(57)【要約】本発明は、天然に存在しない様式で互いに連結する成分分子を含み、このリンカーが、少なくとも１つの酵素切断部位を含み、そしてこの酵素（ｎｅｚｙｍｅ）切断部位が、処置される被験体において酵素によって切断されるように操作される、キメラ分子に関連する。本発明はまた、本キメラ分子、産生用宿主において本キメラ分子を作製する方法、本キメラ分子を診断、予防、治療および栄養上の目的のために、これらを必要とする被験体において用いる方法を含む、組成物およびキットに関連する。
2006503545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の成分分子を多細胞宿主に送達する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）キメラ分子を含む組成物を提供する工程；および
（ｂ）該キメラ分子を該宿主に投与し、処置される宿主を産生する工程を包含し、
ここで該キメラ分子が、少なくとも１つの第１成分分子、少なくとも１つのリンカー、および少なくとも１つの第２成分分子を含み；該リンカーが、酵素切断部位を含み、そして少なくとも第１のリンカーが、該第１成分分子および該第２の成分分子に作動可能に連結して、天然に存在しない連結および該第１成分分子と該第２成分分子の間の切断部位を作製し；
ここで該切断部位は、宿主酵素によるインビボの切断のために操作され、そして産生宿主において切断を受けにくく；
切断部位における該キメラ分子の切断において、少なくとも１つの該成分分子は機能的に活性であり；そして
少なくとも１つの該第１成分分子および該第２成分分子は、ペプチド、タンパク質、またはその活性フラグメントからなる群から選択される１つを含む、方法。
【請求項２】
前記切断部位が、前記宿主の消化管内の酵素によるインビボの切断のために操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、エンテロキナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、または組織型プラスミノーゲンアクチベーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記キメラ分子の前記酵素切断部位における切断において、少なくとも２つの前記成分分子が機能的に活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの前記成分分子が、前記キメラ分子の切断の前は機能的に活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記成分分子が、非阻害的分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記成分分子が、非細胞傷害性分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１成分分子が、前記第２成分分子と同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記キメラ分子が以下：
Ａ（ｘｉＢｉ）ｎ
の式を有し、ここでＡが前記第１成分分子を、ｘが前記リンカーを、Ｂが前記第２成分分子を、ｉおよびｎがそれぞれ自然数を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記式が、以下：
（ａ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）；
（ｂ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）、ここでｘ１およびｘ２は、同一であるかまたは異なり得、そしてＢ１およびＢ２は、同一であるかまたは異なり得る；
（ｃ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）、ここでｘ１、ｘ２およびｘ３は、それぞれ同一であるかまたは異なり得、そしてＢ１、Ｂ２およびＢ３は、それぞれ同一であるかまたは異なり得る；
（ｄ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）、ここでｘ１、ｘ２、ｘ３およびｘ４は、それぞれ同一であるかまたは異なり得、そしてＢ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、それぞれ同一であるかまたは異なり得る；および
（ｅ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）（ｘ５Ｂ５）、ここでｘ１、ｘ２、ｘ３、ｘ４およびｘ５は、それぞれ同一であるかまたは異なり得、そしてＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５は、それぞれ同一であるかまたは異なり得る；  
からなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記第１成分分子がペプチドもしくはタンパク質またはこれらの活性フラグメントであり、少なくとも１つの前記第２成分分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、合成ポリマー、植物産物、真菌類産物、低分子薬物、検出可能分子、ハプテン、リガンド、抗感染剤、ならびにこれらのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される、方法。
【請求項１２】
前記キメラ分子が、ポリタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記キメラ分子が、ポリタンパク質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記キメラ分子が、ポリタンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ｘ１、ｘ２、ｘ３、ｘ４およびｘ５が同一である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５が同一である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも１つの前記成分分子が、抗原、可溶レセプター、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、酵素、抗感染剤、プロドラッグ、毒素、およびこれらの活性フラグメントからなる群より選択される、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも１つの前記成分分子が、可溶ｐ７５ＴＮＦαレセプターＦｃ融合体、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α２ｂ、ＰＥＧ化（ＰＥＧ）インターフェロン−α、ＰＥＧ−アスパラガーゼ、ＰＥＧ−アダマーゼ、抗ＣＯ１７−１Ａ、ヒルジン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、エリスロポエチン、ヒトＤＮＡａｓｅ、ＩＬ−２、凝固因子ＩＸ、ＩＬ−１１、ＴＮＫａｓｅ、活性化タンパク質Ｃ、ＰＤＧＦ、凝固因子ＶＩＩａ、インスリン、インターフェロンα−Ｎ３、インターフェロンγ１ｂ、インターフェロンαコンセンサス配列、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびこれらの活性フラグメントからなる群より選択される、方法。
【請求項１９】
前記第１成分分子が、ペプチド、タンパク質またはこれらの活性フラグメントであり、そして前記第２成分分子が、キメラ化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの前記成分分子が、抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１成分分子が、抗体またはこれらの活性フラグメントであり、そして前記第２成分分子が、抗体以外である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２成分分子が、抗体またはこれらの活性フラグメントであり、そして前記第１成分分子が、抗体以外である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１成分分子および前記第２成分分子が、それぞれ抗体またはこれらの活性フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの前記成分分子が、抗微生物性のペプチド、タンパク質、これらのアナログまたは活性フラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの前記成分分子が、デフェンシン、リゾチーム、またはラクトフェリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの前記成分分子が、ヒトまたは非ヒト動物のペプチド、タンパク質、これらのアナログおよび活性フラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの前記成分分子が、植物のペプチド、タンパク質、これらのアナログまたは活性フラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの前記成分分子が、微生物のペプチド、タンパク質、これらのアナログまたは活性フラグメントからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの前記成分分子が、魚のペプチド、タンパク質、これらのアナログまたは活性フラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも２つの前記成分分子が、ペプチド、タンパク質、これらのアナログまたは活性フラグメントからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ペプチドまたはタンパク質が、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＴＦ、ＫＧＦ、ラクトフェリン、リゾチーム、フィブリノゲン、α１−抗トリプシン、エリスロポエチン、ｈＧＨ、ｔＰＡ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、コンセンサスインターフェロン、インスリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ジフテリアタンパク質、および抗好血性因子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１つの前記成分分子が、ホルモンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ホルモンが、テストステロン、エストロゲン、およびプロゲステロンからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１つの前記成分分子が、タキソールまたはそのアナログもしくは誘導体、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、および抗感染剤からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも２つの前記成分分子が、ラクトフェリン／ラクトフェリン；ラクトフェリン／リゾチーム；リゾチーム／リゾチーム；ラクトフェリン／ＥＧＦ；ＥＧＦ／ＥＦＦ；ラクトフェリン／ＩＴＦ；ＩＴＦ／ＩＴＦ；ＩＴＦ／ＥＦＧ；ＥＧＦ／ＫＧＦ；ＫＧＦ／ＫＧＦ；ＩＴＦ／ＫＧＦ；ＫＧＦ／ＰＤＧＦ；ＰＤＧＦ／ＰＤＧＦ；α１−抗トリプシン／ＭＭＰ阻害剤；エストロゲン／プロゲステロン；抗体／抗体；ＩＴＦ／ＩＴＦ；ならびにこれらのアナログ、改変体および誘導体の組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項３６】
前記キメラ分子を投与する工程が、前記処置される宿主において、生物学的効果をもたらし、そして該生物学的効果が、診断効果、予防効果、治療効果、抗感染効果または栄養上の効果である、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記キメラ分子が、さらなるポリペプチドの少なくともフラグメントをさらに含み、ここで該ポリペプチドは産生宿主において高度に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞表面以外の細胞外でのインビボの切断のために操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１成分分子も前記第２成分分子も、インターフェロンβではない、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞上でのインビボの切断のために操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１成分分子が、抗体でも抗体フラグメントでもない、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記切断部位が、内因性処置される宿主酵素による切断ために操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記切断部位が、凝固因子；ＡＤＡＭＴＳ４，５；Ａｇｇｒｅｇａｎａｓｅｓ１，２；トロンビン；プラスミン；補体因子；ガストリシン；顆粒プロテアーゼ；マトリックスメタロプロテイナーゼ；膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ；ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ；ＡＤＡＭ；ネプリリシン；組織型プラスミノーゲンアクチベーター；およびカスパーゼからなる群から選択される内因性宿主酵素による切断ために操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞内での酵素によるインビボの切断のために操作され、そして前記第１成分分子および第２成分分子の組み合わせが、タンパク質形質転換ドメインと細胞傷害性ドメインとの組み合わせ以外である、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞内での酵素によるインビボの切断のために操作され、そして該切断部位が、ウイルス病原体活性化切断部位ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞内での酵素によるインビボの切断のために操作され、そして前記第２成分分子が、細胞傷害性分子ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記キメラ分子が、産生宿主における該キメラ分子の分泌を指示するため、または該産生宿主における該キメラ分子の貯蔵を指示するためのリーダー配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記キメラ分子が、該キメラ分子を前記処置される宿主における作用部位に導くための標的化分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記キメラ分子が、産生宿主から産生された後で、該キメラ分子のインビトロ精製を容易にする精製部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記リンカーが、２つの切断部位および該２つの切断部位の間に隣接したスペーサーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記キメラ分子が、食用産物の成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記食用産物が、ミルク、植物、種子、微生物細胞、ならびにこれらの誘導体および抽出物からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記食用産物が、穀物である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記キメラ分子が、経口投与されるか、非経口投与されるかまたは吸入投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記キメラ分子が、静脈内経路、皮下経路、腹腔内経路、心臓内経路、または経皮経路により非経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
前記キメラ分子が、核酸分子ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
前記キメラ分子が、前記第１成分分子に連結するが前記リンカーには連結しないさらなる分子をさらに含み、ここで該さらなる分子が産生宿主において高度に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
少なくとも１つの前記第１成分分子または第２成分分子が、抗体またはその活性フラグメントであり、該抗体が、抗ＩＬ８、抗ＣＤ１１ａ、抗ＩＣＡＭ−３、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗補体Ｃ５、抗ＴＮＦα、抗ＣＤ４、抗α４β７、抗ＣＤ４０Ｌ（リガンド）、抗ＶＬＡ４、抗ＣＤ６４、抗ＩＬ５、抗ＩＬ４、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ１４７、抗ＣＤ２５、抗β２インテグリン、抗ＣＤ１８、抗ＴＧＦβ２、抗因子ＶＩＩ、抗ＩＩｂＩＩａレセプター、抗ＰＤＧＦβＲ、抗Ｆタンパク質（ＲＳＶ由来）、抗ｇｐ１２０（ＨＩＶ由来）、抗Ｈｅｐ  Ｂ、抗ＣＭＶ、抗ＣＤ１４、抗ＶＥＦＧ、抗ＣＡ１２５、（卵巣癌）、抗１７−１Ａ（結腸直腸細胞表面抗原）、抗抗イディオタイプＧＤ３エピトープ、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ；抗αＶβ３インテグリン、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＨＬＡ、および抗ＨＬＡ  ＤＲまたはこれらの活性フラグメントからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
キメラ分子を含有する組成物、およびヒト処置される宿主および非ヒト動物処置される宿主に対する組成物の投与のための指示を含む添付文書を含むキットであって、該キメラ分子は、少なくとも１つの第１成分分子、少なくとも１つのリンカー、および少なくとも１つの第２成分分子を含み；該リンカーは、酵素切断部位を含み、ここで、少なくとも第１リンカーは、第１成分分子および第２成分分子に作動可能に連結して、天然に存在しない連結および該第１構成部分と該第２構成部分との間の切断部位を生成し；
ここで、該切断部位は、処置される宿主酵素によるインビボの切断のために操作され、そして任意の産生宿主において切断に対し抵抗性であり；
ここで、該切断部位における該キメラ分子の切断において、少なくとも１つの該成分分子が機能的に活性であり；そして
ここで、少なくとも１つの該第１成分分子および第２成分分子は、ペプチド、タンパク質、あるいはこれらのアナログまたは活性フラグメントもしくは誘導体からなる群から選択される１つを含む、
キット。
【請求項６１】
前記切断部位が、前記処置される宿主の消化管内のインビボの切断のために操作される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記切断部位が、エンテロキナーゼによるインビボの切断のために操作される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６３】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞表面上を除く細胞外でのインビボの切断のために操作される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６４】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞表面上でのインビボの切断のために操作される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６５】
前記切断部位が、内因性宿主酵素による、前記処置される宿主における細胞内でのインビボの切断のために操作される、請求項６０に記載のキット。
【請求項６６】
前記第１成分分子と前記第２成分分子との組み合わせが、タンパク質形質転換ドメインと細胞傷害性ドメインとの組み合わせではない、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞内でのインビボの切断のために操作され、そして該切断部位が、ウイルス病原活性切断部位ではない、請求項６０に記載のキット。
【請求項６８】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞内でのインビボの切断のために操作され、そして前記第２成分分子が、細胞傷害性分子以外である、請求項６０に記載のキット。
【請求項６９】
Ａ（ｘｉＢｉ）ｎの式を有するキメラ分子であって、ここで、Ａが第１成分分子を、ｘがリンカーを、Ｂが第２成分分子を、ｉおよびｎがそれぞれ自然数を表し、ここで、該キメラ分子は、少なくとも１つの第１成分分子、少なくとも１つのリンカー、および少なくとも１つの第２成分分子を含み；該リンカーは、酵素切断部位を含み、そして少なくとも第１のリンカーは、第１成分分子と第２成分分子に作動可能に連結して、天然に存在しない連結および該第１成分分子と該第２成分分子との間に切断部位を生成し；
ここで、該切断部位は、宿主酵素によるインビボの切断のために操作され、そして産生宿主において切断を受けにくく；
ここで、該切断部位における該キメラ分子の切断において、少なくとも１つの該成分分子が機能的に活性であり；そして
ここで、少なくとも１つの該第１成分分子および第２成分分子は、ペプチド、タンパク質、あるいはこれらのアナログまたは活性フラグメントもしくは誘導体からなる群から選択される１つを含む、
キメラ分子。
【請求項７０】
請求項６９に記載のキメラ分子であって、前記式が、以下：
（ａ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）；
（ｂ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）、ここでｘ１およびｘ２は、同一であるかまたは異なり得、そしてＢ１およびＢ２は、同一であるかまたは異なり得る；
（ｃ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）、ここでｘ１、ｘ２およびｘ３は、それぞれ同一であるかまたは異なり得、そしてＢ１、Ｂ２およびＢ３は、それぞれ同一であるかまたは異なり得る；
（ｄ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）、ここでｘ１、ｘ２、ｘ３およびｘ４は、それぞれ同一であるかまたは異なり得、そしてＢ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、それぞれ同一であるかまたは異なり得る；および
（ｅ）  Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）（ｘ５Ｂ５）、ここでｘ１、ｘ２、ｘ３、ｘ４およびｘ５は、それぞれ同一であるかまたは異なり得、そしてＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５は、それぞれ同一であるかまたは異なり得る；  
からなる群より選択される、キメラ分子。
【請求項７１】
前記キメラ分子がポリタンパク質である、請求項６９に記載のキメラ分子。
【請求項７２】
請求項７１に記載のキメラ分子をコードする核酸分子。
【請求項７３】
請求項７２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７４】
請求項７２に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項７５】
処置される宿主に投与するために、産生宿主においてキメラ分子の調製のための方法であって、該方法は、以下：（ａ）キメラ分子をコードする核酸分子を提供する工程；（ｂ）産生宿主を、該核酸分子で形質転換する工程；（ｃ）該産生宿主に該キメラ分子を産生させる工程；（ｄ）該キメラ分子を該産生宿主から回収する工程；および（ｅ）該回収したキメラ分子に対して品質管理を実行し、規制当局の許可に適合させる工程を包含し、
ここで該キメラ分子が、第１成分分子、切断部位を含むリンカー、および第２成分分子を含む成分分子を含み、
少なくとも１つの該第１成分分子および該第２成分分子が、ペプチド、タンパク質またはこれらの活性フラグメントを含み；
該リンカーが、該第１成分分子および該第２の成分分子に作動可能に連結して、天然に存在しない連結および切断部位を生成し；
ここで該切断部位は、処置細胞酵素によるインビボ切断のために操作される、
方法。
【請求項７６】
前記酵素が、前記処置される宿主の消化管に存在する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記酵素が、前記処置される宿主において細胞外で作用するが、細胞表面上では作用しない酵素である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記酵素が、前記処置される宿主において細胞表面上で作用する酵素である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記酵素が、前記処置される宿主において細胞内で作用する酵素である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記キメラ分子が、タンパク質低湿転換ドメインと細胞傷害性ドメインとの組み合わせ以外である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記酵素が、前記処置される宿主において細胞内で作用する酵素であり、そして前記切断部位がウイルス病原活性化切断部位ではない、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記酵素が、前記処置される宿主において細胞内で作用する酵素であり、そして前記第２成分分子が細胞傷害性分子以外である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
前記産生宿主が、細菌細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、植物の種子、昆虫細胞、植物、真菌類、および動物からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８４】
処置される宿主に投与するためのキメラ分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する組成物であって、ここで、該キメラ分子は、少なくとも１つの第１成分分子、少なくとも１つのリンカー、および少なくとも１つの第２成分分子を含む成分分子を含み；該リンカーは、酵素切断部位を含み、そして少なくとも第１のリンカーは、第１成分分子と第２成分分子に作動可能に連結して、天然に存在しない連結および該第１成分分子と該第２成分分子との間に切断部位を生成し；
ここで、該切断部位は、処置される宿主酵素によるインビボの切断のために操作され、そして産生宿主において切断に対して抵抗性であり；
ここで、該切断部位における該キメラ分子の切断において、少なくとも１つの該成分分子が機能的に活性であり；そして
ここで、少なくとも１つの該第１成分分子および第２成分分子は、ペプチド、タンパク質、またはこれらの活性フラグメントからなる群から選択される１つを含む、
組成物。
【請求項８５】
前記切断部位が、前記処置される宿主の消化管内の酵素によるインビボの切断のために操作される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
前記酵素が、エンテロキナーゼである、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８７】
前記切断部位が、前記処置される宿主の炎症性組織内の酵素によるインビボの切断のために操作される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８８】
前記炎症性組織が、炎症性の腸または炎症性の滑膜である、請求項８７に記載の組成物。
【請求項８９】
前記切断部位が、前記処置される宿主における、細胞表面上以外の細胞外でのインビボの切断のために操作される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９０】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞表面でのインビボの切断のために操作される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９１】
前記切断部位が、内因性処置される宿主酵素による、前記処置される宿主における細胞内でのインビボの切断のために操作される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９２】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞内でのインビボの切断のために操作され、前記第１成分分子と前記第２成分分子との組み合わせが、タンパク質形質転換ドメインと細胞傷害性ドメインとの組み合わせではない、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９３】
前記切断部位が、前記処置される宿主における細胞内でのインビボの切断のために操作され、そして前記第２成分分子が、細胞傷害性分子ではない、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９４】
前記組成物が、カプセル化される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９５】
前記成分分子の１つが、前記処置される宿主において、細胞外マトリックスに結合する、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記キメラ分子が、２つの切断部位を含み、そのうちの１つが、産生宿主における発現の後のインビトロでの切断のために操作され、そしてもう１つが、前記処置される宿主におけるインビボでの切断のために操作される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９７】
前記組成物が、経口送達のために処方される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９８】
前記組成物が、非経口送達のために処方される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９９】
非経口送達が、皮下送達、静脈内送達、動脈内送達、心室内送達、頭蓋内送達、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）送達からなる群から選択される、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１００】
前記キメラ組成物が、経鼻送達または吸入送達のために処方される、請求項８４に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記キメラ分子が、ワクチンである、請求項８４に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記キメラ分子が、前記成分分子の１つとしてアジュバントを含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記ワクチンが、病原生物体の成分を含む、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記ワクチンが、癌のワクチンであり、前記成分分子が、癌細胞において過剰発現される分子である、請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０５】
必要とする被験体における、疾患または状態の診断、予防、処置のため、または栄養の増強のための、医薬の調製におけるキメラ分子の使用であって、ここで、該キメラ分子は、少なくとも１つの第１成分分子、少なくとも１つのリンカー、および少なくとも１つの第２成分分子を含み；ここで、該リンカーは、酵素切断部位を含み、少なくとも第１のリンカーは、第１成分分子および第２成分分子と作動可能に結合して、該第１成分分子と該第２成分分子との間に、天然に存在しない連結および天然に存在しない切断部位を生成し；ここで、該切断部位は、処置される宿主の酵素によるインビボの切断のために操作され、そして産生宿主において切断されにくく；ここで、該切断部位における該キメラ分子の切断の際に、該成分分子の少なくとも１つが、機能的に活性であり；そしてここで、該第１成分分子および第２成分分子の少なくとも１つが、ペプチド、タンパク質、またはこれらの活性なフラグメントからなる群から選択される１つを含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、宿主に投与され、インビボで切断されて、処置される宿主において、診断効果、予防効果、治療効果および／または栄養上の効果を生じるために適切な、キメラ分子の分野に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
キメラ分子は、微生物宿主における組換えタンパク質の産生および精製に際しての、インビトロの切断の目的で作製されている。「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｎｋｅｒｓ」と題された米国特許第４，７６９，３２６号（「３２６特許」）（１９８８年９月６日に発行、ｔｈｅ  Ｒｅｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに譲渡される）は、とりわけ、「自然環境においては近接しない３つのセグメントを含み、ここで第１セグメントは真核のタンパク質をコードし、そして少なくとも２アミノ酸の特異的切断配列をコードする第２セグメントと近接し、上記第２セグメントは第３のセグメントと近接し、ここで、上記ＤＮＡの発現産物は、少なくとも１つの酵素薬剤または化学薬剤により、真核タンパク質および特異的切断配列と連結するペプチド結合において特異的に切断され；そして上記第３のセグメントは、宿主ペプチドをコードし、ここで上記第３のセグメントは、宿主ペプチドをコードし、ここで、上記ペプチドは・・・上記真核タンパク質とネイティブには関係しない」組換えＤＮＡ配列に（請求項１）関連する。
【０００３】
それ以来、他の研究者らは、インビトロの産生および加工のための他の系を開発している。このような適応の例としては、以下が挙げられる。
【０００４】
「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」と題された米国特許第４，７４５，０６９号（１９８８年５月１７日発行、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙに譲渡される）は、とりわけ、「外来性タンパク質の発現のために有用な組換えＤＮＡクローニングベクター」に関し、ここで、このクローニングベクターは、「縦列に、リポタンパク質プロモーター領域を規定するヌクレオチド配列、リポタンパク質５’非翻訳領域を規定するヌクレオチド配列、ならびに外来性タンパク質産物をコードする配列、翻訳開始シグナルコドンおよびエンテロキナーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列を介してリポタンパク質遺伝子の５’非翻訳領域の３’末端に結合する産物をコードする配列を、含むように構築される。」（２欄、４５〜６２行）この発明の理論的根拠は、「リポタンパク質遺伝子について観察される高レベルの恒常的な転写・・・外来性ＤＮＡフラグメントの発現のための媒体として、これを推薦する」（２欄、１４〜１７行）である。
【０００５】
「Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｓｏｍａｔｏｃｒｉｎｉｎｅ  ａｎｄ  Ａｌｐｈａ１−Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｌｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｏｃｒｉｎｉｎｅ」と題された米国特許第４，８２８，９８８号（１９８９年５月９日発行、Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ−ＲＩＴに譲渡される）は、とりわけ、「細菌におけるｈＧＲＦの発現（この発現は、ｈＧＲＦのコード配列とｈＡＴまたはそのフラグメント（細菌において最適な様式で、自身を発現する）に対応するコード配列との融合によって有意に、予期せず改善され得る）」（３欄、４〜９行）に関連する。
【０００６】
「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」と題された米国特許第５，２９２，６４６号（「’６４６特許」）（１９９４年３月８日発行、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．に譲渡される）は、とりわけ「選択された異種ペプチドまたは異種タンパク質に融合した、チオレドキシン様のタンパク質配列を含む融合配列」に関連し、この融合配列は、「必要に応じてリンカーペプチドを含み得」、このリンカーペプチドは、「必要な場合、選択された切断部位」を提供する（２欄、４７〜６０行）。’６４６特許において記載される発明は、『可溶組換えタンパク質発現を増加するための新規の方法』（この方法は、『上述の宿主細胞を適切な条件下で培養し、融合タンパク質を産生する工程』を包含する）を提供することを目的とする（３欄、６〜１０行目）。
【０００７】
「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」と題された米国特許第６，０８０，５５９号（２０００年６月２７日、Ａｇｅｎｎｉｘ，Ｉｎｃ．に対して発行）は、「組換えプラスミドを含む、形質転換したアスペルギルス真菌細胞を培養する工程を包含するプロセスにより産生された、インタクトな脱グリコシル化ラクトフェリンタンパク質または１ドメイン脱グリコシル化ラクトフェリンポリペプチドフラグメントであって、上記プラスミドは、５’から３’まで操作可能に連結される、（ａ）プロモーター；（ｂ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）高度に発現する、内因性の、分泌された、アスペルギウスポリペプチドのアミノ末端部分をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の５’部分；（ｄ）ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列（このペプチドリンカーは、アスペルギウスに内因性のプロテアーゼの切断部位を含む）；および（ｅ）ラクトフェリンまたはラクトフェリンポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチド配列；の構成部分を含み、ここで、上記の形質転換したアスペルギウス真菌細胞は、適切な栄養培地で、ラクトフェリンタンパク質またはラクトフェリンポリペプチドフラグメントが融合産物として産生されるまで培養され、次いで、上記のリンカー配列に特異的な内因性タンパク質分解酵素を介して加工され、ここで、上記の加工されたラクトフェリンまたはラクトフェリンポリペプチドフラグメントは、栄養倍地中に分泌されてそこから単離され、ここで、ラクトフェリンタンパク質またはラクトフェリンポリペプチドフラグメントは、脱グリコシル化されている、インタクトな脱グリコシル化ラクトフェリンタンパク質または１ドメイン脱グリコシル化ラクトフェリンポリペプチドフラグメント」（請求項１）に、関連する。
【０００８】
「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」と題されたＷＯ９７／２８２７２（１９９７年８月７日公開、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．により出願）は、とりわけ、以下の方法に関連する：「このような融合タンパク質からの、標準の組換えタンパク質の発現および精製のための方法。特に、本発明は、融合タンパク質に関し、ここで、さらなるドメインおよび／またはエレメントが、この融合タンパク質に付加される。ヒンジ領域（３）、親水性スペーサー（４）、および二塩基性アミノ酸エンドプロテアーゼ切断部位（５）を含むポリペプチドによって目的のタンパク質に融合したＦｃフラグメント（１）が、これらのドメインおよび／またはエレメントに含まれ、ここで、上記スペーサーは、切断され得、次いでカルボキシペプチダーゼＢ（６）によって消化されて、標準的タンパク質を生じる（２）」（要約書）。
【０００９】
「Ｆｕｓｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」と題されたＷＯ９９／５８６６２（１９９５年５月１３日公開の日本国特許出願）は、以下のタンパク質を含む融合タンパク質に関連する：「Ｎ末端からＣ末端に向かう方向に、ａ）シグナル配列、ｂ）少なくともＣＨ１ドメインの欠失を有する免疫グロブリンＦｃ領域；ｃ）エンテロキナーゼなどによる切断を許容する、Ｃ末端に酵素切断部位を有するペプチドリンカー；およびｄ）エリスロポエチンなどの標的タンパク質のアミノ酸配列からなる標的タンパク質であって、酵素切断の完了後、この標的タンパク質がＮ末端にペプチドリンカー由来のアミノ酸残基を含まないという点で特徴付けられる。従って、Ｎ末端における任意のアミノ酸修飾を有さない標的タンパク質は、酵素処理により、効率的に生成され得る」（要約書) 。
【００１０】
「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｂｅｔａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ」と題されたＷＯ００／２３４７２（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．により出願）は、とりわけ、「インターフェロンβ−１ｂと比較してより高い活性を有し、そして融合タンパク質の有益な特性を有し、通常は活性を事実上喪失しない、インターフェロンβ−１ａ組成物」（２頁、１７〜１９行）に関連する。この明細書は、「アミノ酸配列Ｘ−Ｙ−Ｚを有する単離されたポリペプチドであって、ここでＸはインターフェロンβのアミノ酸配列からなるアミノ酸配列またはその部分を有するポリペプチドであり；Ｙは、任意のリンカー部分であり；そしてＺは、インターフェロンβ以外のポリペプチドの少なくとも一部を含むポリペプチドである、ポリペプチド」（３頁、１〜５行目）に関連して、本発明を記載する。この発明は、「以下の工程を包含する、組換えポリペプチドの産生方法：本発明に従い、宿主細胞の集団を提供する工程；この細胞集団を、組換えＤＮＡによってコードされるポリペプチドが発現される条件下で、培養する工程；および発現されたポリペプチドを単離する工程」（４頁、３〜６行）に、さらに関連する。
【００１１】
「Ｒｕｂｒｅｄｏｘｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」と題されたＷＯ００／３９３１０（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより出願）は、とりわけ、「Ｎ末端ルブレドキシン構成部分およびＣ末端融合ポリペプチドを含む組換えルブレドキシン融合タンパク質」（３頁、３〜５行）に関連する。この融合タンパク質は、「適切に折りたたまれた場合、Ｆｅ２＋を結合して赤色を呈し得、これにより精製の間にこれを追跡しやすくなる。」（３頁、５〜６行）「Ｎ末端ルブレドキシン構成部分とＣ末端融合ポリペプチドとの間の結合は、切断可能な結合であり得るが、そうでなくともよい。」（３頁、１５〜１７行目）
「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ」と題されたＷＯ００／６１７６８（Ｙｅｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．により出願）は、とりわけ、「天然の形成過程において生物学的に非活性な形態で産生され、前駆体の切断後に活性になる分子の産生」に関連する。この明細書は、好ましい実施形態において、「その切断部位において変異させた生物学的活性分子の前駆体をコードするｃＤＮＡを含むベクターで、宿主をトランスフェクトする工程；トランスフェクトされた宿主を培養する工程；前駆体を発現させ、プロテアーゼ処理した後に、生物学的活性分子を単離する工程を、包含する方法」（３頁、２７〜３１行）を、提供する。
【００１２】
「Ａｃｔｉｖａｂｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ」と題されたＷＯ０１／１４５７０（Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｓａｌｅｓ，Ｉｎｃ．により出願）は、とりわけ、「機能的結合ドメイン、トランスロケーションドメイン、および治療ドメインを含む単離された組換えタンパク質であって、ここでこのようなタンパク質はまた、単鎖として発現した後に、インビトロで選択的切断を受けやすいアミノ酸配列も含む、タンパク質」（７頁、１９〜２２行）に、関連する。この明細書中のトランスロケーションエレメントは、「トランスロケーション活性を有する、クロストリジウム神経毒のＨ鎖部分を含む」（１９頁、１１〜１２行）。この発明は、「これらの物質の製造に関する重要な考察」としての「操作されたクロストリジウム毒素の活性化の程度」の課題に取り組む。従って、「ＢｏＮＴ（ボツリヌス神経毒）およびＴｅＴｘ（破傷風毒素）のような神経毒は、急速に増殖する細菌（例えば、異種のＥ．ｃｏｌｉ細胞）において、安全であり、単離が容易で、かつ完全に活性な形態への変換が単純である、比較的非毒性の単鎖（またはより低い毒性活性を有する単鎖）として、効率で発現し得る場合に、大きな利点」（６頁、５〜１１行）である。
【００１３】
分子のインビトロの加工と組み合わされた融合分子のインビボの産生は、「Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ  ａｎｄ  ｍａｇａｉｎｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：ａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題された、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１（２０）：９３３７−４１（１９９４年９月２７日）において記載される。
【００１４】
特定の場合、インビトロで合成されたポリポリペプチドを送達するよりむしろ、インビボでポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。例として、宿主によるインビボのポリペプチド合成は、有利な翻訳後修飾（例えば、Ｃ末端アミド化またはグリコシル化）を受け得る。（ＵＳ  ５，７０７，８２６（ＢｉｏＮｅｂｒａｓｋａ，Ｉｎｃ．に対し１９９８年１月１３日発行）の１欄、１８〜２５行；およびＥＰ  ０１３４  ０８５（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓにより出願、１９８５年３月１３日に公表）の３頁、１３〜１６行；同４頁３〜５行を、参照のこと。）
従って、遺伝子治療の方法は、インビボでのタンパク質の産生のために生物内へ治療遺伝子を送達するために、適用されている。しかし、遺伝子治療の現実は未だ遠く、そして処置形態としての遺伝子治療は、未だ達成されていない。核酸の遺伝子治療送達の例としては、以下が挙げられる：
「Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｊｏｉｎｔｓ」と題された米国特許第６，２２８，３５６号（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎに対し、２００１年５月８日に発行）は、とりわけ、「哺乳動物の関節における白血球浸潤または軟骨分解を阻害するための方法であって、この方法は、プロモーターに作動可能に連結する、関節においてＩＬ−１の作用を相殺するタンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを、上述の関節に直接投与する工程であって、ここで、上述の関節内での上述のタンパク質の発現は、上述の関節において白血球浸潤または軟骨分解の阻害をもたらす工程を、包含する、方法」（請求項１）に、関する。ＩＬ−１の作用を相殺するタンパク質は、例えば、インターロイキン−１レセプターアンタゴニストタンパク質（ＩＲＡＰ）（請求項２）、可溶インターロイキン−１レセプター（請求項３）、可溶ＴＮＦレセプター（請求項４）、またはインターロイキン−１０（請求項５）である。結合組織の病理学の研究のための動物モデルを産生する方法であって、ここでこの方法は、「サイトカインおよびプロテイナーゼからなる群から選択される物質の遺伝子としての使用を含み」、ここでこのプロテイナーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼを使用し、そしてマトリックスメタロプロテイナーゼは、「コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、およびストロメライシンからなる群から選択される」（１４欄、３６行〜１５欄、１行）方法が、さらに開示される。この明細書は、「産物をコードする少なくとも１つの遺伝子を、哺乳動物宿主の結合組織の少なくとも１つの細胞内に導入する」（要約書）ために提供されるが、１度に１つより多い遺伝子を送達するための、明白な特定の戦略は、存在しない。これに関連して、「ＩＲＡＰ  ｇｅｎｅ  ａｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ」と題された米国特許第５，８５８，３５５号（１９９９年１月１２日発行）は、インビトロで滑液細胞をトランスフェクトすることおよび感染された滑液細胞を、関節内注射によって関節結合部分に移植し、軟骨破壊の軽減または滑膜炎の軽減を生じさせることを、開示する。
【００１５】
２０００年１月２５日に発行された、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに対する米国特許第６，０１７，８９６号（表題「Ｐｕｒｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ」）は、とりわけ、「（ａ）アデノシンを切断し得るプリン切断酵素をコードする核酸により哺乳動物細胞をトランスフェクトまたは形質導入することにより、そして（ｂ）トランスフェクトまたは形質導入された細胞とプリン切断酵素に対する有効量の基質とを接触させること」によって、「トランスフェクトまたは形質導入された哺乳動物細胞および周辺細胞を殺傷、複製、または非複製化する方法」に関し、「ここで、この基質は、哺乳動物細胞に対して実質的に非毒性であり、かつ酵素によって切断されてトランスフェクトまたは形質導入された哺乳動物細胞および周辺細胞に対して毒性であるプリンを得、酵素を発現する哺乳動物細胞および周辺細胞を殺傷する」（請求項１）。
【００１６】
２０００年６月２７日に発行された、Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｓｃｈａｆｔ  ＡＧに対する米国特許第６，０８０，５７５号（表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｃａｎ  ｂｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ」）は、とりわけ、「核酸構築物」に関し、これは、「哺乳動物細胞から放出される酵素によって活性化され、この構築物は、以下の成分を含む：ａ）少なくとも１つのプロモーターエレメント、ｂ）活性な化合物（タンパク質Ｂ）をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、ｃ）アミノ酸配列（部分構造Ｃ）をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列（これは、哺乳動物細胞により放出される酵素により特異的に切断され得る）、およびｄ）ペプチドまたはタンパク質（部分構造Ｄ）をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列であり、このペプチドまたはタンパク質（部分構造Ｄ）は、切断可能なアミノ酸配列（部分構造Ｃ）によって活性化合物（タンパク質Ｂ）に結合され、そして活性化合物の活性を阻害する・・・」（要約）。
【００１７】
２０００年１１月１４日に発行された、Ｖｉｃａｌ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄに対して発行された米国特許第６，１４７，０５５号（表題「Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｉｄｓ  Ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ＩＬ−２  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」）は、とりわけ、「ヒト患者における癌を処置するための方法であって、カチオン性脂質により処方されたＤＮＡプラスミドを該患者の腫瘍にインビボで直接投与する工程を包含し；ここで、該プラスミドは、（１）成熟ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド；（２）該第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたペプチドリーダーをコードする第２のポリヌクレオチドであって、ここで、該ペプチドリーダーは、該ＩＬ−２の分泌を指向する、第２のポリヌクレオチド；（３）該第１および第２のポリヌクレオチドと作動可能に会合するプロモーター・・・」（請求項１）に関する。
【００１８】
外来遺伝子はまた、植物に導入されそして発現される。例えば、１９９９年８月１７日に発行された、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａに対する米国特許第５，９３９，５４１号（表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｇｅｎｅ  ｏｒ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ」）は、とりわけ「ブースター配列であって、Ｐ１（ヘルパー成分プロテイナーゼ（ＨＣ−Ｐｒｏ）およびＰ３の一部についてのコード領域を含み、それにより、該ブースター配列は、植物細胞、植物原形質体、または植物全体に対するｐｏｔｙウイルスのゲノムのＨＣ−Ｐｒｏカルボキシ末端の自己タンパク質分解プロセッシングに必要なタンパク質切断部位をコードする領域を含み、それにより、該外来遺伝子または内因性植物遺伝子の発現が、該ブースター配列がない該植物細胞、植物原形質体、または植物全体における発現と比較して増強される、ブースター配列」（請求項１）の提供に関する。
【００１９】
１９９６年２月１３日に発行された、Ｔｅｘａｓ  Ａ  ＆  Ｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍに対する米国特許第５，４９１，０７６号（表題「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒ」）は、とりわけ、「ポリタンパク質産生植物ウイルスに感受性の植物において異種タンパク質を発現するように適合された発現ベクター。このベクターは、ウイルスポリタンパク質プロテアーゼがウイルスポリタンパク質由来の異種タンパク質を切断する特有の能力を利用する」（要約）ことに関する。注記すべきは、このベクターが、ｃＤＮＡを含み、「該ｃＤＮＡが、ポリタンパク質産生Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓの複製可能なゲノムをコードする配列を含む」（請求項１および２）。
【００２０】
Ｚｅｎｅｃａ  Ｌｉｍｉｔｅｄによって出願され、２０００年３月２日に公開されたＷＯ００／１１１７５Ａ１（表題「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ」）は、とりわけ、「トランスジェニック植物における１つ以上のタンパク質を発現するか、または発現レベルを向上させる方法であって、該方法が、該植物のゲノムにＤＮＡ配列を挿入する工程を包含し、該ＤＮＡ配列は、２つ以上のタンパク質コード領域に作動可能に連結されたプロモーター領域および３’−終止領域を含み、ここで、該タンパク質コード領域は、リンカープロペプチドをコードするＤＮＡ配列により互いに分離され、該プロペプチドは、切断部位を提供し、これにより、発現されたポリタンパク質が、成分タンパク質分子へと翻訳後にプロセッシングされる、方法。特に、シグナル配列がまた、翻訳後プロセシングが植物の分泌経路において実行されるように含まれる。この方法に使用するための適切なリンカー配列およびＤＮＡ構築物もまた、記載される」（要約）ことに関する。
【００２１】
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎにより出願され、１９９９年６月１５日に発行された、米国特許第５，９１２，１６７号（表題「Ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ  ｉｎ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ」）は、とりわけ、「ピコルナウイルスに見出される自己触媒性切断部位を使用して、組換えペプチドまたはタンパク質を有効に発現する方法」に関し、「自己触媒性ペプチド切断部位をコードする核酸配列の少なくとも２つのコピーを含む核酸構築物」もまた開示され、ここで、この部位は、特定のアミノ酸配列を含み、そして、「ここで、この構築物は、複製コンピテントピコルナウイルス配列の部分であり、そしてここで、このコピーは、天然に存在する自己触媒性切断部位の部位に位置する」（請求項１）。請求項１に従属する請求項４は、「自己触媒性部位をコードする核酸配列の２つのコピー間にあるポリリンカー」を記載する。請求項５に従属する請求項６（これは、請求項４に従属する）は、「自己触媒性切断部位によって分離される異種タンパク質を含むポリタンパク質」を含むための核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を記載する。別の従属項において、請求項１に記載のベクターは、Ｍｅｎｇｏウイルスである（請求項７）。
【００２２】
２００１年４月２４日に発行された、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに対する米国特許第６，２２１，３５５号（表題「Ａｎｔｉ−ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」）は、「形質導入ドメインおよび細胞傷害性ドメインを含む１つ以上の融合タンパク質」の使用に関する。「この細胞傷害性ドメインは、病原体感染によって特に活性化される。抗病原系は、１つの病原または異なる病原の組み合わせによって感染された細胞を有効に殺傷または傷害させる。」（要約）
ＷＯ  ９８／１３０５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．によって出願された、表題「Ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ｔｏ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」）は、転移性細胞の細胞膜中に位置するプロテアーゼによって活性化され、転移細胞によって取り込まれ得る活性抗癌薬物を生産する加水分解性プロドラッグに関する。一般に、本発明に従う加水分解性プロドラッグは、立体障害の発生を予防するのに十分な長さの自己犠牲的なスペーサーを介して治療薬物に共有結合された転移細胞の表面上に位置されるペプチドヒドロラーゼの基質であるアミノ末端キャップペプチドを含む。治療薬物は、代表的に抗癌薬物である。抗癌薬物は、ドキソルビシン、タキソール、カンプトセシン、マイトマイシンＣまたはエスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｙｃｉｎ）である。代表的に、加水分解性プロドラッグの基質を加水分解するペプチドヒドロラーゼは、カテプシンＢである（要約）。
【００２３】
ＵＳ  ６，２５１，３９２（２００１年６月２６日にＥｐｉｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．対して発行された、表題「Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ」）は、「非分極上皮細胞へ生物学的因子を送達する際の使用のための」標的分子に関し、送達の際、「生物学的因子は、上皮細胞に死をもたらす。標的分子は、例えば、転移性上皮細胞の根絶のために使用され得る」（要約）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
多くの疾患または障害は、１つ以上の遺伝子産物のその存在または欠損に関連する。従って、１つ以上の遺伝子産物の存在または欠損を指向するための１つの活性成分を有する医薬の投与は、非常に効果的に疾患または状態を制御することは十分でないかも知れない。さらに、医薬の半減期を延長し得る場合、１日に数回よりも少ない回数で、多くの理由（便利さ、費用および安全性を含む）による好ましいレジメンで医薬を投与することが可能であり得る。さらに、所定の医薬の容量が減少し得、従って、医薬が作用を必要とする位置により効果的に送達され得る場合、その副作用が減少することが所望される。さらに、処置される宿主への送達のための９０％を超える純度の分子の精製に関連する高い費用を用いることなく、費用効果がある活性分子の送達方法が存在することが所望される。従って、処置される宿主中の所望の部位への１つ以上の活性分子のより効果的でかつ効率的な送達のまだ対処されていない必要性が存在する。
【００２５】
低分子（例えば、組換え低分子ペプチド）の生産のための、このようなペプチドを生産する宿手中で分解されない発現系の必要性の認識がさらに存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
（発明の要旨）
上記のような当該分野で、まだ対処されていない必要性に指向することが、本発明の
１つの目的である。
【００２７】
診断、治療、予防または栄養目的のために、複数細胞宿主（「処置される宿主」）に複数の成分分子を１度に送達するための方法を提供することが、本発明のさらなる１つの目的である。
【００２８】
処置される宿主中で通常分解される分子を、処置される分子に送達するための方法を提供することが、本発明の別の１つの目的でもある。
【００２９】
処置される宿主中の作用部位に分子を送達し、分子の効果を最大にし、そして副作用を最小にすることが、本発明のなお別の１つの目的である。
【００３０】
１つの目的に従って、複数細胞宿主への複数の成分分子の送達の方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）キメラ分子を含む組成物を提供する工程；および（ｂ）宿主にキメラ分子を投与し、処置される宿主を生産する工程、ここで、キメラ分子は、少なくとも１つの第１の成分分子、少なくとも１つのリンカーおよび少なくとも１つの第２の成分分子を含み；リンカーは、酵素切断部位を含み、そして少なくとも第１のリンカーは、第１の成分分子および第２の成分分子に作動可能に連結され、第１の成分分子と第２の成分分子との間の非天然の連結および切断部位を生じ；切断部位は、宿主酵素によってインビボで切断されるために操作され、そして任意の生産宿主中での切断に耐性であり；切断部位でのキメラ分子の切断の際、少なくとも１つの成分分子は、機能的活性であり；そして少なくとも１つの第１の成分分子および第２の成分分子は、ペプチド、タンパク質
またはその活性フラグメントからなる群から選択される１つを含む。
【００３１】
別の１つの目的に従って、上記の通りの方法を提供し、全身を循環する酵素上に位置する切断部位は、酵素によるインビボでの切断のために操作される。従って、例えば、切断酵素は、消化管、尿生殖路、涙液、唾液などに位置され得る。切断酵素はまた、全身に存在し得る。１つの実施形態において、切断酵素は、宿主の尿生殖路中に存在し、例えば、任意の消化酵素（転移のプロセスに関連するような任意のエンテロペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、エンテロキナーゼまたは組織型のプラスミノーゲンアクチベーター）および同様に関連するマトリクスメタロプロテイナーゼ）である。
【００３２】
本発明のなお別の１つの目的に従って、上記の通りの方法を提供し、切断部位は、細胞表面以外で、処置される宿主中の細胞外で、インビボでの切断のために操作され、例えば、１つまたは両方の成分分子は、インターフェロン−β以外である。
【００３３】
本発明のなお別の１つの目的に従って、上記の通りの方法を提供し、切断部位は、細胞表面で、処置される宿主中で、インビボでの切断のために操作され、例えば、第１の成分分子は、抗体または抗体フラグメント以外である。
【００３４】
さらなる１つの目的に従って、上記の通りの方法を提供し、切断部位は、内在性の処置される宿主酵素による切断のために操作される。１つの実施形態において、切断部位は、以下からなる群から選択される内在性宿主酵素による切断のために操作される：凝固因子；ＡＤＡＭＴＳ  ４およびＡＤＡＭＴＳ  ５；Ａｇｇｒｅｇａｎａｓｅｓ  １およびＡｇｇｒｅｇａｎａｓｅｓ  ２；トロンビン；プラスミン；相補体因子；ガストリシン；顆粒プロテアーゼ；マトリクスメタロプロテイナーゼ；膜型マトリクスメタロプロテイナーゼ；ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ；ＡＤＡＭ；ネプリリシン；ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、組織型プラスミノーゲンアクチベーターおよびカスパーゼ。
【００３５】
さらなる１つの目的に従って、上記の通りの方法を提供し、切断部位は、処置される宿主中の酵素による細胞内でのインビボでの切断のために操作され、そして第１の成分分子および第２の成分分子の組み合せは、タンパク質形質導入ドメインおよび細胞傷害性ドメインの組み合せ以外である。
【００３６】
本目的のさらに別の１つによると、切断部位が、処置される宿主中の酵素による細胞内インビボ切断のために操作され、この切断部位がウイルス病原体により活性化された切断部位ではない上記の方法が提供される。
【００３７】
本目的のさらに別の１つによると、切断部位が、処置される宿主中の酵素による細胞内インビボ切断のために操作され、第２の成分が細胞傷害性分子ではないか、細胞傷害性分子以外である上記の方法が提供される。
【００３８】
本目的のさらに別の１つによると、酵素切断部位におけるキメラ分子の切断の際に、成分分子の少なくとも２つが機能的に活性である上記の方法が提供される。
【００３９】
本目的のさらに別の１つによると、成分分子の少なくとも１つが、キメラ分子の切断の前に機能的に活性である上記の方法が提供される。
【００４０】
一実施形態において、上記の成分分子は、非阻害分子である。別の実施形態において、この成分分子は、非細胞傷害性分子である。特定の実施形態において、第１および第２の成分分子は、同一である。他の実施形態において、第１および第２の成分分子は、異なる。
【００４１】
本目的の別の１つによると、キメラ分子が、式：Ａ（ｘｉＢｉ）ｎを有する上記の方法が提供され、ここで、Ａは、第１の成分分子を表し、ｘは、リンカーを表し、Ｂは、第２の成分分子を表し、ｉおよびｎは、各々、正の整数である。
【００４２】
本目的の別の１つによると、式が、以下（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）からなる群から選択される上記の方法が提供される：
（ａ）Ａ（ｘ１Ｂ１）；
（ｂ）Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ここで、ｘ１およびｘ２は、同じであっても異なっていてもよく、そしてＢ１およびＢ２は、同じであっても異なっていてもよく、そしてＡは、Ｂ１およびＢ２と同じであっても異なっていてもよい）；
（ｃ）Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ここで、ｘ１、ｘ２およびｘ３は、同じであっても異なっていてもよく、そしてＢ１、Ｂ２およびＢ３は、同じであっても異なっていてもよく、そしてＡは、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３と同じであっても異なっていてもよい）；
（ｄ）Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）（ここで、ｘ１、ｘ２、ｘ３およびｘ４は、同じであっても異なっていてもよく、そしてＢ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、同じであっても異なっていてもよく、そしてＡは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４と同じであっても異なっていてもよい）；
（ｅ）Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）（ｘ５Ｂ５）（ここで、ｘ１、ｘ２、ｘ３、ｘ４およびｘ５は、同じであっても異なっていてもよく、そしてＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５は、同じであっても異なっていてもよく、そしてＡは、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５と同じであっても異なっていてもよい）。例えば、Ａは、産生宿主において高度に発現されるペプチドまたはポリペプチドであり、その結果、キメラ分子は、成分分子の生成の増加を容易にする。
【００４３】
本目的のさらに別の１つによると、第１の成分分子が、ペプチドもしくはタンパク質またはそれらの活性フラグメントであり、少なくとも１つの第２の成分分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、糖、合成ポリマー、植物産物、真菌産物、低分子薬物、検出可能な分子、ハプテン、リガンド、抗感染剤（ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ）ならびにそれらのアナログおよびフラグメントからなる群から選択される上記の方法が提供される。
【００４４】
本目的の１つによると、キメラ分子がポリタンパク質である上記の方法が提供される。
【００４５】
本目的のさらに別の１つによると、成分分子の少なくとも１つが、抗原、可溶性レセプター、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、酵素、抗感染剤、プロドラッグ、毒素およびそれらの活性フラグメントからなる群から選択される上記の方法が提供される。
【００４６】
本目的のさらに別の１つによると、成分分子の少なくとも１つが、可溶性ｐ７５ＴＮＦαレセプターＦｃ融合物、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α２ｂ、ペグ化（ＰＥＧ）インターフェロン−α、ＰＥＧ−アスパラガーゼ（ａｓｐａｒａｇａｓｅ）、ＰＥＧ−アダマーゼ（ａｄａｍａｓｅ）、抗ＣＯ１７−１Ａ、ヒルジン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、エリスロポイエチン、ヒトＤＮＡａｓｅ、ＩＬ−２、凝固因子ＩＸ、ＩＬ−１１、ＴＮＫａｓｅ、活性化タンパク質Ｃ、ＰＤＧＦ、凝固因子ＶＩＩａ、インシュリン、インターフェロンα−Ｎ３、インターフェロンγ１ｂ、インターフェロンαコンセンサス配列、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼおよびそれらの活性フラグメントからなる群から選択される上記の方法が提供される。
【００４７】
本牧的の別の１つによると、第１の成分分子が、ペプチド、タンパク質またはそれらの活性フラグメントであり、第２の成分分子が、キメラ化合物である上記の方法が提供される。代替の実施形態において、これらの成分分子の２つ以上または全てが、キメラ化合物（例えば、ホルモンまたは糖または低分子）である。このような例において、これらのキメラ化合物は、従来の技術を使用して、インビトロで本発明のリンカーと連結される。本目的の別の１つによると、成分分子の少なくとも１つが抗体である上記の方法が提供される。一実施形態において、第１の成分分子が、抗体またはその活性フラグメントであり、第２の成分分子が、抗体以外である上記の方法が提供される。別の実施形態において、第２の成分分子は、抗体またはその活性フラグメントであり、第１の成分分子は、抗体以外である。さらに別の実施形態において、第１および第２の成分分子は、各々、抗体またはその活性フラグメントである。
【００４８】
本目的の別の１つによると、成分分子の少なくとも１つが、抗微生物性ペプチド、タンパク質、それらのアナログまたは活性フラグメントからなる群から選択される上記の方法が提供される。一実施形態において、成分分子の少なくとも１つは、デフェンシン、リゾチームまたはラクトフェリンである。
【００４９】
本発明の別の１つの目的に従って、その成分分子のうちの少なくとも１つが、ペプチド、タンパク質、それらのアナログまたは活性フラグメントからなる群より選択され、これらがヒトまたは非ヒト動物のペプチド、タンパク質、それらのアナログまたは活性フラグメントである、上記の方法がさらに提供される。別の実施形態において、それらは、植物のペプチド、タンパク質、それらのアナログまたは活性フラグメントである。さらなる実施形態において、それらは、魚または微生物のペプチド、タンパク質、それらのアナログまたは活性フラグメントである。
【００５０】
なお別の１つの目的に従って、その成分分子のうちの少なくとも２つが、ペプチド、タンパク質、それらのアナログまたは活性フラグメントからなる群より選択される、上記の方法が提供される。
【００５１】
さらなる１つの目的に従って、そのペプチドが、ＩＧＦ−Ｉ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＴＦ、ＫＧＦ、ラクトフェリン、リゾチーム、フィブリノゲン、α１−アンチトリプシン、エリスロポエチン、ｈＧＨ、ｔＰＡ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、コンセンサスインターフェロン、インスリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ジフテリアタンパク質、および抗好血性因子からなる群より選択される、上記のペプチドが提供される。
【００５２】
別の１つの目的に従って、その成分分子の少なくとも１つがホルモンである、上記方法が提供される。一実施形態において、そのホルモンは、エストロゲン、テストステロン、およびプロゲステロンからなる群より選択される。
【００５３】
さらなる１つの目的に従って、その成分分子の少なくとも１つが、細胞傷害性化合物（例えば、タキソールまたはそのアナログもしくは誘導体）、酵素インヒビター（例えば、マトリクスメタロプロテイナーゼインヒビター）、および抗感染剤からなる群より選択される、上記方法が提供される。
【００５４】
なお別の１つの目的に従って、成分分子のうちの少なくとも２つが、ラクトフェリン／ラクトフェリン；ラクトフェリン／リゾチーム；リゾチーム／リゾチーム；ラクトフェリン／ＥＧＦ；ＥＧＦ／ＥＧＦ；ラクトフェリン／ＩＴＦ；ＩＴＦ／ＩＴＦ；ＩＴＦ／ＥＦＧ；ＥＧＦ／ＫＧＦ；ＫＧＦ／ＫＧＦ；ＩＴＦ／ＫＧＦ；ＫＧＦ／ＰＤＧＦ；ＰＤＧＦ／ＰＤＧＦ；α１−アンチトリプシン／ＭＭＰインヒビター；エストロゲン／プロゲステロン；抗体／抗体およびＩＴＦ／ＩＴＦ、またはそれらのアナログ、改変体もしくは誘導体からなる群より選択される、上記方法を提供する。
【００５５】
１つの目的に従って、キメラ分子がワクチンである、上記の方法が提供される。一実施形態において、そのキメラ分子は、成分分子のうちの１つとしてアジュバントを含む。別の実施形態において、そのワクチンは、病原性微生物の成分を含む。なお別の実施形態において、そのワクチンは、癌ワクチンであり、その成分分子は、癌細胞中で過剰発現される分子である。
【００５６】
１つの目的に従って、そのキメラ分子の投与が、診断、予防、治療、および栄養補給からなる群より選択される生物学的効果を達成する、上記方法が提供される。
【００５７】
別の１つの目的に従って、そのキメラ分子がさらなるペプチドの少なくともフラグメントをさらに含み、ここでこのポリペプチドが、生成宿主において高度に発現される、上記方法が提供される。
【００５８】
別の１つの目的に従って、そのキメラ分子がその生成宿主（例えば、酵母宿主、哺乳動物細胞宿主またはＥ．ｃｏｌｉ宿主）からのキメラ分子の分泌を指向するため、またはその生成宿主（例えば、植物宿主またはＥ．ｃｏｌｉ宿主）中でのそのキメラ分子の貯蔵を指向するためのリーダー配列をさらに含む、上記方法が提供される。
【００５９】
別の１つの目的に従って、そのキメラ分子が標的化分子を含む、上記方法が提供される。例えば、その標的化分子は、そのキメラ分子を、作用させるために処置される宿主中の特異的部位に指向し得る。
【００６０】
さらに１つの目的に従って、そのキメラ分子が精製タグをさらに含む、上記方法が提供され、ここでその精製タグは、生成宿主から生成された後に、そのキメラ分子のインビトロ精製を容易にする。
【００６１】
別の１つの目的に従って、そのリンカーが２つの切断部位、およびその切断部位の間にスペーサーを含む、上記方法が提供される。
【００６２】
なお別の１つの目的に従って、そのキメラ分子が食用生成物の成分である、上記方法が提供される。一実施形態において、その食用生成物は、乳、植物、種子（例えば、穀物種子）、微生物細胞（例えば、酵母または細菌（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ））、ならびにそれらの誘導体および抽出物からなる群より選択される。
【００６３】
別の１つの目的に従って、そのキメラ分子は、経口により、非経口により（例えば、静脈内に、皮下に、腹腔内に、経皮的に、心臓内に）または吸入により投与される、上記方法が提供される。
【００６４】
１つの目的に従って、そのキメラ分子が核酸分子ではない、上記方法が提供される。
【００６５】
１つの目的に従って、第１または第２の成分分子のうちの少なくとも１つが抗体またはその活性フラグメントであり、その抗体が抗ＩＬ８、抗ＣＤ１１ａ、抗ＩＣＡＭ−３、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗補体Ｃ５、抗ＴＮＦα、抗ＣＤ４、抗α４β７、抗ＣＤ４０Ｌ（リガンド）、抗ＶＬＡ４、抗ＣＤ６４、抗ＩＬ５、抗ＩＬ４、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ１４７、抗ＣＤ２５、抗β２インテグリン、抗ＣＤ１８、抗ＴＧＦβ２、抗第ＶＩＩ因子、抗ＩＩｂＩＩａレセプター、抗ＰＤＧＦβＲ、抗Ｆプロテイン（ＲＳＶ由来）、抗ｇｐ１２０（ＨＩＶ由来）、抗ＨｅｐＢ、抗ＣＭＶ、抗ＣＤ１４、抗ＶＥＦＧ、抗ＣＡ１２５（卵巣癌）、抗１７−１Ａ（結腸直腸細胞表面抗原）、抗抗イディオタイプＧＤ３エピトープ、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ；抗αＶβ３インテグリン、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２、抗ＨＬＡ、および抗ＨＬＡ  ＤＲまたはこれらの活性フラグメントからなる群より選択される、上記方法が提供される。
【００６６】
別の１つの目的に従って、その組成物が薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む、上記方法が提供される。
【００６７】
本発明の別の１つの目的に従って、キメラ分子を含む組成物、およびパッケージ挿入物を含むキットが提供され、ここでそのパッケージ挿入物は、組成物をヒトまたは非ヒトの処置される宿主へ投与するための指示書を含み、そのキメラ分子は、少なくとも１つの第１の成分分子、少なくとも１つのリンカー、および少なくとも１つの第２の成分分子を含み、ここでそのリンカーは、酵素切断部位を含み、少なくとも１つの第１のリンカーは、第１の成分分子および天然に存在しない結合を生成する第２の成分分子およびこの第１の成分分子と第２の成分分子との間の切断部位に作動可能に連結される；ここでその切断部位は、処置される宿主の酵素によってインビトロでの切断のために操作され、いずれの生成宿主における切断にも耐性である；ここでその切断部位でのキメラ分子の切断の際に、その成分分子のうちの少なくとも１つは、機能的に活性であり；その第１および第２の成分分子のうちの少なくとも１つは、ペプチド、タンパク質、またはそれらのアナログ、活性フラグメントもしくは誘導体からなる群より選択されるものを含む。
【００６８】
さらに１つの目的に従って、そのキメラ分子中に切断部位がインビボ（例えば、処置される宿主の胃腸管）での酵素による切断のために操作され、その酵素は、例えば、エンテロキナーゼである、上記キットが提供される。
【００６９】
別の１つの目的に従って、そのキメラ分子中の切断部位は、インビボでの、細胞外での（細胞表面または細胞表面以外のいずれかでの）切断のために操作される、上記キットが提供される。
【００７０】
なお別の１つの目的に従って、そのキメラ分子中の切断部位が処置される宿主における細胞内での（例えば、内因性の宿主酵素）切断のために操作される、上記キットが提供される。一実施形態において、そのキメラ分子は、タンパク質形質導入ドメインおよび細胞傷害性ドメインの組み合わせではない。
【００７１】
なお別の１つの目的に従って、そのキメラ分子中の切断部位が処置される宿主におけるインビボでの細胞内の切断のために操作され、その切断部位がウイルス病原体活性化切断部位ではない、上記キットが提供される。
【００７２】
別の１つの目的に従って、その切断部位が処置される宿主においてインビボでの細胞内の切断のために操作され、第２の成分分子が細胞傷害性分子以外である、上記キットが提供される。
【００７３】
本発明のなお別の１つの目的に従って、式：Ａ（ｘｉＢｉ）ｎを含むキメラ分子が提供され、ここでＡは、第１の成分分子を示し、ｘは、リンカーを示し、Ｂは、第２の成分分子を示し、ｉおよびｎは、各々正数であり、そしてここでキメラ分子は、少なくとも１つの第１の成分分子、少なくとも１つのリンカー、および少なくとも１つの第２の成分分子を含み；リンカー分子は、酵素切断部位を含み、少なくとも１つの第１のリンカーは、第１の成分分子および第２の成分分子に作動可能に連結されて、第１の成分分子と第２の成分分子との間に、天然に存在しない結合および切断部位を生成する；その切断部位は、宿主酵素によるインビボでの切断のために操作され、生成宿主における切断に感受性でない；ここでその切断部位でのキメラ分子の切断の際に、少なくとも１つの成分分子は、機能的に活性であり；そして第１の成分分子および第２の成分分子のうちの少なくとも１つは、ペプチド、タンパク質、またはそのアナログもしくは活性フラグメントもしくは誘導体からなる群より選択されるものを含む。
【００７４】
なお別の１つの目的に従って、上記式が、以下：
（ａ）Ａ（ｘ１Ｂ１）；
（ｂ）Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ここでｘ１およびｘ２は、同じであっても異なっていてもよく、Ｂ１およびＢ２は、同じであっても異なっていてもよい）；
（ｃ）Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ここでｘ１、ｘ２およびｘ３は、各々同じであっても異なっていてもよく、Ｂ１、Ｂ２およびＢ３は、各々同じであっても異なっていてもよい）；
（ｄ）Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）（ここでｘ１、ｘ２、ｘ３およびｘ４は、各々同じであっても異なっていてもよく、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、各々同じであっても異なっていてもよい）；ならびに
（ｅ）Ａ（ｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）（ｘ５Ｂ５）（ここでｘ１、ｘ２、ｘ３、ｘ４およびｘ５は、各々同じであっても異なっていてもよく、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４およびＢ５は、各々同じであっても異なっていてもよい）、
からなる群より選択される上記のキメラ分子が提供される。
【００７５】
別の１つの目的に従って、そのキメラ分子がポリタンパク質である、上記キメラ分子が提供される。
【００７６】
さらに１つの目的に従って、上記のキメラ分子をコードする核酸分子が提供される。本発明のさらなる局面において、そのキメラ分子をコードする核酸分子を含むベクターが提供される。
【００７７】
上記の核酸分子を含む宿主細胞がさらに提供される。
【００７８】
本発明のさらに別の１つの目的に従って、処置される宿主に投与するための、生成宿主中でキメラ分子を調製する方法が提供され、この方法は、（ａ）キメラ分子をコードする核酸を提供する工程；（ｂ）生成宿主をその核酸で形質転換する工程；（ｃ）その生成宿主のキメラ分子を生成させる工程；（ｄ）そのキメラ分子をその生成宿主から回収する工程；ならびに（ｅ）その採取したキメラ分子に対する品質管理を行って、処置される宿主に対する投与のための当局の承認を満たす工程、を包含する。
【００７９】
別の１つの目的に従って、その生成宿主が細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉを含む）；真菌細胞（酵母またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを含む）；植物細胞；植物種子（穀物（例えば、コメ、コムギ、ライ麦、オート麦、およびオオムギ）を含む）；哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）；昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）；植物（例えば、タバコ植物）；および動物（例えば、トランスジェニックウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタ）からなる群より選択される、上記キメラ分子の調製の方法が提供される。
【００８０】
なお別の１つの目的に従って、処置される宿主に投与するための、上記のキメラ分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物が提供される。
【００８１】
別の１つの目的に従って、その切断部位が、例えば、その酵素がエンテロキナーゼの場合、処置される宿主の胃腸管での処置される宿主の酵素による切断のために操作される、上記組成物が提供される。別の実施形態において、その切断部位は、炎症部位における（例えば、滑膜における）、または腫瘍部位における（例えば、胃癌）切断のために操作される。
【００８２】
別の１つの目的に従って、その組成物がカプセル化される、上記方法が提供される。
【００８３】
特に、本発明は、先行技術において開示される方法でもなく、組成物でもないが、このようなものの改善または改変であり得る。
【００８４】
本発明の他の目的、特徴および利点は、本明細書中の説明を読めば、当業者に明らかになる。このような他の目的、特徴および利点は、本発明の一部と見なされる。
【００８５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中の技術用語は、これらの用語が当該分野で従来使用されているように理解されるべきである。この点に関して、使用され得る専門辞書としては、以下が挙げられる：Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより発行，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９））；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により発行，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９））；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により発行，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−８））。さらに、生物工学の用語の定義は、ウェブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｔｅｃｈｔｅｒｍｓ．ｏｒｇ）を介してアクセスされ得る。本発明のよりよい理解のために、以下の用語は、以下の特定の意味を有するものとする：
用語「活性フラグメント」または「生物学的に活性なフラグメント」とは、生物学的活性を有するかまたはこのような活性に関与する能力を有する分子（例えば、タンパク質、核酸分子、または抗体）の一部を意味し、これらのフラグメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、診断目的で、別の分子に特異的に結合する能力（例えば、抗体／抗原反応またはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションもしくはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションにおいて）、酵素活性を有する、酵素認識部位を有する、酵素基質として作用し得る、抗原または免疫原として作用する能力、リガンドまたはレセプターと相互作用する能力、ならびに他の生物学的に活性な分子を阻害する能力。このようなフラグメントは、天然に存在する核酸、ポリペプチド、または抗体の活性に類似であるが、必ずしも同一ではない活性を示し得る。本明細書中のフラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性または減少された所望でない活性を含む。抗体の活性なフラグメントの例は、例えば、免疫グロブリンのＦｃフラグメントもしくはＦａｂフラグメント、または免疫グロブリンの重鎖の可変領域もしくは軽鎖の可変領域である。
【００８６】
用語「アナログ」とは、比較される分子に対して少なくとも約７０％の配列相同性を有する分子を意味する。分子とその対応するアナログとの間の差異としては、例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：保存的アミノ酸変化またはその対応するコドン変化；例えば、１つ以上のジスルフィド結合部位を排除するための、１以上のアミノ酸残基またはその対応するコドンの欠失；例えば、細菌発現を補助するための、メチオニンのようなアミノ酸またはそのコドンの付加；その化学的分子の結合に影響を及ぼさない化学分子の側鎖における保存的変化（例えば、メチル基からエチル基、プロピル基またはブチル基への変化）；あるいはこのような他の類似の例。
【００８７】
用語「抗体」とは、ヒトまたは非ヒト動物において天然に見出されるかまたは誘導される抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、およびそれらのフラグメント（例えば、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントまたはＦｃフラグメント、または重鎖もしくは軽鎖の可変領域）をいう。
【００８８】
用語「抗感染剤」は、細胞増殖抑制性または細胞殺傷性のいずれかの活性を有し、直接的な細胞増殖抑制効果または細胞殺傷効果を有する分子の生成を誘導することによって、直接的または間接的のいずれかで作用する、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および他の抗病原体分子もしくは化合物を含む。抗感染剤の例は、ディフェンシンであるが、これに限定されない。
【００８９】
抗体結合の状況において用語「特異的に結合する」とは、抗体の特定のポリペプチドへの、またはより正確には、特定のポリペプチドの特定のエピトープへの、高い結合能および／もしくは高い親和性結合をいう。このような特定のエピトープへの抗体結合は、代表的には、同じ抗体の、任意の他のエピトープまたはこのような特定のエピトープを含まない任意の他のポリペプチドへの結合より強い。このような特定の抗体は、代表的には、特定のポリペプチドを動物に注射して、このような抗体の生成を誘発することによって生成される。このような特異的抗体は、１週間で、検出可能なレベル（例えば、特定のポリペプチドに対して示される結合の１０％未満）ではあるが、他のポリペプチドに結合し得る。このような弱い結合は、例えば、適切なコントロールの使用によって、特異的抗体結合から容易に認識可能である。一般に、本発明の抗体は、１０−７Ｍ以上、好ましくは、１０−８Ｍ以上（例えば、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍなど）の結合親和性で、特定のポリペプチドに特異的に結合する。
【００９０】
分子に関連する用語「生物学的活性」としては、以下が挙げられる：分子が検出される能力、従って診断活性；分子がワクチンまたはアジュバントとして作用する能力、従って、予防活性；分子が疾患または状態を処置するための治療剤として作用する能力、従って、治療活性；その分子が微生物（例えば、細菌、ウイルス、真菌、プリオン、寄生生物など）の成長または増殖を阻害する能力、従って、抗感染活性；分子が食品の栄養価を増す能力、従って、栄養活性；およびその分子が、他の生物学的反応（例えば、酵素反応；免疫学的（例えば、抗体−抗原結合）結合活性、リガンド−レセプター結合活性）に、またはシグナル伝達反応に関与する能力、ならびにこのような類似の活性。
【００９１】
用語「生物学的効果」とは、例えば、診断効果、予防効果、治療効果、抗感染効果、栄養補給効果、および従来から理解されているような他の生物学的効果を含む、任意の生物学的活性の結果をいう。
【００９２】
用語「内因性の処置される宿主の分子」または「内因性の処置される宿主の酵素」とは、処置される宿主のゲノムによってコードされる分子または酵素をいう。
【００９３】
「発現カセット」は、組換えまたは合成で生成される核酸構築物であり、宿主発現系において１つ以上の組換えポリペプチドを生成するために転写または翻訳され得る一連の特異的な核酸エレメントを含む。この発現カセットは、プラスミドまたはウイルスベクター内に組み込まれて、例えば、発現ベクターを形成し得、または宿主染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸フラグメント中に、例えば、粒子衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によって統合され得る。代表的には、発現カセットは、とりわけ、プロモーター、転写開始、翻訳開始、目的の異種遺伝子、翻訳ターミネーターおよび転写ターミネーターを含む。必要に応じて、発現カセットは、１つ以上の選択マーカーを含み得る。
【００９４】
「発現ベクター」は、宿主細胞中の異種ＤＮＡまたは異種ＲＮＡの発現のための発現カセットを含み、またはその使用に適切なベクターをいう。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターは、市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識内である。必要に応じて、発現ベクターは、発現ベクターを含む宿主細胞の選択のための１つ以上の選択マーカーを含み得る。
【００９５】
用語「細胞外の」は、本発明のキメラ分子の切断に関する場合、例えば、胃腸官中で、血液中で、リンパ液中で、腹膜液中で、間質液中で、髄液中で、滑液中で、膣液中で、または肺液中でおよびこのような類似の空間でのような処置される宿主の細胞の外側のキメラ分子の切断をいう。
【００９６】
用語「細胞内の」は、本発明のキメラ分子の切断に関する場合、処置される宿主中の細胞内のキメラ分子の切断をいう。
【００９７】
食用に適する産物に関して、用語「微生物細胞」は、ヒトまたは動物の消費のために認可されている酵母やＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのような微生物を含む。
【００９８】
用語「微生物タンパク質」は、微生物から得られるタンパク質から誘導されるか、またはそれらのタンパク質に実質的に同一なタンパク質を意味する。この微生物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：細菌、ウイルス、真菌、プリオン、他の単細胞生物、寄生生物、およびこのようなアナログ。
【００９９】
用語「分子」は、天然に存在するかまたは合成により作製される任意の化合物またはその塩を含み、そしてペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質を含むタンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸、炭水化物、植物産物のような天然の産物、合成ポリマーおよびフラグメントを含む他のポリマー、ホルモン、タキソールのような化学化合物、そのアナログまたは誘導体、その組み合わせならびにアナログを含む。
【０１００】
用語「天然に存在する」は、人間の手の介入の結果ではない形態において天然に存在する任意の分子をいう。
【０１０１】
用語「作動可能に結合する」は、キメラ分子中の成分分子と切断部位との間の結合を参考として用いられる場合、成分分子が、例えば、切断部位にてキメラ分子の切断のときに、構成成分分子が１つ以上の生物学的活性を示し得るような様式で結合されることを意味する。
【０１０２】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で用いられる場合、キメラ分子またはキメラ分子を含む組成物の送達の様式について適切であるキャリアを意味する。例えば、非経口投与のために、受容可能なキャリアが生理食塩水であり得；経口投与のために、受容可能なキャリアが米、ミルクおよび野菜などのようなキメラ分子を含むように遺伝的に設計される食物産物であり得、ここで食物産物は、処理されるかまたは、抽出され得る。薬学的に受容可能なキャリアは一般に、無毒の固体、半固体もしくは液体フィルター、希釈液、カプセル化物質または任意の従来の型の処方補助物である。これは、使用される投薬量および濃度にてレシピエントに無毒であり、処方の他の成分と適合可能である。例えば、ポリペプチドを含む処方のためのキャリアは、好ましくは酸化剤およびポリペプチドの半減期または保存期間に有害であることが公知である他の化合物を含まない。適切なキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：水、デキストロース、グリセロール、生理食塩水、エタノール、およびこれらの組み合わせ。キャリアは、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、または処方の効力を高めるアジュバンドのようなさらなる薬剤を含み得る。抗酸化剤、湿潤剤、粘度安定化剤、および類似の薬剤のような他の物質が、必要ならば加えられ得る。Ａｚｏｎｅのような経皮浸透エンハンサーがまた、含まれ得る。本明細書中で経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放処方物または粉末を形成し得る。
【０１０３】
本明細書中で使用するのに適切な用語「薬学的に受容可能な塩」は、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）ならびに無機酸（例えば、塩酸またはリン酸のような）または有機酸（酢酸、マンデル酸、蓚酸および酒石酸）と共に形成されるものを含む。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄（ＩＩＩ）のような無機の塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミンなどのような有機の塩基から誘導され得る。
【０１０４】
食用可能な産物に関する用語「植物」は、野菜および穀物（ｇｒａｉｎ）（例えば、穀物（ｃｅｒｅａｌ  ｇｒａｉｎ）、代表的には、米、小麦、大麦、トウモロコシ、キビ、モロコシおよびカラスムギのような）を含む。
【０１０５】
用語「ポリペプチド」は、グリコシル化を経るような、「産生宿主」によって翻訳後にさらに修飾されていてもいなくても良く、またはポリエチレングリコールを含むような合成ポリマーの化学的付加によりインビトロで修飾されていてもいなくても良い、アミノ酸のポリマーである「分子」である。用語「ポリペプチド」および「ポリペプチド組成物」は、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アナログ、および活性フラグメントまたはその誘導体をいうために使用される。
【０１０６】
用語「産生宿主」は、本発明のキメラ分子を産生するための宿主系をいう。このような宿主系は、キメラ分子およびその所産（ｐｒｏｇｅｎｙ）をコードする任意の組換えベクター（単数または複数）、プラスミド、または単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得、またはそうであった、インビボまたはインビトロのどちらでもよい宿主細胞を含む。
【０１０７】
用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」の同義語であり得、または、さらに、２つ以上のポリペプチドの複合体をいい得、一次構造、二次構造または三次構造であり得る。
【０１０８】
用語「標的酵素」は、本発明のキメラ分子の切断部位がこのために設計されている酵素をいう。例えば、本明細書中のキメラ分子がエンテロキナーゼのための切断部位を有して設計されている場合、「エンテロキナーゼ」は、標的酵素である。
【０１０９】
用語「処置される宿主」は、本発明のキメラ分子の送達が意図され、その結果診断的、予防的、治療的または栄養的効果を含む生物学的効果を生成する宿主を言う。このような処置される宿主としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト、非ヒト動物（例えば、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヤギおよびウマを含む）およびペット（例えばイヌやネコのような）；ならびにげっ歯類；非ヒト霊長類；鳥（例えばニワトリ）；植物；微生物；寄生生物；および魚のような）。「処置される宿主」とは、２つの宿主（例えば、微生物（本明細書中以後、「標的化された微生物」）に特異的な切断部位を含むキメラ分子が被験体に投与され、微生物が被験体のＧＩ管中を介して通過するような）を含み得る。キメラ分子は、標的微生物によって細胞内で切断され得るか、または被験体の酵素である「処置される宿主」酵素による切断のための標的化微生物によってインタクトに放出され得る。例えば、キメラ分子が、例えば切断において活性化される緑蛍光タンパク質のような検出可能なシグナルを有する場合、緑蛍光タンパク質の存在が、ヒトの消化器官における微生物の存在を指示する。用語「個々の」、「被験体」、「患者」および「処置される宿主」が、本明細書中で交換可能に使用される。
【０１１０】
本発明がさらに記載される前に、本発明が、当然変わり得るような、記載される特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲は添付される特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書中で使用される専門用語が、特定の実施形態の記載の目的のみであって、限定が意図されないことが、理解されるべきである。
【０１１１】
値の範囲が提供される場合、文脈が明らかに他を指示しない限り、その範囲の上限と下限の間の下限の単位の十分の一までの各々の介在値および述べられた範囲における他の全ての述べられた値または介在値が、本発明中に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲に独立して含まれ得、そしてまた述べられた範囲における任意の特異的に除外される限界を受けて、本発明中に包含される。述べられた範囲が限界の１つまたは両方を含む場合、これらの限界のいずれかまたは両方を除外する範囲はまた、本発明中に含まれる。
【０１１２】
本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「ポリペプチド」、「ポリヌクレオチド」、「キメラ分子」および「分子」のような用語の単数形が、文脈が明らかに他を指示または規定しない限り、対応する複数形を含む。例えば、「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、複数形のポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含み、「薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」への言及は、１つ以上の薬剤（ａｇｅｎｔｓ）を含む。
【０１１３】
本明細書中で考察される出版物は、本願の出願日の前の開示のためのみに提供される。本明細書中で、本発明が以前の発明のためにこのような出版を早めるために表題化されていないという承認として解釈されるべきものはない。さらに、提供される出版日は、別個に確認する必要があり得る実際の出版日と異なり得る。
【０１１４】
以下に記載される本発明は、例のために与えられ、本発明を限定するような任意の方法において解釈されるべきではない。
【０１１５】
本明細書中の発明者は、２つ以上の成分分子が、宿主（すなわち、「処置される宿主」）への投与のために、１つ以上の切断部位を含む１つ以上のリンカーの使用によって、有利に組み合わせることで天然に存在しないキメラ分子を形成し得、ここで成分分子は、処置される宿主中に存在する酵素のような切断分子によって放出され得ることを発見した。本明細書中のキメラ分子は、好ましくは、処置される宿主における所望の位置にて構成成分部分に切断可能であるような様式で設計され、切断部位においてまたは近接部位にてのいずれかで生物学的効果を達成する。キメラ分子の切断は、例えば胃腸管（ＧＩ）における、滑液中における、または細胞内のような処置される宿主中の実質的に制限された領域において起こり得るか、または血液もしくは他の体液中のように全身的に起こり得る。キメラ分子の切断は、処置される宿主中において機能的である成分分子を放出する。このような成分分子は、キメラ分子の切断の前に活性であってもなくても良い。本発明の１つの実施形態において、キメラ分子における少なくとも１つの成分分子が、ペプチド、ポリペプチドまたはその活性フラグメントである。
【０１１６】
従って、本発明は、処置される宿主に成分分子を送達し、そこにキメラ分子を投与することによってそこでの生物学的効果を達成する方法を含み、各々のキメラ分子は少なくとも２つの成分分子を含み、その各々は、処置される宿主中の切断分子によって切断のための１つ以上の切断部位を含むリンカーによってもう１つの成分分子と結合される。本発明は、キメラ分子、このような核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞などをコードする核酸分子、キメラ分子またはコードする核酸分子を含むキットおよび組成物、ならびにこれらを作製および使用する方法を含む。特に、本発明のキメラ分子は、天然に存在しない。
【０１１７】
最も単純な構成において、本発明のキメラ分子は、以下の式を有する：「ＡｘＢ」。ここで「Ａ」は、第１の成分分子であり、「Ｂ」は、第２の成分分子であり、「ｘ」は、１つ以上の切断部位を含むリンカーである。しかし、本発明のキメラ分子は、「ＡｘＢ」に限定されず、以下の式を有するキメラ分子を含む：「Ａ（ｘｉＢｉ）ｎ」。ここで、「ｉ」および「ｎ」は、各々正の整数であり、「ｘＢ」は、第一に繰り返され得る単位である（本明細書中以後、「繰り返し」）。従って、例えば、本発明のキメラ分子は、以下の式を有するキメラ分子を含む：（Ａｘ１Ｂ１）または（Ａｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）。必要に応じて、キメラ分子は、合理的に作製され得、かつ投与され得る（ｘＢ）単位の繰り返しの任意の数を含む（Ａｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）、（Ａｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）、または（Ａｘ１Ｂ１）（ｘ２Ｂ２）（ｘ３Ｂ３）（ｘ４Ｂ４）（ｘ５Ｂ５）の式を有し得、ここで各々の「Ｂ」は同じでも違っていても良く、さらに「Ａ」と同じでも違っていても良く；そして各々の「ｘ」は、同じでも違っていても良い。いくつかの実施形態において、繰り返しを形成する成分分子Ｂは、小さい。例えば、分子が、小さなペプチドである場合、この小さなペプチドは、単独で投与される場合、迅速に分解される；例えば、ディフェンシンまたは腸内トレフォイル因子（「ＩＴＦ」）のような抗感染性のペプチドのようなもの。さらに、キメラ分子における全ての切断部位に対して、同時にまたは完全に切断されることは、必要ではない。１つ以上の成分分子が、キメラ分子から切断され得る一方、他の成分分子は、残るキメラ分子の一部として残っている。１つの例として、本明細書中のキメラ分子は、切断されていない形態または部分的に切断された形態において、細胞外マトリックスのような組織と結合し得、そして成分分子は、その位置における特定の酵素レベルが高い場合、その時々にそこから放出され得る。さらに、成分分子は、このような成分分子の活性部位が他の分子と自由に相互作用する限りは、切断されることなく他のキメラ分子に一部として活性であり得る。
【０１１８】
本発明は、処置される宿主における所望される位置での切断に対して設計される切断部位を有するキメラ分子を含む。例えば、本明細書中のキメラ分子は、処置される宿主のＧＩ管における酵素によって切断されるように設計され、そこでの活性（例えば、抗感染性活性）のために成分分子を放出し得る。この実施形態の適用が、本発明のキメラ分子を含む動物またはニワトリのえさを提供し、抗生物質を使用することのない抗感染性活性を提供する。この適用はヒトに対しても有用であり、特に乳、乳製品、果物、穀物、肉およびジュースのような乳児食の場合に有用である。このような場合において、キメラ分子は、ＧＩ管における１つ以上の酵素についての１つ以上の切断部位（例えば、エントロキナーゼ切断部位のような）を有するリンカーを用いて構築される。エンテロキナーゼ認識部位または切断部位を表すアミノ酸配列は、公知であり、一般に以下のアミノ酸配列によって表される：−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−。エンテロキナーゼ切断部位を有するキメラ分子は、任意の数の適切な宿主発現系（「産生宿主」）において組換え技術を使用して従来の方法において作製され得る。このような１つの例が、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｎｋｅｒｓ」と題される米国特許第４，７６９，３２６号またはその対応する欧州対応物ＥＰ００３５３８４号に記載される。エンテロキナーゼに加えて、ＧＩ管におけるキメラ分子の切断のために、他のＧＩ管酵素のための切断部位を含むリンカーが、使用され得る。
【０１１９】
本発明のキメラ分子のリンカーへの組み込みのために適切な切断部位の型が、図１に例示されるような特定の処置される宿主酵素（本明細書中以後、「標的酵素」）によって切断され得る特定の型を含む。処置される宿主に対して内因性である宿主および感染性病原体によって導入され得る宿主を含む、処置される宿主中に含まれる全てのプロテアーゼと共に開始して、本明細書中の使用のために適切な切断部位は、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼに対する基質を除外し、特異的でないものを除外する。しかし、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼのようなあまり特異的でないエンドペプチダーゼの、本明細書中での使用が見出される。本発明の１つの実施形態において、切断部位は、エンドペプチダーゼに対する基質である切断部位を含む。本発明の１つの局面において、本明細書中で適切な切断部位は、細胞内酵素に対する基質である切断部位を含む。本発明の別の局面において、切断部位は、細胞外酵素に対する基質である切断部位を含む。本発明のさらなる局面において、切断部位は、細胞表面にて活性である酵素に対する基質である切断部位を含む。特に、標的酵素は、構成的に発現されるか、または誘導性である。これらは全身的にまたは局所的にのいずれかで循環する。
【０１２０】
本発明はさらに、処置される宿主において細胞内切断のために設計される切断部位を有するキメラ分子を含む。本発明の１つの局面において、切断部位は、処置される宿主に対して内因性である細胞内酵素による切断について設計される。本発明の別の局面において、内因性であるか否かに関わらず、切断部位は、処置される宿主中の細胞内に存在する任意の酵素による切断のために設計されるが、但し、キメラ分子が、形質導入ドメインおよび細胞傷害性ドメインからなる組み合わせでなく、または第２の成分分子が、細胞傷害性分子ではない。本発明の別の局面において、切断部位は、処置される宿主において細胞内での切断について設計され、または操作されるが、但し、切断部位が処置される宿主細胞に感染する病原体由来の病原体活性化切断部位ではない。従って、例えば本発明の切断部位が、酵素について設計され、処置される宿主中に別個に誘導されまたは導入され得る。
【０１２１】
本発明はまた、上記のような構造を有し、しかし酵素が宿主に対して内因性であるか否かに関わらず、宿主中に構成的に発現されるか、または宿主中で誘導性である処置される宿主中の細胞外での酵素による切断について設計される切断部位を有する、キメラ分子の投与を含む。細胞外切断は、例えば任意の体液中におけるような、宿主中の任意の場所で起こり得る。任意の体液としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：リンパ液、血液、髄液、腹膜液、滑液、膣分泌液および肺液。細胞外切断は、細胞の表面上の切断であり得る。従って、本発明は、処置される宿主中の細胞表面にて酵素による切断について設計される切断部位を有するリンカーを含むキメラ分子を含む。
【０１２２】
本発明を考慮して、処置される宿主の内側の所望の位置での切断のための本明細書中のキメラ分子における用途のために、適切な酵素切断部位およびそれに対する配列を選択することは、当業者の技術の範囲内である。酵素およびその切断部位に関する情報は、多くのソースから入手可能である。例えば、ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｅｎｚｙｍｅ−ｓｅａｒｃｈ−ｃｌ）は、酵素分類の定義のリストを示す。例として、分類「３．４．−．−」は、酵素「ペプチド結合に作用する（ペプチド加水分解酵素）」である。分類「３．４．２４．−」は、「メタロエンドペプチダーゼ」である。さらに、例えば、「３．４．２１．９エンテロペプチダーゼ」へのリンクをクリックすると、この酵素についての詳細な情報を与える次のページを開く。代替的な名前として「エンテロキナーゼ」を提供する。これは、反応が触媒されると、「トリプシノーゲンの−Ｌｙｓ−／−Ｉｌｅ結合の選択的な切断」に特定化する。この酵素に関するＭｅｄｌｉｎｅにおける文献への参照を提供する。別の例において、「３．４．２１．３８第ＸＩＩａ凝固因子」へのリンクをクリックすると、第ＸＩＩａ凝固因子についての代替的な名前としてＨａｇｅｍａｎ因子を列挙し、そして、反応触媒として「第ＶＩＩ因子のＡｒｇ−／−Ｉｌｅ結合を選択的に切断し、第ＶＩＩａ因子および第ＸＩ因子を形成し、そして第ＸＩａ因子を形成する」と記載する次のページを開く。
【０１２３】
酵素およびその切断部位についての別の参照源は、ＡＨＦＳ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ，Ｉｎｃ．（７２７２  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８１４，ＵＳＡ）から毎年出版される）である。例えば、「２０：４０  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  １４７７頁」には、血栓溶解剤としてＡｌｔｅｐｌａｓｅが列挙され、これは、「酵素ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の生合成（組換えＤＮＡ起源）型」である。さらに、「内因性（［ｅ］ｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ヒトｔ−ＰＡが、いくつかの内因性プロテアーゼ（プラスミン、組織カリクレイン、活性化因子Ｘ（因子Ｘａ）およびトリプシンを含む）によって、アルギニン２７５−イソロイシン２７６ペプチド結合で切断され、２本鎖誘導体を形成し得る１本鎖ポリペプチドとして分泌される」。
【０１２４】
さらに、刊行された文献（例えば、政府のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ））を介して入手可能であるものは、本発明のキメラ分子における使用のための酵素および切断部位についての情報の別のソースである。例えば、検索用語として「関節炎」および「プロテアーゼ」と入力すると、件名として２０００以上の論文が見出され得る。マトリクスメタロプロテイナーゼ３（「ＭＭＰ−３」、「ストロメリシン−１」としてもまた公知）が、Ａｉｇｎｅｒ，Ｔ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４４（１２）：２７７７−８９（２００１年１２月）に記載されるように、正常な状態および初期の変形性骨関症の悪化段階において強く発現しており、かつＭＭＰ−２およびＭＭＰ−１１が後期の疾患においてアップレギュレートされていることに直ちに気付き得る。さらに、カテプシンＫはまた、潜在的なアグリカン分解活性を有するので、滑膜線維芽細胞において高度に発現していることが見出されており、そして、カテプシンＫを生成するアグリカン切断産物は、Ｈｏｕ  Ｗ．Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９（６）：２１６７−７７（２００１年１２月）に記載されるように、カテプシンＫのコラーゲン溶解活性を特に増強することが見出された。従って、本発明のキメラ分子への取り込みのために適切に処置される宿主酵素切断部位の同定は、当業者の技術範囲内である。
【０１２５】
さらなる例として、Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２４）：１８５６６−１８５７３（２０００年６月１６日）は、アグリカンの切断、組換え型ヒトアグリカナーゼ（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）−１（「ＡＤＡＭＴＳ−４」）による、関節疾患における測定可能な損失を経験する第１のマトリクス成分である軟骨の主要なプロテオグリカンを開示する。アグリカナーゼ−１およびアグリカナーゼ−２（「ＡＤＡＭＴＳ−１１／５」）は亜鉛−結合メタロプロテアーゼのアダマリシン（ａｄａｍａｌｙｓｉｎ）ファミリーのメンバーである。Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａらは、Ｐ１位のグルタミン酸残基を含有する全ての部位、および、Ｐ１’位の非極性または無電荷の極性残基（アラニン、ロイシン、またはグリシン）のいくつかの部位で、組換え型ヒトアグリカナーゼ−１がアグリカンを切断すると報告した。最も効率的な切断部位は、分子のＧ２−Ｇ３ドメインにおけるＧｌｕ１６６７−Ｇｌｙ１６６８結合であった。分子のＧ１フラグメントはさらに、Ｇｌｕ１４８０−Ｇｌｙ１４８１において切断され、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４での切断はよりゆっくりと生じた。さらに、著者らは、アグリカナーゼ−１およびアグリカナーゼ−２が、Ａｓｎ３４１−Ｐｈｅ３４２部位を切断せず、マトリクスメタロプロテイナーゼ（「ＭＭＰ」）部位においてもまた切断することなく、アグリカナーゼ−１がアグリカナーゼＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位において切断することが示されている、今日までの唯一の酵素であることを報告した。著者らはさらに、他の研究が、２つのプロテアーゼ（ＭＭＰ−８およびアトロリシン（ａｔｒｏｌｙｓｉｎ）−Ｃ）がアグリカナーゼＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４部位において切断し、また、Ａｓｎ３４１−Ｐｈｅ３４２ＭＭＰ部位において切断したことを示していると報告した。それ故、関節炎の処置のために滑膜の流体に成分分子を送達するためのリンカーのデザインにおいて、例えば、Ｇｌｕ−Ａｌａ配列が、Ｐ１位にグルタミン酸残基を、かつＰ１’位に非極性残基または無電荷の極性残基（アラニン、ロイシン、またはグリシン）を伴って本発明のリンカーに組み込まれ得るか；または、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ配列が用いられ得る。
【０１２６】
切断部位として本発明のキメラ分子に含まれ得る標的酵素の例は、多数あり、当業者に公知である。いくつかの例が表１で示され、そして、これらとしては以下が含まれるがこれらに限定されない：エンテロキンナーゼ（消化管で活性）；第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子および第ＸＩＩａ因子のような凝固因子（血液で活性）；ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−５（アグリカナーゼ−１、アグリカナーゼ−２）（関節、心臓、脳、肺で活性）；トロンビン（血液で活性）；プラスミン（血液で活性）；因子Ｄ、Ｃｌｒ、Ｃ３／Ｃ５変換酵素のような補因子（血液で活性）；ガストリン（胃で活性）；エラスターゼおよびＰＲ−３のような顆粒プロテアーゼ（好中球および白血球で活性、かつ活性形態として分泌される）；ＭＭＰ−２（乳癌および前立腺癌でならびに損傷した肝臓でアップレギュレートされる）、ＭＭＰ−７（Ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ、結腸のようなリンパ腺の上皮で活性、腫瘍でアップレギュレートされる）、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１３（ＭＭＰ−１１およびＭＭＰ−１３は、乳癌においてアップレギュレートされる）のようなマトリクスメタロプロテイナーゼ（「ＭＭＰ」、その大部分がチモーゲンとして分泌される）；ＭＴ−１、ＭＴ−２、ＭＴ−３およびＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−２４のような膜型ＭＭＰ（細胞表面において活性な膜貫通タンパク質；いくらか減らされるが、転移でアップレギュレートされる）；ＴＭＰＲＳＳ−２、ＴＭＰＲＳＳ−４およびＭａｔｒｉｐｔａｓｅのようなＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（細胞表面において活性で、腫瘍においてアップレギュレートされる膜貫通タンパク質）；およそ３０のディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）のＡＤＡＭファミリー、ならびにＡＤＡＭ−１０、ＡＤＡＭ−１７およびＴＡＣＥ（ＴＮＦ変換酵素）を含むメタロプロテイナーゼ（たいていの組織で発現され；原形質膜において活性）；ネプリリシン（ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）（正常な肝臓細胞および腫瘍性の肝臓細胞において発現される；原形質膜において活性）、カテプシンＫ（滑膜線維芽細胞によって分泌される）、肥満細胞トリプターゼ（喘息で活性化される）ならびに組織型プラスミノーゲンアクチベーター。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本発明のキメラ分子の切断部位は、プロテアーゼのための基質である切断部位のみではなく、グリコシダーゼおよびへパラナーゼのような他の酵素のための基質である切断部位を含む。
【０１２８】
別の実施形態において、キメラ分子の中に操作された酵素切断部位は、疾患、ストレス、病原性、アレルギー、早産または老人の状態および処置を必要としている他の状態の下で発現されるか、または高められるために酵素について設計される。
【０１２９】
本発明のリンカーは、１つまたは１つ以上の酵素切断部位を有する。本明細書中のリンカーは、例えば、切断のためにもっと良く酵素に切断部位を曝露するように、有利にスペーサー分子を含み得る。従って、１つの実施形態において、本発明はもっと良く酵素処置に切断部位を曝露するために、リンカーにスペーサーを含む。このような例において、リンカーは、それ自身の上に折り畳まれる傾向がない一連のランダムなアミノ酸残基であり得る。従って、これらのアミノ酸残基は、例えば親水性アミノ酸分子の鎖であり得る。さらに、スペーサーが使われるとき、本発明は必要に応じてリンカーに別の切断部位の追加を含んでもよく、その結果、スペーサーが切断部位とともに切断され、適切であるかまたは天然のＣ末端もしくはＮ末端あるいは適切な活性フラグメントを有する成分分子を生成し得る。
【０１３０】
リンカーのそれぞれの側の成分分子が切断前に、良好なプロテアーゼアクセス能のために活性である、本発明の１つの局面において、本明細書中のリンカーは、必要に応じて約１０〜２０個のアミノ酸残基、より好ましくは、約１１〜１７個のアミノ酸残基（本明細書中以下、「スペーサー」）を含む。例えば、本発明のキメラ分子は、スペーサーが以下のようなアミノ酸配列を含む場合、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとの間のスペーサーを含み得る：タンパク質Ｘ−ＡＳＧＧＧＧＩＥＧＲＧＧＧＧＳＡ−タンパク質Ｙ（太字かつ下線を付した配列は、第Ｖａ因子の切断部位を表し、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙは成分分子である）。従って、成分分子の活性を維持しつつ、切断酵素への切断部位の曝露を確証するために、さらなるアミノ酸が、キメラ分子における酵素切断部位の上流および／または下流に組み込まれ得る。このようなアミノ酸の例は、当該分野で公知であり、例えば、Ｈｏｓｆｉｅｌｄ，Ｔ．およびＬｕ，Ｑ．、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ（Ａｓｐ）４Ｌｙｓ  ｏｎ  Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ａ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：１０〜１６（１９９９）を参照のこと。
【０１３１】
例えば、成分分子が切断されるまで活性でないことが意図される、本発明の別の局面において、より少ないアミノ酸残基が使用され得る。例えば、キメラ分子は、１アミノ酸配列：タンパク質Ｘ−ＧＧＲＳＧＧ−タンパク質Ｙ（ＲＳはプラスミンについての切断部位を表し、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙは成分分子である）を有し得る。
【０１３２】
本発明は、第２の成分分子のＮ末端にある成分分子のＣ末端を結合することが、リンカー分子の付加を伴わずに、切断の際に融合された成分分子自身が切断部位を生成し得る、まれな事例における実施形態を含む。
【０１３３】
本発明の１つの実施形態において、切断部位が細胞表面以外の細胞外切断のために設計される場合、キメラ分子はグリコシル化されたインターフェロンβ以外である。
【０１３４】
本明細書中の成分分子は、宿主における生物学的な効果を達成することが期待され得る任意の分子であり得る。従って本発明は、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、他の天然または合成のポリマーである成分分子、低分子の薬物、診断目的のためのような検出可能な分子、ハプテン、リガンド、抗感染剤ならびにこれらのアナログおよび活性フラグメントを含む。
【０１３５】
本明細書中の成分分子はまた、起源または供給源、ヒトまたは非ヒト、天然または合成のいずれかであり得る。従って、例えば、成分分子はペプチド、タンパク質、十分にヒト、非ヒト動物、植物、魚、昆虫ならびに細菌、ウイルス、真菌および寄生虫を含む微生物から入手可能なそれらとまったく同じのそのアナログあるいは誘導体であり得る。
【０１３６】
本発明の別の局面において、キメラ分子は多タンパク質であり、少なくとも２つまたは全ての成分分子がペプチドもしくはポリペプチドまたはその活性フラグメント（本明細書中以下、「タンパク質成分」）である。本明細書中における使用に適したタンパク質成分としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗体、抗原、レセプター、成長因子、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、酵素、抗感染剤、プロドラッグ、毒素、栄養増強分子およびこれらの活性フラグメント。
【０１３７】
（表１．サンプル標的酵素：処置される宿主細胞において、インビボでのキメラ分子の切断に有用なエンドプロテアーゼ）
【０１３８】
【表１】
2006503545.tif 000003
本発明のさらなる実施形態において、少なくとも１つの成分分子は、以下からなる群から選択される：可溶性ｐ７５ＴＮＦαレセプターＦｃ融合物、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子（「ＧＣＳＦ」）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、インターフェロン−α２ｂ、ペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）（「ＰＥＧ」）インターフェロン−α、ＰＥＧ−アスパラガース（ａｓｐａｒａｇａｓｅ）、ＰＥＧ−アダマーゼ、抗ＣＯ１７−１Ａ、ヒルジン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、エリスロポイエチン、ヒトＤＮＡａｓｅ、ＩＬ−２、凝固因子ＩＸ、ＩＬ−１１、ＴＮＫａｓｅ、活性化タンパク質Ｃ、ＰＤＧＦ、凝固因子ＶＩＩａ、インシュリン、インターフェロンα−Ｎ３、インターフェロンγ１ｂ、インターフェロンαコンセンサス配列、血小板活性化因子アセチル加水分解酵素およびこれらの活性フラグメントまたは誘導体。
【０１３９】
もう１つの本発明の実施形態において、キメラ分子は成分分子としてペプチド、タンパク質または以下からなる群から選択されるその活性フラグメントを含む：インターロイキン；ＩＧＦ−Ｉ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＴＦおよびＫＧＦを含む成長因子；ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦを含むコロニー刺激因子；第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子、ｔＰＡを含む凝固因子；ｈＧＨを含む成長ホルモン；ラクトフェリンおよびリゾチームを含む抗感染剤；フィブリノゲン；α１−アンチトリプシン；エリスロポイエチン；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンのコンセンサスを含むインターフェロン；インシュリン；ヒト絨毛膜ゴナドトロピン；ジフテリアタンパク質；抗好血性因子；レセプター；ワクチン；抗生物質；またはそのアナログもしくはフラグメント。
【０１４０】
本発明の好ましい実施形態において、リストがウェブサイト：ｗｗｗ．ＦＤＡ．ｇｏｖにおいて見い出され得る、食糧医薬品局（「ＦＤＡ」）によって認可された薬物を成分分子として使用することが特に望ましい。例えば、生物製剤の下に認可された生体分子については、２００２年のＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏｖａｌｓの下のリンクは、以下のような分子を列挙する：再発性形態の多発性硬化症を処置するための、インターフェロンβ−１ａ（商標「Ｒｅｂｉｆ」）；ジフテリアおよび破傷風毒素および無細胞の百日咳ワクチン（商標、「Ｄａｐｔａｃｅｌ」）；慢性Ｃ型肝炎を有する成人の処置のためのペグインターフェロンα−２ａ（商標「Ｐｅｇａｓｙｓ」）；ならびに、慢性関節リウマチのためのヒト腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）に特異的な組換え型ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であるアダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）（商標「Ｈｕｍｉｒａ」）。他の認可された生物製剤は、認可の年の下に列挙される。
【０１４１】
本発明の１つの実施形態において、成分分子のいずれもが抗体ではない。
【０１４２】
本発明の別の実施形態において、１つまたは２つ以上の成分分子が抗体またはその活性フラグメント（本明細書中以下、「抗体成分」）である。本明細書中の抗体成分は、治療目的、予防目的または診断目的に適している任意のものを含む。好ましい実施形態において、抗体成分は、ＦＤＡによって認可された抗体のリストから選択される。このような抗体の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗ＩＬ８抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＩＣＡＭ−３抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗補体Ｃ５抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＣＤ４抗体、抗α４β７抗体、抗ＣＤ４０Ｌ（リガンド）抗体、抗ＶＬＡ４抗体、抗ＣＤ６４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ１４７抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗β２インテグリン抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＴＧＦβ２抗体、抗第ＶＩＩ因子抗体、抗ＩＩｂＩＩａレセプター抗体、抗ＰＤＧＦβＲ抗体、抗Ｆタンパク質抗体（ＲＳＶ由来）、抗ｇｐ１２０抗体（ＨＩＶ由来）、抗ＨｅｐＢ抗体、抗ＣＭＶ抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＶＥＦＧ抗体、抗ＣＡ１２５（卵巣癌）抗体、抗１７−ｌＡ（結腸直腸細胞表面抗原）抗体、抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体；抗αＶβ３インテグリン抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＬＡ抗体、抗ＴＮＦ抗体、および抗ＨＬＡＤＲ抗体。
【０１４３】
１つの実施形態において、第１の成分分子は抗体またはその活性フラグメントであり、第２の成分分子または他の成分は、抗体または抗体フラグメントでない。さらなる実施形態において、第１の成分分子は抗体または抗体フラグメントでないが、第２の成分分子または他の成分分子は抗体またはそれらのフラグメントである。発明のバリエーションにおいて、キメラ分子のすべての成分分子は、抗体またはその活性フラグメントである。
【０１４４】
本発明はさらに、１つの実施形態において、少なくとも１つの成分分子が抗細菌性ペプチド、タンパク質、類似体またはその活性フラグメントであるキメラ分子を含む。このような抗細菌性のペプチドは公知であり、例えば、ディフェンシン、リゾチーム、ラクトフェリン、ＩＴＦ、マガイニンおよび他の天然の抗感染剤が挙げられる。
【０１４５】
別の実施形態において、本発明は、キメラ分子を含み、ここで、本明細書中に記載されるように、第１の成分分子がペプチド、タンパク質またはその活性フラグメントであり、第２の成分分子は化合物である。本明細書中における使用に適した化合物は、好ましくは、ＣＤＥＲによって認可された薬物の下で、例えば、ｗｗｗ．ＦＤＡ．ｇｏｖで、見い出され得るように、ＦＤＡによって認可された薬物である。本発明の１つの局面において、化合物は、ホルモン（例えば、テストステロン、エストロゲン、プロゲステロンまたはそのアナログもしくは誘導体）である。本発明の別の局面において、化合物は毒性化合物（例えば、タキソール、ドキソルビシン、シスプラチンまたはそのアナログもしくは誘導体）である。発明のバリエーションにおいて、化合物はインヒビター（例えば、マトリクスメタロプロテアーゼインヒビター、または化学的な抗感染剤）である。
【０１４６】
２つの成分分子を含むキメラ分子の例としては、以下の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない：ラクトフェリン／ラクトフェリン；ラクトフェリン／リゾチーム；リゾチーム／リゾチーム；ラクトフェリン／ＩＴＦ；リゾチーム／ＩＴＦ；ラクトフェリシン（ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ）／ラクトフェリシン；ＩＴＦ／ＩＴＦ；ＥＧＦ／ＥＦＧ；ＥＧＦ／ＫＧＦ；ＫＧＦ／ＫＧＦ；ＫＧＦ／ＰＤＧＦ；ＰＤＧＦ／ＰＤＧＦ；α１−抗トリプシン／ＭＭＰインヒビター；エストロゲン／プロゲステロン；抗体／抗体；ならびにこれらのアナログ、改変体および誘導体。
【０１４７】
キメラ分子の成分分子は、異なった活性を保有し得る。例えば、成分分子がマトリックスメタロプロテイナーゼ（「ＭＭＰ」）である場合、成分分子は、細胞増殖を変更し、アポトーシスを調節し、細胞移動に影響を及ぼし、細胞間連絡に影響を及ぼし、そして腫瘍の進行に影響を及ぼすように選択され得る。例示として、ＭｃＣａｗｌｅｙ，Ｌ．Ｊ．および  Ｍａｔｒｉｓｉａｎ，Ｌ．Ｍ．、「Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ｔｈｅｙ'ｒｅ  ｎｏｔ  ｊｕｓｔ  ｆｏｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｙｍｏｒｅ！」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：５３４〜５４０の５３６（２００１）において開示される「ＭＭＰ−７−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｆａｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｋｉｌｌｉｎｇ  Ｆａｓ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ」。代替の実施形態において、本発明のキメラ分子は、ＭＭＰ活性のインヒビターである成分分子を含み得る。
【０１４８】
本発明のキメラ分子組成物は、処置される宿主における生物学的効果を達成するために、処置される宿主に投与される。この生物学的効果は、診断効果、予防効果、治療効果、抗感染効果、または栄養上の効果であり得る。
【０１４９】
本発明のキメラ分子組成物はまた、宿主において目的のポリペプチド（特に目的のポリペプチドの活性）の活性を調節することを望む場合、または特定の解剖学的部位における活性を提供することを望む場合、治療薬剤としての使用をも見出す。  
【０１５０】
成分分子は、有利に結合され、処置される宿主における異なった部位への送達または切断のためのキメラ分子を形成し得る。１つの実施形態において、抗感染剤を含むようなキメラ分子は、処置される宿主の消化管に送達される。このような成分の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：胃腸管においては、例えば以下であるが、これらに限定されない：腸三葉型因子（「ＩＴＦ」）のような抗感染剤およびマゲイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）、ラクトフェリン、ラクトフェリシン、界面活性剤タンパク質（例えば、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄ、およびリゾチーム）；シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２インヒビター（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９０：５５１（１９９９））のような抗炎症剤；ＤＭＢＴＩ（悪性脳腫瘍における欠損（Ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ）１）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８８８０（２００１）に記載されるような食道癌および消化管癌において欠失している分泌性腫瘍抑制因子）のような抗癌分子；乳タンパク質のような栄養増強分子；ならびに上皮成長因子（「ＥＧＦ」）、インスリン様成長因子（「ＩＧＦ−Ｉ」）およびケラチノサイト成長因子（「ＫＧＦ」）のような成長因子。胃腸管において放出される成分分子としては、胃腸管において活性な成分分子および消化管を裏ばりする上皮細胞を横切って輸送され得る成分分子（例えば、ＩｇＡ）が、挙げられる。本発明のこのような実施形態において、酵素は、通常、処置される宿主の消化管内に存在し、他の酵素を加えたり投与したりする必要はない。  
【０１５１】
成分分子はまた、例えば感染、癌のような疾患、鬱血反応もしくはアレルギー反応、または他の炎症状態を、予防するかまたは処置するために適切なエアロゾルを使用する肺への投与のために、有利に結合され得る。本明細書中での使用に適切な抗感染剤としては、成分分子としての、界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｂおよび界面活性剤タンパク質ＳＰ−Ｃが挙げられる。
【０１５２】
さらに、成分分子は、本明細書中のキメラ分子として、慢性関節リウマチの患者の関節のような炎症の局部部位に有利に投与され得る。これらの成分分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：ＩＬ−１０、インターロイキン１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）および可溶性ＴＮＦ−αレセプター（「ｓｏｌＴＮＦＲ」）など。
【０１５３】
本発明の別の局面において、本明細書中のキメラ分子は、静脈内投与のために意図される。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：多系統造血の刺激のためのＧＭ−ＣＳＦおよび／またはＩＬ−３、ならびに乳癌腫のためのＦｌｔ２およびＴＲＡＩＬ。幾つかの場合において、治療効力は、プロテアーゼ切断部位を設計することによって増強され得、この切断部位は、成分分子活性が所望であるような体内中の部位もしくはその近傍で優先的に切断される。これは、キメラ分子中の１つ以上の切断部位を、処置される条件においてその発現および／または活性が局所的に増大するプロテアーゼによって選択的に認識されるように設計することによって、達成される。  
【０１５４】
１つの実施形態において、本発明のキメラ分子中の少なくとも１つの成分分子は、Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ  ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ由来の真核生物リボソーム−不活性化タンパク質である、α−トリコサンチン（α−Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ）（ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）の複製を阻害する）（例えば、Ｋｕｍａｇａｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：４２７−４３０（１９９３）を参照）のような阻害分子であり得る。  
【０１５５】
キメラ分子が、第２成分分子とリンカーによって連結された第１成分分子を有する、本発明の好ましい実施形態において、この第１成分分子は、第２成分分子の活性を阻害せず、逆もまた然りである。
【０１５６】
別の実施形態において、本発明のキメラ分子は、このキメラ分子を処置される宿主中の作用位置へと導くための標的化分子を含む。この標的化分子は、例えば細胞表面レセプターなどのレセプターのリガンド、またはある位置に対する親和性を有する別の分子を含む。例としては、Ｔ細胞を活性化することなくＴ細胞を結合する抗ＣＤ４０抗体またはＥＧＦレセプターを活性化することなくＥＧＦレセプターを結合するＥＧＦフラグメントがある。この標的化分子は、本発明のキメラ分子における第１成分分子の代わりをし得るか、または第１成分分子と連結され、この第１成分分子から切断され得る。  
【０１５７】
必要に応じて、本発明のキメラ分子は、シグナルペプチドすなわちリーダー配列を含み、このシグナルペプチドすなわちリーダー配列は、キメラ分子が産生宿主内で産生され、例えばこの産生宿主から分泌され得るか、または産生宿主内での貯蔵が指向されるように、このキメラ分子の分泌または貯蔵を指示する。リーダー配列の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第４，８７０，００８号に記載されるようなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のα−因子分泌リーダー；または、キメラ分子が単子葉植物の種子内で産生される場合、種子貯蔵タンパク質由来のシグナルペプチド（例えば、ＷＯ  ０１／８３７９２に記載されるようなコメのＧｔ１およびＧ１ｂ遺伝子）。  
【０１５８】
１つの実施形態において、本発明のキメラ分子は、第１成分分子として、例えば、産生宿主において高度に発現される産生宿主タンパク質またはその一部（本明細書で以後、「産生宿主ペプチド（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｈｏｓｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）」）をさらに含む。本発明の１局面において、高度に発現される産生宿主ペプチドを有するキメラ分子は、１つ以上の第２成分分子（代表的に、産生宿主ペプチドの非存在下での発現が困難である）に、集団的に連結される。このような第２成分分子の例としては、ＩＴＦ、マゲイニン、および他の天然の抗感染剤のような低分子ペプチドが挙げられる。従って、本発明の１つの実施形態において、キメラ分子は、以下の式によって表され得る：産生宿主ペプチド−（リンカー−低分子ペプチド）ｎ、または産生宿主ペプチド−リンカー−（低分子ペプチド）ｎ。ここで、ｎは、１〜約１０の正の整数であり；必要に応じて、約２〜約７の正の整数であり；さらに必要に応じて、約３〜約５の正の整数である。この低分子は、その発現が所望され、そして例えば約２個〜約６０個；必要に応じて、約５個〜約４０個；さらに必要に応じて、約７個〜約２５個；なお必要に応じて、約１０個〜約２０個の範囲にわたるアミノ酸残基の配列を含み得る、任意の低分子である。必要に応じて、本発明のキメラ分子はまた、産生宿主からの産生後の精製を容易にする部分（例えば、ヒスチジンタグ）も、含み得る。
【０１５９】
１つの実施形態において、本発明は、リンカーがスペーサーを含むような、キメラ分子をさらに包含する。このスペーサーは、数個のアミノ酸残基だけを含み得る。このスペーサーは、例えば、キメラ分子の切断部位における酵素切断には影響しないが、しかしなお、切断をより容易にするために、切断部位を露出させるようなスペーサーである。別の実施形態において、このリンカーは、スペーサーがどの成分分子にも結合しないように、スペーサーの両端に１つずつ、２つの切断部位を有する。
【０１６０】
本発明のキメラ分子は、処置される宿主内への送達のために任意の数の方法において処方され得る。１つの実施形態において、このキメラ分子は、例えば、キメラ分子をコードする核酸分子が、産生宿主内に導入される場合、食用製品の成分である。このような食用製品としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：乳汁（産生宿主が、ヤギまたはウシのような動物である場合）、植物（産生宿主が、トマトのような野菜である場合）、種子（産生宿主が、コメ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、または雑穀のような穀物である場合）、微生物細胞（産生細胞が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓまたは酵母である場合）ならびにこれらの誘導体および抽出物。
【０１６１】
従って、本発明は、キメラ分子を、経口、経頬、経膣、経直腸、頭蓋内、脳室内、非経口または吸入による投与によって、処置される宿主に送達する方法を包含する。送達の非経口経路としては、静脈内、動脈内、鼻腔内、筋肉内、皮下、腹腔内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）が挙げられる。
【０１６２】
本発明の別の実施形態において、キメラ分子は、成分分子としてのポリペプチドワクチンもしくは核酸ワクチン、および／または成分分子としてのアジュバント分子、あるいはこのような組み合わせを含む。ワクチンは、感染性生物、トキソイド、または癌細胞によって過剰発現される癌抗原の成分であり得る。  
【０１６３】
１つの実施形態において、キメラ分子は、核酸分子ではない。しかし、キメラ分子がポリタンパク質である場合、本発明は、このキメラ分子をコードする核酸分子、ならびにこの核酸分子を含むベクター、およびこの核酸分子を含む宿主細胞を、包含する。従って、一般的に、キメラ分子がポリタンパク質である場合、本発明は、５'から３'の方向で以下をコードする核酸分子を提供する：リンカーをコードする核酸に連結された第１成分分子のリンカー、これは、次いで、第２成分分子をコードする核酸分子に連結される。本明細書中のキメラ分子は、プロモーターおよび、必要に応じて、転写ターミネーター、ならびにさらに必要に応じて、翻訳ターミネーターを含み、これら全てが適切な宿主（例えば、キメラ分子の発現のための産生宿主）をトランスフェクトするために使用され得る発現ベクター内に挿入された、発現カセットの形態で構築され得る。  
【０１６４】
本発明の別の実施形態において、キメラ分子は、リンカーが上述のような酵素切断部位を含んだままであるような、核酸分子である成分分子を含む。このようなキメラ分子が、処置される宿主内に送達され得、ここで、例えば、切断に際して、核酸成分分子は転写され、そして／または翻訳されて、処置される宿主において効果を達成する。
【０１６５】
本発明は、キメラ分子および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む組成物を、さらに包含する。本明細書中での使用に適した薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤は、当該分野で従来的である。この組成物は、キメラ分子が処置される宿主に投与される経路に適切な方法で、処方される。従って、この組成物は、経口送達、頬送達、直腸送達、膣送達、頭蓋内送達、脳室内送達、非経口送達（鼻腔内送達、静脈内送達、腹膜内送達、動脈内送達、皮下送達、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）送達、または吸入を含む）のために適切に処方され得る。  
【０１６６】
別の実施形態において、本発明は、本発明のキメラ分子組成物およびこの組成物の処置される宿主への投与説明書を含むキットを、包含する。この説明書は、代表的に、この組成物の投与経路（例えば、経口送達、頬送達、直腸送達、膣送達、頭蓋内送達、脳室内送達、非経口送達（鼻腔内送達、静脈内送達、動脈内送達、腹膜内送達、皮下送達、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）送達、または吸入を含む））を記載する。  
【０１６７】
成分分子を有するキメラ分子の、処置される宿主への送達は、このキメラ分子が、処置される宿主内に存在する１つ以上の酵素によってインビボで切断され得る場合、活性分子を処置される宿主へ送達し、生物学的効果を達成する効率的な方法である。本発明のキメラ分子は、宿主への、個々の活性成分分子より長期間にわたる活性分子の送達のために操作され得る。本発明のキメラ分子はまた、処置される宿主における切断および作用のための特定の部位への活性分子の送達のために操作され得る。本発明のキメラ分子は、相乗的に作用し得るか、または疾患もしくは状態に他の方法で対処し得る、１つ以上の活性分子を組み合わせるために、さらに操作され得る。  
【０１６８】
本発明のキメラ分子は、当該分野の任意の従来的手順によって作製され得る。例えば、１つのそのような方法において、第１成分分子をコードする核酸配列は、５'→３'の方向で、少なくとも１つの切断部位を含むリンカーに連結され、この切断部位は、次に第２成分分子に連結される。代表的には、これらの連結は、適切な制限酵素認識および切断の部位において形成され、ここで、異なった核酸フラグメントは、調節配列（例えば、プロモーター、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、そして必要に応じて、エンハンサーと共に、一緒に連結されて、選択マーカーを含むかまたは含まない、発現カセットを作製する。必要に応じて、選択マーカーは、ベクター内に存在し得、ここで、このベクター内に発現カセットが挿入されて発現ベクターを形成し得、この発現ベクターは、キメラ分子の産生のために細胞（「産生宿主」）内にトランスフェクトされ得る。本発明のキメラ分子がいかにして作製され得るかの例は、以下に、説明の目的で示される。これらは、限定することを意図しない。従来技術は、キメラ分子、組成物およびこのような新規のものを含むキットを介して使用される。  
【０１６９】
（ポリペプチド組成物）
用語「目的のタンパク質および目的のポリペプチド」は、本発明のキメラ分子の成分分子が、タンパク質およびポリペプチドである実施形態を言う。これらの目的のタンパク質および目的のポリペプチドは、天然に存在する供給源から得られ得るか、または組換え技術によるように合成的に産生され得る。天然に存在するタンパク質およびポリペプチドの供給源は、一般的に、タンパク質が誘導されるべき種に依存する。目的のタンパク質はまた、例えば、適切な宿主において目的のタンパク質をコードする組換え遺伝子を発現させることによって、合成的な手段からも誘導され得る。任意の便利なタンパク質精製手順が使用され得る。例えば、溶解物は、元々の供給源から調製され得、そしてＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、またはアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製され得る。個々の成分分子は、一緒に化学的に連結され得るか、または例えば、産生宿主においてコード核酸分子を発現することによって、単一のポリペプチドとして発現され得る。
【０１７０】
本発明はまた、ポリペプチドフラグメントの、本明細書中のキメラ分子中の成分分子としての用途を提供する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、対応する天然に存在するポリペプチドに関連する、１つ以上の活性を示す。フラグメントは、例えば、全長ポリペプチドに対する抗体を産生する際；およびポリペプチドに結合し、そして／またはその活性を調節する検出薬剤の方法における用途を見出す。目的のポリペプチドのフラグメントは、代表的には、少なくとも約１０〜３００アミノ酸（ａａ）長であり；必要に応じて、このフラグメントは、少なくとも約２５ａａ長であり；さらに必要に応じて、このフラグメントは、少なくとも約５０ａａ長であり、なお必要に応じて、このフラグメントは、少なくとも約７５ａａ長であり；その上なお必要に応じて、このフラグメントは、少なくとも約１００ａａ長である；なおさらに必要に応じて、このフラグメントは、少なくとも約２００ａａ長である。目的の特定のフラグメントとしては、酵素活性を有するフラグメント、生物学的活性を有するフラグメント、および他のタンパク質または核酸と結合するフラグメントが、挙げられる。  
【０１７１】
天然に存在するタンパク質に加えて、本発明のキメラタンパク質の成分分子は、天然に存在する形態から変化したポリペプチド（例えば、融合タンパク質を含む改変体ならびにそれらのアナログおよび誘導体）を含み得、ここで、このような改変体は、天然に存在するタンパク質と相同であるか、または実質的に類似である。例として、融合タンパク質は、目的のポリペプチドまたはそのフラグメント、ならびに目的のポリペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端、または目的のポリペプチドの内部に、インフレームで融合された、目的のポリペプチド以外のポリペプチド（「融合パートナー」）を含み得る。このような融合パートナーは、本発明のリンカーによって、成分分子と連結されてもされなくてもよい。
【０１７２】
適切な融合パートナーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：融合パートナーに特異的な抗体を結合し得るポリペプチド（例えば、血球凝集素、ＦＬＡＧ、およびｃ−ｍｙｃのようなエピトープタグ）；蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、Ａｎｔｈｏｚｏａｎ種由来の蛍光タンパク質）；β−ガラクトシダーゼ；ルシフェラーゼ；ｃｒｅリコンビナーゼのような、検出可能シグナルを提供するポリペプチド）；触媒機能を提供するかまたは細胞応答を誘導するポリペプチド；真核生物細胞からの融合タンパク質の分泌を提供するポリペプチド；原核生物細胞からの融合タンパク質の分泌を提供するポリペプチド；金属イオンへの結合を提供するポリペプチド  （例えば、ｎ＝３〜１０であるようなＨｉｓｎ（例えば、６Ｈｉｓ））。  
【０１７３】
例えば、融合パートナーが、免疫学的に認識し得るエピトープを提供する場合、エピトープ特異的抗体が、ポリペプチドレベルを定量的に検出するために使用され得る。幾つかの実施形態において、融合パートナーは、検出可能シグナルを提供し、そしてこれらの実施形態において、検出方法は、融合パートナーによって産生されるシグナルの型に基づいて選択される。例えば、融合パートナーが蛍光タンパク質である場合、蛍光が測定される。
【０１７４】
融合パートナーが、検出可能産物を生じる酵素である場合、この産物は、適切な手段を使用して検出され得る。例えば、酵素β−ガラクトシダーゼは、基質に依存して有色産物を生じ、この有色産物は、分光光度計によって検出され得、そして蛍光酵素ルシフェラーゼは、ルミノメーターで検出可能な発光産物を生じ得る。
【０１７５】
本発明のキメラ分子のポリペプチドは、天然に存在しない環境において存在する、すなわち、それらの天然に存在する環境から分離されている。特定の実施形態において、このキメラ分子が、実質的に他のタンパク質を含まない組成物中に存在するように、このキメラ分子は実質的に精製される。  
【０１７６】
本発明のキメラ分子のポリペプチドは、単離体として存在し得、すなわち、実質的に他のタンパク質または他の天然に存在する生物学的分子（例えば、多糖類、ポリヌクレオチド、およびそれらのフラグメントなど）を含まない。特定の実施形態において、キメラ分子は、少なくとも約９５％、一般的には少なくとも約９７％、より一般的には少なくとも約９７％、必要に応じて、少なくとも約９８％または９９％純粋である。
【０１７７】
任意の便利な精製手順が、本明細書中の目的のために使用され得る。適切な場合、タンパク質精製方法論は、例えば、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｄｅｕｔｈｓｅｒ編）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．１９９０）において記載される。
【０１７８】
（ペプチド）
本発明の幾つかの実施形態において、成分分子はペプチドである。幾つかの実施形態において、ペプチドは、１つ以上の以下の活性を示す：相互作用タンパク質への目的のペプチドの結合を阻害する；第２ポリペプチド分子への目的のポリペプチドの結合を阻害する；目的のポリペプチドのシグナル伝達活性を阻害する；目的のポリペプチドの酵素活性を阻害する；目的のポリペプチドのＤＮＡ結合活性を阻害する。幾つかの実施形態において、ペプチドは、対応する天然に存在するタンパク質の約３アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５アミノ酸〜約３０アミノ酸、または約１０アミノ酸〜約２５アミノ酸の配列を有する。
【０１７９】
ペプチドは、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含み得る。ペプチドは、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の組み合わせ、ならびに種々の「デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、およびＮα−メチルアミノ酸、など）を含み得、特定の特性を有する。さらに、ペプチドは、環状であり得る。ペプチドは、特定の立体配座モチーフを導入するために、非古典的アミノ酸を含み得る。任意の公知の非古典的アミノ酸が、使用され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート；（２Ｓ，３Ｓ）−メチルフェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン；２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−カルボン酸；ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート；β−カルボリン（ＤおよびＬ）；ＨＩＣ（ヒスチジンイソキノリンカルボン酸）；およびＨＩＣ（ヒスチジン環状尿素）。アミノ酸アナログおよびペプチド模倣物は、ペプチドに組み込まれ、特定の二次構造を誘導するかまたは指示し得る。これらのアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−カルボン酸）、β−ターン誘導ジペプチドアナログ；β−シート誘導アナログ；β−ターン誘導アナログ；α−へリックス誘導アナログ；γ−ターン誘導アナログ；Ｇｌｙ−Ａｌａターン誘導アナログ；アミド結合アイソスター；またはトレトラゾール。
【０１８０】
ペプチドは、直鎖状または環状であり得るデプシペプチド（ｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ）であり得る（Ｋｕｉｓｌｅら，１９９９）。ペプチドは、環式または二環式であり得る。例えば、Ｃ末端カルボキシル基またはＣ末端エステルは、カルボキシル基の−ＯＨまたはエステル（−ＯＲ）あるいはエステルの、それぞれＮ末端アミノ基での内部置換によって、環化が誘導され、環式ペプチドを形成し得る。例えば、ペプチド酸を生じ合成および切断の後、遊離酸は、溶液中（例えば、メチレンクロリド（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物中）のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような、適切なカルボキシル基アクチベーターによって、活性化エステルに変換される。次いで、環式ペプチドが、活性化エステルのＮ末端アミンでの内部置換によって、形成される。重合化と反対に、内部環式化は、非常に希薄な溶液の使用によって増強され得る。環式ペプチドを作製する方法は、当該分野で周知である。
【０１８１】
（抗体）
本発明は、特定のポリペプチド（本明細書中以後、「標的ポリペプチド」とする）を、１個以上の成分分子として特異的に認識する抗体またはその活性フラグメントを含むキメラ分子を提供する。適切な抗体を、当該分野で慣習的な種々の手段で、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗体フラグメントとして産生し得る。本明細書中の抗体としては、天然の形かまたは当該分野で慣習的なヒト化した形でのヒト抗体、非ヒト動物抗体（例えば、非ヒト霊長類抗体、マウス抗体、ラット抗体、ヒツジ抗体、ヤギ抗体、ウサギ抗体、ブタ抗体、ウシ抗体など）が挙げられる。本明細書の抗体としては、また、霊長類化した抗体およびキメラ抗体が挙げられる。
【０１８２】
本発明の抗体は、多様な機能を果たし得る。それらは、標的抗体、中和抗体、安定化抗体または増強抗体として機能し得る。それらは、アゴニストまたは他の抗体のアンタゴニストとして機能し得る。それらは、ＡＤＣＣを仲介し得る。そのリガンドまたはその基質に対する同族のポリペプチドの結合を特異的に阻害するために、抗体をブロックし得、機能し得る。さらに、本発明の抗体は、他の分子の基質としてのそれらの同族のペプチドの結合を、特異的に阻害し得る。
【０１８３】
１つの実施形態では、ポリクローナル抗体を、標的ポリペプチドの全てまたは一部を含むポリペプチドでの宿主動物の免疫化により入手し得る。例えば、ヒト標的ポリペプチドに対する抗体を作製するために、適切な宿主動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、モルモット、ニワトリ、およびウサギが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質免疫原の起源としては、マウス、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、サル、鳥類、昆虫、爬虫類または甲殻類を含む任意の種であり得る。宿主動物は、一般に免疫原とは異なる種である。抗体産生の方法は、当該分野で周知であり、ＨｏｗａｒｄおよびＢｅｔｈｅｌｌ（２０００）により記載される。一般に、成分分子として使用される抗体は、処置される宿主と適合性である。例えば、抗体が、キメラ分子の構成要素として、ヒトに治療目的で、予防目的で、または、診断目的で投与される場合、抗体は、好ましくは、ヒト抗体またはヒト化した抗体あるいはそれらの活性フラグメントである。
【０１８４】
免疫原は、完全なタンパク質またはそのフラグメントおよびその誘導体を含み得る。免疫原は、タンパク質またはその一部が翻訳後の修正（例えば、グリコシル化）を含み得る場合、天然の標的タンパク質上に発見される。標的タンパク質の細胞外ドメインを含む免疫原（例えば、癌抗原）は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、慣習的な組換え方法を使用したクローン化した遺伝子の発現または腫瘍細胞培養上清からの単離）により産生される。
【０１８５】
本発明のポリクローナル抗体は、慣習的な技術により調製される。これらは、約１％未満の混入物しか含まない、実質的に純粋な形での標的タンパク質を用いる宿主動物の免疫化を含む。あるいは、完全細胞が、細胞表面上で、免疫原または抗原（例えば、膜タンパク質）を高濃度で発現するように、標的タンパク質またはその抗原性部分をコードする核酸分子でトランスフェクトした完全細胞を用いて、宿主動物を免疫化し得る。このような例としては、標的ポリペプチドをコードする核酸を含むバキュロウイルスでトランスフェクトした昆虫細胞の使用、またはこのような核酸分子を含むベクターでトランスフェクトしたマウス細胞の使用がある。
【０１８６】
免疫原に対する宿主動物の免疫反応を増加させるために、標的タンパク質をアジュバントに結合し得る。適切なアジュバントとしては、ミョウバン、デキストラン、硫酸塩、大型ポリマーアニオン、ならびに油および水のエマルション、例えば、完全なまたは不完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。標的タンパク質は、また、合成キャリアタンパク質または合成抗原に連結し得る。標的タンパク質は、宿主に通常は、最初の用量とともに、皮内に、皮下に、筋肉内にまたは腹腔内に投与され、その後、１回以上の、通常は少なくとも２回のさらなる効果促進の用量を投与する。以下の免疫化では、免疫化した宿主由来の血清を収集し、抗体産生を試験する。生じた抗血清に存在する免疫グロブリンをさらに、公知の方法（例えば、アンモニウム塩分画またはＤＥＡＥクロマトグラフィー）を使用して分画し得る。
【０１８７】
また、本発明のモノクローナル抗体を、慣習的な技術により産生し得る。一般に、上に記載した免疫化した宿主動物の脾臓結節および／またはリンパ結節は、プラズマ細胞の供給源を提供し、次いで、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を産生するための骨髄腫細胞を融合して、不死化した。ハイブリドーマ細胞を培養し、個々のハイブリドーマに由来する培養上清を、所望の特異性を有する抗体を産生するクローンを同定するための標準的技術を使用して、スクリーニングする。ハイブリドーマ細胞上清または宿主に存在する腹水から、慣習的な技術（例えば、不溶性支持体（すなわちタンパク質Ａセファロース）に結合した抗原を使用するアフィニティクロマトグラフィー）により抗体を精製し得る。このような様式により産生した抗体を、その後改変し、または、所望の特性を含むように最適化し得る。
【０１８８】
抗体を、免疫グロブリン分子の通常の多重結合構造の代わりに、単鎖として産生し得る。単鎖抗体は、以前に、Ｊｏｓｔら（１９９４）に記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、少なくとも約４個の小さな中性アミノ酸（すなわち、グリシンまたはセリン）をコードするスペーサーに連結する。この融合物によってコードされるタンパク質は、もとの抗体の特異性および親和性を保持している機能性可変領域の集合を可能にする。
【０１８９】
本発明は、また、「人工的な」抗体（例えば、インビボで産生し、選択した単鎖抗体および抗体フラグメント）を提供する。いくつかの実施形態において、これらの抗体は、バクテリオファージまたは他のウイルス粒子の表面上に表れる。他の実施形態において、人工的な抗体は、ウイルス構造タンパク質またはバクテリオファージ構造タンパク質（Ｍ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質を含むが、これに限定されない。）を有する融合タンパク質として存在する。このような人工的な抗体を産生する方法は、当該分野において周知である（米国特許第５，５１６，６３７号；同５，２２３，４０９号；同５，６５８，７２７号；同５，６６７，９８８号；同５，４９８，５３８号；同５，４０３，４８４号；同５，５７１，６９８号および同５，６２５，０３３号）。いくつかの実施形態において、本明細書中で使用するための抗体としては、１つ以上の重鎖、１つ以上の軽鎖、１つ以上の軽鎖と一緒になった１つ以上の重鎖またはそれらの可変領域のみが挙げられる。
【０１９０】
インビボの使用のために、特にヒトへの注入のために、いくつかの実施形態では、非ヒト抗体の抗原性を減少することが望ましい。処置される宿主の非ヒト抗体を含むキメラ分子に対する免疫反応は、潜在的に、治療が効果的である期間を減少し得る。ヒト化抗体の方法は、当該分野において公知である。ヒト化抗体は、遺伝子組換えヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の産物であり得、例えば、国際特許出願ＷＯ９０／１００７７およびＷＯ９０／０４０３６に記載される。あるいは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメインおよび／またはヒト配列に対応する枠組みドメインを置換するために、目的の抗体を、組換えＤＮＡ技術により設計し得る（例えば、ＷＯ９２／０２１９０に記載されるように）。
【０１９１】
さらに、キメラ分子の構成要素を作製するために、または本発明のキメラ分子をコードする核酸分子を作製するために、免疫グロブリンをコードする遺伝子が、本発明において使用され得る。免疫グロブリンｃＤＮＡで構成した免疫グロブリン遺伝子は、当該分野で公知であり、例えば、Ｌｉｕら（１９８７ａ）およびＬｉｕら（１９８７ｂ）中に記載される。メッセンジャーＲＮＡを、ハイブリドーマまたは脾臓またはこのような抗体を産生する他の細胞から単離し、ｃＤＮＡライブラリーを産生するために使用する。目的のｃＤＮＡを、特定のプライマー（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号に記載される）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（‘‘ＰＣＲ’’）により増幅し得る。あるいは、ライブラリーを作製し、目的の配列を単離するためにスクリーニングを行った。抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ヒト定常領域配列に融合し得る。ヒト定常領域（‘‘Ｃ領域’’）遺伝子の配列は、当該分野で公知であり、例えば、Ｋａｂａｔら、１９９１中に記載される。ヒトＣ領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手可能である。アイソタイプの選択は、所望のエフェクター機能（例えば、相補体固定または抗体依存性細胞傷害性）により導かれる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプならびにκ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域のいずれかを使用し得る。次いで、キメラヒト化抗体を、慣習的な方法により発現する。
【０１９２】
また他の実施形態において、本発明のキメラ分子中で成分分子として使用するための抗体は、十分にヒト抗体であり得る。例えば、ヒト抗体と同一である異種の抗体を使用し得る。異種ヒト抗体が、充分なヒト化抗体である抗体を意味するので、それらが、ヒト抗体を発現するために、遺伝的に設計されてきた非ヒト宿主中で産生される（例えば、ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８，２４８９３およびＷＯ９９／５３０４９中に記載される）例外を有する。
【０１９３】
本明細書の使用に適した抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ）を、インタクトなタンパク質の切断（例えば、プロテアーゼまたは化学切断）により調製し得る。あるいは、切断した遺伝子（例えば、重（‘‘Ｈ’’）鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域、その後翻訳終止コドンをコードするＤＮＡ配列を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子）を設計し得る。
【０１９４】
ヒトＣ領域セグメントに対する可変（‘‘Ｖ’’）領域セグメントの続く結合のために、Ｊ領域に有用な制限部位を導入するためのプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するために、Ｈおよび軽（‘‘Ｌ’’）鎖Ｊ領域のコンセンサス配列を、使用し得る。Ｃ領域ｃＤＮＡを、部位に関する変異生成により改変し、制限部位をヒト配列の相同な位置に配置し得る。
【０１９５】
抗体を産生するための慣習的な発現ベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、任意のＶＨまたはＶＬ配列が、例えば、プラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣまたはＥＢＶに誘導されたエピソームに容易に挿入され、発現し得るように、適切な制限部位を設計する。このようなベクターでは、スプライシングは、通常、Ｊ領域に挿入されたスプライスドナー部位とヒトＣ領域の前のスプライスアクセプター部位との間に生じ、また、ヒトＣＨエクソン内に生じたスプライス領域でも生じる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体の部位に生じる。生じたキメラ抗体を、任意の強力なプロモーター（レトロウイルスＬＴＲ、例えば、Ｏｋａｙａｍａら（１９８３）に記載されたＳＶ−４０初期プロモーター；例えば、Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）に記載されたラウス肉腫ウイルスＬＴＲおよび例えば、Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら（１９８５）に記載されたモロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲまたは天然の免疫グロブリンプロモーターを含む）に接合し得る。
【０１９６】
（核酸組成物）
本発明はまた、それぞれが、本発明のポリペプチド、または、適切な条件下で、上に記載したキメラ分子の本発明のポリペプチドを産生するように発現される能力のあるそのフラグメントをコードするオープンリーディングフレームを有する核酸分子を、提供する。核酸分子は、キャリアを含む核酸組成物の形態で存在し得る。用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライス改変体、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉ、ペプチド核酸および本発明の核酸配列を含むベクターを含む。本発明のタンパク質をコードする核酸に、相同であるかまたは実質的に類似するかまたは同一である核酸もまた、この用語に含まれる。従って、本発明は、本発明のタンパク質およびアナログまたはその誘導体をコードする遺伝子を提供する。
【０１９７】
本明細書に使用される場合、用語遺伝子またはゲノム配列は、約２０ｋｂまでまたはコード領域を超えるまで、あるいは、さらにいずれかの向きで、発現の調節に関与する５’および３’非コードヌクレオチド配列に隣接したかまたはしていない、イントロンを含むかまたは含まない、本発明の特定のタンパク質およびポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡかまたはゲノムＤＮＡかまたはｍＲＮＡのいずれかを意味することを意図する。遺伝子は、染色体外遺伝の維持のためかまたは宿主ゲノムへの組込みのための適切なベクターに導入され得る。
【０１９８】
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドとしては、約１ｋｂ（しかしより多くも可能である）の側方のゲノムＤＮＡを転写領域の５’または３’末端のいずれかに含む特定の転写調節配列および翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサーなどが挙げられる。特定の実施形態では、ゲノムＤＮＡは、１００ｋｂｐかまたはそれより小さいフラグメントとして単離され得、る；そして、染色体配列の側面に、実質的に何も隣接しない。コード領域に隣接するゲノムＤＮＡ、３’または５’のいずれか、または時々イントロン中に見出される内在的な調節配列は、適切な組織特異的な発現および段階特異的な発現に必要な配列を含む。
【０１９９】
本発明の核酸組成物は、本発明のタンパク質の全て、または一部をコードし得る。二本鎖または一本鎖フラグメントは、慣習的な方法に従って化学的合成したオリゴヌクレオチドにより、制限酵素消化により、ＰＣＲ増幅などによりＤＮＡ配列から入手され得る。
大部分について、ＤＮＡフラグメントは、少なくとも１５ｎｔのものであり、通常は、少なくとも１８ｎｔまたは２５ｎｔのものであり、そして少なくとも約５０ｎｔのものであり得る。
【０２００】
本発明のキメラ分子が、プローブとして使用される場合、本発明の核酸は、直接検出し得る標識（例えば、放射標識または蛍光標識）を組み込むヌクレオチドアナログ、または、後の反応で可視化し得る標識（例えば、種々のハプテン）を組み込むヌクレオチドアナログを含み得る。一般的な放射標識したアナログとしては、３２Ｐまたは３５Ｓで標識したもの、例えば、α−32Ｐ−ｄＡＴＰ、−ｄＴＴＰ、−ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ；ならびにγ−３５Ｓ−ＧＴＰ、α−３５Ｓ−ｄＡＴＰなどが挙げられる。ただちに、主題核酸に組み込まれた、商業的に利用可能な蛍光ヌクレオチドアナログとしては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、ローダミン、ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹなどで標識したデオキシリボヌクレオチドアナログおよび／またはリボヌクレオチドアナログが挙げられる。続く標識のために、一般的にヌクレオチドに結合したハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびジニトロフェニルを含む。
【０２０１】
本発明の核酸は、以下に記載したように、転写かまたは翻訳のアンチセンス阻害のために使用され得る。例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｒｔ  Ｂ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３１４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９９）；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｒｔ  Ａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３１３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．（１９９９）；Ｈａｒｔｍａｎｎら（編）  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｋｌｕｗｅｒ  Ｌａｗ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９９）；Ｓｔｅｉｎら（編）  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１９９８）；Ａｇｒａｗａｌら（編）  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ（１９９８）を参照のこと。
【０２０２】
本発明の核酸分子はまた、当業者に公知の、本明細書では詳しく述べる必要のない幅広い種のベクターの一部（例えば、ポリヌクレオチド構築物）として提供され得る。ベクターとしては、プラスミド；コスミド；ウイルスベクター；ヒト、酵母、細菌およびＰ１由来の人工染色体（ＨＡＣ’ｓ、ＹＡＣ’ｓ、ＢＡＣ’ｓ、ＰＡＣ’ｓなど）；ミニ染色体などが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当業者に周知の多数の出版物（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９９９）、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊｏｎｅｓら（編）  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ  Ｌｔｄ（１９９８）；Ｊｏｎｅｓら（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ  Ｌｔｄ（１９９８）を含む）に十分に記載される。ベクターは、本発明の核酸の発現を提供し得；本発明の核酸の増殖を提供し得、または両方を提供し得る。
【０２０３】
本発明の核酸が、ベクターかまたはプラスミドの一部である場合、ベクターまたはプラスミドは、「組換えベクター」または「構築物」と呼ばれ得る。本発明の構築物は、産生した宿主細胞（‘‘クローニングベクター’’）中での本発明の核酸の増殖；異なる生物に由来する宿主細胞間での本発明の核酸の往復（‘‘シャトルベクター’’）；産生した宿主細胞の染色体への本発明の核酸の挿入（‘‘挿入ベクター’’）；本発明のセンスＲＮＡ転写物かまたはアンチセンスＲＮＡ転写物の発現（例えば、細胞のない系または培養した宿主細胞内で）（‘‘発現ベクター’’）；および産生した宿主中で本発明の核酸によりコードされる本発明のポリペプチドの産生（‘‘発現ベクター’’）に有用である。
【０２０４】
ベクターは、代表的には、少なくとも１個の複製起源、少なくとも１個の非相同な核酸の挿入に対する部位（例えば、複数の、きちんと群生した、単一の切断制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有するポリリンカーの形態で）および少なくとも１個の選択マーカーを含むが、いくつかの組み込んだベクターは、宿主内で染色体の改変に機能する起源を欠いていて、そして、いくつかのベクターは、選択マーカーを欠いている。
【０２０５】
本発明のキメラ分子をコードする核酸分子に関して、または核酸分子を成分分子として含むキメラ分子に関して、核酸分子は、代表的には、実質的に純粋に単離され、および、得られる遺伝子またはポリヌクレオチドを含む。通常は、ＤＮＡは、本発明の遺伝子の配列またはそのフラグメントを含まない、実質的に他の核酸配列を含まずに得られ、一般には少なくとも約５０％の純度、通常は、少なくとも約９０％の純度であり、そして、代表的な「組換え体」は、天然に生じる染色体上で、通常は結合しない１個以上のヌクレオチドに、隣接されている。
【０２０６】
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
本発明のなお別の実施形態において、処置される宿主に対して、キメラ分子を細胞内に投与するための成分分子は、例えば、アンチセンス分子、リボザイムまたはＲＮＡｉのような宿主中での標的タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節し、および一般には減少するかまたはダウンレギュレートする薬剤である。
【０２０７】
アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）すなわち、天然の核酸由来の化学的改変を有する合成ＯＤＮ、または、このようなアンチセンス分子をＲＮＡとして発現する核酸構築物を含む。アンチセンス配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡに対して相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、種々のメカニズムを介して（例えば、ＲＮＡｓｅ  Ｈの活性化を介して、または、立体構造の障害を介して、翻訳に使用可能なｍＲＮＡの量を減少することにより）遺伝子発現を阻害する。１個またはアンチセンス分子の組み合わせを投与し得、ここで、組み合わせは、複数の異なる配列を含み得る。
【０２０８】
適切なベクター中の全てかまたは一部の標的遺伝子配列の発現により、アンチセンス分子を産生し得、ここで、転写開始は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として産生されるような向きである。あるいは、アンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、少なくとも約７のヌクレオチド長であり、通常は、少なくとも約１２のヌクレオチド長であり、より通常には、少なくとも約２０のヌクレオチド長であり、約５００のヌクレオチド長より多くはなく、約５０のヌクレオチド長より多くはなく、約３５のヌクレオチド長より多くはなく、ここで、長さは、交差反応の欠如を含む、阻害、特異性の効率により支配される。７から８塩基長の短いオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｗａｇｎｅｒら（１９９６）に記載されるような、強力で選択的な遺伝子発現のインヒビターであり得る。
【０２０９】
特定の内因性のセンス鎖ｍＲＮＡ配列の特定の領域が、アンチセンス配列により相補的であるとして選択される。オリゴヌクレオチドに対する特定の配列の選択は、経験的な方法を使用し得、ここで、インビトロかまたは動物モデル中の標的遺伝子の発現の阻害に関して、いくつかの候補体配列をアッセイする。配列の組み合わせもまた使用され得、ここで、ｍＲＮＡ配列のいくつかの領域を、アンチセンス相補性のために選択する。
【０２１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｗａｇｎｅｒら（１９９３）；Ｍｉｌｌｉｇａｎら（１９９３）に記載されるように、当該分野で公知の方法により化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドは、それらの細胞内の安定性および結合親和性を増加するために、天然のホスホジエステル構造から化学的に改変され得る。
【０２１１】
アンチセンスインヒビターに対する代替物として、触媒作用的な核酸化合物（例えば、リボザイムまたはアンチセンス結合体）が、遺伝子発現を阻害するために使用され得る。リボザイムは、インビトロで合成され得、または、発現ベクター中にコードされ得、そこからリボザイムは、例えば、ＷＯ９５２３２２５およびＢｅｉｇｅｌｍａｎら（１９９５）に記載されるように、標的細胞中で合成される。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例は、ＷＯ９５０６７６４中に記載される。ｍＲＮＡ加水分解を仲介し得る金属複合体（例えば、ターピリジル（ｔｅｒｐｙｒｉｄｙｌ）Ｃｕ（ＩＩ））とのアンチセンスＯＤＮの結合体が、Ｂａｓｈｋｉｎら（１９９５）に記載される。
【０２１２】
（干渉ＲＮＡ）
いくつかの実施形態では、成分分子は、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。ＲＮＡ干渉は、真核生物遺伝子をサイレンシングする方法を提供する。二本鎖ＲＮＡは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、真菌、植物、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび哺乳動物中で、その同起源のｍＲＮＡの相同性依存的な分解を誘導し得る（Ｇａｕｄｉｌｌｉｅｒｅら、２００２）。特定のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを減少させるためのＲＮＡｉの使用は、遺伝子のコード領域に由来する二本鎖ＲＮＡの干渉特性に基づいている。この技術は、遺伝子機能を破壊するための効率の良い高処理能力法である（Ｏ’Ｎｅｉｌ、２００１）。
【０２１３】
本発明の１つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドの実質的な部分に由来する相補的なセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを、インビトロで合成する。生じたセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを、注入緩衝液中でアニーリングし、その二本鎖ＲＮＡを被験体に注入するかまたは他の方法で被験体に導入した。すなわち、食料中で、またはＲＮＡ（ＷＯ９９／３２６１９）を含む緩衝液中に浸漬することにより被験体に導入する。別の実施形態では、本発明の遺伝子に由来するｄｓＲＮＡは、センス方向およびアンチセンス方向の両方で、コード配列に作動可能に結合した適切に位置したプロモーターからセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡの両方を同時に発現することによりインビボで産生される。
【０２１４】
（本発明のポリペプチドの調製）
以下の節でより詳細に記載された複数の使用に加えて、本発明の核酸組成物は、本発明のキメラ分子のポリペプチド調製での使用を見出す。一般に、ポリヌクレオチドの発現に関しては、転写開始領域および翻訳開始領域を含む発現ベクターを含む発現カセットが使用され得、この転写開始領域および翻訳開始領域は、誘導され得るかまたは構成的であり得、ここで、コード領域は、転写開始領域、ならびに転写および翻訳終結領域の転写制御下で、作動可能に結合している。
【０２１５】
従って、本発明のキメラ分子は、当該分野における任意の従来的な習慣的な技術により作製され得る。他に明白に提供されなければ、本発明は、本明細書中のキメラ分子を作製する任意の特定の方法に限定されないことを理解すべきである。例えば、本発明のキメラ分子は、例えば、本明細書に引用した特許および出版物に記載されるかまたはＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （第２版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．；およびＡｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．に記載されるような組換え技術により作製され得る。さらに、生物学的なプロトコルは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｃｏｍ．のようなウェブサイトを介して利用され得る。本明細書のキメラ分子は、また、研究室合成により作製され得、例えば、いくつかのポリペプチド配列、ポリヌクレオチド配列または化学的存在物およびこのような配列または分子をインビトロで一緒に連結により、作製される。
【０２１６】
本発明の１つの実施形態において、本発明のキメラ分子をコードするＤＮＡ分子は、キメラ分子の産生のために産生宿主中で発現され得る発現カセット中に組み込まれ得る。発現カセットは、転写調節配列および翻訳調節配列（例えば、プロモーター、転写開始配列および転写終結配列ならびに翻訳開始配列および翻訳終止配列）を含む。エンハンサーが、シス位置またはトランス位置に存在しても存在しなくてもよい。図記のように、５’→３’向きに、転写調節配列および翻訳調節配列を含むＤＮＡフラグメントが、キメラ分子をコードするＤＮＡに結合し得、このＤＮＡは、以下を含む：第１成分分子をコードする第１ＤＮＡフラグメント、それは、順に第２ＤＮＡフラグメントに結合し得、第２ＤＮＡフラグメントは、切断部位を含むリンカーをコードし、切断部位は、順に第３ＤＮＡフラグメントに結合し得、第３ＤＮＡフラグメントは、第２成分分子をコードし、その後、翻訳終止配列および転写終結配列が続く。結合は、代表的には、適切な制限エンドヌクレアーゼ制限部位でなされ、そして、異なるフラグメントが一緒に、例えば、ＤＮＡリガーゼに結合する。発現カセットは、プラスミドまたはウイルスベクターの一部であり得る。一般に使用されるベクターとしては、Ｇａｔｅｗａｙベクター（ｗｗｗ.Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ.ｃｏｍ）およびＣｒｅａｔｏｒベクター（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）が挙げられる。
【０２１７】
従って、本発明は、本発明のポリペプチド（その分子がポリプロテインである場合、本明細書のキメラ分子を含み、その成分分子がペプチドまたはポリペプチドまたはその活性フラグメントである場合、本明細書の成分分子を含む）を産生する方法を提供する。この方法は、一般に、上のように、インビボ生成またはインビトロ生成のいずれかでの核酸構築物の宿主細胞への導入を包含する。インビトロのキメラ分子の産生に関して、宿主細胞は、インビトロでの核酸構築物の発現およびコードされた本発明のポリペプチドの産生そして（例えば、培養培地から、または宿主細胞内から（例えば、宿主細胞を破壊することにより）またはその両方から）、本発明のポリペプチドの収集に適した条件下で培養される。
【０２１８】
本発明は、本発明のポリペプチドを産生する方法をまた提供し、その方法は、例えば、ＷＯ  ００／６８４１２、ＷＯ０１／２７２６０、ＷＯ０２／２４９３９、ＷＯ０２／３８７９０、ＷＯ９１／０２０７６およびＷＯ９１／０２０７５に記載されるウサギ網状赤血球を含まない溶解物、カエル卵母細胞溶解物、小麦胚芽溶解物、細菌溶解物などの使用により、当該分野で周知である無細胞インビトロ転写／翻訳方法を使用する。
【０２１９】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをインビボで産生する方法を提供し、例えば、遺伝子組換え動物中で産生する方法が、例えばＷＯ９３／２５５６７に記載される。
【０２２０】
本発明は、さらに宿主細胞を提供し、例えば、本発明の核酸および本発明の組換えベクターを含む宿主細胞を有する組換え宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は、インビトロ培養中に存在し得、また、多細胞生物の一部ででもあり得る。宿主細胞は、以下にさらに詳細に記載される。
【０２２１】
必要に応じて、プロセシングおよび／または分泌のために、キメラ分子を、産生宿主中のある区画または細胞小器官に方向付けするためのシグナルペプチド、リーダーペプチド、輸送（ｔｒａｎｓｉｔ）ペプチドをコードする、シグナル配列、リーダー配列または輸送配列は、調節配列と、第１の成分分子をコードする第１のＤＮＡフラグメントとの間に適切に挿入され得る。例えば、産生宿主が、酵母細胞である場合、融合タンパク質をプロセシングおよび分泌のために、ゴルジ体へ方向付け得るシグナル配列またはリーダー配列は適切である。このようなシグナル配列は、分泌タンパク質（例えば、米国特許第４，８７０，００８号に記載されるように酵母のα因子）のプレ配列またはプロ配列に由来し得る。
【０２２２】
あるいは、産生宿主が植物である（例えば、稲である）場合、ＷＯ９９／１６８９０中に記載される調節配列およびリーダー配列を使用して、発現カセットは、植物の種子中でのキメラ分子の発現のために構築され得る。植物産生宿主中の本発明のキメラ分子の産生のための発現カセットは、また、ＷＯ００／０４１４６に記載されるように作製される。
【０２２３】
例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの真菌宿主中の本発明のキメラ分子の産生のための発現カセットもまた、例えば、ＷＯ９７／４５１５６およびＷＯ９３／２２３４８中に記載されるように作製される。
【０２２４】
本発明のキメラ分子は、さらに、産生宿主中に多量に発現されるタンパク質の全てまたは一部を用いて作製され得る。そのようなものを含む発現カセットは、例えば、米国特許第４，８２８，９８８号、米国特許第５，２９２，６４６号中に記載される。
【０２２５】
本明細書中での使用のための、キメラ分子をコードする核酸分子の産生のために適切な発現ベクターは、核酸分子の挿入を提供するために、一般に、プロモーター配列の近辺に位置する好都合な制限部位を有する。発現宿主中で作動する選択マーカーが、必要に応じて、このような構築物中に存在し得る。発現ベクターは、融合パートナーをコードする核酸分子をさらに含み得る。ここで、融合パートナーは、さらなる機能性、すなわち、タンパク質合成の増加、分泌のためのリーダー配列、安定性、定義された抗血清との反応性、酵素マーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ）などを提供する。
【０２２６】
本明細書中での使用のために適切な発現カセットは、転写開始領域、その遺伝子またはフラグメントおよび転写終結領域を含むように調製され得る。特に興味深いのは、機能性エピトープまたはドメインの発現を可能にする配列の使用であり、通常は、少なくとも約８アミノ酸長であり、より通常的には、少なくとも約１５アミノ酸長から約２５アミノ酸長までであり、または上記のフラグメントのいずれかであり、遺伝子の完全オープンリリーディングフレームまでである。ＤＮＡの産生宿主中への導入の後、構築物を含む細胞は、選択マーカーを使用して選択され得、細胞は増殖され、次いで、発現のために使用される。
【０２２７】
タンパク質、ポリペプチド（抗体を成分分子として含む）を含むキメラ分子は、発現のための目的に依存し、従来的な方法のとおりに、原核生物かまたは真核生物中で発現され得る。大規模なタンパク質の産生のために、単細胞生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａ）、例えば、ＳＦ９細胞またはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ  ｃｅｌｌなどのバキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞または高等生物（例えば、植物および脊椎動物、特に哺乳動物）の細胞（例えば、ＣＯＳ７細胞）が、発現宿主細胞として使用され得る。ある状況では、真核細胞中で遺伝子を発現することが好ましく、ここで、コードされたタンパク質は、天然の折りたたみおよび翻訳後の修飾を受ける。適切な植物細胞としては、双子葉類（例えば、タバコ植物、トマト植物）または単子葉類（その種子を含む）（例えば、穀物：カラスムギ、稲、小麦、大麦、サトウモロコシおよび他の食用植物）が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーター、エンハンサー、ターミネーターおよびベクターの組み合わせは、各宿主で発現を最適化され得る。小さなペプチドもまた、研究室で合成され得る。実施例に記載された上記の宿主細胞のいずれかかまたは他の適切な宿主細胞もしくは生物が、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を含むキメラ分子を複製し、および／または発現するために使用される場合、生じた複製した核酸、ＲＮＡ、発現したタンパク質またはポリペプチドは、産生宿主細胞または生物の産物として、本発明の範囲内である。産物は、当該分野で公知の任意の適切な手段により回収される。例えば、溶解物は、元の起源（例えば、内性の本発明のポリペプチドを発現する細胞または本発明のポリペプチドを発現する発現ベクターを含む細胞）から調製され得、そして、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィーなどを使用して精製され得る。
【０２２８】
本発明での使用に適した発現系のさらなる記載としては、例えば、米国特許番号第４，７４５，０６９号；同４，８２８，９８８号；同６，３１２，９２３号；同６，３４２，３７５号；同６，２３５，８７８号；ＲＥ３７，３４３号；米国特許番号第６，０６８，９９４号；同６，０８０，５５９号；同５，６９５，９８５号；同６，２７７，６３３号；同６，２３２，１０５号；同６，２２２，０９４号；同５，８８８，８１４号；同５，９８１，２７５号：同６，０２５，５４０号；同５，７５０，１７２号；同６，３２９，１３７号；Ｕ．Ｓ．６，３０３，３６９号が挙げられる。
【０２２９】
本明細書のキメラ分子が、植物産生宿主中で発現する場合、キメラ分子は、植物の葉または苗条で発現するように標的され得る。あるいは、キメラ分子は、植物（例えば、稲、小麦、大麦、カラスムギ、キビ、トウモロコシ、サトウモロコシを含む穀物植物のような単子葉類）の子実または種子中での発現のために標的され得る。植物産生宿主の種子中で発現したキメラ分子は、キメラ分子の活性が保存されるかまたは実質的に維持されるような手段で、処理される。従って、種子を含むキメラ分子の抽出物が作製され得、抽出物は、食物サプリメントまたは栄養添加物として食物に組み込まれ得る。あるいは、種子または種子抽出物は、低温プロセスを使用して、例えば、穀物中のデンプンが麦芽シロップに変わり、ポリペプチドが実質的にインタクトなままであるような条件下で、抽出物を麦芽醸造物に添加することにより、処理され得る。本明細書のキメラ分子を生成するためのこのような系が使用される場合、キメラ分子中の切断部位は、種子または抽出物の処理の間それが活性化されないように、設計されなければならない。
【０２３０】
（組成物）
本発明は、さらに、本発明のキメラ分子を含む、組成物（薬学的組成物を含む）を提供する。これらの組成物は、緩衝液（それは、キメラ分子の所望の使用に従って選択され）を含み得、および、また、意図した使用に対して適切な他の物質も含み得る。当業者は、幅広い種が当該分野で公知である、種々の緩衝液が、意図された使用に適した緩衝液を容易に選択し得る。ある例では、組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を含み得、当該分野で公知であり、本明細書では詳細に論じる必要がない。本明細書の使用に適した薬学的に受容可能な賦形剤は、例えば、Ａ  Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９５）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”第１９版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを含む、種々の出版物中に記載される。
【０２３１】
本明細書の組成物は、可能な投与の様式に従って処方される。従って、組成物が、鼻腔内にまたは吸入により投与されることが意図される場合、そのような目的のために、組成物は、当該分野で習慣的なように、粉末形態に変えられ得る。他の処方物（例えば、経口的または非経口的な送達のための）もまた、当該分野で慣習的なものとして使用される。
【０２３２】
（賦形剤および処方物）
いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を有する処方で提供され、種々の賦形剤が、当該分野で公知であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ、２０００；Ａｎｓｅｌら、１９９９；Ｋｉｂｂｅら、２０００に記載される。薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、ビヒクル、アジュバント、キャリアまたは希釈剤）は、一般社会に容易に入手可能である。さらに、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤、安定剤、湿潤剤など）は、一般社会に容易に入手可能である。
【０２３３】
薬学的投薬形態では、本発明のキメラ分子は、それらの薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得、またはそれらはまた、単独で、または他の薬学的に活性な化合物と共同して、ならびに組み合わせて、使用され得る。以下の方法および賦形剤は、単に模範であり、決して限定的ではない。
【０２３４】
経口調製物に関しては、キメラ分子は、単独で、または錠剤、粉末、顆粒またはカプセルをつくるために適切な添加剤（例えば、従来の添加剤（例えば、乳糖、マンニトール、コーンスターチまたはポテトスターチ）；結合剤（例えば、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、またはカルボキシメチルセルロース塩）；潤滑剤（例えば、タルクもしくはステアリン酸マグネシウム）；および所望の場合、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤および矯味矯臭剤）と組み合わせて、使用され得る。
【０２３５】
適切な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールおよびエタノールならびにそれらの組み合わせである。さらに、所望の場合、ビヒクルは、少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤）を含み得る。このような投薬形態を調製する実際の方法は、公知であるかまたは当業者に明らかである（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、１９８５）。投与される組成物または処方物は、いずれにしても、処置される被験者中で所望の状態を達成するために十分な量のキメラ分子を含む。
【０２３６】
このキメラ分子は、それらを、水溶媒または非水溶媒（例えば、植物油または他の類似油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコール；および所望の場合、従来の添加剤（例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および防腐剤）とともに）に溶解、懸濁または乳化することにより、注射のための調製物中に処方され得る。
【０２３７】
キメラ分子は、吸入により投与されるエアゾール処方で使用され得る。本発明の化合物は、加圧された受容可能な噴霧剤中（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、または窒素）に処方され得る。
【０２３８】
さらに、キメラ分子は、種々の基剤（例えば、乳化基剤または水溶性基剤）と混合することにより、坐剤へと生成され得る。本発明の化合物は、坐剤により直腸に投与され得る。坐剤は、体温で融解し、室温ではまだ固体化しているビヒクル（例えば、ココアバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコール）を含み得る。
【０２３９】
経口投与または直腸投与のための単位投薬形態（例えば、シロップ、エリキシル剤および懸濁液）で提供され、各投薬単位中（例えば、小さじ一杯、大さじ一杯、錠剤、坐剤）は、予め決めた量の１つ以上のインヒビターを含む組成物を含む。同様に、注射または静脈内投与のための単位投薬形態は、組成物中にインヒビターを、滅菌水、通常の生理食塩水または他の薬学的に受容可能なキャリア中の溶液として含み得る。
【０２４０】
（診断方法、予防方法、治療方法および栄養増強の方法）
本発明は、種々の診断方法、予防方法、治療方法、および栄養増強の方法を提供し、ここでその方法は処置される宿主への、有効量の本発明のキメラ分子またはこのようなものを含む組成物の投与を含み、ここで、成分分子は、診断活性、予防活性および栄養増強活性を有する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、その方法は、処置される宿主へのキメラ分子、またはキメラ分子を含む組成物の投与を含み、ここで、その成分分子は、診断目的のための生物学的分子に結合し得る。例えば、成分分子は、自己抗原または感染生物の抗原をコードする循環核酸分子に結合し得る、検出し得る標識を有するポリヌクレオチドであり得る。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、その方法は、処置される宿主へのキメラ分子またはキメラ分子を含む組成物の投与を含み、ここで、その成分分子は、予防的な目的のためのワクチンである。例えば、成分分子は、ポリペプチドかまたはＤＮＡワクチンであり得る。このようなワクチンは、特に好都合であり得、ここで、成分分子は、別に分解された小さなペプチドである。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、その方法は、処置される宿主へのキメラ分子またはそのようなものを含む組成物の投与を含み、ここで、成分分子は、治療的価値（例えば、処置した宿主中のタンパク質またはレセプターの生物学的活性を調節する（例えば、活性化し、増加し、または阻害する））を有する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、処置した宿主中のタンパク質の酵素活性の調節を含む。他の実施形態では、処置した宿主中のタンパク質のシグナル伝達活性を調節する方法が提供される。他の実施形態では、本発明のタンパク質と他の相互作用するタンパク質または他の高分子（例えば、ＤＮＡ、炭水化物、脂質）との相互作用を調節する方法が提供される。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、処置される宿主への、キメラ分子、もしくはそのようなものを含む組成物を投与して、栄養的な価値を有する成分分子を提供する点で、あるいは、食物の価値を最適化するための抗感染剤を提供する点のいずれかで、処置した宿主の栄養を増強することを含む。
【０２４５】
本発明は、また、処置される宿主へのキメラ分子またはそのようなものを含む組成物の送達または投与を提供し、ここで、キメラ分子は、成分分子の分解を有利に減少する。
【０２４６】
本発明は、さらに、処置される宿主へのキメラ分子またはそのようなものを含む組成物の送達または投与を提供し、ここで、キメラ分子は、成分分子の利用性を有利に増加する。
【０２４７】
ヒトおよび非ヒト動物を含む種々の宿主は、本発明の方法に従って処置され得る。一般に、このような宿主は、「哺乳動物」または「哺乳類」であり、ここで、これらの用語は、肉食動物類（例えば、イヌおよびネコ）、げっ歯類（例えば、マウス、モルモットおよびラット）および他の動物（ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギおよびブタならびに霊長類（例えば、ヒト、チンパンジーおよびサル）を含む）を含む、哺乳綱内にある生物を記載するために広く使用される。多くの実施形態において、その宿主は、ヒトである。動物モデルは、実験調査者にとって関心が持たれるものであり、ヒト疾患の処置のためのモデルを提供する。
【０２４８】
（処方物、投薬量および投与の経路）
有効量のキメラ分子（低分子、本発明のポリペプチドに特異的な抗体または成分分子として、本発明のポリペプチドを含む）が宿主に投与され、ここで、「有効量」は、所望の結果を産生するために十分な投薬量を意味する。例えば、いくつかの実施形態では、所望の結果は、少なくともコントロールと比較して本発明のポリペプチドの所定の生物学的活性における減少である。それに対して、他の実施形態では、所望の結果は、コントロールと比較して、（個体においてか、または個体の局所性解剖部位における）活性な本発明のポリペプチドのレベルの増加である。また、例として、いくつかの実施形態では、所望の結果は、少なくともコントロールと比較して本発明のポリペプチドの酵素活性の減少であり、それに対して、他の実施形態では、所望の結果は、コントロールと比較して、酵素的に活性な本発明のポリペプチド（個体内で、または個体内の解剖学的部位中で）のレベルの増加である。
【０２４９】
代表的には、本発明の組成物は、１％未満から約９５％までの活性成分を含み、好ましくは、約１０％から約５０％である。一般に、小児には、約１００ｍｇと５００ｍｇとの間で投与され、成人には、約５００ｍｇと５ｇとの間で投与される。投与は一般に、注射により、多くの場合、局部への注射による。投与の頻度は、患者の応答性に基づいて、介護者により決定される。他の効果的な投薬量は、型どおりの試験を介して用量応答曲線を確立することにより、当業者によって容易に決定され得る。
【０２５０】
キメラ分子または成分分子の量を計算するために、当業者は、所望の効果を有するために必要な成分分子の量についての入手可能な情報を容易に使用し得る。活性な本発明のポリペプチドのレベルを増加するために必要な成分分子の量は、インビトロの実験から計算され得る。成分分子の量は、当然、使用した特定の成分分子に依存して異なる。
【０２５１】
本発明の方法では、キメラ分子は、所望の活性を生じ得る任意の好都合な手段を使用して宿主に投与される。従って、キメラ分子は、宿主に投与するための種々の処方物に組み込まれ得る。より、詳しくは、本発明のキメラ分子は、適切な、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせることにより、薬学的組成物に処方され得、そして、固体の、半固体の、液体のまたは気体の形態で（例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射、吸入薬およびエアゾールで）調製物中に処方され得る。
【０２５２】
従って、キメラ分子の投与は、例えば、経口で、口腔に、直腸に、非経口的に（鼻腔内に、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、皮内に、経皮的に（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮下に、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、心臓内に（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉａｌ）、心室内に、頭蓋内になどおよび移植による投与を含む）のような種々の手段で達成され得る。薬剤は、毎日、毎週、適切に、または従来法で決定して投与され得る。
【０２５３】
用語「単位投薬形態」とは、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物被験体への単位投薬量として適切な物理的に別個の単位をいい、各単位量は、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはビヒクルと関連して所望の効果を産生するために十分な量を計算した、予め決めた量の本発明の化合物を含む。本発明の新規の単位投薬形態のための仕様は、使用される特定の化合物に達成される効果および宿主中の各化合物と関連した薬力学に依存する。
【０２５４】
キメラ分子が、成分分子としてポリペプチド、ポリヌクレオチド、そのアナログまたは模倣物（例えば、アンチセンス組成物）を含む場合、このキメラ分子は、任意の多数の経路（ウイルス感染、マイクロインジェクションまたは小胞の融合を含む）によって、組織または宿主細胞へと導入され得る。ジェットインジェクション（ｊｅｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）はまた、Ｆｕｒｔｈら、（１９９２），Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０５：３６５−３６８に記載されるように、筋内投与のために使用され得る。ＤＮＡは、金微粒子上にコーティングされ得、そして特定のボンバードメントデバイスまたは「遺伝子銃」によって、文献（例えば、Ｔａｎｇら、（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：１５２−１５４を参照のこと）に記載されるように皮内送達され得る。ここで、金発射体は、治療的ＤＮＡでコーティングされ、次いで、皮膚細胞へと射出される。
【０２５５】
当業者は、用量レベルが、特定の化合物、症状の重篤度および副作用に対する被験体の感受性の関数として変動し得ることを、容易に理解する。所定の化合物についての好ましい投薬量は、種々の手段によって、当業者に容易に決定され得る。
【０２５６】
処置によって、宿主を侵している病理学的状態に関連する症状の少なくとも寛解を意味し、ここで、寛解とは、広い意味で使用されて、処置される病理学的状態（例えば、炎症およびそれに伴う疼痛）に関連するパラメータ（例えば、症状）の強度の少なくとも減少をいう。従って、処置はまた、病理学的状態または少なくともそれに伴う症状が完全に阻害される（例えば、発生が予防される）または停止（ｓｔｏｐ）（例えば、終結（ｔｅｒｍｉｎａｔｅ））される状況を包含し、その結果、宿主は、病理学的状態または少なくともその病理学的状態を特徴付ける症状をもはや被らない。
【０２５７】
活性試薬の単位用量（通常、経口用量または注射可能な用量で）を有するキットが、提供される。このようなキットにおいて、単位用量を含む容器に加えて、目的の病理学的状態を処置する際の薬物の使用および付随する利点を記載する、情報パッケージ挿入物が存在する。好ましい化合物および単位用量は、本明細書中に上記される。
【０２５８】
１実施形態において、成分分子として抗体を含むキメラ分子は、癌または増殖障害または免疫障害または代謝障害の処置のために、このような処置を必要とする被験体に投与される。このような抗体は、例えば、注射（例えば、静脈内投与）によって全身的に；または適切な部位への注射もしくは塗布（例えば、腫瘍への直接的注射、またはこの部位が手術中に露出される場合、この部位への直接的塗布）によって；局所的塗布によって（例えば、障害が皮膚上にある場合）、投与され得る。このような抗体は、単独でかまたは他の薬剤（例えば、細胞傷害性剤）と組み合わせて、投与され得る。
【０２５９】
本発明の方法を使用して処置され得る腫瘍としては、以下が挙げられる：癌腫（例えば、結腸、直腸、前立腺、乳房、黒色腫、腺管、子宮内膜、胃、膵臓、中皮腫、口腔粘膜異形成、侵襲性口腔癌、非小細胞肺癌腫（「ＮＳＣＬ」）、移行性および扁平上皮細胞の尿路（ｕｒｉｎａｒｙ）癌腫など）；神経学的悪性腫瘍（例えば、神経芽細胞腫、多形性グリア芽細胞腫、星状細胞腫、神経膠腫など）；血液学的悪性疾患（例えば、小児期急性白血病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、悪性皮膚Ｔ細胞、菌状息肉腫、非ＭＦ皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、Ｔ細胞リッチな皮膚リンパ球性過形成、水疱性類天疱瘡、円板状エリテマトーデス、扁平苔癬など）；婦人科学の癌（例えば、子宮頚部および卵巣）；精巣癌；肝臓癌（肝細胞癌腫（「ＨＣＣ」）および胆管の腫瘍を含む）；多発性骨髄腫；食道の腫瘍；他の肺腫瘍（小細胞および明細胞を含む）；ホジキンリンパ腫；異なる器官における肉腫など。
【０２６０】
例えば、処置されるべき疾患または状態が炎症または免疫機能である他の実施形態において、本発明は、このような炎症または免疫障害を処置するための、本発明のキメラ分子（ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、低分子などを含む）を提供する。本発明の処方物を使用して処置可能な疾患状態としては、以下が挙げられる：種々の型の関節炎（例えば、慢性関節リウマチおよび変形性関節症）、皮膚の種々の慢性炎症状態（例えば、乾癬）、炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）、インスリン依存性糖尿病、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（「ＭＳ」）および全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」））、アレルギー性疾患、移植拒絶、成人呼吸促進症候群、アテローム硬化症、末梢血管、心血管および中枢神経系（「ＣＮＳ」）の血管の閉塞に起因する虚血疾患。本開示を読めば、当業者は、本発明の処方物の投与によって、他の疾患状態および／または症状が、処置および／または緩和され得ることを認識する。
【実施例】
【０２６１】
以下の実施例は、本発明を如何にして作製および使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、そして本発明者らが彼らの発明であるとみなす範囲を限定することを意図せず、そして以下の実験が実施された全ての実験であるかまたは唯一の実験であると示すこともまた、意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は℃であり、そして圧力は大気圧またはその付近である。
【０２６２】
（実施例１：細菌における発現）
本明細書中のキメラ分子は、細菌産生宿主において発現され得る。細菌における発現系には、以下に記載されるものが挙げられる：
【０２６３】
【化１】
2006503545.tif 000004
（実施例２：酵母における発現）
本明細書中のキメラ分子は、酵母産生宿主において発現され得る。酵母における発現系には、以下に記載されるものが挙げられる：
【０２６４】
【化２】
2006503545.tif 000005
（実施例３：バキュロウイルス発現系における発現）
本明細書中のキメラ分子は、昆虫細胞産生宿主において発現され得る。昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成される：米国特許第４，７４５，０５１号；Ｆｒｉｅｓｅｎら、「Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９８６）（Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ、編）；ＥＰ  ０  １２７，８３９；ＥＰ  ０  １５５，４７６；およびＶｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：７６５−７７６；Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）４２：１７７；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：４０９；Ｍａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−５９４；Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３１２９；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８５）８２：８８４４；Ｍｉｙａｊｉｍａら、Ｇｅｎｅ（１９８７）５８：２７３；ならびにＭａｒｔｉｎら、ＤＮＡ（１９８８）７：９９。多数のバキュロウイルスの株および改変体ならびに宿主由来の対応する許容性の昆虫宿主細胞が、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｇｅｎｅｒｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８６）８：２７７−２７９およびＭａｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−５９４に記載される。
【０２６５】
（実施例４：哺乳動物細胞における発現）
このキメラ分子は、哺乳動物細胞においても発現され得る。哺乳動物発現は、以下に記載されるように達成される：Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８２）７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１および米国特許第４，３９９，２１６号。哺乳動物発現の他の特徴は、以下に記載されるように促進される：ＨａｍおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．（１９７９）５８：４４、ＢａｒｎｅｓおよびＳａｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８０）１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、ＷＯ９０／１０３４３０、ＷＯ８７／００１９５および米国再特許第３０，９８５号。
【０２６６】
（実施例５：ＥＦＧおよびＴＦＦを含むキメラ分子）
処置される宿主の消化管または腸管において有利に放出され得る成分分子としては、以下が挙げられる：抗菌活性を有するもの（例えば、ラクトフェリンおよびリゾチーム）、および粘膜組織に対する保護特性もしくは治癒特性を有するもの（例えば、ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）および三つ葉型因子ファミリーのペプチド：ＴＦＦ１（以前にはｐＳ２）、ＴＦＦ２（以前にはｈＳＰ）およびＴＦＦ３（以前には腸三つ葉型因子（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒｅｆｏｉｌ  ｆａｃｔｏｒ）））。本発明のこのような実施形態において、キメラ分子の切断部位は、処置される宿主の消化管中またはその表面上で活性な酵素によってタンパク質分解されるように設計される。例えば、ヒトエンテロキナーゼは、十二指腸および空腸の粘膜において活性である。
【０２６７】
本発明の好ましい実施形態において、キメラ分子は、ヒトＥＧＦおよびＴＦＦ２の両方の１つ以上のコピーを含み、その各々は、エンテロキナーゼ切断部位を含むリンカーによって連結される。組換え産物は、薬学的に受容可能なキャリア中の精製薬物として、またはトランスジェニックウシ、トランスジェニックヒツジまたはトランスジェニックヤギの乳汁中で、あるいはトランスジェニック植物産物（例えば、イネ）において発現される栄養医薬品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）として経口投与される。このような処置から利益を受けると予測される患者集団としては、急性胃腸炎症性疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病の発赤）を有する患者、およびこれらの疾患の慢性形態を有する患者が挙げられる。アルコールまたはＮＳＡＩＤの消費から生じる潰瘍または粘膜損傷もまた、このような処置から利益を得ることが推定される。
【０２６８】
ＴＦＦ２およびＥＧＦは、いくつかの理由で、経口送達される組換えキメラ分子の成分に十分適しているようである。これらはともに、通常、消化管で生成され、それらの条件に対してともに安定であり、生物学的に相乗作用を示すようである（Ｏｅｒｔｅｌ，Ｍら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５：４１８，２００１）。ＥＧＦは、広い生物学的潜在能を有する分子であり、壊死している腸炎、ゾリンジャー−エリソン症候群、胃腸潰瘍形成、および先天性微絨毛萎縮症を有する患者において臨床的に試験されてきた（Ｇｕｇｌｉｅｔｔａ．，Ａ．ら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ７：９４５−５０，１９９５）。ＥＧＦは、胃腸粘膜に対してマイトジェン性であり、胃酸分泌を阻害し、その両方は、治癒を速めると考えられる。組換えヒトＥＧＦは、プラシーボ制御された二重盲検の臨床試験において十二指腸潰瘍の処置において経口的に活性であることが報告された（Ｐａｌｏｍｉｎｏ，Ａ．ら，Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ３５：１０６６−２２，２０００）。
【０２６９】
Ｎ末端ＥＧＦ、続いて、エンテロキナーゼ切断部位を含むリンカー、およびＴＦＦ２からなるキメラ分子は、いくつかの様式において、組換えＥＧＦの生成および使用を改善し得る。成熟組換えＥＧＦは、分子量が約６ｋＤであり、多くの生成宿主において生成される場合、生成および精製の間にＣ末端プロセシングに起因して、活性を失うと報告された（Ｅｎｇｌｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：１２３８４−９０，１９８６）。ＥＧＦ上のＣ末端融合成分は、おそらく発現レベルを増加させつつ、このような所望されないプロセシングを妨害または排除し得る。ＥＧＦのＴＦＦ２への融合はまた、ＴＦＦが胃および小腸の粘膜におけるムチン糖タンパク質に結合する報告された能力の結論として、より長期にわたって、所望の位置にＥＧＦ活性を維持するはずである（Ｐｏｕｌｓｏｎ，Ｓ．ら、Ｇｕｔ  ４３：２４０−４７，１９９８）。同様に、静脈内投与された組換えＥＧＦの８分間という半減期（Ｃａｌｎａｎ，Ｄ，ら、Ｇｕｔ  ４７：６２２−２７，２０００）は、ＴＦＦ２ムチン結合の結論としてこの融合構築物において増加し、そしてＭＷが増加すると推測される。
【０２７０】
上記のキメラ分子構築物のＴＦＦ２成分は、分子量が約１２〜１４ｋＤであり、これは、使用される産生宿主が、その分子の単一のＮ結合部位でその分子を完全にグリコシル化可能であるか否かに依存する。ラットモデルにおいて、組換えＴＦＦ２は、皮下経路および経口経路の両方を介して、胃潰瘍の治癒を促進し（Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｓ．ら、Ｇｕｔ  ４５：５１６〜２２，１９９９）、粘膜の血流を増強して胃の分泌を刺激し（Ｋｏｎｔｕｒｅｋ，Ｐ．ら、Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  ６８：７１〜９，１９９７）、そしてヒト単球の遊走を刺激する（Ｃｏｏｋ，Ｇ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４５６：１５５〜５９，１９９９）。これらの知見により予測される通り、ＴＦＦ２ノックアウトマウスは、胃粘膜の成長の減少、酸分泌の増加、およびヨードメタシン処置後の胃潰瘍に対する感受性の増加を示した（Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｊ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０９：１９３〜２０４，２００２）。多様な潰瘍状態において、３つすべての三葉（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子ならびにＥＧＦを生成する腺構造が形成されて、おそらく、病巣治癒を促進する（Ｐｏｕｌｓｏｍ，Ｒ．，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １１０：１１３〜３４，１９９６）。要するに、ＴＦＦ２は、組換え生成についての改善された特性ならびに上記に列挙した胃腸状態に対する効力を有するキメラ分子において、ＥＧＦと有効に作用し得る。
【０２７１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＥＧＦ（Ｈｅｒｂｅｒ  Ｂｉｏｔｅ  ＳＡ，Ｈａｖａｎａ，Ｃｕｂａ）およびＴＦＦ２（Ｔｈｉｍ，Ｌ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３１８：３４５〜５２，１９９３）の両方の組換え形態を生成するために首尾良く使用されている。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉは、リフォールディングされた組換えＥＧＦ（Ｌｅｅ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：２４５〜４８，２０００）およびＴＦＦ１（ＴＦＦ２に対して相同な分子であるが、２つではなく１つのシステインリッチな三葉ドメインを有する）を生成するために首尾良くしようされている。従って、これらの産生宿主のうちの１つまたは両方を使用して、有用な量の活性組換えＥＧＦ／リンカー／ＴＦＦ２キメラ分子を生成することが、可能であるはずである。
【０２７２】
（実施例６：ヒト上皮成長因子と、エンテロキナーゼ切断部位を含むリンカーと、ヒトＴＦＦ２とを含む、キメラ分子の調製）
本発明に従って、ＥＧＦ／エンテロキナーゼ切断部位リンカー／ＴＦＦ２融合化合物を、生成する。５’→３’の方向で、上記成分ＤＮＡ配列を、それらの成分の末端に適切な切断部位をＰＣＲ増幅を使用して設計すること、当業者にとって公知であるような市販の制限酵素およびＤＮＡリガーゼをそれぞれ使用してそれらのフラグメントを切断し一緒に連結することによって、連結する。その成分は、順番に、酵母ＧＡＰＤＨプロモーター配列、酵母α接合因子リーダー配列、および配列番号１におけるタンパク質をコードするヒト上皮成長因子のＤＮＡ配列を含む。この３’末端に、配列番号２に示されるエンテロキナーゼ切断部位を含むリンカーをコードするＤＮＡ配列を付加する。最後に、配列番号３におけるタンパク質をコードするヒト三葉ファミリー因子２（ＴＦＦ２、ｈＳＰとしても公知、Ｔｏｍａｓｓｅｔｔｏ，Ｃ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  ９：４０７，１９９０）のＤＮＡ配列を、この３’末端に付加し、最後に、酵母α接合因子ターミネーターを付加する。
【０２７３】
構築物の正確性を、ＤＮＡ配列決定によって確認し、次いで市販の酵母発現ベクターであるＹｅｐ２４（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ由来であり、そして選択マーカーとして使用するためにＵｒａ３遺伝子を含む）にクローニングする。この構築物を、当該分野で公知の方法を使用して、生成物酵母株であるＩＮＶＳｃｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製であり、Ｕｒａ３を欠いている）にトランスフェクトする。結果としてプラスミドｐＥＥＴ−１を含む、選択された形質転換体をファーメンテイション（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）のために使用して、大きな選択生成物として融合化合物ポリペプチドを生成する。
【０２７４】
Ｔｈｉｍ，Ｌ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３１８：３４５−５２，１９９３に記載されるように、この形質転換体を、８リットルのＹＰＤ培地＋６０ｎｇ／ｌ酵母抽出物中、３０℃にて、ＯＤ６５０が５０を超えるまで増殖させた。Ｔｈｉｍ，Ｌ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３１８：３４５−５２，１９９３に記載されるように、ファーメンテイションブロスを遠心分離によって清浄化し、Ａｍｉｃｏｎ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎによって濃縮し、ｐＨを１．７に調整し、伝導率を４．５ｍＳに調整し、そしてＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに充填し、溶出した。この融合タンパク質を、Ｃａｌｎａｎ，Ｄ．ら、Ｇｕｔ  ４７：６２２−２７，２０００に記載されるように、ＥＧＦについての初代ラット肝細胞増殖アッセイにおける中和アリコートの活性を測定することによって、得られた画分中で検出する。ピーク画分における活性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認し、それによると、相当な量の融合タンパク質を含む画分は、Ｇａｉｌｌａｒｄ，Ｉ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：６１５０，１９９６に記載されるように、２０ＫＤ  ＭＷまたはその付近にバンドを有し、これは、エンテロキナーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いるインビトロでの第二のアリコートのインキュベートにより切断されるが、汚染されたバンドは、大部分は変化しない。
【０２７５】
プールされた画分は、さらにＴｈｉｍ，Ｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３１８：３４５−５２，１９９３に記載されるように、エンドトキシンを含まない装置およびＶｙｄａｃ  Ｃ４逆相ＨＰＰＬＣカラムクロマトグラフィーを用いて精製する。記載されるように、アセトニトリルおよびＴＦＡ中のＲＰ−ＨＰＬＣは、グリコシル化されていない融合タンパク質からグリコシル化された融合タンパク質および集合体を分離し、そして所望の生成物から所望でないエンドトキシンを分離する。最終のプールされた物質におけるエンドトキシンを、リムルス遊走細胞アッセイ（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ａｓｓａｙ）（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ，Ｉｎｃ，Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｅ，ＭＡ）を用いて測定し、これは、精製タンパク質の１ＥＵ／ｍｇ未満である。ピーク画分を、上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって実証し、プールし、そして２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に対してダイアフィルトレーションする。
【０２７６】
精製した物質を、治療用投与にとって適切な濃度（例えば、１％カルボキシメチルセルロース中の約８ｍｇタンパク質／ｍｌ（経口投与用）または４０ｍｇ／ｍｌマンノース中の約８ｍｇタンパク質／ｍｌ（滅菌濾過および非経口薬物の凍結乾燥用））に濾過することによって濃縮する。経口投与は−２０℃で保存し、凍結乾燥物質は４℃で安定である。
【０２７７】
最終調製物は、例えば、１２％ゲルでの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９５％より高い純度であり、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって５％未満のオリゴマーを有し、９０％よりも高い推定Ｎ末端配列をエドマン分解によって示し、そして１ｍｇのタンパク質あたり１ＥＵ未満のエンドトキシンおよびＥＧＦバイオアッセイによって等モル濃度でアッセイした場合にモノマーＥＧＦ成分の活性の約２０％以内である融合タンパク質１モルあたりの生物学的活性を有し、品質管理測定に合格する。同様に、精製融合化合物は、インビトロで上皮細胞移動アッセイ（Ｐｏｕｌｓｏｍ，Ｒ．，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １０：１１３−３４，１９９６）において等モル濃度でアッセイした場合、ＴＦＦ２成分の生体活性の約２０％以内の生物学的活性を有する。
【０２７８】
急性胃腸管障害に関して処置されるべき患者は、経口処方物中の融合化合物を１日あたり約５００ｍｇまで受け、そして滅菌注射用水中で新たに作製される皮下調製物において約２ｍｇ／ｋｇ／日までを受ける。
【０２７９】
本発明を、本発明の特定の実施形態を参照して記載してきたが、種々の変更が行われ得、そして本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく等価物で置換され得ることが当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスの工程を本発明の目的、趣旨および範囲に合わせるために、多くの改変が行われ得る。全てのこのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０２８０】
【化３】
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【０２８１】
【化４】
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【０２８２】
【化５】
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【０２８３】
【表２】
2006503545.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】図１は、切断部位が本発明のキメラ分子のリンカーについて設計され得る酵素（「標的酵素」）の型の図示である。
【配列表】
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【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月13日(2005.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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