(57)【要約】骨芽細胞株によって選択的に発現される新規な遺伝子が、提供される。遺伝子の発現は、骨芽細胞株の細胞（前駆細胞を含む）に高度に制限される。骨形成を刺激するために、骨芽細胞中の新規な遺伝子に結合する薬剤を提供することによって、骨の形成を促進する方法がまた、提供される。  本発明は、骨芽細胞によって発現されることが見出された遺伝子を提供することによって、先行技術に内在していたこれらおよび他の欠点を克服することを追及した。このように、本発明は、骨芽細胞によって発現されかつ骨形成に必要とされる分子をコードする遺伝子（Ｏｓｔｅｒｉｘと称する）の同定に関する。従って、本発明は、一般的に、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントに関する。
2004537968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードするタンパク質コード領域を含む、ＤＮＡセグメント。
【請求項２】
前記配列が、トランス活性化ドメインを含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記トランス活性化ドメインが、配列番号２の２７位と２７０位との間由来のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項４】
前記Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドが、配列番号５の配列を有するとさらに規定される、請求項３に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項５】
少なくとも１つのジンクフィンガードメインを含む、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項６】
前記ジンクフィンガードメインが、配列番号２の２９０位と３７４位との間由来のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項７】
前記Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドが、配列番号４の配列を有するとさらに規定される、請求項６に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項８】
プロリンリッチドメインを含む、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項９】
前記プロリンリッチドメインが、配列番号２の２７位と１９２位との間由来のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１０】
前記Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドが、配列番号６の配列を有するとさらに規定される、請求項９に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１１】
前記Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドが、配列番号２の配列を有するとさらに規定される、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１２】
前記ジンクフィンガードメインが、転写因子Ｓｐ−１と７７．６％の相同性である、請求項５に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１３】
前記ジンクフィンガードメインが、転写因子Ｓｐ−２と６９．４％の相同性である、請求項５に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１４】
前記ジンクフィンガードメインが、転写因子Ｓｐ−３と７７．８％の相同性である、請求項５に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１５】
前記ジンクフィンガードメインが、転写因子Ｓｐ−４と７７．８％の相同性である、請求項５に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１６】
配列番号２由来の連続アミノ酸配列を含むＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードする、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１７】
前記ＤＮＡセグメントが、配列番号１由来の連続核酸配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１８】
４２８アミノ酸長のＯｓｔｅｒｉｘタンパク質をコードする、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項１９】
前記Ｏｓｔｅｒｉｘコード領域が、プロモーターの制御下で位置決めされる、請求項１に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項２０】
前記プロモーターが、組換えプロモーターである、請求項１９に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項２１】
組換えベクターとしてさらに規定される、請求項１９に記載のＤＮＡセグメント。
【請求項２２】
請求項１に記載のＤＮＡセグメントを含む、組換え宿主細胞。
【請求項２３】
原核生物の宿主細胞としてさらに規定される、請求項２２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２４】
前記原核生物の宿主細胞が、細菌の宿主細胞である、請求項２３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２５】
前記細菌の宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項２４に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２６】
真核生物の宿主細胞としてさらに規定される、請求項２２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２７】
骨芽細胞としてさらに規定される、請求項２６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２８】
前記骨芽細胞が、ＢＭＰ２で処理したＣ２Ｃ１２細胞である、請求項２７に記載の組換え宿主細胞。
【請求項２９】
間葉前駆細胞としてさらに規定される、請求項２６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２２に記載の組換え宿主細胞であって、前記ＤＮＡセグメントが、組換えベクターによって、該細胞中に導入され、該組換えベクターが、プロモーターの制御下で位置決めされたＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む、組換え宿主細胞。
【請求項３１】
組換え宿主細胞中でＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドを発現すること、および該発現されたＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドを得ることによって調製された、組換えＯｓｔｅｒｉｘポリペプチド。
【請求項３２】
核酸セグメントであって、以下：
ａ）配列番号１の少なくとも１４個の連続ヌクレオチドと同一の配列を有するか、またはこの連続ヌクレオチドと相補性である、１４のヌクレオチドからなる配列領域を含む、核酸セグメント；あるいは
ｂ）配列番号１の該核酸セグメントまたはその相補体に、標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする１４〜１０，０００のヌクレオチド長の核酸セグメント、
として特徴付けられる、核酸セグメント。
【請求項３３】
前記セグメントが、配列番号１由来の少なくとも１４個の連続ヌクレオチドの配列領域またはその相補体を含む、請求項３２に記載の核酸セグメント。
【請求項３４】
前記セグメントが、配列番号１由来の少なくとも１７個の連続ヌクレオチドの配列領域またはその相補体を含む、請求項３３に記載の核酸セグメント。
【請求項３５】
前記セグメントが、配列番号１由来の少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの配列領域またはその相補体を含む、請求項３４に記載の核酸セグメント。
【請求項３６】
前記セグメントが、配列番号１由来の少なくとも２５個の連続ヌクレオチドの配列領域またはその相補体を含む、請求項３５に記載の核酸セグメント。
【請求項３７】
前記セグメントが、配列番号１由来の少なくとも３０個の連続ヌクレオチドの配列領域またはその相補体を含む、請求項３６に記載の核酸セグメント。
【請求項３８】
前記セグメントが、配列番号１由来の少なくとも３５個の連続ヌクレオチドの配列領域またはその相補体を含む、請求項３７に記載の核酸セグメント。
【請求項３９】
前記セグメントが、配列番号１由来の少なくとも４０個の連続ヌクレオチドの配列領域またはその相補体を含む、請求項３８に記載の核酸セグメント。
【請求項４０】
前記セグメントが、配列番号１の前記核酸セグメントまたはその相補体に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、請求項３２に記載の核酸セグメント。
【請求項４１】
前記セグメントが、少なくとも１７個のヌクレオチド長である、請求項４０に記載の核酸セグメント。
【請求項４２】
前記セグメントが、少なくとも２０個のヌクレオチド長である、請求項４１に記載の核酸セグメント。
【請求項４３】
前記セグメントが、少なくとも２５個のヌクレオチド長である、請求項４２に記載の核酸セグメント。
【請求項４４】
前記セグメントが、少なくとも３０個のヌクレオチド長である、請求項４３に記載の核酸セグメント。
【請求項４５】
前記セグメントが、少なくとも３５個のヌクレオチド長である、請求項４４に記載の核酸セグメント。
【請求項４６】
前記セグメントが、少なくとも４０個のヌクレオチド長である、請求項４５に記載の核酸セグメント。
【請求項４７】
前記セグメントが、約３キロベースペアまでの長さである、請求項３２に記載の核酸セグメント。
【請求項４８】
配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットであって、該ポリヌクレオチドが、真核生物細胞中で作動可能なプロモーターの制御下にある、発現カセット。
【請求項４９】
前記プロモーターが、前記コード配列に対して異種である、請求項４８に記載の発現カセット。
【請求項５０】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項４８に記載の発現カセット。
【請求項５１】
前記プロモーターが、誘導プロモーターである、請求項４８に記載の発現カセット。
【請求項５２】
前記発現カセットが、ウイルスベクター中に含まれる、請求項４８に記載の発現カセット。
【請求項５３】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクターからなる群から選択される、請求項５２に記載の発現カセット。
【請求項５４】
前記発現カセットが、ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項４８に記載の発現カセット。
【請求項５５】
配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む、細胞であって、該ポリヌクレオチドが、真核生物細胞中で作動可能なプロモーターの制御下にあり、該プロモーターが、該ポリヌクレオチドに対して異種である、細胞。
【請求項５６】
患者の骨粗鬆症を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の発現ベクターを部位に投与する工程を包含し、該発現ベクターは、プロモーターの転写制御下でＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、そして該Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドの発現は、該骨粗鬆症の処置を生じる、方法。
【請求項５７】
前記プロモーターが、構成的なプロモーターである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記プロモーターが、誘導プロモーターである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記プロモーターが、非誘導プロモーターである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記発現ベクターが、ウイルスベクターを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記ウイルスベクターが、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記発現ベクターが、内視鏡的に、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、病巣内に、経皮的に、または皮下に送達される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記投与が、繰り返される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
精製したＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドを含む、組成物。
【請求項６５】
前記ポリペプチドが、単離されたＯｓｔｅｒｉｘジンクフィンガードメインを含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ポリペプチドが、単離されたＯｓｔｅｒｉｘトランス活性化ドメインを含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ポリペプチドが、単離されたＯｓｔｅｒｉｘプロリンリッチドメインを含む、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６８】
配列番号２由来の配列を含む、約５アミノ酸長と約２０アミノ酸長との間の精製されたポリペプチド。
【請求項６９】
Ｏｓｔｅｒｉｘと免疫学的に反応性である、抗体。
【請求項７０】
Ｏｓｔｅｒｉｘ転写のエフェクターを同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）ＯｓｔｅｒｉｘおよびＯｓｔｅｒｉｘ発現を測定するレポーター遺伝子を発現する、ベクター、と（ｉｉ）候補物質とを混合する、工程、ならびに
該Ｏｓｔｅｒｉｘによる該レポーター遺伝子の転写を変更する該候補物質を同定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項７１】
前記Ｏｓｔｅｒｉｘを発現するベクターが、組替えＯｓｔｅｒｉｘを発現する、操作された細胞を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記エフェクターが、Ｏｓｔｅｒｉｘによる前駆細胞から骨芽細胞への細胞分化を刺激する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記エフェクターが、Ｏｓｔｅｒｉｘによる前駆細胞から骨芽細胞への細胞分化を調節する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
刺激因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）Ｏｓｔｅｒｉｘを発現し得る一群の前駆細胞を含む組成物を混合する工程；
ｂ）該混合物を候補物質とともにインキュベートする工程；
ｃ）前駆細胞の分化について、該混合物を試験する工程；および
ｄ）前駆細胞から骨芽細胞への分化を刺激する、該候補物質を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７６】
前記前駆細胞が、間葉前駆細胞である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
阻害因子または刺激因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）Ｏｓｔｅｒｉｘを発現する一群の組換え細胞を含む、第１の組成物と一群を含む第２の組成物とを混合する工程；
ｂ）該混合物を候補物質とともにインキュベートする工程；
ｃ）骨芽細胞の活性について、該混合物を試験する工程；および
ｄ）骨芽細胞の活性を阻害または刺激する候補物質を同定する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
政府は、国立保健研究所からの助成金交付番号ＨＬ４１２６４−１２に従って、本発明において権利を有する。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、一般に、骨芽細胞および骨形成におけるその役割に関する。より詳細には、本発明は、骨形成に必要とされる骨芽細胞タンパク質をコードする遺伝子の同定および単離に関する。
【０００３】
（２．関連技術の説明）
骨形成は、綿密に制御された発達プロセスであり、このプロセスは、初期の間葉濃縮領域を定義づけるモルフォゲン媒介性のパターン形成シグナルと、次ぐ、軟骨細胞および骨芽細胞を生成するための細胞特異的な分化プログラムの誘導とを含む。位置情報は、ｈｏｘ遺伝子発現の領域特異的パターンと共に、特定の形態形成領域内において細胞から放出される、ソニックヘッジホッグのような分子の勾配を介して伝達される。次いで、これらが、骨の形態形成タンパク質、ならびに軟骨細胞特異的な分化プログラムおよび骨芽細胞特異的な分化プログラムを開始させる関連分子の局在的な生成を調節する。分化は、所定の系統への間葉幹細胞の初期方向付けと、次ぐ、遺伝子発現の組織特異的パターンの誘導とを必要とする。骨芽細胞に特異的な遺伝子発現の制御に関するかなりの情報が、骨において選択的に発現するオステオカルシンのようなタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の分析からもたらされた。一般的な転写因子および組織特異的な転写因子の両方が、このプロモーターを制御する。同定された最初の骨芽細胞特異的転写因子であるＯｓｆ２／Ｃｂｆａ１は、骨芽細胞系統において初期に発現され、そして骨芽細胞におけるその選択的発現のために必須のオステオカルシンプロモーター中の特定のＤＮＡ配列と相互作用する（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉ  １９９９）。Ｃｂｆａ１は、破骨細胞分化のために必要とされる。
【０００４】
骨粗鬆症において観察される骨塩密度（ＢＭＤ）の減少は、一部、骨を形成する骨芽細胞の活性減少から生じる（Ｊａｃｋｓｏｎ  ２０００）。この細胞分化プロセスに関与する転写因子の同定は、骨粗鬆症についての処置プロトコルを開発するにおいて有益であった。他の転写因子も同様に、この分化プロセスに関与する可能性がある。骨粗鬆症のような骨疾患の処置において骨形成を増強するための薬剤開発のために、マスター転写（ｍａｓｔｅｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を同定することは有益である。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、骨芽細胞によって発現されることが見出された遺伝子を提供することによって、先行技術に内在していたこれらおよび他の欠点を克服することを追及した。このように、本発明は、骨芽細胞によって発現されかつ骨形成に必要とされる分子をコードする遺伝子（Ｏｓｔｅｒｉｘと称する）の同定に関する。従って、本発明は、一般的に、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントに関する。従って、本発明は、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子、ならびに、このような遺伝子を作製する方法および使用する方法を提供する。本発明はまた、Ｏｓｔｅｒｉｘに結合し、従ってＯｓｔｅｒｉｘの活性を調節する、他のタンパク質に関する。これらのタンパク質を同定する方法もまた記載する。
【０００６】
本発明のＤＮＡセグメントはさらに、単離された骨芽細胞遺伝子（この産物が、骨形成に必要とされる）を含むものとして特徴付けられ得る。
【０００７】
本発明の好ましいＤＮＡセグメントは、配列番号２からの連続アミノ酸配列を含む、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードする。あるいは、本発明のＤＮＡセグメントは、配列番号１からの連続核酸配列を含むものとして規定付けられ得る。
【０００８】
本発明のＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドは、代表的に、ジンクフィンガードメイン、およびプロリンリッチドメインを含むトランス活性化ドメインを含むものとして特徴付けられる。本発明のＯｓｔｅｒｉｘタンパク質は、骨芽細胞によって発現されるものとして、さらに特徴付けられ得る。本発明のＯｓｔｅｒｉｘタンパク質は、約４６ｋＤａのポリペプチドとして記載され得る。
【０００９】
Ｏｓｔｅｒｉｘのジンクフィンガードメインは、配列番号２からの２９０位〜３７４位のアミノ酸配列を含むものとして特徴付けられ得る。これはさらに、配列番号４によって規定され得る。
【００１０】
Ｏｓｔｅｒｉｘのトランス活性化ドメインは、配列番号２からの２７位〜２７０位のアミノ酸配列を含むものとして特徴付けられ得る。これはさらに、配列番号５によって規定され得る。
【００１１】
Ｏｓｔｅｒｉｘのプロリンリッチドメインは、配列番号２からの２７位〜１９２位のアミノ酸配列を含むものとして特徴付けられ得る。これはさらに、配列番号６によって規定され得る。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明は、約４２８アミノ酸長のＯｓｔｅｒｉｘタンパク質をコードするＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を提供する。好ましくは、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＯｓｔｅｒｉｘタンパク質をコードする。
【００１３】
他の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２からの連続アミノ酸配列を含む、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードするＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を提供する。
【００１４】
本発明のＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子は、好ましくは、ｃＤＮＡであるが、ゲノムコピーは決して排除されない。Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子は、Ｃ２Ｃ１２マウス細胞株、通常は、骨格筋細胞の前駆体（ＡＴＣＣ  ＃  ＣＲＬ１７７２）から得られ得るが、他のＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子供給源は排除されない。
【００１５】
本明細書中の以下で記載されるような、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子の生物学的な機能的等価物および構造的等価物もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００１６】
特定の好ましいＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子は、配列番号１の核酸配列を含む。しかし、これは決して限定ではなく、本発明の単なる一つの例示的実施形態である。他の多くのこのようなＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を作製する方法および使用する方法に関する詳細な指針が、本明細書に含まれる。
【００１７】
本発明の遺伝子はまた、他のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。これは一般的に、このような核酸構築物の発現の後に、融合タンパク質の生成を生ずる。Ｎ末端融合タンパク質およびＣ末端融合タンパク質の両方が意図される。
【００１８】
実質的に任意のタンパク質コードＤＮＡ配列もしくはポリペプチドコードＤＮＡ配列、またはそれらの組み合わせが、Ｏｓｔｅｒｉｘ配列に融合されて、融合タンパク質をコードし得る。これは、標的化ポリペプチド、治療タンパク質、組換え発現のためのタンパク質、１つ以上の標的化ポリペプチドが結合したタンパク質、タンパク質サブユニットなどをコードするＤＮＡ配列を含む。当業者は、所望される機能に依存して、融合Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質を得るために任意の配列を使用し得ることを理解する。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、一般的に、配列番号１の１４個連続するヌクレオチドと同じ配列を有するかまたは配列番号１の１４個連続するヌクレオチドに相補的である、少なくとも１４個連続するヌクレオチドからなる配列領域を含む核酸セグメントとして特徴付けられる、核酸セグメントとして記載され得る。あるいは、本発明の核酸セグメントは、標準的なハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１の核酸セグメントまたはその相補体にハイブリダイズする、１４〜約１０，０００ヌクレオチド長の核酸セグメントとして特徴付けられ得る。
【００２０】
好ましい核酸セグメントは、配列番号１からの少なくとも１４個連続するヌクレオチドまたはその相補体の配列領域を含む。他の好ましい核酸セグメントは、配列番号１の核酸セグメントまたはその相補体にハイブリダイズするセグメントを含む。より好ましい実施形態では、このセグメントは、約２５ヌクレオチド長である。あるいは、このセグメントは、約３キロベース対までの長さであり得る。
【００２１】
本発明はさらに、Ｏｓｔｅｒｉｘ  ｃＤＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’ＵＴＲ、ならびに、Ｏｓｔｅｒｉｘの隣接領域の５’隣接領域および３’隣接領域を含むＤＮＡセグメントを含む。これらの５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲのゲノムＤＮＡ配列、ならびに、５’隣接配列および３’隣接配列は、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子の骨芽細胞特異的な転写を調節するという点で重要である。５’隣接配列は、骨芽細胞において外来遺伝子の転写を標的化する際に、特に有用であり得ることが見出された。例えば、本発明者らは、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子の単離されたプロモーターフラグメントを使用して、トランスジェニックマウスにおいてリポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）の転写を駆動する実験を意図する。他の細胞型においてではなく骨芽細胞においてＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子が発現することは、単離されたプロモーターフラグメントが、骨芽細胞特異的なプロモーターであることの指標として使用される。従って、本発明の一つの局面では、選択されたタンパク質をコードする異種遺伝子またはＤＮＡセグメントに対して作動可能に連結された、Ｏｓｔｅｒｉｘの５’隣接領域を含むＤＮＡセグメントを意図する。組織特異的な骨芽細胞プロモーターを使用して、骨芽細胞における遺伝子の標的化された発現を獲得し得る。
【００２２】
本発明の別の局面は、一般的に、精製または実質的に精製されたＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドに関する。一般的に、「精製（された）」は、種々の他の成分を取り除くために分画に供されたタンパク質またはポリペプチドの組成物をいい、そしてこの組成物は、その発現された生物学的活性を実質的に保持している。用語「実質的に精製（された）」が使用される場合、この表示は、そのタンパク質またはペプチドが、組成物の主成分を形成する（例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％以上を構成する）組成物をいう。特定の実施形態において、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、第二のポリペプチド配列に作動可能に連結され得る。配列番号２からの連続配列を含む約５〜４２８アミノ酸長の精製または実質的に精製されたポリペプチドが本発明に包含されることもまた意図される。従って、例えば、本発明は、配列番号２の約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４１５個、４２０個から４２８個まで連続するアミノ酸配列のポリペプチドまたはタンパク質を意図する。中間の長さを有するポリペプチドもまた、有用であるとして意図される。さらに、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の特定の機能的領域をコードするポリペプチドもまた意図される。従って、配列番号２のアミノ酸番号２９０〜アミノ酸番号３７４のジンクフィンガードメインをコードする、配列番号２の約８４個連続するアミノ酸を含むポリペプチド；配列番号２のアミノ酸番号２７〜アミノ酸番号２７０のトランス活性化ドメインをコードする、配列番号２の約２４３個連続するアミノ酸を含むポリペプチド；および、配列番号２のアミノ酸番号２７〜アミノ酸番号１９２のプロリンリッチドメインをコードする、配列番号２の約１６５個連続するアミノ酸を含むポリペプチドもまた意図される。いくつかのこのような好ましい配列はまた、配列番号４、配列番号５または配列番号６として規定され得る。
【００２３】
組換えベクターおよびプラスミドは、本発明の別の重要な局面を形成する。このようなベクターにおいて、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子は、プロモーター（一般的には、哺乳動物細胞またはヒト細胞において作動的なプロモーター）の転写制御下に位置付けられる。「〜の転写制御下に位置付けられる」とは、Ｏｓｔｅｒｉｘ配列が、プロモーターから下流でありかつそのプロモーターの転写制御下に位置付けられ、その結果、哺乳動物宿主細胞またはヒト宿主細胞へのこのベクターの導入に際して、そのプロモーターが、哺乳動物宿主細胞またはヒト宿主細胞中において、コードされるＯｓｔｅｒｉｘタンパク質の発現を指示し得ることを意味する。
【００２４】
従って、本発明の組換えベクターは、一般的に、プロモーターから下流に作動可能に位置付けられたＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を含み、ここでこのプロモーターは、哺乳動物細胞またはヒト細胞において、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子の発現を指示し得る。好ましくは、プロモーターは、Ｏｓｔｅｒｉｘの検出を可能にするに十分な量でのＯｓｔｅｒｉｘの発現を指示する。従って、このようなプロモーターは、哺乳動物細胞またはヒト細胞において「作動的」である。
【００２５】
本発明に従う発現ベクターおよびプラスミドは、１つ以上の構成的プロモーター（例えば、転写を促進するにおいて一般的に活性であるウイルスプロモーターまたは哺乳動物遺伝子由来のプロモーター）を含み得る。構成的ウイルスプロモーターの例としては、レトロウイルスベクター由来のＨＳＶ、ＴＫ、ＲＳＶ、ＬＴＲプロモーター配列、ＳＶ４０およびＣＭＶプロモーターが挙げられ、このうち、ＣＭＶプロモーターが、現在好ましい例である。構成的哺乳動物プロモーターの例としては、βアクチンプロモーターによって例示されるような、種々のハウスキーピング遺伝子プロモーターが挙げられる。他のプロモーターは、ｄｅｃｔｉｎ−１、ｄｅｃｔｉｎ−２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ  ＭＬＰ、βアクチン、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩプロモーターであり得る。
【００２６】
誘導性プロモーターおよび／または調節エレメントもまた、本発明の発現ベクターにおける使用が意図される。適切な誘導性プロモーターの例としては、シトクロムＰ４５０遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ホルモン誘導性遺伝子（例えば、エストロゲン遺伝子プロモーター）などのような遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。電離放射線への曝露に応答して活性化されるプロモーター（例えば、ｆｏｓ、ｊｕｎおよびｅｇｒ−１）もまた意図される。
【００２７】
組織特異的なプロモーターおよび／または調節エレメントもまた、特定の実施形態において有用である。本発明の発現ベクターにおいて使用され得るこのようなプロモーターの例としては、以下が挙げられる：結腸上皮細胞に特異的な肝臓脂肪酸結合（ＦＡＢ）タンパク質遺伝子由来のプロモーター；ケラチノサイトに特異的なケラチン遺伝子由来のプロモーター；膵臓細胞に特異的なインスリン遺伝子由来のプロモーター；肝臓細胞に特異的な、トランスフィレチン（ｔｒａｎｓｐｈｙｒｅｔｉｎ）、α１−アンチトリプシン、プラスミノゲン活性化因子インヒビター１型（ＰＡＩ−１）、アポリポタンパク質ＡＩおよびＬＤＬレセプター遺伝子由来のプロモーター；希突起膠細胞に特異的な、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子由来のプロモーター；グリア細胞に特異的な、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子由来のプロモーター；眼に標的化するために特異的な、ＯＰＳＩＮ由来のプロモーター；および、神経細胞に特異的である神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター。
【００２８】
発現ベクターおよびプラスミドの構築および使用は、当業者に周知である。従って、実質的に任意の哺乳動物細胞発現ベクターが、本明細書に開示される遺伝子と関連して使用され得る。
【００２９】
好ましいベクターおよびプラスミドは、少なくとも１つのマルチクローニング部位を有して構築される。特定の実施形態では、発現ベクターは、プロモーターとＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子配列との間に作動可能に位置付けられたマルチクローニング部位を含む。このようなベクターは、他の実施形態におけるその使用に加えて、第二のタンパク質コードＤＮＡセグメントをマルチクローニング部位にクローニングして、その結果、その第二のタンパク質コードＤＮＡセグメントが、Ｏｓｔｅｒｉｘ配列と連続しかつインフレームとなることによって、Ｎ末端融合タンパク質を作製するために使用され得る。
【００３０】
他の実施形態では、発現ベクターは、発現可能なＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子配列から下流に作動可能に位置付けられたマルチクローニング部位を含み得る。これらのベクターは、その使用に加えて、第二のタンパク質コードＤＮＡセグメントをマルチクローニング部位にクローニングして、その結果、その第二のタンパク質コードＤＮＡセグメントが、Ｏｓｔｅｒｉｘ配列と連続しかつインフレームとなることによって、Ｃ末端融合タンパク質を作製するにおいて有用である。
【００３１】
第二のタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸セグメントも存在するベクターおよびプラスミドもまた、その核酸セグメント自体の性質とは無関係に、当然ながら、本発明によって包含される。
【００３２】
第二のリポーター遺伝子が、本発明の発現ベクター中に含まれ得る。第二のリポーター遺伝子は、第二の転写単位中に含まれ得る。適切な第二のリポーター遺伝子としては、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、ミコフェノール酸、ヒスチジノールおよびメトトレキサートのような薬剤に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。あるいは、リポーター遺伝子は、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質のような、容易に検出され得る遺伝子であり得る。
【００３３】
発現ベクターはまた、ＩＲＥＳエレメント、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナー／スプライスアクセプターシグナルなどのような他の核酸配列を含み得る。
【００３４】
適切な発現ベクターの特定の例は、組換えアデノウイルス系、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系、または組換えレトロウイルス系を使用して、発現のために適合されたベクターである。他の中でも、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、および欠損性Ｂ型肝炎ウイルスもまた使用され得る。
【００３５】
特定の実施形態では、発現ベクターまたはプラスミドは、配列番号１の核酸配列を有するＯｓｔｅｒｉｘリポーター遺伝子を含み得る。
【００３６】
組換え宿主細胞は、本発明の別の局面を形成する。このような宿主細胞は、一般的に、少なくとも１コピーの単離されたＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を含む。発現目的のために好ましい細胞は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞である。従って、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞および植物細胞のような細胞もまた可能である。最も好ましくは、宿主細胞は、細菌宿主細胞である。好ましい細菌宿主細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉである。あるいは、好ましい真核生物宿主細胞の例は、骨芽細胞または間葉前駆細胞である。しかし、他の細胞型が、本発明の細胞型から排除されないことが理解される。
【００３７】
特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、好ましくは、細胞にＯｓｔｅｒｉｘを発現させるかまたはＯｓｔｅｒｉｘを発現するように刺激するのに有効な様式で、最も好ましくは、Ｏｓｔｅｒｉｘの検出を可能にするに十分な量で、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子を組み込む。従って、組換え宿主細胞は、好ましくは、組換えベクターによって細胞中に導入されたＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を含む。
【００３８】
特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、好ましくは、Ｏｓｔｅｒｉｘの検出を可能にするに十分な量で、コードされるＯｓｔｅｒｉｘタンパク質を生成するようにＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を発現する。発現されるＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドは、好ましくは、配列番号２からの連続アミノ酸配列を含む。
【００３９】
本発明の組換えＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドは、特定の実施形態において、組換え宿主細胞中においてＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドを発現させる工程、および総組換え宿主細胞成分中から、発現されたＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドを精製する工程によって、調製され得る。
【００４０】
適切な組換え宿主細胞の例としては、以下が挙げられる；ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株の細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、例えば、ＣＯＳ−７）、ならびにＷ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２および２９３細胞。
【００４１】
哺乳動物から細胞を取り出し、そして限られた期間にわたってその細胞を培養した後に確立された一次細胞株の細胞もまた、本発明の細胞に含まれる。これらの細胞は、人為的に操作され得、そして、その細胞が元々取り出された同一宿主動物に戻され得る。Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子を含むこのような細胞は、その位置とは無関係に、本発明の範囲内に含まれる。
【００４２】
当然ながら、組換え細胞はまた、遺伝子治療によって標的化され得るので、動物またはヒト被験体の身体内に位置付けられた細胞を含む。これらの細胞は、遺伝子が得られた様式（例えば、トランスフェクション、感染など）とは無関係に、少なくとも１コピーのＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子またはベクターを含むすべての細胞を含む。
【００４３】
ある特定の実施形態では、配列番号１の核酸配列を含むＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を含む組換え宿主細胞が意図される。
【００４４】
Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子を使用する多くの方法は、本発明から獲得される。本発明から獲得されるより特定の方法は、抑制因子、または刺激因子または調節因子を同定する方法であり、この方法は、候補物質と共に、Ｏｓｔｅｒｉｘを発現するか、あるいは発現し得る細胞を混合する工程および候補物質がＯｓｔｅｒｉｘの発現を、抑制、刺激または調節するか否かを同定する工程を包含する。Ｏｓｔｅｒｉｘを発現する細胞は、組換えＯｓｔｅｒｉｘを発現するように遺伝子操作された細胞または骨芽細胞を含み得る。なお別の実施形態において、Ｏｓｔｅｒｉｘ  ｃＤＮＡを含むトランスフェクト細胞は、Ｏｓｔｅｒｉｘの転写制御下にあるレポーター遺伝子と同時にトランスフェクトされ得る。従って、例えば、候補物質がＯｓｔｅｒｉｘ発現を誘導または刺激する場合、Ｏｓｔｅｒｉｘによりその発現が制御されるレポーター遺伝子は、発現され、そして測定される。このレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質またはその発現が容易に検出される他の任意の遺伝子であり得る。
【００４５】
従って、Ｏｓｔｅｒｉｘ転写のエフェクターを同定する方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）Ｏｓｔｅｒｉｘを発現するベクターおよびＯｓｔｅｒｉｘ発現を測定するレポーター遺伝子、ならびに（ｉｉ）候補物質を混合する工程、ならびにこのＯｓｔｅｒｉｘによるレポーター遺伝子の転写を変更する候補物質を同定する工程。Ｏｓｔｅｒｉｘを発現するベクターは、組換えＯｓｔｅｒｉｘを発現する遺伝子操作細胞において含まれ得る。
【００４６】
エフェクターは、Ｏｓｔｅｒｉｘによる前駆細胞の骨芽細胞への細胞分化を、刺激または調節する物質である。
【００４７】
本発明はまた、刺激因子を同定する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：ａ）Ｏｓｔｅｒｉｘを発現する能力のある前駆細胞集団を含む組成物を混合する工程；ｂ）候補物質とこの混合物をインキュベートする工程；ｃ）前駆細胞の分化についてこの混合物を試験する工程；およびｄ）前駆細胞の骨芽細胞への分化を刺激する候補物質を同定する工程。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、間葉前駆細胞であり得る。
【００４８】
本発明はまた、抑制因子または刺激因子を同定する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）Ｏｓｔｅｒｉｘを発現する組換え細胞の集団を含む第１の組成物と骨芽細胞集団を含む第２の組成物とを混合する工程；（ｂ）候補物質と共にこの混合物をインキュベートする工程；（ｃ）骨芽細胞の活性化についてこの混合物を試験する工程；および（ｄ）骨芽細胞の活性化を、抑制または刺激する候補物質を同定する工程。
【００４９】
本発明は、さらに骨芽細胞において、Ｏｓｔｅｒｉｘに結合することによって、Ｏｓｔｅｒｉｘの活性を調節する因子を提供する。これらの因子は、骨形成のＯｓｅｒｉｘ媒介性の活性化を、抑制、刺激または調節し得る。従って、これらの因子は、骨粗鬆症、骨折修復の加速、骨組織再構築および他の骨障害のための治療に有効に使用され得る。より好ましい実施形態において、本発明のこれらの因子は、薬学的に受容可能な媒体において処方される。いくつかの実施形態において、これらの因子は、骨芽細胞において天然に存在するタンパク質であり得る。
【００５０】
それゆえ、これらの因子（タンパク質）は、酵母ツーハイブリット法によって同定され得る。この因子はまた、骨芽細胞からＯｓｔｅｒｉｘを沈殿させるためにＯｓｔｅｒｉｘ特異的抗体を使用し、それにより、Ｏｓｔｅｒｉｘに結合し、そして調節するいくつかの因子を共沈させることによって同定され得る。共沈された因子は、タンパク質配列決定または当業者に公知の他の方法により同定され得る。
【００５１】
Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子、タンパク質、骨細胞の分化を活性化するか、または刺激するタンパク質と相互作用する因子は、以下のいくつかの骨障害の処置のために使用され得る：例えば、骨粗鬆症、グルココルチコイド誘導性骨粗鬆症、パジェット病、骨代謝回転の異常な増加、歯周病、歯の欠損、骨折、慢性関節リウマチ、補綴周囲の（ｐｅｒｉｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）骨溶解、骨形成不全症、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症など。
【００５２】
長年にわたる特許法上の習慣に従って、単語「ａ」および「ａｎ」は、本明細書（特許請求の範囲を含む）において単語と共に使用される場合、「１つ以上」を意味する。
【００５３】
本発明の他の目的、特徴および利益は、以下に記載される説明から明らかとなる。しかしながら、本発明の精神および範囲内にある種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者に明らかなので、本発明の好ましい実施形態とは示されているものの詳細な説明および特定の実施例は、例示のみのために提供されることが理解されるべきである。
【００５４】
（例示的な実施形態の説明）
（Ａ．序論）
骨形成は、間葉細胞前駆体の、骨芽細胞への分化を含む複雑なプロセスである。骨芽細胞前駆体と骨芽細胞系列の細胞との相互作用は、骨芽細胞形成に欠くことができない。骨芽細胞特異的転写因子Ｃｂｆａ１は、相当長い間、骨芽細胞の分化に必須であることが公知である。この分化経路を制御する他の転写因子もまた存在することが推測された。
【００５５】
本発明者らは、骨芽細胞が、これまで未知の少なくとも１つの転写因子を、最初に骨芽細胞となった時点で特異的に発現することを示した。この遺伝子は、骨芽細胞分化の時点で新生骨において発現され、そしてまた、二次骨化中心において、より後にも発現され、このことは、その発現が、より成熟した骨芽細胞において維持されることを示す。本発明者らは、この遺伝子を不活化し、そしてこの遺伝子についてホモ接合性変異体であるマウスを作製した。これらのマウスは、骨を完全に欠く。従って、Ｏｓｔｅｒｉｘは、骨芽細胞分化を制御するマスター転写因子である。
【００５６】
本発明者らは、この分子を、配列番号２に規定されるとおりの、４２８アミノ酸を含むと特徴付けした。さらに、この同定された分子は、ジンクフィンガードメインおよびプロリンリッチドメインを含むトランス活性化ドメインからなる。骨芽細胞および骨芽細胞の前駆細胞中の遺伝子発現の特殊化に起因して、本発明者らは、同定された４２８アミノ酸分子に「Ｏｓｔｅｒｉｘ」との名称を付けた。
【００５７】
Ｏｓｔｅｒｉｘのジンクフィンガードメインは、配列番号２のアミノ酸２９０〜３７４によって規定される、これまで記載された転写因子Ｓｐ−１、Ｓｐ−２、Ｓｐ−３およびＳｐ−４中の類似のモチーフとの相同性を顕著に示す（図２Ｂを参照のこと）、３つのジンクフィンガーを含むとさらに特徴付けられ得る。しかし、この３つのジンクフィンガーを含むドメインの外側では、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質は、これらの４つの転写因子とも、他のあらゆる転写因子とも、何の相同性も示さなかった。対照的に、Ｓｐ−１、Ｓｐ−２、Ｓｐ−３およびＳｐ−４は、それらのジンクフィンガードメインの内側および外側の両方でかなりの相同性を示す。
【００５８】
本発明者らは、マウスＯｓｔｅｒｉｘのカルボキシ末端に存在するペプチドを用いて抗Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体を作製した。この抗体は、ＢＭＰ２処理Ｃ２Ｃ１２細胞中に存在する約４９ｋＤａの移動度のポリペプチドを認識した。このポリペプチドは、マウスＯｓｔｅｒｉｘ  ｃＤＮＡを発現するベクターを用いたＣＯＳ７細胞のトランスフェクション後に検出された組換えタンパク質と同じ移動度を有した（図３）。
【００５９】
本明細書中以下で使用される場合、用語Ｏｓｔｅｒｉｘは、全長分子だけでなく、この分子のアイソフォーム、グリコシル化形態および非グリコシル化形態、ならびにＯｓｔｅｒｉｘファミリーの他のメンバーを含むと解釈されるものとする。異なるアイソフォームは、骨芽細胞調製物（例えば、ＢＭＰ２処理Ｃ２Ｃ１２株）の抽出物から、Ｏｓｔｅｒｉｘの異なるドメインに対するポリクローナル抗Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体またはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いる免疫沈降によって精製され得る。異なるアイソフォームもまた、組換え形態で生成され得る。この目的のために、各アイソフォームをコードするｃＤＮＡは、細菌、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞において発現され、そして発現されたタンパク質は、Ｏｓｔｅｒｉｘに対する抗体を用いて精製される。
【００６０】
本発明者らは、本明細書中に記載されるＯｓｔｅｒｉｘタンパク質および／またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドが、骨形成を制御するために機能するだけでなく、特定の抗原（例えば、抗原の炭水化物部分またはペプチド部分）の効果的認識および取込みをも媒介してこのタンパク質を活性化し得、そして骨形成を刺激し得ることを意図する。さらに、本明細書中に記載されるタンパク質および／またはポリペプチドは、可溶性分子（例えば、サイトカイン、増殖因子、化学的メディエーター）のレセプターとして；骨芽細胞の移動を媒介するホーミング／接着／ローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）レセプターとして；それによって骨芽細胞の機能を調節するシグナル伝達レセプターとして；および／またはそれによってそれらの機能を調節し得る骨芽細胞上のシグナル伝達レセプターリガンドとして役立ち得る。さらに、本発明のタンパク質および／またはポリペプチドは、Ｏｓｔｅｒｉｘをまた認識する、非骨芽細胞集団（例えば、軟骨細胞、例えば歯などにおける間葉細胞、または他の細胞型）へと活性化シグナルを伝達し得る。
【００６１】
（Ｂ．ＯｓｔｅｒｉｘについてのＤＮＡセグメントおよびＲＮＡセグメント）
（１．ＤＮＡセグメント）
本発明の重要な局面は、Ｏｓｔｅｒｉｘをコードする、単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクター、ならびにＯｓｔｅｒｉｘを発現するＤＮＡ技術の適用を通した組換え宿主細胞の作製および使用に関する。
【００６２】
より詳細には、本発明は、他の哺乳動物ゲノムＤＮＡセグメントまたは総染色体から単離された哺乳動物ＤＮＡセグメントに関する。本発明のＯｓｔｅｒｉｘＤＮＡセグメントについての好ましい供給源は、ヒト遺伝子配列である。本発明のＯｓｔｅｒｉｘ配列をクローニングする際に、確立された骨芽細胞株を有利に選択し得る。しかし、他の供給源（例えば、少なくともいくつかの骨芽細胞を含む、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）は同じ程度に適切である。特に、本発明のＤＮＡセグメントは、Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ  ＃  ＣＲＬ  １７７２）と名付けられた、ＢＭＰ２処理マウス細胞株（これは通常、骨格筋細胞の先駆体である）から単離可能であることが見出されている。本発明のＤＮＡセグメントは、組換え宿主細胞に組み込まれた場合、Ｏｓｔｅｒｉｘ様活性またはＯｓｔｅｒｉｘ様特性（例えば、本明細書中で以下で規定された）を組換え宿主細胞へと付与し得る。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡセグメント」とは、特定の種の、総ゲノムＤＮＡおよび染色体を含まない、実質的に単離されたＤＮＡ分子をいう。それゆえ、ＯｓｔｅｒｉｘをコードするＤＮＡセグメントとは、比較的多数の骨芽細胞を含むことが既知の組織またはＢＭＰ２処理Ｃ２Ｃ１２株の総ゲノムＤＮＡからなお単離されたかまたは精製された、Ｏｓｔｅｒｉｘコード配列を含むＤＮＡセグメントをいう。用語「ＤＮＡセグメント」に含まれるのは、ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、ならびにまた、組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む）である。
【００６４】
同様に、単離または精製されたＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を含むＤＮＡセグメントとは、天然に存在する他の遺伝子またはタンパク質コード配列から実質的に単離されている、Ｏｓｔｅｒｉｘコード配列および特定の局面では調節配列を含む、ＤＮＡセグメントをいう。この局面では、用語「遺伝子」は、簡略化のために、ポリペプチドまたは機能的タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを言及するために用いられる。当業者によって理解されるように、この機能的用語は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現するかまたは発現するように適用され得る、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列およびより小さな操作された遺伝子セグメントの両方を含む。
【００６５】
「他のコード配列から実質的に単離された」とは、目的の遺伝子（この場合、Ｏｓｔｅｒｉｘ）が、ＤＮＡセグメントのコード領域の重要な部分を形成することおよびこのＤＮＡセグメントが天然に存在するコードＤＮＡの大きな部分（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子もしくはｃＤＮＡコード領域）を含まないことを意味する。もちろん、これは、もともと単離されたＤＮＡセグメントを言及し、そして後で人工的にこのセグメントに付加された遺伝子もコード領域も排除しない。
【００６６】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号２によるアミノ酸配列（ヒトまたは哺乳動物のＯｓｔｅｒｉｘに対応する）をそのアミノ酸配列内に含む、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を組み込んだ、単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明は、本質的に配列番号２に示すとおりのアミノ酸配列をそのアミノ酸配列内に含む、タンパク質またはポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。もちろん、このＤＮＡセグメントもしくはベクターが全長Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質をコードする場合、またはこれらがＯｓｔｅｒｉｘタンパク質を発現する際に使用されることが意図される場合、最も好ましい配列は、本質的に配列番号２に示すとおりの配列および（例えば、本明細書中に開示されるような、任意の適切なアッセイによって決定され得るような）骨芽細胞／骨芽細胞転写活性を保持するタンパク質コードする配列である。
【００６８】
用語「本質的に配列番号２に示すとおりの配列」とは、この配列が、配列番号２の一部に実質的に対応し、そして配列番号２のアミノ酸に同一でないかまたは生物学的に機能的に等価でないアミノ酸が比較的少ないことを意味する。用語「生物学的に機能的に等価」は、当該分野で周知であり、そしてさらに本明細書中で詳細に定義される。従って、配列番号２のアミノ酸と同一であるかまたは機能的に等価な、約７０％と約８０％との間（またはより好ましくは約８１％と約９０％との間；またはさらにより好ましくは約９１％と約９９％との間）のアミノ酸を有する配列は、「本質的に配列番号２に示すとおり」である配列である。
【００６９】
特定の他の実施形態では、本発明は、本質的に配列番号１に示すとおりの核酸配列をその配列内に含む、単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。用語「本質的に配列番号１に示すとおり」は、上記と同じ意味で用いられ、そして核酸配列が配列番号１の一部に実質的に対応し、かつ配列番号１のコドンと同一でないかまたは機能的に等価でないコドンが比較的少ないことを意味する。さらに、骨芽細胞転写活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡセグメントが最も好ましい。用語「機能的に等価なコドン」は、同じアミノ酸をコードするコドン（例えば、アルギニンまたはセリンについての６個のコドン）を言及するように、そしてまた生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンを言及するように、本明細書中で用いられる。表１は、アミノ酸および各アミノ酸をコードするコドンを示す。
【００７０】
【表１】
2004537968.tif 000003
高レベルのタンパク質産生が、骨芽細胞分化に関する基準を下げることによって達成され得ることは、特定の局面において、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、活性を欠くタンパク質を産生することは、本発明の範囲内である。このようなタンパク質は、非常に高容量において、そのタンパク質に対する抗体を惹起するために有用であり得る。他の局面において、活性が所望であり、そして詳細な例は、骨芽細胞分化活性を維持するタンパク質および／またはポリペプチドを得るための好ましい方法を説明する。
【００７１】
アミノ酸配列および核酸配列は、さらなるＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸、あるいは５’配列または３’配列のようなさらなる残基を含み得、そしてその配列が上記の基準（タンパク質発現が考慮される場合、骨芽細胞分化活性の維持が挙げられる）に合う限り、依然として、本質的に、本明細書中に開示される配列の１つに記載されるようなものであることもまた、理解される。末端配列の付加は、例えば、コード領域の５’部分または３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得るか、あるいは遺伝子内に生じることが既知である種々の内部配列（すなわち、イントロン）を含み得る核酸配列に特に適用される。
【００７２】
イントロン領域または隣接領域を除いて、そして遺伝コードの縮重を入れて、約６５％と約８０％との間、またはより好ましくは、約８０％と約９０％との間；またはなおより好ましくは、約９０％と約９９％との間の、配列番号１のヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有する配列は、「本質的に配列番号１に記載されるような」配列である。配列番号１に記載される配列と本質的に同じである配列はまた、比較的ストリンジェントな条件下で、配列番号１の相補体を含む核酸セグメントにハイブリダイズし得る配列として、機能的に定義され得る。適切な比較的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であり、そして本明細書中に明白に記載されており、例えば、比較的低い塩および／または高温の条件（例えば、高い選択性を必要とする適用に対して、５０℃〜７０℃の温度で、０．０２Ｍ〜０．１５Ｍ  ＮａＣｌによって提供されるような）のような条件である。このような比較的ストリンジェントな条件は、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間の、もしあったとしてもほとんどないミスマッチを許容し、そしてＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を単離するために特に適切である。
【００７３】
例えば、マウス組織（例えば、骨芽細胞および二次骨形成中心）ならびに細胞株（例えば、Ｃ２Ｃ１２株）におけるＯｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡの発現は、高ストリンジェントな条件下（６５℃で０．１２Ｍ  ＮａＣｌ）で、ノーザンブロッティングにおいて、全長ｃＤＮＡプローブ（すなわち、配列番号１）を用いて、容易に検出可能であった。同様に、Ｏｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡは両方、ＲＴ−ＰＣＲＴＭによって検出可能であった。これらの結果は、マウスＯｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡが、配列番号１のヌクレオチドと同一であるかまたはこのヌクレオチドを含むヌクレオチド配列（ｃＤＮＡのプローブまたはプライマーのいずれかとして）を用いて検出可能であることを示す。Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体が転写研究に添加された場合、ＤＮＡ結合は特異的に阻害された（図４Ａおよび図４Ｂ）。組換えＯｓｔｅｒｉｘが、コンセンサスＳＰ１オリゴヌクレオチドに結合することもまた、示された。アミノ酸残基２７〜１９２の間のプロリンリッチセグメントは、強力な転写活性化活性を有した。従って、Ｏｓｔｅｒｉｘは、転写因子の原則的な特徴を示した。Ｏｓｔｅｒｉｘはさらに、核タンパク質であることが示された。
【００７４】
戻し交配マウスから得られたゲノムＤＮＡのパネルを使用して、マウスゲノムにおいて、Ｏｓｔｅｒｉｘに関する遺伝子をマッピングした。戻し交配した動物を、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×Ｍ  Ｓｐｒｅｔｕｓ）マウスとＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより提供されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの間の交配から生成した。この遺伝子は、マウスの第１５染色体に対して、ヒトにおける染色体１２ｑ１３と相同領域にマッピングされることが示された（図８Ａおよび図８Ｂ）。
【００７５】
当然、本発明はまた、配列番号１に記載される配列と相補的であるか、または本質的に相補的である、ＤＮＡセグメントを包含する。「相補的な」核酸配列とは、標準的なワトソン−クリック相補規則に従って塩基対合し得る配列である。すなわち、より大きなプリンがより小さなピリミジンと常に塩基対合して、シトシンと対合したグアニン（Ｇ：Ｃ）、およびＤＮＡの場合にはチミンと対合したアデニン（Ａ：Ｔ）、またはＲＮＡの場合にはウラシルと対合したアデニン（Ａ：Ｕ）の組合せのみを形成する配列である。
【００７６】
本明細書中において使用される場合、用語「相補的配列」とは、上記の同じヌクレオチド比較によって評価され得る場合、または本明細書中に記載される条件のような比較的ストリンジェントな条件下で、配列番号１の核酸セグメントにハイブリダイズし得ると定義される場合に、実質的に相補的である核酸配列を意味する。従って、これらの相補的配列は、その全長にわたって実質的に相補的であり、そして非常に少ない塩基ミスマッチを有する。例えば、６塩基長の核酸配列は、これらが１つのみのミスマッチを有して６つの位置のうちの５つでハイブリダイズする場合に、相補的であると称され得る。当然、「完全に相補的な」核酸配列とは、その全長にわたって完全に相補的であり、そして塩基ミスマッチを有さない、核酸配列である。等価なものは、転写活性を示す。これは、この核酸配列を非Ｏｓｔｅｒｉｘ核酸配列から区別する１つの特徴である。
【００７７】
アンチセンス構築物は、ＤＮＡ分子（例えば、遺伝子またはｃＤＮＡであり、遺伝子のエキソンとイントロンとの両方、およびエキソン：イントロンの境界を含む）のコードセグメントに対して相補的なヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。アンチセンス分子は、所定の遺伝子または構築物の転写、翻訳またはこれらの両方を阻害するよう設計され、その結果、得られるタンパク質産物のレベルが低減または減少される。アンチセンスＲＮＡ構築物、またはこのようなアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを使用して、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞において（例えば、ヒト被験体を含む宿主動物において）、遺伝子の転写または翻訳、あるいはその両方を阻害し得る。
【００７８】
（２．ハイブリダイゼーションプローブ）
本発明の核酸セグメントは、コード配列自体の長さにかかわらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組み合わせられ得、その結果、それらの全体の長さは、大いに変動し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ることが意図され、全長は、好ましくは、調製の容易さ、および意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける用途によって制限される。Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の発現を指向する際のそれらの用途に加えて、本明細書中に開示される核酸配列はまた、他の種々の用途を有する。例えば、これらはまた、核酸ハイブリダイゼーションの実施形態において、プローブまたはプライマーとしての有用性を有する。従って、配列番号１の１４ヌクレオチド長の連続する配列と同じ配列を有するか、またはこの配列に相補的である、少なくとも１４ヌクレオチド長の連続配列からなる配列領域を含む、核酸セグメントが、特定の有用性を見出すことが意図される。同一であるかまたは相補的である、より長い連続配列（例えば、約１４、１５、１６、１７、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１１００、１２００、１２４８、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００〜２９５０（全ての中間の長さを含む）のヌクレオチドの配列）、および約２．９ｋｂの全長配列までさえもがまた、特定の実施形態において有用である。
【００７９】
「中間の長さ」とは、この文脈において、示された範囲の間の任意の長さ（例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００；１，０００〜２，０００；２，０００〜３，０００；３，０００〜５，０００；５，０００〜１０，０００の範囲にわたる全ての整数を含み、そして約１２，００１、１２，００２、１３，００１、１３，００２まで（これらの値を含む）などの配列）を意味することが、容易に理解される。
【００８０】
このような核酸プローブがＯｓｔｅｒｉｘコード配列に特異的にハイブリダイズする能力は、これらが所定のサンプルにおける相補的配列の存在を検出する際に有用であることを可能にする。しかし、他の用途が予測され、これには、変異体種のプライマー、または他の遺伝構築物を調製する際の使用のためのプライマーの調製のための、配列情報の使用が挙げられる。
【００８１】
配列番号１と同一であるかまたは相補的である、１０、２０、３０、５０、または１００〜２００もなどのヌクレオチドの連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有する核酸分子は、例えば、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして、特に意図される。これは、Ｏｓｔｅｒｉｘの構造遺伝子または調節遺伝子が、組織および細胞の両方において分析されることを可能にする。本発明者らは、Ｏｓｔｅｒｉｘに対するヒトＤＮＡを生成した。このヒトｃＤＮＡの推定アミノ酸配列は、マウス配列と９５％同一である（図１０）。本発明者らはまた、ヒトＯｓｔｅｒｉｘに対するゲノムＤＮＡの配列を同定した。フラグメントの全サイズ、および相補的ストレッチのサイズは、最終的に、特定の核酸セグメントの意図される使用または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般に、ハイブリダイゼーションの実施形態において用途を見出し、ここで、連続する相補領域の長さは変動し得る（例えば、約１０ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出することが望まれる相補的配列の長さに従って、約２．９ｋｂまでのより大きな連続した相補的ストレッチが使用され得る。
【００８２】
約１０〜１４ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定かつ選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。１０塩基長より長いストレッチにわたる連続した相補的配列を有する分子が、一般に好ましいが、ハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度を改善するためには、一般に、１５〜２０の連続したヌクレオチド、または望ましい場合にはなおより長いヌクレオチドの遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計することが、好ましい。
【００８３】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に開示される配列のいずれかの任意の部分から選択され得る。必要とされることの全ては、配列番号１に記載の配列を再検討し、そしてプローブまたはプライマーとして利用することを望む約１０ヌクレオチド長から全長配列まで（全長配列を含む）の配列の任意の連続した部分を選択することである。プローブ配列およびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、例のみとして、さらなるＤＮＡを増幅するために、全配列の末端の近く由来のプライマー、または機能的ドメインをコードする配列の末端由来のプライマーを使用することを望み得る；ＤＮＡ全体、またはジンクフィンガー領域、またはプロリンリッチ配列に対応するプローブを使用して、他の種由来のＯｓｔｅｒｉｘ型遺伝子をクローニングし得るか、またはヒトを含む任意の種由来のさらなるＯｓｔｅｒｉｘ様遺伝子もしくは相同遺伝子をクローニングし得る；そしてジンクフィンガーまたはプロリンリッチ配列を中心とした配列を有する、野生型および変異体のプローブまたはプライマーを使用して、ＯｓｔｅｒｉｘについてＤＮＡサンプルをスクリーニングし得る。さらに、異なるＯｓｔｅｒｉｘアイソフォーム周辺を中心とする配列を有するプローブまたはプライマーを使用し得る。
【００８４】
配列番号１から連続した配列を含む核酸セグメントを選択および調製するプロセスは、代替的に、核酸フラグメントの調製として記載され得る。もちろん、フラグメントはまた、他の技術によって（例えば、機械的せん断によってかまたは制限酵素消化によって）得られ得る。小さな核酸セグメントまたはフラグメントは、自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して通常実施されるように、例えば、化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸再生技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，６８２，１９５号（各々が本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、選択された配列を組換え産生のための組換えベクターに導入することによって、および分子生物学の当業者に一般的に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【００８５】
従って、本発明のヌクレオチド配列は、それらがＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子またはｃＤＮＡの相補的ストレッチと二重鎖分子を選択的に形成する能力のために、使用され得る。予測される適用に依存して、種々の条件のハイブリダイゼーションを使用して、標的配列に対するプローブの種々の程度の選択性を達成することが望まれる。高い選択性を必要とする適用については、代表的に、ハイブリッドを形成するために、比較的ストリンジェントな条件を使用することが望まれる。例えば、比較的低い塩および／または高温の条件（例えば、５０℃〜７０℃の温度で、０．０２Ｍ〜０．１５Ｍ  ＮａＣｌによって提供されるような）が選択される。このような選択条件は、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間の、もしあったとしてもほとんどないミスマッチを許容し、そしてＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を単離するために特に適切である。
【００８６】
もちろん、いくつかの適用（例えば、基礎をなすテンプレートにハイブリダイズした変異体プライマー鎖を使用して、変異体を調製することを望む適用、または関連する種由来のＯｓｔｅｒｉｘコード配列、機能的等価物などを単離することを求める適用）については、ヘテロ二重鎖の形成を可能にするために、より低いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件が、代表的に、必要とされる。これらの状況において、２０℃〜５５℃の範囲にわたる温度で０．１５Ｍ〜１．０Ｍの塩のような条件を使用することが望まれ得る。これによって、交差ハイブリダイズ種が、コントロールハイブリダイゼーションに対して陽性にハイブリダイズするシグナルとして、容易に同定され得る。実際に、本発明者らはまた、低ストリンジェンシーな条件下（１Ｍ  ＮａＣｌ、３０〜４５％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、３７℃）で、マウスＯｓｔｅｒｉｘの配列（配列番号９）とヒトｃＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションさせることによって、マウスＯｓｔｅｒｉｘに対するヒト等価物を検出し得た。いずれの場合においても、ＮａＣｌ濃度を低下させることによって、または漸増量のホルムアミドの添加によって、条件はよりストリンジェントにされ得、これは、上昇した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化させるよう働くことが、一般的に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は容易に操作され得、従って、一般に、所望の結果に依存する、えり抜きの方法である。
【００８７】
特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションを決定するために、本発明の核酸配列を適切な手段（例えば、標識）と組み合わせて使用することは、有利である。広範な種々の適切な指示薬手段が、当該分野において公知であり、これには、蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンド、または検出可能なシグナルを与え得る他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）が挙げられる。好ましい実施形態において、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ（例えば、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ）を使用することが、望ましいようである。酵素タグの場合には、ヒトの目によってかまたは分光測光的に可視の手段を提供して、相補的な核酸を含むサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定するために使用され得る比色定量指示薬基質が公知である。
【００８８】
一般に、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーションプローブは、溶液ハイブリダイゼーションおよび固相を使用する実施形態の両方における試薬として有用であることが、予測される。固相を含む実施形態において、試験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）が、選択されたマトリックスまたは表面に、吸着または他の様式で固定される。次いで、この固定された一本鎖核酸は、所望の条件下で、選択されたプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに供される。選択される条件は、必要とされる特定の基準（例えば、Ｇ＋Ｃ含有量、標的核酸の型、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブの大きさなどに依存する）に基づく特定の状況に依存する。非特異的に結合したプローブ分子を除去するための、ハイブリダイズした表面の洗浄に続いて、標識によって、特異的ハイブリダイゼーションが検出されるか、または定量さえされる。
【００８９】
本発明は、配列番号１という特定の核酸配列および配列番号２という特定のアミノ酸配列に限定されないこともまた、理解される。従って、組換えベクターおよび単離されたＤＮＡセグメントは、Ｏｓｔｅｒｉｘコード領域自体、基本的なコード領域における選択された変更もしくは改変を保有するコード領域を様々に含み得るか、またはこれらは、それにもかかわらずＯｓｔｅｒｉｘコード領域を含む、より大きなポリペプチドをコードし得るか、または改変体アミノ酸配列を有する、生物学的に機能が等価なタンパク質もしくはポリペプチドをコードし得る。
【００９０】
本発明のＤＮＡセグメントは、生物学的に機能が等価なＯｓｔｅｒｉｘタンパク質およびポリペプチドを包含する。このような配列は、核酸配列および従ってコードされるタンパク質に天然に存在することが公知である、コドンの縮重および機能的等価性の結果として生じ得る。あるいは、機能的に等価なタンパク質またはポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術の適用を介して作製され得、ここで、タンパク質構造における変化は、交換されるアミノ酸の特性の考慮に基づいて、操作され得る。ヒトによって設計される変化は、部位特異的変異誘発技術の適用を介して導入されて、例えば、タンパク質の抗原性に改善を導入し得るか、または分子レベルで転写活性を試験するために、Ｏｓｔｅｒｉｘ変異体を試験し得る。
【００９１】
所望であればまた、例えば、Ｏｓｔｅｒｉｘコード領域が、例えば、精製または免疫検出の目的で、所望の機能を有する他のタンパク質またはポリペプチドと同じ発現ユニットにおいて整列している、融合タンパク質およびポリペプチドを調製し得る（例えば、それぞれアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得るタンパク質、または酵素標識コード領域によって同定され得るタンパク質）。
【００９２】
（３．組換えベクターおよびタンパク質発現）
組換えベクターは、本発明のさらなる重要な局面を形成する。特に有用なベクターは、ＤＮＡセグメントのコード部分（全長タンパク質をコードしていてもより小さなポリペプチドをコードしていても）がプロモーターの制御下におかれているベクターであることが意図される。プロモーターは、例えば骨芽細胞において、コードセグメントまたはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を、例えば、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲＴＭの技術を、本明細書中に開示される組成物と組み合わせて使用して、単離することによって得られ得るような、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子と天然に会合するプロモーターの形態であり得る（ＰＣＲＴＭの技術は、米国特許第４，６８３，２０２号および米国特許第４，６８２，１９５号（各々が本明細書中に参考として援用される）に開示されている）。
【００９３】
（ａ．プロモーターおよびエンハンサー）
哺乳動物細胞においてタンパク質コード遺伝子の転写を制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝エレメントを含む。細胞の機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）は、各エレメントにより運ばれる調節情報を収集および統合し得、異なる遺伝子が、異なる、しばしば複雑なパターンの転写調節を発展させることを可能にする。
【００９４】
用語プロモーターは、本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための開始部位の周囲にクラスター形成した転写制御モジュールの群をいうために使用される。プロモーターがどのように組織化されるかに関する判断の多くは、いくつかのウイルスプロモーター（ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写ユニットのためのプロモーターが挙げられる）の分析に由来する。より最近の研究によって増加した、これらの研究は、プロモーターが、不連続な機能的モジュールを含み、各々のモジュールが、約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして転写アクチベータータンパク質のための１つ以上の認識部位を含むことを示した。各プロモーターにおける少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成のための開始部位の位置を決めるよう機能する。この最も知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のためのプロモーター）においては、開始部位自体に重なる不連続なエレメントが、開始の位置を固定することを補助する。
【００９５】
さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。近年、多数のプロモーターが、その開始部位から下流に機能的エレメントを含むことが示されているが、代表的には、これらのエレメントは、開始部位の３０−１１０ｂｐ上流の領域に位置する。エレメント間の間隔は、フレキシブルであり、その結果、プロモーター機能は、エレメントがお互いに対して逆向きになった場合でも、または移動された場合でも、維持される。ｔｋプロモーターにおいて、エレメント間の間隔は、活性が減少し始めるまで、５０ｂｐ離れるまで、増加し得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するために、共同的に、または独立してのいずれかにおいて、機能し得るようである。
【００９６】
エンハンサーは、最初は、ＤＮＡの同一分子上において、離れた場所に位置する、プロモーターからの転写を増加する遺伝エレメントであるとして検出された。離れた距離にわたって作用するこの能力は、原核生物転写調節の古典的研究において、ほとんど前例がない。
【００９７】
その後の研究は、エンハンサー活性を有するＤＮＡの領域は、プロモーターのように組織化されることを示した。すなわち、エンハンサー活性を有するＤＮＡ領域は、多数の個々のエレメントから構成され、エレメントの各々が、１つ以上の転写タンパク質と結合する。
【００９８】
エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な違いは、操作に関するものである。エンハンサー領域は全体として、かなり離れた転写を刺激し得なければならず；このことは、プロモーター領域またはその成分エレメントには、必ずしも当てはまらない。一方、プロモーターは、特定の部位において、特定の方向において、ＲＮＡ合成の開始を指示する１つ以上のエレメントを有さなくてはならないが、他方エンハンサーは、これらの特異性を有さない。この操作に関する差異とは別に、エンハンサーとプロモーターは、非常に似通った実体を有する。これらは、細胞内の転写活性化という、同一の一般的な機能を有する。これらは、しばしば、重複し、そして連続し、しばしば、非常に類似するモジュール構成を有するようである。これらを考慮すると、これらの考察は、エンハンサーとプロモーターが、相同な実体であり、そしてこれら配列に結合した転写活性化タンパク質は、基本的に同一の方法において、細胞転写機構と相互作用し得ることを示唆する。
【００９９】
本発明と共に使用され得るウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサー、および誘導性プロモーター／エンハンサーのリストは、表２および３に示される。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢによる）もまた、Ｏｓｔｅｒｉｘまたはアンチセンス構築物の発現を駆動するために使用され得る。
【０１００】
表２
代表的なプロモーター
【０１０１】
【表２】
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表３
エンハンサーおよびインデューサー
【０１０２】
【表３】
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コード配列をプロモーターの制御下に置くために、タンパク質の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端は、選択されたプロモーターの約１ヌクレオチド「下流」（すなわち、３’側）と約５０ヌクレオチド「下流」との間に配置されることが、当該分野で理解されている。さらに、真核生物発現が意図される場合、代表的に、ポリアデニル部位がもとのクローン化セグメント内に含まれない場合、共輸送体タンパク質を含む転写単位に、適切なポリアデニル化部位（例えば、５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）を組み込むことが所望される。代表的に、ポリＡ付加部位は、転写の終結の前のある位置で、タンパク質の終結部位の約３０〜約２０００ヌクレオチド「下流」に位置する。
【０１０３】
クローン化遺伝子およびそれらのプロモーターのインビボの発現を研究するための２つの基本的な手順がある。一過性の系において、目的の遺伝子は、培養された細胞の集団に導入され、そしてその活性は、数時間〜数日以内にアッセイされる。もとの一過性発現の研究は、キャプシド形成したＳＶ４０組換え体を利用した。わずかな細胞のみがこの組換え遺伝子を取込みそして発現するにすぎないが、異種遺伝子の転写が容易に検出され得る。あるいは、この組換え遺伝子のプロモーター（制御領域）が研究されている場合、このプロモーターおよびエンハンサーは、遺伝子のコード領域（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）、Ｅ．ｃｏｌｉクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ））でクローニングされ得る。このプロモーターの活性は、適切な遺伝子産物の存在についてアッセイすることによりモニターされ得る。
【０１０４】
クローン化遺伝子およびそれらの制御領域を研究するための第２の方法は、安定なトランスフェクションである。安定なトランスフェクションは、長期間連続培養物中のトランスフェクトされた遺伝子から中程度の発現レベルを得るために好ましい方法である。この方法において、組換えＤＮＡ分子は、ウイルス感染によって、ＤＮＡ媒介遺伝子移入技術によって導入される。形質転換されていない細胞の集団の間の組換え体の安定なトランスフェクト体の同定は、表現型の変化を必要とする。通常、薬物選択マーカーの封入は、安定な形質転換体の発見および選択を助ける。標的配列および列挙されたプロモーター／エンハンサーの組み合わせのいずれかを含む発現カセットをサブクローニングするために適切なプラスミドは、当業者に周知である。この標的配列およびプロモーター／エンハンサーを含むようなプラスミドは、安定なトランスフェクションプロトコルまたは一過性トランスフェクション手順において使用され得る。
【０１０５】
他の実施形態において、特定の利点は、コードＤＮＡセグメントを、組換え体、すなわち異種プロモーターの制御下に置くことにより得られることが意図される。本明細書中で使用する場合、組換え体または異種プロモーターは、その天然の環境でＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子と通常は会合していないプロモーターをいうことが意図される。このようなプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＬａｃＺ、ＬＴＲ、ＴＫ、ＰＯＬＨおよびＭＭＴＶ、または通常は他の遺伝子と会合している他のプロモーター、および／または任意の他の細菌、ウイルス、真核生物もしくは哺乳動物細胞から単離されるプロモーターが挙げられ得る。当然、発現のために選択された、細胞型、生物体、またはさらには動物におけるＤＮＡセグメントの発現を効率的に指示するプロモーターを用いることが重要である。タンパク質発現のためのプロモーターおよび細胞型の組み合わせの使用は、一般に、分子生物学の当業者に公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照のこと。用いられるプロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよく、そして組換えタンパク質またはポリペプチドの大スケールの生成において有益であるのと同様に、適切な条件下で、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルな発現を指示するために使用され得る。高レベルの発現において使用するために意図される適切なプロモーター系としては、ＣＭＶおよびＳＶ４０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
（ｂ．発現ベクター）
上記のように、組換えＯｓｔｅｒｉｘタンパク質およびポリペプチドを調製するための発現の実施形態と共に、より長いＤＮＡセグメントがもっともしばしば使用され、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質全体をコードするＤＮＡセグメントが最も好ましいことが意図される。しかし、抗Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体を作製するために使用され得るのと同様に、Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドまたはエピトープコア領域の発現を指示するより短いＤＮＡセグメントの使用もまた、本発明の範囲内であることが理解される。
【０１０７】
約１５〜約５０アミノ酸長、より好ましくは約１５〜約３０アミノ酸長のポリペプチド抗原をコードするＤＮＡセグメントは、特に有用であることが意図される。もちろん、これらのポリペプチドは、この範囲の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長）であり得る。これは、約１５アミノ酸長、約２０アミノ酸長、約２５アミノ酸長、約３０アミノ酸長、約３５アミノ酸長、約４０アミノ酸長、約４５アミノ酸長、または約５０アミノ酸長における「約」の意味であり、１つの状況において、「約」は、記載された長さより１〜４アミノ酸長いかまたは短い範囲を意味し、１４または１５ほどの長さが最小の長さである。ＤＮＡセグメントをコードするポリペプチドは、一般に、約４５〜約１５０、または約９０ヌクレオチドまでのオーダーの最小コード長を有する。全長タンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、配列番号２に従うタンパク質について、約１２８ヌクレオチドのオーダーの最小コード長を有し得る。
【０１０８】
本発明のＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチドの発現に戻ると、一旦、適切な（所望ならば、全長）クローンが得られると、それらがｃＤＮＡベースであるかゲノムであるかに関わらず、Ｏｓｔｅｒｉｘの組換え体調製のための発現系を調製することに進み得る。原核生物系または真核生物系における発現のためのＤＮＡセグメントの操作は、組換え発現の当業者に一般に公知の技術によって、実施され得る。実質的に任意の発現系が、Ｏｓｔｅｒｉｘの発現に用いられ得ると考えられる。
【０１０９】
Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質をコードするＤＮＡセグメントを用いる宿主細胞の形質転換は、活性なＯｓｔｅｒｉｘを得るために便利な手段を提供することが提案されている。しかし、別個の発現後の再構築はまた、確実に本発明の範囲内である。
【０１１０】
ｃＤＮＡ配列およびゲノム配列の両方が、真核生物発現のために適切である。なぜなら、宿主細胞は、一般に、ゲノム転写物をプロセシングして、タンパク質への翻訳のために機能的なｍＲＮＡを生じるからである。一般に、組換え遺伝子として、この遺伝子のｃＤＮＡバージョンを用いることが、より簡便であり得る。ｃＤＮＡバージョンの使用は、遺伝子のサイズが一般にゲノム遺伝子（これは代表的には、ｃＤＮＡ遺伝子よりも大きな桁までである）よりはるかに小さく、そして標的細胞をトランスフェクトするために、ゲノム遺伝子よりも容易に用いられ得るという点で、利点を提供する。しかし、本発明者らは、所望の場合、特定の遺伝子のゲノムバージョンを用いる可能性を除外しない。
【０１１１】
さらに、例えば、遺伝子産物の別個の部分に対する抗体を作製するために、この遺伝子産物の配列全体が未知のままである場合でさえ、部分配列を発現することが可能である。本明細書中で記載されるように、コンピュータープログラムは、潜在的な免疫学的有意性を有する領域の選択を助けるために利用可能である。例えば、この分析を実施し得るソフトウェアは、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）が商業的に容易に入手可能である。このソフトウェアは代表的に、タンパク質の表面上に特徴的に見出され、従って、抗原性決定因子として作用する可能性のある親水性配列を位置決めするための標準的なアルゴリズム（例えば、Ｋｙｔｅ／ＤｏｏｌｉｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法）を使用する。
【０１１２】
多量のタンパク質またはポリペプチドの組換え産生において、このタンパク質を分析して、推定膜貫通配列を検出することが得策であり得る。このような配列は、代表的に、非常に疎水性であり、そして標準的な配列分析ソフトウェア（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ））の使用により容易に検出される。膜貫通タンパク質が、多くの発現系（特に、Ｅ．ｃｏｌｉ）において合成される場合、膜貫通配列の存在は、しばしば、有害である。なぜなら、これはそのタンパク質のネイティブのコンフォメーションへの再生が困難な不溶性凝集体の生成を生じるからである。膜貫通配列の欠失は、代表的に、残りの構造のコンフォメーションを有意には変更しない。
【０１１３】
さらに、膜貫通配列（その名が示す通り、膜内に包埋されている）は、接近不可能である。従って、これらの配列に対する抗体は、一般に、インビボ研究またはインサイチュ研究において有用である。発現のために使用される遺伝子からの膜貫通コード配列の欠失は、標準的な技術によって達成され得る。例えば、偶然配置された制限酵素部位が、所望の遺伝子フラグメントを切除するために使用され得るか、またはＰＣＲＴＭ型増幅が、この遺伝子の所望の部分のみを増幅するために使用され得る。
【０１１４】
本明細書中で使用する場合、用語「操作された」および「組換え」細胞は、外因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子（例えば、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチドをコードするｃＤＮＡまたは遺伝子）が導入された細胞をいうことが意図される。従って、操作された細胞は、組換え導入された外因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子を含まない天然に存在する細胞と区別可能である。従って、操作された細胞は、ヒトの手により導入された遺伝子を有する細胞である。組換え細胞は、導入されたｃＤＮＡまたはゲノム遺伝子を有する細胞を含み、そしてまた、特定の導入遺伝子とは天然では会合しないプロモーターに隣接して位置する遺伝子を含む。
【０１１５】
本発明に従って、組換えＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチド（変異体であろうと野生型であろうと）を発現するために、１つ以上のプロモーターの制御下にあるＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチドコード核酸セグメントを含む発現ベクターを調製する。コード配列をプロモーターの「制御下」に置くために、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を、一般に、選択されたプロモーターの約１ヌクレオチド下流（すなわち、３’側）と約５０ヌクレオチド「下流」との間に配置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、そしてコードされた組換えタンパク質の発現を促進する。これは、この状況において、「組換え発現」の意味である。
【０１１６】
種々の宿主発現系においてタンパク質またはポリペプチドの発現を達成するために、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を含む発現ベクターを構築するための多くの標準的な技術が利用可能である。発現のために利用可能な細胞型としては、組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
原核生物宿主の特定の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−、原栄養菌性の、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２７３３２５）；杆菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；ならびに他の腸内細菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓおよび種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種）である。
【０１１８】
一般に、レプリコンおよび宿主細胞と適合性の種から誘導される制御配列を含むプラスミドベクターは、これらの宿主と共に使用される。このベクターは、通常、複製起源、および形質転換細胞において表現型選択を提供し得るマーク配列を有する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、しばしば、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ亜種由来のプラスミド）を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン耐性よびテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含み、従って、形質転換細胞を同定するための手段を提供する。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドもしくはファージもまた、その独自のタンパク質を発現するために微生物により使用され得るプロモーターを含まなければならないか、またはこのようなプロモーターを含むように改変されなければならない。
【０１１９】
さらに、レプリコンおよび宿主微生物と適合性の制御配列を含むファージベクターは、これらの宿主と関連して、形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ファージλＧＥＭＴＭ−１１は、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２）を形質転換するために使用され得る組換えファージベクターを作製する際に使用され得る。
【０１２０】
より後の精製および分離または切断のための、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶縮合タンパク質の生成における使用のための、さらなる有用なベクターとしては、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５）；およびｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の適切な縮合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼを有する縮合タンパク質、ユビキチン、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）などである。
【０１２１】
組換えＤＮＡ構築において最も一般的に用いられるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター系、ラクトースプロモーター系、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。これらはもっとも一般的に用いられるが、他の微生物プロモーターが発見および利用されており、そして、それらのヌクレオチド配列に関連する詳細が公表されており、当業者が微生物プロモーターをプラスミドベクターと機能的に結合させることを可能にしている。
【０１２２】
細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における、組換えタンパク質生成に関連する以下の詳細は、一般的な組換えタンパク質生成についての例示的な情報から得られ、特定の組換え発現系に対するこれらの適応は、当業者に公知である。
【０１２３】
発現ベクターを含有する細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）を、多くの適切な培地（例えば、ＬＢ）のうちのいずれかにおいて増殖する。この組換えタンパク質の発現は、例えば、培地にＩＰＴＧを添加することか、またはインキュベーションをより高温に切り換えることによって、誘導され得る。この細菌を、さらなる（一般に、２〜２４時間の）期間にわたって培養した後、遠心分離によって細胞を収集し、そして洗浄して残渣の培地を除去する。
【０１２４】
次いで、この細菌細胞を、例えば、細胞ホモジナイザーにおける破壊によって溶解させ、そして遠心分離して、高密度な封入体および細胞膜を、可溶性細胞成分から分離する。この遠心分離は、この高密度な封入体が、緩衝液への糖（例えば、スクロース）の組み込み、および選択的な速度での遠心分離によって、選択的に富化される条件下で、行われ得る。
【０１２５】
組換えタンパク質が、多くの例における場合のように、封入体において発現される場合、この封入体は、混入宿主タンパク質のいくらかを除去するために、いくつかの溶液のうちのいずれかにおいて洗浄され得、次いで、高濃度の尿素（例えば、８Ｍ）か、または、還元剤（例えば、β−メルカプトエタノールまたはＤＴＴ（ジチオスレイトール））の存在下におけるグアニジン塩酸塩のようなカオトロピックな薬剤を含む溶液中に、可溶化され得る。
【０１２６】
いくつかの状況下では、タンパク質が、ネイティブなタンパク質のコンフォメーションとより密接に類似するコンフォメーションへの、リフォールディングプロセスを受けるのに適切な条件下で、数時間インキュベートすることが、有利であり得る。このような条件としては、一般に、低いタンパク質濃度（５００μｇ／ｍｌ未満）、低い還元剤レベル、２Ｍ未満の尿素濃度、そしてしばしば、タンパク質分子内のジスルフィド結合の交換を容易にする、還元グルタチオンおよび酸化グルタチオンの混合物のような試薬の存在が挙げられる。
【０１２７】
このリフォールディングプロセスは、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってか、またはこのネイティブな分子に特異的な抗体（これは、このネイティブな分子またはより少量の組換えタンパク質で免疫された動物から得られ得る）を用いて、モニターされ得る。リフォールディングの後、このタンパク質は、さらに精製され得、そして、イオン交換樹脂およびゲル透過樹脂を含むいくつかの支持体のうちのいずれかにおけるか、あるいは種々の親和性カラムにおける、クロマトグラフィーによって、リフォールディング混合物から分離され得る。
【０１２８】
原核生物に加えて、真核微生物（例えば、酵母培養物）もまた、用いられ得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または通常のパン酵母は、真核微生物の中でもっとも一般に用いられるが、他の多くの株が一般に利用可能である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７が、一般に用いられる（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、１９７９；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、１９７９；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、１９８０）。このプラスミドは、トリプトファン（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１）において増殖する能力を欠く、酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する、ｔｒｐｌ遺伝子をすでに含む（Ｊｏｎｅｓ、１９７７）。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐｌ障害の存在は、トリプトファンの非存在下における増殖による、形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【０１２９】
酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、１９８０）または他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓら、１９６８；Ｈｏｌｌａｎｄら、１９７８）（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートアイソメラーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートアイソメラーゼ、ホスホグルコースアイソメラーゼ、およびグルコキナーゼに対するプロモーターが挙げられる。適切な発現プラスミドを構築する際、これらの遺伝子と関連する終結配列をまた、発現ベクターの発現が望まれる配列の３’側に連結し、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供する。
【０１３０】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する、他の適切なプロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびに上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびマルトース利用およびガラクトース利用を担う酵素に対するプロモーター領域が挙げられる。
【０１３１】
微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養物もまた、宿主として用いられ得る。原則的に、脊椎動物培養物由来であろうと無脊椎動物培養物由来であろうと、任意のこのような細胞が働き得る。哺乳動物細胞に加えて、これらは、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；および組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））に感染したか、または１つ以上のＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチドコード配列を含む、組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系を含む。
【０１３２】
有用な昆虫系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、外来遺伝子を発現する。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。このＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチドコード配列を、ウイルスの非必須領域（例えば、多面性遺伝子）にクローン化し、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、多面性プロモーター）の制御下に配置する。このコード配列の首尾良い挿入は、多面性遺伝子の失活および非閉塞性組換えウイルス（すなわち、多面性遺伝子によってコードされるタンパク質性のコーティングを欠くウイルス）の生成を生じる。次いで、これらの組換えウイルスを用いて、挿入された遺伝子が発現される、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染する（例えば、米国特許第４，２１５，０５１号（Ｓｍｉｔｈ））。
【０１３３】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯ細胞およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞株である。さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を改変および処理する、宿主細胞菌株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）および処理（例えば、切断）は、このタンパク質の機能のために重要であり得る。
【０１３４】
異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後の処理および改変に対する、特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来の遺伝子の正確な改変および処理を保証するように選択され得る。このために、グリコシル化、細胞内輸送、高度な発現およびＤＮＡ複製のための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、所望の場合、用いられ得、高度な発現を可能にする細胞が好ましい。
【０１３５】
哺乳動物のこのような細胞における使用のための発現ベクターは、本来、複製起点（必要に応じて）、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位を伴う、発現される遺伝子の正面に位置するプロモーター、および転写終止配列を含む。複製起点は、ＳＶ４０または他のウイルス性（ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）供給源に由来し得るような、外来性の起源を含む、ベクターの構築物、または、宿主細胞染色体複製機構のいずれかから得られ得る。このベクターが、宿主細胞染色体内へ組み込まれる場合、後者がしばしば十分である。
【０１３６】
このプロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来し得る。さらに、このようなコントロール配列が、宿主細胞系と適合性である場合、所望のＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子配列と通常結合するプロモーター配列またはコントロール配列を利用することもまた可能であり、そして所望であり得る。
【０１３７】
多くのウイルスベース発現系が利用され得、例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、そしてもっとも頻繁にはＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、両方とも、同様にＳＶ４０ウイルスの複製起点を含むフラグメントとして、このウイルスから容易に得られるので、特に有用である。このウイルスの複製起点に位置するＢｇｌＩ部位に向かって、ＨｉｎｄＩＩＩ部位から伸長する、約２５０ｂｐの配列が含まれる場合、より小さいＳＶ４０フラグメントまたはより大きいＳＶ４０フラグメントもまた用いられ得る。さらに、このようなコントロール配列が、宿主細胞系と適合性である場合、所望の遺伝子配列と通常結合するプロモーター配列またはコントロール配列を利用することもまた可能であり、そしてしばしば所望である。
【０１３８】
アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合において、コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳コントロール複合体（例えば、後期プロモーター配列および三部構成のリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロかまたはインビボの組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスのゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染した宿主において生存可能であり、かつＯｓｔｅｒｉｘタンパク質を発現し得る、組換えウイルスを生じる。
【０１３９】
特定の開始シグナルもまた、Ｏｓｔｅｒｉｘコード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接するＫｏｓａｋ配列を含む。外来性の翻訳コントロールシグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）は、提供される必要がさらにあり得る。当業者は、容易にこのシグナルを決定し得、そして必要なシグナルを提供し得る。開始コドンは、全挿入物の翻訳を保証するために、所望のコード配列のリーディングフレームと、インフレーム（またはインフェーズ）でなければならないことは周知である。これらの外来性翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、種々の起源であり得る。発現の効率は、適切な転写増強エレメント、転写ターミネーターの含有によって増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７）。
【０１４０】
真核生物の発現において、ポリアデニル化部位が本来のクローン化セグメント内に含まれなかった場合、代表的に、適切なポリアデニル化部位（例えば、５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）を、転写単位に組み込むこともまた、所望である。代表的に、ポリＡ付加部位は、転写終止前の位置のタンパク質の、終止コドンの約３０〜２０００ヌクレオチド「下流」に位置する。
【０１４１】
長期間の、高収率の組換えＯｓｔｅｒｉｘタンパク質の生成のために、安定な発現が好ましい。例えば、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードする構築物を安定に発現する細胞株を、操作し得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されるベクターを用いて、宿主細胞を形質転換し得る。外来ＤＮＡの導入の後、操作した細胞を、富化培地において１〜２日間増殖させ、次いで、選択培地に切り換える。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、この選択に対する耐性を与え、そして、細胞がそれらの染色体内にプラスミドを安定に組み込み、そして増殖して、巣を形成するのを可能にし、次いで、この巣をクローン化し、そして細胞株に拡大する。
【０１４２】
多くの選択系が用いられ得、これらとして、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞における、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら、１９６２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｒｙら、１９８０）が挙げられるが、これらに限定されない。代謝拮抗物質耐性もまた、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、１９８１）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１）；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８４）に対する、選択の基礎として用いられ得る。
【０１４３】
本発明のＯｓｔｅｒｉｘは、「過剰発現」され得る（すなわち、骨芽細胞における天然の発現と比較してか、または組換え宿主細胞中の他のタンパク質の発現と比較してさえも、増大したレベルで発現される）ことを企図する。このような過剰発現は、放射標識化および／またはタンパク質精製を含む、種々の方法によって評価され得る。しかし、直接的な方法、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよびタンパク質染色またはウエスタンブロット、それに続く、定量分析（例えば、得られたゲルまたはブロットの濃度測定スキャニング）を含む方法が、好ましい。天然の骨芽細胞におけるレベルと比較した、組換えタンパク質または組換えポリペプチドのレベルの特異的な増大は、宿主細胞によって生成された他のタンパク質と比較した、その特定のタンパク質の相対的な豊富さであり、そして例えば、ゲル上で可視化されるので、過剰発現の指標である。
【０１４４】
組換え発現によって、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドを生成するための、現在好ましい方法を、本明細書中に記載する。例えば、実施例５は、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換え発現によって得られ得ることを提供する。
【０１４５】
（Ｃ．Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチド）
（１．Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の精製）
本発明のさらなる局面は、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドの精製に関し、そして特定の実施形態において、実質的な精製に関する。本明細書中で用いられる場合、用語「精製タンパク質」は、骨芽細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、または、組換え宿主細胞から単離可能である、Ｏｓｔｅｒｉｘ組成物（ここで、このＯｓｔｅｒｉｘは、天然に入手可能な状態と比較して（すなわち、この場合、骨芽細胞抽出物またはＣ２Ｃ１２細胞抽出物内での、Ｏｓｔｅｒｉｘの純度と比較して）、任意の程度に精製される）をいうことを意図する。従って、精製Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質とはまた、インタクトな細胞においてＯｓｔｅｒｉｘタンパク質が天然に存在し得る環境から離れた、タンパク質をいう。
【０１４６】
本発明の精製Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質または精製Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドは、一般にＯｓｔｅｒｉｘ活性を有することを企図する。すなわち、これらは、骨芽細胞に導入された推定リガンドに結合する能力、ならびに骨芽細胞の分化および／または骨の形成を促進する能力を有する。
【０１４７】
一般に、「精製された」とは、分別に供されて、他の細胞成分のような、種々の非Ｏｓｔｅｒｉｘ組成物が除去された、Ｏｓｔｅｒｉｘ組成物をいう。タンパク質精製における使用に適する種々の技術は、当業者に周知である。これらとしては、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などでの沈降、または熱変性、およびそれに続く遠心分離；クロマトグラフィー工程（例えば、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、レクチン親和性および他の親和性クロマトグラフィー工程）；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこのような技術および他の技術の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に提示される特定の実施例は、抗Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体での免疫沈降を使用するＯｓｔｅｒｉｘの精製である。
【０１４８】
用語「実質的に精製された」が用いられる場合、この用語は、Ｏｓｔｅｒｉｘが、その組成物の主成分を形成する（例えば、組成物中のタンパク質の約５０％またはそれ以上を構成する）、組成物をいう。好ましい実施形態において、実質的に精製されたタンパク質は、組成物中のタンパク質の６０％よりも多くを構成する。
【０１４９】
「均一に精製された」ポリペプチドまたはタンパク質は、本発明において適用される場合、そのポリペプチドまたはタンパク質が、他のタンパク質および生物学的成分を実質的に含まない、純度のレベルを有することを意味する。例えば、精製ポリペプチドまたは精製タンパク質は、しばしば、分解性配列決定が首尾良く行われ得るほど十分に、他のタンパク質成分を含まない。
【０１５０】
Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の精製の程度を数量化するための種々の方法は、本開示に鑑みて、当業者に公知である。これらとしては、例えば、活性画分の比活性を決定すること、または、画分内のポリペプチドの数をゲル電気泳動によって評価することが挙げられる。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって、画分内のポリペプチドの数を評価することは、しばしば、本発明の状況において（例えば、タンパク質純度を評価することにおいて）好ましい。
【０１５１】
Ｏｓｔｅｒｉｘ画分の純度を評価するための好ましい方法は、この画分の比活性を計算し、それを開始骨芽細胞または開始Ｃ２Ｃ１２の抽出物の比活性と比較し、そして従って、本明細書中で「〜倍精製数」によって評価される、純度の程度を計算することである。
【０１５２】
転写活性の量を表すために用いられる実際の単位は、もちろん、精製を行うために選択された特定のアッセイ技術に依存する。上で考察したように、本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットを用いて、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の相対的な量を検査することを選択する。この目的のために、Ｏｓｔｅｒｉｘに対するポリクローナル抗体（これらの分子のいくつかのエピトープを認識する抗体）を用いることが好ましい。本発明者らは、現在、Ｏｓｔｅｒｉｘアッセイの合成ポリペプチドに対する、ウサギポリクローナル抗体を有し、この試験サンプルを、タンパク質濃度について検査し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてクーマシーブルーによって染色する。次いで、同時に泳動したさらなるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットし、Ｏｓｔｅｒｉｘに対する推定バンドを同定する。次いで、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の量を、総タンパク質濃度に相対純度（これは、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定分析によって決定される）を乗じることによって計算する。例えば、１つの画分が１ｍｇ／ｍｌのタンパク質および７０％の純度のＯｓｔｅｒｉｘを含む場合、この画分は、０．７ｍｇ／ｍｌのＯｓｔｅｒｉｘタンパク質を含むと計算される。このシステムの利点は、分解したＯｓｔｅｒｉｘの混入の問題を排除し得るように、Ｏｓｔｅｒｉｘのタンパク質プロフィールを、同時に試験し得ることである。
【０１５３】
より迅速かつ慣習的な分析のために、本発明者らは、ダブルサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用い、ここでＥＬＩＳＡプレートを、Ｏｓｔｅｒｉｘに対するＭＡｂで最初にコーティングし、試験サンプルと共にインキュベートし、そして最後に、Ｏｓｔｅｒｉｘに対するポリクローナル抗体とともにインキュベートする。この試験サンプルにおけるＯｓｔｅｒｉｘの量は、プレートに結合するポリクローナル抗体の量に基づいて決定される。
【０１５４】
Ｏｓｔｅｒｉｘの相対的なタンパク質の量は、必ずしも相対的な生物学的活性を表さないかもしれない。精製手順の間、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質が分解および／または変性される場合、または、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の異なるアイソフォームが、異なる程度の生物学的活性を示す場合、このことは特に問題である。従って、相対的な生物学的活性を測定することが重要である。本発明者らは、骨芽細胞に結合する能力に基づいて、この生物学的活性を決定することを選択する。
【０１５５】
当該分野において一般に公知であるように、この比活性を決定するために、総タンパク質の１ｍｇあたりの活性の単位数を計算する。精製手順において、開始材料（すなわち、組織抽出物）の比活性は、Ｏｓｔｅｒｉｘの天然の状態における比活性を表す。各工程において、Ｏｓｔｅｒｉｘはその天然の状態と比較して精製されているので、一般に、Ｏｓｔｅｒｉｘの比活性が、この値よりも上に増大すると予測する。好ましい実施形態において、Ｏｓｔｅｒｉｘの比活性を開始材料の比活性と比較し、そしてこれをＸ倍精製と表すことによって、所定のＯｓｔｅｒｉｘ画分の純度の程度を評価することを企図する。活性または比活性の実際の単位に存在し得る任意の差異にも関わらず、阻害性画分の純度がこのように別の画分と比較され得るので、「〜倍精製」の使用は有利である。
【０１５６】
本発明のＯｓｔｅｒｉｘを、その天然の状態と比較して約１０倍と約３０倍との間まで、および好ましくは、約３０倍と約１００倍との間まで、さらにより好ましくは、約３００倍まで精製することが意図される。
【０１５７】
本明細書中以下に開示される、好ましい精製方法は、いくつかの工程を含み、実質的に精製されたＯｓｔｅｒｉｘタンパク質を調製するための、本発明者らが現在知っている、最良の形態を表わす。この方法は、ウエスタンブロッティングによって評価したように、タンパク質またはポリペプチドの実質的な精製をさらなる特徴づけおよび使用に十分な収量でもたらすので、現在好ましい。このＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチド精製の好ましい形態は、本明細書中以下に記載される順序での特定の精製工程の実施を含む。しかしながら、当該分野で一般的に公知なように、様々な精製工程を実施する順序は変更され得るかまたは、特定の工程は省略され得、そしてなおも、実質的に精製されたＯｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチドの調製に適した方法となると考えられている。
【０１５８】
上述したように、特定の実施形態における使用には好ましいが、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチドが常にその最も精製された状態で提供されるべきであるという一般的な必要条件は存在しない。実際、実質的というほどには精製されていないタンパク質またはポリペプチドは、それでもなお、天然の状態と比較してＯｓｔｅｒｉｘ活性が富化されており、特定の実施形態における有用性を有することが意図される。例えば、より低程度に精製されたＯｓｔｅｒｉｘ調製物は、天然でＯｓｔｅｒｉｘと会合している分子を含み得る。そうであれば、これは、究極的に、細胞表面（例えば、補助レセプター）または細胞質中（例えば、シグナル伝達成分）でＯｓｔｅｒｉｘと会合する固有の分子の同定につながり得る。
【０１５９】
より低い程度の関連する精製を示す方法は、タンパク質産物の全回収、または発現したタンパク質の活性の維持における利点を有し得る。不活性産物もまた、特定の実施形態において（例えば、抗体作製において）有用性を有する。
【０１６０】
そのような実施形態に使用するための部分的に精製したＯｓｔｅｒｉｘ画分は、骨芽細胞抽出物またはＣ２Ｃ１２細胞抽出物を、記載される工程のひとつまたはその組合せに供することによって得られ得る。特定の工程を改善された等価物で置換することもまた、有用であると意図される。例えば、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを、ＨＰＬＣ装置を利用して実施することにより、低い圧力のクロマトグラフィーシステムを利用した同じ技術よりも高倍率の精製が一般的にもたらされることが認められる。
【０１６１】
しかしながら、ポリペプチドの移動は、異なる条件のＳＤＳ／ＰＡＧＥで、（時々有意に）変化し得ることが、公知である（Ｃａｐａｌｄｉら，１９７７，本明細書中に参考文献として援用）。従って、異なる電気泳動条件下において、これらの分子量が変化し得ることが認められる。
【０１６２】
（２．生物学的に機能的な等価物および構造的等価物）
上述したように、改変および変化は、Ｏｓｔｅｒｉｘの構造で作製され得、そして類似のまたは別の、所望する特性を有する分子をなおも獲得し得る。例えば、特定のアミノ酸で、構造体との相互作用的な結合能力の目に見えるほどの欠如を伴わずにタンパク質の構造内において他のアミノ酸を置換し得る。その構造体としては、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上、レセプター上、もしくは骨芽細胞上の、結合部位が挙げられる。タンパク質の相互作用的な能力および性質が、タンパク質の生物学的機能的活性を決定するので、特定のアミノ酸配列の置換は、タンパク質配列（あるいは、もちろん、その基本となるＤＮＡコード配列）において行われ得、そしてそれにも拘わらず同様の（アゴニストの）特性を有するタンパク質が得られ得る。同様に、同じ考慮を行って、相殺する（例えば、アンタゴニストの）特性を有するタンパク質またはポリペプチドを作製し得る。従って、本発明者らによって意図されることは、種々の変化が、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチド（または基本となるＤＮＡ）の配列において、それらの生物学的な有用性または活性の目に見えるほどの欠如を伴わずに行われ得るということである。
【０１６３】
機能的等価物に関して、生物学的に機能的な等価のタンパク質またはポリペプチドの定義において固有なのは、分子の定義された部分で作製され得る変化の数には制限があり、そしてなおも、分子は、受容可能なレベルの等価な生物学的活性を伴う分子をもたらし得るという概念であるということもまた、当業者に十分理解される。従って、生物学的に機能的な等価のポリペプチドは、特定の（ほとんどでも全てでもない）アミノ酸が置換され得るポリペプチドとして本明細書中に定義される。もちろん、異なる置換基を有する多数の別のタンパク質／ポリペプチドは、本発明に従って作製され得、そして使用され得る。
【０１６４】
また、特定の残基（例えば、活性部位における残基）がタンパク質またはポリペプチドの生物学的特性または構造的特性にとって特に重要であることが示される場合、そのような残基は、通常交換されないかもしれないことも十分に理解される。
【０１６５】
アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状および型の分析は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが全て正に荷電した残基であること；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン；が、生物学的機能等価物として本明細書中に定義されることを明らかにする。
【０１６６】
保存的な置換は、当該分野で周知であり、その例としては、アラニンのセリンへの変化；アルギニンのリジンへの変化；アスパラギンのグルタミンまたはヒスチジンへの変化；アスパラギン酸のグルタミン酸への変化；システインのセリンへの変化；グルタミンのアスパラギンへの変化；グルタミン酸のアスパラギン酸への変化；グリコーゲンのプロリンへの変化；ヒスチジンのアスパラギンまたはグルタミンへの変化；イソロイシンのロイシンまたはバリンへの変化；ロイシンのバリンまたはイソロイシンへの変化；リジンのアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸への変化；メチオニンのロイシンまたはイソロイシンへの変化；フェニルアラニンのチロシン、ロイシン、またはメチオニンへの変化；セリンのトレオニンへの変化；トレオニンのセリンへの変化；トリプトファンのチロシンへの変化；チロシンのトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変化；およびバリンのイソロイシンまたはロイシンへの変化が挙げられる。
【０１６７】
このような変化の作製において、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。各アミノ酸は、それらの疎水性特性および電荷特性に基づくヒドロパシー指数を割り当てられており、これらは以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１６８】
タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与える際のアミノ酸のヒドロパシー指数の重要性は、一般的に当該分野で理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２，参考として本明細書中に援用）。特定のアミノ酸は、同様のヒドロパシー指数またはヒドロパシースコアを有する他のアミノ酸を置換し得、そしてなおも同様の生物学的活性を保持し得ることが公知である。ヒドロパシー指数に基づく変化の作製において、ヒドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、ヒドロパシー指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてヒドロパシー指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。
【０１６９】
類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行われ得、特にそのようにして作製された生物学的に機能的な等価のタンパク質または生物学的に機能的な等価のポリペプチドは、（本発明の場合のように）免疫学的な実施形態における使用を意図されることもまた、当該分野で理解されている。参考として本明細書中に援用される米国特許第４，５５４，１０１号は、タンパク質の隣接アミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大の局所平均親水性が、タンパク質の免疫原性および抗原性（すなわち、タンパク質の生物学的特性）と関連することを述べている。
【０１７０】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述するように、以下の親水性の値は、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【０１７１】
同様の親水性値に基づく変化の作製において、親水性値が±０．５以内のアミノ酸の置換がさらにより特に好ましい。
【０１７２】
議論は、アミノ酸の変化から生じる機能的に等価なポリペプチドに焦点をあてているが、これらの変化は、コードＤＮＡの変化（遺伝コードが縮重すること、および２つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードし得ることも考慮に入れる）によってもたらされ得ることが認められる。アミノ酸およびそれらのコドンの表を、そのような実施形態における使用のために、ならびに他の使用（例えば、プローブおよびプライマーの設計など）のために本明細書中に示す。
【０１７３】
Ｏｓｔｅｒｉｘの１つ以上の抗原決定基または「エピトープコア領域」に対応するポリペプチドもまた、調製され得る。そのようなポリペプチドは、少なくとも５または６アミノ酸残基長を一般的に有するべきであり、そして約３５〜５０残基などまでを含み得る。
【０１７４】
合成的なポリペプチドは、一般的に約３５残基長であり、その長さは、自動化されたポリペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から入手可能な合成機など）のほぼ上限の長さである。より長いポリペプチドもまた、（例えば、組換え手段によって）調製され得る。
【０１７５】
米国特許第４，５５４，１０１号（Ｈｏｐｐ、参考として本明細書中に援用）は、親水性に基づいた、一次アミノ酸配列からのエピトープの同定および調製を教示する。Ｈｏｐｐに開示された方法により、当業者は、アミノ酸配列内からエピトープを同定し得る。
【０１７６】
多数の科学出版物はまた、アミノ酸配列の分析からの第２の構造の予測およびエピトープの同定に熱心である（ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ，１９７４ａ，ｂ；１９７８ａ，ｂ，１９７９）。任意のこれらは、所望される場合、米国特許第４，５５４，１０１号中でのＨｏｐｐの教示を補足するために用いられ得る。
【０１７７】
さらに、コンピュータープログラムが、タンパク質の抗原性部分およびエピトープコア領域の予測を補助するために現在利用可能である。例としては、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ解析（ＪａｍｅｓｏｎおよびＷｏｌｆ，１９８８；Ｗｏｌｆら，１９８８）に基づくプログラム、プログラムＰｅｐＰｌｏｔ（登録商標）（Ｂｒｕｔｌａｇら，１９９０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，１９８５）、およびタンパク質の三次元構造予測のための他の新しいプログラム（ＦｅｔｒｏｗおよびＢｒｙａｎｔ，１９９３）が挙げられる。そのような解析を実行する能力のある市販のさらなるソフトウェアは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）と称される。
【０１７８】
さらなる実施形態において、ポリペプチドをコードする遺伝子の部分が組換え宿主中で発現され、そして免疫応答を惹起するそれらの能力について得られたタンパク質を試験するポリペプチドの主な抗原決定基は、経験的アプローチによって同定され得る。例えば、ＰＣＲＴＭは、タンパク質のＣ末端から徐々により長くなるフラグメントを欠いているある範囲のポリペプチドを調製するために用いられ得る。各々のこれらのポリペプチドの免疫活性は、免疫優性のポリペプチドのフラグメントまたはドメインを同定するために決定される。次いで少数のアミノ酸のみが各反復で除去されるさらなる研究において、ポリペプチドの抗原決定基の位置がより正確に決定されることが可能になる。
【０１７９】
一旦１つ以上のそのような解析が終了すると、１つ以上の抗原決定基の本質的特徴を少なくとも含有するポリペプチドが調製される。次いでそのポリペプチドは、ポリペプチドに対する抗血清の産生に使用される。これらの決定基をコードするミニ遺伝子または遺伝子融合体もまた、（例えば、ＰＣＲＴＭクローニング方法論を用いる）標準の方法によって構築され得、そして発現ベクター中に挿入され得る。
【０１８０】
ワクチン接種へのそのような小さいポリペプチドの使用は、ポリペプチドの（Ｂ型肝炎表面抗原、キーホールリンペットヘモシニアンまたはウシ血清アルブミンのような）免疫原性キャリアタンパク質への結合体化を典型的に必要とする。この結合体化を実施するための方法は、当該分野において周知である。
【０１８１】
本明細書中に記載されるペプチジル化合物に加えて、本発明者らはまた、他の立体的に類似の化合物がポリペプチド構造の重要な部分を模倣するために処方され得ることを意図する。ペプチド模倣物と称され得るそのような化合物は、本発明のポリペプチドと同じ方法で使用され得、従ってそれらもまた機能的な等価物である。
【０１８２】
タンパク質の二次構造のエレメントを模倣する特定の模倣物は、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）に記載される。ポリペプチド模倣物の使用の裏づけとなる、根底にある理論的根拠は、タンパク質のポリペプチドバックボーンが、（抗体と抗原との相互作用のような）分子相互作用を促進するような方法でアミノ酸側鎖を方向付けるために主に存在するということである。従って１つのポリペプチド模倣物が、天然の分子と同様の分子相互作用を可能にするために設計される。
【０１８３】
ポリペプチド模倣物概念のいくつかの成功した適用は、タンパク質内のβターンの模倣物に焦点をあてており、βターンは高度に抗原性であることが知られている。おそらく、ポリペプチド内のβターン構造は、本明細書中で議論したように、コンピューターベースのアルゴリズムによって予測され得る。一旦ターンの構成アミノ酸が決定されると、模倣物は、アミノ酸側鎖の必須エレメントの類似の空間的な配向性を達成するために構築され得る。
【０１８４】
さらなる構造的な等価物または模倣物の産生は、当業者に公知のモデリングおよび化学物質設計の技術によって達成され得る。レセプターモデリングの技術は、現在周知であり、そしてそのような方法によって骨芽細胞Ｏｓｔｅｒｉｘレセプターに結合する化学物質が設計され得、次いで合成され得る。全てのそのような立体的に同様な構築物は、本発明の範囲内に入ることが理解される。
【０１８５】
（３．Ｏｓｔｅｒｉｘに対する抗体の産生）
抗体の調製および特徴づけの手段は、当該分野で周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；本明細書中で参考として援用を参照）。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するための方法は、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じ様にして一般的に始まる。手短に言えば、ポリクローナル抗体は、本発明に従って（用いる抗原組成物および抗原プロトコルに依存して、事前の免疫寛容化を伴うかまたは伴わないかのいずれかで）免疫原性組成物で動物を免疫し、そしてその免疫された動物から抗血清を回収することによって調製される。
【０１８６】
広範囲の動物種が、抗血清の産生のために用いられ得る。代表的に、抗抗血清の産生のために用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。ウサギの血液の容積は相対的に大量であるため、ウサギが、ポリクローナル抗体の産生のための好ましい選択である。
【０１８７】
当該分野で周知のように、所定の組成物は、その免疫原性が変化し得る。従って、ペプチド免疫原またはポリペプチド免疫原をキャリアにカップリングすることによって達成され得るように、宿主の免疫系を追加免疫することが、しばしば必要である。例示的で好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンもまた、キャリアとして用いられ得る。ポリペプチドをキャリアタンパク質に結合体化するための手段は当該分野で周知であり、グルタルアルデヒド、μ−マレイミドベンコイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス−ビアゾ化ベンジジンを含む。
【０１８８】
当該分野で周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られている免疫応答の非特異的な刺激物の使用によって増強され得る。適切なアジュバントとしては、全ての受容可能な免疫刺激化合物（例えば、サイトカイン、トキシンまたは合成組成物）が挙げられる。
【０１８９】
使用され得るアジュバントとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ＭＤＰ化合物（ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰ、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）など）が挙げられる。ＲＩＢＩは、細菌から抽出した３つの成分であるＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０エマルジョン中に含む。ＭＨＣ抗原でさえも使用され得る。
【０１９０】
例示的に、しばしば好ましいアジュバントは、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（殺傷されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異的な刺激物）、不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【０１９１】
ポリクローナル抗体の産生に用いられる免疫原組成物の量は、天然の免疫原の性質ならびに免疫に用いられる動物において変化する。多様な経路（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）が、免疫原を投与するために用いられ得る。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の様々な時点における免疫化された動物の血液のサンプリングによってモニターされ得る。
【０１９２】
第２の追加免疫注入がまた、与えられ得る。追加免疫および力価測定の工程は、適切な力価が達成されるまで繰り返される。所望されるレベルの免疫原性が得られる場合、免疫化された動物は、採血され、単離され、保存された血清および／またはその動物が、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の産生に用いられ得る。
【０１９３】
ウサギポリクローナル抗体の産生のために、動物は、耳の静脈から、あるいは心臓穿刺によって採血され得る。取り出された血液は、凝固され、次いで遠心分離されて細胞全体および血餅から血清成分を分離される。その血清は、そのまま多様な用途に使用され得るか、あるいは、抗体画分が周知の方法（固体マトリックスに結合された別の抗体もしくはポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーエラー！ リンクが正しくありません。によって、または、例えば、プロテインＡクロマトグラフィーもしくはプロテインＧクロマトグラフィーを用いることによって精製され得る所望の。
【０１９４】
ＭＡｂは、周知の技術（例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第４，１９６，２６５号に例示される技術）の使用によって容易に調製され得る。代表的に、この技術は、適切な動物を、選択された免疫原組成物（例えば、精製されたＯｓｔｅｒｉｘタンパク質または部分精製されたＯｓｔｅｒｉｘタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（または任意の骨芽細胞組成物（共通抗原への寛容化後に用いられる場合））によって免疫することを含む。その免疫化組成物は、抗体産生細胞を刺激するために有効な様式で投与される。
【０１９５】
ＭＡｂを産生するための方法は、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じ様にして一般的に始まる。マウスおよびラットのようなげっ歯動物は、好ましい動物であるが、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、カエル細胞の使用もまた、可能である。ラットの使用は、特定の利点を提供し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６，６０〜６１頁）が、マウスが好ましく、最も慣用的に使用されそしてより高い割合で安定な融合体を一般的に与えるため、ＢＡＬＢ／ｃマウスが最も好ましい。本発明者らは、ラット中にマウスＯｓｔｅｒｉｘに対するＭＡｂを産生した。マウス起源の分子を用いてマウスを免疫することは技術的に困難であるため、これが最初であった。これに対して、本発明者らは、ヒトＯｓｔｅｒｉｘに対するＭＡｂの産生のためにマウスを選ぶ。
【０１９６】
動物は、一般的に上に記載したように抗原を注入される。抗原は、必要であれば、キーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリア分子とカップリングされ得る。抗原は、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバントまたは不完全アジュバントのようなアジュバントと代表的に混合される。同じ抗原を用いる追加免疫注入は、約２週間の間隔で行われる。
【０１９７】
免疫に続き、抗体を産生する潜在能力を有する体細胞（特にＢリンパ球（Ｂ細胞））が、ＭＡｂ産生プロトコルに使用するために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃もしくはリンパ節から、または末梢分裂中の血サンプルから得られ得る。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましく、前者は形質芽球段階にある抗体産生細胞の豊富な源であるからであり、後者は末梢血が入手しやすいからである。
【０１９８】
しばしば、動物のパネルを免疫し、そして最も高い抗体力価を有する動物の脾臓を取り出し、そして脾臓のリンパ球をシリンジを用いて脾臓をホモジナイズすることにより得る。代表的に、免疫したマウス由来の脾臓は、約５×１０７〜２×１０８のリンパ球を含む。
【０１９９】
免疫された動物由来の抗体産生Ｂリンパ球を、次に一般的に免疫された動物と同じ種の、不死の骨髄腫細胞の細胞と融合させる。ハイブリドーマを産生する融合手順での使用に適した骨髄腫細胞株は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、そして酵素を欠乏しており、これによりこの細胞株は特定の選択培地で増殖できなくなり、このことが所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する。
【０２００】
多数の骨髄腫細胞のうちの任意の１つは、当業者に公知である（Ｇｏｄｉｎｇ、ｐｐ．６５〜６６、１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、ｐｐ．７５〜８３、１９８４）ので使用され得る。例えば、免疫した動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌを使用し得る；ラットについては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０を用い得る；そしてＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６はすべて、ヒトの細胞融合と関連して有用である。
【０２０１】
ひとつの好ましいマウス骨髄腫細胞は、細胞株貯蔵所ナンバーＧＭ３５７３を要求することによって、ＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから容易に入手可能である、ＮＳ−１骨髄腫細胞株（Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１とも名付けられている）である。使用され得る他のマウス骨髄腫細胞株は、８−アザグアニン抵抗性マウスのマウス骨髄腫ＳＰ２／０非産生性細胞株である。
【０２０２】
抗体産生脾臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞のハイブリッドを生成する方法は、２：１の比率で体細胞と骨髄腫細胞を混合することを通常包含するが、細胞膜の融合を促進する因子（単数または複数）（化学的または電気的）の存在下で、比率は、それぞれ、約２０：１から約１：１まで変わり得る。センダイウイルスを用いる融合方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）によって記載されており、それらの方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる、例えばＧｅｆｔｅｒら（１９７７）では３７％ＰＥＧを用いる。電気的に誘導された融合方法の使用もまた適切である（Ｇｏｄｉｎｇ  ｐｐ．７１−７４、１９８６）。
【０２０３】
融合手順は通常、約１×１０−６〜１×１０−８の低い頻度で生存可能なハイブリッドを産生する。しかし、問題を引き起こさない。なぜならば、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地で培養することによって親の融合していない細胞（特に、通常では、永久的に分裂をし続ける融合していない骨髄腫細胞）から区別されるからである。選択培地は一般的に、組織培養培地に核酸の新規合成を妨げる因子を含んだものである。模範的で好ましい因子は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方の新規合成を妨げる、これに対してアザセリンはプリン合成のみを妨げる。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合には、培地にヌクレオチドの原料としてヒポキサンチンおよびチミジンが補われている（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合には、培地にヒポキサンチンが補われている。
【０２０４】
好ましい選択培地は、ＨＡＴである。ヌクレオチドのサルベージ経路を作動する能力のある細胞だけがＨＡＴ培地で生存し得る。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の鍵となる酵素（たとえば、ヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素（ＨＰＲＴ））を欠損しており、そしてそれらは生存することができない。Ｂ細胞はこの経路を作動し得るが、それらは培養中に限られた寿命を有し、一般的に約２週間以内に死ぬ。したがって、選択培地で生存し得る細胞だけが、骨髄腫およびＢ細胞から形成されたハイブリッドである。
【０２０５】
この培養は、特定のハイブリドーマが選択される集団を提供する。代表的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタ−のプレートで単一クローンの希釈により細胞培養し、それに続いて望ましい反応性について個々のクローンの上清（約２〜３週間後）を検査することによって実行される。そのアッセイは、感度がよく、早く、使用し易くあるべきである（例えばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノバインディングアッセイなど）。
【０２０６】
選択されたハイブリドーマを次に、連続的に希釈し、そして個々の抗体産生細胞株にクローン化し、次にこれらのクローンは永久に増殖してＭＡｂを提供し得る。その細胞株は、２つの基本的な方法でＭＡｂ産生のために利用され得る。
【０２０７】
ハイブリドーマのサンプルは、本来の融合（例えば、同系のマウス）のために体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用される型の細胞適合性の動物に注入され得る（しばしば腹腔内に）。必要に応じて、動物は、注入する前に炭化水素（特に、プリスタン（テトラメチルペンタデカン）のようなオイル）を用いてプライムされる。注入された動物は、融合した細胞ハイブリッドによって産生される特異的なモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発達させる。次いで、血清または腹水のような動物の体液を、穿刺し、高濃度でＭＡｂを供給し得る。
【０２０８】
個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得、ＭＡｂは自然に培養培地に分泌され、そこからＭＡｂは高濃度で容易に得られ得る。
【０２０９】
他の実施形態では、ＭＡｂは、「ヒト化」ＭＡｂを含むキメラＭＡｂである。このようなアプローチでは、キメラＭＡｂを、マウス抗Ｏｓｔｅｒｉｘ産生細胞由来のプロモーター配列、リーダー配列および可変領域配列ならびにヒト抗体遺伝子由来の定常領域エキソンを含む組換えＤＮＡをクローン化することによって操作される。すなわち、マウスの相補的な決定領域（「ＣＤＲ」）を、マウスＩｇの重Ｖ鎖および軽Ｖ鎖からヒトＶドメインへと移す。これの後に、マウスの対応物のフレームワーク領域内のいくつかのヒト残基の置換が続き得る。
【０２１０】
このような組換え遺伝子によってコードされた抗体は、マウス−ヒトキメラである。その抗体の特異性は、マウスの配列に由来する可変領域によって決定される。定常領域によって決定されるそのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来している。これらのヒト化抗Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体は、インビボでの診断的および治療的な方法の使用に特に適している。組換えタンパク質としてヒト化ＭＡｂを産生するために、マウスの抗ヒトＯｓｔｅｒｉｘの軽鎖および重鎖の可変ドメインまたはマウスの抗ヒトＯｓｔｅｒｉｘ  ＭＡｂをコードするヌクレオチド配列を、まず初めにＰＣＲＴＭによってクローン化し、そして次にヒトの軽鎖および重鎖の定常領域を含む発現ベクターに挿入する。これらの発現ベクターは、たくさんの研究者（Ｃｏら、１９９６；Ｃｏら、１９９２）によって日常的に使用されている。最も適切なヒトフレームワークの選択が必要とされ得ることを企図する。例えば、最小の位置のテンプレートを用いて抗体を設計することは、この目的に対する１つの方法である（Ｃａｏｕｔｏら、１９９５）。組換えタンパク質は、哺乳動物細胞（例えば、マウス骨髄腫細胞株Ｓ１９４）で産生され得、そして次にプロテインＡセファロースカラムを用いて精製され得る。
【０２１１】
どちらかの手段によって産生されたＭＡｂは、所望される場合、濾過、遠心分離、およびＨＰＬＣもしくはアフィニティークロマトグラフィーのような種々のクロマトグラフ法を用いてさらに精製され得る。本発明のモノクローナル抗体のフラグメントは、このようにして産生されたモノクローナル抗体から、ペプシンもしくはパパインのような酵素を用いた消化を含む方法、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断によって、得られ得る。あるいは、本発明に包含されるモノクローナル抗体のフラグメントは、自動ペプチドシンセサイザーを用いて合成され得る。
【０２１２】
本発明のＭＡｂは、たくさんの方法に有用である。例えば、ＭＡｂは、生体系中の骨芽細胞またはＯｓｔｅｒｉｘタンパク質を単離および／もしくは同定するため使用され得るか、またはそれらが使用され得る。
【０２１３】
分子クローニングアプローチを使用して、ＭＡｂを産生し得ることもまた企図される。このアプローチのために、コンビナトリアルイムノグロブリンのファージミドライブラリーを、免疫された動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調製し、そして適切な抗体を発現するファージミドを、抗原を発現する細胞およびコントロール細胞（例えば、正常対腫瘍細胞）を用いてパニングすることによって選択する。従来のハイブリドーマ技術に対するこのアプローチの利点は、約１０４倍多くの抗体が生産され得、そして一回でスクリーニングし得ること、および新しい特異性が、ＨおよびＬ鎖の組み合わせによって生じ、そのことが適切な抗体を見つけ出す機会をさらに増加させることである。
【０２１４】
Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質および／またはポリペプチドに対する自己抗体は、病理学的な条件下で、マウス、ならびに他の種（例えば、ヒト）で産生され得ることもまた企図される。例えば、このような自己抗体は、免疫不全の症状があるヒトの患者中に、検出できるレベルで存在し得る。自己抗体は、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチドを認識する関連の抗体を用いるＥＬＩＺＡによって検出され得る。ＥＬＩＺＡのプレートをまず初めに（ウサギ）抗Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体でコートし、そして次にＯｓｔｅｒｉｘの組換え形態またはネイティブな形態でコートする。これらのプレートは、テストサンプル（例えば、ヒト血清）とともにインキュベートされ、次に（ヒト）イムノグロブリンに対する抗体とともにインキュベートされる。あるいは、Ｏｓｔｅｒｉｘの組換え形態またはネイティブな形態は、ＥＬＩＺＡプレート上に直接的に固定化され得る。自己抗体の量を、プレートに結合する抗イムノグロブリン抗体の量を測ることによって決定する。Ｏｓｔｅｒｉｘに対する自己抗体を測るこのアッセイおよび他のアッセイは、診断的な目的で有用であり得る。
【０２１５】
（Ｄ．Ｏｓｔｅｒｉｘ関連因子およびアッセイの開発）
本明細書中に記載されているＯｓｔｅｒｉｘ関連因子は、たくさんの領域、例えばスクリーニングアッセイ、臨床的なサンプルでのＯｓｔｅｒｉｘの量および質のモニタリングまたは骨芽細胞に外来遺伝子の発現を標的化すること（全て本明細書中でさらに詳細に記載されている）に有用であることが企図される。本明細書中で使用される場合、用語「Ｏｓｔｅｒｉｘ関連因子」とは、以下のものをいう：全長ならびに部分的なＤＮＡセグメント；Ｏｓｔｅｒｉｘファミリーの他のメンバー；単離され精製されたネイティブなＯｓｔｅｒｉｘならび組換え的に産生されたＯｓｔｅｒｉｘ；上記形態のいずれかに対して惹起された抗体；Ｏｓｔｅｒｉｘを過剰産生するように操作された細胞および動物。
【０２１６】
本明細書中に記載されているＯｓｔｅｒｉｘ関連因子は、もちろん、さらに、Ｏｓｔｅｒｉｘの発現および／または機能を調節する分子を検索するために使用され得る（例えば、天然に存在するタンパク質、化学薬品、合成ペプチド、炭水化物、脂質、組換えタンパク質、細胞抽出物、および上清など）。これには、例えば、細胞でＯｓｔｅｒｉｘに結合してその活性を増強し、それによって骨産生を増強する分子を検索するための、Ｏｓｔｅｒｉｘトランスフェクタントの使用が含まれ得る。
【０２１７】
本発明の因子の他の企図される使用は、細胞分化を調節（例えば、間葉前駆細胞のような前駆細胞の分化を調節）して、骨芽細胞を形成することである。別の実施例では、Ｏｓｔｅｒｉｘプロモーターを導入することによって骨芽細胞株を樹立し得る。これは、骨芽細胞への細胞分化を促進するＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子の５’隣接領域を使用すること、または骨芽細胞特異的プロモーターにより促進された癌遺伝子（たとえば、ｃ−ｍｙｃ）を使用することによって成し遂げられ得る。
【０２１８】
本明細書中で記載されているＯｓｔｅｒｉｘ関連因子を使用して、インビトロでの抗体の産生を調節し得ることもまた企図される。
【０２１９】
（１．Ｏｓｔｅｒｉｘ関連因子およびアッセイ）
以下の試薬は、本発明で「Ｏｓｔｅｒｉｘ関連因子」として挙げられるものである：ａ）５’および３’の隣接領域を含む、ＯｓｔｅｒｉｘのＤＮＡセグメント、ｂ）短縮転写物または変異した転写物を含むＯｓｔｅｒｉｘのセンス鎖またはアンチセンス鎖のＲＮＡセグメント、ｃ）短縮形態または変異した形態および生物学的な等価物を含む、Ｏｓｔｅｒｉｘのポリペプチドまたはタンパク質、ｄ）Ｏｓｔｅｒｉｘに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、ｅ）Ｃ２Ｃ１２、およびＯｓｔｅｒｉｘを発現する他の細胞株、ｆ）Ｏｓｔｅｒｉｘのポリペプチドまたはタンパク質を産生するために設計されたベクター、ｇ）Ｏｓｔｅｒｉｘを発現するように操作された細胞株、ｈ）遺伝子のＯｓｔｅｒｉｘファミリーの他のメンバーおよび上記の試薬を用いて同定され得るそれらの産物、ならびにｉ）上記の試薬を用いて同定され得るＯｓｔｅｒｉｘの関連するリガンド。
【０２２０】
Ｏｓｔｅｒｉｘ関連試薬を使用する以下のアッセイはまた、本発明で「Ｏｓｔｅｒｉｘ関連アッセイ」として挙げられるものである：ａ）サザンブロッティング、ゲノムＰＣＲＴＭ、コロニーおよびプラークハイブリダイゼーション、およびスロットブロッティングを含む、ＯｓｔｅｒｉｘＤＮＡを検出するアッセイ；ｂ）ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲＴＭ、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマー伸長アッセイ、およびＲＮａｓｅ保護アッセイを含む、ＯｓｔｅｒｉｘＲＮＡを検出するアッセイ；ｃ）ＥＬＩＺＡ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、ラジオイムノ吸収および競合アッセイ、ならびに免疫蛍光および免疫組織化学的染色を含む、Ｏｓｔｅｒｉｘのポリペプチドおよびタンパク質を検出するアッセイ；ならびにｄ）Ｏｓｔｅｒｉｘ結合アッセイ、ＤＣに誘導されたＴ細胞の活性化アッセイ、骨芽細胞接着アッセイ、およびＯｓｔｅｒｉｘの発現を調べるためのアッセイを含む、Ｏｓｔｅｒｉｘ依存性の骨芽細胞の相互作用を調節する試薬を検索するアッセイ。これらのアッセイの詳細な方法論は、以下の項に記載される。
【０２２１】
（２．ＤＮＡレベルでのＯｓｔｅｒｉｘを調べるアッセイ）
Ｏｓｔｅｒｉｘのヌクレオチド（配列番号１）または有意な相同性を示す関連するヌクレオチドもしくはＯｓｔｅｒｉｘの部分を含む関連するヌクレオチドは、遺伝子のＯｓｔｅｒｉｘファミリーのメンバーを検出するためのプローブとして使用される。遺伝子のＯｓｔｅｒｉｘファミリーは、これらのプローブのすくなくともひとつを用いて検出可能である遺伝子として規定される。この目的のために、サザンブロッティング、ＰＣＲＴＭ、コロニーおよびプラークハイブリダイゼーション、ならびにスロットブロットハイブリダイゼーションを含む標準的なアッセイは、これまでに記載されたように異なる程度のストリンジェンシーの種々の条件下で使用される。試験される検体には、細胞または組織から単離したｃＤＮＡライブラリー、ゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡフラグメントが挙げられる。これらのアッセイは、変異したＯｓｔｅｒｉｘＤＮＡを選択的に検出するように修正され得る。この目的のためにサザンブロッティングまたはＰＣＲＴＭは、変異したＤＮＡセグメントの検出または増幅に使用される。次いで、これらのセグメントは、変異したヌクレオチドを同定するために配列決定される。あるいは、選択された制限酵素の組み合わせは、サザンブロッティングで分子の異質性を現すために使用される。さらに、これらのアッセイは、Ｏｓｔｅｒｉｘのヌクレオチド配列の種々のドメインまたは種々の部分を選択的に検出するように修正され得る。この目的のために、ヌクレオチド配列の異なった部分に対するプローブまたはプライマーを使用し得る。さらに洗練された方法は、点変異をスクリーニングするために使用され得る。例えば、ＰＣＲＴＭ一本鎖コンフォメーション多型（ＰＣＲＴＭ−ＳＳＣＰ）分析（Ｓａｒｋａｒら、１９９５）を選び得ることが企図される。
【０２２２】
（３．ＲＮＡレベルでのＯｓｔｅｒｉｘを調べるアッセイ）
Ｏｓｔｅｒｉｘのヌクレオチド（配列番号１）または有意な相同性を示す関連するヌクレオチドまたはＯｓｔｅｒｉｘの部分を含む関連するヌクレオチドは、遺伝子のＯｓｔｅｒｉｘファミリーの転写物を検出するためのプローブとして使用される。この目的のために、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲＴＭ、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマー伸長アッセイ、およびＲＮａｓｅ保護アッセイを含む、標準的なアッセイは、これまでに記載されたような異なる程度のストリンジェンシーの種々の条件下で使用される。試験される検体としては、細胞または組織から単離された全ＲＮＡおよびｍＲＮＡ、ならびに生きている動物または患者から得られた細胞および組織サンプル自体が挙げられる。これらのアッセイは、種々のドメインまたは種々のアイソフォームについての転写物を選択的に検出するように修正され得る。この目的のために、本発明者らは、ヌクレオチド配列の異なった部分に対してプローブまたはプライマーを使用する。実際に、本発明者らは、異なったプライマーセットのパネルを用いるＲＴ−ＰＣＲＴＭによってＯｓｔｅｒｉｘのいくつかの短縮された転写物を同定することができた。これらの転写物は、代替のスプライシング機構によって産生されることが見出された。ＲＴ−ＰＣＲＴＭを用いる同様の方法は、他のスプライシングされた改変体および他の機構によって産生される他のアイソフォームでさえ同定するのに使用され得る。あるいは、ノーザンブロッティングは、種々のアイソフォームを選択的に検出することに使用され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドのプローブは、ヌクレオチド配列の異なった部分をそれぞれ網羅するように構成される。オリジナル配列から欠失されるヌクレオチドを規定するために、ＲＮａｓｅ保護アッセイを、使用し得る。変異したＲＮＡの検出もまた、本発明に含まれている。この目的のために、骨芽細胞から単離したＲＮＡは、ノーザンブロッティングまたはＲＴ−ＰＣＲＴＭによって分析される。
【０２２３】
アッセイが、異なったＲＮＡ種を選択的に検出するように設計され得ることを更に企図する。ＲＴ−ＰＣＲＴＭを使用する同様の方法を使用して、スプライシングされた改変体および他の機構によって産生される他のアイソフォームでさえ同定し得る。あるいは、ノーザンブロッティングは、異なったアイソフォームを選択的に検出することに使用され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドのプローブは、各々がヌクレオチド配列の異なった部分を網羅するように構成されている。オリジナル配列から欠失されるヌクレオチドを規定するために、ＲＮａｓｅ保護アッセイは、使用され得る。
【０２２４】
（４．タンパク質またはポリペプチドレベルでのＯｓｔｅｒｉｘを調べるアッセイ）
Ｏｓｔｅｒｉｘに対する抗体は、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドを検出するために使用され得る。この目的のために、ＥＬＩＺＡ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、ラジオイムノ吸収およびラジオイムノ競合アッセイ、ならびに免疫蛍光および免疫組織化学的染色を含む標準のアッセイは、特異性および感受性の異なる程度の種々の条件下で使用される。試験される検体としては、生存可能な細胞、全体の細胞抽出物、および樹立された細胞株の異なる細胞成分画分、ならびに、生きている動物または患者から単離された細胞、組織、および体液が挙げられる。これらのアッセイは、Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドまたはタンパク質の異なるエピトープ、ドメイン、またはアイソフォームを選択的に検出するように修正され得る。この目的のために、本発明者らは、異なるエピトープまたはドメインに対するＭＡｂのパネルを開発しそして使用する。
【０２２５】
（５．Ｏｓｔｅｒｉｘの活性およびＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子の発現を調節する試薬を検索するためのアッセイ）
最終的に、上記で記載されたＯｓｔｅｒｉｘ関連アッセイをまた使用して、Ｏｓｔｅｒｉｘ依存性活性を調節する分子を検索し得、このアッセイは、候補となる物質とＯｓｔｅｒｉｘ発現細胞を混合すること、およびこの候補となる物質がＯｓｔｅｒｉｘの発現を阻害／刺激するか否かを同定することを包含する。好ましくは、Ｏｓｔｅｒｉｘ発現細胞は、骨芽細胞である。あるいは、Ｏｓｔｅｒｉｘ発現細胞は、組換えＯｓｔｅｒｉｘを発現する操作された細胞を含み得る。
【０２２６】
第１のスクリーニングは、候補となる物質がＯｓｔｅｒｉｘの発現に影響するか否かを決定する。この目的のために、骨芽細胞発現細胞（たとえば、Ｃ２Ｃ１２細胞、マウスの骨芽細胞、ヒトの骨芽細胞）は、個々にまたは組み合わせて、候補となる物質で処理され、そして次にｍＲＮＡ、タンパク質、機能のレベルで増強されたＯｓｔｅｒｉｘの活性について試験される。あるいは、候補となる物質は、マウスのような生きている動物内に投与することによってインビボで試験され得る。この場合、骨芽細胞は、候補となる物質またはそれらの組み合わせを用いた処置後のマウスから単離され、そして再度、ｍＲＮＡ，タンパク質、および／または機能のレベルを測ることによって、増強されたＯｓｔｅｒｉｘの活性についてインビトロで試験される。これらのアッセイを行なう際に、Ｏｓｔｅｒｉｘの異なるアイソフォームの活性に対する、候補となる物質の効果をまた試験することが重要である。好ましい実施形態では、Ｏｓｔｅｒｉｘの発現を増強または刺激するこれらの因子は、薬学的に受容可能な媒体中で処方される。
【０２２７】
骨芽細胞におけるＯｓｔｅｒｉｘの活性を阻害する候補となる物質は、骨芽細胞の分化または骨の形成の阻害によって同定され得る。本発明はしたがって、骨芽細胞のＯｓｔｅｒｉｘが媒介する活性化を阻害する因子を提供する。好ましい実施形態において、本発明の因子は、薬学的に受容可能な媒体中で処方される。
【０２２８】
本発明は、さらに骨芽細胞を精製するための方法を提供する。好ましくは、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ）固体支持体に連結されたＯｓｔｅｒｉｘのタンパク質またはポリペプチドを含む、固定されたＯｓｔｅｒｉｘ組成物を調製する工程；
（ｂ）前記固定したＯｓｔｅｒｉｘ組成物を、骨芽細胞が前記のＯｓｔｅｒｉｘに結合することを可能にするのに有効な条件下で、骨芽細胞を含むと推測される試験組成物に接触させる工程；
（ｃ）前記試験組成物から非結合成分を除去する工程；ならびに
（ｄ）前記固定したＯｓｔｅｒｉｘ組成物から結合した骨芽細胞を放出する工程。
【０２２９】
なおさらなる実施形態では、本発明は、骨芽細胞の相互作用を阻害／刺激する新規な化合物を同定する方法に関し、この化合物は「候補となる物質」と称され得る。このスクリーニング技術が、骨芽細胞の活性化を阻害／刺激する目的に役立つ任意の化合物の一般的な同定での有用性を証明することを企図される。骨芽細胞活性化の刺激は、骨粗鬆症、骨の骨折修復における骨の再構築などのような疾患での治療的用途を有する。
【０２３０】
この事項において有用な化合物は、決して抗体に制限されないことが、さらに企図される。実際に、これは、スクリーニングアッセイの適用を通じた同定のために最も有用な薬理学的化合物が、本質的に非ペプチジルであり、そして堅固な結合または他の化学的相互作用を通じた骨芽細胞の活性化プロセスを阻害することに役立つ事例であることを示し得る。
【０２３１】
候補分子は、Ｏｓｔｅｒｉｘの発現を抑制するか、または高める能力について、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで骨芽細胞により試験され得る。この目的のために、骨芽細胞は、試験サンプルと共にインキュベートされ、次いで、Ｏｓｔｅｒｉｘの発現について、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲＴＭ、インサイチュハイブリダイゼーション、プライマー伸長アッセイ、および（ＲＮＡレベルでの）ＲＮａｓｅ保護アッセイによってか、またはＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、放射線免疫吸収アッセイおよび競合アッセイ、ならびに（タンパク質レベルでの）免疫蛍光染色および免疫組織化学染色によって試験される。
【０２３２】
候補物質は、その活性を高め、かつ骨の形成を刺激するＯｓｔｅｒｉｘと相互作用し得る、あらゆるタイプの物質であり得、一方で、候補物質を得るための一つの好ましい方法は、コンビナトリアル・ケミストリー技術を利用することによる方法である。このような技術は、当業者に周知であり、そしてＶａｎＨｉｊｆｔｅ  Ｌら、１９９９およびＦｌｏｙｄ  Ｃ．Ｄ．ら、１９９９（本明細書中で参考として援用される）に記載される方法を包含する。
【０２３３】
（Ｅ．Ｏｓｔｅｒｉｘファミリーの他のメンバーおよびＯｓｔｅｒｉｘのリガンド）
（１．Ｏｓｔｅｒｉｘファミリーの他のメンバー）
Ｏｓｔｅｒｉｘと構造的特性または機能的特性を共有する他の分子が存在することが予想される。例えば、ヒトの等価物は、マウスにおいて本来発見された分子に対して同定されてきた。他の種におけるＯｓｔｅｒｉｘ等価物、Ｏｓｔｅｒｉｘアイソフォーム、およびＯｓｔｅｒｉｘサブユニットを含むこれらの分子は、Ｏｓｔｅｒｉｘファミリーのメンバーとして表され、そして本発明に包含される。これは、Ｏｓｔｅｒｉｘ関連試薬およびＯｓｔｅｒｉｘ関連アッセイの有用性が、発明者がＯｓｔｅｒｉｘと構造的特性または機能的特性を共有する分子を同定することを可能にすることに起因する。
【０２３４】
Ｏｓｔｅｒｉｘのヒト等価物を同定するために、ゲノムＰＣＲＴＭおよびＲＴ−ＰＣＲＴＭ増幅が、用いられ得る。これらの方法において、ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、上記のようなマウスＯｓｔｅｒｉｘヌクレオチド／アミノ酸配列に基づいて設計されたプライマーセットを使用して、異なる程度のストリンジェンシーを用いる種々の条件下で、増幅される。ＰＣＲＴＭ産物は、次いでクローン化され、そして配列決定される。それらが、ヌクレオチドまたはアミノ酸いずれかのレベルで、マウスＯｓｔｅｒｉｘに対して有意な相同性を示す場合、これらのＰＣＲＴＭ産物は、ヒト細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーから、関連するｃＤＮＡをクローン化するために用いられる。
【０２３５】
コロニーハイブリダイゼーションを行うために、ヒト骨芽細胞、または末梢血白血球、またはヒトゲノムＤＮＡライブラリーから調製されたｃＤＮＡライブラリーは、マウスＯｓｔｅｒｉｘ  ｃＤＮＡ、またはこれらのｃＤＮＡの標的化された断片と、異なる程度のストリンジェンシーを用いる種々の条件下で、ハイブリダイズされる。あるいは、これらのライブラリーは、マウスＯｓｔｅｒｉｘおよびＯｓｔｅｒｉｘの配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドと、ハイブリダイズされ得る。
【０２３６】
実際に、本発明者らは、サザンブロッティングによって、Ｏｓｔｅｒｉｘのヒト等価物を検出し得た。これらの結果は、マウスＯｓｔｅｒｉｘおよびヒトＯｓｔｅｒｉｘが、配列番号１のヌクレオチド配列を用いて検出し得るために十分高いヌクレオチド配列相同性を示すことを示す。これらの結果は、Ｏｓｔｅｒｉｘのヒト等価物が、マウス起源のｃＤＮＡプローブを用いて、検出可能であることを確証する。ヒトＯｓｔｅｒｉｘはまた、ＤＮＡ配列のアライメントによって、マウスＯｓｔｅｒｉｘに対して、アミノ酸配列において９５％の同一性を示した。
【０２３７】
ヒト骨芽細胞を認識する抗体は、多数の方法において有用であることが企図される。例えば、ヒト骨芽細胞を認識する抗体は、Ｏｓｔｅｒｉｘのヒト等価物を同定するために用いられ得る。より詳細には、関連するタンパク質は、免疫沈降によって精製され得、次いで配列決定され得る。ヒト等価物をコードしているｃＤＮＡは、次いでＰＣＲＴＭおよび／またはＰＣＲＴＭ産物（アミノ酸配列から設計されたプライマーを用いて増幅される）もしくはオリゴヌクレオチドを使用するコロニーハイブリダイゼーションによってクローン化され得る。
【０２３８】
マウスＯｓｔｅｒｉｘの関連するリガンドは、Ｏｓｔｅｒｉｘのヒト等価物を同定するための分子プローブとして役立ち得る。より詳細には、マウスＯｓｔｅｒｉｘに対するリガンドの可溶性形態は、ヒト骨芽細胞に対するそれらの結合について、初めに試験される。それらが有意な結合を示す場合、発現ｃＤＮＡクローニング方法が用いられ、ここで、（検出可能なＯｓｔｅｒｉｘを発現しない）非骨芽細胞株は、ヒト骨芽細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーを用いてトランスフェクトされる。可溶性リガンドを結合するトランスフェクト体（すなわち、発現しているＯｓｔｅｒｉｘのヒト等価物）は、ＦＡＣＳまたはパニングによって単離される。この手順は、Ｏｓｔｅｒｉｘのヒト等価物をコードするｃＤＮＡを同定するために反復される。
【０２３９】
Ｏｓｔｅｒｉｘと相互作用する他のポリペプチドは、酵母ツーハイブリッド系によって同定され得ることが、企図される。この酵母ツーハイブリッド系は、非常に有用で、そしてタンパク質：タンパク質相互作用を研究するために、当該分野において周知であり、そしてそれ故、Ｏｓｔｅｒｉｘと他のポリペプチドとの相互作用を決定するために、本明細書中で用いられる。この系のバリエーションは、相互作用するタンパク質をクローン化するための酵母ファージミド（Ｈａｒｐｅｒら、１９９３；Ｅｌｌｅｄｇｅら、１９９１）またはプラスミド（Ｂａｒｔｅｌら、１９９３ａ，ｂ；ＦｉｎｌｅｙおよびＢｒｅｎｔ、１９９４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに、および公知のタンパク質対の研究に利用可能である。
【０２４０】
このツーハイブリッド系は、タンパク質：：タンパク質相互作用の指標として転写活性を利用する遺伝的方法である。これは、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインから構成される多くの部位特異的転写活性化因子のモジュールの性質に依存する。このＤＮＡ結合ドメインは、活性化因子を、発現される特定の遺伝子に対して標的化するように作用し、そしてこの活性化ドメインは、転写が起こることを可能にするために転写機構の他のタンパク質と接触する。このツーハイブリッド系は、活性化因子の二つのドメインは、共有結合する必要がなく、そして任意の二つのタンパク質の相互作用によって接触され得るという観察に基づく。この系の適用は、以下の二つのハイブリッドが構築されることを必要とする：一つのタンパク質に融合した（Ｏｓｔｅｒｉｘの）ＤＮＡ結合ドメイン、およびいくつかのタンパク質に融合した（Ｏｓｔｅｒｉｘの）転写活性化ドメイン。これらの二つのハイブリッドは、一つ以上のレポーター遺伝子を含む細胞中で発現される。Ｘタンパク質とＹタンパク質が相互作用する場合、それらは、活性化ドメインをＤＮＡ結合ドメインと近接させることによって機能的活性化因子を作製する。これは、レポーター遺伝子の発現によって検出され得る。このアッセイは、通常酵母細胞中で行われてきたが、このアッセイは、哺乳類細胞中でも同様に働き、そして他の真核細胞中でも同様に適用可能である。Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅ．Ｍ．およびＳ．Ｆｉｅｌｄｓ（１９９５）ＰｒｏｔｅｉｎーＰｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．５９：９４−１２３，１０５を参照のこと。
【０２４１】
このツーハイブリッド系の成功は、多くの転写因子（例えば、ＧＡＬ４）のＤＮＡ結合ドメインおよびポリメラーゼ活性化ドメインが、分離され得、次いで機能性を回復させるために再結合され得るという事実に起因する（Ｍｏｒｉｎら、１９９３）。種々のレポーター遺伝子カセットの完全なコピーを有する酵母株は、異なる融合タンパク質をそれぞれ発現する、二つのプラスミドを用いて同時形質転換される。一つのプラスミドは、タンパク質「Ｘ」と（例えば、ＧＡＬ４酵母転写活性化因子）のＤＮＡ結合ドメインとの間の融合物をコードし（ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８５；ＭａおよびＰｔａｓｈｎｅ、１９８７；Ｋｅｅｇａｎら、１９８６）、その一方で、その他のプラスミドは、タンパク質「Ｙ」とＧＡＬ４のＲＮＡポリメラーゼ活性化ドメインとの間の融合物をコードする（Ｋｅｅｇａｎら、１９８６）。このプラスミドは、その調節領域がＧＡＬ４結合部位を含む、レポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）を含む酵母株中に形質転換される。タンパク質Ｘとタンパク質Ｙが相互作用する場合、これらは、二つのＧＡＬ４構成成分を、転写を活性するために十分に近接させることによって、機能的ＧＡＬ４転写活性化タンパク質を再構成する。いずれのハイブリッドタンパク質も、単独では、レポーター遺伝子（ＤＮＡ結合ドメインハイブリッド）の転写を活性化することは不可能である、なぜならば、このハイブリッドタンパク質は、活性化機能および活性化ドメインハイブリッドを提供せず、ＧＡＬ４結合部位に局在し得ないからである。二つの試験タンパク質の相互作用は、ＧＡＬ４の機能を再構成し、そしてレポーター遺伝子の発現を生じる。このレポーター遺伝子カセットは、５’からそのＴＡＴＡボックスへ向かってクローン化されたＧＡＬ４  ＤＮＡ認識部位（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＤａｖｉｓ、１９８４；ＬｏｒｃｈおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ、１９８４）を含む、最小限のプロモーターから構成される。転写活性化は、β−ガラクトシダーゼの発現か、または転写産物に対する栄養要求性選択（例えば、ＵＲＡ３（ウラシル選択）またはＨＩＳ３（ヒスチジン選択））を可能にする特定の栄養素を欠いた最小培地上の形質転換体の増殖のいずれかを測定することによって評価される。Ｂａｒｔｅｌら、１９９３ａ；Ｄｕｒｆｅｅら、１９９３；ＦｉｅｌｄｓおよびＳｔｅｒｎｇｌａｎｔｚ、１９９４、および米国特許５，２８３，１７３号を参照のこと。本出願において引用されるこれら、および全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用される。
【０２４２】
このツーハイブリッド系に加えて、他の方法（例えば、免疫共沈降、架橋、および、勾配またはクロマトグラフィーのカラムを通した同時精製）もまた、Ｏｓｔｅｒｉｘと相互作用するポリペプチドおよびタンパク質を同定するために用いられ得る。同時精製または共沈降されたタンパク質は、次いでタンパク質配列決定を含む、当該分野において公知の方法によって、同定され得る。
【０２４３】
Ｏｓｔｅｒｉｘ  ｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされた哺乳類細胞は、Ｏｓｔｅｒｉｘに結合するペプチドを同定するために用いられ得る。詳細には、ランダムペプチドディスプレイライブラリー（例えば、ＦｌｉＴｒｘＴＭ）を発現するＥ．ｃｏｌｉは、パニングによって、上記トランスフェクト体への結合物に対してスクリーニングされる。数回のスクリーニング後、陽性クローンが、配列決定される。次いで、完全長ポリペプチドが、ペプチド配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチド、またはＰＣＲＴＭプライマーを利用する骨芽細胞ｃＤＮＡライブラリーのコロニーハイブリダイゼーションによって同定される。
【０２４４】
代わりに、Ｏｓｔｅｒｉｘに対する関連するリガンドを単離するための生化学的アプローチでは、骨芽細胞株から調製された全細胞抽出物または膜画分が、可溶性Ｏｓｔｅｒｉｘと結合体化したアフィニティーカラム上にアプライされる。次いで、カラムに結合した分子（すなわち、推定上のリガンド）が、ｐＨを変化させるか、またはＥＤＴＡもしくは糖質を用いて洗浄することによって溶離される。この溶離物は、従来のカラムクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣによって精製され、次いでアミノ酸配列について試験される。これらのリガンドをコードしているｃＤＮＡは、示されたアミノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチド、またはＰＣＲＴＭプライマーを利用する骨芽細胞ｃＤＮＡライブラリーのコロニーハイブリダイゼーションによってクローン化される。
【０２４５】
（Ｆ．Ｏｓｔｅｒｉｘ関連試薬およびアッセイの臨床的適用および準臨床的適用）
本明細書中に記載されるＯｓｔｅｒｉｘ関連因子（すなわち、Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質またはポリペプチド、このようなタンパク質またはポリペプチドに対して惹起される抗体、Ｏｓｔｅｒｉｘの変異型形態、切断型形態、または伸長型形態、このような形態に対して惹起される抗体、Ｏｓｔｅｒｉｘを過剰産生または欠損するように操作された細胞、Ｏｓｔｅｒｉｘと相互作用するタンパク質、およびＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子発現を刺激、活性化、阻害、または調節する因子）は、骨の形成を促進するために用いられ得ることが、さらに企図される。すなわち、これらは、骨障害（例えば、骨粗しょう症、糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、パジェット病、異常に増進された骨の代謝回転、歯周病、歯の損失、骨折、慢性関節リウマチ、捕てつ周辺（ｐｅｒｉｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）の骨溶解、骨形成不全、転移性骨疾患、悪性の高カルシウム血症など）の処置のために用いられ得る。
【０２４６】
（１．Ｏｓｔｅｒｉｘ依存性骨芽細胞機能を調節する試薬についての検索のための薬理学的適用）
あるものは、候補物質が、骨芽細胞によるＯｓｔｅｒｉｘの発現に影響し得るか否かを決定するために、選択され得る。この目的のために、骨芽細胞調製物（例えば、Ｃ２Ｃ１２細胞、マウス骨芽細胞、ヒト骨芽細胞）は、個別にか、または組み合わせでかのいずれかで候補分子を用いて処置され、次いでｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、および機能レベルでＯｓｔｅｒｉｘの発現について試験される。あるいは、これらの候補物質は、生きている動物に投与することによって、インビボで検査され得る。この場合、骨芽細胞は、処置後これらのマウスから単離され、次いで、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、および機能レベルで、再度Ｏｓｔｅｒｉｘ発現についてインビトロで試験される。これらのアッセイの実行において、Ｏｓｔｅｒｉｘの異なるアイソフォームの発現に対する候補物質の効果をまた試験することが、重要である。
【０２４７】
これらの実施形態において、本発明は、骨芽細胞活性化プロセスを刺激する候補物質の能力を決定するための方法に向けられ、この方法は、一般的に以下の工程を包含する：
（ａ）骨芽細胞（および必要な場合、関連する抗原）の集団を含む第二成分と、Ｏｓｔｅｒｉｘを発現する組換え細胞の集団を含む第一成分とを混合する工程；
（ｂ）候補物質と混合物とをインキュベートする工程；
（ｃ）増強された骨芽細胞活性について上記混合物を試験する工程；および
（ｄ）骨芽細胞の活性化を阻害する候補物質を同定する工程。
【０２４８】
候補物質を同定するために、第１に骨芽細胞を活性化可能なＯｓｔｅｒｉｘ組成物が獲得される。必然的に、添加された候補物質の非存在下でＯｓｔｅｒｉｘ組成物の骨芽細胞活性能が測定されるか、もしくは決定される。次いで、Ｏｓｔｅｒｉｘ組成物に候補物質が添加され、そして候補物質の存在下で骨芽細胞を活性化するＯｓｔｅｒｉｘ組成物の能力が再決定される。その非存在下の能力に関連してＯｓｔｅｒｉｘ組成物の骨芽細胞活性能を増大させる候補物質は、刺激能を有する候補物質を示す。
【０２４９】
この候補のスクリーニングアッセイは、準備および実行が全く複雑でなく、かつタンパク質活性およびポリペプチド活性を測定するための上記のアッセイに多くの点で関連する。従って、ネイティブの供給源もしくは組換え体の供給源のいずれかに由来のタンパク質もしくはポリペプチドの比較的精製された調製物を得た後、タンパク質がその骨芽細胞活性化機能を実行可能な好ましい条件下で、タンパク質調製物と候補物質とを混合することが所望される。この様式において、候補物質の存在下において骨芽細胞活性能を比較的増加させる候補物質の能力が測定され得る。
【０２５０】
当然、本発明の全てのスクリーニング方法は、有効な候補物質が見出され得ないという事実にもかかわらず、それら自身有用であることが理解される。なぜならば、Ｏｓｔｅｒｉｘアゴニストおよび／またはアンタゴニストが、存在しないことを知るためには実質的に有用であるからである。本発明は、これらを見出さない、このような候補についてのスクリーニングのための方法を提供する。
【０２５１】
候補分子は、Ｏｓｔｅｒｉｘ依存骨芽細胞相互作用を増強し得る。この可能性を試験するために、試験サンプルは、骨芽細胞活性化アッセイ、Ｏｓｔｅｒｉｘ結合アッセイ、または骨芽細胞接着アッセイに添加される。これらのアッセイの一つにおいてＯｓｔｅｒｉｘの機能を高めるサンプルは、付加的な特性を保有すると考えられる。
【０２５２】
任意の分子が、本発明の目的のための候補分子であり得る。候補分子は、周知の組み合わせの化学技術（例えば、本明細書中で参考として援用される、ＶａｎＨｉｊｆｔｅ  Ｌら、１９９９およびＦｌｏｙｄ  Ｃ．Ｄ．ら、１９９９において記載される技術）を用いて、最も効率的に設計および作成されることが想像される。
【０２５３】
（Ｆ．Ｏｓｔｅｒｉｘを用いる治療）
Ｏｓｔｅｒｉｘは、骨の形成に関与するので、骨障害（例えば、骨粗しょう症、糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、パジェット病、異常に増大した骨代謝、歯周病、歯の損失、骨折、慢性関節リウマチ、捕てつ周辺（ｐｅｒｉｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）の骨溶解、骨形成不全、転移性骨疾患、悪性の高カルシウム血症など）の処置に有効に用いられ得る。
【０２５４】
（１．Ｏｓｔｅｒｉｘのタンパク質治療）
別の治療アプローチは、被験体に対するＯｓｔｅｒｉｘポリペプチド、活性断片、合成ペプチド、これらのミメティックまたはアナログの用意である。このタンパク質は、組換え体発現手段によって生成され得るか、または十分に小さい場合、自動ペプチド合成機によって生成され得る。処方は、投与の経路、および目的に基づいて選択され、リポソームの処方物および古典的な製剤を含むがこれらに限定されない。
（２．Ｏｓｔｅｒｉｘを用いた遺伝子ベースの治療）
本発明者らによって企図される治療の実施形態の１つは、骨形成に関与する事象における、分子レベルでの介入である。詳細には、本発明者らは、骨細胞または前駆細胞にＯｓｔｅｒｉｘポリペプチドを提供可能な発現構築物を、この骨細胞または前駆細胞に提供することを意図する。この配列は、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、ラット遺伝子、ウサギ遺伝子、ネズミ遺伝子、霊長類遺伝子、およびイヌ遺伝子との間で相同なので、これらの核酸のいずれかは、同じか、または生化学的に等価なポリペプチドをコードする遺伝子配列改変体のいずれかとして、ヒト治療に用いられ得る。本明細書中で使用された発現ベクターおよび遺伝的要素の上記の長い考察は、この節において参考として援用される。特に好ましい発現ベクターは、ウイルスベクターである。
【０２５５】
当業者は、インビボ状態およびエキソビボ状態に対してどのように遺伝子送達を適用するか十分に知っている。ウイルスベクターに関して、一般的にウィルスベクターストックが調製される。ウイルスの種類およびその到達可能な力価に依存して、患者に対して、１〜１００、１０〜５０、１００〜１０００、または１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、または１×１０１２までの感染性粒子が送達される。同様の形態が、相対的な取り込み効率の比較によって、リポソームの処方物または他の非ウイルス処方物について推定され得る。薬学的に受容可能な組成物としての処方が、以下に考察される。
【０２５６】
種々の経路が、異なる疾患型について企図される。経路に関する以下の節は、可能な経路の広範な一覧を含む。異なる実施形態において、エキソビボ遺伝子治療が、企図される。エキソビボ実施形態において、患者由来の細胞は、除去され、そして少なくともいくらかの期間、体外で維持される。この期間の間、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子は、これらの細胞に送達され、その後この細胞は、患者に再導入される。
【０２５７】
本発明のいくつかの実施形態において、被験体は、ウイルスベクターに曝露され、次いで被験体は、発現構築物ベースの毒性についてモニターされ、ここでこのような毒性は、特に、被験体に対して有害な状態を引き起こすことを含む。
【０２５８】
（３．薬剤的処方および送達）
本発明の好ましい実施形態において、Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードする発現構築物の送達による骨障害のための処置の方法が、企図される。骨障害（例えば、骨粗しょう症、糖質コルチコイド誘導骨粗しょう症、パジェット病、異常に増大した骨代謝、歯周病、歯の損失、骨折、慢性関節リウマチ、捕てつ周辺（ｐｅｒｉｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）の骨溶解、骨形成不全、転移性骨疾患、悪性の高カルシウム血症など）が処置され得る。
【０２５９】
一般的に、薬剤的組成物の有効量は、疾患またはその症状の程度を検出可能にかつ、反復して、改善、減少、最小化、または制限するために十分な量と定義される。疾患の消失、根絶または治癒を含むより厳密な定義が適用し得る。
【０２６０】
（（ｉ）投与）
Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドを発現する治療用発現構築物は、任意の経路によって投与され得、そして投与の経路は、病変の位置および性質と共に必然的に変化し、そして例えば、皮内の、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）の、非経口の、静脈内の、筋肉内の、鼻腔内の、皮下の、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）の、潅流の、洗浄の、気管内の、腹腔内の、腫瘍内の、直接注射のおよび経口の投与ならびに処方を含む。処置レジメンは、同様に変化し得、そして疾患の進行、ならびに患者の健康および年齢にしばしば依存する。臨床医は、治療処方の公知の効力および毒性（ある場合）に基づいてこのような決断を下すのに最も適している。
【０２６１】
この処理は、種々の「単位用量」を含み得る。単位用量は、治療的組成物の予め決定された量を含むとして、定義される。投与されるべき量、ならびに特定の経路および特定の処方は、臨床に関わる当業者の範囲内である。単位用量は、単一注入として投与される必要はないが、１セットの期間にわたる連続注入を含み得る。本発明の単位用量は、ウイルス構成物に関するプラーク形成単位（ｐｆｕ）に関して、簡便に記載され得る。単位用量は、１０３ｐｆｕ、１０４ｐｆｕ、１０５ｐｆｕ、１０ｐｆｕ６、１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、１０９ｐｆｕ、１０１０ｐｆｕ、１０１１ｐｆｕ、１０１２ｐｆｕ、１０１３ｐｆｕ、およびより高い値に及ぶ。あるいは、ウイルスの種類および達成可能な力価に依存して、１〜１００、１０〜５０、１００〜１０００の感染性ウイスル性粒子（ｖｐ）、または、約１×１０４まで、約１×１０５まで、約１×１０６まで、約１×１０７まで、約１×１０８まで、約１×１０９まで、約１×１０１０まで、約１×１０１１まで、約１×１０１２まで、約１×１０１３まで、約１×１０１４まで、もしくは約１×１０１５までの感染性ウイルス性粒子（ｖｐ）、あるいは、より高い感染性ウイルス性粒子（ｖｐ）を、患者または患者の細胞へ送達する。
【０２６２】
核酸構築物の注入は、発現構築物が注入のために必要な特定のゲージの針を通過し得る限り、シリンジ、または液体の注入に使用される他の方法のいずれかによって、送達され得る。新規な針無し注入システムが、近年、記載されている（米国特許第５，８４６，２３３号）。このシステムは、溶液を保持するためのアンプルチェンバーを規定するノズル、およびこのノズルから投与部位へ溶液を押し出すためのエネルギーデバイスを有する。シリンジシステムもまた、遺伝子治療における使用について記載されており（米国特許第５，８４６，２２５号）、どの深さにおいても予め決定された溶液量を正確に複数回注入することを可能にする。
【０２６３】
遊離塩基としての活性化合物、または薬理学的に受容可能な塩の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合した水中にて調製し得る。分散物もまた、グリセロール中、液体ポリエチレングルコール中およびこれらの混合液中ならびに油中にて調製し得る。保存および使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために、防腐剤を含有する。注入可能な使用に適した薬学的形態としては、滅菌水溶液または滅菌分散物、および注入可能な滅菌溶液または注入可能な滅菌分散物の即時調製物のための滅菌粉末が、挙げられる。（米国特許第５，４６６，４６８号、具体的には、本明細書中にその全体が参考として援用される）。全ての場合において、形態は、滅菌されなければならず、そして、容易な注入可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に、流動性でなければならない。形態は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の汚染作用から、保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適切な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散物媒体であり得る。適切な流動率は、例えば、レクチンのようなコーティングの使用、分散物の場合に必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノ−ル、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって、成し遂げられ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが、好ましい。注入可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）において使用することによって、成し遂げられ得る。
【０２６４】
水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要ならば適切に緩衝化されるべきであり、そして、液体希釈剤は、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて最初に等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈投与、筋内投与、皮下投与、腫瘍内投与および腹腔内投与に適する。この点について、使用され得る滅菌水溶性媒体は、本開示を考慮すると、当業者に公知である。例えば、ある投薬量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、そして、１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または目的注入部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくつかの改変は、処置されている被験者の状態に依存して、必然的に起こる。投与の責任がある人は、いずれの事象においても、個々の被験者のために適切な用量を、決定する。さらに、ヒトへの投与に関しては、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓの標準によって要求される滅菌標準、発熱標準、一般的安全標準および純度標準を、満たすべきである。
【０２６５】
注入可能な滅菌溶液は、活性化合物を必要量で、適切な溶媒中に上記の種々の他の成分とともに組み込むことによって調製され、必要ならば、続いてろ過滅菌する。一般的に、基本分散媒体、および上記の成分からの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、滅菌された種々の活性成分を組み込むことによって、分散物は調製される。注入可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、好ましい調製法は、活性成分および所望される任意のさらなる成分の粉末を、予めろ過滅菌したそれらの溶液から産出する、真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
【０２６６】
本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で、処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、この酸付加塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または酢酸、シュウ酸、タリル酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩はまた、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄）およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から、誘導され得る。処方の際、溶液は、投薬処方と適合し得る様式で、および治療的に有効な量で、投与される。処方物は、種々の投薬形態（例えば、注入可能な溶液、薬物放出カプセルなど）において、容易に投与される。
【０２６７】
本明細書中で使用される場合、「キャリア」としては、いずれのおよび全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸着遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどが、挙げられる。薬学的な活性物質のための、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野に周知である。従来の任意の媒体または薬剤が活性成分と適合し得ない範囲を除いて、治療的組成物中の媒体または薬剤の使用は、企図される。補足の活性成分もまた、組成物中に組み込まれ得る。
【０２６８】
句「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」は、ヒトに投与された場合、アレルギー反応または類似した特異な反応を生成しない分子的実体および組成物をいう。活性成分としてタンパク質を含む水溶性組成物の調製は、当該分野において周知である。典型的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかのような注入可能物として、調製される；注入前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた、調製され得る。用語「接触させる」および「曝露させる」は、細胞に適用される場合、Ｏｓｔｅｒｉｘポリペプチドをコードする治療的構築物を標的細胞に送達するプロセスを記載するために、本明細書中で使用される。
【０２６９】
（Ｈ．ノックアウト動物およびノックアウト細胞、トランスジェニック動物およびトランスジェニック細胞）
Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子欠損細胞、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子欠損細胞株、およびＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子欠損動物は、例えば、上記の同定アッセイに加えて、特異的調節因子（例えば、骨芽細胞遺伝子の発現および活性の刺激因子またはそのインヒビター）の同定の一部として、生成および利用され得る。従って、Ｏｓｔｅｒｉｘ欠損細胞、Ｏｓｔｅｒｉｘ欠損細胞株、およびＯｓｔｅｒｉｘ欠損動物は、代表的な例として、頻繁に本明細書中で使用される。
【０２７０】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｏｓｔｅｒｉｘ欠損」は、対応する細胞、または正常な２つのＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子の野生型コピーを含む細胞を含む細胞株もしくは動物細胞よりも、低レベルの機能的Ｏｓｔｅｒｉｘ活性を示す細胞、細胞株および／または動物をいう。好ましくは、「Ｏｓｔｅｒｉｘ欠損」は、検出可能な機能的Ｏｓｔｅｒｉｘ活性が存在しないことをいう。
【０２７１】
代表的なＯｓｔｅｒｉｘ欠損動物または「ノックアウト」動物は、マウスＯｓｔｅｒｉｘ欠損動物である。ノックアウト動物は、当業者に周知である。例えば、Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉら、１９９５；およびＯｔｔｅｒｂａｃｈならびにＳｔｏｆｆｅｌ、１９９５（これらの両方は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。さらなるＯｓｔｅｒｉｘノックアウト細胞、Ｏｓｔｅｒｉｘノックアウト細胞株およびＯｓｔｅｒｉｘノックアウト動物を生成するための技術は、以下に記載される。
【０２７２】
Ｏｓｔｅｒｉｘ活性が欠損した細胞および細胞株は、当業者に周知である標準的技術を利用してＯｓｔｅｒｉｘノックアウト動物から、誘導され得る。このような動物は、培養においてアッセイ基質として使用され得る細胞株を誘導するために、用いられ得る。初代培養物が利用され得るが、連続細胞株の生成が、好ましい。トランスジェニック動物から連続細胞株を誘導するために使用され得る技術例については、Ｓｍａｌｌら，１９８５を参照のこと。細胞および細胞株の生成のためのこのような技術はまた、以下に記載されるトランスジェニック動物および遺伝子操作された動物に関連して、利用され得る。
【０２７３】
Ｏｓｔｅｒｉｘ欠損細胞に関して、このような細胞としては、例えば、骨障害（例えば、骨粗鬆症）を示す患者から採取された細胞、および骨障害（例えば、骨粗鬆症）を示す患者に由来する細胞株が、挙げられ得る。さらなるＯｓｔｅｒｉｘ欠損細胞およびＯｓｔｅｒｉｘ欠損細胞株は、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子配列にＯｓｔｅｒｉｘ活性を破壊させる変異を導入するための、周知の組み換えＤＮＡ技術（例えば、部位特異的変異誘発）を使用して、生成され得る。
【０２７４】
Ｏｓｔｅｒｉｘ欠損細胞およびＯｓｔｅｒｉｘ欠損動物は、本発明中に記載されるＯｓｔｅｒｉｘヌクレオチド配列を使用して、生成され得る。このような動物としては、以下の任意の種が挙げられるが、これらに限定されない：マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、および非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、リスザルおよびチンパンジー）。
【０２７５】
当該分野において公知である任意の技術を使用して、導入遺伝子（例えば、不活性化してある遺伝子配列）を、動物へ導入して、トランスジェニック動物のファウンダー系統を生成し得る。このような技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：前核のマイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系統へのレトロウイルス媒体遺伝子移（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、１９８５）；胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３）；および精子媒体遺伝子移（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、  １９８９）など。このような技術の総説については、Ｇｏｒｄｏｎ、１９８９（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０２７６】
上記に列挙されるように、標準的胚性幹細胞（ＥＳ）技術は、例えば、Ｏｓｔｅｒｉｘノックアウトの生成のために、利用され得る。ＥＳ細胞は、インビトロで培養される着床前の胚から、取得され得る（例えば、Ｅｖａｎｓら、１９８１；Ｂｒａｄｌｅｙら、１９８４；Ｇｏｓｓｌｅｒら、１９８６；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８６；Ｗｏｏｄら、１９９３参照のこと）。この導入されたＥＳ細胞は、その後、胚をコロニー化させ、そして、その結果生じたキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、１９８８）。
【０２７７】
Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子破壊を達成させるために、遺伝子ターゲティングを介する部位特異的不活性化の技術が、使用され得（Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．１９８７）、そしてＦｒｏｈｍａｎら、１９８９；Ｃａｐｐｅｃｃｈｉ、１９８９；Ｂａｒｒｉｂａｕｌｔら、１９８９；Ｗａｇｎｅｒ、１９９０；およびＢｒａｄｌｅｙら、１９９２中に、総説される。
【０２７８】
さらに、Ｏｓｔｅｒｉｘ配列を連結させる標準的な技術（例えば、相同組み換え）は、所望される任意のＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子領域の不活性化または変更のために、利用され得る。多くの戦略は、相同組み換え率を検出または選択するために、利用され得る。例えば、ＰＣＲは、相同的な挿入のための形質転換体細胞プールのスクリーニング、続く個々のクローンのスクリーニングに、使用され得る（Ｋｉｍら、１９８８；Ｋｉｍら、１９９１）。あるいは、ポジティブ遺伝子選択アプローチが使用され得、ここで、相同的な挿入が起こった場合にのみ活性であるマーカー遺伝子が構築され、これらの組み換え体が直接選択されることを可能にする（Ｓｅｄｉｖｙら、１９８９）。さらに、ポジティブ−ネガティブアプローチ（ＰＮＳ）法が、利用され得る（Ｍａｎｓｏｕｒら、１９８８；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９；Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９）。ＰＮＳ法を利用して、非相同組み換え体は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用することによって、およびその非相同的な挿入に対してヘルペス薬物（例えば、ガンシクロビルまたはＦＩＡＵ）を用いて選択することによって、選択され得る。このような逆の選択（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）によって、生存する形質転換体における相同組み換え体の数が、増大される。
【０２７９】
これらのような技術を介して生成されるＥＳ細胞は、非ヒト動物の生殖細胞系へ導入される場合、モザイクでない、すなわち、キメラでない子孫の生成を可能にする。このような子孫は、本明細書中で、ファウンダー動物と、いわれる。一旦、ファウンダー動物が生成されると、ファウンダー動物は、特定の動物のコロニーを生成するために、交配、同系交配、異系交配または異種交配され得る。
【０２８０】
上記の、Ｏｓｔｅｒｉｘノックアウトマウスの生成の例として、まず標準的技術が、マウスＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子配列の単離のために、利用され得る。このような配列は、以下で議論されるように、標準的分子技術、ならびにプローブおよび／またはＰＣＲプライマーとしてのヒトＯｓｔｅｒｉｘヌクレオチド配列を利用することによって、慣用的に単離され得る。
【０２８１】
次いで、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子の不活性な対立遺伝子は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）における相同組換えのための、ポジティブ選択およびネガティブ選択を併用する標準的手順を使用する標的化変異誘発によって、生成され得る。Ｏｓｔｅｒｉｘゲノムクローンは、例えば、１２９／ｓｖマウスゲノムライブラリーから単離され得、このゲノムライブラリーは、遺伝子ターゲティングのために使用されるＥＳ細胞と同遺伝子系である。第一コードエキソン（エキソン２）の欠損部位の５’側および３’側の両側に隣接する相同配列を含むヌル（ｎｕｌｌ）ターゲティングベクターが構築され得、この第一コードエキソンは、翻訳開始コドン、および他の必須な遺伝子コード配列を含む。このベクターは、ポジティブ選択のための耐性マーカー（例えば、ネオマイシン耐性マーカー（Ｎｅｏ））、およびネガティブ選択のためのネガティブマーカー（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）マーカー）を、有する。以前に報告されたターゲティングベクターに類似するベクターが、利用され得、そのターゲティングベクターは、他の遺伝子（例えば、ニーマン−ピック病、ＮＭＤＡレセプターおよび甲状腺ホルモンレセプター）に関するノックアウトマウスの生成のために、首尾よく使用される。
【０２８２】
簡単に述べると、ベクターＤＮＡは、Ｗ９．５  ＥＳ細胞（雄性由来）に、エレクトロポレーションし得、次いで、そのＷ９．５  ＥＳ細胞は、Ｎｅｏ遺伝子を発現するトランスジェニックマウス由来のマウス胚性線維芽細胞の支持細胞層上で、培養および選択され得る。Ｇ４１８（３５０ｍｇ／ｍｌ；Ｎｅｏを得るため）およびガンシクロビル（２  ｍＭ；ＴＫを失うため）は、ＵＲＯ−Ｄ遺伝子にて相同組換えが起こった耐性ＥＳ細胞コロニーを選択するために、培養培地に添加され得る。組換え体は、サザンブロットハイブリダイゼーション分析によるＥＳ細胞コロニーからのゲノムＤＮＡのスクリーニングによって、同定される。４０の染色体の正常な相補体もまた有する、正確に標的化されたＥＳ細胞クローンは、変異を有するマウスを誘導するために、使用され得る。ＥＳ細胞は、交尾後３．５日目にて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得た胚盤胞へマイクロインジェクションされ得、そして、胚盤胞は、偽妊娠の雌性マウスへ再着床され、その雌性マウスは、乳母として働く。大部分がＥＳ細胞由来であるキメラ子孫は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ宿主胚盤胞由来の黒色の外被（ｂｌａｃｋ  ｃｏａｔ  ｃｏｌｏｒ）に対する高い割合のアグーチ色の外被（ａｇｏｕｔｉ  ｃｏａｔ  ｃｏｌｏｒ）（ＥＳ細胞の起源の１２９／ｓｖ系統の色）によって、同定される。雄性キメラ子孫は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性と繁殖させることによる変異の生殖細胞系伝達について、試験される。これらの交配由来のアグーチ子孫は、変異についてヘテロ接合であることが予想され、このことは、サザンブロット分析によって確認される。これらのＦ１ヘテロ接合子孫は、表現型の分析のための３種の遺伝子型全て（野生型、ヘテロ接合変異体およびホモ接合変異体）の子孫を含むＦ２同腹子を生成するために、交配される。
【０２８３】
（１．トランスジェニック動物の作製法）
このように、本発明の特定の実施例は、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子に関してノックアウトであり、ゆえに、Ｏｓｔｅｒｉｘが関連する骨障害についてモデルとして役立つトランスジェニックマウスを提供し、そして、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子発現およびＯｓｔｅｒｉｘ機能活性のインヒビターおよび刺激因子の両方を含む調節因子の同定のためのアッセイ系もまた、提供する。
【０２８４】
本発明の考察はトランスジェニックマウスを言及するが、マウスは、単に模範的なモデル動物であり、そして、モデル動物として慣習的に使用される他の任意の哺乳動物（例えば、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタなど）は、本明細書中に記載される技術を使用して生成され得る、ということが理解される。一般的な局面において、トランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を可能にする様式において、ゲノム中に所定の導入遺伝子を組込むことによって、生成される。本明細書中で使用される場合、用語「動物」および「非ヒト動物」は、ヒトを除く脊椎動物全てを含む。これらの用語はまた、胚段階および胎児段階を含む、発生の全段階における個々の動物を含む。「トランスジェニック動物」は、亜細胞レベルでの意図的な遺伝子操作によって、直接的または間接的に受け取られた遺伝情報を保有する１つ以上の細胞を含む、任意の動物である。遺伝的操作は、マイクロインジェクション、組換えウイルスを用いる感染、粒子ボンバードメントまたはエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない、遺伝物質を細胞へ導入する任意の方法によって、行われ得る。この用語は、古典的な交雑育種またはインビトロ受精を含むことを意図せず、むしろ、１つ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子を受け取る動物を含むことを意味する。この分子は、染色体内に組込まれ得るか、または染色体外で複製するＤＮＡであり得る。遺伝情報は、レシピエントが属する動物種に対して外来であり得るか、個々のレシピエントに対してのみ外来であり得るか、または、そのレシピエントによって既に保持され、ネイティブな遺伝子よりも異なるレベルで、異なる時間で、もしくは異なる位置で発現される遺伝情報であり得る。
【０２８５】
トランスジェニック動物を生成する方法は、ＷａｇｎｅｒおよびＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号；本明細書中に参考として援用される）によって、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５（本明細書中にその全体が参考として援用される）によって、および「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版（Ｈｏｇａｎ、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＣｏｓｔａｎｔｉｍｉおよびＬｏｎｇ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；本明細書中にその全体が参考として援用される）中に、一般的に記載される。
【０２８６】
典型的に、ゲノム配列に隣接される遺伝子は、マイクロインジェクションによって、受精卵に移される。マイクロインジェクションされた卵は、雌性宿主に移植され、そして子孫は、導入遺伝子の発現のために、スクリーニングされる。トランスジェニック動物は、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類および魚類が挙げられるが、これらに限定されない多くの動物由来の受精卵から、生成され得る。特に好ましい実施形態において、Ｏｓｔｅｒｉｘのノックアウトであるトランスジェニックマウスが、生成される。
【０２８７】
マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは，当該分野において既知である任意の方法によって、調製され得る。例えば、マイクロインジェクションのためのＤＮＡクローンは、細菌性プラスミド配列の除去に適切な酵素を用いて切断され得、そしてＤＮＡフラグメントは、標準的技術を使用してＴＢＥ緩衝液中にて１％アガロースゲル上で電気泳動され得る。このＤＮＡバンドは、臭化エチジウムを用いた染色によって、可視化され、そして発現配列を含むバンドが、切り取られる。次いで、この切り取られたバンドは、０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を含む透析バッグ中に配置される。ＤＮＡは、透析バッグに電気溶出され、１：１のフェノール：クロロホルム溶液を用いて抽出され、二倍容のエタノールによって沈澱される。このＤＮＡは、１ｍｌの低塩緩衝液（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再溶解され、そして、Ｅｌｕｔｉｐ−ＤＴＭカラム上で精製される。このカラムを、先ず、３ｍｌの高塩緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いてプライムし、続いて、５ｍｌの低塩緩衝液を用いて洗浄する。このＤＮＡ溶液を、ＤＮＡをカラムマトリクスに結合させるために、３回カラムを通過させる。３ｍｌの低塩緩衝液で１回洗浄された後、このＤＮＡを、０．４ｍｌの高塩緩衝液を用いて溶出し、そして、二倍容のエタノールによって沈澱させる。ＤＮＡ濃度は、ＵＶ分光光度計における２６０ｎｍでの吸光度によって測定される。マイクロインジェクションのために、ＤＮＡ濃度は、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中にて３μｇ／ｍｌに、調整される。
【０２８８】
マイクロインジェクションのためのＤＮＡの精製に関する他の方法は、Ｈｏｇａｎら  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８６）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら  Ｎａｔｕｒｅ  ３００：６１１（１９８２）；Ｔｈｅ  Ｑｉａｇｅｎｏｌｏｇｉｓｔ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，第３版（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ．出版）、およびＳａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）中に、記載されている。
【０２８９】
雌性マウスは、例えば、妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｓｉｇｍａ）の注入を使用し、続いて、４８時間後、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ）を注入することによって、過剰排卵を誘発させられる。雌は、ｈＣＧ注入直後に、雄とともに配置される。ｈＣＧ注入後２１時間で、交尾した雌を、ＣＯ２窒息または頸部脱臼によって屠殺し、そして、胚を、摘出した卵管から回収し、そして、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水中に配置する。卵丘細胞の周囲は、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、除去される。次いで、前核胚を、洗浄し、そして、注入時まで、５％  ＣＯ２、９５％空気での湿気雰囲気を用いた３７．５℃のインキュベーター中で、０．５％  ＢＳＡ（ＥＢＳＳ）を含むアールの平衡塩類溶液中に配置する。胚は、二細胞期で、着床され得る。
【０２９０】
２５μｇのＳａｌＩ−直線化ＳＧＣ標的化ベクターが、１×１０７個の胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションされる。適切なインキュベート期間（例えば、３６時間）の後、トランスフェクトされた細胞は、次いでＧ４１８およびＦＩＡＵを用いて選択される。Ｇ４１８−ＦＩＡＵ−耐性ＥＳコロニーは、９６−ウェルプレート内に取り上げられる（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｓｏｌｉｓら、１９９３）。ポジティブなＥＳクローンは、Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞に注射され、そして偽妊娠ＩＣＲ雌性レシピエントに移入される。胚移植の時点で、この雌性レシピエントは、体重１ｇ当たり０．０１５ｍｌの２．５％アバーティン（ａｖｅｒｔｉｎ）の腹腔内注射によって麻酔される。卵管は、単一の正中背部切開によって露出される。次いで、体壁を通して、卵管の上に直接切開が行われる。次いで、卵巣嚢が時計工鉗子（ｗａｔｃｈｍａｋｅｒｓ  ｆｏｒｃｅｐ）を用いて開裂される。移入される胚は、ＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水）中、および移入ピペットの先端内に配置される（約１０個〜１２個の胚）。このピペットの先端部は卵管漏斗に挿入され、そして胚が移入される。移入後、切開部は２本の縫合糸によって閉じられる。
【０２９１】
得られた雄性キメラは、雌性Ｃ５７ＢＬ／６と交配される。生殖系列伝達は、表現型（例えば、毛色）を用いてスクリーニングされ得、そしてサザン分析によって確認され得る。
【０２９２】
上記のように、トランスジェニック動物およびそのような動物に由来する細胞株は、特定の試験実験における用途を見出し得る。この点で、オステリックス（Ｏｓｔｅｒｉｘ）トランスジェニック動物および細胞株は、試験基質に対して曝露され得る。これらの試験物質は、骨芽細胞に細胞分化を誘導する能力についてスクリーニングされ得る。このような手順によって同定された化合物は、骨の障害（例えば、骨粗鬆症）の処置において有用である。従って、この同定された化合物は、骨の喪失の予防、処置、回復のために用いられ得る。
【０２９３】
（ａ．ＥＳ細胞）
ＥＳ細胞は、インビトロで培養された移植前の胚から得られる（Ｅｖａｎｓら、１９８１；Ｂｒａｄｌｅｙら、１９８４；Ｇｏｓｓｌｅｒら、１９８６；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（１９８６））。導入遺伝子は、当業者に周知の多くの手段を用いてＥＳ細胞に導入される。その後、形質転換されたＥＳ細胞は、非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わされ得る。その後、ＥＳ細胞は胚に定着し、そして得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する（総説として、Ｊａｅｎｉｓｃｈ、１９８８を参照のこと）。
【０２９４】
一旦ＤＮＡが、例えば、エレクトロポレーションによって（Ｔｒｏｎｅｇｕｚｚｏら、１９８８；Ｑｕｉｌｌｅｔら、１９８８；Ｍａｃｈｙら、１９８８）導入されると、当該分野において周知の従来の条件下で、細胞が培養される。これらの細胞（これらは、所望の遺伝子配列を含むＤＮＡ分子を受容している）の回収を容易にするために、検出可能なマーカー遺伝子配列を含む、第２の遺伝子配列と組み合わせて、所望の遺伝子配列を含むＤＮＡを導入することが好ましい。本発明の目的のために、任意の遺伝子配列（細胞内におけるこれらの存在は、その細胞を認識することおよびクローン的に単離することを可能にする）が、検出可能な（選択）マーカー遺伝子配列として用いられ得る。レシピエント細胞において、この検出可能な（選択）マーカー遺伝子配列の存在は、ＰＣＲ、放射標識化ヌクレオチドの検出、または検出可能なマーカー配列の発現を必要としない他の検出アッセイによって認識され得る。代表的には、この検出可能なマーカー遺伝子配列はレシピエント細胞内で発現され、そして選択表現型を生じる。選択マーカーは当業者に周知である。いくつかの例として、ｈｐｒｔ遺伝子（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ、１９６４）、ｎｅｏ遺伝子、単純疱疹ウイルスのｔｋ（ｔｈｙｒｏｉｄｉｎｃ  ｋｉｎａｓｅ）遺伝子（Ｇｉｐｈａｒｔ−Ｇａｓｓｌｅｒら、１９８９）、あるいは、アミノ酸アナログ、ヌクレオシドアナログまたは抗生物質に対する耐性を与える、他の遺伝子などが挙げられる。
【０２９５】
本発明に従って、任意のＥＳ細胞が用いられ得る。しかし、ＥＳ細胞の初代単離体を用いることが好ましい。このような単離体は、胚（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎによって開示された（１９８９）ＣＣＥ細胞株）から、またはＣＣＥ細胞株由来のＥＳ細胞のクローン性単離体（Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇら、１９８９）から直接的に得られ得る。このようなクローン性の単離は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎの方法（１９８７）に従って達成され得る。このようなクローン性増殖の目的は、動物内へ分化のために、より大きな有効性を有するＥＳ細胞を得ることである。クローン的に選択されたＥＳ細胞は、トランスジェニック動物の生成において、前駆体細胞株ＣＣＥの約１０倍有効である。
【０２９６】
（ｂ．相同組換え）
相同組換え（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９９２）は、特定の位置への導入遺伝子の挿入に関する。この技術は、既存の遺伝子の正確な改変を可能にし、そして、前核注射またはウイルスベクターの使用によって生成されたトランスジェニック動物において観察される、位置効果および挿入性不活性化の問題を克服する。さらに、この技術は、特定の遺伝子の不活性化、ならびに、ある遺伝子と別の遺伝子との置換を可能にする。特定の実施形態において、このＤＮＡセグメントは、オステリックスコード領域に隣接する、選択された２つのＤＮＡ領域を含み、それによって、非ヒト動物種のゲノムＤＮＡ内へのコード領域の相同組換えを指向する。
【０２９７】
従って、トランスジェニック構築物の好ましい送達方法は、相同組換えまたは「ノックアウト技術」の使用を含む。相同組換えは、アンチセンスのように、相補的配列と塩基対形成する核酸の傾向に依存する。この場合、塩基対形成は、鎖の破壊および修復が起こり得るように、２つの別個の核酸分子間の相互作用を容易にするために役立つ。換言すれば、この方法の「相同」の局面は、２つの相補的な配列を密接に近接させるための、配列の相同性に依存し、一方「組換え」の局面は、特定の結合の破壊および他の結合の形成によって、他の配列を置換する１つの相補的な配列を提供する。
【０２９８】
実施においては、相同組換えは以下のように用いられる。第一に、標的遺伝子が宿主細胞内に選択される。次いで、標的遺伝子に対する配列相同性は、標的遺伝子を不活性にするいくつかの変異（終止コドン、中断など）とともに、遺伝構築物に含まれる。この不活性化変異に隣接する相同的配列は、この変異体を「隣接する」といわれる。隣接とは、この文脈では、標的相同的配列が、変異の上流（５’）と下流（３’）との両方に位置することを単に意味する。これらの配列は、標的遺伝子の上流および下流のいくつかの配列に対応するべきである。次いで、この構築物は細胞に導入され、従って細胞配列とこの構築物との間の組換えを可能にする。
【０２９９】
実際問題として、この遺伝子構築物は、ビヒクルよりもはるかに正常に働き、遺伝子を妨害する。例えば、組換え体を選択し得ることは重要であり、従って、構築物内に選択マーカー遺伝子を含むことは一般的である。この遺伝子は、種々の生物静力学的薬物および生物致死性薬物に対する耐性を与えることによって、ゲノムＤＮＡ内にこの構築物を組み込んでいる細胞の選択を可能にする。さらに、細胞中で発現される異種遺伝子もまた、この構築物内に有利に含まれ得る。その配列は以下のようであり得る：
・・・ベクター・５’−隣接配列・異種遺伝子・選択マーカー遺伝子・隣接配列−３’・ベクター・・・
従って、この種の構築物を用いて、単一の組換え事象において、（ｉ）内因性遺伝子を「ノックアウトする」こと、（ｉｉ）このような事象を同定するための選択マーカーを提供すること、および（ｉｉｉ）発現のための導入遺伝子を導入することが可能である。
【０３００】
この相同組換えアプローチの別の改良点は、「ネガティブな」選択マーカーの使用を含む。このマーカーは、選択マーカーとは異なり、マーカーを発現する細胞の死を引き起こす。従って、このマーカーは、所望でない組換え事象を同定するために用いられる。選択マーカーを用いて相同組換え体を選択しようとする場合、初期のスクリーニング工程において、無作為で非配列特異的な事象から生成される組換え体から、適切な相同組換え体を同定することは難しい。これらの組換え体はまた、選択マーカー遺伝子を含み得、そして目的の異種タンパク質を発現し得るが、十中八九、所望の「ノックアウト」表現型を有さない。ネガティブな選択マーカーを、隣接領域の外部で構築物に結合することにより、ネガティブな選択マーカーを組み込む多くの無作為な組換え事象に対して選択し得る。ネガティブな選択マーカーは隣接配列の外部にあるので、相同組換えはこのマーカーを導入してはならない。ネガティブな選択を用いて相同組換えを富化するプロセスの例としては、胚性幹細胞または形質転換細胞株における標的遺伝子の破壊（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ、１９９３；ＷｉｌｌｎｏｗおよびＨｅｒｚ、１９９４）および組換えウイルス（例えばアデノウイルス）の生成（Ｉｍｌｅｒら、１９９５）が挙げられる。
【０３０１】
遺伝子標的化の頻度は、標的化のために用いられるＤＮＡの起源に強く影響されるので、標的化される細胞に可能な限り類似な（同遺伝子型の）ＤＮＡを得ることは有益である。このことを達成する１つの方法は、シングルコロニー由来のゲノムＤＮＡからの、長距離ＰＣＲによる目的の領域の単離による。長距離ＰＣＲを用いると、少量の開始ＤＮＡから、７〜１２ｋｂのフラグメントを単離することが可能である。
【０３０２】
遺伝子トラップは、本発明との使用に適する有用な技術である。遺伝子トラップとは、入ってくる導入遺伝子を活性化するための、染色体ＤＮＡに存在する内因性調節領域の利用をいう。導入遺伝子が無作為な位置に挿入する場合、この方法において、組換え遺伝子の発現は起こらないかまたは最小化される。しかし、相同組換えが生じる場合、この内因性調節領域は、入ってくる導入遺伝子と同格に配置され、このことは導入遺伝子の発現を生じる。
【０３０３】
（ｃ．部位特異的組換え）
インテグラーゼファミリーのメンバーは、ＤＮＡ認識配列に結合するタンパク質であり、そしてＤＮＡの認識、対合、切断、鎖の伸長および再連結に関与する。現在、このインテグラーゼのファミリーは、共通の不変なＨｉｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ三つ組を有する、細菌、ファージおよび酵母に由来する、２８種のタンパク質を含む（ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ、１９９２）。真核生物への適用のために最も広範に用いられる部位特異的組換え系のうちの４つとしては：バクテリオファージＰｌ由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰ（Ａｕｓｔｉｎら、１９８１）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μプラスミド由来のＦＬＰ−ＦＲＴ（Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８５）；Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ由来のＲ−ＲＳ（ＭａｅｓｅｒおよびＫａｈｍａｎｎ、１９９１）、および、バクテリオファージＭｕ由来のｇｉｎ−ｇｉｘ（Ｏｎｏｕｃｈｉら、１９９５）が挙げられる。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系およびＦＬＰ−ＦＲＴ系は、後者の２つの系よりも大きい程度、開発されている。Ｒ−ＲＳ系は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系およびＦＬＰ−ＦＲＴ系と同様に、タンパク質およびその認識部位のみを必要とする。Ｇｉｎリコンビナーゼは、逆に配向する２つの組換え部位（ｇｉｘ）の間のＤＮＡ反転を選択的に媒介し、そして、３つのさらなる因子：ネガティブスーパーコイル、エンハンサー配列およびその結合タンパク質Ｆｉｓの補助を必要とする。
【０３０４】
本発明は、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ部位特異的組換え系（Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．を通じて入手可能である）を使用して、ゲノムから特定の遺伝子を取り出すことおよび特定の導入遺伝子構築物をゲノムから切除することを企図する。バクテリオファージＰｌから単離された、Ｃｒｅ（組換えを引き起こす）−ｌｏｘ  Ｐ（交差（ｘ）の遺伝子座）組換え系は、Ｃｒｅ酵素および両方のパートナー分子上のそのｌｏｘＰ認識部位のみを必要とする（ＳｔｅｒｎｂｅｒｇおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、１９８１）。ｌｏｘＰ部位は、８ｂｐのスペーサー領域（Ｃｒｅリコンビナーゼ（３５ｋＤａタンパク質）によって認識される）によって分離される、対称的な２つの１３ｂｐのタンパク質結合領域からなる。ｌｏｘＰについての核酸配列（Ｈｏｅｓｓら、１９８２）およびＣｒｅについての核酸配列（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら、１９８６）は公知である。２つのｌｏｘＰ部位が互いにシスである場合、切除反応が起こる；しかし、２つの部位が互いにトランスである場合、組込み事象が起こる。Ｃｒｅタンパク質は、部位特異的組換え事象を触媒する。この事象は、双方向性である（すなわち、ＣｒｅはＬｏｘＰ部位での配列の挿入を触媒するか、または２つのＬｏｘＰ部位の間にある配列を切除する）。従って、挿入のための構築物がまた隣接ＬｏｘＰ部位を有する場合、Ｃｒｅタンパク質（またはＣｒｅタンパク質をコードするポリヌクレオチド）の、細胞への導入は、構築物ＤＮＡの除去を触媒する。この技術は、米国特許第４，９５９，３１７号（本明細書によって、参考としてその全体が援用される）において可能となっている。
【０３０５】
細菌における初期のインビボ研究は、リコンビナーゼを発現する細胞において、ＣｒｅがｌｏｘＰ隣接ＤＮＡを染色体外に切除することを示した（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、１９８３）。この系に関する主な疑問は、真核生物内での部位特異的組換えが細菌タンパク質によって促進され得るか否かであった。しかし、Ｓａｕｅｒ（１９８７）は、この系が、細菌における場合と同レベルの有効性で、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＤＮＡを切除することを示した。
【０３０６】
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系、特にマウスにおけるＥＳ細胞系を用いたさらなる研究は、独自のトランスジェニック動物の産生のための切除反応の有用性を実証している。ｌｏｘＰ隣接ｎｅｏ−ｔｋカセットのＣｒｅ媒介欠失の前に、相同組換えを用いて、ＥＳ細胞に変異を導入した。このストラテジーを、同一株において合計４回繰り返し、ｒｅｐ−３遺伝子座およびｍＭｓｈ２遺伝子座の対立遺伝子（ＤＮＡ不一致の修復に関与する遺伝子）の両方を変化させた（ＡｂｕｉｎおよびＢｒａｄｌｅｙ、１９９６）。同様に、３５Ｓプロモーター／ルシフェラーゼ遺伝子／ｌｏｘＰ／３５Ｓプロモーター／ｈｐｔ遺伝子／ｌｏｘＰ（ｌｕｃ＋ｈｙｇ＋）からなる導入遺伝子を、タバコに導入した。それに続く、Ｃｒｅでの処理は、５０％の効率でｈｙｇ遺伝子（ｌｕｃ＋ｈｙｇｓ）の欠失を引き起こす（ＤａｌｅおよびＯｗ、１９９１）。ｌｏｘＰ隣接ｎｅｏ遺伝子で標的化されたＩｇ軽鎖κ定常領域を有するトランスジェニックマウスを、Ｃｒｅ産生マウスと交配し、初期胚由来の選択マーカーを除去した（Ｌａｋｓｏら、１９９６）。マーカーの除去のための、この一般的なアプローチは、調節基によって生じる問題、および、集団への新しい遺伝子の導入に関する消費者に起因する。
【０３０７】
本発明における使用のために企図される類似の系は、ＦＬＰ／ＦＲＴ系である。この系を用いて、ＦＲＴ隣接ｎｅｏカセットを有するマウスＥＳ細胞においてヒストン４遺伝子を標的化し、その後、ＦＬＰ媒介組換えによってマーカーを欠失した。このＦＬＰタンパク質は、ＦＬＰを駆動する誘導性プロモーターから、またはそのタンパク質自体を用いて得られ得る（Ｗｉｇｌｅｙら、１９９４）。
【０３０８】
本発明はまた、ゲノムからの特定のトランスジェニック構築物の切除、ならびにゲノムからの特定の遺伝子の取り出しのための、組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ）１および組換え活性化遺伝子２の使用を企図する。ＲＡＧ−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２９４７５）およびＲＡＧ−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６４７９６およびＭ３３８２８）は、特定の組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を認識し、そして免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプター遺伝子のアセンブリのために必要とされるＶ（Ｄ）Ｊ組換えを触媒する（Ｓｃｈａｔｚら、１９８９；Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒら、１９９０；ＣｕｍｏおよびＯｅｔｔｉｎｇｅｒ、１９９４）。非リンパ細胞におけるＲＡＧ−１タンパク質およびＲＡＧ−２タンパク質のトランスジェニック発現は、レポーター基質のＶ（Ｄ）Ｊ組換えを支持する（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒら、１９９０）。本発明における使用のために、目的の形質転換構築物は、隣接ＲＳＳを含むように操作される。形質転換の後、ＲＳＳの内部である形質転換構築物は、形質転換細胞におけるＲＡＧ−１およびＲＡＧ−２の一過性の発現によって、ゲノムから欠失され得る。
【０３０９】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術が、本発明者によって発見された技術を、本発明の実施においてよく機能するように説明し、従って、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられ得ることは、当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に鑑み、多くの変更が本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態においてなされ得、そして同様の結果または類似の結果をなお得ることを理解すべきである。
【０３１０】
以下は、実施例１〜実施例５において用いられた方法である。
【０３１１】
（材料および方法）
（細胞培養）マウス筋肉の筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞、マウス胚の線維芽細胞であるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２クローン、ＣＯＳ−７細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｓ１９４細胞およびＰＣ１２細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。Ｃ２Ｃ１２細胞を、１５％の胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）および抗生物質（１００単位／ｍｌ  ペニシリン）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）において維持した。ヒト組換えＢＭＰ−２またはＴＧＦ−β１を用いてＣ２Ｃ１２をインキュベートする場合、培地を、５％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＤＭＥＭで置換した。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｓ１９４細胞およびＰＣ１２細胞を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質の存在下で、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持した。
【０３１２】
（ＲＮＡの単離および分析）全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて細胞およびマウス組織から単離し、そしてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。ＲＮＡ発現の分析を、前述（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）のようにノーザンブロットによって行った。用いたプローブとして、オステリックスｃＤＮＡ、マウスオステオカルシンｃＤＮＡ、マウスＯＳＦ２／Ｃｂｆａ１  ｃＤＮＡ、１８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｃＤＮＡおよびヒトＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡの３’非翻訳配列を含むプローブが挙げられる。
【０３１３】
（ｃＤＮＡクローニング）Ｃ２Ｃ１２細胞を、１５％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養してコンフルーエンシーに到達させ、血清を５％にまで減少させ、そして、この細胞を、３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２の存在下または欠如下において、さらに２４時間増殖させた（Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４）。この細胞から、全ＲＮＡを抽出した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをさらに精製した。個々の全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、増幅し、そしてＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造業者の説明書に従って用いて、ＰＣＲによってサブトラクトした。サブトラクション後、ｃＤＮＡ産物をｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。サブトラクトしたｃＤＮＡライブラリーを、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた示差ハイブリダイゼーションによってさらにスクリーニングした。オステリックスの全長ｃＤＮＡを単離するために、オステリックス特異ｃＤＮＡプローブで、マウス頭蓋冠ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【０３１４】
（５’−ＲＡＣＥ）ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  ＲＬＭ−ＲＡＣＥキット（Ａｍｂｉｏｎ）を製造業者の説明書に従って用いて、５’−ＲＡＣＥを行った。
【０３１５】
（インサイチュハイブリダイゼーション）インサイチュハイブリダイゼーション分析のためのプローブを生成するために、本発明者らは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（＋）のＥｃｏＲＩ部位に３’非翻訳配列をコードする、オステリックスｃＤＮＡの５６３ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをクローン化した。次いで、ＤＮＡをＮｏｔＩで直線化し、そしてＴ３ポリメラーゼで転写し、センスＲＮＡプローブを得たか、または、ＤＮＡをＸｈｏＩで直線化し、そしてＴ７ポリメラーゼで転写し、アンチセンスＲＮＡプローブを得た。転写反応は、［３５Ｓ］ＵＴＰを標識として含んだ。前記（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５）のように、微量の改変体を用いてインサイチュハイブリダイゼーションを行った。スライドを８日間露光した。
【０３１６】
（プラスミド構築物）アミノ酸２７〜４２８をコードするオステリックスｃＤＮＡのセグメントを、ベクターｐｃＤＮＡ３．１−５ＵＴ−Ｆｌａｇ（Ｌｅｆｅｂｖｒｅら、１９９７）のＢａｍＨ１部位およびＸｂａ１部位にクローン化し、哺乳類発現プラスミドｐｃＤＮＡＦｌａｇ−Ｏｓｔｅｒｉｘを産生した。
【０３１７】
（ゲルシフト分析）ゲルシフト分析のために、二本鎖オリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチドキナーゼおよび［［γ］−３２Ｐ］ＡＴＰで標識化した。オステリックス発現ベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ−７の抽出物とともに、室温で２０分間、プローブオリゴヌクレオチド（２０，０００ｃｐｍ）をインキュベートした。この反応生成物を、０．２５  Ｘ  ＴｒｉｓボレートＥＤＴＡ緩衝液を含む４％ポリアクリルアミドゲル上で、４℃で泳動した。
【０３１８】
（トランスフェクション）転写活性化研究のために、オステリックスｃＤＮＡの種々のセグメントを、Ｇａｌ４発現ベクターｐＳＧ４２４（ＳａｄｏｗｓｋｉおよびＰａｔｓｈｎｅ、１９８９）のＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間で、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインを用いて、インフレームでクローン化した。ＣＯＳ−７細胞を、１０％の胎仔仔ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で、８％ＣＯ２中で増殖させた。１μｇのＧａｌ４発現プラスミドを、５つのＧａｌ４ＤＮＡ結合部位およびＥ１ｂプロモーターを含む、０．２５μｇのルシフェラーゼレポータープラスミド（ＬｕｏおよびＳａｗａｄｏｇｏ、１９９６）ならびに０．２５μｇのｐＳＶ−β−Ｇａｌ（内部コントロールとして）とともに、細胞内にトランスフェクトした。この細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）でトランスフェクトし、そしてトランスフェクトの２４時間後に回収した。ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を、記載されるように（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５）測定した。組換えオステリックスタンパク質を得るために、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、ｐｃＤＮＡＦｌａｇ−ＯｓｔｅｒｉｘをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、そしてトランスフェクトの２４時間後に回収した。
【０３１９】
（抗オステリックス抗体の精製）オステリックスタンパク質のＣ末端に位置する１４アミノ酸のペプチド（ＡＨＧＧＳＰＥＱＳＮＬＬＥＩ）でウサギを免疫化することによって、抗体を作製した。この抗体を、１４アミノ酸のペプチドと結合した３Ｍ  Ｅｍｐｈａｚｅ  Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＡＢ１カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）上でアフィニティー精製し、そして低ｐＨおよび高ｐＨで溶出した。次いで、この抗体を、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水に対して透析した。
【０３２０】
（ウエスタンブロット）  細胞溶解産物を、以前に記載されたように調製し（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９８９）、そしてウエスタンブロットを、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて実施した。マウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体およびマウス抗Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインを、それぞれＳｉｇｍａおよびＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した。
【０３２１】
（染色体の位置決め）  Ｏｓｔｅｒｉｘの染色体の位置を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手したマウス種間マッピングパネルに対するサザンハイブリダイゼーションにより決定した。パネルは、（Ｃ５６ＢＬ／６Ｊ  ＸＳＰＲＥＴ／Ｅｉ）Ｆ１ハイブリッドメスマウスとＳＰＲＥＴ／Ｅｉオスマウスとの間の種間交雑からの、９４の戻し交雑子孫由来のゲノムＤＮＡで構成されていた（Ｒｏｗｅら、１９９４）。ＨｉｎｄＩＩＩで消化した戻し交雑子孫由来のゲノムＤＮＡサンプルを含む、サザンブロットメンブレンを０．５ｋｂのＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。制限フラグメント長多型の分布パターンを、分析のためにＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙへ提出した。
【０３２２】
（実施例１）
（骨芽細胞増強転写因子のためのｃＤＮＡのクローニング）
潜在的な骨芽細胞に特異的なタンパク質を同定するために、本発明者らは、サプレッション−サブトラクティブハイブリダイゼーション法を、ディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングと組合わせて使用した。１５％のＦＢＳ含有のＤＭＥＭで構成されるＣ２Ｃ１２細胞の増殖培地を、５％まで血清を低減し、そして細胞がコンフルーエンシーに達した時、細胞を、３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２の存在下または非存在下において、さらに２４時間の間増殖させた（Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４）。その後、両方の細胞からｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを調製し、第１鎖のｃＤＮＡへ逆転写した。第２鎖のｃＤＮＡの合成後、次いで、これらのｃＤＮＡプールを、ＰＣＲ法に基づくサプレッション−サブトラクティブハイブリダイゼーションに使用した。この手順において、ＢＭＰの非存在下で増殖したＣ２Ｃ１２細胞に対応するｃＤＮＡを、ＢＭＰの存在下で増殖したＣ２Ｃ１２細胞に対応するｃＤＮＡから差し引いた。差し引いたｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択した５００個のクローンを、ディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングに用いた。２８個のｃＤＮＡクローンを、選択した。それらは、ＢＭＰ−２処理後のＣ２Ｃ１２細胞から調製されたｃＤＮＡプローブにポジティブであるが、ＢＭＰ−２で未処理のＣ２Ｃ１２細胞に由来するｃＤＮＡプローブにネガティブであった。クローンのＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ検索において決定および試験した。１２個のｃＤＮＡクローンは、ヒトまたはマウスにおいてすでに同定されたタンパク質に一致した。さらに、１６個のｃＤＮＡクローンを、ＢＭＰ２で未処理のＣ２Ｃ１２細胞またはＢＭＰ２で処理したＣ２Ｃ１２細胞のいずれかに由来するＲＮＡを用いてノーザンハイブリダイゼーションで試験した。８個のｃＤＮＡクローンは、未処理のＣ２Ｃ１２細胞由来のＲＮＡに対するハイブリダイゼーションを示さず、そしてＢＭＰ−２処理したＣ２Ｃ１２細胞由来のＲＮＡと強いシグナルを示した。これらｃＤＮＡの１つは、ＢＭＰ−２処理した細胞内で強く誘導される約３．０ｋｂの主要な転写産物に対してハイブリダイズした（後述）。続いて、このｃＤＮＡクローンを、全長ｃＤＮＡを同定するために使用し、全長ｃＤＮＡの配列決定は、分子量が４４．７ｋＤａと予想される４２８個のアミノ酸のポリペプチドをコード化し得るＡＴＧコドンで開始する１２８４個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームを示した（図２Ａ）。５’ＲＡＣＥ実験を、ＢＭＰ−２処理したＣ２Ｃ１２細胞内のｍＲＮＡの５’末端を同定するために実施した。さらなる７１個のヌクレオチドを同定し、これは、図２Ａに示されるｃＤＮＡクローンの配列の前に位置する。この配列は、さらなるインフレームのメチオニンコドンまたは終始コドンを含まず、マウスゲノムにおける図２Ａの最も５’側の４９個のヌクレオチドを直前に位置することもまた見出された。
【０３２３】
内因性のポリペプチドのサイズを試験するため、ポリペプチドのＣ末端に位置する１４個のアミノ酸ペプチドに対する抗体を産生させ、そしてさらに精製した。精製した抗体は、ＢＭＰ−２で処理したＣ２Ｃ１２細胞由来の抽出物内に存在する４６ｋＤａのタンパク質を認識した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるこのポリペプチドの移動度は、ＣＯＳ−７細胞内で発現される組換えポリペプチドの移動度と一致した（図３）。内因性のポリペプチドの予想される分子量は、推定アミノ酸配列から予想されるサイズと一致した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるポリペプチドの移動度はまた、還元剤により影響されなかった。従って、図２Ａによって示されるｃＤＮＡは、全長のポリペプチドをコード化する。
【０３２４】
アミノ酸配列は、カルボキシル末端において３つのＣ２Ｈ２型ジンクフィンガーモチーフの存在を予想させる。図２Ｂに示されるように、これらのジンクフィンガーは、Ｓｐ１、Ｓｐ３、およびＳＰ４内に存在するジンクフィンガーと高度な相同性を有する。下位ではあるが重要な相同性はまた、他のタンパク質（例えば、Ｓｐ２、ＦＫＬＦ−２、ＢＴＥＢ−１、ならびにＴＧＦ−β誘導性の初期遺伝子のＴＩＥＧ−１およびＴＩＥＧ−２）のジンクフィンガー領域で見い出された。このタンパク質のアミノ末端の２８５個のアミノ酸は、転写活性化ドメインに特徴的なプロリン（１４．７％）残基およびセリン残基（１０．２％）が豊富なドメインを含む。ジンクフィンガードメインの上流は、核の局在化のために重要であることが示されているＥＧＲ−１における領域（Ｇａｓｈｌｅｒら、１９９３）と類似する塩基性アミノ酸のストレッチであった。従って、転写因子ドメインを有する新規なポリペプチドが、本明細書中において提供される。
【０３２５】
（実施例２）
（発現パターン）
インビボでこのＲＮＡを発現する細胞型を同定するため、本発明者らは、種々の段階のマウス胚を用いて、そしてさらに新生仔マウスに由来する組織を用いて、インサイチュハイブリダイゼーションを実施した。代表的な例を、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、および図１Ｆに示す。胚発育の１３．５日目に、転写産物を、軟骨細胞の分化を生じている間葉細胞内に検出した（図１Ａ）。弱いシグナルをまた、指の間葉濃縮物（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）中に検出した。Ｅ１４．５での発現を、上顎骨、下顎骨および前額骨の突起内における間葉細胞中に検出した。転写産物をまた、脊椎を含む他の骨格の成分中に検出した（図１Ｂ）。この段階で転写産物は、軟骨の周辺層に限定され、そしてより中心に位置する軟骨細胞には存在しない。小腸、肝臓、胸腺および肺は、ほとんどシグナルを示さなかった。Ｅ１５．５での強い発現を、全ての初期の骨化中心の細胞内に見出した。弱い発現をまた、成長板軟骨の前肥大性帯域内に検出した（図１Ｃ）。上顎骨および下顎骨ならびに歯胚の間葉細胞（図１Ｄ）を形成するＥ１６．５での細胞は、陽性のシグナルを示したのに対して、歯胚中でのメッケルの軟骨組織または歯胚の上皮組織においてほとんど発現が検出されなかった。発生からＥ１７．５日目において、発現は、骨膜内および骨トラベキュラ（ｔｒａｂｅｃｕｌｅｓ）に関連する細胞内で強かった（図１Ｅ）。生後１３日目のマウスにおいて、発現を、二次骨化中心を形成している細胞内と同様に、骨トラベキュラ内に検出した（図１Ｆ）。全体的に、これらの結果は、インビボで、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子は、膜性骨化または軟骨内骨化のどちらかにより形成される全ての骨の骨芽細胞内に発現することを示す。軟骨内骨化により形成される骨格成分において、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子は、分化中の軟骨細胞内で最初に発現し、次いで、軟骨膜内および初期の骨芽細胞内で発現する。膜性骨化により形成される骨格成分において、それは、間葉細胞濃縮物内で最初に発現し、次いで、骨芽細胞内で発現する。Ｏｓｔｅｒｉｘはまた、軟骨内の骨の前肥大性軟骨細胞内で、低レベルで発現する。
【０３２６】
Ｃ２Ｃ１２細胞へＢＭＰ−２を添加した後のどの時点でＯｓｔｅｒｉｘＲＮＡが発現するかを決定するために、時間経過の調査を実施した。Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子の発現を、ＢＭＰ−２の添加後３時間で検出し、１２〜２４時間で最高に達し、そして４８時間後に減少するということを、ノーザンブロット分析は、明らかにした（図９Ｂ）。発現は、ＯＳＦ２／Ｃｂｆａ１（骨芽細胞の分化に重要な転写因子）の発現に対応し、そしてオステオカルシンｍＲＮＡ（骨芽細胞の分化の分子マーカー）の発現を先行した。ＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−βスーパーファミリーとは別のメンバー）がＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子を誘導するかを調査するために、本発明者らは、Ｃ２Ｃ１２細胞をＴＧＦ−β１で処理した。ＢＭＰ−２と同様にＴＧＦ−β１は、筋管の形成を阻害したが（図９Ａ）、ＴＧＦ−β１は、Ｃ２Ｃ１２細胞内にオステオカルシンｍＲＮＡの発現を誘導しなかった（図９Ｂ）。ＴＧＦ−β１は、Ｏｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡの発現に関して影響を与えなかった（図９Ｂ）。Ｏｓｔｅｒｉｘ  ＲＮＡは、骨芽細胞株の、ＲＯＳ１７／２．８細胞内およびＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内で発現し、十分に分化した軟骨細胞株である、ラットの軟骨肉腫細胞（ＲＣＳ）内と同様であったが、Ｏｓｔｅｒｉｘ  ＲＮＡは、ＢＡＬＢ／３Ｔ３繊維芽細胞、Ｓ１９４  Ｂ細胞またはＰＣ１２細胞内では発現されなかった（図９Ｃ）。新生仔マウスの種々の組織を分析した場合、Ｏｓｔｅｒｉｘ  ＲＮＡを、頭蓋冠内にのみ検出し、そして図９Ｃに列挙した他の組織内では検出されなかった。
【０３２７】
（実施例３）
（組換えＯｓｔｅｒｉｘタンパク質の生化学的特性付け）
Ｃ末端部分に位置する３つのジンクフィンガーモチーフ、ならびにＳＰ１、ＳＰ３およびＳＰ４内の類似のモチーフとのそれらの高度な配列相同性は、このポリペプチドがＤＮＡへ結合し得ることを示した。組換えポリペプチド（アミノ酸１７〜４２８）を、ＣＯＳ−７細胞へのＯｓｔｅｒｉｘ発現ベクターのトランスフェクションによって産生した。トランスフェクト細胞からの抽出物を使用して、既に関連するジンクフィンガータンパク質に結合することが既に示されている、コンセンサスＳｐ１結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて、ゲルシフトアッセイを実施した。特定のＤＮＡ−タンパク質複合体のレベルの増加が、抽出物の量の増加によって得られた（図４Ａ）。特定の複合体の形成を、抗Ｃ末端Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体とのインキュベーションによって阻害した（図４Ｂ）。さらに、この阻害は、抗血清を産生するために使用される過剰なＣ末端ペプチドとのさらなるインキュベーションによって回復し、これによってこの複合体が、組換えＯｓｔｅｒｉｘおよび標識化したプローブで構成されることが示唆される。
【０３２８】
Ｇ／Ｃボックス（表４を参照のこと）を含有する異なる二本鎖オリゴヌクレオチドの結合能力をまた、試験した（図６Ａおよび図６Ｂ）。この結果は、ＯｓｔｅｒｉｘがＣｏｌ１ａ１プロモーターおよびＣｏｌ２ａ１プロモーター内のＥＫＬＦコンセンサス部位およびＧ／Ｃリッチ配列を含む、いくつかのＧ／Ｃリッチ配列に対して効率よく結合することを示した。変異を、結合配列をさらに描写するために、Ｃｏｌ２ａ１部位中に導入した。この部位は、ＳＰ１結合についてのコンセンサス部位に非常に類似する。中央のＧ残基における変異は、プローブに対するＯｓｔｅｒｉｘの結合を無効にする。
【０３２９】
本発明者らはまた、Ｏｓｔｅｒｉｘが転写活性ドメインを含むかどうかを試験した。Ｏｓｔｅｒｉｘの種々のセグメントを、酵母転写因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインとインフレームで融合し、そして融合ポリペプチドを、５つのＧａｌ４結合部位およびＥｌｂ最小プロモーターを含むレポーター遺伝子とともにＣＯＳ−７細胞内で発現させた。Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインを発現するプラスミドを、コントロールとしてトランスフェクトした。図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃは、残基２７〜２７０を含むセグメントを示し、そして残基２７〜１９２由来のより小さいプロリン／セリン−リッチなセグメントは、強力な転写の活性化機能を提供した。Ｇａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合した場合、全長タンパク質（１〜４７４）も、Ｏｓｔｅｒｉｘのジンクフィンガー領域（３６３〜４７４）もどちらも転写を活性する能力を有さなかった。本発明者らは、全長タンパク質が活性を欠損させたということを企図する。なぜなら、全長タンパク質は、レポーター遺伝子内のＧａｌ４結合部位に対してよりも、ＣＯＳ−７染色質内の内因性の標的部位に対する高い親和性を有したためである。あるいは、本発明者らは、ジンクフィンガー領域が活性化ドメインをマスクし得、またはプロリンリッチな領域の活性を抑制する別のドメインを含み得ることを企図する。
【０３３０】
（実施例４）
（Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子のマッピング）
マウスゲノムにおけるＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子の染色体位置を決定するため、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手したＤＮＡサンプルの種間マッピングパネルを分析した。このパネルは、（Ｃ５７ＢＬ／６３  Ｘ  ＳＰＲＥＴ／Ｅｉ）Ｆ１ハイブリッドメスマウスとＳＰＲＥＴ／Ｅｉオスマウスとの間の種間交雑由来の、９４の戻し交雑子孫のゲノムＤＮＡから構成した。初めに、Ｃ５７ＢＬ／６ＪのゲノムＤＮＡとＳＰＲＥＴ／ＥｉのゲノムＤＮＡとの間のＨｉｎｄ  ＩＩＩの制限フラグメント長多型を同定するため、０．３ｋｂのＨｉｎｄ  ＩＩＩ  ｃＤＮＡプローブを使用した。次いで、このプローブを、戻し交雑子孫のパネルの９４のゲノムＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡとともに使用した。このパネルのハプロタイプを、他の既にマップされたマーカーと比較した。このマッピングの結果は、Ｏｓｔｅｒｉｘ遺伝子がマウス第１５染色体上のＳｃａ  ８ａとＩｔｇａ５との間に位置することを示す。これらの遺伝子の染色体の位置に基づいて、ヒトＯＳＴＥＲＩＸ遺伝子について予測されるシンテニー領域は、染色体１２ｑ１３である。ヒトの遺伝性の骨格疾患は、この領域にマップされなかった。
【０３３１】
【表４】
2004537968.tif 000009
2004537968.tif 000010
（実施例５）
（考察）
本発明は、ジンクフィンガータンパク質のＳｐ／ＸＫＬＦファミリーの新規なメンバーを提供し、これは、３つのカルボキシル末端のジンクフィンガーを含む。Ｏｓｔｅｒｉｘの３つの８５残基のジンクフィンガードメインは、ＳＰファミリーのドメインと近縁であり、そしてｍＢＴＥＢ−１のドメインとそれよりも幾分遠縁である。ジンクフィンガードメインの外側において、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおける他のタンパク質と配列相同性は存在しないが、アミノ末端部分は、特定の転写活性ドメインに代表的なプロリン残基およびセリン残基が豊富である。組換えＯｓｔｅｒｉｘは、近縁の転写因子Ｓｐ１の標的であるいくつかのＧ／Ｃリッチな結合部位に結合し得る。異種のＤＮＡ結合ドメインに融合するＯｓｔｅｒｉｘのプロリン／セリン−リッチな領域は、強力な転写活性化因子として機能し得る。これらのデータをまとめると、Ｏｓｔｅｒｉｘは、Ｓｐ１およびＥＫＬＦによって認識される部位と類似するＧ／Ｃリッチな部位のサブセットに結合し、そしてアミノ末端のプロリン／セリン−リッチなドメインを介して転写を活性化することが示される。
【０３３２】
Ｏｓｔｅｒｉｘは、骨芽細胞内に特異的に発現する新規な遺伝子を同定するためのスクリーニングにおいて単離した。このために、ＢＭＰ−２での処理によって骨芽細胞内へ分化するマウス筋芽細胞のＣ２Ｃ１２細胞株を、使用した。ディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングと組合わせた、ＰＣＲに基づくサブトラクション法を使用して、ＢＭＰ−２で処理後に誘導されるが、未処理細胞では存在しないか、あるいは非常に低レベルで存在する、ｍＲＮＡを同定した。Ｏｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡにおける増加は、Ｃ２Ｃ１２細胞へのＢＭＰ−２添加後、３時間で検出可能であり、そして１２〜２４時間後に最大となった。ＢＭＰ−２によるＯｓｔｅｒｉｘの誘導の動態は、この系におけるＢＭＰ−２によるＣｂｆａ１の誘導の動態と本質的に一致し、そしてＢＭＰ−２によるｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎの誘導を先行した。対照的に、Ｃ２Ｃ１２細胞において骨芽細胞の表現型を誘導しないＴＧＦ−βは、Ｏｓｔｅｒｉｘの発現を誘導しなかった。ＴＧＦ−β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）と呼ばれる、推定上のジンクフィンガータンパク質の遺伝子は、ＢＭＰ−２およびＴＧＦ−βの両方によって誘導された（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、１９９５）。ＴＩＥＧの発現は、骨芽細胞の分化と関連づけられて報告されている。Ｏｓｔｅｒｉｘの発現の調節機構の詳細な分析は、骨芽細胞の分化におけるＢＭＰのシグナル伝達に関わる分子的な経路の解明を可能にする。従って、本発明者は、ＢＭＰに誘導される骨芽細胞の分化におけるＯｓｔｅｒｉｘの機能的役割の開示のためのさらなる実験を企図する。
【０３３３】
胚発育の間のＯｓｔｅｒｉｘ転写産物の発現パターンの分析は、軟骨細胞に分化している間葉細胞において発現を生じ；続いて、転写産物の検出は、主として肥大性帯域の周りの軟骨膜にシフトし、初期骨化中心内の骨トラベキュラとともに細胞内のＥ１４．５辺りに開始することを示した。Ｏｓｔｅｒｉｘは、軟骨内骨化によって形成される骨格成分内、および膜性骨化によって形成される骨格成分内の両方の骨全体にわたって、全ての骨化中心内で発現される。さらに、生後、Ｏｓｔｅｒｉｘ転写産物は、第２の骨化中心内に見出され、そして、全ての骨トラベキュラに関連する細胞内に見出され続ける。Ｏｓｔｅｒｉｘ  ＲＮＡは、骨化中心内よりも、より低いレベルで軟骨性骨の成長板の前肥大性（ｐｒｅｃｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ）帯域内に発現される。全体として、最初に初期の軟骨形成の間、次いで骨芽細胞の分化の間、そして後の全ての骨芽細胞における、骨格形成におけるＯｓｔｅｒｉｘの発現のパターンは、Ｃｂｆａ１の発現のパターンと非常に類似する。１つの違いは、Ｃｂｆａ１と対照的に、Ｏｓｔｅｒｉｘが成長板の肥大性帯域内ではなく、前肥大性帯域内に発現されることである。従って、Ｏｓｔｅｒｉｘの発現のパターンは、骨芽細胞の分化の経路において転写因子としてのその役割と一致する。
【０３３４】
Ｏｓｔｅｒｉｘの機能をより理解するために、本発明者らは、現在マウス胚性幹細胞における相同的組換えによって対応する遺伝子を不活性化するための実験を実施している。これらの実験は、進行中であり、そして一般的な指針が本明細書の前述の項において提供される。
【０３３５】
本明細書中に開示および請求された全ての組成物および／または方法は、本開示に照らして過度の実験なしに、作製および実施され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、この組成物および方法は、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された、組成物および／または方法ならびに方法の段階においてか、または連続した段階にバリエーションが適用され得ることは、当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的に関連する特定の薬剤が、本明細書中に記載された薬剤の代わりをし、同一の結果または類似の結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかな、全てのこのような類似した代用および改変は、添付された特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０３３６】
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書に記載されるものを補足する例示的な手順または他の詳細が提供される範囲まで、本明細書中で特に参考として援用される。
【０３３７】
【表５】
2004537968.tif 000011
2004537968.tif 000012
2004537968.tif 000013
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本明細書の一部分を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することによって、より良好に理解され得る。
【図１】
図１は、インサイチュハイブリダイゼーションにより検出される骨格細胞におけるＯｓｔｅｒｉｘ  ｍＲＮＡの発現を示す。図１Ａは、１３．５ｄ．ｐ．ｃ．でのマウス胚の後肢を示す。図１Ｂは、１４．５ｄ．ｐ．ｃ．でのマウス胚の矢状（ｓａｇｉｔａｌ）切片を示し、前肢骨（ｆｂ）、下顎骨（ｍｂｌ）、上顎骨（ｍｘｌ）および椎骨（ｖｔｂｒ）の骨芽細胞におけるシグナルを示す。図１Ｃは、１５．５ｄ．ｐ．ｃ．でのマウス胚の後肢を示す。図１Ｄは、１６．５ｄ．ｐ．ｃ．でのマウス胚の上顎および下顎を示し、下顎骨および上顎骨の骨芽細胞におけるシグナルを示す。歯芽（ｔｂ）の間葉はまた、ポジティブシグナル（ｏｃ＝口腔；ｍｃ＝メッケル軟骨）を示した。図１Ｅは、１７．５ｄ．ｐ．ｃ．でのマウス胚の後肢を示す。図１Ｆは、１３日齢のマウスの後肢を示し、第１および第２の骨化中心（ｓｏｃ）および成長プレートの前肥大領域（ｔ＝脛骨；ｆ＝線維；ｐｏｃ＝第１の骨化中心；ｇｐ＝成長プレート；ｂｍ＝骨髄）におけるシグナルを示す。
【図２Ａ】
図２Ａは、マウスＯｓｔｅｒｉｘについてのｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびマウスＯｓｔｅｒｉｘの推測アミノ酸配列を示す。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、関連するジンクフィンガータンパク質の配列を伴うジンクフィンガードメイン内のアミノ酸配列の比較を示す。異なるこれらの関連する配列におけるアミノ酸は、ブラックボックスによって示される。ジンクフィンガーモチーフのシステイン残基およびヒスチジン残基は、アスタリスクによって示される。配列の右側の数字は、％同一性を示す。
【図３】
図３は、内因性Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質の同定を示す。ＣＯＳ７細胞を、Ｆｌａｇタグ化全長Ｏｓｔｅｒｉｘをコードする発現プラスミドでトランスフェクトした。コンフルエントのＣ２Ｃ１２細胞を、ＢＭＰ−２の存在下または非存在下で、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共に、２４時間インキュベートした。ＯｓｔｅｒｉｘのＣ末端部分に対する抗体は、ウエスタンブロットにおいて、内因性Ｏｓｔｅｒｉｘタンパク質および組換えＯｓｔｅｒｉｘを認識した。
【図４】
図４は、ＯｓｔｅｒｉｘのＤＮＡ結合活性を示す。図４Ａは、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトされた、Ｏｓｔｅｒｉｘ  ｃＤＮＡを含む哺乳動物の発現ベクターおよびコントロールの空の発現ベクターを示す。細胞抽出物の増加量を、放射標識した２本鎖Ｓｐ１オリゴヌクレオチドと共にインキュベートし、そしてタンパク質−ＤＮＡ複合体を、ＥＭＳＡによって分析した。図４Ｂは、示されるように、抗Ｏｓｔｅｒｉｘ抗体の存在下または非存在下およびエピトープペプチドの存在下または非存在下において、放射標識した２本鎖Ｓｐ１オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした、発現プラスミドでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞からの細胞抽出物を示す。タンパク質−ＤＮＡ複合体は、ＥＭＳＡにより分析した。アスタリスクはＯｓｔｅｒｉｘ−ＤＮＡ複合体を示す。
【図５】
図５は、胚発生の１６．５日（Ｅ１６．５）での野生型およびＯｓｔｅｒｉｘ−／−変異体のマウス胚の組織学およびインサイチュハイブリダイゼーションを示す。図５Ａ：頭蓋の上部の冠状断面；図５Ｂ：上顎および下顎を示す頭部の冠状断面；図５Ｃ：上腕骨の縦断面；図５Ｄ：腰部における椎骨の横断図。ＡＢ／ＨＴ：アルシアンブルーおよびヘマトキシリントレオシン（ｔｒｅｏｃｉｎ）染色；Ｃｏｌ／ａｌ：マウスｐｒｏα１（Ｉ）コラーゲンＲＮＡに対するプローブ；ＢＳＰ：マウス骨シアロタンパク質（ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）ＲＮＡに対するプローブ；Ｃｂｆａｌ：マウスＣｂｆａ１  ＲＮＡに対するプローブ。
【図６】
図６は、種々のオリゴヌクレオチドに対するＯｓｔｅｒｉｘの結合を示す。図６Ａ．異なる野生型および変異体のプローブのオリゴヌクレオチド配列。図６Ｂ．示される３２Ｐ標識化プローブを有するＯｓｔｅｒｉｘ発現ベクターでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の溶解物のＥＭＳＡ。
【図７】
図７は、転写活性化研究を示す。図７Ａ．Ｏｓｔｅｒｉｘ  ｃＤＮＡおよびタンパク質の構造。図７Ｂ．ＯｓｔｅｒｉｘまたはＯｓｔｅｒｉｘのサブフラグメントを、ＢＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインとインフレームに融合した。対応するＤＮＡを、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー（ｐＳＧ４２４）の制御下に配置し、Ｇａｌ４結合部位の５つのコピーを含むルシフェラーゼレポータープラスミドと共にＣＯＳ−７細胞中に一過性にトランスフェクトした。図７Ｃ．トランスフェクトされた細胞におけるＧａｌ４融合ポリペプチドの発現。アスタリスクは、Ｏｓｔｅｒｉｘ融合ポリペプチドを示す。
【図８】
図８Ａおよび図８Ｂは、マウスＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子の染色体位置およびＯｓｔｅｒｉｘ遺伝子についてのマッピングデータを示す。
【図９】
図９は、Ｏｓｔｅｒｉｘ  ＲＮＡの発現を示す。図９Ａ．ＢＭＰ−２で処理したＣ２Ｃ１２細胞の表現型の変化。コンフルエントＣ２Ｃ１２細胞を、ＢＭＰ−２（３００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦｂ−１（２５ｎｇ／ｍｌ）を含むか、または含まない５％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共に、２４時間インキュベートした。図９Ｂ．Ｃ２Ｃ１２細胞における、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＯＳＦ２／Ｃｂｆａ１およびｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ  ｍＲＮＡの発現の時間経過。コンフルエントＣ２Ｃ１２細胞を、ＢＭＰ−２（３００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＧＦ−ｂ１（２５ｎｇ／ｍｌ）の存在下あるいは非存在下（コントロール）において、５％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭと共に、示された時間インキュベートした。全ＲＮＡ（１０ｕｇ）を、Ｏｓｔｅｒｉｘ  ｃＤＮＡプローブを用いるノーザンブロットによって分析した。フィルターを、ラットｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎおよびマウスＣｂｆａ１  ｃＤＮＡプローブで連続的に再びハイブリダイズさせた。ｍＲＮＡの量を、ＧＡＰＤＨプローブを用いてフィルターを再ハイブリダイズさせることによって実証した。図９Ｃ．種々の細胞株および新生マウス組織におけるＯｓｔｅｒｉｘ  ＲＮＡの発現。
【図１０】
図１０は、ヒトＯｓｔｅｒｉｘおよびマウスＯｓｔｅｒｉｘのアミノ酸配列の比較を示す。
【図２Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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