(57)【要約】本発明は細胞周期の調節のモジュレーター、特に細胞周期に干渉することができるプロテインホスファターゼ阻害剤、上記阻害剤の製造プロセス、および上記阻害剤の使用、特に癌のような疾病の治療における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンタリミド（cantharimide）またはその類似体である、プロテインホスファターゼ阻害剤。
【請求項２】
ホスファターゼがセリン/スレオニン特異的ホスファターゼである、請求項1記載のプロテインホスファターゼ阻害剤。
【請求項３】
ホスファターゼがPP1またはPP2Aである、請求項2記載のプロテインホスファターゼ阻害剤。
【請求項４】
プロテインホスファターゼ阻害剤が細胞透過性である、請求項1から3のいずれか1項記載のプロテインホスファターゼ阻害剤。
【請求項５】
式Ｉの化合物：
【化１】
2004531500.tif 000020
またはその類似体、誘導体もしくは変異体。
【請求項６】
アミノ酸がD-もしくはL-アミノ酸またはその類似体である、請求項5記載の化合物。
【請求項７】
アミノ酸が、D-アラニン、L-アラニン、D-フェニルアラニン、L-フェニルアラニン、D-ロイシン、L-ロイシン、D-イソロイシン、L-イソロイシン、D-トリプトファン、L-トリプトファン、D-ヒスチジン、L-ヒスチジン、D-チロシン、L-チロシン、D-グルタミンおよびL-メチオニンからなる群から選択され、より好ましくは、アミノ酸が、D-トリプトファン、L-トリプトファン、D-ヒスチジン、L-ヒスチジン、D-チロシン、L-チロシン、D-グルタミンまたはL-メチオニンである、請求項5または6記載の化合物。
【請求項８】
アミノ酸がD-ヒスチジンまたはL-ヒスチジンである、請求項5から7のいずれか1項記載の化合物。
【請求項９】
化合物が細胞周期モジュレーターである、請求項5から8のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１０】
化合物が細胞周期を促進する、請求項9記載の化合物。
【請求項１１】
化合物がプロテインホスファターゼ阻害剤である、請求項5から10のいずれか1項記載の化合物。
【請求項１２】
化合物がPP1および/またはPP2Aの阻害剤である、請求項11記載の化合物。
【請求項１３】
式ＩＩの化合物：
【化２】
2004531500.tif 000021
またはその類似体、誘導体もしくは変異体を、アミノ酸またはアミノ酸の類似体、誘導体もしくは変異体と結合させることを含む、請求項1から4のいずれか1項記載のプロテインホスファターゼ阻害剤または請求項5から12のいずれか1項記載の化合物の調製方法。
【請求項１４】
式ＩＩの化合物をアミンの存在下でアミノ酸と結合させることを含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
アミンが第三級アミンである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
アミンがEt3Nである、請求項14または15記載の方法。
【請求項１７】
さらに式ＩＩの化合物を有機溶媒の存在下でアミノ酸と結合させることを含む、請求項13から16のいずれか1項記載の方法。
【請求項１８】
有機溶媒がPhCH3である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
式ＩＩの化合物またはその類似体、誘導体もしくは変異体を15から300℃の間の温度でアミノ酸またはアミノ酸の類似体、誘導体もしくは変異体と結合させる、請求項13から18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
温度が室温である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
温度が100℃から250℃の間である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
温度がおよそ200℃である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
プロテインホスファターゼ阻害剤または式Ｉの化合物をさらに精製する、請求項13から22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２４】
プロテインホスファターゼ阻害剤または式Ｉの化合物を洗浄する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
プロテインホスファターゼ阻害剤または式Ｉの化合物をNaHCO3で洗浄する、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
プロテインホスファターゼ阻害剤または式Ｉの化合物を抽出する、請求項23から25のいずれか1項記載の方法。
【請求項２７】
プロテインホスファターゼ阻害剤または式Ｉの化合物をCH2Cl2で抽出する、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
プロテインホスファターゼ阻害剤または式Ｉの化合物を酸性化する、請求項23から27のいずれか1項記載の方法。
【請求項２９】
プロテインホスファターゼ阻害剤または式Ｉの化合物を濃HClにより酸性化する、請求項28 記載の方法。
【請求項３０】
プロテインホスファターゼ阻害剤または式Ｉの化合物を有機溶媒により抽出する、請求項23から29のいずれか1項記載の方法。
【請求項３１】
有機溶媒が酢酸エチルである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
プロテインホスファターゼ阻害剤または式Ｉの化合物をクロマトグラフィーによりさらに精製する、請求項23から30のいずれか1項記載の方法。
【請求項３３】
クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
式IIIの化合物。
【化３】
2004531500.tif 000022
［式中、ZはO、NHまたはNRであり;
XはCHまたはNであり;
Pは存在しないか、またはメチルであり；
Yは(CH2)nWであり、
Wはイオン化可能な残基で、nは1から8の整数である。］
【請求項３５】
化合物が、式IVまたはVで表される、請求項34記載の化合物。
【化４】
2004531500.tif 000023
【化５】
2004531500.tif 000024
【請求項３６】
細胞の細胞周期をモジュレートするために用いる、請求項34または35記載の化合物。
【請求項３７】
ZがOであり、XがNであり、およびYが-CH2OWであって、Wがアミノ酸またはアミノ酸の類似体もしくは誘導体である、請求項34記載の化合物。
【請求項３８】
アミノ酸がD-ヒスチジンまたはL-ヒスチジンである、請求項37記載の化合物。
【請求項３９】
ZがOであり、XがNであり、およびYが-CH2=CHWであって、Wがアミノ酸またはアミノ酸の類似体もしくは誘導体である、請求項34記載の化合物。
【請求項４０】
アミノ酸がD-ヒスチジンまたはL-ヒスチジンである、請求項39記載の化合物。
【請求項４１】
請求項1から4のいずれか1項記載のプロテインホスファターゼ阻害剤または請求項5から12もしくは34から40のいずれか1項記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項４２】
静脈内送達に適した、請求項41記載の医薬組成物。
【請求項４３】
請求項1から4のいずれか1項記載のプロテインホスファターゼ阻害剤または請求項5から12もしくは34から40のいずれか1項記載の化合物の医薬の製造における使用。
【請求項４４】
医薬が癌の治療用である、請求項43記載の使用。
【請求項４５】
癌が白血病、卵巣癌、結腸癌または腎臓癌である、請求項44記載の使用。
【請求項４６】
請求項1から4のいずれか1項記載のプロテインホスファターゼ阻害剤、または請求項5から12もしくは34から40のいずれか1項記載の化合物、または請求項41もしくは42記載の医薬組成物を投与することを含む、障害または疾病を治療する方法。
【請求項４７】
疾病が癌である、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
癌が白血病、卵巣癌、結腸癌または腎臓癌である、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
別の治療と併用する、請求項46から48のいずれか1項記載の方法。
【請求項５０】
治療方法によって、治療された細胞の別の治療に対する感受性をより高くする、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
別の治療が癌の治療である、請求項49または50記載の方法。
【請求項５２】
別の治療が、放射線照射、シスプラチン、5-フルオロウラシル、メトトレキセート、チミターク（thymitaq）およびタキソール治療からなる群より選択される、請求項49から51のいずれか1項記載の方法。
【請求項５３】
請求項1から4のいずれか1項記載のプロテインホスファターゼ阻害剤、請求項5から12もしくは34から40のいずれか1項記載の化合物、または請求項41もしくは42記載の医薬組成物に細胞を曝露することを含む、細胞周期の進行を制御する方法。
【請求項５４】
細胞をプロテインホスファターゼ阻害剤、化合物または医薬組成物に曝露することにより1つ以上の細胞周期チェックポイントを解除する、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
細胞が哺乳類細胞である、請求項53または54記載の方法。
【請求項５６】
細胞がヒト細胞である、請求項53から55のいずれか1項記載の方法。
【請求項５７】
細胞が新生物または前新生物細胞である、請求項53から56のいずれか1項記載の方法。
【請求項５８】
細胞が癌細胞である、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
細胞が、マウス白血病細胞、ヒト白血病細胞、ヒト卵巣癌細胞、シスプラチン耐性細胞、ヒト結腸癌細胞、ヒト骨肉腫細胞およびヒト腎臓腫瘍細胞からなる群より選択される、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
細胞が、L1210（マウス白血病、p53 mt）、HL60（ヒト白血病、p53 nul）、A2780（ヒト卵巣癌、p53 wt）、ADD（シスプラチン耐性A2780細胞、p53 mt）、HCT116（ヒト結腸癌、p53 wt）、SW480（ヒト結腸癌、p53 wt）、WiDr（ヒト結腸癌、p53 mt）、HT29（ヒト結腸癌、p53 mt）、143BTK-（ヒト骨肉腫）およびG-401（ヒト腎臓、ウィルムス腫瘍）細胞として知られる細胞型から選択される細胞である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
患者に有効量の請求項1から4のいずれか1項記載のプロテインホスファターゼ阻害剤、請求項5から12もしくは34から40のいずれか1項記載の化合物、または請求項41もしくは42記載の医薬組成物を投与することを含む、患者を癌治療に対して感受性にする方法。
【請求項６２】
【化６】
2004531500.tif 000025
［式中、Rはイオン化可能な残基である。］
を、カンタリジン（cantharidin）またはその類似体もしくは誘導体と結合させることを含む、請求項34から40のいずれか1項記載の式IIIの化合物の調製方法。
【請求項６３】
【化７】
2004531500.tif 000026
［式中、Rはイオン化可能な残基である。］
を、カンタリジンまたはその類似体もしくは誘導体と結合させることを含む、請求項34から40のいずれか1項記載の式IIIの化合物の調製方法。
【請求項６４】
イオン化可能な残基またはアミノ酸類似体が、修飾された側鎖を有するヒスチジン類似体である、請求項13から33、62及び63のいずれか1項記載の方法。
【請求項６５】
修飾された側鎖が以下から選択される、請求項64記載の方法。
【化８】
2004531500.tif 000027
【請求項６６】
ホーナー-エモンズ-ウィリング（Horner-Emmons-Willing）またはジュリア（Julia）-オレフィン化合成方法に従って実施する、請求項13から33、62から65のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞周期調節のモジュレーターに関する。特に細胞周期に干渉することができるプロテインホスファターゼ阻害剤；上記阻害剤の製造方法；および上記阻害剤の使用、特に癌のような疾病の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
明細書を通じて、先行技術に関するいかなる考察も、このような先行技術が広く知られていること、または当技術分野において周知の一般知識の一部であることを認めるものであるとみなされるべきではない。
【０００３】
プロテインホスファターゼ
構造および調節タンパク質のリン酸化は、プロテインキナーゼおよびプロテインホスファターゼの両方により制御されている細胞における主要な細胞内制御メカニズムである。このような細胞プロセスは、細胞周期の進行、グリコーゲン代謝、遺伝子発現、および光変換(phototransduction)を含むが、関与するタンパク質のリン酸化状態によりモジュレートされる。多くのプロテインキナーゼが発見されているのとは対照的に、プロテインホスファターゼは比較的少数しか知られていない。3つの主要なクラスのプロテインホスファターゼ、チロシン特異的、セリン/スレオニン特異的、および二重特異性ホスファターゼが存在する。伝統的に、セリンおよびスレオニン残基の脱リン酸化を触媒するプロテインホスファターゼは、その生物学的特徴、特定の阻害剤に対する感受性、および基質特異性に基づいて4つのサブタイプに分類されてきた(PP1、PP2A、PP2B、およびPP2C)。PP1、PP2A、およびPP2Bの一次アミノ酸配列は類似しているが、PP2Cは構造的に異なっており、完全に異なる遺伝子ファミリーに属する。PP4、PP5、PP6およびPP7を含む他のホスファターゼはPP1およびPP2Aとアミノ酸相同性があることが確認されている。
【０００４】
プロテインホスファターゼの阻害
カンタリジン（blister beetles）およびフォストリエシン(fostriecin)（Streptomyces pulveraceus-fostreus）を含むさまざまな天然毒素が、癌の治療に利用されてきた。実際、カンタリジンは有名な媚薬であるスパニッシュフライ(Spanish Fly)の活性成分であり、1264年から抗がん剤として使われてきたi。われわれは、カンタリジンが、卵巣、骨、結腸および造血起源の10種の異なる癌細胞系において細胞毒性を有し、多くの従来の抗がん薬（5-フルオロウラシル）に匹敵する６〜18mMの範囲のIC50値を与えることを示した。カンタリジンは現在臨床的に使用されるが、その腎毒性が広範囲な使用の妨げとなっている。興味深いことに、カンタリジンが好中球生産を促進することが示されている。これは、ほとんどの抗がん剤の投与量を限定する効果がしばしば骨髄抑制に関するものであることと対照的である。フォストリエシンもまた国立癌研究所（アメリカ合衆国）により試験されて、抗がん剤として効力があることが見出され（IC50 0.6〜50mM）、次いで第1相臨床試験に入ったが、その構造的な不安定さのためにそれ以上の開発ができなかったii。さらに最近になって、これらの薬物の主な標的がホスファターゼ酵素PPIおよびPP2Aの阻害であることが発見されたiii,iv。
【０００５】
カンタリジンおよびフォストリエシンは、さまざまなプロテインホスファターゼ阻害活性を有する天然毒素の構造的に多様なグループのメンバーである（表1）v。フォストリエシンは明らかに公知の最も選択的なPP2A阻害剤である一方、カンタリジン(1)は構造的に最小の複合体である。カンタリジンの化学構造に基づいて、我々は、効力が高く選択的な抗がん剤として多くのプロテインホスファターゼ阻害剤を開発した（表2）。表2に見られるように、2つの無水物により修飾したカンタリジン類似体が、結腸腫瘍細胞系、HT29およびWiDr（表にハイライトをつけた）に対してかなりの選択性を示す。けれども、ほとんどの報告された事例においてvi、PPIおよびPP2Aのいずれかまたは両方に対する効力を維持するように修飾をおこなうことは不可能であった。
【０００６】
表１．天然毒素によるプロテインホスファターゼ阻害(IC50)
【表１】
2004531500.tif 000002
【０００７】
表２．選択された無水物により修飾したカンタリジン類似体、PP1およびPP2A阻害および細胞毒性（IC50=μM、72時間曝露後に50%成長阻害を誘導する濃度）
【表２】
2004531500.tif 000003
【０００８】
リン酸化および細胞周期の進行
ほとんどの抗癌剤と同様に、カンタリジンおよびフォストリエシンの細胞毒性は細胞周期の変更により実現される。細胞周期は、キナーゼとホスファターゼの活性の間の相互作用が関与する入り組んだリン酸化ネットワークにより調節されるvii。PPIおよびPP2Aの両方が、細胞周期の進行に関与する重要なシグナル導入メカニズムを制御していることが示されている。ここでは、PP1およびPP2Aはしばしば細胞周期の負の調節因子として分類されるviii,ix,x,xi。この負の調節は網膜芽細胞腫タンパク質(pRb)およびサイクリン依存キナーゼ(cdk)の不活性化に関与している。後者はcdkを直接脱リン酸化することにより、またはキナーゼ/ホスファターゼの上流および下流に影響を与えることにより間接的に、達成することができる。染色体の凝縮、核膜の分解、細胞質微小管の再構成、紡錘体の形成、染色分体の分離、核膜の再集合および細胞質分裂を含む、他の有糸分裂に関する事象もまたPP1およびPP2Aにより制御されるxii。
【０００９】
細胞周期の制御におけるプロテインホスファターゼの負の役割の例としてはさらに、以下の事実が挙げられる。すなわち、（a）いくつかの天然のPP1およびPP2A阻害剤（オカダ酸）は腫瘍プロモーターである。(b)ポリオーマミドルTおよびSV40スモールT抗原のようないくつかのウイルスタンパク質は、老衰細胞の成長を促進する強力なPP2A阻害剤である。(c)内在性プロテインホスファターゼ阻害剤(SET)の過発現は、ウィルムス腫瘍の形成に関与していると考えられている。および(d)プロテインホスファターゼ阻害剤は細胞周期を通して動きを促進して早過ぎる有糸分裂を起こす（フォストリエシン、オカダ酸、カリクリン A）xiii,xiv,xv。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
代替の癌の治療法が必要とされている。さらに、細胞周期をモジュレートし、それにより疾病、特に癌と戦うための医薬品として使用することができる、代替の、好ましくは強力なPPIおよびPP2阻害剤が必要とされている。
【００１１】
少なくとも1つの先行技術の欠点を克服または改善すること、または有用な代替物を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要約
プロテインホスファターゼの阻害は細胞周期を促進するが、過剰なまたは早すぎる細胞周期の促進は同様のメカニズムから致死的である。したがって、細胞に細胞周期の進行を強いることを（最近のアプローチと比較すると直観的でないかもしれないが）、癌の治療法として使用することができる。
【００１３】
新規の一連のカンタリジン類似体が同定された。予期せぬことに、これらの新規な類似体のいくつかは強力なPP1およびPP2の阻害剤であることが見出された。
【００１４】
したがって、第1の態様において、本発明は阻害剤がカンタリミド(cantharimide)またはその類似体であるプロテインホスファターゼ阻害剤を提供する。
【００１５】
好ましくは、上記ホスファターゼはセリン/スレオニン特異的ホスファターゼであり、最も好ましくは、PP1またはPP2Aである。好ましくは、プロテインホスファターゼ阻害剤は細胞透過性である。
【００１６】
第2の態様によれば、本発明は式Ｉの化合物：
【化１】
2004531500.tif 000004
【００１７】
またはその類似体、誘導体もしくは変異体を提供する。
【００１８】
アミノ酸は、D-もしくはL-アミノ酸またはその類似体であり、好ましくは、D-アラニン、L-アラニン、D-フェニルアラニン、L-フェニルアラニン、D-ロイシン、L-ロイシン、D-イソロイシン、L-イソロイシン、D-トリプトファン、L-トリプトファン、D-ヒスチジン、L-ヒスチジン、D-チロシン、L-チロシン、D-グルタミンおよびL-メチオニンからなる群より選択される。より好ましくは、アミノ酸は、D-トリプトファン、L-トリプトファン、D-ヒスチジン、L-ヒスチジン、D-チロシン、L-チロシン、D-グルタミンまたはL-メチオニンであり、最も好ましくは、アミノ酸はD-ヒスチジンまたはL-ヒスチジンである。
【００１９】
好ましくは、化合物は細胞周期モジュレーターであり、より好ましくは、化合物は細胞周期を促進する。好ましい実施形態において、化合物はプロテインホスファターゼ阻害剤であり、最も好ましくは、化合物はPP1および/またはPP2Aの阻害剤である。
【００２０】
第３の態様によれば、本発明は、式ＩＩの化合物
【化２】
2004531500.tif 000005
【００２１】
またはその類似体、誘導体もしくは変異体を、アミノ酸またはアミノ酸の類似体、誘導体もしくは変異体と結合させることを含む、第１または第２の態様による化合物を製造する方法を提供する。
【００２２】
使用される特定のアミノ酸は、当然、要求される化合物により決定される。
【００２３】
好ましくは、本発明の方法は、式ＩＩの化合物をアミンの存在下でアミノ酸と結合させることを含む。好ましくは、上記アミンは第３級アミンであり、最も好ましくは、Et3Nである。
【００２４】
より好ましくは、本発明の方法はさらに、式ＩＩの化合物を有機溶媒の存在下でアミノ酸と結合させることを含む。好ましくは上記有機溶媒はPhCH3である。
【００２５】
本発明の方法は、当業者により決定された適当な温度で実施することができる。好ましくは、上記温度は15℃と300℃の間である。たとえば、反応は室温でおこなってもよいし、または必要な時間を短縮するために、100℃と250℃の間でおこなうと有利である。ある実施形態において、反応は約200℃でおこなう。一般的に、当業者が認める通り、温度が低いほど反応時間が長くなる。
【００２６】
好ましくは、第3の態様の方法により調製された化合物はさらに精製される。好ましい実施形態において、化合物を、好ましくはNaHCO3により洗浄し、好ましくはCH2Cl2により抽出し、好ましくは濃HClにより酸性化する。得られた化合物を酢酸エチルのような有機溶媒により抽出すると有利であり、カラムクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーによりさらに精製してもよい。
【００２７】
第4の態様によれば、本発明は式IIIの化合物を提供する。
【化３】
2004531500.tif 000006
【００２８】
［式中、Zは、O、NHまたはNRであり；
Xは、CHまたはNであり；
Pは、存在しないか、またはメチルであり；
Yは、(CH2)nWであって、
Wは、イオン化可能な残基であり、nは1から8の整数である。］
好ましくは、化合物は、
【化４】
2004531500.tif 000007
【００２９】
または、
【化５】
2004531500.tif 000008
【００３０】
である。
【００３１】
第5の態様によれば、本発明は、細胞の細胞周期をモジュレートするために使用する、上に定義したとおりの式IIIの化合物を提供する。
【００３２】
好ましい実施形態において、ZはO、XはN、Yは-CH2OWであって、Wはアミノ酸またはアミノ酸の類似体もしくは誘導体である。好ましくは上記アミノ酸はD-ヒスチジンまたはL-ヒスチジンである。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、ZはO、XはN、Yは-CH2=CHWであって、Wはアミノ酸またはアミノ酸の類似体もしくは誘導体である。好ましくは上記アミノ酸はD-ヒスチジンまたはL-ヒスチジンである。
【００３４】
第6の態様によれば、本発明は、本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物はいかなる適当な経路により投与されてもよいが、静脈内投与が好ましい。製薬上許容される佐剤、担体および/または添加物を使用してもよい。好ましい上記の製薬上許容される物質は当業者に公知である。
【００３５】
第7の態様によれば、本発明は本発明の化合物の医薬の製造における使用を提供する。好ましくは、上記の医薬は癌の治療に有用である。好ましくは、上記癌は白血病、卵巣癌、結腸癌または腎臓癌である。
【００３６】
第8の態様によれば、本発明は、本発明の化合物または医薬組成物を投与することを含む、障害または疾病を治療する方法を提供する。好ましくは、上記疾病は癌である。好ましくは、上記癌は白血病、卵巣癌、結腸癌または腎臓癌である。
【００３７】
ある実施形態において、上記治療法は別の治療と併用される。好ましくは、上記治療法は、治療される細胞の別の治療に対する感受性を高めるものである。典型的には、別の治療は癌の治療である。最も好ましくは、別の治療は、放射線照射、シスプラチン、5-フルオロウラシル、メトトレキセート、チミターク(thymitaq)、およびタキソール治療からなる群より選択される。
【００３８】
第9の態様によれば、本発明は、細胞を本発明の化合物に曝すことを含む細胞周期の進行を調節する方法を提供する。好ましくは、本発明の化合物により1以上の細胞周期のチェックポイントが解除される。
【００３９】
本発明は特定の細胞型に制限されず、細菌、酵母、下等および高等真核生物を含むすべての細胞源に由来するいかなる適当な細胞型にも用いることができることは明白であるが、好ましくは、細胞は哺乳類細胞である。
【００４０】
好ましい実施形態において、細胞はヒト細胞であり、最も好ましくは、細胞は新生物または前新生物細胞であり、最も好ましくは癌細胞である。好ましくは、細胞は、マウス白血病細胞、ヒト白血病細胞、ヒト卵巣癌細胞、シスプラチン耐性細胞、ヒト結腸癌細胞、ヒト骨肉種細胞およびヒト腎臓腫瘍細胞からなる群より選択される。もっとも好ましくは、細胞は、L1210（マウス白血病、p53 mt）、HL60（ヒト白血病、p53 nul）、A2780（ヒト卵巣癌、p53 wt）、ADD（シスプラチン耐性A2780細胞、p53 mt）、HCT116（ヒト結腸癌、p53 wt）、SW480（ヒト結腸癌、p53 wt）、WiDr（ヒト結腸癌、p53 mt）、HT29（ヒト結腸癌、p53 mt）、143BTK-（ヒト骨肉種）およびG-401（ヒト腎臓、ウィルムス腫瘍）細胞として知られる細胞型から選択される細胞である。
【００４１】
第10の態様によれば、本発明は、患者に有効量の本発明の化合物を投与することからなる、患者を癌治療に対して感受性にする方法を提供する。
【００４２】
患者に送達されるべき本発明の化合物および医薬組成物の実際の投与量は、特定の患者、組成物および投与の方式に対して望まれる応答を達成するために有効な活性成分の量を得るように変化させる。投与量レベルは従来の方法に従って医師が容易に決定することができ、投与される本発明の特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、採用された特定の化合物の排出速度、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康および以前の病歴、およびその他の医学分野において公知のファクターを含むさまざまなファクターに依存する。
【００４３】
第11の態様によれば、本発明は、
【化６】
2004531500.tif 000009
【００４４】
［式中、Rはイオン化可能な残基である。］
を、カンタリジンまたはその類似体もしくは誘導体と結合させることを含む、上で定義した式IIIの化合物を調製する方法を提供する。
【００４５】
第12の態様によれば、本発明は、
【化７】
2004531500.tif 000010
【００４６】
［式中、Rはイオン化可能な残基である。］
を、カンタリジンまたはその類似体もしくは誘導体と結合させることを含む、上で定義した式IIIの化合物を調製する方法を提供する。
【００４７】
本発明の化合物の合成にアミノ酸類似体を用いることができることは当業者には明白である。多くのアミノ酸類似体が販売されており、また、上記の類似体の生成法も当業者に公知である。たとえば、
【化８】
2004531500.tif 000011
【００４８】
のような修飾された側鎖を有するヒスチジン類似体は本発明に有用である。
【００４９】
さらに、たとえば、ホーナー-エモンズ-ウィリング（Horner-Emmons-Willing）またはジュリア（Julia）-オレフィン化条件のような合成方法を選択することにより、本発明の化合物のコンホメーションを操作することができることは当業者に明白であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
発明の詳細な説明
以下に本発明の好ましい実施形態を例示のみの目的で記載する。
【００５１】
カンタリジン(1)およびタウトマイシン(2)（図１）はどちらもPP1およびPP2Aの両方の活性部位に環が開いたジカルボン酸型で結合することが知られている。しかしながら、我々は最近、遊離のカルボン酸塩を1つのみ有する一連の環の開いたカンタリジン類似体は、表1に示すように、PP1およびPP2Aに対する阻害活性を保持しているのみでなく、PP2Aに対する選択性が少し増加していることを示した。この研究の結果として、我々はカンタリジン類似体によるPP1およびPP2Aの阻害に関する我々の理解を再評価せざるを得なくなった。我々の再評価の第1段階は、PP1の結晶構造およびPP2Aの分子的にモデル化された構造のより詳細な検討であった。
【００５２】
表１．環の開いたカンタリジン類似体によるPP1およびPP2Aの阻害
【表３】
2004531500.tif 000012
【００５３】
我々のモデル分析は（データは示さない）、これらの環の開いた類似体は活性部位に結合すること、および単独のカルボン酸残基であってもPP1およびPP2Aの活性部位に結合することを示唆している。エステルのアルキル鎖は、一般にタンパク質の活性部位に近接した酸性のグルーブに近位である。このグルーブの中の主要なアミノ酸は酸性の性質を有し、その結果として、我々は、カンタリジン（または脱メチル化されたノルカンタリジン）の無水物のブリッジ、1つのカルボン酸基および塩基性残基を有する化合物は、PP1およびPP2Aを阻害する能力を有する新しいクラスの化合物を作り出すと考えた。以下にPP1およびPP2Aの両方を阻害する新しいクラスのカンタリジン類似体について記載する。
【００５４】
理論に拘束されないが、これらの新規のプロテインホスファターゼ阻害剤は、細胞周期および細胞周期のチェックポイントの解除を通してその効果を実現すると思われる。これらのホスファターゼ阻害剤は、単独の薬物として致命的であるのみでなく、従来の薬物の細胞毒性を強力にする。
【００５５】
新規のカンタリジン類似体の化学合成
公知のPP1およびPP2A阻害剤であるカンタリジンの化学構造に基づく新しいクラスのプロテインホスファターゼ阻害剤の設計および合成
図2aに、活性部位内に環状ヘプタペプチドであるミクロシスチン-LRが存在するPP1の部分的な結晶構造を示す（共結晶化）。PP1の活性部位は、PP2Aと同様に（結晶構造は報告されていないが、相同性モデル化構造が開発されている）xvi、タンパク質の表面に位置している。ミクロシスチン-LRは環状のコアと疎水性のテイル（新規のアミノ酸Adda）からなる。重要な特徴には、以下の点が含まれる。i)Addaのグルーブ#1（疎水性グルーブとしても知られている）に沿っての結合。この残基の修飾は結合に有害である。ii)ミクロシスチン-LRのArg-側鎖はグルーブ#2に近位であるが、中には存在しない。Quinnxviiが、Argは結合に必要ではないことを示したが、我々の分析は、修飾されたArg-残基は、グルーブ#2を占めることができたとしても、PP1およびPP2Aの両方における結合に影響を与えることを示唆している（データは示さない）。iii)環状ペプチドコアは、グルーブ#3およびグルーブ#4と呼ばれる他の２つの表面グルーブに近位である。後者の例において、ミクロシスチンLRのLeu-側鎖はグルーブ#4に近位であるが中には存在しない。
【００５６】
図2bはカンタリジン酸（カンタリジンの結合型）の同じ図である。意味深いことに、カンタリジン酸はどの残基もグルーブ#1〜４の中に入らない。
【００５７】
グルーブ#1にアクセスすることができる疎水性のテイルが存在しないと、カンタリジンで観察されるPP1およびPP2Aに対する活性が1000倍減少することが知られている（μM対mMxviii）。この方式でモデルを作ると、我々が先に報告した無水物により修飾したカンタリジン類似体には、グルーブ#1に向いているが完全に中に入ってはいないエステル(NOVO-4)およびエーテル(NOVO-9)基（“R”基はスキームIに図式的に示されている）が存在するxix。
【００５８】
グルーブ#2〜4の標的化、選択的なPP1/PP2A阻害剤、および効力のある強力な抗癌剤の開発
PP1およびPP2Aの両方と公知の毒素との相互作用を表現するモデルを開発した（図2a）。これらの毒素、たとえば、ミクロシスチン、ノジュラリン、カリクリン、タウトマイシンおよびオカダ酸はすべて、グルーブ#1に沿って伸びる疎水性のテイルを有する。
【００５９】
公知の毒素でグルーブ#2,3または4にアクセスするものはない。他のグルーブの重要性の可能性が無視されてきたことは、おそらく主な毒素の合成の複雑さのためであろう。典型的には、必要な修飾をおこなうために50を越える合成段階および1〜2年の実験室での作業が必要とされる。
【００６０】
カンタリジンおよびその脱メチル化された類似体であるノルカンタリジンは、現在までに構造的な修飾による試みが多く挫折してきたが、効力または選択性のいずれかを改良するためのより有望な化合物である。一方、我々は、大きく修飾することができ、それにもかかわらずPP1およびPP2Aに対する活性を維持している、新しいクラスのカンタリジン類似体であるカンタリミドを発見した。カンタリジンが修飾されて、PP1およびPP2Aに対する活性を維持しているのはこれが初めてである。
【００６１】
さらに、我々はカンタリミドを1段階の合成により合成することを可能にし、これによりグラム単位の量の純粋なカンタリミドが1日で得られるようになった（スキーム１）。これは、プロテインホスファターゼ阻害剤の開発における重大な動きを意味している。
【化９】
2004531500.tif 000013
スキーム１．カンタリミドの合成
【実施例１】
【００６２】
カンタリミドの合成
典型的には、カンタリミド類似体は、容易に入手できるノルカンタリジン(3)から開始する修正ガブリエル(Gabriel)合成により、普通から良好な収率で合成された。典型的な合成において、168mgの(3)を壁の厚い耐圧ガラス容器に入れた後、無水トルエン(10mL)、1.0当量の無水Et3Nおよび1.0当量の保護されていないアミノ酸（DまたはLのいずれか）を加えた。
【００６３】
典型的な合成において、D-Phe (165mg、1mmol)を、無水トルエン(5mL)、無水トリエチルアミン(101mg、140mL、1mmol)およびノルカンタリジン(168mg、1mmol)およびマグネティックスターラーと共に壁の厚い耐圧ガラス容器に入れた。不均一な混合物を脱ガスし、管を密閉して、安全遮蔽板を取り付けて混合物を200℃に加熱した。約16時間後に、均一な混合物を室温に冷却して注意深く開けた。内容物を酢酸エチルまたはジクロロメタンのいずれか(25mL)に入れ、飽和NaHCO3により洗浄した。次に、水層をジクロロメタン(2×10mL)により抽出し、6M HClを滴下することによりpH2に酸性化して、ジクロロメタン(2×10mL)により再抽出し、Na2SO4により乾燥した。溶媒を減圧下で除去してオイルを得た。クロマトトロムプレート(chromatotrom plate)（溶媒系：EtOAc:ヘキサン  19:1）により精製した。
【００６４】
2004531500.tif 000014
後処理として、NaHCO3による洗浄、CH2Cl2による抽出の後、濃HClによる酸性化、および最後に酢酸エチルによる抽出をおこなった。次に、粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。典型的な収率を下記の表2に示す。
【００６５】
化学合成の簡単さおよびD-およびL-アミノ酸の入手し易さのため、異なる立体異性体の効果の試験が可能になった。
【実施例２】
【００６６】
PP1およびPP2を阻害する化合物の能力のスクリーニング
カンタリミド4〜19を、これらのPP1およびPP2Aを阻害する能力についてスクリーニングした。
【００６７】
プロテインホスファターゼアッセイを、基質として[32P]-グリコーゲンホスホリラーゼa、および組換えPP1(Bernt, N. Methods in Molecular Biology, 1998, 93, 67-78)または部分的に精製された（ニワトリ骨格筋）PP2A触媒サブユニット(Mackintosh,C. 「タンパク質リン酸化：実践的アプローチ」(In Protein Phosphorylation: A Practical Approach)中、D G Hardie編、IRL, 1993)を用いて、基本的に文献(Collins, E.; Sim, A.T.R.; Methods in Molecular Biology 1998, 93, 79-102)に記載される方法により実施した。簡単に述べると、酵素活性を、50mM Tris-HCl (pH7.5)、1mM EGTA、0.1mM EDTA、5mM カフェイン、0.1% メルカプトエタノール、0.3mg/ml BSAを含む緩衝液（最終体積30mL）中で、30℃で測定した。使用されたPP1またはPP2Aの濃度は、直線性を確実にするために反応を15%の脱リン酸化に制限するように設定した。30mgの[32P]-グリコーゲンホスホリラーゼを加えることにより反応を開始し、20分後に100mLの氷冷70% TCAを加えることにより終結した。10分間氷浴に入れた後、サンプルを遠心分離し、上清の100mLのアリコートを取り出して、反応中に放出された[32P]のシンチレーション計数をおこなった。データを、対照（阻害剤が存在しない）のインキュベーション（100%活性）と比較して、プロテインホスファターゼ活性の50%の阻害を生じさせるのに必要な化合物の濃度を表す、化合物のIC50濃度により表現する。
【００６８】
我々のプロトコールの相対的な有効性を保証するため、また、異なるアッセイ条件の効果を標準化できるようにするために、カンタリジン(1)およびノルカンタリジン(3)を内標準として加えた。
【００６９】
ホスファターゼの阻害の研究の結果を表2に示す。類似体4〜11がPP1またはPP2Aのいずれかに対して実質的に阻害効果を示さなかったことを記載しておく。けれども、4は、PP2Aに対してごくわずかな活性を示した。一方、12および13のようにかさ高い芳香族基を導入すると、プロテインホスファターゼ阻害が著しく増加したものの、まだ乏しいものであった（12: PP1 IC50=770±146mM; PP2A IC50=157±33mM、および13: PP1 IC50=312±153mM; PP2A IC50=105±22mM）。活性な類似体に関して、ホスファターゼの阻害に対する特定の立体異性体の効果に全般的に認識できる傾向は存在しないように見える。これに関して、トリプトファンのL-異性体は、両方の酵素に対する阻害活性がD-異性体よりも高いのに対して、チロシン類似体には反対の傾向が観察され、ヒスタミン類似体には有意の立体異性体の効果は観察されなかった。これらの立体異性体の効果が、例外として、アラニンでPP2Aに対してのみD-異性体がL-異性体よりも大きい阻害を示したことを除けば、両方の酵素で同様であることは興味深い。
【００７０】
表２．化合物１、3およびカンタリミド4〜19によるプロテインホスファターゼ1および2Aの阻害
【表４】
2004531500.tif 000015
【００７１】
より強力なカンタリミドの中から他の傾向も明らかになった。塩基性のアミノ酸残基がPP1およびPP2Aの阻害を促進することが確認されたが、さらに容易にイオン化する基を有するカンタリミドもまた活性を示す。
【００７２】
表に報告されたすべてのカンタリミドの中で、14および15のみがカンタリジンと基本的に効力が等しい。驚くべきことに、結合にはほとんど差異がない。それぞれのエナンチオマーにおける、His-側鎖、カルボン酸および三環系のコアの相対的空間配向性を考えると（図3参照）、これは予期せぬ結果である。
【００７３】
我々のモデル分析(Cerius2-LigandFit)の結果は、我々が観察した選択性の欠如を説明する、2つの、高得点の、可能性のある結合方式を示した。14/15およびPP1のデータのみが、すべての場合に14/15もカンタリジン酸と同じ位置に結合することを示している（図4参照）。パネル3aおよび3cは、イミド環およびヒスチジンa-炭素との相互作用を最大化するエナンチオマーの重なりを表す。けれども、これはカルボン酸のアライメントが乏しい結果となり、反対側に7-Oが位置する。7-Oが（少なくともPP2Aの）阻害に対して決定的であることが知られているので、これはPP1およびPP2Aの阻害に差異があるという結果になるべきである。パネル3bおよび3dは、14/15がPP1につながれた好ましいコンホメーションを表しているが、ヒスチジン環およびカルボン酸塩の配向に注目に値する相違がある。
【００７４】
驚くべきことに、この場合、14および15は、基本的に頭が先、または足が先の完全に異なる配向で酵素に対している。この可能性は最初は予想と反対のように思われるが、これは、同様の特徴のものが酵素の同様の位置に存在することを可能にするのである。注目に値することには、14のカルボン酸塩および15の7-Oは、タンパク質の同じ領域に反対向きに位置する。
【００７５】
CERIUS2.4.2(MSI, San Diego, 2000年発売)を用いてコンホメーション分析およびオーバーレイをおこない、MacSpartanProの最小エネルギーコンホーマー(CERIUS2.4.2より)を用いてAMI静電ポテンシャル表面を作り出した。
【００７６】
PP1またはPP2Aのいずれかに阻害活性を示すすべてのカンタリミドは、酵素に対して基本的に同一の三次元構造を示す。けれども、我々は、それぞれの類似体の静電学を考慮すると、活性部位に対してより陰性な表面を与える最も活性なHis類似体に関して顕著な変異が存在することに気づいた。これは、塩基性のアミノ酸側鎖の導入が活性部位に近位の公知の酸性のグルーブとの相互作用を促進するであろうという我々の最初の考えと一致する。
【００７７】
したがって、要約すると、ノルカンタリジンとアミノ酸、D/L-ヒスチジンの混成体である化合物（それぞれNOVO-20およびNOVO-21と名づけられる）は、カンタリジンと同等の効力のプロテインホスファターゼ阻害、および同様の細胞毒性プロファイルを示す、強力な阻害剤である（表3）。
【００７８】
表３．NOVO-20およびNOVO-21について得られたプロテインホスファターゼ阻害および細胞毒性のデータの要約
【表５】
2004531500.tif 000016
【００７９】
我々は、グルーブ#2との相互作用を介してタンパク質に特異的に結合する形を予想していたので、純粋なエナンチオマーにプロテインホスファターゼ選択性がないという我々の試験的なデータに最初は驚いた。コンピューターにより、NOVO-20およびNOVO-21のPP1との相互作用をモデル化し（図5）、これらのエナンチオマーの結合方式における著しい相違を示した。
【００８０】
図5aは、末端イミダゾール環がグルーブ2および3の先端に位置するNOVO-20およびPP1のコンピューターモデルを示す。同様に、図5bは、末端イミダゾール環がグルーブ#3および4の先端に位置するNOVO-21のコンピューターモデルを示す。両方の図に見られるように、どちらの末端イミダゾール環も完全にはグルーブ#2、3または4とかみ合っていない。
【００８１】
以上を考慮すると、NOVO-20の末端イミダゾールの選択的修飾、および「スペーサーアーム」の延長は、グルーブ#2および/またはグルーブ#3へのアクセスを可能にし、その結果、PP1/PP2A選択性を増大させることは、当業者には明白であろう。NOVO-21に対する同様の修飾は、グルーブ#3および/または4へのアクセスを促進する（スキーム3および4参照）。プロテインホスファターゼ選択性(PP1および/またはPP2A)は、これらのタンパク質におけるグルーブ#2〜4の中の公知の区別される接触点の結果として生じる。
【００８２】
我々のモデル分析は、提案された類似体、スキーム1および2がグルーブ#2〜4へのアクセスを可能にすることを示した。これらのグルーブはPP1およびPP2Aにおいて区別される接触点を与える。我々の合成によるアプローチは、これらのグルーブのそれぞれに、順番に、そしてすべての可能な組み合わせで、選択的なアクセスをおこなうことができるように設計された。具体的には、我々のモデルは次のことを予測した。
【００８３】
・塩基性残基の導入はグルーブ#2（酸性アミノ酸が並ぶ）にアクセスする。
【００８４】
・グルーブ#2〜4は、PP1およびPP2Aにおいて区別される接触点を示し、当該領域における異なるアミノ酸配列の結果としてPP1またはPP2Aのいずれかと選択的に相互作用する新規の類似体の開発を可能にする。
【００８５】
・グルーブ#2〜4にアクセスすることにより、PP1および/またはPP2Aのいずれかに対して高い効力(nM)および選択性(＞100倍)を有する低分子量のリガンドの前例のない開発が可能になるであろう。
【実施例３】
【００８６】
グルーブ#2〜4を標的とするための化学
カンタリミドが強力なPP1およびPP2Aの阻害剤であることが示された。モデル分析により、PP1（およびPP2A）の活性部位との好ましい相互作用を最大にする可能性を有する、選択されたカンタリミド類似体の設計が可能になった。そこで、我々は、容易に入手できる光学的に純粋な出発物質、たとえば、D-およびL-セリン、ならびに我々の仮説の立証に必要な標的の迅速な開発を促進し、新規な治療薬の開発の助けとなる確立された合成方法を利用する合成プロトコールを設計した。グルーブ#2および/または3および/または4（イミダゾール環の置換パターンによる）の中への（NOVO-20および21の）末端のイミダゾール環のアクセスを改善するためにスペーサーアーム（スキーム2参照）を延長するための簡単な方法は当業者に公知であろう。下記のスキーム2に示されるようにすべての望まれる類似体の合成が可能である。
【化１０】
2004531500.tif 000017
スキーム２．Bocは第三ブトキシカルボニル基である。試薬：(i)SOCl2; (ii)3-メチル-3-オキセタンメタノール；(iii)BF3.OEt2;xx (iv)KH; (v)RBr;xxi (vi)TFA; (vii)1N NaOH; (viii)ノルカンタリジン、Et3N、加熱；(ix)Ph3P、Im、I2; (x)ホーナー-エモンズ-ウィッティッヒ（Horner-Emmons-Wittig）またはジュリア（Julia）-オレフィン化条件；(xi)カンタリジン、Et3N、加熱。カンタリジンおよびノルカンタリジンは、交換可能に用いることができ、メチル基のある、またはない生成物を生じる。
【００８７】
このような経路(スキーム２)は、セリンおよび単純なアルキル化に見られるようなO-原子を有する類似体の合成、またはこのO-原子の除去および十分に確立された合成的変換の手段を可能にするので、適応性がある。
【実施例４】
【００８８】
側鎖基(R)の合成
修飾された側鎖を有するヒスチジン類似体を、スキーム3に例示されるもののような販売されている置換イミダゾ−ルから容易に得ることができることは、当業者には明白であろう。このため、これらは理想的な出発物質となる。
【化１１】
2004531500.tif 000018
スキーム３．試薬：(i)ホーナー-エモンズ-ウィッティッヒ条件；(ii)ジュリア-オレフィン化条件。これらのアプローチはE-またはZ-二重結合のいずれかの選択的合成を可能にする。
【００８９】
さらに、合成法の選択により、得られる二重結合の立体化学の制御が可能になる。このような制御はその結果として最終標的化合物の配向の微妙な操作を可能にし（スキーム4に概念図として示す）、それによりそれらのPP1およびPP2Aの両方との相互作用の細かい制御をおこなうことが可能になる。
【化１２】
2004531500.tif 000019
スキーム４．二重結合の幾何配置の結果としての微妙なコンホメーションの変化の概念図
合成化学により作り出されたカンタリジン類似体（たとえば、NOVO-4、9、20および21に基づくもの）の別個のライブラリーを、PP1およびPP2A活性について迅速にスクリーニングすることができることは当業者には明白であろう。
【実施例５】
【００９０】
多くのヒト癌の細胞系モデルにおける化合物の生物学的特性の試験
細胞毒性
プロテインホスファターゼ阻害を示す化合物を、さまざまな細胞系の増殖を阻害する能力についてスクリーニングした。研究に選んだ細胞系には、正常な（非癌）細胞系、およびさまざまな細胞周期制御メカニズムを有する、造血および充実性腫瘍型の両方を代表する腫瘍由来の細胞系(すなわち、p53状態)の両方が含まれ、；CCD-18Co（正常ヒト結腸）、L1210（マウス白血病、p53 mt）、HL60(ヒト白血病、p53 nul)、A2780(ヒト卵巣癌、p53 wt)、ADDP（シスプラチン耐性A2780細胞、p53 mt）、HCT116(ヒト結腸癌、p53 wt)、SW480（ヒト結腸癌、p53 wt）、WiDr(ヒト結腸癌、p53 mt)、HT29(ヒト結腸癌、p53 mt)および143BTK-(ヒト骨肉種)細胞が含まれる。これらの細胞系に加えて、阻害剤をG-401細胞(ヒト腎臓、ウィルムス腫瘍)のスクリーニングにも用いることができることは、この腫瘍型が元来低いプロテインホスファターゼ活性を有することを示唆する証拠があるので、当業者には明白であろう。
【００９１】
細胞毒性を評価するためにMTTアッセイを用いることができる。このアッセイでは、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼの臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムからホルマザン結晶を生成する能力により細胞の生存度を決定する。生存細胞数/ウェルは、ホルマザンの生成と直接比例し、ホルマザンの生成は、可溶化の後に分光光度測定(540nm)により測定することができる。この技術から「用量-反応」曲線が得られ、これからIC50値(増殖を50%阻害する濃度)が計算される。この技術はまた、NCI(国立癌研究所、アメリカ合衆国)が新規の抗癌剤をスクリーニングするために使っている。MTTアッセイは、細胞をさまざまな用量のホスファターゼ阻害剤に曝した72時間後におこなわれる。これらの薬物は細胞周期を妨げると思われるものなので、細胞毒性を少なくとも2〜3回の細胞分裂にわたって試験することが重要である。細胞毒性は、もちろんプロテインホスファターゼ阻害と相関関係にあると考えられる。
【００９２】
いくつかの種々の細胞型を用いた細胞毒性の研究の結果を図7に示す。
【実施例６】
【００９３】
細胞周期の事象
慣例として、癌細胞はその細胞周期と呼ばれる過程で複製および分裂する能力に固有の異常を有している。細胞周期の進行はゲノムの完全性を確保するために細かく調節されている。細胞分裂の間に、細胞周期のそれぞれのステージが次のステージに入る前に完結しており、これが一連のチェックポイントを通じて達成されることが必須である。ほとんどの一般的な抗癌剤および放射線治療は、細胞周期の鍵となる要素、特にDNA合成および有糸分裂に影響を与えることによりそれらの効果を実現する。このような戦略は、分裂しない健康な体細胞には影響を与えずに、より早く分裂する細胞のみを標的とすることを意味する。この戦略の不都合な副作用は、骨髄のようなさまざまな健康な細胞群もまた標的となって強い有害作用をもたらすことである。それにもかかわらず、細胞周期機構は医学および放射線腫瘍学者の主要な標的であり続けている。
【００９４】
我々は、母化合物のカンタリジンもまた細胞周期を通じてその効果を実現していることを示した。しかしながら、カンタリジンはG1/S相チェックポイントを迂回することにより細胞周期のS-相(DNA合成)を通じての動きを加速することが示されたので（図6）、メカニズムは他の多くの治療と異なる。これは癌細胞の治療に逆効果を生じるように思われるかもしれないが、合成層への加速された動きは一時的なものに過ぎず(6時間以内、25μM)、これに続いて、細胞周期がG2/M境界で進行を阻まれ(24時間)、細胞が死滅する。
【００９５】
細胞周期のさまざまな相への細胞の分布は、ヨウ化プロピジウム染色およびそれに続くフローサイトメトリー分析により細胞のDNA含有量を測定することにより分析することができる。その結果、老衰細胞(G0)および細胞周期の第1ギャップ(G1)にある細胞は,有糸分裂に入ろうとしている細胞（G2+M）のおよそ半分のDNA含有量を有するのに対して、DNAを合成している細胞(S-相)は中間のDNA含有量を有するであろう。この技術を用いて、細胞周期のさまざまな相にある細胞に対するこれらの新規の薬物の効果を決定することができる。
【００９６】
このような方法論は、細胞周期のそれぞれの相への細胞の分布、特にS-相への細胞の早すぎる蓄積の決定を可能にするが、加速した動き(チェックポイントの解除)の結果としての蓄積と、DNA合成を阻害する薬物を使用した場合に観察されるDNA合成の単純な遮断との間の識別は不可能である。
【００９７】
これらの現象を識別するために、3H-チミジン取り込みアッセイを用いることができる。このアッセイは、細胞のS-相への蓄積が、DNA合成の増加により立証される、細胞周期を通しての加速された動きの結果であるのか、あるいはDNA合成の遮断の結果であるのかを決定する。我々は、カンタリジンもまた、G2/M相細胞周期の遮断を誘導することを示した。しかしながら、細胞周期の分析は、細胞周期のG2(第2ギャップ)またはM(有糸分裂)のいずれの相で細胞が蓄積するかを識別することができない。これらの新規の薬物が細胞周期の有糸分裂に与える効果をさらに明らかにするために、細胞を、DNA(Hoechst染色)、紡錘体、および動原体の蛍光標識により、有糸分裂のさまざまなステージについて組織学的に試験する。この技術により、細胞が早過ぎる有糸分裂をおこなっているか、染色体が有糸分裂のために赤道上に整列しているか、および十分な紡錘体の形成が達成されたかを決定することができる。これらのステージにおける異常は、異常な細胞周期の動きと共に、フォストリエシン、オカダ酸、カリクリンA、ミクロシスチン-LR、およびタウトマイシンを含む他のホスファターゼ阻害剤について記載されてきた。
【００９８】
したがって、プロテインホスファターゼ阻害剤の、細胞周期を通じての動きを加速する能力を明確に同定するために3H-チミジン取り込みの研究を実施することができることは、当業者には明白であろう。カンタリジンに関する先行する研究は、この加速が一時的で処理後6時間以内にしか検出できないことを示している。
【実施例７】
【００９９】
併用の研究
ほとんどの薬物の発見は新しい単独の薬物の開発に焦点が当てられてきた。けれども、併用化学療法の成功を考慮すると。将来の効果的な抗癌治療は、耐性の発生を防ぐために共同して作用する、またはその作用が「相乗的」であるような薬物の発見に基礎がおかれるであろうことが明らかになりつつある(SA32)。そこで、我々はカンタリジンと抗葉酸薬であるチミタークとの併用の効果を試験した。
【０１００】
チミタークは広範囲の従来の化学療法薬の代表的なもので、多くの癌に対して最初に用いられる治療法であり、DNA合成に必須であるチミジル酸の供給を枯渇させる。これらの研究において、これら2つの薬物の併用指数(CI)が、合計72時間の曝露の後に拮抗的(CI＞1)、相加的(CI=1)、または相乗的(CI＜1)のいずれであるかを決定するために50%効果法(Median Effect method)を利用した(SA32)xxii。カンタリジンがチミタークよりも速く細胞効果を誘導することが観察されたので、連続的な薬物投与計画もまた試験した。そこで、HT29細胞をチミターク、次いで24時間後にカンタリジンに連続的に曝したところ、強い相乗的細胞毒性相互作用を示す0.52のCIが得られた。オカダ酸およびカリクリンAのような他のプロテインホスファターゼ阻害剤が、化学療法および放射線治療をそれぞれ増強することが示されている。したがって、本発明の化合物が、たとえば、放射線、シスプラチン、5-フルオロウラシル、メトトレキセート、チミタークおよびタキソールを含むより一般的な治療との併用療法に適しているらしいことは当業者には明白であろう。
【０１０１】
本発明を特定の実施例を参照して記載したが、本発明が他の多くの形態で実施できることは当業者に理解されるであろう。
【０１０２】
参照文献
i. Wang G-S. 「古代中国におけるマダラゲンセイの医学的使用および最近の研究」(Medical uses of mylabris in ancient china and recent studies)、J. Ethnopharmacol. 1989, 26, 147-162。
【０１０３】
ii. Scheithauerら、1986。
【０１０４】
iii. Roberge M; Tudan C; Hung SM; Harder KW; Jirik FR. 「抗腫瘍薬フォストリエシンは有糸分裂に入るチェックポイントおよびプロテインホスファターゼ1および2Aを阻害する」(Antitumour drug fostriecin inhibits the mitotic entry checkpoint and protein phosphatases 1 and 2A)、Cancer Res. 1994, 54, 6115-6121.
iv. Li YM; Mackintosh C; Casida JE. 「プロテインホスファターゼ2Aおよびその[3H]カンタリジン/[3H]エンドタールチオ酸無水物結合部位。カンタリジンおよびATP類似体の阻害剤特異性」(Protein phosphatase 2A and its [3H]cantharidin/[3H]endothall thioanhydride binding site. Inhibitor specificity of cantharidin and ATP analogues)、Biochem. Pharm. 1993, 46, 1435-1443。
【０１０５】
v. (a) Enz A; Zenke G; Pombo-Villar E. 「ホスファターゼ阻害剤としての7-オキサ[2.2.1]ビシクロヘプタン-2,3-ジカルボン酸誘導体」(7-Oxa[2.2.1]bicycloheptane-2,3-dicarboxylic acid derivatives as phosphatase inhibitors)、Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 2513-2518; (b) Sodeoka M; Baba Y: Kobayashi S; Hirukawa N.「 カンタリジン誘導体のプロテインホスファターゼ1、2A1および2Bに対する構造-活性相関」(Structure-activity relationship of cantharidin derivatives to protein phosphatases 1, 2A1, and 2B)、Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 1833-1836; (c) Tatlock JH; Linton MA; Hou XJ; Kissinger CR; Pelletier LA; Showalter RE; Tempczyk A; Villafranca JE. 「新規のカルシネウリン(calcineurin)(PP2B)阻害剤の構造に基づく設計」(Structure-based design of novel calcineurin (PP2B) inhibitors)、Bioorg.Med. Chem. Lett. 1997, 7, 1007-1012。
【０１０６】
vi. Laidley CW; Dauben WG; Guo ZR; Lam JYL, Casida JE. 「安定化されたプロテインホスファターゼ2Aのアフィニティープローブとしての2-カルボキシメチルエンドアタール類似体」(2-Carboxymethylendoathal analogues as affinity probes for stabilized protein phosphatase 2A)、Bioorg. Med. Chem. 1999, 7, 2937-2944。
【０１０７】
vii. Stein, GS.ら、「細胞周期および増殖制御の分子的基礎」(The molecular basis of sell cycle and growth control)、1998, Wiley-Liss Publishers, New York。
【０１０８】
viii. Huang X; Honkanen RE. 「ショウジョウバエレチナール退化C遺伝子産物(rdgC)と相同の、新規のヒトセリン/スレオニンプロテインホスファターゼ、PP7の分子クローニング、発現、および分析」(Molecular cloning, expression, and characterization of a novel human serine/threonine protein phosphatase, PP7, that is homologous to Drosophila retinal degeneration C gene product (rdgC))、J. Biol. Chem. 1998, 273, 1462-1468。
【０１０９】
ix. Lazzereschi D; Coppa A; Mincione G; Lavitrano M; Fragomele F; Colletta G. 「ホスファターゼ阻害剤であるオカダ酸は甲状腺細胞においてTSH-誘導G1-S相遷移を促進する」(The phosphatase inhibitor okadaic acid stimulates the TSH-induces G1-S phase transition in thyroid cells)、Exp Cell Res. 1997, 234, 425-433。
【０１１０】
x. Kawamura K-I, Grabowski D, Weizer K, Bukowski R, Ganapathi R, Br. J. Cancer 1996, 73, 183-188。
【０１１１】
xi. Nakamura K. Antoku S, Cancer Res 1994, 54, 2088-20990。
【０１１２】
xii. Durfeeら、1993。
【０１１３】
xiii. Carlson SG; Eng E; Kim, EC; Perlman EJ; Copeland TD; Ballermann BJ.「腎発生およびウィルムス腫瘍におけるSET、プロテインホスファターゼ2Aの阻害剤の発現」(Expression of SET, an inhibitor of protein phosphatase 2A, in renal development and Wilms-tumor)、J. Am. Soc. Nephrology, 1998, 9, 1873-1880。
【０１１４】
xiv. Yamashita K.ら、「1型および2A型プロテインホスファターゼの強力な阻害剤であるオカダ酸はcdc2/H1キナーゼを活性化し、BHK21細胞に一時的に早過ぎる有糸分裂様状態を誘導する(Okadaic acid, a potent inhibitor of type 1 and type 2A protein phosphatases, activates cdc2/H1 kinase and transiently induces a premature mitosis-like state in BHK21 cells)、EMBO J. 1990, 9, 4331-4338。
【０１１５】
xv. Ghosh S; Schroeter D; Paweletz N. 「オカダ酸はHeLa細胞においてS-相チェックポイントを無効にし、G2-相の進行を加速して早過ぎる有糸分裂を誘導する」(Okadaic acid overrides the S-phase check point and accelerates progression of G2-phase to induce premature mitosis in HeLa cells)、Exp Cell Res. 1996, 227, 165-169。
【０１１６】
xvi. Gauss, C-M; Sheppeck, JE; Naim, AC; Chamberlin, AR. 「オカダ酸クラスの天然阻害剤とSer-Thrホスファターゼ、PP1およびPP2Aの間の結合相互作用の分子モデル分析」(A molecular modelling analysis of the binding interactions between the okadaic acid class of natural product inhibitors and the Ser-Thr phosphatases, PP1 and PP2A)、Bioorg. Med. Chem. 1997, 5, 1751-1773。
【０１１７】
xvii. Taylor C; Quinn RJ; Suganuma M; Fujiki H. 「ミクロシスチン環をモデルにした環状ペプチドによるプロテインホスファターゼ2Aの阻害」(Inhibition of protein phosphatase 2A by cyclic peptides modelled on the microcystin ring)、Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 2113-2116および本文献中の参照文献。
【０１１８】
xviii. Goldberg, J; Huang H-B; Kwon, Y-G; Greengard, P; Naim, AC; Kuriyan, J. 「プロテインセリン/スレオニンホスファターゼ-1の触媒サブユニットの三次元構造」(Three-dimensional structure of the catalytic subunit of protein serine/threonine phosphatase-1)、Nature 1995, 376, 745-753。
【０１１９】
xix. Sheppeck JE II; Gauss C-M; Chamberlin AR. 「天然毒素によるSer-ThrホスファターゼPP1およびPP2Aの阻害」(Inhibition of the Ser-Thr phosphatases PP1 and PP2A by naturally occurring toxins)、1997, 5, 1739-1749。
【０１２０】
xx. McCluskey, A, Walkom, C, Moran, S, Acland, SP, Gardiner, E, Sakoff, JA. 「カンタリミドの合成、プロテインホスファターゼ、分子モデル分析および抗癌活性」(Synthesis, Protein Phophatase, Molecular Modelling analysis and Anticancer activity of the Cantharimides)、Bioorg. Med. Chem. 2001, 準備中の原稿。
【０１２１】
xxi. Volter, KE; Embrey, KJ; Pierins, GK; Quinn, RJ. 「カリクリンAおよびデホスホノカリクリンAのPP1との結合相互作用の研究、オカダ酸クラスの化合物とPP1との結合相互作用の分子認識モデルの開発」(A study of the binding interactions of calyculin A and dephosphonocalyculin A with PP1, development of a molecular recognition model for the binding interaction of the okadaic acid class of compounds with PP1)、European Journal of Pharmaceutical Sciences 2001, 12, 181-194。
【０１２２】
xxii. Corey EJ; Raju N. 「橋かけカルボン酸オルトエステルの新規の一般的合成経路」(A new general synthetic route to bridged carboxylic ortho esters)、Tetrahedron Letters. 1983, 24, 5571-5574。
【０１２３】
xxiii. Smith AB III; Yager KM; Phillips BW; Taylor TM. 「ジエチル(R)-(-)-(1-アミノ-3-メチルブチル)ホスホン酸塩の非対称合成」(Asymmetric synthesis of diethyl(R)-(-)-(1-amino-3-methylbutyl)phosphonate)、Org. Synth. 1997, 75, 19-29。
【０１２４】
xxiv. Chou TC; Talalay P. 「用量-効果相関の定量分析：多数の薬物の酵素阻害剤に対する併用効果」ｈ(Quantitative analysis of dose-effect relationship: the combined effects of multiple drugs on enzyme inhibitors)、Advances in Enzyme Regulation. 1984, 22, 27-55。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】カンタリジン(1)およびタウトマイシン(2)の構造を示す。
【図２】(a) PP1に結合したミクロシスチン-LRの結晶構造を示す。(b) PP1に結合したカンタリジン酸のコンピューターモデル(Cerius2-LigandFit)を示す。
【図３】パネル3aおよび3cは、イミド環とヒスチジンa-炭素の相互作用を最大にするエナンチオマーの重なりを示す。パネル3bおよび3dは、PP1につなぎとめられた14/15の好ましいコンホメーションを示す。ヒスチジン環およびカルボン酸塩の配向に注目に値する相違がある。
【図４】14,15カンタリジン酸、ミクロシスチン-LRおよびPP1の重なりを示す。
【図５】(a) PP1の活性部位に結合したNOVO-20のコンピューターモデルを示す。(b) PP1の活性部位に結合したNOVO-21のコンピューターモデルを示す。
【図６】カンタリジン(25μM)により6および24時間処理したHCT116細胞の細胞周期分析（％分布）を示す。HT29およびL1210細胞において同じ応答が観察された。6時間後のS-相の数の著しい増加(3Hチミジンの取り込みが4.6倍増加)、およびそれに続くG2/M停止の誘導に注意されたい。*P＜0.05、**P＜0.01。
【図７Ａ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｂ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｃ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｄ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｅ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｆ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｇ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｈ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｉ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｊ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｋ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｌ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｍ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｎ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｏ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図７Ｐ】本発明の化合物を用いて種々の細胞型について実施した細胞毒性の研究の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図７Ｎ】
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【図７Ｏ】
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【図７Ｐ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004531500.tif 000114
2004531500.tif 000115