(57)【要約】本発明は、細胞の脱分化及び組織再生をイン・ビトロ及びイン・ビボで誘導する方法及び組成物に向けられている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物組織を再生させる方法であって、
分化した哺乳動物細胞を、それらを脱分化、再生又は両方を誘導することのできる組成物と接触させることにより、脱分化させることを含み、
脱分化後に、それらの哺乳動物細胞が、再分化した又は新たに分化した哺乳動物細胞へと増殖し、再分化することができることを特徴とする、上記の方法。
【請求項２】
脱分化させた哺乳動物細胞を、その後、増殖させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脱分化させた哺乳動物細胞に由来する哺乳動物細胞、組織又は臓器を再生させることを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
脱分化を、イン・ビボで行う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
脱分化を、エキソ・ビボで行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
脱分化が、哺乳動物細胞を脱分化を誘導することのできる組成物と、脱分化を誘導するのに十分な時間にわたって接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
脱分化を、損傷部位で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
損傷が、病気又は外傷により引き起こされた、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
接触が、組成物を損傷部位に注入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
接触が、組成物を全身に注入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
接触が、組成物を、損傷部位に局所的に適用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
接触が、送達用デバイスを移植することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物細胞を、筋肉、皮膚、骨、関節、眼、肺、心臓、脈管構造、腎臓、膵臓又は神経組織から単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物細胞が、筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
組成物が、繊維芽細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子レセプター、骨形成ポリペプチド、骨形成ポリペプチドレセプター、Ｗｎｔポリペプチド、メタロプロテイナーゼポリペプチド、ｍｓｘ１、ｍｓｘ２、Ｅ２Ｆ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＳＭＡＤポリペプチド又は脂肪酸結合ポリペプチドである活性ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
活性ポリペプチドが、融合ポリペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
融合ポリペプチドが、活性ポリペプチド及び前記の細胞への取り込みを促進するポリペプチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が、活性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その活性ポリペプチドが、繊維芽細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子レセプター、骨形成ポリペプチド、骨形成ポリペプチドレセプター、Ｗｎｔポリペプチド、メタロプロテイナーゼポリペプチド、ｍｓｘ１、ｍｓｘ２、Ｅ２Ｆ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＳＭＡＤポリペプチド又は脂肪酸結合ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドが、操作可能にプロモーターに結合されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドが、ベクターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
活性ポリペプチドが、ｍｓｘ−１である、請求項１５又は１８に記載の方法。
【請求項２３】
活性ポリペプチドが、繊維芽細胞成長因子である、請求項１５又は１８に記載の方法。
【請求項２４】
２以上の活性ポリペプチドを含む、請求項１５又は１８に記載の方法。
【請求項２５】
３以上の活性ポリペプチドを含む、請求項１５又は１８に記載の方法。
【請求項２６】
キャリアー及び、繊維芽細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子レセプター、骨形成ポリペプチド、骨形成ポリペプチドレセプター、Ｗｎｔポリペプチド、メタロプロテイナーゼポリペプチド、ｍｓｘ１、ｍｓｘ２、Ｅ２Ｆ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ、ＳＭＡＤポリペプチド又は脂肪酸結合ポリペプチドであるポリペプチドを含む組成物であって、
哺乳動物細胞を脱分化させる当該組成物。
【請求項２７】
分化した哺乳動物細胞を、それらを動物の再生部位からの抽出物を含む組成物と、その組成物又は抽出物が脱分化、再生又は両方を誘導するように接触させることにより脱分化させることを含む方法であって、
脱分化後に、それらの哺乳動物細胞が増殖することができて、再分化した哺乳動物細胞を再生することができる当該方法。
【請求項２８】
脱分化した哺乳動物細胞のその後の増殖を更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
脱分化細胞からの、哺乳動物細胞、組織又は臓器の再生を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
脱分化をイン・ビボで行う、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
脱分化をエキス・ビボで行う、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
キャリアー及び動物の再生部位からの抽出物を含む組成物であって、その抽出物が、分化した哺乳動物細胞を脱分化させる当該組成物。
【請求項３３】
哺乳動物細胞の脱分化を誘導するポリペプチドを同定する方法であって、下記
動物の再生部位からの細胞を抽出し、
その抽出物の成分を精製し、
その精製した成分を哺乳動物細胞に適用し、
その哺乳動物細胞の脱分化の量を観察し、そして
得られた脱分化の量を、哺乳動物細胞をイモリの再生部位からの抽出物と接触させることにより達成された脱分化の量と比較する
ことを含み、同等以上の脱分化活性が、そのポリペプチドの脱分化、再生又は両方を誘導する能力を示す、上記の方法。
【請求項３４】
下記、
マトリクス、及び
動物の再生部位からの抽出物
を含む膏薬であって、この抽出物が、分化した哺乳動物細胞を脱分化させる当該膏薬。
【請求項３５】
抽出物が、有尾目両生類、硬骨魚類、棘皮動物及び甲殻類からの抽出物である、請求項１、２６、２７、３２、３３又は３４に記載の発明。
【請求項３６】
抽出物が、イモリからの抽出物である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抽出物を、ヒト化してある、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
分化した筋管細胞を、それらをイモリの肢の再生部位からの抽出物を含む組成物と、その組成物が脱分化、再生又は両方を誘導するように接触させることによって脱分化させることを含む方法。
【請求項３９】
前記の筋管細胞が、マウスの細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記の筋管細胞が、Ｃ２Ｃ１２細胞である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記の筋管細胞が、イモリの細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記の細胞が、イン・ビトロで培養した細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記の脱分化後に、筋管細胞を増殖させる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
分化した筋管細胞を、それらの細胞をｍｓｘ１ポリヌクレオチドを含む組成物と接触させることによって脱分化させることを含む方法。
【請求項４５】
前記のｍｓｘ１ポリヌクレオチドを誘導性プロモーターに操作可能に結合する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記の筋管細胞が、マウスの細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記の筋管細胞が、イン・ビトロで培養したものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記の脱分化後に、筋管細胞を増殖させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記の細胞が、多能性である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
損傷部位における再生芽形成を、その損傷部位を繊維芽細胞成長因子を含む組成物と接触させることによって誘導することを含む方法。
【請求項５１】
前記の繊維芽細胞成長因子が、創傷繊維芽細胞成長因子である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
損傷部位における再生芽形成を、該部位を繊維芽細胞成長因子レセプターのインヒビターと接触させることにより阻止することを含む方法。
【請求項５３】
前記のインヒビターが、ＳＵ５４０２である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記の損傷が、ゼブラフィッシュの損傷である、請求項５０又は５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記の損傷が、外傷又は病気により招かれたものである、請求項５０又は５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、細胞の脱分化及び組織の再生を促進する組成物を志向する。それは又、細胞の脱分化、増殖及び再生の方法をも志向する。
【０００２】
Ｍｏｒｇａｎ（Ｍｏｒｇａｎ、１９０１）は、用語真再生を造り出して、細胞増殖が新たな解剖学的構造の発生に先行する再生過程に言及した。成体の有尾目の両生類例えばイモリ又はアホロートルは、その四肢、尾、上顎及び下顎、網膜、眼のレンズ、背部の突起（ｃｒｅｓｔ）、脊髄及び心臓の心室を再生することができることが知られている（Ｂｅｃｋｅｒ等、１９７４；Ｂｒｏｃｋｅｓ、１９９７；Ｄａｖｉｓ等、１９９０）が、硬骨魚類例えばＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ（ゼブラフィッシュ）は、ひれ及び脊髄を再生させることが知られている（Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＷｅｓｔｏｎ、１９９５；Ｚｏｔｔｏｌｉ等、１９９４）。棘皮動物及び甲殻類が再生できることはありそうなことである。肝臓を除けば、哺乳動物例えばヒトは、この著しい再生能力を欠いている。
【０００３】
哺乳動物は、典型的には、損傷を（外傷からのものであっても、退行性疾患によるものであっても）、失われた組織を瘢痕組織で置き換えることにより治癒する。傷の治癒（組織の再生とは異なる）は、瘢痕組織を生じるが、これは、組織の保全性と強度の性質を除いては、それが置き換わった細胞型の特定の機能を何ら有しない。例えば、心臓の損傷（心臓発作によるものなど）は、心筋死を生じる。新しい心筋が、死んだ細胞に置き換わるのではなく、瘢痕組織が形成される。今や失われた細胞によりかつて担われていた収縮の負担が、周辺領域に移り、そうして、存在している細胞の作業負荷が増大する。最適な心臓の動作のためには、死んだ組織は心臓の細胞により置き換わることが必要である。
【０００４】
真再生性の再生を制御する分子的及び細胞機構は、不完全に定義されている。この過程における第一段階は、傷の上皮の形成であり、これは、切断後の最初の２４時間以内に起きる。第二段階は、切断面に近い細胞の脱分化を含む。これらの細胞は、増殖して、再生芽として知られる多能性細胞塊を形成し、これは、最終的に再分化して失われた構造を形成する。細胞の脱分化がイモリにおいて示されているにもかかわらず、最終分化した哺乳動物細胞は、分化過程を逆行できないと考えられている（Ａｎｄｒｅｓ及びＷａｌｓｈ、１９９６；Ｗａｌｓｈ及びＰｅｒｌｍａｎ、１９９７）。幾つかの機構が、哺乳動物細胞における細胞可塑性の欠如を説明できよう：（１）脱分化を開始する細胞外因子が切断後に十分発現されない；（２）脱分化のための固有の細胞性シグナリング経路が存在しない；（３）分化因子が、哺乳動物細胞において不可逆的に発現される；及び（４）哺乳動物細胞の構造的特徴が、脱分化を不可能にする。
【０００５】
分化しても、イモリの筋管は、Ｇ０／Ｇ１状態に固定されておらず（Ｈａｙ及びＦｉｓｃｈｍａｎ、１９６１；Ｔａｎａｋａ等、１９９７）、従って、脱分化することができる。対照的に、哺乳動物の骨格筋細胞は、最終分化していると考えられている（Ａｎｄｒｅｓ及びＷａｌｓｈ、１９９６；Ｗａｌｓｈ及びＰｅｒｌｍａｎ、１９９７）。正常な（トランスフォームされおらず、腫瘍形成性でない）哺乳動物の筋管は、細胞周期に再び入るか脱分化することが、イン・ビトロでもイン・ビボでも認められていない。対照的に、腫瘍形成性の哺乳動物細胞は、細胞周期に再入して増殖することが認められている（Ｅｎｄｏ及びＮａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ、１９８９；Ｅｎｄｏ及びＮａｄａｌ−Ｇｉｎａｒｄ、１９９８；Ｉｕｊｖｉｄｉｎ等、１９９０；Ｎｏｖｉｔｃｈ等、１９９６；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等、１９９４；Ｔｉａｉｎｅｎ等、１９９６）。しかしながら、これらの細胞は、異常であり、再生に参加することはできない。腫瘍形成性でない哺乳動物細胞を脱分化させる能力は、長い間求められてきたゴールであり、それを本発明が達成するものである。
【０００６】
失われた組織、器官及び付属肢の代用となる人工臓器、臓器移植、プロテーゼ及び他の手段が、これらの問題に苦しむ多くの人々の生活の質を改善してきたが、これらの方法のすべては、合併症と高いコストに悩まされている。例えば、組織及び臓器移植を受けるだけ十分に幸運な者には、移植物を生かしておくために高価な抗拒絶薬を投与しなければならない。それらの高価なことに加えて、プロテーゼは、失われた付属肢の完全な機能に取って代わることはできないという欠点を有する。
【０００７】
加えて、現在のバイオが媒介する組織及び器官の置換技術は又、重大な不都合をも被っている。ティシューエンジニアリングは、細胞を生体材料基材上でイン・ビトロで培養してから個体（哺乳動物、好ましくはヒト患者）に移植することによって組織を置き換えるアプローチであるが、コスト、時間に妨げられており、その結果は、それが置き換わった組織の固有の機能と形態のすべてを有してはいない構造である。同じ様に、エキス・ビボで幹細胞を利用するアプローチは、同様に、時間に妨げられており、該アプローチでは、幹細胞を骨髄又は中絶胎児から精製しなければならず（限られた起源と取り締まり的抵抗の代表でもある）、イン・ビトロで操作してから、それらの細胞を個体の損傷部位に導入しなければならない。
【０００８】
本発明は、エキス・ビボ及びイン・ビトロのアプローチを回避し、並びに宿主の組織に似た組織の再生を可能にする。再生は、損傷部位での、細胞のイン・ビボでの脱分化、幹細胞の生成、及びその後の幹細胞の、宿主組織又は臓器の細胞及び構造への再分化又は新たな分化によって起きる。かかるアプローチは、広範囲の応用を有している。
【０００９】
発明の簡単な概要
この発明は、細胞をイン・ビボ及びイン・ビトロで脱分化させるための組成物及び方法を提供する。この発明は又、細胞、組織及び器官をイン・ビボ及びイン・ビトロで再生させるための組成物及び方法をも提供する。本発明者は、今般、イモリの抽出物並びにそれから精製した化合物を用いて、この目的及び他の本願で議論する目的を達成することができるということを発見した。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞を脱分化させるための方法及び組成物を提供する。分化の運命が決定されていると以前に考えられたにもかかわらず、分化した細胞は、脱分化させることができる。ある具体例においては、この発明の組成物は、ポリペプチド、核酸又はそれらの組合せを含むが、これらに限られない。脱分化は、イン・ビトロ、イン・ビボ及びエキス・ビボで達成することができる。
【００１１】
再生用抽出物（ＲＥ；再生する任意の動物好ましくはイモリの抽出物をいい、最も好ましくはＲＮＬＥ、ｈＲＮＬＥ及びＲＮＬＥ精製成分をいう）、成長因子（ＧＦ）、及びｍｓｘ１は、集合的に、再生／脱分化因子又はＲＤＦと呼ばれる。
【００１２】
Ｉ．具体例
以下の具体例を、この発明を実施する様々な方法の例として与える。多くの異なるバージョンが、直ちに、この発明の属する様々な分野の当業者には明らかとなろう。
【００１３】
Ａ．イン・ビボ
この発明の組成物は、細胞を脱分化させるために、イン・ビボで用いることができる。外傷によるものでも病気によるものであっても、損傷の部位での細胞の脱分化は、細胞、組織及び器官の再生の初期のステップである。この発明の方法及び組成物により脱分化された細胞は、幹細胞に似るように発生経路を後戻りして、多能性になり、全能性にさえなった。
【００１４】
再生中のイモリの肢の抽出物（ＲＮＬＥ）又はその精製した因子を、損傷部位に、損傷後のある時点で又は損傷後速やかに適用する。幾つかの場合には、これらの組成物は、損傷に、瘢痕組織による治癒の後に適用することができ；かかる事例では、その組織を再損傷して細胞の脱分化を再開させることが望ましい。幾つかの場合には、これらの組成物の様々な成分を、順次的に適用して脱分化を増進させることができる。ＲＥは、製薬分野で公知の任意の方法によって、損傷部位に送達することができ；適用は、連続的でも、瞬間的でもよく、又は脱分化中に時間経過に伴って再度適用してもよい。ＲＥは、障害を受けた細胞、組織又は器官を再生させるために利用することができる。
【００１５】
成長因子（ＧＦ）も又、損傷部位に適用して、細胞の脱分化を誘導することができる。ときには、一種類の成長因子のみを適用することができ；又は一度に幾つかを適用するのが一層有利でありえよう。ＧＦは、損傷時に、損傷の後であるが瘢痕組織形成の開始前に；又は損傷が治癒した後に（この場合には、傷害を受けた組織又は瘢痕組織を除去して、損傷をデ・ノボで負わせてから成長因子を適用する）、損傷部位に適用することができる。ＧＦは、製薬分野で公知の任意の方法にて送達することができ；適用は、連続的でも、瞬間的でもよく、又は脱分化中に時間経過と共に再度適用することができる。損傷は、病気により又は外傷により引き起こされるものであってよい。繊維芽細胞成長因子（Ｆｇｆ）のファミリー由来のＧＦが、幾つかの事例においては、好適である。ＧＦを用いて、傷害を受けた細胞、組織又は器官を再生させることができる。
【００１６】
細胞内成分もまた、イン・ビボで損傷部位に適用して、細胞を脱分化させることができる（例えば、遺伝子ｍｓｘ１、そのポリペプチド産物又は、細胞による取り込みが誘導されるようにしたｍｓｘ１ポリペプチド融合体）。Ｍｓｘ１を、損傷時に、損傷後であるが瘢痕組織形成の前に、又は治癒した損傷部位に適用することができる（最後の事例では、組織を再損傷させてからｍｓｘ１を適用することができる）。Ｍｓｘ１は、製薬分野で公知の任意の方法にて適用することができ；適用は、連続的でも、瞬間的でもよく、又は脱分化中に時間経過に伴って再度適用することができる。この損傷は、病気によるものであっても外傷によるものであってもよい。Ｍｓｘ１は、傷害を受けた細胞、組織又は器官を再生させるために利用することができる。
【００１７】
幾つかの事例においては、ＲＥ、ＧＦ及びｍｓｘ１の組み合わせが、好適である。他の事例においては、様々な成分のシーケンスが有利であり；例えば、ＲＥの適用が先ず望ましく、その後、ＧＦ及び／又はｍｓｘ１を適用する。
【００１８】
Ｂ．エキス・ビボ／イン・ビトロ
病気又は外傷により生じた損傷を修復するために、この発明の組成物及び方法を、分化した細胞を損傷した患者から取り出し、培養にて脱分化させ、次いで、冒された個体の損傷部位に導入するか又は、培養したままで、脱分化した細胞を操作して特定の分化経路に従わせてからその個体に再導入する手順に適用することができる。分化経路は、含脂肪細胞、軟骨細胞、骨形成原細胞及び筋細胞を含むが、これらに限られない。
【００１９】
細胞は、所望の細胞の位置に適当である医療分野で公知の任意の方法によって患者から取り出すことができる。次いで、細胞をイン・ビトロで培養し、そこでそれらを、この発明の任意の方法及び組成物（ＲＤＦの成分を適用することを含む）を利用して脱分化させることができる。この分野で公知の任意の細胞培養法を利用することができ、もし公知でなければ、当業者は、容易に適当な培養条件を決定することができる。所望であれば、これらの細胞を、拡張してから、冒された個体の損傷部位に再導入することができる。損傷は、新しいものでも、瘢痕組織の形成過程にあっても、又は治癒したものであってもよい。最後の事例では、損傷部位を、再度損傷させて再生に有利な環境を造ることができる。これらの細胞は、医療分野で公知で且つ損傷の位置に適当であって送達すべき細胞に適当である任意の方法によって損傷部位に送達することができる。
【００２０】
Ｃ．特定の具体例
１．再生中のイモリの肢の抽出物を利用する細胞の脱分化
イモリの肢の再生の脱分化ステージ中に、分裂した筋細胞の生成物は、切断面近くで、再生芽の形成に有意に寄与する。脱分化した筋細胞は、細胞周期に再入して活発にタンパク質を合成する（すべて、切断後の第一週中）。筋芽細胞は、単核の骨格筋細胞であって、成長因子の存在下で培養すると増殖する。これらの細胞は、筋肉調節因子ｍｙｏＤ及び／又はｍｙｆ−５の発現によって筋原性系列に決定される。集密的にまで成長して成長因子を奪われたならば、これらの筋細胞は、最終分化経路に入って、継続的に幾つかの筋分化因子を発現し始める。これらには、ミオゲニン、ｃｄｋインヒビターｐ２１／ＷＡＦ１、活性化網膜芽細胞腫タンパク質及び筋収縮タンパク質（例えば、ミオシン重鎖及びトロポニンＴ）が含まれる。これらの分化しつつある細胞は、それらの軸に沿って整列し、融合して最終分化した筋収縮しうる筋管を形成する。
【００２１】
イモリの再生初期の肢組織（０〜５日目）からのタンパク質抽出物、ＲＮＬＥは、培養において、イモリとマウスの筋管の脱分化を誘導した。従って、哺乳動物（マウス）の筋管は、再生中のイモリの肢から受けた脱分化シグナルに応答して脱分化することができる。従って、本発明は、哺乳動物組織を脱分化させるための組成物であって、イモリの組織から抽出された少なくとも一種のタンパク質を含む当該組成物を提供する。それ故、ＲＮＬＥ抽出物を用いて、例えば、ヒトからの組織を脱分化させることができる。ＲＮＬＥ抽出物は、イン・ビボで適用することができ、又はイン・ビトロで細胞に適用することができる。
【００２２】
２．ｍｓｘ１の細胞を脱分化させるための利用
Ｍｓｘ１は、ホメオボックス含有転写リプレッサーである。Ｍｓｘ１は、初期再生芽において発現され（Ｓｉｍｏｎ等、１９９５）、発生中のマウスの肢におけるその発現は、未分化細胞（ｍｓｘ１が発現する）と分化中の細胞（ｍｓｘ１は発現しない）との間の境界を画定する（Ｈｉｌｌ等、１９８９；Ｒｏｂｅｒｔ等、１９８９；Ｓｉｍｏｎ等、１９９５）。その上、マウス又はヒトのｍｓｘ１の異所的発現は、培養マウス細胞において、イン・ビトロで筋発生を阻害する（Ｓｏｎｇ等、１９９２；Ｗｏｌｏｓｈｉｎ等、１９９５）。
【００２３】
ｍｓｘ１の発現により細胞を脱分化させる方法を提供する。マウスｍｓｘ１のヌクレオチド配列を、表１に与え（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によりコードされるポリペプチドを、表２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に与える。本発明は、成長培地と異所的ｍｓｘ１発現との組合せ効果が、マウスのＣ２Ｃ１２筋管の、増殖する多能性幹細胞への脱分化を引き起こすことができ、該細胞は、軟骨細胞、含脂肪細胞、骨形成原細胞及び筋管を含む種々の細胞型に再分化することができることを示す。従って、最終分化した哺乳動物細胞は、ここで提出するように、それらの対応する有尾目の両生類の細胞と同様に、適当なシグナルでチャレンジされた場合には多能性幹細胞へと脱分化することができる。Ｍｓｘ１及びｍｓｘ１類似体を、例えば、ヒトの細胞にイン・ビボ及びイン・ビトロで適用して、細胞の脱分化を誘導することができる。
【００２４】
【表１】
2004511209.tif 000002
2004511209.tif 000003
【００２５】
【表２】
2004511209.tif 000004
【００２６】
３．繊維芽細胞成長因子の、組織再生を促進するための利用
この発明は、ここで、Ｆｇｆシグナリングが、再生を媒介することができることを示す。Ｆｇｆは、Ｆｇｆレセプター（Ｆｇｆｒ）に結合するが、哺乳動物の傷の治癒及び腫瘍の血管形成に関与し、胚発生において、肢、歯、脳及び心臓の器官形成における誘導及び／又はパターン形成を含む多くの役割を有している。
【００２７】
Ｆｇｆシグナリング経路のメンバーは、再生芽形成中及び伸出ステージにおいて、表皮並びに間充織で発現される。本発明者は、ゼブラフィッシュのひれの再生中のＦｇｆシグナリングの機能を、Ｆｇｆｒ１の特異的な薬理学的阻害剤を用いて試験した。この薬剤の利用は、再生芽細胞の誘導及び維持におけるＦｇｆシグナリングの明確な必要性を示し、再生体のパターニングにおける更なる役割を示唆した。従って、Ｆｇｆ及び類似の因子を用いて、細胞を脱分化させ、ヒトを含む哺乳動物において組織を再生させることができる。
【００２８】
４．幹細胞のイン・ビトロでの生成
一具体例において、この発明は、イン・ビトロで幹細胞を樹立する方法を提供する。かかる幹細胞は、例えば、個体又は組織培養細胞株から提供された細胞から脱分化される。脱分化は、ＲＤＦの成分を適用することにより達成することができる。これらの幹細胞は、次いで、イン・ビトロ操作により、又は個体に再移植することによって、下流の種々の分化経路に向かわせることができる。
【００２９】
他の具体例において、この発明は、多能性細胞をイン・ビトロで樹立する方法を提供する。かかる多能性細胞は、例えば患者から又は組織培養細胞株から提供された細胞から導かれる。多能性は、ＲＤＦ成分を適用して細胞に脱分化を引き起こして多能性特性を獲得することによって達成することができる。かかる細胞を、次いで、イン・ビトロ操作によって下流の種々の分化経路に向かわせてから患者に移植することができ、又は直接患者に移植することによって下流の種々の分化経路に向かわせることができる。
【００３０】
他の具体例において、この発明は、筋肉由来の細胞を、これらの細胞が幹細胞又は多能性細胞に似るように分化させる方法を提供する。他の具体例において、これらの細胞は、含脂肪細胞、軟骨細胞、筋管又は骨芽細胞などの他の分化経路に進ませることができる。
【００３１】
５．ＲＤＦの利用
ＲＥの利用は、損傷した細胞、組織又は器官を再生させる。損傷部位において、ＲＥを適用することができ、イモリにおいて見られる再生におけるステップを繰り返す。同様に、ｍｓｘ１及び／又はＦｇｆを用いて、損傷部位で細胞を脱分化させて、細胞、組織又は器官の再生を促進することができる。例えば、損傷した組織は、哺乳動物のものであってよく；哺乳動物は、ヒトであってよく且つ損傷部位は、外傷又は病気の結果であってよい。
【００３２】
再生療法により恩恵を受けるであろう退行性疾患及び他の医学的状態には、次のものが含まれるが、これらに限られない：アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患、閉塞性血管病、心筋梗塞、拡張型心筋症、心不全、心筋壊死、心臓弁膜症、僧帽弁逸脱、僧帽弁逆流、僧帽弁狭窄、大動脈弁狭窄及び大動脈弁逆流、頚動脈狭窄、大腿動脈狭窄、発作、跛行、及び動脈瘤；癌関連状態、例えば、癌又は癌治療の結果生じた構造的欠陥；癌例えば乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、皮膚癌、脳腫瘍及び尿生殖器癌（これらに限らない）；皮膚疾患例えば乾癬；関節の病気例えば退行性関節疾患、リウマチ様関節炎、関節炎、骨関節症、骨粗鬆症及び強直性脊椎炎；眼に関連する退行変性例えば白内障、網膜及び黄斑変性（例えば、成人発症型黄斑変性）、色素性網膜炎及びシュタルガルト病；耳に関連する退行変性例えば聴力損失；肺関連疾患例えば慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性繊維症、間質性肺疾患、肺気腫；代謝異常例えば糖尿病；尿生殖器障害例えば腎不全及び糸球体腎障害；神経病学的疾患例えば痴呆、アルツハイマー病、血管性痴呆症及び脳卒中；及び内分泌疾患例えば甲状腺機能低下症。最後に、この発明の方法及び組成物に由来する再生療法は、例えば皮膚、骨、関節、眼、首、脊柱及び脳に対する外傷（通常、瘢痕形成を生じる損傷を生じるもの）に非常に有用であり且つ恩恵を与えることができる。
【００３３】
イモリで見られる肢の再生に加えて、イモリのように、哺乳動物の他の構造例えば皮膚、骨、関節、眼（上皮、網膜、レンズ）、肺、心臓、血管及び他の脈管構造、腎臓、膵臓、生殖器及び神経組織（脳卒中、脊髄損傷）は、再生することができることが予測される。
【００３４】
ＩＩ．定義
別途規定しない限り、すべての技術及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味を有する。
【００３５】
ここでは、命名法に関係した Ｄｅｍｅｒｅｃ等、１９６６ の推奨を適合させる。遺伝子（及び関連核酸）とそれらがコードするタンパク質とを区別するために、遺伝子の略号は、イタリックで示し（又は、下線を引き）、タンパク質の略号は、イタリックにしない。従って、ｍｓｘ１又はｍｓｘ１は、ホメオボックスｍｓｈ１様（ｍｓｘ１）ポリペプチドをコードするホメオボックスｍｓｈ１様（ｍｓｘ１）ヌクレオチド配列を指す。
【００３６】
分子に関して「単離された」は、同定され且つその天然環境の成分から分離され且つ／又は回収された分子を意味する。その天然環境の夾雑成分は、診断又は治療用途を邪魔する物質である。
【００３７】
「真再生」は、細胞増殖が、新しい解剖学的構造の発生；失われ又は損傷を受けた部分の再生又は再構成に先行する過程（新生）をいう。再生は、胚発生を繰り返すことができるが、それは、変質形成（一つの分化した細胞型の他の型へのトランスフォーメーション）をも包含することができる。
【００３８】
「全能性」である細胞は、任意の細胞型に分化することができ、そうして、新しい器官を形成し又は生物の任意の部分を再生することのできるものである。
【００３９】
「多能性」細胞は、固定されてない分化経路を有し、従って、様々な特殊なタイプの組織要素（例えば、含脂肪細胞、軟骨細胞、筋細胞又は破骨細胞）に分化することのできるものである。多能性細胞は、それらが他の細胞型に発生することができる点において全能性細胞に似ているが、様々な多能性細胞は、進むことのできる発生経路の数が限られている。
【００４０】
「マーカー」を用いて、細胞の分化状態を測定する。マーカーは、形態学的に又は生化学的（酵素的）に、特定の細胞型に特徴的であり、又はその細胞型により発現される分子に特徴的である。好ましくは、かかるマーカーは、タンパク質であり、一層好ましくは、当分野で利用可能な抗体その他の結合性分子に対するエピトープを有する。しかしながら、マーカーは、細胞中で見出される、タンパク質（ペプチド及びポリペプチド）、脂質、多糖類、核酸及びステロイドを含む任意の分子からなってよい（これらに限られない）。
【００４１】
マーカーは、当業者が利用可能な任意の方法によって検出することができる。マーカー分子上の少なくとも１つのエピトープを認識して結合する抗体（及び、すべての抗体誘導体）に加えて、マーカーは、分析的技術を利用して検出することができ、例えば、タンパク質ドットブロット、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）又は他の任意のタンパク質を分離するゲルシステム及びその後のマーカーの可視化（ウエスタンブロットなど）、ゲル濾過、アフィニティーカラム精製によって；形態学適に、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、マーカー分子と特異的な反応を有する染料（例えば、ルテニウムレッド及び細胞外マトリクス分子）による染色、特異的な形態学的特徴（例えば、上皮における微絨毛の存在、又は移動細胞例えば繊維芽細胞及び間充織における偽足／糸状偽足）により；及び生化学的に、例えば、酵素による生成物又は中間体、又は細胞の全体的組成、例えばタンパク質の脂質に対する比、又は脂質の糖質に対する比、又は２つの特定の脂質の相互の比又は多糖類に対する比をアッセイすることによって検出することができる。核酸マーカーの場合には、任意の公知の方法を利用することができる。かかるマーカーが核酸であれば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、イン・シトゥーハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、サザーンブロットなどを、適当な検出方法と結合させて利用することができる。
【００４２】
任意の事例において（又は、一層普通に）、マーカーの組合せは、細胞型に対する特異性を示すであろう。例えば、筋原繊維は、単に筋細胞の特徴であり；軸索は、神経組織に所属し、カドヘリンは、上皮に典型的であり、β２−インテグリンは、免疫系の白血球細胞に、そして高脂質含量は、乏突起神経膠細胞に特徴的であり、脂質液滴は、含脂肪細胞に独特のものである。前述の一覧は、非制限的例の提供を意味するものである。
【００４３】
「分化」は、元の細胞型と異なる少なくとも一つの特徴又は機能を獲得し又は有することをいう。分化した細胞は、周囲の構造又は前駆細胞と（たとえ同様の細胞でも）異なる特徴又は機能を有するものである。分化は、限られた細胞のセット（例えば、脊椎動物では、胚の３つの胚葉：外胚葉、中胚葉及び内胚葉）から細胞の多様性を生じさせて、個体を構成する多くの特殊な細胞型のすべてを造り出す。
【００４４】
分化は、細胞が特殊化した表現型を呈するようになる、即ち、他の細胞型と異なる少なくとも一つの特徴又は機能を獲得する発生過程である。殆どの使用において、分化した表現型は、何れかの発生経路の成熟終了点にある細胞表現型をいう。多くの（すべてではない）組織において、分化過程は、細胞周期から出ることと結合しており、幾つかの場合には、それらの細胞は、増殖能を失い又は大幅に制限される。
【００４５】
「脱分化」は、細胞が、発生の時間を「後戻り」して、その先祖の細胞に似る過程をいう。脱分化の例は、負傷して治癒する際に、上皮細胞の特徴が一時的に失われることである。脱分化は、種々の程度に起こりうるものであり：前述の傷の治癒の例では、脱分化は、細胞が認識できる上皮に再分化する少し前まで進んだだけである。大いに脱分化した細胞は、例えば、分化した細胞を生じさせることのできる幹細胞に似ているものである。
【００４６】
「筋細胞」は、それらの主要な役割である収縮により特徴付けられる。筋細胞は、通常、イン・ビボで、伸長して、平行に整列されている。筋細胞の収縮に関係する主要な構成要素は、筋フィラメントである。次の２つの種類の筋フィラメントを区別することができる：（１）主としてアクチンよりなるもの、及び（２）主としてミオシンよりなるもの。アクチンとミオシンは、多くの他の細胞型においても見出され、それらの細胞（又はその部分）が動くことを可能にしているが、筋細胞は、莫大な数の整列された収縮用フィラメントを有していて、それらを利用して機械的仕事を遂行する。
【００４７】
筋組織は、概観と収縮性細胞の配置に基づいて次の２つの主要なクラスに分類することができる：（１）横縞を含む横紋筋、及び（２）横縞を含まない平滑筋。横紋筋は、更に、骨格筋と心筋に細分類することができる。
【００４８】
「骨格筋」組織は、イン・ビボで、平行な横紋筋細胞よりなり、結合組織により包まれている。横紋筋細胞も又、繊維と呼ばれる。骨格筋は、通常、長くて、多核であり、横縞を示す。ときには、それらの繊維に、骨格筋細胞より遥かに小さい外套細胞が結合している。
【００４９】
「心筋」は、骨格筋のように横縞を有する長い繊維よりなる。これらの横縞に加えて、心筋は、骨格筋には存在しない特殊な横縞、横線をも含んでいる。筋繊維が単一の多核原形質単位である骨格筋とはやはり異なって、心筋では、その繊維は、エンド・トゥー・エンドで整列された単核（ときに、二核）細胞からなっている。心筋細胞は、しばしば、網状交差連絡し、多くの大きいミトコンドリアを含んでいる。通常、損傷を受けた心筋は、繊維性の結合組織で置き換わられ、心筋では置き換わられない。
【００５０】
「平滑筋」は、２０〜２００μＭ長の紡錘状細胞よりなり、イン・ビボでは、中央部分で最も太く両端が先細になっている。平滑筋細胞は、ミクロフィラメントを有し、それらは、横紋筋の規則正しい準結晶様式では、配置されていない。これらの細胞は、多くの飲小胞を含み、サクロプラズミック・レティキュラム、隔離カルシウムを有する。平滑筋細胞は、ギャップ結合（又は、ネクサス）を介して互いに接触する。幾らかの平滑筋細胞例えば子宮で見出されるものは分裂することができるが、再生能は、限られており、ダメージを受けた領域は、通常、瘢痕形成により修復される。
【００５１】
他の「収縮性細胞」には、筋線維芽細胞、筋上皮細胞、精巣筋様細胞、神経周膜細胞が含まれる（もっとも、通常、これらは、解剖学的に筋細胞に分類されない）。
【００５２】
「幹細胞」は、娘細胞が他の細胞型に分化しうる任意の前駆細胞をいう。一般に、幹細胞は、大量増殖して、更なる幹細胞を生成すること（自己再生）並びに更に分化した子孫を生成することができる細胞である。従って、単一の幹細胞は、数百万の分化した細胞並びに少数の幹細胞を含むクローンを生成することができる。幹細胞は、それにより、長期間にわたる組織前駆体の継続的増殖を可能にする。哺乳動物造血幹細胞は、骨髄に移動し、その動物の生存期間にわたって、そこに居続ける。同様に、表皮及び精子のように連続的に再生される組織の幹細胞がある。骨格筋の幹細胞などの幾らかの幹細胞は、おそらく、胎児の発生中に存在している（Ｇｉｌｂｅｒｔ、１９９１）。
【００５３】
幹細胞は、非対称的に分裂して、一方の娘細胞は、幹細胞状態を維持し、他方の娘細胞は、幾らか異なる他の特異的機能及び表現型を発現することができる。或は、集団中の幹細胞の幾らかが、対称的に２つの幹細胞に分裂し、そうして、集団中の幾らかの幹細胞は全部維持され、他の細胞は分化した子孫のみにすることができる。外見上、幹細胞として開始した細胞は、分化した表現型に向かって進み、次いで、「逆転」して幹細胞表現型を再発現することが可能である。
【００５４】
奇形癌も又、胎生癌細胞と呼ばれる幹細胞を含んでいる。分裂可能であれば、それらは、消化管及び気道上皮、筋肉、神経、軟骨及び骨を含む広範囲の組織へと分化することができる（Ｇｉｌｂｅｒｔ、１９９１）。
【００５５】
幹細胞と同様に、「前駆細胞」として開始した細胞は、分化した表現型に向かって進むが、次いで、「逆転」して前駆細胞表現型を再発現することができる。前駆細胞は、分化した細胞より一層原始的な細胞表現型を有しており；これらの細胞は、発生経路に沿って一層初期のステップにいるか又は完全に分化した細胞より一層初期の発達段階にいる。しばしば、前駆細胞は、有意の又は非常に高い潜在的増殖能力をも有している。前駆細胞は、発生経路に依り及び細胞が発生して分化する環境に依って、多くの異なる分化した細胞型又は単一の分化した細胞型を生じさせることができる。
【００５６】
「増殖」は、細胞分裂による集団中の細胞数の増加（成長）をいう。細胞増殖は、多数のシグナル変換経路の共同作用的活性化から生じ、しばしば成長因子及び有糸分裂誘起物質に応答して生じる。細胞増殖は、細胞が、細胞内又は細胞外シグナルの作用及び細胞増殖をブロックし又はダウンレギュレートする機構から開放された場合にも促進されうる。
【００５７】
「制御配列」は、操作可能に結合されたコード配列の特定の宿主生物における発現を可能にするＤＮＡ配列である。原核生物の制御配列には、プロモーター、オペレーター配列及びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用する。
【００５８】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係に位置された場合には、「操作可能に結合され」ている。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、もしそれが、コード配列の転写に影響を及ぼすならば、該コード配列に操作可能に結合されており、又はリボソーム結合部位は、もしそれが、翻訳を促進するように位置されているならば、コード配列に操作可能に結合されている。一般に、「操作可能に結合された」は、結合されたＤＮＡ配列が隣接していること、及び分泌リーダーの場合には隣接し且つ読み取りフェーズであることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。結合は、慣用の組換えＤＮＡ方法によって達成される。
【００５９】
「単離された核酸」分子は、それが天然において見出される環境から精製され、少なくとも一つの夾雑核酸分子から分離されている。単離されたｍｓｘ１分子は、細胞中に存在している特異的ｍｓｘ１分子から区別される。しかしながら、単離されたｍｓｘ１分子は、通常ｍｓｘ１を発現している細胞に含まれるｍｓｘ１分子を含み、例えば、この核酸分子は、天然の細胞と異なる染色体上の位置にある。
【００６０】
分子が「精製ポリペプチド」である場合には、そのポリペプチドを、（１）シーケネーターを用いて、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るまで、又は（２）非還元条件下若しくは還元条件下でのクーマシーブルー若しくは銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで精製する。単離されたポリペプチドには、遺伝子工学処理された細胞において不均質に発現されたもの、又はイン・ビトロで発現されたものが含まれる（ｍｓｘ１自然環境の少なくとも一つの成分は存在しないので）。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも一つの精製ステップによって調製する。
【００６１】
ポリペプチド又はポリペプチド断片は、ネイティブな又は天然のポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持している。免疫学的活性は、ネイティブなポリペプチドに保持される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力をいい；生物学的活性は、免疫学的活性を除くネイティブなｍｓｘ１により引き起こされる機能（阻害又は刺激機能）をいう。ｍｓｘ１の生物学的活性には、例えば、細胞分化の調節が含まれる。
【００６２】
核酸配列又はアミノ酸配列の「誘導体」は、ネイティブな化合物から、直接、又は改変若しくは部分的置換によって形成される。「類似体」は、ネイティブ化合物に類似する（同じではない）構造を有するが、ある構成成分又は側鎖に関して異なっている核酸配列又はアミノ酸配列である。類似体は、合成のものであっても異なる進化的起源からのものであってもよく、野生型と比較して類似の又は反対の代謝的活性を有していてよい。同族体は、異なる種に由来する特定の遺伝子の核酸配列又はアミノ酸配列である。
【００６３】
誘導体及び類似体は、上記のような改変された核酸又はアミノ酸を含むならば、完全長であっても完全長でなくてもよい。この発明の核酸又はタンパク質の誘導体又は類似体には、この発明の核酸又はタンパク質に実質的に相同な領域｛様々な具体例において、同じサイズの核酸又はアミノ酸配列上で、又は整列させた配列（整列は、当分野で公知のコンピューターホモロジープログラムによって行う）と比較した場合に、少なくとも約７０％、８０％又は９５％同一性（好ましくは、８０〜９５％同一性）、又はそのコードする核酸は、前述のタンパク質をコードする配列の相補鎖とストリンジェントな、中位にストリンジェントな又は低いストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる｝を含む分子が含まれるが、これらに限られない（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）。
【００６４】
「相同核酸配列」又は「相同アミノ酸配列」又はこれらの変異物は、上記の核酸レベル又はアミノ酸レベルでの相同性により特徴付けられる配列をいう。相同ヌクレオチド配列は、ｍｓｘ１のイソ型をコードする配列をコードする。イソ型は、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織で発現されうる。或は、異なる遺伝子は、イソ型をコードすることができる。相同ヌクレオチド配列には、他の種（脊椎動物、従って、例えば、ヒト、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ及びその他の生物を含むが、これらに限らない）のｍｓｘ１をコードするヌクレオチド配列が含まれる。相同ヌクレオチド配列には、ここに示したヌクレオチド配列の天然のアレル変異物及び変異体も含まれるが、これらに限られない。しかしながら、相同ヌクレオチド配列には、ｈｕｍｍｓｘ１をコードする正確なヌクレオチド配列は含まれない。相同核酸配列には、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の保存的アミノ酸置換体をコードする核酸配列（下記参照）並びにｍｓｘ１の生物学的活性を有するポリペプチドが含まれる。このｍｓｘ１の様々な生物学的活性は、以下に説明する。
【００６５】
「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、開始コドン（ＡＴＧ）を有し且つ３つの「終止」コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡ）の１つで終了するヌクレオチド配列である。しかしながら、この発明では、ＯＲＦは、コード配列の任意の部分であってよく、開始コドン及び終止コドンを含んでも含まなくてもよい。例えば、ｍｓｘ１遺伝子のＯＲＦは、ｍｓｘ１をコードし；好ましくは、ｍｓｘ１ＯＲＦは、ｍｓｘ１の少なくとも５０アミノ酸をコードする。
【００６６】
一般に、「成長因子」は、細胞の成熟及び分化を指示することにより細胞成長及び発生を促進する物質である。成長因子は又、組織の維持及び修復をも媒介する。成長因子は、特異的レセプターに縛られており、非常に低濃度で作用する。
【００６７】
「繊維芽細胞成長因子」（Ｆｇｆ）は、細胞外に放出されて、ヘパリンと結合して二量体を形成し、特異的レセプターチロシンキナーゼ（Ｆｇｆｒ）を活性化する短いポリペプチドの大きいファミリーよりなる成長因子のクラスに属する。Ｆｇｆシグナリングは、哺乳動物の傷の治癒及び腫瘍の血管形成に関与しており（Ｏｒｔｅｇａ等、１９９８；Ｚｅｔｔｅｒ、１９９８）、胚発生において、肢、歯、脳及び心臓の器官形成中の誘導及び／又はパターニングを含む多くの役割を有している（Ｃｒｏｓｓｌｅｙ等、１９９６；Ｍａｒｔｉｎ、１９９８；Ｏｈｕｃｈｉ等、１９９７；Ｐｅｔｅｒｓ及びＢａｌｌｉｎｇ、１９９９；Ｒｅｉｆｅｒｓ等、１９９８；Ｖｏｇｅｌ等、１９９６；Ｚｈｕ等、１９９６）。
【００６８】
Ｆｇｆは、機能的アッセイ（Ｂａｉｒｄ及びＫｌａｇｓｂｒｕｎ、１９９１；Ｍｏｏｄｙ、１９９３）又は抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ニュージャージー又はＰｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン）を用いて、容易に検出することができる。
【００６９】
ポリペプチド又はタンパク質の「成熟」型は、天然のポリペプチド又は前駆体型又はプロタンパク質の産物である。例えば、ｍｓｘ１は、成熟ｍｓｘ１をコードすることができる。天然のポリペプチド、前駆体又はプロタンパク質には、例えば、対応する遺伝子によりコードされる完全長遺伝子産物が含まれる。或は、それは、ここに記載のオープンリーディングフレームによりコードされるポリペプチド、前駆体又はプロタンパク質として定義することができる。産物の「成熟」型は、この細胞内で又はこの遺伝子産物が生じる宿主細胞内で起こりうる少なくとも一つの天然のプロセッシングステップの結果として生じる。かかるポリペプチド又はタンパク質の「成熟」型へ導くプロセッシングステップの例には、オープンリーディングフレームの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の開裂、又はシグナルペプチド若しくはリーダー配列のタンパク質分解性の開裂が含まれる。従って、残基１〜Ｎを有する前駆体ポリペプチド又はタンパク質（残基１は、Ｎ末端メチオニンである）から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残った残基２〜Ｎを有するであろう。或は、残基１〜Ｎを有する前駆体ポリペプチド又はタンパク質（残基１〜ＭのＮ末端シグナル配列は開裂される）から生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜Ｎを有するであろう。更に、ここで用いる場合、ポリペプチド又はタンパク質の「成熟」形態は、タンパク質分解性開裂事象以外の翻訳後修飾ステップから生じうる。かかる付加的過程には、非制限的例として、グリコシル化、ミリストイル化又はリン酸化が含まれる。一般に、成熟ポリペプチド又はタンパク質は、これらの過程の唯一つの働きにより又はそれらの何れかの組合わせによって生じうる。
【００７０】
「活性な」ポリペプチド又はポリペプチド断片は、この発明の天然の（野生型）ポリペプチド（成熟型を含む）の活性に類似する（必ずしも同一ではない）生物学的及び／又は免疫学的活性を保持している。生物学的アッセイ（投与量に依存するか又は依存しない）を用いて活性を測定することができる。ポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする核酸断片は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の一部分を単離し、そのポリペプチドのコードされた部分を発現させて、ｍｓｘ１のコードされた部分の活性をアッセイすることにより調製することができる。免疫学的活性は、ネイティブなｍｓｘ１が有する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力をいい；生物学的活性は、免疫学的加勢を除くネイティブなｍｓｘ１により引き起こされる機能（阻害又は刺激機能）をいう。
【００７１】
ｍｓｘ１に関して、この発明は、更に、遺伝コードの縮重によりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示したヌクレオチド配列と異なり、それ故、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示したヌクレオチド配列によりコードされるのと同じｍｓｘ１をコードする核酸分子の利用を包含する。この発明のために有用な単離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００７２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示したｍｓｘ１配列に加えて、ｍｓｘ１のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多形が、集団内に存在しうる。例えば、個体間のアレル変異は、ｍｓｘ１における遺伝的多形を示すであろう。用語「遺伝子」及び「組換え遺伝子」は、ｍｓｘ１好ましくは脊椎動物のｍｓｘ１をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子をいう。かかる天然のアレル変異は、典型的には、ｍｓｘ１において、１〜５％の変化を生じる。任意の及びすべてのかかるヌクレオチド変異並びにその結果のｍｓｘ１におけるアミノ酸多形（天然のアレル変異の結果であって、ｍｓｘ１の機能的活性を変化させないもの）は、この発明の方法に有用である。
【００７３】
その上、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列と異なるヌクレオチド配列を有する他の種に由来するｍｓｘ１も又、有用である。天然のアレル変異体に対応する核酸分子及びこの発明のｍｓｘ１ｃＤＮＡの同族体を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のｍｓｘ１に対する相同性に基づいて、相同なｍｓｘ１配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするｃＤＮＡ由来のプローブを用いて単離することができる。
【００７４】
「ｍｓｘ１変異型ポリヌクレオチド」又は「ｍｓｘ１変異型核酸配列」は、（１）完全長のネイティブｍｓｘ１、（２）シグナルペプチドを欠く完全長のネイティブｍｓｘ１、（３）ｍｓｘ１の細胞外ドメイン（シグナルペプチドを伴うか又は伴わないもの）、又は（４）完全長ｍｓｘ１の任意の他の断片をコードするヌクレオチド配列との少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する、活性なｍｓｘ１をコードする核酸分子を意味する。通常、ｍｓｘ１変異型ポリヌクレオチドは、完全長のネイティブなｍｓｘ１をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を、一層好ましくは、約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％の核酸配列同一性を、更に一層好ましくは、少なくとも９９％の核酸配列同一性を有するであろう。Ｍｓｘ１変異型ポリヌクレオチドは、シグナルペプチドを欠く完全長のネイティブなｍｓｘ１、ｍｓｘ１の細胞外ドメイン（シグナル配列を伴うか又は伴わないもの）、又は完全長ｍｓｘ１の他の任意の断片をコードすることができる。変異体は、ネイティブなヌクレオチド配列を包含しない。
【００７５】
通常、ｍｓｘ１変異型ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長であり、しばしば、少なくとも約６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、４５０又は６００ヌクレオチド長であり、一層しばしば、少なくとも約９００ヌクレオチド長であるか又はそれ以上である。
【００７６】
ここで同定されたｍｓｘ１をコードする核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要ならばギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後の、関心あるｍｓｘ１配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。核酸配列同一性％を測定する目的でのアラインメントは、当分野の技能内にある様々な方法例えば公衆が利用できるコンピューターソフトウェア例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを利用することによって達成することができる。当業者は、アラインメントの測定のための適当なパラメーターを決定することができる（比較する配列の完全長の最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む）。
【００７７】
ヌクレオチド配列を整列させる場合には、所定の核酸配列Ｃの所定の核酸配列Ｄとの（又は、に対する）核酸配列同一性％｛これは、或は、所定の核酸配列Ｃが所定の核酸配列Ｄと（又は、に対して）ある％の核酸配列同一性を有し又は含むと表すこともできる｝を、下記のように計算することができる：
【数１】
2004511209.tif 000005
（式中、Ｗは、ＣとＤの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムアラインメントにより同一的一致として記録されたヌクレオチド数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である）。
【００７８】
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合には、ＣのＤに対する核酸配列同一性％は、ＤのＣに対する核酸配列同一性％と等しくない。
【００７９】
同族体（即ち、他の種に由来するｍｓｘ１をコードする核酸）又は他の関連配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングのための当業者に周知の方法を利用して、プローブとしてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の特定の配列の全部又は一部分との低い、中位の又は高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションによって得ることができる。
【００８０】
一本鎖ＤＮＡの相補的断片にハイブリダイズする特異性は、反応条件の「ストリンジェンシー」によって測定される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、二本鎖ＤＮＡ形成の傾向が減少するにつれて増大する。核酸ハイブリダイゼーション反応において、ストリンジェンシーは、例えば、ライブラリー由来の完全長クローンを同定するために利用できる特異的ハイブリダイゼーション（高ストリンジェンシー）に有利に選択することができる。一層特異性の低いハイブリダイゼーション（低ストリンジェンシー）を利用して、関連ＤＮＡ分子（相同であるが同一でない分子）又はセグメントを同定することができる（但し正確ではない）。
【００８１】
二本鎖ＤＮＡは、次により安定化される：（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対の種類、（３）反応混合物の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度、及び（５）ある種の有機溶媒例えばホルムアミド（二本鎖ＤＮＡの安定性を減少させる）の存在。一般に、プローブが長いほど、適当なアニーリングに必要とされる温度は高い。一般的アプローチは、温度を変えることであり：一層高い相対的温度は、一層ストリンジェントな反応条件を生じる（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）（これは、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの優れた説明を提供する）。
【００８２】
「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズさせるとは、互いに少なくとも６０％相同であるヌクレオチド配列がハイブリダイズしたままでいるハイブリダイゼーションプロトコールをいう。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特異的配列についての融点（Ｔｍ）より約５℃低く選択する。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡時に、標的配列にハイブリダイズする温度である（規定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度で）。標的配列は、一般に、過剰に存在するので、Ｔｍで、プローブの５０％が、平衡時に、占められる。
【００８３】
（ａ）高ストリンジェンシー
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」条件は、プローブ、プライマー又はオリゴヌクレオチドがその標的配列にのみハイブリダイズすることを可能にする。ストリンジェントな条件は、配列依存性であって、異なるであろう。ストリンジェントな条件は、次を含む：（１）低イオン強度で高温の洗浄液（例えば、１５ｍＭ 塩化ナトリウム、１．５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）；（２）ハイブリダイゼーション中の変性剤（例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ ウシ血清アルブミン、０．１％ フィコール、０．１％ ポリビニルピロリドン、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５；７５０ｍＭ 塩化ナトリウム、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム、４２℃）；又は（３）５０％ ホルムアミド。洗浄液は、典型的には、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳ及び１０％ デキストラン硫酸（４２℃）をも含み、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中での４２℃での洗浄を伴い、その後、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣの高ストリンジェンシー洗浄液（５５℃）で洗浄する。好ましくは、これらの条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％相同な配列が、典型的には、互いにハイブリダイズしたままでいるようにするものである。これらの条件は、例として与えるものであり、制限を意味するものではない。
【００８４】
（ｂ）中ストリンジェンシー
「中位にストリンジェントな条件」は、一層厳しくない洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）を用いて、ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の全体、断片、誘導体又は類似体にハイブリダイズするようにする。一例は、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ中での５５℃でのハイブリダイゼーションとその後の１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中での少なくとも一回の３７℃での洗浄を含む。この温度、イオン強度などは、プローブ長などの実験的因子に適応するように調節することができる。他の中ストリンジェンシー条件は、（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０）に記載されている。
【００８５】
（ｃ）低ストリンジェンシー
「低位にストリンジェントな条件」は、中ストリンジェンシーより一層厳しくない洗浄条件及びハイブリダイゼーション条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）を用いて、ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の全体、断片、誘導体又は類似体とハイブリダイズするようにする。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非制限的例は、３５％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ ＰＶＰ、０．０２％ フィコール、０．２％ ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）デキストラン硫酸（４０℃）中でのハイブリダイゼーションとその後の少なくとも一回の２×ＳＳＣ、２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．１％ ＳＤＳ（５０℃）中での洗浄である。他の低ストリンジェンシー条件例えば種間ハイブリダイゼーションは、（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０；Ｓｈｉｌｏ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１）に記載されている。
【００８６】
ｍｓｘ１の天然のアレル変異体に加えて、コードされるｍｓｘ１のアミノ酸配列にｍｓｘ１機能を変化させない変化を招く突然変異によってＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列に変化を導入することができる。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換へ導くヌクレオチド置換をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列中に作ることができる。「非必須」アミノ酸残基は、ｍｓｘ１の野生型配列からそれらの生物学的活性を変化させることなく変化しうる残基であるが、「必須」アミノ酸残基は、かかる生物学的活性に必要とされる。例えば、ｍｓｘ１中で保存されているアミノ酸残基は、特に変化しにくいと予想される。保存的置換は、当分野において周知である。
【００８７】
有用な保存的置換を、表Ａ「好適な置換」に示す。一のクラスのアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸で置き換える保存的置換は、その置換が化合物の生物学的活性を著しく変えない限り、主題の発明の範囲内にある。もしかかる置換が、生物学的加勢の変化を生じるならば、表Ｂに例示した一層多くの変化を導入して、生成物をｍｓｘ１ポリペプチドの生物学的活性についてスクリーニングする。
【００８８】
【表３】
2004511209.tif 000006
【００８９】
（１）ポリペプチド主鎖例えばβ−シート又はα−ヘリックスの構成、（２）電荷、（３）疎水性、又は（４）標的部位の側鎖の大部分に影響を及ぼす非保存的置換は、ｍｓｘ１ポリペプチドの機能又は免疫学的正体を改変しうる。残基は、表Ｂに示した一般的な側鎖特性に基づいてグループに分けられる。非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスと交換することを伴う。置換は、保存的置換部位に導入することができ、一層好ましくは、非保存的部位に導入することができる。
【００９０】
【表４】
2004511209.tif 000007
【００９１】
変異型ポリペプチドを、当分野で公知の方法例えばオリゴヌクレオチド媒介（位置指定）突然変異導入法、アラニンスキャニング及びＰＣＲ突然変異導入法を利用して作成することができる。位置指定突然変異導入法（Ｃａｒｔｅｒ、１９８６；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、１９８７）、カセット突然変異導入法、制限選択突然変異導入法（Ｗｅｌｌｓ等、１９８５）又は他の公知の技術をクローン化ＤＮＡにおいて実施して、ｍｓｘ１変異型ＤＮＡを生成することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）。
【００９２】
一具体例において、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と約４５％、好ましくは６０％、一層好ましくは７０％、８０％又は９０％、最も好ましくは約９５％相同なアミノ酸配列を含む。
【００９３】
この発明の一面は、例えば単離されたｍｓｘ１及びその生物学的に活性な部分、誘導体、断片、類似体又は同族体の利用である。しかしながら、続く節は、ＲＤＦの全成分に対して適用でき；ｍｓｘ１が、説明目的のための例として用いられる。やはり提供するのは、抗ｍｓｘ１Ａｂを生成するための免疫原として利用するのに適したポリペプチド断片である。一具体例において、ネイティブなｍｓｘ１は、細胞又は組織起源から、標準的なタンパク質精製技術を用いる適当な精製スキームによって単離することができる。他の具体例において、ｍｓｘ１は、組換えＤＮＡ技術によって生成される。組換え発現に対する別法として、ｍｓｘ１を、標準的ペプチド合成技術を用いて化学合成することができる。
【００９４】
（ａ）ｍｓｘ１ポリペプチド
ｍｓｘ１ポリペプチドは、ｍｓｘ１のアミノ酸配列を含み、該配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に与えられている。この発明は又、何れかの残基がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示された対応する残基から変化されているが依然としてｍｓｘ１活性及び生理的機能を保持しているタンパク質をコードする変異体若しくは変異型タンパク質又はその機能的断片をも包含する。
【００９５】
（ｂ）変異型ｍｓｘ１ポリペプチド
一般に、ｍｓｘ１様機能を保っているｍｓｘ１変異体は、配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸によって置換されている任意の変異体を包含し、更に、親の位置の２つの残基間への更なる残基の挿入の可能性並びに親配列からの少なくとも１つの残基の欠失の可能性をも包含する。任意のアミノ酸置換、挿入又は欠失が、この発明に包含される。有利な環境において、この置換は、上記の保存的置換である。
【００９６】
「ｍｓｘ１ポリペプチド変異体」は、少なくとも次を有する活性なｍｓｘ１ポリペプチドを意味する：（１）完全長のネイティブ配列のｍｓｘ１ポリペプチド配列との約８０％アミノ酸配列同一性、（２）シグナルペプチドを欠くｍｓｘ１ポリペプチド配列、（３）ｍｓｘ１ポリペプチドの細胞外ドメイン（シグナルペプチドを伴うか又は伴わないもの）、又は（４）完全長ｍｓｘ１ポリペプチド配列の任意の他の断片。例えば、ｍｓｘ１ポリペプチド変異体は、少なくとも一つのアミノ酸残基が完全長のネイティブなアミノ酸配列のＮ又はＣ末端で付加され又は欠失しているｍｓｘ１ポリペプチドを包含する。ｍｓｘ１ポリペプチド変異体は、完全長のネイティブな配列のｍｓｘ１ポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性を、一層好ましくは少なくとも約８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％のアミノ酸配列同一性を、最も好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ｍｓｘ１ポリペプチド変異体は、シグナルペプチド、ｍｓｘ１ポリペプチド（シグナルペプチドを有するか又は有しないもの）の細胞外ドメイン、又は完全長ｍｓｘ１ポリペプチド配列の任意の他の断片を欠く配列を有しうる。通常、ｍｓｘ１変異型ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長であり、しばしば少なくとも約２０アミノ酸長であり、一層しばしば少なくとも約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００又は３００アミノ酸長又はそれ以上である。
【００９７】
「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、２つの配列を整列させた場合の、開示されたｍｓｘ１中のアミノ酸残基と同一の、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸同一性％を測定するためには、配列を整列させ、必要であれば、ギャップを導入して最大％配列同一性を達成し；保存的置換は、配列同一性部分とは考えない。同一性パーセントを測定するためのアミノ酸配列アラインメント手順は、当業者に周知である。しばしば、市販のコンピューターソフトウェア例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアが、ペプチド配列を整列させるために利用される。当業者は、アラインメントを測定するために、比較する配列の完全長全体にわたっての最大アラインメントを達成するのに必要なアルゴリズムを含む適当なパラメーターを決定することができる。
【００９８】
アミノ酸配列を整列させた場合には、所定のアミノ酸配列Ａの、所定のアミノ酸配列Ｂとの（又は、に対する）アミノ酸配列同一性％｛或は、これは、所定のアミノ酸配列Ａが、所定のアミノ酸配列Ｂと（又は、に対して）ある％のアミノ酸配列同一性を有し又は含むと表すこともできる｝は、下記式により計算することができる：
【数２】
2004511209.tif 000008
（式中、Ｘは、ＡとＢの配列アラインメントプログラム又はアルゴリズムアラインメントにより同一的一致として記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。
【００９９】
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくない。
【０１００】
（ｃ）単離／精製されたポリペプチド
「単離された」又は「精製された」ポリペプチド、タンパク質又は生物学的に活性な断片は、その天然環境の成分から分離され且つ／又は回収される。夾雑成分には、典型的にはこのポリペプチドの診断又は治療用途を邪魔するであろう物質が含まれ、酵素、ホルモン及び他のタンパク質様又は非タンパク質様物質が含まれうる。好ましくは、このポリペプチドは、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度にまで精製する。実質的に単離されたとは、調製物が、乾量で、非ｍｓｘ１夾雑物質を３０％未満、一層好ましくは２０％、１０％未満、最も好ましくは５％未満有することである。単離された、組換えにより生成されたｍｓｘ１又は生物学的に活性な部分は、好ましくは、実質的に、培養培地を含まず、即ち、培養培地は、ｍｓｘ１調製物の容積の２０％未満を、一層好ましくは約１０％未満を、最も好ましくは約５％未満を占める、夾雑物の例には、細胞残骸、培養培地及び、ｍｓｘ１のイン・ビトロ合成中に用いられた及び生成された物質が含まれる。
【０１０１】
（ｄ）生物学的に活性な
ｍｓｘ１の生物学的に活性な部分（又は、タンパク質様の任意のＲＥ成分）には、完全長ｍｓｘ１よりも一層少ないアミノ酸を含み且つｍｓｘ１の活性の少なくとも一つを示すｍｓｘ１のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に十分に相同な又は該配列から誘導されたアミノ酸配列を含むペプチドが含まれる。生物学的に活性な部分は、ネイティブなｍｓｘ１の少なくとも一つの活性を有するドメイン又はモチーフを含む。ｍｓｘ１の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００又はそれより多いアミノ酸残基長であるポリペプチドであってよい。このタンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分を、組換え技術により調製して、ネイティブなｍｓｘ１の機能的活性の少なくとも一つについて評価することができる。
【０１０２】
ｍｓｘ１の生物学的に活性な部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示したアミノ酸配列又は該配列に実質的に相同な配列を有し、且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のタンパク質の機能的活性を保持することができる（自然のアレル変化又は変異によりアミノ酸配列が異なっている）。他の生物学的に活性なｍｓｘ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列と少なくとも４５％相同なアミノ酸配列を含み、且つネイティブなｍｓｘ１の機能的活性を保持することができる。
【０１０３】
（ｅ）キメラ及び融合タンパク質
融合ポリペプチドは、発現研究、細胞局在化、バイオアッセイ、ｍｓｘ１の精製において有用であり、且つこの発明の方法の目的に関して、細胞外適用によるｍｓｘ１の細胞内導入に関して有用である。ｍｓｘ１「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、ｍｓｘ１を非ｍｓｘ１ポリペプチドに融合させて含む。非ｍｓｘ１ポリペプチドは、実質的に、ｍｓｘ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と相同でない。ｍｓｘ１融合タンパク質は、任意の数の生物学的に活性な部分を含む完全なｍｓｘ１の任意の部分を含むことができる。ｍｓｘ１は、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合させることができる。かかる融合タンパク質は、組換えｍｓｘ１の精製を容易にする。ある宿主細胞（例えば、哺乳動物）において、異種性シグナル配列融合物は、ｍｓｘ１発現及び／又は細胞内への取り込みに従順でありうる。例えば、ＨＩＶｔａｔタンパク質の残基を利用して、細胞内への取り込み及び核への送達を促進することができる。更なる典型的な融合物を表Ｃに与える。
【０１０４】
融合タンパク質は、組換え法を利用して容易に造ることができる。ｍｓｘ１をコードする核酸を、イン・フレームで、非ｍｓｘ１をコードする核酸と、ｍｓｘ１のＮＨ２−若しくはＣＯＯ−末端又は内部に融合させることができる。融合遺伝子は又、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む慣用の技術によって合成することもできる。後でアニールさせて再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することのできる２つの連続する遺伝子断片間の相補的オーバーハングを生じさせるアンカープライマーを利用するＰＣＲ（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７）も又、有用である。ｍｓｘ１をインフレームで融合部分にサブクローン化するのを容易にする多くのベクターが市販されている。
【０１０５】
【表５】
2004511209.tif 000009
2004511209.tif 000010
【０１０６】
Ｇ．生化学
抽出物は、最も容易に、その起源とは異なる形態の調製物である。細胞抽出物は、機械的に溶解させた細胞ほどに容易であってよい。かかる調製物は、遠心分離又は濾過によって清澄化して不溶性残骸を除去することができる。
【０１０７】
抽出物は又、溶媒の利用を含む調製物をも包含する。溶媒は、水、洗剤、又は有機化合物（非制限的例）であってよい。抽出物は、殆どの溶媒を除去して濃縮することができ；当業者に一般的な任意の方法（例えば、第二次抽出、ゲル濾過によるサイズ分画法、又は勾配遠心分離法など）を用いて分画することもできる。加えて、抽出物は又、幾つかの成分を保存するために混合物に加えられた物質、例えばタンパク質の寿命を延長するためのプロテアーゼインヒビター又は微生物汚染を防止するためのアジ化ナトリウムをも含むことができる。
【０１０８】
しばしば、細胞又は組織抽出物は、無傷の起源からある成分例えば成長因子、表面タンパク質、核酸、脂質、多糖類などを単離するために調製され、又は一層困難な細胞コンパートメント（ゴルジ体、リソゾーム、核、ミトコンドリア及び葉緑体を含む）を細胞から抽出することができる。
【０１０９】
ＩＩＩ．この発明の実施
Ａ．ＲＮＬＥ抽出物
以下は、本発明のために開発された再生中のイモリの肢の抽出物の調製法を記載する。実施例も参照されたい。以下の手順の多くの変形が、同様の活性を有する抽出物を生成しうることは、当業者には明らかであろう。一般に、この抽出物の活性（実施例参照）の少なくとも一つを有するイモリから生成される任意の抽出物は、本発明者によって企図されるものである。
【０１１０】
しかしながら、再生活性を含む任意の抽出物は、再生する任意の動物例えば有尾目の両生類（イモリ又はアホロートル）及び硬骨魚類例えばＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ（ゼブラフィッシュ）から又は再生中の哺乳動物の肝臓から同様にして調製することができる。かかる抽出物は、少なくとも一つのＲＥの活性を有するであろう。
【０１１１】
例えば、成体のイモリのＮｏｔｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎを、加湿室内に維持する。手術は、麻酔した動物に対して行なう。再生中の肢組織を、次のようにして採取する。前肢を、肘のすぐ近くで切ることにより切断し、軟組織を上げて骨を露出させる。この骨と軟組織を刈り込んで平らな切断表面を生成する。これらのイモリを、スルファメラジン溶液中に一晩置いてから、正常な水環境中に戻す。初期の再生組織（切断後１、３及び５日目）を、肢の傷の上皮に近い０．５〜１．０ｍｍを再切断して、任意の残りの骨を除去することにより集める。再生中でない肢組織は、以前に切断したことのない肢から採取する。組織を前肢の肘に２〜３ｍｍの近いところから採取し、すべての骨を除去する。採取の直後に、すべての組織を液体窒素中で瞬間冷凍して、−８０℃に保存する。
【０１１２】
組織を解凍し、その後のすべての操作を、４℃又は氷上で行なう。６グラムの初期再生組織｛１、３及び５日目由来（各２グラム）｝又は６グラムの再生中でない組織を、別々に、３種類のプロテアーゼインヒビター（例えば、ロイペプチン、アプロチニン及びフェニルメチルスルホニルフルオリド）を含む適当な細胞培養培地中に置く。組織を組織ホモジェナイザー、ハンドホモジェナイザーを用いて破砕し、次いで、短時間超音波処理する。細胞残骸を２回の遠心分離で除去する。不溶性脂質層を吸引し、残りの上清をフィルター滅菌する。次いで、タンパク質含量をアッセイし、この抽出物を−８０℃に保存する。
【０１１３】
Ｂ．ｈＲＮＬＥ；ＲＮＬＥの活性成分の同定
１．導入
この発明は、ＲＮＬＥの少なくとも一つの活性を真似る組成物（これらの活性分子のヒト型を含む）をも包含する。例えば、もしＦｇｆがＲＮＬＥの成分であれば（ありそうなことである；実施例参照）、ヒト型のＦｇｆが、ｈＲＮＬＥ組成物において代用されよう。ＲＮＬＥの「ヒト化」配合物は、ＲＮＬＥ又はＲＮＬＥ様組成物を必要とするヒト患者において免疫応答を刺激するのを回避するのに有利であろう。
【０１１４】
２．生化学的アプローチ
当業者には、如何にして、ＲＮＬＥを出発点として、例えばイモリの肢の再生又は哺乳動物筋管の脱分化の誘導に基づく機能的アッセイを用いて、ｈＲＮＬＥの組成を決定するかは明らかとなろう。ＲＮＬＥの組成物は、分画して、機能的アッセイで試験することができる。たとえ部分的又は僅かな効果であっても活性が見出された場合には、その単離された成分は、活性ＲＮＬＥを構成する候補分子である。各成分は小さい効果を有していても、すべてのＲＮＬＥ精製活性成分の総和は、ＲＮＬＥの効果を真似るであろう。
【０１１５】
３．遺伝学的アプローチ
ＲＮＬＥ中の活性成分を並びに再生における事象の経路及び系列さえも同定するために、遺伝学的システムを利用することができる。この発明は、ゼブラフィッシュの遺伝学的に分析可能な生物のひれの再生がＦｇｆシグナリングを必要とすることを示す。遺伝学的アプローチを用いて、ＲＮＬＥ様活性の原因因子をコードする個々の遺伝子を、マッピング及びクローニングによって同定することができる。一度クローン化されれば、ゼブラフィッシュ遺伝子配列を利用して、ヒトの同族体を、例えばヒトのライブラリーのｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡスクリーニングを利用して同定することができる。同様に、ＢＬＡＳＴ検索及び他のイン・シリコ方法は、同定された遺伝子の幾つかについてかかる実験の必要性を回避することができる。かかる方法において、ｈＲＮＬＥ（又は、選択した生物のＲＮＬＥ）を配合することができる。
【０１１６】
以下は、一つの遺伝学的アプローチを概説するものである。しかしながら、当業者は、変更し又は異なる遺伝学的アプローチを用いて同じゴールに達することができる。例えば、変異遺伝子のホモ接合性が致死を生じる場合には、当業者は、条件的アレル例えば温度感受性アレルを有する変異体を探すことができる。一般に、遺伝学的アプローチは、ゼブラフィッシュなどの適当な生物とスクリーニング又は選択を必要とする（スクリーニングは、多くの所望でない変異体の中の所望の変異体の同定を可能にし；選択は、所望の変異体のみを生じる）。ゼブラフィッシュにおけるひれの再生（実施例参照）は、容易に記録できる可視的スクリーニングとして利用することができる。望ましい変異体は、野生型（ｗｔ）のひれの完全な再生ができない個体、一層大きいがそれ以外は正常なひれを再生する個体、多数のひれを再生する個体、又は異なる身体部分を生じる個体である。
【０１１７】
当業者は、かかるスクリーニングを、先ず遺伝的に限定された（純粋な）魚の集団を、当分野で周知の方法を用いて突然変異導入することにより始めるであろう。突然変異誘発物質は、ＤＮＡ配列に様々な突然変異を引き起こす。化学的突然変異誘発物質例えばＥＭＳ及びＥＮＵは、しばしば、単純な塩基対変化を引き起こす。一層激烈な突然変異誘発物質には、ＵＶ、高速中性子、及びＸ線（塩基対変化と、大小の欠失及び染色体再配列をも引き起こすことができる）が含まれる。当業者は、選択した生物、利用可能な遺伝子マッピング技術、所望の型の突然変異及び安全性を含む因子に基づいて突然変異誘発物質を選択するであろう。
【０１１８】
一度突然変異を起こさせた個体の集団を得たならば、ひれの再生についての最初のスクリーニングをＭ１世代（突然変異誘発後の第一世代）で行って、優性変異（その表現型を発揮するのに１コピーしか必要としない変異遺伝子）を探すことができる。ひれを切断してから、再生能力について、先ず視覚的に、そして必要であれば顕微鏡でスクリーニングする（生きた生物を使用）。遺伝子マッピング及びクローニングの目的のための優性変異は、ｗｔ表現型を劣性マーカーとして用いて調べることができる。
【０１１９】
しかしながら、多くの変異は、ホモ接合の劣性であろう。このＭ１集団を、自家交雑（交配）させて、ホモ接合性遺伝子座をＭ２集団中に達成する。ひれの再生についてのスクリーニングを繰り返す。
【０１２０】
変異個体を分離する場合、しばしば、特に突然変異誘発中に多くの突然変異が誘導されるならば、それらの遺伝的バックグラウンドを「浄化」することが望ましい（当業者は、突然変異の割合を、例えば、変異させた集団を一つの変異につき調べることにより、測定するであろう）。このステップは、一層困難であり、潜在的に仕事を混乱させる潜在的な多遺伝子欠損を排除する。一つの変異体から「バックグラウンド」変異を取り除くためには、それをｗｔ個体と交雑（「戻し交雑」）させる。次いで、その子孫を自家交雑（自殖）させて、Ｆ２世代を変異型表現型の復帰について分析する。変異型表現型が現れた系統は、更なる分析のための優れた候補である。好ましくは、これらの変異体を２回以上戻し交雑する。
【０１２１】
試験で遺伝子数を同定するために、これらの変異体を互いに交雑させて、相補性グループを同定する。相補性は、野生型表現型がすべてのＦ２子孫において見出された場合に生じる。その最も簡単な解釈は、相補性は多くの理由のために少数の例において生じうる（又は、生じえない）という警告を伴って、変異した遺伝子が親と同じ遺伝子ではないということである。もし解釈が生じなければ、この結果は、通常、両親が同じ遺伝子に変異を有することを示している。各解釈グループは、単一の遺伝子を示す。すべての系統は、各解釈グループに維持される。
【０１２２】
変異した遺伝子を、次いで、当業者に周知の技術を用いてマッピングする。マッピングの特性、特に、連鎖マーカーの利用（例えば、形態的であっても又はＤＮＡ多型であっても）は、研究する生物にユニークである。一つのアプローチにおいては、変異型の個体を、「マッピング集団」（遺伝学的に又はクローン化により十分限定された遺伝マーカーを有する）に対して交雑させ、変異型個体を、そのマーカーに対する変異型表現型の連鎖について調べる。他の非常に有用なマッピング集団は、研究している生物の近縁系統（２系統間で、コードＤＮＡ配列の１０ｂｐ中の１ｂｐ、１００ｂｐ中の１ｂｐ、１０００ｂｐ中の１ｂｐ、１０，０００ｂｐ中の１ｂｐが異なる）である。かかる集団は、ＰＣＲベースのマーカーの容易な利用を可能にし、それらは、例外的に容易且つ迅速に記録することができる。
【０１２３】
マッピングがますます微細になった場合には、他の技術を利用して、変異した遺伝子のクローニングを容易にすることができる。例えば、突然変異が起きた領域が公知の配列であれば、候補の遺伝子を同定することができる。かかる遺伝子を、次いで、変異型個体において配列決定して有害な変異（アミノ酸配列の変化又は早すぎる停止コドンを含む）を同定することができる。もしこの領域が未知の配列を有するならば、表現型レスキューによるクローニングを利用することができる。突然変異が起きた領域をｗｔ個体から単離して、一層小さい断片に切って（酵素的に又は物理的力により）、適当な発現ベクター中にサブクローン化してから変異型個体中にトランスフォームすることができる。もしこの変異型表現型をレスキューするならば（即ち、トランスフォームした個体が、スクリーニングアッセイにおいて、ひれを再生するならば）、これは、トランスフォームされたＤＮＡのセグメントが関心ある遺伝子を有することの証拠である。この導入されたＤＮＡを、次いで、周知の方法を用いて配列決定することができる。優性変異の場合には、変異型個体は、そのＤＮＡを提供し、ＤＮＡ断片をｗｔ個体に導入して、変異型表現型を記録する。レスキューは、理想的には、各相補性グループからの少なくとも２つの異なる系統において確認する。加えて、候補遺伝子の位置でのすべてのメンバーの配列決定を行なって、変異遺伝子の様々なアレルを示す各系統で有害な突然変異が起きていることを確認する。しかしながら、注目すべきは、操作可能に結合された領域例えばプロモーター及びエンハンサー並びにスプライス部位内に起きた突然変異であり、これらは、単純な配列決定によっては同定するのが一層困難であろう。当業者は、この問題に如何にアプローチするかを知るであろう。
【０１２４】
一度遺伝子が手に入れば、その配列を利用して、プローブ又はプライマーをデザインして、ヒト（又は、任意の他の生物）の同族体を同定することができる。ヒトのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーは、例外的に有用である。ＰＣＲベースのアプローチは、ヒトのゲノムのテンプレートのみを必要としうる。或は、イン・シリコ実験を行なって、ヒトの同族体を探すことができる（ＢＬＡＳＴ検索など）。ヒトの同族体が、それらを探すプローブとして用いた遺伝子と同様の活性を有することを確認するために、そのヒトの配列を元のスクリーニングからの変異型個体にトランスフォームして、変異型表現型レスキューについて試験することができる。しかしながら、もしそれが失敗したならば、そのヒト配列を発現ベクター中にサブクローン化して、適当な宿主（例えば、大腸菌、ＣＯＳ細胞、又はキイロショウジョウバエＳ２細胞）中にトランスフォームし、イン・ビトロで発現させて収穫してから、例えば、細胞分化アッセイ又は筋管開裂／増殖アッセイ例えば、以下に記載するもの（４（ｅ、ｆ））などに適用することができる。
【０１２５】
４．ｈＲＮＬＥを同定するための差次的遺伝子発現アプローチ
第一部において、細胞柔軟性を調節する候補遺伝子を、両差次的ディスプレー分析を利用することにより及び初期イモリ肢再生体と非再生肢との間のサプレッションサブトラクションｃＤＮＡライブラリーを調製することにより同定することができる。クローン化ｃＤＮＡ断片の差次的発現を、ドットブロットハイブリダイゼーション又はノーザンブロット分析によって確認することができる。選択した候補遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを、イモリの肢の再生ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって生成することができる。かかるｃＤＮＡクローンを、次いで、配列決定して完全長のオープンリーディングフレームを同定することができる。
【０１２６】
第二部において、候補の細胞柔軟性遺伝子の配列をコンピューター化ＢＬＡＳＴ及びモチーフ検索によって分析して、候補のｃＤＮＡが公知の遺伝子の同族体であるか又はそれらが関心ある機能的ドメインを有するかを測定する。肢切断後のアップレギュレーションの程度を、ノーザンブロットのホスホルイメージ分析により評価することができる。候補遺伝子の細胞発現パターンを、再生中のイモリの肢の全載又は組織切片イン・シトゥーハイブリダイゼーションにより測定することができる。顕著なアップレギュレーションを示し及び、通常、成長因子、サイトカイン又は他のリガンド中に見出されるドメインを含む遺伝子が候補であることは、ありそうなことである。関心ある他の遺伝子には、メタロプロテイナーゼ（細胞外マトリクスを分解し、細胞脱分化を助成する酵素）、レセプター（脱分化過程を開始するリガンドと結合することができる）、転写因子（脱分化遺伝子又は下流応答遺伝子の潜在的なレギュレーター）、及び細胞内シグナリング分子（脱分化又は他の再生過程に関与しうる）が含まれる。
【０１２７】
第三部において、候補遺伝子は、細胞脱分化の開始における役割についてアッセイすることができる。一つのアプローチにおいて、候補遺伝子を、哺乳動物発現用ベクター中にクローン化してＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトする。調整培地を、これらのトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から集めて、Ｃ２Ｃ１２筋管を処理するのに使う。これらの筋管を数日にわたって、細胞脱分化の兆候例えば細胞周期への再入、筋肉分化タンパク質のレベルの低下、並びに細胞の分裂及び増殖についてモニターする。２種以上のタンパク質が、細胞脱分化には必要とされうる。それ故、候補遺伝子の組合せを、２種以上の候補遺伝子をＣＯＳ−７細胞に同時トランスフェクトすることにより、又はトランスフェクションから生成した調整培地を種々の候補遺伝子と合せることによってアッセイすることができる。もし特定の候補遺伝子の配列及び発現パターンが、それがコードするタンパク質が、細胞内で、開始シグナルの下流で機能することを示唆するならば、その遺伝子をＣ２Ｃ１２筋管中で異所的に発現させて、その細胞脱分化を誘導する能力を測定することができる。
【０１２８】
（ａ）差次的発現分析の実験的詳細
全ＲＮＡを、３０の再生中のイモリの肢（切断後１、３及び５日目）から抽出する。次いで、再生中でない肢の組織を、同じイモリから、最初の切断の際に集める。同じイモリからの再生中の組織と再生中でない組織の比較は、野生型イモリ集団中に見出される多形による差次的にディスプレーされたｃＤＮＡにおける如何なる偽陽性をも排除するはずである。組織の総容積を評価し、全ＲＮＡを単離する。残留する夾雑ＤＮＡを、このＲＮＡをＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼＩで処理し、試料をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出してからエタノールで沈殿させることにより破壊する。ＲＮＡの濃度及び純度を、２６０ｎｍと２８０ｎｍでの吸光度測定により測定する。ＲＮＡの完全性を、試料を０．１％アガロースゲル上で、０．５Ｍ ホルムアルデヒドの存在下でランすることにより評価する。分解してないＲＮＡだけを差次的ディスプレー分析に用いる。
【０１２９】
差次的ディスプレー分析は、比較する２つの組織内で種々のレベルで発現される遺伝子から生じたＲＮＡ転写物の差次的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅に基づいている。一つのアプローチにおいて、逆転写は、ポリ（Ａ）トラクトに結合して、３’末端で単一ヌクレオチド（Ａ、Ｃ又はＧ）により係留されるアンカープライマーを用いて実施する。その後のＰＣＲ増幅を、３’−アンカープライマー及び８０種類の異なる配列にアニールするようにデザインされた異なるランダムプライマーの１つを用いて行う。それ故、２４０の異なるプライマーセットを用いて、第一鎖ｃＤＮＡ生成物を増幅する。このアプローチは、再生中の及び再生中でないイモリの肢において発現されるすべての転写物の殆ど完全な被覆を与える。差次的ディスプレー分析を、切断後１、３及び５日目に採取した再生中の及び再生中でない組織を用いて行う。増幅生成物を、熱変性させて０．４ｍｍの５％ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で、７０Ｗで、約３時間にわたって分離する。これらのゲルを乾燥させて、Ｋｏｄａｋ のＸ線ＢＭＲフィルムを、１２〜１６時間露出させる。差次的にディスプレーされたｃＤＮＡ断片を生成する反応を、組織の独立のセットから抽出した全ＲＮＡを用いて反復して、差次的ディスプレーパターンを確認する。
【０１３０】
差次的にディスプレーされたｃＤＮＡ断片を、乾燥させたゲルから切り出し、そのゲルを１００μｌのＴＥ（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に置いて、一晩、一定速度で振盪しながら３７℃に加熱することにより溶出する。ワットマンペーパー及びゲル残骸を遠心分離により除去して、ｃＤＮＡ含有上清をＰＣＲ増幅用に保存する。次いで、２つの増幅反応を行う。第一の反応においては、４μｌの未希釈ｃＤＮＡ溶出液をテンプレートとして用い、第二の反応においては、溶出ｃＤＮＡをＴＥ中で１／１０に希釈してから、テンプレートとして用いる。切り出したｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、増幅生成物を１．８％低融点アガロースゲル上で分離する。適当な断片を切り出してゲル精製する。精製した断片をＴ／Ａクローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫなど）に連結し、トランスフォームした細菌コロニーを生育させてプラスミドＤＮＡを単離する。次いで、組換えプラスミドをノーザンブロット用及び配列分析用プローブの作成に利用する。
【０１３１】
ノーザンブロット分析を実施して、差次的にディスプレーされたｃＤＮＡ断片が、再生中の組織と再生中でない組織の間で真に差次的に発現された遺伝子を表すことを確認する。幾つかの差次的に発現された遺伝子は、低レベルで発現されうるし、全ＲＮＡから調製したノーザンを用いて検出されない。それ故、イモリの肢からの単一の選択したポリ（Ａ）ＲＮＡから調製したノーザンを用いて差次的にディスプレーされたｃＤＮＡを利用する。ノーザンブロットは、再生中でない肢及び初期肢再生物のポリ（Ａ）ＲＮＡ（切断後１、３及び５日目）２μｇを隣接するレーンでランすることにより調製する。１０セットの初期肢再生物／再生中でない肢のレーンをランする。ＲＮＡを、０．５Ｍ ホルムアルデヒド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、５ｍＭ 酢酸ナトリウム及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１％アガロースゲル中で８０Ｖでの電気泳動により分離する。このＲＮＡをナイロン膜上にブロットし、その膜にＵＶ架橋して、０．０４％ メチレンブルー（０．５Ｍ 酢酸ナトリウム中）で染色する。このＲＮＡを、ランダムヘキサマープライミング及び３２Ｐ−ｄＣＭＰ取り込み（組換えプラスミドから精製したインサートを使用）により調製したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。差次的発現を、オートラジオグラフィーシグナルの強度をレーン間で比較することにより測定する。ホスホルイメージ分析を実施して、アップ又はダウンレギュレーションのレベルを定量する。３倍以上の転写誘導を示すものは、候補の活性ＲＮＬＥ成分をコード化している。
【０１３２】
（ｂ）サプレッションサブトラクションｃＤＮＡライブラリー実験の詳細
候補の再生及び脱分化遺伝子は又、サプレッションサブトラクションハイブリダイゼーションｃＤＮＡライブラリーを、テスターｃＤＮＡを調製するために初期イモリ肢再生物から単離したＲＮＡ及びドライバーｃＤＮＡを調製するために再生中でないイモリの肢から単離したＲＮＡを用いて生成することによっても同定されうる。サプレッションサブトラクションハイブリダイゼーションは、次の２つの重要な現象に基づいている：（１）過剰なドライバーｃＤＮＡの、テスターｃＤＮＡ集団中に見出される殆どすべての相補的ｃＤＮＡに効果的にハイブリダイズしてユニークなテスター転写物をハイブリダイズしてない一本鎖として残す能力及び（２）同じｃＤＮＡ分子の反対末端に位置する長い逆向き反復の、互いにアニールしてプライマーがアニールした末端に結合するのを防止する能力。
【０１３３】
単一の選択したポリ（Ａ）ＲＮＡを、２００の再生中のイモリの肢（切断後１、３及び５日目）から、及び６００の再生中でない肢から上記のように抽出した全ＲＮＡから単離する。第二ラウンドのポリ（Ａ）選択を、一度選択したポリ（Ａ）ＲＮＡを２回目のオリゴ（ｄＴ）セルロースマトリクスに結合させ、そのセルロースを洗浄して、上記のＲＮＡを溶出させて濃縮することによって実施する。
【０１３４】
第一鎖ｃＤＮＡを、実験用テスター（初期肢再生物）及びドライバー（再生中でない肢）ポリ（Ａ）ＲＮＡの両方から調製する。２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを、４２℃で、１．５時間、ＡＭＶ逆転写酵素を用いて逆転写する。第二鎖ｃＤＮＡ合成を、１６℃で、２時間、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮアーゼＨ及び大腸菌ＤＮＡリガーゼの存在下で実施する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを加えて、試料を、更に３０分間、１６℃でインキュベートする。第二鎖ｃＤＮＡ合成を、ＥＤＴＡ／グリコーゲン混合物の添加により停止させ、これらの試料を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、そしてエタノールで沈殿させる。このｃＤＮＡをｄｄＨ２Ｏに再懸濁させ、ＲｓａＩで消化して、フェノール：クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製する。
【０１３５】
再生中の肢に由来する精製したＲｓａＩ消化したｃＤＮＡを、２つのアリコートに分ける。アダプター１を、これらのアリコートの一方のｃＤＮＡ末端に連結し、アダプター２Ｒを、第二のアリコートのｃＤＮＡ末端に連結する。再生中の肢に由来するアダプターを連結したｃＤＮＡ（アダプター１連結及びアダプター２Ｒ連結ｃＤＮＡ）を、別々に、２つの異なるバイアル中で、再生中でない肢に由来する３０倍過剰のｃＤＮＡ（アダプターを欠くもの）と混合する。これらの試料を、９８℃で、１．５分間変性させてから、６８℃で、６〜１２時間にわたってアニールさせる。これらの２つの再生中の肢に由来する異なるアダプターを含むｃＤＮＡ試料を、次いで、再生中でない肢に由来する新たに変性したｃＤＮＡ（アダプターなし）と一緒に混合し、６８℃で一晩アニールする。この第二ラウンドのハイブリダイゼーション後に、一本鎖５’末端を、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰを用いて充填してから、ハイブリダイズした生成物を両アダプターに特異的なプライマーを用いる２７サイクルの抑制ＰＣＲにかける。これらのＰＣＲ産物を、次いで、希釈し、アダプター１に特異的であるプライマーとアダプター２Ｒに特異的な第二のプライマーを用いるネステッドＰＣＲにかける。これらのステップ中、両端に同じアダプターを有するテンプレートは効率的に増幅されない（何故なら、各テンプレートの２つの末端は、相補的塩基対の長いストレッチを含み、これは、互いにアニールして、標的配列に達するのを妨げるヘアピンループを形成するからである）。増幅されたｃＤＮＡ産物を、次いで、Ｔ／Ａクローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ）中に連結して、主として、初期再生中の肢で優先的に発現されるｃＤＮＡよりなるライブラリーを構築する。同じ手順に従って、再生中でない肢で優先的に発現されるｃＤＮＡのライブラリーを生成することができる。
【０１３６】
たとえこの手順が差次的に発現される遺伝子を富化しても、それは、偽陽性を生じうる。差次的発現を確認するためには、再生中の肢に由来する減算ｃＤＮＡクローンを含むフィルターを、減算した再生中の肢由来の又は減算した再生中でない肢由来の標識ｃＤＮＡでプローブすることによるドットブロット分析を実施する。これら２つのｃＤＮＡでプローブしたときに差次的ハイブリダイゼーションパターンを示すクローンを、ノーザンブロット及びホスホルイメージ分析による差次的発現の確認のために選択する。確認されたクローンのインサートを、次いで、当分野で周知の確立されたプロトコールを用いて配列決定する。
【０１３７】
（ｃ）完全長の差次的に発現されるｃＤＮＡの生成及び配列決定の実験的詳細
下記のプロトコールを用いて、完全長のヒトｃＤＮＡを、ヒトｃＤＮＡライブラリーを利用して同定することができる。ストリンジェンシー条件は、調節する必要がありうる（Ａｕｓｕｂｅｌ、１９８７）。
【０１３８】
完全長ｃＤＮＡクローンを、選択したｃＤＮＡについて、イモリの初期肢再生物ｃＤＮＡライブラリーを、元の差次的にディスプレーしたｃＤＮＡ断片又は減算ｃＤＮＡから作成したプローブを用いてスクリーニングすることによって生成する。プローブを、ランダムヘキサマープライミング及び３２Ｐ−ＣＭＰの取り込みによって標識する。ファージベクター中にクローン化した百万のｃＤＮＡを高密度でプレートし、二連のリフトをナイロン膜上に調製する。これらの膜を、３２Ｐで標識したｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。第二のスクリーニングを、陽性プラークを選択してからそれらを１５０ｍｍプレート当たり３００〜５００プラークの密度で再プレートすることにより実施する。プラークをナイロン膜上にリフトして、特異的ｃＤＮＡプレートとハイブリダイズさせる。第二のスクリーニングから単離した陽性プラークを選択して生育させる。これらのｃＤＮＡインサートをイン・ビボでＲＥ７０４ヘルパーファージを用いてｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド構築物として切り出して、これらのクローンを、５０μｇ／ｍｌ カナマイシンを含む寒天上で選択する。コロニーを選択して、ＬＢ−カナマイシン培養にて生育させて、プラスミドを単離する。これらのクローンを、次いで、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化して、ｃＤＮＡインサートを切り出し、消化物を１％アガロースゲル上で分離してインサートのサイズを測定する。各クローンのインサートのサイズを、ノーザンブロット分析により測定したその対応する転写物のサイズと比較して、そのクローンが完全長のｃＤＮＡを含みうるかどうかを評価する。これらのクローンの末端を配列決定する。もしｃＤＮＡが完全長でないならば、プローブを５’若しくは３’末端又は両方からデザインして（ｃＤＮＡの何れの末端が失われているかによる）、ライブラリーを再度スクリーニングする。この工程を、完全長のオープンリーディングフレームが得られるまで反復する。ライブラリーのスクリーニングによって完全長オープンリーディングフレームを同定することができなかった場合には、５’又は３’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ）を利用して、ｃＤＮＡの失われた部分をクローン化することができる。
【０１３９】
（ｄ）配列分析、アップレギュレーションレベル及び細胞発現パターンに基づく候補の細胞柔軟性遺伝子の選択
差次的に発現されたｃＤＮＡの配列分析　差次的に発現された遺伝子のｃＤＮＡ配列を、ヌクレオチド及びタンパク質ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＧｉｈｓ、１９９６；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９７）により分析する。すべての候補の細胞柔軟性遺伝子が、特定の遺伝子ファミリーに属するものとして認められる訳ではない。これらの新規な遺伝子は、細胞柔軟性において重要な役割を演じうるであろうし；切断後に有意の転写誘導を示すものは、機能について試験する（下記参照）。
【０１４０】
リボプローブ合成　リボプローブを、全載及び組織切片イン・シトゥーハイブリダイゼーション手順で使用する。これらのプローブを、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いて標識する（これは、後で、アルカリホスファターゼと結合させた抗ＤＩＧ抗体を用いて検出することができる）。ｃＤＮＡインサートを含むベクター構築物を、ＢａｍＨＩ（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用のテンプレートとして用いる場合）又はＸｈｏＩ（Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ用のテンプレートとして用いる場合）による消化によって線状化する。リボプローブ合成を、次のように実施する：簡単にいえば、１μｇの線状化ｃＤＮＡ含有ベクターを、ＤＩＧ標識混合物、Ｔ３／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写用緩衝剤、ＲＮアーゼインヒビター、及びＴ３又はＴ７ＲＮＡを含む反応においてテンプレートとして利用する。転写を、３７℃で、２時間にわたって行う。ＤＮＡを、ＤＮアーゼＩの添加によって破壊し、リボプローブを、２つの連続するエタノール沈殿工程により精製する。最終的な精製後に、リボプローブをｄｄＨ２Ｏに再懸濁、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理し、そして濃度及び純度を２６０及び２８０ｎｍでの分光測光により測定する。１％アガロースゲルを１×ＴＥにてランして、リボプローブの存在及び濃度を確認する。
【０１４１】
イモリの肢の粉末の製造　全載イン・シトゥーハイブリダイゼーション手順において、アルカリホスファターゼを結合させた抗ＤＩＧ抗体をブロックするには、イモリの肢の粉末が必要とされる。抗体をブロックするためのイモリの粉末の使用は、抗体のイモリ組織への非特異的結合によるバックグラウンド染色を減じる。切断したイモリの肢を、液体窒素中で瞬間凍結して、イモリの肢の粉末の調製に使用するまで−８０℃に保存する。これらの凍結した肢を液体窒素上で乳鉢と乳棒を用いて粉末に粉砕する。この肢の粉末を４容の氷冷アセトンで処理し、混合して、氷上に３０分間置く。遠心分離後、このアセトンを除去して、試料をアセトンですすぎ、ワットマン紙の紙片に移す（微粉末にする場合）。風乾終了後、この肢粉末を気密性容器内に４℃で保存する。
【０１４２】
全載イン・シトゥーハイブリダイゼーション　初期肢再生体（１〜５日目）での全載イン・シトゥーハイブリダイゼーションを実施して、候補の細胞柔軟性遺伝子の発現パターンを測定する。染色した全載再生体の写真を撮ってから、それらの組織を切片に切る。切片化前の全載の分析は、これらの遺伝子の全体的な発現パターンの評価を可能にし、他方、その組織切片の分析は、特異的な細胞性発現パターンを明らかにする。
【０１４３】
イモリの肢の切断を上記のように実施する。それらの肢を最初の切断から５日以内に再切断して、その組織を直ちに３．７％緩衝パラホルムアルデヒド中で固定する。これらの組織を、０．１％ ツイーン２０を含む燐酸緩衝塩溶液（ＰＢＳＴ）で徹底的に洗浄し、一連のメタノール／ＰＢＳＴ及び溶液で脱水してから、１００％ メタノール中に−２０℃で保存する。組織を、メタノール／ＰＢＳＴ溶液中で再水和してから、ＰＢＳＴ中で３回洗う。これらの試料を、２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫにより、３７℃で、１０、２０又は３０分間処理する。次いで、これらの組織を、ＰＢＳＴで４℃で徹底的に洗って、プロテイナーゼＫ活性を除去し、０．１Ｍ トリエタノールアミン（ｐＨ７．９）中の０．５％ 無水酢酸により１０分間アセチル化する。これらの組織をＰＢＳＴで洗い、４％ パラホルムアルデヒドで２０分間再固定する。これらの試料をＰＢＳＴで徹底的に洗い、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、１００μｇ／ｍｌ ヘパリンナトリウム、１×デンハート溶液、０．１％ ツイーン２０、０．１％ ＣＨＡＰＳ及び５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で洗ってから、回転ハイブリダイゼーションオーブン中で、一晩、６０〜６５℃で、ハイブリダイゼーション溶液中で予備ハイブリダイズする。上記のように調製したリボプローブを９５℃に３０分間加熱して、肢組織に１μｇ／ｍｌの濃度で加える。ハイブリダイゼーションを、４８〜７２時間にわたって、６０〜６５℃で行う。未結合のリボプローブを除去するために、これらの組織をハイブリダイゼーション溶液中で、２０分間、６５℃で洗浄し、次いで、２×ＳＳＣ中で、６５℃で、各２０分ずつ３回洗い、そして０．２×ＳＳＣ中で、６５℃で、各３０分ずつ２回洗う。
【０１４４】
ハイブリダイゼーションプローブを、試料をＭＡＢ（１００ｍＭ マレイン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で洗ってから、ＭＡＢ−Ｂ（２ｍｇ／ｍｌ ＢＡＳを含むＭＡＢ）中で洗うことによって検出する。これらの組織を、抗体ブロッキング溶液（ＭＡＢ−Ｂ中の２０％ 熱不活化ヒツジ血清）で、一晩、４℃で処理する。同時に、アルカリホスファターゼを結合させた抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、ブロッキング溶液中で１：４００に希釈し、１０ｍｇ／ｍｌ イモリ肢粉末と一晩４℃で予備吸着させる。予備吸着後に、このイモリ粉末を遠心分離により除去して、抗体を、ブロッキング溶液中で、１：１０００に希釈（更なる２．５倍希釈）して、これらの組織試料に加える。抗体インキュベーションを一晩４℃で行う。組織を、ＭＡＢで、室温で１０回（各３０分ずつ）洗浄してから、ＡＰ緩衝液（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で２回洗う。これらの組織を、アルカリホスファターゼの基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（１ｍＭ レバミソールを含むＡＰ緩衝液中）中で、１〜６時間、暗黒中でインキュベートする。これらの組織を、ＰＢＳＴ中で数回洗ってから、緩衝された４％ パラホルムアルデヒド中で、一晩、後固定する。試料を、７０％エタノール中で一回洗浄してから、−２０℃でメタノール中に保存する。組織を、１：２のベンジルアルコール：ベンジルベンゾエート溶液（ＢＡＢＢ）中で清浄化する。全載組織を、写真に撮って、この遺伝子の全体的発現を測定する。
【０１４５】
全載イン・シトゥーハイブリダイゼーション及び写真撮影に続いて、それらの細胞発現パターンを、それらの組織をパラフィン中に埋めて１２〜２０μｍのブロックに切片化することにより評価する。組織切片を調べて写真に撮る。
【０１４６】
組織切片のイン・シトゥーハイブリダイゼーション　もし全載手順が、判読するのに弱すぎる発色シグナルを生成するならば、組織切片におけるイン・シトゥーハイブリダイゼーションを行うことができる。切断後に、組織をＯＣＴにて直ちに凍結する。これらの組織を、クリオスタットを１０μｍで用いて切片化し、１時間、４％ パラホルムアルデヒド ＤＥＰＣ−ＰＢＳ中で固定する。これらのスライドを、２×ＳＳＣ（ＤＥＰＣ処理済）中で洗ってから、０．２Ｍ ＨＣｌで８分間処理する。これらの組織を０．１Ｍ トリエタノールアミン（ｐＨ７．９）ですすぎ、０．１Ｍ トリエタノールアミン中の０．２５％ 無水酢酸で１５分間アセチル化する。これらのスライドを、２×ＳＳＣで洗い、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ ホルムアミド、４×ＳＳＣ、１×デンハート溶液、５００μｇ／ｍｌ 熱変性ニシン精子ＤＮＡ、２５０μｇ／ｍｌ 酵母ｔＲＮＡ及び１０％ デキストラン硫酸）中の熱変性リボプローブ（８０℃、３分間）をこれらの組織切片に加える。カバーガラスをこれらの組織の上にシールして、ハイブリダイゼーションを、加湿チャンバー内で、一晩、５５℃で行う。これらの組織を２×ＳＳＣ中で洗ってから、ＳＴＥ（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で洗い、ＲＮアーゼＡ（ＳＴＥ中の４０μｇ／ｍｌ）で、３０分間、３７℃で処理する。切片を、２×ＳＳＣ、５０％ ホルムアミドで、５５℃で洗浄してから、１×ＳＳＣで、室温で洗い、最後に、０．５×ＳＳＣで、室温で洗浄する。
【０１４７】
結合したリボプローブは、スライドを、１分間緩衝液１（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で洗った後に、それらの組織を緩衝液１中の２％ ヒツジ血清でブロックすることにより検出する。アルカリホスファターゼに結合させたヒツジの抗ジゴキシゲニン抗体（Ｒｏｃｈｅ）を、１％ ヒツジ血清を含む緩衝液１で１：５００に希釈し、これらの組織に加えて、加湿チャンバー内で室温で１時間にわたってインキュベートする。次いで、スライドを、緩衝液１で洗い、その後、緩衝液２（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で洗う。基質溶液（緩衝液２中のＮＢＴ／ＢＣＩＰ及び１ｍＭ レバミソール）をこれらの切片に加え、それらのスライドを暗黒中で４℃で一晩インキュベートする。この反応を、これらのスライドを緩衝液３（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に置くことにより停止させる。これらの組織をマウントして、光学顕微鏡により発色染色につき観察する。
【０１４８】
候補の細胞柔軟性遺伝子の優先順位決定　候補の細胞柔軟性遺伝子を、それらの遺伝子ファミリー、転写誘導の程度及び細胞発現パターンによって優先順位を決定することができる。有意にアップレギュレートされた遺伝子及び潜在的な細胞外シグナリング分子（例えば、成長因子、サイトカイン又は他のリガンド）をコードする遺伝子は、直接的候補である。かかる遺伝子は、内部断端細胞の細胞脱分化を開始する因子をコードしうる。主要な関心ある他の遺伝子には、レセプター（開始リガンドと結合することができる）、キナーゼ（脱分化シグナルの細胞内変換において役割を演じることができる）、及び転写因子（脱分化又は分化状態の維持に関与する下流遺伝子を誘導し又は抑制する応答遺伝子でありうる）が含まれる。メタロプロテイナーゼは、細胞外マトリクスを中途妨害することによって細胞脱分化に関与しうる。最後に、切断後顕著にアップレギュレートされるが如何なる公知の遺伝子ファミリーにも属さない新規な遺伝子は、細胞柔軟性の調節において機能しうるので関心が持たれる。
【０１４９】
３０〜１００の差次的に発現される遺伝子を、このアプローチによって予想することができ、それら遺伝子の最大５０％がミトコンドリア遺伝子、全体的細胞周期遺伝子、又は他のハウスキーピング遺伝子であることはありそうなことであり、それ故、ＲＮＬＥ成分であることはありそうもない。次いで、残りの候補の遺伝子を、下記のように、細胞脱分化の開始又は誘導における機能について試験する。
【０１５０】
（ｅ）候補の遺伝子が細胞柔軟性に役割を演じるかどうかを測定するアッセイ
次いで、細胞柔軟性の調節のための候補である差次的に発現される遺伝子を試験して、それらが、培養マウスＣ２Ｃ１２筋管における細胞脱分化を、又は他の具体例においては、イン・ビトロ培養ヒト細胞の脱分化を誘導するように機能するかどうかを測定する。マウスの筋管は、初期肢再生体（切断後１〜５日目）からのタンパク質抽出物で処理した場合又は成長因子の存在下でのｍｓｘ１の異所的発現を誘導した場合に脱分化を誘導することができる。同様のアプローチの利用により、候補の遺伝子が、細胞脱分化を誘導するかどうかを測定することができる。もし候補の遺伝子が、分泌タンパク質（多分、成長因子、サイトカイン又は他のリガンド）をコードしているようであれば、それを発現ベクター中にクローン化して、マウスの筋管をその発現されたタンパク質で処理することが細胞脱分化を誘導しうるかどうかを測定する。もしその遺伝子が細胞因子をコードして、下にある断端組織中で発現されるならば、それを、哺乳動物発現ベクター中にクローン化してその発現をマウスの筋管において誘導し、次いで、その遺伝子の異所的発現がマウスの筋管の脱分化を誘導することができるかどうかを測定する。もし単一遺伝子が、脱分化を誘導することができなければ、様々な候補遺伝子の組合せを、それらの細胞柔軟性を誘導する能力について試験する。遺伝子の組合せが細胞柔軟性を誘導できないならば、再生中でない肢の抽出物を調製してから、それらの抽出物（それら自身は、脱分化を誘導しない）が、候補遺伝子との組合せにおいて、脱分化を誘導できるかどうか測定する。
【０１５１】
候補のイモリ遺伝子のマウス筋管の脱分化を開始する能力についての試験　配列が、分泌される可溶性因子であることを示唆する遺伝子を、マウス筋管の細胞脱分化を開始するそれらの能力について試験する。分泌される遺伝子が細胞脱分化を開始することができるかどうかを測定する比較的容易なアプローチは、培養ＣＯＳ−７細胞を、哺乳動物プロモーター例えばＣＭＶプロモーターにより駆動される候補遺伝子を含むプラスミド構築物でトランスフェクトすることである。トランスフェクションの数日後に、細胞培養培地を集める。ＣＯＳ−７細胞中で発現された分泌された可溶性タンパク質は、この調整培地中に存在する。次いで、この調整培地を用いて、最終分化したマウスの筋管又は培養ヒト細胞を処理して、発現されたタンパク質が脱分化過程を開始することができるかどうかを測定することができる。対照は、擬似的にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に由来する調整培地よりなる。
【０１５２】
単一の候補の遺伝子は、細胞脱分化を開始することができないが、候補遺伝子の組合せは、かかる応答を誘導することができる。それ故、単一の遺伝子が独力で脱分化を開始できないならば、候補の脱分化遺伝子の組合せのＣＯＳ−７細胞への同時トランスフェクションを行ってから、その結果生成した調整培地が細胞脱分化を誘導することができるかどうかを測定する。或は、単独遺伝子をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞に由来する調整培地を合わせて、その合わせた培地を用いて、脱分化アッセイを行うことができる。
【０１５３】
ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション及び調整培地中の候補のタンパク質の存在の確認　ＣＯＳ−７Ｌ細胞を、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）及び１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて、３７℃で、５％ ＣＯ２中で生育させて継代する。トランスフェクションの前日に、２×１０６の細胞を、１００ｍｍ ポリ−Ｄ−リジン被覆した組織培養プレート上の１２ｍｌの成長培地中に置く。ヘマグルチニンタグを完全長ｃＤＮＡの３’末端に加えて、調整培地中のタンパク質の存在を確認できるようにする。完全な構築物をｐＢＫ−ＣＭＶ発現ベクター中にクローン化し、リポソーム媒介のトランスフェクションを利用して培養ＣＯＳ−７Ｌ細胞中にトランスフェクトする。調整培地を集めて、トランスフェクションの開始後４８時間で、脱分化アッセイに利用する。
【０１５４】
この調整培地を、ウエスタンブロット分析を用いて、候補の脱分化タンパク質の存在について調べる。タンパク質を、４〜２０％の直線的勾ゲル上で分離してから、電気泳動によりナイロン膜に移す。これらの膜を風乾し、５％脱脂粉乳でブロックしてから、ブロッキング溶液中で１：１０００に希釈した抗ヘマグルチニン抗体（ｍｏｎｏＨＡ．１１、ＢａｂＣｏ）を含む溶液中で、４℃で一晩インキュベートする。これらのブロットを徹底的に洗い、１時間にわたって、ペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧ二次抗体（ブロッキング溶液で１：１０００に希釈）とインキュベートする。これらのブロットを徹底的に洗い、増強化学発光を行って、候補の脱分化タンパク質が調整培地中に存在するかどうかを測定する。
【０１５５】
候補のタンパク質の、細胞周期再入を誘導する能力についての試験
候補のタンパク質が、マウスの筋管の細胞周期への再入を誘導することができるかどうかを測定するために、ＢｒｄＵ取り込み実験を実施する。簡単にいえば、Ｃ２Ｃ１２筋管（又は、培養ヒト細胞）を、生育培地（ＧＭ２０％ ＦＢＳ及び４ｍＭ グルタミンを加えたＤＭＥＭ）中で、２４ウェルプレート中で集密になるまで生育させてから、ＧＭを分化用培地（ＤＭ２％ ウマ血清及び４ｍＭ グルタミンを加えたＤＭＥＭ）で置き換えることにより分化を誘導する。筋細胞を、４日間にわたって分化させる。次いで、異なるウェル中のＣ２Ｃ１２筋管を調整培地の種々の希釈物（希釈なし、１／２、１／４、１／８、１／１６倍希釈、及び調整培地を含まない対照用ウェル）で最長４日にわたって処理する。ＢｒｄＵをこれらの培養に１０ｎモル／ｍｌの濃度で加えてから１２時間後に、細胞周期への再入を調べる。ＢｒｄＵ取り込みを、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン標識を用いてアッセイする。簡単にいえば、これらの細胞を徹底的にＰＢＳで洗い、２０分間、−２０℃で７０％エタノール／１５ｍＭ グリシン緩衝液（ｐＨ２．０）で固定して、再び洗う。次いで、細胞を、抗ＢｒｄＵ抗体の１：１０希釈物中で３０分間、３７℃でインキュベートする。これらの細胞を洗ってから、フルオレセインを結合した抗マウスＩｇＧ中で３０分間、３７℃でインキュベートする。洗浄後に、これらの細胞を顕微鏡で観察し、ＦＩＴＣフィルターを用いて写真を撮る。緑色の蛍光を発する核を含む細胞は、ＤＮＡ合成に際してＢｒｄＵを取り込んでおり、細胞周期に再入したものとみなす。細胞周期再入が細胞脱分化において重要な役割を演じるとすれば、細胞周期への再入を誘導する任意の候補のイモリ遺伝子は、細胞脱分化の開始及び柔軟性のための重要な遺伝子であると考えられる。
【０１５６】
候補のタンパク質の、筋肉分化タンパク質のレベルを下げる能力についての試験　候補の遺伝子が筋肉分化タンパク質のレベルを下げることができるかどうかを測定するために、上記のマウスの筋管（又は、培養ヒト筋細胞）を、候補の遺伝子を発現しているＣＯＳ−７Ｌ細胞に由来する調整培地で処理する。処理の３日後に、免疫蛍光アッセイを行って、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＭＲＦ４、トロポニンＴ及びｐ２１のレベルの低下があったかどうかを測定する。ＭｙｏＤ、ミオゲニン及びＭＲＦ４は、筋発生の重要なレギュレーターであり、他方、ｐ２１は有糸分裂後状態の開始を知らせ、トロポニンＴは、収縮装置の成分である。これらの因子の全部が、Ｃ２Ｃ１２筋管中で正常に発現され、それらのレベルの減少は、細胞分化の逆転を意味する。これらの細胞を、ＰＢＳで洗い、ザンボニ固定液中で１０分間固定し、再びＰＢＳで洗って、ＤＰＢＳ中の０．２％ トリトンＸ−１００で２０分間透過性にする。これらの細胞を、ＤＰＢＳ中の５％ スキムミルクで、１時間、室温でブロックしてから、一次抗体に一晩、４℃でさらす（ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＭＲＦ４、トロポニンＴ及びｐ２１を認識する一次抗体を使用）。これらの細胞を洗ってから、用いた一次抗体に依って、Ａｌｅｘａ４８８に結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ、ビオチンに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ又は両方の二次抗体で、４５分間にわたって、３７℃で処理する。これらの細胞を洗ってから、蛍光により観察し又はストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ５９４で、４５分間にわたって、３７℃で処理する。後者の細胞を洗ってから、ＦＩＴＣとテキサスレッドフィルターを用いて蛍光顕微鏡により観察する。細胞核を視覚的に観察して、筋発生調節因子ＭｙｏＤ、ミオゲニン及びＭＲＦ４、及びｐ２１のレベルが低下したかどうかを測定する。細胞質を観察して、トロポニンＴレベルが低下したかどうかを測定する。これらの筋肉分化タンパク質の低下したレベルは、筋管脱分化の別の指標である。対照用に、調整培地で処理してない細胞を利用する。それ故、これらの細胞変化を誘導することのできる任意の候補の遺伝子は、細胞脱分化の開始及び柔軟性のための重要な遺伝子と考えられる。
【０１５７】
候補のタンパク質の、筋管開裂及び細胞増殖を誘導する能力についての試験　細胞周期への再入及び／又は筋肉分化タンパク質レベルの低下を開始する任意の候補の遺伝子を、細胞の開裂及び増殖を誘導する能力について試験する。筋管（又は、ヒトの筋細胞）を上記のように生成させる（但し、多数を１００ｍｍ組織培養プレート上にプレートする）。これらの細胞を精製して、低密度で再プレートする。残留単核細胞をニードルアブレーション及び致死的水注入により除去する。これらの細胞を写真に撮り、調整培地を加えて、視覚的検査及び写真撮影により最長７日間にわたってモニターする。調整培地を含む細胞培養培地を、毎日交換する。筋管の一層小さい筋管を形成する開裂又は増殖する単核細胞は、細胞脱分化を示すものと考えられる。筋管開裂を開始することのできる任意の候補の遺伝子は、細胞の脱分化及び柔軟性のための重要な遺伝子であると考えられる。
【０１５８】
（ｆ）脱分化における可能な役割のための細胞タンパク質をコードする候補の遺伝子の試験
下にある断端中で発現されて細胞タンパク質例えばレセプター、転写因子又はシグナル変換タンパク質をコードするらしい候補の遺伝子を、それらをマウス（又はヒトの）筋管を異所的に発現させることにより、細胞脱分化における可能な役割について調べる。ドキシサイクリン抑制可能な候補の遺伝子を含むレトロウイルス構築物（ＬＩＮＸ）を、ＣａＰＯ４法を利用して、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ細胞にトランスフェクトし、その結果生成した組換えレトロウイルスを、調整培地を保存することにより収穫する。筋芽細胞にこの組換えレトロウイルスを、この調整培地を筋芽細胞に４μｇ／ｍｌ ポリブレンの存在下で加えることにより感染させて、１２〜１８時間にわたって感染を生じさせる。この感染培地を、２μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンを含む筋芽細胞生育培地と交換して、候補の遺伝子の発現を阻止する。これらの細胞を４８時間にわたって生育させ、サブクローン化し、２μｇ／ｍｌ ドキシサイクリン及び７５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下で生育させて、トランスダクションされた筋芽細胞について選択する。選択を１４日にわたって続け、クローン化集団を導く。候補の遺伝子を、ＤＭ−ｄｏｘをｄｏｘを欠く培地で置き換えることにより、拡大したクローンにおける筋管形成後に誘導する。次いで、これらの細胞を、上記のように、細胞周期への再入、筋肉分化タンパク質の減少、並びに細胞の分裂及び増殖について試験する。細胞脱分化のこれらの指標の何れかを示す候補の遺伝子は、細胞脱分化経路における重要な応答遺伝子と考えられる。
【０１５９】
或は、他のアプローチは、細菌細胞又は真核生物細胞中で発現された候補のタンパク質の精製を含むことができる。これらの精製タンパク質を、次いで、特定の濃度で、この提案中に記載した細胞脱分化アッセイにおいて利用することができる。
【０１６０】
５．活性なＲＮＬＥ成分を同定するための抗体の作成及び利用
ＲＮＬＥの活性な成分がタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであることはありそうなことである（実施例参照）から、特に、遺伝子又は差次的ディスプレーによるアプローチが困難であるか非生産的であるならば、抗体を用いるアプローチを採ることができる。
【０１６１】
このアプローチにおいては、抗体を、選択した宿主において、全ＲＮＬＥ中の又はＲＮＬＥの画分中の抗原に対して生成する。好ましくは、この宿主は、該宿主から最終的にモノクローナル抗体ｍＡｂを誘導することのできるものである。一度抗体が生成されたならば、それらを、先ずイン・ビトロで、次いで、イン・ビボで、ＲＮＬＥ依存性の過程例えば筋管の脱分化又はイモリの肢の再生をブロックする能力について試験する。次いで、かかる抗体を用いて、ヒト（又は、他の生物）の同族体を、様々なアプローチを利用して、例えばヒトの発現ライブラリーをスクリーニングし、抗原含有ポリペプチドを抗体アフィニティークロマトグラフィーにより単離して末端ペプチド配列決定を実施し、そしてかかる配列を利用して、対応するポリペプチドをコードする核酸を単離するためにイン・シリコ実験を行い又は核酸プローブ及びプライマーをデザインすることにより単離することができる。
【０１６２】
「抗体」（Ａｂ）は、ＲＮＬＥに対する単一のＡｂ（抗ＲＮＬＥ Ａｂ；アゴニスト、アンタゴニスト及び中和Ａｂを含む）、抗ＲＮＬＥ Ａｂ組成物（ポリエピトープ特性を有する）、一本鎖抗ＲＮＬＥ Ａｂ及び抗ＲＮＬＥ Ａｂの断片を含む。「モノクローナル抗体」は、実質的に均質なＡｂの集団から得られる（即ち、この集団を構成する個々のＡｂは、少数存在しうる可能な天然の突然変異を除いて同一である）。Ａｂは、ポリクローナル（ｐＡｂ）、モノクローナル（ｍＡｂ）、ヒト化、二官能性（ｂｓＡｂ）及びヘテロ結合型Ａｂを包含する。
【０１６３】
下記は、このアプローチの一変形を概説するものである。当業者は、他の変形を選択することができ、又は下記のものからそれてしかも尚同じ目的を達成することができる。
【０１６４】
イモリの肢の抽出物を上記（ＩＩＩ．Ａ）のようにして、多量に調製する。好ましくは、この抽出物を、透析などにより濃縮して水性成分を最少にする。或は、これらのタンパク質を、当分野で公知の任意の方法例えば硫安沈殿又はトリクロロ酢酸沈殿によって単離することができる。この調製物を抗原として利用する。
【０１６５】
（ａ）ポリクローナルＡｂ（ｐＡｂ）
ポリクローナルＡｂは、哺乳動物宿主において、例えば少なくとも一回の免疫原（ＲＮＬＥ）（及び、所望であればアジュバント）の注射により生成することができる。典型的には、この免疫原及び／又はアジュバントを、哺乳動物に、多数回の皮下注射又は腹腔内注射によって注射する。アジュバントの例には、完全フロイントアジュバント及びモノホスホリル脂質Ａ合成トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。免疫応答を改善するために、免疫原を、宿主において免疫原性であるタンパク質例えばカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及び大豆トリプシンインヒビターと結合することができる。抗体産生のプロトコールは、十分に記載されている（Ａｕｓｕｂｅｌ等、１９８７；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８）。或は、ｐＡｂを、ニワトリにおいて作成して、ＩｇＹ分子を生成することができる（Ｓｃｈａｄｅ等、１９９６）。
【０１６６】
（ｂ）モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）
抗ＲＮＬＥ ｍＡｂを、ハイブリドーマ法（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、１９８３）を利用して製造することができる。ハイブリドーマ法は、少なくとも次の４つのステップを含む：（１）宿主又は宿主由来のリンパ球の免疫化；（２）ｍＡｂを分泌する（又は、潜在的に分泌する）リンパ球の収穫、（３）それらのリンパ球の不滅化細胞との融合、及び（４）所望（抗ＲＮＬＥ）のｍＡｂを分泌する細胞の選択。
【０１６７】
マウス、ラット、テンジクネズミ、ハムスター、又は他の適当な宿主を免疫化して、免疫原に特異的に結合するＡｂを生成し又は生成しうるリンパ球を誘出する。或は、これらのリンパ球を、イン・ビトロで免疫化することができる。もしヒトの細胞が所望であれば、一般に、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を使用するが；他の哺乳動物起源に由来する脾臓細胞又はリンパ球が好適である。免疫原には、典型的には、ＲＮＬＥ又は融合タンパク質が含まれる。
【０１６８】
これらのリンパ球を、次いで、不滅化した細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成するが、ポリエチレングリコール（Ｇｏｄｉｎｇ、１９９６）などの融合剤により促進する。トランスフォーメーションにより不滅化したゲッ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞を利用することができる（又はラット若しくはマウスミエローマ細胞株）。未融合の不滅化細胞でないハイブリドーマ細胞の純粋な集団が好ましいので、融合後の細胞を、未融合の不滅化細胞の生育又は生存を阻止する少なくとも一種の物質を含む適当な培地で生育させる。一般的技術は、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を利用する。この場合には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンをこの培地（ＨＡＴ培地）に加えて、ハイブリドーマの生育を許しつつ、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の生育を阻止する。
【０１６９】
好適な不滅化細胞は、効率的に融合して、ＨＡＴなどの培地での選択により混合集団から単離することができ、そして融合後に抗体の安定且つ高レベルの発現を支持することができる。好適な不滅化細胞株は、マウスミエローマ株であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （バージニア、Ｍａｎａｓｓａｓ在）から入手可能である。ヒトのミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も又、ヒトｍＡｂの製造のために記載された（Ｋｏｚｂｏｒ等、１９８４；Ｓｃｈｏｏｋ、１９８７）。
【０１７０】
ハイブリドーマ細胞は抗体を細胞外に分泌するので、それらの培養培地を、ＲＮＬＥに対するｍＡｂ（抗ＲＮＬＥｍＡｂ）の存在についてアッセイすることができる。免疫沈殿又はイン・ビトロ結合アッセイ例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ｍＡｂの結合特異性を測定し（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９９９）、スキャッチャード分析（Ｍｕｎｓｏｎ及びＲｏｄｂａｒｄ、１９８０）を含む。
【０１７１】
抗ＲＮＬＥｍＡｂを分泌するハイブリドーマ細胞を、単一クローンから限界希釈手順によって分離してサブクローン化することができる（Ｇｏｄｉｎｇ、１９９６）。適当な培養培地には、ダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、又は所望であれば無タンパク質若しくは低タンパク質の又は無血清の培地が含まれる（例えば、Ｕｌｔｒａ ＤＯＭＡ ＰＦ又はＨＬ−１；メリーランド、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ在、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）。これらのハイブリドーマ細胞は又、腹水としてイン・ビボで生育させることもできる。
【０１７２】
これらのｍＡｂを、培養培地又は腹水液から慣用のＩｇ精製手順例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィーにより、単離し又は精製することができる（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９９９）。
【０１７３】
これらのｍＡｂは又、組換え法によって作成することもできる（米国特許第４１６６４５２号、１９７９）。抗ＲＮＬＥ ｍＡｂをコードするＤＮＡは、容易に単離することができ、慣用の手順を用いて配列決定をすることができ、例えば、マウスの抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、好ましくは、抗ＲＮＬＥ分泌性ｍＡｂハイブリドーマ細胞株から単離したＤＮＡをプローブ検出することができる。一度単離すれば、それらの単離されたＤＮＡ断片を発現ベクター中にサブクローン化し、次いで、それらを宿主細胞例えばサルのＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞（トランスフェクトしなければ、Ｉｇタンパク質を生成しない）にトランスフェクトしてｍＡｂを発現させる。これらの単離されたＤＮＡ断片を、例えば、ヒトの重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列の代りに代用することにより（米国特許第４８１６５６７号、１９８９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、１９８７）、又はＩｇコード配列を非Ｉｇポリペプチドのコード配列の全部又は部分と融合させることによって改変することができる。かかる非Ｉｇポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代用とすることができ、又は一つの抗原結合部位の可変ドメインの代用としてキメラの二価抗体を造ることができる。
【０１７４】
ｉ．機能ブロッキング抗体のスクリーニング
もし機能ブロッキング抗体を所望するのであれば、プール中のハイブリドーマ上清のスクリーニングが魅力的な選択を代表する。単一細胞への限界希釈の前に、融合後のハイブリドーマを、２〜数千の細胞を含むプール（２以上の異なる抗体に相当する）に分ける。これらの上清又はその調製物を用いて、上記の筋管の脱分化などの任意のアッセイ（４（ｅ、ｆ））においてＲＮＬＥ様活性を阻止する能力；好ましくは、イモリの肢の再生能力を阻止する能力についてスクリーニングすることができる。次いで、機能ブロッキング活性を示すプールを、一層小さいプールに希釈ことによりサブクローン化し、スクリーニングを繰り返し、そして活性プールの希釈を繰り返す。この工程をクローナルハイブリドーマ細胞が達成されるまで繰り返す。この場合、機能ブロッキングは、必ずしも、機能の全体的阻止を示すものではなく；ＲＮＬＥの活性に反する効果を示す任意の抗体は候補である。
【０１７５】
一度かかるクローナル株が達成されたならば、それらの抗体を用いて、それらが結合するポリペプチドを単離することができ、ヒト又は他の動物の同族体の同定を進めることができる。
【０１７６】
ｉｉ．ヒトのＲＮＬＥ成分の同定
上で同定された抗体を用いて、抗原含有ポリペプチドをアフィニティー精製することができる。一度これらのポリペプチドが単離されたならば、それらを、当業者に公知の多くの方法で分析して、それらの配列（例えば、Ｎ末端配列）を決定することができる。一度ペプチド断片配列が知れれば、その配列を利用して、同じか又は類似するタンパク質をタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ検索を利用して同定することができ、又は核酸プライマー及びプローブをデザインすることができる。かかるプローブ（遺伝コードの縮重のために縮重している）を用いて、抗体抗原の同族体をコードしている候補の核酸分子を同定することができる。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし；一層好ましくは、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。
【０１７７】
或は、これらの抗体自身を利用して、他の種に由来する類似の又は同一のタンパク質を直接同定することができる。例えば、発現ライブラリー（好ましくは、ヒト由来）を、これらの抗体を用いてスクリーニングすることができる。結合が認められた場合には、そのシグナルは、候補のヒトの同族体タンパク質を示す。或は、タンパク質のミスコンホメーションが細菌媒介の発現ライブラリーで生成されたタンパク質の抗体結合を妨げる場合には、パニングアプローチ又はアフィニティークロマトグラフィーを利用することができる。
【０１７８】
６．候補のアプローチ
本発明者は、表Ｃ１に列記したポリペプチド又はそれらの同族体がＲＥの成分であることはありそうなことであると考えている。
【０１７９】
【表６】
2004511209.tif 000011
【０１８０】
様々なアプローチを利用して、候補の化合物が、ＲＥにおいて活性であるかどうかを同定することができる。当業者は、このアプローチを選択するであろう。例えば、アンチセンス又はアプタマーアプローチを利用して、再生中のイモリの肢の細胞内の候補の成分の発現を、当分野で周知の技術を利用し、次いで、その肢についての再生する能力を試験することにより、阻止することができる。或は、当分野で利用可能な様々な成分に対する機能ブロッキング抗体を利用して、イモリの肢の再生を阻止することができる。もしこの肢が、完全に分化することができないならば、その成分が、ＲＥに含まれていることはありそうなことである。
【０１８１】
Ｃ．ｍｓｘ１
この発明は、細胞の脱分化及び再生（ｍｓｘ１を利用）の方法を提供する。ｍｓｘ１は細胞内因子であるので、それは、細胞に導入しなければならない。次の３つの方法が、企図される：（１）ｍｓｘ１を核酸ベクター内にサブクローン化してから他のベクター（アデノウイルスなど）によって関心ある細胞に送達するか又は直接送達する核酸及び遺伝子治療アプローチ；（２）ｍｓｘ１を通常細胞に入るポリペプチド例えばＨＩＶｔａｔタンパク質（表Ｃ参照）に融合させて；適当な医薬組成物に混合することにより送達に影響しうる融合ｍｓｘ１ポリペプチド；及び（３）ｍｓｘ１の、リポソームなどに入れての、細胞に取り込まれる組成物への混合。医薬組成物及びそれらの利用の詳細は、本明細書中に見出すことができる。
【０１８２】
以下の節はｍｓｘ１遺伝子治療及び分子操作に属するが、これらの方法は、やはり核酸を利用するこの発明の他の部分（例えば、差次的発現によるｈＲＮＬＥの生成など）に適用可能である。
【０１８３】
１．遺伝子治療用組成物
このｍｓｘ１核酸分子（又は、任意の活性なＲＤＦ成分をコードする核酸分子）をベクターに挿入して、遺伝子治療用ベクターとして利用することができる。遺伝子治療用ベクターは、患者に、例えば、静脈注射、局所投与（Ｎａｂｅｌ及びＮａｂｅｌ、米国特許第５，３２８，４７０号、１９９４）により又は定位注射によって送達することができる（Ｃｈｅｎ等、１９９４）。遺伝子治療用ベクターの医薬製剤は、許容しうる希釈剤を含むことができ、又は遺伝子送達用ビヒクルを埋め込んだ低速で放出するマトリクスを含むことができる。或は、完全な遺伝子送達用ベクターは、組換え細胞から無傷で生成することができ（例えば、レトロウイルスベクター）、この医薬製剤は、遺伝子送達システムを生成する少なくとも一つの細胞を含むことができる。
【０１８４】
２．ベクター
ベクターは、ＤＮＡを宿主細胞間で往復輸送するのに用いられ又はヌクレオチド配列を発現させる手段として用いられるツールである。幾つかのベクターは、原核生物においてのみ機能するが、他のものは、原核生物と真核生物の両方で機能して、真核生物での発現のための原核生物からの大規模なＤＮＡの調製を可能にする。関心あるＤＮＡ例えばｍｓｘ１ヌクレオチド配列又は断片の挿入を連結技術及び／又は交配プロトコール（当業者に周知）により達成する。かかるＤＮＡを、ベクターの如何なる機能的構成要素をも破壊しないように挿入する。導入したＤＮＡは、転写及び翻訳を支配するベクターのエレメントに操作可能に結合する。
【０１８５】
ベクターは、２つの一般的なクラスに分けることができる：クローニングベクターは、適当な宿主細胞での増殖に必須でなく、外来ＤＮＡを挿入することのできる領域を有する複製するプラスミド又はファージであり；外来ＤＮＡは、そのベクターの構成要素であるかのように複製して増殖する。発現ベクター（例えば、プラスミド、酵母、又は動物ウイルスゲノム）は、外来ＤＮＡを転写させて翻訳するために、宿主細胞又は組織に外来遺伝物質を導入するために用いられる。発現ベクターにおいて、導入されたＤＮＡは、宿主細胞に挿入されたＤＮＡを転写するように合図するプロモーターなどのエレメントに操作可能に結合される。特異的な因子に応じて遺伝子の転写を制御する誘導性プロモーターなどの幾つかのプロモーターは、非常に有用である。誘導性プロモーターに操作可能に結合したｍｓｘ１又はアンチセンス構築物は、ｍｓｘ１若しくは断片又はアンチセンス構築物の発現を制御することができる。古典的な誘導性プロモーターの例には、α−インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、及びステロイド例えばグルココルチコイド（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９０）及びテトラサイクリンに応答するものが含まれる。他の望ましい誘導性プロモーターには、構築物を導入される細胞にとって内因性でないが、誘導剤が外因的に供給された場合にそれらの細胞において応答性であるものが含まれる。
【０１８６】
ベクターは、多くの異なる表示を有する。「プラスミド」は、追加のＤＮＡセグメントを導入することのできる環状二本鎖ＤＮＡ分子である。ウイルスベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中に受け入れることができる。ある種のベクターは、宿主細胞中で自律的に複製することができる（例えば、細菌用の複製起点を有する細菌用ベクター及びエピソーム性哺乳動物用ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物用ベクター）は、宿主細胞への導入に際して宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、その宿主ゲノムと共に複製される。しかしながら、他の形態の発現ベクター例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）は、企図される。かかるベクターは、遺伝子治療応用において、極めて有用でありうる。
【０１８７】
ｍｓｘ１（又は、断片）を含む組換え発現ベクターは、ｍｓｘ１に操作可能に結合した少なくとも一つの宿主細胞応答性の（又は、イン・ビトロで操作することのできる）調節配列を利用することによりｍｓｘ１転写を調節する。「操作可能に結合した」は、関心あるヌクレオチド配列を調節配列にそのヌクレオチド配列の発現が達成されるように結合することを示す。
【０１８８】
ベクターを様々な生物及び／又は細胞に導入することができる（表Ｄ）。或は、これらのベクターを、例えばＴ７プロモーターの調節配列及びＴ７ポリメラーゼを利用して、イン・ビトロで、転写及び翻訳を行なうことができる。
【０１８９】
【表７】
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2004511209.tif 000013
【０１９０】
ベクターの選択は、用いる生物又は細胞及び所望のベクターの運命により指図される。ベクターは、一度標的細胞内に入れば複製することができ、又は「自殺」ベクターであってよい。一般に、ベクターは、シグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列を含む。これらのエレメントの選択は、ベクターを用いる生物に依存し、容易に決定できる。これらのエレメントの幾つかは、条件付きであってよく、例えば、誘導性又は条件付きプロモーターであってよく、これは、条件が適当であれば「オン」になる。誘導性プロモーターの例には、発現をある細胞型に属させる組織特異的なもの、ステロイド応答性のもの、又は熱ショック反応性のものが含まれる。幾つかの細菌性抑制システム（例えば、ｌａｃオペロン）は、哺乳動物細胞及びトランスジェニック動物において利用されてきた（Ｆｉｅｃｋ等、１９９２；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ等、１９９６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ及びＳｈｏｒｔ、１９９１）。ベクターは、しばしば、選択マーカーを利用して、そのベクターを取り込んだ細胞の同定を容易にする。多くの選択マーカーが、原核生物を用いる利用技術において周知であり（通常、抗生物質耐性遺伝子）、又は独立栄養変異体及び栄養要求性変異体の利用技術において周知である。
【０１９１】
ｍｓｘ１発現を所望しないならば、アンチセンス及びセンスｍｓｘ１オリゴヌクレオチドを利用して、ｍｓｘ１ポリペプチド発現を阻止することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列に結合して二重鎖を形成し、これは、それらの二重鎖の分解を増進し、時期尚早に転写若しくは翻訳を終了し、又は他の手段によって、標的配列の転写又は翻訳をブロックする。
【０１９２】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍｓｘ１ｍＲＮＡ（センス）又はｍｓｘ１ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することのできる一本鎖核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）である。本発明により、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１４ヌクレオチドの（好ましくは、約１４〜３０ヌクレオチドの）ｍｓｘ１ＤＮＡコード領域の断片を含む。一般に、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００塩基長又はそれ以上を含むことができる。他の内で、（Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ、１９８８；ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ等、１９８８）は、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを所定のｃＤＮＡ配列から誘導する方法を記載している。
【０１９３】
アンチセンス及びセンスオリゴヌクレオチドの修飾は、それらの有効性を増大させることができる。修飾された糖−ホスホジエステル結合又は他の糖結合（ＷＯ９１／０６６２９、１９９１）は、標的配列への結合特異性を破壊することなく内因性ヌクレアーゼに対する耐性を与えることによってイン・ビボ安定性を増大させる。共有結合した有機部分（ＷＯ９０／１０４４８、１９９０）又はポリ−（Ｌ）−リジンなどの他の修飾は、オリゴヌクレオチドの標的への親和性を増大させることができる。金属錯体又はインターカレーティング剤（例えば、エリプチシン）及びアルキル化剤を含む他の付着物は、オリゴヌクレオチド標的への結合特異性を改変する。
【０１９４】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞（標的核酸配列を含む細胞）に導入するためには、任意の遺伝子トランスファー方法を利用することができ、これらの方法は、当業者は周知である。遺伝子トランスファー方法の例には、（１）生物学的方法、例えば、エプスタイン−バールウイルスのような遺伝子トランスファー用ベクター又は外因性ＤＮＡのリガンド結合分子への結合（ＷＯ９１／０４７５３、１９９１）、（２）物理的方法、例えば、エレクトロポレーション、及び（３）化学的方法、例えば、ＣａＰＯ４沈殿及びオリゴヌクレオチド脂質複合体（ＷＯ９０／１０４４８、１９９０）が含まれる。
【０１９５】
用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、交換可能に用いる。かかる用語は、特定の主題の細胞をいうだけでなく、かかる細胞の子孫又は潜在的子孫をも指す。突然変異又は環境の影響のためにある種の変化が続く世代において生じうるので、かかる子孫は、実際は、親細胞と同じでないかもしれないが、やはり、この用語の範囲に含まれる。
【０１９６】
真核生物細胞のトランスフェクション及び原核生物細胞のトランスフォーメーションの方法は、当分野において周知である。宿主細胞の選択は、関心ある核酸を導入するために好適な技術を指図するであろう。表Ｅ（これは、制限を意味するものではない）に、当分野で公知の多くの技術をまとめた。核酸の生物への導入は、トランスフェクション法並びに確立された遺伝子技術（必要ならば、その特定の生物についての）を利用するエキス・ビボ技術を用いても行うことができる。
【０１９７】
【表８】
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【０１９８】
ベクターは、しばしば、そのベクターを取り込んだ細胞の同定を容易にするために、特にイン・ビトロで、選択マーカーを利用する。多くの選択マーカーが、原核細胞選択のための技術において周知であり、それは、通常、抗生物質耐性遺伝子であり、又は独立栄養変異体及び栄養要求性変異体の利用である。表Ｆに、哺乳動物細胞トランスフェクション用の一般的な選択マーカーを列記した。
【０１９９】
【表９】
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【０２００】
３．ｍｓｘ１のイン・ビトロでの生成
宿主細胞例えば原核生物又は真核生物宿主細胞を用いて、ｍｓｘ１を生成することができる。ｍｓｘ１をコードする組換え発現ベクターを導入したｍｓｘ１又はｍｓｘ１融合ポリペプチドのイン・ビトロ生成に有用な宿主細胞には、非制限的例として、大腸菌、ＣＯＳ７及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２が含まれる。好ましくは、かかる細胞は、生成されたポリペプチドを、ヒトなどの患者に導入した場合に免疫応答が引き起こされるような仕方で修飾しない。例えば、ある種の糖の翻訳後修飾は、かかる応答を引き起こしうる。好ましくは、かかる細胞は、活性なポリペプチドを生成する。これらの細胞は、ｍｓｘ１又は所望のポリペプチドが生成されるような適当な培地で培養する。もし必要であれば、ｍｓｘ１を、培地又は宿主細胞から単離する。同じく、Ｆｇｆを、適当な対応するポリヌクレオチドを用いて、同様に、生成することができる。
【０２０１】
Ｄ．細胞培養
一次培養を生成するのに適当な培地及び条件は、当分野で周知であって、細胞型により変化し、経験的に決定することができる。例えば、骨格筋、骨、ニューロン、皮膚、肝臓及び胚性幹細胞は、すべて、特定の内容物において異なる培地中で生育する。更に、一つの細胞型のための培地は、研究室ごとに及び研究所ごとに有意に異なりうる。細胞分裂を維持するためには、血清例えばウシ胎児血清を培地に、比較的多量に（５〜３０体積％）加える（やはり、細胞型に依存する）。特異的な精製した成長因子又は複数の成長因子のカクテルも加えることができ、ときには、血清の代用とされる。分化を所望し且つ増殖を望まない場合には、
一般に、有糸分裂誘起物質を含む血清を約０〜２体積％に制限する。分化を促進し及び／又は細胞周期停止状態を促進する特異的な因子又はホルモンを利用することもできる。
【０２０２】
培養中の細胞の生育及び分化中の任意の時間に、特異的な細胞表現型、特異的細胞型の生育及び増殖、又は特異的細胞型の分化の選択のための重要な補助として、生理的酸素条件及び準大気圧酸素条件を利用することができる。一般に、生理的又は低酸素レベル培養は、培養物のアシドーシスを制限する方法例えば強力な緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）の培地への添加、及び頻繁な培地交換及びＣＯ２濃度の変更によって達成される。
【０２０３】
酸素に加えて、培養のための他の気体は、典型的には、約５％ 二酸化炭素であり、残りは、窒素であるが、適宜、変化する量の一酸化窒素（３ｐｐｍほどの低濃度から開始）、一酸化炭素及び他の気体（不活性なものと生物学的に活性なものの両方）を含むことができる。一酸化窒素及び一酸化炭素の両者は、必要であれば、典型的には、非常に少量（即ち、ｐｐｍの範囲）で投与する（経験的に又は文献により決定する）。
【０２０４】
この培地には、様々な成長因子、サイトカイン、血清などを補足することができる。適当な成長因子の例は、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦα及びＴＧＦβ）、血小板成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、インシュリン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びコロニー刺激因子（ＣＳＦ）である。適当なホルモン培地添加物の例は、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン又はグルココルチコイド例えばデキサメタゾンである。サイトカイン培地添加物の例は、インターフェロン、インターロイキン又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）である。当業者は、添加物及び培養成分を、細胞応答、添加物の活性寿命又はそれらの生物活性に影響を与える他の特徴を変えるような種々の培養条件で試験するであろう。加えて、これらの細胞が生育する表面に、それらの細胞の生存、生育及び／又は分化に寄与する様々な基材をプレートすることができる。これらの基材には、ラミニン、ＥＨＳマトリクス、コラーゲン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ポリオルニチン及びフィブロネクチンが含まれるが、これらに限られない。幾つかの例において、３次元培養が望ましい場合には、コラーゲン、ＥＨＳマトリクス又はゼラチンなどの細胞外マトリクスゲルを利用することができる。細胞をかかるマトリクスの上で生育させることができ、又はこれらのゲル自身の中へ投入することができる。
【０２０５】
Ｅ．分化中の細胞
１．イン・ビトロの筋管
患者（好ましくは、ヒト）から単離した又はマウス筋芽細胞株から生成させた筋管（実施例参照）を、適当な培地中で、イン・ビトロで培養する。
【０２０６】
当業者は、如何にして脱分化を達成するために示された条件を変えるかを知るであろう。以下の説明は、説明のための例として示すものである。
【０２０７】
培養において筋管の脱分化を誘導するためには、ＲＥを分化培地（実施例参照）に、細胞を低密度で適当な基材（例えば、組織培養用プラスチック、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ＥＨＳマトリクスなどで被覆した表面）上にプレートした後に、適当な時点で添加する。培地及び抽出物を、好ましくは、毎日交換する。形態的な脱分化を同定するためには、個々の細胞を、０日目に、抽出物の添加前に写真に撮り、抽出物の添加後に、２４時間ごとに、最長で１０日間（又は、それより長期間）写真に撮る。
【０２０８】
２．イン・ビトロで分化した細胞
患者（好ましくは、ヒト）から単離した又は細胞株から生成させた細胞を適当な培地中で、イン・ビトロで培養する。
【０２０９】
当業者は、如何にして、脱分化を達成するために示された条件を変えるのかを知るであろう。以下の説明は、説明のための例として示すものである。
【０２１０】
培養中の細胞の脱分化を誘導するためには、ＲＥを、分化培地（実施例参照）に、細胞を低密度で適当な基材上（例えば、組織培養用プラスチック、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ＥＨＳマトリクスなどを被覆した表面上又は懸濁液中）にプレートした後、適当な時点で添加する。培地及び抽出物を、好ましくは、毎日交換する。形態的な脱分化を同定するためには、個々の細胞を、０日目に、抽出物の添加前に写真に撮り、抽出物の添加後に、２４時間ごとに、最長で１０日間（又は、それより長期間）写真に撮る。
【０２１１】
３．イン・ビボの細胞
細胞（好ましくは、損傷部位の細胞）をＲＥと接触させる。ＲＥは、医薬組成物に配合して、送達を確実にすることができる。
【０２１２】
Ｆ．医薬組成物
この発明の組成物（ＲＤＦ成分）及びそれらの誘導体、断片、類似体及び同族体は、医薬組成物に混合することができる。かかる組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、又は抗体及び製薬上許容しうるキャリアーを含む。「製薬上許容しうるキャリアー」は、任意の及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤など（医薬投与に適合性のもの）を包含する（Ｇｅｎｎａｒｏ、２０００）。かかるキャリアー又は希釈剤の好適な例には、水、塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限られない。リポソーム及び非水性ビヒクル例えば固定油を利用することもできる。慣用の媒質又は薬剤が活性化合物と相容れない場合を除いて、これらの組成物の利用は、企図される。補足の活性化合物も又、これらの組成物に混合することができる。
【０２１３】
これらの活性化合物の投与のための医薬組成物（例えば、ＲＤＦのもの）は、好都合にも、投薬単位形態で与えることができ、製薬業界で周知の任意の方法により製造することができる。すべての方法は、活性化合物を少なくとも一種の補助的成分を含むキャリアーと合わせるステップを含む。一般に、医薬組成物は、活性化合物を、液体キャリアー若しくは微粉末固体キャリアー又は両方と均一に且つ密接に合わせてから、必要であれば、製品を所望の配合物に成形する。医薬組成物において、活性化合物は、病気の進行又は病気状態において所望の効果を生じるのに十分量で含まれる。
【０２１４】
１．一般的考察
この発明の医薬組成物は、その意図した投与経路｛皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（即ち、局所）、経粘膜、及び直腸投与を含む｝に適合するように配合する。非経口、皮内又は皮下適用のために用いられる溶液又は懸濁液は、無菌の希釈剤、例えば注射用の水、塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗細菌剤例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝剤例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、及び張性調節剤例えば塩化ナトリウム又はデキストロースを含むことができる。このｐＨは、酸又は塩基（塩酸又は水酸化ナトリウムなど）を用いて調節することができる。非経口用製剤は、アンプル、ディスポーサブル注射器又はガラス若しくはプラスチックで作られた多数回投与用瓶に封入することができる。
【０２１５】
２．注射用配合物
注射に適した医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散及び無菌の粉末（無菌の注射溶液又は分散の即時調製用）が含まれる。静脈投与用には、無菌のキャリアーには、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（商標）（ニュージャージー、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＢＡＳＦ）又はリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、この組成物は無菌でなければならず、注射器を用いて投与できるだけ流動性であるべきである。かかる組成物は、製造中及び貯蔵中に安定であるべきであり、微生物（細菌及びカビなど）による汚染から保護されなければならない。キャリアーは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及び適当な混合物を含む溶媒又は分散媒であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、所望の粒径を維持することにより（分散の場合）及び界面活性剤を用いることにより維持することができる。様々な抗細菌剤及び抗カビ剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールは、微生物汚染を含むことができる。等張剤例えば糖類、ポリアルコール例えばマンニトール、ソルビトール、及び塩化ナトリウムをこの組成物に含有させることができる。吸収を遅らせることのできる組成物は、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンなどの薬剤を含む。
【０２１６】
無菌の注射用溶液は、適当な溶媒中の所望量の活性化合物又は組成物を、所望の単一の成分又は組合せた成分と混合した後に、滅菌することによって調製することができる。一般に、分散は、活性化合物を、基礎分散媒及び論じたような他の所望の成分を含む無菌のビヒクルに混合することにより調製する。無菌の注射用溶液の調製のための無菌粉末の製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥を含み、これらは、活性成分及び任意の所望の成分（無菌溶液に由来する）を含む粉末を生成する。
【０２１７】
３．経口用組成物
経口用組成物は、一般に、不活性希釈剤又は食べられるキャリアーを含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入することができ、又は錠剤に圧縮することができる。経口治療剤投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と混合することができ、錠剤、トローチ又はカプセルの形態で利用することができる。経口用組成物は又、液体キャリアーを口内洗浄剤としての利用のために用いて調製することもできる（この場合、この液体キャリアー中の化合物は、経口適用される）。製薬上適合性の結合剤及び／又は補助材を含むことができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、次の成分（又は、同様の性質の化合物）の何れでも含むことができる：結合剤例えば微晶質セルロース、トラガカントゴム又はゼラチン；賦形剤例えば澱粉又はラクトース、崩壊剤例えばアルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ又はトウモロコシ澱粉；潤滑剤例えばマグネシウムステアレート又はＳＴＥＲＯＴＥＳ；グリダント例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤例えばシュークロース又はサッカリン；又は調味剤例えばペパーミント、メチルサリチレート又はオレンジ調味剤。
【０２１８】
４．吸入用組成物
吸入による投与のためには、これらの化合物を、適当な噴射剤例えばガス（二酸化炭素など）を含む噴霧器又は加圧容器からエアゾールスプレーとして送達する。
【０２１９】
５．全身投与（パッチを含む）
全身投与も、経粘膜又は経皮的であってよい。経粘膜又は経皮的投与のためには、標的バリヤーを透過することのできる浸透剤を選択する。経粘膜浸透剤には、洗剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与には、鼻スプレー又は坐薬を利用することができる。経皮投与のためには、これらの活性化合物を、軟膏、塗剤、ゲル又はクリームに配合する。
【０２２０】
これらの化合物は又、直腸投与のために、坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどのベースを使用）又は停留浣腸の形態で製造することもできる。
【０２２１】
６．キャリアー
一具体例において、活性化合物は、その化合物を身体からの急速な排除から防護するキャリアーと共に調製する（例えば、インプラント及びマイクロカプセル封入した送達システムを含む制御された放出用の配合物）。生物分解性の、生体適合性ポリマー例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を利用することができる。かかる物質は、ＡＬＺＡ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）及びＮＯＶＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（カリフォルニア、Ｌａｋｅ Ｅｌｓｉｎｏｒｅ）から購入でき、又は当業者により製造されうる。リポソーム懸濁液も又、製薬上許容しうるキャリアーとして利用することができる。これらは、当業者に公知の方法（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ等、米国特許第４，５２２，８１１号、１９８５年に記載のものなど）によって製造することができる。
【０２２２】
７．単位投薬
単位投薬形態の経口用配合物又は非経口用組成物を作成して、投与及び投薬量の均一性を促進することができる。単位投薬形態は、治療すべき患者への単一投薬に適した物理的に別個の単位（治療上有効な量の活性化合物を所望の製薬用キャリアーと合わせて含む）をいう。この発明の単位投薬形態の仕様は、活性化合物の独自の性質及び特定の所望する治療効果並びに活性化合物混合の固有の限界により指図される（これらに、直接、依存する）。
【０２２３】
８．投薬量
本発明の医薬組成物及び方法は、更に、ここに記した他の治療上活性な化合物（通常、傷又は他の関連する病的状態の治療に適用されるもの）を含むことができる。
【０２２４】
組織の再生又は細胞の脱分化を必要とする病気の治療においては、適当な投薬量レベルは、一般に、一日に患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１〜５００ｍｇであり、これは、単一の又は複数の投与量にて投与することができる。好ましくは、この投薬量レベルは、一日に約０．１〜２５０ｍｇ／ｋｇであり；一層好ましくは、一日に約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇである。適当な投薬量レベルは、一日に約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、一日に約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、又は一日に約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであってよい。この範囲内で、この投薬量は、一日に約０．０５〜０．５、０．５〜５又は５〜５０ｍｇ／ｋｇでありうる。経口投与のためには、これらの組成物は、好ましくは、治療すべき患者への投薬量の、症状に基づく調節につき、１．０〜１０００ミリグラムの活性成分、特に、１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０及び１０００．０ミリグラムの活性成分を含む錠剤の形態で与えられる。これらの化合物は、一日に１〜４回の、好ましくは一日に１回又は２回の養生法にて投与することができる。
【０２２５】
しかしながら、任意特定の患者についての特定の投与量レベル及び投薬頻度は変化しうるものであり、用いる特定の化合物の活性、その化合物の代謝的安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の方法及び時間、排出速度、薬物の組合せ、特定の病気の重さ、及び治療を受けている宿主を含む様々な因子に依存するものであるということは、理解されよう。加えて、送達部位も、投薬量及び頻度に強く影響するであろう。
【０２２６】
組織再生を生じる複合治療は、この発明の組成物と、かかる効用について知られている他の化合物との組合せによって説明される。
【０２２７】
９．医薬組成物のキット
これらの医薬組成物は、キット、容器、パック又はディスペンサーに、投与のための指示と共に含まれうる。この発明をキットとして供給する場合には、組成物の種々の化合物を別個の容器に納めて、使用直前に混合する。これらの成分をこのように別々に包装することは、活性化合物の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にしうる。
【０２２８】
（ａ）容器又は入れ物
これらのキットに含まれる試薬は、種々の成分の寿命が保護されて、容器の材料により吸着され又は変化されないように任意の種類の容器にて供給することができる。例えば、密閉されたガラスアンプルは、凍結乾燥したＲＥ、ＲＤＦ又は緩衝剤を含むことができる（これらは、中性の、非反応性気体例えば窒素の下でパッケージされている）。アンプルは、任意の適当な材料例えばガラス、有機ポリマー例えばポリカーボネート、ポリスチレンなど、セラミック、金属又は他の試薬を保持するために典型的に用いられる材料よりなってよい。適当な容器の他の例には、アンプルと同様の物質から加工することのできる単純な瓶、及び箔裏付きのインテリア（アルミニウム又は合金など）よりなるエンベロープが含まれる。他の容器には、試験管、小瓶、フラスコ、瓶、注射器などが含まれる。容器は、無菌的出入り口を有しうる（皮下注射針を刺し通すことのできる栓を有する瓶など）。他の容器は、取り外したときに成分を混合させる容易に取り外せる膜により分離された２つの区画を有することができる。取り外せる膜は、ガラス、プラスチック、ゴムなどであってよい。
【０２２９】
（ｂ）教示材料
キットは又、教示材料を伴って供給することもできる。教示は、紙その他の基材上に印刷することができ、且つ／又は電子的に読むことのできる媒体例えばフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどで与えることができる。詳しい教示は、キットと物理的に結合していなくてよく、ユーザーは、キットの製造業者又は配給業者により指定されたインターネットウェブサイトで指示を受けることができる。
【０２３０】
Ｈ．送達方法（この応用のために改変して適合させることの必要性）
１．間質送達
この発明の組成物を、動物の身体の組織の間隙（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺及び結合組織の間隙を含む）に送達することができる。これらの組織の間隙は、臓器組織の網状繊維、脈管若しくは房の壁の中の弾性繊維、繊維組織のコラーゲン繊維の間の、細胞間の液体ムコ多糖マトリクス、又は筋細胞を包む結合組織内又は骨の裂孔内の同じマトリクスを含む。それは、同様に、循環する血漿及びリンパ管のリンパ液により占められた空間である。それらは、便利に、注射によって、これらの細胞を含む組織に送達することができる。それらは、好ましくは、損傷部位に送達することができ、好ましくは、生細胞及び細胞外マトリクス（死んだ組織及び死につつある組織と直接隣接している）に送達することができる。
【０２３１】
医療の当業者に公知の任意の装置を用いて、この発明の組成物を、間質損傷部位に送達することができる。これらは、注射器、ステント及びカテーテルを含むがこれらに限らない。
【０２３２】
２．全身送達
患者中の又は血管（若しくはリンパ系）自体の損傷した組織の場合には、循環系への送達が望ましいであろう。医療の当業者に公知の任意の装置を用いて、この発明の組成物を循環系に送達することができる。これらには、注射器、ステント及びカテーテルが含まれるがこれらに限られない。一つの便利な方法は、点滴静注による送達である。他のアプローチには、この発明の組成物を長期間にわたって送達するインプラント例えば経皮パッチが含まれる。かかるインプラントは、時間経過と共に患者によって吸収されてもされなくてもよい。
【０２３３】
３．外科的送達
外科的手順中に、この発明の方法及び組成物を、有利に、利用して、関心ある外科手術を容易にすることができ（介入の量を減らすなど）、並びに外科的手順により生じる損傷の回復を容易にすることができる。この発明の組成物は、外科手術に適した方法で送達することができ、これには、外科手術中の領域を浸すこと、移植可能な薬物送達システム、及びこの発明の組成物を含浸させたマトリクス（時間と共に身体により吸収される）が含まれる。
【０２３４】
４．表面送達
患者の外表面の損傷又は損傷した組織の場合には、この発明の組成物の直接的塗布が好適である。例えば、ＲＤＦ組成物に浸漬したガーゼを、直接、損傷部位に適用することができ、その場所に包帯又は他の包むもので保持することができる。或は、この発明の組成物を、局所適用のために当分野で知られている塗剤、クリーム又は他の医薬組成物にて適用することができる。
【０２３５】
実施例
以下の実施例は、本発明の好適具体例を説明するために含まれるものである。以下の実施例で開示する技術は、この発明の実施において十分機能するように本発明者により発見された技術を表し、それ故、その実施のための好適な方法を構成するものと考えられるということを、当業者は認めるべきである。しかしながら、当業者は、本願の開示に照らして、多くの変形が、開示した特定の具体例において為されうること及びそれらはやはり似た又は同様の結果をこの発明の精神及び範囲から離れることなく得ることができるということを認めるべきである。
【０２３６】
１．１　動物／組織の採取
成体のイモリ Ｎｏｔｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ （テネシー、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＆ Ｃｏ．より購入）を、加湿した部屋に２４℃で維持し、ツビフェクス属の蠕虫を２〜３×／週で給餌した。手術を、０．１％ トリカインで約２〜３分間麻酔した動物に行った。再生中の肢の組織を次のようにして採取した。前肢を、肘の直ぐ近くで切ることにより切断し、軟組織を上げて骨を露出させた。この骨と軟組織を刈り込んで平らな切断表面を生成した。これらのイモリを、０．５％ スルファメラジン溶液中に一晩置いてから、正常な水環境中に戻した。初期の再生組織（切断後１、３及び５日目）を、肢の傷の上皮に近い０．５〜１．０ｍｍを再切断して、任意の残りの骨を除去することにより集めた。再生中でない肢組織は、以前に切断したことのない肢から採取した。組織を前肢の肘に２〜３ｍｍの近いところから採取し、すべての骨を除去した。採取の直後に、すべての組織を液体窒素中で瞬間冷凍して、−８０℃に保存した。
【０２３７】
１．２　タンパク質抽出物の製法
組織を解凍し、その後のすべての操作を、４℃又は氷上で行なった。６グラムの初期再生組織｛１、３及び５日目由来（各２グラム）｝又は６グラムの再生中でない組織を、別々に、プロテアーゼインヒビター（２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、及び１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を含む１０ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；カリフォルニア、Ｃａｒｌｓｂａｄ；ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｎｏ．１１９９５−０６５）中に置く。これらの組織を、電子式組織ホモジェナイザーを用いて１〜２分間破砕し、ハンドホモジェナイザーを用いて１０〜１５分間破砕して、３０秒間超音波処理した。細胞の残骸を、２回の遠心分離工程により除去した。ホモジェネートを先ず、２０００ｇで２５分間回転してから、その上清を再び１００，０００ｇで６０分間回転させた。不溶性の脂質層を吸引して、残りの上清を０．４５μｍフィルターを通してフィルター滅菌した。タンパク質含量をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ；イリノイ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いてアッセイし、０．５ｍｌアリコートにて−８０℃に保存した。
【０２３８】
１．３　細胞培養
イモリのＡ１肢細胞を、Ｊｅｒｅｍｙ Ｂｒｏｃｋｅｓ （ロンドン大学、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、英国、Ｌｏｎｄｏｎ） からの寄贈として得た。マウスのＣ２Ｃ１２筋芽細胞株をＡＴＣＣから購入した。イモリのＡ１細胞を、継代培養して、筋発生を誘導し、筋管を単離して低密度でプレートした（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ及びＢｒｏｃｋｅｓ、１９８８；Ｌｏ等、１９９３）。イモリのＡ１細胞を、２４℃で、２％ ＣＯ２中で生育させた。この培養培地を、Ｏｓｍｅｔｔｅ Ａ自動化オスモメーター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．；バージニア、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ）を用いて、アホロートル血漿の重量オスモル濃度２２５Ｏｓｍに合わせた（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ及びＢｒｏｃｋｅｓ、１９８８）。培養培地は、イーグルの塩を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｎｏ． ８６３０−１）、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、０．２８ＩＵ／ｍｌ ウシ膵臓インシュリン、２ｍＭ グルタミン及び蒸留水を含んだ。
【０２３９】
イモリのＡ１細胞における筋管形成を誘導するために、単核細胞を集密になるまで生育させ、上記の培地を、０．５％ ＦＢＳ（分化用培地；ＤＭ）を含む培地に、４〜６日間、置き換えた。これらの筋管を、残りの単核細胞から、穏やかなトリプシン処理（０．０５％ トリプシン）とそれに続く１００μｍ及び３５μｍのナイロンメッシュを通すふるい分けによって単離した。一層大きい残骸及び凝集した細胞は、第一のふるい上に保持され、殆どの筋管は、第二のふるい上に保持され、殆どの単核細胞は両方のふるいを通過した。筋管を、３５μｍのふるいから穏やかに洗い去って、１〜２筋管／ｈｐｆ又は＜０．２５筋管／ｈｐｆで、０．７５％ ゼラチンで予備被覆した３５μｍのふるいの上にプレートした。
【０２４０】
Ｃ２Ｃ１２細胞を、前に記載されたように、継代培養して、筋発生を誘導する（Ｇｕｏ等、１９９５）。Ｃ２Ｃ１２筋管を単離し、穏やかなトリプシン処理及び１００μｍメッシュを通すふるい分け後に、低密度でプレートした。筋管は、このふるいの上に保持されたが、単核細胞は、通過した。筋管を、このふるいから洗い去って、１〜２筋管／ｈｐｆ又は＜０．２５筋管／ｈｐｆで、０．７５％ ゼラチンで予備被覆した３５μｍのプレート上にプレートした。
【０２４１】
筋管の脱分化を誘導するために、０．１〜０．３ｍｇ／ｍｌのＲＮＬＥをＤＭに、３５ｍｍゼラチン被覆したプレートに低密度（＜０．２５筋管／ｈｐｆ）でプレートした２４時間後に添加した。培地及び抽出物を、毎日交換した。形態的な脱分化を同定するために、個々の筋管を、０日目に、抽出物の添加前に、写真に撮り、抽出物の添加後に、２４時間ごとに、最長で１０日目まで写真を撮った。筋特異的マーカーの筋管ダウンレギュレーション並びに細胞周期のＳ期への再入を調べるために、これらの細胞を、僅かに高密度（１〜２細胞／ｈｐｆ）でプレートし、培地及び抽出物を毎日交換した。これらの細胞を、上記のように、４日目に染色した。ＤＭだけで培養した細胞又は非ＲＮＬＥを含むＤＭ中で培養した細胞を、陰性対照として用いた。
【０２４２】
１．４　免疫蛍光顕微鏡観察
３５ｍｍプレート中に低密度でプレートした細胞を、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗ってから、固定して免疫染色した。別途特定しない限り、すべての操作を室温で行い、すべての抗体希釈物をＰＢＳ中の２％ 正常ヤギ血清（ＮＧＳ）／０．１％ ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）中で調製して、インキュベーション後に、ＰＢＳ中の０．１％ ＮＰ−４０で洗った。細胞を、冷メタノール中で−２０℃で１０分間固定し、ＰＢＳで再水和して、１０％ＮＧＳで１５分間ブロックした。
【０２４３】
【表１０】
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【０２４４】
一次抗体を、１時間、３７℃でインキュベートした。３回洗った後に、細胞を二次抗体と共に、４５分間、３７℃でインキュベートした。トロポニンＴについては、Ａｌｅｘａ５９４に結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１００希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；オレゴン、Ｅｕｇｅｎｅ）を用いたが、他方、ミオゲニン及びｍｙｏＤは、ビオチン−ｘｘヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２００希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とその後のストレプトアビジンＡｌｅｘａ５９４（１：１００希釈、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）との４５分間のインキュベーションを要した。一次抗体を省いた対照実験においては、二次抗体の交差反応は認められなかった。
【０２４５】
幾つかの実験において、細胞を、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いて、１２時間、対比染色した｛５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン標識及び検出キットＩを、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ （Ｒｏｃｈｅ）；インジアナ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）の指示に従って使用｝。細胞を顕微鏡で調べ、固定カメラを装着したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００及び蛍光源を用いて写真に撮った。
【０２４６】
ｍｓｘ１でトランスフォームした細胞については（下記参照）、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｆｗｄクローン及びＲｅｖクローンを、ＤＭ−ドキシサイクリン（ＤＭ−ｄｏｘ）の存在下で誘導して分化させると、筋管を生成した。次いで、筋管を穏やかにトリプシン処理して、低密度でＤＭ−ｄｏｘ中に再プレートした。次の日に、その培地を生育培地（ＧＭ）で置き換えて、成長因子の存在下でｍｓｘ１発現を誘導した。細胞を、ｍｙｏＤ、ミオゲニン及びｐ２１発現について、免疫蛍光により、０日目（誘導前）から３日目（誘導後）まで分析した。二次抗体は、１：２００希釈で利用し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｂ−２７６３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）及びＡｌｅｘａ４８８に結合されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａ−１１０３４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含んだ。筋管を、ダルベッコリン酸緩衝塩溶液（ＤＰＢＳ）で３回すすぎ、ザンボニー固定液で１０分間処理し、ＤＰＢＳで１回洗い、そして０．２％ トリトン−Ｘ−１００（ＤＰＢＳ中）で２０分間透過性にした。これらの筋管を、５％ スキムミルク（ＤＰＢＳ中）で、１時間ブロックしてから、２種の一次抗体にさらした（一つは、マウスモノクローナル抗体で、他は、ウサギポリクローナル抗体、一晩、４℃で）。これらの細胞を、ＤＰＢＳで３回洗ってから、２種の二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８に結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）及びビオチンに結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ）で４５分間３７℃で処理した。筋管をＤＰＢＳで３回洗ってから、１μｇ／ｍｌ ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ５９４（Ｓ−１１２２７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に、４５分間、３７℃でさらした。これらの細胞を、ＤＰＢＳで３回洗って、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００倒立顕微鏡（ＦＩＴＣ及びテキサスレッドフィルター使用）を用いて観察した。
【０２４７】
１．５　イモリの再生溶解物活性の特性決定
Ｃ２Ｃ１２筋管を、低密度でＤＭ中に上記のようにプレートした。再生抽出物を、次の３つの方法の１つで処理した：（１）５分間煮沸する；（２）１％ トリプシンで、３０分間、３７℃で消化する；又は（３）数回の凍結／融解サイクルを行なう。３つの別々の実験において、処理した抽出物を、培養筋管に、培地１ｍｌ当たり０．３ｍｇの濃度で加え、抽出物を毎日交換した。抽出物を１％ トリプシンで消化した直後に、そのトリプシンを、細胞を培養したＤＭにおける希釈によって不活性化した。凍結融解実験中に、抽出物の活性を、２〜３回の凍結／融解サイクルの後に試験した。予備処理した抽出物の筋管のＳ期再入への効果を、処理の４日後に、ＢｒｄＵ取り込みアッセイを行うことにより評価した。これらの結果をＲＮＬＥを含むＤＭ中で培養した筋管（陽性対照）及びＤＭのみ又は非ＲＮＬＥ含有ＤＭ中で培養した筋管（陰性対照）におけるＢｒｄＵ取り込みと比較した。
【０２４８】
１．６　レトロウイルスベクター中のｍｓｘ１の構築
マウスのｍｓｘ１遺伝子の完全なコード領域を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片をプラスミドｐｈｏｘ７ＸＳからＳａｃＩ及びＸｂａＩを用いて切り出し、ｄＮＴＰ及びクレノー断片を用いて鈍端化し、ＬＩＮＸレトロウイルスベクターの鈍端化ＣｌａＩ部位に連結した。このｍｓｘ１遺伝子を順方向（ＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｆｗｄ）及び逆方向（ＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｒｅｖ）の両方の向きで含むクローンを同定して、形質導入研究に用いた。
【０２４９】
１．７　Ｃ２Ｃ１２細胞の形質導入及び誘導性ｍｓｘ１を有するクローンの選択
Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏ 細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＳＤ３４４３）を、１０％ テトラサイクリン試験したＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌ ストレプトマイシン及びＤＭＥＭを含む生育培地（ＧＭ）中で集密の７０〜８０％にまで生育させた。細胞を、１０時間にわたってトランスフェクトした。培地を置き換えて、細胞を更に４８時間生育させた。次いで、このレトロウイルス含有調整培地を収穫して、生きた細胞を５００ｇの遠心分離によって除去した。
【０２５０】
Ｃ２Ｃ１２細胞を、２０％テトラサイクリン試験したＦＢＳ、４ｍＭ グルタミン、２μｇ／ｍｌ ドキシサイクリン、及びＤＭＥＭを含むＧＭ中で２０％集密まで生育させた。Ｃ２Ｃ１２細胞に、ＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｆｗｄ又はＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｒｅｖ組換えレトロウイルスを、Ｔ２５組織培養フラスコ中で、ＧＭを、１ｍｌ レトロウイルス調整培地、２ｍｌ ＧＭ及び４μｇ／ｍｌ ポリブレンよりなるレトロウイルス含有培地で置き換えることによって感染させた。細胞を、３７℃／５％ ＣＯ２中で、１２〜１８時間インキュベートし、培地を新鮮なＧＭで置き換えた。これらの細胞を、更に４８時間インキュベートしてから、３７℃／１０％ ＣＯ２インキュベーターに移した。細胞をそれらが集密に達する直前に分けて、Ｇ４１８（７５０μｇ／ｍｌ）中での選択を開始した。選択を６日間続けてから、それらの細胞を１００ｍｍ組織培養プレートに５０細胞／プレートの密度で分けた。選択を更に８日間継続した。個々の細胞コロニーを、クローニングシリンダーを利用して単離し、これらのクローンをＧＭ−Ｇ４１８中で拡大させた。クローンを、誘導性ｍｓｘ１の発現について、全ＲＮＡのノーザン分析及び減じた成長因子の培地における筋細胞分化の阻止により試験した。
【０２５１】
１．８　形態的脱分化アッセイ
筋管を上記のように調製し、０．２５％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡで穏やかにトリプシン処理して、ＤＭ−ｄｏｘ中に２〜４筋管／ｍｍ２の密度で、碁盤目状の３５ｍｍゼラチン被覆プレート上に再プレートした。次の日に、残っている単核細胞を致死的な水注入及び／又はニードルアブレーション｛エッペンドルフマイクロインジェクションシステム（ニューヨーク、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）使用｝によって破壊した。これらの筋管を、次いで、成長因子の存在下でｍｓｘ１を発現するように、培養培地をＧＭ（ドキシサイクリンマイナス）で置き換えることによって誘導した。これらの細胞を、１２〜２４時間ごとに最長で７日間にわたって、観察して写真に撮った。
【０２５２】
１．９　脱分化細胞についての決定転換及び分化多能性アッセイ
ｍｓｘ１発現を、Ｆｗｄクローンにおいてドキシサイクリン（ｄｏｘ）の非存在下で５日間にわたって誘導してから、更なる５日間にわたって２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下で抑制した。対照用ｍｓｘ１−ｒｅｖ及びＣ２Ｃ１２細胞を、同様に処理した。加えて、脱分化したＦｗｄ−２筋管に由来する細胞の２つのクローン集団を、９６ウェルプレート中の限界希釈物にプレートすることにより得た。上記の細胞を次の決定転換及び分化多能性のアッセイにおいて利用した。
【０２５３】
軟骨形成能力
軟骨形成能力を、２μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンの存在下で、公開されたプロトコール（Ｄｅｎｎｉｓ等、１９９９；Ｍａｃｋａｙ等、１９９８）に従って評価した。それらの細胞ペレットを、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）で処理して、ドライアイス／エタノール浴中で凍結させてから、−８０℃に貯蔵した（プラスチックラップ中にラップして）。クリオスタットを利用して、６μｍ切片を調製した。或は、これらの細胞ペレットを、新たに調製した４％ パラホルムアルデヒド中で、一晩４℃で固定し、一連のエタノール／Ｈｅｍｏ ＤＥ洗液で処理して、パラフィン中に包埋した。ミクロトームを用いて、５μｍ切片を調製した。パラフィン包埋ペレットから調製した切片を、次の手順を用いてアルシアンブルーで染色した。試料を清浄化して水和し、１％ アルシアンブルー（３％ 酢酸、ｐＨ２．５中、又は１０％ 硫酸、ｐＨ０．２中）で３０分間染色し、ｄｄＨ２Ｏで３回洗い、アルコールで脱水して、Ｈｅｍｏ ＤＥにて清浄化した。凍結切片を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣ キットを用いて、製造業者の指示に従って、２型コラーゲンについて染色した。但し、これらの試料を、水和に続いて３％ Ｈ２Ｏ２（メタノール中）で３０分間処理してから、５０μＵ／ｍｌ コンドロイチナーゼＡＢＣで３０分間処理した。抗２型コラーゲン抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．；カリフォルニア、Ｆｒｅｍｏｎｔ）を、１：５０希釈で用い、二次ビオチン化抗体を、１：２００で用いた。試料を、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。肥大化軟骨細胞を記載されたようにして（Ｍａｃｋａｙ等、１９９８）誘導し、ペレットをアルシアンブルーを用いて１０型コラーゲンについて染色した（１：５０；ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．）。
【０２５４】
脂質生成能力
脂質生成能力を評価するために、細胞を、最長で２０日間にわたって、２μｇ／ｍｌ ドキシサイクリン、５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸２−ホスフェート、１０ｍＭ β−グリセロホスフェート及び１０−６又は１０−７Ｍ デキサメタゾンを含むＧＭ中で培養した。培地を２日ごとに交換して、培養を、脂質生成分化の形態的兆候についてモニターした。分化誘導後１４〜１９日目に、これらの細胞を１０％ 中性緩衝ホルマリンで５分間固定し、ｄｄＨ２Ｏで３回すすぎ、０．３％ ｗ／ｖ オイルレッドＯで７分間又は１００ｎｇ／ｍｌ ナイルレッドで５分間染色し、そしてｄｄＨ２Ｏで３回すすいだ。オイルレッドＯで染色した細胞をヘマトキシリンで２分間対比染色し、水道水で３回すすぎ、ｄｄＨ２Ｏで一度すすいだ。ナイルレッドで染色した細胞を、蛍光顕微鏡で観察した（ローダミン又はＦＩＴＣフィルター使用）。
【０２５５】
骨形成能力
骨形成能力を、２μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンの存在下で評価した（Ｊａｉｓｗａｌ等、１９９７）。細胞を、製造業者の指示に従って、Ｓｉｇｍａ Ｋｉｔ ８５を用いて、アルカリホスファターゼについて染色した。
【０２５６】
筋発生能力
筋発生能力を、形態的観察及びミオゲニンを認識する抗体を用いる免疫蛍光によって評価した（免疫蛍光研究と題した節を参照されたい）。筋管が、脂質形成能力又は骨形成能力を評価するために処理した培養にて認められた。
【０２５７】
１．１０　ゼブラフィッシュ動物及びひれ切断
３〜６月齢のゼブラフィッシュを、ＥＫＫ Ｗｉｌｌ Ｗａｔｅｒｌｉｆｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ （フロリダ、Ｇｉｂｓｏｎｔｏｎ）から得て、尾ひれの切断に用いた。魚をトリカインにて麻酔して、切断を、かみそりの刃を用いて行ない、尾ひれの１／２を切除した。動物を、温度を３１〜３３℃に保った水中で、様々な時間にわたって再生させたが；これらの温度は、一層普通に用いられている２５〜２８℃の温度（Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＷｅｓｔｏｎ、１９９５）よりも一層迅速な再生を促進する。次いで、魚を麻酔して、ひれ再生体を分析のために取り出した。
【０２５８】
１．１１　ゼブラフィッシュの全載イン・シトゥーハイブリダイゼーション
プローブ
ジゴキシゲニン標識キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により抗血清ＲＮＡプローブを生成するために、２．８ｋｂ ｆｇｆｒ１ｃＤＮＡ断片、１．７ｋｂ ｆｇｆｒ２ｃＤＮＡ断片、０．６ｋｂ ｆｇｆｒ３ｃＤＮＡ断片、１．５ｋｂ ｆｇｆｒ４ｃＤＮＡ断片（Ｔｈｉｓｓｅ等、１９９５）、１．２ｋｂ ｍｓｘｂｃＤＮＡ断片、２．０ｋｂ ｍｓｘｃｃＤＮＡ（Ａｋｉｍｅｎｔｏ等、１９９５）、０．６ｋｂ ｆｇｆ８（ａｃｅ）ｃＤＮＡ断片（Ｒｅｉｆｅｒｓ等、１９９８）、２．２ｋｂ ｆｇｆ４．１ ｃＤＮＡ（Ｄｒａｐｅｒ等、１９９９）、２．４ｋｂ ｗｆｇｆｃＤＮＡ（Ｄｒａｐｅｒ等、１９９９）、３．８ｋｂ β−カテニンｃＤＮＡ（Ｋｅｌｌｙ等、１９９５）、２．６ｋｂ ｆｌｋ１ｃＤＮＡ断片（Ｌｉａｏ等、１９９７）、及び１．８ｋｂ ｓｈｈｃＤＮＡ（Ｋｒａｕｓｓ等、１９９３）を用いた。ゼブラフィッシュｆｇｆｒｃＤＮＡ配列を含む断片を、他の種の公知のｆｇｆｒチロシンキナーゼドメイン配列を用いる縮重ＰＣＲによって単離した。ｆｇｆｒ遺伝子の割り当ては、相同性の比較に基づき；これらの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託されている。
【０２５９】
イン・シトゥーハイブリダイゼーション
ひれの再生体を、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中の４％ パラホルムアルデヒド中で、４℃で一晩固定し、ＰＢＳを２回換えて簡単に洗い、そして−２０℃での貯蔵のためにメタノール中に移した。ひれをＰＢＳ中のエタノールによって段階的に再水和し、次いで、ＰＢＳ−０．１％ ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン−２０；ＰＢＴ）を４回換えて洗った。次いで、ひれを、ＰＢＴ中の１０μｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫと共に３０分間インキュベートし、ＰＢＴ中で２回すすいだ後に、２０分間再固定した。ＰＢＴによる５回の洗浄の後に、ひれを、６５℃で、１時間にわたって、５０％ ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ ツイーン−２０、５０μｇ／ｍｌ ヘパリン、及び５００μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ（ｐＨは、クエン酸により６．０にする）を含む緩衝液中で予備ハイブリダイズさせ、次いで、一晩、０．５μｇ／ｍｌ ジオキシゲニン標識ＲＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液中でハイブリダイズさせた。ひれを、６５℃で、各１０分間ずつ、７５％ ハイブリダイゼーション緩衝液／２５％ ２×ＳＳＣ、５０％ ハイブリダイゼーション緩衝液／５０％ ２×ＳＳＣ、及び２５％ ハイブリダイゼーション緩衝液／７５％ ２×ＳＳＣ中で洗い、その後、０．２×ＳＳＣ中で、各３０分ずつ、６５℃で２回洗った。各５分間の更なる洗浄を室温で、７５％ ０．２×ＳＳＣ／２５％ ＰＢＴ、５０％ ０．２×ＳＳＣ／５０％ ＰＢＴ、及び２５％ ０．２×ＳＳＣ／７５％ ＰＢＴ中で行なった。２ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含むＰＢＴ中での１時間のインキュベーション後に、ひれを、アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に結合させたひれ予備吸着させた抗ジオキシゲニン抗体の１：２０００希釈物を含む同じ溶液中で２時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ反応のために、ひれを、先ず、反応緩衝液（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ９．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ツイーン−２０、１ｍＭ レバミゾール）中で３回洗ってから、１×ニトロブルーテラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）基質を含む反応緩衝液中でインキュベートした。一般に、０．５〜３時間で、陽性シグナルが得られた。染色反応後に、ひれを、ＰＢＴを数回換えて洗い、ＰＢＳ中の４％ パラホルムアルデヒド中で固定した。ひれ再生体の切片を得るために、ひれを、先ず、１．５％ アガロース／５％ シュークロース中でマウントし、次いで、３０％シュークロース中で、一晩インキュベートした。凍結ブロックを、１４μｍで切片化して、Ｎｏｍａｒｓｋｉオプチクスを用いて観察した。
【０２６０】
各プローブについて、少なくとも７つのひれを、切断後、０、６、１２、１８、２４、４８、及び９６時間の時点での発現について、ｆｇｆｒ１、ｍｓｘｂ、ｍｓｘｃ及びｗｆｇｆプローブを用いて試験し、２５〜１００のひれを幾つかの異なる実験において試験した。センス鎖ＲＮＡプローブを用いた実験を初期アンチセンス実験と共に行なって、シグナルの特異性を評価した。薬理学的に処理したひれにおける遺伝子発現を評価するために、同じ数の未処理のひれをも試験した。次いで、すべての染色反応を、強いシグナルが未処理のひれで低倍率で見られた後に停止した。
【０２６１】
１．１２　ゼブラフィッシュにおけるｆｇｆｒ１インヒビター処理
ＳＵ５４０２（Ｒｉ；ＳＵＧＥＮ、カリフォルニア、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させて、魚水に、１．７μＭ又は１７μＭ（０．０１％ ＤＭＳＯ）の終濃度で加えた。１０匹以下の魚を、１リットルの水で処理し、タンクを暗黒中に３１〜３３℃で維持し、ＳＵ５４０２溶液を各２４時間ごとに交換した。ゼブラフィッシュは、通常、生存し、このインヒビター溶液中でも異常な行動は示さなかった。
【０２６２】
１．１３　ゼブラフィッシュにおけるＢｒｄＵの取り込み
ＢｒｄＵをＰＢＳ中に溶解させて、魚を、１００μｇ／ｍｌの終濃度で処理した。一回の実験のために、ひれを切断して、１７μＭ Ｒｉの非存在下又は存在下で、１８〜２４時間にわたって再生させた（ＢｒｄＵは、再生の最後の６時間の間中存在する）。確立された再生芽におけるＲｉの増殖に対する効果を試験するために、ひれを、先ず、４０時間にわたって再生させた。その後、未処理の魚を、更に２時間再生させてから、ＢｒｄＵと共に６時間インキュベートしたが、他方、Ｒｉ処理した魚は、２時間のＲｉ予備インキュベーション後に、Ｒｉ及びＢｒｄＵの両者と共に６時間インキュベートした。
【０２６３】
ひれを集めて、７０％ エタノール／２ｍＭ グリシン中で一晩固定し、１０μｍの切片を凍結ブロックから作成した。これらの切片を、ＢｒｄＵ取り込みについて検出キット（Ｒｏｃｈｅ；スイス国、Ｂａｓｅｌ）を用いて染色し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。未処理の及びＲｉ処理したひれからの切片を、同時に処理して現像した。８つのひれからの約１００の切片を、１８時間及び２４時間の時点から試験したが、他方、６つのひれからの約５０の切片を、４８時間の時点から試験した。
【０２６４】
２．１　再生抽出物は、イモリの筋管の脱分化を誘導する
再生中のイモリの組織に含まれる因子が脱分化を示す細胞の形態的変化を誘導することができるかどうか測定するために、再生中のイモリの肢の抽出物（ＲＮＬＥ）を調製して、培養したイモリの筋管に加えて、それらの筋管を光学顕微鏡で追跡した。
【０２６５】
１〜５日目のイモリの肢の再生体に由来する傷付いた上皮及び隣接する組織を用いて、上記のように、ＲＮＬＥを調製した。Ａ１筋管を、非常に低密度（＜０．２５細胞／ｈｐｆ）で、０．３ｍｇ／ｍｌ ＲＮＬＥを含むＤＭ中で培養して、各筋管を１０日間にわたって密に追跡し、１２〜２４時間ごとに写真に撮った。形態的脱分化の最初の徴候は、３日目に、筋管がそれらの形状を変えて、一層小さい筋管に分裂したときに明白となった。１０日目までに、１６％の筋管が分裂して、一層小さい筋管又は単核細胞を形成した（表ＩＩ）。ＤＭだけ又はＤＭに非再生肢抽出物（陰性対照）を加えたもので培養した筋管では、形態的変化又は細胞分裂は見られなかった。これらの発見は、ＲＮＬＥが、培養イモリ筋管において形態的脱分化を誘導することができるということを示している。
【０２６６】
ＲＮＬＥの、通常休止している多核のイモリの筋管に対する効果を測定するために、ＲＮＬＥをこれらの細胞に加えて、ＢｒｄＵ取り込みについて試験して、ＤＮＡ合成をアッセイした。イモリのＡ１筋管を、低密度（１〜２細胞／ｈｐｆ）でＤＭ中に置き、０．３ｍｇ／ｍｌ ＲＮＬＥと共に培養した（０日目）。培地及び抽出物を毎日交換し、筋管を、４日目に、ＢｒｄＵ取り込みについてアッセイした。休止中のイモリのＡ１筋管をＲＮＬＥを含むＤＭ中で培養した場合には、これらの細胞の２５％が細胞周期のＳ期に入るように刺激された（表ＩＩ）。対照的に、ＤＭだけで培養した筋管の２％だけが、及び０．３ｍｇ／ｍｌ 非再生抽出物を含むＤＭ中で培養した筋管の３％が、ＢｒｄＵを取り込んだ。これらのデータは、再生中のイモリの組織が、イモリの筋管の細胞周期への再入を誘導することのできる因子を含むことを示している。
【０２６７】
【表１１】
2004511209.tif 000020
【０２６８】
２．２　ＲＮＬＥは、哺乳動物の筋管の分子及び細胞の脱分化を誘導する
ＲＮＬＥが、哺乳動物筋管の形態的脱分化を誘導することができる因子を含むかどうかを測定するために、ＲＮＬＥをＣ２Ｃ１２筋管に加えて、それらの細胞を光学顕微鏡で追跡した。
【０２６９】
これらの筋管を非常に低密度（＜０．２５細胞／ｈｐｆ）でプレートし、０．３ｍｇ／ｍｌ ＲＮＬＥを含むＤＭ中で培養して（０日目）、１２〜２４時間ごとに個別に写真に撮って、次の１０日間にわたって起きる細胞形態の変化を記録した。この培地及び抽出物を、毎日交換した。細胞分裂は、２〜３日目までに、プレートした筋管の１１％において認められ、分裂後に、これらの筋管の半数において細胞増殖が認められた（表ＩＩＩ）。これらの細胞現象は、ＤＭだけ又は０．３ｍｇ／ｍｌ 非ＲＮＬＥを含むＤＭで培養した何れのＣ２Ｃ１２筋管においても見られなかった。而して、ＲＮＬＥと共に培養したマウス筋管は、サイトカインによる一層小さい筋管への分裂を、イモリの筋管と殆ど同じ頻度で受ける（１１％対１６％）。加えて、分裂の後に、しばしば、Ｃ２Ｃ１２筋管における細胞増殖が起きるが、これは、ＲＮＬＥ処理したイモリの筋管は増殖しなかったので、予想外の発見である。これらのデータは、ＲＮＬＥが、培養した哺乳動物の筋管の脱分化及び増殖を誘導するということを示している。
【０２７０】
ＲＮＬＥが筋肉の決定及び分化のタンパク質の発現に影響を及ぼすかどうかを測定するために、ＲＮＬＥをＣ２Ｃ１２筋管に加えて、間接免疫蛍光アッセイを行って、筋分化タンパク質ミオゲニン及びｍｙｏＤ並びに筋収縮タンパク質トロポニンＴの変化した発現を測定した。これらの筋原性マーカーの各々は、ＲＮＬＥと共に４日間培養した際に、Ｃ２Ｃ１２筋管においてダウンレギュレートされた。ミオゲニンとＭｙｏＤの核におけるダウンレギュレーションが、それぞれ、筋管の１５％及び１９％において見られた。トロポニンＴは、筋管の３０％の細胞質においてダウンレギュレートされた。対照的に、ｍｙｏＤとミオゲニンは、一貫して、これらの対照中に存在し、トロポニンＴは、これらの対照の約９４〜９７％において同定された（表ＩＩＩ）。ＲＮＬＥ処理した筋管中のすべてのマーカーのダウンレギュレーションは、４日目までに最大となった。これらのデータは、イモリのＲＮＬＥが、培養哺乳動物筋管において、骨格筋分化因子をダウンレギュレートしたということを示している。
【０２７１】
再生中のイモリの組織がＳ期再入を最終分化した哺乳動物筋管において誘導することができるかどうかを測定するために、ＢｒｄＵの取り込みをＲＮＬＥ処理したＣ２Ｃ１２筋管でアッセイした。Ｃ２Ｃ１２筋管を低密度（１〜２細胞／ｈｐｆ）でプレートして、０．３ｍｇ／ｍｌのＲＮＬＥを含むＤＭ中で培養した。抽出物を０日目に加え、培地と抽出物を毎日交換して、細胞をＢｒｄＵ取り込みについて４日目にアッセイした。ＲＮＬＥ処理したＣ２Ｃ１２筋管の１８％が、Ｓ期再入を示した（図３、表１Ｂ）。対照的に、ＤＭだけ又は非ＲＮＬＥを含むＤＭ中で培養した細胞においては、ＢｒｄＵ取り込みは、見られなかった（表ＩＩ）。それ故、ＲＮＬＥは、培養哺乳動物筋管において細胞周期再入を誘導することができる。
【０２７２】
【表１２】
2004511209.tif 000021
【０２７３】
２．３　脱分化シグナルがタンパク質よりなることは、ありそうなことである　ＲＮＬＥ中で見出された脱分化シグナルは、タンパク質、脂質、核酸及び多糖類を含む多くの異なる種類の生体分子に属しうるものであった。これらのＲＮＬＥの活性成分の少なくとも一つの性質を特性決定するために、本発明者は、この抽出物を多くの異なる条件にかけた。これらの結果を、表ＩＶにまとめた。
【０２７４】
ＲＮＬＥの調製物は、脱分化因子が脂質であるという見込みを減じた（高速遠心分離ステップの後で、可溶性脂質が除去されなかったので）。ＲＮＬＥの反復する凍結融解は、脱分化活性を減じたが、５分間の煮沸は、すべての活性をなくした。ＲＮＬＥをプロテアーゼ、トリプシンで処理した場合には、脱分化シグナルは、完全に破壊され、これは、タンパク質がこの因子の主たる成分であることを示している。この脱分化シグナルは、単一のタンパク質又はタンパク質のグループを含むことができ；かかるタンパク質は、ある種の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を含むことができる。
【０２７５】
【表１３】
2004511209.tif 000022
【０２７６】
２．４　誘導性ｍｓｘ１遺伝子を含むＣ２Ｃ１２クローンの生成
マウスのｍｓｘ１遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）（Ｈｉｌｌ等、１９８９）を、ＬＩＮＸベクター中に、順方向（ＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｆｗｄ）及び逆方向（ＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｒｅｖ）の両方の向きでクローン化した。ＬＩＮＸは、テトラサイクリン制御されるトランスアクチベーター（ｔＴＡ）により調節される最小ＣＭＶプロモーターを含むレトロウイルスベクターである（Ｇｏｓｓｅｎ及びＢｕｊａｒｄ、１９９２；Ｈｏｓｈｉｍａｒｕ等、１９９６）。テトラサイクリン又はその類似体、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）は、ｔＴＡに結合して不活性化し、最小ＣＭＶプロモーターからの転写を阻止する。これらの抗生物質の非存在下では、ｔＴＡは、テトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）に結合して、転写を誘導する。
【０２７７】
ＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｆｗｄ及びＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｒｅｖを、Ｃ２Ｃ１２筋管中に形質導入して、選択培地で生育したクローン（Ｆｗｄ−２、Ｆｗｄ−３及びＲｅｖ−２）を、ｄｏｘを用いて、ｍｓｘ１発現を誘導し又は抑制した。全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロットをｍｓｘ１転写物に相補的な４０ヌクレオチドのオリゴマーをプローブとして調べた。Ｍｓｘ１を誘導し、抑制し、又は誘導してから抑制した。誘導の５日後に、２．１ｋｂのｍｓｘ１シグナルが、Ｃ２Ｃ１２−ＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｆｗｄ（Ｆｗｄ）クローンにおいて認められた。ホスホルイメージ分析は、ｍｓｘ１発現において、２５倍の誘導を示した。ｍｓｘ１を２μｇ／ｍｌ ドキシサイクリンを含む培地での生育により再び抑制した場合には、誘導性発現を示すことができた。ＬＩＮＸ−ｍｓｘ１−ｒｅｖ構築物（Ｒｅｖ）を含むＣ２Ｃ１２筋管及びクローンは、ｍｓｘ１を発現しなかった。
【０２７８】
ｍｓｘ１の異所的発現は、マウスの筋芽細胞の筋管への分化を阻止することが示されている（Ｓｏｎｇ等、１９９２）。誘導されたｍｓｘ１タンパク質が機能的であるかどうかを評価するために、トランスフェクトした筋芽細胞を、それらの分化する能力について試験した。クローンをｄｏｘ中で生育させて、ｍｓｘ１発現を誘導し又は抑制した。一度集密に達したならば、ＧＭをＤＭと交換して、ｍｓｘ１の誘導又は抑制を続けた。１０日間にわたって、これらのクローンを、分化の形態的徴候について、位相差顕微鏡により観察した。ｍｓｘ１発現を抑制する条件下で培養したＦｗｄクローンは、容易に、筋管を生成したが、ｍｓｘ１を発現するものは、筋管を生成できなかった。対照用Ｃ２Ｃ１２筋管及びＲｅｖクローンは、誘導又は抑制条件で処理したときに正常に分化した。これらの結果は、Ｆｗｄクローンが、機能的ｍｓｘ１を生成する誘導性ｍｓｘ１遺伝子を含んでいたということを示している。２つのＦｗｄクローン（Ｆｗｄ−２及びＦｗｄ−３）及び１つのＲｅｖクローン（Ｒｅｖ−２）を、更なる研究のために選択した。
【０２７９】
２．５　Ｍｓｘ１は、マウス筋管における筋分化タンパク質の発現を逆転させる
筋管脱分化の一つの生化学的指標は、筋原性分化タンパク質のレベルの減少である。筋原性因子ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＭＲＦ４及びｐ２１が、ｍｓｘ１の発現の結果として減少するかどうかを測定するために、間接免疫蛍光アッセイを、ＧＭの存在下でｍｓｘ１を発現するように誘導された筋管について行った。これらの筋原性因子のすべては、マウス筋管において変化する程度に減少した。ｍｓｘ１誘導のＩ日以内に、ＭＲＦ４は、誘導された筋管の３４％において検出不能なレベルに減少した。同様に、ミオゲニンは、すべての誘導された筋管の約２６％において検出不能であった。検出不能なＭＲＦ４及びミオゲニンのレベルを示す筋管のパーセンテージは、２及び３日目までに、それぞれ５０％及び３８％に上昇した。ＭｙｏＤ発現は、ｍｓｘ１誘導の第２日まで影響を受けなかった。２日目に全筋管の１０％が、ＭｙｏＤレベルの顕著な減少を示し、このパーセンテージは、３日目までに２８％に上昇した。検出不能なｐ２１のレベルを示す筋管のパーセンテージは、誘導後の１日目の１０％から３日目までに２０％まで上昇した。試験筋管の筋原性タンパク質レベルの観察された減少は、筋管の加齢の結果ではないことを確実にするために、対照用筋管を同齢のものとした。筋タンパク質の正常な発現が、対照用Ｃ２Ｃ１２筋管の９０〜１００％において認められた。これらの結果は、異所的ｍｓｘ１発現が、筋原性タンパク質レベルの減少を最終分化した哺乳動物筋管において引き起こすことができることを示している。
【０２８０】
２．６　Ｍｓｘ１は、マウス筋管の分裂及び細胞増殖を誘導する
異所的ｍｓｘ１発現及び成長因子刺激が最終分化した哺乳動物筋管の分裂を誘導することができるかどうかを試験するために、単離された筋管を低密度でプレートして、残りの単核細胞を致死的注入及び／又はアブレーションによって除去した（Ｋｕｍａｒ等、２０００）。新鮮なＤＭをこれらの筋管に加えて、それらを一晩インキュベートした。これらの培養物を、再び、残留単核細胞につき検査し、存在しているものを除去してから、全グリッデド領域を写真に撮った。この手順の後では、Ｆｗｄ又は対照用筋管において、残留単核細胞は認められなかった。次いで、ｍｓｘ１発現を一組のＦｗｄ筋管において誘導したが、一組の対照用筋管は、抑制されたままであった。両方の組の筋管を、ＧＭで刺激し、その後、毎日、最長で７日目まで顕微鏡観察及び写真撮影を行った。脱分化を、次の基準を用いる形態的試験によって評価した：（１）筋管の単核細胞又は一層小さい筋管への分裂及び（２）筋管由来単核細胞の増殖。図３Ａは、大きい多核の筋管（分裂して、２つの一層小さい多核筋管を形成する）の例を示している。この大きい筋管の分裂は、ｍｓｘ１誘導において、６日目に殆ど完了した。一度分裂すれば、それらの２つの筋管は、分離したままであって、脱分化の存続期間中、生存可能であった（対照用筋管培養物にて供給）。誘導条件で処理した１４８の試験筋管のうちで、１３（８．８％）が、分裂して、一層小さい筋管又は単核細胞を形成した。脱分化の最初の徴候は、ｍｓｘ１の誘導２日後に明確になった。この時点で、脱分化する筋管は、完全に分裂して、単核細胞を形成した。細胞ストレッチ及び分裂開始などの切迫した分裂の徴候も又、認められた。かかる分裂は、最終的に、４．５日目までに増殖する、単核の細胞を生じた。これらの筋管から生じたこれらの単核細胞は、増殖し続け、７日目までに細胞集密に達した。その結果生じた単核細胞の増殖は、５日目までに明らかとなり、６日目には、多くの筋管由来の単核細胞が存在した。誘導条件で処理した１４８の試験筋管のうちで、８（５．４％）が、増殖する単核細胞のプールへと脱分化した。従って、ｍｓｘ１は、筋管を、ストレッチ及び分裂へと誘導し、一層小さい筋管又は増殖する単核細胞を生じる。
【０２８１】
筋管の単核細胞への分裂及びその後の増殖がｍｓｘ１発現から生じるものであって隠れた残留単核細胞のアーティファクトの結果ではないことを確認するために、これらの実験を、未誘導Ｆｗｄ、Ｒｅｖ及び形質導入してないＣ２Ｃ１２筋管よりなる対照用細胞を用いて繰り返した。研究した１５１の対照用筋管のうちで、唯一つの典型的でない筋管が分裂して、少数の単核細胞を形成した。しかしながら、これらの細胞は、ＧＭ中では、７日後でさえ、増殖しなかった。他の何れの対照用筋管も、ストレッチング及び分裂の証拠を示さなかったし、増殖する単核細胞は認められなかった。厳格なフィッシャー−アービン検定は、ｍｓｘ１発現筋管と対照用筋管との間の分裂頻度の差異が、ｐ＝０．０００６で有意であることを示した。同様に、ｍｓｘ１発現筋管と対照用筋管との間の分裂／増殖頻度の差異は、ｐ＝０．００３で有意である。従って、異所的ｍｓｘ１発現と成長因子による刺激との組合せは、脱分化させるべきマウスの筋管のあるパーセンテージを、一層小さい筋管又は増殖する単核細胞に誘導することができる。
【０２８２】
２．７　Ｍｓｘ１は、マウスの筋管の多能性幹細胞への脱分化を誘導する
脱分化した、増殖する単核細胞が多能性であるかどうかを測定するために、単一のＦｗｄ−２筋管に由来する細胞の２つのクローン集団を単離した。これらのクローンを、脂質生成、軟骨形成、骨生成又は筋発生に有利な条件下で培養した（Ｄｅｎｎｉｓ等、１９９９；Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ等、１９８８；Ｊａｉｓｗａｌ等、１９９７；Ｍａｃｋａｙ等、１９９８；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ等、１９９９）。Ｍｓｘ１発現を、これらの再分化アッセイ中抑制した。
【０２８３】
これらの脱分化クローンを、２．５×１０５細胞を軟骨形成性分化用培地中でペレット形成して、それらの細胞ペレットに２日ごとに新鮮な培地を供給することによって軟骨形成能力について試験した。これらの細胞は、容易に、アルシアンブルーでかすかに染色され、ＩＩ型コラーゲンを含む細胞外マトリクスを生成する軟骨細胞に分化した。分化した細胞を、更に誘導して、アルシアンブルーで染色され、Ｘ型コラーゲンと反応する肥大性軟骨細胞を形成することができた。軟骨細胞又は肥大性軟骨細胞は、対照用Ｃ２Ｃ１２又はｍｓｘ１−ｒｅｖ−２細胞において同定されなかった。
【０２８４】
脂質生成分化用培地（ＡＤＭ）中で７〜１６日間培養した場合には、脱分化したクローンは、含脂肪細胞の形態を示す細胞を生じた。これらの細胞を、親油性染料のオイルレッドＯ及びナイルレッドでの処理に際して明るいオレンジ色に染まる多くの液胞の存在により特性決定した（図４Ａ）。ＡＤＭで処理した対照用Ｃ２Ｃ１２又はＲｅｖ−２細胞は、これらの脂質生成性の特徴を示さなかった（図４Ａ）。この形態的特徴と脂質染色性液胞の組合せは、これらの細胞の幾つかが、含脂肪細胞に分化したことを示唆している。
【０２８５】
脱分化したクローンは又、骨形成誘導培地（ＯＩＭ）での処理によって、骨形成マーカーを発現する細胞への分化を誘導することもできた。我々は、３５ｍｍプレート当たりの多くのアルカリホスファターゼ活性について陽性に染色される細胞フォーカスを観察したが、非常に僅かのアルカリホスファターゼが、対照用Ｃ２Ｃ１２又はＲｅｖ−２細胞において同定された。筋管は、容易にＡＤＭ又はＯＩＭ中で形成されて、形態及び抗ミオゲニン抗体に対する反応性によって同定された（図４Ａ）。予想されるように、対照用Ｃ２Ｃ１２及びＲｅｖ細胞も又、容易に筋管に分化する（図４Ａ；データは示してない）。
【０２８６】
従って、異所的ｍｓｘ１発現と成長因子処理との組合せは、最終分化したマウス筋管の、増殖する、多能性幹細胞（幾つかの細胞系統に再分化することができる）のプールへの分化を誘導することができる。
【０２８７】
２．８　Ｍｓｘ１は、マウス筋芽細胞の決定転換を誘導する
本発明者は、もしｍｓｘ１発現が最終分化した筋管を完全に脱分化させたならば、ｍｓｘ１の異所的発現がＣ２Ｃ１２筋芽細胞の決定転換を促進しうるであろうことを予期した。Ｍｓｘ１発現を、Ｆｗｄ筋芽細胞中で５日間誘導してから、抑制した。適当な培地で処理した場合には、これらの細胞は、容易に、軟骨細胞、含脂肪細胞、筋管及び骨形成マーカーを発現する細胞に分化する（図５）。決定転換の証拠は、対照用細胞においては認められなかった。これらの結果は、筋芽細胞の決定転換が、ｍｓｘ１の異所的発現から生じたを示している。
【０２８８】
２．９　Ｆｇｆシグナリング経路のメンバーの、ゼブラフィッシュのひれ再生芽形成及び再生伸出中の発現
ゼブラフィッシュのひれは、幾つかの分節化した骨質のひれ鰭条又は鱗状鰭条よりなり、各々は、一対の凹面よりなり、それは、結合組織（繊維芽細胞を含む）並びに神経及び血管を囲む半鰭条に面している。鱗状鰭条は、血管化して神経分布した軟らかい間充織によって結合されている。鱗状鰭条再生中に起きる初期事象は、３３℃に高めた場合には、４つのステージ（Ａ〜Ｄ）に分けることができる（Ｇｏｓｓ及びＳｔａｇｇ、１９５７；Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＷｅｓｔｏｎ、１９９５；Ｓａｎｔａｍａｒｉａ及びＢｅｃｅｒｒａ、１９９１）。第一ステージ中（切断の０〜１２時間後）に、ひれの上皮細胞に由来する傷の上皮が、断端上に形成される。ステージＢ（切断の約１２〜２４時間後）に、傷の上皮細胞は、蓄積し続ける。一方、切断部位に最も近い１〜２分節及び半鰭条間に位置した繊維芽細胞及び骨片母細胞（又は、骨芽細胞）は、ゆるんで組織が乱れ、縦向きの形態となり、傷の上皮に向かって移動するように見える。ステージＣ（２４〜４８時間）までに、これらの細胞の遠方への移動及び増殖が、再生芽を生じている。ステージＤ（４８時間及び再生の残りの期間中）に、再生芽は、次の２つの顕著な機能を有すると考えられる：（１）遠い部分が、細胞分裂により伸出を促進し；（２）近い部分は分化して、再生ひれの特異的構造を形成する。尾ひれの切断後には、完全な再生が、１〜２週間で起きる。
【０２８９】
Ｆｇｆシグナリングがゼブラフィッシュの尾ひれの再生に関与していることを示すために、４つのｆｇｆｒ遺伝子の初期ひれ再生における発現を、切断後０〜９６時間の時点で、イン・シトゥーハイブリダイゼーションを用いて評価した。かすかであるが一貫したｆｇｆｒ１の発現がひれの再生で検出された最も初期の時点は、再生芽形成過程にあるらしい細胞において、切断後１８時間であった。縦のひれの切片は、切断後１８〜２４時間で、ｆｇｆｒ転写物が、切断面にすぐ隣接する半鰭条と該面から遠い半鰭条との間の繊維芽細胞様細胞に局在することを示した。切断後４８時間において、再生伸出中に、全載分析は、再生体の遠い部分と近い部分の両方で、一貫して、ｆｇｆｒｌの発現を示した。このステージの切片は、遠い再生芽を構成する細胞の小集団並びに再生上皮の基底層のかなりの部分において転写を示した。この上皮ドメインは、このステージにおいてソニックヘッジホッグ（ｓｈｈ）を発現する細胞と重複するようであった（Ｌａｆｏｒｅｓｔ等、１９９８）。これらの発現ドメインは又、切断後９６時間でもはっきり見えた。加えて、ｆｇｆｒ２及びｆｇｆｒ３の弱いが一貫した発現が、近いひれ再生体で、切断後４８時間の早い時点で認められた。これらのレセプターは、拡散したドメインで同様に発現された。ｆｇｆｒ４発現は、再生中のひれにおいて検出されなかった。これらのデータは、このひれ再生体の細胞（再生芽前駆細胞並びに成熟再生芽細胞を含む）がＦｇｆのレセプターを発現することを示している。
【０２９０】
ｍｓｘ遺伝子は、Ｆｇｆシグナリング経路における下流の転写標的として含まれており（Ｋｅｔｔｕｎｅｎ及びＴｈｅｓｌｅｆｆ、１９９８；Ｖｏｇｅｌ等、１９９５；Ｗａｎｇ及びＳａｓｓｏｏｎ、１９９５）、胚の間充織の未分化状態（Ｓｏｎｇ等、１９９２）並びに成体の有尾目両生類の肢再生芽（Ｋｏｓｈｉｂａ等、１９９８）に重要であると仮定されてきたので、このひれ再生体におけるゼブラフィッシュのｍｓｘｂ及びｍｓｘｃの発現の開始及びドメインを試験した。検出可能なｍｓｘｂのひれ再生体における発現は、切断の１８時間後であった。切片は、再生芽形成中に、ｍｓｘｂ転写物が、切断面のすぐ近く及び遠くの繊維芽細胞様細胞において、ｆｇｆｒ転写物と同様の仕方で分布していることを示した。再生の４８時間目まで及び残りの期間中、すべてのｍｓｘｂ陽性細胞は前に報告されたように（Ａｋｉｍｅｎｋｏ等、１９９５）遠い再生芽領域内に含まれた。Ｍｓｘｃの発現ドメインは、事実上、すべての時点において、ｍｓｘｂのそれと同一であった。再生芽形成中及び再生伸出中のｆｇｆｒｌ転写物とｍｓｘｂ及びｍｓｘｃ転写物との同じ局在性は、Ｆｇｆシグナリングがこれらの過程において重要であるという仮説を支持している。
【０２９１】
Ｆｇｆが再生中のひれにおいて合成されることを示すために、特性決定されたゼブラフィッシュのｆｇｆ遺伝子を表すプローブをイン・シトゥーハイブリダイゼーション実験において使用した。ｆｇｆ４．１又はｆｇｆ８（ａｃｅ）転写物は、ひれ再生体において検出されなかった。しかしながら、Ｆｇｆ８、Ｆｇｆ１７及びＦｇｆ１８Ｆｇｆリガンドのサブクラスのメンバー「創傷（Ｗ）ｆｇｆ」は、このひれ再生体において発現された（Ｄｒａｐｅｒ等、１９９９）。ｗｆｇｆの発現は、切断後４８時間において、再生上皮の遠い殆どの細胞において、一貫して認められ、そこでは、それは、伸出中維持された。再生芽形成中のｗｆｇｆ発現を調べる実験は、二義的であり、再生体の約５０％におけるかすかな発現を示している。これらのデータは、少なくとも一つのＦｇｆメンバーが再生中のひれに存在していることを示している。
【０２９２】
２．１０　Ｆｇｆｒ１の阻害は、再生芽形成をブロックする
ひれの再生におけるＦｇｆの役割を機能的に評価するために、親油性薬物ＳＵ５４０２（Ｒｉ）を利用した（該薬物は、Ｆｇｆｒ１の自己リン酸化及び基質のリン酸化を、そのチロシンキナーゼドメインに特異的に結合することにより破壊することが知られている）。哺乳動物細胞におけるＦｇｆｒ活性についてのＲｉのＩＣ５０は、１０〜２０μＭであることが以前に示された（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ等、１９９７）。この濃度のＲｉは、発生中のゼブラフィッシュ胚に加えると、尾部構造の劇的な切り詰めを引き起こす。かかる胚は、ドミナントネガティブＦｇｆｒ１をコードするｍＲＮＡを注入されたものと著しく似ている（Ｇｒｉｆｆｉｎ等、１９９５）。それ故、Ｒｉは、ゼブラフィッシュＦｇｆｒ１活性を効果的にブロックした。
【０２９３】
以前の研究は、Ｒｉが、血小板由来成長因子、上皮成長因子及びインシュリンレセプターを哺乳動物細胞において、５０μＭより高濃度でブロックしないこと及び多くのセリンスレオニンキナーゼの活性に対して効果を有しないことを示している（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ等、１９９７；Ｓｕｎ等、１９９９）。しかしながら、Ｒｉは、Ｆｌｋ１、血管内皮成長因子及び内皮前駆細胞の最も初期に知られたマーカーを１０〜２０μＭで阻害する（Ｌｉａｏ等、１９９７）。ゼブラフィッシュのひれの再生では、ｆｌｋ１の一貫した発現は、それが再生芽細胞中に現れたときに（ｎ＝２２）、切断後９６時間まで認められなかった。ｆｌｋ１発現は、再生芽形成中に、切断後２４時間では、イン・シトゥーハイブリダイゼーションによっては明白ではなかった（ｎ＝１４）。
【０２９４】
Ｆｇｆｒ１によるシグナリングが再生に必要とされるかどうかを測定するために、ゼブラフィッシュをＲｉで９６時間処理した直後に切断を行った。ゼブラフィッシュの１．７μＭ Ｒｉ（０．５ｍｇ／リットル）での処理は、変化する程度にひれの再生を阻止した。試験した１０のひれのうち、４つは、正常に再生し、５つは、わずかに再生欠損であり、１つは、再生をブロックされた。しかしながら、１７μＭ Ｒｉ（５ｍｇ／リットル）にさらされたすべての動物は、完全な再生ブロックを示した（ｎ＝９）。これらの結果は、Ｆｇｆシグナリングがゼブラフィッシュのひれの再生に必要であることを示した。
【０２９５】
再生芽がＦｇｆシグナリングの非存在下で形成されるかどうかを測定するために、Ｒｉ処理したひれ再生体を、形態的に調べた。傷の上皮は、一貫して、Ｒｉ処理した魚のひれの断端上に形成されたが、再生芽の形態形成は起きなかった。しかしながら、切断面に近い間充織細胞は、組織の乱れ並びに遠い移動を示唆する縦向きを示した。
【０２９６】
ＢｒｄＵの取り込みを利用して、ＤＮＡ複製と細胞増殖を分析した。切断の後１２〜１８時間及び１８〜２４時間で、Ｒｉ処理したひれにおいて、正常な近い間充織細胞の標識が認められた。再生芽細胞が、Ｒｉの存在下でＤＮＡ複製するかどうかを測定するために、再生伸出中（切断後４０〜４８時間）に、Ｒｉで短く処理したひれにおけるＢｒｄＵの取り込みを分析した。これらのひれの再生芽細胞は、大いに減少したＢｒｄＵの取り込みを示した。遠い再生芽細胞は、未処理のひれの切片において日常的に標識されたが、これらの細胞の標識は、Ｒｉ処理したひれ由来の切片においては、決して認められなかった。その上、標識された近い再生芽細胞は、遠い再生芽における分裂によりＢｒｄＵを取り込んだということはありそうなことであり、未処理のひれの切片には多量に分布していたが、Ｒｉ処理したひれの切片にはまばらに分布していた。それにもかかわらず、切断面に近い間充織細胞の増殖は、やはり、未処理の及びＲｉ処理したグループにおいて類似していた。近い間充織におけるＲｉによる効果の欠如は、乏しい組織透過のためではなかった（ＢｒｄＵ処理の前にＲｉで４８時間処理したひれも、正常な近い間充織の取り込みを示したので）。これらの結果は、Ｆｇｆシグナリングが再生芽形成（おそらく、傷の上皮の近くの間充織細胞の増殖を促進することによる）に必須であることを示している。
【０２９７】
Ｒｉ処理したひれにおける再生のブロックの分子的効果を評価するために、β−カテニン、ｍｓｘｂ及びｍｓｘｃの発現を分析した。β−カテニンは、未処理の再生中のひれの傷上皮において、切断後３時間という早期に及び再生過程を通して、高レベルで発現された。β−カテニンの発現は、Ｒｉ処理したひれにおいては正常であり、これは、かかるひれが傷の治癒に大きな欠損を有しないことを示唆している（ｎ＝７）。しかしながら、Ｒｉ処理したひれにおける再生芽マーカーｍｓｘｂ及びｍｓｘｃの発現は、２４時間の再生体において、極めて低いか又は検出不能であり、４８時間の再生体においては検出不能であった（ｍｓｘｂ：２１ひれ、ｍｓｘｃ：８ひれ）。これらのデータは、Ｆｇｆシグナリングがひれの再生体におけるｍｓｘｂ／ｃの転写に必要であることを示している。
【０２９８】
２．１１　Ｆｇｆｒ１阻害は、再生伸出をブロックする
ｗｆｇｆ及びｆｇｆｒ１発現ドメインは、伸出中ひれ再生体に維持され、再生芽細胞のＢｒｄＵ取り込みはＲｉによってブロックされるので、Ｆｇｆシグナリングが再生芽の維持／再生伸出に関与することは有りそうなことである。この仮説を試験するために、Ｒｉの進行中の再生体に対する効果を試験した。Ｒｉ処理は、更に、２４〜７２時間のひれ再生体の伸出を阻止し、しばしば、異常に厚い再生上皮の蓄積並びにメラノサイトの隣接鰭条への背腹移動を引き起こした。この結果は、通常新しい遠位成長と対をなす上皮及び色素細胞による細胞移動過程の結果でありうる。加えて、新たな骨の沈着は、伸出の欠如にも拘わらず、Ｒｉ処理によって中断されず、鱗状鰭条物質が、これらのひれの分節中の異常に遠い位置で認められた。
【０２９９】
このＲｉによる伸出阻止の分子効果を調べるために、マーカー発現を、Ｒｉの適用期間の２４時間後に試験した。４８又は７２時間での上皮ｗｆｇｆ発現の有意の減少は、見られなかった（ｎ＝１６）。しかしながら、ｍｓｘｂの発現は、既に２４〜４８時間にわたって正常に再生しているＲｉ処理したひれにおいて減少した（１８のＲｉ処理したひれのうちの１０が、検出可能なｍｓｘｂ発現を有しなかったが、残りの８つのひれは、低レベルを示した）。ｍｓｘｃ発現に対する類似の効果が認められた（ｎ＝８）。ｍｓｘｂの発現は、Ｒｉに４８時間さらした２４又は４８時間のひれ再生体において検出されなかった（ｎ＝１８）。従って、Ｆｇｆシグナリングは、再生芽形成及び再生伸出に必要であるが、メラノサイト移動又は骨の沈着を含む他の過程には、決定的ではない。
【０３００】
最後に、ｆｇｆｒ１は又、再生伸出中に、上皮細胞においても発現されたので（図２Ｃ、Ｄ参照）、Ｆｇｆシグナリングは、再生体のパターニングに重要でありうる。この仮説を試験するために、Ｒｉ処理の、パターニング遺伝子ｓｈｈの発現に対する効果を測定した。以前に報告されたように、ｓｈｈは、切断の４８時間後という早期に、ひれの上皮の基底層の両側ドメインに位置した（Ｌａｆｏｒｅｓｔ等、１９９８）。これらの細胞からのＳｈｈの放出は、再生芽細胞の骨片母細胞（再生体の新たな分節の形成において、骨を沈着させる）への分化を指示すると考えられる。４８又は７２時間のひれ再生体のＲｉでの処理は、ｓｈｈ発現を劇的に減少させた（１８のひれのうちの０が、検出可能なｓｈｈ転写物を有した；図６Ｈ）。これらのデータは、ひれ再生体におけるｓｈｈの正常な発現には、完全なＦｇｆシグナリングが必要であることを示している。
【０３０１】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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