(57)【要約】本発明は、生物が利用可能な葉酸、すなわち増大した比率のモノグルタミル葉酸および減少した比率のポリグルタミル葉酸を有する葉酸を、活性な異種または同種のポリグルタミルヒドロラーゼ活性を含むか、または葉酸生合成酵素の活性が増大された、食物グレードの微生物を培養することによって産生する方法を提供する。ポリグルタミルヒドロラーゼをコードする遺伝子および葉酸生合成酵素は、種々の起源のもの、たとえば齧歯類またはヒトを含むその他の哺乳類由来であってもよい。また、食料、特にこのようなモノグルタミル葉酸産生微生物を含む乳製品が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に改変された食品グレードの微生物であって、前記改変は、改変されていない微生物によって産生される量と比較して、産生されるモノグルタミル葉酸の量の増大を生じる微生物。
【請求項２】
モノグルタミル葉酸の合成に関与する少なくとも1つの酵素活性が増大されている、請求項1に記載の微生物。
【請求項３】
前記酵素がgch遺伝子によってコードされるGTPシクロヒドロラーゼを含む、請求項2に記載の微生物。
【請求項４】
ガンマ-グルタミルヒドロラーゼの活性が増大されている、請求項1に記載の微生物。
【請求項５】
前記増大された酵素活性が、対応する遺伝子の多数のコピーが存在した結果として生じる、請求項2または3に記載の微生物。
【請求項６】
前記増大された酵素活性が、対応する遺伝子の発現を増強するプロモーターが存在した結果として生じる、請求項2または3に記載の微生物。
【請求項７】
前記酵素活性をコードする遺伝子が動物起源、特に哺乳類起源である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項８】
前記酵素活性をコードする遺伝子が植物起源である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項９】
前記酵素活性をコードする遺伝子が食品グレードの微生物起源、特に乳酸菌または酵母に由来する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項１０】
乳酸菌である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項１１】
モノグルタミル葉酸を製造する方法であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載の微生物を培養することと、産生された葉酸を回収することとを含む方法。
【請求項１２】
請求項1〜10のいずれか1項に記載の微生物の有効な量を投与することを含む、哺乳類の胃腸管に生物が利用可能な葉酸を供給する方法。
【請求項１３】
請求項1〜10のいずれか1項に記載の微生物を含む、食物製品。
【請求項１４】
乳製品である、請求項13に記載の食物製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、遺伝的に改変された微生物を使用する葉酸特に、生物が利用可能な葉酸、すなわち哺乳類胃腸管に容易に吸収されることができる葉酸の産生の増大に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
葉酸（N-[4-{[（2-アミノ-1,4-ジヒドロ-4-オキソ-6-プテリジニル）メチル]アミノ}ベンゾイル]-L-グルタミン酸;ビタミンB11;ビタミンM）は、造血性ビタミンであり、ヒトおよび動物の健康並びに治癒において重要な役割を果たすものとしてすます認識されている。哺乳類が葉酸を産生することはできない。葉酸の主要な供与源は、植物、特にホウレンソウおよびその他の緑の葉の野菜、草、酵母、およびその他の微生物であり、間接的には動物の器官（腎臓、肝臓）である。葉酸の補充は、現在、それ自体をまたはビタミン標品として投与することによって行われている。しかし、規則的な食餌以外のこのようなビタミンの投与は、高価であり、必ずしも適していない。
【０００３】
葉酸は、多数の異なる葉酸誘導体に対する一般的な用語であり;これらは、酸化の状態、プテリジン環の1炭素の置換、およびグルタミン酸残基の数において異なる。これらの相違は、種々の生理化学的性質に関連し、これは、一定の食物成分と共に葉酸の生物学的利用能に影響を与える可能性がある。葉酸の生物学的利用能の1つの重要な因子は、葉酸の安定度である。酸素、熱、および最も重要なことに、胃の酸性消化の環境への暴露により、葉酸の不安定度を増大させる。食物におけるアスコルビン酸および還元チオールなどの抗酸化物質の存在により、この不安定性から保護される。
【０００４】
葉酸の生物学的利用能に影響を与えるもう一つの因子は、葉酸におけるポリグルタミル残基の存在である。入手可能な情報では、モノグルタミル葉酸の生物学的利用能がポリグルタミル葉酸の生物学的利用能よりも高いことを示す。ポリグルタミル葉酸は、これらが小腸によって吸収される前に、それぞれのモノグルタミル誘導体に加水分解されなければならない。この変換は、腸管のヒドロラーゼによって触媒される。しかし、これらの酵素は、一部の食物に見られる成分によって阻害を受けやすい。さらに、これらの酵素の活性は、グルタミン酸鎖長（Gregory 1989）によっても影響され得る。モノグルタミル誘導体として葉酸が存在することにより、葉酸の生物学的利用能が増大されると結論付けることができる。
【０００５】
葉酸は、肉、野菜、および乳製品などの食物製品に存在する。モノグルタミル葉酸の量およびそれ故に葉酸の生物学的利用能は、卵黄（72%のモノグルタミル葉酸、MGF）、ウシ肝臓（56%のMGF）、オレンジ液汁（21%のMGF）、キャベツ（6%のMGF）、アオイマメ（5%のMGF）、およびレタス（1%未満のMGF）について解析されたとおり、（Seyoum and Selhub, 1998）、食物製品間でかなり変化する。
【０００６】
乳酸菌の細胞内に貯蔵された葉酸は、主にポリグルタミル葉酸の形態で存在している。微生物におけるポリグルタミル葉酸のグルタミン酸末端部の機能の1つは、細胞における葉酸の保持である（Shane and Stokstad, 1975）。その結果、ポリグルタミル葉酸が胃腸（GI）管を介して排泄される間に細菌内に残ってしまい、それ自体を人体によって取込むために利用できない。この課題は、モノグルタミル葉酸の量を増大させ、それ故に細胞内に貯蔵される葉酸の保持を減少させることによって解決される可能性がある。
【０００７】
葉酸は、前駆体GTP、パラアミノ安息香酸、およびグルタミン酸から多酵素経路で合成することができる（図1を参照されたい）。乳酸菌ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）を含むいくつかの微生物において、この経路の-gch、folC、folP、dhna、hppk、およびdhfr-をコードする遺伝子が遺伝子クラスターに組織化されている。GTPシクロヒドロラーゼI（gch、EC3.5.4.16）は、GTPから中間体を介したジヒドロネオプテリン三リン酸への反応を触媒し、ギ酸塩を放出する。次いで、リン酸残基が、おそらくホスファターゼ（Pase）の作用によって除去される。ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ（EC4.1.2.25）は、前者の反応生成物に作用して、グリコールアルデヒドおよび6-ヒドロキシメチル-7,8-ジヒドロプテリンを合成し、これが2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ（hppk、EC2.5.1.15）によって、6-ヒドロキシメチル-7,8-ジヒドロプテリンピロホスフェートに変換される。ジヒドロプテロアートシンターゼ（EC2.7.6.3）は、パラ-アミノ安息香酸に結合して7,8-ジヒドロプテロアートを産生する。葉酸シンターゼ（folC、EC6.3.2.17）は、グルタミン酸をジヒドロプテロアートに結合して、ジヒドロ葉酸を産生する。テトラヒドロ葉酸をジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr、EC1.5.1.3）によってさらに還元した後、ホリル（folyl）ポリグルタミン酸シンターゼ（folC、EC6.3.2.17）により、これまでに結合したグルタミン酸残基の側鎖のカルボキシル基に対してグルタミン酸を付加し、ポリグルタミルテトラヒドロ葉酸を最終的に生成する（図1には示さず）。
【０００８】
WO01/00845は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の葉酸合成に関与する4つの酵素:GTPシクロヒドロラーゼI（FolE）、ジヒドロプテロアートシンターゼ（FolB）、ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ（FolP）、および2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-メチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ（FolK）の配列情報を含む。また、これは、これらのコリネバクテリウム（Corynebacterium）遺伝子をコリネバクテリウム（Corynebacterium）またはその他の微生物に導入することを示唆するが、どの特定の遺伝子が使用され、どのような結果が予想されるかについての手引きは全くない。さらに、これらの酵素をコードする遺伝子のゲノムの構成は、一方のコリネバクテリウムと、バチルス（Bacillus）、乳酸菌、および酵母などの他方の他の微生物との間で大幅に異なっている。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
今回、多くの葉酸を産生するだけでなく、生物が利用可能な形態で葉酸を産生することもできる微生物を調製することができることが見出された。したがって、本発明は、ポリグルタミル葉酸を産生することができ、活性な異種のまたは同種のガンマ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子を含む組換え微生物、または個々の生合成遺伝子の過剰発現によってより多くの葉酸を産生するだけでなく比較的小量のポリグルタミル葉酸を産生することができることにより、外部に葉酸を排出するのに有利なように遺伝的に改変された微生物を提供する。本発明は、さらに適切な、好ましくは微生物の調節配列と共にガンマ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子またはGTPシクロヒドロラーゼ遺伝子などの生合成遺伝子を含む発現カセットを、並びに葉酸を産生し、かつこのような発現カセットを含む微生物を培養することによって葉酸を産生するための方法を提供する。また、本発明は、生物が利用可能な多量の葉酸を産生する微生物を含む食料、特にヨーグルトなどの乳製品、およびその他の発酵した食料を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な記載
本発明は、葉酸、特に生物が利用可能な葉酸、すなわち哺乳類の胃腸管によって容易に吸収される得る葉酸の産生を増大することに関する。本発明は、種々の葉酸誘導体をより多く産生すること、およびインビボにおいて生物によって産生される種々のポリグルタミル葉酸誘導体をモノグルタミル葉酸誘導体に変換することに向けられる。本発明の主要な結果は、3つである：
−第１に、本発明は、ポリグルタミル葉酸誘導体とモノグルタミル葉酸誘導体との間の比を変化してモノグルタミル葉酸誘導体を有利にすることにより、一般に葉酸誘導体および特にモノグルタミル葉酸誘導体の生物学的利用能を増大させる。
【００１１】
−第２に、本発明は、葉酸を産生する宿主細胞の細胞内における葉酸誘導体の保持を制限し、細胞外環境への葉酸の拡散または輸送の増大を増強する。その結果、細胞内に貯蔵された葉酸は、哺乳類の胃腸管よる取込みに利用することができないので、葉酸の生物学的利用能が増大する。
【００１２】
−第３に、本発明は、細胞がより多くの総葉酸量を産生することを可能にする。
【００１３】
したがって、本発明は、モノグルタミル葉酸の生合成に関与する同種または異種の酵素を過剰生産すること、または活性な異種グルタミルヒドロラーゼ遺伝子を含むことにより、細胞内葉酸をより高レベルで産生することができる微生物に関する。活性なグルタミルヒドロラーゼ遺伝子は、発現の際にポリグルタミル葉酸を脱結合してモノグルタミル葉酸にすることができる酵素を得る遺伝子であとる理解される。
【００１４】
本発明によって使用される葉酸生合成遺伝子は、以下の葉酸遺伝子クラスターの遺伝子の1つでもあってもよい：GTPシクロヒドロラーゼI（gch）、ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ（dhna）、および2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ（hppk）、またはgchとhppkなどのその組合せ。変化された酵素活性は、たとえば同種または異種遺伝子の多数のコピーの存在により、および／またはこれらの遺伝子のための強力なプロモーターの存在により、上述した遺伝子によってコードされる酵素の発現を変化した結果として生じてもよい。変化された活性は、増強された活性または減少された活性であってもよく、どちらのものもモノグルタミル葉酸産生の相対的な増大を生じる。
【００１５】
ジヒドロプテロアートシンターゼ（dps）または葉酸シンターゼ（folC）の発現の増強にでは、葉酸産生の増大を引き起こさず、およびジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）の発現の増強では、葉酸産生の減少さえも生じる。本発明に従って最も葉酸産生を増大するための好ましい遺伝子は、gchである。
【００１６】
グルタミルヒドロラーゼは、エンドペプチダーゼ、すなわちポリグルタミル鎖の内部に作用して、単一工程でポリグルタミル鎖の除去を生じるグルタミルヒドロラーゼであってもよい。また、グルタミルヒドロラーゼは、エキソペプチダーゼ、すなわち頻回の工程でポリグルタミル鎖の末端からグルタミル残基を切断して、モノグルタミルの除去を生じる酵素であってもよい。エンドグルタミルヒドロラーゼ遺伝子は、たとえばラットから生じることができるが、エキソグルタミルヒドロラーゼ遺伝子は、たとえばヒト起源から入手可能である。
【００１７】
微生物に導入されるグルタミルヒドロラーゼ遺伝子および葉酸生合成遺伝子は、オリジナルの（改変されていない）遺伝子であってもよい。また、これらは、少なくともグルタミルヒドロラーゼおよび葉酸生合成酵素の触媒ドメインをコードする領域を含む改変された遺伝子であってもよい。特に、異種遺伝子によってコードされるグルタミルヒドロラーゼは、従来のBLASTアルゴリズムを使用して決定されるものとして、Yaoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, 93（19）: 10134-8 and J. Biol. Chem. 1996 271（15）: 8525-8によって記載されたとおりのラットまたはヒトのガンマ-グルタミルヒドロラーゼのアミノ酸配列と少なくとも65%の配列一致性、特に少なくとも75%の一致性を有し、および／またはそのコード配列は、ストリンジェントな条件下でYaoらによって記載されたヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
【００１８】
「葉酸」の用語は、葉酸、並びにその任意の塩、エステル、およびメチル化された誘導体を含む誘導体を包含する。「ポリグルタミル葉酸」の用語は、その側鎖に少なくとも2つの隣接するグルタミル残基を有する葉酸をいうが、「モノグルタミル葉酸」は、実質的な比率で、すなわち葉酸分子の少なくとも25%が、1つのグルタミル基だけを有するような葉酸をいう。
【００１９】
したがって、本発明は、脊椎動物、植物、真菌、または食物グレードの微生物の細菌から生じるガンマ-グルタミルヒドロラーゼをコードする遺伝子または葉酸生合成遺伝子の細胞内発現であって、細胞内ガンマ-グルタミル加水分解活性を生じるものに属する。特に好ましくは、ラット（Yaoら、1996a）、ヒト（Yaoら、1996b, US 5,801,031）, シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana ）（Huangpuら、1996）、大豆（Huangpuら、1996）由来、並びにグラム陽性細菌の枯草菌（Bacillus subtilis）（Margotら、1999）、バチルス・スフェリウス（Bacillus sphaericus）（Hourdouら、1992）、およびバチルス・インターメディウス（Bacillus intermedius）（Leshchinskayaら、1997）由来のガンマ-グルタミルヒドロラーゼ、並びにこれらのタンパク質と少なくとも65%または少なくとも75%の配列同一性を有する機能的に同等なヒドロラーゼである。さらに詳細には、本発明は、構成的にまたは誘導性に遺伝子の有効な発現を生じるような方法で、プラスミドにおけるまたは食物グレード微生物のクロモソーム中の言及したガンマ-グルタミルヒドロラーゼをコードする遺伝子を組込むことに基づく。
【００２０】
また、本発明は、上述したガンマ-グルタミルヒドロラーゼをコードする遺伝子または葉酸生合成遺伝子をコードする遺伝子を、完全にまたは部分的に活性な酵素が得られるような方法で発現することに関する。これらの酵素の活性により、いずれもポリグルタミル葉酸誘導体の脱結合を生じる。この反応では、モノグルタミン酸残基および／またはポリグルタミン酸残基をポリグルタミル葉酸誘導体から酵素処理で加水分解して、モノグルタミル葉酸誘導体を作製するか、または葉酸は、単一のグルタミン酸残基のみを含むような方法で合成される。
【００２１】
したがって、本発明は、上記の通りの葉酸生合成遺伝子の過剰発現により、葉酸全体の、特にガンマ-グルタミルヒドロラーゼをコードする遺伝子の発現の後にポリグルタミル葉酸誘導体から、またはポリグルタミル部分の付着を伴わずに直接生じるモノグルタミル葉酸誘導体の産生を増大させることができる。これにより、細胞内におけるポリ-グルタミル葉酸誘導体の保持が制限され、細胞膜を超えて細胞外環境へモノグルタミル葉酸の活発な受動的な輸送を増大させることが可能になる。その結果、これは一般に葉酸誘導体の、および特に発酵食品においてモノグルタミル葉酸誘導体の産生並びに生物学的利用能の増大を生じる。
【００２２】
後述する実施例1に示したとおり、ラットまたはヒト起源に由来するガンマ-グルタミルヒドロラーゼの乳酸菌および細菌における細胞内発現および翻訳により、ポリグルタミル葉酸のモノグルタミル葉酸への脱結合、細胞内葉酸の保持の減少、モノグルタミル葉酸の増大、および細胞外葉酸の増大を生じる。したがって、本発明に従った製品およびプロセスは、発酵食品における葉酸の生物学的利用能の増大を引き起こす。この生物学的利用能の増大は、2つの現象の結果である。第１に、モノグルタミル葉酸の増大は、天然の腸管における、ポリグルタミル葉酸を脱結合するためのヒドロラーゼ活性の必要性を制限し、これは、一定の食物成分に対して腸管ヒドロラーゼの活性が感受性であるのために、有利である。第２に、微生物に発現されるガンマ-グルタミルヒドロラーゼの活性は、細胞における葉酸の保持を制限して細胞外の葉酸濃度の増大を生じ、これは、乳酸菌がGI管を介して排泄される間に無傷のままで、それ故に葉酸が放出されない条件下において有利である。さらに、細胞からの（モノグルタミル）葉酸の搬出の増大は、フィードバックコントロールの減少によってら生じる葉酸生合成の全体的な速度を増大させるであろう。
【００２３】
実施例2は、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）におけるGTP-シクロヒドロラーゼ（EC3.5.4.16）のおよび2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ（EC2.7.6.3）の過剰発現の効果を示す。L.lactisでは、遺伝子gchは、これらの二つの酵素の二機能性タンパク質をコードする。この効果は、組換えL.lactisを使用する培養における全体的な葉酸産生が増大されりだけでなく、ポリグルタミル葉酸の代わりにモノグルタミル葉酸が特異的に増する。これは、folC遺伝子によってコードされるホリルポリグルタミン酸シンターゼ酵素（folyl polyglutamate sysnthase enzyme ）の、GTP-シクロヒドロラーゼの過剰発現の際により高いフラックスの葉酸生合成に適応させるには不十分な比較的低い活性によって説明することができる。モノグルタミル葉酸は、L.lactis細胞からより容易に排出され、葉酸レベルが増大しただけでなく、生物が利用可能な形態で発酵ブロスを生じ、モノグルタミル形態として培地に排出される。
【００２４】
実施例1は、ラットまたはヒト起源由来のガンマ-グルタミルヒドロラーゼ、および（ポリ/モノ）-グルタミル葉酸を産生する乳酸菌としてのラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）株NZ9000に関するが、本発明は、一般的にその他のガンマ-グルタミルヒドロラーゼのいずれをも、特に食物グレードのガンマ-グルタミルヒドロラーゼを包含する。乳酸菌に発現することができるその他のガンマ-グルタミルヒドロラーゼの例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、大豆、またはバシラス・インターメディウス（Bacillus intermedius）起源のものである。また、本発明は、その他の乳業用乳酸菌、酵母、および真菌などの、L.lactis株NZ9000以外の任意のその他の食物グレード微生物の言及したガンマ-グルタミルヒドロラーゼの発現も包含する。実施例では、成熟ラットまたはヒトのガンマ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子をナイシン誘導性のプロモータの後にクローン化した。また、本発明は、種々の誘導性のプロモーター、たとえばラクトースオペロンに存在するプロモーター（Van Rooijenら、1990、1992）、また構成的プロモーター、たとえばpepN遺伝子（タンら、1992）の制御下におけるガンマ-グルタミルヒドロラーゼの発現を包含する。
【００２５】
実施例2は、同種のgch遺伝子によってコードされるGTP-シクロヒドロラーゼをラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に過剰発現して、葉酸をより高産生することおよびポリグルタミル葉酸に対してモノグルタミル葉酸を特異的に増大することに関するが、本発明は、その他の同種および異種の葉酸生合成遺伝子（たとえばdhnaおよび／またはhppkであるが、FolP（dps）、FolC、またはdhfrではない）のL.lactisにおける過剰発現も包含する。さらに、本発明は、L.lactisのNZ9000株以外のその他の乳業用乳酸菌、酵母、および真菌などの、その他の食物グレード微生物におけるこれらの葉酸生合成遺伝子の発現を包含する。実施例2では、gch遺伝子をナイシン誘導性のプロモータの後にクローン化した。また、本発明は、種々の誘導性のプロモーター、たとえばラクトースオペロンに存在するプロモーター（Van Rooijenら、1990、1992）、また構成的プロモーター、たとえばpepN遺伝子（Tanら、1992）の制御下におけるGTP-シクロヒドロラーゼおよび選択的にその他の葉酸生合成のな酵素の発現を包含する。
【実施例】
【００２６】
実施例1
材料および方法
成熟したエキソペプチダーゼのヒト・ガンマ-グルタミルヒドロラーゼは、ベクターpCR2にクローン化した完全長cDNA（Yaoら、1996a）からPCR法を使用して得た。ベクターは、The Laboratory of Molecular Diagnostics from the Wadsworth Center, Albany, New Yorkから提供された。成熟したヒト・ガンマ-グルタミルヒドロラーゼをコードする885塩基対のPCR産物は、以下のプライマーを使用することによって得た：
HGF-f（CATGCCATGGGACCCCACGGCGACACCGCCAAG）および、
HGF-r（GCTCTAGATCAATCAAATATGTAACATTGCTG）
フォワードプライマーを5'末端で伸長して、ベクターpNZ8048（Kuipersら）内に誘導性のナイシンプロモーターとの転写性融合を可能にするNcoI制限部位を作製した。言及したフォワードプライマーの使用により、成熟した遺伝子においてわずかな修飾（イタリックで表したヌクレオチド）を生じた。リバースプライマーを3'末端で延長して、ベクターpNZ8048内に付着末端ライゲーションを可能にするXbaI制限部位を作製した。成熟ヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子を有する新しく合成したベクターは、pNZ7001と名付けた。
【００２７】
成熟エンドペプチダーゼのラット・ガンマ-グルタミルヒドロラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応法を使用してベクターpCR3中にクローン化された完全長cDNA（Yaoら、1996b）から得た。ベクターは、Wadsworth Center, Albany, New Yorkの分子診断研究室によって提供された。成熟したラット・γ-グルタミルヒドロラーゼをコードする884塩基対のPCR産物は、プライマー：
RGH-f（CATGCCATGGATCCTATGAGCGCGGCTCCAAG）および、
RGH-r（GCTCTAGATCAGTTAAACATATAAGCTTGCTG）
を使用することによって得た。
【００２８】
フォワードプライマーを5'末端で伸長して、ベクターpNZ8048内の誘導性のNISプロモーターとの転写性融合を可能にするNcoI制限部位を作製した。言及したフォワードプライマーの使用により、成熟した遺伝子においてわずかな修飾（イタリックで表したヌクレオチド）を生じた。平滑末端PCR産物を（Invitrogen）ベクターPCRブラントにクローン化して大腸菌に形質転換した。部分消化したNcoI-KpnI断片を単離してpNZ8048にライゲーションした。成熟ラット・γ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子を有する新しく合成したベクターは、pNZ7002と名付けた。
【００２９】
成熟ラットまたはヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子を有するベクターを、エレクトロポレーションによってクロモソームのnisRおよびnisK遺伝子を有するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）株NZ9000に形質転換した。成熟ラットまたはヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子の発現は、NICE系（ナイシン誘導の制御された発現）（De Ruyterら、1996）のプロトコルに従って達成した。ヒトまたはラット・γ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子の発現および翻訳のために、0.1および5ng/mlの間のナイシン濃度を使用した。ウエスタンブロット解析は、Wadsworth Center, Albany, New Yorkんｐ分子診断研究室によって提供されたポリクローナル抗体のみを使用してヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼに対して行った。
【００３０】
成熟ラットまたはヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼ酵素の活性は、0.5%（wt/vol）グルコース（GM17）および10μg/mlクロラムフェニコールを補った5mlのM17（Terzaghi and Sandine 1975）中で、pNZ7001またはpNZ7002を有する乳酸菌（L.lactis）株NZ9000を培養して決定した。OD600までのGM17は、0.5であった。OD600=0.5において、ナイシン（1.0ng/ml）を添加して成熟したラットまたはヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子の発現を誘導した。2時間の増殖の後、20倍に濃縮した細胞抽出物（1ml 0.1Mのメルカプトエタノール、0.1MのNa-PO4緩衝液pH7.0）を、シリカビーズおよびFP120fastprep（商標）細胞粉砕器（Savant Instruments inc, Holbrook, NY, USA）を使用して作製した。500μlの濃縮した細胞抽出物を、20mlの酵母抽出物溶液（0.5g/l酵母抽出物（Difco Laboratories, Detroit, USA）の0.1M Na-PO4緩衝液、pH7.0、1%のアスコルビン酸溶液）に、ポリグルタミル葉酸誘導体の供与源として添加した。37℃において継続的に4時間インキュベーションし、試料を周期的に採取した。試料を100℃で10分間加熱することによって反応を停止させた。葉酸濃度は、カセイ菌（Lactobacillus casei）微生物学的アッセイ法を使用してHorneおよびPatterson（1988）によって記載されたように決定した。ネガティブ対照実験は、pNZ8048（空のナイシン発現カセット）で形質転換した株NZ9000で行った。
【００３１】
成熟ラットまたはヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼ酵素の活性は、0.5%の（wt/vol）グルコース（GM17）および10μg/mlクロラムフェニコールを補ったM17（Terzaghi and Sandine 1975）中でpNZ7001またはpNZ7002を有する乳酸菌（L.lactis）株NZ9000を培養して決定した。OD600=0.5ナイシン（1.0ng/ml）を添加して増殖培養液から周期的に試料を採取した。細胞を上澄から分離できるまで試料を遠心分離した。上澄を、0.1MのNaAc緩衝液、pH4.8、1%のアスコルビン酸で1:1希釈した。細胞を0.1MのNaAc pH4.8、1%アスコルビン酸で洗浄し、もとの体積の0.1MのNaAc緩衝液pH4.8、1%のアスコルビン酸に再懸濁した。全ての試料は、100℃で10分間加熱し、続いてカセイ菌（Lactobacillus casei）微生物学的アッセイ法を使用してHorneおよびPatterson（1988）によって記載されたように決定した。ポリグルタミル葉酸の存在は、γ-グルタミルヒドロラーゼの供与源としてヒト結晶（Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, NL）と共に37℃で4時間試料をインキューベートし、続いて葉酸濃度測定によって解析した。
【００３２】
結果
1.0ng/mlのナイシンの添加により、発現されたヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子の発現を生じじ、これは、ポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロットにおいて視覚化することができた（データ示さず）。ラット・γ-グルタミルヒドロラーゼは、特異的な抗体が利用できなかったのでウエスタンブロットにおいて視覚化することができなかった。
【００３３】
インビトロにおいてモニターしたヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼの機能的な発現
微生物学的葉酸アッセイ法では、主に3個以下のグルタミン酸残基を有する葉酸誘導体を検出する。より長い葉酸鎖（n＞3）に対する検出微生物の増殖反応は、鎖の長さに比例して著しく減少する（Tamuraら、1972）。その結果、3以上のグルタミル残基を有するポリグルタミル葉酸を含む供与源において、たとえば主にヘプタグルタミル葉酸を含む酵母抽出物（Bassettら、1976）に関しては、葉酸は、ポリグルタミル尾部が除去された場合に微生物学的アッセイ法で検出することができるだけである。したがって、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）におけるヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼの機能的な発現を試験するために酵母抽出物を使用した。ナイシンで誘導されるpNZ7001またはpNZ7002を有するL.lactis株NZ9000の細胞抽出物の添加により、ポリグルタミル葉酸の脱結合を生じ、これは、微生物学的アッセイ法によって視覚化することができた。pNZ8048（空のナイシン発現カセット）を有するL.lactis株NZ9000の細胞抽出物の添加では、いずれの脱結合活性も示さなかった（図2）。
【００３４】
インビボにおいてモニターしたγ-グルタミルヒドロラーゼの細胞内発現
pNZ7001またはpNZ7002またはpNZ8048（空のナイシン発現カセット）を有する株NZ9000は、同一の増殖特性を示した。OD600が0.5におけるナイシンによる誘導では、増殖速度に影響を与えなかった（結果示さず）。ナイシンで誘導後、葉酸濃度を株の上澄において、および細胞抽出物において測定した。pNZ7001またはpNZ7002を有するL.lactis株NZ9000は、増殖の間に細胞外の葉酸濃度が増大することによって特徴付けられる。pNZ8048を有するL.lactis株NZ9000における細胞外の葉酸濃度は、増殖の間に一定なままである。γ-グルタミルヒドロラーゼを発現する株の細胞内葉酸濃度は、対照株における細胞内葉酸濃度とは逆に、増殖の間に増大しない。図3は、ナイシンで誘導して2時間後の、細胞内および細胞外の葉酸分配を示す。株NZ9000-pNZ7002は、おそらくラット・γ-グルタミルヒドロラーゼのエンドペプチダーゼ活性が直ちにポリグルタミル葉酸をモノグルタミル葉酸に減少することにより、最も高い細胞外葉酸濃度を有する。ヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼのエキソペプチダーゼ活性は、ポリグルタミル葉酸をより短いポリグルタミル葉酸を経てモノグルタミル葉酸に減少する。また、細胞内に貯蔵されたポリグルタミル葉酸の存在について、細胞抽出物を点検した。葉酸レベルは、γ-グルタミルヒドロラーゼの供与源としてのヒト血漿と共にインキュベーションした後、微生物学的アッセイ法を使用することによって決定した。株NZ9000-pNZ7001およびpNZ7002は、ポリグルタミル葉酸を含まず、葉酸の濃度は、増殖の間に変化しなかった。株NZ9000-pNZ8048における細胞内葉酸濃度は、ポリグルタミル葉酸から部分的になっており、図3を参照されたい。脱結合後の株の発酵ブロス中の細胞外葉酸濃度の増大は、一般に、GM17細菌の増殖培地中に存在する酵母抽出物由来のポリグルタミル葉酸の存在によって引き起こされる。結果からは、発現されたγ-グルタミルヒドロラーゼの酵素活性が細胞内ポリグルタミル葉酸を脱結合し、細胞における葉酸誘導体の保持の減少を生じ、細胞外の葉酸濃度の増大を生じると結論付けることができる。
【００３５】
ヒトおよびラット・γ-グルタミルヒドロラーゼをコードする遺伝子のDNA配列情報については、YAOら、1996 aおよびbの参照文献を参照されたい。
【００３６】
実施例2
材料および方法
GTPシクロヒドロラーゼをコードする遺伝子gchは、配列解析並びにジヒドロ葉酸還元酵素をコードするdhfrおよびホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするdhom遺伝子に隣接するL.lactis株MG1363ゲノムの一部分の非重複性ゲノムデータベースとの相同性比較によって同定した。配列は、プライマーdhfrF（GGAAT TCCAT GGTTA TTGGA ATATG GGCAG AAG）およびdhomR（CGATC CCGGG AAGCC CTGTG CCACT GTCCA A）を使用してゲノム領域を増幅することによって得られた。プライマーは、それぞれgenbankアクセッション番号X60681およびX96988に提供された配列情報に由来した。相同性検索により、増幅された断片の一部分（全長約8kb）が、GTPシクロヒドロラーゼおよび2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼの配列情報を含むことが示唆された。PCR産物は、2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロ-ホスホキナーゼの潜在的な開始コドンおよびGTPシクロヒドロラーゼの潜在的な停止コドンを含むプライマーhppk-f2（CATGC CATGG GGCAA ACAAC TTATT TAAGC ATGGG）およびgch-r3（GGGGT ACCGA TTCTT GATTA AGTTC TAAG）を使用することによって得られ、pNZ8048（Kuipersら）のNcoIおよびKpnI部位にクローン化してプラスミドpNZ7003を作製した。フォワードプライマーを5'末端で伸長して、ベクターpNZ8048内の誘導性のナイシンプロモータとの転写性融合を可能にするNcoI制限部位を作製した。言及したフォワードプライマーの使用により、もとのgch遺伝子の軽微な修飾を生じ;余分なグリシンが、Met-1の後に、次のアミノ酸が変化されないように導入された。リバースプライマーを3'末端で延長して、ベクターpNZ8048内に付着末端ライゲーションを可能にするKpnI制限部位を作製した。ベクターをエレクトロポレーションによってL.lactis株NZ9000（De Ruyterら、1996）に導入し、L.lactis株NZ9000-pNZ7003を作製した。株NZ9000は、pepN遺伝子座に安定して組み込まれたnisRK調節遺伝子を発現した。gchの発現は、発酵ブロスにナイシンを添加することにより、ナイシンプロモータから調節された（De Ruyterら、1996）。
【００３７】
制限、ライゲーション、および形質転換は、Sambrookらよって概略について述べられたような標準的なプロトコルに従って行った。
【００３８】
GTPシクロヒドロラーゼの酵素活性の測定
GTPシクロヒドロラーゼがL.lactisにおいて活発に発現されるかどうかを決定するために、酵素アッセイを行った。酵素の供与源としてNZ9000-pNZ7003の無細胞抽出液を使用し、および市販に利用できるGTPを基質として使用した。GTPシクロヒドロラーゼの活性アッセイ法には、本質的にSaizieuら（1995）によって記載された修飾プロトコルを使用した。pNZ7003を有するL.lactis株NZ9000を、0.5%の（wt/vol）グルコース（GM17）および10μg/mlクロラムフェニコールを補ったM17培地（Terzaghi and Sandine 197）中で培養した。0.5のOD600において、ナイシン（2ng/ml）を添加した。2.5のOD600において、25mlの培養から細胞を回収して1mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5に溶解した。細胞内容物を、シリカビーズおよびFP120fastprep（商標）細胞粉砕器（Savant Instruments Inc., Holbrook, NY, USA）を使用して放出させた。GTPシクロヒドロラーゼ活性は、100mMのトリス/HCl pH8、100mMのKCl、1mMのEDTA pH8、50iMのGTPおよび2%の無細胞抽出物中で30℃において決定した。時間試料は、酵素を不活性化するために100℃で10分間加熱した。GTP消費量および産物の形成をHPLCによって分析した。試料（25μl）を8μ1000ÅPL-SAXカラム（Polymer Laboratories室）に、50mmのリン酸塩、100mmのNaCl、pH6.5を含むランニング緩衝液で、1.2ml/分の流速で適用した。GTP消費量は、254nmにおけるUV吸収によってモニターし（データ示さず）、反応生成物を蛍光定量的に検出した;365nmで励起、446nmで放射（図4を参照されたい）。
【００３９】
gchの過剰発現
培養している乳酸菌にGTPシクロヒドロラーゼをコードするgchおよび2-アミノ-4-ヒドロキシ-6-ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロ-ホスホキナーゼを過剰発現することによる葉酸産生に対する効果は、0.5%の（wt/vol）グルコース（GM17）および10μg/mlクロラムフェニコールを補ったM17培地（Terzaghi and Sandine, 1975）においてpNZ7003を有するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）株NZ9000を培養することによって決定した。0.5のOD600において、ナイシン（2ng/ml）を添加した。2.5のOD600で、細胞を上澄から分離することができるまで細胞培養を遠心分離した。上澄を0.1MのNaAc緩衝液pH4.8、1%のアスコルビン酸で1:1希釈した。細胞を0.1MのNaAc pH4.8、1%のアスコルビン酸で洗浄し、もとの体積の0.1MのNaAc緩衝液pH4.8、1%のアスコルビン酸に再懸濁した。試料を100℃に10分間加熱し、続いてHorneおよびPatterson（1988）によって記載されたようカセイ菌（Lactobacillus casei）微生物学的アッセイ法を使用して葉酸濃度を測定した。ポリグルタミル葉酸の存在は、γ-グルタミルヒドロラーゼの供与源としてのヒト血漿（Sigma-Aldrich Chemie, Zwijndrecht, NL）と共に試料を37℃で4時間インキューベートし、続いてカセイ菌（Lactobacillus casei）微生物学的アッセイ法を使用して葉酸濃度を測定することによって解析した。
【００４０】
結果
GTPシクロヒドロラーゼについての酵素活性アッセイでは、GTPの添加の時点において反応生成物の増大を生じた（図4）。この反応生成物は、以前に報告したクロマトグラフィ（保持時間9.52分）と同様の挙動を有し[Saizieuら、（1995）]、GTPシクロヒドロラーゼの主要な産物であるジヒドロネオプテリン三リン酸に起因するものであった。反応混合液は、過剰のGTPを含んだ。GTP濃度の減少およびジヒドロネオプテリン三リン酸の増大（データ示さず）は、NZ9000-pNZ7003の無細胞抽出液のみについて測定した。株NZ9000-pNZ8048の無細胞抽出液を含む対照反応では、GTPの有意な減少もGTP変換産物の形成も示さなかった。
【００４１】
SDS-PAGEを使用するナイシンで誘導したNZ9000-pNZ7003の細胞抽出物の定性的タンパク質解析では、対照株およびNZ9000-pNZ8048と比較して40kDのタンパク質の過剰な産生を示した（データ示さず）。株NZ9000-pNZ7003の増殖している細胞をナイシンで誘導すると、対照株NZ9000-pNZ8048と比較して、細胞内および細胞外の葉酸濃度の増大を示した（図5）。総葉酸産生は、二倍になった。大部分の余分に産生された葉酸は、増殖培地中に存在し;細胞外の葉酸濃度は、対照株と比較して約20倍に増大した。細胞内葉酸濃度の増大は、あまり重要ではなかった。細胞内葉酸プールの脱結合は、対照株のみにおいて、細胞内葉酸濃度が部分的にポリグルタミル葉酸として存在したことを示した。GTPシクロヒドロラーゼ過剰産生株は、ポリグルタミル葉酸形態の葉酸を細胞内部または、細胞外部に産生しなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】葉酸生合成の経路。括弧は、推定される反応中間体を示す。三リン酸残基は、（P）3として示してある。図は、Lacksら、1995に適合した。
【図２】ナイシンで誘導され、かつラット・γ-グルタミルヒドロラーゼをコードするL.lactisNZ9000またはヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼをコードするpNZ7001、またはネガティブ対照としてのpNZ8048（空の発現カセット）を有するpNZ7002の細胞抽出物で脱結合後の微生物学的アッセイ法で決定した最適pHにおける酵母抽出物中の葉酸濃度。
【図３】指数関数的に増殖した細胞におけるナイシンで誘導後2時間の細胞内および細胞外の葉酸分布。葉酸分布は、酵素の脱結合の前後で、短いグルタミン酸残基およびより長いグルタミン酸残基（N＞3）の葉酸誘導体をして、ヒト血漿脱結合と共に示してある。PNZ8048、RgH、およびHghは、それぞれプラスミドpNZ8048（空の発現カセット）、pNZ7001（nisAプロモータおよび成熟ラット・γ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子）、およびpNZ7002（nisAプロモータおよび成熟ヒト・γ-グルタミルヒドロラーゼ遺伝子）を有するL.lactis株NZ9000に似ている。葉酸濃度は、微生物学的アッセイ法で測定した。
【図４】HPLCおよび蛍光（365nmで励起、446nmで放射）によって解析したジヒドロネオプテリン三リン酸濃度によって検出したGTPシクロヒドロラーゼの過剰発現。凡例：gchを含む株NZ9000-pNZ7003株の無細胞抽出液（◆）およびNZ9000-pNZ8048を含む対照株（縦二本線）。
【図５】gch過剰発現株NZ9000-pNZ7003および対照株NZ9000-pNZ8048（空のプラスミドpNZ8048を含む）の細胞内（ce）および細胞外（sup）の葉酸濃度。葉酸濃度。葉酸濃度は、γ-グルタミルヒドロラーゼの外部の供与源としてヒト血漿で脱結合の前後において微生物学的アッセイ法で測定した。
【参照文献】
【００４３】
De Saizieu, A., Vankan, P. and Van Loon, A. P. G. M. （1995） Enzymic Characterization of Bacillus subtilis GTP Cyclohydrolase I. Journal of Biochemistry 306: 371-377.
Gregory J. F. Chemical and nutritional aspects of folate research: analytical procedures, methods of folate synthesis, stability, and bioavailability of dietary folates. Adv. Food Nutr. Res. 1989; 33:1-101
Home, D.W., Patterson, D. Lactobacillus casei microbiological assay of folic acid derivatives in 96 well microtiter plates. Clin. Chem 34, 2357-2359 （1988）
Huangpu, J., Pak, J.H., Graham, M.C., Rickle, S.A., Graham, J.S. Purification and molecular analysis of an extracellular gamma-glutamyl hydrolase present in young tissues of the soybean plant. Biochem. Biophys. Res. Commun. 226, 1-6 （1996）
Kuipers O.P., de Ruyter P., Kleerebezem M., and de Vos W. Quorum sensing-controlled gene expression in lactic acid bacteria. 1998; 64:15-21
Lacks, S. A., Greenberg, B. and Lopez, P. （1995） A Cluster of Four Genes Encoding Enzymes for Five Steps in the Folate Biosynthetic Pathway of Streptococcuus pneumoniae. Journal of Bacteriology, 66-74.
Leshchinskaya, I.B., Shakirov, E.V., Itskovitch, E.L., Balaban, N.P., Mardano, A.M., Sharipova, M.R., Blagova, E.V., Levdikov, V.M., Kuranova, I.P., Rudenskaya, G.N. and Stepanov, V.M. （1997）
Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius strain 3-19. Purification, properties, and crystaiiization. Biochemistry （Mosc） 62: 903-908.
Rooijen, R.J. van, Gasson, M.J., de Vos, W.M. Characterization of the Lactococcus lactis lactose operon promoter: contribution of flanking sequences and LacR repressor to promoter activity. J. Bacteriol. 174（7）,2273-80 （1992）.
Rooijen, R.J. van, de Vos, W.M. Molecular cloning, transcriptional analysis, and nucleotide sequence of lacR, a gene encoding the repressor of the lactose phosphotransferase system of Lactococcus lactis. J Biol Chem. 265（30）,18499-503 （1990）.
Rosenberg I. H., Godwin H. A. Inhibition of intestinal gamma-glutamyl carboxypeptidase by yeast nucleic acid: an explanation of variability in utilization of dietary polyglutamyl folate. J. Clin. Investig. 1971.
Ruyter P.G. de, Kuipers O.P., de Vos W.M. Controlled gene expression systems for Lactococcus lactis with the food-grade inducer nisin. Appl. Environ. Microbiol. 1996 Oct;62（10）:3662-7.
Seyoum E, Selhub J Properties of food folates determined by stability and susceptibility to intestinal pteroylpolyglutamate hydrolase action. J. Nutr. 1998 Nov;128（11）:1956-60
Shane B. Folylpolyglutamate synthesis and role in the regulation of one-carbon metabolism. Vitam Horm. 1989;45:263-335.
Tan, P.S., van Alen-Boerrigter, I.J., Poolman, B., Siezen R.J., de Vos, W.M., Konings, W.N. Characterization of the Lactococcus lactis pepN gene encoding an aminopeptidase homologous to mammalian aminopeptidase N. FEBS Lett. 1992 Jul 13;306（1）:9-16.
Terzaghi, B.E. and Sandine W.E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1975;38:17-22
Yao, R., Schneider, E., Ryan, T.J., Galivan, J. Human gamma-glutamyl hydrolase: cloning and characterization of the enzyme expressed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996a Sep 17;93（19）:10134-8.
Yao, R., Nimec, Z., Ryan, T.J., Galivan, J. Identification, cloning, and sequencing of a cDNA coding for rat gamma-glutamyl hydrolase. J. Biol. Chem. 1996b Apr 12;271（15）:8525-8.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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