(57)【要約】微細組立されたデバイスに２以上の毛管カラムまたは２以上のチャネルからなるアレイを有するように構成され得るサーモスタット制御システムが開示される。熱伝導性材料が、アレイ内の各カラムまたはチャネルに接触する。１以上の独立制御型加熱または冷却要素が、熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされている。各加熱または冷却要素は、加熱または冷却源に接続されている。また１以上の独立制御型温度検知要素と１以上の独立制御型温度プローブが、熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされている。各温度検知要素は、温度制御器に接続され、また各温度プローブは、温度計に接続されている。このシステムの使用中に、各加熱または冷却源は、特定範囲内での温度安定性を制御するように、１以上の温度検知要素からのフィードバックに応答して、温度制御器によって自動的に調整される。また、温度制御器は、プリセットされた目標温度の特定範囲内に熱伝導性材料の基準温度を維持するように、１以上の温度プローブから温度計へのフィードバックに応答して自動的に調整される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細組立されたデバイス内に設けられた１以上の毛管カラムまたは１以上のチャネルと、
前記毛管カラムまたはチャネルと接触している熱伝導性材料と、
前記熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが加熱または冷却源に接続された１以上の独立制御型加熱または冷却要素と、
前記熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが温度制御器に接続された１以上の独立制御型温度検知要素と、
前記熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが温度計に接続された１以上の独立制御型温度プローブと
を備えるサーモスタット制御システムであって、
システムの使用中に、前記各加熱または冷却源は、特定範囲内での温度安定性を制御するように、１以上の前記温度検知要素からのフィードバックに応答して前記温度制御器によって自動的に調整され、また温度制御器は、プリセットされた目標温度の特定範囲内に、前記熱伝導性材料の基準温度を維持するように、１以上の前記温度プローブから前記温度計へのフィードバックに応答して自動的に調整されるものであることを特徴とするサーモスタット制御システム。
【請求項２】
前記システムは、微細組立されたデバイス内に設けられた複数の個々の前記毛管カラムまたは複数の個々の前記チャネル、または前記毛管カラムまたは前記チャネルの複数の独立したクラスターを備え、前記毛管カラムまたはチャネルは、異なる機器の間に分配されている請求項１に記載の制御システム。
【請求項３】
１以上の毛管カラムと、
各前記毛管カラムを包囲する毛管本体支持体と、
単一若しくは複数の前記毛管本体支持体を支持する第１の熱伝導性材料の２以上のディスクと、
前記第１の熱伝導性材料の前記ディスクに隣接して、単一若しくは複数の前記毛管本体支持体を支持する、前記第１の熱伝導性材料の溶融温度よりも高い溶融温度を有する第２の熱伝導性材料と、
前記第１及び第２の熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが加熱または冷却源に接続された１以上の独立制御型加熱または冷却要素と、
前記第１及び第２の熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが温度制御器に接続された１以上の独立制御型温度検知要素と
を備えることを特徴とするサーモスタット制御システム。
【請求項４】
前記第１及び第２の熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが温度計に接続された１以上の独立制御型温度プローブを更に備え、
システムの使用中に、各前記加熱または冷却源は、特定範囲内での温度安定性を制御するように、１以上の前記温度検知要素からのフィードバックに応答して前記温度制御器によって自動的に調整され、また前記温度制御器は、プリセットされた目標温度の特定範囲内に前記第１及び第２の熱伝導性材料の基準温度を維持するように、１以上の前記温度プローブから前記温度計へのフィードバックに応答して自動的に調整されるものである請求項３に記載の制御システム。
【請求項５】
前記システムは、複数の個々の前記毛管カラム、または前記毛管カラムの複数の個々のクラスターを備え、前記毛管カラムまたはチャネルは、異なる機器の間に分配されている請求項４に記載の制御システム。
【請求項６】
微細組立されたデバイス内でアレイとして結合された２以上の毛管カラムまたは２以上のチャネルと、
前記毛管カラムまたはチャネルと接触している熱伝導性材料と、
前記熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが加熱または冷却源に接続された１以上の独立制御型加熱または冷却要素と、
前記熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが温度制御器に接続された１以上の独立制御型温度検知要素と、
前記熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが温度計に接続された１以上の独立制御型温度プローブと
を備えるサーモスタットアレイ制御システムであって、
システムの使用中に、前記各加熱または冷却源は、特定範囲内での温度安定性を制御するように、前記温度制御器によって自動的に調整され、また温度制御器は、１以上の前記温度プローブから前記温度計へのフィードバックによって、プリセットされた目標温度の特定範囲内に前記熱伝導性材料の基準温度を維持するように、１以上の前記温度検知要素からのフィードバックに応答して自動的に調整されるものであることを特徴とするサーモスタットアレイ制御システム。
【請求項７】
アレイとして結合された２以上の毛管カラムと、
各前記毛管カラムを包囲する毛管本体支持体と、
前記毛管本体支持体を支持する第１の熱伝導性材料の２以上のディスクと、
前記第１の熱伝導性材料の前記ディスクに隣接して、前記毛管本体支持体を支持する第２の熱伝導性材料と、
前記第１及び第２の熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが加熱または冷却源に接続された１以上の独立制御型加熱または冷却要素と、
前記第１及び第２の熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが温度制御器に接続された１以上の独立制御型温度検知要素と
を備えることを特徴とするサーモスタットアレイ制御システム。
【請求項８】
前記第１及び第２の熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされ、それぞれが温度計に接続された１以上の独立制御型温度プローブを更に備え、
システムの使用中に、各前記加熱または冷却源は、特定範囲内での温度安定性を制御するように、１以上の前記温度検知要素からのフィードバックに応答して前記温度制御器によって自動的に調整され、また前記温度制御器は、プリセットされた目標温度の特定範囲内に前記第１及び第２の熱伝導性材料の基準温度を維持するように、１以上の前記温度プローブから前記温度計へのフィードバックに応答して自動的に調整されるものである請求項７に記載の制御システム。
【請求項９】
前記１以上の加熱または冷却要素は、個々の前記カラムまたはチャネルに隣接して位置決めされ、各個々の前記カラムまたはチャネルは、全ての他の前記カラムまたはチャネルから熱的に隔離されている請求項６に記載の制御システム。
【請求項１０】
前記システムは更に、複数の前記カラムまたはチャネルを備え、前記複数のカラムまたはチャネルの２以上は、単一の加熱または冷却要素によって加熱または冷却され、そして単一の加熱または冷却要素によって加熱または冷却されるそのようなカラムまたはチャネルの複数のクラスターは、前記サーモスタットアレイ制御システムに結合され、前記カラムまたはチャネルの１つのクラスター内で単一の加熱または冷却要素によって加熱または冷却される前記カラムまたはチャネルは、同じ温度に維持され、また前記アレイ内の異なるクラスターは、独立して制御可能である請求項６に記載の制御システム。
【請求項１１】
前記１以上の加熱または冷却要素は、個々の前記カラムに隣接して位置決めされ、各個々の前記カラムは、全ての他の前記カラムから熱的に隔離されている請求項７に記載の制御システム。
【請求項１２】
前記システムは更に、複数の前記カラムを備え、前記複数のカラムの２以上は、単一の加熱または冷却要素によって加熱または冷却され、そして単一の加熱または冷却要素によって加熱または冷却されるそのようなカラムの複数のクラスターは、前記サーモスタットアレイ制御システムに結合され、前記カラムの１つのクラスター内で単一の加熱または冷却要素によって加熱または冷却される前記カラムは、同じ温度に維持され、また前記アレイ内の異なるクラスターは、独立して制御可能である請求項７に記載の制御システム。
【請求項１３】
前記１以上の加熱または冷却要素は、前記温度検知要素としても使用される請求項６または７に記載の制御システム。
【請求項１４】
前記毛管カラムまたはチャネルは、電界を必要とする分離方法で使用されるに適しており、また前記毛管カラムまたはチャネルは、前記加熱または冷却要素から電気的に隔離されている請求項６に記載の制御システム。
【請求項１５】
前記毛管カラムは、電界を必要とする分離方法で使用されるに適しており、また前記毛管カラムは、前記加熱または冷却要素から電気的に隔離されている請求項７に記載の制御システム。
【請求項１６】
前記加熱または冷却要素は、前記毛管カラムまたはチャネルを包囲する請求項６に記載の制御システム。
【請求項１７】
前記加熱または冷却要素は、前記毛管カラムまたはチャネルを包囲する請求項７に記載の制御システム。
【請求項１８】
１つの個々の前記カラムまたはチャネルに関連した２以上の独立制御型加熱または冷却要素を備え、前記２以上の独立制御型加熱または冷却要素は、前記カラムまたはチャネルの長さに沿って熱勾配を導入可能なように、前記関連したカラムまたはチャネルに沿って位置決めされている請求項６に記載の制御システム。
【請求項１９】
１つの個々の前記カラムに関連した２以上の独立制御型加熱または冷却要素を備え、前記２以上の独立制御型加熱または冷却要素は、前記カラムの長さに沿って熱勾配を導入可能なように、前記関連したカラムに沿って位置決めされている請求項７に記載の制御システム。
【請求項２０】
１つの個々の前記カラムまたはチャネルに関連した前記独立制御型加熱または冷却要素は、温度プログラミング用に構成されている請求項６に記載の制御システム。
【請求項２１】
１つの個々の前記カラムに関連した前記独立制御型加熱または冷却要素は、温度プログラミング用に構成されている請求項７に記載の制御システム。
【請求項２２】
前記加熱または冷却要素は、固体である請求項６または７に記載の制御システム。
【請求項２３】
前記加熱または冷却要素は、流体である請求項６または７に記載の制御システム。
【請求項２４】
前記流体加熱または冷却要素は、液体である請求項２３に記載の制御システム。
【請求項２５】
前記流体加熱または冷却要素は、気体である請求項２３に記載の制御システム。
【請求項２６】
特別なサンプルに対する解析手順用の最適温度を見つける方法であって、
請求項６のサーモスタットアレイ制御システムを提供する工程と、
試験される異なる温度値の数を決定する工程と、
試験される異なる温度値の数と等しい数のカラムまたはチャネルをサーモスタットアレイ内に含ませる工程と、
前記サンプルに対する前記解析手順を遂行するために、各前記カラムまたはチャネルを構成する工程と、
各個々の前記カラムまたはチャネルの温度を、試験される異なる温度値の１つに維持するように、前記サーモスタットアレイに関連した前記温度制御器を調整する工程と、
前記個々のカラムまたはチャネルの各々が、試験される前記温度値の異なる１つに維持されている状態で、前記カラムまたはチャネルの各々において前記サンプルの異なる部分標本について同時に前記解析手順を遂行する工程と、
前記サンプルに対する前記解析手順用の最適温度を決定するために、前記個々のカラムまたはチャネルで遂行された前記解析手順の結果を比較する工程と、
を備えることを特徴とする前記方法。
【請求項２７】
前記解析手順は、定常変性剤毛管電気泳動である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記解析手順は、単一ストランド配座多形解析である請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
複数のサンプルに対して同時に１つの解析手順を遂行する方法であって、各前記サンプルは前記解析に対して最適な異なる温度を有し、前記方法は、
請求項６のサーモスタットアレイ制御システムを提供する工程と、
試験される異なる温度値の数を決定する工程と、
試験される異なる温度値の数と等しい数のカラムまたはチャネル、あるいはカラムまたはチャネルのクラスターをサーモスタットアレイ内に含ませる工程と、
前記複数のサンプルの１つに対して前記解析手順を遂行するために、各前記カラムまたはチャネルを構成する工程と、
各個々の前記カラムまたはチャネルの温度を、個々の前記サンプルに対して前記解析手順を遂行するための最適温度に維持するように、前記サーモスタットアレイに関連した前記温度制御器を調整する工程と、
前記個々のカラムまたはチャネルの各々が、前記個々のカラムに関連した個々の前記サンプルに対して最適な解析温度に維持されている状態で、前記カラムまたはチャネルの各々において前記異なるサンプルについて同時に前記解析手順を遂行する工程と、
前記サンプルの各々に対する前記解析手順の結果を得る工程と、
を備えることを特徴とする前記方法。
【請求項３０】
前記解析手順は、定常変性剤毛管電気泳動である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記解析手順は、単一ストランド配座多形解析である請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願との相互参照］
この出願は、毛管電気泳動用精密制御型サーモスタットなる名称で２００２年１２月２０日に出願された米国仮出願第６０／４３５，８８５号の優先権を主張し、その全体は参照によってここに組み入れられる。
［連邦補助研究または開発に関する表明］
適用なし
【背景技術】
【０００２】
毛管電気泳動は、サイズや電荷に基づいて分子を分離することに使用される強力な技術である。同一の（または同様な）分離条件を必要とするサンプルの解析では、アレイのカラムの全て、例えばＤＮＡシーケンサーまたはアナライザーの分離カラムの全てを同じ温度に保持することは、しばしば有用である。一方で、アレイの各分離要素に対する温度、またはアレイ内の分離要素のクラスターに対する温度を個々に調整する可能性が、実際上の大きな重要性となる多くの状況がある。例えば、１０通りの異なる温度で動作する１０本の毛管カラムのアレイは、ＤＮＡ分子のある特異な種の分離にとって最適な温度を見つけることに使用できる。逆に、それぞれが最適解析に異なる温度を必要とする１０個の異なるサンプルは、連続して遂行される個々の操業が達成するものを超えた生産性の同様な増加を伴って、平行して操業され得る。
【０００３】
参照によりここに組み入れられるフォレット等の米国特許出願第０９／９７９，６２２号は、多数のヒータを必須のものとして備えたサーモスタットアレイの一実施形態を記載している。各ヒータは、電力供給型の加熱要素によって包囲されている熱伝導性材料の円筒形体積からなる。この加熱要素の電力は、ＲＴＤ、熱電対またはサーミスタのような電気的温度センサを使用するフィードバックループで調整される。このような単一のフィードバックループは、高い等級の安定性（±０．０１℃から±０．０２℃）を有するサーモスタットの設定値を維持することに使用することはできるが、同じ等級の精度で温度をリセットすることは極めて困難である。“リセット可能性”は、任意の与えられた温度（例えば、０℃〜１５０℃の間）をセットして、いつでも、そしてどのヒータに対しても、同じ温度を達成する能力として定義される。このレベルに対するリセット可能性は、最も便利なものが温度の絶対精度に対するものとなる、ある種の校正標準の参照を要求するので、ここで論じられるリセット可能性の必要条件は、実際には通常、絶対温度精度の必要条件でもある。
【０００４】
厳しいリセット可能性の許容値に対する必要性は、溶融温度の微小な差に基づいてＤＮＡ断片が分離される定常変性剤毛管電気泳動（ＣＤＣＥ）のような応用において生じる。ある種のＣＤＣＥプロトコルでは、ピーク間の移動時間差が高度に均一であることが重要である。これは、高い等級のピーク検出の自動化と、異なる毛管からの電気泳動図間の高信頼性のピーク面積測定並びにピークおよび他の特徴のマッチングとを得るためである。数１００分の１度だけの分離温度の差は、特にピークが小さいときは、このことを実行不可能にするほど十分にピークをシフトできる。（一般に、信号対雑音比が低いときはいつでも、小さいピークは、近くの大きなピークによって部分的に又は完全にマスクされ、ピークのシフトは、そのような場合の見込みを複合化する）。それ故、ＣＤＣＥ操業温度を０．１℃の分解能だけにセットすることは十分であるが、これらの場合におけるその温度のリセット可能性は、少なくとも数１００分の１度となるべきであり、±０．０１〜０．０２℃よりも大きくないことが好ましい。
【０００５】
そのようなシステムでリセット可能性を達成することの困難さについての基本的な原因は、制御システムの種々電子部品固有の不正確さである。この不正確さは、部品の材料および設計から生じるものであると共に、電子要素の周囲温度に依存し、また他の要因に依存するものである。このことの特別な例は、個々のセンサの性能におけるユニット毎の変化である。例えば、温度応答の安定性が±０．０１℃以内にある定格のセンサを仮定すると、±０．１℃以上の温度応答のユニット毎の変化がある（これは単に検知要素からのエラーである。センサ用の電子測定システムは、一般に大きな追加的エラーに寄与する）。しばしば“互換性許容値”と呼ばれるこの変化は、そのグループ内の特別なセンサが名目的な“温度応答曲線”から遠くへ変化するかを規定する。そのようなセンサを使用して、±０．０１℃の温度安定性を得ることはできるが、リセット可能性または絶対温度精度は、±０．１℃よりも良くなることはできない。かくして、従来から高い等級の安定性とリセット可能性の双方を同時に達成できる実際の解決法を得るための必要性が存在する。この論議は、例解のために非常に厳しい許容値±０．０１℃を使用しているが、同じ論議は他の値にも適用される。例えば、必要とされる安定性およびリセット可能性は±０．１℃であるが、ユニット毎の変化と、以下で論じられるものを含む他の要因とが、±０．１℃よりも悪いリセット可能性へと導く場合である。
【０００６】
今述べた性能限界を克服できる１つの可能な手段は、±０．０１℃未満の“互換性許容値”を有するように、また電子回路の周囲温度を予め指定された温度に安定化するように設計されたセンサ（例えば、サーミスタ）を、各ヒータで常に使用することである。理論的に可能ではあっても、この解決法は、多くの産業上の応用にとっては実際的ではない。例えば、±０．０１℃未満の“互換性許容値”に適合するように予め選択された多数のサーミスタを商業的に得ることは難しい。それ故、フォレット等によって説明されているサーモスタットアレイでは、市販のサーミスタを利用して各ヒータを制御する場合、新たな組のヒータが測定に使用される毎に、全ての各制御サーミスタを個々に校正し、そして異なる組の校正曲線を使用して温度制御する必要がある。複数のヒータを有する複数の機器にとって、この必要条件は、常に各ヒータを追跡する必要のある厳しい要求をシステムに課す。このことは不便であるばかりでなく、総合的なプロセスに入り込む、注意深いが深刻な間違いを起こすリスクを伴う。
【０００７】
そのような校正および追跡機構を実施しようとする場合でさえ、電子部品の変化に起因して引き起こされる問題は依然として残る。その結果、個々のサーミスタの全ての追跡および校正によっても、制御電子回路の周囲温度自体も熱的に安定化されなければ、あるいは高度に正確な内部温度測定を与えられ、しかも広範囲の校正を受けなければ、繰り返し可能な温度を得ることはできない。そのような必要条件は、構築するシステムを非常に複雑で高価なものにしてしまう。かくして、より良い解決法が依然として望まれる。
【０００８】
本発明は、これらの問題を克服するための方法を提供し、また市販のセンサを使用し、また電子回路が熱的に安定された環境に維持されることを必要としない設計を使用して、±０．０２℃未満の範囲内で温度の安定性およびリセット可能性の双方を可能にするサーモスタットシステムを提供する。
１つの実施形態では、この発明は、微細組立されたデバイス内に設けられた１以上の毛管カラムまたは１以上のチャネルを含むように構成されたサーモスタット制御システムに仕向けられる。個々のカラムまたはチャネル、あるいはカラムまたはチャネルのクラスターは、アレイとして結合されることが好ましい。熱伝導性材料が、各カラムまたはチャネルに接触する。１以上の独立制御型加熱または冷却要素が、熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされている。各加熱または冷却要素は、加熱または冷却源に接続されている。また、１以上の独立制御型温度検知要素と１以上の独立制御型温度プローブが、熱伝導性材料に隣接して又はその中に位置決めされている。各温度検知要素は、温度制御器に接続され、また各温度プローブは、基準温度計に接続されている。このシステムの使用中に、各加熱または冷却源は、特定範囲内での温度安定性を制御するように、１以上の温度検知要素からのフィードバックに応答して、温度制御器によって自動的に調整される。また、温度制御器は、プリセットされた目標温度の特定範囲内に熱伝導性材料の基準温度を維持するように、１以上の温度プローブから温度計へのフィードバックに応答して自動的に調整される。
【０００９】
「図面の簡単な説明」
この発明の他の特徴および利点は、添付図面に関してなされる発明の好ましい実施形態の以下の説明から並びに請求の範囲から明らかとなる。
「図１ａ〜１ｃ」  この発明に係るサーモスタットアレイ制御システムで使用されるに好適な関連した温度制御およびモニタ要素を有する個々の毛管カラムのクラスターの１つの実施形態を示す。図１ａおよび１ｂはそれぞれ軸方向の断面図および軸方向に交差した断面図であり、図１ｃはこの実施形態の温度制御およびモニタ要素の模式図である。
「図２ａおよび２ｂ」  この発明に係るサーモスタットアレイ制御システムで使用される個々の毛管カラムのクラスターのもう１つの実施形態を示す。
「図３」  この発明に係るサーモスタットアレイ制御システムで使用されるに好適な６個のヒータからなるアレイ用の温度制御システムの模式図である。
「図４」  この発明に係る分布型温度制御の実施形態を示す模式図であり、本発明の４個のヒータが４つの異なる単一毛管電気泳動機器に組み込まれている。
「図５」  微細組立されたデバイス上に集積された、この発明に係るサーモスタットアレイ制御システムの実施形態を示す。
「図６」  この発明に係るサーモスタットアレイ制御システムのＣＤＣＥ解析に対する用法の一例を示す。
「図７」  この発明のサーモスタットアレイ制御システムを使用して、それぞれの設定温度の±０．０２℃未満の範囲内で６通りの異なる温度に維持された６個のヒータの結果を示す。
「図８ａおよび８ｂ」  この発明に係るサーモスタットアレイ制御システムをＰＣＲ増幅されたＤＮＡサンプルのＣＤＣＥ分離の最適化に使用した結果を示すグラフである。
「図９ａ〜９ｃ」  この発明に係るサーモスタットアレイ制御システムを使用した再生可能なＣＤＣＥ分離を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ここで説明されるものは、例えばカラム分離に有用な、この発明に係る独立制御型サーモスタットシステムの個々のカラムおよびアレイである。アレイ内の個々のサーモスタット制御システムは、個々の毛管カラム（または微細組立されたデバイス内のチャネル）に、あるいはそのようなカラムまたはチャネルのグループ（クラスター）に関連付けられる。この発明に係る独立制御型サーモスタットのアレイは、例えば「定常変性体毛管電気泳動（ＣＤＣＥ）：突然変異解析に対する高分解能のアプローチ」(K. Khrapko et al., Constant Denaturant Capillary Electrophoresis (CDCE): A High Resolution Approach to Mutational Analysis. Nucl. Acid. Res., 22, 1994, 364-269)に記載されているように、定常変性体毛管電気泳動で有用である。ＣＤＣＥでは、ＤＮＡ断片は、例えば、溶融温度の差に基づいて解析される。この発明のサーモスタットアレイ制御システムで使用されるに好適な、関連した個別制御型サーミスタを有する毛管カラムの個々のクラスターの具体的な実施形態は、図１ａ〜１ｃ並びに図２ａおよび２ｂに示されている。ここで説明されるものに由来する多くの他の実施形態があり、それらは当業者にとって自明であるように代替応用に対して好適である。例えば、分離中に温度を増減することによって、時間勾配が周期的に繰り返される。これは、「循環勾配毛管電気泳動：遺伝子変化の高処理量解析に対する低コストのツール」(Minarik et al., Cycling gradient capillary electrophoresis: a low-cost tool for high-throughput analysis of genetic variations, Electrophoresis 2003, 24, 1716-1722)に記載されている技術である循環温度毛管電気泳動（ＣＴＣＥ）で行われていることである。より単純な非繰り返し勾配と広範囲の種々の温度プログラミング方法もまた好適な応用を構成する。例えば、「毛管アレイ電気泳動を使用したＤＮＡ配列変異細胞の検出用集積化プラットフォーム」(Li et al., Integrated platform for detection of DNA sequence variants using capillary array electrophoresis, Electrophoresis 2002, 23, 1499-1511)で論じられている方法である。ここでの焦点はＣＤＣＥおよび毛管におかれるが、本発明は他の技術、例えばより広い（例えば、数ミリメータ）穴の管系が使用される、電気泳動を含まないものにも等しく良好に適用することができる。
【００１１】
１つの実施形態では、図１ａおよび１ｂに示されるように、この発明に係るサーモスタットシステムの固体ヒータ部品１０は、銅、黄銅またはステンレス鋼のような熱伝導性材料の約６インチ長および１インチ径の円筒ブロック１２を備える。この固体円筒ブロック１２を通して穿孔することによって形成された中空チャネル１４は、熱伝導性材料を通って、この円筒の軸と平行に延びる。１以上の温度センサ１６（例えば、サーミスタ）は、円筒本体の表面の浅い溝に埋め込まれている。中空チャネル１４を通して円筒本体内に挿入されたステンレス鋼製の毛管チューブ１８は、各チューブの外面と各チャネルの内面との間の空間を例えば熱エポキシ２０で満たすことによって、定位置に保持されている。熱伝導性ブロック１２の円筒形外面は、柔軟な加熱要素２２によって包まれ、それから絶縁性発泡体の層２４によってカバーされ、更に熱収縮チューブ２６によって保護されている。
【００１２】
この実施形態の１つの有利な特徴は、ヒータを通る複数の毛管の存在である。例えば、４本の毛管により、図１ｂに一層明瞭に示されているように、プールされた関心のある集団と、プールされた対照の集団と、陽性の対照と、陰性の対照とに対して別々の毛管を使用して、目標ＤＮＡ配列が１回のＣＤＣＥ操業内で完全に解析されるように、実験が設計され得る。しかしながら、ヒータ毎の毛管の数は限定的なものではなく、任意の数の毛管が個々のヒータに組み込まれ得る。さらには、単一のヒータ内の複数の毛管を、他の環境下で詳細に説明されるものとは異なる手法で使用することができる。また、その後に説明されるように、そのようなヒータのグループは、（異なる分離温度を必要とする）異なるＤＮＡ目標を同時に解析することに使用され得る。
【００１３】
図１ｃに模式形態で示されるように、ヒータ要素２２に接続された温度制御器２８は、加熱要素に電流を供給する。この加熱要素は、センサ１６から受信する連続したフィードバック入力に応答して安定した温度を維持するように、連続して調整されている。図１ａも参照すると、精密温度プローブ３０、例えば約３インチ長、０．１２５インチ径で、ステンレス鋼チューブ内に収容され、熱伝導性エポキシを使用して埋め込まれたサーミスタは、穴３２に挿入されて、ヒータ本体の熱伝導性ブロック１２内の絶対温度をモニタすることに使用される。この温度プローブ３０は、デジタル温度計３４に接続され、この温度計は、温度制御器２８に接続されたアナログ出力ボード３８（Ｄ／Ａボード）を含んだコンピュータ３６に対しフィードバックを与える。このアナログ出力ボード３８は、温度制御器の一次動作基準電圧を調整して、目標温度を所望の範囲内に適合させることに使用される。
【００１４】
ここで留意されるべき点は、加熱要素が参照される場合は必ず、より大きな温度制御能力のために、冷却要素も追加可能であるということである。加熱および冷却要素は、ペルチェデバイスのような単一の加熱／冷却要素に組み合わされてもよい。ここで留意されるべき点は、温度センサと温度プローブは、同じカテゴリのデバイス（温度変換器）であるということ、並びにこれら２つの用語は、ここでは発明に係るシステムの温度制御の２つのレベルを明瞭に区別することにのみ使用されているということである。温度センサおよびプローブは、サーミスタ、熱電対、ＲＴＤ、ＰＲＴ、ＳＰＲＴ、ＩＣ（半導体装置）、赤外線検出器、リバーシブル温度指示ラベル、あるいは測定可能な特性が温度と相互に関連した様式で変化する材料やデバイスである。そのような特性には、抵抗、出力電流、可視色、および赤外光放射が含まれる。
【００１５】
ここで説明される好ましい実施形態は、アナログ制御器を使用するが、このユニットは、他の実施形態では他のタイプの制御器によって置換される。一例として、制御ロジック（例えば、オン−オフ制御、比例制御、ＰＩＤ制御、ファジーロジック制御、またはこれらの単一ループまたは複式ループ様式での組み合わせ）は、コンピュータ上のソフトウエア内に存在することができる。このコンピュータは、固体リレーや外部電源のような追加のハードウエアを通して加熱／冷却要素にパルス電流を与えるものである。
【００１６】
もう１つの実施形態では、図２ａ〜２ｂに示されるように、サーモスタットの固体ヒータ要素は、第１の熱伝導性材料４０ａからなる円筒本体４０を備える。この材料は、第２の熱伝導性材料の多数の平行な円形ディスク４０ｂによって定位置に保持された４本のステンレス鋼の毛管１８の回りに鋳造されている。１以上の温度センサ１６（例えば、サーミスタ）は、熱伝導性円筒本体４０の表面の浅い溝に埋め込まれている。熱伝導性ブロック４０の円筒形外面は、柔軟な加熱要素２２によって包まれ、それから絶縁性発泡体の層２４によってカバーされ、更に熱収縮チューブ２６によって保護されている。この温度制御機構は、上記実施形態（図１ｃ）について説明されたものと同じである。
【００１７】
６個のヒータからなるアレイの温度制御が図３に示されている。この実施形態では、独立した基準電圧がＤ／Ａボード４２によって各アナログ温度制御器４４へ送られる。この制御器は、ヒータ４６に埋設されたサーミスタからの電圧をモニタする。この電圧は、サーミスタの温度の尺度である。この制御器は、サーミスタからの電圧が基準電圧と同じになるまで、ヒータに供給される電流を連続して調整する。サーミスタ４８は、温度プローブ５０と同時に温度をモニタし、その測定値を制御ソフトウエア５２に報告する。頻繁な間隔で、ソフトウエアは、ヒータ温度が、所定の時間間隔中はプリセットされた範囲内で安定していたかをチェックする。そうであれば、この安定した温度が目標温度の許容値内であるかを確立するテストが行われる。目標温度からの差が許容値を超える場合、そのヒータに対する基準電圧の訂正値が計算され、Ｄ／Ａボードは、訂正された電圧を適切な出力チャネル上に送るようにセットされる。ヒータ温度が安定することを待機し、許容値に対する温度をテストし、そして基準電圧を訂正するプロセスは、無期限に繰り返される。
【００１８】
原則として制御側の温度センサを、プローブ付きの高精度に校正される温度計と置換し、かくして余分な制御ループを回避することは可能であるが、そのようなアプローチには実際上の困難さが存在する。１つは、温度攪乱に対して必要とされる迅速な応答は、迅速な温度測定を要求するが、迅速な測定は、精度を劣化させるという点にある。もう１つの問題は、最良の制御にとって、制御側のセンサは加熱／冷却要素の極く近くに配置されるべきであって、それ故典型的には装置内に埋設され、簡単に交換、再使用または再校正することが困難になるという点である。ロジスティックスを追跡することの困難さは、既に注目されている。本発明では、多くの異なる温度制御されたゾーンに対し、温度計または制御されているゾーンのいずれかから簡単に取り外すことができるプローブを使用すれば、単一の複式チャネル温度計が高精度の温度を提供することに使用できる。これにより、複式ヒータを制御することに必要な高価で高許容値の部品の数が減少される。同じ温度計およびプローブが、多くの異なる組のヒータに対し経時的に使用できるので、追跡問題は同様に低減される。
【００１９】
図４は、分布型温度制御の実施形態を示している。この場合、本発明の４個のヒータ５４が４つの異なる単一毛管電気泳動機器５６（原則として４つの異なる複式毛管電気泳動機器で代替することができる）に組み込まれている。各ヒータは、この発明の温度制御システム内の別々のアナログ温度制御器５８によって別々に制御され、また機器は個々に操作される。全てのアナログ制御器は、図３に示された様式と同様に、中心位置に物理的に位置決めされている。単一の複式チャネルデジタル温度計は、同様に中心位置にあって、第２レベルの制御を全ての機器に対して提供することに使用される。センサ用のリード、プローブ、およびヒータ電力は、中心位置から異なる機器へ延びる。
【００２０】
上述した例は、離散的な毛管のアレイにとって好適なサーモスタットシステムを示している。精密でリセット可能な独立した温度制御も、微細組立デバイスでは重要である。ここで説明されるサーモスタット／毛管カラムのアレイ全体は、ヒータおよびセンサ（サーミスタ、ＲＴＤ等）並びに必要であれば制御器をも含んで、微細組立デバイス、例えばマイクロチップ上に集積化され得る。マイクロチップの小さいサイズと、組立に使用される大抵の基板材料、例えば溶融シリカの良好な温度伝導性とに起因して、サーモスタットアレイの近隣の加熱／冷却エリアは、互いに強く影響する。この種の熱伝達を避けるために、この発明のサーモスタットアレイが実装されるマイクロデバイスは、個々の温度制御型チャネルまたはチャネルのクラスター間に熱絶縁領域を設ける必要がある。そのようなマイクロデバイスの一例が図５に示されている。
【００２１】
図５を参照すると、溶融シリカのチップ本体６２を有した平坦なマイクロチップ６０は、それぞれが加熱／冷却要素６６に関連した複数のチャネル６４を有する。ワイヤ６８は、加熱／冷却要素６６を個々の温度制御器７２に接続する。温度センサ７０は、温度制御器７２に対してフィードバックを与える。また、温度プローブ７６は、基準温度計７８に接続されている。この基準温度計は、上述したように、コンピュータ８０に対してフィードバックを与える。温度制御は、先の実施形態でのように与えられる。
【００２２】
個々の加熱／冷却要素の組み合わせ間における熱伝達を排除するために、チャネル間にスルーカット７４が作られている。このカットには更に、絶縁性材料、例えばポリウレタンやポリスチレン発泡体を充填することができる。加熱要素６６は、マイクロチップの頂部や底部から取り付けることができる。加えて、カット７４の垂直壁面は、所望のチャネルを包囲する加熱／冷却源を与えるように、導電性材料で被覆され、そして電流源に接続される。
【００２３】
温度センサ７０およびプローブ７６（Ｐｔ、サーミスタ等）は、チャネル６４のいずれかの側部から取り付けることができる。その代わりに、加熱要素が経時的に抵抗を変化させる材料で作られている場合、それ自体が温度検知要素として機能することもできる。例えば、導電性（Ｐｔ、Ｃｒ、Ａｕ、導電性プラスチック）の層は、マイクロデバイスの表面上（またはデバイスの層が結合される以前は内部）に、スパッタリング法または気相成長法を使用して直接堆積することができる。先に説明した毛管カラムサーモスタットアレイの構成と同様に、複式チャネルは、単一の加熱／冷却要素によって加熱（冷却）することができる。また、そのようなチャネルのクラスターは、この発明のサーモスタットアレイに結合することができる。この場合、アレイ内の異なるクラスターは、独立して制御される。
【００２４】
この発明のサーモスタットアレイをＣＤＣＥ解析用のシステムで使用する一例が図６に示されている。図６を参照すると、固体サーモスタットアレイ８２は、例えば別々のミトコンドリアＤＮＡサンプルのＣＤＣＥ解析用分離毛管８４を有する。サンプルは、個々の毛管８４に注入される。毛管はまた、毛管を出るゾーンの包括的回収用に位置決めされている。レーザ照明システム８６は、分光器／ＣＣＤ検出器８８を使用して、例えばレーザ誘導蛍光（ＬＩＦ）検出用の２点照明を作り出す。温度制御は、図５に示されている通りである。この特別な設計では、サーモスタットは、各分離毛管内に一定温度（各カラムで異なる温度）を維持して、ＤＮＡ断片の所望の分解能を達成することに使用される。ＤＮＡ断片に対しては、ＬＩＦ速度測定および断片回収が連続して行われる。
【００２５】
図７は、この発明の制御システムを使用して６通りの異なる温度にセットされた６個のヒータについての１時間の温度読取値を示している。温度は、使用されたサーモスタットの規格に基づいて、それぞれの設定温度の±０．０１℃内に維持されるものとして示されている。
【００２６】
以下の実施例は、本発明の利点を示すために、また当業者がそれを作成および使用することを助けるために提示される。これらの実施例は、如何なる形態においても、この開示の範囲を制限することを意図したものではない。
【実施例１】
【００２７】
［ＣＤＣＥ温度最適化］
ここで説明されるように、ＣＤＣＥを使用して、プールされた集団内で突然変異を発見するために、６個のヒータを有するサーモスタットアレイが修正ＤＮＡシーケンサ（スペクトルメデックス(Spectrumedix)２４１０に基づく）に組み込まれた。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡサンプルのＣＤＣＥのために、突然変異が存在するときに（野生型ホモ二本鎖、突然変異ホモ二本鎖、および２つの野生型−突然変異ヘテロ二本鎖）、各目標配列について４つの異なる良好に解像されたピークが存在するように、ＣＤＣＥ温度を理想的にセットする。この温度は通常、野生型ホモ二本鎖について計算された理論的溶融温度（Ｔｍ）には近いが、確実に等しくはない。最適ＣＤＣＥ温度を決定するために、初期ＣＤＣＥ実験がサンプルに対して行われる。この場合、機器内のサーモスタットアレイにおける６個のヒータは、計算されたＴｍ付近の狭い範囲で僅かに異なる６通りの温度にセットされる。
【００２８】
図８は、ＣＴＬＡ−４Ｅ１として示されたＤＮＡ断片に対するそのような温度最適化を示している。同じＣＴＬＡ−４Ｅ１サンプルは、６個のヒータの各々内で１本の毛管内に注入された。この場合、各ヒータは、７３．５℃〜７７．５℃の範囲内で異なる温度に設定された。７３．５℃では、目標配列について単一のピークだけが観察された。これは、このピークの下に示されたＤＮＡ分子の全ての種が非溶融状態にある場合を表している。７４．５℃では、このピークは、２つの異なるピークに分割されている。このことは、ヘテロ二本鎖種の一方が既に部分的に溶融されているのに対し、野生型ホモ二本鎖、突然変異ホモ二本鎖、および他方のヘテロ二本鎖が全て殆ど非溶融状態にあることを示している。７５．５℃では、４つの異なる良好に解像されたピークが観察された。このことは、４つの種の間の最大示差溶融条件を示している。７６．０℃では、突然変異ホモ二本鎖のピークは、更に野生型から分離されているが、同時に３つの突然変異ピーク間の分解能は、有意に劣化し始めている。７６．５℃では、突然変異ピークは合体し、野生型ピークは突然変異ピークに接近している。このことは、突然変異ホモ二本鎖と２つのヘテロ二本鎖が全てほぼ完全に溶融すると共に野生型が部分的に溶融している状態を表している。最後に、７７．５℃では、全ての４つのピークは、単一のピークに合体している。これは、４つの種の全ての中で、低溶融ドメインは完全に溶融したが、高溶融ドメインはそのまま残って部分的に開いた二重ストランド型のＤＮＡ断片を一緒に保っている場合を表している。この実施例から、７７．５℃が最適ＣＤＣＥ温度であると結論付けることができる。
【００２９】
このように、１／２の温度差からでも全く異なる結果が得られる。図８ｂは、移動時間の有意な変化と、毛管の間に０．１℃だけの温度差がある場合のピーク分解能とを示している。これらの結果は、この発明のシステムを使用して可能であるように、そのような解析中に特定の温度を維持することの重要性を強調している。
【実施例２】
【００３０】
［修正スペクトルメデックスＤＮＡシーケンサにおける分離再現可能性］
実施例１は、ＣＤＣＥにとって精密な温度設定値の重要性を実証した。本実験は、各カラムに対して確実に設定されたように同じ温度環境を作り出すと共に再現可能なＣＤＣＥ分離を行うヒータアレイの能力を実証する。４つのピークの移動時間の変化が、この再現可能性の尺度として使用された。この実験について、ＣＴＬＡ−４Ｅ１サンプルは、２４本の毛管の全てに注入され、そして７７．５℃の最適ＣＤＣＥ温度で操業された。結果として得られた電気泳動図は、図９ａに示されている。この電気泳動図は、時間点１２００の直前に起こるピークに整列されている。この整列ピークからスタートする４つの主たるピークは、ホモ二本鎖およびヘテロ二本鎖の種を、このサンプルに対して表す。解析目的のために、主要測定基準は、これらピーク対の間の移動時間差である。図８ａと８ｂとの比較は、ここに示された移動時間差が毛管とヒータとの間に非常に均一な温度を反映したものであることを示している。
【実施例３】
【００３１】
［修正ベックマンコールタＤＮＡシーケンサにおける分離再現可能性］
この実験では、本発明の２つのヒータが市販のＤＮＡシーケンサ（ＣＥＱ２０００、ベックマンコールタ社(Beckman Coulter Inc.)）に組み込まれた。修正された８本式の毛管アレイは、４本の毛管を第１のヒータに通し、残り４本の毛管を第２のヒータに通すことによって作成された。本発明の温度制御システムは、この２つのヒータに直接接続された。ＣＤＣＥ分離は、アレイ内の８本の毛管アレイの各々を通して、同一のサンプルについて行われた。温度は予め最適化されているので、ホモ二本鎖ピークはほぼ同じ位置へ移動するのに対し、ヘテロ二本鎖ピークは有意に緩やかに移動する。図９ｂは、主要なホモ二本鎖ピークに対して整列後の結果を示している。ヘテロ二本鎖ピーク（５４分の直前および直後）は、ホモ二本鎖から、単一ピーク幅内で毛管およびヒータを横切る一定の距離を移動する。
【実施例４】
【００３２】
［リセット可能性］
この実験は、異なる日に同じ温度を確実にリセットする本発明のヒータの能力を実証する。図９ｃは、この発明に係るヒータ温度のリセット可能性を示している。２つの異なる日に、同一のサンプルが、実施例１で使用された修正スペクトルメデックスシーケンサの２本の毛管に注入された。分離時の小さな温度変化の効果について再び図８ａおよび８ｂを参照すると、図９ｃの移動時間の高い均一性は、電気泳動図を共通のピークに整列することなく、毛管と毛管の間並びに日と日の間の双方で、極めて同様な温度が達成されたことを実証している。この発明のシステムにより可能とされるリセット可能性は、高度に厳しい操業条件を、１つの複式毛管機器からもう１つの機器へ、あるいは複式毛管機器と単一毛管機器との間で、移すことを可能にする。
【００３３】
ここで示された具体的な実施例はＣＤＣＥに関連しているが、この発明のサーモスタットアレイ制御システムは、安定した精密でリセット可能な温度が良質の結果を達成する上で重要である物理的、化学的または生物解析的応用に使用され得る。例えば、ＳＳＣＰによる突然変異の発見、フローサイトメトリーによる細胞解析、イムノアッセイ（結合アッセイ）用の機器使用、血液学や免疫学用の自動化されたインラインのサンプル準備、およびタンパク質分離、高性能液体クロマトグラフィを含む液体クロマトグラフィ、およびロングリードのＤＮＡ配列決定である。微細組立デバイスに埋設された微小ヒータを用いる同じ解決法の実施もまた予測できる。更には、この方法は、分離中の時間的および空間的温度勾配の生成にまで延長できる。例えば、時間的勾配は、分離中に制御ソフトウエア内の目標温度に勾配を持たせることによって達成される。また、空間的勾配は、所定のヒータ上に配置された複数の物理的に分離された加熱要素に対して異なる目標温度を設定することによって達成される。温度循環や、任意の複雑さの他の温度プロフィールもまた、実行可能である。さらに、このヒータシステムは、単一の機器内でＣＴＣＥおよびＣＤＣＥの双方に対して使用可能である。１つの実施形態では、ヘテロ二本鎖ピークの予備的分離に対してＣＴＣＥ操業を行い、それからより高い分解能の分離および解析に対してＣＤＣＥ操業を後続させることができる。
【００３４】
本発明は、好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、当業者は、先の明細書を読んだ後に、ここで述べられた組成および方法に対し、種々の変化、均等物の置換、および他の変更をもたらすことが可能となる。それ故、特許によって許可される保護は、添付の請求の範囲に含まれる定義およびその均等物によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１ａ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムで使用されるに好適な温度制御およびモニタ要素を有する毛管カラムのクラスターの軸方向の断面図。
【図１ｂ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムで使用されるに好適な温度制御およびモニタ要素を有する毛管カラムのクラスターの軸方向に交差した断面図。
【図１ｃ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムで使用されるに好適な温度制御およびモニタ要素を有する毛管カラムのクラスターの温度制御およびモニタ要素の模式図。
【図２ａ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムで使用される毛管カラムのクラスターのもう１つの実施形態の軸方向の断面図。
【図２ｂ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムで使用される毛管カラムのクラスターのもう１つの実施形態の軸方向に交差した断面図。
【図３】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムで使用されるに好適な６個のヒータからなるアレイ用の温度制御システムの模式図。
【図４】本発明に係る分布型温度制御の実施形態を示す模式図。
【図５】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムの実施形態の図。
【図６】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムのＣＤＣＥ解析に対する用法の一例。
【図７】本発明のサーモスタットアレイ制御システムを使用して、それぞれの設定温度の±０．０２℃未満の範囲内で６通りの異なる温度に維持された６個のヒータの結果を示す図。
【図８ａ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムをＰＣＲ増幅されたＤＮＡサンプルのＣＤＣＥ分離の最適化に使用した結果を示すグラフ。
【図８ｂ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムをＰＣＲ増幅されたＤＮＡサンプルのＣＤＣＥ分離の最適化に使用した結果を示すグラフ。
【図９ａ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムを使用した再生可能なＣＤＣＥ分離を示すグラフ。
【図９ｂ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムを使用した再生可能なＣＤＣＥ分離を示すグラフ。
【図９ｃ】本発明に係るサーモスタットアレイ制御システムを使用した再生可能なＣＤＣＥ分離を示すグラフ。
【符号の説明】
【００３６】
１２    熱伝導性ブロック
１４    中空チャンネル
１６    温度センサ
１８    毛管チューブ
２２    加熱要素
２８    温度制御器
３０    精密温度プローブ
３４    温度計
2006515672.tif 000002
【図１ｃ】
2006515672.tif 000003
2006515672.tif 000004
【図３】
2006515672.tif 000005
【図４】
2006515672.tif 000006
【図５】
2006515672.tif 000007
【図６】
2006515672.tif 000008
【図７】
2006515672.tif 000009
【図８ａ】
2006515672.tif 000010
【図８ｂ】
2006515672.tif 000011
【図９ａ】
2006515672.tif 000012
【図９ｂ】
2006515672.tif 000013
【図９ｃ】
2006515672.tif 000014
【国際調査報告】
2006515672.tif 000015
2006515672.tif 000016