(57)【要約】本発明は植物組織からプロテイナーゼインヒビターの抽出法を提供する。プロテイナーゼインヒビターの抽出は、アルコールを含有しない、有機酸と塩とからなる水性溶液を植物組織に添加することから始める。抽出溶液と植物組織とを粉砕して植物組織の平均粒度を減少させ抽出効率を向上させる。抽出溶液対植物組織の重量比は約１：１〜約１：１０を使用する。ポテト塊茎からプロテイナーゼインヒビターIIを抽出する際に、抽出溶液はギ酸および塩化ナトリウムを利用し、平均粒度を約100〜1500ミクロンに減少させる。本発明の方法は、原価効率の良いことが示され、工業的規模で高収率の目標プロテイナーゼインヒビターを与える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテイナーゼインヒビターを含有する植物材料からプロテイナーゼインヒビターを抽出する方法であって、
(a)  約0.5重量％〜約2.5重量％の濃度の有機酸および規定度約0.3〜5.0を与える量の塩を水に加えることにより抽出溶液を調製すること、
(b)  抽出溶液対植物材料が約１：１〜約１：１０の重量比で、抽出溶液に植物材料を加えること、および
(c)  抽出溶液中で植物材料を粉砕して、植物材料の平均粒度が約100ミクロン〜約1500ミクロンとなるように減少させること
の各工程を含む、プロテイナーゼインヒビターを含有する植物材料からプロテイナーゼインヒビターを抽出する方法。
【請求項２】
抽出溶液がアルコールを含有しない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有機酸を酢酸、アスコルビン酸、クエン酸、およびギ酸からなる群から選択する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
スラリーを濾過して、抽出したプロテイナーゼインヒビターを含有する清澄化させた液体抽出物を残して粒子の一部を除く工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抽出溶液対植物材料の重量比が約１：１．５〜１：４である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
有機酸がギ酸であり、塩が塩化ナトリウムである請求項３に記載の方法。
【請求項７】
植物材料がポテト塊茎からなる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
混合物中の塊茎の得られた平均粒度が約1000μｍ未満である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
植物材料がポテト塊茎を含み、得られた平均粒度が約1000μｍ未満であり、そして濾過工程に約15μｍ〜約100μｍのスクリーン寸法のフィルターを使用する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
プロテイナーゼインヒビターがポテトプロテイナーゼインヒビターIIである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
粉砕工程はスラリーを90℃を超える温度に上昇させない請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
原料ポテト塊茎からプロテイナーゼインヒビターIIを抽出する方法であって、
(a)  約0.5重量％〜約2.5重量％の濃度のギ酸および規定度約0.3〜5.0を与える量の塩化ナトリウムを水に加えることにより抽出溶液を調製すること、
(b)   抽出溶液対ポテト塊茎が約１：１〜約１：１０の重量比で、抽出溶液にポテト塊茎をで加えること、および
(c)  抽出溶液中で当該植物材料を粉砕して、植物材料の平均粒度が約100ミクロン〜約1000ミクロンとなるように減少させること
の工程を含む、原料ポテト塊茎からプロテイナーゼインヒビターIIを抽出する方法。
【請求項１３】
ギ酸濃度が約1.2〜1.7重量％であり、塩化ナトリウムの規定度が約0.8〜1.5である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抽出溶液対ポテト塊茎の重量比が約１：２〜１：３である請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
抽出溶液がアルコールを含有しない請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明はプロテイナーゼインヒビターの抽出を増大させる方法に関し、さらに詳細には、全ポテトから抽出されるプロテイナーゼインヒビター−II(Proteinase Inhibitor II:PI2)の収率と純度を改良する方法に関する。
【０００２】
２．従来技術の背景
生化学分野では植物由来のプロテインの抽出、単離および精製は周知である。１９７２年に、MelvilleおよびRyanは、ポテト塊茎からキモトリプシンインヒビターI (Chymotrypsin Inhibitor I) を単離する大量製造法について報告した(Melville, J. C. and Ryan, C. A. Chymotrypsin inhibitor I from potatoes. J. Biological Chem., 247: 3445 - 3453, 1972) 。MelvilleおよびRyanの方法によれば、皮を剥いていないポテトをスライスし、亜ジチオン酸ナトリウム溶液中に浸し、均質化し、ナイロン布を通して絞った。得られた絞り汁のｐHを３に調整し、５°F、１５分間１０００ｘｇで遠心分離させ、上澄み液を集め、硫酸アンモニウムを用いて分別した。
【０００３】
水洗および熱処理により精製を行い、それにより、加熱された分別物の澄明な濾液を貯め、減圧凍結乾燥させた。水中に凍結乾燥させた粉末を懸濁させ、それを水に対して４８時間透析し、粗抽出物から得られた澄明な濾液を凍結乾燥させた。次いで、再懸濁させた抽出物を遠心分離し、Sephadex G-75のカラムに付した。インヒビターIを含有するフラクションを集めて貯め、蒸発させ、Sephadex G-25のカラム上で脱塩させた。得られたゲル濾過されたインヒビター生成物を、Sephadex G-75カラム上で解離させ、Sephadex G-25カラム上で脱塩させることにより精製した約９０％のインヒビターIプロテインであると決定した。
【０００４】
Ryanラボは、インヒビターIについて記載したのと大体同じ方法でプロテイナーゼインヒビターIIの単離および特性化を続報した(Bryant, J., Green, T.R., Gurusaddaiah, T., Ryan, C.L. Proteinase inhibitor II from potatoes: Isolation and characterization of its promoter components. Biochemistry 15: 3418 - 3424, 1976)。Bryant等は、１０分間８０℃の温度に対するそれぞれの安定性に基づいてポテト由来プロテイナーゼインヒビターを２群に区別した。プロテイナーゼインヒビターI(PI1)は、３９，０００の分子量の４混成イソインヒビタープロトマー種から構成される４量体プロテインとして特性化され、一方、PI2は、２１，０００の分子量の４イソインヒビタープロトマー種を含む２量体インヒビターとして特性化される。
【０００５】
国際公開WO99/01474にポテト由来のプロテイナーゼインヒビタープロテインの抽出と単離とが記載されている。ポテト塊茎由来のプロテインを、希釈ギ酸および２０％エタノールのような水性／アルコール抽出媒体中に可溶性形態で抽出する。アルコール抽出物を第一の温度に加熱して望まないプロテインの殆どを変性させ、第二の温度に冷却して、デブリス(debris)と、熱安定なプロテイナーゼインヒビタープロテインを含有する可溶相とを構成する沈殿相を形成する。熱安定なプロテイナーゼインヒビタープロテインを、希釈ギ酸のような適当な透析媒体に対して透析することにより可溶相から析出させる。
【０００６】
最近、PI2は、PI2を含有する栄養ドリンク組成物を与える対象において満腹感(satiety)を延長させる役割を演じるのに関与してきた。米国特許出願第０９／６２４，９２２号は、PI2を含有する栄養ドリンク組成物を含む食事を与えたとき、食後最高３ 1/2時間まで空腹感の顕著な減少を被検者が報告したことを記載する。同様に、満腹度が増強され、各研究は、被検者が、食欲抑制用化合物に典型的に関連する副作用を経験することなく３０日で平均２ｋｇ減量したことを示す。機械論的に、被検者により消費されたとき、トリプシンインヒビターおよびキモトリプシンインヒビターとして、対象により消費されたとき、PI2は内因性コレシストキニン（食物摂取に対する欲望を減少させるのに有効な推定フィードバック剤として知られている）の放出を刺激すると考えられる。
【０００７】
プロテイナーゼインヒビター抽出のための既存の方法は骨が折れしかも時間がかかる数工程を含み、回収したプロテイナーゼインヒビターの収率の損失および純度の減少をもたらす。加えて、殆どの有望な従来方法は抽出溶液中にエタノールの使用に依存しており、高濃度で使用したとき溶液を可燃性にする。従来法のどれも工業規模における使用を示していない。したがって、産業的な質的および量的標準に適合する原価効率がよく且つ効率的な方法でPI2を抽出する大規模抽出法に対する必要性がある。
【０００８】
発明の概要
所望のプロテイナーゼインヒビターを含有する植物材料を有機酸および塩からなる溶液と合わせる。植物材料を、粒度を減少させて粒子の表面積を増大させ、抽出効率を改良するために粉砕する（酸および塩溶液中でスラリーを形成する）。粉砕方法は、局所的な熱作用により目的のプロテイナーゼインヒビターを変性させることなく粒度を減少させるように選択する。酸および塩溶液は粉砕した植物材料からプロテイナーゼインヒビターの抽出を増大させ、破裂した植物細胞から放出する可能性のある他の化合物による分解に対してプロテイナーゼインヒビターを保護する。溶液中に抽出されたら、プロテイナーゼインヒビターを、抽出溶液の遠心分離、清澄化、濾過および乾燥により、単離し精製する。精製したプロテイナーゼインヒビター製品の品質を落とさないように、濾過段階の間に酸および塩溶液を除く。
【０００９】
好適な実施態様では、プロテイナーゼインヒビターII(PI2)を全ポテト塊茎から抽出する。本方法に有効であると知られている有機酸には酢酸、アスコルビン酸、クエン酸およびギ酸等がある。ギ酸が、最終PI2製品の最高純度および最高収率をもたらすことが判明した。溶液中のギ酸の含量を０．５％〜２．５％ｗ／ｗの範囲内、好適にはおおよそ１．５％の含量に調節する。ポテトプロテインの溶解性を増すために塩化ナトリウムを抽出剤溶液に加える。１N〜３Nの間の塩化ナトリウム濃度が使用され、おおよそ１．５Nの濃度が好ましい。抽出溶液対ポテトの重量比（ｗ／ｗ）がそれぞれ１：１〜１：１０、好ましくは１：２．５となる重量比で溶液をポテトに加える。
【００１０】
粉砕はすりつぶすことにより行う。目標の粒度は１００〜１５００μｍの範囲内である。この範囲内で、製品の収率が増加し、スラリーの流れ特性が許容できた。１００μｍ未満に粒度を小さくすると、PI2の回収率の低下をもたらし、流れ特性を改良しなかった。長期間の粉砕処理もPI2の収率を減少させる。多分、温度の上昇とPI2収率を低下させる望ましくないプロテアーゼの放出が原因である。ギ酸および塩化ナトリウムは濾過段階の間に効率的に除去される。
【００１１】
本発明の目的は、植物材料からプロテイナーゼインヒビターの改良した抽出方法を提供することである。
本発明の別の目的は、抽出溶液にエタノールの使用に依存しない、ポテト塊茎からプロテイナーゼインヒビターIIの改良した抽出方法を提供することである。
【００１２】
さらに本発明の目的は、効率的でしかも工業規模で費用効率の高い、ポテト塊茎からのプロテイナーゼインヒビターIIの抽出法を提供することである。
発明の詳細な記述
ポテトからのPI2の抽出および単離は、有機酸（好ましくは、ギ酸）および塩（好ましくは、塩化ナトリウム）の原料ポテトへの添加により開始する。得られた混合物を粉砕してポテト粒子の粒度を小さくさせ、可溶性プロテインを抽出する。遠心分離を用いて固体を除去し、多くの望ましくないプロテインを変性させるがPI2は変性させることのない適切な温度に液体フラクションを加熱する。
【００１３】
溶液を再度遠心分離して望ましくない不溶性プロテインを除去し、液体フラクションを微細濾過処理して相対的に大きな粒子を除く。限外濾過を使用して有機酸および塩を除き、さらに残渣中のPI2を精製する。
【００１４】
全ポテトからのPI2の抽出方法は、収率を可及的に上げ、経費を可及的に少なくし、そして工業的実現可能性を達成する試みにおいて開発された。PI2を溶解させ、分解からPI2を保護し、不溶性ポテト成分から除かれた総PI2を可及的に多くするが、一方で共可溶化(co-solubilized)プロテインの量を可及的に少なくする能力に基づいて抽出溶液を評価する。酸性媒体および高められた温度におけるPI2の溶解性と機能安定性(functional stability)を抽出溶液に組み入れた。塩化ナトリウムとギ酸を含有する抽出溶液がこの目的のために有効であることを見出した。抽出される原材料に対する利用される抽出溶液の割合は、経費目的のために可及的に少なくされ、一方、原材料ポテト塊茎１ｋｇ当たりのPI2の収率を可及的に多くした。
【００１５】
逆相HPLC法
PI2、Kunitzおよびカルボキシペプチダーゼインヒビターの量を逆相HPLCを使用して測定した。Microsorb  C-18カラム（4.6 mm ×250 mm、300 オングストローム孔寸法を有する5μm粒子; Varian Analytical Instruments）を使用した。二種の移動相溶媒を調製した。溶媒Aは800ｇの脱イオン水、150ｇのアセトニトリルおよび0.95のトリフルオロ酢酸であり、溶媒Bは850ｇのアセトニトリルおよび0.85ｇのトリフルオロ酢酸だった。約50mgの試料を100mlの溶媒Aに添加した。試料を30秒間ボルテックス処理をし、次いで、10,000rpmで10分間遠心分離した。RP-HPLC分析のために上澄み液を集めた。カラムに100μｌの試料を注入し、ポンプを800〜2500psigに設定し、温度を30.0℃に設定した。その他の流量、時間、および溶媒組成は表1に記載した通りである。検出器のダイオードアレイを220nmに設定した。
【００１６】
【表１】
2004531582.tif 000002
【００１７】
カラムの較正のため、外部標準を調製して標準曲線を作図した。５ｍｇのBSAを10ｍｌの溶媒Aに溶解した。４容量、すなわち、2.5、50、75、および100μｌをカラムに注入した。結果から較正曲線を形成した。
【００１８】
実施例１
500ｇのポテト塊茎を、Waringブレンダー中で2.5分間213ｍｌの1％ギ酸を使用して抽出した。得られたスラリーを10,000 rpmで40分間遠心分離した。液体をデカント処理し、#4 Whatman 濾紙を通して濾過し、486ｇの清澄抽出物を得た。この清澄抽出物50ｇを、マグネチック攪拌棒を備えた6個の125ｍｌアーレンマイヤーフラスコにそれぞれ注ぎ入れた。表２に相当する量のNaClを各フラスコに入れ、塩が溶解するまで攪拌した。次いで、フラスコを、抽出物の温度が70℃に達するまでホットプレート上で攪拌しながら加熱した。室温まで周囲温度で冷却した後、溶液を12,000 rpmで5分間遠心分離し、次いで、上述した逆相HPLC法を使用して分析した。PI2ピークの面積を積分することによりPI2の報告されたレベルを計算した。注入量は100μｌであり、次の式を使用してピーク面積をプロテインレベルに等しいとした。
【００１９】
【数１】
2004531582.tif 000003
【００２０】
清澄化させたポテト抽出物に種々の量の塩化ナトリウムを加え、次いで、10分間70℃に加熱した。室温に冷却後、PI2の定量のためにHPLC法を使用してPI2後に溶離するプロテインについて溶液を分析した。結果を表2に示す。
【００２１】
【表２】
2004531582.tif 000004
【００２２】
ポテト抽出物からのKunitz不純物（満腹感を増すPI2の有効性を減じることが示されている）の除去を確立するために、SIGMA社から購入した商業的に入手できるKunitz標準品について逆相HPLC法を使用した。Kunitz標準品のクロマトグラフは、Kunitz不純物の主要ピークが約25分の位置に出現することを明らかにした。ポテト中に存在することが知られているその他のインヒビターはカルボキシペプチダーゼインヒビターである。SIGMA社から購入した商業的に入手できるカルボキシペプチダーゼ標準品について逆相HPLC法を使用した。カルボキシペプチダーゼ標準品のクロマトグラフは、カルボキシペプチダーゼ不純物の主要ピークが約１７分の位置に出現する二重項であることを明らかにした。0.3N塩化ナトリウムのそれ以上のレベルで、後加熱処理プロテインレベルは相対的に一定のままである。すべての試験について、PI2のレベルが相対的に一定のままであったことは、70℃でPI2が0.5Nまでの塩レベルで沈殿しないことを示す。加熱処理相において要求されるNaClのレベルに達するために、所望の最終塩濃度のおおよそ2倍を用いて抽出剤を使用することが必要である。したがって、70℃の熱処理の間抽出溶液において少なくとも0.3Nのレベルの塩が望ましく、Kunitz型プロテインの効率的な除去を確実にする。最終PI2製品の純度は、より多量の塩化ナトリウムを用いて改良されることができる。
【００２３】
実施例２
抽出溶液の適切なNaCl含量とギ酸含量との双方を決定するために最適化検討を行った。理想的な抽出溶液配合物は、ポテト母体から遊離するPI2の量を可及的に多くする一方で、可溶化プロテイン混入物を可及的に少なくすることである。PI2の遊離を、1.0N  NaClの抽出溶液組成物に標準化した収率として測定した。これは、加熱処理段階において不純物除去のために有効であると示された0.5N系を超えて２倍増加のNaClを必要とする前述した予測から、標準化ベースとして選択した。最適化目的のため、PI2プロテイン純度を測定し、当該純度を標準化した抽出収率と実験的に比較した。0.0N〜2.0NのNaCl濃度を含有する抽出溶液を試験した。同様にして、抽出溶液のギ酸含量を最適化した。0.0％〜2.5％の範囲のギ酸含量を検討した。
【００２４】
【表３】
2004531582.tif 000005
【００２５】
【表４】
2004531582.tif 000006
【００２６】
【表５】
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【００２７】
【表６】
2004531582.tif 000008
【００２８】
0.5N以上のNaCl規定度が高収率を与えることが判明されたが、収率と純度との双方を可及的に向上させるので1.0N  NaClを選択した。
【００２９】
【表７】
2004531582.tif 000009
【００３０】
【表８】
2004531582.tif 000010
【００３１】
【表９】
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【００３２】
【表１０】
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【００３３】
データは抽出溶液のために1.5％ギ酸含量の使用を示す。その他のギ酸濃度は同様の収率を示すが、
1.5％ギ酸含量が明らかに純度を可及的に大きく向上させる。
【００３４】
実施例３
水中1.5％ギ酸および1.0N  NaClからなる種々の量の抽出溶液を使用して収率における影響を決定するために実験を行った。ポテト対抽出溶液の重量比を１：１〜１：１０に変動させた。使用した比率と観察された収率を表１１に報告する。
【００３５】
【表１１】
2004531582.tif 000013
【００３６】
抽出溶液の最も高い比率の場合に最も高い収率が達成されたが、総収率の増加は０．４を超え１までで最低である（それぞれ1:2.5ｗ／ｗ抽出溶液対ポテト）。抽出溶液の費用ならびに加熱、冷却および蒸発のような材料取り扱いに関することを可及的に少なくするためにこの比率を選択した。
【００３７】
データは、PI2単離のための抽出溶液の好適濃度として、約1.0N塩化ナトリウムの選択を決定させる。1.0N塩化ナトリウムを使用することにより、試験した条件下でPI2の最大限の収率をもたらし、そして同様の収率をその他の濃度で得ることができるが、1.0N  NaClの使用により表されるPI2プロテイン純度は1.0Nで最大である。より少ない塩化ナトリウム使用して、より高いPI2プロテイン純度を達成できるが、これはPI2収率の減少をもたらし得る。塩化ナトリウムのこのレベルはKunitz型不純物の除去のためにも適している。同様に、データは、PI2抽出のための好適濃度として、1.5％ギ酸の選択を決定させる。1.5％ギ酸を含有する抽出溶液は抗微生物および抗プロテイン分解作用に利点を示す。PI2収率は抽出溶液に1.5％ギ酸含量で試験した条件下で最大であり、この濃度は匹敵した収率を達成する配合物のうち最も高いPI2／Kunitz純度も得る。30重量％抽出溶液よりも高いスラリーを作ったとき収率の顕著な向上はない。30％抽出溶液組成物からなるスラリーは、抽出溶液１部対原材料2.5部（１：２．５溶媒対固形分比）にだいたい匹敵する。
【００３８】
実施例４
約1.0N塩化ナトリウムおよび1.5％ギ酸を含有する液体抽出溶液は、可溶性PI2に有効であることが判明した一方でその機能的安定性を維持した。抽出系は、ポテト細胞マトリックスから目標プロテインの放出を最適化するために試験した。物理的粉砕がポテト塊茎細胞の破壊に必要であり、それにより液相にプロテインを放出する。液相中への可溶性プロテインの完全放出、最小限のPI2分解、および液／固分離の容易性についてポテトスラリーの最終粉砕様相を試験した。粉砕様相と抽出効率との相関を試験し、次いで、最適化粉砕様相の分離容易性を試験した。
【００３９】
ASTM規格書１１に合致する一組の積み重ね可能な篩いを、最も粗い篩い寸法のものを一番上に、そして次第に細かい篩い寸法になるように組み合わせる。篩い寸法範囲は、寸法分けしようとする懸濁液中に少なくとも95％の固形分を捕獲するように選択する。おおよそ250グラムの寸法分けしようとする懸濁液を積み重ねた篩いの上に注ぐ。
【００４０】
一番上の篩いを、その篩いを通過する固体が見られなくなるまで繰り返し水洗する。次いで、この篩いを除き、各篩についてこの水洗処理を繰り返す。各篩の内容物を予め秤量したボート中に入れ、１００℃未満であるが５０℃を超える温度で減圧オーブン中に入れ少なくとも１２時間乾燥させた。固体を乾燥後、それらの重量を化学天秤で測定し、記録する。粒度分布を各篩に残った固体の乾燥重量として、残った乾燥固体の総重量の百分率として表す。寸法単位としてマイクロメーターを使用して表１２に報告する。
【００４１】
【表１２】
2004531582.tif 000014
【００４２】
これらの試行全体について、原料ポテトを1.5％ギ酸および1.0N  NaClの水溶液を１：２．５の抽出溶液対ポテト重量比で使用して抽出した。PI2濃度を前述した逆相HPLC法を使用して導いた。
【００４３】
抽出溶液の存在下でポテトの分解の程度を検討した。この抽出態様を試験するために、商業的に入手できるCommitrol粉砕器を使用して最適化した抽出溶液および原料である全ポテトの試料を粉砕した。多くの一致した目標様相に形成する粉砕装置能力を決定し、これらの粉砕の範囲内の粒度分布を試験するために検査プロトコールを設計した。PI2含量について実験的に粉砕したスラリーを分析した。より微細な粉砕様相がｍｇ／ｋｇ基準でPI2収率が上昇する傾向のあることが発見された。1000μｍよりも大きい平均粒度での抽出はPI2抽出効率の著しい低下を示した。
【００４４】
100μｍ未満の公称粒度にUrschel粉砕器を用いて粉砕すると、試料は１ｋｇのポテト当たり85ｍｇのPI2を得た。約1500μｍの粉砕寸法を与えるHobart粉砕器を使用して同ロットのポテトと抽出溶液を使用してなした同様の試験は１ｋｇのポテト当たり70ｍｇのPI2を得た。
【００４５】
【表１３】
2004531582.tif 000015
【００４６】
この実験のために採用した条件下で濾過の容易性に評価できる差はなかった。Urschel粉砕から回収した最終パルプは17.3重量％のスラリーであり、49.8％の水分レベルを含有した。Hobart粉砕から回収したパルプは31.9重量％のスラリーであり、60.5％の水分レベルを含有した。これは、液体重量％収率を使用して、より粗い粉砕様相ではおおよそ10％の収率の潜在的損失を表す（粗く粉砕した廃出固体中残留液体が17.2％に対して微細に粉砕した廃出固体中残留液体が7.1％）。
【００４７】
PI2および質量バランス損失に加えて、より微細な粉砕は、より微細な粉砕プロトコルを使用して抽出された総プロテインがより多量である。得られた液体抽出物を逆相HPLC法を使用して定量した。微細粉砕抽出物は望ましくないプロテインをより高い濃度で含む。特に、PI2／Kunitz純度（PI2の濃度をKunitz不純物およびPI2の総濃度で割ったもの）が粗い粉砕についての7.41％純度から、微細粉砕からもたらされる抽出物の5.99％純度に減少する。
【００４８】
種々の粉砕様相を使用してPI2の収率をさらに検討した。検査した粉砕様相を平均粒度３００μｍ〜平均粒度１２００μｍに変動させた。
【００４９】
【表１４】
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【００５０】
表１４は、PI2収率に関して最終粉砕様相についての最適化検討を提供する。試料組み合わせで最高のPI2収率になるように収率と純度を標準化する。平均粒度がおおよそ500μｍのとき最高収率が観察された。PI2／Kunitz純度も許容できる（その他の粉砕様相で一つのみがより高い純度を示したが、PI2収率において許容できない犠牲があった）。パイロット規模で所望の粉砕様相を生じさせるために、「Microcut Head Assembly」を使用した。粉砕ヘッドの幾つかの機械特性（たとえば、ヘッド中のブレードの数、空間および角度）ならびにインペラーの速度と型により最終粉砕様相を決定する。Microcutのヘッドは、各々0.84インチ厚さの190炭化タングステンを特徴とする。この厚さは、各ブレード間に0.153インチ（388.62μ）の空間を与える。インペラーにより押されて製品はブレード間の空間を通過する。その耐久性とそれが生じさせる均一の粒度のため、使用されるインペラーは「veri-cut」である。このインペラーは、このヘッドアセンブリーと協働して、0.0016インチ（40.64μ）の深さを形成する。インペラー、粉砕用ブレードおよび原材料の相互作用により、観察される温度上昇に信頼できる摩擦を生じさせる。10度の上昇は、PI2の熱安定性（70℃で3時間を超える）のため有害でないと考えられる。カットの深さはインペラーの速度でわずかに変動し得、モーターにより定まる。これらの検討のために、一致した粉砕様相を使用しておおよそ500μの平均粒度を与えた。
【００５１】
次いで、最適化した粉砕様相を使用して、液／固スラリーの適切な分離条件を決定するための試行を行った。液体から固体を分離するために利用できる多くの技法がある。抽出溶液混合物からポテト固体を分離するために適切なものとしてバスケット型遠心分離(basket type centrifuge)が確認された。分離処理の目標はスラリーから抽出される液体を可及的に多くすることであり、一方、可及的に少ない量の水分を含有するケークを形成することにある。液体フラクション内にPI2が分散することが期待されるので、液体回収を可及的に多くすることがPI2の収率を可及的に多くするのに第一に重要事項である。大量生産モデルに直接スケールアップできるパイロットモデルを使用して、パイロット試行を行った。これらの試行により最適化された遠心分離の特性は、フィルター−メッシュスクリーンサイズであった。
【００５２】
【表１５】
2004531582.tif 000017
【００５３】
液体回収データを、データ組み合わせにわたって検査した最も高い収率のものに標準化し、減圧オーブン温浸により固体ケークを測定した場合の水分、そして浮遊固体をジャイロ試験により決定した。表１５からのデータに基づいて、35μフィルターバッグメッシュを継続させたパイロット検討のために、および大量生産のために選択した。最大スクリーンメッシュを利用して液体収率を最大限にした（試験した試料組み合わせ）。残念ながら、このスクリーンメッシュは濾過抽出物内の浮遊固体量も最大にする。75μより下のフィルターバックを使用して、浮遊固体の量の劇的減少が観察されることが分かった。許容できる収率および収集速度と組合わさって、35μフィルターを使用して達成される浮遊固体の減少は、35μバッグを好適な選択にした。
【００５４】
前述は本発明の例証的実施態様を含む。前述の実施態様および本明細書中で記載した方法は、当業者の能力、経験および好みに基づいて変動できる。一定の順序で本方法の段階を単に列挙することは、当該方法の段階の順序に如何なる制限も必ずしも構成しない。前述および図面は本発明を単に説明し例証するものであり、特許請求の範囲で制限する場合を除いて、本発明を制限しない。本発明を開示された当業者は本発明の範囲から逸脱することなく修正および変化させることができる。
【国際公開パンフレット】
2004531582.tif 000018
2004531582.tif 000019
2004531582.tif 000020
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月20日(2003.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
プロテイナーゼインヒビターを含有する植物材料からプロテイナーゼインヒビターを抽出する方法であって、
(a)  約0.5重量％〜約2.5重量％の濃度の有機酸および規定度約0.3〜5.0を与える量の塩を水に加えることにより抽出溶液(アルコールを含有しない）を調製すること、
(b)  抽出溶液対植物材料が約１：１〜約１：１０の重量比で、抽出溶液に植物材料を加えること、および
(c)  抽出溶液中で植物材料を粉砕して、植物材料の平均粒度が約100ミクロン〜約1500ミクロンとなるように減少させること
の各工程を含む、プロテイナーゼインヒビターを含有する植物材料からプロテイナーゼインヒビターを抽出する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
原料ポテト塊茎からプロテイナーゼインヒビターIIを抽出する方法であって、
(a)  約0.5重量％〜約2.5重量％の濃度のギ酸および規定度約0.3〜5.0を与える量の塩化ナトリウムを水に加えることにより抽出溶液(アルコールを含有しない）を調製すること、
(b)   抽出溶液対ポテト塊茎が約１：１〜約１：１０の重量比で、抽出溶液にポテト塊茎をで加えること、および
(c)  抽出溶液中で当該植物材料を粉砕して、植物材料の平均粒度が約100ミクロン〜約1000ミクロンとなるように減少させること
の工程を含む、原料ポテト塊茎からプロテイナーゼインヒビターIIを抽出する方法。
【国際調査報告】
2004531582.tif 000039
2004531582.tif 000040