(57)【要約】免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法が記載される。前記免疫応答能のあるヒト細胞を、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導することができる条件下で、少なくとも一つの試験化合物の存在下においてインキュベートし、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制が決定される。また、このような方法を使用するためのキット、並びにリガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断することができる免疫調節剤が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法であって、
前記免疫応答能のあるヒト細胞を、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導することができる条件下で、少なくとも一つの試験化合物の存在下においてインキュベートすることと、
リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定することと、
によって特徴づけられる方法。
【請求項２】
前記免疫応答性のある細胞が白血球である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記白血球がリンパ球である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記リンパ球がＴ細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞がＪｕｒｋａｔ細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記白血球が抗原提示細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原提示細胞がＢ細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、前記条件は、少なくとも１つのヒト・リガンドをコードするＤＮＡがトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞と共に免疫応答性のある細胞を培養することを含む方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記ＣＨＯ細胞は、ＩＣＡＭ、ＣＤ５４（ＬＦＡ３）、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）を含む群より選択される少なくとも一つのヒト・リガンドまたは受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクションされる方法。
【請求項１０】
前記試験化合物が低分子量化合物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験化合物が約５００までの分子量を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、前記抑制の決定は、細胞をフローサイトメトリー解析またはコンフォーカル顕微鏡解析することによってなされる方法。
【請求項１３】
高内容物スクリーニング（ＨＣＳ）または培地スループット・スクリーニング（ＭＴＳ）のために自動化された、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記経路がＣＤ４０／ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ２／ＬＦＡ３；ＣＤ２８／ＣＤ８０、ＣＤ８６；およびＣＤ１１／ＩＣＡＭを含む受容体−リガンド対の群より選択される方法。
【請求項１５】
免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングするキットであって、
免疫応答能のあるヒト細胞を培養するための手段；
共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導するための手段；
少なくとも一つの試験化合物と共に免疫応答能のあるヒト細胞をインキュベートするための手段；
受容体をマーキングするための手段；および
リガンドで誘導されるの共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定するための手段；
を含むキット。
【請求項１６】
受容体をマーキングするために同位元素または蛍光性タンパク質との複合物を使用する、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定するためにフローサイトメトリー解析またはコンフォーカル顕微鏡解析を使用する、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
リガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断することによりリガンドで誘導される受容体インターナリゼーションを阻止することができる免疫調節剤。
【請求項１９】
低分子量化合物である、請求項１８に記載の免疫調節剤。
【請求項２０】
約５００までの分子量を有する化合物である、請求項１８または１９に記載の免疫調節剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法、前記化合物のスクリーニングに使用するためのキットおよびリガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断し、従ってリガンドで誘導される受容体インターナリゼーション（ＬＩＲＩ）を阻止することができる免疫調節剤に関する。
【０００２】
【発明の背景】
成熟したＴリンパ球の活性化は、抗原認識および二次性シグナルを必要とし、ひとまとめにして共刺激と呼ばれる（１）。現在、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のみを介した抗原認識は、Ｔ細胞を活性化することができず、むしろアネルギーとして知られる不応答性状態を誘導すると考えられている。Ｔ細胞活性化を最適化するためには、共刺激経路の関与が必要である。静止Ｔ細胞に発現した最も特徴づけられた共刺激性受容体は、ＣＤ２８である。そのリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６とＣＤ２８との相互作用は、ＴＣＲ結合を介して開始されるＴ細胞反応を増強して維持することにおいて重大な役割を演ずる（２）。また、ＣＤ２／ＬＦＡ３、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ経路を介した共刺激が実証されている（３）。近年、４−１ＢＢおよびＩＣＯＳは、共刺激分子として機能していることが発見された（４）。
【０００３】
受容体のインターナリゼーションは、長く生物学者を魅了させていた（５）。基本的な機構は完全に解明されていないが、相当な知識が集積されている。特異的ｍＡｂｓと結合した後の共刺激性受容体のインターナリゼーションが注目されている。近年、天然のリガンドで誘導される受容体のインターナリゼーションは、ＣＤ２８／Ｂ７、ＣＤ４０／ＣＤ１５４経路について報告されている（６）。
【０００４】
共刺激シグナルは、Ｔ細胞活性化に対するＴ細胞による、またはアネルギーによる抗原認識の決定において中心的であるので、自己免疫反応の発生における共刺激の役割は明白である。共刺激シグナルは、これらがサイトカイン産生および細胞崩壊など、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター細胞の機能を増強するので、ＴＣＲ結合の結果を決定する二次シグナルを与える。静止している組織抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）に対する共刺激性因子の不存在下では、自己抗原に対するＴ細胞寛容性を誘導し、維持させることができ、そのＡＰＣｓの共刺激物質の異所性の発現は、自己反応性Ｔ細胞を刺激して、自己免疫を生じさせ得ることが示唆されている。実際に、共刺激の遮断により、いくつかの動物の疾患モデルにおける自己免疫反応が改善されることが示されている。また、共刺激分子の遺伝子が遺伝的に削除された「ノックアウトマウス」による証拠は、自己免疫疾患を発生しないか、または少し発生しただけであることを示している。
【０００５】
ヒトにおける炎症および自己免疫疾患に共刺激が関与しているため、共刺激経路を遮断することによって異常な反応を改善しようとする多数の研究が行われてきた。無損傷かまたは遺伝的に操作された、受容体もしくはリガンドのいずれかに対するモノクロナール抗体、受容体に結合する免疫グロブリンあついは可溶性リガンドなどの種々の大きな生体分子は、インビトロにおける共刺激の阻害に対して有効であることが示されており、インビボにおける研究から有望な結果も得られている（１）。
【０００６】
共刺激性受容体とそのリガンドとの間の結合を特異的に阻害することに焦点を合わせ、共刺激をダウンモジュレートすることができる小分子化合物を同定する努力が最近なされた。このような化合物を同定するために、単離した標的または細胞表面受容体の複雑な分子集合体を介した相互作用によって特徴づけられる細胞の相互作用に基づく方法が使用された。
【０００７】
以前に知られている方法では、構成は、典型的にはせいぜい部分的に細胞に基づくだけである。シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）において、たとえば受容体またはこれが存在する膜は、トレーサーを含むビーズに固定されるか、または捕らえられ、適切なリガンドは、放射標識を使って識別される。受容体がトレーサーに結合した場合、ビーズがシンチラントを刺激して光を放射するのためには十分に近くまでラジオアイソトープを連れていく。逆に、受容体結合部位においてラベルのないリガンドまたは競合する薬剤がトレーサーと置き換わる場合、より少ない放射活性がビーズに結合し、その結果としてより少ない光が放射される。したがって、平衡状態では、受容体に対して放射性トレーサーと競合することができる分子の存在を検出することもできるであろう。
【０００８】
しかし、これらの従来技術は、試験される化合物のインビボにおける効率および分子相互作用を予測することができないという不利益を有する。さらに、これらは、発現およびタンパク質精製の工程を必要とするので、これらは時間がかかる。通常、該方法は、試験される化合物と長時間共インキュベーションすることを含み、試験化合物における毒性結果をその望ましい効果と区別することは困難であるので、結果として大きな背景「ノイズ」を引き起こす可能性がある。
【０００９】
略号リスト
本文の残りの全体にわたって、以下の略記号を使用する：
ＡＣＡＳ  活性化された細胞の解析および分類
ＣＨＯ  チャイニーズハムスター卵巣
ＣＤ  分化のクラスター
ＦＣＳ  ウシ胎仔血清
ＦＡＣＳ  蛍光発色セルソーター
ＦＴＩＣ  フルオレセインイソチオシアネート
ＨＬＡ  ヒト白血球抗原
ＩＣＡＭ  細胞間接着分子
ＩＣＯＳ  誘導性の共刺激性因子
ＬＦＡ  白血球機能抗原
ＬＩＲＩ  リガンドで誘導されるの受容体インターナリゼーション
ＰＢＭＣ  末しょう血液単核細胞
ＰＦＡ  パラホルムアルデヒド
ＰＥ  フィコエリトリン
ＳＥＡ  ブドウ状球菌エンテロトキシンＡ
ＳＰＡ  シンチレーション近接アッセイ
【００１０】
【発明の要旨】
本発明は、第一の側面において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングする方法に関する。前記免疫応答性のある細胞を、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導することができる条件下で、少なくとも一つの試験化合物の存在下においてインキュベートし、次いでリガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定する。
【００１１】
一つの態様において、本方法における免疫応答性のある細胞は、白血球である。さらなる態様において、前記白血球はリンパ球である。さらにもう一つの態様において、前記リンパ球は、Ｔ細胞である。さらにもう一つの態様において、前記Ｔ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ細胞である。
【００１２】
もう一つの態様において、前記白血球は、抗原提示細胞である。さらにもう一つの態様において、前記抗原提示細胞は、Ｂ細胞である。
【００１３】
さらなる態様において、前記本方法の条件は、少なくとも１つのヒトリガンドをコードするＤＮＡがトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞と共に、免疫応答性のある細胞を培養することを含む。さらなる態様において、前記ＣＨＯ細胞は、ＩＣＡＭ、ＣＤ５４（ＬＦＡ３）、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）を含む群より選択される少なくとも一つのヒトリガンドまたは受容体をコードするＤＮＡがトランスフェクションされる。
【００１４】
本方法のもう一つの態様において、前記試験化合物は、低分子量化合物であり、これは、好ましくは約５００までの分子量を有する。
【００１５】
本方法のさらに別の態様において、抑制の決定は、細胞のフローサイトメトリまたはコンフォーカル顕微鏡観察によってなされる。
【００１６】
本方法は、有利には高内容物スクリーニング（ＨＣＳ）または培地スループットスクリーニング（ＭＴＳ）のために自動化される。
【００１７】
本方法のもう一つの態様において、前記経路がＣＤ４０／ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）；ＣＤ２／ＬＦＡ３；ＣＤ２８／ＣＤ８０、ＣＤ８６；およびＣＤ１１／ＩＣＡＭを含む受容体−リガンド対の群より選択される。
【００１８】
もう一つの側面において、本発明は、免疫応答能のあるヒト細胞において、リガンドで誘導された共刺激性受容体インターナリゼーション経路を抑制する機能がある化合物をスクリーニングするキットであって、免疫応答能のあるヒト細胞を培養するための手段、共刺激性受容体インターナリゼーションを誘導するための手段、少なくとも一つの試験化合物と共に免疫応答能のあるヒト細胞をインキュベートするための手段、受容体をマーキングするための手段、およびリガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定するための手段を含むキットに関する。
【００１９】
前記キットの一態様において、受容体をマーキングするために、同位元素または蛍光性タンパク質との複合物を使用する。
【００２０】
前記キットのもう一つの態様において、リガンドで誘導される共刺激性受容体インターナリゼーションの抑制を決定することのためにフローサイトメトリー解析またはコンフォーカル顕微鏡解析を使用する。
【００２１】
さらにもう一つの側面において、本発明は、リガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを遮断することにより、リガンドで誘導される受容体インターナリゼーションを阻止することができる免疫調節剤に関する。
【００２２】
一つの態様において、免疫調節性薬剤は、低分子量化合物である。さらなる態様において、化合物は約５００までの分子量を有する。
【００２３】
【発明の詳細な記載】
共刺激は、ヒトＴおよびＢリンパ球活性化の両者において重大な役割を演ずる。共刺激性経路の遮断は、たとえば異常なＴ細胞およびＢ細胞の活性化によって特徴づけられる自己免疫性疾患を改善するであろう。
【００２４】
リガンドと受容体との間の相互作用により、受容体のインターナリゼーションを必然的に生じることが確認されるという観察が、特異的且つ高感受性の方法でなされた。競合的結合剤、たとえば受容体またはリガンドに対するモノクロナール抗体の添加により、リガンドで誘導される受容体インターナリゼーション（ＬＩＲＩ）が遮断された。
【００２５】
本発明は、ヒトリンパ球における共刺激性受容体のアンタゴニストを発見するための新規スクリーニング方法を含む。本方法は、たとえばフローサイトメトリー解析に基づいており、このアッセイにより、多数の化合物がスクリーニングされるであろう。たとえば、この方法により、低分子量化合物の分子量３２１．３９のプテリジン誘導体である物質Ｌが、リガンドで誘導される受容体のダウンモジュレーションを特異的に遮断することが見出された。
【００２６】
このアッセイによって見出された化合物は、ＬＩＲＩを特異的に抑制し、免疫調節剤のための候補物質とみなされる。
【００２７】
現在、物質Ｌによって例証される小分子量化合物が、特異的にＬＩＲＩを抑制することが示されている。これは、小分子量化合物が、天然のリガンドで誘導される膜結合受容体インターナリゼーションを遮断することができるという最初の観測である。これは、該試験化合物をスクリーニングするための方法の有用性を示している。
【００２８】
本発明に従った方法は、通常の化合物をスクリーニングする方法である単離された標的または細胞の標品の代わりに、無処理の生細胞を使用する。本発明の方法を使用することにより、細胞表面受容体の複雑な分子集合体を介した相互作用によって特徴づけられる細胞−細胞相互作用の複雑度を考慮することができる。試験した化合物の有効性は、生物学的挙動および機能を測定することによって予測することができる。
【００２９】
さらに、該分子の相互作用は、細胞の天然環境内で評価することができ、毒性および非特異的作用を同定することができ、且つ選択的な細胞タイプに対する薬剤の効果を識別することができる。全体細胞アッセイにより、他の方法で必要とされるタンパク質の精製および発現の工程が不要となる。
【００３０】
本発明に従った方法において共インキュベーション時間が短いことは、化合物の試験において起こりうる毒性の影響を減軽するが、他の方法では、結果に背景の「ノイズ」を引き起こす可能性がある。
【００３１】
【実験的部分】
材料及び方法
細胞
ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ白血病細胞株を、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ １６４０中で培養した。ＪｕｒｋａｔのサブラインであるＣＤ４０Ｌ＋Ｊｕｒｋａｔ（＞９５％陽性である）およびＣＤ４０Ｌ−Ｊｕｒｋａｔ（＞９９％陰性である）を、ＦＡＣＳソーティングによって確立し、同じ条件下で培養した。
【００３２】
ヒトＳＥＡ維持Ｔ細胞株は、ヒトＰＢＭＣをＳＥＡ（５ｎＭ）で刺激して、ＳＥＡを補った培地を５日ごとに交換することによって確立した。
【００３３】
Ｒａｍｏｓ ２Ｇ６ ４Ｃ１０（ヒトＢ細胞株）は、１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ １６４０において培養した。
【００３４】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）をコードするｃＤＮＡをトランスフェクションして、細胞株を選択培地中で維持した。本研究において使用した形質転換体細胞株は、以下の通りである：ＣＨＯ−ＤＲ４、ＣＨＯ−ＣＤ２８、ＣＨＯ−ＬＦＡ３、ＣＨＯ−ＣＤ４０、ＣＨＯ−ＣＤ４０Ｌ、ＣＨＯ−ＩＣＡＭ１、ＣＨＯ−ＤＲ４−ＣＤ８０−ＬＦＡ３。
【００３５】
試薬
以下のモノクロナール抗体（ｍＡｂｓ）を使用した：αＣＤ２−ＦＩＴＣ（３００５４Ｘ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、αＣＤ３−ＦＩＴＣ（３０１４０Ｘ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、αＣＤｌｌａ−ＰＥ（３０４２５Ｘ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、αＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、αＣＤ２８−ＦＩＴＣ（３３７４４Ｘ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、αＣＤ２８−ＰＥ（３４８０４７、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｉｎｓｏｎ）、αＣＤ４０Ｌ（３３５８５Ｘ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、αＣＤ４０−ＦＩＴＣ（２２０７４Ｘ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、αＣＤ８０−ＰＥ（３４０２９４、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｉｎｓｏｎ）、αＣＤ８６−ＰＥ（３３４３５Ｘ、Ｐｈａｒ Ｍｉｎｇｅｎ）、αＬＦＡ３−ＦＩＴＣ（ＡＨＳ５８０８、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）、αＩＣＡＭ−ＰＥ（３１６２５Ｘ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、αＨＬＡ−ＤＲ ＰＥ（３４７３６７Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｉｎｓｏｎ）、ヤギ−αｍＩｇＧｌ−ＦＩＴＣ（Ｍ３２１０１、ＣＡＬＴＡＧ）およびウサギ−αｍＩｇ−ＦＩＴＣ（Ｆ０２６１、ＤＡＫＯ）。
【００３６】
分子量３２１．３９のプテリジン誘導体である物質Ｌは、合成した。
【００３７】
細胞培養
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ｌｘｌＯ６／ｍｌ）は、ＣＨＯ形質転換体（２ｘｌＯ５／ｍｌ）と共に、１２×７５ｍｍの培養試験管（ファルコン２０５２）内で３７℃および５％ＣＯ２雰囲気において種々の時間培養した。ＬＩＲＩ、ＣＨＯ形質転換体またはＪｕｒｋａｔ細胞に対するモノクロナール抗体または物質の効果を観察するために、対応するｍＡｂｓまたは物質と共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＪｕｒｋａｔ細胞またはＣＨＯ形質転換体と共に培養した。
【００３８】
フロー・サイトメーター・アッセイおよびソートを伴う接着細胞解析（ＡＣＡＳ）アッセイ。
【００３９】
培養後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄し、０．５×１０６／５０μｌの細胞密度で蛍光結合抗体により４℃で３０分間染色した。細胞を二回洗浄してＰＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳにかける前は、細胞を４℃で保持した。細胞サンプルをＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｉｎｓｏｎ）にかけて、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｉｎｓｏｎ）で解析した。また、細胞サンプルの一部を双方向レーザ血球計算器（ＡＣＡＳ ５７０、Ａｍｅｒｉｄｉａｎ）で解析した。
【００４０】
実施例１
ＣＤ８０およびＣＤ８６で誘導されるＣＤ２８のダウンモジュレーション。
【００４１】
ヒトＴ細胞は、細胞表面にＣＤ２８受容体を発現しており、リガンド（ＣＤ８０またはＣＤ８６）と受容体の結合は、Ｔ細胞活性化のための重要な共刺激シグナルを構成する。ヒトＴ細胞株のＪｕｒｋａｔ細胞およびリガンドをトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、受容体の運命を観察するために利用した。３０分間共インキュベーションした後、細胞を洗浄して、ＰＥ結合αＣＤ２８ ｍＡｂで染色した。ＦＡＣＳ解析の結果は、ＣＤ８０がＣＤ２８ダウンモジュレーションを強力に誘導し、ＣＤ８６は、より低い能力を有することを示す。対照細胞株ＣＨＯ−ＤＲは、受容体発現を妨げない（図１）。
【００４２】
ＣＤ２８のダウンモジュレーションは、インキュベーション系におけるリガンド数と相関があるかどうか調査するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（０．５ｘｌ０６／ｍｌ）を、Ｊｕｒｋａｔ細胞対ＣＨＯ／ＣＤ８０の比が２．５−１０：１であるような種々の数のＣＨＯ／ＣＤ８０細胞と共に３０分間インキュベートした。結果は、細胞表面にＣＤ８０リガンドが多く、ＣＤ２８受容体が少ないことを明らかに示している（図２Ａ）。対照細胞株（ＣＨＯ／ＤＲ）では、細胞数が多い場合でさえＣＤ２８発現をダウンモジュレートすることはない。もう一つの実験セットでは、ＣＤ８０がＣＤ２８ダウンモジュレーションをすみやかに誘導することを示している。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＣＨＯ／ＣＤ８０と５：１の比で種々の時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収してＦＡＣＳで解析した。共インキュベーションから３０分後では、表面ＣＤ２８受容体の約７０％がインターナリゼーションされた。２つのタイプの細胞を混合して直ちに遠心分離して染色したとき（「０」時間）でさえ、受容体の約１５％はすでにインターナリゼーションされた（図２Ｂ）。知っている限り、これは、ＣＤ２８が天然のリガンドであるＣＤ８０と結合することによってすみやかにインターナリゼーションすることを示した最初である。
【００４３】
実施例２
ＬＦＡ３（ＣＤ５８）で誘導されるＣＤ２のダウンモジュレーション。
【００４４】
Ｔ細胞上のＣＤ２とＡＰＣ細胞上のＬＦＡ３との間の相互作用は、Ｔ−ＡＰＣ細胞において細胞接着およびＴ細胞共刺激に重要な役割を演ずる。この実験において、我々は、ＬＦＡ３が受容体レベルでＣＤ２発現をダウンモジュレートすることを示した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を種々のヒト分子をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞と共に３０分間共インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収してαＣＤ２−ＰＥで染色し、ＣＤ２の発現をＦＡＣＳで解析した。ＣＨＯ形質転換体は、ＬＦＡ３をトランスフェクションした場合にのみ、ＣＤ２ダウンモジュレーションを誘導した（図３）。ＣＨＯ細胞にトランスフェクションしたその他のヒト分子は、ＣＤ２発現を妨害しなかった。ＣＨＯ／ＬＦＡ３形質転換体は、ＣＤ２８またはその他のＴ細胞受容体の発現を妨害しなかった。ＬＦＡ３は、通常、ＣＤ８０がＣＤ２８発現に対して誘導するよりも劇的にＣＤ２のダウンモジュレーションを誘導する。我々は文献を検索したが、これは、ＣＤ２の天然のリガンドであるＬＦＡ３によって誘導されるＣＤ２インターナリゼーションについての最初の観測である。
【００４５】
実施例３
ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌで誘導される互いにダウンモジュレーションを誘導する。
【００４６】
ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０経路は、ＴおよびＢ細胞の両者の活性化のためのもう１つの共刺激経路を誘導し、ヒト自己免疫性疾患に関与している。ヒトＢ細胞株のＲａｍｏｓ ２Ｇ６ ４Ｃ１０細胞をＣＨＯ／ＣＤ４０Ｌまたはコントロール形質転換体と共に２時間インキュベートし、次いでＣＤ４０の発現をＦＡＣＳで解析した。インキュベーション後、その他の接着分子、たとえばＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＦＡ３、ＩＣＡＭ−１の向上された表面発現と共に、ＣＤ４０のダウンモジュレーションを観察した。（図４Ａ）。
【００４７】
一方、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ４０Ｌの発現は、ＣＨＯ／ＣＤ４０と種々の時間インキュベーションした後に非常に減少していた。インキュベーション後、ＣＤ４０Ｌの発現をＦＡＣＳで解析した。図４Ｂの結果は、１時間共インキュベーションした後、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ４０Ｌの発現が約８０％減少していることを示した。
【００４８】
実施例４
初代細胞におけるリガンドで誘導される受容体ダウンモジュレーション。
【００４９】
受容体モジュレーションを研究するするために、我々は、ヒト細胞株を使用した。ＳＥＡ刺激したヒト末しょう血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、種々のヒト分子をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞と共に３０分間共インキュベーションした。細胞をαＣＤ２−ＰＥまたはαＣＤ２８−ＰＥで染色して、ＦＡＣＳで解析した。図５の結果は、ヒト初代Ｔ細胞の受容体も、リガンドによってダウンモジュレートされることを示す。ヒトＰＢＭＣの培養液を超抗原ＳＥＡによって維持した。２−３週間後、細胞の９９％以上は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋およびＣＤ２＋ＣＤ２８＋であった。これらの細胞をＣＨＯ／ＤＲ形質転換体と共に培養したときに、ＣＤ２またはＣＤ２８の発現は影響を受けなかった（図５）。ＣＤ２の発現は、ＣＨＯ／ＬＦＡ３形質転換体との培養によりダウンモジュレートされ、ＣＤ２８発現は、細胞をＣＨＯ／ＣＤ８０に暴露することによってダウンモジュレートされた。交叉反応は観察されず、Ｊｕｒｋａｔ／ＣＨＯ系における特異性がすでに示された。
【００５０】
次いで、ヒトＳＥＡ刺激したＰＢＭＣをＣＨＯ形質転換体またはＣＤ５４を発現しているヒトＢ細胞株のＲａｊｉ細胞と３０分間共インキュベートした。ＣＨＯ細胞およびＲａｊｉ細胞の一部を４℃において３０分間、αＩＣＡＭ−１モノクロナール抗体であらかじめ処理し、二回洗浄した。共インキュベーションした後、細胞をαＣＤｌｌａ−ＰＥで染色してＣＤ１１α発現について解析した。図６は、ＳＥＡ刺激したＴ細胞上のヒトＣＤｌｌα（ＬＦＡ−１）が、リガンドＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）をトランスフェクションしたＣＨＯ細胞によって適度にダウンモジュレーションされることを示す。また、Ｒａｊｉ細胞は、ＣＤ１１αのダウンモジュレーションを誘導した。両細胞株は、αＣＤ５４ ｍＡｂで前処理した後に機能を失い、ＣＤ１１αとＣＤ５４のライゲーションがＣＤ１１αのダウンモジュレーションを誘導するという強力な証拠となる。我々が知る限り、我々は、ＣＤ５４がヒトにおいてＣＤ１１αのダウンモジュレーションを誘導するという最初の報告をする。
【００５１】
実施例５
受容体ダウンモジュレーションの遮断。
【００５２】
我々は、受容体とリガンドの相互作用が、活性化シグナルの伝達に必要な、受容体のインターナリゼーションを引き起こすことを示した。理論的には、相互作用を遮断することができる試薬は、リガンドで誘導される受容体インターナリゼーションを自然に遮断するであろう。この実験において、我々は、受容体ＣＤ２８またはリガンドＣＤ８０を認識するｍＡｂｓがＬＩＲＩを抑制することができることを示す（図７）。
【００５３】
ＣＨＯ／ＣＤ８０形質転換体をαＣＤ８０ ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂと４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄して、Ｊｕｒｋａｔ細胞と３７℃において３０分間共インキュベートした。ＣＤ２８受容体の発現をＦＡＣＳで解析した。
【００５４】
次いで、Ｊｕｒｋａｔ細胞をαＣＤ２８ ｍＡｂと４℃において３０分間インキュベートした。２回洗浄した後、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＣＨＯ／ＤＲまたはＣＨＯ／ＣＤ８０と３７℃において３０分間インキュベートした。細胞を飽和したαＣＤ２８ ｍＡｂ濃度（１０μｇ／ｍｌ）で、再び４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇで染色した。ＣＤ２８受容体の総発現をＦＡＣＳで解析した。
【００５５】
ＣＨＯ／ＣＤ８０をαＣＤ８０で処理した場合（図７Ａ）またはＪｕｒｋａｔ細胞をαＣＤ２８ ｍＡｂ出前処理した場合（図７Ｂ）、受容体インターナリゼーションは抑制された。すなわち、Ｊｕｒｋａｔ細胞上により多くの受容体が保持された。コントロールｍＡｂｓは、いずれの効果も示さなかった。
【００５６】
ＣＨＯ／ＣＤ４０およびＲａｊｉ細胞をマウス抗ヒトＣＤ４０ ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌ）またはコントロールｍＩｇＧで３０分間前処理した。次いで、ＣＤ４０Ｌ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を、前処理した細胞と３０分間インキュベートした。ＣＤ４０Ｌ＋Ｊｕｒｅｋａｔ細胞におけるＣＤ４０Ｌの発現をＦＡＣＳで解析した。αＣＤ４０ ｍＡｂでＣＨＯ／ＣＤ４０またはＲａｊｉ細胞を前処理することにより、ＣＤ４０の機能が減少されてＣＤ４０Ｌダウンモジュレーションを誘導した（図８）。
【００５７】
実施例６
Ｔ細胞活性化の遮断。
【００５８】
ＳＥＡの存在下でＣＨＯ／ＤＲ／ＣＤ８０細胞と培養した場合には、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、完全に活性化されて、最も重要なＴ細胞増殖因子のうちの１つであるＩＬ−２を産生するであろう。この培養系において、ＳＥＡは、ＨＬＡ−ＤＲ分子に結合して、ＣＨＯ／ＤＲ／ＣＤ８０細胞表面にＳＥＡ−ＤＲの複合体が形成される。Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面のＣＤ３／ＴＣＲは、複合体を認識し、２つの部分の相互作用がＴ細胞に対する第一の活性化シグナルを構成する。共刺激シグナルは、ＣＤ２８（Ｊｕｒｋａｔ細胞上の）とＣＤ８０（ＣＨＯ／ＤＲ／ＣＤ８０上の）との間の結合によって完了される完全なＴ細胞活性化に必要である。
【００５９】
種々の濃度のαＣＤ２８ ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂで前処理したＪｕｒｋａｔ細胞を、ＣＨＯ／ＤＲ／ＣＤ８０形質転換体および超抗原ＳＥＡ（５ｎＭ）と１８時間共培養した。培養上清中に放出されたＩＬ−２をＥＬＩＳＡで決定した。
【００６０】
αＣＤ２ ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂで前処理したＪｕｒｋａｔ細胞を、ＣＨＯ／ＤＲ／ＬＦＡ３形質転換体と１８時間共培養した。上澄のＩＬ−２をＥＬＩＳＡで決定した。
【００６１】
Ｊｕｒｋａｔ細胞をｍＡｂｓで前処理した場合、リガンドで誘導されるの受容体インターナリゼーションを遮断できることが示されており、Ｔ細胞活性化は弱められた。αＣＤ２８ ｍＡｂｓは、Ｊｕｒｋａｔ−ＣＨＯ／ＤＲ／ＣＤ８０系におけるＩＬ−２産生をすっかり消失させ、αＣＤ２ ｍＡｂも、濃度依存的にＪｕｒｋａｔ ＣＨＯ／ＤＲ／ＬＦＡ３系におけるＴ細胞活性化を抑制した。コントロールｍＡｂ（ａＥＭＢＰ）は、いずれの系においてもＴ細胞活性化を妨害しなかった（図９）。また、リガンド（ＣＤ８０またはＬＦＡ３）に対するｍＡｂｓは、ＩＬ−２産生を減少したが、あまりよく効かなかった。
【００６２】
実施例７
リガンドと相互作用した後の共刺激性受容体インターナリゼーション。
【００６３】
リガンドによって誘導されるヒトリンパ球表面受容体のダウンモジュレーションは、複雑なプロセスであり、含まれる機構は完全に説明されていない。この実験において、我々は、ＣＤ２およびＣＤ４０Ｌが該リガンドと相互作用した後にインターナリゼーションされることを示す。
【００６４】
Ｊｕｒｋａｔ細胞をＣＨＯ／ＬＦＡ３またはＣＨＯ／ＣＤ４０と１時間培養した。培養後、細胞の一部を４％のＰＦＡで固定化して、０．１％サポニンで透過化処理し、αＣＤ２またはαＣＤ４０Ｌ ｍＡｂｓで染色した。細胞内に保持された受容体のパーセンテージを表した。陽性細胞の頻度を表した。
【００６５】
表面発現は、ＣＤ２について７０％およびＣＤ４０Ｌについて８０％まで、これらのリガンドとインキュベーションした後に減少していた。細胞を透過化処理して、細胞内受容体に結合したｍＡｂｓを取り込ませた。透過化処理後、ＣＤ２およびＣＤ４０Ｌ発現は、それぞれ約６０％増加し、受容体インターナリゼーション（エンドサイトーシスとも呼ばる）が、表面受容体の消失の原因であることの手堅い証拠である（図１０Ａ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、どちらの受容体も細胞内に発現していない（データ示さず）。８０％以上のＣＤ４０Ｌ＋−Ｊｕｒｋａｔ細胞は、表面ＣＤ４０Ｌを発現し、約３０％だけがリガンド結合後も陽性のままであった。透過化処理後、αＣＤ４０Ｌ染色では、細胞の６０％以上がＣＤ４０Ｌ陽性であることをを示した（図１０Ｂ）。
【００６６】
実施例８
物質Ｌは、リガンドＡで誘導される受容体Ａのダウンモジュレーションを遮断する。
【００６７】
生化学スクリーニング・プログラムにより、分子量３２１．３９を有するプテリジン誘導体である物質Ｌは、受容体とそのリガンドとの間の結合を遮断することが示されている。該物質を本システムのＬＩＲＩアッセイで試験した。
【００６８】
Ｊｕｒｋａｔ細胞をＣＨＯ／リガンドＡまたはＣＨＯ／リガンドＢの形質転換体と共に、種々の濃度の物質Ｌを添加して１５分間共インキュベートした。受容体Ａ（ＣＨＯ／リガンドＡとの培養において）および受容体Ｂ（ＣＨＯ／リガンドＢとの培養において）の発現をＦＡＣＳで分析した。
【００６９】
結果は、リガンドＡで誘導される受容体Ａのダウンモジュレーションは、リガンドＡを有するＣＨＯ細胞を物質Ｌで前処理することにより濃度依存的に阻害されたこと、または該物質で前処理された、リガンドを有するＣＨＯ細胞とインキュベーションした後に、より多くの受容体Ａが細胞表面に保持されたことを示した。物質Ｌは、リガンドＢで誘導される受容体Ｂのダウンモジュレーションを妨害しなかった（図１１）。
【００７０】
実施例９
ヒトＣＤ８０は、ＣＴＬＡ−４のダウンモジュレーションを誘導する。
【００７１】
材料および方法
細胞培養
ヒト末しょう血単核細胞（ＰＢＭＣ）をバフィーコートから分離して、１０％仔ウシ胎児血清およびＳＥＥ（５ｎＭ）を補ったＲＰＭＩ １６４０中で７２時間培養した。リガンドＣＤ８０によるＣＴＬＡ−４のモジュレーションを研究するために、ＳＥＥで活性化した細胞をＣＨＯ／Ｃ８０形質転換体と共に、５：１の比で３７℃において３０分間インキュベートした。細胞を洗浄してＰＥ結合αＣＴＬＡ−４で染色し（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５８５３）、ＦＡＣＳで解析した。
【００７２】
結果
ＣＤ８０によるＣＴＬＡ−４のダウンモジュレーション
ヒト静止Ｔ細胞は、細胞表面にＣＴＬＡ−４を発現しない（データ示さず）。ＳＥＥで活性化した後、ヒトＰＢＭＣは、細胞サイズによって２群に分けることができる。図１２による結果は、８０％程度の大細胞は、その他のＴ活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ５６、ＣＤ６９）の向上された発現とともに、ＣＴＬＡ−４を発現する。小細胞は、静止ＰＢＭＣと同様の表現型のままであった。
【００７３】
活性化後、ＰＢＭＣ細胞をＣＨＯ／ＣＤ８０細胞と混合して、さらに３０分間インキュベートした。ＣＴＬＡ−４のモジュレーションをＦＡＣＳで解析した。図１３による結果は、ＣＴＬＡ−４の発現がＣＤ８０によってダウンモジュレートされたことを示す。並行して培養した結果では、ＣＤ２８およびＣＤ２も、それぞれＣＤ８０およびＬＦＡ３形質転換体によってダウンモジュレートされ、ＬＦＡ３は、ＣＴＬＡ−４の発現をモジュレートしないことを示した（データ示さず）。これらの結果は、誘導性のヒトＴ細胞共刺激性受容体であるＣＴＬＡ−４は、対受容体（ｃｏｕｎｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）のＣＤ８０と相互作用することによってもダウンモジュレートされ、ＣＴＬＡ−４のモジュレーションに厳密な特異性が存在することを示している。
【００７４】
【参照文献】
１． Ｔｉｖｏｌ， Ａ Ｅ ｅｔ ａｌ，”Ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ”， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８， ｐｐ ８２２−８３０ （１９９６）．
２． Ｊｕｎｅ， Ｃ Ｈ ｅｔ ａｌ，”Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ２８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， １１， ｐｐ ２１１−２１６ （１９９０）．
３． Ｗｉｎｇｒｅｎ， Ａ Ｇ ｅｔ ａｌ，”Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ： Ｂ７， ＬＦＡ−３， ａｎｄ ＩＣＡＭ−１ ｓｈａｐｅ ｕｎｉｑｕｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ”， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １５， ｐｐ ２３５−２５３ （１９９５）．
４． Ｍｅｌｅｒｏ， Ｉ ｅｔ ａｌ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ４−１ ＢＢ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ”， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ６ ｐｐ ６８２−６８５ （１９９７）．
５． Ｍａｒｓｈ， Ｍ ｅｔ ａｌ，”Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｒａ ｏｆ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ”， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８５， ｐｐ ２１５−２２０ （Ｊｕｌｙ １９９９）．
６． Ｅｃｋ， Ｓ Ｃ ｅｔ ａｌ，”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２８ ｂｙ Ｂ７−１ ａｎｄ Ｂ７−２ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ”， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ６４， ｐｐ １４９７−１４９９ （Ｎｏｖ １９９７）．
【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６は、ＣＤ２８受容体のダウンレギュレーションを誘導する。
【図２Ａ】
ＣＤ８０によって誘導されるＣＤ２８のダウンレギュレーションの用量依存および時間経過。Ａ：Ｊｕｒｋａｔ細胞を種々の数のＣＨＯ／ＣＤ８０細胞と培養した。
【図２Ｂ】
ＣＤ８０によって誘導されるＣＤ２８のダウンレギュレーションの用量依存および時間経過。Ｂ：Ｊｕｒｋａｔ細胞を５：１の比のＣＨＯ／ＣＤ８０と共に種々の時間インキュベートした。
【図３】
ＬＦＡ３（ＣＤ５８）は、Ｔ細胞におけるＣＤ２発現をダウンモジュレートする。
【図４Ａ】
ヒトＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０は、各々をダウンレギュレートする。Ａ：ヒトＢ細胞株Ｒａｍｏｓ ２Ｇ６ ４Ｃ１０細胞をＣＨＯ形質転換体と共インキュベートした。
【図４Ｂ】
ヒトＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０は、各々をダウンレギュレートする。Ｂ：ＣＤ４０Ｌ＋−Ｊｕｒｋａｔ細胞をＣＨＯ／ＤＲまたはＣＨＯ／ＤＲ／ＣＤ４０細胞と種々の時間インキュベートした。
【図５】
ＬＦＡ−３およびＣＤ８０は、ヒトＰＢＭＣにおいてＣＤ２およびＣＤ２８受容体のダウンモジュレーションを誘導する
【図６】
ヒトＩＣＡＭ１（ＣＤ５４）は、ＣＤｌｌａ（ＬＦＡ−１）をダウンモジュレートし、αＩＣＡＭ１ ｍＡｂは、効果を遮断する。
【図７Ａ】
ＣＨＯ／ＣＤ８０におけるＣＤ８０またはＪｕｒｋａｔにおけるＣＤ２８のｍＡｂｓによる前処理は、ＣＤ８０誘導のＣＤ２８ダウンモジュレーションを遮断する。Ａ：ＣＨＯ／ＣＤ８０形質転換体をαＣＤ８０ ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂとインキュベートした。
【図７Ｂ】
ＣＨＯ／ＣＤ８０におけるＣＤ８０またはＪｕｒｋａｔにおけるＣＤ２８のｍＡｂｓによる前処理は、ＣＤ８０誘導のＣＤ２８ダウンモジュレーションを遮断する。Ｂ：Ｊｕｒｋａｔ細胞をαＣＤ２８ ｍＡｂとインキュベートした。
【図８】
αＣＤ４０ ｍＡｂによるＣＨＯ／ＣＤ４０またはＲａｊｉ細胞の前処理。
【図９Ａ】
共刺激性受容体のダウンモジュレーションを遮断するｍＡｂｓは、Ｔ細胞活性化も遮断する。Ａ：種々の濃度のαＣＤ２８ ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂで前処理したＪｕｒｋａｔ細胞をＣＨＯ／ＤＲ／ＣＤ８０形質転換体および超抗原ＳＥＥと共培養した。
【図９Ｂ】
共刺激性受容体のダウンモジュレーションを遮断するｍＡｂｓは、Ｔ細胞活性化も遮断する。Ｂ：αＣＤ２ ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂで前処理したＪｕｒｋａｔ細胞をＣＨＯ／ＤＲ／ＬＦＡ３形質転換体と共培養した。
【図１０Ａ】
細胞内染色では、受容体がリガンドと相互作用した後にインターナリゼーションすることを示す。Ａ：Ｊｕｒｋａｔ細胞をＣＨＯ／ＬＦＡ３またはＣＨＯ／ＣＤ４０と培養した。
【図１０Ｂ】
細胞内染色では、受容体がリガンドと相互作用した後にインターナリゼーションすることを示す。Ｂ：培養条件及び細胞内染色の手順はＡの記載と同様である。
【図１１】
物質Ｌは、リガンドＡ誘導の受容体Ａのダウンモジュレーションを特異的に抑制する。
【図１２】
ヒトＴ細胞におけるＣＴＬＡ−４の誘導。ヒトＰＢＭＣをＳＥＥ（５ｎＭ）で７２時間活性化して、ＦＡＣＳによって表現型的に分析した。
【図１３】
ＣＤ８０は、ＳＥＥで活性化されたヒトＰＢＭＣにおけるＣＴＬＡ−４の発現をダウンモジュレートする。ＳＥＥ（５ｎＭ）で７２時間活性化されたヒトＰＢＭＣをＣＨＯ／ＣＤ８０と混合して３０分間インキュベートした。ＣＴＬＡ−４の発現をＦＡＣＳによって分析した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
2004516037.tif 000018
【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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