(57)【要約】本発明は、全能性幹細胞の後分化活性を阻害するヒアルロン酸のレチノイン酸エステルの新規の使用に関する。また、本発明は、この幹細胞の分化方法及び上記のエステルの後分化活性を調節し得る分子の選択方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞後分化剤としての、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルの使用。
【請求項２】
前記のエステルは、レチノイン酸による置換率が０．００００１乃至０．５であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記のレチノイン酸による置換率は、０．００２乃至０．１であることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記エステルは、ブチル酸及びレチノイン酸と、ヒアルロン酸とのエステルの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記のエステルの混合物は：
ブチル酸による置換率が０．０５乃至１．０であり；
レチノイン酸による置換率が０．００２乃至０．１であり；且つ
ブチル酸及びレチノイン酸による置換率の比率（ＤＳ  ＲＡ／ＤＳ  ＢＡ）が、少なくとも６である；
ことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記の幹細胞は、哺乳類由来であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記哺乳類は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、霊長類、高等霊長類、齧歯類、ブタ及びウシから選択されることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記の幹細胞は、胚又は体細胞由来であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
幹細胞における心臓発生に関する後分化活性を有する薬剤の調製のための、レチノイン酸の多糖類エステルの使用。
【請求項１０】
心臓発生に関する後分化活性を有する薬剤の調製のための、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
心筋細胞の損傷及び心筋症の、処置及び予防用の薬物の調製のための、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記の心筋細胞の損傷は、心筋梗塞であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
幹細胞をヒアルロン酸のレチノイン酸エステルでインキュベートするステップを本質的に有する心筋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調製方法であって、
任意で、心筋細胞を有する収縮単位を選択するステップを有することを特徴とする前記方法。
【請求項１４】
前記のレチノイン酸エステルは、レチノイン酸によるヒアルロン酸の置換率が、０．００００１乃至０．５であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記のレチノイン酸エステルは、ブチル酸及びレチノイン酸と、ヒアルロン酸とのエステルの混合物であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記のエステルの混合物は：
ブチル酸による置換率が０．０５乃至１．０であり；
レチノイン酸による置換率が０．００２乃至０．１であり；且つ
ブチル酸及びレチノイン酸による置換率の比率（ＤＳ  ＲＡ／ＤＳ  ＢＡ）が、少なくとも６である；
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記の幹細胞は、自系又は異種であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記の選択するステップは、「遺伝子トラッピング」で実行されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の幹細胞は、Ｐ１９、Ｄ３、Ｒ１及びＧＴＲ１細胞から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
心臓発生に関連する調節活性を有する新規の分子を選択する、請求項１３乃至１９のいずれか一項に記載の方法を有する方法であって、選択した前記分子を最適化するステップを任意で有することを特徴とする前記方法。
【請求項２１】
幹細胞の心臓発生分化用のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞モデルの調製方法であって、
前記幹細胞を、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルを単独で、又は他の物質と組み合わせて、適切な培地中でインキュベートするステップを本質的に有することを特徴とする前記方法。
【請求項２２】
前記のレチノイン酸エステルは、レチノイン酸によるヒアルロン酸の置換率が０．００００１乃至０．５であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記のレチノイン酸エステルは、ブチル酸及びレチノイン酸と、ヒアルロン酸とのエステルの混合物であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記のエステルの混合物は：
ブチル酸による置換率が０．０５乃至１．０であり；
レチノイン酸による置換率が０．００２乃至０．１であり、且つ
ブチル酸及びレチノイン酸による置換率の比率（ＤＳ  ＲＡ／ＤＳ  ＢＡ）が、少なくとも６であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記の幹細胞は、Ｐ１９、Ｄ３、Ｒ１、ＧＴＲ１、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ９．１及びＨ９．２細胞から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記のインキュベートするステップは、心筋細胞において分化した細胞を有する収縮単位を選択するステップの後に行うことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
処置が必要な患者において心不全を処置する治療方法であって、異種又は自系の幹細胞を、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルで「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」又は「ｅｘ  ｖｉｖｏ」において処置することを特徴とする前記治療方法。
【請求項２８】
前記のレチノイン酸によるヒアルロン酸の置換率は、０．００００１乃至０．５であることを特徴とする請求項２７に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞治療に適したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの幹細胞の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞の使用は、種々の組織修復や再構築の戦略に先進的なツールを代表しており、これらには、例えば、心筋梗塞後の心臓組織の修復や、心臓の収縮単位を示す心筋細胞の崩壊に関連した、先天的又は後天的な、肥大型又は拡張型心筋症などが挙げられる。
【０００３】
これらの新規の戦略は、心臓血管系の疾病が死亡の主原因である先進諸国において特に注目されている。これまでなされてきた試みは、実験的に心筋梗塞を惹起したマウスやラットの心臓組織に未分化の幹細胞を直接注入する方法を含む（非特許文献１参照）。注入された多くの細胞は、アポトーシスにより消失され、受容した心筋により低率で「教育」され、未だ同定されていない機構を介して未発達の心筋細胞へと分化する。この戦略により、移植された幹細胞は、受容した心筋内で、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて心筋細胞へと分化する必要があり、これにより、非常に低い率で、貧弱な組織障害の修復が行われ、血流力学的な観点から最小限の機能修復が起こる。
【０００４】
代わりに、心不全にかかるモデルマウスで行った実験が示すのは、全能性幹細胞から既に分化した心筋細胞及び「遺伝子トラッピング（ｇｅｎｅ  ｔｒａｐｐｉｎｇ）」による他の表現型の細胞から選択された心筋細胞は、心筋への移植の後でも生存可能であり、受容した心筋組織において永続的に統合可能である（非特許文献２参照）。
【０００５】
しかしながら、細胞分化の誘導の基礎をなす機構は、非常に複雑で、部分的にのみ解明されているだけである。限定された数の組織特異的転写因子の活性化を介して、これらの機構は、特定の心筋の構築へと向かう多重的な遺伝子発現を統合する。
【０００６】
本発明者らは、心臓発生（ｃａｒｄｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）のいくつかのキーとなるステップを示すのに貢献しており、Ｇａｔａ−４やＮｋｘ−２．５などの転写因子をコードする遺伝子の発現により、未成熟の幹細胞において、心臓に特異的な転写物であるα−ミオシン重鎖（ＭＨＣ）及びミオシン軽鎖２−Ｖ（ＭＬＣ）並びに心臓の発現型を誘導することを示してきた（非特許文献３参照）。さらに、複合的で自己分泌型のエンドルフィン作動系は、上述の心臓発生に係る「アーキテクト遺伝子（ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ｇｅｎｅｓ）」の発現を活性化及び統合し得ることを同定された（非特許文献４参照）。
【０００７】
この点、幹細胞を正確且つ効果的に分化誘導させ得る方法は、非常に望ましく、組織修復及び再構築の種々の戦略に関して先進的なツールとなる。
【０００８】
事実、幹細胞における心臓発生工程の有用性は、現在、以下の事実により強力に制限される。つまり、心臓の表現型へと向かう分化が、分化する可能性のある運命を有するすべての細胞のうちの一部を代表とする、という事実に強力に制限されている。多能性幹細胞において、つまり、胚由来の全能性幹細胞よりも分化する能力が制限されている細胞において、心臓発生の工程は、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）により誘導され得る。しかしながら、これら細胞の１５〜２０％のみが、ＤＭＳＯ存在下で、マウス胚性癌腫由来の多能性細胞であるＰ１９細胞に見出されるように、未成熟心筋細胞に分化可能である（非特許文献５参照）。さらに、ＤＭＳＯは、心臓発生を行う全能性幹細胞の割合を有意に増加させ得ない（非特許文献６参照）。幹細胞の分化剤として作用し得るその他の物質であるレチノイン酸は、考慮する細胞型で変化する種々の分化工程を促進するが、レチノイン酸は、多能性Ｐ１９細胞における神経分化（非特許文献７）やいくつかの幹細胞株において心臓分化（非特許文献８）を促進するが、ヒト全能性幹細胞における心筋細胞の分化活性は有さない（非特許文献９）。
【０００９】
従って、いくつかの心臓発生決定機構が解明されているという事実にも関わらず、心筋細胞の欠失を補完し、これにより、有意な数の心疾患患者において臨床的に不可逆な事例を未だ代表する心不全へとつながる心筋の障害の進行を拘束する現在利用可能な治療学的且つ薬物的処置方法はない。
【非特許文献１】Ｏｒｌｉｃ  Ｄら著、Ｎａｔｕｒｅ、２００１年、４１０巻、７０１〜７０５頁
【非特許文献２】Ｋｌｕｇ  ＭＧら著、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９６年、９８巻、２１６〜２２４頁
【非特許文献３】Ｖｅｎｔｕｒａ  Ｃ、Ｍａｉｏｌｉ  Ｍ著、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、２０００年、８７巻、１８９〜１９４頁
【非特許文献４】Ｌｕｃｋ  Ｃ、Ｍａｉｏｌｉ  Ｍ著、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、２０００年、８７巻、１８９〜１９４頁
【非特許文献５】ＭｃＢｕｒｎｅｙ  ＭＷ、Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ  ＥＭＷ、Ｅｄｗａｒｄｓ  ＭＫＳ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＰＪ．著、Ｎａｔｕｒｅ、１９８２年、２９９巻、１６５〜１６７頁
【非特許文献６】Ｘｕ  Ｃ、Ｐｏｌｉｃｅ  Ｓ、Ｒａｏ  Ｎ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＭＫ．著、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、２００２年、９１巻、５０１〜５０８頁
【非特許文献７】ＭｃＢｕｒｎｅｙ  ＭＷら著、Ｎａｔｕｒｅ、１９８２年、２９９巻、１６５〜１６７頁
【非特許文献８】Ｗｏｂｕｓ  ＡＭら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、１９９７年、２９巻、１５２５〜１５３９頁
【非特許文献９】Ｘｕ  Ｃら著、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、２００２年、９１巻、５０１〜５０８頁
【非特許文献１０】Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２８２巻、１１４５〜１１４７頁
【非特許文献１１】Ａｍｉｔ  Ｍら著、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２０００年、２２７巻、２７１〜２７８頁
【非特許文献１２】Ｎａｇｙ  Ａら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３年、９０巻、８４２４〜８４２８頁
【非特許文献１３】Ｖｅｎｔｕｒａ  Ｃら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、２７２巻、６６８５〜６６９２頁
【非特許文献１４】Ｖｅｎｔｕｒａ  Ｃら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、２７３巻、１３３８３〜１３３８６頁
【非特許文献１５】Ｌｉｎｔｓ  ＴＪら著、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９３年、１１９巻、４１９〜４３１頁
【非特許文献１６】Ｓｃｈｏｔｔ  ＪＪら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、２８１巻、１０８−１１１頁
【非特許文献１７】Ｂｅｎｓｏｎ  ＤＷ著、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９年、１０４巻、１５６７〜１５７３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、幹細胞の後分化剤（ｐｒｏ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ）として、レチノイン酸のヒアルロン酸エステルの使用に係り、特に、自発収縮に関連する未成熟新規細胞の存在を特徴とする心臓の表現型の発現を促進する能力に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る上述のエステルは、レチノイン酸で部分的或いは全体的にエステル化される。ヒアルロン酸が完全にエステル化されていない場合、例えば、プロパン酸やブチル酸などの他の短鎖アルカン酸でエステル化されてもよく、好適なのは、ブチル酸である。
【００１２】
さらに、上述のエステルは、１０，０００〜３０，０００の分子量を好ましく有する：このことが意味するのは、かかる「分子量」は、ブチル残基やレチノイン酸残基などの寄与を考慮しないヒアルロン酸単独の平均分子量（ＭＷ）を参照する。
【００１３】
驚くべきことに、レチノイン酸エステルの全能性幹細胞に対する後分化活性は、レチノイン酸とは異なることが観察された。事実、これらのエステルは、幹細胞を心臓発生へと分化させ、且つ、心臓発生性転写特性（つまり、心臓特異的遺伝子の転写を進行或いは誘導させる遺伝子発現において）と心臓特異的遺伝子の転写との両方を同定し得る。
【００１４】
さらなる態様によると、本発明は、心臓の発現型の誘導に係る有効性を増加させるように、レチノイン酸のヒアルロン酸エステルの使用方法に関する。さらに、本発明は、心筋収縮単位の破壊に関連した全ての病態において再構築性の細胞治療に使用され得る心筋細胞を生成させるための上述のエステルの使用に関する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、心筋細胞の損傷の処置及び防止並びに特に心筋梗塞の処置用の、急性又は先天的な心筋症に使用し得る薬物の調製用の上述のエステルの使用に関する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、特に齧歯類やヒト細胞などの哺乳類由来の幹細胞における心臓発生に関連する遺伝子の活性化方法、心臓発生に向かう分化した幹細胞の調製及び単離並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋細胞の調製に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、心臓発生を調節するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物の選択に係るシステムを構築するため、本発明により分化された単離した細胞の使用にも及ぶ。
【００１８】
最後に、本発明は、後天的な病態（心筋梗塞後、虚血、弁に関連した病態など）により発生したり、遺伝的な素因（肥大性又は拡張性心筋症）で同定されたり、或いは、心筋梗塞など心不全の処置に係る治療方法を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、幹細胞の後分化剤としてのレチノイン酸のヒアルロン酸エステルの使用に関する。
【００２０】
これらのエステルは、心臓発生を誘導する遺伝子及び全能性幹細胞における心臓特異的遺伝子の発現に影響を及ぼす。
【００２１】
さらに、上述のエステルは、自発収縮活性、好ましくは３次元で統率された活性に寄与する未成熟心筋細胞の存在を特徴とする心筋の表現型の発生を促進する。
【００２２】
かかる活性に寄与する上述のエステルは、ヒアルロン酸の単糖単位の水酸基がレチノイン酸で部分的又は全体的にエステル化されているエステルである。これらエステルにおけるレチノイン酸の置換の程度は、好ましくは、０．００００１〜０．５、又は、さらに好ましくは、０．００１〜０．１であり、置換率（ＤＳ）は、多糖類の単位モル当たりのレチノイン酸のモル数を示す。
【００２３】
ヒアルロン酸がレチノイン酸で全体的にエステル化されていない場合、例えば、プロパン酸やブチル酸などの他の短鎖アルカン酸でエステル化されてもよく、好適なのは、ブチル酸である。この特異的な場合、好適な混合されたエステルは、レチノイン酸及びブチル酸とヒアルロン酸との混合エステルである。好ましくは、これらは、０．０５〜１．０のブチル酸での置換率を有し、０．００２〜０．１のレチノイン酸の置換率を有し、且つ、ブチル酸及びレチノイン酸の置換率の比率（ＤＳ  ＲＡ／ＤＳ  ＢＡ）が少なくとも６である。
【００２４】
「置換率」に関し、上述の事項は、ヒアルロン酸の各繰り返し単位に関するエステル化された水酸基の数を意味する。
【００２５】
用語「レチノイン酸」又は「（ＲＡ）」は、この化合物の全ての異性体を示す。従って、天然型（ｔｒａｎｓに二重結合が存在するもの）及びその他の全ての可能性のある異性体を示す。
【００２６】
さらに、上述のエステルは、１０，０００〜３０，０００ダルトンの分子量を好ましく有する；「分子量」が意味するのは、ブチル酸やレチノイン酸残基の貢献を考慮せずにヒアルロン酸単独でみた平均分子量（ＭＷ）である。
【００２７】
驚くべきことに、レチノイン酸エステルの全能性幹細胞に対する後分化活性は、レチノイン酸とは異なることが観察された。事実、これらのエステルは、幹細胞を心臓発生へと分化させ、且つ、心臓発生性転写特性（つまり、心臓特異的遺伝子の転写を進行或いは誘導させる遺伝子発現において）と心臓特異的遺伝子の転写との両方を誘導することが知られている（非特許文献５参照）が、ヒト幹細胞では種々の効果を示さない（非特許文献６参照）。
【００２８】
心臓発生の効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、多能性齧歯類細胞をＤＭＳＯで処理すると、上述に代わって観察されるが、この方法の全体的な効果は比較的低い。
【００２９】
上述した新規の使用方法に従って培養状態の幹細胞にレチノイン酸の多糖類エステルの投与により、心臓発生転写特性（心臓特異的遺伝子の転写を進行又は誘導する遺伝子発現）及び心臓特異的遺伝子の転写の両者が同定され得る。
【００３０】
本発明のエステルの効果は、全ての哺乳動物由来の幹細胞にも及び、好ましくは、例えば、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ９．１及びＨ９．２などの胚由来の細胞にも及ぶ。なお、これらの細胞は、非特許文献１０及び１１に述べられている。また、本技術分野において知られた方法に従って単離し得る幹細胞にも及ぶ。
【００３１】
本発明のエステルの効果は、好ましくはＧＴＲ１などの全能性齧歯類幹細胞で測定されてきており（非特許文献１２参照）、これは、「遺伝子トラッピング」により心筋の発現型に関して選択可能なものである（非特許文献２参照）。しかしながら、「遺伝子トラッピング」の手法は、発現型の選択の手法を代表しており、心臓発生の工程の効率を増加し得るツールではない。従って、本発明のエステルの効果は、「遺伝子トラッピング」により選択可能な幹細胞にも及ぶ。
【００３２】
レチノイン酸エステルでの処理は、心臓発生に関連する遺伝子の転写を促進する。特に増加するのは、プロダイノルフィン、Ｎｋｘ−２．５のホメオドメイン転写因子（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのｔｉｎｍａｎ遺伝子に相同性有り）であってその変異はヒトにおいて先天的心筋症を同定するもの、及び「ジンクフィンガードメイン」ファミリーに属する蛋白をコードするＧａｔａ−４に対応する転写物である。さらに、心臓特異的なα−ミオシン重鎖遺伝子及びミオシン軽鎖の２Ｖアイソフォーム（Ｍｌｃ−２ｖ）遺伝子の転写物が増加する。後者は、心臓発生において心筋細胞の心室の配置を同定するため、特に重要なマーカーである。観察される効果は、転写物の安定性を単に帰し得ないが、むしろ、これら遺伝子の転写率の増加に起因する。従って、本発明の第１の態様は、未分化の幹細胞において心臓発生を誘導する工程の効率を増加させるような、レチノイン酸のヒアルロン酸エステルの使用に関する。この使用は、ジンクフィンガーファミリーに属する、プロダイノルフィン、Ｎｋｘ−２．５ホメオドメイン及びＧａｔａ−４などの心臓関連の遺伝子の活性化により好ましく達成される。
【００３３】
本発明の第２の態様は、α−ミオシン重鎖及びミオシン軽鎖２Ｖ（ＭＬＣ−２Ｖ）などの心筋収縮の工程における基本蛋白をコードする遺伝子など、心臓に特異的な遺伝子の転写物を増加させるように、レチノイン酸のヒアルロン酸エステルの使用方法である。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、自発収縮活性に寄与する未成熟心筋細胞の幹細胞から生成することを特徴とする心筋の発現型の工程の全体的な効率を増加させるように、レチノイン酸のヒアルロン酸エステルの使用に関する。
【００３５】
ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルで誘導された心臓発生及び心臓特異的な遺伝子の発現増加により、上述の物質が心臓分化の遺伝子プログラムを操作し得ることを示す。これにより、遺伝子治療に係る複雑で時に有害な技術の可能な代替法を提供する。
【００３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの全能性幹細胞のシステムにおいて、本発明のエステルは、好ましくは、０．０１〜５ｍｇ／ｍＬで、さらに好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で特に活性を有する。
【００３７】
従って、本発明のエステルは、心筋梗塞の場合、先天的若しくは後天的に同定される肥大型若しくは拡張型心筋症の場合又は心筋収縮単位の崩壊に関連する全ての病態の場合の再構築型細胞治療用の極度に先進的な化合物であることが分かる。事実、かかる細胞は、静止状態であり、骨格筋細胞や皮下や幹細胞などのその他の細胞とは異なり、組織障害に反応して増殖する能力はない。
【００３８】
さらなる態様において、本発明は、心筋の損傷、急性又は先天的な心筋症、特に心筋梗塞の処置における治療及び予防に使用され得る薬物を調製するための、上述の本発明によるエステルの使用にも関する。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、特に齧歯類やヒト細胞などの哺乳動物由来の幹細胞における心臓発生を担当する遺伝子の活性化方法に関するとともに、心臓発生へと向かう分化された幹細胞の調製及び分離にも関する。この方法は、培地中で幹細胞をインキュベートするステップを有し、例えば、上述のエステルを好ましくは０．０１〜５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．５〜２．０ｍｇ／ｍＬで添加した、好ましくは血清存在下のＤＭＥＭなどの培地中でインキュベートするステップを有する。これに関連して、自発収縮活性を特徴とする細胞コロニー数で算出した心臓発生工程の生成率の増加は、未処理のコントロール細胞に対して少なくとも３倍以上となる（図５）。上述のエステルを用いた処理は、心筋細胞の選択のステップの後に、好ましくは「遺伝子トラッピング」により任意で行われ、これは、キメラ遺伝子が、ピューロマイシンとは異なり、例えばゲネチシンやＧ４１８などの化学療法剤に耐性を有する遺伝子の上流に「α−ミオシン重鎖」遺伝子プロモーターを有する。さらに、「遺伝子トラッピング」による選択に用いる上述のキメラ遺伝子は、例えばＧＴＲ１細胞のように幹細胞株のゲノムに安定的に一体化されてもよく、或いは、エレクトロポレーションなどにより幹細胞にトランジエントに導入されているのみでもよい（非特許文献２参照）。後者の場合、上述のキメラ構造物は、発現型の選択工程を制御するのに十分であるが、細胞ゲノムに一体化されないが、限定された時間に関して翻訳される核に存在することになる。「遺伝子トラッピング」戦略が上述の選択工程に関して安定な細胞株をもたらさないが、幹細胞において時間が限定された不変性とキメラ遺伝子の発現を所望する場合、ヒトでの心筋の損傷に対する可能性のある細胞治療の手法の観点から非常に興味がもたれる。本発明のエステルは、パスツールピペットなどを用いた自発収縮する心筋細胞コロニーの機械的な単離など、「遺伝子トラッピング」とは異なる選択手法と組み合わせても使用される。
【００４０】
上述の全体的な心臓発生工程の効率は、上述の選択の最終時点で、未処理コントロールで見出されるコロニー数に対する、自発収縮活性を有する心筋細胞コロニー数の増加百分率として好ましく測定される。
【００４１】
従って、本発明により分化し、好ましくはさらに選択された細胞は、未分化なものに比べて収縮し得る未成熟な心筋細胞からなる。従って、本発明の上述の記述に従って得た心筋細胞は、後天的な病態（梗塞後、虚血、弁の損傷に関連したもの等）により発生したり遺伝的な素因（肥大型又は拡張型心筋症）で同定された心筋梗塞や心不全を罹患した患者に対する細胞治療に有用である。
【００４２】
さらに、本発明は、本発明により分化し単離された細胞の、心臓発生の調節に関する薬物を選択するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのシステムの設定への使用にも及ぶ。なお、この調節には、ＧＡＴＡ好ましくはＧａｔａ−４、Ｎｋｘ−２．５、α−ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、プロダイノルフィン、ｄ−ＨＡＮＤ、ＭＥＦ及び心臓のイオンチャネル遺伝子などの遺伝子のうちの少なくとも１つに関する。
【００４３】
代替的に、本発明による分化方法は、心臓の発達、活性又は心筋細胞組織の修復工程を調節する薬学的に活性を有する分子の選択に用いてもよい。これらの試験において、幹細胞は、下述の細胞から好ましく選択される：つまり、非特許文献１０及び１１に記載のＰ１９細胞、Ｄ３細胞、Ｒ１細胞、ＧＴＲ１細胞、Ｈ１細胞、Ｈ７細胞、Ｈ９細胞、Ｈ９．１細胞及びＨ９．２細胞や、本技術分野で知られた方法に従って単離し得る幹細胞などである。
【００４４】
本発明のエステルは、幹細胞用の心臓発生剤であり、従って、自系又は異種の幹細胞で心筋細胞の損傷を修復するのには用い得ない。従って、本発明は、後天的な病態（梗塞後、虚血又は弁の損傷に関連したもの）により発生したり遺伝的な素因（肥大型又は拡張型心筋症）で同定された心筋梗塞や心不全における心臓組織の修復用の、自系又は異種の幹細胞におけるｅｘ  ｖｉｖｏでの心臓発生分化を誘導する方法を含む。この方法は、適切な培地において本発明によるエステルで自系又は異種の幹細胞の処理を含み、任意で、収縮性の心筋細胞の選択及びｉｎ  ｖｉｖｏへの移植を任意に有する。
【００４５】
従って、本発明は、後天的な病態（梗塞後、虚血又は弁の損傷に関連したもの）により発生したり遺伝的な素因（肥大型又は拡張型心筋症）で同定された心筋梗塞や心不全の治療的処置方法を含む。この方法は、好ましくは自系の幹細胞の単離、この細胞の上述のヒアルロン酸のレチノイン酸エステルでの処理及び任意で分化した心筋細胞のさらなる患者への移植用の分化した幹細胞の選択を含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで自発収縮性の未成熟な心筋細胞へと分化する細胞の生存率は、未分化細胞を用いた現行の前臨床試験で得られるものよりも高い。さらに、これらの胚の特性故、移植された心筋細胞は、成長活性をいまだ保持し、成熟細胞へとさらに分化する前にかなりの量の心筋細胞量へと臨床的に増加し、安定的な静止状態へと入り得る。
【００４６】
従って、本発明のエステルで得た結果は、非常に有用である。なぜなら、限定された数の組織特異的な転写因子を活性化し、且つ、心筋細胞構築物の細胞内及び細胞外の特性へと至る遺伝子発現の多重的な特性を統合する工程の効率を増加させるためである。この結果が示すのは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋細胞構造物の再産生へと至る心臓発生工程の全体的な効率を、少なくとも未処理細胞に対して２倍以上と増加させる点である。
【００４７】
心臓の分化に係る初期及び特定の事象の統合に対する本発明のエステルで得た効果により、上述のエステルの使用は、従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋細胞の調製にも拡張される。
【実施例】
【００４８】
（方法）
遺伝子発現の分析
Ｖｅｎｔｕｒａらの方法（非特許文献１３参照）により幹細胞から全ＲＮＡを抽出した。特定のｍＲＮＡのレベルを、前述のプロトコールに従った、対象の各転写物に特異的な［３２Ｐ］ＣＴＰｃＲＮＡプローブを用いた「ＲＮａｓｅプロテクション」により分析した（非特許文献１３参照）。簡単にいうと、Ｇａｔａ−４（２９２ｂｐ）、Ｎｋｘ−２．５（４１４ｂｐ）及びプロダイノルフィン（４２４ｂｐ）遺伝子の主エクソンに対応するフラグメントをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した。ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ又はＸｂａＩで線状化した上述のベクターの転写により、プロダイノルフィン、Ｇａｔａ−４又はＮｋｘ−２．５のセンス鎖ｍＲＮＡを産生した。ＢａｍＨＩで線状化したプラスミドの［３２Ｐ］ＣＴＰ存在下での転写物は、プロダイノルフィン及びＮｋｘ−２．５のアンチセンスｍＲＮＡ鎖を産生する一方、ＸｂａＩで線状化したベクターの転写物は、Ｇａｔａ−４のアンチセンスｍＲＮＡ鎖を産生した。幾つかの実験において、非特許文献３に記載のＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡの分析を実行した。
【００４９】
遺伝子転写検討
非特許文献１３及び１４に述べた「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核ランオフ転写」の手法で単離された核で、遺伝子転写率を分析した。簡単に述べると、５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣＩ（ｐＨ  ８．０）、５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、０．１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、４０％のグリセロール、０．１ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  のフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μｍｏｌ／Ｌのロイペプチン、及び１０  ｍｍｏｌ／Ｌのα−メルカプトエタノールを有する緩衝液に核を懸濁した。１００μＬの２倍反応緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ／ＨＣＩ（ｐＨ  ７．５）、５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、０．３ｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌのジチオスレイトール、並びに１ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、ＧＴＰ及びＣＴＰ）と、５μＬの［α−３２Ｐ］ＵＴＰ  （３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とを上述の核懸濁液（９０μＬ）に添加した。このサンプルを１５分間、室温でインキュベートした。ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅの存在下でＤＮＡを消化することにより、上述の反応を停止した。非特許文献１３に従って、核ＲＮＡを単離した。上述の通り産生させたＧａｔａ−４、Ｎｋｘ−２．５及びプロダイノルフィンの非標識アンチセンスｍＲＮＡの冷プローブ（放射活性なし）の存在下で、約５×１０６ｃｐｍの３２Ｐラベルした核ＲＮＡを、１２時間、５５℃でハイブリダイズさせた。その後、サンプルを、ＲＮａｓｅＡ及びＴ１の混合液でインキュベートし、プロテイナーゼＫで処理した。ハイブリッドフラグメントをフェノール／クロロホルム抽出で回収し、未変成ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。また、放射ラベルした核ＲＮＡは、ラットシクロフィリンクローンｐＩＢ１５の２７０ｂｐを有する、ＮｃｏＩで線状化したｐＢＳベクターから合成したシクロフィリンアンチセンスｍＲＮＡでハイブリダイズさせた。このシクロフィリンｍＲＮＡは、ｍＲＮＡコントロールとして用いた。
【００５０】
（例１．ヒアルロン酸のエステルで処理したＧＴＲ１幹細胞における心臓発生及び心臓特異的転写物の誘導）
ＧＴＲ１幹細胞を、この検討に用いた。この細胞は、齧歯類全能性Ｒ１細胞に由来する（非特許文献１２参照）。心臓特異的遺伝子のプロモーター（例えばα−ミオシン重鎖）は、特異的な化学療法剤に耐性を示し得る蛋白をコードする遺伝子を「駆動」する（非特許文献１３参照）。細胞は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）存在下で未分化状態に維持し得る。この物質は、最終濃度１０００Ｕ／ｍＬで存在させた。培地は、１５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有するＤＭＥＭである。分化誘導するため、ＬＩＦを除去する必要がある。従って、細菌培養用のペトリ皿で、１５％ＦＢＳを有するＤＭＥＭで、ＬＩＦ無しで細胞を培養した。２日後、得た未成熟体（ＥＢｓ）を、細胞接着し得るディッシュ（組織培養用ディッシュ）に移した。３〜５日後、培養中の細胞の一部が心臓発生に関与することを示す最初の細胞収縮が発現した時点で、２μｇ／ｍＬの最終濃度でピューロマイシンを添加する。ネーティブなプロモーターの活性化に加えて、心臓発生に向かう細胞は、上述のキメラ遺伝子のプロモーターを活性化し、これにより、残りの「非心筋細胞」とこれらを分離し得るようになる。その理由は、これらは、上述の化学療法剤に対して耐性を有するようになるためである。このようにして、先進的な「遺伝子トラッピング」手法により、心臓発生の工程を行う細胞のみを選択し得るようになる。
【００５１】
ＬＩＦの除去後ピューロマイシンの選択中、ＧＴＲ１細胞は、上述の種々のヒアルロン酸のレチノイン酸エステルに曝露される。心臓発生工程の種々のステップで収集されたＥＢｓ及びピューロマイシンで選択した心筋細胞は、心臓発生の誘導又は心筋細胞の発現型に対して確立された関与に関連した特定の遺伝子発現プロファイルの分析について、処理される。最終的に、心臓の分化工程の生成率の指標として、収縮性コロニーの数を定量した。
【００５２】
図１は、ＬＩＦ除去後、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルの存在及び不存在下で処理したＧＴＲ１細胞におけるいくつかの心臓発生誘導性遺伝子の発現に係る、「ＲＮａｓｅプロテクション」で実行される定量分析の結果を示す。ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルは、ＬＩＦ除去後５日に収集した未成熟体及びピューロマイシンで選択した心筋細胞において、Ｇａｔａ−４及びＮｋｘ−２．５ｍＲＮＡレベルを顕著に増加誘導し得ることが分かった。これらの転写物の第一は、「ジンクフィンガー」ファミリーの転写因子をコードする一方、第２は、「ホメオドメイン」蛋白の発現に関連する。両方の転写因子は、ヒトを含む種々の動物種において未成熟な心臓の分化に重要な役割を演じる（非特許文献１５乃至１７参照）。さらに、これらの遺伝子の変異は、新生児の生存とは関連しないが心臓の発生において重篤な異常に関連することが見出されてきている（非特許文献１６及び１７参照）。図１は、本発明に係る上述の物質がプロダイノルフィン遺伝子の発現を顕著に増加させることを示す図である。なお、この遺伝子に係るペプチド産物は、幹細胞においてＧａｔａ−４及びＮｋｘ−２．５の発現を惹起及び統合する（非特許文献３参照）。他のＨＲＥｓ（ＨＲＥ−１５及びＨＲＥ−１６）でも、同様の結果を得た。さらに、試験した全てのＨＲＥｓは、心臓に特異的な転写産物である「α−ミオシン重鎖」（ＭＨＣ）及び「ミオシン軽鎖」（ＭＬＣ）をコードする転写物の発現を顕著に増加させた（図２参照）。
【００５３】
ＧＴＲ１細胞をヒアルロン酸（０．７５ｍｇ／ｍＬ）で処理しても、Ｇａｔａ−４及びＮｋｘ−２．５の遺伝子発現に有意な変化は検出されなかった。
【００５４】
（例２．幹細胞における心臓特異的な遺伝子の転写率の測定）
ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルで処理した細胞から単離した核を用いた「核ランオフ」実験で示されるのは、Ｇａｔａ−４及びＮｋｘ−２．５遺伝子発現（図３）及びプロダイノルフィン遺伝子発現（図４）が転写率を効果的に増加させるのに貢献している点である。これらの結果は、ｍＲＮＡの安定性のレベルにおいて上述の物質の単なる効果を排除する。心臓発生及び心臓特異的な遺伝子に発現に及ぼすヒアルロン酸のレチノイン酸エステルにより得られる効果は、プロテインキナーザＣ（ＰＫＣ）の特異的な阻害剤であるチェレリスリンを培地に存在させることにより、中和される（図２乃至４）。この結果は、上述の試験した物質により得られる心臓発生の効果においてＰＫＣ依存性シグナル伝達経路が関与することを示唆する。
【００５５】
（例３．全体的な心臓発生工程の比較分析）
図５は、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルの存在及び不存在で培養したＧＴＲ１細胞における心臓発生工程の生成率の比較分析である：細胞を、全体で１０日間、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステル不存在下（白丸）又は存在下（黒丸；０．７５ｍｇ／ｍＬ）で培養した。未成熟な心筋細胞の発現型の指標として、自発収縮活性を特徴とする心筋細胞コロニーの数を検討した。
【００５６】
ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルは、達成された心臓発生の発現型のマーカーである自発収縮活性に寄与する心筋細胞コロニー数を顕著に増加させ得ることが分かった。
【００５７】
（例４．レチノイン酸のエステルの混合物を用いた全能性幹細胞の処理）
異なるシリーズの実験において、ＧＴＲ１細胞を、ヒアルロン酸及びブチル酸のレチノイン酸エステルの混合物（０．７５ｍｇ／ｍＬ）で曝露した。８日後、未処理のコントロールのプレートのみならず、個々にレチノイン酸−ヒアルロン酸エステルで亜寄りしたプレートに関しても、上述の物質の処理の結果、自発収縮するコロニーが有意に増加することが観察され得る（図５）。これらの効果は、Ｇａｔａ−４及びＮｋｘ−２．５遺伝子の誘導とプロダイノルフィン遺伝子の発現増加とを有する心臓発生の遺伝子プログラムの活性化により達成された。
【００５８】
結論づけると、上述のとおり得た結果は、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステル、並びに、ヒアルロン酸及びブチル酸のレチノイン酸のエステル混合物は、全能性の未成熟な幹細胞において心臓発生工程を誘導及び統合し得る強力な形態形成剤として機能することを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】未成熟幹細胞において心臓発生分化を誘導する遺伝子の発現に及ぼすＨＲＥの影響を示す。ＬＩＦ除去後、１０日間、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステル（０．７５ｍｇ／ｍＬ）の存在（＋）又は不存在（−）下で細胞を処理した。ＥＢｓは、ＬＩＦ（白血病抑制因子）除去後５日の未成熟体を示し、Ｐは、ＬＩＦ除去後１０日のピューロマイシンで選択した心筋細胞を示し、Ａ、Ｂ及びＣは、Ｇａｔａ−４、Ｎｋｘ−２．５及びプロダイノルフィンｍＲＮＡのＲＮａｓｅプロテクションアッセイを示す。左部は、各転写物の相対発現を示すオートラジオグラフであり、右部は、各ｍＲＮＡレベルの定量分析結果を示す。なお、＊は、未処理細胞に対して有意差があることを示す。
【図２】幹細胞における心臓特異的遺伝子発現に及ぼすＨＲＥの影響である。ＬＩＦ除去後、１０日間、ＨＲＥ−１８（０．７５ｍｇ／ｍＬ）の存在（＋）又は不存在（−）下で細胞を処理した。図は、「α−ミオシン重鎖」（ＭＨＣ）及び「ミオシン軽鎖−２Ｖ」（ＭＬＣ）の発現に及ぼすヒアルロン酸のレチノイン酸エステル（０．７５ｍｇ／ｍＬ）の効果をＲＴ−ＰＣＲで相対的に検出したエチジウムブロマイド染色像を示す。この効果は、ＬＩＦ除去後、１０日の未成熟体（ＥＢｓ）及びＬＩＦ除去後１０日のピューロマイシンで選択した心筋細胞（Ｐ）で検出された。実験グループにおいて、幹細胞は、ＰＫＣの特異的阻害剤である１μＭのチェレリスリン（ｃｈｅｌｅｒｉｔｈｒｉｎｅ；Ｃｈｅｌ）の存在下、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルで１０日間幹細胞を処理した。これらのサンプルにおいて、ＬＩＦ除去後、１０日でのピューロマイシンで選択した心筋細胞での遺伝子発現の分析を行った。
【図３】Ｇａｔａ−４及びＮｋｘ−２．５遺伝子の転写率に及ぼすＨＲＥの影響である。Ａ及びＢは、それぞれ、Ｇａｔａ−４及びＮｋｘ−２．５に関する相対的な「核ランオフ転写分析」に係るオートラジオグラフである。ＬＩＦ除去後、１０日間、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステル（０．７５ｍｇ／ｍＬ）存在（＋）又は不存在（−）下で処理した。ＥＢｓは、ＬＩＦ除去後５日の未成熟体を示し、Ｐは、ＬＩＦ除去後１０日のピューロマイシンで選択した心筋細胞を示す。実験グループにおいて、幹細胞は、ＰＫＣの特異的阻害剤である１μＭのチェレリスリンの存在下、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルで１０日間幹細胞を処理した。ＬＩＦ除去後、１０日のピューロマイシンで選択した心筋細胞から単離した核において転写分析を行った。ａは、Ｇａｔａ−４又はＮｋｘ−２．５の転写率を示し、ｂは、コントロールとして用いたシクロフィリン遺伝子の転写率を示す。
【図４】プロダイノルフィンの転写率に及ぼすＨＲＥの影響である。Ａ及びＢは、それぞれ、Ｇａｔａ−４及びＮｋｘ−２．５に関する相対的な「核ランオフ転写分析」に係るオートラジオグラフである。ＬＩＦ除去後、１０日間、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステル（０．７５ｍｇ／ｍＬ）存在（＋）又は不存在（−）下で処理した。ＥＢｓは、ＬＩＦ除去後５日の未成熟体を示し、Ｐは、ＬＩＦ除去後１０日のピューロマイシンで選択した心筋細胞を示す。実験グループにおいて、幹細胞は、ＰＫＣの特異的阻害剤である１μＭのチェレリスリンの存在下、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルで１０日間幹細胞を処理した。ＬＩＦ除去後、１０日のピューロマイシンで選択した心筋細胞から単離した核において転写分析を行った。ａは、プロダイノルフィン遺伝子の転写率を示し、ｂは、コントロールとして用いたシクロフィリン遺伝子の転写率を示す。
【図５】幹細胞における心臓発生工程の収率に及ぼすＨＲＥの影響である。ＬＩＦ除去後（０日）、１０日間、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルの存在（●）若しくは不存在（○）下、又はヒアルロン酸及びブチル酸の混合レチノイン酸エステル存在（◆）下、ＧＴＲ１細胞を培養した。自発収縮活性を特徴とする心筋コロニーの数を、未成熟心筋の表現型の特異的な指標として考慮した。＊は、（○）に対して有意差があることを示し、＄は、（●）に対して有意差があることを示す。
【図１】
2006515521.tif 000002
【図２】
2006515521.tif 000003
【図３】
2006515521.tif 000004
【図４】
2006515521.tif 000005
【図５】
2006515521.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月10日(2004.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞後分化剤としての、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルの使用。
【請求項２】
前記のエステルは、レチノイン酸による置換率が０．００００１乃至０．５であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記のレチノイン酸による置換率は、０．００２乃至０．１であることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記エステルは、ブチル酸及びレチノイン酸と、ヒアルロン酸とのエステルの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記のエステルの混合物は：
ブチル酸による置換率が０．０５乃至１．０であり；
レチノイン酸による置換率が０．００２乃至０．１であり；且つ
ブチル酸及びレチノイン酸による置換率の比率（ＤＳ  ＲＡ／ＤＳ  ＢＡ）が、少なくとも６である；
ことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記の幹細胞は、哺乳類由来であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記哺乳類は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、霊長類、高等霊長類、齧歯類、ブタ及びウシから選択されることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記の幹細胞は、胚又は体細胞由来であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
幹細胞における心臓発生に関する後分化活性を有する薬剤の調製のための、レチノイン酸のヒアルロン酸エステルの使用。
【請求項１０】
心臓発生に関する後分化活性を有する薬剤の調製のための、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
心筋細胞の損傷及び心筋症の、処置及び予防用の薬物の調製のための、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記の心筋細胞の損傷は、心筋梗塞であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
幹細胞をヒアルロン酸のレチノイン酸エステルでインキュベートするステップを本質的に有する心筋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調製方法であって、
任意で、心筋細胞を有する収縮単位を選択するステップを有することを特徴とする前記方法。
【請求項１４】
前記のレチノイン酸エステルは、レチノイン酸によるヒアルロン酸の置換率が、０．００００１乃至０．５であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記のレチノイン酸エステルは、ブチル酸及びレチノイン酸と、ヒアルロン酸とのエステルの混合物であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記のエステルの混合物は：
ブチル酸による置換率が０．０５乃至１．０であり；
レチノイン酸による置換率が０．００２乃至０．１であり；且つ
ブチル酸及びレチノイン酸による置換率の比率（ＤＳ  ＲＡ／ＤＳ  ＢＡ）が、少なくとも６である；
ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記の幹細胞は、自系又は異種であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記の選択するステップは、「遺伝子トラッピング」で実行されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の幹細胞は、Ｐ１９、Ｄ３、Ｒ１及びＧＴＲ１細胞から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
心臓発生に関連する調節活性を有する新規の分子を選択する、請求項１３乃至１９のいずれか一項に記載の方法を有する方法であって、選択した前記分子を最適化するステップを任意で有することを特徴とする前記方法。
【請求項２１】
幹細胞の心臓発生分化用のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞モデルの調製方法であって、
前記幹細胞を、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルを単独で、又は他の物質と組み合わせて、適切な培地中でインキュベートするステップを本質的に有することを特徴とする前記方法。
【請求項２２】
前記のレチノイン酸エステルは、レチノイン酸によるヒアルロン酸の置換率が０．００００１乃至０．５であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記のレチノイン酸エステルは、ブチル酸及びレチノイン酸と、ヒアルロン酸とのエステルの混合物であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記のエステルの混合物は：
ブチル酸による置換率が０．０５乃至１．０であり；
レチノイン酸による置換率が０．００２乃至０．１であり、且つ
ブチル酸及びレチノイン酸による置換率の比率（ＤＳ  ＲＡ／ＤＳ  ＢＡ）が、少なくとも６であることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記の幹細胞は、Ｐ１９、Ｄ３、Ｒ１、ＧＴＲ１、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ９．１及びＨ９．２細胞から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記のインキュベートするステップは、心筋細胞において分化した細胞を有する収縮単位を選択するステップの後に行うことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
処置が必要な患者において心不全を処置する治療方法であって、異種又は自系の幹細胞を、ヒアルロン酸のレチノイン酸エステルで「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」又は「ｅｘ  ｖｉｖｏ」において処置することを特徴とする前記治療方法。
【請求項２８】
前記のレチノイン酸によるヒアルロン酸の置換率は、０．００００１乃至０．５であることを特徴とする請求項２７に記載の治療方法。
【国際調査報告】
2006515521.tif 000007
2006515521.tif 000008
2006515521.tif 000009
2006515521.tif 000010