(57)【要約】本発明は、標的菌株に特異的な酵素（エステラーゼ）と反応する色原性または蛍光原性基質を用いる生化学的手段により微生物を分析する方法および培地に関する。本発明の１つの目的は、このような検出／識別培地の感度、初期半透明度、安定性および使用の容易さを改善することである。この目的のために、本発明の培地は、安定な直ちに使用できる液体状またはゲル状であって、脂肪酸ソルビタンエステル、胆汁酸塩およびそれらの混合物から選択される可溶化剤および安定化剤ならびにアルキルスルフェート塩類（例えばナトリウム塩）から選択される選択的活性化剤を含むことを特徴とする。この培地は、溶媒、例えばジメチルスルホキシドを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に反応培地（Ｍ）と、少なくとも１種の色原性または蛍光原性エステラーゼ基質（Ｓ）とを含むタイプのエステラーゼ活性を有する微生物の検出／識別用培地であって、この検出／識別は、本質的に、エステラーゼ活性の存在を明らかにすることに基づいており、
＊安定な、すぐに使用できる液体状またはゲル状であり、
＊Ａ）以下の群：
―脂肪酸ソルビタンエステル（ＦＡＳＥ）、
―胆汁酸塩、および
―これらの混合物
を含む群から選択される少なくとも１種類の可溶化剤および安定化剤；
Ｂ）以下の群：
―式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2004518418.tif 000012
（式中、Ｒは線状または分岐鎖アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ３０アルキルであり、
Ｘはハロゲン、好ましくはＮａである）；
―非イオン性のポリエーテル誘導体、好ましくは式（ＩＩ）の誘導体：
【化２】
2004518418.tif 000013
（式中、Ｎは２と１５の間の整数（平均＝１０）である）；および
―これらの混合物、
を含む群から選択される少なくとも１種類の選択的活性化剤；ならびに
Ｃ）場合によっては少なくとも１種類の溶媒
を含むことを特徴とする培地。
【請求項２】
基質（Ｓ）の少なくとも１種類のストック溶液および溶媒（Ｃ）を可溶化剤（Ａ）と混合し、反応培地（Ｍ）の成分のうち少なくともいくつかおよび促進剤（Ｂ）に添加することにより得られることを特徴とする請求項１に記載の培地。
【請求項３】
選択的促進剤（Ｂ）が、式（Ｉ）においてＲがテトラデシル基（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）またはＮｉａｐｒｏｏｆ（登録商標）４）または２―エチルヘキシル基（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）またはＮｉａｐｒｏｏｆ（登録商標）８）である製品であることを特徴とする請求項１または２に記載の培地。
【請求項４】
ＦＡＳＥ（Ａ）が以下のもの：
＊エチレンオキシド（ＥＯ）を２０単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）；
＊ポリエトキシル化ソルビタンモノパルミテート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）；
＊ポリエトキシル化ソルビタンモノステアレート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）；
＊ポリエトキシル化ソルビタントリステアレート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５）；
＊ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）；
＊ポリエトキシル化ソルビタンセスキオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８３）；
＊ポリエトキシル化ソルビタントリオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５）；および
＊これらの混合物
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の培地。
【請求項５】
標的微生物がグラム陽性細菌および／または酵母であり、（Ｂ）剤の濃度が培地（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭおよびＳを含む）１リットル当たりのｍｌで表わして
１．１０−４≦［Ｂ］≦１０、
好ましくは１．１０−３≦［Ｂ］≦５、
特に好ましくは１．１０−２≦［Ｂ］≦２
である請求項１に記載の培地。
【請求項６】
標的微生物がグラム陰性細菌であり、（Ｂ）剤の濃度が培地（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭおよびＳを含む）１リットル当たりのｍｌで表わして
１．１０−２≦［Ｂ］≦１００、
好ましくは１．１０−１≦［Ｂ］≦３０、
特に好ましくは１≦［Ｂ］≦２５
である請求項１に記載の培地。
【請求項７】
色原体または蛍光原性エステラーゼ基質が、以下のものを含む群：
―脂肪酸のインドキシルエステルおよびその誘導体、好ましくはＣ６〜Ｃ１１脂肪酸のインドキシルエステル、および特に好ましくは、場合によってはハロゲン化されていてもよいＣ８〜Ｃ９脂肪酸のインドキシルエステル、
―脂肪酸のキノン／アントラキノンエステルおよびその誘導体、好ましくはＣ６〜Ｃ１１脂肪酸のアントラキノンエステル、特に好ましくはＣ８〜Ｃ９脂肪酸のジヒドロキシアントラキノン（アリザリン）エステル、
―脂肪酸のヒドロキシクマリンエステルおよびその誘導体、
―脂肪酸のフルオレセインエステルおよびその誘導体、および
―これらの混合物
から選択されることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項８】
溶媒（Ｃ）が以下のもの：
―アルコール、好ましくはメタノール、エタノールおよびメトキシエタノール；
―アミド、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；
―含硫黄溶媒、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ならびに
―これらの混合物
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９】
（Ａ）剤の溶媒（Ｃ）に対する重量比が、２０：８０と８０：２０の間、好ましくは３０：７０と７０：３０の間、特に好ましくは４０：６０または６０：４０であることを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１０】
培地中の（Ａ）剤の濃度（重量％）が以下のもの：
＊０．１≦［Ａ］≦１０、
＊好ましくは０．５≦［Ａ］≦５、
＊特に好ましくは１．５≦［Ａ］≦３．５
であることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１１】
培地中の基質（Ｓ）の濃度（ｍｇ／ｌ）が以下：
＊５０≦［Ｓ］≦１０００、
＊好ましくは１００≦［Ｓ］≦８００、
＊特に好ましくは２００≦［Ｓ］≦６００
の通り定義されることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１２】
その培養培地（Ｍ）が、以下のもの：
―マッコンキー、コロンビアＡＮＣ、ＰＡＬＣＡＭおよびサブローゲンタマイシン―クロラムフェニコール培地を含むタイプの選択培地、好ましくはマッコンキー培地；および
―コロンビア＋／―血液、トリプカーゼ大豆、栄養ゲロースおよびサブロー培地を含むタイプの非選択的培地、好ましくはコロンビア培地
を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１３】
検出／識別されるべき細菌が、サルモネラであることを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１４】
＊色原性または蛍光原性エステラーゼ基質（Ｓ）を含む溶媒（Ｃ）と少なくとも１種類の可溶化剤（Ａ）から少なくとも１種類のストック溶液を調製すること；
＊反応培地（Ｍ）にこの溶液を添加すること；
＊界面活性剤（Ｂ）および他の任意の添加剤をＳ＋Ａ＋Ｃ＋Ｍ混合物に組み入れること、および
＊全体を均質化すること
から実質的になることを特徴とする請求項１から１３のいずれか一項に記載の培地を得る方法。
【請求項１５】
―請求項１から１３のいずれか一項に記載の培地または請求項１４に記載の方法で得られる培地に分析または検出／識別しようとする微生物を含むと疑われる試料を接種すること、
＊接種した培地を適当な条件下にインキュベートすること、および
＊標的微生物による基質の加水分解を明らかにするコロニーの発色または蛍光を読み取りかつ解釈すること
からなることを特徴とするエステラーゼ活性を有する菌株を検出／識別する方法。
【請求項１６】
―式（Ｉ）の化合物：
【化３】
2004518418.tif 000014
（式中、Ｒは線状または分岐鎖アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ３０アルキルであり、
Ｘはハロゲン、好ましくはＮａである）；
―非イオン性のポリエーテル誘導体、好ましくは式（ＩＩ）の誘導体：
【化４】
2004518418.tif 000015
（式中、Ｎは２と１５の間の整数（平均＝１０）である）；および
―これらの混合物
を含む群から選択される少なくとも１つの製品（Ｂ）の選択的活性剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、生化学的手段による微生物の分析、特に反応培地（特に栄養培地）の接種による微生物の菌株の検出および識別の分野である。後者は、標的菌株に特異的な酵素と反応し得る色原性または蛍光原性基質を含み、問題となる各コロニーについて発色または蛍光を生じる。
【０００２】
本開示の枠内において特により興味深い点は、エステラーゼ活性を有する微生物、特にサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の細菌を検出／識別することである。
【背景技術】
【０００３】
このサルモネラ属は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）で最も重要な属であり、人間において様々な感染症（腸チフス、食中毒）の原因となる。サルモネラ属の菌は、色原性（例えばインジゴ生成性）合成基質または蛍光原性基質を加水分解することが可能な非特異的エステラーゼを有する。
【０００４】
サルモネラ属、より一般的にはエステラーゼ活性を有する微生物の検出／識別は、従来、エステラーゼ活性を有する疑いのある微生物（特にサルモネラ属）のコロニーの検出／識別が可能なゲロース（ｇｅｌｏｓｅ）分離培地上または液体分離培地上で行われている。こうした培地への接種は、分析する試料に前述の培地を浸漬するか、または試料を培地に接触させることによって行われる。
【０００５】
エステラーゼ活性を有する微生物（特にサルモネラ属）は、それらの酵素遺伝子型において、培地中に存在する基質のエステル結合を開裂させるエステラーゼを有し、この結果、前述の基質の一部である活性化された発色団または発蛍光部分を放出させる。この結果、発色または蛍光が生じて加水分解が起こったことがわかり、したがって、標的微生物または標的微生物のコロニーの存在が明らかになる。
【０００６】
ルーチン化された試験を大規模に実行できるようにするためには、検出／識別培地が安定で、対応する検出／識別方法を操作を制限することにより可能な限り単純化する必要がある。また、その方法が高感度（発色または蛍光の高い強度）で一次オーダーの特異性を示すことが重要である。エステラーゼ活性を有する微生物の検出／識別用のこれらのタイプの培地および方法の別の基本的パラメーターは、疑わしいコロニーが明らかにされる割合である。
【０００７】
一方、エステラーゼ基質は、エステラーゼの活性を有する微生物の培養培地と適合性の問題を示すことが知られている。さらに、このようなエステラーゼ基質は経時的に安定していないが、これはエステラーゼ活性に対する感度が保存時間とともに減少することを意味する。
【０００８】
一方ではこの種の培地に、ある菌株に対する選択性とともに未接種状態における半透明性を付与し（妨害なしの成長の読取り）、他方では顕色剤として有用な酵素活性を高める（より明瞭な発色）添加剤があればさらに有益であろう。
【０００９】
こうした状況の中で、仏国特許第２６９７０２８号は、胆汁酸塩（デオキシコール酸ナトリウム）から選択される界面活性剤とともに、インドール基を有するカプリル酸エステル（カプリル酸５―ブロモ―４―クロロ―３―インドリル）からなる色原性エステラーゼ基質を含む、サルモネラ属の菌の存在を明らかにするために培養培地を開示する。この色原体およびこの胆汁酸塩は、サルモネラ属の菌の成長を可能にする栄養培地に含まれている。仏国特許第２６９７０２８号が教えるところによれば、胆汁酸塩は、既にエステラーゼ基質を含んでいる選択培地に直接加えられる。
【００１０】
胆汁酸塩類の使用に伴う１つの問題は、それらが動物起源の出発原料であるという事実（このため品質にある程度の変動が避けられない）に起因する。
【００１１】
さらに、生物学的活性の面で結果の改善をなし得る。
【００１２】
さらに、この培養培地は、エステラーゼ基質の安定性の点ですべての望ましい保証を与えるものではない。実際に、後者は、培養培地との混和が不完全であることが分かる（これは、感度および迅速性の点から見て、得られる結果の質を明らかに落とすものである）。
【００１３】
仏国特許第２６９７０２８号による培養培地が粉末状であることも注意すべきである。これは、液体またはゲル培地を再構成するために、利用者がまず操作を行わなければならないことを意味する。こうした拘束条件は使用するエステラーゼ基質が安定性に欠けている結果である。
【００１４】
さらに、仏国特許第２６９７０２８号の教えるところによって調製されたゲロース培地は半透明ではなく、この結果、標的細菌のいずれかのコロニーに伴う発色を読み誤る危険がある。
【００１５】
最後に、前述の文献の第３頁１７〜２３行には、ＵＮＩＯＮＣＡＲＢＩＤＥによって商標Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）の下で市販されているアニオン性界面活性剤（Ｎａアルキルスルフェート）が、発色を明らかにはできないことが示されている。
【００１６】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ―９２／１７６０７は、ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）４（７―エチル―２―メチル―４―ウンデカノエートハイドロジェンスルフェートまたはそのナトリウム塩）を含むサルモネラ属の菌の検出用培地に関する。この添加剤は、サルモネラ属以外の菌に対する検出培地の選択性を改善すると考えられている（特にプロテウス属の菌種の成長抑止）。ＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）４の濃度は、寒天ゲロース／キシロース／リジンを基礎とする培地中２〜３０ｍｌ／ｌで変えることができる。前述の文献によれば、サルモネラ属の菌の検出は部分的には競争による選択的成長の原理に基づく。さらに、この培地は色原体または蛍光原性エステラーゼ基質を含まない。
【００１７】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ―９９／４１４０９は、サルモネラ属の菌を検出するための色原性エステラーゼ基質に関する。前記文献は、サルモネラ属の菌に特異的なエステラーゼ／リパーゼと反応し、Ｃ８脂肪酸エステルへの親和性を有する色原性化合物の使用を提案する。問題の色原性化合物は式［４―［２―（４―オクタノイルオキシ）―３，５―ジメトキシフェニル）ビニル］キノリニウム―１―（プロパン―３―イル）カルボキシレート］＋［臭化物または塩化物イオン］−のアニオンとカチオンを含む。
【００１８】
より正確には、使用される基質は、カルボキシレートカチオンの、例えばＣ８エステルである。ＷＯ９９／４１４０９による方法は、ソルビタン脂肪酸エステル（好ましくはソルビタンのモノラウリル酸エステルＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）の使用についても記載している。これらの製品は、前記特異的色原性エステラーゼ基質に対する標的コロニーの接種および発色前の培地の透明性を高めるため、培地１リットル当たり２ｇの割合で界面活性剤として使用される。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００およびＮｉａｐｒｏｏｆ（登録商標）８（＝Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）８）が、他の多数の界面活性剤とともに挙げられている。もっとも、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００またはＮｉａｐｒｏｏｆ（登録商標）８（＝Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）８）を含む培地の実施例は示されていない。
【００１９】
いずれにせよ、ＷＯ９９／４１４０９に開示された手段は、検出培地に含まれる酵素基質の選択性または特異性を改良するものとして提供されてはいない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
このような技術的な状況において、本発明の本質的な目的のうちの１つは、エステラーゼ活性を有する微生物の検出／識別用培地であって、分析感度を最適化するように、すなわち、標的微生物の存在を明らかにする発色強度を最大にするように構成される培地を提供することである（エステラーゼ活性の促進）。
【００２１】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼ活性を有する微生物の検出／識別用培地であって、分析対象である試料の接種の前には完全に半透明（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ）である培地を提供することである。
【００２２】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼ活性を有する微生物の検出／識別用培地であって、色原性または蛍光原性酵素エステラーゼ基質を含み、保存に対して安定な（検出時の発色強度を少なくとも数週間、最大レベルに保つ）培地を提供することである。
【００２３】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼ活性を有する微生物の検出／識別用培地であって、液体またはゲル培地を復元するために液体で再生しなければならない乾燥粉末の形態ではなく、そのまますぐに使用できる形態で存在する培地を提供することである。
【００２４】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼ活性を有する微生物の検出／識別用培地であって、特に色原性または蛍光原性エステラーゼ基質（これは非常に高価である）の含有量が低減されることによって、経済的な培地を提供することである。
【００２５】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼ活性を有する微生物、特にグラム陰性腸内細菌（例えば、サルモネラ）、グラム陽性細菌または酵母の検出／識別用培地を提供することである。
【００２６】
本発明の別の本質的な目的は、実行が容易でかつ経済的な前記検出／識別培地を得る方法を提供することである。
【００２７】
本発明の別の本質的な目的は、エステラーゼ活性を有する菌株の検出／識別方法であって、実行が容易（ルーチン試験）で、経済的（試薬の量、取扱性、労力、スピード等）で、信頼性を備え、高感度で、特異的かつ再現性のある方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
これらおよび他の目的は本発明によって達成され、それは、何よりもまず、エステラーゼ活性を有する微生物の検出／識別用培地に関し、特に反応培地（Ｍ）（特に培養培地）と、少なくとも１種の色原性または蛍光原性エステラーゼ基質（Ｓ）とを含むタイプであり、この検出／識別は、本質的に、エステラーゼ活性の存在を明らかにすることに基づいており、前記培地は、
＊安定な、すぐに使用できる液体またはゲル状であり、
＊以下のものを含んでいる：
Ａ）以下の群
―脂肪酸ソルビタンエステル（ＦＡＳＥ）、
―胆汁酸塩、および
―これらの混合物
から選択される少なくとも１種類の可溶化剤および安定化剤、
Ｂ）以下のものを含む群
―式（Ｉ）の化合物：
【化５】
2004518418.tif 000002
（式中、―Ｒは線状または分岐鎖アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ３０アルキルであり、
―Ｘはハロゲン、好ましくはＮａである）；
―非イオン性のポリエーテル誘導体、好ましくは式（ＩＩ）の化合物：
【化６】
2004518418.tif 000003
（式中、Ｎは２と１５の間の整数（平均＝１０）である）；および
―これらの混合物、
から選択される少なくとも１種類の選択的活性化剤；ならびに
Ｃ）場合によっては少なくとも１種類の溶媒。
【００２９】
本発明による培地は、エステラーゼ活性を有する標的微生物のコロニーを特に強く発色させるという長所を有する。これは結果の読取りおよび解釈を非常に容易にする。
【００３０】
この培地がエステラーゼ活性を有しない微生物の成長には有益ではない点に注目するのも興味深い。この特異性は分析には非常に有益である。
【００３１】
本発明による培地は、すぐに使用でき、安定性の点で問題を示すことなく液体または半流動体（ゲル）状である点も有利である。実際、本発明の培地中に含まれるエステラーゼ基質は、比較的急速に劣化する傾向を有することで知られているが、添加剤Ａ、Ｂ（および場合によってはＣ）の存在によって安定化される。
【００３２】
これらの添加剤は、一層の利点、すなわち、エステラーゼ基質（これらは従来溶解しにくい）に優れた可溶性をもたらす。これにより、接種前には半透明の検出／識別培地を得ることが可能となり、これにより発色または蛍光の結果の読取りが容易になる。
【００３３】
最後に、これらの添加剤Ａ、Ｂ（および場合によってはＣ）は比較的廉価であり、操作手順を簡単にし、用いるエステラーゼ基質の量を減らし（安定化）、経済的な面で明らかにコストを節減する。
【００３４】
特異的活性化剤（Ｂ）の特定のクラスを選択し、それを可溶化剤（Ａ）（例えば、ＦＡＳＥまたは胆汁酸塩）と組み合わせたのは発明者によるものである。これらは、驚くべきことに、また予想外にも、生物学的活性、感度、信頼性、特異性、安定性、選択性および半透明性（これらはすべて本発明の生化学的手段による微生物分析に適している）といった性質を実際にもたらす。
【００３５】
本発明の１つの注目すべき特徴によれば、本発明の対象である検出／識別培地は、基質（Ｓ）を溶媒（Ｃ）中に含む少なくとも１種類のストック溶液を可溶化剤（Ａ）と混合し、反応培地（Ｍ）の成分のうち少なくともいくつかと促進剤（Ｂ）を添加することにより得られる。
【００３６】
実際、本発明によれば、１種または複数の（Ａ）剤の存在下にエステラーゼ基質（Ｓ）を溶媒（Ｃ）に可溶化することが重要であると思われる。次いで、基質（Ｓ）／（Ｃ）／（Ａ）のこの混合物を、培養培地（Ｍ）の少なくとも一部（それは好ましくは過冷却ゲルの形である）の一部に組み込む。この操作上の特徴により、本発明の手段によりもたらされる有利な結果の最適化が可能となることが見出された。下記に詳細に説明するように、添加剤（Ｂ）は好ましくは後で培地に組み入れられる。
【００３７】
本発明によれば、選択促進剤（Ｂ）は、Ｒがテトラデシル基（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）またはＮｉａｐｒｏｏｆ（登録商標）４）または２―エチルヘキシル基（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）またはＮｉａｐｒｏｏｆ（登録商標）８）である式（Ｉ）の製品である。選択促進剤（Ｂ）は次式のポリエチレングリコールモノ―ｐ―イソオクチルフェニルエーテル：
【化７】
2004518418.tif 000004
（式中、Ｎは２と１５の間の整数（平均＝１０）である）でもよい。
【００３８】
これらの製品は、ＴＲＩＴＯＮＸ―１００（登録商標）、ＴＲＩＴＯＮＸ―１１４（登録商標）およびＴＲＩＴＯＮＸ―４０５（登録商標）として販売されている。
【００３９】
好ましくは、ＦＡＳＥ（Ａ）は以下：
＊エチレンオキシド（ＥＯ）を２０単位含むポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）；
＊ポリエトキシル化ソルビタンモノパルミテート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）；
＊ポリエトキシル化ソルビタンモノステアレート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）；
＊ポリエトキシル化ソルビタントリステアレート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６５）；
＊ポリエトキシル化ソルビタンモノオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）；
＊ポリエトキシル化ソルビタンセスキオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８３）；
＊ポリエトキシル化ソルビタントリオレエート（２０ＥＯ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５）；および
＊これらの混合物
を含む群から選択される。
【００４０】
前記で選択した製品（ソルビタンエステル）は、非イオン性乳化剤として食品および化粧品産業において広く用いられているが、従来、それらが微生物学的検出／識別培地においてエステラーゼ基質（リパーゼと反応することがなく、カルボン酸塩エステルとも異なる）の安定化剤として使用されたことはない。
【００４１】
前述のＦＡＳＥの親水性親油性バランス（ＨＬＢ）は、それぞれ８．６、６．７、４．７、２．１、４．３、３．７および１．８である。
【００４２】
標的微生物がグラム陽性細菌および／または酵母の場合、（Ｂ）剤濃度は培地（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭおよびＳを含む）１リットル当たりのｍｌで表わして以下のものとする：
１．１０−４≦［Ｂ］≦１０、
好ましくは１．１０−３≦［Ｂ］≦５、
特に好ましくは１．１０−２≦［Ｂ］≦２。
【００４３】
標的微生物がグラム陰性細菌の場合、（Ｂ）剤濃度は培地（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＭおよびＳを含む）１リットル当たりのｍｌで表わして以下のものとする：
１．１０−２≦［Ｂ］≦１００、
好ましくは１．１０−１≦［Ｂ］≦３０、
特に好ましくは１≦［Ｂ］≦２５。
【００４４】
この（Ｂ）／（Ａ）／好ましくは（Ｃ）の相乗的組合せ使用により、標的微生物中のエステラーゼ活性の存在を明らかにすることがより容易になる。それは、他の酵素活性の発現を落とさずに、培地の選択性およびエステラーゼ＋標的微生物（例えばサルモネラ菌）におけるエステラーゼ活性の検出を改善可能とし、これにより問題となる他の標的微生物の存在を明らかにする（β―ガラクトシダーゼ＋またはβ―グルコシダーゼ＋）ために使用できるであろう。
【００４５】
特定の理論に拘束されるものではないが、この相乗的組合せにおいて、化合物（Ｂ）は、標的微生物（例えばサルモネラ）の細胞膜を通した色原性または蛍光原性なエステラーゼ基質の浸透や酵素の分泌に有利な作用を有する（細胞膜が（Ａ）の作用によって可溶化されている場合）。これは、その活性が求められる酵素に関するエステラーゼ＋基質への接近容易性を改善すると考えられる。これは、使用される基質の量を減らしその結果明らかな経済的利点を導き出すことを可能にする。
【００４６】
色原体または蛍光原性エステラーゼ基質（Ｓ）は、以下のものを含む群：
―脂肪酸のインドキシルエステルおよびその誘導体、好ましくはＣ６〜Ｃ１１脂肪酸のインドキシルエステル、および特に好ましくは、場合によってはハロゲン化されていてもよいＣ８〜Ｃ９脂肪酸のインドキシルエステル、
―脂肪酸のキノン／アントラキノンエステルおよびその誘導体、好ましくはＣ６〜Ｃ１１脂肪酸のアントラキノンエステル、特に好ましくはＣ８〜Ｃ９脂肪酸のジヒドロキシアントラキノン（アリザリン）エステル、
―脂肪酸のヒドロキシクマリンエステルおよびその誘導体、
―脂肪酸のフルオレセインエステルおよびその誘導体、および
―これらの混合物
から有利に選択される。
【００４７】
インドールに由来する色原性エステル基質の例を挙げれば、５―ブロモ―３―インドリルノナノエート、６―クロロ―３―インドリルノナノエートおよび５―ブロモ３―インドリルデカノエートである。
【００４８】
アントラキノンに由来する色原性エステル基質の例を挙げれば、アリザリンおよび２―アリザリンオクタノエートである。
【００４９】
溶媒（Ｃ）は、色原性または蛍光原性エステラーゼ基質を可溶性にするための補助剤である。それはまた、可溶化剤（Ａ）の作用を補足する。したがって、これは好ましくは発明による培地の要素である。
【００５０】
本発明の有利な条件によれば、溶媒（Ｃ）は以下のものを含む群から選択される：
―アルコール、好ましくはメタノール、エタノールおよびメトキシエタノール；
―アミド、好ましくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；
―含硫黄溶媒、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ならびに
―これらの混合物。
実際上、使用される溶媒はメタノール、ＤＭＦおよびＤＭＳＯである。
【００５１】
さらにより好ましくは、（Ａ）＝ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、（Ｂ）＝ＮＩＡＰＲＯＯＦ（登録商標）４またはＴＥＲＧＩＴＯＬ（登録商標）４および溶媒（Ｃ）＝ＤＭＳＯの組合せが、本発明による検出／識別培地に総合的に有効であると思われる。
【００５２】
本発明によれば、（Ａ）剤の溶媒（Ｃ）に対する重量比は、２０：８０と８０：２０の間、好ましくは３０：７０と７０：３０の間、特に好ましくは４０：６０または６０：４０である。
【００５３】
また、量的な観点から言うと、培地中の（Ａ）剤の濃度（重量％）は以下のものとすることが好ましい：
＊０．１≦［Ａ］≦１０、
＊好ましくは０．５≦［Ａ］≦５、
＊特に好ましくは１．５≦［Ａ］≦３．５。
培地中で使用する色原性エステラーゼ基質（Ｓ）の量はその濃度（ｍｇ／ｌ）が以下のように定義されるものである：
＊５０≦［基質］≦１０００、
＊好ましくは１００≦［基質］≦８００、
＊特に好ましくは２００≦［基質］≦６００。
【００５４】
検出／識別培地中の培養培地（Ｍ）については、以下のものを含む群から選択されるように特定し得る：
―マッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）、コロンビアＡＮＣ（ＣｏｌｕｍｂｉａＡＮＣ）、ＰＡＬＣＡＭおよびサブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）ゲンタマイシン―クロラムフェニコール培地を含むタイプの選択培地、好ましくはマッコンキー培地；
―コロンビア＋／―血液、トリプカーゼ大豆（ｔｒｙｐｃａｓｅｓｏｙａ）、栄養ゲロースおよびサブロー培地を含むタイプの非選択的培地、好ましくはコロンビア培地。
【００５５】
実際上、当業者は、標的微生物により、および当業者が知悉している完全によく知られた基準によって培養培地（Ｍ）を選択するであろう。
【００５６】
以下に限定されるものではないが、本発明による培地は、サルモネラ属菌の検出／識別に特に適していることが判明した。この検出の場合には、例えば、マッコンキー培地が培地に選択されるであろう。
【００５７】
さらに、本発明による培地は、場合によっては１種または複数の他の酵素基質（例えば色原性または蛍光原性の酵素基質）、ペプトン、１種または複数の成長因子、炭水化物、１種または複数の選択剤、緩衝液、またはゲル化剤などの他の添加物を含むことができる。
【００５８】
本発明による培地は直ちに使用できる（つまり、チューブもしくはフラスコ中、またはペトリ皿上への接種の準備ができている）液体またはゲル状である。
【００５９】
本発明による培地は、液体またはゲル状で４℃で数週間、容器内に保存できる。
【００６０】
その他の特徴によれば、本発明は、さらに、実質的に以下のことからなることを特徴とする、上に定義されるような培地を得る方法に関係する：
＊色原性または蛍光原性エステラーゼ基質（Ｓ）を含む溶媒（Ｃ）と少なくとも１種類の可溶化剤（Ａ）から少なくとも１種類のストック溶液を調製すること；
＊培養培地（Ｍ）にこの溶液および他の添加物を添加すること；ならびに
＊界面活性剤（Ｂ）および他の任意の添加剤をＳ＋Ｃ＋Ａ＋Ｍ混合物に組み入れること、および
＊全体を均質化すること。
【００６１】
ストック溶液は、溶媒（Ｃ）、基質（Ｓ）、および（Ａ）剤を順次組み合わせ、場合によっては相乗性助剤を加えることにより個別に調製される。生成物および量は上に定義した通りである。
【００６２】
均質化した後、ストック溶液を、水で予め再生しておいた過冷却ゲル培地（Ｍ）に加える。培地は非ゲル状の液体培地、例えば栄養スープでもよい。
【００６３】
培養培地（Ｍ）とストック溶液とを混合することにより、直ちに接種できる液体またはゲル状検出培地が得られる。
【００６４】
さらに別の特徴によれば、本発明はさらに、下記の操作からなるエステラーゼ＋菌株（例えば、サルモネラ）の検出／識別方法に関する。
―上に定義されるような検出／識別培地、すなわち製品それ自体に、または上記の方法によって得られた製品に、分析される微生物を含むと疑われる試料を接種すること；
―当業者に知られている適切な条件の下で接種した培地をインキュベートすること；および
―それを例えば３７℃でオーブンにおいてインキュベートした後に現像したコロニーの発色または蛍光（これらの発色または蛍光は、色原性または蛍光原性エステラーゼ基質の標的微生物による加水分解を明らかにする）を読み取り／解釈すること。
【００６５】
最後に、本発明は、以下のもの：
―式（Ｉ）の化合物：
【化８】
2004518418.tif 000005
（式中、―Ｒは線状または分岐鎖アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ３０アルキルであり、
―Ｘはハロゲン、好ましくはＮａである）；
―非イオン性のポリエーテル誘導体、好ましくは式（ＩＩ）の化合物：
【化９】
2004518418.tif 000006
（式中、Ｎは２と１５の間の整数（平均＝１０）である）；および
―これらの混合物
を含む群から選択される少なくとも１種類の製品（Ｂ）の選択的活性剤としての使用に関する。
【００６６】
以下の実施例は、本発明についてのより明瞭な理解をもたらし、その種々の実施形態および実施方法とともにその利点をすべて評価することを可能にするであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６７】
実施例１：エステラーゼ活性を示すグラム陰性細菌種におけるエステラーゼ活性の発現改善のための色原性エステラーゼ基質を含むゲル状培地でのＴｅｒｇｉｔｏｌ４の使用
試験したエステラーゼ基質は５―ブロモ３―インドリルノナノエートである。４０ｇ／ｌの基質ストック溶液を、４０％ジメチルスルホキシドと６０％Ｔｗｅｅｎ２０の混合物を用いて調製する。十分な体積を過冷却されたマッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）培地（ニュートラルレッドを含まない）に加え基質濃度を５００ｍｇ／ｌとする。
【００６８】
次いで、この培地を５つの部分に分け、所定濃度のＴｅｒｇｉｔｏｌ４を各々に加える（下表参照）。出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）懸濁液からこの培地に接種した。ペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを、２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色強度を記録した。結果を下記表１に示す。
【００６９】
【表１】
2004518418.tif 000007
【００７０】
２〜１６ｍｌ／ｌ、より正確には４〜８ｍｌ／ｌの濃度では、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ４はエステラーゼ活性を示す細菌株の発色強度を著しく増加させる。最も有効な濃度は菌株および所望の効果に依存する。菌株によっては、この濃度をさらに増加させることが可能と思われる。
【００７１】
実施例２：ＤＭＳＯと胆汁酸塩の混合物に溶解させたインドキシル系エステラーゼ基質を含むゲル状培地におけるＴｅｒｇｉｔｏｌ４の使用
試験したエステラーゼ基質は５―ブロモ３―インドリルノナノエートである。２５ｇ／ｌの基質ストック溶液を、５ｇ／ｌ胆汁酸塩を加えたメタノールを用いて調製する。十分な体積を過冷却されたマッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）培地（ニュートラルレッドを含まない）に加え基質濃度を５００ｍｇ／ｌとする。
【００７２】
次いで、この培地を５つの部分に分け、所定濃度のＴｅｒｇｉｔｏｌ４を各々に加える（下表参照）。出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）懸濁液からこの培地に接種した。ペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを、２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色強度を記録した。結果を下記表２に示す。
【００７３】
【表２】
2004518418.tif 000008
【００７４】
２〜１６ｍｌ／ｌ、より正確には４〜８ｍｌ／ｌの濃度では、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ４はエステラーゼ活性を示す細菌株の発色強度を著しく増加させる。最も有効な濃度は菌株に依存する。これらの結果は、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ４のエステラーゼ活性に対する効果が基質の使用態様に依存しないことを明らかに示している。
【００７５】
実施例３：エステラーゼ活性を示すグラム陽性細菌種および酵母におけるエステラーゼ活性の発現改善のための色原性エステラーゼ基質を含むゲル状培地でのＴｅｒｇｉｔｏｌ４の使用
試験したエステラーゼ基質は５―ブロモ―４―クロロ―３―インドリルノナノエートである。４０ｇ／ｌの基質ストック溶液を、４０％ジメチルスルホキシドと６０％Ｔｗｅｅｎ２０の混合物を用いて調製する。十分な体積を過冷却されたマッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）培地（ニュートラルレッドを含まない）に加え基質濃度を２５０ｍｇ／ｌとする。
【００７６】
次いで、この培地を６つの部分に分け、所定濃度のＴｅｒｇｉｔｏｌ４を各々に加える（下表参照）。出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）懸濁液からこの培地に接種した。ペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを、２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色強度を記録した。結果を下記表３に示す。
【００７７】
【表３】
2004518418.tif 000009
【００７８】
前の実施例における試験例よりも十分に低いＴｅｒｇｉｔｏｌ４濃度を選択することが、試験した菌株のタイプによって規定された。実際には、それらはグラム陽性細菌または酵母のいずれかであり、過剰のＴｅｒｇｉｔｏｌ４濃度では、この種の菌株は培地上で成長することができない。
【００７９】
前の実施例と同じ方法で、被検微生物のエステラーゼ活性の発現に対するＴｅｒｇｉｔｏｌ４の正の作用が観察できる。この効果は細菌の種によって変化する。Ｔｅｒｇｉｔｏｌ４濃度の選択はさらに種に依存する。一般に、グラム陽性細菌および酵母のために有効な濃度はグラム陰性細菌のために使用される濃度よりかなり低い。しかし、試験濃度では、この実施例で試験したグラム陰性細菌の発色に若干正の効果を観察することできる。
【００８０】
実施例４：エステラーゼ活性を示す細菌種におけるエステラーゼ活性の発現改善を目的とした色原性エステラーゼ基質を含むゲル状培地での他の２種類の界面活性剤Ｔｅｒｇｉｔｏｌ８とＴｒｉｔｏｎＸ１００（非イオン性界面活性剤）の使用
試験したエステラーゼ基質は５―ブロモ―３―インドリルノナノエートである。４０ｇ／ｌの基質ストック溶液を、４０％ジメチルスルホキシドと６０％Ｔｗｅｅｎ２０の混合物を用いて調製する。十分な体積を過冷却されたマッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）培地（ニュートラルレッドを含まない）に加え基質濃度を５００ｍｇ／ｌとする。
【００８１】
次いで、この培地を８つの部分に分ける。第１の部分はそのままペトリ皿に移し、第２の部分には８ｍｌ／ｌのＴｅｒｇｉｔｏｌ４を加え、次の３つには２、４、８ｍｌ／ｌの濃度でＴｅｒｇｉｔｏｌ８を加え、さらに、最後の３つには８、１６、３２ｍｌ／ｌの濃度でＴｒｉｔｏｎＸ１００を加える。出願人のコレクション由来の微生物を、３つの四分円隔離によって０．５マックファーランド（ＭｃＦａｒｌａｎｄ）懸濁液からこの培地に接種した。ペトリ皿を３７℃で４８時間インキュベートした。形成されたコロニーを、２４時間および４８時間のインキュベーション後に視覚的に検査した。これらのコロニーの発色およびその発色強度を記録した。結果を下記表４および５に示す。
【００８２】
【表４】
2004518418.tif 000010
【００８３】
【表５】
2004518418.tif 000011
【００８４】
細菌の成長に対するこれらの化合物の影響を検討するために様々な濃度範囲を事前に試験した。次いで、最も興味深い点をこの例のために取り出した。
試験した実験条件下では、エステラーゼ活性に対してＴｅｒｇｉｔｏｌ８およびＴｒｉｔｏｎＸ１００により得られる効果はＴｅｒｇｉｔｏｌ４で観察された効果ほど明確なものではない。
【００８５】
注：上記の実施例において、菌株の後の数字は、出願人のコレクションにおいて付与された各菌株の整理番号に相当する。発色強度は以下の通り定義された任意スケールに対応する：
０      活性なし
０．１    痕跡程度の発色
０．５    非常に薄い発色
１      低強度だが識別できる発色
２      中強度の明瞭な発色
３      強い発色
４      非常に強い発色
【国際公開パンフレット】
2004518418.tif 000016
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2004518418.tif 000018
2004518418.tif 000019
2004518418.tif 000020
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2004518418.tif 000023
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2004518418.tif 000039
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【国際調査報告】
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2004518418.tif 000043
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