(57)【要約】【課題】本発明は、優れた毛髪回復活性を有し、且つ副作用のない新たな毛髪再生剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、サイクロスポリンＡの代謝産物、即ち、その９番目の残基（ＭｅＬｅｕ）のγ炭素にヒドロキシ基が導入された、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡを有効成分として含んでなる毛髪成長促進剤に関する。また、本発明は、液剤、スプレー、ゲル、ペースト、乳剤、クリーム、コンディショナー及びシャンプーから成る群より選ばれた形状に剤形化されてなる、上記毛髪成長促進剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡを有効成分として含んでなる毛髪成長促進剤。
【請求項２】
液剤、スプレー、ゲル、ペースト、乳剤、クリーム、コンディショナー及びシャンプーから成る群より選ばれた形状に剤形化されてなる、請求項１に記載の毛髪成長促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサイクロスポリン誘導体をを有効成分とする毛髪成長促進剤に関する。更に詳しくは、本発明は、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡを有効成分として含んでなる毛髪成長促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の頭皮には、平均して約１０万から１５万本ほどの毛髪が含有されている。それぞれの毛髪は、主として三つの成長段階、即ち、発育期（ａｎａｇｅｎ）、退行期（ｃａｔａｇｅｎ）、休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）を有し、その後、脱落する。このような毛髪成長サイクルは、３〜６年の周期で繰り返され、一つのサイクルの長さは他のサイクルのそれとは異なる。その結果、平均的な成人で、通常、毎日約５０本から１００本の毛髪が脱落する。一般に脱毛症とはこのような発育成長期の期間が短くなり、退行期及び休止期の毛髪の割合が多くなって、抜け毛の数が過剰に且つ異常に増加する現象に因るものである。
【０００３】
脱毛の原因としては血液循環不良説、男性ホルモン過剰作用説、皮脂の産生・分泌過剰説、過酸化物、細菌などによる頭皮機能低下説、遺伝的要因、老化、ストレスなどが論議されてきた。しかしながら、明確なメカニズムは明らかにされていない。最近は食生活の変化、現代の社会環境などによるストレスの増加などにより脱毛で悩んでいる人口が増えつつある傾向にある。また、脱毛症に罹る人の年齢も低くなっており、しかも女性の脱毛症人口も上昇しつつある現状である。
【０００４】
このような脱毛症の治療や予防のために、これまで幅広く使用されている製剤の一つはミノキシジル含有製剤である。アメリカＦＤＡの承認を受けている毛髪再生剤は二つあり、ミノキシジルはそれら承認を受けている毛髪再生剤のうちの一つである。ミノキシジルは、当初は血圧降下を目的とした高血圧薬剤として開発された。しかしながら、この薬剤を使用した際に、副作用として発毛効果が観察されたことから、それ以後、この薬剤は、毛髪再生剤として有名になった。ミノキシジルが毛髪再生剤として作用するメカニズムについては明確に解明されていないが、ミノキシジルが血管を拡張させることにより血流量が増加し、それによって毛根に多くの栄養が供給され、その結果として毛髪の成育が増進されると推測されている。
【０００５】
このような血流量増加モデルはミノキシジルが毛根を構成する主要細胞である真皮乳頭で血管拡張に関わる成長因子である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の発現を増幅させるという最近の報告によって間接的に支持されている。また、ミノキシジルの毛髪回復メカニズムにおける血管拡張効果以外にも、ミノキシジルが体外培養で毛根中の真皮乳頭細胞の活性化を増進すると共に、体外での小胞の細胞培養において毛嚢の成育を増進させることが報告されている。
これらの事実は、ミノキシジルが成長因子として毛根に直接作用していることを示している。
【０００６】
更に、最近メルク（Ｍｅｒｃｋ）社が発売開始したプロぺシア（Ｐｒｏｐｅｃｉａ）の主成分であるフィナステライド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）は、脱毛症の治療剤として使用される。それは、男性ホルモンであるテストステロンが、テストステロンよりも更に強力な男性ホルモンであるジヒドロテストステロンに転換されることを抑制する。
１９９７年１２月、フィナステライドの１ｍｇタブレットが男性型脱毛症の治療のための毛髪再生剤としてＦＤＡから使用承認を受けて現在販売中である。臨床試験において、それは有意な毛髪成長促進効果を有することが証明されている。しかしながら、フィナステライドには、副作用として男性機能を抑制する虞があることも報告されている。
フィナステライドもミノキシジルも臨床試験における効果がさほど優れず、しかも副作用に対する虞があることから、新たな改善された毛髪再生剤の開発のための研究が活発になされている。
【０００７】
サイクロスポリン系の薬剤は免疫抑制活性を有している。これらはまた、ウィルス、真菌類、原虫等の成長を抑制する効果を有していると共に、腎臓毒性、肝毒性、高血圧、歯周組織肥大、発毛効果等々の様々な生理学的な効果を副作用として有している。
代表的なサイクロスポリンであるサイクロスポリンＡは多数個のＮ−メチルアミノ酸と８番目の位置にＤ−アラニンを有する１１個のアミノ酸で構成された環状のペプチドであって、以下の化学式で表される。
【０００８】
【化１】
2004518706.tif 000002
【０００９】
上記式中、ＭｅＢｍｔは、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−スレオニンを示し、ＡｂｕはＬ−α−アミノ酪酸を示し、Ｓａｒはザルコシンを示し、ＭｅＬｅｕはＮ−メチル−Ｌ−ロイシンを示し、ＶａｌはＬ−バリンを示し、ＡｌａはＬ−アラニンを示し、ＤＡｌａはＤ−アラニンを示し、ＭｅＶａｌはＮ−メチル−Ｌ−バリンを示す。
【００１０】
上記化学式で示されるサイクロスポリンＡのアミノ酸の形態は、特に指定がなければＬ−配置である。アミノ酸残基の番号は上記化学式で示した通り、ＭｅＢｍｔから出発して、即ち、ＭｅＢｍｔを１番にして、時計方向の順序で最後のＭｅＶａｌ（Ｎ−メチル−Ｌ−バリン）を１１番とした。
サイクロスポリンＡ誘導体の命名法は、サイクロスポリンＡのそれと異なる残基とその位置を記載することにより行われる。例えば、サイクロスポリンＡの９番残基であるＮ−メチル−Ｌ−ロイシンがγ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシンに置き換わった誘導体は、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡと表示する。また、各残基は、以下の通常使用されている略語で記載する。即ち、ＭｅＬｅｕはＮ−メチル−Ｌ−ロイシンを、ＭｅＩｌｅはＮ−メチル−Ｌ−イソロイシンを、ＭｅＶａｌはＮ−メチル−Ｌ−バリンを、ＭｅＡｌａはＮ−メチル−Ｌ−アラニンを、ＭｅＮｖａはＮ−メチル−Ｌ−ノルバリンを、ＬｅｕはＬ−ロイシンを、ＩｌｅはＬ−イソロイシンを、Ｓａｒはサルコシンを表す。
【００１１】
これまで、サイクロスポリンの毛髪再生剤としての開発可能性について多くの研究グループによって検討されてきた。特に、動物の発毛試験、ヒトの円形脱毛症（非特許文献１参照。）、ヒト男性型脱毛症（非特許文献２及び非特許文献３参照。）及び動物モデルでの化学療法による脱毛抑制効果（非特許文献４参照。）などについての研究が幅広くなされてきた。マウスの背中での比較試験結果によれば、サイクロスポリンは、ミノキシジルより約１００倍ほど優れた発毛効果を有することが示されている。この結果に基づいて、サイクロスポリンを男性型脱毛症の治療剤として利用する試みがなされており、数多くの特許出願がなされている。
【００１２】
例えば、特許文献１、特許文献２、及び特許文献３は、サイクロスポリン誘導体の毛髪再生剤としての利用を開示している。
また、特許文献４は、８番目の残基が修飾されたサイクロスポリン誘導体を開示しており、特許文献５及び特許文献６は、それぞれイソサイクロスポリン及び免疫抑制サイクロスポリン誘導体を開示している。これらのサイクロスポリン及びその誘導体は、毛髪再生剤として提示されている。
更に、特許文献７及び特許文献８には、経皮吸収性に優れたサイクロスポリンを含んだ製剤の新しい用途として毛髪再生剤が示唆されている。しかしながら、上記文献において用いられているサイクロスポリン類は何れも強力な免疫抑制力を有しており、それ故、いくら毛髪再生効果に優れているとしても、一般の脱毛症の処理に使用するには限界がある。最近、非免疫性サイクロスポリン誘導体を用いた脱毛処理の方法が特許文献６において開示されたが、、本発明に係る［γ―ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの構造はこれには含まれていない。
【００１３】
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、従来技術が包含する問題点を有さない新規な毛髪成長促進剤を見出すべく、その強い免疫抑制力を考慮しつつも、サイクロスポリンの主要代謝産物の発毛効果について調べた。試験した主要代謝産物は、１番目の残基ＭｅＢｍｔのη炭素の位置にヒドロキシ基が導入された代謝産物であるＭ１７、４番目の残基ＭｅＬｅｕ（Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン）からＮ−メチル基が取れた代謝産物であるＭ２１、及び９番目の残基（ＭｅＬｅｕ）のγ炭素にヒドロキシ基が導入された代謝産物であるＭ１である。その結果、免疫抑制力が低減されたＭ１のみが、優れた発毛効果を有することが判った。
Ｍ１は、一般的な命名法に従って［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡと名付けられている。そして、その免疫抑制力はサイクロスポリンＡのそれよりも低いことが知られている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７参照。）。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
斯くして、本発明は、サイクロスポリンＡの代謝産物、即ち、その９番目の残基（ＭｅＬｅｕ）のγ炭素にヒドロキシ基が導入された、下記の式（Ｉ）で表される［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡを有効成分として含んでなる毛髪成長促進剤に関する。
【００１６】
【化２】
2004518706.tif 000003
【００１７】
上記式（Ｉ）において、
Ａは、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−スレオニン（ＭｅＢｍｔ）、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，６Ｅ）−３−スルフヒドリル−４−メチル−２−（メチルアミノ）−６−オクテン酸又は（２Ｓ，４Ｒ，６Ｅ）−３−オクソ−４−メチル−２−（メチルアミノ）−６−オクテン酸を示し、
Ｂは、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ−バリン（Ｖａｌ）又はＬ−ノルバリン（Ｎｖａ）を示し、
Ｃは、ザルコシン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−］、Ｄ−２−（メチルアミノ）ペント−４−エノイル［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨＣＨ２）−ＣＯ−］、Ｄ−２−（メチルアミノ）ペント−４−イノイル［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＣＨ）−ＣＯ−］、Ｄ−メチルチオザルコシン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＳＣＨ３）−ＣＯ−］、Ｎ−メチル−Ｄ−セリン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＯ−］、Ｄ−２−（メチルアミノ）ブタノイル［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−ＣＯ−］、Ｎ−メチル−Ｄ−ノルバリン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）−ＣＯ−］、Ｄ−２−（メチルアミノ）へキス−４−イノイル［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＣＨ３）−ＣＯ−］又はＯ−プロペニル−メチル−Ｄ−セリン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２）−ＣＯ−］を示し、
Ｄは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−バリンを示し、
Ｅは、Ｌ−バリン又はＬ−ノルバリンを示し、
Ｆは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
Ｇは、Ｌ−アラニン又はＬ−α−アミノ酪酸を示し、
Ｈは、Ｄ−アラニン又はＤ−セリンを示し、
ＯＨＭｅＬｅｕは、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシンを示し、
Ｉは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
Ｊは、Ｎ−メチル−Ｌ−バリン又はＬ−バリンを示す。
【００１８】
上記化学式（Ｉ）で表される、発毛作用を有するサイクロスポリン代謝産物の好ましい例としては、下記の化学式（ＩＩ）で表される［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡが挙げられる。
【００１９】
【化３】
2004518706.tif 000004
【００２０】
上記式（ＩＩ）において、
ＭｅＢｍｔは、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−スレオニンを示し、
Ａ’は、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ−バリン（Ｖａｌ）又はＬ−ノルバリン（Ｎｖａ）を示し、
Ｂ’は、ザルコシン、Ｎ−メチル−Ｄ−アラニン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−］、Ｄ−２−（メチルアミノ）ペント−４−エノイル［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨＣＨ２）−ＣＯ−］、Ｄ−２−（メチルアミノ）ペント−４−イノイル［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＣＨ）−ＣＯ−］、Ｄ−メチルチオザルコシン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＳＣＨ３）−ＣＯ−］、Ｎ−メチル−Ｄ−セリン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＯ−］、Ｄ−２−（メチルアミノ）ブタノイル［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−ＣＯ−］、Ｎ−メチル−Ｄ−ノルバリン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）−ＣＯ−］、Ｄ−２−（メチルアミノ）へキス−４−イノイル［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＣＣＨ３）−ＣＯ−］又はＯ−プロペニル−メチル−Ｄ−セリン［（Ｄ）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２）−ＣＯ−］を示し、
Ｃ’は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−バリンを示し、
Ｄ’は、Ｌ−バリン又はＬ−ノルバリンを示し、
Ｅ’は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
Ｆ’は、Ｌ−アラニン又はＬ−α−アミノ酪酸を示し、
Ｇ’は、Ｄ−アラニン又はＤ−セリンを示し、
ＯＨＭｅＬｅｕは、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシンを示し、
Ｈ’は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
ＭｅＶａｌは、Ｎ−メチル−Ｌ−バリンを示す。
【００２１】
上記化学式（Ｉ）で表される、発毛作用を有する、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡのより好ましい例としては、下記の化学式（ＩＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００２２】
【化４】
2004518706.tif 000005
【００２３】
上記式（ＩＩＩ）において、
ＭｅＢｍｔは、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−スレオニンを示し、
Ａ”は、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、Ｌ−アラニン（Ａｌａ）、Ｌ−スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ−バリン（Ｖａｌ）又はＬ−ノルバリン（Ｎｖａ）を示し、
Ｓａｒは、ザルコシンを示し、
ＭｅＬｅｕは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシンを示し
Ｖａｌは、Ｌ−バリンを示し、
Ｂ”は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
Ａｌａは、Ｌ−アラニンを示し、
ＤＡｌａは、Ｄ−アラニンを示し、
ＯＨＭｅＬｅｕは、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシンを示し、
Ｃ”は、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はＬ−ロイシンを示し、
ＭｅＶａｌは、Ｎ−メチル−Ｌ−バリンを示す。
【００２４】
上記化学式（Ｉ）で表される、発毛作用を有する、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの、更に好ましい例としては、下記の化学式（ＩＶ）で表される化合物が挙げられる。
【００２５】
【化５】
2004518706.tif 000006
【００２６】
上記式（ＩＶ）において、
ＭｅＢｍｔは、Ｎ−メチル−（４Ｒ）−４−［（Ｅ）−２−ブテニル］−４−メチル−Ｌ−スレオニンを示し、
Ａｂｕは、Ｌ−α−アミノ酪酸を示し、
Ｓａｒは、ザルコシンを示し、
ＭｅＬｅｕは、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシンを示し
Ｖａｌは、Ｌ−バリンを示し、
ＤＡｌａは、Ｄ−アラニンを示し、
ＯＨＭｅＬｅｕは、γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシンを示し、
ＭｅＶａｌは、Ｎ−メチル−Ｌ−バリンを示す。
【００２７】
また、本発明は、毛髪成長促進効果を有する有効成分として［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡを含んでなる組成物を剤形化した液剤、スプレー、ゲル、ペースト、乳剤、クリーム、コンディショナ又はシャンプーに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に本発明を詳細に説明する。
新規な毛髪再生剤を開発するべく、本発明者らは種々のサイクロスポリン代謝産物を製造し、それらの代謝産物について毛髪再生能の評価試験を行った。
その結果、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡが、他のどの化合物よりも優れた毛髪再生（回復）効果を有することが判った。
以下の実施例等は、本発明の発明者らが実際に実施したベストモードの例示であり、本発明の範囲や精神を逸脱しない限りにおいて、これに種々の修正、付加、置換を行うことが可能であることは、当業者であれば理解出来るであろう。
【００２９】
参考例１  代謝産物Ｍ２１（［ロイシン４］サイクロスポリンＡ）の製造
デカぺプチド（Ｈ−Ｖａｌ−ＭｅＬｅｕ−Ａｌａ−（Ｄ）Ａｌａ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＬｅｕ−ＭｅＶａｌ−ＭｅＢｍｔ（Ａｃ）−Ａｂｕ−Ｓａｒ−ＯＭｅ）をベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸とジメチルアミノピリジンを縮合試薬として使用してＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨと縮合した。得られたウンデカぺプチドを、水酸化ナトリウムとトリフルオロ酢酸で保護基を除去した。生成物をベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸とジメチルアミノピリジンを使用して環化反応に付し、置換されたサイクロスポリンＡ−アセテートとした後、ナトリウムメトキシド（ＮａＯＭｅ）を使用してアセチル基を除去した。
このようにして、４番目のＮ−メチル−Ｌ−ロイシンからメチル基が取れた代謝産物Ｍ２１（［ロイシン４］サイクロスポリンＡ）を合成した。このＭ２１は試験例１の実験結果に示されるように発毛効果がないことが判明した。
【００３０】
参考例２  代謝産物Ｍ１７（１番目のＭｅＢｍｔのη位置にヒドロキシ基が導入された代謝産物）の製造
サイクロスポリンＡの１番目の位置のＯＨ基を無水酢酸と反応させることにより［Ｏ−アセチル］−１−サイクロスポリンＡを合成した。生成物をアゾビスイソブチロニトリル触媒存在下でＮ−ブロモスクシンイミドと還流して［Ｏ−アセチル−６−ブロモ］−１−サイクロンスポリンＡを合成した。生成物をエチルメチルケトン溶媒中、テトラブチルアンモニウムアセテートと沃化ナトリウムの混合物からなる触媒の存在下に加熱して［６−アセトキシ−Ｏ−アセチル］−１−サイクロスポリンＡを合成した。生成物を０．５Ｍナトリウムメトキシド溶液を使用して脱アセチル化してＭ１７を合成した。得られたＭ１７はＭａｓｓとＮＭＲで確認した。このＭ１７は試験例１の実験結果に示されるように発毛効果がないことが判明した（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２，５７，２６８９−２６９１）。
【実施例１】
【００３１】
［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの製造
この実施例では、微生物によって代謝変換後、発毛効果を示す［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの製造法について記載する。
サイクロスポリンＡ代謝産物を製造するための菌株として、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ  ＫＣＴＣ９４４１を使用した。この菌株をグルコース０．７％、酵母エキス０．４５％、モルトエキス０．５％、可溶性澱粉１．０％、ＣａＣＯ３０．００５％を含む培地中、培養温度２７℃で培養した。
【００３２】
菌株の培養は、発酵機を使用し、本培養が始まる前に、まず４日間三角フラスコを用いて前培養した。本培養は４Ｌ発酵機で前記培地を用いて培養した。本培養が始まり２４時間経過した後メタノールに溶かしたサイクロスポリンＡを培地に１００ｍｇ／Ｌの濃度に添加し、７２時間培養を続けた。培養終了後、培養培地を培地と当量の酢酸エチルで抽出した後、有機層を濃縮した。濃縮した試料は液体クロマトグラフィで分離及び分取した。この際のサイクロスポリン誘導体を示す液体クロマトグラフィ結果を図１に示した。図１において、保持時間２２〜２３分のピークはサイクロスポリンＡであり、１５分のピークが［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡである。
【００３３】
ここで、誘導体の分離はＣ−１８カラムを使用し、溶離液は溶媒Ａと溶媒Ｂの混合溶媒を濃度を変えて使用した。最初は１００％溶媒Ａを２分間流し、次いで４分まで溶媒Ａの濃度を６０％に下げて流した後、溶媒Ａの濃度を３９％まで徐々に下げて６０分まで流して試料を溶出させた。そして、再び１００％に戻して６５分まで流した。なお、溶媒Ａは２５％メタノール水溶液であり、溶媒Ｂは１００％アセトニトリルである。
【００３４】
また、この［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡはウサギ肝のミクロソーム酵素を用いても調製できる。
まず、ニュージーランド産の白ウサギの肝臓を摘出して０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液に５分間浸した。細かく刻んだ肝組織をホモジナイザ−で砕いて遠心分離（９０００ｇ、４℃、２０分）した。上澄液を分離して再び遠心分離（１０、５００ｇ、１時間）した。上澄液をデカンてーションにより除き、残ったペレットを０．１Ｍ燐酸塩緩衝生理食塩水に溶解した。得られた溶液は酵素源として使用した。適量の蒸留水中に、調製したミクロソーム酵素（５０ｍｇ）、サイクロスポリン（１ｍｇ）及びＮＡＤＰＨ（５ｍＭ）を入れて、３７℃恒温槽中で１時間反応させた。反応物を同量の酢酸エチルで抽出して分析した。
【００３５】
［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの構造分析
［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡ（Ｃ６２Ｈ１１１Ｎ１１Ｏ１３）の分子量は、ＦＡＢＭＳ（ＺＭＳＡＸ５０５Ｈ）により確認された。そして、ｍ／ｚ１２１９［Ｍ＋Ｈ］＋にピークが確認された。このことはその分子に一つの酸素原子が追加されたことを示している。また、生成物の構造は、１Ｈ−ＮＭＲ（ＢｒｕｋｅｒＮＭＲ６００ＭＨｚ）（図２）と１３Ｃ−ＮＭＲ（ＢｒｕｋｅｒＮＭＲ１５０ＭＨｚ）（図３）を用いて確認した。
【００３６】
処方例１  ［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡ含有発毛トニックの製造
下記表１に記載した如き３種の発毛トニックを調製し、後記試験例１に従って、動物モデルでの毛髪再生効果を調べた。
動物実験の結果、組成物１は、０．１％サイクロスポリンＡ含有発毛トニックと同等の毛髪再生効果を有することが判った。
【００３７】
【表１】
2004518706.tif 000007
【００３８】
処方例２  ［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡ含有ヘアークリームの製造
下記表２に記載した如き３種のヘアークリームを調製した。油性成分は、構成成分が均一な混合物になるように、それらを混合した後、８０℃に加熱した。これとは別に、水性成分も構成成分が均一な混合物になるように、それらを混合した後、８０℃に加熱した。
調製した異なる二つの相の８０℃混合物を一つにして乳化した。得られた乳剤を室温まで冷却した後、これに香料と色素を加えてヘアークリームを調製した。この段階でヘアークリームの容量になるまで水を加えた。
【００３９】
得られたヘアークリームについて、後記試験例１に従って、動物モデルでの毛髪再生効果を調べた。
動物テストの結果、表２に記載の組成物１、即ち、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡ０．１％含有ヘアークリームは、０．１％サイクロスポリンＡ含有ヘアークリームと同等の毛髪再生効果を有することが判った。
【００４０】
【表２】
2004518706.tif 000008
【００４１】
処方例３  ［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡ含有シャンプーの製造
下記表３に記載した如き３種のシャンプーを調製した。
香料、色素及び水を除いた構成成分を混合した後、撹拌しながら加熱してそれらの構成成分を均一な混合物にした。得られた混合物を室温まで冷却した後、これに香料と色素を加えた。最後に水を必要量加えてシャンプーを調製した。
【００４２】
【表３】
2004518706.tif 000009
【００４３】
処方例４  ［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡ含有ヘアコンディショナーの製造
下記表４に記載した如き３種のヘアコンディショナーを調製した。油性成分は、構成成分が均一な混合物になるように、それらを混合した後、８０℃に加熱した。これとは別に、水性成分も構成成分が均一な混合物になるように、それらを混合した後、８０℃に加熱した。
調製した異なる二つの相の８０℃混合物を一つにして乳化した。得られた乳剤を室温まで冷却した後、これに香料と色素を加えてヘアコンディショナーを調製した。ここでヘアコンディショナーの容量になるまで水を加えた。
【００４４】
【表４】
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【００４５】
試験例１  ［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの毛髪再生効果試験
このテストでは生後４２〜４９日のＣ５７ＢＬ／６マウス（雌）を使用した。まず背中部位の毛を電気剃刀を用いて除去し、各マウスの重さを計って体重が均一に分散されるようにして、数グループに分けた。適応期間を一日設けた後、除毛部位にサイクロスポリンＡとサイクロスポリンＡの主要代謝産物である［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡ、Ｍ１７、Ｍ２１及び対照を１日１回３０日間毎日塗布した。サイクロスポリンＡ及びその代謝産物の適用量は１００μｌ（０．０５％ｗ／ｖ）とした。育毛の程度は肉眼で判定し、マウスの背中部位を写真撮影した。図４はＣ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡと［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの発毛効果を測定した動物実験における、対照群の写真を示す。図５はＣ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡと［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの発毛効果を測定した動物実験における、サイクロスポリンＡを塗布した群の写真を示す。図６はＣ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡと［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの発毛効果を測定した動物実験における、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡを塗布した群の写真を示す。発毛効果が代謝変換前のサイクロスポリンＡのそれと同等であることが判る。一方、代謝産物Ｍ１７とＭ２１は顕著な効果がないことが判った。
２０日の試験期間の間中、マウスの背中の状態を観察したが、対照群及び全ての処理群で特異な皮膚刺激所見は観察されなかった。
【００４６】
試験例２  ［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの免疫抑制力試験
免疫抑制力試験は、、ＭＬＲ法（Ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９９４，４７，２０８〜２１５）に従って、健康な成人から得た末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を細胞分裂刺激剤である植物性血球凝集素（ＰＨＡ）で処理することにより求めた。
【００４７】
マイトマイシンＣ（３０μｇ／ｍｌ，３０分）で処理した細胞群（４×１０６／ｍｌ）を賦活細胞として使用して、同数の未処理の反応細胞群と混合して４日間培養した。この間、混合物を１０−６〜１０−１１モル段階希釈のサイクロスポリンＡ及び［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡを含むその誘導体で処理した。
４日間培養した後、混合物に３Ｈ−チミジンを添加し、更に１６時間培養した。
その後、細胞に導入されたチミジン量を測定（液体シンチレーション計数器）して、各サイクロスポリン類のＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）を算出した。
【００４８】
その結果、サイクロスポリンＡのＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）が０．０３５、０．０２５及び０．０３０であるのに対し、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡのそれは０．１６５、０．１７８及び０．１５０であった。
このことから、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡは、サイクロスポリンＡよりも免疫抑制効果が低いことが判った。これは文献（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９８７，４３，１２３−１２７）のデータと一致した。
【００４９】
また、ＰＨＡ刺激に対する細胞増殖抑制力試験は、ＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ）で処理した単核細胞（４×１０６／ｍｌ）に、サイクロスポリンＡ及び［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡを含むその誘導体を段階希釈で１０−６〜１０−１１モル添加した後、３日間培養した。その後、ＭＬＲ法と同様に、３Ｈ−チミジンを各細胞に添加し、更に１６時間培養を続けた。培養後、各サイクロスポリン類のＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）を算出した。サイクロスポリンＡのＩＣ５０（μｇ／ｍｌ）が０．２５、０．４５及び０．３２であったのに対し、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］は１．２３、２．２５及び１．５０であった。
このことから、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡは、サイクロスポリンＡと比べて免疫抑制力が減少していることが判った。
【００５０】
これらの結果に基づき、本発明化合物は、液剤、スプレー、ゲル、ペースト，乳剤，クリーム，コンディショナー、シャンプーなどの形状に剤形化される。
【００５１】
本発明の毛髪再生剤において、毛髪再生を促す投与量は、組成物の全重量に対して０．０１〜３０％、好ましくは０．１〜１０％濃度である。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡを有効成分として含んでなる本発明の毛髪成長促進剤は、免疫抑制力は弱いながらも、より優れた毛髪回復効果に通じる、優れた毛髪成長促進効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの高速液体クロマトグラフィの結果である。
【図２】［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図３】［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡと［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの発毛効果を測定した動物実験における、対照群の写真である。
【図５】Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡと［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの発毛効果を測定した動物実験における、サイクロスポリンＡで処理した群の写真である。
【図６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いてサイクロスポリンＡと［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡの発毛効果を測定した動物実験における、［γ−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン９］サイクロスポリンＡで処理した群の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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