(57)【要約】本発明は、ベクターに挿入されたＤＮＡフラグメントのトランスポゾンが介するマルチプレックス−シークエンシングの自動化された方法に関する。さらに本発明は、特にこのような自動化された方法における効率の増加に関し、ここで効率の増加はトランスポゾンがベクター配列に挿入されたこれらのコンストラクトをシークエンシングする前にスクリーニングを終了することによって得られる。これは興味のあるＤＮＡフラグメントの代わりにベクターをシークエンシングする反応を実施することにおける時間および資源の無駄を防ぐものである。
2004502467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）１つまたはそれ以上の標的ＤＮＡ配列のそれぞれをベクターの挿入部位に挿入したものを用意し；
ｉｉ）標的ＤＮＡを含有するベクターのそれぞれを増幅し、それらをプールし、ここで各々の標的ＤＮＡ配列はプール中で実質的にｋｂ当り等量で存在するものであり；
ｉｉｉ）標的ＤＮＡを含有するベクターのプールを選択可能なトランスポゾンに曝し、ここで選択可能なトランスポゾンは標的ＤＮＡを含有するベクターに実質的に任意の部位で組み込まれて、標的ＤＮＡ含有ベクターおよびトランスポゾン含有ベクターのプールを形成し；
ｉｖ）標的ＤＮＡ含有ベクターおよびトランスポゾン含有ベクターのプールで細胞を形質転換させ、単離し、代表的な数の個々の形質転換体を選択条件下で培養物へ増殖させ；
ｖ）各培養物からのＤＮＡについてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、ここでこのポリメラーゼ連鎖反応は、ベクター配列の挿入部位の３′末端において相補的な１対のプライマーを用いるものであり、そしてベクター配列の全長コピーを効率的に作製するのに十分な各反応サイクル中の伸長時間を有するが、その時間は、トランスポゾンが挿入されたベクターの配列の全長のコピーを効率的に作製するには短かすぎるものとし；
ｖｉ）各ポリメラーゼ連鎖反応において製造されたＤＮＡの量を測定し；そして
ｖｉｉ）実質的な量のＤＮＡを製造するポリメラーゼ連鎖反応に対応するこれらの培養物から標的ＤＮＡを含有するベクターのトランスポゾン隣接領域をシークエンシングすること
の工程からなる、平行して進行するＤＮＡのトランスポゾンで仲介されたシークエンシング方法。
【請求項２】
工程ｉ）〜ｖｉｉ）の１つまたはそれ以上が自動化されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各ポリメラーゼ連鎖反応において製造されたＤＮＡの量を測定する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応完了後のｄｓＤＮＡに対して選択的な蛍光染料を加え、そして得られた蛍光の量を測定することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ｉ）〜ｖｉｉ）の１つまたはそれ以上が自動化されたものである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｄｓＤＮＡに選択的な蛍光染料は、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）およびビスベンズイミド染料からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ｄｓＤＮＡに選択的な蛍光染料がＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ベクターおよびトランスポゾンが異なる選択マーカーを担持するものである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
トランスポゾンが少なくとも３ｋｂである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
トランスポゾンが少なくとも４ｋｂである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
トランスポゾンがＧＰＳ−Ａｐｒａ−２μｍ−ＵＲＡ３である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
トランスポゾンが少なくとも５ｋｂである請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
トランスポゾンがベクターの長さと等しいか、またはより長いものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
トランスポゾンがベクターの長さの少なくとも約５／４である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トランスポゾンが約５ｋｂであり、ベクターが約４ｋｂである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
トランスポゾンがベクターの長さの少なくとも約５／３である請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
トランスポゾンが約５ｋｂであり、ベクターが約３ｋｂである請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【本発明の分野】
本発明は、ベクターに挿入されたＤＮＡ断片の、トランスポゾン仲介マルチプレックスシークエンシングの自動化方法に関する。さらに本発明は、特にこのような自動化された方法における効率の増加に関するもので、ここで効率の増加は、シークエンシング前にトランスポゾンがベクター配列に組み込まれている構築物をスクリーニングで排除することによって得られる。これは、興味のあるＤＮＡ断片の代わりにベクターをシークエンシングする反応を実施することで時間および資材の無駄を防ぐものである。
【０００２】
【発明の背景】
この１０年にゲノムおよび発現配列タグ（ＥＳＴ）シークエンシングから得られた情報に由来する膨大な富は、代表的な全長ｃＤＮＡをクローン化するための労力に著しく貢献する。ヒトおよびマウス由来のゲノムシークエンシングプロジェクトは、近い未来において完了すると予期されているが、これらの種のトランスクリプトームは、長い間不明瞭なままである。この複雑さは、完全に確実に予測できるものであり、ゲノム配列からのｍＲＮＡのスプライシングプログラムは、全長ｃＤＮＡの配列を得ることに焦点を当てたさらなるゲノム研究に駆り立てた。さらに、全長ｃＤＮＡシークエンシングの試みもまた、クローニングのために用いられるｃＤＮＡの増幅を含む方法の後に、ｃＤＮＡ配列の確認が必要とされる。このシナリオは、薬剤発見の試みのための標的遺伝子を確認することに焦点を当てたゲノムセンターにおいて特に流行っている。明らかに、膨大な費用と尽力を使い果たした後に、単に標的遺伝子のコーディング配列が不正確であるという理由で推定の標的について確認方法を欠くというのは無意味であろう。それゆえに、ゲノムセンターにおいて、多数の全長クローンを迅速に、安く、そして正確に配列決定するためのアプローチが必要とされる。この目的のために、本発明者はトランスポゾンにより促進されたマルチプレックスシークエンシング（ＴＥＭＳ）と呼ばれる、新規且つ集積された高いスループットの方法を開発した。
【０００３】
この２０年間に、プラスミドへの大きな挿入物をシークエンシングする多くの方法が開発されている。しかし、これらの方法の多くが、扱い難く、高いスループットの、自動化システムに移すことができなかった。プライマーウォーキングによるシークエンシングは、遅く、高価であり、そしてプライマーがほとんど特徴付けられていない領域における配列に対して設計されているので、しばしば失敗する。同様に、標的クローンの末端からのエキソヌクレアーゼ消化によってクローンのコレクションを作製することによるシークエンシングは、時間がかかり、クローン特異的で、鋳型ＤＮＡの純度および完全性に対して非常に敏感である。さらに、このアプローチを用いた成功率は、非常に変わりやすい。クローンのショットガンシークエンシングは、高いスループットの方法であるが、各クローンから挿入物を単離し、次いで広範で多様な種類の方法によって作製されたより小さい断片を再度クローニングすることが必要である。さらに、制限消化を用いるショットガンライブラリーはクローニングのバイアス、および続くＤＮＡ配列データのランダムではない分布を生じる。
【０００４】
トランスポゾンで仲介されるシークエンシングは、標的ＤＮＡ配列を含有する多数のベクターをプールして、各末端でシークエンシングプライマーを有するトランスポゾンをその構築物にランダムに挿入することによって行うことができる。Ｄｅｖｉｎｅ， Ｓ． Ｅ．， Ｂｏｅｋｅ， Ｊ． Ｅ． （１９９４） Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ ｉｎｔｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ： ａ ｕｓｅｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ＤＮＡ ｍａｐｐｉｎｇ， ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ｐｐ． ３７６５−３７７２、またはＫｉｍｍｅｌ， Ｂ．， Ｍ． Ｊ． Ｐａｌａｚｚｏｌａ， Ｃ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｊ． Ｄ． Ｂｏｅｋｅ， ａｎｄ Ｓ． Ｅ． Ｄｅｖｉｎｅ， １９９７， Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを参照せよ。ゲノム解析においては、この方法の詳細に関しては、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ （Ｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｂ． Ｂｉｒｒｅｎ、Ｒ． ＭｙｅｒｓおよびＰ． Ｈｉｅｔｅｒ編）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．を参照せよ。伝統的に、この方法は、クローニングおよびトランスポゾン挿入段階のために異なる宿主株を介してプラスミドを移動することを要するのでわずらわしい。しかし、最近、いくつかの商業分子生物学製品の製造販売元は、改良型トランスポゾン（即ちＴｎ５など）のランダム挿入を利用するインビトロのトランスポジション系を開発している。あいにく、これらの系のいくつかは、擬陽性の高いバックグラウンドという結果になり、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）による陽性クローンのスクリーニング方法を用いるのが困難である。本発明者は、これらのトランスポゾンをベースとしたシークエンシング方法のいくつかを用いて、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製改良型インビトロＧＰＳ−１トランスポジションシステムに伴なうこれらの難点のいずれも経験しなかった。それにもかかわらず、トランスポゾン挿入物を、興味のある標的ＤＮＡに排他的に向けることはできず、ベクター中に高頻度に現れるのである。この問題を解決し、トランスポゾンが促進するシークエンシング効率の増加のための努力の結果、本発明者は、ユニーク且つ高いスループットの方法、いわゆるトランスポゾンで促進されたマルチプレックスシークエンシング（ＴＥＭＳ）法を開発した。
【０００５】
従って、本発明の目的は、高いスループット且つ効率が良く、低廉なＤＮＡ断片をシークエンシングする方法を提供することである。
さらに本発明の目的は、高いスループットで、効率が良く、低廉な、生成される非標的ＤＮＡ配列の量を最小にする、トランスポゾンで仲介された方法を提供することである。
さらに本発明の別の目的は、標的ＤＮＡ配列に挿入されたトランスポゾンを有する所望の構築物と、他の場所に挿入されたトランスポゾンを有する所望でない構築物とを識別するための、ＰＣＲをベースとしたスクリーニング方法を提供することである。
【０００６】
【発明の概要】
本発明は、次に述べる方法を提供することによって上記の目的に合致するもので、この方法はさらなる便宜のために自動化され得るものである。複数の標的ＤＮＡ配列は、ベクターに各々クローン化され、プールされ、そして各末端にシークエンシングプライマーを有する選択可能なトランスポゾンは標的ＤＮＡを含有するベクターにランダムに挿入される。次に、選択された、トランスポゾンおよび標的ＤＮＡ配列を含有するベクターは、ＰＣＲ反応を用いて個別にスクリーニングされて、標的ＤＮＡ配列上に位置するトランスポゾンを有するベクターを同定する。ＰＣＲ反応はベクター配列の各末端に位置するプライマーを用い、ＰＣＲポリメラーゼが、該ベクターの長さを有する製造物を効率的に製造するための十分な伸長時間を提供するために最適化されるが、ＰＣＲポリメラーゼが、該ベクター＋トランスポゾンの長さを有する製造物を効率的に産生するためには不十分な伸長時間を提供するようにされる。それ故に、有意な量のＰＣＲ産物は、該ベクター中にではなくてＤＮＡ標的配列中にトランスポゾンを含有するベクターのみ製造される。各ＰＣＲ反応に対して有意な量のＰＣＲ産物が存在するか、または存在しないかは、二重らせんＤＮＡ（“ｄｓＤＮＡ”）に対して選択的な定量的蛍光染料を使用することにより迅速に測定可能である。次いで、プレスクリーンにおいて有意なＰＣＲ産物によって確認されるベクターは、トランスポゾンの各末端にあるシークエンシングプライマーを用いて個別にシークエンシングされ、各標的ＤＮＡ配列に読み出される。個々のシークエンシング反応の生の（ｒａｗ）標的ＤＮＡ配列は、プール中の各標的ＤＮＡの全長配列を決定するために組み合わせることができる。
【０００７】
クローンを平行処理することによって、反応がセットアップされシークエンシングされる速さが非常に増大する。さらに、本方法は、任意の特定のベクターに依存することなく、また任意の再クローニング段階を要しない。全体効率のために最も重要なことは、ベクター骨格のシークエンシングは、スクリーニング工程を用いることによって最小限になるか、あるいは消去されることである。本方法の各段階の自動化は、自動化ＤＮＡシークエンシングの当業者においてそれらに適した技術を用いて容易に達成されることができる。
【０００８】
定義
本明細書においては下記のように用いられる。即ち、
「ベクター」とは、細胞中で複製する任意のＤＮＡ構築物であって、未知のＤＮＡ配列が挿入され得る挿入部位を有するものである。
ベクターまたはトランスポゾンに関して、「選択可能である」ということは、ベクターまたはトランスポゾンがベクターまたはトランスポゾンを用いて形質転換された細胞を識別するため使用され得る表現型を有することを意味する。好ましくは、表現型は、形質転換されていない細胞が生き残れない条件にて形質転換された細胞を生き残らせることができるものである。
【０００９】
「標的ＤＮＡ」または「標的ＤＮＡ配列」とは、方法の操作者がシークエンシングを望む既知または未知の配列のＤＮＡ分子である。
「個々の形質転換体の代表的な数」とは、プール中の各標的ＤＮＡについて標的ＤＮＡ中の各塩基の独立したシークエンシング試験を所望の数提供するのに十分な数の、標的ＤＮＡへのトランスポゾンの挿入物を含む形質転換体が存在することを確実にする、最小数の個々の形質転換体である。
【００１０】
ＰＣＲ産物に関する「実質的な量のｄｓＤＮＡ」とは、予定される閾値を超える量のｄｓＤＮＡである。予定された閾値は、ベクター配列の外側または内側にトランスポゾンを含むことが知られている数種の構築物を用いたＰＣＲ反応中で見出されたＰＣＲ産物の多様性を評価することによって同定され得る。
【００１１】
【好ましい実施態様の詳細な記述】
本発明は、平行的に、多数の標的ＤＮＡをシークエンシングするための効率的な自動化が可能な方法を提供するものである。本方法において、各標的ＤＮＡ配列は、選択ベクター中、好ましくはプラスミド中に、ベクター配列中の同一の挿入部位にて挿入される。全ての標的ＤＮＡは同じベクター中に挿入されるか、または異なるベクターが用いられる場合には、１セットのプライマ−がＰＣＲ反応によって全てのベクターを増幅するために使用され得るように、各ベクターは実質的に同じサイズであり、挿入部位の周りに同一の配列を有することが重要である。
【００１２】
多数の標的ＤＮＡ配列のそれぞれを含有するベクターは、各標的ＤＮＡ配列の長さに基づいた割合でプールされるので、そのプールには各標的ＤＮＡ配列の各ｋｂの実質的に等しい量を含有する。プールに含まれる各ベクターの割合は、各標的ＤＮＡ配列の長さを測定し（例えば、アガロースゲルにおける標準サイズのマーカーに対する電気泳動によって）、そして該ベクター中の標的ＤＮＡ配列の長さの全てのｋｂに対する１セットの量の各ベクターを加えることによって決定されることができる。
【００１３】
次に、標的ＤＮＡ含有ベクターに選択可能なトランスポゾンをランダムに挿入するために、トランスポゾン挿入反応をそのプール内で実施する。この工程は伝統的なｉｎ ｖｉｖｏのトランスポゾン挿入により実施され得るが、２種以上のタイプの細胞を介してプラスミドを移動させることを必要とする。ｉｎ ｖｉｔｒｏのトランスポゾン挿入反応は、より簡単且つより速い。トランスポゾンは選択マーカーを有し、ベクターの大きさであるｄｓＤＮＡ 断片を効率的に増加させるが、ベクター＋トランスポゾンの大きさのｄｓＤＮＡ断片を顕著に増加させないことを確立するためのＰＣＲ条件を可能にするのに充分な大きさでなければならない。好ましくは、トランスポゾンはベクターの長さとほとんど同じであるか、またはベクターの長さより長い。最も好ましくは、トランスポゾンはベクターの長さと等しいか、または５／４よりも大きい。特に好ましくは、トランスポゾンはベクターの長さと等しいか、またはベクターの長さの５／３より大きい。ここでベクターは、バクテリアのプラスミドであって、トランスポゾンは好ましくは少なくとも約３ｋｂであり、最も好ましくは少なくとも約４ｋｂであり、さらに特に好ましくは約５ｋｂより大きいまたは約５ｋｂである。
【００１４】
次いでトランスポゾン挿入反応からのベクターのプールを細胞を形質転換することに用い、トランスポゾン選択条件下で、形質転換体を培養する。選択された形質転換体を単離し、培養物に増殖させる。培養物中で増殖して単離された形質転換体の数は、プール中の標的ＤＮＡ配列の数およびサイズに依存する。十分な形質転換体を、各標的ＤＮＡ配列について、単離された形質転換体が、標的ＤＮＡ配列における各塩基および全ての塩基の数倍の独立した配列決定を提供するのに、特に標的ＤＮＡ配列中へのトランスポゾンの個々の挿入物を十分含むことを確実にするため、単離し、そして増殖しなければならない。エラーの予防を確実にするために、当業者は、しばしば配列データの６倍の領域を得ようとするが、多かれ少なかれ状況の利点として選ばれるものでありうる。６倍の領域を得ようとする場合、サム（ｔｈｕｍｂ）の一般則では１８クローンが、この領域を得るのにヌクレオチド１ｋｂごとに実際にシークエンシングされるために必要とされる。しかし、実際に１８クローンをシークエンシングするために、非常に大きな数の形質転換体が単離され、増殖されねばならない。なぜなら、トランスポゾンは、全ての場合において標的ＤＮＡに結合するわけではないが、標的ＤＮＡ含有ベクター全体にわたってランダムに挿入されるからである。それ故に、数字の１８は、トランスポゾンが標的ＤＮＡ配列中に挿入される可能性によって増加する。故に、プール内に存在する各標的ＤＮＡ配列の６倍の配列決定領域を得るためには、単離されるべき形質転換体の数は、ｋｂ×１８×比率（ベクターのサイズ）／（標的ＤＮＡ配列決定のサイズ）における標的ＤＮＡ配列の長さに等しい。
【００１５】
次いで選択された形質転換体由来の各培養物は、そのＤＮＡに関してＰＣＲ反応を実施する。ＰＣＲ反応にはベクター配列の挿入部位の３′末端に相補的なプライマーを用い、そのプライマーはベクター配列全体の大きさを有する断片のＰＣＲ増幅を可能にする。ＰＣＲ反応の反応条件は、ベクターの長さを有する断片を効率的に産生するのに最適化されているが、ベクター＋トランスポゾンの長さを有する断片を効率的に産生しない。本発明による任意の特定のベクターおよびトランスポゾンの組合わせに関するＰＣＲ条件の最適化は、Ｋｉｍｍｅｌ， Ｂ．、Ｍ． Ｊ． Ｐａｌａｚｚｏｌａ、Ｃ． Ｍａｒｔｉｎ、Ｊ． Ｄ． ＢｏｅｋｅおよびＳ． Ｅ． Ｄｅｖｉｎｅ、１９９７， Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＰＣＲ， Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． ゲノム分析においては、“Ａ． ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（Ｅ． Ｇｒｅｅｎ， Ｂ． Ｂｉｒｒｅｎ， Ｒ． ＭｙｅｒｓおよびＰ． Ｈｉｅｔｅｒ編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ． Ｙ．； 並びに Ｃｈａ， Ｒ． Ｓ． およびＴｈｉｌｌｙ， Ｗ． Ｇ．（１９９５）：“ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ”， Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， Ｃ． Ｗ． ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ， Ｇ． Ｓ．（編）， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋのような参照によって導かれるように、慣用の実験によって当業者によって決定されることができる。ポリメラーゼの選択は、反応を最適化する助けになり得るけれども、ＰＣＲに用いられる特定のＤＮＡポリメラーゼは本方法に限定されるものではない。一般的に、伸長温度および／またはＰＣＲ反応の時間は、ベクター＋トランスポゾンの大きさである産物の所望の除去を達成する。最適化のデモンストレーションについては、実施例２を参照されたい。
【００１６】
次に、各ＰＣＲ反応において産生された産物の量を、好ましくは光学的に測定する。光学的な測定はｄｓＤＮＡとヌクレオチドを識別する任意の方法によって実施され得るが、好ましくはｄｓＤＮＡに対する特異的な蛍光染料を用いて実施される。ｄｓＤＮＡ特異的染料には、ビスベンズイミド染料であるＨｏｅｃｈｓｔ ３３５２８およびＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）を含むＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ（Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇｏｎ）社製のシアニン色素がある。ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）が、ｄｓＤＮＡに対する感受性および選択性のために好ましい。蛍光の測定値は、有意な量のｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産物が存在するかどうかを測定するため、予定された閾値と比較される。蛍光の閾値レベルは、単離された形質転換体をスクリーニングするのに用いたものと同じＰＣＲ条件下にて、ベクター単独の大きさ、およびベクター＋トランスポゾンの大きさを有するポジテイブコントロールおよびネガテイブコントロールのＰＣＲ鋳型を用いて実験的に設定される。
【００１７】
実質的な量のｄｓＤＮＡを産生しなかったＰＣＲ反応に対応する形質転換体は配列決定されない。なぜなら、それらはベクター配列中にトランスポゾンを含有するからである。実質的な量のｄｓＤＮＡを産生するＰＣＲ反応に対応する形質転換体には、標的ＤＮＡ配列内にトランスポゾンを含み、配列決定される。２つのシークエンシング反応は、トランスポゾン近傍の標的ＤＮＡ配列の配列を読むために、トランスポゾンの各末端由来のプライマーを用いて、各形質転換体に対して実施される。本シークエンシング反応は、当業者の誰もが実施可能である。
【００１８】
一旦配列データがＰＣＲスクリーニングをパスした全ての形質転換体から回収されると、その配列は標的ＤＮＡ配列のプールにある全ての個々のメンバーに集められる。これは、当該分野で公知のコンピュータ配列分析法によって完了され得、的確な方法は本発明に限定されない。
【００１９】
即時の本方法の利点には、速さ、効率およびその工程を自動化する能力が含まれる。特に、即時の本方法は、ベクター配列中に挿入されたトランスポゾンを有し、そして配列決定した場合には主にベクター配列を生じる非生産的な形質転換体の除去を可能にするクイックＰＣＲ法を提供する。このＰＣＲスクリーニング法は、速く、自動化することができ、そしてそのサイズを決定するためのアガロースゲルの泳動といった、ＰＣＲ産物の任意の単離を必要としない。標的ＤＮＡのプールの使用は、各標的ＤＮＡ配列について必要とするのではなく、単回のトランスポゾン反応および単回の形質転換の実施を可能とする。
【００２０】
【実施例】
実施例１
高いスループットのスクリーニング方法に適したトランスポゾンの選択
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製のオリジナルのトランスポゾン
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（３２ Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ ０１９１５）（“ＮＥＢ”）社製のゲノムプライミングシステムキットは、当初は、標的ＤＮＡ中にランダムに挿入されるトランスポゾンがかなりの正確さで完全にその標的を配列決定できる効率的な方法であるということを証明するのに用いられた。そのキットにより、カナマイシン耐性遺伝子を含有する２つのトランスポゾンのうちの１が与えられた。しかし、カナマイシンは、ごく普通の耐性マーカーであり、標的ＤＮＡ配列がカナマイシン選択可能なベクターに既にクローン化された場合には、異なるトランスポゾンまたは標的ＤＮＡ配列の再クローニングのいずれかが必要とされる。そのキットは、クロラムフェニコール耐性遺伝子マーカーを含む他のトランスポゾンを提供するけれども、それもまたごく普通である。それ故に、トランスポゾンは、さらなるクローニング段階をさけ、各標的ＤＮＡのための正確なトランスポゾンを選択する際のヒューマン・エラーを減少するために、珍しい耐性マーカー（例えばアプラマイシン）を含むよう改変されるべきである。ＧＰＳ−Ａｐｒａトランスポゾン（図２）は、ＮＥＢ ｐＧＰＳ１トランスポゾンを改変することによって構築された。
【００２１】
改変されたトランスポゾンであるＧＰＳ−Ａｐｒａを用いたスクリーニング方法
最初の実験は、スクリーニング方法がトランスポゾンに対して選択された形質転換体から、ベクター中ではなく、標的ＤＮＡ配列中にトランスポゾンを含んでいる形質転換体を同定することを示した。これは、ベクター配列の無駄な配列決定を除外することによってコストを減少させる。元のＮＥＢ ｐＧＰＳ １トランスポゾンは、各末端にプライミング部位を有し、標的ＤＮＡ中に任意に挿入される約１．７ｋｂのトランスポゾンを有する２．６１４ｋｂであった。相補的なＭ１３Ｆおよび相補的なＭ１３Ｒプライマーを用いた３．０ｋｂのベクターをＰＣＲによって増幅することにより、２つの異なったＰＣＲ産物がスラブゲル上で可視化され得る。ベクターは３．０ｋｂであるので、３．０ｋｂのＰＣＲ産物は、トランスポゾンが標的ＤＮＡ配列中にあることを示している。４．７ｋｂのＰＣＲ産物はトランスポゾン（１．７ｋｂ）を含有するベクター（３．０ｋｂ）である。それ故に、標的ＤＮＡ配列中にトランスポゾンを含むクローンは、ゲル上の３．０ｋｂのＰＣＲ産物の存在によって同定されることができる。
【００２２】
挿入物内にトランスポゾンを含むクローンの同定を実証するために、コロニーはトランスポゾン反応の後に形質転換体から選択され、選択のためのアプラマイシンおよびプラスミド抗生物質の両方の抗生物質を含む培地に植菌される。培養物を一晩増殖させて、ＰＣＲは９６ウェルプレート中のＰＣＲカクテルに約１μｌの培養物をどさっとおとすことによって次の日実施される。ＰＣＲ カクテルにはＰＥ社（ＰＥ社 ７６１ Ｍａｉｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ ０６８５９）社製のＡｍｐｌｉｔａｑ酵素および試薬が含まれる。ＰＣＲに対する条件は、標準｛９５℃で５分間、（９５℃で３０秒、５４℃で１分間、７２℃で６分間、３０サイクル）、７２℃で１分間、４度で維持｝であった。サイクル完了（平均２．５時間）後、標準的なサイズのゲルにおいてＰＣＲ反応物５０μｌのうちの８μｌを用いてゲル電気泳動が実施された。トランスポゾンを有しないベクター配列由来のＰＣＲ産物と、トランスポゾンを含むベクター配列由来のＰＣＲ産物間には、明確に検出可能なサイズの違いが存在した。
【００２３】
しかし、シークエンシング反応についての高いスループットを維持するために、電気泳動は、一度に何百ものサンプルをのせることのできる大きなゲル上で実施しなければならなかった。これらの大きなゲルにおいて、３ｋｂおよび４．７ｋｂの断片における差異は、自動化されたシステムで再現可能に検出することは困難である。また、ゲル電気泳動は実に時間がかかり、高いスループットの方法のスクリーニングを実施する際の妨げにもなり得るものであった。
【００２４】
他の高いスループットの方法を探してみると、再現可能で時間のかからないものとしてｄｓＤＮＡの蛍光検出が確立された。ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）アッセイは特に便利であるようである。しかし、ｄｓＤＮＡの蛍光検出法では異なるサイズの断片を識別することはできないので、ＰＣＲ反応が任意のＰＣＲ産物の存在または非存在によって標的ＤＮＡ含有ベクター内におけるトランスポゾンの位置を示すように改変されなければならなかった。標的ＤＮＡ配列中のトランスポゾンを有するクローンのみが、ｄｓＤＮＡ ＰＣＲ産物を生産する場合、次にＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ） ｄｓＤＮＡ染料が、所望のクローンのみに高レベルで蛍光を発する。ベクター中にトランスポゾンを含むウェルは著しいｄｓＤＮＡ産物を増幅しない上に、低いレベルの蛍光を発する。所望のクローンおよび所望でないクローンとの間の蛍光を区別するレベルは、既知のサンプルを使用することによって測定可能である。
【００２５】
多様なＰＣＲ条件が、伸長温度を低くすることによって試験されるが、４．７ｋｂのバンドは擬陽性が増加することなく、一貫して脱落しない。トランスポゾンは、そのサイズを非常に大きくするために再度改変され得る場合には、次いでＰＣＲ条件が、上方のトランスポゾン含有バンドを一貫して脱落するように開発されることができ、それによって擬陽性率が減少する。ネガティブ方向においてトランスポゾン反応に影響しない大きな「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」遺伝子が求められた。ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母２μｍプラスミドは、基準のサイズに合い、また将来において酵母の実験において用いられ得る。それ故に、ＧＰＳ−Ａｐｒａ−２μｍ−ＵＲＡ３トランスポゾンプラスミド（図３）が、約５．０ｋｂのトランスポゾンを含む、全長６．１ｋｂで構築された。ＰＣＲ条件はベクター内にトランスポゾンを有するクローンをうまく脱落させるように改変され、トランスポゾン反応には影響しなかった。実施例２を参照されたい。
【００２６】
実施例２
擬陰性および擬陽性の結果を減少するためのＰＣＲ条件の最適化
基盤となるＰＣＲ概念
このスクリーニングは、完全なベクターＤＮＡの３．９ｋｂｐの断片を増幅するために特別に最適化されたＰＣＲサイクル条件を基盤とする。この場合には、ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ ９２００８）製 ＰＣＲ４ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯであった。ベクターが挿入された５ｋｂｐのトランスポゾンを有する場合には、そのサイズは８．９ｋｂｐまで増大し、それが余りにも大きいので、最適化されたＰＣＲ条件下では増幅できない。
クローンのベクター部分を増幅するために選択されたプライマー配列は、ユニバーサルプライマーであるＭ１３Ｆ（−２０）およびＭ１３Ｒの相補的配列である。その配列は下記の通りである。５′−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ−３′および５′−ＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴ−３′。図１にこの増幅を説明する。
【００２７】
３８４−ウェルフォーマットの開発の背景
多数のクローンを含むプールからのトランスポゾン反応をスクリーニングするために、迅速かつコスト効率のよいスクリーニング方法を開発することが必要とされた。最初の開発の試みは９６−ウェルプロトコールを基盤としていた。３８４−ウェルプレートに変えるために、全ての試薬の容量は、より小さいウェル容量に適合するように等分した。しかしこれらの条件は、観察されていたＰＣＲの失敗の多さから決して理想的ではないことが証明された。このフォーマットに対して、よりエラーに強いＰＣＲの試薬および条件に対する調査に取りかかった。広範な酵素および熱サイクル条件を試験した実験の結果を次章に記述する。
【００２８】
３８４ウェルＰＣＲ最適化方法
ポリメラーゼ選択
いくつかの製造業社から購入された多様なＰＣＲキットの迅速なスクリーニングを行い、９６−ウェルフォーマットに使用されてきたＰＥ 社製ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼに対して、３８４ウェルについての代わりのものを決定した。キットごとに次のものが試験された。即ち、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ’ｓ Ｆａｉｌｓａｆｅ ＰＣＲシステム、およびＴａｋａｒａ社製の３種類のキットである、ＬＡ Ｔａｑ、 Ｅｘ Ｔａｑ、およびＺ−Ｔａｑである（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．の住所は１０２０ Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ ９４３０３−４２３０であり、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの住所は１４０２ Ｅｍｉｌ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１３であり、 そして宝酒造株式会社のバイオメデイカルグループの商業住所は〒５２０−２１９３日本国滋賀県大津市瀬田３−４−１である。）。試験されたサンプルは、プールされた３０の標的ＤＮＡを示した。それらをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社（１１０１１ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７）製のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（３．０ ｋｂ）にクローン化した。培養時間は、３８４ウェルフォーマットで２０時間であった。予備データに基づき、Ｚ−ｔａｑシステムは、ＴＥＭＳのような高スループットのシステムにおける使用に理想的である、それが持つ特徴に起因して購入され、酵素として選択された。サンプルのＰＣＲ産物が泳動された、染色された泳動ゲルを示す図４を参照されたい。
【００２９】
試薬の最適化
また、ＰＣＲスクリーニングの反応にかかるコストを減少させることが望ましい。以下に示される表２に、結果を妥協して処理することなく、多様な試薬のそれぞれを少なくできる量を試験するために実施された多様な実験を要約する。
【００３０】
【表１】
2004502467.tif 000003
【００３１】
上記の実験に基づいて、次の最適化反応用カクテルミックス（１サンプル当り）を決定した。
ｄｄＨ２Ｏ：１７．８７５μＬ
１０×Ｚ−Ｔａｑ緩衝液：２．５μＬ
ｄＮＴＰ混合物：１．５μＬ
鋳型ＤＮＡ：１μＬ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（７５ Ｐａｎｏｒａｍａ Ｃｒｅｅｋ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ １４６２５）によって製造されたＫｅｒｐｌｕｎｋｅｒ Ｎｏ．９６／３８４およびＰｉｎ Ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ Ｎｏ．２５０５２０／２５０３９３を用いて沈殿される）
Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ： ０．１２５μＬ （０．３１２５単位）
ｃＭ１３ｆ（５ｐｍｏｌ／μＬ）： １μＬ
ｃＭ１３ｒ（５ｐｍｏｌ／μＬ）： １μＬ
【００３２】
サーモサイクラー条件の最適化
使用された当初のサーモサイクリング条件は、（株）宝酒造の文献で見出された推薦に基づくものであった。これらの条件は、
１．変性：９８℃で５秒間
２．アニール：５５℃で１０秒間
３．伸長：７２℃で６０秒間（１５．４秒／ｋｂ）
４．１へ、３０回繰り返す。
５．ＰＣＲ反応が評価されるまで４℃。
【００３３】
これらの条件を用いた結果を図２に示す。そのデータから、アニーリングの温度を試験のために低くし、反応特異性を減少させ、こうして増幅される陽性の数を増加させるべきである。次の実験には、アニーリング温度が５２℃まで低下された。これは、全ての反応結果を補うものであるが、１５．４秒／ｋｂｐの伸長時間を用いてトランスポゾン挿入物を含むベクターを増幅させる結果になることが発見された。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）を含む標的ＤＮＡにおけるトランスポゾン挿入後選択され、３８４ウェルプレートのウェル中で２０時間培養して得られた４７個の形質転換体からのＰＣＲ産物を泳動したものである、染色された電気泳動ゲルを示す図５を参照されたい。トランスポゾンを含有するベクターの増幅産物と思われる、９ｋｂｐのバンドの出現は、過剰な伸長時間の結果である。
【００３４】
さらに、４８℃および６８℃の間のアニーリング温度の勾配は、５２℃が、このＰＣＲに使用するのにまさに最適な温度であることを実証するため試験された。同じ実験において、サイクルの数もまた試験された。３０、３５、４０、および４５サイクルが試験された。その実験の結果から、バックグラウンドのノイズを避けるために、サイクル数は低いままであることが必要であるとわかった。４８℃〜６８℃の勾配から、５２℃のアニーリング温度が最適として再確認された。この温度は非特異的になるほど低すぎず、ＰＣＲが失敗する温度である５６℃に達する危険性があるほど高くない。これらの結果が図６に示され、染色された電気泳動ゲルの図であって、それぞれ表される産物が２５μｌのＰＣＲカクテル容量を有する３８４ウェルフォーマットにおいて、２．５ｎｇ／ウェルで、コントロールであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）ベクターの増幅を示す。上記のデータに基づき、サーモサイクリング条件が、次のサイクルを用いて最適に実施するために測定された。
１．変性： ９８℃、５秒間
２．アニール： ５２℃、１０秒間
３．伸長： ７２℃、３０秒 （７．７秒／ｋｂ）
４．１へ、３５回繰り返す。
５．ＰＣＲ反応を評価するまで４℃。
【００３５】
蒸発が、３８４−ウェルプレートにおける問題であることが見出されたので、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（５９０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ ０２４５１）社製のゴム製の「Ｐ」シールが、サーモサイクリングが始まる前にシールされたプレート上に取り付けられた。これに沿って、そして製造者が推奨するとおりに、フタの温度を８５℃に設定した。
【００３６】
下記に示される表３に、最適化工程中に試験された多様なＰＣＲサーモサイクリング条件の要約を提供する。
【表２】
2004502467.tif 000004
【００３７】
ｄｓＤＮＡ 定量化試薬ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）を使用した陽性クローンのスクリーニング　ゲル電気泳動の労働集約的作業を回避するために、ＴＥＭＳ ＰＣＲスクリーニングは、ｄｓＤＮＡ定量化試薬であるＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）を使用する。ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）は、１×ＴＥバッファーにて１５０倍の実用の希釈率まで希釈した。この希釈は最適であると分かったが、製造業社のプロトコールにおいて推奨される２００倍希釈よりわずかに濃縮されたものである。
【００３８】
１ウェルに付き１５０倍希釈したＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ） ２５μｌをＲｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（１２５０ Ｅｌｋｏ Ｄｒｉｖｅ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ ９４０８９２２１３）製Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａ ９６ デイスペンサーを用いて黒い３８４ウェルのプレートに等分した。次いで各ＰＣＲ反応のウェルに付き５μｌを、再度Ｈｙｄｒａデイスペンサーを使用してＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）に添加した。次にプレートを直に分子ダイナミクスジェミニ蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｇｅｍｉｎｉ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）に置き、次いでその蛍光シグナルが測定される前に、そのプレートを１０秒間混合した。
そのアッセイはスクリーニングとして働くので、陽性および陰性ウェル間の蛍光シグナルにおいて明白な違いを有するはずである。１．３、２．５、５および１０μＬのＰＣＲ産物の量を、バックグラウンドに対する陽性シグナルの最大のアッセイ範囲を測定するために試験した。２５μＬ ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）中に５μＬのＰＣＲ産物が使用するために最適な条件であることを示す結果を、表４に示す。
【００３９】
【表３】
2004502467.tif 000005
【００４０】
次に、蛍光リーダーによって生じた出力シグナルは、ヒストグラムデイスプレイにエクスポートされ、陽性クローンのカットオフの値は棒グラフから与えられる。現在の条件を用いて、カットオフは一般的に１０００〜１５００に減少する。
【００４１】
Ｇｅｎｅｓｉｓ ＲＳＰ １５０ ＴＥＣＡＮロボット工学ステーション（ｒｏｂｏｔｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎ）（ＴＥＣＡＮ Ｕ． Ｓ． ＩＮＣ．， Ｐ． Ｏ． Ｂｏｘ １３９５３， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， ＮＣ ２７７０９）は、標的ＤＮＡ配列中にトランスポゾンを有するものとしてスクリーニングすることによって同定されたクローン由来の細胞を含む９６−デイープウェルプレートを生成するのに使用された。各陽性クローンからの細胞をウェルの１つにおいてＳｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈおよび適当な抗生物質（２重選択）中においた。これらのプレートを培養し、次いで培養物を自動化シークエンシングに供した。
【００４２】
３８４−ウェルプレートの最適化ＰＣＲスクリーニング技術の実施例
Ｑ−Ｂｏｔを使用して、クローンを含むトランスポゾンのコロニーを、１ウェル当りＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈ＋適当な抗生物質を６５μｌ含むＧｅｎｅｔｉｘ ３８４ウェルの浅いウェルプレートに選びとった。加湿された３７℃のインキュベータに１９〜２２時間プレートを置いた。滅菌５０％グリセロールをＭｕｌｔｉｄｒｏｐ ３８４ １１５Ｖ 液体デイスペンサー （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， ８ Ｅａｓｔ Ｆｏｒｇｅ Ｐａｒｋｗａｙ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ ＭＡ ０２０３８）を用いて増殖プレートに１ウェル当り２５μｌ等分した。鋳型としてグリセロールプレートを用い、次のレシピを用いてＰＣＲを設定した。
ｄｄＨ２Ｏ： １７．８７５μＬ
１０×Ｚ−Ｔａｑバッファー： ２．５μＬ
ｄＮＴＰ混合物： １．５μＬ
鋳型ＤＮＡ＊ ： １μＬ （Ｋｅｒｐｌｕｎｋｅｒ、ピン−ツールを用いる）
Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ： ０．１２５μＬ （０．３１２５単位）
ｃＭ１３ｆ （５ｐｍｏｌ／μＬ） ： １μＬ
ｃＭ１３ｒ （５ｐｍｏｌ／μＬ）： １μＬ
＊ Ｋｅｒｐｌｕｎｋｅｒが滅菌されたことを確実にするために、７０％エタノール中で貯蔵し、使用前に火炎滅菌する。
【００４３】
ＰＣＲ反応プレートをサーモサイクラー上に置き、次のサイクルを開始する：
１．変性： ９８℃で５秒間
２．アニール： ５２℃で１０秒間
３．伸長： ７２℃で３０秒間（７．７秒／ｋｂ）
４．１へ、３５回繰り返す。
５．ＰＣＲ反応が評価されるまで４℃。
総サイクリング時間：１時間１８分３０秒
【００４４】
反応の進行中に、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）試薬を室温で解凍する。１×ＴＥバッファーで１５０倍希釈したＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）を準備する。３８４−ウェルプレートにつき１０ｍｌを用意する。全ての３８４−ウェルブラックプレートに１ウェルにつきＲｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａを用いて２５μＬ分注する。Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａを用いて、ＰＣＲ反応物をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）プレートに１ウェルに付き５μＬ分配する。すぐに蛍光プレートリーダーにプレートを置き、１０秒間振とうすることによって混合する。蛍光シグナルのデータをフロッピーディスクにエクスポートする。エクセルマクロにデータをインポートし、閾値として１５００を用いて陽性クローンの再配列リストを作成する。ＰＣＲスクリーニングから得られた最終ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）データの例は図７を参照されたい。ＴＥＣＡＮロボットの再配列リストを開けて、Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈおよび適当な抗生物質を含む９６−ウェルの深いウェルプレートに、グリセロールストックプレートからクローンを再配列する。プレートをインキュベートした後、それらの培養物は自動化された方法で配列決定される。
【００４５】
実施例３
ベクターＰＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯにおける未知の配列のトランスポゾンにより促進されたマルチプレックスシークエンシング
トランスポゾン反応
トランスポゾン反応は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製のゲノムプライミングシステム（ＧＰＳ）キットを用いて実施した。キット中の全ての成分はトランスポゾンＧＰＳ１を除いて使用した。使用されたトランスポゾンは、ＧＰＳ１の改変型であった。２つの改変型が作製された。ある変異体において、現存する耐性マーカーであるｐＧＰＳ−Ａｐｒａは、アプラマイシン耐性遺伝子によって置換されたものである。これは耐性マーカーにかかわらず任意のベクターを配列決定するために使用され得ることを確実にするため実施された。他の変異体において、酵母の２μｍ複製起点を含むｐＧＰＳ−Ａｐｒａ−Ｙ２μｍ「スタッファー」領域は、トランスポゾンにクローン化され、そのサイズを５ｋｂまで増加する（図６）。この改変は、ベクター骨格への転位を排除することによって、その工程の効率を改善する目的で作製された。その反応物は、ＤＨ１０Ｂ Ｅ． ｃｏｌｉコンピテント細胞にエレクトロポーレーション法によって形質転換され、トランスポゾンを持つクローンを選択するために、適切な抗生物質（アプラマイシン（１００μｇ／ｍｌ）／カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ））を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（１．０％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキストラクト、１．０％ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．０）の寒天プレート上に播種された。増殖時間は２０〜２２時間である。
【００４６】
ＴＥＭＳ（トランスポゾンにより促進されたマルチプレックスシークエンシング）　ＴＥＭＳを実施した全ての標的ＤＮＡ配列の大きさは、Ｎｏｔ Ｉを用いた標的ＤＮＡ含有ベクターの制限消化によって評価された。同じベクター骨格中に含まれる多様なサイズの標的ＤＮＡ配列を含むプラスミドのセットがプールされた。等モルの濃度は、プールする前に各標的ＤＮＡ配列に対して計算された。単一の鋳型としてプールされたＤＮＡの鋳型を処理するトランスポゾン反応が、実施された。各標的ＤＮＡ配列の各塩基の６倍の領域について、各標的ＤＮＡ配列の大きさの合計に、１ｋｂの配列につき１８クローンである本発明者らの標準係数を乗じて、配列に対してランダムに選択されたクローンの数を決定した。ベクターの大きさの合計および標的ＤＮＡ配列の大きさの合計に基づいて、トランスポゾン挿入の位置の可能性が計算された。この係数×６倍の領域に対するクローンの数は、何個のクローンをランダムに選択し、ＰＣＲスクリーニング法に付したらよいかということを決定する。
【００４７】
算出された数のコロニーを選択し、９６ウェルまたは３８４ウェルの培養プレートに適当な抗生物質を含有するＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（バクトトリプトン、イーストエキストラクト、ＮａＣｌ、ＮａＯＨ）の培地に植菌した。これらの培養プレートは、培養プレート（９６／３８４ウェル）のフォーマットによって１８〜２２時間、振とうせずに一晩培養した。グリセロールストックは、プレートの一次貯蔵用に作製された。５０％グリセロールを直接プレートに添加し、混合した。これにより−８０℃にて無期限に貯蔵することができる。
【００４８】
ベクター挿入物のＰＣＲによる排除
スクリーニングのためのクローンのベクター部分を増幅するために選択されたプライマー配列は、ユニバーサルプライマーＭ１３Ｆ（−２０）およびＭ１３Ｒの相補配列であった。その配列は次のとおりである。即ち、５′−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ−３′および５′−ＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴ−３′である。培養物のＰＣＲは、次の条件で組み立てられた。即ち、鋳型を約１μＬずつピンレプリケーターツール（ｐｉｎ ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ ｔｏｏｌ）を用いて分取されたＰＣＲ反応試薬調製物に入れた。９６−ウェルフォーマットに対する１０×ＰＣＲ緩衝液組成物は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ ｗ／ｖゼラチンである。各反応には、５ピコモルのフォワードプライマーおよび５ピコモルのリバースプライマーを使用した。反応中のｄＮＴＰ濃度は、最終濃度２．５ｍＭであった。各反応に添加されるＴａｑポリメラーゼの量は、０．１単位であった。全ての反応が総容量５０μｌで実施された。３８４−ウェルフォーマットＰＣＲは、Ｐａｎｖｅｒａ社（５４５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）から得たＴａＫａＲａ Ｚ−Ｔａｑキットを用いて２５μｌの合計容量で実施された。このキットは、Ｚ−ｔａｑポリメラーゼ（２．５単位／μＬ）、３０ｍＭ濃度のＭｇ２＋を含有する１０×Ｚ−Ｔａｑバッファー、およびｄＮＴＰ混合物（各２．５ｍＭ）からなる。サーモサイクラーはヒートリッド（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して運転された。このＰＣＲサイクルは短い伸長時間によりトランスポゾンのないベクターのみ増幅するように設計されたものである。後に蛍光分析がプレート上で直接行えるように、黒のＰＣＲプレートが使用された。
【００４９】
ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）を用いた解析条件
ＰＣＲの完了時に、２５μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）をＰＣＲプレートに添加した。１×ＴＥ（Ｔｒｉｓ‐酢酸、ＥＤＴＡ）バッファーでＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）ストックを２００倍に希釈した５０μｌ容量の液を、１０μｌのＰＣＲ反応物と混合した。そのプレートをスペクトロフルオロメーターで読み、ここでその分子を４８０ｎｍで励起し、そのシグナルを５４０ｎｍで放射させた。予め決定された閾値以上である蛍光発光するＰＣＲ産物は、配列決定される陽性クローンであった。その閾値は、ベクター中か、またはベクターへの挿入物中のいずれかのトランスポゾンを含む既知の構築物を用いて実験的に測定された。陽性クローンを選別し、ＴＥＣＡＮロボットアーム（ＴＥＣＡＮ ｒｏｂｏｔｉｃ ａｒｍ）によって、アレイに好適なフォーマットに圧縮した。グリセロールストックは、Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ （バクトトリプトン、イーストエキストラクト、ＮａＣｌ、５Ｎ ＮａＯＨ）および好適な抗生物質の１．５ｍｌを含有する９６ディープウェルプレートに植菌された。これらの培養物を２４時間培養し、次いで培養物由来の標的ＤＮＡをトランスポゾンの両末端にあるプライマーを用いて配列決定した。
【００５０】
シークエンスアセンブリー
Ｐｈｒｅｄ ソフトウェアを用いて、生の（ｒａｗ）配列のベクターのトリミングおよび塩基の呼出しの後に、配列をＰｈｒａｐソフトウェアを用いて整理した（Ｂｒｅｎｔ Ｅｗｉｎｇ， ＬａＤｅａｎａ Ｈｉｌｌｉｅｒ， Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ． Ｗｅｎｄｌ， ａｎｄ Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ．“Ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｔｒａｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈｒｅｄ． Ｉ． Ａｃｃｕｒａｃｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．”１９９８． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８： １７５−１８５．およびＢｒｅｎｔ Ｅｗｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ“Ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｔｒａｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈｒｅｄ． ＩＩ． Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ．”１９９８． Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：１８６−１９４を参照せよ）。そのアセンブリーは、ｃｏｎｓｅｄ （ｃｏｎｓｅｄ： Ａ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ １９９８ を参照のこと）を用いて精査された。完了の基準は、高い品質であって、完全長遺伝子の６倍の領域である。配列１０ｋｂあたりの予測されたエラーの割合は、０．１よりも小さくあるべきである。これらの基準に適合しない場合には、プライマーは標的ＤＮＡ配列におけるエラーしやすい部位のプライマーウオーキングシークエンシングのための鋳型に沿って選択される。プライマーウォーキングシークエンシングは、必要とされるシークエンシングの容量に従って、ＡＢＩ ３１０シークエンサーか、またはＡＢＩ ３７００を使用した高いスループットのシークエンシングのいずれかを用いて実施され、そしてこれらの配列は実質的にそのアセンブリーに付加される。ＢＬＡＳＴ分析は特に既知の遺伝子と比較するために実施される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， Ｇｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．， Ｍｙｅｒｓ， Ｅ． Ｗ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ． Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．”Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０； Ｇｉｓｈ， Ｗ． ＆ Ｓｔａｔｅｓ， Ｄ． Ｊ． （１９９３）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３： ２６６−２７２； Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ． Ｌ．， Ｔａｔｕｓｏｖ， Ｒ． Ｌ． ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｊ． （１９９６）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ”Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６： １３１−１４１ ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ． Ｌ．， Ｓｃｈａｕｆｆｅｒ， Ａ． Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ． ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ． Ｊ． （１９９７）”Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ．” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ ； ａｎｄ Ｚｈａｎｇ， Ｊ． ＆ Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ． Ｌ． （１９９７）”Ｐｏｗｅｒ ＢＬＡＳＴ ： Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ７： ６４９−６５６を参照せよ）。生成された配列の全長は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒと呼ばれる他のアセンブリープログラムにインポートされる（Ｃａｓｈ， Ｈ．， Ｃｌａｒｋ， Ｂ．， Ｇａｌｔ， Ｊ．， Ｇａｒｂ， Ｃ．， Ｇｏｅｂｅｌ ＩＩＩ， Ｃ． Ｊ．， ＆ Ｓｉｎｇｅｒ， Ｊ．　Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ”Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＤＮＡ”． Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ． １９９９．）。このプログラムを用いれば、変更がたとえあるとしても、フレームシフトを引き起こさなかったことを確実にするために、オープンリーデイングフレームを可視化することが容易である。
【００５１】
前記の実施例は、単に例示および説明をするのみであって本発明を限定するものではないと理解される。特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲を離れることなく、多様な改変が、上記の実施態様に対して当業者によってなされ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＴＥＭＳの工程のダイヤグラムである。
【図２】
ＧＰＳ−Ａｐｒａトランスポゾンベクターの配列を示す。
【図３】
ＧＰＳ−Ａｐｒａ−２μｍ−ＵＲＡ３トランスポゾンベクターの配列を示す。
【図４】
トランスポゾン含有ベクターおよび標的ＤＮＡ含有ベクターのベクター部分を倍数化する様々なポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応の産物を示すために染色された電気泳動ゲルの写真である。
【図５】
約９ｋｂの産物を消去するには長すぎる伸長時間を有するＰＣＲ反応の産物を示すために染色された電気泳動ゲルの写真である。
【図６】
様々な伸長温度および異なった数のサイクルにおけるＰＣＲ反応の産物を示すために染色された電気泳動ゲルの写真である。
【図７】
ＰＣＲ反応の産物を示すため染色された電気泳動ゲルの写真、並びに同じＰＣＲ反応についてのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（Ｒ）の結果の表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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