(57)【要約】ｓｉＲＮＡ発現カセットを迅速に産生するための、増幅に基づく方法およびキットを提供する。細胞において、増幅されたｓｉＲＮＡ発現カセットを発現するための方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを産生するための、増幅に基づく方法であって：
ｉ）増幅反応混合物中で、二本鎖プロモーター配列の一方の鎖を、プロモーター配列の５’端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーで処理して；
ｉｉ）増幅反応混合物中で、プロモーター配列の他方の鎖を、プロモーター配列の３’端に相補的な第二のオリゴヌクレオチドプライマーで処理して、ここで第二のプライマーは、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列および／またはアンチセンス配列をコードする配列に相補的な１以上の配列とともに、ループ配列およびターミネーター配列の一方または両方を含んでなる；そして
ｉｉｉ）増幅反応中、プロモーター配列上に前記プライマーをアニーリングさせ、そして伸長させる温度で、そして伸長産物を変性させる温度で、工程（ｉ）および（ｉｉ）の増幅反応混合物を処理して、プロモーター、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列および／またはアンチセンス配列をコードする１以上の配列、並びにループ配列およびターミネーター配列の一方または両方を含んでなる増幅産物を提供することを含んでなり、そして工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を、プロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを増幅するのに十分な回数反復する、前記方法。
【請求項２】
ＰＣＲに基づく方法である、請求項１の方法。
【請求項３】
プロモーターがＰｏｌＩＩＩプロモーターである、請求項１の方法。
【請求項４】
ＰｏｌＩＩＩプロモーターが哺乳動物Ｕ６プロモーターである、請求項３の方法。
【請求項５】
Ｕ６プロモーターがヒトＵ６プロモーターである、請求項４の方法。
【請求項６】
ターミネーター配列をコードする配列が、約４〜６のデオキシアデノシンの配列を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項７】
ターミネーター配列をコードする配列が、６のデオキシアデノシンの配列を含んでなる、請求項６の方法。
【請求項８】
第二のプライマーが、機能するｓｉＲＮＡコード配列を同定するためのタグ配列をさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項９】
タグ配列が、クローニングに有用な制限部位をさらに含んでなる、請求項８の方法。
【請求項１０】
第二のプライマーが、前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列をコードする配列に相補的な配列およびアンチセンス配列をコードする配列に相補的な配列とともに、ターミネーター配列を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１１】
センス配列およびアンチセンス配列をコードする配列に相補的な配列が、ループ配列によって付着されている、請求項１２の方法。
【請求項１２】
ループ配列が、約６〜約９ヌクレオチドを含有する、請求項１３の方法。
【請求項１３】
増幅産物が、プロモーター配列、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列またはアンチセンス配列いずれかをコードする配列、およびループ配列またはターミネーター配列を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１４】
増幅産物が、プロモーター配列、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列またはアンチセンス配列いずれかをコードする配列、およびターミネーター配列を含んでなる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
増幅産物が、プロモーター配列、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列またはアンチセンス配列いずれかをコードする配列、およびループ配列を含んでなる請求項１３の方法であって、別の増幅反応中、増幅産物を第三のオリゴヌクレオチドプライマーで処理する工程をさらに含んでなり、第三のオリゴヌクレオチドプライマーの一部が第一の増幅産物のループ配列に相補的であり、そして第三のオリゴヌクレオチドプライマーは、第一の増幅産物がセンスコード配列を含有する場合にはアンチセンス配列をコードする配列に相補的な配列、または第一の増幅産物がアンチセンスコード配列を含有する場合にはセンス配列をコードする配列に相補的な配列とともに、ターミネーター配列を含んでなり、第二の増幅産物を提供する、前記方法。
【請求項１６】
第二の増幅産物が、プロモーター配列、ループ配列によって付着されているｓｉＲＮＡ分子のセンス配列をコードする配列およびアンチセンス配列をコードする配列、並びにターミネーター配列を含んでなる、請求項１５の方法。
【請求項１７】
増幅されたプロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを細胞にトランスフェクションし、ｓｉＲＮＡ分子が発現される工程をさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１８】
選択される細胞が哺乳動物細胞である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドプライマーの１以上が修飾されている、請求項１７の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドプライマーの１以上が、リン酸化によって修飾されている、請求項１９の方法。
【請求項２１】
発現されたｓｉＲＮＡ分子に感受性であるｍＲＮＡ上の標的部位に関してスクリーニングする工程をさらに含んでなる、請求項１７の方法。
【請求項２２】
２以上の異なるｓｉＲＮＡ発現カセットを細胞にトランスフェクションする、請求項１７の方法。
【請求項２３】
異なるｓｉＲＮＡ発現カセットが、異なるｓｉＲＮＡコード遺伝子および異なるプロモーターの一方または両方を含有する、請求項２２の方法。
【請求項２４】
プロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを産生するためのキットの形のＰＣＲに基づくアプローチであって、二本鎖のプロモーター含有テンプレート、プロモーター含有テンプレートの５’端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、およびプロモーター含有テンプレートの３’端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなり、３’プライマーが、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子のセンス配列および／またはアンチセンス配列をコードする配列に相補的な１以上の配列を含んでなる、前記アプローチ。
【請求項２５】
プロモーターがＰｏｌＩＩＩプロモーターである、請求項２４のＰＣＲに基づくアプローチ。
【請求項２６】
ＰｏｌＩＩＩプロモーターが哺乳動物Ｕ６プロモーターである、請求項２５のＰＣＲに基づくアプローチ。
【請求項２７】
Ｕ６プロモーターがヒトＵ６プロモーターである、請求項２６のＰＣＲに基づく方法。
【請求項２８】
ｓｉＲＮＡが仲介する分解を受けやすい潜在的な標的配列をスクリーニングする方法であって、ｓｉＲＮＡ分子が発現され、そして潜在的な標的配列の分解を仲介することが可能である条件下で、増幅されたｓｉＲＮＡ発現カセットを細胞にトランスフェクションすることを含んでなる、前記方法。
【請求項２９】
標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、ｓｉＲＮＡ分子が発現され、そして標的遺伝子の発現を阻害することが可能である条件下で、増幅されたｓｉＲＮＡ発現カセットを細胞にトランスフェクションすることを含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］本出願は、同時係属米国仮出願第６０／３９１，７１８号、２００２年８月１日出願および第６０／４０８，２９８号、２００２年９月６日出願の優先権を請求する。
【０００２】
政府の権利の言及
［０００２］本発明は、助成金番号ＡＩ２９３２９のもと、米国保健社会福祉省の公衆衛生局からシティー・オブ・ホープ癌センターへの政府の援助を受けて行った。米国政府は、本発明に一定の権利を有しうる。
【０００３】
発明の分野
［０００３］本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関連し、そして多数のＲＮＡｉ遺伝子構築物をスクリーニングして、既定の標的に対して最も効果的であるものを同定するのに有用である。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
［０００４］ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が相同転写物の転写後分解を誘導するプロセスであり、そして植物、真菌、昆虫、原生動物、および哺乳動物を含む、多様な生物で観察されてきている（Ｍｏｓｓ，  Ｅ．Ｇ．ら、２００１；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．ら、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１）。ＲＮＡｉは、トランスフェクションまたは内因性発現いずれかを介して、細胞をｄｓＲＮＡに曝露することによって開始される。二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ）として知られる、２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）断片へとプロセシングされる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１）。これらのｓｉＲＮＡは、ＲＮＡに誘導されるサイレンシング複合体またはＲＩＳＣとして知られる複合体を形成し（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｅ．ら、Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１）、この複合体が相同標的ＲＮＡ分解において機能する。哺乳動物の系において、配列特異的なＲＮＡｉの効果は、２１〜２３塩基転写物またはより長いヘアピン前駆体のトランスフェクションまたは内因性発現いずれかを介して、ｓｉＲＮＡを導入することによって観察されうる。ｓｉＲＮＡを使用すると、ｄｓＲＮＡが誘導する、遺伝子発現の非特異的阻害を導く、インターフェロン経路およびＰＫＲ経路が回避される（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１）。
【０００５】
［０００５］最近、いくつかのグループによって、ヒト細胞において、ｓｉＲＮＡがＰｏｌＩＩＩプロモーターによって有効に転写され、そして標的特異的ｍＲＮＡ分解を誘発しうることが立証された（Ｌｅｅ，  Ｎ．Ｓ．ら、２００２；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，  Ｍ．ら、２００２；Ｐａｕｌ，  Ｃ．Ｐ．ら、２００２；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，  Ｔ．Ｒ．ら、２００２；Ｋｅｔｔｉｎｇ，  Ｒ．Ｆ．ら、２００１）。これらのｓｉＲＮＡコード遺伝子は、搬送のため、プラスミドまたはエピソーム・ウイルス主鎖を用いて、ヒト細胞に一過性にトランスフェクションされた。一過性ｓｉＲＮＡ発現は、長期ｓｉＲＮＡ発現が得られるように設計された構築物を作成する前に、迅速に表現型を決定するのに有用でありうる。特に興味深いのは、既定のｍＲＮＡに沿ったすべての部位が、ｓｉＲＮＡが仲介する下方制御に等しく感受性であるのではないという事実である（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．ら、２００１；Ｌｅｅ，  Ｎ．Ｓ．ら、２００１；Ｙｕ，  Ｊ．Ｙ．ら、２００２；Ｈｏｌｅｎ，  Ｔ．ら、２００２）。
【０００６】
［０００６］短いｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの分解を伴う転写後サイレンシングと対照的に、長いｓｉＲＮＡを用いてＤＮＡをメチル化すると、植物における遺伝子サイレンシングの代替手段が提供されることが示されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎら）。より高次の真核生物において、ＤＮＡは、ＣｐＧ二ヌクレオチドのグアノシンの５’に位置するシトシンでメチル化される。この修飾は、遺伝子発現に重要な制御効果を有し、これは、多くの遺伝子のプロモーター領域に位置する、ＣｐＧアイランドとして知られるＣｐＧリッチ領域が関与する場合、特に当てはまる。ほぼすべての遺伝子関連アイランドは、常染色体に対するメチル化から保護されている一方、ＣｐＧアイランドの徹底的なメチル化は、選択された、インプリントされた遺伝子およびメスの不活性Ｘ染色体上の遺伝子の転写不活性化に関連付けられてきている。通常はメチル化されていないＣｐＧアイランドの異常なメチル化は、不死化されそして形質転換された細胞では比較的頻繁な事象であることが立証されており、そしてヒト癌において、定義される腫瘍サプレッサー遺伝子の転写不活性化に関連付けられてきている。最後の状況では、プロモーター領域の過剰メチル化は、腫瘍抑制遺伝子機能を除去する際のコード領域突然変異の代替法として存在する（Ｈｅｒｍａｎら）。標的遺伝子のメチル化を指示するためのｓｉＲＮＡの使用が、本明細書に援用される米国仮出願第６０／４４７，０１３号、２００３年２月１３日提出に記載される。
【０００７】
［０００７］既定のｍＲＮＡ標的に関するｓｉＲＮＡ標的部位選択に適用される規則は、現時点ではない。したがって、潜在的な標的配列を迅速にスクリーニングして、ｓｉＲＮＡが仲介する分解を受けやすい単数または複数の配列を同定可能であることが重要である。この問題に取り組む最初の試みは、細胞抽出物における、リボザイムなど、核酸産物による対形成を含む塩基対形成にアクセス可能な部位を同定するように設計された、天然ｍＲＮＡ転写物に対するオリゴヌクレオチド／ＲＮアーゼＨ法を利用していた。このアプローチはまた、ｓｉＲＮＡの結合部位を同定するのにも適用されてきた（Ｌｅｅ，  Ｎ．Ｓ．ら、２００１）。オリゴヌクレオチド／ＲＮアーゼＨ法でアクセス可能部位を同定したとしても、なお、アクセス可能部位の標的に対するｓｉＲＮＡを生成する必要がある。このアプローチはまた、ｓｉＲＮＡ部位アクセス可能性にも適用されてきている（Ｌｅｅ，  Ｎ．Ｓ．ら、２００１）。しかし、このプロセスは時間がかかる可能性もあり、そして結局、なお、最終試験のため、ｓｉＲＮＡ遺伝子を合成する必要がある。
【０００８】
［０００８］したがって、本発明の目的は、ｓｉＲＮＡが仲介する分解を受けやすい潜在的な標的配列の迅速なスクリーニングを可能にするため、ｓｉＲＮＡ遺伝子を迅速に合成するための方法およびキットの形で、増幅に基づくアプローチを提供することである。
【０００９】
［０００９］本発明の別の目的は、増幅されたｓｉＲＮＡ発現カセットを細胞にトランスフェクションすることによって、標的遺伝子の発現を調節するかまたは阻害する方法を提供することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
［０００１０］本発明は、プロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを迅速に合成し、そして続いて細胞にトランスフェクションするための、増幅に基づくアプローチ（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を提供する。このアプローチには方法および該方法を実行するためのキットが含まれ、該アプローチを、ｓｉＲＮＡコード遺伝子の容易なスクリーニングに利用して、既定の標的に対して、最適な機能的活性を有するｓｉＲＮＡをコードするものを同定することも可能である。該アプローチを、プロモーターから独立に発現されるｓｉＲＮＡ、あるいはヘアピン前駆体または他の前駆体として発現されるｓｉＲＮＡを用いて、利用することも可能である。該アプローチを用いて産生される増幅産物を、細胞にトランスフェクションし、その後、機能アッセイを行うことによって、続くクローニングなしに直接使用することも可能である。
【００１１】
［０００１１］本発明の方法は、迅速で、そして安価であり、ベクターにクローニングする前に、多数の異なるｓｉＲＮＡ遺伝子候補および／またはプロモーター候補を有効性に関して迅速にスクリーニングすることを可能にする。
【００１２】
［０００１２］本発明の方法は、ｓｉＲＮＡ遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の詳細な説明
［０００２２］本発明は、プロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを産生するための、増幅に基づく方法を提供する。
【００１４】
１つの態様において、該方法は：
ｉ）増幅反応混合物中で、二本鎖プロモーター配列または構築物の一方の鎖を、プロモーター配列の５’端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーで処理して；
ｉｉ）増幅反応混合物中で、プロモーター配列または構築物の他方の鎖を、プロモーター配列の３’端に相補的な第二のオリゴヌクレオチドプライマーで処理して、ここで第二のプライマーは、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列または（および／または）アンチセンス配列をコードする配列に相補的な１以上の配列を含んでなり、場合によってそれとともに、ループ配列およびターミネーター配列の一方または両方を含んでなる；そして
ｉｉｉ）増幅反応中、プロモーター配列または構築物上に前記プライマーをアニーリングさせ、そして伸長させる温度で、そして伸長産物を変性させる温度で、工程（ｉ）および（ｉｉ）の増幅反応混合物を処理して、プロモーター、ｓｉＲＮＡのセンス配列または（および／または）アンチセンス配列をコードする１以上の配列、並びにループ配列およびターミネーター配列の一方または両方を含んでなる増幅産物を提供することを含んでなる。
【００１５】
［０００２３］工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を十分な回数反復して、プロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを増幅しそして検出することも可能である。本発明において、ループ配列および／またはターミネーター配列の代替物であって、ループ配列およびターミネーター配列と同じ機能または目的を達成可能な前記代替物を利用することも可能であることもまた、認識される。上述の工程の変型が本発明内に含まれ、その場合、これらの変型もまた、プロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを産生する、増幅に基づく方法を提供することもまた、認識される。用語、相補的は、好ましい態様においては、２つの配列間の完全な塩基対形成マッチを指すが、こうしたものである必要はなく、そしてしたがって、用語、相補的は、完全な塩基対形成マッチを持たないが、別の方式で、本発明の意図する結果を達成可能な配列もまた、含む。
【００１６】
［０００２４］用語「ループ配列」および「ターミネーター配列」は、ループ要素およびターミネーター要素に対応する配列を指し、最終配列、および最終配列をコードする配列などの前駆体配列いずれか、および相補配列いずれかを含む。
【００１７】
［０００２５］好ましい態様において、該方法は、ＰＣＲに基づく方法である。しかし、本発明は、現在知られるか、または将来知られる、他の増幅法に基づいて、実施することも可能であることが認識される。
【００１８】
［０００２６］プロモーターは、ｓｉＲＮＡ分子を転写可能ないかなるプロモーターであることも可能であり、そして好ましくは、哺乳動物細胞において、ｓｉＲＮＡを転写することも可能なものである。好ましい態様において、プロモーターはＰｏｌＩＩＩプロモーターであり、より好ましくは哺乳動物Ｕ６プロモーターであり、そして最も好ましくはヒトＵ６プロモーターである。他のプロモーター、例えばＨ１プロモーター、Ｕ１またはｔＲＮＡプロモーター、例えばｔＲＮＡ  Ｖａ１、ＭｅｔまたはＬｙｓ３もまた、本発明に有用である可能性もある。Ｕ１  ｓｎＲＮＡプロモーターなどのＰｏｌＩＩプロモーターを使用することもまた可能である。
【００１９】
［０００２７］ターミネーター配列は、機能するターミネーター配列をコードする配列いずれであることも可能である。好ましい態様において、ターミネーター配列は、デオキシアデノシン、好ましくは約４〜６のデオキシアデノシン、そしてより好ましくは６のデオキシアデノシンの配列を含んでなる。
【００２０】
［０００２８］別の態様において、第二のプライマーは、機能するｓｉＲＮＡコード配列を同定するタグ配列をさらに含んでなることも可能である。より好ましい態様において、タグ配列は、クローニングに有用な制限部位をさらに含んでなる。
【００２１】
［０００２９］１つの態様において、第二のプライマーは、センス配列をコードする配列に相補的な配列とともに、ターミネーター配列またはループ配列を含んでなる。
［０００３０］別の態様において、第二のプライマーは、アンチセンス配列をコードする配列に相補的な配列とともに、ターミネーター配列またはループ配列を含んでなる。
【００２２】
［０００３１］さらに別の態様において、第二のプライマーは、前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列をコードする配列に相補的な配列およびアンチセンス配列をコードする配列に相補的な配列とともに、ターミネーター配列を含んでなる。
【００２３】
［０００３２］上述の態様の好ましい態様において、センス配列およびアンチセンス配列は、ループ配列によって付着されていることも可能である。ループ配列は、本発明にしたがって、機能するｓｉＲＮＡ発現カセットの発現を可能にする配列または長さいずれを含んでなることも可能である。好ましい態様において、ループ配列は、他のヌクレオチド塩基よりも多量のウリジンおよびグアニンを含有する。ループ配列の好ましい長さは、約４〜約９ヌクレオチド塩基であり、そして最も好ましくは約８または９ヌクレオチド塩基である。
【００２４】
［０００３３］本発明の方法の増幅産物は、上述の態様のどれが選択されるかに応じて多様であろう。
［０００３４］センス配列およびアンチセンス配列をコードする配列または構築物は、好ましくは約１９〜２９ヌクレオチド、より好ましくは約１９〜２３ヌクレオチド、そして最も好ましくは約２１ヌクレオチドを含有する。ｓｉＲＮＡ分子はまた、３’ヌクレオチド、好ましくは３’ＵＵを含む３’二ヌクレオチドオーバーハングも含有することも可能である。より一般的に、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡ分子にはまた、当該技術分野に知られるものも含まれる。
【００２５】
［０００３５］１つの態様において、増幅産物は、プロモーター配列、およびｓｉＲＮＡ分子のセンス配列またはアンチセンス配列いずれかをコードする配列または構築物を含んでなる。増幅産物はまた、ループ配列またはターミネーター配列を含有することも可能である。
【００２６】
［０００３６］別の態様において、増幅産物は、プロモーター、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列またはアンチセンス配列いずれかをコードする配列または構築物、およびターミネーター配列を含んでなる。
【００２７】
［０００３７］別の態様において、増幅産物は、プロモーター、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列またはアンチセンス配列いずれかをコードする配列または構築物、およびループ配列を含んでなる。この態様において、別の増幅反応中、増幅産物を処理して別の増幅産物を提供することも可能である。第三のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、これを達成することも可能である。この第三のプライマーの一部は、第一の増幅産物のループ配列に相補的である。第三のプライマーはまた、第一の増幅産物がセンスコード配列を含有する場合はアンチセンス配列をコードする配列に相補的な配列、または第一の増幅産物がアンチセンスコード配列を含有する場合はセンス配列をコードする配列に相補的な配列も含んでなる。第三のプライマーはまたターミネーター配列も含むことも可能である。
【００２８】
［０００３８］別の態様において、増幅産物は、プロモーター、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列をコードする配列または構築物、およびアンチセンス配列をコードする配列または構築物を含んでなる。この態様において、センスおよびアンチセンスコード配列または構築物は、ループ配列によって付着されていることも可能である。増幅産物はまた、ターミネーター配列も含有することも可能である。
【００２９】
［０００３９］さらに別の態様において、プロモーター、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列をコードする配列または構築物、およびアンチセンス配列をコードする配列または構築物を含んでなる増幅産物が産生される。センスおよびアンチセンスコード配列または構築物は、ループ配列によって付着されていることも可能である。増幅産物はまた、ターミネーター配列も含有することも可能である。
【００３０】
［０００４０］さらに別の態様において、増幅産物は、別の増幅反応中、第四のオリゴヌクレオチドプライマーであって、その一部がタグ配列に相補的である前記第四のオリゴヌクレオチドプライマーで処理することも可能である。
【００３１】
［０００４１］好ましい態様において、該方法は、増幅されたプロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを精製する工程をさらに含んでなることも可能である。多様な精製技術が当該技術分野に知られ、そして本発明で使用可能である。例を以下に記載する。
【００３２】
［０００４２］別の態様において、増幅された、そして好ましくは精製された、本発明にしたがって産生されたプロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを、スクリーニングのため、細胞にトランスフェクションする。トランスフェクション後、ｓｉＲＮＡが発現されて、遺伝子サイレンシングを誘導することも可能である。
【００３３】
［０００４３］別の態様において、選択された、そして好ましくは精製された、プロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを、選択されたベクターにクローニングする。この態様のため、制限部位をｓｉＲＮＡ発現カセットの末端に、好ましくは産生中に、例えばプライマー内に制限部位コード配列を含むことによって、挿入することも可能であることが認識される。この態様の略図が図９に示されるとともに、本明細書に援用される米国仮出願第６０／３９９，３９７号、２００２年７月３１日出願に示される。
【００３４】
［０００４４］好ましい態様において、選択される細胞は哺乳動物細胞である。
［０００４５］別の好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーの１以上が、好ましくはリン酸化によって、修飾されている。
【００３５】
［０００４６］別の態様において、該方法はまた、発現されたｓｉＲＮＡ分子に感受性であるｍＲＮＡ上の標的部位に関してスクリーニングする工程も含んでなる。
［０００４７］別の態様において、該方法は、対照カセットなどの陽性および／または陰性対照を含む。
【００３６】
［０００４８］別の側面において、本発明は、標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。該方法は、ｓｉＲＮＡが発現され、そして標的遺伝子を阻害することが可能であるように、増幅された、そして好ましくは精製された、ｓｉＲＮＡ発現カセットを細胞にトランスフェクションすることを含んでなる。好ましい態様において、２以上の異なるｓｉＲＮＡ発現カセットで細胞をトランスフェクションする。１つの態様において、異なるｓｉＲＮＡ発現カセットは、異なるループ配列を含む、異なるｓｉＲＮＡコード遺伝子、および／または異なるプロモーターを含有する。
【００３７】
［０００４９］別の側面において、本発明は、本発明にしたがって、増幅されたｓｉＲＮＡ発現カセットを細胞にトランスフェクションすることによって、例えば遺伝子のプロモーター領域を含む標的遺伝子のメチル化を指示することによって、哺乳動物において、遺伝子機能を修飾する方法を提供する。
【００３８】
［０００５０］別の側面において、本発明は、プロモーター含有ｓｉＲＮＡ発現カセットを産生するためのキットの形のＰＣＲに基づくアプローチを提供する。該キットは、二本鎖のプロモーター含有テンプレート、プロモーター含有テンプレートの５’端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、およびプロモーター含有テンプレートの３’端に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを含んでなる。３’プライマーは、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列または（および／または）アンチセンス配列をコードする配列に相補的な１以上の配列もまた含んでなる。
【００３９】
［００５１］３’プライマーは、ループ配列をさらに含んでなることも可能であり、この場合、キットはループ配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含んでなり、該プライマーは、ｓｉＲＮＡ分子のセンス配列またはアンチセンス配列をコードする配列に相補的な配列を含んでなる。
【００４０】
［０００５２］１つの態様において、キットは、センス配列をコードする配列に相補的な配列を含んでなる３’プライマー、およびアンチセンス配列をコードする配列に相補的な配列を含んでなる別の３’プライマーを含んでなる。
【００４１】
［０００５３］別の態様において、３’プライマーは、センス配列をコードする配列に相補的な配列、アンチセンス配列をコードする配列に相補的な配列、およびターミネーター配列を含んでなる。センスおよびアンチセンスコード配列に相補的な配列は、好ましくは、ループ配列によって付着される。
【００４２】
［０００５４］好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくはリン酸化によって、修飾されている。
［０００５５］該キットはまた、ＰＣＲ増幅試薬および増幅されたｓｉＲＮＡ発現カセットを精製する試薬も含んでなることも可能である。
【００４３】
［０００５６］別の好ましい態様において、該キットはまた、陽性対照および陰性対照の一方または両方も含んでなる。
［０００５７］本発明の好ましい態様を以下に記載する；が、本発明は、以下の態様に限定されないことが理解される。
【００４４】
哺乳動物細胞におけるｓｉＲＮＡのＰＣＲ増幅、トランスフェクション、および発現
［０００５８］ＰＣＲに基づくアプローチの手順を図１に模式的に示す。好ましい態様において、ＰＣＲ反応において、ヒトＵ６プロモーターの５’端に相補的な普遍的プライマーとともに、プロモーターの３’端に相補的なプライマー（単数または複数）であって、センスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡ遺伝子に相補的な付加配列を宿する、前記の３’端に相補的なプライマーを用いる（図１Ａ）。センス配列またはアンチセンス配列に転写ターミネーター配列（Ｔｅｒ）が続き、該配列は、好ましくは約４〜６のデオキシアデノシンのストレッチであり、そしてより好ましくは６デオキシアデノシンのストレッチであり、そしてこれに短いさらなる「スタッファー・タグ」配列が続き、この配列は、より後の段階で行いうるクローニングのための制限部位を含むことも可能である。生じるＰＣＲ産物には、Ｕ６プロモーター配列、ｓｉＲＮＡセンスまたはアンチセンスコード配列、ターミネーター配列、および産物の３’末端の短いタグ配列が含まれる。
【００４５】
［０００５９］別の態様において、センス配列およびアンチセンス配列両方が、同一カセットに含まれることも可能である（図１Ｂ、図１Ｄ）。この場合、好ましくは９ヌクレオチドを含有するヌクレオチドループを、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列間に挿入する。生じる単一ＰＣＲ産物には、Ｕ６プロモーター、ステム・ループの形のｓｉＲＮＡセンスおよびアンチセンスコード配列、ＰｏｌＩＩＩターミネーター配列、および「スタッファー」タグ配列が含まれる（図１Ｄ）。このカセットを構築するため、２つの３’プライマーを用いる。第一のＰＣＲ反応は、５’Ｕ６普遍的プライマー、およびＵ６プロモーターの２０ヌクレオチドに相補的な配列に続いてｓｉＲＮＡセンスコード配列に相補的な配列および９ｎｔループを有する３’プライマーを使用する（図１Ｂ）。この第一の反応の１マイクロリットルを、同じ５’Ｕ６プライマー、並びにアンチセンス鎖に付加された９ｎｔループに相補的な配列、Ｔｅｒおよび「スタッファー」タグ配列を宿する３’プライマーを使用する、第二のＰＣＲ反応で再増幅する（図１Ｂ）。
【００４６】
［０００６０］別の態様において、センス、ループ、アンチセンス、Ｔｅｒおよび「スタッファー」タグ配列を宿する単一の３’プライマーを用いて、一工程ＰＣＲ反応を行う（図１Ｃ）。一般的には有効であるが、このアプローチは、かなり長くそして構造化された３’ＰＣＲプライマーを使用し、該プライマーはいくつかの配列では、望ましい全長二本鎖ＰＣＲ産物を得る際に困難を引き起こしうる。
【００４７】
［０００６１］Ｕ６プロモーターに相補的な領域が変化しないため、ＰＣＲ条件は、すべてのｓｉＲＮＡ遺伝子に関して、比較的標準的である。いくつかのカセットを構築するため、各ＰＣＲ工程に１分間およびアニーリング温度として５５℃を用いて、各場合で最適増幅を達成した。直接トランスフェクションを行い、そしてＰＣＲ増幅ｓｉＲＮＡ遺伝子を試験するため、ＰＣＲプライマーの５’末端を、例えばリン酸化によって、好ましくはＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼおよび非放射性ＡＴＰを用いて、修飾することも可能である。プライマーのこの修飾は、ＰＣＲ産物を細胞内で安定化させ、それによって、ＰＣＲ産物の有効性を増進する。
【００４８】
［０００６２］ＰＣＲ反応が完了したら、例えばゲルろ過カラムを介してプライマーから産物をカラム精製するか、または電気泳動後、ゲルから直接切除することも可能である。以下に記載され、そして本明細書に援用される同時係属出願第６０／３５６，１２７号、２００２年２月１４日出願に記載されるものなどの、陽イオン性リポソームキャプシド形成および／または標準的トランスフェクション法の後、精製産物を細胞に適用することも可能である。ノーザンブロッティング解析によって、トランスフェクションＰＣＲ産物の細胞内発現を検出し（図３Ａ）、こうしてすぐれたトランスフェクション効率が立証された。
【００４９】
ｓｉＲＮＡコードＰＣＲ産物を用いた、機能するｓｉＲＮＡおよびアクセス可能標的部位の迅速スクリーニング
［０００６３］増進緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）コード配列に融合したＨＩＶ  ｒｅｖ配列（Ｌｅｅら、２００２）を用いて、細胞における有効性に関して、ＰＣＲ増幅ｓｉＲＮＡコードＤＮＡを試験した。この構築物を、エクジソン誘導性ｐＩＮＤベクター系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。その後、誘導性プロモーターのトランス活性化因子を安定して発現する２９３細胞に、ベクターをトランスフェクションした。この系を使用すると、培地にポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した後、強いＥＧＦＰ発現が生じる（図３Ａ）。
【００５０】
［０００６４］多数のｓｉＲＮＡ遺伝子を試験しようとする場合、トランス活性化因子および標的構築物両方を発現する安定細胞株が好ましい可能性があるが、標的−ＥＧＦＰ融合構築物との同時トランスフェクションは、ｓｉＲＮＡ有効性に関する、迅速でそして高感度の試験を提供する。標的配列ｃＤＮＡは、この誘導性ベクター系に容易にクローニングされ、望ましいＥＧＦＰ融合体を生成することも可能である。この系を利用すると、ＰＣＲ産物から発現される有効なｓｉＲＮＡが、ＥＧＦＰ発現を阻害し、ｓｉＲＮＡ機能のＦＡＣＳまたは顕微鏡に基づく解析いずれかが可能になるであろう。
【００５１】
［０００６５］ＰＣＲアプローチを試験するため、センスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡ遺伝子いずれかを含有するＵ６カセット（図１Ａ）、またはセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ両方をコードするヘアピン構築物（図１Ｃ）を増幅した。ＰＣＲ産物をカラム精製した。その後、精製されたＰＣＲ産物と、誘導性ｒｅｖ−ＥＧＦＰ融合構築物を、エクジソン・トランス活性化因子発現細胞株に同時トランスフェクションした。トランスフェクション４８時間後、培養物にポナステロンＡを添加して、標的ｍＲＮＡ発現を誘導した。この系を用いると、誘導１２時間後に、ｓｉＲＮＡによるＥＧＦＰ発現の強いそして特異的な下方制御が検出可能であった（図２）。センスｓｉＲＮＡ（図２Ｂ）、アンチセンスｓｉＲＮＡ（図２Ｃ）または無関係のｓｉＲＮＡ（未提示）のみを発現するＵ６発現カセットなどの対照カセットのトランスフェクションは、ＥＧＦＰ発現にまったく影響を及ぼさなかった。しかし、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡを発現するカセットを標的と同時トランスフェクションするか、またはヘアピンｓｉＲＮＡ遺伝子を含有する単一カセットを用いると、標的の特異的でそして有効な下方制御が検出された（図２ＤおよびＥ）。最適でそして最も再現性がある阻害（ほぼ９０％）は、ヘアピンｓｉＲＮＡ発現カセットで得られた。これらの結果は、独立に５回、再現された。これらの実験に用いた、９塩基ループ（ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ）の選択される長さおよび配列は、いくつかのマイクロ−ＲＮＡ前駆体に見られるループの系統発生比較に基づく。上記ループを用いた場合、ｓｉＲＮＡセンス鎖の配列は、好ましくは、３’塩基としてＵを含んではならず、これは、これが４ウリジンのストレッチを生成し、このストレッチがＰｏｌＩＩＩターミネーター要素として作用しうるためである。
【００５２】
［０００６６］上記結果は、本発明のトランスフェクション−ＰＣＲ方法論を容易に用いて、細胞におけるｓｉＲＮＡ標的化および機能を迅速に試験することも可能であることを示す。
【００５３】
［０００６７］有効なｓｉＲＮＡの設計において、重要な要素は、最適な阻害活性を生じるｓｉＲＮＡ／標的配列の組み合わせの選択である。これは、ｓｉＲＮＡおよびトランスフェクション法を用いて達成可能であるが、これは費用が高くそして時間がかかる可能性もある。ＰＣＲ戦略を利用することによって、いくつかのｓｉＲＮＡ遺伝子が単一トランスフェクション実験において、同時に試験可能となる。
【００５４】
［０００６８］機能するｓｉＲＮＡ遺伝子の同定を容易にするため、「スタッファー」タグ配列をＰｏｌＩＩＩ転写ターミネーターのすぐ後に挿入した（図１を参照されたい）。このタグを利用することによって、トランスフェクション細胞からトランスフェクションＰＣＲカセットを増幅し、そして続いてｓｉＲＮＡ配列を同定することも可能である（図１Ｄ）。これは、５’Ｕ６普遍的プライマー、およびタグ配列に相補的なプライマーを利用することによって、達成可能である（図１Ｄ）。タグ配列は、Ｔｅｒ配列の６つのＴで始まり、これに、その後のクローニングに使用可能な制限部位、および６つの余分なヌクレオチドの「スタッファー」が続くことも可能である（全部で１８ｎｔ）。いくつかのｓｉＲＮＡの混合物を、誘導性標的−ＥＧＦＰカセットとともに、トランス活性化因子を含有する細胞株に同時トランスフェクションすることも可能である。ポナステロンＡを添加した１２時間後、ＥＧＦＰ陰性細胞およびＥＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳ分取によって収集し、そして両方の分画からＤＮＡを採取することも可能である。その後、単離されたＰＣＲ産物を第二周期の選択および増幅のためにトランスフェクションして、最も強力なｓｉＲＮＡを発現するｓｉＤＮＡ遺伝子を選択することも可能である。その後、生じたＰＣＲ産物をクローニングし、そして配列決定することも可能である。ＥＧＦＰをなお発現する細胞には存在しないが、ＥＧＦＰ陰性分画には存在するであろうため、機能するｓｉＲＮＡを同定することも可能である。
【００５５】
［０００６９］上記アプローチの変型を用いると、いくつかの発現カセットを生成し、そして既定のｍＲＮＡいずれかの上のｓｉＲＮＡ感受性標的部位に関して同時にスクリーニングするのに用いることも可能である。標的配列をＥＧＦＰまたは類似のレポーターに融合させ、そしてＦＡＣＳ解析および分取を介して、スクリーニングを迅速に達成することも可能である。陽性選択がある場合、またはＦＡＣＳ分取可能な表現型が利用可能である場合、この戦略を、内因性標的に対して利用することも可能である。本発明にしたがった増幅戦略は、ｓｉＲＮＡの細胞内発現のための迅速でそして安価なアプローチを提供し、そして続いて、ｓｉＲＮＡによる下方制御に対する標的部位の感受性の試験を提供する。
【００５６】
［０００７０］本発明は、以下の実施例にさらに詳述され、該実施例は、例示のために提供され、そしていかなる方式でも本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００５７】
（実施例１）
標的構築およびｓｉＲＮＡ標的部位の位置決定
［０００７１］先に記載されるように（Ｌｅｅら、２００２）、ｐＩＮＤ誘導性ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングされた、ＥＧＦＰ遺伝子が続くＨＩＶ−ｒｅｖ配列を、ｓｉＲＮＡ標的部位として選択した。ｓｉＲＮＡのアクセス可能標的部位の選択は、先の研究に基づき、そしてＵ６発現系を用いて有効なｓｉＲＮＡ標的であることが示された（Ｌｅｅら、２００２）。標的部位の配列は：
【００５８】
【化１】
2006515158.tif 000002
【００５９】
（配列番号１）であり、ｒｅｖ−ＡＵＧ開始コドンの２１３ヌクレオチド下流に位置する。
（実施例２）
ポリメラーゼ連鎖反応
［０００７２］ヒトＵ６プロモーターをテンプレートとして含有するプラスミドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。５’オリゴヌクレオチド（５’Ｕ６普遍的プライマー）は、Ｕ６プロモーターの５’端の２９ヌクレオチドに相補的であり（太字斜体）
【００６０】
【化２】
2006515158.tif 000003
【００６１】
（配列番号２）、そして該オリゴヌクレオチドをすべてのＰＣＲ工程に用いた。センス、アンチセンス、またはセンスおよびアンチセンス両方のいずれかを含有する３’オリゴヌクレオチドを図１に示し、そして本明細書に記載する。すべての３’ＰＣＲプライマーの３’端の最後の２０ヌクレオチドは、Ｕ６プロモーターの最後の２０ヌクレオチドに相補的であり、これは：
【００６２】
【化３】
2006515158.tif 000004
【００６３】
（配列番号３）である。すべてのＰＣＲ反応を以下のとおりに行った：９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１分間を３０周期。増幅前に、非放射性ＡＴＰを用いてＰＣＲプライマーをキナーゼ処理し（ｋｉｎａｓｅｄ）、そしてＰＣＲ反応に用いる前に、Ｑｉａｇｅｎカラム上で精製した。ＰＣＲ産物もまた、Ｑｕｉａｇｅｎカラム上で精製した。ｓｉＤＮＡコードオリゴの配列は：
１．ｓｉＲＮＡ  ｒｅｖ−のセンス
【００６４】
【化４】
2006515158.tif 000005
【００６５】
（配列番号４）
２．ｓｉＲＮＡ  ｒｅｖ−のアンチセンス
【００６６】
【化５】
2006515158.tif 000006
【００６７】
（配列番号５）
３．ヘアピンｓｉＲＮＡオリゴ１−センス
【００６８】
【化６】
2006515158.tif 000007
【００６９】
（配列番号６）
４．ヘアピンｓｉＲＮＡオリゴ２−アンチセンス
【００７０】
【化７】
2006515158.tif 000008
【００７１】
（配列番号７）である。
［０００７３］斜体配列は、ｓｉＲＮＡコード配列である。
（実施例３）
細胞株および培養条件
［０００７４］１０％ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州サンタアナ）で２９３細胞を増殖させた。エクジソン誘導性安定Ａ２９３クローンが先に記載されており（Ｌｅｅら、２００２）、そして１００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＭＥＭ中で、該細胞を維持した。
【００７２】
（実施例４）
ｓｉＲＮＡ−ＰＣＲ産物のトランスフェクション条件
［０００７５］２５０ｎｇの標的プラスミドを：１）５０ｎｇのセンスｓｉＲＮＡ発現ＰＣＲカセット、および／または５０ｎｇのアンチセンスｓｉＲＮＡ発現ＰＣＲカセット；または２）９ｎｔループによって連結されたセンスおよびアンチセンス両方を発現する単一カセット１００ｎｇ、いずれかと同時トランスフェクションした。わずか２５ｎｇのステム・ループｓｉＲＮＡが標的発現を遮断するのに有効であった。さらなる対照として、無関係なステム・ループｓｉＲＮＡを用い、そして該ｓｉＲＮＡは標的発現にいかなる影響も生じなかった（未提示）。
【００７３】
［０００７６］少量のＰＣＲ増幅ＤＮＡのトランスフェクションを容易にするため、キャリアーとして作用する４００ｎｇのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを各反応に添加した。トランスフェクション４８時間後、５μＭのポナステロンＡを培地に添加して、そして誘導１２時間後、ＥＧＦＰ発現に関して細胞を解析した。製造者に記載されるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＰｌｕｓＴＭ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、６ウェルプレートにおいて、トランスフェクションを行った。顕微鏡画像化のため、細胞を増殖させ、そして０．５％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）で処理したカバーガラス上でトランスフェクションした。誘導１２時間後、６ウェルプレートからカバーガラスを持ち上げ、そして細胞固定のため、４％ＰＦＡを用いて室温で１０分間処理した。マウント溶液にＤＡＰＩを添加して、細胞核を視覚化した。ＦＡＣＳ解析によって、ｒｅｖ−ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの下方制御を定量化した。
【００７４】
（実施例５）
ノーザン解析
［０００７７］製造者の指示にしたがって、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ  Ｂ  Ｉｎｃ．、テキサス州フレンドウッド）を用いて、総ＲＮＡを単離した。５μｇの総ＲＮＡを８Ｍ−６％ＰＡＧＥによって分画し、そしてＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にトランスファーした。ｓｉ−アンチセンスＲＮＡに相補的な３２Ｐ放射標識２１量体プローブをハイブリダイゼーション反応に用い、該反応は、３７℃で１６時間行った。２１量体ＤＮＡオリゴヌクレオチドをＲＮＡ試料と並べて電気泳動し、そしてサイズ対照およびハイブリダイゼーション対照として用いた（未提示）。
【００７５】
（実施例６）
細胞溶解物からのｓｉＲＮＡの直接増幅
［０００７８］ＦＡＣＳ分取によって、ＥＧＦＰ陰性および陽性細胞分画を収集した。分取した分画を遠心分離することによって、細胞ペレットを直ちに回収した。５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４５％ＮＰ４０、０．４５％Ｔｗｅｅｎ、および０．７５μｇ／μｌプロテイナーゼＫ中、３７℃で一晩、ペレットを溶解させた。９５℃で１０分間熱不活性化させた後、３μｌの細胞溶解物をＰＣＲ反応に直接用いた。
【００７６】
（実施例７）
［０００７９］ＨＩＶ−ｒｅｖ部位を標的とするｓｉＲＮＡヘアピンをコードするＰＣＲ増幅遺伝子１５ｎｇとともに、無関係なｓｉＲＮＡ  ＰＣＲ産物１５ｎｇを、誘導性標的ＥＧＦＰカセットを伴って、トランス活性化因子を発現する２９３細胞株に同時トランスフェクションした。トランスフェクション１２時間後、ポナステロンＡを添加してＥＧＦＰ発現を誘導し、そしてＥＧＦＰ陰性および陽性細胞をＦＡＣＳ分取した。ＥＧＦＰ陰性および陽性細胞両方から、遠心分離によって、細胞ペレットを収集し、溶解緩衝液中で一晩溶解させ、そして適切なプライマーセットを利用したＰＣＲによって、ＤＮＡを直接増幅した。２つの異なるｓｉＲＮＡコードＤＮＡカセットを区別する２つの異なる３’プライマーを用いた。機能しないｓｉＲＮＡ発現カセットは、どちらの細胞分画においても、ＰＣＲ増幅によって検出可能なはずである一方、機能するｓｉＲＮＡ発現カセットは、その産物が機能してＥＧＦＰ発現を下方制御しているであろうため、ＥＧＦＰ陰性分画でのみ検出可能であろうと予期された。２回の独立の実験の結果を図３ＢおよびＣに示す。どちらの場合も、機能しないｓｉＲＮＡをコードする遺伝子はすべての分画からＰＣＲ増幅され（図３Ｂ）、一方、機能するｓｉＲＮＡをコードする発現構築物は、主に、ＥＧＦＰ陰性細胞分画で検出された（図３Ｂ）。
【００７７】
（実施例８）
［０００８０］テンプレートとしてＵ６＋１プロモーター構築物（ｐＴＺＵ６＋１）、普遍的５’プライマー、および特異的３’プライマーを用いたＰＣＲによって、抗ＨＩＶ  Ｕ６＋１短ヘアピンｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ＰＣＲ産物を産生した。標準的な５’から３’方向で、プライマーを表１に示す。センス標的配列−ループ−アンチセンス標的配列−ＵＵＵＵＵ（ｐｏｌ３ターミネーター）形式で転写されるように、ｓｈＲＮＡを設計した。Ｕ６＋１プロモーターの５’端にアニーリングする普遍的５’プライマーの配列もまた、表１に示す。表１はさらに、予期されるＰＣＲ産物の３’端の対応する配列（上段、標準的な５’から３’方向で、コード鎖を示す）を示し、該配列は、Ｕ６＋１プロモーターの３’端から始まり、転写の＋１開始部位で終わり、その後、ヘアピンＲＮＡをコードする配列（センス標的／ループ／アンチセンス）、ＰｏｌＩＩＩターミネーター、Ｂｇｌ２部位および余分なヌクレオチドが続く。３’プライマーの配列もまた、表１において、各ＰＣＲ産物の配列の後に示す。
【００７８】
［０００８１］表１はまた、ＳＥＬＥＸ２１４４  ｔＲＮＡＬｙｓ３−ｔａｔ／ｒｅｖ標的２１−ステムｓｈＲＮＡも示す。
（実施例９）
［０００８２］アンチ−ｔａｔ  ｓｉＲＮＡを発現するＰＣＲ増幅発現カセットは、ＨＩＶ感染を強力に阻害することが見出された。遺伝子Ｕ６＋１ＮＬＳ１（ｔａｔ／ｒｅｖ）ｓｈＲＮＡをコードするＰＣＲ増幅短ヘアピンＲＮＡを、プラスミドベクター中の同一遺伝子（ｐＢＳ  Ｕ６＋１ＮＬＳ１（ｔａｔ／ｒｅｖ）ｓｈＲＮＡ）と対比して、図４に示す量で、０．５マイクログラムのＨＩＶ  ｐＮＬ４−３とともに、２９３細胞に同時トランスフェクションして、そしてウイルスがコードするｐ２４抗原アウトプットを３日間に渡って測定した。対照として、空のベクター主鎖（ｐＢＳまたはｐＴＺＵ６＋１）またはアンチ−ｔａｔ  ｓｈＲＮＡの部位９、１０および１１での三重突然変異（Ｕ６＋１ｍＮＬＳ１ｓｈＲＮＡ（ＰＣＲ産物）またはｐＢＳＵ６＋１ｍＮＬＳ１ｓｈＲＮＡ（プラスミドに基づく系））を、ＨＩＶ−１とともに、ＰＣＲ増幅遺伝子としてトランスフェクションした。図４の結果は、プラスミドベクター中の同一遺伝子に比較して、本発明にしたがって産生したカセットを用いて得られる阻害が数対数に相当することを示す。
【００７９】
［０００８３］図４は、Ｕ６＋１  ｔａｔ／ｒｅｖ  ｓｈＲＮＡが、カセットがＰＣＲ産物として直接トランスフェクションされるか、またはプラスミド主鎖の一部であるかに関わりなく、同等のモル比で、匹敵するＨＩＶ阻害を特異的に仲介することを示す。このパネルはまた、少量のｓｈＲＮＡ構築物が、影響を受けやすい標的部位を通じて実質的なＨＩＶ阻害を仲介可能であることも例示する。
【００８０】
（実施例１０）
［０００８４］図５は、ＰＣＲ産物から発現されたｓｈＲＮＡによるＨＩＶ阻害の持続を示す。陽性対照および陰性対照として、Ｕ６＋１  ｔａｔ／ｒｅｖ  ｓｈｏＲＮＡとＵ６＋１  ｔａｔ／ｒｅｖ突然変異体ｓｈＲＮＡ構築物を用いて、実施例９に記載するように、ＨＩＶ同時トランスフェクション阻害アッセイを行った。第３日にウイルス上清を収集した後、集密２９３細胞を１０％集密で、新鮮な培地中に再度蒔き、そしてアッセイのためにウイルス上清を収集する前に、さらに３日間増殖させた。図５は、これらの実験条件下で、ＰＣＲ産物が仲介するＨＩＶ阻害が、少なくとも６日間持続することを示す。
【００８１】
（実施例１１）
［０００８５］図６は、クローニングされたＵ６＋１ｅｎｖ  ｓｈＲＮＡ構築物（表１）を用いたＨＩＶ阻害試験の結果を示す。２９３細胞を〜５０％集密で含有する６クラスタープレートの各ウェルに、製造者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓを用いて、６クラスタープレートのウェルあたり、０．５μｇのクローニングされたプラスミドｓｈＲＮＡおよび０．５μｇのｐＮＬ４−３プロウイルスＤＮＡを同時トランスフェクションした。ウイルス上清のアリコットを、示した時間で採取して、そしてｐ２４抗原に関してアッセイした。Ｔａｔ／ｒｅｖ、阻害の陽性対照；Ｍｔａｔ／ｒｅｖ、プロセシングされたアンチセンス鎖の５’端に比較して１０位、１１位および１２位の標的部位でミスマッチした、阻害の陰性対照。
【００８２】
（実施例１２）
［０００８６］図７は、一組のＰＣＲ反応から精製された各２００ｎｇのＵ６＋１  ｅｎｖ  ｓｈＲＮＡ  ＰＣＲ産物を用いた、ＨＩＶ阻害アッセイの結果を示す。ｐＴＺＵ６＋１は、Ｕ６＋１プロモーターを含有する陰性対照プラスミドである。
【００８３】
（実施例１３）
［０００８７］図８は、別の組のＰＣＲ反応から精製された各１００ｎｇのＵ６＋１  ｅｎｖ  ｓｈＲＮＡ  ＰＣＲ産物を用いた、Ｕ６＋１  ｅｎｖ  ｓｈＲＮＡによるＨＩＶ阻害を示す。Ｕ６＋１  ｔａｔ／ｒｅｖ  ｓｈＲＮＡおよびＵ６＋１  ｔａｔ／ｒｅｖ突然変異体ｓｈＲＮＡ  ＰＣＲ産物を対照として含んだ。
【００８４】
［０００８８］本発明の背景を解明し、そして本発明の実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書に用いた刊行物および他の資料は、本明細書に個々に援用されるかのように、本明細書に援用される。
【００８５】
［０００８９］本発明は、本発明の好ましい態様の詳細に関連して本特許出願に開示されているが、該開示は、限定する意味よりも例示的な意味で意図されていることが理解されるはずであり、これは本発明の精神および付随する請求項の範囲内の修飾が当業者に容易に思い浮かぶであろうことが意図されるためである。
【００８６】
【化８】
2006515158.tif 000009
【００８７】
【化９】
2006515158.tif 000010
【００８８】
【化１０】
2006515158.tif 000011
【００８９】
【化１１】
2006515158.tif 000012
【００９０】
参考文献
【００９１】
【化１２】
2006515158.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、ｓｉＲＮＡを発現するＵ６転写カセットを得るのに用いるＰＣＲ戦略の略図である。５’ＰＣＲプライマーは、Ｕ６プロモーターの５’端に相補的であり、そしてすべてのＰＣＲ反応の標準である。Ａ）３’ＰＣＲプライマーは、Ｕ６プロモーターの３’端の配列に相補的であり、そしてセンス配列またはアンチセンス配列いずれか、４〜６のデオキシアデノシンのストレッチ（Ｔｅｒ）およびさらなる「スタッファー・タグ」配列が続く。アデノシンは、Ｕ６  ＰｏｌＩＩＩプロモーターの終結シグナルであり；したがって、このシグナルの後に付加されるいかなる配列も、ＰｏｌＩＩＩポリメラーゼによって転写されず、そしてｓｉＲＮＡの一部とならないであろう。Ｂ）センス配列およびアンチセンス配列が、２工程ＰＣＲ反応によって、９ｎｔループにより連結され、そしてカセットに挿入される。Ｃ）９ヌクレオチドループに連結されるセンス配列およびアンチセンス配列、並びにそれに続くアデノシンストレッチ、並びにＴａｇ配列が、単一の３’プライマーに含まれる。Ｄ）ＰＣＲ反応によって得られる完全ＰＣＲ発現カセット。トランスフェクション細胞から、機能するｓｉＲＮＡを増幅し、そして同定するため、またはＤに示したＰＣＲ産物の収量を増加させるため、図に示すように、普遍的５’Ｕ６プライマーおよびＴａｇ配列に相補的な３’プライマー（やはり標準的）を用いて、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを行うことも可能である。
【図２】［０００１４］図２は、２９３細胞にトランスフェクションしたｓｉＲＮＡ含有ＰＣＲカセットを用いた、増進緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現の阻害を示す。センス、アンチセンス、またはセンスおよびアンチセンス両方のｓｉＲＮＡいずれかを含有するＰＣＲカセットを、標的構築物とともに、エクジソン・トランス活性化因子を発現する２９３細胞に同時トランスフェクションした。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ標的は、誘導性プロモーターから発現される緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡと融合している。ポナステロンＡを添加した後、ＥＧＦＰ発現は、対照細胞（Ａ）で検出可能であるが、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ発現ＰＣＲ産物の混合物（Ｄ）、またはヘアピン構築物を発現するＰＣＲカセット（Ｅ）いずれかをトランスフェクションした細胞では検出不能である。パネルＢおよびＣは、標的およびセンスのみ（Ｂ）またはアンチセンスのみ（Ｃ）を発現するＰＣＲカセットの細胞への同時トランスフェクションを示す。Ｒｅｖ−ＥＧＦＰタンパク質は、Ｒｅｖ部分の核小体局在シグナルのため、主に細胞核小体にある。
【図３】［０００１５］図３は、トランスフェクション細胞におけるｓｉＲＮＡの検出およびｓｉＲＮＡコードＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。Ａ２９３細胞においてトランスフェクションされたＰＣＲ産物から発現されるｓｉＲＮＡのノーザンゲル解析。レーン１、ＥＦＧＰ標的構築物のみをトランスフェクションされた細胞；レーン２、アンチセンスコード構築物のみをトランスフェクションされた細胞；レーン３、アンチセンスおよびセンスコード構築物を同時トランスフェクションされた細胞；レーン４、ヘアピン発現構築物をトランスフェクションされた細胞。プローブは、アンチセンスに相補的である。レーン２〜４において、ｓｉＲＮＡコードＤＮＡ構築物を、誘導性ＥＧＦＰ構築物と同時トランスフェクションした。ヘアピン産物は、個々に発現されたｓｉＲＮＡより小さいようであり、ヘアピンループがプロセシングされたことを立証する。ＢおよびＣ。トランスフェクションされたＰＣＲ構築物のＰＣＲ増幅。Ｂ。ＥＧＦＰ陽性細胞および陰性細胞を分取する、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）からの非特異的ｓｉＲＮＡコードＤＮＡのＰＣＲ増幅。機能しない構築物は、すべての細胞分画で検出される。レーン１およびレーン４は、ＥＧＦＰ陽性分画からの増幅結果を示す。レーン２および３は、ＥＧＦＰ陰性分画からの増幅結果を示す。Ｃ。ＦＡＣＳ分取された、ＥＧＦＰ発現細胞および非発現細胞からの、機能するヘアピン発現構築物のＰＣＲ増幅。増幅結果によって、ＥＧＦＰ陰性分画のみに、機能するｓｉＲＮＡが存在することが示される（レーン２〜３）。レーン４では、増幅された産物が少量あり、これはおそらくＥＧＦＰ陰性細胞のある程度の混入に由来するものであろう。ＮＣは陰性ＰＣＲ対照を示す。
【図４】［０００１６］図４は、ＰＣＲ産物およびプラスミドから発現されるｓｈＲＮＡによるＨＩＶ阻害の比較を示すグラフである。
【図５】［０００１７］図５は、本発明にしたがったＰＣＲ産物から発現されるｓｈＲＮＡによるＨＩＶ阻害の持続を示すグラフである。
【図６】［０００１８］図６は、クローニングされたＵ６＋１  ｓｈＲＮＡ構築物を用いる、ＨＩＶ阻害の試験の結果を示すグラフである。
【図７】［０００１９］図７は、本発明にしたがった、精製Ｕ６＋１  ｓｈＲＮＡ  ＰＣＲ産物を用いるＨＩＶ阻害アッセイの結果を示すグラフである。
【図８】［０００２０］図８は、本発明にしたがった、精製Ｕ６＋１  ｓｈＲＮＡ産物を用いるＨＩＶ阻害アッセイの結果を示すグラフである。
【図９】［０００２１］図９は、ＰＣＲ増幅ｓｉＲＮＡ発現カセットをクローニングベクターにクローニングする、本発明の態様を図式的に示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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