(57)【要約】ゲルミンスチューブ（ｇｅｌ ｍｉｎｃｉｎｇ ｔｕｂｅ）およびメッシュ材を含む、ゲルをミンスするための器具および方法。メッシュ材はチューブの端の全体にわたる。ミンス器具を使用してゲルを細分するため、ゲル（２０６）をミンスチューブ（２０８）の中のメッシュ材（２０４）の上に置き、ミンスチューブとメッシュ材とゲルとを遠心機内で回転させることにより、ゲルが細分されて概ね均一な小さい断片になるようゲルをメッシュ材に通過させる。メッシュ材はネスト化チューブ（ｎｅｓｔｉｎｇ ｔｕｂｅ）（２０８）の形態でチューブに固定されていてもよい。ネスト化チューブは回収容器（２０２）の開口部内でネスト化する。メッシュ材は、ネスト化チューブ内で条件多孔質膜と直列に配置されていてもよい。ネスト化チューブと回収容器とを遠心することによりゲルがメッシュ材を通過し、これによりゲル材料が細切されて断片となる。ゲルは続いて膜の上に落ちる。膜上でゲルを処理し、ゲル材料中の分析物に対して分析またはその他の処理を行ってもよい。
2004518944.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中にメッシュ材を有するミンスチューブ（ｍｉｎｃｉｎｇ ｔｕｂｅ）を用いて半固体材料を細分する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）ミンスチューブのメッシュ材の上に半固体材料を置く段階；および、
（ｂ）ミンスチューブ、メッシュ、および半固体材料を遠心してメッシュに半固体材料を通過させ、これによって半固体材料を細分して断片にする段階。
【請求項２】
以下の段階をさらに含む、請求項１に記載の方法：
（ｃ）抽出溶液をミンスチューブに導入し、半固体材料から分析物を抽出する段階；
（ｄ）抽出溶液および半固体材料を含むミンスチューブをインキュベートする段階；ならびに、
（ｅ）細分された半固体剤材料から分析物を溶出する段階。
【請求項３】
抽出される分析物が高分子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抽出される分析物が、タンパク質、ペプチド、核酸、および炭水化物からなる群より選択される成分のうち少なくとも１つまたはそれ以上を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
メッシュ材がミンスチューブの管腔全体にわたり、かつ、メッシュ材がミンスチューブの上端から凹状となる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
以下の段階をさらに含む、請求項１に記載の方法：
（ｃ）抽出溶液をミンスチューブに導入し、半固体材料から１つ以上の分析物を抽出する段階であって、抽出溶液および１つ以上の分析物によって分析物溶液が生成される段階；ならびに、
（ｄ）分析物溶液を回収容器の中へ移送する段階であって、回収容器がその中に条件多孔質膜を有し、それによって分析物溶液が条件多孔質膜と接触状態になるような段階。
【請求項７】
以下の段階を含む、請求項６に記載の方法：
（ｅ）分析物溶液の一部または全部が条件多孔質材を通過するように、分析物溶液とともに回収容器を遠心する段階。
【請求項８】
条件多孔質材が、長鎖アルキル基、イオン交換基、短鎖カルボン酸塩またはスルホン酸塩、キレート基、およびボロン酸からなる群より選択される成分のうち１つ以上を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
条件多孔質材が、ポリ二フッ化ビニリデン膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、および／またはガラス繊維膜を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
半固体材料が電気泳動ゲルまたはその切片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
中に条件多孔質材を有する第一の処理チューブを用いて半固体材料を処理するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）第一の処理チューブ内で半固体材料を反応物と混合して、反応混合物を生成する段階；および、
（ｂ）反応混合物の一部または全部が条件多孔質材を通過するよう、第一の処理チューブを遠心する段階。
【請求項１２】
以下の段階をさらに含む、請求項１１に記載の方法：
（ｃ）第一の処理チューブが回収容器内にネスト化されるように第一の処理チューブを回収容器に入れる段階；および、
（ｄ）回収容器内の反応混合物を捕捉する段階。
【請求項１３】
以下の段階をさらに含む、請求項１２に記載の方法：
（ｅ）回収容器とネスト化させるための第二の処理チューブを提供する段階であって、第二の処理チューブが第二の条件多孔質材を含む段階；
（ｆ）第一の処理チューブを第二の処理チューブの中にネスト化し、かつ、第二の処理チューブを回収容器の中にネスト化する段階；
（ｇ）第一の処理チューブおよび第二の処理チューブを遠心する段階；ならびに、
（ｈ）回収容器内の反応混合物を捕捉する段階。
【請求項１４】
条件多孔質材がポリ二フッ化ビニリデン膜またはナイロン膜を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
第一の処理チューブが、マイクロタイタープレートと整列および嵌合するための処理チューブのアレイを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
第一の処理チューブが第一の処理チューブの管腔の第一の端にメッシュ材を含み、かつ、条件多孔質材が第一の処理チューブの管腔の第二の端に配置される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
反応物が条件多孔質材の上に配置され、かつ、反応物が、長鎖アルキル基、イオン交換基、抗体、短鎖カルボン酸塩またはスルホン酸塩、キレート基、およびボロン酸からなる群より選択される成分のうち１つ以上を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
半固体材料が電気泳動ゲルまたはその切片を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
中にメッシュ材を有するミンスチューブを用いて半固体材料を細分する方法であって、メッシュ材を通過した物質が回収容器に捕捉されるようにミンスチューブが回収容器内にネスト化されている、以下の段階を含む方法：
（ａ）ミンスチューブに半固体材料を入れる段階；ならびに、
（ｂ）半固体材料がメッシュ材によって細分されて断片になるまでミンスチューブおよび回収容器を遠心する段階。
【請求項２０】
以下の段階をさらに含む、請求項１９に記載の方法：
（ｃ）ミンスチューブの後、回収容器の前に直列にネスト化された処理チューブを提供する段階であって、処理チューブがその中に条件多孔質材を有し、かつ、条件多孔質材がメッシュ材と直列である段階。
【請求項２１】
条件多孔質材が、長鎖アルキル基、イオン交換基、抗体、ストレプトアビジン、短鎖カルボン酸塩またはスルホン酸塩、キレート基、およびボロン酸からなる群のうち１つ以上の成分を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
半固体材料を細分するための器具であって、以下を含む器具：
ミンスチューブ；および、
該ミンスチューブの中に配置されたメッシュ。
【請求項２３】
タンパク質または核酸を含み且つメッシュの上に配置された電気泳動ゲルまたはその切片をさらに含む、請求項２２に記載の器具。
【請求項２４】
ゲルのポリアクリルアミド濃度が１０％を超える、請求項２３に記載の器具。
【請求項２５】
メッシュが金属メッシュまたはポリマーメッシュを含む、請求項２２に記載の器具。
【請求項２６】
メッシュがステンレス鋼メッシュまたはナイロンメッシュを含む、請求項２５に記載の器具。
【請求項２７】
メッシュの穴のサイズが面積０．０１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２である、請求項２２に記載の器具。
【請求項２８】
メッシュの穴のサイズが実質的に均一である、請求項２７に記載の器具。
【請求項２９】
メッシュがミンスチューブの端を覆い、かつ該メッシュが平坦であるかまたは該ミンスチューブの内部へと凹状に突出する、請求項２２に記載の器具。
【請求項３０】
メッシュが、溶接、接着剤、または圧縮リングによってミンスチューブに固定される、請求項２２に記載の器具。
【請求項３１】
請求項２２に記載の器具および酵素溶液を含むキット。
【請求項３２】
請求項２２に記載の器具および器具の使用方法を説明した印刷物を含むキット。
【請求項３３】
請求項２２に記載の器具および予備のメッシュ材を含むキット。
【請求項３４】
請求項２２に記載の器具と、固定化抗体を含む粒子とを含むキット。
【請求項３５】
請求項２２に記載の器具と、中に条件多孔質メッシュ材を有する処理チューブとを含むキット。
【請求項３６】
ゲルからタンパク質および核酸を回収するための器具であって、以下を含む器具：
管腔を有するミンスチューブであって、
該管腔全体にわたる第一の条件多孔質材と、
該管腔全体にわたるメッシュ材とを含むミンスチューブ；ならびに、
該ミンスチューブに隣接して配置された回収容器であって、該ミンスチューブの内容物が該メッシュ材および該条件多孔質材を通過して該回収容器に流入するように配置された回収容器。
【請求項３７】
ミンスチューブが回収容器の中にネスト化される、請求項３６に記載の器具。
【請求項３８】
第二の条件多孔質材を含む処理チューブをさらに含む請求項３６に記載の器具であって、内容物がメッシュ材、第一の条件多孔質材、および第二の条件多孔質材を直列に通過するよう、該処理チューブが該ミンスチューブに隣接して配置される器具。
【請求項３９】
ミンスチューブが処理チューブの中にネスト化され、かつ、該処理チューブが回収容器の中にネスト化される、請求項３８に記載の器具。
【請求項４０】
ミンスチューブおよび処理チューブが、マイクロタイタープレートと整列および嵌合するためのチューブのアレイである、請求項３９に記載の器具。
【請求項４１】
内容物が抽出緩衝液およびタンパク質を含む、請求項３６に記載の器具。
【請求項４２】
第一の条件多孔質材が、固定化トリプシン、固定化キモトリプシン、固定化ペプシン、固定化パパイン、固定化炭素鎖、および固定化抗体のうち少なくとも１つを含む、請求項３６に記載の器具。
【請求項４３】
第一の条件多孔質材がポリ二フッ化ビニリデン膜またはナイロン膜を含む、請求項３６に記載の器具。
【請求項４４】
ミンスチューブが以下を含む、請求項３６に記載の器具：
メッシュを含む第一の部分；ならびに、
該ミンスチューブの内容物が該メッシュおよび第一の条件多孔質材を直列で通過するように、該第一の条件多孔質材を有する第二の部分。
【請求項４５】
第一の部分が第二の部分の中にネスト化され、かつ該第二の部分が回収容器の中にネスト化される、請求項４４に記載の器具。
【請求項４６】
第一の部分および第二の部分が、マイクロタイタープレートと整列および嵌合するためのチューブのアレイである、請求項４４に記載の器具。
【請求項４７】
チューブのアレイがマイクロタイタープレートである、請求項４６に記載の器具。
【請求項４８】
メッシュが金属メッシュまたは織物メッシュを含む、請求項３６に記載の器具。
【請求項４９】
メッシュがステンレス鋼メッシュまたはナイロンメッシュを含む、請求項４８に記載の器具。
【請求項５０】
メッシュの穴のサイズが面積０．０１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２である、請求項３６に記載の器具。
【請求項５１】
ゲルを細分および処理するための器具であって、以下を含む器具：
中にメッシュ材を有するミンスチューブ；および、
該ミンスチューブに接続された回収容器であって、中に条件多孔質材が配置された回収容器。
【請求項５２】
条件多孔質材に試薬が付着された、請求項５１に記載の器具。
【請求項５３】
付着する試薬が、固定化トリプシン、固定化キモトリプシン、固定化ペプシン、固定化パパイン、固定化炭素鎖、および固定化抗体のうち少なくとも１つを含む、請求項５２に記載の器具。
【請求項５４】
回収容器が、反転関係で、かつ取り外し可能にミンスチューブに接続される、請求項５１に記載の器具。
【請求項５５】
メッシュが金属メッシュまたは織物メッシュを含む、請求項５１に記載の器具。
【請求項５６】
メッシュがステンレス鋼メッシュまたはナイロンメッシュを含む、請求項５１に記載の器具。
【請求項５７】
メッシュの穴のサイズが面積０．０１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２である、請求項５１に記載の器具。
【請求項５８】
条件多孔質材がポリ二フッ化ビニリデン膜またはナイロン膜を含む、請求項５１に記載の器具。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ゲル電気泳動は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ポリペプチド、およびタンパク質などの生物学的分子を分離するための一般的な手法である。ゲル電気泳動では、かけられた電場によって分子が濾過ゲル内を移動する速度に従って、分子がバンドに分離される。
【０００２】
この技術で使用される基本的な器具は、しばしばガラス管内に封入されるかまたはガラスもしくはプラスチックの板の間にスラブとして挟まれるゲルで構成される。ゲルは、細孔を規定するオープンな分子ネットワーク構造を有し、細孔は導電性の緩衝塩類溶液で飽和される。ゲル内のこれらの細孔は、移動する高分子が通過できるだけ十分に大きい。
【０００３】
ゲルは、ゲルと電源の陰極および陽極との間の電気的接触をつくる緩衝溶液と接触した状態でチャンバ内に置かれる。高分子と追跡用色素とを含む試料がゲルの上に置かれる。ゲルに電位が印加され、これによって試料の高分子と追跡用色素とがゲル下部に向かって移動する。この電気泳動は追跡用色素がゲルの端に到達する直前に停止される。次に、分離した高分子のバンドの位置が決定される。追跡用色素および移動度が既知である高分子に対して特定のバンドの移動距離を比較することによって、他の高分子の移動度を決定することができる。次に、高分子のサイズを計算するかまたは異なるサイズの高分子をゲル内で分離することができる。
【０００４】
電気泳動には広範なゲル形成材料が使用される。タンパク質、ペプチド、および小さな核酸などの分子量が小さい材料の分離には、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびその他の関連ポリマーが好まれる。逆に、大きい分子には、アガロース、酢酸セルロース、およびデンプンが好まれる。これらのゲル材料は典型的には水性系と相溶性であるが、中には非水性溶液とも相溶性であるものもある。
【０００５】
ゲル材料を所望の物理的形状に形成するには、選択した材料に応じて種々の技術が用いられる。アガロースまたはゼラチンの場合、ポリマーを加熱して液体にするのが一般的な方法である。次にこの溶液を型に流し入れ、冷却により重合させる。ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびその他の関連ポリマーは、過硫酸アンモニウムおよびテトラメチルエチレンジアミンを用いたフリーラジカル誘導型重合を含む種々の手段により化学的に重合させることができる。
【０００６】
ゲル電気泳動に伴う一般的な問題点は、タンパク質、核酸、またはその他の関心対象分析物を他の化合物から分離した後、それをゲルから取り出すのが困難であるという点である。ゲルマトリックスの細孔サイズは非常に小さいため、起電力によってマトリックス内に引き込まれた後の大きな分子は容易にゲルから外へ拡散しない。タンパク質も、起電力が存在しない場合はゲルマトリックス内に容易に拡散しない。タンパク質の分子量が大きいほど、その分子をゲル内へまたはゲルから外へ拡散させるのが困難になる。したがって、分子をゲルから抽出するまたはゲル内に導入できるようゲルを調整する技術が開発されている。
【０００７】
最新技術としては、ふるいを用いてゲルを細分する手法が含まれる。Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ ＥｃｋｅｒｓｋｏｒｎおよびＲｕｄｏｌｆ Ｇｒｉｍｍは、注射筒の端に取り付けたステンレス鋼のふるいを用いたゲルの細分について説明している。Ｂ． Ｒａｄｏｌａ（編）， 電気泳動フォーラム ’９１（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｆｏｒｕｍ ’９１）， Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍｕｎｉｃｈ， １９９１， ｐｐ． ５０１−５０６に記載されているように、ＥｃｋｅｒｓｋｏｒｎおよびＧｒｉｍｍは自身らの技術がＪ． ＨｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎおよびＲ． Ｄｅｒｎｉｃｋによるものとしている。別の文献Ｊ． Ｌｉｌａ Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９９； ２０： ７３２−７３７では、タンパク質を取り出してさらなる分析に供するため、ステンレス鋼のふるい分けスクリーンを使用してゲルを細分している。この文献では、この発案がＥｃｋｅｒｓｋｏｒｎおよびＧｒｉｍｍ、ならびにＨｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎおよびＤｅｒｎｉｃｋによるものとしている。Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａらは注射筒の狭いほうの端にステンレス鋼のふるい分けスクリーンを取り付け、プランジャーの圧力を利用してゲルをスクリーンに通過させた。
【０００８】
しかし、このアプローチには重大な欠点がある。第一に、注射器の費用が大きく、多数のゲルを同時に処理する場合は特に注射器の費用が大きくなる。この費用の一部は、注射器が注射筒、プランジャー、およびガスケットを含む複数の部品で構成されていることに起因する。第二に、ユーザーはプランジャーの操作により手動でゲルをメッシュに通過させなければならない。この技術は非常に労働集約的であり、かつ自動化に適さない。第三に、プランジャーにより印加される力はメッシュ最上部で止まるため、プランジャーではすべてのゲルをきれいにメッシュに通過させることができない。
【０００９】
例えば分離用の濾過膜など種々の目的の障壁に材料を通過させるうえで遠心力が有用であることを他の研究者らが示している。例えば、Ｗｉｌｓｏｎの米国特許第３，５８３，６２７号には、ネスト状にした２つのチューブの上側の端にフィルターを固定し、かつ、チューブを回転させて高分子を残したまま溶媒をフィルターに通過させることによって、溶液中の高分子量の物質を濃縮する方法が記載されている。この基本原理を用いて高分子を濃縮する例は、例えばＢｏｗｅｒらの米国特許第４，６３２，７６１号など数多くある。しかし、これらの装置および方法は溶液の濾過を目的として設計されたものであり、半固体のゲルまたはその他の物質の切り出しまたは細分には適していない。
【００１０】
さらに、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄのミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は現在、ゲル断片の細切用として、製品番号４２６００「ＤＮＡ抽出用ウルトラフリーＤＡ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ＤＡ）」を販売している。この製品にも複数の欠点がある。第一に、この製品はネスト状のチューブセットを使用しており、上側チューブの基部には、チューブセットを回転させたときにゲルを細切することを意図したプラスチック製の突出部が成形されている。しかし、実際には、得られる細切ゲルには大きく且つサイズの不均一なゲル片が含まれ、このため抽出の効率および信頼性が低くなるため、これらの突出部はうまく機能しない。第二に、このミリポア製の装置は主としてアガロースゲル用として推奨されており、ポリアクリルアミドゲルにも使用できるものの、ポリマーの最大重量濃度が１０％に制限されている。分子量の非常に小さいペプチドおよびタンパク質の分離には１２％、１５％、１８％、またはそれ以上のポリマー重量濃度を必要とすることが多く、ポリマーの重量濃度が１０％未満のゲルでは、通常、これらのペプチドおよびタンパク質を効率的に分離することができない
【００１１】
したがって、種々の分子のゲルからの抽出または逆にゲル内への導入を容易にするため、簡単に、効率的に、高い信頼度で、かつ安価にゲルを細切する方法が求められている。特に、例えばヒトゲノムプロジェクトならびに遺伝子同定および遺伝子産物発現のための次のプロジェクトなどを通じて、ますます多くの分析物が研究に利用できるようになってきており、これに伴って、こうした抽出または導入をハイスループットかつ自動的な形式で実施することが求められている。
【００１２】
本発明の説明の大部分はゲルからタンパク質を取り出すことに関連するが、ゲルから他の分子を取り出すことも関心対象であることが多い。当業者は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸のように一般的に電気泳動に供される他の分子に対して、本明細書に記載の技術を容易に適用できると思われる。
【００１３】
発明の概要
本発明は、タンパク質、核酸、または他の関心対象の分析物を含むゲルを、小さく且つサイズの均一な断片に細切する簡便な方法であって、ゲル内への試薬の拡散またはゲル外への分析物の拡散を容易にする方法を提供する。１つの態様において、本発明の器具は、メッシュまたは格子の障壁を組み込んだ遠心チューブで構成される。チューブを回転させて遠心力によって引かれたゲルを障壁に通過させ、これによってミンスチューブ（ｍｉｎｃｉｎｇ ｔｕｂｅ）の形態をとる。メッシュまたは格子は、好ましくは、小さく且つ、製造ロットのロット内および異なるロット間で均一な穴間隔を有する。
【００１４】
メッシュ材はチューブ端全体にわたる。ミンスチューブを用いてゲルを細切するには、メッシュ材およびチューブの上にゲルを置く。メッシュ材およびゲルを遠心機で回転させると、メッシュ材を通過してゲルが引かれ、これによりゲルは概ね均一な小さい断片に細切される。
【００１５】
メッシュ材はネスト化チューブ（ｎｅｓｔｉｎｇ ｔｕｂｅ）の形態でチューブに固定されていてもよい。ネスト化チューブは回収容器の開口部内でネスト化する。または、メッシュ材は、ネスト化チューブ内で条件多孔質膜と直列に配置されていてもよい。ネスト化チューブおよび回収容器を遠心にかけることにより、ゲル材料をメッシュ材に通過させて細切し断片にする。ゲルは続いて膜の上に落ちる。このゲルを膜上で処理してゲル材料内の分析物を抽出するかまたはその他の処理を行ってもよい。
【００１６】
別の態様においては、ネスト状になったセットの１つの部分がゲル細分用のメッシュ材を含むような部分またはセグメントを遠心チューブが含んでいてもよい。別の部分は多孔質膜または条件多孔質膜を提供する。別の部分は、膜によって保持されるか、または疎水性の相互作用によってタンパク質を結合するよう誘導された膜を用いることによって保持される、逆相捕捉材料を提供する。別の部分は多量のタンパク質を捕捉するための固定化抗体を提供する。複数の種類のこのような固定化抗体を、ネスト化用の個別のセグメントとして提供してもよく、または単一セグメント内に組合せて提供してもよい。最後のセグメントは、遠心力によってカラム内を通過した液体を受けるためのレセプタクルまたは回収容器であってもよい。
【００１７】
本発明は、ゲル細分化の過程を単純かつ自動化に適した状態にするという点で特に利点を有する。しばしば、アミノ酸配列決定などのさらなる分析を行うために非常に多くの試料を処理しなければならないことがある。本発明の装置および方法により、抽出の前にスパーテルを用いてゲルを刻むまたは破砕するなどの甚大な手作業が回避される。
【００１８】
本発明の１つの利点は、タンパク質もしくはその他の分析物をゲルから溶出する、または試薬をゲル内に均一に分散させるために必要な時間を大幅に短縮できることである。この利点が得られる理由は、本発明により非常に細かく細切されたゲルが得られることにある。タンパク質またはその他の分析物はゲルマトリックスから外へ拡散しなければならないため、拡散距離が長くなるほど抽出に要する時間が長くなる。したがって、非常に細かく細切されたゲルであれば、例えばタンパク質がゲルの内外へ迅速に拡散される。
【００１９】
さらに、本発明によりゲル断片の厚さが均一となり、これによって、試薬がゲル内へとまたはゲルの外へと拡散する距離が均一となる。細分されたゲルの断片に試薬が浸透するのに必要な時間またはゲル断片から外へと物質が拡散するのに必要な時間が均一となりかつ再現性を有するのは、断片のサイズが均一でありかつ再現性を有する場合に限られる。手作業で細分したゲルにはこの均一性がなく、したがって、ゲルから外へ拡散する例えばタンパク質の量にばらつきが生じ、その結果以後の特徴決定の結果が不均一となる。多くの場合、ゲル試料に含まれる以後の特徴決定に利用できるタンパク質の量は非常に少ないため、ゲルマトリックスからの溶出の均一性および効率性は非常に重要である。
【００２０】
したがって、本発明の方法および装置は複数の利点を提供する。第一に、Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎらが説明している注射器は遠心チューブよりはるかに費用がかかる。第二に、本発明で説明する遠心法は、注射器／プランジャー・メッシュ装置を使用する方法と比較してより容易かつ安価に自動化に適合できる。第三に、小さなゲル断片に遠心力を与えることにより、断片をふるいに完全に通過させかつ回収チューブへと引き込むことができ、これにより、圧力による力が除去された後に注射器メッシュ内にゲル材料が残存するという従来技術の問題点が解決される。ゲル細分用の成形突出部を有するミリポア社の製品（製品番号４６２００）とは対照的に、本発明のふるいのアプローチではより小さくかつより均一なゲル断片が得られ、その結果、分析物の抽出がより効率的かつ高信頼性となる。本発明はまた、遠心力により効率的にゲルをふるいメッシュ材に通過させることができるため、ミリポア社の製品と異なりポリアクリルアミド濃度が１０％を超えるゲルでも細分する。
【００２１】
別の特定の態様において、本発明の方法および器具は、ポリアクリルアミド濃度が約３％〜１０％、約５％〜１０％、約１０％〜１１％、約１０％〜１２％、約１０％〜１５％、約１０％〜１８％、約１０％〜２０％、約１２％〜１５％、約１２％〜１８％、約１２％〜２０％、約１５％〜１８％、約１５％〜２０％、および約１８％〜２０％であるゲルの細分に使用される。同様に、他の特定の態様において、本発明は他の任意の種類のゲルを細分し、ゲルの種類にはアガロースゲルが含まれるがこれに限定されることはない。
【００２２】
本発明の１つの局面において、内部にメッシュ材を有するミンスチューブを用いて半固体材料を細分する方法は、以下の段階を含む：半固体材料をミンスチューブのメッシュ材上に置く段階；ならびに、ミンスチューブ、メッシュ、および半固体材料を遠心してメッシュに半固体材料を通過させ、これにより半固体材料を細分して断片にする段階。さらなる段階として以下が含まれていてもよい：ミンスチューブに抽出溶液を導入し、半固体材料から分析物を抽出する段階；抽出溶液と半固体材料とを含むミンスチューブをインキュベーションする段階；ならびに、細分した半固体材料から分析物を溶出する段階であって、溶出された分析物が高分子であってもよく、または選択的にタンパク質、ペプチド、核酸、および炭水化物のうち少なくとも１つもしくはそれ以上であってもよい段階。さらに、メッシュ材はミンスチューブの管腔全体にわたっていてもよく、かつ、メッシュ材はミンスチューブの上端に対して凹状であってもよい。
【００２３】
さらなる段階として以下が含まれていてもよい：ミンスチューブに抽出溶液を導入し、半固体材料から分析物を抽出する段階であって、抽出溶液および分析物によって分析物溶液が生成される段階；ならびに、分析物溶液を回収容器に移送する段階であって、回収容器がその内部に条件多孔質材を有し分析物溶液が条件多孔質材と接触状態にあってもよい段階。さらに方法は、分析物溶液の一部または全部が条件多孔質材を通過して流れるよう分析物溶液とともに回収容器を遠心する段階であって、条件多孔質材が、長鎖アルキル基、イオン交換基、短鎖カルボン酸塩もしくはスルホン酸塩、親和基（例えば抗体）、ストレプトアビジン、キレート基、またはボロン酸からなる群より選択される１つ以上の成分を含む段階を含んでいてもよい。方法の１つの局面では、条件多孔質材はポリ二フッ化ビニリデン膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、および／またはガラス繊維膜であってもよく、かつ、半固体材料は電気泳動ゲルまたはその一部であってもよい。
【００２４】
本発明の別の局面において、内部に条件多孔質材を有する第一の処理チューブを用いて半固体材料を処理する方法は以下の段階を含む：第一の処理チューブ内で半固体材料を反応物と化合させて反応混合物を生成させる段階；ならびに、反応混合物の一部または全部が条件多孔質材を通過するよう、第一の処理チューブを遠心する段階。方法は、第一の処理チューブを回収容器に入れる段階であって第一の処理チューブが回収容器内にネスト化してもよい段階；ならびに、回収容器内の反応混合物を捕捉する段階をさらに含んでいてもよい。もしくは、方法は以下の段階をさらに含んでいてもよい：回収容器とともにネスト化するための第二の処理チューブを提供する段階であって、第二の処理チューブが第二の条件多孔質材を含む段階；第一の処理チューブを第二の処理チューブ内にネスト化し、かつ、第二の処理チューブを回収容器内にネスト化する段階；第一の処理チューブおよび第二の処理チューブを遠心する段階；ならびに、回収容器内の反応混合物を捕捉する段階。条件多孔質材は、ポリ二フッ化ビニリデン膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、および／またはガラス繊維膜であってよく、かつ、方法の１つの局面において、第一の処理チューブは、マイクロタイタープレートと整列および嵌合するための処理チューブアレイであってもよい。第一の処理チューブは第一の処理チューブの管腔の第一の端にメッシュ材を有していてもよく、かつ、条件多孔質材は第一の処理チューブの管腔の第二の端に配置されていてもよい。反応物は条件多孔質材上に配置されていてもよく、かつ、反応物は、長鎖アルキル基、イオン交換基、短鎖カルボン酸塩もしくはスルホン酸塩、親和基（例えば抗体）、ストレプトアビジン、キレート基、またはボロン酸からなる群より選択される１つ以上の成分を含んでいてもよい。さらに、半固体材料は電気泳動ゲルまたはその一部であってもよい。
【００２５】
本発明の別の局面は、内部にメッシュ材を有するミンスチューブを用いて半固体材料を細分する方法であって、メッシュ材を通過する物質が回収容器内に捕捉されるようにミンスチューブが回収容器内にネスト化していてもよい方法であって、以下の段階を含む方法を含む：半固体材料をミンスチューブに入れる段階；ならびに、半固体材料がメッシュ材によって細分され断片になるまでミンスチューブおよび回収容器を遠心する段階。方法は以下の段階をさらに含んでいてもよい：ミンスチューブの後、回収容器の前に直列にネスト化する処理チューブを提供する段階であって、処理チューブがその中に配置された条件多孔質材を含み、かつ条件多孔質材がメッシュ材と直列である段階。さらに、条件多孔質材は、長鎖アルキル基、イオン交換基、短鎖カルボン酸塩もしくはスルホン酸塩、親和基（例えば抗体）、ストレプトアビジン、キレート基、またはボロン酸からなる群のうち１つ以上を含んでいてもよい。
【００２６】
半固体材料を細分するための器具は以下を含んでいてもよい：ミンスチューブ；ならびに、ミンスチューブ内に配置されたメッシュであって、ミンスチューブに遠心力が印加された場合にミンスチューブ内のメッシュの片側に置かれた半固体材料が引かれて通過するようなメッシュ。半固体材料は電気泳動ゲルまたはその一部であってもよく、かつ、タンパク質または核酸を含んでいてもよい。さらに、ゲルのポリアクリルアミド濃度は１０パーセントを超えていてもよく、または１０パーセント未満であってもよい。装置のメッシュは、ステンレス鋼メッシュまたはナイロンメッシュなど、金属またはポリマーのメッシュであってもよい。メッシュの穴のサイズは０．０１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２であってもよく、かつ、メッシュの穴のサイズは実質的に均一であってもよい。メッシュはミンスチューブの一端を覆っていてもよく、かつ、平らであってもまたはミンスチューブ内に凹状に突出していてもよい。メッシュは溶接、接着剤、または圧縮リングによってミンスチューブに固定されていてもよい。
【００２７】
器具は、以下を含むキットであってもよい：緩衝溶液（１つ以上の酵素などの抽出試薬を１つ以上含んでいても含んでいなくてもよい）、器具の使用方法が印刷された説明書、予備のメッシュ材、固定化抗体で処理されたまたは固定化抗体に付加された粒子、および、内部に条件多孔質メッシュ材を有する処理チューブ。
【００２８】
ゲルからタンパク質および核酸を回収するための器具の別の態様は以下を含む：管腔を有するミンスチューブであって、管腔全体にわたる第一の条件多孔質材と管腔全体にわたるメッシュ材とを有するミンスチューブ；ならびに、ミンスチューブの内容物がメッシュ材および条件多孔質材を通過して回収容器に入るようミンスチューブに隣接して配置された回収容器。ミンスチューブは回収容器内にネスト化していてもよい。さらに器具は、第二の条件多孔質材を含む処理チューブであって、内容物がメッシュ材、第一の条件多孔質材、および第二の条件多孔質材を直列に通過するよう、ミンスチューブに隣接して配置された処理チューブを含んでいてもよい。ミンスチューブは処理チューブ内にネスト化していてもよく、かつ、処理チューブは回収容器内にネスト化していてもよい。本発明の１つの局面において、ミンスチューブおよび処理チューブは、マイクロタイタープレートと整列および嵌合する処理チューブアレイである。器具の内容物は抽出緩衝溶液およびタンパク質を含んでいてもよい。さらに、第一の条件多孔質材は、固定化酵素（例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパインなどのプロテアーゼ）、固定化炭素鎖、および固定化抗体のうち１つ以上を含んでいてもよい。第一の条件多孔質材は、ポリ二フッ化ビニリデン膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、および／またはガラス繊維膜であってもよい。１つの局面において、ミンスチューブは以下を含んでいてもよい：メッシュを含む第一の部分；ならびに、第一の条件多孔質材を含む第二の部分であって、ミンスチューブの内容物がメッシュおよび第一の条件多孔質材を直列に通過するような部分。第一の部分は第二の部分内にネスト化していてもよく、かつ第二の部分は回収容器内にネスト化していてもよい。第一の部分および第二の部分は、マイクロタイタープレートと整列および嵌合するチューブアレイであってもよい。メッシュ材は、穴のサイズが０．０１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２のステンレス鋼メッシュまたはナイロンメッシュである、金属または織物のメッシュであってもよい。
【００２９】
ゲルを細分および処理するための器具の別の態様は以下を含む：内部にメッシュ材を有するミンスチューブ；ならびに、ミンスチューブに接続された回収容器であって、回収容器内に条件多孔質材が配置された回収容器。条件多孔質材に試薬を付着させてもよく、試薬は、固定化トリプシン、固定化炭素鎖、および固定化抗体のうちの１つであってもよい。回収容器は、反転関係で、取り外し可能にミンスチューブに接続されていてもよい。メッシュは、穴のサイズが０．０１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２であるステンレス鋼メッシュまたはナイロンメッシュなどの、金属または織物のメッシュであってもよい。条件多孔質材は、ポリ二フッ化ビニリデン膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、および／またはガラス繊維膜であってもよい。
【００３０】
本明細書に記載の本発明の特徴および利点は、添付の図面に示されているように、本発明の好ましい態様のより具体的な説明により明らかになると思われる。
【００３１】
発明の詳細な説明
以下に、添付の図面を参照しながら本発明の好ましい態様を説明する。なお、図面中において、類似の番号は同一または機能的に類似の要素を示す。当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく他の構成および配置も用いられ得ることが理解されるものと思われる。さらに、電気泳動ゲルまたはその一部の細分化および処理について本発明を説明するが、材料がメッシュまたはスクリーン材料を通して細分できるものである限り、本発明はいかなる半固体材料にも適用可能である。さらに、本発明の説明は主としてゲルからのタンパク質回収について説明したものであるが、本発明は他の物質の回収にも使用可能であり、このような物質としては核酸、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および炭水化物、ならびにその組合せ（例えば糖タンパク質、プロテオグリカン、核酸、ペプチド−核酸複合体など）が含まれるがこれらに限定されることはない。または、本発明は任意の高分子の回収にも使用可能である。
【００３２】
本明細書において、「高分子」とは、特定のサイズ（下記参照）より大きいかまたは特定の数より多い単量体単位（下記参照）を含む、重合性または非重合性の分子を指す。非重合性高分子の分子量は典型的に約１０，０００ダルトンを超える。また、タンパク質などの重合性高分子は典型的に２５を超えるアミノ酸を含む。核酸などの重合性高分子は典型的に４０を超えるヌクレオチドを含む。多重結合性炭水化物などの重合性高分子は典型的に１０を超える個別の糖単量体を含む。上記以外の重合性高分子は当業者には明らかであると考えられ、上述の重合性分子の組合せ（例えばペプチド−核酸）を含んでいてもよい。「高分子」という語には、分析物の抽出源である特定のゲル（例えば、アガロース、ポリアクリルアミドなど）の分子は含まれない。
【００３３】
本明細書において、「ペプチド」とは２５個以下のアミノ酸からなるポリマーを指す。
【００３４】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」とは４０個以下のヌクレオチドからなるポリマーを指す。
【００３５】
本明細書において「精製された」という語が特定の分子に対して使用される場合、この語は、分子が少なくともいくつかの周辺混入物質から分離されていることを意味する。混入物質には、精製される分子と通常関連性がある分子が含まれる。例えば、細胞内分子は、細胞内で通常その分子とともに存在する核酸分子およびタンパク質分子のうち少なくともいくつかと分離された場合、精製されたという。当業者に認識されると思われるが、「精製された」という語は相対的なものであり、かつ、本質的に、ある分子と通常関連性がある他の分子に対してその分子の濃度が上昇することを意味する。例えば、タンパク質の混合物を分子量カラムに通過させると、特定のタンパク質（すなわち精製されるタンパク質）の希釈と、元の混合物中に存在する他のタンパク質に対するこのタンパク質の濃度上昇とが生じる可能性がある。したがって、一般的に、「精製された」という語は、精製をもたらす処理に供された分子が緩衝溶液などの試薬または水などの化合物から分離されるということを意味するものではない。
【００３６】
本明細書において「単離された」という語が特定の分子に対して使用される場合、この語は、分子が実質的にすべての周辺混入物質から分離されていることを意味する。したがって「単離された」という語は、単離された分子が、もともと存在していた混入物質の量に対して少なくとも９５％純粋であることを意味する。換言すると、単離された分子は、周辺混入物質の少なくとも９５％から分離された状態にある。
【００３７】
本発明は、それ自体自動化に寄与する安価な方式でゲルを細分するためにふるい分けスクリーンを使用する。ゲルを均一な小さい断片に細分するため、金属メッシュ材または織物メッシュ材のスクリーンが使用可能である。スクリーンは０．０１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２の開口部を有していてもよい。好ましくは、各開口部の面積は０．０９ ｍｍ２〜０．３６ ｍｍ２である。開口部の形状は、正方形、長方形、楕円形、円形、三角形、またはこれらの変形を含め、任意の形状であってよい。特定の態様において、開口部の形状に関わらず、開口部の面積は約０．０１ ｍｍ２〜０．１ ｍｍ２、約０．０１ ｍｍ２〜１ ｍｍ２、約０．０１ ｍｍ２〜２ ｍｍ２、約０．０１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２、約０．０１ ｍｍ２〜５ ｍｍ２、約０．１ ｍｍ２〜１ ｍｍ２、約０．１ ｍｍ２〜５ ｍｍ２、約０．１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２、約１ ｍｍ２〜５ ｍｍ２、約１ ｍｍ２〜９ ｍｍ２、および約５ ｍｍ２〜９ ｍｍ２である。
【００３８】
粒子をそのサイズによって分離するために使用される金属ふるいなどのスクリーン、および、ナイロンメッシュなどの織物は、開口部が０．０９ ｍｍ２未満〜０．３６ ｍｍ２以上であり且つ多数の製造ロットにわたって極めて均一なものが市販されている。これらのスクリーンおよび織物は多数の供給業者から入手可能であり、このような供給業者としては例えばマクマスター・カール（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ、カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｆｅ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＣＡ ９０６７０−２９３２）があるがこれに限定されることはない。このような材料は、ステンレス鋼またはナイロンなど適切な材料で作られた場合は非常に不活性となりうる。ゲルは、機械的な力によりこれらの材料を通過する際に、均一な厚さを持った非常に小さな断片となる（Ｊ． Ｌｉｌａ Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９９； ２０：７３２−７３７）。
【００３９】
装置は、メッシュ材を通した遠心により得られたゲル断片からの溶出によってインタクトなタンパク質を捕捉するために使用できる。従来、ゲルからのタンパク質の取り出しは電気溶出によって行われていた。これは、ゲルに電流を流し、本来ゲル内でタンパク質を分離させる機序と同じ機序によってタンパク質を取り出すという方法である。参考文献としては、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ， Ｍ．Ｗ．ら、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」， Ｃ．Ｈ．Ｗ． ＨｉｒｓおよびＳ．Ｎ． Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｖｏｌ． ９１， ｐ．２２７がある。しかし、ゲルが非常に小さい要素に細分されている場合は、タンパク質の大部分を直接溶出することが可能になる。この方法により溶出されたタンパク質は自動シーケンサーを用いて配列決定することができ、自動シーケンサーとしては、例えばベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）またはアプレラ（Ａｐｐｌｅｒａ， Ｉｎｃ．）などの製造業者から市販されているものなどがある。
【００４０】
図１に、ゲルを細分して断片にするためのゲルミンス器具１００の１つの態様を示す。器具１００はゲルミンスチューブ１０２、および、スクリーンまたはメッシュ材１０４を含む。図１に示すように、ミンスチューブ１０２はプラスチック製遠心チューブであってもよい。ミンスチューブ１０２は、内部の空洞１１４を形成する開放端１０８と閉鎖端１１０とを有する。ミンスチューブ１０２は、開放端と閉鎖端とを有しそれによって液体を保持できるような、ボウル、皿、バケツ、または任意の容器であってよい。後述の別の態様について説明しているように、ミンスチューブは、間に管腔を有する２つの開放端を有していてもよい。本図に示す態様において、ミンスチューブ１０２は、閉鎖端１１０が円錐形である点においてエッペンドルフ遠心チューブに似た形状である。
【００４１】
メッシュ材１０４はミンスチューブ１０２の開放端１０８全体にわたる。図１に示すように、メッシュ材１０４はミンスチューブ１０２の縦軸に対して垂直であってもよく、または、チューブ端１１２から空洞１１４内へと突出する凹形状であってもよい。メッシュ材１０４はチューブ端１１２の上に取り外し可能に置かれていてもよく、または、チューブ端１１２に固定されていてもよい。遠心処理中、メッシュ材１０４にかかる力によってメッシュが空洞１１４内を閉鎖端１１０の方向へ進むことがないよう、メッシュ材１０４はミンスチューブ１０２に固定されていなければならない。
【００４２】
ゲルミンス器具１００を使用してゲルを細分するには、空洞１１４上方のメッシュ材１０４の上にゲル１０６を置く。ゲル１０６は任意のゲルであってよいが、好ましくは電気泳動ゲルまたはその一部である。ミンスチューブ１０２、メッシュ材１０４、およびゲル１０６を遠心機内で回転させて、ゲルが細分されて小さい断片となるようゲル１０６をメッシュ材１０４に均一に通過させる。ゲル１０６をメッシュ材１０４の上に載せたときにゲルを散乱させることなくチューブを遠心機内に置けるように、メッシュ材１０４をミンスチューブ１０２の開放端１０８に固定してもよい。
【００４３】
メッシュ材１０４は、機械力によってその場に保持されるよう、ミンスチューブ１０２に挿入してもよい。具体的には、ステンレス鋼のメッシュ材片を、ミンスチューブ上部の直径の約２倍になるように切断してもよい。ミンスチューブの開口部より上にあるメッシュの部分はミンスチューブ内へと押され、したがってメッシュはやや凹状となり開口部内へと突出する。ミンスチューブ１０２の開口部の外側に出ているメッシュ１０４の端はメッシュをその位置に保持するため曲げられていてもよい。細切するゲル試料１０６をミンスチューブの空洞１１４の上方の凹面に置き、アセンブリ全体を遠心処理に供する。メッシュをその位置に保持するための別の方法としては、接着、溶接、または、メッシュがミンスチューブの空洞内に吊り下がるようにミンスチューブ上部にメッシュを固定するその他の方法が含まれるが、これらに限定されることはない。ナイロンメッシュなど柔軟なメッシュを使用する場合、ミンスチューブ上部にメッシュを固定することは有用である。後述のように、ミンスチューブは、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）、ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ、ニューヨーク州Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）、フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルベニア州Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）およびその他の製造業者から入手可能な遠心チューブから作成してもよい。
【００４４】
ミンスチューブ１０８の代わりに、内部にメッシュ材が配置されたマイクロタイタープレートを使用してもよい。このようにマイクロタイタープレートを使用することにより、ハイスループットが実現でき、かつ、複数のゲル片を効率的に細切することが可能になる。
【００４５】
図２に、ゲルミンス器具２００の別の態様を示す。この態様において、メッシュ材２０４はネスト化ミンスチューブ（ｎｅｓｔｉｎｇ ｍｉｎｃｉｎｇ ｔｕｂｅ）２０８の基部に固定されている。メッシュ材２０４は、接着剤もしくは溶接によってネスト化ミンスチューブ２０８に固定してもよく、圧縮リングによってネスト化ミンスチューブ２０８の周囲に結び付けてもよく、または、当業者に周知の他の任意の手段により取り付けてもよい。または、ミンスチューブ２０８がチューブ管腔内に形成された段を有していてもよく、かつ、メッシュ材２０４が段の上で管腔全体にわたって嵌め込まれていてもよい。
【００４６】
ネスト化ミンスチューブ２０８の外形は回収容器２０２の内径より小さく、かつ、ネスト化ミンスチューブ２０８は回収容器２０２の空洞２１４の中に取り外し可能な状態で置かれる。好ましい態様において、回収容器２０２は、図１を参照して上記に説明したミンスチューブ１０２と同様の遠心チューブである。ネスト化ミンスチューブ２０８の上端周囲には縁２１６が配置され、縁２１６は回収容器２０２の内径より大きい直径となるようネスト化ミンスチューブ２０８の上端から放射状に突出する。したがって縁２１６は、ネスト化ミンスチューブ２０８を回収容器２０２の中に固定し、遠心処理中にネスト化ミンスチューブ２０８が空洞２１４の中へと突出できる距離を制限し、かつ、回収容器２０２からネスト化ミンスチューブ２０８を取り出す際には便利な把持点として機能する。ネスト化ミンスチューブ２０８および回収容器２０２は、好ましくは不活性なプラスチック材料で形成される。しかし、当業者には明らかであるように、ネスト化チューブ２０８および回収容器２０２は任意のプラスチック、金属、またはその他の材料で形成してよい。
【００４７】
ネスト化ミンスチューブ２０８は使用中、回収容器２０２の内部に都合よくネスト化する。同様に、所望される場合は、後述のようにゲル試料の処理をさらに補助するため、ユーザーは回収容器２０２からネスト化ミンスチューブ２０８を取り出してもよい。本図において、ネスト化ミンスチューブ２０８が有するメッシュ材２０４はネスト化チューブの一端に配置されているが、メッシュ材２０４は、中央の領域または図２に示されているのと反対側の端部でネスト化ミンスチューブ２０８に取り付けられていてもよい。好ましくは、ゲル２０６を飛散させることなくメッシュ材２０４の上に置くことができるよう、メッシュ材２０４は、図に示すように下端部か、または中央の領域のどこかに配置される。
【００４８】
図２で開示したネスト化チューブは、例えばミリポア社および他の製造業者によって製造されている、濃縮用または限外濾過用に使用される標準的な遠心ネスト化チューブセットを改変することによって作成してもよい。ネスト化チューブを作成する１つの方法は、標準的なネスト化チューブの下部を限外濾過膜の領域で切断し、かつ、メッシュ材を、接着するかまたはネスト化チューブのプラスチックを溶かしてメッシュ材をネスト化チューブに溶接することによって取り付ける。次に、ネスト化チューブを標準的なネスト化チューブセットの遠心チューブに入れてもよく、ゲル試料をネスト化チューブ内のメッシュ上に置いてもよく、かつ、このネスト状になった組を遠心機で回転させてもよい。次に、細分されたゲル断片が遠心チューブ内に回収される。遠心チューブ内でこの断片をさらなる処理に供してもよい。
【００４９】
図３Ａ〜３Ｄに、図２のゲルミンス器具を使用してゲルから試料を抽出する過程を示す。図３Ａは、ネスト化ミンスチューブ２０８、メッシュ材２０４、および回収容器２０２を含む図２のゲルミンス器具２００である。使用においては、ゲル２０６がミンス器具２００のネスト化ミンスチューブ２０８の中に置かれる。ゲル２０６が遠心力により引かれてメッシュ材２０４を通過し空洞２１４に入るまで、器具２００が遠心処理に供される。図３Ｂに示すように、ゲル２０６は、メッシュ材２０４を通過する際、実質的に同様のサイズの複数の断片３１０に細分される。
【００５０】
図３Ｃに示すように、遠心によってメッシュを通過させてゲルを細分した後、抽出緩衝溶液３１２を回収容器２０２に導入してもよい。本発明は抽出緩衝溶液の使用とともに説明しているが、溶液は緩衝溶液でなくてもよく、任意の抽出溶液であってよい。したがって、抽出緩衝溶液３１２は緩衝剤を含んでいても含んでいなくてもよい。抽出緩衝溶液３１２を、ネスト化ミンスチューブ２０８の管腔に通過させ、かつメッシュ材２０４に通過させて回収容器２０２に流入させてもよい。一般的に抽出緩衝溶液は、その後の凍結乾燥が容易となるような、重炭酸アンモニウムなどの揮発性の塩を用いて調製される。しかし、当業者に明らかであるように、任意の標準的な抽出溶媒を使用してよい。抽出緩衝溶液３１２を導入した後、細分されたゲル試料をインキュベートしてもよい。溶出効率は、分析物の分子量、ゲル単位重量あたりのポリマーの量、およびゲル断片のサイズによって異なるため、インキュベーションの時間および温度に関する技術的仕様は既知であるかまたは実験的に決定される。
【００５１】
図３Ｄに示すように、インキュベーション中、抽出緩衝溶液３１２により、ゲルを細分した断片３１０からタンパク質などの分析物が溶出され、緩衝剤−分析物溶液３１４が生成される。緩衝剤−分析物溶液３１４は、一般的に電気泳動の対象となる任意の分析物も含んでいてよく、このような分析物としては例えばタンパク質、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸が含まれる。インキュベーション後、ネスト化ミンスチューブ２０８を回収容器２０２から取り出してもよく、かつ、溶出された試料を取得するためピペット３１６を使用してもよい。インキュベーション後にネスト化ミンスチューブ２０８を回収容器２０２から取り出すが、インキュベーション前または回収容器２０２に抽出緩衝溶液３１２を導入する前にネスト化ミンスチューブ２０８を取り出すことと同様であることは明白である。
【００５２】
ゲル断片から溶出したタンパク質はさらなる分析に使用してもよい。例えば、あるタンパク質が他のタンパク質と結合する傾向は細胞内でこれらタンパク質間に生じ得る相互作用を示唆するものであり、このような傾向についてタンパク質を調べることは頻繁に行われている。このような相互作用を評価する方法としては、平衡透析、表面プラスモン共鳴の変化などが含まれる。さらに、このような溶出されたタンパク質を使用して、細胞内メッセンジャー化合物または薬物候補物質などの小分子との相互作用を評価してもよい。溶出されたタンパク質が細胞機能の調節において重要である場合、薬物候補物質である小分子によって細胞機能を変化させることができるか否かを決定することが望ましいことが多い。
【００５３】
図４Ａ〜４Ｄは、別の回収方法としてミンスチューブを回収容器内に反転することによる回収方法を含む、ゲルミンス器具４００の別の態様を示したものである。ゲルミンスチューブ４０２は開放端４０７および閉鎖端４０８を有する。図１および図２の態様と同様、ミンスチューブ４０２の中には、ミンスチューブ４０２の直径全体にわたるメッシュ材４０４が配置される。この態様では、メッシュ材４０４がミンスチューブ４０２の中央部領域で直径全体にわたっていることが示されている。当業者には明らかであるように、メッシュ材４０４はミンスチューブ４０２の開放端４０７の近くまたは閉鎖端４０８の近くに配置されていてもよい。
【００５４】
図４Ａに示すように、ゲル４０６はミンスチューブ４０２内でメッシュ材４０４の上に置かれる。ゲル４０６がメッシュ材４０４を通過しかつこれにより細分されて図４Ｂに示すようにゲル断片４１０となるまで、ミンスチューブ４０２、メッシュ材４０４、およびゲル４０６が遠心にかけられる。図４Ｂに示すように、抽出溶液４１２がミンスチューブ４０２内に導入される。当業者に明らかであるように、抽出溶液４１２は緩衝溶液であってよい。分析物をゲル断片から導出しこれにより分析物溶液４２０を生成するため、ミンスチューブ４０２を抽出溶液４１２およびゲル断片４１０とともにインキュベートする。インキュベート後、分析物溶液４２０が回収容器２０２から回収容器４１４へと流し込まれる。図４Ｃに示すように、残りのゲル断片はメッシュ材４０４によりミンスチューブ４０２内に保持される。
【００５５】
回収容器４１４は選択的に、空洞４２２に配置された、ポリ二フッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、ガラス繊維、またはその他の多孔質材の膜４１６を含んでいてもよい。図４Ｃに示すように、分析物溶液の飛散を減らしかつ分析物溶液を回収容器４１４内に完全に滴下させるためにミンスチューブ４０２を反転して回収容器４１４の中に入れることができるよう、回収容器４１４は好ましくはミンスチューブ４０２の外形より大きい内径を有する。しかし、当業者に明らかであるように、ミンスチューブ４０２および回収チューブ４１４の直径は同じであってもよく、または、ミンスチューブ４０２の直径は回収容器４１４の直径より小さくても大きくてもよい。膜４１６は空洞４２２の直径全体にわたる。
【００５６】
ミンスチューブ４０２は任意の標準的な技術を用いて回収容器４１４に取り付けられてよい。例えば、ミンスチューブ４０２は、開放端４０７と閉鎖端４０８との間に位置する領域を起点としミンスチューブ４０２の周囲から伸びる周縁（図には示していない）を有していてもよい。したがって、この縁により、ミンスチューブ４０２を反転状態で回収容器４１４内に置くことが可能となる。同様に、ミンスチューブ４０２は回収容器４１４の内径に摩擦力によって嵌め込まれてもよく、これによってミンスチューブ４０２を反転状態で固定してもよい。別の態様において、ミンスチューブ４０２はテープ留めもしくはクリップ留めされていてもよく、または、ミンスチューブ４０２を回収容器４１４に固定もしくはねじ止めできるようなねじ山を有していてもよい。
【００５７】
回収容器４１４に流し込まれた分析物溶液４２０は膜４１６より上の領域を占める。膜４１６は条件多孔質材であり、このことは、溶液に力が印加された場合以外は液を膜に通過させないだけ十分に膜の細孔が小さいことを意味する。したがって、図４Ｃに示すように、分析物溶液４２０は膜４１６より上の領域に保持される。
【００５８】
分析物溶液４２０から分析物を濾過および回収するため、回収容器４１４およびミンスチューブ４０２を遠心にかける。遠心中、分析物溶液４２０は膜４１６の細孔を通過して引かれ空洞４２２に入る。図４Ｄに示すように、ゲル断片４１０は再度メッシュ材４０４を通過して引かれ膜４１６の上に落ちる。遠心により溶出産物の完全な回収が可能となり、かつ同時に、膜４１６がゲル断片４１０を溶出産物から分離するため、より純粋な回収が行われる。
【００５９】
１つの態様において、膜４１６はポール・ガルマン社（Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｃｏｒｐ、ミシガン州Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）から販売されているビオダイン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）Ｃ膜である。ビオダインＣ膜は、細孔表面に高密度のカルボキシル基を有するナイロン６，６膜である。ビオダインＣ膜を改変して逆相表面を作成してもよい。膜の改変方法の１つは、回転振盪機に載せたポリプロピレン容器内で、２０ ｍＭ ＥＤＣ（１−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含むｐＨ ５．５の１００ ｍＭ ＭＥＳ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）５０ ｍＬに７ ｃｍ ｘ ７ ｃｍの膜を入れ、室温で１５分間インキュベートすることである。インキュベート後、０．５ Ｍ Ｎ−ヒドロスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）水溶液（またはｓｕｌｆｏ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）５ ｍＬを添加し、２０分間よく混合する。この溶液をデカントし、新鮮なＭＥＳ緩衝液で膜を洗浄する。次に、５０％テトラヒドロフランを含む０．１ Ｍ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ ８．１）中で５０ ｍＭヘキサデシルアミンとともに膜をインキュベートする。振盪を加えながら室温で２時間膜をインキュベートし、次に、膜に対して、０．１ ＮａＨＣＯ３で１０分間の洗浄を３回行い、続いて水で１０分間の洗浄を３回行う。膜を空気乾燥させる。このビオダインＣ膜それ自体をカチオン交換樹脂として使用してもよい。
【００６０】
同じくポール・ガルマン社により製造販売されているビオダインＢ膜は、ペプチドまたはタンパク質を捕捉するための強力なアニオン交換膜として使用できる。ビオダインＢ膜はオリゴヌクレオチド用の捕捉膜としても適している。
【００６１】
当業者には明らかであるように、ミンスチューブ４０２を回収容器４１４の上方に反転させる際、ミンスチューブ４０２を遠心しなくてもよい。しかし、ミンスチューブ４０２から回収容器４１４へと分析物溶液を移送するのに役立つため、このような連結遠心が望ましい。このように、この方法により、メッシュ材を取り外す必要なく処置および処理を行うことができる。
【００６２】
ゲル断片４１０から溶出されたタンパク質を膜４１６で捕捉してもよい。膜４１６はインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から販売されているＩｎｖｉｔｒｏｌｏｎ Ｐなどのポリ二フッ化ビニリデン膜であってもよく、または、本明細書に記載の材料も含めタンパク質に対する親和性を有する他の材料であってもよい。
【００６３】
以下に図５を参照しながら説明するように、別の態様において、タンパク質が回転され膜を通過して効果的に捕捉されるよう、膜はネスト化されたチューブセットの中に配置される。捕捉されたタンパク質は、自動シーケンサーでＥｄｍａｎ法を用いて配列解析してもよい。参考文献としては、「タンパク質配列解析：実践的アプローチ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」， Ｊ．Ｂ．Ｃ． ＦｉｎｄｌａｙおよびＭ．Ｊ． Ｇｅｉｓｏｗ編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８９， ｐ． １のＫ．Ｊ． ＷｉｌｓｏｎおよびＰ．Ｍ． Ｙｕａｎ「ペプチドおよびタンパク質の精製（Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」がある。細分されたゲル断片から溶出されたタンパク質は膜上で捕捉され、この膜は切り出して自動シーケンサー装置に直接入れることができる。
【００６４】
本発明の他の態様において、抽出された分析物に対して他の調製段階を行うために、遠心ゲルミンス器具に対して追加の機能を設計してもよい。特に、追加の試料処理段階を同じチューブセット内で実施してもまたはネスト化されたチューブセット内で実施してもよい。一旦細分されたゲル断片は溶媒およびその他の試薬による処置がより行いやすくなっているため、このような追加処理は特に望ましい。これは、小さいゲル断片では、その中に埋め込まれた分子（分析物）がより容易かつ迅速にこのような試薬と接触するまたはこのような試薬内へと拡散するという事実に起因する。
【００６５】
例えば、ゲル切片内で単離されたタンパク質は、ペプチドに分解してさらなる分析に供するため、トリプシンまたはその他周知の蛋白質分解酵素（集合的にプロテアーゼと呼ぶ）を用いて処理されることが多い。参考文献としてはＴ． Ｒａｂｉｌｌｏｕｄら， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １９９９； ２０， ３６０３−３６１０がある。タンパク質染色によりスポットとして可視化されたタンパク質を含むゲルのセグメントは、切り出され、細断され、かつ、空気乾燥によりまたはアセトニトリルなど水混和性の揮発性溶媒を用いることにより脱水される。これらは次にトリプシンまたは他のプロテアーゼを含む緩衝液で再水和され、３７℃で１５時間消化される。タンパク質の消化により精製されたペプチドは混合溶媒で抽出される。
【００６６】
本発明の方法は、約７時間〜２０時間、９時間〜２０時間、１２時間〜２０時間、１４時間〜２０時間、１６時間〜２０時間、９時間〜１６時間、１２時間〜１６時間、１４時間〜１６時間、９時間〜１４時間、１２時間〜１４時間、および９時間〜１２時間など、１５時間より長いまたは短い（例えば、約３０分、約１時間、約２時間、約５時間、約１０時間、約２０時間など）プロテアーゼ消化時間で実施することができる。同様に、プロテアーゼ消化の温度は約２５℃〜４５℃（例えば、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃など）、約３０℃〜４５℃、約３２℃〜４３℃、約３２℃〜４０℃、約３２℃〜３７℃、約３２℃〜３４℃、約３４℃〜４２℃、約３４℃〜３７℃、および約３７℃〜４０℃であってもよい。
【００６７】
他のタンパク質と同様にトリプシンも、一般的な種々の技術を用いて膜、ポリマー、またはガラス片などの固体支持体に固定することができる。Ｗ．Ｖ． Ｂｉｅｎｖｅｎｕｔら， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９； ７１（２１）， ４８００−４８０７には、活性カルボン酸基を含む化学修飾したポリ二フッ化ビニリデン膜にトリプシンを固定化する方法が記載されている。タンパク質のアミノ基が活性カルボン酸基を反応し、これによりタンパク質が膜へと結合する。他の多くの固定化技術も当業者に周知であり、「タンパク質の結合および架橋の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ）」， Ｓｈａｎ Ｓ． Ｗｏｎｇ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３にも詳述されている。固定化されたトリプシンまたは他の任意のプロテアーゼは細分されたゲルの下に層として配置してもよく、こうすることによって、ゲルから溶出されたタンパク質はこの層と相互作用ししたがって自由トリプシンによる試料自体の混入を生じることなくペプチドに分解される。
【００６８】
図５に、メッシュ材５０４と処理膜５１６とを含むネスト化チューブ５０８を有するミンスチューブ器具５００の態様を示す。ネスト化チューブ５０８は、図２を参照して上記に説明したネスト関係と同様の関係で回収容器５０２内にネスト化される。この態様では、ゲル５０６のようなゲルを細分して断片にするためにメッシュ材５０４を使用する。膜５１６はメッシュ材５０４の後に直列で配置される。膜５１６は、前述のように、溶液に力が印加された場合以外は液を膜に通過させないだけ十分に小さい細孔を有する膜である条件多孔質材であってもよい。膜５１６はまた、ネスト化チューブ５０８に確実に固定される。メッシュ材５０４がネスト化チューブ５０８の第一の部分に配置され、かつ、膜５１６が、メッシュ材５０４から間隔をあけてネスト化チューブ５０８の第二の部分に配置される。メッシュ材５０４と膜５１６との間に空間があることにより、遠心中にメッシュ材５０４を通過させてゲル５０６を引くことが可能となる。
【００６９】
遠心処理中、ゲル５０６はメッシュ材５０４により細分されかつメッシュ材５０４を通過し、かつ、膜５１６の上に蓄積する。１つの態様において、膜５１６はトリプシンなどのプロテアーゼを固定化状態で含む。細分されたゲル断片が膜５１６上に蓄積すると同時に、ゲル断片から溶出するタンパク質をプロテアーゼが消化し始める。
【００７０】
図６にゲルミンス器具６００の別の態様を示す。この態様において、ゲルミンス器具６００はミンスチューブ６０８および処理チューブ６１２を有する。ミンスチューブ６０８および処理チューブ６１２はネスト化チューブであり、かつ図に示すように、ミンスチューブ６０８が処理チューブ６１２の中にネスト化している。ゲルを細分するため、メッシュ材６０４がミンスチューブ６０８の中に固定される。前述の態様について説明したのと同じく、メッシュ材６０４はミンスチューブ６０８の上部、中央部、または下部に配置されていてもよい。
【００７１】
細分されたゲルまたはゲル内に含まれる分子を処理するため、条件多孔質膜６１６が処理チューブ６１２の中に固定される。したがって、ネスト化されると、メッシュ材６０４と膜６１６とは直列になる。膜６１６は条件多孔質膜であってもよく、かつ／または、長鎖アルキル基、第三級アミンまたは第四級アミンなどのイオン交換基、短鎖カルボキシレートまたはスルホネート、金属イオンアフィニティ捕捉のためのキレート基、炭水化物を捕捉するためのボロン酸などの付加、および類似の修飾によって修飾してもよい。または、膜６１６は、イオン交換粒子または逆相捕捉粒子などの粒子を膜上に含むかまたは支持していてもよい。
【００７２】
本図に示した態様において、処理チューブ６１２の長手方向の長さはミンスチューブ６０８より長い。したがって、共にネスト化されると、メッシュ材６０４と膜６１６との間に間隙６１０が形成される。間隙６１０は、メッシュ材６０４によりゲルがミンスされた後、細分されたゲルを完全に包含できるよう十分に大きいことが好ましい。しかし、当業者には明らかであるように、処理チューブ６１２の長手方向の長さは刻み処理チューブ６１２より長くなくてもよい。１つの態様において、ミンスチューブ６０８が処理チューブ６１２の内部へと挿入される距離を制限するための段または棚状の突起がミンスチューブ６０８または処理チューブ６１２のいずれかの側面に形成されていてもよい。
【００７３】
別の態様において、ミンスチューブ６０８および処理チューブ６１２はテーパーの断面形状を有する。これにより、ミンスチューブ６０８は処理チューブ６１２内で容易にネスト化される。製造中、テーパーの角度を変化させることにより、またはミンスチューブ６０８および処理チューブ６１２の側面に形成されてもよい任意のねじ山、棚状の突起、もしくは段のサイズを変更することにより、間隙６１０のサイズを決定してもよい。
【００７４】
別の態様において、間隙６１０のサイズを決定するため、ミンスチューブ６０８と処理チューブ６１２との間で、これらチューブの外周または内周にスペーサー（図には示していない）を設けてもよい。
【００７５】
処理チューブ６１２は回収容器６０２の中にネスト化される。回収容器６０２は、前述の態様に関して説明したように遠心チューブであってもよい。処理チューブ６１２の膜６１６と回収容器６０２の内面との間に空洞６１４が形成される。ミンスチューブ６０８および処理チューブ６１２は取り外し可能な状態で互いにネスト状になり、且つ取り外し可能な状態で回収容器６０２内にネスト状になっているため、１つのネスト化されたチューブを他方のチューブなしで使用しても、または、ネスト化された両チューブを直列で共に使用してもよい。
【００７６】
使用に際しては、ゲル６０６がメッシュ材６０４の上に置かれる。遠心中、ゲル６０６は細分されて小片となり、間隙６１０に入る。膜６１６が、長鎖アルキル基、第三級アミンまたは第四級アミンなどのイオン交換基、アフィニティ捕捉試薬（抗体、リガンド、タンパク質に結合する物質またはその他の試薬など）、短鎖カルボキシレートまたはスルホネート、金属イオンアフィニティ捕捉のためのキレート基、炭水化物を捕捉するためのボロン酸、または類似の修飾を膜上に有する処理膜である場合は、ゲルおよびゲル内の物質の処理が生じる。膜６１６が非処理膜である場合は、抽出緩衝液などの抽出溶液が処理チューブ６１２内に流入する。処理後、遠心により抽出溶液および選択された物質が引かれ膜６１６を通過して回収容器６０２の空洞６１４に入る。
【００７７】
別の態様では、１つ以上の追加の処理チューブがミンスチューブ６０８および処理チューブ６１２と直列に使用される。したがってユーザーは、器具を分解することなく複数の処理を連続で行うため個別の膜上で所望の処理を用いることができる。
【００７８】
別の態様では、ゲルミンスチューブ６０４なしで複数の処理チューブが直列で使用される。
【００７９】
実施例１
本発明の１つの態様では、例えばシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ミズーリ州Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）のカタログ番号Ｇ３９１０（１９９９年版カタログｐ．４８２）のようなカルボン酸基を含む微小ガラス粒子上に、トリプシンが固定化される。ガラス粒子はカルボジイミドを用いて活性化され（前述のＳ．Ｓ． Ｗｏｎｇの文献を参照）、トリプシンなどのタンパク質と、そのタンパク質のアミノ基を介して結合する。こうして得られた固定化トリプシンの粒子が、濾過膜の上、または粒子を保持するが溶液およびタンパク質を通過させる他の同様の支持体の上に置かれる。固定化トリプシン膜が、メッシュ層の下になるように管腔内に配置される。これらの層は、膜がネスト機構より下になるように膜をチューブ内に機械的に押し込むか、または、図５を参照してすでに説明したようにネスト化チューブにトリプシン層を固定することによって直列に配置される。
【００８０】
メッシュと固定化トリプシン粒子を含む膜とが直列に配置され回転にかけられると、ゲルがメッシュを通過して細分され、固定化トリプシンを有するフィルター上にゲルの小片と溶液とが落ちる。フィルターは、ポール・ゲルマン社（Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｃｏｒｐ．、ミシガン州Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）から販売されている分子量カットオフ膜などの条件多孔質膜であってもよい。ゲルから溶出されたタンパク質はトリプシンにより消化される。その結果得られたペプチドおよび／またはタンパク質は、遠心力により固定化トリプシン粒子から分離し、膜を通過して回収容器または捕捉チューブ内へと移動する。ペプチドおよびタンパク質を膜を通過させて引くために必要な遠心力は、固定化トリプシンを支持している膜の透過性または分子量カットオフ値によって異なる。所望される場合、これらミンスおよび処理の複数の反応は、ミンスチューブセットおよび処理チューブセットなど単機能のネスト化チューブセットを用いて個別に実施してもよい。
【００８１】
実施例２
別の態様において、トリプシンは、Ｂｉｅｎｖｅｎｕｔらが説明しているようなカルボキシレート修飾ポリ二フッ化ビニリデン膜などを用いて、膜自体の上に固定化される。処理された膜は第二のネスト状遠心チューブの下部に接着または溶接されていてもよく、かつ、前述と同様の方法で使用されてもよい。
【００８２】
固定化トリプシンを使用することの利点の一つは、溶液中ではトリプシンによる他のトリプシンの消化が生じてその結果トリプシンペプチドが放出されるが、トリプシンを固定化することによりこの消化が生じなくなるということである。トリプシンの自己分解は、関心対象のペプチドの質量分析の解釈をより複雑化する、一般的な問題である。この手段によって、単回の回転でメッシュ材によりゲルを細分することが可能となり、これにより、タンパク質を溶出しかつそれらを切断して分析に供しうるペプチドの純粋アリコットを得るために必要な時間を大幅に短縮することができる。
【００８３】
本発明はまた、細分されたゲルに対する他の処理段階を提供する。例えば、ペプチドを質量分析計に導入する前に脱塩することは当然に行われている。これを行うための特に便利な方法の１つは、Ｃ−１８誘導シリカなどの逆相樹脂にペプチドを吸着させることである。この方法は、ミリポア社で製造されている市販の製品ＺＩＰＴＩＰ、および、アミカ（ＡｍｉＫａ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）で製造されている同様の製品で使用されている。アミカ社の製品は、ピペットチップの側面に取り付けられる、Ｃ−１８鎖含有樹脂で構成されている。ペプチドが樹脂に結合するよう試料が吸い上げられ、かつ、液体が排出される際に塩が洗い流される。結合したペプチドは水でさらに洗浄することができ、次に、有機溶媒などの混合水性溶液で溶出してさらなる分析に供することができる。
【００８４】
当業者に明らかであるように、本発明は、分光法などの分析技術（例えば、ＩＲ、ＵＶ、ＮＭＲなど）用および質量分析用としてペプチドを回収するためにゲルを処理することに加えて、エドマン（Ｅｄｍａｎ）配列解析用のタンパク質の調製、配列解析もしくは増幅用の核酸の試料の抽出、または、インタクトなタンパク質および／もしくは核酸を必要とするようなタンパク質−タンパク質、核酸−タンパク質、もしくは核酸−核酸の相互作用研究に使用するための単離、および、その他の用途に使用することができる。
【００８５】
実施例３
本発明において、ペプチドが産生されると同時に捕捉されるよう、固定化トリプシンの下方に逆相層を配置してもよい。例えば、固定化トリプシンについて前述したように、濾過膜の上にＣ−１８修飾ガラス粒子の層を配置してもよい。粒子はフェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カリフォルニア州Ｔｏｒｒａｎｃｅ）から入手可能である。
【００８６】
固定化Ｃ−１８膜は、固定化トリプシン膜の場合と同様、直列で使用してもまたは細分用のメッシュ材とは別の反応で使用してもよい。事実、研究者が所望する任意の数のカスタム配列として種々の膜を多数重ねることができる。一例として、ゲル細分用のメッシュを含む第一のミンスチューブを、膜上に固定化トリプシンを有する第二のネスト化処理チューブの上に配置してもよい。試料はまず、ゲルをメッシュに通過させ且つゲルを細分するのには十分であるがトリプシンを保持する膜に溶液を通過させるのには十分でない力で遠心にかけられる。次に、タンパク質が消化されるのに十分な時間をかけて、細分されたゲルをトリプシン膜上でインキュベートさせる。タンパク質のトリプシン消化のための技術およびインキュベーション時間は当業者に周知である。
【００８７】
次に、ペプチドおよび液体を、トリプシンを保持している条件多孔質膜に通過させかつＣ−１８ガラス粒子を捕捉している第二の条件多孔質膜上へと移送するため、チューブを回転させる。液体がこのフィルターを通過する際、ペプチドはＣ−１８により捕捉され、一方、塩溶液は通過してチューブ底部または別の回収容器へと流入する。液体は、遠心力により、メッシュと固定化相を有する膜とのカラムを通過する。カラムの下に新しい回収容器を配置してもよく、かつ、適切な力価の溶出溶媒または緩衝液をカラム上部に添加し２回目の遠心をかけることによってペプチドを回収容器内に溶出させてもよい。
【００８８】
また別の態様では、関心対象でないタンパク質を捕捉し分析物試料から除去するための固定化抗体を用いた、処理技術および精製技術のネスト化セットが使用される。例えば、タンパク質のゲル分離後に、特定の存在度の高い「ハウスキーピング」タンパク質が相当量存在し、ゲル内の存在度の低い関心対象タンパク質と同じ場所へと移動していることが判明することは珍しくない。存在度の高いタンパク質は存在度の低いタンパク質をマスクし、且つその同定または配列決定を困難にする。存在度の高いタンパク質は一般的によく知られており且つ単離が容易であり、この問題を解決する１つの方法は、これらのタンパク質に対して作成されたモノクローナル抗対またはポリクローナル抗体をこれらタンパク質に選択的に結合させることによって存在度の高いタンパク質を除去することである。抗体の作製方法は当業者に周知である。
【００８９】
実施例３ではタンパク質およびペプチドを捕捉し脱塩するためのＣ−１８粒子を有する膜の使用について説明しているが、炭素１８原子より短いまたは長いアルキル鎖（例えば、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ２０など）を付着させた膜も本発明とともに問題なく使用することができる。長いアルキル鎖を付着させてもよい膜はポール・ゲルマン社（Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｃｏｒｐ．、ミシガン州Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）により製造されている。レステック社（Ｒｅｓｔｅｋ Ｃｏｒｐ．、ペンシルベニア州Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ）はガラス繊維に結合されたＣ−８またはＣ−１８のアルキル鎖を有する抽出ディスクを販売している（Ｃ１８ディスク、４７ ｍｍ、カタログ番号２４００４；Ｃ８ディスク、４７ ｍｍ、カタログ番号２４０４８）。これらも捕捉媒体として使用可能である。
【００９０】
ペプチドを捕捉するためにアルキル鎖でコーティングされた膜または粒子を使用することに加えて、イオン交換樹脂粒子、または選択的にイオン化可能基で誘導体化したイオン交換特性を有するよう修飾した膜を使用してもよい。このようなイオン交換は、例えば核酸または特定の強イオンのペプチドもしくはタンパク質を捕捉する上で非常に効率が高い可能性もある。
【００９１】
実施例４
この実施例では、トリプシンについてすでに説明したのと同様の方法で、活性化されたガラスまたは他の類似の基体上に抗体が固定化される。粒子を保持するのに十分な細孔を有する濾過膜もしくは他の類似の支持体の上に、抗体を付着させた粒子が置かれるか、または、膜自体に対してもしくはガラス繊維など濾過膜を貫通しない材料に対して抗体が固定化される。次に、前述のように、チューブの開口部全体にわたって膜が固定される。タンパク質または類似の混合物が膜上に置かれ且つアセンブリ全体が遠心にかけられると、混合物のうち固定化抗体との結合能を持つ構成成分が捕捉され、濾過膜の上に残る。したがって濾過液は存在度の高いタンパク質が減損した状態となり、さらなる分析手順で存在度の低いタンパク質を調べることが可能となる。
【００９２】
この態様において特に有用であるのは、遠心力が印加されるまでは溶液を容易に通過させない濾過膜、または条件多孔質膜である。このような膜は、ポアティクス社（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ）から市販されているポリカーボネート膜であってもよい。
【００９３】
実施例５
本発明は、脱水技術および再水和技術などの標準的な処理技術とともに使用でき、かつ、これらの処理技術とともに使用するための適合を行うことができる。一例として、ゲル内トリプシン消化プロトコル（Ｉｎ−Ｇｅｌ Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を以下に示す。当業者に明らかであるように、このプロトコルに変更を行うことも可能である。段階は以下のとおりである：
１．清潔なスパーテルまたは類似の切り出しツールを用いてゲルから所望のバンドを切り出す；
２．ネスト化チューブ内のメッシュ材の上にゲルを置く；
３．１０，０００ ｒｐｍでチューブを回転させることにより、ゲルをミンスし、細分されたゲル断片を、条件多孔質膜を有する第二のネスト化レセプタクル内へと引く；
４．ミンスされたゲルに５０％ Ｈ２Ｏ／５０％アセトニトリル洗浄液２５０μＬを添加し、５分間洗浄する；
５．遠心をかけて溶液を膜に通過させることにより、アセトニトリル洗浄液を除去する。
６．５０％アセトニトリル／５０ ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液２５０μＬを添加し、室温で３０分間洗浄する。振盪が有効である場合もある；
７．遠心によりアセトニトリル／ＮＨ４ＨＣＯ３溶液を除去する；
８．５０％アセトニトリル／１０ ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３溶液２５０μＬを添加し、室温で３０分間洗浄する；
９．回転させてアセトニトリル／ＮＨ４ＨＣＯ３溶液を除去し、溶液を廃棄する；
１０．ミンスされたゲル断片が完全に乾燥するまでスピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）で乾燥させる；
１１．１０ ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ １５μＬの中で、ゲル１５ ｍｍ３につき修飾トリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））０．１μｇを添加する；
１２．５〜１０分間放置し、酵素／緩衝溶液をゲルに吸収させる；
１３．いかなる追加の酵素を入れずに１０ ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液をさらに２０μＬ添加する；
１４．ミンスされたすべてのゲル断片が緩衝液で覆われていることを確認し、覆われていない場合はすべてのゲル断片が覆われるよう緩衝液の量を増加させる；
１５．３７℃で２４時間インキュベートする；
１６．遠心して上清を回収する；
１７．０．１％ ＴＦＡ含有６０％アセトニトリル水溶液２００μＬを用い、室温で６０分間振盪して二回目の抽出を行う；
１８．遠心して、受けチューブから抽出液を回収する；
１９．通常、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによるタンパク質同定に必要な抽出液は２つのみであるが、定量化を行うために３つ目の抽出液が必要である可能性があり、この場合は段階１７および１８を繰り返す；
２０．スピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）により抽出溶液の量を５〜１０μＬまで減少させる；ならびに、
２１．ＭＡＬＤＩ−ＭＳ用に、抽出液１μＬを内部標準溶液（すなわちブラジキニン１００ ｆｍｏｌを含む）１μＬおよびα−シアノ−４−ヒドロキシ−トランス−ケイ皮酸（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）１μＬと混合する。
【００９４】
実施例６
以下に、本発明を用いた別のプロトコル例を説明する。
１．エタノールですすいだスパーテルを用いて、所望のゲルバンドおよびブランクのゲル片をほぼ同サイズで切り出す。
２．切り出した各ゲルをそれぞれ別のミンスチューブの中のメッシュ材の上に置く；
３．１０，０００ ｒｐｍでチューブを回転させることにより、ゲルをミンスし、ゲル断片を膜上へと移送する；
４．ミンスされた断片をＭｅＯＨ ２００μＬで５分間脱水し、次にチューブを振盪しながら３０％ ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ ２００μＬで５分間ゲル断片を再水和させる。
５．水２００μＬ、１０分間の洗浄によりゲル断片を２回洗浄する；
６．ゲル断片が無色になるまで、１００ ｍＭ重炭酸アンモニウム／３０％ アセトニトリルによる１回１０分間の洗浄を行う（最低３回）。緩衝液の濃度を下げ乾燥手順を速めるため、最後に水による洗浄を１回行ってもよい；
７．スピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）でゲル断片を乾燥させる；
８．２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／配列解析等級の修飾トリプシン３００ ｎｇ、または、２５ｍＭ 重炭酸アンモニウム／配列解析等級の修飾トリプシン３００ ｎｇでゲル断片を再水和させる。ゲル断片が膨張してもゲル断片を完全に覆うだけの十分な量を供給するよう注意する；
９．注意深くボルテックスにかけて、ゲル断片と再水和溶液とを混合し、３７℃で少なくとくとも８時間インキュベートする；
１０．遠心にかけて上清をチューブ底部に移動させる；
１１．５０％ アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡを用いて室温で１０分間ゲル断片を抽出する；
１２．遠心にかけて、消化物の上清に抽出液を添加する；
１３．スピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）により抽出溶液の体積を１０μＬまで減少させる；ならびに、
１４．抽出液１μＬを適切なＭＡＬＤＩマトリックス２μＬとともにＭＳ分析に供する。
【００９５】
当業者に明らかであるように、プロトコルは様々に異なっていてもよい。さらに、追加のまたは選択的な処理または段階を使用してもよい。例えば、選択的な処理の１つにおいて、遠心チューブが数ミリグラムの逆相樹脂を含んでいてもよい。段階９〜１１のように上清および第一の抽出液を回収した後、消化されたペプチドと樹脂との結合を可能にするためアセトニトリル溶液の体積を減少させてもよい。次に、２５ ｍＭ重炭酸アンモニウムで樹脂を数回洗浄してもよい。樹脂を８０％アセトニトリル／２５ ｍＭ重炭酸アンモニウムと混合することにより、樹脂からペプチドを取り出してもよい。溶出されたペプチドは清潔な微小遠心チューブに移送し、１０μＬになるまでスピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）により蒸発させる。
【００９６】
実施例７
以下に、本発明を用いた別のプロトコル例を説明する。
１．清潔なスパーテルまたは類似の切り出しツールを用いてゲルから所望のバンドを切り出す；
２．ネスト化チューブ内のメッシュ材の上にゲル切片を置く；
３．エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５４１５Ｃ遠心機を用いて１０，０００ ｒｐｍでチューブを回転させることにより、ゲルをミンスし、かつ、ミンスされたゲル断片を膜の上へと引く；
４．ミンスメッシュを含む第一のネスト化チューブを取り外す；
５．超純水１００μＬを添加してミンスされたゲル片を覆うことによりゲルを洗浄する。ゲル片が覆われていない場合は、ゲル断片を完全に覆うよう十分な量の水を追加する；
６．ゲルを放置して１５分間インキュベートし、次に、チューブを回転させて水を膜に通過させ回収チューブへと移送する；
７．段階５および６を繰り返す；
８．超純水の代わりに２５ ｍＭ重炭酸アンモニウムを用いて段階５および６を繰り返す；
９．膜およびミンスされたゲル片を含むネスト化チューブを清潔な１．５ ｍＬ エッペンドルフ微小遠心チューブの中に移し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）に入れる；
１０．完全に乾燥するまでスピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）で乾燥させる；
１１．１０ ｍＭ 重炭酸アンモニウム２５μＬの中で、ゲル１５ ｍｍ３につき修飾トリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））０．１μｇを添加する；
１２．５〜１０分間放置し、酵素／緩衝溶液をゲルに吸収させる；
１３．酵素なしで重炭酸アンモニウム２５〜５０μＬをさらに添加し、すべてのゲル断片を完全に覆う；
１４．３７℃で一晩または約１６時間インキュベートする；
１５．遠心にかけて上清を回収する；
１６．膜およびゲル断片を含むネスト化チューブをエッペンドルフ回収チューブから取り出し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）を用いて抽出溶液の体積を５〜１０μＬまで減少させる（通常、最初の抽出液は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によるタンパク質同定に必要なペプチド断片を十分に含んでいる）；ならびに、
１７．回収されたペプチド断片を含む溶液を、適切なＭＡＬＤＩマトリックスとともにステージプレートに載せる。所望の場合は内部標準溶液も使用する。
【００９７】
実施例８
本発明の１つの局面では、ゲルのミンスにエッペンドルフ５４１５Ｃ遠心機を使用する。試験結果を下表に示す。
【００９８】
【表１】
2004518944.tif 000003
本試験で使用したゲル、および記号の定義は以下のとおりである。
４％ＴＧ−２．５％ビスアクリルアミドで架橋されている４％アクリルアミド
８％ＴＧ−２．５％ビスアクリルアミドで架橋されている８％アクリルアミド
１０％ＴＧ−２．５％ビスアクリルアミドで架橋されている１０％アクリルアミド
１０％ ＢＴ−４．１％ビスアクリルアミドで架橋されている１０％アクリルアミド
１２％ ＢＴ−５％ビスアクリルアミドで架橋されている１２％アクリルアミド
２０％ ＴＧ−２．５％ビスアクリルアミドで架橋されている２０％アクリルアミド
「Ａ」は、幅０．０１４５インチの開口部と直径０．００５５インチのワイヤとを有するメッシュ材を示す。
「Ｂ」は、幅０．０２６７インチの開口部と直径０．００６５インチのワイヤとを有するメッシュ材を示す。
「＋」は、ゲルがメッシュを完全に通過したことを示す。
「−」は、ゲルがメッシュを完全に通過しなかったことを示す。
「＋／−」は、ゲルの一部がメッシュを通過し、一部がメッシュ上に残ったことを示す。
【００９９】
特定の態様において、半固体材料をメッシュに通過させそれにより半固体材料を細分して断片にするための遠心操作は、以下の範囲の相対遠心力（ＲＣＦ）で実施可能である：約１，０００ ｘ ｇ〜２６，０００ ｘ ｇ、約１，０００ ｘ ｇ〜２４，０００ ｘ ｇ、約１，０００ ｘ ｇ〜２０，０００ ｘ ｇ、約１，０００ ｘ ｇ〜１６，０００ ｘ ｇ、約１，０００ ｘ ｇ〜１２，０００ ｘ ｇ、約１，０００ ｘ ｇ〜８，０００ ｘ ｇ、約１，０００ ｘ ｇ〜６，０００ ｘ ｇ、約１，０００ ｘ ｇ〜４，０００ ｘ ｇ、約１，０００ ｘ ｇ〜２，０００ ｘ ｇ、約４，０００ ｘ ｇ〜２４，０００ ｘ ｇ、約４，０００ ｘ ｇ〜２０，０００ ｘ ｇ、約４，０００ ｘ ｇ〜１６，０００ ｘ ｇ、約４，０００ ｘ ｇ〜１２，０００ ｘ ｇ、約４，０００ ｘ ｇ〜８，０００ ｘ ｇ、約４，０００ ｘ ｇ〜６，０００ ｘ ｇ、約８，０００ ｘ ｇ〜２４，０００ ｘ ｇ、約８，０００ ｘ ｇ〜２０，０００ ｘ ｇ、約８，０００ ｘ ｇ〜１６，０００ ｘ ｇ、約８，０００ ｘ ｇ〜１２，０００ ｘ ｇ、約８，０００ ｘ ｇ〜１０，０００ ｘ ｇ、約１０，０００ ｘ ｇ〜２４，０００ ｘ ｇ、約１０，０００ ｘ ｇ〜２０，０００ ｘ ｇ、約１０，０００ ｘ ｇ〜１６，０００ ｘ ｇ、約１０，０００ ｘ ｇ〜１２，０００ ｘ ｇ、約１２，０００ ｘ ｇ〜２４，０００ ｘ ｇ、約１２，０００ ｘ ｇ〜１６，０００ ｘ ｇ、約１２，０００ ｘ ｇ〜１４，０００ ｘ ｇ、約１６，０００ ｘ ｇ〜２４，０００ ｘ ｇ、約１６，０００ ｘ ｇ〜２０，０００ ｘ ｇ、および、約２０，０００ ｘ ｇ〜２４，０００ ｘ ｇ。
【０１００】
種々の層に溶液を通過させるために遠心力を使用することにより、各層が互いに付着する。したがって、選択的に層間に圧シールを設けてもよい。チューブの各セグメントは互換性モジュールであるため、ユーザーは特定の分析物処理の用途に合わせてカスタム設計のネスト化チューブセットを組むことができる。
【０１０１】
例えば、ネスト化セットの一部により、ゲルを細分するためのふるいまたはメッシュ材が提供されうる。多孔質膜または条件多孔質膜でその場所に保持されている固定化トリプシンまたは膜自体に固定化されているトリプシンを別の部分から提供してもよい。膜によって、または疎水性相互作用でタンパク質を結合するよう誘導された膜を使用することによって、その場所に保持されている逆相捕捉材料を別の部分から提供してもよい。存在度の高いタンパク質を捕捉するための固定化抗体を別の部分から提供してもよい。複数の種類の固定化抗体（またはその一部；例えばＦｃ断片、ＦａｂもしくはＦａｂ’２断片、Ｈ鎖もしくはＬ鎖、またはその組合せ）等を、ネスティング用の個別のセグメントとしてまたは組み合わせて単一のセグメントにした状態で提供してもよい。最後のセグメントは、遠心力によってカラムを通過した液体を回収するためのレセプタクルまたは回収容器であってもよい。このようなセグメントは液体を廃棄するために取り外してもよく、かつ、その代わりに、カラムから関心対象のペプチドまたはタンパク質を溶出するための新しいセグメントを取り付けてもよい。さらに、ネスト化チューブセットの各セグメントは段階の間で取り外してもよい。
【０１０２】
具体的には、ゲルをメッシュにより細分し且つトリプシンで消化した後に逆相パッキング上でペプチドを捕捉することが目的である場合、混合溶媒系を用いて逆相パッキングからペプチドを溶出する前に、このネスト化したチューブセットのメッシュセグメントおよびトリプシンセグメントを取り外し、かつ廃棄するかまたは再使用のために洗浄してもよい。
【０１０３】
本発明の融通性を示すさらなる例として、チューブを反転し且つより大きいフィルター含有チューブに入れて次の処理段階に供してもよい。例えば、ゲルを細分しタンパク質を抽出した後、存在度の高いタンパク質の一部を除去する必要がある場合は、フィルターと膜上に固定化された抗体とを含む第二のチューブを使用してもよい。第二のチューブは、チューブを反転し遠心により軽く回転させたときに溶液を含む試料がフィルターを通過して固定化抗体と接触するよう、最上部に置かれる。タンパク質は必要とされるだけ長時間にわたって抗体と接触状態に維持されうる。本発明のこの概念は、消化、精製などの他の試料処理段階にも拡張可能である。
【０１０４】
広範な種々のプロセスがネスト化チューブ内で連続的に実施でき、かつ、異なる調製済みチューブを使用することにより異なる手順が選択できるため、ゲル材料をミンスおよび処理するためのシステムは高度の柔軟性を有する。例えば、チューブの１つがトリプシンを含み且つ別のチューブがパパインを含んでいてもよく、ユーザーは実施するプロセスの用途に最もよく適合するチューブを選択することができる。１つの態様において、これらのネスト化チューブは、ネスト化チューブのアレイがマイクロタイタープレートのチューブと整列するようなネスト化マイクロタイタープレートである。マイクロタイタープレートは閉鎖した底部を持つチューブのアレイと結合するか、またはマイクロタイタープレートの中にそのようなアレイが形成される。ミンスチューブまたは処理チューブは８ ｘ １２または１６ ｘ ２４の形式またはその他の形式にアレイ化されたチューブのセットであってもよく、チューブアレイは、受けプレートとしての従来のマイクロタイタープレートと嵌合できるよう、標準的なマイクロタイタープレートと互換性のある中心を有する。９６ウェル、３８４ウェル、またはそれ以上のウェルを有するマイクロタイタープレート全体を同時に回転にかけることのできる遠心装置がフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）（Ｍａｒａｔｈｏｎ ２１０００および２１０００Ｒ遠心機、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルベニア州Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）、ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８０４および５８１０遠心機、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）および他の製造業者から入手可能であるため、前述のネスト化チューブセットはネスト化マイクロタイタープレートの形式で提供されてもよい。これにより、個別のチューブセグメントを操作せずに多数の試料を簡便に同時処理することが可能となり、したがって本発明はハイスループットの分析に特に有用である。
【０１０５】
本発明はさらに、高分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および炭水化物などの分子を単離および／または精製するための方法を含む。これらの方法は以下の段階を含む：（ａ）前述のミンスチューブのメッシュ材の上にゲル切片を置く段階、（ｂ）ミンスチューブ、メッシュ、およびゲル切片を遠心してゲル切片をメッシュに通過させ、ゲル切片を細分して断片にする段階、ならびに、（ｃ）抽出溶液を用いてゲル切片の断片を抽出する段階。選択的に、抽出溶液によって抽出され且つその中に存在する分子を、例えば抽出溶液溶媒の沈殿または蒸発によって、濃縮してもよい。典型的に、ゲル切片の断片は質量分析による分析の前に抽出溶液から分離される。
【０１０６】
本発明はまた、高分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および炭水化物などの分子を単離および／または精製するための方法を含む。これらの方法は以下の段階を含む：（ａ）ゲル電気泳動により１つ以上の分子を分離する段階、（ｂ）電気泳動したゲルを切り出して１つ以上の関心対象分子を含むゲル切片を得る段階、（ｃ）前述のミンスチューブのメッシュ材の上にゲル切片を置く段階、（ｄ）ミンスチューブ、メッシュ、およびゲル切片を遠心してゲル切片をメッシュに通過させ、ゲル切片を細分して断片にする段階、ならびに、（ｅ）抽出溶液を用いてゲル切片の断片を抽出する段階。
【０１０７】
当業者に認識されるように、本発明の方法で使用される抽出溶液は水性であってもまたは非水性であってもよい。
【０１０８】
さらに、本発明の方法で使用される抽出溶液のｐＨは、塩基性であっても、酸性であっても、または中性であってもよい。塩基性の抽出溶液が使用される場合、これらの溶液のｐＨは約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５、約１１．０、約１１．５、約１２．０、約１２．５、約１３．０、約１３．５、または約１４．０であってもよい。酸性の抽出溶液が使用される場合、これらの溶液のｐＨは約６．５、約６．０、約５．５、約５．０、約４．５、約４．０、約３．５、約３．０、約２．５、約２．０、約１．５、約１．０、または約０．５であってもよい。さらに、抽出溶液のｐＨは以下の任意の範囲内であってもよい：約ｐＨ １．０〜約ｐＨ ５．０、約ｐＨ ２．０〜約ｐＨ ６．０、約ｐＨ ３．０〜約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ４．０〜約ｐＨ ８．０、約ｐＨ ５．０〜約ｐＨ ９．０、約ｐＨ ６．０〜約ｐＨ １０．０、約ｐＨ ７．０〜約ｐＨ １１．０、約ｐＨ ８．０〜約ｐＨ １２．０、および、約ｐＨ ９．０〜約ｐＨ １３．０。
【０１０９】
本発明の方法で使用される抽出溶液は、分子の特定クラスの変性を促進および／または阻害する物質を１つ以上含んでいてもよい。例えば、タンパク質の精製および／または単離を目的として本発明の方法を設計する場合、抽出溶液は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）とＲＮＡの消化を促進する１つ以上のリボヌクレアーゼとを含んでいてもよい。同様に、ＤＮＡの精製および／または単離を目的として本発明の方法を設計する場合、抽出溶液は、デオキシリボヌクレアーゼを実質的に含んでいなくてもよく、しかし１つ以上のリボヌクレアーゼを含んでいてもよい。
【０１１０】
本発明はさらに、高分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および炭水化物などの分子を同定するための方法を含む。これらの方法は以下の段階を含む：（ａ）前述のミンスチューブのメッシュ材の上にゲル切片を置く段階、（ｂ）ミンスチューブ、メッシュ、およびゲル切片を遠心してゲル切片をメッシュに通過させ、ゲル切片を細分して断片にする段階、（ｃ）抽出溶液を用いてゲル切片の断片から分子を抽出する段階、ならびに、（ｄ）抽出溶液に対して質量分析（例えば、タンデム質量分析、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析、（ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）など）を行い、存在する分子を同定する段階。典型的に、ゲル切片の断片は質量分析による分析の前に抽出溶液から分離される。
【０１１１】
本発明はまた、高分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および炭水化物などの分子を同定するための方法を含む。これらの方法は以下の段階を含む：（ａ）ゲル電気泳動により１つ以上の分子を分離する段階、（ｂ）電気泳動したゲルを切り出して１つ以上の関心対象分子を含むゲル切片を得る段階、（ｃ）前述のミンスチューブのメッシュ材の上にゲル切片を置く段階、（ｄ）ミンスチューブ、メッシュ、およびゲル切片を遠心してゲル切片をメッシュに通過させ、ゲル切片を細分して断片にする段階、（ｅ）抽出溶液を用いてゲル切片の断片から分子を抽出する段階、ならびに、（ｆ）抽出溶液に対して質量分析（または、本明細書の他の箇所に記載の技術など他の分析技術）を行い、存在する分子を同定する段階。
【０１１２】
本発明はさらに、高分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および炭水化物などの分子の配列決定を行うための方法を含む。これらの方法は以下の段階を含む：（ａ）前述のミンスチューブのメッシュ材の上にゲル切片を置く段階、（ｂ）ミンスチューブ、メッシュ、およびゲル切片を遠心してゲル切片をメッシュに通過させ、ゲル切片を細分して断片にする段階、（ｃ）抽出溶液を用いてゲル切片の断片から分子を抽出する段階、ならびに、（ｄ）抽出溶液に対して質量分析（例えば、タンデム質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳ−ＭＳ、ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＩＣＰ−ＭＳなど）を行い、存在する分子を同定する段階。前述のように、典型的に、ゲル切片の断片は質量分析による分析の前に抽出溶液から分離される。
【０１１３】
本発明はまた、高分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および炭水化物などの分子の配列決定を行うための方法を含む。これらの方法は以下の段階を含む：（ａ）ゲル電気泳動により１つ以上の分子を分離する段階、（ｂ）電気泳動したゲルを切り出して１つ以上の関心対象分子を含むゲル切片を得る段階、（ｃ）前述のミンスチューブのメッシュ材の上にゲル切片を置く段階、（ｄ）ミンスチューブ、メッシュ、およびゲル切片を遠心してゲル切片をメッシュに通過させ、ゲル切片を細分して断片にする段階、（ｅ）抽出溶液を用いてゲル切片の断片から分子を抽出する段階、ならびに、（ｆ）抽出溶液に対して質量分析（例えば、タンデム質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳ−ＭＳ、ＦＴＩＣＲ−ＭＳ、ＩＣＰ−ＭＳなど）を行い、存在する分子を同定する段階。
【０１１４】
質量分析を行うための方法は、その全開示内容が参照として本明細書に完全に組み入れられる米国特許第６，２３８，８７１号、第５，９５５，７２９号、第５，８５４，４８６号、第５，７１６，８２５号、第５，７０５，８１３号に記載されている。特に、Ｋｏｓｔｅｒらの米国特許第６，２３８，８７１号には、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＥＳ−ＭＳ）を用いて核酸の配列決定を行う方法が記載されている。
【０１１５】
本明細書で説明されている方法が、タンパク質、ペプチド、核酸、およびすべての種類の高分子を含むその他の物質の単離に使用できることは理解されるべきである。
【０１１６】
本発明の１つの局面では、ゲルをミンスおよび処理するためのキットが提供される。キットは、複数の構成要素および試薬をパッケージ化して一緒に提供することによって、例えば本発明の方法の実施を迅速化するのに役立つ。さらに、方法の精度および信頼度を向上させるため、これらのキットの試薬はあらかじめ計量された状態で提供されてもよい。キットは、キットの１つ以上の構成要素を収容するよう区画化された保持具を含んでいてもよい。ゲルをミンスしかつゲルから分析物を抽出するための本発明のキットは、通常、箱などであるカートンと、箱、チューブ、アンプル、瓶、袋、プレートなどである１つ以上のコンテナと、ミンスチューブと、下記の品目のうち１つ以上の任意の組合せとを含む。
【０１１７】
本発明のキットは、図を参照しながらすでに説明したように、条件多孔質を含む受け容器または処理チューブを含んでいてもよい。
【０１１８】
キットはゲルを処理するための１つ以上の溶液、または、１つ以上の溶液を調製するための材料を含んでいてもよく、そのような例としては例えば相溶性の塩溶液に溶解したトリプシン酵素、またはパッケージ化された乾燥酵素がある。溶液は、条件多孔質膜に捕捉されたタンパク質またはペプチドを溶出するための水性溶媒、非水性溶媒、または混合溶媒を含んでいてもよい。さらに溶液は、トリプシン、長鎖アルキル基、イオン交換基、短鎖カルボン酸塩またはスルホン酸塩、キレート基、またはボロン酸などの試薬を含む溶媒、緩衝溶液、または溶液であってもよい。キットは、ゲルから得られた成分を処理または抽出するよう修飾された条件多孔質膜に捕捉されているタンパク質またはペプチドを溶出するための水性溶媒、非水性溶媒、または混合溶媒を含んでいてもよい。
【０１１９】
キットは１つ以上の予備の膜もしくは予備のメッシュ材を含んでいてもよく、または、ユーザーがゲルのカスタム断片を得られるよう異なる細孔径のメッシュ材を含んでいてもよい。キットは使用方法を記載した印刷物を含んでいてもよい。
【０１２０】
キットは、ゲルから得られた成分のうち、後の分析手順に干渉するまたはこれを損ねる可能性のある成分を選択的に除去するための処理済または未処理の膜を１つ以上含んでいてもよい。膜は、長鎖アルキル基、第三級アミンまたは第四級アミンなどのイオン交換基、短鎖カルボキシレートまたはスルホネート、金属イオンアフィニティ捕捉のためのキレート基、またはボロン酸で処理されていてもよい。キットは、イオン交換粒子または逆相捕捉粒子などの粒子を膜上に有していてもよい。
【０１２１】
本発明のキットはさらに、ゲルもしくはゲル電気泳動器装置、ピペット、またはスパーテルを含む品目を１つ以上含んでいてもよい。
【０１２２】
以上、本発明をその好ましい態様を参照しながら具体的に図示および説明したが、当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の形式および詳細において種々の変更を行いうることが理解されるものと思われる。
【０１２３】
本明細書中で参照しているすべての刊行物、論文、および特許は、米国仮特許出願第６０／２１８，８２１号も含め、参照として本明細書に完全に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】メッシュ材を含むゲルミンスチューブを示した図である。
【図２】メッシュ材を含む、ネスト化されたゲルミンスチューブを示した図である。
【図３Ａから３Ｄ】図２のネスト化されたチューブの使用法を、細分されたゲルの処理および基本的な回収技術を含めて示した図である。
【図４Ａから４Ｄ】ゲルミンスチューブの別の態様の使用法を、ゲルミンスチューブを回収容器内へ反転させることによる別の回収方法を含めて示した図である。
【図５】メッシュ材の底部および処理膜を含む、ネスト化されたゲルミンスチューブの別の態様を示した図である。
【図６】ネスト化された処理チューブおよび回収容器を有する、ネスト化されたゲルミンスチューブの別の態様を示した図である。
【図１】
2004518944.tif 000004
【図２】
2004518944.tif 000005
【図３】
2004518944.tif 000006
【図４】
2004518944.tif 000007
【図５】
2004518944.tif 000008
【図６】
2004518944.tif 000009
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004518944.tif 000067
2004518944.tif 000068
2004518944.tif 000069
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【国際調査報告】
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