(57)【要約】ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液であって、レーザーグラニュロメーターで測定すると、１から６μｍの間、特に３から６μｍの間に含まれる直径または粒径をおもに有する結晶粒子の形態で、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質が存在し、３から８の間、好ましくは４から６の間に含まれるｐＨ、最も好ましくは４．０から５．０のｐＨでの水性ビヒクル中で、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４における懸濁液の濃度は、１から８０ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは２から５０ｍｇ／ｍｌの間に含まれることを特徴とする懸濁液。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液であって、レーザーグラニュロメーターで測定すると、１から６μｍの間、特に３から６μｍの間に含まれる直径または粒径をおもに有する結晶粒子の形態で、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質が存在し、３から８の間、好ましくは４から６の間に含まれるｐＨ、最も好ましくは４．０から５．０のｐＨでの水性ビヒクル中で、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４における懸濁液の濃度は、１から８０ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは２から５０ｍｇ／ｍｌの間に含まれることを特徴とする懸濁液。
【請求項２】
前記水性ビヒクルが、等張性の浸透圧を有する塩水溶液である、請求項１記載の懸濁液。
【請求項３】
前記塩水溶液が、酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含む、請求項１または２記載の懸濁液。
【請求項４】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質が、ＥＰＩ−ｈＮＥ４である、請求項１から３のいずれか一項記載の懸濁液。
【請求項５】
レーザーグラニュロメーターで測定すると、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４の結晶粒子の少なくとも６５％が、３から６μｍの間の粒径または直径を有する、請求項４記載の懸濁液。
【請求項６】
霧状化の後、インパクターグラニュロメーターによって測定すると、約２μｍのＭＭＡＤを有するＥＰＩ−ｈＮＥ４結晶化粒子を含む霧状小滴を与えるように適合化された、請求項１から５のいずれか一項記載の懸濁液。
【請求項７】
直接顕微鏡によって測定すると、１から６μｍの間の直径または粒径をほとんどが有し、好ましくは粒子の少なくとも７５％が１から３μｍの間の直径をまたは粒径を有する、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４のスフェロイド様の粒子を含む乾燥パウダー。
【請求項８】
レーザーグラニュロメーターで測定すると、１から６μｍの間の直径または粒径をほとんどが有し、好ましくは粒子の少なくとも６０％が１から３μｍの間の直径をまたは粒径を有する、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４のスフェロイド様の粒子を含む乾燥パウダー。
【請求項９】
レーザーグラニュロメーターで測定すると、粒子の少なくとも９０％が０．５から４．０μｍの間の直径または粒径を有し、ＭＭＡＤが約２．１μｍである、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４のスフェロイド様の粒子を含む乾燥パウダー。
【請求項１０】
適切な噴射ビヒクル中に、請求項１から６のいずれか一項記載のＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液、または請求項７から９のいずれか一項記載の乾燥パウダーを含む乾燥パウダーエアゾールを含む、吸入可能な製薬製剤。
【請求項１１】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を含む溶液から開始し、以下の工程：
（ａ）溶液のｐＨを３．５から４．５の間に含まれる値に調節し、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を結晶化させる工程；及び
（ｂ）ｐＨを３．０から８．０の間の値に調節する工程；
を含む、請求項１から６のいずれか一項記載のＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液の調製方法。
【請求項１２】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の凍結乾燥パウダーから開始し、以下の工程：
（ａ）３．０未満のｐＨを有するバッファー中にＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を溶解する工程；
（ｂ）３．５から４．５の間に含まれる値に溶液のｐＨを調節し、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を結晶化する工程；及び
（ｃ）３．０から８．０の間に含まれる値にｐＨを調節する工程；
を含む、請求項１から６のいずれか一項記載のＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液の調製方法。
【請求項１３】
請求項１から６のいずれか一項記載の懸濁液において、液相から結晶を分離する工程、残余の水を捨てる工程、及び得られた砕けやすい圧縮ケーキを均質化する工程を含む、請求項７または８記載の乾燥パウダーの調製方法。
【請求項１４】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の溶液をスプレー乾燥する工程を含む、請求項９記載の乾燥パウダーの調製方法。
【請求項１５】
ｈＮＥの過剰な活性のためである疾患状態を治療するための医薬の調製のための、請求項１０記載の吸入可能な製薬製剤の使用。
【請求項１６】
前記疾患が、呼吸器疾患である、または嚢胞性線維症、気腫、ＡＲＤＳ（急性呼吸促進症候群）、及びＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）から選択される、請求項１５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の結晶化粒子の懸濁液、前記懸濁液の調製方法、前記懸濁液から由来する乾燥パウダーエアゾール、前記懸濁液または前記乾燥パウダーエアゾールを含む吸入可能な製薬製剤、及び各種の病理的状態の治療における前記吸入可能な製薬製剤の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌｅｙ等に対する国際特許出願ＷＯ ９６／２０２７８は、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）を阻害する数多くの遺伝学的に操作された新規なタンパク質を記載している。前述の特許出願に示されているように、ヒト好中球エラスターゼ（ヒト白血球エラスターゼとしても知られている）は、多核性白血球のアズール顆粒の主要な中性プロテアーゼの一つである。この酵素は、病原体の除去、及び結合組織再構成に関与している。
【０００３】
ｈＮＥの主な全身性インヒビターは、α１アンチトリプシンとして以前に知られているα−１−プロテアーゼである。一定数の病理的状況において（遺伝的疾患、慢性気管支炎、気腫、嚢胞性線維症）では、これらのインヒビターは、血流中に十分な量で存在しないかまたは不活性化しており、肺組織の過度の破壊を引き起こすｈＮＥの非制御的なエラストリシス活性を導く。
【０００４】
かくしてＷＯ ９６／２０２７８は、安定で、非毒性で、高度に効力を有するｈＮＥのインヒビターである新規なタンパク質を提案している。これらのインヒビターは、塩基性膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）またはヒト起源のタンパク質、特にヒトインター−α−トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）の軽鎖で見出されるクニッツ型（Ｋｕｎｉｔｚ−ｔｙｐｅ）阻害ドメインから由来するインヒビターの群の一部を形成する。それらはとりわけ、ＥＰＩ−ｈＮＥ−１、ＥＰＩ−ｈＮＥ−２、ＥＰＩ−ｈＮＥ−３、及びＥＰＩ−ｈＮＥ−４である。ＷＯ ９６／２０２７８のインヒビターは、バイオテクノロジー法によって生産され、生物学的クニッツドメインに関して改変されたＤＮＡ配列を含み、その配列はそれらのインヒビターをより強力にしている。これらのインヒビターの一つであるＥＰＩ−ｈＮＥ−４は特に興味深い。
【０００５】
ＷＯ ９６／２０２７８は、ｈＮＥインヒビター、ＥＰＩ−ｈＮＥ−１、ＥＰＩ−ｈＮＥ−２、ＥＰＩ−ｈＮＥ−３、及びＥＰＩ−ｈＮＥ−４についてのＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ生産システムの調製、タンパク質生産、及び精製を記載している（特に実施例１０−１５参照）。
【０００６】
非機能的なヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｉｓ４）を含む酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓミュータント株ＧＳ１１５を、上流の誘導可能なＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓａｏｘｌ遺伝子プロモーター、及び下流のａｏｘｌ転写終結及びポリアデニル化配列の制御の下で、所望のｈＮＥインヒビターのアミノ末端に直接融合されたＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合因子αプレプロペプチドをコードする配列を含む発現プラスミドによってトランスフォームした。この発現プラスミドをＳａｃＩ切断によって直線化し、直線状ＤＮＡを相同的組換えによって、スフェロプラストトランスフォームーションによりＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５のゲノム内に取り込ませ、添加されるヒスチジンの不存在下で増殖を選択し、メタノール利用表現型、分泌レベル、及び遺伝子量についてスクリーニングした（サザンブロットによって見積もられる）。ａｏｘｌ遺伝子ローカス内に直列の整列として挿入された約４のコピーの発現プラスミドを有すると見積もられた株が選択された。
【０００７】
選択された株の培養は、第一に炭素源としてグリセロールを有するバッチモードで増殖され、次いでグリセロールを枯渇し、グリセロール制限フィードモードで増殖され、さらに細胞塊を増大し、ａｏｘｌプロモーターを抑制し、最後にメタノール制限フィードモードで培養された。後期の間でａｏｘｌプロモーターは十分に活性であり、前記タンパク質が培養培地に分泌される。
【０００８】
次いでＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質が精製される。特異的な精製法は、各タンパク質の特異的な特性によって変化する。略記すると、培養培地を遠心分離し、上清をマイクロ濾過にかけ、次いで限外濾過にかけ、任意にディア濾過にかけ、次いでタンパク質を硫酸アンモニア沈降及びイオン交換クロマトグラフィーによって回収する。
【０００９】
本出願人によって出願された欧州特許出願第００２０３０４９．２号及び、その優先権を享受する国際特許出願ＰＣＴ／ＦＲ ０１／０２６９９は、前記タンパク質の発現のための宿主細胞の培養培地からの、製薬学的質のＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の精製の改良法を記載し、その方法は以下の工程を含む：
（ａ）カチオン性交換吸着剤の膨潤したパッド上に培養培地から由来した部分を通過させ、溶出物を回収する工程；
（ｂ）生成した溶出物に対して、その疎水性度によってタンパク質の分離を実施する工程；
（ｃ）カチオン交換カラムに対して生成した溶出物を通過させる工程；
（ｄ）任意に滅菌条件下で生成した培地を濾過する工程；及び
（ｅ）任意に生成した濾過物を凍結乾燥し、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を回収する工程。
【００１０】
工程（ｄ）の最後で得られた溶液、またはそれから得られた凍結乾燥パウダーは、本発明に係る懸濁液を調製するために使用でき、前記懸濁液は、本発明に係る吸収可能な製薬製剤に取り込ませることができる。
【００１１】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質、特にＥＰＩ−ｈＮＥ−４の精製法を完成させた本出願人は、次いで精製ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を含む製薬組成物の開発に対して、非常に多大な研究と努力を注いだ。
【００１２】
実際に本出願人は、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４の溶液を含む口内で吸収可能な製薬組成物の開発に集中した。しかしながら製品の開発の過程で、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４の溶液は、一度ネブライザーに配置されると不安定で沈殿する傾向を有し、溶液の濁りを生ずることが見出された。
【００１３】
このタンパク質の沈殿化形態は、治療上不活性であろうと最初に考えられた。しかしながら驚くべき且つ予期せぬことに、沈殿化形態はＥＰＩ−ｈＮＥ−４の結晶化形態であり、この結晶化は前記タンパク質の活性に負に影響しないことが見出された。用語、「ＥＰＩ−ｈＮＥ−４の結晶化形態」は、ロッド状の構造と主に１０μｍ未満の粒径を有するこのタンパク質の不溶性形態を意味する。
【００１４】
かくして本出願人は、前記タンパク質が結晶形態で存在するＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液の開発にその努力を向け、前記懸濁液は、製薬組成物、特に吸入可能な製薬製剤に取り込ませることができる。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
特定の濃度及びｐＨの特異的な条件下で室温で安定である懸濁液を調製することができ、それによって室温で安定である前記懸濁液を取り込んだ製薬組成物の調製が可能であることが、驚くべきことに見出された。この室温安定性は、通院患者の治療のために特に重要である。
【００１６】
溶液の代わりに、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液を使用することは、活性物質でより濃縮され、それによってより短い時間での薬剤の投与を許容する製剤の開発を可能にするために、吸入可能な製薬組成物の調製において主要な利点を構成する。
【００１７】
必要とされる吸入時間はしばしば長く、そのことが主要な制限として認識され、それ故微弱な患者の承諾しか導かないために、吸入可能な薬剤の投与において、このことな重要な因子である。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
かくして、本発明は、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液に関し、前記懸濁液は、レーザーグラニュロメーターで測定すると、１から６μｍの間、特に３から６μｍの間に含まれる粒径をおもに有する結晶粒子の形態で、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質が存在することを特徴とし、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質における懸濁液の濃度は、１から８０ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは２から５０ｍｇ／ｍｌの間に含まれ、最も好ましくは、３から８の間、好ましくは４から６の間に含まれるｐＨ、最も好ましくは４．０から５．０のｐＨでの水性ビヒクル中に、処理される治療上の状態に必要とされるＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の量に依存する。
【００１９】
前記懸濁液は、室温で少なくとも２ヶ月の期間に亘り、生物学的活性及び粒径分布の点で安定である。
【００２０】
前記水性ビヒクルは好ましくは、等張性の浸透圧を有する塩水溶液である。
【００２１】
前記塩水溶液は、酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含んで良い。
【００２２】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質は、ＥＰＩ−ｈＮＥ−１、ＥＰＩ−ｈＮＥ−２、ＥＰＩ−ｈＮＥ−３、及びＥＰＩ−ｈＮＥ−４からなる群から適切には選択され、好ましくはＥＰＩ−ｈＮＥ−３またはＥＰＩ−ｈＮＥ−４である。最も好ましくは、それはＥＰＩ−ｈＮＥ−４である。
【００２３】
次いで前記懸濁液は好ましくは、レーザーグラニュロメーターで測定すると、少なくとも６５％が３から６μｍの間の粒径を有するＥＰＩ−ｈＮＥ−４の結晶粒子を含む。
【００２４】
Ｐａｒｉ ＬＣ−ｓｔａｒネブライザーで測定されたこの懸濁液の吸入量は、約４０から５０％であり、これは吸入可能な製薬製剤としては優れた値である。
【００２５】
ＥＰＩ−ｈＮＥ−４の結晶化粒子を含む霧状小滴のＭＭＡＤ（Ｍｅｄｉａｎ Ｍａｓｓ Ａｅｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｄｉａｍｅｔｅｒ）は、インパクターグラニュロメーターによって測定すると、約２μｍである。このＭＭＡＤ値は、非常に呼吸可能な分画及び肺への有効な浸透を確保するのに十分に適している。
【００２６】
乾燥パウダーは、例えば好ましくはｐＨを３．５から４．５に調節した後、前記懸濁液を遠心分離にかけ、上清を分離し、ペレットを穏やかに真空乾燥し、次いで均質化して、凝集物から粒子を個別化することによって、前記懸濁物から由来できる。これらの条件下では、直接顕微鏡によって測定すると、１から６μｍの間の粒径または直径をほとんどが有するスフェロイド様の粒子が得られる。乾燥パウダーは、レーザーグラニュロメーターによって溶液中で測定した場合、懸濁液のものと匹敵するサイズ分布を有する。
【００２７】
乾燥パウダーは、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の溶液、またはＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の凍結乾燥パウダーから由来することもできる。
【００２８】
かくして本発明はまた、直接顕微鏡によって測定すると、ほとんど１から６μｍの間の粒径または直径を有する、好ましくは粒子の少なくとも７５％が１から３μｍの間の粒径または直径を有する、且つレーザーグラニュロメーターによって測定すると、ほとんどが１から６μｍの間の粒径または直径を有する、好ましくは粒子の少なくとも６０％が１から３μｍの間の粒径または直径を有する、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４のスフェロイド様の粒子を含む乾燥パウダーに関する。この乾燥パウダーは、前述のＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液において、液相から結晶を分離する工程、残余の水を捨てる工程、及び得られた砕けやすい圧縮ケーキをを均質化する工程を含む方法によって適切に得られる。
【００２９】
本発明はまた、レーザーグラニュロメーターによって測定すると、粒子の少なくとも９０％が０．５から４．０μｍの間の粒径または直径を有し、約２．１μｍのＭＭＡＤを有する、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４のスフェロイド様の粒子を含む乾燥パウダーに関する。このＭＭＡＤ値は、パウダーを適切な噴射ビヒクルに分散した場合、非常に呼吸可能な分画及び肺への有効な浸透を確保するのに十分に適している。この乾燥パウダーは、ＰＩ−ｈＮＥタンパク質の溶液のスプレー乾燥の工程を含む方法によって、簡便に得られても良い。
【００３０】
本発明はまた、前述のＥＰＩ−ｈＮＥ−４タンパク質の懸濁液を含む吸入可能な製薬製剤、または適切な噴射ビヒクル中に前述の乾燥パウダーを含む乾燥パウダーエアゾールに関する。
【００３１】
本発明はさらに、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の溶液または凍結乾燥パウダーのいずれかから開始する、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液の調製方法に関する。
【００３２】
【発明の実施の形態】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の溶液から開始する場合、前記懸濁液の適切な調製方法は、以下の工程を含む：
（ａ）溶液のｐＨを３．５から４．５の間に含まれる値に調節し、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を結晶化させる工程；及び
（ｂ）ｐＨを３．０から８．０の間の値に調節する工程。
【００３３】
前記工程（ａ）及び（ｂ）は、１から４０℃、好ましくは４から３０℃の温度で適宜実施できる。
【００３４】
凍結乾燥パウダーから開始する場合、懸濁液を調製するための適切な方法は、以下の工程を含む：
（ａ）３．０未満のｐＨを有するバッファー中にＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を溶解する工程；
（ｂ）３．５から４．５の間に含まれる値に溶液のｐＨを調節し、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を結晶化する工程；及び
（ｃ）３．０から８．０の間に含まれる値にｐＨを調節する工程。
【００３５】
前記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程は、１から４０℃、好ましくは４から３０℃の温度で適宜実施できる。
【００３６】
本発明はまた、前記記載のＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液、溶液、またはその凍結乾燥パウダーから開始する、前述の乾燥パウダーの調製方法に関する。
【００３７】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液から開始する場合、前述のパウダーの調製方法は、前記の懸濁液中で、例えば遠心分離またはミクロン以下のフィルターでの濾過によって、液相から結晶を分離する工程、適宜固相のケーキを過度に圧縮しない方法を使用して、例えば４０℃未満の温度で大気圧よりわずかに低い圧力で穏やかに蒸発させることによって、残余の水を捨てる工程、及び得られた固体のケーキを均質化し、例えばＦｒｉｔｓｃｈ社製のＰｕｌｖｅｒｉｓｅｔｔｅ ５（プラネタリーミル）、またはＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｍｏｄｅｒｎｅ， Ｐａｒｉｓ社製の電気的ミリング装置Ｍｏｕｌｉｎを使用して、適宜当該技術分野で周知のミリング法によって、凝集粒子を個別化する工程を含む。
【００３８】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の溶液から開始する場合、乾燥パウダーを調製するための適切な方法は、以下の工程を含む：
（ａ）３．５から４．５の間に含まれる値に溶液のｐＨを調節し、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を結晶化する工程；
（ｂ）前記懸濁液中で、例えば遠心分離またはミクロン以下のフィルターでの濾過によって、液相から結晶を分離する工程；
（ｃ）固相ケーキを過度に圧縮しない方法を適宜使用して、好ましくは４０℃未満の温度で大気圧よりわずかに低い圧力で穏やかに蒸発することによって、残余の水を捨てる工程；
（ｄ）得られた固相のケーキを均質化し、適宜当該技術分野で周知のミリング法によって、凝集粒子を個別化する工程。
【００３９】
前記（ａ）及び（ｂ）の工程は、１から４０℃、好ましくは４から３０℃の温度で適宜実施できる。
【００４０】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の溶液から開始する場合、好ましい方法は、この溶液をスプレー乾燥する工程を含む。この工程のパラメーターは、パウダーが適切な噴射ビヒクルに分散される場合、非常に呼吸可能な分画、及び肺への有効な浸透を確保するように、粒径分布を得るように簡便に調節されて良い。
【００４１】
ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の凍結乾燥パウダーから開始する場合、乾燥パウダーの適切な調製方法は、以下の工程を含む：
（ａ）３．０未満のｐＨを有するバッファーにＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を溶解する工程；
（ｂ）３．５から４．５の間に含まれる値に溶液のｐＨを調節し、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質を結晶化する工程；
（ｃ）前記懸濁液中で、例えば遠心分離またはミクロン以下のフィルターでの濾過によって、液相から結晶を分離する工程；
（ｄ）固相ケーキを過度に圧縮しない方法を適宜使用して、好ましくは４０℃未満の温度で大気圧よりわずかに低い圧力で穏やかに蒸発することによって、残余の水を捨てる工程；
（ｅ）得られた固相のケーキを均質化し、適宜当該技術分野で周知のミリング法によって、凝集粒子を個別化する工程。
【００４２】
前記（ａ）及び（ｂ）の工程は、１から４０℃、好ましくは４から３０℃の温度で適宜実施できる。
【００４３】
本発明はまた、ｈＮＥの過度の活性によるものである、疾患状態を治療するための医薬の調製のための、ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の前記懸濁液または乾燥パウダーエアゾールの使用に関する。
【００４４】
疾患状態は特にいずれかの呼吸器疾患であって良く、嚢胞性線維症、気腫、ＡＲＤＳ（急性呼吸促進症候群）、及びＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）からなる群から選択されて良い。
【００４５】
以下の実施例は、本発明をより適切に記載するために機能するが、いかなる態様でも制限するものとは考慮されない。
【００４６】
以下の記載は、図面の図１から３Ｂを参照することによってより適切に理解されるであろう。
【００４７】
【実施例】
実施例１：ＥＰＩ−ｈＮＥ４の精製
酵母生産システム
ｈＮＥインヒビターを、高細胞密度のＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５発酵の培養上清中の分泌タンパク質として生産する。
【００４８】
所望のｈＮＥインヒビターをコー津する合成ＤＮＡの５’末端に直接、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合因子αプレプロペプチドをコードする合成ＤＮＡ配列をライゲートすることによって構築する。この融合遺伝子は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｈｉｓ４遺伝子をもコードするプラスミド上に乗せられた、上流の誘導可能なＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓａｏｘｌ遺伝子プロモーターと、下流のａｏｘｌ遺伝子転写終結及びポリアデニル化配列の間に挟まれている。
【００４９】
直線化した発現プラスミドＤＮＡを、スフェロプラストトランスフォーメーションにより、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５のゲノム内に相同的組換えによって取り込ませる。再生したスフェロプラストを、添加したヒスチジンの不存在下での増殖について選択する。個々の単離物を、メタノール利用表現型（ｍｕｔ＋）、分泌レベル、及び遺伝子コピー数についてスクリーニングする。かくして高レベルのＥＰＩ−ｈＮＥ−４を分泌する株ＰＥＹ−５３を選択した。この株を。ａｏｘｌ遺伝子ローカス内に挿入された発現プラスミドＤＮＡの４のコピーを含むように、ゲノムＤＮＡのサザン分析によって評価する。
【００５０】
タンパク質生産
Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＥＹ−５３を、純粋酸素の代わりに加圧空気を使用する点を除いて、ＷＯ ９６／２０２７８に記載された方法と同様な混合フィード発酵で増殖させる。略記すると、培養物を初めに、炭素源としてグリセロールを有するバッチ態様で増殖させる。グリセロールの枯渇後、培養物をグリセロール制限フィード態様で約４時間増殖させ、さらに細胞塊を増やしａｏｘｌプロモーターを抑制する。最後の生産期で、培養物をメタノール制限フィード態様で増殖させる。このフェーズの間で、ａｏｘｌプロモーターは十分に活性であり、ｈＮＥインヒビターが調製培地（Ｃ．Ｍ．）中に分泌される。ＰＥＹ−５３発酵Ｃ．Ｍ．中のＥＰＩ−ｈＮＥ−４の最終濃度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びＲＰ−ＨＰＬＣによって測定すると約１０００ｍｇ／ｌであった。ＰＥＹ−５３培養物によって生産された主な分子種は、正確にプロセッシングされたＥＰＩ−ｈＮＥ−４タンパク質である。しかしながら、この株はまた、別の態様でプロセッシングされたＥＰＩ−ｈＮＥ−４タンパク質を表すであろうわずかに高い分子量を有するタンパク質を約５−２０％分泌する。正確にプロセッシングされたＥＰＩ−ｈＮＥ−４を、以下に記載されたようにこれらの混在物を実質的に含まないように精製できる。
【００５１】
実施例１に記載されたように得られた１００ｌのＰＥＹ−５３ＣＭを回収し、以下のような膨張ベッドを通過させた：１０ｌのクロマトグラフィーマトリックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＳＰ）を、５０ｍＭの酢酸アンモニウムｐＨ３．５で平衡化し、３００ｃｍ／ｈで３０ｌまで同じバッファーで流出させる。サンプル搭載後、カラムを１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ３．５で洗浄し、２８０ｎｍで０．０５未満の吸収を得る。ビーズを１０ｌにパックし、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４を、１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ４．５バッファーでカラムを流すことによって回収する。
【００５２】
かくして、約１００ｇのＥＰＩ−ｈＮＥ−４を含む１０ｌ溶液が得られた（２８０ｎｍでのスペクトル測定アッセイ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、クマシータンパク質アッセイ、及び生物学的活性アッセイによって測定される）。
【００５３】
ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のシリカカラムＬｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ １００ＲＰ／水＋１％ＴＦＡ及びアセトニトリル＋１％ＴＦＡの勾配）は、別の態様でプロセッシングされた形態が正確な形態から分離されないことを示した。グリーン混在物による混在もまた検出可能である。
【００５４】
溶液を、さらなる精製の前に２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｌｉｍｍｉｐａｃｋ ２００）で滅菌濾過した。
【００５５】
疎水性相互作用クロマトグラフィーを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製の１５ｌＢＰＴＧカラム中の、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のフェニルセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗマトリックスを使用して、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）システムで前記の１０ｌ溶液を通過させることによって実施した。使用されるバッファーは、Ａ：酢酸ナトリウム５０ｍＭｐＨ４．５＋１Ｍ ＮａＣｌ、及びＢ：酢酸ナトリウム５０ｍＭｐＨ４．５であった。溶出を、３００ｃｍ／ｈの流速を使用して１００％Ｂでの一度の工程で実施した。
【００５６】
得られた溶出物は、約５０ｇの精製ＥＰＩ−ｈＮＥ４を含んだ（２８０ｎｍでのスペクトル測定アッセイ、クマシータンパク質アッセイ、及び生物学的活性アッセイによって測定される）。
【００５７】
ＲＰ−ＨＰＬＣは、別の態様でプロセッシングされた形態が分離できないことを示した。グリーン顔料は検出できなかった。
【００５８】
次いで、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓクロマトグラフィーシステムを使用して、カチオン交換クロマトグラフィーを実施した。使用されたマトリックスは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製の１５ｌＢＰＧ２００カラム中の、ＢｉｏＲａｄ社製のＭａｃｒｏｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｓマトリックであった（スルホナート表面基を有する架橋化メタクリラートに基づく堅いマトリックス）。使用されｔバッファーは、Ａ：酢酸アンモニウム１０ｍＭｐＨ３．５、Ｂ：酢酸ナトリウム５０ｍＭｐＨ６．２、及びＣ：二炭酸アンモニウムｐＨ７．８であった。バッファーＢでの第一の溶出物を、誤ってプロセッシングされた形態を分離するために使用した。次いで溶出を、３００ｃｍ／ｈの流速で１００％Ｂでの一度の工程によって実施した。
【００５９】
溶出物は、約４０ｇの精製ＥＰＩ−ｈＮＥ−４を含み（２８０ｎｍでのスペクトル測定アッセイ、クマシータンパク質アッセイ、及び生物学的活性アッセイによって測定される）、それは約４０％の精製方法の全体の収率に対応した。
【００６０】
ＲＰ−ＨＰＬＣは、別の態様でプロセッシングされた形態が１．５％未満であることを示した。グリーンの顔料は検出されなかった。
【００６１】
溶出物を凍結乾燥し、−２０℃で維持した。
【００６２】
実施例２：ＥＰＩ−ｈＮＥ−４製剤の調製
実施例１で得られたＥＰＩ−ｈＮＥ４凍結乾燥パウダーから開始して、以下のＥＰＩ−ｈＮＥ４懸濁液の１２のバッチを、以下に記載の方法を使用して調製した：
【００６３】
製剤１０／４：ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に１０ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤１０／５：ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に１０ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤５／４：ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に５ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤５／５：ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に５ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤２．５／４：ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に２．５ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤２．５／５：ｐＨ５．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に２．５ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤２０／４（４℃）：４℃の温度で調製した、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に２０ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤２０／４（３０℃）：３０℃の温度で調製した、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に２０ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤３０／４（４℃）：４℃の温度で調製した、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に３０ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤３０／４（３０℃）：３０℃の温度で調製した、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に３０ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤５０／４（４℃）：４℃の温度で調製した、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に５０ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
製剤５０／４（３０℃）：３０℃の温度で調製した、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウム溶液中に５０ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液；
【００６４】
結晶粒子ＥＰＩ−ｈＮＥタンパク質の懸濁液の調製のための一般的方法
２．５、５及び１０ｍｇ／ｌＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液の調製
ｐＨ３．０の１５ｍｇ／ｍｌのＥＰＩ−ｈＮＥ−４の溶液を、以下のように調製した：パウダー形態の１４０ｍｇのＥＰＩ−ｈＮＥ−４を、７ｍｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ３．０に溶解する。ｐＨを１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）で２．０に調節する。要介護、溶液をＭｅｄｉａＫａｐ ５フィルターで濾過し、ｐＨを１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でｐＨ３．０に調節した。
【００６５】
タンパク質濃度をＵＶ分光測定によってチェックし、溶液を１０ｍＭ酢酸ナトリウムで１５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。
【００６６】
１０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．４％塩化ナトリウムｐＨ１２の半分の容量を添加し、１０ｍｇ／ｍｌＥＰＩ−ｈＮＥ−４、ｐＨ４．０の溶液を得た。必要ば場合には、１ＭＨＣｌまたは１Ｍ水酸化ナトリウムで、ｐＨを４±０．１に調節しても良い。
【００６７】
溶液をガラス容器に移し、室温で一晩結晶化させた。
【００６８】
５０μｌのサンプルを遠心分離し、対照相顕微鏡分析のためペレットを採取した。
【００６９】
図１は、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４の結晶のロッド様の構造を示すこのペレットの顕微鏡写真である。
【００７０】
懸濁液を均質化し、次いで半分の容量を別のガラス容器に移し、１ＭＮａＯＨでｐＨ５．０に調節した。この点で、ｐＨ４．０及び５．０の懸濁液を必要なように繰り返し希釈し、５ｍｇ／ｍｌ及び２．５ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。
【００７１】
２０、３０及び５０ｍｇ／ｍｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の懸濁液の調製
製剤２０／４（４℃）、２０／４（３０℃）、３０／４（４℃）、３０／４（３０℃）、５０／４（４℃）及び５０／４（３０℃）を、それぞれ３０、４５及び７５ｍｇ／ｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４の溶液から開始し、全ての工程を４℃の温度または３０℃の温度のそれぞれで実施し、溶液を７２時間の期間の間結晶化させて調製した。結晶化の速度論に有意な差異は、二つの温度の間で観察されなかった。
【００７２】
実施例３：レーザーグラニュロメーターによるＥＰＩ−ｈＮＥ４懸濁液の分析
実施例２で調製された懸濁液中のＥＰＩ−ｈＮＥ４粒子のグラニュロメトリーを、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩで分析した。その結果のいくつかが、以下の表１に示されている・
【表１】
2004512377.tif 000002
【００７３】
前記の表は、懸濁液のそれぞれにおいて、少なくとも６５％の粒子が３から６μｍの間の直径を有することを示す。
【００７４】
実施例４：ＥＰＩ−ｈＮＥ４懸濁液の生物学的活性の測定方法
ＥＰＩ−ｈＮＥ−４懸濁液の生物学的活性を、比色測定試験を使用してヒト好中球エラスターゼの阻害のレベルを測定することによって確認した。
【００７５】
ヒトエラスターゼは、合成基質Ｎ−メトキシスクシニル−ａｌａ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリドを加水分解する。
【００７６】
加水分解の間で、産物ｐ−ニトロアニリド（黄色）が放出される。かくしてＥＰＩ−ｈＮＥ−４の生物学的活性は、ヒトエラスターゼの阻害のレベル、引き続きｐ−ニトロアニリドの放出の減少の観点で計算される。
【００７７】
ＥＰＩ−ｈＮＥ−４の懸濁液の各種の希釈物が調製され、希釈溶液としてトリス１００ｍＭ、ＮａＣｌ５０ｍＭ、トリトンＸ１０００．２５％、ＢＳＡ０．１％、ｐＨ８．０を使用して、ＵＶ分光測定によって特異的なタンパク質濃度が記載される。同じバッファー中のｈＮＥ１００ｎＭの１００μｌが添加され、希釈サンプルが室温で１５分間インキュベートされる（攪拌は必要ない）。１００μｌの４．２ｍＭの基質（前述の通り）が添加され、混合物が３７℃で１５分間インキュベートされる。５０μｌの氷冷酢酸の添加により、反応が停止される。コントロールとしてバッファー単独及びＥＰＩ−ｈＮＥ−４サンプルを含まないｈＮＥを使用して、４１０ｎｍの波長での吸光度が測定される。
【００７８】
実施例５：ＥＰＩ−ｈＮＥ４懸濁液の安定性
ｐＨ５．０の２．５、５及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＰＩ−ｈＮＥ−４の３の懸濁液、及びｐＨ４．０の２０、３０及び５０ｍｇ／ｍｌのＥＰＩ−ｈＮＥ−４濃度の３の懸濁液のＥＰＩ−ｈＮＥ４のサイズ分布及び阻害活性が、それらの安定性を確認するために２ヶ月間に亘り分析された。
【００７９】
懸濁液を実施例２に記載された方法により調製した。各懸濁液の３のバイアルを、ｐＨ４．０の２．５、５及び１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＰＩ−ｈＮＥ−４の３の懸濁液について室温で、及びｐＨ４．０の２０、３０及び５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＰＩ−ｈＮＥ−４の３の懸濁液について４℃で二ヶ月間貯蔵した。
【００８０】
懸濁液の生物学的活性を、前記実施例４に記載されたような発色測定ヒト好中球エラスターゼ阻害アッセイを使用して、２ヶ月間の最初と最後で測定した。二ヶ月間の最初と最後で、有意な差異は見出されなかった。
【００８１】
粒子のサイズ分布を、二ヶ月間の最初と最後で、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩを使用するレーザーグラニュロメーターによって測定した。室温で２ヶ月間の貯蔵期間の後、ＥＰＩ−ｈＮＥ４、１０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．０の懸濁液のサイズ分布に有意な変更はない。
【００８２】
ｐＨ５．０で１０ｍｇ／ｍｌの濃度のＥＰＩ−ｈＮＥ−４の懸濁液のＥＰＩ−ｈＮＥ４のサイズ分布及び阻害活性は、室温で１０ヶ月後にいずれの有意な変化をも示さなかった。
【００８３】
実施例６：ＥＰＩ−ｈＮＥ４懸濁液の霧状化。霧状小滴のサイズ分布分析と顕微鏡観察
実施例２で調製された懸濁液を、Ｐａｒｉ ＬＣ−ｓｔａｒ Ｊｅｔ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒで霧状化した。
【００８４】
当該技術分野で周知の方法によって測定した吸入可能な塊は約４０−５０％であり、それは吸入可能な製薬製剤について良好な値である。
【００８５】
霧状化粒子サイズ分布を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩでのレーザーグラニュロメトリーによって分析した。ＭＭＡＤは３−４μｍであった。
【００８６】
霧状化粒子サイズ分布を、当該技術分野で周知の方法によって、８．０μｍ、６．０μｍ、４．０μｍ、３．０μｍ、２．０μｍ、１．５μｍ、１．０μｍ、０．７５μｍ、０．５μｍ及び０．２５μｍの連続的フィルターでのインパクターグラニュロメトリーによって分析した。試験された懸濁液のそれぞれについて、約２μｍのＭＭＡＤが見出された。
【００８７】
図２は、約２．５μｍの直径を有し、ロッド様の形状のＥＰＩ−ｈＮＥ４結晶粒子を含む霧状小滴の顕微鏡写真である。
【００８８】
実施例７：乾燥パウダーの調製、顕微鏡観察による前記パウダーの分析、及びその生物学的活性の測定
ｐＨ３．０のＥＰＩ−ｈＮＥ−４の１５ｍｇ／ｍｌの溶液を、以下のように調製する：パウダー形態の１４０ｍｇのＥＰＩ−ｈＮＥ−４を、７ｍｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ３．０に溶解する。１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）でｐＨを２．０に調節する。溶解後、溶液をＭｅｄｉａＫａｐ ５フィルターで濾過し、１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を使用してｐＨをｐＨ３．０に調節した。
【００８９】
タンパク質濃度をＵＶ分光測定によってチェックし、溶液を１５ｍｇ／ｍｌの濃度に１０ｍＭ酢酸ナトリウムで希釈した。
【００９０】
１０ｍＭ酢酸ナトリウム、２．４％塩化ナトリウムｐＨ１２の半分の容量を添加し、１０ｍｇ／ｍｌＥＰＩ−ｈＮＥ−４ｐＨ４．０の溶液を得た。必要な場合には、１ＭＨＣｌまたは１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを４±０．１に調節しても良い。
【００９１】
溶液をガラス容器に移し、室温で７２時間結晶化させた。
【００９２】
懸濁液を０．２２μｍのフィルターで濾過した。フィルターを回収し、ブルーシリガケルを含むデシケーターで一晩乾燥させた（水の段階的蒸発を許容するシステム）。砕けやすい圧縮パウダーをフィルターから回収した。単純な手動式機械的均質化をモルタルを使用して実施し、それによって非常に細かい視覚的に均質なパウダーを得た。
【００９３】
このパウダーを、Ｔｈｏｍａｓプレート上で直接顕微鏡により観察した。図３Ａは乾燥形態のＥＰＩ−ｈＮＥ４の不規則なスフェロイド様の構造を示すパウダーの顕微鏡写真であり、個々の粒子のほとんどは１から６μｍの間の直径または粒径を有する。顕微鏡写真の暗色の領域はおそらく、個々の粒子の重なり、または手動で不十分に均質化されたサンプルの残余の凝集物を表す。
【００９４】
直接顕微鏡でＴｈｏｍａｓプレート顕微鏡写真で測定された個々の粒子の直径の統計学的分析（スフェロイド様の粒子の最大と最小の直径の平均）は、個々の粒子のほとんど（８０％以上）が１から６μｍの間の直径（または粒径）を有し、粒子の少なくとも７５％が、１から３μｍの間の直径（または粒径）を有することを示した。中間径（または粒径）は約２．１μｍであり、平均径（または粒径）は２．３３±０．１８μｍである。
【００９５】
このパウダーを１％ＮａＣｌ溶液に分散し、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩでのレーザーグラニュロメトリーによって分析した。レーザーグラニュロメトリーデータの完全な統計学的分析は、実施例３で得られたものと非常に類似する粒子サイズ分布を示し、粒子の少なくとも６５％は１から６μｍの間の直径（または粒径）を有した。
【００９６】
ｐＨ５．０でのＥＰＩ−ｈＮＥ４の１０ｍｇ／ｍｌの懸濁液を、実施例２に記載されたものと非常に相同な方法によってこのパウダーから調製した。懸濁液の生物学的活性を、前期の実施例４に記載された発色測定ヒト好中球エラスターゼ阻害アッセイを使用して測定した。この生物学的活性は、実施例５の１０ｍｇ／ｍｌのＥＰＩ−ｈＮＥ４ｐＨ５．０の懸濁液で測定されたものと有意な差異を示さなかった。
【００９７】
実施例８：乾燥パウダーの調製、及びレーザーグラニュロメトリーによるその分析
乾燥パウダーを、ＥＰＩ−ｈＮＥ−４の以前のバッチの生産の間で得られた２ｌの懸濁液から調製した。
【００９８】
懸濁液を１００００ｇで３０分間遠心分離した。上清を捨て、生成したペレットを１０ｍＭ二炭酸アンモニウムバッファーの１００ｍｌ中に均質化した。懸濁液を０．２２μｍのフィルターで濾過した。濾過物を回収し、ブルーシリカゲルを含むデシケーターで一晩乾燥した（水の段階的な蒸発を許容するシステム）。４ｇの砕けやすい圧縮パウダーを濾過物から回収した。Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｍｏｄｅｒｎｅ， Ｐａｒｉｓ社製の電気的ミリング装置Ｍｏｕｌｉｎ ＪＫを使用して均質化を実施し、それによって非常に細かい視覚的に均質なパウダーを得た。
【００９９】
このパウダーのグラニュロメトリーを、乾燥サンプラー≪Ｓｃｉｒｏｃｃｏ ２０００≫を備えたＭａｌｖｅｒｎ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００ （Ｍａｌｖｅｒｎ， ＵＫ））で分析した。
【０１００】
その結果は、粒子のほとんど（８０％以上）が１から６μｍの間の直径（または粒径）を有し、粒子の少なくとも６０％が１から３μｍの間の直径（または粒径）を有することを示した。中間系（または粒径）は約２．６６μｍであった。
【０１０１】
実施例９：スプレー乾燥による乾燥パウダーの調製、並びにレーザーグラニュロメトリー及び生物学的アッセイによるその分析
パウダー形態または結晶化形態（実施例８参照）の１ｇのＥＰＩ−ｈＮＥ４を、１％塩酸ｐＨ２．５を含む水中に溶解した。この溶液を、以下の条件下でミニスプレードライアーＢｕｃｈｉ Ｂ１９１．Ａを使用してスプレー乾燥（霧状化）した：
−　スプレーの内径：０．７ｍｍ
−　スプレー流速：３．４ｇ／ｌ
−　空気圧：６００ｌ／ｈ
−　乾燥空気流速：３５ｍ３／ｈ
−　乾燥空気注入温度：１２０℃
−　乾燥空気排出温度：７４−７５℃。
【０１０２】
パウダーを、Ｔｈｏｍａｓプレートで直接顕微鏡によって観察した。図３Ｂは、乾燥形態のＥＰＩ−ｈＮＥ４の不規則なスフェロイド様の構造を示すパウダーの顕微鏡写真であり、個々の粒子のほとんどが、１から３μｍの間の直径または粒径を有することを示す。図３Ａと比較して暗色の領域が存在しないことは、パウダーの良好な均質化を示す。
【０１０３】
パウダー粒子のサイズ分布を、乾燥サンプラーＳｃｉｒｏｃｃｏ ２０００を備えたＭａｌｖｅｒｎｅ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ２０００を使用するレーザーグラニュロメトリーによって分析した。
【０１０４】
その結果は、９０％の粒子が０．５−４．０μｍの直径または粒径を有し、７５％が０．５−０．２８μｍの直径または粒径を有し、６０％が０．５−２．２μｍの直径または粒径を有し、ＭＭＡＤは２．１６μｍであることを示した。
【０１０５】
実施例４に記載されたようなパウダーの特異的生物学的活性の測定は、タンパク質が十分に活性であることを示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、水の存在下でのＥＰＩ−ｈＮＥ−４の結晶のロッド様の構造を示すＥＰＩ−ｈＮＥ４懸濁液の遠心分離の後得られたペレットの顕微鏡写真である。
【図２】図２は、約２．５μｍの直径を有し、ロッド状の形状のＥＰＩ−ｈＮＥ４結晶粒子を含む霧状小滴の顕微鏡写真である。
【図３Ａ】図３Ａは、乾燥形態でのＥＰＩ−ｈＮＥ４粒子のスフェロイド様構造を示す乾燥パウダーの顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、乾燥形態でのＥＰＩ−ｈＮＥ４粒子のスフェロイド様構造を示す乾燥パウダーの顕微鏡写真である。
【国際公開パンフレット】
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2004512377.tif 000004
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2004512377.tif 000031
2004512377.tif 000032
【国際調査報告】
2004512377.tif 000033
2004512377.tif 000034