(57)【要約】ＨＣＶなどの複製にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを利用するウイルス（ＲＤＲＰウイルス）のウイルスゲノムのゲノム複製をインビトロで行う方法。該方法は、ＲＤＲＰを産生する細胞内で複製が起こっているときにリポータータンパク質が生成されるように、リポーター配列（アンチセンスの方向）の５'末端および３'末端に作動可能に連結したウイルスゲノムの３'および５'非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む構築物を用いる。本発明の方法は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含むＲＤＲＰウイルスのゲノム複製を測定するための有効な手段、またＲＤＲＰウイルスのゲノム複製を抑制する能力について化合物を迅速にスクリーニングするための有効な手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製をＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存するウイルス（ＲＤＲＰウイルス）のゲノム複製をインビトロで測定する方法であって、工程：
（ａ）該ＲＤＲＰウイルスのゲノム配列のｃＤＮＡでトランスフェクションしておいたウイルス適合性の真核細胞を培養し、
（ｂ）該培養細胞を、リポーター遺伝子配列のｃＤＮＡをアンチセンスの方向で含む構築物でトランスフェクションし、その際、該リポーター遺伝子のｃＤＮＡ配列は、その５'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の３'末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）のｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、その３'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の５'末端のＵＴＲのｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、
（ｃ）該細胞を該ＲＤＲＰウイルスの複製が可能な条件下、充分な時間培養し、ついで
（ｄ）該リポーター遺伝子配列によってコードされるタンパク質の存在について該細胞を分析する
ことを含み、それによって該タンパク質の検出が該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製を測定する手段を提供することを特徴とする方法。
【請求項２】
該ＲＤＲＰウイルスがFlaviviridae科の成員である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ＲＤＲＰウイルスがＨＣＶである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該ウイルス適合性の真核細胞がヒトのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該ウイルス適合性の真核細胞がヒトの肝臓または腎臓細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）の該ウイルス適合性の真核細胞がヒト細胞株２９３ＦＬ＃９からのものである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）において、培養細胞のトランスフェクションを、エレクトロポレーション、リポソーム輸送、ＣａＰＯ４ショック、およびＤＥＡＥ−デキストランショックから選ばれる方法を用いて行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）において、該構築物が、５'ＵＴＲ配列の３'末端に作動可能に連結したデルタリボザイムのｃＤＮＡをセンスの方向でさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ゲンチシン耐性、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性、およびピューロマイシン耐性から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該リポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）において、該構築物が、５'ＵＴＲ配列の末端に作動可能に連結した肝炎デルタリボザイムのｃＤＮＡをセンスの方向でさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）において該構築物が配列番号１８を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において該構築物が配列番号１８を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
リポーター遺伝子配列のｃＤＮＡをアンチセンスの方向で含む構築物であって、該リポーター遺伝子のｃＤＮＡ配列が、その５'末端でＲＤＲＰウイルスの天然の３'末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）のｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、その３'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の５'末端のＵＴＲのｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結していることを特徴とする構築物。
【請求項１５】
該ＲＤＲＰウイルスがＨＣＶである、請求項１４に記載の構築物。
【請求項１６】
５'ＵＴＲ配列の３'末端に作動可能に連結した肝炎デルタリボザイムのｃＤＮＡをセンスの方向でさらに含む、請求項１４に記載の構築物。
【請求項１７】
該ＲＤＲＰウイルスがＨＣＶであり、該リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ゲンチシン耐性、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性、およびピューロマイシン耐性から選ばれる、請求項１６に記載の構築物。
【請求項１８】
配列番号１７を含む構築物。
【請求項１９】
請求項１４に記載の構築物を含む細胞。
【請求項２０】
請求項１６に記載の構築物を含む細胞。
【請求項２１】
２９３Ｂ４α細胞。
【請求項２２】
複製をＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存するウイルス（ＲＤＲＰウイルス）のゲノム複製を抑制する化合物または条件をインビトロで同定する方法であって、工程：
（ａ）該ＲＤＲＰウイルスのゲノム配列の全てまたは一部のｃＤＮＡでトランスフェクションしておいたウイルス適合性の真核細胞を培養し、
（ｂ）該培養細胞を、リポーター遺伝子配列のｃＤＮＡをアンチセンスの方向で含む構築物でトランスフェクションし、その際、該リポーター遺伝子のｃＤＮＡ配列は、その５'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の３'末端からの非翻訳領域（ＵＴＲ）のｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、その３'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の５'末端からのＵＴＲ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、
（ｃ）該培養細胞を、該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製を抑制することができると思われる化合物または条件に暴露し、
（ｄ）該細胞を該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製が可能な条件下、充分な時間培養し、ついで
（ｅ）該リポーター遺伝子配列によってコードされるタンパク質の存在について該細胞を分析する
ことを含み、それによって該リポーター遺伝子配列によってコードされる該タンパク質レベルの低減が、該化合物または条件が該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製を抑制しうることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２３】
該ＲＤＲＰウイルスがFlaviviridae科の成員である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該ＲＤＲＰウイルスがＨＣＶである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該ウイルス適合性の真核細胞がヒトのものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
該ウイルス適合性の真核細胞がヒトの肝臓または腎臓細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）の該ウイルス適合性の真核細胞がヒト細胞株２９３ＦＬ＃９からのものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｂ）において、培養細胞のトランスフェクションを、エレクトロポレーション、リポソーム輸送、ＣａＰＯ４ショック、およびＤＥＡＥ−デキストランショックから選ばれる方法を用いて行う、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）において、該構築物が、５'ＵＴＲ配列の３'末端に作動可能に連結したデルタリボザイム配列のｃＤＮＡをセンスの方向でさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
該リポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ゲンチシン耐性、ゼオシン耐性、ハイグロマイシン耐性、およびピューロマイシン耐性から選ばれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
該リポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｂ）において、該構築物が、５'ＵＴＲ配列の末端に作動可能に連結した肝炎デルタリボザイムのｃＤＮＡをセンスの方向でさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
該化合物または条件が、小さな分子量の合成化学物質、生きた生物またはかつて生きていた生物由来の有機化合物、生きた生物またはかつて生きていた生物由来の有機化合物に基づく合成化学物質、音、光および温度よりなる群から選ばれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
該化合物が小さな分子量の合成化学物質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
工程（ａ）において、該ウイルス適合性の細胞がＨＣＶのゲノム配列の全てのｃＤＮＡでトランスフェクションされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）において、該ＲＤＲＰウイルスのゲノム配列の該一部が、実質的にＮＳ２からＮＳ５ｂの領域をコードするゲノム配列からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）において、該ＲＤＲＰウイルスのゲノム配列の該一部が、実質的にＮＳ５ｂをコードするゲノム配列からなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ａ）における該培養細胞が２９３Ｂ４α細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
工程（ｂ）における構築物が配列番号１８を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
ゲノム複製をＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存するウイルス（ＲＤＲＰウイルス）に感染した細胞に選択的に作用させる方法であって、工程：
（ａ）該感染した細胞を、該細胞に作用させうるタンパク質をコードする遺伝子配列のｃＤＮＡをアンチセンスの方向で含む構築物でトランスフェクションし、その際、該ｃＤＮＡ配列は、その５'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の３'末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）のｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、その３'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の５'末端のＵＴＲのｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、ついで
（ｂ）該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製を充分な時間行わせる
ことを含み、それによって該ＲＤＲＰウイルスのゲノムが複製されると、該複製したＲＤＲＰウイルスによって産生されるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが工程（ａ）の構築物を発現させ、それによって細胞が作用を受ける
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／２６５,４３７号（その内容全体を参照のため本明細書中に引用する）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、医薬および分子生物学の技術分野に向けられたものであり、さらに詳細には、本発明は、複製を酵素ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）に依存するウイルスのウイルスゲノムの複製のためのインビトロ系である。本発明の方法は、ＲＤＲＰウイルスにおけるゲノム複製を測定する有効な手段を提供し、またＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含むＲＤＲＰウイルスのゲノム複製を抑制する能力について化合物を迅速にスクリーニングする有効な手段をも提供する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスゲノムは、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成されていること、および二本鎖または一本鎖であることが知られている。一般に、ウイルスゲノムは、複製後にゲノムをパッケージングする働きをするウイルスコートタンパク質をコードするし、また細胞の酵素とともにウイルスゲノムの酵素的複製を容易にする非構造タンパク質をもコードする。一本鎖ＲＮＡゲノムを有する幾つかのウイルスの場合は、ウイルスゲノムによってコードされる非構造タンパク質の１つはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）であり、これはウイルスがそのゲノム配列を複製するのに必要である。ウイルスの酵素ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはまたＲＮＡレプリカーゼとも呼ばれる。
【０００４】
ウイルスのFlaviviridae科は、複製をそれ自身のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存するウイルスのタイプの１つである。Flaviviridaeは、（＋）方向に一本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスの科である。「（＋）方向」なる語は、５'から３'方向に読み取ったときにコード方向またはセンス方向に存在する一本鎖核酸分子を示すために慣用で使用するものである。Flaviviridae科は、フラビウイルス、動物病原性ペスチウイルス、最近特徴付けられたＧＢウイルス（ＧＢＶ−Ａ、ＧＢＶ−ＢおよびＧＢＶ−Ｃ／Ｇ型肝炎ウイルス）、およびヒト疾患の観点から最も重要なHepacivirus属またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含む。これらウイルスのＲＮＡゲノムは、一般に、タンパク質加水分解によって別個の構造的および非構造的タンパク質産物のセットに開裂されるポリタンパク質をコードする単一の長いオープンリーディングフレームを含んでいる。ゲノムのオープンリーディングフレームの翻訳は、インターナルリボソーマルエントリーサイト（internal ribosomal entry site）（ＩＲＥＳ）として機能する５'非翻訳領域（ＵＴＲ）によって指令される。これらウイルスのゲノムの３'末端は、複製に必須と考えられる種々の長さの高度に保存されたＵＴＲ領域を含んでいる。
【０００５】
Flaviviridae科のウイルスで最もよく知られたものはＣ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）であり、これは非経口的に伝播する向肝性の（hepatotropic）ウイルスであり、霊長類において急性および慢性の肝炎並びに肝細胞癌腫を引き起こす。世界の人口の約２％がＨＣＶ感染に罹っていると思われる。ＨＣＶに対しては現在のところワクチンは存在せず、現在の治療は一般にインターフェロンの単独療法、またはアルファ−インターフェロンとヌクレオチドアナログであるリバビリンとの組み合わせに限られている。（１）（２）（３）（４）（５）。
【０００６】
ＨＣＶは、約３０００〜３０１１アミノ酸のポリタンパク質をコードする単一の中断されないオープンリーディングフレームからなる９.６ｋｂ長のゲノムを有するポジティブ鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶポリタンパク質は、複製、パッケージングおよび感染に必要な個々のＨＣＶタンパク質の前駆体である。ポリタンパク質前駆体の構造領域（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７タンパク質を含む）は、宿主細胞のシグナルペプチダーゼによりプロセシングされる。該前駆体の非構造領域（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂタンパク質を含む）は、ＮＳ２とＮＳ３の間はＮＳ２−３プロテアーゼによってプロセシングされ、一方、ポリタンパク質のＮＳ３−ＮＳ５Ｂ領域のプロセシングはＮＳ３プロテアーゼ活性によって達成される。
【０００７】
ＨＣＶウイルスの複製様式は依然として推論の域を越えず、現在の理解はフラビウイルスおよびペスチウイルスの他のものとの類推に基づいている。ＨＣＶの複製は、宿主細胞へのウイルスの侵入、およびウイルス粒子から宿主細胞の細胞質へのウイルスゲノム（＋）一本鎖ＲＮＡの放出によって開始されると思われている。ウイルスＲＮＡは細胞の酵素によって翻訳され、コードされたウイルスのポリタンパク質はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）を含む幾つかの別個の機能性ウイルスタンパク質にプロセシングされる。ついで、ＲＤＲＰは（−）鎖のＲＮＡ中間体の合成を開始し（鋳型ウイルスゲノムから）、この中間体が今度は新たな（＋）鎖ＲＮＡ分子の合成の鋳型として働く。ついで、これら（＋）鎖ウイルスＲＮＡ分子を、さらなるウイルスポリタンパク質発現、新たな（−）鎖ＲＮＡ分子の合成、または子孫ビリオンへのパッケージングに用いることができ、ついでこれら子孫ビリオンを感染細胞中に放出してＨＣＶ感染を拡散することができる。（１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在のところ、Flaviviridae科のＲＤＲＰウイルスの複製をインビトロでモニターする有効なシステムは存在しない。その結果、これら（＋）鎖ＲＮＡウイルスの複製のメカニズムを研究したり、またはそのような複製を抑制する化合物または条件を決定する手段が欠落している。細胞ベースでのＨＣＶ複製のためのシステムは記載されているが（１１）、これらシステムは抗ウイルス活性について多数の化合物をスクリーニングするためのプラットホームには容易にフォーマッティングできないプロトコールおよび終点に頼っている（１２）。本発明は、ＲＤＲＰウイルスの複製の有効なインビトロ操作およびモニタリングのためのシステムを提供することによってこれら課題に対する解決を提供するものである。本発明のシステムは、ＲＤＲＰウイルスの複製に対するインヒビターをスクリーニングするための都合のよいプラットホームを提供すべく組み立てることができる。本発明の方法はまた、ＲＤＲＰウイルスに感染した細胞をインビボで処置するための治療法をデザインするための手段をも提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、複製をＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存するウイルス（これらウイルスのタイプを本明細書で以下「ＲＤＲＰウイルス」という）のゲノムの複製をインビトロで有効に測定する方法を提供する。本発明の方法は、ＲＤＲＰウイルスのゲノムのｃＤＮＡでトランスフェクションしたウイルス適合性の（virally-compatible）真核細胞を培養し、ついでこれら培養した細胞を本発明の構築物でトランスフェクションする工程を含み、その際、該構築物はリポーター遺伝子配列をアンチセンスの方向に含む。該構築物のリポーター遺伝子ｃＤＮＡ配列は、その５'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の３'末端の非翻訳領域（以下、「ＵＴＲ」という）のｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、その３'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の５'末端のＵＴＲのｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結している。それゆえ、構築物は、天然のＲＤＲＰウイルスゲノムの３'および５'ＵＴＲによってフランキングされたリポーター遺伝子のアンチセンスの方向にあるｃＤＮＡからなっているであろう。本発明の構築物を含むトランスフェクションした細胞を、該ウイルスの複製が可能な条件下、充分な時間培養し、該リポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の存在について細胞を分析する。ＲＤＲＰウイルスゲノムのｃＤＮＡが複製され培養細胞内でプロセシングされておれば、ＲＤＲＰ酵素は合成され、それによって該構築物の重合および該リポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の合成が可能となる。かくして細胞でのリポータータンパク質の検出が該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製をモニターおよび測定する手段を提供する。
【００１０】
他の側面において、本発明は、複製をＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存するウイルス（ＲＤＲＰウイルス）のゲノム複製を抑制する化合物または条件をインビトロで有効に同定する方法を提供する。本発明の方法は、ＲＤＲＰウイルスのゲノム配列の全てまたは一部のｃＤＮＡでトランスフェクションしたウイルス適合性の真核細胞を培養し、ついでこれら培養した細胞を本発明の構築物でトランスフェクションする工程を含み、その際、該構築物はリポーター遺伝子配列をアンチセンスの方向に含む。該構築物のリポーター遺伝子ｃＤＮＡ配列は、その５'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の３'末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）のｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、その３'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の５'末端のＵＴＲのｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結している。培養細胞を、該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製を抑制することが可能であると思われる化合物または条件に暴露し、その後または同時に該細胞を、該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製が可能な条件下、充分な時間培養する。該リポーター遺伝子配列によってコードされるタンパク質の存在について細胞を分析し、それによって、該リポータータンパク質レベルの低下は該化合物または条件が該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製を抑制可能であることを示している。
【００１１】
本発明はまた、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存するウイルス（ＲＤＲＰウイルス）に感染した細胞に選択的に作用させる方法をも提供する。この方法は、ＲＤＲＰウイルスに感染した組織または細胞に、細胞に作用しうるタンパク質をコードする遺伝子または配列のｃＤＮＡをアンチセンスの方向に含む本発明の構築物でトランスフェクションすることを含み、その際、該タンパク質をコードする該ｃＤＮＡ配列は、その５'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の３'末端の非翻訳領域（ＵＴＲ）のｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、その３'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の５'末端のＵＴＲのｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結している。該ＲＤＲＰウイルスのゲノム複製に充分な時間をかける。それゆえ、該ＲＤＲＰウイルスのゲノムが複製されるとＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）が産生され、該ポリメラーゼが該構築物の重合を引き起こし、それによって該作用するタンパク質の感染細胞内での合成が可能となるであろう。このようにして、該ＲＤＲＰウイルスに感染した細胞のみが作用を受け、それによって感染細胞と正常細胞との混合集団内でＲＤＲＰウイルスに感染した細胞を選択的に作用させるメカニズムが得られる。本発明のこの態様の好ましい側面において、達成される作用は、細胞にとって有害または致死的であるタンパク質をコードする配列のｃＤＮＡを該構築物中に挿入することにより、該ＲＤＲＰウイルスに感染した細胞を選択的に害するかまたは殺すことである。
【００１２】
本発明の方法の全ての側面において、好ましい態様はＲＤＲＰウイルスがウイルスのFlaviviridae科から選ばれるものを含む。ＲＤＲＰウイルスはＨＣＶであるのが最も好ましい。
【００１３】
本発明の方法の全ての側面においてさらに好ましい態様は、本発明の構築物がさらに、該構築物の３'末端に該３'末端に隣接してセンスの方向で作動可能に連結したデルタリボザイム配列のｃＤＮＡを含むものを包含する。ＲＤＲＰウイルスがＨＣＶであるときは、肝炎デルタリボザイムのｃＤＮＡが天然のＨＣＶウイルスゲノムの５'ＵＴＲのｃＤＮＡの３'末端にセンスの方向で作動可能に連結している。
【００１４】
他の側面において、本発明は、リポーター遺伝子配列のｃＤＮＡをアンチセンスの方向で含む構築物を提供し、その際、該リポーター遺伝子ｃＤＮＡ配列は、その５'末端でＲＤＲＰウイルスの天然の３'末端のＵＴＲのｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結しており、その３'末端で該ＲＤＲＰウイルスの天然の５'末端のＵＴＲのｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）に作動可能に連結している。あるいは、本発明の他の側面において、リポーター遺伝子配列のアンチセンスｃＤＮＡの代わりに構築物は「作用性（affecting）遺伝子」のアンチセンスｃＤＮＡを含んでいてよく、その際、該遺伝子は細胞に作用することのできるタンパク質、好ましくは細胞を害するかまたは殺すことのできるタンパク質をコードする。これら本発明の側面において、ＲＤＲＰウイルスはＨＣＶであるのが好ましい。
【００１５】
本発明の構築物はさらに、作動可能に連結した構成的または誘導性プロモーターを含む。
本発明の構築物はさらに、天然のウイルスゲノムの５'ＵＴＲのｃＤＮＡ（アンチセンスの方向）の３'末端に作動可能に連結した肝炎デルタリボザイムのｃＤＮＡをセンスの方向で含むのが好ましい。
他の側面において、本発明は、本発明の構築物でトランスフェクションした真核細胞、好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞を提供する。
【００１６】
重要なウイルス科であるFlaviviridaeの幾つかの成員のウイルス複製をモデルとした都合のよいインビトロ系は今日まで報告されていない。このインビトロ系の欠如は、ウイルス感染、とりわけＨＣＶ感染の治療のための抗ウイルス剤の開発に向けたこの技術分野での研究の著しい障害となってきた。本明細書に記載するのは、ＲＤＲＰゲノムの複製が起こっている細胞の検出を可能とすべくフォーマッティングすることのできるインビトロ系である。この方法は、ＲＤＲＰウイルスゲノムの複製に応答して検出可能なリポータータンパク質を発現する構築物を使用する。本発明の方法は、ＲＤＲＰウイルスゲノムの複製を抑制することのできる化合物または条件をスクリーニングすべく操作することができる。本発明の方法はまた、ＲＤＲＰウイルスに感染した細胞に選択的に作用することのできるメカニズムをも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書では種々の定義および略語が提供される。大抵の術語は、特に断らない限り、本発明の技術分野の当業者によって付与されるような意味を有する。
【００１８】
以下の略語を本明細書で用いる：ＨＣＶ：Ｃ型肝炎ウイルス；ＤＮＡ：デオキシリボ核酸；ＲＮＡ：リボ核酸；ＵＴＲ：非翻訳領域；ｈｄｖｒｉｂｏ：肝炎デルタウイルスリボザイム；ＰＣＲ：複製連鎖反応；ＲＤＲＰ：ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素；ＩＲＥＳ：インターナルリボソームエントリーサイト；ＲＴ：逆転写酵素；およびＲＴ−ＰＣＲ：逆転写複製連鎖反応。
【００１９】
本明細書において「インビトロ」は、生きた生物内で起こることを意味する「インビボ」とは対照的に、生きた生物の外部で起こることを意味する。インビトロは、培養細胞内で起こる、または所定のプロセスを行うのに必要な細胞成分を含む細胞溶解液系内で起こるプロセスおよび条件を記載することができる。
【００２０】
本願の出願人は、ＲＤＲＰゲノムの複製の測定およびそのような複製のインヒビターの同定に関する本発明のインビトロ法を、細胞培養系で、あるいはウイルス適合性の真核細胞の細胞溶解液系で行うことができることを意図している。
【００２１】
本発明の文脈では、「ウイルス適合性の細胞」とは、ウイルスゲノムの複製を完了するためにＲＤＲＰウイルスによって必要とされる細胞タンパク質を含む真核細胞をいう。ウイルス適合性の細胞としては、これらに限られるものではないが、ウイルス粒子がその全複製サイクルを完了できる、すなわちウイルスが他の感染性のウイルス粒子を再生産および生成できる細胞が挙げられる。また、全ウイルス複製サイクルを維持できないが、ウイルスＲＮＡゲノムの複製は維持できる細胞も含まれる。好ましいウイルス適合性の細胞の例としては、哺乳動物、とりわけヒトの肝臓および腎臓細胞、およびＢ細胞およびＴ細胞が挙げられる。
【００２２】
「ＲＤＲＰウイルスのゲノム配列のｃＤＮＡでトランスフェクションしたウイルス適合性の細胞」とは、目的とするウイルスの機能性のゲノム配列を安定に導入した、ウイルス適合性の細胞をいう。ウイルスゲノムの複製を研究および測定するために本発明の方法を行う場合は、天然の複製を最も有効に擬態および研究するため、天然のウイルスゲノム配列の殆どまたは全てを導入するのが好ましいであろう。ウイルスの複製のインヒビターを同定するために本発明の方法を行う場合には、ゲノム全てを細胞のゲノム中に導入することもできるし、あるいは選択したウイルスゲノムの部分がＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列を含んでいる限り（これはＨＣＶゲノムのＮＳ５Ｂ部分として知られている）、研究すべきタンパク質をコードするウイルスゲノムの選択した部分のみを導入することもできる。ウイルスゲノムの全てまたは選択した部分を適当な細胞株に安定にトランスフェクションする方法は、当業者に知られている。たとえば、そのような方法は、“Continuous Human Cell Lines Inducibly Expressing Hepatitis C Virus Structural and Nonstructural Proteins”、Darius Marpour, Petra Kary, Charles M. RiceおよびHuber E. Blum (1998) Hepatology 28: 192201；“Transfection of a Differentiated Human Hepatoma Cell Line (Huh7) with In Vitro-Transcribed Hepatitis C Virus (HCV) RNA and Establishment of a Long-Term Culture Persistently Infected with HCV”、Young J. Yooら、J. of Virology, Vol. 69, No. 1, Jan. 1995, p. 32-38に報告されている。フラビウイルスのゲノム配列は一般に科学文献で利用可能であり、たとえば、ウイルスおよびフラビウイルス遺伝子配列を含む配列のジーンバンクライブラリーについてはwww.ncbi.nlm.nih.gov/genbankを参照。
【００２３】
本願の出願人は、ＲＤＲＰ細胞のゲノム複製の測定およびそのような複製のインヒビターの同定に関する本発明のインビトロ法を、ウイルス適合性の細胞の細胞培養系のみならず、これら細胞の細胞溶解液系でも行うことができることを意図している。たとえば、ＨＣＶ感染細胞培養からの細胞またはＨＣＶ陽性の個体から採り出した組織を、ＨＣＶ複製タンパク質源として働くことのできる細胞溶解液を作製するのに用いることができる。この溶解液は、当該技術分野でよく知られた方法、たとえば化学的または物理的手段によって感染培養液または組織細胞を溶解し、ついで巨大分子細胞破砕物の細胞溶解液を遠心分離によって清澄化することによって調製することができる。本発明のリポーター構築物のインビトロ転写によって産生されたリポーターＲＮＡを上記細胞溶解液に加え、ついでリポーターＲＮＡを加えた該溶解液をゲノムの複製が可能な適当な条件下でインキュベートすることができる。そのような条件（たとえば、温度、ｐＨ、塩濃度など）は知られており、あるいはアッセイについて選択した特定の系に対して当業者が実験により容易に決定することができる。ついで溶解液をアッセイしてリポータータンパク質が産生されたか否かを調べ、それによってウイルスゲノムの複製が溶解液系で起こったことが示される。そのような溶解液系は、ＲＤＲＰウイルスの複製のインヒビターの迅速かつ高処理量のスクリーニングに従う。
【００２４】
ウイルスに関して本明細書で使用する「複製」なる語は、感染性粒子の生成という結果となる全ウイルスの複製ではなく、ウイルスのゲノムの複製に関する。
【００２５】
本明細書において「トランスフェクション」とは、化学的、物理的または他の手段により異種ＤＮＡを真核細胞中に挿入するプロセスをいう。そのような手段としては、これに限られるものではないが、リポソーム輸送（異種ＤＮＡを含むリポソームミセルが細胞膜との融合によって細胞内にＤＮＡを輸送する）；ＣａＰＯ４またはＤＥＡＥ−デキストランショック（これら化学種が細胞膜を物理的に破砕することによって巨大分子が細胞の外部から内部に移動することを可能にする）；およびエレクトロポレーション（電気的ショックを用いて細胞膜を破砕することによって巨大分子が細胞の外部から内部に移動することを可能にする）が挙げられる。そのような方法は当該技術分野でよく知られている。新たに台頭しつつある核酸送達系はアデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス系を含み、これらウイルス系は遺伝子療法を目的としてヒト組織に異種ＤＮＡ配列を送達すべく開発および使用されつつある。また、本明細書において使用する「トランスフェクションした」とは、安定にトランスフェクションした細胞（この場合、トランスフェクションしたＤＮＡは宿主細胞のＤＮＡと組換えを起こして宿主細胞のゲノムの永続的な一部分となる）および一過性にトランスフェクションした細胞（この場合、トランスフェクションしたＤＮＡは宿主細胞のＤＮＡとは独立のままであり、異種ＤＮＡによる「感染」から細胞を防御するように作用する宿主細胞のメカニズムによって破壊されるか、または宿主細胞の複製によって希釈されるかのいずれかである）の両者を包含する。
【００２６】
さらに、複製の鋳型として用いるＲＮＡは、ウイルス感染、インビトロ転写ＲＮＡのトランスフェクション、および宿主細胞に安定にまたは一過性にトランスフェクションしたＤＮＡの転写（これらに限られるものではない）を含む方法によって細胞に送達することができる。安定にまたは一過性にトランスフェクションした異種ＤＮＡからのＲＮＡ転写は、構成的かまたは誘導性のいずれかで起こることができる。
【００２７】
本発明の文脈において、当業者は、トランスフェクションしたＤＮＡの転写が作動可能に連結したプロモーター系によって駆動されることを理解するであろう。「プロモーター」は、コード配列または機能性のＲＮＡの発現を制御できる調節核酸配列である。一般に、コード配列はプロモーター配列の３'側に位置するであろう。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子に由来するものであってもよいし、または天然に見出される異なるプロモーターからの異なる配列からなっていてもよい。異なる刺激に応答しての、または細胞または組織の発生の異なる段階での、細胞および組織のタイプに依存して、様々なよく知られたプロモーターが種々のコード配列の発現の指令に適していることが理解される。さらに、プロモーター配列（本発明のトランスフェクションしたＤＮＡの一部である）は、トランスフェクションしたＤＮＡの発現が構成的であるかまたは誘導性であるかを決定するであろう。構成的なプロモーターの例としては、これらに限られるものではないが、サイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、ヒト免疫不全ウイルスのロングターミナルリピートプロモーター、およびニワトリベータ−アクチンプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、これらに限られるものではないが、テトラサイクリン応答プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、およびマイフェプリストン誘導性プロモーターが挙げられる。
【００２８】
「作動可能に連結した」とは、一の核酸配列の機能が他の核酸配列によって影響を受けるような単一核酸フラグメント上の２またはそれ以上の核酸配列の関係をいう。たとえば、プロモーターは、それがコード配列の発現に影響を及ぼしうる（すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）ときに該コード配列に作動可能に連結している。コード配列は、プロモーターなどの調節配列にセンスまたはアンチセンスの方向で作動可能に連結することができる。
【００２９】
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼウイルス」または「ＲＤＲＰウイルス」なる語は、その核酸ゲノムの複製および感染性ウイルスの産生を機能性のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存するウイルスを意味する。とりわけ本発明に関連して、本発明者らはFlaviviridae科の成員であるウイルスを包含する。このウイルス科の成員の全てがウイルスゲノムの複製をウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに依存していることが示されている。ＲＤＲＰは、ＲＤＲＰとゲノムの３'および５'非翻訳領域（ＵＴＲ）との相互作用、新たなＲＮＡ鎖の合成の開始、および増殖する子孫ＲＮＡの継続した伸長を含む、ＲＮＡの複製における幾つかの必須の段階を行う。この科の種々の成員の各々のＵＴＲは特定のウイルスに特有であり、同定され、シークエンシングされてパブリックドメイン（すなわち、ジーンバンクデータベース）に収容されており、それゆえ容易に入手可能である。本発明の好ましい側面において、肝炎デルタウイルスからのリボザイムの配列を本発明の構築物の３'末端に配置する。この配列は、ＲＮＡに転写されたときに触媒機能を有し、ＲＮＡ転写物の３'末端からそれ自身を開裂するであろう。たとえばＨＣＶを用いた場合、この開裂事象は本発明のアンチセンスＲＮＡ転写物中のＨＣＶ ３'ＵＴＲについて適切な３'末端およびセンスＲＮＡ転写物中のＨＣＶ ５'ＵＴＲについて適切な５'末端という結果となる。肝炎デルタウイルスリボザイムの触媒は、リボザイム自体に含まれる配列によって制御されている。このようであるから、本明細書に記載の本発明の構築物に含まれる肝炎デルタリボザイムの配列は（ＨＣＶ以外にも）他のＲＤＲＰウイルス系に用いることができ、従って本発明のアンチセンスリポーター構築物の殆どまたは全てに用いることができる。
【００３０】
本発明の文脈において「発現」とは、センスまたはアンチセンスＲＮＡの産生という結果となるＤＮＡの転写をいい、またポリペプチド（リポータータンパク質など）へのｍＲＮＡの翻訳をもいう。
【００３１】
「リポーター遺伝子」または「リポーター遺伝子配列」とは、真核細胞で発現され、都合よく検出することのできる（化学的に、分光測光法により、免疫学的に、比色分析により、放射能により、またはレセプター媒体カスケード系によるものを含む）タンパク質をコードする遺伝子をいう。リポーターの例としては、これらに限られるものではないが、ルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ゲンチシン（genticin）耐性、ゼオシン（zeocin）耐性、ハイグロマイシン耐性、およびピューロマイシン耐性が挙げられる。
【００３２】
リポーター遺伝子配列は、検出可能な効果を生成することによって本発明の方法において細胞または溶解液に作用する。本願出願人は、研究者の目的がウイルスゲノムの複製が起こっている際に他の特異な効果を選択的に生成することであるときは、リポーター配列の代わりに他の遺伝子配列を用いることもできることを意図している。それゆえ、有害な効果という結果となる１またはそれ以上の遺伝子をリポーター配列の代わりに（またはリポーター配列に加えて）本発明の構築物挿入用に選択する場合は、本発明の方法は、フラビウイルスに感染した細胞の選択的な治療法をデザインするメカニズムを提供し、その際、作用する１またはそれ以上の遺伝子を含む該構築物は複製フラビウイルスが感染していることがわかっている細胞にインビボで送達される。
【００３３】
本明細書において使用する「本発明の構築物」という場合の「構築物」とは、本明細書に使用する意味でのリポーター遺伝子または作用性遺伝子のコード配列、該コード配列の発現に関係する調節配列（とりわけコード配列の転写を容易にするプロモーターを含み、またコード配列に結合し必要とされる転写はされるが翻訳はされない５'および／または３'配列をも含む）、および研究対象のＲＤＲＰウイルスの３'および５'非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むＤＮＡ配列をいう。これら配列はセンスまたはアンチセンスの方向であってよい。全体の構築物配列は、標準分子生物学的方法を用いて生成する。本発明の構築物はまた、作動可能に連結したリボザイム配列をも含んでいてよい。
【００３４】
本発明の代表的構築物を図１に示してあり、（５'から３'の順に）ＳＶ４０プロモーター配列（センス方向、ＨＣＶ ３'ＵＴＲに作動可能に連結）、ＨＣＶ ３'ＵＴＲ（アンチセンス方向、ルシフェラーゼタンパク質のコード配列に作動可能に連結）、ルシフェラーゼタンパク質のコード配列（アンチセンス方向、ＨＣＶ ５'ＵＴＲに作動可能に連結）、ＨＣＶ ５'ＵＴＲ（アンチセンス方向、肝炎デルタリボザイムのコード配列に作動可能に連結）、および肝炎デルタリボザイムのコード配列（センス方向）を含み、該構築物はｐＭＪ０５０と称するプラスミドにより細胞に送達される。
【００３５】
本発明の一つの側面において、ウイルス複製のインヒビターをスクリーニングする方法が提供される。ウイルス複製を抑制する可能性のある化合物および条件としては、これらに限られるものではないが、小さな分子量の合成化学物質、生きた生物またはかつて生きていた生物由来の有機化合物、生きた生物またはかつて生きていた生物由来の有機化合物に基づく合成化学物質、並びに種々の周波数の音、および種々の波長の光および温度を含む種々の条件が挙げられる。例として、化合物は小さな分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸を含み、天然のものであっても合成したものであってもよい。
【００３６】
ウイルス複製のインヒビターについて化合物をスクリーニングする方法は、機能性のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現するに充分なウイルスゲノムの全てまたは一部を含む細胞または細胞溶解液を利用するプロトコールを含み、該細胞または細胞溶解液に本発明の適当なリポーター構築物を加える。ウイルスゲノムおよびリポーター構築物系をウイルスゲノムの複製に従う条件下、ウイルス複製の潜在的なインヒビターの存在下に置く。かくして、ウイルスゲノムの複製を抑制することのできる、および／または発現されたＲＤＲＰ酵素の機能性を抑制することのできる、化合物または条件をリポーター配列の発現の抑制により同定することができる。
【００３７】
充分なウイルスゲノムが存在して機能性のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの産生という結果となる場合に本発明の方法は機能性である。それゆえ、培養細胞または細胞溶解液に使用するウイルスゲノムのコード配列は、全ウイルスゲノムの一部としてＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのコード配列を含んでいてよいし、あるいはウイルスゲノムのサブゲノムフラグメント、たとえばＨＣＶの場合ではＮＳ２からＮＳ５ｂまでの領域、またはＮＳ３からＮＳ５ｂまでの領域をコードするサブゲノムフラグメント含んでいてもよい。この観点から、本発明の方法は、ＮＳ５ｂ ＲＤＲＰのみならず、ＮＳ２プロテアーゼ、ＮＳ３プロテアーゼ、およびＮＳ３ヘリカーゼをも個々にまたは一緒に抑制する能力を有するインヒビターのスクリーニングを可能にする。とりわけ、多くの異なる標的を抑制する可能性について化合物をスクリーニングすることができることは、必須の酵素機能の１またはそれ以上をターゲティングするインヒビターの種々の組み合わせを試験することを可能にし、これら化合物の相互作用がこれら化合物のＲＮＡ複製を抑制する能力に有利にまたは有害に作用するかどうかを確立する。
【００３８】
実施例
以下の実施例は本発明の方法を説明するものであるが、本発明の範囲を限定するものと考えてはならない。本明細書の開示に基づいて、当業者には本発明の方法の多くの可能な変更が明らかであろう。
【００３９】
実施例１〜３では、本発明の構築物中にリポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼを用い、ヒト腎臓細胞でのＨＣＶウイルスゲノムの複製を調べる。実施例３は、本発明の方法を用いてＨＣＶ複製の既知のインヒビターを確かめる方法の使用を説明する。実施例４は、ＨＣＶゲノム複製のインヒビターの半高処理量スクリーニングアッセイを説明する。
【００４０】
実施例１
Flaviviridaeウイルスの複製は、真核細胞には通常見出されない酵素であるウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰ）によって触媒される段階により起こることが知られている。ホタルルシフェラーゼ遺伝子（細胞生物学で用いられる一般的なリポーター遺伝子である）のアンチセンス配列からなるＨＣＶ ＲＤＲＰ用基質を選択した。この配列を「ＨＣＶ様」にみえるようにするため、この配列の両側に天然のＨＣＶウイルスゲノムの５'および３'非翻訳領域（ＵＴＲ）をＨＣＶ複製中間体の（−）鎖に認められるのと同じ方向でフランキングした。本明細書で採用した慣行を用い、ＲＮＡゲノムの（−）鎖に存在する方向は５'から３'に向けて読んだ場合にアンチセンスの方向として言及されるであろう。本発明の方法の好ましい態様を示すため、ＨＣＶの５'ＵＴＲ配列の３'末端に肝炎デルタリボザイムｈｄｖｒｉｂｏを結合させ、ｈｄｖｒｉｂｏがＲＮＡをプロセシングしたときに５'ＵＴＲの配列の完全性が保持されるようにした（リポーターの戦略を図１に示す）。このようにしたのは、５'ＵＴＲはまたインターナルリボソーマルエントリーサイト（ＩＲＥＳ）としても作用することが当業者に知られている（１３）からであり、５'ＵＴＲ配列を可能な限り天然のウイルスに認められるものと同じくらい本物に保つのが望ましかったからである。
【００４１】
この構築物を２９３細胞株（ヒト胚性腎細胞）［２９３ＦＬ＃９と称するもの（この細胞株は、以前にトランスフェクションして天然のＨＣＶ遺伝子型１ｂゲノムの完全長ｃＤＮＡコピーを含んでいた）］に安定にトランスフェクションした。本発明の構築物を含む細胞株（２９３Ｂ４α）は、ＨＣＶウイルスゲノムのゲノム複製の結果として活性で検出可能なルシフェラーゼを産生することが示された。
【００４２】
ｐＭＪ０５０構築物の調製
ｐＭＪ０５０を３工程で調製した。まず、ＨＣＶゲノムの３'非翻訳領域（３'ＵＴＲ）とホタルルシフェラーゼ遺伝子とのアンチセンス配列を互いに結合した；第二に、ＨＣＶの５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）のアンチセンス配列とｈｄｖｒｉｂｏのセンス配列とを互いに結合した；最後に、これら２つの構築物を互いに結合して、それぞれ５'から３'の順に読んで「３'ＵＴＲ−ホタルルシフェラーゼ−５'ＵＴＲ−ｈｄｖｒｉｂｏ（センス方向）」のアンチセンス配列からなる配列とした（図２）。
【００４３】
３'ＵＴＲおよびルシフェラーゼ配列の構築
ＨＣＶの３'ＵＴＲのアンチセンス配列を、ＰＣＲプライマーとして３'ＵＴＲ５'（new）および３'ＵＴＲＨＯ（全てのオリゴのヌクレオチド配列については表１を参照）を用いてプラスミドｐ９０（Charles Rice博士、Washington University、セントルイスより提供）からＰＣＲ増幅した。ホタルルシフェラーゼのアンチセンス配列を、ＰＣＲプライマーとしてＬＵＣＨＯおよびＬＵＣＩＦ３'を用いてプラスミドｐＧＬ３（Promega Corporation、マジソン、ウイスコンシン）からＰＣＲ増幅した。これら２つのＰＣＲ産物を互いに結合するため、これら２つのＰＣＲ産物の等モル量をオリゴ３'ＵＴＲ５'およびＬＵＣＩＦ３'と混合する重複ＰＣＲを行い、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。
【００４４】
表１：ｐＭＪ０５０を生成およびシークエンシングするのに使用したオリゴのヌクレオチド配列
【表１】
2004537271.tif 000002
【００４５】
重複ＰＣＲの産物を制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＡａｔIIで消化し、ＨｉｎｄIIIおよびＡａｔIIで線状にしておいたpLitmus28（New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ）中にライゲートした。ライゲーション反応からのプラスミド（pLitmus283'UTR luciferase）を化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。このプラスミドで形質転換した大腸菌を、アンピシリンを含む固体栄養アガー上で生育する能力により選択した。アンピシリン耐性の細菌菌体からプラスミドＤＮＡを単離し、その配列をＢｓｒＧＩ、ＨｉｎｄIIIおよびＡａｔIIを用いた制限酵素分析により確認し、シークエンシングオリゴＬＵＣＦＯＲ、ＬＵＣＲＥＶ、ＬＩＴＦＯＲ、およびＬＩＴＲＥＶを用いて配列分析した。
【００４６】
アンチセンス５'ＵＴＲおよびセンスｈｄｖｒｉｂｏ配列の構築
肝炎デルタウイルスリボザイム（ｈｄｖｒｉｂｏ）の配列を、ＰＣＲプライマーとしてＨＥＰＨＯおよびＲＩＢＯＨＤ３'を用いてプラスミドpFullLengthVec（William Mason博士、Fox Chase Cancer Center、フィラデルフィア、ペンシルベニアより提供）からＰＣＲ増幅した。ＨＣＶゲノムの５'ＵＴＲをプラスミドpSignalIRES（Robert Kovelman、Signal Pharmaceuticals、サンディエゴ、カリフォルニアより提供）からＰＣＲ増幅し、ＰＣＲプライマーとして５'ＵＴＲ５'、５'ＵＴＲＨＯ、およびＲＩＢＯＨＤ３'を用いた重複ＰＣＲによりｈｄｖｒｉｂｏ配列に結合した。
【００４７】
重複ＰＣＲからのＤＮＡ産物を制限酵素ＸｂａＩおよびＡａｔIIで消化し、ＸｂａＩおよびＡａｔIIで消化して線状にしておいたpLitmus28中にライゲートした。この組換えプラスミド（pLitmus285'UTRΔribo）を化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。このプラスミドで形質転換した大腸菌を、アンピシリンを含む固体栄養アガー上で生育する能力により選択した。アンピシリン耐性の細菌菌体からプラスミドＤＮＡを単離し、その配列をＸｂａＩおよびＡａｔIIを用いた制限酵素分析により確認し、プライマー５'ＵＴＲ５'およびＲＩＢＯＨＤ３'を用いて配列分析した。
【００４８】
ｐＭＪ０５０の構築物
プラスミドpLitmus283'UTR luciferaseおよびpLitmus285'UTR hdvriboを制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＡａｔIIで消化することにより、両プラスミド中の挿入物を結合した。等モル量のＤＮＡを混合し、ライゲートした。ライゲーション反応で得られたＤＮＡを化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。形質転換した大腸菌を、アンピシリンを含む固体栄養アガー上で生育する能力により選択した。アンピシリン耐性の細菌菌体からプラスミドＤＮＡを単離した。リポーター遺伝子の挿入を、ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩを用いた制限酵素分析により確認した。
【００４９】
真核細胞で転写すべきリポーター遺伝子としては、pLitmus28reporterからのリポーター遺伝子を真核プロモーターを含むプラスミド中に配置しなければならなかった。このことを行うため、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩを用いた制限消化によってpLitmus28reporterからリポーター遺伝子を取り出し、ＨｉｎｄIIIおよびＳｐｅＩで前もって消化して線状にしておいたプラスミドpZeoSV中にライゲートした。ライゲーション反応で得られたＤＮＡを化学的にコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。形質転換した大腸菌を、ゼオシンを含む固体栄養アガー上で生育する能力により選択した。ゼオシン耐性の細菌菌体からプラスミドＤＮＡを単離し、組換えプラスミドの配列をＨｉｎｄIII、ＴｔｈIIIIおよびＫｐｎＩを用いた制限酵素分析により確認し、オリゴ３'ＵＴＲ５'ｎｅｗ、３'ＵＴＲＨＯ、５'ＵＴＲ５'、５'ＵＴＲＨＯ、ＬＵＣＨＯ、ＬＵＣＩＦ３'、ＨＥＰＨＯ、ＲＩＢＯＨＤ３'、ＬＵＣＦＯＲ、およびＬＵＣＲＥＶを用いて配列分析した。正しい配列構築物を含むプラスミドをｐＭＪ０５０と称した（図３）。
【００５０】
実施例２
２９３Ｂ４α細胞株の生成
（ａ）ゼオシン耐性２９３ＦＬ＃９細胞のトランスフェクションおよび選択
ＨＣＶタンパク質の環境下でＲＮＡとしてのアンチセンスルシフェラーゼ構築物を発現する細胞株を生成するため、エレクトロポレーションによりｐＭＪ０５０を２９３ＦＬ＃９細胞にトランスフェクションした（５×１０６細胞中に３〜１０μｇのプラスミド；BioRadエレクトロポレーター中、９６０°Ｆおよび０.２ｋＶにて１パルス）。トランスフェクタントを各２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８およびゼオシンの存在下で数週間増殖させ、そのゲノムにｐＭＪ０５０を安定に導入した細胞を選択した。４８のゼオシン耐性で安定なトランスフェクタントをランダムに選択し、さらに拡張した。
【００５１】
（ｂ）ルシフェラーゼアッセイ
市販のルシフェラーゼアッセイ系（Promega Corp.、マジソン、ウイスコンシン）を製造業社の指示に従って用い、４８の安定なトランスフェクタントを活性なルシフェラーゼを発現する能力について試験した。簡単に説明すると、４８のクローン細胞株の各々からの１×１０６細胞を１００μｌの溶解緩衝液で溶解した。溶解液を遠心分離により清澄化し、−８０℃で貯蔵した。１００μｌのルシフェリン基質を加えてルミノメーターで定量することにより、２０μｌの細胞溶解液をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【００５２】
得られた４８のクローンのうち１２のクローンが種々の量のルシフェラーゼ活性を発現した。これら１２のクローンをゼオシンおよびＧ４１８の存在下でさらに数週間増殖させ、ついでルシフェラーゼ活性について再度試験した（図４）。細胞株２９３Ｂ４αが、最も高レベルのルシフェラーゼ活性を定常的かつ再現可能に有していたので、さらなる研究に選択した。
【００５３】
２９３Ｂ４α細胞株の特徴付け
（ａ）タンパク質の産生
ウエスタンブロット分析を用い、２９３Ｂ４α細胞株がルシフェラーゼ、ＨＣＶコア、ＨＣＶセリンプロテアーゼ（ＨＣＶ ＮＳ３遺伝子によってコードされる）、およびＨＣＶ ＲＤＲＰ（ＨＣＶ ＮＳ５ｂによってコードされる）を産生するか否かを決定した。ウエスタンブロット分析は、４つの全てのタンパク質が２９３Ｂ４α細胞株によって産生されることを示した（図５）。
【００５４】
（ｂ）ルシフェラーゼＲＮＡの産生
理論的にはルシフェラーゼタンパク質が２９３Ｂ４α細胞中で産生される唯一の方法は、ＲＤＲＰが細胞内に存在してアンチセンスルシフェラーゼＲＮＡをセンス方向に転写できるか否かにかかっている。ＲＴ−ＰＣＲを用い、（１）アンチセンスルシフェラーゼＲＮＡの転写がＳＶ４０プロモーターによって駆動されて起こっているか否か、および（２）該アンチセンスＲＮＡがセンスルシフェラーゼＲＮＡに転写されているか否か、を決定した。これら両者を決定するため、オリゴＬＵＣＦＯＲおよびＬＵＣＲＥＶをＲＴ−ＰＣＲに用いた。
【００５５】
RNAgents ＲＮＡ単離キット（Promega Corp.、マジソン、ウイスコンシン）を製造業社の指示に従って用い、５×１０６の２９３Ｂ４α細胞から全細胞質ＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡの１／５０に等価なアリコートを各ＲＴ−ＰＣＲに用いた。ＲＮＡのアンチセンス鎖およびセンス鎖の存在を決定するため、反応のＲＴ部分をオリゴの一方のみの存在下で行った（すなわち、ＬＵＣＲＥＶはアンチセンス鎖を検出し、ＬＵＣＦＯＲはセンス鎖を検出する）。反応液の温度を５分間９５℃に上げてＲＴ酵素を熱不活化し、ついで他方のオリゴを加えてＰＣＲを通常どおりに進行させた。
【００５６】
２９３Ｂ４α細胞の細胞質はルシフェラーゼＲＮＡの両方の分子種を含んでいたが、２９３ＦＬ＃９細胞はいずれの分子種も含んでいなかった（図６）。同様に、ＲＴ工程をＲＴ−ＰＣＲから除外するか、またはＲＴ−ＰＣＲの前にＲＮＡ試料をＲＮアーゼで処理すると、生成物は得られなかったので、２９３Ｂ４α細胞のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲで検出された産物はＲＮＡからのものであって混入ＤＮＡからのものではないことが示された。さらに、ＲＴ−ＰＣＲの前にＲＮＡ試料をＤＮアーゼで処理してもＲＴ−ＰＣＲで生成される産物の量に影響はなかった。
【００５７】
実施例３
ルシフェラーゼ、ＨＣＶセリンプロテアーゼおよびＩＲＥＳ媒体翻訳のインヒビターによるルシフェラーゼ活性の抑制
４つの化学物質、すなわち、ＨＣＶセリンプロテアーゼを抑制することが知られている２つの化学物質、ＨＣＶ ＲＮＡのＩＲＥＳ媒体翻訳を抑制することが知られている１の化学物質、および２９３Ｂ４α細胞株でホタルルシフェラーゼを抑制することが知られている１の化学物質を、２９３Ｂ４α細胞株でホタルルシフェラーゼレベルを低減させる能力について試験した。３５ｍｍプレートに５×１０５細胞／プレートを接種し、３７℃で一夜インキュベートした。化合物の添加４８時間後に細胞を上記溶解緩衝液で溶解した。ルシフェラーゼアッセイ系（Promega Corp.、マジソン、ウイスコンシン）を製造業社の指示に従って用い、ルシフェラーゼ活性を定量した。４つの化合物全てがルシフェラーゼ活性を抑制する能力を有していた（表２）。
【００５８】
表２：２９３Ｂ４α細胞株におけるルシフェラーゼ活性の抑制
化合物 インヒビタークラス 抑制１
化合物Ａ                      ＨＣＶプロテアーゼ            ＋＋
化合物Ｂ                      ＨＣＶプロテアーゼ            ＋＋
化合物Ｃ                      ＨＣＶ ＲＤＲＰ                 ＋
化合物Ｄ                      ルシフェラーゼ              ＋＋＋
ビヒクル（０.３％ＤＮＳＯ）   Ｎ／Ａ                       ― ―
（注）１活性に対する略語：＋＋＋：７５％を超える抑制；＋＋：７５％と５０％の間の抑制；＋：４９％と２５％の間の抑制；および― ―：２５％未満の抑制
【００５９】
実施例４
２９３Ｂ４α細胞株を用いたＨＣＶ複製のインヒビターの半高処理量アッセイ
９６ウエルのプレートに３０００の２９３Ｂ４α細胞／ウエルをプレーティングし、ついで細胞を３７℃で一夜インキュベートしてウエルの低部へ細胞を付着させることからアッセイは始まる。細胞をプレーティングした１６〜２４時間後に種々の濃度の化合物をウエルに加える。化合物添加の３６〜４８時間後に培地を細胞から除去し、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄する。細胞を２５μｌの溶解緩衝液で溶解し、−８０℃にて貯蔵する。溶解液を室温で解凍し、２０μｌの溶解液および１００μｌのルシフェリン基質を不透明なマイクロタイタープレートのウエルに入れる。ルシフェラーゼ活性をルミノメーターで定量する。個々の化合物の活性強度を線形回帰により計算する。２９３ＦＬ＃９細胞をｐＭＪ０５０でエレクトロポレーションし、Ｇ４１８およびゼオシンで選択した。４８のクローンをランダムに選択し、ルシフェラーゼを産生する能力について試験した。ルシフェラーゼを産生することのできた１２のクローンのルシフェラーゼ活性を定量し、図４に示す。２９３Ｂ４α細胞株をさらなる研究のために選択した。
【００６０】
２９３Ｂ４α細胞を溶解緩衝液で溶解し、溶解液中のタンパク質を４〜１２％ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離した。これらタンパク質を電気泳動によりニトロセルロースに移した。ルシフェラーゼ、ＨＣＶコア、ＨＣＶセリンプロテアーゼ、およびＨＣＶ ＲＤＲＰを、個々のタンパク質に特異的な抗体により検出した。
【００６１】
RNAgents ＲＮＡ単離キットを製造業社（Promega Corp.、マジソン、ウイスコンシン）の指示に従って用い、２９３Ｂ４α細胞に対して全細胞質ＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＲＮＡおよび２％の各ＲＮＡ試料を用い、センスまたはアンチセンスのいずれかのルシフェラーゼＲＮＡからＤＮＡを製造した。Ｃ＝センス方向のルシフェラーゼ遺伝子（コード）；Ａ＝アンチセンス方向のルシフェラーゼ遺伝子（非コード）；およびＡ／Ｃ＝単一の管ＲＴ−ＰＣＲ、はＲＮＡのコードおよび非コード分子種を識別しない。ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲの正の対照として用いた（図６）。
【００６２】
本明細書に引用した全ての参考文献を参照のためその全体を引用する。
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】２９３Ｂ４α細胞株でのＲＤＲＰ依存性ルシフェラーゼ活性の産生の模式図。
【００６４】
【図２】ｐＭＪ０５０の構築のクローニング戦略。
【００６５】
【図３】左から右へ５'から３'方向に示したｐＭＪ０５０のヌクレオチド配列。図３Ａは、ＳＶ４０プロモーターおよびＨＣＶ ３'ＵＴＲを含む（アンチセンスの方向）ヌクレオチド配列を示す；図３Ｂは、ルシフェラーゼコード領域（アンチセンスの方向）；ＨＣＶ ５'ＵＴＲ配列（アンチセンスの方向）；および肝炎デルタウイルスリボザイム配列（センスの方向）を示す；図３Ｃは、プラスミドの骨格配列を示す。
【００６６】
【図４】ｐＭＪ０５０で安定にトランスフェクションした２９３ＦＬ＃９細胞でのルシフェラーゼの産生。
【００６７】
【図５】２９３Ｂ４α細胞株でのルシフェラーゼ、ＨＣＶコア、ＨＣＶセリンプロテアーゼ、およびＨＣＶ ＲＤＲＰの産生。
【００６８】
【図６】２９３Ｂ４α細胞株でのルシフェラーゼのセンスおよびアンチセンスＲＮＡの産生。
【００６９】
【図７】本発明の構築物においてリポーター遺伝子としてルシフェラーゼを用いた、ＨＣＶのゲノムでトランスフェクションしたＢ４アルファヒト腎臓細胞での本発明のメカニズムの模式図。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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