(57)【要約】本発明は、Ｃ型肝炎ウィルスに慢性的に感染した対象の確認同定および処置のための方法を提供する。いくつかの場合、対象は、非ＣｐＧ治療に無反応なものである。好ましくは、対象を、セミソフトな骨格を有するＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸により処置する。
2006515277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以前の非ＣｐＧ治療を使用した処置に成功しなかったＨＣＶ感染を有する対象を処置するための方法であってり、
かかる処置を必要としている対象に、ＣｐＧ免疫刺激性核酸を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む前記方法。
【請求項２】
非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロン−  アルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファおよびリバビリンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
非ＣｐＧ治療は、ペグ化インターフェロンアルファおよびリバビリンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＡクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＢクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
さらにインターフェロンアルファを対象に投与するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インターフェロンアルファは、実質的にＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、骨格修飾を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
骨格修飾は、チオリン酸ホスホロチオエート骨格修飾である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＨＣＶ感染を有し、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を処置するための方法であってり、
かかる処置を必要としている対象に、ＣｐＧ免疫刺激性核酸を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む前記方法。
【請求項１６】
さらに非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を確認同定することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象は、樹枝状細胞樹状細胞あたり産生されたインターフェロンアルファの検定アッセイに基づき無反応でありそうであると確認同定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象は、ＨＣＶ遺伝子型に基づき無反応でありそうであると確認同定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファおよびリバビリンを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
さらに対象に抗ウィルス剤を投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗ウィルス剤は、インターフェロンアルファである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
インターフェロンアルファは、治療量以下で投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
慢性のＣ型肝炎ウィルス感染の処置に有用なＣｐＧ免疫刺激性核酸をスクリーニングする方法であって、
慢性のＣ型肝炎ウィルス感染を有する対象からの末梢血単核細胞を、ＣｐＧ免疫刺激性核酸と接触させること、および
曝露後の前記末梢血液単核細胞の試験反応を測定すること、ここで対象は以前の治療を使用した処置に成功しなかった、
を含む、前記方法。
【請求項２８】
試験反応は、Ｂ細胞の刺激、ＩＬ−６の分泌、ＩＬ−１０の分泌、ＩＬ−１２の分泌、インターフェロンガンマの分泌、１型インターフェロン（アルファ＋ベータ）の分泌、ＩＰ−１０の分泌、ＮＫの活性、ＣＤ８０の発現、ＣＤ８６の発現、ＣＤ８３の発現、およびＭＨＣクラスＩＩの発現の上方調節からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
末梢血単核細胞は、樹枝状細胞樹状細胞を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
樹枝状細胞樹状細胞は、形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
試験反応は、ＩＬ−１２の分泌、１型インターフェロンの分泌、ＣＤ８０の発現、ＣＤ８６の発現、ＣＤ８３の発現、およびＭＨＣクラスＩＩの発現の上方調節からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
接触はin vitroで生じる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
末梢血単核細胞は、培養される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、培養末梢血単核細胞に添加される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
以前の治療は、非ＣｐＧ治療である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
以前の治療は、異なる配列またはクラスのＣｐＧ核酸による治療である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
さらに正常な対象からの末梢血単核細胞からの制御反応を刺激する能力について、ＣｐＧ免疫刺激性核酸をスクリーニングすることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
さらに実質的にＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に、末梢血単核細胞を、実質的にＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時にインターフェロンアルファに接触させることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
ＨＣＶ感染を有し、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を確認同定するための方法であってり、
Ｃ型肝炎ウィルス感染を有する対象から採取した末梢血単核細胞をＣｐＧ免疫刺激性核酸に曝露すること、
前記細胞から産生されたインターフェロンアルファを測定すること、および
樹枝状細胞樹状細胞あたり産生されたインターフェロンアルファの量を決定すること、ここで１．０ｐｇ／ｍｌより少ない量は、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を示す、
を含む、前記方法。
【請求項４１】
０．５ｐｇ／ｍｌより少ない量は、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
非ＣｐＧ治療は、リバビリンを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＩＦＮ−アルファは、ペグ化インターフェロンアルファである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＡクラスまたはＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
末梢血単核細胞は、さらにＣｐＧ免疫刺激性核酸と共に抗ウィルス剤に曝露される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
抗ウィルス剤は、インターフェロンアルファである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
末梢血単核細胞は、樹枝状細胞樹状細胞を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
樹枝状細胞樹状細胞は、形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｃ型肝炎ウィルス感染は、急性のＣ型肝炎ウィルス感染である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
さらにＨＣＶの遺伝子型を決定することを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
Ｃ型肝炎ウィルス感染を有する対象を処置するための方法であってり、
請求項４０に記載の方法に従って確認同定した対象に、ＣｐＧ免疫刺激性核酸分子を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項５４】
対象にインターフェロンアルファをさらに投与することを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＡクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＢクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、骨格修飾を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
骨格修飾は、チオリン酸ホスホロチオエート骨格修飾である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
Ｃ型肝炎ウィルス感染は、慢性のＣ型肝炎ウィルス感染である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６３】
Ｃ型肝炎ウィルス感染は、急性のＣ型肝炎ウィルス感染である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
以前の非ＣｐＧ治療を使用した処置に成功しなかったＨＣＶ感染を有する対象を処置するための方法であってり、
かかる処置を必要としている対象に、セミソフトな骨格を有するＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む前記方法。
【請求項６５】
ＨＣＶ感染を有し、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を処置するための方法であってり、
かかる処置を必要としている対象に、セミソフトな骨格を有するＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む前記方法。
【請求項６６】
ＨＣＶ感染を有し、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を確認同定するための方法であってり、
Ｃ型肝炎ウィルス感染を有する対象から採取した末梢血単核細胞をＡクラスまたはＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸に曝露すること、
前記細胞から産生されたインターフェロンアルファを測定すること、および
樹枝状細胞樹状細胞あたり産生されたインターフェロンアルファの量を決定すること、ここで１．０ｐｇ／ｍｌより少ない量は、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を示す、
を含む、前記方法。
【請求項６７】
以前の非ＣｐＧ治療を使用した処置に成功しなかったＨＣＶ感染を有する対象を処置する方法であってり、
かかる処置を必要としている対象からの末梢血単核細胞を、免疫反応を刺激するのに有効な量のＣｐＧ免疫刺激性核酸と接触させること、および
前記細胞を対象に再注入することを含む前記方法。
【請求項６８】
末梢血単核細胞は、樹枝状細胞樹状細胞を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
樹枝状細胞樹状細胞は、形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、Ｃクラス免疫刺激性核酸である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
Ｃクラス免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を有する、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｃ型肝炎ウィルスに慢性的に感染した対象の処置のための方法および製品を提供する。
【０００２】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は、フラビウィルス(Flavivirus)科のプラス鎖ＲＮＡウィルスであり、ヒトおよび他の霊長類数種の肝細胞に感染する。１９８９年に最初に特徴付けられ（１）、ＨＣＶは、３つの構造タンパク質：コアおよび２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１およびＥ２）、ならびにウィルス複製および宿主細胞との相互作用に関与するいくつかの非構造（ＮＳ）タンパク質をコードする、９．５ｋｂのゲノムを有する（２）し、３つの構造タンパク質：コアおよび２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ１およびＥ２）、ならびにウィルス複製および宿主細胞との相互作用に関与するいくつかの非構造（ＮＳ）タンパク質（２）をエンコードする。
【０００３】
ＨＣＶは、深刻な公衆衛生問題であり、非経口の非Ａ、非Ｂ型肝炎の＞９０％をもたらす（１）。世界の人口の０．４〜１．５％は、感染しており（３、４）、約３００，０００人のカナダ人を含む（Health Canada）。急性の感染の圧倒的多数が無症状であることから、疫学的統計を編集するのは難しい；しかしながら、ＨＣＶ感染した個人の５０〜８０％は、ウィルスを除去できないと推定され、彼らのほとんどが一生キャリアとなる。キャリアの約５０％が慢性の肝炎を発症し、彼らの２０％が肝硬変を発症し、彼らの多くが続いて肝細胞癌を発症するだろう（５〜９）。Ｃ型肝炎は、米国内で年間推定８，０００〜１０，０００人の死者をもたらす（ＣＤＣ）。
米国およびカナダ国において、２種類の異なる処方計画があり、Ｃ型肝炎の治療として認可されている：アルファインターフェロンによる単剤治療ならびにアルファインターフェロンおよびリバビリン(Ribavirin)による併用治療である。より高価で、より多くの副作用を伴うにもかかわらず、併用治療は、一貫して単剤治療より高い割合の持続的反応をもたらす。
【０００４】
いくつかの形態のアルファインターフェロンが、利用可能である（アルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、およびコンセンサスインターフェロン（Alfacon））。これらのインターフェロンを、典型的に毎週３回皮下に与える。ペグ化(pegylated)インターフェロン、すなわち、循環における継続期間を増加させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の付添加により修飾されたアルファインターフェロンは、別のインターフェロンであり、毎週１回のみ与えられる。リバビリンは、対照的に、経口抗ウィルス剤であり、２００ｍｇカプセルで１日２回与えられる。
アルファインターフェロンの副作用は、以下を含む：けん怠感、筋肉痛、頭痛、悪心および嘔吐、注射部位の皮膚の炎症、微熱、体重減少、被刺激性、うつ病、自殺、軽度の骨髄抑制および抜け毛（可逆性改善可能）。リバビリンについては、以下の副作用を含む；貧血けん怠感および被刺激性、そう痒、皮膚の発疹、鼻詰まり、副鼻腔炎および咳。
【０００５】
インターフェロン単独でのまたはインターフェロンおよびリバビリンを併用する処置は、患者の５０〜７５％における血清ＡＬＴレベルの急速な改善および患者の３０〜５０％における血清からの検出可能なＨＣＶ  ＲＮＡの消失へと至らしめる。肝疾患における長期の改善は通常たいてい、ＨＣＶ  ＲＮＡが治療中消失し、治療完了後少なくとも６月間検出不可能なままである場合にのみ生じる。併用処置は、処置におけるＨＣＶ  ＲＮＡのより高い喪損失率および処置が完了したときのより低い再発率の両方をもたらす。しかしながら、結果は、ウィルスの遺伝子型に強く依存し、より良い結果が遺伝子型２および３についてはより良い結果が得られるが（ペグ化ＩＦＮ−αおよびリバビリンによる１年間の処置により約９０％）、遺伝子型１のＨＣＶについてはより乏しい結果（約４０％の持続的反応）が得られる。現在、北米におけるＨＣＶ慢性キャリアの大多数は、遺伝子型１である。
【０００６】
最適な処置継続期間は、インターフェロンの単剤治療または併用治療を使用するか、ならびにＨＣＶ遺伝子型により、様々である。典型的に、継続期間は６〜１２月に及ぶ。
現在、ＨＣＶに対するワクチン、または慢性の感染に極めて有効な治療はない。したがって、慢性キャリアを処置するのに使用することができる有効な処置が至急必要である。
【０００７】
発明の概要
本発明は、一つにはＣｐＧ免疫刺激性核酸をＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に慢性的に感染し、以前の投与した非ＣｐＧ治療に無反応である対象を処置するのに使用することができるという所見を含む、いくつかの驚くべき発見を前提とする。本発明はさらに、一つにはＣｐＧ免疫刺激性核酸およびＩＦＮ−アルファなどの抗ウィルス剤の併用によりから、かかる対象において相乗反応を有することが可能であるという所見を前提とする。
【０００８】
一つの側面において、本発明は、以前の非ＣｐＧ治療を使用した処置に成功しなかったＨＣＶ感染を有する対象を処置するための方法であり、かかる処置を必要としている対象に、ＣｐＧ免疫刺激性核酸を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む前記方法を提供する。
【０００９】
一つの態様において、非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファを含む。関連する態様において、インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロン−アルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファである。別の態様において、非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファおよびリバビリン、またはインターフェロンアルファおよびリバビリンおよびエマンチジン(emantidine)を含む。いくつかの重要な態様において、非ＣｐＧ治療は、ペグ化インターフェロンアルファおよびリバビリンなどの抗ウィルス薬を含む。
一つの態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＡクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である。別の態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＢクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である。
さらなる態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である。
【００１０】
さらにインターフェロンアルファなどの抗ウィルス薬をＣｐＧ免疫刺激性核酸と共に対象に投与することを随意に含んでもよい。
インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファであってもよいが、そのようにれほど限定されない。一つの態様において、抗ウィルス薬は、実質的にＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に投与される。
一つの態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、骨格修飾を含む。関連する態様において、骨格修飾は、チオリン酸ホスホロチオエート骨格修飾である。いくつかの重要な態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフト(semi-soft)な骨格を含む。他の重要な態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を有するＣクラス免疫刺激性核酸である。
【００１１】
したがって、別の側面において、以前の非ＣｐＧ治療を使用した処置に成功しなかったＨＣＶ感染を有する対象を処置するための方法であり、かかる処置を必要としている対象に、セミソフトな骨格を有するＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む前記方法を提供する。
さらに別の側面において、以前の非ＣｐＧ治療を使用した処置に成功しなかったＨＣＶ感染を有する対象を処置する方法であり、かかる処置を必要としている対象からの末梢血単核細胞を、免疫反応を刺激するのに有効な量のＣｐＧ免疫刺激性核酸と接触させること、および前記細胞を対象に再注入することを含む前記方法を提供する。
【００１２】
一つの態様において、末梢血単核細胞は、樹枝状細胞樹状細胞を含む。別の態様において、樹枝状細胞樹状細胞は、形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞を含む。一つの態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、Ｃクラス免疫刺激性核酸である。関連する態様において、Ｃクラス免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を有する。
別の側面において、本発明は、ＨＣＶ感染を有し、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を処置するための方法であり、かかる処置を必要としている対象に、ＣｐＧ免疫刺激性核酸を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む前記方法を提供する。
【００１３】
一つの態様において、本方法は、さらに非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を確認同定することを含む。一つの態様において、対象は、樹枝状細胞樹状細胞あたり産生されたインターフェロンアルファの検定アッセイに基づき無反応でありそうであると確認同定される。別の態様において、対象は、ＨＣＶ遺伝子型に基づき無反応でありそうであると確認同定される。
一つの態様において、非ＣｐＧ治療は、ＩＦＮ−アルファを含む。関連する態様において、非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファおよびリバビリンを含む。
【００１４】
一つの態様において、本方法は、さらに対象に抗ウィルス剤を投与することを含む。重要な態様において、抗ウィルス剤は、インターフェロンアルファである。インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファであってもよいが、そのようにれほど限定されない。一つの態様において、インターフェロンアルファは、治療量以下で投与され、随意にＣｐＧ免疫刺激性核酸およびインターフェロンアルファの組み合わせは、相乗的である。
【００１５】
一つの態様において、対象を処置するのに使用されるＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＡクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸、ＢクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸、またはＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である。
一つの態様において、対象が非ＣｐＧ治療に無反応でありそうかどうかを確認同定するのに使用されるＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＡクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸、またはＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である。
【００１６】
一つの態様において、抗ウィルス剤は、実質的にＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に投与される。他の態様において、インターフェロンアルファは、ＣｐＧ免疫刺激性核酸による処置の前に、ある期間投与される。
ある態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、骨格修飾を含む。関連する態様において、骨格修飾は、チオリン酸ホスホロチオエート骨格修飾である。いくつかの好ましい態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を含み、いくつかのより好ましい態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を有するＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である。
【００１７】
別の側面において、ＨＣＶ感染を有し、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を処置するための方法であり、かかる処置を必要としている対象に、セミソフトな骨格を有するＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む前記方法を提供する。
【００１８】
さらに別の側面において、本発明は、慢性のＣ型肝炎ウィルス感染の処置に有用なＣｐＧ免疫刺激性核酸をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、慢性のＣ型肝炎ウィルス感染を有する対象からの末梢血単核細胞を、ＣｐＧ免疫刺激性核酸に接触させること、および曝露後の前記血液単核細胞の試験反応を測定することを伴う。対象からの末梢血単核細胞であり、該対象は治療を使用した処置に成功しなかった。
【００１９】
一つの態様において、試験反応は、Ｂ細胞の刺激、ＩＬ−６の分泌、ＩＬ−１０の分泌、ＩＬ−１２の分泌、インターフェロンガンマの分泌、１型インターフェロン（アルファ＋ベータ）の分泌、ＩＰ−１０の分泌、ＮＫの活性、ＣＤ８０の発現、ＣＤ８６の発現、ＣＤ８３の発現、およびクラスＩＩのＭＨＣクラスＩＩの発現の上方調節からなる群から選択される。
【００２０】
別の態様において、末梢血単核細胞は、樹枝状細胞樹状細胞を含む。関連する態様において、樹枝状細胞樹状細胞は、形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞を含む。さらに別の態様において、細胞は、樹枝状細胞樹状細胞であり、試験反応は、ＩＬ−１２の分泌、１型インターフェロンの分泌、ＣＤ８０の発現、ＣＤ８６の発現、ＣＤ８３の発現、およびクラスＩＩのＭＨＣの発現の上方調節からなる群から選択される。
【００２１】
一つの態様において、接触はin vitroで生じる。別の態様において、末梢血単核細胞を、培養する。さらに別の態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸を、培養末梢血単核細胞に添加する。
一つの態様において、以前の治療は、非ＣｐＧ治療である。別の態様において、非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファを含む。別の態様において、非ＣｐＧ治療は、さらにリバビリンを含む。他の態様において、インターフェロンアルファは、ペグ化インターフェロンアルファである。一つの態様において、以前の治療は、異なる配列またはクラスのＣｐＧ核酸による治療である。
【００２２】
他の態様において、本方法は、さらに正常な対象からの末梢血単核細胞からの制御反応を刺激する能力について、ＣｐＧ免疫刺激性核酸をスクリーニングすることを含む。
本方法は、さらに実質的にＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時に、末梢血単核細胞を、実質的にＣｐＧ免疫刺激性核酸と同時にインターフェロンアルファに接触させることを含んでもよい。
【００２３】
一つの態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、骨格修飾を含む。関連する態様において、骨格修飾は、チオリン酸ホスホロチオエート骨格修飾である。重要な態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を含む。ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＡクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸、ＢクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸、またはＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸であってよい。いくつかの態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、Ｃクラス免疫刺激性核酸であり、他の態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を有するＣクラス免疫刺激性核酸である。
【００２４】
別の側面において、本発明は、ＨＣＶ感染を有し、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を確認同定するための方法を提供する。本方法は、Ｃ型肝炎ウィルス感染を有する対象から採取した末梢血単核細胞をＣｐＧ免疫刺激性核酸に曝露すること、前記細胞から産生されたインターフェロンアルファを測定すること、および樹枝状細胞樹状細胞あたり産生されたインターフェロンアルファの量を決定することを含み、ここで１．０ｐｇ／ｍｌより少ない量は、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を示す。一つの態様において、０．５ｐｇ／ｍｌより少ない量は、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を示す。
【００２５】
一つの態様において、非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファを含む。別の態様において、非ＣｐＧ治療は、リバビリンを含む。別の態様において、ＩＦＮ−アルファは、ペグ化ＩＦＮ−アルファである。
いくつかの重要な態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＡクラスまたはＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である。
さらに他の態様において、末梢血単核細胞を、さらにＣｐＧ免疫刺激性核酸と一緒に抗ウィルス剤に曝露する。抗ウィルス剤は、インターフェロンアルファであってもよいが、そのようにれほど限定されない。一つの態様において、インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファである。
【００２６】
一つの態様において、末梢血単核細胞は、樹枝状細胞樹状細胞を含む。別の態様において、樹枝状細胞樹状細胞は、形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞を含む。
別の態様において、Ｃ型肝炎ウィルス感染は、急性のＣ型肝炎ウィルス感染である。
別の態様において、本方法は、さらにＨＣＶの遺伝子型を決定することを含む。
【００２７】
さらなる側面において、ＨＣＶ感染を有し、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を確認同定するための方法であり、Ｃ型肝炎ウィルス感染を有する対象から採取した末梢血単核細胞をＡクラスまたはＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸に曝露すること、細胞から産生されたインターフェロンアルファを測定すること、および樹枝状細胞樹状細胞あたり産生されたインターフェロンアルファの量を決定することを含み、ここで１．０ｐｇ／ｍｌより少ない量は、非ＣｐＧ治療に無反応でありそうな対象を示す、前記方法が提供される。
【００２８】
さらに別の側面において、本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス感染を有する対象を処置するための方法であり、上述の方法に従って確認同定した対象に、ＣｐＧ免疫刺激性核酸分子を前記感染を処置するのに有効な量で投与することを含む、前記方法を提供する。
一つの態様において、本方法は、対象にインターフェロンアルファをさらに投与することを含む。一つの態様において、インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファである。
【００２９】
一つの態様において、対象を処置するのに使用されるＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ＡクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸、ＢクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸、またはＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸である。
別の態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、骨格修飾を含む。関連する態様において、骨格修飾は、チオリン酸ホスホロチオエート骨格修飾である。さらに別の態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、セミソフトな骨格を含む。
一つの態様において、Ｃ型肝炎ウィルス感染は、慢性のＣ型肝炎ウィルス感染である。別の態様において、Ｃ型肝炎ウィルス感染は、急性のＣ型肝炎ウィルス感染である。
【００３０】
本発明の各限定は、本発明の様々な態様を包含する。したがって、一つの要素または要素の組み合わせを伴う本発明の各限定を、本発明の各側面に含むことができることが予想される。
本発明のこれらのおよび他の側面は、以下に詳細に記載する。
【００３１】
図面の簡単な説明
図１は、３クラスのＣｐＧによる刺激の後のＨＣＶ感染したおよび正常なＰＢＭＣからのＩＦＮ−α分泌の誘導を示す。正常なまたはＨＣＶ感染した対象からのＰＢＭＣを、異なるクラスのＣｐＧと共に４８時間インキュベートした。細胞上清を採集し、市販のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＦＮ−α分泌について検定アッセイした。正常な１０対象およびＨＣＶ感染した１０対象についての平均ＩＦＮ−α分泌を、黒いバーで示す。
図２は、慢性のＨＣＶキャリアおよび正常な対象から新しく単離したＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析を示す。ＰＢＭＣを、ＨＣＶ感染した対象および正常な健康な提供者の血液から単離し、蛍光標識した抗形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞（ｐＤＣ）抗体で免疫染色した。細胞をフローサイトメーターで分析し、結果をＣｐＧにより刺激したときのこれらの同じ対象についてのＩＦＮ−α分泌データと比較した。
【００３２】
図３は、ＣクラスおよびソフトなＣオリゴヌクレオチドによるＰＢＭＣの刺激によるＩＦＮ−α誘導を示す。正常なまたはＨＣＶ感染した対象からのＰＢＭＣを、異なるクラスのＣｐＧと共に４８時間インキュベートした。細胞上清を採集し、市販のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＦＮ−α分泌について検定アッセイした。正常な１０対象およびＨＣＶ感染した１０対象についての平均ＩＦＮ−α分泌を、黒いバーで示す。
図４は、セミソフトなＣクラスＣｐＧのパネルによる刺激の後のＩＦＮ−α誘導を示す。ＨＣＶ感染した５対象から単離したＰＢＭＣを、セミソフトなＣクラスのオリゴヌクレオチドのパネルと共に４８時間インキュベートした。細胞上清を採集し、市販のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＦＮ−α分泌について検定アッセイした。ＨＣＶ感染した５対象についての平均ＩＦＮ−α分泌を、黒いバーで示す。
【００３３】
図５は、３クラスのＣｐＧによる刺激の後のＩＦＮ−γ分泌を示す。正常なまたはＨＣＶ感染した対象からのＰＢＭＣを、異なるクラスのＣｐＧと共に４８時間インキュベートした。細胞上清を採集し、市販のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＦＮ−γ分泌について検定アッセイした。正常な１０対象およびＨＣＶ感染した１０対象についての平均ＩＦＮ−γ分泌を、黒いバーで示す。
図６は、セミソフトなＣクラスＣｐＧのパネルによる刺激の後のＩＦＮ−γ誘導を示す。ＨＣＶ感染した５対象から単離したＰＢＭＣを、セミソフトなＣクラスのオリゴヌクレオチドのパネルと共に４８時間インキュベートした。細胞上清を採集し、市販のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＦＮ−γ分泌について検定アッセイした。ＨＣＶ感染した５対象についての平均ＩＦＮ−γ分泌を、黒いバーで示す。
【００３４】
図７は、３クラスのＣｐＧによる刺激の後のＩＰ−１０分泌を示す。正常なまたはＨＣＶ感染した対象からのＰＢＭＣを、異なるクラスのＣｐＧと共に４８時間インキュベートした。細胞上清を採集し、市販のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＰ−１０分泌について検定アッセイした。正常な１０対象およびＨＣＶ感染した１０対象についての平均ＩＰ−１０分泌を、黒いバーで示す。
図８は、Ｂ細胞の増殖へのＣｐＧの効果を示す。ＨＣＶ感染したまたは正常な提供者からのＰＢＭＣを、クラスＡ、ＢまたはＣのＣｐＧと共に５日間インキュベートした。細胞を、放射活性能測定の前に１６〜１８時間、３Ｈ−チミジンを用いてパルス(pulse)した。値を対照の培地と比較した刺激指数として表す（ＳＩ＝ＣｐＧを用いてインキュベートした細胞のｃｐｍ／培地のみを用いてインキュベートした細胞のｃｐｍ）。
【００３５】
図９は、Ｂ細胞の増殖へのセミソフトなＣクラスＣｐＧの効果を示す。ＨＣＶ感染した５対象から単離したＰＢＭＣを、Ａ、Ｂ、ＣおよびセミソフトなＣクラスＣｐＧと共に５日間インキュベートした。そして細胞を、放射活性能測定の前に１６〜１８時間３Ｈ−チミジンを用いてパルスした。値を対照の培地と比較した刺激指数として表す（ＳＩ＝ＣｐＧを用いてインキュベートした細胞のｃｐｍ／培地のみを用いてインキュベートした細胞のｃｐｍ）。
図１０は、３クラスのＣｐＧによる刺激の後のＩＬ−１０分泌を示す。正常なまたはＨＣＶ感染した対象からのＰＢＭＣを、異なるクラスのＣｐＧと共に４８時間インキュベートした。細胞上清を採集し、市販のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＬ−１０分泌について検定アッセイした。正常な１０対象およびＨＣＶ感染した１０対象についての平均ＩＬ−１０分泌を、黒いバーで示す。
【００３６】
図１１は、リバビリンおよびＣｐＧ単独でまたはイントロンＡとの組み合わせによるＨＣＶ感染した細胞の刺激の後のＩＦＮ−α分泌を示す。ＨＣＶ感染した１０対象および正常で健康な１０提供者から単離したＰＢＭＣを、イントロンＡ、リバビリンまたはＣ−クラスＣｐＧ単独と共にならびにまたイントロンＡ（精製した外因性源のＩＦＮ−α源）と共におよびイントロンＡなしで４８時間インキュベートした。細胞上清を採集し、市販のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＦＮ−α分泌について検定アッセイした。各対象についてのためにイントロンＡ単独でについて測定したＩＦＮ−αの量を、バックグラウンドとみなし、データをグラフに含めませる前に、イントロンＡ、リバビリン＋イントロンＡおよびＣクラス＋イントロンＡから、これらの同じ対象について差し引いた。正常なおよびＨＣＶ対象についての平均値を、それぞれ黒いおよび白いバーで示す。
図１２は、ＨＣＶ感染した細胞によるＩＦＮ−α分泌へのイントロンＡを併用したＣｐＧの相乗効果である。ＨＣＶ感染した１５対象からのＰＢＭＣを、ＣクラスＣｐＧ単独でまたはイントロンＡ（精製した外因性源のＩＦＮ−α源）と共に４８時間インキュベートした。細胞上清を採集し、市販のＥＬＩＳＡキットにより、ＩＦＮ−α分泌について検定アッセイした。各対象についてのためにイントロンＡ単独でについて測定したＩＦＮ−αの量を、データをグラフに含めませる前に、ＣｐＧ＋イントロンＡから、これらの同じ対象について差し引いた。
図は、請求の範囲に記載されている発明の実施可能性に必要ないと理解される。
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明によると、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、以前のインターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）治療が失敗した患者を含む、ＨＣＶに慢性的に感染した患者からのＰＢＭＣを、健康な対象からのＰＢＭＣと同様の方法で活性化することができることが発見された。
【００３８】
内因性ＩＦＮ−α分泌は、機能障害および他の刺激に反応する機能障害および能力の低下をもたらすＨＣＶにより感染したと思われる形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞（ＰＤＣ）から強く誘導されるたことが発見された。ある場合には、健康なボランティアからのＰＢＭＣにおいて高レベルのＩＦＮ−αを誘導するＡおよびＣ  ＣｐＧクラスが、ｐＤＣから最も高いレベルのＩＦＮ−αを誘導することが見出された。さらに、セミソフトなＣクラスＣｐＧ  ＯＤＮもまた、特にこの効果に有用であることが発見された。これらのＯＤＮは、反復投与により腎臓内に蓄積しないため、いくつかの態様において好ましいだろう。
【００３９】
本発明によると、外因性ＩＦＮ−α（イントロンＡ）とリバビリンはのいずれも、単独でまたは一緒に使用されたとき、正常な対象またはＨＣＶ慢性のキャリアからのＰＢＭＣに対してへのいかなる検出可能な直接的な免疫刺激効果を全く有しないことがさらに発見された。しかしながら、イントロンＡおよびＣｐＧ  ＯＤＮ（例、ＢまたはＣクラス）を一緒に使用するときには、内因性ＩＦＮ−αの産生についての強力な相乗効果が、観察される。
これらの結果は、ＣｐＧ  ＯＤＮが、単独で、またはＩＦＮ−αと共に、慢性のＨＣＶ感染を処置するのに、有効な処置であることを示す。本発明は、これらの発見に基づき、ＨＣＶ感染を防止するおよび処置する方法および製品を提供する。
【００４０】
慢性の感染は、少なくとも一部は、急速なＨＣＶの突然変異速度率に起因するようであり、免疫の監視を逃れることができる類似種の産生をもたらす（１０、１１）。体液性免疫および細胞性媒介免疫（ＣＭＩ）の両方の反応を、慢性的に感染した個人において検出することができる。抗体を不活性化することが、感染からの防御に重要絶対不可欠である一方、細胞性媒介免疫（ＣＭＩ）は、一度感染が定着すると、ウィルス除去において主要な役割を果たすようである。
【００４１】
一つの側面において、本発明は、以前の非ＣｐＧ治療を用いた処置に成功しないＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）に感染した対象を処置するための方法を提供する。本方法は、かかる処置を必要としている対象に、ＣｐＧ免疫刺激性核酸を前記感染を阻害するのに有効な量で投与することを含む。
【００４２】
本明細書中、非ＣｐＧ治療は、ＣｐＧ免疫刺激性核酸ではない活性または不活性化合物を使用する治療である。様々な態様において、非ＣｐＧ治療は、インターフェロンアルファを含む。ペグ化ＩＦＮ−アルファは一般に、好ましくはリバビリンおよび随意にアマンタジンと組み合わせて、ＨＣＶ対象（例、ヒトＨＣＶ患者）に投与される。インターフェロンアルファは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファであり得る。前述のインターフェロンアルファ処置の全てを、非ＣｐＧ治療の定義に含む。
【００４３】
以前の非ＣｐＧ治療を用いた処置に成功しない対象は、前の処置にもかかわらず、治療中止の６月後、血流中に検出可能なウィルス量を未だに有する対象である。これらの対象は、以前の非ＣｐＧ治療に反応するかもしれないが、検出可能なウィルス量により示されたように、感染および続いて再発を制御できない対象を含む。本明細書中、そして便宜上、これらの対象を「無反応者」というが、しかしながらこの用語は、臨床設定において定義されたようにではなく、本明細書中に定義されたように理解される。すなわち、臨床設定において「無反応者」は、処置にいかなる反応も示さない狭い一部の対象のみを定義するにもかかわらず、本発明においては、以前の処置にいくらかのレベルの反応がある一方、未だ処置に成功しないより広い部類の対象を指す。処置に成功する対象は、処置の中止の６月後、血流中に検出可能なウィルス量を有しない対象である。成功した処置とは、処置の中止後少なくとも６月間持続的に、血流中における検出不可能なレベルのウィルス量へと至らしめる処置を意味する。無反応者とはまた、本明細書中、暗にＨＣＶに慢性的に感染したと理解される。
【００４４】
本明細書中、ＣｐＧ核酸を使用する処置というとき、本方法を対象の成功した処置を達成するのに使用する。ＣｐＧ処置を使用する対象の成功した処置とは、治療中止の６月後、血流中におけるウィルス量の検出不可能なレベルへの低減と定義する。興味深いことに、ウィルス量は、ＣｐＧ処置中または直後、減少することが観察されないかもしれないが、むしろ処置後時間と共に減少し、処置の中止の６月後これらの対象の血流中に検出可能なウィルスがないという最終的な結果となるのみかもしれない。、感染を処置するとは、したがって、対象の血流中においてウィルス量を検出不可能なレベルに低減させ、そのレベルを処置の中止後６月間持続させることを意味する。したがって、剤の有効な量を、この最終結果を達成するために投与する。
【００４５】
いくつかの態様において、潜在的無反応者は、予期して確認同定されてもよく（すなわち、非ＣｐＧ治療による実際のin vivo処置前に）、そして本発明は、かかる対象の確認同定のためのみならず、それらの処置のための方法を提供する。潜在的無反応者を、特にＡクラスおよびＣクラスのＣｐＧ免疫刺激性核酸に反応する能力を評価することにより確認同定してもよい。ＣｐＧ免疫刺激性核酸に反応する能力を、ＨＣＶ感染した対象におけるｐＤＣあたり産生されたインターフェロンアルファの量により評価する。本発明によると、ＩＦＮ−アルファ治療などの非ＣｐＧ治療に反応しそうにないＨＣＶ感染した対象を、かかる処置を受ける前に確認同定できることが発見された。In vivo治療前にかかる対象を確認同定することが可能であることにより能力は、不必要な処置を排除し、対象を、本発明のＣｐＧ免疫刺激性核酸単独での、またはＩＦＮ−アルファを含むが、それに限定されない他の抗ＨＣＶ治療と組み合わせての処置に、治療的に有利な位置に置く。これらの対象は、成功しない処置を受けないことにより、細胞毒性に冒されることが少なくなり、ウィルス増殖期間がを、成功しない処置を受けないことにより、低減少すさせるだろう。ｐＤＣあたり妥当なレベル以下のＩＦＮ−アルファ誘導を有する対象は、ＩＦＮ−アルファによる処置に不成功でありそうであり、したがって本明細書中に提供した方法を使用して処置すべきである。ＩＦＮ−アルファ誘導およびｐＤＣ数の測定を、例においてより詳細に記載する。
【００４６】
本明細書中で論じた治療剤および方法のいずれによっても処置に成功するＨＣＶ感染した対象はおそらく、まだ体内にウィルスを有するだろうと理解される。しかしながら、対象は、ウィルスを完全に根絶することはできない一方、ウィルス量を（検出不可能なレベルに）制御することができる。ある特定の理論に束縛されることを意図していないがにもかかわらず、かかる対象における検出不可能なウィルス量の維持は、制御するウィルスの複製および蔓延を制御することができる免疫系を伴うことが予想される。
【００４７】
本明細書中に提供された教示指導を受けた当業者は、対象がＩＦＮ−アルファ治療に対して「無反応者」でありそうかどうか決定することができるだろう。一例として、ＩＦＮ−アルファ誘導が、核酸指定の配列番号１で指定された核酸などのＡクラス核酸により、例に記載された培養条件下で行なわれた場合、ＩＦＮ−アルファ治療に反応する能力を示す正常な反応は、ｐＤＣあたり少なくとも１ｐｇ／ｍｌだろう。これより少ない量は、いくらかのｐＤＣ機能障害を示す。ｐＤＣあたり０．５ｐｇ／ｍｌ未満の量は、ＩＦＮ−アルファ処置へのより高い確率の無反応と相関関係がある。当業者は、検定アッセイにおいて使用された核酸の特定の型についてかかるカットオフ値を決定することができ、したがって（少なくとも）そのようにかかる対象を実際に処置する前に、ＩＦＮ−アルファ治療による処置に成功しないと予想される対象を確認同定する能力がある。
【００４８】
さらに他の態様において、非ＣｐＧ治療（例、ＩＦＮ−アルファ治療）に対する無反応者でありそうな対象を確認同定する方法は、さらに該対象が感染したＨＣＶの遺伝子型の同定を含む。例えば、遺伝子型１のＨＣＶに感染した対象は、ＩＦＮ−アルファ治療による処置に成功しない可能性が高い。したがって、かかる対象におけるＤＣあたりのＩＦＮ−アルファの産生を評価するのに加えて、それらのＨＣＶ遺伝子型もまた決定することができ（当該技術分野で既知の方法を使用して）、そして情報のこの組み合わせを、ＩＦＮ−アルファ治療に無反応でありそうな対象を確認同定するのに使用することができる。
【００４９】
いくつかの側面において、本発明は、非ＣｐＧ治療を使用する処置に成功しそうにない対象を確認同定し（非ＣｐＧ治療により対象を実際に処置することなく）、そしてＣｐＧ免疫刺激性核酸単独で、または限定はされないが、ＩＦＮ−アルファなどの抗ウィルス剤と組み合わせて使用して、対象を処置する方法を提供するとさらに理解される。
上記方法はまた、特定のＣｐＧ免疫刺激性核酸への反応について、対象をスクリーニングするために使用することができる。
【００５０】
さらに他の態様において、本方法は、以前の非ＣｐＧ治療を受けたことがあるが処置に成功していない対象を確認同定する追加のステップを伴ってもよい。本明細書中に提供された教示指導を受けた当業者は、かかる対象を確認同定することができるだろう。一例として、かかる対象は、処置の中止の６月後、血流中に検出可能なウィルス量を有するだろう。いくつかの態様において、これらの対象はまた、処置の直後にウィルス量の低減を実証するかもしれないが、この低減は、持続しない。
【００５１】
本発明は、とりわけ、ＣｐＧ免疫刺激性核酸単独で、またはＨＣＶ感染について以前記載されたものなどの他の活性剤との組み合わせを使用して、以前の非ＣｐＧ治療による処置に成功しない対象を処置することを意図する。広く定義されたように、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドモチーフを有する核酸であり、ここで少なくともジヌクレオチドのＣは、非メチル化されていないである。ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、本明細書中ならびに本明細書中に引用されたおよび参照として組み込まれた特許および特許出願により詳細に記載されているように、Ａクラス、ＢクラスおよびＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸を含むが、これらに限定されない。これらのクラスのＣｐＧ免疫刺激性核酸は、異なる特性および活性化プロファイルを有する。
【００５２】
重要な態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、Ｃクラス免疫刺激性核酸である。本発明によると、Ｃクラス免疫刺激性核酸は、クラスＡおよびＢクラスの中間の特性を有していたが、いくつかの態様において、Ａより好ましかったことが、驚くべきことに見出された。本明細書中に提供された例は、以前の非ＣｐＧ治療による処置に成功しない、慢性的に感染した対象のｐＤＣは、自体ＨＣＶに感染し、それによりいくつかの側面において機能障害になるが、かかる細胞のＣｐＧ免疫刺激性核酸、特にＣクラス免疫刺激性核酸への曝露は、それらの機能を回復させることを実証する。いくつかの態様において、本明細書中により詳細に記載されているように、Ｃクラス免疫刺激性核酸はまた、「ソフト」または「セミソフト」な変種のいずれかであることが好ましい。いくつかの好ましい態様において、ＣｐＧ免疫刺激は、セミソフトなＣクラス核酸である。
【００５３】
他の側面において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、活性剤と組み合わせて使用し、好ましくはＨＣＶ処置について以前記載したものを含む。特に重要なのは、インターフェロン−α（例、イントロンＡ）とＣｐＧ免疫刺激性核酸との使用である。本発明のＣｐＧ免疫刺激性核酸と組み合わせて使用することができるインターフェロンは、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファを含むが、これらに限定されない。他の抗ウィルス剤は、本明細書中に記載されている。ＣｐＧクラスのいずれも、これらの組み合わせで使用できる。一例として、本発明によると、外因的に投与されたインターフェロン−αは、これらの対象の処置に成功しないにもかかわらず、ＣｐＧ免疫刺激性核酸と組み合わせたとき、治療的に有効であることが、予想外に見出された。いくつかの態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、Ｃクラス免疫刺激性核酸である。いくつかの好ましい態様においては、セミソフトなＣクラス核酸である。
【００５４】
ＣｐＧ核酸および抗ウィルス剤（例、インターフェロンアルファ）の投与のタイミングは、対象および感染の重篤度に依存して変化してもよい。ＣｐＧ核酸を、ＣｐＧ免疫刺激性核酸と実質的に同時に投与してもよい。これは、２つの剤を、投与前に組み合わせてもよく、または投与の過程において（例えば、対象の静脈ライン内へ両方供給して）組み合わせてもよく、あるいは別々だが、２つの投与を行なうのにかかる時間内で（例えば、対象に２回注射する時間）投与してもよいことを意味する。本剤を実質的に同時にまたは互い違いの形で投与するかどうかに関わらず、順序は変化してもよい。したがって、いくつかの態様において、ＣｐＧ免疫刺激性核酸をＩＦＮ−アルファなどの抗ウィルス剤の前に投与してもよい一方、他では抗ウィルス剤の後に投与してもよい。
【００５５】
ＣｐＧ核酸を他の抗ウィルス剤（例、ＩＦＮ−アルファ）と一緒にに使用するとき、これらの化合物を、治療的に有効な複合量において投与してもよい。いずれかの化合物の量は、したがって治療量以下または治療量以上（すなわち、単独で投与したとき治療的に有効であろう量以下または以上）であってもよい。あるいは、化合物をそれぞれ治療量で投与してもよいが、それらの剤の組み合わせは、副作用の低減などの治療的利益有効性を引き起こすもたらす。好ましい態様において、抗ウィルス薬がＩＦＮ−アルファである場合、治療量を投与する。実際投与する量に関わらず、剤の組み合わせは、相乗的であってもよい。相乗反応は、剤の組み合わせにより予想される相加的付加反応より大きいものである。
【００５６】
さらに他の側面においておよび上に提供した説明に合わせて、本発明は、ＨＣＶに慢性的に感染し、非ＣｐＧ治療による処置に成功しない、または非ＣｐＧ治療への無反応者でありそうな対象から単離した免疫細胞を刺激する能力についてＣｐＧ核酸をスクリーニングする方法を提供する。これらのスクリーニング方法は、一般的に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣｐＧ免疫刺激性核酸と、免疫反応を刺激するのに十分な有効量で接触することにより、in vitroで行なわれる。免疫反応は、様々なマーカーにより測定することができ、ＩＦＮ−アルファの産生、Ｂ細胞の刺激、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロンガンマ、１型インターフェロン（アルファ＋ベータ）などのサイトカインの分泌、ＩＰ−１０などのケモカインの分泌、ＮＫの活性、副刺激分子（例、ＣＤ８０、ＣＤ８６）および成熟分子（例、ＣＤ８３）の発現ならびにＭＨＣクラスＩＩの発現の上方調節を含む。
【００５７】
いくつかの重要な態様において、免疫細胞は、樹枝状細胞樹状細胞であり、好ましくは形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞（ｐＤＣ）であり、免疫反応マーカーは、この細胞種型に特異的である。これらは、副刺激分子（例、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現、成熟分子（例、ＣＤ８３）の発現、ＩＬ−１２および１型インターフェロン（アルファ＋ベータ）の発現および／または分泌、およびＭＨＣクラスＩＩの発現の上方調節を含むが、限定されない。これらのin vitro検定アッセイは、ＰＢＭＣの残留物からのｐＤＣなどの樹枝状細胞樹状細胞の単離に依存しないと理解される。むしろ検定アッセイは、ＰＢＭＣの同一の集団において行なうことができる。
【００５８】
さらに別の側面において、本発明は、ＣｐＧ免疫刺激性核酸により処置される慢性のＣ型肝炎ウィルス感染を有する対象を確認同定するための方法を提供する。本方法は、慢性のＣ型肝炎ウィルス感染を有する対象から採取した末梢血単核細胞を、ｉ）ＣｐＧ免疫刺激性核酸、およびｉｉ）ＣｐＧ免疫刺激性核酸および抗ウィルス薬（例、インターフェロンアルファ）に曝露すること、ならびに曝露後、末梢血単核細胞の反応を測定することを伴う。ＣｐＧ免疫刺激性核酸への反応は、非ＣｐＧ治療の後または代わりにＣｐＧ免疫刺激性核酸により処置する対象を示す（上記のとおりであるが、非ＣｐＧ治療に反応しそうにない対象を確認同定した後のみ）。ＣｐＧ免疫刺激性核酸単独への反応より大きい、抗ウィルス剤（例、インターフェロンアルファ）が一緒のＣｐＧ免疫刺激性核酸への反応は、組み合わせて処置する対象を示す。本明細書中に記載したように、抗ウィルス剤は、インターフェロンアルファであることができ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａまたはコンセンサスインターフェロンアルファを含むがこれらに限定されない。好ましくは、末梢血単核細胞は、形質細胞様樹枝状細胞樹状細胞などの樹枝状細胞樹状細胞を含む。本発明は、このように、ＣｐＧ免疫刺激性核酸単独でまたは抗ウィルス剤（例、ＩＦＮ−アルファ）と組み合わせて使用して確認同定された対象の処置をさらに含み、スクリーニング検定アッセイの結果に依存する。
【００５９】
臨床戦略は、局所のおよび全身のかかる核酸のin vivo投与、ならびに無反応であるＨＣＶ感染した対象から単離したｐＤＣを免疫刺激性核酸によりin vitroで活性化し、そして患者に局所的にまたは全身的に再注入するex vivo戦略を含む。これらの治療戦略は、他の増殖因子（ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ｆｌｔ３−リガンド、など）ならびに他の刺激（超抗原、ウィルス産物）と組み合わせて含んでもよい。天然ＩＦＮ−αは、１２１ダース以上の独立した遺伝子産物のファミリー仲間であり、個々の産物が独自の活性プロファイルを有することから、天然インターフェロンの臨床使用は、単一の組み換えＩＦＮ−α遺伝子由来の組み換えＩＦＮ−αと比較して好ましいだろう。
【００６０】
本発明は、さらにＣ型肝炎に感染した対象からのｐＤＣを活性化する方法を提供する。本方法は、かかる処置を必要としている対象からｐＤＣを単離すること、単離したｐＤＣをin vitroで培養すること、ｐＤＣをがin vitroで有効量の単離した免疫刺激性核酸と接触させすること、および接触させした細胞を対象に戻すことを伴う。細胞はまた、in vitroで増殖因子またはサイトカインと接触することができる。本発明のこの側面によると、免疫刺激性核酸およびＩＦＮ−αによる処置を求める条件は、上記のとおりである。
【００６１】
ＩＦＮ−アルファ自体は、１２１ダース以上の関連する、相同タンパク質（アイソフォームイソ型、以下の表１参照）のファミリー仲間を表し、それぞれは独自の遺伝子によりエンコードされ、それぞれは独自の活性プロファイルを示す。ウィルスにおける異なるアルファインターフェロン種の活性は、最高２０倍またはそれ以上変化することができる。臨床使用におけるＩＦＮ−アルファ製品産物は、組み換えタンパク質または単一のアイソフォームイソ型の高純度の天然タンパク質である。米国において、ＩＦＮ−αは、組み換えヒトＩＦＮ−α２ａ（ロフェロン−Ａ）、組み換えヒトＩＦＮ−α２ｂ（イントロンＡ）、および精製した天然ＩＦＮ−αｎ３（アルフェロン(ALFERON)Ｎ）として入手可能である。米国外では、ＩＦＮ−αはまた、精製した天然ＩＦＮ−αｎ１（ウェルフェロン(WELLFERON)）として入手可能である。
【００６２】
表１．ヒトＩＦＮ−αのファミリー仲間
【表１】
2006515277.tif 000003
【００６３】
本発明の方法のいくつかは、ＩＦＮ−αの存在を検出することを含む免疫反応の測定を必要とする。ＩＦＮ−αについての検定アッセイは、当該技術分野において周知である。これらは、直接的な試験、例えば、少なくとも１つのＩＦＮ−αに特異的な酵素結合イムノソルベント検定アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、および間接的な試験、例えば、ＮＫ細胞活性化／細胞毒性（Trinchieri G Adv Immunol 47: 187-376 (1989)）を含み、クラスＩのＭＨＣについて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により表現型の検査をする機能試験を含む。当該技術分野で周知の追加の特異的な検定アッセイ方法は、ＩＦＮ−αの局所濃度または局所的存在が重要である状況設定において、特に有用であり得る。これらの方法は、例えば、免疫組織化学、核酸ハイブリダイゼーションッド形成（例、ノーザンブロッティング）、ウェスタンブロッティング、逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）、およびin situ 原位置のＲＴ／ＰＣＲを含む。細胞内ＩＦＮ−αもまた、フローサイトメトリーを使用して検出することができる。
【００６４】
いくつかの側面において、本発明は、ｐＤＣ活性化の測定を伴う。ｐＤＣ活性化は、多くの方法により、検定アッセイすることができる。これらは、ＩＦＮ−αの産生、副刺激分子（例、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現、成熟分子（例、ＣＤ８３）の発現、ＩＬ−１２の発現、およびクラスＩＩのＭＨＣクラスＩＩの発現の上方調節を含む。外因性ＩＦＮ−αの投与とは違い、ｐＤＣの活性化は、様々な、ＩＦＮ−αの全ての種類形状ではないが、ＩＦＮ−βなどの他のＩ型ＩＦＮの産生へと至らしめる。したがって、いくつかの態様において、ｐＤＣは、ＩＦＮ−αを含むＩ型インターフェロンを産生する能力により測定されたように活性化される。
【００６５】
本発明は、免疫刺激性核酸を伴う様々な方法を提供する。免疫刺激性核酸は、核酸分子であり、免疫系の細胞への接触において、それ自体、増殖するおよび／または活性化するために、免疫系の接触した細胞を誘導する能力がある。接触は、直接的または間接的であることができ、例えば、免疫刺激性核酸は、産物を発現するために第一の種の免疫細胞の第一の型を直接的に刺激してもよく、該産物は順に免疫刺激性核酸に曝露されていないか、または第二の種の反応しない免疫細胞の第二の型を刺激するであろう。免疫刺激性核酸の免疫刺激効果は、免疫刺激性核酸の配列により偶然エンコードされ得るるかもしれないいかなる産物からも分離区別される。同様に、免疫刺激性核酸の免疫刺激効果は、いかなるアンチセンスメカニズム機構とも異なり、依存しない。
【００６６】
ある限られた核酸のみが、免疫刺激性核酸である。最初は、あるパリンドローム配列は、免疫刺激性であると信じられていた。Tokunaga T et al. Microbiol Immunol 36: 55-66 (1992); Yamamoto T et al. Antisense Res Dev 4: 119-22 (1994)。さらなる研究は、非パリンドローム配列もはまた、免疫刺激性であり、ただし、特定の配列状況を有するＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）を含有することを実証した。Krieg AM et al. Nature 374: 546-9 (1995)。
【００６７】
免疫刺激性核酸は、一本鎖または二本鎖であってよい。一般的に、二本鎖核酸分子はin vivoにてより安定している一方、一本鎖核酸分子は増大した免疫活性を有する。したがって、本発明のいくつかの側面において、免疫刺激性核酸は一本鎖が好ましく、他の側面において、免疫刺激性核酸は二本鎖が好ましい。
【００６８】
本発明に従って提供する方法および製品は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用に関する。ＣｐＧ  ＯＤＮは、ほとんどの（＞９５％）Ｂ細胞の増殖、免疫グロブリン（Ｉｇ）、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の分泌ならびにアポトーシスからの保護を引き起こす誘因する。加えて、ＣｐＧ  ＯＤＮはまた、ＤＣの成熟をもたらし、ＤＣ、単球、およびマクロファージを直接的に活性化し、ＩＦＮ−α／β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ケモカインおよびＴＮＦ−αを分泌させする。これらのサイトカインは、ＩＦＮ−γを分泌するためにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激してＩＦＮ−γを分泌させ、増大した溶解活性を増大させる有する。概して、ＣｐＧは、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γに支配され、Ｔｈ２サイトカインの分泌がほとんどない状態で、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γに支配されるサイトカイン産生の強力なＴｈ１様の傾向パターンのサイトカイン産生を誘導する。
【００６９】
先天性の、免疫反応の誘導に加えて、ＣｐＧ  ＤＮＡはまた、（ｉ）Ｂ細胞の抗原受容体を通じておよびＣｐＧにより惹起誘因されたＢ細胞のシグナル経路間の強力な相乗効果、（ｉｉ）ＢおよびＴ細胞抗原特異的反応の両方を増大させる抗原特異的Ｔ細胞の助けを置き換えまたは増大させる、Ｔｈ１様サイトカイン、ならびにおよび（ｉｉｉ）細胞反応に必要な副刺激分子の上方調節のため、抗原特異的反応を増大させる。
【００７０】
ＣｐＧ  ＯＤＮは、明らかなＴｈ１様反応を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＨＢｓＡｇへの強力な補助剤アジュバントであることを示してきた（主にＩｇＧ２ａ抗体および強力なＣＴＬ）（４９）。ＣｐＧ  ＯＤＮは、モノホスホリル脂質Ａ（MPL、Corixa）などの他のＴｈ１補助剤アジュバントより、またはヒトへの使用には毒性が強すぎる完全フロイント補助剤アジュバント（ＣＦＡ）よりも、優れていることが見出された。同様の結果が、ＣｐＧ  ＯＤＮの様々な他の抗原（４７、５０〜５３）との使用で報告されている。ＣｐＧ  ＯＤＮはまた、Ｔｈ２抗原（すなわち、住血吸虫(Schistosomiasis)の表面抗原）（５４）またはＴｈ２補助剤アジュバント（すなわち、ミョウバン）の予防接種により以前に確立されたＴｈ２反応を変えることが報告されている。
【００７１】
健康なヒトのＰＢＭＣを刺激するのに有効であることが見出された少なくとも３つの基本的なクラスのＣｐＧ  ＯＤＮがある（表１）。これらは、ＣｐＧ  ＯＤＮが免疫細胞を刺激することが可能なできる異なる方法に関連しそうな差動区別できる効果を有する。
ＢクラスのＣｐＧ  ＯＤＮは、ヌクレアーゼ耐性チオリン酸ホスホロチオエート骨格と共に合成され、一般的に良好なＢ細胞およびＤＣの活性化を特徴とし、ＩＬ−１２および抗体の産生へと至らしめるが、限られたＮＫ細胞の活性化は限定的でしかないのみである。ＣｐＧ（このクラスの一員）（配列番号：２）を市販の肝炎Ｂワクチンに対する補助剤アジュバントとして、市販の肝炎Ｂワクチンに試験する第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において既に実証されているように、このクラスのＯＤＮは、ワクチン補助剤アジュバントとして良好に機能する（６０）。
【００７２】
ＡクラスのＣｐＧ  ＯＤＮは、キメラ骨格と共に合成され、ここで５’および３’末端は、チオリン酸ホスホロチオエートであり、中心ＣｐＧモチーフ領域は、ホスホジエステルである。これらのＯＤＮは、良好なＮＫ細胞およびＤＣの活性化を特徴とし、ＩＦＮ−αのより多い産生へと至らしめるが、限られたＢ細胞活性化は限定的でしかないである。
ＣクラスのＣｐＧ  ＯＤＮは、チオリン酸ホスホロチオエート骨格と共に合成され、他の２つのクラスのＣｐＧ  ＯＤＮの中間の刺激特性を有する（例、Ｂ細胞の良好な活性化ならびにＮＫ細胞およびＤＣの活性化）。
【００７３】
表１：３つの異なるクラスのＣｐＧ  ＯＤＮにより誘導されたin vitro免疫活性化のパターン
【表２】
2006515277.tif 000004
１Ｓ−ＯＤＮは、チオリン酸ホスホロチオエート骨格から作られる。
２ＳＯＳ−ＯＤＮは、キメラ骨格から作られ、ここで中心ＣｐＧ含有の領域は、ホスホジエステル連鎖を有し、ＯＤＮの３’および５’末端は、チオリン酸ホスホロチオエート連鎖から作られる。
【００７４】
本発明の方法は、Ａクラス、ＢクラスおよびＣクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸の使用を包含してもよい。ＣｐＧ核酸については、異なるクラスのＣｐＧ核酸があると最近いわれている。１つのクラスは、Ｂ細胞を活性化するには強力であるが、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞の活性化の誘導においては比較的弱い；このクラスは、Ｂクラスと呼ばれている。ＢクラスＣｐＧ核酸は典型的に、完全に安定化され、ある好ましい塩基状況内で非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、米国特許6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；および6,339,068参照。別のクラスは、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞の活性化を誘導するには強力であるが、Ｂ細胞の刺激においては比較的弱い；このクラスは、Ａクラスと呼ばれている。ＡクラスＣｐＧ核酸は典型的に、５’および３’末端に安定したポリ(poly)Ｇ配列および少なくとも６つのヌクレオチドのパリンドロームホスホジエステルＣｐＧジヌクレオチド含有の配列を有する。例えば、公開済の特許出願PCT/US00/26527（WO 01/22990）参照。さらに別のクラスのＣｐＧ核酸は、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、ＩＦＮ−αを誘導する；このクラスは、Ｃクラスと呼ばれている。ＣクラスＣｐＧ核酸は、第一の特徴として、典型的に完全に安定化されており、Ｂクラス型の配列およびＧＣ含量が高いパリンドロームまたはパリンドロームに近いもの(near-palindrome)を含む。このクラスは、2001年8月17日出願の米国仮特許出願60/313,273、米国にて2002年8月19日出願のUS10/224,523に記載されており、これら全体の内容は、参照考文献により本明細書中に組み込まれる。
【００７５】
「Ａクラス」ＣｐＧ免疫刺激性核酸は、共に2000年9月27日に出願された、米国非仮出願09/672,126および公開済のPCT出願PCT/USOO/26527（WO01/22990）に記載されている。これらの核酸は、高レベルのインターフェロンアルファを誘導する能力がある一方、Ｂ細胞活性化への最小限の効果を有することを特徴とする。ＡクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸は、Yamamotoおよび同僚により記載された六量体のパリンドロームＧＡＣＧＴＣ、ＡＧＣＧＣＴ、またはＡＡＣＧＴＴを必ずしも含有する必要はない。Yamamoto S et al. J Immunol 148: 4072-6 (1992)。
【００７６】
Ａクラス免疫刺激性核酸の典型的な配列は、共に2000年9月27日に出願された、米国非仮特許出願09/672,126および公開済のPCT出願PCT/US00/26527（WO01/22990）に記載されている。
ＢクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸は、ヒトＢ細胞を強力に活性化するが、インターフェロン−αを誘導する最小限の効果を有する。ＢクラスＣｐＧ免疫刺激性核酸は、それぞれ2001年2月27日および2001年5月29日に発行された、米国特許6,194,388 Blおよび米国特許6,239,116 B1に記載されている。
【００７７】
本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１種の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。少なくとも１種の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、「ＣｐＧ  ＤＮＡ」または、後に３’グアニンが続きかつリン酸結合により連鎖した５’シトシンを含有するし、３’グアニンが続き、そしてリン酸結合により連鎖するＤＮＡ）を含有し、免疫系を活性化する核酸分子でである。ＣｐＧオリゴヌクレオチド全体は、非メチル化することができ、または一部を非メチル化してもよいが、少なくとも５’ＣＧ３’のＣは、非メチル化しなければならない。用語ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたはＣｐＧ核酸は、本明細書中、特に明記のない限り、免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは核酸を意味する。
【００７８】
一つの態様において、本発明は、少なくとも式：
５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’
式中、Ｘｌ、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ヌクレオチドである、
で表される、ＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供する。一つの態様において、Ｘ２は、アデニン、グアニン、またはチミンである。別の態様において、Ｘ３は、シトシン、アデニン、またはチミンである。
【００７９】
別の態様において、本発明は、少なくとも式：
５’ＮｌＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４Ｎ２３’
式中、Ｘｌ、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ヌクレオチドであり、Ｎは、ヌクレオチドのいずれでもよく、ＮｌおよびＮ２は、それぞれ約０〜２５Ｎからなる核酸配列である、
で表される、単離したＢクラスＣｐＧオリゴヌクレオチドを提供する。一つの態様において、Ｘ１Ｘ２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、およびＴｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドであり；Ｘ３Ｘ４は、ＴｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、およびＣｐＡからなる群から選択されるジヌクレオチドである。好ましくは、Ｘ１Ｘ２は、ＧｐＡまたはＧｐＴであり、Ｘ３Ｘ４は、ＴｐＴである。他の態様において、Ｘ１またはＸ２または両方は、プリンであり、Ｘ３またはＸ４または両方は、ピリミジンであるか、あるいはＸ１Ｘ２は、ＧｐＡであり、Ｘ３またはＸ４または両方は、ピリミジンである。別の好ましい態様において、Ｘ１Ｘ２は、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＣ、ＡｐＧ、およびＧｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドである。さらに別の態様において、Ｘ３Ｘ４は、ＴｐＴ、ＴｐＡ、ＴｐＧ、ＡｐＡ、ＡｐＧ、ＧｐＡ、およびＣｐＡからなる群から選択されるジヌクレオチドである。Ｘ１Ｘ２は、別の態様において、ＴｐＴ、ＴｐＧ、ＡｐＴ、ＧｐＣ、ＣｐＣ、ＣｐＴ、ＴｐＣ、ＧｐＴおよびＣｐＧからなる群から選択されるジヌクレオチドであり；Ｘ３は、ＡおよびＴからなる群から選択されるヌクレオチドであり、Ｘ４は、ヌクレオチドであるが、ここで、Ｘ１Ｘ２が、ＴｐＣ、ＧｐＴ、またはＣｐＧのとき、Ｘ３Ｘ４は、ＴｐＣ、ＡｐＴまたはＡｐＣではない。
【００８０】
別の好ましい態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列５’ＴＣＮ１ＴＸ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’（配列番号：２６）を有する。本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、いくつかの態様において、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から選択されるＸ１Ｘ２を含み、Ｘ３Ｘ４は、ＴｐＴ、ＣｐＴおよびＴｐＣからなる群から選択される。
【００８１】
本発明のＢクラスＣｐＧ核酸配列は、上記に広く記載されたものであり、ＰＣＴ公開済の特許出願PCT/US95/01570およびPCT/US97/19791、ならびにそれぞれ2001年2月27日および2001年5月29日に発行された、米国特許6,194,388 Blおよび米国特許6,239,116 B1に開示されている。典型的な配列は、これらの後者の出願および特許に開示されているものを含むが、これらに限定されない。
【００８２】
Ｃクラス免疫刺激性核酸は、免疫系の細胞への独自のおよび所望の刺激効果を有する、少なくとも２つの相異なるモチーフを含有する。これらのＯＤＮのいくつかは、旧来の「刺激性」ＣｐＧ配列および「ＧＣ含量が高い」または「Ｂ細胞中和」モチーフの両方を有する。これらの組み合わせのモチーフ核酸は、Ｂ細胞の活性化および樹枝状細胞樹状細胞（ＤＣ）の活性化の強力な誘導物質である旧来の「クラスＢ」ＣｐＧ  ＯＤＮと関連する効果と、ＩＦＮ−αおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化の強力な誘導物質であるが、Ｂ細胞およびＤＣの活性化の比較的弱い誘導物質であるより最近記載されたクラスの免疫刺激性核酸（「クラスＡ」ＣｐＧ  ＯＤＮ）と関連する効果との中間に位置する免疫刺激効果を有する。Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546-9; Ballas ZK et al. (1996) J lmmunol 157 : 1840-5; Yamamoto S et al. (1992) Immunol 148: 4072-6。好ましいクラスＢのＣｐＧ  ＯＤＮはしばしばチオリン酸ホスホロチオエート骨格を有し、好ましいクラスＡのＣｐＧ  ＯＤＮは混合またはキメラ骨格を有する一方、Ｃクラスの組み合わせモチーフ免疫刺激性核酸は、安定した、例えば、チオリン酸ホスホロチオエート、キメラ、またはホスホジエステルの骨格を有してもよく、いくつかの好ましい態様において、それらはセミソフトな骨格を有する。
【００８３】
一つの側面において、本発明は、この新しいクラスの組み合わせモチーフ免疫刺激性核酸に属する免疫刺激性核酸を提供する。Ｂ細胞刺激ドメインは、式：５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２３’により定義される。Ｄは、Ｃ以外のヌクレオチドである。Ｃは、シトシンである。Ｇは、グアニンである。Ｈは、Ｇ以外のヌクレオチドである。
Ｘ１およびＸ２は、０〜１０ヌクレオチド長の核酸配列のいずれでもよい。Ｘ１は、ＣＧを含んでもよく、この場合、好ましくはこのＣＧの直前にＴがある。いくつかの態様において、ＤＣＧは、ＴＣＧである。Ｘ１は、好ましくは０〜６ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、Ｘ２は、ポリＧまたはポリＡモチーフのいずれも含有しない。他の態様において、免疫刺激性核酸は、５’末端または３’末端にポリＴ配列を有する。本明細書中、「ポリＡ」または「ポリＴ」は、一続きの４または５以上の連続したＡまたはＴ、それぞれ例えば、５’ＡＡＡＡ３’または５’ＴＴＴＴ３’を意味する。
【００８４】
本明細書中、「ポリＧ末端」は、一続きの４または５以上の連続したＧ、例えば、核酸の５’末端または３’末端に生じる、５’ＧＧＧＧ３’を意味する。本明細書中、「ポリＧ核酸」は、式５’Ｘ１Ｘ２ＧＧＧＸ３Ｘ４３’を有する核酸を意味し、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとＸ３およびＸ４の１つは、Ｇである。
【００８５】
この式のもとで、Ｂ細胞刺激ドメインについてのいくつかの好ましいデザインは、ＴＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧＴ、ＴＴＣＧＴ、ＴＴＴＣＧＴ、ＴＣＧＴＣＧＴを含む。
核酸の第二のモチーフは、ＰまたはＮであり、Ｘ１のすぐ５’側またはＸ２のすぐ３’側に位置する。
【００８６】
Ｎは、Ｂ細胞中和配列であり、ＣＧＧトリヌクレオチドで始まり、少なくとも１０ヌクレオチド長である。Ｂ細胞中和モチーフは、少なくとも１つのＣｐＧ配列を含み、ここでＣＧは、Ｃが先行するか、またはＧが続くか（Krieg AM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 12631-12636）、あるいは、ＣＧのＣがメチル化されている、ＣＧ含有ＤＮＡ配列である配列含有のＣＧであり、ここで、ＣＧのＣは、メチル化される。本明細書中、「ＣｐＧ」は、３’グアニン（Ｇ）が続く５’シトシン（Ｃ）であり、リン酸結合により連鎖していする。５’ＣＧ３’の少なくともＣは、非メチル化されていなければならない。中和モチーフは、他の非刺激性モチーフ中に存在するとき、ある程度の免疫刺激能力を有するモチーフであるが、他の免疫刺激性モチーフの状況に存在するとき、他のモチーフの免疫刺激の潜在性を低減させる役目をする。
【００８７】
Ｐは、ＧＣ含量が高いパリンドロームであり、少なくとも１０ヌクレオチド長の配列を含有する。本明細書中、「パリンドローム」および、同等に、「パリンドローム配列」とは、逆方向反復のことであり、すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’などの配列であり、ここでＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’などは、通常のワトソンクリック塩基対を形成することができる塩基である。
本明細書中、「ＧＣ含量が高いパリンドローム」とは、ＧおよびＣを塩基組成物の少なくとも３分の２有するパリンドロームである。いくつかの態様において、ＧＣ含量が高いドメインは、好ましくは「Ｂ細胞刺激ドメイン」に対してへの３’である。１０塩基長のＧＣ含量が高いパリンドロームの場合、パリンドロームは、したがって少なくとも８つのＧおよびＣを含有する。１２塩基長のＧＣ含量が高いパリンドロームの場合、パリンドロームはまた、少なくとも８つのＧおよびＣを含有する。１４−ｍｅｒのＧＣ含量が高いパリンドロームの場合、パリンドロームの少なくとも１０の塩基は、ＧおよびＣである。いくつかの態様において、ＧＣ含量が高いパリンドロームは、ＧおよびＣのみで構成されている。
【００８８】
いくつかの態様において、ＧＣ含量が高いパリンドロームは、ＧおよびＣを塩基組成物の少なくとも８１％有する。かかる１０塩基長のＧＣ含量が高いパリンドロームの場合、パリンドロームは、したがってＧおよびＣのみで構成されている。かかる１２塩基長のＧＣ含量が高いパリンドロームの場合、パリンドロームの少なくとも１０の塩基（８３％）がＧおよびＣであることが好ましい。いくつかの好ましい態様において、１２塩基長のＧＣ含量が高いパリンドロームは、ＧおよびＣのみで構成されている。１４−ｍｅｒのＧＣ含量が高いパリンドロームの場合、パリンドロームの少なくとも１２の塩基（８６％）は、ＧおよびＣである。いくつかの好ましい態様において、１４塩基長のＧＣ含量が高いパリンドロームは、ＧおよびＣのみで構成されている。ＧＣ含量が高いパリンドロームのＣは、非メチル化され得るか、またはそれらはメチル化され得る。
【００８９】
一般的にこのドメインは、少なくとも３つのＣおよびＧを有し、より好ましくはそれぞれ４つ、および最も好ましくは、それぞれ５または６以上である。このドメインにおけるＣおよびＧの数は、同一である必要はない。ＣおよびＧは、自己相補的二重らせん、またはＣＣＧＣＧＣＧＧなどのパリンドロームを形成することができるよう、配置列されるのが好ましい。これは、ＡまたはＴにより中断されてもよいが、好ましい自己相補性は、少なくとも部分的に例えばモチーフＣＧＡＣＧＴＴＣＧＴＣＧ（配列番号： ）またはＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号： ）として保たれる。相補性が保たれないとき、非相補的塩基対は、ＴＧが好ましい。好ましい態様において、パリンドロームの一部ではない３つ以内の連続した塩基があり、好ましくは２つ以内、およびもっとの好ましくはたった１つである。いくつかの態様において、ＧＣ含量が高いパリンドロームは、少なくとも１つのＣＧＧ三量体、少なくとも１つのＣＣＧ三量体、または少なくとも１つのＣＧＣＧ四量体を含む。他の態様において、ＧＣ含量が高いパリンドロームは、ＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号： ）またはＧＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣ（配列番号： ）、ＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧ（配列番号： ）またはＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣ（配列番号： ）ではない。
ＧＣ含量が高い領域のＧの少なくとも１つは、イノシン（I）で置換してもよい。いくつかの態様において、Ｐは、Ｉを２つ以上含む。
【００９０】
ある態様において、免疫刺激性核酸は、以下の式の１つである：５’ＮＸ１ＤＣＧＨＸ２３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２Ｎ３’、５’ＰＸ１ＤＣＧＨＸ２３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２Ｐ３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２ＰＸ３３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＰＸ３３’、５’ＤＣＧＨＸ２ＰＸ３３’、５’ＴＣＧＨＸ２ＰＸ３３’、５’ＤＣＧＨＰＸ３３’、または５’ＤＣＧＨＰ３’。
【００９１】
他の側面において、本発明は、式：５’Ｎ１ＰｙＧＮ２Ｐ３’により定義される免疫刺激性核酸を提供する。Ｎ１は、１〜６ヌクレオチド長のいかなるどの配列でもよい。Ｐｙは、ピリミジンである。Ｇは、グアニンである。Ｎ２は、０〜３０ヌクレオチド長のいかなるどの配列でもよい。Ｐは、少なくとも１０ヌクレオチド長の配列を含有する、ＧＣ含量が高いパリンドロームである。
Ｎ１およびＮ２は、５０％以上のピリミジンを含有してもよく、より好ましくは、５０％以上のＴを含有してもよい。Ｎ１は、ＣＧを含有してもよく、この場合、好ましくはこのＣＧの直前にＴがある。いくつかの態様において、Ｎ１ＰｙＧは、ＴＣＧ（５’ＴＣＧＧを有するＯＤＮ  ５３７６など）であり、最も好ましくは、ＴＣＧＮ２であり、ここでＮ２は、Ｇではない。
【００９２】
Ｎ１ＰｙＧＮ２Ｐは、１または２以上のイノシン（Ｉ）ヌクレオチドを含んでもよい。Ｎ１中のＣまたはＧのいずれかは、イノシンにより置き換えられてもよいが、ＣｐＩは、ＩｐＧより好ましい。ＩｐＧなどのイノシンの置換については、最適な活性は、「セミソフト」なまたはキメラ骨格の使用により達成してもよく、ここでＩＧ間またはＣＩ間の連鎖は、ホスホジエステルである。Ｎ１は、少なくとも１つのＣＩ、ＴＣＩ、ＩＧまたはＴＩＧモチーフを含んでもよい。
【００９３】
ある態様において、Ｎ１ＰｙＧＮ２は、ＴＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧＴ、ＴＴＣＧＴ、ＴＴＴＣＧＴ、およびＴＣＧＴＣＧＴからなる群から選択される配列である。
Ｃクラス核酸のいくつかの非限定的なの例は、以下を含む：
【表３】
2006515277.tif 000005
【００９４】
細胞への取り込みを促進させるために、ＣｐＧ含有のオリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性核酸は、好ましくは８〜１００塩基長の範囲である。しかしながら、８ヌクレオチドより大きいいずれのどの大きさの核酸でも（大きいｋｂ長でさえも）、より大きな核酸は、細胞内でオリゴヌクレオチドに分解されるため、本発明によると、十分な免疫刺激性モチーフが存在する場合、本発明による免疫反応を誘導することができる。好ましくは、免疫刺激性核酸は、８〜１００ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの好ましい態様において、免疫刺激性核酸は、１２〜４０ヌクレオチド長である。より好ましい態様において、免疫刺激性核酸は、８〜３０ヌクレオチド長である。最も好ましい態様において、免疫刺激性核酸は、８〜２４ヌクレオチド長である。
【００９５】
「パリンドローム配列」は、逆方向反復、すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’などの配列を意味し、ここでＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’、ＣおよびＣ’、ＤおよびＤ’、およびＥおよびＥ’は、通常のワトソンクリック塩基対を形成することができる塩基である。In vivoにおいて、かかるパリンドローム配列は、二本鎖構造を形成してもよい。一つの態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、パリンドローム配列を含有する。この状況において使用されるパリンドローム配列は、パリンドロームのことであり、ここでＣｐＧは、パリンドロームの一部であり、好ましくはパリンドロームの中心である。別の態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、パリンドロームを含んでいない。パリンドロームを含んでいないＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがパリンドロームの一部ではないものである。かかるオリゴヌクレオチドは、パリンドロームを含んでもよく、ここでＣｐＧは、パリンドロームの中心ではない。
【００９６】
本発明のいくつかの態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、「ＣｐＧジヌクレオチド」である免疫刺激性モチーフを含む。ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていてもよくまたは非メチル化されていてもよいであり得る。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫刺激性核酸は、非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、非メチル化５’シチジンに３’グアノシンが続き、リン酸結合により連鎖していする）を含有し、免疫系を活性化する核酸分子である；かかる免疫刺激性核酸は、ＣｐＧ核酸である。ＣｐＧ核酸は、多数の発行交付済の特許、公開済の特許出願、および他の刊行物に記載されており、米国特許6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；および6,339,068を含む。
【００９７】
少なくとも１つのメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫刺激性核酸は、メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、メチル化５’シチジンに３’グアノシンが続き、リン酸結合により連鎖しているする）を含有し、免疫系を活性化する核酸である。他の態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドを含まない。ＣｐＧジヌクレオチドを含まないこれらのオリゴヌクレオチドは、非ＣｐＧオリゴヌクレオチドと呼ばれ、非ＣｐＧ免疫刺激性モチーフを有する。本発明は、したがって、メチル化または非メチル化されていてもよいであり得る他の型の免疫刺激性モチーフを有する核酸を包含する。本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドはさらに、メチル化および非メチル化ＣｐＧおよび非ＣｐＧ免疫刺激性モチーフのどの組み合わせも含み得る。
【００９８】
免疫刺激性核酸分子は、キメラ骨格を有してもよい。本発明の目的のために、キメラ骨格とは、部分的に安定化した骨格のことであり、ここで少なくと１つのインターヌクレオチド連鎖は、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様であり、ここで少なくとも１つの他のインターヌクレオチド連鎖は、安定化したインターヌクレオチド連鎖であり、ここで少なくとも１つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様連鎖および少なくとも１つの安定化した連鎖が異なる。ボラノホスホネート連鎖は、ホスホジエステル連鎖に対して安定化されていると報告されていることから、骨格のキメラ性質の目的のために、ボラノホスホネート連鎖は、状況に依存して、ホスホジエステル様としてまたは安定化として分類され得る。例えば、本発明のキメラ骨格は、一つの態様において、少なくとも１つのホスホジエステル（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）連鎖および少なくとも１つのボラノホスホネート（安定化した）連鎖を含み得る。
【００９９】
別の態様において、本発明のキメラ骨格は、ボラノホスホネート（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）およびチオリン酸ホスホロチオエート（安定化した）連鎖を含み得る。「安定化したインターヌクレオチド連鎖」は、ホスホジエステルインターヌクレオチド連鎖と比較して、例えば、エキソ−またはエンド−ヌクレアーゼを介した）in vivo分解に比較的耐性がある（例えば、エクソ−またはエンド−ヌクレアーゼ経由で）インターヌクレオチド連鎖を意味する。好ましい安定化したインターヌクレオチド連鎖は、限定はなく、チオリン酸ホスホロチオエート、ジチオリン酸ホスホロジチオエート、ホスホン酸メチルホスホネート、およびチオリン酸メチルホスホロチオエートメチルを含む。他の安定化したインターヌクレオチド連鎖は、限定はなく：ペプチド、アルキル、デホスホ(dephospho)、および上記の他のものを含む。
【０１００】
チオリン酸ホスホロチオエートなどの修飾された骨格を、ホスホルアミドまたはＨ−ホスホネートの化学反応を使った自動化技術を使用して合成してもよい。アリールおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許4,469,863に記載されているように作ることができ；およびアルキルホスホトリエステル（ここで、荷電酸素部分を米国特許5,023,243および欧州特許092,574に記載のようにアルキル化する）を、自動化固体相合成により、市販の試薬使用して調製することができる。他のＤＮＡ骨格修飾物および置換物を作る方法が、記載されている。Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90: 544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165。キメラオリゴヌクレオチドを調製する方法もまた、既知である。例えば、Uhlmannらに交付された特許に、かかる技術を記載している。
【０１０１】
混合骨格修飾されたＯＤＮを、市販のＤＮＡシンセサイザーおよび標準のホスホロアミダイト化学反応を使用して合成してもよい。（F. E. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK 1991およびM. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)）。カップリング連鎖後、ＰＳ連鎖を、Beaucage試薬(R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regan and S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)）（アセトニトリル中０．０７５Ｍ）またはフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を使用して硫化により導入し、無水酢酸、テトラヒドロフラン（１：１：８；ｖ：ｖ：ｖ）中２，６−ルチジンおよびＮ−メチルイミダゾール（テトラヒドロフラン中１６％）によるキャッピングが続く。このキャッピングステップを、硫化反応後に行い、チオリン酸ホスホロチオエート連鎖が存在位置すべき位置での望ましくないホスホジエステル（ＰＯ）連鎖の形成を最小限に抑える。例えば、ＣｐＧジヌクレオチドでの、ホスホジエステル連鎖の導入の場合、中間リン−ＩＩＩを、水／ピリジン中のヨウ素溶液を用いた処置により酸化する。
【０１０２】
固体支持体からの開裂および濃アンモニアを用いた処置（５０℃で１５時間）による最終的な脱保護の後、ＯＤＮを、ＮａＣｌ勾配（例、緩衝液Ａ：アセトニトリル／水＝１：４／ｖ：ｖ中１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／水＝１：４／ｖ：ｖ  ｐＨ６．８；緩衝液Ｂ：１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、アセトニトリル／水＝１：４／ｖ：ｖ中１．５ＭのＮａＣｌ／水＝１：４／ｖ：ｖ；５〜６０％のＢ  １ｍｌ／分で３０分）を使用してGen-Pak Faxカラム（Millipore-Waters）上でＨＰＬＣによりまたはキャピラリーゲル電気泳動により分析する。ＯＤＮを、Source High Performanceカラム（Amersham Pharmacia）上でＨＰＬＣによりまたはＦＰＬＣにより精製することができる。ＨＰＬＣのと同質一の分画をは組み合わせ、Ｃ１８カラム経由でまたは限外ろ過により組み合わせ、脱塩する。ＯＤＮを、計算した質量を確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。
【０１０３】
本発明の核酸はまた、他の修飾を含むことができる。これらは、アルキル−およびアリール−ホスフェート（ここで、荷電しているホスホネートの酸素を、アルキルまたはアリール基により置き換すえる）、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル、ここで荷電酸素部分がアルキル化されている、などの、非イオン性のＤＮＡ類似体を含む。いずれかまたは両方の末端にテトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを含む核酸もまた、実質的にヌクレアーゼ分解に耐性があることがを示されしている。
【０１０４】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ソフトまたはセミソフトなオリゴヌクレオチドであってよい。ソフトなオリゴヌクレオチドは、部分的に安定化した骨格を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、ここでホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、少なくとも１つの内部(internal)ピリミジン−プリンジヌクレオチド（ＹＺ）内でのみでおよびそれに直接隣接してのみ生じる。好ましくは、ＹＺは、ＹＧであり、ピリミジン−グアノシン（ＹＧ）ジヌクレオチドである。少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチド自体は、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖を有する。少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドに直接隣接して生じるホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドに対してへの５’、３’、または５’および３’の両方であることができる。
【０１０５】
特に、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、「内部ジヌクレオチド」を伴う。内部ジヌクレオチドは一般的に、インターヌクレオチド連鎖により結合した隣接したヌクレオチドのどの対を意味してもよく、ここでヌクレオチド対のいずれのヌクレオチドも、末端ヌクレオチドではなく、すなわち、ヌクレオチド対のいずれのヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端を定義すづけるヌクレオチドではない。
【０１０６】
したがって、ｎヌクレオチド長である直鎖状オリゴヌクレオチドは、合計ｎ−１のジヌクレオチドおよびたったｎ−３の内部ジヌクレオチドを有する。内部ジヌクレオチド中の各インターヌクレオチド連鎖は、内部インターヌクレオチド連鎖である。したがって、ｎヌクレオチド長である直鎖状オリゴヌクレオチドは、合計ｎ−１のインターヌクレオチド連鎖およびたったｎ−３の内部インターヌクレオチド連鎖を有する。戦略的に配位置したホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、したがって、核酸配列におけるヌクレオチドの全てのどの対の間に位置してもよいするホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖をいうのことである。いくつかの態様において、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、５’または３’末端に一番近いヌクレオチド対のいずれかの間に位置しない。
【０１０７】
好ましくは、少なくとも１つの内部ＹＺジヌクレオチドに直接隣接して生じるホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、それ自体内部インターヌクレオチド連鎖である。したがって、配列Ｎｌ  ＹＺ  Ｎ２について、ここでＮｌおよびＮ２はそれぞれ、他から独立して、単一のヌクレオチドのいずれでもあり、ＹＺジヌクレオチドは、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖を有し、および加えて（ａ）Ｎ１およびＹは、Ｎｌが内部ヌクレオチドのとき、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖により連鎖し、（ｂ）ＺおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドのとき、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖により連鎖し、または（ｃ）ＮｌおよびＹは、Ｎｌが内部ヌクレオチドのとき、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖により連鎖し、そしてＺおよびＮ２は、Ｎ２が内部ヌクレオチドのとき、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖により連鎖する。
【０１０８】
本発明のソフトなオリゴヌクレオチドは、完全に安定化したオリゴヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼの開裂に比較的感受性があると信じられている。特定の理論またはメカニズム機構に結び付く意味はなく、本発明のソフトなオリゴヌクレオチドは、ソフトな全長オリゴヌクレオチドに対して免疫刺激活性が低いまたは無いフラグメントに開裂可能であると信じられている。特にオリゴヌクレオチドの中央付近への、少なくとも１つのヌクレアーゼ感受性のインターヌクレオチド連鎖の取り込みは、オリゴヌクレオチドの薬物動態を変える「オフスイッチ」を提供し、オリゴヌクレオチド最大免疫刺激活性の継続期間を低減させると信じられている。これは、慢性の局所の炎症または免疫刺激、例えば、腎臓に関する障害を回避するのが望ましい組織および臨床用途における組織において特別な価値があるり、ここで、慢性の局所の炎症または免疫刺激、例えば、腎臓に関する障害を回避するのが望ましい。
【０１０９】
セミソフトなオリゴヌクレオチドは、部分的に安定化した骨格を有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、ここで、ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、少なくとも１つの内部ピリミジン−プリン（ＹＺ）ジヌクレオチド内でのみ生じる。セミソフトなオリゴヌクレオチドは一般的に、対応する完全に安定化した免疫刺激性オリゴヌクレオチドと比べてに関する増大した免疫刺激効力を有する。セミソフトなオリゴヌクレオチドのより大きい効力のため、セミソフトなオリゴヌクレオチドは、ある場合には、より低い効果的な濃度で使用してもよく、所望の生物学的効果を達成するのに、従来の完全に安定化した免疫刺激性オリゴヌクレオチドよりもより低い有効な用量を有する。
【０１１０】
セミソフトなオリゴヌクレオチドの前述の特性は一般的に、内部ＹＺジヌクレオチドを伴うホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖の「用量」の増加に伴って増加すると信じられている。したがって、例えば、一般的に、５つの内部ＹＺジヌクレオチドを有するあるオリゴヌクレオチド配列について、５つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド連鎖を有するオリゴヌクレオチドは、４つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＧインターヌクレオチド連鎖を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性があり、同様に、３つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド連鎖を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性があり、同様に、２つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド連鎖を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性があり、同様に、１つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド連鎖を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫刺激性があると信じられている。重要なことに、１つの内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド連鎖の含有でさえも、内部ホスホジエステルまたはホスホジエステル様ＹＺインターヌクレオチド連鎖が無いより有利であると信じられている。ホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖の数に加えて、核酸全長での位置もまた、効力に影響を与え得る。
【０１１１】
ソフトおよびセミソフトなオリゴヌクレオチドは一般的に、好ましい内部位置におけるホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖に加えて、分解に耐性がある５’および３’末端を含むだろう。かかる分解耐性末端は、対応する非修飾末端にわたるエキクソヌクレアーゼの消化に対する増大した耐性をもたらすの結果になる全てのどんな好適な修飾をも含み伴い得る。例えば、５’および３’末端は、骨格の少なくとも１つのリン酸修飾の含有により安定化され得る。好ましい態様において、各末端での骨格のは少なくとも１つのリン酸修飾は、独立してチオリン酸ホスホロチオエート、ジチオリン酸ホスホロジチオエート、ホスホン酸メチルホスホネート、またはチオリン酸メチルホスホロチオエートメチルインターヌクレオチド連鎖である。別の態様において、分解耐性末端は、３’末端でペプチドまたはアミド連鎖により結合接続した１または２以上のヌクレオチド単位を含む。
【０１１２】
ホスホジエステルインターヌクレオチド連鎖は、自然界で見出された核酸の特徴を示す連鎖の型である。ホスホジエステルインターヌクレオチド連鎖は、２つの架橋酸素原子により隣接し、およびまた、一方は荷電のおよび他方は非荷電の、２つの追加の酸素原子により結合したリン原子を含む。ホスホジエステルインターヌクレオチド連鎖は、オリゴヌクレオチドの組織半減期を低減させることがのに重要であるとき、特に好ましい。
【０１１３】
ホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、化学的におよび／またはジアステレオマー的に(diastereomerically)ホスホジエステルに似ているリン含有の架橋基の部分である。ホスホジエステルへの類似性の測定は、ヌクレアーゼの消化への感受性およびＲＮＡｓｅ  Ｈを活性化する能力を含む。したがって例えば、ホスホジエステルであるが、チオリン酸ホスホロチオエートではない、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼの消化に感受性がある一方、ホスホジエステルおよびチオリン酸ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの両方は、ＲＮＡｓｅ  Ｈを活性化する。好ましい態様において、ホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、ボラノホスフェート（または同等に、ボラノホスホネート）連鎖である。米国特許5,177,198；米国特許5,859,231；米国特許6,160,109；米国特許6,207,819；Sergueev et al., (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27。別の好ましい態様において、ホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖は、ジアステレオマー的に純粋なＲｐチオリン酸ホスホロチオエートである。ジアステレオマー的に純粋なＲｐチオリン酸ホスホロチオエートは、ヌクレアーゼの消化に対してより感受性でがあり、ＲＮＡｓｅ  Ｈの活性化において、混合またはジアステレオマー的に純粋なＳｐチオリン酸ホスホロチオエートよりも良好であると信じられている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体は、同時係属の1999年7月27日出願の米国特許出願09/361,575、および公開済のＰＣＴ出願PCT/US99/17100（WO 00/06588）の主題対象である。本発明の目的のためには、用語「ホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖」は、特異的にジチオリン酸ホスホロジチオエートおよびホスホン酸メチルホスホネートインターヌクレオチド連鎖を除くことに注意すべきである。
【０１１４】
上述のように、本発明のソフトおよびセミソフトなオリゴヌクレオチドは、ＣおよびＧの間にホスホジエステル様連鎖を有してもよい。ホスホジエステル様連鎖の一例は、Ｒｐ構造におけるチオリン酸ホスホロチオエート連鎖である。オリゴヌクレオチドのｐ−キラリティーは、活性を測定する時点に依存して、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの免疫活性に明らかに反対の効果を有することができる。４０分の早い時点で、チオリン酸ホスホロチオエートＣｐＧオリゴヌクレオチドのＲｐではあるがＳｐではない立体異性体は、マウス脾臓細胞におけるＪＮＫのリン酸化を誘導する。対照的に、４４時間の遅い時点で検定アッセイしたときには、ＳｐではあるがＲｐではない立体異性体は、脾臓細胞の増殖のを刺激するのにおいて活性である。ＲｐおよびＳｐ立体異性体の速度論および生物活性におけるこの違いは、細胞の取り込みにおけるどの違いからの結果に由来しでもないが、むしろｐ−キラリティーの２つの対立する生物学的役割によるものである可能性が最も高い。第一に、早い時点での免疫細胞を刺激することに関してはついて、Ｓｐと比較したＲｐの立体異性体の向上した活性は、Ｓｐと比較して、ＣｐＧ受容体である、ＴＬＲ９との相互作用、または下流情報伝達経路の誘導において、より有効であってもよいことを示す。他方では、Ｓｐと比較したて、Ｒｐ  ＰＳ−オリゴヌクレオチドのより速い分解は、情報伝達のより短い継続期間をもたらすため、Ｓｐ  ＰＳ−オリゴヌクレオチドが、遅い時点で試験したとき、生物学的により活性であるようである。らしいように情報伝達のより短い継続期間をもたらす。
【０１１５】
驚くべき強力な効果は、ＣｐＧジヌクレオチド自体においてｐ−キラリティーにより達成される。立体ランダム(stereo-random)なＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較して、単一のＣｐＧジヌクレオチドがＲｐでにおいて連鎖した同族体は、わずかにより活性であった一方、Ｓｐ連鎖含有の同族体は、脾臓細胞の増殖の誘導についてほぼ不活性であった。
【０１１６】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドの大きさ（すなわち、核酸の全長でのヌクレオチド残基の数）もまた、オリゴヌクレオチドの刺激性活性に貢献してもよい。細胞への取り込みを促進させるために、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは好ましくは、最短６ヌクレオチド残基を有する。６ヌクレオチドよりも大きいなどの大きさの核酸でも（大きいｋｂ長でさえも）、より大きな核酸は、細胞内で分解されるため、十分な免疫刺激性モチーフが存在する場合、本発明によると、免疫反応を誘導することができる。本発明者らは、４ヌクレオチドくらい短いセミソフトなオリゴヌクレオチドもまた、細胞の内部に送達され得る場合、免疫刺激性でがあり得ると信じている。本発明によるある好ましい態様において、本発明によると、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、４〜１００ヌクレオチド長である。典型的な態様において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、６〜４０ヌクレオチド長である。ある好ましい態様において、本発明によると、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、６〜１９ヌクレオチド長である。
【０１１７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは一般的に、４〜１００、いくつかの態様において、１０〜４０の範囲の長さを有する。長さは、１６〜２４ヌクレオチドの範囲であってもよい。
【０１１８】
用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」もまた、塩基および／または糖類などのにおいて置換または修飾を有する核酸またはオリゴヌクレオチドを包含する。例えば、これらは、２’位のヒドロキシル基以外のおよび５’位のリン酸基またはヒドロキシ基以外の低分子量の有機基に共有結合した骨格糖類を有する核酸を含む。したがって修飾核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含んでもよい。加えて、修飾核酸は、リボースの代わりにアラビノースまたは２’−フルオロアラビノースなどの糖類を含んでもよい。したがって、核酸は、骨格組成物において異質（heterogeneous）ヘテロ遺伝子であってもよく、それにより、（核酸塩基と共にアミノ酸骨格を有する）ペプチド核酸などと一緒に連鎖したポリマー単位のどの可能な組み合わせでも含有する。
【０１１９】
核酸もまた、Ｃ−５プロピン、ピリミジンおよび７−デアザ−７−置換プリン修飾された塩基などの置換プリンおよびピリミジンを含む。Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4。プリンおよびピリミジンは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロシトシン、，２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、および他の天然および非天然由来の核酸塩基、置換および非置換の芳香族部分を含むが、それらに限定されない。他のかかる修飾は、当業者に周知である。
【０１２０】
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、天然ＲＮＡおよびＤＮＡと比較して、様々な化学修飾および置換を包含することができ、ホスホジエステルインターヌクレオチド架橋、β−Ｄ−リボース単位および／または天然ヌクレオチド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）を含む伴う。化学修飾の例は、当業者に既知であり、例えば、Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90: 543；"Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993；Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36: 107-129；およびHunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7: 331-417に記載がある。本発明によるオリゴヌクレオチドは、本発明によると、１または２以上の修飾を有してもよく、ここで各修飾は、天然ＤＮＡまたはＲＮＡからなる同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルインターヌクレオチド架橋および／または特定のβ−Ｄ−リボース単位および／または特定の天然ヌクレオチド塩基位置に位置する。
【０１２１】
例えば、本発明は、１または２以上の修飾を含むオリゴヌクレオチドに関し、ここで各修飾は、独立して：
ａ）修飾されたインターヌクレオチド架橋によりヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステルインターヌクレオチド架橋の置換、
ｂ）デホスホ架橋によるヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステル架橋の置換、
ｃ）別の単位による糖リン酸骨格からの糖リン酸単位の置換、
ｄ）修飾された糖単位によるβＰ−Ｄ−リボース単位の置換、および
ｅ）修飾されたヌクレオチド塩基による天然ヌクレオチド塩基の置換、
から選択される。
オリゴヌクレオチドの化学修飾についてのより詳細な例は、以下の通りである。
【０１２２】
ヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステルインターヌクレオチド架橋を、修飾されたインターヌクレオチド架橋により置き換えることができ、ここで、修飾されたインターヌクレオチド架橋は、例えばチオリン酸ホスホロチオエート、ジチオリン酸ホスホロジチオエート、ＮＲ１Ｒ２−ホスホルアミデートド、ボラノホスフェート、α−ヒドロキシベンジルホスホネート、ホスフェート−（Ｃ１−Ｃ２ｌ）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート−［（Ｃ６−Ｃ１２）アリール（Ｃ１−Ｃ２ｌ）−Ｏ−アルキル］エステル、，（Ｃ１−Ｃ８）アルキルホスホネートおよび／または（Ｃ６−Ｃ１２）アリールホスホネート架橋、（Ｃ７−Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチル−アリール（例、WO95/01363に開示）から選択され、ここで、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ２０）アリールおよび（Ｃ６−Ｃ１４）アリールは、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノにより随意に置換され、およびここでＲ１およびＲ２は、互いに独立して、水素、，（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、（Ｃ６−Ｃ２０）−アリール、（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、好ましくは  水素、，（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、好ましくは（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルおよび／またはメトキシエチルであり、あるいはＲ１およびＲ２は、それらを有する窒素原子と共に、群Ｏ、ＳおよびＮからのさらなるヘテロ原子を更に含み得る５〜６員の複素環を形成する。
【０１２３】
デホスホ架橋によるヌクレオチドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステル架橋の置換（デホスホ架橋は、例えば、Uhlmann E and Peyman A in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotide and Analogs", S. Agrawal、Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ffに記載がある）、ここで、デホスホ架橋は、例えばデホスホ架橋ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチル−ヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよび／またはシリル基から選択される。
【０１２４】
糖リン酸骨格からの糖リン酸単位（すなわち、一緒に糖リン酸単位を形成するβ−Ｄ−リボースおよびホスホジエステルインターヌクレオチド架橋）(すなわち、糖リン酸骨格は、糖リン酸単位からなる)は、別の単位により置き換えることができ、ここで他の単位は、例えば「モルホリノ誘導体」オリゴマー(例えば、Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17: 6129-41に記載のように)、つまり、例えば、モルホリノ誘導体単位による置換を作る;またはポリアミド核酸(「ＰＮＡ」；例えば、Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5: 3-7に記載のように）、つまり、例えば、ＰＮＡ骨格単位による、例えば、２−アミノエチルグリシンによる置換を作るのに好適である。
【０１２５】
β−リボース単位またはβ−Ｄ−２’−デオキシリボース単位は、修飾された糖単位により置き換えることができ、ここで、修飾された糖単位は、例えばβ−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボース、好ましくは２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボースは、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２,、４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリストロ−ヘキソ−ピラノース、ならびに炭素環（例えば、Froehler J (1992) Am Chem Soc 114: 8320に記載）および／または開鎖糖類似体（例えば、Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49: 7223に記載）および／または二環糖類似体（例えば、Tarkov M et al. (1993) Helv Chine Acta 76: 481に記載）から選択される。
【０１２６】
いくつかの好ましい態様において、糖は、特にホスホジエステルまたはホスホジエステル様インターヌクレオチド連鎖により連鎖した一方または両方のヌクレオチドについて、２’−Ｏ−メチルリボースである。
【０１２７】
核酸もまた、Ｃ−５プロピン、ピリミジンおよび７−デアザ−７−置換プリン修飾された塩基などの置換プリンおよびピリミジンを含む。Wagner RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4。プリンおよびピリミジンは、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン、ならびに他の天然および非天然由来の核酸塩基、置換および非置換の芳香族部分を含むが、それらに限定されない。
【０１２８】
修飾された塩基は、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ａ、およびＵなどのＤＮＡおよびＲＮＡにおいて典型的に見出されるた天然由来の塩基からは化学的に相異なるが、これらの天然由来の塩基と基本的な化学構造を共有するどんな塩基でもよい。修飾されたヌクレオチド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ウラシル、ジヒドロウラシル、プソイド（pseudo）ウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、，５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、，５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノ−プリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、好ましくは７−デアザ−７−置換および／または７−デアザ−８−置換プリン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、例えば、Ｎ４−エチルシトシン、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン、例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン、６−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオチド、Ｃ５−プロピニルピリミジン、ならびにおよびジアミノプリン、例えば、２,、６−ジアミノプリン、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、ヒポキサンチンまたは天然ヌクレオチド塩基の他の修飾物から選択されてもよい。このリストは、例示典型的なものであり、限定と解釈されない。
【０１２９】
本明細書中に記載の特定の式中の、一連組の修飾された塩基を定義する。例えば文字Ｙは、シトシンまたは修飾されたシトシン含有のヌクレオチドの意味で使用される。修飾されたシトシンとは、本明細書中、この塩基をオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を低下させることなく置き換えることができる、シトシンの天然由来のまたは非天然由来のピリミジン塩基類似体である。
【０１３０】
修飾されたシトシンは、５−置換シトシン（例、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン、および非置換または置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、プソイド−イソシトシン、縮合環系を有するシトシン類似体（例、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）、ならびにウラシルおよびその誘導体（例、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル，５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）を含むが、それらに限定されない。いくつかの好ましいシトシンは、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、およびＮ４−エチル−シトシンを含む。本発明の別の態様において、シトシン塩基は、ユニバーサル塩基（例、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基）、芳香族環系（例、フルオロベンゼンまたはジフルオロベンゼン）または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）により置換される。
【０１３１】
文字Ｚは、グアニンまたは修飾されたグアニン塩基の意味で使用される。修飾されたグアニンは、本明細書中、この塩基オリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を低下させることなくこの塩基を置き換えることができる、グアニンの天然由来のまたは非天然由来のプリン塩基類似体である。修飾されたグアニンは、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニンなど）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例、Ｎ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）、８−置換グアニン（例、８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）、および６−チオグアニンを含むが、それらに限定されない。本発明の別の態様において、グアニン塩基は、ユニバーサル塩基（例、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール、およびＫ−塩基）、芳香族環系（例、ベンズイミダゾールまたはジクロロ−ベンズイミダゾール、，１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボンキシル酸アミド）または水素原子（ｄＳｐａｃｅｒ）により置換される。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドは、１または２以上のアクセス可能な５’末端を有してもよい。２つのかかる５’末端を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを作り出すことが可能である。これを、例えば、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドを作製す発生させるために、３’３’連鎖を介してを通じて２つのオリゴヌクレオチドを結合接触させることにより達成してもよい。３’３’連鎖は、ホスホジエステル、チオリン酸ホスホロチオエートまたはどの他の修飾されたインターヌクレオチド架橋でもよい。かかる連鎖を成し遂げる方法は、当業者に既知である。例えば、かかる連鎖は、Seliger, H.; et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'- and 5'-5'-internucleotide linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleotides & Nucleotides (1991), 10 (1-3), 469-77およびJiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7 (12), 2727-2735に記載されている。
【０１３３】
加えて、３’末端ヌクレオチド間の連鎖がは、ホスホジエステル、チオリン酸ホスホロチオエートまたは他の修飾された架橋ではない、３’３’連鎖核酸はを、トリ−またはテトラ−エチレングリコールホスフェートリン酸部分などの追加のスペーサーを使用して調製することができる（Durand, M. et al, Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA) 12 and two (dT) 12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31 (38), 9197-204、米国特許5658738、および米国特許5668265）。あるいは、非ヌクレオチドリンカーは、エタンジオール、プロパンジオールが、または標準のホスホロアミダイト化学反応を使用して、脱塩基（abasic）デオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）単位にが由来であっしてもよい（Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22 (11), 2022-7）。非ヌクレオチドリンカーを、１回または複数回組み込むことができるか、あるいは互いに結合することができ、連鎖されるべきする２つのＯＤＮの３’末端間のどの所望の距離も可能にする。
【０１３４】
本発明における使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で周知の多数の手順を使用して、新たに合成することができる。例、ｂ−シアノエチルホスホロアミダイト法（Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H., Tet. Let. 22: 1859,1981）；ヌクレオチドＨ−ホスホネート法（Garegg et al., Tet. Let. 27: 4051-4054,1986; Froehler et al, Nucl. Acid. Res. 14: 5399-5407, 1986,; Garegg et al, Tet. Let. 27: 4055-4058, 1986, Gaffney et al., Tet. Let. 29: 2619-2622, 1988）。これらの化学反応を、市場に流通している様々な自動化核酸シンセサイザーにより、行なうことができる。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドという。単離したオリゴヌクレオチドとは、は一般的に、自然界で通常関連する成分から分離されたオリゴヌクレオチドをいうである。一例として、単離したオリゴヌクレオチドは、細胞から、細胞核から、ミトコンドリアからまたはクロマチンから分離したものであってもよい。
【０１３５】
オリゴヌクレオチドは、部分的に分解に耐性がある（例えば、安定化している）。「安定化したオリゴヌクレオチド分子」は、（例えば、エキソ−またはエンド−ヌクレアーゼを介した）in vivo分解に（例えば、エクソ−またはエンド−ヌクレアーゼ経由で）比較的耐性があるオリゴヌクレオチドを意味する。核酸の安定化は、骨格修飾により経由で成し遂げることができる。チオリン酸ホスホロチオエート連鎖を有するオリゴヌクレオチドは、最大活性を提供し、細胞内エキクソ−およびエンド−ヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護する。他の修飾されたオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルおよびチオリン酸ホスホロチオエート核酸の組み合わせ、ホスホン酸メチルホスホネート、チオリン酸メチルホスホロチオエートメチル、ジチオリン酸ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ、およびこれらの組み合わせを含む。
【０１３６】
チオリン酸ホスホロチオエートなどの修飾された骨格は、ホスホルアミドまたはＨ−ホスホネートの化学反応を使った自動化技術を使用して合成してもよい。アリールおよびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許4,469,863に記載したように作ることができ；アルキルホスホトリエステル（ここで、荷電酸素部分は、米国特許5,023,243および欧州特許092,574に記載したようにアルキル化されている）は、市販の試薬を使用して自動化固体相合成により調製することができる。他のＤＮＡ骨格修飾および置換を作る方法は、記載がある（例、Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544,1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165,1990)。
【０１３７】
他の安定化したオリゴヌクレオチドは、以下のものを含む：アルキル−およびアリール−ホスフェート（ここで、荷電ホスホネート酸素(phosphonate oxygen)は、アルキルまたはアリール基により置き換えられる）などの非イオン性のＤＮＡ類似体、ホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステル、ここで、荷電酸素部分は、アルキル化されている。末端の一方または両方にテトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを含む核酸はまた、末端の一方または両方で、実質的にヌクレアーゼ分解に耐性があることを示している。
【０１３８】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドもまた、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体部分の間で１または２以上の通常と異なる異常な連鎖を含有してもよい。通常のインターヌクレオシド連鎖は、３’５’連鎖である。他の全ての連鎖は、２’５’、５’５’、３’３’、２’２’、２’３’連鎖などの通常と異なる異常なインターヌクレオシド連鎖と見なす。それにより、２’から５’の命名法は、リボースの炭素原子に従って選択される。しかしながら、環拡大糖類似体（例、ヘキサノース(hexanose)、シクロヘキセンまたはピラノース）または二−または三環式糖類似体などの非天然糖部分を使う場合、この命名法は、単量体の命名法に従って変わる。３’−デオキシ−β−Ｄ−リボピラノース類似体（ｐ−ＤＮＡとも呼ばれる）において、モノヌクレオチドは、例えば４’２’連鎖経由で結合接続する。
【０１３９】
ヌクレオチドが、１つの３’３’連鎖を含む場合、このオリゴヌクレオチド類似体は、非連鎖の５’末端を有するだろう。同様に、ヌクレオチドが、１つの５’５’連鎖を有する場合、このオリゴヌクレオチド類似体は、２つの非連鎖の３’末端を有するだろう。ヌクレオチドの非連鎖の末端のアクセス可能性は、それらの受容体によって、よりアクセス可能であってもよい。通常と異なる異常な連鎖（３’３’および５’５’）の両方の型については、Ramalho Ortigaoら（Antisense Research and Development (1992) 2, 129-46）による記載があり、これにより、３’３’連鎖を有するオリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼによる開裂に対する向上した安定性を示すことが報告された。
【０１４０】
連鎖の異なる型もまた、１つの分子内で結合することができ、オリゴマーの分枝化へと至らしめる。オリゴヌクレオチドの一部が、３’末端で３’３’連鎖を介して経由で第二のオリゴヌクレオチド部分におよび２’末端で２’３’連鎖を介して経由で分子の第三の部分に結合した場合、これは、３つの５’末端（３’３’、２’３’分枝）を有する分枝状オリゴヌクレオチドをもたらす。
【０１４１】
原則として、オリゴヌクレオチドの異なる部分の間または異なるオリゴヌクレオチドの間の連鎖はそれぞれ、その受容体による認識に負の干渉緩衝をしない限りは、分子の全部分を介して経由で生じ得る。核酸の性質に従って、連鎖は糖部分（Ｓｕ）、複素環核酸塩基  （Ｂａ）またはリン酸骨格（Ｐｈ）を伴うことができる。したがって、Ｓｕ−Ｓｕ、Ｓｕ−Ｐｈ、Ｓｕ−Ｂａ、Ｂａ−Ｂａ、Ｂａ−Ｓｕ、Ｂａ−Ｐｈ、Ｐｈ−Ｐｈ、Ｐｈ−Ｓｕ、およびＰｈ−Ｂａ型の連鎖が可能である。オリゴヌクレオチドが、ある非ヌクレオチド置換基によりさらに修飾される場合、連鎖もまた、オリゴヌクレオチドの修飾された部分を介して経由で生じ得る。これらの修飾もまた、修飾核酸、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはモルホリノオリゴヌクレオチド類似体を含む。
【０１４２】
連鎖は、好ましくはＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｂ、Ｐ、およびハロゲンからなり、３〜３００原子を含む。３原子の一例は、アセタール連鎖（ＯＤＮ１−３’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−３’−ＯＤＮ２；Froehler and Matteucci）であり、例えば、１つのヌクレオチドの３’−ヒドロキシ基を第二のオリゴヌクレオチドの３’−ヒドロキシ基に結合する。約３００原子の一例は、ＰＥＧ−４０（テトラコンタポリエチレングリコール）である。好ましい連鎖は、ホスホジエステル、チオリン酸ホスホロチオエート、ホスホン酸メチルホスホネート、ホスホルアミデートド、ボラノホスホネートン酸、アミド、エーテル、チオエーテル、アセタール、チオアセタール、ウレア、チオウレア、スルホンアミド、シッフ塩基およびジスルフィド連鎖である。別の可能性は、Solulink BioConjugation System（www.trilinkbiotech.com）の使用である。
【０１４３】
オリゴヌクレオチドが、２または３以上の配列部分からなる場合、これらの部分は、同一または異なり得る。したがって、３’３’連鎖を有するオリゴヌクレオチドにおいて、配列は、同一の５’−ＯＤＮ１−３’３’−ＯＤＮ１−５’または異なる５’−ＯＤＮ１−３’３’−ＯＤＮ２−５’であり得る。さらに、様々なオリゴヌクレオチド部分ならびにそれらに結合するリンカーの化学修飾は、異なってもよい。短いオリゴヌクレオチドの取り込みが、長いオリゴヌクレオチドより非効率的なようであるため、２または３以上の短い配列の連鎖は、免疫刺激の改善をもたらす。短いオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは２〜２０ヌクレオチド、より好ましくは３〜１６ヌクレオチドだが、最も好ましくは  ５〜１０ヌクレオチドである。好ましくは、２または３以上の非連鎖の５’末端を有する連鎖オリゴヌクレオチドである。
【０１４４】
オリゴヌクレオチドの部分配列もまた、非ヌクレオチドリンカー、特に脱塩基リンカー（ｄＳｐａｃｅｒｓ）、トリエチレングリコール単位またはヘキサエチレングリコール単位により連鎖してもよい。さらに好ましいリンカーは、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ１２のアミノリンカーなどのアルキルアミノリンカー、およびまたＣ３またはＣ６のチオールリンカーなどのアルキルチオールリンカーである。オリゴヌクレオチドもまた、さらにアルキルまたは置換アルキル基により置換してもよい芳香族残基によって、連鎖することができる。オリゴヌクレオチドもまた、ダブラー(Doubler)またはトレブラー(Trebler)単位（www.glenres.com）、特に３’３’連鎖を有するオリゴヌクレオチドを含んでもよい。複数のダブラー、トレブラー、または他の乗数単位によるオリゴヌクレオチドの分枝化は、本発明のさらなる態様であるデンドリマー（dendrimer）へと至らしめる。オリゴヌクレオチドもまた、ペプチド修飾試薬またはオリゴヌクレオチド修飾試薬（www.glenres.com）に由来起因するリンカー単位を含んでもよい。さらに、ペプチド（アミド）連鎖により結合接続する１または２以上の天然または非天然アミノ酸残基を含んでもよい。
【０１４５】
オリゴヌクレオチドを連鎖する別の可能性は、複素環塩基の架橋を介するもの経由である（Verma and Eckstein; Annu. Rev. Biochem. (1998) 67: 99-134; 124頁）。さらに別の可能性は、１つの配列部分の糖部分と別の配列部分の複素環塩基との間の連鎖である（Iyer et al. Curr. Opin. Mol. Therapeutics (1999) 1: 344-358; 352頁）。
【０１４６】
異なるオリゴヌクレオチドは、確立された方法により合成され、固体相合成中オンラインで一緒に連鎖することができる。あるいは、それらを、個々の部分配列の合成後、一緒に連鎖してもよい。
【０１４７】
「対象」とは、ヒトまたは脊髄動物を意味し、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、非ヒトの霊長類（例、サル）、魚（養殖種、例えば、サケ）、ウサギ、ラット、およびマウスを含むがこれらに限定されない。
【０１４８】
「ウィルス感染を有する対象」とは、ウィルスに曝露されていて、急性のまたは慢性の徴候あるいまたは体内に検出可能なレベルウィルスを有するで対象である。本発明の好ましい態様において、対象は、慢性のウィルス感染を有するものであり、より好ましくは、慢性のＣ型肝炎感染を有するものである。本発明の重要な側面において、対象は、Ｃ型肝炎感染の以前の治療に無反応であるものである。例えば、無反応である対象は、本明細書中に記載のように、Ｃ型肝炎感染について、例えば、ＩＦＮ−α（例、イントロンＡ）により以前に処置したが、かかる処置がは成功しなかったものを含む。本発明は、有効な処置に優先順位を付けるために、無反応である対象を処置することを、そしてある場合には無反応であるであろう対象を確認同定することを意図する。
【０１４９】
免疫刺激性核酸は、どんな脊椎動物においても有効であり得る。異なる免疫刺激性核酸は、哺乳動物種に依存して最適な免疫刺激を引き起こし得る。したがって、ヒトでは最適な刺激または抑制を引き起こす免疫刺激性核酸は、ヒトでは最適な刺激または抑制を引き起こすが、マウスでは最適な刺激または抑制を引き起こさないかもしれずなく、逆もまた同様である。当業者は、本明細書中に提供支給した教示指導を使用して、本明細書中に記載のおよび／または当業者に既知である通常の検定アッセイを使用して、目的の関心のある特定の哺乳動物種に有用な最も適切な免疫刺激性核酸を確認同定することができる。
【０１５０】
免疫刺激性核酸を、対象に直接投与してもよく、または核酸送達複合体と併せて投与してもよい。「核酸送達複合体」とは、ターゲティング手段標的とする方法と関連する（例えば、イオンまたは共有結合している、または内部に封入してある）核酸分子を意味する（例えば、標的細胞（例、ｐＤＣまたはＢ細胞）へのより高い親和性結合および／または標的細胞による増大した細胞の取り込みをもたらす分子）。核酸送達複合体の例は、ステロール（例、コレステロール）、脂質（例、陽イオン性脂質、ビロソーム(virosome)またはリポソーム）、または標的細胞に特異的な結合剤（例、標的細胞に特異的な受容体により認識されるリガンド）に関連する核酸を含む。好ましい複合体は、標的細胞によるインターナリゼーション内在化の前に著しい分離非連鎖を防止するために、in vivoで十分に安定であっしていてもよい。しかしながら、複合体は、核酸を機能的な形状で放出するよう、細胞内の適切な条件下で開裂することができる。
【０１５１】
免疫刺激性核酸または他の治療は、単独で投与してもよく（例、生理食塩水または緩衝液中に）または当業者に既知であるどんな送達ビヒクルでも使用してよい。例えば、以下の送達ビヒクルについて記載がある：コチレート(cochleates); エマルソーム(emulsomes)；ＩＳＣＯＭｓ；リポソーム；生（live）バクテリアベクター（例、サルモネラ菌、大腸菌、BacillusCalmette-Guerin、赤痢菌、乳酸菌）；生ウィルスベクター（例、ワクシニア、アデノウィルス、単純ヘルペスウィルス）；ミクロスフィア；核酸ワクチン；ポリマー（例、カルボキシメチルセルロース、キトサン）；ポリマー環；プロテオソーム；フッ化ナトリウム；遺伝子組み換え植物；ビロソーム；ウィルス様粒子。当業者は、当業者に既知である他の送達ビヒクルもまた、使用してよいことを認識するだろう。
【０１５２】
本明細書に提供された指導と組み合わせて、様々な活性化合物を選ぶことにより、そして効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害な副作用の重篤度および好ましい投与方法などのなどの因子を考慮することにより、相当な毒性をもたらさず、それでいて、上記のように特定の対象を処置するのに完全に有効な、有効な治療上の処置処方計画を立てることができる。いかなる特定の用途への有効な量も、処置する疾患または条件、投与する特定の免疫刺激性核酸（例えば、ＣｐＧ免疫刺激性核酸のクラス、非メチル化ＣｐＧモチーフの数またはそれらの核酸内での位置、オリゴヌクレオチドへのキラリティー度など）、抗原もまた投与するかどうかおよびかかる抗原の性質、対象の大きさ、疾患または条件の重篤度などの因子に依存して変化することができる。当業者は経験的に、過度の実験を必要とすることなく特定の免疫刺激性核酸および／または他の治療剤の有効量を決定することができる。
【０１５３】
成人したヒト対象について、本明細書中に記載の免疫刺激性核酸化合物の用量は典型的に、約５０μｇ／回投与量〜２０ｍｇ／回投与量、より典型的に約８０μｇ／回投与量〜８ｍｇ／回投与量、および最も典型的に約８００μｇ／回投与量〜４ｍｇ／回投与量の範囲である。対象の体重の観点で述べると、典型的な用量は、約０．５〜５００μｇ／ｋｇ／回投与量、より典型的に約１〜１００μｇ／ｋｇ／回投与量、および最も典型的に約１０〜５０μｇ／ｋｇ／回投与量の範囲である。用量は、投与の経路を含む因子に依存し、例えば、経口投与は、皮下投与よりも実質的に多い用投与量が必要だろう。
【０１５４】
本発明の処方は、薬学的に許容し得る溶液で投与され、薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、アジュバント補助剤、および随意に他の治療成分を通常含んでもよい。
【０１５５】
免疫刺激性核酸を、ウィルス感染の処置に有用な、当業者に既知である他の剤と併せて与えることができる。例の部で実証したように、相乗反応を提供するために、特に重要なのは、ＩＦＮ−αなどの抗ウィルス剤との免疫刺激性核酸の組み合わせである。免疫刺激性核酸は、現在ＩＦＮ−αと一緒に投与しているリバビリンの代用として使用することができる。ＩＦＮ−αと組み合わせての使用のための、現在使用されているかまたは調査中であるかかる他の剤の例は、アマンタジン、およびサイトカインを含み、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＦＮ−γを含む。
【０１５６】
抗ウィルス剤は、ウィルスによる細胞の感染または細胞内でのウィルスの複製を防止する化合物である。ウィルス複製の過程は、宿主細胞内のＤＮＡ複製に密接に関連することから、非特異的抗ウィルス剤は宿主にしばしば有害であるため、抗ウィルス薬剤は、抗菌バクテリア薬剤よりも大幅に少ない。抗ウィルス剤によりブロックまたは抑制することができる、ウィルス感染の過程内にいくつかの段階がある。これらの段階は、宿主細胞へのウィルスの付着（免疫グロブリンまたは結合ペプチド）、ウィルスの脱殻（例、アマンタジン）、翻訳開始（例、インターフェロン、アンチセンス、およびリボザイム）を含むウィルス性ｍＲＮＡの合成または翻訳（例、インターフェロン、アンチセンス、およびリボザイム）、ウィルス酵素（例、非構造セリンプロテアーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素およびヘリカーゼ）、ウィルスＲＮＡまたはＤＮＡの複製（例、ヌクレオシド類似体）、新しいウィルスタンパク質の成熟（例、Boehringer Ingelheim製セリンプロテアーゼ抑制剤BILN2061ZWなどのプロテアーゼ抑制剤）、Livfit（米国特許6,136,316）などの抗酸化剤、ならびにのウィルス出芽および放出を含む。他の抗ウィルス剤は、米国特許6,130,326、および米国特許6,440,985、および公開済の米国特許出願20020095033に記載がある。リバビリン類似体もまた、本発明により包含された抗ウィルス剤である。
【０１５７】
ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドと同様の合成化合物であるが、不完全なまたは異常なデオキシリボースまたはリボース基を有する。ヌクレオチド類似体が細胞内にあると、これらはリン酸化されてし、三リン酸形成物を産生し、ウィルスＤＮＡまたはＲＮＡ内への取り込みの際に正常なヌクレオチドと競合争する。ヌクレオチド類似体の三リン酸型が、伸長中の核酸鎖内に取り込まれると、ウィルスポリメラーゼとの不可逆的な関係をもたらし、したがって連鎖停止との、不可逆的な関係をもたらす。
【０１５８】
免疫グロブリン治療は典型的に、ウィルス感染の予防に使用されるが、ウィルスの循環および新しく形成された細胞の感染からの防止のレベルを低減させるのにも使用される。ウィルス感染についての免疫グロブリン治療は、抗原特異的であるよりもむしろ、免疫グロブリン治療は、細胞外ビリオンへの結合ならびにウィルス感染に感受性がある細胞に付着することおよび入ることの防止により機能するため、バクテリア感染と異なる。本治療は、抗体が宿主内に存在する期間中、ウィルス血の低減に有用である。一般的に２種類の型の免疫グロブリン治療があり、通常の免疫グロブリン治療および高力価免疫グロブリン治療である。通常の免疫グロブリン治療は、正常な血液提供者の血清から調製し、プールした抗体製品を使用する。このプールした製品は、Ａ型肝炎、パルボウィルス、エンテロウィルス（特に新生児内の）などの広範囲のヒトウィルスに対するへの低力価の抗体の低力価を含む。通常の免疫グロブリン治療をＨＣＶに使用するため、血清を、ＨＣＶに以前感染し、自発的にまたはいくつかの治療形態により、感染を除去するのに成功した人から得なければならないだろう。高力価免疫グロブリン治療は、特定のウィルスに対するへの高力価の抗体の高力価を有する個体人の血清から調製した抗体を使用する。そしてそれらの抗体を、特異的ウィルスに対して使用する。ＨＣＶについて、高力価免疫グロブリンを、Ｃ型肝炎免疫グロブリンを産生するために組み換えＨＣＶタンパク質によりボランティアを予防接種することにより産生することができる。
【０１５９】
本発明の方法において好適な他の抗ウィルス剤は、Triangle Pharmaceuticals, Inc.、Gilead、ICN、Procter and GambleおよびViroPharma Incorporatedにより製造される。
【０１６０】
治療での使用のために、有効量の免疫刺激性核酸を、免疫刺激性核酸を所望の部位、例えば、粘膜、全身に送達させるいかなる方法によっても対象に投与することができる。本発明の医薬組成物を「投与すること」は、当業者に既知のいかなる方法により成し遂げてもよい。投与の好ましい経路は、経口、非経口、病巣内、局所、経皮、筋肉内、鼻腔内、気管内、吸入、眼、膣、および直腸を含むが、それらに限定されない。
【０１６１】
経口投与のために、化合物（すなわち、免疫刺激性核酸、または他の治療剤）を、当該技術分野で周知の薬学的に許容し得る担体と併せて容易に処方することができる。かかる担体は、処置する対象による経口摂取のために、本発明の化合物を、錠剤、ピル、ドラジェー、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤として得ることができ、所望の場合、好適な助剤を添加した後、随意に得られる混合物を挽いて、顆粒の混合物を加工し、錠剤またはドラジェーコアを得る。好適な賦形剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトール、またはソルビトールを含む、糖類などの充填剤；例えば、コーンスターチ、小麦デンプン、米デンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤である。所望の場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、あるいはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの崩壊剤を添加してもよい。随意に経口処方はまた、内部酸条件を中和するために生理食塩水または緩衝液内に処方してもよく、またはいかなる担体も用いず投与してもよい。
【０１６２】
ドラジェーコアは、好適な被覆剤と共に提供する。この目的のために、濃糖溶液を使用してもよく、随意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールジェル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。染料または色素を、活性化合物の投与量の異なる組み合わせを同定または特徴づけるために、錠剤またはドラジェー被覆剤に添加してもよい。
【０１６３】
経口で使用することができる医薬製剤は、ゼラチンで作られた押し込み型のカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で作られた、ソフトな密閉カプセルを含む。押し込み型のカプセルは、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ならびに、随意に、安定剤を有する混和物中に活性成分を含むことができる。ソフトカプセル地中で、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁されてしていてもよい。加えて、安定剤を添加してもよい。経口投与のために処方されたミクロスフィアもまた使用してよい。かかるミクロスフィアは、当該技術分野で明確である。経口投与のためのすべての処方は、かかる投与に好適な用量であるべきである。
【０１６４】
口腔投与については、組成物を、従来の方法で処方した錠剤またはトローチ剤の形で摂ってもよい。
吸入による投与については、本発明の使用化合物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体の使用と共に、加圧パックからのエアゾールスプレーの形表現または噴霧器の形態形で都合よく送達してもよい。加圧エアゾールの場合、用量単位を、定量を送達させるバルブを提供することにより決定してもよい。吸入器または吹付け器における使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物および乳糖またはデンプンなどの好適な粉剤ベースの粉剤混合物を含んで処方してもよい。
【０１６５】
化合物は、それらを全身的に送達させるのが望ましいとき、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口の投与のために処方してもよい。注射のための処方は、単位用量形状で、例えば、アンプルまたは複数投与量の容器で、添加保存剤と共に、提供され表してもよい。組成物は、懸濁液、溶液または油性または水性のビヒクル中の乳液などの形状を取ってもよく、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの処方(formulatory)剤を含んでもよい。
【０１６６】
非経口の投与のための医薬処方は、水溶性の形状での活性化合物の水溶液を含む。加えて、活性化合物の懸濁液を、適切な油性の注射懸濁液として調製してもよい。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、あるいは、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性の注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよい。随意に、懸濁液はまた、好適な安定剤、または高濃度の溶液の調製物ができるよう、化合物の溶解度を増加させる剤を含んでもよい。
あるいは、活性化合物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌の発熱物質を含まない水と一緒にの構成するのために、粉剤の形状であってもよい。
【０１６７】
化合物もまた、坐薬または停留浣腸剤などの直腸または膣組成物において処方してよく、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐薬基材を含む。
以前記載した処方に加えて、本化合物はもまた、デボー製剤として処方してもよい。かかる長時間作用型の処方は、好適なポリマーまたは疎水性の材料（例えば許容し得る油中の乳液として）あるいはイオン交換樹脂と共に、またはやや溶けにくい誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として、処方してもよい。
【０１６８】
医薬組成物はまた、好適な固体またはゲル相担体あるいは賦形剤を含んでもよい。かかる担体または賦形剤の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを含むが、それらに限定されない。
【０１６９】
好適な液体または固体の医薬調製物の形状は、例えば、吸入用の水性溶液または生理食塩水性の溶液、マイクロカプセル、コチレート化(encochleated)、微細な金粒子への被覆、リポソーム中に含有、噴霧、エアゾール、皮膚に埋め込むためのペレット、または皮膚に傷を付けて入れるための鋭利な物の上での乾燥である。医薬組成物はまた、顆粒、粉剤、錠剤、被覆錠、（マイクロ）カプセル、坐薬、シロップ、乳液、懸濁液、クリーム、ドロップまたは活性化合物の長時間放出をする製剤を含み、崩壊剤錠剤分解物質、結合剤、被覆剤、膨張剤、潤滑剤、香味料、甘味料または可溶化剤などの調製賦形剤および添加剤および／または助剤は、上記のとおり習慣的に使用される。医薬組成物は、様々な薬剤送達システムにおける使用に好適である。薬剤送達の方法の簡単な概要については、参照により本明細書中に組み込まれている、Langer Science 249: 1527 (1990)を参照。
【０１７０】
免疫刺激性核酸は、それ自体（ストレートで(neat)）または薬学的に許容し得る塩の形状で投与してもよい。薬に使用するときは、塩は、薬学的に許容し得るべきであるが、薬学的に許容し得る塩でないものは、その薬学的に許容し得る塩の調製に都合よく使用してもよい。かかる塩は、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリルチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製したものを含むが、それらに限定されない。また、かかる塩は、アルカリ金属あるいはカルボキシル酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ土類塩として調製することができる。
【０１７１】
好適な緩衝剤は、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）を含む。好適な保存剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）を含む。
【０１７２】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体を含む。用語「薬学的に許容し得る担体」とは、ヒトまたは他の脊髄動物に投与するのに好適な、１または２以上の適合性固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。用語「担体」とは、活性成分を適用を促進させるために活性成分と組み合わせる併せた、天然または合成の、有機または無機成分を意味する。医薬組成物の成分もまた、所望の医薬的効率を実質的に低下させるであろう相互作用がない方法で、本発明の化合物と共に、および互いに混ざり合うことができる。
【０１７３】
様々な投与経路が、利用可能である。選択した特定の方法は、もちろん、選択した特定の補助剤アジュバントまたは抗原、処置する特定の条件および治療の有効性に必要な用量に依存するだろう。本発明の方法は、一般的に言えば、医学的に許容し得るどんな投与方法でも使用して実行してよく、つまり、臨床的に許容できない有害な効果をもたらすことなく有効なレベルの免疫反応を生み出すどんな方法も意味する。好ましい投与方法は、上述の通りである。
【０１７４】
組成物は、都合よく単位用量の形状で提供され表してよく、薬学の技術分野で周知のどんな方法によって調製してもよい。すべての方法は、化合物を１または２以上の副成分を構成する担体と関連させるステップを含む。一般的に、組成物を、均一におよび密接に化合物を液体担体、細かく分裂した固体担体、または両方と関連させて調製し、そして、必要な場合、製品を成形する。液体投与量単位は、バイアルまたはアンプルである。固体投与量単位は、錠剤、カプセルおよび坐薬である。患者の処置のために、化合物の活性、投与の方法、予防接種の目的(すなわち、予防または治療)、障害の性質および重篤度、患者の年齢および体重に依存して、異なる用量を必要としてもよい。ある投与量の投与は、個々の投与量単位の形での単一の投与による、あるいはいくつかのより小さな投与量単位による両方により、行なうことができる。
【０１７５】
他の送達システムは、時間放出、遅延放出または持続的放出の送達システムを含むことができる。かかるシステムは、化合物の反復投与を回避することができ、対象および医師の利便性を増加させる。多くの型の放出送達システムが、利用可能であり、当業者に既知である。それらは、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート(copolyoxalates)、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチル酸、およびポリ無水物などのポリマーをベースとしたシステムを含む。薬剤含有の前述のポリマーのマイクロカプセルが、例えば、米国特許5,075,109に記載されている。送達システムはまた、コレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸などのステロールまたはモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチドをベースとしたシステム；ワックス被覆剤；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合した移植片；などを含む非ポリマーシステムを含む。具体例は、（ａ）浸食システム、ここで、本発明の剤は、米国特許4,452,775、4,675,189、および5,736,152などに記載のマトリックスの形状内に含まれ、および（ｂ）拡散システム、ここで、活性成分が、米国特許3,854,480、5,133,974および5,407,686などに記載のポリマーから制御された速度で浸透する、を含むが、それらに限定されない。加えて、ポンプをベースとしたハードウェア送達システムを使用することもでき、そのうちいくつかは、移植に適合している。
【０１７６】
いくつかの態様において、免疫刺激性核酸は、修飾される。ある態様において、免疫刺激性核酸は、少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性インターヌクレオチド連鎖を有する修飾された骨格を有する。ヌクレアーゼ耐性インターヌクレオチド連鎖は、チオリン酸ホスホロチオエート連鎖、ジチオリン酸ホスホロジチオエート連鎖、ホスホン酸メチルホスホネート連鎖、およびペプチド連鎖を含む群から選択することができる。ある態様において、修飾免疫刺激性核酸は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。免疫刺激性核酸は、ある態様においてパリンドロームである一方、他の態様において、免疫刺激性核酸はパリンドロームではない。いくつかの好ましい態様において、免疫刺激性核酸は、８〜１００ヌクレオチド長である一方、他の好ましい態様において、免疫刺激性核酸は、１２〜４０ヌクレオチド長である。好ましい大きさ、配列および修飾は、以下により詳細に記載する。
【０１７７】
以下の例は、説明の目的のために含まれ、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１７８】
例
この研究の目的は、異なるクラスのＣｐＧ  ＯＤＮの、ＨＣＶ慢性のキャリアからのＰＢＭＣを刺激する能力を評価することであった。ＰＢＭＣを、正常で健康なボランティアおよびＨＣＶの慢性のキャリアから採集した全血から単離し、in vitroでの異なるクラスのＣｐＧ  ＯＤＮならびにソフトおよびセミソフトな分子の、Ｂ細胞の増殖、サイトカイン分泌（ＩＦＮ−γ、，ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０  およびＩＦＮ−α）およびケモカイン分泌（ＩＰ−１０）を刺激する能力を評価した。
また、外因性ＩＦＮ−α−２ｂ（イントロンＡ）およびリバビリンの、どちらか単独で、互いに組み合わせて、およびＣｐＧ  ＯＤＮ（ＢおよびＣクラス）と組み合わせての免疫刺激効果を評価した。
【０１７９】
材料および方法
オリゴヌクレオチド 
すべてのオリゴヌクレオチドのストックを、ｐＨ８．０のＴＥ緩衝液中に再懸濁した（OmniPer(登録商標); EM Science, Gibbstown, NJ）。細胞検定アッセイにおいて使用する直前に、様々なＯＤＮの希釈物を、１０％の熱で不活性化した、正常なヒトＡＢ血清（Wisent Inc, St. Bruno, QC）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco BRL, Grand Island, NY）を含有するのＲＰＭＩ  １６４０完全培地（Gibco BRL, Grand Island, NY）中内で作製した。外因性ＩＦＮ−αの相乗効果実験のために、イントロンＡ（インターフェロンアルファ−２ｂ、DIN 02223406, Schering Canada Inc., Pointe-Claire, Quebec, Canada）をＯＤＮ溶液に添加し、最終濃度１２５または１０００ＩＵ／ｍｌを得た。リバビリン（CAS 36791-04-5, Calbiochem, CN Biosciences Inc., La Jolla, CA, USA）を滅菌蒸留水で再構成し、５００μｍのストックを作り出し、上記のとおり培地中内で希釈し、ウェル内で最終濃度５μｍを得た。細胞を、５％ＣＯ２を用いて３７℃でインキュベートした。４８時間後、細胞上清を各ウェルから採集し、−８０℃で冷凍した。
【０１８０】
実験で使用したＯＤＮを以下の表に示す：
表２：実験で使用したオリゴの配列
【表４】
2006515277.tif 000006
＊オリゴヌクレオチド骨格内でチオリン酸ホスホロチオエート結合を置き換えるホスホジエステル結合を、（−）により示す
【０１８１】
ＰＢＭＣの単離
全血（２００ｍｌ）を、正常で健康な１０成人の対象ならびに、以前６月の一連のＩＦＮ−αをベースとした治療を受け、処置に失敗したか、または再発した反応者である、ＨＣＶに慢性的に感染した１５成人の対象から、静脈穿刺によりヘパリン化したグリーントップ(green top)のバキュテイナー（vacutainer）に採集した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ficoll-Hypaque（Amersham Phannacia Biotech, Uppsala, Sweden）を用いて４００×ｇで３５分間、遠心分離により精製した。細胞を、１０％の正常なヒトＡＢ血清（熱で不活性化した）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン含有のＲＰＭＩ完全培地中１０×ｌ０６／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【０１８２】
Ｂ細胞の増殖  
細胞を、上記のとおり単離し、完全ＲＰＭＩ培地中１×ｌ０６／ｍｌで再懸濁し、１００μｌの細胞を、丸底の９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＯＤＮ溶液（１００μｌ）をウェルに添加し、選択した範囲の最終濃度（１、３、６μｇ／ｍｌ）を得た。細胞を５日間培養し、そして放射活性能測定のためにろ紙の上に採取する前に、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）により１８時間パルスしを送った(pulsed)。結果を、無処置の対照培地に対する刺激指数（ＳＩ）として報告する。
【０１８３】
サイトカイン検定アッセイ
新しく単離したＰＢＭＣを、１０×ｌ０６／ｍｌ（２×最終濃度）で再懸濁し、１００μｌの細胞を、等量のＯＤＮ溶液（２×最終所望濃度）含有の平底の９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。一連の濃度（１、３、６μｇ／ｍｌ）を、各ＯＤＮに試験ついてした。細胞を、５％ＣＯ２を用いて３７℃でインキュベートした。４８時間後、細胞上清を各ウェルから採集し、−８０℃で検定アッセイするまで冷凍した。
【０１８４】
上清澄み中のＩＦＮ−α、ＩＰ−１０、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γレベルを、市販のＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, MN, USA; IP-10, Cat# DIP 100, IL-10, Cat# D1000, IFN-γ Cat# DIF50またはPBL Biomedical, IFN-α Cat# 4110S）を使用して測定した。測定したＥＬＩＳＡ値が、製造元指定のキットの検出限界より低かったとき、最低の検出可能な限界と等しい値を、データの表に入力した。
【０１８５】
結果
１５人の慢性的に感染したＨＣＶ対象および正常で健康な１０ボランティアから採集した血液から単離したＰＢＭＣを、異なるクラスのＣｐＧ（例、クラスＡ、Ｂ、Ｃ、ソフトなＣ、セミソフトなＢおよびセミソフトなＣ）と共に３７℃でインキュベートし、および細胞上清を、インキュベーション期間中、サイトカインの存在を示すサイトカイン分泌について評価した。これらの実験の結果を、以下に示す。
【０１８６】
ＰＢＭＣによるＩＦＮ−α分泌の誘導
３クラスのＣｐＧ  ＯＤＮを、正常なボランティアからのＰＢＭＣについて試験したとき、非常に高いレベルのＩＦＮ−αがＡクラス（ＣｐＧ配列番号１）により、適度なレベルがＣクラス（ＣｐＧ配列番号４）により産生され、そしてほんの低レベルが、Ｂクラス（ＣｐＧ配列番号２）により誘導された（図１）。ＩＦＮ−αの主な細胞源は、ｐＤＣである。
【０１８７】
ＨＣＶ慢性のキャリアから得られたＰＢＭＣを用いて、すべての３クラスのＣｐＧは、ＩＦＮ−αの分泌を誘導することができた。ＢおよびＣクラスを用いたレベルは、正常なＰＢＭＣを用いて得られたものと同じであった。対照的に、Ａクラスは、正常なレベルのたった約５０％を誘導し（図１）、ＨＣＶ感染したｐＤＣの機能障害は、ＩＦＮ−αを誘導するＡクラスＣｐＧの有効性に対する影響がいくらかあるが、Ｃクラスはないことを提案している。したがって、ＡまたはＣクラスＣｐＧは、ＨＣＶ慢性のキャリアの処置に使用することができるが、ある場合には、Ｃクラスが好ましいだろう。
【０１８８】
ｐＤＣの数を、ＦＡＣＳ分析により決定した。ＡおよびＣクラスＣｐＧ  ＯＤＮのいずれかにより分泌されたＩＦＮ−αの量と比較して、直鎖状の線形回帰をこれに対し行ない、正常な対象についての妥当な相関関係（例、それぞれＲ＝０．４３および０．５８）が、見出された。相関関係が、ＣクラスＯＤＮについてわずかに良いことがさらに発見された。対照的に、ＨＣＶ感染した対象について、ｐＤＣの数および分泌したＩＦＮ−αの量の間で、相関関係が見られなかった（それぞれＲ＝０．０２および０．０８）（図３）。ＨＣＶ感染したＤＣは、それにもかかわらず、ＣｐＧ  ＯＤＮへの反応においてＩＦＮ−αを分泌することができる。
【０１８９】
これらのＯＤＳのソフトおよびセミソフトの変化交代の効果もまた、分析した。分子の中心領域に１列のホスホジエステル結合を有するソフトな分子を合成した。ＣｐＧモチーフのシトシンおよびグアニンヌクレオチド間にある１または２以上の個々のホスホジエステル結合を有するセミソフトな分子を合成した。ソフト（図３）およびセミソフト（図４）なＣクラスＣｐＧ  ＯＤＮの両方は、最初のＣクラスＣｐＧ  ＯＤＮと同様の方法で、正常なまたはＨＣＶのＰＢＭＣからのＩＦＮ−α分泌を刺激することができた。いくつかのセミソフトなＣクラスＣｐＧ  ＯＤＮは、普通のＣクラスＣｐＧ配列番号４よりもさらに強力だった（図４）。これは、分子は、最大の免疫刺激を有するのにまだ十分に安定であしており、ＣｐＧモチーフ？集団？の中心のホスホジエステルは、その活性を増加させるからであろう。
【０１９０】
ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ分泌の誘導  
図５は、Ｔｈ１サイトカインである、ＩＦＮ−γの分泌を誘導する異なるクラスのＣｐＧの能力を比較する。クラスＡは、低レベルのＩＦＮ−γを誘導したのに比べて、クラスＢは適度の量を産生し、クラスＣのＣｐＧは、高濃度のＩＦＮ−γを刺激した。ＨＣＶ感染したおよび正常なＰＢＭＣの両方は、すべての３クラスのＣｐＧへの同様のＴｈ１反応を示した。同様の結果が、セミソフトなクラスＣのＣｐＧ  ＯＤＮを用いて得られた（図６）。
【０１９１】
ＰＢＭＣによるＩＰ−１０分泌の誘導  
１型および２型インターフェロンの産生と関連するケモカインであるＩＰ−１０もまた、ＣｐＧ  ＯＤＮにより誘導される。最高レベルがをＡクラスにより誘導されし、次に高いのがＣクラスによるものであり、最も低いのが、ＢクラスＣｐＧ  ＯＤＮによるものである。ＣｐＧ  ＯＤＮのクラスに関わらず、同様のレベルのＩＰ−１０がを、正常な対象およびＨＣＶ慢性のキャリアからのＰＢＭＣにより誘導されした（図７）。
【０１９２】
ＣｐＧ  ＯＤＮによるＢ細胞の刺激  
Ｂ細胞の刺激へのＣｐＧの効果もまた、調査した。図８および９に示したように、ＣｐＧクラスＡは、ＨＣＶ感染したおよび正常な集団の両方について、Ｂ細胞の弱い刺激因子であった。対照的に、クラスＢ、ＣおよびセミソフトなＣのＣｐＧは、Ｂ細胞を強力に活性化した。正常なおよびＨＣＶ感染した対象からのＰＢＭＣの間では、差異がなかった。
【０１９３】
ＣｐＧ  ＯＤＮによる刺激後のＰＢＭＣからのＩＬ−１０分泌
ＣｐＧによる刺激後のサイトカインＩＬ−１０の産生もまた評価し、これらの結果を、図１０に示した。ＨＣＶ感染したおよび正常な対象の両方について、すべてのクラスのＣｐＧは、ＩＬ−１０分泌を著しく誘導し、正常なボランティアからのＰＢＭＣおよびＨＣＶ慢性のキャリアからのＰＢＭＣの間で差異はなかった。いくつかの細胞種型は、ＣｐＧによるインキュベーション後、ＩＬ−１０を産生できる；しかしながらＢ細胞は、このサイトカインの主要な生産元であることから、ＩＬ−１０産生は、Ｂ細胞活性化のレベルの指標として使用することができる。
【０１９４】
イントロンＡおよびリバビリンの効果
リバビリンおよび外因性ＩＦＮ−αイントロンＡの、単独でまたはＣｐＧと組み合わせてのin vitro効果を、ＨＣＶ感染した細胞について試験した。リバビリンとイントロンＡのいずれも、それら自体または一緒に、ＨＣＶ感染したＰＢＭＣによるＩＦＮ−α分泌の誘導をもたらさなかった（図１１）。
上述のように、ＡおよびＣクラスのＣｐＧ  ＯＤＮは、正常なおよびＨＣＶ感染した対象からのｐＤＣからのＩＦＮ−α分泌の強力な誘導をもたらす。さらに、ＣｐＧおよびイントロンＡを一緒に使用したとき、対象の大多数（６０％）について相乗反応があった（図１２）。
【０１９５】
考察
ＣｐＧ  ＯＤＮは、クラスＡおよびＣのＣｐＧを使用して、より高いレベルで、およびクラスＢのＣｐＧ  ＯＤＮを使用してより低いレベルで、ＩＦＮ−αを分泌するために、ＨＣＶに慢性的に感染した患者からＤＣを誘導することができる。分泌したＩＦＮ−αのレベルは、正常な健康なボランティアからの細胞を用いて観察されたものと同程度である。なお、ＩＰ−１０がを、刺激されたＨＣＶのＰＢＭＣから誘導されることからし、さらにＴｈ１型の免疫活性化を示しているす。
ＨＣＶ抗原に特異的な免疫反応は、ＨＣＶに慢性的に感染した人の中に既に存在した。これらは、Ｔｈ２に偏っており、したがってＨＣＶ感染した細胞の除去を引き起こすことができない。Ｔｈ１型の反応は、ウィルス除去に必要であろう。全身のＴｈ１サイトカインのレベルの増大は、追加の抗原なしになく、ＨＣＶに慢性的に感染した人が、ウィルス除去に役立つＴｈ１型のＨＣＶに特異的な免疫反応を発展させるようにする。すべてのクラスのＣｐＧ（Ａ、ＢおよびＣ）は、Ｔｈ１型の反応を確立することができる。これらのＴｈ１型反応は、ＨＣＶ慢性の感染の長期の除去に必須であるが、直接的な抗ウィルス効果を有するが免疫系に直接的な効果を有しない、外因性ＩＦＮ−α治療により誘導するのは難しい。ＣｐＧ  ＯＤＮは、したがって、ＨＣＶ慢性のキャリアを処置するために、外因性ＩＦＮ−αと組み合わせて使用することができる。
【０１９６】
あるいは、ＣｐＧ  ＯＤＮはまた、単独で使用することもできる。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γなどのサイトカインの誘導のおかげで、Ｔｈ１型のＨＣＶに特異的な免疫反応の誘導に加えて、ＣｐＧ  ＯＤＮはそれ自体によりのままで、直接的な抗ウィルス効果を有する。ある場合には、ＡおよびＣクラス分子が、より高いレベルのＩＦＮを誘導することから、好ましい。それらの特徴的な配列に依存して、ＣｐＧ  ＯＤＮは、ｐＤＣの機能、成熟およびＩ型ＩＦＮの産生を選択的に刺激することができる（Krug、A et al., Eur J Immunol, 2001; 31: 2154-2163）。本発明によると、２つのクラスのＣｐＧ  ＯＤＮが、ＩＦＮ−α産生の刺激において優れていることを示したにもかかわらず、どのＣｐＧ  ＯＤＮも、骨格またはＣｐＧ配列に関わらず、慢性のＨＣＶの処置に使用することができた。In vivoでの特異なＣｐＧ  ＯＤＮによる異なるＩ型のＩＦＮアイソフォームイソ型の制御された放出は、単一のサブタイプ亜型である組み換えＩ型ＩＦＮ（例えば、イントロンＡは、ＩＦＮ−α  ２ｂのみ）の全身の投与より優れている。ＣｐＧ  ＯＤＮのソフトおよびセミソフトな変形は、それらの親分子と同様のレベルのＩＦＮ−αの刺激をすることができる。ＣｐＧ  ＯＤＮのソフトまたはセミソフトな変形、特にＣクラスは、より簡単に分解され、したがって器官、特に肝臓、脾臓および腎臓内に蓄積することが予想されないため、選択的にＨＣＶの慢性の処置に使用することができただろう。
【０１９７】
少なくとも５０％のＨＣＶ対象が、外因性ＩＦＮ−α治療に反応するのに失敗したが、しかしながらＣｐＧ  ＯＤＮ（特にＡおよびＣクラス）は、すべての対象において、正常な健康なボランティアと同程度のレベルで、in vitroでＩＦＮ−α分泌を誘導することができた。
ＣｐＧ  ＯＤＮは、したがって、ＩＦＮがペグ化していてもいなくても、そして処置もまたリバビリンを含んでいてもいなくても、外因性ＩＦＮ−α治療に反応するのに失敗した患者を処置するのに使用することができた。高レベルのＩＦＮ−αを誘導するＣｐＧ  ＯＤＮのクラスが好ましく、さらにより好ましい長期処置は、セミソフトな変形だろう。
【０１９８】
市販のイントロンＡ（ＩＦＮ−α−２ｂ）とリバビリンのいずれも、単独でまたは組み合わせて、in vitroで正常なまたはＨＣＶ感染した対象からのＰＢＭＣからのＩＦＮ−α分泌を誘導することはできなかった。しかしながらＣｐＧ  ＯＤＮをイントロンＡと組み合わせて使用したとき、相乗効果が、ＨＣＶ感染した対象からのＰＢＭＣからのＩＦＮ−α分泌について、相乗効果が観察された。ＣクラスのＯＤＮは、外因性ＩＦＮ−αによる相乗効果を有することを示した；しかしながら、市販のアルファインターフェロンによるどのクラスのＣｐＧ  ＯＤＮによる処置も、治療的に効果的であろう。以前述べたように、無刺激の代謝産物への分解が比較的簡単なため、ＣｐＧ  ＯＤＮのセミソフトな変形を、腎臓などの末端器官における蓄積の心配なく慢性の処置に使用することができた。
【０１９９】
リバビリンは、Ｔｈ１効果を有するといわれているが、これらの研究において、ヒトＰＢＭＣにおいて免疫刺激活性を有しなかった。イントロンＡと組み合わせても、リバビリンは、内因性のＩＦＮ−α産生を向上させしなかった。したがって、リバビリンをＨＣＶの併用治療においてＣｐＧ  ＯＤＮと置き換えることは、持続的ウィルス反応の割合を増加させるだろう。ＣｐＧ  ＯＤＮと併せたとき、リバビリンは、ＣｐＧの有効性を低減させた。ＣｐＧ  ＯＤＮは、したがって、リバビリンの非存在下でアルファインターフェロンと組み合わせて与えるべきである。
【０２００】
ＣｐＧ  ＯＤＮを、ＩＭ、ＳＣおよびＩＶでヒト対象に投与し、そして耐容用性があり、安全であると決定された（臨床研究、進行中）。ＳＣ、ＩＭ、ＩＶ、吸入、その他、などのどんな有効な経路投与でも許容し得るだろう。しかしながら皮下投与が、選択される経路だろう。ＣｐＧ  ＯＤＮをＴＥ緩衝液中に希釈し、ＰＢＭＣに添加したが、しかしながら、ＣｐＧ  ＯＤＮはまた、生物接着性(bioadhesive)ポリマー（Sha et al., 1999）、コチレート（Gould-Fogerite et al., 1994, 1996）、デンドリマー（Kukowska-Latallo et al., 1996, Qin et al, 1998）、腸溶被覆カプセル（Czerlcinsky et al., 1987, Levine et al., 1987）、エマルソーム（Vancott et al., 1998、Lowell et al., 1997）、ISCOMs（Mowat et al., 1993、Morein et al., 1999、Hu et al., 1998, Carlsson et al.,1991）、リポソーム（Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992）、ミクロスフィア（Gupta et al., 1998、Maloy et al., 1994, Eldridge et al., 1989）、ナノスフィア（Roy et al., 1999）、ポリマー環（Wyatt et al., 1998）、プロテオソーム（Lowell et al., 1988,1996）およびビロソーム（Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998）などの送達システムにおいて処方することもできる。
【０２０１】
ＨＣＶ慢性のキャリアの処置のために、ＣｐＧ  ＯＤＮを、反復して、毎日１回から毎月１回投与することができるが、好ましくは３〜１０日間に１回、最も好ましくは毎週、長期間である。この期間は、１月から２年であることができるが、好ましくは３〜１２月、最も好ましくは６月である。したがって最適な治療は、毎週２回または毎週１回６月間与えられる。また、誘導期中、より頻繁に（最初の１〜３月間、毎日または隔日おきあるいは毎週２回または毎週１回）、そして維持のために頻度を低くして（さらに数ヶ月間、毎週、隔週、または毎月）与えることもできる。
【０２０２】
併用治療のために、ＣｐＧおよびアルファインターフェロン（ペグ化しているまたはしていない）を潜在的に、（ｉ）一緒に混合し、同時に同じ経路で（皮下）与える、（ｉｉ）同時におよび同じ経路で与えるが、混合しない、（ｉｉｉ）同時にだが異なる異なる経路で与える（例えば、アルファインターフェロンは、ＳＣで与えることができ、ＣｐＧは、ＩＶ、ＩＭ、ＩＤ、経口または局所的に与えることができる）、（ｉｖ）同じまたは異なる経路で、異なる時間および計画で与える、あるいは（ｖ）連続して与えることができる。この後者の場合、好ましくはＩＦＮ−αを、ウィルス量を低減させるために最初に与え、そしてＣｐＧ  ＯＤＮをその後、長期間の制御のために、Ｔｈ１型適応免疫を誘導するおよび持続させるために与える。
【０２０３】
参考文献
【表５】
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【０２０４】
【表６】
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【０２０５】
【表７】
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【０２０６】
【表８】
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【０２０７】
【表９】
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【０２０８】
【表１０】
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【０２０９】
【表１１】
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【０２１０】
均等物
様々な修飾は、本明細書中に開示された態様のために与えられたと理解されるものである。したがって、上記記載は、限定として解釈するべきではないが、単に好ましい態様の例示として解釈すべきである。当業者は、本明細書に付随する特許請求の範囲内で他の修飾を想定することができるだろう。
本明細書に開示されたすべての参考文献、特許および特許出願は、全体として参照参考文献によって組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】３クラスのＣｐＧによる刺激の後のＨＣＶ感染したおよび正常なＰＢＭＣからのＩＦＮ−α分泌の誘導を示した図である。
【図２】慢性のＨＣＶキャリアおよび正常な対象から新しく単離したＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析を示した図である。
【図３】ＣクラスおよびソフトなＣオリゴヌクレオチドによるＰＢＭＣの刺激によるＩＦＮ−α誘導を示した図である。
【図４】セミソフトなＣクラスＣｐＧのパネルによる刺激の後のＩＦＮ−α誘導を示した図である。
【図５】３クラスのＣｐＧによる刺激の後のＩＦＮ−γ分泌を示した図である。
【図６】セミソフトなＣクラスＣｐＧのパネルによる刺激の後のＩＦＮ−γ誘導を示した図である。
【図７】３クラスのＣｐＧによる刺激の後のＩＰ−１０分泌を示した図である。
【図８】Ｂ細胞の増殖へのＣｐＧの効果を示した図である。
【図９】Ｂ細胞の増殖へのセミソフトなＣクラスＣｐＧの効果を示した図である。
【図１０】３クラスのＣｐＧによる刺激の後のＩＬ−１０分泌を示した図である。
【図１１】リバビリンおよびＣｐＧ単独でまたはイントロンＡとの組み合わせによるＨＣＶ感染した細胞の刺激の後のＩＦＮ−α分泌を示した図である。
【図１２】ＨＣＶ感染した細胞によるＩＦＮ−α分泌へのイントロンＡを併用したＣｐＧの相乗効果を示した図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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