(57)【要約】本発明は、薬理学的活性、具体的には、抗毒活性を有している植物カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物、および単離されたその活性化合物に関する。さらに本発明は、上記抽出物の抽出方法に関する。また、本発明は、有効量の上記抽出物またはその活性化合物、治療用化合物、および必要に応じて薬学的に許容される担体を含む、ガンの処置のための医薬組成物または生成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬理学的活性、具体的には、坑毒活性を有していることを特徴とする、植物カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物。
【請求項２】
以下の段階を含む抽出手順を使用して得られる、請求項１に記載の抽出物：
ａ）前記カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物の出発材料を脂肪族アルコール中で抽出する段階であって、前記出発材料が、果実、地上部、地下部、およびそれらの混合物から選択され、前記アルコール中に出発材料を溶解させ、それにより前記材料の前記アルコール中の懸濁液を得、前記懸濁液を攪拌し、前記懸濁液をフリットガラスによって濾過し、それにより第１濾液と第１固形分を得る段階；
ｂ）前記第１固形分を脂肪族アルコール中で抽出し、それにより第２濾液と第２固形分を得る段階；
ｃ）前記第１濾液および第２濾液を混合し、それにより混合濾液を得、前記混合濾液を減圧下で蒸発させ、それにより前記抽出物を得る段階。
【請求項３】
以下の段階を含む抽出手順を使用して得られる、請求項１に記載の抽出物：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階。
【請求項４】
以下の段階を含む抽出手順を使用して得られる、請求項１に記載の抽出物：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｄ）段階ｃ）の残渣をメタノールで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｅ）段階ｄ）のメタノールをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｆ）段階ｅ）の粘性物質をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてジクロロメタン−メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにかける段階、および
ｇ）第１画分を回収し、前記画分を蒸発させて、生物学的活性のある成分を有している粘性物質を得る段階。
【請求項５】
以下の段階を含む抽出手順を使用して得られる、請求項１に記載の抽出物：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｄ）段階ｃ）の残渣をメタノールで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｅ）段階ｄ）のメタノールをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｆ）段階ｅ）の粘性物質をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてジクロロメタン−メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにかける段階、
ｇ）生物学的活性のある成分を有している第１画分を回収する段階、
ｈ）段階ｇ）の濃縮画分をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてヘキサン−アセトンを使用するカラムクロマトグラフィーにかけて２つの画分を得る段階、および
ｉ）段階ｈ）の後、カラムをメタノールで洗浄して、生物学的活性のある成分を有している第３画分を得る段階。
【請求項６】
以下を含む組成物：
−請求項１から５のいずれか１項に記載のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物、ならびに
−正常な、ガンとは無関係の細胞、組織、または器官に対して関連のある有害な副作用を及ぼす、少なくとも１つの治療用化合物および／または理学療法剤。
【請求項７】
被験体への同時、別々、または逐次投与のための混合調製物としての、以下を含む生成物：
−請求項１から５のいずれか１項に記載のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物、ならびに
−正常なガンとは無関係の細胞、組織、または器官に対して関連のある有害な副作用を及ぼす、少なくとも１つの治療用化合物および／または理学療法剤。
【請求項８】
前記抽出物の１つが、アスクレピン、カラクチン、ボルシャリン、カロトロピン、カロトロパゲニン、ウザリゲニン、カロトキシン、ウシャリン、およびウシャリジンを含む群から選択される少なくとも２つの、活性化合物を含む、請求項６に記載の組成物または請求項７に記載の生成物。
【請求項９】
前記抽出物の１つが、表１に示される化合物の少なくとも１つを含む、請求項６若しくは８に記載の組成物、または請求項７若しくは８に記載の生成物。
【請求項１０】
抽出物：治療用化合物の重量比が０．００１：１から１０００：１の範囲にある、請求項６、８、および９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から９のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１１】
医薬品として使用するための、請求項６および８から１０のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から１０のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１２】
ガンの処置のための医薬品として使用するための、請求項６および８から１０のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から１１のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１３】
前記ガンが、乳ガン、リンパ腫、肉腫、膵臓ガン、黒色腫、結腸直腸ガン、神経膠腫、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、皮膚ガン、骨肉腫、卵巣ガン、中枢神経ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、頭頸部ガン、前立腺ガン、肝臓ガン、血液のガンを含む群から選択される、請求項１２に記載の組成物または生成物。
【請求項１４】
１つまたは複数の別の治療用化合物をさらに含む、請求項６および８から１３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から１３のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１５】
前記治療用化合物（類）が抗ガン剤である、請求項６および８から１４のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から１４のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１６】
前記治療用化合物が、アドリアマイシン、アルケラン、ａｒａ−ｃ、ブレオマイシン、ｂｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、ヘキサメチルメラミン、ハイドレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ムフォラン、ナベルビン、ナイトロジェンマスタード、オキサリプラチン、リツキサン、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、タキソール、タキソティア、トポテカン（ハイカムチン）、バルペン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ゼローダ（カペシタビン）、またはゼバリンを含む群から選択される、請求項６および８から１５のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から１４のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１７】
前記治療用化合物が、アドリアマイシン、ビンクリスチン、カンプトテシン、およびオキサリプラチンを含む群から選択される、請求項６および８から１６のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から１６のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１８】
前記治療用化合物（類）が、細胞傷害抗体またはその断片である、請求項６および８から１７のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から１７のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１９】
前記治療用化合物（類）が、細胞傷害性ホルモンまたはその断片である、請求項６および８から１８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から１８のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項２０】
前記治療用化合物（類）が、細胞傷害性ペプチドまたはその断片である、請求項６および８から１９のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から１９のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項２１】
さらに薬学的に許容される担体を含む請求項６および８から２０のいずれか１項に記載の組成物、あるいは前記組成物および／または治療用化合物（類）がさらに薬学的に許容される担体を含む、請求項７から２０のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項２２】
１つまたは複数の治療用化合物の副作用を緩和するための医薬品の調製のための、請求項１から５のいずれか１項に記載のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物の使用。
【請求項２３】
１つまたは複数の治療用化合物の個体に投与される用量を増量するための医薬品の調製のための、請求項１から５のいずれか１項に記載のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物の使用。
【請求項２４】
前記治療用化合物（類）が坑ガン活性を有している、請求項２２または２３に記載の抽出物の使用。
【請求項２５】
前記治療用化合物（類）が、アドリアマイシン、アルケラン、ａｒａ−ｃ、ブレオマイシン、ｂｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、ヘキサメチルメラミン、ハイドレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン（カンプトサール、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ムフォラン、ナベルビン、ナイトロジェンマスタード、オキサリプラチン、リツキサン、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン、タキソール、タキソティア、トポテカン（ハイカムチン）、バルペン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ゼローダ（カペシタビン）、またはゼバリンを含む群から選択される、請求項２２から２４のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項２６】
前記治療用化合物（類）が、アドリアマイシン、ビンクリスチン、カンプトテシン、およびオキサリプラチンを含む群から選択される、請求項２２から２５のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項２７】
前記治療用化合物（類）が細胞傷害抗体またはその断片である、請求項２２から２６のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項２８】
前記治療用化合物（類）が細胞傷害性ホルモンまたはその断片である、請求項２２から２７のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項２９】
前記治療用化合物（類）が細胞傷害性ペプチドまたはその断片である、請求項２２から２８のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項３０】
前記治療用化合物（類）が治療用放射線である、請求項２２から２９のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項３１】
前記抽出物が、アスクレピン、カラクチン、ボルシャリン、カロトロピン、カロトロパゲニン、ウザリゲニン、カロトキシン、ウシャリン、およびウシャリジンを含む群から選択される少なくとも２つの、活性化合物を含む、請求項２２から３０のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項３２】
前記抽出物がさらに、表１に示される化合物の少なくとも１つを含む、請求項２２から３１のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項３３】
前記抽出物が前記治療用化合物（類）の前に投与される、請求項２２から３２のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項３４】
前記抽出物が前記治療用化合物（類）の後に投与される、請求項２２から３３のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項３５】
前記抽出物が前記治療用化合物（類）と同時に投与される、請求項２２から３４のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項３６】
抽出物：治療用化合物の重量比が０．００１：１から１０００：１の範囲にある、請求項２２から３５のいずれか１項に記載の抽出物の使用。
【請求項３７】
以下の段階を含む、生物学的活性のある成分を有している抽出物を得るための抽出プロセス：
ａ）前記カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物の出発材料を脂肪族アルコール中で抽出する段階であって、前記出発材料が、果実、地上部、地下部、およびそれらの混合物から選択され、前記アルコール中に出発材料を溶解させ、それにより前記材料の前記アルコール中の懸濁液を得、前記懸濁液を攪拌し、前記懸濁液をフリットガラスによって濾過し、それにより第１濾液と第１固形分を得ることによる段階；
ｂ）前記第１固形分を脂肪族アルコール中で抽出し、それにより第２濾液と第２固形分を得る段階；
ｃ）前記第１濾液および第２濾液を混合し、それにより混合濾液を得る段階；および
ｄ）前記混合濾液を減圧下で蒸発させて前記抽出物を得る段階。
【請求項３８】
以下の段階を含む、カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉、茎、樹皮、および根の中に実質的に存在している生物学的活性のある成分を有しているいくつかの抽出物を得るための抽出プロセス：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、および
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階。
【請求項３９】
以下の段階をさらに含む、請求項３８に記載の抽出プロセス：
ｄ）段階ｃ）の残渣をメタノールで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｅ）段階ｄ）のメタノールをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｆ）段階ｅ）の粘性物質をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてジクロロメタン−メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにかける段階、および
ｇ）生物学的活性のある成分を有している第１画分を回収し、展開液を蒸発させて、前記抽出物を得る段階。
【請求項４０】
さらに、
ｈ）段階ｇ)の画分をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてヘキサン−アセトンを使用するカラムクロマトグラフィーにかけて２つの画分を得る段階、
ｉ）段階ｈ）の後、カラムをメタノールで洗浄して、生物学的活性のある成分を有している第３画分を得る段階、
を含む、請求項３８または３９に記載の抽出プロセス。
【請求項４１】
段階ｂ）が２０から８０℃の間の作業温度で行われる、請求項３８から４０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４２】
前記段階ｂ）が１回から５回繰り返される、請求項３８から４１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４３】
段階ｂ）の継続時間が４時間から４８時間の間である、請求項３８から４０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４４】
段階ｄ）の固相がシリカゲルである、請求項３８から４３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４５】
段階ｄ）の展開液が２成分展開液であり、展開液２つの成分の割合が１００：０から０：１００の間である、請求項３８から４４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４６】
前記２成分展開液の成分に、アルコール性溶媒と非極性溶媒が含まれている、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４７】
段階ｅ）が２０から５０℃の間の作業温度で行われる、請求項３９から４６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４８】
段階ｆ）の固相がシリカゲルである、請求項３９から４５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４９】
段階ｆ）の展開液が２成分展開液であり、展開液２つの成分の割合が１００：０から０：１００の間である、請求項３９から４５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５０】
２成分展開液の成分が非極性溶媒と別の極性溶媒である、請求項４９に記載のプロセス。
【請求項５１】
展開液の２つの成分の割合である非極性：極性が、５０：５０から１００：０の間である、請求項５０に記載のプロセス。
【請求項５２】
段階ｈ）の溶媒がメタノールである、請求項４０から４９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５３】
段階ｅ）が２０から５０℃の間の作業温度で行われる、請求項３９から５２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５４】
請求項３７から５３のいずれか１項に記載のプロセスによって単離された活性のある抽出物。
【請求項５５】
請求項５４に記載の活性のある抽出物の医薬品としての使用。
【請求項５６】
ガンの処置における医薬品の調製のための、請求項５４に記載の活性のある抽出物の使用。
【請求項５７】
そのような処置が必要な個体に対して、請求項６および８から２１のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項７から２１のいずれか１項に記載の生成物を投与する段階を含む、ガンを処置するための方法。
【請求項５８】
前記ガンが、乳ガン、リンパ腫、肉腫、膵臓ガン、黒色腫、結腸直腸ガン、神経膠腫、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、皮膚ガン、骨肉腫、卵巣ガン、中枢神経ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、頭頸部ガン、前立腺ガン、肝臓ガン、血液のガンを含む群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記治療用化合物が放射線である、請求項６および８から２１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項７から２１のいずれか１項記載の生成物。
【請求項６０】
中に請求項１から５のいずれか１項に記載のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物が存在する容器、および中に治療用化合物が存在する容器を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野に関する。本発明は、第１の態様において、薬理学的活性、具体的には抗腫瘍活性および／または抗毒活性を有している植物カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物、ならびにその単離された活性化合物に関する。第２の態様においては、本発明は、上記抽出物を得るための方法に関する。本発明はさらに、第３の態様において、有効量の上記抽出物またはその活性化合物を含む、ガンの処置のための医薬組成物に関する。第４の態様においては、本発明は、医薬品としての上記抽出物またはその活性化合物の使用、ならびにガンの処置のための医薬品の調製のための上記抽出物またはその活性化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガンは、いくつかのゲノム変異が細胞周期速度を乱した場合に、細胞増殖が増大することまたは細胞死が減少すること、あるいはそれらの両方によって特定の組織において生じる。この摂動は、遺伝的に形質転換された細胞集団の抑制できない増殖を導く。この形質転換された細胞集団に由来するいくつかの細胞は、血管由来の表現型へと変化し、これらは健常組織から内皮細胞を補充することができ、発達しつつある新生物性の腫瘍組織の持続的な増殖をもたらす。続いて、いくつかの細胞は、主要な移動経路として血管またはリンパ管を使用して、新生物性の腫瘍組織から移動して新しい組織をコロニー形成する。このプロセスは、転移プロセスとしても知られている。
【０００３】
実際、ガン患者を処置するために医療機関において現在使われている薬剤のほとんどは、程度の差はあるが、治療されるガンの細胞速度、すなわち、細胞増殖を標的とする薬である。このような抗ガン剤の作用機構は、原則的に、細胞速度に作用することによる悪性細胞の発達の混乱に関係している。これらの薬としては、アルキル化剤、挿入剤、代謝拮抗物質などが挙げられ、これらの多くはＤＮＡの複製および伸張プロセスを調節するＤＮＡまたは酵素を標的とする。これらの薬はＤＮＡを攻撃する。
【０００４】
これらの薬の重大な欠点は、これらの薬が選択的様式では作用しないこと、すなわち、これらが正常細胞と腫瘍細胞とを選択しないことに関係している。これらの薬は、急激に増殖する細胞、すなわち、ガン細胞のＤＮＡが、それほど急激には増殖しない細胞、すなわち、正常細胞のＤＮＡよりもこの種の薬剤に対してより敏感であるという事実に基づいて使用される。しかし、急激に増殖する腫瘍が必ずしも高いレベルの細胞増殖を示すというわけではない。急激に増殖する腫瘍には、これらの腫瘍細胞が由来する正常細胞の集団と比較して、低いレベルの細胞死を示す腫瘍が含まれる場合もある。この種の急激に増殖する腫瘍については、記載したような薬は有効ではない。
【０００５】
さらに、細胞速度へのアプローチを用いる標準的なガンの処置において使用される薬の大多数は、毒性があるかまたはときには非常に毒性が高いという欠点を有する。すなわち、健常細胞、組織、および器官に対して多くの有害な副作用を伴い、これによってそれらの臨床用途が、患者について比較的少ない回数の投与に制限される。また、これらの化合物のいくつかは、ガンに対して何らかの目に見える効果を生じるためには多数の化学療法レジメンと組み合わせなければならない。明らかに、このような抗ガン剤の組み合わせにより、処置の毒性が不利益に大きくなり、適用できる投与回数もまた制限される。
【０００６】
細胞速度へのアプローチとは異なる治療アプローチを使用する、例えば、抗チューブリン化合物のような天然の起源に由来する一部の抗ガン剤が提案されている。上記の薬は、腫瘍塊から逃げ出して先ず隣接する組織を侵襲し、その結果転移を確立する癌細胞の移動を妨げることを目的とする。しかし、これまでに知られているこの種の化合物は、重大な毒性の副作用を示し、これにより長期間にわたる処置でのそれらの使用が制限されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、上記の欠点の少なくともいくつかを克服する改良された抗ガン剤を見出すことが、当該分野で緊急に必要である。結果として、改良された抗ガン剤を提供することが、本発明の全体的な目的である。具体的には、本発明は、最少量の副作用を示す改良された抗ガン剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの実施形態は、植物カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物であり、上記抽出物は、薬理学的活性、具体的には、抗毒活性を有することを特徴としている。
【０００９】
本発明の別の実施形態は、以下の段階を含む抽出手順を使用して得られる、上記の抽出物である：
ａ）上記カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物の出発材料を脂肪族アルコール中で抽出する段階であって、上記出発材料が、果実、地上部、地下部、およびそれらの混合物から選択され、上記アルコール中に出発材料を溶解させ、それにより上記材料の上記アルコール中の懸濁液を得、上記懸濁液を攪拌し、上記懸濁液をフリットガラスによって濾過し、それにより第１濾液と第１固形分を得る段階；
ｂ）上記第１固形分を脂肪族アルコール中で抽出し、それにより第２濾液と第２固形分を得る段階；
ｃ）上記第１濾液と上記第２濾液を混合し、それにより混合濾液を得、上記混合濾液を減圧下で蒸発させ、それにより上記抽出物を得る段階。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、以下の段階を含む抽出手順を使用して得られる、上記の抽出物である：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、以下の段階を含む抽出手順を使用して得られる、上記の抽出物である：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｄ）段階ｃ）の残渣をメタノールで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｅ）段階ｄ）のメタノールをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｆ）段階ｅ）の粘性物質をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてジクロロメタン−メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにかける段階、および
ｇ）第１画分を回収し、上記画分を蒸発させて、生物学的活性のある成分を有している粘性物質を得る段階。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、以下の段階を含む抽出手順を使用して得られる、上記の抽出物である：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｄ）段階ｃ）の残渣をメタノールで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｅ）段階ｄ）のメタノールをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｆ）段階ｅ）の粘性物質をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてジクロロメタン−メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにかける段階、
ｇ）生物学的活性のある成分を有している第１画分を回収する段階、
ｈ）段階ｇ）の濃縮画分をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてヘキサン−アセトンを使用するカラムクロマトグラフィーにかけて２つの画分を得る段階、および
ｉ）段階ｈ）の後、カラムをメタノールで洗浄して、生物学的活性のある成分を有している第３画分を得る段階。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、以下を含む組成物である：
−上記のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物、ならびに
−正常な、ガンとは無関係の細胞、組織、または器官に対して関連のある有害な副作用を及ぼす、少なくとも１つの治療用化合物および／または理学療法剤。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、被験体への同時、別々、または逐次投与のための混合調製物としての、以下を含む生成物である：
−上記のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物、ならびに
−正常なガンとは無関係の細胞、組織、または器官に対して関連のある有害な副作用を及ぼす、少なくとも１つの治療用化合物および／または理学療法剤。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、上記抽出物の１つが、アスクレピン（ａｓｃｌｅｐｉｎ）、カラクチン（ｃａｌａｃｔｉｎ）、ボルシャリン（ｖｏｒｕｓｈａｒｉｎ）、カロトロピン（ｃａｌｏｔｒｏｐｉｎ）、カロトロパゲニン（ｃａｌｏｔｒｏｐａｇｅｎｉｎ）、ウザリゲニン（ｕｚａｒｉｇｅｎｉｎ）、カロトキシン（ｃａｌｏｔｏｘｉｎ）、ウシャリン（ｕｓｈａｒｉｎ）、およびウシャリジン（ｕｓｈａｒｉｄｉｎ）を含む群から選択される少なくとも２つの、活性化合物を含む、上記の組成物または上記の生成物である。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、上記抽出物の１つが、表１に示されている化合物の少なくとも１つを含む、上記の組成物または上記の生成物である。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、抽出物：治療用化合物の重量比が０．００１：１から１０００：１の範囲にある、上記の組成物または上記の生成物である。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、医薬品として使用するための、上記の組成物または上記の生成物である。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、ガンの処置のための医薬品として使用するための、上記の組成物または上記の生成物である。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、上記ガンが、乳ガン、リンパ腫、肉腫、膵臓ガン、黒色腫、結腸直腸ガン、神経膠腫、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、皮膚ガン、骨肉腫、卵巣ガン、中枢神経ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、頭頸部ガン、前立腺ガン、肝臓ガン、血液のガンを含む群から選択される、上記の組成物または生成物である。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、１つまたは複数の別の治療用化合物をさらに含む、上記の組成物または上記の生成物である。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が抗ガン剤である、上記の組成物または上記の生成物である。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物が、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、アルケラン（ａｌｋｅｒａｎ）、ａｒａ−ｃ、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ））、ｂｉＣＮＵ、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、サイトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）（ジェムザール（ｇｅｍｚａｒ））、ハーセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ヘキサメチルメラミン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅ）、ハイドレア（ｈｙｄｒｅａ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（カンプトサール（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン（ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ムフォラン（ｍｕｐｈｏｒａｎ）、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎｍｕｓｔａｒｄ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｅ）、リツキサン（ｒｉｔｕｘａｎ）、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎｅ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキソティア（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）（ハイカムチン（ｈｙｃａｍｔｉｎ））、バルペン（ｖｅｌｂａｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ＶＰ−１６、ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）（カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ））、またはゼバリン（ｚｅｖｅｌｉｎ）を含む群から選択される、上記の組成物または上記の生成物である。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物が、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、およびオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）を含む群から選択される、上記の組成物または上記の生成物である。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が細胞傷害抗体またはその断片である、上記の組成物または上記の生成物である。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が細胞傷害性ホルモンまたはその断片である、上記の組成物または上記の生成物である。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が細胞傷害性ペプチドまたはその断片である、上記の組成物または上記の生成物である。
【００２８】
本発明の別の実施形態は、さらに薬学的に許容される担体を含む上記の組成物、あるいは上記組成物および／または治療用化合物（類）がさらに薬学的に許容される担体を含む、上記の生成物である。
【００２９】
本発明の別の実施形態は、１つまたは複数の治療用化合物の副作用を緩和するための医薬品の調製のための、上記のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物の使用である。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、１つまたは複数の治療用化合物の個体に投与される用量を増量するための医薬品の調製のための、上記のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物の使用である。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が坑ガン活性を有している、上記の抽出物の使用である。
【００３２】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、アルケラン（ａｌｋｅｒａｎ）、ａｒａ−ｃ、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ））、ｂｉＣＮＵ、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、サイトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）（ジェムザール（ｇｅｍｚａｒ））、ハーセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ヘキサメチルメラミン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅ）、ハイドレア（ｈｙｄｒｅａ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（カンプトサール（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン（ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ムフォラン（ｍｕｐｈｏｒａｎ）、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎｍｕｓｔａｒｄ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｅ）、リツキサン（ｒｉｔｕｘａｎ）、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎｅ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキソティア（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）（ハイカムチン（ｈｙｃａｍｔｉｎ））、バルペン（ｖｅｌｂａｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ＶＰ−１６、ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）（カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ））、またはゼバリン（ｚｅｖｅｌｉｎ）を含む群から選択される、上記の抽出物の使用である。
【００３３】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、およびオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）を含む群から選択される、上記の抽出物の使用である。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が細胞傷害抗体またはその断片である、上記の抽出物の使用である。
【００３５】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が細胞傷害性ホルモンまたはその断片である、上記の抽出物の使用である。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が細胞傷害性ペプチドまたはその断片である、上記の抽出物の使用である。
【００３７】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物（類）が治療用放射線である、上記の抽出物の使用である。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、上記抽出物が、アスクレピン（ａｓｃｌｅｐｉｎ）、カラクチン（ｃａｌａｃｔｉｎ）、ボルシャリン（ｖｏｒｕｓｈａｒｉｎ）、カロトロピン（ｃａｌｏｔｒｏｐｉｎ）、カロトロパゲニン（ｃａｌｏｔｒｏｐａｇｅｎｉｎ）、ウザリゲニン（ｕｚａｒｉｇｅｎｉｎ）、カロトキシン（ｃａｌｏｔｏｘｉｎ）、ウシャリン（ｕｓｈａｒｉｎ）、およびウシャリジン（ｕｓｈａｒｉｄｉｎ）を含む群から選択される少なくとも２つの、活性化合物を含む、上記の抽出物の使用である。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、上記抽出物がさらに、表１に示されている化合物の少なくとも１つを含む、上記の抽出物の使用である。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、上記抽出物が上記治療用化合物（類）の前に投与される、上記の抽出物の使用である。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、上記抽出物が上記治療用化合物（類）の後に投与される、上記の抽出物の使用である。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、上記抽出物が上記治療用化合物（類）と同時に投与される、上記の抽出物の使用である。
【００４３】
本発明の別の実施形態は、抽出物：治療用化合物の重量比が０．００１：１から１０００：１の範囲にある、上記の抽出物の使用である。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、以下の段階を含む、生物学的活性のある成分を有している抽出物を得るための抽出プロセスである：
ａ）上記カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物の出発材料を脂肪族アルコール中で抽出する段階であって、上記出発材料が、果実、地上部、地下部、およびそれらの混合物から選択され、上記アルコール中に出発材料を溶解させ、それにより上記出発材料の上記アルコール中の懸濁液を得、上記懸濁液を攪拌し、上記懸濁液をフリットガラスによって濾過し、それにより第１濾液と第１固形分を得ることによる段階；
ｂ）上記第１固形分を脂肪族アルコール中で抽出し、それにより第２濾液と第２固形分を得る段階；
ｃ）上記第１濾液および第２濾液を混合し、それにより混合濾液を得る段階；および
ｄ）上記混合濾液を減圧下で蒸発させ、それにより上記抽出物を得る段階。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、以下の段階を含む、カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉、茎、樹皮、および根の中に実質的に存在している生物学的活性のある成分を有しているいくつかの抽出物を得るための抽出プロセスである：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、および
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、以下の段階をさらに含む上記の抽出プロセスである：
ｄ）段階ｃ）の残渣をメタノールで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｅ）段階ｄ）のメタノールをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｆ）段階ｅ）の粘性物質をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてジクロロメタン−メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにかける段階、および
ｇ）生物学的活性のある成分を有している第１画分を回収し、展開液を蒸発させて、上記抽出物を得る段階。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、以下の段階をさらに含む上記の抽出プロセスである：
ｈ）段階ｇ)の画分をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてヘキサン−アセトンを使用するカラムクロマトグラフィーにかけて２つの画分を得る段階、および
ｉ）段階ｈ）の後、カラムをメタノールで洗浄して、生物学的活性のある成分を有している第３画分を得る段階。
【００４８】
本発明の別の実施形態は、段階ｂ）が２０から８０℃の間の作業温度で行われる、上記のプロセスである。
【００４９】
本発明の別の実施形態は、上記段階ｂ）が１回から５回の間繰り返される、上記のプロセスである。
【００５０】
本発明の別の実施形態は、段階ｂ）の継続時間が４時間から４８時間の間である、上記のプロセスである。
【００５１】
本発明の別の実施形態は、段階ｄ）の固相がシリカゲルである、上記のプロセスである。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、段階ｄ）の展開液が２成分展開液であり、展開液の２つの成分の割合が１００：０から０：１００の間である、上記のプロセスである。
【００５３】
本発明の別の実施形態は、上記２成分展開液の成分にアルコール性溶媒と非極性溶媒が含まれる、上記のプロセスである。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、段階ｅ）が２０から５０℃の間の作業温度で行われる、上記のプロセスである。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、段階ｆ）の固相がシリカゲルである、上記のプロセスである。
【００５６】
本発明の別の実施形態は、段階ｆ）の展開液が２成分展開液であり、展開液の２つの成分の割合が１００：０から０：１００の間である、上記のプロセスである。
【００５７】
本発明の別の実施形態は、２成分展開液の成分が非極性溶媒と別の極性溶媒である、上記のプロセスである。
【００５８】
本発明の別の実施形態は、展開液の２つの成分の割合である非極性：極性が５０：５０から１００：０の間である、上記のプロセスである。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、段階ｈ）の溶媒がメタノールである、上記のプロセスである。
【００６０】
本発明の別の実施形態は、段階ｅ）が２０から５０℃の間の作業温度で行われる、上記のプロセスである。
【００６１】
本発明の別の実施形態は、上記のプロセスによって単離された活性のある抽出物である。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、医薬品としての上記の活性のある抽出物の使用である。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、ガンの処置における医薬品の調製のための、上記の活性のある抽出物の使用である。
【００６４】
本発明の別の実施形態は、そのような処置が必要な個体に対して、上記の医薬組成物または上記の生成物を投与することを含む、ガンを処置するための方法である。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、上記ガンが、乳ガン、リンパ腫、肉腫、膵臓ガン、黒色腫、結腸直腸ガン、神経膠腫、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、皮膚ガン、骨肉腫、卵巣ガン、中枢神経ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、頭頸部ガン、前立腺ガン、肝臓ガン、血液のガンを含む群から選択される、上記の方法である。
【００６６】
本発明の別の実施形態は、上記治療用化合物が放射線である、上記の組成物または上記の生成物である。
【００６７】
本発明の別の実施形態は、中に上記のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物が存在する容器、および中に治療用化合物が存在する容器を含む、キットである。
【発明の効果】
【００６８】
本発明は、植物カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物に関する。第１の態様において、本発明は、薬理学的活性、具体的には、抗腫瘍活性および／または抗毒活性を有している、植物カロトロピスプロケラの抽出物に関する。驚くべきことに、本発明の少なくとも１つの抽出物は、抗毒活性と抗腫瘍効果を兼ね備えている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
本発明によれば、用語「抗腫瘍活性」とは、少なくとも１つの抽出物またはその単離された化合物によって発揮される、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ならびに生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での抗腫瘍効果を意味する。抗腫瘍効果には、基本的に、細胞増殖の劇的な減少、およびプロアポトーシス効果が含まれるがこれらに限定されない。重要なことは、本発明の抽出物が、特に、乳ガン、黒色腫、またはリンパ腫のような多数のガン種に対して抗腫瘍活性を示すことである。
【００７０】
本発明の抽出物の別の特徴には、それらの抗毒活性が含まれる。用語「抗毒活性」とは、本発明の抽出物またはその単離された化合物の、治療用化合物または処置剤の効果を弱めるまたは反転させる能力を意味する。「治療用化合物」とは、本明細書中で使用される場合は、正常な、すなわち、ガンではない関連する細胞、組織、または器官に対して関係する有害な毒作用（類）を発揮する化合物を意味する。したがって、用語治療用化合物には、有害な毒性の副作用を及ぼす、特定の疾患を処置するために使用される化合物、薬、理学療法剤、または医薬品もまた含まれる。このような副作用は当業者に公知であり、これには、疲労感、吐き気、嘔吐、痛み、口のびらん、乾燥肌、敏感肌、脱毛、赤血球および白血球数の減少が含まれるがこれらに限定されない。このような治療用化合物としては、化学療法薬、放射線、抗体、およびホルモンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
本発明に有用な治療用化合物には、化学療法に使用される化合物、または細胞傷害性の化合物が含まれる。これらとしては、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、アルケラン（ａｌｋｅｒａｎ）、ａｒａ−ｃ、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ））、ｂｉＣＮＵ、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎｕｍ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、サイトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）（ジェムザール（ｇｅｍｚａｒ））、ハーセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ヘキサメチルメラミン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅ）、ハイドレア（ｈｙｄｒｅａ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（カンプトサール（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン（ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ムフォラン（ｍｕｐｈｏｒａｎ）、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎｍｕｓｔａｒｄ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｅ）、リツキサン（ｒｉｔｕｘａｎ）、ＳＴＩ−５７１、ストレプトゾシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎｅ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキソティア（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）（ハイカムチン（ｈｙｃａｍｔｉｎ））、バルペン（ｖｅｌｂａｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ＶＰ−１６、ゼローダ（ｘｅｌｏｄａ）（カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ））、またはゼバリン（ｚｅｖｅｌｉｎ）のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
治療薬が本発明の抽出物に由来する１つまたは複数の抗ガン剤を含むことが、本発明の別の態様である。考えられる本発明の抗ガン性化合物は、アスクレピン（ａｓｃｌｅｐｉｎ）、カラクチン（ｃａｌａｃｔｉｎ）、ボルシャリン（ｖｏｒｕｓｈａｒｉｎ）、カロトロピン（ｃａｌｏｔｒｏｐｉｎ）、カロトロパゲニン（ｃａｌｏｔｒｏｐａｇｅｎｉｎ）、ウザリゲニン（ｕｚａｒｉｇｅｎｉｎ）、カロトキシン（ｃａｌｏｔｏｘｉｎ）、ウシャリン（ｕｓｈａｒｉｎ）、およびウシャリジン（ｕｓｈａｒｉｄｉｎ）のようなカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）から抽出される任意の化合物である。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、抗ガン性化合物は、表２に示されている２"オキソ−ボルシャリン（２"ｏｘｏ−ｖｏｒｕｓｈａｒｉｎ）およびそれらの誘導体のような、カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）から抽出される任意の化合物である。
【００７４】
治療薬が本発明の抽出物であることが、本発明の別の態様である。上記抽出物は、抗毒活性を有している抽出物と同一である場合がある。あるいは、上記抽出物は、いずれかの抽出物に由来する１つまたは複数の活性化合物が含まれないことを除いて、抗毒活性を有する抽出物と同一である場合もある。あるいは、上記抽出物は、いずれかの抽出物中に１つまたは複数の別の活性化合物を含むことを除いて、抗毒活性を有する抽出物と同一である場合もある。あるいは、上記抽出物は、いずれかの抽出物中の１つまたは複数の活性化合物の濃度が異なることを除いて、抗毒活性を有する抽出物と同一である場合もある。
【００７５】
治療用化合物が放射線のような理学療法剤であることが、本発明の別の態様である。上記放射線は、医療において使用されるあらゆるものであり得る。例えば、放射線は、腫瘍性の増殖を縮小させるために、骨髄移植プログラムの一部として全身に照射するためなどに使用されるものであり得る。放射線はまた、診断に使用されるもの、例えば、Ｘ線マーカーまたは放射性マーカーにおいて使用されるものである場合もある。
【００７６】
治療用化合物が抗体またはその断片であることが、本発明の別の態様である。上記抗体は細胞傷害活性を示す。治療用抗体の例として、ハーセプチンＲ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＲ）、Ｃａｐｒｏｍａｂ  Ｐｅｎｄｅｔｉｄ注射液（Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、およびトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７７】
治療用化合物がホルモンまたはその断片であることが、本発明の別の態様である。上記ホルモンは細胞傷害活性を示す。治療用ホルモンの例としては、ブセレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎｅ）、フルオキシメステロン（ｆｌｕｏｘｙｍｅｓｔｅｒｏｎｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｅ）、ノルエタンドロロン（ｎｏｒｅｔｈａｎｄｒｏｌｏｎｅ）、ノルエチステロン（ｎｏｒｅｔｈｉｓｔｅｒｏｎｅ）、プレドニソロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、プレドニソン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、およびタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎｅ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７８】
治療用化合物がペプチドまたはその断片であることが、本発明の別の態様である。上記ペプチドは細胞傷害活性を示す。
【００７９】
抗体、ホルモン、またはペプチドに関連する断片によって、抗体、ホルモン、またはペプチド全体の標的を認識することができる抗体、ホルモン、またはペプチドの部分を含むペプチドが意味される。上記断片はまた、抗体、ホルモン、またはペプチド全体の標的を認識することもできる。上記部分には、その部分による標的の認識を実質的に変化させることのないアミノ酸置換、欠失、または挿入が含まれる場合がある。置換、欠失、または挿入の数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、または５００未満であり得る。
【００８０】
抽出物の抗毒活性によって、さらに高用量の治療用化合物の投与が可能になることが、本発明の別の態様である。さらに高用量の治療用化合物を投与することによって、ガンをより迅速かつ効率的に処置することができる。本発明の抽出物と組み合わせて、高用量を受けた個体は、治療用化合物の副作用が減るという利点が得られる。
【００８１】
抽出物の抗毒活性によって、治療用化合物の組み合わせの投与が可能になることが、本発明の別の態様である。組み合わせ治療は、ガンの異なる状況を同時に標的とし、それによってさらに有効な効率のよい処置をもたらす。本発明の組み合わせを投与することによって、患者が苦しむ副作用はより少なくなり、組み合わせ治療の効果が得られる。
【００８２】
別の実施形態において、本発明は、抽出物から単離された活性化合物に関する。用語抽出物の「活性化合物」または「活性のある成分」は、本明細書中では、同義として使用され、上記で定義された抽出物の活性の少なくとも１つに類似する活性を示す、抽出物中に存在する化合物を意味する。
【００８３】
さらに別の実施形態において、本発明は、植物カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物を得るための方法に関する。
【００８４】
本発明の抽出物の少なくとも１つが抗腫瘍活性を発揮するという事実から、本発明の抽出物は、ガンのような疾患の処置に特に有用である。したがって、別の態様において、本発明は、上記抽出物の１つ、またはその少なくとも１つの活性化合物を含む医薬組成物に関する。
【００８５】
さらに、本発明の抽出物がさらに抗毒活性も発揮するので、これは、毒性の副作用を示す他の医薬品のような他の治療用化合物と組み合わせられることにもまた、特に適している。したがって、別の実施形態では、本発明は、上記抽出物の１つ、またはその少なくとも１つの活性化合物と、毒性の副作用を及ぼす薬理学的活性を発揮する第２の化合物を含む医薬組成物に関する。
【００８６】
さらに、本発明は、上記抽出物の１つ、および／またはその少なくとも１つの活性化合物の、医薬品としての使用に関する。本発明はさらに、抽出物の１つまたはその少なくとも１つの活性化合物の、疾患、特にガンの処置のための医薬品の調製における使用に関する。
【００８７】
別の実施形態では、本発明はさらに、ガンを処置するための方法に関する。
【００８８】
本発明の他の目的および利点は、添付の図面と組み合わせた以下の詳細な記載によって明らかになるであろう。
【００８９】
抽出物の特性
ガガイモ科（Ａｓｃｌｅｐｉａｄａｃｅａｅ）に属するカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物は、アフリカおよびアジアに生育している植物である。この植物は、古くから民間療法において使用されており、また、解熱剤、抗マラリア薬、止寫剤、鎮痛剤、抗炎症性消化薬、粘膜保護剤、ならびに殺虫剤、鎮咳剤、抗菌剤、創傷治癒薬、筋弛緩剤のようなかなりの数の使用に関しても研究されてきた。カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物の茎、花、および葉は、カルデノリドとして知られている特定の化合物を含むことが知られている。最近、心臓毒性活性が、これらのカルデノリドに起因すると考えられ、これらは心不全を処置するためのヒトの治療法において活用されている。
【００９０】
本発明は、予想外に、別の型の活性、具体的には、「抗腫瘍活性」を示すカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物の本発明の少なくとも１つの抽出物に関する。さらに、本発明の少なくとも１つの抽出物が、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、さらには生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で抗腫瘍効果を示すことが明らかにされた。上記の本発明の抽出物は、細胞増殖の劇的な減少を誘導し、そしてプロアポトーシス活性を示す。これらの特性は、実施例３および４でさらに説明される。また、上記の本発明の抽出物の少なくとも１つがいくつかの型のガンに対して非常に活性があることも、本発明者らによって生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で示されている。下記の実施例に示すように、上記の本発明の抽出物は、乳ガン、リンパ腫、黒色腫を含む組織学的な腫瘍型の広範囲のパネルを示す試験したいくつかの腫瘍モデルに対して有意な抗腫瘍効果を発揮する。これらのモデルは、これらがヒトのガンの特異的な臨床段階を模倣するので、臨床的に関連している。
【００９１】
驚くべきことに、上記の本発明の抽出物は、比較的低い用量で活性が高い。上記抽出物は、０．４から２．２ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、０．５から２ｍｇ／ｋｇの範囲の低用量で抗腫瘍活性を発揮することができる。低用量での高い抗腫瘍活性は、上記抽出物の活性が高いことを示している。驚くべきことに、以下の実施例を読めば、上記の本発明の抽出物が、慢性的に低用量、すなわち、０．６ｍｇ／ｋｇから１．２５ｍｇ／ｋｇでアッセイした場合に、高用量、すなわち、５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの用量よりも有意に高い抗腫瘍効果を示すことも明らかになるであろう。健常な動物に実際に投与することができる上記抽出物の最大量をいう、本発明の上記抽出物の最大耐用量（ＭＴＤ）指数は、２０ｍｇ／ｋｇの抽出物である。この値は、本発明の上記抽出物が広い治療幅を有することを示している。
【００９２】
用語「毒性」または「毒作用」は、健常な細胞、組織、または器官に対して有し得る化合物の有害な効果（類）を意味する。本発明の抽出物の別の重要な特性には、その低い毒性レベルが含まれる。上記抽出物は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で血液学的な変化を誘導することはなく、体重の減少を誘導することはなく、種々の型の器官および組織に対してほとんど副作用を示さないことが明らかとなった。実際、上記の本発明の抽出物の毒性レベルは驚くほど低い。上記の本発明の抽出物は、良好な抗腫瘍活性、低いレベルの毒性、および悪性の副作用の最も少ない誘導の本質的な特徴を兼ね備えている。
【００９３】
さらに、本発明の植物カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物はまた、「抗毒活性」をも示す。上記のように、用語「抗毒活性」は、本明細書中で使用される場合には、化合物の有害な副作用を弱めるかまたは反転させる本発明の抽出物の能力を意味する。驚くべきことに、本発明者らにより、本発明の抽出物と有害な副作用を及ぼす他の治療用化合物との組み合わせによって、治療用化合物の望ましくない副作用を低減させることができることが明らかにされた。例えば、実施例８は、本発明の抽出物と、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、またはアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎｅ）のような周知の抗ガン性化合物との組み合わせにより、これらの抗ガン性化合物によって誘導される正常な細胞に対する毒性により引き起こされるいくつかの副作用の軽減ができることを示す。
【００９４】
抗毒活性は、本発明の抽出物の少なくとも１つが治療用化合物の前に投与される場合、すなわち、それらが逐次投与される場合に明白である。本発明の１つの態様は、治療用化合物が投与される前のいずれかの時点で抽出物を投与することである。本発明のさらなる態様は、治療用化合物が投与される前の３３６、３１２、２８８、２６４、２４０、２１６、１９２、１６８、１４４、１２０、９６、７２、４８、２４、２０、１６、１２、８、４、２、１、または０．５時間以内に抽出物を投与することである。
【００９５】
抗毒活性はまた、本発明の抽出物の少なくとも１つが、治療用化合物と同時に、すなわち、１つの組成物として、同時または別々の投与によって投与される場合にも明白である。
【００９６】
抗毒活性はまた、本発明の抽出物の少なくとも１つが、治療用化合物の後で投与される、すなわち、それらが逐次投与される場合にもまた明白である。本発明の１つの態様は、治療用化合物が投与された後のいずれかの時点で抽出物を投与することである。本発明のさらなる態様は、治療用化合物が投与された後、０．５、１、２、４、８、１２、１６、２０、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８、３１２、または３６６時間未満に抽出物を投与することである。
【００９７】
逐次投与においては、上記抽出物は１回、または任意の回数、そして種々の用量で、治療用化合物の投与の前および／または後に投与することができる。逐次投与は、同時または逐次投与と組み合わせることができる。
【００９８】
抽出物の組成
本発明の抽出物は、１つまたはいくつかの活性化合物、すなわち、本発明の抽出物の上記で定義した活性の少なくとも１つと類似する活性を示す本発明の抽出物中に存在する化合物を含む。少なくとも１つの抽出物の主な活性は、抗腫瘍活性および抗毒活性である。当業者に理解されるように、上記抽出物中に存在する活性化合物は、これらの特性の１つだけを発揮するか、または場合によっては、これらの特性の両方を発揮する場合もある。
【００９９】
別の実施形態においては、本発明の抽出物の少なくとも１つは、アスクレピン（ａｓｃｌｅｐｉｎ）、カラクチン（ｃａｌａｃｔｉｎ）、ボルシャリン（ｖｏｒｕｓｈａｒｉｎ）、カロトロピン（ｃａｌｏｔｒｏｐｉｎ）、カロトロパゲニン（ｃａｌｏｔｒｏｐａｇｅｎｉｎ）、ウザリゲニン（ｕｚａｒｉｇｅｎｉｎ）、カロトキシン（ｃａｌｏｔｏｘｉｎ）、ウシャリン（ｕｓｈａｒｉｎ）、およびウシャリジン（ｕｓｈａｒｉｄｉｎ）、２"オキソ−ボルシャリン（２"ｏｘｏ−ｖｏｒｕｓｈａｒｉｎ）を含む群より選択される活性化合物の少なくとも２つを含む。
【０１００】
理解されるように、本発明の抽出物は、カルデノリドの群には属さない１つまたは複数の活性化合物と、他の化合物をさらに含む場合がある。別の実施形態では、抽出物は、表１に示される化合物の少なくとも１つを含む。
【０１０１】
【表１】
2006503872.tif 000002
【０１０２】
別の実施形態では、本発明は、本発明の抽出物から単離された活性化合物に関する。
【０１０３】
本発明の別の実施形態では、抽出物の活性化合物は、２"オキソ−ボルシャリン（２"ｏｘｏ−ｖｏｒｕｓｈａｒｉｎ）である。本発明の１つの態様は、表２に示されるような上記化合物（化合物Ａ）およびその誘導体（化合物ＢからＨ）の抗ガン活性および／または抗毒活性である。
【０１０４】
【表２】
2006503872.tif 000003
【０１０５】
抽出方法
別の実施形態によると、本発明の抽出物は、アルコール抽出、具体的には、メタノール抽出によって得ることができる。
【０１０６】
別の実施形態において、本発明は、以下の段階を含む本発明の抽出物を得るための方法に関する：
ａ）上記カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物の出発材料を脂肪族アルコール中で抽出する段階であって、上記出発材料が、果実、地上部、地下部、およびそれらの混合物から選択され、上記アルコール中に出発材料を溶解させ、それにより上記材料の上記アルコール中の懸濁液を得、上記懸濁液を攪拌し、上記懸濁液をフリットガラスによって濾過し、それにより第１濾液と第１固形分を得ることによる段階；
ｂ）上記第１固形分を脂肪族アルコール中で抽出し、それにより第２濾液と第２固形分を得る段階；
ｃ）上記第１濾液と上記第２濾液を混合し、それにより混合濾液を得る段階；および
ｄ）上記混合濾液を減圧下で蒸発させ、それにより油状の残渣を得る段階。
【０１０７】
好ましい実施形態においては、上記カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物の出発材料は、地下部から、具体的には根から選択される。
【０１０８】
別の実施形態においては、本発明の出発材料を抽出するために使用される脂肪族アルコールはメタノールである。さらに別の実施形態においては、抽出プロセスにおいて得られた残渣が溶媒中、具体的には、薬学的に許容される溶媒中に採取される。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明は、以下の段階を含む本発明の抽出物を得るための方法に関する：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を形成させる段階、
ｄ）段階ｃ）の残渣をメタノールで少なくとも６、１２、１８、または好ましくは２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｅ）段階ｄ）のメタノールをデカントし、濾過後に濾液を蒸発させて粘性物質を形成させる段階、
ｆ）段階ｅ）の粘性物質をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてジクロロメタン−メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにかける段階、
ｇ）第１画分を回収する段階、
ｈ）段階ｇ）の濃縮画分をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてヘキサン−アセトンを使用するカラムクロマトグラフィーにかけて２つの画分を得る段階、
ｉ）段階ｈ）の後、カラムをメタノールで洗浄して、第３画分を得る段階。
【０１１０】
本発明の抽出物には、段階ｃ）、段階ｇ）、および段階ｉ）から得られたものが含まれる。
【０１１１】
抽出が、上記抽出物中に含まれる生物学的活性のある化合物の完全性を維持することと両立する様式で行われることが、本発明の１つの態様である。このような予防策は当業者に既知である。
【０１１２】
抽出物の適用可能性
本明細書中で開示される抽出物の少なくとも１つが持つ、興味深い特性、具体的には、その抗腫瘍活性、その抗毒活性、その低レベルの毒性、および／または低用量でのその高い活性により、本発明の抽出物（類）またはその活性化合物は、疾患の処置のための医薬品、特に、ガンを処置するための医薬品としての使用に特に適している。
【０１１３】
別の実施形態において、本発明は、本発明の抽出物またはその活性化合物の医薬品としての使用に関する。
【０１１４】
さらに別の実施形態において、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抽出物またはその活性化合物の、ガンの処置における医薬品の調製のための使用にも関する。特に、上記の本発明の抽出物またはその活性化合物は、ガンの処置における医薬品の調製のために使用される。本発明にしたがって処置することができるガンの例として、乳ガン、リンパ腫、肉腫、膵臓ガン、黒色腫、結腸直腸ガン、神経膠腫、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、皮膚ガン、骨肉腫、卵巣ガン、中枢神経ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、頭頸部ガン、前立腺ガン、肝臓ガン、血液のガンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１５】
上記のように、本発明の抽出物は、抗毒活性をも含む。本発明者らは、本発明の抽出物またはその活性化合物と、関連する有害な副作用を及ぼす第２の化合物との組み合わせによって、その治療活性を損なうことなく、この第２の化合物の毒性活性の低減が可能であることを明らかにした。したがって、また、本発明のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）抽出物は、他の化合物、具体的には、他の抗ガン性化合物と医薬品において組合せることもできる。
【０１１６】
抽出物を含む医薬組成物
別の実施形態において、本発明は、治療有効量の本発明のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物またはその活性化合物と、薬学的に許容される担体を含む、ガンの処置のための医薬組成物に関する。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明は、以下を含むガンの処置のための医薬組成物に関する：
−治療有効量の本発明のカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物またはその活性化合物、
−治療有効量の治療用化合物、および
−薬学的に許容される担体。
【０１１８】
用語「治療有効量」は、本明細書中で使用される場合は、処置される疾患の症状の緩和を含む、組織、システム、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発する、研究者、獣医師、医師、または他の臨床医学者によって想定される少なくとも１つの抽出物または活性化合物または薬学的な薬剤の量を意味する。
【０１１９】
医薬組成物は、当業者に既知の様式で調製することができる。このためには、本発明の抽出物および／またはその任意の活性化合物、１つまたは複数の固体または液体の薬学的担体、ならびに望ましい場合には、他の薬学的活性のある化合物を組み合わせて、適切な投与形態または投与量形態にし、次いでこれを、ヒト用の薬剤または動物用の薬剤において医薬品として使用することができる。
【０１２０】
医薬組成物の特定の形態は、例えば、溶液、懸濁液、乳液、クリーム、錠剤、カプセル剤、スプレー式点鼻薬、リポソーム、またはマイクロレザーバーであり得、特に、経口摂取できる形態の、または例えば、滅菌の注射可能な水溶液または油性の懸濁液もしくは坐剤のような滅菌の注射可能な形態の組成物であり得る。意図される組成物の好ましい形態は、乾燥した固体の形態であり、これには、カプセル剤、顆粒、錠剤、丸剤、大きい丸剤、および散剤が含まれる。固体の担体には、例えば、ラクトースのような１つまたは複数の担体、増量剤、崩壊剤、例えば、セルロース、カルボキシメチルセルロース、またはデンプンのような結合剤、あるいはステアリン酸マグネシウムのような、錠剤が打錠機器に付着することを防ぐための付着防止剤を含めることができる。錠剤、丸剤、および大きい丸剤は、直ちに崩壊するように、または有効成分の徐放を生じるように、形成することができる。
【０１２１】
さらにまた、本発明の抽出物またはその活性化合物は、それらの抗毒活性により、毒性の副作用を示す他の医薬品のような、毒性の副作用を及ぼす薬理学的活性を発揮する他の治療用化合物と組み合わせるのに特に適している。
【０１２２】
「毒性の副作用を及ぼす薬理学的活性を発揮する治療用化合物」としては、任意の疾患の処置に使用されるが、望ましくない毒作用を誘導する任意の化合物を挙げることができる。好ましくは、このような化合物はガンの処置に使用される化合物である。例えば、本発明の抽出物またはその活性化合物は、抗腫瘍効果を有する１つまたは複数の他の化合物と組み合わせることができる。抗腫瘍効果を有している２つ以上の化合物が組み合わせられるので、より一層の抗腫瘍活性を得ることができる。さらに、このような組み合わせにより、１つまたは数種の抗腫瘍性化合物によって誘導される毒性の副作用を軽減することも可能である。
【０１２３】
本発明の抽出物またはその活性化合物の別の治療用化合物との組み合わせには、上記抽出物またはその活性化合物と他の治療用化合物を別々に使用することが含まれる。具体的には、この組み合わせには、他の治療用化合物の使用の前（処置前）、同時、または使用後（処置後）に、本発明の抽出物またはその活性化合物を使用することが含まれる。
【０１２４】
あるいは、抽出物またはその活性化合物の別の治療用化合物との組み合わせには、両方の成分の混合物も含まれる。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、上記抽出物またはその少なくとも１つの活性化合物である第１の成分と、毒性の副作用を及ぼす薬理学的活性を発揮する治療用化合物を含む第２の成分を含む医薬組成物に関する。
【０１２５】
生成物
本発明の１つの態様は、被験体に同時に、別々に、または逐次投与するための、カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物および治療用化合物を含む生成物である。生成物が本発明にしたがって使用されることが、本発明の１つの態様である。
【０１２６】
同時投与手段によって、２つの成分は被験体に対して同時に、例えば、２つの成分の混合物として投与される。例として、静脈内投与される溶液、錠剤、液剤、塗り薬などが挙げられるがこれらに限定されない。それぞれの調製物は両方の成分を含む。
【０１２７】
別々の投与手段によって、２つの成分は、同時に、または実質的に同時に被験体に投与されるが、成分は別個の混合されていない調製物として生成物中に存在する。例えば、２つの成分は、個別の錠剤として生成物中に存在する場合がある。錠剤は、両方の錠剤を同時に嚥下することによって、または１つの錠剤の直後に別の錠剤を嚥下することによって、被験体に投与することができる。
【０１２８】
逐次投与手段によって、２つの成分は被験体に逐次投与され、成分は別個の混合されていない調製物として生成物中に存在する。服用の間には時間の間隔が存在する。例えば、１つの成分は、他方の成分の後、３３６、３１２、２８８、２６４、２４０、２１６、１９２、１６８、１４４、１２０、９６、７２、４８、２４、２０、１６、１２、８、４、２、１、または０．５時間までに投与される。
【０１２９】
逐次投与では、抽出物を一度に投与することができ、また、治療用化合物の投与前および／または後に任意の回数および種々の用量で投与することもできる。逐次投与は、同時投与または逐次投与と組み合わせることができる。
【０１３０】
キット
本発明の別の態様は、その中にカロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物が存在している容器、およびその中に治療用化合物が存在している容器を含むキットである。本発明の抽出物および本発明の治療用化合物は上記されている。
【０１３１】
カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の抽出物が存その中に在している容器、および治療用化合物がその中に存在している容器を含むキットについて言及することによって、キットが、２種類の１つずつの容器に反映される、単回用量または複数回の用量を含むことができることが理解される。２種類の１つずつの容器のそれぞれは、複数回の用量を含むことができ、また、多数の単一のそれぞれは単回用量を含むことができる。キットが、それぞれの治療用化合物が別々の容器に含まれるか、または治療用化合物の混合物が１つの容器に含まれる、１つまたは複数の治療用化合物を含むことができることが理解される。
【０１３２】
容器は、医療の分野で既知の任意のものであってよい。それらには、バイアル、ブリスター包装、注射器、再封可能な瓶、分散手段を備えた瓶、吸入器、滴瓶、パッチ、塗布器、坐剤であり得る。
【０１３３】
別々の容器により、抽出物と治療用化合物を、同時に、別々に、または逐次投与することができる。
【０１３４】
処置方法
本発明の抽出物の少なくとも１つの好ましい抗腫瘍特性により、上記抽出物は、ガンに罹患している個体の処置に特に有用である。別の実施形態では、本発明はまた、そのような処置が必要な個体に本発明の医薬組成物を投与することを含む、ガンの処置方法に関する。その低いレベルの毒性とその最小の副作用により、ガンの処置のための医薬組成物中での１つの上記抽出物の使用には、最小限の副作用しか伴わない。結果として、上記の本発明の抽出物は、ガンの処置の間の長い期間にわたって使用することができる。
【０１３５】
具体的には、好ましい実施形態において、本発明は、ガンを処置するための方法に関する。ここでは、ガンは、乳ガン、リンパ腫、肉腫、膵臓ガン、黒色腫、結腸直腸ガン、神経膠腫、非小細胞肺ガン、小細胞肺ガン、皮膚ガン、骨肉腫、卵巣ガン、中枢神経ガン、腎臓ガン、膀胱ガン、頭頸部ガン、前立腺ガン、肝臓ガン、血液のガンを含むがこれらに限定されない群から選択される。
【０１３６】
これらの目的のために、本発明の医薬組成物は、従来の毒性のない薬学的に許容される担体、補助薬、および賦形剤を含む投与量単位処方物として、経口で、非経口（すなわち、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、または輸液技術を含む）で、投与することができ、スプレー吸入により投与することができ、また直腸から投与することもできる。
【０１３７】
本発明の方法によれば、上記医薬組成物を、治療の過程の間の異なる時点で別々に、または分割された形態または単一の組み合わせ形態で同時に投与することができる。したがって、本発明は、このような全ての同時または交互の処置計画を含むと理解され、それに沿って用語「投与する」が解釈される。
【０１３８】
本質的に、固形の腫瘍であるガンの処置の第１の様態には、外科手術、放射線治療、および化学療法が、別々にまたは組み合わせて含まれる。本発明の抽出物は、これらの医療技術と組み合わせて使用することに適している。本発明の抽出物は、放射線治療における腫瘍細胞の感度を増大させることにおいて、また化学療法薬による腫瘍に対する損傷を強くするまたは増すことにおいても有用であり得る。本発明の抽出物はまた、多剤耐性の腫瘍細胞を感作するためにも有効である。本発明の抽出物は、その効果を高めるために放射線治療において使用される放射線を含む、他のＤＮＡを損傷する治療用化合物と組み合わせた投与に有用な治療用化合物である。
【０１３９】
理解されるように、本発明の医薬組成物は、特異的な用量レベルで、特異的な用量の頻度でヒトに投与することができる。特異的な用量レベルおよび用量の特異的な頻度は、任意の特定の患者について変更することができ、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食餌療法、投与の様態および時間、排泄速度、薬の組み合わせ、治療を受けている患者の特定の症状の重篤度に依存する。
【０１４０】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものである。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するとみなすべきではない。第１の実施例は、植物カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）からの本発明の抽出物の抽出を説明する。実施例２から４は、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での抗腫瘍特性に関する。実施例５から７は、本発明の抽出物の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での抗腫瘍特性について記載する。実施例８は、本発明の抽出物の抗毒効果を説明する。
【実施例１】
【０１４１】
植物カロトロピスプロケラからの本発明の抽出物の抽出プロセス
本発明の抽出物（抽出物Ａ）を、カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）植物（ガガイモ科）の根からメタノールによって単離した。上記抽出物はさらに抽出物Ａと呼ぶ（合わせるために）。約１０グラムの植物を１５０ｍｌのメタノールとともに三角フラスコに入れた。懸濁液を１２時間磁気によって震盪させ、その後ガラスフリット上で濾過した。残った固形分を、再び、メタノールで２時間抽出した。両方の濾液を混合し、回転式エバポレーターを使用することにより減圧下で蒸発させた。メタノール性の抽出物から構成される残渣を、本明細書中では以後、抽出物Ａと呼ぶ。
【０１４２】
抽出物Ａの分析により、数種の化合物の存在が明らかになった。上記抽出物Ａ中で同定された化合物の特定の群には、アスクレピン（ａｓｃｌｅｐｉｎ）、カラクチン（ｃａｌａｃｔｉｎ）、ボルシャリン（ｖｏｒｕｓｈａｒｉｎ）、カロトロピン（ｃａｌｏｔｒｏｐｉｎ）、カロトロパゲニン（ｃａｌｏｔｒｏｐａｇｅｎｉｎ）、ウザリゲニン（ｕｚａｒｉｇｅｎｉｎ）、ウシャリン（ｕｓｈａｒｉｎ）、およびウシャリジン（ｕｓｈａｒｉｄｉｎ）のようなカルデノリドが含まれる。さらに、抽出物Ａ中に存在するいくつかの他の化合物としては、３−Ｏ−アセチルカロトロピン（３−Ｏ−ＡＣＥＴＹＬ−ＣＡＬＯＴＲＯＰＩＮ）、α−アミリン（ＡＬＰＨＡ−ＡＭＹＲＩＮ）、安息香酸α−アミリン（ＡＬＰＨＡ−ＡＭＹＲＩＮ−ＢＥＮＺＯＡＴＥ）、α−カロトロペオール（ＡＬＰＨＡ−ＣＡＬＯＴＲＯＰＥＯＬ）、α−ラクツセロール（ＡＬＰＨＡ−ＬＡＣＴＵＣＥＲＯＬ）、酢酸α−ラクツセリル（ＡＬＰＨＡ−ＬＡＣＴＵＣＥＲＹＬ−ＡＣＥＴＡＴＥ）、イソ吉草酸α−ラクツセリル（ＡＬＰＨＡ−ＬＡＣＴＵＣＥＲＹＬ−ＩＳＯＶＡＬＥＲＡＴＥ）、アラビノース（ＡＲＡＢＩＮＯＳＥ）、ベンゾイルイソリネオロン（ＢＥＮＺＯＹＬＩＳＯＬＩＮＥＯＬＯＮＥ）、ベンゾイルリネオロン（ＢＥＮＺＯＹＬＬＩＮＥＯＬＯＮＥ）、β−アミリン（ＢＥＴＡ−ＡＭＹＲＩＮ）、安息香酸β−アミリン（ＢＥＴＡ−ＡＭＹＲＩＮ−ＢＥＮＺＯＡＴＥ）、β−カロトロペオール（ＢＥＴＡ−ＣＡＬＯＴＲＯＰＥＯＬ）、β−シトステロール（ＢＥＴＡ−ＳＩＴＯＳＴＥＲＯＬ）、キャウトシュ（ＣＡＯＵＴＣＨＯＵＣ）、コログラウコゲニン（ＣＯＲＯＧＬＡＵＣＯＧＥＮＩＮ）；コロトキシゲニン（ＣＯＲＯＴＯＸＩＧＥＮＩＮ）；Ｄ−グルコサミン（Ｄ−ＧＬＵＣＯＳＡＭＩＮＥ）、フルゴシド（ＦＲＵＧＯＳＩＤＥ）、ギガンテオール（ＧＩＧＡＮＴＥＯＬ）、ギガンチン（ＧＩＧＡＮＴＩＮ）、グルコース（ＧＬＵＣＯＳＥ）、ヒスタミン（ＨＩＳＴＡＭＩＮＥ）、イソギガンテオール（ＩＳＯＧＩＧＡＮＴＥＯＬ）、イソラクツセロール（ＩＳＯＬＡＣＴＵＣＥＲＯＬ）、イソリネオロン（ＩＳＯＬＩＮＥＯＬＯＮＥ）、ローレーンリネオロン（ＬＡＵＲＡＮＥ  ＬＩＮＥＯＬＯＮＥ）、リノール酸（ＬＩＮＯＬＥＩＣ−ＡＣＩＤ）、リノレン酸（ＬＩＮＯＬＥＮＩＣ−ＡＣＩＤ）、メリッシルアルコール（ＭＥＬＩＳＳＹＬ−ＡＬＣＯＨＯＬ）、ムダリン（ＭＵＤＡＲＩＮＥ）、オレイン酸（ＯＬＥＩＣ−ＡＣＩＤ）、パルミチン酸（ＰＡＬＭＩＴＩＣ−ＡＣＩＤ）、プロセロシド（ＰＲＯＣＥＲＯＳＩＤＥ）、シュードカロトロパゲニン（ＰＳＥＵＤＯＣＡＬＯＴＲＯＰＡＧＥＮＩＮ）、ラムノーススチグマステロール（ＲＨＡＭＮＯＳＥ  ＳＴＩＧＭＡＳＴＥＲＯＬ）、シリオゲニンタラキサステロール（ＳＹＲＩＯＧＥＮＩＮ  ＴＡＲＡＸＡＳＴＥＲＯＬ）、安息香酸タラキサステロール（ＴＡＲＡＸＡＳＴＥＲＯＬ−ＢＥＮＺＯＡＴＥ）、およびトリプシン（ＴＲＹＰＳＩＮ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４３】
本発明の他の抽出物は、以下の段階を含む方法によって単離される：
ａ）カロトロピスプロケラ（Ｃａｌｏｔｒｏｐｉｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）の葉身、茎、樹皮、および根の出発材料をすりつぶして植物の微粉末を得る段階、
ｂ）段階ａ）の粉末をジクロロメタンで２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｃ）段階ｂ）のジクロロメタンをデカントし、（濾過後に）濾液を蒸発させて粘性物質を形成させる段階、
ｄ）段階ｃ）の残渣をメタノールで２４時間、ソックレー抽出装置を用いて抽出する段階、
ｅ）段階ｄ）のメタノールをデカントし、（濾過後に）濾液を蒸発させて粘性物質を得る段階、
ｆ）段階ｅ）の粘性物質をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてジクロロメタン−メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにかける段階、
ｇ）第１画分を回収する段階、
ｈ）段階ｇ）の濃縮画分をフラッシュシリカゲルおよび溶媒としてヘキサン−アセトンを使用するカラムクロマトグラフィーにかけて２つの画分を得る段階、
ｉ）段階ｈ）の後、カラムをメタノールで洗浄して、第３画分を得る段階。
【０１４４】
段階ｃ）で単離された抽出物を、以後、抽出物Ｂと呼ぶ。段階ｇ）で単離された抽出物を、以後、抽出物Ｃと呼ぶ。段階ｉ）で単離された抽出物を、以後、抽出物Ｄと呼ぶ。
【実施例２】
【０１４５】
細胞株の全体的な細胞増殖に対する本発明の抽出物の効果
本実施例は、種々の型のガンに対する本発明の抽出物Ａの抗腫瘍活性を説明する。
【０１４６】
抽出物Ａの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での活性を明らかにするために、ＭＴＴ試験を行った。ＭＴＴ試験は当該分野で周知の試験であり、細胞株全体の増殖に対する特定の生成物の効果を迅速に、すなわち５日以内に測定する間接的技術である。この試験によって、代謝活性のある生存している細胞の数を測定する。該代謝活性のある生存している細胞は、黄色味がかった色を有しているＭＴＴ生成物（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５  ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ））を、生存している細胞によってのみ行われるミトコンドリアによる還元によって青色の生成物であるホルマザンへと変換することができる。実験の最後に得られたホルマザンの量を分光光度計で測定し、該量は生存している細胞の数に正比例する。
【０１４７】
表２に記載した４８のヒトのガン細胞株を、抽出物Ａの存在下で試験した。これらの細胞株は、膵臓ガン、肉腫、乳ガン、黒色腫、結腸癌、神経膠腫、肺ガン、膀胱ガン、前立腺ガン、および頭頸部ガンである１０種の組織型に及んでいた。細胞を１ウェルあたり１００μｌの細胞懸濁液を含む平底の９６ウェルマイクロウェル中で、細胞型に応じて３０００から５０００個の細胞／ウェルの間に増殖させた。それぞれの細胞株を、表２に示したそれらの特有の細胞培養培地中に接種した。
【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
３７℃で２４時間のインキュベーション時間後、培養培地を、その中に抽出物Ａを０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／ｍｌの種々の濃度で溶解させた１００μｌの新しい培地と置き換えた。それぞれの実験条件を６回実施した。
【０１５０】
３７℃にて７２時間薬剤とのインキュベーション（実験条件）、または７２時間の薬剤を含まないインキュベーション（対照）、の後、培地を、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ中に溶解させた１００μｌのＭＴＴによって置換した。その後、マイクロウェルを３７℃で３時間インキュベートし、４００ｇで１０分間遠心分離した。ＭＴＴを除去し、形成したホルマザン結晶を１００μｌのＤＭＳＯ中に溶解させた。マイクロウェルを５分間震盪し、分光光度計で、最大ホルマザン吸収波長に対応する５７０ｎｍと、バックグラウンドノイズの波長である６３０ｎｍの２つの波長について読み取った。
【０１５１】
それぞれの実験条件について、各条件、すなわち６個のウェルの平均の標準誤差（ＳＥＭ）をともなって、平均のＯＤを計算した。残っている生存細胞の割合を、対照と比較して計算した。これらの実験の結果を、図１から１１に示す。
【０１５２】
図１は、１０個の組織学的型についての総合的な結果を示す。示すように、抽出物Ａは試験した全ての組織型に対して抗腫瘍効果を発揮した。膀胱から得たヒトの腫瘍細胞株は、抽出物Ａに対して、残りの９種の組織型よりも弱い感受性を示した。植物の抽出物が細胞集団の５０％を死滅させる濃度、いわゆる、ＩＣ５０値を決定した。該ＩＣ５０値は、乳房から得た細胞株および膵臓の細胞株については、０．５μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌの間となった。０．５〜０．１μｇ／ｍｌのＩＣ５０値を伴うさらに重要な抗腫瘍効果が、肉腫、黒色腫、神経膠腫、肺ガン、頭頸部ガン、および結腸直腸ガン細胞株について得られた。ＰＣ３前立腺ガン細胞は際立った感受性を示し、０．０１から０．０５μｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０値を有していた。
【０１５３】
図１に示すように、５つの乳ガン細胞株の平均のＩＣ５０値は、０．５から１μｇ／ｍｌの範囲にあった。５つの個々の乳ガン細胞株である、Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ−７、およびＨｓ５７８Ｔの全体的な増殖をさらに図２に示す。細胞株Ｔ−４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−１、およびＨｓ５７８Ｔは、抽出物Ａに対して同程度の感受性を示したが、ＭＣＦ−７細胞は残りの４つの乳ガンモデルよりも急激に、その全体的な増殖が低下した。
【０１５４】
図１に示すように、７個の肉腫細胞株の平均のＩＣ５０値（表２を参照）は、０．５から０．１μｇ／ｍｌの範囲にあった。個々の細胞株の全体的な増殖をさらに図３に示す。抽出物Ａは、Ａ２０４細胞株に対して最も重要な抗腫瘍効果を誘導した。実際に、ＩＣ５０値は、０．１から０．０５μｇ／ｍｌの間であることが明らかになった。Ｈｓ７２９細胞株は、７つの肉腫細胞株のうち最も感受性が低いと考えられた。それにもかかわらず、この細胞株は、１から５μｇ／ｍｌの範囲の抽出物Ａに対するＩＣ５０値を示した。
【０１５５】
図１に示すように、７個の膵臓ガン細胞株（表２を参照）の平均のＩＣ５０値は、０．５から０．１μｇ／ｍｌの範囲にあった。同程度の全体的な増殖が、７個の膵臓ガン細胞株のうちの６つについて観察された（図４）。これらの７個の細胞株のうち、Ｐａｎｃ−１は抽出物Ａに対して最も敏感であると思われ、Ｈｓ７６６Ｔが最も感受性が低いと思われた。これらの２つの細胞株のＩＣ５０値は、それぞれ、０．１から０．５μｇ／ｍｌ、１から５μｇ／ｍｌの範囲にあった。
【０１５６】
図１に示すように、５個の黒色腫細胞株（表２を参照）の平均のＩＣ５０値は、０．５から０．１μｇ／ｍｌの範囲にあった。本発明の抽出物は、５μｇ／ｍｌに相当する濃度またはそれよりも高い濃度で、全ての黒色腫細胞株の全体的な増殖を６０％以上低下させた（図５）。Ｍａｌｍｅ−３ＭおよびＧ−３６１は、５つの黒色腫細胞株の中で最も敏感であった。これらは、同程度の全体的な増殖を示し、０．１から０．５μｇ／ｍｌの範囲のＩＣ５０値を有していた。
【０１５７】
図１に示すように、７つの結腸ガン細胞株（表２を参照）の平均のＩＣ５０値は、０．５から０．１μｇ／ｍｌの範囲にあった。試験した種々の結腸直腸ガン細胞株（図６）のうち、ＬｏＶｏ株は０．１μｇ／ｍｌ程度のＩＣ５０値を有しており、最も感受性が高い結腸直腸株であると考えられた。ＳＷ９４８腫瘍細胞株は、最も感受性が低いと考えられ、０．５から１μｇ／ｍｌの範囲にあるＩＣ５０値を有していた。
【０１５８】
図１に示すように、７つのヒトの神経膠腫細胞株（表２を参照）の平均のＩＣ５０値は、０．５から０．１μｇ／ｍｌの範囲にあった。Ｈｓ６８３は抽出物に対して最も感受性が高い細胞であった（図７）。そのＩＣ５０値はほぼ０．０５μｇ／ｍｌであった。対照的に、Ａ１７２細胞の増殖は、０．０１から１０μｇ／ｍｌまでの濃度では抽出物Ａによる影響を受けなかった。ＩＣ５０値は１０から５０μｇ／ｍｌの範囲にあった。
【０１５９】
図１に示すように、２つのヒト非小細胞肺ガン細胞株（ＮＳＣＬＣ）の平均のＩＣ５０値は、０．１から０．５μｇ／ｍｌの範囲にあった。図８は、いずれの株も抽出物Ａに対して敏感であることを示している。
【０１６０】
図１に示すように、２つのヒト膀胱ガン細胞株（表２を参照）の平均のＩＣ５０値は、５０から１００μｇ／ｍｌの範囲にあった。２つの株は、抽出物Ａに対する感受性に関して、顕著な差を示した（図９）。実際には、５μｇ／ｍｌの抽出物Ａで、Ｔ２４細胞株の全体的な増殖は８０％以上低下したが、Ｊ８２細胞株の全体的な増殖は、１００μｇ／ｍｌで３２％しか低下しなかった。Ｊ８２細胞株は抽出物Ａに対して非常に感受性が低いと思われた。
【０１６１】
１つの前立腺ガン細胞株（ＰＣ３細胞株）の全体的な増殖を、抽出物Ａで細胞を処理した際のＭＴＴアッセイによって評価した。抽出物Ａは、１００μｇ／ｍｌから０．５μｇ／ｍｌの間で約９０％の全体的な増殖の阻害を誘導した。ＩＣ５０値はおよそ０．１μｇ／ｍｌであった（図１０）。
【０１６２】
図１に示すように、５つの頭頸部ガン細胞株の平均のＩＣ５０値は０．１から０．５μｇ／ｍｌの範囲にあった。同程度の全体的な増殖が、５個の頭頸部ガン細胞株のうちの４つについて観察された（図１１）。これらの５つの細胞株のうち、ＳＣＣ９は最も感受性が低いと思われた。それにもかかわらず、抽出物ＡについてのＩＣ５０値はおよそ５μｇ／ｍｌであった。
【０１６３】
まとめると、本発明の抽出物Ａは、上記の実験においてアッセイした４８個のヒトのガン細胞株のうち４６個に対して目覚ましい抗腫瘍効果を発揮する。これらの抗腫瘍効果は、非常に広い範囲の組織型のパネルを示す、これらのヒトのガンモデルの全体的な増殖の著しい低下に対応する。
【実施例３】
【０１６４】
細胞動態に対する本発明の抽出物の効果
本実施例は、本発明の抽出物Ａの細胞静止作用を説明する。実施例２に記載したＭＴＴ比色アッセイによって行った実験により、抽出物ＡがＭＴＴアッセイに供した４８個のヒトのガン細胞株のほとんどの全体的な増殖を著しく低下させることが明らかである。以下の実施例では、この抽出物によって誘導される全体的な増殖の低下が、細胞周期速度（実施例３）またはアポトーシスの誘導（実施例４を参照）のレベルで生じる変化のいずれに、またはそれらの両方に対応しているのかを調べる。
【０１６５】
細胞周期は、一般的に、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ期を含むいくつかの期に分けられる。細胞増殖および／または細胞死を制御するタンパク質の周辺で生じる変化が、抽出物Ａ中に存在する活性化合物の１つの標的となり得る。細胞周期速度の変化は、例えば、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、および臭化エチジウムなどの種々の蛍光基を用いてフローサイトメトリーによって調べることができる。フローサイトメトリーにより、それぞれのガン細胞（数千におよぶ）を細胞周期に位置づけることができる。したがって、ＤＮＡヒストグラムパターンの変化が、種々の治療用化合物の作用機構を明らかにするために使用される。フローサイトメトリー分析によって得られたデータは、Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ区画の有意な推定を導くために、図形的にまたは数学的に処理される。ほとんどの数学的処理は、特定のモデルと仮定に基づく。
【０１６６】
細胞株を、７ｍｌの培養培地を含むフラスコ（２５ｃｍ２面積）中に播種した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、細胞培養培地を、抽出物Ａを細胞集団の５０％（ＩＣ５０）、３０％（＝ＩＣ３０）、および１０％（ＩＣ１０）を死滅させる濃度で溶解させた新しい培地で置き換えた。２４時間または７２時間の処理後、細胞を懸濁液中に回収し、４℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、７０％のエタノール（４℃）を用いて−２０℃で一晩透析した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウム溶液（８０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で３０分間インキュベートし、その後、４℃で一晩維持した。リボヌクレアーゼＡ（３％Ｖ／Ｖ）を添加して、二本鎖のＤＮＡの切断を誘導した。細胞周期のポートレートをそれぞれの試料について構築した。フローサイトメーターに組み込まれている特異的なソフトウェアプログラムを使用して、細胞周期の種々の期にある細胞のパーセンテージを正確に決定した。細胞周期のそれぞれの期をピーク面積について記録し、パーセンテージとして計算した。全細胞周期の面積を１００％とした。それぞれの実験を３回行った。それぞれの種々の期の平均のパーセンテージ、および関連する平均の標準誤差を計算した。所定の条件についてのそれぞれの細胞周期を、対照細胞、すなわち、未処理細胞の同一の細胞周期と比較した。
【０１６７】
抽出物Ａは、ヒトの腫瘍細胞株に対して非常に有効である。本発明者らのフローサイトメトリー実験で使用した濃度は、ＭＴＴの結果（実施例２）にしたがって選択した。培養物を漸増濃度の抽出物Ａで２４時間または７２時間処理した場合に、抽出物Ａが細胞周期の１つの期での蓄積を促進するかどうかを調べるために、５つのヒトのガン細胞株Ｈｓ６８３（神経膠腫）、Ｊ８２（膀胱）、Ａ１７２（神経膠腫）、ＲＰＭＩ（頭頸部）、およびＨＣＴ−１５（結腸）を試験し、細胞の１０、３０、および５０パーセントを死滅させる用量を決定した（表３）。
【０１６８】
【表３】
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【０１６９】
ＨＣＴ−１５の細胞周期の分析（図１２）は、細胞集団の分布が、試験した濃度とは無関係に、２４時間の処理後の対照と類似していることを示した。一方、顕著なＳ集団が、０．２５μｇ／ｍｌの抽出物で７２時間処理した細胞において見られた。対照においてＳ画分は細胞の２１％を占め、０．２５μｇ／ｍｌの抽出物Ａで処理した場合には５９％に達した。Ｓ画分の増加には、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の減少が伴った。Ｇ０／Ｇ１集団は、７１％から２９％へと顕著に減少した。
【０１７０】
ＲＰＭＩの細胞周期の分析（図１３）は、０．０５μｇ／ｍｌの抽出物Ａで処理した細胞集団の分布が、処理の２４時間後の対照と類似していることを示した。Ｓ期の弱い増加が、０．１および０．２５μｇ／ｍｌで観察された。対照的に、Ｓ集団の大きな増加が、ＲＰＭＩ細胞株を、試験した３つの濃度の抽出物Ａとともに７２時間インキュベートした場合に生じた。抽出物Ａを、それぞれ０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、および０．２５μｇ／ｍｌでアッセイすると、Ｓ期の細胞は約７１％、６９％、および６２％になった。同時に、Ｇ０／Ｇ１期の細胞の割合は顕著に減少し、Ｇ２／Ｍ期の細胞がわずかに増加し、細胞集団の２９％に達した。
【０１７１】
Ａ１７２細胞株を、１０および２５μｇ／ｍｌの抽出物Ａで処理した。これらの濃度はＩＣ１０およびＩＣ５０に対応する。結果（図１４）は、試験した抽出物Ａのどの濃度でも、処理の２４時間後にＧ０／Ｇ１期の増大が誘導されたことを示した。対照では、細胞の３９％がＧ０／Ｇ１期にあったが、抽出物Ａで処理した細胞は６０％に達した。Ｇ０／Ｇ１期の蓄積と同時に、本発明者らは、試験した最も高い濃度において、Ｇ２／Ｍ期でのわずかな蓄積を観察した。処理の２４時間後に観察された効果は、７２時間後には消えていた。実際、種々の細胞周期の期において明確な変化は観察されなかった。
【０１７２】
Ｊ８２細胞株は抽出物にほとんど反応しなかった（ＭＴＴアッセイを参照）。フローサイトメトリーのために選択した濃度は、約ＩＣ１０およびＩＣ３０に対応していた（図１５）。処理の２４時間後、試験した濃度にかかわらず、Ｇ０／Ｇ１期にわずかな蓄積が得られた。一方、細胞を５０および１００μｇ／ｍｌの抽出物Ａで７２時間処理した場合には、それぞれの細胞集団の３０および４７％がＳ期にあったが、対照条件ではわずか１８％にしか達しなかった。１００μｇ／ｍｌでは、Ｇ２／Ｍ期での蓄積も観察された。
【０１７３】
０．０５μｇ／ｍｌの抽出物Ａでの処理の２４時間後、Ｈｓ６８３細胞はＧ０／Ｇ１期に蓄積し、対照（５８％）と比較して７０％に達した（図１６）。本発明者らは、同時に、Ｓ期の細胞の割合の減少を観察した。同様に、いずれの濃度でも、処理の７２時間後には細胞のほとんどがＧ０／Ｇ１期にあった。実際、対照においてはＧ０／Ｇ１期にある細胞は細胞集団の４６％を示したが、処理の７２時間後の細胞の６０％以上がＧ０／Ｇ１期にあった。
【０１７４】
要するに、抽出物ＡはＧ０／Ｇ１期での蓄積を誘導し、このような状況下ではこのことは、抽出物Ａが細胞静止作用を有していることを示している。
【実施例４】
【０１７５】
本発明の抽出物のプロアポトーシス効果
本実施例は、本発明の抽出物Ａのプロアポトーシス効果を説明する。
【０１７６】
細胞死は２つの異なる方法、偶然にまたは遺伝的にプログラムされた方法のいずれかで起こり得る。偶然の細胞死は壊死とも呼ばれ、本質的には、例えば、物理的または生物学的攻撃の結果として生じる。アポトーシスは、遺伝的にプログラムされた細胞死である細胞死の形態を意味し、これは通常の生理学的条件下で生じる。アポトーシスの誘導後、複数の事象のカスケードが細胞内で誘導される。該カスケードとして細胞死受容体の活性化、一連の細胞質プロテアーゼの活性化、アポトーシス体の形成、ＤＮＡの断片化が挙げられる。
【０１７７】
アポトーシス経路に対する抽出物Ａの影響を、４つのヒトのガン細胞株：Ｈｓ６８３（神経膠腫）、Ｊ８２（膀胱）、Ａ１７２（神経膠腫）、およびＨＣＴ−１５（結腸）について調べた。
【０１７８】
細胞を、７ｍｌの培養培地を含むフラスコ（２５ｃｍ２面積）中に播種した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、細胞培養培地を、本発明の抽出物Ａを細胞集団の５０％および３０％を死滅させる種々の濃度で溶解させた新しい培地で置換した。２４時間または７２時間の処理後、細胞を懸濁液中に回収し、数えた。２５００００個の細胞を１０分間、１７００ｒｐｍで４℃にて遠心分離した。ペレットをＰＢＳで４℃で洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム溶液とともに４℃で１５分間、暗所でインキュベートした。それぞれの試料について、およそ１００００個の細胞からのデータを、対数目盛りで記録した。フローサイトメーターに組み込まれているソフトウェアを使用して、アポトーシス経路および／または壊死経路にある細胞、ならびに正常な細胞のパーセンテージを正確に決定した。それぞれの実験を２回行った。アポトーシス経路および壊死経路の両方について、割合の平均、および関連する平均の標準誤差を計算した。それぞれの条件を、対照、すなわち、未処理細胞と比較した。
【０１７９】
細胞を、０．２５μｇ／ｍｌの抽出物Ａで２４時間処理した場合には、対照の細胞と比較して、ＨＣＴ−１５アポトーシス細胞の４倍の増加が観察された（図１７）。Ａ１７２細胞株は、細胞を２５μｇ／ｍｌの抽出物Ａによって２４時間処理した場合には、アポトーシス経路および壊死経路が連動すると考えられた（図１８）。この傾向は、処理の７２時間後も保たれていた。抽出物Ａでの処理により、Ｊ８２細胞のアポトーシスが濃度依存性の様式で誘導された。このことは、処理の７２時間後に特に明確であった（図１９）。壊死細胞のパーセンテージの増加もまた、７２時間で両方の濃度において観察された。Ｈｓ６８３アポトーシス細胞のパーセンテージにおける２．５倍の増加が、０．０２５μｇ／ｍｌの抽出物Ａでの処理の２４時間後に得られた（図２０）。処理の７２時間後には、アポトーシス細胞のパーセンテージは、濃度依存性の様式で増加した。
【０１８０】
最後に、抽出物Ａはアポトーシス細胞の割合の増大を誘導した。壊死経路に対する効果は、特定の条件下で得られた。
【実施例５】
【０１８１】
本発明の抽出物の最大耐用量
本実施例では、本発明の抽出物ＡについてのＭＴＤ指数を決定した。所定の薬剤の最大耐用量（ＭＴＤ）は、健常な動物、すなわち腫瘍が移植されていない動物に対して急激に投与することができる、すなわち１回の腹腔内、静脈内、皮下で、または１回の経口で投与することができる薬剤の最大量として定義される。
【０１８２】
抽出物ＡのＭＴＤ指数を決定するための実験条件は以下のとおりである。腫瘍を移植していないマウスの生存時間は注射後１４日間まで記録された。ＭＴＤ指数の決定のために抽出物Ａの６つの異なる用量を使用した。腫瘍を有しているマウスに投与した最も高い用量は１６０ｍｇ／ｋｇであった。他の用量は、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、および８０ｍｇ／ｋｇであった。ＭＴＤ指数の決定のために、それぞれの実験群は２匹のマウスから構成した。以下の表４は、抽出物Ａを使用してＭＴＤ指数について得られたデータを示す。
【０１８３】
【表４】
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【０１８４】
上記の定義から、抽出物ＡのＭＴＤ指数はマウスの単回投与については２０ｍｇ／ｋｇである。したがって、健常な動物に対して急激に投与できる抽出物Ａの最大量を意味する抽出物Ａの最大耐用量（ＭＴＤ）指数は、２０ｍｇ／ｋｇである。この値は、抽出物Ａが広い治療幅を有していることを示す。
【実施例６】
【０１８５】
３つのガンモデルについて評価した本発明の抽出物の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での効果
本実施例は、３つの異なるガンモデルに対する本発明の抽出物Ａの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での効果を説明する。
【０１８６】
抽出物Ａの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での効果を、リンパ腫、黒色腫、および乳ガンを含む種々の腫瘍型を移植したマウスについて研究した。生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での効果を、３種のパラメーターを用いて評価した：
−腫瘍を保有しているマウスの体重を処置の間に記録することにより評価される、累積毒性
−１週間に３回、キャリパーで腫瘍の大きさを測定することにより評価される、腫瘍増殖レベルで発揮される実際の抗腫瘍効果。実際の腫瘍の増殖は、２つの最大垂直直径を乗じることにより面積（ｍｍ２）として表現される。
−Ｔ／Ｃ指数によって計算される処置されたマウスについての生存性の獲得。この指数は、処置されたマウスの群（Ｔ）の生存時間の平均値と対照群（Ｃ）の生存時間の平均値との比である。抽出物は、Ｔ／Ｃ値が１３０％を上回る（Ｐ＜０．０５）場合に活性であるとみなされ、１５０％よりも高い値（Ｐ＜０．０１）については非常に活性であり、７０％未満の値については毒性とみなされる。
【０１８７】
リンパ腫モデルに対する抽出物Ａの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での効果
抽出物Ａを、侵攻性のＰ３８８リンパ腫モデルについて評価した。最初の実験では３つの用量、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および２．５ｍｇ／ｋｇを対照と比較した。マウスに１０６個のＰ３８８細胞を、０日目に皮下に接種し、その後の３週間、移植後５日、７日、９日、１２日、１４日、１６日、１９日、２１日、および２３日に９回処置した。それぞれの実験群は９匹のマウスを含む。
【０１８８】
図２１Ａは、抽出物Ａがマウスの体重には影響を与えなかったことを示す。図２１Ｂは、抽出物ＡがＰ３８８リンパ腫の増殖の低下を顕著に誘導したことを示す。７×１０ｍｇ／ｋｇの投与スケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は１１１％のＴ／Ｃ指数を生じ、６×５ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は１００％のＴ／Ｃ指数を生じ、そして８×２．５ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は１２１％のＴ／Ｃ指数を生じた。最後に、これらの結果は、抽出物Ａの投与によりＰ３８８リンパ腫の増殖は低下したが、Ｐ３８８リンパ腫を保有しているマウスの生存性は、試験した濃度では有意には伸びなかったことを示している。
【０１８９】
実験の第２のセットにおいては、投与回数を９回から１６回に増やし、同時に１回の投与あたりの用量を減少させた。皮下投与した用量は２．５ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、および０．６３ｍｇ／ｋｇであった。抽出物Ａを、日毎、１週間に５日、５週間連続して投与した（５×５＝２５）。
【０１９０】
図２２Ｂは、０．６３ｍｇ／ｋｇおよび１．２５ｍｇ／ｋｇの用量のこれらの活性のある抽出物Ａが、ごくわずかな毒作用しか有していないことを示している。なぜなら、Ｐ３８８リンパ腫を保有しているマウスは、処置の間に体重が減らなかったからである。図２２Ａは、０．６３ｍｇ／ｋｇおよび１．２５ｍｇ／ｋｇの両方の用量で、抽出物ＡがＰ３８８リンパ腫の増殖を顕著に低下させたことを示している。さらに、１５×２．５ｍｇ／ｋｇの投与スケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１３７％のＴ／Ｃ指数を生じ、１５×１．２５ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１３７％のＴ／Ｃ指数を生じ、１３×０．６３ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１１６％のＴ／Ｃ指数を生じた。したがって、２．５ｍｇ／ｋｇの抽出物Ａの１５回の投与と、１．２５ｍｇ／ｋｇの抽出物Ａの１５回の投与により、これらのＰ３８８リンパ腫を保有しているマウスの生存性が３７％顕著に増加した。結果として、抽出物Ａでの２．５ｍｇ／ｋｇおよび１．２５ｍｇ／ｋｇでの処置により、Ｐ３８８リンパ腫を保有しているマウスの生存性が長くなった。
【０１９１】
要するに、本発明の抽出物Ａは、動物の体重の減少は伴わなずに侵攻性のＰ３８８リンパ腫モデルに対して有意な抗腫瘍効果を発揮する。また、予想外に、本発明の抽出物Ａは、低用量、すなわちおよそ１．２５から０．６３ｍｇ／ｋｇで慢性的にアッセイした場合に、高用量、すなわちおよそ１０ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇよりも高い抗腫瘍活性を発揮する。
【０１９２】
黒色腫モデルに対する抽出物Ａの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での効果
抽出物Ａを、侵攻性のＢ１６黒色腫モデルについて評価した。抽出物Ａを、２．５ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、および０．６３ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに皮下投与した。抽出物Ａを、日毎、１週間に５日、連続して５週間にわたって投与した。
【０１９３】
図２３Ａは、投与した用量が、ごくわずかな毒作用しか有していないことを示している。なぜなら、Ｂ１６黒色腫を保有しているマウスは、処置の間に体重が減らなかったからである。図２３Ｂは、２．５または１．２５ｍｇ／ｋｇで分注した抽出物Ａの投与が、Ｂ１６黒色腫の増殖を有意に低下させたことを示している。さらに、２０×２．５ｍｇ／ｋｇの投与スケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１１７％のＴ／Ｃ指数を生じ、２０×１．２５ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１１７％のＴ／Ｃ指数を生じ、２５×０．６３ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１４０％のＴ／Ｃ指数を生じた。したがって、抽出物ＡはＢ１６黒色腫の増殖を低下させ、Ｂ１６黒色腫を保有しているマウスの生存性を有意に長くした。特に、抽出物Ａを、０．６３ｍｇ／ｋｇで２５回投与した場合に有意性のレベルに達している。
【０１９４】
第２のセットの実験では、抽出物Ａを経口投与した。図２４Ａは、投与した用量が、ごくわずかな毒作用しか有していないことを示している。なぜなら、Ｂ１６黒色腫を保有しているマウスは、処置の間に体重が減らなかったからである。図２４Ｂは、２．５または１．２５ｍｇ／ｋｇでの抽出物Ａの経口投与が、移植後２５日までＢ１６黒色腫の増殖を有意に低下させたことを示している。さらに、１９×２．５ｍｇ／ｋｇの投与スケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１１４％のＴ／Ｃ指数を生じ、１５×１．２５ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１００％のＴ／Ｃ指数を生じ、１６×０．６３ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１０４％のＴ／Ｃ指数を生じた。したがって、抽出物Ａは、２．５ｍｇ／ｋｇで、Ｂ１６黒色腫の腫瘍の増殖の低下を誘導し、Ｂ１６黒色腫を保有しているマウスの生存性をわずかに長くした。
【０１９５】
要するに、２つの実験のセットは、本発明の抽出物Ａが投与の態様とは無関係にＢ１６黒色腫に対して有意な抗腫瘍効果を発揮するという証拠を提供している。
【０１９６】
乳ガンモデルに対する抽出物Ａの生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での効果
抽出物Ａを、ＭＸＴ−ＨＩ乳ガンモデル、すなわち、乳ガンのホルモン非感受性変異株について評価した。ＭＸＴ−ＨＩモデルは、肝臓への激しい転移プロセスを伴う未分化のガン腫に対応する。したがって、これは、ヒトの乳ガンの後期臨床病期に対応する。ＭＴＸ−ＨＩは、極めて侵攻性の高い生物学的腫瘍モデルを代表する。
【０１９７】
Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスの両脇腹にＭＸＴ腫瘍断片を皮下注射することによりマウスにＭＸＴ−ＨＩ乳ガンを誘導する。処置しない場合は、接種したマウスは、接種後４週間から７週間の間に死亡する。抽出物Ａを、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および２．５ｍｇ／ｋｇでの９回の投与、すなわち、１週間に３回の連続する３週間の投与によってアッセイした。
【０１９８】
図２５Ａは、この実験で使用した抽出物Ａの種々の処置スケジュールによっては、本質的には、重要な毒性の副作用は誘導されなかったことを示している。なぜなら、ＭＸＴ−ＨＩを保有している腫瘍マウスは、有意には体重が減少しなかったからである。図２５Ｂは、２．５ｍｇ／ｋｇの９回の投与がＭＸＴ−ＨＩ腫瘍の増殖を有意に低下させたことを示している。９×１０ｍｇ／ｋｇの投与スケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１０３％のＴ／Ｃ指数を生じ、９×５ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１０３％のＴ／Ｃ指数を生じ、そして９×２．５ｍｇ／ｋｇのスケジュールについてのＴ／Ｃ指数値は、１１９％のＴ／Ｃ指数を生じた。したがって、抽出物Ａは、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＭＸＴ−ＨＩを保有しているマウスの生存性を長くした。
【０１９９】
図２６には、対照群（処置していない）および試験群（抽出物で処置した）において実験の間に死亡したＭＸＴ−ＨＩ乳ガンを保有しているマウスの数を示す。カプラン・マイヤー統計分析を使用して、それぞれの群の９匹のマウスの死亡率を示す。統計値は、生存性に関して対照群の全体的なフィットと比較した、試験群の全体的なフィットを明確に示している。
【０２００】
要するに、上記の実験は、抽出物ＡがＭＸＴ−ＨＩ乳ガンの腫瘍に対して有意な抗腫瘍効果を発揮するという証拠を提供する。
【０２０１】
実施例６の結論
本発明の抽出物Ａは、試験したガンのモデルに対して有意な抗腫瘍効果を有している。これらのモデルは、ガン腫、リンパ腫、および黒色腫を含む組織学的腫瘍型の広い範囲のパネルを示す。これらのモデルは、これらがヒトのガンの特異的な臨床病期を模倣しているので、臨床的に関連している。これとは別に、これらはまた、これらのうちの２つが肝臓に劇的に転移することから、生物学的に侵攻性であり、侵襲性でもある。
【０２０２】
本発明の抽出物Ａは、極めて有意な抗腫瘍効果を有しているが、腫瘍を保有しているマウスが処置の間に体重が減らなかったので、ごくわずかな毒作用しか示さない。したがって、半精製された抽出物は、ここで報告された全ての抗腫瘍活性を担っている抗腫瘍性化合物に加えて、「解毒剤」を含んでいる可能性がある。
【０２０３】
驚くべきことに、抽出物Ａは、低用量、すなわちおよそ１．２５から０．６３ｍｇ／ｋｇで慢性的にアッセイした場合に、高用量、すなわちおよそ１０ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇよりも有意に高い抗腫瘍活性を誘導する。
【実施例７】
【０２０４】
本発明の抽出物の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での毒作用
本実施例は、本発明の抽出物Ａの、特に生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での血液毒性および一般毒性の毒作用を説明する。
【０２０５】
血液毒性
血液毒性を、それぞれの動物種についての血液学的プロフィールを確立することによって評価する。血小板、赤血球、および白血球の数に特に注意を払った。抽出物Ａの効果を、２つの用量、すなわち５ｍｇ／ｋｇと１．２５ｍｇ／ｋｇで、マウスへの腹腔内投与によって評価した。投与スケジュールは、１週間に５回の連続する５週間にわたる投与、結果として全部で２５回の注射であった。動物を、最後の注射の３日後に屠殺した。１群あたり１０匹のマウスとした。
【０２０６】
対照と比較して（図２７）、抽出物Ａでの処置後の血液学的パラメーターに関して統計学的に有意な違いは観察されなかった。処置後の赤血球の平均細胞容積、平均赤血球ヘモグロビン量、および平均赤血球ヘモグロビン濃度、および血小板については、有意な違いは観察されなかった。
【０２０７】
一般毒性
異なる型の器官および組織から得た、ヘマトキシリン−エオシンで染色した組織スライドの従来の組織病理学的分析によって、抽出物Ａの一般毒性をマウスについて試験した。抽出物Ａの効果を、５ｍｇ／ｋｇと１．２５ｍｇ／ｋｇで、腹腔内投与によって評価した。投与スケジュールは、１週間に５回の連続する５週間にわたる投与、結果として全部で２５回の注射であった。動物を、最後の注射の３日後に屠殺した。脳、心臓、肝臓、膵臓、胃、小腸、および卵巣を採取した。１群あたり１０匹のマウスとした。
【０２０８】
採取した器官の試験により、対照（処置していない）群は器官に何ら特定の変化を示さないことが示された。また、処置したマウスにおいても、脳、心臓、肝臓、膵臓、胃、小腸、および卵巣は、５ｍｇ／ｋｇまたは１．２５ｍｇ／ｋｇの用量の抽出物Ａでの処置によっては影響を受けなかった。このことは、抽出物Ａが一般的な毒作用を有していないことを示している。
【実施例８】
【０２０９】
本発明の抽出物の抗毒効果
本実施例は、本発明の抽出物の抗毒効果を説明する。４から５週齢の雌性マウスに、最大耐用量の２倍から４倍の、２つの周知の臨床的に使用されている抗腫瘍薬、アドリアマイシンについては（ＭＴＤ×４）、ビンクリスチンについては（ＭＴＤ×２）を注射した。マウスに、０日目に、４０ｍｇ／ｋｇ体重のアドリアマイシンの１回の腹腔内注射、または２０ｍｇ／ｋｇ体重のビンクリスチンの１回の腹腔内注射をした。図２８のＬｏｔ１は、ビンクリスチンのＭＴＤ×２、またはアドリアマイシンのＭＴＤ×４のいずれかを注射したマウスについての生存曲線を示す。
【０２１０】
本発明の抽出物Ａを、抗腫瘍薬の注射の前に、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で腹腔内注射した。以下の異なるスケジュールを適用した。
−抽出物Ａを、同じ日（すなわち、０日目）に、しかし、治療用化合物であるアドリアマイシンまたはビンクリスチンの注射の４時間前に注射した。この処置の結果を、図２８にロット２で示す。
−抽出物Ａを、治療用化合物であるアドリアマイシンまたはビンクリスチンを注射する日の前の８日間、１日に１回注射した。この処置の結果を、図２８にロット３で示す。
−抽出物Ａを、治療用化合物であるアドリアマイシンまたはビンクリスチンを注射する日の前の８日間、１日に１回注射し、さらに、抗腫瘍薬の注射後７日間、１日に１回注射した。この処置の結果を、図２８にロット４で示す。
【０２１１】
図２８に見ることができるように、抽出物Ａを治療用化合物と組み合わせて使用した全てのスケジュールによって、単一の薬剤としての治療用化合物の注射と比較して、マウスの生存性が有意に伸びた。
【０２１２】
第２の例は、別の投与スケジュールを用いて抽出物Ａの抗毒効果を説明する。マウスに、０日目に２０ｍｇ／ｋｇ体重のビンクリスチンを１回腹腔内注射した。図２９のロット１は、ビンクリスチンを注射したマウスの生存曲線を示す。
【０２１３】
抽出物Ａを、抗腫瘍薬の前に、またはそれと同時に、１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で腹腔内注射した。以下の異なるスケジュールを適用した。
−抽出物Ａを、同じ日（すなわち、０日目）に、しかし、治療用化合物であるビンクリスチンの注射の６時間前に注射した。この処置の結果を、図２９にロット２で示す。
−抽出物Ａを、同じ日（すなわち、０日目）に、しかし、治療用化合物であるビンクリスチンの注射の４時間前に注射した。この処置の結果を、図２９にロット３で示す。
−抽出物Ａを、同じ日（すなわち、０日目）に、しかし、治療用化合物であるビンクリスチンの注射の２時間前に注射した。この処置の結果を、図２９にロット４で示す。
−抽出物Ａを、同じ日（すなわち、０日目）に、治療用化合物であるビンクリスチンの注射と同時に注射した。この処置の結果を、図２９にロット５で示す。
【０２１４】
抗腫瘍薬によって誘導される毒作用に対する防御性、すなわち抽出物Ａの抗毒効果を決定するために適用したパラメーターは、「生存性の延長」から成っていた。統計分析をカプラン・マイヤー統計分析によって行った。有意性のレベルをｐ＜０．０５とした。
【０２１５】
図２９に見ることができるように、抽出物Ａをビンクリスチンの注射の４時間前に注射したスケジュール（ロット３）は、単一の薬剤としての治療用化合物の注射と比較して、マウスの生存性を有意に伸ばした。
【０２１６】
したがって、抽出物Ａは、アドリアマイシンまたはビンクリスチンのような頻繁に使用される致死量の抗腫瘍性化合物の毒作用から、マウスを有意に保護することができると結論付けることができる。したがって、本発明の抽出物Ａは抗毒効果を有しており、これにより、周知の抗腫瘍性化合物の毒作用を減らすことができる。
【０２１７】
第３の例は、抽出物Ｂの抗毒効果を説明する。４から５週齢の雌性マウスに、４種類の周知の臨床的に使用されている抗腫瘍性化合物：アドリアマイシン、ビンクリスチン、オキサリプラチン、およびカンプトテシンを注射した。マウスに、０日目に、２０ｍｇ／ｋｇ体重のアドリアマイシンの１回の腹腔内注射、または２０ｍｇ／ｋｇ体重のビンクリスチンの１回の腹腔内注射、または４０ｍｇ／ｋｇ体重のオキサリプラチンの１回の腹腔内注射、または２０ｍｇ／ｋｇ体重のカンプトテシンの１回の腹腔内注射をした。
【０２１８】
図３０、図３１、図３２、図３３のロット１は、アドリアマイシン、ビンクリスチン、オキサリプラチン、またはカンプトテシンのいずれかを注射したマウスについての生存曲線を示す。
【０２１９】
図３０から図３３のロット２は、１０ｍｇ／ｋｇの抽出物Ｂを注射したマウスについての「生存点」を示す。
【０２２０】
図３０から図３３のロット３は、同じ日（すなわち、０日目）に、しかし治療用化合物の注射の４時間前に１０ｍｇ／ｋｇ体重の抽出物Ｂを腹腔内注射したマウスについての生存曲線を示す。
【０２２１】
図３０から図３３に見ることができるように、治療用化合物と組み合わせて使用した抽出物Ｂは、単一の薬剤としての治療用化合物の注射と比較して、マウスの生存性を有意に伸ばした。抽出物Ｂは、細胞傷害性の性質を示さなかった。実際、単一の薬剤として抽出物Ｂを注射した場合には、死亡したマウスはなかった。統計分析を、カプラン・マイヤー統計分析によって行った。抽出物Ｂと治療用化合物のそれぞれの組み合わせについて、有意性のレベルをｐ＜０．０５とした。
【０２２２】
したがって、抽出物Ｂは頻繁に使用される抗腫瘍薬の致死量の毒作用からマウスを有意に保護すると結論付けることができる。したがって、抽出物Ｂは抗毒効果を有しており、これにより、周知の抗腫瘍薬の毒作用を減らすことができる。抗毒活性は、抽出物Ａと同様に抽出物Ｂにおいて保存されていた。
【０２２３】
第４の例は、抽出物Ｃの抗毒効果を説明する。抽出物Ｃを、２０ｍｇ／ｋｇ体重のアドリアマイシンと組み合わせて使用した。
【０２２４】
図３４のロット１は、２０ｍｇ／ｋｇ体重のアドリアマイシンを注射したマウスについての生存曲線を示す。
【０２２５】
図３４のロット２は、同じ日（すなわち、０日目）に、しかし治療用化合物の注射の４時間前に、１０ｍｇ／ｋｇの抽出物Ｃを注射したマウスの生存曲線を示す。
【０２２６】
図３４に見ることができるように、抽出物Ｃの注射により、単一の薬剤としての治療用化合物の注射と比較して、マウスの生存性の有意な延長が誘導された。したがって、抽出物Ｃは上記抽出物Ｂと同様に抗毒特性を示すと結論付けることができる。
【０２２７】
第５の例は、抽出物Ｄの抗毒効果を説明する。４から５週齢の雌性マウスに、アドリアマイシンを注射した。マウスに、０日目に、２０ｍｇ／ｋｇ体重のアドリアマイシンを１回、腹腔内注射した（図３５のロット１）。図３５のロット２は、同じ日（すなわち、０日目）に、しかし治療用化合物であるアドリアマイシンの注射の４時間前に５ｍｇ／ｋｇ体重の用量の抽出物Ｄを腹腔内注射したマウスについての生存曲線を示す。
【０２２８】
図３５に見ることができるように、抽出物Ｄの注射によって、単一の薬剤としての治療用化合物の注射と比較して、マウスの生存性の有意な延長が誘導された。したがって、抽出物Ｄが、上記抽出物Ｃと同様に抗毒特性を示すと結論付けることができる。
【０２２９】
最後に、これらの実験は、本発明の精製された抽出物が、単一の薬剤として治療用化合物を注射したマウスと比較して、マウスの生存性を有意に伸ばすことを説明している。抽出物Ｄは、最も精製された抽出物であり、抗腫瘍薬によって誘導される毒作用に対して抗毒特性を示した。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】本発明の抽出物の濃度の関数として、種々の型の腫瘍の全体的な増殖を記載する。
【図２】乳ガン細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図３】肉腫細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図４】膵臓ガン細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図５】黒色腫細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図６】結腸ガン細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図７】神経膠腫細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図８】肺ガン細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図９】膀胱ガン細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図１０】前立腺ガン細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図１１】頭頸部ガン細胞株であるヒトのガン細胞株に対する、本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。
【図１２】ヒト細胞株ＨＣＴ−１５に対応する細胞の細胞周期速度に対する本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。図の上段は、種々の用量の抽出物での、対照の細胞に対する、生存しているガン細胞の割合として、全体的な細胞増殖を示す。図の中段および下段は、それぞれ２４時間および７２時間後の、種々の濃度の前記抽出物の細胞周期速度に対する効果を示す。統計学的有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて評価した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１３】ヒト細胞株ＲＰＭＩに対応する細胞の細胞周期速度に対する本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。図の上段は、種々の用量の抽出物での、対照の細胞に対する、生存しているガン細胞の割合として、全体的な細胞増殖を示す。図の中段および下段は、それぞれ２４時間および７２時間後の、種々の濃度の前記抽出物の細胞周期速度に対する効果を示す。統計学的有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて評価した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１４】ヒト細胞株Ａ１７２に対応する細胞の細胞周期速度に対する本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。図の上段は、種々の用量の抽出物での、対照の細胞に対する、生存しているガン細胞の割合として、全体的な細胞増殖を示す。図の中段および下段は、それぞれ２４時間および７２時間後の、種々の濃度の前記抽出物の細胞周期速度に対する効果を示す。統計学的有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて評価した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１５】ヒト細胞株Ｊ８２に対応する細胞の細胞周期速度に対する本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。図の上段は、種々の用量の抽出物での、対照の細胞に対する、生存しているガン細胞の割合として、全体的な細胞増殖を示す。図の中段および下段は、それぞれ２４時間および７２時間後の、種々の濃度の前記抽出物の細胞周期速度に対する効果を示す。統計学的有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて評価した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１６】ヒト細胞株Ｈｓ６８３に対応する細胞の細胞周期速度に対する本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での効果を示す。図の上段は、種々の用量の抽出物での、対照の細胞に対する、生存しているガン細胞の割合として、全体的な細胞増殖を示す。図の中段および下段は、それぞれ２４時間および７２時間後の、種々の濃度の前記抽出物の細胞周期速度に対する効果を示す。統計学的有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて評価した。＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１７】ヒト細胞株ＨＣＴ−１５に対応する細胞に対する本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのアポトーシス誘導効果および壊死誘導効果を示す。図の上段は２４時間後、図の下段は７２時間後の種々の用量での前記抽出物のアポトーシス誘導効果および壊死誘導効果を示す。
【図１８】ヒト細胞株Ａ１７２に対応する細胞に対する本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのアポトーシス誘導効果および壊死誘導効果を示す。図の上段は２４時間後、図の下段は７２時間後の種々の用量での前記抽出物のアポトーシス誘導効果および壊死誘導効果を示す。
【図１９】ヒト細胞株Ｊ８２に対応する細胞に対する本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのアポトーシス誘導効果および壊死誘導効果を示す。図の上段は２４時間後、図の下段は７２時間後の種々の用量での前記抽出物のアポトーシス誘導効果および壊死誘導効果を示す。
【図２０】ヒト細胞株Ｈｓ６８３に対応する細胞に対する本発明の抽出物の生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのアポトーシス誘導効果および壊死誘導効果を示す。図の上段は２４時間後、図の下段は７２時間後の種々の用量での前記抽出物のアポトーシス誘導効果および壊死誘導効果を示す。
【図２１】生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）リンパ腫モデルに対する本発明の抽出物の効果を示す。前記抽出物を、２．５ｍｇ／ｋｇ；５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの抽出物の用量で腹腔内注射によって、Ｐ３８８リンパ腫の腫瘍を有しているマウスに投与した。図２１Ａは、対照（処置していない）マウスおよび処置したマウスの体重に対する前記抽出物の効果を示す。図２１Ｂは、対照マウスおよび処置したマウスにおける腫瘍の増殖に対する前記抽出物の効果を示す。
【図２２】生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）リンパ腫モデルに対する本発明の抽出物の効果を示す。前記抽出物を、０．６３ｍｇ／ｋｇ；１．２５ｍｇ／ｋｇ、および２．５ｍｇ／ｋｇの抽出物の用量で腹腔内注射によって、Ｐ３８８リンパ腫の腫瘍を有しているマウスに投与した。図２２Ａは、対照マウスおよび処置したマウスの体重に対する前記抽出物の効果を示す。図２２Ｂは、対照マウスおよび処置したマウスにおける腫瘍の増殖に対する前記抽出物の効果を示す。
【図２３】生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）黒色腫モデルに対する本発明の抽出物の効果を示す。前記抽出物を、２．５ｍｇ／ｋｇ；１．２５ｍｇ／ｋｇ、および０．６３ｍｇ／ｋｇの抽出物の用量で腹腔内注射によって、Ｂ１６−黒色腫を有しているマウスに投与した。図２３Ａは、対照（処置していない）マウスおよび処置したマウスの体重に対する前記抽出物の効果を示す。図２３Ｂは、対照マウスおよび処置したマウスにおける腫瘍の増殖に対する前記抽出物の効果を示す。
【図２４】生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）黒色腫モデルに対する本発明の抽出物の効果を示す。前記抽出物を、０．６３ｍｇ／ｋｇ；１．２５ｍｇ／ｋｇ、および２．５ｍｇ／ｋｇの抽出物の用量で経口で、Ｂ１６−黒色腫の腫瘍を有しているマウスに投与した。図２４Ａは、対照マウスおよび処置したマウスの体重に対する前記抽出物の効果を示す。図２４Ｂは、対照マウスおよび処置したマウスにおける腫瘍の増殖に対する前記抽出物の効果を示す。
【図２５】生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）乳ガンモデルに対する本発明の抽出物の効果を示す。前記抽出物を、２．５ｍｇ／ｋｇ；５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの抽出物の用量で腹腔内注射によって、ＭＸＴ−ＨＩ乳ガンを有しているマウスに投与した。図２５Ａは、対照（処置していない）マウスおよび処置したマウスの体重に対する前記抽出物の効果を示す。図２５Ｂは、対照マウスおよび処置したマウスにおける腫瘍の増殖に対する前記抽出物の効果を示す。
【図２６】試験群（すなわち、２．５ｍｇ／ｋｇ；５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの抽出物用量でのマウスの腹腔内注射）および対照群のＭＸＴ−ＨＩ乳ガンを有しているマウスについての統計学的な一般的適合を、生存性に関して（カプラン・マイヤー統計分析）示す。
【図２７】対照マウスと比較して、腹腔内注射の３日後のマウスにおける白血球、赤血球、ヘモグロビンの量、およびヘマトクリット濃度に対する、５ｍｇ／ｋｇおよび１．２５ｍｇ／ｋｇの用量での本発明の抽出物の効果を示す（図中、「白いバー」についての抽出物用量は１．２５ｍｇ／ｋｇである）。
【図２８】抗腫瘍性化合物アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、またはビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、またはカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と組み合わせた場合の、本発明の抽出物の抗毒効果を示す。
【図２９】抗腫瘍性化合物アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、またはビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、またはカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と組み合わせた場合の、本発明の抽出物の抗毒効果を示す。
【図３０】抗腫瘍性化合物アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、またはビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、またはカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と組み合わせた場合の、本発明の抽出物の抗毒効果を示す。
【図３１】抗腫瘍性化合物アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、またはビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、またはカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と組み合わせた場合の、本発明の抽出物の抗毒効果を示す。
【図３２】抗腫瘍性化合物アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、またはビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、またはカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と組み合わせた場合の、本発明の抽出物の抗毒効果を示す。
【図３３】抗腫瘍性化合物アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、またはビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、またはカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と組み合わせた場合の、本発明の抽出物の抗毒効果を示す。
【図３４】抗腫瘍性化合物アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、またはビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、またはカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と組み合わせた場合の、本発明の抽出物の抗毒効果を示す。
【図３５】抗腫瘍性化合物アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、またはビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、またはカンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、またはオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）と組み合わせた場合の、本発明の抽出物の抗毒効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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