(57)【要約】本発明は、バイオテクノロジー、免疫学、遺伝子工学、ならびに微生物および医療産業に関する。本発明の目的は、自然および誘導性自己免疫病変を有する動物を用いて、タンパク質およびペプチド、特にｇｐ１２０に対する触媒抗体を製造する方法を開発することである。種々の触媒抗体製造法も、開示されている。本発明の方法は、患者に注射した場合に、抗原に対して吸着性を示すと同時に破壊的機能を有し、それにより疾患の進行を停止させることができる、触媒ワクチンを創生することを可能にする。本発明は、対象となる触媒抗体と一緒のｇｐ１２０タンパク質フラグメントによる動物の病変を発症する典型的ペプチドエピトープを含む融合タンパク質により動物系ＳＪＬの自己免疫化の発明の方法を開示している。本発明は、潜在的な切り出し部分ｇｐ１２０のペプチドフラグメントを含む触媒クローンの共有結合的選択を実施しうる、高度に反応性の化学組成物により自己免疫動物を免疫化する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然または誘導性自己免疫病理を有する動物を用いる触媒抗体の製造方法であって、ミエリン塩基性タンパク質またはそのフラグメントと触媒抗体の潜在的基質または潜在的基質のフラグメントとからなる融合タンパク質を動物に投与することを特徴とする、製造方法。
【請求項２】
潜在的基質が、ｇｐ１２０（ＨＩＶ−１の表面糖タンパク質）またはそのフラグメントであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
自然または誘導性自己免疫病理を有する動物としてマウスを用いることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
塩基性ミエリンタンパク質で免疫化すると実験的自己免疫脳脊髄炎を発症し得る株のマウスを用いることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
以下の構造：
【表１】
2004527248.tif 000004
を特徴とする融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【表２】
2004527248.tif 000005
【請求項７】
自然または誘導性自己免疫病理を有する動物を用いる触媒抗体の製造方法であって、ハプテンを含む抗原で動物を免疫化し、ハプテンがメカニズム依存性共有結合性プロテアーゼ阻害剤とペプチドとのコンジュゲートであり、そのペプチドが触媒抗体の潜在的基質のフラグメントであることを特徴とする、製造方法。
【請求項８】
潜在的基質が、ｇｐ１２０またはそのフラグメントであることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
自己免疫動物としてマウスを用いることを特徴とする、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスを用いることを特徴とする、請求項７〜９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ハプテン、ならびにその異性体およびラセミ体。
【化１】
2004527248.tif 000006
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー、免疫学、遺伝子工学、微生物および医薬産業に関するものであり、ヒト免疫不全ウイルスの主要表面タンパク質であるタンパク質抗原、特にｇｐ１２０の破壊を意図した可能性のある治療法である触媒的に活性な抗体の製造および発現への組み合わせたアプローチを含む。
【背景技術】
【０００２】
生理学的に活性な物質およびバイオ医療に有用な天然の対象物を標的とした触媒抗体を、モデル化した化学変換における遷移状態を特異的に表すものとして設計し得ることが知られている。米国特許第５，９４８，６５８号は、上記アプローチにより設計され、麻薬のコカインを特異的に切断することが可能な抗体を開示している。モノクローナル抗体製造の技術が高度に発達しているにもかかわらず、対応する反応の遷移状態をモデル化することが困難であるため、このアプローチは、高分子バイオポリマー、タンパク質およびペプチドの場合は有効ではあり得ない。
【０００３】
ｇｐ１２０に対して直接的に有効な触媒抗体の製造が、ＷＯ９７０３６９６に開示されている。しかし、ＷＯ９７０３６９６によれば、その抗体は、患者血清から得られるものであるため、医用薬物製造にむけた統合された医療技術の進歩を妨げている。
【０００４】
発明の概要
本発明の目的は、自然および誘導性自己免疫病変を有する動物の使用を伴う、タンパク質およびペプチド、特にｇｐ１２０に対する触媒抗体を製造する方法を開発することであり、その方法は、患者に注射したとき、抗原に結合するのみでなく、それを破壊し、それにより疾患の進展を抑制することができる「触媒性ワクチン」を設計することを可能にする。
【０００５】
一つの実施態様によれば、本発明は、自然および誘導性自己免疫病変を有する動物の使用を伴う触媒抗体の製造方法を提供する。自然および誘導性自己免疫病変を有する動物として、マウスを用いる。用いたマウスは、ミエリン塩基性タンパク質またはそのフラグメントによる免疫化により、実験性自己免疫性脳脊髄炎の発症を誘導することができる血統に属する。動物に、ミエリン塩基性タンパク質またはそのフラグメント、および触媒抗体の潜在的基質または潜在的基質のフラグメントからなる融合タンパク質を投与する。潜在的基質は、ｇｐ１２０（ＨＩＶ−１の表面糖タンパク質）またはそのフラグメントである。
【０００６】
本発明の方法において使用される融合タンパク質は、以下の構造を有する。
【０００７】
【表３】
2004527248.tif 000002
【０００８】
上記構造の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が提唱されている。
【０００９】
別の実施態様によれば、本発明は、自然および誘導性自己免疫病変を有する動物を用いる触媒抗体の製造方法を提供する。自然および誘導性自己免疫病変を有する動物は、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスであり、このマウスは、ハプテンを含有する抗原で免疫化され、そのハプテンは、メカニズム依存性共有結合性プロテアーゼ阻害剤とペプチドとのコンジュゲートであり、そのペプチドは、触媒抗体の潜在的基質のフラグメントである。
【００１０】
触媒抗体の潜在的基質は、ｇｐ１２０またはそのフラグメントである。
【００１１】
本発明の方法において使用されるハプテンならびにその異性体およびラセミ体は、以下の構造を有する。
【００１２】
【化２】
2004527248.tif 000003
【００１３】
発明の好ましい実施態様
本発明を以下の実施例により説明する。
【００１４】
実施例１．原核系における発現のための、融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐをコードするヌクレオチド配列を含有する遺伝子構築物の開発
１）  ＳＪＬマウスに自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導するために、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の８９〜１０４ペプチドを選んだところ、ペプチドは、以下の組成を有した：ＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰＰＳ［Sakai, K., Zamvil, S. S., Mitchell, D. J., Lim, M., Rothbard, J. B., and Steinman, I., 1988. Characterization of a major encephalitogenic T cell epitope in SJL/J mice with synthetic oligopeptides of myelin basic protein. J. Neuroimmunol. 19: 21-32.,  Tan, I. J., Kennedy, M. K., and Miller, S. D. 1992. || Regulation of the effector stages of experimental autoimmune encephalomyelitis via neuroantigen specific tolerance induction.  II. Fine specificity of effector T cell inhibition. J. Immunol. 148: 2748-2755］。上記ペプチドに対応するＤＮＡ配列を、終止コドンおよび制限部位を付加的に含む２つの重複するオリゴヌクレオチドからＰＣＲにより合成した。得られたＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いてｐＥＴ３２ｂプラスミド中にクローニングした。得られたプラスミドを以下、ｐＥＴ３２ｍｂｐと記載する。発現、単離及び精製のすべての段階において組換えタンパク質を正確に同定するために、ｐＥＴ３２ｂＣＨおよびｐＥＴ３２ＣＨｍｂｐ構築物を操作し、ヒトｐ６２ｃ−ｍｙｃタンパク質の１０アミノ酸長の免疫優性のエピトープをコードする配列を含ませた［Evan G. I., Lewis G. K., Ramsay G., Bishop J. M.,  Mol. Cell. Biol. 1985, V. 5 (12), p. 3610-3616.］。
【００１５】
２）  表面タンパク質ｇｐ１２０の構造、免疫原性および機能的活性に関する多数の入手可能な刊行物［Hansen J. E., Lund, O., Nielsen, J.O. Brunak, S., and Hansen, J.-E., S. 1996. Prediction of the secondary structure of HIV-1 gp120. Proteins.25: 1-11 || Shioda, T., Oka, S., Xin, X., Liu, H., Harukuni, R., Kurotani, A., Fukushima, M., Hasan, M. K., Shiino, T., Takebe, Y., Iwamoto, A. and Nagai, Y. 1997.  In vivo sequence variability of human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120: association of V2 extension with slow disease progression.  J. Virol. 71: 4871-4881 || Sullivan, N., Sun, Y., Sattentau, Q., Thali, M., Wu, D., Denisova, G., Gershoni, J., Robinson, J., Moore, J., and Sodroski, J. 1998.  CD4-Induced Conformational Changes in the Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120 Glycoprotein: Consequences for Virus Entry and Neutralization.  J. Virol. 72: 4694-4703］により、比較的一定の配列を有し、免疫処置剤として最も有望なタンパク質領域の配置同定が可能になった。さらなる研究のために、キメラペプチドが選択されたが、これは、ｇｐ１２０の３つのフラグメントからなり（Ｉ、IIおよびIIIと記載）、第１、第２および第３超可変領域が欠失していた。ＨＸＢ２−ｅｎｖ遺伝子配列を、この構築物の合成のための最初の鋳型として用いた［Page, K. A., Landau, N. R., and Littman, D. R. 1990. Construction and use of a human immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J. Virol. 64: 5270-5276］。フラグメントＩ、IIおよびIIIは、合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲの後に、「重複伸長法によるスプライシング」アプローチを用いてフラグメントを集合させることによって得られた（図１）。最終ＰＣＲ産物Ｉ−IIIおよび中間生成物Ｉ−II、II−IIIおよびIIIを、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミドにクローニングし、その後ｐＥＴ３２ｂ（図２、８、９、１０および１２番）、ｐＥＴ３２ｍｂｐ（図２：５番）、ｐＥＴ３２ｂＣＨ（図２、６および１１番）およびぺＴ２１ＣＨｍｂｐ（図２、７番）に、それぞれの制限酵素、すなわち、Ｉ−IIIにはＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ、Ｉ−IIにはＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ、II−IIIにはＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、およびIIIにはＥｃｏＲＶ／ＤｒａＩ−ＢａｍＨＩを用いてサブクローニングした。これらの構築物の生成物を用いて、免疫化の結果得られたｇｐ１２０に対する抗体のタンパク質分解活性を試験した。
【００１６】
ＳＪＬマウスの免疫化のために、ｇｐ１２０糖タンパク質に対するタンパク分解抗体を得るために、ｐＥＴ２８ａベクターに基づく最終構築物を操作した（図３、１５番）。構築物７からのＮｅｏＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、それぞれの制限部位でｐＥＴ２８ａに再クローニングした。免疫応答試験をするために、ｐＥＴ２８ａベクターに基づくものであって、ｇｐ１２０Ｉ−IIIの遺伝子は含むがｍｂｐペプチドおよびｃ−ｍｙｃのエピトープをコードする配列は含まない、更なる構築物（図３：１３番）を類似の方法で得た。
【００１７】
電気的コンピテント細胞（electrocompetent cell）の調製、形質転換、制限酵素処理、ライゲーション、ＰＣＲおよびＤＮＡ電気泳動は、標準的方法に従って実施した［Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. || Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.］。
【００１８】
実施例２．融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐの発現、単離および精製
融合タンパク質を、Ｔ７溶原化Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を本実施例で使用した）中で発現させた。タンパク質を、以下のように発現させた：
１．  コンピテント細胞を、実施例１の３に従って０．１μgのプラスミドで形質転換し、３０μg/mlカナマイシンおよび２％グルコースを含有するペトリ皿上に播種した。細菌コロニーを３０℃で１２〜１４時間増殖させた。
２．  コロニーを、３０mg/mlカナマイシンおよび０．１％グルコースを含有する、細菌用培地２×ＹＴの１Ｌ中に完全に懸濁した。
３．  細胞培養物を、適度に通気しながら、３０℃で、０．６〜１０Ｕになるまで増殖させるが、３時間未満とする。その後、ＩＰＴＧを１mMとなるように加えて、３０℃で３時間誘導を行った。
【００１９】
融合タンパク質の単離および精製
融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐを、変性条件下、以下のように単離した：
１．  細胞培養物を、室温で１０分間５０００rpmで遠心した。沈殿物を、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に、初期容量の５０分の１で懸濁した。リゾチームおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加え、それぞれ０．１mg/mlおよび０．１％とし、混合物を３０℃で３０分間インキュベートした。
２．  溶解物を、０℃まで冷却し、粘性が消失するまで超音波処理し２０，０００rpmで４０分間遠心した。
３．  沈殿物を、初期容量の２００分の１の５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１mM  ＥＤＴＡ−Ｎａおよび１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を含む緩衝液中に注意深く懸濁し、２００００rpmで４０分間遠心し、クロマトグラフ用緩衝液Ａに再懸濁し、同じ条件で遠心した。
４．  沈殿物を、クロマトグラフィー用緩衝液Ａ（５０  mM  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4、３００mM  ＮａＣｌおよび６Ｍ尿素、ｐＨ８．０）中に懸濁し、氷上で１時間インキュベートし、２０，０００rpmで１０分間遠心した。
５．  上清を、クロマトグラフ用緩衝液Ａで平衡化した金属キレートカラムに、１時間あたり１０カラム容量の速度で負荷し、カラムを、ベースラインが移動しなくなるまで、１時間あたり３０カラム容量の速度で緩衝液Ｂ（５０mM  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4、３００mM  ＮａＣｌおよび６Ｍ尿素、ｐＨ７．０）で洗浄した。
６．  １時間あたり３０カラム容量の速度で緩衝液Ｂ（５０mM  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4−２０  mM  ＭＥＳ−ＮａＯＨ、３００mM  ＮａＣｌおよび６Ｍ尿素、ｐＨ５．０）で溶出させ、その後緩衝液Ａで二回目の平衡化を行い、固定化させた金属イオンおよび保持されたタンパク質を１００  mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を含む緩衝液Ａで除去した。
７．  溶出画分を、ゲル電気泳動で分析して、合わせて、タンパク質を室温で脱イオン水で透析することにより沈殿させた。
８．  タンパク質沈殿物を、４０００rpmで１０分間遠心して分離し、７０％エタノールで洗浄し、最小容量の７０％エタノール中に懸濁し、粒子が沈殿しなくなるまで超音波処理し、これを懸濁液として滅菌したポリプロピレンチューブ中で＋４℃で保存した。
【００２０】
融合タンパク質の分析
融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐの得られた調製物の同一性および純度を確認するために、タンパク質の以下の特徴を測定した：
１．  タンパク質の電気泳動上の純度を方法１により測定したところ、９７％であった。
２．  ｃ−ｍｙｃエピトープに対する抗体の免疫反応性を方法２により測定したところ、タンパク質が免疫反応性であることが認められた。
３．  質量分析法による分子量（Ｄａ）を、方法３により測定したところ、４２３０７Ｄａであることが明らかになり、計算値は４２０７５であり、誤差は、許容可能な±２．５％であった。
４．  金属キレート吸着剤によるタンパク質の特異的吸収（％）を方法４により測定したところ、＞９５％であった。
【００２１】
分析方法：
１．電気泳動図密度計測
タンパク質の変性電気泳動を、６Ｍ尿素溶液を用いて、濃縮・分画ゲル中で、Ｌａｅmmｌｉの方法に従って実施した。ゲル染色をクーマシーブルーＲ−２５０で、銅塩でコントラスト増強を用いて行った。密度計測は、密度計測器又はコンピュータ支援プレートスキャナで行い、その後、電気泳動図をデジタル化し分析した（図４Ａ）。
【００２２】
１．  以下の組成を有するように−２成分ゲルを調製した。
上層ゲル：アクリルアミド／ビスアクリルアミド比２９／１を６．６６％、ドデシル硫酸ナトリウム０．１％、０．１２５  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、および６Ｍ尿素、ｐＨ６．８。
下層ゲル：アクリルアミド／ビスアクリルアミド比２９／１を１０％、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．３７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび６Ｍ尿素、ｐＨ８．９。
２．  タンパク質検体を、５％２−メルカプトエタノールを含む検体緩衝液と混合し、１００℃で５分間過熱し、ゲルに負荷した。電気泳動を、指示色素が溶出するまで２５mAで行った。
３．  分画ゲルを分離し、１０％エタノールおよび１０％酢酸の熱混合物中で５分間インキュベートした。
４．  以下の組成の熱混合物中で１０分間ゲルをインキュベーションして染色した：１５％エタノール−２５％酢酸、０．３ｇ／ＬクーマシーブルーＲ−２５０、および０．４５ｇ／Ｌ硫酸銅６水和物。
５．  染色後、第３項に記載のように、完全に脱色するまでゲルを複数回洗浄した。
６．  ゲルを、密度計測器の仕様書に従って密度計測に付した。コンピュータ支援プレートスキャナによる電気泳動図のデジタル化には、色彩イメージのグリーンチャンネルまたはスキャナのグリーンフィルタを使用した。電気泳動図のイメージを、Scion Imageソフトウェアを用いて表面プロット法により分析した。調製物純度は、主ピークの全検出ピークの合計に対する比として定義した。
【００２３】
２．イムノブロッティング
イムノブロッティングは、ブロッキングＢＳＡ溶液を用いて標準法に従って実施した。ハイブリダイゼーション緩衝液にウシ血清アルブミン（フラクションＶ）を０．５％となるように補充した（図４Ｃ）。
１．  電気泳動を、予め染色したマーカーを用いて、方法２に従って行った。
２．  分画ゲルを分離し、その際、ＨｙＢｏｎｄ  Ｎ＋メンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へのトランスファーの方法を、製造業者の仕様書に従って０．８mA/cm2で４０分間、セミドライ電気トランスファー用ＬＫＢ装置を用いて行った。
３．  メンブランを、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０mM  ＮａＣｌおよび５％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ）の溶液で１時間ブロックした。
４．  メンブランを、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０mM  ＮａＣｌおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む脱ブロック溶液で、５分間、２回洗浄した。その後、モノクローナル抗体１−９Ｅ１０．２とのハイブリダイゼーションを、５０  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０  mM  ＮａＣｌおよび０．５％ウシ血清アルブミンの溶液中で１時間行った。
５．  第４項に従って脱ブロック（洗浄）を行い、メンブランを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Sigma Immunochemicals）にコンジュゲートさせたウサギＦｃ特異的抗マウスＩｇＧ二次抗体に第４項に記載したのと同様の条件下で、ハイブリダイズさせた。
６．  メンブランを、第４項記載のように脱ブロックし、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、３mg/ml  １−クロロ−４−ナフトールおよび０．００３％Ｈ2Ｏ2の溶液で、３０分間染色した。
【００２４】
すべての分析を、特性評価した抗原で測定したように、一次および二次抗体の力価をそれぞれ１：１００００および１：４０００として用いて実施し、試験タンパク質を０．１μgの量で電気泳動にかけた。考え得る試験タンパク質の免疫反応性の存在を、以下の基準により視覚的に測定した：試験タンパク質の電気泳動度に相当する電気泳動度を有し、明瞭な輪郭を有する単一染色ゾーンが現れること。これらの基準が満たされたとき、機器を用いる分析を実施した。
【００２５】
最終的半定量的分析では、Scion Imageソフトウェアを用いたSurface Plot法により、染色ゾーンの染色強度を密度計測で評価した。試験結果は、密度測定図において、ピーク高さの半値がベースライン変動の範囲より５倍高いときに、陽性と判定した。
【００２６】
３．ＭＡＬＤＩ質量分析
検体を以下のようにして、分析用に調製した。
１．  最小容量のタンパク質懸濁液のアリコートを、真空遠心機中で蒸発乾固させた。
２．  １％水性トリフルオロ酢酸および３０％アセトニトリルの混合物１〜５μL中に残渣を溶解し、マトリックスとして２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）を用いてベースプレートにのせ、分析した。
３．  性能についてＶＩＳＩＯＮ−２０００装置に類似する、ＴＯＦ  ＭＡＬＤＩ質量分析計を、タンパク質標準品（トリプシンおよびアンジオテンシン）で予め較正し、タンパク質質量スペクトルを、内部較正を用いて読み取った。分子イオンの質量を、実施した較正を考慮に入れたVISION-2000 Mass Analyzerソフトウェアを用いて測定した。
【００２７】
４．特異的吸着
タンパク質調製物の機能的性質を確認するため、過剰金属キレート吸着剤により溶液からの吸着について定性的に試験した。６×Ｈｉｓの配列を有する試験タンパク質を、ｐＨ８．０で金属キレート吸着剤により固定化する。
【００２８】
１．  金属キレート吸着剤Ｔａｌｏｎ（Clontech Laboratories Inc.）の必要な容量を、緩衝溶液（５０mM  Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＨ2ＰＯ4、３００mM  ＮａＣｌおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で平衡化し、１：１懸濁液の一部２０μLを試験管に移した。
【００２９】
２．  試験タンパク質溶液１０μgを加え、第１項の緩衝液で容量を１００μLに調整した。試験管を振盪しながら１５分間インキュベートし、放置し、その後アリコート１０μLを分析用に採取した。
【００３０】
３．  試験検体中の測定タンパク質濃度が０．００５μg/mlを超えない（すなわち、タンパク質濃度をＢＳＡ試験により測定したとき、対照と有意に相違しない）とき、吸着が完了したものとみなした。これは、９５％吸着レベルに相当する。
【００３１】
実施例３．融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐによる自己免疫ＳＪＬマウスの免疫化
ＳＪＬマウスを、以下のように融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐで免疫化した：
１．  最終M. tuberculosis濃度２mg/mlおよび抗原濃度１．５mg/mlおよび３mg/mlを有する完全フロイントアジュバント中の抗原で、６〜８週齢の雌ＳＪＬマウス５匹を１週間間隔で２回免疫化した。
２．  総量０．１mlになる調製物を、最初の免疫化の場合、背部に沿って３箇所、２回目の免疫化の場合には、足蹠に皮下注射した。
３．  血液脳関門を弱めるために、一回目の免疫化の１日前およびその２日後、百日咳毒素調製物４００ngを腹腔内にさらに注射した。
４．  最初の免疫化の１７日後、マウスに、１匹あたり免疫原性タンパク質５０μgの用量、総容量０．２mlを、ＰＢＳ中の抗原を腹腔内に追加投与した。
５．  追加投与の処置と同時に、実験および対照（非免疫化）マウスの眼窩から血液を採取し、免疫応答の発達をモニターした。血清中の特異的抗体の存在を酵素免疫アッセイにより測定した。
６．  実験開始２１日後に、免疫化学試験において最大の抗原特異的応答を示したマウスを、脾臓摘出および血液採取に用いた。ハイブリドーマクローンを得るための細胞融合およびファージ提示ライブラリとしてのその後のクローニングのためのｍＲＮＡ単離のために、脾臓を使用した。
【００３２】
免疫化の過程における抗原特異的タンパク質分解抗体の出現を確認するために、前臨床実験的自己免疫脳脊髄炎として明らかにされた誘導された自己免疫病変のバックグラウンドに対して、以下の試験を実施した。
【００３３】
得られたポリクローナル抗体調製物の抗原特異性およびタンパク質分解活性の分析
１．  得られた抗体調製物の抗原特異性の分析
数匹の免疫化マウスにおける抗原に対する特異的免疫応答の初期比較モニタリングのために、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）を使用した（図５）。
抗原を免疫プレートに固定化し、免疫化マウスおよび対照マウスから得られた血清とインキュベートした後、抗原抗体複合体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＦｃ特異的ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。免疫化マウスおよび対照マウスの血清を、何段階かに希釈して使用した（１：１２および１：４８）。以下の組換えタンパク質を抗原として用いた：
１）  ｔｒｘ−ｇｐ１２０Ｉ−III−ＣＨ：Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンＡ、第１、第２および第３可変領域の配列が欠失したｇｐ１２０、およびＨｉｓ6−ｃ−ｍｙｃ配列を含む融合タンパク質；
２）  ｔｒｘ−ｇｐ１２０Ｉ−II−III：Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンＡ、ｇｐ１２０の第１および第２定常領域の配列およびＨｉｓ6配列を含む融合タンパク質；
３）  ｔｒｘ−ｇｐ１２０II−III−Ｈ：Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンＡ、第３定常領域から開始する配列のＣ末端を伴う、ｇｐ１２０の第２定常領域の配列、およびＨｉｓ6配列を含む融合タンパク質；
４）  ｔｒｘ−ｇｐ１２０III−Ｈ：Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンＡ、第３定常領域から開始するｇｐ１２０のＣ末端、およびＨｉｓ6配列を含む融合タンパク質；および
５）  ｔｒｘ−ＣＨ：Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンＡおよびＨｉｓ6配列、これを陰性対照として用いて、これらのタンパク質配列に対して得られた抗体の非特異的結合を測定する。
【００３４】
実施した実験の結果（図５）、融合タンパク質で免疫化したマウスの血清から得られた抗体調製物のすべてが、抗原と相互作用した。
【００３５】
２）  得られたポリクローナル抗体調製物のタンパク質分解活性の分析
タンパク質分解活性を測定するために、抗体を、セファロース上に固定化した組換えＧタンパク質を用いて親和性クロマトグラフィーにより精製した。活性は、異なる２種の方法で検出した（図６）。
【００３６】
Ａ．蛍光アッセイ。  方法の原理（図６Ａに概略を述べた）は、フルオロホアで重度に標識されたタンパク質による蛍光消失現象に基づく。この現象は文献に記載されており、主として、様々なフルオロホア分子の芳香環の相互作用（例えば、疎水性およびスタッキング接触の強度による）、およびポリペプチド鎖への切断導入による蛍光増強に基づいている。この試験において、フルオレスセインイソチオシアネートで過剰に標識されたウシ血清アルブミンおよび組換えタンパク質ｔｒｘ−ｇｐ１２０Ｉ−III−ＣＨ（以下ＢＳＡ−ＦＩＴＣおよびｇｐ１２０−ＦＩＴＣと記載）を、タンパク質分解の基質として用いた。反応を、対照に対する蛍光の増強によりモニターした。キモトリプシン活性で汚染されていないトリプシンをモデルプロテアーゼとして用いて、方法の感度を測定し、基質および酵素の量に依存する一時的シグナル変化を評価した。
【００３７】
試験した抗体調製物のタンパク質分解活性を測定するために、ベースラインおよび３７℃で２４時間および４８時間インキュベーションした後、トリプリケートで測定した。これらの実験の結果は以下のことを示唆している（図７〜９）。
【００３８】
−第一に、タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−III−ＭＢＰで免疫化したマウスから得た調製物のタンパク質分解活性は、対象ＳＪＬマウスと比べ、両方の基質を用いたとき増大していた。
−第二に、抗原特異的タンパク質分解活性の増大は、全体的増大に支配的に関与している。ｇｐ１２０−ＦＩＴＣでは、非免疫マウスに比べ、シグナルが１０〜２０倍増大したが、ＢＳＡ−ＦＩＴＣでは、シグナルはわずか２倍の増加であった。
−第三に、セリン反応性不可逆的阻害剤を添加すると、ＢＳＡ−ＦＩＴＣの加水分解速度の測定値が有意に低下したことから、この場合、支配的なメカニズムは、セリン依存性触媒作用である。
−第四に、免疫沈澱により反応から選択的に除去されるＩｇＧ分子は、少なくとも、観察されたタンパク質分解活性の主要部に関与する。
【００３９】
測定が高感度であること、および簡便・迅速性などの効果に議論の余地はない一方で、残念ながら、この方法には、いくつかの欠点があり、そのうちの主要なものは、蛍光の変化と、基質および酵素量、検体量、緩衝液組成、およびｐＨなどとの複雑な非線形関係であり、これらがポリクローナル抗体調製物の酵素活性の定量的評価および特性評価を困難なものにしている。さらに、抗体の全プール中のアブザイムの実際の量は、数パーセント以下を構成するかもしれないため、この試験によるタンパク質活性測定は、酵素に対し大過剰の基質を要する。
【００４０】
上記に関し、得られた抗体調製物のタンパク質分解活性の別の測定方法を、代替法として使用した。
【００４１】
Ｂ．酵素アッセイ
図６Ｂに概略を示した、タンパク質分解活性検出の本方法の原理は、タンパク質分解反応の基質として高度に活性な酵素であるリボヌクレアーゼＡの少量（反応あたり約１ng）の使用に基づいている。リボヌクレアーゼ活性のレベルは、活性ＲＮＡアーゼＡの濃度に線形従属し、このレベルを、反応の重合体基質としてポリシチジル酸を用いる酸溶解残渣法により測定した。タンパク質分解活性検出のこの方法は、おそらく基質に対する酵素の有意なモル過剰の達成を可能にし、それにより、研究中のタンパク質分解反応の条件を、非平衡キネティックスモデル（［Ｓ］0＜＜［Ｅ］）の条件により近づける。
【００４２】
考え得るアーティファクトを除外するために、研究中の抗体調製物のすべてについて、内因性リボヌクレアーゼ活性、および添加したリボヌクレアーゼ活性を非酵素的に変化させる溶液成分の存在について試験した。試験中の抗体調製物のすべてが、内因性リボヌクレアーゼ活性を有さず、反応の短時間（１０分間）インキュベーションにおいて添加したリボヌクレアーゼ活性を変化させなかった。
【００４３】
試験した抗体調製物のタンパク質分解活性を、以下の条件下で測定した：ＩｇＧ濃度０．１mg/ml、インキュベーション時間１７時間、温度３７℃。この方法で測定した調製物の活性を、リボヌクレアーゼ加水分解速度として表した。
【００４４】
図１０に示した試験結果は、タンパク質分解活性が、ｇｐ１２０−Ｉ−IIIｍｂｐによるマウスの免疫化により１．５〜２倍低下したことを示す。これらの結果は、蛍光試験の結果との限られた一致であった：タンパク質分解活性と免疫化に使用されたイムノゲン用量の間の負の相関のみが再現された。蛍光分析と酵素分析の結果の間の相違は、タンパク質分解の基質の構造の違いにより説明し得るかもしれない。おそらく、ＢＳＡ小球に比べＲＮＡアーゼＡ小球の有するプロテアーゼおよびアブザイムが利用し得る部位は少ない。免疫化に際し、ＩｇＧの総血清濃度は、抗原特異的抗体により何倍にも増加したため、初期のタンパク質分解抗体の比率は低下し、その一方で、新たに形成された抗原特異的タンパク質分解抗体は、ＲＮＡアーゼＡのタンパク質分解性切断の非効率的な触媒であった。
【００４５】
３．免疫応答発生および実験的自己免疫脳脊髄炎誘導のモニタリング
神経抗原ＭＢＰを含む融合タンパク質による免疫化に際し免疫応答発生の性質を特性評価するために、非免疫化ＳＪＬマウス（対照）、合成ペプチドＭＢＰ89-104、組換え融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIＭＢＰ（異なる２用量）および組換えタンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIにより免疫化したマウスからのＴリンパ球における特異的表面マーカー発現の比較分析を行った（図１１）。免疫化はすべて、上記のように同一の条件下で平行して行った。実験開始２１日後、各群２匹のマウスから単離したＣＤ４＋Ｔリンパ球をフローサイトメトリーで分析した。ＳＪＬマウスの特異的性質は、最初にＣＤ８＋Ｔ細胞数が少ないことである。また、免疫応答発生に重要な以下の表面マーカーの発現の変化を検討した：ＣＤ１１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢおよびＣＤ６２−Ｌ。図１１に示した結果は、ペプチドＭＢＰで、およびこの抗原を含む融合タンパク質で免疫化した場合には、完全に発達したＴ細胞免疫応答（記憶細胞の出現）が、免疫化２１日後に誘導されたが、抗原としてｇｐ１２０Ｉ−IIIのみを使用した場合には、免疫応答はまだ発達段階であった。得られたデータは、自己抗原ＭＢＰを使用した場合、免疫応答発生の増強および実験的自己免疫脳脊髄炎発症に典型的なＴリンパ球活性化の証左を提供している。
【００４６】
したがって、上記実施例は、融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐによりＳＪＬマウスを免疫化すると、誘導された実験的自己免疫脳脊髄炎の前臨床段階の基礎疾患に対して、抗原特異的なタンパク質分解抗体が生じることを示している。
【００４７】
実施例４．ｇｐ１２０のペプチドフラグメントの反応性ホスホネート誘導体の合成
第一段階で、遊離アミノ基において保護されているアミノアルキルホスホネートを、トリフェニルホスファイト、イソブタナールおよびベンジルカルバメートの共縮合反応で合成した。この終了時に、氷酢酸１５ml中のトリフェニルホスファイト、イソブタナールおよびベンジルカルバメート各０．１モルの混合物を、発熱しなくなるまで約１時間撹拌した。その後、反応物を８０℃で１時間加熱しながら撹拌した。反応が完全に行われた後、揮発性生成物を、減圧下、水浴上で加熱しながら、ロータリーエバポレーターで除去した。油状残渣をメタノール（１８０ml）中に溶解し、−２０℃で３時間放置して結晶化した。結晶化の後、ジフェニル１−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）−アミノアルキルホスホネートの残渣を、濾過により採取し、最小量のクロロホルム（３０〜４０ml）中で再結晶し、４倍容量のメタノールを加えた。
【００４８】
遊離アミノアルキルホスホネートを得るために、保護基を、ジフェニル１−（Ｎ−ベンジルカルボニル）−アミノアルキルホスホネートを酢酸（０．１モル当たり１５ml）中の臭化水素の３３％溶液で、室温で１時間処理することにより除去した。揮発性成分を、減圧下、水浴上で加熱しながらロータリーエバポレーターで除去した。１−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）−アミノアルキルホスホネート臭化水素酸塩を、無水ジエチルエーテルの添加により得られた残渣から結晶化した。遊離ホスホネートは、臭化アンモニウムの多量の沈殿形成が終わり、懸濁液の完全な乳白化が観察されるまで、ジエチルエーテル中のホスホネート臭化水素酸塩懸濁液を通じて気体状の乾燥アンモニウムを通過させて得た。得られた臭化アンモニウムを濾過により除去し、ジエチルエーテルは、大気圧下、水浴上で蒸発させた。
【００４９】
ハプテンであるＬｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−P（ＯＰｈ）2（ＬＡＥＥＥＶ−P（ＯＰｈ）2）（ここで、P（ＯＰｈ）2は、α−カルボキシル基をジフェニルホスホネートで置換したことを意味する）を得るために、Ｎ末端アミノ基および側鎖基において保護されているペプチドＢｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕをまず合成した。ペプチドＢｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕを、アセトニトリル３００μL中の保護ペプチド２マイクロモル、ホスホネート２マクロモル、およびジシクロヘキシルカルボジイミド２マイクロモルを混合し、１時間インキュベートすることにより、バリンのホスホネート誘導体と融合させた。反応終了後、生成物を、２０nMリン酸カリウム（ｐＨ７．０）中の０〜８０％アセトニトリル勾配を用いて、１５０×３．９mm  Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  ＮｏｖａＰａｋカラムによる逆相ＨＰＬＣにより分離した。得られた画分を、質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で分析した。分子イオン質量１１４５Ｄａ（［Ｍ＋Ｈ］＋）、１１６７Ｄａ  （［Ｍ＋Ｎａ］＋）または１１８３Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋）を有する物質を含む画分を合わせて、凍結乾燥した。残渣を１００％トリフルオロ酢酸１００μL中に溶解し、室温で１時間インキュベートして、保護用ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルおよびｔｅｒｔ−ブチル基を除去した。脱保護したペプチドチジルホスホネートを、反応に無水ジエチルエーテル１０倍量を加えて沈殿させた。沈殿を、１１２５００rpmで１０分間遠心することにより分離し、脱保護手順を繰り返した。残渣を風乾し、−２０℃で保存した。
【００５０】
ペプチジルホスホネートＬＡＥＥＥＶ−P（ＯＰｈ）2の分析
Ｉ．ＴＯＦ−ＭＡＬＤＩ質量分析
１．乾燥ペプチジルホスホネートの最小量に、アセトニトリル５μLを加え、水性の、強酸を含まない２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）をマトリックスとして用いてベースプレートに適用し、分析を行った
【００５１】
２．ＶＩＳＩＯＮ−２０００装置と同等のＴＯＦ  ＭＡＬＤＩ質量分析計を、５００〜２０００Ｄａ  ｍ／ｚ範囲内で、標準品で較正し、試験検体の質量スペクトルを内部較正を用いて得た。分子イオン質量を、較正を考慮に入れたＶＩＳＩＯＮ−２００  Ｍａｓｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアを用いて測定した。分析の予測結果は、８７７．３６、９００．３４および９１５±１Ｄａの質量に相当するピークの存在である。
【００５２】
II．分析用逆相ＨＰＬＣ
１．ペプチジルホスホネート検体０．２mgに２０％アセトニトリルを含有する２０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μLを加えた。
【００５３】
２．得られた検体をインジェクター中に注入し、以下の条件下、１５０×３．９  mm  Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  ＮｏｖａＰａｋカラムによる逆相ＨＰＬＣを用いて勾配溶出を行った：
−緩衝液Ａは、２０％アセトニトリルおよび２０mMリン酸カリウム、ｐＨ７．０；
−緩衝液Ｂは、８０％アセトニトリルおよび２０mMリン酸カリウム、ｐＨ７．０；
−溶出速度は、１．０ml／分で、１００％Ａから１００％Ｂへの直線的勾配を２０分間、その後、１００％Ｂを１０分間とする；
−２６０nm波長のクロマトグラムを記録する。
【００５４】
３．ベースライン補正をせずに、ピークを積算した。主ピーク（最大面積を有する）の保持時間を測定し、主ピーク面積の全ピーク面積に対する比を算出した。予想結果：
保持時間は、１４．７５〜１５．２５分である。クロマトグラフィー純度は、＞９５％である。
【００５５】
III．キモトリプシンのエステル分解活性の阻害
１．０．１  ＨＥＰＥＳおよび０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２を含有する緩衝液中のα−キモトリプシンの１μM溶液０．５mlを調製した。溶液を、９つの５０μLアリコートに分け、残りは廃棄した。
【００５６】
２．１０００μL〜１μLの範囲のアセトニトリル中の試験ペプチジルホスホネートの８段階希釈物を調製した。
【００５７】
３．酵素溶液の最初の８つのアリコートのそれぞれに、対応するペプチジルホスホネート溶液５μLを加え、アセトニトリル５μLを９つ目のアリコートに加えた。
【００５８】
４．検体を２５±５℃で１時間インキュベートした。
【００５９】
５．検体を、脱イオン水４５０μLを含む分光光度計のセルに連続的に移し、混合し、その際、メタノール中のｐ−ニトロフェニルアセテート溶液（２．５mg/ml）１０μLを加え、その後、４００nm波長での光学密度の上昇を記録した。基質加水分解の初速度を、任意の単位で算出した。
【００６０】
６．効果的な阻害剤濃度を算出した。この目的のために、検体１〜８で実測した加水分解速度の検体９で実測した加水分解速度に対する比を算出した。効果的阻害剤濃度は、試験基質の最低濃度と定義され、この濃度では、基質加水分解速度の比は５０％を超えなかった。予想結果：３０μM。
【００６１】
実施例５．ｇｐ１２０のペプチドフラグメントのホスホネート誘導体によるマウスの反応性免疫化
免疫化のために、反応性ペプチドを巨大分子担体C. conholepasヘモシアニン（スカシガイヘモシアニン、ＫＬＨ）にコンジュゲートさせた。第一段階では、担体をＰＢＳ中のビス（スルホスクシンイミジリル）スベレートの過剰量で、３７℃で１時間活性化した。活性化後、ビス（スルホスクシンイミジリル）スベレートに未結合のＫＬＨを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００コンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ  ＹＣメンブラン）を用いて、毎回残渣にＰＢＳを加えて５００μLとし、限外濾液を廃棄する、７回の完全限外濾過（残渣容量７０μL以下）により反応から除外した。得られた溶液に、ＰＢＳ中のペプチジスルホネート溶液を加え、その際、溶液を撹拌せずに、３７℃で１時間インキュベートした。未反応のスクシンイミド基を−、２−エタノールアミン２μLを加えて不活性化した。反応物の低分子成分は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００コンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ  ＹＣメンブラン）を用いて、毎回残渣にＰＢＳを加えて５００μLとし、限外濾液を廃棄する、７回の完全限外濾過（残渣容量７０μL以下）により除去した。最終調製物を、濾過により滅菌し、−２０℃で保存した。
【００６２】
６〜８週齢の雌のＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ、ＳＪＬおよびＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ1マウスを、マウスあたり免疫原性タンパク質５０μgの用量で、総容量０．２mlの完全フロイントアジュバント中の抗原で腹腔内投与により免疫化した。
【００６３】
二回目の免疫化を、初回免疫化の１７日後に、不完全フロイントアジュバント中、同容量および同抗原濃度で行った。同時に、３系統の実験群および対照非免疫マウスからそれぞれ３匹のマウスの眼窩から血液を採取し、免疫応答の発達をモニターした。
【００６４】
実験開始２１日後、免疫学的試験において最大の抗原特異的応答を示したマウスを、脾臓摘出のために屠殺した。これらのマウスの血清から単離したポリクローナル抗体を、抗原特異性および触媒活性について分析した。
【００６５】
前段階で合成したペプチドチジルホスホネートの一部を、ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルにコンジュゲートする反応に用いた。反応は、最小容量のジメチルホルムアミド中で等モル量のペプチドチジルスルホネートおよび活性化ビオチンを混合し、１時間インキュベートすることにより行った。ビオチニル化調製物は、マウスの反応性免疫化の結果として得られた抗体の特異性の分析を意図するものである。
【００６６】
３系統すべての数匹の免疫化マウスにおいて抗原に対する特異的免疫応答をモニターするために、酵素免疫アッセイを用いた。
【００６７】
免疫化マウスおよび対照マウスの血清からの抗体を、プレートにあらかじめ吸着させたマウスＩｇＧに対するヤギ抗体を用い、次に、ビオチン化抗原とインキュベーションし、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたニュートラビジンを用いて、抗原−抗体複合体を検出することにより単離した。ヤギ抗体免疫化および対照マウスの血清からの抗体を、数段階の希釈で用いた（１：１２および１：４８）。使用した抗原を、ビオチン標識化開始ペプチジルホスホネート、ビオチン化Ｖａｌホスホネートおよびニトロフェニルメチル−ｐ−ビオチニルフェニルメチルホスホネートであり、これらにおいては、アブザイムの活性中心の特異的共有結合的修飾が以前明らかにされた。比較分析は、３系統すべての実験マウスの抗体が、全体として抗原の修飾ペプチドフラグメントに対して高い特異性を有し、この実験の条件下では、遊離Ｖａｌホスホネートと相互作用せず、より活性で、より特異性の低い修飾剤への共有結合能を示すことを明らかにしている（図１２）。平均的には、ニュージーランド交雑種では、抗原特異的抗体の量が、他の２種の自己免疫血統に比べて、いくぶんか高いが、共有結合による修飾については、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの抗体がより効果的であることに留意すべきである。
【００６８】
抗原とともに、マウスＩｇＧのＦｃフラグメントに対する、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗体を用いて、プレートのウェル内で特異的に吸着されたマウスの抗体の総量を測定した。これにより、クラスＧのイムノグロブリンの全プールにおける抗原特異的抗体の比率を推定することが可能になった。
【００６９】
得られた抗体の反応性ペプチドとの相互作用の様式についての更なる研究を、イムノブロッティングを用いて、精製前ＩｇＧ調製物で行った。ビオチン化ペプチジルホスホネートとインキュベートした後、変性および還元条件下での電気泳動による分画化、およびメンブランの固定化、抗原抗体複合体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたニュートラビジンを用いて検出した。図１３に示したこの実験の結果は、ペプチドにより共有結合的修飾され得るイムノグロブリン軽鎖および重鎖の両方が、反応性ペプチドＶａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＰＯ（ＯＰｈ）2で免疫化した自己免疫マウスから単離したポリクローナル抗体の調製物中に存在したことを示唆している。
【００７０】
この実施例の条件下での反応性免疫化により、以下のような結果が生じた：
−免疫化の過程で得られた抗体は、免疫化抗原に結合する。
−抗体は、免疫化抗原の「最小」ホスホネート基と反応せず、このことは、研究対象の抗体およびＶａｌP（ＯＰｈ）2の遊離ホスホネート基との間には、何ら非特異的相互作用（または非特異的化学反応）がないことを意味する。
−抗体は、活性な「メカニズム依存性」ホスホネートと反応する、即ち、免疫化抗原に明らかな構造関連を有しないが、ヒドロラーゼと共有結合複合体を形成する能力を有する分子と反応する能力を示す。
−抗体は、免疫化抗原と共有結合複合体を形成する。
【００７１】
組合わせにおいて、上記性質は、組成がＬＡＥＥＥＶ−P（ＯＰｈ）2に対応するペプチジルホスホネートによる免疫化の過程で、エピトープ特異的触媒抗体が生じることを示唆する。
【産業上の利用性】
【００７２】
本発明は、薬物製造医薬産業において有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】ｇｐ１２０フラグメントＩ−IIIのヌクレオチド配列。フラグメントＩ、IIおよびIIIが、順番に着色されている。ＰＣＲに用いるプライマーを、大文字で示す。
【図２】ｐＥＴ３２ｂベクターの使用により得られる組換えタンパク質のダイアグラム。
【図３】ｐＥＴ２８ａベクターの使用により得られる組換えタンパク質のダイアグラム。
【図４】タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐ（構築物１５の生成物）の単離・精製の異なる各段階の電気泳動図（Ａ）およびイムノブロット（Ｂ）。１−誘導前の全細胞タンパク質−２−誘導後全細胞タンパク質；３−可溶性細胞内タンパク質画分；４−金属キレートカラムにより保持されない可溶性タンパク質；５−ｐＨ５．０で溶出される可溶性タンパク質；６−クロマトグラフィー精製後の可溶性タンパク質形態調製物；７−不溶性細胞内タンパク質画分；８−金属キレートカラムにより保持されない不溶性タンパク質；９−クロマトグラフィー精製後の変性タンパク質形態調製物；１０−マーカー。
【図５】異なる用量での融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐで免疫化したＳＪＬマウスの血清中の抗体の抗原特異性の解析。図説明は、イムノゲンの用量；ＳＪＬ−２は、マウス当たり１５０μgの用量で免疫化し、ＳＪＬ−３は、マウス当たり３００μgの用量で免疫化したマウスである。
【図６】タンパク質分解活性の蛍光および酵素分析の原理
【図７】融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐで免疫化したＳＪＬマウスの血清から単離された抗体調製物のタンパク質分解活性の測定。ＳＪＬ−１は対照マウスである。ＳＪＬ−２は、マウス当たり１５０μgの用量で免疫化したマウスである。ＳＪＬ−３は、マウス当たり３００μgの用量で免疫化したマウスである。ＢＳＡ−ＦＩＴＣおよびｇｐ１２０−ＦＩＴＣを、基質として用いた。
【図８】融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐで免疫化したＳＪＬマウスの血清から単離された抗体調製物のタンパク質分解活性の阻害。ＳＪＬ−１は、対照マウスである。ＳＪＬ−２は、マウス当たり１５０μgの用量で免疫化したマウスである。ＡＥＢＳＦ：フッ化アミノエタンベンゼンスルホニルＣＭＣ：フェニルアラニルクロロメチルケトン
【図９】ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐで免疫化したＳＪＬマウスの血清から単離された抗体調製物のタンパク質分解活性の抗種抗体阻害。ＳＪＬ−１は、対照マウスである。ＳＪＬ−２は、マウス当たり１５０μgの用量で免疫化する。抗ＩｇＧ：マウスＩｇＧに対するウサギポリクローナル抗体。
【図１０】異なる用量の融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐで免疫化したＳＪＬマウスの血清から単離した抗体調製物のタンパク質分解活性の酵素的測定。ＳＪＬ−１は対照マウスである。ＳＪＬ−２は、マウス当たり１５０μgの用量で免疫化したマウスである。ＳＪＬ−３は、マウス当たり３００μgの用量で免疫化したマウスである。ＣＢＡは、対照ＣＢＡマウスである。
【図１１】異なる用量の融合タンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐ、組換えタンパク質ｇｐ１２０Ｉ−III、および脳炎原性ペプチドＭＢＰ89-104で免疫化したＳＪＬマウスの免疫系のＴ細胞上表面マーカーの発現レベルの変化。ＳＪＬ−１は、非免疫化マウスである。ＳＪＬ−２は、マウス当たり１５０μgの用量でｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐで免疫化したマウスである。ＳＪＬ−３：マウス当たり３００μgの用量でｇｐ１２０Ｉ−IIIｍｂｐで免疫化したマウス。ＳＪＬ−４は、ペプチドＭＢＰ89-104で免疫化したマウスである。ＳＪＬ−５は、マウス当たり３００μgの用量の組換えタンパク質ｇｐ１２０Ｉ−IIIで免疫化したマウスである。
【図１２】ペプチジルホスホネートで免疫化したＳＪＬ、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒおよびＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１マウスの血清の酵素免疫アッセイ。使用した抗原は、Ａ−ビオチニル化反応性ペプチド；Ｂ−ビオチニル化ジフェニルバリルホスホネート；Ｃ−メチルｐ−ニトロフェニルビオチニルフェニルメチルホスホネートであった。
【図１３】ＳＪＬ（４）、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒ（５）およびＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１（６）系統の免疫化マウスから単離され、抗原で共有結合的な修飾をしたポリクローナル抗体の電気泳動図（Ａ）およびイムノブロット（Ｂ）。レーン１〜３；ＢＳＡ１０μg、トリプシン１μgおよびＢＡＬＢ／ｃマウスのＩｇＧ  １μg。
【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年6月9日(2003.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然または誘導性自己免疫病理を有する動物を用いる触媒抗体の製造方法であって、ミエリン塩基性タンパク質またはそのフラグメントと触媒抗体の潜在的基質または潜在的基質のフラグメントとからなる融合タンパク質を動物に投与することを特徴とする、製造方法。
【請求項２】
潜在的基質が、ｇｐ１２０（ＨＩＶ−１の表面糖タンパク質）またはそのフラグメントであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
自然または誘導性自己免疫病理を有する動物としてマウスを用いることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
塩基性ミエリンタンパク質で免疫化すると実験的自己免疫脳脊髄炎を発症し得る株のマウスを用いることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
以下の構造：
【表１】
2004527248.tif 000151
を特徴とする融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【表２】
2004527248.tif 000152
【請求項７】
自然または誘導性自己免疫病理を有する動物を用いる触媒抗体の製造方法であって、該方法が、潜在的基質ｇｐ１２０のフラグメントであるペプチドのリン酸塩誘導体である抗原を動物に投与することを含み、該ペプチドのアミノ酸配列がＬｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌであることを特徴とする、製造方法。
【請求項８】
下記構造：
【化１】
2004527248.tif 000153
のペプチジルホスホネート。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の方法において使用されるペプチジルホスホネートは、以下の構造を有する。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
化合物であるＬｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−P（ＯＰｈ）2（ＬＡＥＥＥＶ−P（ＯＰｈ）2）（ここで、P（ＯＰｈ）2は、α−カルボキシル基をジフェニルホスホネートで置換したことを意味する）を得るために、Ｎ末端アミノ基および側鎖基において保護されているペプチドＢｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕをまず合成した。ペプチドＢｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕ−（ｔ−Ｂｕ）Ｇｌｕを、アセトニトリル３００μL中の保護ペプチド２マイクロモル、ホスホネート２マクロモル、およびジシクロヘキシルカルボジイミド２マイクロモルを混合し、１時間インキュベートすることにより、バリンのホスホネート誘導体と融合させた。反応終了後、生成物を、２０nMリン酸カリウム（ｐＨ７．０）中の０〜８０％アセトニトリル勾配を用いて、１５０×３．９mm  Ｗａｔｅｒｓ  Ｃ１８  ＮｏｖａＰａｋカラムによる逆相ＨＰＬＣにより分離した。得られた画分を、質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で分析した。分子イオン質量１１４５Ｄａ（［Ｍ＋Ｈ］＋）、１１６７Ｄａ  （［Ｍ＋Ｎａ］＋）または１１８３Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋）を有する物質を含む画分を合わせて、凍結乾燥した。残渣を１００％トリフルオロ酢酸１００μL中に溶解し、室温で１時間インキュベートして、保護用ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルおよびｔｅｒｔ−ブチル基を除去した。脱保護したペプチドチジルホスホネートを、反応に無水ジエチルエーテル１０倍量を加えて沈殿させた。沈殿を、１１２５００rpmで１０分間遠心することにより分離し、脱保護手順を繰り返した。残渣を風乾し、−２０℃で保存した。




【国際調査報告】
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