(57)【要約】メチル化および/または非メチル化核酸での高効率形質転換の能力があり、かつバクテリオファージに耐性である、新規細菌宿主が開示される。そのような細菌は以下を含む：(1)高効率形質転換能を与えるF'エピソーム；(2)メチル化核酸の形質転換を可能にする1つもしくは複数の突然変異；(3)非メチル化核酸での形質転換を可能にする1つもしくは複数の突然変異；および/または(4)バクテリオファージ感染に対する耐性を与える1つもしくは複数の突然変異。そのような細菌を形質転換するための方法、およびそのような細菌(例えば、形質転換についてコンピテントとなっている細菌)を含むキットもまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む単離された細菌：
高効率形質転換能(transformability)を与えるF'エピソーム；メチル化核酸の形質転換を可能にする1つまたは複数の突然変異；非メチル化核酸での形質転換を可能にする1つまたは複数の突然変異；およびバクテリオファージ感染に対する耐性を与える1つまたは複数の突然変異。
【請求項２】
大腸菌株である、請求項1記載の細菌。
【請求項３】
菌株がK-12である、請求項2記載の細菌。
【請求項４】
F'エピソームの遺伝子型がproAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR)を含む、請求項3記載の細菌。
【請求項５】
非メチル化核酸の形質転換を可能にする1つまたは複数の突然変異が、hsdR、hsdMおよび/またはhsdS遺伝子を含む、請求項3記載の細菌。
【請求項６】
メチル化核酸の形質転換を可能にする1つまたは複数の突然変異が、mcrA、mcrBCおよび/またはmrr遺伝子を含む、請求項3記載の細菌。
【請求項７】
バクテリオファージがファージT1である、請求項3記載の細菌。
【請求項８】
バクテリオファージ感染に対する耐性を与える1つまたは複数の突然変異が、tonA遺伝子を含む、請求項3記載の細菌。
【請求項９】
mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) tonA / F' proAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR)を含む遺伝子型をもつ、単離された大腸菌K-12細菌。
【請求項１０】
遺伝子型に以下を含む、請求項9記載の細菌：
mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 deoR tonA panD / F' proAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR)。
【請求項１１】
大腸菌BRL3946(NRRLアクセッション番号B-30640)である、請求項9記載の細菌。
【請求項１２】
大腸菌BRL3946(NRRLアクセッション番号B-30640)の派生物（derivative）である、請求項9記載の細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、バイオテクノロジー分野に関する。特に、本発明は、メチル化および/または非メチル化核酸での高効率形質転換の能力があるバクテリオファージ耐性細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
バイオテクノロジー分野におけるクローニング操作は、しばしば、外因性核酸を細菌宿主へ導入することを含む。特別に設計された細菌宿主は、そのようなクローニング操作に関連した難問にバイオテクノロジー研究者が対処する上で、役に立つことがある。
【０００３】
一つの特定のクローニング課題は、低量で存在する核酸によって細菌宿主を形質転換することに関する。形質転換効率は、細菌宿主の遺伝子型により影響を受けることがある。従って、高効率形質転換の能力がある細菌宿主を用いることで、少量核酸のクローニングの可能性を高めることができる。そのような高効率宿主は、プラスミドライブラリー(例えば、cDNAライブラリー)におけるクローンのようなまれな核酸を得るために特に有用である。そのような宿主はまた、非効率的または複雑なクローニング工程(例えば、単一または複数の平滑末端ライゲーション反応)の産物を形質転換するために特に有用である。
【０００４】
もう一つのクローニング課題は、細菌宿主においてメチル化核酸の導入および維持を排除する細菌制限系に関する。一般的に、メチル化DNAは、まれに発現されるゲノムDNA(まれに発現されるゲノムDNAは、メチル化されている場合もあるし、されていない場合もあるが、活発に発現されるゲノムDNAより高い程度でメチル化されている傾向がある)に関連している。メチル化DNAは、しばしば、特定の発生段階中のみまたは特定の細胞型(例えば、特定の組織または罹患した細胞)においてのみ発現されるため、それは、バイオテクノロジー研究者にとって特に興味深いものでありうる。メチル化DNAの導入および維持を阻止しない細菌宿主は、そのような関心対象のDNAをクローニングするために有用である。
【０００５】
もう一つのクローニング課題は、形質転換された細菌のバクテリオファージ感染に関する。エアゾル化により伝染するバクテリオファージ(例えば、バクテリオファージT1)は、ハイスループットバイオテクノロジー研究所およびゲノミクス研究機関において作製かつ維持されている多数の菌株を含む形質転換された細菌にとって特に深刻な脅威である。バクテリオファージ感染に耐性である細菌宿主は、そのような有益な形質転換された細菌を感染および破壊から防ぐために有用である。
【０００６】
多くの商業的に入手可能な細菌宿主は、メチル化DNAをクローニングすることができず、バクテリオファージ感染を受けやすい。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、メチル化および/または非メチル化核酸での高効率形質転換の能力がある細菌宿主であり、かつバクテリオファージ感染に耐性がある細菌宿主を特徴とする。具体的には、本発明は、以下を含む細菌を特徴とする：(1)高効率形質転換能(transformability)を与えるF'エピソーム；(2)メチル化核酸の形質転換を可能にする1つもしくは複数の突然変異；(3)非メチル化核酸での形質転換を可能にする1つもしくは複数の突然変異；および/または(4)バクテリオファージ感染に対する耐性を与える1つもしくは複数の突然変異。好ましい局面において、細菌宿主は、mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) tonA / F' proAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR)を含む遺伝子型をもつ大腸菌K-12細菌である。特に好ましい局面において、細菌は、遺伝子型：mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 deoR tonA panD / F' proAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR)をもつ大腸菌K-12株BRL3946である。BRL3946株は、National Center for Agricultural Utilization Research in Peoria, Illinois, USAにより維持されているAgricultural Research Service Patent Culture Collectionに寄託されている(NRRLアクセッション番号B-30640)。本発明はまた、そのような細菌を形質転換するための方法を特徴とする。本発明はまた、そのような細菌(例えば、形質転換についてコンピテントとなっている細菌)を含むキットを特徴とする。
【０００８】
本発明に沿った細菌宿主は、当技術分野におけるいくつかのニーズを満たす。そのような細菌は、高効率形質転換の能力があり、低量で存在する核酸のクローニングを可能にする。そのような細菌はまた、まれに発現されるゲノムDNAを含むメチル化DNAのクローニングを可能にする。さらに、そのような細菌は、バクテリオファージ感染に耐性であり、形質転換体を感染および破壊から保護する。
【０００９】
本発明の他の有用な性質および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであると思われる。開示された材料、方法および実施例は、例証となるのみであり、限定することを意図しない。本明細書に記載されたものと類似または等価の方法および材料が本発明を実施するために用いられうることを当業者は認識するものと思われる。
【００１０】
他に規定がない限り、本明細書に用いられたすべての技術的および科学的用語は、バイオテクノロジー分野における当業者により一般に理解されている意味をもつ。本明細書に挙げられたすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、完全に参照として組み入れられる。矛盾する場合、定義を含む本明細書によって統制される。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、核酸をクローニングするための方法および材料を提供する。具体的には、本発明は、メチル化および/または非メチル化核酸での高効率形質転換の能力があり、かつバクテリオファージ耐性である新規な細菌宿主を提供する。本発明はまた、そのような細菌を形質転換するための方法を提供する。本発明はまた、そのような細菌(例えば、形質転換についてコンピテントとなっている細菌)を含むキットを提供する。
【００１２】
細菌宿主
本発明に沿った細菌宿主(または、交換可能に、「細菌」または「宿主」)は、以下を含む：(1)高効率形質転換能を与えるF'エピソーム；(2)メチル化核酸の形質転換を可能にする1つもしくは複数の突然変異；(3)非メチル化核酸での形質転換を可能にする1つもしくは複数の突然変異；および/または(4)バクテリオファージ感染に対する耐性を与える1つもしくは複数の突然変異。
【００１３】
適した細菌宿主は、当業者に公知の任意の属のグラム陰性およびグラム陽性細菌を含み、エシェリヒア属(Escherichia)の種(例えば、大腸菌)、クレブシエラ属(Klebsiella)の種、ストレプトミセス属(Streptomyces)の種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)の種、シゲラ属(Shigella)の種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)の種、エルウィニア属(Erwinia)の種、クレブシエラ属(Klebsiella)の種、バチルス属(Bacillus)の種(例えば、B. セレウス(B. cereus)、枯草菌(B. subtilis)および巨大菌(B. megaterium))、セラチア属(Serratia)の種、シュードモナス属(Pseudomonas)の種(例えば、緑膿菌(P. aeruginosa)およびP. シリンガエ(P. syringae))およびサルモネラ属(Salmonella)の種(例えば、チフス菌(P. typhi)およびネズミチフス菌(S. typhimurium))を含む。多くの細菌株および血清型が本発明に適しており、大腸菌株K、B、CおよびWを含む。好ましい細菌宿主は、大腸菌株K-12である。本発明に沿った細菌宿主が単離されている(すなわち、他の細菌、およびそれらが天然で付随している物質から少なくとも部分的に分離されている)。
【００１４】
本発明に沿った細菌宿主は、本明細書に開示されたもの、およびそれらの派生物（derivative）を含む。「派生的」細菌は、特定の「親」または「祖先」細菌に関して記載される。派生的細菌は、特定の細菌の染色体において1つまたは複数の突然変異(例えば、1つもしくは複数の核酸の付加、挿入、欠失または置換)を導入することにより作製されうる。例えば、RefSeq: NC_000913(GenBank: U00096に由来する、両方とも参照として本明細書に組み入れられる)に同定された大腸菌K-12核酸オープンリーディングフレームの1つまたは複数が突然変異誘発に曝されうる。派生的細菌はまた、特定の細菌に存在する染色体外核酸において1つまたは複数の突然変異(例えば、1つもしくは複数の核酸の付加、挿入、欠失または置換)を導入することにより作製されうる。派生的細菌は、特定の細菌に1つまたは複数の染色体外核酸(例えば、プラスミドまたはF'エピソーム)を加えることにより作製されうる。派生的細菌はまた、特定の細菌から染色体外核酸を除去することにより(例えば、「取り除くこと(curing)」により)作製されうる。すべてのそのような派生物を作製するための技術は、当業者により日常的な事として実施されうる。
【００１５】
高効率形質転換能を与えるF'エピソーム
本発明に沿った細菌宿主は、その形質転換効率(または「形質転換能」)を増強するF'エピソームを含みうる。形質転換とは、細菌における外因性核酸の導入および維持(一過性または安定な)を指す。外因性核酸は、天然かそうでないかのいかなる源に由来し、細菌へ導入できる核酸である。外因性核酸は、例えば、プラスミドDNAおよびファージDNAを含む。
【００１６】
高効率形質転換能を与えるF'エピソームは、F'を欠くが他の点では同じ遺伝子型をもつ細菌と比較して、1つより多い因子により、細菌宿主の形質転換の効率を増加させることができる。好ましい態様において、F'エピソームは、細菌宿主の形質転換効率を2〜4倍、または4倍より多くまでにも増加させる。一般的に、本発明に沿った細菌宿主は、DNAの1マイクログラムあたり少なくとも1 x 107個(例えば、1 x 108個、1 x 109個)の形質転換体の形質転換効率で形質転換されうる。
【００１７】
いくつかの態様において、F'エピソームの全部または一部が宿主の染色体へ組み込まれうる。いくつかの態様において、F'エピソームの全部または一部は、自己複製DNA分子上に存在しうる。いくつかの態様において、F'エピソームの全部または一部は、選択マーカー(例えば、テトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子のような、抗生物質に対する耐性を与える選択マーカー)に遺伝子的に連結されうる。好ましいF'エピソームは、米国特許第6,274,369号に開示されている。他の適したF'エピソームは、同定され、日常的方法を用いて当業者により細菌細胞へ導入されうる。
【００１８】
メチル化および/または非メチル化DNAでの形質転換
本発明に沿った細菌宿主は、メチル化および/または非メチル化核酸の形質転換を可能にする1つまたは複数の突然変異を含みうる。そのような突然変異は、入ってくる外因性DNAを分解する細菌の制限修飾系(Restriction-Modification System)(RMS)の機能を消失させるまたは妨害する。RMSタンパク質をコードする遺伝子は、突然変異(例えば、1つもしくは複数の核酸の付加、挿入、欠失および/または置換)が、RMS構成要素をコードする1つもしくは複数のヌクレオチド、および/またはそのようなヌクレオチドの転写に影響を及ぼすシス作用性決定因子を含む場合には変異体である。当業者は、アンチセンス核酸(例えば、細菌の染色体から、またはプラスミドのような自己複製核酸から作製された)が細菌のRMSの機能を妨害するために用いられうることを認識しているものと思われる。そのようなアンチセンス分子は、本明細書に用いられる場合の「突然変異」の意味の範囲内である。アンチセンス核酸は、例えば、
2006515185.tif 000002
に記載されている。他の、siRNA型、アンチセンス核酸は、例えば、米国特許第6,326,193号、第5,795,715号および第5,457,026号；ならびに米国特許出願第2002/0007051号A1、第60/068,562号および第09/215,257号(WO 9932619についての優先権書類)、第60/159,776号および第60/193,218号(WO 0129058についての優先権書類)、第60/189,739号および第60/243,097号(WO 0168836についての優先権書類)、ならびに第60/193,594号および第60/265,232号(WO 0175164についての優先権書類)に記載されている。
【００１９】
一般に、細菌は、RMSの2つの型を有する。細菌RMSの第一型は、非メチル化DNAを分解する。RMSのこの型は、標的部位(hsd系において、5'-AAC[N6]GTGC-3')を切断するかまたはメチル化するかのいずれかである酵素複合体を形成する、大腸菌hsdR、hsdMおよびhsdS遺伝子産物により例証される。酵素は、非メチル化標的部位を切断するが、ヘミメチル化されている標的配列をメチル化する。従って、機能しうるhsd遺伝子産物を含む細菌は、標的部位でメチル化されていない入ってくる外因性DNAを切断する。他方、存在しないまたは機能しないhsd酵素複合体という結果を生じる、hsdR、hsdMおよび/もしくはhsdSにおける1つまたは複数の突然変異を含む細菌宿主は、標的部位でメチル化されていない外因性DNAをクローニングするために有用でありうる。好ましい態様において、本発明に沿った細菌宿主は、hsdR、hsdMおよびhsdSの欠失によって、非メチル化DNAをクローニングするために有用でありうる。
【００２０】
細菌RMSの第二型は、メチル化DNAを分解する。RMSのこの型は、2つの大腸菌メチルシトシンRMS、McrAおよびMcrBC、により、ならびに大腸菌メチルアデニンRMS、Mrr、により例証される。McrA系は、CGジヌクレオチドのシトシンでメチル化されたDNA、および配列5'-CCGG-3'の2番目のシトシンでメチル化されたDNAを分解する。McrBC系は、配列(G/A)Cのシトシンでメチル化されたDNAを分解する。Mrr系は、アデニンメチル化および/またはシトシンメチル化DNAを分解する。存在しないもしくは機能しないMcrA、McrBCおよび/またはMrr RMS構成要素という結果を生じる、1つまたは複数の突然変異を含む細菌宿主は、メチル化外因性DNAをクローニングするために有用でありうる。好ましい態様において、メチル化DNAをクローニングするために有用な細菌宿主は、突然変異体McrA、McrBCおよびMrr遺伝子を有する。
【００２１】
大腸菌以外の細菌における両方の型のRMSは、特徴付けられており、要望どおり、メチル化および/または非メチル化DNAの導入を可能にするために、日常的な事として、当業者により突然変異を受けうる。
【００２２】
バクテリオファージ耐性
本発明に沿った細菌宿主は、バクテリオファージ感染に対する耐性を与える1つまたは複数の突然変異を含みうる。バクテリオファージ(または「ファージ」)は、それらの遺伝的構成物および/またはそれらのビリオン形態に基づいてお互いに区別されうる。いくつかのファージは、二本鎖DNAゲノムを有し、コルチコウイルス科(corticoviridae)、リポスリックスウイルス科(lipothrixviridae)、プラスマウイルス科(plasmaviridae))、ミロウイルス科(myrovridae)、シフォウイルス科(siphoviridae)、スルホロブスシバテ(sulfolobus shibate)、ポドウイルス科(podoviridae)、テクチウイルス科(tectiviridae)、およびフセロウイルス科(fuselloviridae)のファージを含む。別のファージは、一本鎖DNAゲノムを有し、ミクロウイルス科(microviridae)およびイノウイルス科(inoviridae)のファージを含む。別のファージは、RNAゲノムを有し、レヴィウイルス科(leviviridae)およびシストウイルス科(cystoviridae)のファージを含む。例示的バクテリオファージは、ファージWphi、Mu、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、P1、P2、P4、P22、fd、phi6、phi29、phiC31、phi80、phiX174、SP01、M13、MS2、PM2、SSV-1、L5、PRD1、Qベータ、ラムダ、UC-1、HK97およびHK022を含む。
【００２３】
バクテリオファージ感染に重要な宿主およびファージタンパク質は、当技術分野において知られており、日常的方法を用いて当業者により突然変異を受けうる。ファージ感染に耐性の細菌はまた、突然変異体(自発性または誘発性)細菌の日常的スクリーニングにより得られうる。ファージ耐性細菌は、しばしば、1つまたは複数の型のバクテリオファージの、それらの遺伝物質を細菌細胞へ挿入しうる能力を阻害するまたは実質的に低下させる細胞の性質をもつ。従って、いくつかのバクテリオファージ耐性細菌は、細菌の細胞表面へのバクテリオファージの付着、および/もしくは細菌の細胞質へのバクテリオファージの遺伝物質の挿入を防ぐまたは阻害する細胞の性質をもつ。バクテリオファージ耐性は、例えば、米国特許第5,538,864号、第5,432,066号および第5,658,770号、ならびにSaito, H. and Richardson, C.C., J. Virol. 37:343-352 (1981)、Stacey, K.A. and Oliver, P., J. Gen. Microbiol. 98:569-578 (1977)、Coulton, J.W., Biochim. Biophys. Acta 717:154-162 (1982)、Carta, G.R. and Bryson, V., J. Bacteriol. 92:1055-1061 (1966)、Ronen A. and Zehavi, A., J. Bacteriol. 99:784-790 (1969)、Braun-Breton, C. and Hofnung, M., Mol. Gen. Genet. 16:143-149 (1978)、およびPicken, R.N. and Beacham, I.R., J. Gen. Microbiol. 102:305-318 (1977)にさらに記載されている。
【００２４】
ファージ感染に重要なタンパク質は、突然変異(例えば、1つもしくは複数の核酸の付加、挿入、欠失および/または置換)が、そのタンパク質をコードする1つもしくは複数のヌクレオチド、および/またはそのようなヌクレオチドの転写に影響を及ぼすシス作用性決定因子を含む場合には突然変異体である。当業者は、アンチセンス核酸(例えば、細菌の染色体から、またはプラスミドのような自己複製核酸から作製された)がバクテリオファージ感染を妨害するために用いられうることを認識しているものと思われる。そのようなアンチセンス分子は、本明細書に用いられる場合の「突然変異」の意味の範囲内である。
【００２５】
エアゾル化により伝染するバクテリオファージは、バイオテクノロジー研究所の汚染された排気ダクトにおいてそのようなバクテリオファージのいくつか(例えば、ファージT1)が何年間も生存する可能性があり、形質転換された細菌にとって特に深刻な脅威である。従って、好ましい態様において、本発明の細菌宿主は、ファージT1が細菌の細胞表面へ付着する際に利用する非必須鉄輸送タンパク質をコードする、tonA遺伝子の突然変異により、ファージT1に対する耐性を与えられる。
【００２６】
コンピテント化および形質転換方法
外因性核酸を取り込みかつ維持する能力を細菌に与える(すなわち、細菌を「形質転換可能な」または「コンピテントな」細菌にする)ための、およびそれらを形質転換するためのプロトコールは、よく知られており、本発明に沿った細菌宿主を用いて当業者により日常的な事として実施されうる。Hanahan, J. Mol. Biol. 166:557-580 (1983)に開示されていることに基づいたプロトコールは、典型的には、結果として、細菌宿主に依存して、スーパーコイルのプラスミドDNA 1 μgあたり形質転換体107〜109個の形質転換効率を生じる。Mandel and Higa, J. Mol. Bio. 53:159-162 (1970)に開示されていることに基づいたプロトコールは、典型的には、スーパーコイルのプラスミドDNA 1 μgあたり105〜106個の形質転換体を生じる。細菌宿主はまた、電気穿孔法により形質転換されうる。
【００２７】
多価陽イオン(例えば、カルシウム、マンガン、マグネシウムおよびバリウム)、スルフヒドリル試薬および/または有機溶媒を含む溶液において細菌宿主をインキュベートすることは、形質転換効率に影響を及ぼしうる。細菌宿主がコンピテントとなる前に増殖する温度もまた、形質転換効率に影響を及ぼしうる。例えば、25℃と30℃の間の温度で増殖された大腸菌宿主は、37℃で増殖された大腸菌宿主と比較して形質転換効率の増加を示しうる(米国特許第4,981,797号)。
【００２８】
キット
本発明は、本明細書に開示された細菌宿主を含むキットを提供する。細菌宿主は、典型的には、1つまたは複数の密封容器(例えば、パック、バイアル、チューブまたはマイクロタイタープレート)で提供され、いくつかの態様においてはまた、細菌の栄養培地を含みうる。いくつかの態様において、細菌宿主は、乾燥されたまたは凍結乾燥された形態で提供される。いくつかの態様において、細菌宿主は、形質転換についてコンピテントとなっている。いくつかの態様において、キットは、別の容器に滅菌した細菌栄養培地を含む。キットは、典型的には、細菌宿主の性質(例えば、それの遺伝子型)を記載した文献、および/または形質転換に細菌宿主を使用する際の使用説明書を含む。いくつかの態様において、キットは、別の容器に1つまたは複数の核酸(例えば、プラスミドおよび/またはポリメラーゼ連鎖反応プライマー)を含む。いくつかの態様において、キットは、別の容器に1つまたは複数のクローニング酵素(例えば、核酸ポリメラーゼ、核酸リガーゼ、核酸トポイソメラーゼ、ウラシルDNAグリコシラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、リボヌクレアーゼおよび/またはリボヌクレアーゼ阻害剤)を含む。
【００２９】
本発明は、さらに、以下の実施例に記載されており、それは、例証としての役目を果たすが、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
実施例
実施例1
BRL3496株構築
大腸菌DH5α(商標)(Invitrogen)MCR細胞{mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 deoR / F-}をプラスミドpCM301 recAで形質転換し、DH5α(商標)MCR/pCM301 recAを産生した。プラスミドpCM301 recAは、温度感受性レプリコンを有し、機能性recA遺伝子産物をコードし、P1媒介型形質導入を可能にする。tonA(fhuA)における1.5 Kbの挿入物、連結されたzad220:Tn10トランスポゾン、およびpanD遺伝子における突然変異を有するP1CM溶原化DH5α(商標)(Invitrogen)派生物からの可溶化液を用いて、菌株DH5α(商標)(Invitorogen)MCR/pCM301 recAを形質導入した。テトラサイクリン耐性コロニーを選択し、バクテリオファージT5に対する耐性についてスクリーニングした。ファージT5耐性コロニーを、pCM301 recAを取り除くために42℃で、テトラサイクリン含有培地で再精製した。結果として生じた菌株は、BRL3932と名付けられたが、遺伝子型：mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 deoR tonA(T1) zad220::Tn10 panD / F-をもつ。
【００３１】
菌株3932を、フザリン酸含有培地上に蒔き、テトラサイクリン感受性についてフザリン酸耐性コロニーをスクリーニングすることにより、Tn10トランスポゾンを取り除いた。3932のテトラサイクリン感受性派生物を選択した。この菌株は、BRL3939と名付けられたが、遺伝子型：mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 deoR tonA(T1) panD / F-をもつ。BRL3939のいくつかの単離されたコロニーは、バクテリオファージT5に対してクロスストリークされ、すべてT5耐性であった。
【００３２】
F'エピソームを含むDH10B(商標)(Invitrogen)派生物{mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araΔ139 Δ(ara, leu)7697 galU galK rpsL (Strr) nupG / F' proAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR)}をBRL3939と接合させ、その接合した混合物を、テトラサイクリンおよびナリジクス酸を追加したルイラ-ベルターニ(Luira-Bertani)培地上に蒔いた。結果として生じた菌株は、BRL3946と名付けられたが、遺伝子型：mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 deoR tonA panD / F' proAB+ lacIq lacZ ΔM15 Tn10(TetR)をもつ。
【００３３】
実施例2
プラスミドDNAでのBRL3946の形質転換
pUC19 DNA(10 pg)が、米国特許第4,981,797号に記載された方法によりコンピテントとなったBL3496およびDH5α(商標)(Invitrogen){F- φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 deoR}細胞を形質転換するために用いられた。形質転換反応物は、DNAとともに氷上で15分間インキュベートし、42℃で45秒間熱ショックを与え、450 μl SOC培地を補充し、37℃で1時間インキュベートした。各形質転換反応(すなわち、10 pg pUC19 DNAあたり)に存在すると測定されたコロニー形成単位の数は、以下のとおりである：BL3496について33440 CFUおよびDH5α(商標)(Invitrogen)について10500 CFU。
【００３４】
実施例3
メチル化および非メチル化DNAでのBRL3946の形質転換
pUC19 DNA(100 ng)を、16 μl 反応容量において4ユニットのメチラーゼの存在下で、37℃で1時間、S-アデノシル-メチオニン(SAM)(1.6 mM)有りおよび無しで、インキュベートした。反応物を100倍に希釈し、2 μlを、米国特許第4,981,797号に記載された方法によりコンピテントとなったBL3496およびDH5α(商標)(Invitrogen)細胞を形質転換するために用いた。形質転換反応物は、DNAとともに氷上で15分間インキュベートし、42℃で45秒間熱ショックを与え、250 μl SOC培地を補充し、37℃で1時間インキュベートした。各形質転換反応(すなわち、100 ng pUC19 DNAあたり)に存在すると測定されたコロニー形成単位の数を表1に示す。
【００３５】
【表１】
2006515185.tif 000003
【００３６】
他の態様
前述の説明は、例証することを意図し、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲のその範囲により定義される。他の局面、利点および改変は、特許請求の範囲内である。
【国際調査報告】
2006515185.tif 000004
2006515185.tif 000005