(57)【要約】変異体BNIP3は、固形腫瘍の発症ならびに化学療法および放射線治療に対する耐性において機能上重要な役割を果たしている。本発明は、癌を検出する方法、癌の進行をモニタリングする方法、化学療法または放射線治療に対して耐性の癌を有する患者を特定する方法、および本発明の方法を実施するための診断キットに関する。
2006526992.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の癌を検出する方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)変異体BNIP3の存在について患者からの試料を試験する工程であって、変異体BNIP3が存在すれば患者に癌があることが分かる工程。
【請求項２】
変異体BNIP3が、BNIP3タンパク質の膜貫通ドメインを除去する任意の変異を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
変異が、BNIP3タンパク質の膜貫通ドメインを除去するPESTドメイン変異を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
PESTドメイン変異が、配列番号:5に示したヌクレオチド235におけるアデノシン挿入を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
変異が、BNIP3タンパク質の膜貫通ドメインを除去するCDドメイン変異を含む、請求項2記載の方法。
【請求項６】
CDドメイン変異が、配列番号:3に示したヌクレオチド356におけるアデノシン欠失を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
試料が組織または血液である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
癌が脳癌である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
癌が卵巣癌である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
工程(a)において、変異体BNIP3をコードする核酸分子の存在について試料が試験される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
変異体BNIP3 mRNAの存在について試料が試験される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
工程(a)において、変異体BNIP3タンパク質の存在が確かめられる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
変異体BNIP3タンパク質が配列番号:4に示した配列を有する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
変異体BNIP3タンパク質が配列番号:6に示した配列を有する、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
変異体BNIP3タンパク質のレベルを求めるために抗体が用いられる、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
化学療法または放射線治療に対して耐性の癌を有する患者を特定する方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)変異体BNIP3の存在について患者からの試料を試験する工程であって、変異体BNIP3が存在すれば、患者に化学療法耐性癌または放射線耐性癌があることが分かる工程。
【請求項１７】
変異体BNIP3が、BNIP3タンパク質の膜貫通ドメインを除去する任意の変異を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
変異が、BNIP3タンパク質の膜貫通ドメインを除去するPESTドメイン変異を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
PESTドメイン変異が、配列番号:5に示したヌクレオチド235におけるアデノシン挿入を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
変異が、BNIP3タンパク質の膜貫通ドメインを除去するCDドメイン変異を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
CDドメイン変異が、配列番号:3に示したヌクレオチド356におけるアデノシン欠失を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
試料が組織または血液である、請求項16〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
癌が脳癌である、請求項16〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
癌が卵巣癌である、請求項16〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
工程(a)において、変異体BNIP3をコードする核酸分子の存在について試料が試験される、請求項16〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
変異体BNIP3 mRNAの存在について試料が試験される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
工程(a)において、変異体BNIP3タンパク質の存在について試料が試験される、請求項16〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
変異体BNIP3タンパク質の存在を検出するために抗体が用いられる、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
(i)請求項1記載の方法を実施するための試薬、および(ii)その使用説明書を含む、患者の癌を検出するためのキット。
【請求項３０】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応で変異体BNIP3をコードするmRNAを増幅するための核酸プライマーが試薬に含まれる、請求項29記載のキット。
【請求項３１】
変異体BNIP3タンパク質に特異的な抗体が試薬に含まれる、請求項29記載のキット。
【請求項３２】
野生型BNIP3タンパク質および変異体BNIP3タンパク質を両方とも認識する抗体と、野生型BNIP3タンパク質に特異的な抗体が試薬に含まれる、請求項29記載のキット。
【請求項３３】
(i)請求項16記載の方法を実施するための試薬、および(ii)その使用説明書を含む、化学療法または放射線治療に対して耐性の癌を有する患者を特定するキット。
【請求項３４】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応で変異体BNIP3をコードするmRNAを増幅するための核酸プライマーが試薬に含まれる、請求項33記載のキット。
【請求項３５】
変異体BNIP3タンパク質に特異的な抗体が試薬に含まれる、請求項33記載のキット。
【請求項３６】
野生型BNIP3タンパク質および変異体BNIP3タンパク質を両方とも認識する抗体と、野生型BNIP3タンパク質に特異的な抗体が試薬に含まれる、請求項33記載のキット。
【請求項３７】
配列番号:4に示した配列を有するBNIP3変異体をコードする、単離された核酸配列。
【請求項３８】
配列番号:3に示した配列を有する、請求項37記載の単離された核酸配列。
【請求項３９】
配列番号:6に示した配列を有するBNIP3変異体をコードする、単離された核酸配列。
【請求項４０】
配列番号:5に示した配列を有する、請求項39記載の単離された核酸配列。
【請求項４１】
配列番号:4に示したアミノ酸配列を有する単離されたBNIP3変異体。
【請求項４２】
配列番号:6に示したアミノ酸配列を有する単離されたBNIP3変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌の進行を検出およびモニタリングするための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Bcl-2ファミリーは、細胞死を調節する抗アポトーシス性タンパク質およびアポトーシス促進性タンパク質からなるグループである。この調節は、これらのタンパク質が他のBcl-2ファミリーメンバーとホモ二量体複合体またはヘテロ二量体複合体を形成することによって決定される。抗アポトーシス性メンバーがアポトーシス促進性メンバーとヘテロ二量体を形成するときに、細胞死が阻害される。しかしながら、アポトーシス促進性メンバーが互いとホモ二量体またはヘテロ二量体を形成するときに、細胞死が誘導される。これらのタンパク質複合体は主にミトコンドリア上で形成する。アポトーシス促進性複合体は、ミトコンドリアの膜電位変化、活性酸素種(ROS)の生成、およびミトコンドリアからのタンパク質の放出をもたらす。これらの事象は細胞死の誘導につながる。
【０００３】
Bcl-2 19キロダルトン相互作用タンパク質(Nineteen Kilodalton Interacting Protein)3(BNIP3)は、カスパーゼ活性化およびミトコンドリアチトクロムc放出とは無関係に細胞死を誘導するアポトーシス促進性のBcl-2ファミリーメンバーである(5,8)。BNIP3は、細胞死を誘導するために、ミトコンドリアの膜電位変化(Δψm)および活性酸素種(ROS)の生成を必要とする(5,11)。BNIP3は、BNIP3を分解の標的とするPESTドメイン、Bcl-2ファミリーメンバーの間で保存されている推定BH3ドメイン、線虫(C.elegans)とヒトの間で保存されている保存ドメイン(CD)、およびBNIP3を、BNIP3誘導細胞死に必須のミトコンドリアに導くTMドメインを含む(12,15)。腫瘍内部の低酸素領域は高レベルのBNIP3を発現している(7,10)。しかしながら、腫瘍細胞が依存として生存している腫瘍低酸素領域においてBNIP3がどのような機能を果たしているのかは分かっていない。悪性神経膠腫は、放射線および化学療法を含むマルチモダリティ療法に対する応答を制限する腫瘍低酸素を有する癌の中で最も進行性の腫瘍の1つである(1,16)。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明者らは、変異体BNIP3が固形腫瘍および腫瘍低酸素のマーカーであり、化学療法または放射線による治療に対して耐性の腫瘍の予後指標であることを示した。
【０００５】
従って、一態様において、本発明は患者の癌を検出する方法を提供し、この方法は、(a)変異体BNIP3の存在について患者からの試料を試験する工程であって、変異体BNIP3が存在すれば患者に癌があることが分かる工程を含む。
【０００６】
別の態様において、本発明は患者の癌の進行をモニタリングする方法を提供し、この方法は、
(a)試料中の変異体BNIP3のレベルを求めるために患者からの試料を試験する工程、および
(b)後の時点で工程(a)を繰り返し、前の時点での工程(a)の結果と、後の時点での工程(a)の結果を比較する工程であって、変異体BNIP3のレベルに違いがあれば患者の癌が進行していることが分かる、工程を含む。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、化学療法または放射線治療に対して耐性の癌を有する患者を特定する方法を提供する。この方法は、(a)変異体BNIP3の存在について患者からの試料を試験する工程であって、変異体BNIP3が存在すれば、患者に化学療法耐性癌または放射線耐性癌があることが分かる工程を含む。
【０００８】
本発明の好ましい態様において、前記の方法は脳癌を検出するために用いられる。
【０００９】
本発明のさらに好ましい態様において、前記の方法は卵巣癌を検出するために用いられる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、BNIP3変異体をコードする単離された核酸配列、好ましくは、配列番号:4または配列番号:6に示したタンパク質をコードする核酸配列、より好ましくは、配列番号:3または配列番号:5に示した核酸配列に関する。
【００１１】
本発明はまた、単離されたBNIP3変異体タンパク質、好ましくは、配列番号:4または配列番号:6に示した配列を有する単離されたBNIP3変異体タンパク質に関する。
【００１２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明から本発明の精神および範囲内の様々な変化および変更が当業者に明らかになるので、詳細な説明および特定の実施例は本発明の好ましい態様を示しながら、例示のみのために示されることが理解されるはずである。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明者らは、固形腫瘍の発症ならびに化学療法および放射線治療に対する耐性において、変異体BNIP3が機能上重要な役割を果たしていることを示した。ほとんどの固形腫瘍は、酸素が少ない(低酸素)領域を含んでいる。腫瘍における低酸素領域の程度は、癌に罹患している患者の生存率の低さと相関する。これは、主に2つの理由のせいである。第1に、低酸素細胞は、低酸素誘導細胞死から細胞を防ぐタンパク質のレベルを高めることによって応答する。第2の理由は、低酸素細胞が放射線および化学療法に対して本質的に耐性であることである。放射線は、細胞死を誘導するのに、遊離活性酸素種(ROS)を生じる酸素の存在に依存する。低酸素条件下では、ROSは少ししか産生されず、腫瘍細胞は生き残る。化学療法は、多くの場合、腫瘍内部の血管網を通る送達を必要とする。低酸素領域では、これらの腫瘍血管は存在しないか、血流の低下が観察された。このことは、化学療法薬を低酸素細胞に送達できなくするか、または亜致死量の送達に大きく寄与する。従って、固形腫瘍を化学療法および/または放射線で治療した後、低酸素領域は、腫瘍を拡大し、再増殖させ、癌治療に対するさらなる耐性に寄与する可能性が最も高い腫瘍細胞を含んでいる。これは、有効な治療がなく、低酸素領域がよく見られる脳腫瘍(特に、悪性星状細胞腫)において関連している。これらの生理条件下で低酸素細胞が細胞死からどのように生き残るかを理解することは、最良の治療選択肢の選択および有効な治療の開発を目的とした、腫瘍バイオマーカーの開発に必須のものである。
【００１４】
本発明者らは、BNIP3遺伝子が脳腫瘍において変異していることを発見した。この変異は、BNIP3の保存ドメインまたはPESTドメインにフレームシフトを導入して、膜貫通(TM)ドメインのない切断タンパク質を生じさせる。これらの変異は、ゲノムDNAレベルおよびmRNAレベルの両方で検出された。膜貫通ドメインの欠失は、BNIP3がミトコンドリアに局在するのを妨げ、細胞死が誘導されるのを妨げる。さらに、膜貫通ドメインの欠失は、低酸素誘導細胞死を妨げるドミナントネガティブタンパク質として作用する。BNIP3は、乳房腫瘍および脳腫瘍を含む多くの腫瘍の低酸素領域において発現しているが、これらの細胞は依然として生存している。細胞がこのような高レベルの細胞死促進タンパク質からどのように生き延びることができるかは分かっていない。この逆説は今まで明らかにされていなかった。本発明者らは、BNIP3遺伝子がグレードIV星状細胞腫(多形性神経膠芽腫)の約半分において変異していることを発見した。さらに、タンパク質の未熟切断につながる停止コドンを導入する他の稀な変異が発見された。これらの変異はBNIP3が細胞死を誘導できなくし、BNIP3発現が腫瘍の低酸素領域において高い理由の説明となるかもしれない。本発明者らは、変異体BNIP3が細胞質に局在するが、野生型BNIP3とは異なりミトコンドリアに結合しないことをさらに証明した。野生型BNIP3を含む腫瘍では、このタンパク質は主に核に見られる。この核への局在化はBNIP3とミトコンドリアとの相互作用を妨げ、従って、細胞死が誘導されない。BNIP3は核局在シグナルを欠くので、タンパク質間相互作用による細胞質から核への能動輸送を必要とする。腫瘍において過剰発現している核輸送タンパク質は野生型BNIP3を核に再局在化させ、隔離し、野生型BNIP3の細胞死誘導を妨げることができると考えられる。または、BNIP3核輸送の負の調節因子が低酸素癌細胞において変化しているかもしれない。それにもかかわらず、BNIP3が核に隔離または局在化されるこの現象は以前に証明されておらず、野生型BNIP3が腫瘍において高レベルで発現する理由の説明となるかもしれない。
【００１５】
核へのBNIP3局在化は、低酸素細胞が細胞死を回避し、腫瘍形成に大きく寄与する一般的な機構である可能性が高い。腫瘍における野生型(核)および変異体(細胞質)BNIP3の異なる局在化パターンに加えて、BNIP3発現は、腫瘍バイオマーカー/化学療法および/または放射線療法に対する応答の予後指標として使用することができる。(1)BNIP3細胞下局在(核または細胞質)および(2)BNIP3変異状態についての診断試験から、小児および成人における固形腫瘍(多形性神経膠芽腫(GBM)などの悪性脳腫瘍を含む)を治療するための必須の情報が得られる。
【００１６】
従って、変異体BNIP3が存在するかどうかの試験は、変異体BNIP3が関与する癌の予後評価および診断評価、このような癌に対する素因を有する被検体の特定、変異体BNIP3関連癌を有する患者の進行のモニタリング、ならびに化学療法および放射線治療に耐性の癌を有する患者の特定において使用することができる。
【００１７】
本発明の一態様において、患者の癌を検出する方法が提供される。この方法は、(a)変異体BNIP3の存在について患者からの試料を試験する工程であって、変異体BNIP3が存在すれば患者に癌があることが分かる工程を含む。
【００１８】
用語「変異体BNIP3」は、Bcl-2 19キロダルトン相互作用タンパク質遺伝子3またはタンパク質の変異型を含む。Bcl-2 19キロダルトン相互作用タンパク質遺伝子またはタンパク質として、既知のBNIP3分子の全て(アクセッション番号NM 004052でGenBankに寄託されたもの、またはChen,G.et al.1999 J.Biol.Chem.274:7-10(13)で言及されたものを含む)、ならびに癌の検出に有用な、その任意のバリアント、類似体、誘導体、または断片が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様において、変異体BNIP3は、BNIP3タンパク質の膜貫通ドメイン、ならびに癌の検出に有用な、その任意のバリアント、類似体、誘導体、または断片を除去する任意の変異を含む。好ましい態様において、変異体BNIP3は、BNIP3遺伝子のエキソン3、ならびに癌の検出に有用な、その任意のバリアント、類似体、誘導体、または断片の変異を含む。さらなる好ましい態様において、変異体BNIP3は、PESTドメインまたはCDドメイン、ならびに癌の検出に有用な、その任意のバリアント、類似体、誘導体、または断片に任意の変異を含む。別の好ましい態様において、変異体BNIP3は、BNIP3タンパク質(配列番号:6)の膜貫通ドメイン、ならびに癌の検出に有用な、その任意のバリアント、類似体、誘導体、または断片を除去する、ヌクレオチド236におけるアデノシン(A)の挿入(235 236insA)(配列番号:5)の結果として、PESTドメインにフレームシフト変異を含む。別の好ましい態様において、変異体BNIP3は、BNIP3タンパク質(配列番号:4)の膜貫通ドメイン、ならびに癌の検出に有用な、その任意のバリアント、類似体、誘導体、または断片を除去する、ヌクレオチド356におけるアデノシン(A)の欠失(356delA)(配列番号:3)の結果として、CDドメインにフレームシフト変異を含む。
【００１９】
句「変異体BNIP3の存在について試料を試験する」は、変異体BNIP3タンパク質の存在について試験すること、ならびに変異体BNIP3タンパク質をコードする核酸分子の存在について試験することを含む。タンパク質および核酸を検出する方法は以下にさらに詳細に述べられる。
【００２０】
本明細書で使用する用語「癌」は、変異体BNIP3の発現に関連する全ての癌を含む。好ましい態様において、癌は脳癌である。
【００２１】
本明細書で使用する用語「患者からの試料」は、検出が望まれる癌細胞を含む任意の試料を意味する。試料として、生物学的液体、組織抽出物、新鮮に採取された細胞、および細胞培養においてインキュベートされた細胞の溶解産物を含むが、これに限定されない。好ましい態様において、試料は脳腫瘍組織である。
【００２２】
用語「対照試料」は、基礎レベルまたは正常レベルを確かめるのに使用することができる任意の試料を含み、健常人から採取された組織試料または生理学的液体を模倣する試料を含んでもよい。
【００２３】
本発明の方法は、癌(特に、脳癌)の診断および段階付けに使用することができる。本発明はまた、癌の進行をモニタリングするのに、およびある特定の治療が有効か有効でないかモニタリングするのに使用することができる。特に、この方法は、外科手術、癌化学療法、および/または放射線療法後に全ての腫瘍組織が存在しないか、または除去されたことを確かめるために使用することができる。さらに、この方法は、癌化学療法および腫瘍再発をモニタリングするのに、または化学療法および放射線治療が有効かどうか前もって確かめるのに使用することができる。
【００２４】
一態様において、本発明は、患者の癌の進行をモニタリングする方法を意図する。この方法は、
(a)試料中の変異体BNIP3のレベルを求めるために患者からの試料を試験する工程、および
(b)後の時点で工程(a)を繰り返し、前の時点での工程(a)の結果と、後の時点での工程(a)の結果を比較する工程であって、変異体BNIP3のレベルに違いがあれば患者の癌が進行していることが分かる、工程を含む。
【００２５】
特に、後の時点で変異体BNIP3のレベルが増加していれば、癌が進行しており、治療が(適用可能であれば)有効でないことが分かるかもしれない。対照的に、後の時点で変異体BNIP3のレベルが減少していれば、癌が後退しており、治療が(適用可能であれば)有効であることが分かるかもしれない。
【００２６】
本発明者らはまた、変異体BNIP3が、固形腫瘍の発症ならびに化学療法および放射線治療に対する耐性のマーカーであることを発見した。従って、本発明は、化学療法または放射線治療に対して耐性の癌を有する患者を特定する方法を提供する。この方法は、
(a)変異体BNIP3の存在について患者からの試料を試験する工程であって、変異体BNIP3が存在すれば、患者に化学療法耐性癌または放射線耐性癌があることが分かる工程を含む。
【００２７】
変異体BNIP3が関与する癌の前記の診断評価および予後評価、ならびにこのような障害に対する素因を有する被検体の特定のために様々な方法を使用することができる。このような方法は、例えば、変異体BNIP3をコードする核酸分子およびその断片の検出、または変異体BNIP3タンパク質の検出(例えば、変異体BNIP3(ペプチド断片を含む)に対する抗体を使用した検出)に頼ってもよい。これらをそれぞれ以下で説明する。
【００２８】
(a)核酸分子を検出する方法
一態様において、本発明の方法は、変異体BNIP3をコードする核酸分子の検出を含む。当業者であれば、試料中の変異体BNIP3をコードする核酸配列を検出するのに使用するためのヌクレオチドプローブを構築することができる。適切なプローブとして、変異体BNIP3の領域に由来する少なくとも5個の連続したアミノ酸をコードする核酸配列に基づく核酸分子が挙げられる。好ましくは、プローブは15〜30個のヌクレオチドを含む。変異体BNIP3の領域として、BNIP3遺伝子のヌクレオチド356またはヌクレオチド235/236の周囲の領域が挙げられる。特に、ヌクレオチドプローブは、図5に示したBNIP3変異体(配列番号:3および5)の1つを検出するように設計されてもよい。
【００２９】
ヌクレオチドプローブは、適切なシグナルをもたらし、十分な半減期を有する放射標識(例えば、32P、3H、14Cなど)などの検出可能な物質で標識されてもよい。使用することができる他の検出可能な物質として、ある特定の標識抗体によって認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識抗原に特異的な抗体、および発光化合物が挙げられる。ハイブリダイゼーションの割合、およびプローブと、検出しようとするヌクレオチドとの結合、およびハイブリダイゼーションに使用できるヌクレオチドの量を考慮して、適切な標識を選択することができる。Sambrook et al,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(2nd ed.)で概説されているように、標識されたプローブは、ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜などの固体支持体上で核酸にハイブリダイズすることができる。核酸プローブは、変異体BNIP3をコードする遺伝子(好ましくは、ヒト細胞中の遺伝子)を検出するのに使用することができる。ヌクレオチドプローブはまた、変異体BNIP3が関与する障害の診断、このような障害の進行のモニタリング、または治療のモニタリングにおいて有用である可能性がある。一態様において、プローブは、癌(好ましくは、脳癌)の診断および癌の進行のモニタリングに用いられる。
【００３０】
プローブは、変異体BNIP3タンパク質をコードする遺伝子を検出するハイブリダイゼーション技術において使用することができる。この技術は、一般的に、患者または他の細胞供給源に由来する試料から得られた核酸(例えば、組換えDNA分子、クローニングされた遺伝子)とプローブを、プローブと核酸中の相補配列との特異的なアニーリングに好ましい条件下で接触およびインキュベーションすることを伴う。インキュベーション後、アニーリングしなかった核酸が除去され、プローブにハイブリダイズした核酸がもしあれば、その存在が検出される。
【００３１】
核酸分子の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの増幅方法を用いた特異的な遺伝子配列の増幅と、それに続く、一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)および対立遺伝子特異的PCRなどがあるが、これに限定されない当業者に周知の技法を用いた増幅分子の分析を伴ってもよい。当業者であれば適切なプライマーを日常的に設計することができる。具体的には、実施例1に記載のように、BNIP3のエキソン3またはPESTドメインに対してSSCPを行うことができる。SSCP分析のために、ゲノムDNAを、原発腫瘍組織または血液試料などの組織から抽出することができる。PCRプライマー(例えば、BNIP3遺伝子のエキソン3のイントロン/エキソン接合部に隣接するプライマー)を設計することができる。非変性ポリアクリルアミドゲル上でのPCR産物の分析によって、一塩基対挿入または欠失を検出することができる。
【００３２】
変異体BNIP3をコードする遺伝子の発現の質的局面および量的局面をアッセイするために、本明細書に記載のハイブリダイゼーションおよび増幅の技法を使用することができる。例えば、RNAを、変異体BNIP3をコードする遺伝子を発現することが知られている細胞タイプまたは組織から単離し、本明細書で言及されるハイブリダイゼーション(例えば、標準的なノザン分析)またはPCR法を用いて試験することができる。この技法は、正常なまたは異常な選択的スプライシングによる可能性のある転写物サイズの違いを検出するのに使用することができる。この技法は、正常個体で検出される完全長転写物および/または選択的スプライス転写物のレベルと、変異体BNIP3タンパク質または遺伝子が関与する癌の症状を示す個体で検出される完全長転写物および/または選択的スプライス転写物のレベルとの量的な違いを検出するのに使用することができる。
【００３３】
プライマーおよびプローブは、インサイチューで(すなわち、生検または切除術から得られた患者組織の(固定および/または凍結した)組織切片上で直接)前記の方法に用いられてもよい。
【００３４】
従って、本発明は、患者の癌を検出する方法を提供する。この方法は、
(a)変異体BNIP3遺伝子またはその一部を含む核酸分子を、患者からの試料から抽出する工程;
(b)抽出された核酸分子をポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅する工程;
(c)変異体BNIP3をコードする核酸分子の存在を確かめる工程;および
(d)試料中の変異体BNIP3のレベルと対照試料を比較する工程であって、対照と比較して変異体BNIP3のレベルの増加が存在すれば、患者に癌があることが分かる工程を含む。
【００３５】
(b)変異体BNIP3タンパク質を検出する方法
別の態様において、本発明の方法は、変異体BNIP3タンパク質の検出を含む。一態様において、変異体BNIP3タンパク質は、BNIP3タンパク質を配列決定し、図6に示したように(または当技術分野において周知のように)野生型BNIP3と比較してアミノ酸配列に違いがあるかどうかを確かめることによって検出することができる。好ましい態様では、図6ならびに配列番号:4および6に示したBNIP3変異体の1つを検出することができる。
【００３６】
別の態様において、変異体BNIP3タンパク質は、このタンパク質のサイズと野生型タンパク質のサイズを比較することによって検出することができる。前記で述べたように、図6(配列番号:4および6)に示した2つの変異体タンパク質はタンパク質の膜貫通ドメインを欠き、従って、野生型タンパク質より分子量が低い。具体的には、235 236insA変異体BNIP3タンパク質の推定サイズは約12kDaであり、356delA変異体BNIP3タンパク質の推定サイズは約20kDaであるが、野生型タンパク質の推定サイズは約30kDaである。タンパク質間のサイズの違いは、迅速逆相高速液体クロマトグラフィー(rapid high-performance reversed phase liquid chromatographic)法、GC MS法、疎水性クロマトグラフィー(例えば、ブチル-Toyopearl650カラムを使用する)、DEAE-セルロース、Bio-Gel P-60、およびDEAE-Sephadexでの連続クロマトグラフィー、ならびに/またはゲル電気泳動(例えば、SDS-PAGE)を含む様々な生化学的技法を用いて検出することができ、従って、変異体BNIP3タンパク質を検出するのに使用することができる。
【００３７】
さらに別の態様において、変異体BNIP3タンパク質は、変異体BNIP3に特異的に結合する抗体または野生型BNIP3に特異的に結合する抗体を用いて検出される。野生型BNIP3タンパク質および変異体BNIP3タンパク質の両方に対する抗体は、当業者によって容易に調製することができる。実施例1に記載のように、本発明者らは、変異体BNIP3タンパク質に結合しない野生型BNIP3抗体を調製した。特に、野生型BNIP3および変異体BNIP3の両方を認識する抗体、ならびに変異体BNIP3タンパク質に結合しない野生型BNIP3抗体は有利に使用することができる。野生型NIP3および変異体NIP3の両方を認識する第1の抗体を用いてアッセイを行うと、野生型または変異体いずれかのBNIP3が存在するかどうか確かめることができる。同じ供給源に由来する試料に対して、変異体BNIP3タンパク質に結合しない、野生型BNIP3に対する第2の抗体を用いて、第2のアッセイを行うと、存在するBNIP3が野生型または変異体かどうか確かめることができる。
【００３８】
変異体BNIP3タンパク質に対する抗体は、当技術分野において周知の技法を用いて調製することができる。例えば、(例えば、図6または配列番号:4および6に示した配列などの)変異体BNIP3のペプチドを使用することによって、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を標準的な方法を用いて作成することができる。哺乳動物(例えば、マウス、ハムスター、またはウサギ)を、哺乳動物において抗体応答を誘発する免疫原形態のペプチドで免疫することができる。ペプチドに免疫原性を付与する技法として、担体への結合または当技術分野において周知の他の技法が挙げられる。例えば、前記のタンパク質またはペプチドをアジュバントの存在下で投与することができる。免疫の進行は、血漿または血清中の抗体力価を検出することによってモニタリングすることができる。抗体レベルを評価するために、抗原として前記の免疫原を用いて標準的なELISAまたは他のイムノアッセイ法を使用することができる。免疫の後、抗血清を入手することができ、所望であれば、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。
【００３９】
モノクローナル抗体を作成するために、抗体産生細胞(リンパ球)を、免疫された動物から採取し、標準的な体細胞融合法によってミエローマ細胞と融合して、これらの細胞を不死化し、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技法は当技術分野において周知である(例えば、Kohler and Milstein(22)によって最初に開発されたハイブリドーマ法、ならびにヒトB細胞ハイブリドーマ法(23)、ヒトモノクローナル抗体を作成するEBV-ハイブリドーマ法(24)、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング(25)などの他の技法)。ハイブリドーマ細胞を、ペプチドと特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。
【００４０】
本明細書で使用する用語「抗体」は、変異体BNIP3またはその断片と特異的に反応する抗体断片を含むことが意図される。抗体を、従来の技法を用いて断片化することができ、断片を、前記と同じように有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、F(ab')2断片は、抗体をペプシン処理することによって作成することができる。結果として生じるF(ab')2断片を、ジスルフィド結合を還元するように処理して、Fab'断片を得ることができる。
【００４１】
キメラ抗体誘導体(すなわち、非ヒト動物可変領域とヒト定常領域を組み合わせた抗体分子)も本発明の範囲内に意図される。キメラ抗体分子として、例えば、マウス、ラット、または他の種の抗体に由来する抗原結合ドメインとヒト定常領域を挙げることができる。本発明の変異体BNIP3抗原の遺伝子産物を認識する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作成するために、従来の方法を使用することができる(例えば、Morrison et al.,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.81,6851(1985);Takeda et al.,Nature 314,452(1985),Cabilly et al.,U.S.Patent No.4,816,567;Boss et al.,U.S.Patent No.4,816,397;Tanaguchi et al.,European Patent Publication EP171496;European Patent Publication 0173494,United Kingdom patent GB 2177096B)を参照のこと。キメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりヒト被験者において免疫原性が低いと予想される。
【００４２】
ヒト定常領域キメラを作成することによって、本明細書に記載の本発明のタンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体またはキメラ抗体をさらにヒト化することができる。ここでは、可変領域の一部(特に、抗原結合ドメインの保存フレームワーク領域)はヒト由来であり、超可変領域のみが非ヒト由来である。このような免疫グロブリン分子は、当技術分野で周知の技法(例えば、Teng et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80,7308-7312(1983);Kozbor et al.,Immunology Today,4,7279(1983);Olsson et al.,Meth.Enzymol.,92,3-16(1982))、およびPCT Publication WO92/06193またはEP0239400)によって作成することができる。ヒト化抗体は商業生産することもできる(Scotgen Limited,2 Holly Road,Twickenham,Middlesex,Great Britain)。
【００４３】
変異体BNIP3に対して反応性の特異的抗体または抗体断片(単鎖Fvモノクローナル抗体などがあるが、これに限定されない)はまた、細菌において発現している免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーを、変異体BNIP3の核酸分子から作成されたペプチドを用いてスクリーニングすることによって作成することができる。例えば、ファージ発現ライブラリーを用いて、完全なFab断片、VH領域、およびFV領域を細菌において発現することができる(例えば、Ward et al.,Nature 341,544-546:(1989);Huse et al.,Science 246,1275-1281(1989);およびMcCafferty et al.Nature 348,552-554(1990)を参照のこと)。または、抗体またはその断片を作成するために、SCID-huマウス(例えば、Genpharmによって開発されたモデル)を使用することができる。
【００４４】
変異体BNIP3と特異的に反応する抗体または誘導体(例えば、酵素結合体もしくは標識誘導体)は、様々な試料(例えば、生物学的材料)において変異体BNIP3を検出するのに使用することができる。これは、診断試薬または予後試薬として用いられてもよく、タンパク質の発現レベルの異常もしくは構造の異常、ならびに/または変異体BNIP3の時間的な位置、組織、細胞、もしくは細胞下での位置を検出するのに用いられてもよい。特定の療法の効力を評価またはモニタリングするのに、インビトロイムノアッセイも使用することができる。本発明の抗体はまた、変異体BNIP3タンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞における変異体BNIP3をコードする遺伝子の発現レベルを確かめるためにインビトロで使用することができる。
【００４５】
抗体は、変異体BNIP3の抗原決定基と抗体との結合相互作用に頼る任意の既知のイムノアッセイにおいて使用することができる。このようなアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ(例えば、ELISA)、免疫蛍光、免疫沈降、ラテックス凝集、赤血球凝集、および組織化学検査である。抗体は、癌における変異体BNIP3の役割を確かめるために、および癌を診断するために、試料中の変異体BNIP3を検出および定量するのに使用することができる。特に、本発明の抗体は、免疫組織化学的分析(例えば、細胞レベルおよび細胞下レベル)において、変異体BNIP3タンパク質を検出するために、変異体BNIP3タンパク質の場所を特定の細胞および組織ならびに特定の細胞下位置に突き止めるために、ならびに発現レベルを定量するために使用することができる。
【００４６】
変異体BNIP3を検出するために、光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて抗原の位置を突き止める当技術分野において周知の細胞化学的技法を使用することができる。一般的に、本発明の抗体を検出可能な物質で標識することができ、組織および細胞における変異体BNIP3タンパク質の場所を、検出可能な物質の存在に基づいて突き止めることができる。検出可能な物質の例として、以下:放射性同位体(例えば、3H、14C、35S、125I、131I)、蛍光標識(例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体)、発光標識(例えば、ルミノール);酵素標識(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ)、ビオチニル基(印をつけたアビジン(例えば、蛍光マーカー、または光学的方法もしくは熱量測定法によって検出することができる酵素活性を含有するストレプトアビジン)、二次レポーター(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ)によって認識される予め決められたポリペプチドエピトープが挙げられるが、これに限定されない。ある態様では、標識は、潜在的な立体障害を小さくするために様々な長さのスペーサーアームを介して取り付けられる。抗体はまた、電子顕微鏡によって容易に視覚化される高電子密度物質(例えば、フェリチンまたはコロイド状金)に結合されてもよい。
【００４７】
抗体または試料は、細胞、抗体などを固定化することができる担体または固体支持体に固定化されてもよい。例えば、担体または支持体は、ニトロセルロース、またはガラス、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、および磁鉄鉱でもよい。支持体材料は、球(例えば、ビーズ)、円筒形(例えば、試験管もしくは壁の内面、または棒の外面)、あるいは平板(例えば、シート、試験片)を含む任意の可能な形状をとることができる。一次抗原-抗体反応が、変異体BNIP3タンパク質に反応性の抗体に対して特異性を有する第2の抗体を導入することによって増幅される間接方法も使用することができる。一例として、変異体BNIP3タンパク質に対して特異性を有する抗体がウサギIgG抗体であれば、第2の抗体は、本明細書に記載の検出可能な物質で標識されたヤギ抗ウサギγグロブリンでもよい。
【００４８】
放射標識が検出可能な物質として用いられる場合、変異体BNIP3の場所はラジオオートグラフィーによって突き止めることができる。ラジオオートグラフィーの結果は、様々な光学的方法でラジオオートグラフにおける粒子の密度を求めることによって、または粒子を計数することによって定量することができる。
【００４９】
変異体BNIP3タンパク質に対する標識抗体は、外科手術を受けている患者の腫瘍組織の場所の決定 (すなわち、画像化)において使用することができる。一般的に、インビボ用途の場合、抗体は、放射標識(例えば、ヨウ素-123、ヨウ素-125、ヨウ素-131、ガリウム-67、テクネチウム-99、およびインジウム-111)で標識される。標識抗体調製物は、組織が画像化される数時間前〜4日前に、適切な担体に溶解して患者に静脈内投与することができる。この期間の間、結合しなかった画分は患者から取り除かれ、残った抗体だけが腫瘍組織に結合している。同位体の存在は適切なγ線カメラを用いて検出される。外科医に腫瘍の位置を正確に示すために、標識された組織を、患者の体にある既知のマーカーと相関付けることができる。
【００５０】
従って、別の態様において、本発明は、患者の癌を検出する方法を提供する。この方法は、
(a)患者からの試料と、変異体BNIP3に結合する抗体を接触させる工程;
(b)試料中の変異体BNIP3のレベルを検出する工程;および
(c)試料中の変異体BNIP3のレベルと対照試料を比較する工程であって、対照と比較して変異体BNIP3のレベルが増加していれば、患者に癌があることが分かる工程を含む。
【００５１】
II.キット
本明細書に記載の方法は、本発明の任意の方法を実施するのに必要な試薬を含む、予め包装された診断キットを使用することによって実施することができる。キットは、例えば、患者をスクリーニングおよび診断するために、ならびに癌の発症に対する素因を示す個体をスクリーニングおよび特定するために(例えば、臨床の場で)便利に使用することができる、本明細書に記載の少なくとも1つの特定の核酸または抗体を含んでもよい。キットはまた、ポリメラーゼ連鎖反応で変異体BNIP3をコードする核酸を増幅するための核酸プライマーを含んでもよい。キットはまた、本発明の方法において有用なヌクレオチド、酵素、および緩衝液、ならびに200bpラダーなどの電気泳動マーカーを含んでもよい。キットはまた、本発明の方法を実施するための詳細な説明書を含む。
【００５２】
III.単離された変異体
本発明は、さらに、本発明のBNIP3変異体をコードする単離された核酸配列、好ましくは、配列番号:4または配列番号:6に示したタンパク質をコードする核酸配列、より好ましくは、配列番号:3または配列番号:5に示した核酸配列に関する。
【００５３】
本発明はまた、単離されたBNIP3変異体タンパク質(好ましくは、配列番号:4または配列番号:6に示した配列を有する)を含む。
【００５４】
以下の限定しない実施例は本発明の例示である。
【００５５】
実施例
実施例1
悪性神経膠腫は最もよく診断される脳腫瘍である(1,2)。腫瘍低酸素は、放射線および化学療法を用いた、これらの腫瘍の治療における主な制限である(3,4)。Bcl-2 19キロダルトン相互作用タンパク質3(BNIP3)は、HIF-1αによって転写が活性化される、Bcl-2ファミリーの低酸素誘導性アポトーシス促進性メンバーである(5,7)。BNIP3は、その膜貫通(TM)ドメインを介してミトコンドリアに結合し、細胞死を誘導する(5,8,9)。BNIP3は腫瘍の低酸素領域において高レベルに発現しているが、逆説的に細胞死を誘導しない(7,10)。本実施例では、本発明者らは、BNIP3が、正常脳と比較して原発性(またはデノボ)多形性神経膠芽腫(GBM)腫瘍の低酸素領域において高レベルに発現していることを確かめた。BNIP3はGBM腫瘍の33％において変異しており、これがTMドメインが除去された切断タンパク質につながることが発見された。腫瘍に由来する変異体BNIP3は神経膠腫細胞において細胞死を誘導せず、ミトコンドリアと共に局在するか、またはミトコンドリア膜電位(Δψm)の消失を誘導する。細胞死滅活性の消失に加えて、変異体BNIP3は、一部が野生型(wt)BNIP3とヘテロ二量を形成することによって、神経膠腫細胞の低酸素誘導細胞死も阻害する。さらに、本発明者らは、生きたGBM腫瘍細胞の核においてwtBNIP3レベルが高く、これによりBNIP3とミトコンドリアとの結合が妨げられることを発見した。正常酸素条件下では、BNIP3発現は核に局在するが、低酸素の間、細胞質での発現が増加し、ミトコンドリアへの局在が低酸素誘導細胞死に寄与する。まとめると、GBM腫瘍におけるBNIP3機能の消失(BNIP3の変異のために細胞死が誘導されなくなることによる消失、またはwtBNIP3が核に保持されることによる消失)は、BNIP3機能の消失が低酸素条件下での生存の利点をGBM細胞に付与するように、BNIP3が腫瘍サプレッサーとして働くことを示唆している。
【００５６】
方法
RT-PCRおよびクローニング
RNA-Bee(Tel-Test)を使用し製造業者の説明書に従って、脳腫瘍組織バンク(London,Canada)から入手した凍結GBM腫瘍からRNAを単離した。BNIP3オープンリーディングフレームのオリゴヌクレオチドプライマー
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を使用して、BNIP3 mRNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅した。この反応に1μgのRNAを使用した。PCR産物をアガロースゲル上で移動させ、産物を単離し、前記のPCRプライマーを用いてManitoba Institute of Cell Biologyの配列決定施設で配列決定した。さらに、変異BNIP3 cDNAのPCR産物をTAベクター(Invitrogen)にクローニングした。次いで、変異体BNIP3 cDNAをpcDNA3発現ベクターにサブクローニングし、後のトランスフェクション実験に使用した。
【００５７】
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト神経膠芽腫細胞株U251およびU87(それぞれ、Dr.V.W.Yong,University of CalgaryおよびDr.C.Hao,University of Albertaから入手した)を、10％胎仔ウシ血清、2mM L-グルタミン、1mM MEMピルビン酸ナトリウム、0.3％グルコース、および100units/mlペニシリン/ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変必須培地(DMEM)中で培養した。細胞株を、5％CO2の存在下で37℃で加湿インキュベーター内で増殖させた。細胞を、5％CO2を満たしN2でバランスをとった低酸素チャンバー(Forma Scientific)内で、低酸素条件下(1％酸素未満)、37℃で維持した。トランスフェクション実験はU87およびU251細胞株を用いて行った。約40％のコンフルエンスになるように、細胞をトランスフェクションの48時間前にプレートした。製造業者の説明書に従って、U87細胞株はGeneporter(GTS)を用いてトランスフェクトし、U251細胞株はEffectene(Qiagen)を用いてトランスフェクトした。
【００５８】
細胞死曲線
U251およびU87細胞を100mmプレートにプレートし、約80％コンフルエンスまで増殖させ、次いで、低酸素条件で0時間、24時間、48時間、72時間、および96時間インキュベートした。低酸素下でのインキュベーション後、細胞をプレートからトリプシン処理し、遠心分離して細胞ペレットを集めた。細胞を培地100μlに再懸濁し、アクリジンオレンジ(100μg/ml)および臭化エチジウム(100μg/ml)を4μl添加した。10μlアリコートを取り出し、顕微鏡スライドの上に置き、カバーガラスをかぶせた。フルオレセインフィルターを使用して、DNA凝縮核の数を計数することによって、死細胞のパーセントを求めた。以前に述べられたように(5)、試料1つにつき少なくとも200個の細胞を計数した。
【００５９】
β-ガラクトシダーゼ生存率アッセイ
U87およびU251細胞を、100mm培養プレートにおいて、2μgのpCDNA3、pCDNA3-BNIP3、pCDNA3-BNIP3ΔTM、pCDNA3-356delA BNIP3プラスミドDNAおよび0.5μgのβ-ガラクトシダーゼレポータープラスミドDNAで同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を正常酸素条件下で24時間インキュベートした。細胞を、0.2％グルタルアルデヒドを含む0.1M PBSで10分間固定し、0.1M PBSで3回洗浄し、次いで、X-gal緩衝液(0.5mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-ガラクトピラノシド、3mM K3Fe(CN)6、3mM K4Fe(CN)6・3H2O、1mM MgCl2を含む0.1M PBS)で37℃で24時間染色した。平坦な青色染色の細胞の総数の中の丸い凝縮した青色染色の細胞の数を評価することによって、死細胞のパーセントを計算した。1つの実験につき少なくとも200個の細胞を計数した。
【００６０】
ウェスタンブロッティング
以前に公表されたように(5)、総タンパク質または核タンパク質のためにU251細胞を溶解した。溶解産物(60mg)をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。膜を5％脱脂粉乳でブロックし、BNIP3に対するモノクローナル抗体(1:1000)(5)、プロカスパーゼ8抗体(1:1000,Upstate Biotech.)、HDAC1抗体(1:1000,Upstate Biotech),)、またはβ-アクチン(1:50,Sigma)でウエスタンブロットした。ウエスタンブロットを化学発光(NEN-Dupont)で視覚化した。
【００６１】
免疫染色および共焦点顕微鏡観察
パラフィン包埋した原発性神経膠芽腫腫瘍切片スライドを脳腫瘍組織バンクから入手し、オーブン内(70℃)で20分間焼いた。スライドを脱パラフィンし、H2Oに5分間移し、抗原回復溶液(antigen retrieval solution)(Dako Corporation)を含むコプリンジャーに98.5℃で40分間入れた。スライドを取り出し、室温(RT)まで冷却し、次いで、PBS(0.5％Triton X100)で5分間、3回洗浄した。ブロッキング溶液(1XPBS、0.2％Triton X100、0.02％アジ化ナトリウム、5％ヤギ血清、および0.1％ウシ血清アルブミン)を各スライドにRTで2時間添加した。一次抗体(ポリクローナル抗BNIP3 1:700希釈(5)、抗GFAP 1:50希釈(Dako)、抗HIF-1α 1:100希釈(Novus)、および抗チトクロムc 1:100希釈(Dr.Andrews,McMaster Universityから贈与された)をブロッキング溶液で希釈し、スライドに添加した。スライドを4℃で一晩インキュベートし、その後に洗浄した。適切なビオチン化二次抗体(1:200希釈,Vector Inc.)をブロッキング溶液に溶解して調製し、スライドにRTで2時間添加し、次いで、3回洗浄した。ブロッキング溶液(15mg/ml)に溶解した、適切な蛍光色素(テキサスレッドまたはオレゴングリーン,Vector Inc.)に結合したストレプアビジン(Strepavidin)をスライドに添加し、暗所でRTで2時間インキュベートした。DAPI染色液を含むVectashield(Vector)を各スライドに添加し、カバーガラスを置き、密封した。二重免疫蛍光のために、第2の一次抗体を添加し、第1の一次抗体と同じ手順に従って一晩インキュベートした。
【００６２】
2μgのpCDNA3、pCDNA3-BNIP3、pCDNA3-BNIP3ΔTM、またはpCDNA3-356delA BNIP3を用いたU87およびU251細胞株のトランスフェクション後、細胞を24時間および48時間インキュベートし、次いで、トリプシン処理および遠心分離を行い、ついで、培地2mlに再懸濁した。200μlのアリコートを、ThermoShandonサイトスピンに1000RPMで5分間、培地-低加速で入れた。すぐに、サイトスピンから得られたスライドを、1xPBSに溶解した3.7％ホルムアルデヒドでRTで1時間固定した。1xPBS(0.1％NP40)で3回洗浄した後、スライドを一次BNIP3抗体(10xFBS、1xPBS、0.1％NP40で1:700に希釈)とRTで1時間インキュベートした。次いで、スライドをPBS(0.1％NP40)で3回洗浄し、ヤギ抗ウサギフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合二次抗体(Sigma)と1時間インキュベートした。もう3回洗浄した後、スライドを、ヘキスト色素(核の対比染色用)を含むVectashield封入剤を含むカバーガラスで封入した。DNA凝縮を評価するために、試料1つあたり200個以上の細胞を計数した。蛍光は、Photometrics Cool Snap CFカメラを備えたOlympus BX51蛍光顕微鏡およびFluoview2.0ソフトウェアを使用するOlympus IX70倒立共焦点レーザー顕微鏡を用いて視覚化および捕捉した。
【００６３】
ミトコンドリア膜電位の測定
U251細胞をチャンバースライド内で増殖させ、Geneporter(GTS)を使用し製造業者の説明書に従って、pEGFP N1(Clontech)と、pCDNA3、pCDNA3-BNIP3、pCDNA3-BNIP3ΔTM、およびpCDNA3-356delA BNIP3で同時トランスフェクトした。16時間のインキュベーションの後、スライドを1X Hepes-緩衝生理食塩溶液(HBSS)で2回洗浄し、テトラメチルローダミン(TMRM;Molecular Probes)を150μm最終濃度でスライドに添加し、暗所でRTで10分間インキュベートした。次いで、スライドを、Fluoview2.0ソフトウェアを使用するOlympus IX70倒立共焦点レーザー顕微鏡で視覚化した。
【００６４】
GBM腫瘍の免疫組織化学的染色
GBMスライドを脳腫瘍組織バンクから入手した。次いで、脱パラフィンおよび再水和の際に、スライドを加湿チャンバーに入れ、200mlのブロッキング溶液を各スライドの上に置き、RTで2時間インキュベートした。一次抗体をスライドに添加し(抗BNIP3 1:200)、4℃で一晩インキュベートした。次いで、スライドを、1XPBS(0.05％ TritonX100)で3回洗浄した。二次抗体(ビオチン化ヤギ抗ウサギ1:200,Vector Inc.)をブロッキング溶液に溶解して調製し、各スライドに添加した。次いで、スライドをRTで2時間インキュベートし、次いで洗浄し、0.3％H2O2の中でRTで30分間インキュベートした。次いで、スライドをElite ABC溶液(Vector,Inc)に対して洗浄し、スライドの上に置き、RTで30分間インキュベートした。洗浄後、DAB基質をスライドに添加し、染色が検出されるまで2〜10分間インキュベートした。水を5分間添加することによって、反応を止めた。スライドを、段階的なエタノール(50〜100％)およびキシレンによる連続洗浄で脱水し、次いで、Permount(Fisher)で封入した。負の対照として、組織試料を二次抗体のみとインキュベートした。正の対照として、マウス骨格筋を、この組織で高レベルで内因的に発現しているBNIP3について染色した。
【００６５】
一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)
DNeasy Tissue Kitを用いて製造業者の説明書(Qiagen)に従って、ゲノムDNAを原発性GBM腫瘍または血液試料から抽出した。BNIP3遺伝子(アクセッション番号AL162274)のエキソン3のイントロン/エキソン接合部に隣接するPCRプライマーを設計した。プライマーの配列は、
2006526992.tif 000004
であった。PCR反応混合物は、総体積50mlで、3mlの高忠実度Taqポリメラーゼ(Roche)、100ngのDNA、10pmolの各プライマー、0.4mlのdNTP(5mM dATP,25mM dCTP,25mM dGTP,25mM dTTP)混合物、ならびに0.5mlの10mci/ml a-P32-dATP、3mlの25mM MgCL2、5mlの10XPCR緩衝液を含んだ。標識PCR産物(5ml)を、10mlのホルムアミド色素(95％ホルムアミド、20mM EDTA、0.05％キシレンシアノール、0.05％ブロモフェノールブルー)と混合し、95℃で5分間変性した。対照試料を変性条件下および非変性条件下で分析した。各試料を非変性10％ポリアクリルアミドゲルにおいて使用した。
【００６６】
対立遺伝子特異的PCR
ゲノムDNAを原発性GBM腫瘍から抽出した。対立遺伝子特異的PCRのために、BNIP3遺伝子のエキソン4(CDドメイン変異を含む)の変異に相補的な3'末端塩基を用いて、変異体特異的プライマー
2006526992.tif 000005
を作成した。第2のプライマーは、BNIP3の変異体および野生型エキソン4の両方に共通のものであった
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。DNA(100ng/ml)をプライマーと共にPCR反応物に添加した。PCR反応のアニーリング温度は59.8℃であり、PCR反応は35サイクル後に完了した。対照として、変異体特異的プライマーを、変異体および野生型エキソン4配列の両方を認識するプライマーと取り替えた。
【００６７】
アンチセンス実験
アンチセンスオリゴヌクレオチド
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(Sigma Genesys,Oakville,ON)およびセンスオリゴヌクレオチド
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は、ヒトBnip3遺伝子の塩基-1〜+19に相補的であった。ランダム配列オリゴヌクレオチド
2006526992.tif 000009
は、スクランブル配列において同じ塩基を含んでいた。分解しないように、オリゴヌクレオチドをホスホロチオエートで修飾した。オリゴヌクレオチドをOpti-MEM(Gibco BRL)で希釈し、オリゴフェクタミン(Invitrogen)と混合し、U87細胞と4時間インキュベートし、次いで、低酸素培地を添加し、細胞を低酸素下で72時間さらにインキュベートした。細胞死をアクリジンオレンジ染色で確かめるか、前記のように細胞を溶解し、BNIP3発現についてタンパク質抽出物を分析した。
【００６８】
結果
正常脳では、BNIP3は非常に低いレベルで発現しているが、GBM腫瘍では、BNIP3発現レベルは著しく増加しており、その発現は壊死領域(一般的な低酸素代用マーカー,図1A)を取り囲んでいる。GBM細胞がBNIP3およびグリア繊維性酸性タンパク質(GFAP)(星状細胞の中間フィラメントマーカー)を同時に発現しているので、BNIP3は悪性星状細胞でも発現している。正常グリア細胞では、BNIP3は非常に低いレベルで発現している(図1B)。BNIP3、HIF-1α、およびGlut1は、腫瘍の低酸素領域において選択的に発現していることが多い(7,10)。GBM腫瘍では、HIF-1αおよびGlut1はBNIP3と同時に発現しているが、正常脳では検出されない(図1Cおよび1D)。これは、BNIP3はGBM腫瘍の低酸素領域において発現していることを裏付けている。
【００６９】
GBM腫瘍はBNIP3発現の増大を示すが、腫瘍細胞は依然として生存している。wtBNIP3 cDNAがGBM腫瘍に存在しているかどうかを確かめるために、本発明者らは、24の腫瘍からBNIP3をコードするcDNAを配列決定した。24の原発性GBM腫瘍のうち8つは、BNIP3のPESTまたはCDドメインをコードするcDNAに変異を示すことが見出された(表1,図2A)。これらの変異は全て、BNIP3の機能的TMドメインを除去するフレームシフトをもたらす。正常脳では、変異は見出されなかった。(PESTドメイン配列を含む)エキソン3にBNIP3変異が存在することを確かめるために、一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)分析を行った。これは、GBM DNAにおいて、正常脳からのDNAに存在しないさらなる(上部)バンドを示した(図2Bi)。ゲノム腫瘍DNAの配列決定およびSSCPからのさらなるバンドによって変異が確かめられた(データ示さず)。これらの発見は、BNIP3遺伝子がGBM腫瘍において変異していることを裏付けている。これらの変異が腫瘍にしか存在しないかどうかを確かめるために、BNIP3変異を有する8人の患者の7人から血液試料を入手した。これらの血液試料のうち3つがBNIP3変異を示した。対照として、腫瘍DNAにwtBNIP3遺伝子を有する16人の患者のうち9人が、分析に使用できる血液試料を有した。全員が血液DNAにwtBNIP3遺伝子を示した(図2C,データ示さず)。これらの結果は、非腫瘍DNAのBNIP3変異が生殖系列にあり得ることを示唆している。
【００７０】
GBM腫瘍において検出された全てのBNIP3変異から、切断型非機能タンパク質が予測される。wtBNIP3のみを認識するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行った。BNIP3変異が検出された腫瘍では、wtBNIP3の量が減少していた(図2D)。wtおよび変異体BNIP3の両方を認識するポリクローナル抗体を使用した時、BNIP3が変異している腫瘍にしか、切断型バンドが見出されなかった(図2D)。本発明者らはまた癌細胞株がBNIP3変異を含むかどうかを調べた。U87およびU251細胞ならびに他の神経膠腫細胞株において、BNIP3は野生型であったが、卵巣癌細胞株SkOv3では、BNIP3はPESTドメインにおいて変異していた(235 236insA)。この変異は切断タンパク質をもたらしたが、wtBNIP3はSkOv3細胞では検出されなかった(図2E)。正常酸素条件下では、変異体BNIP3は構成的HIF-1α発現と相関して発現していた(図2E)(データ示さず)。従って、同定されたBNIP3変異は切断タンパク質をもたらす。
【００７１】
これらのBNIP3変異によってTMドメインが除去されるので、本発明者らは、変異体BNIP3が神経膠腫細胞株において細胞死を誘導する能力を確かめた。低酸素条件下のU87およびU251細胞において、BNIP3タンパク質は細胞死と相関して増加し(図3A)、これは、BNIP3が低酸素誘導細胞死に寄与することを示唆している(6)。次いで、細胞をwtBNIP3、TM欠失BNIP3(BNIP3ΔTM)、356delA BNIP3(変異体CDドメイン,Mut BNIP3)、またはベクターのみ(対照)でトランスフェクトし、wtBNIP3のみが細胞死を誘導した(図3B)。神経膠腫細胞への235 236insA BNIP3(変異体PESTドメイン)のトランスフェクションも細胞死を誘導しなかった(データ示さず)。BNIP3ΔTMは、低酸素誘導細胞死を阻害するドミナントネガティブタンパク質として働くことが示された(6)。U251細胞を、BNIP3ΔTM、356delA BNIP3(MutBNIP3)、またはベクターのみ(対照)でトランスフェクトし、低酸素条件に暴露した。ベクターのみでトランスフェクトした細胞が40％の細胞死を示したのに対して、BNIP3ΔTMまたは356delA BNIP3でトランスフェクトした細胞は、20％の細胞死、50％の減少を示したが、正常酸素下の細胞の細胞死は10％しかなかった(図3C)。BNIP3が神経膠腫細胞における低酸素誘導細胞死に必要なことを確かめるために、BNIP3に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド(低酸素下でBNIP3発現を効果的にブロックする)は低酸素誘導細胞死を阻害した(図3D)。これは、変異体(356delA)BNIP3が細胞死を誘導せず、ドミナントネガティブに働き、wtBNIP3を介した低酸素誘導細胞死をブロックすることを示している。従って、BNIP3は、原発性GBM腫瘍における腫瘍サプレッサーとして働き、低酸素条件下での神経膠腫細胞の生存を妨げている可能性がある。
【００７２】
BNIP3は、ミトコンドリアの外膜と結合し、Δψmを消失させることで細胞死を誘導する(5,9,11,14,17)。BNIP3の変異が、そのミトコンドリア局在化に影響を及ぼすかどうか確かめるために、U251細胞を、wtBNIP3または切断型(356delA)BNIP3でトランスフェクトした。ミトコンドリアマーカーとの二重蛍光によって示されるように(図3E)、wtBNIP3のみがミトコンドリアと共に局在した。低酸素条件下では、356delA BNIP3を発現している細胞も、ミトコンドリアとの内因性BNIP3局在化を効果的にブロックした(図3E)。さらに、U251細胞を、緑色蛍光タンパク質(GFP)と共に、wtBNIP3または356delA BNIP3でトランスフェクトした。次いで、生細胞を膜電位色素TMRMで染色した。wtBNIP3を発現する細胞では、TMRM染色は減少したのに対して(このことはΔψmの消失を示す)、356delA BNIP3を発現する細胞ではTMRM蛍光は変化しなかった(図3F)。356delA BNIP3がwtBNIP3のミトコンドリアへの局在化をブロックするので、wtBNIP3および356delA BNIP3をU87細胞にトランスフェクトし、wtBNIP3のみを認識する抗体でウエスタンブロットした。wtおよび変異体BNIP3を同時に発現させると、より大きな分子量のタンパク質バンドが現れた。これは、wtおよび変異体BNIP3の両方を認識する抗体を用いて確かめられた(図3G)。アガロースビーズに結合しているHisタグ化356delA BNIP3融合タンパク質を使用すると、この融合タンパクにwtBNIP3が結合した。このことは、wtおよび変異体BNIP3がヘテロ二量体を形成することを示している(図3G)。従って、変異体(356delA)BNIP3はミトコンドリアに局在せず、wtBNIP3のミトコンドリア局在化をブロックする。これは、変異体およびwtBNIP3のヘテロ二量体化によって媒介される可能性が高い。これは、変異体BNIP3が低酸素誘導細胞死を媒介できなくなる基礎をなすドミナントネガティブ機構を裏付けている。
【００７３】
原発性GBM腫瘍の1/3におけるBNIP3変異のこの発見は、GBM腫瘍における腫瘍サプレッサーp53およびPTENの変異率に近い(16,18)。SSCP分析(図2B)により示されるように、wtBNIP3対立遺伝子は、原発性GBM腫瘍において変異体BNIP3対立遺伝子と共に存在する。これにより、変異がハプロ不全をもたらすか、またはヘテロ接合性の機能消失(functional loss of heterozygosity(LOH))がGBM腫瘍亜集団(例えば、低酸素領域)において起こることが示唆される。
【００７４】
BNIP3はミトコンドリアに局在することによって細胞死を誘導するので、本発明者らはGBM腫瘍におけるBNIP3の細胞下局在化を調べた。腫瘍を、BNIP3、チトクロムc(ミトコンドリアマーカー)、およびDNAについて標識した。wtBNIP3を有する腫瘍は主に核局在化を示し、低レベルの細胞質染色が検出されたが、BNIP3はミトコンドリアと共に局在しなかった。対照的に、356delA BNIP3を含む腫瘍は、主に、細胞質局在化を示したが、wtBNIP3と同様に、変異体BNIP3はミトコンドリアに局在しなかった(図4A)。実際に、BNIP3変異を有する8個のGBM腫瘍のうち7個は主に細胞質染色を示したが、wtBNIP3を有する20個のGBM腫瘍のうち19個は主に核染色を示した。正常酸素条件下のU251細胞では、内因性BNIP3は核において低レベルで発現した(図4B)。低酸素下では、wtBNIP3タンパク質レベルは増加し、主に細胞質において検出され、ミトコンドリアと共に局在していた(図4B)。wtBNIP3は、U251細胞から単離された核画分において存在しているが、核区画におけるその発現は低酸素の間、増加しないのに対して、細胞質画分では、BNIP3発現は著しく増加する(図4C)。GBM腫瘍の核におけるwtBNIP3の保持は、腫瘍内の低酸素細胞の細胞死回避の基礎をなすさらなる新規の機構をもたらす。
【００７５】
HIF-1αは、腫瘍生存に関与する標的遺伝子(例えば、エリスロポエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、および癌遺伝子c-Met) または細胞死に関与する遺伝子(例えば、BNIP3)の転写を活性化する(4,6,7,19-21)。本発明の結果は、BNIP3誘導細胞死がBNIP3の変異またはwtBNIP3の核保持によって抑止され、腫瘍生存に有利になるようにバランスが傾くことを示唆している。従って、BNIP3機能の消失は、低酸素条件下で細胞死を回避する神経膠腫細胞の新規の機構である。他の固形腫瘍におけるBNIP3変異の発生率および割合はまだ確かめられていない。それにもかかわらず、BNIP3変異は、多くのタイプの癌細胞が低酸素下で生き残る共通の機構である可能性がある。
【００７６】
本発明は、好ましい実施例と現在考えられているものに関して説明されたが、本発明は、開示された実施例に限定されないことが理解されるべきである。反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる、様々な変更および等価な配置を含むことが意図される。
【００７７】
全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願がその全体が参照として本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されるのと同じ程度で、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００７８】
明細書で言及した参考文献の完全引用
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2006526992.tif 000011
2006526992.tif 000012
【００７９】
（表１）神経膠芽腫におけるBNIP3をコードするcDNAで見られる同定された変異のリスト
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＊BNIP3 cDNAで見られる変異のアミノ酸位置を示す。
PESTは、このドメインにおいて保存されているアミノ酸であり、BH3はBcl-2ホモロジー3ドメインであり、CDは保存ドメインであり、TMは膜貫通ドメインにである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
以下、本発明を図面と関連して説明する。
【図１】BNIP3が脳腫瘍(特に、低酸素領域)において高発現しているが、正常脳では発現していないことを示す。A)正常脳または原発性多形性神経膠芽腫(GBM)パラフィン包埋腫瘍組織をBNIP3抗体で免疫染色した。壊死領域(N)を含むGBMを示すパネルを、BNIP3について免疫染色した(暗い色)。B)正常脳または原発性GBM組織を、BNIP3およびGFAP(星状細胞マーカー)について免疫染色した。C)正常脳および原発性GBMの切片をBNIP3抗体およびHIF-1a抗体で免疫染色した。DNAをヘキスト(Hoechst)で染色した。D)正常脳および原発性GBMの切片をBNIP3抗体およびGlut-1抗体で免疫染色し、共焦点顕微鏡で分析した。これらの結果は、3回の独立した実験に相当する。
【図２】BNIP3タンパク質を切断させるBNIP3変異が悪性神経膠腫から得られたゲノムDNAにおいて同定されたことを示す。A)野生型BNIP3を示すDNA配列、およびGBM腫瘍に由来するPESTドメイン変異を示すDNA配列のクロマトグラムを示す。B)PESTドメイン変異を含む原発性GBMおよび正常脳(N)からDNAを単離した。一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)分析をBNIP3のエキソン3に対して行った。下のバンドは野生型BNIP3に相当するが、上のバンドは、BNIP3遺伝子の一塩基対挿入に相当する。このバンドの配列決定によってヌクレオチド挿入が確認された(データ示さず)。負の対照として、非変性試料も分析した。CDドメイン変異を含むGBM腫瘍(GBM)および正常脳(N)からDNAを単離した。C)脳腫瘍組織バンクから血液試料を入手し、DNAを単離した。SSCPを行った。PEST変異を含むGBM腫瘍からのDNAを正の対照として使用した。SSCPの負の対照として、非変性試料も分析した。D)同様にGBM腫瘍を溶解し、単離されたタンパク質を、i)野生型BNIP3のみを認識するモノクローナル抗体でウエスタンブロットした。ローディング対照として、ブロットをはがし、アクチン抗体で再プローブした。Wは野生型BNIP3を表すが、Mは変異体BNIP3を表す。Nは正常脳を表す。E)i)卵巣癌細胞株SkOv3およびHEK293細胞(正常酸素(N)条件下または低酸素(H)条件下)を溶解し、BNIP3ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロットした。アクチンをローディング対照として使用した。BNIP3のアミノ末端領域の融合タンパク質を抗体とインキュベートすることによって、抗体の特異性を確認した。これによって、この図に示した反応性バンドが効果的に除去された(データ示さず)。ii)SkOv3細胞およびHEK293細胞を低酸素条件下に72時間置き、溶解し、BNIP3モノクローナル抗体でウエスタンブロットした。iii)これらの細胞をまた、正常酸素条件下および低酸素条件下でBNIP3ポリクローナル抗体で免疫染色した。DNAをヘキスト色素で染色した。
【図３】変異体BNIP3が神経膠芽腫細胞株の細胞死を誘導しないことを示す。A)i)神経膠腫細胞株U87およびU251を低酸素条件下に置き、24時間間隔でサンプリングした。細胞を溶解し、BNIP3発現についてウエスタンブロットした。アクチンを試料ローディング対照として使用した。ii)(DNA凝縮を検出する)アクリジンオレンジ染色を用いて、ある期間にわたって低酸素条件下で、U87細胞およびU251細胞の細胞死も数えた。エラーバーは、3つの別々の独立した実験からの標準誤差を表す。B)神経膠芽腫細胞株U87およびU251を、野生型(wt)BNIP3、膜貫通欠失(DTM)BNIP3、および切断BNIP3(変異体CDドメイン,356delA)でトランスフェクトした。細胞死の量は、実施例に記載のようにクロマチン凝縮によって求めた。これらの結果は、b-gal細胞生存アッセイ(データ示さず)を用いて、細胞死において明らかな形態変化によって確認した。C)U251細胞を、BNIP3 DTMのcDNA、切断BNIP3(変異体CDドメイン,356delA)のcDNA、または空のベクター(対照)を、b-gal発現ベクターと共にトランスフェクトした。細胞を低酸素条件下に72時間置き、細胞死の量を、β-ガラクトシダーゼを発現する細胞において求めた。正常酸素(Normoxia)は、正常酸素条件下で空のベクターでトランスフェクトされたU251細胞の細胞死量を表す。同様の結果が、変異PESTドメイン、255 256insA(データ示さず)を有する変異体BNIP3で得られた。エラーバーは、3つの独立した実験から求められた標準誤差を表す。＊は、低酸素下で空のベクター(対照)でトランスフェクトされた細胞と、低酸素下でBNIP3 DTMまたは切断BNIP3でトランスフェクトされた細胞との間で統計的に有意であることを表すp値<0.001を指す。D)U87細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチド、およびスクランブル(scrambled)オリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、低酸素条件下に72時間置いた。細胞死の量を求めた。対照細胞はトランスフェクトされないか(対照)、正常酸素条件(normoxia)に置かれた細胞であった。＊は、統計的に有意である<0.05のp値を表す。BNIP3の低酸素条件下(72時間)のウエスタンブロットを、挿入された囲みに示す。E)U251細胞を、wt BNIP3または切断BNIP3(変異体CDドメイン,356delA)のcDNAを含む発現ベクターでトランスフェクトし、正常酸素条件下または低酸素条件下に置いた。トランスフェクションの48時間後、細胞をMitotracker(ミトコンドリア染色)およびBNIP3抗体(赤色)で染色した。細胞を、共焦点顕微鏡で分析した。これらの結果は3つの独立した実験を表す。F)i)U251細胞も、wtBNIP3、BNIP3 DTM、切断BNIP3(変異体CDドメイン,356delA)のcDNA、または空のベクター(対照)を、緑色蛍光タンパク質(GFP)発現プラスミドと共にトランスフェクトした。ii)生細胞をTMRMで染色し、少なくとも200個の細胞をTMRM染色が存在するかどうか計数した。TMRM染色を失った(膜電位の喪失)細胞の割合を計算した。エラーバーは、3つの独立した実験の標準誤差を表す。G)U87細胞を、野生型BNIP3および切断BNIP3(変異体CDドメイン,356delA)で単独でまたは組み合わせてトランスフェクトした。次いで、細胞を溶解し、i)BNIP3モノクローナル抗体(野生型BNIP3のみを認識する)またはii)ポリクローナル抗体(野生型および切断BNIP3の両方を認識する)でウエスタンブロットした。iii)Hisタグ化切断BNIP3はニッケルアガロースビーズに結合し、ベクターのみまたはwt BNIP3でトランスフェクトされたHEK293細胞を溶解し、これらのビーズに添加した。ビーズを250mMイミダゾールで洗浄し、結果として生じた溶出液をwt BNIP3についてウエスタンブロットした。負の対照として、ビーズのみを、wtBNIP3を発現する溶解産物とインキュベートした。wt BNIP3を発現するwtBNIP3を正の対照として使用した。ブロットをはがし、抗Hisタグ抗体で再プローブした。
【図４】原発性神経膠芽腫腫瘍において野生型BNIP3が核に局在することを示す。A)変異体BNIP3(変異体PESTドメイン)または野生型BNIP3を含む神経膠芽腫腫瘍を、BNIP3およびチトクロムc(ミトコンドリアマーカー)に対する抗体で染色した。DNAをヘキスト色素で染色した。画像は、デコンボリューションソフトウェア(ImagePro Plus 4.5およびSharpstack 4.5,MediaCybernetics)を備えた蛍光顕微鏡によって取り込んだ。同様の結果が他のGBM腫瘍から得られた。各パネルにおいて、矢印は、変異体BNIP3または野生型BNIP3を発現している同じ細胞の染色を示す。B)U251細胞を正常酸素条件下または低酸素条件下に置き、BNIP3抗体およびMitotracker(緑色)で免疫染色した。画像は共焦点レーザー顕微鏡によって取り込んだ。黄色の染色は、BNIP3とMitotracker染色が共存していることを示す。C)U251細胞の細胞質画分および核画分を、正常酸素条件下または低酸素条件下(48時間)で単離および溶解した。溶解産物をBNIP3発現についてウエスタンブロットし、ブロットをはがし、対照としてカスパーゼ8(細胞質タンパク質)およびHDAC1(核タンパク質)に対する抗体で再プローブした。
【図５】野生型のDNA配列(配列番号:1)ならびに2種類のBNIP3変異体のDNA配列(配列番号:3および5)を示すヌクレオチドのアラインメントを示す。囲みは、BNIP3 DNAにおいて同定された変異の部位を示す。
【図６】野生型の推定アミノ酸(配列番号:2)ならびに2種類の変異BNIP3タンパク質の推定アミノ酸(配列番号:4および6)を示す。太字のアミノ酸は、野生型と比較して異なる変異体BNIP3タンパク質アミノ酸を示す。
【図１Ａ】
2006526992.tif 000014
【図１Ｂ】
2006526992.tif 000015
【図１Ｃ】
2006526992.tif 000016
【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2006526992.tif 000020
【図２Ｄ】
2006526992.tif 000021
【図２Ｅ】
2006526992.tif 000022
【図３Ａ】
2006526992.tif 000023
【図３Ｂ】
2006526992.tif 000024
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2006526992.tif 000026
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
2006526992.tif 000028
【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006526992.tif 000036
2006526992.tif 000037
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