(57)【要約】この発明は同種異系および異種の外来材料をデセルラライズする方法に関し、外来材料は内生体細胞で被覆されたバイオプロテーゼを以後に製造するためのものであり、ここでは該外来材料を先ず胆汁酸溶液で処理し、次にアルコールで処理するが、両処理には中間にまたは後続して洗浄工程を行い、少なくとも最終洗浄工程では、流動性処理媒体から得られる力による組織および細胞への機械的作用と組合せる。該処理後には組織は、外来細胞物質およびウイルスが完全に除去され、バイオプロテーゼを受けるレシピエントの細胞による被覆のために優れた出発材料となる。
2004531291.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオデタージェントを使用して同種異系および異種の外来材料をデセルラライズし、バイオプロテーゼのレシピエント由来の内生細胞で被覆されたバイオプロテーゼを製造するための方法であって、外来材料をまず胆汁酸で処理し、それにより細胞を殺し、細胞を被覆し、かつ組織マトリックスとの結合を分離し、次いでアルコールで処理し、それによりさらに細胞を殺し、これら各工程に続いて洗浄工程を行い、そして少なくとも最後の洗浄工程を媒体流中にて行うことにより、液の力を組織マトリックスおよび細胞に機械的に作用させることを特徴とする方法。
【請求項２】
媒体流が拍動性である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞を包み込むデオキシコール酸を使用することにより、胆汁酸で細胞を脱着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１％〜２％デオキシコール酸を使用する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
３０％〜６０％アルコールを使用することにより細胞を殺す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
４０％アルコールを使用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
リン酸緩衝液を洗浄媒体として使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
非流動媒体で洗浄するために漸減する濃度の洗浄媒体を使用する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
非流動媒体中のデオキシコール酸処理を２４時間以内、アルコール処理を約２０分間、および洗浄を約６０分間行う、請求項１から７までに記載の方法。
【請求項１０】
外来材料に対するデオキシコール酸処理および／またはアルコール処理および／または中間の洗浄サイクルを、各器官における天然の流動条件に近い拍動性媒体流中で実施する、請求項１から７までに記載の方法。
【請求項１１】
流動媒体の速度を変更できる、請求項１および１０に記載の方法。
【請求項１２】
流動する洗浄媒体を連続的または断続的に置換する、請求項１、１０および１１に記載の方法。
【請求項１３】
デタージェント流の濃度を徐々に低下させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
処理すべき外来材料を各媒体流中、予め装着した状態に保持する、請求項１および１０から１３までに記載の方法。
【請求項１５】
拍動性媒体流を発生するポンプ（３）が結合している循環路（１）、および循環路（１）に着脱可能に組込まれたデセルラライズ室（２）であって、ここには処理すべき同種異系または異種の外来材料（８）を予め装着した状態にて長軸方向が処置媒体流の方向に伸びるようにアダプター（１０、１１）を用いて固定でき、アダプターは着脱可能にデセルラライズ室（２）に配置され、固定区画（１４、１５）および循環路（１）に接続するための連結部材（１２、１３）を有している、該デセルラライズ室（２）によって特徴付けられる、請求項１および１０から１４までに記載の媒体流中で外来材料を処理するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオプロテーゼ（生体人工補助物）を受けるレシピエント（受給者）の内生細胞で被覆されたバイオプロテーゼを製造するためにバイオデタージェントを使用して同種異系および異種の外来材料をデセルラライズ（除細胞化）する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以後に移植を受けるレシピエントの内生細胞で被覆した同種異系および異種の外来材料からバイオプロテーゼを製造するに当たり、免疫反応を予防し、新たに樹立される内生細胞の増殖と再生を確実にするには、外来細胞を含まない「無細胞」構造を提供する必要がある。しかしながら、従来のデセルラライズ法およびバイオデタージェントの使用では組織マトリックスから全細胞物質を除くことができないので、例えばブタ組織に含まれているウイルスが引き起こしかねない「未知」ウイルスの影響を排除できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、内生細胞で被覆する予定の外来材料をデセルラライズする方法であって、外来組織由来の細胞を確実に完全かつ温和に除去する方法を特定することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この課題は請求項１に記載する特性を有する方法による本発明によって解決される。
【０００５】
換言すれば、本発明の着眼点は、胆汁酸処理、アルコール処理、および組織マトリックスへの流動媒体の機械的衝撃による上流または下流の洗浄工程とを組合せ、遅くとも最後の洗浄工程において細胞を除去することにより、内生細胞で再被覆する最初の同種異系または異種の製品から外来細胞を除去することにある。
【０００６】
好ましくはデオキシコール酸の形で使用する胆汁酸は、徐々に、または機械的刺激により加速されて細胞を被覆し、コラーゲンとエラスチンで形成されるマトリックス（以後「コラーゲンマトリックス」と呼称する）と細胞との間に分離層を形成し、マトリックスから細胞を離脱させる。同時に、デオキシコール酸は細胞分解効果を示す。離脱した細胞とデオキシコール酸は後続する洗浄工程で洗い落とされる。好ましくはエタノールまたはプロパノールを用いる、後続するアルコール処理は、デオキシコール酸がアルコールに良く溶解するため、残留デオキシコール酸を完全に廃棄させる。存在するかもしれない残留デオキシコール酸はマトリックスに残った細胞を離脱させ、一方アルコールは殺細胞性および抗ウイルス効果を示す。それに続く最後の洗浄工程は好ましくは拍動性脈流であって、その力は各器官部分の壁に及び、かつマトリックスを膨張させ、あるいは残留する細胞に直接に機械的な力を及ぼし、膨張したマトリックスからそれら細胞が除去される。
【０００７】
本方法のその他の工程または全工程は、好ましくは拍動性脈流による機械的作用を組合わせてもよいと考えられる。こうして、前記デオキシコール酸の拍動性脈流は、マトリックスの運動と膨張のために細胞とコラーゲンマトリックスとの間に分離層の迅速な形成を起こし、かつ細胞に作用する力のために細胞の離脱を容易にする。
【０００８】
引用形式請求項および以下に記載する態様は、本発明に属するその他の特性および有利な改良点を説明するものである。
【０００９】
ここに提唱する方法を使用すると、無細胞の初期製品、すなわち細胞物質およびウイルスを含まない心臓弁または血管のような、バイオプロテーゼを製造するための器官部分を提供することができ、続いてこれらの製品は各レシピエントからの内生細胞で被覆される。
【００１０】
外来材料からなる器官部分を流動性媒体中で処理するこの装置は、各器官部分を入れるデセルラライズ室および媒体の流動を起こすポンプを含むが、これらは順次に循環路（ring line）の中に組込まれる。この循環路には、各々処理媒体を注入し、または排出するための注入バルブおよび排出バルブを有する。デセルラライズ室は、この室とその中に含む媒体中の器官を移動できるように循環路から離脱させることができる。処理すべき器官部分を固定し、該器官に似た形のアダプターに縫合して容器内に予め装着し、流れの方向について長軸方向に配置する。
【００１１】
以下に本発明の一態様を、図面を参照してさらに詳細に説明する。図面の簡単な説明参照。
【００１２】
本明細書に記載する態様では、屠畜場で摘出したブタ大動脈弁から脂肪を除き、適当なサイズに切断し、測定し、かつ微生物（カビ、好気性細菌、嫌気性細菌、マイコプラズマ）を検査する。一時的な保存は、最高温度４℃では７日間を超えないものとする。
【００１３】
このようにして調製した心臓弁を１％〜２％デオキシコール酸溶液（または同様な効果を示す胆汁酸）中に入れ、その中で２４時間、３７℃で貯蔵する。デオキシコール酸は脂肪酸と包摂化合物の形でいわゆる付加体を形成できるので、デオキシコール酸はすべての面上で細胞を包み込むことができ、それによって組織マトリックスとの接着結合を解消する。同時に、デオキシコール酸は殺細胞効果を有する。
【００１４】
続いて、このように処理した心臓弁を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の希釈セット中で濃度を漸減させながら定常的に動かしつつ洗浄して、デオキシコール酸で処理した組織マトリックスに由来する細胞を除去する。
【００１５】
これに続く第３工程では、心臓弁を４０％アルコール中、室温で約１０分間処理して、抗ウイルス効果を発揮させ、また、コラーゲン構造中に残留する細胞を殺す。アルコールは良好な溶媒なので、これは同時に残留する酸を洗浄してさらに多くの細胞を脱着する。
【００１６】
別のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）セットを用いて、この心臓弁をもう一度洗浄し、次に拍動性ＰＢＳ媒体流中で機械的に処理する。この拍動性媒体流は、媒体流について長軸方向に事前に装填してあるデセルラライズ室内の心臓弁を律動的に広げ、同時に機械力をかける。この工程は、残留細胞をコラーゲン構造から機械的に脱着して、全ての細胞物質が除去され、それ故にウイルスを含有できない無細胞構造が得られる。このように処理して細胞および使用したデセルラライズ液を含まない心臓弁の組織マトリックス図２を参照は、後にこのバイオプロテーゼで処置するレシピエントから得た内生内皮細胞で再被覆するために卓越した適合性を有し、このバイオプロテーゼは免疫学的反応またはウイルス感染の危険なしに人体内に移植できる。
【００１７】
本発明は、一つにはバイオプロテーゼの製造に使用する外来材料の型および起源に関して；また、二つには本方法の必須工程（すなわち、付加体形成性胆汁酸およびアルコールでの処置；中間段階または下流段階での洗浄；組織への穏和な機械的作用のための好ましくは拍動性脈流への各器官部分の暴露；の組合せ）が実行される限り、操作上のパラメータに関して、本明細書に記載する処置法の変形に限定されるものではない。本方法は最終の洗浄工程で行うだけによっても実施できるが、その代わりにまたはそれに加えて、流動媒体中でその他のまたは全ての処置工程を行うことによっても実施できる。これが、各媒体の効果を機械的に支援して、細胞へのさらに良好な全面アクセスが達成され、さらに、拍動の作用のために細胞を容易に脱着し、または膨張したコラーゲンマトリックスから除去する。
【００１８】
心臓弁をデセルラライズする装置の一つを図１に示す。この装置は処置する心臓弁を入れるデセルラライズ室２、膜ポンプ３、および下流のイコライザー室４を持つ循環路１を包含する。膜ポンプ３はホース５を経て駆動装置（記載していない）に接続する。おのおのの作用がほぼ心臓弁の作用に対応する排出バルブ６および注入バルブ７を循環路１への膜ポンプ３にある二つの連結部に接続して組込む。心臓弁を処理する時には、これらの弁が弁フラップを有するので、排出バルブ６は省略できる。
【００１９】
この装置の中心部は、液体の力の付加的効果を使用してブタ大動脈弁８をデセルラライズするためのデセルラライズ室２である。デセルラライズ室２はパイアクリル製の透明な中空シリンダー９からなり、その両開口末端面には、テフロン製のアダプター１０と１１とが密閉的に中心配置され、取り付けられており、そのアダプターは連結部材１２、１３を経て循環路１に結合され、これらには各々固定区画１４、１５があり、いずれも中空シリンダー９内に突出している。その外縁には、大動脈弁８を予め装着した状態で末端面のリムにしっかりと保持するための、放射状に配置した固定孔１６、１７を有する。アダプター１０、１１にある二個の固定区画１４、１５の外径は大動脈弁８の直径と大体同じである。後側のアダプター１１はブリッジ１８およびリングランド２０内側にある第一パッキング２７を経て固定できるが、これはネジ付リング２１を回転するとその雌ネジがアダプター１１の雄ネジに螺合して中空シリンダー９に結合する。アダプター１０にはカラー２２があり、これは中空シリンダー９の末端表面に載っており、中空シリンダー９の雄ネジに螺合する雌ネジのあるネジ付キャップ２３を用いて固定できる。漏出防止のため、第二のパッキング１９がある。デセルラライズ室が上にある循環路１のホース片は可撓性材料（シリコン）製であって、脈動ポンプ効果による媒体流を確保する。
【００２０】
前記アダプター１０、１１の設計および配置のため、適当に調製した大動脈弁８はアダプター１０、１１の反対側の固定区画１４、１５に中空シリンダー９外で縫合することができる。前記のようにして固定した大動脈弁８を中空シリンダー９内に挿入する。先ず、デオキシコール酸を循環路１内の注入バルブ２４および排出バルブ２５または連結部材１３、１４の一つを経てデセルラライズ室２および循環路１内に導入する；次に膜ポンプ３を作動させてデオキシコール酸の拍動性脈流を大動脈弁８の横または中を連続的に流し、この組織に及ぼされる流れの機械的な力は心臓弁のレシピエントにとって外来の細胞の脱着および除去を完成する。デオキシコール酸を排出した後、生理食塩水またはリン酸緩衝液を本装置に注入し、組織をデオキシコール酸および有毒成分が全て除去されるまで洗浄する。この洗浄工程の後に大動脈弁８のアルコール処理およびリン酸緩衝液中での洗浄工程が後続する。
【００２１】
本デセルラライズ法の処理工程は、全て前記装置内で各媒体の拍動性脈流中で行う。媒体流の方向は、バイオプロテーゼを移植するときの、自然の流動方向である。注入バルブ２４および排出バルブ２５は、媒体交換のために使用されるが、しかし、洗浄工程のために連続的に、新鮮な洗浄液を供給し、使用済の洗浄液を排出することもできる。
【００２２】
循環路および膜ポンプと結合せずに、デセルラライズ室を流れる媒体なしに処理工程の１種または数種を実施することも、所望ならば可能であるが、これは要すれば手動でまたはモーターを使用してもよく、または前記のように、要すれば、デセルラライズ室の外で個々の処理工程を実施してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】流通回路中の心臓弁をデセルラライズする装置を示す。
【図２】流通回路に組込まれ、心臓弁を入れるべきデセルラライズ室の断面図を示す。
【図３ａ】本発明の方法を使用してデセルラライズした大動脈弁壁の顕微鏡による断面図を示す。
【図３ｂ】図３aに示した大動脈弁壁正中線組織断面の拡大図を示す。
【符号の説明】
【００２４】
１  循環路（ring line）
２  デセルラライズ室
３  血液ポンプ／膜ポンプ
４  イコライザー室
５  ホース（膜ポンプ３用）
６  排出バルブ
７  注入バルブ
８  大動脈弁（バイオプロテーゼ）
９  中空シリンダー
１０  第一アダプター（媒体流方向について前端）
１１  第二アダプター（媒体流方向について後端）
１２  連結部材
１３  連結部材
１４  固定区画
１５  固定区画
１６  固定孔
１７  固定孔
１８  １１のブリッジ
１９  第一パッキング
２０  ９のリングランド
２１  ネジ付リング
２２  １０のカラー
２３  雄ネジキャップ
２４  注入および排出バルブ
２５  注入および排出バルブ
２６  膜バルブ
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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