(57)【要約】本発明は、アデノシン A3 レセプターアゴニスト(A3RAg)がナチュラルキラー (NK) 細胞を活性化するとの驚くべき知見に基づく発明である。この活性化は、アデノシン A3 レセプターアンタゴニストの存在下で無効化された。この新規効果を呈するA3RAgの一例は、C1-IB-MECAである。従って、本発明は、治療効果を具備する薬学的組成物の製剤のためのA3RAgsの使用に関し、前記治療効果はNK細胞の活性化を含むものである。更に、本発明は治療効果を達成するための治療的方法および薬学的組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療効果を達成するための薬学的組成物の製剤におけるA3RAgの使用であって、前記治療効果がNK細胞の活性化を含む使用。
【請求項２】
前記A3RAgが、一般式(I)の化合物又は該化合物の薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の使用：
【化１】
2004531523.tif 000009
この式中で、
R1は、アルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル若しくはシアノアルキル又は下記の一般式 (II) の基を表し、：
【化２】
2004531523.tif 000010
この式中で：
Yは、酸素、硫黄または炭素原子を表し；
X1は、H、アルキル、RaRbNC (=0)-またはHORc-を表し、ここで、
RaおよびRbは、同一であっても異なっていてもよく、水素、アルキル、アミノ、ハロアルキル、アミノアルキル、BOC-アミノアルキル、および シクロアルキルから選択されるか又は共に連結されて２〜５の炭素原子を含有する複素環を形成し；並びに
Rcは、アルキル、アミノ、ハロアルキル、アミノアルキル、BOC-アミノアルキル、およびシクロアルキルから選択され；
X2は、H、ヒドロキシル、アルキルアミノ、アルキルアミドまたはヒドロキシアルキルであり；
X3およびX4は、独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アミド、アジド、ハロ、アルキル、アルコキシ、カルボキシ、ニトリロ、ニトロ、トリフルオロ、アリール、アルカリル、チオ、チオエステル、チオエーテル、-OCOPh、-OC (=S) OPhを表すか、又はX3およびX4双方が＞ C=Sに連結して５員環を形成する酸素であり、或いはX2およびX3は式(III)：
【化３】
2004531523.tif 000011
の環を形成し、この式中で、R'およびR''は、独立にアルキル基を表し；
R2は、水素、ハロ、アルキルエーテル、アミノ、ヒドラジド、アルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ピリジルチオ、アルケニル; アルキニル、チオ、及びアルキルチオから選択され；並びに
R3は、式-NR4R5の基であり、ここで、
R4は、水素原子またはアルキル、置換されたアルキル若しくはアリール-NH-C (Z)-から選択される基であり、ZはO、S、若しくはNRaであり、Raは上記の定義を具備するものであり；ここでR4が水素の場合、
R5は、R-及びS-1-フェニルエチル、ベンジル、フェニルエチル基（非置換であるか或いは１以上の位置がアルキル、アミノ、ハロ、ハロアルキル、ニトロ、ヒドロキシル、アセトアミド、アルコキシ、及びスルホン酸又はその塩から選択される置換基で置換される）；ベンゾジオキサンメチル、フルリル、L-プロピルアラニル-アミノベンジル、β-アラニルアミノ-ベンジル、T-BOC-β-アラニルアミノベンジル、フェニルアミノ、カルバモイル、フェノキシ又はシクロアルキルから選択されるか;或いはR5は、次ぎの式：
【化４】
2004531523.tif 000012
で表される基であるか、
或いはR4がアルキル又はアリール-NH-C (Z)-である場合、R5はヘテロアリールNRa-C (Z)-、ヘテロアリールC (Z)-、アルカリル-NRa-C (Z)-、アルカリルC (Z)-、アリール-NR-C (Z)- 及び アリール-C (Z)-（Zは酸素、硫黄もしくはアミンを表す）から選択される。
【請求項３】
請求項２に記載の使用であって、前記A3RAgが一般式(IV) のヌクレオシド誘導体である使用：
【化５】
2004531523.tif 000013
この式中のX1、 R2 および R4は請求項２で定義したとおりである。
【請求項４】
請求項１に記載の使用であって、前記A3RAgがN6-2- (4- アミノフェニル) エチルアデノシン (APNEA)、 N6- (4-アミノ-3- ヨードベンジル) アデノシン-5'-(N-メチルウロンアミド) (AB-MECA) および N6- (2-ヨードベンジル)-アデノシン- 5'-N- メチルウロンアミド (IB-MECA) および 2-クロロ- N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N- メチルウロンアミド (C1-IB-MECA)から選択される使用。
【請求項５】
請求項４に記載の使用であって、前記A3RAgがC1-IB-MECAである使用。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の使用であって、経口投与に適切な薬学的組成物の製剤における使用。
【請求項７】
ナチュラルキラー (NK) 細胞を活性化するための方法であって、前記細胞を前記NK細胞を活性化するのに効果的な特定量の作用物質と接触させることを含み、前記作用物質がアデノシン A3 レセプターアゴニスト (A3RAg)である方法。
【請求項８】
前記A3RAgが、一般式(I)の化合物又は該化合物の薬学的に許容される塩である、請求項７に記載の使用：
【化６】
2004531523.tif 000014
この式中で、
R1は、アルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル若しくはシアノアルキル又は一般式 (II) の基を表し、：
【化７】
2004531523.tif 000015
この式中で、
Yは、酸素、硫黄もしくは炭素原子を表し；
X1は、H、アルキル、RaRbNC (=0)-またはHORc-を表し、ここで、
RaおよびRbは、同一であっても異なっていてもよく、水素、アルキル、アミノ、ハロアルキル、アミノアルキル、BOC-アミノアルキル、および シクロアルキルから選択されるか又は共に連結されて２〜５の炭素原子を含有する複素環を形成し；並びに
Rcは、アルキル、アミノ、ハロアルキル、アミノアルキル、BOC-アミノアルキル、およびシクロアルキルから選択され；
X2は、H、ヒドロキシル、アルキルアミノ、アルキルアミドまたはヒドロキシアルキルであり；
X3およびX4は、独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アミド、アジド、 ハロ、アルキル、アルコキシ、カルボキシ、ニトリロ、ニトロ、トリフルオロ、アリール、アルカリル、チオ、チオエステル、チオエーテル、-OCOPh、-OC (=S) OPhを表すか、又はX3およびX4双方が＞ C=Sに連結して５員環を形成する酸素を表すか、又はX2およびX3は式(III)：
【化８】
2004531523.tif 000016
の環を形成し、この式中で、R'およびR''は、独立にアルキル基を表し；
R2は、水素、ハロ、アルキルエーテル、アミノ、ヒドラジド、アルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ピリジルチオ、アルケニル; アルキニル、チオ、及びアルキルチオから選択され；並びに
R3は、式-NR4R5の基であり、ここで、
R4は、水素原子またはアルキル、置換されたアルキル若しくはアリール-NH-C (Z)-から選択される基であり、ZはO、S、若しくはNRaであり、Raは上記の定義を具備するものであり；ここでR4が水素の場合、
R5は、R-及びS-1-フェニルエチル、ベンジル、フェニルエチル基（非置換であるか或いは１以上の位置がアルキル、アミノ、ハロ、ハロアルキル、ニトロ、ヒドロキシル、アセトアミド、アルコキシ、及びスルホン酸又はその塩から選択される置換基で置換される）；ベンゾジオキサンメチル、フルリル、L-プロピルアラニル-アミノベンジル、β-アラニルアミノ-ベンジル、T-BOC-β-アラニルアミノベンジル、フェニルアミノ、カルバモイル、フェノキシ又はシクロアルキルから選択されるか;或いはR5は、次ぎの式：
【化９】
2004531523.tif 000017
で表される基であるか、
或いはR4がアルキル又はアリール-NH-C (Z)-である場合、R5はヘテロアリールNRa-C (Z)-、ヘテロアリールC (Z)-、アルカリル-NRa-C (Z)-、アルカリルC (Z)-、アリール-NR-C (Z)- 及び アリール-C (Z)-（Zは酸素、硫黄もしくはアミンを表す）からなる群から選択される。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記A3RAgが一般式 (IV) の化合物である方法：
【化１０】
2004531523.tif 000018
この式中のX1、 R2およびR4は請求項８で定義したとおりである。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、A3RAgがN6-2- (4- アミノフェニル) エチルアデノシン (APNEA)、N6- (4-アミノ-3-ヨードベンジル) アデノシン-5'-(N-メチルウロンアミド) (AB-MECA)およびN6- (2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N- メチルウロンアミド (IB-MECA)および2-クロロ- N6- (2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N- メチルウロンアミド (C1-IB-MECA)から選択される方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記A3RAgがC1-IB-MECAである方法。
【請求項１２】
治療処置のための方法であって、必要とする個体に効果的な量の作用物質を治療効果を達成するために投与することを含み、前記治療効果がナチュラルキラー (NK) 細胞を活性化することを含み、前記作用物質がアデノシン A3 レセプターアゴニスト(A3RAg)である方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記A3RAgが請求項８で定義した一般式 (I)の化合物である方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記A3RAgが請求項９で定義した一般式(IV)のヌクレオシド誘導体である方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記A3RAgが、N6-2- (4- アミノフェニル) エチルアデノシン (APNEA)、N6- (4-アミノ-3-ヨードベンジル) アデノシン-5'-(N-メチルウロンアミド) (AB-MECA)およびN6- (2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N- メチルウロンアミド (IB-MECA)および2-クロロ- N6- (2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N- メチルウロンアミド (C1-IB-MECA)から選択される方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記A3RAgが C1-IB-MECAである方法。
【請求項１７】
請求項１２〜１６の何れか１項に記載の方法であって、前記A3RAgが前記個体に経口的に投与される方法。
【請求項１８】
疾患または障害を治療するための方法であって、かかる治療を必要とする個体に特定量の活性化NK細胞を投与することを含み、前記NK細胞がNK細胞を活性化量のA3RAgと接触させることによりエクスビボで活性化される方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記NK細胞が自己細胞であり、
前記個体からNK細胞を回収することと、
前記細胞を前記NK細胞を活性化するのに効果的な特定量のA3RAgと接触させることと、
前記活性化NK細胞を前記個体に導入することと、
を含む方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記活性化NK細胞が前記個体に注射される方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法であって、
提供者個体に該提供者個体におけるNK細胞を活性化するのに効果的な特定量のA3RAgを投与することと、
前記活性化NK細胞を前記提供者個体から回収することと、および
前記活性化NK細胞を移植者個体に投与することと、
を含む方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１の何れか１項に記載の方法であって、前記A3RAgが前記提供者個体に経口的に投与される方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２２の何れか１項に記載の方法であって、前記A3RAgが請求項８で定義した一般式 (I)の化合物である方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記A3RAgが請求項９で定義した一般式 (IV)のヌクレオシド誘導体である方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記A3RAgが、N6-2- (4- アミノフェニル) エチルアデノシン (APNEA)、N6- (4-アミノ-3- ヨードベンジル) アデノシン-5'-(N-メチルウロンアミド) (AB-MECA)およびN6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N- メチルウロンアミド (IB-MECA)および2-クロロ- N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N- メチルウロンアミド (C1-IB-MECA)から選択される方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記A3RAgがC1-IB-MECAである方法。
【請求項２７】
治療効果を達成するための薬学的組成物であって、生理学的に許容される賦形剤および前記治療効果を達成するのに効果的な特定量のA3RAgを含み、前記治療効果がNK細胞の活性化を含む薬学的組成物。
【請求項２８】
前記A3RAgが、一般式(I)の化合物又は該化合物の薬学的に許容される塩である、請求項２７に記載の薬学的組成物：
【化１１】
2004531523.tif 000019
この式中で、
R1は、アルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル若しくはシアノアルキルまたは下記の一般式 (II) の基を表し、：
【化１２】
2004531523.tif 000020
この式中で：
Yは、 酸素、硫黄または炭素原子を表し；
X1は、H、アルキル、RaRbNC (=0)-またはHORc-を表し、ここで、
RaおよびRbは、同一であっても異なっていてもよく、水素、アルキル、アミノ、ハロアルキル、アミノアルキル、BOC-アミノアルキル、およびシクロアルキルから選択されるか又は共に連結されて２〜５の炭素原子を含有する複素環を形成し；並びに
Rcは、アルキル、アミノ、ハロアルキル、アミノアルキル、BOC-アミノアルキル、およびシクロアルキルから選択され；
X2は、H、ヒドロキシル、アルキルアミノ、アルキルアミドまたはヒドロキシアルキルであり；
X3およびX4は、独立に水素、ヒドロキシル、アミノ、アミド、アジド、 ハロ、アルキル、アルコキシ、カルボキシ、ニトリロ、ニトロ、トリフルオロ、アリール、アルカリル、チオ、チオエステル、チオエーテル、-OCOPh、-OC (=S) OPhを表すか、又はX3およびX4双方が＞ C=Sに連結して５員環を形成する酸素を表すか、又はX2およびX3は式(III)：
【化１３】
2004531523.tif 000021
の環を形成し、この式中で、R'およびR''は、独立にアルキル基を表し；
R2は、水素、ハロ、アルキルエーテル、アミノ、ヒドラジド、アルキルアミノ、アルコキシ、チオアルコキシ、ピリジルチオ、アルケニル; アルキニル、チオ、及びアルキルチオから選択され；並びに
R3は、式-NR4R5の基であり、ここで、
R4は、水素原子またはアルキル、置換されたアルキル若しくはアリール-NH-C (Z)-から選択される基であり、ZはO、S、若しくはNRaであり、Raは上記の定義を具備するものであり；ここでR4が水素の場合、
R5は、R-及びS-1-フェニルエチル、ベンジル、フェニルエチル基（非置換であるか或いは１以上の位置がアルキル、アミノ、ハロ、ハロアルキル、ニトロ、ヒドロキシル、アセトアミド、アルコキシ、及びスルホン酸又はその塩から選択される置換基で置換される）；ベンゾジオキサンメチル、フルリル、L-プロピルアラニル-アミノベンジル、β-アラニルアミノ-ベンジル、T-BOC-β-アラニルアミノベンジル、フェニルアミノ、カルバモイル、フェノキシ又はシクロアルキルから選択されるか;或いはR5は、次ぎの式：
【化１４】
2004531523.tif 000022
の基であるか、
或いはR4がアルキル又はアリール-NH-C (Z)-である場合、R5はヘテロアリールNRa-C (Z)-、ヘテロアリールC (Z)-、アルカリル-NRa-C (Z)-、アルカリル-C (Z)-、アリール-NR-C (Z)- 及び アリール-C (Z)-（Zは酸素、硫黄もしくはアミンを表す）から選択される。
【請求項２９】
請求項２８に記載の薬学的組成物であって、前記A3RAgが一般式 (IV) のヌクレオシド 誘導体である薬学的組成物：
【化１５】
2004531523.tif 000023
この式中のX1、R2およびR4は請求項２８で定義したとおりである。
【請求項３０】
請求項２９に記載の薬学的組成物であって、A3RAgが、N6-2- (4-アミノフェニル) エチルアデノシン (APNEA)、N6- (4-アミノ-3- ヨードベンジル) アデノシン-5'- (N-メチルウロンアミド) (AB-MECA)およびN6-(2-ヨードベンジル) アデノシン-5'-N-メチルウロンアミド (IB-MECA)および2-クロロ- N6-(2-ヨードベンジル)- アデノシン-5'-N-メチルウロンアミド (C1-IB-MECA)から選択される薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の薬学的組成物であって、前記A3RAgがC1-IB-MECAである方法。
【請求項３２】
請求項２７〜３１の何れか１項に記載の薬学的組成物であって、前記A3RAgが経口投与のための形態である薬学的組成物。
【請求項３３】
請求項３２に記載の薬学的組成物であって、単回用量単位形態（single dosage unit form）の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナチュラルキラー細胞を活性化するためのアデノシン A3 レセプターアゴニストの治療的な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下に説明する事項は、従来技術のリストである。このリストは本発明の技術分野における現在の技術水準を説明するために適切であると考えられる。
【０００３】
- Nilsson J. and Olsson AG. Atherosclerosis 53: 77-82, (1984);
- Ward AC, et al. Biochem Biophys Res Commun 224: 10-6 (1994);
- Wilson NJ, et al. Biochem Biophys Res Commun 244: 475-80 (1998)].
- Giblett ER, et al. Lancet 2: 1067-9 (1972)
- Priebe T, et al. Cell Immunol 129: 321-8 (1990);
- Miller JS, et al. J Immunol 162: 7376-82 (1999);
- Hall TJ, et al. Clin Exp Immunol 54: 493-500 (1983);
- Trinchieri G. Annu Rev Immunol 13: 251-76 (1995);
- Link AA, et al. J Immunol 164: 436-42 (2000);
- Hasko G, et al. FASEB 14: 2065-74 (2000);
- Hasko G, et al. Eur J Pharmacol 358: 261-8 (1998);
＜発明の背景＞
ナチュラルキラー細胞(NK細胞)は、ある種の腫瘍細胞標的を迅速に溶解させる能力に基いてマウスで最初に同定された。これらの細胞は、末梢血リンパ球の小さいサブセットであり、全体のリンパ球集団の５から１６パーセントを構成し、そして免疫記憶を有さないリンパ球の別個のグループを形成し、そして適応免疫システムから独立した存在である。
【０００４】
NK細胞は、ヒトの健康および疾患に重要な様々な機能を媒介する。例えば、NK細胞が、悪性細胞に並びにウイルス、細菌、および原生生物に感染した細胞に対する重要な第一線の防御機構であることが見出されている。加えて、これらの細胞は、免疫調整、造血（haematopoiesis）、生殖（reproduction）および神経内分泌相互作用（neuroendocrine interactions）に参加している。NK細胞が多くのサイトカインの産生に影響するという発見により、NK細胞（Ｔ細胞と同様に）が適応免疫において異なる効果を有する別個の機能的なサブセットへと分化するとの示唆が導かれた。
【０００５】
＜発明の概要＞
本発明にしたがって、アデノシン A3 レセプターアゴニスト(A3RAg)が、ナチュラルキラー (NK)細胞を活性化すること、及びこの活性化がアデノシン A3 レセプターアンタゴニスト(A3RAn)の存在下で無効化（abolished）されることが見出された。
【０００６】
アデノシンは、ユビキタスなヌクレオシドであり、全ての体細胞に存在している。それは、代謝的に活性な細胞又はストレスを受けた細胞から放出され、そして次に制御分子として作用する。アデノシンは、特異的なA1、A2A、A2B および A3  Ｇ蛋白質関連細胞表面レセプターを介して細胞に結合し、このようにしてアデニリル・シクラーゼおよびホスホリパーゼC のレベルを制御することによりシグナル伝達分子として作用している[Linden J. The FASEB J5 : 2668-2676 (1991) ; Stiles G. L. Clin. Res. 38: 10-18 (1990)]。
【０００７】
第１側面に基づいて、本発明は、治療効果を達成するための薬学的組成物の調製のためのアデノシン A3 レセプターアゴニスト(A3RAg)の使用に関する（前記治療効果はNK細胞の活性化を含む）。
【０００８】
本明細書中で「アデノシン A3 レセプターアゴニスト」という用語は、アデノシン A3 レセプターに結合することが可能な任意の分子を意味しており、これにより完全に又は部分的に前記レセプターを活性化される。かかる分子の例を、以下に記載する。ここで課題としている完全アゴニスト（full agonist）は、研究された調製法において、そのレセプターの活性化により達成可能な最大の起こり得る反応（maximal possible response）を生じるアゴニストであると理解されるべきである、一方で部分アゴニスト（partial agonist）は、いかに高い濃度が適用されようとも、前記レセプターの最大活性化を発生することができないアゴニストとして理解されるべきである。
【０００９】
「効果的な量」（又は「に効果的な量」）は、当該技術分野において既知の知見に基づいて決定される。前記量は、検出可能な及び好ましくは治療上効果的なレベルでNK細胞の活性化を達成するのに効果的でなければならない。当業者は、とりわけ治療される疾患のタイプ及び重症度並びに治療様式（treatment regime）にしたがって前記効果的な量をいかに決定するかを知り得る。
【００１０】
「NKの活性化」という用語は、外来性（foreign）もしくは異常性（abnormal）及び望まれない（undesired）細胞に対するNK細胞の細胞傷害性の又は細胞増殖抑制性（cytostatic）の作用の活性化自体を、或いは望まれない（外来性もしくは異常性）細胞に対するプレ活性化（即ち、既に活性化している）NK細胞（pre-active NK cells）の細胞傷害性の又は細胞増殖抑制性の作用の上昇を、同様にサイトカイン産生刺激などの他の生物学的機能の上昇を意味している。
【００１１】
また、本発明は、NK細胞を活性化するための方法に関し、この活性化は前記細胞に効果的な量のアデノシン A3 レセプターアゴニスト (A3RAg)を供給することによって達成される。
【００１２】
更に、本発明は、治療処置（therapeutic treatment）のための方法を提供し、該方法は、必要とする個体に治療効果を達成するのに効果的な量のA3RAgを投与することを含み、前記治療効果が前記個体におけるNK細胞の活性化を含む方法である。
【００１３】
「治療」という用語は、疾患に関連する望まれない症状の改善（たとえ前記疾患が回復しなくとも）、例えば、痛みの軽減；発症前のかかる症状の出現（manifestation）の阻止（prevention）；症状の悪化（deterioration）を若しくは疾患の進行を遅延させる；重症度の減少（lessening）もしくは前記疾患の回復（cure）；自然の若しくは通常の治癒プロセスの促進；生存率の改善もしくは疾患に罹患した個体のより迅速な回復；疾患の発症の阻止、またはこれらの２以上の組み合わせを意味している。
【００１４】
本発明は、疾患の又は障害の治療のための方法に関する。該方法は、かかる治療を必要とする個体に活性化NK細胞を投与することを含み、前記NK細胞がNK細胞に効果的な量のA3RAgを接触させることにより事前に（a priori）活性化される方法である。典型的には、かかる方法は、NK細胞を前記個体（即ち、自己のNK細胞）から回収すること（withdrawing）と、かかる細胞を少なくとも１つの効果的な量のA3RAgに暴露することと、および前記活性化NK細胞を移植者（recipient）に導入することと、を含む（エクスビボ 活性化）。或いは、前記NK細胞は、提供者から回収されてもよい。かかる提供されたNK細胞は、プライムされた提供者において前記A3RAgで活性化後に回収されてもよく、または回収後であって且つ前記移植者個体への投与前にインビトロで活性化されてもよい。本発明の本側面は、免疫担当細胞をプライムされた提供者から非免疫の移植者へと、免疫性が移行することを意味する「養子移入（adoptive transfer）」の用語によっても知られている。
【００１５】
「事前の活性化（a priori activation）」の用語は、細胞もしくは組織培養又は動物モデルの何れかにおけるNK細胞の活性化を意味している。ここで各々の前記の細胞、組織または動物は、NK細胞の活性化に効果的な特定量のA3RAgで処理され、そして次にその中に前記活性化NK細胞を含有する細胞の又は組織の調製物は、前記培養物から又は前記動物から、それを必要とする非免疫個体へと投与するために取り出される。個体に投与される前記活性化NK細胞は、好ましくは自己細胞（しかし、それに限定されない）である。
【００１６】
なお更に本発明は、治療効果を達成するための薬学的組成物を提供し、該組成物は前記治療効果を達成するために効果的な量のA3RAgを含み、前記治療効果はNK細胞の活性化を含む。
【００１７】
本発明を理解し、そしてそれを実際にどのように実施するかを理解するために、好適な態様が以下に記載される。この態様は、限定されることのない実施例の様式で、本願に添付される図面を参照して記載される。
【００１８】
＜発明の詳細説明＞
以下の実施例に示されるように、C1-IB-MECA（A3RAg）は、インビトロ および インビボの双方において生物学的に有意なレベルでNK細胞を活性化することが見出された。NK細胞は多くの生物学的プロセス（悪性 および 感染性の疾患に対抗する防御、免疫調整、造血、生殖および神経内分泌相互作用）に係わっているので、この発見は明らかに治療的価値を有するものである。
【００１９】
本発明の一側面に基づき、本発明は、個体のナチュラルキラー (NK) 細胞を、該個体に効果的な量の１以上のA3RAgを投与することによって、活性化するための方法を提供する。
【００２０】
いくつかのアデノシン A3 レセプターアゴニストの特性とそれを調製する方法は、特にUS 5,688,774; US 5,773,423, US 5,573,772, US 5,443,836, US 6, 048,865, WO 95/02604, WO 99/20284およびWO 99/06053, WO 97/27173に、同様に当業者が容易に利用可能な他の文献に、詳細に記載されている。
【００２１】
本発明の一態様によると、前記A3RAgは、一般式 (I) の化合物であるか又は該化合物の生理学的に許容される塩である：
【化１６】
2004531523.tif 000002
【００２２】
この式中で、
R1は、アルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル若しくはシアノアルキル又は下記の一般式 (II) の基を表し、：
【化１７】
2004531523.tif 000003
【００２３】
この式中で：
Yは、酸素、硫黄または炭素原子を表し；
X1は、H、アルキル、RaRbNC (=O)-またはHORc-を表し、ここで、
RaおよびRbは、同一であっても異なっていてもよく、水素、アルキル、アミノ、ハロアルキル、アミノアルキル、BOC-アミノアルキル、およびシクロアルキルから選択されるか又は共に連結されて２〜５の炭素原子を含有する複素環を形成し；並びに
Rcは、アルキル、アミノ、ハロアルキル、アミノアルキル、BOC-アミノアルキル、およびシクロアルキルから選択され；
X2は、H、 ヒドロキシル、 アルキルアミノ、アルキルアミド又はヒドロキシアルキルであり；
X3およびX4は、独立に水素、 ヒドロキシル、 アミノ、 アミド、 アジド、 ハロ、アルキル、 アルコキシ、 カルボキシ、 ニトリロ、 ニトロ、 トリフルオロ、 アリール、 アルカリル、 チオ、 チオエステル、 チオエーテル、-OCOPh、-OC (=S) OPhを表すか、又はX3およびX4双方が＞ C=Sに連結して５員環を形成する酸素であり、或いはX2およびX3は、式(III)：
【化１８】
2004531523.tif 000004
【００２４】
の環を形成し、この式中R'およびR''は、独立にアルキル基を表し；
R2は、水素、 ハロ、アルキルエーテル、 アミノ、 ヒドラジド、 アルキルアミノ、 アルコキシ、 チオアルコキシ、 ピリジルチオ、 アルケニル; アルキニル、 チオ、およびアルキルチオから選択され；並びに
R3は、式-NR4R5の基であり、ここで、
R4は、水素原子またはアルキル、置換されたアルキル若しくはアリール-NH-C (Z)-から選択される基であり、ZはO、 S、若しくはNRaであり、Raは上記の定義を具備するものである；ここでR4が水素の場合、
R5は、R-及びS-1-フェニルエチル、 ベンジル、 フェニルエチル基（非置換であるか或いは１以上の位置がアルキル、 アミノ、 ハロ、 ハロアルキル、 ニトロ、 ヒドロキシル、 アセトアミド、 アルコキシ、 及びスルホン酸又はその塩から選択される置換基で置換される）；ベンゾジオキサンメチル、 フルリル、L-プロピルアラニル-アミノベンジル、β-アラニルアミノ-ベンジル、T-BOC-β-アラニルアミノベンジル、 フェニルアミノ、 カルバモイル、 フェノキシ又はシクロアルキル ;或いはR5は、次ぎの式：
【化１９】
2004531523.tif 000005
【００２５】
で表される基であるか、
或いはR4がアルキル又はアリール-NH-C (Z)-である場合、R5はヘテロアリールNRa-C (Z)-、 ヘテロアリールC (Z)-、 アルカリル-NRa-C (Z)-、 アルカリルC (Z)-、 アリール-NR-C (Z)- 及び アリール-C (Z)-（Zは酸素、 硫黄もしくはアミンを表す）からなる群から選択される。
【００２６】
より好ましくは、前記A3RAgは、一般式 (IV)：
【化２０】
2004531523.tif 000006
【００２７】
のヌクレオシド誘導体および前記化合物の生理学的に許容される塩である（式中のX1、 R2およびR4は上記で定義した）。
【００２８】
本発明の化合物の置換基の部分を形成する非環状の脂肪族基（例えば、アルキル、 アルケニル、 アルキニル、 アルコキシ、 アラルキル、 アルカリル、 アルキルアミンなど）は、分枝状の又は直鎖状の脂肪族鎖であり、好ましくは１若しくは２〜１２の炭素原子を含有するものである。
【００２９】
本発明で採用される前記化合物の「生理学的に許容される塩」に言及する場合、それは任意の無毒の、製薬産業において通常使用されるアルカリ金属、アルカリ土類金属、およびアンモニウムの塩を意味しており、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム  アンモニウムおよびプロタミン亜鉛の塩を含み、これらは当該技術分野において既知の方法により調製される。この用語は、無毒の酸付加塩（一般に本発明の化合物を適切な有機または無機の酸と反応させることにより調製される）をも含む用語である。
【００３０】
前記酸付加塩は、生物学的有用性および遊離塩基の性質特性（qualitative properties）を保持し、毒性がないものか又は他の点で望ましくないものではないものである。その例には、特に塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタリン酸などの無機酸に由来する酸が含まれる。有機酸には、特に酒石酸、酢酸、プロピオン酸、クエン酸、リンゴ酸、マロン酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、グリコール酸、グルコン酸、ピルビン酸、琥珀酸、サリチル酸およびp-トルエンスルホン酸（p-toluenesulphonic acids）などのアリールスルホン酸が含まれる。
【００３１】
本発明の一般式 (IV)にしたがって採用されるA3RAgの特定例には、N6-2- (4-アミノフェニル) エチルアデノシン (APNEA)、 N6- (4-アミノ-3-ヨードベンジル) アデノシン5'- (N-メチルウロンアミド) (AB-MECA)およびN6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N- メチルウロンアミド (IB-MECA) 並びに好ましくは 2-クロロ-N6-(2-ヨードベンジル)- アデノシン-5'-N-メチルウロンアミド (C1-IB-MECA)が含まれるが、それらに限定されない。
【００３２】
本発明は、治療処置のための方法をも提供する。該方法は、必要とする個体に効果的な量の作用物質（active agent）を治療効果を達成するために投与することを含み、前記治療効果がナチュラルキラー (NK) 細胞の活性化を含み、前記作用物質がアデノシン A3 レセプターアゴニスト(A3RAg)である方法である。
【００３３】
更に、本発明は、疾患（disease）または障害（disorder）を治療するための方法を提供する。該方法は、かかる治療を必要とする個体に特定量の活性化NK細胞を投与することを含み、前記NK細胞はNK細胞を活性化量のA3RAgと接触させることにより事前に活性化される方法である。一態様に基づくと、前記NK細胞は、同じ個体から回収される自己細胞であり、そして次にそれらは前記活性化を達成するために効果的な特定量のA3RAgと接触させることによりエクスビボで活性化され、そして次に前記個体に適切な非経口投与により再導入される。
【００３４】
或いは、前記NK細胞は、提供者から取得されてもよい。この取得は、前記A3RAgを前記提供者に前記細胞の回収前に十分な時間投与することによる、若しくは前記細胞を上記のように培養して活性化することによる、又はこれら両方によるインビボ活性化後に行われる。個体から比較的精製されたNK細胞集団を回収するための方法およびそれらを培養物中で処理する方法は、当該技術分野において既知であり、本明細書中で更に詳細に説明する必要はない。
【００３５】
前記A3RAgは、異なる様式で処方されてもよい。それは、それ自体を処方されてもよく又は薬学的に許容される塩へと転換されてもよい。それは、単独で又は薬学的に許容される担体、希釈剤、添加剤およびアジュバンド（一般的に薬学的に許容される賦形剤として本明細書中で言及される）と組み合わせて投与できる。
【００３６】
A3RAgをインビボ 治療のために個体に又は養子移入治療のために動物モデルに供給する場合、それは好ましくは経口デリバリ用に処方される。しかしながら、経静脈、皮下、筋肉内、髄内注射、動脈内、腹腔内および鼻内投与、同様に髄腔内（intrathecal）および輸液技術による投与を含む非経口投与などの他の投与方法もまた適切である。経口投与に関して、良好な経口の生体利用効率を有するA3RAgが好適に選択される。所望の治療効果を達成するのに良好な経口の生体利用効率で且つ良好な有効性でA3RAgに関してスクリーニングすることは、熟練した技術者が容易に到達できるルーチンの操作である。
【００３７】
経口的にA3RAgを投与する場合、それは錠剤、懸濁剤、液剤、乳剤、カプセル、粉剤、シロップ等に投与に関して好適に処方される。
【００３８】
非経口的にA3RAgを投与する場合、それは一般的に単位量（unit dosage）の注射可能な形態（液剤、懸濁剤、乳剤）に処方され、且つそれは無菌の水溶液もしくは分散剤および無菌の注射可能な溶剤もしくは分散剤に再構成するための無菌の粉剤を含む。
【００３９】
本明細書中に例示されるように、ヒトは実験動物よりも一般的に長く治療され、その治療はその疾患経過の長さ（the length of the disease process）に比例した長さを有している。服用量（doses）は、特定期間（例えば、数日）にわたる単回服用量（single doses）又は複数服用量（multiple doses）であってもよく、そして治療される個体の高さ（high）、体重、および性別などの身体的な特徴に依存する。一般的に、投与される服用量は、好ましくは単位量形態（unit dosage form）である。治療は、一般的に範囲（a length）を有しており、この範囲は、疾患経過及び作用物質有効性（active agent effectiveness）及び治療される患者種（patient species）の範囲（length）及びステージ（stage）に関して不確定（contingent）であってもよい。
【００４０】
従って、本発明は、治療効果を達成するための薬学的組成物をも提供し、該組成物は薬学的に許容される 賦形剤および前記治療効果を達成するために効果的な特定量の活性成分を含み、前記治療効果はNK細胞の活性化を含み、前記活性成分はA3RAgである。当業者によって認識されるように、本発明の組成物は、１つのA3RAgを又は２以上のA3RAgの組み合わせを含んでいてもよい。
【００４１】
「薬学的に許容される 賦形剤」の用語は、任意の不活性で無毒の物質を意味している。この物質は、A3RAgと反応しない。また、この物質は、希釈剤または担体として製剤に通常添加されるか、或いは前記製剤に形態又は粘度（consistency）を付与するために添加されて、それに特定の形態（例えば、単純なシロップ、芳香性の粉剤のような丸製剤態、および他の様々な形態）が付与される。前記賦形剤は、前記製剤に安定性（例えば、保存料）を提供するための又は前記製剤に食用芳香（edible flavor）などを提供するための物質であってもよい。
【００４２】
前記賦形剤は、従来から使用されている任意の賦形剤であればよく、A3RAgの溶解性およびA3RAgとの反応性の欠如などの物理化学的な考慮と投与経路とによってのみ限定される。賦形剤の選択は、採用される特定のA3RAgにより、同様に前記組成物を投与するために使用される特定の方法により部分的に決定される。従って、前記賦形剤は、添加剤、着色剤、希釈剤、緩衝化剤、崩壊剤、加湿剤（moistening agents）、保存料、香料添加剤、および薬学的に適合する担体を含んでいてもよい。加えて、前記賦形剤はアジュバンドであってもよく、これは定義から、予測可能な様式で前記活性成分（active ingredient）の作用に影響する物質である。
【００４３】
従って、経口投与に適切な薬学的組成物は、
(a)液状溶液（liquid solutions）であって、効果的な量のA3RAgが希釈剤（例えば、水、塩類溶液、天然果汁、アルコール、シロップなど）に溶解されたもの；
(b)カプセル剤〔例えば、通常のハード若しくはソフトシェルのゼラチンタイプであり、例えば、界面活性剤、潤滑剤（lubricants）、および不活性な増量剤（fillers）を含有している〕、錠剤、ロゼンジ〔ここで、A3RAgはスクロース及びアカシア又はトラガカントなどの風味剤（flavor）中に存在しているか、或いは前記A3RAgはゼラチン及びグリセリンなどの不活性の基剤中に存在している〕、及びトローチ剤であり、各々は規定量のA3RAgを固形（solids）もしくは顆粒（granules）の状態で含有している；
(c)粉剤；
(d)適切な液体中の懸濁剤；
(e)適切な乳剤；
(f)リポソーム製剤；並びに他の剤
から構成されていてもよい。
【００４４】
また、A3RAgは、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤として製造されてもよい。これらのエアロゾル製剤は、例えば、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素等の圧耐性の噴霧剤中に配置することが可能である。それらは、ネブライザー又はアトマイザーなどの非圧縮型の製剤として処方されてもよい。
【００４５】
更に、前記薬学的組成物は、非経口投与用に処方されてもよく、そして水性および非水性、等張性の無菌注射液（酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および前記製剤を意図される移植者の血液と等張にならしめる溶質を含有させることが可能）を含んでいてもよく、また水性および非水性の無菌懸濁剤（懸濁する薬剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存料を含む）を含んでいてもよい。鉱油（petroleum）、動物性、植物性、又は化学合成油などの油（Oils）、並びに脂肪性の（fatty）アルカリ金属、 アンモニウム、およびトリエタノールアミンの塩などの石鹸（soaps）、並びに適切な洗浄剤（detergents）を、非経口投与に使用してもよい。更に、注射部位の刺激を最小化する又は排除するために、前記組成物は１以上の非イオン性界面活性剤を含有していてもよい。
【００４６】
適切な 界面活性剤は、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモノオレアート）およびプロピレンオキシドをプロピレングリコールで縮合することにより形成される疎水性ベースを有するエチレンオキシドの高分子量の付加体（adducts）を含む。
【００４７】
前記非経口製剤は、単位服用量または複数服用量を封入したコンテナー（例えば、アンプルおよびバイアル）中に存在でき、そして注射の際に使用直前に無菌液状担体（例えば、水）の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。即時注射用の（Extemporaneous）溶液および懸濁剤は、以前に記載された種類の無菌の粉剤、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００４８】
これより本発明を以下の実施例で説明する。これらの実施例は、本発明を限定する目的ではなく、説明する目的で記載される。明らかに、これらの実施例に関して多くの修飾および変形が、上記の教示に照らして実施可能である。それゆえ、本発明は、以下に特に記載される様式以外にも、本願の特許請求の範囲の範囲内で、他の多くの実施可能な様式で実施できると理解されるべきである。
【実施例】
【００４９】
合成A3 アデノシン レセプターアゴニスト 2-クロロ-N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N-メチルウロンアミド (C1-IB-MECA)の効果を、NK細胞のインビトロ、エクスビボ及びインビボでの活性に関して試験した。
【００５０】
A3 アデノシン レセプターアンタゴニスト 9-クロロ-2- (2-フラニル)-5 [ (フェニルアセチル) アミノ] [1,2,4,]-トリアゾロ [1, 5-c] キナゾリン (MRS-1220)を、C1-IB-MECAのA3ARに対する特異的な結合を証明するために使用した。
【００５１】
全ての薬物は、RBI（Massachusetts、 USA）から入手した。ストック溶液を、5mgのC1-IB-MECA又はMRS 1220をジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解して調製した。更なる希釈は、RPMI中で行った。
【００５２】
マウスの脾細胞は、ICR マウス (Harlan Laboratories、 Jerusalem、 Israel)の脾臓に由来する。ヒト 単核球を、健常正常ボランティアのヘパリン処理した血液からフィコールハイパークグラジエントで分離した。
【００５３】
＜実施例１＞
ヒト 末梢血 NK細胞の活性におけるC1-IB-MECAの効果を、標的としてK562 白血病細胞を用いた標準的な4h 51Cr-放出アッセイによりアッセイした。ヒト 単核球を、96 ウェル丸底プレートで5x105 細胞/ウェルの濃度で培養し、そしてエフェクター(E) 細胞として使用した。この細胞を、1OnM  C1-IB-MECAで18 時間プレインキュベートし、次に前記アゴニストをウェルから洗浄除去し、そして細胞を10% FCSを含有しているRPMI中に再懸濁した。K562 細胞を標的(T)として使用し、そして100μciのNa2 [51Cr] O4で３７℃、１時間ラベルした。
【００５４】
余剰の51Crを除去するための多数回の洗浄操作後、標的細胞(1x104)を、RPMI中に再懸濁し、そしてエフェクター細胞とE: T比率を1: 50で200μ1の総容量中で混合した（トリプリケートアッセイ）。4 時間のインキュベーション（37℃、5% C02存在下）後に、プレートを遠心分離し、そして上清をガンマーカウンター (LKB)中でカウントした。
【００５５】
NK 細胞傷害性を次ぎの方程式を用いて計算した（CPM: counts per minute）：
2004531523.tif 000007
CPM自然発生およびCPM最大を、それぞれアッセイ培地中で又は1%トライトンの存在下で、Na2 [51Cr] O4の存在下の標的細胞の上清のCPMを測定することにより決定した。自然発生の放出は、この実験の全体を通して最大放出の10％以下であったことを記しておくべきであろう。
【００５６】
C1-IB-MECAとのプレインキュベーション後にナチュラルキラー細胞の活性の増加が観察された。A3 アデノシン レセプターアンタゴニスト MRS-1220の導入は、A3 アデノシン レセプターの特異的な活性化を呈するC1-IB-MECAによる刺激効果を無効化した(図1)。
【００５７】
＜実施例2＞
［薬物］
C1-IB-MECAをDMSO中に溶解し、そして次にインビボ 実験のためにPBS中に希釈物を調製した。
【００５８】
［エクスビボNK活性］
C1-IB-MECAによるインビボのNK細胞活性の誘導を調査するために、雄の２月齢、平均２０ｇｒ体重のICR マウス (Harlan Laboratories、 Jerusalem、 Israel)に、C1-IB-MECAを経口投与した。
【００５９】
処理マウスに由来する脾細胞を評価するために取り出し、そしてNK細胞活性をYAC リンパ腫 細胞を標的として用いた標準的な4h [51Cr]-放出アッセイにより試験した。より詳細には、脾細胞(1x106)を96 丸底ウェル プレート中で培養し、そして10% FBSを含有するRPMI中で再懸濁した。前記YACリンパ腫細胞を、100μciのNa2 [51Cr] O4で３７℃、１時間ラベルした。次に、2x104 細胞を再懸濁し、そしてエフェクター細胞をE: T比率を50: 1（200μlの容量中）で混合した。4hのインキュベーション（37℃、5% CO2存在下）後に、プレートを遠心分離にかけ、そして上清をガンマーカウンター (LKB)中でカウントした。NK 細胞傷害性を上記の方程式を用いて計算した。
【００６０】
最初に、C1-IB-MECAの用量依存性効果を、経口経路を介して様々な量の前記薬物 (10〜1000μg/Kg 体重)を前記マウスに投与することにより決定した。前記薬物で処理後48 時間に脾細胞を前記マウスから分離し、そして上記に記載のように51Cr アッセイを用いてＮＫ活性に関して試験した。図２に示したように、NK活性の用量依存性増強効果をC1-IB-MECAで誘導し、そして最大活性が10μg/kg 体重の服用量で観察された。
【００６１】
別の実験で、ＮＫ活性におけるC1-IB-MECA (10μg/kg 体重)の時間動態的効果（time kinetic effect）を調査した。この実験において、マウスを連続した４日間前記薬物で処理した。４個体（最後の処理の11および18日後）のマウスを殺傷し、そして脾臓を摘出した。脾細胞を分離し、そして上記のように5lCr アッセイを用いてＮＫ活性について試験した。加えて、IL-12 レベルを評価するために血清サンプルを集めた。各群は５個体のマウスを有し、試験は４回繰り返された。
【００６２】
結果は釣鐘型の応答を示し、最後のC1-IB-MECA 治療後の４日目にピークのNK細胞活性を呈し、１８日目にコントロールレベルに達した(図3)。サイトカイン IL-12のレベルの増加は、C1-IB-MECA処理マウスに由来する血清サンプルにおいて認められた(図4)。
【００６３】
＜実施例３＞
［腫瘍細胞］
B16-F10（メラノーマ細胞）およびHCT-116（ヒト 結腸カルシノーマ 細胞）を、この一連の実験に使用した。細胞を10%胎児ウシ血清 (FBS)を含有しているRPMI培地中で維持した。細胞を週に２回新規に調製した培地に移した。
【００６４】
このインビボ試験において、２月齢で平均体重が25grのC57B1/6J 雄マウス (Harlan Laboratories、 Jerusalem、 Israel)を人為的なメラノーマ肺転移マウスモデルとして使用した。この実験系では接種の15日後に転移性の肺病巣が発生する。C57B1/6J マウスは、静脈内に(i. v.) B-16 メラノーマ細胞(2.5x105)を接種され、そして10μg／kg 体重のC1-IB-MECA（腫瘍接種の次ぎの日に開始した）による経口投与で毎日処理された。コントロールとして、供試されたマウスはビヒクル単独で処理された。
【００６５】
15 日後、前記マウスを殺傷し、そして脾臓を取り出し、そして血清サンプルをIL-12レベルの評価するために集めた。各群は15 マウスを有していた、試験は３回繰り返された。
【００６６】
更に別の実験において、HCT-116 (1.2x106) 結腸カルシノーマ 細胞をNude/BalbC マウスのわき腹に皮下注射した。マウスを腫瘍接種後の次ぎの日から10μg/Kg 体重のC1-IB-MECAで毎日経口治療した。コントロールとして、供試マウスをビヒクル単独で処理した。腫瘍成長を腫瘍の幅（Ｗ）と長さ（Ｌ）とを測定することにより3〜4 日毎に評価した（腫瘍接種の13 日後に開始した）。各群は10 マウスを有し、試験は３回繰り返された。腫瘍サイズを次ぎの式にしたがって計算した。
【００６７】
2004531523.tif 000008
加えて、血清サンプルをIL-12 レベルの評価のために採取した。肺転移性病巣の発生および結腸カルシノーマ 腫瘍サイズにおいて著しい阻害が、C1-IB-MECA処理マウスで観察された（図5A、 5B）。
【００６８】
C1-IB-MECA処理マウスに由来する血清サンプルにおいて測定されたIL-12レベルは、双方の腫瘍保持モデルにおいて、コントロール群で得られたレベルよりも41％高かった（図5Cおよび5D）。また、NK細胞活性は、非処理マウスと比較してC1-IB-MECAで処理したメラノーマを又は結腸カルシノーマを保持するマウスに由来する脾細胞中で増加していた（(図5Eおよび5F)。
【００６９】
＜実施例4＞
［養子移入実験］
養子移入実験に関して、10 μg/kg 体重のC1-IB-MECAで処理したB16-F10 メラノーマ保持マウスに由来する脾細胞を「活性化」細胞と命名した。そしてコントロール 群に由来するものを「非活性化」脾細胞と命名した。メラノーマ細胞に対しインビボで作用する「活性化」脾細胞の能力を調査した。「非活性化」および「活性化」脾細胞（上記定義を参照のこと）を、B16-F10 メラノーマ細胞(2.5x105)を４日前に接種したマウスに移植した。しかしながら、B16-F10 メラノーマ細胞を接種したコントロール供試マウスは脾細胞を接種されなかった。
【００７０】
前記マウスを１５日目に殺傷し、肺を取り出した。肺メラノーマ病巣の数を解剖顕微鏡を用いて計数した。各群は10 マウスを有し、試験は３回繰り返された。
【００７１】
図6により示されるように、「活性化」脾細胞を移植したマウスは、「非活性化」脾細胞を移植されたマウスで又はコントロール群で発生した病巣数と比較して肺転移性病巣の発生が著しい阻害されていた。これらの結果は、C1-IB MECAがNK細胞を活性化したことを証明している。
【００７２】
［血清サンプルのIL-12分析］
IL-12 レベルを分析するため血清サンプルを取得し、そして市販のマウスELISAキット（ R & D systems、 Minneapolis MN）を用いてアッセイした。
【００７３】
［統計学的分析］
結果をチューデント t 検定を用いて統計学的に評価した。異なる実験の平均値間を比較する統計学的な分析を実行した。統計的有意性の判定基準をp ＜ 0.05とした。
【００７４】
＜考察＞
ここで示された結果は、A3ARアゴニスト（C1-IB-MECA）がIL-12 産生を誘導し、次にNK細胞の活性がインビボで上昇したことを示している。標的細胞とエクスビボでインキュベートした場合に、脾細胞（C1-IB-MECAで経口治療されたマウスから取得された）は、用量に及び時間に依存的なＮＫ活性の増加を呈した。メラノーマを又は結腸カルシノーマを保持するマウスをC1-IB-MECAで治療することにより、IL-12産生が誘導され、NK細胞活性が増加し、そして腫瘍発生が阻害された。加えて、C1-IB-MECA 処理メラノーマ保持マウスに由来する脾細胞（B 16-F 10 メラノーマ細胞を接種されたマウスに移植された）は、転移性の肺病巣の発生を阻止することが可能であった。
【００７５】
アデノシンは、免疫系に様々な効果を発揮する。その効果には、抗炎症活性、サイトカイン産生の調節、血小板凝集の阻害、エリスロポエチン産生の誘導、それゆえにリンパ球機能の変化（inflection） [Nilsson J. and Olsson AG. Atherosclerosis 53: 77-82, (1984); Ward AC, et al. Biochem Biophys Res Commun 224: 10-6 (1994);およびWilson NJ, Jaworowski A, Ward AC, Hamilton JA. cAMP enhances CSF-1-induced ERK Biochem Biophys Res Commun 244: 475-80 (1998)]が含まれる。アデノシンは、臨床上免疫系と関連しており、このことはSCID患者における観察から明らかとなった。前記患者は、酵素であるアデノシンデアミナーゼを欠失しており、それ故、アデノシンを分解することができない[Giblett ER, et al. Lancet 2: 1067-9 (1972)]。プリンヌクレオチドは、リンパ細胞に対する複数の効果を有することが報告されている[Priebe T, et al. Cell Immunol 129: 3218 (1990)]。ヒト NK細胞を細胞外プリンヌクレオチドとインキュベーションすることにより、増殖の用量依存的阻害を生じたが、腫瘍標的細胞を溶解（lyse）する能力には影響しなかった[Miller JS, et al. J Immunol 162: 7376-82 (1999)]。
【００７６】
ジブチリルcAMPまたはホルスクリン（forskulin；アデニリル・シクラーゼを活性化することにより細胞のcAMPレベルを上昇させる薬剤）は、特定の腫瘍標的細胞に対するNK細胞の細胞溶解活性を阻害することが可能であった[Hall TJ, et al. Clin Exp Immunol 54: 493-500 (1983)]。アデノシンレセプターアゴニストを使用して得られた結果は、マウスNK細胞活性を制御しているA1およびA2 レセプターが何らかの役割を担っていることを示唆している。
【００７７】
Priebe 等 (supra.)は、マウス脾臓 リンパ球において、NK細胞の活性がアデノシン レセプター A2アゴニストによって阻害されたが、これに反して強力なA1 レセプターアゴニストは効果的な刺激因子であることを報告した。
【００７８】
本明細書中に記載された結果は、特定のA3ARアゴニストの投与がインビボでNK細胞の活性化を生じることを示している。
【００７９】
IL-12は、NK細胞活性の誘導による及び腫瘍壊死因子の産生による、Ｔｈ１応答の及び細胞性免疫の中心的な誘導因子であることが知られているサイトカインである[Trinchieri G. Annu Rev Immunol 13: 251-76 (1995)]。以前の報告は、アデノシンのアナログが、IL12の産生を、活性化したヒト単核球によって、A2A レセプターの刺激および続くcAMPの増加を介して阻害したことを示している[Link AA, et al. J Immunol 164: 436-42 (2000)]。
【００８０】
Hasko 等 [Hasko G, et al. FASEB 14: 2065-74 (2000)]は、アデノシン レセプターアゴニストが、腹膜ＭＱにおけるIL-12の産生をGCS-21680 (A2ARアゴニスト) ＞ IB-MECA (A3ARアゴニスト) ＞ CCPA (A1ARアゴニスト)の順番の強度で阻害したことを示した。これらの結果は、A2 アデノシン レセプターが、アデノシンアゴニストによるIL-12 産生を阻害することに関して優位であることを示唆している。加えて、IB-MECAの効果が二相性であったこと、即ち、IL-12 産生の阻害が10μMで最大に達したが、一方で100μM IB-MECAがIL-12産生を増加したことが示されている[Hasko G. et al. supra.]。
【００８１】
他方、Hasko & Szaboの同じグループは、マウスへの致死用量の内毒素（リポポリサッカライド）に対する前治療としてのIB-MECAのIP 投与(500μg/kg)が、マウスの生存を改善したことを示した。LPS処理により血漿中に高レベルのIL-12が出現したが、IB-MECAによる前処理は血漿中のIL-12レベルを抑制した。IB-MECAのこの効果は、動物が前記薬物で前処理された際にのみ生じることは明白であり、そして治療後８時間まで観察されたことを記しておくべきである[Hasko G, et al. Eur J Pharmacol 358: 261-8 (1998)]。この試験において、C1-IB-MECAの低服用量の投与は、IL-12 産生を誘導し、引き続きＮＫ活性が誘導される。従って、A3ARアゴニストがIL-12 産生を誘導し、これによりC1-IB-MECA 抗腫瘍効果に作用するＮＫ活性を刺激すると結論される。
【００８２】
本明細書中に記載された結果は、A3ARアゴニスト(C1-IB-MECA)の低服用量の経口投与が、血清 IL-12レベルの増加を誘導し、続いてNK細胞活性の上昇および腫瘍成長阻害を生じることを示している。これらの結果は、前記レセプターの慢性活性化（chronic activation）が反対の効果を生じるだろうことを示しており、その後、それらは前記レセプターの急性活性化（acute activation）において観察されることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１はアデノシン A3 レセプターアゴニスト（C1- IB-MECA）のヒト 末梢血 NK細胞における治療効果を示す図である。
前記効果は、前記細胞を10 nM  C1-IB-MECAでインキュベーションした後に調査された。逆の効果が、アデノシン A3 レセプターアンタゴニスト(MRS 1220)の存在下で得られた。これらの効果は、標的細胞（K562 白血病細胞）の活性化NK細胞によるリシス（％リシス）のレベルにより決定された。
【図２】図２はマウスNK細胞の活性化における、様々な量(10〜1000μg/kg 体重)のC1-IB-MECAのマウスへの経口投与の効果を示す図である。前記効果は、Na2 [51Cr] O4でラベルされたYAC リンパ腫細胞からの51Cr放出のパーセント（総放出に対する）により決定された。
【図３】図３はNK細胞活性における、C1-IB-MECAの時間依存性の刺激効果を示す図である。
この実験は、マウスへのC1-IB-MECA (10μg/kg 体重)の連続した４日間の経口投与後に行われ、そして前記効果は5lCr放出のパーセント（総放出に対する）により決定された。
【図４】図４はC1-IB-MECA処理マウス (1Oμg/kg 体重)に由来する血清サンプルにおけるIL-12レベルを示す図である。
【図５】図５はメラノーマおよび結腸カルシノーマの発生におけるC1-IB-MECAの阻害効果を示す図である。
マウスのメラノーマおよび結腸カルシノーマの発生において、C1-IB-MECAの阻害効果が示された（図5A、 5B）。対応するメラノーマを又は結腸カルシノーマを保持するマウスにおいてIL-12 レベルが増加していた(それぞれ図5C、 5D)。また、NK細胞活性〔5lCr 放出のパーセント（総放出に対する）により決定された〕の増加が、非処理マウスと比べて、C1-IB-MECAで処理したメラノーマを又は結腸カルシノーマを保持するマウスに由来する脾臓で認められた（それぞれ図5E、 5F）。
【図６】図６は、B 16-F 10 メラノーマ保持マウス中で成長した腫瘍細胞における、移植されたC1-IB-MECA-「活性化」NK細胞の阻害効果を示す図である。
この効果は、「活性化」NK細胞のメラノーマ保持マウスへの移植後に発生した肺転移性病巣数により決定された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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