(57)【要約】本発明は、脂肪により制御される遺伝子を特定する方法と、特定された遺伝子およびそれらのタンパク質を用いることにより疾患の治療に使用する組成物を決定する際に引き続き該遺伝子を使用することに関する。特定された組成物は、脂肪により制御される遺伝子の発現を制御するか、またはそれらのタンパク質産物の活性を調節する。新規なミトコンドリア担体タンパク質であるＭＥＴＰおよび脂肪応答性転写因子であるＦＴＦ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が教示される。血漿糖タンパク質Ａ１ＢＧのヌクレオチド配列が教示される。ヒトＧＰＡＴおよびラットＧＬＯＬのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が教示される。ヒトＭＥＴＰ、ＧＬＯＬ、ＦＴＦ１、ＳＣＤ、ＧＰＡＴおよびＡ１ＢＧの制御配列が教示される。ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＦＴＦ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＧＢ、Ｓｐｏｔ−１４、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼおよびＭＥＴＰについて、多価不飽和脂肪酸制御機能が教示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１を含む配列と、
（ｂ）配列番号３を含む配列と、
（ｃ）配列番号６を含む配列と、
（ｄ）配列番号１１を含む配列と、
（ｅ）配列番号１３を含む配列と、
（ｆ）配列番号１６を含む配列と、
（ｇ）配列番号１８を含む配列と、
（ｈ）配列番号２４を含む配列と、
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、
（ｊ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、
（ｋ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、
（ｌ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、
（ｍ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列と、
（ｎ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｍ）のいずれかとハイブリッド形成する配列と、
（ｏ）（ａ）〜（ｍ）のいずれかの機能的誘導体である配列とからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドセグメント。
【請求項２】
ｃＤＮＡである請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドセグメント。
【請求項３】
適切なベクター中に請求項１に記載のポリヌクレオチドセグメントを含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドセグメントと異種である宿主細胞中に前記セグメントを含む宿主細胞。
【請求項５】
（ａ）請求項１に記載のセグメントのヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を有する配列と、
（ｂ）請求項１に記載のセグメントのヌクレオチドの少なくとも３０個の連続した塩基を有する配列と、
（ｃ）請求項１に記載のセグメントのヌクレオチドの少なくとも５０個の連続した塩基を有する配列とからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドセグメントと異種であるベクター中に含まれた前記セグメントを含むベクター。
【請求項７】
タグを含むか、またはタグをコードする請求項３または６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１に記載のセグメントによりコードされるポリヌクレオチドとほぼ同じ生物学的機能または活性を保有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドセグメント。
【請求項９】
請求項１に記載のポリヌクレオチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記セグメントを有する対照動物および前記セグメントを有する試験動物を選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記セグメントの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項１０】
前記動物が哺乳類である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記哺乳類がラットである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項４に記載の宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記セグメントの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項１３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項４に記載の宿主細胞、その一部またはその単離ポリヌクレオチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記セグメントの産物または前記セグメントの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項１４】
（ａ）配列番号２を含む配列と、
（ｂ）配列番号４を含む配列と、
（ｃ）配列番号７を含む配列と、
（ｄ）配列番号１２を含む配列と、
（ｅ）配列番号１４を含む配列と、
（ｆ）配列番号１７を含む配列と、
（ｇ）配列番号２５を含む配列と、
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、
（ｉ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、
（ｊ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、
（ｋ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、
（ｌ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列とからなる群から選択される単離ポリペプチドを含む単離ポリペプチドセグメント。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリペプチドセグメントと異種である宿主細胞中に前記セグメントを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載のセグメントのポリペプチドの生産に十分な条件下で請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程からなる前記ポリペプチドを生産するプロセス。
【請求項１７】
請求項１４に記載のポリペプチドとほぼ同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドセグメント。
【請求項１８】
請求項１４に記載のポリペプチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記セグメントを有する対照動物と前記セグメントを有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記セグメントの発現産物または前記セグメントの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項１９】
前記動物が哺乳類である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳類がラットである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１４に記載のポリペプチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項１５に記載の宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記セグメントの発現産物または前記セグメントの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載のポリペプチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項１５に記載の宿主細胞、その一部またはその単離ポリペプチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記セグメントの産物または前記セグメントの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項２３】
（ａ）配列番号５を含む配列と、
（ｂ）配列番号１０を含む配列と、
（ｃ）配列番号１５を含む配列と、
（ｄ）配列番号２０を含む配列と、
（ｅ）配列番号２１を含む配列と、
（ｆ）配列番号２６を含む配列と、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、
（ｉ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、
（ｊ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、
（ｋ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列と、
（ｌ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｋ）のいずれかとハイブリッド形成する配列とからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドセグメント。
【請求項２４】
ゲノムＤＮＡである請求項２３に記載の単離ポリヌクレオチドセグメント。
【請求項２５】
適切なベクター中に請求項２３に記載のポリヌクレオチドセグメントを含むベクター。
【請求項２６】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドセグメントと異種である宿主細胞中に前記セグメントを含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドセグメントに作動可能なように連結された遺伝子によりコードされるポリペプチドの生産に十分な条件下で請求項２６に記載の宿主細胞を培養する工程からなる、前記ポリペプチドを生産するプロセス。
【請求項２８】
（ａ）請求項２３に記載のセグメントのヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を有する配列と、
（ｂ）請求項２３に記載のセグメントのヌクレオチドの少なくとも３０個の連続した塩基を有する配列と、
（ｃ）請求項２３に記載のセグメントのヌクレオチドの少なくとも５０個の連続した塩基を有する配列とからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドフラグメント。
【請求項２９】
請求項２８に記載のポリヌクレオチドセグメントと異種であるベクター中に含まれた前記セグメントを含むベクター。
【請求項３０】
請求項２３に記載のセグメントによりコードされるポリヌクレオチドとほぼ同じ生物学的機能または活性を保有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドセグメント。
【請求項３１】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記セグメントを有する対照動物および前記セグメントを有する試験動物を選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記セグメントに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項３２】
前記動物が哺乳類である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳類がラットである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項２６に記載の宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記セグメントに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項３５】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）請求項２６に記載の宿主細胞、その一部またはその単離ポリヌクレオチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記セグメントに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項３６】
請求項１、１４または２３のいずれか１項に記載のセグメントを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を治療するための組成物。
【請求項３７】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記障害が、湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸、ならびにそれらの機能的誘導体および化学的誘導体からなる群から選択される請求項３６に記載の組成物。
【請求項４０】
脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を治療するための請求項３６に記載の組成物の使用。
【請求項４１】
ＰＵＦＡ障害を治療するための請求項４０に記載の組成物の使用。
【請求項４２】
前記障害が、湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、前記対象の組織試料由来の請求項１または２３に記載のセグメント中の生殖系列における配列を野生型の前記セグメントの生殖系列における配列と比較することからなる、前記対象における請求項１または２３に記載のセグメント中の生殖系列における変化の検出を含み、前記対象の生殖系列における配列の変化が前記障害の存在または素因を示す方法。
【請求項４４】
前記障害はＰＵＦＡ障害である請求項４３に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項４５】
前記障害が、湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項４４に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項４６】
前記比較が、免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ＤＮＡフィンガープリント法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ラジオイムノアッセイ、免疫放射線検定法および免疫酵素検定法からなる群から選択される方法により実施される請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、前記対象の組織試料由来の請求項１４に記載のポリペプチドの配列を野生型の前記ポリペプチドの配列と比較することからなり、前記野生型と比較したときの前記対象の配列の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる前記障害の存在または素因を示す方法。
【請求項４８】
前記障害はＰＵＦＡ障害である請求項４７に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項４９】
前記障害が、湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項４８に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項５０】
前記比較が、ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ＤＮＡフィンガープリント法、ラジオイムノアッセイ、免疫放射線検定法、免疫酵素検定法およびポリペプチド微量検定法からなる群から選択される方法により実施される請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを有する対照動物と前記ポリヌクレオチドを有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記ポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項５２】
前記動物が哺乳類である請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳類がラットである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項５５】
ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞、その一部またはその単離ポリヌクレオチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリヌクレオチドの産物または前記ポリヌクレオチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項５６】
ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを有する対照動物と前記ポリペプチドを有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記ポリペプチドの発現産物または前記ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項５７】
前記動物が哺乳類である請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記哺乳類がラットである請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを含み、前記ポリペプチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリペプチドの発現産物または前記ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項６０】
ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドを含み、前記ポリペプチドと異種である宿主細胞、その一部またはその単離ポリペプチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ポリペプチドの産物または前記ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法。
【請求項６１】
Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域であるヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ヒトポリヌクレオチドを有する対照動物と前記ヒトポリヌクレオチドを有する試験動物とを選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記ヒトポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項６２】
前記動物が哺乳類である請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記哺乳類がラットである請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域であるヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ヒトポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ヒトポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項６５】
Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域であるヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ヒトポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞、その一部またはその単離ポリヌクレオチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ヒトポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項６６】
ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるコード配列のポリヌクレオチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を治療するための組成物。
【請求項６７】
ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸障害を治療するための組成物。
【請求項６８】
Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される制御領域を調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸障害を治療するための組成物。
【請求項６９】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
前記障害が、湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記化合物が小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸、ならびにそれらの機能的誘導体および化学的誘導体からなる群から選択される請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７２】
脂肪酸障害を治療するための請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項７３】
ＰＵＦＡ障害を治療するための請求項７２に記載の組成物の使用。
【請求項７４】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、前記対象の組織試料由来のＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるコード配列を表すポリヌクレオチドの生殖系列における配列を野生型の該ポリヌクレオチドの生殖系列における配列と比較することからなる、前記対象における前記ポリヌクレオチド中の生殖系列における変化の検出を含み、前記対象の生殖系列における変化が前記障害の存在または素因を示す方法。
【請求項７６】
対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、前記対象の組織試料由来のＧ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される制御領域を表すヒトポリヌクレオチドの生殖系列における配列を野生型の該ヒトポリヌクレオチドの生殖系列における配列と比較することからなる、前記対象における前記ポリヌクレオチド中の生殖系列における変化の検出を含み、前記対象の生殖系列における変化が前記障害の存在または素因を示す方法。
【請求項７７】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項７５または７６に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項７８】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項７７に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項７９】
前記比較が免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ＤＮＡフィンガープリント法、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ラジオイムノアッセイ、免疫放射線検定法および免疫酵素検定法からなる群から選択される方法により実施される請求項７５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、前記対象の組織試料由来のＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドの配列を該ポリペプチドの野生型の配列と比較することからなり、前記野生型と比較したときの前記対象の配列の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる前記障害の存在または素因を示す方法。
【請求項８１】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項８０に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項８２】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項８１に記載の障害の存在または素因を診断する方法。
【請求項８３】
前記比較が免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ＤＮＡフィンガープリント法、ラジオイムノアッセイ、免疫放射線検定法、免疫酵素検定法およびポリペプチド微量検定法からなる群から選択される方法により実施される請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＦＴＦ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＧＢ、Ｓｐｏｔ−１４、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼおよびＭＥＴＰまたはそれらの制御領域の配列からなる群から選択される遺伝子をともに有する対照動物および試験動物を選択する工程と、
（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記対照動物と前記試験動物との間の、前記遺伝子の発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項８５】
前記動物が哺乳類である請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記哺乳類がラットである請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項８４〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）ＳＣＤ１、ＳＣＤ２，ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＦＴＦ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＧＢ、Ｓｐｏｔ−１４、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼおよびＭＥＴＰまたはそれらの制御領域の配列からなる群から選択される遺伝子を含む宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記遺伝子の発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項９０】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を検出する方法であって、対象における請求項１に記載のポリヌクレオチドセグメントから選択される遺伝子の発現産物の発現のレベルを予備測定した発現対照レベルを基準として測定することからなり、前記対照と比較したときの前記発現産物の発現の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を示す方法。
【請求項９３】
脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を検出する方法であって、対象におけるＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ、ＦＴＦ１、ＧＬＯＬ、ＡＩＢＧおよびＭＥＴＰからなる群から選択される遺伝子の発現産物の発現のレベルを予備測定した発現対照レベルを基準として測定することからなり、前記対照と比較したときの前記発現産物の発現の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を示す方法。
【請求項９４】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項９２または９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記方法が免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ラジオイムノアッセイ、免疫放射線検定法、免疫酵素検定法ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチド微量検定法からなる群から選択される請求項９２〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
請求項１４に記載のポリペプチドまたはその免疫原性の部分に免疫反応性を有する抗体。
【請求項９８】
ＦＴＦ１、ＧＬＯＬおよびＭＥＴＰからなる群から選択されるポリペプチドまたはその免疫原性の部分に免疫反応性を有する抗体。
【請求項９９】
請求項１４に記載のポリペプチドまたはＦＴＦ１、ＧＬＯＬおよびＭＥＴＰからなる群から選択されるポリペプチドについて培地をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項９７または９８に記載の抗体をマーカー分子で標識して結合体を形成させること、
（ｂ）前記結合体を前記培地に曝露させること、および
（ｃ）前記培地中において前記結合体と生体分子との間に前記ポリペプチドの存在を示す結合が存在するかどうかを判定することからなる方法。
【請求項１００】
請求項１４に記載のポリペプチドまたはＦＴＦ１、ＧＬＯＬおよびＭＥＴＰからなる群から選択されるポリペプチドについて培地をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項９７または９８に記載の抗体を前記培地に曝露させること、
（ｂ）前記抗体をマーカー分子に曝露させること、および
（ｃ）前記培地中において前記マーカー分子と生体分子との間に前記ポリペプチドの存在を示す結合が存在するかどうかを判定することからなる方法。
【請求項１０１】
前記化合物が請求項９７または９８に記載の抗体からなる請求項３６に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記組成物がＳＣＤ１、ＳＣＤ２，ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ａ１ＧＢ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼに対する抗体からなる群から選択される請求項６６〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０３】
脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害を治療するための請求項１０１または１０２に記載の組成物の使用。
【請求項１０４】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項１０３に記載の使用。
【請求項１０５】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項１０４に記載の使用。
【請求項１０６】
脂肪により制御された遺伝子またはタンパク質を特定する方法であって、
（ａ）動物種を選択し、それらを試験群と対照群とに分けること、
（ｂ）試験群と対照群とに脂肪非含有飼料を所定の期間与えること、
（ｃ）その後、試験群に高度に精製された多価不飽和脂肪酸を経腸的または非経口的に第２の所定の期間与えること、
（ｄ）その後、対照群および試験群から組織を摘出すること、
（ｅ）対照群の組織由来のＲＮＡを試験群の組織由来のＲＮＡと比較し、対照群と試験群との間で異なるレベルで発現されたＲＮＡを選択すること、および
（ｆ）選択されたＲＮＡと関連する遺伝子またはタンパク質を決定することからなる方法。
【請求項１０７】
前記動物がラットである請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記所定の期間が少なくとも２週間である請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第２の所定の期間が少なくとも２週間である請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記比較がディファレンシャル・ディスプレイ法およびノーザンブロット法による請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
ＭＥＴＰ、ＧＬＯＬ、ＦＴＦ１、Ａ１ＢＧ、ＳＣＤ、ＧＰＡＴ、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域である、２つまたはそれ以上のヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ヒトポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドと異種である２つまたはそれ以上の宿主細胞を選択する工程と、
（ｂ）前記宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、
（ｃ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｄ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ヒトポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項１１２】
ＭＥＴＰ、ＧＬＯＬ、ＦＴＦ１、Ａ１ＢＧ、ＳＣＤ、ＧＰＡＴ、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域である、２つまたはそれ以上のヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、
（ａ）前記ヒトポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドと異種である２つまたはそれ以上の宿主細胞、その一部またはその単離ポリヌクレオチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、
（ｂ）前記試験群を化合物を用いて処理する工程と、
（ｃ）前記試験群と前記対照群との間の、前記ヒトポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法。
【請求項１１３】
ＭＥＴＰ、ＧＬＯＬ、ＦＴＦ１、Ａ１ＢＧ、ＳＣＤ、ＧＰＡＴ、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の２つまたはそれ以上のヒトポリヌクレオチド制御領域を調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を治療するための組成物。
【請求項１１４】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記障害が湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項１１４に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記化合物が小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸、ならびにそれらの機能的誘導体および化学的誘導体からなる群から選択される請求項１１３〜１１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１７】
脂肪酸により変化する遺伝子にかかわる障害を治療するための請求項１１３に記載の組成物の使用。
【請求項１１８】
ＰＵＦＡ障害を治療するための請求項１１７に記載の組成物の使用。
【請求項１１９】
前記障害が、湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項１１８に記載の使用。
【請求項１２０】
脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を検出する方法であって、対象におけるヒトＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ、ＦＴＦ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧおよびＭＥＴＰからなる群から選択される遺伝子の２つまたはそれ以上の発現産物の発現レベルを予備測定した発現対照レベルを基準として測定することからなり、前記対照と比較したときの前記発現産物の発現の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を示す方法。
【請求項１２１】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記障害が、湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記方法が免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ラジオイムノアッセイ、免疫放射線検定法および免疫酵素検定法、ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチド微量検定法からなる群から選択される請求項１２０〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
請求項９〜１３、１８〜２２、３１〜３５、５１〜６５、８４〜９１または１１１〜１１２のいずれか１項に記載の方法により特定される化合物。
【請求項１２５】
脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を治療するための請求項１２４に記載の化合物の使用。
【請求項１２６】
前記障害がＰＵＦＡ障害である請求項１２５に記載の化合物の使用。
【請求項１２７】
前記障害が、湿疹、心血管障害、炎症、体重異常、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択される請求項１２６に記載の使用。
【請求項１２８】
心血管障害が高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患からなる群から選択される請求項３８、７０、および１１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２９】
心血管障害が高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患からなる群から選択される請求項４２、７４、１１９および１２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３０】
心血管障害が高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患からなる群から選択される請求項４５、４９、７８、８１、９１、９５、１０５および１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
炎症が副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡からなる群から選択される請求項３８、７０および１１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３２】
炎症が副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡からなる群から選択される請求項４２、７４、１１９および１２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３３】
炎症が副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡からなる群から選択される請求項４５、４９、７８、８１、９１、９５、１０５および１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
体重異常が肥満、悪液質および食欲不振からなる群から選択される請求項３８、７０および１１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３５】
体重異常が肥満、悪液質および食欲不振からなる群から選択される請求項４２、７４、１１９および１２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３６】
体重異常が肥満、悪液質および食欲不振からなる群から選択される請求項４５、４９、７８、８１、９１、９５、１０５および１２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、（ａ）その遺伝子が脂肪により制御される（ｆａｔ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ、以後「脂肪調節性」と称する）タンパク質の活性を調節（モジュレート）する組成物、（ｂ）脂肪調節性遺伝子の活性を調節する組成物および（ｃ）脂肪調節性遺伝子の発現を効果的に制御する組成物を特定する方法、ならびにそのようにして特定された組成物に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の欠乏は、湿疹、心血管障害、炎症、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群および糖尿病のような多くの疾患と関連づけられている（ホロビン　ディー　エフ（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ　Ｄ．Ｆ．）、１９９０年、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ワイリー・リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）［ニューヨーク所在］ならびにマッザ　ジーおよびドマー　ビー　ディー（Ｍａｚｚａ　Ｇ．ａｎｄ　Ｄｏｍａｈ　Ｂ．Ｄ．）（編）、２０００年、Ｈｅｒｂｓ，Ｂｏｔａｎｉｃａｌｓ　ａｎｄ　Ｔｅａｓ、テクノミックパブリシャーズ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）［ペンシルバニア州ランカスター所在］）。食事へのＰＵＦＡの補給がこれらの多くの状態に対する療法として試みられた。そのような適用の成功の程度は著しく異なっていた。
【０００３】
ＰＵＦＡが糖尿病性神経障害の症状の一部を軽減し、矯正する可能性があることが認められている（ダインスら（Ｄｉｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、第３６巻、１１３２〜１１３８ページおよびコッターら（Ｃｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｄｉａｂｅｔｉｃ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ：Ｎｅｗ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ａｎｄ　Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、エルセビイアサイエンス　ビー　ブイ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｂ．Ｖ．）［アムステルダム所在］、１１５〜１２０ページ）。研究者らは、ｎ−３およびｎ−６脂肪酸族のシクロオキシゲナーゼ代謝物およびリポキシゲナーゼ代謝物の産生または変化がこれらの有益な効果の一部を担っていると推測している。カメロンら（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９３年、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第１０９巻、９７２〜９７９ページ）およびダインスら（Ｄｉｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９６年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　Ｌｅｕｋｏｔｒ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄｓ、第５５巻、１５９〜１６５ページ）はともに、血管拡張物質であるプロスタグランジンのレベルの増加または血管収縮物質でかつ血小板凝集性のプロスタグランジンの減少により、糖尿病性神経障害の症状が軽減される可能性があると仮定した。脂肪酸の薬物としての開発は、限られた成果しか上がらなかった。これは、一部には、経口投与された脂肪酸が多くの生体異物の薬物のようには挙動せず、その代謝が複雑であるからである。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、（ａ）配列番号１を含む配列と、（ｂ）配列番号３を含む配列と、（ｃ）配列番号６を含む配列と、（ｄ）配列番号１１を含む配列と、（ｅ）配列番号１３を含む配列と、（ｆ）配列番号１６を含む配列と、（ｇ）配列番号１８を含む配列と、（ｈ）配列番号２４を含む配列と、（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、（ｊ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、（ｋ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、（ｌ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、（ｍ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列と、（ｎ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｍ）のいずれかとハイブリッド形成する配列と、（ｏ）（ａ）〜（ｍ）のいずれかの機能的誘導体である配列とからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチドセグメント（単離されたポリヌクレオチド断片）を教示する。本発明は、本発明のポリヌクレオチドとほぼ同じ生物学的機能または活性を保有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドセグメントを含む。１実施形態では、単離ポリヌクレオチドセグメントはｃＤＮＡである。
【０００５】
本発明は、（ａ）配列番号２を含む配列と、（ｂ）配列番号４を含む配列と、（ｃ）配列番号７を含む配列と、（ｄ）配列番号１２を含む配列と、（ｅ）配列番号１４を含む配列と、（ｆ）配列番号１７を含む配列と、（ｇ）配列番号２５を含む配列と、（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、（ｉ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、（ｊ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、（ｋ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、（ｌ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列とからなる群から選択される単離ポリペプチドを含む単離ポリペプチドセグメントを教示する。
【０００６】
本発明は、本発明のポリペプチドセグメントと異種である宿主細胞中に該セグメントを含む宿主細胞を含む。本発明はまた、本発明のセグメントのポリペプチドの生産に十分な条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程からなる、該ポリペプチドを生産するプロセスも教示する。本発明は、本発明のセグメントのポリペプチドとほぼ同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチド配列を含む。
【０００７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該セグメントを有する対照動物と該セグメントを有する試験動物とを選択する工程と、（ｂ）前記試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照動物と試験動物との間の、該セグメントの発現産物または該セグメントの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法も教示する。動物は、哺乳類であってよい。哺乳類は、ラットであってよい。
【０００８】
他の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該セグメントの発現産物または該セグメントの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示している。
【０００９】
他の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞、その一部またはその単離ポリペプチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該セグメントの発現産物または該セグメントの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を含む。
【００１０】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号５を含む配列と、（ｂ）配列番号１０を含む配列と、（ｃ）配列番号１５を含む配列と、（ｄ）配列番号２０を含む配列と、（ｅ）配列番号２１を含む配列と、（ｆ）配列番号２６を含む配列と、（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも８０％相同である配列と、（ｈ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも９０％相同である配列と、（ｉ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも９５％相同である配列と、（ｊ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも９８％相同である配列と、（ｋ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの配列と少なくとも９９％相同である配列と、（ｌ）ストリンジェントな条件下で（ａ）〜（ｋ）のいずれかとハイブリッド形成する配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドセグメントを教示する。単離ポリヌクレオチドセグメントはゲノムＤＮＡであってよい。
【００１１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドセグメントを含むベクターも教示する。ベクターはそのセグメントと異種であってよい。該ベクターは、タグを含むか、またはタグをコードしていてよい。本発明は、本発明のポリヌクレオチドセグメントと異種である宿主細胞中に該セグメントを含む宿主細胞を教示する。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）本発明のセグメントのヌクレオチドの少なくとも１５個の連続した塩基を有する配列と、（ｂ）本発明のセグメントのヌクレオチドの少なくとも３０個の連続した塩基を有する配列と、（ｃ）本発明のセグメントのヌクレオチドの少なくとも５０個の連続した塩基を有する配列とからなる群から選択される単離ポリヌクレオチドフラグメントを含む。
【００１３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該セグメントを有する対照動物および該セグメントを有する試験動物を選択する工程と、（ｂ）試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照動物と試験動物との間の、該セグメントの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示する。動物は、哺乳類であってよい。哺乳類は、ラットであってよい。
【００１４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該セグメントの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００１５】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドセグメントの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）本発明の宿主細胞、その一部またはその単離ポリヌクレオチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、セグメントの産物またはセグメントの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法をさらに教示する。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、本発明のセグメントを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸により制御される遺伝子（以後「脂肪酸調節性遺伝子」と称する）にかかわる障害を治療するための組成物を教示する。本発明は、脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を治療するための本発明の組成物の使用をさらに教示する。
【００１７】
本発明はまた、対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、対象の組織試料由来の本発明のセグメント中の生殖系列における配列を野生型のセグメントの生殖系列における配列と比較することからなる、対象における本発明のセグメント中の生殖系列における変化の検出を含み、対象の生殖系列における配列の変化が障害の存在または素因を示す方法も教示する。
【００１８】
本発明は、対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、対象の組織試料由来の本発明のポリペプチドの配列を野生型のポリペプチドの配列と比較することからなり、野生型と比較したときの対象の配列の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる前記障害の存在または素因を示す方法を教示する。
【００１９】
本発明は、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを有する対照動物と該ポリヌクレオチドを有する試験動物とを選択する工程と、（ｂ）試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照動物と試験動物との間の、該ポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００２０】
本発明は、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該ポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００２１】
本発明は、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞、その一部またはその単離ポリヌクレオチドを有する試験群および対照群を選択する工程と（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該ポリヌクレオチドの産物または該ポリヌクレオチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００２２】
本発明は、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリペプチドを有する対照動物と該ポリペプチドを有する試験動物とを選択する工程と、（ｂ）試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照動物と試験動物との間の、該ポリペプチドの発現産物または該ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００２３】
本発明は、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリペプチドを含み、該ポリペプチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該ポリペプチドの発現産物または該ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００２４】
本発明は、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ポリペプチドを含み、該ポリペプチドと異種である宿主細胞、その一部またはその単離ポリペプチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該ポリペプチドの産物または該ポリペプチドの相対量または相対活性を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００２５】
本発明は、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域であるヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ヒトポリヌクレオチドを有する対照動物と該ヒトポリヌクレオチドを有する試験動物とを選択する工程と、（ｂ）試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照動物と試験動物との間の、該ヒトポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００２６】
本発明は、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域であるヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ヒトポリヌクレオチドを含み、該ヒトポリヌクレオチドと異種である宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該ヒトポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００２７】
本発明は、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域であるヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ヒトポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドと異種である宿主細胞、その一部またはその単離ポリヌクレオチドを有する試験群および対照群を選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該ヒトポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００２８】
本発明は、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるコード配列のポリヌクレオチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を治療するための組成物を教示する。
【００２９】
本発明は、ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドを調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸障害を治療するための組成物を教示する。
【００３０】
本発明は、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される制御領域を調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸障害を治療するための組成物を教示する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、対象の組織試料由来のＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるコード配列を表すポリヌクレオチドの生殖系列における配列を野生型の該ポリヌクレオチドの生殖系列における配列と比較することからなる、該対象における該ポリヌクレオチド中の生殖系列における変化の検出を含み、対象の生殖系列における変化が前記障害の存在または素因を示す方法を教示する。
【００３２】
本発明は、対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、対象の組織試料由来のＧ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される制御領域を表すヒトポリヌクレオチド中の生殖系列における配列を野生型の該ヒトポリヌクレオチドの生殖系列における配列と比較することからなる、対象における該ヒトポリヌクレオチド中の生殖系列における変化の検出を含み、対象の生殖系列における変化が前記障害の存在または素因を示す方法も教示する。
【００３３】
本発明は、対象における脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を診断する方法であって、該対象の組織試料由来のＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧ、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択されるポリペプチドの配列を該ポリペプチドの野生型の配列と比較することからなり、野生型と比較したときの対象の配列の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる前記障害の存在または素因を示す方法を教示する。
【００３４】
本発明は、脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＦＴＦ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＧＢ、Ｓｐｏｔ−１４、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼおよびＭＥＴＰまたはそれらの制御領域の配列からなる群から選択される遺伝子をともに有する対照動物および試験動物を選択する工程と、（ｂ）試験動物を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）対照群と試験群との間の、該遺伝子の発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示している。
【００３５】
本発明は、脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）ＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、ＦＴＦ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＧＢ、Ｓｐｏｔ−１４、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼおよびＭＥＴＰまたはそれらの制御領域の配列からなる群から選択される遺伝子を含む宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該遺伝子の発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法も教示する。
【００３６】
本発明は、脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害の存在または素因を検出する方法であって、対象における本発明のポリヌクレオチドセグメントから選択される遺伝子の発現産物の発現のレベルを予備測定した発現対照レベルを基準として測定することからなり、対照と比較したときの前記発現産物の発現の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を示す方法を教示する。
【００３７】
本発明は、脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を検出する方法であって、対象におけるＳＣＤ１、ＳＣＤ２、ＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ、ＦＴＦ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧおよびＭＥＴＰからなる群から選択される遺伝子の発現産物の発現レベルを予備測定した発現対照レベルを基準として測定することからなり、対照と比較したときの発現産物の発現の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を示す方法を教示する。
【００３８】
他の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその免疫原性の部分に免疫反応性を有する抗体を教示する。複数の実施形態において、該抗体はＦＴＦ１、ＧＬＯＬおよびＭＥＴＰからなる群から選択されるポリペプチドまたはそれらの免疫原性の部分に免疫反応性を有する。
【００３９】
本発明は、本発明のポリペプチド、またはＦＴＦ１、ＧＬＯＬおよびＭＥＴＰからなる群から選択されるポリペプチドについて培地をスクリーニングする方法であって、（ａ）本発明の抗体をマーカー分子で標識して結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成させること、（ｂ）結合体を該培地に曝露させること、および（ｃ）該培地中において結合体と生体分子との間に該ポリペプチドの存在を示す結合が存在するかどうかを判定することからなる方法を教示する。
【００４０】
本発明は、本発明のポリペプチド、またはＦＴＦ１、ＧＬＯＬおよびＭＥＴＰからなる群から選択されるポリペプチドについて培地をスクリーニングする方法であって、（ａ）本発明の抗体を該培地に曝露させること、（ｂ）該抗体をマーカー分子に曝露させること、および（ｃ）該培地中において前記マーカー分子と生体分子との間に該ポリペプチドの存在を示す結合が存在するかどうかを判定することからなる方法を教示する。
【００４１】
本発明は、脂肪により制御された遺伝子またはタンパク質を特定する方法であって、（ａ）動物種を選択し、それらを試験群と対照群とに分けること、（ｂ）試験群および対照群に脂肪非含有飼料を所定の期間与えること、（ｃ）その後、試験群に高度に精製された多価不飽和脂肪酸を経腸的または非経口的に第２の所定の期間与えること、（ｄ）その後、対照群および試験群から組織を摘出すること、（ｅ）対照群の組織由来のＲＮＡを試験群の組織由来のＲＮＡと比較し、試験群と対照群との間で異なるレベルで発現されたＲＮＡを選択すること、および（ｆ）選択されたＲＮＡに関連する遺伝子またはタンパク質を決定することからなる方法を教示する。所定の期間は少なくとも２週間であってよい。第２の所定の期間は少なくとも２週間である。比較は、ディファレンシャル・ディスプレイ法およびノーザンブロット法によって行うことができる。
【００４２】
本発明は、ＭＥＴＰ、ＧＬＯＬ、ＦＴＦ１、Ａ１ＢＧ、ＳＣＤ、ＧＰＡＴ、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域である、２つまたはそれ以上のヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ヒトポリヌクレオチドと異種である、該ポリヌクレオチドを含む２つまたはそれ以上の宿主細胞を選択する工程と、（ｂ）宿主細胞をクローニングし、該クローンを試験群と対照群とに分ける工程と、（ｃ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｄ）試験群と対照群との間の、該ヒトポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００４３】
本発明は、ＭＥＴＰ、ＧＬＯＬ、ＦＴＦ１、Ａ１ＢＧ、ＳＣＤ、ＧＰＡＴ、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の制御領域である、２つまたはそれ以上のヒトポリヌクレオチドの活性を阻害または促進する化合物を特定する方法であって、（ａ）該ヒトポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドと異種である２つまたはそれ以上の宿主細胞、その一部またはその単離ポリヌクレオチドを有する試験群と、対照群とを選択する工程と、（ｂ）試験群を化合物を用いて処理する工程と、（ｃ）試験群と対照群との間の、該ヒトポリヌクレオチドと作動可能なように連結されたポリヌクレオチドの発現産物の相対量を測定する工程とからなる方法を教示する。
【００４４】
本発明は、ＭＥＴＰ、ＧＬＯＬ、ＦＴＦ１、Ａ１ＢＧ、ＳＣＤ、ＧＰＡＴ、Ｇ６ＰＤ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４およびΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼからなる群から選択される遺伝子の２つまたはそれ以上のヒトポリヌクレオチド制御領域を調節する化合物と医薬として許容可能な担体とを含む、脂肪酸調節性遺伝子にかかわる障害を治療するための組成物を教示する。
【００４５】
本発明は、脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を検出する方法であって、対象におけるヒトＳＣＤ、Ｇ６ＰＤ、ＧＰＡＴ、ＦＡＳ、ＣＯＭＴ、ＡｐｏＡ−１、ＩＮＳＩＧ１、Ｓｐｏｔ−１４、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ、ＦＴＦ１、ＧＬＯＬ、Ａ１ＢＧおよびＭＥＴＰからなる群から選択される２つまたはそれ以上の遺伝子発現産物の発現レベルを予備測定した発現対照レベルを基準として測定することからなり、対照と比較したときの発現産物の発現の変化が脂肪酸により変化した遺伝子にかかわる障害の存在または素因を示す方法を教示する。
【００４６】
本発明の比較または測定は、免疫ブロット法、免疫細胞化学、エライザ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）、ＤＮＡフィンガープリント法、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリッド形成法、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ラジオイムノアッセイ、免疫放射線検定法および免疫酵素検定法からなる群から選択される方法により実施可能である。
【００４７】
本発明の組成物は、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸、本発明の抗体、ならびにそれらの機能的誘導体および化学的誘導体からなる群から選択してよい。
【００４８】
本発明は、脂肪酸障害を治療するための本発明の組成物の使用を教示する。
障害は、ＰＵＦＡ障害であってよい。障害は、湿疹、心血管障害（高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症（副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡を含むが、これらに限定されない）、体重異常（肥満、悪液質および食欲不振を含むが、これらに限定されない）、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症からなる群から選択されてよい。
【００４９】
（実施形態の詳細な説明）
ここで本発明を図面を参照しながら説明する。
脂肪酸が細胞膜および細胞内プロセスを維持するうえで重要であることは十分に立証されている。脂肪酸は、ヒトの疾患において重要であるが未だ十分には理解されていない役割を有するとも考えられている。脂肪酸の臨床的効果はそのように定まっていないので、本発明者らは、脂肪酸がある種の疾患状態において特定の遺伝子を制御していると仮定した。現在までのところ、脂肪酸が遺伝子または遺伝子発現をどのように制御しているかについてはほとんど知られていない。
【００５０】
本発明者らは、組織脂肪酸の変化を誘発するために、種々のＰＵＦＡを補給した脂肪非含有食事モデルを用いた。この食事モデルとディファレンシャル・ディスプレイ技術を用いることにより、本発明者らは脂肪酸によって制御される遺伝子を特定した。これらの特定された遺伝子の一部は新規のものであるが、一部はよく知られている。脂肪により制御を受ける（脂肪調節性）遺伝子を本発明者らが発見したことにより、ある種の疾患を脂肪酸を用いてより効果的に治療可能な理由がより十分に理解されている。したがって、本発明はヒトまたは哺乳類の脂肪酸代謝障害の治療用の化合物の開発を教示する。
【００５１】
脂肪酸代謝を調節する薬物は、食事介入によって可能である以上に劇的な脂肪酸レベルの変化をもたらすはずである。これは、脂肪酸を薬物として用いた場合には可能でないと思われる有効な治療薬の開発を可能にする。
【００５２】
（定義）
以下の例をあげた説明を、本明細書中で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供する。この説明は便宜的なものとして示されており、本発明を限定するものではない。
【００５３】
「アゴニスト」は、他の分子の活性を増大させる薬物またはホルモンのような任意の分子または医薬作用物質を指す。
「アンタゴニスト」は、他の分子の活性を阻害または消失させる薬物またはホルモンのような任意の分子または医薬作用物質を指す。
【００５４】
「化学的誘導体」。本明細書では、ある分子が別の分子の「化学的誘導体」であると言う場合は、その分子が通常その別の分子の一部ではない付加的で化学的な部分を有するときである。そのような部分により、分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などが改善される可能性がある。あるいはその部分により分子の毒性が低減され、分子の何らかの望ましくない副作用が除去または軽減されるなどの可能性がある。そのような作用をもたらし得る部分は、マック　イー　ダブリュ（Ｍａｃｋ　Ｅ．Ｗ．）、１９９０年、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マックパブリッシングカンパニー社（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、第１３版に開示されている。そのような部分を分子に連結する手順は当技術分野においてよく知られている。
【００５５】
「組成物」には遺伝子、タンパク質、ポリヌクレオチド、ペプチド、化合物、薬物および薬理学的作用物質が含まれる。
「制御領域」は、遺伝子の転写の開始、終結を支援もしくは阻害、さもなければ調節することができる、またはそうするのに必要とされる核酸配列を指す。制御領域はプロモーター、エンハンサー、サイレンサーおよび／または他の調節要素を含み得る。制御領域は、単独でまたは独占的に転写を十分に開始、終結あるいは調節し得るか、またはし得ないが、他の核酸配列と協力してそのような調節に作用し得る核酸配列をも含む。
【００５６】
「デサチュラーゼ」は、脂肪酸分子の炭化水素領域に二重結合を生成させることができる酵素である脂肪酸デサチュラーゼを指す。
本明細書における「障害」とは、構造または機能の混乱または異常を指す。障害は疾患を含む
【００５７】
「薬物」。薬物にはタンパク質、ペプチド、変性ペプチド、条件設定された細胞培養液から精製された物質、有機分子、無機分子、抗体またはオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。薬物は天然に存在してもよく、または合成的もしくは組換えにより生産可能である。
【００５８】
「エンハンサー」は、特定の１つまたは複数の転写因子により結合されたときに、転写を促進または増大させるＤＮＡ調節要素からなる核酸配列である。さらに、エンハンサーは、特定の因子により結合されたとき遺伝子発現レベルの増大を誘発かつ達成するために、（プロモーターに対して上流または下流の）いずれかの方向に任意の位置で機能しうる。さらに、本発明によれば、エンハンサーは脂肪酸により制御される（脂肪酸調節性）遺伝子の酵素活性を増大または促進し、および／または該遺伝子の転写を増大または促進する化合物（すなわち、試験化合物）も指す。
【００５９】
「脂肪酸」は、長い飽和炭化水素鎖または１価もしくは多価不飽和炭化水素鎖と末端カルボキシル基とからなる化合物の種類である。
「機能的誘導体」。配列（タンパク質または核酸のいずれか）の「機能的誘導体」は、そのタンパク質配列または核酸配列の生物学的活性と本質的に類似した（機能上または構造上のいずれかの）生物学的活性を有する分子である。タンパク質の機能的誘導体は、特異的機能の発揮についての修飾の必要性に応じ、共有結合される糖質のような翻訳後修飾を含み得る。「機能的誘導体」という用語は分子の「フラグメント」、「セグメント」、「変異体」、「類縁体」、または「化学的誘導体」を含むことを意味する。
【００６０】
「遺伝子」は、その配列が特定のタンパク質またはポリペプチド鎖の生産に必要な情報を含む核酸分子またはその一部を指す。ポリペプチドは、そのタンパク質の機能的活性が保持される限りはそのコード配列の全配列または任意の部分によりコードされ得る。遺伝子は、コード領域の前後の領域だけでなく個々のコードセグメント（エキソン）の間に介入する配列（イントロン）も含みうる。核酸構築物の「異種（の）」領域（すなわち、異種遺伝子）は、本来は該構築物の他の遺伝子成分に関連して認められない、より大きい核酸構築物内の識別可能なＤＮＡ部分である。したがって、異種遺伝子が哺乳類の脂肪酸調節性遺伝子をコードしているとき、該遺伝子には通常、供給源の生物体のゲノム内で構造ゲノムＤＮＡに隣接していないプロモーターが隣接することになる。
【００６１】
「宿主系」は、転写および／または転写を許容しまたは可能にする環境または条件を提供する細胞、組織、器官、生物体またはそれらの一部からなればよい。
「同一性」、「類似性」または「相同性または相同（な）」は、配列を比較することによって判定される２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。当技術分野では、同一性とは、状況に応じてそのような配列の文字列間の一致によって判定される、ポリヌクレオチド配列間の配列の類似性の程度も意味する。同一性と類似性はいずれも容易に計算し得る（レスク　エー　エム（Ｌｅｓｋ　Ａ．Ｍ．）編、１９８８年、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、オックスフォードユニバーシティプレス（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）、スミス　ディー　ダブリュ（Ｓｍｉｔｈ　Ｄ．Ｗ．）編、１９９３年、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）、グリフィン　エー　エムおよびグリフィン　エッチ　ジー（Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ａ．Ｍ．ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ｈ．Ｇ．）編、１９９４年、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ　１、フマナプレス（Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニュージャージー）、フォンヘイネ　ジー（ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ　Ｇ．）、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）およびグリブスコフ　エムおよびデベラウフ　ジェー（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ　Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　Ｊ．）編、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ、エムストックトンプレス（Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク）。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性と類似性とを測定する多くの方法が存在するが、両用語は当業者によく知られている（フォンハイネ　ジー（ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ　Ｇ．）、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク；グリブスコフ　エムおよびデベラウフ　ジェー（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ　Ｍ．ａｎｄ　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　Ｊ．）編、１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ、エムストックトンプレス（Ｍ　Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク；およびカリロ　エッチおよびリップマン　ディー（Ｃａｒｉｌｌｏ　Ｈ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ　Ｄ．）、１９８８年、ＳＬＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．、第４８巻、１０７３ページ）。配列間の同一性または類似性を測定するのに一般的に用いられている方法としては、カリロ　エッチおよびリップマン　ディー（Ｃａｒｉｌｌｏ　Ｈ．ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ　Ｄ．）、１９８８年、ＳＬＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．、第４８巻、１０７３ページに記載されている方法があるが、これに限定されない。同一性と類似性とを測定する方法は、コンピュータプログラムに組み込まれている。２つの配列間の同一性と類似性とを測定するコンピュータプログラムの方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（デベラウフら（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８４年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．、第１２巻、３８７〜３９５ページ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３〜４１０ページ）などがあるが、これらに限定されない。
【００６２】
「単離（された）」は、その自然状態から「人に手により」変化した、すなわち、天然に存在するものの場合、変化した、もしくはその元の環境から除去された、またはその両方であることを意味する。例えば、その生来の状態で生きている生物体に自然に存在する天然のポリヌクレオチドは「単離されて」いないが、その生来の状態で共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドは、この用語が本明細書において用いられているように「単離されて」いる。単離の一環として、または単離後に、そのようなポリヌクレオチドを例えば突然変異誘発のため、融合タンパク質を形成するため、また宿主内での増殖または発現のためにＤＮＡのような他のポリヌクレオチドに結合することが可能である。単独またはベクターのような他のポリヌクレオチドに結合した単離ポリヌクレオチドは、培養中または丸ごとの生物体中の宿主細胞に導入可能である。培養中または丸ごとの生物体中の宿主細胞に導入されたとき、そのようなＤＮＡは天然に存在する状態や環境中にはないため、この用語が本明細書で用いられているように、そのようなＤＮＡは単離されていることになる。同様に、ポリヌクレオチドは、例えば培地製剤、ポリヌクレオチドを例えば細胞へ導入するための溶液、天然に存在しない組成物である化学反応または酵素反応用の組成物または溶液のような、組成物中に存在しうるが、この場合にも単離ポリヌクレオチドは本明細書で用いられているようなこの用語の意味の範囲内にある。
【００６３】
「変異」は遺伝物質中の何らかの検出可能な変化である。変異は、１つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドの化学的もしくは生理学的構成、易変性、複製、表現型上の機能、または組換えに影響を与える何らかの検出可能で不自然な変化（またはその組合せ）でありうる；ヌクレオチドは付加され、欠失し、置換され、逆位となり、または逆位を伴ったり伴わずに新しい部位に転移されうる。変異は自然に起こり得るものであり、突然変異原の適用により、または部位特異的変異により実験的に誘発され得る。変異ポリペプチドは変異核酸分子から生じうる。
【００６４】
「核酸構築物」は、ポリヌクレオチド配列を組み込むプラスミドまたはベクター（これらに限定されない）を含む遺伝要素を指す。例えば、核酸構築物は、異種遺伝子に作動可能なように連結されるプロモーターまたは制御領域からなるベクターであってよい。
【００６５】
本明細書で用いられている「作動可能なように連結される」とは、プロモーターまたは制御領域の存在または変調がリポーター配列遺伝子などの異種遺伝子の転写に影響を及ぼすような、核酸構築物のプロモーターまたは制御領域と該異種遺伝子との連結を示す。作動可能なように連結された配列は、同じＲＮＡ転写物上で転写される２つの部分を含むこともある。したがって、プロモーターおよび「リポーター配列」のような２つの配列は、プロモーターにおいて開始する転写がリポーター配列のＲＮＡ転写物を生成させるならば、作動可能なように連結されている。
【００６６】
「プラスミド」。本明細書で開示された開始プラスミドは、市販されているか、公的に入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから周知の公開された手順の通常の使用により構築可能であるかのいずれかである。本発明に従って使用可能な多くのプラスミドならびにその他のクローニングベクターおよび発現ベクターは、当業者によく知られ容易に使用できる。さらに、当業者は本発明における使用に適した他のプラスミドをいくらでも容易に構築しうる。
【００６７】
本発明の「ポリヌクレオチド」はｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、または、例えばクローニングにより得られ、もしくは化学的合成技術かそれらの組合せにより生産されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡなどのＤＮＡの形態でありうる。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖でありうる。一本鎖のポリヌクレオチドは、センス鎖としても知られるコード鎖でも、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖でもよい。ポリヌクレオチドは一般に、非修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを表す。従って、例えば本明細書において用いられるポリヌクレオチドは、特に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域または一本鎖、二本鎖および三本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとからなり、一本鎖もしくはより一般には二本鎖もしくは三本鎖であるか、または一本鎖と二本鎖の領域の混合物であるハイブリッド分子を表す。さらに、本明細書において用いられるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方からなる三本鎖の領域について言及する。そのような領域の鎖は同じ分子由来でも異なる分子由来でもよい。該領域には１つまたは複数の分子の全てが含まれうるが、より一般的にはいくつかの分子の一領域のみを意味する。三重らせん領域の分子の１つはオリゴヌクレオチドであることが多い。本明細書において用いられるように、ポリヌクレオチドという用語はＤＮＡまたは１つもしくは複数の修飾塩基を含むＤＮＡも含む。従って、ＤＮＡまたは安定性もしくはその他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡは、本明細書中でその用語が意味するように「ポリヌクレオチド」である。さらに、ＤＮＡまたは（ちょうど２例を挙げると）イノシンのような例外的な塩基もしくはトリチル化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡは、本明細書中でその用語が用いられているように「ポリヌクレオチド」である。当業者に知られた多くの有用な目的に役立つ、非常に多くの修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに施されてきたことは理解されるであろう。本明細書中で用いられているように、ポリヌクレオチドという用語は、そのような化学的、酵素的または代謝的に修飾されたポリヌクレオチドの形態だけでなく、ＤＮＡの化学的形態ならびにウイルス、および単純な細胞と特に複雑な細胞などの細胞のＲＮＡの特性も含む。ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ばれることの多い短いポリヌクレオチドを含む。この二本鎖ヌクレオチド配列の転写により生じたＲＮＡと、本発明の核酸分子のアンチセンス鎖または該核酸分子のオリゴヌクレオチドフラグメントとは、本発明の範囲内にあると考えられることも理解されるであろう。アンチセンス配列は、本発明の核酸分子の配列をその転写に関して正常な状態に対して反転することにより構築される。アンチセンス配列は開始コドンの前の領域または非保存領域を反転することにより構築されることが好ましい。アンチセンス配列は当技術分野で知られた手順を用いて化学合成および酵素的連結反応により構築可能である。
【００６８】
「プロモーター」は、下流（３’方向）の遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼを直接または間接的に結合することが可能なＤＮＡ調節要素からなる核酸配列を指す。本発明によれば、プロモーターの誘導が異種遺伝子の転写に影響を及ぼすように異種遺伝子に連結されうるヌクレオチド配列を含む、核酸構築物のプロモーターである。
【００６９】
「精製（された）」。「精製された」タンパク質または核酸とは、組換えにより生産されたか、化学的に合成されたか、天然の供給源から精製されたかのいずれかの、一般に夾雑物を含まないタンパク質または核酸の調製物である。
【００７０】
「組換え」は、組換えＤＮＡ技術により生成され、天然に存在する核酸配列とは異なる再結合された核酸配列、遺伝子もしくはそれらの断片（フラグメント）、またはそれらの新たな組合せを指す。
【００７１】
「調節要素」は、異種遺伝子などの連結された１つまたは複数の遺伝子の発現を転写を介して調節するために、活性化転写調節タンパク質または１つもしくは複数の活性化転写調節タンパク質からなる複合体が結合する核酸配列の全体または一部からなるデオキシリボヌクレオチド配列を指す。
【００７２】
「リポーター遺伝子」は、その産物が、宿主細胞または宿主系により他の状況では生産されないか、あるいは宿主細胞または宿主系において最小限または無視し得る量で生産され、宿主細胞または宿主系における転写活性のレベルを分析するためにリポーター遺伝子産物を定量的に測定できる様々な既知の方法により検出可能なポリペプチドまたはタンパク質である、核酸コード配列である。例としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、分泌性胎盤アルカリホスファターゼおよび他の分泌性酵素の遺伝子などがある。
【００７３】
「サイレンサー」は、標的遺伝子の制御領域内のサイレンサー配列の存在が、プロモーターにおける標的遺伝子の転写を、別個のＤＮＡセグメントとしてのその作用により、あるいは、これらの遺伝要素に結合し、その結果標的遺伝子の発現に対して負の制御をもたらすトランス作用因子の作用により抑制するようなＤＮＡ制御領域の核酸配列または部分を指す。
【００７４】
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、特異性を与えるために十分に厳密で、ミスマッチの数を低減し、許容できる速度で安定なハイブリッドの形成を可能にするために十分に融通の利く条件である。そのような条件は当業者に知られ、例えばサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、またはオースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年−、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン　ワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、に記載されている。単なる例として、短いヌクレオチドを用いたストリンジェントなハイブリッド形成は、０．０１〜０．１ｐｍｏｌ／ｍｌのような高濃度のプローブを用いてＴＭより５〜１０℃低い温度で実施することができる。「ストリンジェントな条件」という用語は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは９７％の同一性が存在する場合に限りハイブリッド形成が起こることを意味することが好ましい。
【００７５】
「タグ」は、例えば、市販の抗体により認識されるｃ−ｍｙｃエピトープおよび／または６ヒスチジン残基の列を構成またはコードする、特定の短いアミノ酸配列またはそれをコードするオリゴヌクレオチド配列を指す。実際には、タグはタグ付きタンパク質のその後の識別および精製を容易にする。
【００７６】
本明細書で用いている「タグ付きタンパク質」は、連結されたタグ配列を備えるタンパク質を指す。例えば、タグ付きタンパク質には、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端でｃ−ｍｙｃエピトープと６ヒスチジン残基とに連結された哺乳類の脂肪酸調節性ポリペプチドがある。
【００７７】
本明細書で用いている「試験化合物」は、小分子（例えば、小有機分子）、薬理化合物または薬理作用物質、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体フラグメント、ならびにＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列などの核酸配列を含む。
【００７８】
「トランスフェクション」は、外来または異種のＤＮＡ（すなわち核酸構築物）がレシピエントの真核宿主細胞に導入される過程を指す。したがって、真核細胞においては、宿主細胞に外来ＤＮＡが獲得されることをトランスフェクションと称する。原核細胞および真核細胞（例えば、酵母および哺乳類細胞）において、導入されたＤＮＡはプラスミドのような染色体外因子上に維持されるか、宿主ゲノムに組み込まれる可能性がある。真核細胞に関しては、安定にトランスフェクションされた細胞とは、導入されたＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、それが染色体複製により娘細胞に引き継がれる細胞である。この安定性は、導入ＤＮＡを含んだ娘細胞集団からなる細胞株または細胞クローンを、その真核細胞が樹立できることによって示される。
【００７９】
「形質転換」は、外来または異種のＤＮＡ（すなわち核酸構築物）がレシピエントの原核宿主細胞に導入される過程を指す。したがって、原核細胞においては、宿主細胞に外来ＤＮＡが獲得されることを形質転換と称する。真核細胞における形質転換は、腫瘍化状態と類似した、真核細胞の培養中の無制限増殖状態への変化または形質転換を指す。原核細胞および真核細胞（例えば、酵母および哺乳類細胞）において、導入されたＤＮＡはプラスミドのような染色体外因子上に維持されるか、宿主ゲノムに組み込まれる。原核細胞に関しては、安定に形質転換された細菌細胞とは、導入されたＤＮＡが染色体に組み込まれ、その結果、それが染色体複製により娘細胞に引き継がれるものである。この安定性は、導入ＤＮＡを含んだ娘細胞集団からなる細胞株または細胞クローンを、その原核細胞が樹立できることによって示される。
【００８０】
本明細書で用いている「トランスフェクション／形質転換」は、外来または異種のＤＮＡ（すなわち核酸構築物）が真核もしくは原核宿主細胞または宿主系に導入された過程を指す。
【００８１】
ポリヌクレオチドの「変異体」は、他の基準となるポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なるポリヌクレオチドである。タンパク質または核酸の「変異体」は、そのタンパク質または核酸と構造および生物学的活性が実質的に同様な分子を指すことを意味する。したがって、２つの分子が共通の活性を有し、互いに置換し得るならば、一方の分子の組成や２次、３次または４次構造が他方の分子に認められるものと同一でないとしても、あるいはアミノ酸またはヌクレオチド配列が同一でないとしても、それらは、その用語が本明細書において用いられているとおりに変異体とみなされる。一般的に、その差異は限定されており、その結果基準の分子と変異体のヌクレオチド配列が全体的に非常に類似しており、かつ多くの領域において同一である。変異体のヌクレオチド配列の変化はサイレント変異であってもよい。すなわち、その変化は該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変化させなくてもよい。変化がこの種のサイレントな変化に限られる場合、変異体は基準の分子と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードすることになる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることがある。そのようなヌクレオチドの変化は、基準の配列によりコードされるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合および切断をもたらすことがある。
【００８２】
「ベクター」。クローニングするためにＤＮＡを挿入することが可能なプラスミドもしくはファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列。ベクターは、宿主細胞内で自律的に複製することが可能であり、そのようなＤＮＡ配列を特定できる方法で切断可能な部位であって、かつそこにＤＮＡを挿入し得る１つまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位によってさらに特徴づけることが可能である。ベクターはさらに、ベクターで形質転換された細胞の識別における使用に適したマーカーを含めることが可能である。マーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。「クローニングベクター」という語が時には「ベクター」の代わりに使用される。
【００８３】
前述のように、本発明者らは脂肪酸代謝に関連する遺伝子およびそれらのプロモーターをコードする、本明細書で「対象ポリヌクレオチド」と称する種々のＤＮＡ配列を特定し、配列を決定した。対象ポリヌクレオチドから産生または発現されるペプチドおよびポリペプチドを、本明細書では「対象ポリペプチド」と称する。
【００８４】
本発明が対象ポリヌクレオチドまたは対象ポリペプチドとそれぞれ実質的な配列相同性を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含むことは理解できよう。「実質的な配列相同性を有する配列」という用語は、対象ポリヌクレオチドに対してわずかな、または重要でない配列上の変化を有するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を意味する；すなわち、相同性配列は、実際の配列と実質的に同様に機能して実際の配列と実質的に同じポリペプチドを生産する。変化は、局所的な突然変異または構造上の変化に起因する可能性がある。本発明のＤＮＡ配列と８５〜９０％の配列相同性を有する配列は、対象ポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持する機能的な対象ポリペプチドを提供すると予想される。本発明のさらなる実施形態は、対象ポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドである。他の実施形態は、対象ポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも８０％同一な領域を含むポリヌクレオチド、およびそのポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドである。これは、対象ポリヌクレオチドと全長にわたり少なくとも９０％同一なポリヌクレオチドを含み、かつ少なくとも９５％の相同性を有するポリヌクレオチドがこれらの実施形態に含まれる。さらに、少なくとも９５％の相同性を有するもののうち、少なくとも９７％を有するものは非常に好ましく、また、それらの中で少なくとも９８％および少なくとも９９％を有するものは特に非常に好ましく、少なくとも９９％を有するものはより好ましい。
【００８５】
（ＰＵＦＡを補給した飼料を与えたラットの肝臓におけるディファレンシャルな（差次的）遺伝子発現）
本発明者らは、ディファレンシャル・ディスプレイ法（リアング　ピーおよびパーディー　エー　ビー（Ｌｉａｎｇ　Ｐ．ａｎｄ　Ｐａｒｄｅｅ　Ａ．Ｂ．）、１９９２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５７巻、９６７〜９７１ページ）を用いて食事中の脂肪により調節または制御される遺伝子を特定した。雌のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットの群に脂肪を含まない飼料を２週間与えた。２週間後に、１群（対照）を除くすべての群にさらに２週間にわたり高度に精製されたＰＵＦＡを補給した。ラットを屠殺し、組織を摘出して、ディファレンシャル・ディスプレイ法およびノーザンブロット法用のＲＮＡを得た。ディファレンシャル・ディスプレイ法では、ラット肝から得られたｍＲＮＡ集団を比較することにより、食事中の脂肪により制御された遺伝子が特定された。
【００８６】
試験のために、ラットを６群に分け、脂肪を含まない飼料を１４日間与えた。さらに２週間、各群に脂肪を含まない飼料を次の補給物とともに与えた。すなわち、第１群には補給物を与えず（脂肪非含有対照）、第２群にはリノール酸（ＬＡ、１８：２ｎ−６）、第３群にはγ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ｎ−６）、第４群にはα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３ｎ−３）、第５群にはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５ｎ−３）、第６群にはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６ｎ−３）を与えた。脂肪酸は、実施例１に記載のように、５重量％の脂肪酸固有の濃度で飼料に加えて投与した。ラットに自由摂取させた。
【００８７】
このディファレンシャル・ディスプレイ実験に用いたプロトコールは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ｄｅｌｔａ（登録商標）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｋｉｔ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）カタログ番号Ｋ１８１０−１）に基づき、かつ厳密に準拠したものである。各プライマーの組合せを各投与群の３匹のラット由来の逆転写ｃＤＮＡとともに用い、すべての実験を独立して２回ずつ行った。
【００８８】
発明者らの予備的なディファレンシャル・ディスプレイ試験では、対照群とＬＡ投与群との間に差は示されなかった。これらの前試験および他の技術的理由から、本発明者らは、完全なディファレンシャル・ディスプレイ・スクリーニングに第１群（補給物なし、脂肪非含有対照）、第３群（ＧＬＡ）および第６群（ＤＨＡ）を選択した。
【００８９】
ラット肝ｃＤＮＡを、１０種の任意のＰプライマーと９種のアンカーＴプライマーとの９０種の組合せ、ならびにＰプライマーのみの５５種の組合せを用いて増幅した。対照、ＧＬＡ、ＤＨＡ試料を、各プライマー対ごとに３つずつ、合計９つ調製した。一般的に、５つのプライマー対についての反応を同時に行った。これらの試料をポリアクリルアミドゲル上で一緒に泳動した。実験を繰り返し、結果を検証した。合計２６１０の個別反応を行い、分析した。両実験で差次的に発現したバンドのみをさらに解析した。
【００９０】
（結果）
ディファレンシャル・ディスプレイ・ゲルの検査から、少なくとも２回の独立した実験で差次的に発現したと思われる１４４個のバンドが明らかにされた。各実験には、飼料群１、３および６の各々から３匹のラットを用いた。ＰプライマーおよびＴプライマーのＰＣＲ産物である合計８４個の特有なバンドと、増幅反応物に存在する２つのプライマーのうちの１つだけを用いた増幅反応から明らかに生じたさらに６０個の複製バンドが特定された。１４４個の差次的に表示されたヒットのうちの１００個を、ＴＡクローニング法を用いてｐＣＲＩＩ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングし、ノーザンブロット分析に用いた。１００クローンのノーザンブロットから、６１クローンが差次的に発現し、３９クローンがそうでないことが確認された。ノーザンブロットメンブレンには、対照、ＬＡ投与、ＧＬＡ投与、ＥＰＡ投与およびＤＨＡ投与動物群から分離されたラット肝ＲＮＡを含めた。
【００９１】
ノーザンブロットにおいて６１の陽性と確認されたクローンのその後の配列決定から、１４種の遺伝子に属する２８の特有なＤＮＡ配列が特定された。これらの遺伝子のうちの１１遺伝子のｍＲＮＡレベルは脂肪を含まない条件下でより高く、ＰＵＦＡを与えたときに低減されるのに対して、これらの遺伝子のうちの３遺伝子のｍＲＮＡレベルは脂肪を含まない条件下でＰＵＦＡ補給時と比較してより低い。これらの１４遺伝子を表１および２に示す。
【００９２】
（発見された遺伝子）
Ｉ．ＭＥＴＰ遺伝子およびポリペプチド
試験において特定された差次的に発現したバンドのうちの１つは、ＭＥＴＰ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる、特性の解析が行われていない未知のミトコンドリア担体タンパク質遺伝子に属することが確認されたラット部分ｃＤＮＡクローンであった。ＧｅｎｅＴｒａｐｐｅｒ（登録商標）技術（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を用いて、ラットＭＥＴＰ遺伝子をクローニングした。全長コード配列（ＣＤＳ）をＤＮＡ塩基配列決定により決定した（図１）。
【００９３】
生物情報学的手法を用いて、そのヒト遺伝子を、第１４染色体のゲノムＤＮＡのフラグメントに関するＧｅｎＢａｎｋのＨＴＧＳデータベース内に発見した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１３５８３８）。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、提示されたヒト遺伝子配列をクローニングおよびＤＮＡ配列決定により立証した（図２）。エキソンをＡＬ１３５８３８のゲノムＤＮＡ上にマッピングしたところ、遺伝子は６個のコーディングエキソンを含むことが見いだされた。
【００９４】
生物情報学的手法を用いてヒトＭＥＴＰ遺伝子の制御領域を特定し、地図を作製した。ＡＴＧから位置−１〜−１５００の制御領域を図６に示す。
ヒトおよびラットのこの遺伝子を比較したところ、アミノ酸配列レベルで８７％同一（８９％陽性）であることが見いだされた（図３）。
【００９５】
ヒトおよびラットのこのタンパク質は、ミトコンドリアエネルギー輸送（担体）タンパク質ファミリーに属し、このタンパク質ファミリーに特有の３つのシグネチャ・モチーフ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ　ｍｏｔｉｆ）を含むことが見いだされた。図４に、ヒトミトコンドリアエネルギー輸送タンパク質遺伝子ファミリーの４メンバー、ＭＥＴＰ、ＭＣＡＴ（ミトコンドリアカルニチン／アシルカルニチントランスロケース；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００３７８）、ＴＸＴＰ（トリカルボキシレート輸送タンパク質；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ５３００７）およびＵＣＰ２（ミトコンドリア脱共役タンパク質２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００３３４６）の間の多重アライメントを、このタンパク質ファミリーのＰＲＯＳＩＴＥシグネチャ・モチーフＰＳ００２１５を囲い枠内に強調して示す。ヒトタンパク質におけるこれらのモチーフは、アミノ酸位置１９〜２８、１１５〜１２４および２３７〜２４６（図４の枠で囲った部分）に位置する。モチーフの共通パターンは、Ｐ−ｘ−［ＤＥ］−ｘ−［ＬＩＶＡＴ］−［ＲＫ］−ｘ−［ＬＲＨ］−［ＬＩＶＭＦＹ］−［ＱＧＡＩＶＭ］（ＰｒｏｓｉｔｅパターンＰＳ００２１５）である。
【００９６】
ＭＥＴＰとミトコンドリア担体タンパク質ファミリーの密接に関連したヒトタンパク質との間の関係を示す多重配列アライメントを図４に示す。
ラットおよびヒトのＭＥＴＰタンパク質は、このファミリーのタンパク質を表す３部分ドメイン構造を有する。タンパク質配列のドットマトリックス解析のグラフィックを作製した（データは示さず）。内部が類似しているドメインのそれぞれが２つのトランスメンブラン領域と短いループとを含んでいる。これは、厳しいカットオフ値に到達した６つのピークが予測されるトランスメンブラン領域である、ヒト遺伝子に関する図５に示すＤｅｎｓｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｕｒｆａｃｅ（ＤＡＳ）予測（セルゾら（Ｃｓｅｒｚｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、第１０巻、６７３〜６７６ページ）の結果から明らかである。
【００９７】
ラット部分ｃＤＮＡクローンをノーザンブロット法のプローブとして用いることにより、ラット肝におけるこの遺伝子のｍＲＮＡの相対存在量がＰＵＦＡ投与後に劇的に増加することが示された（表１および２）。
【００９８】
ヒトおよびラットにおける組織分布を評価するノーザンブロット試験（実施例３７を参照）により、ＭＥＴＰ転写物が肝臓のみで検出されることが示された。
これらの所見は、ＭＥＴＰが多価不飽和脂肪酸によって制御される肝臓特異的ミトコンドリア担体タンパク質であることを確認するものである。本発明者らのデータは、ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットではｍＲＮＡ存在量が増加することを示唆している。したがって、本発明は、新規の薬物標的すなわちＭＥＴＰについて、その遺伝子発現またはその遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするための該遺伝子ならびにプロモーターの使用を含めて記述するものである。
【００９９】
ＩＩ．ＧＬＯＬ遺伝子およびポリペプチド
試験において特定された差次的に発現した他のバンドは、機能未知のヒト遺伝子と非常に類似したラットの部分ｃＤＮＡクローンであった。このヒト遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８３１９８およびＮＭ＿０１４２９７において「甲状腺において発現されるｍＲＮＡ」とされている。このヒト遺伝子配列のＣＤＳはＧｅｎＢａｎｋに提出されているが、それに関する現存刊行物は存在しない。
【０１００】
ＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）をＢＬＡＳＴＮを用いて検索して、遺伝子の５’末端を含むげっ歯類の配列を特定した。そのような特定された１つのマウスのＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷ１０６７１７）からデザインしたフォワード・プライマーとクローニングしたラットの部分ｃＤＮＡからデザインしたリバース・プライマーとを用いて、ラットＧＬＯＬ（グリオキサラーゼＩＩ様（ｇｌｙｏｘａｌａｓｅ　ＩＩ−ｌｉｋｅ）遺伝子の全長コード配列（ＣＤＳ）を決定した。配列を図７に示す。
【０１０１】
ＧｅｎＢａｎｋにおけるそのヒト配列は、ＰＣＲクローニング（Ｄ８３１９８からデザインしたプライマーを用いた）およびＤＮＡ配列決定により立証された（図８）。
【０１０２】
生物情報学的手法を用いて、そのヒト遺伝子をＧｅｎＢａｎｋの第１９染色体に帰属する配列上のＨＴＧＳ部門内に発見した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０６８７８５）。エキソンをこのゲノムＤＮＡにマップしたところ、遺伝子は６個のコーディングエキソンを含むことが見いだされた。
【０１０３】
生物情報学的手法を用いて、ヒトＧＬＯＬの制御領域を特定し、地図を作製した。ヒトＧＬＯＬ　ＣＤＳを用いてＢＬＡＳＴＮによりＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門を検索することにより、該遺伝子の５’ＵＴＲを含むヒトＥＳＴの集合を特定した。この実験から、長さ４３７ｂｐの上流イントロンの存在が明らかにされた。本発明者らの結果は、このイントロンの末端が誤って５’ＵＴＲと同定されているＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８３１９８に記載されているものと異なっている。本発明者らは、部位−９０５から上流側の高度に反復する要素を含む領域をさらに特定した。ＡＴＧから部位−４３８および部位−９０５の間の制御領域が特定された。これを図１３に示す。
【０１０４】
ラットおよびヒト遺伝子に対するアミノ酸配列を比較したところ、９２％同一または９５％類似であることが見いだされた（図９）。
本発明者らは、ＧＬＯＬをタンパク質のメタロβ−ラクタマーゼスーパーファミリーのメンバーであると決定した。該タンパク質は、２つのドメインによって構成されている。ドメイン１は残基１〜１６８からなっていて、他のメタロβ−ラクタマーゼとの相同性を有しており、一方、ドメイン２は残基１６９〜２２７からなっている。β−ラクタマーゼのほかに、他の多くのタンパク質がこのファミリーに属している。これらのタンパク質には、Ｓ−Ｄ−ラクトイルグルタチオンの加水分解を触媒しグルタチオンとＤ−乳酸を生成するグリオキサラーゼＩＩファミリーのメンバーであるチオールエステラーゼおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおける自然形質転換に必須であり、ＤＮＡ取込みに関与する輸送体であると思われるコンピテンス（ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）タンパク質が含まれる。コンピテンスタンパク質を除き、これらのタンパク質は補因子として１分子当たり２つの亜鉛イオンと結合する。
【０１０５】
ＧＬＯＬのモデル化の基礎となりうる構造を特定するために、ＢＬＡＳＴＰを用いてＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋの３次元構造データベースについてヒト遺伝子を検索した。ＰＤＢのＩＤコード登録１ＱＨ５（Ｓ−［Ｎ−ヒドロキシ−Ｎ−ブロモフェニルカルバモイル］グルタチオンを含むヒトグリオキサラーゼＩＩ）および１ＱＨ３（活性部位に存在するカコジル酸および酢酸イオンを含むヒトグリオキサラーゼＩＩ）は、１次配列に基づいて、有効なモデル化を保証するに十分類似していることが示された（ＧＬＯＬ配列中の１７５アミノ酸残基にわたって２５％同一、４３％類似）。ヒトグリオキサラーゼＩＩの３次元表示を図１１に示す。
【０１０６】
ＧＬＯＬのモデルはドメイン１（ＧＬＯＬの１〜１６８残基）に関するものである。ＧＬＯＬの３次元表示を図１２に示す。下記のヒトグリオキサラーゼＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５３１７）における金属配位に関与する主要なアミノ酸残基の７つすべてが１次構造においてＧＬＯＬ中で完全に保存されており（図１０）、３次構造空間において高度に保存されている。
【表１】
2004512852.tif 000002
【０１０７】
グリオキサラーゼＩＩへのグルタチオンの結合または活性部位の形成に関与する他の重要な残基（キャメロンら（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｆｏｌｄ．Ｄｅｓ．第７巻、１０６７〜１０７８ページ）を、これらの残基がＧＬＯＬ中で類似残基とどのように相関しているかということとともに以下に示す。
【表２】
2004512852.tif 000003
【０１０８】
これらのモデルにより、ＧＬＯＬの触媒活性について重要な確認がなされ、活性部位において重要な残基が示される。
【０１０９】
ラットの部分ｃＤＮＡクローンをノーザンブロット法のプローブとして用いた場合、ラット肝におけるＧＬＯＬ遺伝子のｍＲＮＡの相対的存在量はＰＵＦＡ投与後に劇的に減少した（表１および２）。
【０１１０】
ラットにおける組織分布を評価するノーザンブロット試験で、ＧＬＯＬ転写物が検査したすべての組織で発現していて、肝臓および腎臓において高レベルであることが示された。ヒトにおける同様な試験においても遍在的な発現が示され、肝臓、腎臓及び骨格筋において高レベルで、結腸において最も高いレベルであった。
【０１１１】
これらの所見から、ＧＬＯＬが多価不飽和脂肪酸により制御される遍在的に発現するグリオキサラーゼＩＩ様タンパク質であることが確認される。したがって、本発明は、新規な薬物標的すなわちＧＬＯＬについて、その遺伝子発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするために該遺伝子ならびにそのプロモーターを使用することを含めて記述している。
【０１１２】
ＩＩＩ．ＦＴＦ１遺伝子およびポリペプチド
試験において特定された差次的に発現される別のバンドは、マウスＯＡＳＩＳ遺伝子とオルソロガスであるラットの部分ｃＤＮＡクローンであった。ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を用いて、ラットのＦＴＦ１（脂肪応答性転写因子１（ｆａｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１））遺伝子の５’末端をクローニングし、全長コード配列（ＣＤＳ）をＤＮＡ配列決定により決定した（図１４）。
【０１１３】
ホンマら（Ｈｏｎｍａ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９９年、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．第６９巻、９３〜１０３ページ）は、マウスＯＡＳＩＳ遺伝子（ｏｌｄ−ａｓｔｒｏｃｙｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を特定し、特徴付けを行った。彼らはこの遺伝子がＣＲＥＢ／ＡＴＦ遺伝子ファミリーに属する転写因子をコードすることを示し、また、ロイシンジッパーモチーフおよび塩基性のＤＮＡ結合ドメインを含むことを示している。これらの研究者らは、該遺伝子の発現がマウス脳の寒冷傷害時に誘導されることを示した。彼らは、この転写因子とＰＵＦＡまたは糖尿病との関連は何も示さなかった。
【０１１４】
ヒト遺伝子は、ＴＢＬＡＳＴＮを用いたマウスＯＡＳＩＳアミノ酸配列、およびＢＬＡＳＴＮを用いたマウスＯＡＳＩＳのｃＤＮＡ配列を用いてＧｅｎＢａｎｋのＨＴＧＳデータベースを検索することにより特定された。エキソンを、標準的な生物情報学的手法を用いてゲノムＤＮＡのこの配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００９６４７）上にマップしたところ、遺伝子が１２エキソンから構成されていることが確認された。ＧｅｎＢａｎｋのＨＴＧＳデータベースから得られたｈＦＴＦ１の配列を用いてデザインされたプライマーを用いてヒト遺伝子をクローニングし、全長ＣＤＳを配列決定した（図１５）。
【０１１５】
本発明者らは、生物情報学的手法を用いて、ヒトＦＴＦ１遺伝子の制御領域を特定し、地図を作製した。ＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門を検索することにより、この遺伝子の５’ＵＴＲを含むヒトＥＳＴの集合を特定し、部位−８８３から上流側の高度に反復する要素を含む領域を特定した。ＡＴＧからの部位−１〜−８８３の制御領域を図１９に示す。
【０１１６】
ヒトおよびラットのＦＴＦ１遺伝子ならびにマウスＯＡＳＩＳ遺伝子の間の類似性を示す多重配列アライメントを図１６に示す。ヒトおよびラットのＦＴＦ１遺伝子は、９１％同一または９３％類似である。ヒトおよびマウスの遺伝子は９０％同一であり、一方、ラットおよびマウスの遺伝子は９５％同一である。
【０１１７】
ＦＴＦ１のモデル化の基礎となりうる構造を特定するために、ＢＬＡＳＴＰを用いて３次元構造を含むＧｅｎＢａｎｋのＰＤＢデータベースを検索した。転写因子ｃ−ｊｕｎ（ＰＤＢ　ＩＤコード：１ＦＯＳ、ｃ−ｆｏｓと２量体化し、ＤＮＡと複合体化したｃ−ｊｕｎ癌原遺伝子（プロトオンコジーン）［転写因子ａｐ−１］）の構造の一部が鋳型構造として特定された（図１７）。ＦＴＦ１は、４３アミノ酸の配列についてｃ−ｊｕｎと３７％同一であった。
【０１１８】
比較モデル化を用いて、位置２９５〜３３７のアミノ酸残基をｃ−ｊｕｎの構造上にモデル化した。これは、塩基性ＤＮＡ結合領域ならびにロイシン・ジッパー・モチーフに対応している（図１８）。
【０１１９】
ヒトＦＴＦ１遺伝子は、ＰＲＯＳＩＴＥにより推定されるように「ｂＺＩＰ転写因子塩基性ドメイン・シグネチャ」（アミノ酸２９５〜３１０）および「ロイシンジッパーパターン」モチーフ（アミノ酸３３２〜３５３）を含む。これらのモチーフは、超らせん（ｃｏｉｌｅｄ　ｃｏｉｌ）予測領域（アミノ酸２８５〜３５９）内に位置する。３次元モデル化領域は、ｂＺＩＰ塩基性ドメイン・シグネチャおよびＣ末端に向かうロイシン・ジッパーの始まりのＮ末端を含んでいる。
【０１２０】
残基２８５〜３５９は、ＣＯＩＬＳ　ｖ２．１ソフトウェア（ルパスら（Ｌｕｐａｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５２巻、１１６２〜１１６４ページ）を用いて、超らせん構造を形成するのに非常に有利なアミノ酸配列を含むものとして高い確実性をもってマップされた。この超らせん構造は、図１８に示す３次元モデルで認めることが可能である。
【０１２１】
ラットの部分ｃＤＮＡクローンをノーザンブロッティングのプローブとして用いた場合、ラット肝におけるＦＴＦ１遺伝子のｍＲＮＡの相対的存在量はＰＵＦＡ投与後に劇的に減少していた（表１および２）。
【０１２２】
ラットにおける組織分布を評価するノーザンブロット試験により、ＦＴＦ１転写物が検査したすべての組織において発現し、脂肪、卵巣および神経におけるレベルが最高であることが示された。ヒトにおける同様な試験から、結腸、胎盤、肺、小腸および心臓における発現のレベルが高いことが示された。
【０１２３】
これらの所見から、ＦＴＦ１が多価不飽和脂肪酸により制御される広範に発現する転写因子であることが確認される。したがって、本発明は、新規な薬物標的すなわちＦＴＦ１について、脂肪調節性の転写因子の発現を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするために該遺伝子を使用することおよび／またはそのプロモーターを使用することを含めて記述している。
【０１２４】
ＩＶ．Ａ１ＢＧ遺伝子およびポリペプチド
試験において特定された他の差次的に発現するバンドは、ヒトα−１ｂ糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）と非常に類似したラットの部分ｃＤＮＡクローンであった。ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）を用いて、ラットＡ１ＢＧの５’末端をクローニングし、全長コード配列（ＣＤＳ）をＤＮＡ配列決定により決定した（図２０）。
【０１２５】
成熟ヒトＡ１ＢＧタンパク質（４７４アミノ酸残基）は、以前に精製され、該タンパク質のアミノ酸配列は通常のタンパク質配列決定により決定された（イシオカら（Ｉｓｈｉｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８３巻、２３６３〜２３６７ページ）が、遺伝子のクローニングも特徴付けも行われていない。
【０１２６】
Ａ１ＢＧの配列決定されたタンパク質は、メチオニンでは始まらなかった。Ａ１ＢＧは血漿タンパク質であるので、未熟なタンパク質は分泌経路のためのシグナル配列を含むはずであると仮定した。ＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門（ｄｂｅｓｔ）におけるヒトタンパク質配列を用いたＴＢＬＡＳＴＮクエリにより、本発明者らは、転写物の始めの部分にエキソンの欠損を含む、Ａ１ＢＧ遺伝子の５’末端のヒトＥＳＴ（Ｗ２５０９９）を発見した。このＥＳＴから遺伝子の５’末端の知見を拡大し、エキソン１の５’ＵＴＲの１５ヌクレオチドおよびエキソン２の大部分を含めた（下記を参照）。
【０１２７】
生物情報学的手法を用いて、ヒトＡ１ＢＧ遺伝子を、ヒトタンパク質配列を用いたＴＢＬＡＳＴＮクエリにより第１９染色体のゲノムＤＮＡのフラグメント上に、ＧｅｎＢａｎｋ　ＨＴＧＳデータベース内に見出した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ０１２３１３）。エキソンをこの配列上にマップしたころ、遺伝子は８エキソンから構成されることが示された。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ヒト遺伝子配列をクローニングおよびＤＮＡ配列決定により立証した。ヒトＡ１ＢＧ遺伝子配列を図２１に示す。
【０１２８】
この新規に発見されたＮ末端のアミノ酸配列は、成熟タンパク質のＮ末端を生成させる予測切断部位を備えた古典的シグナル配列に十分に適合する２１残基を含む。ニューラル・ネットワークおよび隠れマルコフ・モデルはいずれも高い確率で同じ切断部位を予測した（ヘンリクら（Ｈｅｎｒｉｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．第１０巻、１〜６ページ）。したがって、未熟なタンパク質は、以前に報告された４７４残基でなく４９５アミノ酸残基を含む。
【０１２９】
本発明者らは、生物学的情報手法を用いて、ヒトＡ１ＢＧ遺伝子の制御領域を特定し、地図を作製した。先に示したように、本発明者らは１５ｂｐの５’ＵＴＲを含むヒトＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｗ２５０９９）を特定した。ＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門を検索することにより、本発明者らはさらに部位−４３０から上流側の転写において活性な領域を特定した。ＡＴＧからの部位−１〜−４３０の制御領域を図２５に示す。
【０１３０】
ラットおよびヒトのＡ１ＢＧを比較したところ、アミノ酸配列レベルで４４％同一または５５％類似であることが見いだされた（図２２）。
Ａ１ＢＧは、免疫グロブリンドメインおよび主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ドメインのシグネチャ・モチーフを含むタンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーに属している。Ａ１ＢＧは、５つの部分のドメイン構造を示す。各ドメインはジスルフィド架橋を含む。ヒトタンパク質は、配列全体を通して４つのアスパラギンがグリコシル化されており、グルコサミン結合部位を含む。
【０１３１】
有効なモデル化を行うのに十分に類似した既知の構造を有するタンパク質を特定するため、ヒトＡ１ＢＧをｐｄｂデータベースに対して検索した。多数のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞阻止受容体（ＫＩＲ）構造が優れた候補として特定された。ＫＩＲ２ＤＬ２を比較モデル化の適切な構造として選択した（ＰＤＢ　ＩＤコード：２ＤＬＩ−キラー免疫グロブリン受容体２ｄｌ２、三角型）。図２３を参照のこと。
【０１３２】
ＮＫ細胞は、自己と非自己とを識別する（これにより適切な標的細胞に対してのみＮＫに仲介される溶解作用が誘導される）と同時に、特定の病原体に感染した細胞または腫瘍細胞に対してその細胞溶解性の殺傷作用を発動させる。自己認識を達成する１つの機序は、細胞表面の阻止受容体による制御によるものである。これらの受容体は標的細胞表面上に発現されたクラスＩ　ＭＨＣ分子と相互作用することができ、異常細胞はクラスＩ主要組織適合性複合体分子が欠損している。
【０１３３】
図２４に示すように、ＫＩＲ２ＤＬ２の細胞外ＭＨＣクラスＩ結合部分が２つのドメインのみからなっているということから、Ａ１ＢＧの最後の２つのドメインをこの鋳型構造を用いてモデル化した。
【０１３４】
フクロネズミ（キャタニーズ　ジェー　ジェーおよびクレス　エル　エフ（Ｃａｔａｎｅｓｅ　Ｊ．Ｊ．ａｎｄ　Ｋｒｅｓｓ　Ｌ．Ｆ．）、１９９２年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３１巻、４１０〜４１８ページ）およびマングース（キーら（Ｑｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｔｏｘｉｃｏｎ、第３２巻、１４５９〜１４６９ページおよびキーら（Ｑｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｔｏｘｉｃｏｎ、第３３巻、２４１〜２４５ページ）由来の抗出血性因子の部分的アミノ酸配列決定から、Ａ１ＢＧとの高度な類似性が示されている。これらは、マングースの血漿糖タンパク質ＡＨＦ１／ＡＨＦ２（ヘビ毒メタロプロテイナーゼに対する抗出血性因子）およびフクロネズミの血漿糖タンパク質オプリン（ヘビ毒メタロプロテイナーゼに対して活性なプロテイナーゼ阻害物質）である。ＡＨＦ１／ＡＨＦ２の既知の配列がＡ１ＢＧと約５０％同一であり、オプリンの既知の配列が約３５％同一であることは、これらのタンパク質が実際にヒトＡ１ＢＧに対するオーソログであることを強く示唆している。しかし、ヒトＡ１ＢＧは抗出血活性を有さないことが報告されていることに注意すべきである（イシオカら（Ｉｓｈｉｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８３巻、２３６３〜２３６７ページ）。
【０１３５】
本発明者らのデータは、Ａ１ＢＧに関する他の報告および刊行物と一致するが、他の研究者らはこのタンパク質の役割を特定していない。本発明者らは、α−１ｂ糖タンパク質が、免疫系機能の制御に重要であるナチュラルキラー細胞阻止受容体構造と類似していることを認めている。
【０１３６】
ラットの部分ｃＤＮＡクローンをノーザンブロッティングのプローブとして用いて評価した場合、ラット肝におけるＡ１ＢＧ遺伝子のｍＲＮＡの相対的存在量はＰＵＦＡ補給後に増加していた（表１および２参照）。Ａ１ＢＧのｍＲＮＡの発現の増加は脂肪酸を補給した個体間でかなり異なっており、ＤＨＡ投与群に最高の発現が認められた。
【０１３７】
ヒトおよびラットにおける組織分布を評価するノーザンブロット試験により、Ａ１ＢＧ転写物が高度に肝臓特異的であることが示された。
これらの所見から、Ａ１ＢＧが肝臓により産生される血漿タンパク質であり、多価不飽和脂肪酸により制御されることが確認される。本発明者らのデータは、ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットではｍＲＮＡ存在量が減少することを示唆している。したがって、本発明は、新規な薬物標的すなわちＡ１ＢＧについて、その遺伝子発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質ならびに免疫学的疾患に対して有効な新規試験化合物をスクリーニングするために、該遺伝子およびプロモーターを使用することを含めて記述している。
【０１３８】
Ｖ．ＳＣＤ遺伝子およびポリペプチド
試験において特定された差次的に発現したさらに２つのバンドは、既知の代謝機能を有するラットステアロイルＣｏＡデサチュラーゼのラットの部分ｃＤＮＡクローン（ＳＣＤ１およびＳＣＤ２、それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０２５８５およびＡＢ０３２２４３）であった。さらに、本発明者らの研究室における研究から、ｍＲＮＡ発現ならびにＳＣＤ活性がストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発性糖尿病において低いことが示されている。これは、糖尿病マウスにおけるＳＣＤ１のｍＲＮＡの発現についても当てはまる（ウォーターズ　ケー　エムおよびタムビ　ジェー　エム（Ｗａｔｅｒｓ　Ｋ．Ｍ．ａｎｄ　Ｎｔａｍｂｉ　Ｊ．Ｍ．）、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻、２７７７３〜２７７７７ページ）。逆に、ヒトＳＣＤのｍＲＮＡ発現はいくつかの癌性組織において高い（リーら（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第５７巻、３４８〜３５２ページ）。これらのデータは、ラットのＳＣＤ１遺伝子およびＳＣＤ２遺伝子ならびにヒトのＳＣＤ遺伝子が食事脂肪（特にＰＵＦＡ、表２を参照）により、また、疾患（タムビ　ジェー　エム（Ｎｔａｍｂｉ　Ｊ．Ｍ．）、１９９４年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．第４０巻、１５４９〜１５５８ページ）において転写時に制御されることを示唆している。
【０１３９】
マウスおよびラットのタンパク質も特徴付けがなされ、機能が立証されている（ミヤザキら（Ｍｉｙａｚａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５巻、３０１３２〜３０１３８ページおよびシーデら（Ｔｈｉｅｄｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６１巻、１３２３〜１３２５ページ）。ＳＣＤ１はパルミトイルＣｏＡ（１６：０）またはステアロイルＣｏＡ（１８：０）のいずれかを不飽和化（デサチュレート）すると提唱されており、一方、ＳＣＤ２は１６：０に対するよりも１８：０のデサチュラーゼに対して選択性を示すと提唱されている（キムら（Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．第４１巻、１３１０〜１３１６ページ）。ヒトＳＣＤタンパク質の機能解析は報告されていない（ツアンら（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３４０巻、２５２〜２６４ページ）。
【０１４０】
ラットＳＣＤに対するポリクローナル抗体が生産され、免疫ブロット分析に用いられている（ハッサンら（Ｈａｓｓａｎ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９７巻、８８８３〜８８８８ページ）。
【０１４１】
マウスでは、ＳＣＤ１およびＳＣＤ２のＰＵＦＡ抑制を担うプロモーター要素が特定されている（タムビ　ジェー　エム（Ｎｔａｍｂｉ　Ｊ．Ｍ．）、１９９９年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．第４０巻、１５４９〜１５５８ページ）。２つのアイソフォームのマウスプロモーターの高度に保存された領域は７７％同一である。これらの要素には、ＰＵＦＡ応答領域（ＰＵＦＡ−ＲＲ）と総称される、ステロール調節要素（ＳＲＥ）、ＣＣＡＡＴ結合因子または核因子（ＮＦ−Ｙ）結合部位およびエンハンサー結合タンパク質配列（Ｃ／ＥＢＰ）が含まれる。疾患においてヒトＳＣＤが明らかに転写制御を受けるにもかかわらず、ヒトＳＣＤ制御領域は研究されていない。
【０１４２】
ヒトＳＣＤ制御領域を含むヒト配列を特定するために、ＢＬＡＳＴＮおよび利用可能なヒトＳＣＤのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１３６４７およびＡＦ０９７５１４）を用いてＧｅｎＢａｎｋのＨＴＧＳ部門を検索した。検索により、ヒトｃＤＮＡに対応する６個のエキソンを含む第１０染色体上のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ１３９８１９）が特定された。最初のエキソンは、ヒトＳＣＤ　ｃＤＮＡのＡＴＧおよび５’ＵＴＲを含んでいる。部位−１〜−２００６ｂｐのＡＴＧの上流側配列の地図を作製し、該配列の１９７０ｂｐフラグメントを特異的プライマーを用いたＰＣＲによりクローニングした。ヌクレオチド配列を図２６に示す。
【０１４３】
ヒトＳＣＤ制御領域のヌクレオチド配列をマウスＳＣＤ１制御領域およびＳＣＤ２制御領域と比較した（図２７）。マウスのＳＣＤ１プロモーターおよびＳＣＤ２プロモーターに存在するＰＵＦＡ−ＲＲ要素は、ヒトＳＣＤ制御領域に保存されている。ヒトＳＣＤの制御領域内のこれらのモチーフがヒトＳＣＤ遺伝子の発現をＰＵＦＡにより制御している可能性がある。
【０１４４】
したがって、本発明者らは、ＳＣＤ遺伝子の転写を仲介するヒト制御領域をクローニングした。本発明の実施形態として、本発明者らは、脂質関連疾患の治療に有用であると思われる試験化合物の化学ライブラリーをスクリーニングするために用いるヒトＳＣＤプロモーター／リポーター構築物を合成した。
【０１４５】
これらの所見は、新規な薬物標的すなわちＳＣＤの遺伝子発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするために該遺伝子ならびにプロモーターを使用することを含む、ＳＣＤに対する標的試験化合物を特定する新規な方法を示している。
【０１４６】
ＶＩ．アポリポタンパク質Ａ−１遺伝子およびポリペプチド
試験において差次的に発現した他のバンドは、アポリポタンパク質Ａ−１（ＡｐｏＡ−１）のラットの部分ｃＤＮＡであった。アポリポタンパク質Ａ−１のｃＤＮＡは、ラット（ハッダドら（Ｈａｄｄａｄ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６１巻、１３２６８〜１３２７７ページ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０２５９７）およびヒト（ブレスロウら（Ｂｒｅｓｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第７９巻、６８６１〜６８６５ページ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００００３９）からクローニングされている。
【０１４７】
ＡｐｏＡ−１は、血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要なタンパク質成分である。ＡｐｏＡ−１は、ほとんどの血漿コレステリルエステルの形成を担うレシチン／コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の補因子である（ソウターら（Ｓｏｕｔａｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９７５年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１４巻、３０５７〜３０６４ページ）。マウスおよびヒトのＡｐｏＡ−１プロモーターを用いたトランスフェクション試験についての記述がある（スリヴァスタヴァら（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２６７巻、４２７２〜４２８０ページ）。このタンパク質は、抗体を用いたラジオイムノアッセイにより測定されることが多い（カーリンら（Ｋａｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９７６年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．第１７巻、３０〜３７ページ）。ヒトＡｐｏＡ−１に選択的に結合するタンパク質（アフィボディ）を単離するための、１価のファージディスプレイのために構成されたコンビナトリアルライブラリーの使用についての記述がある（ノードら（Ｎｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１５巻、７７２〜７７７ページ）。
【０１４８】
ＰＵＦＡはＡｐｏＡ−１のｍＲＮＡレベルを低下させることが報告されており（バーソウら（Ｂｅｒｔｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２３２巻、１７９〜１８７ページ）、これは、本発明者らのノーザンブロットデータの結果（表２参照）と一致している。本発明者らのデータは、ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットではｍＲＮＡ存在量が増加することを示唆している。
【０１４９】
これらの所見は、新規な薬物標的すなわちＡｐｏＡ−１の遺伝子発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするために該遺伝子ならびにプロモーターを使用することを含む、ＡｐｏＡ−１に対する標的試験化合物を特定する新規な方法を示している。
【０１５０】
ＶＩＩ．Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ遺伝子
試験において特定された差次的に発現した別のバンドは、ＰＵＦＡの代謝に関与するミトコンドリアβ酸化補助酵素Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼのラット部分ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６１１８４）（パロサール　ピー　エムおよびヒルチューネン　ジェー　ケー（Ｐａｌｏｓａａｒｉ　ａｎｄ　Ｈｉｌｔｕｎｅｎ　Ｊ．Ｋ．）、１９９０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６５巻、２４４６〜２４４９ページならびにミュラー・ニューテン　ジーおよびストッフェル　ダブリュー（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｎｅｗｔｅｎ　Ｇ．ａｎｄ　Ｓｔｏｆｆｅｌ　Ｗ．）、１９９１年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、第３７２巻、６１３〜６２４ページ）であった。この酵素は、シスΔ３エノイルＣｏＡのトランスΔ２エノイルＣｏＡへの変換を触媒する。ラット遺伝子は３−チア脂肪酸により誘導される（マドセンら（Ｍａｄｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．第３９巻、５８３〜５９３ページ）。
【０１５１】
本発明者らは、ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットにおいてｍＲＮＡ発現が誘導されることを示した。いくつかのヒト遺伝病、例えば、カルニチン輸送欠損、ツェルヴェーガー症候群、Ｘ連鎖副腎脳白質ジストロフィーは、β酸化の遺伝子／酵素に関連している（ワンダースら（Ｗａｎｄｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９２年、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．第１５巻、６４３〜６４４ページ、ローら（Ｒｏｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第８５巻、１７０３〜１７０７ページ、およびウエイら（Ｗｅｉ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．第４７巻、２８６〜２９６ページ）。
【０１５２】
Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼをコードするヒト遺伝子がクローニングされた（ジャンセンら（Ｊａｎｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第２３巻、２２３〜２２８ページ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１９１９）。ヒト遺伝子の制御領域は公表されている（ジャンセンら（Ｊａｎｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第２３巻、２２３〜２２８ページ）。タンパク質は精製され、抗体が産生された（ミュラー−ニューテン　ジーおよびストッフェル　ダブリュー（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｎｅｗｔｅｎ　Ｇ．ａｎｄ　Ｓｔｏｆｆｅｌ　Ｗ．）、１９９１年、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ、第３７２巻、６１３〜６２４ページ）。トランス３−ヘキセノイルＣｏＡのような基質を用いたその酵素活性の試験は当業者によって知られている（グルビッツら（Ｇｕｒｖｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３４４巻、９０３〜９１４ページならびにパロサーリ　ピー　エムおよびヒルチューネン　ジェー　ケー（Ｐａｌｏｓａａｒｉ　ａｎｄ　Ｈｉｌｔｕｎｅｎ　Ｊ．Ｋ．）、１９９０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６５巻、２４４６〜２４４９ページ）。
【０１５３】
ラットの部分ｃＤＮＡクローンをノーザンブロット法のプローブとして用いて、本発明者らはＰＵＦＡがΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼのｍＲＮＡレベルを増加させることを示している（表１および２参照）。
【０１５４】
これらの所見は、薬物標的すなわちΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼの遺伝子発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするためにラットおよびヒト遺伝子ならびにプロモーターを使用することを含む、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼに対する標的試験化合物を特定する新規な方法を示している。
【０１５５】
ＶＩＩＩ．脂肪酸シンターゼ遺伝子およびポリペプチド
差次的に発現したバンドの１つが脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）として特定された。ラット（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６２８８８およびＭ７６７６７）およびヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ２６６４４およびＵ２９３４４）を含むいくつかの動物種のＦＡＳ　ｃＤＮＡについて特徴付けがなされている。
【０１５６】
ＦＡＳは、アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡおよびＮＡＤＰＨからの長鎖脂肪酸パルミチン酸の合成を触媒する（ワキル　エス　ジェイ（Ｗａｋｉｌ　Ｓ．Ｊ．）、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２８巻、４５２３〜４５３０ページ）。ＦＡＳは、各ペプチドサブユニットが約２６０ｋＤの大きさのホモ二量体として存在する。各サブユニットは７つの別個の成分の活性（β−ケトアシルシンターゼ、アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡトランスアシラーゼ、β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼ、エノイルレダクターゼ、β−ケトアシルレダクターゼ、チオエステラーゼ）および補欠分子族４’−ホスホパンテテイン（アシル担体タンパク質）の結合部位を有する。組換え大腸菌から精製されたヒトＦＡＳは、これらの活性のすべてを示す（ジャヤクマールら（Ｊａｙａｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９３巻、１４５０９〜１４５１４ページ）。ジャヤクマールら（Ｊａｙａｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９２巻、８６９５〜８６９９ページ）は、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２からＦＡＳをほぼ均質になるまで精製した。
【０１５７】
ＦＡＳの発現は、栄養およびホルモンに制御されている（セメンコヴィッチ　シー　エフ（Ｓｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈ　Ｃ．Ｆ．）、１９９７年、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．第３６巻、４３〜５３ページ）。ラットの部分ｃＤＮＡクローンをノーザンブロット法のプローブとして用いたとき、本発明者らのデータ（表１および２）は、ＰＵＦＡがＦＡＳのｍＲＮＡレベルを低下させることを示す以前に報告されたデータ（クラーケら（Ｃｌａｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１２０巻、２２５〜２３１ページおよびアームストロングら（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１７７巻、１０５６〜１０６１ページ）と一致している。さらに、その発現はストレプトゾトシン誘発性糖尿病において変化する（サガーソン　イー　ディーおよびカーペンター　シー　エー（Ｓａｇｇｅｒｓｏｎ　Ｅ．Ｄ．ａｎｄ　Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ　Ｃ．Ａ．）、１９８７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第２４３巻、２８９〜２９２ページ）。これは、ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットではｍＲＮＡの存在量が減少していることを示唆する本発明者らの結果と一致している。
【０１５８】
ＦＡＳのラットプロモーターは、リポーター検定システムを用いて培養細胞およびトランスジェニックマウスのいずれにおいても十分に特徴づけられている（セメンコヴィッチ　シー　エフ（Ｓｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈ　Ｃ．Ｆ．）、１９９７年、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．第３６巻、４３〜５３ページ）。ヒトＦＡＳ遺伝子の２つのプロモーターについても記載されており、１つはラット遺伝子と非常に類似しており、もう１つは第１イントロンの３’末端の約２６０塩基対からなるプロモーターＩＩである（シューら（Ｈｓｕ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻、１３５８４〜１３５９２ページ）。
【０１５９】
ヒトＦＡＳに対する抗体は入手可能であり、免疫組織化学およびウェスタンブロット法に用いられている（ジョワイユら（Ｊｏｙｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．第７０巻、１４３８〜１４４４ページ、ジャヤクマールら（Ｊａｙａｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９３巻、１４５０９〜１４５１４ページ、およびウィレンツら（Ｗｉｌｅｎｔｚ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｄｅｖ．Ｐａｔｈｌ．第３巻、５２５〜５３１ページ）。
【０１６０】
ＦＡＳは、抗腫瘍療法の有望な選択的標的として提案されている（クハージダら（Ｋｕｈａｊｄａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９１巻、６３７９〜６３８９ページ）。ＦＡＳタンパク質についての薬物スクリーニング検定が記載されている（特許協力条約国際特許出願公開第ＷＯ００／５１４３０号）。
【０１６１】
本発明者らは、ＦＡＳ遺伝子の発現を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするためにヒトプロモーターを使用することを含む標的試験化合物を特定する新規な方法を教示している。
【０１６２】
ＩＸ．グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子およびポリペプチド
試験において特定された差次的に発現されたバンドの１つは、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）遺伝子のラットの部分ｃＤＮＡであった。Ｇ６ＰＤ　ｃＤＮＡは、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０７４６７）およびヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３６７４）からクローニングされている。
【０１６３】
Ｇ６ＰＤは、ペントースリン酸の産生および還元的生合成や細胞の酸化還元状態の維持のためのＮＡＤＰＨのかたちの還元力の産生をもたらすペントースリン酸経路における最初の反応を触媒する。
【０１６４】
ヒトＧ６ＰＤは、組換え大腸菌（バウティスタら（Ｂａｕｔｉｓｔａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９２年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第１１１９巻、５１２〜５１８ページ）ならびにヒト赤血球（アデディラン　エス　エー（Ａｄｅｄｉｒａｎ　Ｓ．Ａ．）、１９９６年、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、７８巻、１６５〜１７０ページ）およびラット脳（アスカールら（Ａｓｋａｒ　ｅｔ　ａｌ．）、Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．第３３巻、５１２〜５１８ページ）を含む種々の他の供給源から精製されている。
【０１６５】
Ｇ６ＰＤは、ホルモン、栄養素および酸化体ストレスにより組織特異的に制御を受ける（クレツィエンら（Ｋｌｅｔｚｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．第８巻、１７４〜１８１ページ）。ＰＵＦＡはＧ６ＰＤ　ｍＲＮＡレベルを低下させると報告されており（トムリンソンら（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１１８巻、４０８〜４１５ページおよびヨシダら（Ｙｏｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．第４５巻、４１１〜４２１ページ）、これは、本発明者らのノーザンブロットの所見からの結果と一致している（表２を参照）。
【０１６６】
ラットおよびヒト双方のＧ６ＰＤのプロモーターがクローニングされ、リポーター検定システムを用いて特徴づけられている（ウーシニら（Ｕｒｓｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１７０巻、１２０３〜１２０９ページ、クレツィエンら（Ｋｌｅｔｚｉｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．第８巻、１７４〜１８１ページおよびフィリッペら（Ｐｈｉｌｌｉｐｐｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２２６巻、３７７〜３８４ページ）。Ｇ６ＰＤに対する抗体は入手可能である（ダオら（Ｄａｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第７９巻、２８６０〜２８６４ページおよびムーアら（Ｍｏｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第７巻、１４１９〜１４２４ページ）。
【０１６７】
本発明者らは、Ｇ６ＰＤの遺伝子発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするためにラットおよびヒト遺伝子ならびにプロモーターを使用することを含む、Ｇ６ＰＤに対する標的試験化合物を特定する新規な方法を教示している。
【０１６８】
Ｘ．グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子およびポリペプチド
ＧＰＡＴのミトコンドリア型アイソフォームおよびミクロソーム型アイソフォームが報告されている。試験において特定された差次的に発現されたバンドの１つは、グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）遺伝子のミトコンドリア型アイソフォームのラットの部分ｃＤＮＡであった。ミトコンドリア型イソ酵素のラットおよびマウスｃＤＮＡのみがクローン化されている（ガネシュら（Ｇａｎｅｓｈ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１４３９巻、４１５〜４２３ページ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０２１３４８およびシンら（Ｓｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６６巻、２３８３４〜２３８３９ページ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００８１４９）。
【０１６９】
生物情報学的手法を用いて、ＧｅｎＢａｎｋのＨＴＧＳデータベースにおいてヒト遺伝子を第１０染色体のゲノムＤＮＡのフラグメント上に特定した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ３９１９８６）。オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、提示されたヒト遺伝子配列をクローニングおよびＤＮＡ配列決定により立証した（図２８）。エキソンをＡＬ１３５８３８のゲノムＤＮＡ上にマップしたところ、遺伝子は２０個のコーディングエキソンを含むことが見いだされた。ナガセら（Ｎａｇａｓｅ　ｅｔ　ａｌ．）（２０００年、ＤＮＡ　Ｒｅｓ．第７巻、２７３〜２８１ページ）は、このヒトＧＰＡＴ　ＣＤＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０４６７８０）のカルボキシル末端のみを含む不完全なｃＤＮＡをクローニングしている。このヒト遺伝子配列のＣＤＳはＧｅｎＢａｎｋに提出されたが、グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子としてのその機能上の同一性を示唆するアノテーションは存在しない。それは単に「ＫＩＡＡ１５６０タンパク質のｍＲＮＡ」と同定されただけである。
【０１７０】
ヒト、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＢ７１６０５）およびマウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３２１７５）のＧＰＡＴ遺伝子間の同一性および類似性を示す多重配列アライメントを図２９に示す。ヒトおよびマウスの遺伝子は９３％同一または９６％類似であり、一方、ヒトおよびラットの遺伝子は９２％同一または９５％類似である。
【０１７１】
現在までのところ、マウスのプロモーターの特徴づけのみが報告されている（ジャーキンスら（Ｊｅｒｋｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻、１４１６〜１４２１ページおよびエリクッソンら（Ｅｒｉｃｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、７２９８〜７３０５ページ）。
【０１７２】
生物情報学的手法を用いて、ヒトＧＰＡＴ遺伝子の制御領域を特定し、地図を作製した。ヒトＧＰＡＴ　ＣＤＳによりＢＬＡＳＴＮを用いてＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門を検索することにより、遺伝子の５’ＵＴＲの２０５ｂｐを含むヒトＥＳＴを特定した（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＶ６９５２８８）。この実験から、独自に５’ＵＴＲを含む２つの追加の上流エキソンと、長さ３１ｋｂをこえる第１のイントロンの存在が明らかにされた。ＡＴＧからの部位−３２５３５〜−３４５３４の制御領域を図３０に示す。
【０１７３】
ＧＰＡＴは、１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸を生成するためのｓｎ−グリセロール３−リン酸のアシル化を触媒し、それによりグリセロ脂質の生成のための確実なステップを提供する（ベル　アール　エムおよびコールマン　アール　エー（Ｂｅｌｌ　Ｒ．Ｍ．ａｎｄ　Ｃｏｌｅｍａｎ　Ｒ．Ａ．）、１９８０年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第４９巻、４５９〜４８７ページ）。マウスミトコンドリアタンパク質に対する抗体が産生されている（イェットら（Ｙｅｔ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３２巻、９４８６〜９４９１ページ）。
【０１７４】
ラットの部分ｃＤＮＡクローンをノーザンブロット分析のプローブとして用いて、本発明者らはＰＵＦＡがＧＰＡＴ　ｍＲＮＡレベルを低下させることを最初に示している（表１および２参照）。
【０１７５】
本発明者らはこのように、新規な薬物標的すなわちＧＰＡＴについて、その遺伝子発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするためにラットおよびヒトの遺伝子ならびにプロモーターを使用することを含めて示している。
【０１７６】
ＸＩ．Ｓｐｏｔ−１４遺伝子およびポリペプチド
試験において特定された差次的に発現したバンドの１つは、Ｓｐｏｔ−１４遺伝子のラットの部分ｃＤＮＡであった。Ｓｐｏｔ−１４配列は、ヒト（グリラスカら（Ｇｒｉｌｌａｓｃａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．第４０１巻、３８〜４２ページ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ０８４０９）、ラット（リアウ　シー　ダブリューおよびトウル　エイチ　シー（Ｌｉａｗ　Ｃ．Ｗ．ａｎｄ　Ｔｏｗｌｅ　Ｈ．Ｃ．）、１９８４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５９巻、７２５３〜７２６０、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ０１９３４）およびマウス（グリラスカら（Ｇｒｉｌｌａｓｃａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．第４０１巻、３８〜４２ページ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ９５２７９）において知られている。ラットおよびマウスのＳｐｏｔ−１４遺伝子の発現は、肝臓および脂肪組織において広く研究されている。Ｓｐｏｔ−１４特異抗体を用いて脂質生成組織の核に見いだされたＳｐｏｔ−１４タンパク質は、甲状腺ホルモン（Ｔ３）および食事中の炭水化物により共同作用的に誘導される（キンロウら（Ｋｉｎｌａｗ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６４巻、１９７７９〜１９７８３ページ、キンロウら（Ｋｉｎｌａｗ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１３３巻、６４５〜６５０ページ、クラークら（Ｃｌａｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｊ．Ｎｕｔｒ．第１２０巻、２１８〜２２４ページ、ジャンプら（Ｊｕｍｐ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．第３５巻、１０７６〜１０８４ページおよびリュー　エイチ　シーおよびトウル　エイチ　シー（Ｌｉｕ　Ｈ．Ｃ．ａｎｄ　Ｔｏｗｌｅ　Ｈ．Ｃ．）、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．第８巻、１０２１〜１０３７ページ）。
【０１７７】
Ｓｐｏｔ−１４は、脂質生成に密接に関連づけられており、より具体的には正常組織および癌組織における脂質生成を増大させる代謝インテグレータである（カニングハムら（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｔｈｙｒｏｉｄ、第８巻、８１５〜８２５ページ）。ＴＨＲＳＰ遺伝子は、ヒトの肝臓および脂肪細胞、特に脂肪腫小節において発現する。さらに、その発現はストレプトゾトシン誘発性糖尿病において変化する（ジャンプら（Ｊｕｍｐ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．第４巻、１６５５〜１６６０ページ）。これは、ＳＴＺ誘発性糖尿病ラットではｍＲＮＡの存在量が減少していることを示唆する本発明者らの結果と一致している。本発明者らのノーザンブロットデータ（表２）は、ＰＵＦＡがＳｐｏｔ−１４のｍＲＮＡレベルを低下させることを示す、以前に報告されたデータと一致している（フォレッツら（Ｆｏｒｅｔｚ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３４１巻、３７１〜３７６ページ）。
【０１７８】
グリラスカら（Ｇｒｉｌｌａｓｃａ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９７年、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．第４０１巻、３８〜４２ページ）は、ヒトおよびマウスの遺伝子（ＴＨＲＳＰとも呼ばれる）およびプロモーターをクローニングし、それがラット遺伝子と同じ構成を有し、高度に保存されたアミノ酸配列（８０％を超える）を示すことを見いだした。タビオーら（Ｔａｖｉａｕｘ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９７年、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ．第７６巻、２１９〜２２０ページ）は、蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成により、ＴＨＲＳＰ遺伝子を１１ｑ１３．５〜ｑ１４．１に位置づけた。
【０１７９】
長鎖脂肪酸合成の増大が乳癌において発生することがある。それは、不良な予後を示す腫瘍増殖では必ず発生する。Ｓｐｏｔ−１４タンパク質は、脂肪酸合成酵素をコードする遺伝子を活性化する。ＴＨＲＳＰ遺伝子が存在する染色体領域１１ｑ１３の増幅によっても、乳癌の予後不良が予測される。モンカーら（Ｍｏｎｃｕｒ　ｅｔ　ａｌ．）（１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９５巻、６９８９〜６９９４ページ）は、１１ｑ１３の増幅された領域のテロメア末端におけるマーカーＤ１１Ｓ９０６とＤ１１Ｓ９３７との間にＴＨＲＳＰ遺伝子の位置を特定し、該遺伝子が乳癌由来細胞株において増幅かつ発現されることを見いだした。他の所見から、腫瘍の脂質代謝を決定付ける因子としての該タンパク質の役割を裏づけられた。Ｓｐｏｔ−１４の発現は、乳癌における２つの予後指標、すなわち脂質生成の増大と１１ｑ１３の増幅との間に病態生理学的関連性をもたらした。
【０１８０】
本発明は、薬物標的すなわちＳｐｏｔ−１４の遺伝子発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするためにラットおよびヒトの遺伝子ならびにプロモーターを使用することを含む、Ｓｐｏｔ−１４に対する試験化合物を特定する新規な方法を教示する。
【０１８１】
ＸＩＩ．カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子およびポリペプチド
試験において特定された差次的に発現されたバンドの１つは、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）遺伝子のラットの部分ｃＤＮＡであった（サルミネンら（Ｓａｌｍｉｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９０年、Ｇｅｎｅ、第９３巻、２４１〜２４７ページおよびランドストロームら（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９１年、ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．第１０巻、１８１〜１８９ページ）。
【０１８２】
ＣＯＭＴは、基質中のフェノール性水酸基の１つをメチル化することにより、種々の生物における様々なカテコール含有分子を不活性化する（ガルドベルグおよびマースデン（Ｇｕｌｄｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｍａｒｓｄｅｎ）、１９７５年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．第２７巻、１３５〜３０６ページ）。哺乳類においては、神経伝達物質、ホルモンおよびパーキンソン病の治療に用いられているＬ−ドーパのようなカテコール部分を含む薬物は、ＣＯＭＴにより不活性化される（テンフネン　ジェイ（Ｔｅｎｈｕｎｅｎ　Ｊ．）、１９９６年、ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．第１５巻、４６１〜４７３ページ）。ＣＯＭＴの阻害剤は、パーキンソン病およびアルツハイマー病の治療に有用であると考えられている（ジョーガら（Ｊｏｒｇａ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．第６７巻、６１０〜６２０ページならびにチョン　ビー　エスおよびメースフェルダー　ティー　エル（Ｃｈｏｎｇ　Ｂ．Ｓ．ａｎｄ　Ｍｅｒｓｆｅｌｄｅｒ　Ｔ．Ｌ．）、２０００年、Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．第３４巻、１０５６〜１０６５ページ）。
【０１８３】
ヒトおよびラットのＣＯＭＴ遺伝子ならびにプロモーターについての記載がある（テンフネンら（Ｔｅｎｈｕｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２２３巻、１０４９〜１０５９ページ、カイら（Ｘｉｅ　ｅｔ　ａｌ．），１９９９年、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第５６巻、３１〜３８ページおよびテンフネンら（Ｔｅｎｈｕｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９６年、ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．第１５巻、４６１〜４７３ページ）。ＣＯＭＴは精製されており、それに対する抗体についての記載がある（ティルグマン　シーおよびウルマネン　アイ（Ｔｉｌｇｍａｎｎ　Ｃ．ａｎｄ　Ｕｌｍａｎｅｎ　Ｉ．）、１９９６年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ　Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．第６８４巻、１４７〜４６１ページおよびカストナーら（Ｋａｓｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第６２巻、４４９〜４５７ページ）。
【０１８４】
アドレナリンを基質として用いたＣＯＭＴの酵素検定は公表されており、当業者によって十分に知られている（ヴィエイラ・コエルホ　エムおよびソアレス・ダ・シルヴァ　ピー（Ｖｉｅｉｒａ−Ｃｏｅｌｈｏ　Ｍ．ａｎｄ　Ｓｏａｒｅｓ−ｄａ−Ｓｉｌｖａ　Ｐ．）、１９９９年、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．第８２１巻、６９〜７８ページおよびボルゲスら（Ｂｏｒｇｅｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｊ．Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｎｈｉｂ．第１３巻、４７３〜４８３ページ）。
【０１８５】
ラットの部分ｃＤＮＡクローンをノーザンブロット法のプローブとして用いて、本発明者らはＰＵＦＡがＣＯＭＴのｍＲＮＡレベルを低下させることを最初に示す（表１および２を参照）。
【０１８６】
よって本発明者らは、ＣＯＭＴ遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするためにラットおよびヒト遺伝子ならびにプロモーターを使用することを含む、ＣＯＭＴ発現を標的とする試験化合物を特定する新規な方法を示している。
【０１８７】
ＸＩＩＩ．ＩＮＳＩＧ１遺伝子およびポリペプチド
試験において特定された差次的に発現されたバンドの１つは、インスリン誘導性遺伝子１（ＩＮＳＩＧ１）のラットの部分ｃＤＮＡであった。ＩＮＳＩＧ１配列は、ヒト（ペンら（Ｐｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第４３巻、２７８〜２８４ページ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９６８７６）およびラット（当初ＣＬ−６と命名された）（ダイアモンドら（Ｄｉａｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８巻、１５１８５〜１５１９２ページ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１３６１９）において知られている。
【０１８８】
ラットＣＬ−６は、肝細胞株においてインスリンにより最も高度に誘導される遺伝子であり、再生および発生時に増殖中の肝臓において発現される（ボルトフら（Ｂｏｒｔｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ、第７巻、１９９〜２０７ページ、チンら（Ｃｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２６９巻、Ｅ６９１〜Ｅ７００ページおよびハーバーら（Ｈａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第２２巻、９０６〜９１４ページ）。
【０１８９】
ヒトの同遺伝子は、翻訳領域内でラット遺伝子と８０％の同一性を共有している。蛍光ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成により、該遺伝子は７ｑ３６に位置づけされた（ペンら（Ｐｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第４３巻、２７８〜２８４ページ）。ヒトおよびラットタンパク質の推定分子量は、それぞれ３０および２８ｋＤａである。ＩＮＳＩＧ１は、５つの潜在的な膜スパンニングドメインを有し、ラットタンパク質に対するウェスタンブロットにおいて抗ＣＬ−６抗血清を用いて測定された実験的分子量は約４３ｋＤａである（ダイアモンドら（Ｄｉａｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８巻、１５１８５〜１５１９２ページ）。
【０１９０】
ＩＮＳＩＧ１は肝再生に関与することが知られており、インスリンにより高度に誘導される。同タンパク質は、他のタンパク質の機能ドメインと明確な相同性を有さない。発現の程度は肝臓および腎臓で最高であり、続いて心臓および筋肉である（ダイアモンドら（Ｄｉａｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８巻、１５１８５〜１５１９２ページ）。ヒトＩＮＳＩＧ１に関するプロモーター試験がルシフェラーゼ検定を用いて実施されている（ペンら（Ｐｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第４３巻、２７８〜２８４ページ）。
【０１９１】
ラットの部分ｃＤＮＡクローンをノーザンブロット法のプローブとして用いて、本発明者らはＰＵＦＡがＩＮＳＩＧ１のｍＲＮＡレベルを低下させることを最初に示している（表１および２を参照）。
【０１９２】
よって本発明者らにより、ＩＮＳＩＧ１遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を調節する新規な薬物または化学物質をスクリーニングするためにラットおよびヒトの遺伝子ならびにプロモーターを使用することを含む、ＩＮＳＩＧ１発現を標的とする試験化合物を特定する新規な方法が示されている。
【０１９３】
（対象ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
対象ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書でさらに考察するように、疾患、特にヒト疾患の治療法および診断法の発見のための研究試薬および研究材料として用いることができる。
【０１９４】
（ヌクレオチドプローブ）
本発明の核酸分子により、当業者は生体材料中のヌクレオチド配列の検出に用いるヌクレオチドプローブを構築することが可能である。本明細書に記載のように、制限酵素の多くの特有の制限配列が、対象ポリヌクレオチドの配列一覧に特定される核酸分子内に組み込まれており、これらによって、本発明の対象ポリヌクレオチドに特有なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列へのアクセスが可能となる。対象ポリヌクレオチドに特有なヌクレオチド配列またはそのイソ型（アイソフォーム）は、当技術分野で周知の手順により実施される化学合成および酵素的連結反応によって構築することも可能である。
【０１９５】
ヌクレオチドプローブは、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ等のような十分なシグナルを提供しかつ十分な半減期を有する放射性標識を始めとする検出可能なマーカーで標識することができる。使用できる他の検出可能なマーカーとしては、特異的標識抗体により認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識抗原に対して特異的な抗体および化学発光化合物などがある。適切な標識は、検出すべきヌクレオチドへのプローブのハイブリッド形成および結合の速度と、ハイブリッド形成に利用可能なヌクレオチドの量とを考慮して選択可能である。ヌクレオチドプローブは、本発明の対象ポリヌクレオチドと関連または類似の遺伝子を検出するために用いることができる。
【０１９６】
したがって、本発明はまた、検出可能なマーカーで標識した本発明の１つまたは複数のヌクレオチドプローブに試料をハイブリッド形成条件下で接触させることと、試料中の核酸分子とヌクレオチドプローブとの間のハイブリッド形成の程度を測定することとから成る、試料中の対象ポリヌクレオチドに関連するかまたは類似のポリペプチドをコードする核酸分子の存在を検出する方法も提供する。
【０１９７】
本発明の方法に用いることができるハイブリッド形成条件は、当技術分野で知られており、例えば、前述のサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）に記載されている。ハイブリッド形成産物は、当技術分野で知られている技術を用いて分析することができる。ヌクレオチドプローブは、本明細書に記載のように検出可能なマーカーで標識することができ、ハイブリッド形成産物は、検出可能なマーカーまたは検出可能なマーカーによってもたらされる検出可能な変化を検出することにより、分析することができる。
【０１９８】
（プライマー）
本発明の核酸分子の同定は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において本発明のポリヌクレオチド分子を増幅するためのプライマーとして用いることができるヌクレオチド配列の同定および単離または合成も可能にする。ＰＣＲに用いるプライマーの長さと塩基とは、一方のプライマーから合成される伸長産物がその鋳型から分離されたとき、他方のプライマーが伸長して規定の長さの核酸となるための鋳型として働き得るように、両プライマーが所望の配列の別々の鎖でかつその配列上の相対的な位置にハイブリッド形成するように選択する。
【０１９９】
本発明において用いることができるプライマーは、精製された制限エンドヌクレアーゼ消化物中にあるように天然に存在する、あるいは、例えばホスホトリエステルおよびホスホジエステル法または自動化法（コノリー　ビー　エー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ　Ｂ．Ａ．）、１９８７年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．第１５巻、３１３１〜３１３９ページを参照）のような当技術分野で知られている技術を用いて合成により生産されるオリゴヌクレオチド、すなわち、本発明の核酸分子の２つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む分子である。プライマーは、本発明のＤＮＡ配列と相補的であるプライマー伸長産物の合成を可能とする条件下、例えば、ヌクレオチド基質、ＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在下で適切な温度およびｐＨのもとに置いたとき、合成の開始点として作用することができる。プライマーは、他のプライマーコピーとの塩基対合により２次構造を形成しない配列またはヘアピン構造を形成する配列であることが好ましい。プライマーは、１本鎖または２本鎖であってよい。プライマーが２本鎖である場合、増幅産物を調製するためにプライマーを使用する前に、鎖を分離するべく処理すればよい。プライマーは、約７〜２５ヌクレオチドを含むことが好ましい。
【０２００】
プライマーは、増幅産物の検出を可能にする検出可能なマーカーで標識することができる。適切な検出可能なマーカーは、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉおよび３Ｈのような放射性マーカー、化学発光マーカーのような発光マーカー（好ましくはルミノール）、および蛍光マーカー（好ましくは、ダンシルクロライド、フルオレセイン−５−イソチオシアネートおよび４−フルオロ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３ジアゾール）ならびにビオチンのような補因子である。十分な量のプライマーが増幅すべき本発明の核酸またはそのオリゴヌクレオチド配列と相補的な配列を含んでいるならば、プライマーは非相補的配列を含んでいてよいことは理解できよう。制限部位のリンカーも、増幅産物のクローニングと配列決定とを容易にする適切な制限酵素による増幅産物の消化を可能にしつつ、プライマーに組み込まれていてもよい。
【０２０１】
（検定−配列の増幅）
したがって、ポリメラーゼ連鎖反応において核酸分子またはその核酸分子の所定のオリゴヌクレオチドフラグメントを増幅可能なプライマーを用いて、増幅配列を生成させるべく増幅配列の生成が可能な条件下で試料を処理することと、増幅配列を検定することとを含む、試料中の対象ポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドの所定のオリゴヌクレオチドフラグメントをコードする配列を有する核酸分子の存在を確定する方法が提供される。
【０２０２】
ポリメラーゼ連鎖反応は、引用により本願に組み込まれる、イニス　エム　エーおよびゲルファント　ディー　エイチ（Ｉｎｎｉｓ　Ｍ．Ａ．ａｎｄ　Ｇｅｌｆａｎｄ　Ｄ．Ｈ．）、１９８９年、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、イニス　エム　エー、ゲルファント　ディー　エイチ、シンスキー　ジェー　ジェーおよびホワイト　ティー　ジェー（Ｉｎｎｉｓ　Ｍ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ　Ｄ．Ｈ．，Ｓｈｉｎｓｋｙ　Ｊ．Ｊ．ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ　Ｔ．Ｊ．）（編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］、３〜１２ページに一般的に記載されているように、標的核酸配列を増幅する方法を指す。
【０２０３】
増幅産物は、当技術分野で知られている技術を用いて、それらの各サイズに基づいて単離し、区別することが可能である。例えば、増幅後、ＤＮＡ試料をアガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色した後に紫外（ＵＶ）光下で可視化することが可能である。ＤＮＡは所望のレベルに増幅することができ、放射性標識またはビオチン標識されたヌクレオシド三リン酸のような検出可能なマーカーを有するヌクレオチド誘導体を組み込むためにさらなる伸長反応を行うことができる。プライマーを検出可能なマーカーで標識してもよい。検出可能なマーカーは、制限酵素および電気泳動による分離または当技術分野で知られている技術により分析することができる。
【０２０４】
ＰＣＲを用いる本発明の方法において用いることができる条件は、ハイブリッド形成および増幅反応が試料中のＤＮＡおよび適切な相補的ハイブリッド形成プライマーの存在下で進行することを可能にする条件である。ポリメラーゼ連鎖反応に適した条件は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、本願明細書に援用する、イニス　エム　エーおよびゲルファント　ディー　エイチ（Ｉｎｎｉｓ　Ｍ．Ａ．ａｎｄ　Ｇｅｌｆａｎｄ　Ｄ．Ｈ．）、１９８９年、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、イニス　エム　エー、ゲルファント　ディー　エイチ、シンスキー　ジェー　ジェーおよびホワイト　ティー　ジェー（Ｉｎｎｉｓ　Ｍ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ　Ｄ．Ｈ．，Ｓｈｉｎｓｋｙ　Ｊ．Ｊ．ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ　Ｔ．Ｊ．）（編）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク所在］、３〜１２ページを参照のこと。好ましくは、ＰＣＲには好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓから得られるポリメラーゼ（ＧｅｎｅＡｍｐキットのＴａｑポリメラーゼ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用いるか、あるいは、他の熱安定性ポリメラーゼを用いてＤＮＡ鋳型鎖を増幅してもよい。
【０２０５】
本発明の核酸を増幅するのにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列に基づく増幅法（Ｎｕｃｌｅｉｃ−Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）のような他の技術を用いることができることは理解されよう。ＬＣＲにおいては、標的鎖上に互いに隣接してハイブリッド形成する２つのプライマーが標的鎖の存在下で連結されて相補鎖を形成する（バックマン（Ｂａｃｋｍａｎ）、１９９１年、および１９８９年６月１４日公表の欧州公告出願第０３２０３０８号）。ＮＡＳＢＡは２つのプライマーを用いる連続増幅法であり、一方のプライマーはＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーター配列を組み込んでおり、第２のプライマーは標的配列の第１のプライマーに対して相補的な配列から得られるものである（マレク（Ｍａｌｅｋ）への米国特許第５，１３０，２３８号）。
【０２０６】
（ベクター）
本発明はまた、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に改変される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリヌクレオチドの生産を教示している。
【０２０７】
本発明のこの態様によれば、ベクターは、例えば、プラスミドベクター、１本鎖または２本鎖のファージベクター、あるいは１本鎖または２本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターであってよい。これに関する特定の実施形態において、ベクターは特異的発現を可能にする。そのような特異的発現は、誘導性発現または特定の種類の細胞のみにおける発現または誘導性かつ細胞特異的発現である。誘導性ベクターのうちの特定のものは、温度および栄養添加物のような操作しやすい環境因子により発現誘導可能なベクターである。原核生物の宿主および真核生物の宿主に用いるための構成を有し誘導可能な発現ベクターを含む、本発明のこの態様に適した様々なベクターは、当業者に良く知られており、また日常的に用いられている。そのようなベクターとしては、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミドから、バクテリオファージから、トランスポゾンから、酵母エピソームから、挿入エレメントから、酵母染色体エレメントから、ウイルス（バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス）から得られるベクター、ならびにコスミドおよびファージミドのようなプラスミド遺伝因子とバクテリオファージ遺伝因子とから得られるようなそれらの組合せに由来するベクターなどがある。これらのすべてが、本発明のこの態様による発現のために用いることができる。
【０２０８】
市販されている以下のベクターを、例として記載する。細菌用のベクターの主なものは、ｐＱＥ−９、ｐＱＥ−１６、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−４０、ｐＱＥ−５０およびｐＱＥ−６０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ、ｐＴｒｃＨｉｓおよびｐＢＡＤ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＥＴ−５（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ｐＢＳファージミドベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＣＡＬ、ｐＥＴ−３およびｐＳＰＵＴＫ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３２−８およびｐＲＩＴ２Ｔ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））およびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）である。真核ベクターの主なものは、ｐＧＡＰＺ、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＳ２／ＣＴおよびｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＣＡＴ３およびｐＧＬ３（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＸＴ１、ｐＤｕａｌ、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＥＳＣ、ＨｙｂｒｉＺＡＰ２．１、ＩｍｍｕｎｏＺＡＰおよびｐＲＳ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ならびにｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））である。これらのベクターは、本発明のこの態様に従って当業者が使用可能な多くの市販かつよく知られたベクターの単なる例として列挙する。例えば、宿主における本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発現に適した他のプラスミドまたはベクターを、本発明のこの態様に用いることができることは理解されよう。一般的に、宿主においてポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現させるためにポリヌクレオチドを維持、増殖または発現するのに適した任意のベクターが、この点で発現に用いることができる。
【０２０９】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、例えばｍＲＮＡ転写を誘導するプロモーターなどの適切な発現制御配列と作動可能なように連結されている。プロモーター領域は、制限部位または候補プロモーター・フラグメント、すなわちプロモーターを含む可能性があるフラグメントを導入するための部位の下流のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニットのようなプロモーター領域を欠くリポーター転写ユニットを備えたベクターを用いて所望の遺伝子から選択することが可能である。よく知られているように、プロモーターを含むフラグメントをベクターのＣＡＴ遺伝子の上流の制限部位に導入することにより、標準的なＣＡＴ検定により検出可能なＣＡＴ活性が生じる。この目的に適したベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＡＴ３のように、よく知られており、容易に入手できる。本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターには、よく知られ、かつ容易に入手できるプロモーターだけでなく、リポーター遺伝子を用いて前記の技術により容易に得られるプロモーターも含まれる。本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した既知の原核プロモーターは、大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲおよびＰＬプロモーターならびにｔｒｐプロモーターなどである。この点について適した既知の真核プロモーターは、ＣＭＶ即時型プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーターのようなレトロウイルスＬＴＲｓのプロモーターおよびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターなどである。
【０２１０】
増殖および発現用のベクターは一般的に、例えば、前記のサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）に記載されているような選択可能なマーカーおよび増幅領域を備える。
【０２１１】
（宿主細胞）
本明細書で前述したように、本発明は、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に改変される宿主細胞をも教示している。
宿主細胞中のポリヌクレオチド構築物は、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産するために通常の方法で用いることが可能である。対象ポリヌクレオチドまたはポリペプチド産物またはそのイソ型またはその一部は、当技術分野で知られている技術を用いて適切な宿主細胞中で発現させることにより得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物または細胞株、例えば、細菌、哺乳類、酵母または他の菌類、ウイルス、植物または昆虫の細胞などがある。外来ＤＮＡを発現させるために細胞を形質転換またはトランスフェクションする方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、イタクラら（Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，７０４，３６２号、ヒンネンら（Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９７８年、マライら（Ｍｕｒｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，８０１，５４２号、マックナイトら（ＭｃＫｎｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，９３５，３４９号、ハーゲンら（Ｈａｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）米国特許第４，７８４，９５０号、アクセルら（Ａｘｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，３９９，２１６号、ゲッダルら（Ｇｏｅｄｄａｌ　ｅｔ　ａｌ．）、米国特許第４，７６６，０７５号およびサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ）に所在］（すべてを本願明細書に援用する）を参照）。適切な宿主の代表的な例としては、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトミセスおよび枯草菌のような細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギルス細胞のような菌類の細胞；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ−１、ＺＲ−７５−１、チャン（Ｃｈａｎｇ）、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞；ならびに植物細胞などがある。
【０２１２】
宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込み、本発明のポリヌクレオチドを発現するべく遺伝子工学的に改変することが可能である。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプ・ローディング（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染またはその他の方法により行うことが可能である。そのような方法は、デービスら（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、エルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）［ニューヨーク所在］およびサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ）に所在］のような多くの標準的な実験手引き書に記載されている。
【０２１３】
（対象ポリペプチドの生産）
本明細書において前述したように、本発明は組換え技術による本発明のポリヌクレオチドの生産についても教示している。
対象ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に付加的なアミノ末端またはカルボキシル末端アミノ酸を加えた、または成熟ポリペプチドの内部にアミノ酸を加えた（例えば、成熟型が２つ以上のポリペプチド鎖を有している場合）ポリペプチドをコードする。そのような配列は、例えば、前駆体から成熟型へのタンパク質のプロセシングにおいて役割を果たし、タンパク質輸送を可能にし、タンパク質の半減期を延長または短縮し、検定または生産のためのタンパク質の操作を容易にすると思われる。一般的にｉｎ　ｖｉｖｏの場合と同様に、付加的アミノ酸は細胞の酵素により処理されて成熟タンパク質から離れうる。
【０２１４】
１つまたは複数のプロ配列と融合した成熟型のポリペプチドを有する前駆体タンパク質は、不活性型のポリペプチドである可能性がある。プロ配列が除去されるとき、一般にそのような不活性な前駆体は活性化される。活性化の前にプロ配列の一部またはすべてが除去されうる。一般的に、そのような前駆体はプロタンパク質と呼ばれている。
【０２１５】
したがって、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、成熟タンパク質＋リーダー配列（プレタンパク質と呼ばれることがある）、プレタンパク質のリーダー配列ではない１つまたは複数のプロ配列を有する成熟タンパク質の前駆体、または、活性型および成熟型のポリペプチドを生産するプロセシング段階で通常除去されるリーダー配列および１つまたは複数のプロ配列を有するプロタンパク質の前駆体であるプレプロタンパク質をコードする。
【０２１６】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチドを発現させるために、上記の宿主／ベクター系を培養することにより調製可能である。組換え生産される対象タンパク質またはその一部は、市販のタンパク質濃縮システムのような当技術分野で知られている技術を用い、タンパク質を塩析した後透析することにより、アフィニティクロマトグラフィーにより、あるいは陰イオンまたは陽イオン交換樹脂を用いてさらに精製することができる。
【０２１７】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下において哺乳類細胞、酵母、細菌またはその他の細胞中で発現させることが可能である。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物から得られるＤＮＡを用いてそのようなタンパク質を生産するために用いることが可能である。原核および真核宿主とともに用いるための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、前記のサムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）によって記載されている。
【０２１８】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの異種構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは一般的に、発現のためのプロモーターと作動可能なように連結するべく標準的な技術を用いてベクターに挿入する。ポリヌクレオチドを、転写開始部位がリボソーム結合部位に対して５’に適切に配されるように位置づけする。リボソーム結合部位は、発現されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’に位置することになる。一般的に、開始コドン（通常ＡＵＧ）で始まりリボソーム結合部位と開始コドンとの間に位置する他の読み取り枠は存在しない。また、一般的に、発現ポリヌクレオチドの末端に翻訳停止コドンが存在し、真核宿主に用いるための構成物にポリアデニル化シグナルが存在する。転写領域の３’末端に適切に配置された転写終結シグナルもポリヌクレオチド構成物に含まれうる。
【０２１９】
翻訳されたタンパク質を小胞体内腔、ペリプラズム空間または細胞外の環境へ分泌するために、適切な分泌シグナルを発現ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは、ポリヌクレオチドに対して内因性であってよく、あるいは異種のシグナルであってもよい。タンパク質の発現に用いられる微生物の細胞は、凍結−融解の繰り返し、音波処理、機械的破砕または細胞溶解剤の使用などの任意の手頃な方法、または当業者に知られている他のそのような方法により破砕することが可能である。対象ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸による抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィーおよびレクチン・クロマトグラフィーなどの既知の方法により、組換え細胞の培養物から回収し、精製することが可能である。精製には高速液体クロマトグラフィーを用いることが最も好ましい。単離および／または精製時にポリヌクレオチドが変性する場合、活性な構造を再生するためにタンパク質をリフォールディングするための良く知られた技術を用いることができる。
【０２２０】
本発明の核酸分子は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合システム、例えば、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のｐＧＥＸ−１Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴおよびｐＧＥＸ−３Ｘにクローニングすることができる。融合遺伝子は、ＩＰＴＧにより高レベルの発現を誘導し得る強力なｌａｃプロモーターを調節要素として含むことができる。融合産物から所望のポリペプチドをタンパク質分解により切断することを可能にするトロンビンまたはＸａ因子切断部位が存在してもよい。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−対象ポリペプチド融合タンパク質は、例えばファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製のグルタチオン・セファロース４Ｂカラムを用いて容易に精製することができる。２６ｋＤａのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼポリペプチドを、トロンビン（ｐＧＥＸ−１ＴまたはｐＧＥＸ−２Ｔ）またはＸａ因子（ｐＧＥＸ−３Ｘ）により切断し、同じアフィニティカラムを用いてポリペプチドから分離することが可能である。必要ならば、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、登録商標）またはＤＥＡＥセルロースを用いた追加のクロマトグラフ工程を含めることが可能である。２つの酵素をタンパク質および酵素検定法によりモニターし、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認することができる。
【０２２１】
対象タンパク質またはその一部を、固相合成（メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９６４年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ａｓｓｏｃ．第８５巻、２１４９〜２１５４ページ）または均一溶液中の合成（ホウベンウェイルら（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ワンシュ　イー（Ｗａｎｓｃｈ　Ｅ．）（編）、第１５巻、ＩおよびＩＩ、ティーム（Ｔｈｉｅｍｅ）［ドイツ所在］）のようなタンパク質の化学においてよく知られている技術を用いて化学合成によって調製することもできる。
【０２２２】
本発明の背景において、対象ポリペプチドは生物学的活性を有する様々な構造型の一次タンパク質を含む。例えば、対象ポリペプチドは酸性塩または塩基性塩の形もしくは中性の形であってよい。さらに、個々のアミノ酸残基は酸化または還元により修飾されていてよい。さらに、最終的な効果としては対象ポリペプチドの生物学的活性が保持されるようにしつつ、様々な置換、削除または付加をアミノ酸または核酸配列に対して行うことができる。コードの縮重のため、例えば、同じアミノ酸をコードするヌクレオチド配列中にかなりの変動が存在しうる。
【０２２３】
ポリペプチドは、融合タンパク質のような修飾された形態で発現可能であり、また分泌シグナルだけでなく付加的な異種の機能領域も備えることができる。したがって、精製時またはその後の取扱いおよび保存時の宿主細胞中の安定性および持続性を改善するために、例えば、付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域をポリペプチドのカルボキシル末端またはアミノ末端に付加してもよい。また、精製を容易にするために、融合タンパク質をポリヌクレオチドまたはポリペプチドに付加してもよい。そのような領域は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。とりわけ、分泌または排出を誘発するため、安定性を改善するため、または精製を容易にするために、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにペプチド部分を付加することは、当技術分野では通常かつ常用の技術である。例えば、薬物の発見において、アンタゴニストを特定するためのハイスループットスクリーニング検定を目的としてタンパク質が抗体のＦｃ部分と融合されている（ベネットら（Ｂｅｎｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．第８巻、５２〜５８ページおよびジョハンソンら（Ｊｏｈａｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０巻、９４５９〜９４７１ページを参照のこと）。
【０２２４】
（抗体）
タンパク質を用いる検査に関して、脂肪調節性遺伝子産物に対する抗体を標準的な免疫学的技術、本明細書に記載した融合タンパク質または合成ペプチドを用いて生成させることが可能である。モノクローナル抗体を、ワルドマン　ティー　エー（Ｗａｌｄｍａｎｎ　Ｔ．Ａ．）、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５２巻、１６５７〜１６６２ページおよびハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］に記載されているような現在では通常の技術を用いて生産することも可能である。抗体フラグメント、すなわちＦａｂ’フラグメントを同様に用いることが可能であることも理解できよう。免疫検定法、例えば、被検試料を抗体と接触させ遺伝子産物への結合を検出するエライザ（ＥＬＩＳＡ）は、脂肪酸調節性遺伝子産物の存在および量を測定する迅速かつ効率のよい方法を提供し得る。例えば、抗体を用いて、臨床試験に登録された被験者における医薬品の効果を試験することが可能である。
【０２２５】
したがって、本発明はまた、対象ポリペプチドおよびそのフラグメントに、もしくは対象ポリヌクレオチド領域、特に対象ポリペプチドの遺伝子座またはその一部のポリヌクレオチド配列に特異的に結合することができる、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびそれらのフラグメントならびにそれらの免疫学的な結合性を有する同等物も提供する。「抗体」という用語は、均質な分子の実体または複数の異なる分子の実体からなる血清製剤のような混合物の両方を称するのに用いられる。ポリペプチドをペプチド合成機で合成により調製し、担体分子（例えば、カサガイヘモシアニン）と結合させ、ウサギに数カ月にわたり注射してもよい。ウサギ血清を対象ポリペプチドまたはフラグメントに対する免疫反応性について試験する。モノクローナル抗体は、該タンパク質のポリペプチド、融合タンパク質またはそれらのフラグメントをマウスに注射することにより生産することができる。モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、対象ポリペプチドまたはそのフラグメントとの特異的な免疫反応性について試験する（ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］）。これらの抗体は、検定だけでなく医薬品においても有用である。
【０２２６】
十分な量の所望のポリペプチドが得られたならば、様々な目的に用いることができる。一般的な用途は、特異的に結合する抗体の生産である。これらの抗体はポリクローナルまたはモノクローナルのいずれでもよく、当技術分野でよく知られているｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏの手法により生産することができる。ポリクローナル抗体を生産するために、適切な標的免疫系、一般的にマウスまたはウサギを選択する。実質的に精製された抗原を、該動物に適した方法および免疫学者によく知られている他のパラメーターによって決まる仕方で免疫系に与える。一般的な注射の経路は、足蹠、筋肉内、腹腔内または皮内である。もちろん、他の動物種をマウスまたはウサギの代わりに用いてもよい。次いで、ポリクローナル抗体を当技術分野において知られている手法を用いて精製し、所望の特性が得られるように調整する。
【０２２７】
免疫学的反応は通常免疫検定法により検定する。通常、そのような免疫検定法は、例えば抗原と同じ細胞により同じ方法で産生された、抗原の供給源のある程度の精製を必要とする。ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］またはゴーディング　ジェー　ダブリュー（Ｇｏｄｉｎｇ　Ｊ．Ｗ．）、１９９６年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ［米国ニューヨーク所在］に記載されているような、様々な免疫検定法が当技術分野においてよく知られている。
【０２２８】
１０８Ｍ−１または好ましくは１０９から１０１０Ｍ−１の、またはより強い親和性を有するモノクローナル抗体は一般的に、ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］またはゴーディング　ジェー　ダブリュー（Ｇｏｄｉｎｇ　Ｊ．Ｗ．）、１９９６年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ［米国ニューヨーク所在］に記載されているような標準的方法により調製されるであろう。その概要を述べると、適切な動物を選択し、望ましい免疫化プロトコールに従う。適切な期間の後に、その動物の脾臓を切除し、個々の脾臓細胞を適切な選択条件下で一般に不死化骨髄腫細胞に融合させる。その後、細胞をクローニングにより分離し、各クローンの上清を、抗原の所望の領域に対して特異的な適切な抗体の産生について試験する。
【０２２９】
他の適切な手法は、リンパ球を抗原性ポリペプチドにｉｎ　ｖｉｔｒｏで曝露させること、あるいはその代わりにファージまたは類似のベクター中の抗体ライブラリーを選択することを伴う（フーセら（Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５〜１２８１ページ）。本発明のポリペプチドおよび抗体は、修飾を施して、あるいは施さずに用いることができる。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質を共有結合または非共有結合させることにより標識されるであろう。様々な標識および複合の手法が知られており、科学および特許文献のいずれにも広範に報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害物質、蛍光物質、化学発光体、磁気粒子等がある。そのような標識の使用を教示している特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号などである。また、組換え免疫グロブリンを生産してもよい（米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。
【０２３０】
（対象ポリヌクレオチドに対するポリクローナル抗体の生成）
対象ポリヌクレオチドコード配列の配列を大腸菌内で融合タンパク質として発現させる。過剰発現したタンパク質をゲル溶離により精製し、ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［米国ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］により記載された方法に類似の方法を用いてウサギおよびマウスを免疫する。この方法は、他の様々なタンパク質に対する抗体を発生させることが示されている（例えば、クレマーら（Ｋｒａｅｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．、第３４巻、６６３〜６７１ページ）。
【０２３１】
概要を示すと、対象ポリヌクレオチドから選択した一続きのコード配列をプラスミドｐＥＴ５Ａ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州）またはｐＭＡＬシステム（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国）に融合タンパク質としてクローニングする。ＩＰＴＧによる誘導の後、予想された分子量を有する融合タンパク質が過剰発現していることを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより立証する。融合タンパク質を電気溶出によりゲルから精製する。対象ポリペプチド融合産物としてのタンパク質の同定は、Ｎ末端におけるタンパク質配列決定により立証することが可能である。次に、精製タンパク質をウサギにおいて免疫原として用いる。ウサギを完全フロイント・アジュバント中の１００μｇタンパク質で免疫し、３週間間隔で２回、最初は不完全フロイント・アジュバント中の１００μｇの免疫原を、その後ＰＢＳ中の１００μｇの免疫原を追加投与する。その２週間後に抗体を含む血清を採取する。
【０２３２】
この手順を繰り返して、対象ポリペプチドの突然変異型に対する抗体を生成させる。これらの抗体を野生型の対象ポリペプチドに対する抗体とともに用いて、種々の組織および体液中の突然変異型の存在および相対レベルを検出する。
【０２３３】
（対象ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体の生成）
以下のプロトコールに従ってモノクローナル抗体を生成させる。マウスを、よく知られているようにグルタルアルデヒドまたはＥＤＣを用いてカサガイヘモシアニンに結合させた完全な対象ポリペプチドまたはそのペプチド（野生型または突然変異体）からなる免疫原で免疫する。
【０２３４】
免疫原をアジュバントと混合する。各マウスに１０から１００μｇの免疫原を４回注射し、４回目の注射後に、血清が免疫原に対する抗体を含んでいるかどうかを調べるためマウスから血液試料を採取する。血清の力価をＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより測定する。免疫原に対する抗体の存在を示す血清を有するマウスをハイブリドーマの生産のために選択する。
【０２３５】
免疫マウスから脾臓を摘出し、ハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ）所在］に記載されているように、単一細胞懸濁液を調製する。細胞融合は、本質的にコーラー　ジーおよびミルスタイン　シー（Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ．ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ．）、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻、４９５〜４９７ページにより記載されているように実施する。その概要を記載すると、Ｐ３．６５．３骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ））をハーロウ　イーおよびレーン　ディー（Ｈａｒｌｏｗ　Ｅ．ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ．）（編）、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールドハーバープレス（Ｃｏｌｄ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨークコールドハーバー所在］により記載されているようにポリエチレングリコールを用いて免疫脾臓細胞と融合させる。細胞を９６ウエル組織培養プレートを用いて２×１０５細胞／ウエルの密度に蒔く。個々のウエルを生育について調べ、生育の見られるウエルの上清を対象ポリペプチド特異抗体の存在について、野生型または突然変異型の標的タンパク質を用いてＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより検査する。陽性ウエル中の細胞を、確立してモノクローン性を確認するべく増殖させ、サブクローニングする。
【０２３６】
特徴付けおよび検定法開発用の十分な量の抗体を生産するため、所望の特性を有するクローンをマウスの腹水症として、または中空ファイバーシステム中で拡大かつ増殖させる。
【０２３７】
（対象ポリペプチドのサンドイッチ検定法）
モノクローナル抗体をプレート、チューブ、ビーズまたは粒子のような固体表面に付着させる。抗体を９６ウエルのエライザ（ＥＬＩＳＡ）プレートのウエル表面に付着させることが好ましい。対象ポリペプチド／タンパク質（野生型または突然変異体）を含む１００μｌの試料（例えば、血清、尿、組織の細胞質ゾル）を固相抗体に加える。試料を室温で２時間インキュベートする。次に、容器を傾けて試料液を除き、結合していない物質を除去するために固相を緩衝液で洗浄する。１００μｌの第２のモノクローナル抗体（対象ポリペプチド／タンパク質上の異なる決定基に対する抗体）を固相に加える。この抗体を検出用分子または原子（例えば、１２５Ｉ、酵素、蛍光団または発色団）で標識し、第２抗体の結合した固相を室温で２時間インキュベートする。容器を傾けて第２抗体を除き、結合していない物質を除去するために固相を緩衝液で洗浄する。
【０２３８】
試料中に存在する対象ポリペプチド／タンパク質の量に比例する結合標識の量を定量する。野生型対象ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体ならびに対象ポリペプチドにおいて同定された突然変異のそれぞれに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて別個の検定を行う。
【０２３９】
（脂質代謝の影響を受ける疾患の存在または素因の検出およびその治療のモニタリング）
先に論述したように、疾患においては脂質代謝が無調節であることが多い。脂肪調節性遺伝子における遺伝的多形が疾患感受性に寄与している可能性がある。
【０２４０】
本明細書に開示する対象ポリヌクレオチドは、診断ツールとして、対象ポリヌクレオチドの遺伝的多形の検出または対象ポリヌクレオチドの発現レベルの変動の検出に有用である。真核生物、詳細には哺乳類、特にヒトにおける対象ポリヌクレオチドの異常な型、あるいは対象ポリヌクレオチドの発現レベルの減少または増加を検出することにより、疾患の診断の方法が提供されるであろう。対象ポリヌクレオチドの遺伝的多形または対象ポリヌクレオチドの発現の変化を示す真核生物（本明細書では「個体」でもある）、詳細には哺乳類、特にヒトは、種々の技術により検出することができる。
【０２４１】
脂肪調節性遺伝子は広く発現しているので、対象の被検試料は、血液を含む様々な組織から得ることが可能である。脂肪調節性遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質は羊水においても評価することが可能であるので、脂肪調節性遺伝子の試験を出生前検査のパネルに含めることも可能である。したがって、脂肪調節性遺伝子転写物および遺伝子産物の定量的検査も本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２４２】
脂肪調節性遺伝子における遺伝的多形をスクリーニングする核酸およびタンパク質に基づく方法はすべて、本発明の教示内容の範囲内にある。例えば、脂肪調節性遺伝子の配列を知れば、ＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブを構築し、通常の技術を用いて血液のような組織中のゲノムＤＮＡとのハイブリッド形成により脂肪調節性遺伝子の突然変異を検出するために用いることが可能である。脂肪調節性遺伝子の突然変異または発現の量的変化をスクリーニングするために、ＲＮＡプローブまたはｃＤＮＡプローブを同様に検索することが可能である。異なるプローブの混合物、すなわち「プローブカクテル」も複数の突然変異の検査に用いることが可能である。
【０２４３】
核酸に基づく検査に関しては、ゲノムＤＮＡを、特定の配列の検出に直接に用いることができ、または、分析の前にＰＣＲを用いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで酵素的に増幅することができる（サイキら（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１３５０〜１３５３ページおよびサイキら（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２４巻、１６３〜１６６ページ）。この主題の総説は、カスキー　シー　ティー（Ｃａｓｋｅｙ　Ｃ．Ｔ．）、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３６巻、１２２３〜１２２８ページにより、またランデグレンら（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４２巻、２２９〜２３７ページにより公開されている。特定のＤＮＡ配列の検出は、特異的オリゴヌクレオチドを用いたハイブリッド形成（ワラスら（Ｗａｌｌａｃｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．第５１巻、２５７〜２６１ページ）、ダイレクトＤＮＡシーケンシング（チャーチら（Ｃｈｕｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８１巻、１９９１〜１９９５ページ）、制限酵素の使用（フラベルら（Ｆｌａｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９７８年、Ｃｅｌｌ、第１５巻、２５〜４１ページ、ギーバーら（Ｇｅｅｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第７８巻、５０８１〜５０８５ページ）、変性剤を含むゲル中の電気泳動の移動度に基づく識別（マイヤーズら（Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．第５１巻、２７５〜２８４ページ）、ＲＮａｓｅプロテクション（マイヤーズら（Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻、１２４２〜１２４６ページ）、化学的切断（コットンら（Ｃｏｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８５巻、４３９７〜４４０１ページ）およびリガーゼ媒介検出法（ランデグレンら（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４１巻、１０７７〜１０８０ページ）のような方法により実現することができる。ＰＣＲを用いて、個体に存在する対象ポリヌクレオチドのレベルまたは状態の特徴付けを比較分析により行うことができる。
【０２４４】
タンパク質に基づく検査に関しては、本明細書に記載のように標準的な免疫学的技術、融合タンパク質または合成タンパク質を用いて、脂肪調節性遺伝子産物に対して抗体を生成させることが可能である。
【０２４５】
脂肪調節性遺伝子産物およびその機能の特徴づけを用いて、脂肪調節性遺伝子の診断およびスクリーニングならびに治療のモニターに、機能検定を用いることも可能である。例えば、脂肪調節性遺伝子または産物の直接的なスクリーニングではなく、遺伝子機能のレベルを調べる酵素学的検査を用いることが可能である。この種の検査は、テイ−サックス病におけるように他の疾患および状態に用いられている。
【０２４６】
したがって、本発明は、対象ポリヌクレオチドの発現の変化または突然変異を検出するための当技術分野で知られている方法および本明細書に記載の方法を用いることにより疾患を検出する方法を提供する。例えば、対象ポリヌクレオチドの発現の低下を、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮａｓｅプロテクション、ノーザンブロット法および他のハイブリッド形成法などのポリヌクレオチドの定量のための当技術分野で知られている方法のいずれか１つを用いて測定することが可能である。したがって、本発明は、脂質代謝の影響を受ける疾患を検出する方法、ならびに湿疹、心血管障害（高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症（副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡を含むが、これらに限定されない）、体重異常（肥満、悪液質および食欲不振を含むが、これらに限定されない）、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症などの疾患の遺伝的素因を検出する方法を提供する。
【０２４７】
（薬物スクリーニング検定）
本明細書の教示により、脂肪酸結合性分子との相互作用のような対象ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの作用を増大する化合物（アゴニスト）または阻害する化合物（アンタゴニスト）を特定するための化合物のスクリーニング方法が提供される。遺伝性の脂肪酸の障害における対象ポリヌクレオチドの特定は、遺伝子組換え法（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ）の分野における進歩と相まって、ヒトの疾患をさらに研究するのに必要な情報を提供するものである。これは、湿疹、心血管障害（高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症（副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡を含むが、これらに限定されない）、体重異常（肥満、悪液質および食欲不振を含むが、これらに限定されない）、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症を含む、家族性の脂肪酸障害および脂肪酸代謝の他の疾患をモデル化するうえで極めて有用である。薬物スクリーニング検定は、酵母を用いるＤＮＡ−タンパク質相互作用検定（酵母ワン・ハイブリッド）における本発明で述べている遺伝子の制御領域またはその一部の使用により有効になる。薬物スクリーニングのための酵母タンパク質−タンパク質相互作用（ツー・ハイブリッド）またはタンパク質−ＲＮＡ相互作用検定における本明細書に記載の遺伝子もしくはその一部または転写ＲＮＡの使用も、有効な薬物スクリーニング法を提供する。そのような相互作用する分子を、薬物スクリーニングの目的で、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで再構成することも可能である。
【０２４８】
例えば、アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングのために、合成反応の混合物、膜、細胞包膜もしくは細胞壁のような細胞画分、またはそのいずれかの調製物を、対象ポリヌクレオチドに結合する分子を発現する細胞から調製することができる。調製物を、アゴニストまたはアンタゴニストの可能性のある候補分子の非存在下または存在下で標識ポリヌクレオチドとともにインキュベートする。候補分子が結合性分子に結合する能力は、標識リガンドの結合性の低下に反映される。
【０２４９】
潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストの脂肪酸様の作用を、例えば、候補分子と細胞または適切な細胞調製物との相互作用の後にリポーターシステムの活性を測定し、作用をベースライン（対照）の測定と比較することにより、測定することができる。この点で有用であると思われるリポーターシステムは、産物に変換される比色定量用標識基質、脂肪酸酵素活性の変化に応答するリポーター遺伝子、および当技術分野で知られている結合検定を含むが、これらに限定されない。
【０２５０】
アンタゴニストの検定の他の例は、競合的阻害試験用の適切な条件下で、対象ポリペプチドおよび潜在的なアンタゴニストを、膜に結合した対象ポリペプチド結合性分子、組換えの対象ポリペプチド結合性分子、天然の基質またはリガンド、もしくは基質またはリガンドの擬態物と組み合わせる競合試験である。潜在的アンタゴニストの有効性を評価するために、結合性分子に結合または産物に変換される対象ポリペプチド分子の数を正確に測定することができるように、対象ポリペプチドを放射能または比色定量用化合物などで標識することが可能である。
【０２５１】
潜在的アンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し、それによりその活性を阻害または消失させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体などである。潜在的アンタゴニストは、対象ポリペプチドによって誘導される活性を誘導することなく、結合性分子上の同じ部位に結合し、その結果、対象ポリペプチドの結合を遮断することにより対象ポリペプチドの作用を妨げる、密接に関連するタンパク質または抗体のような小有機分子、ペプチド、ポリペプチドであってもよい。潜在的アンタゴニストとして、アンチセンス分子（オカノら（Ｏｋａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、ＥＭＢＯ　Ｊ．第７巻、３４０７〜３４１２ページ）などが挙げられる。潜在的アンタゴニストは、対象ポリペプチドに関連する化合物およびその誘導体などである。
【０２５２】
潜在的アンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し、それにより、その活性を阻害または消失させる小有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよび抗体などである。潜在的アンタゴニストは、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂肪酸ならびにそれらの化学的および機能的誘導体からなる群から選択することができる。
【０２５３】
特定の脂肪調節性タンパク質の生物学的活性のモジュレーターの開発には、個々の検定用調製物に存在する脂肪により制御されるイソ酵素を区別する必要がある。天然の組織供給源から脂肪調節性タンパク質を単離し、各々の新規なイソ酵素を研究するという古典的アプローチを用いてもよい。他のアプローチは、１つのイソ酵素の寄与に有利で、調製物中の他のイソ酵素の寄与を最小限にするような検定条件を特定することである。さらに他のアプローチは、免疫学的手段による脂肪調節性タンパク質の分離である。脂肪により制御されるイソ酵素を区別する前記のアプローチは、時間がかかるものである。そのため、複数のイソ酵素を含む調製物を用いて、選択的な脂肪調節性タンパク質のモジュレーターを開発する多くの試みが行われた。さらに、天然の組織供給源からの脂肪調節性タンパク質の調製物は限定的タンパク質分解を受けやすく、完全長の脂肪調節性タンパク質と異なる速度論的特性、調節特性および生理学的特性を有する活性のあるタンパク質分解産物の混合物を含んでいる可能性がある。
【０２５４】
本発明の組換え対象ポリペプチド産物は、新規かつ特異的なモジュレーターの開発を著しく促進する。内因性脂肪調節性タンパク質の活性を欠く宿主細胞中でイソ酵素を組換えにより発現させることによって、イソ酵素を精製する必要を回避可能である。脂肪調節性タンパク質の活性を調節する化合物が発見されたならば、特定の対象酵素に対するその活性を他の脂肪により制御されるイソ酵素に対するその活性と比較することにより、その選択性を評価することが可能である。したがって、一連の独立した検定における本発明の組換え対象ポリペプチド産物と他の組換え脂肪調節性タンパク質産物との組合せが、特定の脂肪調節性タンパク質の選択的モジュレーターを開発するためのシステムを提供する。選択的モジュレーターとしては、例えば、対象ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体および他のタンパク質またはペプチド、対象ポリペプチド（標的生体分子に選択的に結合するオリゴヌクレオチドを選択する方法を記載している特許協力条約国際公開第ＷＯ９３／０５１８２号を参照）または対象ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および対象ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに特異的に結合する他の非ペプチド性の天然または合成化合物などがある。対象ポリペプチドの酵素活性または細胞内のその局在性を変化させる対象ポリヌクレオチドの突然変異型も考えられる。単独およびモジュレーターと結合した組換え対象ポリペプチドの結晶化、Ｘ線結晶学による原子構造の解析およびそれらの構造のコンピュータモデリングは、非ペプチド性の選択的モジュレーターの設計と最適化とに有用な方法である。構造に基づく薬物設計の一般的総説については、例えば、エリクソンら（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９２年、Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第２７巻、２７１〜２８９ページを参照のこと。
【０２５５】
選択的モジュレーターの開発の標的は、例えば（１）他のタンパク質に接触かつ／または対象の脂肪調節性タンパク質を細胞内に局在化する、同タンパク質の領域、（２）基質に結合する同タンパク質の領域、および（３）対象ポリペプチドのリン酸化部位などである。
【０２５６】
したがって、本発明は、脂質により影響を受ける障害を促進する化合物をスクリーニングし、選択する方法を提供する。また、本発明は、湿疹、心血管障害（高トリグリセリド血症、異常脂質血症、アテローム動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管疾患および末梢血管疾患を含むが、これらに限定されない）、炎症（副鼻腔炎、喘息、膵臓炎、骨関節症、慢性関節リウマチおよびざ瘡を含むが、これらに限定されない）、体重異常（肥満、悪液質および食欲不振を含むが、これらに限定されない）、精神障害、癌、嚢胞性線維症、月経前症候群、糖尿病および糖尿病合併症などの脂質代謝に関連する疾患ならびに脂質代謝に必ずしも関連しない他の疾患を治療またはその進行を抑制する化合物をスクリーニングし、選択する方法を提供する。
【０２５７】
（脂肪調節性遺伝子のＤＮＡ制御領域、ＣＤＳおよびＲＮＡに関するタンパク質相互作用検定）
タンパク質相互作用は、細胞内の事実上あらゆる生物学的プロセス、例えば、代謝、輸送、シグナル伝達および疾患に密接に関連している。酵母ツー・ハイブリッドおよびワン・ハイブリッド・システムの開発により、ｉｎ　ｖｉｖｏでのタンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用またはタンパク質−ＲＮＡ相互作用を研究し、特定することが可能になった（フィールズ　エスおよびソング　オー（Ｆｉｅｌｄｓ　Ｓ．ａｎｄ　Ｓｏｎｇ　Ｏ．）、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４０巻、２４５〜２４６ページ、ウルマソフら（Ｕｌｍａｓｏｖ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７６巻、１８６５〜１８６８ページ、フルヤマ　ケーおよびサッサ　エス（Ｆｕｒｕｙａｍａ　Ｋ．ａｎｄ　Ｓａｓｓａ　Ｓ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１０５巻、７５７〜７６４ページ、およびギウリスら（Ｇｙｕｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｃｅｌｌ、第７５巻、７９１〜８０３ページ）。これらの相互作用は細胞の機能にとって重要なものであるので、相互作用するパートナーを特定することが、機能および病態への関与の解明に向けての第１段階である。そのような相互作用を調節する（阻害または活性化する）新規な化学物質は、ヒト、動物ならびに植物の疾患において著しい製薬上および治療上の利益をもたらすと思われる。鉄芽球性貧血患者において、スクシニルＣｏＡシンテターゼとヘム生合成酵素δ−アミノレブリン酸シンターゼ−Ｅ（ＡＬＡＳ−Ｅ）との間の相互作用が阻害されていることが現在知られている（フルヤマ　ケーおよびサッサ　エス（Ｆｕｒｕｙａｍａ　Ｋ．ａｎｄ　Ｓａｓｓａ　Ｓ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１０５巻、７５７〜７６４ページ）。小分子−ＲＮＡ相互作用によるヒト細胞における遺伝子発現の阻害が最近説明された（ファンら（Ｈｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９６巻、１２９９７〜１３００２ページ）。タンパク質−ＲＮＡ阻害技術の使用は、抗ＨＩＶ療法の開発への有望なアプローチである（ハミーら（Ｈａｍｙ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９４巻、３５４８〜３５５３ページおよびメイら（Ｍｅｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９８年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、１４２０４〜１４２１２ページ）。
【０２５８】
（薬物デザイン）
本発明のアンタゴニストおよびアゴニストならびにその他の化合物は、単独または治療用化合物のような他の化合物とともに用いることができる。医薬組成物は、例えば、罹患部位に直接マイクロインジェクションすることにより、または静脈内もしくは他の経路により投与するなどの任意の効果的で都合のよい方法で投与可能である。本発明の組成物を、対象者に投与するのに適した医薬の担体のような、細胞、組織もしくは生物とともに使用するための非滅菌または滅菌済の１つまたは複数の担体と組み合わせて使用してもよい。そのような組成物は、例えば、培地添加物または治療上有効な量の本発明のアンタゴニストもしくはアゴニストおよび医薬として許容可能な担体もしくは賦形剤からなる。そのような担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せがあるがこれらに限定されない。製剤は投与方法に適するように調製される。
【０２５９】
脂肪調節性遺伝子の機能の調節は、脂肪調節性の代謝系遺伝子のタンパク質の構造または機能の様々な側面と相互作用するようにデザインし得る治療薬または薬物を使用することにより達成することが可能である。例えば、薬物または抗体は、タンパク質の折りたたみ構造に結合して、欠陥のある構造を是正し得る。あるいは、薬物は特定の機能残基に結合して、基質または補因子に対するその親和力を増加させ得る。薬物または作用物質の有効性は、欠陥のある脂肪調節性遺伝子のタンパク質が発現する細胞系中でｉｎ　ｖｉｔｒｏで調節をモニターするスクリーニングプログラムにより確認することが可能である。
【０２６０】
あるいは、そのようなタンパク質の構造と機能との相関についての知見、および様々な突然変異タンパク質における特異的欠陥についての知見から、脂肪調節性遺伝子のタンパク質の活性を調節するように薬物をデザインすることが可能である（コプゼイら（Ｃｏｐｓｅｙ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇｓ、ストックトンプレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク）。
【０２６１】
（遺伝子治療）
対象ポリヌクレオチドの発現をｉｎ　ｖｉｖｏで調節するために、本発明による種々の遺伝子治療法を用いることができる。例えば、アンチセンスＤＮＡ分子を工学設計し、対象ポリヌクレオチドのｍＲＮＡの翻訳をｉｎ　ｖｉｖｏで遮断するために用いることができる。代替案としては、対象ポリヌクレオチドのｍＲＮＡをｉｎ　ｖｉｖｏで切断し破壊するためにリボザイム分子を設計することができる。別の選択肢では、対象ポリヌクレオチドの５’領域（コード配列の上流の領域を含む）とハイブリッド形成し、３重らせん構造を形成するように設計したオリゴヌクレオチドを用いて、対象ポリヌクレオチドの転写を阻害または減少させることができる。さらに別の選択肢では、完全長の野生型対象ポリヌクレオチドをコードする核酸を、さもなければ野生型対象ポリヌクレオチド産物を十分な量であるいは全く産生することができない細胞にｉｎ　ｖｉｖｏで導入することができる。
【０２６２】
例えば、従来の置換療法では、遺伝子産物またはその機能上の同等物を治療上有効な量で患者に投与する。脂肪調節性遺伝子のタンパク質は、ドイチャー　エム（Ｄｅｕｔｃｈｅｒ　Ｍ．）（編）１９９０年、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１８２巻に記載されているような通常の手法を用いて精製することが可能である。治療用の十分な量の遺伝子産物またはタンパク質は、例えば、培養細胞系または合成による製造により得ることが可能である。遺伝子産物を刺激または置換する薬物療法も用いることが可能である。送達媒体およびスキームを、特定の標的遺伝子に合わせて特別に調整することが可能である。
【０２６３】
遺伝子を患者の細胞またはベクター（患者に遺伝子産物をｉｎ　ｖｉｖｏで供給する）に送達するための組換え技術を用いる遺伝子治療も、本発明の範囲内である。レトロウイルスは、体細胞遺伝子治療における実験用の好ましいベクターとみなされており、感染効率が高く、安定な組込みと発現を示す（オーキンら（Ｏｒｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．第７巻、１３０〜１４２ページ）。例えば、脂肪調節性遺伝子のｃＤＮＡをレトロウイルスベクターにクローニングし、その内因性プロモーターから、またはレトロウイルスＬＴＲ（末端反復配列）から駆動することができる。使用可能な他の送達系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（マクラウフリンら（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第６２巻、１９６３〜１９７３ページ）、ワクシニアウイルス（モスら（Ｍｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５巻、３０５〜３２４ページ）、ウシパピローマウイルス（ラスムッセンら（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１３９巻、６４２〜６５４ページ）またはエプスタインバーウイルスのようなヘルペスウイルス群のメンバー（マルゴルスキーら（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８８年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第８巻、２８３７〜２８４７ページ）などである。
【０２６４】
アンチセンス、リボザイムおよび３重らせんヌクレオチドを、対象ポリヌクレオチドの翻訳または転写を阻害するようにデザインする。これを実現するためには、使用するオリゴヌクレオチドを、対象ポリヌクレオチドに特有の適切な配列に基づいてデザインすべきである。例えば、限定の意図はないが、オリゴヌクレオチドは、対象ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が他のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とほぼ相同である領域（本明細書では「固有領域」と称する）の中にあるべきでない。
【０２６５】
アンチセンス分子の場合、配列を固有領域から選択することが好ましい。また、配列の翻訳を防ぐべく標的ｍＲＮＡ配列との十分に強いアニーリングを実現するために、配列の長さが少なくとも１８ヌクレオチドであることも好ましい（イザント　ジェー　ジーおよびワイントラウプ　エッチ（Ｉｚａｎｔ　Ｊ．Ｇ．ａｎｄ　Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　Ｈ．）、１９８４年、Ｃｅｌｌ、第３６巻、１００７〜１０１５ページおよびローゼンブルグら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、第３１３巻、７０３〜７０６ページ）。
【０２６６】
「ハンマーヘッド」タイプのリボザイムの場合、リボザイムの標的配列を固有領域から選択することも好ましい。リボザイムは、高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ＲＮＡの少なくとも一部とヌクレオチド配列が相補的であるハイブリッド形成領域と標的ＲＮＡを切断するように構成された触媒領域とからなる。ハイブリッド形成領域は、９個またはそれ以上のヌクレオチドを含んでいる。したがって、該ハンマーヘッドリボザイムは、上記の配列と相補的であり、長さが少なくとも９ヌクレオチドであるハイブリッド形成領域を有する。そのようなリボザイムの構成と生産は当該技術分野においてよく知られており、ハーゼロフ　ジェーおよびゲルラヒ　ダブリュ　エル（Ｈａｓｅｌｏｆｆ　Ｊ．ａｎｄ　Ｇｅｒｌａｃｈ　Ｗ．Ｌ．）、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、５８５〜５９１ページにより十分に記載されている。
【０２６７】
リボザイムには、天然にＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａに存在し（ＩＶＳまたはＬ−１９　ＩＶＳ　ＲＮＡとして知られている）、トーマス　セヒ（Ｔｈｏｍａｓ　Ｃｅｃｈ）および共同研究者らにより広範に記載されている（ザウら（Ｚａｕｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２２４巻、５７４〜５７８ページ、ザウ　エー　ジェーおよびセヒ　ティー　アール（Ｚａｕｇ　Ａ．Ｊ．ａｎｄ　Ｃｅｃｈ　Ｔ．Ｒ．）、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３１巻、４７０〜４７５ページ、ザウら（Ｚａｕｇ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、第３２４巻、４２９〜４３３ページ、特許公開条約国際特許出願公開第ＷＯ８８／０４３００号、ビーン　エム　ディーおよびセヒ　ティー　アール（Ｂｅｅｎ　Ｍ．Ｄ．ａｎｄ　Ｃｅｃｈ　Ｔ．Ｒ．）、１９８６年、Ｃｅｌｌ、第４７巻、２０７〜２１６ページ）ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼのようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後「Ｃｅｃｈタイプリボザイム」と称する）も含まれる。Ｃｅｃｈエンドリボヌクレアーゼは、標的ＲＮＡ配列とハイブリッド形成し、その後、標的ＲＮＡの切断が起こる８塩基対の活性部位を有する。Ｃｅｃｈタイプリボザイムの標的である８塩基対の活性部位配列は、対象ポリヌクレオチドに存在するが、脂肪調節性タンパク質の他のポリヌクレオチドには存在しない。
【０２６８】
化合物は、送達媒体としてのリポソームの使用を含むがこれに限定されない、当技術分野において知られている様々な方法により投与することが可能である。裸のＤＮＡまたはＲＮＡも、末端の修飾、環状分子の形成、もしくはホスホチオネートおよびチオホスホリル修飾された結合などの別の結合の使用により、分解に対して抵抗性のある形態である場合には使用することができる。さらに、核酸の送達は、核酸分子がポリリシンまたはトランスフェリンに結合している促進輸送によってもよい。核酸を、レトロウイルス、ワクシニア、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスを含むがこれらに限定されない様々なウイルス担体のいずれかにより細胞内に輸送することもできる。
【０２６９】
代替案として、そのようなアンチセンス、リボザイム、３重らせんもしくは対象ポリヌクレオチド分子をコードするかまたはこれらのいずれかである組換え核酸分子を構築することが可能である。核酸分子はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。仮に核酸がＲＮＡをコードしている場合、所望のＲＮＡ産物が十分なコピー数生産されるように、その配列を調節要素に作動可能なように連結させることが好ましい。調節要素により、配列の恒常的または制御された転写が可能にする。１つまたは複数のＲＮＡをコードする細菌プラスミドまたはウイルスＲＮＡもしくはウイルスＤＮＡのような転移ベクターを、細胞または生物の細胞内にトランスフェクションすることができる（レウェリンら（Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１９５巻、１１５〜１２３ページ、ハナハンら（Ｈａｎａｈａｎ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８３年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１６６巻、５５７〜５８０ページ）。ひとたび細胞内に入れば、転移ベクターは複製することができ、細胞内のポリメラーゼにより転写されてＲＮＡを生産するか、または宿主細胞のゲノムに組み込まれることもある。あるいは、転移ベクターまたはその一部が宿主細胞のゲノムに組み込まれるように、１つまたは複数のＲＮＡをコードする配列を含む転移ベクターをマイクロインジェクションのようなマイクロマニュピュレーション法により細胞にトランスフェクションするか、細胞に導入することができる。
【０２７０】
（医薬組成物の組成、製剤および投与）
本発明の医薬組成物は、それ自体知られている方法、例えば、通常の混合、溶解、造粒、糖衣丸調製、研和、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥工程により製造することができる。
【０２７１】
したがって、本発明に従って使用する医薬組成物は、医薬として使用し得る製剤への活性化合物の処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容できる担体を用いて通常の方法で調合することができる。適切な製剤は、選択する投与経路によって決まる。
【０２７２】
注射の場合、本発明の作用物質は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンガー液または生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合する緩衝液を用いて調合することができる。経粘膜投与の場合、透過すべきバリアに適した浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は当該技術分野において一般的に知られている。
【０２７３】
経口投与の場合、活性化合物を当分野でよく知られた医薬として許容できる担体と混合することにより、該化合物を容易に調合することが可能である。そのような担体は、本発明の化合物を、治療を受ける患者が経口摂取するための錠剤、丸薬、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等に調合することを可能にする。経口投与用の医薬製剤は、望ましければ錠剤または糖衣丸コアを得るために適切な補助剤を添加した後に、固体賦形剤を用いて（任意選択で得られた混合物を粉砕し、粒剤の混合物を処理して）得ることが可能である。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖またはセルロース調製物（例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン）のような、増量剤である。望ましい場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムを始めとするその塩のような崩壊剤を加えてもよい。
【０２７４】
糖衣丸コアには、適切なコーティングを施す。この目的のために、任意選択でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含みうる高濃度の糖溶液を用いることができる。識別または活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるために、染料または色素を錠剤または糖衣丸コーティングに加えてもよい。
【０２７５】
経口で使用し得る医薬製剤には、ゼラチン製の押込みばめカプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤とで調製した軟性封入カプセルなどがある。押込みばめカプセルには、ラクトースのような増量剤、デンプンのような結合剤および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、および任意選択で安定剤との混合物の形で有効成分を含めることが可能である。軟性カプセルにおいては、活性化合物は脂肪油、流動パラフィンもしくは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁してよい。さらに、安定剤を加えてもよい。経口投与用のすべての製剤は、そのような投与に適した用量のものであるべきである。
【０２７６】
口腔内投与の場合、組成物は通常の方法で調合した錠剤またはトローチ剤の形態とすることができる。
吸入投与の場合、本発明に従って使用する化合物を、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガスを用いた加圧容器または噴霧器からのエアゾール噴霧の形で適宜送達する。加圧エアゾールの場合、用量単位は一定量を送達する弁を設けることにより決定することができる。吸入器または吹き入れ器において使用するカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン）を、化合物とラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含めて製剤化することができる。
【０２７７】
化合物は、注射、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存料を加えて単位用量の剤形（例えばアンプルまたは複数回分容器入り）とすることができる。組成物は、油性もしくは水性媒体中の懸濁剤、溶液または乳剤のような形態とすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような調合助剤を含んでいてよい。
【０２７８】
非経口投与用医薬製剤としては、水溶性の形態の活性化合物の水溶液などがある。さらに、活性化合物の懸濁剤を適切な油性懸濁注射剤として調製することができる。適切な親油性溶媒または媒体としては、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームなどがある。水性懸濁注射剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁剤の粘度を高める物質を含んでもよい。任意選択で、懸濁剤は、適切な安定化剤や、または高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を高める作用物質を含んでもよい。
【０２７９】
あるいは、有効成分は、使用前に適切な媒体（例えば発熱物質非含有滅菌水）で構成するために粉末状でもよい。
化合物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含む坐剤または停留浣腸剤のような直腸内組成物として製剤化してもよい。
【０２８０】
前述の製剤に加えて、化合物をデポ製剤として調合してもよい。そのような長時間作用する製剤は、埋め込み（例えば皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば化合物を適切な高分子材料もしくは疎水性材料（例えば許容し得る油中乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいはやや溶けにくい誘導体として、例えばやや溶けにくい塩として製剤化してもよい。
【０２８１】
本発明の疎水性化合物用の医薬用担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機高分子および水相からなる共溶媒系である。当然、共溶媒系の割合は、その溶解性および毒性特性を失うことなく、大幅に変えてもよい。さらに、共溶媒成分の実体を変えてもよい。
【０２８２】
あるいは、疎水性医薬化合物の他の送達系を用いることができる。リポソームおよび乳剤は、疎水性薬物の送達媒体または担体のよく知られている例である。通常毒性がより大きいという犠牲を払うが、ジメチルスルホキシドのような特定の有機溶媒も用いることができる。さらに、化合物は、治療薬を含む疎水性固体高分子の半透過性マトリックスのような徐放性システムを用いて送達することができる。様々な徐放性材料が確立されており、当業者によく知られている。徐放性カプセル剤は、それらの化学的性質によって、化合物を数週間から最長１００日間にわたり放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性によっては、タンパク質の安定化のために追加の戦略を用いてもよい。
【０２８３】
医薬組成物は、適切な固相またはゲル相の担体または賦形剤を含んでいてもよい。そのような担体または賦形剤としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールのような高分子などがあるが、これらに限定されない。
【０２８４】
本発明の化合物の多くは、医薬として適合しうる対イオンを有する塩として提供されうる。医薬として適合しうる塩は、塩化水素、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含むがこれらに限定されない多くの酸を用いて形成可能である。塩は、対応する遊離塩基形よりも、水性または他のプロトン性溶媒により溶けやすい傾向がある。
【０２８５】
適切な投与経路は、例えば、経口、直腸内、経粘膜、経皮または腸内投与、または筋肉内注射、皮下注射、脊髄内注射、ならびに髄膜内注射、脳室内への直接注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射もしくは眼内注射などの非経口的送達である。
【０２８６】
あるいは、化合物を全身的でなく局所的に、例えば、罹患部位への化合物の直接注射により、しばしばデポ製剤または徐放性製剤として投与することができる。
【０２８７】
さらに、薬物を標的指向型薬物送達系、例えば、罹患細胞に特異的な抗体で被覆したリポソームに入れて投与することができる。そのリポソームは、その細胞を標的とし、その細胞によって選択的に取り込まれるであろう。
【０２８８】
医薬組成物は一般的に、特定の１つまたは複数の適応症の治療または予防に有効な量で投与する。最適用量は、各治療様式および適応症ごとの標準的方法により、徴候、その重症度、投与経路、合併症状等を考慮に入れて決定することは理解される。治療においてまたは予防として、活性物質を注射用組成物として、例えば好ましくは等張性の無菌の水性分散剤として個体に投与することができる。治療上有効な用量は、そのような疾患に伴う症状の改善をもたらすのに有効な化合物の量をさらに表す。本出願の化合物の製剤化および投与の技術については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マックパブリッシングカンパニー社（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．）、ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、最新版に見いだすことができる。哺乳類、特にヒトへの投与の場合、活性物質の１日投与量レベルは０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、一般的に約０．０１ｍｇ／ｋｇであると予想される。いずれにしても医師は、個体にとって最も適切で、かつ年齢、体重およびその個体の反応により異なる実際の投与量を決定することになる。上記の用量は平均的な場合の例示である。もちろんより高いまたはより低い用量範囲が正当である個別の例があり得るが、そのようなものは本発明の範囲内である。
【０２８９】
本発明の化合物は動物（特に哺乳類）の障害（獣医による適用）において特に有用な可能性がある。
本発明はさらに、１つまたは複数の本発明の上記組成物を詰めた１つまたは複数の容器からなる診断用または医薬としての包装物およびキットを提供する。そのような容器には、医薬品もしくは生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた書式の、ヒトに投与するための該製品の製造、使用または販売についての該政府機関による承認を示す注意書きを添付することができる。
【０２９０】
（実施例）
本発明を、以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、本発明のある特定の態様を例示するものであるが、開示された発明の限定を表すものでも、範囲を定めるものでもない。
【０２９１】
実施例１−ＰＵＦＡを補給した飼料を与えたラットの肝臓における差次的遺伝子発現
Ａ．動物実験
４週齢の雌のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（５２〜７２ｇ）をチャールズリバーカナダリミテッド（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｃａｎａｄａ　Ｌｔｄ．）から購入し、ケージ当たり３〜４匹として４週間飼育した。ラットを無作為に６群に分け、脂肪非含有飼料（Ｔｅｋｌａｄ＃９４０１２３）を与えた。２週間後、第２〜６群に高度に精製された多価不飽和脂肪酸を補給した飼料をさらに２週間与えた。各群に対して用いた個別の脂肪酸の濃度は、飼料配合物の総量の５％（重量％）であった。実験計画を以下に示す。
【０２９２】
第１群：脂肪非含有対照
第２群：リノール酸（ＬＡ）−ベニバナ油として供給
第３群：α−リノレン酸（ＡＬＡ）−アマ油として供給
第４群：γ−リノレン酸（ＧＬＡ）−１，３−ＧＬＡプロパンジオールとして供給
第５群：エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）−１，３−ＥＰＡプロパンジオールとして供給
第６群：ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）−１，３−ＤＨＡプロパンジオールとして供給
【０２９３】
飼料は、油を脂肪非含有飼料に混入して調製した。この混合飼料は、脂肪酸の酸化を防ぐために窒素雰囲気下で−２０℃で保存した。給餌は毎日同じ時間に行った。飼料配合物を以下に示す。
【０２９４】
第２群（ＬＡ）−６２．５ｇベニバナ油＋９３７．５ｇ脂肪非含有飼料
第３群（ＡＬＡ）−８７．７ｇアマ油＋９１２．３ｇ脂肪非含有飼料
第４群（ＧＬＡ）−５５．８ｇＧＬＡジオール＋９４４．３ｇ脂肪非含有飼料
第５群（ＥＰＡ）−５７．９ｇＥＰＡジオール＋９４２．１ｇ脂肪非含有飼料
第６群（ＤＨＡ）−５９．７ｇＤＨＡジオール＋９４０．３ｇ脂肪非含有飼料
ラット（１６６〜２２９ｇ）を麻酔下で心臓穿刺により屠殺した。肝臓を生理食塩水で潅流し、摘出して、ＲＮＡ抽出に備えて液体窒素中で凍結した。
【０２９５】
Ｂ．ラット肝からのＲＮＡ単離およびＤＮａｓｅ処理
０．４ｇの各肝臓から製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いて全ＲＮＡを単離した。混入ゲノムＤＮＡを除去するために、ＲＮＡ試料をＲＱ１　ＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））とともに３７℃で３０分間インキュベートした。その後ＲＮＡを沈澱させ、再懸濁して終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとした。
【０２９６】
Ｃ．ＲＮＡの１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写
ディファレンシャル・ディスプレイ反応のための鋳型ｃＤＮＡを得るために、ＲＮＡの１本鎖ｃＤＮＡへの逆転写を行った。製造業者のプロトコールに従って、２μｇの全ＲＮＡを、総容量１０μｌ中でオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いたＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いて逆転写した。
【０２９７】
Ｄ．ディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲ
ラット肝ｃＤＮＡを、１０種の任意のＰプライマーと９種のアンカーＴプライマーとの９０種の組合せ、ならびにＰプライマーのみの５５種の組合せを用いて増幅した（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｄｅｌｔａ（登録商標）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｋｉｔ）。対照、ＧＬＡ、ＤＨＡの処理群当たり３匹の個々のラット由来の試料を、各プライマー対ごとに合計９サンプル調製した。製造業者のプロトコール（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に従って、Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）２　ＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いてディファレンシャルディスプレイ処理を実施し、合計５５ｎｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを得た。一般的に、可能な場合には５プライマー対についての反応をマスターミックスを用いて同時に行った。次いでこれらの試料を７Ｍ尿素を含む４．５％ポリアクリルアミド上で泳動させた。実験を繰り返して、結果を検証した。両実験において差次的（ディファレンシャル）に発現されたバンドのみについてさらに特徴づけを行った。
【０２９８】
以下のプライマー（５’から３’方向に示す）を用いた。
【表３】
2004512852.tif 000004
【０２９９】
Ｅ．差次的に表示されたバンドのクローニング
差次的に発現された各ｃＤＮＡフラグメントをゲルから切り出した後、最初にディファレンシャル・ディスプレイ法で用いたのと同じＰおよびＴまたはＰおよびＰプライマーの組合せを用いて増幅させた。精製したＰＣＲフラグメント（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を線状化したｐＣＲＩＩベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結した（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｒａｐｉｄ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ）。製造業者の仕様に従って、１０個の個別コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、ベクター特異的蛍光標識プライマー（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を用いて両鎖についてそれらの挿入フラグメントの配列決定を行った。配列解析を、Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（インフォーマックスインコーポレイティッド社（ＩｎｆｏｒＭａｘ　Ｉｎｃ．））を用いて行った。
【０３００】
Ｆ．ノーザンブロット分析
ディファレンシャル・ディスプレイ実験で発見された遺伝子の発現パターンを確認するため、かつこれらの遺伝子の転写物のサイズを測定するために、ノーザンブロット分析を行った。サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｕｒ）に所在］に従って、１、２、４、５および６（上記を参照）の各処理群からの３匹の個別のラット由来の８μｇの全ＲＮＡをホルムアルデヒドアガロースゲル上にのせ（ロードし）、電気泳動により分離し、毛細管現象によりナイロン膜（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））に転写した。ＲＮＡの膜への転写を、メチレンブルー染色により確認した。ノーザンブロット用のＤＮＡプローブは、差次的に発現された遺伝子由来の部分ＤＮＡ配列を有するプラスミドから、その挿入ＤＮＡを、ｐＣＲＩＩの挿入部位に隣接する両側に結合する２つのプライマー
５’−ＡＣＴＡＧＣＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧ−３’および
５’−ＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣ−３’を用いて増幅して得た。挿入ＤＮＡを、製造業者の仕様に従って、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰおよびＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（登録商標）ＤＮＡ標識ビーズ（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて標識した。ノーザンブロットを、オースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年−、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）［ニューヨーク］に記載のプロトコールにしたがって実施した。膜を４２℃で一夜ハイブリッド形成させ、最終的なストリンジェンシーを５５℃で０．２５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳとして洗浄した。ロード操作の標準化のために、すべての膜を１８Ｓ　ｒＲＮＡサブユニットに対するヌクレオチドプローブで探査した。
【０３０１】
Ｇ．ディファレンシャル・ディスプレイにより同定された遺伝子
この実験により、ＰＵＦＡ投与後に発現の変化を示す１４個の遺伝子が同定された。この実験から得られたｃＤＮＡフラグメントを含む以下の１７個のプラスミドは、その１４個の固有の遺伝子を示す。
【０３０２】
【表４】
2004512852.tif 000005
【０３０３】
【表５】
2004512852.tif 000006
【０３０４】
実施例２−ｒＭＥＴＰおよびｈＭＥＴＰの哺乳類発現ベクターへのクローニング
Ａ．ｒＭＥＴＰの５’末端の入手
ｒＭＥＴＰの完全コード配列を含むクローンを、製造業者の指示に従い、Ｇｅｎｅｔｒａｐｐｅｒ（登録商標）ｃＤＮＡ　Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ラット肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）から得た。ｃＤＮＡライブラリーを探査し、捕捉されたｃＤＮＡ標的を修復するのに用いたオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＧＴＧＧＴＣＴＴＣＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧＡＧ−３’であった。修復されたＤＮＡを用いて、ＵｌｔｒａＭａｘ（登録商標）ＤＨ５α−ＦＴ細胞（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を形質転換した。ｒＭＥＴＰを含むコロニーを、遺伝子特異的プライマーとして５’−ＧＣＴＡＣＧＣＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＴＡＴＣＡＡＧＴＣＣ−３’および５’−ＣＡＧＧＣＡＧＴＡＴＧＧＣＡＣＴＴＴＧＡ−３’を用いたコロニーＰＣＲにより同定した。ＰＣＲ反応物には、０．５μＭの各プライマー、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ緩衝液（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）および０．０２５Ｕ／μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を含めた。ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間；９５℃で３０秒間、５８℃で４５秒間および７２℃で４５秒間を３５サイクル；７２℃で７分間；であった。プラスミドＤＮＡを選択されたコロニーから単離し、配列を決定した。得られた配列を用いてｒＭＥＴＰの読み取り枠を特定し、遺伝子をサブクローニングするためのプライマーをデザインした。完全コード配列を含むプラスミドをｐＳｒ１０６６．１と名付けた。
【０３０５】
Ｂ．ＭＥＴＰのクローニング
ラットおよびヒトのＭＥＴＰをＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）哺乳類発現ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローニングした。ｃ−ｍｙｃエピトープとポリヒスチジンペプチドとを含むＣ末端タグを有するＭＥＴＰタンパク質（すなわちｒＭＥＴＰ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＭＥＴＰ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ）またはタグを含まないＭＥＴＰタンパク質（すなわちｒＭＥＴＰおよびｈＭＥＴＰ）を生産するために、各遺伝子について２つのプラスミド構築物を作製した。ラットおよびヒト遺伝子のクローニング用のフォワードプライマーはそれぞれ
【０３０６】
５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＴＴＧＧ−３’および
５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＣＡＴＣＧ−３’
【０３０７】
であった。これらのプライマーは翻訳開始コドンに隣接するＫｏｚａｋ共通配列を含む。ラット遺伝子のプライマーはＢａｍＨＩ切断部位（下線部分）を含み、一方、ヒト遺伝子のプライマーはＫｐｎＩ切断部位（下線部分）を含む。ｒＭＥＴＰおよびｈＭＥＴＰをクローニングするためのリバースプライマーの配列はそれぞれ
【０３０８】
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＡＧＣＣ−３’および
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣ−３’
【０３０９】
であった。これらのプライマーはＮｏｔＩ切断部位（下線部分）を含み、翻訳終止コドンを備えている。ｒＭＥＴＰ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＭＥＴＰ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓのクローニング用のリバースプライマーはそれぞれ
【０３１０】
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＧＴＧＡＧＣＣ−３’および
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＧＡＧＣ−３’
【０３１１】
であった。これらのプライマーは、ＮｏｔＩ切断部位（下線部分）を含み、終止コドンの３塩基のうちの２塩基のみを有するので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０３１２】
ＰＣＲを、製造業者の指示に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて行った。ｐＳｒ１０６６．１をｒＭＥＴＰ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを生成させるためのＤＮＡ鋳型として用いた。ｐＭｒ１０７６．１（下記）をｒＭＥＴＰのＤＮＡ鋳型として用いた。Ｐｒｏｑｕｅｓｔ（登録商標）ヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）由来のプラスミドＤＮＡをヒト遺伝子の鋳型として用いた。
【０３１３】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ（ラット遺伝子）かＫｐｎＩ（ヒト遺伝子）のいずれかを用いて消化し、同じ酵素で切断したｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ａに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、配列を決定した。ｒＭＥＴＰ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｒＭＥＴＰ用のプラスミドをそれぞれｐＭｒ１０７６．１およびｐＭｒ１０７６．２と名付けた。ｈＭＥＴＰ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＭＥＴＰの双方について、２つの異なる配列を得た。単離されたもののうち約半分はコード配列の部位４０４にＧを有し（Ａｒｇ１３５）、半分はこの部位にＴを有しており（Ｌｅｕ１３５）、このことは（遺伝特性のスクリーニングに有用となり得る）遺伝的多型の可能性がある部位であることを示すものである。部位４０４にＧを有するｈＭＥＴＰ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＭＥＴＰ用のプラスミドをそれぞれｐＭｈ１０８１．１およびｐＭｈ１０８４．１と名付けた。部位４０４にＴを有するｈＭＥＴＰ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＭＥＴＰ用のプラスミドをそれぞれｐＭｈ１０８３．１およびｐＭｈ１０８５．１と名付けた。
【０３１４】
実施例３−ｒＧＬＯＬおよびｈＧＬＯＬの哺乳類発現ベクターへのクローニング
Ａ．ｒＧＬＯＬの５’末端の入手
ｒＧＬＯＬ　ｃＤＮＡの５’末端をＰＣＲによりクローニングした。フォワードプライマーの配列（５’−ＣＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＡＧＡＴＧ−３’）は、ｒＧＬＯＬのマウスオーソログの５’末端をコードするマウスＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷ１０６７１７）に基づくものとした。同プライマーは、５’ＵＴＲおよび翻訳開始コドン（下線部分）に相当する。リバースプライマー（５’−ＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡ−３’）は、ディファレンシャル・ディスプレイによって得られたｒＧＬＯＬクローンに基づくものとした。ＰＣＲを、前述（実施例２）のようにＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑポリメラーゼ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いて行った。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ラット肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）から単離したプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＴＡクローニングによりｐＣＲＩＩベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に挿入した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列を決定した。得られた配列を用いて遺伝子をクローニングするためのフォワードプライマーをデザインした。ｒＧＬＯＬの５’末端を含むプラスミドをｐＣｒ１０６７．１と名付けた。
【０３１５】
Ｂ．ＧＬＯＬのクローニング
ラットおよびヒトＧＬＯＬをＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）哺乳類発現ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローニングした。ｃ−ｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するＧＬＯＬタンパク質（すなわちｒＧＬＯＬ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＧＬＯＬ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ）またはタグを含まないＧＬＯＬタンパク質（すなわちｒＧＬＯＬおよびｈＧＬＯＬ）を生産するために、各遺伝子について２つのプラスミド構築物を作製した。ラットおよびヒト遺伝子のクローニング用のフォワードプライマーはそれぞれ
【０３１６】
５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＣＣ−３’および
５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＣＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣＣ−３’
【０３１７】
であった。これらのプライマーは、翻訳開始コドンに隣接するＫｏｚａｋ共通配列およびＢａｍＨＩ切断部位（下線部分）を含む。ｒＧＬＯＬおよびｈＧＬＯＬのクローニング用のリバースプライマーの配列はそれぞれ
【０３１８】
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＣ−３’および
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’
【０３１９】
であった。これらのプライマーは、ＮｏｔＩ切断部位（下線部分）を含み、翻訳終止コドンを備えている。ｒＧＬＯＬ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＧＬＯＬ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓのクローニング用のリバースプライマーはそれぞれ
【０３２０】
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＣＣＣ−３’および
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＴＧＣＡＣＣ−３’
【０３２１】
であった。これらのプライマーは、ＮｏｔＩ切断部位（下線部分）を含み、終止コドンに必要な３塩基のうちの２塩基のみを有するので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０３２２】
ＰＣＲは、製造業者の指示に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて行った。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ラット肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）からのプラスミドＤＮＡをｒＧＬＯＬ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを生成させるためのＤＮＡ鋳型として用いた。ｐＭｒ１０７５．１（下記）をｒＧＬＯＬのＤＮＡ鋳型として用いた。Ｐｒｏｑｕｅｓｔ（登録商標）ヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）由来のプラスミドＤＮＡをｈＧＬＯＬ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを生成させるための鋳型として用いた。ｐＭｒ１０７２．１（下記）をｈＧＬＯＬのＤＮＡ鋳型として用いた。
【０３２３】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ａに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、配列を決定した。ｒＧＬＯＬ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｒＧＬＯＬ用のプラスミドをそれぞれｐＭｒ１０７５．１およびｐＭｒ１０７５．２と名付けた。ｈＧＬＯＬ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＧＬＯＬ用のプラスミドをそれぞれｐＭｈ１０７２．１およびｐＭｈ１０７２．２と名付けた。独立したＰＣＲ反応の産物をクローニングし、配列決定を行って確認したヒト遺伝子について得られた配列には、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ８３１９８に報告されている配列と異なる１塩基、すなわちコード配列の部位４６のＧの代わりにＡが含まれていた。これにより、Ｇｌｙ１６の代わりにＡｒｇ１６となっている。
【０３２４】
実施例４−ｒＦＴＦ１およびｈＦＴＦ１の哺乳類発現ベクターへのクローニング
Ａ．ｒＦＴＦ１の５’末端の入手
ｒＦＴＦ１　ｃＤＮＡの５’末端を、製造業者の指示に従ってＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて得た。５’−ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）と、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いて雌Ｗｉｓｔａｒラットから単離した１μｇの全脂肪ＲＮＡとを用いて調製した。５’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ反応を、１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＧＣ　ｃＤＮＡポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、対応する緩衝液および０．５Ｍ　ＧＣ−ｍｅｌｔ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む以外は、推奨のとおりに設定した。遺伝子特異的プライマーの配列を
５’−ＣＴＧＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＴ−３’
とした。ＰＣＲ条件を、９４℃で３分間；９４℃で３０秒間、６９℃で１０秒間および７２℃で３分間を５サイクル；９４℃で３０秒間、６７℃で１０秒間および７２℃で３分間を５サイクル；９４℃で３０秒間、６５℃で１０秒間および７２℃で３分間を３５サイクル；とした。産物をゲル精製し、ＴＡクローニングによりｐＣＲＩＩベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に挿入した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列を決定した。得られた配列を用いて、ｒＦＴＦ１の読み取り枠を特定し、哺乳類発現ベクターへの遺伝子のクローニング用のフォワードプライマーをデザインした。ｒＦＴＦ１の５’−ＲＡＣＥ産物を含むプラスミドをｐＣｒ１０９２．１と名付けた。
【０３２５】
Ｂ．ＦＴＦ１のクローニング
ラットおよびヒトのＦＴＦ１をＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）哺乳類発現ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローニングした。ｃ−ｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するＦＴＦ１タンパク質（すなわちｒＦＴＦ１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＦＴＦ１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ）またはタグを含まないＦＴＦ１タンパク質（すなわちｒＦＴＦ１およびｈＦＴＦ１）を生産するために各遺伝子について２つのプラスミド構築物を作製した。ラットおよびヒト遺伝子のクローニング用のフォワードプライマーをそれぞれ
【０３２６】
５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＧＡＡＣＣＴＴＴＣＣ−３’および
５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＧＡＡＣＣＣＴＴＣＣ−３’
【０３２７】
とした。これらのプライマーは、翻訳開始コドンに隣接するＫｏｚａｋ共通配列およびＫｐｎＩ切断部位（下線部分）を含んでいる。ｒＦＴＦ１およびｈＦＴＦ１のクローニング用のリバースプライマーの配列を
５’−ＣＡＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧ−３’
とした。このプライマーは、ＸｈｏＩ切断部位（下線部分）を含み、翻訳終止コドンを備えている。ｒＦＴＦ１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＦＴＦ１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓのクローニング用のリバースプライマーを
５’−ＣＡＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧ−３’
とした。このプライマーは、ＸｈｏＩ切断部位（下線部分）を含むが、終止コドンは含まないので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０３２８】
ＰＣＲを、製造業者の指示に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＧＣ　ｃＤＮＡポリメラーゼおよび１Ｍ　ＧＣ−ｍｅｌｔ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて行った。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ラット肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）由来のプラスミドＤＮＡをラット遺伝子の鋳型として用いた。Ｐｒｏｑｕｅｓｔ（登録商標）ヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）由来のプラスミドＤＮＡをヒト遺伝子の鋳型として用いた。
【０３２９】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同じ酵素で切断したｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ａに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、配列を決定した。忠実度のあまり高くないＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＧＣ　ｃＤＮＡポリメラーゼを用いた結果、いくつかのヌクレオチド置換が生じた。いくつかの単離クローンのＤＮＡフラグメントを連結したところ、正しいポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列が得られた。ｒＦＴＦ１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｒＦＴＦ１用のプラスミドをそれぞれｐＭｒ１０８８．１およびｐＭｒ１０８９．１と名付けた。ｈＦＴＦ１／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＦＴＦ１用のプラスミドをそれぞれｐＭｈ１０９０．１およびｐＭｈ１０９１．１と名付けた。
【０３３０】
実施例５−ｒＡ１ＢＧおよびｈＡ１ＢＧの哺乳類発現ベクターへのクローニング
Ａ．ｒＡ１ＢＧの５’末端の入手
ｒＡ１ＢＧ遺伝子の５’末端を、製造業者の指示に従ってＳＭＡＲＴ（登録商標）ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて得た。５’−ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）と、ディファレンシャル・ディスプレイ試験に用いたＤＨＡ補給飼料を与えたラットから単離した１μｇの全肝臓ＲＮＡとを用いて調製した。５’−ＲＡＣＥ　ＰＣＲ反応を、１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および対応する緩衝液を含む以外は、製造業者の推奨のとおりに行った。遺伝子特異的プライマーの配列は
５’−ＣＡＡＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＧ−３’
であった。産物をゲル精製し、ＴＡクローニングによりｐＣＲＩＩベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結させた。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列を決定した。得られた配列を用いて、ｒＡ１ＢＧの読み取り枠を特定し、哺乳類発現ベクターへの遺伝子のクローニング用のプライマーをデザインした。ｒＡ１ＢＧの５’−ＲＡＣＥ産物を含むプラスミドをｐＣｒ１０７８．１と名付けた。
【０３３１】
Ｂ．Ａ１ＢＧのクローニング
ラットおよびヒトのＡ１ＢＧをＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）哺乳類発現ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローニングした。ｃ−ｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンペプチドを含むＣ末端タグを有するＡ１ＢＧタンパク質（すなわちｒＡ１ＢＧ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＡ１ＢＧ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ）またはタグを含まないＡ１ＢＧタンパク質（すなわちｒＡ１ＢＧおよびｈＡ１ＢＧ）を生産するために各遺伝子について２つのプラスミド構築物を作製した。ラットおよびヒト遺伝子のクローニング用のフォワードプライマーをそれぞれ
【０３３２】
５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧ−３’および
５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣ−３’
【０３３３】
とした。これらのプライマーは、翻訳開始コドンに隣接するＫｏｚａｋ共通配列およびＢａｍＨＩ切断部位（下線部分）を含む。ｒＡ１ＢＧおよびｈＡ１ＢＧのクローニング用のリバースプライマーの配列をそれぞれ
【０３３４】
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧ−３’および
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣ−３’
【０３３５】
とした。これらのリバースプライマーは、ＮｏｔＩ切断部位（下線部分）を含み、翻訳終止コドンを備えている。ｒＡ１ＢＧ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＡ１ＢＧ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓのクローニング用のリバースプライマーをそれぞれ
【０３３６】
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧ−３’および
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣ−３’
【０３３７】
とした。これらのプライマーは、ＮｏｔＩ切断部位（下線部分）を含み、終止コドンに必要な３塩基のうちの２塩基のみを有するので、遺伝子はベクターによって供給されるタグを有する枠内に配される。
【０３３８】
ＰＣＲを、製造業者の指示に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて行った。ｒＡ１ＢＧの５’末端を得るのに用いた５’−ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡをラット遺伝子のＤＮＡ鋳型として用いた。Ｐｒｏｑｕｅｓｔ（登録商標）ヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）由来のプラスミドＤＮＡをヒト遺伝子の鋳型として用いた。
【０３３９】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ａに連結した。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。プラスミドを単離し、配列を決定した。ｒＡ１ＢＧ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｒＡ１ＢＧ用のプラスミドをそれぞれｐＭｒ１０８２．１およびｐＭｒ１０７７．１と名付けた。ｈＡ１ＢＧ／Ｍｙｃ−ＨｉｓおよびｈＡ１ＢＧ用のプラスミドをそれぞれｐＭｈ１０８７．１およびｐＭｈ１０８６．１と名付けた。
【０３４０】
実施例６−ｈＧＰＡＴの哺乳類発現ベクターへのクローニング
ヒトＧＰＡＴをＰＣＲによりｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）哺乳類発現ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローニングする。フォワードプライマー
５’−ＣＡＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧ−３’
は、翻訳開始コドンに隣接するＫｏｚａｋ共通配列およびＢａｍＨＩ切断部位（下線部分）を含んでいる。リバースプライマー
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＧＡＡＴＡＴＡＴＴＣＴＡＧ−３’
は、ＮｏｔＩ切断部位（下線部分）を含み、翻訳終止コドンを備えている。
【０３４１】
ＰＣＲを、製造業者の指示に従ってＡｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）−ＨＦ２ポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））およびＰｒｏｑｕｅｓｔ（登録商標）ヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）由来のプラスミドＤＮＡを用いて実施する。
【０３４２】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で切断したｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ａに連結する。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換する。プラスミドを単離し、配列を決定する。
【０３４３】
実施例７−ヒトＳＣＤ制御領域のクローニング
ヒトＳＣＤプロモーターをヒト白血球ゲノムＤＮＡからクローニングした。血液を本発明者らの研究室のボランティアから採取し、ゲノムＤＮＡの調製に用いた。ＡＴＧの上流の部位−１９８１ｂｐ〜−１２ｂｐに相当する制御領域をフォワードおよびリバースの合成プライマーを用いて増幅した。プラスミドｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））へのクローニングを容易にするために、制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列（増幅する配列内に存在しない）をフォワードおよびリバースプライマーの末端に導入した。
【０３４４】
ＰＣＲ増幅によるヒトＳＣＤ制御領域のクローニングに用いたフォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ
５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＡＡ−３’および
５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣＡＣＴＴＴＣＣ−３’
である。
【０３４５】
ＰＣＲ増幅を、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡＭＰ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００機器を用いて、０．５μｇのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、１×ｄＮＴＰミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州所在）、１×ｃＤＮＡ　ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む５０μｌの反応容積中で行った。
【０３４６】
ＰＣＲ反応条件を
９４℃で２秒間、７２℃で３分間を７サイクル
９４℃で２秒間、６７℃で３分間を３２サイクル
６７℃で４分間
とした。
【０３４７】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ所在）を用いてゲル精製した。精製したＰＣＲ産物およびリポーターベクターｐＧＬ３−ｂａｓｉｃを別々に制限酵素ＢｇｌＩＩで消化して、ＰＣＲ産物をｐＧＬ３−ｂａｓｉｃのルシフェラーゼ遺伝子への読み枠を合わせて連結するのに適した適合性末端を生成させた。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換した。生成したプラスミドｐＧｈ３０２２．１を制限酵素分析でスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確認した。得られたヒトＳＣＤ制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０３４８】
実施例８−ヒトＭＥＴＰ制御領域のクローニング
ＭＥＴＰ制御領域（１５００ｂｐ）をヒト白血病ゲノムＤＮＡからＰＣＲによりクローニングする。ＡＴＧの上流の部位−１５００ｂｐ〜−１ｂｐで始まるフォワードおよびリバースの合成プライマーを用いて、制御領域をＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ増幅によりヒトＭＥＴＰ制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ
５’−ＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＴＧＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＧＣ−３’および
５’−ＧＡＡＣＡＡＧＧＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣ−３’である。
【０３４９】
ＰＣＲ増幅を、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡＭＰ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００機器を用いて行う。例えば、ＰＣＲを０．５μｇのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、１×ｄＮＴＰミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州所在）、１×ｃＤＮＡ　ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む５０μｌの反応容積で実施する。
【０３５０】
ＰＣＲ反応条件は
９４℃で２秒間、７２℃で３分間を７サイクル
９４℃で２秒間、６７℃で３分間を３２サイクル
６７℃で４分間
である。
【０３５１】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ所在）を用いてゲル精製し、製造業者の指示に従ってＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結する。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換する。得られたプラスミドを制限酵素分析によりスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確認する。次いでヒトＭＥＴＰ制御領域をｐＣＲＩＩベクターからルシフェラーゼリポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））へ再クローニングする。得られたヒトＭＥＴＰ制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０３５２】
実施例９−ヒトＧＬＯＬ制御領域のクローニング
ＧＬＯＬ制御領域（４６８ｂｐ、部位−９０５〜−４３８の範囲）をヒト白血病ゲノムＤＮＡからＰＣＲによりクローニングする。ＧＬＯＬ制御領域の５’末端の最初の３０ヌクレオチドはＡヌクレオチドに富み（図１３を参照）、プライマーに組み込むとＰＣＲによるクローニングが困難になるであろう。したがって、ＡＴＧの上流側の部位−８８６ｂｐおよび−４３８ｂｐで始まるフォワードおよびリバースの合成プライマーを用いてＰＣＲにより制御領域を増幅する。ＰＣＲ増幅によりヒトＧＬＯＬ制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ
【０３５３】
５’−ＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＧＣＣＣＣＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＧＴＧ−３’および
５’−ＣＴＧＣＣＧＣＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧＧＧＧＣＴＣ−３’
である。
【０３５４】
ＰＣＲ増幅を、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡＭＰ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００機器を用いて実施する。例えば、ＰＣＲを０．５μｇのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、１×ｄＮＴＰミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州所在）、１×ｃＤＮＡ　ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む５０μｌの反応容積で実施する。
【０３５５】
ＰＣＲ反応条件は
９４℃で２秒間、７２℃で３分間を７サイクル
９４℃で２秒間、６７℃で３分間を３２サイクル
６７℃で４分間
である。
【０３５６】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ所在）を用いてゲル精製し、製造業者の指示に従って、ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結する。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換する。得られたプラスミドを制限酵素分析によりスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確認する。次いで、ヒトＧＬＯＬ制御領域をｐＣＲＩＩベクターからルシフェラーゼリポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））へ再クローニングする。得られたヒトＧＬＯＬ制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０３５７】
実施例１０−ヒトＦＴＦ１制御領域のクローニング
ＦＴＦ１制御領域（８８３ｂｐ、ＡＴＧの上流の部位−８８３〜−１の範囲）をヒト白血病ゲノムＤＮＡからＰＣＲによりクローニングする。ＦＴＦ１制御領域の５’末端の最初の３０ヌクレオチドは、ＡおよびＴヌクレオチドに富み（図１９を参照）、プライマーに組み込むとＰＣＲによるクローニングが困難になるであろう。したがって、ＡＴＧの上流側の部位−８５０ｂｐおよび−１ｂｐでそれぞれ始まるフォワードおよびリバースの合成プライマーを用いてＰＣＲにより制御領域を増幅する。ＰＣＲ増幅によりヒトＦＴＦ１制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ
【０３５８】
５’−ＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴＣ−３’および
５’−ＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＣＣＣＣＴＴＣＣ−３’
である。
【０３５９】
ＰＣＲ増幅を、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡＭＰ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００機器を用いて実施する。例えば、ＰＣＲを０．５μｇのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、１×ｄＮＴＰミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州所在）、１×ｃＤＮＡ　ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む５０μｌの反応容積で実施する。
ＰＣＲ反応条件は
９４℃で２秒間、７２℃で３分間を７サイクル
９４℃で２秒間、６７℃で３分間を３２サイクル
６７℃で４分間
である。
【０３６０】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ所在）を用いてゲル精製し、製造業者の指示に従って、ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結する。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換する。得られたプラスミドを制限酵素分析によりスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確認する。次いで、ヒトＦＴＦ１制御領域をｐＣＲＩＩベクターからルシフェラーゼリポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））へ再クローニングする。得られたヒトＦＴＦ１制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０３６１】
実施例１１−ヒトＡＩＢＧ制御領域のクローニング
ＡＩＢＧ制御領域（４３１ｂｐ）をヒト白血病ゲノムＤＮＡからＰＣＲによりクローニングする。制御領域を、ＡＴＧの上流の部位−４３０ｂｐおよび−１ｂｐで始まるフォワードおよびリバースの合成プライマーを用いてＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ増幅によりヒトＡＩＢＧ制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ
５’−ＴＧＡＡＣＣＣＣＡＣＣＴＴＴＧＧＴＧＴＣＡＣＡＴＧＴＧＣＡＧ−３’および
５’−ＧＡＴＧＧＴＣＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣＣＧＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧ−３’
である。
【０３６２】
ＰＣＲ増幅を、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡＭＰ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００機器を用いて実施する。例えば、ＰＣＲを０．５μｇのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、１×ｄＮＴＰミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州所在）、１×ｃＤＮＡ　ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む５０μｌの反応容積で実施する。
ＰＣＲ反応条件は
９４℃で２秒間、７２℃で３分間を７サイクル
９４℃で２秒間、６７℃で３分間を３２サイクル
６７℃で４分間
である。
【０３６３】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ所在）を用いてゲル精製し、製造業者の指示に従って、ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結する。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換する。得られたプラスミドを制限酵素分析によりスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確認する。次いで、ヒトＡＩＢＧ制御領域をｐＣＲＩＩベクターからルシフェラーゼリポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））へ再クローニングする。得られたヒトＡＩＢＧ制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０３６４】
実施例１２−ヒトＧＰＡＴ制御領域のクローニング
制御領域（１９６２ｂｐ）をヒト白血病ゲノムＤＮＡからＰＣＲによりクローニングする。制御領域を、ＡＴＧの上流の部位−３４５３４ｂｐおよび−３２５７５ｂｐで始まるフォワードおよびリバースの合成プライマーを用いてＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ増幅によりヒトＧＰＡＴ制御領域をクローニングするのに用いるフォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ
５’−ＴＴＧＧＣＴＣＡＣＣＴＣＡＧＴＧＣＣＣＣＣＡＧＴＣ−３’および
５’−ＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＴＣＧＴＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＡＴＣ−３’
である。
【０３６５】
ＰＣＲ増幅を、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＧｅｎｅＡＭＰ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００機器を用いて実施する。例えば、ＰＣＲを０．５μｇのゲノムＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、１×ｄＮＴＰミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州所在）、１×ｃＤＮＡ　ＰＣＲ反応緩衝液（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））および１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）ｃＤＮＡポリメラーゼミックス（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を含む５０μｌの反応容積で実施する。
ＰＣＲ反応条件は
９４℃で２秒間、７２℃で３分間を７サイクル
９４℃で２秒間、６７℃で３分間を３２サイクル
６７℃で４分間
である。
【０３６６】
ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ所在）を用いてゲル精製し、製造業者の指示に従って、ＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結する。連結反応産物を用いて大腸菌株ＴＯＰ１０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換する。得られたプラスミドを制限酵素分析によりスクリーニングし、ＤＮＡ配列決定により確認する。次いで、ヒトＧＰＡＴ制御領域をｐＣＲＩＩベクターからルシフェラーゼリポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））へ再クローニングする。得られたヒトＧＰＡＴ制御領域／リポーター構築物を用いて、種々の哺乳類細胞株をトランスフェクションし、リポーター活性を測定する。
【０３６７】
実施例１３−酵母の細胞全体またはスフェロプラストを用いる薬物スクリーニング検定
Ａ．スフェロプラストの調製
６×Ｈｉｓタグあり／なしヒトＳＣＤ遺伝子で形質転換した出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（またはその他）のＯＬＥ１欠失突然変異体の培養をストックの細胞懸濁液から開始する。酵母を適切な培地中で生育させ、脂肪酸δ−９−デサチュラーゼをコードする遺伝子の発現を誘導するために２％ガラクトースを用いる。１６時間のインキュベーションの後、細胞を４℃、２０６０×ｇで５分間遠心分離し、蒸留水で１回洗浄し、遠心分離する。細胞ペレットの容積と重量を測定する。細胞を０．１Ｍトリス−ＳＯ４（ｐＨ９．４）、１０ｍＭ　ＤＴＴに懸濁し（１：２重量／容積）、３０℃でインキュベートする。１０分間のインキュベーションの後に、遠心分離により細胞ペレットを得て、１．２Ｍソルビトールで１回洗浄し（１：２０重量／容積）、１．２Ｍソルビトール、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁する（１：１重量／容積）。リチケース（Ｌｙｔｉｃａｓｅ）の１５，８００×ｇ（１分間）の上清を２０００Ｕ／ｍｌの濃度で細胞懸濁液に加え、５０ｒｐｍの回転式振とう器で３０℃でインキュベートする。スフェロプラストへの変換は、４０分間のインキュベーションの後に、懸濁液を蒸留水で希釈してから顕微鏡下で観察することにより確認する。７０分間のインキュベーションの後に、約９０％の細胞がスフェロプラストに変換される。
【０３６８】
Ｂ．スフェロプラストの試験化合物とのインキュベーション
スフェロプラストを４℃、２０６０×ｇで５分間遠心分離してハーベストし、１．２Ｍソルビトールで１回洗浄し、誘導条件を維持して約２．５〜３．０のＯ．Ｄ．６００の読み取り値を得るために１％ブリジ（Ｂｒｉｊ）５８、１．２Ｍソルビトールおよび２％ガラクトースを含む適切な培地に再懸濁する。スフェロプラスト懸濁液の試料の一部１０ｍｌをいくつかの１２５ｍｌ三角フラスコに移し、各フラスコ中で２００μｌの各種濃度の試験化合物とともに回転式インキュベータで２７０ｒｐｍ、３０℃でインキュベートする。３０分間のインキュベーション後に、２〜２００μＭ（１μＣｉ）の［１−１４Ｃ］パルミチン酸を培養物に加え、さらに１２０分間インキュベートする。この時点でＯ．Ｄ．６００を測定し、スフェロプラストを遠心分離によりハーベストし、０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄する。
【０３６９】
Ｃ．全酵母細胞の試験化合物とのインキュベーション
ヒトＳＣＤ遺伝子で形質転換した出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＯＬＥ１欠失突然変異体を、１％ブリジ（Ｂｒｉｊ）５８を含む９ｍｌの適切な培地（Ｏ．Ｄ．６０００．４、細胞は約３．２×１０６個／ｍｌ）と２００μｌの各種濃度の試験化合物とを含むいくつかの１２５ｍｌ三角フラスコ中でインキュベートする。回転式振とう器中で２７０ｒｐｍ、３０℃で１時間インキュベートした後、１μＣｉの［１−１４Ｃ］パルミチン酸（１％ブリジ（Ｂｒｉｊ）５８を含むインキュベーション培地に溶解）を終濃度２〜２００μＭで細胞懸濁液に加える。阻害物質および放射性標識脂肪酸とともに５時間インキュベートした後、ガラクトースを終濃度２％となるように加えて導入遺伝子の発現を誘導する。酵母をさらに１９時間インキュベートした後、４℃、５０００×ｇで１０分間遠心分離してハーベストする。細胞を０．１％ＢＳＡを含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．０）で洗浄し、下記のように総脂質を抽出する。
【０３７０】
Ｄ．脂質分析
細胞全体またはスフェロプラストのペレットを１０％ＫＯＨでけん化して遊離脂肪酸を得、さらにメタノール中ＢＦ３を用いてメチル化する。２０５ｎｍに設定したダイオード・アレイ検出器、固体シンチレーション・カートリッジ（１４Ｃ検出効率９７％）を備えた放射性同位体検出器（１７１型、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）［カリフォルニア州所在］）およびμＢｏｎｄａｐａｋ（登録商標）Ｃ−１８ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）インサートを含むプレカラムに取り付けた逆相ＯＤＳ（Ｃ−１８）ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ内径、粒子径５μｍ）を装着したヒューレットパッカード（Ｈａｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）１０９０、シリーズＩＩクロマトグラフ装置を用いて、脂肪酸メチルエステルを高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析する。脂肪酸メチルエステルを流速１ｍｌ／分でアセトニトリル／水（９５：５容積比）を用いてアイソクラクティックで分離し、真正標準品との比較により同定する。
あるいは、脂肪酸メチルエステルをキャピラリーカラム・ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析する。
【０３７１】
実施例１４−酵母ミクロソームを用いる薬物スクリーニング検定
Ａ．酵母ミクロソームの調製
６×Ｈｉｓタグ付きまたはタグなしのδ−９−デサチュラーゼで形質転換した出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＯＬＥ１欠失突然変異体の２〜５ｌ培養を、ガラクトースを含まない適切な培地を用いて約３．２×１０５個／ｍｌの細胞密度（Ｏ．Ｄ．６０００．４）で開始する。２７０ｒｐｍの回転式振とう器で３０℃で８時間インキュベートした後、ガラクトースを終濃度２％となるように加える。酵母をさらに１２時間インキュベートし、４℃、２０６０×ｇで１０分間の遠心分離によりハーベストし、水で洗浄する。細胞ペレットをその容積の１／３に、ｐＨ７．２の単離用緩衝液（８０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、１０ｍＭ　ＫＣｌ、３２０ｍＭスクロース、２ｍＭ　ＰＭＳＦおよびプロテアーゼインヒビター混合物）に再懸濁する。細胞懸濁液を液体Ｎ２の入った乳鉢に注ぎ、セラミック乳棒を用いて砂とともに粉砕する。酵母粉末をコニカル試験管に移し、ペレットの容積の２／３の単離用緩衝液を加える。砂を５７×ｇで１分間遠心分離することにより除去し、懸濁液を１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して、細胞破片、核およびミトコンドリアを分離した。上清を１０６，０００×ｇで１時間遠心分離して、ミクロソームペレットを得、それを７００μｌの単離用緩衝液に再懸濁する。このミクロソーム懸濁液についてタンパク検定を実施する。
【０３７２】
Ｂ．酵母ミクロソームの試験化合物とのインキュベーション
δ−９−デサチュラーゼの活性を、［１−１４Ｃ］１６：０（パルミチン酸）の［１−１４Ｃ］１６：１ｎ−７（パルミトレイン酸）への変換を測定することにより調べる。４３．２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ　ＡＴＰ、５００μＭ　ＮＡＤＨおよび１０μＭ補酵素Ａならびに一連の濃度の試験化合物を含む０．２５ｍｌの８０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．２）中に加えた終濃度３３μＭの０．２０μＣｉ基質脂肪酸を入れたプレインキュベート済み試験管に、５００μｇの酵母ミクロソームタンパク質を加えて反応を開始する。同試験管を激しく渦攪拌し、振とう水浴中で１５分間インキュベート（３７℃）した後、２ｍｌの１０％（重量／容積）ＫＯＨエタノール溶液を加えて、反応を停止させる。インキュベーション混合物中の脂質をＮ２雰囲気中８０℃で４５分間けん化する。次いで試料を氷中５分間放置してから酸性化する。脂肪酸をヘキサンで抽出し、メタノール中ＢＦ３で９０℃で３０分間エステル化する。脂肪酸メチルエステルを実施例１３に記載のようにＨＰＬＣにより分析する。
結果を、１分間あたり、ミクロソームタンパク質１ｍｇあたりに生成したパルミトレイン酸のピコモル数で表す。
【０３７３】
実施例１５−精製酵素を用いる薬物スクリーニング検定
Ａ．酵母ミクロソームからのδ−９−デサチュラーゼの単離
６×Ｈｉｓでタグ標識したδ−９−デサチュラーゼを含む酵母ミクロソームをＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１４またはデオキシコール酸塩／トリトンＸ１００混合物（２重量％）とともに４℃で２時間撹拌し、δ−９−デサチュラーゼを可溶化する。あるいは、酵母ミクロソームをアセトン中の２．５％水（容積比）で処理して、該界面活性剤の可溶化能を高めることが可能である。混合物を１０６，０００×ｇで１時間遠心分離する。該酵素を含む上清を、迅速タンパク質液体クロマトグラフィーシステム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））に装着した予め平衡化済みのＨｉＴｒａｐ（登録商標）キレート化（Ｎｉ２＋固定イミノジアセテート）カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））にロードする。カラムを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄する。タグ標識タンパク質を、０〜５００ｍＭの範囲のイミダゾールを含む同じ緩衝液で溶離し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））濃縮器を用いて限外ろ過によりさらに濃縮する。
【０３７４】
Ｂ．δ−９−デサチュラーゼの試験化合物とのインキュベーション
濃縮した酵素を、１ｍＭ　ＮＡＤＨ、８０μＭシトクロムｂ５、４μＭ　ＮＡＤＨ−シトクロムｂ５レダクターゼ、６ｍＭ卵ホスファチジルコリン、２％トリトンＸ−１００、０．４％デオキシコール酸ナトリウム、放射性標識パルミトイル−ＣｏＡおよび一連の濃度の試験化合物を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）中で３０〜３７℃でインキュベートする。１５〜９０分間のインキュベーションの後、反応を停止させ、実施例１３に記載のように脂肪酸メチルエステルを分析する。
【０３７５】
あるいは、酵素活性をパルミトイル−ＣｏＡの存在下または非存在下でのＮＡＤＨ酸化速度により測定することが可能である。
【０３７６】
実施例１６−実施例１３〜１５に記載の薬物スクリーニング検定のラット肝ミクロソームを用いたバリデーション
Ａ．ラット肝ミクロソームの調製
酵素活性の高い時期に、軽ハロタン（鉱油中１５％）麻酔したウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットを放血により屠殺した。肝臓をただちに０．９％冷ＮａＣｌ溶液ですすぎ、重量を測定し、はさみで細切する。別途指定しない限り、すべての操作を４℃で行う。０．２５Ｍスクロース、６２ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　Ｎ−アセチルシステイン、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液中（１：３重量／容積）で４ストロークのポッター−エルベージェム（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ）組織ホモジナイザーを用いて肝臓をホモジナイズする。ホモジネートを１０，４００×ｇで２０分間遠心分離して、ミトコンドリアと細胞破片を除去する。上清を３層チーズクロスでろ過し、１０５，０００×ｇで６０分間遠心分離する。ミクロソーム・ペレットを小型のガラス／テフロンホモジナイザーで同じホモジナイゼーション溶液に緩やかに再懸濁し、−７０℃で保存する。ミトコンドリアの混入がないことを酵素的に評価する。ウシ血清アルブミンを標準としてタンパク質濃度を測定する。
【０３７７】
Ｂ．ラット肝ミクロソームの試験化合物とのインキュベーション
４２ｍＭ　ＮａＦ、０．３３ｍＭナイアシンアミド、１．６ｍＭ　ＡＴＰ、１．０ｍＭ　ＮＡＤＨ、０．１ｍＭ補酵素Ａおよび一連の濃度の試験化合物を含む１．５ｍｌのホモジナイゼーション溶液中の終濃度３３．３μＭの０．２０μＣｉの基質脂肪酸（パルミチン酸）を入れたプレインキュベート済の試験管に、２ｍｇのミクロソームタンパク質を加えて反応を開始する。試験管を激しく渦攪拌し、振とう水浴中（３７℃）で１５分間インキュベートした後、反応を停止させ、実施例１３に記載のように脂肪酸を分析する。あるいは、脂肪酸メチルエステルをキャピラリーカラム・ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で分析する。
【０３７８】
実施例１７−アポリポタンパク質Ａ−１に関する薬物スクリーニング検定
ＡｐｏＡ−１と相互作用する試験化合物は、補酵素としてのＡｐｏＡ−１の機能を妨害してＬＣＡＴ活性の喪失をもたらす可能性がある。薬物スクリーニング検定は、ＬＣＡＴ活性に関するよく知られている酵素検定に基づいている（リー　エムおよびプリチャード　ピー　エイチ（Ｌｉ　Ｍ．ａｎｄ　Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ　Ｐ．Ｈ．）、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５巻、１８０７９〜１８０８４ページおよびソルシ−トーマスら（Ｓｏｒｃｉ−Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５巻、１２１５６〜１２１６３ページ）。
【０３７９】
概要を述べると、精製した組換えＡｐｏＡ−１または精製した血漿ＡｐｏＡ−１を［３Ｈ］コレステロールおよびホスファチジルコリンと０．８：１２．５：２５０のモル比で（約１．２μｇ）、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．４、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１５ｍＭアジ化ナトリウム、０．６％脂肪酸非含有血清アルブミンおよび２ｍＭ　β−メルカプトエタノール中で混合する。試験化合物を適切な濃度で反応に加える。適切な容積の新鮮血漿を反応混合物に加えて、ＬＣＡＴを供給する。３７℃での３０分間のインキュベーションの後に、エタノールを加えて反応を停止させる。総脂質を抽出し、シリカゲルＧプレートとヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（容積比７０：１２：１）とを用いて薄層クロマトグラフィー法により該脂質を分離して、［３Ｈ］コレステロールの［３Ｈ］コレステロールエステルへの変換を測定する。コレステロールエステルスポットの放射活性を、液体シンチレーション計数法により、ベルトールド社（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）の放射性同位体スキャナでプレートをスキャンすることにより、あるいは当技術分野で知られているオートラジオグラフ法により測定する。
【０３８０】
コントロール反応（試験化合物を含まない）と比較した場合の試験反応の変化は、ＡｐｏＡ−１に対する試験化合物の調節作用の尺度である。
あるいは、ファージ・ディスプレイ法に適合させた組合せライブラリーから得られ、ＡｐｏＡ−１に結合する小ペプチドまたはアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）を、ノードら（Ｎｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１５巻、７７２〜７７７ページに記載の同様な方法を用いて特定する。
【０３８１】
実施例１８−グリセロール−３リン酸アシルトランスフェラーゼに関する薬物スクリーニング検定
実施例１３、１４および１５に記載のように、６×Ｈｉｓタグ付きまたはタグなしのＧＰＡＴをコードするヒトまたは哺乳類の遺伝子で形質転換した出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアシルトランスフェラーゼ突然変異体から細胞全体、スフェロプラスト、ミクロソーム、ミトコンドリアまたは精製酵素を得る。
【０３８２】
細胞または細胞小器官（すなわちミクロソームまたはミトコンドリア）または精製酵素を種々の濃度の試験化合物の存在下で放射標識したグリセロールおよびパルミトイルＣｏＡもしくは他のアシルＣｏＡとともに２〜１２時間（細胞）または５〜２０分間（細胞小器官または精製酵素）インキュベートする。反応をブタノールで停止させ、生成されたリゾホスファチジン酸を、シリカゲルＧプレートおよび溶媒混液を用いた２次元薄層クロマトグラフィーにより分離する。一次元目をクロロホルム：メタノール：７Ｎアンモニア（容積比６５：２５：４）を用いて行い、二次元目をクロロホルム：メタノール：酢酸：水（容積比１７０：１５：１５：２）を用いて行う。放射標識されたリゾホスファチジン酸スポットを含むシリカを削り取り、シンチレーションカウンターで放射活性を計数する。あるいは、質量検出器／オンライン１４Ｃ検出器を用いたＨＰＬＣ法を使用してもよい。
【０３８３】
実施例１９−Ｓｐｏｔ−１４に関する薬物スクリーニング検定
Ｓｐｏｔ−１４は、転写因子のすべての特性を有する核タンパク質である。酵母ツー・ハイブリッドシステムにより、Ｓｐｏｔ−１４が多くの転写因子の場合と同様にホモ２量体化する強い傾向を有することが示された（カニンガムら（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１３８巻、５１８４〜５１８８ページ）。
【０３８４】
したがって、酵母ツー・ハイブリッドシステムを用いてＳｐｏｔ−１４のホモ２量体化を阻害する化合物をスクリーニングする。ツー・ハイブリッド検定は、実施例２１に記載のように実施する。Ｓｐｏｔ−１４　ｃＤＮＡを、それぞれＤＮＡ活性化ドメイン（ＡＤ）およびＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含むプレイ（ｐｒｅｙ）ベクターおよびベイト（ｂａｉｔ）ベクターにクローニングする。これらのベクターを適切に改変した酵母株に導入する。Ｓｐｏｔ−１４のホモ２量体化（ドメインの相互作用）によりＡＤがＤＢＤの近傍にもたらされ、その結果リポーター遺伝子の発現が誘発される。リポーター遺伝子の発現を、当技術分野でよく知られた技術を用いて検定する。Ｓｐｏｔ−１４の２量体化を阻害する任意の試験化合物で形質転換酵母を処理することにより、選択培地上での酵母の生育が阻害される。
【０３８５】
実施例２０−ＭＥＴＰに関する薬物スクリーニング検定
酵母においてミトコンドリア機能に関与するいくつかの遺伝子が知られている（ベレンキイら（Ｂｅｌｅｎｋｉｙ　ｅｔ　ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第１４６７巻、２０７〜２１８ページおよびコンタミン　ブイおよびピカード　エム（Ｃｏｎｔａｍｉｎｅ　Ｖ．ａｎｄ　Ｐｉｃｈａｒｄ　Ｍ．）、２０００年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、第６４巻、２８１〜３１５ページ）。特定のミトコンドリア機能を欠く酵母突然変異体は、温度感受性およびグリセロールもしくはエタノール培地上での生育阻害等のいくつかの表現型を示す。そのような酵母突然変異体をＭＥＴＰ遺伝子で形質転換し、表現型上の復帰突然変異体を分析する。関連ヒト遺伝子による酵母突然変異体の表現型の相補性は、当技術分野でよく知られている（ナカシマら（Ｎａｋａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、９５６７〜９５７２ページおよびアマラバジら（Ａｍａｒａｖａｄｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第９９巻、３２９〜３３３ページ）。ＭＥＴＰを含む復帰突然変異株を用いて、突然変異体の表現型を相補するＭＥＴＰの能力を阻害する新規化学物質をスクリーニングする。
【０３８６】
ミトコンドリア担体タンパク質と推定されるタンパク質をコードする２つの酵母遺伝子、ＹＭＣ１およびＹＭＣ２（グラフら（Ｇｒａｆ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９３年、Ｙｅａｓｔ、第９巻、３０１〜３０５ページ）はＭＥＴＰと約３０％の同一性を共有しており、機能上の関連性を示している。ＹＭＣ１およびＹＭＣ２の単一の突然変異体または２重突然変異体の表現型を確定する。該表現型はＭＥＴＰにより相補されるので、上記のように薬物スクリーニングに用いられる。
【０３８７】
実施例２１−酵母１−または２−ハイブリッドシステムを用いる薬物スクリーニング検定
酵母ワン・ハイブリッドまたはツー・ハイブリッド検定の方法は当業者に既知である（フィールズ　エスおよびソング　オー（Ｆｉｅｌｄｓ　Ｓ．ａｎｄ　Ｓｏｎｇ　Ｏ．）、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４０巻、２４５〜２４６ページ、ウルマソフら（Ｕｌｍａｓｏｖ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７６巻、１８６５〜１８６８ページならびにフルヤマ　ケーおよびサッサ　エス（Ｆｕｒｕｙａｍａ　Ｋ．ａｎｄ　Ｓａｓｓａ　Ｓ．）、２０００年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１０５巻、７５７〜７６４ページ）。検定用の試薬またはキット、例えば、ＨｙｂｒｉｄＨｕｎｔｅｒ（登録商標）酵母ツー・ハイブリッドおよびＲＮＡ−タンパク質　ＨｙｂｒｉｄＨｕｎｔｅｒ（登録商標）システム（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ））、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ（登録商標）ワン・ハイブリッドおよびツー・ハイブリッドシステム（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））およびＨｙｂｒｉＺＡＰ（登録商標）ツー・ハイブリッドシステム（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が市販されている。
以下の検定法は、本明細書に開示されている脂肪酸により制御される遺伝子のすべてに対して適切なものである。
【０３８８】
Ａ．酵母１−ハイブリッド検定
既知の標的要素または制御領域「ベイト」をリポーター遺伝子（例えばＨＩＳ３）の上流に挿入し、酵母ゲノムに組み込んで新規リポーター株を作る。ベイトＤＮＡ配列と相互作用するＤＮＡ結合性タンパク質をスクリーニングするために、該酵母株を活性化ドメイン（ＡＤ）融合ライブラリーで形質転換する。標的配列へのＡＤ／ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）ハイブリッドタンパク質の結合は、リポーター遺伝子の転写活性化およびその後の選択をもたらす。例えば、ＨＩＳ３の発現はヒスチジンを欠く最少培地上でのコロニー増殖を可能にする。ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）をコードするｃＤＮＡを単離し、特性を検討する。試験化合物の存在下で標的要素または制御領域をＤＢＰに曝露することにより試験化合物をスクリーニングするために、該相互作用をｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで再構築する。当業者によく知られている、ＤＮＡ／タンパク質結合作用を測定する検定法により、試験化合物の作用を評価する。
【０３８９】
Ｂ．酵母２−ハイブリッド検定
２つの物理的に異なる機能ドメイン、すなわちＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と活性化ドメイン（ＡＤ）とを必要とする。問題のポリペプチドを「ベイト」ベクターにクローニングし、ＤＢＤとのハイブリッドタンパク質として発現させる。相互作用する可能性のあるタンパク質をコードするｃＤＮＡのライブラリーを「プレイ」ベクター内のＡＤを含む読み枠にクローニングする。ベイトおよびプレイ・ベクターの融合構築物をいくつかの改変酵母株の１つを形質転換する。ベイトおよびプレイハイブリッドタンパク質間の相互作用が起きると、プレイのＡＤがＤＢＤと緊密に接触し、リポーター遺伝子の転写が活性化される。相互作用する陽性のタンパク質を、栄養欠損培地上で平板培養し、リポーター活性の有無をスクリーニングすることにより容易に特定する。試験化合物の存在下で２つの相互作用するタンパク質を曝露することにより試験化合物をスクリーニングするために、これらの２つのタンパク質間の相互作用をｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで再構築する。当業者によく知られている、タンパク質／タンパク質結合作用を測定する検定法により、試験化合物の作用を評価する。
【０３９０】
実施例２２−ＩＮＳＩＧ１に関する薬物スクリーニング検定
安定な、ＩＮＳＩＧ１を過剰発現する細胞株を樹立し、発現しない細胞株を対照とする。過剰発現する細胞株および対照細胞株から細胞膜を単離し、標識した試験化合物とともにインキュベートする。適切なインキュベーション時間の後に膜を回収し、結合していない試験化合物を除去するために洗浄する。当業者によく知られている技術を用いて、ＩＮＳＩＧ１を含む膜に結合した量を対照の膜に結合した量と比較することにより、試験化合物の特異的結合を測定する。
【０３９１】
あるいは、肝細胞株Ｈ３５をインスリンによるＩＮＳＩＧ１の誘導の存在下または非存在下で用いる。あるいは、肝切除後の再生中の肝細胞から単離された膜を用い、肝切除を受けていない動物由来の膜と比較する。場合によっては、単離された膜でなく細胞全体を用いてもよい。あるいは、精製ＩＮＳＩＧ１を用いて、人工的な組換えＩＮＳＩＧ１／膜複合体を生成させ、ＩＮＳＩＧ１を含まない膜複合体と比較する。
【０３９２】
実施例２３−酵母相補性を用いたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに関する薬物スクリーニング検定
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧ６ＰＤ無発現（ｎｕｌｌ）突然変異体は、有機硫黄源（すなわち、０．１ｍＭ　Ｌ−メチオニン、０．５ｍＭ　Ｌ−システイン、０．２ｍＭグルタチオン、０．２ｍＭホモシステインまたは０．２ｍＭ　Ｓ−アデノシルメチオニン）もしくは無機硫黄源（すなわち、０．５ｍＭ硫酸塩、０．５ｍＭ亜硫酸塩または０．５ｍＭ硫化物）を欠く培地中で生育しない（トーマスら（Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９１年、ＥＭＢＯ　Ｊ．第１０巻、５４７〜５５３ページ）。そのような酵母突然変異体をＧ６ＰＤ遺伝子で形質転換し、表現型上の復帰突然変異体を分析する。酵母突然変異体の表現型の関連ヒト遺伝子による相補は、当技術分野でよく知られている（ナカシマら（Ｎａｋａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、９５６７〜９５７２ページおよびアマラバジら（Ａｍａｒａｖａｄｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第９９巻、３２９〜３３３ページ）。Ｇ６ＰＤを含む復帰突然変異株を用いて、突然変異体の表現型を相補するＧ６ＰＤの能力を阻害する新規化学物質をスクリーニングする。
【０３９３】
丸ごと全体または透過性化処理された酵母細胞またはスフェロプラストを用いるこのモデルは新規のものであり、Ｇ６ＰＤ活性に影響を及ぼす試験化合物のスクリーニングに有用である。
【０３９４】
実施例２４−精製または粗精製の酵素抽出物を用いたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼに関する薬物スクリーニング検定
Ｇ６ＰＤ遺伝子で形質転換した大量のＧ６ＰＤ無発現突然変異酵母を、十分な選択システムを備えた適切な最少培地中で生育させる。過剰生産されたＧ６ＰＤタンパク質をアフィニティクロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーにより単離する。酵母ホモジネートを前述（実施例１４を参照）のように液体Ｎ２法を用いて得、２’，５’−ＡＤＰ−セファロースカラムにアプライする。２つの緩衝液系を用いてＧ６ＰＤタンパク質を溶出させる。第１の溶出緩衝液は５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．０２％β−メルカプトエタノールを含むトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６であり、第２の溶出緩衝液は０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．０である。当技術分野で知られている方法によりタンパク質濃度を測定する。あるいは、酵母の粗抽出物をＧ６ＰＤタンパク質の供給源として用いる。
【０３９５】
種々の試験化合物によるＧ６ＰＤ活性の調節を、ＮＡＤＰ＋のＮＡＤＰＨへの変換に起因する３４１ｎｍでの蛍光の増大を追跡することにより分光光度法を用いて測定する。酵素反応を、１００μｌの精製酵素または酵母の粗抽出物と、９００μｌのトリス−ＨＣｌ　５０ｍＭ（ｐＨ８．１）、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２００μＭグルコース−６−リン酸、１００μＭ　ＮＡＤＰ＋と、一連の濃度の各試験化合物とを入れたキュベット中で実施する。ＮＡＤＰＨのモル吸光係数として６２７０を用いて酵素の特異的活性を計算する。
【０３９６】
実施例２５−酵母を用いたＧＬＯＬに関する薬物スクリーニング検定
ＧＬＯ２およびＧＬＯ４のような出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるグリオキサラーゼ遺伝子は、哺乳類のＧＬＯＬと著しい相同性を有する。酵母のｇｌｏ２／ｇｌｏ４二重欠失突然変異体（グリオキサラーゼＩＩ活性なし）は、ＧＬＯＬ遺伝子による形質転換の適切な宿主である。ＧＬＯＬ遺伝子で形質転換された出芽酵母のｇｌｏ２／ｇｌｏ４二重欠失突然変異体を、ＹＰＤ（２％グルコース、２％ペプトン、１％酵母抽出物）または適切なアミノ酸および炭素源（２％グルコースまたは３％グリセロール）を含む合成最少培地（０．１７％酵母窒素ベース、０．５％硫酸アンモニウム）中で生育させる。形質転換した酵母のスフェロプラストを実施例１３に記載のようにして得る。全酵母細胞を、アルコール（すなわちメタノール、エタノールまたはイソプロピルアルコール）で透過性化する。両モデル細胞を透過性グルタチオン結合体および５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）とともにインキュベートする。チオールエステルの加水分解を当技術分野で知られている技術を用いて４１２ｎｍで追跡し、ＧＬＯＬ活性をモニターする。種々の濃度の試験化合物を加え、ＧＬＯＬ活性を測定する。
【０３９７】
実施例２６−酵母相補性を用いたＧＬＯＬに関する薬物スクリーニング検定
酵母ｇｌｏ２／ｇｌｏ４二重欠失突然変異体は、メチルグリオキサールの存在下では生育しない。そのような酵母突然変異体をＧＬＯＬ遺伝子で形質転換し、表現型の復帰突然変異体を分析する。酵母突然変異体の表現型の関連ヒト遺伝子による相補は、当技術分野でよく知られている（ナカシマら（Ｎａｋａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、９５６７〜９５７２ページおよびアマラバジら（Ａｍａｒａｖａｄｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第９９巻、３２９〜３３３ページ）。ＧＬＯＬを含む復帰突然変異株を用いて、突然変異の表現型を相補するＧＬＯＬの能力を阻害する新規化学物質をスクリーニングする。
【０３９８】
丸ごと全体または透過性化処理された酵母細胞またはスフェロプラストを用いるこのモデルは新規のものであり、ＧＬＯＬ活性に影響を及ぼし、それによりメチルグリオキサールに対する感受性を増大または低下させる試験化合物のスクリーニングに有用である。
【０３９９】
実施例２７−精製酵素を用いたＧＬＯＬに関する薬物スクリーニング検定
ＧＬＯＬ遺伝子で形質転換した大量のｇｌｏ２／ｇｌｏ４二重突然変異酵母を生育させ、実施例１４に記載の液体Ｎ２法を用いて酵母ホモジネートを得ることにより、過剰生産されたＧＬＯＬタンパク質を単離する。ホモジネートを固定化グルタチオンを含むカラムにアプライし、３Ｍ　ＮａＣｌを添加したＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．２）でＧＬＯＬタンパク質を溶出させる。当技術分野でよく知られている方法によりタンパク質濃度を測定する。
【０４００】
ＧＬＯＬ活性の調節を、グルタチオン結合体および５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を含む１ｍｌの１００ｍＭ　ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２中で３７℃で測定する。この反応に、７〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＧＬＯＬおよび適切な濃度の試験化合物も含める。２４０ｎｍでの吸光度の低下を追跡するか、あるいは４１２ｎｍでの吸光度の増加によるグルタチオンの生成を追跡することにより酵素活性を測定する。
【０４０１】
実施例２８−脂肪酸シンターゼに関する薬物スクリーニング検定
ＦＡＳ遺伝子で形質転換した大量のＦＡＳ無発現突然変異酵母を十分な選択システムを備えた適切な最少培地中で生育させる。実施例１４で前述したように液体Ｎ２法を用いて酵母ホモジネートを得る。酵母ホモジネート由来の過剰生産されたＦＡＳタンパク質を、段階的なポリエチレングリコールおよび硫酸アンモニウム沈澱、ゲルろ過および陰イオン交換クロマトグラフィーにより単離する。当技術分野でよく知られている方法によりタンパク質濃度を測定する。
【０４０２】
あるいは、酵母の粗抽出物をＦＡＳタンパク質の供給源として用いる。
ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ＋への酸化を３４０ｎｍで分光光度法により追跡するか、あるいは放射標識されたアセチルＣｏＡまたはマロニルＣｏＡのパルミチン酸への取り込みを分析するＨＰＬＣ法を用いることにより、種々の試験化合物によるＦＡＳ活性の調節を測定する。
【０４０３】
実施例２９−酵母相補性を用いるΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼに関する薬物スクリーニング検定
酵母突然変異体の表現型の関連ヒト遺伝子または哺乳類遺伝子による相補は、当技術分野でよく知られている（ナカシマら（Ｎａｋａｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、９５６７〜９５７２ページおよびアマラバジら（Ａｍａｒａｖａｄｉ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９７年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．第９９巻、３２９〜３３３ページ）。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ突然変異体は、オレイン酸含有試験培地（０．１％酵母抽出物、０．６７％酵母窒素ベース、０．０２％トゥイーン−４０、０．１％オレイン酸および０．１％デキストロース；または１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、０．２％オレイン酸および０．０２％トゥイーン−４０）中で生育しない。そのような酵母突然変異体を当技術分野でよく知られている技術を用いて哺乳類Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換し、試験培地中の表現型の復帰突然変異体を分析する。Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼを含む復帰突然変異株を用いて、突然変異体の表現型を相補するΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼの能力を阻害する新規化学物質をスクリーニングする。丸ごとまたは透過性化処理された酵母細胞または酵母スフェロプラストを用いるこのモデルは、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ機能に影響を及ぼし、それによりオレイン酸要求性を増大または低下させる試験化合物のスクリーニングに適している。
【０４０４】
実施例３０−精製酵素を用いたΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼに関する薬物スクリーニング検定
哺乳類Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ遺伝子で形質転換した大量のΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ突然変異酵母を生育させ、実施例１４に記載の液体Ｎ２法を用いて酵母ホモジネートから過剰生産されたタンパク質を得る。分画遠心法を用いてホモジネートからミトコンドリアペレットを単離する。ペレットを１００ｍｌの２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４に再懸濁し、氷浴中で２分間超音波処理する。懸濁液を７０℃で３０秒間加熱し、氷上で冷却し、４℃、１５，０００×ｇで１５分間遠心分離する。ミトコンドリア可溶化物を２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析し、ベッド容積７０ｍｌのＣＭ５２セルロースカラムにロードした。非結合タンパク質を２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６．０で溶出させ、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼを３０ｍｌの２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で溶出させた。溶出液を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）に対して透析し、高速タンパク質液体クロマトグラフィーモノＱ陰イオン交換カラム上で２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）と１Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）とを用いて勾配溶出により分離する。Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼは５０ｍＭ　ＮａＣｌで溶出する。当技術分野でよく知られている方法によりタンパク質濃度を測定する。
【０４０５】
Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼ活性の試験化合物による調節をビンストックおよびシュルツ（Ｂｉｎｓｔｏｃｋ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｌｚ）（１９８１年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．第７１巻、４０３〜４１１ページ）に従って、３４０ｎｍにおいて分光光度法により測定する。反応には、適切な濃度の基質（３−シス−オクテノイルＣｏＡまたは３−トランス−ヘキセノイルＣｏＡ）、試験化合物および精製酵素を含める。
【０４０６】
あるいは、組換えΔ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼを含む全酵母または透過性化処理された酵母細胞またはスフェロプラストを検定に用いる。これらの検定に用いる酵母を、Δ３，Δ２エノイルＣｏＡイソメラーゼの内在性の特異的基質を産生するように遺伝学的に改変することも可能である。
【０４０７】
実施例３１−粗精製の可溶化物または精製酵素を用いたＣＯＭＴに関する薬物スクリーニング検定
大腸菌または適切な宿主系において十分な量の活性のある組換え哺乳類ＣＯＭＴを生産するために、遺伝子を細菌の発現ベクター、例えばｐＫＥＸ１４に導入する。ＩＰＴＧによるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の誘導後に、ＣＯＭＴが高レベルで産生される（総細菌タンパク質の最大１０％）。酵素を当技術分野で知られている手順（ランドストロームら（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９２年、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．第１１２９巻、１４９〜１５４ページ）を用いて大腸菌から精製する。精製酵素を、ＣＯＭＴ活性を調節する薬物をスクリーニングするために用いる。あるいは、細菌の粗精製の可溶化物を検定に用いる。
【０４０８】
試験化合物によるＣＯＭＴ活性の調節を当技術分野で知られている方法を用いて測定する（ティルグマン　シーおよびカルッキネン　エヌ（Ｔｉｌｇｍａｎｎ　Ｃ．ａｎｄ　Ｋａｌｋｋｉｎｅｎ　Ｎ．）、１９９０年、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、第２６４巻、９５〜９９ページおよびラウタラら（Ｌａｕｔａｌａ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９９年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ、第７３６巻、１４３〜１５１ページ）。その概要を述べると、適切な緩衝液中に５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２ｍＭ　Ｌ−システイン、０．１５ｍＭ［１４Ｃ］Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（０．１μＣｉ）および１〜１００μｇの哺乳類ＣＯＭＴ（精製酵素または粗精製の可溶化物として提供）を含む２５０μｌのインキュベーション混合物を３７℃で５分間プレインキュベートする。その後、０．５ｍＭカテコール（基質として）および適切な濃度の試験化合物をインキュベーション混合物に加える。１０〜３０分間のインキュベーション期間の後、２５μｌの冷４Ｍ過塩素酸を加えて反応を終結させる。試料を氷上に１０分間保持し、その後２２，０００×ｇで５分間遠心分離する。
【０４０９】
出口容積２０μｌの１０００μｌ液体シンチレーションフローセルを用いるベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）１１０Ｂカクテルポンプを備えたインライン放射性同位体フロー検出器を装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＰＬＣクロマトグラフ（１０９０シリーズＩＩ）を用いて、メチル化カテコール生成物をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンから分離する。あるいは、シラン処理したセリウム活性化白金ガラスを発光物質として充填した３００μｌフローセルを使用する。
あるいは、組換えＣＯＭＴを含む全酵母または透過性化処理された酵母細胞またはスフェロプラストを薬物スクリーニング検定に用いる。
【０４１０】
実施例３２−ヒトＳＣＤ制御領域を用いる薬物スクリーニング検定
ヒトＳＣＤ制御領域を含むプラスミドｐＧｈ３０２２．１をヒトＳＣＤプロモーター活性を調節する薬物をスクリーニングするために用いる。当業者に知られている技術を用いて、ＳＣＤ制御領域の機能を評価するために一過性のトランスフェクションを実施する。
【０４１１】
製造業者の記載のように、６０ｍｍ組織培養皿中で１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いて、ＨｅｐＧ２細胞を１０μｇのｐＧｈ３０２２．１（実施例７）および１μｇのベクターｐＲＳＶ−ＮＥＯ（ＡＴＣＣ）でトランスフェクションする。２４時間インキュベートした後、細胞を２つの１５０ｍｍ組織培養皿に１：２の希釈率で継代し、さらに２４時間生育させた。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を８００μｇ／ｍｌの濃度で培地に加える。抗生物質の選択圧力下で３〜４週間生育させた後、抵抗性クローンを単離し、それらのルシフェラーゼ活性について特徴づけを行う。
【０４１２】
製造業者の推奨事項に従って、ルシフェラーゼ酵素検定システム（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて薬物スクリーニングを行う。その概要を述べると、９６ウエルプレートにおいて生育させたトランスフェクション済み細胞を試験化合物に曝露させる。適切なインキュベーション時間の後に、細胞をＭｇ２＋およびＣａ２＋非含有ＰＢＳで洗浄する。細胞を２０μｌの１×ルシフェラーゼ細胞培養物溶解試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ）（ＣＣＬＲ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて溶解する。プレートを自動インジェクタを備えたルミノメータにのせる。インジェクタによりウエル当たり１００μｌのルシフェラーゼ検定試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））が添加され、反応により生じた発光を２秒間の遅延の後に１０秒間読み取ってから次のウエルに移り、この操作を繰り返す。試験化合物を含まない細胞培養物を対照として用いる。ルシフェラーゼ活性の有意な差は、試験化合物がヒトＳＣＤプロモーター活性を調節していることを示す。
【０４１３】
この検定または他のリポーター検定は、脂肪調節性遺伝子の制御領域を用いる薬物スクリーニングに有用である。
【０４１４】
実施例３３−動物モデルにおける、脂肪調節性遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体を用いた薬物スクリーニング検定
脂肪調節性遺伝子によりコードされるポリペプチドに対するモノクローナル抗体を当技術分野で知られている方法を用いて調製する。
ラットを試験群と対照群に無作為に分ける。試験化合物およびプラセボを試験群および対照群にそれぞれ経腸的または非経口的に投与する。試験化合物およびプラセボをボーラスまたは持続投与により与える。適切な投与期間の後に、動物を放血により屠殺し、免疫検定用の組織試料を採取する。
【０４１５】
血液においては、脂肪調節性遺伝子によりコードされる標的ポリペプチドの排出量を、血液を遠心分離し、血漿を対応するモノクローナル抗体に曝露することにより測定する。抗原抗体複合体の量を、マーカーに連結されている二次抗体を用いて検出する。これらの免疫学的生成物を、当技術分野で知られている方法（例えば免疫蛍光法または化学発光法）を用いて定量する。
【０４１６】
同様に、試験動物および対照動物の器官全体または血中の白血球を実施例１６に記載のようにホモジナイズする。本明細書に記載のように、遠心分離により細胞破片を除去し、上清を免疫検定に用いる。
【０４１７】
この検定法は、正常または疾患（例えば糖尿病または癌）動物モデルにおける脂肪調節性遺伝子の発現を変化させる薬物の特定にも適している。
【０４１８】
実施例３４−細胞培養物における、脂肪調節性遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体を用いた薬物スクリーニング検定
ＨｅｐＧ２細胞を試験化合物を含む（試験群）または含まない（対照群）培地中で生育させる。適切な処理期間の後に培地を集め、細胞をＰＢＳで洗浄し、当技術分野で知られている技術を用いて溶解する。脂肪調節性遺伝子によりコードされる排出された標的ポリペプチドを含む培地および細胞可溶化物を実施例３３に記載の免疫検定に用いる。
【０４１９】
実施例３５−アフィニティクロマトグラフィーおよび脂肪調節性遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体を用いた薬物スクリーニング検定
本明細書に記載（実施例３３）したモノクローナル抗体を、当業者に知られている架橋剤を用いてプロテインＧ　ＰＯＲＯＳ（登録商標）カラム（パーセプティブバイオシステムズ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）［マサチューセッツ州］）に固定化する（エヴァンスら（Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．）１９９６年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．第１４巻、５０４〜５０７ページ）。モノクローナル抗体を含まず、架橋剤で処理されたカラムを対照として用いる。
【０４２０】
天然または合成ペプチドの組合せライブラリーをカラムに注入する。非結合物質をカラム容積の数倍のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、結合ペプチドを１２ｍＭ　ＨＣｌで溶出させ、当業者に知られている方法（例えばアセトニトリルの勾配を用いて展開する逆相ＨＰＬＣおよび質量分析）を用いて特徴づけを行う。
【０４２１】
この検定法は、脂肪調節性遺伝子によりコードされるポリペプチドに対して産生させたモノクローナル抗体に対して高い親和性を有する抗原性試験化合物の特定に用いる。特定された試験化合物は、標的ポリペプチドと類似した抗原特性を有するため、疾患における前記標的ポリペプチドの機能を模倣するのに用いられる。
【０４２２】
実施例３６−抗体を用いる診断検定
標的ポリペプチドの産生の変化が疑われる対象から得た分画血液（例えば血漿および白血球）を関連疾患の診断に用いる。白血球は、当技術分野で知られている技術を用いて溶解する。
【０４２３】
脂肪調節性遺伝子によりコードされる標的ポリペプチドの量を、血漿および白血球可溶化物を対応するモノクローナル抗体に曝露することにより測定する。抗原抗体複合体の量を、マーカーに連結されている二次抗体を用いて検出する。これらの免疫学的生成物を、当技術分野で知られている方法（例えば免疫蛍光法または化学発光法）を用いて定量する。
【０４２４】
実施例３７−ノーザンブロット分析によるＲＮＡの組織分布の測定
Ａ．ラット
ウイスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（約３００ｇ）をチャールズリバーカナダリミティッド（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｃａｎａｄａ　Ｌｔｄ．）から入手し、通常の飼料を与えて５〜６日間飼育した。各ラットを麻酔下で心臓穿刺により屠殺し、ただちにその組織を生理食塩水で潅流した。適切な組織を速やかに摘出し、液体窒素中で凍結した。
【０４２５】
製造業者のプロトコールに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いて雌ラットの肝臓、脳、腎臓、肺、卵巣、脾臓、心臓、骨格筋、腹部脂肪組織および神経からＲＮＡを単離した。脾臓、心臓、筋、脂肪組織および神経から単離したＲＮＡをその後、製造業者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ（登録商標）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。さらに、オーフレイ　シーおよびローゲオン　エフ（Ａｕｆｆｒａｙ　Ｃ．ａｎｄ　Ｒｏｕｇｅｏｎ　Ｆ．）（１９８０年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１０７巻、３０３〜３１４ページ）に記載のように雄ラットの精巣からＲＮＡを単離した。精巣を液体窒素のもとで微粉末に粉砕し、３Ｍ　ＬｉＣｌおよび６Ｍ尿素中でホモジナイズした。同ＲＮＡを４℃で沈殿させ、遠心分離によりペレットとした。ペレットを再懸濁し、クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した後、エタノールで沈澱させた。
【０４２６】
各組織について、６匹のラット（神経の場合）または４匹のラット（神経を除くすべての組織）由来のプールした全ＲＮＡ１０μｇを、標準的な手順（サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．）、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）［ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｕｒ）に所在］）を用いて、ホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動に供し、毛細管現象によりナイロン膜（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）に転写した。
【０４２７】
ノーザンブロット分析を、標準的な手順を用いて実施した（オースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年−、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）［ニューヨーク所在］）。プローブを、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰおよびＲｅｄｉｐｒｉｍｅ（登録商標）ＩＩランダムプライムラベリングシステム（Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡを標識することにより調製した。ディファレンシャル・ディスプレイ試験（実施例１）において得られたラットＭＥＴＰ、ＦＴＦ１、Ａ１ＢＧおよびＧＬＯＬのｃＤＮＡプローブを用いた。０．２５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いた５５℃での高いストリンジェンシーで膜を洗浄した。ローディングの標準化のために１８Ｓ　ｒＲＮＡサブユニットに対するヌクレオチドプローブで膜を探査した。
【０４２８】
Ｂ．ヒト
１２種のヒト組織（脳、心臓、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺および末梢血白血球）由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを含む膜をクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した（ヒト１２レーンＭＴＮブロット）。ノーザンブロット分析を、標準的な手順を用いて実施した（オースベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．）、１９９４年−、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）［ニューヨーク所在］）。プローブを、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰおよびＲｅｄｉｐｒｉｍｅ（登録商標）ＩＩランダムプライムラベリングシステム（Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡを標識することにより調製した。ＭＥＴＰのｃＤＮＡプローブは、ヒト遺伝子の完全コード配列に一致した。ＧＬＯＬ、ＦＴＦ１およびＡ１ＢＧのｃＤＮＡプローブは、ヒト遺伝子の完全コード配列のそれぞれ塩基１〜６５２、５６４〜１３６３および２１４〜９１５に相当した。０．２５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いた５５℃での高いストリンジェンシーで膜を洗浄した。
【０４２９】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ラットミトコンドリアエネルギー輸送タンパク質ＭＥＴＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。これらの配列は、配列番号１，２に相当する。
【図２】ヒトミトコンドリアエネルギー輸送タンパク質ＭＥＴＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。これらの配列は、配列番号３，４に相当する。
【図３】ラット（ｒＭＥＴＰ）およびヒト（ｈＭＥＴＰ）のミトコンドリアエネルギー輸送タンパク質間のペアワイズアライメントを示す図。これらの配列は、配列番号２，４に相当する。
【図４】ヒトミトコンドリアエネルギー輸送タンパク質遺伝子ファミリーの４つのメンバーであるＭＥＴＰ（配列番号４）、ＭＣＡＴ（ミトコンドリアカルニチン／アシルカルニチントランスロカーゼ）、ＴＸＴＰ（トリカルボキシレート輸送タンパク質）およびＵＣＰ２（ミトコンドリア脱共役タンパク質２）の間の多重アライメントを示す図。囲い枠でこのタンパク質ファミリーのＰＲＯＳＩＴＥシグネチャ・モチーフであるＰＳ００２１５を強調する。
【図５】ヒトＭＥＴＰのトランスメンブラン領域のＤｅｎｓｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｕｒｆａｃｅ（ＤＡＳ）法による予測を示すグラフ。
【図６】ヒトＭＥＴＰ遺伝子の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。部位−１はＡＴＧのすぐ上流のヌクレオチドである。この配列は配列番号５に相当する。
【図７】ラットグリオキサラーゼＩＩ様タンパク質（ＧＬＯＬ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。これらの配列は配列番号６，７に相当する。
【図８】ヒトグリオキサラーゼＩＩ様タンパク質（ＧＬＯＬ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。これらの配列は配列番号８，９に相当する。
【図９】ラット（ｒＧＬＯＬ）およびヒト（ｈＧＬＯＬ）のグリオキサラーゼＩＩ様タンパク質間のペアワイズアライメントを示す図。これらの配列は、配列番号７，９に相当する。
【図１０】ヒトグリオキサラーゼＩＩ様タンパク質（ＧＬＯＬ；配列番号９）およびヒトグリオキサラーゼＩＩ（ＧＬＯ）の間のペアワイズアライメントを示す図。ドメイン１（下線部分）におけるこれら２つのタンパク質間の高度な類似性と金属イオン配位に関与する非変異残基（アステリスクにより表す）が示されている。
【図１１】黒丸で示す２つの亜鉛イオンと楕円で囲んだドメイン１（ＧＬＯＬのモデル化の鋳型）を有するヒトグリオキサラーゼＩＩ酵素の三次元リボン表示を示す図。
【図１２】モデル化したヒトＧＬＯＬの三次元リボン表示を示す図。
【図１３】ヒトＧＬＯＬ遺伝子の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。
部位−１はＡＴＧのすぐ上流のヌクレオチドである。この配列は配列番号１０に相当する。
【図１４】ラット脂肪応答性転写因子ＦＴＦ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。これらの配列は配列番号１１，１２に相当する。
【図１５】ヒト脂肪応答性転写因子ＦＴＦ１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。これらの配列は配列番号１３，１４に相当する。
【図１６】マウスＯＡＳＩＳ遺伝子（ＭＵＳ）ならびにラット（ＲＡＴ）およびヒト（ＨＵＭ）のＦＴＦ１タンパク質間の多重アライメントを示す図。これらの配列は配列番号１２，１４に相当する。
【図１７】ＤＮＡ鋳型へのｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ結合状態の三次元リボン表示を示す図。
【図１８】ＤＮＡ鋳型へのｃ−ｆｏｓおよびモデル化ＦＴＦ１結合状態の三次元リボン表示を示す図。
【図１９】ヒトＦＴＦ１遺伝子の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。部位−１はＡＴＧのすぐ上流のヌクレオチドである。この配列は配列番号１５に相当する。
【図２０】ラットα−１Ｂ糖タンパク質Ａ１ＢＧのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。これらの配列は配列番号１６，１７に相当する。
【図２１】ヒトα−１Ｂ糖タンパク質Ａ１ＢＧのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。これらの配列は配列番号１８，１９に相当する。
【図２２】ラット（ｒＡ１ＢＧ）およびヒト（ｈＡ１ＢＧ）のα−１Ｂ糖タンパク質間のペアワイズアライメントを示す図。これらの配列は配列番号１７，１９に相当する。
【図２３】ヒトキラー細胞阻止受容体ＫＩＲ２ＤＬ２の細胞外リガンド結合部分の三次元リボン表示を示す図。
【図２４】ヒトＡ１ＢＧのモデル化した第４および第５ドメインの三次元リボン表示を示す図。
【図２５】ヒトＡ１ＢＧ遺伝子の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。部位−１はＡＴＧのすぐ上流のヌクレオチドである。この配列は配列番号２０に相当する。
【図２６】ヒトＳＣＤ遺伝子の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。部位−１はＡＴＧのすぐ上流のヌクレオチドである。この配列は配列番号２１に相当する。
【図２７】マウスＳＣＤ１（ｍＳＣＤ１）、マウスＳＣＤ２（ｍＳＣＤ２）およびヒトＳＣＤ（ｈＳＣＤ；配列番号２２，２３）のプロモーター間の多価不飽和脂肪酸応答領域（ＰＵＦＡ−ＲＲ）の比較を示す図。部位−１はＡＴＧのすぐ上流のヌクレオチドである。
【図２８】ヒトグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼｈＧＰＡＴのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す図。これらの配列は配列番号２４，２５に相当する。
【図２９】ヒト（ｈＧＰＡＴ）、ラット（ｒＧＰＡＴ）およびマウス（ｍＧＰＡＴ）グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質間の多重アライメントを示す図。この配列は配列番号２５に相当する。
【図３０】ヒトＧＰＡＴ遺伝子の制御領域のヌクレオチド配列を示す図。部位−１はＡＴＧのすぐ上流のヌクレオチドである。この配列は配列番号２６に相当する。
【図５】
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【図２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512852.tif 000241
【国際調査報告】
2004512852.tif 000242
2004512852.tif 000243
2004512852.tif 000244
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