(57)【要約】本発明は、新規発現系、そこで用いるための構築体およびベクター、並びに一連の用途、特には医薬に適する組換えポリペプチドの製造へのその系の使用に関する。この系は、チオレドキシンおよび目的のポリペプチドの間に融合するユビキチンを含む融合タンパク質を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオレドキシンおよび目的のポリペプチドの間に融合したユビキチンを含む三重融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
目的のポリペプチドが癌関連抗原、またはＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６、もしくはＥ７由来の抗原、およびそれらの誘導体である、請求項１記載の三重融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項３】
ユビキチンおよびそのＣ末端目的ポリペプチドの融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、目的ポリペプチドが癌関連抗原、またはＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ６Ｅ７由来の抗原、およびそれらの誘導体であることを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項４】
癌関連抗原がＭａｇｅ、ＰＳ１０８、Ｐ５０１Ｓ、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｐｒａｍｅ、Ｃ７４＿３９、Ｃ７６＿１およびプロスターゼからなる群より選択される、請求項２または３に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項６】
目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列がチオレドキシンおよびユビキチンの間に挿入される、請求項５に記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１項のＤＮＡ配列でトランスフォームした宿主細胞。
【請求項８】
ユビキチン特異的エンドプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列でさらに同時トランスフォームされている、請求項７記載の宿主細胞。
【請求項９】
ユビキチン特異的プロテアーゼが構成性プロモーターの制御下にある、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１０】
ユビキチン特異的プロテアーゼが誘発性プロモーターの制御下にある、請求項８記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ユビキチン特異的エンドプロテアーゼがサッカロミセス・セレビシエ由来のＵＢＰ１である、請求項８から１０のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項１２】
細菌である請求項７から１１のいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項１３】
大腸菌である請求項１２の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれか１項記載のＤＮＡによってコードされる融合タンパク質。
【請求項１５】
そのカルボキシ末端に親和性タグをさらに含む、請求項１４記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
親和性タグがヒスチジンタグまたはＣ−Ｌｙｔａタグを含む群から選択される、請求項１５記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
ヒスチジンタグが少なくとも４つのヒスチジン残基を含む、請求項１６記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１４から１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質の製造方法であって、請求項７の宿主細胞を培養し、請求項１から４のいずれか１項に記載のＤＮＡを発現させ、および融合タンパク質を回収することを含み、該タンパク質はユビキチン特異的エンドプロテアーゼによってタンパク分解的に開裂される製造方法。
【請求項１９】
真正アミノ末端を有する目的の組換えポリペプチドの製造方法であって：
（ａ）請求項８から１１のいずれか１項記載の宿主細胞を、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の融合体およびユビキチン特異的エンドプロテアーゼの同時発現を可能にする条件下で培養し、並びに
（ｂ）組換えペプチドを直接細菌細胞から、それがｉｎ ｖｉｖｏでユビキチン特異的エンドプロテアーゼの作用を受けた後に回収する、
ことを含む製造方法。
【請求項２０】
ユビキチン特異的エンドプロテアーゼがサッカロミセス・セレビシエ由来のＵＢＰ１である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１４から１７のいずれか１項に記載のタンパク質を含むワクチンの製造方法であって、該タンパク質を適切なアジュバント、希釈剤または他の薬学的に許容し得る賦形剤と混合することを含む方法。
【請求項２２】
ワクチンの製造方法であって、請求項１９または２０に記載の方法に従ってタンパク質を産生させ、該タンパク質を適切なアジュバント、希釈剤または他の薬学的に許容し得る賦形剤と共に調剤することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規発現系、そこで用いるための構築体およびベクター、並びに一連の用途、特に医薬に適する組換えポリペプチドを産生するためのその系の使用に関する。特に、本発明は、細菌宿主において、高レベルの可溶性でコンフォメーション的に正しい組換えポリペプチドを産生するように設計された系に関する。より詳しくは、本発明は、ユビキチン融合体の形態またはチオレドキシン−ユビキチン融合体の形態にあり、かつ、所望のタンパク質の安定性および可溶性の程度が高まるように、任意にユビキチン特異的エンドプロテアーゼの同時発現を伴って産生される組換えポリペプチドの発現に関する。
【０００２】
多くの異種タンパク質が、容易に特定される培地中の宿主細胞の高細胞密度に至る迅速な増殖を特徴とする細胞宿主において高レベルで頻繁に発現されている。しかしながら、提供される利益にもかかわらず、微生物発現系、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における異種タンパク質、特には真核生物タンパク質の過剰発現は、しばしば、「封入体」と呼ばれる不溶性細胞質凝集体、主として組換えタンパク質およびそれらの非還元性ポリマーからなる電子高密度粒子につながる。
【０００３】
封入体の産生は、タンパク質凝集、宿主介在タンパク質凝集、不正確もしくは不完全な処理、正しくないタンパク質修飾および不適当なタンパク質折り畳みから生じ得る。真核生物タンパク質は、それら本来の構造を安定化するためにジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基も含む。大腸菌、大腸菌細胞質において封入体として発現するとき、非天然の分子間または分子内ジスルフィド結合の他に還元されたシステイン残基を有するタンパク質が見出される。
【０００４】
タンパク質を利用できるようにするには、６Ｍ尿素または８ＭグアニジニウムＨＣｌのような強力なカオトロピック試薬による凝集の変性とそれに続く復元が必要である。そのようなプロセスによって得られる収量は少ない。さらに、この復元工程が正しく折り畳まれたタンパク質、すなわち、その本来の三次元立体配座を保持するタンパク質につながらないことが頻繁にある。加えて、これらの手順はタンパク質ごとに設計しなければならない効率的な再折り畳みプロセスの開発を必要とし、そのようなプロセス設計の経験的な性質は産業的または医学的重要性を有するタンパク質の大規模産生に適合しない。
【０００５】
タンパク質が十分に折り畳まれ、かつ可溶性になる機構は十分には理解されていない。タンパク質の適切な折り畳みに必要な情報はその一次配列内に含まれているものの、実験的な証拠はプロテインフォルダーゼおよびイソメラーゼのような他の因子がタンパク質の折り畳みおよび三次構造形成を補助するという見解を支持する。
【０００６】
例えば大腸菌においては、特に高発現レベルが達成されるとき、幾つかのパラメータが真核生物タンパク質の溶解度に影響を与えるものと思われる。例えば、大腸菌熱ショックシャペロンＧｒｏＥＳＬは新たに合成されたポリペプチドの正しい折り畳みに介在することが示されている（Ｗｅｉｓｓｍａｎ， Ｊ．Ｓ．， Ｋａｓｈｉ， Ｙ．， Ｆｅｎｔｏｎ， Ｗ．Ａ． ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｃｈ， Ａ．Ｌ．， １９９４， Ｃｅｌｌ ７８， ６９３−７０２）。加えて、大腸菌と真核細胞との酸化還元環境は異なり、したがって、タンパク質の溶解度に影響を及ぼす。最後に、タンパク質それ自体が不正確に折り畳まれる場合、これはその溶解度に影響を与える可能性があり、したがって、しばしば不正確に折り畳まれたタンパク質が不溶性凝集体の形態で堆積する。
【０００７】
したがって、これらの発現の基礎的問題を克服し、かつそのように行う上で組換えタンパク質の可溶形態での直接発現を最大化することがしばしば望ましい。
【０００８】
欧州特許出願 ０ ７６８ ３８２ Ａ２は、細菌から可溶性タンパク質を産生するための方法であって、所望のタンパク質をチオレドキシン（Ｔｒｘ）とトランスで同時発現させることを特徴とする方法を開示する。
【０００９】
他のタンパク質、例えば、シストソーマ・ジャポニクム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）および大腸菌ＤｓｂＡフォルダーゼ、タンパク質内でのジスルフィド結合形態に関与する周辺質酵素、が大腸菌における融合タンパク質の発現に用いられている（Ｄａｖｉｓ Ｇ．Ｄ．， Ｅｌｉｓｅｅ Ｃ．， Ｎｅｗｈａｍ Ｄ．Ｍ． ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｒ．Ｇ． １９９９， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６５， ３８２−３８８）。
【００１０】
しかしながら、多くのそのような融合タンパク質は、タンパク質の起源（原核または真核）に関わりなく、標的タンパク質のすべての生物学的特性を保持することができない。これを克服するため、次に、ペプチダーゼを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素開裂により、関心タンパク質を融合パートナーから選択的に分離しなければならない。このプロセスは関心タンパク質を低収率で生じる非効率的なものであり、さらに、しばしば再現性がなく、実施のたびに異なる開裂産生物をもたらす。これらの欠点はそのような系の有用性を低下させる。
【００１１】
ユビキチンは高度に保存された小さい（７６アミノ酸）真核生物タンパク質である（Ｂｕｔｔ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８６， ２５４０−２５４４）。これは、それ自体（すなわち、ポリユビキチン）または１もしくは２種類のリボソームタンパク質のいずれかとの天然遺伝子融合体から発現される（Ｂａｋｅｒ Ｒ．Ｔ． １９９６， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７， ５４１−５４６）。ユビキチンとの直鎖融合体の溶解度が高まっていることは報告されているが、これは常にそうであるとは限らない（Ｒ． Ｂａｋｅｒ， Ｓ． Ｓｍｉｔｈ， Ｒ． Ｍａｒａｎｏ， Ｊ． ＭｃＫｅｅ ＆ Ｐ． Ｂｏａｒｄ １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ２５３８１−２５３８６）。
【００１２】
ユビキチン融合タンパク質は、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＢＰ）の大ファミリーのメンバーによって、正確にユビキチンのカルボキシ末端グリシン残基の後で、容易に開裂可能であるように思われる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ユビキチンは、ユビキチンが直鎖ポリユビキチンタンパク質としてそれ自体に結合するか、またはハイブリッドタンパク質として無関係のアミノ酸配列に結合する前駆体のタンパク分解処理によって排他的に生じる。酵母サッカロミセス・セレビシエにおける４つのユビキチンコーディング遺伝子座のファミリーが報告されている（Ｅ． Ｏｚｋａｙｎａｋ， Ｄ． Ｆｉｎｌｅｙ， Ｍ． Ｓａｌｏｍｏｎ ＆ Ａ． Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ， １８９７， Ｔｈｅ ＥＭＢＯ ｊｏｕｒｎａｌ ６， １４２９−１４３９）。ユビキチン融合タンパク質が酵母において発現するとき、内在性ＵＢＰがその融合タンパク質からユビキチンを迅速に、かつ定量的に除去する（Ｃ． Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ， Ｄ． Ｇｒａｙ ＆ Ｒ． Ｂａｋｅｒ １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ３２２８０−３２２８５）。ユビキチン特異的プロテアーゼは、１つだけプロリンを除いて（この場合、開裂速度は２０倍の遅さである）そのサイズまたはユビキチンのすぐ後に続くアミノ酸残基にかかわらず、直鎖融合体におけるユビキチン部分のカルボキシ末端でＧ７６−Ｘペプチド結合を開裂する。酵母におけるＵＢＰ酵素の大ファミリーのメンバーがこの開裂を行う。４つのＵＢＰが酵母からクローニングされ、機能的に特徴付けられている。大腸菌において発現するユビキチン融合タンパク質は、内在性ＵＢＰ活性の欠如のため、開裂されないままである。クローン化ＵＢＰ遺伝子が利用できるため大腸菌においてそれらがユビキチン融合タンパク質と共に同時発現するのを可能にしている。ＷＯ ９１／１７２４５に記載のようにＵＢＰ１は可変性同時翻訳開裂活性を有することが示されており、これは大腸菌において様々なサイズの融合体に対して試験されている。
【００１３】
このＵＢＰ１プロテアーゼは、ユビキチンとポリペプチド、ペプチドまたはユビキチン以外のタンパク質とのあらゆる融合タンパク質からユビキチン部分を除去する。ユビキチンもユビキチン特異的プロテアーゼも大腸菌においては、またはそれに関しては、原核生物においては見出されてはいない。現在、ユビキチン融合タンパク質からの所望のポリペプチドの産生は、ユビキチン特異的プロテアーゼを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ消化工程の導入を必要とする。そのようなプロセスは長期の反応時間を必要とし、所望の組換え産生物の収量の変動を生じる。これらの不利な点は、そのようなプロセスの産業規模での実施の障害となっている。
【００１４】
本発明は、上述の欠点を被ることのない新規発現系を提供する。
【００１５】
第１の側面において、本発明はユビキチンと標的組換えタンパク質との新規融合タンパク質に属する。別の側面においては、本発明は、融合体が「サンドイッチ」ユビキチン融合タンパク質であり、ユビキチン部分がチオレドキシンと目的のポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質との間に位置する融合タンパク質に属する。本発明のさらなる態様においては、ここで説明されるタンパク質の産生方法が提供される。
【００１６】
タンパク質は細菌、ウイルス、原虫、真菌および哺乳動物資源に由来するものであり得る。特には、本発明は、ユビキチンと腫瘍関連抗原または癌治療に適する分化抗原との融合タンパク質に関する。好ましい抗原は、Ｍａｇｅタンパク質およびそれらのＭａｇｅ誘導体、、ＰＳ１０８（ＷＯ ９８／５０５６７）、Ｐ５０１Ｓ（ＷＯ ９８／３７４１８）およびそれらの誘導体、並びにＦｅｒｇｕｓｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９， ９６， ３１１４−３１１９）並びに国際特許出願ＷＯ ９８／１２３０２、ＷＯ ９８／２０１１７およびＷＯ ００／０４１４９（Ｐ７０３Ｐ）に開示される前立腺癌関連タンパク質、プロスターゼおよびそれらの誘導体を含むタンパク質群から選択される。好ましいＰ５０１Ｓ誘導体はタンパク質の５５−５５３カルボキシ末端、好ましくは、タンパク質の１−３２０アミノ末端を含む。他の好ましい抗原には、Ｃｒｉｐｔｏ（ＵＳ ５．２５６．６４３）、Ｐｒａｍｅ（ＷＯ ９６／１０５７７）、Ｃ７４＿３９（ＰＣＴ／ＥＰ０１／０１７７９）、Ｃ７６＿１（ＧＢ ００１７５１２．５）、ウイルス抗原、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７、Ｅ６およびＥ２タンパク質およびそれらの誘導体、例えば、プロテインＤ１／３ Ｅ７（ＷＯ ９９／１０３７５）並びにＨＢＶポリメラーゼ（Ｊｉ Ｈｏｏｎ Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ， １９９６， ＢＢＲＣ ２２３， ２６４−２７１；Ｌｅｅ Ｈ．Ｊ． ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １５， ８２１−８２６）。
【００１７】
別の側面においては、本発明は、融合体が「サンドイッチ」ユビキチン融合タンパク質であり、ユビキチン部分がチオレドキシンと目的のポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質との間に位置する融合タンパク質に属する。上で用いられる３つの用語−ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質−はここでは交換可能に用いることができ、ペプチドは、通常、約５０残基以下のオーダーの比較的短いポリペプチドを指す。具体的な態様においては、三重融合体（ｔｒｉｆｕｓｉｏｎ）内の標的組換えタンパク質が癌関連抗原であり、より好ましくは、そのタンパク質はＭａｇｅタンパク質およびそれらのＭａｇｅ誘導体、ＰＳ１０８（ＷＯ ９８／５０５６７）および誘導体、Ｃｒｉｐｔｏ（ＵＳ ５．２５６．６４３）、Ｐｒａｍｅ（ＷＯ ９６／１０５７７）、Ｃ７４＿３９（ＰＣＴ／ＥＰ０１／０１７７９）、Ｃ７６＿１（ＧＢ ００１７５１２．５）、Ｐ５０１Ｓ（ＷＯ ９８／３７４１８）およびそれらの誘導体、プロスターゼおよびそれらの誘導体（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９９９， ９６， ３１１４−３１１９）並びに国際特許出願ＷＯ ９８／１２３０２、ＷＯ ９８／２０１１７およびＷＯ ００／０４１４９（Ｐ７０３Ｐ）におけるものを含むタンパク質群から選択される。好ましいＰ５０１Ｓ誘導体はタンパク質の５５−５５３カルボキシ末端、好ましくは、タンパク質の１−３２０アミノ末端を含む。別の具体的な態様においては、標的タンパク質はＨＰＶ Ｅ２、Ｅ７、Ｅ６タンパク質またはそれらの融合体、例えば、Ｅ６Ｅ７融合体、およびそれらの誘導体、例えば、プロテインＤ１／３ Ｅ７（ＷＯ ９９／１０３７５）である。さらなる具体的な態様においては、標的タンパク質はＨＢＶポリメラーゼである。この三重融合体は、ジスルフィド含有残基の再折り畳みおよび可能性融合タンパク質の産生における第１融合パートナー、チオレドキシンの能力を、新生ポリペプチド鎖の安定化によるシャペロンとしての作用および特異的ユビキチンプロテアーゼによって認識される開裂部位による処理されたタンパク質の回収に対する貢献における第２融合パートナー、ユビキチンの能力に結びつける。
【００１８】
チオレドキシンおよびユビキチンの同時翻訳発現は本発明のタンパク質の可溶化を増大させ、タンパク質精製収率、精製タンパク質の溶解度、安定性および品質に対してもかなりの肯定的な衝撃を与える。
【００１９】
本発明のユビキチン部分は、好ましくは、排他的に限定されるものではないが、ヒト起源のものである。
【００２０】
好ましい標的ポリペプチドはＭａｇｅファミリーに由来するものである。ＭＡＧＥ遺伝子のファミリーによってコードされる抗原は、主として、（悪性メラノーマを含む）メラノーマ細胞およびＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）を含む幾つかの他の癌、頭部および頸部扁平上皮細胞癌、膀胱移行細胞癌、食道癌、乳癌並びに大腸癌で発現するが、精巣および胎盤を除く正常組織では検出できない（Ｇａｕｇｌｅｒ， １９９４；Ｗｅｙｎａｎｔｓ， １９９４；Ｐａｔａｒｄ， １９９５）。
【００２１】
Ｍａｇｅファミリーは、Ｘ染色体上に位置し、かつそれらのコーディング配列において互いに６４ないし８５％の相同性を共有する１２の密接に関連する遺伝子、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＭＡＧＥ５、ＭＡＧＥ６、ＭＡＧＥ７、ＭＡＧＥ８、ＭＡＧＥ９、ＭＡＧＥ１０、ＭＡＧＥ１１、ＭＡＧＥ１２のファミリーである（Ｄｅ Ｐｌａｅｎ， １９９４）。これらは、時折、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ２、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ａ５、ＭＡＧＥ Ａ６、ＭＡＧＥ Ａ７、ＭＡＧＥ Ａ８、ＭＡＧＥ Ａ９、ＭＡＧＥ Ａ１０、ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２として知られ、現在はＭＡＧＥ Ａファミリーを形成する。関連性はより離れるものの、２つの他のタンパク質群もこのＭＡＧＥファミリーの一部である。これらはＭＡＧＥ ＢおよびＭＡＧＥ Ｃ群である。ＭＡＧＥ Ｂファミリーは、ＭＡＧＥ Ｂ１（別名、ＭＡＧＥ Ｘｐ１、およびＤＡＭ１０）、ＭＡＧＥ Ｂ２（別名、ＭＡＧＥ Ｘｐ２およびＤＡＭ６）、ＭＡＧＥ Ｂ３およびＭＡＧＥ Ｂ４を含む。ＭＡＧＥ Ｃタンパク質は、現在、ＭＡＧＥ Ｃ１およびＭＡＧＥ Ｃ２を含む。大まかに言うと、ＭＡＧＥタンパク質は、そのタンパク質のＣ末端に向かって位置する中心配列シグネチャを含むものと定義することができる（例えば、ＭＡＧＥ Ａ１ ３０９アミノ酸タンパク質に関しては、中心シグネチャはアミノ酸１９５−２７９に相当する）。一般には、ＷＯ ９９／４０１８８に記載されるように、ＭＡＧＥタンパク質は核領域においてＭＡＧＥ Ａ１のアミノ酸１９５〜２７９と約５０％同一である。本発明においてはＭａｇｅ誘導体も意図されており、これは、例えば、ＷＯ ９９／４０１８８に記載されている。
【００２２】
別の好ましいポリペプチドはヒトパピローマウイルスに由来するものであり、これはヒトパピローマ誘導腫瘍の治療または予防において有用性が見出される。特には、ＷＯ ９９／１０３７５に記載されるように、このポリペプチドは早期タンパク質、Ｅ１〜Ｅ７であり、最も好ましくは、ヘモフィリウス・インフルエンザＢ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｉｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂ）に由来するプロテインＤに連結する、ＨＰＶ株１６または１８に由来するＥ２、Ｅ６またはＥ７タンパク質を含む融合タンパク質である。ウイルスＤＮＡの組み込みの後、発癌プロセスが始まって２種類の早期タンパク質Ｅ６およびＥ７の過剰発現につながり、これが正常な細胞分化の漸次喪失および癌の発生につながる。Ｅ６およびＥ７は、それぞれ主要腫瘍サプレッサータンパク質、ｐ５３およびｐＲＢ、網膜芽細胞腫遺伝子産生物を不活性化することにより、正常細胞サイクルを克服する。
【００２３】
ワクチンが腫瘍抗原を含むことが本発明の特に好ましい側面である；そのようなワクチンは、驚いたことに、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌またはメラノーマのような癌の治療において効力を有する。したがって、これらの処方は腫瘍関連抗原の他に腫瘍支持機構（例えば、血管形成、腫瘍浸潤）に関連する抗原を含むことができる。さらに、癌の治療におけるワクチンに特に関連する抗原には、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、チロシナーゼ、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＰＲＡＭＥ（ＷＯ ９６／１０５７７）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＵＳ ５．２５６．６４３）、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＨＡＧＥ、プロスターゼ（Ｐ． Ｎｅｌｓｏｎ， Ｌｕ Ｇａｎ， Ｃ． Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｐ． Ｍｏｓｓ， Ｒ． Ｇｅｌｉｎａｓ， Ｌ． Ｈｏｏｄ ＆ Ｋ． Ｗａｎｄ， Ｐｒｏｃ． Ｎｔｌ． Ａｃｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９９） ９６， ３１１４−３１１９）（ＷＯ ９８／１２３０２および対応するＵＳ ５，９５５，３０６；ＷＯ ９８／２０１１７および対応するＵＳ ５，８４０，８７１およびＵＳ ５，７８６，１４８；並びにＷＯ ００／０４１４９も参照）、ＰＳ１０８（ＷＯ ９８／５０５６７）、Ｐ５０１Ｓ（ＷＯ ９８／３７０９３  配列番号１１３）並びに前立腺癌関連タンパク質（ＷＯ ９９／６７３８４  配列番号９）も含まれる。好ましいＰ５０１Ｓ誘導体はそのタンパク質の５５−５５３カルボキシ末端、好ましくは、そのタンパク質の１−３２０アミノ末端を含む。これらの抗原およびそれらの誘導体は三重融合系を用いる発現の好ましい標的ポリペプチドである。
【００２４】
好ましい態様においては、チオレドキシンは融合タンパク質においてユビキチンの上流に位置する。目的のポリペプチドは融合タンパク質においてユビキチンの下流に位置する。好ましい態様において、三重融合体内の関心ポリペプチドはＭａｇｅ−３、ＰＳ１０８、Ｐ５０１Ｓおよび前立腺癌関連抗原、プロスターゼ、プロテインＤ Ｅ７、並びにそれらの断片および相同体を含む群から選択される。
【００２５】
本発明の融合タンパク質は単細胞宿主、例えば、原核生物および低級真核生物、例えば、酵母および細菌において発現させることができる。本発明の融合タンパク質は、好ましくは、大腸菌において発現させる。好ましい態様においては、これらのタンパク質は親和性ペプチドを有する。好ましくは、この親和性タグは、本発明のタンパク質のカルボキシ末端に融合し、好ましくは５ないし８ヒスチジン残基、好ましくは少なくとも４残基、最も好ましくは６ヒスチジン残基を含有するヒスチジン・テールを含む。好ましくは、この親和性ペプチドは、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも４残基の隣接ヒスチジン残基を有する。最も好ましくは、このタンパク質は６つの直接隣接するヒスチジン残基を含む。これらのヒスチジンタグは、特にはＮｉキレートベースのＩＭＡＣクロマトグラフィーによる、組換えタンパク質の精製の補助として設計される。別の好ましい態様においては、これらのタンパク質はＣ−ＬＹＴＡタグをそれらのカルボキシ末端に有する。好ましくは、分子のＣ末端部分が用いられる。Ｌｙｔａは、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、アミダーゼＬＹＴＡ、（ｌｙｔＡ遺伝子によってコードされる｛Ｇｅｎｅ， ４３ （１９８６） ｐａｇｅ ２６５−２７２｝ペプチドグリカン主鎖内の特定の結合を特異的に分解するオートリシンを合成する肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から誘導される。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインはコリンまたは幾つかのコリン類似体、例えば、ＤＥＡＥに対する親和性の原因である。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現する大腸菌Ｃ−ＬＹＴＡの開発に利用されている。Ｃ−ＬＹＴＡ断片をそのアミノ末端に含むハイブリッドタンパク質の精製が記載されている｛Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： １０， （１９９２） ｐａｇｅ ７９５−７９８｝。ここで用いられる場合、好ましい態様は、残基１７８から開始するＣ末端に見出されるＬｙｔａ分子の反復部分を利用する。特に好ましい形態は残基１８８−３０５を組み込む。これらの好ましい融合体も新規であり、本発明の一側面を形成する。
【００２６】
本発明は、本発明の融合体をコードする単離核酸も提供する。特には、本発明は、チオレドキシンと目的のポリペプチドとの間に融合するユビキチンを含む三重融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。また、本発明は、ユビキチンとそのＣ末端での目的のポリペプチドとの融合体をコードするＤＮＡ配列をも提供する。コドン最適化遺伝子を用いることができる。そのようなＤＮＡ配列は、適切な発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞において発現させることができる。本発明の好ましい形態においては、発現は細菌株、最も好ましくは大腸菌において行う。本発明による融合体をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターおよびその配列でトランスフォームした宿主も本発明の一部を形成する。
【００２７】
上記融合タンパク質は標準ＤＮＡ合成技術を用いて、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８５， ２４， ５０９０−５０９８においてＤ．Ｍ． Ｒｏｂｅｒｔｓらによって記載される酵素的ライゲーションにより、化学合成により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素重合により、または、例えば熱安定性ポリメラーゼを用いる、ＰＣＲ技術により、またはこれらの技術の組合せにより産生させることができる。ＤＮＡの酵素重合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）のようなＤＮＡポリメラーゼを用いて、ヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを必要に応じて含む適切なバッファ中、１０〜３７℃で、一般には５０μｌ以下の容量で行うことができる。ＤＮＡ断片の酵素的ライゲーションは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼを用いて、適切なバッファ、例えば、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．４）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．０１Ｍジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭ ＡＴＰおよび０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン中、４℃〜周囲温度の温度で、一般には５０ｍｌ以下の容量で行うことができる。ＤＮＡポリマーまたは断片の化学合成は、通常のホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホロアミダイト化学により、’Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ’ （ｅｄ． Ｈ．Ｇ． Ｇａｓｓｅｎ ａｎｄ Ａ． Ｌａｎｇ）， Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ （１９８２）、または他の科学刊行物、例えば、Ｍ．Ｊ． Ｇａｉｔ， Ｈ．Ｗ．Ｄ． Ｍａｔｔｈｅｓ， Ｍ． Ｓｉｎｇｈ， Ｂ．Ｓ． Ｓｐｒｏａｔ， ａｎｄ Ｒ．Ｃ． Ｔｉｔｍａｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８２， １０， ６２４３；Ｂ．Ｓ． Ｓｐｒｏａｔ， ａｎｄ Ｗ． Ｂａｎｎｗａｒｔｈ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８３， ２４， ５７７１；Ｍ．Ｄ． Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ａｎｄ Ｍ．Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８０， ２１， ７１９；Ｍ．Ｄ． Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ａｎｄ Ｍ．Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １９８１， １０３， ３１８５；Ｓ．Ｐ． Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １９８３， １０５， ６６１；Ｎ．Ｄ． Ｓｉｎｈａ， Ｊ． Ｂｉｅｒｎａｔ， Ｊ． ＭｃＭａｎｎｕｓ， ａｎｄ Ｈ． Ｋｏｅｓｔｅｒ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８４， １２， ４５３９；およびＨ．Ｗ．Ｄ． Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９８４， ３， ８０１に記載されるもののような固相技術を用いて行うことができる。
【００２８】
目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片および、三重融合体においては、チオレドキシンは、それぞれ、ユビキチンをコードするＤＮＡ配列の３’末端および５’末端に連結される。これらのコーディング配列は停止コドンが創出されないようにインフレームに結合されなければならず、停止コドンの創出は融合体をコードするｍＲＮＡの翻訳の早すぎる終了を生じる。
【００２９】
本発明のさらなる態様においては、ここで説明されるタンパク質の産生方法が提供される。特には、この本発明の方法は、好ましくは：
（ａ）本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列でトランスフォームした宿主細胞を培養する工程、および
（ｂ）融合タンパク質を回収する工程、
を含むことができる。
【００３０】
最終産生物は、好ましくは、ユビキチン特異的エンドプロテアーゼによってタンパク分解的に開裂可能である形態で回収される。好ましくは、ユビキチン特異的エンドプロテアーゼは、ＵＢＰ１遺伝子によってコードされる８０９残基タンパク質ＵＢＰ１またはそれらの機能的誘導体である。
【００３１】
「形質転換」という用語は、ここでは、宿主細胞への外来ＤＮＡの導入を意味するように用いられる。これは、例えばＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； Ｅｄｓ． Ｓ．Ｍ． Ｋｉｎｇｓｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｊ． Ｋｉｎｇｓｍａｎ； Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄ， １９８８に記載される通常の技術を用いる、適切なプラスミドまたはウイルスベクターでの形質転換、トランスフェクションまたは感染によって達成することができる。「形質転換された」または「形質転換体」という用語は、以後、目的の外来遺伝子を含み、かつそれを発現する結果としての宿主細胞に適用される。好ましくは、本発明の組換え抗原は単細胞宿主、より好ましくは細菌系、最も好ましくは大腸菌において発現される。
【００３２】
本発明の好ましい側面においては、この方法は、合成融合タンパク質を大腸菌においてユビキチン特異的エンドプロテーゼと共にトランスで同時発現させることを特徴とする。ユビキチン特異的エンドプロテアーゼのトランスでの同時発現は、精製後にｉｎ ｖｉｔｒｏでプロテアーゼを添加する必要なしに、チオレドキシンおよびユビキチン融合パートナーを含有しない標的ポリペプチド抗原を産生するに好ましい。したがって、本発明の方法論は、標的ポリペプチド内に真正アミノ末端を、または、その代わりに、選択されたあらゆるアミノ末端を人工的に生成するのに用いることができる。好ましくは、ユビキチン特異的エンドプロテアーゼはサッカロミセス・セレビシエ由来のＵＢＰ１である。
【００３３】
特には、真正アミノ末端を有する関心組換えポリペプチドの産生方法は：
（ａ）本発明の融合体およびユビキチン特異的エンドプロテアーゼの同時発現を許容する条件下で宿主を培養する工程、並びに
（ｂ）定義されたアミノ末端を有する関心組換えポリペプチドを、それがｉｎ ｖｉｖｏでユビキチン特異的プロテアーゼの作用を受けた後に、回収する工程、
を含むことができる。
【００３４】
好ましくは、この組換えストラテジーは融合タンパク質をコードする遺伝子構築体を発現ベクターにクローニングしてチオレドキシン−ユビキチン・カルボキシ末端融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を形成することを含み、この遺伝子構築体は５’から３’方向にチオレドキシンをコードするＤＮＡ配列、このチオレドキシンをコードするＤＮＡ配列に結合するユビキチンをコードするＤＮＡ配列、およびこのユビキチンをコードするＤＮＡ配列に結合する目的のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。アフィニティクロマトグラフィーによる簡素化精製を可能にする親和性タグ、好ましくは、ポリヒスチジンテールまたはｃ−ＬＹＴＡタグを融合タンパク質のカルボキシ末端に加工することができる。
【００３５】
この方法は、前記発現ベクターを適切な細菌発現株、好ましくは細菌、最も好ましくは大腸菌内にトランスフォームし、チオレドキシン−ユビキチン・カルボキシ末端融合ポリペプチドの発現を許容することも含む。遺伝子構築体は、好ましくは誘発性プロモーター、例えば、λｐＬプロモーターの制御下にあり、培養培地へのトリプトファンの添加があらゆる温度でのλｐＬプロモーターの誘導を可能にする。このさらに改善された系は、発酵レベル、例えば、タンパク質が本質的により可溶性の形態でより良好に発現することができる生理学的条件下での評価および監視に用いることができる。この改善は無細胞抽出物調製品のレベルで観察することができ、そこではそのような抽出物の標準調製法、次いで標準分析法による決定で、組換えタンパク質は主として可溶性画分中に見出される。そのような方法の１つは、発現した物質（ペレットおよび上清画分の両者）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くクーマシーブルー染色、走査および画像濃度測定によるその走査の分析の実施からなる。
【００３６】
本発明の好ましい態様であるユビキチン特異的プロテアーゼの同時発現が必要である場合、ユビキチン特異的エンドプロテアーゼをコードする適合性のいわゆるプロセシングベクターで、レシピエント細菌株を同時形質転換する。「同時形質転換」という用語は、ここでは、２種類の適合性プラスミドに由来する外来ＤＮＡを適切な宿主細胞に導入することを意味するのに用いられる。これは、例えば、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーター［ＩＰＴＧ］の制御下でプロテアーゼを発現させることによって達成することができる。ユビキチンプロテアーゼ遺伝子は、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエのユビキチン−プロテアーゼ１（ＵＢＰ１）である。あるいは、ユビキチンプロテアーゼ発現カセットをトリメーラ（ｔｒｉｍｅｒａ）融合体ではなく同じプラスミドに配置することができ、かつ別個のプロモーター（例えば、構成性プロモーター）の制御下か、または誘導性プロモーターの制御下で発現させることができる。ユビキチン特異的エンドプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列により同時形質転換した宿主細胞も本発明の一部を形成する。
【００３７】
これらの発現およびプロセシングベクターは新規であり、これらも本発明の一部を形成する。特には、本発明は、目的のポリペプチドのさらなるクローニングに適するポリリンカーの上流にチオレドキシンおよびユビキチン部分を含む組換えＤＮＡベクターを含む。
【００３８】
複製可能な発現ベクターは、本発明に従い、宿主細胞に適合するベクターを開裂してインタクトな（ｉｎｔａｃｔ）レプリコンを有する直鎖状ＤＮＡセグメントを得て、さらにその直鎖状セグメントを、その直鎖状セグメントと一緒になって所望の産物をコードする１以上のＤＮＡ分子（例えば、本発明のタンパク質をコードするハイブリッドＤＮＡ配列）またはそれらの誘導体と、ライゲーション条件下で結合させることによって作製することができる。
【００３９】
したがって、このハイブリッドＤＮＡ配列は、予め形成されていても、所望であればベクターの構築の際に形成されてもよい。
【００４０】
ベクターの選択は、部分的には、宿主細胞に応じて決定される。宿主細胞は原核生物であっても真核生物であってもよいが、好ましくは大腸菌である。適切なベクターにはプラスミド、バクテリオファージ、コスミドおよび組換えウイルスが含まれる。発現およびクローニングベクターは、好ましくは、選択可能なマーカーを含み、それによってそのマーカーを発現する宿主細胞のみが選択的条件下で生存する。選択遺伝子には、限定されるものではないが、アンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするものが含まれる。
【００４１】
複製可能な発現ベクターの作製は、ＤＮＡの制限切断、重合およびライゲーションのための適切な酵素を用いて、例えば上記に引用されるＭａｎｉａｔｉｓらに記載される手順によって、従来法により行うことができる。
【００４２】
組換え宿主細胞は、本発明に従い、形質転換条件下で、本発明の複製可能な発現ベクターまたは本発明の２種類の適合性ベクターで宿主細胞を形質転換することによって作製する。適切な形質転換条件は通常通りのものであり、例えば、上記で引用されるＭａｎｉａｔｉｓら、または「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」 第ＩＩ巻， Ｄ．Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ 編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ， １９８５に記載されている。特には、本発明は、本明細書に記載される通り、両方の発現ベクターを用いて同時形質転換された細菌であって、２つの遺伝子が２つの異なる産物として発現される前記細菌に関する。
【００４３】
本発明の２種類の適合性ベクターで同時形質転換されている細菌株も本発明の一部である。
【００４４】
形質転換条件の選択は、宿主細胞に応じて決定される。すなわち、大腸菌のような細菌宿主は、ＣａＣｌ２の溶液（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９７３， ６９， ２１１０）またはＲｂＣｌ、ＭｎＣｌ２、酢酸カリウムおよびグリセロールの混合物を含む溶液で処理し、さらに続いて３−［Ｎ−モルホリノ］プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌおよびグリセロールで処理すればよい。酵母細胞のような下等真核生物の培養時の直接取り込みによる形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． １９７８， ７， １９２９）の方法を用いることによって行うことができる。
【００４５】
形質転換された宿主細胞の、ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下での培養は、例えば、上記で引用されるＭａｎｉａｔｉｓらおよび「ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」に記載されるように従来法によって行う。すなわち、細胞に栄養素を供給し、５０℃未満、好ましくは２５℃〜３５℃、最も好ましくは３０℃の温度で培養することが好ましい。インキュベーション時間は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットによって評価される細菌細胞中のポリペプチドの割合に従って、数分〜数時間の範囲で変化させることができる。
【００４６】
本発明の組換えタンパク質は、宿主細胞に応じた通常の方法によって回収する。したがって、宿主細胞が細菌、例えば、大腸菌である場合、それを物理的、化学的または酵素的に溶解し、得られた溶解物からタンパク質産物を単離すればよい。次に、通常の技術を用いてそれを精製する。発現系の特異性は、目的のポリペプチドに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって評価することができる。
【００４７】
通常のタンパク質単離技術としては、選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、およびモノクローナル抗体アフィニティカラムを含むアフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。
【００４８】
本発明のタンパク質がヒスチジンテール（Ｈｉｓタグ）を有して発現される場合、それらはイオン金属アフィニティクロマトグラフィカラム（ＩＭＡＣ）カラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーによって容易に精製することができる。ユビキチン特異的プロテアーゼの作用によりｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはユビキチン特異的エンドプロテアーゼの同時発現によりｉｎ ｖｉｖｏで、プロセシングされ得るこれらの融合体は、プロセシングされた目的のポリペプチドを生じる。そのヒスチジンテールを依然として有する後者は、同様にアフィニティクロマトグラフィーによって容易に精製することができる。
【００４９】
これらのポリペプチドは、さらなる精製工程にかけることによって高レベル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる可視化で８０％を上回り、好ましくは９０％を上回る純度）に精製することができる。さらなる精製工程はＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ工程であり、これはＩＭＡＣカラムにかける前または後のいずれかで実施することにより高度に精製されたタンパク質を得ることができる。それらは還元条件下でＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析すると主たる単一バンドを示し、ウェスタンブロット分析は宿主細胞タンパク質の混入が５％未満であることを示す。
【００５０】
本発明は、本発明のプロセシングされたタンパク質を含むワクチンの製造方法であって、そのタンパク質を薬学的に許容し得る賦形剤もしくは担体、または適切なアジュバントもしくは免疫応答増強剤と混合することを含む方法も提供する。加えて、本発明は、ワクチンの製造方法であって、上記方法に従って融合タンパク質を産生させ、さらに該タンパク質を適切なアジュバント、希釈剤または他の薬学的に許容し得る賦形剤とともに調剤することを含む方法を提供する。
【００５１】
ワクチンの製造は、一般には、「ワクチン設計−サブユニットとアジュバントの取り扱い（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ − Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ）」 （Ｅｄ． Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ６ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５に一般的に記載されている。リポソーム中への封入はＦｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号によって記載されている。
【００５２】
本発明のタンパク質には、好ましくは、アジュバントが添加されている。適切なアジュバントとしては、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）もしくはリン酸アルミニウムが含まれる）が挙げられるが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化チロシンもしくはアシル化糖、カチオン性もしくはアニオン性に誘導体化された多糖、またはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。他の適切なアジュバント系には、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩の組合せが含まれる。
【００５３】
Ｔｈ１型応答を優先的に誘導する上で使用するのに好ましいアジュバントには、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩の組合せが含まれる。ＭＰＬアジュバントはＲｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）から入手可能である（米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６．０３４号および第４，９１２，０９４号を参照）。本発明のタンパク質と一緒に使用する上で好ましい他のアジュバントは、サポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）であり、これは単独で、または他のアジュバントと組み合わせて用いることができる。
【００５４】
例えば、増強された系は、ＷＯ ９４／００１５３に記載されるモノホスホリルリピドＡ及びサポニン誘導体の組合せ、特には、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、あるいはＷＯ ９６／３３７３９に開示されているＱＳ２１がコレステロールでクエンチングされている反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）の低い組成物を含む。
【００５５】
ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを水中油エマルジョン中に含む特に効力の高いアジュバント配合物がＷＯ ９５／１７２１０に記載されており、これが好ましい配合物である。
【００５６】
他の適切なアジュバントはＣｐＧである。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないもの）も、Ｔｈ１応答を優先的に誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ ９６／０２５５５、ＷＯ ９９／３３４８８並びに米国特許第６，００８，２００号および第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列も、例えば、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：３５２， １９９６によって記載されている。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドも、単独で、または他のアジュバントと組み合わせて用いることができる。
【００５７】
例えば、増強された系は、ＷＯ ００／０９１５９に開示されているＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド及びサポニン誘導体の組合せ、特には、ＣｐＧおよびＱＳ２１の組合せを含む。好ましくは、この配合物は水中油エマルジョンおよびトコフェロールをさらに含む。
【００５８】
他の好ましいアジュバントには、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州、合衆国）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、ベルギーから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）、例えば、係属中の米国特許出願番号第０８／８５３，８２６号および第０９／０７４，７２０号に記載されるものが含まれ、これらの開示は参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【００５９】
他の好ましいアジュバントには、下記一般式（Ｉ）：
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ
（式中、ｎは１−５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１−５０アルキルまたはフェニルＣ１−５０アルキルである）
のアジュバント分子が含まれる。
【００６０】
本発明の一実施形態は、ｎが１〜５０、好ましくは４〜２４、最も好ましくは９であり；Ｒ成分がＣ１−５０、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、最も好ましくはＣ１２アルキルであり、かつＡが結合である一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン配合物から構成される。このポリオキシエチレンエーテルの濃度は０．１〜２０％の範囲、好ましくは０．１〜１０％、最も好ましくは０．１〜１％の範囲にあるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ（第１２版：エントリ７７１７）に記載されている。これらのアジュバント分子はＷＯ ９９／５２５４９に記載されている。
【００６１】
上記一般式（Ｉ）によるポリオキシエチレンエーテルは、所望であれば、他のアジュバントと組み合わせることができる。例えば、好ましいアジュバントの組合せは、好ましくは、係属中の英国特許出願 ＧＢ ９８２０９５６．２に記載されるような、ＣｐＧとの組み合わせである。
【００６２】
以下の実施例を参照することにより本発明をさらに説明する。
【００６３】
実施例Ｉ：
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓを発現する大腸菌株の調製
１．−タンパク質の設計
本構築は、大腸菌の細胞質内に目的のタンパク質を遊離するユビキチンプロテアーゼ（ＵＢＰ１）によって認識される三重融合タンパク質の設計に基づく。この融合タンパク質は、融合パートナーとしてのチオレドキシンおよびユビキチン、ならびに発現させる異種タンパク質としてＭａｇｅ３を含む。大腸菌由来のチオレドキシン遺伝子（ｔｒｘＡ）は、ｔｒｘＡ遺伝子より下流のクローニングを可能にするＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の市販ベクター由来のものである。ユビキチンＯＲＦはヒトユビキチン遺伝子に由来する。ユビキチンは高度に保存されたタンパク質であり、したがって、ヒトユビキチンはサッカロミセス・セレビシエのＵＢＰ１によって認識され、その開裂部位はユビキチンのＣ末端側のグリシン７６の後ろに位置する。
【００６４】
ユビキチンおよびＭａｇｅ３をこの順番でチオレドキシンの下流にクローニングした。チオレドキシンはＳ−Ｇ−Ｇ−Ｇリンカーを介してユビキチンに連結させる。このリンカーは、融合パートナーの個々の作用を妨害する可能性がある融合パートナー間の立体相互作用を制限するために付加される。ユビキチンとＭａｇｅ３との間の接合部残基はメチオニンである。天然Ｍａｇｅ３配列のＮ末端には修飾を施した。すなわちＮ末端ルールに従う不安定残基である第２および第３の酸であるＰおよびＬを、天然Ｍａｇｅ３配列から除去した。融合及びプロセシングされたタンパク質の様々な精製を可能にするため、ヒスチジンテールをＭａｇｅ３に付加した。
【００６５】
大腸菌において発現させようとする融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３の設計を図１に記載する。上記のタンパク質の設計に対応するヌクレオチドコーディング配列を図２ａ（配列番号１）に示し、これは大腸菌性発現プラスミド内のλｐＬプロモーターの制御下に配置した。三重融合体の長さは５２２アミノ酸であり、開裂後、Ｍａｇｅ３は３２１個のアミノ酸のタンパク質となる（後者を、配列番号２を表す図２ｂの配列におけるボールド体で表す）。
【００６６】
２．−融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓを発現するプラスミドであるプラスミドｐＴＵｂｉＭ３（＝ｐＲＩＴ １５０２１）を作製するためのクローニング方法
チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓを発現するベクターｐＲＩＴ１５０２１を作製するための出発物質として、幾つかのプラスミドを用いた：
−ヒトユビキチンコーディング配列を含む、Ｓｈａｔｚｍａｎ博士（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）から入手したプラスミドｐＮＭＨｕｂＰｏｌｙ（５２５３ｂｐ）；
−Ｍａｇｅ３コーディング配列を担持するプラスミドｐＲＩＴ１４４７７（６６２２ｂｐ）（ＷＯ ９９／４０１８８に記載）；
−異種タンパク質をチオレドキシンとλｐＬプロモーター下流で融合させるのに用いられるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の発現ベクターである、ｐＴＲＸｆｕｓ。
【００６７】
三重融合体チオレドキシン、ユビキチンおよびＭａｇｅ３をヒスチジンテールとインフレームで発現するプラスミドを作製するために用いられる本方法を図３に示す。この方法は、以下の工程を含む。
【００６８】
ａ）−Ａｃｃ６５Ｉ制限部位（イタリック体で表す）、ＳＧＧＧリンカーコーディング配列（ボールド体で表す）を含む伸長部分を伴うユビキチン配列のＰＣＲ増幅。このＰＣＲ反応のテンプレートはプラスミドｐＮＭＨｕｂＰｏｌｙであり、フォワードプライマーは４９量体オリゴヌクレオチド：
2004501648.tif 000002
であり、リバースプライマーは２７量体オリゴヌクレオチド：［５’−ＡＣＣ−ＡＣＣ−ＴＣＴ−ＴＡＧ−ＴＣＴ−ＴＡＡ−ＧＡＣ−ＡＡＧ−ＡＴＧ−３’］であった。
【００６９】
ｂ）−ユビキチン配列の３’末端に相補的な２７ヌクレオチド配列（ボールド体で表す）を５’末端に含むＭａｇｅ３配列の最初の１００ｂｐのＰＣＲ増幅。このＰＣＲ反応のテンプレートはプラスミドｐＲＩＴ１４４７７（ＷＯ ９９／４０１８８に記載）であり、コーディングプライマーは５７量体オリゴヌクレオチド：
2004501648.tif 000003
であり、リバースプライマーはＭａｇｅ３配列内に存在するＦｓｐＩ制限部位（イタリック体で表す）を含む２４量体オリゴヌクレオチド：
2004501648.tif 000004
であった。
【００７０】
ｃ）−両ＰＣＲ断片を、４９量体オリゴヌクレオチドのフォワードプライマーおよび２４量体オリゴヌクレオチドのリバースプライマーを用いるＰＣＲによって結合させ、ＡＣＣ６５Ｉ制限部位をその５’末端に、かつＦｓｐＩ制限部位をその３’末端に有する３３０ｂｐ断片を作製した。Ｍａｇｅ３ ＯＲＦの残りの部分は、ＦｓｐＩおよびＸｂａＩ制限酵素でのＴＣＭ２２２の制限消化によって得た。
【００７１】
ｄ）−ＰＣＲ断片（Ａｃｃ６５Ｉ−ＦｓｐＩ）、制限断片（ＦｓｐＩ−ＸｂａＩ）およびｐＵＣ１９（Ａｃｃ６５Ｉ−ＸｂａＩ）の３断片ライゲーションによりｐＲＩＴ １５０９６（ｐＵＢＩＭ３、３８９６ｂｐ）を作製し、それを中間構築体として得た。制限断片ＦｓｐＩ−ＸｂａＩは配列決定によって確認を行った。
【００７２】
ｅ）−正しい配列を有する二重融合遺伝子を含むプラスミドｐＲＩＴ１５０９６を、Ａｃｃ６５ＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化した（ユビキチンＯＲＦはＸｂａＩ制限部位を含むため、ｐＵＣ１９から断片を切り出すのにＸｂａＩを用いることはできなかった）。１２０５ｂｐ断片を、Ａｃｃ６５ＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＴｒｘＦｕｓ中にクローニングして、最終的な発現プラスミドｐＲＩＴ１５０２１（ｐＴＲＸＵｂｉＭ３）を得た。
【００７３】
得られたプラスミドｐＲＩＴ１５０２１を、誘導性λｐＬプロモーター（アンピシリン選択）の制御下でチオレドキシン、ユビキチンおよびＭａｇｅ３の三重融合体をヒスチジンテールとインフレームで発現させるのに用いる。
【００７４】
３．−大腸菌Ｂ１２８５株をもたらす、ｐＲＩＴ１５０２１による大腸菌ＧＩ７２４株の形質転換
プラスミドｐＲＩＴ１５０２１（アンピシリン耐性）を、アンピシリン（１ＯＯμｇｒ／ｍｌ）に対して耐性である形質転換体について選択することにより、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の大腸菌ＧＩ７２４（Ｆ−、λ−、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＰＬ８、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ、ｃＩ）に導入した。
【００７５】
大腸菌レシピエント株ＧＩ７２４は、その細菌染色体内に、厳密に調節されたトリプトファンプロモーターの制御下に遺伝子工学的に挿入されたｃＩリプレッサ遺伝子を含み、このプロモーターがトリプトファンの添加により目的の遺伝子の発現を可能にする（Ｍｉｅｓｃｈｅｎｄａｈｌ ｅｔ ａｌ， （１９８６） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ４： ８０２−８０８）。これはいかなる温度でも行うことができる。
【００７６】
４．−細菌株Ｂ１２８５の増殖および誘導
大腸菌Ｂ１２８５株を、３０℃で都合のよい抗生物質を補充した誘導培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中、３０℃で増殖させた。
【００７７】
細菌の対数増殖期の間に、トリプトファン（最終濃度１００μｇｒ／ｍｌ）を添加することによりλリプレッサーの産生を抑制し、三重融合体を合成させることで、３０℃での誘導を実施した。３０℃でのインキュベーションは４時間継続した。誘導のＴ＝０、Ｔ＝２時間およびＴ＝４時間の時点で細菌を回収した。細菌をペレット化し、−２０℃で保存した。
【００７８】
実施例ＩＩ：
融合パートナーを含まない対照対応物Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓを発現する大腸菌株の調製
１．−融合パートナーを含まないＭａｇｅ３−Ｈｉｓを発現するプラスミドであるプラスミドｐＲＩＴ１５０６９（ＴＣＡＪ１２）を作製するためのクローニング方法
幾つかのプラスミドを、Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓを発現するベクターｐＲＩＴ１５０６９を作製するための出発物質として用いた：
−プラスミドベクターｐＡＬ７８１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、λｐＬプロモーター下流のタンパク質を発現させるためのベクター対照として用いる。これはチオレドキシンを含まない。
【００７９】
−ユビキチン−Ｍａｇｅ３コーディング配列を担持する、ｐＵＣ１９系プラスミドであるプラスミドｐＲＩＴ１５０９６。
【００８０】
−Ｍａｇｅ３コーディング配列を担持するプラスミドｐＲＩＴ１４４７７（ＴＣＭ２２２）（ＷＯ ９９／４０１８８に記載）。
【００８１】
このクローニング方法は別個の工程を含んでいた（図４）。
【００８２】
ａ）−プラスミドベクターｐＡＬ７８１を制限酵素ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩで消化した。
【００８３】
ｂ）−５’末端にＮｄｅＩ制限部位を、および３’末端にＦｓｐＩ制限部位を有するＭａｇｅ３配列の最初のおよそ１００ｂｐのＰＣＲ増幅。このＰＣＲ反応のテンプレートはプラスミドｐＲＩＴ１４４７７であり、コーディングプライマーはＮｄｅＩ制限部位（イタリック体で表す）を含む３４量体オリゴヌクレオチド：
2004501648.tif 000005
であり、リバースプライマーはＦｓｐＩ制限部位（イタリック体で表す）を含む２４量体オリゴヌクレオチド：
2004501648.tif 000006
であった。
【００８４】
ｃ）−Ｍａｇｅ３ ＯＲＦの残りの部分は、ｐＲＩＴ１５０９６をＦｓｐＩおよびＰｓｔＩ制限部位で消化することによって得た。
【００８５】
ｄ）−ＮｄｅＩおよびＦｓｐＩで消化したベクターｐＡＬ７８１と、ＰＣＲ断片（ＮｄｅＩ−ＦｓｐＩ）および制限断片（ＦｓｐＩ−ＰｓｔＩ）とのライゲーションを実施し、発現プラスミドｐＲＩＴ１５０６９（ＴＣＡＪ１２）を得た。
【００８６】
２．−大腸菌Ｂ１３２６株をもたらす、ｐＲＩＴ１５０６９による大腸菌ＧＩ７２４株の形質転換
プラスミドｐＲＩＴ１５０６９（アンピシリン耐性）を、アンピシリン（１００μｇｒ／ｍｌ）に対して耐性である形質転換体について選択することにより、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の大腸菌ＧＩ７２４（Ｆ−、λ−、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＰＬ８、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ、ｃＩ）に導入した。細菌株Ｂ１３２６の増殖および誘導は、実施例Ｉ、パラグラフ４に記載される通りに行った。
【００８７】
実施例ＩＩＩ：
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓを発現し、かつユビキチン特異的エンドプロテアーゼＵＢＰ１を同時発現する大腸菌株の構築
１．−サッカロミセス・セレビシエ由来のユビキチン特異的エンドプロテアーゼＵＢＰ１を発現するプラスミドであるプラスミドｐＲＩＴ１５０２２の構築
ｐＲＩＴ１５０２１に適合し、かつサッカロミセス・セレビシエ・ユビキチンプロテアーゼ（ＵＢＰ１）を構成的に発現する、ｐＢＢＲ１−２由来のプラスミド（ｐＲＩＴ１５０２２）（カナマイシン選択）が遺伝子工学的に作製された（図５を参照）。ｉｎ ｖｉｖｏでの三重融合体からの目的のタンパク質の開裂が、レシピエント大腸菌株中での両プラスミドの同時発現によって可能になった。
【００８８】
出発物質は以下の通りであった：
−サッカロミセス・セレビシエ由来のＵＢＰ１遺伝子を（大腸菌内において機能する）プラスミド自身のプロモーターの制御下に含む、Ｂｏｌｌｅｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ Ｌｉｂｒｅ ｄｅ Ｂｒｕｘｅｌｌｅｓ）から入手したプラスミドｐＪＴ７０（ＴｏｂｉａｓおよびＶａｒｓｈａｖｓｋｙ （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２６６， １２０２１−１２０２８）。
【００８９】
−カナマイシン耐性プラスミドであるプラスミドｐＢＢＲ１ ＭＣＳ２（Ｍ． Ｅ． Ｋｏｖａｃｈ， Ｒ． Ｗ． Ｐｈｉｌｌｉｐｓ， Ｐ． Ｈ． Ｅｌｚｅｒ， Ｒ． Ｍ． Ｒｏｏｐ ＩＩおよびＫ． Ｍ． Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， １９９４， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １６ （５）， ８００−８０２）。このプラスミドは、それ自体をｐＢＲ３２２由来のＣｏ１Ｅ１系ベクターに適合させるボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）の複製起点を担持する。
【００９０】
ＵＢＰ１完全長遺伝子（それ自身の天然プロモーターを有しており、大腸菌内で機能する）は、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで制限消化することによってプラスミドｐＪＴ７０から取得した。その２．８ｋｂ断片をｐＢＢＲ１ＭＣＳ２中にクローニングし、ｐＲＩＴ１５０２２（カナマイシン耐性）を得た。
【００９１】
２．−大腸菌Ｂ１２８６株をもたらす、ｐＲＩＴ１５０２１およびｐＲＩＴ１５０２２による大腸菌ＧＩ７２４株の形質転換
初代大腸菌レシピエント株ＧＩ７２４（Ｆ−、λ−、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＰＬ８、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ、ｃＩ）（任意の温度でトリプトファンによるλｐＬプロモーターの誘導が可能である）を、プラスミドｐＲＩＴ１５０２１（アンピシリン耐性）およびｐＲＩＴ１５０２２（カナマイシン耐性）によって同時形質転換した。こうして得られた両プラスミドを担持する株はＢ１２８６と命名され、アンピシリン（１００μｇｒ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇｒ／ｍｌ）に対する耐性による選択が可能となった。Ｂ１２８６細菌株の増殖および誘導は、実施例Ｉ、パラグラフ４に記載される条件に従って行った。
【００９２】
実施例ＩＶ：
融合タンパク質ユビキチン−Ｍａｇｅ ３−Ｈｉｓ、融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ ３−Ｈｉｓ、および組換えにより発現させた融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ ３ Ｈｉｓのｉｎ ｖｉｖｏプロセシングの特性解析
１．−抽出物の調製／クーマシー染色を行ったＳＤＳ−ポリアクリルアミド１２．５％ゲルおよびウェスタンブロットの分析
凍結細胞を解凍し、ＰＢＳバッファに再懸濁した。細胞を細胞破壊機Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ中で破壊した。遠心分離（４℃で２０分、１６０００ｇ）の後、ペレット、上清および全体抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質は、クーマシーブルー染色ゲル上で可視化し、さらに抗Ｍａｇｅ３モノクローナル抗体（クローンＭＧ３２、ＳＢ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）および抗Ｈｉｓテールモノクローナル抗体（ＱｉａｇｅｎのＰｅｎｔａｈｉｓ）を用いるウェスタンブロットによって同定した。
【００９３】
上清とペレットの両方において、発現したタンパク質の割合および量の測定を染色ゲル上で行った。ゲルをＢｉｏ−ｒａｄ ＧＳ−７００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒでスキャンし、データをＢｉｏ−ｒａｄ Ｍｕｌｔｉ−ＡｎａｌｙｓｔＴＭ／ＰＣ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．１によって解析した。同じレーン内のすべてのピーク下の面積の合計に対する、目的のタンパク質ピーク下の面積の比率をパーセントとして算出することにより、比収率データを生成した。
【００９４】
２．−結果および結論
上述の実験アプローチは、Ｍａｇｅ３単独、Ｍａｇｅ３三重融合形態および同じ遺伝子系（ｐＬプロモーター、トリプトファン誘導、３０°）を用いてｉｎ ｖｉｖｏでプロセシングされたＭａｇｅ３の発現パターンの比較を可能にしている。
【００９５】
融合パートナーを含まないＭａｇｅ３−Ｈｉｓを発現する株対照対応物Ｂ１３２６＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５０６９）については、クーマシーゲルにおいて僅かに可視であり（全タンパク質の＜１％）、かつ半分が上清中に、および半分がペレット中に分布する約４５ＫＤの主要バンドが検出された。
【００９６】
株Ｂ１２８５＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５０２１）については、三重融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３−Ｈｉｓに対応する６５ＫＤのバンドがクーマシーゲルにおいて可視であり、主として上清中に存在していた。
【００９７】
三重融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ開裂を試験するため、三重融合体およびユビキチナーゼ（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｓｅ）ＵＢＰ１を同時に発現する株Ｂ１２８６＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５０２１、ｐＲＩＴ１５０２２）を発現させた。クーマシーゲルにおいて高度に可視であり（図６）、約４５ＫＤおよび２５ＫＤに見出される２つの生成断片が得られた。両部分は特異的抗体抗チオレドキシンおよび抗ユビキチンによって認識されるため、主として上清中に存在する４５ＫＤバンドはウェスタンブロットによって示されるように（図６）プロセシングされたＭａｇｅ３タンパク質を表し、２５ＫＤのバンドは開裂した融合パートナーに対応する。
【００９８】
Ｍａｇｅ３単独の発現に熱誘導ｐＬプロモーターを用い、かつ三重融合体にトリプトファン誘導ｐＬプロモーターを用いる従来の実験（可溶性のプロセシングされたＭａｇｅ３の量は１０〜２０ｍｇ／リットル（全タンパク質の４％）と見積もられた）においては、プロセシングされたＭａｇｅ３の溶解度は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅとそれに続くクーマシーブルー染色、走査および画像濃度計測によるその走査の分析による評価で、５０％〜約８０％の範囲であった。他の実験も、Ｍａｇｅ３の溶解度が古典的な熱誘導系における３０−７０上清／ペレット分布から３０℃三重融合系における９５−５分布に有意に増加していることを同様に示している。
【００９９】
この場合、三重融合タンパク質の効率的なｉｎ ｖｉｖｏプロセシングは、より均一で、酸化の程度が低く、かつ分解が少ない可溶性産物の収率における、Ｍａｇｅ３についての従来の発現結果との比較で約４倍の増加と共に生じた。ｉｎ ｖｉｖｏで遊離された組換えタンパク質は、単一のタンパク質として発現した対応物よりも均一であるように思われる。
【０１００】
実施例Ｖ：
融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（５５→５５３）Ｈｉｓを発現する大腸菌株の構築
１．−三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（５５→５５３）Ｈｉｓを発現する発現プラスミドの構築
このストラテジーは２種類のプラスミドを含む。第１のプラスミドは、三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３をコードするｐＲＩＴ１５０２１（ｐＴＵｂｉＭ３）である。第２のプラスミドは、カルボキシ末端がポリヒスチジンテールで伸長された、前立腺抗原Ｐ５０１Ｓ［ＷＯ ９８／３７０９３］のアミノ酸５５−５５３のコーディング配列を担持するｐＲＩＴ１５０６３（ｍａ３２１）である。
【０１０１】
このクローニングストラテジーは３つの工程を含む：
ａ）−第１工程は発現ベクターｐＲＩＴ１５０８８（ＴＣＡＪ１４）（図７を参照）の構築である。
λｐＬプロモーターの制御下に三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓを含むプラスミドｐＲＩＴ１５０２１をＡｆｌＩＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化し、３７８２ｂｐの制限断片ＡｆｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片を精製した後、以下のもので構成される合成アダプターで連結した：
＊コーディング鎖：５’ ＴＴＡ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＣＡ ３’ および
＊相補鎖：５’ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＴＡ ＣＣＡ ＣＣＴ ＣＴＴ ＡＧＴ Ｃ ３’。
【０１０２】
この連結により、チオレドキシン−ユビキチン融合体の下流に異種タンパク質を融合させて三重融合体を実現するのに有用な多重クローニング部位を含むベクターｐＲＩＴ１５０８８が生成した。
【０１０３】
ｂ）−第２工程は、発現ベクターｐＲＩＴ１５０６３（図８ａの制限マップを参照）の構築である。出発物質は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ市販のプラスミドｐｃＤＮＡ３．１から誘導され、かつＥｃｏＲＩとＮｏｔＩクローニング制限部位との間に３．４ｋｂインサートを含む組換えプラスミドｐ５０１Ｓであった。このプラスミドはＰ５０１Ｓコーディング配列（１６６２ｂｐ長）を含み、Ｃｏｒｉｘａから入手した。
【０１０４】
＊Ｐ５０１Ｓのサブクローニング：
Ｐ５０１Ｓオープン・リーディング・フレームの最後の４９９アミノ酸＋その下流６８ｂｐをコードするヌクレオチド配列を含む１５６９ｂｐ断片を、Ｐ５０１Ｓプラスミドから、ＮｃｏＩ消化によって単離した。Ｔ４ポリメラーゼ処理の後、その断片を、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ、Ｔ４ポリメラーゼ処理によって開いたプラスミドｐＵＣ１８に、ＮｃｏＩがＰ５０１Ｓオープン・リーディング・フレームのＮ末端配列（すなわち、アミノ酸位置５５）において回復するような方法でサブクローニングした。得られたプラスミドをｐＲＩＴ１５０６１と命名した。
【０１０５】
＊Ｓ．セレビシエＣＵＰ１プロモーターおよび酵母αプレプロシグナル配列の導入：
酵母ＣＵＰ１プロモーターおよび酵母αプレプロシグナル配列を含むＰＣＲ断片を３つの連続するＰＣＲ工程によって得た：
−ＰＣＲ工程１：オリゴヌクレオチドＭＤＥＮＨＥ１ＣＵＰ１（ｃ ５’ ＧＧＡ ＣＴＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＣＴＡ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＣＡ ＡＧＡ Ｇ ３’）およびＭＤＥＣＵＰ１ＡＴＧ（ｎｃ ５’ＣＡＴ ＴＴＴ ＡＴＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＴＴＧ ＡＴＴ Ｇ ３’）を用いる、鋳型としてのｐＲＩＴ１２４７１プラスミド上でのＣＵＰ１プロモーターの増幅。
【０１０６】
−ＰＣＲ工程２：オリゴヌクレオチドＭＤＥＰＲＥＰＲＯＡＴ（ｃ ５’ ＣＡＡ ＴＣＡ ＡＴＣ ＡＡＴ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＴＡ ＡＡＡ ＴＧＡ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＴＴ ＣＡＡ ＴＴＴ ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＡ ３’）およびＭＤＥＳＩＧＮＡＬ２（ ｎｃ５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＴＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＣＴＴ ＴＴＣ ＴＣＧ ＡＧ ３’）を用いる、鋳型としてのｐＰＩＣ９プラスミド（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）上でのαプレプロシグナル配列の増幅。
【０１０７】
−ＰＣＲ工程３：ＰＣＲ１およびＰＣＲ２によって得られた断片並びにオリゴヌクレオチドＭＤＥＮＨＥ１ＣＵＰ１およびＭＤＥＳＩＧＮＡＬ２を用いるＰＣＲによる、ＣＵＰ１プロモーター及びαプレプロシグナル配列の結合。
【０１０８】
ＰＣＲ３の後、増幅した断片を精製し、Ｔ４ポリメラーゼ処理してＮｃｏＩ消化した。断片を、プラスミドｐＲＩＴ１５０６１内のＴ４ポリメラーゼ処理したＨｉｎｄＩＩＩ部位とＮｃｏＩ部位との間に導入した。このプラスミドをｐＲＩＴ１５０６２と命名した。
【０１０９】
＊ＨＩＳテールによるＣ末端の伸長：
ＨＩＳテール伸長用の断片を、鋳型としてｐ５０１Ｓプラスミド並びにオリゴヌクレオチドＭＤＥ５０１ＳＡＣ（ｃ ５’ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＴＡ ＧＣＡ ＧＴＧ ＡＧ ３’）およびＭＤＥ５０１ＨＩＳ（ｎｃ ５’ＣＴＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＣＣ ＣＧＧ ＧＴＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＴＣ ＣＡＣ ＣＣＧ ＣＴＧ ＡＧＴ ＡＴＴ ＴＧＧ ＣＣＡ ＡＧＴ ＣＧ ３’）を用いるＰＣＲによって得た。増幅した断片を精製し、ＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩによって消化し、ｐＲＩＴ１５０６２プラスミド内のＳａｃＩ（重複アミノ酸４３９）とＥｃｏＲＩ部位との間に導入し、正しいオープン・リーディング・フレームを復元して、２グリシン残基、それに続く６ヒスチジン残基、およびそれに続く停止コドンをコードする配列によってｐ５０１Ｓ配列をインフレームで伸長させた。さらには、ＳｍａＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位が導入されている。
このプラスミドをｐＲＩＴ１５０６３と命名した（図８ｂ）。
【０１１０】
ｃ）−第３工程は、三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（ａａ５５→ａａ５５３）を発現するプラスミドであるｐＲＩＴ１５０９０（ＴＣＡＪ１６）の構築である（図８を参照）。
【０１１１】
プラスミドｐＲＩＴ１５０８８をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、プラスミドｐＲＩＴ１５０６３（ｍａ３２１）の制限消化から精製される１５３７ｂｐのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片と連結して、三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（５５→５５３）Ｈｉｓを発現するプラスミドｐＲＩＴ１５０９０（ＴＣＡＪ１６）を得た。
【０１１２】
三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（５５→５５３）Ｈｉｓの配列が図９に示されており、アミノ酸配列は図９ｂ（配列番号４）に示され、ヌクレオチドコーディング配列は図９ａ（配列番号３）に示される。この三重融合体は７１０残基の長さである。ｉｎ ｖｉｖｏプロセシングの後、５０９アミノ酸長のｐ５０１様タンパク質が生成される（図９ｂにおいてボールド体で示される）。
【０１１３】
２．−大腸菌Ｂ１３２３株を導く、ｐＲＩＴ１５０９０による大腸菌ＧＩ７２４株の形質転換
プラスミドｐＲＩＴ１５０９０（アンピシリン耐性）を、アンピシリンに対して耐性である形質転換体について選択することにより、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の大腸菌ＧＩ７２４に導入して大腸菌Ｂ１３２３株を形成した。ＧＩ７２４は細菌染色体内に遺伝子操作されたｃＩリプレッサー遺伝子を厳密に調節されたトリプトファンプロモーターの制御下に含み、これはいかなる温度であってもトリプトファンの添加によって目的の遺伝子の発現を可能にする。Ｂ１３２３株の増殖および導入は上述の通りに行った。
【０１１４】
実施例ＶＩ：
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン（５５→５５３）Ｈｉｓを発現し、かつユビキチン特異的エンドプロテアーゼＵＢＰ１を同時発現する大腸菌株の構築
１．−ユビキチン特異的エンドプロテアーゼＵＢＰ１を発現するプラスミドであるプラスミドｐＲＩＴ１５０２２の構築
ｐＲＩＴ１５０２１に適合し、かつサッカロミセス・セレビシエ・ユビキチンプロテアーゼ（ＵＢＰ１）を構成的に発現する、ｐＢＢＲ１−２から誘導されたプラスミド（ｐＲＩＴ１５０２２）（カナマイシン選択）が遺伝子操作された（図５を参照）。
【０１１５】
２．−Ｂ１３２９を導く、大腸菌ＧＩ７２４株の形質転換
初期大腸菌受容菌株ＧＩ７２４株をプラスミドｐＲＩＴ１５０９０（アンピシリン耐性）およびｐＲＩＴ１５０２２（カナマイシン耐性）で、アンピシリンおよびカナマイシンの両者に対して耐性である形質転換体を選択することによって同時形質転換した。
【０１１６】
プラスミドｐＲＩＴ１５０２２はサッカロミセス・セレビシエのユビキチナーゼＵＢＰ１を構成的に発現し、これはｉｎ ｖｉｖｏでの三重融合体からの目的のタンパク質の開裂を可能にする。Ｂ１３２９株の増殖および導入は上記の通りに行った。
【０１１７】
実施例ＶＩＩ：
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（５５→５５３）Ｈｉｓおよび組換えで発現した融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（５５→５５３）Ｈｉｓのｉｎ ｖｉｖｏプロセシングの特徴付け
凍結細胞を解凍してＰＢＳバッファーに再懸濁させた。細胞を細胞破壊機Ｏｎｅ Ｓｈｏｔにおいて破壊した。遠心分離（２０分、１６０００ｇ、４℃）の後、ペレット、上清および全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質をクーマシーブルー染色ゲルによって可視化し、モノクローナル抗体抗Ｐ５０１ ＰＡ／Ｇ ｐｕｒｅ ５０１１ ＯＥ３Ｄ４Ｇ３ ３００２（Ｃｏｒｉｘａから入手）を用いるウェスタンブロットによって同定した。
【０１１８】
ウェスタンブロットにおいて、株Ｂ１３２９についてはプロセシングされたＰ５０１Ｓ（５５→５５３）タンパク質に対応する約５０ｋｄのバンドが可視化され、それに対して、株Ｂ１３２３については約６７ｋｄのバンドが検出された（非プロセシング融合タンパク質）。これらの結果を図１０に示す。
【０１１９】
実施例ＶＩＩＩ：
融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）−Ｈｉｓを発現する大腸菌株ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１１５）の構築
１．−タンパク質の設計
大腸菌において発現させようとする融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）−Ｈｉｓの設計を図１１に示す。
【０１２０】
生じるタンパク質の一次構造は図１２ａ（配列番号５）に示される配列を有する。上記タンパク質の設計に対応するコーディング配列（図１２ｂ、配列番号６を参照）を大腸菌発現プラスミド内でバクテリオファージλに由来するλｐＬプロモーターの制御下に配置した。この大腸菌発現プラスミドにおいては、ＰＬプロモーターはそのＰＬプロモーターの前のオペレーター領域に結合するｃＩリプレッサーによって厳密に調節される。
【０１２１】
２．−チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）融合タンパク質の生成のためのクローニングストラテジー
融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）Ｈｉｓを発現するベクターｐＲＩＴ１５１１５（ＴＣＡＪ２１）の生成のための出発物質として幾つかのプラスミドを用いた：
−三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３ ＨｉｓをコードするプラスミドｐＲＩＴ１５０２１（ｐＴＵｂｉＭ３）。
−市販のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎプラスミドｐｃＤＮＡ３．１から誘導され、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩクローニング制限部位との間に３．４ｋｂインサートを含む、Ｐ５０１Ｓを発現する組換えプラスミド。このプラスミドはＰ５０１Ｓコーディング配列（１６６２ｂｐ長）を含み、Ｃｏｒｉｘａから入手した。
【０１２２】
このクローニングストラテジーは２つの工程を含んでいた：
ａ）−発現ベクターｐＲＩＴ１５０８８（ＴＣＡＪ１４）の構築（図１３を参照）。三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３をλｐＬプロモーターの制御下に含むプラスミドｐＲＩＴ１５０２１をＡｆｌＩＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化し、３７８２ｂｐの制限断片ＡｆｌＩＩ−ＰｓｔＩ断片を精製した後、コーディング鎖：［５’ ＴＴＡ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＣＡ ３’］および相補鎖：［５’ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＴＡ ＣＣＡ ＣＣＴ ＣＴＴ ＡＧＴ Ｃ ３’］から構成される合成アダプターで連結した。この連結により、異種タンパク質をチオレドキシン−ユビキチン融合体の下流に融合させて三重融合体を実現するのに有用な多重クローニング部位を含むベクターｐＲＩＴ１５０８８が生成した。
【０１２３】
ｂ）−融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）を発現するプラスミドであるｐＲＩＴ１５１１５（ＴＣＡＪ２１）の構築（図１４）。三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ １→３２０を発現するプラスミドの生成に用いられるストラテジーは、以下のものからなっていた：
＊プラスミドベクターｐＲＩＴ１５０８８（ＴＣＡＪ１４）の制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＩでの消化。
【０１２４】
＊Ｈｉｓテールとインフレームであるチオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）のコーディング配列のＰＣＲ増幅。このＰＣＲ反応の鋳型はＣｏｒｉｘａ製のプラスミドＰ５０１Ｓであった。フォワードプライマーは５５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド［５’ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＴＴ ＡＡＧ ＡＣＴ ＡＡＧ ＡＧＧ ＴＧＧ ＴＡＴ ＧＧＴ ＣＣＡ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＣＴ Ｇ−３’］であり、リバースプライマーは７５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド［５’ ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＴＡ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＣＣ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＡＴＡ ＧＴＧ ＴＣＴＣＣＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＧＧＴ −３’］であった。そのＰＣＲ断片を制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して付着末端を生成した。
【０１２５】
＊プラスミドｐＲＩＴ１５１１５（ＴＣＡＪ２１）を生成する、このＰＣＲ断片と、ＡｆｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＲＩＴ１５０８８（ＴＣＡＪ１４）との連結。
【０１２６】
３．−融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）Ｈｉｓを発現する株Ｂ１３５６＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１１５）の獲得
プラスミドｐＲＩＴ１５１１５（アンピシリン耐性）を、アンピシリンに対して耐性である形質転換体を選択することにより、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の大腸菌株ＧＩ７２４（Ｆ−、λ−、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＰＬ８、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ、ｃＩ）に導入した。ＧＩ７２４は、細菌染色体内に遺伝子操作されたｃＩリプレッサー遺伝子を厳密に調節されたトリプトファンプロモーターの制御下に含み、これはトリプトファンの添加によって目的の遺伝子の発現を可能にする。Ｂ１３５６株の増殖および導入は、実施例Ｉ、第４節において前述される通りに行った。
【０１２７】
実施例ＩＸ：
融合パートナーなしにＰ５０１Ｓ（１−３２０）を発現するＢ１３９５＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１３９）を発現する大腸菌株の調製
１．−融合パートナー・チオレドキシンおよびユビキチンなしにＰ５０１Ｓ（１−３２０）を発現する対照対応物であるプラスミドｐＲＩＴ１５１３９（ＴＣＡＪ２３）の構築
出発物質は以下の通りであった：
−λｐＬプロモーター下流のタンパク質を発現させるための対照ベクターとして用いられるプラスミドベクターｐＡＬ７８１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。これはチオレドキシンを含まない。
−ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩクローニング制限部位との間に３．４ｋｂインサートを含む市販プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から誘導される、組換えプラスミドＰ５０１Ｓ。このプラスミドはＰ５０１Ｓ全長コーディング配列（１６６２ｂｐ長）を含み、Ｃｏｒｉｘａから入手した。
【０１２８】
このクローニングストラテジーを図１５に概述する。
ａ）−制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｍａＩによるベクターｐＡＬ７８１の消化。
【０１２９】
ｂ）−ＨｉｓテールとインフレームにあるＰ５０１Ｓ（１−３２０）コーディング配列のＰＣＲ増幅。このＰＣＲ反応の鋳型は、Ｃｏｒｉｘａ製のプラスミドＰ５０１Ｓであった。フォワードプライマーは４０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド［５’ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＧＴ ＣＣＡ ＧＣＧ ＴＣＴ ＧＴＧ ＧＧＴ ＧＡＧ ＣＣＧ ＣＣＴ Ｇ ３’］であり、リバースプライマーは７５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド［５’ ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＴＡ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＣＣ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＡＴＡ ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＧＧＴ −３’］であった。そのＰＣＲ断片をＮｄｅＩおよびＸｍａＩ制限酵素で消化して付着末端を生成した。
【０１３０】
ｃ）−プラスミドｐＲＩＴ１５１３９（ＴＣＡＪ２３）を生成する、ＰＣＲ断片と、ＮｄｅＩおよびＸｍａＩで消化したベクターｐＡＬ７８１との連結。
【０１３１】
２．−融合パートナーなしにＰ５０１Ｓ １→３２０を発現する対照対応株Ｂ１３９５＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１３９）の生成
プラスミドｐＲＩＴ１５１３９（アンピシリン耐性）を、アンピシリンに対して耐性である形質転換体を選択することにより、大腸菌ＧＩ７２４（Ｆ−、λ−、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＰＬ８、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ、ｃＩ）に導入した。Ｂ１３９５株の増殖および導入は、実施例Ｉ、第４節において前述されるように行った。
【０１３２】
実施例Ｘ：
融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ １→３２０およびユビキチナーゼＵＢＰ１を発現するＢ１３７２＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１１５、ｐＲＩＴ１５０２２）を発現する大腸菌株の調製
１．−サッカロミセス・セレビシエ由来のユビキチナーゼＵＢＰ１を構成的に発現するプラスミドｐＲＩＴ１５０２２の構築
図５および実施例ＩＩＩ、§１を参照。
【０１３３】
２．−融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ １→３２０およびユビキチナーゼＵＢＰ１を発現する株Ｂ１３７２＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１１５、ｐＲＩＴ１５０２２）の生成
大腸菌株ＧＩ７２４（Ｆ−、λ−、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＰＬ８、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ、ｃＩ）を、アンピシリンおよびカナマイシンに対して耐性である形質転換体を選択することにより、プラスミドｐＲＩＴ１５１１５（アンピシリン耐性）およびｐＲＩＴ１５０２２（カナマイシン耐性）で同時形質転換した。プラスミドｐＲＩＴ１５０２２はサッカロミセス・セレビシエのユビキチナーゼＵＢＰ１を構成的に発現し、これはｉｎ ｖｉｖｏでの三重融合体からの目的のタンパク質の開裂を可能にする。Ｂ１３７２株の増殖および誘導は、実施例Ｉ、第４節に前述されるように行った。
【０１３４】
実施例ＸＩ：
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１→３２０）Ｈｉｓおよび組換えで発現した融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１→３２０）Ｈｉｓのｉｎ ｖｉｖｏプロセシングの特徴付け
１．−抽出物の調製／クーマシー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミド１２．５％ゲルおよびウェスタンブロットでの分析
凍結細胞を解凍し、ＰＢＳバッファーに再懸濁させた。細胞を細胞破壊機Ｏｎｅ Ｓｈｏｔにおいて破壊した。遠心分離（２０分、１６０００ｇ、４℃）の後、ペレット、上清および全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質をクーマシーブルー染色ゲルで可視化し、抗ｈｉｓテールモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ製のＰｅｎｔａｈｉｓ）を用いるウェスタンブロットによって同定した。
【０１３５】
上記実験アプローチは、Ｐ５０１Ｓ １→３２０単独、Ｐ５０１Ｓ １→３２０三重融合形態およびｉｎ ｖｉｖｏで同じ遺伝子系（ｐＬプロモーター、トリプトファン誘導、３０℃）を用いてプロセシングされたＰ５０１Ｓ １→３２０の発現パターンの比較を可能にしている。
【０１３６】
２．−結果および結論
株Ｂ１３５６＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１１５）については、三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ １→３２０に対応する約５０ＫＤのバンドがクーマシー染色ゲルにおいて僅かに可視であり、上清およびペレットに分布し、ウェスタンブロットにおいて抗Ｐｅｎｔａｈｉｓモノクローナル（Ｑｉａｇｅｎ）によって認識された。
【０１３７】
三重融合体のｉｎ ｖｉｖｏ開裂を評価するため、三重融合体およびユビキチナーゼＵＢＰ１を同時に発現する株Ｂ１３７２＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１１５、ｐＲＩＴ１５０２２）を発現させた。クーマシーゲルおよびウェスタンブロットにおいて可視であり（図１６）、約３２ＫＤおよび２５ＫＤに見出される２種類の生成断片が得られた。上清中に多量に存在する３２ＫＤバンドは、ウェスタンブロットによって示されるようにプロセシングされたＰ５０１Ｓ（１→３２０）タンパク質を表し、２５ＫＤのバンドは開裂した融合パートナー・チオレドキシンおよびユビキチンに対応する。
【０１３８】
融合パートナーなしにＰ５０１Ｓ（１→３２０）を発現する対照対応株Ｂ１３９５＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１３９）については、染色ゲルにおいてもＰｅｎｔａｈｉｓモノクローナルによるウェスタンブロットにおいても組換えタンパク質を同定することはできなかった（図１７）。この場合、三重融合タンパク質の効率的なｉｎ ｖｉｖｏプロセシングは、まったく発現しなかった単一タンパク質として発現する対応物と比較して、タンパク質Ｐ５０１Ｓ（１→３２０）の収量における重大な増加と共に生じ、高度に可溶性の産物を導いた。
【０１３９】
実施例ＸＩＩ：
融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７を発現する大腸菌株Ｂ１３５７＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１０６）の構築
１．−タンパク質の設計
大腸菌において発現させようとする融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓの設計を図１８に示す。
【０１４０】
生じるタンパク質の一次構造は図１９ａ（配列番号７）に示される配列を有する。上記タンパク質の設計に対応するコーディング配列（図１９ｂ、配列番号８を参照）を大腸菌発現プラスミド内に、バクテリオファージλに由来するλｐＬプロモーターの制御下に配置した。この大腸菌発現プラスミドにおいては、ＰＬプロモーターはそのＰＬプロモーターの前のオペレーター領域に結合するｃＩリプレッサーによって厳密に調節される。
【０１４１】
２．−チオレドキシン−ユビキチン−プロテインＤ１／３−Ｅ７融合タンパク質を生成させるためのクローニングストラテジー
出発物質は以下の通りである：
−三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３をコードするプラスミドｐＲＩＴ１５０２１（ｐＴＵｂｉＭ３）。
−Ｃ末端がポリヒスチジンテールで伸長されている融合タンパク質ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７のコーディング配列を担持するプラスミドｐＲＩＴ１４５０１（ＴＣＡ３０８）（ＷＯ ９９／１０３７５）。
【０１４２】
このクローニングストラテジーは２つの工程を含んでいた：
ａ）−発現ベクターｐＲＩＴ１５０８９（ＴＣＡＪ１５）の構築（図２０）。三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３をλｐＬプロモーターの制御の下に含むプラスミドｐＲＩＴ１５０２１をＡｆＩＩＩおよびＰｓｔＩ制限酵素で消化し、３７８２ｂｐの制限断片ＡｆＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片を精製した後、コーディング鎖：［５’ ＴＴＡ ＡＧＡ ＣＴＡ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＣＣ ＣＧＧ ＧＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＴＧＣ Ａ ３’］および相補鎖：［５’ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＧＣ ＡＧＧ ＡＴＣ ＣＡＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＣＴ ＴＡＧ ＴＣ ３’］から構成される合成アダプターと連結した。この連結により、異種タンパク質をチオレドキシン−ユビキチン融合体の下流に融合させて三重融合体を生成するのに有用な多重クローニング部位を含むベクターｐＲＩＴ１５０８９が生成した。
【０１４３】
ｂ）−融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７を発現するプラスミドであるｐＲＩＴ１５１０６（ＴＣＡＪ１７）の構築（図２１を参照）。
【０１４４】
プラスミドベクターｐＲＩＴ１５０８９をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、プラスミドｐＲＩＴ１４５０１（ＴＣＡ３０８）の制限消化から精製される６７４ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結して、三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７を発現するプラスミドｐＲＩＴ１５１０６（ＴＣＡＪ１７）を得た。
【０１４５】
３．−融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７ Ｈｉｓを発現する株Ｂ１３５７＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１０６）の獲得
プラスミドｐＲＩＴ１５１０６（アンピシリン耐性）を、アンピシリンに対して耐性である形質転換体を選択することにより、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の大腸菌株ＧＩ７２４（Ｆ−、λ−、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＰＬ８、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ、ｃＩ）に導入した。ＧＩ７２４は、細菌染色体内に遺伝子操作されたｃＩリプレッサー遺伝子を厳密に調製されたトリプトファンプロモーターの制御下に含み、これはトリプトファンの添加によって目的遺伝子の発現を可能にする。Ｂ１３５７の増殖および導入は、実施例Ｉ、第４節に前述される通りに行った。
【０１４６】
実施例ＸＩＩＩ：
融合パートナーなしにプロテインＤ１／３−Ｅ７ Ｈｉｓを発現するＢ１３４４＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５０９７）を発現する大腸菌株の調製
１．−融合パートナーなしにプロテインＤ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを発現する対照対応物であるプラスミドｐＲＩＴ１５０９７（ＴＣＡＪ１９）の構築
出発物質は以下の通りである：
−プラスミドベクターｐＲＩＴ１５０８９（ＴＣＡＪ１５）。
−ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓのコーディング配列を担持するプラスミドｐＲＩＴ１４５０１（ＴＣＡ３０８）。
【０１４７】
このクローニングストラテジーが図２２に概述される。プラスミドベクターｐＲＩＴ１５０８９をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、プラスミドｐＲＩＴ１４５０１の制限消化から精製される６７７ｂｐのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と連結する。これは、ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを発現するプラスミドｐＲＩＴ１５０９７（ＴＣＡＪ１９）を生じる。
【０１４８】
２．−融合パートナーなしにプロテインＤ１／３−Ｅ７を発現する対照対応株Ｂ１３４４＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５０９７）の生成
プラスミドｐＲＩＴ１５０９７（アンピシリン耐性）を、アンピシリン（１００μｇｒ／ｍｌ）に対して耐性である形質転換体を選択することにより、大腸菌ＧＩ７２４（Ｆ、λ−、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＰＬ８、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ、ｃＩ）に導入した。Ｂ１３４４株の増殖および導入は、実施例Ｉ、第４節に前述される通りに行った。
【０１４９】
実施例ＸＩＶ：
融合体チオレドキシン−ユビキチン−プロテインＤ１／３−Ｅ７ ＨｉｓおよびＵＢＰ１を発現するＢ１３４７＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１０６、ｐＲＩＴ１５０２２）を発現する大腸菌株の調製
１．−サッカロミセス・セレビシエ由来のユビキチナーゼＵＢＰ１を構成的に発現するプラスミドｐＲＩＴ１５０２２の構築
図５および実施例ＩＩＩ、§１を参照。
【０１５０】
２．−融合体チオレドキシン−ユビキチン−プロテインＤ１／３−Ｅ７ ＨｉｓおよびユビキチナーゼＵＢＰ１を発現する株Ｂ１３４７＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１０６、ｐＲＩＴ１５０２２）の生成
大腸菌株ＧＩ７２４（Ｆ−、λ−、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＰＬ８、ａｍｐＣ：：Ｐｔｒｐ、ｃＩ）を、アンピシリンおよびカナマイシンに対して耐性である形質転換体を選択することにより、プラスミドｐＲＩＴ１５１０６（アンピシリン耐性）およびｐＲＩＴ１５０２２（カナマイシン耐性）で同時形質転換した。プラスミドｐＲＩＴ１５０２２はサッカロミセス・セレビシエのユビキチナーゼＵＢＰ１を構成的に発現し、これはｉｎ ｖｉｖｏでの三重融合体からの目的のタンパク質の開裂を可能にする。Ｂ１３４７株の増殖および誘導は、実施例Ｉ、第４節に前述されるように行った。
【０１５１】
実施例ＸＶ：
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−プロテインＤ１／３−Ｅ７ Ｈｉｓおよび組換えで発現した融合体チオレドキシン−ユビキチン−プロテインＤ１／３−Ｅ７ Ｈｉｓのｉｎ ｖｉｖｏプロセシングの特徴付け
１．−抽出物の調製／クーマシー染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミド１２．５％ゲルおよびウェスタンブロットでの分析
凍結細胞を解凍し、ＰＢＳバッファーに再懸濁させた。細胞を細胞破壊機Ｏｎｅ Ｓｈｏｔにおいて破壊した。遠心分離（２０分、１６０００ｇ、４℃）の後、ペレット、上清および全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質をクーマシーブルー染色ゲルで可視化し、抗ＨＰＶ１６Ｅ７（Ｚｙｍｅｄ）および抗ｈｉｓテール・モノクローナル抗体（ＱｉａｇｅｎのＰｅｎｔａｈｉｓ）を用いるウェスタンブロットによって同定した。これを図２３に示す。
【０１５２】
上記実験アプローチは、ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７単独、ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７三重融合形態および同じ遺伝子系（ｐＬプロモーター、トリプトファン誘導、３０℃）を用いてｉｎ ｖｉｖｏでプロセシングされたＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７の発現パターンの比較を可能にしている。
【０１５３】
２．−結果および結論
融合パートナーなしにＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７を発現する対照対応株Ｂ１３４４＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５０９７）については、クーマシーゲルにおいて僅かに可視であり、かつ半分が上清中に、および半分がペレット中に分布する約３３ＫＤの主要バンドが検出された。
【０１５４】
株Ｂ１３５７＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１０６）については、三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７ Ｈｉｓに対応する約５６ＫＤのバンドがクーマシーゲルにおいて可視であり、かつ抗Ｅ７（Ｚｙｍｅｄ）および抗ｐｅｎｔａｈｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ）モノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットにおいて同定された。
【０１５５】
三重融合体のｉｎ ｖｉｖｏ開裂について試験するため、三重融合体およびＵＢＰ１を同時に発現する株Ｂ１３４７＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１０６、ｐＲＩＴ１５０２２）を発現させた。クーマシーゲルにおいて高度に可視であり、かつ約３３ＫＤおよび２５ＫＤに見出される２種類の生成断片が得られた。主として上清中に存在する３３ＫＤバンドは、ウェスタンブロットによって示されるようにプロセシングされたＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７タンパク質を表し（図２３）、２５ＫＤのバンドは開裂した融合パートナー・チオレドキシンおよびユビキチンに対応する。
【０１５６】
実施例ＸＶＩ：
ｐＴＲＣプロモーターの制御下でサッカロミセス・セレビシエ由来のユビキチナーゼ（ＵＢＰ１）を発現する適合性プラスミドの構築
１．−ＩＰＴＧで誘導可能な適合性ユビキチナーゼ発現プラスミドｐＲＩＴ１５１１３（ＴＣＡＪ２０）の構築
上記プラスミドの獲得に必要な異なる工程の概略が図２４に示されている。第１工程は、ユビキチナーゼ・コーディング配列をベクターＴＲＣ９９Ａ内のＴＲＣプロモーター（Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入、カタログ番号２７−５００７−０１）の制御下に導入することからなる（図２４ａ）。ｐＲＩＴ１５０５４（ＴＣＡＪ１１）は、（ＰＣＲによって生成した）ＵＢＰ１の１１３ｂｐ ＮｃｏＩ−ＣｌａＩ断片がｐＣＲＩＩ−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号Ｋ４６５０−０１）にクローニングされている中間構築物である。この操作の結果として、ＵＢＰ１ ＡＴＧコドンと重複するＮｃｏＩクローニング部位が作製されている。第２工程として、ＴＣＡＪ１８（ｐＲＩＴ１５１１６）からの断片ＳｐＨＩ−ＳａｌＩが適合性ベクターｐＡＣＹ１８４（Ｎｅｗ Ｅｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから購入、カタログ番号Ｅ４１５２Ｓ）に導入されている（図２４ｂ）。
【０１５７】
２．−融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７−ｈｉｓおよび誘導性ＵＢＰ１を発現する大腸菌株Ｂ１５００＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１０６、ｐＲＩＴ１５１１３）の調製
プラスミドｐＲＩＴ１５１１３を、三重融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３を発現する受容菌株（実施例ＸＩＩを参照）に形質転換し、大腸菌株Ｂ１５００＝ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１０６、ｐＲＩＴ１５１１３）を得た。
【０１５８】
この株を、トリメラ（ｔｒｉｍｅｒａ）融合体の発現および誘導後の２つの異なる時点でのトリメラのｉｎ ｖｉｖｏプロセシングについて特徴付けた。２つの試験した条件で、トリメラＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７の効率的な開裂が生じた。加えて、プロセシング開裂が同時翻訳的に生じないとき、すなわち、ＵＢＰ１酵素の誘導が後に発酵の間に、ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７三重融合体の誘導後、全トリメラがひとたび発現したときに生じる場合、より高レベルの開裂タンパク質を観察することができる。
【０１５９】
結論
本発明者らは、本発明に従って開発される系が、改善された溶解性およびより良好な折り畳みを備える目的の組換えポリペプチドの産生につながっていることを示している。より良好な折り畳みに関連するものと思われるより良好な溶解性は封入体に会合していることが見出される組換え産物の割合がより低いことによって実験的に定義され、タンパク質上清およびペレットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とそれに続くクーマシーブルー染色、走査および画像濃度計測によるその走査の分析により；または変性剤を用いて封入体から組換え産物を可溶化する可能性の増加により評価される。ユビキチナーゼによる目的のポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ開裂は、ユビキチナーゼが構成性および誘導性のプロモーターの制御下にある条件において達成されている。
【０１６０】
本発明者らは、説明される方法が、フラスコ培養において、系の産業的アップスケールに適合する発現収率を生成し得ることを示しており、これは産業的重要性を有するタンパク質の製造を可能にする。実際のスケールアップ、パラメータ化培養はさらに良好な発現結果を生じ得る。
【０１６１】
最後に、この発現ベクターを、融合パートナーから下流の幅広いクローニングが可能となるように遺伝子操作し、様々なタンパク質の発現について試験することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３−Ｈｉｓ融合体の設計を示す図である。
【図２】
融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＭＡＧＥ３ ＨＩＳの配列を示す図である。図２ａはヌクレオチド配列（配列番号１）を示し、図２ｂはアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】
ｐＲＩＴ １５０２１を構築するためのクローニング方法を示す図である。図３ａはクローニング方法を示し、図３ｂは得られる発現プラスミドを示す。
【図４】
ｐＲＩＴ １５０６９を構築するためのクローニング方法を示す図である。
【図５】
酵母ＵＢＰ１をコードするプラスミドの構築を示す図である。
【図６】
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓ、融合タンパク質ユビキチン−Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓ、および組換えによって発現された融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓの、ｉｎ ｖｉｖｏプロセシングの特性解析を示す図である。
【図７】
チオレドキシンおよびユビキチンに融合させた組換えタンパク質を発現するように設計されたベクターｐＲＩＴ１５０８８の構築を示す図である。
【図８】
融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１（ａａ５５→５５３）を発現するプラスミドであるｐＲＩＴ１５０９０の構築を示す図である。図８ａはＰ５０１Ｓ（５５→５５３）を発現するｐＲＩＴ １５０６３の制限マップを示し、図８ｂはｐＲＩＴ １５０９０のクローニング方法を示す。
【図９】
融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（ａａ５５→５５３）Ｈｉｓの配列を示す図である。図９ａはヌクレオチド配列（配列番号３）を示し、図９ｂはアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図１０】
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（５５→５５３）Ｈｉｓおよび組換えによって発現された融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（５５→５５３）Ｈｉｓのｉｎ ｖｉｖｏプロセシングの特性解析を示す図である。この融合体は、ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５０９０）およびＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５０２２、ｐＲＩＴ１５０９０）によって３０℃で発現させた。
【図１１】
チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）−Ｈｉｓ融合体の設計を示す図である。
【図１２】
融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）Ｈｉｓの配列を示す図である。図１２ａはアミノ酸配列（配列番号５）を示し、図１２ｂはヌクレオチド配列（配列番号６）を示す。チオレドキシンおよびリンカー配列は通常のフォントで表し、ユビキチン配列はイタリック体で表し、Ｐ５０１Ｓアミノ酸配列はボールド体で表す。
【図１３】
発現ベクターｐＲＩＴ１５０８８（ＴＣＡＪ１４）の構築を示す図である。
【図１４】
融合体チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）Ｈｉｓを発現するプラスミドであるｐＲＩＴ１５１１５（ＴＣＡＪ２１）の構築を示す図である。
【図１５】
融合パートナーであるチオレドキシンおよびユビキチンを含まないＰ５０１Ｓ（１−３２０）を発現する対照対応物である、プラスミドｐＲＩＴ１５１３９（ＴＣＡＪ２３）の構築を示す図である。
【図１６】
ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１１５）による融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１−３２０）の発現、およびＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１１５、ｐＲＩＴ１５０２２）による３０℃でプロセシングされたＰ５０１Ｓ（１−３２０）を示す図である。
【図１７】
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−Ｐ５０１Ｓ（１→３２０）と比較した、融合パートナーを含まない対照対応物ＧＩ７２４（ｐＲＩＴ１５１３９）の発現を示す図である。
【図１８】
チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３ Ｅ７−Ｈｉｓ融合体の設計を示す図である。
【図１９】
チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３ Ｅ７−Ｈｉｓ融合体の配列を示す図である。図１９ａはアミノ酸配列（配列番号７）を示し、図１９ｂはヌクレオチド配列（配列番号８）を示す。チオレドキシンおよびリンカー配列は通常のフォントで表し、ユビキチン配列はイタリック体で表し、プロテインＤ１／３−Ｅ７アミノ酸配列はボールド体で表す。
【図２０】
発現ベクターｐＲＩＴ１５０８９（ＴＣＡＪ１５）の構築を示す図である。
【図２１】
融合体チオレドキシン−ユビキチン−ＰｒｏｔＤ１／３−Ｅ７を発現するプラスミドであるｐＲＩＴ１５１０６（ＴＣＡＪ１７）の構築を示す図である。
【図２２】
融合パートナーを含まないプロテインＤ１／３−Ｅ７−Ｈｉｓを発現する対照対応物であるプラスミドｐＲＩＴ１５０９７（ＴＣＡＪ１９）の構築を示す図である。
【図２３】
融合タンパク質チオレドキシン−ユビキチン−プロテインＤ１／３−Ｅ７ Ｈｉｓおよび組換えによって発現された融合体チオレドキシン−ユビキチン−プロテインＤ１／３−Ｅ７ Ｈｉｓのｉｎ ｖｉｖｏプロセシングの特性解析を示す図である。
【図２４】
ＴＲＣプロモーターの制御下でユビキナーゼ（ＵＢＰ１）を発現する適合性プラスミドの構築を示す図である。図２４ａは、ベクターＴＲＣ９９ＡにおけるＴＲＣプロモーターの制御下へのユビキナーゼ・コーディング配列の導入を示す。図２４ｂは、ＴＣＡＪ１８（ｐＲＩＴ１５１１６）由来のＳｐＨ Ｉ−Ｓａｌ Ｉ断片の、ｐＡＣＹ１８４適合性ベクター中への移行を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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