(57)【要約】例えば抗体、抗原、受容体及びリガンド等の特異的結合パートナーの利用による試料の定性的及び定量的決定のためのイムノアッセイキットであって、担体又はマイクロタイタープレートであって複数のウェルを有し１次結合パートナーでプレコートされたものを含み、結合パートナーが凍結乾燥物として固定化された形で存在するキット。マイクロタイタープレートのウェルの一部は、増加的な希釈度の、凍結乾燥形の、決定されるべき試料の参照標準シリーズを追加的に含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体、抗原、受容体及びリガンド等の特異的結合パートナーの利用による試料の定性及び定量的決定のためのイムノアッセイキットであって、担体又はマイクロタイタープレートであって複数のウェルを有し1次結合パートナーでプレコートされたものを含み、前記結合パートナーは固定化された形で凍結乾燥物として存在するキットにおいて、マイクロタイタープレートのウェルの一部が、決定されるべき試料の参照標準シリーズを、増加する希釈度で、凍結乾燥形で、追加的に含むことを特徴とするキット。
【請求項２】
マイクロタイタープレートのウェルが、酵素-又はビオチン-カップリングされた2次結合パートナーのコンジュゲート特に2次結合抗体と、ビオチン-カップリングされたコンジュゲートの場合酵素とを、凍結乾燥形で追加的に含むことを特徴とする請求項１記載のイムノアッセイキット。
【請求項３】
マイクロタイタープレートのウェルが、試料希釈溶媒を凍結乾燥形で含むことを特徴とする請求項１又は２記載のイムノアッセイキット。
【請求項４】
テストキットが、プレコートされたマイクロタイタープレートに加え、洗浄緩衝液、基質溶液及び停止溶液のみを含むことを特徴とする請求項１、２又は３記載のイムノアッセイキット。
【請求項５】
ビオチン-カップリングされた抗体コンジュゲートの場合、ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)が2次試薬として用いられることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のイムノアッセイキット。
【請求項６】
テストキットが、ペルオキシダーゼ安定剤及び/又は一般的な凍結乾燥保護剤例えばタンパク質(例えばアルブミン(例えばBSA)タンパク加水分解物(ペプトン、ゼラチン...)カゼイン)及び/又はポリマー(例えばデキストラン、PVA、PVP)、糖(たとえばスクロース、トレハロース、ラクトース、キシリット(xylite)、ソルビトール、マンニトール、マルトース、グルコース、イノシトール)及び/又は静菌剤(例えばチメロサール、プロクリン)及び/又はフェノール物質及びアニリン、または置換基を有するもの(低分子アルキル残基又はCl、Br...)(例えばo-メトキシフェノール、o-メチルフェノール、p-メチルフェノール、o-アミノフェノール、o-ヒドロキシ安息香酸、(o、m又はp)-ヒドロキシベンジルアルコール、アニリン、p-アミノ安息香酸、p-メトキシ-アニリン、ベンジルアルコール、安息香酸、p-ニトロフェノール、ベンジルアミン、1-フェニル-1,2-エタンジオール、トランス-1,2-シクロヘキサンジオール、シス-1,2-シクロヘキサンジカルボン酸、シクロヘキシルアミン)及び/又は疎水性の化合物及び/又は溶媒(例えばDMF、エチレングリコール、DMSO)及び/又は界面活性剤(例えばTween-20)及び/又はアリールホウ酸化合物(例えばフェニルホウ酸、4-ブロモフェニルホウ酸、3-アセトアミノフェニルホウ酸、1-ナフチルホウ酸)及び/又は基質類似物(例えばTMB、ルミノール)及び/又はポリヒドロキシ化合物(例えばポリオール、ポリ(エチレングリコール)、グリセロール)及び/又はエクトイン(例えば(S)-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボン酸[THP(B)]、(S,S)-β-2-メチル-5-ヒドロキシ-1,2,4,5,6-テトラ-ヒドロピリミジン-4-カルボン酸、[THP(A)])及び/又はイオン及び/又は多価イオン(例えば金属イオン(Al、Zn、Mg、Fe、Cu...))及び/又は錯体試薬(例えばEDTA)及び/又はアミノ酸(例えばグリシン、プロリン、4-ヒドロキシプロリン、セリン、グルタメート、アラニン、リシン、サルコシン、γ-アミノ酪酸、フェニルアラニン)及び/又はTRIS、塩、アミン、Na-コール酸塩、スクロース モノラウレート及び/又は2-O-β-マンノシル グリセレートのような物質を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項記載のイムノアッセイキット。
【請求項７】
研究的診断及びin vitro診断における適用のための、菌血清学、例えばHIV、HepV、EBV、CMV等の感染の検出への適用のための、腫瘍の診断、例えば腫瘍マーカー又は腫瘍関連タンパク質、血管新生マーカー、転移マーカー等の検出への適用のための、例えば動物アレルゲン、植物花粉、食品成分などのアレルギー学における適用のための、例えばANA/ENA、真性糖尿病/IDDM、甲状腺抗原、自己免疫肝炎、APS等の分野における自己抗原の検出等の自己免疫診断における適用のための、例えばサイトカイン、接着分子、ケモカイン等の検出等の、炎症性の工程又は感染により起される免疫疾患の検出のための、例えば排卵テスト、妊娠テスト等のホルモンバランスの変化の検出のための、例えば治療的抗体及び抗原、有機及び無機化合物の検出等の治療モニタリングにおける適用のための、アポトーシス又はネクローシスによる細胞死の検出のための、及び/又は遺伝的な変化、遺伝的疾患の検出のための、請求項１〜６のいずれか１項記載のイムノアッセイキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば抗体、抗原、受容体及びリガンド等の特異的結合パートナーの利用による、試料の定性的および定量的な決定のためのイムノアッセイキットであって、担体またはマイクロタイタープレートであって複数のウェルを有し一次結合パートナーでプレコートされたものを含み、前記結合パートナーが凍結乾燥物として固定化された形態で存在するものに関する。
【０００２】
イムノアッセイ、酵素カップリングされたイムノアッセイ、蛍光ラベルイムノアッセイ、発光ラベルイムノアッセイまたは他のいずれかのマーカーでラベルされたイムノアッセイは、例えば抗原、リガンド、受容体、抗体等のタンパク質ならびに化学物質を検出及び定量するための、ルーチン的な診断及び研究的な診断に用いられる。従来技術によれば、そのようなテストキットにおける結合パートナーのひとつはポリスチレンプレート等の固体担体に結合し、一方テストを実行するのに必要な他の試薬は、テストキットの別のコンポネントとして添加される。これらの試薬は通常、濃縮液又は凍結乾燥物として定量された形の検出対象タンパク質(参照標準)、標準溶媒(medium)及びサンプル希釈溶媒、カップリングされた形の第2の特異的結合パートナー(コンジュゲート)であって濃縮又は作業溶液であるもの、必要であれば2次検出システム、並びに酵素ラベルの場合は検出に必要となる基質試薬を含む。酵素反応を止めるため停止溶液が添加され、通常濃縮物として存在するアッセイ緩衝液が、第2の特異的結合パートナー及び2次試薬のための作業溶液を調製するのに利用可能である。作業工程間に洗浄工程が必要なため、慣用のイムノアッセイキットは洗浄緩衝液を、通常濃縮液の形で含む。
【０００３】
商業的に利用可能なELISAキットは、有効なテストシステムをユーザーに提供する。その製品は、アッセイをするのに必要な全ての試薬を、最適化された濃度及び量で含み、且つアッセイをどのように実行するかについての詳細なプロトコルをも含む。個々の反応工程は、概して連続的に実行される。分析物(標準、試料)及び固相を伴なう2次抗体(カクテル)を用いたジョイントインキュベーションは、多くのアッセイシステムにおいて有用である。
【０００４】
イムノアッセイの典型的な例はサンドイッチELISA(酵素結合イムノソルベントアッセイ)である。
【０００５】
典型的には、そのようなELISAキットは下記のコンポネントを含む：
・96ウェルを有し、1次抗体でプレコートされ、ブロックされ固定化されたマイクロタイタープレート；
・参照材料：規定された濃度の、標準のシリーズを確立するための分析物(標準)；
・酵素−(西洋わさびペルオキシダーゼ)又はビオチン−カップリングされた2次抗体；
・必要であればストレプトアビジン酵素(西洋わさびペルオキシダーゼ)；
・基質溶液(テトラメチレン  ベンジジン)
・洗浄緩衝液：試料のインキュベーションに先立ち、及び反応工程間に、プレートを洗浄するための生理食塩水溶液；
・アッセイ緩衝液：2次抗体及びストレプトアビジン酵素濃縮液を希釈(作業溶液を調製)するための生理食塩水溶液；
・試料希釈溶媒：参照材料及び未知の試料を希釈するための特定の液体溶媒；
・酵素反応を止めるための停止溶液
【０００６】
アッセイを行なうためには、以下の作業工程をユーザーが実行しなければならない：
・作業溶液の調製
・参照材料の希釈による、標準のシリーズの確立
・マイクロタイタープレートの洗浄；
・試料希釈溶媒の提供；
・個々の参照希釈液の適用(標準のシリーズ)；
・未知の試料の適用；
・酵素-又はビオチン-カップリングされた2次抗体の添加；
・マイクロタイタープレートの洗浄；
・任意にストレプトアビジン酵素の添加；
・マイクロタイタープレートの洗浄；
・基質の添加；
・停止溶液の添加；
・光学密度の測定。
【０００７】
本発明は、そのようなアッセイキットの操作を簡便にし、定性的識別に加えての定量的評価をの実現を可能とすることを目的とする。アッセイの実施にかかる作業及び時間を減少させることに加え、本発明はさらに、必要な操作工程を最小化することにより、ユーザーの誤りの可能性を減少させることを目的とする。さらに、本発明は、キットの重量及び体積を明らかに減少させることによりパッケージングの体積及びパッケージングのコスト、並びに輸送料金を低減し、標準化された基礎キットを延長された製品保存寿命で提供することによりロジスティックを簡便にすることを目的とする。
【０００８】
この目的を解決するため、本発明のイムノアッセイキットは本質的に、マイクロタイタープレートのウェルの一部が、決定されるべき試料の参照標準のシリーズを、凍結乾燥された形において増加的な希釈度をもって追加的に含むことからなる。担体又はマイクロタイタープレートは追加的に、決定されるべき試料の参照標準のシリーズを既に含むという事実により、実験室での分析における参照材料の作業溶液及び対応する希釈シリーズの調製の煩雑な工程が除かれる、純粋に定性的な分析に加えて、増加的に連続的な標準の間の領域内の規定されたテスト結果の間の内挿による定量的な見積と定量的な決定もまた、簡便になった。参照材料の作業溶液の調製及び標準希釈溶媒のマイクロタイターウェルへの導入を必要としない、標準のシリーズのために提供されたそのようなイムノアッセイキットの設計は、実質的に方法を合理化及び単純化することを可能とする。特に精密な再現性のある標準のシリーズを提供し、そのため誤りの可能性を実質的に低減する。
【０００９】
特に有利な態様においては、イムノアッセイキットの予製はさらに加速され、試料の決定に必要な工程がさらに低減される。この目的のために、形態(configuration)は、有利に、マイクロタイタープレートのウェルが追加的に2次結合パートナーの酵素-又はビオチン-カップリングしたコンジュゲート、特に2次結合抗体を含むように形作られ、前記ビオチン-カップリングしたコンジュゲートの場合、凍結乾燥された形の酵素を含む。従って、検出されるべきタンパク質を定量するための、規定されたタンパク濃度で用いられる標準のシリーズに加え、上記ラベルの一つ以上とカップリングされた2次的な特異的結合パートナー(力価測定された濃度のコンジュゲート並びに任意に2次試薬)が、検出のために、既に凍結乾燥した固相の形で、相に強固に結合した1次結合パートナーと共に導入される。これらのコンポネントの凍結乾燥形即ち約-30℃の低温での脱水形での提供は、参照材料の前反応をおそれる必要がない程度に反応動態を凍結させる。高度に希釈された作業溶液並びに安定性に乏しい溶液がストックの状態では保持されず、テストが始まる直前になって始めて、担体上で溶媒の添加又は再加水によって調製されるため、誤りのもととなりうるものがさらに除かれる。
【００１０】
さらなる増強、及び決定に必要な作業工程数のさらなる減少のため、形態は、マイクロタイタープレートのウェルが、凍結乾燥形の試料希釈溶媒を含むように形作られる。特定の試料希釈溶媒をマイクロタイタープレートの対応するウェルに、例えば2℃において、必要量導入することができ、一方2次抗体-酵素コンジュゲート、又は2次抗体及びビオチンコンジュゲートの混合物を、同じ温度においてマイクロタイタープレートの全てのウェルにに導入することができる。そこでそのように充填されたマイクロタイタープレートは、例えば-30℃に予め冷却された凍結乾燥装置における凍結乾燥工程により、凍結乾燥に供される。
【００１１】
しかし、テストキットを完成させるために、そのような予製された担体又は予製されたマイクロタイタープレートは、少量の追加コンポネントを必要とし、テストキットは有利には、プレコートされたマイクロタイタープレートに加えて、洗浄緩衝液、基質溶液、及び停止溶液だけを含む。
【００１２】
したがって、試料の決定のためには、それは、規定された体積の蒸留水を標準シリーズ及び任意のブランクのウェル並びに試料のウェルに添加することによりマイクロタイタープレートを再水和するために単に必要となり、そこで未知の試料が充填されインキュベートされる。マイクロタイタープレートを洗浄し、アッセイに用いられる全てのマイクロタイターウェルに基質を適用した後、停止溶液を所定期間後に添加し、テストの評価を直ちに始める。
【００１３】
このような点から形態は有利には、ビオチン-カップリング2次抗体コンジュゲートの場合、ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)を2次試薬として用いるように形作られる。
【００１４】
主として、本発明による形態は、ユーザーにとってのアッセイの実施が、未知の試料の添加及び酵素反応にまで減らされたものであり、全ての他の工程は予めELISAキットの製造者により実行されている。従ってマイクロタイタープレートは製造者により、特異的な1次抗体で被覆され、ブロックされ固定化されており、そこでプレートは、例えば-20℃に冷却され、上記の試料希釈試薬の標準シリーズ、並びに2次抗体-酵素コンジュゲート又は2次抗体-ビオチンコンジュゲート及びストレプトアビジン酵素混合物を導入する追加の工程が、製造者により、規定された様式で実行される。従ってアッセイの実施は、分析されるべき試料の添加及び基質の着色に基づいたアッセイの評価にまで減少される。
【００１５】
特に有利な態様においては、本発明のイムノアッセイキットは、テストキットが、ペルオキシダーゼ安定剤及び/又は一般的な凍結乾燥保護剤(lyoprotectants)例えばタンパク質(例えばアルブミン(例えばBSA)タンパク加水分解物(ペプトン、ゼラチン...)カゼイン)、ポリマー(例えばデキストラン、PVA、PVP)、糖(たとえばスクロース、トレハロース、ラクトース、キシリット(xylite)、ソルビトール、マンニトール、マルトース、グルコース、イノシトール)、静菌剤(例えばチメロサール、プロクリン)、フェノール物質及びアニリン、または置換基を有するもの(低分子アルキル残基又はCl、Br...)(例えばo-メトキシフェノール、o-メチルフェノール、p-メチルフェノール、o-アミノフェノール、o-ヒドロキシ安息香酸、(o、m又はp)-ヒドロキシベンジルアルコール、アニリン、p-アミノ安息香酸、p-メトキシ-アニリン、ベンジルアルコール、安息香酸、p-ニトロフェノール、ベンジルアミン、1-フェニル-1,2-エタンジオール、トランス-1,2-シクロヘキサンジオール、シス-1,2-シクロヘキサンジカルボン酸、シクロヘキシルアミン)；疎水性の化合物及び溶媒(例えばDMF、エチレングリコール、DMSO)；界面活性剤(例えばTween-20)；アリールホウ酸化合物(例えばフェニルホウ酸、4-ブロモフェニルホウ酸、3-アセトアミノフェニルホウ酸、1-ナフチルホウ酸)；基質類似物(例えばTMB、ルミノール)；ポリヒドロキシ化合物(例えばポリオール、ポリ(エチレングリコール)、グリセロール)；エクトイン(例えば(S)-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロピリミジン-4-カルボン酸[THP(B)]、(S,S)-β-2-メチル-5-ヒドロキシ-1,2,4,5,6-テトラ-ヒドロピリミジン-4-カルボン酸、[THP(A)])；イオン及び/又は多価イオン(例えば金属イオン(Al、Zn、Mg、Fe、Cu...))；錯体試薬(例えばEDTA)；アミノ酸(例えばグリシン、プロリン、4-ヒドロキシプロリン、セリン、グルタメート、アラニン、リシン、サルコシン、γ-アミノ酪酸、フェニルアラニン)及び/又はTRIS、塩、アミン、Na-コール酸塩、スクロース モノラウレート、2-O-β-マンノシル グリセレートのような物質を含むように設計される。
【００１６】
特に単純な手順モードを考慮すると、本発明のイムノアッセイキットは複数の適用オプションに適している。特に有利な態様においては、この形式のイムノアッセイキットの使用は、研究的診断及びin vitro診断への適用のためのもの、菌血清学、例えばHIV、HepV、EBV、CMV等の感染の検出への適用のためのもの、腫瘍の診断、例えば腫瘍マーカー又は腫瘍関連タンパク質、血管新生マーカー、転移マーカー等の検出への適用のためのもの、例えば動物アレルゲン、植物花粉、食品成分などのアレルギー学における適用のためのもの、例えばANA/ENA、真性糖尿病/IDDM、甲状腺抗原、自己免疫肝炎、APS等の分野における自己抗原の検出等の自己免疫診断における適用のためのもの、例えばサイトカイン、接着分子、ケモカイン等の検出等の、炎症性の工程又は感染により起される免疫疾患の検出のためのもの、例えば排卵テスト、妊娠テスト等のホルモンバランスの変化の検出のためのもの、例えば治療的抗体及び抗原、有機及び無機化合物の検出等の治療モニタリングにおける適用のためのもの、アポトーシス又はネクローシスによる細胞死の検出のためのもの、及び/又は遺伝的な変化、遺伝的疾患の検出のためのものである。
【００１７】
以下において、従来技術との対比において、本発明をより詳細に説明し、従来技術は、標準キットと称する。
【００１８】
1.ELISAキットのコンポネント：
a)直接的に酵素-カップリングしたコンジュゲート
【００１９】
【表１】
2004527758.tif 000002
【００２０】
b)ビオチンにカップリングした2次抗体、2次試薬ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)又は類似物。
【００２１】
【表２】
2004527758.tif 000003
【００２２】
2.アッセイの実施のための操作工程：
a)直接酵素-カップリングしたコンジュゲート
【００２３】
【表３】
2004527758.tif 000004
【００２４】
b)ビオチンにカップリングされた2次抗体、2次試薬ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ又は類似物
【００２５】
【表４】
2004527758.tif 000005
【００２６】
本発明は、抗体カップルの利用により、抗原の検出に適用しうる(サンドイッチELISA)。同様に、対応する抗原による抗体の検出は容易である。対応する結合パートナーによる受容体又はリガンドの検出は本発明の適用の他の選択肢であり、したがって非常に多くのテストフォーマットが利用可能である。アッセイは特に、タンパク質、ステロイド、化学的化合物、薬物、核酸及び同様の物質の検出に用いることができる。
【００２７】
反応複合体の検出は、直接カップリングされた酵素(例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等)の利用により、2次工程において生じる酵素反応(ビオチン-ストレプトアビジン-HRP、酵素カップリングされた抗体に対する検出抗体等)を介して行ないうる。イムノアッセイにおける使用に適切ないずれの他のラベル、例えば蛍光色素、化学発光ラベル、放射活性ラベル等も、同様に用いることができる。
【００２８】
1次結合パートナーを不動化するのに用いられる担体は、好ましくはポリスチレン96-ウェルマイクロタイタープレートであるが、イムノアッセイにおける使用に適切な、他のいずれの担体をも同様に、本発明の実行に採用することができる。
【００２９】
測定に用いられる全ての試料は、分析物を含有する液体の試料から構成されることができ、より具体的には、血清、血漿調製物、局所体液、全血等の体液、並びに細胞培養上清、緩衝された分析物溶液等とすることができる。
【実施例】
【００３０】
以下において、本発明を、具体的な適用例を用いてより具体的に説明する。
【００３１】
適用例１
ヒトICAM-1の検出のためのサンドイッチELISA
A)試料希釈溶媒、標準シリーズ、HRPコンジュゲートと関連したプレートの製造
工程１：
被覆：
96-ウェルマイクロタイタープレートを、従来技術に従って、PMS緩衝液中2.5μg/ml抗-ICAM-1で被覆する(ウェルあたり100μl、インキュベーション一晩4℃)。
【００３２】
工程２：
ブロッキング：
被覆溶液を吸い出し、プレートを洗浄緩衝液(PBS/Tween)で２回洗浄する。ポリスチレン表面を飽和させるため(非特異的結合の防止)、プレートをウェルあたり300μl PBS/2%BSAでブロックする(2時間、室温)。
【００３３】
工程３：
固定化：
ブロック溶液を吸い出し、プレートを2回洗浄し、ウェルあたり150μl PBS/15%スクロースを添加する。1時間室温でインキュベートした後、固定化溶液をデカントする。循環ドライヤー中28℃で約20時間プレートを乾燥させる。プレートを-20℃で凍結する。
【００３４】
工程４：
試料希釈溶媒の導入：
被覆したプレートを凍結状態で使用する。試料希釈溶媒を2℃に冷却する。標準シリーズを確立するため、100μlの試料希釈溶媒を、マイクロタイタープレートの最初の2つの列の各ウェルに導入する。100μlの試料希釈溶媒をブランク決定のための対応するウェルに添加する。90μlの試料希釈溶媒を、未知の試料を決定するためのそれぞれの対応するウェルに添加する。
【００３５】
工程５：
標準シリーズの確立：
参照材料(組換えヒトICAM-1)の作業溶液(20ng/ml) (2℃)を、二重決定において、マイクロタイタープレートの左側の最上の2つのウェル内に導入する(100μl/ウェル)。標準シリーズ(10ng/ml; 5ng/ml; 2.5ng/ml; 1.25ng/ml; 0.63ng/ml)を、プレート中での連続1:2希釈により調製する。
【００３６】
工程６：
HRPコンジュゲートの導入：
HRPコンジュゲート(抗-ICAM-1-HRP)の作業溶液を、2℃に冷却し、マイクロタイタープレートの全てのウェルに迅速に導入する(50μl/ウェル)。
【００３７】
工程７：
凍結乾燥：
全てのコンポネントの充填の直後に、マイクロタイタープレートをホイルでカバーし、予め-30℃に冷却した凍結乾燥装置内に導入する。凍結乾燥を、-30℃で約20時間行なう。凍結乾燥装置から出した直後に、乾燥したプレートを、アルミニウムの袋に、乾燥剤と共に溶封する。
【００３８】
B)アッセイの実施：
プレートをアルミニウムの袋から取り出す。
標準シリーズ並びにブランクを、ウェルあたり150μlの蒸留水の添加により再水化し、試料ウェルを140μlのH2Oの添加により再水化する。10μlの未知の試料をそれぞれ試料ウェルに入れる。プレートをホイルでカバーし、室温で1時間インキュベートする。プレートを3回洗浄し、100μlの基質溶液をプレートの各ウェルに添加する。15分後に、酵素反応を、停止溶液(100μl)の添加により停止し、各ウェルの色の密度を光学測定的に評価する。
【００３９】
適用例２
ヒトインターロイキン10(IL-10)検出のためのサンドイッチELISA
A)試料希釈溶媒、標準シリーズ、ビオチンコンジュゲート、ストレプトアビジン-HRPと関連したプレートの製造
工程１：
被覆：
96-ウェルマイクロタイタープレートを、従来技術に従って、PBS緩衝液中5μg/ml抗-IL-10で被覆する(ウェルあたり100μl、インキュベーション一晩4℃)。
【００４０】
工程２：
ブロッキング：
被覆溶液を吸い出し、プレートを洗浄緩衝液(PBS/Tween)で1回洗浄する。ポリスチレン表面を飽和させるため(非特異的結合の防止)、プレートをウェルあたり300μl PBS/2%BSAでブロックする(2時間、室温)。
【００４１】
工程３：
固定化：
ブロック溶液を吸い出し、プレートを2回洗浄し、ウェルあたり150μl PBS/15%スクロースを添加する。1時間室温でインキュベートした後、固定化溶液をデカントする。循環ドライヤー中28℃で約20時間プレートを乾燥させる。プレートを-20℃で凍結する。
【００４２】
工程４：
試料希釈溶媒の導入：
被覆したプレートを凍結状態で使用する。試料希釈溶媒を2℃に冷却する。標準シリーズを確立するため、100μlの試料希釈溶媒を、マイクロタイタープレートの最初の2つの列の各ウェルに導入する。100μlの試料希釈溶媒をブランク決定のための対応するウェルに添加する。50μlの試料希釈溶媒を、未知の試料を決定するためのそれぞれの対応するウェルに添加する。
【００４３】
工程５：
標準シリーズの確立：
参照材料(組換えヒトIL-10)の作業溶液(400pg/ml) (2℃)を、二重決定において、マイクロタイタープレートの左側の最上の2つのウェル内に導入する(100μl/ウェル)。標準シリーズを、プレート中での連続1:2希釈により(200-3.1pg/ml)調製する。
【００４４】
工程６：
ビオチンコンジュゲート及びストレプトアビジン-HRPの導入：
ビオチンコンジュゲート(抗-IL-10-BT)及びストレプトアビジン-HRPの混合物の作業溶液を、2℃に冷却し、マイクロタイタープレートの全てのウェルに迅速に導入する(50μl/ウェル)。
【００４５】
工程７：
凍結乾燥：
全てのコンポネントの充填の直後に、マイクロタイタープレートをホイルでカバーし、予め-30℃に冷却した凍結乾燥装置内に導入する。凍結乾燥を、-30℃で約20時間行なう。凍結乾燥装置から出した直後に、乾燥したプレートを、アルミニウムの袋に、乾燥剤と共に溶封する。
【００４６】
B)アッセイの実施：
プレートをアルミニウムの袋から取り出す。
標準シリーズ並びにブランクを、ウェルあたり150μlの蒸留水の添加により再水化し、試料ウェルを100μlのH2Oの添加により再水化する。50μlの未知の試料をそれぞれ試料ウェルに入れる。プレートをホイルでカバーし、室温で3時間インキュベートする。プレートを3回洗浄し、100μlの基質溶液をプレートの各ウェルに添加する。15分後に、酵素反応を、停止溶液(100μl)の添加により停止し、各ウェルの色の密度を光学測定的に評価する。
【００４７】
適用例３
インターフェロンα(IFN_)に対するヒト抗体の検出のための逆サンドイッチELISA
A)試料希釈溶媒、標準シリーズ、HRPコンジュゲートと関連したプレートの製造
工程１：
被覆：
96-ウェルマイクロタイタープレートを、従来技術に従って、PBS緩衝液中10μg/mlストレプトアビジンで被覆する(ウェルあたり100μl、インキュベーション一晩4℃)。
【００４８】
工程２：
特異的コーティング/ブロッキング：
ストレプトアビジン被覆溶液を吸い出し、プレートを洗浄緩衝液(PBS/Tween)で1回洗浄する。プレートを特異的に被覆しポリスチレン表面を飽和させるため(非特異的結合の防止)、ウェルあたり300μlのIFNα-ビオチンコンジュゲート、1μg/ml PBS/2%BSA(2時間、37℃)で、プレートの被覆及びブロックをそれぞれ行なう。
【００４９】
工程３：
固定化：
被覆/ブロック溶液を吸い出し、プレートを2回洗浄し、ウェルあたり150μl PBS/15%スクロースを添加する。1時間室温でインキュベートした後、固定化溶液をデカントする。循環ドライヤー中28℃で約20時間プレートを乾燥させる。プレートを-20℃で凍結する。
【００５０】
工程４：
試料希釈溶媒の導入：
被覆したプレートを凍結状態で使用する。試料希釈溶媒を2℃に冷却する。標準シリーズを確立するため、100μlの試料希釈溶媒を、マイクロタイタープレートの最初の2つの列の各ウェルに導入する。100μlの試料希釈溶媒をブランク決定のための対応するウェルに添加する。75μlの試料希釈溶媒を、未知の試料を決定するためのそれぞれの対応するウェルに添加する。
【００５１】
工程５：
標準シリーズの確立：
参照材料(抗ヒトIFN_抗体)の作業溶液(200ng/ml) (2℃)を、二重決定において、マイクロタイタープレートの左側の最上の2つのウェル内に導入する(100μl/ウェル)。標準シリーズを、連続1:2希釈により調製する(100-1.6ng/ml)。
【００５２】
工程６：
HRPコンジュゲートの導入：
HRPカップリングしたIFN_タンパク質の作業溶液を、2℃に冷却し、マイクロタイタープレートの全てのウェルに迅速に導入する(50μl/ウェル)。
【００５３】
工程７：
凍結乾燥：
全てのコンポネントの充填の直後に、マイクロタイタープレートをホイルでカバーし、予め-30℃に冷却した凍結乾燥装置内に導入する。凍結乾燥を、-30℃で約20時間行なう。凍結乾燥装置から出した直後に、乾燥したプレートを、アルミニウムの袋に、乾燥剤と共に溶封する。
【００５４】
B)アッセイの実施：
プレートをアルミニウムの袋から取り出す。
標準シリーズ並びにブランクを、ウェルあたり150μlの蒸留水の添加により再水化し、試料ウェルを125μlのH2Oの添加により再水化する。25μlの未知の試料をそれぞれ試料ウェルに入れる。プレートをホイルでカバーし、室温で2時間インキュベートする。プレートを3回洗浄し、100μlの基質溶液をプレートの各ウェルに添加する。15分後に、酵素反応を、停止溶液(100μl)の添加により停止し、各ウェルの色の密度を光学測定的に評価する。
【００５５】
適用例４
ヒト腫瘍壊死因子α(TNFα)の検出のためのBioLISA(受容体-リガンド結合)
A)試料希釈溶媒、標準シリーズ、ビオチンコンジュゲート、ストレプトアビジン-HRPと関連したプレートの製造
工程１：
被覆：
96-ウェルマイクロタイタープレートを、従来技術に従って、PBS緩衝液中1μg/ml組換えTFN受容体で被覆する(ウェルあたり100μl、インキュベーション一晩4℃)。
【００５６】
工程２：
ブロッキング：
被覆溶液を吸い出し、プレートを洗浄緩衝液(PBS/Tween)で1回洗浄する。ポリスチレン表面を飽和させるため(非特異的結合の防止)、プレートをウェルあたり300μlのPBS/2%BSA(2時間、室温)でブロックする。
【００５７】
工程３：
固定化：
ブロック溶液を吸い出し、プレートを2回洗浄し、ウェルあたり150μl PBS/15%スクロースを添加する。1時間室温でインキュベートした後、固定化溶液をデカントする。循環ドライヤー中28℃で約20時間プレートを乾燥させる。プレートを-20℃で凍結する。
【００５８】
工程４：
試料希釈溶媒の導入：
被覆したプレートを凍結状態で使用する。試料希釈溶媒を2℃に冷却する。標準シリーズを確立するため、100μlの試料希釈溶媒を、マイクロタイタープレートの最初の2つの列の各ウェルに導入する。100μlの試料希釈溶媒をブランク決定のための対応するウェルに添加する。50μlの試料希釈溶媒を、未知の試料を決定するためのそれぞれの対応するウェルに添加する。
【００５９】
工程５：
標準シリーズの確立：
参照材料(組換えTFNα)の作業溶液(2000pg/ml) (2℃)を、二重決定において、マイクロタイタープレートの左側の最上の2つのウェル内に導入する(100μl/ウェル)。標準シリーズを、プレート中で連続1:2希釈により(1000-16pg/ml)調製する。
【００６０】
工程６：
ビオチンコンジュゲート及びストレプトアビジン-HRPの導入：
ビオチンコンジュゲート(抗TFNα BT)及びストレプトアビジン-HRPの混合物の作業溶液を、2℃に冷却し、マイクロタイタープレートの全てのウェルに迅速に導入する(50μl/ウェル)。
【００６１】
工程７：
凍結乾燥：
全てのコンポネントの充填の直後に、マイクロタイタープレートをホイルでカバーし、予め-30℃に冷却した凍結乾燥装置内に導入する。凍結乾燥を、-30℃で約20時間行なう。凍結乾燥装置から出した直後に、乾燥したプレートを、アルミニウムの袋に、乾燥剤と共に溶封する。
【００６２】
B)アッセイの実施：
プレートをアルミニウムの袋から取り出す。
標準シリーズ並びにブランクを、ウェルあたり150μlの蒸留水の添加により再水化し、試料ウェルを100μlのH2Oの添加により再水化する。50μlの未知の試料をそれぞれ試料ウェルに入れる。プレートをホイルでカバーし、4℃で一晩インキュベートする。プレートを3回洗浄し、100μlの基質溶液をプレートの各ウェルに添加する。15分後に、酵素反応を、停止溶液(100μl)の添加により停止し、各ウェルの色の密度を光学測定的に評価する。
【国際公開パンフレット】
2004527758.tif 000006
2004527758.tif 000007
2004527758.tif 000008
2004527758.tif 000009
2004527758.tif 000010
2004527758.tif 000011
2004527758.tif 000012
2004527758.tif 000013
2004527758.tif 000014
2004527758.tif 000015
2004527758.tif 000016
2004527758.tif 000017
2004527758.tif 000018
2004527758.tif 000019
2004527758.tif 000020
2004527758.tif 000021
2004527758.tif 000022
2004527758.tif 000023
2004527758.tif 000024
2004527758.tif 000025
2004527758.tif 000026
2004527758.tif 000027
2004527758.tif 000028
2004527758.tif 000029
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004527758.tif 000030
【国際調査報告】
2004527758.tif 000031
2004527758.tif 000032
2004527758.tif 000033
2004527758.tif 000034
2004527758.tif 000035
2004527758.tif 000036