(57)【要約】本発明は、抗アンドロゲン、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）選択的アゴニストおよび場合により化学去勢剤を含む医薬製品または１日用量に関する。本発明は、更に、患者のアンドロゲンに刺激される疾患（例えば、前立腺癌または良性前立腺肥大）を治療的に処置するおよび／または予防する方法に関する。更に、本発明は、この目的のための医薬製品の製造における抗アンドロゲン、ＥＲβ選択的アゴニストおよび場合により化学去勢剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬製品であって、患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防するための患者への同時または連続投与用の抗アンドロゲンおよびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）選択的アゴニストを含む医薬製品。
【請求項２】
医薬製品であって、患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防するための患者への同時または連続投与用の抗アンドロゲン、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）選択的アゴニストおよび化学去勢剤を含む医薬製品。
【請求項３】
化学去勢剤が、ゴセレリンおよびロイプロレリンより選択される請求項２に記載の医薬製品。
【請求項４】
抗アンドロゲンが、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミドまたはその薬学的に許容しうる塩、鏡像異性体または溶媒和化合物、酢酸クロルマジノンおよび酢酸シプロテロンより選択される請求項１〜３のいずれかに記載の医薬製品。
【請求項５】
ＥＲβ選択的アゴニストが、ゲニステイン、ジアゼンおよびクメステロール、それらのエストロゲン類似体、またはそれらの薬学的に許容しうる塩、鏡像異性体または溶媒和化合物ＥＲβ選択的アゴニストから成る群より選択される請求項１〜４のいずれかに記載の医薬製品。
【請求項６】
抗アンドロゲンおよびＥＲβ選択的アゴニストが、２５〜１０００：０．０３〜２５０の重量比でそれぞれ与えられている請求項１〜５のいずれかに記載の医薬製品。
【請求項７】
患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防するための患者へ投与用の１日医薬用量であって、患者への同時または連続投与用の抗アンドロゲンおよびＥＲβ選択的アゴニストを含む１日医薬用量。
【請求項８】
２５〜１０００ｍｇの抗アンドロゲンを含む請求項５に記載の用量。
【請求項９】
０．０３〜２５０ｍｇのＥＲβ選択的アゴニストを含む請求項５または請求項６に記載の用量。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製品および薬学的に許容しうる希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防するための患者への同時または連続投与用の抗アンドロゲンおよびＥＲβ選択的アゴニストの医薬製品の製造における使用。
【請求項１２】
患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防するための患者への同時または連続投与用の抗アンドロゲン、化学去勢剤およびＥＲβ選択的アゴニストの医薬製品の製造における使用。
【請求項１３】
アンドロゲンに刺激される疾患が、前立腺癌、良性前立腺肥大、アクネおよび多毛症より選択される請求項１１または請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
医薬製品が、請求項３〜６のいずれか１項に記載されているものである、請求項１１、請求項１２または請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防する方法であって、患者に抗アンドロゲンおよびＥＲβ選択的アゴニストを同時にまたは連続的に投与することを含む方法。
【請求項１６】
患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防する方法であって、患者に抗アンドロゲン、化学去勢剤およびＥＲβ選択的アゴニストを同時にまたは連続的に投与することを含む方法。
【請求項１７】
アロマターゼ阻害剤または抗エストロゲンを含む請求項１に記載の医薬製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗アンドロゲン（anti-androgen）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）選択的アゴニストおよび場合により化学去勢剤（chemical castration agent）を含む医薬製品（pharmaceutical product）または１日用量（daily dose）に関する。本発明は、更に、患者のアンドロゲンに関連した状態（例えば、前立腺癌または良性前立腺肥大）を治療的に処置するおよび／または予防する方法に関する。更に、本発明は、この目的のための医薬製品の製造における抗アンドロゲン、ＥＲβ選択的アゴニストおよび場合により化学去勢剤の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
前立腺、具体的には、それらの上皮細胞は、悪性でも良性でも、概して、ホルモン依存性であり、それによって、アンドロゲン受容体を経るアンドロゲン作動性増殖シグナリングの阻害に感受性である。アンドロゲン除去は、外科的去勢または化学的去勢を経て、例えば、ゴセレリンまたはロイプロレリン（leuprorelin）のような黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニストまたはＬＨＲＨアンタゴニストを用いて行うことができる。アンドロゲンの作用は、抗アンドロゲン療法を用いて、例えば、アンドロゲン受容体において作用するビカルタミド（bicalutamide）（またはその鏡像異性体）、フルタミドまたはニルタミド（nilutamide）などの抗アンドロゲンを用いて対抗することもできる。これら抗アンドロゲンの性状および有用性は、例えば、本明細書中に援用される次の論文に概説されている。
【０００３】
フルタミド（flutamide）
R O Neri, J. Drug Develop., 1987, 1 (Suppl.), 5-9 and Urology, 1989, 34 (Suppl. 4), 19-21 および英国特許出願第１３６０００１号；
ビカルタミド（bicalutamide）
B J A Furr et al., Urology, 1996, 47 (Suppl. 1A), 13-25, G J C Kolvenbag et al., Urology, 1996, 47 (Suppl. 1A), 70-79 および欧州特許出願第０１００１７２号の実施例６の表に挙げられた８番目の化合物として；
ニルタミド（nilutamide）
M G Harris et al., Drugs and Aging, 1993, 3, 9-25 および英国特許出願第１５１８４４４号。
【０００４】
非ステロイド性抗アンドロゲンであるビカルタミドは、４’−シアノ−α’，α’，α’−トリフルオロ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオノ−ｍ−トルイジドのラセミ体であり、ＣＡＳＯＤＥＸTMという AstraZeneca 商品名で知られている。ＥＰ−１００１７２号は、４’−シアノ−α’，α’，α’−トリフルオロ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオノ−ｍ−トルイジド（ＥＰ−１００１７２号では、４−シアノ−３−トリフルオロメチル−Ｎ−（３−ｐ−フルオロフェニルスルホニル−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオニル）アニリンと称される）を、実施例６の表に挙げられた８番目の化合物として開示している。該当する構造は、式Ｉ
【０００５】
【化１】
2004529182.tif 000002
【０００６】
で示され、４’−シアノ−α’，α’，α’−トリフルオロ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオノ−ｍ−トルイジドは、異なったＲ−およびＳ−の鏡像異性体の形で存在しうる。このＲ−鏡像異性体は、（−）異性体であり、in vivo で薬理学的に活性な化合物である。これら鏡像異性体の更に詳細については、Tucker and Chesterton, J. Med. Chem. 31, pp 885-887 (1988) を参照する。
【０００７】
抗アンドロゲンであるフルタミドは、ＥＵＬＥＸＩＮTMという商品名で知られている。フルタミドは、２−メチル−Ｎ−［４−ニトロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］プロパンアミド；α，α，α−トリフルオロ−２−メチル−４’−ニトロ−ｍ−プロピオノトルイジド；および４’−ニトロ−３’−トリフルオロメチルイソブチルアニリドという別名でも知られている。フルタミドは、ＵＳ３，８４７，９８８号に開示されている。該当する構造は、次の式ＩＩで示される。
【０００８】
【化２】
2004529182.tif 000003
【０００９】
抗アンドロゲンであるニルタミドは、ＮＩＬＡＮＤＲＯＮTMという商品名で知られている。ニルタミドは、５，５−ジメチル−３−［４−ニトロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］−２，４−イミダゾリジンジオン；および１−（３’−トリフルオロメチル−４’−ニトロフェニル）−４，４−ジメチルイミダゾリン−２，５−ジオンという別名でも知られている。ニルタミドは、ＵＳ４，０９７，５７８号に開示されている。該当する構造は、次の式ＩＩＩで示される。
【００１０】
【化３】
2004529182.tif 000004
【００１１】
クロルマジノンは、例えば、その酢酸塩の形で抗アンドロゲンである。この酢酸塩の形は、１７−（アセチルオキシ）−６−クロロプレグナ−４，６−ジエン−３，２０−ジオン；６−クロロ−１７−ヒドロキシプレグナ−４，６−ジエン−３，２０−ジオン酢酸塩；６−クロロ−６−デヒドロ−１７α−ヒドロキシプロゲステロン酢酸塩；６−クロロ−６−デヒドロ−１７α−アセトキシプロゲステロン；および１７α−アセトキシ−６−クロロ−６，７−デヒドロプロゲステロンという別名で知られている。クロルマジノンは、ＵＳ３，４８５，８５２号に開示されている。
【００１２】
シプロテロンは、（１β，２β）−６−クロロ−１，２−ジヒドロ−１７−ヒドロキシ−３’Ｈ−シクロプロパ［１，２］プレグナ−１，４，６−トリエン−３，２０ジオン；６−クロロ−１７−ヒドロキシ−１α，２α−メチレンプレグナ−４，６−ジエン−３，２０−ジオン；６−クロロ−６−デヒドロ−１７α−ヒドロキシ−１，２α−メチレンプロゲステロン；および６−クロロ−１，２α−メチレン−４，６−プレグナジエン−１７α−オール−３，２０−ジオンという別名で知られている。シプロテロンは、ＵＳ３，２３４，０９３号に開示されている。酢酸シプロテロンは抗アンドロゲンである。
【００１３】
アンドロゲンの作用に、抗アンドロゲン療法単独によって得られるよりも大きい程度に対抗することは、望ましいと考えられる。これは、アンドロゲンに関連した状態、すなわち、上に論及された前立腺癌のようなアンドロゲンに刺激される疾患、更には、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）のような状態の処置および／または予防に有用であると考えられる。
【００１４】
発明の概要
本発明は、患者のアンドロゲンに関連した状態を治療的に処置するおよび／または予防するための患者への同時（simultaneous）または連続（sequential）投与用の、抗アンドロゲン、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）選択的アゴニストおよび場合により化学去勢剤を含む医薬製品を提供することによってこれを達成する。
【００１５】
本発明は、更に、患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防するための患者へ投与用の１日医薬用量（daily pharmaceutical dose）であって、患者への同時または連続投与用の抗アンドロゲンおよびＥＲβ選択的アゴニストを含む１日医薬用量を提供する。
【００１６】
本発明のもう一つの側面は、患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防するための患者への同時または連続投与用の、抗アンドロゲン、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）選択的アゴニストおよび場合により化学去勢剤の医薬製品の製造における使用に関する。
【００１７】
更にもう一つの側面は、患者のアンドロゲンに刺激される疾患を治療的に処置するおよび／または予防する方法であって、患者に抗アンドロゲン、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）選択的アゴニストおよび場合により化学去勢剤を同時にまたは連続的に投与することを含む方法に関する。
【００１８】
発明の詳細な説明
何年もの間、一つのエストロゲン受容体（ＥＲα）しか存在しないと考えられていた。より最近になって、第二のエストロゲン受容体（ＥＲβ）が発見された。これら二つの受容体は、異なった組織分布を有し、ＥＲαは、子宮、精巣、下垂体、卵巣、腎、精巣上体および副腎で最高の発現を示すが、ＥＲβは、脳、前立腺、卵巣、肺、膀胱および精巣上体で最も高く発現される。ＥＲαおよびＥＲβは、異なった遺伝子によってエンコードされている。ＥＲβのクローニングは、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996), 93:5925-5930, Kuiper et al, "Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary" に記載されている。G Prins および L Birch は、雄ラットの新生児エストロゲン処置を記載しているが、これは、三つの前立腺葉全ての上皮細胞でのアンドロゲン受容体発現をダウンレギュレーションすることが示されおり、したがって、全体的前立腺成長遅滞をもたらす（Endocrinology (1995), Vol. 136, No. 3, 1303-1314, G Prins and L Birch, "The development pattern of androgen receptor expression in rat prostate lobes is altered after neonatal exposure to estrogen"）。
【００１９】
本発明は、患者のアンドロゲンに関連した状態（例えば、早期または進行した前立腺癌）を治療的に処置するおよび／または予防するための抗アンドロゲンおよびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）選択的アゴニストの併用によって生じる驚くべき相乗効果に基づいている。この組合せは、応答の程度、応答速度、疾患進行への時間および患者の生存率の内の一つまたはそれを超えるものに関して相乗効果を有することがありうる。この組合せは、アンドロゲンに刺激される疾患、例えば、前立腺癌の開始を予防する場合、遺伝的にこの疾患に罹患しやすいヒトに有益な作用を有するであろうと期待される。慣用的な方法は、患者を、癌にかかる危険によって、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のような特定の血中タンパク質の経時測定値および家族病歴の評価によって分類するのに利用可能である。
【００２０】
いずれの特定の理論にも拘束されたくはないが、本発明者は、この相乗効果は、患者のアンドロゲン受容体のダウンレギュレーションを引き起こすＥＲβ選択的アゴニストの作用と一緒になった、アンドロゲン受容体における抗アンドロゲンの作用の結果であると考えている。本発明者は、これら二つのエストロゲン受容体が、異なった且つ潜在的に反対の作用を有することによって、ＥＲα選択的アゴニストによるＥＲαの活性化が細胞増殖を引き起こし、選択的ＥＲβアゴニストによるＥＲβの活性化が増殖を阻害すると考えているので、本発明は、ＥＲβに選択的であるアゴニストの使用を必要とする。
【００２１】
「アンドロゲンに関連した状態（androgen related condition）」という用語は、本明細書中において「アンドロゲンに刺激される疾患」とも称され、アンドロゲンによって活性化されるまたは引き起こされる疾患を意味する。このような疾患には、良性および悪性の前立腺癌、アクネ（acne）および多毛症が含まれる。
【００２２】
「製品（product）」という用語は、抗アンドロゲンおよびＥＲβ選択的アゴニストの混合物（例えば、双方の化合物を含有するカプセル剤または錠剤として与えられる）かまたは別々の量のこれら化合物を含むキット（例えば、ＥＲβ選択的アゴニスト錠剤セットおよび別の抗アンドロゲン錠剤セット）を意味するものである。後者の製品は、患者へのこれら化合物の同時または連続（すなわち、時間的に間隔を置いた）投与に用いることができるが、予め混合された化合物は同時投与用である。各々の薬剤の吸収速度、代謝および排泄速度などの因子は、腫瘍部位におけるそれらの存在に影響を与えるであろう。このような因子は、医師が、有益な作用を得るために二つの薬剤の共同投与を必要とする医学的状態の処置を考える場合に、常套的に考慮されるし且つ充分に技術の範囲内である。
【００２３】
患者は、ヒト男性、例えば、成人でありうるが、他の哺乳動物の処置も考えられる。
本発明の一つの態様において、抗アンドロゲンは、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミドまたはその薬学的に許容しうる塩、鏡像異性体または溶媒和化合物、酢酸クロルマジノンおよび酢酸シプロテロンより選択される。例えば、抗アンドロゲンは、ビカルタミドのＲ−鏡像異性体でありうる。具体的な抗アンドロゲンに依存して、適当な塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩またはｐ−トルエンスルホン酸塩のような酸付加塩、またはナトリウム塩またはカリウム塩のようなアルカリ金属塩である。
【００２４】
好ましくは、ＥＲβ選択的アゴニストは、ゲニステイン（genistein）、ジアゼン（diadzen）およびクメステロール（coumesterol）、またはそれらのエストロゲン類似体（ＷＯ００／６２７６５号に記載のものなど）、またはそれらの薬学的に許容しうる塩、鏡像異性体または溶媒和化合物ＥＲβ選択的アゴニストから成る群より選択される。ＥＲβ選択的アゴニストという用語は、ＥＲβアゴニストが、ＥＲαよりＥＲβに選択的であるということを意味する。別の態様において、このアゴニストは、５倍、１０倍、２０倍、１００倍またはそれを超える増加する優先順位で、ＥＲαよりもＥＲβに選択的である。より好ましくは、ＥＲβアゴニストは、ＥＲαではなくＥＲβに完全に選択的である。ＥＲβにより選択的であるとされるアゴニストは、ＷＯ００／５９８９７号およびＷＯ００／６２７６５号に開示され、これらアゴニストの製造の開示を含めた開示は、本発明で用いることができるアゴニストの例を与えるために本明細書中にそのまま援用される。フィトエストロゲンについての更に詳細は、Endocrinology 1998, v. 139,10, pp4252-4263 に開示されているが、これは、ＥＲβに選択的である場合に本発明で用いることができるアゴニストの例を与えるために本明細書中にそのまま援用される。当業者は、ある試験化合物がＥＲβの選択的アゴニストであるか否かを決定することができる。特異性を決定するのに適当なエストロゲン受容体結合検定および細胞に基づくＥＲ転写検定は、本明細書中の実施例部分に記載されている。
【００２５】
化学去勢剤を用いる場合、これは、例えば、ゴセレリン（goserelin）およびロイプロレリン（leuprorelin）より選択される。
医薬製品において、抗アンドロゲンおよびＥＲβ選択的アゴニストは、例えば、２５〜１０００ｍｇ（好ましくは、この範囲の下限は５０または１００である；好ましくは、この範囲の上限は５００、３５０、３００、１５０または５０である；これら範囲内の適当な値は７５０、３７５、１５０、１２５または５０である）：０．０３〜２５０（好ましくは、この範囲の下限は０．１であり、好ましくは、この範囲の上限は１０である；最も好ましい範囲は０．３〜２．５である；この範囲内の適当な値は０．３、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、２または２．５である）の重量比で与えられうる。ビカルタミドについては、好ましい範囲は、１０〜３５０（好ましくは、この範囲の下限は５０である；好ましくは、この範囲の上限は３００、１５０または５０である；これら範囲内の適当な値は１５０または５０である）である。フルタミドについて、好ましい範囲は１００〜１０００であり、７５０または３７５が好ましい値である。酢酸クロルマジノンについて好ましい値は５０である。酢酸シプロテロンについて好ましい範囲は２００〜３００である。ニルタミドについて好ましい範囲は５０〜５００であり、３００または１５０が好ましい値である。
【００２６】
一つの態様において、本発明の医薬製品の各々の化合物は、毎日投与される。もう一つ可能な投薬計画は、抗アンドロゲンを隔日に投薬し且つＥＲβ選択的アゴニストも（同じまたは異なった）隔日に投薬することであると考えられる。或いは、抗アンドロゲンを３日、４日、５日、６日または７日毎に投与し、そしてＥＲβ選択的アゴニストを３日、４日、５日、６日または７日毎に（例えば、抗アンドロゲンと同日に）投与する。このために、医薬製品を投薬説明書と一緒に含むキットを提供することができる。
【００２７】
一つの例で、１日医薬用量は、２５〜１０００ｍｇ（好ましくは、この範囲の下限は５０または１００ｍｇである；好ましくは、この範囲の上限は５００、３５０、３００、１５０または５０ｍｇである；これら範囲内の適当な値は７５０、３７５、１５０、１２５または５０ｍｇである）の量の抗アンドロゲンを含む。ＥＲβ選択的アゴニストは、好ましくは、０．０３〜２５０ｍｇ（好ましくは、この範囲の下限は０．１ｍｇである；好ましくは、この範囲の上限は１０ｍｇである；最も好ましい範囲は０．３〜２．５ｍｇである；この範囲内の適当な値は０．３、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、２または２．５ｍｇである）の量で与えられる。ビカルタミドについて好ましい範囲は、２５〜３５０ｍｇ（好ましくは、この範囲の下限は５０ｍｇである；好ましくは、この範囲の上限は３００、１５０または５０ｍｇである；これら範囲内の適当な値は１５０または５０ｍｇである）である。フルタミドについて好ましい範囲は、１００〜１０００ｍｇであり、７５０または３７５ｍｇが好ましい値である。酢酸クロルマジノン（chlormadinone acetate）について好ましい値は５０ｍｇである。酢酸シプロテロン（cyproterone acetate）について好ましい範囲は２００〜３００ｍｇである。ニルタミドについて好ましい範囲は５０〜５００ｍｇであり、３００または１５０ｍｇが好ましい値である。
【００２８】
一つの態様において、この１日用量は、２５０ｍｇのフルタミド３回（例えば、２５０ｍｇを８時間毎に投与する）または１２５ｍｇのフルタミド３回（例えば、１２５ｍｇを８時間毎に投与する）を含む。もう一つの態様において、１日用量は、５０ｍｇのビカルタミド３回（例えば、５０ｍｇを８時間毎に投与する）または１５０ｍｇのビカルタミド１回を含む。
【００２９】
本発明の製品および用量は、経口使用に（例えば、錠剤、カプセル剤、水性または油状懸濁剤、乳剤または分散性散剤または顆粒剤として）、局所使用に（例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、または水性または油状溶液または懸濁剤として；例えば、経皮パッチ中での使用に）、非経口投与に（例えば、静脈内、皮下、筋肉内または血管内投薬用の滅菌水性または油状水剤または懸濁剤として）適した形、または直腸投薬用の坐剤としてあってよい。好ましくは、本発明の製品および用量は、経口使用に適した形で、例えば、錠剤またはカプセル剤としてある。
【００３０】
本発明の製品および用量は、慣用法により、当該技術分野において周知である慣用的な薬学的に許容しうる希釈剤または担体を用いて得ることができる。
錠剤製剤に適した薬学的に許容しうる希釈剤または担体には、例えば、ラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムのような不活性希釈剤；トウモロコシデンプンまたはアルギン酸のような造粒剤および崩壊剤；ゼラチンまたはデンプンのような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクのような滑沢剤；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルのような保存剤；およびアスコルビン酸のような抗酸化剤が含まれる。錠剤製剤は、胃腸管内でのそれらの崩壊およびその後の活性成分の吸収を変更ためにかまたは、それらの安定性および／または外観を改善するために、どちらの場合も当該技術分野において周知の慣用的なコーティング剤および手順を用いてコーティングされていてよいし、またはコーティングされていなくてよい。
【００３１】
経口使用のための組成物は、活性成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されているゼラチン硬カプセル剤の形であってよいし、または活性成分が、ラッカセイ油、流動パラフィンまたはオリーブ油のような油または水と混合されているゼラチン軟カプセル剤としてあってよい。
【００３２】
ヒトへの単一薬剤療法での抗アンドロゲン（ビカルタミド）の投与は、血液中に循環しているテストステロンの量を増加させるということが認められている。Blackledge et al, (Urology, 1996, 47, Suppl. 1A), pp 44-47) は、総テストステロンの基底レベルからほぼ倍増することを開示している。テストステロンレベルのこのような増加は、充分な量の抗アンドロゲンがＣＮＳに接近し且つ視床下部においてアンドロゲン受容体をブロックする場合に起こると考えられる。結果として起こるアンドロゲンフィードバックの欠如は、視床下部による追加のＬＨＲＨ放出を引き起こし、これが順次、下垂体による黄体形成ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出および精巣でのテストステロンの生産を引き起こす。脂肪および他の組織中のアロマターゼ酵素は、若干の増加した濃度のテストステロンをエストラジオールに変換するが、これは、血中のエストロゲン濃度を増加させる。これについての更なる考察は、C Mahler et al, Clinical Pharmacokinetics, 1998, 34(5), pp 405-417 によって与えられている。不利な作用は生じる。すなわち、循環性エストロゲンレベルの増加は、女性化乳房、胸痛、ホットフラッシュ、不能症および性欲低減の内一つまたはそれを超える副作用を引き起こすことがありうる。女性化乳房についての考察は、C J Tyrrell, Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 1999, 2(4): pp 167-171 に見出されうる。
【００３３】
このために、一つの側面において、本発明は、更に、女性化乳房、胸痛、ホットフラッシュ、不能症および性欲低減より選択される少なくとも一つの副作用の発生率または重症度の増加を抑制することを目的としたアロマターゼ阻害剤または抗エストロゲンを包含する。適当なアロマターゼ阻害剤は、ＡＲＩＭＩＤＥＸTMという AstraZeneca 商品名で知られているアナストロゾール（anastrozole）である。アナストロゾールは、２，２’−［５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イルメチル）−１，３−フェニレン］ジ（２−メチルプロピオニトリル）として知られ、ＵＳ再発行Ｎｏ．３６，６１７に開示されている。適当な抗エストロゲンは、ＮＯＬＶＡＤＥＸTMという AstraZeneca 商品名で知られているタモキシフェン（tamoxifen）である。タモキシフェンは、１−（ｐ−β−ジメチルアミノエトキシフェニル）−１，２−ジフェニルブト−１−エンのトランス異性体であり、ＵＳ４，５３６，５１６号に開示されている。
【００３４】
抗アンドロゲンおよび抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）は、それぞれ、２５〜１０００ｍｇ（または抗アンドロゲンについて上に明記されたいずれか他の値）：０．５〜１００（好ましくは、この範囲の下限は１または５である；好ましくは、この範囲の上限は４０、２０または１０である；この範囲内の適当な値は２０である）の比率で与えられる。アロマターゼ阻害剤（aromatase inhibitor）を用いる場合、抗アンドロゲンおよびアロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール（anastrozole））は、それぞれ、２５〜１０００（または抗アンドロゲンについて上に明記されたいずれか他の値）：０．００５〜１００（好ましくは、この範囲の下限は０．０５または０．５である；好ましくは、この範囲の上限は５０、１０または１である；最も好ましい範囲は０．５〜１である；この範囲内の適当な値は１である）の比率で与えられる。
【００３５】
適当な１日医薬用量は、０．５〜１００ｍｇのタモキシフェンまたはその薬学的に許容しうる塩または溶媒和化合物を含む。好ましくは、この範囲の下限は１または５ｍｇであり；好ましくは、この範囲の上限は４０、２０または１０ｍｇであり；この範囲内の適当な値は２０ｍｇである。アロマターゼ阻害剤を用いる場合、適当な１日医薬用量は、０．００５〜１００ｍｇのアナストロゾールまたはその薬学的に許容しうる塩または溶媒和化合物を含む。好ましくは、この範囲の下限は０．０５または０．５ｍｇであり；好ましくは、この範囲の上限は５０、１０または１ｍｇであり；最も好ましい範囲は０．５〜１ｍｇであり；この範囲内の適当な値は１ｍｇである。
【００３６】
実験方法
動物試験および／または適当な臨床試験における in vitro 実験方法も in vivo 実験方法も、本発明の医薬製品の協力活性を評価するのに用いることができる。
【００３７】
in vitro 方法
アンドロゲン依存性またはアンドロゲン非依存性のヒト前立腺癌細胞系は、本発明の製品の種々の濃度の抗アンドロゲンかまたはＥＲβ選択的アゴニスト成分に、または種々の濃度の両成分の組合せに in vitro で暴露することができる。それによって、この組合せの作用の程度および持続期間を決定することができる。例えば、ヒト前立腺ＤＵ１４５細胞、ＴＳＵ−ＰＲ１細胞、ＣＷＲ２２細胞、ＰＣ−３細胞またはＬＮＣａＰ細胞を用いることができる。成長阻害は、例えば、標準的な軟寒天コロニー形成検定または例えば、標準的なＭＴＴ検定を用いて評価することができる。細胞アポトーシスは、例えば、標準的なＥＬＩＳＡ検定、例えば、Boehringer, Mannheim, Germany から入手可能な Cell Death Detection ＥＬＩＳＡ Plus Kit を用いて評価することができる。アンドロゲン受容体発現は、例えば、TaqmanTMＰＣＲまたは免疫組織化学を用いて評価することができる。それによって、例えば、抗アンドロゲンおよびＥＲβ選択的アゴニストの組合せで、ほとんど細胞傷害性でない濃度で単独に用いられる場合にその組合せのどちらかの成分の最大の達成可能な作用よりも増加した細胞成長阻害が得られるということを示すことができるし、そして例えば、組合せを用いる場合、どちらかの成分についての用量反応曲線は、より大きい力価を示すように移動することができる。例えば、ＥＲβ選択的アゴニストは、アンドロゲン受容体を調節することができるということも示されうる。
【００３８】
in vivo 方法
前立腺癌組織または細胞系に由来する腫瘍は、ラットまたはマウスなどの動物、特に、無胸腺ヌードマウスまたはラット中で成長することができる。これら腫瘍細胞または組織の接種または植込および成長後、試験動物を本発明で処置することができ、各々の処置計画前、中および後の腫瘍サイズを評価して、この処置の治療的作用の指標を与えることができる。
【００３９】
例えば、Dunning Ｒ−３３２７Ｈ前立腺癌組織の成体雄近交系 Copenhagen ラットでの植込および成長を、J T Isaacs et al., Cancer Research, 1981, 41, 5070-5075 および Cancer Research, 1989, 49, 6290-6294 によっておよび D J George et al., Cancer Research, 1999, 59, 2395-2401 によって開示された一般的な手順にしたがって行う異種移植片モデルを用いることができる。試験化合物は、例えば、Tween ８０（登録商標）中にボールミル磨砕によって、例えば、約１６時間懸濁させ、そして強制飼養によって経口投与することができる。抗アンドロゲンであるビカルタミドおよびＥＲβ選択的アゴニストの組合せ製品の経口投与が、例えば、摘出された異種移植片組織の慣用的なＫｉ６７免疫染色によって測定されるような組織増殖の実質的な減少、および腫瘍成長速度の実質的且つ持続した減少を引き起こすということを評価する。
【００４０】
例えば、ヒトＣＷＲ２２アンドロゲン依存性前立腺癌の雄ヌードマウスでの植込および成長を、T G Pretlow et aI., Cancer Research, 1994, 54, 604-6052 および Cancer Research, 1996, 56, 3042-3046 によって開示された一般的な手順にしたがって行う異種移植片モデルを用いて、抗アンドロゲンビカルタミドおよびＥＲβ選択的アゴニストの組合せ製品の経口投与が、例えば、摘出された異種移植片組織の慣用的なＫｉ６７免疫染色によって測定されるような組織増殖の実質的な減少、および腫瘍成長速度の実質的且つ持続した減少を引き起こすということを評価することができる。
【００４１】
例えば、ヒトＰＣ−３またはＴＳＵ−ＰＲ１前立腺癌の雄ヌードマウスでの植込および成長を行う異種移植片モデルを用いて、抗アンドロゲンビカルタミドおよびＥＲβ選択的アゴニストの組合せ製品の経口投与が、腫瘍成長速度の実質的且つ持続した減少を引き起こすということを評価することができる。
【００４２】
ヒト臨床試験
前立腺癌を示している患者を、病期について評価し、ＰＳＡレベルを適当な腫瘍マーカーとして用いるであろう。適当なエントリー判定基準を有する患者を、臨床プログラムに割り当てるであろう。一つの患者群に、抗アンドロゲンビカルタミドを経口投与し、次の患者群に、抗アンドロゲンビカルタミドおよびＥＲβ選択的アゴニストの組合せを経口投与するであろう。血液試料を定期的に採取し且つＰＳＡレベルについて分析するであろう。限局した前立腺腫瘍成長は、直腸指診（ＤＲＥ）、コンピューター連動断層撮影（ＣＡＴ）走査および前立腺組織生検試料採取の内一つまたはそれを超えるものを用いて評価するであろう。臨床的反応は、慣用的な判定基準を用いて決定するであろう。例えば、完全反応は、腫瘍塊が完全に退行していることを示し、部分反応は、元の腫瘍体積の５０％またはそれを超える減少として定義され、そして安定した疾患は、５０％未満の腫瘍体積の減少または腫瘍体積の増加なしとして定義されるであろう。
【００４３】
ＢＰＨを示している患者での該当する試験も実施することができる。
特異性を決定するエストロゲン受容体結合検定：
エストロゲン受容体に結合する化合物の能力は、放射性標識されたエストロゲンである［125Ｉ］−１６α−ヨード−３，１７β−エストラジオール（ＮＥＮ，Ｃａｔ．＃ＮＥＸ−１４４）との結合について拮抗するその能力によって測定することができる。この放射性リガンドを、以下、［125Ｉ］−エストラジオールと称する。
【００４４】
ＥＲβ（Gen Bank Accession ＃Ｘ９９１０１）またはＥＲα（Gen Bank Accession ＃Ｍ１２６７４）のｃＤＮＡを、発現ベクターｐＳＧ５（Stratagene）中にクローン化し、下記のように大腸菌（Ｅ．coli）中に形質転換し、そして陰イオン交換樹脂カラム（Qiagen Ｃａｔ．＃１２１２５）を用いて精製することができる。次に、受容体タンパク質を、これらプラスミドの in vitro 転写および翻訳により、ＴＮＴ  Ｔ７ Quick-Coupled 網状赤血球溶解産物システム（Promega Ｃａｔ．＃Ｌ１１７０）を用いて製造することができる。網状赤血球溶解産物（１２．５ｍｌ）を、３１２．５μｇのＥＲ−αプラスミドおよび６２５μｇのＥＲ−βプラスミドと一緒に３０℃で９０分間インキュベートする。次に、プログラムされた溶解産物を小分けし、−８０℃で凍結貯蔵する。
【００４５】
試験化合物を、１０ｐＭ〜３μＭの半対数濃度で二重に調べる。これら化合物は、ＤＭＳＯ中の１ｍＭ原液として調製後、９６ウェルプレート中において一連の３倍濃度の２０μｌアリコートに、結合検定用緩衝液（１ｍＭ中：２０ＨＥＰＥＳ、１５０ＮａＣｌ、１  ＥＤＴＡ、６モノチオグリセロールおよび１０Ｎａ2ＭｏＯ4；１０％ｗｔ／ｖｏｌグリセロール、ｐＨ＝７．９）中で希釈する。受容体アリコートを氷上で融解させ、結合検定用緩衝液中で適当に（下を参照されたい）希釈する。希釈された受容体（３０μｌ／各）を各ウェルに加える。［125Ｉ］−エストラジオールを、製造者のエタノール原液から結合検定用緩衝液中９００ｐＭの作業液へと希釈する。最終検定容量は、２０μｌの試験化合物、３０μｌのプログラム化網状赤血球溶解産物および１０μｌの９００ｐＭ［125Ｉ］−エストラジオールから成る６０μｌである。［125Ｉ］−エストラジオールの最終濃度は１５０ｐＭである。最終検定混合物が入ったプレートを、振とう機上で２分間混合し、４℃で一晩（約１６時間）インキュベートする。
【００４６】
受容体に結合した放射性リガンドと未結合のものを、セファデックスカラムでの濾過によって分離する。カラム（４５μｌのベッド容量）は、乾燥カラム基剤（Pharmacia Ｃａｔ＃Ｇ−２５）を９６ウェルカラム鋳型（Millipore MultiScreen Plates Ｃａｔ＃ＭＡＨＶＮ４５１０）に加えることによって調製する。次に、カラムを、３００μｌの結合検定用緩衝液で飽和させ、４℃で貯蔵する。使用前に、貯蔵されたカラムを２０００ＲＰＭで１０分間回転後、２００μｌの新鮮な結合用緩衝液で２回洗浄する。次に、結合検定混合物（５０μｌ／各）をカラムに加え、３５μｌの追加の溶離容量を速やかにカラムに加える。次に、受容体に結合した放射性リガンドを、２０００ＲＰＭで１０分間の遠心分離によってカラムから溶離する。シンチレーション混合物（１４５μｌ）を、溶離した放射性リガンド／受容体複合体に加え、放射性標識を液体シンチレーション計数によって測定する。
【００４７】
非特異的結合は、１５０ｎＭジエチルスチルベステロール（diethylstilbesterol）（ＤＥＳ）との拮抗によって決定する。結合親和性は、特異的結合（ＳＢ）パーセントへの濃度の関係を次の式に当てはめることによって得られるＩＣ50値によって Cheng-Prushoff 式を用いて計算されるＫiとして表す。
【００４８】
【数１】
2004529182.tif 000005
【００４９】
この検定で、標準エストロゲン受容体リガンドであるエストラジオールおよびＤＥＳを、ＥＲ−βおよびＥＲ−αの高親和性（Ｋi＜１ｎＭ）非選択的リガンドとして検出する。
【００５０】
結合検定に加えられる受容体−プログラム化網状赤血球溶解産物の容量は、製造される受容体の各々のバッチで得られる二つの測定値から別個に決定することができる。最初に、受容体標品の一連の希釈を用いて、標準化合物についてＫiを決定する。リガンド結合親和性のスキャッチャード分析は、これら化合物について報告されたＫiおよび許容しうるシグナル：ノイズ比（約１０）を生じた受容体希釈率で行う。このような実験は、０．１〜１ｎＭの［125Ｉ］−エストラジオールのＫDおよび５〜３０ｐｍｏｌのＢmaxを示した。
【００５１】
ＥＲ転写活性についての細胞に基づく検定：
ＥＲｓは、エストロゲン応答配列（ＥＲＥ）と称される共通ＤＮＡ配列において遺伝子のプロモーター領域を結合するリガンド依存性転写因子である。薬物のＥＲアゴニストまたはアンタゴニスト活性は、エストロゲン応答配列の制御下においてプラスミドから発現されるレポーター酵素活性の量を測定することによって、ＥＲおよびレポータープラスミドで一時的にトランスフェクションされた細胞を薬物に暴露した時に決定した。
【００５２】
プラスミド：
エストロゲン受容体α（αＥＲ，Gen Bank 受託＃Ｍ１２６７４）およびβ（βＥＲ，Gen Bank ＃Ｘ９９１０１）を、発現ベクターｐＳＧ５（Stratagene）中にクローン化した。ビテロゲニン遺伝子エストロゲン応答配列（ｖｉｔＥＲＥ）のトリマーを、オリゴヌクレオチドとして合成し、ｐＥＲＥ３ｇａｌと称されるコンストラクト中のβグロビン基本プロモーターに取り付けた。この応答配列およびプロモーターを、エンドヌクレアーゼＳｐｅＩ（クレノウフラグメントで補充される）およびＨｉｎｄIIIでの消化によってｐＥＲＥ３ｇａｌから除いた。このブラント／ ＨｉｎｄIIIフラグメントを、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）エンハンサーレポータープラスミド（ｐＢＧＡＬｅｎｈ，Stratagene）中にクローン化した。αＥＲおよびβＥＲプラスミドを、Endo Free Maxi Kit（Qiagen）を用いて精製し、そしてＤＮＡ濃度および純度（Ａ２６０／２８０比）を、分光光度法によって決定した（Pharmacia）。１．８のＡ２６０／２８０比および＞１ｕｇ／ｕＬの濃度を有するＤＮＡだけを、トランスフェクションに用いた。
【００５３】
ビテロゲニン応答配列：
【００５４】
【化４】
2004529182.tif 000006
【００５５】
細胞：
トランスフェクションは全て、２９３細胞（Human Embryonic Kidney 細胞ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７３）で行う。細胞を、１０％ＦＢＳ、グルタミン、ピルビン酸ナトリウムおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ中で成長させる。細胞を７０％密集まで成長させ、１：４に分割する。
【００５６】
トランスフェクション：
１．  ２９３細胞を、前夜、コラーゲンＩを被覆した１５０ｍｍ組織培養プレート（Biocoat, Becton Dickinson ＃３５４５５１）上に、ＤＭＥＭ（Mediatech １７−２０５−ＣＶ）１０％活性炭ストリッピング済みＦＢＳ（バイオセル（biocell）＃６２０１−３１）中に６０〜７０％の密度で分割する。
【００５７】
２．  翌朝、トランスフェクションの１時間前に、培地を新鮮なＤＭＥＭ  １０％ストリッピング済みＦＢＳおよび補足物に交換する。
３．  トランスフェクションは、Profection Kit（Promega ＃Ｅ１２００）を用いて行う。このキットは、リン酸カルシウムに媒介されるトランスフェクション技術に基づく。試薬を、滅菌ポリスチレン管中に次の順序で加える。
【００５８】
【表１】
2004529182.tif 000007
【００５９】
４．  低に設定されたボルテックスを用いて、溶液Ａを溶液Ｂに滴加する。得られた溶液は、乳白色になるはずである。充分に混合を行うことが重要である。この溶液を３０分間静置させた後、ボルテックスで撹拌後、溶液を細胞に加える。
【００６０】
５．  この混合物を１５０ｍｍプレートに滴加する。プレートを前後左右に静かに揺り動かすことによって充分に混合する。１時間後、きわめて微細な沈殿が、２０倍の倍率で細胞の上およびより上に浮遊して認められるはずである。この沈殿が認められない場合、トランスフェクションは有効ではないであろう。これら細胞を１２時間インキュベートする。
【００６１】
受容体刺激：
１．  トランスフェクションの翌日、細胞を、１ｍＭ  ＥＧＴＡを含有するカルシウム不含およびマグネシウム不含Ｍｇ不含ＰＢＳ（ｐＨ  ７．６）で２回洗浄する。細胞を、３ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡで２分間トリプシン処理する。トリプシンを、ＤＭＥＭ  １０％ＦＣＳで中和する。細胞を、１０００ｘｇで５分間ペレットにする。次に、この細胞ペレットを、グルタミン、ピルビン酸塩および Penn／Strep を補足した２％フェノールレッドフリーＦＣＳを加えた５ｍＬ  ＤＭＥＭ中に再懸濁させる。
【００６２】
２．  ５０μｌの得られた細胞懸濁液を、９６ウェル組織培養皿（Biocoat Ｂ＆Ｄ  ＃３５４４０７）の各ウェル中に、マルチチャンネルピペッターを用いてプレーティングする。これら皿には、予め、５０μｌのＤＭＳＯ−可溶化試験化合物を、ＤＭＥＭ中の試験濃度の２倍加えた。報告されるデータは、ｎ＝４ウェル（単一ポーク（poke））およびｎ＝２（９点濃度反応曲線）両方である。
【００６３】
３．  細胞を、選択された化合物中において３７℃で一晩インキュベートする。
受容体検定：
１．  ２４時間後、１００μｌの７％ＣＰＲＧ（Roche ０８８４３０８）混合物を、１ｘＺ−緩衝液中で各ウェルに加え、そのプレートを３７℃で３時間静かに振とうさせる。ＣＰＲＧは、β−ガラクトシダーゼによってそれが切断されるにつれ、鮮赤色に変わる。
【００６４】
２．  吸光度測定値（５７０ｎｍ）は、プレートリーダー（Molecular Devices）を用いて得た。
３．  データは、ＭＳ Excel を用いてコンパイルし且つ分析する。
【００６５】
１０Ｘ  Ｚ緩衝液
【００６６】
【表２】
2004529182.tif 000008
【００６７】
７％ＣＰＲＧ混合物
５０ｍＬについて：
５０ｍＬのＣＰＲＧの内３．５ｍＬを加える
３．５ｍＬの１０ｘＺ緩衝液を加える
１ｍＬの１０％ＳＤＳを加える
ＤＩ水で５０ｍＬとする
【国際公開パンフレット】
2004529182.tif 000009
2004529182.tif 000010
2004529182.tif 000011
2004529182.tif 000012
2004529182.tif 000013
2004529182.tif 000014
2004529182.tif 000015
2004529182.tif 000016
2004529182.tif 000017
2004529182.tif 000018
2004529182.tif 000019
2004529182.tif 000020
2004529182.tif 000021
2004529182.tif 000022
2004529182.tif 000023
2004529182.tif 000024
2004529182.tif 000025
2004529182.tif 000026
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004529182.tif 000027
【国際調査報告】
2004529182.tif 000028
2004529182.tif 000029
2004529182.tif 000030
2004529182.tif 000031