸の偶発的な副生成物とみなされていた。しかし、最近の研究により、様々な細胞において、調節酵素によるＯ２−の生成、および調節酵素によるＯ２−のＨ２Ｏ２への変換に関する証拠が見出されている。Ｏ２−のＨ２Ｏ２への変換は、自然発生的にも起こり得るが、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）により著しく促進される。細胞を血小板由来の成長因子および上皮成長因子に暴露させることで、Ｈ２Ｏ２の産生を誘発し、Ｈ２Ｏ２は、ｐ４２／ｐ４４  ＭＡＲＫおよびチロシンリン酸化を含むシグナル伝達経路の構成成分を活性化する。
【０００４】
幾つかの生物系は、反応性酸素を生成する。細菌またはホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅまたはホルボールエステルのような様々な可溶性メディエータに好中球を暴露すると、呼吸バーストと称される酸素の大量消費を促進して、まずスーパーオキシドを生成し、さらにＨ２Ｏ２、ＨＯＣｌおよびヒドロキシラジカルを二次生成する。この酸素消費の原因となる酵素は、呼吸バーストオキシダーゼ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼ）である。
【０００５】
特に細胞増殖に関連した状況では、非食細胞によるＲＯＩの生成の証拠が見出されつつある。Ｈ２Ｏ２、Ｏ２−、またはその両方の生成が幾つかの型の細胞で有意に観察されている。線維芽細胞およびヒト内皮細胞は、インターロイキン−１または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなサイトカインに応答して、スーパーオキシドの放出の増加を示す（Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２６３， ５３９−５４５； Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １３７， ３２９５−３２９８）。Ｒａｓで形質転換された線維芽細胞は、対照の線維芽細胞と比較して、スーパーオキシドの放出の増加を示す（Ｉｒａｎｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５， １６４９−１６５２）。ラット血管平滑筋細胞は、ＰＤＧＦ （Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０， ２９６−２９９）、およびアンジオテンシン（Ｇｒｉｅｎｄｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７４， １１４１−１１４８； Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８０， ４５−５１； Ｕｓｈｉｏ−Ｆｕｋａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ２３３１７−２３３２１）に応答して、Ｈ２Ｏ２の放出の増加を示し、これらの細胞中のＨ２Ｏ２は、増殖速度の上昇と関連する。形質転換した線維芽細胞および血管平滑筋細胞中のＨ２Ｏ２は、増殖速度の上昇と関連する。様々な細胞型でのＲＯＩの発生を表１に要約する（Ｂｕｒｄｏｎ， Ｒ． （１９９５） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １８， ７７５−７９４を基に作成）。
【０００６】
【表１】
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【０００７】
好中球により生成されるＲＯＩは、細胞障害性機能を有する。ＲＯＩは、通常、侵入してくる微生物に対するものであるが、ＲＯＩはまた、組織損傷（例えば、関節炎、ショック、肺疾患、および炎症性腸疾患のような炎症状態）を誘発するか、またはＤＮＡを損傷させることにより、腫瘍の発生または発達に関与する可能性がある。Ｎａｔｈａｎ（Ｓｚａｔｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ５１， ７９４−７９８）は、腫瘍細胞におけるＲＯＩの生成が、腫瘍に見られる高変異性（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｂｉｌｉｔｙ）に寄与する場合があり、したがって腫瘍異質性、浸潤および転移に寄与する可能性があると提唱した。
【０００８】
細胞障害性および変異原性の役割のほかに、ＲＯＩは、シグナル分子としての理想的な特性を有する：１）ＲＯＩは、上流のシグナルに応答して、制御された様式で生成される；２）シグナルは、ＳＯＤおよびカタラーゼ／ペルオキシダーゼによるＯ２−およびＨ２Ｏ２の迅速な代謝により終結され得る；３）ＲＯＩは、標的分子、例えば、ＮＦκ−ＢおよびＡＰ−１のような酸化還元感受性調節タンパク質に対する下流の影響を誘発する（Ｓｃｈｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９９１） ＥＭＢＯ Ｊ． １０， ２２４７−２２５８； Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２， １３−２２）。Ｏ２−およびＨ２Ｏ２のような酸化剤は、細菌において比較的明確な役割を有し、ＳｏｘＩ／ＩＩレギュロンを介して作動し、転写を調節する。
【０００９】
ＲＯＩは、細胞分裂の調節に直接的な役割を有するようであり、成長に関連する病理学的状態におけるマイトジェンシグナルとして機能し得る。このような状態としては、癌および心血管疾患が挙げられる。Ｏ２−は、サイトカインに応答して内皮細胞で生成され、血管新生で役割を果たし得る（Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎ．１３７， ３２９５−３２９８）。Ｏ２−およびＨ２Ｏ２はまた、「生命シグナル（ｌｉｆｅ−ｓｉｇｎａｌｓ）」として機能し、細胞がアポトーシスするのを防ぐと提唱されている（Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １３８， ３２９５−３２９８）。上述のように、多くの細胞が、成長因子（例えば、血小板由来の成長因子（ＰＤＦＧ）、上皮由来の成長因子（ＥＧＦ）、アンジオテンシンＩＩ、および各種サイトカイン）に応答して、Ｏ２−／Ｈ２Ｏ２の産生を増加させ、かつ増殖を増大させる。ＲＯＩ生成を阻害することにより、マイトジェン応答を阻止する。外因的に生成されたＯ２−およびＨ２Ｏ２へ暴露されると、細胞増殖の増大がもたらされる。応答性のある型の細胞の一部のリストを以下の表２に示す。（Ｂｕｒｄｏｎ， Ｒ． （１９９５） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １８， ７７５−７９４を基に作成）。
【００１０】
【表２】
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【００１１】
非形質転換細胞は、成長因子およびサイトカインに応答してＲＯＩを産生することができるが、腫瘍細胞は、非制御様式でＲＯＩを産生するようである。一連のヒト腫瘍細胞は、非腫瘍細胞と比較して、大量の過酸化水素を生産した（Ｓｚａｔｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ５１， ７９４−７９８）。Ｒａｓで形質転換されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、大量のスーパーオキシドを生成し、幾つかのメカニズムによりスーパーオキシド生成を阻害すると、「正常」成長表現型へ復帰した。
【００１２】
Ｏ２−は、黒色腫、乳癌、線維肉腫、およびウイルス性形質転換腫瘍細胞を含む癌細胞における形質変換された表現型の維持に関与している。マンガン型のＳＯＤ（ＭｎＳＯＤ）レベルの減少が、癌細胞およびインビトロ形質転換細胞系において測定され、Ｏ２−レベルの増加が予測される（Ｂｕｒｄｏｎ， Ｒ． （１９９５） Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １８， ７７５−７９４）。ＭｎＳＯＤは、黒色腫で欠失されていることが非常に多い染色体である６ｑ２５にコードされる。黒色腫および他の癌細胞でのＭｎＳＯＤの過剰発現（Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． ｏｆ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０， ３１１３−３１１７； Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４２， ６０９−６１７； Ｙａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ５６， ２８６４−２８７１）は、形質転換された表現型を抑制した。
【００１３】
ＲＯＩは、高血圧症、アテローム硬化症、および血管形成術後の再狭窄に関連した血管平滑筋の成長に関連付けられる。Ｏ２−生成が、ウサギ大動脈外膜で見られる（Ｐａｇａｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４， １４４８３−１４４８８）。血管内皮細胞は、サイトカインに応答してＯ２−を放出する（Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １３７， ３２９５−３２９８）。Ｏ２−は、培養中の大動脈平滑筋細胞により生成され、Ｏ２−生成の増加は、アンジオテンシンＩＩにより刺激され、アンジオテンシンＩＩはまた細胞肥大を引き起こす。ラットモデル系では、アンジオテンシンＩＩを注入すると、高血圧、ならびに続いて単離した大動脈組織でＯ２−生成の増加を引き起こす（Ｕｓｈｉｏ−Ｆｕｋａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ２３３１７−２３３２１； Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２７２８８−２７２９４）。血管系に局在化する形態のＳＯＤの静脈内注入、またはＯ２−スカベンジャーの注入は、アンジオテンシンＩＩ誘発性高血圧を阻止し、ＲＯＩ生成を阻害した（Ｆｕｋｕｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ８０， ４５−５１）。
【００１４】
食細胞呼吸バーストオキシダーゼとしても知られる好中球ＮＡＤＰＨオキシダーゼは、特殊酵素的ＲＯＩ生成系の研究に関するパラダイムを提供する。この広範に研究された酵素は、ＮＡＤＰＨを酸化して、酸素を還元して、Ｏ２−を形成する。ＮＡＰＤＨオキシダーゼは、複数のタンパク質から構成され、細胞質ゾルおよび膜構成成分の集合により調節される。触媒部分は、２つの構成成分：ｇｐ９１ｐｈｏｘ（ｇｐは、糖タンパク質を指し、ｐｈｏｘは、食細胞およびオキシダーゼの略語である）およびｐ２２ｐｈｏｘ（ｐは、タンパク質を指す）からなる完全原形質膜酵素であるフラボシトクロムｂ５５８から構成される。ｇｐ９１ｐｈｏｘは、１つのフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）および２つのヘム、ならびにＮＡＤＰＨ結合部位を有する。ｐ２２ｐｈｏｘは、細胞質ゾル調節タンパク質の結合部位として作用するＣ末端プロリンリッチ配列を有する。２つのシトクロムサブユニットであるｇｐ９１ｐｈｏｘおよびｐ２２ｐｈｏｘは、遺伝性障害である慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）の場合のように、いずれかのサブユニットの遺伝的欠如がパートナーサブユニットの欠如をもたらすため、互いを安定化するように見える（Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２７２８８−２７２９４）。必須細胞質ゾルタンパク質としては、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、およびスモールＧＴＰ加水分解酵素Ｒａｃ（この２つのアイソフォームが存在する）が挙げられる。ｐ４７ｐｈｏｘおよびｐ６７ｐｈｏｘはともに、ＳＨ３領域およびプロリンリッチ領域を含み、それらの領域は、活性化中にオキシダーゼ構成成分の集合を制御するタンパク質相互作用に関与する。好中球酵素は、ｐ４７ｐｈｏｘ、およびおそらくは他の構成成分のリン酸化による細菌性食作用または走化性シグナルに、ならびにＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃを活性化するためのグアニンヌクレオチド交換による細菌性食作用または走化性シグナルに応答して調節される。
【００１５】
非食細胞組織中のＲＯＩの起源は未確認であるが、免疫化学的方法、ノーザンブロット、および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、食細胞オキシダーゼ構成成分の発生量が、幾つかの系で評価されている。ｐ２２ｐｈｏｘのメッセージは、Ｒａｃ１に関するメッセージのように広範に発現される。Ｏ２−生成をすることができる幾つかの細胞型は、以下の表３に要約するように、ｇｐ９１ｐｈｏｘを含むｐｈｏｘ構成成分のすべてを含有することが実証された。これらの細胞型には、内皮細胞、大動脈外膜、およびリンパ球が含まれる。
【００１６】
【表３】
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【００１７】
しかしながら、糸球体間質細胞、ラット大動脈平滑筋、および線維芽細胞を含む表３に示す幾つかの他の細胞型で、明らかに異なるパターンが見られる。これらの細胞では、ｇｐ９１ｐｈｏｘの発現が欠如しているが、ｐ２２ｐｈｏｘ、および場合によっては細胞質ゾルｐｈｏｘ構成成分が存在することが実証された。ｐｇ９１ｐｈｏｘおよびｐ２２ｐｈｏｘは好中球では互いを安定化するため、ｇｐ９１ｐｈｏｘに関連する可能性のある幾つかの分子が、糸球体間質細胞、ラット大動脈平滑筋、および線維芽細胞におけるＲＯＩ生成の原因であるという多くの推論が存在してきた（Ｕｓｈｉｏ−Ｆｕｋａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１，２３３１７−２３３２１）。ｇｐ９１ｐｈｏｘが遺伝的に欠如した患者由来の線維芽細胞の研究により、ｇｐ９１ｐｈｏｘサブユニットはこれらの細胞でのＲＯＩ生成に関与していないという証拠が得られた（Ｅｍｍｅｎｄｏｒｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ５１，２３３−２２７）。アンチセンスアプローチを用いて血管平滑筋からｐ２２ｐｈｏｘを欠如させると、このサブユニットは、検出可能なｐｇ９１ｐｈｏｘを欠如しているにもかかわらず、これらの細胞でのＲＯＩ生成に関与することを示した（Ｕｓｈｉｏ−Ｆｕｋａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ２３３１７−２３３２１）。この時点では、ｇｐ９１ｐｈｏｘに関連し、かつこれらの細胞でのＲＯＩ生成に関与する可能性のある分子候補は未知である。
【００１８】
したがって、特に非食細胞組織および非食細胞でのＲＯＩ生成に関与するタンパク質の同定が必要である。またこれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびタンパク質自体の一次配列も必要である。また、これらのタンパク質をコードするヌクレオチドを含むように設計したベクターも必要である。ヌクレオチド配列に由来するプローブおよびＰＣＲプライマーは、これらのタンパク質の合成に関与したｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列を検出、局在化および測定するのに必要である。さらに、これらのベクターで細胞をトランスフェクトする手段が必要である。またこれらの分子を生産する発現系も必要である。また、局在化、検出、測定、および受動免疫化を含む様々な用途のために、これらの分子に対する抗体が必要である。
【００１９】
［発明の概要］
本発明は、ヌクレオチド配列の新規ファミリー、およびこれらのヌクレオチド配列によりコードされるＮｏｘタンパク質と称されるタンパク質を提供することで、上述の問題を解決する。特に、本発明は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５で表されるヌクレオチド、ならびにそれらの保存的置換物および断片を含む組成物を提供し、ここで配列番号１およびその断片は、配列番号２を含むタンパク質およびその断片の発現をコードし、配列番号３およびその断片は、配列番号４を含むタンパク質およびその断片の発現をコードする。配列番号５は、Ｎｏｘ１のためのプロモーター配列である。以下の記述により限定することを意図しないが、これらのＮｏｘタンパク質である配列番号２および４、ならびにそれらの断片がＲＯＩ産生に関与すると考えられる。本発明はまた、これらのヌクレオチド配列を含有するベクター；配列番号２および配列番号４、またはそれらの断片を含むタンパク質を生産する、これらのベクターでトランスフェクトした細胞；ならびにこれらのタンパク質およびそれらの断片に対する抗体を提供する。本発明はまた、配列番号２または配列番号４、およびそれらの断片を含むタンパク質の産生をコードするベクターを投与することにより、細胞増殖を刺激する方法を提供する。本発明はさらに、配列番号２または配列番号４、およびそれらの断片を含むタンパク質を投与することにより、細胞増殖を刺激する方法を提供する。本発明のヌクレオチドおよび抗体は、本発明のタンパク質の産生をコードする核酸の検出、局在化および測定に、また本発明のタンパク質の検出、局在化および測定に有用である。これらのヌクレオチドおよび抗体は、検出、局在化および測定の目的で、キット中の他の試薬と組み合わせることができる。
【００２０】
より詳細には、本発明は、配列番号２または４に記載のタンパク質、またはそれらの断片の活性あるいは発現を改変することによって、細胞分裂または細胞増殖を調節する方法を含む。天然に存在するか、または天然で発現される形態のこれらのタンパク質は、薬剤開発において、例えば、これらの酵素の活性の阻害を観察することにより、化学物質ライブラリーおよび薬剤ライブラリーのスクリーニングに有用であると予測される。かかる化学物質および薬剤は、癌、前立腺肥大、良性前立腺肥大、高血圧、アテローム硬化症、および以下に記載するような異常細胞成長または増殖を含む多くの他の障害のための治療剤として有用である可能性が高い。完全発現タンパク質は、これらのアッセイで有用であり得る。阻害または改変のための標的であり得る分子の一部として、ピリジンヌクレオチド（ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ）の結合部位、フラボタンパク質ドメイン（およそＣ末端の２６５個のアミノ酸）、および／またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の結合部位もしくは触媒部位が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明はさらに、化合物の活性を測定するためのアッセイにおいて使用するためのレポーター−プロモーター構築物を創出することを含む。本発明の方法はさらに、癌、乾癬、前立腺肥大、良性前立腺肥大、心血管疾患、血管およびリンパ管を含む（これらに限定されない）脈管の増殖、静動脈奇形、眼に関連した脈管問題、アテローム動脈硬化症、高血圧、および血管形成後の再狭窄（これらに限定されない）を含む異常成長に関連した状態の治療のための薬剤または他の療法の開発に有用であり得る。本発明の酵素は、これらの酵素の活性を調節し得る薬剤および他の作用物質を開発するための優れた標的である。活性の調節とは、酵素活性を増大させること、低減させることまたは欠如させることであることを理解されたい。これらの酵素の活性の調節は、異常成長に関連した状態の治療に有用であり得る。
【００２２】
配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片で表される酵素の活性に影響を及ぼす薬剤はまた、特定の状態の治療において他の治療薬と組み合わせてもよい。例えば、これらの薬剤は、癌の治療における血管新生阻害剤、高血圧の治療用の抗高血圧薬、およびアテローム硬化症の治療用のコレステロール低減薬と組み合わせてもよい。
【００２３】
したがって、本発明の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片の産生をコードするヌクレオチド配列、またはその断片を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、これらのヌクレオチド配列、またはそれらの断片を含有するベクターを提供することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、これらのベクターでトランスフェクトした細胞を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる別の目的は、これらのベクターでトランスフェクトした細胞を、動物およびヒトに投与することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる別の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはそれらの断片に対して産生されるモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、またはそれらの断片を含む抗体を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片の産生をコードするヌクレオチド配列、またはその断片を含有する遺伝子を、動物およびヒトに、また動物およびヒトから得られる細胞に投与することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片の産生をコードするヌクレオチド配列、またはその断片を含有する遺伝子のアンチセンス相補的配列を、動物およびヒトに、また動物およびヒトから得られる細胞に投与することである。
【００３１】
本発明のさらに別の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片の産生をコードするヌクレオチド配列、またはその断片を含有するベクターを、動物およびヒトに投与することにより、細胞増殖を刺激または阻害する方法を提供することである。本発明の目的はまた、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片の産生をコードするヌクレオチド配列、またはその断片のアンチセンス相補配列を含有するベクターを、動物およびヒトに投与することにより、細胞増殖を刺激または阻害する方法を提供することである。これらの細胞増殖を刺激する方法は、腫瘍形成の動物モデルの開発、化学療法または放射線療法後の血液骨髄細胞の細胞増殖の刺激、または貧血の場合における血液骨髄細胞の細胞増殖の刺激（これらに限定されない）を含む様々な用途に有用である。
【００３２】
本発明のさらに別の目的は、配列番号２もしくは配列番号４で示されるタンパク質、またはその断片を発現する癌に対する免疫療法に有用な抗体を提供することである。
【００３３】
本発明のさらなる別の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片の産生をコードするヌクレオチド配列、またはその断片の検出、局在化および測定に有用なヌクレオチドプローブを提供することである。
【００３４】
本発明の別の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはそれの断片の産生をコードするヌクレオチド配列、またはその断片の検出、局在化および測定に有用な抗体を提供することである。
【００３５】
本発明の別の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片をコードする配列番号１、配列番号３で表される核酸、またはそれらの断片を含む核酸の検出に有用なキットを提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、Ｎｏｘ１のプロモーター領域を表す配列番号５で表される核酸、またはその断片を含む核酸の検出に有用なキットを提供することである。
【００３７】
本発明のさらなる別の目的は、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片をコードする配列番号１、配列番号３で表される核酸、またはそれらの断片を含む核酸の局在化に有用なキットを提供することである。
【００３８】
本発明のさらに別の目的は、Ｎｏｘ１のプロモーター領域を表す配列番号５で表される核酸、またはその断片を含む核酸の局在化に有用なキットを提供することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、タンパク質（ＲＯＩ産生に関与する配列番号２および配列番号４、またはそれらの断片で表されるタンパク質を含む）の検出に有用なキットを提供することである。
【００４０】
本発明のさらに別の目的は、タンパク質（ＲＯＩ産生に関与する配列番号２および配列番号４、またはそれらの断片で表されるタンパク質を含む）の検出および測定に有用なキットを提供することである。
【００４１】
本発明のさらなる別の目的は、タンパク質（ＲＯＩ産生に関与する配列番号２および配列番号４、またはそれらの断片で表されるタンパク質を含む）の局在化に有用なキットを提供することである。
【００４２】
本発明のさらに別の目的は、ＲＯＩ産生に関連した異常細胞増殖の診断および予後で使用するための、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片をコードする核酸、またはその断片の検出、測定あるいは局在化に有用なキットを提供することである。
【００４３】
本発明の別の目的は、ＲＯＩ産生に関連した異常細胞増殖の診断および予後において使用するための、ＲＯＩ産生に関与するタンパク質、またはその断片の検出、測定または局在化に有用なキットを提供することである。
【００４４】
本発明のさらなる目的は、Ｎｏｘファミリーのタンパク質の細胞レベルまたは活性を調節する薬剤に関してスクリーニングするために、配列番号２および配列番号４、またはそれらの断片で表されるタンパク質を使用することである。
【００４５】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、以下の開示する実施形態の詳細な説明および添付の図面の参照により明らかとなるであろう。
【００４６】
［発明の詳細な説明］
本発明は、新規ファミリーのヌクレオチド配列、およびこれらのヌクレオチド配列によりコードされるＮｏｘタンパク質と称されるタンパク質を提供することで、上述の問題を解決する。「Ｎｏｘ」という用語は、「ＮＡＤＰＨ−オキシダーゼ」を指す。これらの新規タンパク質は、ＲＯＩを生成する大型関連ファミリーのタンパク質の一部であり、ｍｏｘタンパク質（ｍｏｘは、マイトジェンＮＡＤＰＨオキシダーゼに関する略語である）、およびＤｕｏｘタンパク質（ｄｕｏｘは、二重オキシダーゼに関する略語である）が挙げられる。特に、本発明は、ヌクレオチド配列である配列番号１、配列番号３、または配列番号５、およびそれらの断片を含む新規組成物を提供する。配列番号１、またはその断片は、配列番号２を含むタンパク質、またはその断片をコードする。配列番号３、またはその断片は、配列番号４を含むタンパク質、またはその断片をコードする。配列番号５は、Ｎｏｘ１のプロモーター領域である。
【００４７】
本明細書中に記載するＮｏｘタンパク質は、ＲＯＩ産生に関与するｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質に対する相同性を有するが、Ｎｏｘタンパク質は、新規でかつ異なるファミリーのタンパク質を含む。本発明に含まれるＮｏｘタンパク質は、還元ゲル電気泳動により測定すると、およそ６５ｋＤａの分子量を有し、細胞中でＲＯＩ生成を誘発することが可能である。以下に詳述するように、本発明のＮｏｘタンパク質はまた、細胞成長の調節において機能し、したがって、癌のような異常細胞成長を伴う疾患に関連付けられる。本発明は、ヒトに見出されるＮｏｘタンパク質について記載しているが、Ｎｏｘファミリーの遺伝子／タンパク質は、多細胞生物において広く分布している可能性が高い。
【００４８】
上述のヌクレオチド配列のほかに、本発明はまた、これらのヌクレオチド配列およびそれらの断片を含有するベクター；配列番号２、配列番号４、およびそれらの断片を含むタンパク質を産生する、これらのベクターでトランスフェクトした細胞；ならびにこれらのタンパク質およびそれらの断片に対する抗体を提供する。本発明はまた、配列番号２、配列番号４、およびそれらの断片を含むタンパク質の産生をコードするベクター、または該ベクターを含む細胞を投与することにより、細胞増殖を刺激する方法を提供する。本発明のヌクレオチドおよび抗体は、本発明のタンパク質の産生をコードする核酸の検出、局在化および測定に有用であり、かつ本発明のタンパク質の検出、局在化および測定に有用である。これらのヌクレオチドおよび抗体は、検出、局在化および測定の目的で、キット中で他の試薬と組み合わせることができる。これらのキットは、反応性酸素中間体の産生に関連した細胞増殖と関連のある状態の診断および予後において有用である。
【００４９】
本発明は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列およびその断片を含む組成物を提供することにより、上述の問題を解決する。本発明はまた、配列番号３で表されるヌクレオチド配列およびその断片を含む組成物を提供する。本発明はさらに、配列番号５で表されるヌクレオチド配列およびその断片を含む組成物を提供する。
【００５０】
本発明は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列によりコードされる配列番号２で表されるタンパク質を含む組成物を提供する。本発明はさらに、配列番号３で表されるヌクレオチド配列によりコードされる配列番号４で表されるタンパク質を含む組成物を提供する。
【００５１】
本発明は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列またはその断片によりコードされる、配列番号２で表されるタンパク質またはその断片を含む組成物を提供する。本発明はまた、配列番号３で表されるヌクレオチド配列またはその断片によりコードされる、配列番号４で表されるタンパク質またはその断片を含む組成物を提供する。
【００５２】
本発明は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５で表されるヌクレオチド配列、およびそれらの断片を含むベクターを提供する。本発明はまた、これらのベクターでトランスフェクトした細胞を提供する。さらに、本発明は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列またはその断片で安定にトランスフェクトした細胞を提供する。本発明はまた、配列番号３で表されるヌクレオチド配列またはその断片で安定にトランスフェクトした細胞を提供する。
【００５３】
本発明は、配列番号２で表されるタンパク質またはその断片を産生する、配列番号１で表されるヌクレオチド配列またはその断片で安定にトランスフェクトした細胞を提供する。さらに、本発明は、配列番号４で表されるタンパク質またはその断片を生産する、配列番号３で表されるヌクレオチド配列またはその断片で安定にトランスフェクトした細胞を提供する。
【００５４】
本発明は、配列番号２で表されるタンパク質またはその断片を産生する、配列番号１で表されるヌクレオチド配列で安定にトランスフェクトした細胞を投与することにより、成長を刺激する方法を提供する。本発明はまた、配列番号４で表されるタンパク質またはその断片を生産する、配列番号３で表されるヌクレオチド配列またはその断片で安定にトランスフェクトした細胞を投与することにより、成長を刺激する方法を提供する。
【００５５】
具体的には、本発明は、配列番号２で表されるタンパク質またはその断片を生産する、配列番号１で表されるヌクレオチド配列またはその断片で安定にトランスフェクトした細胞を投与することにより、腫瘍形成を刺激する方法を提供する。本発明はまた、配列番号４で表されるタンパク質またはその断片を産生する、配列番号３で表されるヌクレオチド配列またはその断片で安定にトランスフェクトした細胞を投与することにより、腫瘍形成を刺激する方法を提供する。
【００５６】
本発明はまた、配列番号１、配列番号３、または配列番号５、あるいはそれらの断片に対するアンチセンスヌクレオチド配列を開発するのに使用されてもよい。これらのアンチセンス分子は、それぞれ配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片で表されるタンパク質をコードする配列番号１、または配列番号３、またはそれらの断片のヌクレオチド配列の翻訳を妨害するのに使用されてもよい。これらのアンチセンス分子、またはこれらのアンチセンス分子をコードするベクターを、ヒトおよび動物に投与することは、配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片で表されるタンパク質の産生を阻害し、それによりＲＯＩの産生を低減させ、細胞増殖を阻害するであろう。これらの方法は、腫瘍発達および血管成長の研究で使用するための動物モデルを作成するのに、およびインビボで腫瘍および血管成長に影響を及ぼす治療の有効性を研究するのに有用である。
【００５７】
本発明はまた、本発明の酵素の増殖活性を調節し、それにより細胞分裂に影響を及ぼす薬剤および化学物質のハイスループットスクリーニングの方法を提供する。コンビナトリアル化学物質ライブラリーを、これらの酵素の増殖活性を調節する化学物質に関してスクリーニングしてもよい。薬剤および化学物質は、配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片で表されるタンパク質を含む、発現タンパク質あるいは内因性タンパク質の酵素活性を調節するそれらの能力に基づいて評価され得る。内因性タンパク質は、多くの異なる組織または細胞、例えば結腸細胞から得ることもできる。薬剤もまた、配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片で表される発現タンパク質あるいは内因性タンパク質に結合するそれらの能力に基づいて評価され得る。酵素活性は、ホロタンパク質により触媒されるＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ依存性スーパーオキシド生成であってもよい。酵素活性はまた、ホロタンパク質ドメインまたはフラボタンパク質ドメインのいずれかにより触媒されるＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ依存性ジアフォラーゼ活性であってもよい。
【００５８】
フラボタンパク質ドメインとは、配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片で示される酵素のＣ末端側のおよそ半分を意味する。これらのタンパク質およびそれらの断片は、シトクロムｃ、ニトロブルーテトラゾリウムおよび他の色素に対するＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼ活性を有する。発現タンパク質またはその断片は、現存のコンビナトリアル化学物質ライブラリーの自動型スクリーニングにおいて使用することができる。以下の記述により限定されることを望まないが、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ結合部位、およびＦＡＤ結合部位は、薬剤および他の組成物の、Ｎｏｘ酵素に結合する能力、またはそれらの酵素活性を調節する能力を評価するのに有用であると考えられる。ホロタンパク質、またはＣ末端側の半分もしくは末端領域の使用は、ハイスループット薬剤スクリーニングを開発するのに好ましい。
【００５９】
本発明はまた、配列番号２、配列番号４で表されるタンパク質、およびそれらの断片に対する抗体を提供する。本発明の抗体は、配列番号２、配列番号４で表されるタンパク質、およびそれらの断片の局在化、検出および測定を含めた様々な目的で有用である。抗体は、これらの目的を達成するためのキットとして使用されてもよい。これらの抗体はまた、選択的に細胞死させる細胞障害剤に連結させてもよい。抗体という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、および他の種類の任意の種類の抗体を含む。抗体という用語はまた、完全無傷抗体、またそれらの断片（Ｆａｂ断片およびＦａｂ＋Ｆｃ断片が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
【００６０】
本発明はまた、配列番号１、配列番号３で表されるヌクレオチド配列、およびそれらの断片を提供する。これらのヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、およびそれらの断片として表されるタンパク質の合成に関与するメッセンジャーＲＮＡの局在化、検出および測定を含めた様々な目的に有用である。本発明はまた、配列番号５で表されるヌクレオチド配列およびその断片を提供する。このヌクレオチド配列は、Ｎｏｘファミリーのタンパク質の合成に関与するメッセンジャーＲＮＡの局在化、検出および測定を含めた様々な目的に有用である。これらのヌクレオチドはまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５で示されるヌクレオチド配列、またはそれらの断片を含有するメッセンジャーＲＮＡのような核酸の局在化、検出および測定用の、あるいはそれらを含有する大型ヌクレオチド配列の単離用の標識プローブの構築において使用され得る。これらのヌクレオチド配列は、当業者に既知の技法を用いて、他の種の鎖から相同鎖を単離するのに使用され得る。これらのヌクレオチド配列はまた、プローブおよび相補鎖を作製するのにも使用され得る。
【００６１】
より詳細には、本発明は、配列番号２、配列番号４で表されるタンパク質、またはそれらの断片を改変することにより、成長を調節する方法を含む。
【００６２】
「マイトジェン調節因子」という用語は、細胞分裂に影響を及ぼすように作用する任意の分子を意味するのに本明細書中で使用される。
【００６３】
「動物」という用語は、雄雌両方のヒトおよび非ヒト動物を意味するのに本明細書中で使用される。
【００６４】
本明細書中で使用される単数形の用語は、単数または複数のものを意味するように定義され、文脈が不適当でない限り複数形を含む。
【００６５】
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「オリゴペプチド」は、あるアミノ酸のα炭素のカルボキシル基と、別のアミノ酸のα炭素のアミノ基との間の縮合反応で形成されるペプチド結合により、α炭素が連結されたアミノ酸（通常Ｌ−アミノ酸）の鎖である。鎖の一方の末端にある末端アミノ酸（すなわち、アミノ末端）は遊離アミノ基を有し、鎖のもう一方の末端アミノ酸（すなわち、カルボキシ末端）は遊離カルボキシル基を有する。したがって、「アミノ末端」（Ｎ−末端と略記）という用語は、タンパク質のアミノ末端にあるアミノ酸上の遊離αアミノ基、またはタンパク質内の任意の他の位置にあるアミノ酸のαアミノ基（ペプチド結合に関与する場合、イミノ基）を指す。同様に、「カルボキシ末端」（Ｃ末端と略記）という用語は、タンパク質のカルボキシ末端にあるアミノ酸上の遊離カルボキシル基、またはタンパク質内の任意の他の位置にあるアミノ酸のカルボキシル基を指す。
【００６６】
通常、タンパク質を構成するアミノ酸は、タンパク質のアミノ末端から、カルボキシ末端に向かって順番に番号が付けられている。したがって、ある１のアミノ酸が別のアミノ酸の「次にくる」といった場合、その１のアミノ酸は、先行するアミノ酸よりもタンパク質のカルボキシ末端側にある。
【００６７】
「残基」という用語は、アミド結合によりタンパク質に組み込まれるアミノ酸（ＤまたはＬ）またはアミノ酸擬似体を指すために本明細書中で使用される。したがって、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、あるいは特に限定されない限り、天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能する、天然アミノ酸の既知の類縁体（すなわち、アミノ酸擬似体）であってもよい。さらに、アミド結合擬似体は、当業者に既知のペプチド骨格修飾を包含する。
【００６８】
さらに、当業者は、上述したように、コードされた配列中において、唯一のアミノ酸または一定のアミノ酸（約２０％未満、通常約１０％未満、より通常的に約１％未満）を変更させた、付加させた、もしくは欠失させた置換物、欠失物または付加物が、保存的改変物の一形態であり、ここで変更とは、化学的に類似したアミノ酸によりアミノ酸を置換することであると理解するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換は、当該技術分野で既知である。以下の６つの群はそれぞれ、互いに関して保存的置換されうるアミノ酸である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６９】
ペプチドの長さが比較的短い（すなわち、約５０個未満のアミノ酸）場合、ペプチドは、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて合成されることが多い。配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に取り付けた後に、配列に残りのアミノ酸を順次付加する固相合成は、本明細書中に記載する抗原エピトープの化学的合成の好ましい方法である。固相合成の技法は、当業者に既知である。
【００７０】
あるいは、本明細書中に記載する抗原エピトープは、組換え核酸方法論を用いて合成される。一般にこれは、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を作製すること、特定のプロモーターの制御下にある発現カセット中に核酸を配置すること、宿主中でペプチドまたはタンパク質を発現すること、発現されたペプチドまたはタンパク質を単離すること、および望ましい場合にはペプチドまたはタンパク質を変性させることを含む。かかる手順により当業者を導くのに十分な技法が、文献中に見出される。
【００７１】
幾つかの所望のタンパク質断片またはペプチドが、ベクターに組み込まれたヌクレオチド配列にコードされる場合、当業者は、該幾つかの所望のタンパク質断片またはペプチドは、スペーサー分子（例えば１つまたは複数のアミノ酸から構成されるペプチド）により分離されてコードされてもよいことを理解するであろう。一般に、スペーサーは、所望のタンパク質断片またはペプチドを結合すること、またはそれらの間の幾らかの最小距離、または他の空間的関係を保存すること以外の特定の生物活性を有さない。しかしながら、スペーサーを構成するアミノ酸は、フォールディング、正味の電荷、または疎水性のような分子の何らかの特性に影響を与えるように選択されてもよい。発現組換えタンパク質の精製に有用であり得る残基の産生をコードするヌクレオチド配列を、ベクター中に構築してもよい。かかる配列は、当該技術分野で既知である。例えば、ポリヒスチジン配列をコードするヌクレオチド配列をベクターに付加して、ニッケルカラム上での発現組換えタンパク質の精製を容易にしてもよい。
【００７２】
組換えペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質は、いったん発現すれば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動等を含む、当業者に既知の標準的手順に従って精製することができる。約５０〜９９％均一性である実質的に純粋な組成物が好ましく、治療剤として使用するには、８０〜９５％またはそれ以上の均一性を有することが最も好ましい。
【００７３】
当業者は、化学的合成、生物学的発現または精製後の、所望のタンパク質、それらの断片およびペプチドは、タンパク質、それらの断片およびペプチドの自然立体配座と実質的に異なる立体配座を有し得ることを理解するであろう。このような場合は、タンパク質を変性および還元して、続いてタンパク質を好ましい立体配座へリフォールディングさせることが必要であることが多い。タンパク質を還元および変性させ、リフォールディングを誘発する方法は、当業者に既知である。
【００７４】
本発明の遺伝的構築物は、種々のタンパク質、それらの断片、およびペプチドのコード配列を含む。遺伝的構築物はまた、発現タンパク質の精製または検出を可能にするように選択されたエピトープまたはドメインを含む。かかるエピトープまたはドメインには、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ由来のグルタチオン結合ドメイン、ヘキサヒスチジン、チオレドキシン、血球凝集素抗原、マルトース結合タンパク質、および当業者に一般的に知られる他のものをコードするＤＮＡ配列が含まれる。好ましい遺伝的構築物としては、配列番号１、配列番号３、配列番号５で表されるヌクレオチド配列、またはそれらの断片が挙げられる。以下の：ａ）所望のタンパク質、それらの断片またはペプチドの複数コピー、ｂ）所望のタンパク質、それらの断片、またはペプチドの様々な組合せ、およびｃ）所望のタンパク質、それらの断片、またはペプチドの保存的改変、ならびにそれらの組合せをコードするために、付加的または代替的ヌクレオチド配列が遺伝的構築物に含まれていてよいことが理解されよう。好ましいタンパク質としては、それぞれ配列番号２および配列番号４で示されるヒトＮｏｘ４タンパク質およびヒトＮｏｘ５タンパク質、ならびにそれらの断片、およびそれらの保存的置換物が挙げられる。
【００７５】
本発明のヌクレオチド配列はまた、例えば交互にスプライシングされたメッセージ（ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ ｓｐｌｉｃｅｄ ｍｅｓｓａｇｅｓ）の検出を可能とするハイストリンジェントな条件下で、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド配列のような核酸配列にハイブリダイズするのに用いてもよい。
【００７６】
遺伝的構築物は、ｐｃＤＮＡ−３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中の組換え配列を用いて、例えばＮＩＨ  ３Ｔ３細胞中の発現系で発現されて、組換えタンパク質を産生する。好ましい発現系としては、Ｃｏｓ−７細胞、組換えバキュロウイルスを用いた昆虫細胞、および酵母が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に既知の他の発現系を本発明の遺伝的構築物の発現のために使用してもよいことが理解されよう。本発明の好ましいタンパク質は、それぞれ配列番号２および配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有する、ヒトＮｏｘ４およびヒトＮｏｘ５と本明細書中で称される配列、またはそれらの断片、あるいは組換えタンパク質の機能を、有意に不利な改変をしないようになされたアミノ酸置換を有するアミノ酸配列である。
【００７７】
専門用語
本明細書中に含まれる新規Ｎｏｘタンパク質について記載するのに使用される専門用語の幾つかは、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２６５９２、米国非仮出願第０９／４３７，５６８号、ならびに米国仮出願第６０／２５１，３６４号、同第６０／２４９，３０５号、および同第６０／２８９，１７２号での専門用語と異なることを理解されたい。ｍｏｘおよびｎｏｘという用語は同義である。本明細書中に記載する場合、「ヒトＮｏｘ４」という用語は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、あるいはそれらの断片または保存的置換物を含むタンパク質であって、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列、あるいはそれらの断片または保存的置換物によりコードされるタンパク質を指す。本明細書中で使用する場合、「ヒトＮｏｘ５」という用語は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列、あるいはそれらの断片または保存的置換物を含むタンパク質であって、配列番号３に記載されるヌクレオチド配列、あるいはそれらの断片または保存的置換物によりコードされるタンパク質を指す。「ヒトＮｏｘ１」のプロモーターは、配列番号５に記載される核酸配列、あるいはそれらの断片または保存的置換物を指す。
【００７８】
組換え遺伝子の構築
所望の遺伝子をｐｃＤＮＡ３のような転移ベクターに連結して、組換え体は、Ｃｏｓ−７細胞のような宿主細胞を形質転換するのに使用される。当業者に一般的に知られるように、種々の転移ベクター、宿主細胞およびトランスフェクション方法を使用することができることが理解されよう。トランスフェクションで使用するための３つの所望の遺伝子は、配列番号１、配列番号３、および配列番号５で示される。例えば、リポフェクトアミン媒介性トランスフェクション、およびインビボ相同組換えを用いて、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞にＮｏｘ４遺伝子（配列番号１）を導入した。
【００７９】
合成遺伝子をクローニングして、Ｎｏｘ遺伝子を含む組換え構築物を、Ｃｏｓ−７細胞系の集密単層培養で生産および成長させる。次に、発現された組換えタンパク質を、好ましくはアフィニティクロマトグラフィ技法を用いて精製し、その純度および特異性を既知の方法で決定する。
【００８０】
様々な発現系を組換えタンパク質の発現に使用することができる。かかる発現方法としては、以下の：Ｅ．ｃｏｌｉおよび枯草菌を利用したものを含む細菌発現系、ウイルス系、酵母発現系、昆虫細胞および哺乳類細胞の培養、ならびに当業者に既知の他の発現系が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
細胞のトランスフェクション
本発明のベクターを、任意の所望の細胞または細胞系にトランスフェクトしてもよいことが理解されよう。インビボまたはインビトロの細胞のトランスフェクションは、いずれも本発明の一部として意図される。トランスフェクションするための好ましい細胞としては、以下の：線維芽細胞（おそらく創傷治癒および皮膚形成を強化するため）、顆粒球（ＡＩＤＳ、および再生不良性貧血で見られるような免疫系不全での機能を増大するのに有用である可能性がある）、筋細胞、神経芽細胞、茎細胞、骨髄細胞、骨芽細胞、Ｂリンパ球、およびＴリンパ球が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
細胞は、当業者に既知の様々な方法でトランスフェクトすることができ、以下の：エレクトロポレーション、遺伝子銃、リン酸カルシウム、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、およびｆｕｇｅｎｅ、ならびにアデノウイルストランスフェクション系が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
配列番号１、配列番号３、またはそれらの断片で表される核酸でトランスフェクトした宿主細胞を用いて、それぞれ配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片で表されるタンパク質を発現させる。配列番号１、配列番号３、または配列番号５、あるいはそれらの断片で表される核酸でトランスフェクトした宿主細胞はスクリーニングアッセイにおいても使用される。
【００８４】
これらの発現タンパク質は、抗体を産生するために使用される。これらの抗体は、Ｎｏｘタンパク質の１つを発現する癌に対する免疫療法が挙げられるが、これらに限定されない様々な用途に、および配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片で示されるタンパク質の検出、局在化および測定に使用してもよい。
【００８５】
発現タンパク質の精製および特徴付け
本発明のタンパク質を、ヘキサヒスチジンのようなポリヒスチジン構成成分との融合タンパク質として発現させ、ニッケルまたはコバルトアフィニティマトリックスを用いた金属アフィニティカラムに結合することにより精製することができる。タンパク質はまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させ、グルタチオンアガロースマトリックスを用いたアフィニティクロマトグラフィにより精製することができる。タンパク質はまた、例えば血球凝集素抗原との融合タンパク質としてタンパク質を発現することにより、イムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することもできる。発現タンパク質または天然に存在するタンパク質はまた、陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィ、ゲル排除クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、色素結合クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム沈殿、有機溶媒中での沈殿、または当業者に一般的に知られる他の技法を包含する従来のクロマトグラフィおよび精製方法により精製することができる。
【００８６】
発現タンパク質の活性の評価方法
配列番号２、配列番号４として表されるタンパク質、それらの保存的置換物、およびそれらの断片が挙げられるが、それらに限定されない本発明の発現タンパク質の活性を評価する種々の方法が利用可能である。
【００８７】
１．スーパーオキシド生成に関するホロタンパク質およびその断片のアッセイ
Ａ．概説
これらのアッセイは、本発明の酵素の活性を調節するように設計された薬剤の有効性を評価するのに有用である。ホロタンパク質は、当業者に既知の方法を用いて、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス技術を用いて）、または他の細胞で発現され得る。膜分画または精製タンパク質をアッセイに使用する。アッセイは、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、およびＲａｃ１のような他の細胞タンパク質、ならびに潜在的な他の未確認要素（例えば、キナーゼまたは他の調節タンパク質）を必要とし得るか、またはそれらにより改良され得る。
【００８８】
Ｂ．シトクロムｃ還元
ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨを、約１００μＭ濃度で還元剤として使用する。シトクロムｃの還元は、減衰係数２１ｍＭ−１ｃｍ−１と仮定して、５５０ｎｍでの吸光度の増加により分光光度的にモニタリングする。アッセイは、スーパーオキシドジスムターゼ約１０μｇの存在下および非存在下で実施する。スーパーオキシド依存性還元とは、「スーパーオキシドジスムターゼの非存在下でのシトクロムｃ還元」から「スーパーオキシドジスムターゼの存在下でのシトクロムｃ還元」を減算したものと定義する（Ｕｈｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， ２０９９０−２０９９７）。アセチル化シトクロムｃの還元が専らスーパーオキシドによるものであると考えられるため、アセチル化シトクロムｃも使用され得る。
【００８９】
Ｃ．ニトロブルーテトラゾリウム還元
ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）還元については、シトクロムｃの代わりにＮＢＴが使用される以外は、同様の一般的プロトコルが使用される。概して、濾過した０．２５％ニトロテトラゾリウムブルー（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）約１ｍＬを、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｉｇｍａ）約６００ユニットを含むハンクス緩衝液または含まないハンクス緩衝液中に添加し、試料を約３７℃でインキュベートする。酸化ＮＢＴは透明であるのに対し、還元ＮＢＴは、青色であり不溶解性である。不溶解性生成物を遠心分離により収集し、ペレットをピリジン（Ｓｉｇｍａ）約１ｍＬに再懸濁して、約１０分間１００℃に加熱して、還元ＮＢＴを溶解させる。還元ＮＢＴの濃度は、減衰係数１１，０００ｍＭ−１ｃｍ−１を用いて、５１０ｎｍでの吸光度を測定することで求められる。未処理ウェルを用いて、細胞数を求める。
【００９０】
Ｄ．発光
スーパーオキシド生成はまた、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウム硝酸塩、Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｉｕｓ， ＭＯ）を利用した化学発光検出系によりモニタリングしてもよい。ハンクス溶液約１５０μＬ中で、約１００μＭのＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）および１０μＭのルシゲニン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）と試料を混合する。発光は、全体で約５分間、およそ１分間隔で、１回当たりの読み取り時間０．５秒間で、ＬｕｍｉＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ， Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ， ＩＬ）を用いて、９６ウェルプレート中でモニタリングされ、各データセットの最も安定な値を比較するために使用される。上述のように、スーパーオキシドジスムターゼを幾つかの試料に添加して、発光がスーパーオキシドから生じていることを証明する。緩衝液ブランクを各読み取り値から差し引く（Ｕｓｈｉｏ−Ｆｕｋａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， ２３３１７−２３３２１）。
【００９１】
Ｅ．無傷細胞でのアッセイ
スーパーオキシド生成に関するアッセイを、無傷細胞、例えばＮｏｘでトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を用いて実施してもよい。原則的には、上記アッセイのいずれかを、無傷細胞、例えばＮｏｘでトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を用いてスーパーオキシド生成を評価するのに使用することができる。好ましいアッセイ方法はＮＢＴ還元である。
【００９２】
２．およそＣ末端２６５アミノ酸残基から構成される切断型タンパク質のアッセイ
以下の記述により限定することを意図しないが、およそＣ末端２６５アミノ酸残基から構成される切断型タンパク質は、スーパーオキシドを生成しないと予測され、したがって、切断型タンパク質のアッセイにおいては、スーパーオキシドジスムターゼを添加しない。基本的には、類似のアッセイが確立され、ＮＢＴ、シトクロムｃ、ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化物、または別の酸化還元活性色素のスーパーオキシド非依存性還元が検査される。
【００９３】
ヌクレオチドおよび核酸プローブ
配列番号１、配列番号３、配列番号５で表されるヌクレオチド配列、ならびにそれらの断片、つまりＰＣＲプライマーを、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、ならびにそれらの断片に関連した核酸の局在化、検出および測定に使用してもよい。配列番号１および配列番号３で表されるヌクレオチド配列は、本出願では、それぞれヒトＮｏｘ４遺伝子およびヒトＮｏｘ５遺伝子とも称される。配列番号５で表されるヌクレオチド配列は、本出願では、Ｎｏｘ１プロモーター配列と称される。
【００９４】
配列番号１、配列番号３、配列番号５で表されるヌクレオチド配列、ならびにそれらの断片および保存的置換物は、それぞれ配列番号１、配列番号３、および配列番号５で表されるヌクレオチド配列を含む、より大きいヌクレオチド配列を単離するためのプローブを作製するのに使用してもよい。配列番号１、配列番号３、および配列番号５で表されるヌクレオチド配列、ならびにそれらの断片およびそれらの保存的置換物はまた、他の種におけるＮｏｘタンパク質を同定および単離するためのプローブを作製するのにも使用してもよい。
【００９５】
本明細書中に記載する核酸には、配列番号２、配列番号４、ならびにそれらの断片および保存的置換物の産生をコードするメッセンジャーＲＮＡが含まれる。かかる核酸としては、ｃＤＮＡプローブが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプローブは、当業者に既知の様々な方法で標識され得る。かかる標識方法としては、同位体標識および非同位体標識が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプローブは、配列番号２、配列番号４、ならびにそれらの断片および保存的置換物をコードするｍＲＮＡのような核酸の局在化のためのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成に使用してもよい。局在化は、当業者に既知の技法を用いて、超微細構造レベルおよび光学顕微鏡レベルの両方の解像度でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を用いて実施され得る。
【００９６】
これらのプローブはまた、当業者に既知の技法（溶液ハイブリッド形成が挙げられるが、これに限定されない）を用いて、核酸およびｍＲＮＡレベルを検出ならびに定量化するのに使用してもよい。
【００９７】
本発明のＮｏｘタンパク質の投与
配列番号２、または配列番号４、あるいはそれらの断片または保存的置換物で表されるタンパク質は、薬学的組成物を生産するために薬学的に許容可能なキャリアまたはビヒクルと組み合わされ、動物に投与される。かかる投与は、成長または細胞増殖を刺激するために行われてもよい。投与はまた、抗体の産生のために行われてもよい。
【００９８】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能なキャリアまたは薬学的に許容可能なビヒクル」という用語は、有害な生理学的応答を引き起こさずに生存動物組織またはヒト組織と接触させて使用するのに適切であり、かつ有害な様式で組成物の他の構成成分と相互作用しない、水または生理食塩水、油、ゲル、軟膏、溶媒、希釈剤、液体軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセル等（これらに限定されない）の任意の液体を意味する。
【００９９】
薬学的組成物は、単位投薬形態で、利便性よく用意してもよく、また従来の薬学的技法により調製してもよい。かかる技法は、有効成分および薬学的キャリア（複数可）または賦形剤（複数可）を会合させるステップを含む。概して、配合物は、有効成分を液体キャリアと一様にかつ密接に会合させることで調製される。
【０１００】
非経口投与に適した配合物としては、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、および配合物を対象とされるレシピエントの血液と等張とさせる溶質を含有し得る水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。配合物は、単位用量または複数回用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中に用意してもよく、また使用する直前に、滅菌液体キャリア（例えば、注射用蒸留水）を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管してもよい。即時調合注射溶液および懸濁液は、当業者により一般的に使用される滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。
【０１０１】
好ましい単位投薬配合物は、投与される成分の用量または単位、あるいはそれらの適切な分画を含む配合物である。特に上述した成分のほかに、本発明の配合物は、当業者により一般的に使用される他の作用物質を含んでもよいことが理解されるはずである。
【０１０２】
薬学的組成物は、口腔内および舌下を含む経口、直腸、非経口、エーロゾル、鼻、筋内、皮下、皮内、ならびに局所のような種々の経路により投与され得る。本発明の薬学的組成物は、溶液、乳濁液および懸濁液、ミクロスフェア、粒子、微粒子、ナノ粒子、およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されない種々の形態で投与され得る。
【０１０３】
薬学的組成物は、約４℃〜１００℃の温度で保管され得る。薬学的組成物はまた、室温を含む種々の温度で、凍結乾燥状態で保管されてもよい。薬学的組成物は、当業者に既知の従来の手段により殺菌されてもよい。かかる手段としては、濾過、照射、および熱が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物はまた、細菌成長を阻害するために、チメロサールのような静菌剤と組み合わせてもよい。
【０１０４】
当業者に既知の方法を用いて、ポリクローナル抗体の産生のために投与されてもよい。抗体を産生するために好ましい動物は、ウサギおよびマウスである。これらのタンパク質またはそれらの断片での免疫化に他の動物を使用してもよい。かかる動物としては、以下の：ヒツジ、ウマ、ブタ、ロバ、ウシ、サル、ならびにモルモットおよびラットのようなげっ歯類が挙げられるが、これらに限定されない。１回の免疫化レジメン当たり約１〜７回の投薬が必要であり得ると予測される。初期注射は、約０．１μｇ〜１ｍｇの範囲であり得て、好ましい範囲は、約１μｇ〜８００μｇ、より好ましい範囲は、およそ２５μｇ〜５００μｇである。ブースター注射は、０．１μｇ〜１ｍｇの範囲であり得て、好ましい範囲は、およそ１μｇ〜８００μｇ、より好ましい範囲は、約１０μｇ〜５００μｇである。
【０１０５】
投与容量は、投与経路、およびレシピエントの大きさに応じて様々である。例えば、筋内注射は、約０．１ｍｌ〜１．０ｍｌの範囲であり得る。
【０１０６】
アジュバント
当業者に既知の様々なアジュバントを、抗体産生用の薬学的組成物中のタンパク質と併せて投与してもよい。かかるアジュバントとしては、以下の：ポリマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーのようなコポリマー（ブロックコポリマーを含む）、ポリマーＰ１００５、フロイント完全アジュバント（動物用）、フロイント不完全アジュバント、モノオレイン酸ソルビタン、スクアレン、ＣＲＬ−８３００アジュバント、ミョウバン、ＱＳ２１、ムラミルジペプチド、トレハロース、細菌抽出物（ミコバクテリア抽出物を含む）、無毒化内毒素、膜脂質、またはそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０７】
モノクローナル抗体は、当業者に既知の方法に従って、ハイブリドーマ技術を用いて生産することができる。抗体は、研究試薬または診断試薬として有用であるか、あるいは受動免疫化するのに使用することができる。組成物は、任意にアジュバントを含む。
【０１０８】
研究または診断試薬として有用なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、配列番号２、配列番号４、およびそれらの断片または保存的置換物の検出ならびに測定に使用されてもよい。かかる抗体は、細胞、細胞抽出液、組織、組織抽出液、生検材料、腫瘍、および生体液のような試料が挙げられるが、これらに限定されない生物学的試料中で、これらのタンパク質を検出するのに使用され得る。かかる検出能力は、これらのタンパク質に関連した疾患の検出に有用であり、診断および予後を容易とし、かつ潜在的な代替治療法を提案する。
【０１０９】
検出は、免疫細胞化学、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、または当業者に一般的に知られているような他のアッセイを使用することにより達成され得る。Ｎｏｘ４およびＮｏｘ５タンパク質、あるいはそれらの断片または保存的置換物は、以下の：放射標識、色素、磁気粒子、ビオチン−アビジン、蛍光分子、化学発光分子および系、フェリチン、コロイド金、およびタンパク質標識の技術分野の当業者に既知の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない一般的に既知のアプローチにより標識され得る。
【０１１０】
抗体の投与
配列番号２、配列番号４として示されるタンパク質に対する抗体、あるいは該タンパク質の断片または保存的置換物に対する抗体はまた、受動免疫化パラダイムにおいて、ヒトおよび動物に直接投与してもよい。配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片の細胞外部分に対する抗体は、これらの細胞外エピトープに結合する。これらの抗体に標識を結合することにより、結合部位の局在化および可視化が容易となる。これらの抗体へのリシンまたは他の細胞毒のような分子の結合は、配列番号２、配列番号４、またはそれらの断片を発現する細胞を選択的に損傷させるか、または選択的に死滅させるのを助長する。
【０１１１】
キット
本発明は、抗体、核酸プローブ、標識抗体、標識タンパク質またはそれらの断片を用いた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、またはそれらの組合せ、およびそれらの断片もしくは保存的置換物の検出、局在化および測定に有用なキットを含む。診断キットはまた、本明細書中に記載のＮｏｘタンパク質（すなわち、ヒトＮｏｘ４および／またはヒトＮｏｘ５）の相対的発現を測定または検出し得る。
【０１１２】
キットは、免疫細胞化学、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、溶液ハイブリッド形成、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、定量的ＰＣＲ、および当業者に既知の技法を用いた、これらの核酸、タンパク質またはそれらの断片の検出、局在化および測定用の他のアッセイに使用され得る。
【０１１３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、またはそれらの断片で示されるヌクレオチド配列はまた、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、またはそれらの断片に関連した交互にスプライシングされたメッセージを検出するために、ハイストリンジェントな条件下で使用してもよい。
【０１１４】
関係するハイブリダイズ用配列を含む配列番号１、配列番号３、配列番号５の断片を、チップアレイの表面上に合成することができる。続いて、例えば腫瘍からのＲＮＡ試料を蛍光的にタグ付けして、検出用チップ上にハイブリダイズさせる。このアプローチは、腫瘍の型を特徴付けるために、かつ治療方法を調整するために、および／または予後情報を提供するために、診断的に使用され得る。かかる予後情報は、疾患進行および寿命に関する予測値となる可能性があり、また治療の選択にも影響を及ぼし得る。
【０１１５】
他の本発明について、以下の実施例によりさらに説明するが、実施例は、いかなる場合でも本発明の範囲に限定を課すものと解釈されるべきではない。対照的に、様々な他の実施形態、変形形態、およびそれらの等価物が考えられ、それらは、当業者が本明細書中の説明を参酌すれば、本発明の精神を逸脱することなく、見出しうることが、明らかに理解されよう。
【０１１６】
実施例１
ヒトＮｏｘ４タンパク質（配列番号２）の産生をコードするヒトＮｏｘ４  ｃＤＮＡ（配列番号１）の配列解析およびクローニング
クエリー配列としてＮｏｘ３（配列番号６）を用いて、発現配列タグ（ＥＳＴ）の７８９塩基対の配列決定した部分（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＡＩ７４２２６０号）、および４０８塩基のＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋ番号第ＡＩ８８５６８１号）（Ｎｏｘ３のアミノ酸残基４３３〜５６０に相当するｃＤＮＡ配列に対して２６％同一性を示すクローン、およびＮｏｘ３のアミノ酸残基５〜４８に相当するｃＤＮＡ配列に対して３６％同一性を示す第２のクローン）を発見した。この相同体を、２つのＥＳＴ配列：（配列番号７，５’−ＣＡＡＣＧＡＡＧＧＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣ−３’、および配列番号８，５’−ＣＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴＧＡＴＴＣＣＧＣＴＧＡＧ−３’）に基づく２つのＰＣＲプライマーを用いてクローニングした。ＰＣＲは、ヒト胎児腎臓ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて実施し、０．８５ｋｂの産物の配列を決定した。次に、配列決定の結果に基づいて、以下のプライマー：５’−ＲＡＣＥ：配列番号９，５’−ＴＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＣＡＴＧ−３’：配列番号１０，５’−ＴＡＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＴＡＴＡＣＡＧＣＡ−３’（ネステッドＰＣＲ用）、３’−ＲＡＣＥ：配列番号１１，５’−ＴＣＣＡＴＴＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＡＴＧＴＧＴ−３’：配列番号１２，５’−ＣＴＣＡＧＣＧＧＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＴＧＴＧ−３’（ネステッドＰＣＲ用）を用いて、同じライブラリーを使用して５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥを実施した。ＰＣＲパラメータは、９５℃で１分３０秒間変性させた後に、記載するように「９５℃で３０秒間、６２℃または６５℃で２０秒間、７２℃で４５秒間」を１サイクルとして、２５〜３５サイクルとした。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、またはゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）で精製した。陽性のＰＣＲバンドを、ＡＢＩ３７７自動配列決定により配列決定した。プライマーは、完全長ｃＤＮＡをサブクローニングするように設計され、正確な配列は、自動配列決定により確認された。
【０１１７】
ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｓｍａｒｔ／）のウェブベースのＳＭＡＲＴプログラム（バージョン３．１）に従って、分泌シグナル配列を予測した。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の予測は、ＥｄｉｔＳｅｑプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて行い、系統発生解析およびマルチプル配列アラインメントは、Ｍｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いたｃｌｕｓｔａｌ方法を用いて行った。膜貫通αへリックスは、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）により、ＴＭＨＭＭアルゴリズムを用いて予測した。
【０１１８】
製造業者のプロトコルに基づいて、あるいは神経膠腫細胞系に関する（Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ． １９９９）に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いて全ＲＮＡを細胞系から抽出した。製造業者により提供される方法に従って、オリゴｄＴを使用して、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いて、ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡへと逆転写した、
【０１１９】
表４は、ｃＤＮＡおよび予測タンパク質の基本的特徴を示す。ｇｐ９１ｐｈｏｘ（別称、Ｎｏｘ２配列番号１３）およびＮｏｘ１（配列番号１４）によりコードされるタンパク質と同様に、新規配列は、およそ６５ｋＤの予測タンパク質をコードし、メッセージサイズは、長さが類似している（２．０〜２．２ｋｂ）。Ｎｏｘ４はまた、強塩基性の５９個のアミノ酸、強酸性の４５個のアミノ酸、２１２個の疎水性アミノ酸、１７１個の極性アミノ酸、ｐＨ７．０で等電点８．６９５および電荷１６．５４９を有していた。Ｎｏｘ４はまた、ｇｐ９１ｐｈｏｘおよびＮｏｘ１と２１〜５９％の同一性を示す。Ｎｏｘ１、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｎｏｘ３およびＮｏ４は、ｇｐ９１ｐｈｏｘに類似したサブファミリー内に集まっている。Ｎｏｘ４の予測タンパク質配列のアラインメントを図２に示す。分子は、２つの大きなドメイン、すなわち疎水性膜貫通配列のＮ末端クラスター、およびＣ末端フラボタンパク質ドメインに大別される。後者は、シトクロムＰ−４５０レダクターゼおよびフェレドキシン−ＮＡＤＰオキシドレダクターゼを含む多数のＦＡＤ結合タンパク質と弱い相同性を示す（Ｒｏｔｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。フラボタンパク質ドメイン内には、他のフラボタンパク質中の既知のＦＡＤ結合部位と相同性を示す２つのセグメント（図２（ａおよびｂ）に示す）、および他のタンパク質中で立証されたピリジンヌクレオチド結合部位に対して相同的なＣ末端に近い４つのセグメントが存在する。これらの最初には、ピリジンヌクレオチド結合部位を特徴づけるＧ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｐ正準配列が含まれる。Ｎｏｘ型すべてにおいて、この配列の後にＦが続き、これは、ＮＡＤＨ特異的酵素ではなく、ＮＡＤＰＨ特異的酵素に典型的である。
【０１２０】
Ｎｏｘ４は、Ｎ末端の最末端付近に予測膜貫通αへリックスを含む（図２の薄斜線ボックス）。しかしながら、この領域はまた、これらの形態でシグナルペプチド配列であると強固に予測される。各アイソフォームに関する予測タンパク質分解性切断部位を矢印で示し、これらの位置での切断は、最初の推定膜貫通配列の損失を引き起こす。５つのさらなる膜貫領域もこのタンパク質中で予測される。これらの多くのＣ末端が、Ｎｏｘ１、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｎｏｘ３およびＮｏｘ４で若干予測され、予測アルゴリズムによってはまったく予測できない。ｇｐ９１ｐｈｏｘの既知の特徴、特にフラボタンパク質ドメインの細胞質ゾル表面のロケーションと一致したモデル（図３）を生成するために、この膜貫通領域を含むことが必要である。このモデルでは、ｇｐ９１ｐｈｏｘ中の既知のＮ連結グリコシル化部位は、細胞外ループに正確に局在化される（が、これらの部位は、他のアイソフォームでは保存されない）。さらに、細胞質ゾル調節タンパク質ｐ４７ｐｈｏｘ（Ｂｉｂｅｒｓｔｉｎｅ−Ｋｉｎｋａｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）に結合するｇｐ９１ｐｈｏｘの多塩基ループは、細胞質ゾル表面上に局在化される。一般に、細胞外ループは、長さおよび配列が非常に変化しやすい傾向にある一方で、膜貫通へリックスおよび細胞内ループは、配列および長さがより保存される傾向にある（図２）。
【０１２１】
Ｎ末端内には、５つの絶対的に保存されたヒスチジンが存在し（図２）、これはまた、Ｎｏｘファミリーの酵素の他の成員すべてで保存される。ｇｐ９１ｐｈｏｘは、２つのヘム基を含み、このヘム基の鉄が、それぞれ２つのヒスチジンの窒素に連結され（Ｉｓｏｇａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、これらが、Ｎ末端内に存在すると考えられる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。さらなる保存ヒスチジンは、ＦＡＤ結合領域内に存在し、したがって、ヘム連結の候補ではない。したがって、Ｎ末端内の５つのヒスチジンのうちの４つが、おそらくヘム領域に関与し、図３に示すように、２つのヘム基が結合するための部位の一部を提供する。
【０１２２】
【表４】
2004537981.tif 000006
【０１２３】
実施例２
Ｎｏｘ４  ｍＲＮＡの組織発現
完全長Ｎｏｘ４転写物に関する予測サイズに相当する優性Ｎｏｘ４  ２．４ｋｂメッセージは、成体腎臓ならびに胎児腎臓で高度に発現される（図４Ａ）。さらに、弱いＮｏｘ４バンドが、胎児腎臓および成体腎臓で４．５キロベース（ｋｂ）で検出された（図４Ａ）。それは、腎臓中のエリスロポイエチン産生の部位で特に発現される。ＲＴ−ＰＣＲは、腎臓発現を確認し、また試験した膵臓、胎盤、卵巣、精巣および骨格筋を含む胎児組織すべてにおいて、ならびに成体組織の幾つかにおいて、Ｎｏｘ４の発現を明らかにした。
【０１２４】
実施例３
ヒトＮｏｘ５に関するｃＤＮＡの配列解析およびクローニング
クエリー配列としてＮｏｘ３（配列番号６）を用いたＢｌａｓｔ検索はまた、２つの未確認ゲノムクローン、すなわちそれぞれＧｅｎＢａｎｋ第ＡＣ０２７０８８号および第ＡＣ０２６５１２号との相同性を確認した。これらのクローンは、３つのエキソン内のＮｏｘ３に対して４６〜５０％の同一性を示した。５’−ＲＡＣＥおよび３’−ＲＡＣＥは、ヒト胎児腎臓ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌａ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて、ゲノム配列に基づいて設計した以下の４つのプライマー：配列番号１５，５’−ＣＴＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＡＧＣ−３’；配列番号１６，５’−ＴＧＧＧＴＣＴＧＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＣＴＣ−３’（ネステッドＰＣＲ用）；３’−ＲＡＣＥ：配列番号１７，５’−ＡＴＣＡＡＧＣＧＧＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’、配列番号１８；５’−ＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＧＣ−３’（ネステッドＰＣＲ用）を用いて行った。ＰＣＲパラメータは、９５℃で１分３０秒間変性させた後に、記載するように「９５℃で３０秒間、６２℃または６５℃で２０秒間、７２℃で４５秒間」を２５〜３５サイクルとした。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、またはゲル精製キット（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）で精製した。プライマーは、完全長ｃＤＮＡをサブクローニングするように設計され、正確な配列は、ＡＢＩ  ３７７７自動配列決定により確認された。
【０１２５】
ＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ｓｍａｒｔ／）のウェブベースのＳＭＡＲＴプログラム（バージョン３．１）に従って、分泌シグナル配列を予測した。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の予測は、ＥｄｉｔＳｅｑプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて行い、系統発生解析およびマルチプル配列アラインメントは、Ｍｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いたｃｌｕｓｔａｌ方法を用いて行った。膜貫通αへリックスは、ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）により、ＴＭＨＭＭアルゴリズムを用いて予測した。
【０１２６】
製造業者のプロトコルに基づいて、あるいは神経膠腫細胞系に関するＩｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）に従って、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いて全ＲＮＡを細胞系から抽出した。製造業者により提供される方法に従って、オリゴｄＴを使用して、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いて、ＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡへと逆転写した、
【０１２７】
表４は、ｃＲＮＡおよび予測タンパク質の基本的特徴を示す。ｇｐ９１ｐｈｏｘ（配列番号１３）およびＮｏｘ１（配列番号１４）によりコードされるタンパク質と同様に、Ｎｏｘ４およびＮｏｘ５に関する新規配列は、およそ６５ｋＤａの予測タンパク質をコードし、メッセージサイズは、長さが類似している（２．０〜２．２ｋｂ）。Ｎｏｘ３、Ｎｏｘ４およびＮｏｘ５は、ｇｐ９１ｐｈｏｘと２１〜５９％の同一性を示す。Ｎｏｘ５は、特有の群を形成し、その群のうち、１つの成員のみが、現在までに同定され、その成員は、そのファミリーの他の成員から非常に異なっている。系統樹中のその位置に基づいて、Ｎｏｘ５は、始原Ｎｏｘに最も近い遺伝子を表現し得る。
【０１２８】
ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｎｏｘ１、Ｎｏｘ３、Ｎｏｘ４およびＮｏｘ５の予測タンパク質配列のアラインメントを図２に示す。分子は、２つの大きなドメイン、すなわち疎水性膜貫通配列のＮ末端クラスター、およびＣ末端フラボタンパク質ドメインに大雑把に分けられる。後者は、シトクロムＰ−４５０レダクターゼおよびフェレドキシン−ＮＡＤＰオキシドレダクターゼを含む多数のＦＡＤ結合タンパク質と弱い相同性を示す（Ｒｏｔｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。フラボタンパク質ドメイン内には、他のフラボタンパク質中の既知のＦＡＤ結合部位と相同性を示す２つのセグメント（図２に示す）、および他のタンパク質中で立証されたピリジンヌクレオチド結合部位に対して相同的なＣ末端に近い４つのセグメントが存在する。これらの最初には、ピリジンヌクレオチド結合部位を特徴づけるＧ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｐ正準配列が含まれる。Ｎｏｘ型すべてにおいて、この配列の後にＦが続き、これは、ＮＡＤＨ特異的酵素ではなく、ＮＡＤＰＨに典型的である。
【０１２９】
Ｎｏｘ１、Ｎｏｘ３、Ｎｏｘ４、およびＮｏｘ５のＮ末端側の半分はすべて疎水性であるが、Ｎｏｘ５は、図２に示すように、予測膜貫通αへリックスの細部でいくらか他のものと異なる。Ｎｏｘ５は、Ｎ末端予測シグナルペプチドを含有しないが、予測膜貫通αへリックスを含有する。（図２の最初の斜線ボックスのＮｏｘ５配列）。予測アルゴリズムに従って、Ｎｏｘ５のＮ末端の端の方は、膜の内部に、フラボタンパク質ドメインと同じ側に位置する。５つのさらなる膜貫領域もこのタンパク質中で予測される。これらの多くのＣ末端が、Ｎｏｘ５で強く予測される。ｇｐ９１ｐｈｏｘの既知の特徴、特にフラボタンパク質ドメインの細胞質ゾル向きの位置と一致したモデル（図３）を生成するために、この膜貫通領域を含むことが必要である。このモデルでは、ｇｐ９１ｐｈｏｘ中の既知のＮ連結グリコシル化部位は、細胞外ループに正確に局在化される（が、これらの部位は、他のアイソフォームでは保存されない）。さらに、細胞質ゾル調節タンパク質ｐ４７ｐｈｏｘ（Ｂｉｂｅｒｓｔｉｎｅ−Ｋｉｎｋａｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）に結合するｇｐ９１ｐｈｏｘの多塩基ループは、細胞質ゾル面上に局在化される。一般に、細胞外ループは、長さおよび配列が非常に変化しやすい傾向にある一方で、膜貫通へリックスおよび細胞内ループは、配列および長さがより保存される傾向にある（図２）。
【０１３０】
Ｎ末端内には、絶対的に保存された５つのヒスチジンが存在し（図２）、これはまた、Ｎｏｘファミリーの酵素の他の成員すべてで保存される（データは示さず）。ｇｐ９１ｐｈｏｘは、２つのヘム基を含有し、このヘム基の鉄が、それぞれ２つのヒスチジル窒素に連結され（Ｉｓｏｇａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３）、これらが、Ｎ末端内に存在すると考えられる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。もう一つの保存ヒスチジンは、ＦＡＤ結合領域内に存在するので、ヘム連結の候補ではない。したがって、Ｎ末端内の５つのヒスチジンのうちの４つが、おそらくヘム連結に関与し、図３に示すように、２つのヘム基の結合部位の一部を提供する。
【０１３１】
さらに、高度に陽イオン性のプロリンリッチ配列（図２および図３に示すＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｒｉｃｈ配列）がｍＮｏｘ５の膜の細胞質ゾル側上のＮ末端の一番端の方に位置する。この領域は、別のタンパク質中のＳｒｃ相同性３（ＳＨ３）ドメイン用の結合配列として作用すると考えられる。ＳＨ３ドメインは、分子間または分子内プロリンリッチ配列を認識すると知られている。これは、ｇｐ９１ｐｈｏｘと会合する膜関連サブユニットであるｐ２２ｐｈｏｘに類似しており、ｇｐ９１ｐｈｏｘの活性を調節する細胞質ゾルサブユニットの１つであるｐ４７ｐｈｏｘ中のＳＨ３ドメイン用の結合部位として作用するＣ末端プロリンリッチ配列（Ｐａｒｋｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８）を含む。以下の記述により拘束されることを望まないが、Ｎｏｘ５中のプロリンリッチ配列は、内部ｐ２２ｐｈｏｘとして作用する可能性があり、細胞質ゾル調節タンパク質との相互作用を可能にする。
【０１３２】
実施例４
Ｎｏｘ５  ｍＲＮＡの組織発現
コード領域の３’−部分を用いたＮｏｘ５に関してプローブしたノーザンブロット（図４Ａ）により、試験した胎児組織すべてにおいて、完全長Ｎｏｘ５転写物にサイズが相当する２．２ｋｂバンドの存在が明らかとなった。この種類はまた、成体脾臓および精巣においても、２．６ｋｂおよび６ｋｂの大きな転写物を伴って、少量見られた。３’非翻訳領域の一部を用いたプローブにより、同様の２．６ｋｂおよび６ｋｂバンドの存在が明らかとなった（図４Ｂ）。したがって、これらのより大きなバンドは、同じ遺伝子に由来するより大きな転写物である。ＲＴ−ＰＣＲにより、精巣および脾臓におけるＮｏｘ５の発現を確認し、また卵巣、胎盤、および膵臓において、弱く発現されていることを明らかにした（図５）。
【０１３３】
実施例５
Ｎｏｘ４およびＮｏｘ５のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
Ｇ３ＰＤＨは、対照として使用した。Ｇ３ＰＤＨ  ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を用いて精製し、ＢＥＣＫＭＡＮ  ＤＵ６４０Ｂ分光光度計を用いて、２６０ｎｍでの吸光度を測定して定量化した。Ｇ３ＰＤＨの標準曲線を、蒸留水中の既知の濃度のＧ３ＰＤＨ  ＰＣＲ産物の１０倍段階希釈物を用いて構築した。リアルタイムＰＣＲ増幅は、０．２μＭの各プライマー、１：８４，０００ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）、およびＡｄｖａｎｔａｇｅ２Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐｏｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を含むＰＣＲ反応液中で、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を用いて行った。増幅は、「変性（９５℃、０秒、ランプ速度２０°／秒）、アニーリング（６５℃、５秒、ランプ速度２０／秒）、および伸長（７２℃、３０秒、ランプ速度２０℃／秒）」のサイクルを３６サイクル行った。各伸長段階の最後に蛍光をモニタリングした。定量化および融解曲線を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアを用いて分析した。ＲＴ−ＰＣＲにより、腎臓発現を確認し、また試験した胎児組織すべてにおいて、ならびに膵臓、胎盤、卵巣、精巣および骨格筋を含む幾つかの成体組織において、Ｎｏｘ４の発現を明らかにした（図５を参照）。次に、標準Ｇ３ＰＤＨに対する未知のコピーの比率を算出し、図６Ｃに報告する。ＲＴ−ＰＣＲはまた、精巣および脾臓におけるＮｏｘ５の発現を確認し、また卵巣、胎盤、および膵臓において、弱く発現することを明らかにした（図５）。このデータは、Ｎｏｘファミリーの成員の発現パターンが、組織特異的であり、ｇｐ９１ｐｈｏｘの発現に対応しないことを示す。
【０１３４】
実施例６
Ｎｏｘ４およびＮｏｘ５のノーザンブロッティング
ヒト胎児および成体複数組織ノーザンブロット（Ｈｕｍａｎ Ｆｅｔａｌ ａｎｄ Ａｄｕｌｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を、製造業者による指示書に従って、３２Ｐ−ランダムプライマー標識Ｎｏｘ４、またはＮｏｘ５プローブとハイブリダイズさせた。プローブは、Ｎｏｘ４用のプライマーである配列番号７および配列番号８、ならびにＮｏｘ５用のプライマーである配列番号１９，５’−ＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＧＣＴＣＧＣ−３’、および配列番号２０，５’−ＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＴＴＣＴＣＡＣＡＡＴＧＧＣＣ−３’を用いたＰＣＲにより調製された。ＰＣＲ産物は、アミノ酸１１〜２９４（Ｎｏｘ４）、または２７８〜５５７（Ｎｏｘ５）に相当するコード配列を表す。Ｎｏｘ５の転写物サイズは、胎児のノーザンブロットと成体のノーザンブロットとの間で異なるため、プライマー（配列番号２１，５’−ＣＣＴＣＡＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＣＣＣ−３’、および配列番号２２，５’−ＴＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＧＡＴＧＣＣＧＧ−３’）により増幅したＮｏｘ５の３’非翻訳領域の４２０ｂｐのＰＣＲ産物を用いても、ノーザンブロットをハイブリダイズさせた。
【０１３５】
完全長Ｎｏｘ４転写物の予測サイズに相当する優性Ｎｏｘ４  ２．４ｋｂメッセージは、成体ならびに胎児腎臓で高度に発現され（図４Ａ）、最近の報告を確証している（Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｇｅｉｓｚｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｓｈｉｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。さらに、弱いＮｏｘ４バンドが、胎児および成体腎臓で４．５キロベース（ｋｂ）に検出された（図４Ａ）。Ｎｏｘ５に関してプローブしたノーザンブロット（図４Ａ）により、試験した胎児組織すべてにおいて、完全長Ｎｏｘ５転写物に相当するサイズの２．２ｋｂバンドが存在することが明らかとなった。この種類はまた、成体脾臓および精巣において、２．６ｋｂおよび６ｋｂの大きな転写物を伴って、少量見られた。３’非翻訳領域の一部を用いたプローブにより、同様に２．６ｋｂおよび６ｋｂバンドの存在が明らかとなった（図４Ｂ）。したがって、これらのより大きなバンドは、同じ遺伝子に由来するより大きな転写物である。
【０１３６】
実施例７
配列番号１または配列番号３によるＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクション  それぞれＮｏｘ４タンパク質（配列番号２）またはＮｏｘ５タンパク質（配列番号４）の産生をコードする配列番号１または配列番号３で表されるヌクレオチド配列を、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するｐＥＦ−ＰＡＣベクター（Ｍａｒｙ Ｄｉｎａｕｅｒ， Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮから得られる）のＮｏｔ１部位にサブクローニングする。トランスフェクションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １−３， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９８９に記載されるように実施した。ｐＥＦ−ＰＡＣ中の配列番号１、および空ベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に別個にトランスフェクトする。
【０１３７】
配列番号１で表されるヒトＮｏｘ４遺伝子で、配列番号３で表されるヒトＮｏｘ５遺伝子で、および空ベクターでそれぞれ安定にトランスフェクトした１０５〜１０３個の細胞を、ＤＭＥＭおよび１０％子ウシ血清を含有する０．３％温（４０℃）寒天溶液中に調製する。ＤＭＥＭおよび１０％子ウシ血清を用いて調製した硬化０．６％寒天板上に細胞を分布させる。培養（３７℃、５％ＣＯ２）して３週後に、コロニー形成が顕微鏡で観察される。
【０１３８】
１０％子ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中に維持した約２×１０６個の細胞を、ＤＮＡ１０μｇでトランスフェクトする。２日後に、細胞を分けて、１ｍｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する同じ培地中で選択する。１０〜１４日間選択培地中で生存するコロニーを、ピューロマイシン存在下で、連続的に継代培養する。
【０１３９】
空ベクターで安定にトランスフェクトし、上述のように３週間軟寒天で培養した細胞は、足場非依存性成長を示さない。対照的に、軟寒天中で３週間培養した、Ｎｏｘ４（配列番号１）またはＮｏｘ５遺伝子（配列番号３）で安定にトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、コロニーの足場非依存性成長を示す。トランスフェクトした細胞は、長い紡錘様細胞を特徴とする（Ｖ１２）Ｒａｓでトランスフェクトした細胞で見られるのと類似した形質転換様形態を示す。
【０１４０】
実施例８
トランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＮｏｘ４（配列番号１）またはＮｏｘ５（配列番号３）の発現
トランスフェクション後の、Ｎｏｘ４  ｍＲＮＡまたはＮｏｘ５  ｍＲＮＡの発現を確証するために、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロッティングを実施する。Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ単離キット（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、またはＲｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１０６個の細胞から全ＲＮＡを調製する。各コロニーに関するｃＤＮＡは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ−ＰＣＲキット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を用いて、全ＲＮＡ１〜２μｇから調製する。ＰＣＲ増幅は、配列番号２３および配列番号２４で表されるプライマーを用いて実施する。ノーザンブロッティングに関しては、全ＲＮＡ１０〜２０μｇを、１％アガロースホルムアルデヒドゲル上で分離して、ナイロンフィルターに移す。紫外線（ＵＶ）架橋した後、フィルターを、実施例６に記載するように、ノーザンブロッティングアッセイに使用する。大量のＮｏｘ４  ｍＲＮＡまたはＮｏｘ５  ｍＲＮＡを発現するコロニーをさらなる分析用に選択する。
【０１４１】
実施例９
ＮＡＤＰＨ依存性スーパーオキシド生成アッセイ
本発明の一実施形態では、ヒトＮｏｘ４遺伝子（配列番号１）またはヒトＮｏｘ５遺伝子（配列番号３）で安定にトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウム）発光アッセイ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， ２０１５−２０２３）を用いて、スーパーオキシド生成に関して分析する。細胞を冷ハンクス溶液で洗浄し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザを用いて、１５％スクロースを含有するハンクス緩衝液中で、氷上でホモジナイズする。細胞溶解産物を、ドライアイス／エタノール浴中で即座に凍結させる。アッセイ用に、細胞溶解産物３０μｇを２００μＭ  ＮＡＤＰＨおよび５００μＭルシゲニンと混合する。ＬｕｍｉＣｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて、３回続けて１分間隔で、発光をモニタリングし、最高値を比較用に使用した。タンパク質濃度は、ブラッドフォード法により求める。
【０１４２】
スーパーオキシド生成を、安定にトランスフェクトした細胞系の幾つかからの溶解産物中でモニタリングし、トランスフェクトしていないＮＩＨ  ３Ｔ３細胞溶解産物によるスーパーオキシド生成と比較する。発光シグナルは、スーパーオキシドジスムターゼおよび全般的なフラボタンパク質阻害剤であるジフェニレンヨードニウムにより阻害されるが、添加した組換えヒトｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘ、およびＲａｃ１（ＧＴＰ−γＳ）（これらは、食細胞呼吸バーストオキシダーゼにとって必須の細胞質ゾル要素である）によっては影響を受けない。
【０１４３】
本発明の代替的かつ好ましい実施形態では、Ｎｏｘ４（ＹＡ２８）、Ｎｏｘ５（ＹＡ２８）、または空ベクター（ＮＥＦ２）で安定にトランスフェクトした細胞を、ＤＭＥＭ、１０％子ウシ血清、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１μｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する培地中で、１０ｃｍの組織培養プレートにおいて、およそ８０％集密性にまで成長させる。細胞（各細胞型の５つの組織培養プレート）を、５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で簡単に洗浄した後、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いて、プレートから解離させる。１０００ｘｇで簡単に遠心分離することで、細胞をペレット化する。
【０１４４】
細胞を透過性にするために、凍結融解溶解を行い、この後に、小穿孔針で細胞物質に通す。上清を除去して、細胞をドライアイス上で１５分間凍結させる。細胞を融解した後に、Ｓｉｇｍａのプロテアーゼ阻害剤の混合物（カタログ番号Ｐ２７１４）を含有する溶解緩衝液（ハンクス緩衝塩溶液−ＨＢＢＳ）２００μｌを添加する。氷上の細胞に、１８ゲージ針を１０回通し、３４％スクロースを含有するＨＢＳＳ緩衝液２００μｌを添加して、１７％スクロースの最終濃度とした。スクロースは、保管時の安定性を高めるようであった。凍結溶融および針を通すことの組合せが、実質的にすべての細胞の溶解をもたらし、この物質を細胞溶解産物と称する。
【０１４５】
ＢｉｏＲａｄのタンパク質アッセイ系を用いて、タンパク質濃度に関して、細胞溶解産物をアッセイする。アッセイプレート（９６ウェルプラスチックプレート）中で、ＨＢＳＳ緩衝液、アラキドン酸、およびタンパク質０．０１〜１μｇを組み合わせることにより、ＮＡＤＰＨ依存性化学発光に関して、細胞溶解産物をアッセイする。１．５ｍＭのＮＡＤＰＨ、および７５μＭのルシゲニンをアッセイミックスに添加することで、ＮＡＤＰＨは２００μＭ、および１０μＭのルシゲニンは１０μＭの最終濃度として、反応を開始し、化学発光を即座にモニタリングする。最終アッセイ容量は、１５０μｌである。最適アラキドン酸濃度は、５０〜１００μＭである。ＰａｃｋａｒｄのＬｕｍｉｃｏｕｎｔルミノメータを用いて、３７℃でのルシゲニンとスーパーオキシドとの間の反応の化学発光を測定する。プレートを６０分間連続的にモニタリングし、各試料についての最大相対発光単位（ＲＬＵ）値を用いてグラフにする。
【０１４６】
５０〜１５０μＭの濃度範囲内のＮａＣｌまたはＫＣｌの存在は、活性を最適化するのに重要である。ＭｇＣｌ２（１〜５ｍＭ）はさらに、活性を約２倍高めた。Ｎｏｘ４  ＮＡＤＰＨ−オキシダーゼ活性に関するこの無細胞アッセイ、およびＮｏｘ５  ＮａＤＰＨ−オキシダーゼに関する無細胞アッセイは、Ｎｏｘ４酵素およびＮｏｘ５酵素のモジュレーター（阻害剤または刺激剤）をスクリーニングするのに有用である。このアッセイはまた、概してＮｏｘ  ＮＡＤＰＨ−オキシダーゼ活性を検出するのに、またＮｏｘファミリーの酵素のモジュレーター（阻害剤または刺激剤）をスクリーニングするのに使用され得る。
【０１４７】
実施例１０
Ｎｏｘ４  ｃＤＮＡ（配列番号１）またはＮｏｘ５  ｃＤＮＡ（配列番号３）でトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞により生成されるスーパーオキシドによるニトロブルーテトラゾリウム還元
無傷細胞によるスーパーオキシド生成を、ニトロブルーテトラゾリムのスーパーオキシドジムスターゼ感受性還元を用いてモニタリングする。ＮＥＦ２（ベクターのみの対照細胞）、ＹＡ２６（Ｎｏｘ４（配列番号１）でトランスフェクトした細胞）、ＹＡ２６（Ｎｏｘ５（配列番号３）でトランスフェクトした細胞）、ＹＡ２８（Ｎｏｘ４（配列番号１）でトランスフェクトした細胞）、およびＹＡ２８（Ｎｏｘ５（配列番号３）でトランスフェクトした細胞）を、ウェル１つ当たり５００，０００個の細胞で、６ウェルプレートで平板培養する。約２４時間後に、細胞から培地を除去し、細胞を１ｍＬハンクス溶液（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）で１度洗浄する。濾過した０．２５％ニトロブルーテトラゾリウム （ＮＢＴ，Ｓｉｇｍａ）約１ｍＬを、スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓｉｇｍａ）６００ユニットとともに、又は単独で、ハンクス中に添加し、細胞を５％ＣＯ２の存在下で、３７℃にてインキュベートする。８分後、細胞を掻爬（ｓｃｒａｐ）し、１０，０００ｘｇ以上でペレット化する。ペレットをピリジン（Ｓｉｇｍａ）１ｍＬに再懸濁させ、１００℃で１０分間加熱して、還元ＮＢＴを可溶化させる。１１，０００Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を用いて、５１０ｎｍで吸光度を測定することで、還元ＮＢＴの濃度を求める。幾つかのウェルは未処理であり、細胞数を求めるのに使用する。スーパーオキシドジスムターゼは細胞を浸透しない可能性が高いので、スーパーオキシドは、細胞外で生成されなくてはならない。これらの細胞により生成されるスーパーオキシドの量は、活性ヒト好中球により生成されるスーパーオキシドの約５〜１０％である。
【０１４８】
実施例１１
Ｎｏｘ４およびＮｏｘ５でトランスフェクトした細胞における細胞内構成成分の改変
Ｎｏｘ４またはＮｏｘ５により生成されるスーパーオキシドが細胞内標的に影響を及ぼすことができるかを試験するために、対照の細胞系およびＮｏｘでトランスフェクトした細胞系におけるアコニターゼ活性を、Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ４０１， ７９−８２に記載されるような方法を用いてモニタリングする。アコニターゼは、活性の損失をもたらすスーパーオキシドによる改変を非常に受けやすい４つの鉄−硫黄クラスターを含有し、細胞内スーパーオキシダーゼ生成のレポーターとして使用されている。アコニターゼ活性は、Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， １３３９９−１３４０５に記載されるように求められる。アコニターゼ活性は、トランスフェクトした対照と比較して、ＹＡ２６およびＹＡ２８と称したＮｏｘでトランスフェクトした細胞系で、有意に減少する。
【０１４９】
これらの細胞におけるアコニターゼのおよそ５０％が、差次的遠心分離に基づいてミトコンドリア性であり、細胞質ゾル形態およびミトコンドリア形態の両方が影響を受けた。鉄−硫黄中心を含有しない対照細胞質ゾル酵素およびミトコンドリア酵素は影響を受けない。したがって、Ｎｏｘ４でトランスフェクトした細胞およびＮｏｘ５でトランスフェクトした細胞で生成されるスーパーオキシドは、細胞内構成成分と反応して、細胞内構成成分を改変することが可能である。
【０１５０】
実施例１２
ヒトＮｏｘ４  ｃＤＮＡ（配列番号１）、またはヒトＮｏｘ５  ｃＤＮＡ（配列番号３）でトランスフェクトした細胞を与えたヌードマウスにおける腫瘍形成  約２×１０６個のＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（配列番号１によりＮｏｘ４でトランスフェクトした細胞、配列番号３によりＮｏｘ５でトランスフェクトした細胞、または空ベクターを使用してトランスフェクトした細胞のいずれか）を、４〜５週齢のヌードマウスの頸部の側面に皮下注射する。３〜６匹のマウスに、３つのＮｏｘ４でトランスフェクトした細胞系をそれぞれ、Ｎｏｘ５でトランスフェクトした細胞系をそれぞれ注射し、３匹のマウスに、空ベクターでトランスフェクトした細胞（対照）を注射する。２〜３週後に、マウスを屠殺する。腫瘍を１０％ホルマリン中に固定し、組織学的分析により特徴づけする。
【０１５１】
別の研究では、１５匹のマウスに、Ｎｏｘ４でトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を注射する。注射した１５匹のマウスのうち、１４匹は、注射の１７日以内に大きな腫瘍を示し、腫瘍はＮｏｘ４  ｍＲＮＡの発現を示す。
【０１５２】
別の研究では、１５匹のマウスに、Ｎｏｘ５でトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を注射する。注射した１５匹のマウスのうち、１４匹は、注射の１７日以内に大きな腫瘍を示し、腫瘍はＮｏｘ５  ｍＲＮＡの発現を示す。
【０１５３】
実施例１３
非癌性成長におけるＮｏｘ４およびＮｏｘ５の役割の実証
正常成長におけるＮｏｘ４およびＮｏｘ５に関する役割は、Ｎｏｘ４またはＮｏｘ５に対するアンチセンスを用いることにより、ラット大動脈血管平滑筋細胞において実証される。アンチセンスＤＮＡによるトランスフェクションは、スーパーオキシド生成および血清依存性成長の両方の減少をもたらす。したがって、Ｎｏｘ４およびＮｏｘ５は、この細胞型において正常成長に関係している。
【０１５４】
実施例１４
バキュロウイルス発現系におけるヒトＮｏｘ４タンパク質（配列番号２）およびヒトＮｏｘ５タンパク質（配列番号４）の発現
配列番号２および配列番号４はまた、組換えバキュロウイルスを用いて、昆虫細胞中で発現される。Ｎｏｘ４およびＮｏｘ５発現ウイルス系を樹立するために、まず、Ｎｏｘ４遺伝子（配列番号１）またはＮｏｘ５遺伝子（配列番号５）をｐＢａｃＰＡＫ８ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）に別個にクローニングし、組換えバキュロウイルスは、製造業者のプロトコルに従って、標準的な方法を用いて構築される。簡潔に述べると、ＰＣＲで増幅させたＮｏｘ４  ＤＮＡまたはＮｏｘ５  ＤＮＡを、ベクターのＫｐｎＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。ＰＣＲ増幅に使用したプライマーは、配列番号２１、２２、２３および２４である。ｓｆ９昆虫細胞（２×１０６個の細胞）を、トランスフェクション緩衝液ＡおよびＢ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて、商品名ＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ（登録商標）で販売される線状バキュロウイルスＤＮＡ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）０．５ｍｇ、および５ｍｇのｐＢａｃＰＡＣ８  Ｎｏｘ４で感染させる。５日後に、組換えウイルスを含有する上清を収集し、新鮮なｓｆ９細胞を７日間感染させることで増幅する。増幅は３回行い、Ｎｏｘ４  ＤＮＡまたはＮｏｘ５  ＤＮＡを含有する組換えウイルスの存在は、同じプライマーを用いてＰＣＲにより確認される。ウイルスを３回増幅した後、プラーク精製を行い、高力価のウイルスを得る。寒天板中のおよそ２×１０８個のｓｆ９細胞を、ウイルスの段階希釈物で５日間感染させ、ウイルスプラークを容易に検出するために、ニュートラルレッドで着色する。選択ウイルスプラークを抽出し、ヒトＮｏｘ４  ＤＮＡまたはヒトＮｏｘ５  ＤＮＡの存在を、再びＰＣＲにより確認する。
【０１５５】
実施例１５
ヒトＮｏｘ４（配列番号２）、およびヒトＮｏｘ５（配列番号４）に対する抗体
ヒトＮｏｘ４（配列番号２）、またはヒトＮｏｘ５（配列番号４）に対して、ウサギ中で、ポリクローナル抗体を別個に産生する。グルタルアルデヒドを用いて、タンパク質を別個にキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合する。
【０１５６】
まず初めに、完全フロイントアジュバント中の抗原を種々のウサギに注射し、３週毎の間隔で、不完全フロイントアジュバント中の抗原を４回ブーストする。各注射で、およそ０．５ｍｇから１ｍｇのペプチドが投与される。各ブーストの１週後に採血し、最終ブーストの２週後に、最後の採血を行う。抗Ｎｏｘ４抗体または抗Ｎｏｘ５抗体を、当業者に既知の技法を用いてＮｏｘ４またはＮｏｘ５を結合させたアフィニティカラム上で精製する。未結合のタンパク質を緩衝液２０ｍｌで洗い流す。ゲルからの抗体溶出を、６ｍｌの溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．５％トリトンＸ−１００）で実施した。次に、０．９ｍｌの１Ｍ  トリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０  を添加することで、溶出液を中和する。
【０１５７】
増強化学発光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用いて、抗原の検出を行う。総計１０μｇのタンパク質を各レーンに添加するウェスタンブロットにおいて、Ｎｏｘ４またはＮｏｘ５に対するアフィニティ精製をした抗体を、１：１０００の希釈で使用する。
【０１５８】
実施例１６
Ｎｏｘ１用のレポーター構築物の構築
ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を親ベクターとして使用した。ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターは、真核生物プロモーターおよびエンハンサー配列が欠如しており、推定調節配列をクローニングする際に、適応性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）が最も高い。このプラスミドでトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ活性の発現は、ｌｕｃ＋から上流にある機能性プロモーターの挿入および適した配向性に依存する。また、潜在的エンハンサー因子を、プロモーターの上流に、あるいはｌｕｃ＋遺伝子の下流にあるＢａｍＨＩまたはＳａｌＩ部位中に挿入することができる。プライマー配列番号２５，５’−ＧＣＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴ−３’、および配列番号２６，５’−ＡＡＣＴＣＴＣＧＡＧＴＧＴＣＡＡＧＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＧＡＧＣ−３’を、ゲノムＤＮＡとともに使用して、Ｘｈｏ制限部位に隣接したＮｏｘ１（配列番号５）のプロモーター領域が得られた。次に、制限部位を使用して、ｐＧＬ３プラスミドにＮｏｘ１プロモーター領域を挿入した（図７を参照）。ルミノメーターを用いて測定されるルシフェラーゼ活性により、適切にトランスフェクションすることができた。
【０１５９】
実施例１７
アッセイとしてのレポーター構築物の使用
実施例１６で得られた構築物を、ヒトＣａｃｏ−２またはＨＴ−２９細胞に安定にトランスフェクトする。トランスフェクションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｏｌｕｍｅｓ １−３， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． １９８９に記載されるように行う。ｐＥＦ−ＰＡＣ中の配列番号５および、および空ベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、Ｃａｃｏ−２細胞に別個にトランスフェクトする。ヒトＮｏｘ１プロモーター遺伝子配列番号５で、および空ベクターで安定にトランスフェクトした１０５〜１０３個の細胞を、ＤＭＥＭおよび１０％子ウシ血清を含有する０．３％温（４０℃）寒天溶液中に調製する。ＤＭＥＭおよび１０％子ウシ血清を用いて調製した硬化０．６％寒天板上に細胞を分布させる。培養（３７℃、５％ＣＯ２）して３週後に、コロニー形成が顕微鏡で観察される。１０％子ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中に維持した約２×１０６個の細胞を、１０μｇのＤＮＡでトランスフェクトする。２日後に、細胞を分けて、１ｍｇ／ｍｌピューロマイシンを含有する同じ培地中で選択する。１０〜１４日間選択培地中で生存するコロニーを、ピューロマイシン存在下で、連続的に継代培養する。
【０１６０】
ＲＯＩの発現をすると思われる培地に化合物を添加することで、コロニーをスクリーニングアッセイとして使用する。ルシフェラーゼ生産の測定は、化合物がＮｏｘ１遺伝子の誘発を増強したか、あるいは阻害したかどうかを示し、化合物の細胞効果に基づく薬剤の開発を促進する。
【０１６１】
実施例１８
癌細胞におけるＮｏｘ３、Ｎｏｘ４、およびＮｏｘ５  ｍＲＮＡの発現
多くの癌細胞が、反応性酸素種を過剰生産し（Ｓｚａｔｒｏｗｓｋｉ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎ， １９９１）、このことが、形質転換された表現型での原因となり得る（Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。Ｎｏｘ１〜５の発現について、様々なヒト腫瘍および他の細胞系で研究して、これらの酵素が幾つかの腫瘍で見られる反応性酸素の生成の原因となり得るかどうかを決定した。ヒト癌におけるＮｏｘファミリーの成員の発現。ＲＴ−ＰＣＲを図５と同様に行った。図６Ａは、以下の細胞系：ＥＳ−２（卵巣明細胞癌腫）、ＰＡ−１（卵巣奇形癌）、Ｏｖｃａｒ−３（卵巣腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳腺癌）、ＳＫＯ−００７（プラスマ細胞腫）、Ｃａｃｏ−２（結腸癌腫）、Ｔ８４（結腸癌腫）、ＨＥＫ２９３（アデノウイルスで形質転換した胚腎）、およびＨｅｌａ（子宮頸部腺癌）でのＮｏｘ発現を示す。図６Ｂは、ヒトグリア芽細胞腫由来、またはヒト星状細胞初代培養物由来の５つの細胞系でのＮｏｘ発現を示す。図６Ｃは、リアルタイムＰＣＲの結果から得られた、Ｇ３ＰＤＨと比較した、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｎｏｘ４、およびＮｏｘ５の発現の比を示す。
【０１６２】
図６Ａおよび図６Ｂに示すように、Ｎｏｘアイソフォームは、検査した１４の腫瘍または形質転換細胞系のうち１２で発現された。Ｎｏｘ１は、２つの結腸癌系、Ｃａｃｏ−２およびＴ−８４、ならびに形質転換細胞系ＨＥＫ２９３で発現され、また程度は低いが、Ｈｅｌａ細胞でも発現される。Ｎｏｘ４は、これらの細胞系のうち１１で観察された一方で、Ｎｏｘ５は、７で観察された。ｇｐ９１ｐｈｏｘもまた、これらの細胞系のうち半分以上で発現された。ｍＲＮＡの同一性は、図５、図６Ａ、および図６Ｂに示すように、配列決定で確認した。
【０１６３】
ヒトグリア芽細胞腫に由来する生脳腫瘍細胞系では、Ｎｏｘ５およびｇｐ９１ｐｈｏｘの可変性発現とともに、Ｎｏｘ４は常に発現された（図６Ｂ）。リアルタイムＰＣＲにより、Ｇ３ＰＤＨに対するＮｏｘの発現の比が、初代ヒトアストロサイトと比較して、様々な腫瘍細胞系において有意に変化したことが明らかとなった（図６Ｃ）。グリア芽細胞腫の細胞起源は明確に確立されていないが、この癌型は、アストロサイト系統から生じると多くの研究者は考えている。
【０１６４】
癌および形質転換細胞系でのＮｏｘ型の発現は、正常組織中での発現とは厳密には相関せず、Ｎｏｘイソフォームの発現はときとして癌細胞で変更されることを示した。したがって、Ｎｏｘアイソフォームの異常発現または異常調節は、幾つかの癌細胞で見られる反応性酸素生成の増加の原因となり得る。
【０１６５】
上記で引用した特許、刊行物、および抄録はすべて、それらの全体が参照により本明細書に援用される。米国仮特許出願第６０／２４９，３０５号、同第６０／２５１，３６４号、同第６０／２８９，１７２号、同第６０／２８９，５３７号は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。上述の引用例は、本発明の好ましい実施形態にのみ関するものであり、併記の特許請求項に規定する本発明の精神および範囲を逸脱することなく、多くの変更または修正がなされ得ることが理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
このファミリーのタンパク質間での類似性の度合いを示す樹状図であり、また関連植物酵素も含む。
【図２】ｇｐ９１ｐｈｏｘヒト（ｈｕｍａｎ）、Ｎｏｘ１ヒト、Ｎｏｘ３ヒト、Ｎｏｘ４ヒト、およびＮｏｘ５ヒトの予測タンパク質配列のアラインメントを表す。
【図３】
ｇｐ９１ｐｈｏｘの既知の特徴に従うモデルである。
【図４】
ノーザンブロット分析により測定されるＮｏｘ３、Ｎｏｘ４、およびＮｏｘ５の組織発現を表す。
【図５】
Ｎｏｘファミリーのタンパク質の組織発現のＲＴ−ＰＣＲ測定を示す。ＲＴ−ＰＣＲは、本明細書中に記載するように、Ｎｏｘ特異的ＰＣＲプライマーを用いて行った。サイクル数は、特に指示する場合を除いて３５回であった（括弧内がサイクル数）。
【図６】
ａ，ｂ；腫瘍または形質転換された細胞系におけるＮｏｘアイソフォームの発現
Ｃ；実時間ＰＣＲの結果から得られた、グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）と比較した、ｇｐ９１ｐｈｏｘ、Ｎｏｘ４、およびＮｏｘ５の発現の比を表す。
【図７】
Ｎｏｘ１用のプロモーター−レポーター構築物の製作を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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