(57)【要約】本発明は抗腫瘍薬などの治療用医薬の送達に用いられる新規なポリマーミセルを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性シェルに囲まれた疎水性コアからなるミセル形成組成物であって、該親水性シェルがポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）であることを特徴とする上記組成物。
【請求項２】
前記ミセル形成組成物がさらに治療用医薬を含み、且つ該治療用医薬が該ミセル内に取り込まれている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記疎水性コアがポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記疎水性コアが、ポリエステル、ポリオルトエステル；ポリ無水物；チロシン誘導プソイド−ポリ（アミノ酸）；ポリホスファゼン；ポリ（アルキルアクリレート）；ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）；ならびにこれらの組み合わせ、から構成される群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリエステルが、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ラクチド／グリコリドコポリマー、ポリカプロラクトンならびにこれらの誘導体から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記疎水性コアがポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）である、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記疎水性コアが、ポリエステル、ポリオルトエステル；ポリ無水物；チロシン誘導プソイド−ポリ（アミノ酸）；ポリホスファゼン；ポリ（アルキルアクリレート）；ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）；ならびにこれらの組み合わせ、から構成される群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリエステルが、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ラクチド／グリコリドコポリマー、ポリカプロラクトンならびにこれらの誘導体から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記治療用医薬が抗腫瘍化合物である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗腫瘍化合物が、少なくとも１種のフタロシアニン化合物、アントラサイクリン化合物、代謝拮抗物質、アルキル化薬およびタキサン系薬物から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記フタロシアニン化合物が塩化アルミニウムフタロシアニンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アントラサイクリン化合物がドキソルビシンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記代謝拮抗物質が、メトトレキセート、マイトマイシンおよび５−フルオロウラシルから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アルキル化薬がカルムスチンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記タキサン系薬物がパクリタキセルである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記代謝拮抗物質が、メトトレキセート、マイトマイシンおよび５−フルオロウラシルから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記治療用医薬が、疎水性抗生物質、疎水性抗真菌薬、免疫調節薬、抗ウイルス薬およびステロイド系もしくは非ステロイド系抗炎症薬から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記治療用医薬がゲノム断片からなる、請求項２に記載の組成物。
【請求項１９】
治療用医薬の有効量がポリマーミセル内に取り込まれている、医薬組成物。
【請求項２０】
前記治療用医薬が、透析、水中油手法、水中への医薬／ポリマー固体分散物の可溶化または医薬およびミセルの単純平衡によりポリマーミセル内に取り込まれている、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
治療用医薬を投与する方法であって、
請求項２のミセル形成組成物を準備する段階、および
該ミセル形成組成物をそれを必要とする被験者に投与する段階、
を有する上記方法。
【請求項２２】
治療用医薬を保護する方法であって、該治療用医薬をミセル形成組成物内にカプセル化する段階を有する上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の属する分野
本発明は、限定するものではないが抗癌薬のような治療用医薬の送達に有用なポリマーミセルからなる組成物に関する。
【０００２】
２．発明の背景
化学療法薬の使用にまつわる大きな障害は、癌細胞に対する選択性がないことである。この選択性の欠如が、正常細胞と異常細胞の両方に薬物が送達されることによる、かかる薬物の使用の有害副作用につながってきた。標的細胞に対する薬物選択性の欠如は癌以外の各種疾患治療においても問題である。多くの研究が、薬物を標的細胞に選択的に送達することができる薬物運搬体の開発に向けて集中的に行なわれた。例えば、低治療指標薬物の特異的送達を向上させるために、リポソーム、微粒子、ナノ関連物質および薬物・ポリマー結合体などの各種薬物運搬体が研究されてきた。
【０００３】
研究された標的手段のうちリポソーム（リン脂質小胞）が多くの注目を集めた。しかしながらその標的能力は、肝臓および脾臓の細網内皮（ＲＥ）細胞による素早い捕食、血漿中における不安定性、大きさからくる管外遊出時の限られた能力、その製造上の技術的問題および酸化に対する感受性により、限られたものであった。個々の問題に対する解決策は見つかっているが、２つ以上の問題に対する解決策が１つの組成物中に組み合わされることはめったになかった。例えば、ＲＥ細胞による認識が下げられ安定性が向上されると、５０ ｎｍ未満の直径の安定なリポソームを得るのは困難である。
【０００４】
ポリマーミセルは１９８４年にＢａｄｅｒ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．により薬物運搬体として最初に提案された（Ａｎｇｅｗ． Ｍａｋｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． １２３／１２４ （１９８４） ４５７−４８５）。ポリマーミセルは高まる科学的な注目の的となり、その内部コアに薬物を溶解させることができること、また概して大きさが小さいこと（１００ｎｍ未満）および細網内皮系（ＲＥＳ）による捕食を逃れる傾向にあることなどの魅力的な特徴を有していることから、水難溶性の薬物運搬体の候補として浮上してきた。
【０００５】
ミセルは、ウイルスあるいはリポタンパク質のような天然に存在する運搬体としばしば比較される。これら３つの運搬体全ては、その取り込み物がウイルスに対するＤＮＡであれあるいはリポタンパク質およびミセルに対する水不溶性薬物であれ、標的細胞への運搬の際にその取り込み物が保護されるのを可能とするよく似たコア・シェル構造を有する。
【０００６】
リポタンパク質は、腫瘍が低密度リポタンパク質に対して増強された要求を発現することから、抗腫瘍化合物を癌細胞に標的するための運搬手段として提案された。しかしながら、主に薬物が組み込まれたリポタンパク質は正常細胞によっても認識されるであろうことから、また腫瘍上の受容体部位に対してもともと体内にあるリポタンパク質と競合しなければならないであろうことから、運搬体としてのリポタンパク質の能力は疑われてきた。反対に、ウイルスは免疫反応を引き起す傾向があるので、ウイルス運搬体は主に遺伝子物質の送達に用いられ、送達用運搬体の繰り返し適用を必要としない用途に至適使用があり得る。
【０００７】
ポリマーミセルは、水不溶性薬物の送達に最も有利な運搬体のひとつであると思われる。ポリマーミセルはコア・シェル構造により特徴づけられる。ポリマーミセルに関する薬学的研究は主にそれぞれ親水性シェル部分構造Ａと疎水性コアポリマーＢを持つＡ−Ｂジブロック構造のコポリマーを中心に行なわれてきた。ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）（Ａ−Ｂ−Ａ）のようなマルチブロックコポリマーもミセルに自己組織化することができ、薬物運搬体の候補として記載されてきた（Ｋａｂａｎｏｖ， Ａ．Ｖ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２５８ （１９８９） ３４３−３４５）。ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＢＬＡ）、ポリ（ＤＬ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）あるいはポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）のような生分解性ポリマーから一般に構成される疎水性コアは、水不溶性薬物に対してリザーバとして働き、薬物が水性環境と接触することを防ぐ。このコアは、例えばポリ（アスパラギン酸）（Ｐ（Ａｓｐ））のような水溶性ポリマーから構成されることも可能であるが、この場合この水溶性ポリマーは疎水性薬物の化学的結合により疎水性にされる、あるいは２つの逆に帯電したポリイオンの会合により形成される（ポリイオン複合体ミセル）。ポリスチレン（Ｐｓｔ）あるいはポリ（メチルメタアクリレート）（ＰＭＭＡ）のような非−または難−生分解性ポリマーを内部コアの構成成分として用いることをいくつかの文献が記載している。例えば、Ｚｈａｏ， Ｃ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｇｍｕｉｒ ６ （１９９０） ５１４−５１６；Ｚｈａｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８ （１９９５） １７２８−１７３１およびＩｎｏｕｅ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５１ （１９９８） ２２１−２２９を参照されたい。臨床的に適切な薬物運搬体としてみなされるためには、非−生分解性ポリマーは無害で且つその分子量は十分低く腎臓ルートを介して排泄されるものでなければならない。この疎水性内部コアは、アルキル鎖あるいはジアシルリピッド（例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ））のような極めて疎水性の大きい短鎖からも構成され得る。疎水性鎖はポリマーの１つの末端に付けることもでき、あるいはポリマー構造内でランダムに分布させることもできる。
【０００８】
シェルは、ミセルの安定化、ならびに血漿タンパク質および細胞膜との相互作用の役割をになう。シェルは、例えばＰＥＯのような親水性、非生分解性、生体適合性のポリマー鎖から一般に構成される。運搬体の生体内分布は親水性シェルの性質によって主に決まる。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡ）およびポリ（アルキルアクリル酸）のような他のポリマーはミセルに温度あるいはｐＨ感受性を付与し、いずれ生体接着性の特性を授けるのに用いることもできると考えられる。標的部分構造と結合するためにミセルの表面に官能基を有するミセルも知られている。例えば、Ｓｃｈｏｌｚ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８ （１９９５） ７２９５−７２９７を参照されたい。
【０００９】
ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）（ＰＶＰ）は、その骨格鎖中の無極性のメチレン基およびその環中のメチン基に囲まれた極めて極性の大きいラクタム基を有する、周知の水溶性、生体適合性、両親媒性のポリマーである。ＰＶＰは従来よりポリスチレンラテックスを合成する際の立体安定剤として用いられている。例えば、Ｇａｂａｓｔｏｎ， Ｌ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３１ （１９９８） ２８８３−２８８８；Ｒｕｔｔ， Ｊ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ．：Ｐａｒｔ Ａ： Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ．， ３２ （１９９４） ２５０５−２５１５を参照されたい。ＰＶＰはまた凍結防止剤および凍結乾燥防止剤として用いられる場合もある。例えばＳｋａｅｒ， Ｈ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｉｃｒｏｓｃ． １１０ （１９７７） ２５７−２７０；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ， Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｒｅｎｔｅｒ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， ４２ （１９８８） １９０−１９９を参照されたい。
【００１０】
ＰＶＰはＰＥＧと比較して、非イオン性およびイオン性共溶質に対してそれが示す相互作用の多様性において優れている。Ｍｏｌｙｎｅｕｘ， Ｐ．， Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ． Ｐｏｖｉｄｏｎｅ （１９８３） １−１９を参照されたい。長アルキル鎖あるいは芳香族部分構造を持つ分子と最も顕著に結合が起こる。ＰＥＧと同様、ＰＶＰはまたコロイド性運搬体およびペプチド／タンパク質の生体内循環時間を増大させることもできる。例えば、Ｋａｍａｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５７ （１９９９） ４４８−４５３；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ， Ｖ．Ｐ．， Ｊ． Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ １５ （１９９８） １−１９を参照されたい。さらにポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）とポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のジブロックコポリマーを含有するナノ粒子は凍結乾燥の後集合体化することも示された。Ｄｅ Ｊａｅｇｈｅｒｅ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １６ （１９９９） ８５９−８６６を参照されたい。この問題は凍結乾燥防止剤を使用することにより巧みに回避された。この問題は、ＰＶＰはそれ自身凍結乾燥防止剤であるので、ＰＶＰを使用することにより未然に防げたと思われる。
【００１１】
Ｎ−ビニルピロリドン（ＶＰ）は各種のビニルモノマーと共重合させることができる。電気的陰性モノマーとは交互コポリマーを形成し、アクリレートとはランダムコポリマーを形成する。また例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）とＰＶＰとから構成されるグラフトコポリマーも製造されている。Ｅｇｕｉｂｕｒｕ， Ｊ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｓａｎ Ｒｏｍａｎ， Ｐｏｌｙｍｅｒ ３７ （１９９６） ３６１５−３６２２を参照されたい。この研究では、ＰＬＬＡマクロモノマーがＶＰと共重合されたが、ポリマーミセルの形成は評価されなかった。
【００１２】
現在まで、生分解性のポリマーミセルの調製に取り組むほとんどの研究は、親水性シェルを形成するためにはＰＥＧを使用することが中心であった。例えば、Ｘ． Ｚｈａｎｇ， Ｘ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． １３２ （１９９６） １９５−２０６；Ｙｏｋｏｙａｍａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ ５５ （１９９８） ２１９−２２９；Ａｌｌｅｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｒｅｌｅａｓｅ ６３ （２０００） ２７５−２８６を参照されたい。
【００１３】
従って、ＰＥＧを含んでいないが優れた可溶化特性を示し各種の医薬に対しいくつもの結合部位を提供する、新規な生体適合性、生分解性のポリマーミセルシステムに対するニーズが依然としてある。それは、その凍結乾燥された形態に水を加えると容易に再分散または再溶解するものでなければならない。本発明ではそのようなシステムはジブロックＰＶＰ−ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）から構成される。
【００１４】
３．発明の概要
本発明は、親水性シェルに囲まれた疎水性コアからなるミセル形成組成物であって、該親水性シェルがＰＶＰであることを特徴とするミセル形成組成物を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、
治療用医薬；および、
親水性シェルに囲まれた疎水性コア、
からなるミセル形成組成物であって、該親水性シェルがＰＶＰであり、且つ該治療用医薬が該ミセル内に取り込まれているミセル形成組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本ポリマーミセルに少なくとも１種の適切な治療用医薬を組み込む方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、治療用医薬を含むポリマーミセル組成物であって、該治療用医薬が、該ミセルの疎水性コアもしくは親水性シェル内に取り込まれることにより加水分解などの化学的相互作用から保護され得る、ポリマーミセル組成物を提供する。
【００１８】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、以下の詳細な説明を読むことにより当業者にはよりたやすく理解されよう。
【００１９】
４．発明の詳細な説明
本発明は、水に対して難溶性であり且つ／または親水性シェルに対して特異的親和性を有する治療用医薬の送達に用いられ得るポリマーミセルからなるコロイド状組成物を提供する。本ポリマーミセルは、疎水性コアが親水性シェルに囲まれているコア・シェル構造により特徴づけされる。この親水性シェルは、親水性ポリマーまたはコポリマーからなる。
【００２０】
本発明の親水性ポリマーは、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）（ＰＶＰ）のポリマーまたはコポリマーである。
【００２１】
疎水性部分構造がミセルのコアを構成する。この疎水性部分構造は、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）、ポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ラクチド／グリコリドコポリマー、ポリカプロラクトンならびにこれらの誘導体のようなポリエステル；ポリオルトエステルおよびその誘導体；ポリ無水物およびその誘導体；チロシン誘導プソイド−ポリ（アミノ酸）およびその誘導体；ポリホスファゼンおよびその誘導体；ポリ（アルキルアクリレート）およびその誘導体；ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）およびその誘導体；ならびにこれらの組み合わせから選ばれる。好ましい疎水性部分構造はポリ（Ｄ， Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）である。このＰＤＬＬＡは約１０％〜約５０％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度で存在する。
【００２２】
４．１　ミセルの形成
ミセルの形成は２つの力の結果として起こる。ひとつは分子の会合をもたらす引力であり、もうひとつはミセルがはっきりと肉眼で見える段階にまで無制限に成長するのを防ぐ反発力である。両親媒性のコポリマーは、その親水性ポリマーかその疎水性ポリマーのどちらかに対して選択的である溶媒の中に入れると自己会合する。
【００２３】
両親媒性コポリマーのミセル化過程は低分子量の界面活性剤のそれに似ている。非常に低い濃度では、ポリマーは単に単一の鎖として存在する。濃度が高くなり臨界会合濃度（「ＣＡＣ（ｃｒｉｔｉｃａｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）」と呼ばれる臨界値に達すると、コポリマーの疎水性部分が、ポリマーが希釈されている水性媒体との接触を避けるようになり、ポリマー鎖は会合し始めミセルを形成する。ＣＡＣでは、ミセルコアの内部には多量の溶媒が存在し、ミセルはゆるんだ集合体 （ｌｏｏｓｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ） と記述され、より高い濃度で形成されるミセルよりも大きい径を示す。それらの濃度においては、その平衡状態はミセル形成に有利に働き、ミセルはその低エネルギー状態配置をとるようになり、残存する溶媒は疎水性コアから次第に放出されミセル径は小さくなる。両親媒性コポリマーは一般に低分子量界面活性剤のＣＡＣよりもずっと低いＣＡＣを示す。例えば、ＰＥＯ−ＰＢＬＡおよびＰＮＩＰＡ−ＰＳｔのＣＡＣは０．０００５〜０．００２％の間にある。しかしながら一部の両親媒性コポリマーはもっと高いＣＡＣを示し、ポロクサマーの場合は０．０１〜１０％にまで達する。高いＣＡＣを有する両親媒性コポリマーは薬物標的手段として適切ではない場合があるが、これはそれが水性環境中では不安定であり、希釈されると容易に解離するからである。
【００２４】
両親媒性コポリマーのミセル化は、その疎水性鎖が親水性ポリマーにランダムに結合しているかあるいは親水性鎖の１つの末端にグラフト結合しているかによって２つの異なるタイプのミセルになり得る。ランダム変性ポリマーから形成されるミセルは一般に末端変性ポリマーから形成されるミセルよりも小さい。ミセルの径は、コア中に疎水性鎖を閉じ込める疎水力によって、またミセル径を制限している鎖間の排除体積反発力によって主に決まる。ランダム変性コポリマーおよび末端変性コポリマーにおけるこれら２つの力のバランスの差が、それらの異なる径を説明しうる。末端疎水性基が会合してミセルを形成すると、その疎水性セグメントの周りに固定された水クラスターはコアから排除され、コアと親水性シェルとの間には直接の相互作用は存在せず、この親水性シェルは可動性線状鎖としてミセル構造中に残る。しかしながらランダム変性ポリマーは、ポリマーの疎水性部分と親水性部分が絡まり合いコアと水性媒体との間で接触が起こることを可能とするような形で会合する。これは、露出した疎水性コアはポリマーミセルの二次集合体をつくる可能性があるので、重要な問題である。二次集合体は、結合型ドキソルビシン（ＤＯＸ）を内包するＰＥＯ−Ｐ（Ａｓｐ）ミセルシステムにおける大粒子（１００ｎｍより大きい）の存在を説明する仮説としても提案されている。
【００２５】
４．２　臨界会合濃度（ＣＡＣ）の決定
光散乱がミセルの分子量および会合数の測定に広く用いられている。しかしながらミセル化の開始はミセルのＣＡＣがこの光散乱法の感度内に入って初めて検出することができる。これは水中のポリマーに対してはめったに起こらないことである。水性条件下にあるゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）は、コポリマーの単一鎖とコポリマーのミセル部分が異なる溶出容積を示すことから用いることができる。またＧＰＣによりミセルの分子量とその会合数を同時に測定することも可能である。サイズ排除カラムを通しての溶出の際にポリマーミセルの一体性が維持されるということは重要である。カラムへのポリマーの吸着も問題を呈する場合があり、ミセルが大きなゆるんだ集合体から構成される、ＣＡＣに近い濃度において特にそうである。
【００２６】
ＣＡＣを測定する好ましい方法は蛍光プローブの使用を伴うが、なかでもピレンが広く用いられている。ピレンは、非常に疎水性でありまた周囲の環境の極性に敏感である縮合芳香族炭化水素である。ＣＡＣより低いところでは、ピレンは強極性の媒体である水に可溶化されている。ミセルが形成されると、ピレンはミセルのコアによって提供される疎水性領域のほうに優先的に分配され、従って無極性の環境に直面する。その結果、蛍光強度の増加、発光スペクトルの振動性微細構造の変化、および励起スペクトルにおける （０，０） バンドの赤方偏移のようないくつもの変化が観察される。見掛けのＣＡＣは、ピレンの蛍光プロット、すなわち発光スペクトルからのＩ１／Ｉ３比または励起スペクトルからのＩ３３８／Ｉ３３３比対濃度プロットから求めることができる。その傾きにおける大きな変化がミセル化の開始を意味する。Ｉ１／Ｉ３比は一番高いエネルギーの発光ピークと三番目に高いエネルギーの発光ピークとの間の強度比であり、一定の励起波長と、Ｉ１とＩ３に対応する可変発光波長において測定される。蛍光法で測定されたＣＡＣは二つの理由から注意深く解釈されねばならない。第一に、ピレンの濃度は、ミセル化が起こる時に傾きの変化が正確に検出できるよう極端に低く（１０−７Ｍ）保つ必要がある。第二に、蛍光スペクトルの緩やかな変化が場合によっては疎水性不純物の存在が原因で起こりうるあるいはプローブと個々のポリマー鎖もしくはミセル形成前の集合体との会合によって起こりうる。蛍光プローブの異方性の変化もミセル化の開始と関係している。
【００２７】
本発明の組成物のようなポリマーミセルはその小さい径（１０〜１００ｎｍ）により特徴づけられる。この小さい径は、運搬体物質の管外遊出に必要とされる以外に、本組成物の滅菌を濾過だけで行うことを可能とし、また毛細血管の塞栓リスクを最小限にする。これは、もっと大きな医薬運搬体では見られるものではない。ミセルの径は、コポリマー分子量、親水性鎖と疎水性鎖の相対割合、および会合数など各種の要因に依存する。透析により調製されるミセルの径は、ポリマーを溶解するのに使用される有機溶媒により影響を受けうる。
【００２８】
ミセルの直径および径の多分散性は水または等張性緩衝液中で動的光散乱（ＤＬＳ（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ））により直接求めることができる。ＤＬＳはまたポリマーミセルの球形度についての情報を提供することもできる。
【００２９】
ミセル径は、例えば原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）のような方法によっても推定することができる。これらの方法はミセル形状および径分散性の特性評価を可能とする。超遠心分離速度調査がポリマーミセルの多分散性を評価するのに場合によって行われる。
【００３０】
４．３　ポリマーミセル中への治療用医薬の組み込み
ミセル中への治療用医薬の組み込みは当業者に周知の方法により行うことができる。例えば、予備形成されたミセルを含む溶液にその化合物を溶解することによって、水中油手法または透析法により組み込みを行うことができる。
【００３１】
用いうる治療用医薬は、以下に掲げるもののように、ポリマーミセル中に安定した方法で取り込まれ且つ治療的に有効な用量で投与できる化合物であればどのような化合物であってもよい。好ましくは、本発明で用いられる治療用医薬は、ミセル中に効率的に取り込まれるように疎水性である。しかしながら、イオン性ミセルと、逆に帯電している親水性化合物（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）との間に安定した複合体を形成させることも可能である。好適な医薬としては、フタロシアニン（例えば塩化アルミニウムフタロシアニン）、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン（ＤＯＸ））、難溶性代謝拮抗物質（例えばメトトレキセート、マイトマイシン、５−フルオロウラシル）およびアルキル化薬（例えばカルムスチン）のような抗腫瘍化合物が挙げられる。ミセルはパクリタキセルのようなタキサンを取り込むこともできる。
【００３２】
ミセルに取り込むことができるその他の医薬としては、在来の疎水性抗生物質および抗真菌薬（例えばアムホテリシンＢ）、貧水溶性免疫調整薬（例えばシクロスポリン）、貧水溶性抗ウイルス薬（例えばＨＩＶタンパク質分解酵素抑制剤）および貧水溶性ステロイド系抗炎症薬（例えばデキサメタゾン）、非ステロイド系抗炎症薬（例えばインドメタシン）およびゲノム断片がある。
【００３３】
さらに、化学的結合あるいは、（透析、乳化手法、水性媒体中での医薬とミセルの単純平衡化または水中での医薬／ポリマー固形分散物の可溶化を通しての）物理的取り込みにより、医薬を本発明のポリマーミセル組成物中に組み込むことができる。
【００３４】
タンパク質のような親水性化合物もまた本発明のポリマーミセル組成物中に組み込むことができる。しかしながらかかる親水性物質の組み込みは、その分子の化学的疎水化または親水性シェルに対する特異的親和性を必要とする場合がある。ポリイオン化合物は、ポリイオン複合体ミセルの形成を通して組み込むことができる。
【００３５】
医薬の物理的取り込みは一般に透析または水中油乳化手法によって行なわれる。透析法は、医薬とコポリマーを両者が可溶である溶媒（例えばエタノールまたはＮ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド）中から、そのポリマーの親水性部分に対してのみ選択的である溶媒（例えば水）中にもってくることからなる。良溶媒が選択溶媒で置換されると、その過程の間にポリマーの疎水性部分が会合してミセルコアを形成し、不溶性の医薬を取り込む。この透析を数日間に亘って続けると有機溶媒の完全な除去がもたらされる。水中油乳化手法では、水不溶性の揮発性溶媒（例えばクロロフォルム）中の医薬溶液を、本コポリマーの水溶液に加えて水中油型乳化液を形成させる。溶媒が蒸発するとミセル・医薬複合体が形成される。後者の方法に対する透析法の主たる優位点は、塩素系溶剤のような有毒の可能性のある溶剤の使用を避けられることである。
【００３６】
医薬の取り込み方法はミセル内の医薬の分布に影響を与える。例えばＣａｏ ｅｔ ａｌ． （Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２４ （１９９１） ６３００−６３０５）は、ミセルが形成されているときにミセルに組み込まれたピレンは、ミセルが形成された後に組み込まれたピレンほどはその水性環境から保護されていないことを示したが、この場合この初めの方法は後の方法よりも三倍多い医薬取り込み量を与えた。
【００３７】
本発明のポリマーミセルの取り込み効率は、添加される医薬の初期量に依存する。最大取り込み可能量を越えると治療用医薬の析出を生じ、従って低い収率となる。さらに、治療用医薬の組み込み効率は、コポリマーの会合数にも依存する。大きい会合数を示すミセルは、その内部コアにより多量の医薬を可溶化させる。
【００３８】
４．４　治療用医薬が組み込まれたポリマーミセルの例
ポリマーミセル中に組み込まれた化合物ならびに対応する医薬取り込み方法の例を下の表に示す。本発明のポリマーミセル組成物は、限定するものではないが抗癌薬、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの各種治療用医薬の送達システムとして使用するのに、あるいは身体の特定の器官に診断用薬を送達するのに好適であると考えられる。
【００３９】
表　ポリマーミセル中に組み込まれた医薬およびトレーサーの例
2004501180.tif 000002
2004501180.tif 000003
【００４０】
医薬が組み込まれたことの証拠はＧＰＣまたはＤＬＳにより得ることができるが、これは両者の方法がともにミセル径の変化を検出するからである。医薬の存在は通常ミセル径の増大を伴う。ミセルコア内部における医薬の所在場所は実験をクェンチすることにより示すことができる。例えば、ＤＯＸの水溶性クェンチャーであるヨウ化物（Ｉ）は、ミセルに組み込まれた医薬の蛍光に影響しないが、遊離の医薬の蛍光をクェンチする。このような実験で、ＤＯＸは凍結乾燥および水中再構成の後もＰＥＯ−ＰＢＬＡ内に保持されることが示された。ＤＯＸの場合、ミセルコア内の医薬の自己会合は医薬蛍光強度の低下ももたらす。最近、ポリマーミセル中のアムホテリシンＢの保持とゆっくりとした放出が、ＰＥＯ−ＰＢＬＡミセル中に組み込んだ後その溶血作用の低下を測定することにより間接的に確かめられた。
【００４１】
４．５　医薬への応用
本発明のポリマーミセル組成物は、例えば経口送達、持続放出および部位特異的医薬標的などの各種の医薬分野において使用するのに好適である。好ましくは、本発明のミセルは水不溶性医薬の運搬手段として使用される。
【００４２】
５．実施例
以下の実施例は例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００４３】
材料
市販の溶剤をＭｏｑｕｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ケベック州、テールボンヌ）から購入し、試薬はＡｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入した。Ｎ−ビニル−２−ピロリドン（ＶＰ）、２−イソプロポキシエタノール、ミネラルオイル中３５重量％水素化カリウム（ＫＨ）および１８−クラウン−６は、さらに精製することなく用いた。Ｄ，Ｌ−ラクチドを６０℃で無水の酢酸エチルから三回再結晶させ、次にＰ２Ｏ５上で減圧下２４時間室温にて乾燥させた。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を、使用する直前に乾燥アルゴン雰囲気下ナトリウムおよびベンゾフェノン上で還流と蒸留を行った。１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−カルボニトリル）（ＡＣＣＮ）をエタノール溶液から水中への析出により精製し、４日間真空下で乾燥させた。セファロース２ＢをＳｉｇｍａ（ミズーリ州、セントルイス）から入手し、使用する前に水で平衡化させた。ミセル調製に使用した透析バッグはＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（カリフォルニア州、ランチョドミンゲス）のＭＷＣＯ ６０００−８０００であった。全ての反応は前もってフレーム処理した丸底フラスコ中で行い、この丸底フラスコには乾燥アルゴン雰囲気下でゴム製隔膜を取り付けた。
【００４４】
分子量はミレニアム（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）ソフトウエアプログラムのついたゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｏｄｅｌ ６００、マサチューセッツ州、ミルフォード）により測定した。三つのスタイラジェル（Ｓｔｙｒａｇｅｌ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ、ＨＲ１、ＨＲ３、ＨＲ４、４．６×３００ ｍｍ）および微分屈折率検出計（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｆｒａｃｔｏｍｔｅｒ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ｗａｔｅｒｓ ２４１０）を使用した。移動相はＣＨＣｌ３（３０℃および１ ｍＬ／ｍｉｎ）であった。カラムカリブレーションは標準ポリスチレン（Ａｌｄｒｉｃｈ、ウィスコンシン州、ミルウォーキー）で行った。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをそれぞれ重水素化されたクロロフォルム中でＶａｒｉａｎ ３００およびＢｒｕｃｋｅｒ ＡＭＸ ６００スペクトルメーターに記録した。
【００４５】
臨界会合濃度（ＣＡＣ）は定常状態ピレン蛍光法により求めた。ピレン水溶液中の両親媒性ポリマーの濃度を上げていくと、ピレンの励起スペクトル中に３３３から３３８．５ｎｍへの（０，０）バンドのシフトがあることが既に示されている。Ｉ３３８／Ｉ３３３強度比により測定されるこの変化は、ピレン分子の水環境から疎水性ミセルコアへの移動に伴うもので、見かけのＣＡＣを推定するのに用いることができる。ポリマー濃度は異なるがそれぞれ１０−７Ｍのピレンを含有するいくつかの水中ポリマー溶液を調製し、４℃で暗所にて一晩撹拌を続けた。定常状態蛍光スペクトルをＳｅｒｉｅ ２ Ａｍｉｎｃｏ Ｂｏｗｍａｎ 蛍光測定器（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ 社、ニューヨーク州、ロチェスター）を用いて２０℃撹拌下で５分後に測定した（λｅｍ＝３９０ｎｍ）。単峰および微分の径分布プロセッサー（ＳＤＰ：ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）強度分析（Ｎ４Ｐｌｕｓ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、フロリダ州、ヒアリア）を用いて動的レーザー散乱（ＤＬＳ：ｄｙｎａｍｉｃ ｌａｓｅｒ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）により２０℃の水およびＰＢＳ中でミセル径を求めた。
【００４６】
ＰＶＰ−ＯＨの調製
ヒドロキシ末端ＰＶＰ（ＰＶＰ−ＯＨ）を、連鎖移動剤として２−イソプロポキシエタノールを用いてラジカル重合により調製した。 ＶＰ（５ ｍＬ、４７ ｍｍｏｌ）およびＡＣＣＮ（０．１１ ｇ、０．４５ ｍｍｏｌ）を６０−３００ ｍＬの２−イソプロポキシエタノール中に可溶化させた。これらの溶液をアルゴンでガス抜きした。重合を８０℃で、乾燥アルゴン雰囲気下で撹拌しながら、２４時間行った。２−イソプロポキシエタノールの蒸発の後、ポリマーを過剰ジエチルエーテル中に析出させた。このようにして得られた白色粉末を、最少量のＣＨ２Ｃｌ２中に可溶化させて三回精製し、ジエチルエーテルから再析出させ、最後に真空中で乾燥させた。
【００４７】
ＰＶＰ−ＯＨの特性評価
１Ｈ ＮＭＲ δ（ｐｐｍ）：１．１５ （ｍ， ＣＨ３）、３．５−４ （広い信号、ＣＨＰＶＰ）
１３Ｃ ＮＭＲ δ（ｐｐｍ）：１７５ （Ｃ＝Ｏ ＰＶＰ）、６３．０５ （ＣＨ２ＯＨ）
【００４８】
表１：ＰＶＰの平均分子量
2004501180.tif 000004
【００４９】
ＰＶＰ−ＯＨの平均分子量を表１に示す。溶媒／ＶＰ容積比が高くなると分子量が低くなることが分る。
【００５０】
ブロックコポリマーＰＶＰ−ＰＤＬＬＡの調製
本ブロックコポリマーは陰イオン開環重合により得た。
【００５１】
ＫＨ（０．５６７ ｇ、１４ ｍｍｏｌ）をアルゴンパージ下で丸底フラスコに入れた。無水ＴＨＦをダブルチップニードル（ｄｏｕｂｌｅ−ｔｉｐｐｅｄ ｎｅｅｄｌｅ）を介して加え、得られた分散液をさっと撹拌して、その後このＴＨＦを除去した。ＴＨＦ３０ ｍＬをこのフラスコに加え、得られた分散液を０℃まで冷却する。６０℃真空中Ｐ２Ｏ５上で２４時間前もって乾燥したＰＶＰ−ＯＨ（１．５ ｇ）を６０℃でＴＨＦ３０ ｍＬ中に可溶化させた。この溶液を、ダブルチップニードルを用いて前記撹拌下の分散液に加え、得られた溶液を０℃に１時間保持した。室温まで加温した後、撹拌を４時間続けた。分散液を別のフラスコに移し、１８−クラウン−６（０．０８５ ｇ、０．３２ ｍｍｏｌ）を室温にて加え、３０分撹拌した。Ｄ，Ｌ−ラクチドの重合を、ＴＨＦ２０ ｍＬに溶解させたＤ，Ｌ−ラクチド（１．５ ｇ、１０ ｍｍｏｌ）を素早く導入することにより開始させた。１６時間後、酢酸１ ｍＬと水５ ｍＬを加えることによりこの重合を終了させた。このポリマー溶液を水に対して４℃で２４時間透析してミセルを形成させた。透析の後、溶液を４０７９０×ｇで３０分遠心分離にかけすべてのポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）ホモポリマーを除去した。上澄み液を凍結させ、凍結乾燥システム（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、モデル７７５３５、ミズーリ州、カンサスシティ）で凍結乾燥させた。凍結乾燥粉末を水中に再溶解させ、遊離ＰＶＰ−ＯＨをＳｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、１×４０ ｃｍ）を通過させることにより除去した。このミセル溶液を凍結させ、２日間凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００５２】
ＰＶＰ−ＰＤＬＬＡの特性評価
１Ｈ ＮＭＲ δ （ｐｐｍ）：５．２ （ｍ， ＣＨ ＰＤＬＬＡ）、３．５−４ （広い信号， ＣＨ ＰＶＰ）
１３Ｃ ＮＭＲ δ （ｐｐｍ）：１７５ （Ｃ＝Ｏ ＰＶＰ）、１６９ （Ｃ＝Ｏ ＰＤＬＬＡ）、６９．８ （ＣＨ−
ＣＨ３ＰＤＬＬＡ）、１７．２ （ＣＨ−ＣＨ３ＰＤＬＬＡ）。
【００５３】
表２：ＰＶＰ−ＰＤＬＬＡおよびポリマーミセルの特性評価
2004501180.tif 000005
【００５４】
組成の異なるいくつかのＰＶＰ−ＰＤＬＬＡブロックコポリマーを合成した。表２に示すように、ミセルの平均径は４４〜１６８ ｎｍであり、ＣＡＣは低い。最も短いＰＬＡセグメントを有するサンプル３ｃが最も高いＣＡＣを示した。その径分布はしかしながら、ＳＤＰ分析（表３）で明らかにされているように単峰性ではなかった。
【００５５】
表３：ＰＶＰ−ＰＤＬＬＡミセルの径分布、ＳＤＰ強度分析
2004501180.tif 000006
【００５６】
表３に示されているように、全てのサンプルは二峰分布のミセルを与え、小粒子の径は２６〜１２４ ｎｍであり、より大きな集合体の径は１０６〜４１９ ｎｍであった。
【００５７】
医薬取り込み効率を調べるために、インドメタシンを表４に示すようにＰＶＰ−ＰＤＬＬＡおよびＰＥＧ−ＰＤＬＬＡに取り込んだ。
【００５８】
表４：ポリマーミセルへのインドメタシンの組み込み
2004501180.tif 000007
引用されているデータは３測定値の平均±標準偏差である。
【００５９】
前記医薬および前記コポリマーをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、水に対し暗所で２４時間透析した。この溶液を０．２２ μｍ孔径フィルターを通して濾過し、凍結乾燥させた。インドメタシンの取込量をＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５２Ａダイオードアレー分光光度計（アイダホ州、ボイジー）を用いて３２０ ｎｍにおけるＤＭＦ中ミセル溶液のＵＶ吸収を測定することにより求めた。
【００６０】
ＰＶＰ−ＰＤＬＬＡミセルおよびＰＥＧ−ＰＤＬＬＡミセル中へのインドメタシン取込効率は低医薬レベルでは同じようなものであった。医薬取込量が高くなると、ＰＶＰ−ＰＤＬＬＡミセルの取込効率はＰＥＧ−ＰＤＬＬＡミセルのそれよりも優れたものであった（同じ分子量を有するコポリマーを考慮して）。理論に縛られるのを望むものではないが、低医薬比率では医薬は最初にコア中に組み込まれ、高比率になるとＰＶＰの親水性シェル中に組み込まれるようになると考えられる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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