(57)【要約】本発明は式（Ｉ）【化１】2004518713.tif 000006で表される４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドおよび医薬としてのその使用に関する。該化合物（Ｉ）は、安定狭心症もしくは不安定狭心症のような心疾患、プリンズメタル型狭心症（痙攣）、急性冠状動脈性症候群、心不全、心筋梗塞、卒中、血栓症、末梢動脈の閉鎖性疾患ＰＡＯＤ、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、ＰＴＣＡ後の内皮損傷、本態性高血圧症、肺高血圧症、二次性高血圧症、腎血管性慢性糸球体腎炎、勃起障害、心室性不整脈の治療および予防、閉経後の女性もしくは避妊薬摂取後における心臓血管損傷危険性の低下、糖尿病もしくは糖尿病合併症（腎症、網膜症）、血管形成、気管支喘息、慢性腎不全、肝硬変、記憶力の衰えまたは学習能力の衰えの治療および予防のために使用することができる。
2004518713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮ＮＯ−シンターゼの発現を刺激する医薬の製造のための式（Ｉ）
【化１】
2004518713.tif 000005
で表される４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドの使用。
【請求項２】
心臓血管疾患、安定狭心症もしくは不安定狭心症、冠状動脈性心臓病、プリンズメタル型狭心症、急性冠状動脈性症候群、心不全、心筋梗塞、卒中、血栓症、末梢動脈の閉鎖性疾患、内皮機能障害、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、ＰＴＣＡ後の内皮損傷、高血圧症、本態性高血圧症、肺高血圧症、二次性高血圧症、腎血管性高血圧症、慢性糸球体腎炎、勃起障害、心室性不整脈、糖尿病もしくは糖尿病合併症、腎症、網膜症、血管形成、気管支喘息、慢性腎不全、肝硬変、骨粗鬆症、記憶力の衰えもしくは学習能力の衰えを治療するか、または閉経後の女性もしくは避妊薬摂取後における心臓血管損傷の危険性を低下させる医薬の製造のための４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドの使用。
【請求項３】
医薬が、内皮の機能障害、高血圧症、冠状動脈性心臓病、安定狭心症、糖尿病合併症またはアテローム性動脈硬化症の処置用である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
有効投与量の４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドおよび製薬的に許容し得る担体を含有する、内皮ＮＯ−シンターゼの発現を刺激する医薬製剤。
【請求項５】
有効投与量の４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドおよび製薬的に許容し得る担体を含有する、心臓血管疾患、安定狭心症もしくは不安定狭心症、冠状動脈性心臓病、プリンズメタル型狭心症、急性冠状動脈性症候群、心不全、心筋梗塞、卒中、血栓症、末梢動脈の閉鎖性疾患、内皮機能障害、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、ＰＴＣＡ後の内皮損傷、高血圧症、本態性高血圧症、肺高血圧症、二次性高血圧症、腎血管性高血圧症、慢性糸球体腎炎、勃起障害、心室性不整脈、糖尿病もしくは糖尿病合併症、腎症、網膜症、血管形成、気管支喘息、慢性腎不全、肝硬変、骨粗鬆症、記憶力の衰えもしくは学習能力の衰えを治療するか、または閉経後の女性もしくは避妊薬摂取後における心臓血管損傷の危険性を低下させる医薬製剤。
【請求項６】
医薬製剤が丸剤、錠剤、ラッカー処理された錠剤、糖衣錠、顆粒剤、ハードゼラチンもしくはソフトゼラチンのカプセル、水性、アルコール性もしくは油性の溶液、シロップ、乳液もしくは懸濁液、坐薬、注射もしくは注入用溶液、軟膏、チンキ剤、スプレー、経皮治療系、鼻用スプレー、エーロゾル混合物、マイクロカプセル、インプラントまたはロッドの形態である、請求項４または５に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は式（Ｉ）
【化２】
2004518713.tif 000003
で表される４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドおよび医薬製剤としてのその使用に関する。内皮ＮＯ−シンターゼ（ｅＮＯＳ、ＮＯＳ−ＩＩＩ）は、アルギニンの酸化によって一酸化窒素（ＮＯ）を産生する３つのイソ酵素のグループに属する。内皮に放出されたＮＯは多くの重要な心臓血管メカニズムにおいて極めて重要である。それは血管拡張作用を有し、そして血小板の凝集、内皮への白血球の接着および脈管内膜の平滑筋細胞の増殖を阻止する。
【０００２】
内皮ＮＯ−シンターゼは、転写段階および転写後段階の両方において生理学的ないし病態生理学的な調節に支配される。内皮中に既に存在する酵素が、特定のアミノ酸の燐酸化を介して、あるいはまた特定のタンパク質との直接相互作用によってもカルシウム依存性活性化およびカルシウムと無関係な活性化に影響されることもある。通常は一時的であるが、このＮＯ放出を刺激するものは、細胞外のアルギニン、１７β−エストロゲン、および血流が内皮管腔の表面に及ぼす機械的刺激（剪断応力）である。後者はさらに、転写段階でｅＮＯＳの調節を行う。すなわち、例えば、Ｓｅｓｓａ等（Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７４ （１９９４） ３４９−３５３）は、運動トレーニングおよびそれによる剪断応力の増加によってｅＮＯＳの顕著な増加を獲得することができた。
【０００３】
生体内で転写後段階の調節が関係するのがどうかは、明白には証明されていない。すなわち、例えば、高い投与量のアルギニンを投与すると、冠状動脈性心臓病の患者では内皮依存性の血管緊張低下にただ一時的な改善がもたらされるだけである。
【０００４】
他方、ｅＮＯＳタンパク質のアップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の重要性は科学的に承認されている。すなわち、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤シムバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）の保護特性は、脂質低下の外に、さらに一部には生体内ｅＮＯＳの発現の増加によるとされ得ることを示す研究成果が存在している（Ｅｎｄｒｅｓ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５ （１９９８） ８８８０−８８８５）。ｅＮＯＳ遺伝子の５’−側面領域（“ｅＮＯＳプロモーター”）中のそれぞれの点変異、およびそれによるｅＮＯＳ遺伝子転写率の減少が、日本人では冠動脈攣縮の危険の増加に関係していることもまた知られている（Ｎａｋａｙａｍａ等、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９９ （１９９９） ２８６４−２８７０）。
【０００５】
したがって、現在の仮説では、ｅＮＯＳ調節の転写および転写後のメカニズムは、多数の疾患、特に心疾患においてひどく妨害されるということである。種々の心疾患のまさに初期の段階でさえ、血管の並んでいる内皮中のこの種の機能障害は生物活性ＮＯの欠損をもたらすことが可能であり、その欠損は該疾患が進行するにつれ測定可能な病態生理学的および形態学的変化の形で明示される。すなわち、初期のアテローム発生の発症段階は、例えば低密度リポタンパク質の酸化、血管内膜中の単球の漸増および沈殿、並びに脈管内膜細胞の増殖のような内皮ＮＯ放出の減少によってその進行速度を速める。アテローム発生の結果は血管内部のプラークの形成であり、それは次いで剪断応力の減少によって内皮ＮＯ放出の一層の減少および病理学上のさらなる劣化をもたらすことがある。また、内皮ＮＯは血管拡張剤でもあるので、そのＮＯの減少はさらにしばしば高血圧症をもたらし、そしてそれは独立の危険因子としてさらに別の臓器損傷を引き起こすこともある。
【０００６】
したがって、これら疾患の処置への治療アプローチの目標は、内皮ＮＯ発現を増加させることによりこの一連のできごとを妨害することでなければならない。予め損傷した血管中のＮＯ−シンターゼの過発現を生体外でもたらす遺伝子導入実験では、前述の進行を妨げることが事実上可能であり、したがってこのアプローチの正しいことを示す証拠になる（Ｖａｒｅｎｎｅ等， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １１ （２０００） １３２９）。
【０００７】
細胞培養中、ｅＮＯＳの転写および発現に直接作用することがあるいくつかの低分子量化合物は文献に開示されている。しかしながら、既述のスタチン類は、生体内ｅＮＯＳのこのような増加を副作用として示すことが現在まで可能だったただ一つの物質である。しかしながら、この種の物質の副作用について知られた範囲を考慮すれば、この作用が毒物学上問題でない投与量でどの程度であるのかは不明瞭である。
【０００８】
Ｌｉａｏ等はＷＯ ９９／４７１５３およびＷＯ ００／０３７４６においてｒｈｏＧＴＰａｓｅ阻害剤の使用並びに内皮細胞中のｅＮＯＳを増加させるための、および種々の疾患、例えば卒中または肺高血圧症を治療するためのアクチン細胞骨格の構成に影響を及ぼす薬剤の使用を特許請求している。しかしながら、これを遂行する具体的な方法は示していない。
【０００９】
したがって、内皮細胞中でｅＮＯＳ−発現をアップレギュレーションする医薬に対する強い要求がある。本発明の目的は、この能力を示す化合物を提供することである。
この目的は、内皮ＮＯ−シンターゼの発現を刺激する医薬の製造のための式（Ｉ）
【化３】
2004518713.tif 000004
で表される４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドの使用によって達成される。
【００１０】
この目的はまた、有効量の４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドおよび製薬的に許容し得る担体を含有する、内皮ＮＯ−シンターゼの発現を刺激する医薬製剤によっても達成される。
【００１１】
本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物の全ての溶媒和物例えば水和物、アルコールとの付加物、式（Ｉ）の化合物の活性代謝物質、およびまた生理学的に受容することができかつ開裂し得る基を含有する式（Ｉ）の化合物の誘導体およびプロドラッグ、例えばエステル、アミド、並びに式（Ｉ）中のＮ−Ｈ基がＮ−メチルのような、Ｎ−アルキル基またはＮ−アシル基例えばＮ−アセチルまたはＮ−アルギニルで置換されている化合物およびそのＮ−アシル基中の官能基上で形成される製薬的に許容し得る塩を包含する。
【００１２】
ＷＯ ００／５１９７０には、医薬としての４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドの製造および使用が開示されている。該化合物は、コリン作動性作用の強い増強作用を有し、哺乳動物の中枢神経系疾患、さらに詳しく云えば健忘症、痴呆症例えば老人性痴呆、アルツハイマー病痴呆、種々の疾患と関係のある痴呆、例えば大脳血管性痴呆、外傷後の大脳性痴呆、脳腫瘍による痴呆、慢性硬膜下血腫による痴呆、正常圧水頭症による痴呆、 脳膜炎後の痴呆、パーキンソン病系痴呆等の治療および／または予防に有用である。該化合物は統合失調症、うつ病、卒中、頭部外傷、ニコチン禁断症状、脊髄損傷、不安症、頻尿、尿失禁、筋強直性ジストロフィー、注意欠陥多動性障害、過度の昼間の眠気（ナルコレプシー）、パーキンソン病または自閉症のための治療剤および／または予防剤として有用であると予想される。ＷＯ ００／５１９７０には内皮ＮＯ−シンターゼ発現のアップレギュレーションのための、特に、心臓血管疾患、安定狭心症もしくは不安定狭心症、冠状動脈性心臓病、プリンズメタル型狭心症、急性冠状動脈性症候群、心不全、心筋梗塞、卒中、血栓症、末梢動脈の閉鎖性疾患、内皮機能障害、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、ＰＴＣＡ後の内皮損傷、高血圧症、本態性高血圧症、肺高血圧症、二次性高血圧症、腎血管性高血圧症、慢性糸球体腎炎、勃起障害、心室性不整脈、糖尿病もしくは糖尿病合併症、腎症、網膜症、血管形成、気管支喘息、慢性腎不全、肝硬変、骨粗鬆症、記憶力の衰えもしくは学習能力の衰えを治療するか、または閉経後の女性もしくは避妊薬摂取後における心臓血管損傷の危険性を低下させるための４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドの使用は開示または示唆されていない。
【００１３】
式（Ｉ）の化合物は、文献で知られている２−インダニルアミンから出発して製造することができる。遊離塩基またはその塩の形態での２−インダニルアミンを、例えばトリエチルアミンのような塩基の存在下において４−フルオロベンゾイルクロリドと反応させることができる。一般的に、その反応はジクロロメタン、テトラヒドロフラン、トルエンまたはジオキサンのような溶媒中で、好ましくは室温において実施される。あるいはまた、式（Ｉ）の化合物は前述の２−インダニルアミンを、例えばジイソプロピルエチルアミンの存在下、適切なカップリング試薬、例えばカルボジイミド類、ＨＡＴＵまたはＴＯＴＵを用いて４−フルオロ安息香酸とカップリング反応させることにより得られる。
【００１４】
式（Ｉ）の化合物の合成のためのさらに別の反応は、当業者に自明であり、よく知られており、また文献、例えばＨｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ， Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）， Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， またはＯｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ に記載の方法またはそれと類似の方法により標準的な条件の下で実施することができる。所望により、式（Ｉ）の化合物は、慣用の精製方法例えば再結晶またはクロマトグラフィーによって精製することができる。式（Ｉ）の化合物を製造するための出発化合物は、商業的に入手可能であるか、または文献に記載の方法または類似の方法で製造することができる。
【００１５】
式（Ｉ）の化合物は、内皮ＮＯ−シンターゼの発現をアップレギュレーションするのに使用することができ、様々な疾患の処置に有用な医薬化合物である。本発明の関連において、処置はそれぞれの疾患の治療および予防処置を含む。
【００１６】
本発明化合物（Ｉ）で処置し得る疾患の例としては、安定狭心症および不安定狭心症のような心疾患、冠状動脈性心臓病、プリンズメタル型狭心症、急性冠状動脈性症候群、心不全、心筋梗塞、卒中、血栓症、末梢動脈の閉鎖性疾患（ＰＡＯＤ）、内皮機能障害、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、ＰＴＣＡ後の内皮損傷、高血圧症例えば本態性高血圧、肺高血圧および二次性高血圧（腎血管性高血圧、慢性糸球体腎炎）、勃起障害、心室性不整脈、およびまたは閉経後の女性もしくは避妊薬摂取後における心臓血管損傷の危険を挙げることができる。
【００１７】
化合物（Ｉ）は、さらに、糖尿病および糖尿病合併症（腎炎、網膜症）、血管形成、気管支喘息、慢性腎不全、肝硬変、骨粗鬆症、記憶力の衰えまたは学習能力の衰えの治療および予防処置に使用することもできる。
好ましい適応症は、安定狭心症、冠状動脈性心臓病、高血圧症、内皮機能障害、アテローム性動脈硬化症および糖尿病合併症である。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物はまた、他の製薬的に活性な化合物、好ましくは式（Ｉ）の化合物の作用を増強することができる化合物と組み合わせて使用することができる。
そのような化合物の例としてはスタチン類； ＡＣＥ阻害剤；ＡＴ１アンタゴニスト；アルギナーゼ阻害剤；ＰＤＥ Ｖ阻害剤；Ｃａアンタゴニスト；α遮断薬；β遮断薬；メチマゾールおよび類似化合物；アルギニン；テトラヒドロビオプテリン；ビタミン類特にビタミンＣおよびビタミンＢ６；ナイアシンを挙げることができる。
【００１９】
所望により他の製薬学的に活性な化合物と組み合わせた化合物（Ｉ）は、医薬それ自体で、または医薬製剤の形態で動物好ましくは哺乳動物、特にヒトに投与することができる。本発明のさらに別の目的は、有効量の式（Ｉ）の化合物および製薬的に許容し得る担体、すなわち一種以上の製薬的に許容し得る担体物質および／または添加物を含有する医薬製剤（または医薬組成物）である。該医薬製剤は、内皮ＮＯ−シンターゼの発現を刺激するために、特に前記症候群の治療および予防処置用の医薬のために使用される。
【００２０】
本発明による医薬は、例えば丸剤、錠剤、ラッカー処理された錠剤、糖衣錠、顆粒剤、ハードゼラチンもしくはソフトゼラチンのカプセル、水性、アルコール性もしくは油性の溶液、シロップ、乳液または懸濁液の形態で経口投与されるか、または坐薬の形態で直腸投与され得る。投与はまた、注射または注入用溶液の形態で、例えば皮下に、筋肉内にまたは静脈内に実施することもできる。他の適切な投与形態には、例えば軟膏、チンキ剤、スプレーもしくは経皮治療系の形態での経皮または局所投与、または鼻用スプレーもしくはエーロゾル混合物の形態での吸入投与、またはマイクロカプセル、インプラントもしくはロッドがある。好ましい投与形態は、例えば、治療すべき疾患およびその程度による。
【００２１】
医薬製剤中の式（Ｉ）の化合物の量は、１回の投与当り通常は０．２〜８００ｍｇ、好ましくは０．５〜５００ｍｇ、特に好ましくは１〜２００ｍｇであるが、しかし医薬製剤のタイプによってはさらに高いこともある。その医薬製剤は、通常、０．５〜９０重量％の式（Ｉ）の化合物を含有する。医薬製剤の調製はそれ自体知られた方法で行なうことができる。このためには、式（Ｉ）の化合物を一種以上の固形または液体の製薬担体物質および（または）添加剤（または補助物質）と一緒にし、そして所望により、治療または予防効果を有するその他の製薬的に活性な化合物と組み合わせて適切な投与形態または剤形にする。次いでそれはヒトまたは獣医用の医薬として使用することができる。
【００２２】
丸剤、錠剤、糖衣錠およびハードゼラチンカプセルの製造のためには、例えば、ラクトース、デンプン例えばトウモロコシデンプン、またはデンプン誘導体、タルク、ステアリン酸もしくはその塩などを使用することが可能である。ソフトゼラチンカプセルおよび坐薬のための担体には、例えば脂肪、ワックス、半固形ないし液体の多価アルコール、天然油もしくは硬化油などがある。溶液例えば注射用溶液または乳液もしくはシロップの調製に適当な担体には、例えば、水、生理的食塩水、アルコール類例えばエタノール、グリセリン、多価アルコール、スクロース、転化糖、グルコース、マンニトール、植物油などがある。さらにまた、例えば、式（Ｉ）の化合物を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を例えば注射または注入用製剤の調製のために使用することも可能である。マイクロカプセル、インプラントまたはロッドに適当な担体には、例えばグリコール酸および乳酸の共重合体がある。
【００２３】
化合物（Ｉ）および担体に加えて、該医薬製剤はさらに添加剤例えば充填剤、崩壊剤、結合剤、減摩剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、分散剤、保存剤、甘味料、着色剤、着香剤、芳香剤、糊料、希釈剤、緩衝物質、溶剤、溶解剤、デポ効果を達成するための剤、浸透圧を変更するための塩類、コーティング剤または酸化防止剤を含有することができる。
【００２４】
投与すべき式（Ｉ）の化合物の投与量は個々の場合によるが、慣例のように、最適効果を達成する個々の状況に適応させる。したがって、それは、治療される疾患の性質および重度、さらにまた治療されるヒトまたは動物の性、重量および個々の反応性、化合物（Ｉ）の作用期間、治療が急性もしくは慢性または予防であるかどうか、または式（Ｉ）の化合物の外にその他の活性化合物が投与されるかどうかに左右される。
【００２５】
一般に、所望の結果を得るには、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは０．３〜５ｍｇ／ｋｇ（それぞれの場合、体重１ｋｇ当りのｍｇ）の１日当りの投与量が、約７５ｋｇ体重の成人への投与に適切である。１日当りの投与量は１回の投与で投与するか、または特に多量を投与する場合にはいくつかの例えば２回、３回または４回の個別投与量に分けて投与することができる。ある場合には、個々の反応によって１日当りの所定の投与量よりも多くするか、または少なくすることが必要であることもある。
【００２６】
式（Ｉ）の化合物はまた、前述で指摘した以外の目的に使用することもできる。実施例は診断目的、生化学ツールとしての使用、およびさらに別の化合物例えば製薬的に活性な化合物の製造用中間体としての使用を包含するが、それらは本発明を限定するものではない。
以下に、本発明を実施例により説明する。
【００２７】
【実施例】
４−フルオロ−Ｎ−（インダン−２−イル）−ベンズアミドの製造
４３．７０ｇ（２５８モル）の２−アミノインダン塩酸塩および５３．４３ｇ（５２８ミリモル）のトリエチルアミンを２５０ｍｌのテトラヒドロフランと混合し、４２．８９ｇ（２７０ミリモル）の４−フルオロベンゾイルクロリドを加え、その混合物を室温で２時間攪拌した。
次いで得られた混合物を氷／ＨＣｌ混合物上に注ぎ、得られた沈殿をろ過し、ＮａＨＣＯ３溶液および水で洗浄し、次いで真空乾燥した。粗生成物をメタノールから結晶化した。白い結晶性生成物４７．８ｇ（７３％）が得られた。
融点：１６７℃。
ＭＳ：Ｍ＋Ｈ＋：２５６．１
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：２．９６（ｄｄ， ２Ｈ， Ｈ１／Ｈ３）， ３．２５（ｄｄ， ２Ｈ， Ｈ３／Ｈ１）， ４．７０（６重線， １Ｈ， Ｈ２）， ７．１２−７．１９（ｍ， ２Ｈ， Ｈ４，７／５，６）， ７．２０−７．２８（ｍ， ２Ｈ， Ｈ５，６／４，７）， ７．３０（ｔ， ２Ｈ， Ｈ３’， ５’）， ７．９５（ｄｄ， ２Ｈ， Ｈ２’， ６’）， ８．６８（ｄ， １Ｈ， ＮＨ）。
【００２８】
ｅＮＯＳ転写の活性化の測定
ｅＮＯＳ転写の活性化は、Ｌｉ等 “Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｌｐｈａ ａｎｄ／ｏｒ ｅｐｓｉｌｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ”， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９８； ５３： ６３０−６３７に詳記されているようにして測定した。
簡潔に云えば、ｅＮＯＳ遺伝子の出発コドンの３．５ｋＢの長い断片５’ をクローン化し、順番付けし、次いでホタルのルシフェラーゼ発現プラスミド中でクローン化して、レポーター遺伝子の作用によるｅＮＯＳプロモーターの活性化をモニターした。このプロモーター−レポーター構築物を発現しているトランスフェクションされた安定なヒト内皮細胞系を化合物試験に使用した。細胞は該化合物（Ｉ）と一緒に１８時間インキュベートした。
【００２９】
該化合物を前もって滅菌性ＤＭＳＯに溶解した。完全培地中で０．５％ＤＭＳＯの最終濃度が得られた。これらの細胞中のリポーター遺伝子発現の誘導は、標準ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ． Ｎｏ Ｅ１５０）をメーカーの指示により使用して測定した。化合物（Ｉ）とインキュベートした細胞中のルシフェラーゼ誘導を、溶媒だけとインキュベートしたものと比較した。両方の活性の比率（転写誘導比、ＴＩＲ）を化合物濃度の関数としてプロットした。典型的には、ＴＩＲ値は化合物の効力を示さない１の比率の低濃度から出発し、ｅＮＯＳ転写の増加を示す最大のＴＩＲ値、ＴＩＲ（ｍａｘ）まで伸びた。化合物濃度の関数としての転写誘導比のＥＣ５０値をグラフで決定した。
ｅＮＯＳ−転写に及ぼす化合物（Ｉ）の効果は、ｅＮＯＳタンパク質検出に基づいた別のアッセイで確認した。始原のヒト臍静脈帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を標準操作によって単離し、培養した。融合細胞を化合物（Ｉ）と１８時間インキュベートし、ｅＮＯＳタンパク質発現に及ぼす効果をウェスタンブロット定量法で測定した。化合物（Ｉ）のインキュベーション後、ＨＵＶＥＣを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１％ＳＤＳおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する氷冷溶解バッファー中で溶解した。溶解物を標準の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ニトロセルロース膜にブロットした。特定の一次モノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＵＫ）およびアルカリホスファターゼ標識の二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を使用して、特定のｅＮＯＳタンパク質バンドを視覚化し、次いで化学蛍光検出方法に基づいて定量した。化合物（Ｉ）については、ＥＣ５０値は０．８μＭであり、ＴＩＲ（ｍａｘ）は４．１０であった。
【００３０】
動物モデル
動物実験はすべて、ドイツの動物愛護法に従いそして米国国立衛生研究所の実験動物に対する配慮および使用のためのガイドによる実験動物の使用に関するガイドラインに従って実施した。
【００３１】
動物および処置（実験Ａ〜Ｃ）
アポＥ欠損マウスおよびｅＮＯＳ欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ血統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， Ｍｅ）を使用した。動物はすべて１０〜１２週令で、重さ２２〜２８ｇであった。外科処置の３日前に、マウスを４つのグループ（アポＥ対照、ｎ＝１０〜１２；化合物（Ｉ）を含むアポＥ、ｎ＝１０〜１２；ｅＮＯＳ対照、ｎ＝１０〜１２；化合物（Ｉ）を含むｅＮＯＳ、ｎ＝１０〜１２）に分け、標準のげっ歯動物用食餌（４％脂肪および０．００１％コレステロールを含有する；下記ではプラシーボグループとして示される）または標準のげっ歯動物用食餌＋化合物（Ｉ）のいずれかを与えた（１０ｍｇ／ｋｇ／日または３０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与）。
【００３２】
Ａ．アポＥノックアウトマウスにおける抗高血圧効果
血圧はコンピューター化されたテイル−カフ（ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ）システムを使用して、意識のあるマウスで測定した。
化合物（Ｉ）について、アポＥ欠損マウスを４ヶ月処置した後の血圧は、プラシーボグループと比較すると３０ｍｇ／ｋｇ／日のグループで有意に（ｐ＜０．０５）低下した（１１５±２ｍｍＨｇに対して９２±５ｍｍＨｇ）。ｅＮＯＳ欠損マウスにおける同様の投与での４週間処置後では血圧減少を全く観察することができなかった。
【００３３】
Ｂ．新内膜形成およびアテローム発生（大腿動脈カフ）の阻止
アポＥ欠損マウスを化合物（Ｉ）（食餌中に圧搾された１０ｍｇ／ｋｇ／日）で３日間処置した後に、各動物をペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入、次いでキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔し、カフをＭｏｒｏｉ等（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １０１：１２２５−３２、１９９８）に記載のように大腿動脈の周りに置いた。簡潔に云えば、左大腿動脈を解剖した。ＰＥ−５０管材料（内径０．５６ｍｍ、外径０．９６５ｍｍ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａ）で作られた非密封性の２．０ｍｍポリエチレンカフをその動脈の周りに置き、２つの７−０の縫合で適所に結び付けた。右大腿動脈を周囲の組織から単離したが、カフは置かなかった。外科処置の後１４日間化合物（Ｉ）による処置を継続した。その後、動物を犠牲にした。ウェスタンブロッティング定量法による血管ｅＮＯＳ発現の測定のために大動脈を採取した。両方の大腿動脈を集め、ホルマリンに固定し、パラフィンに埋め込んだ。２０個の断面（１０μｍ）を左大腿動脈のカフ付き部分および右動脈の対応する部分から切断した。各切断面を標準ヘマトキシリンおよびエオシンの染色に付した。形態測定の分析は、画像解析コンピュータ・プログラム（ＬｅｉｃａＱＷｉｎ， Ｌｅｉｃａ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＧＢ）を使用して行なった。各断面について、管腔、新内膜および中膜の領域を測定した。このために、新内膜は管腔と内部弾性板との間の領域として定義された。また、中膜は内部弾性板と外部弾性板との間の領域として定義された。新内膜領域と中膜領域との間の比率を、新内膜／中膜の比として表した。
【００３４】
化合物（Ｉ）は不適合な新内膜形成を２だけ減少させ、新内膜対中膜の比をプラシーボグループでの０．３９±０．０７から化合物グループでの０．１７０±０．０４に減少させた。同時に、血管ｅＮＯＳの発現は２．１だけ増強された。アポＥノックアウトマウスの代わりにｅＮＯＳ欠損マウスを使用した同様の設定では化合物（Ｉ）の効果を全く証明することができなかった。
【００３５】
Ｃ．慢性処置でのアテローム動脈硬化性プラーク形成の予防
アポＥ欠損マウスを食餌中に圧搾された化合物（Ｉ）で１６週間処置し、最後に犠牲にした。大動脈を各マウスから取り除き、ホルマリンに固定し、パラフィンに埋め込んだ。プラーク形成を大動脈（大動脈弓から隔膜まで）中の脂質病変形成によって測定し、油性赤色Ｏの染色によって分析した。血管ｅＮＯＳの発現に及ぼす各化合物の効果を定量化するために、この実験では大腿動脈を使用した。
【００３６】
本発明の化合物（Ｉ）はプラーク形成を有意に減少させた（プラシーボグループでの１３．３±２．６％に対して５．２±１％、全表面の％で表示された全体のプラークサイズの値）。血管ｅＮＯＳ発現は、処置グループで１．７５倍アップレグレーションされることが分かった。
【００３７】
Ｄ．アポＥ欠損症罹患マウスの冠動脈性機能の改善
年老いたオスの野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｗｉｇａ ＧｍｂＨ， Ｓｕｌｚｆｅｌｄ）および６ヶ月令、重さ２８〜３６ｇのアポＥ欠損マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ血統、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， Ｍ）を実験に使用した。マウスを３つのグループ（Ｃ５７ＢＬ／６， ｎ＝８；アポＥ対照， ｎ＝８；化合物（Ｉ）を含むアポＥ， ｎ＝８）に分け、標準のげっ歯動物用食餌（４％脂肪および０．００１％コレステロールを含有する）または標準のげっ歯動物用食餌＋化合物（Ｉ）のいずれかを８週間与えた（３０ｍｇ／ｋｇ／日を経口投与）。
【００３８】
マウスをペントバルビトンナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与）で麻酔し、心臓を迅速に切り取り、氷冷潅流バッファーに入れた。大動脈にカニューレを挿入し、次いで６０ｍｍＨｇの一定の潅流圧力で直ちに作動し始める潅流装置（ＨＵＧＯ ＳＡＣＨＳ ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ、Ｆｒｉｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に接続した。心臓を変形クレブス重炭酸塩バッファーとともに逆行する方法で潅流し、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２で平衡に保ち、３７．５℃に維持した。
【００３９】
勾配付きの小さなチューブ（ＰＥ５０）を肺静脈を介して左心室に通し、引いて心室壁に通して、溝のある端によって頂上に固着し、チップ−マイクロマノメーター（Ｍｉｌｌａｒ １．４ Ｆｒｅｎｃｈ）に接続した。同一の肺静脈を介して左心房にカニューレを挿入し、心臓を１０ｍｍＨｇの一定の前負荷圧および６０ｍｍＨｇの後負荷圧で作動モードに切り替えた。大動脈流出および心房流入を超音波流量プローブ（ＨＳＥ／Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して連続的に測定した。冠動脈流量は、心房の流量と大動脈の流量との差として計算した。血流力学データはすべて１０００Ｈｚのサンプリングレートでデジタル化し、専門のソフトウェア（ＨＥＭ， Ｎｏｔｏｃｏｒｄ）を使用してＰＣで記録した。
心臓を３０分間そのままで安定化させた。機能性の血流力学データはすべて定常状態中並びに容積負荷および圧力負荷中に測定された。
左心室機能の曲線は、前負荷圧力を変えることにより作成した。前負荷曲線を得るには、後負荷を６０ｍｍＨｇにセットし、前負荷を一連の５〜２５ｍｍＨｇに関して５ｍｍＨｇ段階ずつで調節した。心臓は圧力負荷と容積負荷との間の基準状態で安定化された。
【００４０】
アポＥ欠損の動物から単離した心臓は、Ｃ５７Ｂ１６野生のマウスと比較するとこの設定でより少ない冠動脈流量を示した（４．９５ｍｌ／分に対して３．６ｍｌ／分）。本発明化合物（Ｉ）を含むアポＥ欠損動物を処置すると、冠動脈の流量は病気でない野性のマウスのレベルに匹敵する５ｍｌ／分に増加した。化合物（Ｉ）はまた、前負荷依存性の冠状動脈の流れを改善し、抗虚血効果の表示として心室性不整脈の発生率を減少させた。
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月30日(2003.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮ＮＯ−シンターゼの発現を刺激する医薬の製造のための式（Ｉ）
【化１】
2004518713.tif 000022
で表される４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドの使用。
【請求項２】
心臓血管疾患、安定狭心症もしくは不安定狭心症、冠状動脈性心臓病、プリンズメタル型狭心症、急性冠状動脈性症候群、心不全、心筋梗塞、血栓症、末梢動脈の閉鎖性疾患、内皮機能障害、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、ＰＴＣＡ後の内皮損傷、高血圧症、本態性高血圧症、肺高血圧症、二次性高血圧症、腎血管性高血圧症、慢性糸球体腎炎、勃起障害、心室性不整脈、糖尿病もしくは糖尿病合併症、腎症、網膜症、血管形成、気管支喘息、慢性腎不全、肝硬変、骨粗鬆症、または閉経後の女性もしくは避妊薬摂取後における心臓血管損傷の危険性を低下させる医薬の製造のための４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドの使用。
【請求項３】
医薬が、内皮の機能障害、高血圧症、冠状動脈性心臓病、安定狭心症、糖尿病合併症またはアテローム性動脈硬化症の処置用である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
有効投与量の４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドおよび製薬的に許容し得る担体を含有する、内皮ＮＯ−シンターゼの発現を刺激する医薬製剤。
【請求項５】
有効投与量の４−フルオロ−Ｎ−インダン−２−イルベンズアミドおよび製薬的に許容し得る担体を含有する、心臓血管疾患、安定狭心症もしくは不安定狭心症、冠状動脈性心臓病、プリンズメタル型狭心症、急性冠状動脈性症候群、心不全、心筋梗塞、血栓症、末梢動脈の閉鎖性疾患、内皮機能障害、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、ＰＴＣＡ後の内皮損傷、高血圧症、本態性高血圧症、肺高血圧症、二次性高血圧症、腎血管性高血圧症、慢性糸球体腎炎、勃起障害、心室性不整脈、糖尿病もしくは糖尿病合併症、腎症、網膜症、血管形成、気管支喘息、慢性腎不全、肝硬変、骨粗鬆症、または閉経後の女性もしくは避妊薬摂取後における心臓血管損傷の危険性を低下させる医薬製剤。
【請求項６】
医薬製剤が丸剤、錠剤、ラッカー処理された錠剤、糖衣錠、顆粒剤、ハードゼラチンもしくはソフトゼラチンのカプセル、水性、アルコール性もしくは油性の溶液、シロップ、乳液もしくは懸濁液、坐薬、注射もしくは注入用溶液、軟膏、チンキ剤、スプレー、経皮治療系、鼻用スプレー、エーロゾル混合物、マイクロカプセル、インプラントまたはロッドの形態である、請求項４または５に記載の医薬製剤。
【国際調査報告】
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2004518713.tif 000024