(57)【要約】本発明は、単球／マクロファージ細胞活性化、増殖、分化、アポトーシス、および炎症性サイトカインの産生の制御による炎症性疾患の治療のための副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）レセプター１（Ｒ１）アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２レセプターアゴニストの使用に関する。ＣＲＨ系として、本発明者らは、ＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２レセプターおよびそのサブタイプ並びにＣＲＨ結合タンパク質（ＢＰ）、ＣＲＨ偽レセプターに対する天然および合成のＣＲＨおよびウロコルチン（ＵＣＮ）アゴニストおよびアンタゴニストとして定義する。本発明は、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αなどの炎症促進性サイトカインの産生により炎症応答を開始および維持するうえで重要な役割を演じている単球／マクロファージ細胞のＣＲＨ系を媒体とした制御を用いて、炎症性疾患の改善または治療のための薬理学的介入に向けられている。炎症とは、本発明者らは、組織障害を引き起こす有毒な内生または外因性の刺激に対する生物体の応答として定義する。炎症は宿主の防衛メカニズムであり、防衛する生物体を傷つける。本発明はまた、単球／マクロファージ系の制御のための天然および合成ＣＲＨ系モデュレーターのインビトロおよびインビボ評価法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患または状態の治療のための１またはそれ以上の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストの使用。
【請求項２】
該１またはそれ以上の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストが、単球／マクロファージの応答、単球／マクロファージ細胞の活性化、増殖、分化、アポトーシスまたはサイトカイン産生を修飾する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該１またはそれ以上の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストがアンタラーミンを含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
該炎症性疾患または状態が、慢性炎症性腸疾患、特発性炎症障害、結合組織の炎症障害、炎症性の脱髄性多発ニューロパシー、炎症性のミオパシー、滑液包炎を含む関節の炎症性疾患、線維筋痛症候群および上部胃腸管の炎症性疾患である、請求項１ないし３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
１またはそれ以上の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストを含む医薬組成物。
【請求項６】
局所投与または全身投与用に製剤化されている、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保存剤、香味剤および着色剤などの通常の賦形剤をさらに含む、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
経口、非経口または皮内投与用に製剤化されている、請求項５ないし７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
注射液として製剤化されている、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該１またはそれ以上の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストがアンタラーミンを含む、請求項５ないし９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該１またはそれ以上の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストがアンタラーミンである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
炎症性疾患または状態の治療用医薬組成物の製造のための１またはそれ以上の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストの使用。
【請求項１３】
該炎症性疾患または状態が、慢性炎症性腸疾患、特発性炎症障害、結合組織の炎症障害、炎症性の脱髄性多発ニューロパシー、炎症性のミオパシー、滑液包炎を含む関節の炎症性疾患、線維筋痛症候群および上部胃腸管の炎症性疾患である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
１またはそれ以上の個々の医薬組成物に含まれる１またはそれ以上のＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストを含む、炎症性疾患または状態の治療のためのキット。
【請求項１５】
該１またはそれ以上のＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストがアンタラーミンを含む、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患の治療のための医薬組成物に関する。とりわけ、本発明は、合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／または合成ＣＲＨ−Ｒ２アゴニストを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
他の側面において、本発明は、合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／または合成ＣＲＨ−Ｒ２アゴニストを用いた炎症性疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
１．炎症性応答
炎症なる語は、組織障害を引き起こす有害な内生または外因性の刺激に対する局所的な応答を意味し、毛細血管の拡張および白血球の浸潤および炎症の典型的な徴候および症状（膨潤、発赤、局所的および／または全身の体温および痛みの増大を含む）を特徴とする。内生および外因性の有害物質は、感染性疾患を含む炎症を引き起こす。炎症は宿主の防御機構であり、結果的に防御する生物に害を及ぼすことがある。高レベルのこれらサイトカインは、重篤な感染性および種々の炎症性疾患において認められる。病因が未知の急性または慢性の炎症性疾患は、単離するのが困難な感染因子によって引き起こされる。一つのよく知られた例は、胃潰瘍の大部分が細菌のヘリコバクター・ピロリによる感染によるとの理解である。他方、通常炎症と関係しない疾患は、実際は低度の慢性炎症によって引き起こされる。実際、動脈硬化症は特徴的な例である。自己免疫疾患もまた炎症性の反応を引き起こすことができ、免疫複合体沈積疾患（immune complex deposition disease）が特徴的な例である。刺激されたマクロファージの産物である炎症促進性の（pro-inflammatory）サイトカインのＩＬ−１、ＴＮＦ−アルファ、およびＩＬ−６は、炎症プロセスの開始に重要な役割を果たしている。感染性の因子もまた病因が未知の急性または慢性の炎症性疾患を引き起こすことに注意すべきである。
【０００４】
２．ＣＲＨ系
ニューロペプチドの副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）ファミリーは幾つかの構成員からなり、そのうち哺乳動物において最も著名なものは、４１アミノ酸からなる視床下部ペプチドであるＣＲＨ、およびＣＲＨと４５％の配列ホモロジーを有する４０アミノ酸からなるペプチドであるウロコルチン（ＵＣＮ）である。ＣＲＨの生物学的作用は少なくとも２つの異なるタイプのレセプター、Ｇ−タンパク質結合レセプタースーパーファミリーに属するＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２によって媒体されている。ＣＲＨは、ＣＲＨ−Ｒ２に比べて１０倍高い親和性をＣＲＨ−Ｒ１に対して示す。免疫系ではＣＲＨ−Ｒ１レセプターは脾臓および胸腺で同定されている。ＣＲＨ−Ｒ１レセプターの非ペプチドレセプターアンタゴニストの最近の合成は、組織レベルでのＣＲＨの機能的意義の一層正確な評価のための有用な手段を提供している。ＣＲＨ−Ｒ２サブタイプに対して低い親和性しか有しないＣＲＨとは対照的に、ＵＣＮは、ＣＲＨ−Ｒ１、ＣＲＨ−Ｒ２α、ＣＲＨ−Ｒ２βレセプターおよびＣＲＨ結合タンパク質（ＣＲＨ−ＢＰ）を含むＣＲＨ機能の全ての既知のエフェクターに結合する。
【０００５】
３．ＣＲＨ系と免疫系との相互作用
ＣＲＨは、免疫系に対し、炎症反応の部位で直接、および副腎からのコルチゾールの産生の刺激により間接的に作用する。ＣＲＨは、炎症応答の部位で神経末および上皮細胞により放出されて炎症の近傍に在住する免疫細胞に直接作用する。ＣＲＨの間接的な作用は抗炎症であるが、その直接−パラ分泌作用は明らかに炎症促進性である点に注意すべきである。それゆえ、特異的な抗ＣＲＨ血清によるその局所作用の妨害は、幾つかの炎症モデルにおける炎症応答をインビボで弱める。ＣＲＨの免疫標的は肥満細胞である。しかしながら、肥満細胞に加えて多くの他の免疫細胞も特異的なＣＲＨ結合部位を示し、そのような免疫細胞としてマウス脾細胞、ヒト末梢血単球、リンパ球、単球−マクロファージおよびＴｈ細胞が挙げられる。ＣＲＨレセプターはまた、炎症を起こした滑膜および炎症を起こした皮下組織にも存在する。マクロファージでのＣＲＨ−Ｒ１レセプター発現は、リポ多糖（ＬＰＳ）への暴露によりアップレギュレーションされる。実際、炎症部位でのＣＲＨレセプターの数は、ＣＲＨの濃度と平行して増加する。ＣＲＨの役割は主として肥満細胞と関連付けられている、というのはその投与が肥満細胞の脱顆粒、すなわちＣＲＨ−Ｒ１レセプターアンタゴニストであるアンタラーミン（antalarmin）によって抑制される効果という結果となるからである。
【０００６】
マクロファージは、炎症応答の際のイニシエーター細胞の一つであり、一連の炎症促進性サイトカインの主たる源である。マクロファージの活性化は細菌ＬＰＳなどの抗原性シグナルにより起こり、細菌ＬＰＳはトール様レセプター４（Toll-like Receptor 4; TLR-4）に結合し、サイトカインの転写およびこれら細胞による分泌を活性化する。局所および全身の両炎症に際して、マクロファージは炎症促進性サイトカインの優勢な源である。
【０００７】
２．胃腸管（ＧＩ）炎症におけるＣＲＨ系
ＣＲＨファミリーのペプチドは、ＧＩ管の全長にわたって発現される。実際、ＣＲＨはヒト結腸中の腸クロム親和性細胞によって産生され、一方、ＵＣＮはラットの胃および結腸の両者で検出することができる。最近刊行された報告は、ＣＲＨファミリーのペプチドおよびそのレセプターが炎症プロセスへのＧＩ応答と同様にＧＩ運動性の制御に参画していることを示唆している。実際、ＣＲＨは潰瘍性大腸炎を罹患した患者の直腸粘膜に存在し、局所的な炎症促進の役割を担っていることが今や充分に確立されている。さらに、ＵＣＮはヒト結腸粘膜の基底膜中のマクロファージで同定されており、局所的な炎症応答の制御に参画している。一般に、ＧＩ管でのＣＲＨファミリーのペプチドの作用はレセプターのタイプに特異的であり、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターおよびＣＲＨ−Ｒ２レセプターは多かれ少なかれ反対の作用を有していると思われる。実際、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターの活性化は結腸推進（propulsive）活性の増幅という結果となり、一方、ＣＲＨ−Ｒ２レセプターの活性化はマウスおよびラットでの胃液空白化率（gastric emptying rate）の抑制という結果となる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、急性および慢性の炎症疾患の処置における治療モダリティー（therapeutic modalities）の使用に関する。本発明による治療計画は、単球／マクロファージの応答、単球／マクロファージの細胞活性化、増殖、分化、アポトーシスおよびサイトカイン産生の修飾、およびそれゆえ炎症応答の強度の調節を目的として、合成ＣＲＨ−Ｒ１レセプターアンタゴニストおよび／または合成ＣＲＨ−Ｒ２レセプターアゴニストの使用に関する。本発明者らのデータは、ＣＲＨは炎症応答を高め、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターを介して作用し、一方、ＵＣＮは炎症応答を弱め、ＣＲＨ−Ｒ２レセプターを介して作用することを示している。ＣＲＨおよびＵＣＮのこれら作用は、表面にＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２の両レセプターを発現する単球／マクロファージ細胞へのこれらペプチドの直接的な作用の結果である。
【０００９】
単球／マクロファージへのＣＲＨ系の制御的役割を示すため、３つのタイプの実験モデルが用いられる：（ａ）マクロファージのインビトロ培養、（ｂ）インビボ動物モデル、および（ｃ）ヒト炎症疾患のパラダイム。
【００１０】
（ａ）本発明者らのインビトロ実験では、本発明者らは２つのタイプのマクロファージ、RAW 264.7単球／マクロファージ細胞株（マウスミエローマに由来し、ＬＰＳに応答してすべての炎症促進性サイトカインを産生する）およびBalb/cマウスからのチオグリコレートによって誘起された腹膜マクロファージを用いた。ＣＲＨは、ＬＰＳによって誘発されたＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６の産生を促進した。一方、ＵＣＮはマクロファージアポトーシスの誘発により炎症応答を改善した。このＵＣＮの作用は、ＬＰＳ誘発RAW 264.7マクロファージおよび一次（primary）骨髄マクロファージでは一層顕著であった。RAW 264.7細胞をＵＣＮで処理すると、ストレス誘発キナーゼＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰＫの迅速な活性化、ＢａｘのアップレギュレーションおよびＦａｓリガンド発現およびアポトーシスの促進という結果となった。
【００１１】
（ｂ）本発明者らのインビボ実験では、本発明者らはBalb/cマウスでのＬＰＳ誘発内毒素ショックモデルを用いたが、これは全身性炎症の確立されたモデルであり、マクロファージがショックの発症の原因の炎症促進性サイトカインの主たる源である。本発明者らは、ＬＰＳの前に合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストを投与すると統計学的に有意な仕方で生存を長引かせることを見出した。この効果は内毒素ショックの初期の段階で一層顕著であった。ＣＲＨ−Ｒ１の遮断はマクロファージに由来するサイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６のＬＰＳ誘発上昇を抑制し、サイトカイン発現におけるＣＲＨシグナルの役割が確認された。
【００１２】
（ｃ）本発明者らのヒトデータについては、本発明者らは胃炎を罹患した患者を用いた。この予期研究で選択した胃炎のモデルは、その局在化し境界のよく定められた（well-circumscribed）性質および適切な根治処置の後の完全な可逆性（reversibility）のゆえに、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）によって引き起こされたものであった。本発明者らの新鮮な組織試料は、胃鏡検査生検により得た。本発明者らの研究のデザインは、ＣＲＨ転写物およびペプチドは正常なヒト胃粘膜には検出することができないが、ＵＣＮは胃上皮細胞に存在および局在することを示す本発明者らのパイロットデータに基づいていた。本発明者らのデータは、ヒトの胃においてＵＣＮが炎症の強力なサプレッサーであることを示す本発明者らの仮説を確認した。
【００１３】
それゆえ、本発明者らは、インビトロおよびインビボの両者において、ＣＲＨ−Ｒ１アゴニストは炎症応答を高め、ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストは炎症応答を改善し、ＣＲＨ−Ｒ２アゴニストもまた炎症応答を改善したことを示す。本発明は、そのような化合物をヒトの局所および全身性炎症の治療に使用することに関する。
【００１４】
一つの側面において、本発明は、１またはそれ以上の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストを含む医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明による化合物と関連して使用する「合成」なる語は、当該化合物が天然に存在する化合物ではないが、ある種の技術的プロセスを用いて製造されることを意味する。それゆえ、合成化合物は、たとえば、組換え法を用いてまたは化学合成によることを条件としてタンパク質およびペプチド、および小さな有機化合物を含む。
【００１６】
それゆえ、「合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニスト」は、ＣＲＨ−Ｒ１機能を抑制し、ＣＲＨ−Ｒ１アッセイに加えたときにＣＲＨペプチドの作用および合成ＣＲＨ−Ｒ１アゴニストの作用をブロックし、それゆえＣＲＨ−Ｒ１レセプターがＣＲＨなどのアゴニストリガンドで刺激されたときに該化合物を使用しない同アッセイに比べて小さなシグナルという結果となるような合成化合物である。「合成ＣＲＨ−Ｒ２アゴニスト」は、ＣＲＨ−Ｒ２を活性化し、ＣＲＨ−Ｒ２アッセイにおいて該化合物を使用しない同アッセイと比べてＣＲＨなどのＣＲＨ−Ｒ２レセプター活性化の結果としてのシグナルを生成させるような合成化合物である。
【００１７】
ＣＲＨ−Ｒ１アッセイおよびＣＲＨ−Ｒ２アッセイは当該技術分野において知られている。ある候補合成化合物がそれぞれアンタゴニストまたはアゴニストのいずれであるかを決定するため、原則として当該技術分野で知られた適当なＣＲＨ−Ｒ１アッセイおよびＣＲＨ−Ｒ２アッセイのいずれも用いることができる。ＣＲＨ−Ｒ１アッセイおよびＣＲＨ−Ｒ２アッセイの好ましい例は開発されている。ＣＲＨ−Ｒ１レセプターによる生物学的活性のアッセイ：（ａ）ＣＲＨはｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼを活性化する、Ｆａｓリガンドの産生を刺激する、およびＰＣ１２ラットクロム親和性細胞腫の細胞のアポトーシスを誘発する。ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミンは、これらＣＲＨにより媒体された作用をすべてブロックする（Dermitzakiら、2002）。（ｂ）ＣＲＨはマクロファージのリポ多糖（ＬＰＳ）に対する炎症応答をインビトロで促進させる。ＣＲＨの促進作用はＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミンによって完全にブロックされる（Agelakiら、2002）。ＣＲＨ−Ｒ２レセプターによる生物学的活性のアッセイ：ウロコルチンおよびウロコルチンIIはマクロファージのアポトーシスを誘発する。この作用はＣＲＨ−Ｒ２レセプターによって媒体される、なぜなら特異的なアンタゴニストであるsauvagine-30は完全にこの作用をなくしたからである（Tsatsanisら、提出）。
【００１８】
アンタラーミンは合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストの一例である。
【００１９】
他の側面において、本発明は、炎症性疾患および状態の治療用医薬組成物の製造のための１またはそれ以上の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストの使用に関する。
【００２０】
本発明の医薬組成物は、活性化合物に加えて、通常の賦形剤、たとえば希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、保存剤、香味剤および着色剤を含んでいてよい。本発明の医薬組成物は、経口、非経口、または静脈内投与を含むあらゆる適当な投与経路用に製剤化できる。好ましい投与剤形は注射剤である。
【００２１】
医薬組成物中の活性化合物の量は、実際の活性化合物、レシピエントの年齢、体重、および状態に依存する。所定の活性化合物の適当な量を決定することは、常法の実験に基づいて当業者の範囲内である。
【００２２】
投与すべき量および頻度および投与経路は、所定の化合物および実際の状態に依存し、担当医の裁量に任せられるであろう。
【００２３】
本発明による医薬組成物で処置すべき炎症性疾患または障害としては、これらに限られるものではないが、以下のものが挙げられる：慢性炎症性腸疾患、特発性炎症障害、結合組織の炎症障害、炎症性の脱髄性多発ニューロパシー、炎症性のミオパシー、滑液包炎を含む関節の炎症性疾患、線維筋痛症候群および上部胃腸管の炎症性疾患。
【００２４】
「治療」なる語は広く理解すべきであり、治療に加えて疾患の予防、障害または疾患の軽減および炎症性疾患または障害の再発の予防を含む。
【００２５】
特定の治療について、たとえば、一つの合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストと一つの合成ＣＲＨ−Ｒ２アゴニストの使用により、１を超える活性化合物を本発明に従って特定の疾患の治療に用いるなら、すべての活性化合物を含む一つの医薬組成物中に１を超える活性化合物を含むよう製剤化することができ、またはそれぞれ１またはそれ以上の活性化合物を含む２またはそれ以上の異なる医薬組成物中に１を超える活性化合物を含むよう製剤化することができる。
【００２６】
活性化合物の組合せを２またはそれ以上の別々の医薬組成物中に製剤化する場合は、これら医薬組成物は同時に投与してもよいし、あるいは異なる時点または頻度で製剤化してよい。
【００２７】
そのような活性化合物の組合せを２またはそれ以上の別々の医薬組成物に製剤化するときは、これら医薬組成物は、１またはそれ以上の個々の医薬組成物中に１またはそれ以上のＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストを含むキットにて提供するのが適している。
【００２８】
それゆえ、他の側面において、本発明は、１またはそれ以上の個々の医薬組成物中に１またはそれ以上のＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストおよび／またはＣＲＨ−Ｒ２アゴニストを含む炎症性疾患または状態の治療のためのキットに関する。
【００２９】
キットはまた、キットに含まれる医薬組成物の投与の頻度、量および期間についての指示を含む。
【００３０】
実験
つぎに本発明を実験的な研究によりさらに記載するが、これは本発明を限定するものと解してはならない。
【００３１】
材料および方法
細胞培養
RAW 264.7細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)、10mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン(すべてGibcoより購入)を補充したDulbecco変性Eagle培地中、5%CO2および37℃にて培養した。細胞を刺激の１日前に25cm2フラスコにプレーティングした。ついで、細胞を10μg/mlの大腸菌由来LPS(血清型0111:B4、カタログ#L2630、Sigma)および濃度10-8Mの組換えCRH(Sigma)で刺激した。
【００３２】
チオグリコレート誘起マクロファージの単離および刺激
4%チオグリコレート溶液を投与２日前に調製し、オートクレーブした。1.5mlのチオグリコレート溶液をBALB/cマウスに腹腔内注射し、腹膜マクロファージをDulbecco変性培地を用いた腹腔洗浄により単離した。ついで、細胞を、10%FCS、10mM L-グルタミン、100U/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシン(Gibco)を補充したDMEM中で培養した。細胞を5x105/mlの濃度にてプレーティングし、刺激の２４時間前に培養液に維持した。
【００３３】
動物
雄の体重20〜25gのBalb/cマウス（8〜10週齢）を用いた。これらマウスを適応およびその健康の確保のため、各実験の少なくとも１週間前から本発明者らの動物施設で維持した。各動物は齧歯類の実験室食および水を随時与えられた。使用したＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストは、Pediatric and Reproductive Endocrinology Branch、NICHD、NIH、ベセスダ、メリーランドにより提供された。アンタラーミンをまず100%エタノールに濃度200mg/mlにて溶解し、ついでCremaphor EL(Sigma)で1:1比に希釈し、最後に滅菌水中の10%エタノールおよび10%Cremaphor EL中に2mg/mlのアンタラーミンの作業ストックとした。大腸菌リポ多糖(血清型0111:B4、カタログ# L2630)およびSalmonella enteritidisリポ多糖(カタログ# L6011)をSigmaから購入した。抗体およびTNF-α、IL-1βおよびIL-6決定の因子をR&D(ネブラスカ、米国)から購入した。
【００３４】
ＬＰＳ誘発内毒素ショック
LD50の決定のため、１群５匹のマウスにPBSに10mg/mlの濃度で溶解したSalmonella由来LPS(Sigma)の200、400、600、700または1000μg/マウスを腹腔内(i. p)注射した。動物の生存を７日間モニターした。同じプロトコールを大腸菌由来LPS(O111:B4)に用いた。LPSを注射したマウスの生存に及ぼすアンタラーミンの効果を決定するため、40匹のマウスを４つの異なる群に分けた：第一の群は20mg/kg(体重)の濃度のアンタラーミンを投与され、第二の群は20mg/kg(体重)のアンタラーミンおよび体重25g当たり0.7mgの濃度のLPSを投与され、第三の群はLPSおよびアンタラーミン希釈液を投与され、第四の群はアンタラーミン希釈液のみを投与された。プロトコールに従い、およびHPA軸応答(HPA axis response)を有意に変えることのないよう、LPS注射の1.5時間前にアンタラーミンまたは希釈液でマウスを前処理した。ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミン単独では動物の生存に影響はなく、アンタラーミン単独の注射は実験で繰り返さなかった。
【００３５】
全ＲＮＡの単離およびＲＴ ＰＣＲ
全細胞RNAをTrizol試薬(Gibco)を用いて単離した。逆転写(Thermoscript RT、Invitrogen)後、1μlのcDNA産物をPCRにより33サイクルで増幅した。プライマーの各ペアについて行った標準曲線（データは示していない）によって示されるように、33サイクルではすべてのmRNA増幅は増幅の対数期にあることに注意すべきである。10μlの増幅産物を3%アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色で可視化した。バンドの強度をTINAscanソフトウエアを用いて定量した。
【００３６】
アクチンのプライマーは、センス：5'-TCA GAA GAA CTC CTA TGT GG-3；アンチセンス：5'-TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3'であり、499bpの産物を与えた；Tnf-αについては、5'-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3'；5'-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3'であり、590bpの産物を与えた；IL-1βについては、5'-GGA TGA GGA CAT GAG CAC CT-3'および5'-TCC ATT GAG GTG GAG AGC TT-3'であり、196bpの産物という結果となった；IL-6については、5'-TGA AGT TCC TCT CTG CAA GAG ACT-3'、5'-TGA GGA AGG CCG TGG TTG T-3'であり、200bpの産物を与えた。全細胞RNAをTrizol試薬(Gibco)を用いて単離した。逆転写(Thermoscript RT、Invitrogen)後、1μlのcDNA産物をPCR(Platinum Taqポリメラーゼ、Invitrogen)により33サイクル増幅し、55℃の温度でアニーリングした。プライマーの各ペアについて行った標準曲線（データは示していない）によって示されるように、33サイクルではすべてのmRNA増幅は増幅の対数期にあることに注意すべきである。10μlの増幅産物を3%アガロースゲルで分離し、Bio-Rad Molecular Analyst Systemを用いた臭化エチジウム染色で可視化した。“TINAscan”ソフトウエアを用いて定量を行った。各実験を４回繰り返した。
【００３７】
全組織RNAを、Trizol試薬(Gibco BRL Co、メリーランド)を用いて胃腔生検から抽出した。混入ゲノムDNAをDNase(Gibco BRL)の添加により除去した。逆転写を、SuperScript Preamplification System(Gibco BRL)および全量20μlのランダムヘキサマーを用いて行った。2μlのRT産物を鋳型として用い、2mM MgCl2、１強度(one strength)のPCR緩衝液、0.2mMのセンスおよびアンチセンスプライマー、0.2mM dNTPsおよび2.5U Taqポリメラーゼ(Gibco)を最終反応容量50μlにて用いたPCRにより増幅した。PCRはPerkin-Elmer DNA Thermal Cycler中、以下のサイクルパラメーターを用いて行った：前増幅サイクル(98℃で5分間の変性、65℃で1分のアニーリング、および72℃で1分の伸長)、63℃で1分のアニーリングを2サイクル、35サイクルの増幅(95℃で1分の変性、60℃で1分のアニーリングおよび72℃で1分の変性および72℃で7分の最後の伸長工程。オリゴヌクレオチドは刊行されたヒト配列に従い、Ucnセンス：5'-CAGGCGAGCGGCCGCG-3'、およびアンチセンス：5'-CTTGCCCACCGAGTCGAAT-3'およびCRHセンス：5'-CAACTTTTTCCGCGTGTTGCT-3'、およびアンチセンス：5'-ATGGCATAAGAGCAGCGCTAT-3'とデザインした。増幅産物のサイズは、Ucnについては145bp、CRHについては360bpと予測された。オリゴヌクレオチドは、MWG-Biotech, AG(Munchen、ドイツ)により常法で合成した。ゲノムまたは他のDNA混入の可能性を排除するため、Ucn RNAに陽性の試料にRT酵素を添加しなかった対照試料(no RT)またはDNA鋳型なしの対照試料(no DNA)を各アッセイに含めた。アクチンのPCRはまた、RNAおよびcDNA調製物の良い品質を確実にすべく標準手順を用いて行った。増幅したPCR産物を1%アガロースゲル電気泳動により分画し、UV下での臭化エチジウム染色により検出した。
【００３８】
ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ
体躯血からの血清を以下のようにして回収した：a)TNF-αの決定のためにはLPS投与の1時間後、およびb)IL-1βまたはIL-6レベルの決定のためには4時間後。各時点および処理で各群は実験当たり５匹の動物から構成されていた。血清を回収し、製造業者(R&D、ネブラスカ、米国)に従ってELISAによるサイトカイン決定に使用するまで凍結した。同様に、細胞培養上澄み液を刺激の24時間後に回収し、分析のときまで70℃で貯蔵した。コルチコステロンをRIAによりLPS投与の1時間後に回収した血清で測定した。血清を70℃で凍結し、製造業者(ICN、米国)の推奨に従って分析した。
【００３９】
アポトーシスの定量測定
細胞を96ウエルプレート中、ウエル当たり10,000細胞の初期濃度にてプレーティングした。「細胞死検出」ELISAプラスキットを用い、製造業者のプロトコールに従ってヌクレオソームDNAの断片化を直接決定することによりアポトーシスを測定した。
【００４０】
ＦＡＣＳ分析
細胞を異なる時点について指示した濃度のＵＣＮおよび／またはＬＰＳで処理し、ＰＢＳ中に回収し、７−アミノアクチノマイシン（7AAD）とともに10分間インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー(Coulter)により分析した。
【００４１】
ウエスタンブロット分析
刺激の後、細胞を回収し、62.5mM Tris HCl、pH=6.8、10%グリセリン、2%SDS中で溶解し、ついで新たにインヒビターのフェニルメチルスルホニルフルオライド(10mg/ml)、0.5mM DTTおよび50mM Na2Fを加えた。
【００４２】
ヒト組織標本
１ヶ月を超える上腹部痛および／または消化不良の徴候の病歴を有する患者に、University Hospital in Heraklion（クレタ）で効力のある現行の診断プロトコールに従い、胃鏡検査を施した。以下のカテゴリーの患者は除外した：十二指腸または胃潰瘍、胃食道の逆流かまたは感染のいずれかの結果としての食道炎、食道および上部ＧＩ管の運動障害、胆嚢または胆管の結石、膵炎、肝硬変、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、糖尿病または癌の病歴を有する患者。過去１ヶ月の間に制酸剤以外の薬を服用した患者もまた除外された。上記症例の注意深い除外の後、胃鏡検査を受けた患者を２つの群：対照（ｎ＝８）およびヘリコバクター・ピロリ胃炎と診断された患者（ｎ＝１５）に分けた。これら２群には、年齢、性別、食習慣、または喫煙に関して差異はなかった。正常な内視鏡知見および胃腔（antral）生検における炎症要素の不在を示す患者は対照とした。ヘリコバクター・ピロリによる慢性胃炎を罹患する患者は、適合性の病歴（compatible history）並びに胃粘膜の平らなまたは隆起した糜爛および滲出性要素を含む診断知見を有する個体とした。障害は通常、胃腔において一層顕著であった。ヘリコバクター・ピロリの存在は、組織学的に、および胃腔生検を尿素含有培地に置いて該生物によってアンモニアが生成することに伴い生じるｐＨ変化から簡単な検出を可能とすることにより(CLOテスト、デルタウエスト、ベントリー、オーストラリア)、検出した。第二の胃鏡検査を、二重抗生物質１０日スキーム（アモキシシリン、1g P.O. b.i.d、クラリスロマイシン、500mg P.O. b.i.d.）およびオメプラゾール（20mg P.O b.i.d.を10日間、ついで20mg q.d.を１ヶ月）からなる根治治療の２ヶ月後に行った。胃腔での免疫反応性のウロコルチン（ｉｒ−ＵＣＮ）レベルの一層代表的な測定を達成するため、試料を内視鏡鉗子により胃腔（小弯（lesser curve）および大弯（greater curve）、前壁および後壁）から採取した。各患者の試料をプールし、直ちに70℃に凍結した。胃炎の組織学的な等級付けは、Sydney分類に基づき、患者の種々の群を知らない同一人物により行った。慢性炎症は、穏やか、中程度および重篤として等級付け、それぞれ(+)、(++)および(+++)で表した。炎症の不在はゼロで示した。ヘリコバクター・ピロリの存在は、胃腔粘膜の表層上皮でのその存在の密度によって(+)、(++)および(+++)として等級付けた。炎症の不在およびヘリコバクター・ピロリについて陰性の生検は、正常な生検とした。ヒトの分娩時の胎盤はObstetrics and Gynecology Department、Heraklion University Hospitalで出産した女性から得た。標本の採取に先立ってインフォームドコンセントおよび倫理委員会の充分な認可を得た。
【００４３】
ウロコルチンのためのＲＩＡ
各患者からプールした胃鏡検査胃腔生検試料を、氷冷0.1N HCI中でホモジナイズし、10,000g、4℃にて20分間遠心分離した。上澄み液を10容量の0.1N HCIで酸性にし、10,000gで10分間遠心分離し、新たな上澄み液を活性化Sep-Pak C18カートリッジカラム(Sep-Pak、Waters Associates、ミルフォード、マサチューセッツ)、20mlの0.1N HCIで洗浄し、3mlの80%アセトニトリル20%0.01N HCIで溶出し、真空乾燥した(Speed-Vac)。Ir-UcnをRIA Ucnキット(Peninsula Laboratories, Inc.、カリフォルニア、米国)により製造業者の指示に従ってアッセイした。使用したウサギ抗血清(RIK 8034)は、ヒトUcnに対しては100%の交差反応性を示し、ヒトＣＲＨ、ウロコルチンIIおよびIII、ソーバジン（sauvagine）、ウロテンシンIおよびIIに対しては交差反応性を示さなかった。本発明者らの手では、アッセイの感度は10pgであり、IC50は109pg/チューブであった。結果を、Bradford法により全細胞ホモジネートで決定した全細胞タンパク質（μg）当たりのir-CRHのpgとして表した。
【００４４】
免疫組織化学
ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に対し、免疫染色を行った。胃腔生検からのパラフィン切片を切断し、標準アルカリホスファターゼにより染色した−アルカリホスファターゼ(APAAP)法(DAKO, A/S、グロストラップ、デンマーク)。簡単に説明すると、抗体とインキュベートする前にパラフィン切片をクエン酸ナトリウム溶液中でマイクロ波で加熱した。キシレン脱蝋しアルコール再水和した切片を、0.1Mクエン酸三ナトリウムを充填したコプリンジャー（coplin jars）に入れ、通常のマイクロ波オーブンで700Wにて5分間、３回加熱した。ついで、スライドを15分間冷却し、Tris緩衝食塩水(TBS)で洗浄した。湿チャンバで正常ウサギ血清(1:20、30分、室温)とインキュベーションすることにより非特異的結合をブロックした後、上記ウサギ抗ＵＣＮポリクローナル血清(IHC 8034、Peninsula Laboratories, Inc.、希釈1:1000)を用いて第一の抗体インキュベーションを行った(1時間、室温)。TBSで洗浄した後、切片を抗ウサギIgGおよびAPAAP複合体(DAKO)とともにインキュベートした。Fast red TR(DAKO, A/S、グロストラップ、デンマーク)を発色原として薄いヘマトキシリン対比染色とともに用い、切片を温かいglycergel(DAKO)でマウントした。一次抗体の代わりに非免疫IgGとともにインキュベーションすることにより、または1μMのＵＣＮペプチド(Sigma、セントルイス、ミズーリ、米国)により室温で一夜不活化した抗血清を用いることにより、負の対照切片を各実験に含めた。Kodak Elite Chromeフィルム100 ASAを用い、標準光学顕微鏡で写真を撮った。
【００４５】
結果
Ａ．インビトロ研究
マクロファージに対するＵＣＮの作用
ＵＣＮは、ヌクレオソーム形成およびフローサイトメトリー分析によって決定されるように、血清除去しＬＰＳ誘発したRAW-264.7マクロファージにおけるアポトーシスを促進した。細胞を血清の存在下で培養したときには、ＵＣＮは細胞増殖を促進した。同じ作用は一次骨髄マクロファージでも観察され、ＵＣＮはＬＰＳ誘発アポトーシスを促進した。
【００４６】
ＵＣＮがマクロファージのアポトーシスを促進する分子メカニズム
RAW264.7細胞をＵＣＮで処理すると、細胞のストレス誘発キナーゼJNKおよびp38MAPKの迅速な活性化、BaxのアップレギュレーションおよびFasリガンド発現の促進という結果となった。
【００４７】
ＣＲＨはRAW264.7細胞からのＬＰＳ誘発サイトカイン産生を促進する
マクロファージに対するＣＲＨの作用を決定するため、RAW264.7細胞を血清含有培地で培養し、1x10-8Mの濃度のＣＲＨの存在下または不在下で大腸菌由来ＬＰＳで刺激した。ＣＲＨは胎盤では10-6Mの濃度で認められ、副腎では10-6〜10-9Mの範囲であるので、使用したＣＲＨの濃度は末梢組織でのＣＲＨの生理的範囲内のものである。ＬＰＳの存在下で細胞を２４時間処理すると、TNF-α、IL-1βおよびIL-6の分泌が刺激された。ＣＲＨの存在下では３つのサイトカインのレベルはすべて有意に高く、ＣＲＨがＬＰＳシグナルを高めることを示していた。しかしながら、細胞をＣＲＨ単独で処理したときにはサイトカイン分泌に対して最小の効果しか認められなかった。具体的には、ＣＲＨは、ＬＰＳ誘発されたTNF-α分泌（p=0.04）、IL-1β分泌（p=0.01）およびIL-6分泌（p=0.04）を有意に高めた。
【００４８】
ＣＲＨがサイトカインの転写に対して作用を有するか否かを決定するため、ＣＲＨの存在下または不在下でＬＰＳで処理した細胞からＲＮＡを単離し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてTNF-α、IL-1βおよびIL-6のｍＲＮＡレベルを評価した。ＰＣＲ反応は、各産物の増幅の曲線によって決定されるように、増幅が対数期にある場合に３３サイクルで行った。ＣＲＨは３つのすべてのサイトカインの基礎ｍＲＮＡレベルで最小の促進作用しか有しないが、ＬＰＳ誘発レベルに対しては一層強い増強作用を有する。アクチンに対する正規化後のＲＴ−ＰＣＲ産物の濃度計分析により、ＣＲＨ単独ではIL-1β、TNF-αおよびIL-6の最小の転写しか誘発しなかったが、ＬＰＳ誘発されたサイトカインの転写は強く増強することが明らかとなった。転写レベルで生じた増大はタンパク質レベルで示された増大よりも低く、転写後レベルでのＣＲＨのさらなる作用が示唆された。あるいは、このことはＲＴ−ＰＣＲの半定量法の低い感度の結果なのかもしれない。同じ実験を４回繰り返して同様の結果を得た。
【００４９】
ＣＲＨはチオグリコレート誘起腹膜マクロファージにおけるＬＰＳ誘発サイトカイン産生を促進する
ＣＲＨが一次マクロファージにおいて同じ作用を奏するか否かを決定するため、本発明者らはチオグリコレート誘起腹膜マクロファージをＣＲＨおよびＣＲＨとＬＰＳで処理した。チオグリコレート誘起マクロファージはプライミングされた炎症性マクロファージであり、この方法を用い、ＬＰＳで促進する必要なく炎症性マクロファージを研究することができる。ＣＲＨはTNF-α、IL-1βまたはIL-6の転写を誘発することはできなかったが、ＬＰＳ誘発炎症促進性サイトカインの発現を有意に高めた。濃度計分析データを分析したところ、RAW264.7細胞で観察されたのと同様の差異が示された。それゆえ、ＣＲＨは活性化RAW264.7細胞および活性化一次マクロファージの両者で強力な作用を有し、ＬＰＳなどの強力な補助刺激物質（co-stimulant）の不在下ではサイトカイン発現を誘発することができない。
【００５０】
Ｂ．インビボ研究
ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミンはＬＰＳ誘発敗血症ショックに供したマウスの生存を長引かせた
体重25g当たり0.2、0.4、0.6、0.7および1mgの濃度のＬＰＳを腹腔内投与した。0.4mg/25gで処理した動物の80%、0.6mg/kgで処理した動物の40%および0.7または1mg/25gで処理した動物の0%と比べて0.2mg/25gで処理した動物の100%が生存した。LD50は体重25g当たり0.5mgで評価し、LD100は体重25g当たり0.7mgおよびそれ以上で評価した。本発明者らの実験の目的のためには、本発明者らはＣＲＨ−Ｒ１遮断の可能な保護効果を決定するためLD50よりも高い投与量を使用することを望んだ。それゆえ、マウスに0.7mg/25gのＬＰＳ、すなわちLD100投与量であるがＣＲＨ−Ｒ１遮断の可能な保護効果をマスキングするには高すぎない量を注射した。敗血症ショックの際に生じる事象のカスケードにおけるＣＲＨ−Ｒ１シグナルの役割を決定するため、以前の報告に従って吸収を確実にすべくＬＰＳの投与の１.５時間前にＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストの腹腔内投与をし、または投与することなく、致死量のＬＰＳにマウスを暴露した。結果が特定のタイプのＬＰＳに特異的なものでないことを確認するため、２つの異なるタイプのＬＰＳを用いた。体重25g当たり0.7mgの投与量のＬＰＳの腹腔内注射は、注射後１２〜３１時間以内に致死を誘発した。具体的には、Salmonella enteritidis由来のＬＰＳ単独で処理したマウスでは、致死は１４〜３１時間で観察された。１８時間ではＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミンで前処理したマウスでは２０％でしかなかったのと比べ、動物の６０％が死亡した。全体として、ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミンで前処理したマウスでは生存が有意に長引いた（p=0.022）。同様に、大腸菌由来ＬＰＳを注射しＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミンで前処理したマウスの７２％が１８時間後に依然として生存していたのに対し、大腸菌−ＬＰＳ単独で処理した動物はすべて死亡した。ＬＰＳとＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミンとで処理し内毒素ショックを生き抜いたマウスを７日間にわたって観察したところ依然として生存しており、ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミン処理が生存を長引かせるだけでなく生存を改善することを示していた。ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミン単独で処理した動物はすべて生存した。全体的な生存はＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミンの存在下で有意に改善された（p=0.002）。実験は、１群１０匹の動物を用い、各ＬＰＳサブタイプについて３回繰り返した。
【００５１】
ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストであるアンタラーミンは内毒素誘発炎症促進性サイトカインを抑制した
ＬＰＳの投与は、１時間でピークに達する血漿TNF-αの急性の上昇という結果となった。TNF-αは、ＬＰＳ単独と比べてアンタラーミンを前処理したマウスで有意に低下した（n=5動物／群、p=0.001）。同様に、血漿IL-1βおよびIL-6はＬＰＳ処理後３〜４時間でピークに達し、敗血症ショックの間高いままである。IL-1βおよびIL-6はともにＬＰＳ投与後４時間で上昇したが、アンタラーミンを前処理したマウスでは有意に低かった（IL-1βについてはn=5動物／群、p=0.013；IL-6についてはn=5動物／群、p<0.0001）。アンタラーミンの存在下でのサイトカインレベルの差異が動力学の変化の結果であるか否かを決定するため、本発明者らはＬＰＳ注射後２時間でTNF-αを測定し、アンタラーミンを前処理したマウスのTNF-αレベルがＬＰＳ単独で処理した動物よりも有意に低いままであることを見出した（p<0.001）。同様の差異は、ＬＰＳ注射後６時間でIL-1βおよびIL-6を測定したときに観察された。それゆえ、ＬＰＳ処理した動物は、ＬＰＳとアンタラーミンとで処理したマウスよりも６時間でのIL-1β（p<0.01）およびIL-6（p<0.001）のレベルが有意に高かった。従って、本発明者らは、炎症促進性サイトカインの動力学の変化によるのではなく炎症促進性サイトカインレベルを下げることによって、アンタラーミンがＬＰＳ誘発敗血症ショックの際の生存を長引かせると結論することができた。
【００５２】
ＵＣＮ転写物は正常なおよび炎症を起こしたヒト胃粘膜に存在する
ＣＲＨ様ペプチドの発現を、全ＲＮＡ調製物でＲＴ−ＰＣＲを用いてヒト胃粘膜からの胃腔生検で調べた。ヒトＵＣＮ遺伝子をターゲティングすべくデザインしたプライマーを用い、独特のＲＴ−ＰＣＲ産物を正常な胃粘膜および炎症を起こした胃粘膜の両者の生検からのＲＮＡ調製物で増幅させた。ＤＮＡバンドのサイズは、正の対照として用いたヒト胎盤ＲＮＡ試料から増幅したものと同じであった。逆転写酵素またはｃＤＮＡ鋳型を用いずに平行して行った負の対照の試料ではＰＣＲ産物は検出されず、ゲノムＤＮＡまたは他のＤＮＡの試料への混入の可能性が排除された。対照的に、ヒトＣＲＨ遺伝子のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行ったときには、予測されたサイズのＤＮＡバンドという結果となった胎盤試料のようなＰＣＲ産物は正常な胃粘膜および炎症を起こした胃粘膜からのＲＮＡ試料で増幅されなかった。これら試料からのＲＮＡ調製物の品質は、アクチン遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅により確実にした。これら結果から、ヒトの胃の胃粘膜にはＣＲＨ遺伝子転写物ではなくＵＣＮ遺伝子転写物が存在することが明らかとなった。
【００５３】
正常なおよび炎症を起こしたヒト胃粘膜中のＵＣＮペプチド
ＵＣＮは、ヘリコバクター・ピロリ感染した患者の小窩および粘液分泌腺（胃腔腺（antral glands））の上皮細胞に存在していた。陽性の染色はまた、毛細管および胃粘膜基質に分散した炎症要素（inflammatory element）、主として形質細胞の凝集物に局在していた。ヒト分娩期の胎盤は正の対照として染色された。胎盤切片では、周辺の基質陰性絨毛とは対照的に栄養芽上皮細胞で特異的な陽性染色が観察され、この方法の特異性が確認された。非免疫ＩｇＧによる一次抗体の置換または処理前の過剰のＵＣＮペプチドによる抗体の不活化は、両組織タイプで均一に陰性の免疫染色という結果となった。
【００５４】
ＵＣＮレベルと胃粘膜における炎症との関係
ヒト胃粘膜標本中のｉｒ−ＵＣＮのレベルを、局所的な炎症活性の程度と相関付けた。患者を以下の群に分けた：（ａ）活性な胃炎を罹患していない、すなわち、急性または慢性の炎症またはヘリコバクター・ピロリ感染の徴候を有しない被験者（n=8）；（ｂ）胃粘膜の慢性および急性炎症およびヘリコバクター・ピロリ感染により胃炎と診断された患者（n=15）；（ｃ）病理学的に炎症の後退が確認されヘリコバクター・ピロリ感染の要素を有しない、ヘリコバクター・ピロリ根治の治療を受けた２ヶ月後のレスポンダー（responders）（n=10）および（ｄ）炎症（慢性または急性）の要素およびヘリコバクター・ピロリ感染の残っている非レスポンダー（n=5）。ＵＣＮは、非胃炎被験者（ａ群、2.0±1.3pg/μg(全タンパク質)）と比べてヘリコバクター・ピロリ胃炎患者（ｂ群、10.4±1.8pg/μg(全タンパク質)）で有意に上昇していることがわかった（p<0.001）。ＵＣＮレベルはさらに、他のすべての群（ａ、ｂおよびｄ）と比べてヘリコバクター・ピロリ根治の治療に対するレスポンダーの群（ｃ群、43.1±9.8pg/μg(全タンパク質)、P<0.001）で増大していた。該処置に対する非レスポンダーの群（ｃ、18.7±12.3pg/μg(全タンパク質)）ではそのような上昇は観察されなかったことに注意すべきである。胃炎生検（n=30）からのＲＩＡデータと調べた各病理学的パラメーター（急性および慢性の炎症およびヘリコバクター・ピロリ感染の程度）との相関により、ＵＣＮのレベルと急性および慢性炎症およびヘリコバクター・ピロリ感染の両手段による胃炎の病理段階との間の有意の負の相関関係が明らかとなり、炎症活性およびヘリコバクター・ピロリ感染の後退の際のｉｒ−ＵＣＮレベルの増大が確認された。
【００５５】
結論として、本発明は、単球／マクロファージの活性化、増殖、分化、アポトーシスおよびサイトカイン産生を制御する組織ＣＲＨ系の薬理学的操作を含む新規でこれまで思いもよらなかった手段を用いることにより、炎症を制御する薬理学的手段を提供する。本発明者らは、ＣＲＨが炎症応答を高めるのに対し、ＵＣＮは炎症応答を弱めることを見出した。これらＣＲＨおよびＵＣＮの効果は、単球／マクロファージ細胞に対する直接的な作用の結果である。Balb/cマウスにおけるＬＰＳ誘発内毒素ショックモデル（全身炎症の確立されたモデル）を用いた本発明者らのインビボ実験において、ＬＰＳの前の合成ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストの投与は統計的に有意な仕方で生存を長引かせた。この効果は内毒素ショックの初期段階で一層顕著であった。ＣＲＨ−Ｒ１遮断もまたマクロファージ由来サイトカインTNF-α、IL-1β、およびIL-6のＬＰＳ誘発上昇を抑制し、サイトカイン発現におけるＣＲＨ媒体シグナルの役割が確認された。RAW 264.7単球／マクロファージ細胞株（マウスミエローマに由来し、ＬＰＳに応答してすべての炎症促進性サイトカインを産生する）およびBalb/cマウスからのチオグリコレート誘起腹膜マクロファージの２つのタイプのマクロファージを用いた本発明者らのインビトロ実験において、本発明者らはＣＲＨがＬＰＳ誘発されたTNF-α、IL-1βおよびIL-6の産生を促進することを見出した。それゆえ、ＣＲＨシグナルは、マクロファージによるＬＰＳ誘発炎症促進性サイトカインの産生を増強するうえで初期段階でかつ重要な役割を担っている。本発明者らはまた、ＵＣＮがマクロファージのアポトーシスを誘発することにより炎症応答を改善することを見出した。このＵＣＮの効果は、インビトロにおいてＬＰＳ誘発RAW 264.7マクロファージおよび一次骨髄マクロファージ培養液で一層顕著であった。RAW 264.7細胞をＵＣＮで処理すると、ストレス誘発キナーゼJNKおよびp38MAPKの迅速な活性化、BaxのアップレギュレーションおよびFasリガンド発現の促進およびアポトーシスという結果となった。さらに、本発明者らが動物においてインビトロおよびインビボで得た知見はまた、ヒトで確認された。実際、ヘリコバクター・ピロリ胃炎を罹患する患者からの胃粘膜生検において、ＵＣＮレベルが低いままであった非応答患者と比べてヘリコバクター・ピロリの根治処置はＵＣＮの劇的な増大という結果となり、ヘリコバクター・ピロリ感染を含む有害な刺激に対する胃粘膜でのＵＣＮの細胞保護的な役割がさらに確認された。それゆえ、本発明者らのデータを総合すると、ＣＲＨ ＵＣＮ系は、単球／マクロファージの増殖、分化、アポトーシスおよび炎症性サイトカインの産生に対するその作用により、炎症応答の制御において重要な役割を果たしていることが示唆される。
【００５６】
参考文献
以下に本明細書の記載および実施例で引用した参考文献を列記する。これら参考文献は、参照のため本明細書の記載に含められる。
【００５７】
Agelaki S, Tsatsanis C, Gravanis A, Margioris AN. 「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンは、マウスにおいてインビトロでおよびリポ多糖誘発内毒素ショックでマクロファージからの炎症促進性サイトカインの産生を高める」Infect Immun. 2002;70:6068-6074
【００５８】
Agnello D, Bertini R, Sacco S, Meazza C, Villa P, Ghezzi P. (1998) 「ニューロペプチドウロコルチンによる腫瘍壊死因子産生のコルチコステロイドに依存しない抑制」Am J Physiol. 275:757-762
【００５９】
Audhya, T.,R. Jain, C. S. Hollander. (1991). 「副腎皮質刺激ホルモン放出因子によるレセプター媒体イムノモデュレーション」Cell Immunol 134:77-84
【００６０】
Baigent, S. M.およびP. J. Lowry. (2000). 「末梢ラット組織における副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRF)、ウロコルチン、CRFレセプターおよびCRF-結合タンパク質のｍＲＮＡ発現プロファイル」J Mol Endocrinol 25:43-52
【００６１】
Bamberger CM, Bamberger AM. (2000) 「末梢ＣＲＨ／ウロコルチン系」Ann N Y Acad Sci  917:290-296
【００６２】
Bamberger CM, Wald M, Bamberger AM, Ergun S, Beil FU, Schulte HM. (1988) 「ヒトリンパ球はウロコルチンを産生するが、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンは産生しない」J Clin Endocrinol Metab. 83:708-711
【００６３】
Brar BK, Stephanou A, Okosi A, Lawrence KM, Knight RA, Marber MS, Latchman DS. (1999) 「ＣＲＨ様ペプチドは心臓の筋細胞を致死的な虚血障害から保護する」Mol Cell Endocrinol  158:55-63
【００６４】
Crofford, L. J., H. Sano, K. Karalis, E. L. Webster, E. A. Goldmuntz, G. P. Chrousos, and R. L. Wilder. (1992). 「炎症性関節炎を罹患するLewisラットの関節での副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンの局所的分泌」J Clin Invest 90:2555-64.
【００６５】
Crofford, L. J., H. Sano, K. Karalis, T. C. Friedman, H. R. Epps, E. F. Remmers, P. Mathern, G. P. ChrousosおよびR. L. Wilder. (1993). 「慢性関節リウマチおよび骨関節症を罹患する患者の滑液および組織中の副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン」J Immunol 151:1587-96
【００６６】
Dautzenberg FM, Hauger RL. (2002) 「ＣＲＦペプチドファミリーおよびそのレセプター：さらなるパートナーの発見」Trends Pharmacol Sci  23:71-77
【００６７】
Dermitzaki, E., C. Tsatsanis, A. GravanisおよびA. N. Margioris. (2002). 「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンは、ｐ３８マイトジェン活性化されたプロテインキナーゼの活性化によりＰＣ１２細胞においてＦａｓリガンド産生およびアポトーシスを誘発する」J Biol Chem 277:12280-7
【００６８】
Elenkov, I. J.およびG. P. Chrousos. (1999). 「ストレスホルモン、Th1/Th2パターン、炎症促進性/抗炎症性サイトカインおよび疾患に対する罹病性」Trends Endocrinol Metab 10:359-368
【００６９】
Elenkov, I. J., E. L. Webster, D. J. TorpyおよびG. P. Chrousos. (1999). 「ストレス、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、グルココルチコイド、および免疫/炎症性応答：急性および慢性の効果」 Ann N Y Acad Sci 876:1-11; discussion 11-3
【００７０】
Karalis, K., H. Sano, J. Redwine, S. Listwak, R. L. WilderおよびG. P. Chrousos. (1991). 「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンのインビボでの自己分泌またはパラ分泌炎症性作用」Science 254:421-3
【００７１】
Kawahito, Y., H. Sano, S. Mukai, K. Asai, S. Kimura, Y. Yamamura, H. Kato, G. P. Chrousos, R. L. WilderおよびM. Kondo. (1995). 「潰瘍性大腸炎を罹患する患者での結腸粘膜中の副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン」Gut 37:544-51
【００７２】
Kohno M, Kawahito Y, Tsubouchi Y, Hashiramoto A, Yamada R, Inoue K, Kusaka Y, Kubo T, Elenkov E, Chrousos GP, Kondo M, Sano H. (2001). 「慢性関節リウマチおよび骨関節症を罹患する患者の滑液中のウロコルチン発現：炎症活性との関連」J Clin Endocrinol Metab 86:4344-4352
【００７３】
Martinez V, Wang L, Rivier J, Vale W, Tache Y. (2002) 「マウスでの胃空隙および直腸通過に対する末梢副腎皮質刺激ホルモン放出因子およびウロコルチンIIおよびIIIの分化作用：ＣＲＦレセプターサブタイプ１および２の役割」J Pharm Exp Ther 301:611-617
【００７４】
Million M, Maillot C, Saunders P, Rivier J, Vale W, Tache Y. (2002). 「新規なＣＲＦ関連ペプチドであるヒトウロコルチンIIは、ラットにおいて胃通過に対して選択的なＣＲＦ２媒体作用を示す」Am J Physiol 282:34-40
【００７５】
Muramatsu Y, Fukushima K, Iino K, Totsune K, Takahashi K, Suzuki T, Hirasawa G, Takeyama J, Ito M, Nose M, Tashiro A, Hongo M, Oki Y, Nagura H, Sasano H. (2000) 「ヒト直腸粘膜でのウロコルチンおよび副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプターの発現」Peptides.21:1799-1809
【００７６】
Nishikimi T, Miyata A, Horio T, Yoshihara F, Nagaya N, Takishita S, Yu-tani C, Matsuo H, Matsuoka H, Kangawa K. (2000) 「正常な心臓および疾患を有する心臓におけるウロコルチン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子ファミリーの成員」 Am J Physiol 279:3031-3039
【００７７】
Pedersen WA, Wan R, Zhang P, Mattson MP. (2002) 「ウロコルチンIIではなくウロコルチンは、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンレセプター１型により酸化的および興奮毒性細胞死から培養海馬ニューロンを保護する」J Neurosci  22:404-412
【００７８】
Perrin, M. H.およびW. W. Vale. (1999). 「副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプターおよびそのリガンドファミリー」Ann N Y Acad Sci 885:312-28
【００７９】
Poliak S, Mor F, Conlon P, Wong T, Ling N, Rivier J, Vale W, Steinman L. (1997) 「ストレスおよび自己免疫：ニューロペプチドである副腎皮質刺激ホルモン放出因子およびウロコルチンは、視床下部−下垂体−副腎軸および免疫系の両者に対する作用により脳脊髄炎を抑制する」J Immunol. 158:5751-5756
【００８０】
Theoharides TC, Singh LK, Boucher W, Pang X, Letourneau R, Webster E, Chrousos G. (1998). 「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンは皮膚の肥満細胞の脱顆粒および血管透過性の増大を誘発する、該ホルモンの炎症促進作用の可能な説明」Endocrinology 139:403-408
【００８１】
Tsatsanis C, Androulidaki A, Dermitzaki E, Gravanis A, Margioris AN. 「マクロファージアポトーシスに対する副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）およびその関連ペプチドであるウロコルチンおよびウロコルチンIIの分化作用」（提出中）
【００８２】
Turnbull AV, Vale W, Rivier C. (1996) 「副腎皮質刺激ホルモン放出因子関連哺乳動物ペプチドであるウロコルチンは、ラットにおいて熱障害による浮腫を抑制する」Eur J Pharmacol. 303:213-216
【００８３】
Vaughan J, Donaldson C, Bittencourt J, Perrin MH, Lewis K, Sutton S, Chan R, Turnbull AV, Lovejoy D, Rivier C. (1995) 「ウロコルチン、魚のウロテンシンＩおよび副腎皮質刺激ホルモン放出因子に関連する哺乳動物ニューロペプチド」Nature 778:223-234
【００８４】
Webster, E. L., D. E. Tracey, M. A. Jutila, S. A. Wolfe, Jr., and E. B. De Souza. (1990). 「マウス脾臓での副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター：レジテントマクロファージとしてのレセプター含有細胞の同定」Endocrinology 127:440-52
【００８５】
Webster, E. L., D. J. Torpy, I. J. ElenkovおよびG. P. Chrousos. (1998). 「副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンおよび炎症」Ann N Y Acad Sci 840:21-32
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】RAW264.7細胞を１０−９Ｍ ＵＣＮおよび１０μｇ／ｍｌのＬＰＳで処理し、ヌクレオソーム形成によりアポトーシスを測定した。
【００８７】
【図２】ＵＣＮはRAW264.7マクロファージにおいてＬＰＳ誘発ｐ３８ＭＡＰＫおよびＪＮＫの活性化を促進する。
【００８８】
【図３】ＣＲＨはRAW264.7マクロファージからのＬＰＳ誘発炎症促進性サイトカインの分泌を高める。（ａ）ＣＲＨ、ＬＰＳおよびＣＲＨとＬＰＳで処理した細胞の培地中のＴＮＦ−αレベル。ＴＮＦ−αレベルは、ＬＰＳ単独よりもＣＲＨおよびＬＰＳで細胞を処理したときに有意に高い。（ｂ）ＣＲＨはＬＰＳ誘発ＩＬ−１β分泌を有意な仕方で増強する。（ｃ）ＣＲＨはRAW264.7細胞からのＬＰＳ誘発ＩＬ−６分泌を増強する。
【００８９】
【図４】（ａ）ＣＲＨは炎症促進性サイトカインを転写レベルで増強する。ＩＬ−１β（上段のパネル）、ＴＮＦ−α（第二のパネル）およびＩＬ−６（第三のパネル）ｍＲＮＡレベルを半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により決定した。ＣＲＨは３つのすべてのサイトカインの発現を誘発し、ＬＰＳ誘発転写活性化をさらに増強する。（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）ＩＬ−１β（Ｂ）、ＴＮＦ−α（Ｃ）およびＩＬ−６（Ｄ）のＲＴ−ＰＣＲ産物の濃度計分析。
【００９０】
【図５】ＣＲＨはBalb/cマウスからのチオグリコレート誘発腹膜マクロファージにおけるＬＰＳ誘発炎症促進性サイトカインの発現を高める。ＩＬ−１β（Ａ：上段のパネル）、ＴＮＦ−α（Ｂ：上段のパネル）およびＩＬ−６（Ｃ：上段のパネル）ｍＲＮＡ発現を、アクチンに対して正規化したＲＴ−ＰＣＲ産物の濃度計分析により定量化した。
【００９１】
【図６】ＣＲＨ−Ｒ１レセプターアンタゴニストであるアンタラーミンは、サルモネラ・エンテリチディス由来ＬＰＳ処理した動物の生存を長引かせた。
【００９２】
【図７】アンタラーミンによるＣＲＨ−Ｒ１レセプターの遮断は、ＬＰＳ誘発内毒素ショックに供したマウスにおいてＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−６レベルを有意に低下させた。
【００９３】
【図８】ヒト正常胃粘膜の生検、胃炎を罹患した２人の異なる被験者からの炎症を起こした胃粘膜の２つの生検、および分娩時のヒト胎盤の生検から単離した全ＲＮＡ中のＣＲＨ様ペプチドについてのＲＴ−ＰＣＲ分析。ＵＣＮについての１４５ｂｐの予測されたサイズのＤＮＡ産物がすべての試料において認められる。逆転写酵素を含まない負の対照試料（ｎｏＲＴ）およびＤＮＡ鋳型を含まない負の対照試料をも示してある。ＣＲＨについての３６０ｂｐの予測されたサイズのＤＮＡ産物は、胎盤ＲＮＡ試料でのみ検出された。アクチンについてのＲＴ−ＰＣＲは、すべての試料におけるＲＮＡの品質を確認するために行った。
【００９４】
【図９】ヘリコバクター・ピロリ感染と関連した慢性胃炎を罹患した患者の胃粘膜でのＵＣＮについての免疫組織化学染色（Ｃ、Ｄ）。ヒト胎盤を正の対照として用いた（パネルＡ、Ｂ）。胃粘膜および胎盤組織切片を抗ＵＣＮ抗体で染色した（パネルＢ、Ｄ）。免疫反応性のウロコルチン（Ｉｒ−ＵＣＮ）が小窩の上皮細胞（Ｆ）および粘液分泌腺（Ｇ）に局在化された。陽性の染色はまた、毛細管（Ｃ）および胃粘膜基質に分散した炎症要素（inflammatory element）（Ｓ）、主として形質細胞（Ｐ）でも観察された。胎盤切片では、栄養芽上皮細胞（Ｔ）が周辺の基質絨毛（Ｖ）とは対照的にＵＣＮに対して陽性に染色された。正常ウサギＩｇＧまたはＵＣＮペプチド不活化抗体を用いた対照免疫染色（パネルＡ、Ｃ）は均一に陰性であった。当初の倍率×２５０。
【００９５】
【図１０】ヒト胃粘膜生検中のＵＣＮレベル。パネルＡ：胃の炎症を有しない（正常）患者とヘリコバクター・ピロリ感染により胃炎を罹患していると診断された患者との比較。Ｉｒ−ＵＣＮは、ヘリコバクター・ピロリ胃炎および胃の炎症を有する患者群で有意に（ｐ＜０.００１）上昇していることがわかった。パネルＢ：治療を受ける前とヘリコバクター・ピロリ根治の処置を受けた２ヶ月後のヘリコバクター・ピロリ胃炎の患者の比較。病理学的な知見により、後者はレスポンダー（responders）（急性および慢性の炎症の後退およびヘリコバクター・ピロリ感染の徴候なし）と非レスポンダー（炎症の持続および／またはヘリコバクター・ピロリ感染の徴候）とに細分された。ｉｒ−ＵＣＮレベルの有意の上昇は、処置群には認められたが（ｐ＜０.００１）、非応答患者には認められなかった。
【００９６】
【図１１】胃炎を罹患する患者からの胃生検でのＵＣＮレベルと炎症活性レベルとの相関分析（ｎ＝３０）。Ａ：慢性炎症、Ｂ：急性炎症、およびＣ：ヘリコバクター・ピロリ感染。統計的に有意な負の相関が３つのすべてのパラメーターで観察された（スピアマンの順位相関）。
【図１】
2006509756.tif 000002
【図２】
2006509756.tif 000003
【図３】
2006509756.tif 000004
【図４】
2006509756.tif 000005
【図５】
2006509756.tif 000006
【図６】
2006509756.tif 000007
【図７】
2006509756.tif 000008
【図８】
2006509756.tif 000009
【図９】
2006509756.tif 000010
【図１０】
2006509756.tif 000011
【図１１】
2006509756.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月27日(2005.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006509756000001.app
【国際調査報告】
2006509756.tif 000013
2006509756.tif 000014
2006509756.tif 000015
2006509756.tif 000016