(57)【要約】Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Alaという配列を有するヒューマニン（HN）は、家族性アルツハイマー病に関連した変異遺伝子によって誘導される神経細胞死を抑制する分子に関するスクリーニングによって同定されたポリペプチドである。本出願は、一つもしくはそれ以上のD-アミノ酸もしくはリン酸化アミノ酸、または多量体を形成するアミノ酸を含む、ヒューマニン由来のポリペプチドを提供する。HN誘導体は、神経変性疾患に付随する細胞障害性から神経細胞を保護するために有用である。有効性がより高く、したがって有効量がより少ないことによって、HN誘導体は、天然型HNよりも良好な治療剤となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのD-アミノ酸またはリン酸化アミノ酸を含む、神経細胞を細胞障害性から保護するヒューマニンの誘導体。
【請求項２】
D-アミノ酸の位置がヒューマニンの14Serの位置に対応する、請求項1記載の誘導体。
【請求項３】
D-アミノ酸がD-セリンである、請求項1記載の誘導体。
【請求項４】
D-アミノ酸がD-プロリンである、請求項1記載の誘導体。
【請求項５】
多量体を形成する活性を有する一つまたは複数のアミノ酸が付加された、神経細胞を細胞障害性から保護するヒューマニンの誘導体。
【請求項６】
互いと結合する活性を有する一つまたは複数のアミノ酸を含む、請求項5記載の誘導体。
【請求項７】
アミノ酸配列がEFLIVIKSまたはEFLIVKSを含む、請求項6記載の誘導体。
【請求項８】
以下に定義されるポリペプチドからなる群より選択される、請求項1または5記載の誘導体：「S14Pを有するHN」、「（D-Ser14）HN」、「（D-Ser7）HN」、「（D-Ser7/14）HN」、「AGA-（D-Ser14）HN」、「AGA-（D-Ser14）HN17」、「EFLIVIKS-HNG」、「EFLIVIKS-HNG-KKK」、「EFLIVIKS-（S7A）HN」、「EFLIVIKS-AGA-HNG」、およびそのキメラ混合体。
【請求項９】
請求項1または5記載の誘導体をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項1または5記載の誘導体を細胞に接触させる段階を含む、神経細胞を細胞障害性から保護する方法。
【請求項１１】
請求項1または5記載の誘導体および一つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項1または5記載の誘導体を個体に投与する段階を含む、神経変性障害を有するまたは有することが疑われる個体を治療する方法。
【請求項１３】
障害がアルツハイマー病である、請求項12記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権に関する情報
本出願は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、2002年5月16日に提出された米国特許仮出願第60/380,958号からの優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、新規ポリペプチド、および、神経保護のため、例えばアルツハイマー病のような神経変性障害を治療するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
アルツハイマー病（AD）は、進行性の痴呆に関連する最も発生率の高い神経変性疾患である。この疾患に関する根本的な治療はこれまでのところ開発されていない。脳の萎縮がADにおける中心的な異常であるが、ADに対する将来的な治癒的治療を確立するためには、神経の喪失に至る病理メカニズムを理解しなければならない。
【０００４】
三つの変異遺伝子（アミロイド前駆体タンパク質変異体、プレセニリン（PS）1変異体、およびPS2変異体）が、早期発症型家族性AD（FAD）を引き起こすことが知られている：[1]。試験された全てのFAD変異体は、神経細胞において発現されると、細胞障害性を引き起こす、または増強する。したがって、細胞障害性を抑制する分子は、ADおよび他の神経変性疾患を治療するために有用となる可能性がある。
【０００５】
Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala（配列番号：1）という配列を有するヒューマニン（Humanin；HN）は、変異FAD遺伝子によって誘導された神経細胞死を抑制する分子に関するスクリーニングによって同定されたポリペプチドである。HNは、神経細胞を細胞死に対して保護することが示されている。HNのSer14がGlyに置換されているHN誘導体（S14Gとして示す）は、HNの細胞死抑制機能を顕著に増強する。HNは、低いμMレベルで十分な神経保護を示すが、（S14G）HN（「HNG」（配列番号：2）とも略称される）も同様に、低いnM濃度で神経保護を示す。
【発明の開示】
【０００６】
発明の開示
本発明は、野生型の24残基ヒューマニン（HN）ポリペプチドにおいて特定の改変を作製することによって、HNより有意に高い神経保護活性を有しうるHN誘導体を得ることができるという発見に、少なくとも一部基づいている。これらのHN誘導体は、HNのD-異性体およびHNの多量体、例えば二量体がより高い神経保護活性を有するという認識に基づいている。これらの発見に基づき、本発明は、新規HN誘導体、およびアルツハイマー病のような神経変性障害の細胞障害作用に対して神経細胞を保護するためにそれらを用いる方法を提供する。
【０００７】
一般的に、一つの態様において、本発明は、例えばヒューマニンのSer14の位置に少なくとも一つのD-アミノ酸を含む、神経細胞を細胞障害性から保護する精製HN誘導体を特徴とする。例えば、D-アミノ酸は、D-セリンまたはD-プロリンとなりうる。
【０００８】
もう一つの態様において、本発明には、多量体を形成することができる、例えば互いと結合することができる一つまたは複数のアミノ酸を含む、神経細胞を細胞障害性から保護するHN誘導体が含まれる。例えば、アミノ酸の配列は、EFLIVIKS（配列番号：20）またはEFLIVKS（配列番号：24）となりうる。
【０００９】
本明細書において用いられるように、「ヒューマニン誘導体」とは、真正のヒューマニンポリペプチド（配列番号：1）において一つまたは複数のアミノ酸が改変されたポリペプチドを意味する。HN誘導体は、以下のポリペプチドからなる群より選択されうる：S14Pを有するヒューマニン（配列番号：4）、P-S7 HN（配列番号：5）、P-S7/14 HN（配列番号：6）、（D-ser14）HN（配列番号：7）、（D-Ser7）HN（配列番号：8）、（D-Ser7/14）HN（配列番号：9）、AGA-（D-Ser14）HN（配列番号：10）、AGA-（D-Ser14）HN17（配列番号：11）、EFLIVIKS-HNG（配列番号：19）、EFLIVIKS-HNA（配列番号：18）、EFLIVIKS-HN（配列番号：17）、EFLIVIKS-HNG-KKK（配列番号：16）、EFLIVIKS-(S7A)HN（配列番号：15）、およびEFLIVIKS-AGA-HNG（配列番号：22）、ならびにそのキメラ混合体。本明細書において用いられる「S14P」という用語は、野生型HNにおける14位のS（セリン）がP（プロリン）に置換されていることを意味する。同じ変換が他の置換（例えば、S7A）にも当てはまる。「（D-Ser7）」とは、7位のセリンが通常のL-異性体からD-異性体にスイッチ（ラセミ化）されていることを意味する。「AGA-HN」とは、アミノ酸Arg4およびPhe6がアラニンに置換されてR4A/F6A-HNを形成しているHN誘導体の略称である（これは、HN誘導体の4位、5位および6位におけるAGAトリプレットから命名された）。「HN17」とは、Pro3からPro19までのアミノ酸17個を含む切断型HNである。
【００１０】
他の局面において、本発明には、新規HN誘導体をコードする核酸および新規HN誘導体の有効量に細胞を接触させることによって、神経細胞を細胞障害性から保護する方法が含まれる。本発明にはさらに、誘導体および一つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物が含まれる。もう一つの局面において、本発明は、障害を治療するために有効な新規HN誘導体の量を個体に投与することによって、神経変性障害を有するまたは有することが疑われる個体を治療する方法を特徴とする。例えば、障害はアルツハイマー病でありうる。
【００１１】
本明細書において用いられる「タンパク質」および「ポリペプチド」とはいずれも、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）によらない、アミノ酸残基の任意の鎖を意味する。修飾にはまた、アセチル化；アシル化；ADPリボシル化；アミド化；フラビン、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、脂質、脂質誘導体またはホスファチジルイノシトール等との共有結合；クロスリンク形成；環状化；ジスルフィド結合形成；脱メチル化；ピログルタミル化；γ-カルボキシル化；ヒドロキシル化；ヨード化；メチル化；ミリストイル化；酸化；ユビキチン化等が含まれる。本発明において有用なHN誘導体は、「精製された」または「実質的に純粋」であると呼ばれ、これはポリペプチドを含む組成物が、関心対象のポリペプチド、例えばHN誘導体の少なくとも60重量（乾燥重量）％であることを意味する。好ましくはポリペプチド組成物は、関心対象のポリペプチドの少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも90重量％、および最も好ましくは少なくとも99重量％である。純度は、任意の適当な標準的な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析によって測定することができる。
【００１２】
HN誘導体組成物の有効量とは、神経変性障害の症状において測定可能な減少を提供する量である。
【００１３】
参照配列に対する同一性が100％未満であるポリペプチド配列の場合、同一でない位置とは、参照配列に対する保存的置換または非必須アミノ酸の置換となりうる。「非必須」アミノ酸残基とは、神経保護活性を消失または実質的に変化させることなく、HNの野生型配列（例えば、配列番号：1の配列）から改変されうる残基である。一方、「必須」アミノ酸残基ではそのような変化が起こる。
【００１４】
特記しない限り、本明細書における全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書に記述の方法および材料と類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適した方法および材料を下記に記述する。本明細書において言及した全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、説明するために提供され、制限的に解釈されるべきではない。
【００１５】
HN誘導体は、神経変性疾患に関連した細胞障害から神経細胞を保護するために有用である。有効性がより高くしたがって有効量がより低いことから、HN誘導体は、天然型HNよりも良好な治療剤となる。ペプチドの有効量がより低いことにより、HN誘導体に付随しうる毒性または副作用を最小限にすることができる。同様に、有効量がより低いことによって、これらのペプチドの製造（例えば、遺伝子操作または化学合成）および精製は、経済性といった観点からより現実的になる。さらに、HN誘導体は、神経変性疾患の病理メカニズムを調べるためおよびより多くの薬物を開発するための有効なツールを、製薬企業に提供する。
【００１６】
本発明の他の特徴および長所は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００１７】
発明の詳細な説明
アルツハイマー病のような神経変性障害を治療する必要がある。これらの疾患に対する有用な治療法を確立する一つの方法は、神経細胞死の発生を制御することである[2〜18]。本発明は、神経保護剤として役立つ新規HN誘導体ポリペプチド、ならびにアルツハイマー病のような神経変性障害が診断された後、およびそのような障害を発症するリスクを有すると考えられる患者の予防物質としてこれらの障害の発病前に、神経変性障害を治療するためにそれらを利用することに関する。
【００１８】
新規HN誘導体は野生型HNのアミノ酸配列に基づくが、誘導体のそれぞれは、天然に存在するHNポリペプチドと比較してHN誘導体の神経保護剤活性を有意に増加させる付加アミノ酸および／または置換アミノ酸を有する。新規HN誘導体を下記に記述すると共に、誘導体ポリペプチド、ならびにHN誘導体を含む薬学的組成物および製剤を作製する方法を記述する。
【００１９】
神経保護作用を有するヒューマニン誘導体
神経保護作用を有するHN誘導体は、野生型HNと類似であるが、当初の野生型HNと比較して有意に改善された神経保護剤活性を有する新規ポリペプチドを作製するためにHN配列（配列番号：1）において様々なアミノ酸が付加または置換されているポリペプチドである。
【００２０】
新規HN誘導体は、長さがアミノ酸少なくとも約17〜約32個、例えば、12、14、16、17、18、20、22、24、26、28、30、または32個であり、野生型HNポリペプチドの二つの主なクラスの改変の一つまたは双方を含む。
【００２１】
第一の改変は、野生型HNのアミノ酸24個のうち一つのD-ラセミ化である。例えば、Ser14またはSer7アミノ酸またはその双方を、L-異性体からD-異性体に変換することができる。
【００２２】
第二の改変は、野生型HNと比較してHN誘導体の多量体形成、例えば二量体形成を促進する。例えば、二量体形成は、EFLIVIKSまたはEFLIVKSのような多量体形成ペプチドをHNポリペプチドに付加することによって増強することができる。
【００２３】
他の改変も同様に可能であり、二つの主要な改変の一つまたは複数と組み合わせることができる。例えば、特定のHN誘導体において、Arg4およびPhe6アミノ酸を、アラニンに置換して、R4A/F6A、または省略形でAGA-HNを形成することができる。さらに、Ser14をグリシンに置換して、省略形でHNGとも呼ばれるS14G HNを形成することができ、またはプロリンに置換して省略形でHNPとも呼ばれるS14Pを形成することができる。他の態様において、Ser7を例えばアラニンによって置換してS7A HNを形成する。
【００２４】
単一のHN誘導体におけるこれらの改変の任意の二つまたはそれ以上の組み合わせも同様に可能である。
【００２５】
表1は、HNおよびそれぞれがHN誘導体内での改変の一つまたは複数を具体化する様々な代表的なHN誘導体を示す。
【００２６】
（表１）ヒューマニン（HN）誘導体
2006503553.tif 000002
注：天然に存在するHNに存在しないアミノ酸残基を太字で示す。「p-S」は、リン酸化L-Serを表す。
【００２７】
本発明は、HNにおける7位および14位でのセリン残基がHNの活性調節において本質的な役割を果たすことを示している。Ser14残基が果たす特定の役割は、D-ラセミ化によるHN活性の調節である。L-Ser14残基をD-Serに置換すると、HNの細胞保護作用は著しく増強された。この有効性はHNG、すなわちS14G置換を有するHNと同等であった。このように、S14G置換は、Ser14のD-ラセミ化を模倣する可能性が最も高く、低いμMレベルで有効である真正HNは前駆体型であり、これはSer14ラセミ化によってさらに活性化されて低いnMレベルで有効となる可能性が最も高い。そのような変換は単なる物理的プロセスに過ぎない可能性があるが、この変換はL-SerからD-Serへの変換酵素であるセリンラセマーゼによって媒介されるという別の可能性もある。HNのL-Ser14をD-Serに変換する酵素の存在を調べる価値があり、酵素の局在および調節を決定すれば、HNペプチドの外からの投与以外の方法によってHNを活性化する方法の理解に有意に貢献するであろうことから、もし存在すれば、酵素を同定することは価値がある。ごく最近、Woloskerら[34]は、グリア細胞において遊離のL-SerをD-Serに変換する最初の哺乳類セリンラセマーゼを同定してクローニングした。
【００２８】
Ser7残基は、Ser14とは異なる役割を有する。S7A置換は、HNの作用を無効にしたが、Ser7ラセミ化は影響を受けなかった。S7A置換によるHN作用の喪失は、EFLIVIKSとの融合体によって回収され、Ser7がEFLIVIKS融合体と類似の役割を果たすことを示唆する。EFLIVIKSまたはEFLIVKSが二量体を形成する確立されたアミノ酸配列であること[32、33]、およびEFLIVIKS単独では細胞保護作用を有しなかったという事実を考慮すると、Ser7は、HNが自己二量体形成を行うために必須であり、HNの自己二量体形成がHNの作用にとって必須である可能性が最も高い。実際に、異なるようにタグを付けた二種類のHNおよびHN誘導体を用いた沈殿実験から、HNが自己二量体を形成することができ、S7A置換はその自己二量体形成活性を喪失させることが判明した。この実験はまた、EF-（S7A）HNがEFLIVIKS領域を通して自己二量体を形成するという証拠を提供する。EFLIVIKSの融合が（S7A）HNにEFLIVIKS融合HNと同程度に強力な細胞保護を発揮させるという知見から、（S7A）HNは、単に自己二量体を形成できないために細胞保護を発揮できないことが示される。反対に、培養培地におけるHN、HNG、または（S7A）HNの見かけの安定性は、EFLIVIKSとの融合によってほとんどまたはごくわずかしか影響を受けなかったことから[培養培地において10 μMペプチドの72時間インキュベーションによって、HN、HNG、または（S7A）HNの量はゼロ時間でその量の約2/3となったが、EF-HN、EP-HNG、またはEF-（S7A）HNの量は実質的に不変であった（データは示していない）]、（S7A）HNおよびHNの作用のEFLIVIKS融合による増強が、二量体形成を通して、または通さずにこれらのペプチドの安定性の増加の原因であった可能性は低い。このレベルの安定性の変化は、EFLIVIKSとの融合による救出作用の劇的な増強を説明することができなかった。
【００２９】
EFLIVIKSの融合が二量体形成のタグとして機能することを支持する多数の証拠が他にもある。第一に、HNG-KKKから類似の知見が得られた。HNG-KKKは作用を示さなかったが、EF-HNG-KKKは、強力な細胞保護を示した。この場合、EF-HNG-KKKはEF-HNGより約10倍活性が弱かった。したがって、C末端のKKK置換はHNGの二量体形成活性を弱めること、N末端のEFLIVIKSの融合がこの負の作用に拮抗すること、およびN末端のEFLIVIKSによる二量体形成に及ぼす刺激作用とC末端のKKKKによる阻害作用とのバランスによって、EF-HNG-KKKの作用の有効性がHNGより低くなったと考えられる。第二に、単離されたEFLIVIKSペプチドは、EF-（S7A）HNおよびEF-HNG-KKKの神経保護機能を選択的に遮断したが、EF-HNまたはEF-HNGの機能は遮断せず、EF-（S7A）HNおよびEF-HNG-KKKによる神経保護は、融合したEFLIVIKSの二量体形成を通して得られるという強い証拠を提供する。第三に、過剰量のHNG-KKKは、HN-HN相互作用を置換することができなかったが、同じ濃度のHNGは置換することができた。これは、HNG-KKKがHNと複合体を形成する活性をほとんど有しないという明確な証拠を提供する。最後に、EFLIVIKSの融合は、（C8A）HNに対して影響を及ぼさなかった。このことは、EFLIVIKS融合による機能的増強は、融合HNペプチドに対する物理的作用が原因でないことを示している。
【００３０】
EFLIVIKS融合が（C8A）HNの作用を増強できなかったという知見は、HNにおいて異なる二種類の無効変異体が存在することを示唆している：一つは（S7A）HNまたはHNG-KKKであり、その作用はEFLIVIKS融合体によって回復し、もう一つは（C8A）HNであり、その作用はこの技法によっては回復しない。このように、（C8A）HNが受容体非結合変異体であることが示されているという事実を考慮すると[14]、細胞保護作用を発揮するためにHNにとって少なくとも二つの異なる段階が存在する可能性が最も高い：一つは二量体形成（またはオリゴマー形成）であり、もう一つは、推定の受容体に対するHNの結合を含む二量体形成後プロセスである。したがって、推定のHN受容体がHN結合に反応して二量体形成またはオリゴマー形成を受ける可能性があると考えられる。HNの作用は、特定のチロシンキナーゼ系[14]によって媒介されることから、この考え方は、チロシンキナーゼ誘発増殖因子およびサイトカインが、二量体形成によってこの作用を発揮するという十分に確立された事実と一致し、これは受容体の二量体形成またはオリゴマー形成にとって必須である。
【００３１】
このように、本発明は、それぞれが独自の方法でHNの救出機能の増強に関与する、二つのセリン残基の異なる本質的な役割を発見した。一つはSer14のラセミ化であり、もう一つは、Ser7が関与する二量体形成である。これらの知見は、先に考察したようにHNの作用メカニズムに新しい洞察を提供するが、それらはまた、より強力なHN誘導体を形成するために有効であった。例えば、本明細書においてAGA-HNGと省略される（R4A/F6A）HNGは、非常に強力な細胞保護を発揮する：10〜30 pMでは半分の保護、および100〜300 pMでは完全な保護。Ser14の特定の役割を考慮して、本発明者らはD-Ser14を有する（R4A/F6A）HNの影響を調べ、このペプチドがS14Gを有する（R4A/F6A）HN（AGA-HNG）と類似の効力および有効性で細胞保護を発揮することを発見したが、この場合もS14G置換がSer14ラセミ化を模倣するという考え方と一致する。本発明者らはまた、EFLIVIKS融合AGA-HNGがAGA-HNGよりさらに強力であることを発見し、この場合も、EFLIVIKS融合体およびS14G置換が、異なるメカニズムでHNの作用を増強することを示唆している。用いた神経毒性Aβ濃度の1/2500000の濃度である10 pMで十分に細胞保護を示すEFLIVIKS融合AGA-HNGは、同定された中で最も強力なHN誘導体である。これらのペプチドは、AD関連障害からHNが神経細胞をどのように保護するかに関する理解のみならず、臨床的に有用なHN誘導体の開発に有意に貢献すると考えられる。
【００３２】
本発明には、本発明の核酸によってコードされる、またはコードされるポリペプチドと実質的に同一である配列を有するポリペプチド（例えば、配列番号：4、5、6、7、8、9、10、11、15、16、17、18、19、または22のいずれかによってコードされるポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチド）であるHN誘導体が含まれる。核酸はDNAまたはRNAであってもよい。核酸配列は、例えば哺乳類、他の真核生物、または原核生物の遺伝子コードに従ってアミノ酸配列から推定することができる。HNポリペプチドをコードする核酸配列は、5'-atg gct cca cga ggg ttc agc tgt ctc tta ctt tta acc agt gaa att gac ctg ccc gtg aag agg cgg gca-3' （配列番号：26）であってもよい。
【００３３】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、長さまたは翻訳後改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）によらず、アミノ酸の任意の鎖を記述するために本明細書において互換的に用いられる。このように、「HNポリペプチド」または「HN誘導体」という用語には、本明細書に記述の野生型HNの改変の一つまたは複数を含む組換えまたは合成によって産生されたHN誘導体ポリペプチドが含まれる。この用語はまた、付加されたアミノ末端のメチオニン（原核細胞において発現するために有用である）を有するポリペプチドを含む。
【００３４】
本明細書に記述の新規HN誘導体は、任意の核酸分子によってコードされることができ、野生型HNと少なくとも同じ、好ましくはそれより大きい神経保護活性を有する、生物活性変異体、切断型および融合ポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドは、抗体の産生、本発明の核酸またはHN誘導体の活性または発現を調節することができる他の細胞遺伝子産物または化合物の同定のため、および神経変性障害に関連した細胞障害性を治療、阻害、または予防するために有用な薬剤としての用途を含むがこれらに限定されない多様な用途のために調製することができる。
【００３５】
いくつかの態様において、多量体形成ペプチドのような非HN誘導体をHN誘導体のN末端またはC末端に融合させることができる。得られた融合ポリペプチドも同様にHN誘導体であり、リガンドに対して高い親和性を有する部分が含まれうる。例えば、融合タンパク質は、HN誘導体配列をGST配列のC末端に融合させたGST-HN誘導体となりうる。そのような融合体タンパク質は、組換え型HN誘導体の精製を促進することができる。または、融合タンパク質は、そのN末端で異種シグナル配列を含むHN誘導体となりうる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳類宿主細胞）において、HN誘導体の分泌は、異種シグナル配列を用いることによって増加させることができる。
【００３６】
融合タンパク質にはまた、血清タンパク質の全てまたは一部、例えばIgG定常領域またはヒト血清アルブミンが含まれうる。本発明のHN誘導体融合ポリペプチドを薬学的組成物に組み入れて、これをインビボで被験者に投与することができる。HN誘導体融合タンパク質を用いて、HN誘導体基質のバイオアベイラビリティに影響を及ぼすことができる。
【００３７】
既に融合部分（例えば、EFLIVIKSのような多量体形成ペプチドまたはGSTポリペプチド）をコードする発現ベクターが市販されている。HN誘導体をコードする核酸を、融合部分がHN誘導体とフレームが一致して連結するように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００３８】
HN誘導体は、無傷のシグナル配列を含むポリペプチドを含む実質的に純粋なポリペプチド、および分泌型ポリペプチドとなりうる。特に好ましいのは、通常の生理的条件で可溶性であるHN誘導体である。
【００３９】
本発明はまた、本明細書において命名した特定のHN誘導体と機能的に同等であるHN誘導体を含む。本発明のHN誘導体は、それらが、動物のような生物系において、本明細書において特に命名したHN誘導体と同じ神経保護活性を有するという点において、特に命名したHN誘導体と同等である。これらのさらなるHN誘導体は、本発明のHN誘導体の少なくとも60％を有し、70％、75％、80％、85％、90％またはそれ以上を有しうり（表1）、かつ野生型HNと少なくとも同じ神経保護活性を有する。参照配列、例えばHN（配列番号：1）より長さが長いまたは同等であるポリヌクレオチドの場合、比較は、参照配列の完全長に関して行う。ポリヌクレオチドが参照配列より短い場合、例えば配列番号：1より短い場合、比較は同じ長さの参照配列のセグメントについて行う。神経保護活性に関する比較は、一般的にポリペプチドの等しい濃度が用いられ比較される生物活性アッセイ法に基づく。
【００４０】
機能的に同等のHN誘導体は、例えばそれらが本明細書に記述の二つの主要なクラスの改変からの一つまたは複数の改変を含む限り、付加または置換されたアミノ酸残基を含む誘導体となりうる。置換は、関係する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性特徴における類似性に基づいて行ってもよい。例えば、機能的に同等なHN誘導体は、一つまたは二つの非必須アミノ酸が置換または除去されている、例えば保存的アミノ酸置換によって置換されている誘導体である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。このように、HNポリペプチドにおいて予想される非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからのもう一つのアミノ酸残基に置換することができる。
【００４１】
変異されるアミノ酸残基の数に特に制限はないが、アミノ酸配列において置換、欠失、および／または挿入によって変異される残基の数は、一般的に15残基またはそれ未満、好ましくは12残基またはそれ未満、より好ましくは10残基またはそれ未満、およびさらにより好ましくは8残基またはそれ未満（例えば5残基またはそれ未満）であると考えられる。神経保護活性が維持される限り、付加されるアミノ酸の数に制限はない。人工的に産生されたアミノ酸配列および天然に存在するポリペプチド配列は、アミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されているアミノ酸配列に含まれる。
【００４２】
HNG17（3PRGFSCLLLLTGEIDLP19）のアラニン走査実験から、Pro3、Cys8、Leu9、Leu12、Thr13、Ser14、またはPro19のいずれかによるアラニンの置換によって、四つのFAD遺伝子のみならずAβ1-43に対して10 nMで保護を示さないペプチドが得られたが、Ser7を含む他の任意の残基によるアラニンの置換は、10 nMでのHNG17の細胞保護作用に影響を及ぼさないことが判明した（国際公開公報第01/21787号）。この知見から、HN誘導体におけるアミノ酸7個（HN17のPro3、Cys8、Leu9、Leu12、Thr13、Ser14、およびPro19の対応するアミノ酸）が、神経保護にとって極めて重要であることが明らかとなる。したがって、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを、必須のアミノ酸以外の残基の置換、欠失、および／または挿入のような改変によって調製することができる。
【００４３】
さらにより重要なことは、活性にとって必須のアミノ酸であると先に記述したアミノ酸7個でさえも同様に、他のアミノ酸に置換してもよい点である。例えば、ポリペプチドは、HNG17の12位のグリシンがセリン（HN-17である）である場合においても神経保護活性を保持する。さらに、7位のロイシンに対応する位置がアルギニンに置換されている合成ポリペプチドは、HNと類似の神経保護活性を示した（国際公開公報第01/21787号）。さらに、HNG-17の6位に対応するCysの代わりにHis、Arg、またはLysのような塩基性アミノ酸を有するHNG誘導体は、神経保護活性を示す。これらの事実に従って、これらのポリペプチドの活性にとって必須でないおよび／または必須であるアミノ酸を変異させることによって、ポリペプチドと同等またはより高い神経細胞死抑制活性を有するポリペプチドの調製が期待される。
【００４４】
本発明のHN誘導体には、神経細胞を細胞障害性から保護して、式（I）からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる：
Pro-Xn1-(Cys/bXaa)-(Leu/Arg)-Xn2-Leu-Thr-(Gly/Ser)*-Xn3-Pro  （I）
（式中、「Cys/bXaa」は、システインまたは塩基性アミノ酸を示し、「（Leu/Arg）」は、ロイシンまたはアルギニンを示し、「（Gly/Ser）」は、グリシンまたはセリンを示し、かつXn1、Xn2、およびXn3は、独立してそれぞれ、10残基を超えない任意のアミノ酸を示す）。式（I）において星印で示すアミノ酸の位置は、ヒューマニンの14Serの位置に対応する。本発明のHN誘導体には、式（I）のアミノ酸配列において、好ましくは星印で示す位置で少なくとも一つのD-アミノ酸または一つのリン酸化アミノ酸が含まれてもよい。または、本発明のHN誘導体には、式（I）のアミノ酸配列の他に、多量体を形成する活性を有する一つまたは複数のアミノ酸が含まれる。上記のようなアミノ酸配列を有するポリペプチドは、以下のように表記してもよい：
Pro-(Xaa)1-10-(Cys/bXaa)-(Leu/Arg)-(Xaa)1-10-Leu-Thr-(Gly/Ser)*-(Xaa)1-10-Pro （II）
（式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し；「（Xaa）m-n」は、任意のアミノ酸のm〜n個の残基を示し、「bXaa」は、塩基性アミノ酸を示し、「（Cys/bXaa）」は、システインまたは塩基性アミノ酸を示し、「（Leu/Arg）」は、ロイシンまたはアルギニンを示し、および「（Gly/Ser）」はグリシンまたはセリンを示す）。
【００４５】
塩基性アミノ酸は、そのR基（側鎖）がpH 7.0で陽性荷電であるアミノ酸を指す。中性アミノ酸の例には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。塩基性アミノ酸としてアルギニン、リジン、またはヒスチジンを有する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば以下のように表すことができる：
Pro-Xn1-(Cys/Arg/Lys/His)-(Leu/Arg)-Xn2-Leu-Thr-(Gly/Ser)*-Xn3-Pro    (III)
（式中、「（Cys/Arg/Kys/His）」は、システイン、アルギニン、リジン、またはヒスリジンを意味し、「（Leu/Arg）」は、ロイシンまたはアルギニンを意味し、「（Gly/Ser）」は、グリシンまたはセリンを意味し、およびXn1、Xn2、およびXn3は、独立してそれぞれ、10残基を超えない任意のアミノ酸を示す）。本明細書において、アルギニンおよびリジンは、この位置での塩基性アミノ酸として特に好ましい。しかし、ポリペプチドが、EFLIVIKS（配列番号：20）またはEFLIVKS（配列番号：24）のような多量体を形成するさらなるアミノ酸を有する場合、「Cys/bXaa」または「（Cys/Arg/Lys/His）」の位置でのアミノ酸は、システインまたは塩基性アミノ酸に限定されず、如何なるアミノ酸であってもよい。
【００４６】
好ましくは、Xn1、Xn2、およびXn3はそれぞれ、2〜6残基、0〜4残基、および2〜6残基の独立した任意のアミノ酸であり（すなわち、Xn1= (Xaa)2-6、Xn2= (Xaa)0-4、およびXn3= (Xaa)2-6）；より好ましくはそれぞれ、3〜5残基、1〜3残基、および3〜5残基（すなわち、Xn1= (Xaa)3-5、 Xn2= (Xaa)1-3、およびXn3= (Xaa)3-5）；ならびに最も好ましくはそれぞれ、4、2、および4残基（すなわち、 Xn1= (Xaa)4、Xn2= (Xaa)2、およびXn3= (Xaa)4）である。約6残基の付加アミノ酸は時に、αヘリックスを形成して、単一のアミノ酸のような挙動を示す。したがって、本発明の誘導体ポリペプチドは、わずか6残基の任意のアミノ酸が、4残基、2残基、および4残基からそれぞれなるXn1、Xn2、およびXn3の全てまたは任意の一つに付加されているポリペプチドであってもよい。
【００４７】
そのようなポリペプチドは、既知のペプチド合成技術に従って調製してもよく、同様にそのようなポリペプチドをコードするDNAの発現によって調製してもよい。
【００４８】
好ましくは、Xn1の配列には、例えば、(Arg/Ala)-(Gly/Ala)-(Phe/Ala)-(Ser/Ala)からなる配列、およびその保存的置換を有する配列が含まれる。本明細書において、例えば、「Arg/Ala」は、アルギニンまたはアラニンを示す（「/」は、いずれか一つの残基であることを示し、本明細書を通して同じことが示される）。そのような配列の例には、Arg-Gly-Phe-Ser、Ala-Gly-Phe-Ser、Arg-Ala-Phe-Ser、Arg-Gly-Ala-Ser、Arg-Gly-Phe-Ala等が含まれる。他の例には、Arg-Gly-Ala-Ala、Arg-Ala-Phe-Ala、Arg-Ala-Ala-Ser、Arg-Ala-Ala-Ala、Ala-Gly-Phe-Ala、Ala-Gly-Ala-Ser、Ala-Gly-Ala-Ala、Ala-Ala-Phe-Ser、Ala-Ala-Phe-Ala、Ala-Ala-Ala-Ser、Ala-Ala-Ala-Ala等が含まれる。保存的置換は、先に記述した保存的置換に対応するアミノ酸のグループ内での置換を例とすることができる。一方、Xn2の配列には、好ましくは例えば（Leu/Ala）-（Leu/Ala）からなる配列、およびその保存的置換を有する配列が含まれる。そのような配列には、Leu-Leu、Ala-Leu、Leu-Ala等が含まれる。Ala-Alaも同様にそのような配列の例とすることができる。さらに、Xn3の配列には好ましくは、例えば(Glu/Ala)-(Ile/Ala)-(Asp/Ala)-(Leu/Ala)からなる配列およびその保存的置換を有する配列が含まれる。そのような例には、Glu-Ile-Asp-Leu、Ala-Ile-Asp-Leu、Glu-Ala-Asp-Leu、Glu-Ile-Ala-Leu、Glu-Ile-Asp-Ala等が含まれる。他の例は、Glu-Ile-Ala-Ala、Glu-Ala-Asp-Ala、Glu-Ala-Ala-Leu、Glu-Ala-Ala-Ala、Ala-Ile-Asp-Ala、Ala-Ile-Ala-Leu、Ala-Ile-Ala-Ala、Ala-Ala-Asp-Leu、Ala-Ala-Asp-Ala、Ala-Ala-Ala-Leu、Ala-Ala-Ala-Ala等である。Xn1、Xn2、およびXn3の配列は任意の組み合わせから選択してもよい。
【００４９】
神経細胞の細胞障害性は、確立された神経細胞株（例えば、F11細胞）および初代神経細胞培養（例えば、ラット大脳皮質初代培養）におけるAPP、PS-1、またはPS-2変異体（例えば、V642I/F/G APP、NL-APP、M146L PS-1、およびN141I PS-2）の発現によって、およびAβ（例えば、Aβ1-43）を初代神経細胞培養に添加することによって誘導される。本明細書において「細胞障害性に対する神経細胞の保護」という用語は、先に言及した細胞障害性を含む神経細胞の細胞障害性の少なくとも一つを抑制することを定義する。特に、本発明のHN誘導体には、APP、PS-1、もしくはPS-2変異体またはAβによって引き起こされるこれらの神経細胞死の少なくとも任意の一つを抑制する誘導体が含まれる。細胞死の抑制は、抑制が有意である限り、完全な抑制である必要はない。タンパク質が神経細胞死を抑制できるか否かは、実施例に記述される方法に従って、または他の公表された方法（例えば、国際公開公報第00/14204号を参照されたい）によって検出することができる。
【００５０】
より具体的には、以下の方法を例示することができる：（1）V642I/F/G APP、NL-APP、M146L PS-1、およびN141I PS-2のようなFAD遺伝子を発現するベクターを、単独、または調べるポリペプチドを発現するベクターと組み合わせて神経細胞（例えば、F11細胞）にトランスフェクトする；（2）既定の期間、細胞を培養する（例えば、72時間）、および（3）トリパンブルー排除アッセイ法によって細胞死のレベルを検出する。または、調べるポリペプチドを予め調製して、ポリペプチドの存在下または非存在下で細胞へのFAD遺伝子のトランスフェクション時に細胞死を測定してもよい。FAD遺伝子はまた、誘導型プロモーターを用いて条件的に発現させてもよい。ポリペプチドは、ポリペプチドの存在下での細胞死が、調べるポリペプチドの非存在下で誘導された細胞死と比較して有意に減少すれば、神経細胞死を抑制すると決定される。さらに、初代培養神経細胞のような他の細胞を用いてもよく、細胞死の誘導はまたAβを添加することによって行うことができる。細胞死は、トリパンブルー排除の他に、形態変化、LDHの放出、またはアポトーシス（核の形態変化、DNAの断片化等）を検出することによって測定することができる。
【００５１】
本発明のHN誘導体と機能的に同等であるポリペプチドは、当業者に周知の技術によって、コードする核酸においてランダム変異誘発を用いて作製することができる。しかし、そのようなポリペプチドは、部位特異的変異誘発（この場合も当業者に周知の技術を用いる）によって作製される可能性がより高い。これらのポリペプチドは、機能の増加または機能の減少を有してもよいが、少なくともHNの神経保護作用を有しなければならない。
【００５２】
選択された宿主細胞における発現により適した変種配列を作製するために、本発明の核酸分子のコード配列内の変異を作製することができる。例えば、N-結合部位を高度グリコシル化することが知られている酵母宿主からより容易に回収および精製される均一な産物の発現を得るために、N-結合グリコシル化部位を改変または消失させることができる。この目的のため、発生する任意の一つまたは複数のグリコシル化認識配列の第一または第三のアミノ酸の位置の一つまたは双方での多様なアミノ酸置換、および／または任意の一つまたは複数のそのような認識配列の第二の位置でのアミノ酸欠失は、改変されたトリペプチド配列でのグリコシル化を防止すると考えられる（例えば、Miyajimaら、EMBO J.、5：1193、1986）。
【００５３】
多くの態様において、新規HN誘導体は、野生型HNより2〜3桁大きい生物学的神経保護活性を有する。一つの態様において、HN誘導体は、10 pMもの低濃度で神経保護機能を発揮する。
【００５４】
新規HN誘導体を作製する方法
本発明のポリペプチドは、化学合成することができる（例えば、Creighton、「Proteins: Structures and Molecular Principles」、 W.H. Freeman & Co., ニューヨーク州、1983を参照されたい）または本明細書に記述の組換えDNA技術によって産生することができる。さらなる指針として、当業者は、 Ausubelら（「Current Protocols in Molecular Biology」、第4版、ジョンウィリー＆サンズ、1995）、Sambrookら（「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、1989）、および特に、例えばGait, M.J.編（「Oligonucleotide Synthesis」、IRL出版、オックスフォード、1984）の化学合成を参考にしてもよい。ペプチド合成法は、固相合成または液相合成のいずれであってもよい（日本生化学会編、「新生化学実験講座タンパク質（New Course on Biochemistry Experiments, Proteins） VI」、3〜74頁、東京化学同人、1992）。
【００５５】
本発明のポリペプチドには、その塩が含まれる。そのような塩は、ポリペプチドの酸または塩基に由来する。特に、そのような塩は、無機酸によって形成された塩（例えば、塩酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩等）、有機酸によって形成された塩（例えば、酢酸塩、乳酸塩、蟻酸塩、酪酸塩、グリコール酸塩、プロピオン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等）、および塩基によって形成された塩（例えば、アンモニウム塩、ナトリウム塩およびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、ならびに有機塩基によって形成された塩、アルギニンおよびリジンのようなアミノ酸によって形成された塩）を例とすることができる。
【００５６】
本発明のポリペプチドは、ペプチド誘導体であってもよい。本明細書において、「ペプチド誘導体」という用語は、通常の方法に従って、ポリペプチドの官能基の改変、付加、変異、置換、または欠失によって変化している型を有する分子を指す。官能基のそのような変化は、例えば、ポリペプチドの官能基を保護する、ポリペプチドの安定性または組織学的局在を調節する、ポリペプチドの活性を調節する等のために行われる。本発明のポリペプチドは、アミノ酸の鎖を構成するポリペプチドのN末端、C末端、および官能基の任意の一つが、保護基のような置換基によって改変されているそれらのポリペプチドを例とする。置換基には、例えば、様々なアルキル基、アシル基、アミド基、ホスフェート基、アミノ基、カルボキシル基、およびエステル基が含まれる。しかし、本発明は、これらの例に限定されない。
【００５７】
さらに、ポリペプチドは担体に結合させてもよい。例えば、本発明のポリペプチドをポリエチレングリコール（PEG）、デキストラン、他のポリマー等に結合させてもよい。ポリペプチドは、天然および／または非天然アミノ酸を有してもよい。非天然アミノ酸は、ホモシステイン、β-ヒドロキシバリン、0-4-ヒドロキシフェニルチロシン、a-t-ブチルグリシン、2-アミノ酪酸、a-シクロヘキシルグリシン、a-フェニルグリシン等を例とする。さらに、ポリペプチドのペプチド結合を、ペプチド結合以外の共有結合に適当に置換してもよい。ポリペプチドのペプチダーゼに対する感受性は、非ペプチド結合への置換によって低下させることができ、これは薬物の有効性の持続を増強して、投与経路の広い選択を提供する。非ペプチド結合は、イミノ結合、エステル結合、ヒドラジン結合、セミカルバジド結合、およびアゾ結合を例とするが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００５８】
他の態様において、新規HN誘導体は、既知の宿主細胞を用いる標準的な組換え技術を用いて調製することができる。合成DNAの作製または部位特異的変異誘発によって、任意の所望の変異をヒューマニンcDNAに導入することができる。得られたポリペプチドが神経保護活性を有する限り、改変されるアミノ酸の数および位置に制限はない。ベクター、好ましくはHN誘導体をコードする核酸を含む発現ベクターは、インビトロおよびインビボでHN誘導体を発現するために有用である。組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞、または哺乳類細胞においてHN誘導体を発現させるためにデザインすることができる。適した宿主細胞は、Goeddel、「Gene Expression Technology」：Methods in Enzymology 185、アカデミック出版、サンジエゴ、カリフォルニア州、（1990）においてさらに考察されている。または、例えばT7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、組換え発現ベクターをインビトロで転写および翻訳することができる。
【００５９】
原核細胞におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導型プロモーターを含むベクターによって、大腸菌において行われることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常、組換え型タンパク質のアミノ末端に複数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的に三つの目的を有する：1）組換え型タンパク質の発現を増加させる；2）組換え型タンパク質の溶解度を増加させる；および3）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することによって、組換え型タンパク質の精製に役立つ。しばしば、融合タンパク質の精製後に、組換え型タンパク質を融合部分から分離することができるように、融合部分と組換え型タンパク質との接合部に、タンパク質切断部位を導入する。そのような酵素およびその同源の認識配列には、第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAをそれぞれ標的組換え型タンパク質に融合させる、pGEX（ファルマシアバイオテックインク；Smith, D.B. および Johnson, K.S、1988、Gene 67：31〜40）、pMAL（ニューイングランドバイオラブス）、ビバリー、マサチューセッツ州）、およびpRIT5（ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が含まれる。バキュロウイルス-Sf細胞株（Okamotoら、J. Biol. Chem. 270：4205〜4208、1995）、pcDNA-CHO細胞株（Takahashiら、J. Biol. Chem. 270：19041〜19045、1995）、またはCMVプロモータープラスミド-COS細胞株（Yamatsujiら、EMBO J 15：498〜509、1996）のような他の宿主-ベクター系を用いてもよいが、これらに限定されない。
【００６０】
精製融合タンパク質は、HN誘導体活性アッセイ法（例えば、本明細書において詳述する神経保護活性のアッセイ法）において、またはHN誘導体に対して特異的な抗体を産生するために用いることができる。大腸菌における組換え型タンパク質の発現を最大限にするために、組換え型タンパク質をタンパク質分解によって切断することができない宿主細菌株においてタンパク質を発現させる（Gottesman、「Gene Expression Technology」：Methods in Enzymology 185、アカデミック出版、サンジエゴ、カリフォルニア州、1990、119〜128頁）。もう一つの戦略は、各アミノ酸に関する個々のコドンが大腸菌において選択的に利用されるように（Wadaら、1992、Nucleic Acids Res. 20：2111〜2118）、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変化させることである。本発明の核酸配列のそのような改変は、標準的なDNA合成技術によって行うことができる。
【００６１】
HN誘導体発現ベクターは、酵母発現ベクター、昆虫細胞における発現のためのベクター、例えばバキュロウイルス発現ベクター、または細菌、真菌、もしくは哺乳類細胞における発現に適したベクターとなりうる。哺乳類細胞において用いる場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節要素によって提供される。例えば、一般的に用いられるウイルスプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40（SV40）に由来する。
【００６２】
組換え哺乳類発現ベクターを用いて、特定の細胞タイプにおいて選択的に核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的調節要素を用いて核酸を発現させる）。適した組織特異的プロモーターの非制限的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkertら（1987、Genes Dev. 1：268〜277））、リンパ球特異的プロモーター（Calame および Eaton、1988、Adv. Immunol. 43：235〜275）、特にT細胞受容体のプロモーター（Winoto および Baltimore、1989、EMBO J. 8：729〜733）、および免疫グロブリン（Banerjiら、1983、Cell 33：729〜740；Queen および Baltimore、1983、Cell 33：741〜748）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne および Ruddle（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：5473〜5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら、1985、Science 230：912〜916）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第4,873,316号および欧州特許出願第264,166号）が含まれる。発達調節プロモーター、例えばマウスhoxプロモーター（Kessel および Gruss、1990、Science 249：374〜379）およびa-フェトプロテインプロモーター（Campes および Tilghman、1989、Genes Dev. 3：537〜546）も同様に含まれる。
【００６３】
何らかの状況において、組換え発現ベクター内のHN誘導体の全てもしくは一部をコードする核酸、または宿主細胞ゲノムの特異的部位にそれを相同的に組換えさせる配列を含むHN誘導体核酸分子を含む宿主細胞を作製することが望ましい。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞となりうる。例えば、HN誘導体は、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母、または哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、またはCOS細胞）において発現させることができる。他の適した宿主細胞は当業者に既知である。
【００６４】
ベクターDNAは、通常の形質転換またはトランスフェクション技術、例えばリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む、宿主細胞に外来核酸（例えば、DNA）を導入するための当技術分野で認識された任意の技術によって宿主細胞に導入することができる。
【００６５】
本発明の宿主細胞を用いて、例えば、HN誘導体が産生されるように適した培地において宿主細胞（その中にHN誘導体をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養すること、および任意で培地または宿主細胞からHN誘導体を単離することによって、HN誘導体を産生（すなわち発現）させることができる。
【００６６】
または、本発明のポリペプチドは、もう一つのポリペプチド、例えば、多量体形成、例えば二量体形成ペプチドのようなマーカーポリペプチドまたは融合パートナーに融合させて発現させることができる。融合ポリペプチドは、本来結合しない少なくとも二つのポリペプチドが結合しているポリペプチドであり、ペプチド合成によって、または領域をコードするポリペプチドがインフレームでライゲーションされている核酸を発現させることによって、産生することができる。例えば、細菌によって発現されたタンパク質の精製を容易にするためにヘキサヒスチジンタグに、または真核細胞において発現されるタンパク質の精製を容易にするために血液凝集素タグに、ポリペプチドを融合させることができる。本発明のタンパク質に融合させる他のポリペプチドの例には、タグのような数個の残基を有する短いペプチド、およびタンパク質のような長いポリペプチドを含む任意のポリペプチドが含まれる。特に、そのような例には、ヒスチジンタグ、HAタグ、GFP、マルトース結合タンパク質、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）が含まれる。さらに、抗体断片（Fc断片）等も同様に用いてもよい。他の例には、リーダー配列、分泌シグナル、およびプレタンパク質またはプロタンパク質配列が含まれるが、本発明はこれらの例に限定されない。さらに、本発明のポリペプチドの血液-脳関門の効率よい通過を促進するポリペプチドのグループを、本発明のタンパク質に融合させることができる。
【００６７】
融合タンパク質は、発現される融合タンパク質に対して特異的な抗体を利用することによって、容易に精製してもよい。例えば、Janknechtらによって記述された系によって、ヒト細胞株において発現された非変性融合タンパク質を容易に精製することができる（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：8972〜8976、1991）。この系において、対象遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレームがヒスチジン6個の残基からなるアミノ末端タグに翻訳によって融合されるように、ワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングされる。組換え型ワクシニアウイルスを感染させた細胞の抽出物をNi2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムにローディングして、イミダゾール含有緩衝液によって、ヒスチジンタグを有するタンパク質を選択的に溶出する。
【００６８】
HN誘導体のポリペプチドにおけるアミノ酸残基の数に関して制限はないが、例えば、ポリペプチドを薬学的組成物として用いる場合、分子の大きさがより小さいポリペプチドが一般的に好ましい。活性にとって不要である部分（例えば、アミノ酸残基または官能基）が存在しなければ、抗原性が低下して、他の分子との非特異的相互作用を回避することができ、その結果望ましくない副作用は減少することが期待される。本発明のポリペプチドは、好ましくはアミノ酸残基500個またはそれ未満、より好ましくは100残基またはそれ未満、さらにより好ましくは、50残基またはそれ未満、およびさらにより好ましくは30残基またはそれ未満からなる。ポリペプチドの平均分子量は、好ましくは60 kDaまたはそれ未満、より好ましくは15 kDaまたはそれ未満、より好ましくは6 kDaまたはそれ未満、およびさらにより好ましくは4 kDaまたはそれ未満である。
【００６９】
HN誘導体の製剤と利用
本発明に従って用いられる薬学的組成物は、一つまたはそれ以上の生理的に許容される担体または賦形剤を用いて、通常のように調製することができる。薬剤としてHN誘導体を発現するベクターを、遺伝子治療を行うために用いてもよい。ポリペプチドの分泌型、または分泌シグナルの結合によって改変されたポリペプチドを、遺伝子治療のために発現させてもよい。ベクターを投与する方法には、インビボ法およびエクスビボ法が含まれる。遺伝子治療のためのベクター系には：アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、ヘルペスウイルスベクター（全て、RobbinsおよびGhivizzani、Pharmacol. Ther. 80：35〜47、1998を参照されたい）、レトロウイルスベクター（EngelおよびKohn、Front. Biosci. 4：e26〜33、1999）、レンチウイルスベクター（Lundstrom, K.、1999、J. Recept. Signal Transduct. Res. 19：673〜686）等が含まれるがこれらに限定されない。
【００７０】
神経保護組成物ならびにその生理的に許容される塩および溶媒和化合物は、様々な方法によって投与のために調製することができる。例えば、投与は、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、心室内、嚢内、脊髄内、大槽内、腹腔内、経粘膜、または口腔内となりうる。適した投与法には、経皮、鼻腔内、経気管支、脊髄内、硬膜内、または脳室内投与も含まれる。化合物は、投与経路に従って、様々な方法で調製することができる。
【００７１】
例えば、アルツハイマー病の治療において変性に対して脳のニューロンを保護するために、標的細胞周囲の濃度が神経変性を有効に抑制するために十分となるように、本発明のポリペプチドを投与することが好ましい。特に、神経細胞死に対してHN（P-S14 HN、P-S7 HN、P-S14/7 HN、D-Ser HN）と同等の保護作用を有するHN誘導体は、少なくとも1 nMまたはそれ以上、好ましくは、10 nM、100 nM、または500 nMまたはそれ以上、およびより好ましくは1 μM、5 μM、10 μMまたは30 μMまたはそれ以上の濃度で投与する必要がある。神経細胞死に対してEF-HN（またはEF-（S7A）HN）と同等の保護作用を有するHN誘導体は、10 pMまたは100 pMまたはそれ以上の濃度で、好ましくは1 nM、10 nM、50 nM、100 nM、または300 nMまたはそれ以上で投与しなければならない。神経細胞死に対してD-Ser14HN（D-Ser7/14HN、S7A HNG17、EF-HNG-KKK）と同等の保護作用を有するHN誘導体は、1 pM、5 pM、10 pM、50 pM、または100 pMまたはそれ以上、好ましくは1 nM、10 nM、または30 nMまたはそれ以上の濃度で投与しなければならない。神経細胞死に対してAGA-D-Ser14HN（AGA-D-Ser14HN17、EF-HNG、AGA-HNG）と同等の保護作用を有するHN誘導体は、少なくとも100 fMまたはそれ以上、好ましくは1 pM、5 pM、10 pM、50 pM、または100 pMまたはそれ以上、好ましくは1 nMまたはそれ以上の濃度で投与しなければならない。神経細胞死に対してEF-AGA-HNGと同等の保護作用を有するHN誘導体は、少なくとも1 fM、5 fM、10 fM、50 fM、または100 fMまたはそれ以上、好ましくは1 pM、5 pM、10 pM、または30 pMまたはそれ以上の濃度で投与する必要がある。これらの濃度を得るための用量は、投与経路を考慮することによって適切に決定することができる。
【００７２】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増量剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン、またはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に許容される賦形剤を用いて通常の手段によって調製された錠剤またはカプセル剤の形となりうる。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。
【００７３】
経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ剤、または懸濁剤の形となりえて、または使用前に水もしくは他の適した溶媒によって溶解するための乾燥産物の形であってもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンはこの機能に役立つ可能性がある、またはアカシア）、非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または精留植物油）、および保存剤（例えば、メチルまたはプロピルp-ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸）のような薬学的に許容される添加剤を用いて通常の手段によって調製することができる。調製物は、適当であれば緩衝塩、着香料、着色剤および甘味料を含みうる。経口投与のための調製物は、活性化合物の放出が制御されるように適切に調製することができる。
【００７４】
口腔内または舌下投与の場合、組成物は、通常のように調製された錠剤またはロゼンジの形となりうる。
【００７５】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または連続注入によって非経口投与のために調製することができる。注射用製剤は、保存剤を加えて、単位投与剤形、例えばアンプルまたは多用量容器の形であってもよい。組成物は、油性または水性媒体における懸濁液、溶液、または乳液のような形状となりえて、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような処方物質を含みうる。または、活性成分は、使用前に適した溶媒、例えば滅菌発熱物質不含水によって溶解するための粉末剤形となりうる。
【００７６】
化合物は、例えばカカオバターまたは他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含む坐剤または浣腸のような直腸組成物に調製することができる。
【００７７】
既に記述された製剤の他に、化合物はまたデポー調製物として調製することができる。そのような長時間作用型の製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）、または筋肉内注射によって投与してもよい。このように、例えば、化合物は、適したポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳剤として）、またはイオン交換樹脂によって、または溶解性の低い誘導体、例えば難溶性の塩として調製することができる。
【００７８】
神経保護組成物の作用は中枢神経系であることから、輸送技術は、組成物が血液-脳関門を通過できるようにデザインすることができる。そのような技術は、当技術分野で既知である（例えば、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第89/10134号、CloughesyおよびBlack、J. Neurooncol. 26：125〜132、1995；およびBegley、J. Pharm. Pharmacol. 48：136〜146、1996を参照されたい）。神経保護組成物の成分はまた、そのCNSへの流入を促進するために当技術分野で既知の方法を用いて改変（例えば、化学的に）することができる。
【００７９】
場合によっては、特に神経保護組成物の一つまたはそれ以上の成分が血液-脳関門を通過しない場合、神経保護組成物を中枢神経系に直接輸送することが望ましいかも知れない。そのような方法の例は、脳室内注射（Kordowerら、Exp. Neurol. 124：21〜30、1993）、または浸透圧ポンプ（例えば、Alzet（登録商標）ポンプ）の設置である。そのような方法のもう一つの例は、大槽間隙に直列のフィルターと共にOmayaリザーバー-シャントを外科的に留置することである。適当な賦形剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩液）中の神経保護組成物を、既定通りに注射によってシャントに注入する。全ての場合において、特定の輸送剤形のために用いられる適当な処方に対して検討を行う。
【００８０】
吸入投与の場合、神経保護組成物は、例えば、適した噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適した気体を用いてエアロゾルスプレーとして輸送される。規定の用量の輸送を促進する方法を含む、当技術分野で既知の他の適した鼻腔内輸送法を用いることができる。
【００８１】
組成物は、望ましければ、活性成分を含む一つまたはそれ以上の単位投与剤形を含んでもよいパックまたはディスペンサー装置の形となりうる。パックは、例えばブリスタパックのように、金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置は、投与の説明書を添付することができる。
【００８２】
本発明の治療組成物はまた、その多くが当業者に既知である担体または賦形剤を含みうる。用いることができる賦形剤には、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、EDTA、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが含まれる。
【００８３】
そのような製剤を作製する方法は周知であり、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Gennaro, A.R.編、第20版、2000、ウィリアムス＆ウィルキンス、ペンシルバニア州、アメリカにおいて認められうる。
【００８４】
典型的に、静脈内投与の用量は、大槽内投与の場合より大きく、例えばHN誘導体の10〜1,000μg/kgを投与してもよい。例えば、誘導体は、1〜100 μg/kg/時間の範囲の濃度で静脈内投与してもよい。
【００８５】
本発明のHN誘導体を用いて、またはHN誘導体を発現するベクターを用いて予防または治療される標的疾患は、用いたHN誘導体が疾患を治療するために有効である限り、如何なるようにも制限されない。好ましい標的疾患の例には、神経変性障害、特にアルツハイマー病が含まれる。これまでの研究から、神経細胞死がアルツハイマー病において起こることが判明した（I. Nishimotoら、1997、Adv. Pharmacol. 41：337〜368）。APP（I. Nishimotoら、1998、Neurobiol. Aging. 19：S33〜S38）およびプレセニリン（Nishimuraら、1999、Clin. Genet. 55：219〜225）のある種の活性化が、細胞死に関連することが示唆されている。したがって、本発明の薬学的組成物は、アルツハイマー病において起こる神経変性に対して保護する薬剤として応用可能であると期待される。アルツハイマー病の他に、例えば、脳虚血による神経細胞死によって引き起こされた疾患（T. Kirino、1982、Brain Res. 239：57〜69）は、本発明の薬学的組成物を用いることによって予防することができる。さらに、痴呆を伴うパーキンソン病（M.H. Polymeropoulosら、1997、Science 276：2045〜2047）；びまん性レーヴィ小体疾患（M.G. Spillantiniら、1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95：6469〜6473）；ダウン病を伴う痴呆等も同様に、本発明のタンパク質を用いる治療および予防の標的である。さらに、APP類似体であるAPLP1は、先天性のネフローゼ症候群の原因遺伝子であると言われていることから（Lenkkeri, U.ら、1998、Hum. Genet. 102：192〜196）、ネフローゼ症候群のような腎疾患も同様に治療および予防の標的である。
【００８６】
本発明を実施するための最善の様式
本発明は、請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限しない以下の実施例においてさらに説明する。
【００８７】
実施例
細胞培養物中に存在する細胞の死滅率をモニタリングする細胞死アッセイ法により測定された通り、下記の実施例において、表1に示すものなどのHN誘導体またはそれらの組み合わせが、FAD遺伝子変異体またはAβペプチドによって通常引き起こされる細胞死を阻害することが示される。さらに本実施例により、これらのHN誘導体が少なくとも部分的には、多量体を形成することにより、AβペプチドおよびFAD遺伝子変異体によって引き起こされる細胞死を阻害することを示している。
【００８８】
下記の実施例において、特記載しない限り、全体をとおして以下の材料および一般法を用いる。
【００８９】
（表２）実施例で用いたペプチドの一覧
2006503553.tif 000003
注：天然HNに存在しないアミノ酸残基は太字で示している。「p-S」はホスホリル化L-Serを意味する。
【００９０】
遺伝子、ポリペプチド、および材料
すべてCMVプロモーター駆動性のpcDNAベクター中に存在する、V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、およびN141I-PS2 cDNAは過去に記載されている［2、14、15、21］。HNおよびHNGはペプチド研究所（大阪府箕面、日本）から購入した。他のHNペプチドは化学的に合成した。より詳細には、本明細書の「新規HN誘導体を作製する方法」の項を参照されたい。合成ペプチドの組成は逆相HPLCで確認した。Aβ1-43ペプチドはペプチド研究所から購入した。他の材料は市販のものであった。
【００９１】
細胞および細胞死アッセイ法
下記の開示において、小ペプチドが神経細胞を細胞傷害性から阻害することを示すために用いた、細胞ベースのアッセイ法をいくつか記載する。
【００９２】
一つのアッセイ法では、V642I-APPによるトランスフェクションは、F11神経細胞ハイブリッド細胞において細胞死を引き起こす［2、12、14、15］。他のアッセイ法では、Aβペプチドによる処理は、初代培養皮質ニューロンにおける細胞死を引き起こす［14〜18、24〜26］。
【００９３】
ラット胎齢13日の初代培養された初代培養ニューロンとマウス神経芽細胞腫細胞とのハイブリッドであるF11細胞は、NGFによる分化を伴わない活動電位の生成などの初代培養ニューロンの代表的特徴を有するため、初代培養ニューロンの最良のモデルの一つである［22］。これらは神経細胞機能の様々な研究において用いられている［2、11〜16、26〜31］。これらの細胞を用いて、V642I-APPによる細胞傷害性のメカニズムが詳細に分析されている［13］。APPのV642変異体による細胞傷害性は複数の異なる系でも確認されている［3、6、10、21］。以前に記載されたように［16］、18％ウシ胎仔血清（FBS；Hyclone、ユタ州ローガン）および抗生物質を添加したHam's F-12（GibcoBRL、メリーランド州ゲイザースバーグ）中でF11細胞を培養した。F11細胞（7×104細胞/ウェル；6穴プレート中で、18％FBSを添加したHam's F-12により12〜16時間培養した）を、リポフェクションにより［FAD cDNA 2μg、LipofectAMINE 4μl、PLUS試薬8μl（GibcoBRL）］、FAD遺伝子をコードするプラスミドで血清非存在下で3時間トランスフェクトし、18％FBSを添加したHam's F-12中で2時間インキュベートした。次いで、培地を、HNペプチドを含むまたは含まない、10％FBSを添加したHam's F-12に交換し、細胞をさらに67時間培養した。トランスフェクションの72時間後、細胞死滅率をトリパンブルー排除アッセイ法により測定した。本アッセイ法は下記のとおりに実施した。細胞を穏やかにピペッティングして懸濁し、0.4％（最終0.08％）トリパンブルー溶液（Sigma、ミズーリ州セントルイス）50μlを細胞懸濁液200μlと室温で混合した。トリパンブルー溶液との混合後3分以内に、染色された細胞を計数した。
【００９４】
マウス皮質ニューロンの初代培養を、以前に記載されたように［16］、ポリ-L-リシンでコーティングした24穴プレートまたは96穴プレート（住友ベークライト、秋田、日本）中、血清非存在下、N2補助成分存在下で実施した。この方法によるニューロンの純度は＞98％であった。調製ニューロン（96穴プレートに播種したニューロンについては、2.5×104または5×104細胞/ウェル、100μl培地/ウェル；24穴プレートに播種したニューロンについては、1.25×105細胞/ウェル、250μl培地/ウェル）を、10μM（10μM HNを用いた実験の場合）の合成HN存在下または非存在下で16時間予備インキュベートし、それぞれ10μM HN存在下または非存在下、25μM Aβで72時間処理した。初代培養ニューロンは培地交換中の一時的乾燥に敏感であるため、本発明者らは、25μM Aβを用いて下記のとおりにニューロンを処理した。まず、半量（96穴プレート中のニューロンについては50μl；24穴プレート中のニューロンについては125μl）の古い培地を廃棄した。次いで、同量（96穴プレート中のニューロンについては50μl；24穴プレート中のニューロンについては125μl）の、10μM HNおよび50μM Aβ（Aβは直接分割した）を含むあらかじめ加温した新鮮培地を培養物に加えた。記載されているとおり［14、15］、神経毒性を誘導するために25μMで用いたAβペプチドは、37℃で72時間の細胞培養中に培地中で凝集を生じた。WST-8細胞生存率アッセイ法を、以前に記載されたように［14〜16、23］、Cell Counting Kit-8（和光純薬工業、大阪、日本）を用いて実施した。
【００９５】
カルセインアッセイ法を、以前に記載されたように［14、16］、カルセイン-AM｛3',6'-ジ-(O-アセチル)-2',7'-ビス[N,N-ビス(カルボキシメチル)アミノメチル]フルオレセイン,テトラアセトキシメチルエステル；同仁化学研究所｝を用いて実施した。これらのアッセイ法は、下記のとおり、96穴プレートに播種したニューロンによる実験中に同時に行った。Aβ処理の72時間後、細胞に、WST-8溶液10μlおよび600μMカルセイン-AM 1μlの混合物を加えた。37℃のCO2インキュベーター内で2時間インキュベートした後、WST-8の吸光度をOD450で測定した。バックグラウンドを低くするために培地をPBSに交換した後、カルセイン特異的蛍光（ex＝485nm、em＝535nm）を蛍光顕微鏡で観察するか、または分光蛍光計（Wallac1420 ARVOsx Multi Label Counter）で測定した。カルセインアッセイ法およびWST-8アッセイ法を用いたほとんどの細胞生存率データは、96穴プレート中5×104細胞/ウェルで播種したニューロン（高密度ニューロン）から得たものであり、2.5×104細胞/ウェルで播種した細胞（低密度ニューロン）による両アッセイ法で確認した。
【００９６】
カルセインアッセイ法のためのいくつかの実験は、24穴プレートに播種したニューロンで実施された。これらの実験では、図5および6に示すとおり、96穴プレートのカルセイン蛍光測定（走査時間＝1秒）におけるバックグラウンドに比べて、カルセイン蛍光測定に適した分光蛍光計の設定（走査時間＝0.5秒）により、バックグラウンドが明らかに高くなった。初代培養ニューロンを用いたほとんどの実験で、4つの別々の実験を行い、結果の平均±S.D.について論じた。
【００９７】
イムノブロット法
イムノブロット法を、記載のとおりに行った［14〜16］。トランスフェクトしたFAD遺伝子発現の分析については、各FAD遺伝子（V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、N141I-PS2）でトランスフェクトした細胞の溶解産物（20μg/レーン）をSDS-PAGEにかけ、PVDFシートに電気的にブロッティングした。ブロック後、シートを、抗体［APP変異体については5μg/ml 22C11（CHEMICON、カリフォルニア州テメキュラ）；PS1変異体については1/2000の抗PS1 N末端抗体（CHEMICON）；PS2変異体については1/500の抗PS2抗体（Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ベバリー）］に浸漬し、続いてHRP標識二次抗体に浸漬した。抗原のバンドをECL（Amersham Pharmacia Biotech、スウェーデン、ウプサラ）で可視化した。
【００９８】
二量体化実験
合成(His)6タグHN誘導体ペプチド（1nmol）をNi-NTAアガロース20μl（QIAGEN、ドイツ、ヒルデン）と共に全量0.5mlの緩衝液A［20mMトリス/HCl（pH8.0）および1mM DTT］中、4℃で1時間インキュベートし、緩衝液B［20mMトリス/HCl（pH7.4）、1mM DTT、および150mM NaCl］で一回洗浄した。合成FLAGタグペプチド（1nmol）を全量0.5mlの緩衝液B中、(His)6タグペプチドを固定したビーズと4℃で2時間、回転振盪器で混合し、緩衝液Bで三回洗浄した。洗浄したビーズを20μlの2×サンプリング緩衝液［100mMトリス/HCl（pH6.8）、200mM DTT、4％(w/v）SDS、0.2％ブロモフェノールブルー、および20％(v/v）グリセロール］と混合し、煮沸した。上清をトリス/トリシンSDS-PAGEにかけた後、1/5000抗FLAGモノクローナル抗体M2（Sigma）によるイムノブロット法を行った。
【００９９】
統計解析
本明細書に記載されたすべての実験は、別々のトランスフェクション、処理、または沈降により、少なくとも三回繰り返されたものであり、それぞれが同等の結果を生じた。統計解析は、一方向ANOVA、および続いてpost-hocテストを用いて実施し、p＜0.05を有意として評価した。
【０１００】
実施例1
ホスホ-Ser HNペプチドまたはHNペプチドが神経細胞を細胞傷害性から阻害することを示すために、細胞死アッセイ法を実施した。表3〜表4の結果は、P-S14 HN（配列番号：4）、P-S7 HN（配列番号：5）、またはP-S7/14 HN（配列番号：6）がそれぞれ、真正HN（配列番号：1）の神経保護作用の用量反応曲線と同様の用量反応曲線で、Aβ処理またはV642I-APPに対して神経細胞保護効果を発揮したことを示している。これらのホスホリル化HN誘導体の作用強度および有効性はいずれもHNとほぼ同等であった。
【０１０１】
表3は、25μM Aβ1-43で処理して、ホスホ-Ser HNペプチド（配列番号：4〜6）またはHN（配列番号：1）存在下または非存在下で72時間培養した、初代培養ニューロンの細胞生存率を示す。表3の値は未処理ニューロンからのカルセイン蛍光の％（平均±S.D）を表す。
【０１０２】
表4は、pcDNA（vec）またはV642I-APP cDNAでトランスフェクションしてホスホ-Ser HNペプチド（配列番号：4〜6）またはHN（配列番号：1）存在下または非存在下で培養したF11神経細胞ハイブリッド細胞の細胞生存率を示す。トランスフェクションから72時間後に、トリパンブルー排除により、細胞生存率を測定した。「非処置」とは、トランスフェクションしていないことを意味する。これらの実験において、V642I-APPの発現はHNペプチドに影響されなかった。表4に示す値は全細胞中の死細胞の％（平均±S.D）で示している。実験1およびその後のすべての実験で、CMVプロモーター駆動性の、V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2ホロタンパク質の発現を調べ、被験ペプチドによって影響されないことを見出した。
【０１０３】
（表３）
2006503553.tif 000004
（*Aβ処理細胞に対してp＜0.01）
【０１０４】
（表４）
2006503553.tif 000005
（*V642I-APP cDNA単独でトランスフェクトした細胞に対してp＜0.01）
【０１０５】
実施例2
実験2において、細胞死アッセイの結果により、Ser14でアミノ酸置換されたHN誘導体の、V642I-APP誘導性細胞死に対する保護能力が示される。5つの代表的アミノ酸である、Arg（代表的な塩基性残基）、Glu（代表的な酸性残基）、Trp（代表的な芳香族残基）、Thr（代表的なOH含有残基）、およびPro（独特の残基）について試験した。トランスフェクションなしの、または空のpcDNAベクターによって誘導された基準細胞傷害性はそれぞれ、9.0±1.4または10.0±1.9（全細胞中の死細胞の％）であり、V642I-APPトランスフェクションによる細胞傷害性は53.7±1.2％、(S14R)HN、(S14W)HN、(S14T)HN、または(S14E)HN（それぞれ10μM）存在下でのV642I-APPによる細胞傷害性はそれぞれ、52.6±1.0％、54.5±4.2％、54.0±2.3％、または45.0±1.9％であった。しかし、同じ条件下では、10μM (S14P)HN（配列番号：4）または真正HN（配列番号：1）存在下でのV642I-APPによる細胞傷害性はそれぞれ12.5±1.0％または11.0±0.1％であった。これらのデータにより、V642I-APP誘導性神経細胞死の抑制に関して、Proが機能的にSer14の代わりとなることが示される。
【０１０６】
実施例3
本実験は、D-Serで置換されたHN誘導体の神経細胞死に対する保護能力を示すために実施した。この誘導体には(D-Ser14)HN、(D-Ser7)HNおよび(D-Ser7/14)HN（配列番号：7〜9）が含まれる。本発明者らは、様々な種類の残基のうち、GlyおよびProのみが機能的にSer14の代わりとなりうるという結果の意味について考察した。Glyは側鎖がないため、D体を持たない唯一のアミノ酸である。Proは側鎖を有するが、その分子スペースは小さい。したがって、ProまたはGlyがそれぞれ小さい側鎖を持つか、または側鎖がないことは、HNの活性な配座を維持する上で有利であり、Ser14のD-ラセミ化によって実現される可能性があるとの仮説を立てた。図1（カルセイン染色したニューロンの顕微鏡像）および図2〜図4（定量分析）に示すとおり、(D-Ser14)HNは、カルセイン蛍光分析およびWST-8吸光度分析ならびにトリパンブルー排除アッセイ法（データは示していない）で評価して、25μM Aβ1-43による神経細胞死を100pM〜1nMのIC50で抑制し、1nM〜10nMで完全な神経保護を示した。対照的に、真正HNは10μMで完全な抑制を示し、IC50は100nM〜1μMであった（図12〜図14参照）。これらのデータは、14位のSerのD-ラセミ化により、HNがAβに対する神経保護を真正HNの100倍〜1000倍の強度で発揮しうることを示している。同様に、(D-Ser14)HNはV642I-APPならびに他のFAD変異体（NL-APP、M146L-PS1、N141I-PS2）に対する強力な細胞保護を示した。NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2はF11神経細胞ハイブリッド細胞において細胞傷害性を生じることが確立されており［13〜16］、これらのFAD変異体による細胞傷害性のメカニズムは十分に分析されている［13、17、18］。すべてのIC50値は共通して100pMから1nMの間であり、完全抑制は10nMの(D-Ser14)HNによって引き起こされた。この作用強度はHNの強度よりも2桁から3桁高く、HNGの強度と実質的に同等であった。(D-Ser14)HNは、CMVプロモーター駆動性の、V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2ホロタンパク質のいずれの発現も抑制しなかった（データは示していない）。
【０１０７】
対照的に、7位におけるSerのD-異性体置換は、HNの神経保護作用の強度および有効性を変えることはなかった。(D-Ser7)HNは、Aβ1-43、V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2による神経細胞死に対するHNの作用とほぼ同等の作用強度を示した。また、D-Ser7の置換は(D-Ser14)HNの神経保護作用に影響しなかった。D-Ser7およびD-Ser14両方を有するHNである(D-Ser7/14)HNの、V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2に対する細胞保護作用は、(D-Ser14)HNの作用と実質的に同等であった。合わせ考えると、これらのデータは、HNの作用がSer7でのD-ラセミ化によって増強されず、かつHNが14位のD-serラセミ化によって特異的に活性化されることを示している。
【０１０８】
実施例4
本発明者らは以前、Arg4およびPhe6両方におけるAla置換が、HNGの有効性をさらに3倍〜10倍増強し、(R4A/F6A)HNG（AGA-HNG）が、100pM〜300pMで完全な神経保護を示すことを報告した［16］。HNG作用のR4A/F6A置換による増強は、トリプシン/キモトリプシン切断部位の欠損およびプロテアーゼからのHNGの保護に起因していた。本実験は、AGA-(D-Ser14)HN（配列番号：10）およびAGA-(D-Ser14)HN17（配列番号：11）の細胞保護に対する影響を調べた。AGA-(D-Ser14)HN（配列番号：10）は、V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、N141I-PS2、またはAβ1-43それぞれに対し、100pMで完全な細胞保護を示した（図5〜図6）。その細胞保護作用のIC50値は共通して約10pMであった。これらの実験において、CMVプロモーター駆動性の、V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2のホロタンパク質の発現はいずれも、AGA-(D-Ser14)HNによって影響されなかった（データは示していない）。
【０１０９】
［16］に開示されているとおり、HNのPro3-Pro19領域（PRGFSCLLLLTSEIDLP）（HN17、配列番号：25) は完全長HNの阻害活性を有する必須のコアドメインで、Pro3-Pro19ドメインの合成ペプチド（HN17、配列番号：25）は細胞保護において真正HNと同等の強度を有する。この実験では、R4A/F6A［PAGASCLLLLT(D-Ser)EIDLP］を伴うD-Ser14含有Pro3-Pro19（配列番号：11）（AGA-(D-Ser14)HN17と呼ばれる）のV642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2による神経細胞死に対する効果も調べた。AGA-(D-Ser14)HN17（配列番号：11）は、これらの各FAD遺伝子による神経細胞死を、IC50は約10pMで、完全には100pMで、用量依存的に抑制した。AGA-(D-Ser14)HN17は、CMVプロモーター駆動性の、V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2のホロタンパク質の発現をいずれも抑制しなかった（データは示していない）。したがって、AGA-(D-Ser14)HN17（配列番号：11）は神経保護においてAGA-(D-Ser14)HNと同じくらい強力である。
【０１１０】
実施例5、実施例6および実施例7−多量体化
実施例5、実施例6および実施例7（図10〜図14）において、二量体を生成するために確立されたアミノ酸配列である［32、33］、EFLIVIKS（配列番号：20）またはEFLIVKS（配列番号：24）と融合したN末端は、いくつかのHN誘導体の神経細胞死を抑制する能力を回復することが示された。
【０１１１】
実施例5において、最大10μMにおいて、(S7A)HN（配列番号：12）は初代培養ニューロンにおいてAβ1-43による神経細胞死を抑制しないことが示された（図7〜図8）。低密度（図8A、図8B）および高密度（図8C、図8D）の初代培養ニューロン培養物による二つの別々の細胞生存率アッセイ法で、非常に類似した結果が得られ、これにより(S7A)HNの効果がないことが示された。これは、V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2による神経細胞障害性に対する(S7A)HNの効果についても同様であった（V642I-APPについては図9A；他のFAD遺伝子についてはデータは示していない）。(S7A)HNに細胞保護効果がないことは、この変異ペプチドをコードするプラスミド（pHN/S7A）を用いることによって確認した。V642I-APPによるF11神経細胞死は、(C8A)HNをコードするプラスミド（pHNA）の場合と同様、pHN/S7Aによる同時トランスフェクションによって抑制されなかったが、一方で、HNまたはHNGをコードするプラスミド（pHNまたはpHNG）によるトランスフェクションはV642I-APPによる神経細胞障害性の著しい抑制をもたらした［トランスフェクションなしの基準細胞障害性（死細胞％、平均±S.D.）については10.2±0.6％；pFLAGによる細胞障害性（pHNの空のプラスミド）については9.5±0.5％；V642I-APP＋pFLAGによる細胞障害性については55.2±1.3％；V642I-APP＋pHNによる細胞障害性については12.0±2.2％；V642I-APP＋pHNGによる細胞障害性については11.3±0.7％；V642I-APP＋pHNAによる細胞障害性については55.9±1.0％；V642I-APP＋pHN/S7Aによる細胞障害性については55.8±2.7％］。この実験において、以前の報告のとおり［14］、V642I-APPの発現はHNまたはHN誘導体をコードする各プラスミドの同時トランスフェクションによって影響されなかった（データは示していない）。したがって、Ser7はHNが細胞保護作用を示すために必須であった。したがって、この残基は非常に重要であるが、Ser14とは異なる様式で役割を果たしている。
【０１１２】
対照的に、(S7A)HNG17は、培養された初代培養ニューロンにおけるAβ1-43による神経細胞死に対してIC50約1nMの抑制効果を示し、完全抑制は約10nMで認められた（図7〜図8）。これは、V642I-APPによるF11神経細胞障害性の場合も同様であった（図9A）。これらのデータにより、(S7A)HNは神経保護効果を持たないが、より短い(S7A)HNG17は強力な神経保護作用を有することが示される。
【０１１３】
実施例6（図7および図9B）において、C末端KRRAがKKKKに置換されたHNG（HNG-KKK、配列番号：14）は神経保護作用を失っていることが示された（10nMおよび100μMの効果についての顕微鏡像はそれぞれ図7および図10；カルセインおよびWST-8アッセイ法のデータは図9Bおよび図12〜図13）。完全長HNの細胞保護作用はC末端KRRAのKAAAへの置換またはC末端VKRRAの欠失によってわずかに影響を受けるにすぎないことが以前に判明していた［14、16］ため、これは予想外である。これらの知見に基づき、HNがその細胞保護作用を示すためには、少なくとも二つの異なる段階が必要であると考えられる。一つは、神経細胞の表面に特異的結合部位がある［14］ことによって支持されるとおり、細胞表面の推定受容体へのHNの結合である。もう一つはC末端KKK置換がPro3-Pro19コアドメインの作用を無効にするプロセスである。このプロセスはHNの多量体化であると考えられる。
【０１１４】
実施例7（図10〜図14）において、HNペプチドの多量体化が(S7A)HNおよびHNG-KKKの神経保護作用を回復することが示された。
【０１１５】
EFLIVIKS（EF）と融合したN末端を有するHNG-KKKを、二量体化の効果を調べるために合成した。25μM Aβ1-43で処理した初代培養ニューロンにおいて、EF-HNG-KKK（配列番号：16）は10nM〜100nMで完全な神経保護を示し、IC50値は約1nMであったが、非融合HNG-KKKは10μMでもまったく作用を誘発しなかった（図10〜図11、および図12〜図13の右図）。EFLIVIKS単独では、同じ系において最大100μMでも神経保護を示すことはなかった（図10、および図12〜図13の左図）。これらの知見を、F11細胞系でのV642I-APPによる神経細胞障害性に対するEF-HNG-KKKの作用について確認した。EF-HNG-KKKは低いnM濃度で強力な細胞保護を示したが、HNG-KKKは同じ系において100μMでも効果がなかった（図10）。EFLIVIKS単独では最大100μMでも細胞保護を示すことはなかった（図12〜図14、左図）。EF-HNG-KKK作用のIC50値は約100pMで、完全抑制は10nM EF-HNG-KKKで得られた。これらのデータをすべて合わせると、C末端KKKはHNGの二量体化の可能性を妨げ、この阻害は融合した二量体化標識によってさらに拮抗されたと考えられる。
【０１１６】
HNG-KKKおよびEF-HNG-KKKからの結果に基づき、HN17はC末端残基がないため、非常に二量体化しやすいと考えられる。C末端KRRAを有する真正HNが、低いμMで二量体化するためにはSer7が必要であるが、HN17が二量体するのには必要でない場合、前述のとおり、(S7A)HNG17はHNG17と同等に有効であるため、EFLIVIKS融合により(S7A)HNが細胞保護を示すことができると思われる。反対に、EFLIVIKS融合によって(S7A)HNが細胞障害性を示すことができない場合、二量体化はHN作用にとって必須のプロセスではないことになる。
【０１１７】
予想されたとおり、初代培養ニューロンにおいてEFLIVIKS融合(S7A)HN［EF-(S7A)HNと略記、配列番号：15］は、Aβ1-43による細胞障害性に対して保護作用を示した（図10〜図11、および図12〜図13の一番左の図）。EF-(S7A)HNは100nMでAβ神経毒性の完全抑制を示し、IC50値は約10nMであったが、(S7A)HNまたはEFLIVIKS単独ではいずれもまったく神経保護を示さなかった。EFLIVIKS-HN（EF-HN、配列番号：17）もHNの100倍の強度、すなわちEF-(S7A)HNと実質的に同等の強度で、Aβ神経毒性に対する神経保護作用を示した（図10〜図11、および図12〜図13の左から二番目の図）。対照的に、(C8A)HN（HNA）（MAPRGFSALLLLTSEIDLPVKRRA/配列番号：3）は、EFLIVIKSと融合した場合でさえ、完全に不活性であった（図11ならびに、図12および図13の左から三番目の図）。
【０１１８】
V642I-APP発現F11神経細胞でも、EF-(S7A)HNは、IC50は1nMであり、100nMで完全な細胞保護作用を示した（図14）。この強度はHNの約100倍であった。同じ条件下で、(S7A)HNは、最大10μMでも細胞保護作用を示すことはなかった。EF-HNは、HNの約100倍の強度、すなわちEF-(S7A)HNと同等の強度の細胞保護を示した（図14の左から二番目の図）。対照的に、(C8A)HNはこの場合も、EFLIVIKSと融合した場合でさえ、完全に不活性であった（図14の左から三番目の図）。
【０１１９】
実施例8
実験8からの結果（図15および図16）により、EF-(S7A)HNおよびEF-HNG-KKKの救出作用に対するEFLIVIKSの遮断効果が示唆された。単離EFLIVIKSペプチドが、EF-(S7A)HNまたはEF-HNG-KKKのEFLIVIKS領域に結合しかつ単量体状態の(S7A)HN領域またはHNG-KKK領域を維持するので、EF-(S7A)HNまたはEF-HNG-KKKによる神経保護は融合EFLIVIKSの二量体化を通して行われるならば、それらの作用は過剰量の単離EFLIVIKSペプチドを加えることによって遮断される。反対に、融合EFLIVIKSが、融合ペプチドの安定化などの、二量体化とは異なる役割を果たす場合、EFLIVIKSを加えてもEF-(S7A)HNまたはEF-HNG-KKKの救出作用を阻害することはないと考えられる。図15〜図16に示すとおり、25μM Aβ1-43による大量の神経細胞死は、EFLIVIKS非存在下でEF-(S7A)HNまたはEF-HNG-KKKによって用量依存的に抑制されたが、一方でEF-(S7A)HNまたはEF-HNG-KKKは100μM EFLIVIKS存在下でAβ神経毒性をまったく抑制することができなかった。明らかに対称的に、10μM EF-HNまたはEFLIVIKS-HNG（EF-HNG）は100μM EFLIVIKS存在下でもAβ神経毒性を完全に抑制することができた。この結果は、10μMのHNまたはHNGが、HNまたはHNG自体の二量体化を通して完全な神経保護作用を示すことができるという考えに一致している。二つの異なる生存率アッセイ法から本質的に同じ結果が得られた（図15）。これらのデータは、EF-(S7A)HNまたはEF-HNG-KKKが融合EFLIVIKSを通しての自己二量体化により神経保護機能を発揮することを強く示している。
【０１２０】
実施例9
本実施例（図17）において、HNおよび他のHN誘導体の正または負の二量体化が存在することが証明された。合成(His)6-HNを合成HN-FLAGと混合し、Ni-ビーズにより沈殿させた。沈殿をHN-FLAGについて抗FLAG抗体で調べた。図17Aに示すとおり、HN-FLAGは(His)6-HNによって沈殿したが、一方、Ni-ビーズはそれ自体ではHN-FLAGを沈殿させることができなかった（データは示していない）。同じ条件下で、(S7A)HN-FLAGは、(His)6-(S7A)HNによって沈殿しなかった。EF-(S7A)HN-FLAGは(His)6-EF-(S7A)HNによって、(His)6-HNによるHN-FLAGの沈殿と同じくらい効率的に沈殿した。用いたトリス/トリシンゲルにおいて、EF-(S7A)HN-FLAGの移動はHNの移動からわずかに改変されたが、その代わりに、その移動は不十分なスタッキングにより広いバンドを生じることがあった。
【０１２１】
HN-FLAGが(His)6-HNによってそれらのHN領域を通じて沈殿したことを確認するために、タグ非含有HNを加えた（図17B）。過剰量のタグ非含有HN存在下では、少量のHN-FLAGが(His)6-HNにより沈殿したが、一方過剰量のEFLIVIKSは(His)6-HNによるHN-FLAGの沈殿を妨害することはできなかった。対照的に、(His)6-EF-(S7A)HNによるEF-(S7A)HN-FLAGの沈殿は、過剰量のEFLIVIKSを加えることでブロックされたが、(S7A)HNではされなかった。HNG-KKKは、同じ濃度のHNGがHN-FLAG/(His)6-HN相互作用を消失させた条件下で、(His)6-HNによるHN-FLAGの沈殿に影響しないことも判明した。図17に示す各実験で、(His)6タグHNペプチドも同様に沈殿した（データは示していない）。これらのデータより（i）HNは自己二量体化することができること；（ii）(S7A)HNは自己二量体化についてはほとんど活性がないこと；（iii）EFLIVIKS融合は(S7A)HNの二量体化を可能にすること；および（iv）HNG-KKKはHNとの複合体を形成する活性がほとんどないことが確認された。
【０１２２】
実施例10
本実施例（図18〜図21）において、より強力なHNの誘導体を分析した。例えば、カルセイン蛍光およびWST-8吸光度アッセイ法の両方で評価して（それぞれ図19の上図および下図）、EFLIVIKS融合HNG（EF-HNG、配列番号：19）は1nMで完全な細胞保護を示し、IC50は約100pMであった。以前に記載されているとおり［16］、Aβ1-43誘導性神経細胞死に対するHNG作用のIC50値は約500pMであったため、EFLIVIKSとの融合はHNG作用のさらに数倍の増強を引き起こした。図20の4つの図により、EF-HNGがV642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2のいずれかによる神経細胞障害性に対してIC50約10pMの細胞保護作用を有するが、真正HNGはFAD遺伝子による細胞死を約30pMのIC50で抑制したことを示しており、ここでもEFLIVIKS融合がHNGの作用を2倍〜3倍増強することを示している。
【０１２３】
EF-HNGよりもさらに強力に、EF-AGA-HNG（配列番号：22）は、10pMで25μM Aβ1-43に対する神経保護を示した（図18ならびに図19の上図および下図）。IC50値は、カルセインアッセイ法で評価して約100fM、WST-8アッセイ法で評価して約1pMであった。これら二つのアッセイ法間で観察されたIC50値の差は、ニューロンのカルセイン蛍光は神経突起の生存率だけでなく神経細胞体の生存率も反映するが、WST-8アッセイ法は主に神経細胞体の生存率を表すという公知の事実によるものであった。したがって、結果はこのHN誘導体が神経細胞体の生存率よりも神経突起の生存率に対して、わずかに強い作用を有することを示している。
【０１２４】
EF-AGA-HNGの細胞保護作用の強度増大は、FAD遺伝子による神経細胞障害性の場合にも同様であった。図20の右の4つの図に示すとおり、10pMで、EF-AGA-HNGはV642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2のいずれかによる神経細胞障害性に対して完全な細胞保護を示した。IC50値は共通して約100fMであった。EF-HNGとAGA-HNGとの間で観察された作用強度の差は、F11細胞では観察されなかった。FAD遺伝子トランスフェクトF11細胞を様々な濃度のAGA-HNGまたはEF-AGA-HNGで処理しても、各FAD遺伝子の発現はほとんどまたは僅かしか変化しなかった（図21）。したがって、EF-AGA-HNGは、FAD遺伝子による神経細胞障害性に対する細胞保護作用を示すことが知られているHN誘導体の中で、最も強力なHN誘導体である。
【０１２５】
（表５）HN誘導体および他のペプチドの一覧
2006503553.tif 000006
【０１２６】
略称、配列、および抑制作用の強度を各ペプチドについて示している。強度は各ペプチドのAβおよび４つのFAD遺伝子（V642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、およびN141I-PS2）に対する作用（*で示す）、またはAβおよびV642I-APPに対する作用（**で示す）の概要を示している。「完全保護」とは、完全な細胞保護を示した各ペプチドの最低濃度を示している。「完全NE」とは、10μMで細胞保護効果を持たなかった対応するペプチドを示している。p-Sとは、ホスホリル化L-Serを示す。表5は、二量体化ペプチドであるEFLIVIKS（配列番号：20）も含んでいる。
【０１２７】
産業上の利用可能性
本発明は神経変性疾患に関係する細胞障害性から神経細胞を保護する際に有用な、ヒューマニン誘導体を提供する。有効性がより高くしたがって有効量がより低いことから、HN誘導体は、天然型HNよりも良好な治療剤となる。ペプチドの有効量がより低いことにより、HN誘導体に付随しうる毒性または副作用を最小限にすることができる。同様に、有効量がより低いことによって、これらのペプチドの製造（例えば、遺伝子操作または化学合成）および精製は、経済性といった観点からより現実的になる。さらに、HN誘導体は、神経変性疾患の病理メカニズムを調べるためおよびより多くの薬物を開発するための有効なツールを、製薬企業に提供する。
【０１２８】
他の態様
本発明をその詳細な説明と合わせて記載してきたが、前述の記載は例示を意図するものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって決められることが、理解されるべきである。他の局面、利点、および改変は添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１２９】
引用文献
[1] Shastry, B. S. and Giblin, F. J. (1999) Brain. Res. Bull. 48, 121-127
[2] Yamatsuji, T., Matsui, T., Okamoto, T., Komatsuzaki, K., Takeda, S., Fukumoto, H., Iwatsubo, T., Suzuki, N., Asami-Odaka, A., Ireland, S., Kinane, T. B., Giambarella, U., and Nishimoto, I. (1996) Science 272, 1349-1352
[3] Wolozin, B., Iwasaki, K., Vito, P., Ganjei, J. K., Lacana, E., Sunderland, T., Zhao, B., Kusiak, J. W., Wasco, W., and D'Adamio, L. (1996) Science 274, 1710-1713
[4] Guo, Q., Furukawa, K., Sopher, B. L., Pham, D. G., Xie, J., Robinson, N., Martin, G. M., and Mattson, M. P. (1996) Neuroreport 8, 379-383
[5] Guo, Q., Sebastian, L., Sopher, B. L., Miller, M. W., Glazner, G. W., Ware, C. B., Martin, G. M., and Mattson, M. P. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4125-4130
[6] Zhao, B., Chrest, F. J., Horton, W. E. Jr., Sisodia, S. S., and Kusiak, J. W. (1997) J. Neurosci. Res. 47, 253-263
[7] Zhang, Z., Hartmann, H., Do, V. M., Abramowski, D., Sturchler-Pierrat, C., Staufenbiel, M., Sommer, B., van de Wetering, M., Clevers, H., Saftig, P., De Strooper, B., He, X., Yankner, B. A. (1998) Nature 395, 698-702
[8] Czech, C., Lesort, M., Tremp, G., Terro, F., Blanchard, V., Schombert, B., Carpentier, N., Dreisler, S., Bonici, B., Takashima, A., Moussaoui, S., Hugon, J., and Pradier, L. (1998) Neuroscience 87, 325-336
[9] Weihl, C. C., Ghadge, G. D., Kennedy, S. G., Hay, N., Miller, R. J., and Roos, R. P. (1999) J. Neurosci. 19, 5360-5369
[10] Luo, J. J., Wallace, W., Riccioni, T., Ingram, D. K., Roth, G. S., and Kusiak, J. W. (1999) J. Neurosci. Res. 55, 629-642
[11] Niikura, T., Murayama, N., Hashimoto, Y., Ito, Y., Yamagishi, Y., Matsuoka, M., Takeuchi, Y., Aiso, S., and Nishimoto, I. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 445-454 
[12] Niikura, T., Hashimoto, Y., Okamoto, T., Abe, Y., Yasukawa, T., Kawasumi, M., Hiraki, T., Kita, Y., Terashita, K., Kouyama, K., and Nishimoto, I. (2001) J. Neurosci. 21, 1902-1910
[13] Hashimoto, Y., Niikura, T., Ito, Y., and Nishimoto, I. (2000) J. Biol. Chem. 275, 34541-34551
[14] Hashimoto, Y., Niikura, T., Tajima, H., Yasukawa, Y., Sudo, H., Ito, Y., Kita, Y., Kawasumi, M., Kouyama, K., Doyu, M., Sobue, G., Koide, T., Tsuji, S., Lang, J., Kurokawa, K., and Nishimoto, I. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6336-6341
[15] Hashimoto, Y., Ito, Y., Niikura, T., Shao, Z., Hata, M., Oyama, F., and Nishimoto, I. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 283, 460-468
[16] Hashimoto, Y., Niikura, T., Ito, Y., Sudo, H., Hata, M., Arakawa, E., Abe, Y., Kita, Y., and Nishimoto, I. (2001) J. Neurosci. 21, 9235-9245
[17] Hashimoto, Y., Niikura, T., Ito, Y., Kita, Y., Terashita, K., and Nishimoto, I. (2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 300, 736-745
[18] Hashimoto, Y., Ito, Y., Arakawa, E., Kita, Y., Terashita, K., Niikura, T., and Nishimoto, I. (2002) J. Neurochem. 80, 426-437
[19] D'Adamio, L., Lacana, E., and Vito, P. (1997) Semin. Immunol. 9, 17-23
[20] Tajima, H., Niikura, T., Hashimoto, Y., Ito, Y., Kita, Y., Terashita, K., Yamazaki, K., Koto, A., Aiso, S., and Nishimoto, I. (2002) Neurosci. Lett. in press
[21] Yamatsuji, T., Okamoto, T., Takeda, S., Murayama, Y., Tanaka, N., and Nishimoto, I. (1996) EMBO. J. 15, 498-509
[22] Platika, D., Boulos, M. H., Braizer, L., and Fishman, M. C. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 3499-3503
[23] Hashimoto, Y., Jiang, H., Niikura, T., Ito, Y., Hagiwara, A., Umezawa, K., Abe, Y., Murayama, Y., and Nishimoto, I. (2000b) J. Neurosci. 20, 8401-8409
[24] Loo, D. T., Copani, A., Pike, C. J., Whittemore, E. R., Walencewicz, A. J., and Cotman, C. W. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 7951-7955
[25] Gschwind, M., and Huber, G. (1995) J. Neurochem. 65, 292-300
[26] Sudo, H., Hashimoto, Y., Niikura, T., Shao, Z., Yasukawa, T., Ito, Y., Yamada, M., Hata, M., Hiraki, T., Kawasumi, M., Kouyama, K., and Nishimoto, I. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 282, 548-556
[27] Storms, S. D., and Rutishauser, U. (1998) J. Biol. Chem. 273, 27124-27129
[28] Huang, P., Miao, S., Fan, H., Sheng, Q., Yan, Y., Wang, L., and Koide, S. S. (2000) Mol. Hum. Reprod. 6, 1069-1078
[29] Sudo, H., Jiang, H., Yasukawa, T., Hashimoto, Y., Niikura, T., Kawasumi, M., Matsuda, S., Takeuchi, Y., Aiso, S., Matsuoka, M., Murayama, Y., and Nishimoto, I. (2000) Mol. Cell. Neurosci. 16, 708-723
[30] Hagiwara, A., Hashimoto, Y., Niikura, T., Ito, Y., Terashita, K., Kita, Y., Nishimoto, I., and Umezawa, K. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 278, 633-639
[31] Ghil, S. H., Kim, B. J., Lee, Y. D., and Suh-Kim, H. (2000) J. Neurochem. 74, 151-158
[32] Gururaja, T. L., Narasimhamurthy, S., Payan, D. G., and Anderson, D. C. (2000) Chem. Biol. 7, 515-527 
[33] Xu, X., Leo, C., Jang, Y., Chan, E., Padilla, D., Huang, B. C., Lin, T., Gururaja, T., Hitoshi, Y., Lorens, J. B., Anderson, D. C., Sikic, B., Luo, Y., Payan, D. G., and Nolan, G. P. (2001) Nat. Genet. 27, 23-29
[34] Wolosker, H., Blackshaw, S., and Snyder, S. H. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 13409-13414
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】表記の濃度のD-Ser HNペプチドの存在下または非存在下における神経細胞障害性試験の結果を表す代表的な細胞カルセイン蛍光顕微鏡写真を示す。Aβ1-43またはFAD遺伝子による神経細胞障害性に及ぼすD-Ser HNペプチドの影響を示す。初代培養ニューロンを、25 μM Aβ1-43によって処置して、（D-Ser14）HNまたは（D-Ser7）HNの表記の濃度の存在下または非存在下において培養した。Aβ処置の開始72時間後、生存しているニューロンをカルセイン-AMによって染色した。細胞カルセイン蛍光の代表的な顕微鏡写真を示す。
【図２】表記の濃度のD-Ser HNペプチドの存在下または非存在下における神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。Aβ1-43またはFAD遺伝子による神経細胞障害性に及ぼすD-Ser HNペプチドの影響を示す。上のパネル（A）および左下（B）のパネル：初代培養ニューロン（2.5×104個/ウェル）を25 μM Aβ1-43によって処置して、（D-Ser14）HNまたは（D-Ser7）HNの漸増濃度の存在下または非存在下（-）において培養した。細胞生存率はそれぞれ、Aβ処置の72時間後にカルセイン蛍光アッセイ法（上のパネル）およびWST-8吸光度アッセイ法（下のパネル）によって測定した。他のパネル（C〜F）：F11細胞に、いずれかのFAD遺伝子（V642I-APP cDNA、NL-APP cDNA、M146L-PS1 cDNA、N141I-PS2 cDNA）をトランスフェクトして、表記のように様々な濃度（10 pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM、100μM（左から右に））の（D-Ser14）HNまたは（D-Ser7）HNの存在下または非存在下（-）において培養した。細胞の死亡率は、トランスフェクションの72時間後にトリパンブルー排除アッセイ法によって測定した。それぞれの実験において、細胞をトランスフェクション後の陽性対照として10 nM HNG（HNG）と共にインキュベートした。それぞれの実験において陰性対照（非処置）として、細胞に、プラスミドなしのトランスフェクション技法を行って、またはAβを含まない処置を行って、培地と共に72時間培養した。もう一つの対照として、細胞に空のベクター（vec）をトランスフェクトして、培地と共に72時間培養した。特に明記していない限り、実施例において示された値は、少なくとも3回の独立した実験での平均値±S.D.を示す。
【図３】表記の濃度のD-Ser HNペプチドの存在下または非存在下での神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。F11細胞に、いずれかのFAD遺伝子（V642I-APP cDNA、NL-APP cDNA、M146L-PS1 cDNA、N141I-PS2 cDNA）をトランスフェクトして、表記のように様々な濃度（10 pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM、100μM（左から右に））の（D-Ser14）HNまたは（D-Ser7）HNの存在下または非存在下（-）において培養した。細胞の死亡率は、図2と同じように測定した。
【図４】表記の濃度のD-Ser HNペプチドの存在下または非存在下での神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。F11細胞に、いずれかのFAD遺伝子（V642I-APP cDNA、NL-APP cDNA、M146L-PS1 cDNA、N141I-PS2 cDNA）をトランスフェクトして、表記のように様々な濃度（10 pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM、100μM（左から右に））の（D-Ser7/14）HNの存在下または非存在下（-）において培養した。細胞の死亡率は、図2と同じように測定した。
【図５】表記の濃度のAGA-(D-Ser14)HNの存在下または非存在下での神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。Aβ1-43またはFAD遺伝子による神経細胞障害性に及ぼすAGA-(D-Ser14)HNの影響を示す。上のパネル（A）および左下（B）の小さいパネル：初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、AGA-(D-Ser14)HNの様々な濃度（左から右に10 pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM）の存在下または非存在下（-）で培養した。細胞死亡率および生存率はいずれも、Aβ処置の72時間後にトリパンブルー排除アッセイ法（％死細胞の縦軸で示すパネル）およびカルセインアッセイ法（カルセイン蛍光強度の縦軸で示すパネル）によってそれぞれ測定した。カルセイン実験は、24ウェルプレートに播種したニューロンについて実施した（実施例を参照されたい）。96ウェルプレートに播種したニューロンについて同じ実験を行って、類似の結果を得た。カルセイン実験における値は、「非処置」の値の百分率を示す。上のパネル（C）および右下（D）の小さいパネル：F11細胞に、いずれかのFAD遺伝子（V642I-APP cDNA、NL-APP cDNA、M146L-PS1 cDNA、N141I-PS2 cDNA）をトランスフェクトして、様々な濃度（左から右に10 pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM、100μM）のAGA-（D-Ser14）HNの存在下または非存在下（-）において培養した。細胞の死亡率は、トリパンブルー排除アッセイ法によってトランスフェクションの72時間後に測定した。それぞれの実験において、細胞をトランスフェクションまたはAβ処置後の陽性対照として10 nM HNGと共にインキュベートした。各実験における陰性対照（非処置）として、細胞に、プラスミドを含まないトランスフェクション技法を行うか、またはAβによる処置を行わずに、培地と共に72時間培養した。もう一つの対照として、細胞に空のベクター（vec）をトランスフェクトして、培地と共に72時間培養した。
【図６】表記の濃度のAGA-（D-Ser14）HN17の存在下または非存在下での神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。Aβ1-43またはFAD遺伝子による神経細胞障害性に及ぼすAGA-（D-Ser14）HN17ペプチドの作用は、図5に示す場合と同じであると推定された。
【図７】表記の濃度の（S7A）HN、（S7A）HNG17、HNG、またはHNG-KKKの存在下または非存在下での神経細胞障害性試験の結果を表す代表的な細胞カルセイン蛍光顕微鏡写真を示す。Aβ1-43による神経細胞障害性に及ぼす影響を示す。初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、表記の濃度の（S7A）HNG17、（S7A）HN、HNG、またはHNG-KKKの存在下または非存在下で培養した。Aβ処置の開始72時間後、生きているニューロンをカルセイン-AMによって染色した。細胞カルセイン蛍光の代表的な写真を示す。
【図８】表記の濃度の（S7A）HNまたは（S7A）HNG17の存在下または非存在下での神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。Aβ1-43による神経細胞障害性に及ぼす影響を示す。初代培養ニューロン（2.5×104個/ウェル[A、B]または5×104個/ウェル[C、D]で培養）を、25 μM Aβ1-43によって処置して、様々な濃度（左から右に10 pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM）の（S7A）HNまたは（S7A）HNG17の存在下または非存在下（-）で培養した。細胞の死亡率は、Aβ処置の72時間後にカルセインアッセイ法（B、D）またはWST-8アッセイ法（C、E）によって測定した。各実験における陰性対照（非処置）として、細胞をAβによって処置せずに、培地と共に72時間培養した。
【図９】表記の濃度の（S7A）HN、（S7A）HNG17、HNG、またはHNG-KKKの存在下または非存在下における神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。V642I-APPまたはAβ1-43による神経細胞障害性に及ぼす影響を示す。A：F11細胞に、V642I-APP cDNAをトランスフェクトして、またはトランスフェクトせずに（非処置）、様々な濃度（左から右に10 pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM）の（S7A）HNまたは（S7A）HNG17の存在下または非存在下（-）で培養した。細胞死亡率は、トリパンブルー排除アッセイ法によってトランスフェクションの72時間後に測定した。もう一つの対照として、細胞に空のベクター（vec）をトランスフェクトして、培地と共に72時間培養した。B：Aβ1-43による神経細胞死に及ぼすHNG-KKKの影響。初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、10 nM HNG-KKKまたはHNGの存在下または非存在下で培養した。細胞生存率は、Aβ処置の72時間後にそれぞれ、WST-8アッセイ法（右の小さいパネル）およびカルセインアッセイ法（左の小さいパネル）によって測定した。各実験において陰性対照（非処置）として、細胞にAβ処置を行わずに、培地と共に72時間培養した。
【図１０】表記の濃度のEFLIVIKS、EF-（S7A）HN、HNG-KKK、EF-HNG-KKK、またはEF-HNの存在下または非存在下での神経細胞障害性試験の結果を表す代表的な細胞カルセイン蛍光顕微鏡写真を示す。初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、EFLIVIKS、EF-（S7A）HN、HNG-KKK、EF-HNG-KKK、またはEF-HNの存在下または非存在下で培養した。Aβ処置開始の72時間後、生きているニューロンをカルセイン-AMによって染色した。細胞カルセイン蛍光の代表的な写真を示す。
【図１１】表記の濃度の（C8A）HN（HNA）、EF-（C8A）HN、EF-（S7A）HN、HNG-KKK、またはHNの存在下または非存在下での神経細胞障害性試験の結果を表す代表的な細胞カルセイン蛍光顕微鏡写真を示す。初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、表記の濃度のEF-（S7A）HN、EF-HNG-KKK、EF-（C8A）HN、（C8A）HN（HNA）、またはHNの存在下または非存在下で培養した。Aβ処置開始の72時間後、生きているニューロンをカルセイン-AMによって染色した。細胞カルセイン蛍光の代表的な写真を示す。
【図１２】表記の濃度の（C8A）HN（HNA）、EF-（C8A）HN、EFLIVIKS、EF-（S7A）HN、HNG-KKK、EF-HNG-KKK、EF-HNまたはHNの存在下または非存在下における神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、EFLIVIKS-融合HNペプチドまたは対応する非融合HNペプチドの漸増濃度の存在下において培養した。細胞生存率は、Aβ処置の72時間後にカルセインアッセイ法によって測定した。陰性対照として（非処置）、細胞にAβ1-43による処置を行わずに培地と共に72時間培養した。EF-HNAおよびHNAを用いた実験は10 μMペプチドによって行った。ニューロンは、10 μM EF-HNAまたは10 μM HNAの存在下または非存在下において25 μM Aβ1-43によって処置した。
【図１３】表記の濃度の（C8A）HN（HNA）、EF-（C8A）HN、EFLIVIKS、EF-（S7A）HN、HNG-KKK、EF-HNG-KKK、EF-HNまたはHNの存在下または非存在下における神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、EFLIVIKS-融合HNペプチドまたは対応する非融合HNペプチドの漸増濃度の存在下において培養した。細胞生存率は、Aβ処置の72時間後にWST-8アッセイ法によって測定した。陰性対照として（非処置）、Aβ1-43による処置を行わずに細胞を培地と共に72時間培養した。EF-HNAおよびHNAを用いた実験は10 μMペプチドによって行った。ニューロンは、10 μM EF-HNAまたは10 μM HNAの存在下または非存在下において25 μM Aβ1-43によって処置した。右のパネルにおいて、100 nM EF-HNG-KKKの存在下でのWST-8細胞生存率に関するS.D.の値は、0.149であった。
【図１４】表記の濃度の（C8A）HN（HNA）、EF-（C8A）HN、EFLIVIKS、EF-（S7A）HN、HNG-KKK、EF-HNG-KKK、EF-HNまたはHNの存在下または非存在下における神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。F11細胞にV642I-APP cDNAをトランスフェクトして、EFLIVIKS-融合HNペプチドまたは対応する非融合HNペプチドの漸増濃度の存在下において培養した。細胞死亡率は、Aβ処置の72時間後にトリパンブルー排除アッセイ法によって測定した。陰性対照として、細胞に、プラスミドを含まないトランスフェクション技法を行うか（トランスフェクションなし）、または空のベクターをトランスフェクト（vecトランスフェクション）して、培地と共に72時間培養した。右下の隅のパネルにおいて、EF-HNG-KKKの細胞保護作用の曲線との比較を容易にするために、図7Bに示すようにEF-HNGの細胞保護作用の用量反応曲線を重ね合わせる。
【図１５】EF-（S7A）HN、EF-HNG-KKK、EF-HN、またはEF-HNGの神経保護作用に及ぼすEFLIVIKSの遮断作用を表すグラフを示す。初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、100 μM EFLIVIKSの存在下でEF-（S7A）HN（EF-S7A-HN）またはEF-HNG-KKK（EF-HNG-KKK）の表記の漸増の濃度と共に培養した。Aβ処置の開始72時間後、ニューロンの生存率をWST-8アッセイ法（左のパネル）およびカルセインアッセイ法（右のパネル）によって定量した。25 μM Aβ1-43の存在下でEFLIVIKSの非存在下におけるEF-（S7A）-HNまたはEF-HNG-KKKの神経保護作用[EFLIVIKS（-）でのEF-S7A-HN、またはEFLIVIKS（-）でのEF-HNG-KKK]を示す（n＝1）。非処置（非処置）、Aβ処置のみの他に、他の対照は、25 μM Aβ1-43に対する10 μM EF-HN（EF-HN）またはEF-HNG（EF-HNG）の救出機能に及ぼす100 μM EFLIVIKSの負の作用であった。
【図１６】EF-（S7A）HN、EF-HNG-KKK、EF-HN、またはEF-HNGの神経保護作用に及ぼすEFLIVIKSの遮断作用を表す代表的な細胞カルセイン蛍光顕微鏡写真を示す。初代ニューロンを、ペプチドの表記の組み合わせ[EFLIVIKS、100 μM；EF-HNG-KKK、10 μM；EF-（S7A）HN（EF-S7Aとして省略）、10 μM；EF-HN、10 μM；EF-HNG、10 μM]の存在下または非存在下において25 μM Aβ1-43によって処置したまたは処置しない場合の、細胞カルセイン蛍光の代表的な写真を示す。
【図１７】HNまたは他のHN誘導体の陽性または陰性の二量体形成を示す免疫沈殿-ウェスタンブロットアッセイ法の結果を示す。A：C末端のFLAG-タグをつけたHN誘導体ペプチド[HN-DYKDDDDK（HNFLAG）、（S7A）HN-DYKDDDDK（S7A-FLAG）、EFLIVIKS-（S7A）HN-DYKDDDDK（EF-S7A-FLAG）]を、（His）6タグペプチド[(His)6-HN（His-HN）、（His）6-（S7A）HN（His-S7A）、または（His）6-EFLIVIKS-（S7A）HN（His-EF-S7A）]を固定したNi-ビーズによって沈殿させた。沈殿物をトリス／トリシンゲル電気泳動および抗FLAG抗体によって分析した。パネルの左側の数値は、kDaでの分子量を示す。B：FLAGタグHN誘導体ペプチド（His-HNまたはHis-EF-S7A）を、各競合物質の過剰量の存在下[なし（-）、100 nmolタグなしHN（HN）、100 nmol EFLIVIKS（EF）、100 nmol（S7A）HN（S7A）、10 nmol HNG（HNG）、または10 nmol HNG-KKK（HNG-KKK）]で、（His）6-タグHN誘導体ペプチド（HN-FLAGまたはEF-S7A-FLAG）によって沈殿させた。沈殿物におけるFLAGペプチドは、M2抗体によって検出した。パネルの左側のバーは、kDaでの分子量を示す（上から下に、30、21.5、14.3、6.5、3.4）。
【図１８】表記の濃度のEF-AGA-HNGまたはEF-HNGの存在下または非存在下における神経細胞障害性試験の結果を表す代表的なカルセイン蛍光顕微鏡写真を示す。初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、表記の濃度のEF-AGA-HNGまたはAGA-HNGの存在下または非存在下において培養した。Aβ処置開始の72時間後、生きているニューロンをカルセイン-AMによって染色した。細胞カルセイン蛍光の代表的な写真を示す。
【図１９】EF-AGA-HNG、EF-HNG、またはAGA-HNGの存在下または非存在下での細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。AβまたはFAD遺伝子による神経細胞障害性に及ぼすEF-AGA-HNGの影響。初代培養ニューロンを25 μM Aβ1-43によって処置して、表記のように、EF-AGA-HNG、EF-HNG、またはAGA-HNGの漸増濃度の存在下で培養した。細胞生存率は、Aβ処置の72時間後にカルセイン蛍光アッセイ法（上のパネル）またはWST-8吸光度アッセイ法（下のパネル）によって測定した。値は、Aβ処置を行わない細胞から得たカルセイン蛍光（上のパネル）または特異的WST-8吸光度（WST-8の吸光度−非特異的吸光度）の百分率として示す。
【図２０】EF-AGA-HNG、EF-HNG、またはAGA-HNGの存在下または非存在下における神経細胞障害性試験の結果を表すグラフを示す。F11細胞に、いずれかのFAD遺伝子（V642I-APP cDNA、NL-APP cDNA、M146L-PS1 cDNA、N141I-PS2 cDNA）をトランスフェクトして、漸増濃度のEF-AGA-HNG（四角と線）、EF-HNG（三角と線）、またはAGA-HNG（丸と太い線）の存在下で培養した。細胞の死亡率は、トランスフェクションの72時間後にトリパンブルー排除アッセイ法によって測定した。
【図２１】表記の濃度のEF-AGA-HNGまたはEF-HNGの存在下または非存在下でV642I-APP、NL-APP、M146L-PS1、またはN141I-PS2の発現試験の結果を表すイムノブロット写真を示す。F11細胞にV642I-APP cDNA、NL-APP cDNA、M146L-PS1 cDNA、またはN141I-PS2 cDNAをpcDNAまたはpcDNA（vec）においてトランスフェクトして、EF-AGA-HNG（1 fM、10 fM、100 fM、1 pM、10 pM、100 pM、1 nM、10 nM、100 nM）またはAGA-HNG（1 pM、10 pM、100 pM、1 nM）の漸増濃度の存在下または非存在下で培養した。細胞溶解物にSDS-PAGEおよび抗APP抗体22C11（上のパネル；矢印はV642I-APP（パネルA）またはNL-APP（パネルB）のホロタンパク質を示す）；抗PSI抗体[左下のパネル；上および下の矢印はそれぞれ、M146L-PS1のホロタンパク質およびN末端断片（NTF）を示す]（パネルC）、または抗PS2抗体[右下のパネル；上および下の矢印はそれぞれ、N141I-PS2のホロタンパク質およびC末端断片（CTF）を示す]（パネルD）によるイムノブロットアッセイ法を行った。パネルの左側の数値は、kDaでの分子量を示す。
【図１】
2006503553.tif 000007
【図２】
2006503553.tif 000008
【図３】
2006503553.tif 000009
【図４】
2006503553.tif 000010
【図５】
2006503553.tif 000011
【図６】
2006503553.tif 000012
【図７】
2006503553.tif 000013
【図８】
2006503553.tif 000014
【図９】
2006503553.tif 000015
【図１０】
2006503553.tif 000016
【図１１】
2006503553.tif 000017
【図１２】
2006503553.tif 000018
【図１３】
2006503553.tif 000019
【図１４】
2006503553.tif 000020
【図１５】
2006503553.tif 000021
【図１６】
2006503553.tif 000022
【図１７】
2006503553.tif 000023
【図１８】
2006503553.tif 000024
【図１９】
2006503553.tif 000025
【図２０】
2006503553.tif 000026
【図２１】
2006503553.tif 000027
【配列表】
2006503553000001.app
【国際調査報告】
2006503553.tif 000028
2006503553.tif 000029
2006503553.tif 000030
2006503553.tif 000031
2006503553.tif 000032