(57)【要約】本発明は、抗痙攣剤、神経保護剤、心血管剤のごとき、神経学および精神医学上の障害の治療を含めた、または痛みを管理するための、ω−コノペプチド、その誘導体または医薬上許容される塩、およびその使用に関する。さらに、本発明は、コノペプチドをコードするおよびプロペプチドをコードする核酸配列ならびにそのプロペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）表２に記載されたペプチド
（ｂ）（ａ）のペプチドの誘導体；および
（ｃ）表１に記載されたプロペプチド
よりなる群から選択される単離ペプチド。
【請求項２】
Ｘａａ１がＬｙｓ、Ｘａａ２がＴｙｒ、Ｘａａ３がＧｌｕであって、Ｘａａ５がＴｒｐである請求項１記載の単離ペプチド。
【請求項３】
表１に記載されたアミノ酸配列を有するω−コノペプチドをコードする単離核酸。
【請求項４】
該核酸が表１に記載されたヌクレオチド配列を含む請求項３記載の単離核酸。
【請求項５】
表１に記載されたアミノ酸配列を有する単離コノペプチドプロペプチド。
【請求項６】
電位依存性イオンチャネル障害と関連する障害を治療または予防する方法であって、治療上有効量の、請求項１記載のペプチド（ａ）および（ｂ）またはその医薬上許容される塩よりなる群から選択される活性薬剤をそれを必要とする患者に投与することを特徴とする該方法。
【請求項７】
該障害が、神経障害であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
該神経障害が、発作であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
該発作が、癲癇に関連する発作であることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該神経障害が、低酸素症、酸素欠乏症または虚血に関連する神経毒性損傷である請求項７記載の方法。
【請求項１１】
該神経毒性損傷が、発作、脳血管事故、脳または脊髄外傷、心筋梗塞、身体的外傷、溺死、窒息、分娩仮死または低血糖事象に関連することを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該障害が痛みであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１３】
該痛みが、片頭痛、急性疼痛、持続性疼痛、神経障害性疼痛または侵害受容性疼痛であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該障害が炎症であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１５】
該障害が心血管障害であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）下、２０００年７月２１日付で出願された米国仮出願シリアル番号６０／２１９，６１６および２００１年２月５日付で出願された米国仮出願シリアル番号６０／２６５，８８８に対する利益を請求する。これらの各出願をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０００２】
本発明は、メリーランド州ベセスダのアメリカ国立予防衛生研究所の国立一般医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって授けられた助成金番号ＰＯ１ ＧＭ４８６７７下の政府援助によりなされた。合衆国政府は本発明にある種の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
本発明は、抗痙攣剤、神経保護剤、心血管剤のごとき神経学および精神医学上の障害の治療を含めた、または痛みを管理するための、ω−コノペプチド、その誘導体または医薬上許容される塩およびその使用に関する。さらに、本発明は、コノペプチドをコードするおよびプロペプチドをコードする核酸配列ならびにそのプロペプチドに関する。
【０００４】
本発明の背景を説明する場合、特に、実施に関するさらなる詳細を提供する場合において、本明細書中で用いる刊行物および他の資料は、出典明示して本明細書の一部とみなし、利便のため、以下の本文中では著者および日付で参照して、添付の参考文献リストにおいて著者のアルファベット順で列記する。
【０００５】
コーヌス（Ｃｏｎｕｓ）は、被食体に毒液を注入する捕食性海洋腹足動物（巻貝）の属である。有毒なイモガイは、高度に発達した毒液器官を用いて、有毒なコノトキシンのそれらのカクテルをそれらの被食体に送達する。Ｃｏｎｕｓ ｍａｇｕｓのごとき捕魚性種において、該イモガイは、そのサイホン中の化学的感覚器を用いて魚の存在を検知し、該イモガイは閉められる場合その口を十分に延ばし、毒液を含有する中空の銛様の歯を魚に放つ。これは、魚を不動とさせ、イモガイが付属のフィラメント介してその口にそれを巻き込むのを可能とする。コーヌスおよびそれらの毒液に関する一般的な情報については、ウェブサイトアドレス ｈｔｔｐ：／ｇｒｉｍｗａｄｅ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｎｉｍｅｌｂ．ｅｄｕ．ａｕ／ｃｏｎｅ／ｒｅｆｅｒｅｎｃ．ｈｔｍｌを参照されたし。被食体捕捉は、特殊なイオンチャネルおよび受容体サブタイプを標的とするペプチドの精巧な蓄積を通して達成される。各コーヌス種の毒液は、５０〜２００ペプチドのユニークな組を含有するらしい。毒液の組成は、種間および各種内の個々の巻貝間で大きく異なり、各々は、その被食体を麻痺させるように最適に進化している。毒液の有効成分は、小さなペプチド毒素、典型的には長さが１２〜３０個のアミノ酸残基で、高密度のジスルフィド結合のために典型的には高度に制限されたペプチドである。
【０００６】
該毒液は、分離される場合、ある範囲の生物学的活性を示し；マウスに注射される場合、それらはある範囲のショックないし抑制の生理学的な応答を得る非常に多数の異なるペプチド成分よりなる。最近の研究の焦点となっている毒液の麻痺性成分は、α−、ω−およびμ−コノトキシンである。これらのコノトキシンの全てが、神経伝達を妨害することによって作用するが、各々は、プロセスの異なる点を標的として、これを達成する。該α−コノトキシンは、ニコチン性のリガンド感受性（ｌｉｇａｎｄ ｇａｔｅｄ）チャネルを標的とし、該μ−コノトキシンは、電位依存性（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）ナトリウムチャネルを標的とし、ω−コノトキシンは、電位依存性カルシウムチャネルを標的とする（Ｏｌｉｖｅｒａら、１９８５；Ｏｌｉｖｅｒａら、１９９０）。例えば、結合は、α−、αＡ−およびφ−コノトキシンとニコチン性リガンド感受性イオンチャネルとの間；ω−コノトキシンと電位依存性カルシウムチャネルとの間；μ−コノトキシンと電位依存性ナトリウムチャネルとの間；δ−コノトキシンと電位依存性ナトリウムとの間；κ−コノトキシンと電位依存性カリウムチャネルとの間；コナントキン（ｃｏｎａｎｔｏｋｉｎ）とリガンド感受性グルタミン酸（ＮＭＤＡ）チャネルとの間で確立されている。
【０００７】
しかしながら、これらのペプチドの少数だけの構造および機能が現在決定されている。機能が決定されたペプチドでは、３つのクラスの標的：電位依存性イオンチャネル；リガンド感受性イオンチャネルおよびＧタンパク結合受容体が評価された。
【０００８】
電位依存性イオンチャネルを標的とするコーヌスペプチドには、ナトリウムチャネルの不活性化を遅延させるもの、ならびにナトリウムチャネル、カルシウムチャネルおよびカリウムチャネルに特異的なブロッカーが含まれる。リガンド感受性イオンチャネルを標的とするペプチドには、ＮＭＤＡおよびセロトニン受容体のアンタゴニスト、ならびに競合的および非競合的なニコチン性受容体アンタゴニストが含まれる。Ｇ−タンパク受容体に作用するペプチドには、ニューロテンシンおよびバソプレシンの受容体アゴニストが含まれる。コノトキシンの新しい医薬上の選択性は、少なくとも部分的に、ジスルフィド・ループ内の超可変性アミノ酸と結合した特異的ジスルフィド結合骨格によって規定される（概説につきＭｃＩｎｔｏｓｈら、１９９８参照）。
【０００９】
痛みの治療に用いる薬物が存在し、それは論文中でおよび当業者に対して知られている。例えば、Ｍｅｒｋ　Ｍａｎｕａｌ、第１６版（１９９２）を参照。しかしながら、減少した副作用および毒性を持ち、常習性がなくより活性な鎮痛剤についての要求が存在する。理想的な鎮痛剤は、痛みの自覚を低下させ、広い範囲の痛みのタイプにわたって鎮痛を生じ、経口的または非経口的に与えられようとも十分に作用し、最小または全く副作用を生じず、寛容性および薬物依存を生じる傾向がないものであろう。
【００１０】
該コノペプチドの高い効力および優れた選択性のために、いくつかのものがヒト障害の治療のために臨床的開発の種々の段階にある。例えば、２つのコーヌスペプチドは、痛みの治療用に開発されている。最も進んでいるは、Ｎ−タイプのカルシウムチャネルブロッカーのω−コノトキシンＭＶＩＩＡ（ジコノチド（ｚｉｃｏｎｏｔｉｄｅ））である（Ｈｅａｄｉｎｇ， Ｃ．， １９９９；米国特許第５，８５９，１８６号参照）。Ｃｏｎｕｓ　ｍａｇｕｓから単離されたω−コノトキシンＭＶＩＩＡは、モルヒネより約１０００倍強力であり、まだ寛容性および麻薬の嗜癖特性を生じていない。ω−コノトキシンＭＶＩＩＡは、ヒト臨床試験の第ＩＩＩ相（最終段階）を完了し、治療剤として承認された。ω−コノトキシンＭＶＩＩＡは、髄腔内に通されたカテーテルを用いて、埋込み可能でプログラム可能なポンプによりヒト患者に導入される。術後疼痛における使用のための前臨床試験は、Ｃｏｎｕｓ　ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓから単離されたもう一つのコーヌスペプチド、コンツラキン−Ｇに関して実施されている（Ｃｒａｉｇら， １９９９）。コンツラキン−Ｇは１６個のアミノ酸Ｏ−結合糖ペプチドであり、そのＣ末端は、ニューロテンシンに似ている。それは、ニューロテンシン受容体のアゴニストであるが、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイでの痛みの阻害において、ニューロテンシンよりかなり強力であるらしい。
【００１１】
中枢神経系（ＣＮＳ）に対する虚血性損傷は、全脳または局所虚血のいずれかから起因し得る。全脳虚血は、全脳への血流が心停止に起因し得るごときある期間止まる条件下で生じる。局所虚血は、一部の脳が、脳血管の血栓塞栓性閉塞、外傷性頭部または脊髄損傷、浮腫または脳もしくは脊髄の腫瘍から起因し得るその通常の血液供給を奪われた状態下で生じる。全脳および局所虚血の双方は、全脳虚血性疾患が一過性であるか、あるいは局所虚血が非常に限定された領域に影響するとしても広範囲の神経損傷につき潜在力を有する。
【００１２】
癲癇は、脳ニューロンの異常な過剰放電によって惹起される変容した意識、運動活性、感覚性現象の突然の短い発作、または不適当行動によって特徴付けられる脳機能の再発性の発作性障害である。最も共通した形態の痙攣発作は、意識および運動制御の喪失、および全肢の強直性または間代性痙攣で始まるが、いずれの再発性の発作パターンも癲癇と称される。原発性または特発性癲癇なる用語は、発作の原因が確認できない場合を示す。二次性または症候性の癲癇は、それが外傷、新生物、感染、発育異常、脳血管疾患または種々の代謝性疾患のごとき因子と関連する場合の疾患を示す。癲癇発作は、部分発作（限局性、局所発作）または全身発作（痙攣性または非痙攣性）に分類される。部分発作のクラスには、単純部分発作、複雑部分発作および副次的な全身性の部分発作が含まれる。全身発作のクラスには、欠神発作、非定型欠神発作、ミオクローヌス発作、間代性発作、強直性発作、硬直性−間代性発作（ｇｒａｎｄ ｍａｌ）および無緊張発作が含まれる。抗痙攣特性を有する治療剤は、発作の治療に用いられる。発作を根絶または緩和するのに用いる大部分の治療剤は、少なくとも、発作中心からの興奮の拡大を低下させ、ニューロンの正常な集合体の機能のデトネーション（ｄｅｔｏｎａｔｉｏｎ）および崩壊を防止する効果を介して作用する。利用されている従来の抗痙攣剤には、フェニトイン、フェノバルビタール、プリミドン、カルバマゼピン、エトスクシイミド（ｅｔｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、クロナゼパムおよびバルプロエートが含まれる。いくつかの新規で化学的に区別される抗痙攣薬が、近年、ラモトリジン、フェルバメート（ｆｅｒｌｂａｍａｔｅ）、ガバペニン（ｇａｂａｐｅｎｉｎ）およびトピラメート（ｔｏｐｉｒａｍａｔｅ）を含めて市販のために承認された。発作およびそれらの治療のさらなる詳細については、Ｒａｌｌ ＆ Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ（１９８５）およびＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ（１９９２）参照。
【００１３】
コーヌス種における多数の生物学的に活性な物質に関して、それらをさらに特徴付けし、発作および痛みのごとき電位依存性イオンチャネルに関連する障害を治療することができるペプチドを同定することが望ましい。驚くべきことに、かつ本発明により、出願人は、電位依存性イオンチャネルに関連する障害の治療に有用であり得、安全で有効な治療のための長期の切実な必要性に対処できる新規なコノトキシンを発見した。
【００１４】
発明の概要
本発明は、抗痙攣剤、神経保護剤、心血管剤のごとき、神経学および精神医学上の障害の治療を含めた、または痛みを管理するのための、ω−コノペプチド、その誘導体または医薬上許容される塩、ならびその使用に指向される。本発明は、さらに、ω−コノペプチドをコードするおよびプロペプチドをコードする核酸配列、ならびにプロペプチドに指向される。
【００１５】
より詳細には、本発明は、後記の表２に記載されるアミノ酸配列を有するω−コノペプチドに指向される。
【００１６】
また、本発明は、ω−コノペプチドの誘導体または医薬上許容される塩、あるいは誘導体に指向される。誘導体の例には、該Ａｒｇ残基は、Ｌｙｓ、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Ｌｙｓ、Ｎ−メチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌｙｓ、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌｙｓまたはいずれかの合成塩基性アミノ酸によって置換でき；該Ｌｙｓ残基は、Ａｒｇ、オルニチン、ホモアルギニン、ノル−Ｌｙｓまたはいずれかの合成塩基性アミノ酸によって置換でき；該Ｔｙｒ残基は、メタ−Ｔｙｒ、オルト−Ｔｙｒ、ノル−Ｔｙｒ、モノ−ハロ−Ｔｙｒ、ジ−ハロ−Ｔｙｒ、Ｏ−スルホ−Ｔｙｒ、Ｏ−ホスホ−Ｔｙｒ、ニトロ−Ｔｙｒまたはいずれかの合成ヒドロキシ含有アミノ酸で置換でき；該Ｓｅｒ残基は、Ｔｈｒまたはいずれかの合成ヒドロキシル化アミノ酸で置換でき；該Ｔｈｒ残基は、Ｓｅｒまたはいずれかの合成ヒドロキシル化アミノ酸で置換でき；該Ｐｈｅ残基は、いずれかの合成芳香族アミノ酸で置換でき；該Ｔｒｐ残基は、Ｔｒｐ（Ｄ）、ネオ−Ｔｒｐ、ハロ−Ｔｒｐ（ＤまたはＬ）またはいずれかの合成芳香族アミノ酸で置換でき；および該Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｙｐ残基はグリコシル化できる。該ハロゲンは、ヨード、クロロ、フルオロまたはブロモ；好ましくは、ハロゲン置換−Ｔｙｒにつきヨードおよびハロゲン置換−Ｔｒｐにつきブロモである。また、該Ｔｙｒ残基 は、３−ヒドロキシルまたは２−ヒドロキシル異性体（各々、メタ−Ｔｙｒまたはオルト−Ｔｙｒ）ならびに対応するＯ−スルホ−およびＯ−ホスホ−誘導体で置換できる。酸性アミノ酸残基は、いずれの合成酸性アミノ酸、例えば、ＧｌｙおよびＡｌａのテトラゾリル誘導体で置換できる。脂肪族アミノ酸は、非天然脂肪族のｎ＝８以下の分岐鎖または直鎖ＣｎＨ２ｎ＋２を持つ合成誘導体によって置換できる。該Ｃｙｓ残基は、ＤもしくはＬ配置であり得、所望によりホモシステイン（ＤもしくはＬ）で置換されていてもよい。
【００１７】
合成芳香族アミノ酸の例には、限定されるものではないが、ニトロ−Ｐｈｅ、４−置換−Ｐｈｅ（ここに、置換基はＣ１−Ｃ３アルキル、カルボキシル、ヒドロキシメチル、スルホメチル、ハロ、フェニル、−ＣＨＯ、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈおよび−ＮＨＡｃである）が含まれる。合成ヒドロキシ含有アミノ酸の例には、限定されるものではないが、４−ヒドロキシメチル−Ｐｈｅ、４−ヒドロキシフェニル−Ｇｌｙ、２，６−ジメチル−Ｔｙｒおよび５−アミノ−Ｔｙｒのごときが含まれる。合成塩基性アミノ酸の例には、限定されるものではないが、Ｎ−１−（２−ピラゾジリニル）−Ａｒｇ、２−（４−ピペリニル）−Ｇｌｙ、２−（４−ピペリニル）−Ａｌａ、２−［３−（２Ｓ）ピロリニニル］−Ｇｌｙおよび２−［３−（２Ｓ）ピロリニニル］−Ａｌａが含まれる。これらおよび他の合成塩基性アミノ酸、合成ヒドロキシ含有アミノ酸または合成芳香族アミノ酸は、ＲＳＰ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡによるおよびそこから入手可能であるＢｕｉｌｄｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｉｎｄｅｘ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０（１９９９ カタログ、ヒドロキシ含有アミノ酸および芳香族アミノ酸については４〜４７頁に、および塩基性アミノ酸については６６〜８７頁に記載されており；また、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄｓ．ｃｏｍも参照されたし）（これらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載されている。合成酸性アミノ酸の例には、各々出典明示して本明細書の一部とみなす、Ｏｒｎｓｔｅｉｎら（１９９３）によっておよび米国特許第５，３３１，００１号に記載されるごとき、カルボキシル、リン酸、スルホン酸ならびに合成テトラゾリル誘導体を含む酸性官能基を持つそれらの誘導体が含まれる。
【００１８】
所望により、本発明のω−コノペプチドにおいては、Ａｓｎ残基は修飾されてＮ−グリカンを含んでいてもよく、ＳｅｒおよびＴｈｒおよびＨｙｐ残基は修飾されてＯ−グリカン（例えば、ｇ−Ｎ、ｇ−Ｓ、ｇ−Ｔおよびｇ−Ｈｙｐ）を含んでいてもよい。本発明によれば、グリカンはいずれかのＮ−、Ｓ−またはＯ−結合した単−、二−、三−、多−またはオリゴ糖を意味し、それらは当該技術分野で知られている合成または酵素法によって天然または修飾アミノ酸のいずれかのヒドロキシ、アミノまたはチオール基に結合することができる。グリカンを構成する単糖には、Ｄ−アロース、Ｄ−アルトロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グロース、Ｄ−イドース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｄ−フコースまたはＤ−アラビノースが含まれ得る。これらの糖は、例えば、１以上のＯ−硫酸、Ｏ−リン酸、Ｏ−アセチル、またはシアル酸のごとき酸性基ならびにこれらの組合せで、構造的に修飾されていてもよい。グリカンには、Ｄ−ペニシラミン２，５およびそのハロゲン化誘導体のごとき同様のポリヒドロキシ基またはポリプロピレングリコール誘導体も含まれ得る。また、グリコシド結合はベータであって１−４または１−３、好ましくは１−３である。グリカンとアミノ酸との間の結合はアルファまたはベータであってもよく、好ましくはアルファであって１−である。
【００１９】
コアＯ−グリカンは、Ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｅｅｎら（１９９８）（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）によって記載されている。ムチン型Ｏ−結合オリゴ糖はＧａｌＮＡｃ残基によってＳｅｒまたはＴｈｒ（または本ペプチドの他のヒドロキシル化残基）に結合している。単糖形成ブロックおよびこの第１のＧａｌＮＡｃ残基に結合した結合は「コアグリカン」と定義され、そのうちの８が同定されている。各コアグリカンについてグリコシド結合の型（向きおよび結合性）は定義される。適当なグリカンおよびグリカン・アナログは、１９９９年１０月１９日に出願された米国出願第０９／４２０，７９７号および１９９９年１０月１９日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４３８０（ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ００／２３０９２）（各々、出典明示して本明細書の一部とみなす）にさらに記載されている。好ましいグリカンはＧａｌ（β１→３）ＧａｌＮＡｃ（α１→）である。
【００２０】
所望により、前記のω−コノペプチドにおいて、Ｃｙｓ残基の対はＳｅｒ／（ＧｌｕもしくはＡｓｐ）、Ｌｙｓ／（ＧｌｕもしくはＡｓｐ）またはＣｙｓ／Ａｌａ組合せのごとき、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）ラクタムまたはエステル−チオエーテル交換でペアで置きかえることができる。公知の方法（Ｂａｒｎａｙら、２０００；Ｈｒｕｂｙら、１９９４；Ｂｉｔａｎら、１９９７）による順次カップリングは、ラクタム架橋での天然Ｃｙｓ架橋の置換を可能とする。チオエーテル・アナログは、ＲＳＰ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓから市販されているハロ−Ａｌａ残基を用いて容易に合成できる。
【００２１】
本発明は、対象における電位依存性チャネル障害と関連する障害を治療する方法にさらに指向され、該方法は、治療上有効量の、本明細書に記載されたω−コノペプチドまたはその医薬上許容される塩もしくはその溶媒和物を含む医薬組成物を該対象に投与することを特徴とする。また、本発明は、治療上有効量の本明細書に記載されたω−コノペプチドまたはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物、および医薬上許容される担体を含む医薬組成物に指向される。
【００２２】
より詳細には、本発明は、さらに、抗痙攣剤、神経保護剤のごとき、発作治療のためのごとき、心血管剤のごとき神経障害の治療を含めた、または痛みを管理するための本明細書に記載されたこれらのペプチドまたは核酸の使用に指向される。
【００２３】
より詳細には、本発明は、本発明のコノペプチドをコードするまたはこれらのコノペプチドについての前駆体ペプチドをコードする核酸、ならびに前駆体ペプチドにも指向される。本発明の他のコノペプチドの前駆体ペプチドをコードする核酸配列を表１に記載する。また、表１はこれらの前駆体ペプチドのアミノ酸配列を記載している。
【００２４】
好ましい具体例の詳細な記載
本発明は、ω−コノペプチド、その誘導体または医薬上許容される塩に関する。本発明は、さらに、抗痙攣剤、神経保護剤のごとき神経障害の治療のため、心血管剤のごとき発作を治療するためのごとき、または例えば、鎮痛剤として痛みを管理するための本ペプチド、その誘導体およびその医薬上許容される塩の使用に指向される。本発明は、さらに、ω−コノペプチドをコードする核酸配列およびプロペプチドをコードする核酸配列、ならびにそのプロペプチドに指向される。
【００２５】
本発明は、もう一つの態様において、有効量のω−コノペプチド、そのムテイン、その活性断片または医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む医薬組成物に関する。かかる医薬組成物は、電位依存性イオンチャネルにて作用する能力を有し、かくして、ヒトを含めた動物の生体の障害または疾患を治療するのに有用であり、その障害または疾患は、中枢神経系の電位依存性イオンチャネルの部分的または完全な遮断に応答し、治療上有効量の本発明の医薬組成物をそれを必要とするヒトを含めた動物の生体に投与する工程を含む。
【００２６】
電位依存性カルシウムチャネルは、ニューロン中、および心筋、平滑筋および骨格筋および他の興奮性細胞中に存在し、シナプス伝達におけるごとき、膜興奮性、筋収縮および細胞分泌における様々な役割を演じることが知られている（ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ）。ニューロン細胞において、電位依存性カルシウムチャネルは、それらの電気生理学的ならびにそれらの生化学的（結合）特性によって分類されている。６つのクラスの生理学的に区別されるカルシウムチャネル、すなわち、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、ＱおよびＲ−タイプのチャネルが現在まで同定されている。
【００２７】
脳内カルシウムの蓄積（カルシウム過負荷）は、酸素欠乏症、虚血、片頭痛、および癲癇痙攣の後のごとき、脳の活動亢進期間後に見られることはよく知られている。中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞におけるカルシウムが制御されていない高濃度は、前記疾病と関連する大部分の変性変化を引き起こすことが知られている。脳細胞のカルシウムチャネルをブロックできる化合物は、従って、発作、酸素欠乏症、虚血、片頭痛、精神病または癲癇、いずれの他の痙攣性の障害の治療において有用であり、それらの同一物と関連する変性変化の予防において有用である。
【００２８】
ＣＮＳにおけるいわゆるＬ−型カルシウムチャネルをブロックする化合物は、ＣＮＳにおけるカルシウムの取込みを直接的にブロックすることによって前記障害の治療に有用である。さらに、いわゆるＮ−およびＰ−型のカルシウムチャネル、ならびに可能な他の型のカルシウムチャネルは、神経伝達物質の放出の変調に関連付けられる。Ｎ−および／またはＰ−型のカルシウムチャネルをブロックする化合物は、ＣＮＳのかかる活動亢進期間後に見られる神経伝達物質放出の増強、特に、ＣＮＳのかかる活動亢進期間後のグルタミン酸放出の増強を阻害することによって、前記の脳の活動亢進期間後のＣＮＳにおけるカルシウムの過負荷を間接的でかつ非常に強力に防止する。さらに、Ｎ−および／またはＰ−型のカルシウムチャネルのブロッカーは、問題の該化合物の選択性に依存して、アスパラギン酸、ＧＡＢＡ、グリシン、ドーパミン、セロトニンおよびノルアドレナリンのごとき様々な他の神経伝達物質の放出を阻害する。
【００２９】
かくして、本発明の医薬組成物は、神経保護剤、心血管剤、抗痙攣剤、鎮痛剤または全身麻酔薬への補助薬として有用である。「神経学上の障害または疾病」は、限定されるものではないが、総体および限局性の虚血性および出血性の発作、頭部外傷、脊髄損傷、心停止または新生児仮死における低酸素症誘導の神経細胞損傷、あるいは癲癇を含めた神経系の障害または疾患である。加えて、「神経学上の障害または疾病」は、神経保護剤（ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、抗痙攣剤、鎮痛剤、および／または全身麻酔における補助物として示され、有用であり、推奨または処方できる疾患状態および疾患である。
【００３０】
より詳細には、本発明は、癲癇の治療および緩和のための、および一般的な抗痙攣剤として、これらの化合物の使用に指向される。また、本発明は、典型的には、発作に続く低酸素症、酸素欠乏症または虚血性疾患、脳血管事故、脳または脊髄外傷、心筋梗塞、身体的外傷、溺死、窒息、分娩仮死または低血糖事象に関連した神経毒性損傷を低下させるためのこれらの化合物の使用に指向される。さらに、本発明は、急性および慢性の痛み、かかる片頭痛、侵害受容性および神経障害性の疼痛を含めた痛みを治療するためのこれらの化合物の使用に指向される。これらの化合物の他の使用は、米国特許第５，８５９，１８６号に記載され、それをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００３１】
「神経保護剤」は、神経の障害または疾患と関連するニューロン死を予防できる化合物である。「抗痙攣剤」は、単純部分発作、複合部分発作、痙攣重積状態、および頭部手術を含めた続いての頭部外傷を引き起こすごとき外傷誘導発作によって生成した痙攣を減少できる化合物である。「鎮痛剤」は、麻酔または意識喪失を生じない侵害受容性刺激に対する認知を変更することによって痛みを緩和できる化合物である。「筋弛緩剤」は、筋肉緊張を低下させる化合物である。「全身麻酔における補助物（ａｄｊｕｎｃｔ）」は、意識喪失に関連した痛みを知覚する能力の喪失を生じる麻酔剤と組み合せて有用な化合物である。
【００３２】
本発明は、限定されるものではないが、総体および限局性の虚血性および出血性の発作、頭部外傷、脊髄損傷、心停止または新生児仮死における低酸素症誘導の神経細胞損傷、癲癇、または望ましくない副作用のない他の痙攣性障害を含めた神経系の障害および疾患の治療に有用な方法にさらに関連する。
【００３３】
かくして、１つの具体例において、本発明は、対象による痛みの認知を低下／緩和／減少させる方法、または対象における鎮痛を誘導するための方法を提供し、ここに、該方法は、治療上有効量の、本明細書に記載されたω−コノペプチド、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。その痛みは、急性、持続性、炎症性または神経障害性の疼痛であり得る。
【００３４】
第２の具体例において、本発明は、対象における発作、頭部または脊髄の外傷または損傷、酸素欠乏症、低酸素症誘導の神経細胞損傷、虚血、片頭痛、精神病、不安、精神分裂病、炎症、運動障害、癲癇、いずれかの他の痙攣性障害を治療する方法、または同一物と関連した変性変化の予防における方法を提供し、ここに、該方法は、治療上有効量の本明細書に記載のω−コノペプチド、またはその医薬上許容される塩またはその溶媒和物を含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００３５】
本明細書に記載されたω−コノペプチドは、化学的に合成するのに十分に小さい。前記のω−コノトキシンペプチドを調製するための一般的な化学合成は、後記されている。また、ω−コノペプチドの種々のものが、米国特許第４，４４７，３５６号（Ｏｌｉｖｅｒａら、１９８４）；第５，５１４，７７４号；第５，７１９，２６４号；および第５，５９１，８２１号、ならびにＰＣＴ公開出願ＷＯ ９８／０３１８９（これらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載された技術を用いて、特定のコーヌス種からの単離および精製によって得ることができる。
【００３６】
本発明のω−コノペプチドはイモガイからの精製によって得ることができるが、個々の巻貝から得ることができるω−コノペプチドの量は非常に少量であるため、所望の実質的に純粋なω−コノペプチドは、固相戦略を用いる化学合成によって商業的に価値ある量にて現実には最良に得る。例えば、単一のイモガイからの収量は約１０マイクログラム以下のω−コノペプチドペプチドであり得る。「実質的に純粋」とは、該ペプチドが同一タイプの他の生物学的分子の実質的な不存在下にて存在することを意味し；それは好ましくは少なくとも約８５％純度、好ましくは少なくとも約９５％純度の量で存在する。生物学的に活性なω−コノペプチドペプチドの化学合成は、もちろんアミノ酸配列の正確な決定の過程に依存する。
【００３７】
また、ω−コノペプチドは、当該技術分野でよく知られている組換えＤＮＡ技術によっても産生できる。かかる技術はＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）によって記載されている。注目する遺伝子（すなわち、適当なω−コノペプチドをコードする遺伝子）は、標準的手法を用いることによって適当な発現ベクターのクローニング部位に挿入できる。これらの手法は、当業者によく知られている。次いで、注目する遺伝子を含有する発現ベクターを用いて、所望の細胞系をトランスフェクトできる。リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションまたはエレクトロポレーションのごとき標準的トランスフェクション手法を利用できる。非常に広範囲の宿主／発現ベクターの組合せを用いて、注目するコノトキシンペプチドをコードする遺伝子を発現できる。かかる組合せは当業者によく知られている。このようにして産生したペプチドを単離し、要すれば還元し、酸化して、正確なジスルフィド結合を形成させる。
【００３８】
本発明のω−コノペプチド中にジスルフィド結合を形成させる１つの方法は、冷室温下または室温にて長時間の線状ペプチドの空気酸化である。この手法の結果、実質量の生物活性のジスルフィド結合ペプチドが創製する。酸化されたペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を用いて分画して、異なる結合立体配置を有するペプチドを分離する。その後、これらの画分を天然物質の溶出と比較するか、または単純なアッセイ方法を用いることによって、最大の生物学的効力の正確な結合を有する特定の画分を容易に決定する。しかしながら、より低い生物効力の他の画分の存在から生じる希釈のため、幾分より高い投与量が必要となり得る。
【００３９】
該ペプチドは、絶対固相技術、部分固相技術、フラグメント縮合または古典的な溶液カップリングによるごとき、適当な方法によって合成される。
【００４０】
通常の液相ペプチド合成においては、ペプチド鎖は、構成アミノ酸を所望の順序で伸長するペプチド鎖に付加する一連のカップリング反応によって調製できる。種々のカップリング試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボニルジイミダゾール、種々の活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドまたはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドのエステル、ならびに種々の切断試薬を用いて溶液中で反応を行い、続いて中間体を単離および精製することはよく知られている古典的なペプチド法である。古典的な溶液合成は、論文「Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ）： Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ」（１９７４）に詳記されている。絶対的固相合成の技術は、テキストブック、「Ｓｏｌｉｄ‐Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，１９６９）に記載されており、米国特許第４，１０５，６０３号（Ｖａｌｅら、１９７８）の開示によって例示されている。合成のフラグメント縮合法は米国特許第３，９７２，８５９号（１９７６）に例示されている。他の利用可能な合成は、米国特許第３，８４２，０６７号（１９７４）および第３，８６２，９２５号（１９７５）によって例示されている。γ−カルボキシグルタミン酸残基を含有するペプチドの合成は、Ｒｉｖｉｅｒら（１９８７）、Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉら（１９９３）およびＺｈｏｕら（１９９６）によって例示されている。
【００４１】
かかる化学合成に共通しているのは、当該基が最終的に除去されるまで、その部位で化学反応が起こるのを妨ぐであろう適当な保護基で種々のアミノ酸部位の不安定な側鎖基を保護することである。また、通常共通しているのは、その原子団がカルボキシル基において反応し、続いてα−アミノ保護基を選択的に除去してその位置で続く反応が起こることを許容する間に、アミノ酸または断片上のα−アミノ基を保護することである。したがって、かかる合成における工程として、不安定側鎖を有する残基の種々のものに結合した適当な側鎖保護基を有するペプチド鎖中に所望の順序で位置する各アミノ酸残基を含む中間体化合物を生成することが共通している。
【００４２】
側鎖アミノ保護基の選択に関する限り、一般的に、合成中α−アミノ基の脱保護の間には除去されないものが選択される。しかしながら、いくらかのアミノ酸、例えば、Ｈｉｓについては、保護は一般的には必要でない。ペプチド合成に用いられるべき特定の側鎖保護基の選択においては、以下の一般規則に従う：（ａ）保護基は好ましくはカップリング条件下にてその保護特性を保持し、かつ、分裂しないこと、（ｂ）保護基は合成の各工程にてα−アミノ保護基を除去するために選択した反応条件下で安定でなければならないこと、ならびに、（ｃ）側鎖保護基は、ペプチド鎖を望ましくないように変化させない反応条件下にて、所望のアミノ酸配列を含む合成の完了の際に、除去可能でなければならないこと。
【００４３】
組換えＤＮＡ技術を用いてこれらのペプチドの多くまたは全てでさえ調製することが可能である。しかしながら、ペプチドをそのように調製しない場合には、当該技術分野で知られている他の等価な化学合成も先に述べたごとく用い得るが、それを好ましくはメリフィールド固相合成を用いて調製する。固相合成は、保護α−アミノ酸を適当な樹脂にカップリングさせることによって、ぺプチドのＣ−末端から開始される。かかる出発物質は、α−アミノ−保護アミノ酸を、エステル結合によりクロロメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチル樹脂に結合させることによって、あるいは、アミド結合によってベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂またはパラメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂に結合させることによって調製できる。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Ｂｏｄａｎｓｋｙら（１９６６）によって記載されている。クロロメチル化樹脂はＢｉｏ Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）およびＬａｂ． Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社から市販されている。かかる樹脂の調製は、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９６９）によって記載されている。ＢＨＡおよびＭＢＨＡ樹脂支持体は市販されており、合成すべき所望のポリペプチドがＣ−末端に非置換アミドを有する場合に一般的に用いられる。したがって、式−Ｏ−ＣＨ２−樹脂支持体、−ＮＨ ＢＨＡ樹脂支持体または−ＮＨ−ＭＢＨＡ樹脂支持体を有するもののごとく、固体樹脂支持体は当該技術分野で知られているいずれのものであってもよい。未置換アミドが望まれる場合、切断がアミドを直接的に与えるためにＢＨＡまたはＭＢＨＡ樹脂の使用が好ましい。Ｎ−メチルアミドが望まれる場合、それはＮ−メチルＢＨＡ樹脂から生成することができる。他の置換されたアミドが所望ならば、米国特許第４，５６９，９６７号の教示（Ｋｏｒｎｒｅｉｃｈら、１９８６）を用いることができ、あるいは、遊離酸以外のなお他の基がＣ−末端に望まれる場合、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌテキスト（１９７４）に記載された古典的方法を用いてペプチドを合成するのが好ましいであろう。
【００４４】
ＢｏｃまたはＦｍｏｃによって、および側鎖保護基によって保護されたＣ−末端アミノ酸は、適当には、Ｃ−末端に遊離酸を有するペプチドを合成すべき場合、まず、攪拌しつつ約６０℃にて２４時間、ＤＭＦ中のＫＦを用い、Ｋ． Ｈｏｒｉｋｉら（１９７８）に記載された手法に従って、クロロメチル化樹脂にカップリングさせることができる。ＢＯＣ−保護アミノ酸を樹脂支持体にカップリングさせた後に、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＴＦＡ単独を用いることによって、α−アミノ保護基を除去する。脱保護は約０℃と室温との間の温度で行う。ジオキサン中のＨＣｌのごとき他の標準的な切断試薬および特異的α−アミノ保護基の除去のための条件は、ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅ（１９６５）に記載されているごとく使用できる。
【００４５】
α−アミノ保護基の除去後、残りのα−アミノ−および側鎖−保護アミノ酸を所望の順序で段階的にカップリングさせて本明細書に前記に定義した中間体化合物を得るか、あるいは別法として、合成中に各アミノ酸に別々に付加し、そのうちの幾つかは固相反応器に添加する前に互いにカップリングさせ得る。適当なカップリング試薬の選択は当業者の範囲内にある。カップリング試薬として特に適当なのは、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＨｏＢｔまたはＨｏＡｔの存在下でのＤＣＣ、ＤＩＣ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ）である。
【００４６】
ペプチドの固相合成に用いる活性化試薬は、ペプチドの技術分野でよく知られている。適当な活性化試薬の例は、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドのごときカルボジイミドである。他の活性化試薬およびペプチド・カップリングにおけるそれらの使用は、ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅ（１９６５）ならびにＫａｐｏｏｒ（１９７０）によって記載されている。
【００４７】
各保護アミノ酸またはアミノ酸配列を約２倍以上の過剰量で固相反応器に導入し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）の媒体中またはＤＭＦもしくはＣＨ２Ｃｌ２単独中でカップリングを行い得る。中間体カップリングが起こる場合、次のアミノ酸のカップリングより前のα−アミノ保護基の除去前にカップリング手法を繰り返す。手動で行う場合、合成の各段階でのカップリング反応の成功は、好ましくは、Ｋａｉｓｅｒら（１９７０）によって記載されているごとく、ニンヒドリン反応によってモニターする。カップリング反応は、Ｂｅｃｋｍａｎ ９９０自動合成器におけるように、Ｒｉｖｉｅｒら（１９７８）において報告されているごときプログラムを用いて自動的に行い得る。
【００４８】
所望のアミノ酸配列が完成した後に、液体フッ化水素またはＴＦＡ（Ｆｍｏｃ化学を用いる場合）のごとき試薬を用いる処理によって、中間体ペプチドを樹脂支持体から取り外すことができ、それは、樹脂からペプチドを切断するだけではなく、全ての残存する側鎖保護基および以前に除去されていない場合には、Ｎ末端の　−アミノ保護基をも切断して、ペプチドを遊離酸の形態で得ることができる。配列中にＭｅｔが存在する場合、好ましくは、ＨＦを用いて樹脂からペプチドを切断する前にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／エタンジチオールを用いて最初にＢｏｃ保護基を除去して、潜在的なＳ−アルキル化を排除する。フッ化水素またはＴＦＡを切断に用いる場合には、アニソール、クレゾール、ジメチルスルフィドおよびメチルエチルスルフィドのごとき１以上のスカベンジャーを反応容器に含ませる。
【００４９】
ペプチド−樹脂の一部である場合のペプチドの環化とは対照的に、好ましくは、線状ペプチドの環化に影響してＣｙｓ残基間の結合を創製する。かかるジスルフィド環化結合をもたらすために、当該技術分野でよく知られているごとく、アンモノリシスによって、完全に保護されたペプチドをヒドロキシメチル化樹脂またはクロロメチル化樹脂支持体から切断して、完全に保護されたアミド中間体を得ることができ、その後、それを適当に環化および脱保護することができる。別法として、脱保護ならびに上記の樹脂またはベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂もしくはメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）からのペプチドの切断は、フッ化水素酸（ＨＦ）またはＴＦＡを用いて０℃で行うことができ、その後、上記のように酸化できる。
【００５０】
また、自動合成器を用いてもペプチドが合成される。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ ３５７自動ペプチド合成器を用いて、Ｃ末端にて開始してＭＢＨＡ Ｒｉｎｋ樹脂（典型的には１００ｍｇの樹脂）にアミノ酸を順次カップリングさせる。カップリングは、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）中の１，３−ジイソプロピルカルボジイミドを用いるか、または２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジエチルイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）によって行う。ＦＭＯＣ保護基は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のピペリジンの２０％溶液での処理によって除去する。その後、樹脂をＤＭＦ（２回）、続いてメタノールおよびＮＭＰで洗浄する。
【００５１】
また、前記のコノトキシンペプチドのアナログまたは活性断片のムテインは本明細書に含まれる。例えば、Ｈａｍｍｅｒｌａｎｄら（１９９２）参照。そのコノトキシンペプチドのアナログまたは活性断片の、誘導体ムテインは、米国特許第５，５４５，７２３号（特に、第２欄、第５０行〜第３欄、第８行）；第５，５３４，６１５号（特に、第１９欄、第４５行〜第２２欄、第３３行）；および第５，３６４，７６９号（特に、第４欄、第５５行〜第７欄、第２６行）（各々をここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に概説されたごとき保存的アミノ酸置換を含めた公知の手法により合成できる。
【００５２】
また、本発明のω−コノペプチドは、典型的には、発作、脳血管事故、脳または脊髄外傷、心筋梗塞、身体的外傷、溺死、窒息、分娩仮死または低血糖事象に続く低酸素症、酸素欠乏症または虚血性疾患に関連する神経毒性損傷を減少させるのに有用である。神経毒性損傷を減少させるために、ω−コノペプチドは、患者が経験するであろうＣＮＳ損傷を効果的に最小とするように、低酸素症、酸素欠乏症または虚血性疾患の開始の２４時間以内に患者に治療上有効量にて投与されるであろう。
【００５３】
本発明のω−コノペプチドは、さらに、例えば、鎮痛剤として痛みの制御、および片頭痛、急性疼痛または持続性疼痛の治療に有用である。それらは、予防的にあるいは片頭痛エピソードに関連する症状を緩和する、または急性もしくは持続性疼痛を治療するために用いることができる。これらの用途では、ω−コノペプチドは、痛みを克服または和らげる治療上の有効量にて投与される。
【００５４】
有効成分として本発明の化合物を含有する医薬組成物は、慣用的な医薬調剤技術に従って調製できる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．社，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を参照されたし。典型的には、治療上有効量の有効成分は医薬上許容される担体と混合されるであろう。担体は、投与、例えば、静脈内、経口、非経口または髄腔内、に望ましい製剤の形態に依存して非常に様々な形態を取ることができる。送達方法については、米国特許第５，８４４，０７７号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）を参照されたし。
【００５５】
「医薬組成物」とは、医薬投与につき適当な物理的に区別される統一性のある部分を意味する。「投与単位形態における医薬組成物」とは、医薬投与につき適当な物理的に区別される統一性のある単位を意味し、各々は、担体と組み合わせたおよび／または包被内に入れられた活性化合物の毎日用量、複数（４回まで）またはサブマルチプル（４０回より下）の毎日用量を含有する。該組成物が毎日用量、または毎日用量の半分または１／３または１／４を含むかは、該医薬組成物が、１日当り１回または例えば、２、３または４回投与されるべきかに依存するであろう。
【００５６】
本明細書に用いられる「塩」なる用語は、無機または有機の酸および／または塩基、好ましくは塩基塩で形成された酸性および／または塩基性塩を示す。特に、本発明の化合物を医薬として使用する場合、医薬上許容される塩が好ましいが、他の塩は、例えば、これらの化合物を処理するのに、または医薬タイプでない使用を意図する場合に有用性を見出せる。これらの化合物の塩は、技術が認識されている手法によって調製できる。
【００５７】
かかる医薬上許容される塩の例には、限定されるものではないが、各々、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩またはリン酸塩および酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、イソチオン酸塩、酢酸テオフィリン、サリチル酸塩等のごとき無機および有機の付加塩が含まれる。低級アルキル四級アンモニウム塩等も同様に適当である。
【００５８】
本明細書に用いる「医薬上許容される」担体なる用語は、非毒性の、不活性固体の、半固形液体の充填剤、希釈剤、カプセル化物質、いずれかのタイプの処方補助剤、または単に、セーラインのごとき無菌水性媒体を意味する。医薬上許容される担体として機能できる物質のいつらかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースのごとき糖、コーンスターチおよび馬鈴薯デンプンのごときデンプン、セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースのごときその誘導体；粉末トラガカントゴム；メルト、ゼラチン、タルク；カカオ脂および坐薬ワックスのごとき賦形剤；落花生油、綿実油、べにばな油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油のごとき油；プロピレングリコールのごときグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールのごときポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのごときエステル、寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのごとき緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張性セーライン、リンゲル液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬処方において用いられる他の非毒性の適合性物質である。
【００５９】
また、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのごとき湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、矯味剤および芳香剤、保存剤および抗酸化剤は、処方者の判断により該組成物中に存在できる。医薬上許容される抗酸化剤の例には、限定されるものではないが、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のごとき水溶性抗酸化剤；アスコルビルパルチメート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）またはブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レクチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等のごとき油可溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のごとき金属キレート化剤が含まれる。
【００６０】
経口投与に関しては、化合物をカプセル剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、メルト剤、散剤、懸濁剤または乳剤のごとき固体または液体の製剤に処方化できる。経口投与形態での組成物の調製においては、いずれかの通常の医薬媒体を用いることができ、これは例えば、（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤のごとき）経口液体製剤の場合においては、水、グリコール、油剤、アルコール、矯味剤、保存料、着色剤、懸濁化剤等；あるいは（例えば、散剤、カプセル剤および錠剤のごとき）経口固体製剤の場合においては、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のごとき担体である。投与におけるそれらの簡便性のために、錠剤およびカプセル剤は最も有利な投与単位形態を表し、その場合、固体医薬担体を明らかに用いる。所望ならば、錠剤は標準的な技術によって糖衣または腸溶衣をかけ得る。活性薬剤をカプセル化して、それが血液脳関門を通過することを許容すると同時に胃腸管を安定に通過させ得る。例えば、ＷＯ９６／１１６９８を参照されたし。
【００６１】
非経口投与に関しては、化合物を医薬担体に溶解して、液剤または懸濁剤として投与できる。適当な担体の例示は水、セーライン、デキストロース溶液、フラクトース溶液、エタノール、または動物、植物もしくは合成起源の油剤である。また、担体は、他の成分、例えば、保存剤、懸濁化剤、可溶化剤、緩衝剤等も含むこともできる。また、化合物を髄腔内投与する場合、それらを脳脊髄液に溶解できる。
【００６２】
様々な投与経路が利用可能である。選択された特定の様式は、選択された特定の薬物、治療されるべき疾患状態の重篤度および治療上の効力のために必要とされる用量にもちろん依存するであろう。本発明の方法は、一般的に言えば、医学的に許容できるいずれの様式の投与を用いても実施でき、臨床的に許容できない副作用を生じることなく、活性化合物の有効レベルを生じるいずれの様式も意味する。かかる投与様式には、経口、直腸、舌下、局所、経鼻、経皮または非経口の経路が含まれる。「非経口」なる用語は、皮下、静脈内、硬膜外、潅注、筋肉内、放出ポンプまたは注入が含まれる。
【００６３】
例えば、本発明による活性薬剤の投与は、いずれの適当な送達手段を用いても達成でき、
（ａ）ポンプ（例えば、ＬａｕｅｒおよびＨａｔｔｏｎ（１９９３）、Ｚｉｍｍら（１９８４）ならびにＥｔｔｉｎｇｅｒら（１９７８）参照）；
（ｂ）マイクロカプセル化（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号；第４，３５３，８８８号および第５，０８４，３５０号参照）；
（ｃ）持続性放出ポリマー埋込み剤（例えば、米国特許第４，８８３，６６６号参照）；
（ｄ）マイクロカプセル化（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、第５，１５８，８８１号、第４，９７６，８５９号および第４，９６８，７３３号ならびに公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９５／０５４５２参照）；
（ｅ）ＣＮＳに対する裸のまたは非カプセル化の細胞移植（例えば、米国特許第５，０８２，６７０号および第５，６１８，５３１号参照）；
（ｆ）皮下、静脈内、動脈内、筋肉内もしくは他の適当な部位への注射；または
（ｇ）カプセル剤、液剤、錠剤、丸剤または持続性放出製剤における経口投与
が含まれる。
【００６４】
本発明の１つの具体例において、活性薬剤は、ＣＮＳ、好ましくは、脳室、脳実質、髄腔または他の適当なＣＮＳ位置、最も好ましくは髄腔内に直接的に送達される。
【００６５】
あるいは、ターゲティング治療を用いて、抗体または細胞特異的リガンドのごときターゲティング・システムの使用によって、さらにとりわけ、ある種のタイプの細胞に活性薬剤を送達できる。ターゲティングは、種々の理由、例えば、薬剤が許容できない毒性があるならば、余りにも高用量を必要とするならば、または標的細胞に入ることができないならば望ましい。
【００６６】
また、ペプチドである活性薬剤は、活性薬剤をコードするＤＮＡ配列を患者の体内、特に脊髄領域に移植するために設計された細胞に導入する細胞ベースの送達システムにて投与できる。適当な送達システムは、米国特許第５，５５０，０５０号およびＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９４／２５５０３、ＷＯ９５／０１２０３、ＷＯ９５／０５４５２、ＷＯ９６／０２２８６、ＷＯ９６／０２６４６、ＷＯ９６／４０８７１、ＷＯ９６／４０９５９およびＷＯ９７／１２６３５に記載されている。適当なＤＮＡ配列は、開示された配列および公知の遺伝暗号に基づいて、各活性薬剤について合成により調製できる。
【００６７】
活性薬剤は、好ましくは、治療上有効量にて投与される。活性化合物の「治療上有効量」または単に「有効量」とは、いずれの医学的治療にも適用できる適当な利益／リスク比にて、所望の疾患を治療するのに十分な化合物の量を意味する。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療すべき疾患の性質および重篤度に依存するであろう。治療の処方箋、例えば、投与量、時期等に関する決定は、一般医師または専門医の責任の範囲内にあり、典型的には治療すべき障害、個々の患者の症状、送達部位、投与方法、および実践者に知られている他の因子を考慮する。技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。
【００６８】
用量は、局所的または全身的に所望の薬物レベルを達成するように適当に調製できる。典型的には、本発明の活性薬剤は、活性薬剤の約０．００１ｍｇ／ｋｇないし約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇないし約７５ｍｇ／ｋｇの用量範囲にてそれらの効果を示す。適当な用量は、１日当り複数のサブ用量にて投与できる。典型的には、用量またはサブ用量は、単位投与形態当り約０．１ｍｇないし約５００ｍｇの活性薬剤を含有できる。より好ましい用量は、単位投与形態当り約０．５ｍｇないし約１００ｍｇの活性薬剤を含有するであろう。用量は、一般的には、低レベルにて開始され、所望の効果が達成されるまで増加させる。対象における応答がかかる用量にて不十分である事象において、より高用量（または異なるより局所化された送達経路による有効なより高用量）さえ、患者耐容性が許される範囲まで使用できる。例えば、２４時間にわたる連続投与または１日当りの複数用量は、化合物の適当な全身レベルを達成すると考えられる。
【００６９】
痛みの治療では、投与経路がＣＮＳに直接的であるならば、考えられる用量は、１日当り約１ｎｇないし約１００ｍｇ、好ましくは１日当り約１００ｎｇないし約１０ｍｇ、より好ましくは１日当り約１μｇないし約１００μｇである。末梢的に投与されるならば、考えられる用量は、いくらか高く、１日当り約１００ｎｇないし約１０００ｍｇ、好ましくは１日当り約１０μｇないし約１００ｍｇ、より好ましくは１日当り約１００μｇないし約１０ｍｇである。コノペプチドが連続注入によって（例えば、ポンプ送達、生分解性ポリマー送達または細胞ベースの送達により）送達されるならば、低用量がボーラス送達についてよりも考えられる。
【００７０】
有利には、該組成物は、投与単位として処方され、各単位は、活性薬剤の固定用量を供給するように適合される。錠剤、被覆錠、カプセル剤、アンプル剤および坐剤は、本発明による投与形態の例である。
【００７１】
活性薬剤は、すなわち、適当な有効用量が、単一または複数の単位用量にて用いられた投与形態と一致するであろうように、有効量を構成することを必要とするにすぎない。正確な個々の用量、ならびに毎日用量は、使用ヒトまたは動物につき医師または獣医の指示の下、標準的医学原理により決定される。
【００７２】
医薬組成物は、一般的には、全組成物の重量当り、活性薬剤の約０．０００１ないし９９重量％、好ましくは約０．００１ないし５０重量％、より好ましくは約０．０１ないし１０重量％を含有するであろう。また、活性薬剤に加えて、該医薬組成物および医薬品は、他の医薬上活性な化合物を含有できる。他の医薬上活性な化合物の例には、限定されるものではないが、鎮痛剤、サイトカインおよび臨床医学の全ての主要領域における治療剤が含まれる。他の医薬上活性な化合物と共に用いる場合、本発明のコノペプチドは、薬物カクテルの形態にて送達できる。カクテルは、本発明で有用ないずれかの化合物と、もう一つの薬物または薬剤の混合物である。本具体例において、共通の投与ビヒクル（例えば、丸剤、錠剤、埋込み剤、ポンプ、注射溶液等）は、薬剤を補足的に増強する組合せにて本組成物の双方を含有するであろう。カクテルの個々の薬物は、治療上有効量にて各々投与される。治療上の有効量は、前記のパラメーターによって決定されるであろうが；それは、いずれの事象においても薬物が、所望の効果を達成するのに有効である時間に必要とされる身体の領域における薬物レベルを確立するその量である。
【００７３】
本発明の実施には、特記されない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝子学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニックバイオロジーを使用し、それらは当該技術分野の技量内にある。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２；Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５；Ａｎａｎｄ、１９９２；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ、１９９１；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８；ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ、１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ． Ｈ． ＭｉｌｌｅｒおよびＭ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４および１５５巻（Ｗｕら編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ． Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ． Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６）；Ｒｉｏｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８８；Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）参照。
【００７４】
実施例
本発明を以下の実施例に参照することによって説明するが、それは例示的な方法によって提供するもので、如何なる場合においても本発明を限定することを意図するものではない。当該技術分野でよく知られている標準的な技術、または以下に特記される技術を利用した。
【００７５】
実施例１
ω−コノペプチドの単離
毒液管から粗製毒液を抽出し（Ｃｒｕｚら、１９７６）、従前に記載されているごとく成分を精製した（Ｃａｒｔｉｅｒら、１９９６）。毒液管からの粗製抽出物を、ＶｙｄａｃＣ１８半分取用カラム（１０×２５０ｍｍ）を用いる逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によって精製した。生物活性ピークのさらなる精製は、ＶｙｄａｃＣ１８分析用カラム（４．６×２２０ｍｍ）にて行った。流出物は２２０ｍｍでモニターした。ピークを収集し、そのアリコートを活性につきアッセイした。精製中に、ＨＰＬＣ画分をマウスへの脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）注入によりアッセイした（Ｃｌａｒｋら、１９８１）。
【００７６】
精製ペプチドのアミノ酸配列は、標準的な方法によって決定した。１２０Ａ アナライザを備えたＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７７Ａタンパク質シークエンサー（ＤＮＡ／Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ）上の自動エドマン分解によって配列決定する前に、精製したペプチドを還元し、アルキル化した（Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９９５；Ｓｈｏｎら、１９９４）。
【００７７】
本方法により、表１に「単離」ごとく記載されたω−コノペプチドを得た。これらのω−コノペプチド、ならびに表１に記載された他のω−コノペプチドおよびω−コノペプチド前駆体を米国特許第５，５９１，８２１号に記載されたごとく合成する。
【００７８】
実施例２
ω−コノペプチドをコードするＤＮＡの単離
ω−コノペプチドをコードするＤＮＡは、Ｏｌｉｖｅｒａら（１９９６）に記載されているごとき、当該技術分野でよく知られている一般的手法を用いる慣用技術に従って単離およびクローン化した。別法として、ｃＤＮＡライブラリーは、慣用技術を用いてコーヌス毒液管から調製した。単一クローンからのＤＮＡは、Ｍ１３ユニバーサル・プライミング部位およびＭ１３リバース・ユニバーサル・プライミング部位にほぼ対応するプライマーを用いる慣用技術によって増幅させた。ほぼ３００〜５００ヌクレオチドのサイズを有するクローンを配列決定し、既知のω−コノペプチドに対する配列中の類似性につきスクリーニングした。ＤＮＡ配列およびコードされたプロペプチド配列を表１に記載する。また、成熟毒素をコードするＤＮＡ配列は、表１に記載されたＤＮＡ配列に基づいて調製できる。本発明のω−コノペプチドの整列を表２に記載する。
【００７９】
表１
2004512025.tif 000002
【００８０】
2004512025.tif 000003
【００８１】
2004512025.tif 000004
【００８２】
2004512025.tif 000005
【００８３】
2004512025.tif 000006
【００８４】
2004512025.tif 000007
【００８５】
2004512025.tif 000008
【００８６】
2004512025.tif 000009
【００８７】
2004512025.tif 000010
【００８８】
2004512025.tif 000011
【００８９】
2004512025.tif 000012
【００９０】
2004512025.tif 000013
【００９１】
2004512025.tif 000014
【００９２】
2004512025.tif 000015
【００９３】
2004512025.tif 000016
【００９４】
2004512025.tif 000017
【００９５】
2004512025.tif 000018
【００９６】
2004512025.tif 000019
【００９７】
2004512025.tif 000020
【００９８】
2004512025.tif 000021
【００９９】
2004512025.tif 000022
【０１００】
2004512025.tif 000023
【０１０１】
2004512025.tif 000024
【０１０２】
2004512025.tif 000025
【０１０３】
2004512025.tif 000026
【０１０４】
2004512025.tif 000027
【０１０５】
2004512025.tif 000028
【０１０６】
2004512025.tif 000029
【０１０７】
2004512025.tif 000030
【０１０８】
2004512025.tif 000031
【０１０９】
2004512025.tif 000032
【０１１０】
2004512025.tif 000033
【０１１１】
2004512025.tif 000034
【０１１２】
2004512025.tif 000035
【０１１３】
2004512025.tif 000036
【０１１４】
2004512025.tif 000037
【０１１５】
2004512025.tif 000038
【０１１６】
2004512025.tif 000039
【０１１７】
2004512025.tif 000040
【０１１８】
2004512025.tif 000041
【０１１９】
2004512025.tif 000042
【０１２０】
2004512025.tif 000043
【０１２１】
2004512025.tif 000044
【０１２２】
2004512025.tif 000045
【０１２３】
2004512025.tif 000046
【０１２４】
2004512025.tif 000047
【０１２５】
2004512025.tif 000048
【０１２６】
2004512025.tif 000049
【０１２７】
2004512025.tif 000050
【０１２８】
2004512025.tif 000051
【０１２９】
2004512025.tif 000052
【０１３０】
2004512025.tif 000053
【０１３１】
2004512025.tif 000054
【０１３２】
2004512025.tif 000055
【０１３３】
2004512025.tif 000056
【０１３４】
2004512025.tif 000057
【０１３５】
2004512025.tif 000058
【０１３６】
2004512025.tif 000059
【０１３７】
2004512025.tif 000060
【０１３８】
2004512025.tif 000061
【０１３９】
2004512025.tif 000062
2004512025.tif 000063
【０１４１】
2004512025.tif 000064
【０１４２】
2004512025.tif 000065
【０１４３】
2004512025.tif 000066
【０１４４】
2004512025.tif 000067
【０１４５】
2004512025.tif 000068
【０１４６】
2004512025.tif 000069
【０１４７】
2004512025.tif 000070
【０１４８】
2004512025.tif 000071
【０１４９】
2004512025.tif 000072
【０１５０】
2004512025.tif 000073
【０１５１】
2004512025.tif 000074
【０１５２】
2004512025.tif 000075
【０１５３】
2004512025.tif 000076
【０１５４】
2004512025.tif 000077
【０１５５】
2004512025.tif 000078
【０１５６】
2004512025.tif 000079
【０１５７】
2004512025.tif 000080
【０１５８】
2004512025.tif 000081
【０１５９】
2004512025.tif 000082
【０１６０】
2004512025.tif 000083
【０１６１】
2004512025.tif 000084
【０１６２】
2004512025.tif 000085
【０１６３】
2004512025.tif 000086
【０１６４】
2004512025.tif 000087
【０１６５】
2004512025.tif 000088
【０１６６】
2004512025.tif 000089
【０１６７】
2004512025.tif 000090
【０１６８】
2004512025.tif 000091
【０１６９】
2004512025.tif 000092
【０１７０】
2004512025.tif 000093
【０１７１】
2004512025.tif 000094
【０１７２】
2004512025.tif 000095
【０１７３】
2004512025.tif 000096
【０１７４】
名称：　Ｓｘ６．３
2004512025.tif 000097
【０１７５】
2004512025.tif 000098
【０１７６】
2004512025.tif 000099
【０１７７】
2004512025.tif 000100
【０１７８】
2004512025.tif 000101
【０１７９】
2004512025.tif 000102
【０１８０】
2004512025.tif 000103
【０１８１】
2004512025.tif 000104
【０１８２】
2004512025.tif 000105
【０１８３】
2004512025.tif 000106
【０１８４】
2004512025.tif 000107
【０１８５】
2004512025.tif 000108
【０１８６】
2004512025.tif 000109
【０１８７】
2004512025.tif 000110
【０１８８】
【表１】
2004512025.tif 000111
【表２】
2004512025.tif 000112
【０１８９】
実施例３
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性
フリングス（Ｆｒｉｎｇｓ）聴覚原性痙攣感受性マウス
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ抗痙攣活性をＷｈｉｔｅら（１９９２）によって記載されたフリングスの聴覚原性痙攣感受性マウスにおいて分析する。該ω−コノペプチドは、本アッセイにおいて抗痙攣活性を有することを見出す。
【０１９０】
実施例４
ＣＦ Ｎｏ．１におけるω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ抗痙攣活性を、最大電気ショック、皮下ペンチレンテトラゾール（Ｍｅｔｒａｚｏｌ）痙攣閾値および閾値硬直性伸展テストを用いて、Ｗｈｉｔｅら（１９９２）によって記載されたＣＦ ＮＯ．１マウスにおいて分析する。ω−コノペプチドは、抗痙攣活性を有することを見出す。
【０１９１】
実施例５
ペンチレンテトラゾール誘発閾値痙攣モデルにおける
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性
ω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性をペンチレンテトラゾールの持続静脈内注射を用いて分析する（Ｗｈｉｔｅら、１９９５）。ピーク効果の時点にて、痙攣溶液（１０単位（米国薬局方）／ｍｌヘパリンナトリウムを含有する０．９％セーライン中の０．５％ペンチレンテトラゾール）を０．３４ｍｌ／分の一定速度にて尾静脈に注入する。注入の開始から最初の痙攣および間代性痙攣の始まりまでの秒単位の時間を薬物処置したまたは対照動物につき記録する。各指標に対する時間を各マウスにつきペンチレンテトラゾールのｍｇ／ｋｇに変換し、平均およびその平均の標準誤差を計算する。ω−コノペプチドはｉ．ｖ． ペンチレンテトラゾール痙攣閾値を上昇させることを見出す。
【０１９２】
実施例６
疼痛モデルにおけるω−コノペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性
ω−コノペプチドの抗疼痛活性をいくつかの動物モデルで示す。これらのモデルには、神経損傷モデル（Ｃｈａｐｌａｎら、１９９７）、ラットにおけるｓ．ｃ．ホルマリン注射に対する侵害受容性応答（Ｃｏｄｅｎｅ、１９９３）およびＮＭＤＡ−誘導持続性疼痛モデル（Ｌｉｕら、１９９７）が含まれる。これらの各モデルにおいて、ω−コノペプチドおよびω−コノペプチド誘導体が鎮痛特性を有することを見出す。
【０１９３】
より詳細には、本試験は、侵害受容性および神経障害性の疼痛のマウスモデルにおいて、ω−コノペプチドの髄腔内投与の効果を評価する。侵害受容性疼痛では、ω−コノペプチドの効果は、炎症性の痛みの２つの異なる試験において試験した。第１のものは、相対的に短期的だか、信頼性のある痛み行動を生じるために理想的なホルマリン試験であり、それは容易に定量化される。痛み行動には２つの相が存在し、その第２のものは、後肢のホルマリン誘発炎症から大きく誘因されると推測される。ω−コノペプチドは、ホルマリン注射に先立ち１０分前に投与される。注射によって生じたひるみ回数および／またはなめ期間をモニターする。第１の相は一次影響の直接的な活性化のためであり、かくして、脊髄の長時間の変化にほとんど依存しなく、ω−コノペプチドは第２の相における疼痛行動の大きさに最大の効果を有すると推測される。
【０１９４】
また、後肢に完全フロインドアジュバンドの注射を受けた動物における機械的および熱的な閾値を試験する。これは、後肢の腫脹を含めた局所炎症、および機械的および熱的な閾値における激しい減少を生じ、注射後２４時間以内に検出される。ω−コノペプチドを受けたラットにおける閾値の変化は、ビヒクルの髄腔内注射を受けたラットのものと比較される。
【０１９５】
重要な課題は、疼痛モデルが確立された後に投与される場合に薬物が効果的であるかどうか、または前処置として用いられるだけならばそれらが効果的であるかどうかである。明らかに、臨床的要求は、痛みが発生した後に効果的である薬物についてである。この問題を扱うために、炎症（ＣＦＡ）または神経損傷が確立された後に、動物が試験され、ここに、ω−コノペプチドが反復して投与される。これらの実験において、ω−コノペプチドは、髄腔内（ｉ．ｔ．）経路により毎日注射される。機械的および熱的閾値（各々、自由に運動する動物におけるホン・フレイ・ヘアー（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒ）で、また自由に運動する動物におけるハーグレイブ（Ｈａｒｇｒａｖｅ’ｓ）試験で測定）を、損傷が誘導され、測定された疼痛変化を経時的にモニターした後、２ないし４週間反復する。
【０１９６】
実施例７
疼痛モデルにおけるω−コノペプチドの効果
また、ω−コノペプチドの鎮痛活性を以下の疼痛モデルにて試験する：
【０１９７】
持続性疼痛（ホルマリン試験）。髄腔内（ｉｔ）薬物注射をＨｙｌｄｅｎおよびＷｉｌｃｏｘ（１９８０）によって記載されたごとく行う。ω−コノペプチドまたはビヒクルを５ ｌの容量で投与する。ｉ．ｔ．注射１５分後に、右後肢に２０ ｌの５％ホルマリンを注射する。動物は、観察を促すために鏡が背後にある透明なプレキシガラスの筒に入れる。動物を５分間当り２分間詳しく観察し、動物が注射された肢をなめるのに費やした時間量を合計４５〜５０分間このように記録する。結果を５分当りの秒で表すなめ時間として表す。その実験の終わりにて、全動物を加速回転棒に配置し、最初の落下までの潜伏時間を記録した。ω−コノペプチドは、神経障害性疼痛を治療するための効力を予測する本モデルにおいて活性であると見出される。
【０１９８】
急性疼痛（テイル−フリック法（ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ））。ω−コノペプチドまたはセーラインを５μｌの一定容量にてＨｙｌｄｅｎおよびＷｉｌｃｏｘ（１９８０）の方法により髄腔内（ｉ．ｔ．）投与する。マウスを尾を曝露してタオルで穏やかに包む。ｉ．ｔ．注射後の種々の時点にて、尾を５４Ｃに維持した水浴中に浸け、積極的な尾の引込め時間を記録する。８秒まで引込めなければ、組織損傷を避けるために尾を取り出す。
【０１９９】
神経障害性疼痛。部分的坐骨神経結紮を用いて、神経障害性疼痛におけるＭａｒ１の効力を評価する。神経損傷はＭａｌｍｂｅｒｇおよびＢａｓｂａｕｍ（１９９８）の方法により生成する。動物をケタミン／キシラジン溶液で麻酔し、坐骨神経を曝露し、神経の１／３ないし１／２の周囲の８−０絹縫合糸でしっかりと結紮する。偽手術のマウスにおいては、神経を曝露したが結紮はしない。動物は、試験実施前少なくとも１週間回復させる。試験日に、マウスを金網フレーム上のプレキシガラスの筒に入れ、少なくとも６０分間馴化させる。機械的異痛をＣｈａｐｌａｎら（１９９４）に記載されるアップ−ダウン法を用いて較正されたフォン・フレイ・フィラメント（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ）で評価し、５０％引込め閾値を計算する。その一連のフィラメントのいずれにも応答しない動物を最大値３．６グラムで示し、それは、典型的には、屈曲なくして後肢を持ち上げたフィラメントであり、動物体重のほぼ１／１０に一致する。
【０２００】
得られたデータは、ω−コノペプチドが、痛みの３種の共通して用いたモデル：急性、持続性／炎症および神経障害性疼痛モデルにおいて強力な鎮痛特性を有することを示す。
【０２０１】
実施例８
カルシウム−チャネルアンタゴニスト活性：イオン電流の阻害
カルシウムチャネルを介するイオン電流を単一パッチ−クランプ電極により電圧固定された細胞中で評価する。主として、これらの全細胞パッチ−クランプ試験をＮ１Ｅ１１５マウス神経芽細胞腫細胞に対して行うが、ヒト神経芽細胞腫細胞系ＩＭＲ−３２を含めた種々の細胞タイプも評価される。
【０２０２】
大部分の測定は、他のイオン電流の不存在下でカルシウム電流の評価を可能とするバス・セーライン（ｂａｔｈ ｓａｌｉｎｅ）を用いて得られる。これらの溶液は、８０ｍＭ ＮＭＤＧ（ナトリウム置換体として）、３０ｍＭ ＴＥＡＣ１（カリウム電流の遮断）、１０ｍＭ ＢａＣｌ２（カルシウムチャネルを介する電荷−担体として）、およびｐＨ７．３の１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有した。また、いくらかの溶液が、２ｍＭキニジン（カリウム電流の遮断）および３μＭテトロドトキシン（ナトリウム電流の遮断）を含有した。通常のバス・セーラインは、（ｍＭ）：１４０ ＮａＣｌ、１０ グルコース、３ ＫＣｌ、２ ＣａＣｌ２、１ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３である。細胞内溶液は、（ｍＭ）：ｐＨ７．３〜７．４の１５０ ＣｓＣｌ、０．５ ＣａＣｌ２、５ ＥＧＴＡ、５ ＭｇＣｌ２、２ Ｋ２ＡＴＰである。バス・セーラインおよび全ての内部溶液は使用前に濾過する。
【０２０３】
ピペットをコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）７０５２ガラス（Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ， Ｃａｌｉｆ． ９１７１１）から作成し、Ｓｙｌｇａｒｄ（Ｄｏｗ Ｃｏｍｉｎｇ， Ｍｉｄｌａｎｄ， Ｍｉｃｈ． ４８６４０）でコーティングし、使用前にファイヤーポリッシュ（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈ）した。気泡数は、典型的は、５ないし６であり、ピペット抵抗は典型的には２〜５ＭＯｈｍである。カルシウム電流に対する顕著な効果が観察されないコーニング８１６１、キンブル（Ｋｉｍｂｌｅ）および他のガラスを用いる。
【０２０４】
記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ １−Ｃ 増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ． ９４４０４）で室温にて行い、ｐＣＬＡＭＰ ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析する。データを０．１ＫＨｚの典型的なサンプリング速度で１０００Ｈｚにてフルターをかけ；全ての場合に、データはバイアスを回避するためのサンプリング速度のせいぜい１／５の頻度にてフィルターをかける。データをソフトウェアによってオンラインで集める。分析を画面上で行い、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＬａｓｅｒＪｅｔ Ｐｒｉｎｔｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ． ９４３０６）を介して出力する。
【０２０５】
典型的な実験は、以下のごとく行なう：シール形成に続いて、シリーズ抵抗補正（ｓｅｒｉｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）および容量一過性解除（ｃａｐａｃｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｃａｎｃｅｌｌａｔｉｏｎ）後に、電位固定プロトコールを行い、ここに、細胞電位は、保持用電位（典型的には、−１００ｍＶ）から、１０ｍＶずつ増量して−６０ｍＶないし＋２０ｍＶの範囲とする試験電位まで段階的に進める。細胞は、パルスの間、５秒間保持電位に保持する。他の保持電位から開始するプロトコールは、通常、同一範囲の試験電位をカバーした。ω−コノペプチドは、そのような細胞系にてカルシウムチャネル遮断活性を有することが見出される。
【０２０６】
本発明の方法および組成物は、様々な具体例の形態において組込むことができ、そのいくつかだけを本明細書に開示すると認められるであろう。他の具体例が存在し、それは本発明の精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。かくして、記載された具体例は例示であり、制限として構成されるべきものではない。
【０２０７】
参考文献リスト
Ａｂｉｋｏ， Ｈ．ら （１９８６）． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ３８： ３２８−３３５．
Ａｌｄｒｅｔｅ， Ｊ． Ａ．ら （１９７９）． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ７： ４６６−４７０．
Ｂａｒｎａｙ， Ｇ．ら （２０００）． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．
Ｂｉｔａｎ， Ｇ．ら （１９９７）． Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ． ４９： ４２１−４２６．
Ｂｏｄａｎｓｋｙら （１９６６）． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｄ． ３８： １５９７−９８．
【０２０８】
Ｃａｒｔｉｅｒ， Ｇ． Ｅ．ら （１９９６）． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７１： ７５２２−７５２８．
Ｃｈａｎｄｌｅｒ， Ｐ．ら （１９９３）． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： １７１７３−１７１７８．
Ｃｈａｐｌａｎ Ｓ． Ｒ． （１９９７）． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８０： ８２９−８３８．
Ｃｌａｒｋ， Ｃ．ら （１９８１）． Ｔｏｘｉｃｏｎ １９： ６９１−６９９．
Ｃｏｄｅｒｅ， Ｔ． Ｊ． （１９９３）． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ５： ３９０−３９３．
【０２０９】
Ｃｒｕｚ， Ｌ． Ｊ．ら （１９７６）． Ｖｅｒｌｉｇｅｒ １８： ３０２−３０８．
Ｅｔｔｉｎｇｅｒ， Ｌ． Ｊ．ら （１９７８）． Ｃａｎｃｅｒ ４１： １２７０−１２７３．
Ｈａｍｍｅｒｌａｎｄら （１９９２）． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２２６： ２３９−２４４．
Ｈｅａｄｉｎｇ， Ｃ． （１９９９）． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ＣＰＮＳ Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｒｕｇｓ １： １５３−１６６
【０２１０】
Ｈｏｒｉｋｉ， Ｋ．ら （１９７８）． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １６５−６８．
Ｈｕｂｒｙ， Ｖ．ら （１９９４）． Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２： ２３１−２４１．
Ｈｙｌｄｅｎ， Ｊ． Ｌ． Ｋ．およびＷｉｌｃｏｘ， Ｇ． （１９８０）． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ６７： ３１３−３１６．
Ｋａｉｓｅｒら （１９７０）． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３４： ５９５．
【０２１１】
Ｋａｐｏｏｒ （１９７０）． Ｊ Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ５９： １−２７．
Ｋｏｒｎｒｅｉｃｈ， Ｗ． Ｄ．ら （１９８６）． 米国特許第４，５６９，９６７号．
Ｌｕｅｒ， Ｍ． Ｓ． ＆ Ｈａｔｔｏｎ， Ｊ． （１９９３）． Ａｎｎａｌｓ Ｐｈａｒｍｃｏｔｈｅｒａｐｙ ２７： ９１２−９２１．
Ｌｉｕ， Ｈ．ら （１９９７）． Ｎａｔｕｒｅ ３８６： ７２１−７２４．
Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｊ． Ｓ．ら （１９９５）． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３４： １４５１９−１４５２６．
【０２１２】
ＭｃＩｎｔｏｓｈ， Ｊ． Ｍ．ら （１９９８）． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２９４： ６０５−６２４．
Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， 第１６版， Ｂｅｒｋｏｗ， Ｒ．ら編．，
Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ． Ｊ．， ｐｐ． １４３６−１４４５ （１９９２）．
Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ （Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ） ： Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ
Ｐｅｐｔｉｄｅｎ， Ｅ． Ｗｕｎｓｃｈ （編）， Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ， Ｇｅｒ．
（１９７４）．
【０２１３】
Ｎｅｈｌｉｇ， Ａ．ら （１９９０）． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｒａｔ
ｂｒａｉｎ． Ｉｎ Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｓｅｉｚｕｒｅｓ， Ｗａｓｔｅｒｌａｉｎ， Ｃ． Ｇ．およびＶｅｒｔｔ， Ｐ． （編），
Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２８５−１９４．
Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ， Ｙ．ら （１９９３）． Ｉｎｔ． Ｊ Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４２： ５３３−５３８．
Ｏｌｉｖｅｒａ， Ｂ． Ｍ．ら （１９８４）． 米国特許第４，４４７，３５６号．
Ｏｌｉｖｅｒａ， Ｂ． Ｍ．ら （１９８５）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： １３３８−１３４３．
【０２１４】
Ｏｌｉｖｅｒａ， Ｂ． Ｍ．ら （１９９０）． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ２５７−２６３．
Ｏｌｉｖｅｒａ， Ｂ． Ｍ．ら （１９９６）． 米国特許第５，５１４，７７４号．
Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，ら （１９９３）． Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３： ４３−４８．
Ｒａｌｌ Ｔ． Ｗ．およびＳｃｈｌｅｉｆｅｒ， Ｌ． Ｓ． ｉｎ Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， 第７版， Ｇｉｌｍａｎ，
Ａ． Ｇ．ら編．， Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ４４６−４７２ （１９８５）．
【０２１５】
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版 （１９９０， Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ）．
Ｒｉｖｉｅｒ， Ｊ． Ｒ．ら （１９７８）． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １７： １９２７−３８．
Ｒｉｖｉｅｒ， Ｊ． Ｒ．ら （１９８７）． Ｂｉｏｃｈｅｍ ： ２６： ８５０８−８５１２．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら （１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．
【０２１６】
Ｓｈｏｎ， Ｋ．−Ｊ．ら （１９９４）． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ ： １１４２０−１１４２５．
ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，
Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ （１９６９）．
Ｖａｌｅら （１９７８）． 米国特許第４，１０５，６０３号．
Ｔｒｏｕｐｉｎ， Ａ． Ｓ．ら （１９８６）． ＭＫ−８０１． Ｉｎ Ｎｅｗ Ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ Ｄｒｕｇｓ，
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ４， Ｍｅｌｄｒｕｍ， Ｂ． Ｓ． ａｎｄ Ｐｏｒｔｅｒ，
Ｒ． Ｊ． （編）， Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｙ， Ｌｏｎｄｏｎ， ｐｐ． １９１−２０２．
【０２１７】
Ｖａｎ ｄｅ Ｓｔｅｅｎ， Ｐ．ら （１９９８）． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ． ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３：１５１−２０８．
Ｗｈｉｔｅ， Ｈ． Ｓ．，ら （１９９２）． Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ． １２： ２１７−２２６．
Ｗｈｉｔｅ， Ｈ． Ｓ．，ら （１９９５）． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ
Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃ Ｄｒｕｇｓ． Ｉｎ Ａｎｔｉｅｐｉｌｅｐｔｉｃ Ｄｒｕｇｓ，
第４版， Ｌｅｖｙ， Ｒ． Ｈ．編．， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ． Ｙ．， ｐｐ． ９９−１１０．
【０２１８】
Ｗｏｎｇ， Ｅ． Ｈ． Ｐ．ら （１９８６）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ７１０４−７１０８．
Ｚｈｏｕ Ｌ． Ｍ．，ら （１９９６）． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６６： ６２０−６２８．
Ｚｉｍｍ， Ｓ．ら （１９８４）． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４４： １６９８−１７０１．
【０２１９】
米国特許第３，８４２，０６７号．
米国特許第３，８６２，９２５号．
米国特許第３，９７２，８５９号．
米国特許第５，５１４，７７４号．
【０２２０】
米国特許第５，５５０，０５０号．
米国特許第５，５９１， ８２１号．
米国特許第５，７１９，２６４号．
米国特許第５，８４４，０７７号 （１９９８）．
【０２２１】
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９２／１９１９５．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９４／２５５０３．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９５／０１２０３．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９５／０５４５２．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９６／０２２８６．
【０２２２】
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９６／０２６４６．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９６／４０８７１．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９６／４０９５９．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９７／１２６３５．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ９８／０３１８９．
ＰＣＴ公開出願ＷＯ ００／２３０９２．
【国際公開パンフレット】
2004512025.tif 000113
2004512025.tif 000114
2004512025.tif 000115
2004512025.tif 000116
2004512025.tif 000117
2004512025.tif 000118
2004512025.tif 000119
2004512025.tif 000120
2004512025.tif 000121
2004512025.tif 000122
2004512025.tif 000123
2004512025.tif 000124
2004512025.tif 000125
2004512025.tif 000126
2004512025.tif 000127
2004512025.tif 000128
2004512025.tif 000129
2004512025.tif 000130
2004512025.tif 000131
2004512025.tif 000132
2004512025.tif 000133
2004512025.tif 000134
2004512025.tif 000135
2004512025.tif 000136
2004512025.tif 000137
2004512025.tif 000138
2004512025.tif 000139
2004512025.tif 000140
2004512025.tif 000141
2004512025.tif 000142
2004512025.tif 000143
2004512025.tif 000144
2004512025.tif 000145
2004512025.tif 000146
2004512025.tif 000147
2004512025.tif 000148
2004512025.tif 000149
2004512025.tif 000150
2004512025.tif 000151
2004512025.tif 000152
2004512025.tif 000153
2004512025.tif 000154
2004512025.tif 000155
2004512025.tif 000156
2004512025.tif 000157
2004512025.tif 000158
2004512025.tif 000159
2004512025.tif 000160
2004512025.tif 000161
2004512025.tif 000162
2004512025.tif 000163
2004512025.tif 000164
2004512025.tif 000165
2004512025.tif 000166
2004512025.tif 000167
2004512025.tif 000168
2004512025.tif 000169
2004512025.tif 000170
2004512025.tif 000171
2004512025.tif 000172
2004512025.tif 000173
2004512025.tif 000174
2004512025.tif 000175
2004512025.tif 000176
2004512025.tif 000177
2004512025.tif 000178
2004512025.tif 000179
2004512025.tif 000180
2004512025.tif 000181
2004512025.tif 000182
2004512025.tif 000183
2004512025.tif 000184
2004512025.tif 000185
2004512025.tif 000186
2004512025.tif 000187
2004512025.tif 000188
2004512025.tif 000189
2004512025.tif 000190
2004512025.tif 000191
2004512025.tif 000192
2004512025.tif 000193
2004512025.tif 000194
2004512025.tif 000195
2004512025.tif 000196
2004512025.tif 000197
2004512025.tif 000198
2004512025.tif 000199
2004512025.tif 000200
2004512025.tif 000201
2004512025.tif 000202
2004512025.tif 000203
2004512025.tif 000204
2004512025.tif 000205
2004512025.tif 000206
2004512025.tif 000207
2004512025.tif 000208
2004512025.tif 000209
2004512025.tif 000210
2004512025.tif 000211
2004512025.tif 000212
2004512025.tif 000213
2004512025.tif 000214
2004512025.tif 000215
2004512025.tif 000216
2004512025.tif 000217
2004512025.tif 000218
2004512025.tif 000219
2004512025.tif 000220
2004512025.tif 000221
2004512025.tif 000222
2004512025.tif 000223
2004512025.tif 000224
2004512025.tif 000225
2004512025.tif 000226
2004512025.tif 000227
2004512025.tif 000228
2004512025.tif 000229
2004512025.tif 000230
2004512025.tif 000231
2004512025.tif 000232
2004512025.tif 000233
2004512025.tif 000234
2004512025.tif 000235
2004512025.tif 000236
2004512025.tif 000237
2004512025.tif 000238
2004512025.tif 000239
2004512025.tif 000240
2004512025.tif 000241
2004512025.tif 000242
2004512025.tif 000243
2004512025.tif 000244
2004512025.tif 000245
2004512025.tif 000246
2004512025.tif 000247
2004512025.tif 000248
2004512025.tif 000249
2004512025.tif 000250
2004512025.tif 000251
2004512025.tif 000252
2004512025.tif 000253
2004512025.tif 000254
2004512025.tif 000255
2004512025.tif 000256
2004512025.tif 000257
2004512025.tif 000258
2004512025.tif 000259
2004512025.tif 000260
2004512025.tif 000261
2004512025.tif 000262
2004512025.tif 000263
2004512025.tif 000264
2004512025.tif 000265
2004512025.tif 000266
2004512025.tif 000267
2004512025.tif 000268
2004512025.tif 000269
2004512025.tif 000270
2004512025.tif 000271
2004512025.tif 000272
2004512025.tif 000273
2004512025.tif 000274
2004512025.tif 000275
2004512025.tif 000276
2004512025.tif 000277
2004512025.tif 000278
2004512025.tif 000279
2004512025.tif 000280
2004512025.tif 000281
2004512025.tif 000282
2004512025.tif 000283
2004512025.tif 000284
2004512025.tif 000285
2004512025.tif 000286
2004512025.tif 000287
2004512025.tif 000288
2004512025.tif 000289
2004512025.tif 000290
2004512025.tif 000291
2004512025.tif 000292
2004512025.tif 000293
2004512025.tif 000294
2004512025.tif 000295
2004512025.tif 000296
2004512025.tif 000297
2004512025.tif 000298
2004512025.tif 000299
2004512025.tif 000300
2004512025.tif 000301
2004512025.tif 000302
2004512025.tif 000303
2004512025.tif 000304
2004512025.tif 000305
2004512025.tif 000306
2004512025.tif 000307
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512025.tif 000308
【国際調査報告】
2004512025.tif 000309
2004512025.tif 000310