(57)【要約】【課題】錯化金属カチオンを含む免疫アジュバント、および該免疫アジュバントを含むワクチン【解決手段】本発明は、脂肪相と；アニオン性ポリマーと多価金属カチオンまたは異なる金属カチオンの混合物を錯化させることによって得られる、非ゼロ量の有機金属ゲルと；を含む組成物に関する。本発明はまた、少なくとも一つの不溶性多価カチオン塩の懸濁水溶液、少なくとも一つの水溶性アニオンポリマー、および任意に少なくとも一つの親水性界面活性剤を調製し；任意に一つの親油性界面活性剤を含む油相でもってその懸濁液を乳化し；必要であれば、乳濁液のｐＨを調節して不溶性多価カチオンを可溶化し；任意に、過剰の多価カチオンを加え；最終的に得られた乳濁液を中和する；ことを含む、乳濁液を調製する方法に関する。本発明はまた、前記組成物を含むワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪相と；アニオン性ポリマーまたは異なるアニオン性ポリマーの混合物を多価金属カチオンまたは異なる金属カチオンの混合物と錯化させることによって得られた非ゼロ量の有機金属ゲルと；を含む組成物。
【請求項２】
前記有機金属ゲルは、多価カチオン塩または多価カチオン塩の混合物を含む体積Ｖｃの懸濁液または溶液と、アニオン性ポリマーまたはアニオン性ポリマーの混合物を含む体積Ｖｐの溶液または懸濁液を、有機金属ゲルをもたらすゲル化現象を引き起こすのに十分な比率で、必要な場合は得られた混合物を攪拌しながら、混合することによって得ることができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脂肪相は、無機油、植物または動物由来の油、前記油のアルキルエステル、脂肪酸のアルキルエステル、脂肪酸のアルキルエーテル、脂肪酸とポリオールのエステル、および脂肪アルコールとポリオールのエーテル、から選択される一以上の化合物を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記油のアルキルエステルは、前記油のメチルエステル、エチルエステル、直鎖または分枝鎖のプロピルエステル、および直鎖または分枝鎖のブチルエステルから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記油は、白色鉱油、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、ダイズ油、コムギ胚種油、グレープシード油、ヒマワリ油、ヒマシ油、アマニ油、ダイズ油、コーン油、コプラ油、パーム油、ナッツ油、ヘーゼルナッツ油、ナタネ油、および、オリーブまたは魚肝から抽出したスクアランまたはスクアレンから選択される、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂肪酸エステルは、１２〜２２の炭素原子を含む脂肪酸エステルから選択され、特に、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リシノール酸、およびイソステアリン酸のエステルから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記脂肪酸のアルキルエステルは、オレイン酸エチル、オレイン酸メチル、ミリスチン酸イソプロピル、およびパルミチン酸オクチルから選択される、請求項３および６の何れかに記載の組成物。
【請求項８】
前記脂肪酸とポリオールのエステルは、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、脂肪酸トリグリセリド、脂肪酸とポリグリセロールのエステル、または脂肪酸とプロピレングリコールのエステル、脂肪酸とヘキソール、特にソルビトールまたはマンニトールとのエステル、および脂肪酸とヘキソール無水物、特にソルビタンまたはマンニタンとのエステル、から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記脂肪相を、約５〜７０重量％、特に１５〜６０重量％含む、請求項１〜８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記多価金属カチオンは、二価または三価の金属カチオン、特に二価のカルシウム、マグネシウム、マンガンまたは亜鉛カチオン、或いは三価の鉄またはアルミニウムカチオンから選択される、請求項１〜９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記有機金属ゲルを得るために使用される前記カチオン塩の懸濁液または溶液における、溶液または懸濁液１リットル当たりのモル数で表される前記金属カチオン濃度[Ｃ]は、通常約１０-3〜１０  mol/Lであり、特に１０-2〜５  mol/Lであり、さらに特には０．１〜１mol/Lである、請求項２〜１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記有機金属ゲルを得るために使用されるカチオン塩の懸濁液または溶液における前記カチオン塩は、前記カチオンの水酸化物、炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、グルコヘプトン酸塩、フルクトヘプトン酸塩、乳酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、塩化物、およびグリセロリン酸塩から選択される、請求項２〜１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記有機金属ゲルを得るために使用されるカチオン塩の懸濁液または溶液における前記塩は、水酸化カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マンガン、グリセロリン酸マンガン、グルコン酸亜鉛、フルクトヘプトン酸カルシウム、サリチル酸アルミニウム、および酢酸アルミニウムから選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記有機金属ゲルを得るために使用されるカチオン塩の懸濁液または溶液における前記塩は、グリセロリン酸マンガンまたはグリセロリン酸マンガンおよびグルコン酸マンガンの混合物である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記多価金属カチオンと錯体化されるアニオン性ポリマーの懸濁液または溶液における前記アニオン性ポリマーは、硫酸化ポリマー、デキストラン、カラゲラン、カルボン酸ポリマー、ポリアクリレート、ペクチン、アルギン酸、または天然ゴム、キサンタンガム、およびガーゴムから選択される、請求項２〜１４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記多価金属カチオンと錯体化されるアニオン性ポリマーの懸濁液または溶液における前記使用されるアニオン性ポリマーは、アルギン酸ナトリウムである、請求項２〜１５の何れかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記有機金属ゲルを得るために使用されるアニオン性ポリマーの懸濁液または溶液における、前記溶液または懸濁液の重量パーセントとして表される前記アニオン性ポリマー濃度[Ｐ]は、通常約０．１〜１０重量％であり、特に０．５〜５重量％、さらに特には１〜５重量％である、請求項２〜１６の何れかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記有機金属ゲルを生成する混合物の調製のための、カチオン塩の懸濁液または溶液と、アニオン性ポリマーの溶液または懸濁液との比率は、[Ｐ]／[Ｃ]比が０．０１〜１００、特に０．１〜５０、さらに特に１〜約１０であるように選択される、請求項１６および１７の何れかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記有機金属ゲルの調製に使用される前記懸濁液または溶液の溶媒は水である、請求項２〜１８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記有機金属ゲルは、多価カチオン塩を含む懸濁水溶液または水溶液と、アニオン性ポリマーを含む水溶液または懸濁水溶液を、必要ならば得られた混合物を攪拌しながら、混合することによって得られる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
乳濁液形態、特に、その連続相が脂肪相であり、その分散相が前記多価金属カチオン−アニオン性ポリマーゲル錯体である乳濁液形態である、請求項１〜２０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
一以上の薬剤的に許容される界面活性剤を含む、請求項１〜２２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、および、特にポリグリセロールエステル、ソルビタン、マンニタンまたはスクロースのエステルのような糖エステル、エトキシ化された糖エステル、アルコキシル化された脂肪アルコール、エトキシ化された脂肪酸、酢酸または酪酸との反応によって修飾されたモノグリセリドおよびジグリセリド；エトキシ化されたモノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリド、グルコースエーテル、キシロースエーテル、およびラクチトールエーテルのような糖エーテルから選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記使用される界面活性剤は、前記界面活性剤または界面活性剤の混合物のＨＬＢが、４〜１２、特に５〜８であるように選択される、請求項２２および２３の何れかに記載の組成物。
【請求項２５】
約０．５〜１０重量％、特に１〜５重量％の界面活性剤を含む、請求項２２〜２４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の乳濁液を調製する方法であって、
（ａ）少なくとも一つの不溶性の多価カチオン塩、少なくとも一つの水溶性のアニオン性ポリマー、および任意に、少なくとも一つの親水性界面活性剤を含む懸濁水溶液または水溶液を調製する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で調製した懸濁液を、親油性界面活性剤を任意に含む油相に乳濁させる工程と、
（ｃ）必要であれば、前記乳濁液のｐＨを調節して前記不溶性の多価カチオン塩を可溶化させる工程と、
（ｄ）任意に、過剰の多価カチオンを添加する工程と、
（ｅ）前記最終的に得られた乳濁液を中和する工程、
を含む方法。
【請求項２７】
工程（ａ）は、体積Ｖｃのカチオン塩懸濁液または溶液と、体積Ｖｐのアニオン性ポリマーの溶液または懸濁液を混合することを含み、体積比Ｖｃ／Ｖｐが、１／１００〜１／１であり、特に１／５０〜１／１０であり、前記カチオン塩の懸濁液または溶液をアニオン性ポリマーの溶液または懸濁液に、必要ならば得られた混合物を攪拌しながら注ぎ、もしくはアニオン性ポリマーの懸濁液または溶液をカチオン塩の溶液または懸濁液に、必要ならば得られた混合物を攪拌しながら注ぐことによって混合される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ｅ）で得られた乳濁液は、有機金属ゲルの懸濁液を得るために脂肪相の溶媒に溶解され、得られた懸濁液は前記ゲルを単離するために遠心分離に供される、請求項２６または２７に記載の方法の変形方法。
【請求項２９】
請求項１〜２５の何れか一項に記載の組成物の、ワクチン組成物のアジュバント相としての使用。
【請求項３０】
ワクチンの調製方法であって、請求項１〜２５に何れか一項に記載の組成物の有効量を、免疫アジュバントとして添加することを含む方法。
【請求項３１】
少なくとも一つの抗原、または、アミノ酸配列を含む化合物の少なくとも一つのインビボでの発生剤、および、非ゼロ量の請求項１〜２５の何れか一項に記載の組成物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン組成物のための新規のアジュバント、並びに、少なくとも一つの抗原、特にウイルス、細菌、または寄生虫由来の抗原と、少なくとも一つのアジュバントを含む前記組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
非常に多くの物質が、抗原に対する免疫応答を改善するとして開示されている。
【０００３】
水酸化アルミニウムおよびリン酸カルシウムに代表される水に不溶性の無機塩が、現在までにヒトワクチン接種を認可されている唯一のものである。それらはワクチン接種サイトにおいて不耐性反応（reaction of intolerance）をほとんど誘起しないが、一方、有効性が弱く効果の持続時間が短い。
【０００４】
家畜のワクチンにおいてアジュバントとして使用される注射剤には油もある。それらは非常に効果的だが、時折、局所的な反応を誘起する。それらは、抗原媒体との混合物として使用され、注射剤用の液体乳剤を形成する。
【０００５】
これらの乳剤が水中油（Ｏ／Ｗ）型であるとき、疾病に対する動物の保護は迅速に得られるが、しかし数ヶ月という短い期間だけである。
【０００６】
これらの乳剤が油中水（Ｗ／Ｏ）型であるとき、疾病に対する動物の保護は数週間後に得られるが、一年以上の長期間持続する。この長期間の保護作用は、抗原媒体の水滴が油によってコーティングされているためであると考えられる。
【０００７】
フランス特許公報  ＦＲ  ２  ７３３  １５１およびＦＲ  ２  ７５４  ７１５には、有機アニオンと組み合わされた多価カチオンの水溶性の塩も開示されている。これらの溶解塩は、非常に耐容性がよく、迅速な保護を与えるが、しかし単独でアジュバントとして使用された場合に持続時間が短い。それらが（Ｏ／Ｗ）乳濁液または微小乳濁液という形態で油と組み合わされた場合、少なくとも（Ｗ／Ｏ）型のワクチンによって得られるよりは延長された保護を誘起する。
【０００８】
米国特許公報  ３  ９２５  ５４４およびベルギー特許公報  ６２３  ８２５は、アジュバントとして、１〜５％  重量／体積のアルギン酸ナトリウムおよび、アルギン酸を不溶化するイオン、例えばカルシウムイオンを含むワクチンを開示しており、そのアルギン酸を不溶化する隔離イオンの濃度は、不溶性ゲルを形成するために必要な濃度より少ない。
【０００９】
極めて迅速に疾病に対する保護が得られることと、その保護が長期間維持されることの両方を可能にするワクチン接種は、現在のところ存在していない。それ故、本出願人は、上述の不都合な点を有さない免疫アジュバントを開発することによってこの問題を解決しようとした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
従って、本発明は、脂肪相と；アニオン性ポリマーまたは異なるアニオン性ポリマーの混合物を多価金属カチオンまたは異なる多価金属カチオンの混合物と錯化させることによって得られる非ゼロ量の有機金属ゲルと；を含む組成物である。
【００１１】
本発明の組成物における有機金属ゲルは、多価カチオン塩または多価カチオン塩の混合物を含む体積Ｖｃの懸濁液または溶液と、アニオン性ポリマーまたはアニオン性ポリマーの混合物を含む体積Ｖｐの溶液または懸濁液を、有機金属ゲルをもたらすゲル化現象を引き起こすのに十分な比率で、必要ならば得られた混合物を攪拌しながら、混合することによって得ることができる。
【００１２】
本発明の組成物を構成する脂肪相は、通常、無機油、植物または動物由来の油、前記油のアルキルエステル、脂肪酸のアルキルエステルまたは脂肪酸のアルキルエーテル、脂肪酸とポリオールのエステルおよび脂肪アルコールとポリオールのエーテルから選択される一以上の化合物を含む。
【００１３】
無機物由来の油の例として、石油由来の油、例えばＭＡＲＣＯＬTM  ５２のような白色鉱油が挙げられる。植物由来の油の例として、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、ダイズ油、コムギ胚種油、ヒマワリ油、ヒマシ油、アマニ油、ダイズ油、コーン油、コプラ油、パーム油、ナッツ油、ヘーゼルナッツ油、ナタネ油、或いは、オリーブからのスクアランまたはスクアレンが挙げられる。動物由来の油の例として、鯨油、獣脂油、魚肝から抽出したスクアランまたはスクアレンが挙げられる。
【００１４】
油のアルキルエステルの例として、メチルエステル、エチルエステル、前記油の直鎖または分枝鎖のプロピルエステル、或いは直鎖または分枝鎖のブチルエステルが挙げられる。
【００１５】
上述のエステルを調製するのに適した脂肪酸は、特に、１２〜２２の炭素原子を含むもの、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、リシノール酸、またはイソステアリン酸であり、２０℃で液状である脂肪酸が都合よい。
【００１６】
脂肪酸エステルの例として、オレイン酸エチル、オレイン酸メチル、ミリスチン酸イソプロピル、またはパルミチン酸オクチルのような脂肪酸のアルキルエステル、脂肪酸とポリオールのエステル、または脂肪アルコールとポリオールのエーテルであり、さらに特には、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、脂肪酸トリグリセリド、ポリグリセロールによる脂肪酸のエステルまたは脂肪酸とプロピレングリコールのエステル、例えばソルビトールまたはマンニトールのようなヘキソールによる脂肪酸のエステル、例えばソルビタンまたはマンニタンのような無水ヘキソールによる脂肪酸のエステルが挙げられる。
【００１７】
本発明の状況において、脂肪相は上記化合物の一つ、或いは、上記化合物の幾つかの混合物を含む。
【００１８】
本発明の組成物は、通常、約５〜７０重量％、特に１５〜６０重量％の脂肪相を含む。
【００１９】
多価金属カチオンの中で、アニオン性ポリマーまたはアニオン性ポリマーの混合物と錯化され得るのは、特に二価または三価の金属カチオンであり、さらに特には、二価のカルシウム、マグネシウム、マンガンまたは亜鉛のカチオン、或いは三価の鉄またはアルミニウムカチオンである。
【００２０】
本発明の組成物に含まれる有機金属ゲルを得るために使用され得る、カチオン塩の懸濁液または溶液における、溶液または懸濁液１リットル当たりのモル数で表される金属カチオン濃度[Ｃ]は、通常、約１０-3〜１０モルパーリッターであり、特に１０-2〜５モルパーリッターであり、さらに特には０．１〜１モルパーリッターである。
【００２１】
これらのカチオン塩は薬剤的に許容可能である。これらは例えば、水酸化物、炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、グルコヘプトン酸塩、フルクトヘプトン酸塩（fructoheptonate）、乳酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、塩化物、またはグリセロリン酸塩である。
【００２２】
本発明の組成物の有機金属ゲルの調製において使用される塩の例として、水酸化カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マンガン、グリセロリン酸マンガン、グルコン酸亜鉛、フルクトヘプトン酸カルシウム、サリチル酸アルミニウム、または酢酸アルミニウムが挙げられる。
【００２３】
本発明の一実施形態に従って、使用される多価カチオン塩はグリセロリン酸マンガンまたはグリセロリン酸マンガンおよびグルコン酸マンガンの混合物である。
【００２４】
アニオン性ポリマーのなかで、多価金属カチオンと錯化され得るものは、特に、硫化ポリマー、デキストラン、カラゲナン、カルボン酸ポリマー、ポリアクリレート、ペクチン、アルギン酸、天然ゴム、キサンタンガム、またはガーゴムである。
【００２５】
本発明の一実施形態に従って、使用されるアニオン性ポリマーはアルギン酸ナトリウムである。
【００２６】
本発明の組成物に含まれる有機金属ゲルを得るために使用され得るアニオン性ポリマーの懸濁液または溶液における、溶液または懸濁液の重量パーセントとして表されるアニオン性ポリマーの濃度[Ｐ]は、通常約０．１〜１０重量％であり、特に０．５〜５重量％であり、さらに特には１〜５重量％である。
【００２７】
有機金属ゲルを生成する混合物の調製のための、カチオン塩の懸濁液または溶液と、アニオン性ポリマーの溶液または懸濁液との比率は、[Ｐ]／[Ｃ]比が０．０１〜１００、特に０．１〜５０、さらに特には１〜約１０であるように選択される。
【００２８】
有機金属ゲルの調製に使用される懸濁液または溶液の溶媒は、通常、極性溶媒であり、好ましくは互いに混和性である。これらは好ましくは水、または薬剤的に許容可能な水−アルコール性混合物である。
【００２９】
本発明のひとつの観点に従って、有機金属ゲルは、多価カチオン塩または多価カチオン塩の混合物を含む懸濁水溶液または水溶液を、アニオン性ポリマーまたはアニオン性ポリマーの混合物を含む水溶液または懸濁水溶液と、必要な場合は得られた混合物を攪拌しながら、混合することによって得ることができる。
【００３０】
本発明の他の観点に従って、有機金属ゲルは、多価カチオン塩を含む懸濁水溶液または水溶液を、アニオン性ポリマーを含む水溶液または懸濁水溶液と、必要ならば攪拌しながら混合することによって得ることができる。
【００３１】
上記で定義された組成物は、乳濁液形態、特にその連続相が脂肪相であり、分散相が多価金属カチオン−アニオン性ポリマーゲル錯体である乳濁液形態が好ましい。
【００３２】
上記で定義された組成物は、薬剤的に許容可能な一以上の界面活性剤を含んでもよい。
【００３３】
本発明の組成物に使用される界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、例えばポリグリセロールエステル、ソルビタン、マンニタン、またはスクロースのエステルのような糖エステル、エトキシ化された糖のエステル、アルコキシ化脂肪アルコール、エトキシ化脂肪酸、酢酸または乳酸との反応によって修飾されたモノグリセリドおよびジグリセリド；エトキシ化されたモノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリド、例えばグルコースエーテル、キシロースエーテル、およびラクチトールエーテル（lactitol ethers）のような糖エーテルである。
【００３４】
使用される界面活性剤は、特に、界面活性剤の混合物のＨＬＢが４〜１２、好ましくは５〜８であるように選択される。
【００３５】
上記で定義された組成物は通常、約０．５〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％の界面活性剤を含む。
【００３６】
本発明の対象はまた、上記で定義された乳濁液の調製方法であり、これは、
（ａ）少なくとも一つの不溶性の多価カチオン塩、少なくとも一つの水溶性のアニオン性ポリマー、および任意に、少なくとも一つの親水性界面活性剤を含む懸濁水溶液または水溶液を調製する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で調製した懸濁液を、親油性界面活性剤を任意に含む油相に乳濁させる工程と、
（ｃ）必要であれば、前記乳濁液のｐＨを調節して前記不溶性の多価カチオン塩を可溶化させる工程と、
（ｄ）任意に、過剰の多価カチオンを添加する工程と、
（ｅ）前記最終的に得られた乳濁液を中和する工程、を含む。
【００３７】
前記方法の工程（ａ）は、通常、体積Ｖｃのカチオン塩懸濁液または溶液と、体積Ｖｐのアニオン性ポリマーの溶液または懸濁液を混合することを含み、体積比Ｖｃ／Ｖｐが、通常、１／１００〜１／１であり、特に１／５０〜１／１０であり、前記カチオン塩の懸濁液または溶液をアニオン性ポリマーの溶液または懸濁液に、必要ならば得られた混合物を攪拌しながら注ぎ、もしくはアニオン性ポリマーの懸濁液または溶液をカチオン塩の溶液または懸濁液に、必要ならば得られた混合物を攪拌しながら注ぐことによって混合されることによる。
【００３８】
工程（ａ）においては、水酸化カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸マンガン、グルコン酸カルシウム、グルコン酸マンガン、グリセロリン酸マンガン、グルコン酸亜鉛、フルクトヘプトン酸カルシウム、サリチル酸アルミニウム、または酢酸アルミニウムから選択される一以上の塩が使用されることが好ましい。
【００３９】
上記で定義された方法の一つの変形例に従って、工程（ｅ）で得られた乳濁液は、有機金属ゲルの懸濁液を得るために脂肪相の溶媒に溶解され、得られた懸濁液は前記ゲルを単離するために遠心分離に供される。この変形例は、低油含量の組成物を調製するために用いられる。
【００４０】
他の観点に従って、本発明は、上記で定義された組成物の、ワクチン組成物のアジュバント相としての使用である。
【００４１】
本発明はまた、上記で定義された組成物の有効量を免疫アジュバントとして添加することを含む、ワクチンを調製する方法である。
【００４２】
上記で定義された組成物は、当該分野の技術者に周知の従来の油性アジュバントと組み合わせて使用されてもよい。
【００４３】
調製されたワクチンがＷ／Ｏ型乳濁液である場合、本発明の組成物は抗原相と混合され、それから全体が乳化される。
【００４４】
最後の観点に従って、本発明は、少なくとも一つの抗原、または、アミノ酸配列を含む化合物の少なくとも一つのインビボでの発生剤、および、非ゼロ量の上記で定義された組成物を含む組成物である。
【００４５】
発現抗原、または、アミノ酸配列を含む化合物の少なくとも一つのインビボでの発生剤は、ウイルス、細菌、または寄生虫のような微生物の死んだものか、これらの微生物の精製画分か、または、それらの病原性を減弱させた生の微生物か、のいずれかを意味する。本発明の抗原を構成するウイルスの例として、狂犬病ウイルス、オーエスキー病ウイルスのようなヘルペスウイルス、インフルエンザのようなオルトミクソウイルス、口蹄疫病ウイルスのようなピコルナウイルス、またはＨＩＶのようなレトロウイルスが挙げられる。本発明の抗原を構成する細菌型の微生物の例として、大腸菌、およびパスツレラ属、フロンキュロシス（Furonculosis）、ビブリオ、ブドウ球菌、および連鎖球菌が挙げられる。寄生虫の例としては、トリパノソーマ属、プラスモディウム、およびレーシュマニアが挙げられる。組換えウイルス、特に、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリア痘瘡ウイルス、ヘルペスウイルス、またはバキュロウイルスのような非エンベロープウイルスも挙げられる。それはまた、そのゲノムが、好ましくは対応するエンベロープウイルスの複製に必須でない部分に挿入された、抗体合成を誘導する抗原サブユニットをコード化した配列を含み、および／または、上述のエンベロープウイルスまたは病原性微生物に対する防御効果を含む生非エンベロープ組換えウイルスベクターであると解され；これらの抗原サブユニットは、例えばタンパク質、糖タンパク質、ペプチドまたはペプチド画分、および／またはエンベロープウイルス、細菌、または寄生虫のような生きた微生物による感染を防御する画分であることができる。微生物に挿入される外来遺伝子は例えばオーエスキーウイルスまたはＨＩＶから得ることができる。
【００４６】
特に、病原性微生物またはウイルスから得られた外来核酸配列を挿入された核酸配列からなる組換えプラスミドにも述べられる。外来の核酸配列は、アミノ酸配列を含む化合物を発現するように意図され、この化合物自体が、宿主生物において免疫反応を引き起こすように意図されている。
【００４７】
アミノ酸配列を含む化合物を「インビボ」で発現する発生剤は、前記インビボの発生剤が導入された宿主生物において、前記化合物を発現することが可能な全ての生物学的生成物を示す。アミノ酸配列を含む化合物は、タンパク質、ペプチド、または糖タンパク質であってよい。これらのインビボにおける発生剤は、通常、遺伝子工学に由来する方法によって得られる。特にそれらは、特に外来遺伝子の核酸配列を挿入された組換えベクターの役割を果たす、生きた微生物、通常ウイルスから構成される。これらの化合物は、周知であり、特に組換えサブユニットワクチンとして使用される。これに関することが、M.ELOIT他の記事であるJournal of virology (1990) 71, 2925-2431、および国際特許出願公報  ＷＯ−Ａ−９１／００１０７および同じくＷＯ−Ａ−９４／１６６８１に言及されている。本発明のインビボでの発生剤も、宿主生物においてアミノ酸配列を有する化合物を発現可能な外来核酸配列を含む組換えプラスミドから構成される。そのような組換えプラスミド、およびそれらを宿主生物へ投与する方法は、1990年の LIN 他によるCirculation 82: 2217,2221、および、COX他によるJ. of VIROL, Sept.1993, 67, 9, 564-5667、および、国際特許公報ＷＯ  ９５／２５５４２に開示されている。インビボでの発生剤に含まれる天然の核酸配列に従って、宿主生物内で発現されるアミノ酸配列を有する化合物は、
（ｉ）抗原であり、免疫反応を開始させる、
（ｉｉ）病気、基本的に宿主生物において引き起こされる機能上の状態の病気の治療作用を有する。この場合、インビボの発生剤は、遺伝子治療型の、宿主の処置を可能にする。
【００４８】
例として、そのような治療作用は、インビボでの発生剤による、インターロイキン、特にインターロイキン２のようなサイトカインの合成から成ることができる。これらは、癌細胞を選択的に排除することを目的とした免疫反応を開始または増強させることを可能にする。
【００４９】
本発明の組成物は、抗原の性質と、治療される対象の性質に依存した濃度の抗原を含む。しかしながら、本発明のアジュバントが通常必要とされる抗原の投与量を実質的に減少させることを可能にすることは、特に注目すべきことである。抗原の適正濃度は、当該分野の技術者によって従来通りに決定されてよい。通常、この投与量は０．１μｇ／ｃｍ3〜１ｇ／ｃｍ3であり、さらに通常は１μｇ／ｃｍ3〜１００ｍｇ／ｃｍ3である。本発明の組成物中におけるインビボでの発生剤の濃度も、特に発生剤の性質と、投与される宿主に依存する。この濃度は、当該分野の技術者によって、日常的な実験に基づいて容易に決定されることができる。しかしながら指針として、インビボの発生剤が組換え微生物の場合、本発明の組成物の濃度は１０2〜１０15微生物／ｃｍ3であり、好ましくは１０5〜１０12微生物／ｃｍ3であるように特定することができる。インビボの発生剤が組換えプラスミドの場合、本発明の組成物の濃度は、０．０１ｇ／ｄｍ3〜１００ｇ／ｄｍ3であることができる。上記で定義されたワクチンは、アジュバント相および抗原相を混合し、任意に水または薬剤的に許容可能な希釈溶媒を加えることによって調製される。以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、これに限定されるものではない。
【００５０】
（実施例１）
１％のアルギン酸ナトリウムを含む、高粘度且つ高グルロン酸（guluronic acid）含量の溶液（SATIALGINETMSG800））を調製する。
【００５１】
水に不溶性の塩である水酸化カルシウムの、５００ミリモーラーの不溶性塩懸濁水溶液を調製する。
【００５２】
その懸濁液１ｍｌと２０ｇのアルギン酸溶液を混合する。得られた混合物を、親油性界面活性剤として、モノオレイン酸ソルビタン、またはＨＬＢが約４．３のMONTANETM80を１重量％含む、白色鉱油（MARCOLTM52）１００ｇに急速に攪拌して分散させる。
【００５３】
数滴の濃縮酢酸で酸性化し、乳濁液を得る。この乳濁液は連続油相を有し、その分散相はアルギン酸カルシウムの安定なゲル化錯体から成る。
【００５４】
このアルギン酸カルシウム乳濁液は、免疫アジュバントを構成し、これは、抗原媒体に乳化されて、有効性が改良された安定なＷ／Ｏ型ワクチンを形成する。この新規の免疫アジュバントは、最終的なワクチンの製造の前に、Ｓｅｐｐｉｃ社が販売しているMONTANIDETMISAアジュバント系のような他の油性アジュバントと任意に混合されてもよい。
【００５５】
（実施例２）
３．５％のアルギン酸ナトリウムを含む、低粘度且つ高グルロン酸含量の溶液（SATIALGINETMSG80））を調製する。
【００５６】
水に不溶性の塩、炭酸マンガンの５００ミリモーラーの懸濁水溶液を調製する。
【００５７】
その懸濁液１ｍｌと、２０ｇのアルギン酸ナトリウム溶液を混合する。得られた混合物を、MONTANETM80 を２重量％含んだ１００ｇのMARCOLTM52に、３０００回転／分で３分間、高速攪拌機を回転させて分散させる。
【００５８】
数滴の濃縮酢酸で酸性化し、炭酸マンガンを可溶化させて乳濁液を得る。
【００５９】
免疫アジュバントはこのように、連続油相を含み、その分散相がアルギン酸マンガンの安定なゲル錯体から成る乳濁液として得られる。
【００６０】
（実施例３）
３．５％のアルギン酸ナトリウムを含む、低粘度且つ高グルロン酸含量の溶液（SATIALGINETMSG80））を調製する。
【００６１】
水に微溶性の塩、グリセロリン酸マンガンの５００ミリモーラーの懸濁液を調製する。
【００６２】
その懸濁液１ｍｌ、２０ｍｌのアルギン酸溶液、および１．０５ｇ（５％）の親水性界面活性剤、ポリエトキシ化されたオレイン酸ソルビタン（ＥＯ値  ＝  ８０）、ＨＬＢが１５であるＭＯＮＴＡＮＯＸTM８０を混合する。得られた混合物を、ＭＯＮＴＡＮＥTM80を５重量％含む、１００ｇのＭＡＲＣＯＬTM  ５２に、３０００回転／分で３分間、高速攪拌機を回転させて分散させる。使用した界面活性剤系（ＭＯＮＴＡＮＯＸTM  ８０＋ＭＯＮＴＡＮＥTM  ８０）のＨＬＢは、６である。
【００６３】
乳濁液は、数滴の濃縮酢酸で酸性化してグリセロリン酸マンガンを可溶化し、アルギン酸マンガンの錯体を形成し、その後、水酸化ナトリウムで中和してｐＨを５．５にして得られる。そのようにして得られたアジュバントは、その連続相が油相であり、その分散相がアルギン酸マンガンの安定なゲル錯体から成る乳濁液である。
【００６４】
このアジュバントの有効性は、ＯＦ１系統の２０ｇのメスのマウスで評価され、オバルブミングレードＶ（ＯＶＡ）を抗原として含むワクチン１００μｌを皮下に注射した（調製したものは全て、動物毎に投与する抗原の量が一定になるように、および各注射で１μｇになるように調節した）。このワクチン接種のスキームは、最初の注射から２８日後の追加免疫を含む。
【００６５】
最初の群のマウスには、アジュバントなしのＯＶＡを単独で投与した（対照１）。
【００６６】
２つ目の群のマウスには、１部の標準的な油性アジュバント（ＭＯＮＴＡＮＩＤＥTM ＩＳＡ  ５６４、ＳＥＰＰＩＣ社販売）に対して、１部の生理食塩水中のＯＶＡを含むＷ／Ｏ型（調製Ａ）のワクチン（Ａ）を投与した（当該分野の技術に従った組成物）。
【００６７】
３つ目の群のマウスには、３部のワクチン（Ａ）に対して、上述で調製されたアルギン酸マンガンの錯体を含むアジュバント１部から構成される調製（Ｂ）（本発明に従った組成物）を投与した。
【００６８】
４つ目の群のマウスには、１部のワクチン（Ａ）に対して、上述で調製されたアルギン酸マンガンの錯体を含むアジュバント１部から構成される調製（Ｃ）（本発明に従った組成物）を投与した。
【００６９】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体のレベルは、追加免疫の直前のＤ＝２８日、Ｄ＝５６日およびＤ＝９０日に測定した。この結果を次の表に示す。
【表１】
2004527615.tif 000002
この結果は、アルギン酸マンガンの錯体を添加することによって、標準的なＷ／Ｏワクチン（Ａ）の短期間での（２８日間）有効性が、体液性応答（ＩｇＧ１）、および細胞性応答（ＩｇＧ２ａ）の両方で著しく上昇したことを示す。同様の効果が、追加免疫の後、５６日および９０日でも観察される。
【００７０】
（実施例４）
鉱物油に乳化したアルギン酸マンガン錯体から成る免疫アジュバントを、実施例３と同様に調製した。
【００７１】
このアジュバント１部と、生理食塩水中のオバルブミン溶液１部を混合し、中間体製剤（Ｉ）を得た。
【００７２】
１部の標準的なアジュバントＭＯＮＴＡＮＩＤＥTM  ＩＳＡ  ５６４に対して、生理食塩水１部を含むプラセボ乳濁液（Ｐ）を調製した。
【００７３】
このアジュバントの有効性は、ＯＦ１系統の２０ｇのメスのマウスで評価され、オバルブミングレードＶ（ＯＶＡ）を抗原として含むワクチン１００μｌを皮下に注射した（調製したものは全て、動物毎に投与する抗原の量が一定になるように、および各注射で１μｇになるように調節した）。このワクチン接種のスキームは、最初の注射から２８日後の追加免疫を含む。
【００７４】
最初の群のマウスには、アジュバントなしのＯＶＡを単独で投与した（対照１）。
【００７５】
２つ目の群のマウスには、１部のＭＯＮＴＡＮＩＤＥTM  ＩＳＡ  ５６４に対して、１部の生理食塩水中のＯＶＡから構成される、Ｗ／Ｏ型（調製Ａ）のワクチン（Ａ）を投与した（当該分野の技術に従った組成物）。
【００７６】
３つ目の群のマウスには、３部のプラセボ（Ｐ）と１部の製剤（Ｉ）から成る製剤（Ｄ）を投与した（本発明に従った組成物）。
【００７７】
４つめの群のマウスには、１部のプラセボ（Ｐ）と１部の製剤（Ｉ）から成る製剤（Ｅ）を投与した（本発明の組成物）。
【００７８】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体のレベルは、追加免疫の直前のＤ＝２８日、Ｄ＝５６日およびＤ＝９０日に測定した。この結果を次の表に示す。
【表２】
2004527615.tif 000003
表２に示された結果は、アルギン酸マンガンの錯体を含むワクチンの、短期間（Ｄ＝２８日間）且つ追加免疫後における有効性が、著しく改良されたことを示す。ＩｇＧ１抗体のレベルは、実施例３におけるワクチン調製方法によって得られたものと有意差はなかった。これは、本発明のアジュバントがその使用方法に関わらず有効であることを証明した（実施例３のように、標準的な油性ワクチンに添加する、あるいは、実施例４のように、抗原媒体に添加し、続いて標準的な油性アジュバントに添加する）。
【００７９】
（実施例５）
実施例３で得られた乳化アルギン酸マンガン錯体を、有機溶媒（エーテルまたはイソプロピルアルコール）で半分に希釈した。その乳濁液の鉱油部分を溶解し、アルギン酸錯体の粒子を遠心分離によって単離した。この溶媒残渣を蒸発させ、約５％のみの残渣鉱油を含む、錯体に富んだ免疫アジュバントを得た。
【００８０】
このアジュバントの有効性は、ＯＦ１系統の２０ｇのメスのマウスで評価され、オバルブミングレードＶ（ＯＶＡ）を抗原として含むワクチン１００μｌを皮下に注射した（調製したものは全て、動物毎に投与する抗原の量が一定になるように、および各注射で１μｇになるように調節した）。このワクチン接種のスキームは、最初の注射から２８日後の追加免疫を含む。
【００８１】
最初の群のマウスには、アジュバントなしのＯＶＡを単独で投与した（対照１）。
【００８２】
２つ目の群のマウスには、アジュバントとしてＭｎ++カチオンの濃度が製剤Ｆと同じような濃度であるようにグリセロリン酸マンガンを含み、また、製剤Ｆと同量のＯＶＡを含むワクチンを投与した（対照２）（当該分野の技術に従った組成物）。
【００８３】
３つ目の群のマウスには、アルギン酸マンガン錯体に富むアジュバントと、１０μｇ／ｍｌのアルブミンを含むワクチン製剤（Ｆ）を形成するためのＯＶＡ抗原溶液との混合物から成る製剤（Ｆ）を投与した。
【００８４】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体のレベルは、追加免疫の直前のＤ＝２８日、Ｄ＝５６日およびＤ＝９０日に測定した。この結果を次の表に示す。
【表３】
2004527615.tif 000004
抗体の分析から、対照２の非錯体性カチオンに対して、アジュバント「アルギン酸マンガン錯体」の遅延効果が明らかに示された。
【００８５】
（実施例６）
３．５ｇのアルギン酸ナトリウム、１．１３ｇのグリセロリン酸マンガン、および５．７ｍｇのＯＶＡを含む１００ｇの溶液を調製した。得られた混合物の６０ｇを、モノオレイン酸マンニタンおよびポリエトキシ化されたオレイン酸の、その混合物のＨＬＢが６で
あるような割合の混合物を５重量％含む１００ｇのＭＡＲＣＯＬTM  ５２に、３０００回転／分で急速に攪拌することによって分散させた。
【００８６】
得られた乳濁液を数滴の濃縮酢酸で酸性化し、グリセロリン酸マンガンを可溶化し、アルギン酸マンガンの錯体を形成させた。
【００８７】
次いで、この乳濁液にトリエタノールアミンを添加してｐＨを５．５にした。ＯＶＡ抗原、並びに、油およびアルギン酸マンガン錯体から構成される油性アジュバントを含むワクチン（Ｇ）を得た。
【００８８】
このアジュバントの有効性は、ＯＦ１系統の２０ｇのメスのマウスで評価され、オバルブミングレードＶ（ＯＶＡ）を抗原として含むワクチン１００μｌを皮下に注射した（調製したものは全て、動物毎に投与する抗原の量が一定になるように、および各注射で１μｇになるように調節した）。このワクチン接種のスキームは、最初の注射から２８日後の追加免疫を含む。
【００８９】
最初の群のマウスには、アジュバントなしのＯＶＡを単独で投与した（対照１）。
【００９０】
２つ目の群のマウスには、１部のＭＯＮＴＡＮＩＤＥTM ＩＳＡ  ５６４に対して１部の生理食塩水中のＯＶＡから構成されるＷ／Ｏ型（調製Ａ）のワクチン（Ａ）を投与した（当該分野の技術に従った組成物）。
【００９１】
３つ目の群のマウスには、ワクチン（Ｇ）（本発明に従った組成物）を投与した。
【００９２】
４つ目の群のマウスには、実施例４で調製したプラセボ（Ｐ）１部に対して１部のワクチン（Ｇ）から成る調製（Ｈ）を投与した（本発明に従った組成物）。
【００９３】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体のレベルは、追加免疫の直前のＤ＝２８日、Ｄ＝５６日およびＤ＝９０日に測定した。この結果を次の表に示す。
【表４】
2004527615.tif 000005
アジュバントとして乳化錯体を含むワクチンＧは、短期間においては、標準的なワクチンＡより有効性が高く、長期間においては、同様の有効性を有した。
【００９４】
２つのアジュバントを含むワクチンＨは、単独のアジュバントの二つのワクチンよりも、短期間および５６日後の両方において著しく高い有効性を有した。従って、相乗作用が観察された。
【００９５】
（実施例７）
実施例３で得られた乳化アルギン酸マンガン錯体を用い、有機溶媒（エーテルまたはイソプロピルアルコール）で半分に希釈した。その乳濁液の鉱油部分を溶解し、アルギン酸錯体の粒子を遠心分離によって単離した。
【００９６】
溶媒残渣を蒸発させ、約５％のみの残渣鉱油を含む、錯体に富んだ免疫アジュバントを得た。
【００９７】
このアジュバントの有効性は、ＯＦ１系統の２０ｇのメスのマウスで評価され、旋毛虫の幼虫の寄生虫性抗原を含むワクチン１００μｌを皮下に注射した（調製したものは全て、動物毎に投与する抗原の量が一定になるように、および各注射で５μｇになるように調節した）。このワクチン接種のスキームは、最初の注射から２８日後の追加免疫を含む。
【００９８】
最初の群のマウスには、１部のＭＯＮＴＡＮＩＤＥTM  ＩＳＡ  ７６３に対して、１部の生理食塩水中の旋毛虫の幼虫の寄生虫性抗原から成る、Ｗ／Ｏ型のワクチンを投与した（対照４）。
【００９９】
２つ目の群のマウスには、アジュバントとしてＭｎ++カチオンの濃度が製剤Ｊと同じような濃度であるようにグリセロリン酸マンガンを含み、また、製剤Ｊと同量の旋毛虫の幼虫の寄生虫性抗原を含むワクチンを投与した（対照５）。
【０１００】
３つ目の群のマウスには、アルギン酸マンガン錯体に富むアジュバントと、旋毛虫の幼虫の寄生虫性抗原溶液の混合物から成る、５０μｇ／ｍｌの抗原を含む製剤（Ｊ）を投与した（本発明の化合物）。
【０１０１】
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体のレベルは、Ｄ＝１４日、Ｄ＝４２日およびＤ＝９０日に測定した。この結果を次の表に示す。
【表５】
2004527615.tif 000006
この結果から、本発明のワクチンが、短期間において、可溶化塩を含むワクチンと同程度の有効性を有し、また、Ｗ／Ｏ型のワクチンよりも高い有効性を有することが示された。長期間においては、Ｗ／Ｏ型のワクチンとほとんど同じ程度の有効性を有し、可溶化塩によるワクチンよりも高い有効性を有した。
【０１０２】
（実施例８）
実施例１〜６に記載された異なるアジュバントを含むワクチンを、ＯＦ１系統のマウスに皮下注射した（注射量は１００μｌ）。注射サイトにおける局所反応の強度は、７日後における０（反応なし）〜５（組織の壊死を伴う非常に強い反応）の範囲の数的なスケールで、７日後に記録した。この結果を次の表に示す。
【表６】
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この結果から、本発明のアジュバントを含むワクチンは良好な耐容性を有し、局所的な反応は対照Ａを上回らなかった。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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