(57)【要約】本発明は、通常、互いに横に配置された２つのポリペプチド鎖を含んでなる多価タンパク質複合体（ＰＰＣ）を提供する。各ポリペプチド鎖は一般に３または４つの「ｖ領域」を含んでなり、これは反対のポリペプチド鎖の対応するｖ領域と一致した際に抗原結合部位を形成し得るアミノ酸配列を含んでなる。各ポリペプチド鎖には最大約６つの「ｖ領域」が使用できる。各ポリペプチド鎖のｖ領域は互いに線状に連結され、これは散在する架橋領域によって連結されていてもよい。ＰＰＣの形に配置されている場合、各ポリペプチド鎖のｖ領域は個々の抗原結合部位を形成する。
2006526408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一および第二のポリペプチド鎖を含んでなる、多価タンパク質複合体（ＰＰＣ）であって、
第一のポリペプチド鎖が、式ａ１−ｌ１−ａ２−ｌ２−ａ３［式中、ａｌ、ａ２およびａ３は免疫グロブリン可変ドメインであり、ｌ１およびｌ２はペプチドリンカーであり、ａ１はａ２のＮ末端にあり、ａ２はａ３のＮ末端にある］で示されるポリペプチド配列を含んでなり、
第二のポリペプチド鎖が、式ｂ１−ｌ３−ｂ２−ｌ４−ｂ３［式中、ｂ１、ｂ２およびｂ３は免疫グロブリン可変ドメインであり、ｌ３およびｌ４はペプチドリンカーであり、ｂ３はｂ２のＮ末端にあり、ｂ２はｂ１のＮ末端にある］で示されるポリペプチド配列を含んでなり、
第一および第二のポリペプチド鎖が一緒になって、少なくとも３つの抗原結合部位を含んでなる複合体を形成し、
該抗原結合部位の各々が、第一のポリペプチド鎖由来の可変ドメインと、第二のポリペプチド鎖由来の可変ドメインとを含んでなり、
各結合部位が免疫グロブリン重鎖可変ドメインと免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとを含んでなる、
多価タンパク質複合体。
【請求項２】
各ポリペプチド鎖が、１〜３つの付加的な免疫グロブリン可変ドメインをさらに含んでなり、各ドメインはペプチドリンカーを介して連結されており、
該第一および第二のポリペプチド鎖が一緒になって、４〜６つの抗原結合部位を含んでなる複合体を形成し、かつ、
該抗原結合部位の各々が、第一のポリペプチド鎖由来の可変ドメインと、第二のポリペプチド由来の可変ドメインとを含んでなる、
請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
少なくとも１つのポリペプチド鎖が、毒素、サイトカイン、リンホカイン、酵素、増殖因子、およびアフィニティー精製タグからなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含んでなる、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
該抗原結合部位の少なくとも２つが、同じ結合特異性を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
該抗原結合部位の各々が、異なる結合特異性を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
該抗原結合部位が同じ結合特異性を有する、請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
該抗原結合部位が、少なくとも２つの異なる結合特異性を有する、請求項２に記載の複合体。
【請求項８】
該抗原結合部位の少なくとも３つが異なる結合特異性を有する、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
該抗原結合部位の少なくとも４つが異なる結合特異性を有する、請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
少なくとも５つの抗原結合部位を含んでなり、かつ、該結合部位の少なくとも５つが異なる結合特異性を有する、請求項７に記載の複合体。
【請求項１１】
各々異なる結合特異性を有する６つの抗原結合部位を含んでなる、請求項７に記載の複合体。
【請求項１２】
少なくとも５つの抗原結合部位を含んでなり、かつ、該結合部位の少なくとも５つが異なる結合特性を有する、請求項７に記載の複合体。
【請求項１３】
該抗原結合部位の２つが腫瘍関連抗原のエピトープに特異的であり、該第三の抗原結合部位がターゲッティング可能な構築物と反応性がある、請求項１に記載の複合体。
【請求項１４】
２つの抗原結合部位が腫瘍関連抗原のエピトープに特異的であり、その第三の抗原結合部位がターゲッティング可能な構築物と反応性があり、そのターゲッティング可能な構築物上のエピトープがハプテンである、請求項１３に記載の多価タンパク質複合体。
【請求項１５】
ターゲッティング可能な構築物に結合された請求項１に記載の少なくとも１つの複合体を含んでなり、該構築物上の第一のハプテンに結合されている複合体であって、
該構築物が、同時に第二の多価タンパク質複合体と結合し得る第二のハプテンをさらに含んでなる、複合体。
【請求項１６】
腫瘍関連抗原が、癌腫、黒色腫、肉腫、神経膠腫、白血病およびリンパ腫に関連する抗原からなる群から選択される、請求項１４に記載の多価タンパク質複合体。
【請求項１７】
腫瘍関連抗原が、α−フェトタンパク質、Ａ３、ＣＡ１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、葉酸受容体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、壊死抗原、ＰＡＭ−４、胎盤増殖因子、前立腺酸性ホスファターゼＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシンおよびＶＥＧＦからなる群から選択される、請求項１４に記載の多価タンパク質複合体。
【請求項１８】
少なくとも２つの腫瘍抗原結合部位を含んでなり、両腫瘍抗原結合部位がＣＥＡに特異的であり、該第三の結合部位がハプテン、ヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）に特異的である、請求項１６に記載の多価タンパク質複合体。
【請求項１９】
多価タンパク質がＢＳ１４ＨＰまたはｈＢＳ１４である、請求項１６に記載の多価タンパク質複合体。
【請求項２０】
ＩＭＰ２４１またはＩＭＰ２４５に結合されている、請求項１９に記載の多価タンパク質複合体を含んでなる、複合体。
【請求項２１】
新生物性症状を治療もしくは診断または治療および診断するプレターゲッティング法であって、
（ａ）該被験体に、請求項１に記載の多価タンパク質複合体を投与し、ここで、２つの抗原結合部位は腫瘍関連抗原に向けられ、かつ、１つの抗原結合部位は、二価ハプテンを含んでなるターゲッティング可能な構築物に向けられており；
（ｂ）必要に応じて、被験体にクリアリング組成物を投与して、該組成物に循環からその多価複合体をクリアリングさせ；かつ
（ｃ）二価ハプテンを含んでなり、かつ、１以上のキレート化された、もしくは化学的に結合された治療薬または診断薬をさらに含んでなるターゲッティング可能な構築物を、被験体に投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２２】
診断薬が、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、および９０Ｙまたはその組合せからなる群から選択される放射性核種である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該放射性標識が、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）を用いて画像化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
肉眼で見えない新生物腫瘍を特定するための術中診断を目的として適用する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ターゲッティング可能な構築物が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に用いるための１以上の造影剤を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
造影剤が、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）からなる群から選択される金属である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ターゲッティング可能な構築物が、超音波イメージングに用いるための１以上の造影剤を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
ターゲッティング可能な構築物が、リポソーム脂質膜の外面と共有結合されている二価ＨＳＧ−ペプチドを有するリポソームである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
リポソームがガス充填されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ターゲッティング可能な構築物が、新生物細胞を死滅させるのに有用な１以上の放射性同位元素を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
放射性同位元素が、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃまたはその組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
プレターゲッティング治療を、１以上の治療薬投与の前、同時または後に行う、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
治療薬が、サイトカイン、化学療法薬、またはコロニー刺激増殖因子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
治療薬が、タキサン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド、抗生物質、酵素、プラチナ錯体、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、およびアンタゴニストからなる群から選択される化学療法薬である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
治療薬が、ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、およびアンドロゲンからなる群から選択される化学療法薬である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
治療薬が、アザリビン、ブレオマイシン、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、酪酸フェニル、プレドニゾン、プロカルバジン、セムスタチンストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、プロピオン酸テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビンブラスチン、およびビンクリスチンからなる群から選択される化学療法薬である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
治療薬が、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γからなる群から選択されるサイトカインである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
治療薬が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン(erthropoietin)およびトロンボポエチンからなる群から選択されるコロニー刺激増殖因子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
被験体に請求項１に記載の「裸の」多価タンパク質複合体を投与することを含んでなる被験体において新生物性疾患を治療する方法であって、
抗原結合部位の少なくとも１つが、α−フェトタンパク質、Ａ３、ＣＡ１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、葉酸受容体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、壊死抗原、ＰＡＭ−４、胎盤増殖因子、前立腺酸性ホスファターゼＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシンおよびＶＥＧＦからなる群から選択される抗原と結合する、方法。
【請求項４０】
新生物性疾患が、癌腫、肉腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病、および黒色腫からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
被験体においてＢ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞免疫もしくは自己免疫疾患を治療する方法であって、
被験体に、請求項１に記載の多価タンパク質複合体と医薬上許容される担体とを含んでなる治療組成物を１用量以上投与することを含んでなる、方法。
【請求項４２】
被験体においてＢ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞免疫もしくは自己免疫疾患を治療する方法であって、
該被験体に、請求項２に記載の多価タンパク質複合体と医薬上許容される担体とを含んでなる治療組成物を１用量以上投与することを含んでなり、
各抗原結合部位がＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２の異なるエピトープと結合する、方法。
【請求項４３】
多価タンパク質複合体を、２０〜１５００ｍｇタンパク質／回で非経口投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
多価タンパク質複合体を、２０〜５００ｍｇタンパク質／回で非経口投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
多価タンパク質複合体を、２０〜１００ｍｇタンパク質／回の用量で非経口投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
被験体が、２０〜１００ｍｇタンパク質／回の反復非経口用量として多価タンパク質複合体を受容する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
被験体が、２０〜１５００ｍｇタンパク質／回の反復非経口用量として多価タンパク質複合体を受容する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
多価タンパク質複合体の一部画分が放射性同位元素で標識されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
放射性同位元素が、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃまたはその組合せからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
被験体においてＢ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞免疫もしくは自己免疫疾患を検出または診断するための方法であって、
被験体に、請求項２に記載の多価タンパク質複合体と医薬上許容される担体とを含んでなる診断組成物を投与することを含んでなり、
各抗原結合部位が、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２の異なるエピトープと結合し、該複合体が、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、および９０Ｙまたはその組合せからなる群から選択される放射性核種で放射性標識されている、方法。
【請求項５１】
放射性標識が、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）を用いて画像化される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
肉眼で見えない新生物腫瘍を特定するための術中診断を目的として適用する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
被験体においてＢ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞免疫もしくは自己免疫疾患を検出または診断する方法であって、
被験体に、請求項２に記載の多価タンパク質複合体と医薬上許容される担体とを含んでなる診断組成物を投与することを含んでなり、
各抗原結合部位がＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２の異なるエピトープと結合し、該複合体が磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に用いるための１以上の造影剤で標識されている、方法。
【請求項５４】
造影剤が、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）からなる群から選択される常磁性イオンである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
疾病または疾患を患う被験体に、請求項１に記載の複合体を投与することを含んでなる、非新生物性疾病または疾患を診断する方法であって、
該複合体に検出可能な標識が付着され、該抗原結合部位の１以上がその疾病または疾患のマーカー物質に特異的である、方法。
【請求項５６】
該疾病または疾患が真菌により引き起こされる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
真菌が、小胞子菌、白癬菌、表皮菌、スポロトリクス・シェンキィ、クリプトコックス・ネオフォルマンス、コクシジオイデス・イミチス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマティティディスおよびカンジダ・アルビカンスからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
該疾病または疾患がウイルスにより引き起こされる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルスからなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
該疾病または疾患が細菌により引き起こされる、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
細菌が、炭疽菌、ストレプトコッカス・アガラクティー、レジュネラ・ニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、および結核菌からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
該疾病または疾患がマイコプラズマにより引き起こされる、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
疾該病または疾患が寄生虫により引き起こされる、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
該疾病または疾患がマラリアである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
該疾病または疾患が自己免疫疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６６】
自己免疫疾患が、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、硬皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡(parnphigus vulgaris)、ウェゲナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、および繊維性肺胞炎からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
該疾病または疾患が、心筋梗塞、虚血性心疾患、またはアテローム斑である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６８】
該疾病または疾患が移植片拒絶である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６９】
該疾病または疾患がアルツハイマー病である、請求項５５に記載の方法。
【請求項７０】
該疾病または疾患がアトピー組織により引き起こされる、請求項５５に記載の方法。
【請求項７１】
該疾病または疾患が、炎症部位における活性化された顆粒球、単球、リンパ細胞またはマクロファージの付着により引き起こされる炎症であり、その炎症が感染性病原体により引き起こされる、請求項５５に記載の方法。
【請求項７２】
該検出可能な標識が、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、および９０Ｙまたはその組合せからなる群から選択される放射性核種である、請求項５５に記載の方法。
【請求項７３】
該放射性標識が、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）を用いて画像化される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
該疾病または疾患の術中診断を目的として適用する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
抗原結合部位の少なくとも１つが、ターゲッティング可能な構築物に特異的であり、該構築物が磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に用いるための１以上の造影剤を含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項７６】
造影剤が、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）からなる群から選択される常磁性イオンである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
抗原結合部位の少なくとも１つが、ターゲッティング可能な構築物に特異的であり、ターゲッティング可能な構築物が超音波イメージングに用いるための１以上の造影剤を含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項７８】
抗原結合部位の少なくとも１つが、ターゲッティング可能な構築物に特異的であり、ターゲッティング可能な構築物がリポソーム脂質膜の外面に共有結合されている二価ＨＳＧ−ペプチドを有するリポソームを含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項７９】
リポソームがガス充填されている、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
被験体において非新生物性疾病または疾患を、治療または診断するプレターゲッティング法であって、
（ａ）被験体に、請求項１に記載の多価タンパク質複合体を投与し、ここで、２つの抗原結合部位は腫瘍関連抗原に向けられ、かつ、１つの抗原結合部位は、二価ハプテンを含んでなるターゲッティング可能な構築物に向けられており；
（ｂ）必要に応じて、被験体にクリアリング組成物を投与して、該組成物に循環からその多価複合体をクリアリングさせ；かつ
（ｃ）二価ハプテンを含んでなり、かつ、１以上のキレート化された、もしくは化学的に結合された治療薬または診断薬をさらに含んでなるターゲッティング可能な構築物を、被験体に投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項８１】
該疾病または疾患が真菌により引き起こされる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
真菌種が、小胞子菌、白癬菌、表皮菌、スポロトリクス・シェンキィ、クリプトコックス・ネオフォルマンス、コクシジオイデス・イミチス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマティティディスおよびカンジダ・アルビカンスからなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
該疾病または疾患がウイルスにより引き起こされる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
ウイルス種が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルスからなる群から選択される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
該疾病または疾患が細菌により引き起こされる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
細菌が、炭疽菌、ストレプトコッカス・アガラクティー、レジュネラ・ニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、および結核菌からなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
該疾病または疾患がマイコプラズマにより引き起こされる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８８】
該疾病または疾患が寄生虫により引き起こされる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８９】
該疾病または疾患がマラリアである、請求項８０に記載の方法。
【請求項９０】
該疾病または疾患が自己免疫疾患である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９１】
自己免疫疾患が、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、硬皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡(parnphigus vulgaris)、ウェゲナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、および繊維性肺胞炎からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
該疾病または疾患が、心筋梗塞、虚血性心疾患、およびアテローム斑からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９３】
該疾病または疾患が移植片拒絶である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９４】
該疾病または疾患がアルツハイマー病である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９５】
該疾病または疾患がアトピー組織により引き起こされる、請求項８０に記載の方法。
【請求項９６】
該疾病または疾患が、炎症部位における活性化された顆粒球、単球、リンパ細胞またはマクロファージの付着により引き起こされる炎症であり、その炎症が感染性病原体により引き起こされる、請求項８０に記載の方法。
【請求項９７】
ターゲッティング可能な構築物が、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、および９０Ｙまたはその組合せからなる群から選択される放射性核種で標識される、請求項８０に記載の方法。
【請求項９８】
放射性標識が、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）を用いて画像化される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
該適用が該疾患の術中診断を目的とするものである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
ターゲッティング可能な構築物が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に用いるための１以上の造影剤を含んでなる、請求項８０に記載の方法。
【請求項１０１】
造影剤が、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）からなる群から選択される常磁性イオンである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
ターゲッティング可能な構築物が、超音波イメージングに用いるための１以上の造影剤を含んでなる、請求項８０に記載の方法。
【請求項１０３】
ターゲッティング可能な構築物が、リポソーム脂質膜の外面に共有結合されている二価ＨＳＧ−ペプチドを有するリポソームを含んでなる、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
リポソームがガス充填されている、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
抗体依存的酵素プロドラッグ治療（ＡＤＥＰＴ）の方法であって、
（ａ）新生物性疾患を有する患者に、プロドラッグを活性化し得る共有結合酵素を含んでなる、請求項３に記載の多価タンパク質複合体を投与し；
（ｂ）必要に応じて、該患者にクリアリング組成物を投与して、該組成物に循環からその多価複合体をクリアリングさせ；かつ
（ｃ）該患者に該プロドラッグを投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項１０６】
請求項１に記載の１以上の多価タンパク質複合体を用いて標的分子を検出することを含んでなる、アッセイ法。
【請求項１０７】
請求項１に記載の１以上の多価タンパク質複合体を用いて細胞を染色することを含んでなる、免疫染色法。
【請求項１０８】
請求項１に記載の第一のポリペプチドまたは第二のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１０９】
請求項１０８に記載の単離された核酸を含んでなる、核酸発現カセット。
【請求項１１０】
（ａ）式ａ１−ｌ１−ａ２−ｌ２−ａ３（式中、ａｌ、ａ２およびａ３は免疫グロブリン可変ドメインであり、ｌ１およびｌ２はペプチドリンカーである）で示されるポリペプチド鎖を含んでなる第一のポリペプチドをコードする第一の核酸と作動可能なように連結された、第一のプロモーター、
（ｂ）式ｂ１−ｌ３−ｂ２−ｌ４−ｂ３（式中、ｂ１、ｂ２およびｂ３は免疫グロブリン可変ドメインであり、ｌ３およびｌ４はペプチドリンカーである）で示される第二のポリペプチド鎖を含んでなるポリペプチドをコードする第二の核酸と作動可能なように連結された、第二のプロモーター、
を含んでなるエピソームであって、
第一および第二のポリペプチド鎖が一緒になって、少なくとも３つの抗原結合部位を含んでなる複合体を形成し、
該抗原結合部位の各々が、第一のポリペプチド鎖由来の可変ドメインと、第二のポリペプチド鎖由来の可変ドメインとを含んでなり、
エピソームが宿主細胞に形質転換された際に、第一の核酸と第二の核酸が同時発現される、エピソーム。
【請求項１１１】
プラスミドまたはコスミドである、請求項１１０に記載のエピソーム。
【請求項１１２】
請求項１１０に記載のエピソームを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１１３】
該宿主細胞が大腸菌、酵母、植物細胞および哺乳類細胞からなる群から選択される、請求項１１２に記載の宿主細胞。
【請求項１１４】
請求項１１２に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、多価タンパク質複合体を製造する方法。
【請求項１１５】
細胞がネズミ骨髄腫細胞系統である、請求項１１２に記載の宿主細胞。
【請求項１１６】
プラスミドがｐｄＨＬ２である、請求項１１１に記載のエピソーム。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、疾病の治療および診断に有用な、三価二重特異性タンパク質をはじめとする多価タンパク質複合体、およびそのようなタンパク質を製造する方法に関する。
【０００２】
背景技術
本明細書を通じて、種々の特許、公開出願および科学参照文献が当技術分野の状況および内容を示すために引用されている。それらの開示は引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
【０００３】
本発明は、３つ、または４つの抗原結合部位（ＡＢＳ）を含んでなる「多価タンパク質複合体」またはＰＰＣと呼ばれる新規なタンパク質構造を対象とする。これらのＰＰＣは、免疫グロブリンと比べた場合に三価および四価などの新規な特性を含み、正常（異所）組織または罹患組織の診断、検出および治療などの適用において免疫グロブリンまたは他の操作型抗体と置き換えることができる。これらの罹患組織としては、癌、感染症、自己免疫疾患、心血管疾患、および神経疾患が挙げられる。正常な組織は、それらが異所性である場合（副甲状腺、胸腺、子宮内膜など、誤った場所にある場合）、または治療手段としてそれらのアブレーションが必要な場合（例えば、癌治療における骨髄アブレーション）などに検出および／またはアブレーションされ得る。
【０００４】
組換えＤＮＡ技術によって産生される抗体の個々のＶＨおよびＶＬドメインは互いに対をなして、結合能を備えたヘテロ二量体（組換えＦｖフラグメント）を形成し得る（米国特許第４，６４２，３３４号）。しかしながら、このような非共有結合分子は、生理条件下で実用性を持つまでには十分な安定性がない。同族ＶＨおよびＶＬドメインは適当な組成および長さのペプチドリンカー（通常１２を超えるアミノ酸残基からなる）によって連結し、結合活性を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。Ｆｖの製造方法は米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，１３２，４０５号に開示されている。このペプチドリンカーの長さをアミノ酸残基１２未満に減らすと、同じ鎖上のＶＨとＶＬの対合が妨げられ、他の鎖上で、相補性を有するＶＨドメインとＶＬドメインの対合を強い、その結果、機能的多量体が形成する。３〜１２の間のアミノ酸残基のリンカーで結合されたＶＨおよびＶＬドメインのポリペプチド鎖は主として二量体（ダイアボディーと呼ばれる）を形成する。０〜２の間のリンカーの場合、三量体（トリアボディーと呼ばれる）および四量体（テトラボディーと呼ばれる）が好ましいが、オリゴマー形成の厳密なパターンは、リンカーの長さの他、Ｖ−ドメインの組成ならびに配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）によって異なるものと思われる。多価を有する単一特異性ダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーは、５アミノ酸残基以下からなるペプチドリンカーを用いて得られている。２つの異なるポリペプチドのヘテロ二量体であり、そのＶＨドメインからなる各ポリペプチドが、短いペプチドリンカーにより別の抗体のＶＬドメインと結合した１つの抗体を形成する二重特異性とダイアボディーもまた、一方のシストロンにおいてＶＨ１−リンカー−ＶＬ２を含んでなる組換え遺伝子構築物を含み、もう一方のシストロンにおいてＶＨ２−リンカー−ＶＬ１を含んでなる第二の組換え遺伝子構築物を含む二シストロン性の発現ベクターを用いて作製されている[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 6444-6448; Atwell et al., Molecular Immunology (1996) 33: 1301-1302;Holliger et al., Nature Biotechnology (1997) 15: 632-631; Helfrich et al., Int. J. Cancer (1998) 76: 232-239; Kipriyanov et al., Int. J. Cancer (1998) 77: 763-772; Holiger et al., Cancer Research (1999) 59: 2909-2916]。より最近では、また、二重の特異性を有する四価タンデムダイアボディー（ｔａｎｄａｂと呼ばれる）も報告されている[Cochlovius et al., Cancer Research (2000) 60: 4336-4341]。二重特異性ｔａｎｄａｂは２つの相同なポリペプチドの二量体であり、各々、自己会合時に２つの異なる特異性の各々に関して２つの可能性のある結合部位の形成を促進するための配向で連結された２つの異なる抗体の４つの可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２）を含む。
【０００５】
上記のようにペプチドリンカーの長さを変えることによる単一特異性ダイアボディー、単一特異性トリアボディー、単一特異性テトラボディーおよび二重特異性ダイアボディーの製造方法は、米国特許第５，８４４，０９４号、同第５，８３７，２４２号およびＷＯ９８／４４００１に開示されている。
【０００６】
ＶＨおよびＶＬドメインから多重特異性多価抗原結合タンパク質を製造する別法は、米国特許第５，９８９，８３０号および同第６，２３９，２５９号に開示されている。このような多価多重特異性抗原結合タンパク質は、一方のポリペプチド鎖がペプチドリンカーによる一連の結合をした二以上のＶＨドメイン（同じまたは異なる抗体に由来する）からなり、もう一方のポリペプチド鎖がペプチドリンカーにより一連の結合をした相補的ＶＬドメインからなる、２つのポリペプチド鎖をコードする二シストロン性ベクターを発現させることによって得られる。
【０００７】
結合タンパク質の価数を高めることは、結合作用によるそのタンパク質の機能的親和性を増強するので、興味深い。親和性の増強により、得られたタンパク質は標的細胞により強く結合することができる。さらにまた、多価性は、架橋により、標的細胞の増殖阻害を誘導し得るか(Ghetie, et al, Blood, 97: 1392-8, 2001)、またはインターナリゼーションを促進することができ(Yarden, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94: 9637, 1990)、いずれかの特性が抗腫瘍薬に望ましい。本発明は、治療および診断適用に用いるための多価多重特異性薬剤を開発するたゆまない必要性に取り組みものである。
【０００８】
本発明のもう１つの領域は、バイオアッセイ分野である。事実上、生物医学科学はどの分野でも化学反応および生化学反応をアッセイし、特定の分析物の存在および量を判定する必要がある。この必要性は、生化学経路をマッピングし、それらの機能を疾病の進行と相関させる基礎科学研究所から、患者が通常、臨床上関連のある分析物のレベに関してモニタリングされる臨床診断までの範囲に及ぶ。他の領域としては、薬理研究、軍事適用、獣医学的適用、食品適用、および環境適用が挙げられる。これらの場合では総て、特定の分析物、または分析物群の存在および定量を判定する必要がある。
【０００９】
化学、生化学、バイオテクノロジー、分子生物学、および他の多くのものの分野における分析については、多くの場合、１以上の分子構造の存在の検出、および構造間の結合の測定にするのが有利である。対象となる分子構造としては、典型的には、限定されるものではないが、細胞、抗体、抗原、代謝産物、タンパク質、薬物、小分子、タンパク質、酵素、核酸ならびにそのリガンドおよび分析物が挙げられる。医学では、例えば、それは、受容体もしくはサイトカインなどの細胞成分、または種々の疾病過程のマーカーとして役立ち、生理学的液体に天然に存在するか、またはその系に導入された、抗体および抗原の存在を判定するのに極めて有用である。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡ分析は診断、遺伝学的試験および研究、農業ならびに医薬開発に極めて有用である。分子細胞生物学の急速な発展状況ならびに正常系および罹患系に関する理解により、蛍光団または放射性同位元素などの標識の必要がなく、定量かつ定性的で、目的分子に特異的であり、感受性が高く、実施が比較的簡単な検出法の必要性がますます高まっている。
【００１０】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、多くの蛍光アッセイ、質量分析、比色アッセイ、ゲル電気泳動、ならびに多数のより特殊なアッセイなど、これらの分野の要求を満たすための多くの方法論が開発されている。これらのアッセイ技術の大部分は、特に標識を付着させる、または大きくは試験するサンプルを精製および増幅させる特殊な調製を必要とする。リガンドと抗リガンドの間の結合事象を検出するには、結合の存在または進展に関する検出可能なシグナルが必要である。通常、このシグナルは目的のリガンドまたは抗リガンドのいずれかにコンジュゲートされている標識により与えられる。検出可能なシグナルを生じ、それに対する好適な標識が存在する物理的または化学的結果としては、いくつか挙げれば、射活性、蛍光、化学発光、燐光、および酵素活性がある。この標識は次に、分光光度法、放射分析法、または光学的追跡法により検出することができる。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、直鎖上の並びで少なくとも３つの抗原結合部位（ＡＢＳ）を含んでなる、多価タンパク質複合体（ＰＰＣ）、二量体を提供する。本発明はまた、複合体などの第二の分子に化学的に結合されたＰＰＣである、融合ＰＰＣも提供する。「融合ＰＰＣ」はＰＰＣ全部のサブセットであり、本開示においてＰＰＣとは「融合ＰＰＣ」も意味するものとする。
【００１２】
本発明はまた、ＰＰＣの少なくとも１つのポリペプチドをコードする核酸も提供する。そのポリペプチドを含んでなる宿主細胞も本発明の一つの態様である。
さらに、本発明はまた、患者にＰＰＣまたは融合ＰＰＣを投与することにより、癌、感染症、心疾患または自己免疫疾患などの疾患の症状を軽減する方法も提供する。
【００１３】
具体的には、第一および第二のポリペプチド鎖を含んでなる多価タンパク質複合体（ＰＰＣ）であって、第一のポリペプチド鎖が式ａ１−ｌ１−ａ２−ｌ２−ａ３で示されるポリペプチド配列を含み、式中、ａｌ、ａ２およびａ３は免疫グロブリン可変ドメインであり、ｌ１およびｌ２はペプチドリンカーであり、ａ１はａ２のＮ末端にあり、ａ２はａ３のＮ末端にあり、第二のポリペプチド鎖が式ｂ１−ｌ３−ｂ２−ｌ４−ｂ３で示されるポリペプチド配列を含み、式中、ｂ１、ｂ２およびｂ３は免疫グロブリン可変ドメインであり、ｌ３およびｌ４はペプチドリンカーであり、ｂ３はｂ２のＮ末端にあり、ｂ２はｂ１のＮ末端にあり、第一および第二のポリペプチド鎖が一緒になって、少なくとも３つの抗原結合部位を含む複合体を形成し、抗原結合部位の各々が、第一のポリペプチド鎖由来の可変ドメインと、第二のポリペプチド鎖由来の可変ドメインとを含み、各結合部位が免疫グロブリン重鎖可変ドメインと免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとを含む、多価タンパク質複合体が提供される。
【００１４】
各ポリペプチド鎖は、１〜３つの付加的な免疫グロブリン可変ドメインをさらに含んでもよく、各ドメインはペプチドリンカーを介して連結されており、第一および第二のポリペプチド鎖はともに、４〜６つの抗原結合部位を含む複合体を形成し、かつ、該抗原結合部位の各々は第一のポリペプチド鎖由来の可変ドメインと第二のポリペプチド由来の可変ドメインとを含む。これらのポリペプチド鎖のうち少なくとも１つは、毒素、サイトカイン、リンホカイン、酵素、増殖因子、およびアフィニティー精製タグからなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含んでもよい。
【００１５】
この複合体は可能性のある結合親和性の組合せのいずれを含んでもよく、例えば、これらの抗原結合部位のうち少なくとも２つが同じ結合特異性を有することができ、これらの抗原結合部位の各々は異なる、または同じ結合特異性を有することができ、これらの抗原結合部位は少なくとも２つの異なる結合特異性を有することができ、これらの抗原結合部位のうち少なくとも３つが異なる結合特異性を有することができ、これらの抗原結合部位のうち少なくとも４つが異なる結合特異性を有することができ、これらの結合部位のうち少なくとも５つが異なる結合特異性を有する場合には、その複合体は少なくとも５つの抗原結合部位を含むことができ、または、その複合体は、各々異なる結合特異性を有する６つの抗原結合部位を含むことができる。別の例では、これらの抗原結合部位のうち２つが腫瘍関連抗原のエピトープに特異的であり、第三の抗原結合部位がターゲッティング可能な構築物と反応性がある。別の例では、２つの抗原結合部位が腫瘍関連抗原のエピトープに特異的であり、第三の抗原結合部位がターゲッティング可能な構築物と反応性があり、この場合、そのターゲッティング可能な構築物上のエピトープはハプテンである。さらに別の複合体では、その複合体は構築物上の第一のハプテンに結合されており、その構築物は、同時に第二の多価タンパク質複合体と結合し得る第二のハプテンをさらに含む。
【００１６】
これらの各例では、複合体は腫瘍関連抗原と結合することができるか、または抗原が、癌腫、黒色腫、肉腫、神経膠腫、白血病およびリンパ腫に関連する抗原、例えば、α−フェトタンパク質、Ａ３、ＣＡ１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、葉酸受容体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、壊死抗原、ＰＡＭ−４、胎盤増殖因子、前立腺酸性ホスファターゼＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシンおよび／またはＶＥＧＦからなる群から選択される。
【００１７】
別の例では、その複合体は少なくとも２つの腫瘍抗原結合部位を含み、ここで、両腫瘍抗原結合部位はＣＥＡに特異的であり、第三の結合部位はハプテン、ヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）に特異的である。
多価タンパク質はＢＳ１４ＨＰ、またはｈＢＳ１４であってよく、これらはＩＭＰ２４１、またはＩＭＰ２４５と結合し得る。
【００１８】
もう１つの態様では、（ａ）被験体に、上記の複合体を投与し、ここで、２つの抗原結合部位が腫瘍関連抗原に向けられ、かつ、１つの抗原結合部位が、二価ハプテンを含むターゲッティング可能な構築物に向けられており；（ｂ）必要に応じて、被験体にクリアリング組成物を投与して、該組成物に循環からその多価複合体をクリアリングさせ；かつ、（ｃ）二価ハプテンを含み、かつ、１以上のキレート化された、もしくは化学的に結合された治療薬または診断薬をさらに含むターゲッティング可能な構築物を、被験体に投与することにより、新生物性症状を治療もしくは診断、または治療および診断するプレターゲッティング法において、上記のいずれの組成物を用いてもよい。
【００１９】
その診断薬は１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、および９０Ｙまたはその組合せからなる群から選択される放射性核種であってよく、それらは例えば、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、単光子放射コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）によって検出することができる。その適用は肉眼で見えない新生物腫瘍を特定するための術中診断を目的とするものであってもよい。そのターゲッティング可能な構築物は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に用いるための１以上の造影剤、例えば、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）からなる群から選択される金属を含んでもよい。そのターゲッティング可能な構築物は、超音波イメージングで用いるための１以上の造影剤を含んでもよい。
【００２０】
ターゲッティング可能な構築物はリポソーム脂質膜の外面に共有結合されている二価ＨＳＧ−ペプチドを有するリポソームであってもよい。このリポソームはガス充填されていてもよい。
【００２１】
このターゲッティング可能な構築物は新生物細胞を死滅させるのに有用な１以上の放射性同位元素、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃまたはその組合せを含んでもよい。
【００２２】
このプレターゲッティング療法は１以上の治療薬投与の前、同時、または後に行うことができる。この治療薬はサイトカインまたは化学療法薬、またはコロニー刺激増殖因子であってもよい。この治療薬は、タキサン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド、抗生物質、酵素、プラチナ錯体、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、およびアンタゴニストからなる群から選択される化学療法薬であってもよいし、あるいは、ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、およびアンドロゲンからなる群から選択してもよい。この治療薬は、アザリビン、ブレオマイシン、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、酪酸フェニル、プレドニゾン、プロカルバジン、セムスタチンストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、プロピオン酸テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビンブラスチン、およびビンクリスチンからなる群から選択される化学療法薬であってもよい。この治療薬は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γからなる群から選択されるサイトカインであってもよいし、あるいは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリトロポエチン(erthropoietin)およびトロンボポエチンからなる群から選択されるコロニー刺激増殖因子であってもよい。
【００２３】
また、被験体に上記の「裸の」（naked）多価タンパク質複合体を投与することにより、被験体の新生物性疾患を治療する方法も提供され、ここで、該抗原結合部位の少なくとも１つが、α−フェトタンパク質、Ａ３、ＣＡ１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、葉酸受容体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、壊死抗原、ＰＡＭ−４、胎盤増殖因子、前立腺酸性ホスファターゼＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシンおよびＶＥＧＦからなる群から選択される抗原と結合する。
【００２４】
新生物性疾患は癌腫、肉腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病、および黒色腫からなる群から選択される得る。
また、被験体においてＢ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞免疫もしくは自己免疫疾患を治療する方法であって、該被験体に、上記の多価タンパク質複合体と医薬上許容される担体とを含む治療組成物を１用量以上投与することを含む方法も提供される。
【００２５】
また、被験体に多価タンパク質複合体と医薬上許容される担体とを含む治療組成物を１用量以上投与することにより、被験体のＢ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞免疫もしくは自己免疫疾患を治療する方法も提供され、ここで、各抗原結合部位はＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２の異なるエピトープと結合する。この複合体は、２０〜１５００ｍｇタンパク質／回、または２０〜５００ｍｇタンパク質／回、または２０〜１００ｍｇタンパク質／回で非経口投与し得る。被験体は２０〜１００ｍｇタンパク質／回の反復非経口用量、または２０〜１５００ｍｇタンパク質／回の反復非経口用量を受容してもよい。これらの方法では、多価タンパク質複合体の一部画分が、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃまたはその組合せなどの放射性同位元素で標識される。
【００２６】
また、被験体に上記の多価タンパク質複合体と医薬上許容される担体とを含む診断組成物を投与することにより、被験体のＢ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞免疫もしくは自己免疫疾患を検出または診断するための方法が提供され、ここで、各抗原結合部位はＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２の異なるエピトープと結合し、該複合体は、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、１８８Ｒｅ、および９０Ｙまたはその組合せからなる群から選択される放射性核種で放射性標識されている。検出は上記のようにして行うことができる。その適用は肉眼で見えない新生物腫瘍を特定するための術中診断を目的とするものであってもよい。
【００２７】
また、被験体に上記の多価タンパク質複合体と医薬上許容される担体とを含む診断組成物を投与することを含み、被験体のＢ細胞悪性腫瘍、またはＢ細胞免疫もしくは自己免疫疾患を検出または診断するための方法であって、各抗原結合部位がＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２の異なるエピトープと結合し、該複合体が磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に用いるための１以上の造影剤で標識されている方法も提供される。この造影剤は上記の通りであってよい。
【００２８】
また、非新生物性疾病または疾患を患う被験体に上記の複合体を投与することにより、該疾病または疾患を診断する方法も提供され、ここで、該複合体に検出可能な標識が付着され、該抗原結合部位の１以上がその疾病または疾患のマーカー物質に特異的である。この疾病または疾患は、小胞子菌(Microsporum)、白癬菌(Trichophyton)、表皮菌(Epidermophyton)、スポロトリクス・シェンキィ(Sporothrix schenckii)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)、およびカンジダ・アルビカンス(Candida albican)などの真菌、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルスなどのウイルスにより引き起こされるものであり得る。この疾病または疾患は、炭疽菌(Anthrax bacillus)、ストレプトコッカス・アガラクティー(Streptococcus agalactiae)、レジュネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophilia)、化膿連鎖球菌(Streptococcus  pyrogenes)、大腸菌(Escherichia coli)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、Ｂ型インフルエンザ菌(Hem
ophilis influenzae B)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ライム病スピロヘータ、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、らい菌(Mycobacterium leprae)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、および結核菌(Mycobacterium tuberculosis)などの細菌、またはマイコプラズマにより引き起こされるものであり得る。この疾病または疾患はマラリアなどの寄生虫により引き起こされるものであり得る。この疾病または疾患は、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、硬皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡(parnphigus vulgaris)、ウェゲナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、および繊維性肺胞炎などの自己免疫疾患であり得る。この疾病または疾患は、心筋梗塞、虚血性心疾患、およびアテローム斑、または移植拒絶、またはアルツハイマー病、または異所組織により引き起こされるものであり得る。この疾病または疾患は、炎症部位における活性化された顆粒球、単球、リンパ細胞またはマクロファージの付着により引き起こされる炎症であってもよく、その炎症は感染性病原体により引き起こされる。
【００２９】
また、（ａ）被験体に、請求項１に記載の多価タンパク質複合体を投与し、ここで、２つの抗原結合部位その疾病に特異的なマーカー物質に向けられ、１つの抗原結合部位が、二価ハプテンを含むターゲッティング可能な構築物に向けられており；（ｂ）必要に応じて、該被験体にクリアリング組成物を投与して、該組成物に循環からその多価複合体をクリアリングさせ；かつ（ｃ）二価ハプテンを含み、かつ１以上のキレート化された、もしくは化学的に結合された治療薬または診断薬をさらに含むターゲッティング可能な構築物を、被験体に投与することにより、被験体の非新生物性疾病または疾患を治療または診断するプレターゲッティング法も提供される。この疾病または疾患は上記の通りであり得る。
【００３０】
また、（ａ）新生物性疾患を有する患者に、プロドラッグを活性化し得る共有結合酵素を含む上記のような多価タンパク質複合体を投与し；（ｂ）必要に応じて、該患者にクリアリング組成物を投与して、該組成物に循環からその多価複合体をクリアリングさ；かつ、（ｃ）該患者に該プロドラッグを投与することによる、抗体依存的酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）も提供される。
また、上記のような１以上の多価タンパク質複合体を用いるアッセイおよび免疫染色法も提供される。
【００３１】
さらに、上記のような第一または第二のポリペプチドをコードする単離された核酸分子、およびそのような単離核酸分子を含む、核酸発現カセットも提供される。また、（ａ）式ａ１−ｌ１−ａ２−ｌ２−ａ３（式中、ａｌ、ａ２およびａ３は免疫グロブリン可変ドメインであり、ｌ１およびｌ２はペプチドリンカーである）で示されるポリペプチド鎖を含む第一のポリペプチドをコードする第一の核酸と作動可能なように連結された、第一のプロモーター、（ｂ）式ｂ１−ｌ３−ｂ２−ｌ４−ｂ３（式中、ｂ１、ｂ２およびｂ３は免疫グロブリン可変ドメインであり、ｌ３およびｌ４はペプチドリンカーである）で示される、第二のポリペプチド鎖を含むポリペプチドをコードする第二の核酸と作動可能なように連結された第二のプロモーターを含むエピソームであって、該第一および第二のポリペプチド鎖が一緒になって、少なくとも３つの抗原結合部位を含む複合体を形成し、該抗原結合部位の各々が該第一のポリペプチド鎖由来の可変ドメインと該第二のポリペプチド鎖由来の可変ドメインとを含み、そのエピソームが宿主細胞に形質転換された際に、該第一の核酸と該第二の核酸が同時発現されるエピソームも提供される。このエピソームはプラスミドであってもコスミドであってもよい。また、核酸、発現カセットおよび／または上記のようなエピソームを含む宿主細胞も提供される。宿主細胞は、例えば、大腸菌、酵母、植物細胞および哺乳類細胞であり得る。
【００３２】
また、上記のような宿主細胞を培養することを含む、多価タンパク質複合体の製造方法も提供される。この宿主細胞は、例えば、ネズミ骨髄腫細胞系統であり得る。エピソームは、ｐｄＨＬ２であるプラスミドを含み得る。
【００３３】
本発明の他の態様および利点は、以下の本発明の好ましい態様の具体的説明でさらに説明する。
【発明の具体的説明】
【００３４】
定義：
本明細書において「操作型抗体」（engineered antibody）とは、生化学的または組換え的に産生された、抗体の機能的誘導体の総てを包含する。あるタンパク質が少なくとも１つの抗原結合部位（ＡＢＳ）、または他のＣＤＲ領域（同じポリペプチド鎖上のもの、または異なるポリペプチド鎖上のもの）と組み合わせた場合にＡＢＳを形成し得る相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するならば、そのタンパク質は抗体の機能的フラグメントである。この操作型抗体の定義には、少なくとも、組換え抗体、タグ付き抗体、標識抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、組換え（天然に対して）多量体抗体、単鎖抗体、ダイアボディー、トリアボディー、四価多量体（ダイアボディーの二量体）、五価多量体（ダイアボディーとトリアボディーの二量体）、六価多量体（トリアボディーの二量体）およびその他より高次の多量体型の抗体を含む。
【００３５】
本明細書において「単鎖抗体（ｓｃＦｖ）」（single-chain antibody）とは、結合抗体の結合ドメイン（重鎖および軽鎖の双方）を単離し、その結合機能の保存が可能な架橋部分を提供することによって作製された、操作型抗体構築物をさす。これは本質的に、抗原との結合に必要な可変ドメインのみを有する、徹底的に短縮された抗体を形成する。単鎖抗体の同定および構築は、米国特許第４，９４６，７７８号； Bird etal., Science 242:423 (1988)およびHuston et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA85:5879 (1988)をはじめとする多くの先行刊行物に記載されている。
【００３６】
「ヒト化」（humanized）は、免疫グロブリンまたは操作型抗体構築物（免疫グロブリンまたは操作型抗体構築物を含んでなる本発明のＰＰＣを含む）のフレームワーク領域の少なくとも一部がヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。例えば、Roguska et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973が記載しているような可変ドメインの再表面化により抗体または抗体構築物をヒト化するためのいずれの方法を本発明のＰＰＣに適用してもよい。あるいは、Hurle and Gross((1994) Curr. Opin. Biotech. 5:428-433)の総説のようなＣＤＲグラフト（ＣＤＲシャッフルとも呼ぶ）またはリシェイプも使用できる。相補性決定領域（ＣＤＲ）の操作もヒト化抗体を達成する１つの方法である。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズミ定常領域の免疫原性に付随する潜在的な問題を回避する。例えば、米国特許第５，８７４，５４０号および同第６，２５４，８６８号参照。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般技術は、例えば、Orlandi et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989)の刊行物に記載されている。ヒト化ＭＡｂを製造するための技術は、例えば、Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992), Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993), Winter & Milstein, Nature 349: 293 (1991)が記載している。
【００３７】
「組換え核酸」または「組換え的に産生された核酸」（recombinantly produced nucleic acid）とは、その天然または内在供給源から単離され、天然に存在するフランキングまたは内部ヌクレオチドを付加、欠失または変更を加えることで化学的または酵素的に改変された、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸をさす。フランキングヌクレオチドは、記載のヌクレオチド配列または部分配列から上流または下流のいずれかにあるヌクレオチドであり、一方、内部ヌクレオチドは記載の配列または部分配列内に存在するヌクレオチドをさす。
【００３８】
「組換え手段」とは、タンパク質を単離し、そのタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を同定し、発現ベクターに挿入する技術をさす。次に、このベクターを細胞に導入すると、細胞はそのタンパク質を発現する。組換え手段はまた、異なる供給源からのコードＤＮＡまたはプロモーターＤＮＡを、ＰＰＣの発現、タンパク質の構成的発現、またはタンパク質の誘導型発現のための１つのベクターに連結することも包含する。
【００３９】
「プロモーター」とは、構造遺伝子の転写を指示してｍＲＮＡを生産するＤＮＡ配列をさす。一般に、プロモーターは構造遺伝子の開始コドンに近接した遺伝子の５’領域に存在する。プロモーターが誘導プロモーターであれば、その転写速度は誘導剤に応答して高まる。これに対し、プロモーターが構成プロモーターであれば、その転写速度は誘導剤によっては調節されない。
【００４０】
「エンハンサー」とは、プロモーターエレメントをさす。エンハンサーは、特定の遺伝子がｍＲＮＡへと転写される効率を、転写開始部位に対するそのエンハンサーの距離または配向とは無関係に増強することができる。
【００４１】
「相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」とは、ｍＲＮＡ鋳型から逆転写酵素によって形成される一本鎖ＤＮＡ分子をさす。一般に、逆転写の開始には、ｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーが用いられる。当業者はまた、このような一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補物からなる二本鎖ＤＮＡ分子をいう際にもこの「ｃＤＮＡ」という用語を用いる。
【００４２】
「発現」とは、あるポリペプチドが構造遺伝子から産生されるプロセスをさす。このプロセスは、遺伝子のｍＲＮＡへの転写とそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。
【００４３】
「クローニングベクター」とは、プラスミド、コスミド、ファージミド、またはバクテリオファージなど、宿主細胞内で自律的に複製する能力を有し、遺伝子操作のため細胞を形質転換するのに用いられるＤＮＡ分子をさす。クローニングベクターは一般に、外来ＤＮＡ配列が、そのベクターの必須の生物機能の損失なく、同定可能な様式で挿入できる１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにそのクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに好適なマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子は一般に、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。
【００４４】
「発現ベクター」とは、組換え宿主中での外来タンパク質の発現を提供する、外来タンパク質をコードするクローニングされた構造遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子をさす。一般に、クローニングされた遺伝子の発現は、プロモーターおよびエンハンサー配列などの特定の調節配列の制御下に置かれる（すなわち、その調節配列と作動可能なように連結されている）。プロモーター配列は構成的であっても誘導型であってもよい。
【００４５】
「組換え型宿主」または「宿主細胞」とは、クローニングベクターか、または発現ベクターのいずれかを含む原核細胞または真核細胞のいずれかをさす。この用語はまた、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローニングされた遺伝子を含むように遺伝的に操作された原核細胞または真核細胞を含むものとする。宿主細胞は、限定されるものではないが、大腸菌および酵母などの単細胞生物が挙げられる。本発明の文脈では、哺乳類、昆虫、および植物などの多細胞生物由来の細胞も宿主細胞として意図される。好適な細胞の例は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)を参照。哺乳類宿主細胞はいずれの哺乳類起源であってもよく、少なくとも、ヒト、ウシ、イヌ、ネズミ、クマネズミ、ウマ、ブタ、ネコおよび非ヒト霊長類起源の細胞を含む。
【００４６】
「腫瘍関連抗原」（tumor-associated antibody）は、本来発現されない、または正常細胞では極めて低レベルでしか発現されないタンパク質である。しかしながら、新生物または前新生物細胞（癌細胞となる素因を持つ細胞では、腫瘍関連抗原は正常細胞よりも高いレベルで発現される。好ましい腫瘍関連抗原は、新生物または前新生物細胞において極めて高レベルで発現されるが、正常細胞では極めて低レベルであるか、または発現されないものである。「抗原」および「腫瘍関連抗原」は周知のものであり、少なくとも、α−フェトタンパク質、Ａ３、Ａ３３（ＧＩ癌、特に結腸癌）、ＣＡ１２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ５２（慢性リンパ性白血病およびその他のリンパ腫）、ＣＤ７４、ＣＤ６６、ＣＤ８０、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、葉酸受容体、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６（前立腺癌）、インスリン様増殖因子、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、壊死抗原、ＰＡＭ−４、胎盤増殖因子、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭＡ、Ｓ１００、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシンおよびＶＥＧＦが挙げられる。さらに、本発明のＡＢＳは、少なくとも、上記に挙げられている抗原のエピトープと結合するＡＢＳを含む。腫瘍関連抗原はその腫瘍細胞自体によって産生されるものであっても、または、腫瘍の血管内皮などの隣接構造によって産生されるものであってもよい。正常細胞種と悪性細胞種の双方に存在するＢ細胞、Ｔ細胞およびその他のこのような「系列」抗原は、悪性細胞による示差発現、またはこれらの系列抗原（例えば、正常および悪性Ｂ細胞におけるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２）に対する抗体に対する悪性細胞の感受性のために、やはり有用な標的となり得る。当業者には、腫瘍関連抗原の他の多くの例が知られている。例えば、Urban et al., Ann. Rev. Immunol. 10:617 (1992)参照。上記の一覧は例に過ぎず、腫瘍関連抗原に最も密接な関係のある癌を挙げたものである。ほとんどの場合、各腫瘍関連抗原は最大２、３、４、５、６またはそれ以上のエピトープを有し得る。
【００４７】
腫瘍関連抗原と関連のある既知の腫瘍としては、少なくとも、癌腫、黒色腫、肉腫、神経膠腫、骨髄腫、白血病およびリンパ腫が挙げられる。
【００４８】
本明細書において「感染性病原体」および「病原体」は微生物および寄生虫を表す。「微生物」としては、ウイルス、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌などの微生物が挙げられる。「寄生虫」とは、マラリア原虫、スピロヘータなど、感染力のある、一般に、顕微鏡的の、または極めて小さな多細胞性無脊椎動物、またはその卵子もしくは幼形を表し、それらは抗体により誘導されるクリアランス、または溶解的もしくは食細胞的破壊を受けやすい。感染性病原体の例としては、例えば、真菌、ウイルス、寄生虫、細菌、原生動物、またはマイコプラズマが挙げられる。真菌は、小胞子菌、白癬菌、表皮菌、スポロトリクス・シェンキィ、クリプトコックス・ネオフォルマンス、コクシジオイデス・イミチス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマティティディスおよびカンジダ・アルビカンスの種に由来するものであり得る。ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルスの種に由来するものであり得る。細菌は、例えば、炭疽菌、ストレプトコッカス・アガラクティー、レジュネラ・ニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、結核菌、および破傷風菌毒素であり得る。寄生虫は蠕虫またはマラリア原虫であり得る。原生動物は、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、トキソプラスマ(Toxoplasma gondii)、ランゲルトリパノソーマ(Trypanosoma rangeli)、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ローデシアトリパノソーマ(Trypanosoma rhodesiensei)、ブルーストリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本住血吸虫(Schistosoma japanicum)、バベシア・ボビス(Babesia bovis)、アイメリア・テネス(Eimeria tenella)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、熱帯リーシュマニア(Leishmania tropica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、タイレリア・パルバ(Theileria parva)、胞状条虫(Taenia hydatigena)、テニア・オビス(Taenia ovis)、カギナシサナダ(Taenia saginata)、単包条虫(Echinococcus granulosus)またはメソセストイデス・コルティ(Mesocestoides corti)であり得る。マイコプラズマは、マイコプラズマ・アルスリティディス(Mycoplasma arthritidis)、マイコプラズマ・ヒオリニス(Mycoplasma hyorhinis)、マイコプラズマ・オーラル(Mycoplasma orale)、マイコプラズマ・アルギニニ(Mycoplasma arginini)、アコールプラズマ・ライドラウィー(Acholeplasma laidlawii)、マイコプラズマ・サリバラム(Mycoplasma salivarum)、および肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)であり得る���本発明の生成物（ＰＰＣ）および方法によって治療可能な感染性病原体および病原体の他の例は、Davis et al, “Microbiology” (Harper & Row, New York, 1973 以降)の第二版以降に含まれており、当業者に周知である。
【００４９】
本発明に関して「治療する」とは、その様々な文法形において、病態、疾病の進行、病因因子（例えば、細菌またはウイルス）、または他の異常な症状の有害な作用を予防、治癒、逆転、緩和、改善、最小化、抑制または中断することをさす。本発明の方法のいくつかは病因因子の物理的除去を含むので、当業者ならば、本発明の化合物が病因因子に曝される前または曝されると同時に投与される状況（予防治療）および本発明の化合物が病因因子に曝された後（相当後であっても）に投与される状況において同等の効果を示すことが分かるであろう。
【００５０】
特に断りのない限り、本明細書での「抗体」または「免疫グロブリン」という用語の使用は、その抗体フラグメントおよび機能的誘導体（すなわち、操作型抗体）を含むものと理解される。抗体は任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの完全抗体、または二重または多重の抗原もしくはエピトープ特異性を有するハイブリッド抗体、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’などのフラグメント（ハイブリッドフラグメントを含む）であり得る。機能的誘導体は操作型抗体を含む。
【００５１】
「組換えタンパク質」「組換え的に産生されたタンパク質」または「組換え的に産生された免疫毒」とは、そのタンパク質を発現し得るＤＮＡの内在コピーを持たない非天然細胞を用いて産生されたペプチドまたはタンパク質をさす。これらの細胞は適当な核酸配列の導入によって遺伝的に変更されているので、そのタンパク質を産生する。組換えタンパク質は、そのタンパク質を産生する細胞と通常関連のあるタンパク質およびその他の細胞下成分と一緒に見出される。
【００５２】
「選択的細胞傷害性試薬」とは、種々の細胞集団に、例えば生物内に加えた際に、細胞の何らかの物理的特徴、すなわち、その細胞傷害性試薬が結合し、次に、インターナライズされることになる表面リガンドまたはマーカーに基づいて、その集団虫の１つの細胞種を死滅させる化合物をさす。
【００５３】
「表面マーカー」とは、タンパク質、炭水化物、または糖タンパク質など、細胞の表面に存在する種々の構成要素をさす。細胞種が異なれば、異なる細胞表面マーカーを発現することから、細胞表面マーカーの存在により細胞を同定することができる。例えば、Ｂ細胞はＣＤ１９、ＣＤ２０(Ansell et al., J. Clin. Oncology, 20:3885-3890 (2002)およびWitzig et al., J. Clin. Oncology 20:2453-2463参照)およびＣＤ２２を発現する。従って、ＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２を認識する抗体が結合すれば、その細胞を正常または悪性いずれかのＢ細胞として同定される。別の例として、Ｂ細胞は、Ｂ細胞が腫瘍関連抗原ＭＵＣ１またはＣＤ７４を発現し得る多発性骨髄腫であってもよい。Ｂ細胞表面  マーカーはＢ細胞のアブレーションのために使用でき、Ｂ細胞腫瘍関連抗原は、上記の多発性骨髄腫などのＢ細胞腫のアブレーションのために使用できる。
【００５４】
「ＣＤ２２」とは、Ｉｇスーパーファミリーに属す系統限定Ｂ細胞抗原をさし、正常な成熟Ｂリンパ細胞上だけでなく、限定されるものではないが、急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、慢性Ｂリンパ細胞（Ｂ−ＣＬＬ）、Ｂリンパ腫細胞（バーキットリンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫および濾胞性リンパ腫など）、およびヘアリー細胞白血病をはじめとする多種の悪性Ｂ細胞の表面でも発現される。米国特許第６，１８３，７４４号および同第６，３０６，３９３号参照。ＣＤ２２はＢ細胞発達の初期段階では発現せず、幹細胞または最終段階の血漿細胞の表面でも見られない。Vaickus et al., Crit. Rev. Oncol/Hematol. 11:267-297 (1991)。さらに、正常ヒト血清またはＣＬＬを有する患者由来の血清において抗原の放出は検出されない。Li et al., Cell. Immunol. 118:85-99 (1989)。
【００５５】
特定の場合によれば、薬剤の「治療上有効な量」は、治療の必要な患者の症状を改善するため、または疾病およびその合併症を部分的に抑制するのに十分な量であると判定されたものでなければならない。このような使用に有効な量は疾病の重篤度および患者の全身の健康状態によって異なる。患者に必要とされ、許容される限り、用量および頻度に応じて単回または複数回の投与が必要とされる場合がある。
【００５６】
本明細書において「検出方法」とは、検出可能な標識の製造のために当技術分野で公知のいずれかのアッセイ（免疫アッセイおよび比色アッセイを含む）をさす。これらのアッセイとしては、少なくとも、ビオチンとアビジン（ストレプトアビジンを含む）を用いるアッセイ、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降、免疫組織化学技術および凝固アッセイが挙げられる。これらのアッセイの詳細な記載はMaertens & Stuyverに対するＷＯ９６／１３５９０に示されている。「生体サンプル」とは、血液（血清および血漿サンプルも含む）、痰、脳脊髄液、尿、リンパ液または可能性のあるいずれもの組織学的切片、ならびにその他の体液など、動物（ヒトを含む）から採取された、可能性のあるいずれものサンプルをさす。検出はまた、イムノシンチグラフィー、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、超音波検査法、Ｘ線など、病巣部を画像化する方法を含む。
【００５７】
「結合特異性」「特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性のある」とは、本発明のタンパク質またはＡＢＳに関していう場合、ヘテロな集団のタンパク質およびその他の生物工学製品の存在下でタンパク質または炭水化物の存在の決定因子となる結合反応をさす。従って、示された免疫アッセイ条件下で、特定のＰＰＣは特定のタンパク質または炭水化物と結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質または炭水化物と有意な量では結合しない。このような条件下でのＰＰＣに対する特異的結合には、特定のタンパク質または炭水化物に対するその特異性に関して選択されたＰＰＣが必要である。例えば、ＣＤ２２抗原に特異的なＰＰＣは、ＣＤ２２タンパク質と特異的に免疫反応性があるが、他のタンパク質とは免疫反応性がないＰＰＣを提供するように選択すればよい。種々の免疫アッセイ形式が、特定のタンパク質または炭水化物と特異的に免疫反応性のあるＰＰＣを選択するために使用できる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質または炭水化物と特異的に免疫反応性のある抗体を選択するために、通常用いられる。特異的免疫反応性を決定するのに使用できる免疫アッセイ形式および条件を記載したものとしては、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publication, New York (1988)を参照。
【００５８】
「単離された」または「実質的に精製された」とは、核酸またはタンパク質に対して用いられる場合、その核酸またはタンパク質がその天然状態で会合している他の細胞成分を実質的に含まないことを表す。それは乾物または水溶液のいずれであってもよいが、均質な状態であることが好ましい。純度と均質性は通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学的技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質は実質的に精製されている。
【００５９】
「〜をコードする核酸」または「〜をコードする核酸配列」とは、特定のタンパク質またはペプチドの発現を指示する核酸をさす。この核酸配列は、ＲＮＡへと転写されるＤＮＡ鎖配列と、タンパク質へと翻訳されるＲＮＡ配列の双方を含む。この核酸配列は全長核酸配列ならびに全長配列に由来する短い配列の双方を含む。ある特定の核酸配列は天然配列または特定の宿主細胞においてコドン選択性を与えるために導入し得る配列の縮重コドンを含むものと理解される。この核酸は、いずれか個々の一本鎖として、または二重らせん形態でセンス鎖とアンチセンス鎖の双方を含む。
【００６０】
「医薬組成物」とは、種々の調製物の処方物をさす。非経口処方物は公知であり、本発明で用いるのに好ましい。治療上有効な量の免疫毒を含む処方物は無菌液体、液体懸濁物、または凍結乾燥型のいずれかであり、必要に応じて安定剤または賦形剤を含む。凍結乾燥組成物は好適な希釈剤、例えば、注射水、生理食塩水、０．３％グリシンなどで、約０．０１ｍｇ／ｋｇ宿主体重〜１０ｍｇ／ｋｇ以上のレベルで再構成される。
【００６１】
「架橋剤」（crossliker）は当技術分野で周知のものであり、少なくとも、ＡＢＨ（２１５０９）、ＡＥＤＰ（２２１０１）、ＡＭＡＳ（２２２９５）、ＡＮＢ−ＮＯＳ（２１４５１）、ＡＰＤＰ（２７７２０）、ＡＰＧ（２０１０８）、ＡＳＢＡ（２１５１２）、ＢＡＳＥＤ（２１５６４）、ＢＭＢ（２２３３１）、ＢＭＤＢ（２２３３２）、ＢＭＨ（２２３３０）、ＢＭＯＥ（２２３２３）、ＢＭＰＡ（２２２９６）、ＢＭＰＨ（２２２９７）、ＢＭＰＳ（２２２９８）、ＢＭ［ＰＥＯ］３（２２３３６）、ＢＭ［ＰＥＯ］４（２２３３７）、ＢＳＯＣＯＥＳ（２１６００）、ＢＳ３（２１５８０）、ＤＦＤＮＢ（２１５２５）、ＤＭＡ（２０６６３）、ＤＭＰ（２１６６６）、ＤＭＳ（２０７００）、ＤＰＤＰＢ（２１７０２）、ＤＳＧ（２０５９３）、ＤＳＰ（２２５８５）、ＤＳＳ（２１５５５）、ＤＳＴ（２０５８９）、ＤＴＢＰ（２０６６５）、ＤＴＭＥ（２２３３５）、ＤＴＳＳＰ（２１５７８）、ＥＤＣ（２２９８０）、ＥＧＳ（２１５６５）、ＥＭＣＡ（２２３０６）、ＥＭＣＨ（２２１０６）、ＥＭＣＳ（２２３０８）、ＧＭＢＳ（２２３０９）、ＨＢＶＳ（２２３３４）、ＫＭＵＡ（２２２１１）、ＫＭＵＨ（２２１１１）、ＬＣ−ＳＭＣＣ（２２３６２）、ＬＣ−ＳＰＤＰ（２１６５１）、ＭＢＳ（２２３１１）、Ｍ２Ｃ２Ｈ（２２３０３）、ＭＰＢＨ（２２３０５）、ＭＳＡ（２２６０５）、ＮＨＳ−ＡＳＡ（２７７１４）、ＰＤＰＨ（２２３０１）、ＰＭＰＩ（２８１００）、ＳＡＤＰ（２１５３３）、ＳＡＥＤ（３３０３３）、ＳＡＮＤ（２１５４９）、ＳＡＮＰＡＮ（２２６００）、ＳＡＳＤ（２７７１６）、ＳＡＴＡ（２６１０２）、ＳＡＴＰ（２６１００）、ＳＢＡＰ（２２３３９）、ＳＦＡＤ（２７７１９）、ＳＩＡ（２２３４９）、ＳＩＡＢ（２２３２９）、ＳＭＡＣＣ（２２３６０）、ＳＭＰＢ（２２４１６）、ＳＭＰＨ（２２３６３）、ＳＭＰＴ（２１５５８）、ＳＰＤＰ（２１８５７）、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ（２１５５６）、スルホ−ＤＳＴ（２０５９１）、スルホ−ＥＧＳ（２１５６６）、スルホ−ＥＭＣＳ（２２３０７）、スルホ−ＧＭＢＳ（２２３２４）、スルホ−ＨＳＡＢ（２１５６３）、スルホ−ＫＭＵＳ（２１１１１）、スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（２１６５０）、スルホ−ＭＢＳ（２２３１２）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ（２７７３５）、スルホ−ＳＡＤＰ（２１５５３）、スルホ−ＳＡＮＰＡＨ（２２５８９）、スルホ−ＳＩＡＢ（２２３２７）、スルホ−ＳＭＣＣ（２２３２２）、スルホ−ＳＭＰＢ（２２３１７）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（２１５６８）、スルホ−ＳＢＥＤ（３３０３３）、ＳＶＳＢ（２２３５８）、ＴＦＣＳ（２２２９９）、ＴＨＰＰ（２２６０７）、ＴＭＥＡ（３３０４３）、およびＴＳＡＴ（３３０６３）が挙げられる(Pierce Chemical, Rockford, IL.括弧内はカタログ番号)。さらなるリンカーの記載に関しては、米国特許第４，６８０，３３８号および２００２年１２月２４日出願の仮特許出願６０／４３６，３５９も参照。
【００６２】
「化学療法薬」（chemotheraputic agent）とは、当技術分野で公知のいずれの化学療法薬であってもよく、少なくとも、タキサン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカアルカロイド、抗生物質、酵素、プラチナ錯体、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、およびアンタゴニストが挙げられる。具体的には、化学療法薬はステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、およびアンドロゲンからなる群から選択される。より具体的には、化学療法薬はアザリビン、ブレオマイシン、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、酪酸フェニル、プレドニゾン、プロカルバジン、セムスタチンストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、プロピオン酸テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビンブラスチン、およびビンクリスチンからなる群から選択される。
【００６３】
「細胞傷害薬」とは、既知の総ての細胞障害剤および細胞増殖抑制剤を含む。これらの薬剤の例は、Goodman et al.,”THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS,” Sixth Edition, A.G. Gilman et al,eds./Macmillan Publishing Co. New York, 1980、ならびにその最新版に挙げられている（米国特許第６，０８３，４７７号および同第６，３９５，２７６号も参照）。これらの薬剤としては、少なくとも、以下のもの：抗アポトーシス薬、代謝拮抗物質、アルカロイド、細胞分裂抑制薬、酵素阻害剤、ＣＯＸ−阻害剤、化学療法薬；ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびマイトマイシンなどの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；シスプラチンなどのプラチナ錯体；ヒドロキシ尿素などの置換尿素；プロカルバジンなどのメチルヒドラジン誘導体；ミトタンなどの副腎皮質抑制剤；副腎皮質ステロイド(adrenocortisteroid)（プレドニゾン）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロプロゲステロンおよび酢酸メゲストロール）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（タモキシフェン）、およびアンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）などのホルモンおよびアンタゴニストが挙げられる。他の細胞傷害薬の例としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素および放射性核種が挙げられる。例えば、Pastan et al., Cell 47:641 (1986)、およびGoldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994)参照。その他の好適な毒素も当業者には公知である。
【００６４】
治療薬は本明細書で定義された通りであるが、少なくとも、免疫調節剤、酵素、ホルモンが挙げられる。
【００６５】
放射性核種としては医学的診断薬、治療薬および画像化法に有用ないずれの放射性同位元素（すなわち、検出可能な標識）も含む。放射性核種の例としては、２２５Ａｃ、１１１Ａｇ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１１Ｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１５４−１５８Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１２０Ｉ、１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１９４Ｉｒ、１７７Ｌｕ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、９９Ｍｏ、１３Ｎ、１５Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、２２３Ｒａ、８２ｍＲｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ、１５３Ｓｍ、８３Ｓｒ、８９Ｓｒ、１６１Ｔｂ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、８６Ｙ、９０Ｙおよび８９Ｚｒが挙げられる。これらの放射性核種のうち、２２５Ａｃ、１１１Ａｇ、７７Ａｓ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１６９Ｅｒ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１９４Ｉｒ、１７７Ｌｕ、９９Ｍｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、２２３Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、７５Ｓｅ、１５３Ｓｍ、８９Ｓｒ、１６１Ｔｂおよび９０Ｙが、治療用放射性核種および治療用陽イオンとして特に有用である。さらに、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１１Ｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１５４−１５８Ｇｄ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、５１Ｍｎ、５２Ｍｎ、１３Ｎ、１５Ｏ、３２Ｐ、２２３Ｒａ、８２Ｒｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８３Ｓｒ、９４Ｔｃ、９９Ｔｃ、８６Ｙ、９０Ｙおよび８９Ｚｒは診断用放射性核種および診断用陽イオンとして特に有用である。
【００６６】
「抗菌薬」は微生物に対して細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用を有するいずれかの薬剤である。抗菌薬はそれらの作用に基づき、（１）細菌細胞壁合成、（２）細胞質膜、（３）タンパク質合成、おおよび（４）核酸合成の４つの主要な群に便宜上分類することができ、これらの各群はしばしばいくつかのクラスに細分類することができる。抗菌化学療法に関する総説は、M. P. E. Slack (In: Oxford Textbook of Medicine, Second Ed., Vol. I, edited by D. J. Weatherall, J. G. G. Lidingham、およびD. A. Warrell, pp. 5.35-5. 53; Oxford University Press, Oxford/Melbourne/New York,1987)による章、およびSection XII, Chemotherapy of Microbial Diseases (In: Goodman and Gilman’s THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 6th Ed., Goodman et al., Eds., pp. 1080-1248; Macmillan Publishing Co., New York, 1980、およびまた2001版)に見出すことができる。これらのテキストで示されるように、数種の抗菌薬は、宿主に許容される濃度で微生物を死滅させる、または阻害することから、それらの毒性において選択的である（すなわち、その薬物は微生物構造または宿主細胞とは異なるまたは生合成経路に作用する）。他の薬剤は微生物の増殖を一時的に阻害できるだけであり、阻害剤を除くと再び増殖を始め得る。多くの場合、微生物または寄生虫を死滅させる、または阻害する能力は体内および体液中の薬剤濃度の関数である。
【００６７】
サイトカインは当業者に公知であり、少なくとも、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、インターフェロン−α、インターフェロン−β、およびインターフェロン−γなどの「免疫調節剤」が挙げられる。
【００６８】
上記で示される定義は互いに排他的ではないと理解される。例えば、１つの分子が細胞傷害薬、放射性核種および検出可能な標識であり得る。
【００６９】
多価タンパク質複合体（ＰＰＣ）の構造
本発明は、通常、互いに横に配置された２つのポリペプチド鎖を含んでなる多価タンパク質複合体（ＰＰＣ）を提供する。各ポリペプチド鎖は一般に３または４つの「ｖ領域」を含んでなり、これは反対のポリペプチド鎖の対応するｖ領域と一致した際に抗原結合部位を形成し得るアミノ酸配列を含んでなる。しかしながら、各ポリペプチド鎖には最大約６つの「ｖ領域」が使用できる。各ポリペプチド鎖のｖ領域は互いに線状に連結され、これは散在する架橋領域によって連結されていてもよい。ＰＰＣの形に配置されている場合、各ポリペプチド鎖のｖ領域は個々の抗原結合部位を形成する。従って、例えば、４つの抗原結合部位と３つの架橋領域を有するＰＰＣは以下のように示すことができる：
［アミノ末端］−ａ１−ｌ１−ａ２−ｌ２−ａ３−ｌ３−ａ４−［カルボキシル末端］
［カルボキシル末端］−ｂ１−ｌ４−ｂ２−ｌ５−ｂ３−ｌ６−ｂ４−［アミノ末端］
【００７０】
ここで示されるように、第一のポリペプチドは、３つのリンカー領域ｌ１、ｌ２およびｌ３によって連結された４つのｖ領域ａ１、ａ２、ａ３およびａ４を含んでなる。ＰＰＣの第二のポリペプチドは、４つの対応するｖ領域ｂ１、ｂ２、ｂ３およびｂ４と、３つの散在リンカー領域ｌ４、１５およびｌ６を含んでなる。このＰＰＣの個々のポリペプチド鎖は各鎖の対応するｖ領域の相補的結合により互いに結合されている。従って、上記で示したように、ａ１はｂ１に結合し、ａ２はｂ２に結合し、ａ３はｂ３に結合するなどである。
【００７１】
本発明のＰＰＣは、その２つのポリペプチド鎖上の対応するｖ領域（すなわち、ａｎ〜ｂｎ）の配置が抗原結合部位を提供する限り、種々のアミノ酸配列のｖ領域を含み得る。対応するｖ領域の結合は、ＰＰＣの個々の抗原結合部位を形成する。ＰＰＣ上の各抗原結合部位を形成するための好ましい方法は、抗体または抗体フラグメント由来の既知の抗原結合領域の対応ＶＨおよびＶＬ領域を配置することである。しかしながら、本発明の実施はこのような既知の抗原結合領域の組み込みに限定されるものではない。対応するＶＨおよびＶＬ領域を用いる場合、２つのｖ領域（すなわち、ａｎまたはｂｎ）のどちらがＶＨまたはＶＬをコードするかに制限はない。例えば、ｎ＝３のとき、以下に挙げるＶＨおよびＶＬの組合せが可能である。
【００７２】
【表１】
2006526408.tif 000003
さらなる例として、４つのｖ領域が存在する場合、以下のいずれもが可能性がある。
【００７３】
【表２】
2006526408.tif 000004
【００７４】
一つの態様では、このＰＰＣの１つのポリペプチドは配列番号１（図１Ｄ）であり得る。もう１つの態様では、このＰＰＣの１つのポリペプチドは配列番号２（図１Ｅ）であり得る。好ましい態様では、このＰＰＣの１つのポリペプチドは配列番号１であり、もう１つのポリペプチドは配列番号２である。
【００７５】
ＰＰＣのポリペプチドの各ｖ領域は独立であるので、その各抗原結合部位は独立に同じまたは異なる親和性または特異性を有することができる。別の好ましい態様では、ＰＰＣの抗原結合部位は異なるエピトープまたは同じエピトープと結合する。本発明の実施において、このようないずれかの態様で、個々の各抗原結合部位に対する結合親和性はおそらく異なり、それが許容される。
【００７６】
上記に示したように、本発明のＰＰＣの好ましい態様は、ｖ領域に関して既知のＶＨおよびＶＬ配列を含んでなる。例えば、ＰＰＣにとって標的抗体と同じ特異性を有するＡＢＳを有することが好ましければ。標的抗体の遺伝子はクローニングすることができるか、またはその標的抗体に対してタンパク質シーケンシングを行うことができる。次に、標的抗体のＶＨおよびＶＬ配列を決定することができる。ＰＰＣの抗原結合部位のうち少なくとも１つが標的抗体として対応するＶＨおよびＶＬ領域を含んでなる宿主においてこのＰＰＣの両ポリペプチドを同時発現させるよう、核酸構築物を作製してもよい。これらの抗原結合部位は標的抗体と同一でばければ類似の抗原結合特異性および親和性を有すると予測される。本発明のこの態様の実施においては、この標的抗体はヒト、非ヒトまたは操作型抗体であり得る。さらにまた、この抗体は、その配列が公開ドメインにあるいずれの抗体であってもよい。
【００７７】
任意の特異性の標的抗体を産生する方法は当技術分野で公知である。例えば、モノクローナル抗体は抗原から作製することができる。種々の宿主細胞上で抗原レパートリーを発現する組換え抗体ライブラリー発現ライブラリーをスクリーニングしてもよい。さらに、抗体を精製し、抗原アフィニティーカラムを用いてそれらのタンパク質配列を決定してもよい。
【００７８】
本発明のもう１つの態様では、このＰＰＣＶＨおよびＶＬ領域は「ヒト化」モノクローナル抗体またはヒト抗体に由来するものであってよい。  あるいは、このＶＨおよび／またはＶＬ領域は、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーから単離されたヒト抗体フラグメントに由来する配列を含んでもよい。例えば、Barbas et al., METHODS: A companion to Methods in Enzymology 2: 119(1991)、およびWinter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994)参照。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーを作製するのに有用なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, Calif.)ｋら入手することができる。
【００７９】
ヒト抗体ＶＨまたはＶＬ配列は、マウスで産生されたヒトモノクローナル抗体に由来するものであってよい。このような抗体は、抗原投与に応答して特定のヒト抗体を産生するように「操作」されたトランスジェニックマウスから得ることができる。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内在する重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚幹細胞系統に由来するマウス系統に導入する。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスはヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生するために使用できる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Green et al., Nature Genet. 7: 13 (1994)、Lonberg et al., Nature 368: 856 (1994)、およびTaylor et al., Int. Immun. 6: 579 (1994)によって記載されている。
【００８０】
これらのリンカー領域は、例えば立体的拘束のため、ＰＰＣの個々のポリペプチド鎖の対応するｖ領域を抗原結合部位に配置できるよう（すなわち、ａ１／ｂ１、ｂ２／ａ２など）十分な長さのいずれのアミノ酸配列を含んでもよい。しかしながら、これらのリンカー配列は、ポリペプチド鎖上の２つの隣接するｖ領域が互いに再び折りたたまれないようにしなければならない（すなわち、ａ１／ａ２、ｂ１／ｂ２など）。一般に、１０アミノ酸よりも長いリンカーはフォールディングバックの問題を示す可能性が高い。好ましい態様では、これらのリンカーは３〜８アミノ酸の間の長さのポリペプチドを含んでなる。いずれのアミノ酸をリンカーに用いてもよいが、好ましいアミノ酸は柔軟で親水性のものである（例えば、グリシンおよびセリン）。このようなリンカーの例としては、例えば、図１Ｄおよび１Ｅで示される本発明のリンカーが挙げられる。立体傷害が課せられていないいくつかの態様では、リンカー領域は除いてもよい。
【００８１】
タグ付きＰＰＣ
本発明のＰＰＣはまた、ＰＰＣと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供する「エピトープタグ」との融合物を含んでなるキメラ分子（本明細書では、「タグ付きＰＣ」と呼ぶ）を形成するように改変してもよい。このエピトープタグは通常、標的タンパク質のアミノまたはカルボキシル末端に置かれる。このエピトープタグを設けることで、標的タンパク質が容易に検出できるだけでなく、アフィニティー精製により容易に精製できるようになる。種々のタグエピトープが当技術分野で周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５(Field et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 2159参照)；ｃ−ｍｙタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体(Evans et al., (1985) Molecular and Cellular Biology, 5: 3610)；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体(Paborsky et al., (1990) Protein Engineering, 3: 547参照)が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ−ペプチド(Elnhauer et al., J. Biochem. Biophys. Methods, 2001 Oct 30, 49 (1-3), 455-65; Song et al., Int. J. Oncol. 2003 Jan, 22(1)93- 8; Werkmeister et al., Biochim. Biophys Acta 1993 May 7,1157(1):50-4; Hopp et al. (1988) BioTechnology 6: 1204三章); ＫＴ３エピトープペプチド(Martine et al. (1992) Science, 255:192参照)；チューブリンエピトープペプチド(Skinner (1991) J. Biol. Chem. 266:15173参照)；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393参照)が挙げられる。タグ付きＰＰＣは全ＰＰＣの一部であり、本開示でＰＰＣという場合にはタグ付きＰＰＣと理解される。
【００８２】
本発明の一つの態様では、ＰＰＣの３つまたは４つのＡＢＳが腫瘍関連抗原のエピトープに特異的であり得る。ＰＰＣの各ＡＢＳは異なる腫瘍関連抗原に特異的であり得る。例えば、１つの腫瘍関連抗原はＣＥＡであってよく、別の腫瘍関連抗原は非ＣＥＡ抗原であってよい。本発明のもう１つの態様では、このＰＰＣはハプテンのエピトープに特異的な少なくとも１つのＡＢＳを有する。このハプテンは、例えば、ヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）であり得る。
【００８３】
本発明のもう１つの態様では、このＰＰＣは化学結合によって第二の分子と結合されている。この結合は架橋剤を用いてなし得る。あるいは、この結合は、抗原−抗体、ホルモン−受容体、薬物−受容体、細胞表面抗原−レクチン、ビオチン−アビジン、基質／酵素、ペプチド−受容体、および相補的核酸鎖、ハプテン−抗−ハプテン系などの結合対であり得る。記載のアビジンは、米国特許第５，６９８，４０５号によって記載されているような、親和性軽減アビジンおよび免疫原性軽減アビジンを含む。
【００８４】
一つの態様では、このＰＰＣはペプチド（タンパク質を含む）と結合させて融合ＰＰＣを形成してもよい。この結合は、ＰＰＣがそれ自体ペプチドからなるので、２つｊのペプチドを連結するために使用できるいずれの結合であってもよい。例えば、１つの方法は、ペプチド合成装置で融合ＰＰＣを合成することである。この場合、その結合はペプチド結合（アミド結合とも呼ばれる）であろう。別法として、融合ＰＰＣの両ポリペプチドをコードするためのＤＮＡを合成またはクローニングするものがある。このＤＮＡを発現ベクター中に置き、宿主細胞に永久的または一時的に形質転換する。さらなる別法として、２つのペプチドを連結するために化学架橋剤を用いるものがある。
【００８５】
本発明のＰＰＣ分子は「診断薬」などの「検出可能な標識」をさらに含んでもよい。検出可能な標識および診断薬としては、放射性標識、蛍光標識、発光（化学発光および生物発光）標識、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）標識およびＳＰＥＣＴ標識が挙げられる。標識の選択については周知であるが、特定の例を以下に示す。標識を検出する方法は一般に知られており、米国特許第４，５９５，６５４号、同第４，７３５，２１０号、同第４，７９２，５２１号、同第５，３６４，６１２号、同第５，４３９，６６５号、同第５，６３２，９６８号、同第５，６９７，９０２号、同第５，７５３，２０６号、同第６，０７１，４９０号、同第６，１２０，７６８号、同第６，１２６，９１６号および同第６，１８７，２８４号にも記載されている。本開示のこの節の種々の標識に関する考察は、本発明の標識に対する言及総てに当てはまる。
【００８６】
放射性標識は治療用陽イオンおよび診断用陽イオンとしてさらに分類することができる。診断用陽イオンは２５〜１０，０００ｋｅＶを有する粒子および／または陽電子を放射し得る。治療用陽イオンは２０〜１０，０００ｋｅＶを有する粒子および／または陽電子を放射し得る。in vivo用のタンパク質を標識するのに好適な放射性標識の常法は一般に本発明のＰＰＣを標識するのにも好適である。このような方法は当業者には公知であり、とりわけ、例えば、Childs et al., J. Nucl. Med., 26:293 (1985)；ならびに米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，６２４，８４６号、同第５，３３４，７０８号、同第５，６７０，１３２号、同第５，５１４，３６３号、同第５，９７６，４９２号、同第６，３５８，４８９号および同第６，４４０，３８６号に開示されている。広範な標識技術が、Feteanu,”LABELED ANTIBODIES IN BIOLOGY AND MEDICINE”, pages 214-309 (McGraw-Hill Int. Book Co., New York et al, 1978)に開示されている。種々の金属放射性同位元素の導入は、Wagner et al., J. Nucl. Med., 20, 428 (1979); Sundberg et al, J. Med. Chem., 17, 1304 (1974)；およびSaha et al. J. Nucl. Med., 6, 542 (1976)に従ってなすことができる。これらの方法の中には、標識抗体の使用を記載したものものある。これらの方法は、これらの方法の中で記載されている抗体を本発明のＰＰＣに置き換えることで、本発明において使用できる。
【００８７】
検出可能な標識は蛍光標識、化学発光標識、または生物発光標識であり得る。蛍光標識の例としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ο−フタルデヒドまたはフルオレサミンが挙げられる。化学発光標識の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。生物発光標識の例としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリンが挙げられる。
【００８８】
検出可能な標識は１以上の造影剤を含んでもよい。造影剤は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）に有用である。磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）剤は、例えば、Pykett, Scientific American, 246, 78(1982); Runge et al., Am. J. Radiol., 141, 1209 (1983)により記載されている。ＭＲＩ造影に有用な化合物の例としては、常磁性イオン、例えば、Ｇｄ（III）、Ｅｕ（III）、Ｄｙ（III）、Ｐｒ（III）、Ｐａ（ＩＶ）、Ｍｎ（II）、Ｃｒ（III）、Ｃｏ（III）、Ｆｅ（III）、Ｃｕ（II）、Ｎｉ（II）、Ｔｉ（III）、およびＶ（ＩＶ）イオン、またはラジカル、例えば、ニトロキシドの複合体が挙げられ、これらは好適なリンカーを介してさらに基質と結合させることができる。ＭＲＩ造影剤は、患者の安全性と機器設計が合理的に達成でき、適合性のある磁場強度を用い、外部カメラによる検出が可能な十分量で存在しなければならない。このような薬剤の必要条件は、媒体中の水分子に対して作用を有する薬剤に関する技術分野で周知であり、とりわけ、例えば、Pykett, Scientific American, 246:78 (1982)；およびRunge et al., Am. J. Radiol, 141: 1209 (1987)に開示されている。
【００８９】
この検出可能な標識はＸ線またはコンピューター断層撮影法用の１以上の放射不透過剤または造影剤を含み得る。放射不透過剤または造影剤はバリウム、ジアトリゾエート、エチオダイズド油、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨードアミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパンＳＡＢ酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメト酸、イオタスル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メチリゾエート、プロピリオドン、または塩化タリウム（Ｉ）であり得る。米国特許第５，１２０，５２５号、同第５，１２８，１１９号、同第５，３２８，６７９号参照。
【００９０】
検出可能な標識は、例えばリポソーム（ガス充填リポソームを含む）またはデキストランなどの１以上の超音波造影剤を含み得る。
【００９１】
記載の検出可能な標識の他、ＰＰＣは放射性核種などの治療薬を含んでもよい。本発明のＰＰＣを標識するために適用できる他の方法は米国特許第５，０６１，６４１号、同第５，１０１，８２７号に開示されている。
【００９２】
検出または治療用の放射性標識抗体および操作型抗体を用いるためのさらなる例は、米国特許第４，６２４，８４６号、同第５，４８２，６９８号、同第５，５２５，３３８号、同第５，６０９，８４６号、同第５，７１６，５９５号、同第５，７２８，３６９号、同第５，７３６，１１９号、同第５，７４６，９９６号、同第５，７７２，９８１号、同第５，７７６，０９３号、同第５，７７６，０９４号、同第５，７７６，０９５号、同第５，８４３，３９７号、同第５，８５１，５２７号、同第５，９５８，４０８号、同第５，９６５，１３１号、同第６，０１０，６８０号、同第６，０７７，４９９号、同第６，０９６，２８９号、同第６，３３１，１７５号、同第６，３６１，７７４号、同第６，３８７，３５０号、同第６，３９９，０６８号、および同第６，４５８，９３３号に見出せる。本発明のＰＰＣはこれらの特許で述べられているいずれの抗体と置き換えることもできる。
【００９３】
本発明はまた、ＰＰＣの少なくとも１つのＡＢＳが癌関連抗原上のエピトープに特異的であり、少なくとも１つのＡＢＳがハプテン上のエピトープに特異的であるＰＰＣを提供する。
【００９４】
本発明のもう１つの態様は複合体に結合されているＰＰＣを対象とする（抗体複合体の記載に関しては米国特許第４，８２４，６５９号を参照）。この結合は架橋剤によるものであり得る。この複合体は、放射性核種、または細胞傷害薬、薬物、化学療法薬、および放射性核種であり得る。
【００９５】
本発明のもう１つの態様では、このＰＰＣは、エフェクター細胞の表面上の抗原に対して特異性を有する少なくとも１つのＡＢＳと、標的細胞またはウイルス上の抗原に対して特異性を有する少なくとも１つのＡＢＳを有し得る。第一の抗原の例は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球、単球、またはマクロファージの表面の抗原であり得る。この場合、ＰＰＣとこれらの２つの抗原との結合の結果、標的細胞の死滅または有糸分裂の休止が起こり得る。以下の文献ではこれらの特徴を有する多価タンパク質の有用性に触れている：Takemura et al., Cancer Immunol. Immunother. 2002 Mar; 51(1):33-44; Kipriyanov et al., J. Immunol. 2002 Jul 1; 169(1):137-44; Stockmeyer et al., J. Immunol 2000 Nov 15; 165(10):5954-61。
【００９６】
本発明のもう１つの態様では、このＰＰＣは、細胞の表面上の抗原に対して特異性を有する少なくとも１つのＡＢＳと、抗原性物質に対して特異的な少なくとも１つのＡＢＳとを有し得る。第一の抗原の例は、Ｂ細胞、単球、樹状細胞およびマクロファージの表面の抗原であり得る。この場合、ＰＰＣとこれらの細胞表面抗原および抗原性物質との結合の結果、その抗原性物質に対する免疫応答の誘導が起こる。
【００９７】
もう１つの態様では、本発明は、そのポリペプチドのうち１つが付加的なＶ領域を含んでなるＰＰＣを対象とする。このＶ領域は、付加的なリンカーによって他のＶ領域に結合していてもよい。この付加的Ｖ領域は、毒素、ハプテンおよび検出可能な部分のアミノ酸配列を含み得る。毒素、ハプテンおよび検出可能な部分の多くの例は既知のアミノ酸配列を有するタンパク質およびペプチドである。これらのペプチドの多くは本明細書の至るところで例として挙げられている。これらのアミノ酸配列は本段落中に記載されているＶ領域において使用可能である。
【００９８】
二重特異性および多重特異性ＰＰＣ
本発明は、ＰＰＣを衣装する方法を提供する。一般に、抗体または操作型抗体の使用を必要とするいずれの方法も(例えば、Cao Y and Lam, L. Adv Drug Deliv Rev 2003 Feb 10;55 (2):171-97参照)、類似の結合親和性および特異性を有するＰＰＣを用いて行うことができる。これらの方法は、この開示ならびにその中に引用されている参照文献、特許および特許出願に記載されているいずれの方法も含む。以下、特定の態様を記載する。
【００９９】
二重特異性および多重特異性ＰＰＣはエフェクター機能の補充および腫瘍細胞の治療に効果的である。多重特異性とは、本発明のＰＰＣのような操作型抗体の、複数のＡＢＳを有する能力をいい、各ＡＢＳは異なるエピトープと結合する。上記のように、本発明の融合ＰＰＣは少なくとも３〜１０以上のＡＢＳを有することができ、各ＡＢＳは異なるエピトープに対して特異性を持ち得る。さらに各異なるエピトープは同じ抗原上にあっても異なる抗原上にあってもよい。二重特異性抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の強力なエフェクター機能を補充する上での特定の使用が見出されている。従って、二重特異性抗体は、Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）(Staerz et al., Nature 314: 628-631, 1985)またはＦｃＲIII（ＣＤ１６）(De Palazzo et al., Cell Immunol. 142: 338-347, 1992)と標的細胞ｈの細胞表面抗原とを架橋して、細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞による標的細胞の死滅するために用いられてきた。マウスでは、このような抗−ＣＤ３  ｂｉｓＡｂは固形腫瘍の増殖を阻害することができ(Titus et al., J. Immunol. 138: 4018-4022, 1987, Garrido et al., Cancer Res. 50: 4227-4232, 1990)、またはリンパ腫を根絶することさえでき(Brissinck et al., J. Immunol 147: 4019-4026, 1991)；ヒトでは悪性神経膠腫に対して使用されている(Brissinck et al., J. Immunol. 147: 4019-4026, 1991)。二重特異性抗体はまた、骨髄由来の白血病細胞のex vivoでの一掃にも用いられている(T. Kaneko et al., Blood 81: 1333-1341, 1993参照)。in vitro合成された二重特異性抗体はまた、酵素、抗原、毒素、放射性核種および細胞傷害薬を腫瘍細胞に送達するために用いられている(Bonardi et al., Cancer Res. 53:187-199 1992参照)。上記方法のいずれも、およびこの開示に引用されている参照文献中の方法のいずれもは、本発明の二重特異性ＰＰＣを、これらの方法において明示されている多重特異性抗体（または機能的誘導体）の基質として用いて行うことができる。
【０１００】
本発明の多重特異性ＰＰＣは腫瘍の画像化に有用であり得る。
二重特異性抗腫瘍マーカー、抗ハプテン抗体が腫瘍の画像化のために用いられている(J. M. Le Doussal et al. Int. J. Cancer Supplement 7: 58-62, 1992; P. Peltier et al. J. Nucl. Med. 34: 1267-1273 1993; C. Somasundaram et al. Cancer Immunol. Immunother. 36: 337-345, 1993; A. Bruynck et al. Br. J. Cancer 67: 436-440, 1993)。この方法は２つの工程を含む。第一の工程では、二重特異性抗体を注入し、腫瘍関連抗原と結合させることにより腫瘍に局在させる。第二の工程では、次に、放射性標識したハプテンを注入し、二重特異性抗体と結合させることにより優先的に腫瘍に局在させ、腫瘍の画像化を可能とする。腫瘍細胞に特異的な少なくとも１つのＡＢＳとハプテンに特異的な１つのＡＢＳを有する本発明の多重特異性ＰＰＣは、同じ結果を達成すべくその二重特異性抗体の変わりに使用できる。
【０１０１】
別の例としては、本発明のＰＰＣは、薬物を送達するために一方の結合部位、腫瘍に結合させるためにもう一方の結合部位を用い、あるいはP. A. Trail et al. (Science 261: 212-215, 1993)が腫瘍に対するドキソルビシンの送達に関して記載しているものと類似の系を用い、細胞傷害薬を腫瘍細胞に送達するために使用できる。これらの著者は、ドキソルビシンと共有結合されたＬｅｗｉｓ  Ｙ抗原に対する抗体を用いており、これはリソソームおよびエンドソームにインターナライズされた。この結合はこれらの環境下で切断可能であり、これらの細胞に薬物の送達をもたらす。腫瘍細胞に対する抗体の結合力を高めるには、二価ＰＰＣが特に有用であり得る。特異性は、同じ腫瘍上の２つの（またはそれ以上）の異なる腫瘍関連抗原、または同じ腫瘍関連抗原上の２つ（またはそれ以上）のエピトープに対する二重特異性抗体を用いることにより高めることができる。
【０１０２】
本発明の多重特異性ＰＰＣは、血液脳関門を通して治療薬を送達するために使用できる。この方法では、百日咳菌(Bordetella pertussis)のアドヘシンＦＨＡ、または白血球接着分子ＣＲの天然リガンドに対する１つのＡＢＳ(E. I Tuomanen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7824-7828, 1993)およびその他のＡＢＳを有する多重特異性ＰＰＣを、次に、標的に向け、治療作用を得ることができる。
【０１０３】
多価ＰＰＣは、例えば、腫瘍関連抗原の２つの異なるエピトープに放射性標識ＰＰＣにより結合させることにより、腫瘍を限局化する際に、画像化目的で特に有用であり得る。１つの腫瘍関連抗原に対して２つのＡＢＳが存在することで、この検出法のシグナル／ノイズ比を高め得る結合力成分が得られる。
【０１０４】
本発明の多重特異性ＰＰＣは、通常の環境下では特異性のない部位または抗原に抗体eo再ターゲッティングする際に使用できる。このＰＰＣは２つのＡＢＳを有し、一方のＡＢＳは標的部位に特異的であり、もう一方のＡＢＳは選択された抗体分子の部分に結合することができる。この方法では、抗原標的に対して特異性のない抗体はＰＰＣを介して抗原と近接される。この原理は、循環中の抗体を腫瘍などの体内の部位再テーゲッティングするため、また、自己免疫疾患により例示される不適切な免疫応答を遮断するために有利であり、エフェクター機能の補充を可能とする。
【０１０５】
このように、多重特異性ＰＰＣは、抗体鎖全体との結合によってエフェクター機能を補充するために使用できる。このＰＰＣの一方のＡＢＳは治療のため抗原に向けられ、エフェクター機能の補充のために完全抗体に向けられる。
【０１０６】
本発明の好ましい態様では、ＰＰＣのＡＢＳは腫瘍関連抗原のエピトープに特異的であり得る。この腫瘍関連抗原は、例えば、癌腫、黒色腫、肉腫、神経膠腫、白血病またはリンパ腫に関連するものであり得る。腫瘍関連抗原は１を超えるエピトープを有してもよい。例えば、腫瘍関連抗原は少なくとも１、２、３、４つのエピトープを有する。１を超える細胞種に存在し、本発明に有用なその他の標的抗原としては、ＣＤ７４、ＨＬＡ−ＤＲがある。構築物が１を超えるＡＢＳを含む場合、そのＡＢＳ同じ腫瘍抗原または異なる腫瘍抗原上のエピトープに特異的であり得る。従って、３または４つのＡＢＳを有するＰＰＣは１〜３つまたは４つの腫瘍抗原と結合し得る。
【０１０７】
好ましい態様では、ＰＰＣのこのＡＢＳは、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）Ｍｕ−９およびＭＡｂ  ６７９と同じ結合特異性を有する。これは、例えば、モノクローナル抗体の配列を用いてＰＰＣのＶＨおよびＶＬ領域を構築することによって達成することができる。
【０１０８】
さらに、本発明のＰＰＣは、ハプテン上のエピトープと結合する１以上のＡＢＳを含み得る。このハプテンはヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）またはインジウム−ＤＴＰＡであり得る。本質的に、このＰＰＣのＡＢＳは１つのハプテンの複数のエピトープ、または異なるハプテンの異なるエピトープと結合し得る。ＰＰＣの３以上のＡＢＳが、制限無く、腫瘍関連抗原またはハプテンのいずれの組合せとも結合し得る。一例として、１つのＡＢＳはＣＥＡと結合することができるが、別のＡＢＳは非ＣＥＡ腫瘍関連抗原と結合することができる。例えば、ＡＢＳの数をＮとすれば、腫瘍関連抗原と結合するＡＢＳの数は０〜Ｎの範囲であり得る。残りのＡＢＳは総てハプテンと結合し得る。
【０１０９】
上記で例を示したように、本発明の多重特異性ＰＰＣは、いずれの方法においても、多重特異性操作型抗体の代替として役立ち得る。これらの方法としては、本開示およびその中に引用されている参照文献、特許および特許出願に記載されているいずれの方法も含む。ＰＰＣの使用のより具体的な例を以下に示す。
【０１１０】
疾患の治療、診断および検出方法
本発明はまた、癌関連抗原に向けられたＡＢＳを有する本開示のＰＰＣのいずれかを投与することにより、新生物性疾患の症状を治療、診断、および検出する方法を提供する。ＰＰＣは１以上の治療薬、診断薬、または検出薬および１以上のサイトカインとともに投与することができる。この治療薬は化学療法薬または化学療法薬の組合せであってもよい。この治療薬またはサイトカインの投与はＰＰＣ投与の前、同時または後であってよい。
【０１１１】
１を超える治療薬を用いる場合、それらの治療薬は同じであっても異なっていてもよく、例えば、治療用放射性核種、薬物、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、受容体アンタゴニスト、別の薬剤によって活性化された酵素またはプロ酵素、自己分泌物またはサイトカインであり得る。本発明の使用においては毒素も使用できる。本発明において有用なｓの他の治療薬としては、アンチＤＮＡ、アンチＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの放射性標識オリゴヌクレオチド、アンチタンパク質およびアンチクロマチン細胞傷害薬または抗菌薬が挙げられる。その他の治療薬も当業者に公知であり、本発明に従うこのような他の治療薬の使用も具体的に意図される。
【０１１２】
好ましい態様では、これらの治療薬は異なる同位元素を含んでなり、これらはそれらの個々のエネルギー放射の結果として異なる距離で効果的であり、第一および第二の治療薬として用いられる。このプロセスは腫瘍のより効果的な治療を達成し、通常の臨床状況で大きさの異なる複数の腫瘍を示す患者において有用である。
【０１１３】
利用可能な同位元素のうち、最小の腫瘍堆積物および単一細胞を治療するのに有用なものは少数で、薬物または毒素がこのような状況に対するより有用な治療薬となり得る。従って、本発明の好ましい態様では、同位元素は、薬物、毒素および中性子補足剤などの非同位元素種と組合せて用いる。細胞に対して細胞傷害作用を有する多くの薬物および毒素が知られており、本発明とともに用いることができる。それらはMerck Index, Goodman and Gilmanなどの、薬物および毒素についての概論、および上記に引用されている参照文献に見出せる。
【０１１４】
細胞内タンパク質合成を妨げる薬物も本発明の方法において使用可能であり、このような薬物は当業者に公知であり、ピューロマイシン、シクロヘキシミド、およびリボヌクレアーゼが挙げられる。
【０１１５】
これらの治療薬をＰＰＣと結合させてもよい。１つの組換えタンパク質が細胞傷害薬、治療薬または化学療法薬を含んでなる結合タンパク質の作製方法もまた、当業者に公知である。これらの方法を本発明のＰＰＣに適用することができる。例えば、抗体−シュードモナス外毒素Ａ  ＰＰＣが、Chaudhary et al., Nature 339: 394(1989), Brinkmann et al., Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 88:8616 (1991), Batra et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 5867 (1992), Friedman et al., J. Immunol. 150: 3054 (1993), Wels et al., Int. J. Can. 60: 137 (1995), Fominaya et al., J. Biol. Chem. 271: 10560 (1996), Kuan et al., Biochemistry 35: 2872 (1996)、およびSchmidt et al., Int. J. Can. 65: 538 (1996)により記載されている。ジフテリア毒素部分を含む抗体−毒素ＰＰＣが、Kreitman et al., Leukemia 7: 553 (1993), Nicholls et al., J. Biol. Chem. 268: 5302 (1993), Thompson et al., J. Biol. Chem. 270: 28037 (1995)、およびVallera et al., Blood 88: 2342 (1996)により記載されている。Deonarain et al., Tumor Targeting 1: 177 (1995)は、ＲＮアーゼ部分を有する抗体−毒素ＰＰＣを記載しており、一方、Linardou et al., Cell Biophys. 24-25: 243 (1994)は、ＤＮアーゼＩ成分を含んでなる抗体−毒素ＰＰＣを作製した。さらなる例として、Dohlsten et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 91:8945 (1994)は、ブドウ球菌内毒素−Ａを含んでなる抗体−毒素ＰＰＣを報告している。これらの方法は本発明の毒素を含んでなるＰＰＣを作製するためにも適用できる。他の好適な細胞傷害薬は本開示の定義の節に挙げられている。
【０１１６】
上記の治療薬のいずれの組合せを用いてもよいと理解すべきである。例えば、ＰＰＣは２以上の放射性同位元素または薬物とコンジュゲートしてもよい。治療薬の混合物を用いる場合には、複数の治療薬を腫瘍部位に送達し、それにより、この方法の利点を高める。核種の混合物の使用は、注入したビオチニル化キレートのより高いパーセンテージが腫瘍標的へ有毒な弾頭を送達するというさらなる利点を持つ。
【０１１７】
本発明はまた、例えば、光線力学療法で用い、また、適当な非イオン化放射線と組合せ用いる色素も意図する。本発明の方法における光とポルフィリンの使用もまた意図され、癌治療におけるそれらの使用についてはすでに概説されている(van den Bergh, Chemistry in Britain, 22: 430-437 (1986))。
【０１１８】
本発明はまた、被験体において新生物性疾患の症状を軽減する方法も提供する。被験体はウマ、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ニワトリなどをはじめとするいずれの動物であってもよい。好ましい態様では、動物はヒトである。この方法では、新生物性疾患を示す患者に、その症状を軽減するためにＰＰＣを投与する。新生物性疾患は癌腫、肉腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病、黒色腫などであり得る。好ましい態様では、新生物性疾患は、緩徐進行型Ｂ細胞リンパ腫、急速進行型Ｂ細胞リンパ腫（非ホジキンリンパ腫を含む）、慢性リンパ性白血病、または急性リンパ性白血病などのＢ細胞悪性腫瘍である。
【０１１９】
本発明のもう１つの態様は、Ｂ細胞性悪性腫瘍を治療する方法を対象とする。この方法はＢ細胞性悪性腫瘍を有する被験体に、医薬上許容される担体と本発明の少なくとも１つのＰＰＣを含有する治療組成物を投与することを含む。Ｂ細胞悪性腫瘍は、少なくとも、癌腫、肉腫、神経膠腫、リンパ腫、白血病および黒色腫をはじめとするいずれのＢ細胞性腫瘍であってもよい。この方法では、ＰＰＣは２０〜１５００ｍｇタンパク質／回の用量で非経口投与される。好ましい態様では、ＰＰＣは２０〜５００ｍｇタンパク質／回の用量で投与してよい。最も好ましい態様では、ＰＰＣは２０〜１００ｍｇタンパク質／回の用量で非経口投与してよい。これらの用量はいっそう高い用量を達成するために反復投与可能である。上記のように、本発明の方法のＰＰＣをはじめ、本発明のＰＰＣは放射性標識してもよい。放射性標識されたＰＰＣを投与する際、その放射性標識の線量は１５〜４０ｍＣｉの間であり得る。好ましい態様では、その線量は１０〜３０ｍＣｉの間である。より好ましい態様では、その線量は２０〜３０ｍＣｉの間であり得る。別のより好ましい態様では、その線量は１０〜２０ｍＣｉの間であり得る。
【０１２０】
もう１つの態様では、方法がＰＰＣの投与を要する場合、ＰＰＣは化学療法薬、サイトカイン、またはコロニー刺激因子の前、後または同時に投与することができる。化学療法薬およびサイトカインの具体例は本明細書の別の節に列挙されている。
【０１２１】
自己免疫疾患および新生物性疾患を治療するための方法をはじめ、本発明の方法いずれも心血管疾患および炎症などの疾患を治療するためにも使用できる。これらの疾病としては、血餅、塞栓、心筋梗塞、虚血性心疾患、およびアテローム斑が挙げられる。これらの疾患を治療するために好適なＰＰＣは、ＣＤ７４（例えば、ｈＬＬ１）、ＮＣＡ（または−ＣＤ６６）およびＮＣＡ９０に特異的なＡＢＳを有するＰＰＣを含む。これにはｈＭＮ３と同じ特異性を有するＡＢＳが含まれる。本発明の画像診断法は特に上述のＰＰＣを用いるために適合可能である。特に検出法、診断法、および細胞アブレーション法は心血管疾患に適用できる。例えば、この検出は、損傷した心臓組織および血管組織を検出するために用いることができる。これらの細胞アブレーション法は罹患した心臓組織をターゲッティングするために用いることができる。炎症は、抗顆粒球（例えば、抗ＣＤ６６、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ４５）、抗リンパ球（抗Ｂまたは抗Ｔ細胞抗体）、および／または抗単球抗体（例えば、抗Ｉａまたは抗ＣＤ７４抗体）を用いて検出または治療することができる。
【０１２２】
本発明のもう１つの態様では、本発明の治療方法は、細胞傷害薬の副作用を予防、緩和または逆転するための他の化合物または技術と組み合わせて使用することができる。このような組合せの例としては、例えば、循環からの複合体、薬物または毒素のクリアランスを促進するため、かつ、治療薬によって引き起こされる骨髄毒およびその他の造血系毒性を緩和または逆転するために、標的一次ＰＰＣ抗体フラグメント複合体（免疫複合体の細胞傷害性成分としての放射性同位元素、薬物または毒素とともに）の投与、または、非コンジュゲート型の薬剤または毒素の投与から３〜７２時間後に、例えば米国特許第４，６２４，８４６号に記載されているような、迅速クリアランスのための第二の抗体とともにＩＬ−１を投与することを含む。この方法も本発明のＰＰＣに適用可能である。
【０１２３】
別の態様では、癌治療はしばしば、１を超える腫瘍死滅剤、例えば、薬物と放射性同位元素、または放射性同位元素と中性子活性化療法用のホウ素−１０剤、または薬物と生物応答改変剤、またはＰＰＣ複合体と生物応答改変剤の組合せを含む。その各成分の効力を最大にするために、このような治療計画にサイトカインを組み込むことができる。
【０１２４】
同様に、βまたはα放射体である放射性同位元素とコンジュゲートしたある種の抗白血病抗体および抗リンパ腫抗体は、これらの薬剤が腫瘍細胞だけに向けられていない場合、特に、腫瘍細胞が循環中および血液形成器官にある場合には、骨髄性副作用およびその他造血系副作用を誘発し得る。抗癌作用を増強しつつ、造血系副作用を軽減または改善するには、造血系サイトカイン（コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ）などの増殖因子）を同時投与、かつ／または逐次投与するのが好ましい。
【０１２５】
その療法の骨髄抑制性副作用またはその他造血系副作用を予防、緩和または逆転することに加え、例えばＩＬ−１などのサイトカインはＩＬ−１２と同様、抗癌作用を持ち得る(Nakamura et al., Gann 77:1734-1739, 1986; Nakata et al., Cancer Res. 48:584-588, 1988)ことから、これら他の治療法と併用する場合、標的化薬剤の治療作用を増強し得る。従って、本発明の別の態様は、サイトカインとターゲッティングＰＰＣとをコンジュゲートしてヘテロ複合体を形成することで、サイトカインの抗増殖活性を最大にすることである。これらのサイトカインはポリペプチドであることから、ＰＰＣとのコンジュゲーションは、ポリペプチドと抗体とを結合させるための常法のいずれを用いて行ってもよい。これらには、例えば、公開されている手法、例えば、Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737, 1978に従う、ヘテロ二官能性試薬Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の使用、グルタルアルデヒド、カルボジイミドなどの縮合試薬および／または架橋試薬が含まれる。
【０１２６】
ＰＰＣの免疫反応性およびターゲッティング特性に影響を与えずに、高いサイトカイン／ＰＰＣ比を達成するのが好ましい。従って、サイトカインのための担体を用い、その担体に複数のサイトカイン分子を結合させ、それを次にＰＰＣに結合させることが有利であり得る。この結果を達成するために特に有効な方法は、Shih et al.，ＰＣＴ／ＵＳ  ＷＯ  ８７／００５０３１の方法を用いることであり、その方法では、付加物をアミノデキストランなどのポリマーとコンジュゲートし、次に、これを部位特異的にＰＰＣの酸化炭水化物部分と結合させる。使用するサイトカインおよびＰＰＣによって、１つのＰＰＣにつき２０〜１００を超えるサイトカイン分子を、ＰＰＣに認め得るほどの影響を及ぼさずに付着させることができ、場合によっては、１つのＰＰＣにつき１００〜１，０００分子のサイトカインを付着させることができる。
【０１２７】
ターゲッティングＰＰＣの作用を増強させるために抗腫瘍活性を有するサイトカインが望ましい場合、特に、有毒な放射性同位元素または薬物とコンジュゲートされている場合は、サイトカインとしてＩＬ−１またはＧ−ＣＳＦの使用が好ましい。ターゲッティングＰＰＣが循環し、骨髄などの正常な他の器官に付着している場合には、通常生じる血液の副作用を予防、緩和または逆転するために、このサイトカインの存在が重要である。数種のサイトカインが腫瘍細胞死滅のためのリンパ系エフェクター細胞機能を有するので（例えば、ＩＬ−２）、本発明のヘテロ複合体は、従来の手段には応答性のない癌であれ、感染症であれ、別の病巣であれ、標的に対して多様な療法を提供する。
【０１２８】
治療薬の投与前、投与中、または投与後に適当量のサイトカインを投与することができる。この目的は、骨髄細胞およびその他の造血系細胞に対する毒性を最小限にしつつ、癌細胞または感染性生物などの病巣での薬剤の細胞傷害活性を最大限とすることである。骨髄リンパ形態の枯渇の可能性だけでなく、赤血球、骨髄球、リンパ球および血小板の状態にも特に目を配った、ＷＢＣ、および、限定されるものではないが、赤血球（red blood cell／ＲＢＣ）総数、血小板総数をはじめとする他の血液要素の注意深いモニタリング（骨髄／リンパ系をモニタリングするための示差的ＷＢＣ分析、ならびに治療経過中の骨髄血液写真を含む）により、サイトカイン治療の至適化が可能となる。どの血液要素が有害な作用を示すかによって、ＩＬ−１とＩＬ−３；ＩＬ−１とＩＬ−２；ＩＬ−１とＧＭ−ＣＳＦ；ＩＬ−１とエリスロポエチンと血小板増殖因子など、サイトカインの組合せをはじめ、サイトカインの選択および投与計画を各状況に応じて個別化することができる。
【０１２９】
各サイトカインは通常ほぼ特定の造血系要素に対してその作用を有することから、単独または組合せとしてのサイトカインの選択と血液毒性との相関は重要である。本発明の方法においてサイトカインを選択するためには次のような指針を用いることができる。例えば、細胞傷害薬が重大な骨髄毒性と血小板毒性の双方を有する場合、ＩＬ−１とＩＬ−３は１：１または２：１（またはそれ以上）の比の組合せが有利である。従って、ＷＢＣ総数の約２，０００を下回るレベルへの減少、および血小板の約２０，０００を下回るレベルへの減少は、１回用量約１μｇ〜約５００μｇ、好ましくは５〜１００μｇ、より好ましくは約１０μｇのｒＩＬ−１を、約１μ〜約２００μｇ、好ましくは５〜５０μｇ、より好ましくは約５μｇのＩＬ−３を投与するとともに、または投与した後に投与することによって逆転させることができる。この適用は反復可能であり、約５〜２０日、通常は約７日以内で骨髄および血小板抑制の逆転が起こる。当業者ならば、サイトカイン投与のタイミングおよび用量、ならびにサイトカインの組合せおよび用量のバリエーションは、用いるサイトカイン、骨髄の性質および／または抑制されている他の造血系要素、患者の性質（例えば、骨髄の状態に影響を及ぼす事前の毒性）、細胞傷害薬、およびプロトコールの関数であることが分かるであろう。
【０１３０】
本発明の方法によって治療可能な自己免疫疾患の例としては、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、硬皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡(parnphigus vulgaris)、ウェゲナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、および繊維性肺胞炎が挙げられる。
【０１３１】
この自己免疫疾患の治療方法は、Ｔ細胞、血漿細胞、またはマクロファージまたは炎症性サイトカイン上のエピトープに特異的なＡＢＳを有する二次抗体またはＰＰＣを投与する付加的工程を含み得る。この付加的工程はＰＰＣの投与前、投与中、または投与後に行えばよい。
【０１３２】
本発明の方法およびＰＰＣのもう１つの主要な適用は、例えば全身性紅斑性狼瘡などの特定の自己免疫疾患において、また、臓器移植を受けた患者において宿主免疫を抑制することである。これらの適用では、このＰＰＣは細胞傷害薬と会合されている。これらの細胞傷害薬は癌の化学療法でしばしば用いられているものと同様であり、骨髄性副作用およびその他の造血系副作用が不随する。これらの薬物に加え、これらのリンパ細胞（特にＴ細胞）に対してターゲッティングされた特異的ＰＰＣ（例えば、活性かされたＴ細胞のヒトＩＬ−２受容体と特異的に結合する、Uchiyama et al., J. Immunol. 126:1393および1398 (1981)の抗Ｔａｃモノクローナル抗体に由来するＡＢＳを有するＰＰＣ）は、臓器拒絶に関連するこれらの細胞の、比較的選択的な死滅を達成するために、薬物、毒素または放射性同位元素などの細胞傷害剤とコンジュゲートすることができる。例えば、Ｔ細胞特異的ＰＣＣを、α、βまたはγ放射性同位元素とコンジュゲートすることができ、これを、臓器移植を受ける前に患者に、および必要があればその後にも投与することができる。
【０１３３】
付随する造血系に対する限られた副作用もなく、高いＴ細胞死滅用量を達成するために、本発明に従い、この治療をサイトカインの使用と組み合わせることができる。この方法は、は腎臓、心臓、肝臓など、臓器拒絶の臨界期を克服する必要のある多くの臓器移植片の長期生存に好ましい。
【０１３４】
サイトカインの用量レベルは、一般に患者の白血球細胞（ＷＢＣ）レベルと相関のある、造血系細胞の抑制程度の関数である。ＷＢＣおよびその他の血液細胞総数の周期的モニタリングと、比較的一定レベルのＷＢＣを達成するために投与されるサイトカインの注入または投与の速度および頻度の調節により、その療法からの過度な骨髄毒性が持続しないように保証する。実験はＷＢＡ抑制を実質的に防ぐに十分な時点および量でＷＢＣの低下の、およびサイトカインの融合の推測が可能である。重要なことには、これはまた、サイトカイン自体による過剰な副作用は生じないが、患者の骨髄およびその他の造血細胞系の抑制を防ぐのに必要であるような副作用のに生じることを保証する。
【０１３５】
サイトカイン用量とＷＢＣ総数との相関は、一般に、ＷＢＣ総数の正常範囲８〜１２，０００／ｍｍ３から約２，０００のレベルへの減少は、約１μｇ〜約５００μｇ、好ましくは５〜１００μｇ、より好ましくは約１０μｇの組換えヒトＩＬ−１の１回量を投与することにより逆転させることができ、このＷＢＣ総数の低下の逆転は約２〜１２日、通常は約４日以内に起こる。臨床家ならば、使用するサイトカインの種類、骨髄および／またはその他の骨髄要素および／または造血系要素のその他の成分の抑制程度および抑制率、ならびに患者および治療プロトコールの個々の特徴に関数としてのサイトカイン投与のタイミングおよび用量のバリエーションが可能であり、多くの場合望ましいことが分かるであろう。これらは、臨床家ならば、通常のモニタリング技術および薬量測定原理を用いて容易に行える。
【０１３６】
自己免疫疾患および新生物性疾患を治療するための方法をはじめ、本発明の方法は、心血管疾患および炎症などの疾患を治療するためにも使用できる。これらの疾患としては、心筋梗塞、虚血性心疾患、およびアテローム斑が挙げられる。これらの疾患を治療するために好適なＰＰＣは、ＣＤ７４（例えば、ｈＬＬ１）、ＮＣＡ（または−ＣＤ６６）およびＮＣＡ９０に特異的なＡＢＳを有するＰＰＣを含む。これにはｈＭＮ３と同じ特異性を有するＡＢＳが含まれる。本発明の画像診断法は特に上述のＰＰＣを用いるために適合可能である。特に検出法、診断法、および細胞アブレーション法は心血管疾患に適用できる。例えば、この検出は、損傷した心臓組織および血管組織を検出するために用いることができる。これらの細胞アブレーション法は罹患した心臓組織をターゲッティングするために用いることができる。炎症は、抗顆粒球（例えば、抗ＣＤ６６、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ４５）、抗リンパ球（抗Ｂまたは抗Ｔ細胞抗体）、および／または抗単球抗体（例えば、抗Ｉａまたは抗ＣＤ７４抗体）を用いて検出または治療することができる。
【０１３７】
自己免疫疾患および新生物性疾患を治療するための方法をはじめ、本発明の方法はいずれも、アルツハイマー病などの神経疾患のような疾患を治療するためにも使用できる。これらの疾患を治療するために好適なＰＰＣは、アルツハイマー患者のアミロイド斑に特異的なＡＢＳを有するＰＰＣを含む。本発明の画像診断法は特に上述のＰＰＣを用いるために適合可能である。特に検出法、診断法、および細胞アブレーション法は神経疾患に適用できる。例えば、この検出は、損傷した脳組織またはアミロイドを含む脳組織を検出するために用いることができる。これらの細胞アブレーション法はアミロイドをターゲッティングするために用いることができる。炎症は、抗アミロイドＰＰＣを用いて検出または治療することができる。
【０１３８】
本発明はまた、罹患組織または疾病を検出および診断する方法も提供する。例えば、提案される治療方法はいずれも、例えば放射性標識などの検出可能な標識を有するＰＰＣを用いて行うことができる。このＰＰＣは患者に投与した後に検出することができる。従って、これらの治療方法はいずれも、患者に投与した後にＰＰＣを検出する付加的工程による検出方法として使用できる。さらに、既知の病原体、罹患細胞、腫瘍関連抗原、疾病関連抗原（例えば、アミロイド）などに対して特異性を有するＰＰＣを用いることで、疾病の存在を診断することができる。
【０１３９】
投与方法
本発明の投与のための好ましい経路は非経口注射である。非経口投与では、本発明の組成物は、医薬上許容される賦形剤とともに、溶液、懸濁液またはエマルションなどの注射可能な単位投与形に調剤される。このような賦形剤は本来無毒であり、非医薬である。このような賦形剤の例としては、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス溶液がある。硬化油およびオレイン酸エチルなどの非水性賦形剤も使用可能である。好ましい賦形剤は生理食塩水中５％のデキストロースである。賦形剤は、バッファーおよび保存剤をはじめ、等張性および化学的安定性を高める物質などの少量の添加剤を含んでもよい。経口投与などの他の投与方法も意図される。
【０１４０】
本発明のＰＰＣは溶液として投与してもよい。この溶液のｐＨはｐＨ５〜９．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲でなければならない。そのＰＰＣは、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌまたはクエン酸などの医薬上許容される好適なバッファーを含む溶液中になければならない。バッファー濃度は１〜１００ｍＭの範囲でなければならない。免疫グロブリンの溶液も塩化ナトリウムまたは塩化カリウムなどの塩を５０〜１５０ｍＭの濃度で含んでもよい。グリセロール、アルブミン、グロブリン、界面活性剤、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミンの塩などの、有効量の安定剤もまた含んでよく、ＰＰＣを含有する溶液に、または溶液を作製する組成物に加えてもよい。ＰＰＣの全身投与は一般に、ＰＰＣの鋳型としてヒト化型の抗体を用いる場合、２〜３日ごと、または１週間に１回行う。あるいは、毎日の投与が有用である。通常投与は、筋肉内注射かまたは血管内注入のいずれかによる。
【０１４１】
投与はまた、鼻腔内またはその他の非経口経路によってもよい。ＰＰＣはまた、血管をはじめとする特定の組織に置いたマイクロスフェア、リポソームまたはその他の微粒子送達系を介して投与してもよい。
【０１４２】
ＰＰＣは、肺への局在送達を達成するためにエアゾールにより投与してもよい。これは水性エアゾール、リポソーム調製物または固体粒子含有調製物またはその誘導体を調製することにより達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）が使用できる。エアゾールの作製には好ましくは音波噴霧器が使用される。音波噴霧器は、ＰＣＣの分解を招き得る、ＰＰＣが剪断に曝されることを最小限とする。
【０１４３】
一般に、投与するＰＰＣの用量は、患者の齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、過去の病歴のような因子によって異なる。好ましくは、患者に飽和量のＰＰＣを投与する。
【０１４４】
一般に、受容者に約５０〜５００ｍｇの範囲のＰＰＣを与えるのが望ましいが、記載されている場合には、より低いまたはより高い用量を投与してもよい。用量の例としては２０〜１５００ｍｇタンパク質／回、２０〜５００ｍｇタンパク質／回、２０〜１００ｍｇタンパク質／回、２０〜１００ｍｇタンパク質／回、２０〜１５００ｍｇタンパク質／回が挙げられる。ＰＰＣのＰＰＣが放射性核種を含んでなる態様では、線量がミリキュラーで測定することができる。この場合、線量は１５〜４０ｍＣｉの間、１０〜３０ｍＣｉの間、２０〜３０ｍＣｉの間、または１０〜２０ｍＣｉの間であり得る。
【０１４５】
組成物は、その投与が受容患者に許容され得るものであれば、「医薬上許容される担体」であると言われる。無菌緩衝生理食塩水は医薬上許容される担体の一例である。他の好適な担体も当業者に周知である。例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)、およびGoodman and Gilman’s THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Goodman et al., Eds. Macmillan Publishing Co., New York, 1980 and 2001 editions参照)。
【０１４６】
治療目的では、１以上のＰＰＣおよび医薬上許容される担体を治療上有効な量で患者に投与する。１以上のＰＰＣと医薬上許容される担体の組合せは、その投与量が背一里学的に有意であれば、「治療上有効な量」で投与されると言われる。薬剤は、その存在が受容患者の生理に検出可能な変化をもたらすならば、生理学上有意である。
【０１４７】
放射性核種と結合されたＰＰＣは微生物療法に特に有効である。被験体の感染部位にＰＰＣが局在したと判定された後、より高い線量の標識ＰＰＣ、一般に、各々患者体重７０ｋｇに対して、Ｉ−１３１では２０ｍＣｉ〜１５０ｍＣｉ／回、Ｙ−９０では５ｍＣｉ〜３０ｍＣｉ／回、またはＲｅ−１８６では５ｍＣｉ〜２０ｍＣｉを注射する。注射は静脈内、動脈内、リンパ管内、髄腔内、または腔内（すなわち、非経口）であってよく、反復可能である。複数回の分割量のＰＰＣまたはＰＰＣコンポジットを投与することは、正常組織の照射に通常の比例的増加をきたさずに、より高い微生物有毒線量を与えることができるので、治療によっては有利である。
【０１４８】
種々の放射性核種が治療に有用であり、それらは上述の標識技術、または当技術分野で周知の、他の通常の技術によって特定のＰＰＣに組み込むことができる。好ましい治療上有効な放射性核種は、アクチニウム−２２５、アスタチン−２１１、ビスマス−２１２、イットリウム−９０、レニウム−１８６、レニウム−１８８、銅−６７、リン−３２、ルテチウム−１７７、ヨウ素−１３１、およびヨウ素−１２５であるが、その他の放射性核種ならびに光増感剤も適している。
【０１４９】
上述のように、ＰＰＣは標識してもよく、本発明の方法の標識ＰＰＣの使用もまた意図される。放射性標識の線量は、イットリウム−９０では１０〜６０ｍＣｉ／回の範囲であり得る。好ましくは、１０〜５０ｍＣｉ／回である。最も好ましくは、１５〜４０ｍＣｉ、または２０〜３０ｍＣｉ／回または１０〜３０ｍＣｉ／回のイットリウム−９０である。
【０１５０】
本発明の好ましい態様では、新生物性疾患を患う患者に投与するＰＰＣは、適当な腫瘍関連抗原のエピトープに特異的な少なくとも１つのＡＢＳを含んでなるＰＰＣである。すなわち、このＰＰＣは１を超える部位（エピトープ）にあるこれらの腫瘍関連抗原の１つと結合することができる。二重特異性および多重特異性免疫グロブリン誘導体はＷＯ００２０８２０４１Ａ２に列挙されているものが使用できる。
【０１５１】
本発明の方法を実施する上で、ＰＰＣは、少なくとも毒素、放射性核種、化学療法薬または抗菌薬を含む、上記の付加的組成物のいずれかをさらに含んでもよい。本発明のいくつかの態様では、化学療法薬はＰＰＣと物理的に結合させることができる。他の態様では、化学療法薬は非結合型である。非結合型化学療法薬はＰＰＣの投与前、投与中、または投与後に投与することができる。
【０１５２】
本発明のもう１つの態様では、ＰＰＣはサイトカイン部分の投与前、投与中、または投与後に投与することができる。本発明のいずれの方法であっても、ＰＰＣの投与前、投与中、または投与後に有利に投与することができる他の薬剤としては、少なくとも、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチンなどが挙げられる。他の有用な薬剤としては、二重特異性抗体とコンジュゲートされた造血系増殖因子がある。
【０１５３】
本発明のＰＰＣは癌治療に用いられる免疫グロブリンに置き換えることができる。放射性同位元素、薬物、および毒素が、癌細胞によって産生されるか、または癌細胞に関連するマーカーと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントとコンジュゲート可能であること、およびこのような抗体複合体を用いて、放射性同位元素、薬物または毒素を腫瘍部位へターゲッティングし、それらの治療作用を増強し、かつ、副作用を最小限とすることができる。これらの薬剤および方法の例は、Wawrzynczak and Thorpe (Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer, L. M. Franks and N. M. Teich, eds, Chapter 18, pp. 378-410, Oxford University Press. Oxford, 1986)、Immunoconjugates. Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer (C. W. Vogel, ed., 3-300, Oxford University Press, N.Y., 1987)、Dillman, R.O. (CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 1:357, CRC Press, Inc., 1984)、Pastan et al. (Cell 47:641, 1986)、Vitetta et al. (Science 238:1098-1104, 1987)およびBrady et al. (Int. J. Rad. Oncol. Biol. Phys. 13:1535-1544, 1987)に概説されている。癌のための免疫複合体の他の例および他の形態の療法は、とりわけ、米国特許第４，３３１，６４７号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４６８，４５７号、同第４，４４４，７４４号、同第４，４６０，４５９号、同第４，４６０，５６１、同第４，６２４，８４６号、同第４，８１８，７０９号、同第４，０４６，７２２号、同第４，６７１，９５８号、同第４，０４６，７８４号、同第５，３３２，５６７号、同第５，４４３，９５３号、同第５，５４１，２９７号、同第５，６０１，８２５号、同第５，６３５，６０３号、同第５，６３７，２８８号、同第５，６７７，４２７号、同第５，６８６，５７８号、同第５，６９８，１７８号、同第５，７８９，５５４号、同第５，９２２，３０２号、同第６，１８７，２８７号、および同第６，３１９，５００号に開示されている。これらの方法はまた、免疫複合体操作抗体および本発明のＰＰＣを用いる従前の方法の抗体の置換により、本発明の方法に適用可能である。
【０１５４】
本発明のいずれかの方法に用いるための本発明のＰＰＣは抗菌薬と会合させるか、または抗菌薬とともに投与することができる。
【０１５５】
本発明のいずれかの方法に用いるための本発明のＰＰＣはサイトカインおよび免疫調節剤（本開示の他所に定義されている）と会合させるか、または抗菌薬とともに投与することができる。これらのサイトカインおよび免疫調節剤としては、少なくとも、インターフェロンα、βおよびγ、ならびにコロニー刺激因子が挙げられる。
【０１５６】
本発明はまた、本発明のＰＰＣを用いて、患者において免疫応答を刺激するための方法も提供する。一つの態様では、本発明のＰＰＣは抗イディオタイプ抗体のＡＢＳを含み得る。このＰＰＣは、身体の免疫応答を高めるべく、腫瘍関連抗原のエピトープを模したものである。
【０１５７】
本発明のＰＰＣは現状で抗体を用いる多くの免疫学的手法に用いることができる。これらの手法は抗イディオタイプ抗体、および免疫系を追加免疫するためのエピトープコンジュゲート抗体の使用を含む。米国特許第５，７９８，１００号、同第６，０９０，３８１号、同第６，１３２，７１８号参照。抗イディオタイプ抗体は癌および感染性疾患に対するワクチンとしても用いられる（米国特許第６，４４０，４１６号および同第６，４７２，５１１号）。さらに、多重特異性ＰＰＣは多剤輸送体タンパク質と結合可能であり、細胞および病原体の多剤耐性表現型を克服する。これらの方法における抗体は本発明のＰＰＣにより置換可能である。
【０１５８】
本発明はまた、自己免疫疾患の症状を治療するための方法を提供する。この方法では、本発明のＰＰＣを自己免疫疾患患者に投与する。ＰＰＣは投与前に医薬上許容される担体と混合してもよい。本方法のＰＰＣはＢ細胞抗原エピトープに対して結合特異性を有する少なくとも１つのＡＢＳを含むべきである。Ｂ細胞抗原はＣＤ２２であってよく、エピトープはＣＤ２２のエピトープＡ、エピトープＢ、エピトープＣ、エピトープＤおよびエピトープＥであってよい。Ｂ細胞関連抗原はまた、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ７４などの別の細胞抗原であってもよい。
【０１５９】
ＡＢＳは類人霊長類、ネズミモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト起源の配列を含み得る。例えば、ＡＢＳはヒト化ＬＬ２（抗−ＣＤ２２）またはＡ２０（抗−ＣＤ２０）モノクローナル抗体起源のものであり得る。
【０１６０】
投与は２０〜２０００ｍｇ／回の用量で非経口的である。投与は、一定程度の症状の軽減が達成されるまで繰り返すことができる。
【０１６１】
本発明の方法によって治療可能な患者は、ヒトをはじめとするいずれの動物も含む。好ましくは、動物はヒト、霊長類、ウマ、イヌおよびネコなどの哺乳類である。
【０１６２】
本発明の方法およびＰＰＣは全身化学療法に対して耐性または不応である疾病の治療に使用できる。これらのものとしては、種々のウイルス、真菌、細菌および原生動物感染症、ならびに特定の寄生虫感染症が挙げられる。その他の感染症としては、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、例えばエプスタイン−バーウイルスおよびサイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス(Rhabdoviridae)ならびにパポーバウイルスによって引き起こされるものがあり、これらは総て全身性の抗生物質／細胞傷害薬により治療が困難なものである。ＰＰＣ複合体の使用は抗ウイルス薬および毒素の、有意に高い治療係数をもたらし、それらの効力を高め、全身性の副作用を軽減する。ＰＰＣと治療用放射性同位元素（熱中性子で活性化可能なホウ素付加物を含む）との複合体による標的放射免疫治療は、抗ウイルス治療の新たなアプローチを与える。
【０１６３】
本方法およびＰＰＣによって治療可能な原生動物としては、例えば、マラリア原虫（特に、マラリア寄生虫である熱帯熱マラリア原虫）、トキソプラスマ（トキソプラスマ症感染性病原体）、リーシュマニア（リーシュマニア症の感染性病原体）、および赤痢アメーバー(Escherichia histolytica)が挙げられる。本発明のＰＰＣを用いると、種々の段階でのマラリアの検出および治療が有意に向上した。上記のように、種虫抗原と結合するＭＡｂが知られている。しかしながら、血液段階の寄生虫は種虫抗原を持っていないので、ターゲッティングを目的とする種虫抗原に対するＭＡｂの使用は、注射前と直後、および宿主の肝細の混合物を用いるのが好ましい。あるいは、原生動物の１を超える寄生虫段階を標的とするＡＢＳを有するＰＰＣ（熱帯熱マラリア原虫など）も有用である。ＭＡｂは画像化のため（例えば、Ｔｃ−９９ｍ）または治療のため（例えば、アスタチン−２１１、レニウム−１８６）の好適な放射性核種と、あるいは、より選択的な治療のための抗マラリア薬（例えば、ピリメタミン）とコンジュゲートさせる。
【０１６４】
トキソプラスマ症もまた、全身化学療法に耐性がある。トキソプラスマ(T. gondii)、または天然の宿主抗体と特異的に結合するＭＡｂがトキソプラスマ症に対する免疫応答に役割を果たし得るかどうかは明らかではないが、マラリア原虫の場合のように、適切にターゲッティングされたＰＰＣは治療薬の送達のために有効なビヒクルである。
【０１６５】
広く流行している蠕虫感染症である住血吸虫症は、数種の淡水巻き貝により運ばれる遊泳ケルカリアによって誘発される。マラリアの場合のように、感染プロセスには種々の段階のケルカリアが関与している。複数の段階のケルカリア、必要に応じて１以上のその上の複数のエピトープと結合し、好ましくは多重特異性複合体の形態のＰＰＣは、効果的なターゲッティングおよび治療効力の増強のための造影剤または治療薬とコンジュゲートすることができる。
【０１６６】
シャガス病の原因病原体クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)の１以上の形態と結合するＰＰＣを作製し、この微生物感染症の検出および治療に用いることができる。細胞表面糖タンパク質と反応性のあるＰＰＣ、ならびにトリパノソーマの分化段階の他の表面抗原と反応性のあるＰＰＣは、造影剤および治療薬を体内の寄生虫性炎症の部位に向けるのに好適である。
【０１６７】
利用可能な薬物により治療するための、別の極めて困難な感染性生物としては、らい菌（Mycobacterium leprae）がある。らい菌表面の複数のエピトープと特異的に結合するＰＰＣを作製し、造影剤および／または抗生物質／細胞傷害薬をこの桿菌にターゲッティングするするために単独または組み合わせて用いることができる。
【０１６８】
蠕虫感染症、例えば、それ自体化学療法薬には比較的不応性である糞線虫症および旋毛虫症は、その寄生虫上の１つの、または好ましくは複数のエピトープと特異的に結合するＰＰＣを用いた、本発明に従うＰＰＣ標的診断および治療の好適な候補である。
【０１６９】
大多数のヒト感染症の原因となる微生物および寄生虫のほとんどと特異的に結合する抗体は入手可能であるか、または容易に作製することができる。これらの多くがこれまでにin vitro診断目的で用いられてきたが、本発明は、感染部位に診断薬および治療薬をターゲッティングするための抗体複合体の成分としてのそれらの有用性を示す。ヒトおよび動物の微生物病原体および無脊椎動物寄生虫は、その種々の段階で発現される多様な抗原を有する複雑な生活環を持つ生物である。従って、異なる形態上の抗原決定因子を認識するＰＰＣ複合体が作製され、適当な治療法と結びついた混合物または多重特異性複合体のいずれかとして組み合わせて使用されれば、標的治療が最良に達成され得る。その抗体は精製可能であり、その配列決定も可能であるので、ＰＰＣの作出は難しいものではない。同じ原理を、造影剤、例えば放射性核種および／またはＭＲＩ増強剤を付着させることによって感染部位を検出するＰＰＣを含んでなる試薬の使用に当てはめることができる。
【０１７０】
本発明はまた、有効量のＰＰＣを投与することにより罹患組織を術中同定する方法、およびＰＰＣが、組織組織と特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、ターゲッティング可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１つの他の抗原結合部位とを含んでなり、該少なくとも１つの抗原結合部位が、標的細胞、組織もしくは病原体上の、またはそれらにより産生される、またはそれらと関連する分子上の相補的結合部位と結合し得るターゲッティング可能な構築物も提供する。
【０１７１】
本発明はまた、有効量のＰＰＣを投与し、ターゲッティング可能な構築物を投与することによる、被験体における罹患組織の内視鏡的同定のための方法も提供する。このＰＰＣは、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、ターゲッティング可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含んでなり、該少なくとも１つの抗原結合部位は標的細胞、組織もしくは病原体上の、またはそれらにより産生される、またはそれらと関連する分子上の相補的結合部位との特異的結合を示す。
【０１７２】
本発明で用いるのに好適なもう１つの検出方法として、例えばGiven Imaging (Norcross GA)から市販されているタイプの摂取カプセル型カメラ／検出器を用いたワイヤレスカプセル型内視鏡検査がある。
【０１７３】
本発明はまた、有効量のＰＰＣを投与し、ターゲッティング可能な構築物を投与することによる、被験体における罹患組織の内視鏡的同定のための方法も提供する。この態様では、ＰＰＣは、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、ターゲッティング可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含んでなり、該少なくとも１つの抗原結合部位は標的細胞、組織もしくは病原体上の、またはそれらにより産生される、またはそれらと関連する分子上の相補的結合部位との特異的結合を示す。
【０１７４】
本発明はまた、有効量のＰＰＣとターゲッティング可能な構築物を投与することによる、被験体における罹患組織の血管内同定のための方法も提供する。このＰＰＣは、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、ターゲッティング可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含んでなる。この少なくとも１つの抗原結合部位は標的細胞、組織もしくは病原体上の、またはその細胞、組織もしくは病原体より産生される、またはそれらと関連する分子上の相補的結合部位と結合し得る。この標的組織は正常な甲状腺、肝臓、心臓、卵巣、胸腺、副甲状腺、子宮内膜、骨髄、または脾臓由来の組織であり得る。
【０１７５】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットも提供する。このキットはターゲッティング可能な構築物を含み得る。このターゲッティング可能な構築物は、上記でターゲッティング可能な構築物に関して好適であることを記載したいずれの標識によって標識してもよい。
【０１７６】
なお、このターゲッティング可能な構築物は標識されなくともよいが、このキットはターゲッティング可能な構築物を標識するための標識試薬を含み得る。標識試薬を含める場合、標識と架橋剤を含めばよい。このキットはまた、ターゲッティング可能な構築物に特異的な少なくとも１つのＡＢＳと、ターゲッティング可能な組織に特異的な少なくとも１つのＡＢＳとを含んでなる本発明のＰＰＣも含み得る。このキットは必要に応じて、非局在ＰＰＣをクリアリングするためのクリアリング組成物を含んでもよい。
【０１７７】
ＰＰＣをコードする核酸
本発明のもう１つの態様は、本発明のいずれかのＰＰＣの少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する核酸分子を対象とする。本発明の核酸のオープンリーディングフレームは、そのオープンリーディングフレームの発現を誘導する１以上の核酸エレメントと、作動可能なように連結すればよい。これらのエレメントは当業者に公知であり、少なくとも、プロモーター、エンハンサー、近接刺激エレメントなどが挙げられる。好ましい態様では、核酸分子はＰＣＣの両鎖をともに発現する２つのオープンリーディングフレームを含んでなり得る（例えば図１Ａ参照）。
【０１７８】
本発明の核酸は、例えば、発現カセットまたはエピソーム（プラスミド、コスミドなど）のような多数の形態で存在し得る。従って、発現カセット、またはプラスミドもしくはコスミドなどのエピソームも本発明の一つの態様として構想される。本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸を含んでなる宿主細胞を対象とする。この宿主細胞は大腸菌、酵母、植物細胞または哺乳類細胞であり得る。哺乳類細胞は、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞であり得る。
【０１７９】
本発明の核酸は発現可能である。核酸がＲＮＡである場合、その発現はＲＮＡをＤＮＡへと逆転写する第一工程を含み得る。次に、このＤＮＡ配列を、発現ベクター中の、転写発現を制御する調節配列と作動可能なように連結し、次に、原核生物または真核生物いずれかの宿主細胞に導入することができる。プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列の他、発現ベクターは、翻訳調節配列と、発現ベクターを有する細胞の選択のためのマーカー遺伝子を含む。
【０１８０】
原核生物の宿主での発現に好適なプロモーターは抑制型、構成型または誘導型であり得る。好適なプロモーターは当業者に周知であり、Ｔ４、Ｔ３、Ｓｐ６およびＴ７ポリメラーゼを認識し得るプロモーター、バクテリオファージλのＰＲおよびＰＬプロモーター、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、熱ショックおよびｌａｃＺプロモーター、枯草菌(B. subtilis)のα−アミラーゼおよびシグマ特異的プロモーター、桿菌のバクテリオファージのプロモーター、放線菌プロモーター、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーター、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターが挙げられる。原核生物プロモーターは、Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987); Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamin Cummins (1987); Ausubel et al., 前掲、およびSambrook et al., 前掲に概説されている。
【０１８１】
本発明はまた、本発明の核酸を有する宿主細胞も提供する。好ましい原核生物宿主は大腸菌である。好ましい大腸菌株としては、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１、およびＥＲ１６４７(例えば、Brown (Ed.), MOLECULAR BIOLOGY LABFAX, Academic Press (1991)参照)。もう１つの好ましい宿主としては、ＢＲ１５１、ＹＢ８８６、ＭＩ１１９、ＭＩ１２０、およびＢ１７０株などをはじめとする枯草菌(Bacillus subtilus)がある（例えば、Hardy, “Bacillus Cloning Methods,” in DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, Glover (Ed.), IRL Press (1985)参照）。他の宿主としては哺乳類細胞がある。
【０１８２】
核酸を発現させるための方法は当業者に周知である。例えば、Ward et al.,”Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, “ MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATION, pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995)参照。さらに、原核細胞において抗体をクローニングするための発現系も市販されている。例えば、IMMUNO ZAP. TM. Cloning and Expression System (Stratagene Cloning Systems; La Jolla, Calif.)は大腸菌の抗体軽鎖および重鎖の発現のためのベクターを提供する。
【０１８３】
本発明の核酸は真核細胞、特に哺乳類、昆虫、および酵母細胞で発現させるのが好ましい。特に好ましい真核生物宿主は哺乳類細胞である。哺乳類細胞は、適切な折りたたみおよびグリコシル化をはじめとする、クローニングされたポリペプチドに対する翻訳後修飾を提供する。例えば、このような哺乳類宿主細胞としては、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、非分泌型骨髄腫細胞（ＳＰ２／０−ＡＧ１４；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８１）、ラット脳下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３２）、およびラット肝細胞腫細胞（Ｈ−４−II−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）が挙げられる。
【０１８４】
哺乳類宿主に関しては、転写および翻訳調節シグナルは、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、およびシミアンウイルスなどのウイルス源に由来するものであり得る。さらに、アクチン、コラーゲン、またはミオシンなどの哺乳類発現産物由来のプロモーターが使用できる。あるいは、原核生物プロモーター（バクテリオファージＴ３ＲＮＡポリメラーゼ  プロモーターなど）も使用でき、この場合にはこの原核生物プロモーターは真核生物のプロモーターにより調節される（例えば、Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990); Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)参照）。遺伝子の発現が調節できるように、転写開始調節シグナルは抑制または活性化を可能とするものが選択できる。一般に、真核生物調節領域はＲＮＡ合成の開始を指示するに十分なプロモーター領域を含む。このような真核生物プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター(Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273 (1982))；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター(McKnight, Cell 31: 355 (1982))；ＳＶ４０初期プロモーター(Benoist et al., Nature (London) 290:304 (1981))；ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Gorman et al., 前掲)；サイトメガロウイルスプロモーター(Foecking et al., Gene 45:101 (1980))；酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター(Johnston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:6971 (1982); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5951 (1984))；およびＩｇＧプロモーター(Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989))が挙げられる。
【０１８５】
強力な調節配列が、本発明の最も好ましい調節配列である。このような好ましい調節配列の例としては、ＳＶ４０プロモーター−エンハンサー(Gorman,”High Efficiency Gene Transfer into Mammalian cells,” DNA CLONING: A PRACTICAL Approach, Volume II, Glover (Ed.), IRL Press pp. 143-190 (1985))、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター−エンハンサー(Bebbington et al., Bio/Technology 10:169 (1992))、および抗体重鎖プロモーター(Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989))が挙げられる。また、軽鎖の発現のためのκ鎖エンハンサーおよびＩｇＨエンハンス(Gillies, “DEsign of Expression Vectors and Mammalian Cell Systems Suitable for Engineered Antibodies,” Antibody Engineering: A Practical Guide, C. Borrebaeck (Ed.), W. H. Freeman and Company, pp. 139-157 (1992); Orlandi et al., 前掲)も好ましい。
【０１８６】
ＰＰＣ配列および作動可能なように連結されたプロモーターは、線状分子であっても、より好ましくは共有結合閉環分子であってもよい非複製ＤＮＡ分子として、真核細胞に導入することができる。このような分子には自己複製能がないので、そのタンパク質の発現は導入された配列の一時的発現によって起こる。導入配位を宿主の染色体へ組み込むことによる永続的発現が起こることが好ましい。
【０１８７】
この導入配列は、受容宿主内で自己複製し得るプラスミドまたはウイルスベクターに組み込むことが好ましい。この目的で、数種の可能性あるベクター系が利用できる。１つのベクター種として、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、またはＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来する、自己複製型の染色体外プラスミドを提供するＤＮＡエレメントを用いるものがある。第二のベクター種としては、宿主の染色体中への目的のゲノム配列またはｃＤＮＡ配列の組み込みに頼るものがある。
【０１８８】
また、ｍＲＮＡの最適な合成に付加的なエレメントが必要な場合もある。これらのエレメントとしては、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが挙げられる。このようなエレメントを組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターとしては、Okayama, Mol. Cell. Biol. 3:280 (1983)、Sambrook et al., 前掲、Ausubel et al., 前掲、Bebbington et al.,  前掲、Orlandi et al.,  前掲、およびFouser et al., Bio/Technology 10:1121 (1992); Gillies, 前掲が記載しているものがある。イントロン配列を含むゲノムＤＮＡ発現ベクターは、Orlandi et al., 前掲により記載されている。また、一般には、Lerner et al. (Eds.), NEW TECHNIQUES IN ANTIBODY GENELTION, Methods 2(2) (1991)を参照。
【０１８９】
ターゲッティング可能な構築物を含む方法
本発明はまた、疾患を治療または診断する方法も提供する。
本方法では、少なくとも、（Ａ）標的組織のエピトープに特異的な１つのＡＢＳと、（Ｂ）ターゲッティング可能な構築物に特異的な１つのＡＢＳを有する本発明のＰＰＣが提供され、患者に投与される。このＰＰＣを投与した後、ターゲッティング可能な構築物を患者に投与する。このＰＰＣとターゲッティング可能な構築物は実質的に同時に患者に投与してもよい。
【０１９０】
本開示の目的では、このターゲッティング可能な構築物は２通りの式のものであり得る。
第一の構造では、ターゲッティング可能な構築物は式：
Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ(ＨＳＧ)−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ(ＨＳＧ)−Ｌｙｓ(Ｙ)−ＮＨ2
の化合物であり、この化合物はＸまたはＹに硬酸陽イオンキレート剤と、残りのＸまたはＹに軟酸陽イオンキレート剤を含み、この化合物は少なくとも１種の診断用または治療用陽イオン、および／または１以上のキレート化された、または化学的に結合された治療薬、診断薬または酵素をさらに含んでなる（本開示の他所に記載）。診断薬は、例えば、Ｇｄ（III）、Ｅｕ（III）、Ｄｙ（III）、Ｐｒ（III）、Ｐａ（IV）、Ｍｎ（II）、Ｃｒ（III）、Ｃｏ（III）、Ｆｅ（III）、Ｃｕ（II）、Ｎ（II）、Ｔｉ（III）、Ｖ（IV）イオンまたはラジカルであり得る。
【０１９１】
第二の式では、このターゲッティング可能な構築物は式：
Ｘ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｙ）−ＮＨ２
の化合物であり、この化合物はＸまたはＹに硬酸陽イオンキレート剤または軟酸陽イオンキレート剤を含み、残りのＸまたはＹは存在せず、この化合物は少なくとも１種の診断用または治療用陽イオン、および／または１以上のキレート化された、または化学的に結合された治療薬、診断薬または酵素をさらに含んでなる（本開示の他所に記載）。診断薬は、例えば、Ｇｄ（III）、Ｅｕ（III）、Ｄｙ（III）、Ｐｒ（III）、Ｐａ（IV）、Ｍｎ（II）、Ｃｒ（III）、Ｃｏ（III）、Ｆｅ（III）、Ｃｕ（II）、Ｎ（II）、Ｔｉ（III）、Ｖ（IV）イオンまたはラジカルであり得る。
【０１９２】
ターゲッティング可能な構築物を用いる本発明の方法はいずれも、ターゲッティング可能な構築物の組合せも使用できる。好ましい態様では、このターゲッティング可能な構築物はＩＭＰ２４１、ＩＭＰ２８１（図９Ａ）、ＩＭＰ２８４（図９Ｂ）、ＩＭＰ２８８、またはその組合せである。
【０１９３】
本方法では、非局在ＰＰＣを循環からクリアリングするために、必要に応じて、患者にクリアリング組成物を投与してもよい。このクリアリング化合物は、ＰＰＣの投与後、しかし、ターゲッティング可能な構築物の投与前に投与する。これらの方法は、米国特許第４，６２４，８４６号、ＷＯ９２／１９２７３、およびSharkey et al., Int. J. Cancer 51: 266 (1992)に詳細に記載されている。
【０１９４】
記載の方法はin vitro診断に使用できる。放射性標識モノクローナル抗体を用いた画像診断法が周知であり、本発明のＰＰＣに適用可能である。イムノシンチグラフィーの技術では、例えば、抗体をγ放射性同位元素で標識し、患者に導入する。γ放射性同位元素の位置および分布を検出するためにはγカメラを用いる。例えば、Srivastava (ed.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum Press 1988), Chase,”Medical Application of Radioisotopes,” REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edition, Gennaro et al. (eds.), pp.624-652 (Mack Publishing Co., 990)、Brown, “Clinical Use of Monoclonal Antibodies, “BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227- 49, Pezzuto et al. (eds.) (Chapman & Hall 1993)、およびGoldenberg, CA--A Cancer Journal for Clinicians 44: 43 (1994)参照。本発明の方法は、例えば、上記で引用した技術のモノクローナル抗体を本発明のＰＰＣに置き換えることで実施できる。
【０１９５】
画像診断では、放射性同位元素をＰＰＣに直接、または媒介官能基を用いて間接的に結合させればよい。有用な媒介官能基としては、エチレンジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸などのキレート剤が挙げられる。例えば、米国特許第５，０５７，３１３号および同第５，１２８，１１９号参照。
【０１９６】
純粋な診断目的（治療または診断／治療目的に対して）では、患者に送達する線量は、最小半減期、最小体内滞留、ならびに検出および正確な測定を可能とする最少量の同位元素の最良の組合せで同位元素を選択することにより、できる限り低レベルで維持する。ＰＰＣと結合可能であり、かつ、画像診断に適当な放射性同位元素の例としては、γ−放射体、ならびに９９Ｔｃ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、５１Ｃｒ、８９Ｚｒ、１８Ｆおよび６８Ｇａなどの陽電子放射体が挙げられる。他の好適な放射性同位元素も当業者に公知である。好ましいγ−放射体は５０〜５００Ｋｅｖの範囲のγ線放射ピークを有するが、それは主として、放射線検出器に関する技術の現状からこのようなレベルが好ましいためである。このようなγ−放射体の例としては、９９Ｔｃ、６７Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉが挙げられる。
【０１９７】
これらのＰＰＣはまた、in vivo診断の目的で常磁性イオンで標識することもできる。磁気共鳴イメージングに特に有用な元素としては、Ｇｄ、Ｍｎ、ＤｙおよびＦｅイオンが挙げられる。in vitro診断を増強するためのその他の方法は、例えば米国特許第６，０９６，０８９号、同第５，９６５，１３１号および同第５，９５８，０４８号で見出せる。
【０１９８】
別のアプローチでは、検出方法は、アビジン／ストレプトアビジンとビオチンの間の結合を利用することによって改良される。卵白に見られるアビジンは、ビタミンＢ複合体であるビオチンに対して極めて高い結合親和性を有する。ストレプトミセス・アビジニー(Streptomyces avidinii)から単離されたストレプトアビジンはアビジンに類似しているが、非特異的な組織結合が低いので、ストレプトアビジンの変わりに用いられる場合が多い。基本的な診断法としては、アビジン／ストレプトアビジン（またはビオチン）とコンジュゲートしたＰＰＣ複合体を投与すること、ビオチン（またはアビジン／ストレプトアビジン）を含んでなるクリアリング組成物を注射すること、および診断薬とビオチン（またはアビジン／ストレプトアビジン）の複合体を投与することを含む。免疫原性を引き下げ、反復適用を可能とするために、クリアリング組成物のビオチン（またはアビジン／ストレプトアビジン）成分を、炭水化物部分（デキストランなど）またはポリオール基（例えば、ポリエチレングリコール）と結合させるのが好ましい。
【０１９９】
この基本的方法の改良は、哺乳類にアビジン／ストレプトアビジン（またはビオチン）とコンジュゲートさせたＰＰＣを非経口注射すること、ビオチン（またはアビジン／ストレプトアビジン）を含んでなるクリアリング組成物を注射すること、およびアビジン／ストレプトアビジン（またはビオチン）をさらに含んでなる、本発明の多重特異性ＰＰＣを非経口的注射することによって行う。ＷＯ９４／０４７０２参照。
【０２００】
本方法のさらなるバリエーションでは、複数のアビジン／ストレプトアビジンまたはビオチン部分をポリマーとコンジュゲートし、次に、これをＰＰＣ成分にコンジュゲートすることにより、検出の改良が達成できる。本発明に適合させれば、複数のアビジン／ストレプトアビジンまたはビオチン部分を含む単一特異性または多重特異性ＰＰＣが作出できる。ターゲッティングの増強を得るための、複数アビジン／複数ストレプトアビジンおよび／または複数ビオチンポリマー複合体を構築および使用するための技術は、Griffiths, ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０４２９５により開示されている。
【０２０１】
もう１つのバリエーションでは、ビオチン（またはアビジン／ストレプトアビジン）とコンジュゲートしたターゲッティングＰＰＣ複合体を注射すること、少なくとも１用量のアビジン／ストレプトアビジン（またはビオチン）クリアリング剤を注射すること、およびビオチン（またはアビジン／ストレプトアビジン）と、金属検出剤でキレート化された天然に存在する金属原子キレートタンパク質の複合体を含んでなる診断組成物を注射することにより、検出の改良が達成される。本発明の好適なターゲッティングタンパク質はフェリチン、メタロチオネイン、フェレドキシンなどである。ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５１４９参照。
【０２０２】
もう１つの態様では、本発明の方法は治療に使用できる。この治療法では、好適な治療薬は、放射性同位元素、ホウ素付加物、免疫調節剤、毒素、光活性薬または色素、癌  化学療法薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗菌薬、抗原虫薬および化学増感薬からなる群から選択される（米国特許第４，９２５，６４８号、同第４，９３２，４１２号参照）。好適な化学療法薬は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)、およびGoodman and Gilman’s THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Goodman et al., Eds. Macmillan Publishing Co., New York, 1980 and 2001 editions)に記載されている。さらに、好適な治療用放射性同位元素は、α−放射体、β−放射体、γ−放射体、オージェ電子放射体、α粒子を放射する中性子捕捉剤、および電子捕捉により崩壊する放射性同位元素からなる群から選択される。好ましくは、放射性同位元素は、２２５Ａｃ、１９８Ａｕ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、２１３Ｂｉ、１０Ｂ、および２１１Ａｔからなる群から選択される。
【０２０３】
治療薬として用いる場合、ホウ素がホウ素中性子補足療法（ＢＮＣＴ）において有用である。ＢＮＣＴは、安定な同位元素Ｂ−１０（自然存在率１９．８％で存在）が熱中性子の照射を受けてα粒子とＬｉ−７核を生じる際に起こる核反応に基づくものである。これらの粒子は約１細胞径の光路長を有し、直線的な高いエネルギー移動を生じる。この核反応で生じた短距離１．７ＭｅＶ  α粒子の数個だけで、細胞核をターゲッティングし、それを破壊するのに十分である。Barth et al., Cancer, 70: 2995-3007 (1992)。十分な数の熱中性子と悪性細胞周囲または内部に局在した臨界量のＢ−１０が存在する場合にのみ  １０Ｂ（ｎ，α）７Ｌｉ反応が起こり、それにより有意な生物作用が生じることから、生じた放射線は局在する。Ｂ−１０の中性子補足断面図は、捕捉反応も受け得る組織内に見られる窒素および水素のものよりもはるかに優れており（相対的な数値：Ｎ−１４では１、Ｈ−１では５．３、そしてＢ−１０では１１５６０）、従って、正常細胞と悪性細胞の間で、ひと度、Ｂ−１０の高濃度差が達成されれば、後者だけが中性子照射の影響を受ける。これがホウ素中性子補足療法の科学的基礎である。この方法は、Barth et al.,前掲；Barth et al. Cancer Res., 50:1061-70 (1990); Perks et al., Brit. J. Radiol., 61:1115-26(1988)にさらに詳細に記載されている。
【０２０４】
本明細書で意図される治療製剤は、病原体のエピトープに特異的なＡＢＳを含んでなるＰＰＣを含んでなる。このＰＰＣは、非経口投与に好適なビヒクル中で、治療上有効な放射性同位元素および／または抗生物質／細胞傷害薬とコンジュゲートされている。また同様に、治療製剤は、放射性同位元素および／または抗生物質／細胞傷害薬とコンジュゲートされた多重特異性抗病原体ＰＰＣ複合体を含んでなる。
【０２０５】
ある場合、特に、病原体が「隠されている」か、または多少とも接近しにくい場合には、薬物を放射性核種と組み合わせるのが有利である。長距離作用型の放射性核種ならば、その複合体がいくつかの抗原に接近可能である限り、隠れている病原体に達し得る。また、放射線は感染細胞の溶解を引き起こし、細胞内の病原体をその複合体の抗菌薬成分に曝す。
【０２０６】
本発明の抗菌性多重特性造影ＰＰＣはおよび単一特異性または多重特異性治療ＰＰＣはまた、感染病巣へのＰＰＣターゲッティングのための治療キットまたは診断キットに便宜に提供することができる。一般に、このようなキットは、本発明のＰＰＣ複合体を含有するウイルスを、凍結乾燥調製物としてまたは注射ビヒクル中に含む。この複合体をシンチグラフィーイメージングまたは放射性同位元素療法に用いる場合、それは通常、個別容器で放射性標識のための試薬および付属物とともに非放射性複合体として提供され、一方、ＭＲＩ剤および治療薬／毒素複合体は通常、すでにＰＰＣとコンジュゲートされた常磁性種または抗生物質／細胞傷害薬とともに供給される。このキットは、第二の個別包装された、治療薬に特異的な非標識ＰＰＣ、その担体、または放射性核種または常磁性イオンのためのキレート剤をさらに含んでもよい。
【０２０７】
当技術分野では、放射性核種療法の種々の方法は、例えば、Harbert, “Nuclear Medicine Therapy”, New York, Thieme Medical Publishers, 1087, pp. 1-340に記載のように、癌およびその他の病態の治療に使用できることが周知である。これらの手法の経験のある臨床家ならば、本明細書に記載のサイトカインアジュバント療法を、その造血系副作用を緩和するために、このような手法に適合させることが容易にできる。同様に、より正確な標的療法（例えば、癌、感染症または自己免疫疾患のため）のため、および臓器移植療法のために、単独で、またはＰＰＣ複合体として投与される細胞傷害薬による治療は、同位元素または放射性標識抗体を用いる放射性同位元素療法と類似の原理により支配される。従って、当業者ならば、サイトカイン使用に関する記載を、薬物療法前、薬物療法中、または薬物療法後のサイトカインの投与による骨髄抑制およびその他このような造血系副作用を緩和するように適合させることができる。
【０２０８】
治療上有用な免疫複合体は、本発明のＰＰＣに光活性薬または色素をコンジュゲートすることにより得ることができる。病巣に適切な光を当てることで病巣を検出および治療するためには、蛍光およびその他の色素原、または色素（可視光感受性ポルフィリンなど）が用いられている。治療法では、これは光線照射、光線療法、または光線力学療法と呼ばれている(Jori et al., (eds.), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430(1986))。さらに、光線療法を達成するために、モノクローナル抗体が光活性化色素と結合されている。Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983);同書, Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986); 同書, Photochem. Photobiol. 46:83 (1987) ; Hasan et al, Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med. 9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991)。本発明は、光活性薬または色素を含んでなるＰＰＣの治療的使用を意図する。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体は当業者に公知である。例えば、Ghetie et al, Cancer Res. 48:2610 (1988); Hekman et al., Cancer Immunol. Immunother. 32:364 (1991); Kaminski et al., N. Engl. J. Med. 329:459 (1993); Press et al., N. Engl. J. Med. 329:1219 (1993); Maloney et al., Blood 84:2457 (1994); Press et al., Lancet 346:336 (1995); Longo, Curr. Opin. Oncol. 8:353 (1996)参照。  
【０２０９】
ターゲッティング可能な構築物は１０Ｂ原子を含み得る。この場合、この方法は、ターゲッティング可能な構築物が局在している罹患組織（新生物組織を含む）のＢＮＣＴを達成する付加工程を含み得る。ＢＮＣＴの考察については、米国特許第５，８４６，７４１号、同第６，２２８，３６２号を参照。
【０２１０】
本発明のもう１つの態様では、本方法のターゲッティング可能な構築物は酵素を含み得る。この酵素は薬物の細胞傷害性を増強することができるものであり得る。例えば、この酵素は薬剤を無毒型から有毒型へと変換することができる。あるいは、この酵素は有毒薬物をいっそう有毒な薬物へと変換することができる。このような酵素−プロドラッグ結合パートナーの例は、Ｉ−１３１−抗体−カルボキシペプチダーゼＧ２とトポイソメラーゼ阻害プロドラッグＣＰＴ−１１；β−ラクタマーゼとセファロスポリン−ドキソルビシン；アルカリ性ホスファターゼとリン酸エトポシド；カルボキシペプチダーゼＧ２と安息香酸マスタードのグルタミン酸誘導体；およびβ−グルクロニダーゼとｐ−ヒドロキシアニリンマスタードなど、グルクロニドを形成し得るいずれかの薬物のグルクロニドがある。標的酵素の活性かのための他の例は、Bioconjuate Chem. , Vol. 4, (1), 3-9 (1993)に述べられている。
【０２１１】
ＰＰＣが標識されているか、またはターゲッティング可能な構築物が標識されている方法では、その方法は、患者において標的細胞、標的組織、または病原体（すなわち、感染性病原体）を検出するために使用できる。
【０２１２】
ＰＰＣの生産方法
本発明はまた、本発明のＰＰＣを生産するための方法も提供する。一つの態様では、これらの方法は、ポリペプチド配列中に直線上に配置されている３つまたは４つのｖ領域（すなわち、ａ１、ａ２、ａ３など）を含んでなり、必要に応じてそれらのｖ領域の間に散在したアミノ酸結合配列を含むアミノ酸配列を有する第一のポリペプチドを提供すること；ポリペプチド配列中に直線上に配置された３つまたは４つのｖ領域（すなわち、ｂ１、ｂ２、ｂ３など）を含んでなり、必要に応じてそれらのｖ領域の間に散在したアミノ酸結合配列を含むアミノ酸配列を有する第二のポリペプチドを提供すること；および第一のポリペプチドと第二のポリペプチドを、その個々のポリペプチド鎖が、対応するｖ領域（すなわち、ａ１とｂ１、ａ２とｂ２、ａ３とｂ３など）の相補的結合により互いに横に配置され、かつ、互いに結合するような適当な条件下で接触させることを含む。
【０２１３】
これらのＰＰＣの生産方法は、例えば、ペプチド合成装置にてポリペプチドを作製し、個々のポリペプチド鎖の相補的結合を可能とするための適当な条件下、液相にてそれらを結合させることによって行うことができる。当業者ならば、個々のポリペプチド鎖を結合させるための、このような方法のいくつかに思い当たるであろう。例えば、ＰＰＣのポリペプチド１とポリペプチド２を、製造業者（例えば、Applied Biosystems）の説明書に従い、ペプチド合成装置にて合成することができる。あるいは、ペプチドは商業的研究機関(例えば、Sigma-Genosys, The Woodlands, TX)に郵送発注してもよい。これらの乾燥ペプチドを混合し、水または５％ＮＨ４ＯＨを含む水で可溶化し、ＰＰＣを作製すればよい。
【０２１４】
好ましい態様では、この２つのＰＰＣポリペプチドを、宿主細胞中で同時発現させることができる。例えば、２つの異なるクローニング部位に挿入された２つの異なる遺伝子を同時発現し得る発現プラスミド（本明細書では同時発現プラスミドと呼ばれる）を選択すればよい（例えば、ＢＳ１４ＨＰ−ＧＡＰ＋）。ＰＰＣのポリペプチド１およびポリペプチド２をコードするオープンリーディングフレームを有する核酸分子を、この２つのクローニング部位にクローニングすることができる。これらの核酸分子を従来の技術によってクローニングしてもよいし、または、それらはオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成してもよい。この同時発現プラスミドを、発現用酵母細胞などの真核生物宿主にトランスフェクトすればよい。ＰＰＣは、必要な量のＰＰＣが生産されるまで、その真核生物宿主を培養することにより製造できる。
【０２１５】
本発明のいずれの生産方法であっても、生産されたＰＰＣはタグ付きＰＰＣであり得る。タグ付きＰＰＣは、ＦＬＡＧ配列またはポリＨＩＳ配列など、付加的なペプチド配列を含んでなる。この配列により、発現したＰＰＣはいずれも、適切なアフィニティーカラムで精製可能となる。
【０２１６】
ダイアボディーおよびトリアボディー（本発明のＰＰＣを含む）のための好適な発現系のもう１つの例としてｐｄＨＬ２ベクターがあり、これは次にメトトレキサート治療により選択および増幅可能な、増幅可能なネズミｄｈｆｒ遺伝子を含む。Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191 (1989)。このｐｄＨＬ２ベクターは、２つのメタロチオネインプロモーターおよびＩｇＨエンハンサーにより独立に制御される２つの遺伝子の独立発現をもたらす。哺乳類組換え宿主細胞系統における発現を増強するために増幅可能な選択マーカーを用いる一例が実施例２に示されている。
【０２１７】
本発明のＰＰＣの発現のために好適な宿主細胞または細胞系統は当業者に公知であり、上記の「宿主細胞」の定義にも挙げられている。１つの宿主細胞は、いずれの発現分子もヒトグリコシル化パターンで修飾可能とするヒト細胞である。ヒト宿主細胞は本発明の方法に不可欠であるか、または好ましいことを示しているわけではないことに留意すべきである。
【０２１８】
例示として、ＳＰ２／０細胞は、２つの抗体成分のコード配列を含む線状化ｐｄＨＬ２ベクターでのエレクトロポレーションにより、トランスフェクトすることができる。トランスフェクション４８時間後に、０．０５〜０．１μＭメトトレキサートを含有する培地で細胞を培養することにより、選択を開始することができる。この２つの抗体配列の増幅は、メトトレキサート濃度を５μＭまで段階的に引き上げることによって達成される。
【０２１９】
ＰＰＣが適切に形成されたことを確認するため、または精製のために、ＰＰＣのＡＢＳによって認識される抗原を付加した抗原アフィニティーカラムによりＰＰＣを精製することができる。抗原アフィニティー精製カラムでは、適切なＡＢＳを持たないＰＰＣはこのアフィニティーカラム基質に結合できないので、適切に形成されたＡＢＳを有するＰＰＣだけを精製することができる。この抗原アフィニティー精製は何度でも行える。例えば、ＰＰＣのＡＢＳが抗原１、抗原２および抗原３を認識する場合、このＰＰＣはこれら３つの抗原をそれぞれ付加した３つの抗原アフィニティー精製カラムにより精製することができる。例えばタンパク質沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、共沈殿、および共復元などの他の精製方法も当業者に公知である。
【０２２０】
以下、実施例を示し、限定されるものではないが、本発明の請求内容を説明する。
【実施例】
【０２２１】
実施例１．二重特異性三価ヘテロ二量体ＢＳ１４ＨＰの設計
ＧＡＰプロモーター系を用いて、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)における外来遺伝子の構成的発現用にＢＳ１４ＨＰを設計した。Ｐ．パストリス細胞の線状化ＤＮＡプラスミド（ＢＳ１４ＨＰ−ＧＡＰ＋）でのトランスフェクションは、２つのＤＮＡセグメント（図１Ａ）の宿主染色体のＧＡＰ遺伝子座への安定した部位特異的組込みをもたらす。これらの２つのＤＮＡセグメントは、オープンリーディングフレーム、ポリペプチド１（配列番号９）およびポリペプチド２（配列番号１０）それぞれをコードする配列番号１および配列番号２を含有している。この２つのＤＮＡセグメントの各々はＧＡＰプロモーターのヌクレオチド配列も含んでいるので、ポリペプチド１およびポリペプチド２のアミノ酸配列をコードする２つのｍＲＮＡ種が同じ宿主細胞で合成される。
ポリペプチド１
【化１】
2006526408.tif 000005
（配列番号１）
ポリペプチド２
【化２】
2006526408.tif 000006
（配列番号２）
【０２２２】
上記のポリペプチド１および２の模式図で示される「α因子」は、シグナルペプチドを表し、このシグナルペプチドは合成およびタンパク質輸送中に除去され、その結果、タンパク質（シグナルペプチドを持たない）が培地へと分泌される。カルボキシル末端ヘキサヒスチジン（６Ｈｉｓ）配列により、市販の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）材料を用いた分泌されたタンパク質の迅速かつ効率的な精製が可能となる。ｈＭＮ−１４ＶＨは、癌胎児性抗原(CEA; Shevitz et al, J. Nucl. Med., suppl., 34, 217P, 1993)と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の重鎖可変領域（ＶＨ領域）のアミノ酸配列である。ｈ６７９ＶＫは、トリペプチド部分ヒスタミン−スクシニル−グリシル（本明細書では「ＨＳＧ」と呼ぶ； Morel et al, Molecular immunology, 27, 995-1000, 1990）を含有している分子と高親和性で結合する、６７９（ＩｇＧ１，κクラスの抗体）と呼ばれるヒト化ネズミモノクローナル抗体である。６７９の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＫ）に関するヌクレオチド配列は決定されている(Qu et al, 非公開の結果)。この構築物の設計にヒト化型６７９可変ドメイン(Rossi. et al, 非公開の結果)を使用した。
【０２２３】
ポリペプチド内ドメイン対合を阻止するように、構築物の可変ドメイン間の短ペプチドリンカー、ＧＧＧＧＳ、ＬＥＧＧＧＳ、ＧＧＧＱＦＭおよびＧＧＧＧＳを設計する。２つの異なるポリペプチド（図１Ｂ）は、同族のＶＨドメインとＶＫドメインが対合し、その結果として、図１Ｃにて示されるＣＥＡに対する２つの機能的結合部位とＨＳＧに対する１つの機能的結合部位を形成することにより、互いに非共有結合する。
【０２２４】
ｐＧＡＰＺα＋改変型ベクター
図２にて示される新規構築物ｐＧＡＰＺα＋を操作し、単一ピキア宿主細胞由来の２つの異種ポリペプチドの合成を通じて二重特異性構築物を作製した。ＳＳ１リンカーを構成する２つの重複オリゴヌクレオチドを合成し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、９５℃まで加熱した後、３０分かけて室温までゆっくりと冷却することによりアニーリングした。
ＳＳ１リンカー  トップ
【化３】
2006526408.tif 000007
（配列番号３）
ＳＳ１リンカー  ボトム
【化４】
2006526408.tif 000008
（配列番号４）
オリゴヌクレオチド二本鎖をｐＧＡＰＺαＡベクター(Invitrogen)のＢａｍＨＩ部位と連結し、形質転換体を適切な配向にあるリンカーの存在についてスクリーニングした。
【０２２５】
ピキア発現プラスミドＢＳ１４ＨＰ−ＧＡＰ＋の構築
ＢＳ１４−Ｏｒｆ−１−ｐＧＡＰｚα＋のクローニング
鋳型としてのプラスミド構築物ｈＭＮ−１４ＶＨ−Ｌ５−ｈ６７９ＶＫ−ＧＡＰ＋(Rossi et al, 非公開の結果)と、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
Ｌ６−ｈＭＮ１４ＶＨ  Ｘｈｏ  レフト
【化５】
2006526408.tif 000009
（配列番号５）
ｈＭＮ１４ＶＨ  ＳａｌＩ  ライト
【化６】
2006526408.tif 000010
（配列番号６）
を用いてＰＣＲ反応を行い、アンプライマーＸｈｏＩ−Ｌ６−ｈＭＮ−１４ＶＨ−ＳａｌＩを作製した。
【０２２６】
ＰＣＲアンプライマーをｐＧｅｍＴベクター(Promega)にクローニングし、５’−Ｔ７配向に挿入されたクローンについてスクリーニングした。この構築物、Ｌ６−ｈＭＮ−１４−ｐＧｅｍＴ（Ｔ７）をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、それを、構築物を作製するためにＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いてｈ６７９ＶＨ−Ｌ５−ｈＭＮ−１４ＶＫ−ＧＡＰ＋プラスミド構築物(Rossi et al, 非公開の結果)から切り出した、ｈ６７９ＶＨ−Ｌ５−ｈＭＮ１４ＶＫを含有しているＤＮＡ断片と連結して、中間プラスミド構築物ＢＳ１４ＨＰｏｒｆ１−ｐＧｅｍＴを作製した。この中間構築物をまず、ＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で埋めてその末端を平滑にした。クレノウ断片処理後、ＤＮＡ分子をＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、ＢＳ１４ＨＰ−ｏｒｆ１と呼ばれる断片を作製した。ｐＧＡＰｚα＋ベクター（図２）をまず、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、クレノウ酵素で埋めてその末端を平滑にし、次に、これをＳａｌＩで消化した。消化したベクターを挿入断片と連結して、ＢＳ１４ｏｒｆ１−ｐＧＡＰＺα＋を作製した。
【０２２７】
ＢＳ１４−ｏｒｆ２−ＰＧＡＰＺα＋ＡＶＲＸのクローニング
鋳型としてのプラスミド構築物ｈ６７９ＶＨ−Ｌ５−ｈＭＮ−１４ＶＫ−ＧＡＰ＋(Rossi et al, 非公開の結果)と、以下のプライマー：
ＨＭＮ−１４ＶＫ  ＥｃｏＲＩ  レフト
【化７】
2006526408.tif 000011
（配列番号７）
ｈＭＮ１４ＶＫ−Ｌ５  ＭｆｅＩ  ライト
【化８】
2006526408.tif 000012
（配列番号８）
を用いてＰＣＲ反応を行い、アンプライマーＥｃｏＲＩ−Ｌ５−ｈＭＮ−１４ＶＫ−Ｌ５−ＭｆｅＩを作製した。
【０２２８】
アンプライマーをＥｃｏＲＩおよびＭｆｅＩ制限酵素で消化し、それをＥｃｏＲＩで消化したプラスミド構築物ｈＭＮ−１４ＶＨ−Ｌ５−ｈ６７９ＶＫ−ＡｖｒＸ(Rossi et al, 非公開の結果)と連結して、構築物ＢＳ１４ＨＰ−ｏｒｆ２−ｐＧＡＰＺα＋ＡＶＲＸを作製した。
【０２２９】
ＢＳ１４ＨＰ−ＧＡＰ＋の最終構成
構築物ＢＳ１４ＨＰ−ｏｒｆ２−ｐＧＡＰＺα＋ＡＶＲＸをＮｓｉＩおよびＳｐｅＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により分離した。ＢＳ１４−ｏｒｆ２コード配列を含有している２２６０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離した。この単離核酸分子をＳｂｆＩおよびＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、それをＮｓｉＩ／ＳｐｅＩ  ＢＳ１４−ｏｒｆ２断片（上記）と連結して、最終構築物ＢＳ１４ＨＰ−ＧＡＰ＋を作製した。
【０２３０】
ピキア・パストリスにおけるＢＳ１４ＨＰの構成的発現
トランスフェクション用にＡｖｒII制限エンドヌクレアーゼでの消化によりＢＳ１４ＨＰ−ＧＡＰ＋構築物を調製した。この線状化構築物を使用し、標準的な方法を用いて、ピキア・パストリスのＸ−３３株をエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。安定した形質転換体を１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤ−寒天平板で単離した。９個のゼオシン耐性コロニーをＹＰＤ−ゼオシン平板に再度線条接種し、単離クローンを用いて、改変ＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％トリプトン、２％デキストロース、０．４μｇ／ｍｌビオチン、１．３４％酵母窒素塩基、１００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ６．０）の入ったバッフル付振盪フラスコに接種した。フラスコ培養物を２５０ＲＰＭ、３０℃にて４８〜７２時間、６００ｎｍにおける光学密度が１８〜２５の間となる静止期まで振盪した。分泌された組換えタンパク質を含むであろう培地を遠心分離により清澄化し、ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップを用いて活性タンパク質についてアッセイした。
【０２３１】
分析ステップは以下の通りである。培養培地のサンプルをＥＢバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５０μＭ  ＥＤＴＡ；０．００５％界面活性剤Ｐ２０；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で１：５希釈し、それをＢＩＡｃｏｒｅＸシステムにより高密度にＨＳＧを結合させたセンサーチップに注入した（５０μｌ）。希釈培地を注入した後、２０μｇ／ｍｌのＷＩ２  ＩｇＧ、ｈＭＮ−１４に対する抗イディオタイプ抗体を含有するＥＢをセンサーチップに注入して（１００μｌ）、二重特異性結合を確認した。初期結合の傾きを用いて収量を測定した。試験した９個のゼオシン耐性クローンのうちの７個のクローンが二重特異性タンパク質を産生し、収量は培養培地１リットル当たり最大３ｍｇであった。
【０２３２】
多量の組換えタンパク質を精製するために、最も高い発現をしているクローンの培養培地をダイアフィルトレーションによりＮｉ結合バッファー（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭイミダゾール；５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．０）へとバッファー交換した。バッファー交換後、培地のタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ  ＩＭＡＣアフィニティーカラムに流した。そのカラムを２０ｍＭイミダゾール含有バッファーで十分に洗浄し、２５０ｍＭイミダゾール含有バッファー（２５０ｍＭイミダゾール；５０ｍＭ  ＮａＣｌ；２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）で溶出した。溶出液を上記のようにＢＩＡｃｏｒｅにより分析し、結合活性総てを保持した（図３）。
【０２３３】
ＢＳ１４ＨＰの生化学分析
発現した、精製済みＢＳ１４ＨＰをアッセイするために、タンパク質サンプルを還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより可視化した。図４で示されるように、これらの結果から、サンプルが高度に精製されており、重大なタンパク質汚染がないことが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより、精製したタンパク質複合体が、推定分子量４０，６１４ダルトンと４０，０６１ダルトンに近い速度でゲル中を移動する、同じくらいのサイズを有する２つのｃ（すなわち、狭い間隔で並んだバンド）ポリペプチド鎖を含んでなることが解明された。
【０２３４】
発現した産物をさらに分析するために、発現タンパク質をＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析およびサイズ排除ＨＰＬＣ分析により分析した。発現ＢＳ１４ＨＰについての両分析により、８１ｋＤａの二量体タンパク質構造と一致する単一ピークが得られた（図５）。
【０２３５】
結合化学量論は、図３で示したもののようなＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムから推定することができる。ＷＩ２：ＢＳ１４ＨＰモル結合比は、各分子量を正規化し、ＢＳ１４ＨＰのＨＳＧセンサーチップとの結合から得られた応答単位（ＲＵ）とＷＩ２のＢＳ１４ＨＰとの結合によるＲＵのさらなる増大との比較によって得られる。いくつかのＢＳ１４ＨＰ調製物を分析すると、その測定比は０．８〜０．９の間であった。１分子当たり２つの機能的ＣＥＡ結合部位が存在しているタンパク質の理論上の最大比が１．０であるため、この比から、１分子当たり２つの機能的ＣＥＡ結合部位が存在していることが分かる。対照として、種々の一価ＣＥＡ結合二重特異性（ｈＭＮ−１４×６７９）構築物は総て０．４〜０．４５間のモル比を示した。
【０２３６】
ＢＳ１４ＨＰのＣＥＡ結合を競合的ＥＬＩＳＡ法により分析し、１つのＣＥＡ結合基を有するＢＳ１．５Ｈおよび２つのＣＥＡ結合基を有するｈＭＮ−１４  Ｆ（ａｂ’）２と比較した（図６）。ＨＲＰコンジュゲートｈＭＮ−１４  ＩｇＧ（１ｎＭ）を、ＣＥＡコーティングウェル（０．５μｇ／ウェル）内でインキュベートする前に、ＢＳ１４ＨＰ、ＢＳ１．５ＨまたはｈＭＮ１４  Ｆ（ａｂ’）２のいずれかと、１〜２５０ｎＭの範囲の濃度で混合した。ＢＳ１４ＨＰのＩＣ５０は２．７ｎＭであり、この値はｈＭＮ１４  Ｆ（ａｂ’）２の２．０ｎＭに近い。一価ＣＥＡ結合剤、ＢＳ１．５ＨのＩＣ５０は１０ｎＭであった。これらの結果は、ＢＳ１４ＨＰがＣＥＡと二価で結合することを示すという点でＢＩＡｃｏｒｅ分析と一致している。さらに、結合力は、天然ｈＭＮ１４  Ｆ（ａｂ’）２のものと同等である。
【０２３７】
in vitroでの免疫反応性のＳＥ−ＨＰＬＣ分析により、ＢＳ１４ＨＰがＣＥＡと二価で結合する能力を有することが確認された。漸増量のＣＥＡを１２５Ｉ−ｈＢＳｌ４と混合すると、ＨＰＬＣにより、１つのＣＥＡまたは２つのＣＥＡのいずれかと結合した１２５Ｉ−ｈＢＳ１４複合体に相当する２つの異なるピークシフトが明らかであった（図６Ｂ）。
【０２３８】
ＢＳ１４ＨＰのin vivo分析
ＧＷ−３９担癌マウスにおいてＢＳ１４ＨＰの腫瘍プレターゲッティングへの有用性を１１１Ｉｎで標識した二価ＨＳＧペプチド（ＩＭＰ−２４１）を使用して評価した。ＩＭＰ−２４１は、ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ここで、ＰｈｅのＮ末端アミノ基はＤＯＴＡと連結しており、各リシンのイプシロンアミノ基はＨＳＧ基を含有する誘導体である）の構造を有している。テトラペプチド主鎖（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−（Ｄ−Ｔｙｒ）−Ｌｙｓ）は、ｄ−アミノ酸（Ｄ−Ｔｙｒ）を含有しており、Ｃ末端ｌｙｓのカルボキシル基はアミド化されている。
【０２３９】
この分析による結果を、化学的に連結したｈＭＮ−１４×６７９（Ｆａｂ’×Ｆａｂ’）とＢＳ１．５Ｈ（二重特異性ダイアボディー）の結果と比較した。ＧＷ−３９担癌ヌードマウス（ＣＥＡ陽性）をＢＳ１４ＨＰ、ＢＳ１．５ＨまたはｈＭＮ−１４×６７９でプレターゲッティングした。最初に、１３１Ｉ標識二重特異性薬剤を使用して生体分布を観察した。図７に１３１Ｉ−ＢＳ１４ＨＰの腫瘍滞留および血液クリアランスを示している。予備試験で決定したように、二重特異性標的化薬剤の投与から１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２４１ペプチドの投与までの時間は、先に投与したものを１％ＩＤ／ｇ以下の濃度まで血液からクリアリングさせるのに必要な時間量である。ＢＳ１４ＨＰとｈＭＮ−１４×６７９の場合には、ターゲッティングする前のクリアランス時間として２４時間を用いた。より迅速に血液からクリアリングするより小さなＢＳ１．５Ｈの場合には、クリアランス時間として１５時間を用いた。ＩＭＰ−２４１(Immunomedics, Inc)、２つのＨＳＧ基とＤＯＴＡ部分を含有するペプチドに１１１インジウムを添加し、プレターゲッティングしたマウスに注射した。注射の３時間後に１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１の生体分布を調べ（図８Ａ）、図８Ｂに腫瘍／非腫瘍比を示している。
【０２４０】
これらの結果は、ＢＳ１．５ＨまたはｈＭＮ１４×６７９のいずれかでプレターゲッティングしたマウスの場合と比べて、ＢＳ１４ＨＰでプレターゲッティングしたマウスにおいて、約３倍多い１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２４１ペプチドが腫瘍と特異的に結合したことを示している。総ての非腫瘍器官における放射能は低く、３つのプレターゲッティング薬剤間では同等であった。
ポリペプチドＩＭＰ２８１（図９Ａ）、ＩＭＰ２８４（図９Ｂ）およびＩＭＰ２８８（図９Ｃ）を使用してこれらの試験を再度行ったところ、同じ結果が得られた。
【０２４１】
実施例２  骨髄腫細胞で発現された二重特異性三価ヘテロ二量体ｈＢＳ１４
本発明者らは、他の種類の宿主細胞系から類似のＰＰＣが作製されるかどうかを調べるために、哺乳類細胞培養においてｈＢＳ１４と呼ばれる融合タンパク質の製造スキームを開発した。哺乳類細胞培養で産生されるｈＢＳ１４  ＰＰＣが、酵母Ｐ．パストリスで産生された（実施例１）ＢＳ１４ＨＰと構造的にも機能的にも類似するように設計した。ＤＮＡプラスミドベクターをｈＢＳ１４発現用に操作し、それを用いてＳＰ２／０−Ａｇｌ４マウス骨髄腫細胞、ＮＳＯマウス骨髄腫およびＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞においてトランスジェニック細胞系統を作製した。ここでは特定細胞系統を使用したが、当然のことながら、本発明のベクターは、例えば、ヒト細胞系統のようないかなる哺乳類細胞系統においても使用し得る。
【０２４２】
ｈＢＳ１４  ＤＮＡ発現ベクターの作製
ｈＢＳ１４ポリペプチドをコードする核酸を哺乳類発現ベクターｐｄＨＬ２に組換え挿入することにより、抗体産生の増幅を可能にした。ｐｄＨＬ２ベクターは、ＩｇＧ定常領域（ＣＨおよびＣＫ）の遺伝子を含有しているが、これは、もともと、可変ドメインカセットを受け取り、完全なＩｇＧの合成を指示するように設計されたものである。本発明者らは定常領域配列を有していない新規単鎖系構築物の発現に関心を抱いたため、ｈＢＳ１４遺伝子を構成し、ｐｄＨＬ２ベクターへと導入することが容易な新たなシャトルベクターを作出する必要があった。図１０Ａを参照。
【０２４３】
オーバーラッピング合成オリゴヌクレオチド（８５量体）をアニーリングして、図１０Ａに示した特徴を有する二本鎖ＤＮＡを形成した。この二本鎖をｐＧＥＭ３ｚクローニングベクター(Promega)のＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位と連結して、ＳＶ３シャトルベクターを作製した。ＢＳ１４ＨＰ−ＧＡＰ＋（実施例１）から可変ドメイン遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を介してＳＶ３シャトルベクターでオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に構成した。ポリペプチド１および２をコードするＯＲＦ１およびＯＲＦ２の両方についてＳＶ３構築物を作製した。（図１０Ｂを参照）。
【０２４４】
各ＯＲＦは、未完成ポリペプチドの分泌を指示するＩｇＧ軽鎖リーダーペプチド、続いて、可変ドメイン遺伝子、次には６つのヒスチジンのコドン、そして２つの停止コドンを含む。可変ドメインは、５または６個のアミノ酸残基からなるリンカーペプチドにより分離されている。ＯＲＦ１およびＯＲＦ２を単一ｐｄＨＬ２発現ベクターにサブクローニングした。ＯＲＦ１をＸｂａＩおよびＢｇｌII制限エンドヌクレアーゼを用いてそのシャトルベクターから切り出し、ｐｄＨＬ２のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、中間構築物ｈＢＳ１４０ＲＦ１−ｐｄＨＬ２を作製した。次いで、ＯＲＦ２をＸｈｏＩおよびＥａｇＩ制限酵素を用いてそのシャトルベクターから切り出し、中間体ｈＢＳ１４０ＲＦ１−ｐｄＨＬ２構築物のそれらの同じ部位にクローニングして、最終的な２シストロン性発現ベクターｈＢＳ１４−ｐｄＨＬ２（図１１）を作製した。
【０２４５】
ＳＰ２／０骨髄腫細におけるｈＢＳ１４遺伝子の安定トランスフェクションおよび増幅
ＳＰ２／０−Ａｇｌ４マウス骨髄腫細胞は、ｐｄＨＬ２発現ベクターを用いる組換えＩｇＧの多量発現にこれまで使用されてきた。他の発現ベクターを用いる組換えＩｇＧの多量発現には、ＮＳ０マウス骨髄腫およびＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞が使用されている。ｈＢＳ１４−ｐｄＨＬ２  ＤＮＡベクターをＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼでの消化により線状化し、それをエレクトロポレーション（４５０ボルト、２５μＦ）により３つの細胞系統（４×１０６細胞）の各々にトランスフェクトすることに成功した。ｐｄＨＬ２ベクターは、クローン選択の他にメトトレキサート（ＭＴＸ）による遺伝子増幅も可能にするジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＨＥＲ）遺伝子を含んでいる。
【０２４６】
形質転換体を０．５μＭ  ＭＴＸの存在下で、９６穴プレートで培養することによりクローニングし、ＥＬＩＳＡによりｈＢＳ１４発現クローンについての一次スクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡスクリーニング形式は以下の通りとした：ＨＳＧ含有ペプチド（ＩＭＰ２３９）とウシ血清アルブミンからなる複合体をまず、マイクロプレートウェルに吸着させた後、推定クローンのコンディショニング培地をマイクロプレートウェルに移して、ｈＢＳ１４を複合体のＨＳＧ基と結合させた。結合したｈＢＳ１４をＷＩ２、ｈＭＮ−１４に対するラット抗イディオタイプＩｇＧおよびＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧで検出した。いくつかの陽性クローンを同定し、それらを拡大した。ＢＩＡｃｏｒｅによりＨＳＧ（ＩＭＰ２３９）センサーチップを用いてｈＢＳ１４の発現を確認した。培養培地の注入後の応答単位（ＲＵ）の増大により、ｈＢＳ１４の発現が示された。ＷＩ２のその後の注入によるＲＵのさらなる増大により、ｈＢＳ１４が二重特異性を有しており、かつ、十分に機能するものであることが立証された。この方法では、正確なリアルタイム生産性測定が可能な精製６７９−タンパク質を用いて標準濃度曲線を作成した。ＳＰ２／０、ＹＢ２／０およびＮＳＯにおける最高の最終培養ｈＢＳ１４生産者の初期生産性は、それぞれ、０．８ｍｇ／Ｌ、３．７ｍｇ／Ｌおよび４．４ｍｇ／Ｌであった。
【０２４７】
遺伝子増幅とその結果として得られる生産性の増大は、培養培地中のＭＴＸ濃度を数ヶ月かけて段階的に上昇させることにより実現した。生産性の増大の一例を、図１２にてＳＰ２／０クローン１Ｈ６で示している。ＭＴＸ濃度は、０．０５μＭから１μＭへと上昇させ、生産性は、負の影響なく、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０およびＮＳ０の各クローンでは、それぞれ、８ｍｇ／Ｌ、１６ｍｇ／Ｌおよび９．３ｍｇ／Ｌまで増大した。さらなるＭＴＸ処理と選択によってこれらの収量をさらに高めることができると思われる。一般に、ＭＴＸ濃度は最大５μＭまで上昇させることが可能であり、生産性のかなりの増大が追加される。
【０２４８】
ｈＢＳ１４の製造および精製
ｈＢＳ１４のおよそ１００ｍｇをほぼ均質に精製した。１μＭ  ＭＴＸで増殖させた各典型的細胞系統のターミナルローラーボトル培養で出発材料を作製した。ＨＳＧに基づくアフィニティー精製樹脂を作製したことにより精製工程が一段と容易になった。ａｆｆｉｇｅｌ−ＩＭＰ２３９、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅ試験の両方で使用した同じペプチド、を用いた最初の試みは、強力な結合親和性によってタンパク質を変性させることなく溶出させることとなったため、あまりうまくいかなかった。試験した無数の溶出バッファーはいずれもｈＢＳ１４を効率的に溶出しなかった。６７９に対する親和性が１／１０〜１／１００低いように設計した新規ペプチド（ＩＭＰ２９１）を合成し、標準的な方法によりａｆｆｉｇｅｌ(BIO-RAD)とコンジュゲートさせた。高結合力（＞２０ｍｇ／ｍｌ）ａｆｆｉｇｅｌ−ＩＭＰ２９１は、高収量、高精製および活性の高保持を提供することから、ｈＢＳ１４のアフィニティー精製に理想的であることが分かる。
【０２４９】
要するに、ローラーボトルの培養培地をクロスフロー精密濾過（０．２μＭ）により清澄化した後、クエン酸でｐＨを４．５に調整した。清澄化し、ｐＨ調整した培地のｈＢＳ１４をＳ−セファロース陽イオン交換カラムに流し、その培地を部分的に約２５倍精製した。Ｓ−セファロースカラムを２×ＰＢＳ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ；８０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で溶出し、その溶出液をａｆｆｉｇｅｌ−ＩＭＰ２９１カラムに流した。そのカラムを１Ｍイミダゾール；１５０ｍＭスクロース；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０；５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４．５、５０ｍｌで溶出した。溶出した産物を調製バッファー（１５０ｍＭスクロース；０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０；１０ｍＭ  ＮａＡｃ、ｐＨ４．５）で透析した。この手順により、アフィニティーカラムと結合したｈＢＳ１４のほぼ１００％の溶出が可能である。
【０２５０】
ｈＢＳ１４の生化学分析
基本的な生化学分析では、この精製プロセスにより高度に精製されたｈＢＳ１４が得られることが実証された。ｈＢＳ１４の天然四次元構造は、ポリペプチド１（３９．９４ｋＤａ）とポリペプチド２（３９．５ｋＤａ）の７９．４ｋＤａヘテロ二量体となるように設計された。精製ｈＢＳ１４のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィール（図Ｃ）は、保持時間９．２３分に、８０ｋＤａタンパク質のプロフィールと一致する鋭い主要ピークを示す。ＢＳ１．５Ｈダイアボディー（５４ｋＤａ）、ｈＭＮ−１４トリアボディー（７８ｋＤａ）、およびｈＭＮ−１４Ｆ（ａｂ’）２（１００ｋＤａ）を、分子量およびサイズ標準と同じカラムに流した。これらのタンパク質の保持時間はそれぞれ９．６０分、９．３５分、および８．７７分であった。これらのＨＰＬＣプロフィールは、各細胞系統から精製したバッチ間で非常によく似ていた（図Ｃ）。約１１．４分のピークは非タンパク質性のバッファーのピークである。８．３０分の小さなピークは全タンパク質の３％を占め、おそらくは二量体化した／凝集したｈＢＳ１４である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用い、ｈＢＳ１４のポリペプチド成分の純度および品質を評価した。図１４に示されているクーマシーブルーで染色した還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、この二工程精製法により高純度が達成されることを示している。レーンに４μgタンパク質の過剰添加を行った場合でも、汚染タンパク質は微量しか検出されなかった。このＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、この小さなＨＰＬＣピーク（８．３０分）が実際にはｈＢＳ１４凝集物であり、汚染タンパク質ではないことを示す。ポリペプチド１および２に関する分子量（ＭＷ）はそれらのポリペプチドの推定アミノ酸配列から算出した。この２つのバンドのＭｒはｈＢＳ１４ポリペプチドの算出ＭＷと一致している。推定されたように、この２つのバンドは、分子デザインに基づくと当モル濃度であるはずなので、同じ強度のものであると思われる。認められるほどのタンパク質分解の痕跡はなかった。精製ｈＢＳ１４の等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、推定アミノ酸配列から算出した場合、ｈＢＳ１４の等電点（ｐＩ）（ｐＩ＝７．７３）付近の主要なバンドを示す（図１５）。より低いｐＩにおそらく関連生成物と思われるバンドの痕跡があり、いくつかの基本的アミノ酸残基の無視できるほどの脱アミド化の結果である可能性がある。これらを考え合わせると、この標準的な生化学分析の組合せは、トランスジェニック骨髄腫細胞がｈＢＳ１４をデザイン通りに正確に合成および分泌すること、および本発明者らが高度に精製された材料を生じ得る確かな精製方法を開発したことを示唆する。ｈＢＳ１４の生化学的特性は種々の細胞系統から調製されたバッチ間では区別が付かなかった。
【０２５１】
機能的同定は二重特異性結合特性を証明するｃＢＩＡｃｏｒｅ試験により得た（図１６）。ｈＢＳ１４は、センサーチップ上に固定化されたＨＳＧと強固に結合した。このＨＳＧと結合したタンパク質は、次に加えられるＣＥＡまたはＷＩ２を捕捉することができるが、このことはそれらが両抗原と同時に結合することを示す。ＷＩ２の結合がアプローチを飽和させる場合には、結合の理論量を求めることができる。ＷＩ２の結合によって起こるＲＵのさらなる増加を、ＨＳＧセンサーチップとの結合時におけるｈＢＳ１４の最初のＲＵ増加と比較した。ＲＵレベルにおける各増加は結合した質量に直接比例することから、ＷＩ２：ｂｓＡｂモル結合比は、式（ＲＵｈＢＳ１４）×（ＭＷｈＢＳ１４／ＭＷＭＩ２）を用いて算出することができる。ｈＢＳ１４はＣＥＡに関して二価（ＨＳＧに関しては一価）となるように設計され、従って、ＷＩ２（これもまた二価）を１：１モル比で結合しなければならない。実際、ＷＩ２とｈＢＳ１４との実験的に決定されたモル結合比は０．７〜０．８の間であり、理論的最大値の１．０に近いことが分かった。等濃度のｈＢＳ１４がＨＳＧセンサーチップと結合した場合、ＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムがＳＰ２／０またはＹＢ２／０細胞のいずれに由来するロット間でも区別が付かなかった（図１７）。  
【０２５２】
これらのデータは、一次アミノ酸配列が、それから作り出される宿主細胞とは無関係に、単独でＰＰＣの構造および機能を担うことを示している。ＰＰＣ  ｈＢＳ１４は３つの異なる哺乳類細胞系統で産生されたバッチ間で同等であるだけでなく、類似の一次アミノ酸配列を有するが、酵母で産生されたＢＳ１４ＨＰとも構造および機能に関しても極めて類似していた。
【０２５３】
生体高分子配列：
実施例２で用いた生体高分子の核酸およびアミノ酸配列は以下の通りである。
ｈＢＳ１４ポリペプチド１の推定アミノ酸配列：
【化９】
2006526408.tif 000013
（配列番号１１）
または
【化１０】
2006526408.tif 000014
（配列番号１１）
ｈＢＳ１４ポリペプチド２の推定アミノ酸配列：  
【化１１】
2006526408.tif 000015
（配列番号１２）
または
【化１２】
2006526408.tif 000016
（配列番号１２）
ｈＢＳ１４オープンリーディングフレーム１（リーダーペプチドのコード配列を含む）の核酸配列：
【化１３】
2006526408.tif 000017
（配列番号１３）
ＨＢＳ１４オープンリーディングフレーム２（リーダーペプチドのコード配列を含む）の核酸配列：
【化１４】
2006526408.tif 000018
（配列番号１４）
ｈＢＳ１４−ｐＤＨＬ２プラスミド構築物の核酸配列：
【化１５】
2006526408.tif 000019
2006526408.tif 000020
2006526408.tif 000021
（配列番号１５）
実施例３：ｈＢＳ１４のアフィニティー精製
ｈＢＳ１４を、下記のように調製および使用された新規なアフィニティー樹脂を用いて均質になるまで精製した。
【０２５４】
ＩＭＰ２９１−ａｆｆｉｇｅｌの活性化および結合
ＩＭＰ２９１ペプチド（図１８の構造参照）を、無水クロロ酢酸（ＣＡＡ）を用い、Ａｆｆｉｇｅｌ  １０２(BIO- RAD Laboratories, Hercules CA)に結合させた。ＣＣＡ（１．５ｇ，８．８ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解し、３０ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌ  １０２スラリーに加えた。そのｐＨをトリエチルアミンで９．０に調整し、室温で１時間反応させ、Ａｆｆｉｇｅｌのアミン基にＣＡＡを結合させた。このＣＡＡ−Ａｆｆｉｇｅｌを洗浄し、０．２Ｍホウ酸ナトリウム，ｐＨ８．０に交換した。全部で１６６ｍｇのＩＭＰ２９１を１０ｍｌの０．２Ｍホウ酸ナトリウム，ｐＨ８．０に溶解した後にスラリーに加え、次に、これを室温で一晩揺動し、このペプチドを、チオエーテル結合の形成を介してＣＡＡ−Ａｆｆｉｇｅｌに結合させた。この樹脂を、０．２Ｍホウ酸ナトリウム，ｐＨ８．０中のシステインを終濃度２０ｍＭまで加えることでクエンチし、室温で１時間インキュベートした。
【０２５５】
アフィニティー樹脂の定性
ＩＭＰ２９１−Ａｆｆｉｇｅｌ樹脂を以下のように定性した。カラムに０．５ｍｌの樹脂を充填し、ＰＢＳで平衡化した。１０ｍｌのＰＢＳ中、全部で２３．５ｍｇのＢＳ１．５ＨＰをカラムに通した。非結合画分において全部で１４ｍｇのＢＳ１．５ＨＰが検出されたことから、９．５ｍｇが結合したことになる。１Ｍイミダゾール、１５０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  ＮａＡｃ，ｐＨ４．５を含む溶出液７ｍｌ中に、全部で９．２ｍｇが回収された。この樹脂の結合力は３３０ｐｍｏｌ／ｍｌであると判定された。ｈＢＳ１４に関しては、これは２６．７ｍｇ／ｍｌの能力に相当する。
【０２５６】
ＩＭＰ２９１−ａｆｆｉｇｅｌによるｈＢＳ１４の一工程精製
１４４ｍｇのｈＢＳ１４を含有する（ＢＩＡｃｏｒｅにより評価）、全部で２２リットルのｈＢＳ１４  ＹＢ２／０クローン＃８回転瓶培養物を遠心分離し、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００；および１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を得た。上清液を０．２μＭ  Ｍｉｌｌｉｐａｋ−２００フィルターを通してオートクレーブにかけた１０Ｌボトル閉鎖系に濾過除菌した。濾過した媒体を２〜４ｍｌ／分の範囲の流速で、１０ｍｌ  ＩＭＰ２９１−Ａｆｆｉｇｅｌカラム（直径２．５ｃｍ）に流した。このＰＢＳでベースラインまで洗浄した後、１０７ｍｌの溶出バッファー（１Ｍイミダゾール、１５０ｍＭスクロース、５０ｍＭクエン酸，ｐＨ４．５）で溶出した。全部で９３ｍｇのｈＢＳ１４を溶出した。サイズ排除ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は総て、一工程ｐＩＭＰ２９１−Ａｆｆｉｇｅｌアフィニティークロマトグラフィーから高純度の均質な生成物が得られたことを示した。ＢＩＡｃｏｒｅおよびin vivo分析は、この生成物に十分な活性があったことを示した。  
【０２５７】
実施例４：ヌードマウスにおけるヒト結腸直腸腫瘍異種移殖片のプレターゲッティングのためのｈＢＳ１４の使用
この実施例は、三価二重特異性ｈＢＳ１４分子（ｈＭＮ−１４×ｈＭＮ−１４×６７９）の、ＩＭＰ−２４５、９９ｍＴｃ標識ペプチドをヒト結腸腫瘍（ＧＷ−３９）異種移殖片にプレターゲッティングする能力を実証するものである。ＩＭＰ２４５の構造は図１９に示されている。ＩＭＰ−２４５は当技術分野で公知の標準的な技術を用いて作製および標識した。例えば、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる公開出願ＵＳ２００３０１９８５９５を参照。
【０２５８】
実験ではマウス３群１５個体を用い、各々を剖検し、１群５個体を画像化した。３群のマウスに６μＣｉ１２５Ｉ−ｈＢＳ１４（４０μｇ，５．０×１０−１０モル）を投与した。最後の群（画像化群）では、３個体に非標識ｈＢＳ１４を与えた。総てのマウスに対する９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５投与量は、二重特異性：ペプチド比１０：１で、〜４０μＣｉ（９２ｎｇ，５．０×１０−１１モル）であった。ペプチド投与から１、４および２４時間後にマウスを剖検し、以下の群に分けた。
【０２５９】
第Ｉ群：１２５Ｉ−ｈＢＳ１４（４時間でクリアランス）、その後、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５［マウス１５個体；ｓａｃ５／ＤＣＳ注射後１時間、４時間、および２４時間の時点］
第II群：１２５Ｉ−ｈＢＳ１４（２４時間でクリアランス）、その後、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５［マウス１５個体；ｓａｃ５／ＤＣＳ注射後１時間、４時間、および２４時間の時点］
第III群：１２５Ｉ−ｈＢＳ１４（４８時間でクリアランス）、その後、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５［マウス１５個体；ｓａｃ５／ＤＣＳ注射後１時間、４時間、および２４時間の時点］
第IV群：ｈＢＳ１４（４８時間でクリアランス（３個体））、その後、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５（５個体総て）［マウス５個体；ＤＣＳ注射後１時間、３時間、６時間、および２４時間の時点でマウスを画像化］
【０２６０】
腫瘍の増殖速度の違いにより、最初にｈＢＳ１４の投与に利用できたマウスは２０個体だけであった。１５個体を第III群に当て、５個体を第Ｉ群に用いた。残りのマウス（画像化マウスを含む）に１週間後に注射を行った。ＧＷ−３９腫瘍を移植したマウスの総てが使用可能な腫瘍を発達させたわけではなかったので、第Ｉ群だけを１０個体とし、ペプチド注射後１時間と注射後２４時間で犠牲にした。
【０２６１】
図２０（上のパネル）のグラフは、クリアリングのためペプチドの投与４時間前にｈＢＳ１４を与えた場合のマウスにおける１２５Ｉ−ｈＢＳ１４と９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５の腫瘍の取り込みを示している（第Ｉ群）。ペプチド投与後１時間では、腫瘍において１３．５±５．９４％ＩＤ／ｇ  ｈＢＳ１４であったのに対し、２．９±０．４６％ＩＤ／ｇのＩＭＰ−２４５（ペプチドはｈＢＳ１４の４．７分の１）であった。２４時間では、この比は、腫瘍におけるＩＭＰ−２４５（９．０８±４．９４％ＩＤ／ｇ）はｈＢＳ１４（３．７９±４．１５％ＩＤ／ｇ）の２．４倍と逆転した。ｈＢＳ１４およびペプチドペプチドの血中レベルは注射後１時間で高かった（ｈＢＳ１４およびＩＭＰ−２４５に関して、それぞれ、１６．８５±２．９５％ＩＤ／ｇおよび３６．８７±６．４２％ＩＤ／ｇ）。
【０２６２】
第II群のマウスに関するデータは図２０（下のパネル）に示されている。腫瘍においてｈＢＳ１４よりも約２倍高いＩＭＰ−２４５が見られた。最大変動量は、ＩＭＰ２４５投与後４時間の群で生じた（腫瘍におけるＩＭＰ−２４５が１５．９±１６．３％ＩＤ／ｇ）。１個体のマウスが腫瘍において４．６％ＩＤ／ｇのｈＢＳ１４とわずか３．６％ＩＤ／ｇのＩＭＰ−２４５を示し、他方、この群の別のマウスも、４．４％ＩＤ／ｇのｈＢＳ１４と１８．１％ＩＤ／ｇのＩＭＰ−２４５を示したことから、これらの変動はｈＢＳ１４の取り込みによるものではないと考えられる。しかしながら、腫瘍サイズ間の相関があるものと思われる。これらのデータは、マウスでは腫瘍が大きいほどよりよいターゲッティングが得られることを示唆している。
【０２６３】
図２１（上のパネル）のグラフは、クリアリングのためペプチドの投与４８時間前にｈＢＳ１４を与えたマウスにおける１２５Ｉ−ｈＢＳ１４と９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５の腫瘍の取り込みを示している（第III群）。第II群のマウス（２４時間でクリアランス）同様、３つの時点総てで腫瘍に対するｈＢＳ１４の一貫したターゲッティングが見られた。ペプチド注射後１時間（ｈＢＳ１４投与後４９時間）では、腫瘍において３．５±０．８６％ＩＤ／ｇのｈＢＳ１４であった。このレベルはその後の２時点（ｈＢＳ１４投与後、５２時間と７２時間）でも維持されており、それぞれ３．６２±１．５９％ＩＤ／ｇと６．９７±３．１０％ＩＤ／ｇであった。これらのデータは、ｈＢＳ１４分子の二価ｈＭＮ−１４部分が、流出、またはそうでなければ消失なく腫瘍に留まるその能力を高めたことを示唆するものである。このｈＢＳ１４と腫瘍との安定した結合はまた、腫瘍において比較的一定の９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５シグナルを生じる。ペプチド注射後１時間では、腫瘍において２１．０３±２．４７％ＩＤ／ｇであった。４時間後では、１４．５３±４．９０％ＩＤ／ｇであり、２４時間後では１５．４７±９．３１％ＩＤ／ｇであった。これら３つの時点の間の差はいずれにも有意性はないが、９９ｍＴｃはこのような短い半減期（６．０２時間）を持つことから、２４時間における実際のシグナルの相対量は１３分の１である。
【０２６４】
図２２に示されている表は、３つ総ての群のマウス（４、２４、４８時間でのｈＢＳ１４のクリアランス）に関する、ペプチド投与後１時間の種々の組織における９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５の％ＩＤ／ｇと腫瘍／非腫瘍比（Ｔ：ＮＴ）をまとめたものである。画像化には臨床上初期の時点が望ましいので、ペプチド注射後１時間を用いた。
【０２６５】
画像化したマウスからのデータを図２３に示す。最初の画像対はマウスの腫瘍の位置を示す。ｈＢＳ１４（５×１０−１０モル）を投与した後、４８時間後に９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５（４０μＣｉ；５×１０−１１モル）を投与した。動物１と２にはペプチドのみを与え、一方、動物３、４および５にはｈＢＳ１４の後にペプチドを投与した。これらの動物は以下の腫瘍サイズを有していた。
【０２６６】
動物１：１．６８ｃｍ３腫瘍
動物２：０．６２ｃｍ３腫瘍
動物３：１．２２ｃｍ３腫瘍
動物４：０．６２ｃｍ３腫瘍
動物５：０．５６ｃｍ３腫瘍
二番目の画像対はｅ第二のペプチド投与後１時間の画像を示す。わずか２１時間後に、ｈＢＳ１４でプレターゲッティングされたマウスの腫瘍が明確に可視化された。大多数のシグナルは、予測されたように、この初期の時点では膀胱に局在し、画像においては腎臓にも明らかであった。外部放射活性は動物４の脚に見られ（丸囲み）、脚を洗浄することにより除去した。
【０２６７】
三番目の画像対はペプチド投与後３時間の画像データを示す。３時間の時点で動物３を除いた。このマウスは腫瘍取り込みが極めて高く、このマウスの画像を調節すると、残りの４個体のマウスの感受性が低下した。ペプチドのみを投与したマウスでは、腫瘍の輪郭は見えたが、動物４および５で見られたことから、これは血液プールによるものであって、直接ターゲッティングによるものではなかった。このマウスは最初の時点からなお麻酔の作用下にあり、それらの膀胱を排泄することはできず、膀胱で高いシグナルが見られるに至った。
【０２６８】
四番目の画像対はペプチド投与後２４時間の画像データを示す。この時点ではシグナルはマウス内にほとんど残っておらず、従って、最初の時点で用いた１０分ではなく２０分間で画像化を行った。９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５の投与前にｈＢＳ１４でプレターゲッティングしたマウスの腫瘍のみに検出されるシグナルが局在していた。
【０２６９】
３種総てのプレターゲッティングマウスおよびペプチド単独を投与した両マウスを２４時間画像化の後に剖検したが、それらの結果が図２１（下のパネル）に示されている。プレターゲッティングマウスにおいては腫瘍および腎臓の取り込みが最も高かった（それぞれ１９．０１±２．８０％ＩＤ／ｇおよび３．８１±０．８０％ＩＤ／ｇ）。対照マウスの腫瘍に存在するペプチドは極めて少なかったが（０．３０±０．０８％ＩＤ／ｇ）、腎臓における量はプレターゲッティングマウスと同等であった（３．７１±０．４３％ＩＤ／ｇ）。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１ａ】パネルＡは、構成的ＧＡＰプロモーターから合成された２種のｍＲＮＡをコードする、ＢＳ１４ＨＰ−ＧＡＰ＋ベクター中の発現カセットを示す。パネルＢは、Ｋｅｘ２プロテアーゼによるα因子シグナルの切断後の、２つの成熟型異種ポリペプチド、ｈ６７９ＶＨ−ＧＧＧＧＳ−ｈＭＮ−１４ＶＫ−ＬＥＧＧＧＳ−ｈＭＮ−１４ＶＨ−６Ｈｉｓ（左）およびｈＭＮ−１４ＶＫ−ＧＧＧＱＦＭ−ｈＭＮ−１４ＶＨ−ＧＧＧＧＳ−ｈ６７９ＶＫ−６Ｈｉｓ（右）の図を示す。パネルＣは、ＣＥＡに対する２つの結合部位とＨＳＧに対する１つの結合部位を有するポリペプチド１および２のヘテロ二量体化によって形成される三価タンパク質構造の図を示す。パネルＤは、ＥＡＥＡＥＦＭ−ｈ６７９ＶＨ−ＧＧＧＧＳ−ｈＭＮ−１４ＶＫ−ＬＥＧＧＧＳ−ｈＭＮ−１４ＶＨ−６Ｈｉｓのアミノ酸配列とｃＤＮＡ配列を示す。パネルＥは、ＥＡＥＡＥＦ−ｈＭＮ−１４ＶＫ−ＧＧＧＱＦＭ−ｈＭＮ−１４ＶＨ−ＧＧＧＧＳ−ｈ６７９ＶＫ−６Ｈｉｓのアミノ酸配列とｃＤＮＡ配列を示す。
【図１ｂ】 
【図１ｃ】 
【図１ｄ】 
【図１ｅ】 
【図２】同じ宿主細胞由来の２つの異種ポリペプチドの同時発現に用いる改変型ピキア(Pichia)発現ベクターｐＧＡＰＺα＋の構築を示す。
【図３】ピキア・パストリス(Pichia pastoris)クローンの培地においてＢＳ１４ＨＰの発現を評価するために用いられる多くのＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムのうちの１つを示す。静止期まで増殖させた後、培地をＢＩＡｃｏｒｅ溶出バッファーで１０倍希釈し、ＨＳＧを結合させたセンサーチップに注入した。次に、ＷＩ２  ＩｇＧ（ｔｏｈＭＮ−１４に対する抗ｉｄ）を注入することにより、これらのサンプルの二重特異性が確認された。
【図４】ＢＳ１４ＨＰの、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。精製タンパク質サンプルに対して４〜２０％ポリアクリルアミドＴｒｉｓ−グリシン  ゲルにて還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。示されたレーンに、１、４および１０μｇを添加した。矢印は、分子量標準の位置を示す。
【図５】精製ＢＳ１４ＨＰのサイズ排除ＨＰＬＣ特性を示す。
【図６Ａ】（ａ）は競合的ＥＬＩＳＡ実験の結果のグラフを示す。ＨＲＰコンジュゲートｈＭＮ１４  ＩｇＧ（１ｎＭ）を、ＣＥＡコーティング（０．５μｇ／ウェル）内でインキュベートする前に、ＢＳ１４ＨＰ、ＢＳ１．５Ｈ（ＢＳ１４ＨＰと同じ可変ドメインに由来する、ＣＥＡに対して一価、ＨＳＧに対して１価の二重特異性ダイアボディー）、またはｈＭＮ１４  Ｆ（ａｂ’）２のいずれかと、１〜２５０ｎＭの範囲の濃度で混合した。阻害率％をサンプルのｎＭに対してプロットする。それぞれの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求め、（ｂ）はＣＥＡとのＢＳ１４ＨＰ免疫反応性のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す。
【図６Ｂ】（ａ）は競合的ＥＬＩＳＡ実験の結果のグラフを示す。ＨＲＰコンジュゲートｈＭＮ１４  ＩｇＧ（１ｎＭ）を、ＣＥＡコーティング（０．５μｇ／ウェル）内でインキュベートする前に、ＢＳ１４ＨＰ、ＢＳ１．５Ｈ（ＢＳ１４ＨＰと同じ可変ドメインに由来する、ＣＥＡに対して一価、ＨＳＧに対して１価の二重特異性ダイアボディー）、またはｈＭＮ１４  Ｆ（ａｂ’）２のいずれかと、１〜２５０ｎＭの範囲の濃度で混合した。阻害率％をサンプルのｎＭに対してプロットする。それぞれの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求め、（ｂ）はＣＥＡとのＢＳ１４ＨＰ免疫反応性のＳＥ−ＨＰＬＣの結果を示す。
【図７】ＧＷ３９担癌ヌードマウスにおける１２５Ｉ標識ＢＳ１４ＨＰの腫瘍滞留と血液クリアランスのグラフを示す。％注入量／グラム（％ＩＤ／ｇ）を時間（時間）に対してプロットしている。
【図８Ａ】３つの二重特異性構築物でプレターゲッティングしたＧＷ−３９担癌マウスにおける１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１の生体分布（Ａ）および３時間後の腫瘍／非腫瘍比（Ｂ）、ならびに２４時間後の腫瘍／非腫瘍比を示す。標準偏差はエラーバーとして示されている（ＡおよびＣ）か、または括弧で示されている（Ｂ）。
【図８Ｂ】３つの二重特異性構築物でプレターゲッティングしたＧＷ−３９担癌マウスにおける１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１の生体分布（Ａ）および３時間後の腫瘍／非腫瘍比（Ｂ）、ならびに２４時間後の腫瘍／非腫瘍比を示す。標準偏差はエラーバーとして示されている（ＡおよびＣ）か、または括弧で示されている（Ｂ）。
【図８Ｃ】３つの二重特異性構築物でプレターゲッティングしたＧＷ−３９担癌マウスにおける１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１の生体分布（Ａ）および３時間後の腫瘍／非腫瘍比（Ｂ）、ならびに２４時間後の腫瘍／非腫瘍比を示す。標準偏差はエラーバーとして示されている（ＡおよびＣ）か、または括弧で示されている（Ｂ）。
【図９】パネルＡはＩＭＰ２８１の分子構造を示し、パネルＢはＩＭＰ２８４の分子構造を示し、パネルＣはＩＭＰ２８８の図を示す。
【図１０】ＳＶ３構築物ならびにＯＲＦ１およびＯＲＦ２ポリペプチドの構成を示す。
【図１１】ｈＢＳ１４−ｐＤＨＬ２発現ベクターの模式図を示す。
【図１２】ｈＢＳ１４  ＳＰ２／０クローン１Ｈ６のＭＴＸ増幅の結果を示す。
【図１３】精製ｈＢＳ１４のＳＥ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１４】精製ｈＢＳ１４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【図１５】精製ｈＢＳ１４のＩＥＦ分析の結果を示す。
【図１６】ｈＢＳ１４のＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を示す。
【図１７】ＳＰ２／０またはＹＢ２／０細胞のいずれかで産生されたｈＢＳ１４のＨＳＧ結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を示す。
【図１８】ペプチドＩＭＰ２９１の構造を示す。
【図１９】ペプチドＩＭＰ２４５の構造を示す。
【図２０】ペプチドの投与前にクリアリングのために、４時間目（上のパネル）または２４時間目（下のパネル）にｈＢＳ１４を与えた場合の、マウスにおける１２５Ｉ−ｈＢＳ１４および９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５の腫瘍取り込みを示す（それぞれ、群ＩおよびII）。
【図２１】上のパネルは、ペプチドの投与前にクリアリングのために４８時間目にｈＢＳ１４を与えたマウスにおける１２５Ｉ−ｈＢＳｌ４および９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５の腫瘍取り込みを示す（群III）。下のパネルは、注射２４時間後に画像化したマウスにおけるペプチド取り込みを示す。
【図２２】注射１時間後の９９ｍＴｃ−ＩＭＰ−２４５ペプチドの％ＩＤ／ｇおよび腫瘍／非腫瘍比を示す表である。
【図２３】マウスにおける画像化データを示す。最初の画像対は、マウスにおける腫瘍の位置を示す。二番目の画像対は、ペプチド投与１時間後の画像を示す。三番目の画像対はペプチド投与３時間後の画像データを示す。最後の画像対は、ペプチド投与２４時間後の画像を示す。
【配列表】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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