(57)【要約】本発明は、機能的α−４−インテグリンタンパク質を発現できないマウス、および、α−４インテグリンアンタゴニスト活性に関する薬剤を分析する方法、ならびに、遺伝子マーカーとしてＶＬＡ−４調節因子、特にアンタゴニストの有効性を分析する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウス。
【請求項２】
表現型が、
ａ）機能的α−４インテグリンを含む第一の遺伝子マーカーが検出不可能なレベルであること、および、
ｂ）ノックアウトマウスにおける第二の遺伝子マーカーのレベルが、コントロール野生型マウスにおける前記遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されていること、
を含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
第二の遺伝子マーカーが、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，ｄ−ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４,５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
第二の遺伝子マーカーのレベルの調節が、コントロール野生型マウスで測定された第二の遺伝子マーカーのレベルと比べて、前記マウスで測定された前記第二の遺伝子マーカーのレベルが増加することを含み、前記第二の遺伝子マーカーは、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項３に記載のマウス。
【請求項５】
第二の遺伝子マーカーのレベルが調節されることが、ノックアウトマウスで測定された
第二の遺伝子マーカーのレベルが、コントロール野生型マウスで測定された前記第二の遺伝子マーカーのレベルと比べて減少することを含み、前記第二の遺伝子マーカーは、
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４,５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；または、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ、
を含む、請求項３に記載のノックアウトマウス。
【請求項６】
マウスがノックアウトマウスであり、そのゲノムは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子を有し、
（ａ）前記第一の対立遺伝子は、前記第一の対立遺伝子に、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現させないような欠陥を含み；
（ｂ）前記第二の対立遺伝子は、前記第二の対立遺伝子に、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現させないような欠陥を含み；および、
（ｃ）前記ゲノムは、操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンプロモーターをコードするｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子の２つのコピーを含み、
前記ノックアウトマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない、請求項１に記載のマウス。
【請求項７】
欠陥が、前記第一の対立遺伝子および前記第二の対立遺伝子における１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失を含む、請求項６に記載のノックアウトマウス。
【請求項８】
導入遺伝子が、操作可能にｔｅｔＰプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする前記単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含み、かつ、配列番号１のＤＮＡ配列を含む、請求項６に記載のノックアウトマウス。
【請求項９】
機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスであって、
（ａ）対立遺伝子に機能的α−４インテグリンタンパク質を発現させないような欠陥を有する、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子；および、
（ｂ）配列番号１のＤＮＡ配列を含む導入遺伝子の２つのコピー、
を含むゲノムを有し、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウス。
【請求項１０】
機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法であって、
（ａ）機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子を含む２種のノックアウトマウスを交雑する工程［各ノックアウトマウスの第一または第二の対立遺伝子のいずれかが機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないように、ノックアウトマウスはそれぞれ第一の対立遺伝子または第二の対立遺伝子のいずれかに欠陥を含む］；
（ｂ）工程（ａ）の交雑で得られた胚を回収すること［胚は、欠陥に関してヘテロ接合型である］；
（ｃ）操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子を、工程（ｂ）で回収された各胚に挿入し、トランスフェクトされた胚を形成する工程；
（ｄ）トランスフェクトされた胚を偽妊娠雌マウスに挿入し、それにより偽妊娠雌マウスがマウスを産むようにすること［産まれるマウスのゲノムは、
（ｉ）機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子（第一または第二の対立遺伝子のいずれかが対立遺伝子に機能的α−４インテグリンタンパク質を発現させないような欠陥を含む）、および、
（ii）前記ゲノムに統合されている導入遺伝子、
を含む］；および、
（ｅ）工程（ｄ）で生産された２種のマウスを交雑し、α−４ホモ接合型ノックアウトマウス（そのゲノム内に導入遺伝子の２つのコピーを含む）を生産すること、
を含み、工程（ｅ）で得られたノックアウトマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法。
【請求項１１】
工程（ａ）の第一の対立遺伝子または第二の対立遺伝子のいずれかにおける欠陥が、第一の対立遺伝子または第二の対立遺伝子が機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないような第一の対立遺伝子または第二の対立遺伝子の破壊を含む、請求項１０に記載の機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法。
【請求項１２】
導入遺伝子が配列番号１のＤＮＡ配列を含む、請求項１０に記載の機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法。
【請求項１３】
導入遺伝子を胚に挿入する工程が、
（ａ）導入遺伝子を発現ベクターに挿入する工程；および、
（ｂ）ベクターを胚に挿入すること、
を含む、請求項１０に記載の機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法。
【請求項１４】
工程（ａ）の２種のヘテロ接合型α−４ノックアウトマウスは、ジャクソンラボラトリーのストック番号００２４６３を付与されたものである、請求項１０に記載の機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法。
【請求項１５】
機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法であって、
（ａ）ジャクソンラボラトリーのストック番号００２４６３を付与された２種のヘテロ接合型α−４インテグリンノックアウトマウスを交雑する工程；
（ｂ）工程（ａ）の交雑で得られた胚を回収する工程；
（ｃ）配列番号１のＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を工程（ｂ）で回収された各胚に挿入して、トランスフェクトされた胚を形成する工程；
（ｄ）偽妊娠雌マウスがゲノム内に導入遺伝子を有するα−４インテグリンヘテロ接合型ノックアウトマウスを産むように、トランスフェクトされた胚を偽妊娠雌マウスに挿入する工程；および、
（ｅ）工程（ｄ）で生産された２種のノックアウトマウスを交雑し、ゲノム内に導入遺伝子の２つのコピーを含むホモ接合型α−４インテグリンノックアウトマウスを生産する工程；
を含み、その結果、工程（ｅ）のノックアウトマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法。
【請求項１６】
（ａ）野生型マウスに薬剤を投与する工程；
（ｂ）野生型マウスで遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）の測定値と、コントロール野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルとを比較する工程、
を含み、野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが、コントロール野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されることは、薬剤がα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性を有する可能性があることを示す、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニストとして可能性のある活性に関して薬剤を分析する方法。
【請求項１７】
遺伝子マーカーが、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４,５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが調節されることが、コントロール野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて増加することを含み、ここで、遺伝子マーカーは、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８  ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子マーカーのレベルが調節されることが、野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが、コントロール野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて減少することを含み、ここで、遺伝子マーカーは、
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ：
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；または、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ、
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）機能的α−４インテグリンを発現できないマウスに薬剤を投与する工程；
（ｂ）マウスで遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；および、
（ｃ）マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと、機能的α−４インテグリンを発現できないコントロールマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルとを比較する工程、を含み、マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが、コントロールマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されることは、薬剤がα−４インテグリンタンパク質アンタゴニストに関連する有害な副作用を改善する活性を有する可能性があることを示す、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニストに関連する有害な副作用を改善する活性に関して薬剤を分析する方法。
【請求項２１】
遺伝子マーカーは、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，ｄ−ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１．ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４,５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
調節されることが、コントロールマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて、マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが増加することであり、ここで、遺伝子マーカーは、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
調節されることが、コントロールノックアウトマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて、ノックアウトマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルにおいて減少することであり、ここで、遺伝子マーカーは、
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４,５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；または、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ、
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
マウスおよびコントロールマウスがノックアウトマウスであり、そのゲノムが、
（ａ）対立遺伝子に機能的α−４インテグリンタンパク質を発現させないような欠陥を有する機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子；および、
（ｂ）操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子の２つのコピー、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
導入遺伝子が、操作可能にｔｅｔＰプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の部分を含み、配列番号１のＤＮＡ配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）哺乳動物から第一の血液サンプルを採取し、第一の血液サンプル中の幹細胞前駆体濃度を測定する工程；
（ｂ）薬剤を哺乳動物に投与する工程；
（ｃ）哺乳動物から第二の血液サンプルを採取し、第二の血液サンプルで幹細胞前駆体濃度を測定する工程；および、
（ｄ）第一の血液サンプルで測定された幹細胞前駆体濃度と、第二の血液サンプルで測定された幹細胞前駆体濃度とを比較する工程、
を含み、第二の血液サンプルで測定された幹細胞前駆体濃度が、第一の血液サンプルで測定された幹細胞前駆体濃度と比べて増加することは、薬剤がα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性を有する可能性があることを示す、可能性のあるα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性に関して薬剤を分析する方法。
【請求項２７】
哺乳動物が、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、またはヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）薬剤を哺乳動物に投与する工程；
（ｂ）哺乳動物の血液で幹細胞前駆体濃度を測定する工程；および、
（ｃ）哺乳動物の血液における幹細胞前駆体の測定濃度と、コントロール哺乳動物の血液における幹細胞前駆体の測定濃度とを比較する工程、
を含み、哺乳動物の血液の幹細胞前駆体濃度が、コントロール哺乳動物の血液の幹細胞前駆体濃度と比べて増加することは、薬剤がα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性を有する可能性があることを示す、可能性のあるα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性に関して薬剤を分析する方法。
【請求項２９】
哺乳動物が、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウスまたはヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
マウスが、トランスジェニックマウスであり、そのゲノムが、
（ａ）機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる対立遺伝子を含まず；かつ、
（ｂ）操作可能にプロモーターと結合した機能的α−４インテグリン機能的タンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子の２つのコピーを含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項３１】
導入遺伝子が、操作可能にｔｅｔＰプロモーターと結合した機能的α−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含み、配列番号１のＤＮＡ配列を含む、請求項３０に記載のマウス。
【請求項３２】
（ａ）化合物または薬剤を生物に投与する工程；
（ｂ）生物から採取された生体サンプルで、ＶＬＡ−４受容体シグナリングに関する遺伝子マーカーの発現レベルを測定する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）の遺伝子マーカーの発現レベルと、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベルとを比較する工程、
を含み、ここで、生体サンプルとコントロール生体サンプルとで測定された遺伝子マーカーの発現レベルの差は、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリングを調節することを示す、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節するかどうかを決定する方法。
【請求項３３】
コントロール生体サンプルが、化合物または薬剤の投与の前に生物から採取された生体サンプル、または、化合物または薬剤が投与されていない実質的に類似の生物から採取された生体サンプルを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子マーカーが、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，ｄ−ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４,５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
生体サンプルにおける遺伝子マーカーの発現レベルが、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベル未満であり、これは、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を拮抗することを示し、ここで、遺伝子マーカーは、
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４,５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；または、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ、
を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
生体サンプルにおける遺伝子マーカーの発現レベルが、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベルより大きく、これは、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を拮抗することを示し、ここで、遺伝子マーカーは、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベルが、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベル未満であり、これは、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を拮抗することを示し、ここで、遺伝子マーカーが、マクロファージマンノース受容体ｍＲＮＡ、ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ、ＥＳＴ５７１５３５、およびＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１からなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
化合物または薬剤が、タンパク質、化学物質、またはヌクレオチド配列、ホルモン、炭水化物またはレクチンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
化合物または薬剤が、免疫原としてＶＬＡ−４受容体を有する抗体、ＶＬＡ−４受容体ｍＲＮＡとハイブリダイズするアンチセンス分子、または、ＶＬＡ−４受容体ｍＲＮＡを開裂させるリボザイムである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
（ａ）第一の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｂ）第一の生体サンプルで、マクロファージマンノース受容体ｍＲＮＡ遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；
（ｃ）可能性のあるアンタゴニストを生物に投与する工程；
（ｄ）第二の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｅ）第二の生体サンプルで、マクロファージマンノース受容体ｍＲＮＡ遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；および、
（ｆ）工程（ｂ）と工程（ｅ）との測定レベルを比較する工程、
を含み、工程（ｅ）で測定された遺伝子マーカーのレベルが、工程（ｂ）で測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて減少することは、可能性のあるアンタゴニストがＶＬＡ−４のシグナリング活性を拮抗することにおける有効性を有することを示す、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングの可能性のあるアンタゴニストの有効性を決定する方法。
【請求項４１】
第一および第二の生体サンプルが、体液、体の組織、または、それらの組み合わせを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
可能性のあるアンタゴニストが、タンパク質、ヌクレオチド配列、化学物質、または、それらの組み合わせを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
生物が哺乳動物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
（ａ）化合物または薬剤と、生物からの生体サンプルとを接触させる工程；
（ｂ）生体サンプルで、ＶＬＡ−４受容体シグナリングに関する遺伝子マーカーの発現レベルを測定する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）で測定された遺伝子マーカーの発現レベルと、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベルとを比較する工程、
を含む、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節、特に拮抗する化合物または薬剤の能力を決定する方法。
【請求項４５】
遺伝子マーカーが、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，ｄ−ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４,５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
生体サンプルにおける遺伝子マーカーの発現レベルが、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベル未満であり、これは、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を拮抗することを示し、ここで、遺伝子マーカーが、
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４,５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；または、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ、
を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
生体サンプルにおける遺伝子マーカーの発現レベルが、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベルより大きく、これは、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を拮抗することを示し、ここで、遺伝子マーカーが、
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３,５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；または、
血液の幹細胞前駆体濃度、
を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
ハイスループット様式で実施される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）第一の生体サンプルをマウスから採取する工程；
（ｂ）第一の生体サンプルで、遺伝子マーカーＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓのレベルを測定する工程；
（ｃ）可能性のあるアンタゴニストをマウスに投与する工程；
（ｄ）第二の生体サンプルをマウスから採取する工程；
（ｅ）第二の生体サンプルで、遺伝子マーカーＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓのレベルを測定する工程；および、
（ｆ）工程（ｂ）と工程（ｅ）との測定レベルを比較する工程、
を含み、ここで、工程（ｅ）で測定された遺伝子マーカーのレベルが、工程（ｂ）で測定された遺伝子マーカーのレベルに比べて減少することは、可能性のあるアンタゴニストがＶＬＡ−４のシグナリング活性を拮抗することにおける有効性を有することを示す、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングの可能性のあるアンタゴニストの有効性を決定する方法。
【請求項５０】
第一および第二の生体サンプルが、体液、体の組織、または、それらの組み合わせを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
可能性のあるアンタゴニストが、タンパク質、ヌクレオチド配列、化学物質、または、それらの組み合わせを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）第一の生体サンプルをマウスから採取する工程；
（ｂ）第一の生体サンプルで、遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５のレベルを測定する工程；
（ｃ）可能性のあるアンタゴニストをマウスに投与する工程；
（ｄ）第二の生体サンプルをマウスから採取する工程；
（ｅ）第二の生体サンプルで、遺伝子ＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５のレベルを測定する工程；および、
（ｆ）工程（ｂ）と工程（ｅ）との測定レベルを比較する工程、
を含み、ここで、工程（ｅ）で測定された遺伝子マーカーのレベルが、工程（ｂ）で測定された遺伝子マーカーのレベルに比べて減少することは、可能性のあるアンタゴニストがＶＬＡ−４のシグナリング活性を拮抗する有効性を有することを示す、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングの可能性のあるアンタゴニストの有効性を決定する方法。
【請求項５３】
第一および第二の生体サンプルが、体液、体の組織、または、それらの組み合わせを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
可能性のあるアンタゴニストが、タンパク質、ヌクレオチド配列、化学物質、または、それらの組み合わせを含む、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規で、有用で、かつこれまで未知の、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスに関する。本発明はまた、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウス、およびそれから得られた情報を、α−４インテグリンタンパク質活性を調節する化合物または薬剤、およびＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節する化合物または薬剤を分析することに利用する方法を含む。
【０００２】
優先権の主張
本願は、２００１年１０月１７日付けで出願されたイギリス国仮出願第０１２４８９５.４号の利益を主張し、その全体を参照により本明細書に加入する。
国内優先権の主張
本願は、２００１年６月８日付けで出願された米国仮出願第６０／２９７,１１２号；
「機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウス、および、α−４インテグリンタンパク質−アンタゴニスト活性に関して化合物または薬剤を分析する方法、ならびにＶｌａ−４受容体のシグナリング活性の調節因子の有効性を評価するための遺伝子マーカー」という名称の２００２年５月２３日付けで出願された米国特許仮出願（出願番号は与えられていない）、および、「機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウス、および、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性に関して化合物または薬剤を分析する方法、ならびにＶｌａ−４受容体のシグナリング活性の調節因子の有効性を評価するための遺伝子マーカー」という名称の２００２年５月２９日付けで出願された米国仮出願（出願番号は与えられていない）の利益を主張し、ここで前記出願は、参照によりその全体を本明細書に加入する。
【背景技術】
【０００３】
白血球は、微生物侵入に対する体の防御システムにおける主要作動因子である。これはまた、自己免疫反応プロセスや炎症において体自身の細胞を攻撃することにおいて主要な役割を有する。体の防御システムの一部をなすその他の細胞は、顆粒球およびマクロファージである。これら細胞は非特異的成分である。顆粒球は、好中球、好塩基球および好酸球で構成され、これらはいずれも、微生物に遭遇すると細胞毒性の化合物を放出することができる。マクロファージは、食細胞活動により侵入した抗原を殺すこともできる。
【０００４】
その上、リンパ系は、抗原特異的免疫反応を引き起こし、これは、Ｔ細胞およびＢ細胞（それらの分化の源または部位にちなんでそれぞれ名付けられた）で構成される。特に、Ｔ細胞は、それらの主な分化が起こる場所である胸腺にちなんで名付けられている。３種の異なるタイプのＴ細胞がある。Ｔ−キラー細胞は、ウイルス感染細胞のような外来抗原を提示する細胞を破壊する。ヘルパーＴ細胞は、抗体を生産するＢ細胞を補助する。残りのタイプのＴ細胞は、Ｔ−サプレッサー細胞であり、これは、免疫系の体液性および細胞媒介性の分岐の抑制を媒介する。
【０００５】
同様に、Ｂ細胞はまた、それらが分化し成熟する体の位置、すなわち骨髄にちなんで名付けられている。Ｂ細胞は、ヘルパーＴ細胞に結合すると、特定の外来抗原に対して特異的な抗体を放出する。これら抗体の放出により、抗原の破壊が起こる。
【０００６】
全ての免疫系細胞（上述したものなど）は、循環系およびリンパ系の至る所を循環し、外来抗原から身体を守る。外来生物が身体に侵入すると、免疫系内の様々なカスケードやメカニズムが活性化され、抗原を破壊する。しかしながら、場合によっては、免疫系は、健康な自己由来細胞を攻撃したり、抗原の存在に過剰反応したりして、それにより、いくつか例を挙げると、気管支喘息、若年性糖尿病、バセドー病のような病気、または、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、糖尿病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン病、皮膚筋炎、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、またはグレーブス病のような自己免疫疾患を引き起こす。
【０００７】
α−４インテグリンタンパク質
インテグリンは、相同膜貫通型リンカータンパク質の大規模なファミリーを形成する。インテグリンは、細胞−細胞相互作用および細胞−細胞外基質相互作用のメディエーターとして作用する。全ての受容体は、非共有結合により共に連結したα鎖とβ鎖とからなるヘテロダイマーである。これらの鎖は膜貫通型糖蛋白質サブユニットである。現在、１６種の異なるα鎖と、８種の異なるβ鎖が知られており、組み合わされて少なくとも２２種の異なるインテグリンを形成する［Newham and Humphries，1996］。インテグリンタンパク質のそのリガンドへの結合は、Ｍｇ2+やＣａ2+のような２価カチオンに依存する。
【０００８】
α−４インテグリンタンパク質は、β−１鎖と、ＶＬＡ−４（Very Late Antigen−４）受容体を形成するか、または、β−７鎖とＬＰＡＭ−１（Lymphocytes Payer's Patch Adhesion Molecule）受容体を形成する。両方の受容体は、主として、好中球以外の全てのサブクラスの白血球で発現される［Bochner et al.，1991］、［Dunon et al.，1996］。しかしながら、近年の研究によれば、α−４インテグリンはまた、好中球で発現されることが示されている［Issekutz，1998］、［Taooka  et al.，1999］。ＶＬＡ−４受容体はまた、発生の際に、様々な他の組織で発現され、例えば筋肉  ［Yang et al.，1996］、［Rosen et al., 1992］、肝臓［Jaspers et al.，1995］、胎盤および心臓［Yang et al.，1995］で発現される。α−４インテグリンはまた、細胞外基質の成分として、結合セグメント−１（ＣＳ−１）を介して、オルタナティブスプライシングされたフィブロネクチンセグメントに結合する［Hynes，1992］。ＶＬＡ−４およびＬＰＡＭ−１はまた、内皮に存在するＶＣＡＭ−１（vascular cell Adhesion molecule）に結合することもできる。しかしながら、ＬＰＡＭ−１だけは、消化管関連リンパ節に存在するＭａｄＣＡＭ−１（mucosal vascular addressin）に結合する（Payer's Patches）。
【０００９】
ＶＬＡ−４受容体および接着におけるその役割
ＶＬＡ−４受容体は、白血球で非常に低いレベルで構成的に発現される［Chen et al.，1999］、［Yednock et al.，1995］、［Chan et al.，1991］、［Shimizu et al.，1990］。発現は、「インサイドアウト（inside out）」または「アウトサイドイン（outside in）」メカニズムを介して、細胞の活性化の際に迅速にアップレギュレートされる。ＶＬＡ−４受容体は、白血球の内皮への強固な接着において重要な役割を有する。
【００１０】
白血球の内皮の膜への接着、および、組織への移動は、多数の分子が関与する多段階プロセスである。一般的に、白血球の血管外漏出は、主として高内皮細静脈（ＨＥＶ）で起こり、高内皮細静脈とは、リンパ球遊走に特化した内皮であり、脾臓以外の全ての二次リンパ器官で見出される［Girard and Springer，1995］。殆どの再循環リンパ球は、選択的にＨＥＶに結合し、その他の血管内皮細胞には強固に接着しない。二次リンパ器官の特定の器官へのリンパ球の補充は、「ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）」と呼ばれる。
【００１１】
ＨＥＶにおけるリンパ球の接着と遊走は、初めのうちはＬ−セレクチン−シリアルルイスＸ（ｓＬｅＸ）相互作用で媒介され、その後、ＬＦＡ−ｌ／ＩＣＡＭ−１およびＬＰＡＭ−１／ＭａｄＣＡＭ−１相互作用によりリンパ球は活性化される。活性化に関与する因子および分子は、ＨＥＶではよく特徴付けされていない。末梢非リンパ組織において、接着の第一段階は、内皮の膜に沿って白血球を繋げ、ロールさせることであり、これはセレクチンで媒介される。この相互作用は、さらなる接着経路が活性化されるまでの一時的なものである。
【００１２】
炎症、および多量の体の特定の領域におけるケモカインおよびサイトカインは、白血球の活性化をもたらす。その上、炎症はまた、ＶＬＡ−４を活性化し、その発現は、様々な因子を介してアップレギュレートされ、該因子としては、例えばβ−ケモカインＭＩＰ−１β（マクロファージ炎症性タンパク質）があり、これは接着分子ＣＤ４４への結合を介して白血球に提示される。ＭＩＰ−１βの白血球への提示の際、ＶＬＡ−４は活性化され、強固な細胞接着を媒介する。ＶＬＡ−４はまた、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αを介して活性化される。内皮の膜へ強固に接着した後に限り、白血球は膜を超えて遊走し、組織に入ることができる。
ＶＬＡ−４活性のコントロールを介して炎症をコントロールする試みがなされてきた。例えば、特異的抗体でＶＬＡ−４をブロックすることにより、限定された治療効果を得ることができた。その上、ＶＬＡ−４のブロッキングにより、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からの好酸球の血管外漏出または好酸球蓄積およびモルモット喘息モデルにおける遅発性喘息反応を阻害できることがわかっている［Sagara et al.，1997］。また、可溶性ＶＣＡＭ−Ｉｇ融合タンパク質でのＶＬＡ−４のブロッキングにより、肥満でない糖尿病マウスにおける養子移入による自己免疫の糖尿病の発症を遅らせ得ることがわかっている［Jakubowski et al.，1995］。
【００１３】
加えて、ＶＬＡ−４媒介接着、それによる白血球の組織への遊走は、様々な病気、例えば半月形腎炎［Allen et al.，1999］、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、糖尿病、シェーグレン病［McMurray 1996］、喘息、多発性硬化症、および、神経疾患［Mousa and Cheresh，1997］において主要な役割を有することが提唱されている。
【００１４】
インビボでのＶＬＡ−４またはその欠失の効果をさらに理解するために、および、薬剤がα−４インテグリンアンタゴニスト活性を有するかどうかを決定するインビボで化合物または薬剤を分析する方法を開発するために、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない哺乳動物を開発する試みがなされている。特に、トランスジェニックおよびノックアウトマウスが、インビボでの遺伝子またはタンパク質機能を決定するのに役に立つ手段を提供することがよく理解されている［Capecchi，1994，Capecchi，1989，Capecchi，1989 で総評される］。その上、ノックアウトモデルは、抗体を用いた研究に対して確かな利点を有し、なぜなら、インビボでの不適切な架橋現象、Ｆｃ−受容体介在効果または不十分な浸透により生じる人為的結果により、抗体が誤って導かれる可能性があるためである［Sharpe，1995］。
【００１５】
接着分子のノックアウトマウス
ほとんどの接着分子に関してホモ接合型ノックアウトモデルが開発され、細胞−細胞外基質相互作用に関して研究されている。（［Hynes，1996］、［George and Hynes，1994］、［Ley，1995］、［Hynes，1994］、［Hynes and Wagner，1996］、［Nebert and Duffy，1997］で総評される）。数種のノックアウトは致死性であり、なかでも、以下のインテグリンである：α−４［Yang  et  al., 1995］、α−５［Yang et al.，1993］；α−６［Georges-Labouesse et al.，1996］、α−８［Hynes，1996 に述べられている］、α−９［Hynes，1996 に述べられている］、α−ｖ［Hynes，1996 に述べられている］、β−１［Fassler and Meyer，1995］、［Stephens et al.，1995］、および、β−４［van derNeut et al., 1996］。
【００１６】
ホモ接合型α−４インテグリンノックアウトを作製する近年の試みは、成功していない。α−４インテグリンタンパク質のホモ接合型ノックアウトは、マウスにおいて、胎盤および心臓の発達における深刻な欠陥のために胚の段階で死に至る。［Yang et al.，1995］ 特に、このようなノックアウトマウスにおいて、尿膜と柔毛膜との融合が妊娠１１日目に失敗することがわかっている。約５０％の子孫がこの失敗を克服しているものの、その生き残った子孫は、発達中の心臓の２つの層が共に融合し損ねるために妊娠１４日目に死亡する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、機能的α−４インテグリンタンパク質を生産できなくても、妊娠期を生き抜き、生存可能なマウスに成熟できるマウスが必要である。このようなマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質の拮抗を引き起こす遺伝子型および表現型の効果を決定することにおいて多大な有用性を有する可能性がある。
【００１８】
さらに必要なことは、α−４インテグリンタンパク質活性、または、ＶＬＡ−４受容体、特にそのアンタゴニストのシグナリング活性を調節する能力に関して化合物または薬剤をインビボおよびインビトロで分析する方法である。このような化合物または薬剤は、α−４インテグリンタンパク質またはＶＬＡ−４受容体の発現に関連する病気および疾患、例えば、これらに限定されないが、いくつか例を挙げると、気管支喘息、若年性糖尿病、バセドー病、または、橋本甲状腺炎、悪性貧血，アジソン病、糖尿病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン病、皮膚筋炎、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、またはグレーブス病のような自己免疫疾患の炎症および多血症の治療において用途を有する。
【００１９】
本明細書における全ての参考文献の引用は、このような参考文献が本願の「従来技術」として用いられると認めたものとして解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明によれば、機能的α−４インテグリンタンパク質を生産できない新規かつ有用なマウスを提供する。さらに本発明によれば、α−４インテグリンタンパク質活性またはＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節するそれらの能力に関して、インビボおよびインビトロで化合物または薬剤を分析する新規の方法を提供する。
従って、概括的に、本発明は機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスに及ぶ。
【００２１】
その上、本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスに及び、該マウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を検出することができず、該マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが、コントロール野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されるという表現型を有する。コントロール野生型マウスで測定されたレベルと比べて本発明のマウスで調節される特定の遺伝子マーカーとしては、いくつか例を挙げると以下のものが挙げられる（ただしこれらに限定されない）：
【００２２】
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，ｄ−ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｐａｌｅ  ｅａｒ）（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【００２３】
以下で説明するが、本発明のマウスで測定された、これら遺伝子マーカーのうちのいくつかのレベルは、コントロール野生型マウスで測定されたレベルと比べて増加するが、一方で、本発明のマウスで測定された、その他の遺伝子マーカーのレベルは、遺伝子マーカーのコントロール野生型マウスで測定されたレベルと比べて減少する。本発明のマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが、コントロール野生型マウスで測定されたレベルと比べて増加する遺伝子マーカーとしては、いくつか例を挙げると以下のものが挙げられる：
【００２４】
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【００２５】
同様に、本発明のマウスで測定されたレベルが、野生型コントロールマウスで測定されたレベルと比べて減少する遺伝子マーカーの例としては、いくつか例を挙げると以下のものが挙げられる（ただしこれらに限定されない）：
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；および、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ。
【００２６】
その上、本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスに及び、該マウスは、ノックアウトマウスである。このような本発明のノックアウトマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現することができる第一および第二の対立遺伝子を含み、ここで、第一の対立遺伝子は、第一の対立遺伝子に機能的α−４インテグリンタンパク質を発現させないような欠陥を含み、第二の対立遺伝子は、第二の対立遺伝子に機能的α−４インテグリンタンパク質を発現させないような欠陥を含む。このようなノックアウトマウスはまた、操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子の２つのコピーをそのゲノム内に含む。特定の実施形態において、用いられるプロモーターは、ｔｅｔＰプロモーターであり、導入遺伝子は、配列番号１のＤＮＡ配列を含む。
【００２７】
多数のタイプの欠陥を用いて、本発明のノックアウトマウスが機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できなくなるように対立遺伝子発現を破壊することができる。このような欠陥の例としては、ただしこれらに限定されないが、第一の対立遺伝子および第二の対立遺伝中の１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、挿入、および／または欠失が挙げられる。
【００２８】
その上、本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法に及び、以下の工程：
（ａ）機能的α−４インテグリンタンパク質を発現することができる第一および第二の対立遺伝子を含む２種のノックアウトマウスを交雑する工程［各ノックアウトマウスの第一または第二の対立遺伝子のいずれかが、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないように、ノックアウトマウスはそれぞれ第一の対立遺伝子または第二の対立遺伝子のいずれかに欠陥を含む］；
（ｂ）工程（ａ）の交雑で得られた胚を回収する工程；
（ｃ）操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子を、工程（ｂ）で回収された各胚に挿入し、導入遺伝子が胚のゲノムに取り込まれるようにトランスフェクトされた胚を形成する工程；
（ｄ）偽妊娠雌マウスが機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子を含むマウスを産むように、トランスフェクトされた胚を偽妊娠雌マウスに挿入する工程［第一または第二の対立遺伝子のいずれかが、対立遺伝子に機能的α−４インテグリンタンパク質を発現させないような欠陥と、導入遺伝とを含む］；および、
（ｅ）工程（ｄ）で生産された２種のマウスを交雑し、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子を含むノックアウトマウスを生産する工程［第一および第二の対立遺伝子がそれぞれ、対立遺伝子に機能的α−４インテグリンタンパク質を発現させないような欠陥を含み、ノックアウトマウスのゲノムが導入遺伝子の２つのコピーを含む］；
を含み、工程（ｅ）のノックアウトマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない。
【００２９】
本発明の方法で用途を有するヘテロ接合型α−４ノックアウトマウスの特定の例は、ヘテロ接合型α−４インテグリンノックアウトマウスであり、これは、ジャクソンラボラトリー（Bar Harbor，Maine）から容易に入手可能であり、ジャクソンラボラトリーのストック番号００２４６３が付与されている。これらヘテロ接合型ノックアウトマウスを以下で詳細に説明する。
【００３０】
加えて、本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法に及び、該方法において、導入遺伝子は、操作可能にｔｅｔＰプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含み、配列番号１のＤＮＡ配列を有する。
【００３１】
当然ながら、当業者であれば、導入遺伝子をマウス胚に挿入する多数の方法が容易に利用可能である。このような挿入のための特定の方法は、導入遺伝子を発現ベクターに挿入すること、続いて、発現ベクターを胚に挿入することを含む。本発明において用途を有するその他の方法を以下で説明する。
【００３２】
その上、本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法に及び、以下の工程を含む：
（ａ）ジャクソンラボラトリーのストック番号００２４６３を付与された２種のヘテロ接合型α−４インテグリンノックアウトマウスを交雑する工程［２種のノックアウトマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質をコードする第一または第二の対立遺伝子のいずれかに、対立遺伝子のいずれか１つにおける機能的α−４インテグリンタンパク質発現が破壊されるような欠陥を有する］；
（ｂ）工程（ａ）の交雑で得られた胚を回収する工程；
（ｃ）操作可能にｔｅｔＰプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の部分、および、配列番号１のＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を、工程（ｂ）で回収された胚に挿入して、胚のゲノムに導入遺伝子が含まれるようにトランスフェクトされた胚を形成する工程；
（ｄ）偽妊娠雌マウスがゲノムに導入遺伝子を含むヘテロ接合型α−４ノックアウトマウスを産むように、トランスフェクトされた胚を偽妊娠雌マウスに挿入する工程；および、
（ｅ）工程（ｄ）で生産された２種のマウスを交雑し、ゲノム内に導入遺伝子の２つのコピーを含むホモ接合型α−４ノックアウトマウスを生産する工程。
【００３３】
得られたノックアウトマウスは、双方の対立遺伝子のα−４インテグリンタンパク質を発現する能力を破壊する欠陥に関してホモ接合型であり、そのゲノム中に導入遺伝子の２つのコピーを含む。従って、得られたマウスは、妊娠期を生き抜き、生存可能なマウスに成熟するが、驚くべきことに、かつ意外なことに、成体マウスでは機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない。
【００３４】
他の実施形態において、本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスに及び、ここで該マウスはトランスジェニックマウスである。このような本発明のトランスジェニックマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子が、非機能的に短縮されたα−４インテグリンタンパク質をコードする導入遺伝子の２つのコピーで置換されたゲノムを有し、ここで、導入遺伝子は、操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含む。その結果として、本発明のトランスジェニックマウスは、妊娠期を生き抜き、成体マウスに成熟することができるが、成体マウスでは機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない。
【００３５】
当業者であれば、内因性対立遺伝子または遺伝子を異種核酸分子で置き換えるための多数の方法を容易に利用可能である。本発明において用途を有する特定の方法は相同組換えであり、以下で説明する。
【００３６】
本発明のトランスジェニックマウスの特定の実施形態において、導入遺伝子は、操作可能にｔｅｔＰ−プロモーター［Gossen and Bujard，1992］と結合したα−４インテグリンタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の部分を含み、配列番号１のＤＮＡ配列を含む。
【００３７】
当然ながら、本発明はさらに、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないトランスジェニックマウスの製造方法に及ぶ。このような方法の第一工程は、第一のトランスジェニックマウス（機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できるいずれかの対立遺伝子が、操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子で置換された）と、第二のトランスジェニックマウス（機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できるいずれかの対立遺伝子が、導入遺伝子で置換された）とを交雑することを含む。このような方法の第二工程は、交雑で得られた子孫のなかから、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる双方の対立遺伝子が導入遺伝子の２つのコピーで置換されたゲノムを有するものを選択することを含む。これら選択された子孫は、成体マウスにおいて機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない本発明のトランスジェニックマウスである。
【００３８】
加えて、本発明は、α−４インテグリンタンパク質活性またはＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節、特に拮抗するそれらの能力に関して化合物または薬剤を分析する方法に及ぶ。特に、本発明は、化合物または薬剤を、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のα−４インテグリンタンパク質活性を調節する能力に関して分析する方法に及び、（ａ）化合物または薬剤をマウスに投与する工程、（ｂ）マウスで遺伝子マーカーのレベルを測定する工程、および（ｃ）工程（ｂ）の測定値と、コントロールマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルとを比較する工程、を含む。コントロールマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて、処理マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが調節されることは、その化合物または薬剤が、α−４インテグリンタンパク質活性またはＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の調節因子としての有効性を有する可能性があるということを示す。本発明のこのような方法において用途を有する特定の遺伝子マーカーとしては、いくつか例を挙げると以下のものが挙げられる（ただしこれらに限定されない）：
【００３９】
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，ｄ−ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
【００４０】
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【００４１】
その上、本発明は、化合物を、α−４インテグリン活性またはＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節、特に拮抗する能力に関して分析する方法に及び、該方法において、野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが調節されることは、コントロール野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて増加することを含む。野生型マウスにおけるそれらのレベルと比べて、本発明のノックアウトマウスにおいてレベルが増加したことが決定された遺伝子マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：
【００４２】
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【００４３】
従って、化合物または薬剤をマウスに投与することにより、これら遺伝子マーカーのいずれかのレベルの増加がもたらされるような本発明の方法において、該化合物または薬剤は、α−４インテグリンタンパク質活性またはＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の、可能性のあるアンタゴニストである。
【００４４】
加えて、本発明は、化合物または薬剤をα−４インテグリンアンタゴニスト活性に関して分析する方法に及び、該方法において、野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが調節されることは、コントロール野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて減少することを含む。α−４インテグリンタンパク質の活性が減少または拮抗するされた場合にレベルが減少する遺伝子マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：
【００４５】
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄ；または、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ。
【００４６】
その結果として、化合物または薬剤のマウスへの投与により、これら遺伝子マーカーのいずれかのレベルの減少をもたらすような本発明の方法において、該化合物または薬剤は、α−４インテグリンタンパク質活性またはＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の可能性のあるアンタゴニストである。
【００４７】
その上、本発明は、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニストに関連する有害な副作用を改善する活性に関して化合物または薬剤を分析する方法に及び、以下の工程：
（ａ）化合物または薬剤を機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない本発明のマウスに投与する工程；
（ｂ）マウスで遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；および、
（ｃ）マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない本発明のコントロールマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルとを比較する工程、
を含み、化合物または薬剤を投与されたマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないコントロールマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されることとは、その化合物または薬剤が、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニストに関連する有害な副作用を改善する活性を有する可能性があることを示す。この実施形態において用途を有する遺伝子マーカーの例は上述されている。当然ながら、この実施形態における調節は、上述したα−４インテグリンアンタゴニスト活性に関して化合物または薬剤を分析する方法おいて観察される調節とは反対の方向である。従って、α−４インテグリン活性を有する化合物または薬剤が遺伝子マーカーをアップレギュレートする場合、α−４インテグリンアンタゴニストの有害な副作用を改善できる化合物または薬剤は、その特定の遺伝子マーカーをダウンレギュレートし得る。
【００４８】
本発明のマウスの他の特性は、その血液の幹細胞前駆体濃度が、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できるマウスの血液で観察された幹細胞前駆体濃度よりも大きいことである。本発明のマウスのこの特性は、化合物または薬剤のα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性に関する分析に容易に用いることができる。特に、化合物または薬剤投与後の哺乳動物で測定された幹細胞前駆体濃度が、化合物または薬剤の投与の前に哺乳動物の血液で測定された前駆細胞の濃度と比べて増加することは、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に対する、その化合物または薬剤のα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を示す。従って、本発明は、化合物または薬剤を可能性のあるα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性に関して分析する方法に及び、以下の工程を含む：
（ａ）哺乳動物から第一の血液サンプルを採取し、第一の血液サンプルで幹細胞前駆体濃度を測定する工程；
（ｂ）化合物または薬剤を哺乳動物に投与する工程；
（ｃ）哺乳動物から第二の血液サンプルを採取し、第二の血液サンプルで幹細胞前駆体濃度を測定する工程；および、
（ｄ）第一の血液サンプルで測定された幹細胞前駆体濃度と、第二の血液サンプルで測定された幹細胞前駆体濃度とを比較する工程。
【００４９】
第二の血液サンプルで測定された幹細胞前駆体濃度が、第一の血液サンプルで測定された幹細胞前駆体濃度と比べて増加することは、その化合物または薬剤が、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性を有する可能性があることを示す。
【００５０】
その上、本発明は、化合物または薬剤をα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性に関して分析する方法に及び、以下の工程を含む：
（ａ）化合物または薬剤を哺乳動物に投与する工程；
（ｂ）哺乳動物の血液で幹細胞前駆体濃度を測定する工程；および、
（ｃ）哺乳動物の血液で測定された幹細胞前駆体濃度と、コントロール哺乳動物の血液中で測定された幹細胞前駆体濃度とを比較する工程、
を含み、ここで、哺乳動物の血液の幹細胞前駆体濃度が、コントロール哺乳動物の血液の幹細胞前駆体濃度と比べて増加することは、その化合物または薬剤が、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性を有する可能性のあることを示す。
【００５１】
当然ながら、多数のタイプの哺乳動物が、化合物または薬剤をα−４インテグリンアンタゴニスト活性に関して分析する方法において用途を有する。特定の例としては、いくつか例を挙げれば、ただしこれらに限定されないが、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、またはヒトが挙げられる。
【００５２】
他の実施形態において、本発明は、本発明のノックアウトマウスにおけるレベルが、野生型マウスにおけるそのレベルと比べて調節された本明細書で説明された遺伝子マーカーを、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリングを調節するかどうかを決定するのに使用することに及ぶ。上記で説明したように、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングは、α−４インテグリンタンパク質の活性に依存する。その結果として、α−４インテグリン発現における調節（例えば減少すること）は、ＶＬＡ−４受容体シグナリングの調節を起こし得る。従って、概括的に、本発明は、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングを調節するかどうかを決定する方法に及び、該方法は、以下の工程：
（ａ）化合物または薬剤を生物に投与する工程；
（ｂ）生物から採取された生体サンプルで、ＶＬＡ−４受容体シグナリングに関する遺伝子マーカーの発現レベルを測定する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）の遺伝子マーカーの発現レベルと、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベルとを比較する工程、
を含み、ここで、生体サンプルとコントロール生体サンプルとで測定された遺伝子マーカーの発現レベルの差は、その化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングを調節することを示す。
【００５３】
本発明の方法において、生体サンプルとしては、ただしこれらに限定されないが、体液、例えば、血液、尿、唾液、粘液、精液、リンパ液等、または固体サンプル、例えば組織、骨、毛等が挙げられる。当然ながら、コントロール生体サンプルは、化合物または薬剤の投与の前に生物から採取された生体サンプルが可能であり、またあるいは、化合物または薬剤が投与されていない第一の生物と実質的に類似した第二の生物から採取された生体サンプル（同一または類似の種、年齢、体重、性別等）が可能である。
【００５４】
その上、α−４インテグリンタンパク質の活性と、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性とが直接的に関係するために、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない本発明のノックアウトマウスにおいて調節される遺伝子マーカーはまた、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節するための遺伝子マーカーでもある。このような遺伝子マーカーの例としては、いくつか例を挙げると以下のものが挙げられる（ただしこれらに限定されない）：
【００５５】
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，ｄ−ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ：
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
【００５６】
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【００５７】
本発明のノックアウトマウスにおいて発現レベルが増加し、それによりＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性が拮抗される場合に増加するこれら遺伝子マーカーの例としては、
以下のものが挙げられる：
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【００５８】
従って、生物に投与された化合物または薬剤により、これら遺伝子マーカーのいずれかのレベルがコントロール生物での測定値と比べて増加することが起こる本発明の方法において、該化合物または薬剤は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のアンタゴニストである。
【００５９】
ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性が拮抗される場合にレベルの減少を示すＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に関する遺伝子マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３’末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；および、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ。
【００６０】
従って、生物に投与された、これら遺伝子マーカーのいずれかのレベルがコントロール生物で測定されたレベルと比べて減少することが起こる化合物または薬剤は、その化合物または生物が、ＶＬＡ−４受容体アンタゴニストであることを示す。
【００６１】
特定の実施形態において、本発明は、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリングを調節するかどうかを決定する方法に及び、ここで、遺伝子マーカーは、マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡであり、そのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１１９７４が付与されており、配列番号１３に記載される。上記で説明したように、化合物または薬剤の投与により、マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡのレベルの減少がもたらされた場合、その化合物または薬剤は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のアンタゴニストであり、喘息、関節炎、ＭＳなどの病気または疾患を治療するための医薬品としての用途をすでに有する可能性がある。
【００６２】
同様に、本発明は、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリングを調節するかどうかを決定する方法に及び、ここで、遺伝子マーカーとしては、ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ、または、ＳＯＣＳ−１タンパク質が挙げられ、そのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０００６７７（配列番号１７に記載される）、ＥＳＴＡＡ５７１５３５（配列番号１８のＤＮＡ配列；図２１）、または、ＥＳＴＡＡ１５４３７１（配列番号２１のヌクレオチド配列；図２３）を付与されている。化合物または薬剤の投与により、これら遺伝子マーカーの１つのレベルの減少がもたらされる場合、その化合物または薬剤は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のアンタゴニストであり、喘息、関節炎、ＭＳなどの病気または疾患を治療するための医薬品としてすでに用途を有する可能性がある。
【００６３】
多数のタイプの化合物または薬剤が、本発明の方法において用途を有する。このようなタイプの例としては、以下のものが挙げられる（ただしこれらに限定されない）：タンパク質；例えば、免疫原としてＶＬＡ−４受容体を有する抗体もしくはこのような抗体の断片、または、免疫原としてα−４インテグリンタンパク質を有する抗体もしくはこのような抗体の断片；化学物質；核酸分子、例えば、ＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス分子、または、ＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質をコードするＲＮＡを開裂させるリボザイム；炭水化物；またはホルモン。本発明において用途を有する化合物または薬剤の特定の例は、米国特許第６,３３１,５５２号、第６,３５２,９７７号、およびＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９９／２３０６３に記載されており、その全体を参照により本明細書に加入する。
【００６４】
加えて、本発明は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングの可能性のあるアンタゴニストの有効性を決定する方法に及び、ここで、このような方法は、以下の工程を含む：
（ａ）第一の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｂ）第一の生体サンプル中の、マクロファージマンノース受容体遺伝子マーカーに関するハツカネズミｍＲＮＡのレベルを測定する工程；
（ｃ）可能性のあるアンタゴニストを生物に投与する工程；
（ｄ）第二の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｅ）第二の生体サンプルで、マクロファージマンノース受容体遺伝子マーカーに関する遺伝的ハツカネズミｍＲＮＡのレベルを測定する工程；および、
（ｆ）工程（ｂ）と工程（ｅ）との測定レベルを比較する工程。
【００６５】
工程（ｂ）における遺伝子マーカーの測定レベルと比べて、工程（ｅ）における遺伝子マーカーの測定レベルが減少することは、可能性のあるアンタゴニストが、ＶＬＡ−４のシグナリング活性を拮抗することにおいて有効性を有することを示す。当然ながら、上述したように、第一および第二の生体サンプルは、体液、体の組織、または、それらの組み合わせを含み得る。遺伝子マーカーであるマクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、登録番号Ｚ１１９７４が付与されており、配列番号１３に記載される。
【００６６】
本発明はさらに、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングの可能性のあるアンタゴニストの有効性を決定する方法に及び、ここで、このような方法は、以下の工程を含む：
（ａ）第一の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｂ）第一の生体サンプルで、ＪＡＢ遺伝子マーカーに関するハツカネズミｍＲＮＡのレベルを測定する工程；
（ｃ）可能性のあるアンタゴニストを生物に投与する工程；
（ｄ）第二の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｅ）第二の生体サンプルで、ＪＡＢ遺伝子マーカーに関するハツカネズミｍＲＮＡのレベルを測定する工程；および、
（ｆ）工程（ｂ）と工程（ｅ）との測定レベルを比較する工程。
【００６７】
工程（ｅ）における遺伝子マーカーの測定されたレベルが、工程（ｂ）における遺伝子マーカーの測定レベルと比べて減少することは、可能性のあるアンタゴニストが、ＶＬＡ−４のシグナリング活性を拮抗することにおいて有効性を有することを示す。当然ながら、上述したように、第一および第二の生体サンプルは、体液、体の組織、または、それらの組み合わせを含み得る。遺伝子マーカーであるＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ、または、ＳＯＣＳ−１タンパク質のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０００６７７が付与されており、配列番号１７に記載される。
【００６８】
加えて、本発明はさらに、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングの可能性のあるアンタゴニストの有効性を決定する方法に及び、ここで、このような方法は、以下の工程を含む：
（ａ）第一の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｂ）第一の生体サンプルで、遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ５７１３５３のレベルを測定する工程；
（ｃ）可能性のあるアンタゴニストを生物に投与する工程；
（ｄ）第二の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｅ）第二の生体サンプルで、遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ５７１３５３のレベルを測定する工程；および、
（ｆ）工程（ｂ）と工程（ｅ）との測定レベルを比較する工程。
【００６９】
工程（ｅ）で測定された遺伝子マーカーのレベルが、工程（ｂ）における遺伝子マーカーの測定レベルと比べて減少することは、可能性のあるアンタゴニストが、ＶＬＡ−４のシグナリング活性を拮抗することにおいて有効性を有することを示す。当然ながら、上述したように、第一および第二の生体サンプルは、体液、体の組織、または、それらの組み合わせを含み得る。遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ５７１３５３（ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン）のヌクレオチド配列は、配列番号２１に記載される。
【００７０】
その上、本発明は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングの可能性のあるアンタゴニストの有効性を決定する方法に及び、ここで、このような方法は、以下の工程を含む：
（ａ）第一の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｂ）第一の生体サンプルで、ＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；
（ｃ）可能性のあるアンタゴニストを生物に投与する工程；
（ｄ）第二の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｅ）第二の生体サンプルで、遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ５７１３５３のレベルを測定する工程；および、
（ｆ）工程（ｂ）と工程（ｅ）との測定レベルを比較する工程。
【００７１】
工程（ｅ）における遺伝子マーカーの測定レベルが、工程（ｂ）における遺伝子マーカーの測定されたレベルと比べて減少することは、可能性のあるアンタゴニストが、ＶＬＡ−４のシグナリング活性を拮抗することにおける有効性を有することを示す。当然ながら、上述したように、第一および第二の生体サンプルは、体液、体の組織、または、それらの組み合わせを含み得る。遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１（Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ）のヌクレオチド配列は、配列番号２３に記載される。
【００７２】
上記で説明したように、多数のタイプの生物が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングの可能性のあるアンタゴニストの有効性を分析する方法において用途を有する。特定の例としては、いくつか例を挙げると（ただしこれらに限定されない）、哺乳動物、例えばヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、またはヒトが挙げられる。
【００７３】
その上、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節する、特にこのような活性を拮抗するそれらの能力に関して化合物または薬剤を分析することはまた、本発明のインビトロでの方法を用いて実施することもできる。従って、本発明はさらに、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節、特に拮抗する化合物または薬剤の能力を決定する方法に及び、以下の工程を含む：
（ａ）化合物または薬剤と、生物からの生体サンプルとを接触させる工程；
（ｂ）生体サンプルで、ＶＬＡ−４受容体シグナリングに関する遺伝子マーカーの発現レベルを測定する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）で測定された遺伝子マーカーの発現レベルと、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベルとを比較する工程。
【００７４】
ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性が拮抗された際にレベルの増加が示されることがわかっているＶＬＡ−４受容体マーカーのレベルが増加する場合、その化合物または薬剤は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のアンタゴニストである。同様に、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性が拮抗された際にレベルの減少が示されることがわかっているＶＬＡ−４受容体マーカーのレベルが減少する場合、その化合物または薬剤は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のアンタゴニストである。ＶＬＡ−４遺伝子マーカーの例、および、減少したＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の結果としての調節は、上述のとおりである。
従って、本発明の目的は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスを提供することである。
【００７５】
本発明の他の目的は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスを生産する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、α−４インテグリン活性またはＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節するそれらの能力に関して化合物または薬剤を分析する、有用かつこれまで未知の方法を提供することである。
【００７６】
本発明のさらに他の目的は、有用で、新規かつこれまで未知の、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない本発明のマウスから得られた表現型情報を利用する、化合物または薬剤をα−４インテグリンアンタゴニスト活性に関してインビボで分析する方法を提供することである。
【００７７】
本発明のさらに他の実施形態において、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリングを調節するかどうかを決定する、新規かつ有用な方法が提供される。
【００７８】
添付図面と詳細な説明を参照することによって、本発明のこれら観点および他の観点をさらに評価する。
【００７９】
図面の説明
図１Ａ〜１Ｄは、配列番号１のヌクレオチド配列である。
図２は、α−４インテグリンｃＤＮＡの図式的なマップである。クローニングに用いられるプライマーの位置が示される（ｃＤＮＡの第一の部分についてはｆＶおよびｃＤＮＡ１Ｂ−Ｒ、ならびに、第二の部分についてはｃＤＮＡ２−ＦおよびｃＤＮＡ２−Ｒ）。開始および停止コドン、ならびに、得られたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、同様に、ベクターへのｃＤＮＡクローニングに関連する制限部位が示される。該遺伝子は、４つのポリアデニル化部位を有し、いずれもｃＤＮＡ２−Ｒの３’に位置する［De Meirsman et al.，1996］。
【００８０】
図３は、プラスミドｐＢＳＫ２.６である。
図４は、プラスミドｐＣＲ２ｃＤＮＡである。
図５は、プラスミドｐＮＥＢ１.１である。
図６は、プラスミドｐＮＥＢ１.１（−）である。
図７は、ヘテロ接合型雌×ホモ接合型雄の交雑の典型的な系統図である：９匹の総子孫マウスのうち１匹だけが、ホモ接合型ノックアウトであり、残り全てが、ヘテロ接合型ノックアウトである。四角は雄動物を示し、丸は雌動物を示す。中央に点が付いている記号は、ホモ接合型ノックアウトマウスを示し、半分黒く半分白い記号は、ヘテロ接合型ノックアウトマウスを示す。第一の同腹子は、１９９９年８月２４日に産まれ、第二の同腹子は、１９９９年９月１３日に産まれた。
図８は、内因性α−４インテグリンバックグラウンドを評価するためのＰＣＲ分析である。プライマーの位置は、図９のＢにおけるゲノムのα−４インテグリンＤＮＡの図式的なマップに示される。
【００８１】
図９は、α−４インテグリンバックグラウンドの遺伝子型分析であり、Ａは、１.４ｋｂのＰｓｔＩ／ＫｐｎＩプローブとハイブリダイズさせた、ＰｓｔＩを用いた尾のゲノムＤＮＡ断片のサザンブロットである。約３ｋｂと３.５ｋｂの２つのバンドがヘテロ接合型マウスを示し、３.５ｋｂの１つのバンドのみが内因性α−４インテグリンに関するホモ接合型ＫＯのマウスを示し、そして、Ｂは、ゲノムのα−４インテグリンＤＮＡの図式的なマップである。１.４ｋｂのプローブの位置、および、Ｙａｎｇ等によるα−４ノックアウトマウスの作製に関する置換領域が示される。ＰＣＲに用いられたプライマーのおよその位置が示される。関連する制限部位のみを示す。
【００８２】
図１０は、特異的α−４インテグリン抗体（ＣＤ４９ｄ，クローン９Ｃ１０，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色された、脾臓切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析結果である。ｗｔマウスにおいて褐色に染色された部分はα−４インテグリンタンパク質を示し、これはＫＯマウスには存在しない。
図１１は、ｔｅｐ−ＶＬＡ導入遺伝子（操作可能にｔｅｔＰプロモーターと結合したα−４インテグリンの部分を含み、配列番号１のＤＮＡ配列を有する導入遺伝子）の図式的なマップであり、プローブの位置と、内因性ＲＮＡとトランスジェニックＲＮＡとの両方に関する保護断片の指示とを含む。ＲＮＡ保護分析には、一般的に、２０〜３０μｇのＤＮアーゼで処理したトータルＲＮＡが用いられた。プローブは、約６０ｂｐの転写開始部位のｔｅｔ−プロモーターの３’と、α−４ＤＮＡの第二のエキソンの末端とで構成され、従って、内因性ＲＮＡと、トランスジェニックＲＮＡとの両方にハイブリダイズし、異なるサイズの保護されたＲＮＡが得られた。保護されたトランスジェニックＲＮＡのサイズは、約５５０ｎｔであり、一方で、保護された内因性ＲＮＡのサイズは、４９０ｎｔである。線状化されたプローブは、約７００ｎｔのサイズである。
【００８３】
図１２は、本発明のホモ接合型α−４インテグリンノックアウト（ＫＯ）マウス（５９系）と、ＦＶＢマウスとを比較したＲＮアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）である。５９系マウスからの組織サンプルに関する導入遺伝子の保護されたサイズは、予想以上に顕著に短い。
図１３は、２種の異なる系、胸腺および脾臓のＫＯマウスのＲＰＡである。系２の導入遺伝子サイズは、予想されたサイズであるが、それに対して、系１は、導入遺伝子の短縮形態を示す。しかしながら、正しいサイズを示した系は、ＦＶＢマウスで示される内因性発現レベルに比べて、かなり低い導入遺伝子レベルを示す。ＦＶＢおよびＣ５７（野生型）マウスは、保護された内因性ＲＮＡのバンドを示す。
図１４は、プラスミドｐＮＥＢ３.７（−）である。このプラスミドは、約３.６ｋｂの完全長α−４ｃＤＮＡを含む。
図１５は、ｔｅｔＰ−ＶＬＡ導入遺伝子である。α−４ｃＤＮＡをｔｅｔ−プロモーターにより発動させた。マイクロインジェクションの前に、このプラスミドをＸｈｏＩで線状にした。
【００８４】
図１６は、マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡの結果のＴａｑｍａｎ分析である。脳サンプルにおけるＨＭＲ１０３１およびＰ／Ｌ９８４で処理したＥＡＥマウスのｍＲＮＡレベルは、賦形剤コントロールマウスに比べて統計学的に有意に低い。脾臓サンプルは、いずれの処理においても脳と同じ結果を示さない（＊：ｐ値：００１〜０.０５）。
図１７Ａ〜１７Ｃは、配列番号１３のヌクレオチド配列である。
図１８は、Ｔａｑｍａｎ分析で用いられたＥＡＥマウスの臨床評価である。
図１９は、配列番号１７のヌクレオチド配列である。
図２０は、ＪＡＢ  ＦＡＣＳの結果である。
【００８５】
図２１は、配列番号１８のヌクレオチド配列である。
図２２は、遺伝子マーカーとしてＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５を用いた実施例IVの詳細なＴａｑｍａｎの結果である。
図２３は、配列番号２１のヌクレオチド配列である。
図２４は、遺伝子マーカーとしてＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１を用いた実施例Ｖの詳細なＴａｑｍａｎの結果である。
【００８６】
詳細な説明
本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスをうまく作製できるという発見に基づく。このようなマウスは、化合物または薬剤をα−４インテグリンアンタゴニスト活性に関して分析する方法において、すでに用途を有する。
【００８７】
その上、本発明の機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスは、これまで未知の表現型を有する。特に、マウスで測定された特定の遺伝子マーカーのレベルは、野生型マウスにおいて測定されたこれらと同じ遺伝子マーカーのレベルと比べて調節される。この表現型データは、α−４インテグリンアンタゴニスト活性に関して化合物または薬剤を分析する方法において多大な有用性を有する。
【００８８】
従って、概括的に、本発明は、機能的α−４インテグリン活性を発現できないマウスに及ぶ。このようなマウスの例としては、ただしこれらに限定されないが、ノックアウトマウスおよびトランスジェニックマウスが挙げられ、その両方を以下で説明する。
【００８９】
多数の用語および句が本明細書および請求項で用いられることを特記する。これらの用語および句の定義を以下に示す：
本明細書で用いられる用語「トランスジェニック」は、タンパク質またはポリペプチドをコードする１またはそれ以上の単離された核酸分子、または、タンパク質を安定して取り込み、それらを後に続く世代に受け継ぐことができる植物または動物を意味する。
【００９０】
本明細書で用いられる用語「ノックアウト」は、マウスのゲノムにおいて特定の遺伝子発現が破壊されたマウスを意味する。
本明細書で用いられる用語「調節」は、遺伝子マーカーの測定レベルがコントロールと比較して変化することを意味する。この調節とは、遺伝子マーカーの測定レベルが、コントロールで測定されたその遺伝子マーカーのレベルと比べて増加することであり得る。あるいは、調節とは、遺伝子マーカーの測定レベルが、コントロールで測定されたその遺伝子マーカーのレベルと比べて減少することであり得る。
【００９１】
本明細書で用いられる用語、特定のタンパク質をコードする単離された核酸分子の「部分」は、ペプチドまたはポリペプチドをコードする十分な数の連続したヌクレオチドを含む単離された核酸分子の部分断片を意味する。当然ながら、単離された核酸分子の「部分」は、１個より多くのヌクレオチドからなり、その部分によりコードされたペプチドまたはポリペプチドは、以下のペプチドおよびポリペプチド定義で説明される多数のアミノ酸残基を含む。
【００９２】
本明細書で用いられる用語「ペプチド」は、ペプチド結合により共有結合で結合した２またはそれ以上のアミノ酸を意味する。特定の実施形態において、ペプチドは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも３０、さらにより好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは５０またはそれ以上のアミノ酸を含む。
【００９３】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、複数の連続したアミノ酸から成る直線状ポリマーを意味する。特に、ポリペプチドは、１００ｋＤより大きい分子量を有し得る。
本明細書で用いられる用語「表現型」は、細胞または生物の観察可能な特徴を意味する。このような観察可能な特徴としては、物理的な外観、同様に、細胞または生物に存在する特定の生理学的な組成物のレベルが挙げられる。
【００９４】
本明細書で用いられる用語「コントロール」は、生物または生物の生体サンプルに関しては、化合物もしくは薬剤の投与の前の生物、もしくは、化合物もしくは薬剤の投与の前の生物から採取された生体サンプル、または、その化合物または薬剤が投与されていない第一の生物と実質的に類似した第二の生物（同一または類似の種、年齢、体重、性別等）から採取された生体サンプル、もしくは、その化合物または薬剤が投与されていない第一の生物と実質的に類似した第二の生物（同一または類似の種、年齢、体重、性別等）から採取された第二の生体サンプル、を意味する。従って、「コントロール」は、分析される化合物または薬剤で処理されていない。
【００９５】
本明細書で用いられる用語「遺伝子マーカー」は、生理学的な組成物を意味し、生物中で測定されたそのＲＮＡまたはタンパク質レベルは、特定のタンパク質が生物中に存在するかどうか、または、生物中で機能するかどうかを同定するのに役立つ。その上、遺伝子マーカーは、特定のタンパク質をコードしてもよく、またあるいは、タンパク質の「代理」マーカーとして役立つ可能性もあり、その活性は、生体サンプル中の遺伝子マーカーのレベルに関連する。この関係は、直接であってもよく、その場合、タンパク質活性レベルの減少は、遺伝子マーカーレベルの減少に相当し、またあるいは、その関係は、逆であってもよく、その場合、タンパク質活性レベルの減少は、遺伝子マーカーレベルの増加に相当する。このような生理学的な組成物としては、いくつか例を挙げると、ただしこれらに限定されないが、細胞（例えば、幹細胞前駆体）タンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、または脂肪酸が挙げられる。特定の本発明の実施形態において、特定の遺伝子マーカーの測定レベルは、本発明のマウスにおいて、野生型コントロールマウスで測定されたこのような遺伝子マーカーのレベルと比べて調節される。このような、本発明のマウスで測定されたレベルが、野生型マウスで測定されたレベルと比べて調節される遺伝子マーカーの例としては、以下のものが挙げられる（ただしこれらに限定されない）：
【００９６】
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，ｄ−ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳ  ハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
【００９７】
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡ  ハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【００９８】
これらタンパク質のいずれかの活性と直接的な関係を有する、α−４インテグリンまたはＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に関する遺伝子マーカーの例としては、いくつか例を挙げると、以下のものが挙げられる（ただしこれらに限定されない）：
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；および、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ。
【００９９】
同様に、α−４インテグリンタンパク質の活性またはＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性と逆の関係を有し、従って、これらタンパク質のいずれかの活性が減少する場合にレベルの増加を示す遺伝子マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα−鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
【０１００】
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【０１０１】
ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に関する「代理遺伝子マーカー」の特定の例は、マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡであり、その核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１１９７４が付与されており、配列番号１３に記載される。その結果として、生物に投与された、マクロファージマンノース受容体ｍＲＮＡの測定レベルを減少させる化合物または薬剤は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を拮抗する能力を示す。
【０１０２】
ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に関する「代理遺伝子マーカー」のその他の特定の例は、ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓであり、その核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ  ＡＢ０００６７７が付与されており、配列番号１７に記載される。その結果として、生物に投与された、ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓの測定レベルを減少させる化合物または薬剤は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を拮抗する能力を示す。
【０１０３】
ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に関する「代理遺伝子マーカー」のその他の特定の例は、ＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５（ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン）（配列番号２１ヌクレオチド配列を有する）、および、ＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１（Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ）（配列番号２３のヌクレオチド配列を有する）である。
【０１０４】
本明細書で用いられる用語「対立遺伝子」は、遺伝子の代わりとなる一連の形態の１つを意味する。２倍体細胞において、各遺伝子は、２つの対立遺伝子を有することがあり、それぞれ相同染色体上の同じ位置（遺伝子座）を占める。
本明細書で用いられる用語「偽妊娠」は、不妊交尾後に様々な哺乳動物で通常生じる妊娠に似た無発情期の状態を意味する。
【０１０５】
本明細書で用いられる用語「野生型」は、生物の、正常な非突然変異形態、すなわち、自然に見られる形態を意味する。
本明細書で用いられる句「幹細胞前駆体」は、血液で見出される比較的未分化な細胞を意味し、これは、自己再生能力を失っており、所定の細胞系統の前駆体である。例えば、骨髄幹細胞は、赤血球（赤血球）、様々な白血球（好中球、好酸球、好塩基球、単球、肥満細胞）および血小板の幹細胞前駆体を生じる。本発明のマウスにおいて、このような幹細胞前駆体の血中濃度は、このような幹細胞前駆体の野生型コントロールマウスの血中濃度より大きい。
【０１０６】
本明細書で用いられる用語「導入遺伝子」および「トランスジェニックＤＮＡ」は、交換可能に用いることができ、本発明のマウスの製造に用いるためのマウス胚のゲノムに挿入しようとする外因性の単離された核酸分子を意味する。特定の実施形態において、導入遺伝子は、ｔｅｔＰプロモーターと操作可能に結合したα−４インテグリンをコードするｃＤＮＡ分子の部分を含む。より特定には、導入遺伝子は、配列番号１のＤＮＡ配列を含む。
【０１０７】
本明細書で用いられる用語「化合物」または「薬剤」は、現在知られていないか、またはその後発見されるいかなる組成物を意味する。本発明において用途を有する化合物または薬剤の例としては、有機化合物（例えば、人工の、天然に存在する、および光学活性のもの）、ペプチド（人工の、天然に存在する、および光学活性のもの、すなわちＤ型またはＬ型アミノ酸のいずれか）、炭水化物、核酸分子等が挙げられる。
【０１０８】
本明細書で用いられる用語「ヘテロ接合型」は、特定の遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する生物を意味する。より特定には、特定のタンパク質に関して「ヘテロ接合型」のノックアウトマウスとは、そのゲノムがそのタンパク質を発現することができる対立遺伝子、および、タンパク質を正常に発現できる対立遺伝子を有するが、そのタンパク質の成功裡な発現を破壊する欠陥を有するマウスのことである。従って、ヘテロ接合型ノックアウトマウスは、特定のタンパク質を発現することができる。
【０１０９】
本明細書で用いられる用語「ホモ接合型」は、特定の遺伝子の２つの同一な対立遺伝子を有する生物を意味する。より特定には、特定のタンパク質に関して「ホモ接合型」であるノックアウトマウスとは、そのゲノムが、そのタンパク質を正常に発現することができる２つの対立遺伝子を有するが、各対立遺伝子が、そのタンパク質の成功裡な発現を破壊する欠陥を有するマウスのことである。従って、ホモ接合型ノックアウトマウスは、特定のタンパク質を発現できない。
【０１１０】
その上、本発明に従って、当業界の範囲内で通常の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば以下を参照：Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition（1989）Cold Spring Ｈarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New  York（本明細書においては「Sambrook et al., 1989」），DNA Cloning：APractical Approach，Volumes Ｉ and II（D.N. Glover ed．1985）；OligonucleotideSynthesis（MJ．Gait  ed．1984）；Nucleic Acid Hybridization［B.D．Hames & S.J．Higgins eds.（1985）］；Transcription And Translation［B.D．Hames & SJ．Higgins，eds.（1984）］；Animal  Cell Culture［R.I．Freshney，ed.（1986）］；Immobilized Cell And Enzymes［IRL Press，（1986）］；B．Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning（1984）；F.M．Ausubel et al.（eds.）．Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.（1994）。
【０１１１】
従って、本明細書で用いられる場合、以下の用語は、以下に示す定義で用いられる。
「ベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンであり、他のＤＮＡセグメントをそこに付着させ、付着されたセグメントの複製を起こすことができる。「レプリコン」とは、インビボでのＤＮＡ複製の自律的ユニットとして機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができるいかなる遺伝子要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【０１１２】
外因性または異種ＤＮＡが細胞内部に導入された場合、細胞は、このようなＤＮＡで「トランスフェクトされた」ことになる。そのトランスフェクトされたＤＮＡが表現形の変化をもたらす場合、細胞は、外因性または異種ＤＮＡで「形質転換された」ことになる。好ましくは、形質転換ＤＮＡは、染色体ＤＮＡに（共有結合で）統合されるべきであり、それにより細胞のゲノムが作り上げられる。
「異種」ＤＮＡは、細胞中に、または細胞の染色体部位に自然に存在しないＤＮＡ意味する。特に、異種ＤＮＡとしては、細胞に対して外来の遺伝子が挙げられる。
【０１１３】
「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、または、それらのいずれかのホスホエステル類似体（例えばホスホロチオエートおよびチオエステル）の一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのいずれかのリン酸エステル重合形態を意味する。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。用語「核酸分子」、特に「ＤＮＡ分子」または「ＲＮＡ分子」は、該分子の１次および２次構造のみを意味し、いかなる特定の３次形態にも限定されない。従って、この用語は、特に直線状または環状ＤＮＡ分子で見出される二本鎖ＤＮＡ（例えば制限断片）、プラスミド、および染色体を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する際に、配列は、本明細書においては、ＤＮＡの非転写鎖（すなわちｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）にそって５’から３’方向の配列のみを与える通常の慣習に従って記載される。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を施したＤＮＡ分子である。
【０１１４】
「相同組換え」は、ベクターの外来ＤＮＡ配列を染色体の特定の染色体部位に挿入することを意味する。特定の相同組換えに関して、ベクターは、染色体配列に相同な十分に長い領域を含み、相補的結合およびベクターの染色体への取り込みを可能にする。相同なより長い領域や、より高度な配列類似性は、相同組換え効率を高め得る。
【０１１５】
ＤＮＡ「コーディング配列」は、インビトロまたはインビボで、適切な調節配列のコントロール下に置かれた場合に、細胞中で転写されポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドンと、３’（カルボキシル）末端にある翻訳停止コドンとで決定される。コーディング配列としては、これらに限定されないが、原核細胞生物配列、真核細胞生物性ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核細胞生物性（例えば哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列が挙げられ、さらに合成ＤＮＡ配列も含まれる。コーディング配列が真核細胞で発現されることを意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写停止配列は、通常、コーディング配列の３’に位置する。
【０１１６】
転写および翻訳制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列であり、これらは、宿主細胞においてコーディング配列の発現を提供する。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは、制御配列である。
【０１１７】
「プロモーター配列」または「プロモーター」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合させること、および、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を明確にする目的において、プロモーター配列は、転写開始部位とその３’末端で境界を接しており、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小限の数の塩基または要素を含むように上流（５’方向）に伸長する。転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより便利に定義される）、および、ＲＮＡポリメラーゼの結合を起こすタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）は、プロモーター配列内に見出される。
【０１１８】
発現制御配列が、そのＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節する場合、ＤＮＡ配列は、発現制御配列に「操作可能に結合」している。用語「操作可能に結合した」とは、発現されるべきＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えばＡＴＧ）を含むこと、および、正確なリーディングフレームを維持し、発現制御配列のコントロール下でＤＮＡ配列を発現させ、ＤＮＡ配列によりコードされた所望の産物を生産させること、を含む。組換えＤＮＡ分子に挿入されることが望まれる遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、このような開始シグナルをその遺伝子の前に挿入することができる。
【０１１９】
ＲＮＡポリメラーゼによりコーディング配列がｍＲＮＡに転写され、次にトランスＲＮＡスプライシングされ、コーディング配列によりコードされたタンパク質に翻訳される場合、そのコーディング配列は、細胞中の転写および翻訳制御配列の「制御下で」ある。
【０１２０】
「シグナル配列」は、細胞表面上で発現されるべきタンパク質のコーディング配列の始めに含まれる。この配列は、成熟ポリペプチドに向けてシグナルペプチド、Ｎ末端をコードし、宿主細胞にポリペプチド（成熟ポリペプチド）を移動させるようにする。本明細書において、用語「トランスロケーションシグナル配列」は、この種のシグナル配列を意味するものとして用いられる。
【０１２１】
トランスロケーションシグナル配列は、真核生物および原核生物由来の様々なタンパク質に結合していることを見出すことができ、しばしば両方のタイプの生物で機能的である。
【０１２２】
本明細書で用いられる用語「配列相同性」は、全てのその文法上の形態において、「共通の進化起源」を有するタンパク質（例えばスーパーファミリー（例えば免疫グロブリンスーパーファミリー）からのタンパク質）と、異なる種（例えばミオシン軽鎖など）（Reeck et al.，1987，Cell50：667）からの相同タンパク質との間の関係を意味する。
【０１２３】
従って、用語「配列類似性」は、全てのその文法上の形態において、共通の進化起源を共有しない核酸またはタンパク質のアミノ酸配列間の同一性または対応の度合いを意味する（上述のＲｅｅｃｋ等を参照）。しかしながら、一般的な用法および本願において、用語「相同な」とは、「高く」のような副詞で修飾される場合、配列類似性を意味し、共通の進化起源を意味しない場合がある。
【０１２４】
特定の実施形態において、少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）のヌクレオチドが、ＤＮＡ配列の定義された長さにわたって適合した場合、２つの核酸配列は、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクで利用可能な標準的なソフトウェアを用いて、または、例えばその特定のシステムで定義されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で、配列を比較することにより同定することができる。定義された適切なハイブリダイゼーション条件は、当業界の技術範囲内である。例えば、上述の Maniatis等；上述の DNA Cloning，Vols．Ｉ & II；Nucleic Acid Hybridizationを参照。
【０１２５】
同様に、特定の実施形態において、２つのアミノ酸配列は、３０％を超過するアミノ酸が同一である、または、約６０％を超過するアミノ酸が類似（機能的に同一）である場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同配列は、例えばデフォルトパラメーターを用いたＧＣＧ（Genetics Computer Groupの、ＧＣＧパッケージバージョン７のプログラムマニュアル、Madison Wisconsin）パイルアッププログラムを用いて、アライメントにより同定される。
【０１２６】
本明細書において、用語「〜に対応する」とは、類似性または相同性が測定された分子と正確に位置が同一であっても、または異なっていても、類似または相同配列を意味するものとして用いられる。従って、用語「〜に対応する」とは、配列類似性を意味するものであって、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基のナンバリングを意味するものではない。
【０１２７】
従って、ＶＬＡ−４アンタゴニストがヒトで試験される臨床条件において、当業者は、試験される化合物の有効性を評価するために、本明細書で説明された遺伝子マーカーの１つに対応する、または相同なヒト遺伝子発現を分析するだけでよい。上記で説明したように、この相同性または対応は、決まった実験技術を用いて当業者により容易に決定することができる。
【０１２８】
ベクターは、当業界既知の方法により所望の宿主細胞に導入され、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合，ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿，リポフェクション（リソソーム融合）、ジーンガンの使用、またはＤＮＡベクター輸送体により導入される（例えば、Wu et al.，1992，J．Biol．Chem．267：963-967；Wu and Wu，1988，J．Biol．Chem．263：14621-14624；Hartmut et al.，1990年３月１５日付けで出願されたカナダ国特許出願第２,０１２,３１１号を参照）。特定の本発明の実施形態において、「宿主細胞」は、マウス胚である。
【０１２９】
機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウス
上記で説明したように、トランスジェニックおよびノックアウトマウスは、インビボで遺伝子またはタンパク質の機能を決定するための役に立つツールを提供する［Capecchi，1994，Capecchi，1989，Capecchi，1989 で総評される］。
その上、ノックアウトモデルは、抗体を用いた研究に確実な利益を有するが、これは、不適切な架橋現象により生じた人工物、Ｆｃ−受容体媒介効果、および、インビボでの不十分な侵入のために、もしかすると抗体が誤って導かれる可能性があるためである［Sharpe，1995］。
【０１３０】
本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスに及び、該マウスは、ノックアウトマウスである。本発明のノックアウトマウスにおいて、α−４インテグリンタンパク質を発現することができる双方の対立遺伝子が、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないように破壊されており、操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子の２つのコピーが、そのノックアウトマウスのゲノムに挿入されている。その結果として、本発明のノックアウトマウスは、妊娠期を生き抜き、マウスに成熟するが、成体マウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない。特定の本発明の実施形態において、導入遺伝子は、操作可能にｔｅｔＰプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードするｃＤＮＡ分子部分を含み、配列番号１のＤＮＡ配列を有する。
【０１３１】
その上、本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウスの製造方法に及び、該方法は、以下の工程を含む：
（ａ）２種のヘテロ接合型α−４インテグリン機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子を含むノックアウトマウスを交雑する工程、ここで、各ノックアウトマウスの第一または第二の対立遺伝子のいずれかが機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないように、該ノックアウトマウスはそれぞれ第一の対立遺伝子または第二の対立遺伝子のいずれかに欠陥を含む；
（ｂ）工程（ａ）の交雑で得られた胚を回収する工程；
（ｃ）操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子を、工程（ｂ）で回収された各胚に挿入し、導入遺伝子を有するトランスフェクトされた胚を形成する工程；
（ｄ）偽妊娠雌マウスがゲノムに導入遺伝子を含むヘテロ接合型α−４ノックアウトマウスを産むように、トランスフェクトされた胚を偽妊娠雌マウスに挿入する工程；および、
（ｅ）工程（ｄ）で生産された２種のα−４ヘテロ接合型ノックアウトマウスを交雑して、ゲノム内に導入遺伝子の２つのコピーを含むホモ接合型α−４ノックアウトマウスを生産する工程。
【０１３２】
α−４インテグリンタンパク質をコードする対立遺伝子の発現を破壊する欠陥を置くために、当業者であれば多数の方法が容易に利用可能である。このような方法として例えば、ゲノムから対立遺伝子を欠失させるためのノックアウト技術を用いる方法が挙げられる。あるいは、ナンセンスおよびアンバー変異、または、非機能的α−４インテグリンタンパク質の発現をもたらす変異のような変異導入に、組換え技術を用いることもできる。他の実施形態において、α−４インテグリンタンパク質をコードする対立遺伝子は、野生型動物でアンチセンス方向で発現させた場合のそれらの表現型効果を試験することによって、破壊に関して試験することができる。このアプローチにおいて、野生型対立遺伝子の発現は抑制され、それにより突然変異体表現型がもたらされる。ＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖形成（アンチセンス−センス）によりｍＲＮＡの正常な操作が妨げられ、部分的または完全に野生型遺伝子効果が失われる。この技術を用いることによって、組織培養におけるＴＫ合成が阻害され、ショウジョウバエにおけるＫｒｕｐｐｅｌ変異、およびマウスにおけるＳｈｉｖｅｒｅｒ変異の表現型が生じた［Izant et al.，Cell，36：1007−1015（1984）；Green et al.，Annu．Rev．Biochem.，55：569−597（1986）；Katsuki et al.，Science，241：593−595（1988）］。このアプローチの重要な利点は、全同起源のｍＲＮＡの発現の有効な阻害に関して発現させるのに遺伝子のほんのわずかな部分しか必要としないことである。アンチセンス導入遺伝子は、それ自身のプロモーターまたは正しい細胞型で発現された他のプロモーターの制御下に置かれ、ＳＶ４０ポリＡ部位の上流に置かれる。この導入遺伝子は、トランスジェニックマウスを作製するのに用いることができ、また、遺伝子ノックアウト技術を用いることによってなされる。
【０１３３】
本発明の方法において用途を有する特定のヘテロ接合型α−４インテグリンノックアウトマウスは、ジャクソンラボラトリー（Jackson laboratories，Bar Harbor，ME）から入手可能であり、ジャクソンラボラトリーのストック番号００２４６３が付与されている。
【０１３４】
本発明の方法のその他の工程は、α−４インテグリンヘテロ接合型ノックアウトマウスの交雑で生じた胚を回収すること、操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンをコードするｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子で胚をトランスフェクトすること、トランスフェクトされた胚を偽妊娠マウスに挿入すること、２種のヘテロ接合型子孫を交雑する工程、および、次に、ホモ接合型α−４インテグリンノックアウトであり、それらのゲノムに導入遺伝子の２つのコピーを有するこの第二の交雑（Ｆ２世代）の子孫を選択すること、を含む。これらの工程を実施する方法は、十分に当業者の技術範囲内である。例えば、操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンをコードするｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。発現ベクターは、続いて順番に、回収されたα−４インテグリンヘテロ接合型胚をトランスフェクトするのに用いられる。必要に応じて、必要な転写および翻訳シグナルを組換え発現ベクターに提供することができ、または、それらは、天然の遺伝子、すなわちα−４インテグリンタンパク質および／またはそのフランキング領域をコードする遺伝子により供給されていてもよい。その上、必要に応じて、発現ベクターは、複製開始点を含んでいてもよい。
【０１３５】
マウスのゲノム内で導入遺伝子が発現されれば、当業界既知のいずれかのプロモーター／エンハンサー要素で制御することができるが、これらの調節要素は、マウス細胞で機能的でなければならない。導入遺伝子発現を制御するのに用いることができるプロモーターとしては、これらに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Benoist and Chambon，1981，Nature290：304−310）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Yamamoto，et al.，1980，Cell 22：787−797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al.，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78：1441−1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al.，1982，Nature 296：39-42）；酵母またはその他の菌類からのプロモーター要素、例えばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および、動物転写制御領域、これは組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている：膵臓の腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al.，1984，Cell 38：639-646；Ornitz et al.，1986，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology  7：425-515）；膵臓のβ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan，1985，Nature 315：115-122）、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al.，1984，Cell 38：647-658；Adames et al.，1985，Nature 318：533-538；Alexander et al.，1987，Mol．Cell．Biol．7：1436-1444）、精巣、乳房、リンパ系細胞および肥満細胞で活性なマウス乳腺ガンウイルス制御領域（Leder et al.，1986，Cell 45：485-49５）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al.，1987，Genes and Devel．1：268-276）、肝臓で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al.，1985，Mol．Cell．Biol．5：1639-1648；Hammer et al.，1987，Science 235：53-58）、肝臓で活性なα−１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al.，1987，Genes and Devel．1：161-171）、骨髄細胞で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Mogram et al.，1985，Nature 315：338-340；Kollias et al.，1986，Cell 46：89-94）、脳の希突起膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al.，1987，Cell 48：703-712）、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani，1985，Nature 314：28３-286）、および、視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason et al.，1986，Science 234：1372-1378）が挙げられる。特定の実施形態において、導入遺伝子で利用されるプロモーターは、ｔｅｔ−プロモーターである。ｔｅｔ−プロモーターは、事実上サイレントの最小限のｈＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）プロモーターと、数個のｔｅｔＯ（ｔｅｔ−オペレーター）配列（ＴＲＥ（ｔｅｔ−応答要素）と呼ばれる）で構成される。（Gossen and Bujard，1992）。最小限のｈＣＭＶプロモーターはサイレントであると考えられているにもかかわらず、転写調節は厳密ではなく、それに続く遺伝子の低いレベルの「漏れ」が起こるということが一般的にわかっている。導入遺伝子を含む発現ベクターは、４つの一般的なアプローチで同定することができる：（ａ）所望のプラスミドＤＮＡまたは特異的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、（ｂ）核酸ハイブ��ダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子機能の存在または非存在、および（ｄ）挿入配列の発現。第一のアプローチにおいて、核酸は、ＰＣＲにより増幅することができ、増幅産物の検出に提供される。第二のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたマーカー遺伝子と相同な配列を含むプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第三のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系を、同定し、外来遺伝子のベクターへの挿入により生じる特定の「選択マーカー」遺伝子機能の存在または非存在に基づき選択することができ、この遺伝子機能とは、例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスでの封入体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）形成などである。他の例において、導入遺伝子がベクターの「選択マーカー」遺伝子配列挿入される場合、導入遺伝子を含む組換え体は、選択マーカー遺伝子機能の非存在により同定することができる。第四のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは、導入遺伝子によりコードされる短縮α−４インテグリンタンパク質の活性、生化学的または免疫学的特徴を分析することによって同定することができる。短縮タンパク質に対する抗体は、決まった実験技術を用いて容易に作製することができる。抗体を生産することがわかっている特定の方法としては、これらに限定されないが、もともとはＫｏｈｌｅｒおよび Milsteinにより開発されたハイブリドーマ技術［Nature 256：495-497（1975）］、同様にトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［Kozbor et al.，Immunology Today 4：72 1983］；Cote et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80：2026-2030（1983）］、および、ヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［Cole et al.，in  Monoclonal Antibody and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc．，pp.７７-96（1985）］が挙げられる。
【０１３６】
本発明において用途を有する哺乳動物発現ベクターとしては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターのような誘導性プロモーターを有するベクターが挙げられ、例えば、ＤＨＦＲ発現ベクターまたはＤＨＦＲ／メトトレキセート共増幅ベクターを有するいかなる発現ベクターであり、例えばｐＥＤである（ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＳｂａＩ，ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩクローニング部位、クローン化遺伝子およびＤＨＦＲ両方を発現するベクターである；Kaufman，Current Protocols in Molecular Biology，16．12（1991）を参照）。あるいは、グルタミンシンセターゼ／メチオニンスルホキシミン共増幅ベクターであり、例えばｐＥＥ１４である（Ｈｉｎｄ III，ＸｂａＩ，ＳｍａＩ，ＳｂａＩ，ＥｃｏＲＩ、およびＢｃｌＩクローニング部位を有し、グルタミンシンターゼおよびクローン化遺伝子を発現するベクターである；Celltech）。他の実施形態において、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の制御下でエピソーム発現を指揮するベクターを用いることができ、例えばｐＲＥＰ４（ＢａｍＨＩ，ＳｆｉＩ，ＸｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＮｈｅＩ，Ｈｉｎｄ III，ＮｈｅＩ，Ｐｖｕ II，およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカーを有する；Invitrogen）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨＩ，ＳｆｉＩ，ＸｈｏＩ，ＮｏｔＩ，ＮｈｅＩ，Ｈｉｎｄ III，ＮｈｅＩ，Ｐｖｕ II、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成的ｈＣＭＶ前初期遺伝子、ハイグロマイシン選択マーカー；Invitrogen）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ，ＰｖｕＩ，ＮｈｅＩ，Ｈｉｎｄ III，ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩ，ＳｆｉＩ，ＢａｍＨＩクローニング部位、誘導性メタロチオネインIIａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨＩ，ＸｈｏＩ，ＮｏｔＩ，Ｈｉｎｄ III，ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ，ＮｈｅＩ，Ｈｉｎｄ III，ＮｏｔＩ，ＸｈｏＩ，ＳｆｉＩ、およびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂によりＮ末端ペプチドで精製可能、エンテロキナーゼで開裂される；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。本発明で用いられる選択可能な哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｈｉｎｄ III，ＢｓｔＸＩ，ＮｏｔＩ，ＳｂａＩ、およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Ｈｉｎｄ III，ＳｐｅＩ，ＢｓｔＸＩ，ＮｏｔＩ，ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられる。本発明に従って使用されるワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター（上述のＫａｕｆｍａｎ，１９９１を参照）としては、これらに限定されないが、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＡｆｌＩ，ＮａｒＩ，ＢｓｐＭII，ＢａｍＨＩ，ＡｐａＩ，ＮｈｅＩ，Ｓａｃ II，ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄ IIIクローニング部位；ＴＫ−およびβ−ｇａｌ選択）、およびｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｌＩ，ＡｃｃＩ，Ｈｉｎｄ II，ＳｂａＩ，ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）が挙げられる。
【０１３７】
発現ベクターは、当業界でよく知られた方法で胚に導入され、該方法としては、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション；トランスダクション、細胞融合，ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、ジーンガンの使用、またはＤＮＡベクター輸送体がある（例えば、Wu et al.，1992，J．Biol．Chem．267：963−967；Wu and Wu，1988，J．Biol．Chem．263：14621−14624；Hartmut等の１９９０年３月１５日付けで出願されたカナダ国特許出願番２，０１２，３１１号を参照）。
【０１３８】
同様に、トランスフェクトされた胚を偽妊娠マウスに挿入することに関する工程はまた、よく理解されており、当業者であれば利用可能である。このような技術の特定の例は、Wagner等の米国特許第５,１７５,３８５号、および、Daynの米国特許第５,９２９,０４３号で明確に記載されており、これらいずれも参照によりその全体を本明細書に加入する。
【０１３９】
機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないトランスジェニックマウス
その上、上記で説明したように、本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないトランスジェニックマウスに及ぶ。特に、本発明のトランスジェニックマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる第一および第二の対立遺伝子が、操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子の２つのコピーで置換されたゲノムを有する。その結果として、本発明のトランスジェニックマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない。
【０１４０】
当然ながら、本発明は、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないトランスジェニックマウスの製造方法に及び、該方法は、以下の工程を含む：
（ａ）機能的α−４インテグリンタンパク質を発現することができる対立遺伝子が、操作可能にプロモーターと結合したα−４インテグリンタンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡ分子の部分を含む導入遺伝子で置換されたゲノムを有する第一のトランスジェニックマウスと、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できる対立遺伝子が、該導入遺伝子で置換されたゲノムを有する第二のトランスジェニックマウスとを交雑する工程；
（ｂ）機能的α−４インテグリンタンパク質を発現することができる双方の対立遺伝子が該導入遺伝子の２つのコピーで置換されたゲノムを有する子孫を交雑体から選択すること。
【０１４１】
これら選択された子孫はトランスジェニックマウスであり、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないために本発明のトランスジェニックマウスである。
【０１４２】
第一および第二のトランスジェニックマウス内でα−４インテグリンタンパク質を発現することができる対立遺伝子を、上述の導入遺伝子で置換するために、多数の方法が当業者にとって利用可能である。このような方法の１つとして、遺伝子ターゲティングがある。「遺伝子ターゲティング」は、ゲノムＤＮＡの断片が哺乳動物細胞に導入され、断片が内因性相同配列に位置し組みかえられている場合に生じる相同組換えのタイプである。これは、ゲノムに特異的変異を起こすために、酵母からマウスにいたる様々な系で用いられてきた。遺伝子ターゲティングは、インビボでのタンパク質機能を研究するのに有用であるばかりでなく、ヒトの病気や遺伝子治療のための動物モデルを作製するのにも有用である。該技術は、細胞に導入されたＤＮＡと、その細胞の内因性染色体ＤＮＡとの相同組換えを含む。その結果として、この技術により、内因性ＤＮＡを外因性ＤＮＡ（例えば操作可能にプロモーターと結合した配列番号１を含む導入遺伝子）に「交換する」ことができる。決まった実験技術を用いて本発明の用途に容易に適合させることができる遺伝子ターゲティングの特定の方法は、米国特許第６,１４３,５６６号で説明されており、その全体を参照により本明細書に加入する。胚を導入遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトする技術、および、トランスフェクトされた胚をＦ１の偽妊娠雌マウスに挿入する技術は、上述の通りである。当然ながら、これら技術は、本発明のトランスジェニックマウスの作製においてすでに用途を有する。
【０１４３】
α−４インテグリンタンパク質活性を調節する能力に関して化合物または薬剤を分析する方法
上記で説明したように、生物が機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないことにより、驚くべきことに、かつ意外なことに、その生物において表現型の変化が起こることがわかった。このような生物は、それらの表現型に関して得られた情報に加えて、α−４インテグリンタンパク質活性を調節、特に拮抗する能力に関して化合物または薬剤を分析する方法においてすでに用途を有する。特に、驚くべきことに、かつ意外なことに、機能的α−４インテグリンの欠失が、哺乳動物における様々な遺伝子マーカーのレベルを調節することがわかった。このようなマーカーの例としては、以下のものが挙げられる（ただしこれらに限定されない）：
【０１４４】
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，ｄ−ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃｄｓ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］：
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃｄｓ；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
および、血液の幹細胞前駆体濃度。
【０１４５】
より特定には、本発明のマウスの表現型において、機能的α−４インテグリンタンパク質の非存在により、様々な遺伝子マーカーの測定レベルが増加することがわかり、該遺伝子マーカーとしては、いくつか例を挙げると、以下のものが挙げられる（これらに限定されない）：
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ
３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【０１４６】
また、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスにおいて、いくつかの遺伝子マーカーの測定レベルが減少することもわかった。レベルが減少する遺伝子マーカーの例としては、いくつか例を挙げると、以下のものが挙げられる：
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；および、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ。
【０１４７】
本発明のマウスから得られたこの情報を用いて、α−４インテグリンアンタゴニスト活性の活性を調節、特に拮抗する能力に関して化合物または薬剤を分析する方法が見出された。α−４インテグリンタンパク質活性を拮抗する化合物または薬剤は、多様な病気または疾患、例えば炎症、喘息、関節炎、ＭＳなどを治療する治療剤として用途を有する可能性がある。従って、本発明は、α−４インテグリンタンパク質活性を調節、特に拮抗する能力に関して化合物または薬剤を分析する方法に及び、該方法は、（ａ）化合物または薬剤を野生型マウスに投与する工程、（ｂ）野生型マウスで遺伝子マーカーのレベルを測定する工程、および（ｃ）工程（ｂ）の測定値と、コントロール野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルとを比較する工程、を含む。野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが、コントロール野生型マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されることは、化合物または薬剤がα−４インテグリンタンパク質アンタゴニスト活性を有する可能性を示す。その調節がα−４インテグリンタンパク質活性の減少に直接関係する遺伝子マーカーの例、および、そのレベルがα−４インテグリンタンパク質活性の減少に逆に関係する遺伝子マーカーの例は、上述した通りである。従って、これら遺伝子マーカーのレベルを調節する化合物または薬剤は、上述したように、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニストとしての能力を有する。従って、化合物または薬剤の投与後に以下の遺伝子マーカーのいずれかのレベルが増加する場合、その化合物または薬剤は、α−４インテグリンアンタゴニスト活性を有する可能性がある：
【０１４８】
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【０１４９】
あるいは、化合物または薬剤の投与後に以下の遺伝子マーカーのいずれかのレベルが減少する場合は、その化合物または薬剤は、α−４インテグリンアンタゴニスト活性を有する可能性がある：
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；または、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ。
【０１５０】
その上、類似の方法は、化合物または薬剤を投与された動物からの血液サンプルと、コントロール哺乳動物から採取された血液サンプルとを比較する代わりに、化合物または薬剤の投与前の哺乳動物から採取された血液サンプルと、化合物または薬剤の投与後に同哺乳動物から採取された血液サンプルとを比較することを含む。
【０１５１】
その上、本発明は、α−４インテグリンアンタゴニストまたはＶＬＡ−４受容体アンタゴニストに関連する副作用を改善できる化合物または薬剤を分析するための、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスの使用に及ぶ。特に、本発明のマウスは、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない。従って、本質的に，それらの調節された表現型は、哺乳動物にいて機能的α−４インテグリンが欠失することにより生じる。従って、本発明のマウスに投与された化合物または薬剤により、そのマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが、野生型コントロールマウスで測定された遺伝子マーカーの測定レベルと比べて調節される場合、その化合物または薬剤は、α−４インテグリンタンパク質またはＶＬＡ−４受容体アンタゴニストに関連する副作用を治療することにおいて用途を有する可能性がある。
【０１５２】
従って、本発明は、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニストまたはＶＬＡ−４受容体アンタゴニストに関連する有害な副作用を改善する活性に関して、化合物または薬剤を分析する方法に及び、該方法は、以下の工程：
（ａ）機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスに化合物または薬剤を投与する工程；
（ｂ）マウスで遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；および、
（ｃ）マウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない本発明のコントロールマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルとを比較する工程、
を含み、化合物または薬剤が投与されたマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルが、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないコントロールマウスで測定された遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されることは、その化合物または薬剤が、α−４インテグリンタンパク質アンタゴニストに関連する有害な副作用を改善する活性を有する可能性があることを示す。
【０１５３】
α−４インテグリンアンタゴニストまたはＶＬＡ−４受容体アンタゴニストに関連する有害な副作用を改善する用途を有する化合物または薬剤は、α−４インテグリンアンタゴニスト投与の結果としてそれらの調節とは逆の方向で遺伝子マーカーの測定レベルを調節し得る。従って、特定の遺伝子マーカーに関して、α−４インテグリンアンタゴニスト投与により遺伝子マーカーの測定レベルが減少する場合、α−４インテグリンアンタゴニストに関連する副作用を治療するための化合物または薬剤により、遺伝子マーカーの測定レベルが増加し、逆もまた同様である。本発明のこのような方法において用途を有する遺伝子マーカーの例は、上述した通りである。
【０１５４】
本発明の方法において、現在利用可能な多数の方法が、化合物または薬剤を投与するのに用いることができる。特に、化合物または薬剤は、非経口で、例えば静脈注射により投与することができ、また、これらに限定されないが、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下，腹膜内、心室内、および頭蓋内投与が挙げられる。本発明において用途を有する化合物または薬剤のさらなる他の投与方法は、経粘膜であり、例えば、経口、鼻、または直腸もしくは経皮がある。
血液サンプルの採取方法および遺伝子マーカーの測定方法を以下で説明する。
【０１５５】
化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節する能力を有するかどうかを決定する方法
上記で説明したように、機能的α−４インテグリンを発現できない本発明のマウスにおける遺伝子マーカーのレベルは、機能的α−４インテグリンを発現できない本発明のマウスにおけるこれら遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されることが見出された。上記で説明したように、いくつかの遺伝子マーカーは、α−４インテグリンタンパク質の活性に対して直接調節され、いくつかの遺伝子マーカーは、α−４インテグリンタンパク質活性に対して逆に調節される。その上、上述した理由と同様で、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のレベルは、α−４インテグリンタンパク質の存在レベルに直接的に関係する。その結果として、生物におけるα−４インテグリンタンパク質に関する遺伝子マーカーのレベルを、コントロール生物における遺伝子マーカーのレベルと比べて調節するような生物に投与された化合物または薬剤は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節する能力も有する。従って、α−４インテグリンタンパク質に関する上述の遺伝子マーカーおよびそれらの調節はまた、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に関する遺伝子マーカーであり、同じ方法で調節される。従って、本発明は、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節するかどうかを決定する方法に及び、以下の工程を含む：
（ａ）化合物または薬剤を生物に投与する工程；
（ｂ）生物から採取された生体サンプルで、ＶＬＡ−４受容体シグナリングに関する遺伝子マーカーの発現レベルを測定する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）の遺伝子マーカーの発現レベルと、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベルとを比較する工程。
【０１５６】
生体サンプルとコントロール生体サンプルとで測定された遺伝子マーカーの発現レベルの差は、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリングを調節することを示す。特に、その発現レベルが増加する遺伝子マーカー、すなわちＶＬＡ−４受容体シグナリング活性に対して逆に関連する遺伝子マーカーの例としては、以下のものが挙げられる（ただしこれらに限定されない）：
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２），完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ
３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡ  ハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；および、
血液の幹細胞前駆体濃度。
【０１５７】
同様に、その発現レベルが減少する遺伝子マーカー、すなわちＶＬＡ−４受容体シグナリング活性に対して直接的に関連する遺伝子マーカーの例としては、以下のものが挙げられる：
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；および、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ。
【０１５８】
当然ながら、生体サンプルとしては、ただしこれらに限定されないが、体液、例えば、血液、尿、唾液、粘液、精液、リンパ液等、または固体サンプル、例えば組織、骨、毛等が挙げられる。その上、コントロール生体サンプルとは、化合物または薬剤の投与の前に生物から採取された生体サンプルが可能であり、またあるいは、化合物または薬剤が投与されていない第一の生物と実質的に類似した第二の生物（同一または類似の種、年齢、体重、性別など）から採取された生体サンプルが可能である。当然ながら、生物は、哺乳動物が可能であり、いくつか例を挙げると、これらに限定されないが、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコのマウスの、またはヒトが挙げられる。
【０１５９】
ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の「代理」マーカーであり、その発現レベルがＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に直接的に関連する遺伝子マーカーの特定の例は、マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡであり、これは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１１９７４が付与されており、配列番号１３に記載される。
【０１６０】
ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の「代理」マーカーであり、その発現レベルがＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に直接的に関連する遺伝子マーカーの他の特定の例は、ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ、または、ＳＯＣＳ−１タンパク質であり、そのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０００６７７が付与されており、配列番号１７に記載される。
【０１６１】
ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の「代理」マーカーであり、その発現レベルがＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性に直接的に関連する遺伝子マーカーのその他の特定の例は、ＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５（ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン）（配列番号２１のヌクレオチド配列を有する）、および、ＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１（Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ）（配列番号２３のヌクレオチド配列を有する）である。
【０１６２】
同様に、本発明は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を拮抗する化合物または薬剤の能力を決定する方法に及び、該方法は、以下の工程：
（ａ）第一の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｂ）第一の生体サンプルで遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；
を含み、ここで、該遺伝子マーカーは、以下からなる群より選択される：
ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；
ハツカネズミ主要組織適合遺伝子座クラスII領域；
ハツカネズミキャッピングタンパク質βサブユニットアイソフォーム１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ペルオキシソーム内在性膜タンパク質ＰＭＰ３４に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスインターフェロン調節因子１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミＧＴＰアーゼＩＧＴＰのｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスｓｐｉ２プロテイナーゼ阻害剤（ｓｐｉ２／ｅｂ１）のｍＲＮＡ，３末端；
Ｑ０１５１４種と相同：インターフェロン誘導グアニル酸結合タンパク質；
Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；
ＮＲＮＴ（３ｅ−３９）：ヒトホスファチジルイノシトール（４，５）ビスリン酸５−ホスファターゼ；
ハツカネズミ（クローンＵ２）Ｔ細胞特異的タンパク質のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；および、
マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ，
【０１６３】
（ｃ）可能性のあるアンタゴニストを生物に投与する工程；
（ｄ）第二の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｅ）第二の生体サンプルで遺伝子マーカーのレベルを測定する工程、および、
（ｆ）工程（ｂ）と工程（ｅ）との測定レベルを比較する工程。
【０１６４】
工程（ｅ）における遺伝子マーカーの測定レベルが、工程（ｂ）における遺伝子マーカーの測定レベルと比べて減少することは、その化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４のシグナリング活性のアンタゴニストであることを示す。当然ながら、上述したように、第一および第二の生体サンプルは、体液、体の組織、または、それらの組み合わせを含み得る。本発明において用途を有する特定の遺伝子マーカーは、以下のものである：マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ１１９７４が付与されており、配列番号１３に記載される；ＪＡＢに関するハツカネズミｍＲＮＡ，完全ｃｄｓまたはＳＯＣＳ−１タンパク質、そのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０００６７７が付与されており、配列番号１７に記載される；ＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５（ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン）、配列番号２１のヌクレオチド配列を有する；および、ＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１（Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ）、配列番号２３のヌクレオチド配列を有する。
【０１６５】
加えて、本発明は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を拮抗する化合物または薬剤の能力を決定する方法に及び、該方法は、以下の工程：
（ａ）生物から第一の生体サンプルを採取する工程；
（ｂ）第一の生体サンプルで遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；
を含み、ここで、該遺伝子マーカーは、以下からなる群より選択される：
ハツカネズミ抗フォン−ウィルブランド因子抗体ＮＭＣ−４κ鎖ｍＲＮＡ；
免疫グロブリンα重鎖，スイッチ領域およびｃｏｎに関するマウス遺伝子；
（Ｈ−２クラスＩ組織適合性抗原，Ｄ−Ｋα鎖前駆体；
ハツカネズミＭＨＣクラスＩのＱａ−１ａ抗原ｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
ハツカネズミリボソームタンパク質Ｌ４１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
マウスＭＨＣクラスＩのＤ領域細胞表面抗原（Ｄ２ｄ）遺伝子，完全ｃ；
赤血球分化レギュレーターに関するハツカネズミｍＲＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（１ｅ−９２）；，完全配列［ハツカネズミ］；
ｖｃ５０ｅ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス２細胞ハツカネズミｃＤＮＡクローン７７８０２８；
ＮＲＮＴ（０.０）：IIＧＰタンパク質に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
Ｉｇγ鎖、分泌型および膜結合型に関するマウスＤＮＡ，部分的；
ＮＲＮＴ（２ｅ−６１）：ＰＳＭＢ５に関するハツカネズミＤＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｐ３２５０７種と相同：ポリオウイルス受容体相同前駆体；
マウスＩｇの再配列させたＨ鎖のｍＲＮＡ定常領域；
ハツカネズミｍＲＮＡのＲＨＡＭＭ；
Ｒ７４６３８ＭＤＢ０７９３マウス脳，ＳｔｒａｔａｇｅｎｅハツカネズミｃＤＮＡ３’末端；
ハツカネズミの薄い耳（ｅｐ変異対立遺伝子）のｍＲＮＡ，部分的ｃｄｓ；
ｍｊ３５ｈ０９.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス胚ＮｂＭＥ１３.５  １４.５ハツカネズミｃＤＮＡクローン４；
ＭＵＳＧＳ００７６１マウス３’方向ｃＤＮＡ；ＭＵＳＧＳ００７６１；クローンｍｂ１４９４．ＴＩＧＲ  ｃｌｕｓ；
Ｐ４１７２５種と相同：脳の強化されたヒアルロナン結合タンパク質ＰＲＥ；
Ｄ２Ａドーパミン受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡ；
ｍｏ５４ｂ０５.ｒ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈマウス胚１０  ５ｄｐｃ  １０６６５０１６ハツカネズミｃＤＮＡのｃｄｓ；
ｍｔ２３ｇ１１.ｒ１  Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳハツカネズミｃＤＮＡクローン６２１９５６ ５’ＴＩＧＲのｃ；
ハツカネズミＢｏｐ１のｍＲＮＡ，完全ｃｄｓ；
Ｃ７５９５９マウス３.５−ｄｐｃ胚盤胞ｃＤＮＡハツカネズミｃＤＮＡクローンＪ０００１Ｃ０５；および、
血液の幹細胞前駆体濃度；
【０１６６】
（ｃ）可能性のあるアンタゴニストを生物に投与する工程；
（ｄ）第二の生体サンプルを生物から採取する工程；
（ｅ）第二の生体サンプルで、遺伝子マーカーのレベルを測定する工程；および、
（ｆ）工程（ｂ）と工程（ｅ）との測定レベルを比較する工程。
【０１６７】
工程（ｅ）における遺伝子マーカーの測定レベルが、工程（ｂ）における遺伝子マーカーの測定レベルと比べて増加することは、その化合物または薬剤は、ＶＬＡ−４のシグナリング活性のアンタゴニストであることを示す。当然ながら、上述したように、第一および第二の生体サンプルは、体液、体の組織、または、それらの組み合わせを含み得る。
【０１６８】
上記で説明したように、多数のタイプの生物が、本発明の方法において用途を有する。特定の例としては、いくつか例を挙げると、ただしこれらに限定されないが、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、またはヒトのような哺乳動物が挙げられる。
【０１６９】
ＶＬＡ−４受容体シグナリング活性の調節因子
上記で説明したように、本発明の方法で評価することができる化合物または薬剤としては、免疫原としてＶＬＡ−４受容体を有する抗体もしくはこのような抗体の断片、または、免疫原としてα−４インテグリンタンパク質を有する抗体もしくはこのような抗体の断片；化学物質；核酸分子、例えばＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質をコードするＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス分子、または、α−４インテグリンタンパク質のＶＬＡ−４受容体をコードするＲＮＡを開裂するように加工されたリボザイム；炭水化物；ホルモン、またはレクチン、が可能である。このような化合物または薬剤の特定の例を以下に説明する。
【０１７０】
ａ．抗体
ＶＬＡ−４シグナリング活性を調節する化合物または薬剤の一例は、免疫原としてα−４インテグリンまたはＶＬＡ−４受容体のいずれかを含む抗体である。このような抗体としては、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられる。その上、抗ＶＬＡ−４および抗α−４インテグリン抗体は、交差反応性の可能性があり、例えば、これらは、それぞれ異なる種からのＶＬＡ−４およびα−４インテグリンタンパク質を認識する可能性がある。ポリクローナル抗体は、より大きい交差反応性の可能性を有する。
あるいは、本発明の抗体は、例えばマウスのＶＬＡ−４またはα−４インテグリンタンパク質の単一形態（single form）に特異的であってもよい。
【０１７１】
ＶＬＡ−４またはα−４インテグリンタンパク質に対するポリクローナル抗体を製造するために、当業界既知の様々な方法を用いることができる。抗体の製造のために、ＶＬＡ−４またはα−４インテグリンタンパク質を注入することにより様々な宿主動物を免疫化することができ、該動物としては、これらに限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が挙げられる。一実施形態において、ＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質、または、それらの断片は、免疫原性担体、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合させることができる。免疫応答を増加させるために、宿主の種に応じて様々なアジュバントを用いることができ、例えば、これらに限定されないが、フロインド（完全および不完全）、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールであり、場合によってはヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム−パルヴムも有用である。
【０１７２】
ＶＬＡ−４受容体もしくはα−４インテグリンタンパク質またはそれらの断片に向けられたモノクローナル抗体の調製のために、培養での連続的な細胞系による抗体分子製造を提供する技術のいずれも用いることができる。該技術としては、これらに限定されないが、もともとはKohlerおよびMilsteinにより開発されたハイブリドーマ技術［Nature 256：495-497（1975）］、同様に、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［Kozbor et al.，Immunology Today 4：72 1983］；Cote et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80：2026-2030（1983）］、および、ヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［Cole et al.，in Monoclonal Antibody and Cancer Therapy，Alan R．Liss，Inc.，pp.７７-96（1985）］。必要に応じて、モノクローナル抗体は、無菌動物で生産させることもできる［ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５］。ＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の作製に関して開発された技術［Morrison et al.，J．Bacterial．159：870（1984）；Neubergeｒ et al.，Nature 312：604-608（1984）；Takeda et al.，Nature 314：452-454（1985）］も用いることができる；このような抗体は、本発明の範囲内である。このようなヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ＶＬＡ−４受容体シグナリングアンタゴニストとして用いるのに好ましく、なぜなら、ヒトまたはヒト化抗体は、外因性抗体よりも免疫反応，特にそれ自身のアレルギー応答を誘発する可能性がかなり低いためである。
【０１７３】
本発明に従って、単鎖抗体の生産に関して説明された技術［Ｈｕｓｔｏｎの米国特許第５,４７６,７８６号および第５,１３２,４０５号；米国特許第４,９４６,７７８号］が、ＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質特異的単鎖抗体を生産するのに適用可能である。本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に関して説明された技術を利用して［Huse et al.，Science 246：1275−1281（1989）］、ＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質またはそれらの誘導体もしくは類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を迅速で簡単に同定することができる。
【０１７４】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は、既知の技術により生産することができる。例えば、このような断片としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：  Ｆ(ａｂ’)2断片、これは抗体分子のペプシン消化により生産することができる；Ｆａｂ’断片、これはＦ(ａｂ’)2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生産することができる；および、Ｆａｂ断片、これは抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生産することができる。
【０１７５】
抗体の製造において、所望の抗体のスクリーニングは、例えば、ラジオイムノアッセイ，ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着分析）、「サンドイッチ」免疫分析、イムノラジオメトリック分析、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散分析、インサイチュ免疫分析（例えばコロイド金、酵素または放射線同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集分析（例えば、ゲル凝集分析，血球凝集分析）、補体結合分析、免疫蛍光分析、タンパク質Ａ分析、および、免疫電気泳動法分析等のような当業界既知の技術によって達成することができる。一実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。他の実施形態において、一次抗体は、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体が標識される。イムノアッセイにおける結合の検出に関する多くの手段が当業界既知であり、本発明の範囲内である。例えば、ＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質に特異的なエピトープを認識する抗体を選択するために、このようなエピトープを含むＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質断片に結合する産物に関して生成したハイブリドーマを分析することもできる。特定の動物種からのＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質に特異的な抗体を選択するために、その動物種の細胞で発現される、または、それから単離されたＶＬＡ−４またはα−４インテグリンタンパク質との明確な結合に基づき選択することができる。
【０１７６】
前述の抗体はまた、ＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質の位置確認および活性に関する当業界既知の方法で用いることができ、該方法としては、例えば、ウェスタンブロッティングに関して、インサイチュでＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質をイメージングすること、上述または当業界既知のいずれの検出技術を用いて適切な生理学的サンプル等でそれらのレベルを測定すること、である。
当然ながら、ＶＬＡ−４またはα−４インテグリンタンパク質の活性を作動または拮抗する抗体を生産することができる。このような抗体は、説明された分析を用いて試験することができる。
【０１７７】
ｂ．アンチセンスおよびリボザイム
本発明はまた、これらタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節することにより、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性またはα−４インテグリンタンパク質の調節すること活性を調節するアンチセンスヌクレオチド、および、リボザイムの調製に及ぶ。このような発現を調節すること、特に減少させるかまたは妨害することは、ＶＬＡ−４受容体シグナリングアンタゴニスト活性を示すこ化合物または薬剤をもたらす。このアプローチは、アンチセンス核酸およびリボザイムを利用して、アンチセンス核酸でそのｍＲＮＡをマスキングすること、またはリボザイムでそれを切断させることのいずれかによって特異的ｍＲＮＡの翻訳をブロックする。
【０１７８】
アンチセンス核酸とは、特異的ｍＲＮＡ分子少なくとも一部分に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子である［Marcus-Sekura，Anal．Biochem．172：298（1988）を参照］。細胞中で、その細胞はそのｍＲＮＡハイブリダイズし、二本鎖分子を形成する。その細胞は、この二本鎖形態においてｍＲＮＡを翻訳しない。それゆえに、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡのタンパク質への発現を妨害する。約１５個のヌクレオチドのオリゴマー、および、ＡＵＧ開始コドンにハイブリダイズする分子は特に効率的であり、なぜなら、それらは簡単に合成でき、より大きい分子を器官細胞に導入する際の問題がより少ないと思われるためである。アンチセンス方法は、インビトロでの多くの遺伝子発現を阻害するのに用いられてきた［上述の Marcus-Sekura，1988；Hambor et al.，J．Exp．Med．168：1237（1988）］。必要に応じて、合成アンチセンスヌクレオチドは、天然のホスホエステル結合よりむしろ、ホスホロチオレート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｌａｔｅ）またはチオエステルのようなホスホエステル結合類似体を含む。このようなホスホエステル結合類似体は、より分解耐性であり、従って安定性が増加し、それゆえにアンチセンス核酸の有効性も増加する。
【０１７９】
リボザイムとは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼといくらか類似した方法で特異的に他の一本鎖ＲＮＡ分子を切断させる能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、ある種のｍＲＮＡはそれら自身のイントロンを切り出す能力を有するという観察から発見された。これらＲＮＡのヌクレオチド配列を改変することにより、研究者は、ＲＮＡ分子中で特定のヌクレオチド配列を認識し、それを切断させる分子を加工することを可能にした［Cech，J．Am．Meet．Assoc．260：3030（1988）］。それらが配列特異的であるために、特定の配列を有するｍＲＮＡだけが不活性化される。
【０１８０】
研究者は、２タイプのリボザイム、すなわちテトラヒメナ型、および、「ハンマーヘッド型」を同定した。テトラヒメナ型リボザイムは、４個の塩基配列を認識し、その一方で、「ハンマーヘッド型」は、１１〜１８個の塩基配列を認識する。認識配列が長くなればなるほど、標的ＭＲＮＡ種で独占的に発生する可能性をより高くできる。従って、特異的ｍＲＮＡ種を不活性化するためには、ハンマーヘッド型リボザイムがテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、１８個の塩基認識配列が、それより短い認識配列より好ましい。
【０１８１】
ＶＬＡ−４およびα−４インテグリンタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、当業者により容易に得ることができ（例えば、マウスおよびヒト配列は、ＧｅｎＢａｎｋから容易に得ることができ、例えば、マウスのα−４インテグリンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０１０５７６、ヒトα−４インテグリンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ０３９０１１、マウスのＶＬＡ−４受容体は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４９７２８３が付与されており、およびヒトＶＬＡ−４受容体をコードする配列の多くはＧｅｎＢａｎｋから得ることができる）、従って、ＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質に関するｍＲＮＡに対するアンチセンス分子、およびＶＬＡ−４受容体またはα−４インテグリンタンパク質に関するｍＲＮＡを切断させるリボザイムを調製するのに用いることができ、それによりＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性タンパク質が調節される。
【０１８２】
ｃ．有機化合物
ＶＬＡ−４受容体シグナリング活性を調節する有機化合物が開発されている。例えば、このような化合物は、米国特許第６,３５２,９７７号、および、公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／２３０６３に説明されており、参照によりその全体を本明細書に加入する。このような化合物の特定の例は、式：
【化１】
2004531266.tif 000002
で示される、（Ｓ）−３−（（Ｓ）−２−（４，４−ジメチル−３−（４−（３−（２−メチルフェニル）ウレイド）ベンジル）−２，５−ジオキソイミダゾリジン−１−イル）−２−（２−メチルプロピル）アセチルアミノ）−３−フェニルプロピオン酸またはそれらの生理学的に許容できる塩があり、前記化合物は、本明細書において「ＨＭＲ１０３１」と称する。他の例として、式：
【化２】
2004531266.tif 000003
で示される有機化合物またはそれらの生理学的に許容できる塩があり、前記化合物は、本明細書において「ＩＶＬ９８４」と称する。
【０１８３】
ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節するを調節する候補化合物または薬剤ライブラリー検索
従来、有用な特性を有する新しい化学物質は、いくつかの望ましい特性または活性を有する化学物質（「リード化合物」という）を同定すること、リード化合物の改変体を作製すること、これら改変化合物の特性および活性評価することにより製造されている。しかしながら、最近の傾向は、創薬の全ての側面においてタイムスケールを短縮することである。迅速かつ効率的に多数を試験する能力のために、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法が、通常のリード化合物同定法に替わりつつある。
【０１８４】
特定の実施形態において、ハイスループットスクリーニング方法は、多数の可能性のある治療化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供することを含む。次に、このような「コンビナトリアルケミストリーライブラリー」は、本明細書で述べたような１またはそれ以上の分析でスクリーニングされ、望ましい特徴的な活性を示すライブラリーメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定することができる。従って、同定された化合物は、通常の「リード化合物」として役立たせることができ、または、それ自体を可能性のある、または実際的な治療剤として用いることもできる。
【０１８５】
コンビナトリアルケミストリーライブラリー
コンビナトリアルケミストリーライブラリーは、新しいリード化学物質の製造を補助する好ましい手段である。コンビナトリアルケミストリーライブラリーは、試薬などの多数の化学的「基礎成分」を組み合わせることにより化学合成または生物学的合成のいずれかにより製造された多様な化学物質のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーのようなリニアーコンビナトリアルケミストリーライブラリーは、一連のアミノ酸と呼ばれる化学的基礎成分を、所定の化合物長さ｛すなわち、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数｝に関して全ての可能な方法で組み合わせることによって形成される。このような化学的基礎成分のコンビナトリアル混合により、多数の化学物質を合成することができる。例えば、ある解説者は、１００種の交換可能な化学的基礎成分を組織的にコンビナトリアル混合することによって、理論上、１億種の四量体化合物、または、１００億種の五量体化合物が合成されると述べている（Gallop et al.（1994）37（9）：12331250）。
【０１８６】
コンビナトリアルケミストリーライブラリーの調製は、当業者周知である。このようなコンビナトリアルケミストリーライブラリーとしては、これらに限定されないが、ペプチドライブラリーが挙げられる［例えば、米国特許第５,０１０,１７５号，Furka（1991）Int．J．Pept．Prot．Res.，37：487-493，Houghton et al.,（1991）Nature，354：84-88を参照］。ペプチド合成は、決して本発明において使用を想定、意図されたアプローチのみではない。化学的に多様なライブラリーを製造するその他の化学法も用いることができる。このような化学法としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ペプトイド（ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／１９７３５，１９９１年１２月２６日）、コードされたペプチド（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／２０２４２，１９９３年１０月１４日）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０００９１，１９９２年１月９日）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなダイバーソマー（diversomer）（Hobbs et al.，（1993）Proc．Nat．Acad．Sci．USA 90：69096913）、ビニル様（vinylogous）ポリペプチド（Hagihara et al.,（1992）Ｊ．Amer．Chem．Soc．114：6568）、β−Ｄ−グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチドミメティックス（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  et al.，（１９９２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７９２１８）、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Chen et al.,（1994）J．Amer．Chem．Soc．116：２661）、オリゴカルバメート（Cho，et al.，（1993）Science 261：1303）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al.，（1994）J．Org．Chem．59：658）。概して、以下を参照：Gordon et al.，（1994）．J．Med．Chem．37：1385、核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５,５３９,０８３号を参照）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughn et al．（1996）Nature Biotechnology，14（3）：309-314）、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liang et al.,（1996）Science，274：1520-1522、および米国特許第５,５９３,８５３号を参照）、および低分子有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum（1993）Ｃ＆ＥＮ，１月１８日、第３３頁、イソプレノイド、米国特許第５,５６９,５８８号、チアゾリジノンおよびメタチアザノン（metathiazanone）米国特許第５,５４９,９７４号、ピロリジン、米国特許第５,５２５,７３５号および第５,５１９,１３４号、モルホリノ化合物、米国特許第５,５０６,３３７号、ベンゾジアゼピン第５,２８８,５１４号などを参照）。
【０１８７】
コンビナトリアルライブラリー調製装置は、市販されている（例えば３５７ＭＰＳ，３９０ＭＰＳ，Advanced Chem Ｔech, Louisville\ KY，Symphony，Rainin，Woburn, MA，433A Applied Biosystems（Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA）を参照）。溶液相化学法に関して多数の周知のロボットシステムが開発されている。これらシステムとしては、Takeda Chemical Industries，LTD．（Osaka，Japan）により開発された自動化合成装置のような自動化ワークステーション、および、ロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Zymate II，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，HewlettPackard，Palo Alto，Calif.）が挙げられ、これらは、化学者による手動の合成操作模擬する。上記装置のいずれも本発明での使用に適している。これら措置の性質や、本明細書で説明されたように操作可能なように改変を実施すること（必要に応じて）は、関連業界の当業者には明白である。加えて、多数のコンビナトリアルライブラリーそれ自身が市販されている（例えば、ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St．Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，３D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MDなどを参照）。
【０１８８】
化学ライブラリーのハイスループット分析
上記で説明したように、本発明は、化合物または薬剤がＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節、特に拮抗するかどうかを決定するためのインビトロでの方法に及び、該方法は、以下の工程を含む：
（ｄ）化合物または薬剤と、生物からの生体サンプルとを接触させる工程；
（ｅ）生体サンプルで、ＶＬＡ−４受容体シグナリングに関する遺伝子マーカーの発現レベルを測定する工程；および、
（ｆ）工程（ｂ）で測定された遺伝子マーカーの発現レベルと、コントロール生体サンプルで測定された遺伝子マーカーの発現レベルとを比較する工程。
【０１８９】
当然ながら、このような方法は、ハイスループットスクリーニングに適用することができる。ハイスループットスクリーニングシステムは、市販されている（例えば、Zymark  Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc．Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA などを参照）。一般的に、これらシステムは、全てのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体調剤、時間計測されたインキュベート、および分析に適切な検出器での最終的なマイクロプレートの読み取りなどの全ての工程を自動化する。これら設定可能なシステムにより、ハイスループットおよび迅速な開始、同様に、高度なフレキシビリティーおよびカスタマイズが提供される。このようなシステムの製造元は、様々なハイスループットに関する詳細なプロトコールを供給している。従って、例えば、Zymark Corpは、遺伝子転写の調節、リガンド結合などを検出するためのスクリーニングシステムを説明した技術告示を供給している。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによりよりよく理解することができ、これらは、本発明の例として提供される。以下の実施例は、より十分に本発明の好ましい実施形態を説明するために提供される。しかしながら、これら実施例は、決して本発明の広い範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【０１９０】
〔実施例Ｉ〕
機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないノックアウトマウス調製
ここでは、このようなマウスを製造する方法に従って、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できないマウスが提供される。機能的α−４インテグリンを発現できないマウスは、白血球の接着、炎症部位への遊走およびトラフィッキングにさらなる洞察を加えるための役に立つツールである。その上、このような本発明のマウスは、様々な病気または疾患、例えば、これらに限定されないが、リウマチ様関節炎や喘息の治療のための可能性のあるα−４インテグリンアンタゴニストをスクリーニングするための役に立つ有用性を有する。
【０１９１】
材料および方法
一般的な緩衝液および溶液
【表１】
2004531266.tif 000004
【０１９２】
プラスミド
【表２】
2004531266.tif 000005
【０１９３】
オリゴデオキシリボヌクレオチド
【表３】
2004531266.tif 000006
【０１９４】
抗体
免疫組織化学    ＣＤ４９ｄ，ＢＤ Pharmingen クローン ９Ｃｌ０
【０１９５】
方法
ＤＮＡ操作
（ａ）ＤＮＡ断片のプラスミドへのライゲーション
挿入物をプラスミドにライゲートするために、所望の挿入物を含むプラスミド、および、レシピエントプラスミドの両方を適切な制限酵素で消化した。必要に応じて、再アニーリングを防ぐために、その断片をクレノー処理し、レシピエントプラスミドを脱リン酸化した。アガロースゲルで消化物を泳動してサイズ分離し、所望のバンドをフェノール抽出で抽出することにより、挿入断片をその親プラスミドから分離した。一般的に、レシピエントプラスミドはまた、脱リン酸化の後にアガロースゲルから抽出された。ライゲーション反応のために、通常、１００ｎｇのレシピエントベクターと適切な量の挿入物分画とを混合し、モル比１：１、１：３および１：５にした。アダプターのベクターへの挿入のために、モル比１：５０および１：１００を用いた。反応に、２μｌの１０×緩衝液と、１μｌのＴ４リガーゼ＝１０ユニット（Gibco，Life Technologies）とを加え、総容積は２０μｌになった。反応を１６℃で一晩（１２〜１６時間）進行させた。ＰＣＲ産物のクローニングのために、InvitrogenのＴＡ−クローニングキットを用いた。該キットは、ＰＣＲ反応中、Ｔａｑポリメラーゼは、１つのデオキシアデノシンをＰＣＲ産物の３’末端に付加するという事実に基づく。該キットにより提供された線形化されたベクターは、ＰＣＲ産物がベクターと効率的にライゲートするように１つのデオキシチミジン残基を有する。
【０１９６】
（ｂ）プラスミドＤＮＡのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞への形質転換
この作業において、３種の異なるタイプのコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を用いた：ＤＨ５α細胞（Gibco，Life Technologiesから）、ＸＬ−１ｂｌｕｅ細胞（Stratageneから）およびＩＮＶαＦ’細胞（Invitrogenから）。供給元のプロトコールに従って形質転換反応を行った。形質転換反応を適切な抗生物質を濃度１００μｇ／ｍｌで含むＬＰプレートに置いた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
アンピシリンストック：アンピシリンを１００ｍｇ／ｍｌのストック水溶液として−２０℃で保存し、オートクレーブし少なくとも４５℃に冷却した後、ＬＢ培地に加え、最終濃度を５０μｇ／ｍｌにした。
ＬＢ寒天プレート：ＬＢ培地に、１.５％寒天を加え、オートクレーブした。〜４５℃
で冷却した後、溶液を滅菌条件下で１０ｃｍの皿に注ぐ。形質転換された細菌をプレーティングする前に、所望の抗生物質をプレートに加えた。
低塩濃度のＬＢプレート：低塩濃度のＬＢ培地を用いた以外はＬＢ寒天プレートと同じ方法を用いた。
【０１９７】
（ｃ）プラスミド含有細菌培養の成長
抗生物質ＬＢプレートで培養したシングルコロニーをピックアップし、これを用いて、適切な抗生物質を濃度５０μｇ／ｍｌで含む５ｍｌのＬＢ培地（または低塩濃度のＬＢ培地）に接種した。スモールスケールプラスミドＤＮＡ調製には、この溶液を３７℃のインキュベーター振盪器で１２〜１６時間、２２５ｒｐｍで、インキュベートした。ラージスケールプラスミドＤＮＡ調製には、接種した５ｍｌのＬＢ培養液を〜５時間培養し、次に、適切な抗生物質を濃度５０μｇ／ｍｌで含む１００ｍｌのＬＢ培地に移した。この細胞懸濁液をさらに１２〜１６時間培養した。
【０１９８】
（ｄ）スモールスケールプラスミドＤＮＡ調製（「ミニ−プレップ」）
シングル細菌コロニーからのプラスミドＤＮＡの迅速な単離のために、「ＱＩＡｓｐｉｎプラスミドキット」または「ＱＩＡｐｒｅｐ ８プラスミドキット」（Qiagen）を用いた。２０個を超えるコロニーを分析しなければならない場合は後者のキットを用いた。いずれの場合も、供給元により提供されたプロトコールは、一般的に１.５ｍｌの一晩のＬＢ培養液を出発原料として用いて続けられる。該キットの原理は、改変アルカ細胞溶解リ溶解法と、ＤＮＡのアニオン交換マトリックスへの結合とに基づく。細胞溶解の間、ＲＮアーゼを該キットにより提供されたリシス緩衝液に加えることによりＲＮＡは破壊される。全ての洗浄および溶出緩衝液は該キットに含まれ、ＤＮＡの最終溶出工程は、水またはＴＥで行われる。精製されたプラスミドＤＮＡを制限酵素消化または配列解析で分析し、−２０℃で保存した。
【０１９９】
（ｅ）ラージスケールプラスミドＤＮＡ調製（「マキシ−プレップ」）
大量のプラスミドＤＮＡを精製するために、「Ｑｉａｇｅｎプラスミドマキシキット」（Qiagen）を用いた。該キットの原理は、以下の点を除いては「ミニ−プレップ」キットと同様である：ＤＮＡを高塩濃度緩衝液で溶出させるため、ＤＮＡを濃縮し、イソプロパノール沈殿で脱塩し、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄しなければならない。一般的に、キットに含まれる１つの「Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ５００」と共に１００ｍｌの培養液を用いた。
【０２００】
（ｆ）アガロースゲルからのＤＮＡ抽出
エチジウムブロマイドを含む０.７％アガロースゲルでＤＮＡを泳動し、所望の断片を紫外線で検出し、切り出し、細かく刻み、１.５ｍｌのチューブに移した。これに、ＤＮＡ断片〜７５０μｌのフェノール：トリス（クロロホルムではない）（Sigma）を加え、ボルテックスし、−８０℃で少なくとも３０分間凍結した。次に、チューブを、卓上マイクロ遠心器で１０分間、高速で遠心分離した。上清を取り、保存した。さらなる水またはＴＥを、フェノール相に加え、チューブをボルテックスし、さらに３０分間（またはそれ以上）−８０℃で凍結した。遠心分離工程を繰り返し、上清をプールした。このプールに、等量のフェノール：クロロホルム（Sigma）を加え、ボルテックスし、スピンダウンした。上清を、エタノール沈殿し、最終ペレットを水またはＴＥに再懸濁した。
【０２０１】
配列解析
ＴＯＰＬＡＢ  ＧｍｂＨ（Martiensried，Germany）の施設で、ｐＮＥＢ３.７（−）プラスミドの配列解析をプライマーウォーキング法により行った。両方の鎖を配列解析した。
【０２０２】
トランスジェニックマウスの作製
（ａ）マイクロインジェクションおよび飼育
標準的なマイクロインジェクション技術は、「Manipulating the  Mouse Embryo-A Laboratory Manual」（Hogan et al.，２nd ed．1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN0-87969-384-3）に詳細に説明されており、その全体を参照により本明細書に加入する。このようなプロトコールは、本発明のマウスを作製するための方法ですでに用途を有する。
【０２０３】
【表４】
2004531266.tif 000007
α−４インテグリンノックアウトのマウスヘテロ接合型は、ジャクソンラボラトリー（Bar Harbor，ME）（ストック番号００２４６３）から購入された。これらマウスは、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊバックグラウンドを有する。
【０２０４】
（ｂ）３週齢マウスの尾からのゲノムＤＮＡの抽出
約１ｃｍの尾組織を３〜４週齢マウスから採取した。この尾試験片を１５ｍｌのＳＳＴチューブ（Becton and Dickinson）に置き、７５０μｌの尾の消化緩衝液を加えた。（尾の消化緩衝液；４５０ｍｌの脱イオン水；５ｍｌの１Ｍのトリス（ｐＨ７.５）；１０ｍｌの５ＭのＮａＣｌ；１０ｍｌの０.５ＭのＥＤＴＡ；および、２５ｍｌの１０％ＳＤＳ、滅菌済み）。チューブを密封し、インキュベーター振盪器に置き、５４℃で、２２５ｒｐｍで尾を消化した。１２〜１６時間後、７５０μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール［１：１（２４：１）］（Sigma）を加え、チューブを穏やかに１５〜３０秒間混合した。相分離のために、チューブを、１５分間、４０００ｒｐｍで、室温で遠心分離した。上部の水相を６ｍｌのファルコンチューブに移し、２倍量の９６％エタノールを加えた。ゲノムのＤＮＡ沈殿を溶液から巻き取り、９６ウェルプレートに移した。ＤＮＡを室温で１〜２時間乾燥させ、続いて、それを２００μｌのＴＥに再懸濁し、−２０℃で保存しするか、または即座に加工した。ＰＣＲ反応には、一般的に、１μｌの１：１０希釈をテンプレートとして用い、サザンブロッティングには、３０μｌの希釈しないＤＮＡを用いた。
【０２０５】
（ｃ）尾のゲノムＤＮＡのＰＣＲ試験
尾調製で得られた各ＤＮＡサンプルは、内因性α−４インテグリンノックアウトに関して、同様に、トランスジェニックＤＮＡの存在に関して分析しなければならない。特定の本発明の実施形態において、トランスジェニックＤＮＡは、配列番号１のＤＮＡ配列を含む。ＤＮＡ溶液を水で１：１０に希釈し、９５℃で５分間加熱し、次に、氷上に置いた。１回のＰＣＲ反応あたり１μｌの希釈ＤＮＡを用いた。Perkin ElmerによるＡｍｐｌｉＴａｑ酵素（２.５ユニット／反応）、Invitrogenからの０.２ｍＭのｄＮＴＰおよび１×緩衝液Ｇを５０μｌ容量で用いて反応を行った。特異的標的ＤＮＡに対してＰＣＲ条件およびプライマー濃度を最適化した。全てのＰＣＲ条件において、９２〜９４℃で２〜４分間で行われるＤＮＡ変性工程を最初に行い、続いて、一般的に、プライマーのメルティング温度に応じて、２０〜４５秒間のＤＮＡメルティング（９２〜９４℃）、３０〜６０秒間のプライマーアニーリング（５５〜６４℃）、および、ＰＣＲ産物の長さに応じて３０〜６０秒間のＴａｑ媒介ＤＮＡ合成（７２℃）で構成される３段階法を３５〜４０サイクルを行った。この３５〜４０サイクルを行った後、７２℃で５〜１０分間の伸長工程を行い、全てのＰＣＲ産物が同じ長さになることを確実にした。次に、ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動で分析した。
【０２０６】
内因性α−４インテグリン遺伝子のバックグラウンドを決定するためのインテグリンＰＣＲ
プライマー：ＩｔｇｎII−Ｆ、ＩｔｇｎII−Ｒ、ＮｅｏＦ−２、それぞれ最終濃度２５、５０および２５μＭ。
ＰＣＲ条件：
９４℃で４分間を１サイクル、
９４℃で４５秒間を３５サイクル、
６１℃で４５秒間、
７２℃で１分間、１０秒間の自己伸長を含む、
７２℃で１０分間を１サイクル。
【０２０７】
ｔｅｔＰ−ＶＬＡ導入遺伝子の存在を決定するためのＴｅｔ−プロモーターＰＣＲ
プライマー：ＴｅｔＰ−ＴｈｅｒｉｏｎおよびｒＭ、それぞれ最終濃度０.４μＭ。
ＰＣＲ条件：
９４℃で３分間を１サイクル、
９４℃で４５秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル、
７２℃で１０分間を１サイクル。
【０２０８】
トランスジェニックマウスからの組織および血液サンプルの採取
組織採取のために、マウスを、頚部脱臼により屠殺した。所望の組織を滅菌条件下で採取し、ドライアイス上で予め冷却した２４−ウェル組織培養皿に置いた。次に、サンプルを、使用するまで−８０℃で保存した。血液採取のために、一般的に成体マウスあたり０.４〜０.６ｍｌの２.５％アバーティンを腹腔内注射してマウスを麻酔した。以下のように眼窩を出血させることにより血液サンプルを採取した：頭を親指と人差し指で固定した。キャピラリーチューブを眼球の内側端に挿入し、眼窩の裏に向かって導入した。キャピラリーチューブを慎重に回すことにより血洞に穴をあけた。血液を凝集させないように氷上で血液を０.５ＭＥＤＴＡチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に採取した。
【０２０９】
一次組織培養
（ａ）脾臓細胞単離
マウスを、頚部脱臼により屠殺し、脾臓を無菌で採取した、ＲＰＭＩ１６４０培地（１％ＦＣＳ含有）を含む５０ｍｌ遠心管に置いた。脾臓を、次に、個別に滅菌ゴム製ポリスマン（０.２３ｍｍ孔径のスクリーン、Thomas Scientific）を用いて滅菌ワイヤースクリーンを通して１０ｃｍのペトリ皿に濾し出した。スクリーンを洗浄し、細胞懸濁液を回収し、１５ｍｌの遠心管に移した。１２００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した後、上清をデカントし、赤血球を、１ｍｌ／脾臓の氷冷赤血球リシス緩衝液で１〜３分間、氷上で溶解させた。次に、上清を、慎重に新しい１５ｍｌの遠心管に移し、脂肪ペレットを残した。細胞懸濁液を、１０分間、１２００ｒｐｍで、４℃で遠心分離した。上清を処分し、細胞をＰＢＳに再懸濁し、氷上に置いた。血球計数器（Hauser Scientific）および染料として Trypan Blue（Gibco，Life Technologies）を用いて、生細胞の数を測定した。
赤血球リシス緩衝液：８.２９ｇのＮＨ4Ｃｌ；０.０３７ｇのＥＤＴＡ；１ｇのＫＨＣＯ3；水を加えて１リットルにし、ろ過滅菌した。
【０２１０】
（ｂ）白血球組織培養
脾臓細胞単離プロトコールで調製された白血球を、開始濃度ｌ０7細胞／ｍｌで、５％ＣＯ2で３７℃で培養した。
培地
【表５】
2004531266.tif 000008
【０２１１】
（ｃ）白血球からのＲＮＡ抽出
白血球からのＲＮＡ抽出のために、「RNeasy Blood Mini kit」（Qiagen）を利用した。該キット試薬に含まれる赤血球溶解工程をとばして、白血球溶解工程からプロトコールを開始させた。
【０２１２】
（ｂ）免疫組織化学（ＩＨＣ）プロトコール：凍結組織の調製および染色：
脾臓を、凍結組織マトリックスで部分的に充填された基礎鋳型（base mold）に置いた
。次に、基礎鋳型を、ブロックがほとんど固化するまで（約３０秒間）液体窒素のデュワー中の予め冷却した２−メチルブタンに浸した。ブロックを、次に、ドライアイス上に置き、切片化するまで保存し、−７０℃で凍結した。
切片化のために、ブロックをクライオスタットチャックに置いた。０.５ミクロンの切片を切り出し、二重にフロスト化したスライドに置いた。切片を冷却（−２０℃）アセトン中で２分間固定し、完全に乾燥し、さらに使用するまで−７０℃で保存した。
【０２１３】
染色のために、BD Pharmingenが出版した標準的な「Research Products catalogue」のような共通プロトコールを利用した：
スライドを室温に温め、次に、ＰＢＳで３回リンスした。ＰＢＳ中の０.０３％Ｈ2Ｏ2溶液を１０分間適用し、次に、スライドを、再びＰＢＳでリンスした。５％血清溶液を１０〜３０分間適用し、取り出し、次に、抗体溶液を加え、加湿したチャンバー中で１時間インキュベートした。用いられた抗体は、ＣＤ４９ｄ，クローン９Ｃ１０（ラット抗マウス）（BD Pharmingen）であった。次に、スライドを、３回ＰＢＳで２分間リンスした。次に、スライドを、ビオチン標識抗ラットＩｇＧ抗体と共に３０分間、室温でインキュベートし、続けてＰＢＳで３回それぞれ２分間リンスした。スライドの水気を切り、ＤＡＢ溶液（ジアミノベンジジン）を５分間加えた。過量のＤＡＢを切り、スライドを水を張った皿中の染色ラックに置いた。スライドを水で３回リンスし、次に、対比染色した。スライドをヘマトキシリンに２回浸し、水でリンスし、青色く着色する試薬に２回浸し（Bluing Reagent）、水でリンスした。次に、スライドを、以下の溶液にそれぞれ１５分間沈めた：９６％エタノール、８０％エタノール、９６％エタノール、キシラノール。Permount（Fisher Scientific）をスライド上にドリップし、ガラスカバースリップで覆った。
【０２１４】
ＲＮＡ操作
（ａ）組織サンプルからのＲＮＡ抽出
融解とそれによるＲＮＡ分解を防ぐために、凍結サンプルをドライアイス上に置いた。各組織サンプルを「RNeasy Midi kit」（Qiagen）に含まれる３.８ｍｌのリシス緩衝液に置き、ＰＴ３１００Ｐｏｌｙｔｒｏｎで約１分間ホモジナイズした。ＲＮアーゼを不活性化するために、強い変性条件下で溶解を行う。次に、「RNeasy Midi kit」のプロトコールに正確に従った。該キットの原理は、２００個以上のヌクレオチド長さのトータルＲＮＡが、キットに含まれるシリカメンブレンカラムに吸収されるという能力に基づく。次に、吸収されたＲＮＡを含むメンブレンを数回洗浄して、不純物からＲＮＡを分離し、次に、水で溶出させる。プロトコールに従って、ＲＮＡのエタノール沈殿を行い、確実に、サンプル中に残留した全てのエタノールを効果的に除去した。エタノール沈殿を−２０℃で１２〜１６時間行い、ＲＮＡをスピンダウンし、ペレットをＲＮアーゼ非含有水で再懸濁し、−２０℃で保存した。
【０２１５】
（ｂ）血液サンプルからのＲＮＡ抽出
新しく採取した血液（ＥＤＴＡチューブ中で氷上で保存）を、「RNeasy Blood Mini kit」（Qiagen）に従ってＲＮＡ抽出用に加工し、そこで説明された指示に従った。得られた精製ＲＮＡをさらなる使用まで−２０℃で保存した。
【０２１６】
（ｄ）Affymetrix遺伝子チップ分析
この実験で分析しようとするＲＮＡを、５匹のＣ５７マウス（Ｃ５７系は以下で説明する）と、本発明のホモ接合型ＫＯ雄（５９系）それぞれから得た。全てのマウスを屠殺した。マウスの脾臓を回収し、氷上で５ｍｌのＲＰＭＩ／１％ＦＣＳ培地に置いた。白血球を上述した通りに単離した。それぞれの白血球総数を評価した。細胞の半分を、RNeasy Blood Mini Kit（Qiagen）のプロトコールに従って即座にＲＮＡ調製に用いた。細胞の残りの半分を１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）を添加した組織培養液に移した。４８時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを調製した。各ＲＮＡ調製の後、より高度に濃縮したＲＮＡサンプルを得るためにＥｔＯＨ沈殿を行った。プローブ合成に用いられたＲＮＡサンプルの最低限の濃度は、０.５μｇ／μｌであった。
【０２１７】
（ｉ）二本鎖ｃＤＮＡ合成
トータルＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを得るために、ｃＤＮＡ合成用の「Superscript Choice System」（Gibco，Life Technologies）を用いた。
（ii）第一鎖ｃＤＮＡ合成
１０μｇのトータルＲＮＡと、１００ｐｍｏｌのＴ７−Ｔ（２４）プライマー（ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＣＧＧ−(Ｔ)24）（配列番号１１）とを混合し、ＲＮアーゼ非含有水で最終容量１１.５μｌにした。プライマーのテンプレートへのアニーリングのため、混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、即座にスピンダウンし、氷上に置いた。サンプルあたり以下の成分を含むマスター混合物を氷上で調製した：４μｌの５×istｃＤＮＡ緩衝液、２μｌの０.１ＭのＤＴＴ、１μｌ（１０ｍＭ）ｄＮＴＰミックス、１.５μｌのＳＳＩＩＲＴ酵素。マスター混合物を調製したらすぐに、ＲＮＡサンプルを室温に移し、マスター混合物を〜３７℃まで約２分間温め、８.５μｌのマスター混合物を各チューブに等量で分配した。混合後、この反応を４２℃で１時間インキュベートした。Ｔ７−Ｔ（２４）プライマーは、トータルＲＮＡのポリＡ末端にアニールし、提供されたヌクレオチドを用いてＳＳＩＩＲＴ酵素により伸長させた。プライマーはまた、Ｔ７プロモーターに組み込まれ、これをその後の工程で用いた。
【０２１８】
（iii）第二鎖合成
迅速に回転させた後、第一鎖の反応を氷上に置き、６０μｌの以下の成分を含むマスター混合物を加えた：４μｌの２ＭのＫＣｌ、２μｌの１Ｍのトリス（室温でｐＨ７.７）、０.４μｌの１ＭのＭｇＣｌ2，２μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）ミックス、０.５μｌ［２Ｕ／μｌ］ＲＮアーゼＨ-；２μｌ［１０Ｕ／μｌ］のＥ．ＣｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ、１μｌ［１０Ｕ／μｌ］のＥ．Ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、水で最終容量６０μｌ（４８.１μｌ）にする。
この混合物を１６℃で２時間インキュベートした。このインキュベーションの間、第二のｃＤＮＡ鎖を生成し、同様に、残留した一本鎖ＲＮＡを破壊した。第一鎖合成の終わりに、ＲＮＡの５’末端を取り囲むヘアピン構造が形成された。
次に、このループを第二鎖合成の開始に用いた。それゆえに、追加のプライマーは加えなかった。２時間インキュベーションした後、オーバーハングを含まない二本鎖ｃＤＮＡを生成するために２μｌ（１０ユニット）のＴ４ポリメラーゼを加え、５分間、１６℃でインキュベートした。
反応を止めるため、１０μｌの０.５ＭのＥＤＴＡを加え、サンプルを−２０℃で保存した。
【０２１９】
（iv）二本鎖ｃＤＮＡの精製
二本鎖ｃＤＮＡに、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１ｍＭのＥＤＴＡで飽和）抽出を行い、続いて、エタノール沈殿を行い、即座に室温で５分間、１２，０００ｒｐｍで回転させた。ペレットを８０％氷冷ＥｔＯＨで２回洗浄し、最後に２μｌの水に再懸濁した。
【０２２０】
（ｖ）インビトロでの転写（ＩＶＴ）によるビオチン標識ＲＮＡの合成
この工程において、AmbionのT7 Megascript Systemからの試薬を用いた。
４回のＩＶＴ反応のためのＮＴＰ標識ミックス：
４回のＩＶＴ反応のために、以下の成分を氷上で合わせた：８μｌの１０×ＡＴＰ、８μｌの１０×ＧＴＰ、６μｌの１０×ＣＴＰ、６μｌの１０×ＵＴＰ（全てのＮＴＰは７５ｍＭ，Ａｍｂｉｏｎ）、１５μｌのＢｉｏ−１１−ＣＴＰ、および、１５μｌのＢｉｏ−１６−ＵＴＰ（いずれも１０ｍＭ，Enzo Diagnostics）。さらなる使用まで、過量のＮＴＰ標識ミックスを−２０℃で保存した。
【０２２１】
（vii）インビトロ転写（ＩＶＴ）反応：
各反応のために、以下の試薬を室温（ＲＴ）で合わせた：１４.５μｌのＮＴＰ標識ミックス、２μｌの１０×転写緩衝液（Ambion）、２μｌの１０×Ｔ７酵素ミックス（Ａｍｂｉｏｎ）、１.５μｌの二本鎖ｃＤＮＡ。この混合物を３７℃で５時間インキュベートした。
【０２２２】
（viii）ＩＶＴ産物の精製：
この工程の間、RNeasy Midi Kit（Qiagen）を利用して、上述のように取り込まれなかったＮＴＰを除去した。ｃＲＮＡの最終溶出の後、０.５倍量の５ＭのＮＨ4Ａｃ、および、２.５倍量の無水ＥｔＯＨを用いたＥｔＯＨ沈殿を行い、確実に、最終ｃＲＮＡから全ての残留ＥｔＯＨを除いた。この沈殿を一晩−２０℃で行った。ｃＲＮＡをペレット化するため、沈殿溶液を１４，０００ｇで３０分間、４℃で、スピンダウンし、ペレットを氷冷８０％ＥｔＯＨで２回洗浄し、最終的に１６μｌの水に再懸濁した。１μｌを、２６０および２８０ｎｍでのＵＶ測定により濃度を決定するのに用い、１μｌを、ＩＶＴ産物の平均長さを１％アガロースゲルで決定するのに用いた。
【０２２３】
標的ハイブリダイゼーション
（ａ）ＩＶＴ産物の断片化
その後のハイブリダイゼーション用にｃＲＮＡを断片化するために、約２０μｇのｃＲＮＡを、４μｌの５×断片化緩衝液と混合し、水で最終容量２０μｌにした。この混合物を３５分間、９５℃でインキュベートした。
５×断片化緩衝液：１Ｍのトリス−酢酸塩（ｐＨ８.１）を４ｍｌ、ＭｇＯＡｃを０.６４ｇ、ＫＯＡｃを０.９８ｇ、水で最終容量２０ｍｌにし、０.２μｍフィルターユニットでろ過し、４℃で保存した。
【０２２４】
（ｂ）ハイブリダイゼーション標的の調製
２０μｌの断片化したｃＲＮＡに、以下の混合物を加えた：１５０μｌの２×ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液、３μｌのニシン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、３μｌの１００×コントロールＢｉｏＢ、ＢｉｏＣ、ＢｉｏＤおよびＣｒｅカクテル、３μｌのアセチル化ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）、３μｌのコントロールオリゴヌクレオチドＢ２（５ｎＭ）、１１８μｌの水。
ＢｉｏＢ、ＢｉｏＣおよびＢｉｏＤは、ビオチン合成経路の細菌遺伝子である。Ｃｒｅは、Ｐ１バクテリオファージからのファージ遺伝子である。これら遺伝子を上述と同様のプロトコールでビオチン標識ｃＲＮＡに転写し、断片化し、それぞれ最終濃度１５ｎＭ、５０ｎＭ、２５０ｎＭおよび１μＭのアリコートにして保存した。１００×コントロールｃＲＮＡカクテルを以下のように混合した：１０μｌの各コントロールアリコート、１０μｌのニシン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）、１２×ＭＥＳを８３.３μｌ、５ＭのＮａＣｌを１８５μｌ、１μｌのＴｗｅｅｎ２０（１０％）、６８０.７μｌの水。
Ｂ２ビオチン化オリゴヌクレオチドは、各Affymetrixチップの側および角にハイブリダイズし、染色およびスキャニングした後、スキャナーによりグリッドを整列させた。オリゴＢ２：５’ｂｉｏ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＣＴＡ  ＣＣＧ  ＴＴＣ  ＡＧ  ３’（配列番号１２）。
２×ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液：８.３ｍｌの１２×ＭＥＳストック、１７.７ｍｌの５ＭのＮａＣｌ、４ｍｌの０.５ＭのＥＤＴＡ、０.１ｍｌの１０％Ｔｗｅｅｎ２０、１９.９ｍｌの水。
１２×ＭＥＳストック：７０.４ｇのＭＥＳ非含有酸一水化物、１９３.３ｇのＭＥＳナトリウム塩、８００ｍｌの水、ｐＨ６.５〜６.７、総容積１０００ｍｌ、０.２μｍフィルターでろ過した。
【０２２５】
（ｃ）標的の精製およびハイブリダイゼーション
使用直前にAffymetrixチップを室温に平衡化した。ハイブリダイゼーションカクテルを９９℃で５分間加熱した。その間に、チップを、１０〜６０分間、２００μｌの１×ＭＥＳに、４５℃で、回転させながら（６０ｒｐｍ）湿潤させた。加熱したサンプルを、マイクロ遠心器で、５分間、最高速度で回転させ、全ての不溶性材料をハイブリダイゼーション混合物から除去した。１×ＭＥＳ緩衝液をチップから除去し、２００μｌの清澄させたハイブリダイゼーション混合物で置き換えた。４５℃で、回転式ボックスで６０ｒｐｍで回転させて一晩（約１６時間）ハイブリダイゼーションした。残りのハイブリダイゼーション混合物を−２０℃で保存した。
【０２２６】
（ｄ）プローブアレイの洗浄および標準的な染色
GeneChip Fluidics Station400を用いて洗浄と染色を行った。染色の前に、機械を適切な緩衝液ＡおよびＢで準備する必要がある。
緩衝液Ａ（非ストリンジェント）：６×ＳＳＰＥ、０.０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０.００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ、１.２μｍフィルターユニットでろ過した。
緩衝液Ｂ（ストリンジェント）：０.５×ＳＳＰＥ、０.０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０.２μｍフィルターユニットでろ過した。
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション混合物をチップから取り出し、前日の残りと合わせた。次に、他のハイブリダイゼーションまで混合物を−８０℃で保存した。チップを２００μｌの緩衝液Ａで充填した。
１つのプローブアレイに関して、以下の試薬を共に混合した：６００μｌの２×染色緩衝液、４８μｌのＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）、１２μｌのストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ）（１ｍｇ／ｍｌ）、５４０μｌの水。
２×染色緩衝液：２００ｍＭのＭＥＳ、２ＭのＮａ+、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０、０.０１％Ａｎｔｉｆｏａｍ。
機械の設定プロトコールＥｕｋＧＥ−ＷＳ２（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）に従って、この溶液でチップを染色し、緩衝液ＡおよびＢおよび水で数回洗浄した。ＳＡＰＥ染色の後、シグナルを増強するために、チップを以下の抗体溶液で染色した：チップあたり、３００μｌの２×染色緩衝液、２４μｌの５０ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ、６μｌの１０ｍｇ／ｍｌの正常ヤギＩｇＧ、３.６μｌの０.５ｍｇ／ｍｌのビオチン化抗体、２６６.４μｌの水。染色後、チップを再び洗浄し、ＳＡＰＥ溶液での第三回目の染色を行った。
【０２２７】
（ｅ）プローブアレイスキャン
GeneChip Softwareでスキャナーを制御した。プローブアレイをスキャナーにローディングする前に、チップのウィンドウを全ての気泡についてチェックする必要がある。気泡が存在する場合、より多くの緩衝液Ａをチップに充填してそれらを取り除く必要がある。各チップを２回スキャンし、データをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ分析に送る前に、その機械で一次データを分析した。
【０２２８】
Affymetrix分析
Affymetrix Data Mining Tool（Affymetrix Santa Clara，California）を用いてAffymetrix分析を行った。第一段階において、この実験に用いられたＡおよびＢマウスの１１Ｋのチップを合わせた１つの仮チップ(virtual chip)を作製した。治療グループにつき、１匹のマウスあたり１つの仮チップを作製し、トータルで２０個の仮チップを得た（５匹の本発明のＫＯマウス、および５匹のＣ５７／ＢＬ６（野生型）マウス）。グループあたり最も悪い染色結果を示した１つのチップを処分し、トータルで１６個のチップを得た。ＫＯグループおよびＣ５７グループに関してチップを合わせ、２つの大きい仮チップを得た。ＫＯチップのデータを、Ｃ５７チップと比較した。ノックアウトチップにおける遺伝子マーカーの発現を、Ｃ５７チップにおける遺伝子マーカーの発現と比較した。得られたデータを以下に示す。
【０２２９】
α−４ｃＤＮＡのクローニング
α−４ｃＤＮＡを２つの部分でＰＣＲ増幅し、数回サブクローニングし、完全長ｃＤＮＡに組み立てた。全てのＰＣＲ反応を「Expand high fidelity PCR kit」とそれを説明する指示書（Roche-Boehringer Mannheim）とを用いて行った。テンプレートＤＮＡとして、「mouse skeletal muscle 5’stretch plus cDNA library」（Clontech）を用いた。
α−４ｃＤＮＡの第一の２.６ｋｂの部分は、エキソン１〜エキソン２３にわたる。この部分のプライマーは、ｆＶおよびｃＤＮＡ１Ｂ−Ｒであった。フォワードプライマーは、ＭｓｃＩ制限部位（平滑）を含み、リバースプライマーは、内部のＫｐｎＩ制限部位の３’に設置される。DeMeirsman et al.，1994に従ってリバースプライマーを設計した。２.６ＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出し、ＭｌｕＮＩ（ＭｓｃＩ）およびＫｐｎＩで消化した。その断片をＫｐｎＩ／ＳｍａＩ（平滑）で消化した pBluescript SK-（Stratagene）にライゲートした。得られたプラスミドは、ｐＢＳＫ２.６と名付けられた。
【０２３０】
上記ｃＤＮＡの第二の１.１ｋｂの部分は、エキソン２３からポリＡシグナルの５’領域にわたる。この部分のプライマーは、ｃＤＮＡ２−ＦおよびｃＤＮＡ２−Ｒであった。両方のプライマーは、以前に DeMeirsman et al.，1994で公開された。フォワードプライマーは、内部ＫｐｎＩ部位の５’に設置され、リバースプライマーは、唯一のＢａｍＨＩ部位に導入される。「ＴＡ−クローニングキット」の指示書（Invitrogen）に従って得られた１.１ｋｂのＰＣＲ産物をｐＣＲ２.１にクローニングした。得られたプラスミドは、ｐＣＲ２ｃＤＮＡと名付けられた（図４）。
【０２３１】
ｐＣＲ２ｃＤＮＡからの挿入物をＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素消化で切り出した。この断片を同様にＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＮＥＢ１９３にクローニングした。得られたプラスミドは、ｐＮＥＢ１.１と名付けられた（図５）。
【０２３２】
ｐＮＥＢ１.１におけるｃＤＮＡ断片の方向がｃＤＮＡの失われた第一の部分が即座に付加されないようなものであったため、ｐＮＥＢ１.１をＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩで消化した後にｃＤＮＡ挿入物を切り出した。この断片をＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩで切られたｐＮＥＢ１９３にクローニングした。得られたプラスミドは、ｐＮＥＢ１.１（−）と名付けられた（図６）。
【０２３３】
ｃＤＮＡ部分の第一および第二の部分を合わせるために、ｐＢＳＫ２.６をＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩで消化した。２.６ｋｂの部分を同じ酵素で消化したｐＮＥＢ１.１（−）にライゲートした。最終的なプラスミドは、ｐＮＥＢ３.６（−）と名付けられ、これは、〜６５ｂｐの開始コドンＡＴＧの５’から始まり〜５００ｂｐの停止コドンＴＧＡの３’で終わる完全長α−４ｃＤＮＡを含む。完全長ｃＤＮＡは、ＢａｍＨＩもしくはＳａｌＩを用いて、５’末端で、および、ＥｃｏＲＩを用いて３’末端で、このプラスミドから切り出し、３.６ｋｂの部分を得ることができ、または、ＢａｍＨＩもしくはＳａｌＩを用いて５’末端で、および、ＸｍｎＩを用いて３’末端で切り出し、３.２ｋｂの部分を得ることができ、いずれの場合においてもポリＡシグナルは含まれない。
【０２３４】
このプラスミドの両方の鎖をＴＯＰＬＡＢ  ＧｍｂＨ（Ｍａｒｔｉｅｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による「プライマーウォーキング法」で配列解析した。Ｎｅｕｈａｕｓ  et al.，１９９１で公開されたｃＤＮＡ配列と比較することによって、Ｎｅｕｈａｕｓ等により仮定された開始コドンが、実際にはさらに下流であり、シグナルペプチドが、４０個ではなくわずか３３個のアミノ酸であることがわかった。このデータは、ＤｅＭｅｉｒｓｍａｎ等により公開されたデータと正確に一致する［DeMeirsman et al.，1994］。
【０２３５】
α−４ヘテロ接合型ノックアウトマウスから採取された胚への導入遺伝子の挿入
トランスフェクションおよびマイクロインジェクション用の構築物の調製
マイクロインジェクション用のＤＮＡクローン（ｔｅｔ−ＶＬＡ）をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩのような適切な酵素で切断させ、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲルでＴＢＥ緩衝液中で電気泳動する（Maniatis et al.，1989）。ＤＮＡバンドをエチジウムブロマイド染色により可視化し、切り出し、０.３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ７.０）を含む透析バッグに置いた。ＤＮＡを透析バッグに溶出させ、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出し、２倍量のエタノールで沈殿させる。ＤＮＡを１ｍｌの低塩濃度の緩衝液（０.２ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７.４）、および１ｍＭのＥＤＴＡ）に再溶解させ、ＥＬＵＴＩＰ−Ｄカラムで精製する。初めに、３ｍｌの高塩濃度の緩衝液（１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリスＴＭ（ｐＨ７.４）、および１ｍＭのＥＤＴＡ）でカラムを準備し、続いて５ｍｌの低塩濃度の緩衝液で洗浄する。ＤＮＡ溶液を３回カラムに通過させ、ＤＮＡをカラムマトリックスに結合させる。３ｍｌの低塩濃度の緩衝液で１回洗浄した後、ＤＮＡを０.４ｍｌの高塩濃度の緩衝液で溶出させ、２倍量のエタノールで沈殿させる。ＵＶ分光光度計で、２６０ｎｍの吸収によりＤＮＡ濃度を測定する。マイクロインジェクションのために、５ｍＭのトリスＴＭ（ｐＨ７.４）および０.１ｍＭのＥＤＴＡで、ＤＮＡ濃度を３μｇ／ｍｌに調節した。マイクロインジェクション用のＤＮＡ精製のためのその他の方法はまた、Hogan等のManipulating the mouse embryo（Cold  Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY（1986））、Palmiter等の Nature 300，611（1982）、Qiagen（Inc，Chatsworth，CA）により出版された「The Qiagenologist，Application Protocols」第三版、および Maniatis等の Molecular Cloning：a laboratory manual（Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY 1989）で説明され、これら全て、その全体を参照により本明細書に加入する。
【０２３６】
トランスジェニック動物の構築：
トランスジェニック実験に適した動物は、標準的な市販の源、例えば Charles River（Wilmington，MA）、Taconic(Germantown，NY）、Harian Sprague Dawley(Indianapolis，IN）、ジャクソンラボラトリー（Bar Harbor，ME）等から得ることができる。
胚の検索（retrieval）およびトランスファーに関しては、Swiss Webster雌マウスが好ましい。Ｂ６Ｄ２Ｆｉ雄は交配に用いることができ、精管切除されたＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ種マウスは偽妊娠を刺激するのに用いることができる。精管切除された雄は、供給元より得ることができる。
【０２３７】
マイクロインジェクション法：
げっ歯類の胚の取り扱いと、ＤＮＡマイクロインジェクションに関する方法は、Hogan et al.，「Manipulating the mouse  embryo」，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY（1986）で詳細に説明されており、その全体を参照により本明細書に加入する。
【０２３８】
トランスジェニックマウス
６週齢の雌マウスに、妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ，Ｓｉｇｍａ）を５ＩＵ注射（０.１ｃｃ，腹腔内）し、続いて、４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ，Ｓｉｇｍａ）を５ＩＵ注射（０.１ｃｃ，腹腔内）することによって、過剰排卵を誘導する。ｈＣＧ注射の後すぐに、雌を雄と共に置く。ｈＣＧから２１時間後、つがいにした雌をＣＯ２で窒息させるか、または頚部脱臼により屠殺し、切り出した輸卵管から胚を回収し、０.５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコリン酸緩衝食塩水に置く。周囲の卵丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去する。次に、前核胚を洗浄し、注射の時間までに、３７.５℃のインキュベーター中で、５％ＣＯ2、９５％空気の加湿した雰囲気で、０.５％ＢＳＡ（ＥＢＳＳ）を含むアール平衡塩溶液に置く。
【０２３９】
ランダムに循環した雌成体マウスを、精管切除した雄（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒまたはその他の匹敵する系）とつがいにし、この目的に用いることができる。同時にレシピエント雌をドナー雌としてつがいにする。胚のトランスファーの時期に、レシピエント雌に体重１グラムあたり０.０１５ｍｌの２.５％アバーティンを腹膜内注射することにより麻酔する。１回の背面正中線切開術により輸卵管を露出させる。次に、輸卵管を直接覆う体壁に切開術を行う。次に、時計工の鉗子を用いて卵巣嚢を割く。トランスファーさせる胚をＤＰＢＳ（トランスファーピペットの先端に）に置く（約１０〜１２個の胚）。ピペットの先端を漏斗に挿入し、胚をトランスファーさせる。トランスファーした後、切開部を２回の縫合で閉じる。
【０２４０】
結果
マウスの飼育結果
５７系：野生型マウス
５９系：ヘテロ接合型×ヘテロ接合型α−４ＫＯ交雑である。４２の交配により、子孫として２８６匹のマウスを生産したことが観察された。２８６匹のマウスのうち、１４７匹がヘテロ接合型の遺伝子型、１３２匹が野生型の遺伝子型、７匹がホモ接合型ノックアウトの遺伝子型であることが特定され、すなわち、４０匹の動物あたり１匹のホモ接合型ＫＯマウスの割合であった。
【０２４１】
ヘテロ接合型×ホモ接合型ノックアウトマウスの飼育
５９系：ヘテロ接合型×ホモ接合型ＫＯの交雑
５９の交配により、総数で２９８匹の動物が生産され、そのうち、２４４匹がヘテロ接合型の遺伝子型、５４匹の動物がホモ接合型ノックアウトの遺伝子型であることが観察され、すなわち、６匹の動物あたり１匹のホモ接合型ＫＯマウスの割合であった。この系におけるこのような交配の同腹子の平均規模は、同腹子あたり５匹の子であることが測定された。
【０２４２】
２種のホモ接合型ノックアウトマウスの飼育
導入遺伝子の２つのコピーを有する２種のホモ接合型α−４インテグリンノックアウト（ＫＯ）マウスの飼育により、ホモ接合型ノックアウトの子孫のみが生じる。しかしながら、生きた子の数は、野生型×野生型の飼育と比較すると顕著に変化する。通常のｗｔ×ｗｔ飼育ペアは、１２匹までの同腹子を生産することができ、これらは全て生存し健康であり得る。「正常な」飼育ペアの同腹子の平均規模は、同腹子あたり６〜８匹である。しかしながら、ホモ接合型ＫＯ×ホモ接合型ＫＯ交雑の生きた子の最大数は、５９系で〜５匹であった（これはこの規則の例外でり、平均同腹子規模は、同腹子（１１の交配で生産された〜３１匹の動物）あたりわずか２〜３匹動物であった）。
【０２４３】
機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない本発明のノックアウトマウスの遺伝子型および表現型の評価
機能的α−４インテグリンを発現できないマウスを形成した後、マウスを評価し、マウスにおける機能的α−４インテグリンの欠失の遺伝子型および表現型効果を測定した。
【０２４４】
遺伝子型分析
動物からの尾のゲノムＤＮＡを、導入遺伝子の存在、さらに内因性α−４インテグリンのバックグラウンドに関して、サザンブロッティングおよび／またはＰＣＲ分析により試験した。
導入遺伝子の検出は、特異的プライマーを用いた、トランスジェニックのみを増幅し、ゲノムＤＮＡは増幅しない条件のＰＣＲにより、単独で行われた。α−４インテグリンｃＤＮＡ構築物のｔｅｔＰ部分を検出するためのリバースプライマーは、α−４インテグリンの第二のエキソンにアニールし、フォワードプライマー（ｔｅｔｐＴ）のみが、導入遺伝子に特異的であり、ｔｅｔ−プロモーターにアニールする。
【０２４５】
内因性α−４インテグリンがｗｔ、ヘテロ接合型またはホモ接合型ノックアウトとして存在するかどうかを評価するためのＰＣＲ分析を、３種のプライマー、２種のフォワードプライマーおよび１種リバースプライマーを組み合わせて実施された。１種のフォワードプライマー（ＩｔｇｎＦ１）は、約２０ｂｐの開始コドンの５’にアニールした。このプライマーだけが内因性ゲノムＤＮＡにアニールするが、これは、ヘテロ接合型α−４ノックアウトマウスを生産するためにその領域がＹａｎｇ等のネオマイシンカセットで置換されているためである［Yang et al.，1995］。リバースプライマー（ＩｔｇｎＲ１）は、ｎｅｏ挿入の３’に結合するために、全ての場合において結合する。第二のフォワードプライマー（ＮｅｏＦ２）は、ｎｅｏカセットにアニールし、それゆえに標的対立遺伝子のみに結合する（図１１（Ｂ））。プライマーＩｔｇｎＦ１およびＩｔｇｎＲ１ペアは、野生型およびヘテロ接合型において、〜２４０ｂｐのバンドを生産する。プライマーＮｅｏＦ２およびＩｔｇｎＲ１ペアは、ヘテロ接合型およびホモ接合型において、〜６００ｂｐのバンドを生産する（図１０）。
【０２４６】
Yang et al. 1995で説明されたように、サザンブロット分析（図１０でグラフで示される）を１.４ｋｂのＰｓｔＩ／ＫｐｎＩプローブで行い、尾のゲノムＤＮＡの制限酵素消化をＰｓｔＩで行い、それにより、ｗｔ対立遺伝子では３.０ｋｂの断片、および、標的対立遺伝子では３.５ｋｂの断片が得られた。
【０２４７】
表現型分析
過剰発現ノックアウトマウスの表現型分析
３種の製造された過剰発現ノックアウト系のうち１種の系が、目のまわりに顕著な症状の変化を示した：５９系におけるほとんど全てのノックアウトマウスの目は感染しているように思われ、それに対して、同じまたは別のケージで飼われたヘテロ接合型または野生型の同腹子は、同種の感染を受けていなかった。
しかしながら、５９系ノックアウトマウスの全てがこの目の感染を起こしたわけではなく、サブライン、すなわちこの系で生じた第一のホモ接合型ノックアウトマウス（５９−１２−８−５）からのほとんど全ての子孫だけであった。感染タイプについてさらに観察するために、同じケージで生まれ成長した２種のホモ接合型ノックアウトの同腹子（あきらかに感染した目を有するマウスと有さないマウス）は、血清学、細菌学および病状の試験のために Charles River Laboratories（Wilmington，MA）に送られた。
【０２４８】
両方のマウスは、血清学に対して陰性と試験された（１９の異なるＥＬＩＳＡ試験が両方のサンプルを用いて実施された）。
両方のマウスの結膜を細菌学試験に提供し、両方のマウス、あきらかに感染していないマウスも、Pasteurella pneumotropicaに陽性と試験された。両方の培養では、ほんのわずかしかコロニーを生じなかった。寄生生物学によれば、両方のマウスは陰性であると報告している（４の異なる寄生体に関して試験した）。
【０２４９】
機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない本発明のマウスにおける幹細胞前駆体の濃度
野生型（ｗｔ）マウスと比較した、本発明のホモ接合型α−４インテグリンノックアウトマウスの組織病理学的分析によれば、顕著な骨髄前駆細胞の肺への辺縁趨向を示し（２／１０動物）、そのうち１匹の動物は細静脈の拡張／崩壊を示し、間質の空間からの強化された辺縁趨向を伴う増加した骨髄の細胞充実性（主に顆粒球の）を示した（７／１０動物）。本発明のＫＯマウスの脾臓は、増加した延髄外の造血、および、胚中心サイズ／細胞充実性における増加を示した（４／１０動物）。さらなる組織病理学の発見によれば、本発明のホモ接合型α−４ノックアウトマウスにおいて、脾性の巨核球増加症（３／１０）、血鉄症（haemosiderosis）を伴う脾性の赤血球貪食（１／１０動物）、および、脾性の胚中心ネクローシス（２／１０動物）が特記された。空腸において、本発明のホモ接合型ＫＯマウスにおける発見は、粘膜固有層の基底または本体における炎症性の浸潤を含む（４／１０動物）。加えて、細静脈の崩壊を伴う肺における骨髄前駆細胞を有する１つのホモ接合型α−４ノックアウト動物からの１つの心臓筋肉サンプルは、心筋症の組織学的徴候を示した。
【０２５０】
免疫組織化学分析結果：
ＩＨＣによってノックアウトマウスの脾臓にα−４タンパク質は検出できなかったが、それに対して、同じバックグラウンドの野生型マウスの脾臓は、α−４タンパク質の存在に関して染色された。これらの結果は、図１０で図示される
【０２５１】
Afrvmetrix分析
Affymetrix Data Mining Toolを用いてデータ分析がなされた。４匹のＣ５７および４
匹の本発明のホモ接合型α−４インテグリンＫＯマウスのデータを治療グループごとにプールした。
本発明のホモ接合型α−４インテグリンＫＯマウスと、Ｃ５７（ｗｔ）マウスとのデータの比較により、ＫＯマウスにおいて、いくつかの遺伝子が顕著にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたことがわかった。その上、ホモ接合型α−４インテグリンＫＯグループにおいて、これら遺伝子のＣ５７系マウスで測定されたレベルと比べてダウンレギュレートされた多数の遺伝子が存在する。以下の表において、本発明のノックアウトマウスにおいて、Ｃ５７（野生型マウス）におけるこれと同じ遺伝子マーカーのレベルと比べてレベルが調節された遺伝子マーカーを列挙する。表の最も右側の列において、１より大きい数値は、遺伝子マーカーの発現（従ってそのレベル）が、野生型マウスにおける遺伝子マーカー発現に対してアップレギュレートされたことを示し、一方で、表の最も右側の列において、１１より小さい数値は、遺伝子マーカーの発現が、野生型マウスにおける遺伝子マーカー発現に対してダウンレギュレートされたことを示す。また、表の左の列では、これらマーカーの登録番号が開示されている。
【０２５２】
【表６】
2004531266.tif 000009
【０２５３】
【表７】
2004531266.tif 000010
【０２５４】
それぞれ個々のマウスおよび治療グループから得られたデータを観察したところ、Asymetrix Data Mining Toolにより、マウスのα−４インテグリン遺伝子が、各単一の本発明のホモ接合型ノックアウトマウスにおいて「非存在」と称され、それに対して、マウスのα−４インテグリンが、全てのＣ５７マウスの場合において「存在」と称されたことが示された。
【０２５５】
結論
上述したように、妊娠期を生き抜きマウスに成熟するが、機能的α−４インテグリンタンパク質を発現できない、新規で有用な、かつこれまで未知のマウスが開示される。上記で説明したように、このようなマウスは、α−４インテグリンアンタゴニスト活性に関して化合物または薬剤を分析する方法において即時的に用途を有する。
加えて、本発明のマウスは、野生型マウスの表現型に対して独特な表現型を有することがわかった。本発明のマウスの表現型から得られた情報は、ＶＬＡ−４受容体タンパク質またはα−４インテグリンタンパク質の活性のシグナリング活性を調節、特に拮抗するそれらの能力に関して化合物または薬剤を分析する方法にすぐに用いることができる。このような活性を有する化合物または薬剤は、多様な炎症性および自己免疫疾患を治療することにおいて役に立つ用途を有する可能性がある。
【０２５６】
〔実施例II〕
ＶＬＡ−４受容体シグナリングを調節することにおける化合物または薬剤の有効性を評価するために遺伝子マーカーを用いる方法
実施例Ｉに記載の本発明のノックアウトマウスから得られた情報を用いたところ、マウスの生体サンプルで測定された遺伝子マーカーのレベルが、野生型マウスで測定されたこれと同じ遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されることがわかった。従って、これら遺伝子マーカーは、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節する化合物または薬剤の能力を評価することにおいてすでに用途を有する「代理」遺伝子マーカーである。その結果として、ＶＬＡ−４のシグナリング活性を調節するため、特に拮抗するための治療剤、および、病気または疾患の多血症を治療するための治療剤としてのこのような化合物または薬剤の有効性は、リサーチまたは臨床条件において評価することができる。
【０２５７】
材料および方法
実験計画：
実施例Ｉで説明したAffymetrixデータを確認するため、および、ＶＬＡ−４阻害の代理遺伝子マーカーとして選択された遺伝子を確認するために、以下の実験を行った。
既知ＶＬＡ−４受容体アンタゴニストの投与
これらの実験において、ＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）マウスを用いた。ＥＡＥマウスは、中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫疾患の動物モデルである。これは、ヒト多発性硬化症（ＭＳ）モデルとして広く用いられている。
賦形剤単独で処理した、および、ＩＶＬ９Ｓ４またはＨＭＲ１０３１で１４日間処理したＥＡＥマウス（以下のプロトコールを参照）（１グループあたり５匹のマウス）を、頚部脱臼により屠殺した。脳を無菌で採取し、ＲＮＡを標準ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）prepを用いて調製した（プロトコールは以下を参照）。調製されたＲＮＡをアガロースゲル上で泳動して、ＲＮＡの品質を調べ、ＵＶスペクトル分析により定量した。Taqman分析を配列特異的プライマーおよびプローブ（配列は以下参照）を用いて行った。
【０２５８】
動物：
ＳＪＬ／Ｊ雌マウス、８週齢（ジャクソンラボラトリー，Bar Harbor，Maine）。
抗原：
ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ１３９−１５１）（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ（配列番号１４））（カタログ番号Ｈ−２４７８） BACHEM，Bioscience，Inc.，3700 Horizon Dr.，King of Prussia，PA 19406。完全フロインドアジュバントＨ３７Ｒａ［１ｍｇ／ｍｌのMycobacterium Tuberculosis H37Ra］Difco（カタログ番号３１１４−６０−５，６×１０ｍｌ）。
【０２５９】
Mycobacterium Tuberculosis
Difco，（カタログ番号３１１４−３３−８，６×１００ｍｇ）百日咳毒素。
Bordetella pertussis
（ＰＢＳおよびラクトースを含む凍結乾燥粉末）List Biological Laboratories（製品番号１８０）。
【０２６０】
マウスにおけるＥＡＥの誘導
ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドを、Ｈ2Ｏ：ＰＢＳ（１：１）溶液に、濃度５ｍｇ／１０ｍｌ（マウスあたり５０μｇのＰＬＰ）または７.５ｍｇ／１０ｍｌ（１グループあたり７５μｇのＰＬＰ）で溶解させ、次に、４０ｍｇ／１０ｍｌの加熱して不活性化した Mycobacterium Tuberculosis H37Raを添加した等量のＣＦＡで乳化した。マウスの腹側の皮下（各側に０.１ｍｌ）に、０.２ｍｌのペプチド乳濁液を注射した。同日の７２時間後、マウスに、生理食塩水中の３５ｎｇおよび５０ｎｇの Bordetella pertussis毒素（１００μｌ）をそれぞれ静脈注射した。
ＩＶＬ９８４もしくはＨＭＲ１０３１または賦形剤コントロール単独（０.２％ヒドロキシプロピルメチルセルロース）での処理を、免疫化してから７日後、最初のＥＡＥ症状が現れる前に始めた。
- ＥＡＥマウス、賦形剤
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＴａｑｍａｎに用いた）、
- ＨＭＲ１０３１Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、皮下）で、７日目から１４日間処理したＥＡＥマウス
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＴａｑｍａｎに用いた）
- ＩＶＬ９８４（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、皮下）で、７日目から１４日間処理したＥＡＥマウス
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＴａｑｍａｎに用いた）
【０２６１】
ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）ＲＮＡ  Ｐｒｅｐ：
組織のホモジナイズ：
脳を半分に分割し、各半分を１.５ｍｌの滅菌チューブに置いた。０.５ｍｌのＴＲＩｚｏｌを各チューブに加え、組織を手持ち式の組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジナイズの後、さらなる０.５ｍｌのＴＲＩｚｏｌを各チューブに加え、サンプルを５分間、室温でインキュベートし、核タンパク質複合体を完全に解離させた。
【０２６２】
相分離
０.２ｍｌのクロロホルム（Ｓｉｇｍａ）を各チューブに加え、ボルテックスした。サンプルをさらに５分間、室温でインキュベートし、次に、１２，０００×ｇで、１５分間、４℃で遠心分離した。
ＲＮＡ沈殿
上部の水相を新しい滅菌チューブに移し、２つのサンプルのマウスあたりの半分を合わせた。０.５ｍｌのイソプロピルアルコールを、それぞれ併せたサンプルに加え、ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。次に、サンプルを、１２，０００×ｇで、４℃で遠心分離した。
ＲＮＡ洗浄
上清を除去し、ペレットを１ｍｌの７５％エタノールで洗浄し、再び５分間、７，５００×ｇで、４℃で遠心分離した。
ＲＮＡの再溶解
最終ペレットを簡単に風乾し、ヌクレアーゼ非含有滅菌水に再懸濁した。ＲＮＡのアリコートをアガロースゲル上で泳動して、１８および２８Ｓバンドの存在を調べた。２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって濃度を決定した。
【０２６３】
Ｔａｑｍａｎ：
Ｔａｑｍａｎプライマーを、マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡに関して注文した（登録番号Ｚ１１９７.４）。（マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡの配列：配列番号１３）。リアルタイムＴａｑｍａｎＰＣＲ研究のためのプライマーを、プライマーエキスプレスソフトウェア（Perkin Elmer）を用いて選択し、Sigma Genosysにより合成した。フォワードおよびリバースプライマーの配列は、それぞれＣＡＡＴＴＣＡＣＧＡＧＡＧＧＣＡＧＧＧＡ（配列番号１５）およびＧＧＧＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＴＧ（配列番号１６）であった。ＰＣＲ産物を４％アガロースゲル上で泳動し、単一バンドの存在を確認した。ＡＢＩ  Ｐｒｉｚｍシステム７７００配列検出器（Perkin-Elmer）で、CybrGreen PCR Core Reagents Kit（Perkin-Elmer）を用いて、製造元のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。反応における最適な最終プライマー濃度が０.２μＭであることがわかった。結果を１８Ｓに基準化し、コピー数の差の対数の底２として、１８ＳのＲＮＡレベルと共に示した。ポイントあたり少なくとも３つの独立したＲＴ反応からのサンプルを用いた。
ＥＡＥマウスの臨床評価を図１８で説明する。
【０２６４】
結果
脳サンプル
ＨＭＲ１０３１およびＩＶＬ９８４で処理したＥＡＥマウスのｍＲＮＡレベルは、賦形剤コントロールマウスに比べて統計学的に有意に低い。
脾臓サンプル
脾臓サンプルはいずれの処理においても脳と同じ傾向を示さない（ｐ値：０.０１〜０.０５）。
以下の表は結果の簡単な一覧である。
【０２６５】
【表８】
2004531266.tif 000011
【０２６６】
これらの結果は、遺伝子マーカーマクロファージマンノース受容体ｍＲＮＡのレベルは、ＶＬＡ−４受容体アンタゴニストで処理されたＥＡＥマウスから採取された生体サンプルにおいて、このようなアンタゴニストで処理されていないＥＡＥマウスで測定されたレベルよりも統計学的に有意に低いことを示す。
詳細なＴａｑｍａｎの結果は図１６に示す。
【０２６７】
考察
上述の結果および図１６の結果によれば、実施例Ｉのノックアウトマウスにおいて発現が調節されたことが見出された遺伝子マーカーは、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の調節のための代理遺伝子マーカーであることが明らかに示される。従って、それらは、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の調節において有効性を有するかどうかを決定することに容易に用いることができる。特に、遺伝子マーカーであるマクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡは、実施例Ｉのα−４インテグリンノックアウトマウスにおいて発現レベルが減少したことが決定され、これもまた、既知ＶＬＡ−４受容体アンタゴニスト（すなわちＩＶＬ９８４）またはＨＭＲ１０３１を投与された生物において発現レベルが減少した。従って、本発明の方法は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のアンタゴニストを同定することに容易に用いることができ、該方法は、いくつか例を挙げると（ただしこれらに限定されない）喘息、関節炎、および多発性硬化症などの病気の多血症を治療することにすでに用途を有する。その上、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節することにおいて有効性を有するかどうかを決定するための本発明の方法はまた、特に臨床条件においてＶＬＡ−４アンタゴニストが投与される患者をモニターするのに容易に用いることができる。
【０２６８】
〔実施例III〕
ＶＬＡ−４受容体シグナリングの調節における化合物または薬剤の有効性を評価するために遺伝子マーカーを用いる方法
実施例Ｉに記載の本発明のノックアウトマウスから得られた情報を用いて、マウスの生体サンプルで測定された遺伝子マーカーのレベルが、野生型マウスで測定されたこれと同じ遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されることがわかった。従って、これら遺伝子マーカーは、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節する化合物または薬剤の能力を評価することにおいてすでに用途を有する「代理」遺伝子マーカーである。その結果として、ＶＬＡ−４のシグナリング活性を調節するため、特に拮抗するための治療剤、および、病気または疾患の多血症を治療するための治療剤としてのこのような化合物または薬剤の有効性は、リサーチまたは臨床条件において評価することができる。
【０２６９】
材料および方法
実験計画：
実施例Ｉで説明したAffymetrixデータを確認するため、および、ＶＬＡ−４阻害の代理遺伝子マーカーとして選択された遺伝子を確認するために、以下の実験を行った。
既知ＶＬＡ−４受容体アンタゴニストの投与
これらの実験において、ＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）マウス、同様に、ＫＯおよびｗｔ本発明のマウスを用いた。ＥＡＥマウスは、中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫疾患の動物モデルである。これは、ヒト多発性硬化症（ＭＳ）モデルとして広く用いられている。
賦形剤単独で処理した、および、ＩＶＬ９８４で１４日間処理したＥＡＥマウス（以下のプロトコールを参照）（１グループあたり５匹のマウス）、同様に、５匹のα−４インテグリン本発明のＫＯマウス、および、４匹の同じ遺伝的バックグラウンドのｗｔマウスを、頚部脱臼により屠殺した。脾臓を無菌で採取し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１％ＦＣＳ含有）を含む１５ｍｌの遠心管に置いた。次に、脾臓を、個別に滅菌ゴム製ポリスマン（０.２３ｍｍ孔径のスクリーン、Thomas Scientific）を用いて滅菌ワイヤースクリーンを通して１０ｃｍのペトリ皿に濾し出した。スクリーンを洗浄し、細胞懸濁液を回収し、１５ｍｌの遠心管に移した。１２００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した後、上清をデカントし、赤血球を、１ｍｌ／脾臓の氷冷赤血球リシス緩衝液で１〜３分間、氷上で溶解させた。次に、上清を、慎重に新しい１５．ｍｌの遠心管に移し、脂肪ペレットを残した。細胞懸濁液を、１０分間、１２００ｒｐｍで、４℃で遠心分離した。上清を処分し、細胞をＰＢＳに再懸濁し、氷上に置いた。血球計数器（Hauser Scientific）および染料として Trypan Blue（Gibco，Life Technologies）を用いて、生細胞の数を測定した。細胞を最終濃度１０7細胞／ｍｌに希釈した。次に、細胞を、ＳＯＣＳ−１（Ｃ２０）およびＳＯＣＳ−１（Ｎ−１８）タンパク質に関して以下のように染色した：
【０２７０】
１）ＳＯＣＳ−１抗体（ＳＯＣＳ−１（Ｃ−２０）（Santa Cruz，ｓｃ−７００５）およびＳＯＣＳ−１（Ｎ−１８）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−７００６）の両方；イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を結合させたマウスＩｇＧ1，κモノクローナル免疫グロブリンアイソタイプ標準（抗ＫＬＨ）（PharMingen，０３２１４Ｃ）の０.２μｇ／μｌの希釈液を調製し、同様に、ＰＢＳ中のアイソタイプコントロールを調製し、その希釈液の２５μｌのアリコートを、９６−ウェルプレートのウェルに入れる、
２）１００μｌの細胞懸濁液（１０7細胞／ｍｌ）を加える、
３）わずかにプレートを叩き、４℃で３０〜６０分間インキュベートする、
４）１００μｌのＰＢＳを各ウェルに加え、４℃で、７００ｒｐｍで５分間回転させる、
５）プレートをひっくり返して上清を捨てる、
６）二次抗体を、ＳＯＣＳ−１抗体で染色したウェルに加え、ロバ抗ヤギＦＩＴＣをＰＢＳで１：１００に希釈し、１００μｌを各ウェルに加える。ＰＢＳをアイソタイプコントロールで染色したウェルに加える、
７）４℃で３０〜６０分間インキュベートする、
８）１００μｌのＰＢＳを各ウェルに加える、
９）プレートを４℃で５分間、７００ｒｐｍで回転させ、プレートをひっくり返して上清を捨てる、
10）細胞をＰＢＳ中の０.１％ホルムアルデヒドに再懸濁し、ＦＡＣＳ分析を行い陽性細胞の数を調べる、
11）赤血球リシス緩衝液：８.２９ｇのＮＨ4Ｃｌ；０.０３７ｇのＥＤＴＡ；１ｇのＫＨＣＯ3；水を加えて１リットルにする、滅菌フィルター。
【０２７１】
ＥＡＥマウスプロトコール：
動物：
ＳＪＬ／Ｊ雌マウス、８週齢，（ジャクソンラボラトリー，Bar Harbor，Maine）。
本発明のα−４インテグリンＫＯおよびｗｔマウス。
【０２７２】
抗原：
ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ１３９−１５１）（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ（配列番号１４））（カタログ番号Ｈ−２４７８） BACHEM，Bioscience，Inc.，3700 Horizon Dr.，King of Prussia，PA 1940６。完全フロインドアジュバントＨ３７Ｒａ［１ｍｇ／ｍｌの Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra］Difco（カタログ番号３１１４−６０−５，６×１０ｍｌ）。
Mycobacterium Tuberculosis
Ｄｉｆｃｏ，（カタログ番号３１１４−３３−８，６×１００ｍｇ）百日咳毒素。
Bordetella pertussis
（ＰＢＳおよびラクトースを含む凍結乾燥粉末）List Biological Laboratories（製品番号１８０）。
【０２７３】
マウスにおけるＥＡＥの誘導
ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドを、Ｈ2Ｏ：ＰＢＳ（１：１）溶液に、濃度５ｍｇ／１０ｍｌ（マウスあたり５０μｇのＰＬＰ）または７.５ｍｇ／１０ｍｌ（１グループあたり７５μｇのＰＬＰ）で溶解させ、次に、４０ｍｇ／１０ｍｌの加熱して不活性化した Mycobacterium TuberculosisH37Raを添加した等量のＣＦＡで乳化した。マウスの腹側の皮下（各側に０.１ｍｌ）に、０.２ｍｌのペプチド乳濁液を注射した。同日の７２時間後、マウスに、生理食塩水中の３５ｎｇおよび５０ｎｇのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（１００μｌ）をそれぞれ静脈注射した。
ＩＶＬ９８４または賦形剤コントロール単独（０.２％ヒドロキシプロピルメチルセルロース）での処理を、免疫化してから７日後、最初のＥＡＥ症状が現れる前に始めた。
- ＥＡＥマウス、賦形剤
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＦＡＣＳに用いた）、
- ＩＶＬ９８４（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、皮下）で、７日目から１４日間処理したＥＡＥマウス
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＦＡＣＳに用いた）
【０２７４】
未処理マウス、ＥＡＥでの誘導なし：
- 本発明のα−４インテグリンＫＯマウス、Ｎ＝５
- 本発明のα−４インテグリンｗｔマウス、Ｎ＝４
【０２７５】
結果
これらの結果は、遺伝子マーカーＪＡＢまたはＳＯＣＳ−１タンパク質のレベルは、ＶＬＡ−４受容体アンタゴニストで処理されたＥＡＥマウスから採取された生体サンプルにおいて、このようなアンタゴニストで処理されていないＥＡＥマウスで測定されたレベルよりも統計学的に有意に低いことを示す。ＪＡＢに対するＣおよびＮ末端抗体を用いてＦＡＣＳ分析を行い、両方の抗体は、一致する結果を示す。また、結果によれば、ＪＡＢは、本発明のＫＯマウスにおいて、ｗｔマウスに比べてＲＮＡレベルをダウンレギュレートするだけでなく、ＪＡＢは、用いられた両方の抗体で測定されたタンパク質レベルを統計学的に有意にダウンレギュレートすることを示す。
詳細なＦＡＣＳの結果を図２０に示す。
【０２７６】
考察
上述の結果および図２０の結果によれば、実施例Ｉのノックアウトマウスにおいて発現が調節されたことがわかった遺伝子マーカーが、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の調節のための代理遺伝子マーカーであることが明らかに示される。従って、それらは、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節することにおいて有効性を有するかどうかを決定することに容易に用いることができる。特に、遺伝子マーカーＪＡＢまたはＳＯＣＳ−１は、実施例Ｉのα−４インテグリンノックアウトマウスにおいて、ＲＮＡレベルの発現レベルを減少させたことが決定され、これはまた、既知ＶＬＡ−４受容体アンタゴニスト（すなわちＩＶＬ９８４）が投与される生物においてタンパク質レベルにおいて発現レベルを減少させた。従って、本発明の方法は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のアンタゴニストを同定することに容易に用いることができ、これは、病気の多血症、いくつか例を挙げると、喘息、関節炎、および多発性硬化症（ただしこれらに限定されない）を治療するのに用途を有する。その上、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節することにおいて有効性を有するかどうかを決定するための本発明の方法はまた、特に臨床条件においてＶＬＡ−４アンタゴニストが投与される患者をモニターするのに容易に用いることができる。
【０２７７】
〔実施例IV〕
ＶＬＡ−４受容体シグナリングの調節における化合物または薬剤の有効性を評価するための遺伝子マーカーを用いる方法
実施例Ｉに記載の本発明のノックアウトマウスから得られた情報を用いたところ、マウスの生体サンプルで測定された遺伝子マーカーのレベルが、これと同じ遺伝子マーカーの野生型マウスで測定されたレベルと比べて調節されることがわかった。従って、これら遺伝子マーカーは、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節する化合物または薬剤の能力を評価することにおいてすでに用途を有する「代理」遺伝子マーカーである。その結果として、ＶＬＡ−４のシグナリング活性を調節するため、特に拮抗するための治療剤、および、病気または疾患の多血症を治療するための治療剤としてのこのような化合物または薬剤の有効性は、リサーチまたは臨床条件において評価することができる。この実施例において、遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５（ｖｍ０６ｆ１１.ｒ１  Ｋｎｏｗｌｅｓ  Ｓｏｌｔｅｒマウス胚盤胞Ｂ１ハツカネズミｃＤＮＡクローン；配列番号１８のＤＮＡ配列を有し、図２１でも示される）が用いられる。この遺伝子マーカーは、実施例Ｉにおいて、本発明のノックアウトマウスにおいてダウンレギュレートされることが見出された。
【０２７８】
材料および方法
実験計画：
実施例Ｉで説明したAffymetrixデータを確認するため、および、ＶＬＡ−４阻害の代理遺伝子マーカーとして選択された遺伝子を確認するために、以下の実験を行った。
既知ＶＬＡ−４受容体アンタゴニストの投与
これらの実験において、ＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）マウスを用いた。ＥＡＥマウスは、中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫疾患の動物モデルである。これは、ヒト多発性硬化症（ＭＳ）モデルとして広く用いられている。
賦形剤単独で処理した、および、ＩＶＬ９８４またはＨＭＲ１０３１で１４日間処理したＥＡＥマウス（以下のプロトコールを参照）（１グループあたり５匹のマウス）を、頚部脱臼により屠殺した。脳を無菌で採取し、ＲＮＡを標準ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）ｐｒｅｐを用いて調製した（プロトコールは以下を参照）。調製されたＲＮＡをアガロースゲル上で泳動して、ＲＮＡの品質を調べ、ＵＶスペクトル分析により定量した。配列特異的プライマーおよびプローブ（配列は以下参照）を用いてＴａｑｍａｎ分析を行った。
【０２７９】
動物：
ＳＪＬ／Ｊ雌マウス、８週齢，（ジャクソンラボラトリー，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）。
【０２８０】
抗原：
ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ１３９−１５１）（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ（配列番号１４））（カタログ番号Ｈ−２４７８） BACHEM，Bioscience，Inc.，3700 Horizon Dr.，King of Prussia，PA 19406。完全フロインドアジュバントＨ３７Ｒａ［１ｍｇ／ｍｌの Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra］Ｄｉｆｃｏ（カタログ番号３１１４−６０−５，６×１０ｍｌ）。
Mycobacterium Tuberculosis
Difco，（カタログ番号３１１４−３３−８，６×１００ｍｇ）百日咳毒素。
Bordetella pertussis
（ＰＢＳおよびラクトースを含む凍結乾燥粉末） List Biological Laboratories（製品番号１８０）。
【０２８１】
マウスにおけるＥＡＥの誘導
ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドを、Ｈ2Ｏ：ＰＢＳ（１：１）溶液に、濃度５ｍｇ／１０ｍｌ（マウスあたり５０μｇのＰＬＰ）または７.５ｍｇ／１０ｍｌ（１グループあたり７５μｇのＰＬＰ）で溶解させ、次に、４０ｍｇ／１０ｍｌの加熱して不活性化した Mycobacterium Tuberculosis H37 Raを添加した等量のＣＦＡで乳化した。マウスの腹側の皮下（各側に０.１ｍｌ）に、０.２ｍｌのペプチド乳濁液を注射した。同日の７２時間後、マウスに、生理食塩水中の３５ｎｇおよび５０ｎｇのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（１００μｌ）をそれぞれ静脈注射した。
【０２８２】
ＩＶＬ９８４もしくはＨＭＲ１０３１または賦形剤コントロール単独（０.２％ヒドロキシプロピルメチルセルロース）での処理を、免疫化してから７日後、最初のＥＡＥ症状が現れる前に始めた。
- ＥＡＥマウス、賦形剤
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＴａｑｍａｎに用いた）
- ＨＭＲ１０３１Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、皮下）で、７日目から１４日間処理したＥＡＥマウス
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＴａｑｍａｎに用いた）
- ＩＶＬ９８４（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、皮下）で、７日目から１４日間処理したＥＡＥマウス
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＴａｑｍａｎに用いた）
【０２８３】
ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）ＲＮＡ  Ｐｒｅｐ：
組織のホモジナイズ：
脳を半分に分割し、各半分を１.５ｍｌの滅菌チューブに置いた。０.５ｍｌのＴＲＩｚｏｌを各チューブに加え、組織を手持ち式の組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジナイズの後、さらなる０.５ｍｌのＴＲＩｚｏｌを各チューブに加え、サンプルを５分間、室温でインキュベートし、核タンパク質複合体を完全に解離させた。
相分離
０.２ｍｌのクロロホルム（Ｓｉｇｍａ）を各チューブに加え、ボルテックスした。サンプルをさらに５分間、室温でインキュベートし、次に、１２，０００×ｇで、１５分間、４℃で遠心分離した。
ＲＮＡ沈殿
上部の水相を新しい滅菌チューブに移し、２つのサンプルのマウスあたりの半分を合わせた。０.５ｍｌのイソプロピルアルコールを、それぞれ併せたサンプルに加え、ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。次に、サンプルを、１２，０００×ｇで、４℃で遠心分離した。
ＲＮＡ洗浄
上清を除去し、ペレットを１ｍｌの７５％エタノールで洗浄し、再び５分間、７，５００×ｇで、４℃で遠心分離した。
ＲＮＡの再溶解
最終ペレットを簡単に風乾し、ヌクレアーゼ非含有滅菌水に再懸濁した。ＲＮＡのアリコートをアガロースゲル上で泳動して、１８および２８Ｓバンドの存在を調べた。２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって濃度を決定した。
【０２８４】
Ｔａｑｍａｎ：
Ｔａｑｍａｎプライマーを、登録番号ＡＡ５７１５３５のＥＳＴ（ＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５（ＥＳＴの配列：配列番号１８））に関して注文した。リアルタイムＴａｑｍａｎＰＣＲ研究のためのプライマーを、プライマーエキスプレスソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて選択し、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓにより合成した。フォワードおよびリバースプライマーの配列は、それぞれＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＧＧＣＡ（配列番号１９）およびＴＣＣＧＴＴＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＣ（配列番号２０）であった。ＰＣＲ産物を４％アガロースゲル上で泳動して、単一バンドの存在を確認した。ABI Prizmシステム７７００配列検出器（Perkin-Elmer）で、CybrGreen PCR Core Reagents Kit（Perkin-Elmer）を用いて、製造元のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。反応における最適な最終プライマー濃度が０.２μＭであることがわかった。結果を１８Ｓに基準化し、コピー数の差の対数の底２として、１８ＳのＲＮＡレベルと共に示した。ポイントあたり少なくとも３つの独立したＲＴ反応からのサンプルを用いた。
ＥＡＥマウスの臨床評価を図１８で説明する。
【０２８５】
結果
脳サンプル
ＨＭＲ１０３１およびＩＶＬ９８４で処理したＥＡＥマウスのｍＲＮＡレベルは、賦形剤コントロールマウスに比べて統計学的に有意に低い。
脾臓サンプル
脾臓サンプルは、いずれの処理においても脳と同じ傾向を示さない（ｐ値：０.０１〜０.０５）。
以下の表は結果の簡単な一覧である。
【０２８６】
【表９】
2004531266.tif 000012
【０２８７】
これらの結果は、遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５のレベルは、ＶＬＡ−４受容体アンタゴニストで処理されたＥＡＥマウスから採取された生体サンプルにおいて、このようなアンタゴニストで処理されていないＥＡＥマウスで測定されたレベルよりも統計学的に有意に低いことを示す。
詳細なＴａｑｍａｎの結果を図２２を示す。
【０２８８】
考察
上述の結果および図２２の結果によれば、実施例Ｉのノックアウトマウスにおいて発現が調節されたことがわかった遺伝子マーカーが、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の調節のための代理遺伝子マーカーであることが明らかに示される。従って、それらは、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の調節において有効性を有するかどうかを決定するのに容易に用いることができる。特に、遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５は、実施例Ｉのα−４インテグリンノックアウトマウスにおいて発現レベルが減少したことが測定され、これもまた、既知ＶＬＡ−４受容体アンタゴニスト（すなわちＩＶＬ９８４）またはＨＭＲ１０３１が投与される生物において発現レベルが減少した。従って、本発明の方法は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のアンタゴニストを同定することに容易に用いることができ、該方法は、いくつか例を挙げると（ただしこれらに限定されない）喘息、関節炎、および多発性硬化症などの病気の多血症を治療することにすでに用途を有する。その上、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節することにおいて有効性を有するかどうかを決定するための本発明の方法はまた、特に臨床条件においてＶＬＡ−４アンタゴニストが投与される患者をモニターするのに容易に用いることができる。
【０２８９】
〔実施例Ｖ〕
ＶＬＡ−４受容体シグナリングの調節における化合物または薬剤の有効性を評価するために遺伝子マーカーを用いる方法
実施例Ｉに記載の本発明のノックアウトマウスから得られた情報を用いたところ、マウスの生体サンプルで測定された遺伝子マーカーのレベルが、野生型マウスで測定されたこれと同じ遺伝子マーカーのレベルと比べて調節されることがわかった。従って、これら遺伝子マーカーは、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節する化合物または薬剤の能力を評価することにおいてすでに用途を有する「代理」遺伝子マーカーである。その結果として、ＶＬＡ−４のシグナリング活性を調節するため、特に拮抗するための治療剤、および、病気または疾患の多血症を治療するための治療剤としてのこのような化合物または薬剤の有効性は、リサーチまたは臨床条件において評価することができる。この実施例において、遺伝子マーカーＡＡ１５４３７１（Ｐ１３７６５種と相同：ＨＬＡクラスII組織適合性抗原，ＤＯ  Ｂ；配列番号２１のＤＮＡ配列（図２１）を有する）が用いられる。実施例Ｉにおいて、この遺伝子マーカーが、本発明のノックアウトマウスにおいてダウンレギュレートされることが決定された。
【０２９０】
材料および方法
実験計画：
実施例Ｉで説明したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータを確認するため、および、ＶＬＡ−４阻害の代理遺伝子マーカーとして選択された遺伝子を確認するために、以下の実験を行った。
既知ＶＬＡ−４受容体アンタゴニストの投与
これらの実験において、ＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）マウスを用いた。ＥＡＥマウスは、中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫疾患の動物モデルである。これは、ヒト多発性硬化症（ＭＳ）モデルとして広く用いられている。
賦形剤単独で処理した、および、ＩＶＬ９８４またはＨＭＲ.１０３１で１４日間処理したＥＡＥマウス（以下のプロトコールを参照）（１グループあたり５匹のマウス）を、頚部脱臼により屠殺した。脳を無菌で採取し、ＲＮＡを標準 ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）ｐｒｅｐを用いて調製した（プロトコールは以下を参照）。調製されたＲＮＡをアガロースゲル上で泳動して、ＲＮＡの品質を調べ、ＵＶスペクトル分析により定量した。Ｔａｑｍａｎ分析を配列特異的プライマーおよびプローブ（配列は以下参照）を用いて行った。
【０２９１】
動物：
ＳＪＬ／Ｊ雌マウス、８週齢，（ジャクソンラボラトリー，Bar Harbor,Maine）。
【０２９２】
抗原：
ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ１３９−１５１）（ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ（配列番号１４））（カタログ番号Ｈ−２４７８） BACHEM，Bioscience，Inc.，3700 Horizon Dr.，King of Prussia，PA 19406。完全フロインドアジュバントＨ３７Ｒａ［１ｍｇ／ｍｌの Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra］Ｄｉｆｃｏ（カタログ番号３１１４−６０−５，６×１０ｍｌ）。
Mycobacterium  Tuberculosis
Difco，（カタログ番号３１１４−３３−８，６×１００ｍｇ）百日咳毒素。
Bordetella pertussis
（ＰＢＳおよびラクトースを含む凍結乾燥粉末） List Biological Laboratories（製品番号１８０）。
【０２９３】
マウスにおけるＥＡＥの誘導
ＰＬＰ１３９−１５１ペプチドを、Ｈ2Ｏ：ＰＢＳ（１：１）溶液に、濃度５ｍｇ／１０ｍｌ（マウスあたり５０μｇのＰＬＰ）または７.５ｍｇ／１０ｍｌ（１グループあたり７５μｇのＰＬＰ）で溶解させ、次に、４０ｍｇ／１０ｍｌの加熱して不活性化した Mycobacterium  Tuberculosis H37Raを添加した等量のＣＦＡで乳化した。マウスの腹側の皮下（各側に０.１ｍｌ）に、０.２ｍｌのペプチド乳濁液を注射した。同日の７２時間後、マウスに、生理食塩水中の３５ｎｇおよび５０ｎｇの Bordetella pertussis毒素（１００μｌ）をそれぞれ静脈注射した。
【０２９４】
ＩＶＬ９８４またはＨＭＲ１０３１または賦形剤コントロール単独：０.２％ヒドロキシプロピルメチルセルロース）での処理を、免疫化してから７日後、最初のＥＡＥ症状が現れる前に始めた。
- ＥＡＥマウス、賦形剤
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＴａｑｍａｎに用いた）
- ＨＭＲ１０３１Ａ（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、皮下）で、７日目から１４日間処理したＥＡＥマウス
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＴａｑｍａｎに用いた）
- ＩＶＬ９８４（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、皮下）で、７日目から１４日間処理したＥＡＥマウス
Ｎ＝１０（５匹のマウスをＴａｑｍａｎに用いた）
【０２９５】
ＴＲＩｚｏｌ（Invitrogen）ＲＮＡ  Ｐｒｅｐ：
組織のホモジナイズ：
脳を半分に分割し、各半分を１.５ｍｌの滅菌チューブに置いた。０.５ｍｌのＴＲＩｚｏｌを各チューブに加え、組織を手持ち式の組織ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。ホモジナイズの後、さらなる０.５ｍｌのＴＲＩｚｏｌを各チューブに加え、サンプルを５分間、室温でインキュベートし、核タンパク質複合体を完全に解離させた。
相分離
０.２ｍｌのクロロホルム（Ｓｉｇｍａ）を各チューブに加え、ボルテックスした。サンプルをさらに５分間、室温でインキュベートし、次に、１２，０００×ｇで、１５分間、４℃で遠心分離した。
ＲＮＡ沈殿
上部の水相を新しい滅菌チューブに移し、２つのサンプルのマウスあたりの半分を合わせた。０.５ｍｌのイソプロピルアルコールを、それぞれ併せたサンプルに加え、ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。次に、サンプルを、１２，０００×ｇで、４℃で遠心分離した。
ＲＮＡ洗浄
上清を除去し、ペレットを１ｍｌの７５％エタノールで洗浄し、再び５分間、７,５００×ｇで、４℃で遠心分離した。
ＲＮＡの再溶解
最終ペレットを簡単に風乾し、ヌクレアーゼ非含有滅菌水に再懸濁した。ＲＮＡのアリコートをアガロースゲル上で泳動して、１８および２８Ｓバンドの存在を調べた。２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって濃度を決定した。
【０２９６】
Ｔａｑｍａｎ：
Ｔａｑｍａｎプライマーを、ＥＳＴに関して登録番号ＡＡ１５４３７１で注文した（ＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１（ＥＳＴに関する配列：配列番号２１））。リアルタイムＴａｑｍａｎＰＣＲ研究のためのプライマーを、プライマーエキスプレスソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて選択し、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓにより合成した。フォワードおよびリバースプライマーの配列は、それぞれＧＡＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＣＧＧ（配列番号２２）およびＡＧＧＴＣＣＡＴＧＡＣＣＡＣＡＴＣＴＣＡＣＡ（配列番号２３）であった。ＰＣＲ産物を４％アガロースゲル上で泳動し、単一バンドの存在を確認する。ＡＢＩ  Ｐｒｉｚｍシステム７７００配列検出器（Perkin-Elmer）で、CybrGreen PCR Core Reagents Kit（Perkin-EImer）を用いて、製造元のプロトコールに従ってＰＣＲ反応を行った。反応における最適な最終プライマー濃度が０.２μＭであることがわかった。結果を１８Ｓに基準化し、コピー数の差の対数の底２として、１８ＳのＲＮＡレベルと共に示した。ポイントあたり少なくとも３つの独立したＲＴ反応からのサンプルを用いた。
ＥＡＥマウスの臨床評価を図１８で説明する。
【０２９７】
結果
脳サンプル
ＨＭＲ１０３１およびＩＶＬ９８４で処理したＥＡＥマウスのｍＲＮＡレベルは、賦形剤コントロールマウスに比べて統計学的に有意に低い。
脾臓サンプル
脾臓サンプルは、いずれの処理においても脳と同じ傾向を示さない（ｐ値：０.０１〜０.０５）
以下の表は、結果の簡単な一覧である。
【０２９８】
【表１０】
2004531266.tif 000013
【０２９９】
これらの結果は、遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１のレベルが、ＶＬＡ−４受容体アンタゴニストで処理されたＥＡＥマウスから採取された生体サンプルにおいて、このようなアンタゴニストで処理されていないＥＡＥマウスで測定されたレベルよりも統計学的に有意に低いことを示す。
詳細なＴａｑｍａｎの結果を図２４に示す。
【０３００】
考察
上述の結果および図２４の結果によれば、実施例Ｉのノックアウトマウスにおいて発現が調節されたことがわかった遺伝子マーカーが、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性の調節のための代理遺伝子マーカーであることが明らかに示される。従って、それらは、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節することにおいて有効性を有するかどうかを決定することに容易に用いることができる。特に、遺伝子マーカーＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１は、実施例Ｉのα−４インテグリンノックアウトマウスにおいて発現レベルが減少したことが測定され、これもまた、既知ＶＬＡ−４受容体アンタゴニスト、すなわちＴＶＬ９８４またはＨＭＲ１０３１を投与された生物において発現レベルが減少した。従って、本発明の方法は、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性のアンタゴニストを同定することに容易に用いることができ、該方法は、いくつか例を挙げると（ただしこれらに限定されない）喘息、関節炎、および多発性硬化症などの病気の多血症を治療することにすでに用途を有する。その上、化合物または薬剤が、ＶＬＡ−４受容体のシグナリング活性を調節することにおいて有効性を有するかどうかを決定するための本発明の方法はまた、特に臨床条件においてＶＬＡ−４アンタゴニストが投与される患者をモニターするのに容易に用いることができる。
【０３０１】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態による範囲に限定されない。実際に、本明細書で説明されたものに加えて、当業者には本発明の様々な改変が前述の説明および添付の図面から明白である。このような改変は、添付の請求項の範囲内であることが意図される。
本明細書および請求項に記載の全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子量値は、概算値であり、説明のために提供されていることがさらに理解される。
様々な出版物が本明細書に引用されており、その開示は、その全体を参照により本明細書に加入する。
【０３０２】
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【図面の簡単な説明】
【０３０３】
【図１Ａ】配列番号１のヌクレオチド配列である。
【図１Ｂ】図１Ａのヌクレオチド配列の続きである。
【図１Ｃ】図１Ｂのヌクレオチド配列の続きである。
【図１Ｄ】図１Ｃのヌクレオチド配列の続きである。
【図２】α−４インテグリンｃＤＮＡの図式的なマップである。
【図３】プラスミドｐＢＳＫ２.６である。
【図４】プラスミドｐＣＲ２ｃＤＮＡである。
【図５】プラスミドｐＮＥＢ１.１である。
【図６】プラスミドｐＮＥＢ１.１（−）である。
【図７】ヘテロ接合型雌×ホモ接合型雄の交雑の典型的な系統図である。
【図８】内因性α−４インテグリンバックグラウンドを評価するためのＰＣＲ分析である。
【図９】α−４インテグリンバックグラウンドの遺伝子型分析である。
【図１０】特異的α−４インテグリン抗体（ＣＤ４９ｄ，クローン９Ｃ１０，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色された、脾臓切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析結果である。
【図１１】ｔｅｐ−ＶＬＡ導入遺伝子（操作可能にｔｅｔＰプロモーターと結合したα−４インテグリンの部分を含み、配列番号１のＤＮＡ配列を有する導入遺伝子）の図式的なマップであり、プローブの位置と、内因性ＲＮＡとトランスジェニックＲＮＡとの両方に関する保護断片の指示とを含む。
【図１２】本発明のホモ接合型α−４インテグリンノックアウト（ＫＯ）マウス（５９系）と、ＦＶＢマウスとを比較したＲＮアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）である。
【図１３】２種の異なる系、胸腺および脾臓のＫＯマウスのＲＰＡである。
【図１４】プラスミドｐＮＥＢ３.７（−）である。
【図１５】ｔｅｔＰ−ＶＬＡ導入遺伝子である。
【図１６】マクロファージマンノース受容体に関するハツカネズミｍＲＮＡの結果のＴａｑｍａｎ分析である。
【図１７Ａ】配列番号１３のヌクレオチド配列である。
【図１７Ｂ】図１７Ａのヌクレオチド配列の続きである。
【図１７Ｃ】図１７Ｂのヌクレオチド配列の続きである。
【図１８】Ｔａｑｍａｎ分析で用いられたＥＡＥマウスの臨床評価である。
【図１９】配列番号１７のヌクレオチド配列である。
【図２０】ＪＡＢ  ＦＡＣＳの結果である。
【図２１】配列番号１８のヌクレオチド配列である。
【図２２】遺伝子マーカーとしてＥＳＴ  ＡＡ５７１５３５を用いた実施例IVの詳細なＴａｑｍａｎの結果である。
【図２３】配列番号２１のヌクレオチド配列である。
【図２４】遺伝子マーカーとしてＥＳＴ  ＡＡ１５４３７１を用いた実施例Ｖの詳細なＴａｑｍａｎの結果である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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