(57)【要約】ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）は望ましくない炎症活性、特に胃腸の炎症活性（例えば、炎症性腸疾患または過敏性腸症候群）の予防または治療に有用である。炎症活性は癌が原因であることもある。ラクトバチルス・サリバリウスは切除および洗浄したヒト胃腸管から単離されるヒト由来のものである。そのような菌株の１つはＷＯ−Ａ−９８３５０１４に記載されるＵＣＣ １１８である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
望ましくない炎症活性の予防および／または治療におけるラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）の菌株の使用。
【請求項２】
望ましくない炎症活性が胃腸の望ましくない炎症活性である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
胃腸の炎症活性が炎症性腸疾患である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
胃腸の炎症活性がクローン病である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
胃腸の活性が潰瘍性大腸炎である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
胃腸の炎症活性が過敏性腸症候群である、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
胃腸の炎症活性が回腸嚢炎である、請求項２に記載の使用。
【請求項８】
胃腸の炎症活性が感染後大腸炎である、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
胃腸の炎症活性が下痢性疾患である、請求項２に記載の使用。
【請求項１０】
下痢性疾患がクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）と関連している、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
下痢性疾患がロタウイルスと関連している、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
下痢性疾患が感染後の下痢性疾患である、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
炎症活性が胃腸の癌によるものである、請求項２に記載の使用。
【請求項１４】
炎症活性が全身性の炎症疾患である、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
全身性の炎症疾患が慢性関節リウマチである、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
望ましくない炎症活性が自己免疫疾患によるものである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１７】
望ましくない炎症活性が癌によるものである、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
癌の予防におけるラクトバチルス・サリバリウスの菌株の使用。
【請求項１９】
ラクトバチルス・サリバリウスが配合物中に含まれている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
配合物が他の共生物質を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
配合物がプレバイオティック物質を含む、請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
配合物が経口摂取可能な担体を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
経口摂取可能な担体が錠剤、カプセル剤または粉末剤のような製薬上許容される担体である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
経口摂取可能な担体がタンパク質および／またはペプチド、特にグルタミン／グルタミン酸に富むタンパク質および／またはペプチド；脂質；炭水化物；ビタミン；ミネラルおよび／または微量元素である、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
経口摂取可能な担体が酸性化ミルク、ヨーグルト、フローズンヨーグルト、粉ミルク、濃縮ミルク、チーズスプレッド、ドレッシングまたは飲料のような食品である、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
ラクトバチルス・サリバリウスが送達システム１ｇあたり１０６ ｃｆｕより多く存在する、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
配合物がアジュバントを含む、請求項１９〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
配合物が細菌成分を含む、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
配合物が薬物を含む、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
配合物が生物学的化合物を含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
菌株または配合物が動物に投与するためのものである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
動物が哺乳動物である、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
哺乳動物がヒトである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
ラクトバチルス・サリバリウスが、免疫系と相互作用する細胞および免疫系の細胞を含む系に導入されたとき、免疫学的マーカーに変化をもたらす、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
免疫系と相互作用する細胞が上皮細胞である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
免疫学的マーカーがサイトカインである、請求項３４または３５に記載の使用。
【請求項３７】
サイトカインがＴＮＦαである、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
免疫系と相互作用する細胞および免疫系の細胞が同一起源に由来するものである、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
免疫系と相互作用する細胞が胃腸管、呼吸器または尿生殖器に由来するものである、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
免疫系の細胞が胃腸管、呼吸器または尿生殖器に由来するものである、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
ラクトバチルス・サリバリウス株がラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウスである、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
ラクトバチルス・サリバリウスがヒト由来のものである、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
ラクトバチルス・サリバリウスが切除および洗浄されたヒト胃腸管から単離される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４４】
ラクトバチルス・サリバリウスが広範囲のグラム陽性およびグラム陰性微生物を阻止する、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４５】
ラクトバチルス・サリバリウスが抗菌活性を有する産物を無細胞上清に分泌し、該活性が増殖中の細胞によってのみ産生され、かつプロテイナーゼＫおよびプロナーゼＥにより破壊される、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４６】
ラクトバチルス・サリバリウス株がＵＣＣ １１８株またはその突然変異体もしくは変異体である、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４７】
ラクトバチルス・サリバリウスが遺伝子的に改変された突然変異体である、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
ラクトバチルス・サリバリウスがラクトバチルス・サリバリウスの天然に存在する変異体である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４９】
ラクトバチルス・サリバリウスが生存可能な細胞の形をしている、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５０】
ラクトバチルス・サリバリウスが生存不可能な細胞の形をしている、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）の菌株の使用に関する。
【０００２】
腸内細菌によるコロニー形成からヒト胃腸管を保護する防御機構は、高度に複雑であり、免疫学的および非免疫学的側面の双方を含む（Ｖ．Ｊ． ＭｃＣｒａｃｋｅｎおよびＨ．Ｒ．Ｇａｓｋｉｎｓ，「共生菌、批評的概説（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ）」， Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＵＫ， １９９９， ｐ．２７８．）。生来の防御機構としては、低い胃のｐＨ、胆汁酸塩、蠕動、ムチン層およびリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）などの抗菌化合物が挙げられる（Ｄ．Ｃ． Ｓａｖａｇｅ，「腸の微生物生態学（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｕｔ）」， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， １９９７， ｐ．２７８．）。免疫学的機構には、特異的リンパ凝集物（これは、小腸および大腸全体に分布し、パイエル板（ｐｅｙｅｒｓ ｐａｔｃｈ）と呼ばれるＭ細胞を基礎とする）が含まれる（Ｍ．Ｆ． Ｋａｇｎｏｆｆ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． １９９３， １０５， １２７５）。これらの部位に提示される管腔（ｌｕｍｉｎａｌ）抗原は、サイトカインネットワークの構築による適当なＴおよびＢ細胞サブセットの刺激および抗体の胃腸管中への分泌をもたらす（Ｍ．Ｒ． ＮｅｕｔｒａおよびＪ−Ｐ Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ，「粘膜免疫学の本質（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９９６， ｐ．２９．， Ｍ．Ｅ． Ｌａｍｍ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， １９９７， ５１， ３１１）。さらに、抗原提示は、上皮細胞を経て、上皮内リンパ球におよび下にある粘膜固有層（ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）の免疫細胞に起こり得る（Ｓ． Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉら， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９８， １６， １０２５）。従って、宿主は実質的に胃腸管の免疫学的防御を講じる。しかし、胃腸管粘膜は、宿主が外部環境と相互作用する最大表面であるので、平均生存期間中に胃腸管により扱われる１００トンに及ぶ食物に対する免疫応答を調節するために特異的防御機構を備えなければならない（Ｆ． Ｓｈａｎａｈａｎ， 「胃腸管の生理学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ）」， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， １９９４， ｐ．６４３．）。さらに、腸では、結腸内に５００種を超え１０１１−１０１２／ｇを数える細菌がコロニーを形成している。従って、これらの防御機構は、非病原性付着菌を、宿主に重要な危害を生じうる侵入性病原体から識別することが可能でなければならない。実際、腸内細菌叢（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｆｌｏｒａ）は新しく摂取された潜在的病原性微生物と競合することにより宿主の防御に寄与する。
【０００３】
非病原性細菌、または共生菌（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）の消費は、健康なボランティアの免疫パラメーターの増強をもたらしている。これらの免疫調節効果の例を表１に掲げる。
【０００４】
【表１】
表１．共生菌（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）の経口消費後の免疫増強効果
2004502633.tif 000002
【０００５】
ヒト胃腸管に存在する細菌は炎症を促進し得る。常在微生物叢への異常な免疫応答は、炎症性腸疾患などのある特定の疾患症状に関係があると指摘されている（Ｂｒａｎｄｚｅａｇ Ｐ．ら， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．， １９９７， １８， ５５５）。正常細菌叢と関連する抗原は通常、免疫寛容をもたらし、この寛容の獲得の失敗が粘膜炎症の主な機構である（Ｓｔａｌｌｍａｃｈ Ａ．ら， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １９９８， １９， ４３８）。この寛容崩壊の確証には、ＩＢＤ（炎症性腸疾患）の患者の腸内細菌叢に対して生起される抗体レベルの増加が含まれる。
【０００６】
ＷＯ−Ａ−９８／３５０１４は、切除および洗浄されたヒトの胃腸管から単離されたラクトバチルス・サリバリウスの菌株は、広範囲のグラム陽性およびグラム陰性微生物を阻止し、かつ抗菌活性を有する産物を無細胞の上清中に分泌することを記載している。
【０００７】
発明の開示
免疫系は、宿主組織を防御しかつ侵入病原体を破壊するように設計される。細菌細胞の存在を認識すると、免疫系の細胞が活性化されて細菌の脅威を排除する。炎症性メディエーターの産生は、細胞活性化および病原体破壊を促進する。
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、ラクトバチルス・サリバリウスの菌株はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで抗炎症効果を誘発することを見出した。本発明者らは、ラクトバチルス・サリバリウスの免疫認知が、炎症活性の抑制をもたらすことを見出した。多数のラクトバチルス・サリバリウスの計画的な消費は、炎症活性の抑制をもたらす。従って、本発明は炎症性腸疾患などの望ましくない炎症応答の予防または治療に大きな治療価値をもつ可能性がある。
【０００９】
ラクトバチルス・サリバリウスは、元来、ヒトの胃腸管内の微生物叢から単離した共生微生物（ｃｏｍｍｅｎｓａｌ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）である。胃腸管内の免疫系は、生じる炎症活性が宿主細胞および組織機能も破壊しうるので、この菌叢のメンバーに対して強い反応を示すことはない。従って、免疫系が胃腸細菌叢の共生する非病原性メンバーを病原体とは異なると認識できる何らかの機構が存在するに違いない。かかる機構が宿主組織に対する損傷を制限し、かつ防御バリアをなおも維持することを保証するのである。
【００１０】
本発明によれば、望ましくない炎症活性の予防および／または治療にラクトバチルス・サリバリウスの菌株の使用が提供される。
【００１１】
本発明の望ましくない炎症活性は、炎症性腸疾患、例えばクローン病（Ｃｒｏｈｎｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、回腸嚢炎または感染後大腸炎、のような望ましくない胃腸の炎症活性でありうる。
【００１２】
胃腸の炎症活性は下痢性疾患であってもよい。下痢性疾患はクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に関連するかまたはロタウイルスに関連するものであってもよい。下痢性疾患はまた、感染後の下痢性疾患であってもよい。
【００１３】
炎症活性は、胃腸の癌または慢性関節リウマチなどの全身性の炎症疾患によるものであってもよい。
【００１４】
他の例においては、望ましくない炎症活性は自己免疫疾患によるものであってもよい。
【００１５】
さらに他の例においては、望ましくない炎症活性は癌によるものであってもよい。
【００１６】
ある実施形態においては、本発明は癌の予防にラクトバチルス・サリバリウスの菌株の使用を提供する。
【００１７】
他の実施形態においては、本発明は配合物中にラクトバチルス・サリバリウスが含まれるラクトバチルス・サリバリウスの菌株の使用を提供する。
【００１８】
好ましくは、配合物は他の共生物質（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ）を含む。あるいはまた、追加的に配合物はプレバイオティック物質（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ）を含む。
【００１９】
理想的には、配合物は経口摂取可能な担体を含む。経口摂取可能な担体は、錠剤、カプセル剤または粉末剤のような製薬上許容される担体であってもよい。
【００２０】
好ましくは、経口摂取可能な担体はタンパク質および／またはペプチド、特にグルタミン／グルタミン酸に富むタンパク質および／またはペプチド；脂質；炭水化物；ビタミン；ミネラルおよび／または微量元素である。
【００２１】
最も好ましくは、経口摂取可能な担体は、酸性化ミルク、ヨーグルト、フローズンヨーグルト、粉ミルク、濃縮ミルク、チーズスプレッド、ドレッシングまたは飲料などの食品である。
【００２２】
ある実施形態においては、ラクトバチルス・サリバリウスは配合物に送達システム１ｇあたり１０６ｃｆｕより多く存在する。
【００２３】
他の実施形態においては、配合物はアジュバントを含む。配合物は細菌成分を含んでもよい。配合物はあるいは、またはさらに薬物を含んでもよい。配合物はまた、生物学的化合物を含んでもよい。
【００２４】
ある実施形態においては、本発明は、動物に投与するための菌株または配合物であるラクトバチルス・サリバリウスの菌株の使用を提供する。好ましくは、動物は哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【００２５】
他の実施形態においては、本発明は、ラクトバチルス・サリバリウスが、免疫系と相互作用する細胞および免疫系の細胞を含む系に導入されたとき、免疫学的マーカーに変化をもたらす、ラクトバチルス・サリバリウスの菌株の使用を提供する。
【００２６】
好ましくは、免疫系と相互作用する細胞は上皮細胞である。最も好ましくは、免疫学的マーカーはサイトカインであり、特にＴＮＦαである。
【００２７】
好ましくは、免疫系と相互作用する細胞および免疫系細胞は、同一起源に由来する。
【００２８】
ある実施形態においては、免疫系と相互作用する細胞は胃腸管、呼吸器または尿生殖器に由来する。
【００２９】
他の実施形態においては、免疫系の細胞は胃腸管、呼吸器または尿生殖器に由来する。
【００３０】
さらなる実施形態においては、本発明は、ラクトバチルス・サリバリウス株がラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）であるラクトバチルス・サリバリウスの菌株の使用を提供する。好ましくは、ラクトバチルス・サリバリウスはヒト由来であり、最も好ましくは、切除および洗浄されたヒト胃腸管由来である。
【００３１】
好ましくは、ラクトバチルス・サリバリウスは、広範囲のグラム陽性およびグラム陰性微生物を阻止する。最も好ましくは、ラクトバチルス・サリバリウスは抗菌活性を有する産物を無細胞上清に分泌し、該活性は増殖中の細胞によってのみ産生され、プロテイナーゼＫおよびプロナーゼＥにより破壊される。
【００３２】
特に好ましいラクトバチルス・サリバリウスの菌株は、ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１８８株またはその突然変異体もしくは変異体である。
【００３３】
ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８株は、ＮＣＩＭＢに１９９６年１１月２７日に寄託され、受託番号ＮＣＩＭＢ ４０８２９が与えられている。ラクトバチルス・サリバリウスの菌株は、ＷＯ−Ａ−９８／３５０１４に記載されている。
【００３４】
ラクトバチルス・サリバリウスは、遺伝子的に改変された突然変異体であってもよいし、またはラクトバチルス・サリバリウスの天然に存在する変異体であってもよい。
【００３５】
好ましくは、ラクトバチルス・サリバリウスは生存可能な細胞の形である。あるいは、ラクトバチルス・サリバリウスは生存不可能な細胞の形であってもよい。
【００３６】
詳細な説明
本願発明者らは、ＧＩＴ微生物叢の調節および消費された株に特異的な分泌抗体の産生をもたらす粘膜免疫応答の調節などの、それらの宿主に対するある特定のｉｎ ｖｉｖｏ効果を反映する共生菌（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ選択するための判定基準を開発した。本発明者らは、ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウスＵＣＣ１１８が胃腸管通過中生存しかつヒト腸細胞系に付着するだけではなく、驚くべきことに、抗炎症効果も有することを見出した。
【００３７】
共生菌は、生存能力のある細胞の形態で、一般に使用される。しかし、共生菌によって発現される有益な因子を含む死滅培養物または組成物のような生育不能細胞まで拡大することも可能である。これは、熱により死滅させた微生物、または、改変ｐＨへの暴露もしくは圧力印加により死滅させた微生物を含む。生育不能細胞を用いた場合、生成物の調製は単純になり、細胞は製剤に容易に組み込むことができ、生存細胞と比べて、保存の要件に対する制限が少ない。チーズ乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＹＩＴ ９０１８）は、米国特許第ＵＳ４３４７２４０号に記載されているように、腫瘍成長の治療および／または予防法として、熱で死滅させた細胞の有効な使用例を提供している。
【００３８】
抗炎症効果を発揮するために無傷の細菌が必要か否か、あるいは、本発明の個々の活性成分を単独で使用することが可能か否かについては、まだわかっていない。特定菌株の前炎症成分（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）が確認されている。グラム陰性細菌の前炎症作用は、リポ多糖（ＬＰＳ）によって媒介されている。ＬＰＳは単独で、部分的に、単球のＣＤ１４受容体にＬＰＳが結合することにより、前炎症ネットワークを誘発する。共生細菌の成分は、全細胞の作用により、抗炎症活性を有すると想定されている。これら成分を単離すれば、製剤学的レベルの操作ができると予想される。
【００３９】
本発明は、以下の実施例からさらによく理解されるであろう。
実施例１：　ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、特に亜種サリバリウス（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＵＣＣ１１８の抗炎症効果のｉｎ ｖｉｖｏ実証の詳細な説明
【００４０】
胃腸炎症のマウスモデル
常在微生物叢に対する異常な免疫応答は、炎症性腸疾患などのある特定の疾患症状に関係があると指摘されている（Ｂｒａｎｄｚｅａｇ Ｐ．ら， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．， １９９７， １８， ５５５）。正常細菌叢に関連する抗原は、通常、免疫寛容をもたらし、この寛容の獲得の失敗が粘膜炎症の主な機構である（Ｓｔａｌｌｍａｃｈ Ａ．ら， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １９９８， １９， ４３８）。この寛容崩壊の確証には、ＩＢＤ（炎症性腸疾患）の患者の腸内細菌叢に対して生起された抗体レベルの増加が含まれる。さらに、胃腸管に炎症性病変を起こしやすくした特定のマウスモデルは、無菌条件で飼育されるかまたは抗生物質で処置されると、無疾患のままである（Ｋｕｈｎ Ｒ．ら， Ｃｅｌｌ， １９９３， ７５， ２６３； Ｐａｎｗａｌａ Ｃ． Ｍ．ら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９８， １６１， ５７３３）。
【００４１】
Ｃ５７ＢＬ／６インターロイキン−１０ノックアウトマウスは、腸内細菌叢の存在下では腸炎を発症しやすくなる。無菌条件に維持すると、ＩＬ−１０ノックアウトマウスは該疾患を発症しない（Ｋｕｈｎ Ｒ．ら， Ｃｅｌｌ， １９９３， ７５， ２６３）。該疾患の病因は腸内細菌叢と関係しているので、この菌叢の特定の成分の排除は、該疾患の重篤度に有益な効果を及ぼす可能性がある。
【００４２】
ラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウスＵＣＣ１１８は、健康なヒトの回腸から単離された共生菌である。該細菌は共生菌株を選択するために設定された多くの判定基準を満たすので胃腸コロニー形成に適している。これらの判定基準には、胆汁耐性（ｂｉｌｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、酸耐性およびヒト大腸細胞系へのｉｎ ｖｉｔｒｏ付着などの形質が含まれる。健康なヒトの摂食試験を実施し、胃腸細菌叢の相当な改変が認められた。さらに、ＵＣＣ１１８は粘膜免疫系により認識され、ＵＣＣ１１８に特異的なＩｇＡの産生と分泌を生じた。
【００４３】
このようにして、ＵＣＣ１１８は胃腸管通過中生存し、腸内細菌叢を調節し、粘膜免疫系により認識される。胃腸管内の炎症応答を調節する上でのこの共生菌の効果を、腸炎のマウスモデルを使って試験した。さらに、本発明者らは、胃腸管内の新生物性変化の割合を低減する上でのラクトバチルス・サリバリウス亜種サリバリウスＵＣＣ１１８の役割を試験した。
【００４４】
２０匹のＩＬ−１０ ＫＯマウス（１０匹はミルクに含まれた共生菌を消費し、１０匹は変更されていないミルクを消費した）を、６週間にわたって研究した。糞便微生物分析を毎週実施し、ラクトバチルス、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、バクテロイド（ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、大腸菌群（ｃｏｌｉｆｏｒｍｓ）、ビフィズドバクテリア（ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）および腸球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の排泄を数えた。犠牲動物では、小腸および大腸を微生物学的におよび組織学的に評価した。
【００４５】
試験動物において、糞便大腸菌群および腸球菌レベルが、対照動物と比較して有意に低下した。犠牲動物において、ウェルシュ菌数の有意な低下が試験マウスで観察された（図１）。対照群における劇症大腸炎による２匹の死と比較して試験群に致死はなかった。大腸腺癌を発症したのは、対照群における５匹と比較して、試験群では１匹だけであった。試験動物の粘膜炎症スコアは、対照マウスの場合より一貫して低かった（図２）。ＵＣＣ１１８消費後の腫瘍発生数の低下は、胃腸管内の炎症レベルの低下と関係があるかまたは胃腸細菌叢の前発癌物質メンバーの排除によると考えられる（Ｒｕｍｎｅｙ Ｃ．Ｊ．，ら， Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， １９９３， １４， ７９；Ｒｏｗｌａｎｄ Ｉ．Ｒ． （１９９５）． Ｉｎ：Ｇｉｂｓｏｎ Ｇ．Ｒ．（編）．「ヒトの大腸細菌：栄養における役割、生理学および病理学（Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ： ｒｏｌｅ ｉｎ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ． ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」， ｐｐ １５５−１７４． Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｄａｒｖｅａｕ Ｄ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １９９９， １７， １９）。
【００４６】
結論として、ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８の消費は、腸内細菌叢の有意な調節ならびに死亡率、癌発生数および疾患スコアの改善をもたらす。
【００４７】
実施例２：　活性クローン病の患者におけるＵＣＣ１１８を用いるヒト試験
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病および潰瘍性大腸炎の両方を含む多数の胃腸管の炎症性障害を包含する。
【００４８】
活性クローン病に罹った患者をＵＣＣ１１８を用いて治療した。簡単に説明すると、発酵乳製品に入れたＵＣＣ１１８を、６週間２２名の患者が消費した。微生物学的および免疫学的測定を、０週、１週、３週および６週に実施した。この試験はプラセボを対照としたものではなかった。
【００４９】
多数の全身性サイトカインレベルを、摂食の経過にわたって測定した。特に、炎症性腸疾患を含む多くの炎症性疾患症状の病因との関係が指摘されている炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を測定した。炎症性腸疾患に対する現行の治療は、特にＴＮＦαレベルを低下することを目指す（Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｄ．Ｈ．，ら， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ．， １９９９， ３４０， １３９８）。本試験においては、全身性ＴＮＦαレベルは、ＵＣＣ１１８の消費後に低下した（図３）。
【００５０】
さらに、患者のクローン病活性指数（ＣＤＡＩ）を試験期間の６週間にわたって評価した。この指数は、各患者の総合的な健康と安寧を評価する。結局、本試験において、大多数の個人に対する該疾患活性指数はわずかに改善した。これらは中度に活性な疾患をもつ患者であり、彼らのＣＤＡＩスコアは増加すると予想された。しかし、ＵＣＣ１１８を用いた治療後、ＣＤＡＩスコアは増加せず、実際、それらは平均１８０から１６０へ改善した。
【００５１】
実施例３：　ラクトバチルス・サリバリウス、特に亜種サリバリウスＵＣＣ１１８の抗炎症効果の根底にある機構のｉｎ ｖｉｔｒｏ実証の詳細な説明
これらの研究には、ＥＬＩＳＡ（細胞外タンパク質の測定）、フローサイトメトリー（細胞内タンパク質の測定）およびｃＤＮＡ発現アレイ（ｍＲＮＡ発現）を含む多数の方法論を利用した。特に、臨床的に重要である腫瘍壊死因子αの発現の試験に狙いを定め、３つの方法論全てを使ってＵＣＣ１１８への暴露後のこのサイトカインの産生の抑制を認めた。
【００５２】
上皮細胞および末梢血単核球を用いたトランスウエルアッセイシステムを使い、細胞外サイトカインレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。ＵＣＣ１１８との共培養後、産生されるＴＮＦα量は、対照培養物と比較して有意に低下した。さらに、ＩＬ−１ＲＡおよびＩＦＮγレベルは低下したが、一方でＩＬ−６および可溶性ＩＬ−６受容体レベルは増加した（図５）。ＴＮＦαに対する細胞内染色は、ＵＣＣ１１８刺激したサンプル中のＴＮＦαレベルが対照と比較するとより低いというＥＬＩＳＡ結果に確証を与えた。
【００５３】
図６は、存在する３細胞シグナル伝達を実証する。ＰＢＭＣとラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８株との共培養は、結果としてＴＮＦα産生を刺激する。しかし、ＰＢＭＣ、ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８株および上皮細胞（ＣａＣｏ−２細胞）の共培養は、結果としてＴＮＦα産生を有意に抑制する。従って、細菌およびＰＢＭＣだけと比較すると、３細胞モデルには有意に異なるシグナル伝達パターンが存在する。
【００５４】
遺伝子アレイは細胞集団中のｍＲＮＡ量を測定する。本発明者らは、末梢血単核球をＵＣＣ１１８を用いて２４時間刺激し、サイトカイン遺伝子発現に与えるその効果を試験した（図７）。サイトカイン遺伝子発現のかなりの改変が認められた。例えば、炎症性サイトカインＩＬ−１βおよびＴＮＦαをコードする遺伝子は消えたが、ＩＬ−６などのＴｈ２型サイトカインをコードする遺伝子は増加した。
【００５５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、ＵＣＣ１１８がＴｈ２型サイトカイン（すなわち、ＩＬ−６およびＩＬ−６可溶受容体）を誘導できるが、一方でＴＮＦαおよびＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインの産生を抑制することを実証した。従って、これらの結果は、ＵＣＣ１１８の消費がＩＢＤなどの炎症性疾患に罹っている患者にとって有益であるだろうことを示唆する。
【００５６】
実施例４：　抗炎症性細菌株に対する試験
ヒトの胃腸管から単離した多数の乳酸菌をこの新規のアッセイシステムで抗炎症効果について試験した。全ての菌株を−２０℃グリセロールストックから取り出し、一夜、ＭＲＳブロス中で嫌気的に培養し、そして抗生物質含有培地中で洗浄した。上皮細胞単層を６週間増殖した後、ＰＢＭＣおよび細菌細胞を加えた。
【００５７】
これらの刺激の結果は図８で観察することができる。対照培養物と比較すると、２種の細菌株がＴＮＦα産生を抑制した。ＴＮＦαの産生を抑制した上記２種の株の、ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８株は、ＷＯ−Ａ−９８３５０１４の主題である。ビフィドバクテリウム・ロングム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＵＣＣ３５６２４株は、本出願と同時出願されたＰＣＴ出願の主題である。
【００５８】
炎症
炎症は、持続的な身体的損傷、感染を有する部位、または進行中の免疫応答が存在する場所での体液、血漿タンパク質および白血球細胞の局所的蓄積を表すために用いられる語句である。炎症性応答の抑制は、多数のレベルで働く（総説としては、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｂ．、およびＷｉｌｓｏｎ Ｍ． １９９８、「健康および疾患における細菌−サイトカイン相互作用」（Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｐｏｒｔｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ、７９−１３０を参照）。制御因子としては、サイトカイン類、ホルモン類（例えば、ヒドロコルチゾン）、プロスタグランジン類、反応性中間体類およびロイコトリエン類が挙げられる。サイトカイン類は、発達、組織修復および血液新生も調節しながら、免疫学的応答および炎症応答の生成および制御に関与する低分子量生物学的活性タンパク質である。それらは、白血球自身の間およびまた他の細胞タイプとのコミュニケーション手段を提供する。殆どのサイトカイン類は、多面発現性であり、複合的な生物学的にオーバーラップした活性を発現する。サイトカインカスケードおよびネットワークは、特定の細胞タイプへの特定のサイトカインの作用よりもむしろ炎症性応答を制御する（Ａｒａｉ ＫＩ，ら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９０；５９：７８３−８３６）。炎症性応答の衰退は、より低い濃度の適切な活性化シグナルおよび炎症性応答を停止に導く他の炎症性メディエイターを生じさせる。ＴＮＦαは、炎症状態を引き起こすサイトカイン類のカスケードおよび生物学的効果を開始させる、中枢的前炎症性サイトカインである。従って、ＴＮＦαを阻害する試薬（例えば、インフリキシマブ）は、現在、炎症性疾患の治療に用いられている。
【００５９】
前炎症性サイトカイン類は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む多くの炎症性疾患の病因において重要な役割を果たしていると考えられている。ＩＢＤを治療するための最新の治療法は、ＩＬ−８およびＴＮＦαを含む、前炎症性サイトカイン類の濃度を低減することを目的としている。そのような治療法は、慢性関節リウマチなどの全身性炎症性疾患の治療においても重要な役割を果たしうる。
【００６０】
本願発明者らが発見したラクトバチルス・サリバリウスの抗炎症特性を考慮すると、これらの菌株は、特に、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）またはインフリキシマブなどの他の抗炎症治療法と組み合わせて用いれば、ある範囲の炎症性疾患の治療に適用しうる可能性がある。
【００６１】
下痢性疾患
腸上皮のバリア機能は、神経（アセチルコリン）および免疫（ヒスタミン）仲介分泌の間に低下しうる。ある細菌性毒素も、Ｃａ２＋およびＰＫＣ依存性分泌を誘導でき、それによって、上皮バリアを妨害する（Ｇａｎｇｕｌｙ ＮＫおよびＫａｕｒ Ｔ．、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ １９９６；１０４：２８−３７、Ｇｒｏｏｔ ＪＡ．、Ｖｅｔ Ｑ １９９８；２０（Ｓ３）：４５−９）。幾つかの研究によって、共生細菌を用いた下痢の予防および治療が調べられた。期待された研究は、早産児、新生児、子供の下痢に対する予防的および治療的使用（Ｉｓｏｌａｕｒｉ Ｅ，ら、Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ １９９４ Ｄｅｃ； ３９（１２）：２５９５−６００）、ならびに抗生物質関連下痢（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉａｒｒｈｏｅａ）の治療（Ｓｉｉｔｏｎｅｎ Ｓ，ら、Ａｎｎ Ｍｅｄ １９９０ Ｆｅｂ； ２２（１）：５７−９）、および旅行者の下痢（ｔｒａｖｅｌｌｅｒ’ｓ ｄｉａｒｒｈｏｅａ）の治療（Ｏｋｓａｎｅｎ ＰＪ，ら、Ａｎｎ Ｍｅｄ １９９０ Ｆｅｂ； ２２（１）：５３−６）についての乳酸菌投与の有効性を立証した。
【００６２】
本発明者らが発見した抗炎症効果から考えると、ラクトバチルス・サリバリウスも恐らくｃＡＭＰ調節が介在して抗下痢効果を生じるのであろう。環状ＡＭＰ依存的Ｃ１分泌は、ヒトの腸における主要分泌経路である（Ｂｒｚｕｓｚｃｚａｋ ＩＭ，ら， ，Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｈｅｐａｔｏｌ． １９９６； １１（９）：８０４−１０）。この抗下痢効果は、胃腸管炎症から生じる下痢にとどまらず、下痢性疾患の一般的治療に適用することができる。
【００６３】
自己免疫疾患
免疫系は、Ｂ細胞およびＴ細胞によって発現される特異性の広いレパートリーを有する。これらの特異性の幾つかは、自己成分に向けられるであろう。自己認識は、クローン除去および自己反応性リンパ球の不活性化によって通常は抑制されている。しかしながら、血清中に見られる多くのタンパク質への抗体による自己免疫の一定した背景が存在する。自己−非自己認識系の崩壊が自己免疫を引き起こす。自己免疫疾患が起きると、その結果として生じる免疫応答が、攻撃すべき抗原を有する組織を損傷する。免疫複合体沈着、ＩＩ型過敏症および細胞仲介反応は、免疫組織学的損傷が起きることによる、最も重要なメカニズムである。自己免疫疾患の例としては、以下に限定されないが、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症および悪性貧血が挙げられる。本願発明者らは、ラクトバチルス・サリバリウスが免疫調節的な細菌であることを見出した。従って、自己免疫疾患を患う患者による、この細菌の単独成分として、または他の細菌と組合せた消費は、器官損傷を制限し、身体の正常な恒常性の回復を助けることができる。
【００６４】
炎症および癌
腫瘍タイプの広い範囲に渡り多機能性サイトカイン類の製造は、著しい炎症性応答が癌を有する患者で進行中であることを示唆している。この応答がｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の増殖および進行に対してどのような保護効果を有しているかは現在明らかにされていない。しかしながら、炎症性応答は、腫瘍を有する宿主に悪影響を及ぼしうるであろう。複雑なサイトカイン相互作用は、サイトカイン製造の調節ならびに腫瘍組織および正常組織内の細胞増殖と関与している（ＭｃＧｅｅ ＤＷ，ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９５ Ｓｅｐ； ８６（１）：６−１１、Ｗｕ Ｓ，ら、Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ １９９４ Ａｐｒ； ５３（１）：５９−６３）。体重減少（悪液質）は癌を有する患者の死亡の共通の最も一般的な原因であり（Ｉｎａｇａｋｉ Ｊ，ら、Ｃａｎｃｅｒ １９７４ Ｆｅｂ； ３３（２）：５６８−７３）、初期の栄養失調は予後不良を示していると長い間認識されてきた（Ｖａｎ Ｅｙｓ Ｊ． Ｎｕｔｒ Ｒｅｖ １９８２ Ｄｅｃ； ４０（１２）：３５３−９）。腫瘍が増殖し広がるためには、新しい血管の形成を誘導し、細胞外基質を侵食しなければならない。炎症性応答は、上記メカニズムで果たされる、すなわち、宿主の衰弱および腫瘍の発達に寄与する、重要な役割を有しうる。ラクトバチルス・サリバリウス、これら細菌株の抗炎症特性によって、悪性細胞の変質の割合を低減できる。さらに、腸内細菌は、食事化合物から、遺伝毒性、発癌性および腫瘍促進活性を有する物質を製造でき、腸内バクテリアは、発癌性前駆体（ｐｒｏ−ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ）をＤＮＡ反応性試薬に活性化することができる（Ｇｉｂｓｏｎ Ｇ．Ｒ．編集、「ヒト結腸の細菌：栄養摂取、生理学および病理学における役割（Ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ： ｒｏｌｅ ｉｎ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」中、Ｒｏｗｌａｎｄ Ｉ．Ｒ． （１９９５）、「結腸の毒性学：腸ミクロフローラの役割（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎ： ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ．）」、ｐｐ １５５−１７４、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）。一般に、ラクトバチルス属の種は、バクテロイド、真正細菌およびクロストリジウム属などの腸内の他の集団に比べて、生体異物代謝酵素の活性が低い（Ｓａｉｔｏ Ｙ，ら、Ｍｉｃｒｏｂ． Ｅｃｏｌ． Ｈｅａｌｔｈ Ｄｉｓ．， １９９２； ５， １０５−１１０）。従って、腸内のラクトバチルス菌の数の増加は、これらの酵素の濃度を有利に改質できるであろう。
【００６５】
プレバイオティック
共生生物の導入は、適当な担体中の微生物を摂取することによって達成される。大腸でのこれらの共生株の増殖を促進するであろう培地を提供することが有利であろう。１種以上のオリゴ糖類、多糖類または他のプレバイオティックの添加は、胃腸管中での乳酸菌の増殖を増強する（Ｇｉｂｓｏｎ， ＧＲ． Ｂｒ． Ｊ． Ｎｕｔｒ． １９９８； ８０（４）：Ｓ２０９−１２）。プレバイオティックとは、陽性値を有すると考えられる固有細菌（例えば、ビフィドバクテリウム、ラクトバチルス）によって結腸内で特異的に発酵された任意の非生存食物成分をいう。プレバイオティックのタイプとしては、フルクトース、キシロース、大豆、ガラクトース、グルコースおよびマンノースを含有するものを挙げることができる。共生株と１種以上のプレバイオティック化合物との組み合わせ投与によって、投与された共生菌のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖が増強され、目立った健康上の利点をもたらすことができ、これをシンビオティック（ｓｙｎｂｉｏｔｉｃ）と呼ぶ。
【００６６】
他の有効成分
ラクトバチルス・サリバリウスは、予防的にまたは、それ自身のもしくは他の共生物質および／または上記のプレバイオティック物質による治療方法として投与できることが理解されるであろう。さらに、細菌を、他の活性物質（例えば、炎症または他の障害、特に胃腸管の障害の治療に用いられるもの）を用いた予防的または治療的投薬計画の一部として用いることができる。このような組み合わせは、単一の配合物で、または同時または異なる時間に投与され、同一または異なる経路で投与される別々の配合物として投与できる。
【００６７】
本発明は、詳細な点で異なりうる前記実施形態に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
プラセボ群と比較したＵＣＣ１１８を消費するマウス中のウェルシュ菌（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）レベルのグラフである（ｐ＜０．０５）。結果は、それぞれの群に対する平均対数値±標準誤差としてプロットしてある。
【図２】
対照マウスと比較した、ＵＣＣ１１８を消費するマウスに対する炎症スコアの棒グラフである。結果は、それぞれの群に対する平均値±標準誤差として示してある。
【図３】
ＵＣＣ１１８を消費する患者の６週にわたってのＴＮＦαレベルのグラフである。結果は、それぞれの時点に対する平均ｐｇ／ｍｌ ＴＮＦαレベルとしてプロットしてある（ｎ＝２２）。
【図４】
共生菌（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）摂食の経過にわたってのＵＣＣ１１８を消費する患者に対するＣＤＡＩスコアのグラフである。ＣＤＡＩスコアは、平均で１８０から１６０に低下する。
【図５】
ＵＣＣ１１８への暴露後のｉｎ ｖｉｔｒｏのサイトカイン産生のグラフである。結果はｐｇ／ｍｌで表してある。
【図６】
ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８へ暴露後の細胞外ＴＮＦα、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒ、およびＩＦＮαレベルの棒グラフである。
【図７】
ＵＣＣ１１８への免疫応答を試験するための、２６８サイトカインおよび関連分子に対する特異的遺伝子配列をもつ遺伝子アレイである。下のパネルは対照培養物を示し、一方、上のパネルはＵＣＣ１１８への暴露後のＰＢＭＣによるサイトカイン遺伝子発現を示す。
【図８】
様々な細菌株の存在下でのＴＮＦαレベルの棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004502633.tif 000040
【国際調査報告】
2004502633.tif 000041
2004502633.tif 000042
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