(57)【要約】コンパートメント系において、原核または真核ホスト細胞からの目的タンパク質の分泌によって、少なくとも一つのタンパク質を製造するための新規方法が記載されており、この場合、この方法は、ホスト細胞が分泌系を安定に発現し、目的タンパク質の異種分泌能力を有しており、かつコンパートメント系が少なくとも第１コンパートメントと第２コンパートメントを有しており、その際、ホスト細胞は第１コンパートメント中に位置し、第１コンパートメントと第２コンパートメントは互いに障壁によって分けられており、その際、障壁は、分泌された目的タンパク質に対して透過性であるが、ホスト細胞に対しては透過性でないことを特徴とする。
2004516029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンパートメント系中でホスト細胞から目的のタンパク質を分泌させることによって、少なくとも一つの目的のタンパク質を製造するための方法において、ホスト細胞が分泌系を安定に発現させ、かつ目的のタンパク質の異種分泌能力を有しており、かつ、コンパートメント系が少なくとも第１コンパートメントおよび第２コンパートメントを有しており、その際、ホスト細胞は第１コンパートメント中に位置し、かつ、第１コンパートメントと第２コンパートメントは互いに障壁によって分けられており、その際、障壁は、分泌された目的のタンパク質に対して透過性であるが、ホスト細胞に対しては透過性ではないことを特徴とする、コンパートメント系において、ホスト細胞から目的のタンパク質を分泌させることによって、少なくとも一つの重要なタンパク質を製造するための方法。
【請求項２】
ホスト細胞が、可動性ベクター上でコードされた分泌系を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可動性ベクターが、プラスミドまたはコスミドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
障壁が、コンパートメント系の第１コンパートメントの一部分である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
障壁が薄膜であり、この薄膜フィルターは、ホスト細胞の移入を防ぎ、薄膜を介して分泌された目的のタンパク質の拡散を可能にする程度の孔径を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
第１コンパートメントが、第２コンパートメントの上方に水平に位置し、かつ、分泌された目的のタンパク質が、第１コンパートメントから第２コンパートメントへ、障壁を介して、重力によって拡散しうる、請求項１および２に記載の方法。
【請求項７】
ホスト細胞がフィルター表面上に位置し、かつ、第２コンパートメントがフィルターの裏面に取り付けられた固相であり、この場合、この固相が、フィルターを介しての拡散の後に、分泌された目的のタンパク質を保持する能力を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ホスト細胞がＥ．Ｃｏｌｉまたはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｔｏｒｉｓ）である、請求項１および２に記載の方法。
【請求項９】
目的のタンパク質の分泌が、ホスト細胞の成長によってもたらされる、請求項１および２に記載の方法。
【請求項１０】
第１コンパートメントおよび第２コンパートメントが、前記フィルターによって分離された、積み重ねられたマイクロウェルである、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
目的のタンパク質が、第２コンパートメント中のスポットとして得られるか、あるいは、目的のタンパク質が、第２コンパートメント中の溶液中で得られる、請求項１および２に記載の方法。
【請求項１２】
分泌された目的のタンパク質が、アフィニティーｔａｇ、エピトープｔａｇを有するか、および／または、分泌シグナル配列および／またはｔａｇ配列を取り除くのに適したプロテアーゼ切断部位を有する、請求項１および２に記載の方法。
【請求項１３】
幾つかの異なる目的タンパク質を製造するための請求項１および２に記載の方法において、それぞれの目的タンパク質を分泌するそれぞれのホスト細胞を第１コンパートメントの定められた領域中に置き、かつぞれぞれの分泌された目的タンパク質を第２コンパートメントの定められた領域に移動させるか、あるいは、それぞれの目的タンパク質を分泌するそれぞれのホスト細胞を、異なる第１コンパートネント中に置き、かつ分泌された目的タンパク質を異なる第２コンパートメントに移動させる、請求項１および２に記載の方法。
【請求項１４】
コンパートメント系中のそれぞれのホスト細胞から目的タンパク質を分泌させることによって、いくつかの異なる目的タンパク質アレイを製造するための方法において、ホスト細胞が分泌系を安定に発現させ、これによりホスト細胞がそれぞれの目的タンパク質を異種的に分泌することを可能にし、かつ、このコンパートメント系が、少なくとも第１コンパートメントおよび第２コンパートメントを有し、その際、異なるホスト細胞は、第１コンパートメント中のアレイの形で配置され、かつ第１コンパートメントと第２コンパートメントは互いに障壁によって分けられており、その際、障壁は分泌された目的タンパク質に対して透過性であるが、ホスト細胞に対しては透過性でなく、かつ、その際、分泌された目的タンパク質は、第２コンパートメント中でアレイの形で収容されることを特徴とする、いくつかの異なる目的タンパク質アレイを製造するための方法。
【請求項１５】
障壁が、コンパートメント系の第１コンパートメントの一部分である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質アレイが、目的の生物体のプロテオームに相当する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
溶血素分泌系遺伝子ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤならびに染色体ｌａｃＺ遺伝子の範囲内の上流の配列を有する、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、コンパートメント系中で、ホスト細胞から目的タンパク質を分泌させることによってタンパク質を製造および精製するための方法、タンパク質アレイを製造するための方法、適したコンパートメント系、および目的タンパク質の製造および分泌のためのホスト細胞およびプラスミドに関する。
【０００２】
背景技術
タンパク質およびプロテオームアレイを製造する従来の技術は、発現ベクター中への、特定の目的タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）のクローニング、およびそれぞれのベクターを有する相当する細菌細胞によるその発現に基づくものである。フィルター上の細菌の緩慢な溶解に引き続いて、細胞崩壊物は洗浄除去され、かつフィルターに結合したタンパク質を結合研究（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ）のために使用する［Ｂｕｅｓｓｏｗ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ ｒｅｓ． ２６：５００７−５００８； Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｍｏｃｒｏｂｉｏｌ． ３： ２９８−３０２］。この方法の欠点は、（ｉ）これらの細菌によって製造されたすべてのタンパク質が、フィルター上に存在することによって、特異的結合試験の妨げとなる細菌タンパク質の高いバックブランドが生じること、および（ｉｉ）目的タンパク質が、細菌溶解の間に変性されうることである。高いバックグランドレベルの問題は、過剰発現されたタンパク質を精製することによって、解決することができるけれども、しかしながら、これは、極めて手間のかかることである。
【０００３】
驚くべきことに、従来の技術の欠点は、コンパートメント系中で、ホスト細胞からの目的タンパク質の分泌を保証する分泌系の使用を可能にする新規の方法によって回避され、この場合、このコンパートメント系は、その合成したホスト細胞およびそのコンパートメントからの目的タンパク質の分離を可能にし、かつ、未変性の形での目的タンパク質の保存を可能にする。
【０００４】
本発明の開示
したがって、本発明の第１の対象は、コンパートメント系中にホスト細胞によって目的タンパク質を分泌することによる、少なくとも一つの目的タンパク質を製造するための方法であり、この場合、ホスト細胞は、分泌系を安定して発現させ、目的タンパク質の異種分泌能力を有し、かつ、コンパートメント系は、少なくとも第１コンパートメントおよび第２コンパートメントを有し、その際、ホスト細胞は第１コンパートメント中に位置し、第１コンパートメントと第２コンパートメントは互いに障壁によって分離されており、その際、障壁は分泌された目的タンパク質に対して透過性であるが、ホスト細胞に対しては透過性ではない。場合によっては、目的タンパク質は、第２コンパートメント中に保持され、かつ、第２コンパートメントから回収されてもよい。この新規方法は、目的タンパク質のコンパートメント系への分泌を確実にし、この場合、このコンパートメント系は、合成されたホスト細胞およびその他すべての成分からの分離を可能にし、かつ、ホスト細胞の溶解を必要としない未変性の形でのタンパク質を保持する。場合によっては、新規方法は、担体上での分泌されたタンパク質の保持、および／またはアフィニティーｔａｇの使用によって精製を可能にし、さらに場合によっては、エピトープｔａｇの使用によってその検出を可能にし、かつ場合によっては、適したプロテアーゼ切断部位を導入することによって、目的タンパク質の機能に影響する分泌シグナルおよびｔａｇ配列の除去を可能にする。
【０００５】
本発明の他の対象は、タンパク質アレイを製造するための方法である。本発明に関して、タンパク質アレイの用語は、目的とする別個のタンパク質の規則的な配列に関し、特に、タンパク質の並列分析を可能にする別個のタンパク質の規則的配列に関する。好ましい構成原理は、チューブ、キャビティーまたは平面上の別個のパッチまたはスポットを用いての分配である［Ｗａｌｔｅｒ ａｔ ａｌ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３： ２９８−３０２］。本発明は、コンパートメント系の一つのコンパートメント中で増殖するホスト細胞から、同コンパートメント系のもう一つのコンパートメントに目的タンパク質を分泌することである。ホスト細胞は分泌系を発現し、この場合、これは、ホスト細胞によって、目的タンパク質を分泌させることを可能にする。コンパートメント系は、少なくとも第１のコンパートメントおよび第２のコンパートメントを有し、その際、種々のホスト細胞は、前記第１コンパートメント中においてアレイの形で配置され、かつ、第１コンパートメントおよび第２コンパートメントは互いに障壁によって分けられており、その際、障壁は、分泌された目的タンパク質に関して透過性であるが、ホスト細胞およびその他の成分に関しては透過性ではなく、かつ、分泌された目的タンパク質は、アレイの形で、第２コンパートメント中で得られる。
【０００６】
本発明の他の対象は、本発明による方法によって得ることが可能なタンパク質アレイである。このようなアレイは、ホスト細胞コンストラクトによって分泌されるタンパク質のみを有していてもよい。
【０００７】
本発明に関する目的タンパク質は、目的の生物体の任意のタンパク質に関し、この場合、この生物体は、ウイルス、原核生物または真核生物であってもよく、この場合、これらは、適した分泌系によって分泌することができる。
【０００８】
本発明に関してのホスト細胞からの目的タンパク質の分泌は、目的タンパク質の、製造するホスト細胞からの細胞外領域への運搬に関する。
【０００９】
本発明に関しての分泌されたタンパク質は、適した分泌系によって分泌することができる任意の目的タンパク質、特に、Ｅ．Ｃｏｌｉα−溶血素タンパク質ＨｌｙＡのＣ−末端シグナル配列を有するかまたはサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのα−因子シグナル配列を有する融合タンパク質として分泌される目的タンパク質を意味する。
【００１０】
ホスト細胞は、目的の異種タンパク質を分泌することが可能な任意の細胞、特に、非病原性グラム陰性菌、好ましくは非病原性Ｅ．Ｃｏｌｉ、特に、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母細胞を示す。
【００１１】
本発明に関しての分泌系は、目的の異種タンパク質の分泌を可能にする任意の原核生物または真核生物系に関し、特にグラム陰性菌［Ｓａｎｄｋｖｉｓｔ ａｎｄ Ｂｇｄａｓａｒｉａｎ （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７：５０５−５１１］、好ましくはグラム陰性菌のタイプＩの分泌系、特に、Ｅ．Ｃｏｌｉα−溶血素分泌系に関し、この場合、これらは、以下の刊行物に記載されている［Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６：１８１−１８５； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９５：５７−６６； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５２： ２６６−２７４； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｅ． １７９： １３３−１４０； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９８： １０３−１１３； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．６６： ２０６０−２０６４； Ｍｏｌｌｅｎｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ． （１９９６） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２１： ８５４−８６０； Ｓｐｒｅｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ （１９９８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６５： １８７−１９２； Ｓｐｒｅｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ （１９９８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６５： １８７−１９２； Ｓｐｒｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３１： １５８９−１６０１］。特にＥ．Ｃｏｌｉα−溶血素分泌系の改変型、またはグラム陽性菌の分泌系［Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０： ３７６−３８１； Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｎ Ａ． Ｌ． Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）． Ｂａｃｏｌｌｕｓ ｓｐｐ．ａｎｄ ｐｔｈｅｒ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ｐ．９１７−９３７．； Ｆｒｅｕｄｌ （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３： ２３１−２４０； Ｐｏｚｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ７２： ６１１−６１９； Ｖａｎ Ｗｅｌｙ ｅｔ ａｌ． （２００１） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ２５： ４３７−４５４］、好ましくは、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）または酵母分泌系、好ましくは、サッカロミセス・セレビジエ  α−因子またはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナル配列［Ｃｒｅｇｈｉｎｏ ａｎｄ Ｃｒｅｇｇ （２０００） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ２４： ４５−６６； これらのイースト分泌系はさらにインヴィトロ  ジェン社から市販されている］によって介在された分泌系である。
【００１２】
本発明に関する好ましい分泌系は、目的の異種タンパク質の分泌を可能にする任意の原核生物または真核生物の分泌系、特にα−溶血素分泌系、好ましくはＥ．Ｃｏｌｉα−溶血素分泌系に関し、特に、Ｅ．Ｃｏｌｉα−溶血素分泌系の改変型［Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６： １８１−１８５； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｅ． １７９： １３３−１４０； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９８： １０３−１１３； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６：２０６０−２０６４； Ｍｏｌｌｅｎｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２１： ８５４−８６０； Ｓｐｒｅｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ （１９９８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６５： １８７−１９２； Ｓｐｒｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３１： １５８９−１６０１］またはインビトロジェン社から市販されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）分泌系の改変型を示す。
【００１３】
本発明における異種タンパク質の分泌は、ホスト細胞によるタンパク質の分泌に関し、この場合、このタンパク質は、ホスト細胞の天然のプロテオームの一部分である必要はないが、相当する遺伝子がホスト細胞染色体中に導入されることによってホスト細胞で合成される。本発明に関して、ホスト細胞によるそれぞれの異種タンパク質の分泌は、分泌機序、特に目的の異種タンパク質とα−溶血素分泌系によるＣ−末端ＨｌｙＡシグナル配列またはサッカロミセス・セレビジエα−因子またはピチア・パストリス酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）シグナル配列との融合体による、ホスト細胞から細胞外領域へのその運搬を意味する。
【００１４】
本発明に関して、安定して分泌系を発現し、かつタンパク質の異種分泌能力を有するホスト細胞は、タンパク質の分泌を導入する能力を有する分泌系の発現を可能にするホスト細胞を示し、この場合、この相当する遺伝子はそのゲノム中に導入される。特に、タンパク質の分泌を誘発する能力を有し、これに相当する遺伝子が染色体中に導入される。特に、タンパク質の異種分泌の能力とは、異種タンパク質を分泌する能力を意味する。分泌系の安定した発現は、分泌系が染色体的に確実にコードされることによって達成されてもよく、この場合、これは、天然由来かあるいは遺伝子工学的におこなわれてもよい。さらに、分泌系の安定した発現に関して、分泌系成分は、可動性ベクター上、たとえば、プラスミド上にクローン化され、さらに分泌すべき目的の異種タンパク質をコードしていることが好ましい。また、分泌系の安定した発現に関して、分泌系および目的の異種タンパク質は、別個の適合する可動性ベクター、たとえばプラスミド上でクローン化される。
【００１５】
以下に、Ｅ．Ｃｏｌｉα−溶血素分泌系に基づく原核生物分泌系、およびピチア・パストリス分泌系に基づく真核生物分泌系を記載する：
原核生物分泌系
原核生物分泌系は、目的の異種タンパク質分泌のためのホスト細胞として、原核細胞の適用に関し、この場合、これらは特に、非病原性グラム陰性細菌、好ましくは非病原性Ｅ．Ｃｏｌｉ、特にＥ．Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ菌株に関するか、あるいは非病原性グラム陽性菌、好ましくはバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｓｐ．）ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｕｃｅｓ ｓｐｐ．）に関する。
【００１６】
本発明において、原核生物ホスト細胞によるそれぞれの異種タンパク質の分泌は、分泌機序による、原核生物ホスト細胞から細胞外領域へのその運搬に関する。
【００１７】
原核生物Ｅ．Ｃｏｌｉα−溶血素分泌系
α−溶血素は、しばしば腸管外Ｅ．Ｃｏｌｉ病原菌によって、主に尿素病原性Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）によってしばしば製造される病原性ファクターである。これは、タンパク質毒のＲｔｘ（毒素中で反復する）ファミリーに属する、膜−衝撃性、孔形成性細胞外サイトトキシンである。ＨｌｙＡタンパク質は、その“溶血素”という表現から、赤血球を含む真核細胞を溶解するが、さらに他の細胞、たとえば顆粒細胞および上皮細胞をも溶解する。Ｒｔｘサイトトキシンは、種々のグラム陰性細菌によって製造され、かつ、９個のアミノ酸から成るグリシンに富む反復配列の可変の数を有するＣ−末端カルシウム結合領域によって特徴付けられる。細胞外スペース中の放出されたＲｔｘ毒素のカルシム−結合は、これらのサイトトキシン活性に関して本質的なものである。これらは、ｓｅｃ−非依存的Ｉ型分泌経路によって、グラム陰性菌の内膜および外膜の双方を渡って運搬される。主な溶血性Ｅ．Ｃｏｌｉ病原菌において、ｈｌｙ決定部位は、染色体上にコードされ、その約５％において、ｈｌｙ遺伝子はプラスミド上に位置する［Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌ （１９９１） Ｉｎ： Ｓｐｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ， Ｅｄｓ． Ａｌｏｕｆ， Ｊ． Ｅ．， Ｆｒｅｅｒ， Ｊ． Ｈ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １１７−１２５； Ｍｕｅｈｌｄｏｒｆ ａｎｄ Ｈａｃｋｅｒ （１９９４） Ｍｉｃｒｏｂ． Ｐａｔｈｏｇｅｎ． １６： １７１−１８１］。
【００１８】
Ｅ．Ｃｏｌｉα−溶血素の合成および分泌は、ｈｌｙＣ、ｈｌｙＡ、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤと示された４個の遺伝子からなるオペロンによってコードされている［Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌ （１９９１） Ｉｎ： Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ， Ｅｄｓ． Ａｌｏｕｆ， Ｊ． Ｅ．， Ｆｒｅｅｒ， Ｊ． Ｈ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １１７−１２５］。ｈｌｙＡはＨｌｙＡ細胞溶解性構造タンパク質をコードするが、同時に合成されたＨｌｙＣタンパク質は、細菌サイトゾルの範囲内で、無毒性プロ溶血素（ｐｒｏＨｌｙＡ）を２個の内在性リシン残基の脂肪族アシル化によって、毒性α−溶血素（ＨｌｙＡ）に翻訳後変換することによって、ＨｌｙＡ活性化のために必要とされるものである［Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌ （１９９１） Ｉｎ： Ｓｏｕｒｃｅ ｂｏｏｋ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ， Ｅｄｓ． Ａｌｏｕｆ， Ｊ． Ｅ．， Ｆｒｅｅｒ， Ｊ． Ｈ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １１７−１２５； Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ６２： ３０９−３３３； Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３４： ８８７−９０１； Ｔｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ３７： ４６４４−４６５２； Ｔｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３８： ９５４１−９５４８］。ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤは、細菌膜を渡ってのＨｌｙＡの運搬に必要とされる［Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌ （１９９１） Ｉｎ： Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ， Ｅｄｓ． Ａｌｏｕｆ， Ｊ． Ｅ．， Ｆｒｅｅｒ， Ｊ． Ｈ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １１７−１２５］。さらに、染色体的にコードされ、かつα−溶血素オペロンの一部分でない、外膜タンパク質ＴｏｌＣは、α−溶血素分泌装置の一部分である［Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌ （１９９１） Ｉｎ： Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ， Ｅｄｓ． Ａｌｏｕｆ， Ｊ． Ｅ．， Ｆｒｅｅｒ， Ｊ． Ｈ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １１７−１２５；Ｓｃｈｌｏｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５６： ３０６−３１９］。ヘリックス（α１）−リンカー−ヘリックス（α２）モティーフを含有する、ＨｌｙＡのＣ−末端の６０個のアミノ酸の範囲内のシグナル配列は、分泌装置によって認識されるのに十分であり［Ｋｏｎｏｎａｋｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ． ８：５９５−６０５； Ｊａｒｃｈａｕ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４５：５３−６０； Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ． （２０００）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ２７１３−２７２０］、この場合、これらは、膜タンパク質ＨｌｙＢ、ＨｌｙＤおよびＴｏｌＣから構成されている。さらにＣ−末端ペプチドは、それ自体によって分泌することができる［Ｊａｒｃｈａｕ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４５：５３−６���； Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ． （２０００）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５： ２７１３−２７２０］。最近になって、α１−両親媒性ヘリックスおよびリンカーのみが示されているが、第２ヘリックスがＨｌｙＡ運搬に関して本質的であることは示されていない［Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ． （２０００）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５： ２７１３−２７２０］。ＨｌｙＡ運搬を促進する内膜通過（ｔｒａｆｆｉｃ）ＡＴＰａｓｅは、細胞質領域でＨｌｙＡ  Ｃ−末端シグナル配列を認識し、ＨｌｙＡ転座を開始させ、かつＨｌｙＡが転座される間に、内膜中で膜内外チャンネルを形成する。ＨｌｙＤは、内部および外部の細菌性膜間のリンカーとして役立つことが示唆されている。これは、内部膜中に挿入されるが、しかしながら、その多くは、周縁質中に位置し、その際、内膜のＨｌｙＢと外膜のＴｏｌＣとの双方に相互に作用することが示唆されている。周縁質ＨｌｙＢループとの相互作用によって、ＨｌｙＤおよびＨｌｙＢは、周縁質を介してチャンネルを形成する。ＨｌｙＤが、ＴｏｌＣ−相同部を有する場合には、ＨｌｙＡが分泌することによる外膜中の膜内外チャンネルの形成において、ＴｏｌＣと関係するであろうことが推定される。したがって、ＨｌｙＤは細菌膜を介してのＨｌｙＡの引き抜き（ｐｕｌｌｉｎｇ）およびその細胞外領域への放出のために必要とされる。プラスミド上にコードされたα−溶血素の場合には、Ｅ．Ｃｏｌｉ中のその合成およびその分泌は、ＨｌｙＲによって増強され、ｈｌｙＲ遺伝子によってコードされた長い距離を有するアクチベーターは、ｈｌｙＣ遺伝子上流のいくらかの距離のところに位置する［Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２１２：７６−８４ ］。対照的に、ｈｌｙＲ相同アクチベーター遺伝子は、染色体ｈｌｙ決定因子中では見出されていない［Ｌｕｄｗｉｇ ａｎｄ Ｇｏｅｂｅｌ （１９９１） Ｉｎ： Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｏｘｉｎｓ， Ｅｄｓ． Ａｌｏｕｆ， Ｊ． Ｅ．， Ｆｒｅｅｒ， Ｊ． Ｈ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． １１７−１２５］。
【００１９】
溶血素分泌装置が、多くの異なるグラム陰性細菌中で働き［Ｓｐｒｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６５： １８７−１９２］、かつ種々の起源の異種タンパク質の分泌に関して使用することができることが、従来証明されている［Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６： １８１−１８５； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９５： ５７−６６； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． ｇｅｎｅｔ． ２５２：２６６−２７４； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｂｅｈｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９５： ５７−６６； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５２： ２６６−２７４； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｇｅｎｅ． １７９： １３３−１４０； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｅｈｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９８： １０３−１１３； Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６６： ２０６０−２０６４； Ｍｏｌｌｅｎｋｒｏｆ ｅｔ ａａｌ． （１９９６） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ２１： ８５４−８６０； Ｓｐｒｅｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ （１９９８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６５： １８７−１９２； ｓｐｒｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｏｌ． ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３１： １５８９−１６０１］。これは、異種遺伝子とｈｌｙＡのＣ−末端シグナル配列との間の遺伝子融合を生じさせることによって達成され、この場合、これらは、ＨｌｙＢ、ＨｌｙＤおよびＴｏｌＣをそれぞれ細菌によって合成される場合に分泌することができる、分泌−コンピテントハイブリッドタンパク質をコードする。したがって、グラム陰性細菌ワクチンキャリアーによって分泌された抗原の発現に関する抗原運搬系として有用であることが示された。しかしながら、種々のタンパク質で得られた異種タンパク質分泌の収量は、極めて異なっていることが明らかである。したがって、溶血素分泌系を介しての異種タンパク質分泌の効率は、異種タンパク質、たとえば、Ｎ−末端シグナル配列を有するタンパク質の性質に依存し、かつ通常は、ｓｅｃ−依存型分泌経路が、溶血素分泌系によって非効率的にのみ運搬されることによって分泌される［Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｅｈｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９８： １０３−１１３］。しかしながら、この問題は、場合によってはｓｅｃＡ変異を有するホスト細胞を使用することによって回避されてもよく［Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９８： １０３−１１３］、この場合、これらは、本発明に関しての好ましい態様である。さらに、溶血素分泌系を介しての異種タンパク質分泌の効率は、ＨｌｙＡｓシグナル前方の異種遺伝子の大きさと相関する［Ｓｐｒｅｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ （１９９８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｒｔｔ． １６５： １８７−１９２］。以下に詳細に示しているように、本発明においてさらにこの問題は、��合によっては、飽和が達成されるまで目的のタンパク質を、キャリアー上のアフィニティーｔａｇを介して適した結合パートナーと結合させることによって対抗する。
【００２０】
真核生物分泌系
真核生物系は、重要な異種タンパク質の分泌のためのホスト細胞としての真核細胞の適用に関し、この場合、この真核細胞は、特に非病原性酵母、たとえば、サッカロミセス・セリビジエまたはピチア・パストリスである。本発明において、真核ホスト細胞によるそれぞれの異種タンパク質の分泌は、分泌機序による真核ホスト細胞から細胞外領域へのその運搬に関する。
【００２１】
酵母ピチア・パストリスは、非常に簡単に遺伝子操作をおこなうことができる。真核微生物である場合には、高等真核生物において生じる多くの翻訳後修飾、たとえば、タンパク質分解プロセシング、タンパク質フォールディング、ジスルフィド結合およびグリコシル化が可能である。したがって、多くの真核性タンパク質は、細菌中で発現せる際に封入体中の不活性化分子として貯蔵され、必要不可欠な翻訳後修飾を有する活性分子として、酵母細胞によって製造することができる。高等真核細胞と比較して、酵母細胞は、増殖がより早く、その発酵が簡単かつ安価であり、さらにその組換え異種タンパク質の収率が高いといった利点を有する［Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ａｎｄ Ｃｒｅｇｇ （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０： ４２２−４２７； Ｄｏｍｉｎｑｕｅａ ｅｔ ａｌ． （１９９８）Ｉｎｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １：１３１−１４２］。
【００２２】
ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、メチロトローフ性酵母（Ｍｅｔｈｌｏｔｈｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ）であり、すなわち、メチロールを代謝する。メタノール代謝における第１工程は、メタノールのホルムアルデヒドへの酸化を必要とする。この工程は、酵素“アルコール−オキシダーゼ”（ＡＯＸ）によって触媒される。酵母細胞に対する過酸化水素（酵素反応生成物）の毒性の影響を回避するために、反応は、特別な細胞器官、いわゆるペルオキソーム中で生じる。ＡＯＸ１−遺伝子の発現は緊密であり、かつ多量のメタノールによって導入される。
【００２３】
Ｐ．パストリス発現系および分泌系は、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から商業的に入手可能である。これらの系は、異種遺伝子の発現のためのＡＯＸ−プロモーターを使用する。メタノールの存在下で発酵装置中でのＰ．パストリス細胞の培養は、培養中の可溶性全タンパク質含量の３０％までの組換えタンパク質の収率を提供する。
【００２４】
Ｐ．パストリスは、細胞内で異種タンパク質を製造することができるか、あるいは、これらのタンパク質を細胞外媒体に分泌することができる。Ｅ．Ｃｏｌｉ中で複製可能であり、かつＰ．パストリスゲノム中に組み込むことが可能なシャトルプラスミドベクターが提供され、この場合、これらは、異種タンパク質の発現および分泌のために使用されてもよく、その際、これは、サッカロミセス・セレビジエからのα−因子−シグナル配列をコードする配列を含み、この場合、これらは、異種タンパク質の効果的な分泌を保証するものである。Ｐ．パストリスが、極めて少量のみの内因性タンパク質を分泌し、かつその増殖媒体が、タンパク質を必要としない場合には、分泌された異種タンパク質は、Ｐ．パストリス培養の主要な分泌生成物を形成する［Ｂｒｅｔｔｈａｕｅｒ ｕｎｄ Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ （１９９９） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０： １９３−２００； Ｂｕｃｋｈｏｌｚ ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１０６７−１０７２； Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ａｎｄ Ｃｒｅｇｇ （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０： ４２２−４２７； Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ ａｎｄ Ｃｒｅｇｇ （２０００） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ｒｅｖ． ２４： ４５−６６； Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １６： ２３−５２； Ｄｏｍｉｎｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｎｔ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １：１３１−１４２； Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １０３： Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： ８１−９４； Ｓｔｒａｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １０３： Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： １０７−１２０］。
【００２５】
Ｐ．パストリス分泌系は、本発明において使用することができる。したがって、前記に示されたＥ．Ｃｏｌｉ溶血素分泌系と同様であり、前記のピチア・パストリスベクター由来のプラスミドが構築されてもよく、この場合、これらのプラスミドは、種々の目的遺伝子および場合によっては種々のプロテアーゼ切断部位およびｔａｇ配列を有している。
【００２６】
本発明によるコンパートメント系は、障壁によって分けられた少なくとも第１コンパートメントおよび第２コンパートメントを有する。好ましくはコンパートメント系は、２個の位置的に分割されたサブセットから成る系を意味し、この場合、第１のコンパートメントは、液体の成長媒体中でかまたは平板表面上で増殖するホスト細胞を有し、第２のコンパートメントは、第１のコンパートメントと障壁によって分けられており、この場合、この障壁は、第１サブセットから第２サブセットへの、ホスト細胞によって製造および分泌されたタンパク質の流れを可能にするが、しかしながらホスト細胞の移入を防止するものである。
【００２７】
障壁は、第１コンポーネントから第２コンポーネントへの特定の対象物の流れを選択的に防止する、コンパートメント系の２個の構成成分を分ける手段を示す。特に、障壁は、コンポーネント系の２個のコンパートメントを区分分けする手段であり、その際、障壁は、タンパク質を流れを可能にするるが他のホスト細胞崩壊物を留める。特にこれは膜、好ましくは薄膜である。本発明の好ましい実施態様において、コンパートメント系の２個の構成部分を分離する障壁は、第１コンポーネントの一部分である。
【００２８】
適したコンパートメント系の例は、（ｉ）図１に示すような、上部フィルターに細菌コロニーを有し、かつ下部フィルター上に分泌されたタンパク質を有する細菌増殖用アガープレート上の二重フィルター系であり、この場合、これは、糞試料中でのＳｈｉｇａ様毒素を製造するＥ．Ｃｏｌｉ検出の原理によって示されているものであり［Ｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３１： １１６７−１１７２］、（ｉｉ）一つのコンパートメント中に液体ホスト細胞培養物、および他のコンパートメント中に分泌されたタンパク質溶液を含有する、異なるフィルター分離コンパートメントから成る系である。これら２個のコンパートメントは、ホスト細胞移入を防止するが、その濃度勾配に沿ってのタンパク質の拡散を可能にする膜によって分離されている。スモールスケールにおいては、図２に例証したように、たとえば、系は、細菌性移入を防止するが、その濃度勾配によってタンパク質を拡散することが可能な膜によって分離された積み重ねられたマイクロウェルから成る系の形でおこなわれる。この場合において、上部ウェルは、前記に示したように、目的タンパク質と適したシグナル配列（たとえば、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＨｌｙＡｓ−または酵母α−因子）との間の融合体を分泌することができるホスト細胞培養を含有していてもよい。ホスト細胞は、上部ウェル中で保持するようにフィルターによって強いられていてもよく、分泌されたタンパク質溶液は下部ウェル中に拡散し、かつ、タンパク質溶液として回収することができる。二重フィルター技術の場合には、上部フィルターは、上部から下部のフィルターへの細菌移入を防止するための孔径を有していなければならないが、しかしながら、下部のフィルターへの分泌された融合タンパク質の流れを可能にする。好ましくは、低いタンパク質結合力を有していてもよい。対照的に、下部フィルターは、最適化されたタンパク質結合力を有していなければならず、この場合、この結合力は、元来のものかまたは、上部フィルター上で増殖する細菌によって分泌されるタンパク質融合体の成分（たとえば、Ａ１タンパク質のＣ−末端領域［Ｃａｒｔｅｇｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５９： ３３７−３４８］）のための最適な結合パートナーである成分（たとえば、一本鎖酢酸）を用いて、特定の箇所で被覆された結果によるものである。双方のフィルターは、細菌増殖用アガープレートから、栄養媒体および成長因子を、細菌性コロニーが成長する上部フィルターに流動させることが可能である。一つのコンパートメントで液体細菌培地および他のコンパートメント中で分泌されたタンパク質溶液を含有する（たとえば、フィルターによって分離された積重ねられたマイクロウェル）、フィルターで分離された異なるコンパートメントを用いる技術の場合には、分離フィルターは、細菌移入を防止するが、分泌された融合タンパク質の流れが可能な孔径を有していなければならない。
【００２９】
原核細胞系：Ｅ．ｃｏｌｉα−溶血素分泌系に基づく異種タンパク質分泌のためのグラム陰性細菌株の構築
本発明に関して、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子は、細菌による完全なα−溶血素分泌装置の発現を可能にするために、染色体的にコードされたｔｏｌＣ遺伝子を有するグラム陰性細菌ゲノム中に導入された。本発明に関して、目的タンパク質は、それぞれの目的異種遺伝子とＨｌｙＡ（ｈｌｙＡｓ）のＣ−末端シグナル配列との間の遺伝子融合によって、α−溶血素分泌系を介しての分泌に適合するようにして製造された。遺伝子融合体は、適した可動性ベクター、たとえばプラスミドまたはコスミド上でクローン化された。引き続いて、これらは、完全なα−溶血素分泌装置を発現するグラム陰性細菌株中に導入され、この場合、これらは、ＨｌｙＢ、ＨｌｙＤおよびＴｏｌＣから構成されている。分泌系の適した発現は、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子を、細菌の染色体中に挿入することによって達成することができる。二者択一的に、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子は、可変性ベクター、たとえばプラスミド上でクローン化することができ、この場合、これらはさらにＨｌｙＡシグナル配列を含む融合体として、目的の異種タンパク質をコード化している。場合によっては、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子および目的の異種タンパク質をコード化する遺伝子とｈｌｙＡｓとの融合体は、それぞれ適合したプラスミド上でクローン化することができる。
【００３０】
分泌したタンパク質は、その担体上に結合させることによって、場合によってはアフィニティーｔａｇを介して、タンパク質アレイの製造のために使用することができる。場合によっては、エピトープｔａｇ配列は、目的の分泌タンパク質の簡単な検出のために含まれていてもよい。さらに、重要なタンパク質の機能の損失を回避するために、場合によっては、Ｈｌｙ−Ａ分泌シグナルおよびｔａｇ配列は、プロテアーゼ処理によって除去するために有用である。したがって、場合によっては、相当するアフィニティーおよび／またはエピトープｔａｇ配列およびプロテアーゼ切断部位は、目的の異種遺伝子の下流でクローン化されてもよい。
【００３１】
本発明に関しては、場合によっては、溶血素分泌装置をｓｅｃＡ突然変異を有するグラム陰性細菌株中に導入する。これは、Ｓｅｃ−依存型分泌経路によって通常分泌されるタンパク質の分泌に関して特に有利であり、かつ、溶血素分泌によって非効率的にのみ運搬されるＮ−末端シグナル配列を有する［Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ． Ｍｉｔｔ． ９８： １０３−１１３］。
【００３２】
場合によっては、分泌されたタンパク質は、単一タンパク質のドット、好ましくは単一タンパク質の等量のドットを有するタンパク質アレイの製造のために使用されてもよく、この場合、これらは、目的タンパク質のキャリアー上への結合によって達成されてもよく、場合によってはアレイのそれぞれの箇所上で同等の濃度でスポットされた適したパートナーとの結合を可能にするアフィニティーｔａｇを介して使用されてもよい。二重フィルター技術の場合には、上部フィルター上で成長したホスト細胞から分泌された目的タンパク質と結合するアフィニティーｔａｇの、その下部フィルター上の結合パートナーとの飽和結合は、下部フィルターへの異種タンパク質の等量での結合を確実にするものである。二者択一的に、一つのコンパートメント中での液体細菌培養および他方のフィルター上での分泌されたタンパク質溶液を含有する種々のフィルターによって分けられたコンパートメントから成る系を使用する場合には、たとえば、積重ねマイクロウェル技術の形で実施することができ、下部ウェル中で回収された分泌タンパク質の濃度が定量されてもよい。場合によっては、エピトープｔａｇ配列は、分泌された目的タンパク質の簡単な検出のために含まれていてもよい。さらに、目的タンパク質の機能の損失を回避するために、場合によっては、プロテアーゼ処理によってＨｌｙＡ−分泌シグナルおよびｔａｇ配列を除去することが有用であってもよい。したがって、場合によっは、相当するアフィニティーおよび／またはエピトープｔａｇ配列およびプロテアーゼ切断部位は、目的の異種遺伝子をコード化するベクター上でクローン化されてもよい。
【００３３】
ａ）染色体的にコードされた溶血素分泌装置を有する、グラム陰性細菌株の構築：
本発明の他の対象は、グラム陰性細菌株、場合によってはＥ．Ｃｏｌｉｌ株の構築であり、この場合、これらは、細菌の染色体の範囲内で溶血素分泌系遺伝子ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤを有している。
【００３４】
α−溶血素分泌装置を安定して発現するＥ．Ｃｏｌｉ株を生成するために、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子は、Ｅ．Ｃｏｌｉ株の細菌染色体、特にｓｅｃＡ  Ｅ．Ｃｏｌｉ突然変異体ＫＬ３２０中に組み込むことができる。したがって、試験において詳細に示しているように、プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤは、以下のクローニング方法によって構築されてもよい：クローニングされたｌａｃＺ遺伝子の範囲内でＥＣｏＲＶ制限部位を含む、□−ｐｉｒ−依存型自殺プラスミドｐＪＲＬａｃＺｉｎｓ（Ｊｏａｃｈｉｍ Ｒｅｉｄｌ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｚｂｕｒｇから譲渡されたもの）は、酵素ＥｃｏＲＶによって切断される。引き続いて、ｈｌｙＢＤ遺伝子は、コスミドｐＣＯＳ１０からＰＣＲによって増殖され、かつ、ＥｃｏＲＶ切断されたプラスミドｐＪＲＬａｃＺｉｎｓとライゲートされ、プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤを製造した。プラスミドにコード化されたｌａｃＺ遺伝子は、このクローニング技術の間に破壊される。プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤは、ｈｌｙＢＤを、任意のＥ．Ｃｏｌｉ菌株または同種ｌａｃＺ遺伝子を含有する他の細菌性菌株の染色体ＬａｃＺ遺伝子へ組み込むことが可能である。ｐｉｒ遺伝子によってコード化された、ｐ−タンパク質の含有しないＥ．Ｃｏｌｉ菌株中での染色体ｌａｃＺ遺伝子は、プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤが挿入され、プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤ上の染色体ｌａｃＺ遺伝子上とのｌａｃＺ配列とのダブルクロスオーバーが生じることによって破壊され、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子が、染色体ｌａｃＺ遺伝子に挿入される。
【００３５】
ｂ）目的タンパク質をコードする遺伝子と、ＨｌｙＡタンパク質のシグナル配列をコードするｈｌｙＡの３’−末端との遺伝子融合体を有するプラスミドの構築  本発明の他の対象は、目的タンパク質をコードする遺伝子と、ＨｌｙＡタンパク質のシグナル配列をコードするｈｌｙＡの３’−末端との遺伝子融合体を有するプラスミドであり、この場合、このプラスミドは、融合タンパク質の搬出を可能にし、かつ場合によっては、プロテアーゼ切断部位、アフィニティーｔａｇおよび／またはエピトープｔａｇを有する。
【００３６】
前記に示したように、目的タンパク質は、それぞれ目的タンパク質をコードするそれぞれの異種遺伝子と、ｈｌｙＡのＣ−末端シグナル配列との遺伝子融合体を生成することによって、α−溶血素分泌系を介しての分泌に適合して製造されてもよい。遺伝子融合体は、プラスミドを含む、適した可動性ベクター上でクローン化することができ、引き続いて、完全なα−溶血素分泌装置を安定して発現するグラム陰性細菌中に導入することができる。
【００３７】
ＳｐｒｅｎｇおよびＧｅｎｔｓｃｈｅｖ（１９９８）［Ｓｐｒｅｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ （１９９８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １６５： １８７−１９２； Ｓｐｒｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｐｂｉｏｌ． ３１： １５８９−１６０１］では、溶血素分泌系を介しての異種タンパク質分泌の効率が、ＨｌｙＡｓシグナルの前方での異種遺伝子の大きさと相関することを示している。本発明によれば、ＨｌｙＡｓ−融合タンパク質分泌細菌株は、場合によっては、等量のタンパク質ドットを有するタンパク質アレイの生成のために使用されてもよく、場合によっては、目的の異種遺伝子のクローニングと一緒に、ＨｌｙＡｓシグナル前方でのアフィニティｔａｇのクローニング（たとえば、ｈｎＲＮＡ−結合タンパク質Ａ１のＣ−末端領域；［Ｃａｒｔｅｇｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５９：３３７−３４８］）が含まれてもよく、この場合、アレイのそれぞれのスポット上での等しい濃度中でスポットされた、適したパートナー（たとえば、Ａ１の場合には一本鎖核酸）に対して結合することができる。二重フィルター技術の場合には、下部フィルター上のアフィニティーｔａｇのそのパートナーに対する飽和結合は、等量の異種タンパク質の同時に生じる結合を確実にするものである。二者択一的に、一つのコンパートメント中での液体細菌培養および他のコンパートメント中での分泌されたタンパク質溶液を有する、異なるフィルター分離コンパートメントから成る系を使用した場合には、たとえば、積重ねられたマイクロウェル技術の形で実施することができ、下部ウェル中で回収された分泌タンパク質濃度が定量されてもよい。さらに、場合によっては、エピトープｔａｇのクローニング（たとえば、Ｈｉｓ−ｔａｇ）を含むことができ、この場合、これらは、生じる融合タンパク質の検出を促進するものである。場合によっては、適したプロテアーゼ切断部位は、目的のタンパク質の機能に影響するであろう分泌シグナルおよびｔａｇ配列の除去を可能にする。
【００３８】
ｃ）重要な異種タンパク質の分泌が可能なグラム陰性細菌の構築：
本発明の他の対象は、場合によってはＥ．Ｃｏｌｉ菌株であってもよい、グラム陰性細菌株であり、この場合、この菌株は、目的タンパク質と、融合タンパク質の搬出を可能にするＨｌｙＡタンパク質をコードするｈｌｙＡの３’−末端との遺伝子融合体を有し、かつ場合によってはプロテアーゼ切断部位、アフィニティーｔａｇおよび／またはエピトープｔａｇを有するプラスミドで形質転換された、染色体ｌａｃＺ遺伝子の範囲内の溶血素分泌系遺伝子ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤを有する。
【００３９】
目的タンパク質とＣ−末端ＨｌｙＡｓ配列との融合体、ならびに場合によってはアフィニティーｔａｇおよび／エピトープｔａｇおよびプロテアーゼ切断部位を有するベクターの構築後に、前記のα−溶血素分泌装置を有するホスト菌株に形質転換することによって、最終的な細菌コンストラクトが得られた。
【００４０】
真核細胞系：異種タンパク質分泌のためのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）菌株の構築
前記に示されたＰ．パストリス分泌系は、本発明に関して使用することができる。前記に示されたＥ．Ｃｏｌｉ溶血素分泌系と同様に、前記に示されたピチア・パストリスベクターから誘導されたプラスミドが構築されてもよく、この場合、これらは、種々の目的遺伝子および場合によっては種々のプロテアーゼ切断部位およびｔａｇ配列を有している。
【００４１】
特定の生物体のそれぞれのタンパク質を有するとされるプロテオームアレイの製造のために、これら生物のそれぞれのタンパク質を分泌されてもよい。したがって、分泌されるそれぞれのタンパク質に関して、それぞれの相当する遺伝子は、ｈｌｙＡのＣ−末端シグナル配列と一緒にかまたはα−因子シグナルと一緒に融合されるべきであり、かつ別個のベクター（たとえば、プラスミド）上にクローン化され、この場合、これらのベクターはα−溶血素分泌装置を発現する細菌株かまたはピチア・パストリス菌株中に形質転換されなければならない。すなわち、そのプロテームが研究されるべき特定の微生物のオープンリーディングフレームの全量が、特定の生物体のプロテオームの全適用範囲に必要とされる細菌コンストラクトの量に反映しうる。
【００４２】
利用性
したがって、この技術は、特に、たとえば単一スポットのアレイとして、生物体の部分的かまたは完全なプロテオームを有するアレイの製造を可能にし、この場合、これらはそれぞれ、たとえば、変性されていない形での単一タンパク質で飽和されていてもよく、あるいは二者択一的な方法において、特定の分泌され、濾過されたタンパク質から成る溶液の製造を可能にする。このようなタンパク質、特にこのようなアレイは、タンパク質のさらなる精製なく直接的に、異なる化学的性質を有するタンパク質結合パートナーの同定のために使用することができ、この場合、これらのパートナーは、他のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物または他のリガンドを含む。アレイ−結合タンパク質を製造する場合において、可溶性結合パートナーを用いての試験は、直接的にそれぞれのアレイにおいて実施されてもよい（たとえば、フィルター）。タンパク質溶液を製造する場合には、結合試験は、アレイと結合した結合パートナーとまたは可溶性結合パートナーと一緒におこなうことができる。したがって、このようなアレイは、すべてのあらゆる結合試験のために適用することができ、この場合、これらの試験は、抗体結合試験および薬剤化合物とアレイと結合した標的タンパク質との結合における試験を含む。さらに、他の分子の結合挙動上での薬剤化合物の影響を試験することができる。さらに、タンパク質溶液の製造の場合には、それぞれのタンパク質は、多くの試験のために使用されてもよい。たとえば、これらは、その構造的性質およびたとえば酵素試験系における生化学的機能に関して分析することができるか、あるいは、特異的抗体を製造するための抗原として使用することができる。
【００４３】
アレイが、そのタンパク質結合能力、およびその結合および他の分子の酵素的能力における影響に関する、薬剤候補化合物の試験に関して適している場合には、本発明は、それぞれの薬剤化合物の作用機序を明らかにするために有用である。
【００４４】
特定の生物体のそれぞれのタンパク質を有するとされるプロテオームアレイを製造するために、これら生物体のそれぞれのタンパク質は分泌されてもよい。したがって、分泌されるべきそれぞれのタンパク質に関して、相当するそれぞれの遺伝子は、前記に示したような適切なシグナル配列（たとえば、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＨｌｙＡｓ−またはイーストα−因子）と一緒に融合しなけれなならず、かつ、別個の可動性ベクター（たとえば、プラスミド）上でクローン化され、この場合、これは、適した分泌系を有するホスト細胞中に形質転換されるべきである。すなわち、そのプロテオームを試験すべき特定の生物体のオープンリーディングフレームの全量は、特定の生物体のプロテオームの全有効範囲に必要とされる細菌コンストラクトの量に反映しうる。試験されるべきそれぞれのプロテオームに関して、これら２つの種類のベクター製造することが考えられる：（ｉ）タンパク質アレイ上での融合タンパク質を保持するためのアフィニティーｔａｇをコードするベクターおよび（ｉｉ）融合タンパク質を容易に検出するためのエピトープｔａｇをコードするベクター。したがって、特定の生物体によって製造されたタンパク質の相互作用における試験は、アフィニティーｔａｇを介して“アフィニティーｔａｇ−ベクター”上でコードされた、すべてのタンパク質のアレイ上への結合、このアレイの“エピトープｔａｇ−ベクター”上でコードされたタンパク質を含有する溶液でのオーバーレイ（ｏｖｅｒｌａｙｉｎｇ）、およびエピトープｔａｇを介してのアレイ−結合体と可溶性タンパク質との相互作用の検出によって実施することができる。
【００４５】
試験
材料−培地、薬剤、酵素およびオリゴヌクレオチド
細菌は、液体培地Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）または１％カザミノ酸を添加された最少Ｍ９培地、またはＬＢ−アガーまたはＭ９＋１％カザミノ酸−アガープレート、あるいはヒツジ血液を有するコロンビアアガープレート、あるいは血液を有するエンテロ溶血素（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）−アガープレート上で増殖させ、その際、後者の２つは、Ｏｘｉｏｉｄ社（Ｗｅｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供されている。組換えプラスミドを有する菌株は、選択的抗生物質による圧力下で培養された。抗生物質濃度は、それぞれのプラスミドのコピー数に依存する（１０〜１００μｇ／ｍｌ）。いくつかの試験において、５％濃度のショ糖および／または２％Ｘ−ｇａｌ溶液（ジメチルホルミアルデヒド中の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−ガラクトキシド）  １０ｍｌ／ｌを、細菌増殖培地に添加した。薬剤は、別記しない限りは、Ｍｅｒｃｋ（Ｉｓｍａｎｉｎｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｑｕｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳｉｇｍａ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入したものである。制限酵素は、Ａｍｅｒｓｃｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（Ｆｒｅｉｂｕｒｕｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入したものである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のために使用されるＴａｇＤＮＡポリメラーゼおよび薬剤は、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｋｏｅｌｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。ＰＣＲのためのプライマーとして使用されたオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ社（Ｕｌｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入したものである。
【００４６】
菌株、ピチア・パストリス株、プラスミド、コスミド、オリゴヌクレオチドおよび抗体
ピチア・パストリス菌株は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能である。ＰＣＲのためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、第１表に挙げられており、かつＩｎｔｅｒａｃｔｉｖａ社から入手可能である（Ｕｌｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。抗体は種々の出所から入手し、かつ、結果の部分に示した。
【００４７】
フィルター材料およびフィルター装置
本発明の予試験において使用される薄膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳａｒｔｏｒｉｕｓ社（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供された。これらは、ニトセルロース、セルロース混合エステルまたはポリ二塩化ビニリデンから成るものである。特定の試験のために使用されたフィルターは、結果の部分に示した。
【００４８】
Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供された“ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ”は、“積重ねマイクロウェル技術”の原理を示すために使用した。
【００４９】
方法
種々のＥ．Ｃｏｌｉ菌株の溶血素生成の測定
Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株の溶血反応活性は、Ｏｘｏｉｄ社によって提供された血液アガープレート上でこれらの菌株を培養することによって試験した。溶血素Ｅ．ｃｏｌｉ菌株は、細菌コロニー周囲の透明な溶血反応領域を惹起する（Ｍｕｅｈｌｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。
【００５０】
それぞれ溶血素オペロンを有する、尿路疾患Ｅ．ｃｏｌｉ菌株５３６、病原性アイランド（Ｐａｉｓ）ＩおよびＩＩ欠損の同系遺伝子系突然変異体５３６−２１［Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５２：１２４１−１２４７； Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６２： ６０６−６１４； Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３） ｊ． ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５４： １１１４５−１１５４］、ｈｌｙ−ネガティブ突然変異体５３６−３９−１９２［Ｊｏｅｒｇ Ｈａｃｋｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ， Ｇｅｍａｎｙ および Ｉｎｇｅ Ｍｕｅｈｌｄｏｆｅｒ， Ｄｅｐａｒｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｂｙｌ Ｇｕｌｄｅｎ， Ｋｏｎｓｔａｎｚ． Ｇｅｒｍａｎｙ によって寄託されている］および１５個の他のＥ．Ｃｏｌｉ菌株（Ｋ−１２ｗｔ［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） ｎｏ． ２９４２５］、ＪＭ１０９［ＡＴＣＣ ｎｏ， ５３３２３によって寄託されている］、ＤＨ１［ＡＴＣＣ ｎｏ． ３３８４９］、ＬＥ３９２［ＡＴＣＣ ｎｏ，３３５７２によって寄託されている］、Ｗ６７８［ＤＳＭ ｎｏ， ６９６８によって寄託されている］３５［ＳｍｉｔｈおよびＬｉｎｇｇｏｏｄ （１９７１）Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４： ４６７−４８５］、Ｊ５３［Ｔａｙｌｏｒ （１９８３） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ｒｅｖ． ４７： ４６−８３．］、ＥＮ９９［Ｂｌｕｍ． （１９９４） Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ， ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｚｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ］ＷＫ６［ＡＴＣＣ ｎｏ， ４７０７８によって寄託されている］、ＨＢ１０１［ＡＴＣＣ ｎｏ， ３３６９４によって寄託されている］、５Ｋ［ＣＧＳＣ ｎｏ， ５５８１によって寄託されている］、ＣＣ１１８［ＭａｎｏｉｌおよびＢｅｃｋｗｉｔｈ（１９８５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：８１２９−８１３３］、Ｃ６００［ＡＴＣＣ ｎｏ， ２３７２４によって寄託されている］、ＭＣ１０２９［Ｃａｓａｄａｂａｎ および Ｃｏｈｅｎ （１９８０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３８： １７９−２０７］、ＤＨ５α［ＡＴＣＣ ｎｏ， ５３３２３によって寄託されている］であり、この場合、これらすべては、Ｊｏｅｒｇ  Ｈａｃｋｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙから提供されたものである）は、一晩に亘っての培養した後にヒツジ血液アガープレート上でその溶血反応活性に関して比較された。図３で示したように、野生型ＵＰＥＣ菌株５３６のみが、赤血球の溶血を惹起する。他の試験において、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株５３６、５３６−２１、Ｊ５３（ｐＵＣＨｌｙＡ）およびＪ５３（ｐＵＣ１８）は、一晩に亘っての培養の後にヒツジ血液アガープレート上でその溶血反応活性について比較された。Ｅ．Ｃｏｌｉ５３６およびＪ５３（ｐＵＣＨｌｙＣＡ）のみが、赤血球の溶血を惹起していた。
【００５１】
ＤＮＡクローニング技術
ＤＮＡ単離、制限酵素を用いてのＤＮＡ切断、アガロースゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの溶離、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株のプラスミドＤＮＡでの形質転換、ＤＮＡプローブの製造、コロニーハイブリダイゼーションおよびサザンハイブリダイゼーション、およびＰＣＲは、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， ｅｄｓ． （２００１） ３ｒｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ］中に記載のようにしてか、および／または、相当するキット、薬剤および酵素の前記に示された供給元によって提供されたマニュアルにしたがっておこなった。
【００５２】
ＤＮＡシークエンシング
キアジェン（Ｑｕｉａｇｅｎ）プロトコールにしたがって単離されたＤＮＡのシークエンシングを、ＧＡＴＣ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＴｏｐｌａｂ（Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によっておこなった。
【００５３】
Ｇ．Ｂｌｕｍ−Ｏｅｈｌｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇによって提供されたコスミドｐＣＯＳ１０［Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６８： ２２−３０］は、尿路疾患性Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）菌株５３６のＰａｉＩ［Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５２： １２４１−１２４７； Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６２： ６０６−６１４； Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５４： １１１４５−１１５４］を含有するものである。Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株ＨＢ１０１（ｐＣＯＳ１０）からの単離に引き続いて、ＰＯＳ１０上でコードされた溶血素オペロンのシークエンシングを、ＧＡＴＣ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって実施した。
【００５４】
ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
タンパク質の検出は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によっておこなわれ、引き続いて、特定の一次抗体およびプロメガ  プロト  ブロット  アルカリフォスファターゼ系を用いてウェスタンブロット分析をおこなった［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ， ｅｄｓ． （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ３ｒｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｐｒｏｍｅｇａ ｍａｎｕａｌ］。
【００５５】
染色体上にコードされた溶血素分泌装置を有するＥ．Ｃｏｌｉ菌株の構築
α−溶血素分泌装置を安定して発現するＥ．Ｃｏｌｉ菌株を生成するために、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子をコードする３．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、種々の非病原性Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株の細菌性染色体中に組み込み、この場合、これらは、Ｋ−１２野生型、Ｅ．ＣｏｌｉＢＬ２１およびＪ５３を含む。
【００５６】
以下のクローニング工程をおこなった；プラスミドｐＪＲＬａｃＺｉｎｓ（Ｊｏａｃｈｉｍ Ｒｅｉｄｌ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇから譲渡されたもの）を、ベクタープラスミドとして使用した。これは、プラスミドｐＣＶＤ４２２に基づく、そのλ−ｐｉｒ−依存型自殺プラスミドであり、この場合、これは、ｂｌａ遺伝子の存在によってアンピシリン耐性を有し、かつ、ｓａｃＢ遺伝子の存在によって、増殖温度３０℃で、５％スクロースの存在下で増殖に対する感受性を有するものである。その後にプラスミドｐＣＶＤ４２２およびその誘導体は、Ｐｉｒ−タンパク質を有する細菌、たとえば、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２菌株Ｓｙ３２７およびＳｍ１０λｐｉｒ中でのみ増殖することができる。クローニングされたｌａｃＺ遺伝子の範囲内でＥｃｏＲＶ切断部位を含有する、プラスミドｐＪＲＬａｃＺｉｎｓは、制限酵素ＥｃｏＲＶによって切断された。その後に、ｈｌｙＢＤ遺伝子を、コスミドＰＣＯＳ１０から、プライマーＳｔｕＨｌｙＢ１およびＨｌｙＤ２Ｓｔｕを用いて、ＰＣＲによって増幅し、ＳｔｕＩでのＰＣＲ産物の消化の後に、ＥｃｏＲＶによって切断されたプラスミドｐＪＲＬａｃＺｉｎｓとライゲートし、プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤを製造した。プラスミドにコードされたｌａｃＺは、このクローニング工程中において破壊された。
【００５７】
プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤは、ｈｌｙＰＢＤ遺伝子を、任意のＥ．ｃｏｌｉ菌株の染色体ｌａｃＺ遺伝子に組み込むか、または同種ｌａｃＺ遺伝子を有する細菌性菌株に組み込むことを可能にし、この場合、これは、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株Ｋ−１２野生型、ＢＬ２１およびＪ５３で例証されている。ｐｉｒ遺伝子によってコードされた、ｐ−タンパク質不含のＥ．Ｃｏｌｉ菌株中の染色体ｌａｃＺ遺伝子は、プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤの導入およびプラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤ上でのｌａｃＺ配列と染色体ｌａｃＺ遺伝子とのダブル−クロスオーバーの発生の後に破壊され、その後に、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＰＤ遺伝子を染色体ｌａｃＺ遺伝子に挿入される。ＬａｃＺ−ネガティブ突然変異体は、表現型的に、得られた菌株が、５％スクロースおよびＸ−ｇａｌを添加したＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ培地）を含むアガープレート上で、３０℃で白色のコロニーが増殖するかどうかについて、およびアンピシリン耐性であるかどうかについて試験することによってスクリーニングした。遺伝型的に、突然変異体を、プライマーｌａｃＺＥＶ−ｕｐおよびｌａｃＺＥＶ−ｄｏｗｎを用いて、ＰＣＲ分析によって試験した。突然変異体から得られたＰＣＲ産物は、野生型ｌａｃ−ポジティブ菌株のものから産物とはその大きさにおいて異なっており、これは、ｈｌｙＢ、ｈｌｙＤ配列の組み込みから生じるものである。さらに、推定される突然変異体の染色体ＤＮＡは、ｌａｃＺおよび組み込まれたｈｌｙＢＤ配列の範囲を切断しない制限酵素で切断することが可能であり、その後にｌａｃＺプローブを用いてのサザンブロット分析をおこなうことができる。突然変異体は、ＤＮＡバンドのシフトによって野生型ｌａｃＺ−ポジティブ菌株とは異なるが、これは、ｈｌｙＢＤ配列の組み込みから生じるものである。
【００５８】
タンパク質Ｘ−ＨｌｙＡｓ−融合タンパク質をコードする遺伝子間の融合体を有するプラスミドの構築
本発明によって請求されたタンパク質製造のための方法を、例証的に確認するために、ｈｌｙＣおよびｈｌｙＡ遺伝子を有するプラスミドｐＵＣＨｌｙＣＡを構築し、プライマーＳｔｕＨｌＣ４およびＨｌｙＡ３ＳｔｕおよびコスミドｐＣＯＳ１０をテンプレートとして用いてＰＣＲによって増幅させ、ＰＣＲ産物をＳｔｕＩで切断した後に、ＳｍａＩによって切断されたプラスミドベクターｐＵＣ１８とライゲートした。
【００５９】
さらに、プラスミドｐＴＯＰＯＭｙｃＨｉｓＨｌｙＡｓを構築した。トロンビンをコードする遺伝子、Ｍｙｃ−エピトープおよびＨｉｓ−ｔａｇを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプラスミドベクターｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡをテンプレートとして、１８ｂｐのトロンビン遺伝子配列を有するＴｈｒｏｍＭｙｃＢＡＤプライマーをフォアードプライマーとして、かつ、ＨｉｓｐＢＡＤプライマーをリバースプライマーとして用いて、ＰＣＲによって増幅させた。得られる８９ｂｐのＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯのｌａｃＺ遺伝子中にクローニングし、プラスミドｐＴＯＰＯ−Ｔｈｒ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。引き続いて、ｈｌｙＡｓ特異的配列を、プライマー対ＸｂａＨｌｙＡｓ−ｕｐおよびＸｂａＨｌｙＡｓ−ｄｏｗｎまたはＸｂａＨｌｙＡｓ−ｕｐおよびＸｂａＨｌｙＡｓリンカーを用いて、ｐＯＣＯＳ１０から増幅させ、１８３または９９ｈｌｙＡｓ−特異的ｂｐを有し、かつＸｂａＩ部位が添加された、ｈｌｙＡ−特異的ＰＣＲ産物を生じ、この場合、これは、前記に示されたプラスミドｐＴＯＰＯ−Ｔｈｒ−Ｍｙｃ−ＨｉｓのＸｂａＩ部位にクローニングされた。最終的なプラスミドコンストラクトは、それぞれ１８３または９９ｈｌｙＡｓ−特異的ｂｐを有する、ｐＴＯＰＯＭｙｃＨｉｓＨｌｙＡｓ−Ａまたは−Ｂと呼称される。
【００６０】
目的の異種タンパク質の分泌を可能にするグラム陰性細菌の構築
本発明によるタンパク質製造のための方法を試験的に確認する目的のために、プラスミドｐＵＣＨｌｙＣＡを、形質転換によって、前記に示されたｈｌｙＢＤ＋Ｅ．Ｃｏｌｉコンストラクトに導入した。得られたＥ．Ｃｏｌｉｌ菌株は、染色体上にコードされた溶血素分泌系およびプラスミドコードされたサイトトキシン、α−溶血素ＨｌｙＡ、および毒素アクチベーターＨｌｙＣを有していた。ＨｌｙＡサイトトキシンの分泌は、ヒツジ血液アガープレート上の濾過滅菌された（０．４５μｍフィルター）培養上清の溶血反応活性によって明らかになった。
【００６１】
Ｅ．Ｃｏｌｉα−溶血素に基づく分泌系の構築
前記に示されたように、細菌に完全なα−溶血素分泌装置の発現の可能にさせる目的で、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子を、染色体上にコードされたｔｏｌＣ遺伝子を有するグラム陰性細菌ゲノムに導入した。目的タンパク質は、それぞれの目的異種遺伝子とＨｌｙＡ（ｈｌｙＡｓ）のＣ−末端シグナル配列との遺伝子融合体の作製によって、α−溶血素分泌系を介しての分泌に適合するようにして製造された。遺伝子融合体は、適した可動性ベクター、たとえばプラスミドまたはコスミド上でクローン化した。引き続いて、これらを、ＨｌｙＢ、ＨｌｙＤおよびＴｏｌＣから成る完全なα−溶血素分泌装置を発現するグラム陰性細菌中に導入した。分泌系の安定した発現は、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤを細菌性染色体中に挿入することによって達成することができる。二者択一的に、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子は、可動性ベクター、たとえばプラスミド上にクローニングされてもよく、この場合、これらは、ＨｌｙＡシグナル配列との融合体として目的の異種タンパク質をコードするか、あるいは、ｈｌｙＢまたはｈｌｙＤ遺伝子、および目的異種タンパク質をコードする遺伝子とｈｌｙＡｓとの融合体を、別個の適合するプラスミド上でクローニングすることができる。
【００６２】
α−溶血素分泌装置を安定して発現するＥ．Ｃｏｌｉ菌株を製造するために、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子をコードする３．６ｋｂＤＮＡフラグメントを、以下のクローニング工程にしたがって、Ｅ．Ｃｏｌｉの染色体遺伝子ｌａｃＺまたはｒｅｃＡ遺伝子中に組み込んだ：
ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤのＥ．Ｃｏｌｉ菌株Ｊ５３の染色体ｌａｃＺ遺伝子への組み込み
プラスミドｐＪＲＬａｃＺｉｎｓ  ９．５ｋｂ（Ｊｏａｃｈｉｍ Ｒｅｉｄｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇから譲渡されたもの）を、ベクタープラスミドとして使用した。これは、６．３ｋｂのプラスミドｐＣＶＤ４２２に基づくλ−ｐｉｒ−依存型自殺プラスミドであり、ｂｌａ遺伝子の存在によるアンピシリン耐性およびｓａｃＢ遺伝子の存在による５％スクロースおよび３０℃の増殖温度下での増殖に対する感受性を有している。結果として、プラスミドｐＣＶＤ４２２、この場合、このＤＮＡ配列はＧＡＴＣ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供されたものであり、かつその誘導体は、λ−タンパク質を有する細菌、たとえば、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株Ｓｙ３２７およびＳｍ１０λｐｉｒ中でのみ複製することができる。ＬａｃＺ配列の範囲内でＥｃｏＲＶ制限部位を含むプラスミドｐＪＲＬａｃＺｉｎｓを、制限酵素ＥｃｏＲＶで切断した。その後に、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメント３．６ｋｂを、コスミドｐＣＯＳ１０から、Ｓｔｕ−ＨｌｙＢ１によって切断された
【００６３】
【外１】
2004516029.tif 000003
【００６４】
（受託番号Ｍ１４１０７を有する溶血素特異的配列にしたがって切断したもの）およびＨｌｙＤ２Ｓｔｕによって切断された
【００６５】
【外２】
2004516029.tif 000004
【００６６】
（受託番号Ｍ１４１０７を有する溶血素特異的配列にしたがって切断したもの）を用いてＰＣＲによって増幅させ、ＰＣＲ産物をＳｔｕＩで消化した後に、ＥＣｏＲＶによって切断されたプラスミドｐＪＲＬａｃＺｉｎｓとライゲートし、１３．１ｋｂのプラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤを製造した。プラスミドにコードされたｌａｃＺ遺伝子は、このクローニング工程中で破壊された。プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤは、ｈｌｙＢＤ遺伝子の、任意のＥ．Ｃｏｌｉ菌株または同種ｌａｃＺ遺伝子を有する他の細菌株中へのｈｌｙＢＤ遺伝子の組み込みを可能にした。ｐｉｒ遺伝子によってコードされた、ｐ−タンパク質を不含のＥ．Ｃｏｌｉ菌株中の染色体ＬａｃＺ遺伝子は、プラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤの導入およびプラスミドｐＬａｃＨｌｙＢＤ上のｌａｃＺ配列と染色体ｌａｃＺ遺伝子との間のダブルクロスオーバーの発生の後に破壊され、引き続いてｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子は染色体ｌａｃＺ遺伝子中に挿入される。ＬａｃＺ−ネガティブ突然変異体を、５％スクロースおよびＸ−Ｇａｌが添加されたＬｙｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ媒体を含むアガープレート上でのホワイトコロニーとして、３０℃で増殖するか、およびアンピシリン耐性を欠如しているかどうか試験することによって表現型的にスクリーニングした。遺伝的に、突然変異を、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ特異的（受託番号Ｖ００２９６）
【００６７】
【外３】
2004516029.tif 000005
【００６８】
を用いて、ＰＣＲ分析によって試験した。突然変異体から得られたＰＣＲ産物は、野生型ｌａｃＺ−ポジティブ菌株のものとはその大きさによって異なっており、それというのもｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ配列の組み込みのためである。さらに、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ配列の染色体ｌａｃＺ遺伝子への組み込みを、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【００６９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２菌株Ｊ５３の染色体ｒｅｃＡ遺伝子へのｈｌｙＢおよびｈｌｙＤの組み込み
ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメント  ３．６ｋｂを、テンプレートとしてのコスミドｐＣＯＳ１０、およびそれぞれ受託番号Ｍ１４１０７であるＧＡＴＣ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確立されたコスミドｐＣＯＳ１０の溶血素特異的配列にしたがってデザインされた
【００７０】
【外４】
2004516029.tif 000006
【００７１】
を用いてＰＣＲによって増幅させた。得られた３．６ｋｂＰＣＲ産物は、Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂａｄ  Ｓｏｄｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ社から市販されているプラスミドベクターｐＥＴＢｌｕｅ−１［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖａｇｅｎ．ｃｏｍ］とライゲートし、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−ｈｌｙＢＤ７．１ｋｂを得た。ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子は、ＩＰＴＧ−誘導性Ｔ７プロモーターの制御下で発現するといった結果が得られた。
【００７２】
テンプレートとしてｐＥＴＢｌｕｅ１−ｈｌｙＢＤ、およびｐＥＴＢｌｕｅ１−ｈｌｙＢＤ配列にしたがってデザインされた
【００７３】
【外５】
2004516029.tif 000007
【００７４】
および前記に示されたリバースプライマーＨｌｙＤ２を用いてのＰＣＲによって、３．９ｋｂのＰＣＲ産物を生じ、この場合、これらは、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子ならびに停止コドンおよびｈｌｙＢの上流のｌａｃＯ／Ｔ７プロモーター配列を有する“Ｓｔｏｐ−ｌａｃＯ／Ｔ７プロモーター−ｈｌｙＢＤ”を形成している。
【００７５】
テンプレートとしてのＥ．Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２菌株Ｃ６００、および双方ともに受託番号ＡＥ０００３５４として示される
【００７６】
【外６】
2004516029.tif 000008
【００７７】
を用いてのＰＣＲは、ｙｇａＤ配列によって上流におよびＯｒａＡ配列によって下流にフランキングされたｒｅｃＡ遺伝子を有するＤＮＡフラグメント２．２ｋｂを増幅させた。得られたＰＣＲ産物２．２ｋｂの、インヴィトロジェン社から市販されているプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  ３．９ｋｂの２９５位への挿入は、６．１ｋｂのプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｙｇａＤ−ｒｅｃＡ−ｏｒａＡを生じた。プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｙｇａＤ−ｒｅｃＡ−ｏｒａＡは、制限酵素ＡｃｃＩで消化することによって直線化され、この場合、これは、ｒｅｃＡ遺伝子の範囲内のｙｇａＤ−ｒｅｃＡ−ｏｒａＡインサート  ２．２ｋｂの９９４位において切断され、クレノーフラグメントによる処理でブラントエンドにされる。
【００７８】
前記に示された３．９ｋｂのＰＣＲ産物“Ｓｔｏｐ−ｌａｃＯ／Ｔ７プロモーター−ｈｌｙＢＤ”と、前記に示されたＡｃｃＩによって切断されたプラスミド６．１ｋｂ“ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｙｇａＤ−ｒｅｃＡ−ｏｒａＡ”とのライゲーションによって、１０ｋｂのプラスミド“ｐＣＲ２．１−ｙｇａＤ−ｒｅｃＡ’−Ｓｒｏｐ−ＰＴ７−ｈｌｙＢＤ−ｒｅｃＡ’’−ｏｒａＡ”が得られ、この場合、これらは、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩによって連続的に消化されており、結果として、ｙｇａＤおよびｒｅｃＡ特異的配列によって上流に、およびｒｅｃＡおよびｏｒａＡ特異的配列によって下流にフランキングされた、３．９ｋｂ“Ｓｔｐ−ｌａｃＯ／Ｔ７  プロモーター−ｈｌｙＢＤ”フラグメントを含有する６．２ｋｂ  ＤＮＡフラグメントを得た。引き続いて、この６．２ｋｂＤＮＡフラグメントを、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで消化された前記６．３ｋｂ自殺ベクタープラスミドｐＣＶＤ４４２とライゲートし、結果として１２．５ｋｂのプラスミドｐＣＶＤ４４２−ＰＴ７−ｈｌｙＢＤを得た。
【００７９】
プラスミドｐＣＶＤ４４２−ＰＴ７−ｈｌｙＢＤは、Ｔ７プロモーターの制御下で、ｒｅｃＡ＋Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の染色体ｒｅｃＡ遺伝子中に、ｈｌｙＢＤ遺伝子を組み込むことを可能にする。ｐｉｒ遺伝子によってコードされるｐ−タンパク質を有しない、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株中での染色体ｒｅｃＡ遺伝子は、プラスミドｐＣＶＤ４４２−ＰＴ７−ｈｌｙＢＤの導入およびプラスミドｐＣＶＤ４４２−ＰＴ７−ｐｈｌｙＢＤ上のｒｅｃＡ配列と染色体ｒｅｃＡ遺伝子との間のダブルクロスオーバーの発生の後に破壊され、この結果として、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子が染色体ｒｅｃＡ遺伝子中に挿入される。ＲｅｃＡ−ネガティブ突然変異体は、５％スクロースおよびＸ−ｇａｌが添加されたＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地を含有するアガープレート上での、３０℃でのその増殖に関して、およびアンピリシン耐性の欠如に関して、同様にＵＶ光線、マイトマイシンＣおよびメチルメタンチオスルホネートに対する感受性に関して、表現型的にスクリーニングした［Ｍｕｅｈｌｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６４： ４９５−５０２］。遺伝的に、突然変異体を、それぞれｒｅｃＡ遺伝子の範囲内でＡｃｃＩ部位の上流および下流で結合する
【００８０】
【外７】
2004516029.tif 000009
【００８１】
を用いて、ＰＣＲ分析によって試験した。突然変異体から得られたＰＣＲ産物は、その大きさによって野生型ｒｅｃ−ポジティブ菌株のものと異なっており、この場合、これは、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ配列の組み込みによって生じるものである。さらに、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ配列の染色体ｒｅｃＡ遺伝子への組み込みは、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。
【００８２】
目的タンパク質をコードする遺伝子とｈｌｙＡｓとの融合体を有するプラスミドの構築
前記に示したように、目的タンパク質は、それぞれの目的の異種遺伝子とＨｌｙＡのＣ−末端シグナル配列（ｈｌｙＡｓ）との遺伝子融合体を製造することによって、α−溶血素分泌系を介しての分泌に適合して製造される。遺伝子融合体を、適した可動性ベクター、たとえばプラスミドまたはコスミド上でクローニングする。その後に、これらは、ＨｌｙＢ、ＨｌｙＤおよびＴｏｌＣから成る完全なα−溶血素分泌装置を発現するグラム陰性菌中に導入する。目的遺伝子とｈｌｙＡｓとの融合体に加えて、場合によっては、アフィニティーｔａｇおよび／またはエピトープｔａｇおよび／またはプロテアーゼ切断部位をコードする配列を、前記に示したように含んでいてもよい。分泌系の適した発現は、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子の細菌染色体中への挿入によって達成することができる。二者択一的に、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子は、可動性ベクター、たとえばプラスミド上でクローニングしてもよく、この場合、これは、さらにＨｌｙＡシグナル配列との融合体として目的の異種タンパク質をコードしている。他の場合において、ｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子、および目的の異種タンパク質をコードする遺伝子とｈｌｙＡｓとの融合体は、別個の適したプラスミド上でクローニングすることができる。
【００８３】
染色体またはプラスミドに位置するｈｌｙＢＤ、ならびに染色体ｔｏｌＣ遺伝子を有するＥ．Ｃｏｌｉ菌株にその後に形質転換される、ｈｌｙＡｓと種々の目的異種遺伝子との融合体を有するプラスミドが構築された。これらの例は、プラスミドコンストラクトｐＵＣＨｌｙＣＡ、ｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＨｌｙＣＡ、ｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＰｈｏＡ−ＨｌｙＡｓおよびｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＬａｃＺ−ＨｌｙＡｓであり、以下のようにして製造された：
３．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、受託番号Ｍ１４１０７を有する溶血素特異的配列およびＳｔｕＩによって切断可能な配列にしたがってデザインされた
【００８４】
【外８】
2004516029.tif 000010
【００８５】
およびテンプレートとしてコスミドｐＣＯＳ０を用いて、ＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し、引き続いて、ＳｍａＩで切断されたプラスミドベクターｐＵＣ１８とライゲートし、ｈｌｙＣおよびｈｌｙＡ遺伝子を有するプラスミドｐＵＣＨｌｙＣＡ  ６．３ｋｂを製造した。
【００８６】
３．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＧＡＴＣ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確立されたコスミドｐＣＯＳ１０の溶血素特異的配列にしたがってデザインされた、
【００８７】
【外９】
2004516029.tif 000011
【００８８】
を用いてＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶによって切断された３．５ｋｂプラスミドベクターｐＥＴＢｌｕｅ−１でライゲートし、Ｔ７プロモーターの制御下で、ｈｌｙＣおよびｈｌｙＡ遺伝子を有する、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＨｌｙＣＡ  ７．１ｋｂを製造した。
【００８９】
１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを、３段階クロスオーバーＰＣＲ（３−ｓｔｅｐ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ＰＣＲ）で増幅させ、この場合、第１ＰＣＲで、テンプレートとしてＥ．Ｃｏｌｉ、
【００９０】
【外１０】
2004516029.tif 000012
【００９１】
を用いて、第２ＰＣＲで、テンプレートとしてｐＣＯＳ１０および
【００９２】
【外１１】
2004516029.tif 000013
【００９３】
を用いて、さらに第３ＰＣＲで、第１ＰＣＲおよび第２ＰＣＲから得られたＰＣＲ産物をテンプレートとして、プライマーＭｉｂｉ−１４８およびＭｉｂｉ−１４９を用いて増幅させた。それぞれのプライマーは、Ｅ，Ｃｏｌｉ  ｐｈｏＡ（受託番号Ｍ１９６６６  ＪＯ４０７９）およびＧＡＴＣ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確立されたコスミドｐＣＯＳ１０の溶血素特異的配列にしたがってデザインされた。第３ＰＣＲから得られた１．５ｋｂＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶでで切断された３．５ｋｂプラスミドベクターｐＥＴＢｌｕｅ−１とライゲートし、Ｔ７プロモーターの制御下で、ｐｈｏＡ−ｈｌｙＡｓ融合体を有する５ｋｂのプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＰｈｏＡ−ＨｌｙＡｓを製造した。
【００９４】
３．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、３段階クロスオーバーＰＣＲ中で増幅させ、この場合、第１ＰＣＲで、テンプレートとしてＥ．Ｃｏｌｉ、
【００９５】
【外１２】
2004516029.tif 000014
【００９６】
を用い、第２ＰＣＲで、ｐＣＯＳ１０をテンプレートとして、
【００９７】
【外１３】
2004516029.tif 000015
【００９８】
を用いて増幅させ、さらに第３ＰＣＲにおいて、第１および第２ＰＣＲから得られたＰＣＲ産物をテンプレートとして、プライマーＭｉｂｉ−１４４およびＭｉｂｉ−１４５をで用いて増幅させた。それぞれのプライマーは、Ｅ．ＣｏｌｉｌａｃＺ（受託番号Ｖ００２９６）、ＧＡＴＣ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確立されたコスミドｐＣｏｓ１０の溶血素特異的配列にしたがってデザインされた。第３ＰＣＲから得られた３．２ｋｂのＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで切断された３．５ｋｂのプスミドベクターｐＥＴＢｌｕｅ−１とライゲートし、Ｔ７プロモーターの制御下でｌａｃＺ−ｈｌｙＡｓ融合体を有している、ｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＬａｃＺ−ＨｌｙＡｓプラスミド  ６．７ｋｂを製造した。
【００９９】
４．２ｋｂのプラスミドｐＴＯＰＯ−Ｔｈｒ−Ｍｙｃ−ＨｌｙＡｓを、以下のようにして構築した：トロンビン、Ｍｙｃ−エピトープおよびＨｉｓ−ｔａｇををコードする遺伝子を、インビトロジェンプラスミドベクターｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡをテンプレートとして、
【０１００】
【外１４】
2004516029.tif 000016
【０１０１】
を用いてＰＣＲによって増幅した。得られた８９ｂｐのＰＣＲ産物を、インビトロジェンベクターｐＣＲ２．１．−ＴＯＰＯのｌａｃＺ遺伝子にクローニングすることによって、４．０ｋｂのプラスミドｐＴＯＰＯ−Ｔｈｒ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓを得た。その後に、ＮｓｉＩによって制限可能な配列によってフランキングされたｈｌｙＡｓを含有するＤＮＡフラグメント２１３ｂｐを、
【０１０２】
【外１５】
2004516029.tif 000017
【０１０３】
を用いて、コスミドｐＣＯＳ１０をテンプレートとして用いて増幅させた。Ｎｓｉ切断されたＰＣＲ産物と、Ｎｓｉ切断されたベクターｐＴＯＰＯ−ｔｈｒ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓとのライゲーションによって、最終的に４．２ｋｂのプラスミドコンストラクトｐＴＯＰＯ−ｔｈｒ−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ＨｌｙＡｓが得られ、この場合、このコンストラクトは、ｈｌｙＡｓおよび目的の種々の遺伝子、たとえば、ｈｌｙＣＡ、ｌａｃＺ、ｐｈｏＡのための組み込み部位として使用される単一のＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位の上流にトロンビン、Ｍｙｃ−エピトープ、Ｈｉｓ−ｔａｇをコードする配列を有している。
【０１０４】
さらに、後に染色体ｔｏｌＣのみを有するＥ．ｃｏｌｉ菌株に形質転換される、ｈｌｙＡｓと種々の目的の異種遺伝子、ならびにｈｌｙＢおよびｈｌｙＤ遺伝子との融合体を有するプラスミドが構築された。これらの例は、プラスミドコンストラクトｐＵＣＨｌｙＣＡＢＤ、ｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＰｈｏＡ−ＨｌｙＡｓＢＤおよびｐＥＴＢｌｕｅ−１−ｌａｃＺ−ＨｌｙＡｓＢＤである。コントロールベクターとして、さらにｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＨｌｙＡｓＢＤが構築された。
【０１０５】
プラスミドｐＵＣＨｌｙＣＡＢＤを以下のようにして構築した：７．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＧＡＴＣ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確立されたコスミドｐＣＯＳ１０の溶血素特異的配列にしたがってデザインされた、
【０１０６】
【外１６】
2004516029.tif 000018
【０１０７】
を用いてのＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで切断された３．５ｋｂのプラスミドベクターｐＥＴＢｌｕｅ−１とライゲートし、Ｔ７プロモーターの制御下でｈｌｙＣＡＢＤオペロンを有している、１０．７ｋｂのプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＨｌｙＣＡＤＢを製造した。
【０１０８】
プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＰｈｏＡ−ＨｌｙＡｓＢＤを、以下のようにして構築した：５．２ＫｂのＤＮＡフラグメントを、３段階のクロスオーバーＰＣＲ中で増幅させ、この場合、第１ＰＣＲでテンプレートとしてＥ．Ｃｏｌｉおよび
【０１０９】
【外１７】
2004516029.tif 000019
【０１１０】
を用い、第２ＰＣＲでテンプレートとしてｐＣＯＳ１０および
【０１１１】
【外１８】
2004516029.tif 000020
【０１１２】
を用いて増幅させ、さらに第３ＰＣＲで、テンプレートとして第１および第２ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物、およびプライマーＭｉｂｉ−１４８およびＨｌｙＢＤを用いて増幅させた。それぞれのプライマーを、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｐｈｏＡ（受託番号Ｍ２９６６６  ＪＯ４０７９）およびコスミドｐＣＯＳ１０の溶血素特異的配列にしたがってデザインし、この場合、これらの特異的配列は、ＧＡＴＣ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確立されたものである。第３ＰＣＲから得られた５．２ＫｂのＰＣＲを、ＥｃｏＲＶで切断した３．５ｋｂのプラスミドベクターｐＥＴＢｌｕｅ−１を用いてライゲートし、Ｔ７プロモーターの制御下で、ｐｈｏ−ｈｌｙＡｓＢＤ融合体を有している、８．７ｋｂのプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１−ｐｈｏＡ−ＨｌｙＡｓＢＤを製造した。
【０１１３】
プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＬａｃＺ−ＨｌｙＡｓＢＤは、以下のようにして構築された：６．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを、３段階のクロスオーバーＰＣＲで増幅させ、この場合、第１ＰＣＲで、Ｅ．Ｃｏｌｉをテンプレートとして、
【０１１４】
【外１９】
2004516029.tif 000021
【０１１５】
を用い、第２ＰＣＲでｐＣＯＳ１０をテンプレートとして、
【０１１６】
【外２０】
2004516029.tif 000022
【０１１７】
を用いて増幅させ、さらに第３ＰＣＲで、第１および第２ＰＣＲから得られたＰＣＲ産物をテンプレートとして、プライマーＭｉｂｉ−１４４およびＨｌｙＤ２を用いて増幅させた。それぞれのプライマーを、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ（受託番号Ｖ００２９６）およびＧＡＴＣ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確立されたコスミドｐＣＯＳ１０の溶血素特異的配列にしたがってデザインされた。第３ＰＣＲから得られた６．９ｋｂのＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで切断された３．５ｋｂのプラスミドベクターｐＥＴＢｌｕｅ−１とライゲートし、Ｔ７プロモーターの制御下でｌａｃＺ−ｈｌｙＡｓＢＤ融合体を有している１０．４ｋｂのプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＬａｃＺ−ＨｌｙＡｓＢＤを製造した。
【０１１８】
プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＨｌｙｐＡｓＢＤを、以下のように構築した：３．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＧＡＴＣ社（Ｋｏｎｓｔａｎｚ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確立されたコスミドｐＣＯＳ１０の溶血素特異的配列にしたがってデザインされた
【０１１９】
【外２１】
2004516029.tif 000023
【０１２０】
を用いてＰＣＲによって増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶによって切断された、３．５ｋｂのプラスミドベクターｐＥＴＢｌｕｅ−１とライゲートし、Ｔ７プロモーターの制御下でｈｌｙＡｓＢＤを有している７．３ｋｂのプラスミドｐＥＴＢｌｕｅ−１−ＨｌｙＡｓＢＤを製造した。
【０１２１】
ピチア  パストリスα−因子に基づく分泌系の構築
前記に示されたＰ．パストリス分泌系を、ＦｕｎＰｒｏＴｅｃの改良型において使用した。前記に示されたＥ．Ｃｏｌｉ溶血素分泌系と同様に、前記に示されたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ピチア・パストリスベクターから誘導されたプラスミドが構築され、この場合、これらは、種々の重要な遺伝子および場合による種々のプロテアーゼ切断部位およびｔａｇ配列を有しているものである、α−因子シグナル配列と目的の種々の異種遺伝子との融合体を有するプラスミドは、インヴィトロジェンプラスミドベクターｐＰＩＣＺａｌｐｈａを用いて構築された。
【０１２２】
プラスミドｐＰＩＣａｌｐｈａ−Ａ−ＬａｃＺは、以下のようにして構築された：３．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって、テンプレートとしてＥ．Ｃｏｌｉ、および
【０１２３】
【外２２】
2004516029.tif 000024
【０１２４】
を用いて増幅させた。ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ消化された３．１ＫｂのＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化された３．６ｋｂのインヴィトロジェンプラスミドｐＰＩＣＺａｌｐｈａＡとライゲートし、６．７ｋｂのプラスミドｐＰＩＣＺａｌｐｈａ−Ａ−ＬａｃＺが得られた。Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’中のこのシャトルプラスミドの増殖に引き続いて、α−因子−シグナル配列−ｌａｃＺ融合体を、プラスミドｐＰＩＣＺａｌｐｈａ−Ａ−ＬａｃＺを、Ｐ．パストリス中に形質転換し、プラスミドｐＰＩＣＺａｌｐｈａ−Ａ−ＬａｃＺ上のＡＯＸ１配列と染色体ＡＯＸ１配列との間のクロスオーバーが発生した後に、Ｐ．パストリスゲノム中に組み込んだ。
【０１２５】
分泌されたタンパク質の保存のためのコンパートメント系の確立
二重フィルター技術
図１で例証したように、適切な孔径を有する２個のフィルターを、細菌増殖用アガープレート上に積み重ねて置いた。上部フィルターは、上部から下部フィルターへの細菌移入を防止する程度の孔径を有するが、分泌された融合タンパク質の下部フィルターへの流れを可能にする。これは、低いタンパク質結合力を有している。対照的に、下部フィルターは適切なタンパク質結合力を有しており、この場合、これは、元来そうであるかまたは上部フィルターで増殖する細菌によって分泌されるべきタンパク質の成分のための適切な結合パートナーである成分を用いて一定の箇所で被覆された結果としてのものである。双方のフィルターは、細菌アガープレートからの栄養媒体および成長因子を、細菌コロニーを成長させる上部フィルター上に流すことを可能にする。溶血素分泌装置を発現する細菌コロニーは、これらに結合する下部フィルター上に拡散しうるＨｌｙＡｓ−融合タンパク質を分泌する。
【０１２６】
前記に示されたＥ．Ｃｏｌｉ菌株５３６、その同系遺伝子変異体５３６−２１および５３６−３９−１９２、Ｅ．ＣｏｌｉＫ−１２ｗｔ，ＪＭ１０９、ＤＨ１、ＬＥ３９２、Ｗ６７８、３５、Ｊ５３、ＥＮ９９、ＷＫ６、ＨＢ１０１、５Ｋ、ＣＣ１１８、Ｃ６００、ＭＣ１０２９、ＤＨ５αは、二重フィルター技術に用いられる：２個のミリポアフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、細菌増殖用アガープレート上に積み重ねて置く。上部フィルター（低いタンパク質結合力を有する、疎水性Ｄｕｒａｐｏｒｅ ｍｅｍｎｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｐｏｒ社、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ、オーダー番号ＨＶＬＰ０９０５０）は、孔径０．４５μｍを有しており、上部フィルターから下部フィルターへの細菌移入を防止するが、下部フィルターへの分泌タンパク質の流れを可能にする。酢酸セルロースおよびニトロセルロースの混合エステルから成り、かつその化学的性質によって適切なタンパク質結合力を有する、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭＦメンブレン（オーダー番号ＶＣＷＰ０９０２５）を下部フィルターとして選択した。細菌増殖用アガープレートから上部フィルターで増殖する細菌コロニーに栄養媒体および増殖因子の流動させることが可能である。細菌は、上部フィルター上に拾い上げられ、かつ、３７℃で３時間に亘って増殖させる。結果として、下部フィルターと結合した分泌タンパク質を、ポンソーＳ染色によって視覚化した。この方法によって、Ｅ．Ｃｏｌｉ５３６によって分泌されたタンパク質のみが検出可能である。他の試験において、下部フィルターは、ヒツジ血液アガープレート上に置かれた。室温での一晩に亘ってのインキュベーションに引き続いて、溶解は、Ｅ．Ｃｏｌｉ５３６によって分泌されたタンパク質毒素の下に存在するスポットとして視覚化された（図３）。他の試験において、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株５３６、５３６−２１、Ｊ５３（ｐＵＣＨｌｙＣＡ）およびＪ５３（ｐＵＣ１８）を、二重フィルター系に用い、その結果、下部フィルターは、３７℃で３時間に亘っての細菌増殖の後に取り除かれ、ヒツジ血液アガープレート上に置いた。室温で一晩に亘ってのインキュベーションの後に、溶解は、Ｅ．Ｃｏｌｉ５３６およびＪ５３（ｐＵＣＣＨｌｙＣＡ）から誘導されたタンパク質スポット下の箇所で視覚化された。
【０１２７】
積重ねマイクロウェル技術
図２に示したように、積重ねマイクロウェルプレートを使用し、この場合、これらは、互いに積み重ねられ、かつ細菌移入を防止するが上部ウェルから下部ウェルへの分泌された融合タンパク質の流れを可能にする程度の孔径を有するフィルター膜によって分離されたマイクロウェルから成る。細菌の液体培養は、上部マイクロウェルプレート中で増殖させる。これらの細菌によって分泌されたタンパク質は、下部ウェル中に拡散し、これによって、タンパク質溶液としてハーベストすることができる。特に、溶血素分泌装置を発現する細菌の液体媒体が、下部ウェル中に拡散するＨｌｕＡｓ−タンパク質融合体を分泌することは好ましく、これによってタンパク質溶液として回収することができる。
【０１２８】
Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供された“ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ”および０．４５μｍのＤｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦメンブレンを有するＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  フィルタープレートＭＡＨＶＳ４５１０およびＧｒｅｉｎｅｒ  ポリプロピレン−マイクロプレート６５１２０１は、予試験において下部ハーベストプレートとして使用された。前記に示されたＥ．ｃｏｌｉ菌株５３６、その同種遺伝子変異体５３６−２１および５３６−３９−１９２、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２ｗｔ，ＪＭ１０９、ＤＨ１、ＬＥ３９２、Ｗ６７８、３５、Ｊ５３、ＥＮ９９、ＷＫ６、ＨＢ１０１、５Ｋ、ＣＣ１１８、Ｃ６００、ＭＣ１０２９、ＤＨ５α）は、二重フィルター技術に使用される。下部プレートから回収されたそれぞれ２０μｌのタンパク質溶液を、Ｏｘｏｉｄヒツジ血液アガープレート上に置いた。Ｅ．Ｃｏｌｉ５３６によって分泌されたタンパク質のみが、溶血反応を誘発した。
【０１２９】
Ｅ．Ｃｏｌｉおよびピチア・パストリス菌株の測定
Ｅ．Ｃｏｌｉおよびピチア・パストリス菌株のタンパク質分泌は、前記に示したように、以下の二重フィルター技術を適用させることによって試験することができる：この系での下部フイルターへの結合後に、分泌されたタンパク質は引き続いて、標準的なタンパク質検出法をおこなってもよく、この場合、これらの方法は、インク染色、ポンソーＳ染色、クマシン染色または銀染色を含む。
【０１３０】
ＨｌｙＡサイトトキシンの場合には、その分泌は、ヒツジ血液アガープレート上の滅菌フィルター（０．４５μフィルター）培養上清のその溶血反応活性によって試験される。
【０１３１】
一般に、公知の画分を含むタンパク質の場合には、それぞれの細菌の濾過滅菌された培養上清は、機能的アッセイ中で試験されてもよい。
【０１３２】
本発明によって得られた結果の例
Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株５３６の病原性アイランドＩ（ＰａｉＩ）上に配置された溶血素オペロンのＤＮＡ配列
コスミドｐＣＯＳ１０［Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６８： ２２−３０］は、Ｇ．Ｂｌｕｍ−Ｏｅｈｌｅｒ，Ｕｎｉｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇによって提供されたものであり、この場合、これは、尿路疾患系Ｅ．Ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）菌株のＰａｉＩを含む［Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５４： １１１４５−１１５４］。キアジェン（Ｑｕｉａｇｅｎ）プロトコールによるＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＨＢ１０１からのその単離に引き続いて、このコスミドは、ＰＣＲｓ中でテンプレートとして、種々のプライマーセットと一緒に、ｐＣＯＳ１０上に配置された溶血素オペロンのオーバーラッピングフラグメントを増幅するために使用された。プライマーの配列は、Ｅ．ＣｏｌｉプラスミドｐＨＬＹ１５２によってコードされた溶血素オペロンのＤＮＡ配列から選択され、この場合、これらは、Ｈｅａａらによって１９８６年、受託番号Ｍ１４１０７として発表されたものである。
【０１３３】
種々のＥ．Ｃｏｌｉ菌株の溶血活性
尿路疾患Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株５３７、病原性アイランド（Ｐａｉｓ）ＩおよびＩＩを欠損したその同系遺伝子突然変異体５３６−２１は、それぞれは溶血素オペロン［Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５２： １２４１−１２４７； Ｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６２： ６０６−６１４； Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １５４： １１１４５−１１５４］を有している。Ｅ．ＣｏｌｉＫＬ３２０−ＨｌｙＢＤ（ｐＵＣＨｌｙＣＡ）および種々のＥ．ＣｏｌｉＫ−１２菌株を、一晩に亘っての増殖後に、ヒツジ血液アガープレート上でのその溶血反応活性について比較した。野生型ＵＰＥＣ菌株５３７およびＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＫＬ３２０−ＨｌｙＢＤ（ｐＵＣＨｌｙＣＡ）ばかりでなく、ＵＰＥＣ突然変異体５３６−２１または任意の他のＥ．ＣｏｌｉＫ−１２菌株は、赤血球の溶血反応を誘発した。
【０１３４】
血液アガープレート上の二重フィルター技術
ＵＰＥＣ菌株５３６、その突然変異体５３６−２１ならびにＥ．Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２菌株およびＥ．Ｃｏｌｉ  ＫＬ３２０−ＨｌｙＢＤ（ｐＵＣＨｌｙＣＡ）を、前記に示したような二重フィルター技術に使用した。上部フィルターにはすべての種々のＥ．Ｃｏｌｉコロニーがみられ、ポンソーＳ処理された下部フィルターには、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株５３７およびＥ．ＣｏｌｉＫＬ−３２０−ＨｌｙＢＤ（ｐＵＣＨｌｙＣＡ）のフィルタースポット下方にのみ染色されたドットが示された。二重フィルター下に位置するヒツジ血液アガーは、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株５３６およびＥ．ＣｏｌｉＫＬ−３２０−ＨｌｙＢＤ（ｐＩＣＨｌｙＣＡ）を有するフィルターの下方に位置する箇所においてのみ溶血反応領域を示した。
【０１３５】
もう一つの試験において、下部フィルターは、３７℃での３時間に亘っての細菌増殖の後に除去され、かつ他のヒツジ血液アガープレート上に置かれた。室温で一晩に亘ってのインキュベーションの後に、溶解は、再度、Ｅ．Ｃｏｌｉ５３６およびＥ．ＣｏｌｉＫＬ−３２０−ＨｌｙＢＤ（ｐＵＣＨｌｙＣＡ）によって分泌されたタンパク質毒素下にあたる箇所で視覚化された。
【０１３６】
図面の簡単な説明
図１：二重フィルター技術、２個のフィルター（１、２）を細菌増殖用アガープレート（３）上に互いに積み重ねて、コンパートメント系（２８）を形成する。目的のタンパク質を分泌する細胞（５）は、単一コロニーの形（４）で上部フィルター上で増殖するが、その際、上部フィルター（１）上で増殖する細胞は、第１のコンパートメント（２９）を形成する。下部フィルター（２）および細菌増殖用アガープレート（３）は、第２のコンパートメント（３０）を形成する。第１コンパートメントの一部分である上部フィルター（１）は障壁として機能し、この場合、この障壁は、上部フィルター（１）から下部フィルター（２）への細菌の移入を防止するが、分泌された目的のタンパク質（５）の下部フィルターへの流れを可能にする程度の孔径を有しており、下部フィルター（２）は、第２コンパートメント（３０）の一部分であり、かつ、適切なタンパク質結合力を有している。双方のフィルター（１、２）は、細菌増殖アガープレート（３）から上部フィルター上で増殖する細菌コロニー（４）へ、栄養媒体および成長因子の流動させる。第１コンパートメント（２９）において、成長した細菌細胞コロニー（４）は、ばらばらの配置を有する。結果として、分泌された目的のタンパク質（５）は、上部フィルター（１）を介して、第２コンパートメント（３０）の下部フィルター（２）に移入し、別個のタンパク質スポットのアレイを形成する。
【０１３７】
図２：積重ねマイクロウェルウェル技術。２個のマイクロタイタープレート（６、７）を、互いに積み重ね、かつフィルター膜によって分離し、コンパートメント系（２８）を形成した。細胞の液体培養物（９）は、上部マイクロタイタープレート（６）のウェル中で増殖しており、かつ膜（８）は、コンパートメント系（２８）の第１のコンパートメント（２９）を形成している。第２のコンパートメント（３０）は、下部マイクロタイタープレート（７）のウェルによって構成され、それに目的のタンパク質（５）が分泌される。フィルター膜（８）は、細菌移入を防止するが、上部マイクロタイタープレート（６）のウェルからの下部マイクロタイタープレート（７）のウェルへの目的タンパク質（５）の流れを可能にする程度の孔径を有している。上部マイクロタイタープレート（６）中で増殖する細胞の液体培養物（９）は、目的のタンパク質（５）を分泌し、この場合、このタンパク質は下部マイクロタイタープレート（７）のウェル中に拡散し、ここで回収される。
【０１３８】
図３：二重フィルター系。Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株５３６（１０）、５３６−２１（１１）、５３６−３９−１９２（１２）、Ｋ−１２ｗｔ（１３）、ＪＭ１０９（１４）、ＤＨ１（１５）、ＬＥ３９２（１６）、Ｗ６７８（１７）、３５（１８）、Ｊ５３（１９）、ＥＮ９９（２０）、ＷＫ６（２１）、ＨＢ１０１（２２）、５Ｋ（２３）、ＣＣ１１８（２４）、Ｃ６００（２５）、ＭＣ１０２９（２６）およびＤＨ５α（２７）を、二重フィルター系に使用した。
【０１３９】
２個のミリポアフィルター（１，２）を、細菌増殖用アガープレート（３）上に互いに積み重ねた。上部フィルター（１）（低いタンパク質結合力を有する親水性Ｄｕｒａｐｏｒｅ メンブレンフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ， オーダー番号ＨＶＬＰ０９０５０）は、上部フィルターから下部フィルター（２）への細菌移入を防止するが、下部フィルター（２）への分泌された融合タンパク質の流れを可能にする、０．４５μｍの孔径を有している。酢酸セルロースとニトロセルロースとの混合エステルから成り、かつその化学的性質によって最適なタンパク質結合力を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭＦメンブレンフィルター（オーダー番号ＶＣＷＰ０９０２５）は、下部フィルター（２）として使用される。双方のフィルター（１、２）は、細菌増殖用アガープレート（３）から細菌コロニーが成長する上部フィルター（１）上への栄養媒体および増殖因子の流動を可能にする。細菌を上部フィルター上に拾い上げ、かつ、増殖を３７℃で３時間に亘っておこなった。その後に、下部フィルター（２）を、３７℃で３時間に亘っての細菌増殖の後に除去し、ヒツジ血液アガープレート上に置いた。室温で一晩に亘ってのインキュベーションの後に、溶解は、Ｅ．Ｃｏｌｉ５３６に分泌されたタンパク質毒の下に位置するスポットで視覚化された。
【０１４０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による二重フィルター技術を示す図
【図２】
本発明による積重ねマイクロウェルウェル技術を示す図
【図３】
本発明による二重フィルター系を示す図
【符号の説明】
１  上部フィルター、  ２  下部フィルター、  ３  細胞増殖用アガープレート、  ４  コロニー、  ５  細胞、  ６  上部マイクロタイタープレート、  ７  下部マイクロタイタープレート、  ８  メンブレン、  ９  細胞液体培養物、  １０  Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株５３６、  １１  ５３６−２１、  １２  ５３６−３９−１９２、  １３  Ｋ−１２ｗｔ、  １４  ＪＭ１０９、  １５  ＤＨ１、  １６  ＬＥ３９２、  １７  Ｗ６７８、  １８  ３５、  １９  Ｊ５３、  ２０  ＥＮ９９、  ２１  ＷＫ６、  ２２  ＨＢ１０１、  ２３  ５Ｋ、  ２４  ＣＣ１１８、  ２５  Ｃ６００、  ２６  ＭＣ１０２９、  ２７  ＤＨ５α、  ２８  コンパートメント系、  ２９  第１コンパートメント、  ３０  第２コンパートメント
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004516029.tif 000097
【国際調査報告】
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2004516029.tif 000099
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