(57)【要約】新規な単離植物プロモーター配列のポリヌクレオチドが、かかるポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトとともに提供される。かかるコンストラクトを所望のＤＮＡ配列の転写の調節に使用するための方法が、かかるコンストラクトを含むトランスジェニック植物とともに開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１−１４、２０、２２−３３、３５−４３、４５−４９、５１、５２、５６−６２、および８８−１２７に列挙された配列と、
（ｂ）配列番号２−１４、２０、２２−３３、３５−４３、４５−４９、５１、５２、５６−６２および８８−１２７に列挙された配列の相補体と、
（ｃ）配列番号２−１４、２０、２２−３３、３５−４３、４５−４９、５１、５２、５６−６２および８８−１２７に列挙された配列の逆相補体と、
（ｄ）配列番号２−１４、２０、２２−３３、３５−４３、４５−４９、５１、５２、５６−６２および８８−１２７に列挙された配列の逆配列と、
（ｅ）配列番号２−１４、２０、２２−２３、２５−３３、３５−４２、４５−４９、５７−５９、６２、８８−９９、１０１−１１２および１１４−１２７に列挙された配列に対して、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも４０％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｆ）配列番号２−１４、２０、２２−２３、２５−３３、３５−４２、４５−４９、５６−５９、６２、８８−９９、１０１−１１２および１１４−１２７に列挙された配列に対して、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも６０％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｇ）配列番号２−１４、２０、２２−２３、２５−３３、３５−４９、５２、５６−６１、６２、８８−９９、１０１−１１２および１１４−１２７に列挙された配列に対して、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも７５％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｈ）配列番号２−１４、２０、２２−３３、３５−４９、５１２、５２、５６−６１、６２、８８−９９、１０１−１１２および１１４−１２７に列挙された配列に対して、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも９０％であるヌクレオチドを有する配列とからなるグループから選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号１および３４に列挙された配列と、
（ｂ）配列番号１および３４に列挙された配列の相補体と、
（ｃ）配列番号１および３４に列挙された配列の逆相補体と、
（ｄ）配列番号１および３４に列挙された配列の逆配列と、
（ｅ）配列番号１および３４に列挙された配列に対して、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも４０％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｆ）配列番号１および３４に列挙された配列に対して、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも６０％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｇ）配列番号１および３４に列挙された配列に対して、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも７５％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｈ）配列番号１および３４に列挙された配列に対して、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも９０％であるヌクレオチドを有する配列とからなるグループから選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１、８６および１２４に列挙された配列と、
（ｂ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１、８６および１２４に列挙された配列の相補体と、
（ｃ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１、８６および１２４に列挙された配列の逆相補体と、
（ｄ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１、８６および１２４に列挙された配列の逆配列と、
（ｅ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１、８６および１２４に提供される配列に対する同一性が少なくとも４０％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｆ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１、８６および１２４に提供される配列に対する同一性が少なくとも６０％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｇ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１、８６および１２４に提供される配列に対する同一性が少なくとも７５％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｈ）配列番号１、２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、４０、４５、４６、５１−５３、５６、５７、６０、６１、８６および１２４に提供される配列に対する同一性が少なくとも９０％であるヌクレオチドを有する配列とからなるグループから選択されるポリヌクレオチドにエンコードされた、単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは配列番号６３−８０、８７および１３０からなるグループから選択される配列を含む、請求項３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
請求項１および２のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子コンストラクト。
【請求項６】
５’から３’への順に、（ａ）プロモーター配列と、（ｂ）関心のあるＤＮＡ配列と、（ｃ）遺伝子ターミネーション配列とを含む遺伝子コンストラクトであって、前記プロモーター配列は請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、遺伝子コンストラクト。
【請求項７】
前記関心のあるＤＮＡ配列は関心のあるポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームを含む、請求項６に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項８】
前記関心のあるＤＮＡ配列は関心のあるポリペプチドをエンコードする遺伝子のノンコーディング領域を含む、請求項６に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載の遺伝子コンストラクトを含む、トランスジェニック細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載のトランスジェニック細胞を含む生物。
【請求項１１】
請求項９に記載のトランスジェニック細胞を含む、植物あるいは該植物の部分、零余子または子孫。
【請求項１２】
請求項５ないし８に記載のいずれかの遺伝子コンストラクトを標的生物のゲノムに安定的に取り込むことを含む、前記標的生物における遺伝子発現を改変するための方法。
【請求項１３】
前記生物は植物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子発現が改変された植物を作出するための方法であって、
（ａ）トランスジェニック細胞を用意するために、（ｉ）配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７の配列を含むプロモーター配列と、（ｉｉ）関心のあるＤＮＡ配列と、（ｉｉｉ）遺伝子ターミネーション配列とを含む遺伝子コンストラクトで植物細胞を形質転換すること、
（ｂ）得られたトランスジェニック細胞を再生と成熟した植物の成長とに導く条件下で培養することを含む、遺伝子発現が改変された植物を作出するための方法。
【請求項１５】
標的生物の表現型を改変するための方法であって、（ａ）配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７の配列を含むプロモーター配列と、（ｂ）関心のあるＤＮＡ配列と、（ｃ）遺伝子ターミネーション配列とを含む遺伝子コンストラクトを、前記標的生物のゲノムに安定的に取り込むことを含む、方法。
【請求項１６】
前記標的生物は植物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）テストされる遺伝子を操作可能に連結したプロモーター配列であって、該プロモーター配列は、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７の配列を含む、遺伝子コンストラクトで植物細胞を形質転換すること、
（ｂ）前記植物細胞を再生と成熟した植物の成長とに導く条件下で培養すること、
（ｃ）得られたトランスジェニック植物の表現型を形質転換されなかった植物の表現型と比較することを含む、所望の機能または表現型の原因遺伝子を同定する方法。
【請求項１８】
（ａ）配列番号２１に列挙された配列と、
（ｂ）配列番号２１に列挙された配列の相補体と、
（ｃ）配列番号２１に列挙された配列の逆相補体と、
（ｄ）配列番号２１に列挙された配列の逆配列と、
（ｅ）配列番号２１に列挙された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも４０％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｆ）配列番号２１に列挙された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも６０％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｇ）配列番号２１に列挙された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも７５％であるヌクレオチドを有する配列と、
（ｈ）配列番号２１に列挙された配列に対し、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて決定された同一性が少なくとも９０％であるヌクレオチドを有する配列とからなるグループから選択された配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子コンストラクト。
【請求項２０】
請求項１９に記載の遺伝子コンストラクトを含む、トランスジェニック細胞。
【請求項２１】
請求項１９に記載のＤＮＡコンストラクトを安定的に前記標的生物のゲノムに取り込むことを含む、標的生物における遺伝子発現を改変するための方法。
【請求項２２】
配列番号２１の配列を含むポリヌクレオチドから配列番号２１の配列を除去することを含む、前記ポリヌクレオチドの発現を改変するための方法。
【請求項２３】
異種ポリヌクレオチドと操作可能に連結された、配列番号２−１４、２０、２２−３３、３５−４３、４５−４９、５１、５２、５６−６２および８８−１２７からなるグループから選択される配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記異種ポリヌクレオチドはオープン・リーディング・フレームを含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヌクレオチドの転写および／または発現の調節に関する。より具体的には、本発明は、ポリヌクレオチドの転写を開始し駆動することができる植物から単離されたポリヌクレオチド調節配列と、かかる調節配列の、内在性および／または異種ポリヌクレオチドの転写およびポリヌクレオチドの産生の改変における利用とに関する。ポリペプチド配列も開示される。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子発現は、部分的には、転写に関与する細胞の諸過程により調節される。転写の過程で、転写されるＤＮＡ配列と相補的な１本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼの作用により形成される。真核細胞における転写の開始は、転写される遺伝子内部に位置するシスに作用するＤＮＡモチーフと、トランスに作用するタンパク質因子との間の複雑な相互作用によって調節される。前記シスに作用する調節領域の中には、ＲＮＡポリメラーゼが最初に直接的にまたは間接的に結合する、プロモーターと呼ばれるＤＮＡ配列がある。ここで用いられる「プロモーター」という用語は、転写に関連する遺伝子の５’非翻訳領域を指し、転写開始部位を含むことが一般的である。エンハンサーのような、その他のシスに作用するＤＮＡモチーフが、前記開始部位の上流および／または下流に位置することもある。
【０００３】
プロモーターとエンハンサーの両方とも、明確で、しばしば重複する数個のエレメントでできていることが一般的であり、それぞれは転写因子として知られる１または２以上のトランスに作用する調節タンパク質によって認識される場合がある。プロモーターは一般的に近位のエレメントとより遠位のエレメントとの両方を含む。例えば、調節タンパク質の結合に重要な、いわゆるＴＡＴＡボックスは、前記開始部位から約２５塩基対上流に見つかるのが一般的である。いわゆるＣＡＡＴボックスは、前記開始部位から約７５塩基対上流に見つかることが一般的である。プロモーターは、約百個から千個の間のヌクレオチドを含むことが一般的であるが、それより長いプロモーター配列もありうる。
【０００４】
トランスジェニック植物の開発のためには、外来遺伝子の強力な発現を駆動する構成的なプロモーターが好ましい。現在、広く利用される構成的な植物プロモーターで唯一入手可能なものは、カリフラワー・モザイク・ウイルスに由来する。さらに、ウイルスプロモーターの使用に関する大衆の懸念のため、トランスジェニック食用植物に使用するように、植物由来のプロモーターの必要性がある。裸子植物のプロモーターはほとんどクローン化されておらず、被子植物由来のプロモーターは裸子植物においてはうまく機能しないことがわかってきた。したがって、トランスジェニック植物におけるポリヌクレオチドの転写および発現を改変するために用いる、植物から単離されたポリヌクレオチドプロモーター領域についての必要性が当業者にまだある。
【０００５】
発明の概要
簡潔に述べると、遺伝子発現の調節に関与する、ユーカリおよびマツから単離されたポリヌクレオチドの調節配列が、かかるポリヌクレオチドの調節領域のトランスジェニック植物での内在性および／または異種のポリヌクレオチドの発現改変における利用方法とともに開示される。具体的には、本発明は、植物遺伝子の５’非翻訳領域またはノンコーディング領域であって、これらの統制下に置かれたポリヌクレオチドの転写を開始および調節する領域に由来するポリヌクレオチドのプロモーター配列を、かかるプロモーター配列を含む単離ポリヌクレオチドとともに提供する。
【０００６】
最初の局面では、本発明は、（ａ）配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７に列挙された配列と、（ｂ）配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７に練居された配列の相補体と、（ｃ）配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７に列挙された配列の逆相補体と、（ｄ）配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７に列挙された配列の逆配列と、（ｅ）前記（ａ）−（ｄ）の配列に対して、ここに定義されるとおりの同一性が４０％、６０％、７５％または９０％のいずれかである配列とからなるグループから選択されるポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド配列と、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７に示された配列に対応するプローブおよびプライマーと、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定されたポリヌクレオチドのいずれかの少なくとも特定された数の連続した残基を含むポリヌクレオチドと、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７に示された配列の部分を含む拡張された配列とを提供するが、これらの全てはここでは「本発明のポリヌクレオチド」として引用される。本発明は、添付された配列表において配列番号６３−８０、８７および１３０として同定された単離ポリペプチド配列と、これらの配列のポリペプチド変異体と、前記単離ポリペプチド配列およびこれらの配列の変異体を含むポリペプチドとを提供する。
【０００７】
別の局面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを、単独で、あるいは、本発明の１または２以上の追加のポリヌクレオチドとの組み合わせで、または１または２以上の既知ポリヌクレオチドとの組み合わせで含む遺伝子コンストラクトを、かかるコンストラクトを含む細胞および標的生物とともに提供する。
【０００８】
関連した局面では、本発明は、５’から３’への順に、本発明のポリヌクレオチドプロモーター配列と、転写されるポリヌクレオチドと、遺伝子ターミネーション配列を含む、遺伝子コンストラクトを提供する。前記転写されるポリヌクレオチドは、関心のあるポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドのオープン・リーディング・フレームを含むものであってもよく、関心のあるポリヌクレオチドのノンコーディング領域すなわち非翻訳領域であってもよい。前記オープン・リーディング・フレームは、センスまたはアンチセンスのいずれの方向でもよい。前記遺伝子ターミネーション配列は宿主植物で機能することが好ましい。遺伝子ターミネーション配列は、関心のある遺伝子のものであることが最も好ましいが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌のノパリンシンターゼのターミネーター（ｎｏｐａｌｉｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）のように本発明の技術分野で一般的に使用されるその他の配列も本発明に有効に利用できる。遺伝子コンストラクトは、さらに、形質転換された細胞を同定するためのマーカーを含むこともある。
【０００９】
さらなる局面では、本発明の遺伝子コンストラクトを含むトランスジェニック細胞が、かかるトランスジェニック細胞とを含む、植物のような生物と、かかる植物の果実と、種子その他の生産物、由来物あるいは子孫とともに提供される。本発明のトランスジェニック植物の零余子（むかご、ｐｒｏｐａｇｕｌｅ）も本発明に含まれる。ここで用いられる「零余子」という語は、挿し木を含めて、有性的あるいは無性的な繁殖または増殖に利用される植物のいかなる部分をも意味する。
【００１０】
植物の品種、特に植物育成者権による品種登録が可能な植物の品種は、本発明から除かれることがある。植物は、単に、該植物またはその先祖の細胞に導入された外来遺伝子をゲノム中に安定的に含むからというだけで、「植物品種」とされる必要はない。
【００１１】
また別の局面では、植物のような標的生物における遺伝子発現を改変するための方法であって、該生物のゲノム中に本発明の遺伝子コンストラクトを安定的に取り込むことを含む方法が提供される。好ましい実施態様では、前記標的生物は植物であり、より好ましくは木本植物であり、さらに好ましくはユーカリ属またはマツ属の種からなるグループから選択され、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａとからなるグループから選択された木本植物である。
【００１２】
別の局面では、ポリペプチド発現が改変された、植物のような標的生物を作成する方法であって、トランスジェニック細胞を提供するために本発明の遺伝子コンストラクトで植物細胞を形質転換すること、再生と成熟した植物の成長とに導く条件下で前記トランスジェニック細胞を培養することを含む方法が提供される。
【００１３】
他の局面では、所望の機能または表現型の原因遺伝子を同定するための方法であって、テストされるポリヌクレオチドと操作可能に連結した本発明のポリヌクレオチドプロモーター配列を含む遺伝子コンストラクトで植物細胞を形質転換すること、該植物細胞を再生と成熟した植物の成長とに導く条件下で培養すること、このトランスジェニック植物の表現型を形質転換されない、すなわち野生型の植物の表現型と比較することを含む方法が提供される。
【００１４】
またさらなる局面では、本発明は、ユビキチンをエンコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。特定の実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１および３４に列挙された配列と、（ｂ）配列番号１および３４に列挙された配列の相補体と、（ｃ）配列番号１および３４に列挙された配列の逆相補体と、（ｄ）配列番号１および３４に列挙された配列の逆配列と、（ｅ）前記（ａ）−（ｄ）の配列に対するここに定義されたヌクレオチド同一性が４０％、６０％、７５％または９０％のいずれかである配列とからなるグループから選択されたポリヌクレオチドを含む。かかるポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドも、かかるポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトと、かかる遺伝子コンストラクトで形質転換された宿主細胞および例えば植物のようなトランスジェニック生物とともに提供される。特定の実施態様では、かかるポリペプチドは配列番号８０または６７に提供される配列を含む。
【００１５】
またさらなる局面では、本発明は、配列番号２１のＤＮＡ配列、配列番号２１の相補体、逆相補体または変異体を含む単離されたポリヌクレオチドを、かかるポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトおよびかかる配列で形質転換された細胞とともに提供する。以下に説明するとおり、配列番号２１の配列を配列番号２１の配列を含むポリヌクレオチドから除去することは該ポリヌクレオチドの発現を増強する。逆に、配列番号２１の配列を関心のあるポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトに含めることは、該ポリヌクレオチドの発現を減少させる。
【００１６】
以下の詳細な説明を参照することにより、本発明の上記のおよびさらなる特長およびその入手方法は明らかとなり、本発明は最も良く理解される。ここで開示された全ての参照文献は、引用によりそれらの全体があたかも各々が個別に取り込まれたかのごとくに取り込まれる。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、植物の表現型を操作するのに用いることのできる単離されたポリヌクレオチド調節領域を、かかる調節領域を含む単離されたポリヌクレオチドとともに提供する。より具体的には、マツおよびユーカリから単離されたポリヌクレオチドのプロモーター配列が開示される。上記のとおり、プロモーターは細胞内の「転写装置」の構成成分であり、遺伝子発現の調節に関与する。組織特異的な遺伝子発現パターンおよび時間特異的な遺伝子発現パターンの両方とも、植物の正常発生においてプロモーターにより開始され、制御されることが知られている。よって、本発明の単離されたポリヌクレオチドのプロモーター配列は、植物の成長および発生と、環境因子および病原体のような外界からの刺激に対する細胞の応答を改変するために用いることができる。
【００１８】
本発明の方法および材料を用いて、関心のある特定のポリペプチドの量を、本発明のプロモーター配列と操作可能に連結された前記ポリペプチドをエンコードする遺伝子、すなわちコーディング配列、の追加のコピーを植物のような標的生物のゲノムに取り込むことにより、増減する場合がある。同様に、前記ポリペプチドの量を増減することは、かかる遺伝子のアンチセンスコピーで標的生物を形質転換することにより行う場合もある。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、林産植物資源、主にＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓおよびＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａから単離されたが、代替策として通常の合成技術を用いて合成してもよい。具体的には、本発明の単離されたポリヌクレオチドには、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定された配列と、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定された配列の相補体と、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定された配列の逆相補体と、上記のポリヌクレオチドのいずれかの少なくとも特定された数の連続した残基（ｘ量体）と、上記のポリヌクレオチドのいずれかに対応する拡張された配列と、上記のポリヌクレオチドのいずれかに対応するアンチセンス配列と、上記のポリヌクレオチドのいずれかの変異体のグループから選択される配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００２０】
別の実施態様では、本発明は、配列番号６３−８０、８７および１３０のポリヌクレオチドにエンコードされた単離ポリペプチドを提供する。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＤＮＡおよびポリペプチドの類似性検索により推定的に同定された。添付された配列表では、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７はポリヌクレオチド配列で、配列番号６３−８０、８７および１３０はポリペプチド配列である。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、植物における転写および／または発現の調節に関与することが知られたプロモーターとの類似性が証明されている。本発明のポリヌクレオチドの推定された正体の説明が、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または推測されるプロモーター領域（残基番号で同定される）とともに以下の表１に示される。
【００２２】
【表１】
2004511216.tif 000002
（続き）
2004511216.tif 000003
（続き）
2004511216.tif 000004
（続き）
2004511216.tif 000005
（続き）
2004511216.tif 000006
【００２３】
１の実施態様では、本発明は、ユビキチンポリペプチドをエンコードするＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａおよびＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓから単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａから単離されたユビキチンポリヌクレオチドの完全長配列は配列番号１に提供され、イントロンを含むプロモーター領域の配列は配列番号２に提供され、イントロンを除いたプロモーター領域の配列は配列番号３に提供される。Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓから単離されたユビキチンポリヌクレオチドの配列は配列番号３４に提供される。関連した実施態様では、本発明は、配列番号８０および６７の配列を含むポリペプチドを含んだ、配列番号１および３４の単離ポリヌクレオチドにエンコードされた単離ポリペプチドを提供する。
【００２４】
ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの塩基の１本鎖または２本鎖のポリマーを意味し、ＤＮＡ分子と、これと対応する、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の、ＨｎＲＮＡおよびｍＲＮＡ分子を含むＲＮＡ分子とを含み、全合成または部分合成されたポリヌクレオチドとともに、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび組み換えＤＮＡを含む。ＨｎＲＮＡ分子は、イントロンを含み、ＤＮＡ分子と一般的に１対１で対応する。ｍＲＮＡ分子は、イントロンが切り出されたＨｎＲＮＡおよびＤＮＡ分子に対応する。ポリヌクレオチドは、遺伝子全体またはそのいかなる部分をも含む。操作可能なアンチセンスポリヌクレオチドは対応するポリヌクレオチドの断片を含み、それゆえに「ポリヌクレオチド」の定義は全てのかかる操作可能なアンチセンス断片を含む。アンチセンスポリヌクレオチドおよびアンチセンスポリヌクレオチドを伴う技術は本発明の技術分野において周知であり、例えば、ロビンソン−ベニオン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎ）ら、「アンチセンス技術（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、メソッズ　イン　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、２５４巻、２３号、３６３−３７５頁、１９９５年およびカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）ら、アーティフィシャル　オーガンズ（Ａｒｔｉｆｉｃ．Ｏｒｇａｎｓ）、２０巻、８号、８３６−８４８頁、１９９６年に記載されている。
【００２５】
ここで記載された全てのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、当業者に慣用される条件で単離精製される。ポリペプチドは、少なくとも約８０％純粋であることが好ましく、少なくとも９０％純粋であることがより好ましく、少なくとも９９％純粋であることが最も好ましい。
【００２６】
ここで使用された「相補体」、「逆相補体」、および「逆配列」という用語の定義は、以下の例で最も良く示されている。５’ＡＧＧＡＣＣ３’という配列に対して、相補体、逆相補体および逆配列は以下のとおりである。
相補体　　　　　　　　３’ＴＣＣＴＧＧ５’
逆相補体　　　　　　　３’ＧＧＴＣＣＴ５’
逆配列　　　　　　　　５’ＣＣＡＧＧＡ３’
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドの一部は、完全長ポリペプチドをエンコードする完全長遺伝子を意味しないという点で、「部分（ｐａｒｔｉａｌ）」配列である。かかる部分配列は、プライマーおよび／またはプローブと、周知の雑種形成技術および／またはＰＣＲ技術とを用いて、さまざまなＤＮＡライブラリを分析し、配列決定することにより拡張できる。部分配列は、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレーム、完全長ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを発現可能な遺伝子か、あるいは別のゲノムの有用な部分かが同定されるまで拡張できる。完全長ポリヌクレオチドおよび遺伝子を含むかかる拡張された配列は、この拡張されたポリヌクレオチドが、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７の１つの配列として同定された配列またはその変異体、あるいはその同定された連続した部分（ｘ量体）またはその変異体を含むとき、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７の１つの配列またはその変異体あるいは配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７の１つの配列の部分またはその変異体に「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ）」と説明される。かかる拡張されたポリヌクレオチドは、約５０個ないし約４、０００個の核酸または塩基対の長さを有するものであってもよいが、約４、０００個以下の核酸または塩基対の長さを有するのが好ましく、約３、０００個の核酸または塩基対の長さを有するのがより好ましく、約２、０００個の核酸または塩基対の長さを有するのがさらに好ましい。一定の状況の下では、本発明の拡張されたポリヌクレオチドは、約１、８００個未満の核酸または塩基対を有するものでもよいが、約１、６００個未満の核酸または塩基対を有するのが好ましく、約１、４００個未満の核酸または塩基対を有するのがより好ましく、約１、２００個未満の核酸または塩基対を有するのがさらに好ましく、約１、０００個未満の核酸または塩基対を有するのが最も好ましい。
【００２８】
同様に、本発明のポリヌクレオチドに対応するＲＮＡ配列、逆配列、相補配列、アンチセンス配列等は、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定されたｃＤＮＡ配列を用いて、決まり切った手順で（ｒｏｕｔｉｎｅｌｙ）確認し、取得することができる。
【００２９】
配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）または部分的なオープン・リーディング・フレームを含む場合がある。さらに、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームは、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として示された配列に対応する拡張された配列または完全長配列の中に同定できる。オープン・リーディング・フレームは、当業者に周知の技術を用いて同定してもよい。これらの技術は、例えば、既知の開始および終了コドンの位置の解析、コドン頻度にもとづく最も可能性の高い読み枠の同定等を含む。ＯＲＦ解析のために適当なツールとソフトウェアは、例えばサンガーセンター（Ｔｈｅ　Ｓａｎｇｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ、ケンブリッジ、英国（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　Ｔｒｕｓｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｃａｍｐｕｓ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＣＢ１０　１ＳＡ、Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ））から入手可能な「ＧｅｎｅＷｉｓｅ」と、ミネソタ大学計算機生物学センター、ミネアポリス、ミネソタ州（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｃｅｎｔｅｒｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、ＵＭＨＧ　Ｂｏｘ　４３、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ　ＭＮ　５５４５５）から入手可能な「Ｄｉｏｇｅｎｅｓ」と、オークリッジ国立研究所、テネシー州、オークリッジ（ｔｈｅ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｇｒｏｕｐ、Ｏａｋ　Ｒｉｄｇｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏａｋ　Ｒｉｄｇｅ、Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ　ＴＮ）から入手可能な「ＧＲＡＩＬ」とが含まれる。オープン・リーディング・フレームおよびオープン・リーディング・フレームの部分は、本発明のポリヌクレオチドの中に同定できる。ひとたび部分的なオープン・リーディング・フレームが同定されると、ポリヌクレオチドは、完全なオープン・リーディング・フレームのポリヌクレオチドが同定できるまで、当業者に周知の技術を用いて部分オープン・リーディング・フレームの領域を拡張することができる。よって、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームは、本発明のポリヌクレオチドを用いて同定できる。
【００３０】
ひとたびオープン・リーディング・フレームが本発明のポリヌクレオチドの中に同定されると、該オープン・リーディング・フレームは、単離および／または合成できる。前記オープン・リーディング・フレームと、当業者に周知の適当なプロモーター、イニシエーター、ターミネーター等とを含む、発現可能な遺伝子コンストラクトが構築できる。かかる遺伝子コンストラクトは、前記オープン・リーディング・フレームにエンコードされたポリペプチドを発現するために宿主細胞に導入される。適当な宿主細胞は、植物細胞、哺乳類細胞、細菌細胞、藻類等を含むさまざまな前核および真核細胞を含む。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドは、その生物活性を決定するため、発現され、さまざまなアッセイ法に使用される。かかるポリペプチドは、抗体作成と、相互作用する相手の蛋白質またはその他の化合物の単離と、相互作用する相手の蛋白質またはその他の化合物のレベルの定量的な測定とに用いることができる。
【００３２】
ここで使用された「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合で連結された、完全長を含むいかなる長さのアミノ酸鎖をも含む。本発明のポリペプチドは、単離精製された天然物であってもよく、あるいは、組み換え技術を用いて部分的にあるいは全面的に生産されてもかまわない。ここで使用される「ポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチド」という用語は、本発明の部分的に単離されたＤＮＡ配列を含むヌクレオチド配列によりエンコードされるポリペプチドを含む。
【００３３】
関連する実施態様では、配列番号６３−８０、８７および１３０に提供された配列からなるグループから選択される配列を有するポリペプチドの少なくとも機能性のある部分を含むポリペプチドが提供される。ここで使用される、ポリペプチドの「機能性のある部分」とは、該ポリペプチドの機能に影響を与えるために必須の活性部位を含む部分、例えば、１または２以上の反応物と結合することが可能な分子の部分をいう。前記活性部位は、１または２以上のポリペプチド鎖上に存在する分離された部分からなる場合もあり、一般的に高い結合親和性を示す。
【００３４】
ポリペプチドの機能性のある部分は、まず、化学的または酵素的に該ポリペプチドを消化して該ポリペプチドの断片を準備することにより、あるいは、前記ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの突然変異解析をすることおよび得られた突然変異ポリペプチドを発現することにより同定することができる。つぎに、前記ポリペプチド断片または突然変異ポリペプチドは、例えば以下に提供される代表的なアッセイ法を用いて、どの部分が生物活性を保持するかを決定するためにテストされる。
【００３５】
本発明のポリペプチドの部分その他の変異体は、合成または組み換えの手段により生成できる。約１００個未満、一般的には約５０個未満のアミノ酸を有する合成ポリペプチドは、本発明の分野の通常の技量を有する者に周知の技術を用いて合成することができる。例えば、かかるポリペプチドは、アミノ酸が次々に伸長中のアミノ酸鎖に付加されていくメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相合成法のような、いずれかの商業的に利用可能な固相技術を用いて合成することが可能である（メリフィールド、ジャーナル　オブ　アメリカン　ケミカル　ソサエティ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、８５巻、２１４９−２１４６頁、１９６３年）。ポリペプチド自動合成装置は、パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ））のような供給者から商業的に入手可能であり、製造者の指示に従って操作することができる。天然のポリペプチドの変異体は、オリゴヌクレオチド指令型（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）部位特異的突然変異生成のような標準的な突然変異生成技術を用いて調製される（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、プロシーディングス　オブ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンシズ　オブ　ジ　ユナイテッド　ステーツ　オブ　アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、４８８−４９２頁、１９８５年）。ＤＮＡ配列の部分は、不完全なポリペプチドの調製を可能にするように標準的な技術を用いて切除される。
【００３６】
ここで使用された「変異体」という用語は、特異的に同定された配列と異なるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含むものであって、１または２以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が、欠失、置換または付加されたものをいう。変異体は、自然界に存在する対立遺伝子の変異体でも、自然界に存在しない変異体でもよい。変異体配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、本発明の配列に対し少なくとも５０％、より好ましくは７５％、さらにより好ましくは９０％の、残基の同一性を示すものをいう。残基の同一性の百分率は、以下に記載のとおり、比較する２つの配列のアライメントをとり（ａｌｉｇｎ）、アライメントがとれた部分の同一残基数を決定し、該同一残基数を本発明の（クエリーの）配列中の全残基数で除算し、その結果を１００倍したものをいう。
【００３７】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、公開で入手可能なコンピューターアルゴリズムを用いて、アライメントをとることができ、特定の領域のヌクレオチドの同一性の百分率を別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して決定することができる。ポリヌクレオチド配列のアライメントおよび類似性同定のための２つの代表的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリヌクレオチドは、（両方の鎖の）ヌクレオチドのクエリー配列の６つの読み枠の概念的な翻訳産物をタンパク配列データベースに対して比較するＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いても解析できる。ポリペプチド配列の類似性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて調べることができる。説明書に記載され、前記アルゴリズムとともに配布された、デフォルトのパラメーター値に設定したＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．４（１９９８年２月２４日）、２．０．６（１９９８年９月１６日）および２．０．１１（２０００年１月２０日）を、本発明による変異体の決定に用いるのが好ましい。ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、本発明によるポリペプチド変異体の決定に用いるのが好ましい。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムは、アルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）らによる「ギャップ入りのＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム」、ニュークレイック　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年という刊行物に記載されている。前記ＢＬＡＳＴＮソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の匿名ＦＴＰサーバー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上の／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／と、ＮＣＢＩ、メリーランド州、ベゼスダ（ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ　３８Ａ、Ｒｏｏｍ　８Ｎ８０５、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ　２０８９４　ＵＳＡ）とから入手することができる。
【００３８】
ＦＡＳＴＡソフトウェアのパッケージは、バージニア大学、バージニア州、シャーロットビル（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＰＯ　Ｂｏｘ　９０２５、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ　２２９０６−９０２５）から入手可能である。説明書に記載され、アルゴリズムとともに配布されたデフォルトのパラメーター値に設定した、バージョン２．０ｕ４（１９９６年２月）を、本発明による変異体の決定に用いることができる。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法は、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、「生物学的な配列の解析のための改良されたツール」、プロシーディングス　オブ　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンシズ　オブ　ジ　ユナイテッド　ステーツ　オブ　アメリカ、８５巻、２４４４−２４４８頁、１９８８年と、ピアソン、「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡを用いる迅速で敏感な配列比較」、メソッズ　イン　エンザイモロジー、１８３巻、６３−９８頁、１９９０年とに記載されている。
【００３９】
以下のランニングパラメーターを、ポリヌクレオチド配列の以下に説明するＥ値（Ｅ　ｖａｌｕｅｓ）および同一性の百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＮを使うアライメントおよび類似性の決定に用いるのが好ましい。Ｕｎｉｘ（登録商標）のランニングコマンドは、「ｂｌａｓｔａｌｌ　−ｐ　ｂｌａｓｔｎ　−ｄ　ｅｍｂｌｄｂ　−ｅ　１０　−Ｇ０　−Ｅ０　−ｒ　１　−ｖ　３０　−ｂ　３０　−ｉ　ｑｕｅｒｙｓｅｑ　−ｏ　ｒｅｓｕｌｔｓ」で、パラメーターは以下のとおりである。
−ｐ　　プログラムの名称　［文字列］；−ｄ　　データベース　［文字列］；−ｅ　　期待値　（Ｅ）　［実数］；−Ｇ　　ギャップを空けるためのコスト　（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）　［整数］；−Ｅ　　ギャップを拡張するためのコスト　（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）　［整数］；−ｒ　　ヌクレオチドのマッチの報酬　（ｂｌａｓｔｎのみ）　［整数］；−ｖ　　１行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数　（Ｖ）　［整数］；−ｂ　　表示するアライメントの数　（Ｂ）　［整数］；−ｉ　　クェリーファイル　［Ｆｉｌｅ　Ｉｎ］；−ｏ　　ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル　［Ｆｉｌｅ　Ｏｕｔ］　　任意。
【００４０】
以下のランニングパラメーターを、ポリペプチド配列のＥ値および同一性の百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＰを使うアライメントおよび類似性の決定に用いるのが好ましい。「ｂｌａｓｔａｌｌ　−ｐ　ｂｌａｓｔｐ　−ｄ　ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄｂ　−ｅ　１０　−Ｇ　０−Ｅ　０　−ｖ　３０　−ｂ　３０　−ｉ　ｑｕｅｒｙｓｅｑ　−ｏ　ｒｅｓｕｌｔｓ」で、パラメーターは以下のとおりである。
−ｐ　　プログラムの名称　［文字列］；−ｄ　　データベース　［文字列］；−ｅ　　期待値　（Ｅ）　［実数］；−Ｇ　　ギャップを空けるためのコスト　（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）　［整数］；−Ｅ　　ギャップを拡張するためのコスト　（ゼロはデフォルトの行動を呼び起こす）　［整数］；−ｖ　　１行説明（ｏｎｅ−ｌｉｎｅ　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）の数　（Ｖ）　［整数］；−ｂ　　表示するアライメントの数　（Ｂ）　［整数］；−ｉ　　クェリーファイル　［Ｆｉｌｅ　Ｉｎ］；−ｏ　　ＢＬＡＳＴレポートアウトプットファイル　［Ｆｉｌｅ　Ｏｕｔ］　　任意。
【００４１】
ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰまたは同様のアルゴリズムにより作成された、クエリー配列による１または２以上のデータベース配列への「ヒット」は、配列の類似部分のアライメントをとって同定する。前記ヒットは、類似性の程度および配列重複の長さの順に並べられる。データベース配列へのヒットは、前記クエリー配列の配列長の一部としか重複しないことを意味するのが一般的である。
【００４２】
ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、アライメントの「期待」（Ｅ）値をも算出する。Ｅ値は、一定の規模のデータベースを検索したときに偶然一定数の隣接した配列にわたって発見が「期待」できるヒットの数を示す。Ｅ値は、好ましいＥＭＢＬデータベースのようなデータベースへのヒットが真の類似性を表すかどうかを決定するための、有意性の閾値として用いられる。例えば、あるポリヌクレオチドのヒットに付与されたＥ値が０．１であることは、ＥＭＢＬデータベースの規模のデータベースにおいて、同様のスコアの配列のアライメントをとった部分にわたって、偶然０．１回マッチすることが期待できると解釈される。この判定基準により、前記ポリヌクレオチド配列のアライメントがとれてマッチした部分は、９０％が同一である確率を有することになる。アライメントがとれてマッチした部分にわたって０．０１未満のＥ値を有する配列については、アルゴリズムＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡを用いてＥＭＢＬデータベースで偶然マッチするものを見つける確率は、１％未満である。
【００４３】
１の実施態様によると、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのそれぞれに関して、「変異体」のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのそれぞれよりも核酸またはアミノ酸の数が同じか少ない配列で、かつ本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比べて０．０１未満のＥ値となる配列を含むのが好ましい。すなわち、変異体ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である確率が９９％以上あり、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下となる、いかなる配列をもいう。好ましい実施態様によると、変異体ポリヌクレオチドとは、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳＴＮまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いるとＥ値が０．０１以下となり、９９％以上の確率で本発明のポリヌクレオチドと同一となる、本発明のポリヌクレオチドの核酸の数以下の数の核酸を有する配列をいう。同様に、好ましい実施態様によると、変異体ポリペプチドとは、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いるとＥ値が０．０１以下となり、９９％以上の確率で本発明のポリペプチドと同一となる、本発明のポリペプチドよりアミノ酸の数が同じか少ない配列をいう。
【００４４】
本発明の変異体ポリヌクレオチドは、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７に列挙されたポリヌクレオチド配列またはこれらの配列の、相補体、逆配列または逆相補体と、ストリンジェントな条件下で雑種形成するというのが代替策である。ここで使用された「ストリンジェントな条件」とは、６Ｘ　ＳＳＣと０．２％　ＳＤＳの溶液で前洗浄し、６５°Ｃ、終夜（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）、６Ｘ　ＳＳＣと０．２％　ＳＤＳの溶液中で雑種形成させ、その後６５°Ｃ、１Ｘ　ＳＳＣと０．１％　ＳＤＳで各３０分ずつ２回洗浄し、６５°Ｃ、０．２Ｘ　ＳＳＣと０．１％　ＳＤＳで各３０分ずつ２回洗浄することを指す。
【００４５】
本発明は、開示された配列とは相違するが、遺伝暗号の縮退の結果本発明のポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチドと同じポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドも含む。したがって、保存的置換の結果、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７に列挙されたポリヌクレオチド配列またはこれらの配列の相補体、逆配列または逆相補体と相違する配列を含むポリヌクレオチドは、本発明により意図されたものであり、本発明に含まれる。さらに、合計が前配列長の１０％未満の欠失および／または挿入の結果として、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７に列挙されたポリヌクレオチド配列、またはこれらの配列の相補体、逆配列または逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオチドも、本発明により意図されたものであり、かつ本発明に含まれる。同様に、合計が全配列長の１０％未満のアミノ酸置換、挿入および／または欠失の結果として配列番号６３−８０、８７および１３０に列挙されたポリペプチド配列と異なる配列を含むポリペプチドは、本発明により意図されたものであり、かつ本発明に含まれる。一部の実施態様では、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの変異体は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの生物活性と同一または類似の生物活性を有する。かかる変異体ポリヌクレオチドは、プロモーター配列として機能し、それゆえ植物の遺伝子発現を改変することができる。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは、さまざまなライブラリから単離してもよく、あるいは当業者に周知の技術を用いて合成してもよい。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、５０個までか、それ以上の核酸のポリヌクレオチドセグメントを得るために、自動オリゴヌクレオチド合成機（例としてベックマン社オリゴ１０００Ｍ　ＤＮＡシンセサイザー）を使用して合成してもよい。複数のかかるポリヌクレオチドセグメントは、分子生物学の分野で周知の標準的なＤＮＡ操作技術を用いて連結することができる。１つの従来の代表的なポリヌクレオチド合成技術は、例えば、８０個の核酸を有する１本鎖ポリヌクレオチドセグメントを合成すること、該セグメントを相補的な８５個の核酸セグメントと雑種形成して５ヌクレオチドのオーバーハングを作り出すことを伴う。次のセグメントも同様の手法で反対側の鎖に５ヌクレオチドのオーバーハングを持つように合成される。この「粘着」末端が、前記の２つの部分が雑種形成したときに適切に連結することを保証する。このようにして、本発明の完全なポリヌクレオチドは、試験管内で全合成できる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定されたポリヌクレオチドと、かかる配列の相補体と、逆配列と、逆相補体と、それらの変異体とのうちのいずれかの、少なくとも特定の数の連続した残基を含むポリヌクレオチド（ｘ量体）を含むポリヌクレオチドを含む。同様に、本発明のポリペプチドは、配列番号６３−８０、８７および１３０として同定されたポリペプチドとそれらの変異体とのうちのいずれかの、少なくとも特定の数の連続した残基を含むポリペプチド（ｘ量体）を含むポリペプチドを含む。ここで使用される「ｘ量体」という用語は、「ｘ」の特定の値に関して、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定されたポリヌクレオチドか、配列番号６３−８０、８７および１３０として同定されたポリペプチドかのいずれかの、少なくとも特定された数（ｘ）の連続した残基を含む配列を指す。好ましい実施態様によると、ｘの値は少なくとも２０が好ましく、少なくとも４０がより好ましく、少なくとも６０がさらに好ましく、少なくとも８０が最も好ましい。よって、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよびそれらの変異体の２０量体、４０量体、６０量体、８０量体、１００量体、１２０量体、１５０量体、１８０量体、２２０量体、２５０量体、３００量体、４００量体、５００量体または６００量体を含む。
【００４８】
上記のとおり、本発明のポリヌクレオチドプロモーター配列は、関心のあるポリヌクレオチドの転写および／または発現を駆動するために遺伝子コンストラクトに用いることができる。関心のあるポリヌクレオチドは形質転換される生物、例えば植物にとって内在性であるか、あるいは異種由来であるかのいずれであってもかまわない。それゆえ、本発明の遺伝子コンストラクトは、野生型植物に存在する、例えば遺伝子のようなポリヌクレオチドの転写および／または発現のレベルを調整するために用いられ、あるいは、野生型植物にはみられないＤＮＡ配列の転写および／または発現を提供するために用いられる。
【００４９】
一部の実施態様では、関心のあるポリヌクレオチドは標的ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームを含む。該オープン・リーディング・フレームは、標的植物へのＤＮＡコンストラクトの形質転換が野生型植物と比較してポリペプチド量が変化するように、該ＤＮＡコンストラクトにセンスまたはアンチセンス方向に挿入される。オープン・リーディング・フレームをセンス方向に含むＤＮＡコンストラクトでの形質転換は、選択された遺伝子の過剰発現をもたらすのが一般的であり、オープン・リーディング・フレームをアンチセンス方向に含む遺伝子コンストラクトでの形質転換は、選択された遺伝子の発現の減少をもたらすのが一般的である。本発明のオープン・リーディング・フレームをセンスまたはアンチセンスどちらかの方向に含むＤＮＡコンストラクトで形質転換された植物の集団は、当業者に周知の技術を用いて、問題の遺伝子の発現が増大または減少していることについてスクリーニングされ、所望の表現型を有する植物が単離される。
【００５０】
標的ポリペプチドの発現は、センスまたはアンチセンスのいずれかの方向で、本発明のオープン・リーディング・フレームの部分を前記遺伝子コンストラクトに挿入することにより阻害できるというのが代替策である。かかる部分は完全長である必要はないが、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも２５個の残基を含むことが好ましく、少なくとも５０個の残基を含むことがより好ましい。しかし、より長い部分か、あるいは完全なオープン・リーディング・フレームかに対応する完全長ポリヌクレオチドを用いてもかまわない。前記オープン・リーディング・フレームの部分は、標的遺伝子の阻害を達成するのに十分な配列類似性があることを条件として、内在配列と正確に同一である必要はない。したがって、１つの種由来の配列が、異なる種の遺伝子の発現を阻害するのに用いられてもよい。
【００５１】
さらなる実施態様では、本発明の遺伝子コンストラクトは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の非翻訳領域、すなわちノンコーディング領域を含むポリヌクレオチドか、あるいはかかる非翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドかを含む。かかるコンストラクトに有用な非翻訳領域の例には、イントロンおよび５’非翻訳リーダー配列が含まれる。かかる遺伝子コンストラクトによる標的植物の形質転換は、例えばナポリ（Ｎａｐｏｌｉ）ら、プラント　セル（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ）、２巻、２７９−２９０頁、１９９０年およびデ・カルバリョ・ニーベル（ｄｅ　Ｃａｒｖａｌｈｏ　Ｎｉｅｂｅｌ）ら、プラント　セル、７巻、３４７−３５８頁、１９９５年によって論じられたのと同様の手法である、コサプレッションの過程によって、植物で発現するポリペプチド量の減少をもたらす。
【００５２】
ポリペプチド発現の調節は、適当な配列またはサブ配列（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）をリボザイムコンストラクトに挿入することにより達成できるというのが代替策である（マッキンタイヤー（ＭｃＩｎｔｙｒｅ）およびマナーズ（Ｍａｎｎｅｒｓ）、トランスジェニック　リサーチ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓ．）、５巻、４号、２５７−２６２頁、１９９６年）。リボザイムとは、各々が本発明の１のポリヌクレオチドにエンコードされるｍＲＮＡ分子中の少なくとも５個の連続したヌクレオチドからなる２つの領域に相補的な雑種形成領域を含む合成ＲＮＡ分子をいう。リボザイムは特異性の高いエンドヌクレアーゼ活性を有し、自己触媒的に前記ｍＲＮＡを切断する。
【００５３】
コーディング配列のような関心のあるポリヌクレオチドは、宿主はのポリヌクレオチドプロモーター配列と、宿主細胞が前記関心のあるポリヌクレオチドと連結した前記プロモーターからＲＮＡを転写することができるように、操作可能に連結される。前記ポリヌクレオチドプロモーター配列は、転写されるポリヌクレオチドの５’末端に位置することが一般的である。配列番号２および３のＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａのユビキチンポリヌクレオチドプロモーター配列か、配列番号３４に含まれるＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓのユビキチンポリヌクレオチドプロモーター配列のような、構成的なプロモーターを用いることは、形質転換された植物の全ての部分における関心のあるＤＮＡ配列の転写に影響を与える。配列番号９−１１の葉特異的プロモーター、配列番号１３−１４の根特異的プロモーター、配列番号２９−３３、５９および８９−９０の花特異的プロモーター、配列番号４９−５５および９４の花粉特異的プロモーター、配列番号４０の芽特異的プロモーターあるいは配列番号４５の分裂組織特異的プロモーターのような、組織特異的プロモーターを用いることは、所望のセンスまたはアンチセンスＲＮＡが関心のある組織のみで産生されるという結果をもたらす。配列番号５，４１−４４および９２の木部化（ｘｙｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）特異的プロモーターのような、時間的に調節されたプロモーターは、形質転換された植物の発生における特定の時のＤＮＡ転写速度の調整に影響を与えるように用いることができる。誘導可能な遺伝子プロモーター配列を用いる遺伝子コンストラクトでは、ＤＮＡの転写速度は、光、熱、嫌気的ストレス、栄養条件の変動等のような外界の刺激により調整できる。
【００５４】
さらに、本発明の遺伝子コンストラクトは、関心のあるポリヌクレオチドの３’側に位置する遺伝子ターミネーション配列を含む。本発明の遺伝子コンストラクトに有効に利用できるさまざまな遺伝子ターミネーション配列が、本発明の技術分野で周知である。かかる遺伝子ターミネーション配列の１つの例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌のノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端である。前記遺伝子ターミネーション配列は、遺伝子プロモーター配列が標的植物において機能することを条件として、前記標的植物に内在性のものでもよく、あるいは異種由来のものでもよい。例えば、前記ターミネーション配列は、他の植物種、植物ウイルス、細菌プラスミド等由来でもかまわない。
【００５５】
本発明の遺伝子コンストラクトは、本発明のコンストラクトを含む形質転換細胞の検出を可能にするように、植物のような標的生物の細胞内で有効な選択マーカーを含むことがあってもよい。本発明の技術分野で周知であるかかるマーカーは、１または２以上の毒素の耐性を有するのが典型的である。かかるマーカーの１つの例は、その発現により中程度の濃度で植物細胞に通常は毒性のあるカナマイシンまたはハイグロマイシンに対する耐性をもたらすＮＰＴＩＩ遺伝子である（ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）ら、ワイスバッハ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）、　ＡおよびＨ編、「植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、アカデミック・プレス、カリフォルニア州　サンジエゴ、１９８８年）。形質転換細胞は、問題の抗生物質を含む培地中での増殖能により同定できる。形質転換細胞中に所望のコンストラクトが存在することは、サザンブロット法およびウェスタンブロット法のような本発明の技術分野に周知の他の技術によって決定することができるというのが代替策である。
【００５６】
本発明の遺伝子コンストラクトの構成要素を操作可能に結合させるための技術は、本発明の技術分野で周知であり、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬプレス、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）に記載された、１または２以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだ合成リンカーの利用を含む。本発明の遺伝子コンストラクトは、それぞれの操作が終わるたびに出来上がったコンストラクトをクローニングし、配列決定して操作の正確さを決定することが可能な、例えば、大腸菌のような少なくとも１つの複製システムを有するベクターに連結される場合がある。
【００５７】
本発明の遺伝子コンストラクトは、植物を含むがこれに限定されない、さまざまな標的生物を形質転換するために用いられる。本発明のコンストラクトを用いて形質転換される植物には、単子葉類被子植物（例、牧草、トウモロコシ、穀類、カラスムギ、コムギ、オオムギ）および双子葉類被子植物（例、シロイヌナズナ、タバコ、マメ科植物、アルファルファ、オーク、ユーカリ、カエデ）の両方と、裸子植物（例、オウシュウアカマツ（Ｓｃｏｔ　ｐｉｎｅ）（アロネン（Ａｒｏｎｅｎ）、フィニッシュ　フォーレスト　リサーチ　ペーパーズ（Ｆｉｎｎｉｓｈ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｒｅｓ．　Ｐａｐｅｒｓ）、５９５巻、１９９６年）、ホワイトスプルース（エリス（Ｅｌｌｉｓ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１１巻、８４−８９頁、、１９９３年）、およびカラマツ（ｌａｒｃｈ）（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、イン　ビトロ　セル（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｌ）、２７巻、２０１−２０７頁、１９９１年）を含む。好ましい実施態様においては、本発明の遺伝子コンストラクトは、その茎が複数年生存して木質組織の追加により毎年直径が増大するような樹木または潅木とここでは定義される、木本植物の形質転換に用いられる。標的植物は、好ましくはユーカリとマツの種を含むグループから選択され、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａからなるグループから選択された。本発明のＤＮＡコンストラクトで有用に形質転換される他の種には、Ｐｉｎｕｓ　ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ　ｂｒｕｔｉａ、Ｐｉｎｕｓ　ｃａｒｉｂａｅａ、Ｐｉｎｕｓ　ｃｌａｕｓａ、Ｐｉｎｕｓ　ｃｏｎｔｏｒｔａ、Ｐｉｎｕｓ　ｃｏｕｌｔｅｒｉ、Ｐｉｎｕｓ　ｅｃｈｉｎａｔａ、Ｐｉｎｕｓ　ｅｌｄａｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ　ｅｌｌｉｏｔｉ、Ｐｉｎｕｓ　ｊｅｆｆｒｅｙｉ、Ｐｉｎｕｓ　ｌａｍｂｅｒｔｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ　ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｉｎｕｓ　ｎｉｇｒａ、Ｐｉｎｕｓ　ｐａｌｕｓｔｒｕｓ、Ｐｉｎｕｓ　ｐｉｎａｓｔｅｒ、Ｐｉｎｕｓ　ｐｏｎｄｅｒｏｓａ、Ｐｉｎｕｓ　ｒｅｓｉｎｏｓａ、Ｐｉｎｕｓ　ｒｉｇｉｄａ、Ｐｉｎｕｓ　ｓｅｒｏｔｉｎａ、Ｐｉｎｕｓ　ｓｔｒｏｂｕｓ、Ｐｉｎｕｓ　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｎｕｓ　ｔａｅｄａ、Ｐｉｎｕｓ　ｖｉｒｇｉｎｉａｎａのようなマツと、Ａｂｉｅｓ　ａｍａｂｉｌｉｓ、Ａｂｉｅｓ　ｂａｌｓａｍｅａ、Ａｂｉｅｓ　ｃｏｎｃｏｌｏｒ、Ａｂｉｅｓ　ｇｒａｎｄｉｓ、Ａｂｉｅｓ　ｌａｓｉｏｃａｒｐａ、Ａｂｉｅｓ　ｍａｇｎｉｆｉｃａ、Ａｂｉｅｓ　ｐｒｏｃｅｒａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ　ｌａｗｓｏｎｉｏｎａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ　ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ　ｔｈｙｏｉｄｅｓ、Ｈｕｎｉｐｅｒｕｓ　ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｌａｒｉｘ　ｄｅｃｉｄｕａ、Ｌａｒｉｘ　ｌａｒｉｃｉｎａ、Ｌａｒｉｘ　ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ、Ｌａｒｉｘ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｌａｒｉｘ　ｓｉｂｅｒｉｃａ、Ｌｉｂｏｃｅｄｒｕｓ　ｄｅｃｕｒｒｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ　ａｂｉｅｓ、Ｐｉｃｅａ　ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉ、Ｐｉｃｅａ　ｇｌａｕｃａ、Ｐｉｃｅａ　ｍａｒｉａｎａ、Ｐｉｃｅａ　ｐｕｎｇｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ　ｒｕｂｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ　ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ　ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ、Ｓｅｑｕｏｉａ　ｇｉｇａｎｔｅａ、Ｓｅｑｕｏｉａ　ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｔａｘｏｄｉｕｍ　ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ、Ｔｓｕｇａ　ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｔｓｕｇａ　ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｔｓｕｇａ　ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ、Ｔｈｕｊａ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｔｈｕｊａ　ｐｌｉｃａｔａのような他の裸子植物と、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ａｌｂａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｂａｎｃｒｏｆｔｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｂｏｔｙｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｂｒｉｄｇｅｓｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｃｌａｄｏｃａｌｙｘ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｃｏｃｃｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄａｌｒｙｍｐｌｅａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｅｇｌｕｐｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｅｌａｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｉｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｄｕｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｆｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｏｍｐｈｏｃｅｐｈａｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｕｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｈｅｎｒｙｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｌａｅｖｏｐｉｎｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｍａｃａｒｔｈｕｒｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｍａｃｒｏｒｈｙｎｃｈａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｍａｃｕｌａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｍｅｇａｃａｒｐａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｍｅｌｌｉｏｄｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｎｉｃｈｏｌｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｎｉｔｅｎｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｎｏｖａ−ａｎｇｌｉｃａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｏｂｌｉｑｕａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｏｂｔｕｓｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｏｒｅａｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｒｅｇｎａｎｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｒｏｂｕｓｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｒｕｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓａｌｉｇｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓｉｄｅｒｏｘｙｌｏｎ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｓｔｕａｒｔｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｔｏｒｅｌｌｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｎｉｇｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｕｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｖｉｍｉｎａｌｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｗａｎｄｏｏ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｙｏｕｍａｎｎｉのようなユーカリと、上記の種のいずれかのハイブリッドとを含むが、これらに限定されない。
【００５８】
遺伝子コンストラクトを標的植物のゲノムに安定的に取り込むための技術は当業者に周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を介した導入法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、生殖器官注入法、未熟胚注入法、高速発射体導入法（ｈｉｇｈ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）等が含まれる。どの技術を選択するかは、形質転換される標的植物により異なる。例えば、双子葉類植物およびいくつかの単子葉類および裸子植物は、例えばベバン（Ｂｅｖａｎ）（ニュークレイック・アシッズ・リサーチ、１２巻、８７１１−８７２１頁、１９８４年）に記載のアグロバクテリウムＴｉプラスミド技術によって形質転換できる。本発明の遺伝子コンストラクトの導入の標的には、葉組織のような組織、解離細胞、プロトプラスト、種子、胚、分裂組織領域、子葉、胚軸等が含まれる。ユーカリおよびマツを形質転換する好ましい方法は、花粉（例えば、アロネン、フィニッシュ・フォーレスト・リサーチ・ペーパーズ、５９５巻、５３頁、１９９６年を参照）または容易に再生可能な胚組織を用いるバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）な方法である。
【００５９】
ひとたび細胞が形質転換されると、本発明の遺伝子コンストラクトをゲノムに取り込んだ細胞は、上で説明したカナマイシン耐性マーカーのようなマーカーにより選択できる。つぎに、トランスジェニック細胞は、本発明の技術分野における周知技術を用いて、植物全体を再生するための適当な培地中で培養される。プロトプラストの場合には、細胞壁は適当な浸透圧条件下で再生させられる。種子または胚の場合には、適当な発芽またはカルス誘導培地が用いられる。外植体については、適当な再生培地が用いられる。植物の再生は、多くの種について十分に確立している。林木の再生の総説としては、ダンスタン（Ｄｕｎｓｔａｎ）ら、「木本植物における体細胞性胚発生」、ソープ（Ｔｈｏｒｐｅ）　ＴＡ編、植物の試験管内胚発生、カラント・プラント・サイエンス・アンド・バイオテクノロジー・イン・アグリカルチャー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｌａｎｔ　ＳｃｉｅｎｃｅおよびＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、２０巻、１２号、４７１−５４０頁、１９９５年）を参照のこと。スプルースの再生についての具体的なプロトコールは、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら、スプルースの体細胞性胚発生、ルダンボー（Ｒｅｄｅｎｂａｕｇｈ）　Ｋ編、シンシード：人工的な種子の作物改良への応用（Ｓｙｎｓｅｅｄ：　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｓｅｅｄ　ｔｏ　ｃｒｏｐ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）、ＣＲＣプレス、２３巻、４２７−４４９頁、１９９３年に説明されている。所望の表現型を有する形質転換植物は、本発明の技術分野における周知技術を用いて選抜される。得られた形質転換植物は、本発明の技術分野における周知技術を用いて、次世代以降のトランスジェニック植物を得るために、有性的または無性的な生殖で増殖させられる。
【００６０】
前記の説明のとおり、標的細胞中のＲＮＡ産生は、プロモーター配列の選択により、あるいは、標的宿主のゲノムに取り込まれたポリヌクレオチドの機能的なコピー数またはインテグレーション部位の選択により制御できる。標的生物は、２以上の本発明の遺伝子コンストラクトで形質転換され、２以上の遺伝子の活性を調整することもある。同様に、遺伝子コンストラクトは、関心のあるポリペプチドをコードする２以上のオープン・リーディング・フレームを含むように、あるいは、かかるポリペプチドをコードする遺伝子の２以上の非翻訳領域を含むように構築してもよい。
【００６１】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、ゲノムマッピング、物理地図マッピングおよび遺伝子のポジショナルクローニングに有用である。以下に詳しく説明するとおり、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として同定されたポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーを設計するのに利用可能である。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、スロットブロットＤＮＡ雑種形成技術のような本発明の技術分野における周知技術を用いて、細胞内に十分に類似性のあるＤＮＡおよびＲＮＡ配列を有するいかなる生物においても、遺伝子の存在を検出し、遺伝子発現パターンを調べるために用いることができる。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーはＰＣＲ増幅に利用できる。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州、サンタクララ）のマイクロアレイ技術を含むさまざまなマイクロアレイ技術と連繋して利用できる。
【００６２】
ここで使用された「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド配列の比較的短いセグメントであって、一般的には６個と６０個の間のヌクレオチドを含むセグメントを指し、雑種形成アッセイ法に使用するプローブとポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅に使用するプライマーとの両方を含む。
【００６３】
あるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーが、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として提示された配列の１つを含む本発明のポリヌクレオチドまたは変異体に「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ）」と記載されるのは、前記オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、あるいはその相補体が、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２７として提示された１の配列か、または前記配列番号で特定された配列の１の変異体かに含まれるときである。本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、ここに開示されるポリヌクレオチドと実質的に相補的な配列を有する。
【００６４】
２つの１本鎖配列に実質的な相補性があると言えるのは、最適なアライメントをとって比較すると、適当なヌクレオチド挿入および／または欠失を有する一方の鎖のヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％ないし９５％、そしてより好ましくは少なくとも９８％ないし１００％対合するときである。実質的な相補性が存在するのは、第１のＤＮＡ鎖が、第２のＤＮＡ鎖と、ストリンジェントな雑種形成条件下で選択的に雑種形成するときであるとするのが代替策である。相補性を決定するためのストリンジェントな雑種形成条件は、塩類の条件が約１Ｍ未満で、より通常的なのは約５００ｍＭ未満で、好ましくは約２００ｍＭ未満である。雑種形成の温度は、５°Ｃでもよいが、一般的には約２２°Ｃ以上で、より好ましいのは約３０°Ｃ以上で、最も好ましいのは約３７°Ｃ以上である。長いＤＮＡ断片ほど、特異的な雑種形成には高い雑種形成温度が必要である。雑種形成のストリンジェントさは、プローブ組成、有機溶媒の存在および塩基のミスマッチングの程度のような他の要因の影響を受けるため、パラメーターの組み合わせは、どれか１のパラメーターだけの絶対的な基準よりも重要である。
【００６５】
特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーは、本発明のポリヌクレオチド配列に相補的な、少なくとも約６個の連続した残基を含み、より好ましくは少なくとも約１０個の連続した残基を含み、最も好ましくは少なくとも約２０個の連続した残基を含む。本発明のプローブおよびプライマーは約８個から１００個までの塩基対の長さであってもよいが、約１０個から５０個の塩基対の長さが好ましく、約１５個から４０個の長さがより好ましい。前記プローブは、ＤＮＡ−ＤＮＡ雑種形成のストリンジェントさと、アニーリングおよび融解の温度と、ループ形成の可能性と、本発明の技術分野において周知のその他の要因とを考慮して、本発明の技術分野で周知の手順を用いて容易に選択できる。ＰＣＲプライマーの設計のための好ましい技術は、ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）およびディクスラー（Ｄｙｋｓｌｅｒ）、「ＰＣＲプライマー：実験室マニュアル（ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ：ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬプレス、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー、１９９５年に開示されている。プローブの設計用と、特にＰＣＲプライマーの設計用とに適したソフトウェアプログラムは、プレミア・バイオソフト・インターナショナル、カリフォルニア州パロアルト（Ｐｒｅｍｉｅｒ　Ｂｉｏｓｏｆｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、３７８６　Ｃｏｒｉｎａ　Ｗａｙ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ　９４３０３−４５０４）から入手することができる。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドに対応する複数のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、キットの形で提供される場合がある。かかるキットは、一般的には、複数のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドプローブを含み、それぞれのプローブは、あるポリヌクレオチド配列に特異的である。本発明のキットは、配列番号１−１４、２０、２２−６２、８１−８６および８８−１２０に同定されたポリヌクレオチド配列を含み、本発明のポリヌクレオチドに対応する１または２以上のプローブまたはプライマーを含む。
【００６７】
ハイスループットアッセイ法に有用な１の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブキットは、固体の表面上の予め定められた（ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ）番地により空間的な位置指定ができる（ｓｐａｔｏａｌｌｙ　ａｄｒｅｓｓａｂｌｅ）場所に各プローブが不動化された、アレイ状のフォーマットの複数のプローブを含む。本発明で有効に用いられるアレイ状フォーマットは、例えば、米国特許明細書第５、４１２、０８７号明細書、第５、５４５、４５１号明細書および国際公開第ＷＯ９５／００４５０号公報に開示されており、その開示内容は、ここでは引用により取り込まれている。
【００６８】
本発明のポリヌクレオチドは、生物またはその繁殖材料のタグづけをし、同定するためにも用いられる。かかるタグづけは、例えば非破壊的で機能のない異種由来の識別子ポリヌクレオチドであって、本発明のポリヌクレオチドの１つを含むポリヌクレオチドを、生物に安定的に導入することにより達成できる。
【００６９】
以下の実施例は、例示のために与えられるのであり、限定のためではない。
【００７０】
【実施例】
実施例１
Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来ユビキチン遺伝子プロモーターの単離と特徴付け
Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリは以下のとおり構築され、スクリーニングされた。ｍＲＮＡは、チャン（Ｃｈａｎｇ）ら（プラント・モレキュラー・バイオロジー・レポーター（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）１１巻、１１３−１１６頁、１９９３年）のプロトコールに若干の改変を施したものを用いて、植物組織から抽出された。具体的には、サンプルは、ＣＰＣ−ＲＮＡＸＢ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ　８，０；２５ｍＭ　ＥＤＴＡ；２．０Ｍ　ＮａＣｌ；２％　ＣＴＡＢ；２％　ＰＶＰおよび０．０５％　スペルミジン＊３ＨＣｌ）に溶解され、２４：１のクロロフォルム：イソアミルアルコールで抽出された。ｍＲＮＡは、エタノール沈殿され、全ＲＮＡ調製物は、ポリ（Ａ）クイックｍＲＮＡアイソレーションキット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｇｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州、ラホヤ）を用いて精製された。ｃＤＮＡ発現ライブラリは、この精製ｍＲＮＡから製造者のプロトコールに従ってＺＡＰエキスプレスｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン）を用いて、逆転写酵素合成された後、得られたｃＤＮＡクローンをラムダＺＡＰへ挿入することにより構築された。得られたｃＤＮＡは、５μｌのライゲーションミックスに１μｌのサンプルＤＮＡを用いて、ギガパックＩＩパッケージングエキストラクト（ストラタジーン）でパッケージングを行った。ライブラリの大量切り出し（ｍａｓｓ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ’細胞およびＸＬＯＬＲ細胞（ストラタジーン）を、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（ストラタジーン）とともに用いて行われた。切り出されたファージミドは、ＮＺＹブロス（ギブコＢＲＬ、メリーランド州、ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ））で希釈され、Ｘ−ｇａｌおよびイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ−カナマイシン寒天プレート上に播かれた。
【００７１】
ＤＮＡミニプレップ用にプレートされ釣り上げられたコロニーのうち、９９％は配列決定に適したインサートを含んでいた。陽性クローンはカナマイシン入りのＮＺＹブロス中で培養され、ｃＤＮＡはアルカリ溶菌法とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法により精製された。１％のアガロースゲルが、シーケンシング用鋳型に染色体の混入があるかどうかをスクリーニングするために用いられた。ダイプライマー配列は、ターボカタリスト８００マシン（パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ部門、カリフォルニア州、フォスターシティ）を製造者のプロトコールに従って用いて調製された。
【００７２】
陽性クローンのＤＮＡ配列は、パーキン・エルマー／アプライド・バイオシステムズ部門のプリズム（Ｐｒｉｓｍ）３７７シーケンサーを用いて得られた。ｃＤＮＡクローンは、まず５’末端側から、そして場合によっては３’末端側からも配列決定された。一部のクローンについては、内部の配列は、サブクローニングされた断片を用いて得られた。サブクローニングは、制限酵素切断部位マッピングおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋ベクターへのサブクローニングという標準的な手法を用いて行われた。
【００７３】
以下の説明のとおり、同定された配列で最も多かったものの１つはユビキチン遺伝子で、今後は「スーパーユビキチン（ＳＵ）」遺伝子という。
【００７４】
ユビキチン遺伝子を含むｃＤＮＡクローンの単離
ユビキチン遺伝子と相同性のあるｃＤＮＡクローンの配列は、上記のハイスループットｃＤＮＡ配列決定から得られた。いくつかの独立のクローン由来の配列はコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）に集約され、コンセンサス配列が、重複するクローンから生成された。単離されたスーパーユビキチンクローンの、プロモーター領域（イントロンを含む）、コーディング領域および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む決定されたヌクレオチド配列は配列番号１に提供される。５’ＵＴＲは１ないし２０６４の残基で、イントロンは１１９６ないし２０３３の残基で、３個の直列反復配列を含むコーディング領域は２０６５ないし２７５１の残基であった。３’ＵＴＲは３２８残基の長さ（２７５５ないし３０８３の残基）である。イントロンを含むスーパーユビキチンプロモーター領域のみのヌクレオチド配列は配列番号２に示される。イントロンを除いたスーパーユビキチンプロモーター領域のみのヌクレオチド配列は配列番号３に示される。Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａスーパーユビキチンの予測アミノ酸配列は配列番号８０に提供される。
【００７５】
ユビキチンタンパク質は、タンパク質分解経路の一部として機能し、タンパク質に共有結合して、分解のための目印になる（総説として、ベルクナップ（Ｂｅｌｋｎａｐ）およびガルバリーノ（Ｇａｒｂａｒｉｎｏ）、トレンズ　イン　プラント　サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１巻、３３１−３３５頁、１９９６年を参照せよ）。このタンパク質は、単一ｍＲＮＡにエンコードされた前駆体ポリペプチドから産生される。スーパーユビキチンｍＲＮＡはこのユビキチン単量体を３コピー含む。
【００７６】
スーパーユビキチンプロモーターのクローニング
スーパーユビキチンプロモーターの断片は、ＰＣＲにもとづく２つの異なるアプローチでクローニングされた。
【００７７】
第１の方法　長距離遺伝子歩行ＰＣＲ
「長距離遺伝子歩行（Ｌｏｎｇ　Ｄｉｓｔａｎｃｅ　Ｇｅｎｅ　Ｗａｌｋｉｎｇ）」ＰＣＲ（ミン（Ｍｉｎ）およびパウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、２４巻、３９８−４００頁、１９９８年）を用いて、ユビキチン遺伝子のコーディング領域の全体と、５’ＵＴＲの９００ｂｐのイントロンと、約１００ｂｐのプロモーターとを含む２ｋｂの断片が得られた。
【００７８】
この断片を生成するために、２本の入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーがマツ由来の単離スーパーユビキチンｃＤＮＡ配列から設計された。上流の配列を増幅するためのプライマーの設計には５’ＵＴＲを用いるのが一般的である。しかし、スーパーユビキチンの利用可能な５’ＵＴＲは非常に短いため、この領域に由来する２本の最初のプライマーはいかなる断片も増幅できなかった。そこで、３’ＵＴＲから配列番号１５および１６のプライマーが設計された。
【００７９】
この方法は、はじめに配列番号１５のプライマーを用いてマツのゲノムＤＮＡを鋳型とする線形（ｌｉｎｅａｒ）ＰＣＲを行うことと、次にターミナルトランスフェラーゼを用いて１本鎖ＤＮＡ産物のＣテーリングを行うことを含む。この断片を、第２のＰＣＲのステップで、配列番号１６のプライマーと配列番号１７のＡＰプライマーとを用いる増幅の鋳型に用いた。前記ＡＰプライマーは、前記ターミナルトランスフェラーゼで生成されたポリＣテール（ｐｏｌｙ　Ｃ　ｔａｉｌ）に結合するように設計された。配列番号１６および１７の両方のプライマーは、適当なベクターのＮｏｔＩ切断部位に増幅産物をクローニングするための制限酵素ＮｏｔＩの切断部位を５’側に含んでいた。最終的なＰＣＲ産物は異なるサイズの断片を含んでいた。これらの断片は電気泳動で分離され、最も大きい断片がゲルから精製され、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化され、発現ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラホヤ）のＮｏｔＩ部位にクローニングされた。これらのクローンの最大のものは、遺伝子の完全なコーディング領域（イントロンは該コーディング領域にはみられなかった）と、９００ｂｐのイントロンを含む５’ＵＴＲを含んでいた。
【００８０】
第２の方法　「ゲノム歩行者」キット
スーパーユビキチン遺伝子プロモーターは「ゲノム歩行者（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒ）」キット（クロンテク、カリフォルニア州、パロアルト）を用いてクローニングされた。これもＰＣＲにもとづく方法で、２本のＰＣＲプライマーを構築することが要求され、そのうちの１つは遺伝子特異的でなければならない。ユビキチンのコーディング領域は高度に保存されているが、異なるユビキチン遺伝子由来の５’ＵＴＲは保存されておらず、遺伝子特異的なプライマーを設計するのに用いることができる。２．２ｋｂの断片が増幅され、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ（プロメガ、ウィスコンシン州、マディソン）にサブクローニングされた。ＰＣＲによる解析とＤＮＡ配列決定により、このクローンは前記９００ｂｐのイントロンと約１ｋｂのプロモーターと思われる領域を含んだスーパーユビキチン遺伝子の５’ＵＴＲ配列を含むことが示された。５’ＵＴＲにイントロンがあることは、植物のポリユビキチン遺伝子の共通の特徴であり、遺伝子発現レベルの決定に関与するのかもしれない。
【００８１】
これらのＰＣＲ反応に用いられた遺伝子特異的プライマーは配列番号１８および１９に提供される。
【００８２】
スーパーユビキチンの発現
遺伝子特異的な５’および３’ＵＴＲ配列由来のプライマーを用いて、異なる植物組織におけるスーパーユビキチンの発現レベルが、ＲＴ−ＰＣＲにより調べられた。スーパーユビキチンは、枝の篩部と木部、細根（ｆｅｅｄｅｒ　ｒｏｏｔ）、受精した球果（ｃｏｎｅ）、針（ｎｅｅｄｌｅ）、一年性球果、花粉嚢（ｐｏｌｌｅｎ　ｓａｃ）、受粉した球果、根の木部、苗条（ｓｈｏｏｔ　ｂｕｄ）、構造根（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｒｏｏｔ）、幹の篩部、および幹を含む、全ての植物の組織で発現されることがわかった。スーパーユビキチンの植物における発現は、前記５’ＵＴＲから調製されたＰＣＲプローブを用いるノザンブロットアッセイ法でも証明された。
【００８３】
スーパーユビキチンプロモーターの機能的な解析
植物におけるスーパーユビキチンプロモーターの機能をテストするために、配列番号２または配列番号３のいずれか（すなわち、イントロン有りまたは無しのいずれか）のスーパーユビキチンプロモーターと操作可能に連結された緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレポーター遺伝子でシロイヌナズナが形質転換された。プロモーターをもたないコンストラクトは陰性の対照実験に用いられ、ＧＦＰの前にクローニングされたＣａＭＶ３５ｓプロモーターを有する植物のＴ−ＤＮＡベクターは陽性の対照実験に用いられた。これらのコンストラクトはアグロバクテリウムを介する形質転換によりシロイヌナズナに導入された。
【００８４】
全ての植物培養培地は、バルブケン（Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ）およびバン・モンターグ（Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ、８５巻、５５３６−５５４０頁、１９８８年のプロトコールに若干の改変を施した上で従った。根の形質転換には、消毒した種子が発芽培地の表面に一列に並べられ、根の回収（ｒｏｏｔ　ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）を容易にするためプレートは立てかけられ（ｐｌａｃｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅｉｒ　ｓｉｄｅｓ）、種子は２週間、２４°Ｃ、１６時間の光周期で育てられた。
【００８５】
前記コンストラクトの発現は、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）についてのレポーター遺伝子の発現レベルを測定することにより調べられた。予備的なＧＦＰの発現（一過性）がＴ−ＤＮＡ導入の際の初期のトランスジェニックな根で検出された。緑色のカルスに発生したトランスジェニックな根は、５０μｇ／ｍｌ　カナマイシンと１００μｇ／ｍｌ　チメンチンを含むシュート誘導培地上で育てられ、さらにＧＦＰ発現についてテストされた。カナマイシン培地での厳しい選択の数週間の後、いくつかの独立のトランスジェニックなシロイヌナズナ株が作成され、ＧＦＰ発現についてテストされた。
【００８６】
イントロンを含むスーパーユビキチンプロモーターと、イントロンを含まないスーパーユビキチンプロモーターとの両方で、発現がみられた。しかし、予備的な結果から、イントロン無しのスーパーユビキチンプロモーターコンストラクトで得られた発現のレベルは、イントロンを含むプロモーターで見られた発現よりも著しく高いことがわかり、前記イントロンにはレプレッサーが含まれるかもしれないことを示唆した。前記イントロンの配列は配列番号２１に提供される。
【００８７】
実施例２
Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来ＣＤＣプロモーターの単離
細胞分裂制御（ＣＤＣ）タンパク質遺伝子と相同性のある植物のＥＳＴ配列が、実施例１に記載のＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａのＣＤＣ遺伝子のプロモーターとおもわれる配列を含む５’ＵＴＲ配列がゲノムＤＮＡから単離された。決定されたヌクレオチド配列は配列番号４に示される。
【００８８】
実施例３
Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来木部化特異的プロモーターの単離
植物の木部化に特異的な植物ＥＳＴ配列は、本質的には実施例１に記載のとおり、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａの木部由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａの木部化特異的プロモーターと思われるものを含む配列がゲノムＤＮＡから単離された。決定されたヌクレオチド配列は配列番号５および４１−４４に提供される。配列番号４１−４４のクローンについての拡張されたｃＤＮＡ配列が、配列番号９２に提供される。
【００８９】
実施例４
Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来４−クマラートＣｏＡリガーゼプロモーターの単離
４−クマラートＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）と相同性のある植物ＥＳＴ配列がＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから実施例１に記載のとおりに単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａの４ＣＬプロモーターと思われるものを含む配列がゲノムＤＮＡから単離された。決定されたヌクレオチド配列は配列番号６に示される。
【００９０】
配列番号６のプロモーターと操作可能に連結された緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）についてのレポーター遺伝子か、ＧＵＳレポーター遺伝子かを含むＤＮＡコンストラクトが用意され、シロイヌナズナ植物個体を形質転換するために用いられた。
【００９１】
実施例５
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来セルロースシンターゼプロモーターの単離
セルロースシンターゼ遺伝子と相同性のある植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおり、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓのセルロースシンターゼ遺伝子のプロモーターと思われるものを含む配列がゲノムＤＮＡから単離された。異なるＤＮＡバンドを鋳型として用いる独立のＰＣＲ実験から、多数の塩基の相違がある２つの配列が得られた。一方のバンドは７５０ｂｐの長さで、このバンドのヌクレオチド配列は配列番号７に示される。他方のバンドは３ｋｂの長さであった。このバンドの３’末端の配列は、配列番号７に示す配列と対応したが、多数の塩基対の相違があった。この３’末端の配列は配列番号８に示される。このバンドの５’末端の配列は配列番号２０に示される。
【００９２】
実施例６
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来葉特異的プロモーターの単離
葉に特異的な植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおり、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓの葉の組織由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、新規なＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ遺伝子（機能不明）の葉特異的プロモーターを含む５’ＵＴＲ配列が、ゲノムＤＮＡから単離された。異なるＤＮＡバンドを用いる独立のＰＣＲ実験から、多数の塩基の相違および欠失がある３つの配列が得られた。これら３つのＰＣＲ断片の決定されたヌクレオチド配列は、配列番号９−１１に示される。
【００９３】
実施例７
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来Ｏ−メチルトランスフェラーゼプロモーターの単離
Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ）と相同性のある植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおり、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓＯＭＴ遺伝子のプロモーターと思われるものを含む５’ＵＴＲ配列が、ゲノムＤＮＡから単離された。決定されたヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。
【００９４】
配列番号１２のプロモーターと操作可能に連結された緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）についてのレポーター遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトが用意され、シロイヌナズナを形質転換するのに用いられた。
【００９５】
実施例８
Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来根特異的なプロモーターの単離
根特異的な受容体様キナーゼ遺伝子と相同性のある植物ＥＳＴ配列が、実施例１に記載のとおり、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａの根特異的プロモーターと思われるものを含む５’ＵＴＲ配列が、ゲノムＤＮＡから単離された。２回の独立のＰＣＲ実験から、多数の塩基の相違がある配列が得られた。これらの２回の実験から決定されたヌクレオチド配列が、配列番号１３、１４、１１０および１１１に示される。
【００９６】
実施例９
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来ＥＦ１−αプロモーターの単離
ユーカリの伸長因子−α（ＥＦ１−α）遺伝子と相同性のある植物ＥＳＴ配列が、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離され、以下のとおり、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓのゲノムＤＮＡライブラリをスクリーニングするのに用いられた。
【００９７】
前記Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓのゲノムＤＮＡライブラリは、ドイル（Ｄｏｙｌｅ）およびドイル、フォーカス（Ｆｏｃｕｓ）、１２巻、１３−１５頁、１９９０年のプロトコールに若干の改変を施したものに従って、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｎｉｔｅｎｓ　ｘ　ｇｒａｎｄｉｓの植物組織から抽出したゲノムＤＮＡを用いて構築された。具体的には、植物組織は、液体窒素の下で粉砕され、２Ｘ　ＣＴＡＢ抽出バッファー（２％　ＣＴＡＢ、すなわち臭化ヘクサデシルトリメチルアンモニウム（ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）；１．４Ｍ　ＮａＣｌ；２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ　８．０；１００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０；１％　ポリビニルピロリドン）に溶解された。クロロフォルム：イソアミルアルコール（２４：１）での抽出の後、１０％　ＣＴＡＢが水層に加えられ、クロロフォルム：イソアミルアルコール抽出が繰り返された。ゲノムＤＮＡはイソプロパノールで沈殿された。
【００９８】
得られたＤＮＡは、標準的な手順の後、制限エンドヌクレアーゼＳａｕＡ１で消化され、フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回抽出され、エタノールで沈殿された。消化された断片は、超遠心機を用いてスクロース密度勾配で分離された。９−２３ｋｂの断片を含む分画がプールされて、エタノールで沈殿された。得られた断片は、製造者のプロトコールに従って、ギガパックＩＩパッケージングエキストラクト（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラホヤ）を用いてパッケージングを行い、ラムダＤＡＳＨ　ＩＩ／ＢａｍＨＩベクター（ストラタジーン）にクローニングされた。このライブラリは一度増幅された。
【００９９】
このライブラリは、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓライブラリ（実施例１に記載）から単離されユーカリのＥＦ１−α遺伝子との相同性を示す放射能標識ＥＳＴ断片で、スクリーニングされた。ファージのライセート（ｌｙｓａｔｅ）が陽性のプラークから調製され、ゲノムＤＮＡが抽出された。
【０１００】
このゲノムＤＮＡから、前記ユーカリ属ＥＦ１−α遺伝子のプロモーターと思われるものを含む５’ＵＴＲ領域が、ＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（ギブコＢＲＬ）を用いて得られた。１０ｋｂの断片が増幅され、制限酵素切断地図が作成された。前記ユーカリ属伸長因子Ａ（ＥＦ１−α）遺伝子のプロモーターと思われるものは４ｋｂの断片に同定され、工作されたＮｏｔＩ部位を含むｐＵＣ１９ベクター（ギブコＢＲＬ）にサブクローニングされた。前記プロモーター領域を含む単離された断片の決定されたゲノムＤＮＡ配列は、配列番号６１および６２に提供され、配列番号６１にエンコードされた予測アミノ酸配列は配列番号７９に提供された。配列番号６１のクローンの拡張された配列は、配列番号１２７に提供される。
【０１０１】
実施例１０
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来花特異的プロモーターの単離
花由来の組織に特異的な植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおりに、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓの花の組織由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓの花特異的プロモーターと思われるものをそれぞれ含むいくつかの配列が、ゲノムＤＮＡから単離された。決定されたヌクレオチド配列は、配列番号２９−３３および５９に示される。配列番号３０−３３のクローンの拡張されたｃＤＮＡ配列は、配列番号８９に提供される。配列番号２９のクローンの拡張されたｃＤＮＡ配列は、配列番号９０に提供される。
【０１０２】
実施例１１
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓおよびＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来花粉特異的プロモーターの単離
花粉特異的な植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおりに、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓおよびＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａの花粉由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、花粉特異的プロモーターと思われるものをそれぞれ含むいくつかの配列が、ゲノムＤＮＡから単離された。Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａから単離され決定されたヌクレオチド配列は配列番号４９−５３に示され、配列番号５１−５３にエンコードされた予測アミノ酸配列は配列番号７３−７５にそれぞれ提供される。配列番号４９のクローンについての拡張されたｃＤＮＡ配列は、配列番号９４に提供される。
【０１０３】
実施例１２
Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来芽特異的および分裂組織特異的プロモーターの単離
芽および分裂組織に特異的な植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおり、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａの芽および分裂組織由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。上記の「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的プライマーとを用いて、２個の配列、すなわち一方は芽特異的プロモーターと思われるものを含む配列で、他方は分裂組織特異的プロモーター特異的プロモーターと思われるものを含む配列が、ゲノムＤＮＡから単離された。これら２つのプロモーターについて決定されたヌクレオチド配列は、配列番号４０および４５に与えられる。配列番号４０および４５にエンコードされた予測アミノ酸配列は、配列番号７０および７１にそれぞれ提供される。
【０１０４】
実施例１３
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来のプロモーターの単離
さまざまな既知の遺伝子に対してある程度の相同性を示す植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおり、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。オーキシン誘導性タンパク質（配列番号２６−２８）、カルボニックアンヒドラーゼ（配列番号３６）、イソフラボンレダクターゼ（配列番号３７および３８）、花粉アレルゲン（配列番号２３−２５）、花粉コートタンパク質（配列番号２２）、スクロースシンターゼ（配列番号５６−５８）、ユビキチン（配列番号３４）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号３５および３９）、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＯＭＴ、配列番号６０）、哺乳類由来マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ、配列番号８１−８６）、ＵＤＰグルコース６−デヒドロゲナーゼ（配列番号１０３）、ラッカーゼ１（配列番号１０５、１０６および１１６）、アラビノガラクタン様１（配列番号１０７）、アラビノガラクタン様２（配列番号１０８、１０９）、理論的に予測されるタンパク質（配列番号１０４）、ｃｏｎｓｔａｎｓ（配列番号１１８）、開花促進因子−１（ＦＰＦ１、配列番号１１９）、転写因子ＤＲＥＢ−１（配列番号１２１）、耐塩性タンパク質（配列番号１２３）、木部特異的ヒスチジンキナーゼ様（配列番号１２５）および根特異的（配列番号１２６）のＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ　ｇｒａｎｄｉｓ遺伝子についてのプロモーターと思われるものを含む配列が、上記の「遺伝子歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的なプライマーとを用いて、ゲノムＤＮＡから単離された。配列番号２２、２５、２６、２８、３４、３５、３６、５６、５７、６０、８６および１２４のＤＮＡ配列にエンコードされる予測アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７６、７７、７８、８７および１３０に提供される。配列番号５８、３５、６０、１０３、１０６および１０７のクローンについての拡張されたｃＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号９１、９３、１１３および１１５−１１７に提供される。
【０１０５】
実施例１４
Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来のプロモーターの単離
さまざまな既知遺伝子に対してある程度の相同性を示す植物ＥＳＴ配列が、本質的には実施例１に記載のとおり、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡ発現ライブラリから単離された。老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）様タンパク質（配列番号４６−４８）、ノデュリンのホモログ花粉特異的（配列番号５４および５５）、カルコン生成酵素（配列番号８８）、ＰｒＭＡＬＥ１（配列番号９５、９６）、ＵＤＰグルコースグリコシルトランスフェラーゼ（配列番号９７）、伸長因子１α（配列番号９８、９９）、Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（配列番号１００−１０２）、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ脂質転移タンパク質２（ＰｒＬＴＰ２、配列番号１１２）、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａａｇａｍｏｕｓタンパク質（配列番号１２０）、乾燥誘導ＤＩ−１９（配列番号１２２）および低温誘導性タンパク質ＬＴＩ（配列番号１２４）のＰｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａ遺伝子について、「ゲノム歩行者」プロトコールと、これらの植物ＥＳＴ配列から設計された遺伝子特異的なプライマーとを用いて、プロモーターと思われるものを含む配列が、ゲノムＤＮＡから単離された。配列番号４６および１２４の配列にエンコードされた予測アミノ酸配列は、配列番号７２および１３０に提供される。配列番号９７のクローンの拡張されたｃＤＮＡ配列は、配列番号１１４に提供される。
【０１０６】
実施例１５
ポリヌクレオチドおよびアミノ酸解析
上記の決定されたｃＤＮＡ配列は、（２０００年１０月更新の）ＥＭＢＬデータベース中の既知配列と比較され、アライメントがとられた。具体的には、配列番号２２−６２および８８−１２０に同定されたポリヌクレオチドは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）を用いて比較され、配列番号１２１−１２７に同定されたポリヌクレオチドはＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．１１（２０００年１月２０日）を用いて比較された。いずれのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムも、「ＵＮＩＸ（登録商標）ランニングコマンド：ｂｌａｓｔａｌｌ　−ｐ　ｂｌａｓｔｎ　−ｄ　ｅｍｂｌｄｂ　−ｅ　１０　−Ｇ０　−Ｅ０　−ｒ１　−ｖ３０　−ｂ３０　−ｉ　ｑｕｅｒｙｓｅｑ　−ｏ　ｒｅｓｕｌｔｓ」というランニングパラメータに設定された。冗長配列の複数のアライメントが、信頼できるコンセンサス配列を作成するのに用いられた。他の植物種または非植物種由来の既知配列に対する類似性にもとづいて、配列番号２２−６２および８８−１２７として同定された本発明の単離ポリヌクレオチドが、上記の表１に示す機能を有するものと推定的に同定された。
【０１０７】
配列番号１−２２、２３、２５−４２、４５−４９、５７−５９、６２、８８−９９、１０１−１１２および１１４−１２７のｃＤＮＡ配列は、上記のとおりにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて前記ＥＭＢＬデータベース中の配列に対して４０％未満の同一性しかないと決定された。配列番号５６および１１３のｃＤＮＡ配列は、上記のとおりにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて、前記ＥＭＢＬデータベース中の配列に対して６０％未満の同一性しかないと決定された。配列番号４３、５２、６０および６１のｃＤＮＡ配列は、上記のとおりにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて前記ＥＭＢＬデータベース中の配列に対して７５％未満の同一性しかないと決定された。配列番号２４、５１および１００のｃＤＮＡは、上記のとおりにコンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴＮを用いて前記ＥＭＢＬデータベース中の配列に対して９０％未満の同一性しかないと決定された。
【０１０８】
実施例１６
スーパーユビキチンプロモーターの制御下でのレポーター遺伝子の改変
独立なシロイヌナズナのトランスジェニック株６つが、異なるスーパーユビキチンプロモーターコンストラクトの制御下でのＧＵＳレポーター遺伝子の相対的な発現を証明するために、Ｐｉｎｕｓ　ｒａｄｉａｔａスーパーユビキチンプロモーターコンストラクトで形質転換された。プラスミドｐＢＩ−１０１のレポーターコンストラクトは、イントロンを含む前記スーパーユビキチンプロモーター（配列番号２）、イントロンを含まない前記スーパーユビキチンプロモーター（配列番号３）およびカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターと読み枠を合わせたＧＵＳ（β−Ｄ−グルクロニダーゼ）レポーター遺伝子を含んだ。プロモーター配列を含まないレポーター遺伝子コンストラクトが対照実験として用いられた。
【０１０９】
シロイヌナズナの植物個体６つのグループが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス形質転換プロトコールを用いて、上記のレポーターコンストラクトで形質転換された。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、例えばベバン（ニュークレイック・アシッズ・リサーチ１２巻、８７１１−８７２１頁、１９８４年）に記載されたような、標準的な技術に従って、１００ｎｇの前記プラスミドＤＮＡで形質転換された。新鮮な植物材料がそれぞれの植物個体がら回収され、タンパク質が植物個体全体から抽出され、該タンパク質の濃度が決定された（ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）、アナリチカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、７２巻、２４８−２５４頁、１９７６年）。前記タンパク質のサンプルは、４−メチル−ウンベリフェロン（ＭＵ）を用いる標準曲線の直線部分に蛍光光度計の測定値が留まるように、担体のウシ血清アルブミンで、１００ｎｇのタンパク質になるまで希釈された。ＧＵＳ活性は、ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、プラント・モレキュラー・バイオロジー・レポーター、５巻、３８７−４０５頁、１９８７年）に説明されたとおり、Ｖｉｃｔｏｒ２　１４２０マルチラベルカウンター（ウォーラック（Ｗａｌｌａｃ）、フィンランド、テュルク（Ｔｕｒｋｕ））を用いて、蛍光光度分析により定量化された。図１に示すとおり、イントロンを含まないスーパーユビキチンポリヌクレオチドを含むコンストラクトは、カリフラワーモザイクウィルス３５ＳプロモーターよりＧＵＳ活性が７倍高く、イントロンを含むスーパーユビキチンプロモーターを含むコンストラクトは、カリフラワーモザイクウィルス３５ＳプロモーターよりＧＵＳ活性が６２倍高かった。プロモーター無しの対照のコンストラクトについては、活性が検出されなかった。
【０１１０】
実施例１７
タバコ植物プロトプラストにおけるスーパーユビキチンプロモーターコンストラクトの活性の決定
プロトプラストの単離
プロトプラストが消毒したタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）の葉の組織から単離され、スーパーユビキチンプロモーターコンストラクトで形質転換された。葉肉プロトプラストは、ビラン（Ｂｉｌａｎｇ）ら（プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ）、　Ａ１巻、１−１６頁、１９９４年）の方法に従って、調製された。複数の完全に開いた葉が無菌の野生型タバコ植物体から除去され、中肋に直角に薄切され、１．２％セルラーゼおよび０．４％ペクチナーゼ（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）を含む酵素消化液に浸漬された。前記の葉は、静置して、暗所にて２６°Ｃで振盪することなく約１８時間保温した。次に、葉の細片は、プロトプラストを放出するために、３０分間穏やかに振盪させた。さらに、プロトプラストは、１００μｍのナイロンメッシュで濾過して精製された。１ｍｌのＷ５溶液（１５４ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１２５ｍＭ　ＣａＣｌ２、５ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　グルコース、ｐＨ５．８−６）が、前記の濾液の上に注意深く重層されて、８０　ｘ　ｇで１０分間遠心された。生きたプロトプラストの層が口の広いピペットで除去され、１０ｍｌのＷ５溶液で７０　ｘ　ｇ５分間の遠心により２回洗浄され、最後に５ｍｌのＷ５溶液中に再懸濁された。プロトプラストは血球計算盤で測定され、生存率は１００％アセトン中の５ｍｇ／ｍｌ二酢酸フルオロセン（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ、ＦＤＡ）で染色した後顕微鏡で決定された。
【０１１１】
プロモーターコンストラクトでの形質転換
前記の単離されたプロトプラストは、ポリエチレングリコール・プロトコールを用いてプラスミドＤＮＡで形質転換された。前記の精製されたプロトプラストは、７０　ｘ　ｇで５分間遠心した後、２ｘ１０６プロトプラスト／ｍｌの密度になるように、ＭＭＭ溶液（１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．１％　ｗ／ｖ　２［Ｎ−モルフォリノ］エタンスルホン酸（２［Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ、ＭＥＳ）、０．５Ｍ　マニトール　ｐＨ　５．８）中に再懸濁された。５ｘ１０５プロトプラスト／ｍｌの２５０μｌずつが１５ｍｌ試験管に分注され、２０μｇのプラスミドＤＮＡと混合された。２５０μｌのポリエチレングリコール−４０００（４０％）が優しく添加され、５分間室温でインキュベーションされた。１０ｍｌのＷ５溶液がゆっくりと添加され、プロトプラストは７０　ｘ　ｇで５分間遠心されて、最後に２ｍｌのＫ３培地（ビランら、プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル、Ａ１巻、１−１６頁、１９９４年）に再懸濁された。形質転換されたプロトプラストは、暗所にて２６°Ｃ２４時間インキュベーションした後、４−メチル−ウンベリフェリル−グルクロニド（ＭＵＧ）を用いてレポーター酵素アッセイのために、タンパク質が抽出された。
【０１１２】
タンパク質は、以下のプロトコールを用いて、前記プロトプラストから抽出された。形質転換されたプロトプラスト懸濁液は、７０ｘ　ｇで１０分間遠心され、５０μｌ抽出バッファー（ジェファーソン、プラント・モレキュラー・バイオロジー・レポーター、５巻、３８７−４０５頁、１９８７年）中に再懸濁されて、ボルテックスを用いて激しく撹拌された。このホモジネートは、４，３００ｒｐｍ、５分間の遠心して沈殿物を除去され、上清を取り出してタンパク質アッセイに用いられた（ブラッドフォード、アナリチカル・バイオケミストリー、７２巻、２４８−２５４頁、１９７６年）。
【０１１３】
図２に示した結果は、イントロン無しのスーパーユビキチンプロモーターの欠失コンストラクト（配列番号３）と、イントロン有りのスーパーユビキチンプロモーターの欠失コンストラクト（配列番号２）の上記のとおり形質転換されたタバコ植物プロトプラストにおけるプロモーター活性を示す。前記欠失コンストラクトは、エンドヌクレアーゼＩＩＩ（ギブコ−ＢＲＬ、メリーランド州、ゲイザーズバーグ）を用いて製造者のプロトコールに従って、ＧＵＳレポーター遺伝子を含むｐＢＩ−１０１プラスミドで作成された。前記欠失コンストラクトは、ＴＡＴＡ配列（配列番号２の塩基対番号１，１０４−１，１１０）の上流の、それぞれ１，１０３、７５３、５７３、４４６、３６８および１９５塩基対を含んでいた。前記ＴＡＴＡ配列の上流の配列を含まない対照実験のコンストラクトも作成された。これらの結果は、イントロン有りのスーパーユビキチンプロモーターの全体を含むコンストラクトが前記プロトプラストの中でのＭＵ活性が最も高かったことを示している。
【０１１４】
図３では、タバコプロトプラストは、ＧＵＳレポーター遺伝子を含むｐＢＩ−１０１プラスミドでの４つの異なるプロモーターコンストラクトで形質転換された。これらは、イントロン無しのスーパーユビキチンプロモーター（配列番号３）と、伸長因子１αプロモーター（配列番号９９）と、５−アデノシルメチオニン合成酵素プロモーター（配列番号１００）とを含んでいた。プロモーター無しの対照実験が実験に含まれ、図３ではｐＢＩ−１０１と呼ばれている。
【０１１５】
実施例１８
Ｐ．ｒａｄｉａｔａ花粉特異的プロモーターおよびＥ．ｇｒａｎｄｉｓ花粉特異的プロモーターのコンストラクトの形質転換シロイヌナズナにおける活性の決定
シロイヌナズナトランスジェニック株は、Ｐ．ｒａｄｉａｔａ花粉特異的プロモーター（配列番号９４）およびＥ．ｇｒａｎｄｉｓ花粉特異的プロモーター（配列番号２２）のコンストラクトを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌で形質転換され、これらのプロモーターコンストラクトの制御下でのＧＵＳレポーター遺伝子の相対的な発現を実証した。前記プロモーターの配列は、ＧＵＳレポーター遺伝子を含むｐＢＩ−１０１プラスミドにクローン化された。
【０１１６】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌の形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＧＶ３１０１株は、エレクトロポレーションを用いてこれらのコンストラクトで形質転換された。アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌のエレクトロポレーション用のコンピテント細胞は、ウォーカーピーチ（Ｗａｌｋｅｒｐｅａｃｈ）およびベルテン（Ｖｅｌｔｅｎ）、プラント・モレキュラー・バイオロジー・マニュアル、Ｂ１巻、１−１９頁、１９９４年の方法に従って調製された。コンストラクトＤＮＡ（４ｎｇ）は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＧＶ３１０１株コンピテント細胞４０μｌに添加され、エレクトロポレーションは以下の設定でＢＴＸ　エレクトロ・セル・マニピュレータ６００を用いて行われた。モードＴ２．５ｋＶ抵抗高電圧（ＨＶ）、キャパシタンス設定Ｃ（ＨＶモードでは使用されない）、抵抗設定Ｒ　Ｒ５（１２９オーム）、チャージ電圧設定Ｓ　１．４４ｋＶ、希望電界強度１４．４ｋＶ／ｃｍおよび希望パルス強度ｔ　５．０ミリ秒。４００μｌのＹＥＰ液体培地（２０ｇ／ｌイースト、２０ｇ／ｌペプトンおよび１０ｇ／ｌ塩化ナトリウム）がキュベットに添加され、室温で１時間回復させるために静置された。ＹＥＰ培地中の形質転換された菌は、５０ｍｇ／ｌカナマイシンおよび５０ｍｇ／ｌリファンピシンを含むＹＥＰ固形培地の上に拡げられ、コロニーを成長させるために、２日間２９°Ｃでインキュベーションされた。
【０１１７】
コンストラクトのアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌への形質転換の確認
前記コンストラクトがアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌に形質転換されていることを確認するために、ＹＥＰプレートからのアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌のコロニー由来のＤＮＡが標準的なプロトコールを用いて単離され、ｐＢＩ−１０１ベクター配列から設計されたプライマーでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅された。前記プライマーの配列は、配列番号１２８および１２９に提示されている。ＰＣＲ反応は標準的なプロトコールに従って設定され、伸長温度７２°Ｃで３０回のＰＣＲサイクルが行われた。
【０１１８】
形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌によるシロイヌナズナの形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌の培養の吸光度は、浸潤培地（５％　スクロース、０．０５％　Ｓｉｌｗｅｔｔ　Ｌ−７７界面活性剤）で０．７に調整された。シロイヌナズナ植物体（コンストラクトあたりパネット（ｐｕｎｎｅｔ）６個、パネットあたり植物１０−１２個体）が２次的なボルト（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｂｏｌｔｓ）を除去することにより刈り込まれた。パネットの中の刈り込まれたシロイヌナズナ植物は、浸潤溶液に浸漬されて、５秒間前後に動かされた。パネットは、過剰の浸潤培地を排出することができるように横倒しに置かれ、上蓋のトレイで覆われ、湿度を保つためにプラスチック製ラップで包まれた。植物は自然条件の生育室に２４時間置かれた。この期間の後、前記上蓋のトレイおよびプラスチック製ラップは除去され、植物は長角果（ｓｉｌｉｑｕｅｓ）が形成されるまで、植物は直立されられた。
【０１１９】
種子が回収され、残存するいかなるアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌およびカビの汚染を殺すために、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液で消毒された。
【０１２０】
無菌条件下で、前記形質転換されたシロイヌナズナ植物体由来の種子１００μｌがエッペンドルフ試験管に入れられた。１ｍｌの滅菌水が添加され、前記種子は１時間を超えない間水を吸収させられた。水は遠心によって除去され、１ｍｌの７０％エタノールが前記種子に添加されて、優しく撹拌された。このステップは１分を超えて継続することは許されない。前記エタノールは遠心により除去され、１ｍｌの５％次亜塩素酸ナトリウム溶液が前記種子に添加され、優しく５分以内の時間撹拌された。前記次亜塩素酸ナトリウム溶液は遠心により除去され、前記種子は滅菌水で１分間洗浄された。前記洗浄のステップはさらに３回遠心しては繰り返された。種子は、最終的に滅菌水に再懸濁された。５００μｌの溶液中の種子が、５０ｍｇ／ｌカナマイシンおよび２５０ｍｇ／ｌチメンチンを含む半分の濃度のムラシゲおよびスクーグ（Ｓｋｏｏｇ）の培地の寒天プレートにピペットで滴下され、火炎滅菌されたワイヤーループで均一に拡げられた。ペトリディッシュは、前記種子にストラティフィケーションを起こさせるために、３日間冷蔵庫に入れられた。その後、プレートは生育室に置かれて、発芽するまで２２°Ｃ１４時間の光周期で生育された。形質転換体の種子と思われるものは、上記の抗生物質含有培地の上で、大きな健康そうな深緑の葉と強い根のシステムを有するものとして選択された。これらのトランスジェニック植物は、取り出されて、２２°Ｃ１２時間の光周期で土壌培養に置かれた。
【０１２１】
植物組織の染色
組織が、Ｐ．ｒａｄｉａｔａの未知の花粉特異的プロモーターおよびＥ．ｇｒａｎｄｉｓの花粉特異的プロモーターのコンストラクトで形質転換されたシロイヌナズナの花、葉、茎および根から取られ、前記花粉特異的プロモーターの制御下でのＧＵＳ遺伝子の発現を決定するために組織化学的に染色された。ＧＵＳ染色プロトコールは、カンピシ（Ｃａｍｐｉｓｉ）ら（プラント・ジャーナル（Ｐｌａｎｔ　Ｊ．）、１７巻、６９９−７０７頁、１９９９年）に説明されている。
【０１２２】
シロイヌナズナの花、葉、茎および根の組織は、免疫化学的染色のための染色液（５０ｍＭ　ＮａＰＯ４　ｐＨ７．２、０．５％　トリトンＸ−１００、１　ｍＭ　Ｘ　グルクロニドナトリウム塩（ギブコ−ＢＲＬ））に浸漬された。前記組織に前記染色液を浸潤させるために、５分間２回真空がかけられた。前記組織は、発色のために、２日間（振盪しながら）３７°Ｃで前記染色液の中に入れたままに置かれ、その後、２４時間３７°Ｃ（振盪しながら）７０％エタノールで脱色された。前記組織は光学顕微鏡を用いて青色のＧＵＳ染色について調べられた。ＧＵＳ発現は、Ｐ．ｒａｄｉａｔａの花粉特異的プロモーターコンストラクトで形質転換された植物の花芽においてのみ観察されたが、葉、茎または根の組織では観察されなかった。Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓの花粉特異的プロモーターコンストラクトについては、ＧＵＳ発現は、花芽とともに葉の排水組織においても観察された。茎または根の組織では発現は観察されなかった。
【０１２３】
ＧＵＳ遺伝子が発現しているのがどの細胞層であるかを決定するために、花芽が薄切のために固定された。花芽は、エッペンドルフ試験管の中でフォルムアルデヒド酢酸（ＦＡＡ）で固定され、１５分間２回真空がかれられた。室温で２時間のインキュベーションの後、１５分間真空が再度かけられて、組織は４°Ｃで終夜静置された。前記組織は、次に、エタノール系列を用いて脱水され、キシレン系列に移された。パラフィンワックス（シグマ）がゆっくりと添加され、組織は、１２時間ごとにワックスを交換しながら７２時間静置された。ミクロトームを用いて、８から１０μｍの厚さの切片が用意された。
【０１２４】
薄切切片は、ＧＵＳ発現が、Ｐ．ｒａｄｉａｔａコンストラクト（配列番号４９）で形質転換されたシロイヌナズナの花芽の葯のタペータム細胞層に限定されていることがわかった。花芽の他の組織では染色は観察されなかった。ＧＵＳ発現は、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓの花粉特異的プロモーターコンストラクトで形質転換されたシロイヌナズナの花芽の花粉粒に限定されたが、低レベルのＧＵＳ発現は葯の繊維組織および結合組織にみられた。花芽の他の器官ではＧＵＳ発現は観察されなかった。
【０１２５】
実施例１９
形質転換シロイヌナズナにおけるＥ．ｇｒａｎｄｉｓＥＦ−１αプロモーター欠失コンストラクトの活性の決定
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍのブライト・イエロー２（ＢＹ−２）細胞の懸濁液が、ＧＵＳ発現を決定するために、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓＥＦ−１αプロモーターの欠失コンストラクトで形質転換された。配列番号１２７の塩基対番号２，１７４から３，７２０までが、レポーター遺伝子ＧＵＳと、ＯＣＳターミネーション配列とを含む発現ベクターｐＡＲＴ９にクローン化された。
【０１２６】
プロトプラストの調製
無菌のＮｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍブライト・イエロー（ＢＹ−２）懸濁培養は実施例１７に記載のとおりに用意された。３から５日間のインキュベーションの後、３ｇのＮ．ｔａｂａｃｕｍＢＹ−２細胞懸濁液が、０．４Ｍマニトール中に１％セルラーゼ、０．３％ペクチナーゼおよび０．５％ドリセラーゼを含む酵素溶液に懸濁された。これらは、暗所において２６°Ｃで３−４時間振盪しながら酵素消化させられた。プロトプラストは、６３μｍナイロンメッシュを通す濾過により精製された。プロトプラストが８０　ｘ　ｇで５分間遠心され、１０ｍｌのＦＭＳ培地（フクダ、ムラシゲおよびスクーグ培地、ハセザワおよびショーノ、プラント・セル・フィジオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．）、２４巻、１２７−１３２頁、１９８３年）で２度洗浄され、最後に、５ｍｌのＦＭＳ培地に懸濁された。プロトプラストは、血球計算盤で計測され、生存率は５ｍｇ／ｍｌのＦＤＡ（フルオレセイン・デアセテート、シグマ、ミシガン州、セントルイス）を含む１００％アセトンで染色し、蛍光顕微鏡下で観察することにより、決定された。
【０１２７】
プロトプラストの形質転換
プロトプラストは、モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）およびオウ（Ｏｗ）（植物分子生物学の方法　実験コースマニュアル（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｃｏｕｒｓｅ　ｍａｎｕａｌ）、１−１６頁、Ｐ．マリガ（Ｍａｌｉｇａ）、Ｄ．クレッシグ（Ｋｌｅｓｓｉｇ）、Ａ．Ｒ．キャッシュモア（Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、Ｗ．グルイセム（Ｇｒｕｉｓｓｅｍ）およびＪ．Ｅ．バーナー（Ｖａｒｎｅｒ）編、コールド・スプリング・ハーバー研究所、ＣＳＨＰ、ニューヨーク州）によって説明されたプロトコールに従って形質転換された。簡潔には、前記プロトコールは以下のとおりである。前記計測するステップに引き続き、プロトプラストは８０　ｘ　ｇで５分間遠心され、１ｘ　ＭｇＭｇ溶液（０．４Ｍマニトール、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１％　２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ））に、５ｘ１０６プロトプラスト／ｍｌで再懸濁された。１００μｌ（０．５ｘ１０５プロトプラスト）が１５ｍｌ試験管に分注され、５ｍｌの１ｘ　ＭａＭｇで洗浄された（２００ｇ、５分間）。ペレットにされたプロトプラストは、５００μｌの１ｘ　ＭａＭｇ溶液に再懸濁され、４５°Ｃに５分間置かれて熱ショック処理を施された。室温で５−１０分間インキュベーションをされた後、形質転換するＤＮＡが添加された（１０−２０μｇのＤＮＡ＋１０μｇのキャリヤーＤＮＡ）。これに、５００μｌの４０％ＰＥＧ−３５００が優しく添加され、室温で２５分間インキュベーションされた。５ｍｌのＷ５溶液（１５４ｍＭ　ＮａＣｌ、１２５ｍＭ　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　グルコース）がゆっくりと少しずつ添加され、これに続いて、２００ｘ　ｇで５分間遠心された。ペレットにされたプロトプラストは１ｍｌのＫ３ＡＭ培地に葯０．５ｘ１０５プロトプラスト／ｍｌの濃度で再懸濁された。サンプルは６ウェルプレートに移され、暗所において４８時間２６°Ｃでインキュベーションされた。
【０１２８】
タンパク質を抽出するために、プロトプラストはマイクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で２００　ｘ　ｇ５分間遠心され、β−メルカプトエタノールを含む１００μｌのＧＵＳ抽出バッファー（５０ｍＭ　ＮａＰＯ４　ｐＨ　７．２、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　８、０．０１％　サルコシル、０．１％　トリトンＸ−１００）に再懸濁され（ジェファーソンら、プラント・モレキュラー・バイオロジー・レポーター、５巻、３８７−４０５頁、１９８７年）、１分間ボルテックス処理を施された。ホモジネートは、５０００ｒｐｍ５分間の遠心で上清が分離された。タンパク質を含む上清が新しい試験管に移され、−８０°Ｃで保存された。タンパク質濃度は、製造者のプロトコールに従って、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州、ヘルキュール（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ））によって決定された。タンパク質抽出液は抽出バッファーで１０倍に希釈された。
【０１２９】
ＧＵＳ発現の決定
前記プロトプラスト抽出液でのＧＵＳ発現は、ＭＵＧ（４−メチル・ウンベリフェリル・β−Ｄ−グルクロニド）アッセイを用いて決定された。抽出バッファーで全量４５μｌに調整された１μｇのタンパク質を含むタンパク質サンプルが、マイクロタイタープレートに分注され、３７°Ｃでインキュベーションされた。それぞれのサンプルに、ＭＵＧの最終濃度が１ｍＭになるように、５μｌの１０ｍＭ　ＭＵＧが添加された。前記プレートは３７°Ｃ３０分間インキュベーションされて、前記プレートを３７°Ｃに保温したまま、１５０μｌの停止液（０．２Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ　１１．２０）を添加することにより終了させた。プレートは、Ｖｉｃｔｏｒ２　１４２０ マルチラベル・カウンターで、励起光を３６５ｎｍに、蛍光発光を４５５ｎｍに設定して、測定された。４−メチル−ウンベリフェロン（ＭＵ）の濃度は、標準曲線に対して計算され、ＧＵＳ発現が計算された。
【０１３０】
図４では、挿入配列無しの対照実験プラスミドと比較して、Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓＥＦ−１α欠失コンストラクトで形質転換されたＮ．ｔａｂａｃｕｍＢＹ−２におけるＧＵＳレポーター遺伝子の発現が増加していることが観察された。
【０１３１】
実施例２０
シロイヌナズナにおける遺伝子発現に対する３’ＵＴＲスーパーユビキチン（ＳＵ）配列の効果の決定
Ｐ．ｒａｄｉａｔａスーパーユビキチン（ＳＵ）プロモーターと遺伝子配列とをエンコードする配列番号１に提示されたポリヌクレオチド配列において、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が同定された（ヌクレオチド番号１，７５４から３，０８３）。この領域の遺伝子の発現に与える効果を決定するために、３’ＵＴＲの２５０ｂｐ（配列番号１のヌクレオチド番号２，７５５から３，０７３）が、３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーターの制御下にあるＧＵＳおよびを含むプラスミドｐＢＩ−１２１と、配列番号２に提示されたＰ．ｒａｄｉａｔａＳＵプロモーター（イントロンを含む）の制御下にあるＧＵＳ遺伝子を含むプラスミドｐＢＩ−１０１とにセンス方向およびアンチセンス方向にクローン化された。対照実験として、イントロン無しの前記ＳＵプロモーター（配列番号３）で、さらにＳＵ３’ＵＴＲ配列も無いコンストラクトと、イントロン有りのＳＵプロモーター（配列番号２）でＳＵ３’ＵＴＲ配列無しのコンストラクトと、３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーターを含むがＳＵ３’ＵＴＲを含まないコンストラクトとが作製された。
【０１３２】
シロイヌナズナが、実施例１８に記載の花浸漬（ｆｌｏｒａｌ　ｄｉｐ）プロトコールを用いて、これらのコンストラクトで形質転換された。
【０１３３】
ＭＵＧアッセイを用いた遺伝子発現レベルの決定
６個のシロイヌナズナ植物個体が、乾燥した組織を切り取って、根を含む植物個体の残りを回収することによって、刈り取られた。根は水道水で洗い流され、サンプルは液体窒素に浸漬された後、−８０°Ｃで保存された。それぞれのコンストラクトから６個の植物個体が液体窒素の下で粉砕され、約１００ｍｇがマイクロフュージ用試験管に移された。それぞれの対照実験からの５つのサンプルがこのアッセイに含められた。抽出バッファー（５０ｍＭ　ＮａＰＯ４　ｐＨ７．２、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ　８、０．０１％　サルコシル、０．１％　トリトンＸ−１００）が調製された。３２ｍｌの抽出バッファーに、８ｍｌのメタノールと２８μｌのβ−メルカプトエタノールが添加された。このバッファーのうち、２００μｌがそれぞれのサンプルに添加され、ボルテックス処理を施されて、氷上に保存された。サンプルは、４°Ｃ、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心された。上清は新しい試験管に移され、８００μｌの抽出バッファーで希釈された。タンパク質濃度は前記ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイキットを用いて決定された。
【０１３４】
上記の４つのコンストラクトによるＧＵＳの発現は、以下のとおり、ＭＵＧアッセイを用いて決定された。（実施例１８に記載の）２８ｍｌの抽出バッファーに、８ｍｌのメタノールと、５６μｌのβ−メルカプトエタノールと、４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が添加された。マイクロタイタープレートのウェルに、それぞれのコンストラクトからの１００ｎｇおよび１０ｎｇと、ＢＳＡを含む抽出バッファー２５μｌおよび１０ｍＭ　ＭＵＧの５μｌとが添加された。前記プレートはフォイルで覆われ、正確に２０分間３７°Ｃでインキュベーションをされた。反応は、１５０μｌの０．２Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１１．２を添加することによって終了された。プレートは、Ｖｉｃｔｏｒ２　１４２０マルチラベル・カウンターで、励起光を３６５ｎｍに設定し、蛍光発光を４５５ｎｍに設定して測定された。ＧＵＳ発現レベルがＭＵの標準曲線に対して決定された。
【０１３５】
図５では、センス方向にＳＵ３’ＵＴＲを含むＳＲ３４コンストラクトは、イントロン無しのＳＵプロモーターの発現を、ほとんどイントロン有りのＳＵプロモーターのレベルにまで増強した。アンチセンス方向にＳＵ３’ＵＴＲを含むＳＲ３３およびＳＥ３５コンストラクトでは、プロモーター活性は基礎レベルに減少した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
イントロン有りのスーパーユビキチンプロモーターか、イントロン無しのスーパーユビキチンプロモーターか、ＣａＭＶ　３５Ｓ　プロモーターかのいずれかを含むプロモーター・レポーターコンストラクトにおけるＧＵＳ遺伝子のシロイヌナズナでの発現を示す図。ＧＵＳ発現は、これらの植物からのタンパク質抽出液中の４−メチル−ウンベリフェロン（ＭＵ）の蛍光測定によって定量された。
【図２】
イントロン有りまたはイントロン無しのスーパーユビキチンプロモーターを含む欠失コンストラクトによるタバコ植物プロトプラストにおけるＧＵＳ遺伝子の発現を示す図。前記コンストラクトは、ＴＡＴＡ配列（配列番号２の塩基対番号１，１０４−１，１１０）の上流１，１０３ｂｐ、７５３ｂｐ、５７３ｂｐ、４４６ｂｐ、３６８ｂｐおよび１９５ｂｐを含むものであった。ＧＵＳ発現は、これらの植物からのタンパク質抽出液中の４−メチル−ウンベリフェロン（ＭＵ）の蛍光測定によって定量された。
【図３】
Ｐ．ｒａｄｉａｔａの構成的プロモーターである、伸長因子−１αか、５−アデノシルメチオニン合成酵素か、イントロン無しのスーパーユビキチンプロモーターかのいずれかを含むコンストラクトによるタバコ植物プロトプラストにおけるＧＵＳ遺伝子の発現を示す図。ＧＵＳ発現は、これらの植物からのタンパク質抽出液中の４−メチル−ウンベリフェロン（ＭＵ）の蛍光測定によって定量された。
【図４】
Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓの構成的プロモーターである伸長因子−１αの断片を含む欠失コンストラクトによるタバコ植物プロトプラストにおけるＧＵＳ遺伝子の発現を示す図。
【図５】
イントロン有りのスーパーユビキチンプロモーターか、イントロン無しのスーパーユビキチンプロモーターか、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターかのいずれかとともに、スーパーユビキチンプロモーターの３’ＵＴＲをセンス方向に含むか、あるいは、アンチセンス方向に含むプロモーターレポーターコンストラクトにおけるＧＵＳ遺伝子のシロイヌナズナでの発現を示す図。ＧＵＳ発現は、これらの植物からのタンパク質抽出液中の４−メチル−ウンベリフェロン（ＭＵ）の蛍光測定によって定量された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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