(57)【要約】長いペントラキシンＰＴＸ３（ＰＴＸ３）またはその機能性誘導体の１つの、自己免疫疾患の予防および治療用薬物の調製のための使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
長いペントラキシＰＴＸ３またはその誘導体の、自己免疫疾患の予防用および治療用薬物の調製のための使用。
【請求項２】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節炎、糖尿病、甲状腺炎、溶血性貧血症、萎縮性睾丸炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、慢性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、ライター症候群、筋肉炎、全身性硬化症または多発性関節炎からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
長いペントラキシンＰＴＸ３が天然に存在するＰＴＸ３である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
長いペントラキシンＰＴＸ３がヒトペントラキシンである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
長いペントラキシンＰＴＸ３が合成により得られたＰＴＸ３である、請求項１−４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
自己免疫疾患を患う患者に、長いペントラキシンＰＴＸ３またはその誘導体の治療上有効な量を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
【請求項７】
自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節炎、糖尿病、甲状腺炎、溶血性貧血症、萎縮性睾丸炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、慢性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、ライター症候群、筋肉炎、全身性硬化症または多発性関節炎からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
長いペントラキシンＰＴＸ３が天然に存在するＰＴＸ３である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
長いペントラキシンＰＴＸ３がヒトペントラキシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
長いペントラキシンＰＴＸ３が合成により得られたＰＴＸ３である、請求項６−９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の予防および治療用薬物の調製のための長いペントラキシンＰＴＸ３（ＰＴＸ３）またはその機能性誘導体の１つの使用に関する。
【０００２】
ＰＴＸ３は様々な細胞タイプにおいて発現しており（Ｂｏｔｔａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７， ２７２： ３２８１７−３１８２３）、特に炎症性サイトカインであるインターロイキン１β（ＩＬ−１β）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）にさらされた後の、単核食細胞および内皮細胞において発現している。
【０００３】
今日までＰＴＸ３の生物学的機能は理解されていなかった。
【０００４】
ＰＴＸ３は、既知のいずれの分子にも関連性のないＮ−末端ドメインと、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のような短いペントラキシンに類似しているＣ−末端ドメインとの２つの構造ドメインからなる（Ｂｒｅｖｉａｒｉｏ Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：２２１９０， １９９２）。
【０００５】
ヒトＰＴＸ３（ｈＰＴＸ３）と動物のＰＴＸ３との間にはかなりの類似度が見られる。特に、マウスＰＴＸ３（ｍＰＴＸ３）は、ＤＮＡ配列と遺伝子構成および位置の点ではｈＰＴＸ３と非常に類似している。ヒトおよびマウスのＰＴＸ３遺伝子の間の同一性の程度は８２％であり、保存的置換を考慮した場合には９０％に達する（Ｉｎｔｒｏｎａ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．： Ｂｌｏｏｄ ８７ （１９９６） １８６２−１８７２）。マウスＰＴＸ３遺伝子はマウスの染色体３の、ヒト３ｑ領域（ｑ２４−２８）に類似する領域に位置しており、ｈＰＴＸ３が３ｑ２５領域に位置しているという報告と一致する（Ｉｎｔｒｏｎａ Ｍ．， ｅｔ ａｌ．： Ｂｌｏｏｄ ８７ （１９９６） １８６２−１８７２）。
【０００６】
ｈＰＴＸ３とｍＰＴＸ３配列との間の高度な類似性は、進化の過程でペントラキシンが高度に保存されてきたことを示す（Ｐｅｐｙｓ Ｍ． Ｂ．， Ｂａｌｔｚ Ｍ． Ｌ．： Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３４：１４１， １９８３）。
【０００７】
ペントラキシンについての総説としては、Ｈ． Ｇｅｗｕｒｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９５， ７：５４−６４を参照されたい。
【０００８】
長いペントラキシンＰＴＸ３は、サイトカインとリポ多糖（ＬＰＳ）の両者によってもたらされる炎症誘発性シグナルを受けた組織において産生される。
【０００９】
これらの炎症誘発性化合物は炎症プロセスにおけるアポトーシス（プログラムされた細胞死）および樹状細胞（ＤＣ）の生理的成熟を促進する。
【００１０】
細胞死は通常炎症プロセスにおいて生体内で起こる。
【００１１】
生物体においてアポトーシスによる瀕死細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｄｙｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）は生組織から除去される。過剰で無秩序なアポトーシスにおいては大量の死細胞（ｄｅａｄ ｃｅｌｌｓ）が生物体による細胞集団の除去能力を阻害する。これらの細胞は組織に蓄積し、未熟ＤＣなどの異常な食細胞によるファゴサイトーシス（食作用）に供され、自己免疫プロセスを促進する可能性が高まる（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆ． １９９８； ５：５６３−５６８）。
【００１２】
自己免疫プロセスの発達と維持のためには、未熟ＤＣによって提示される自己抗原が生物体にとって有害（外来性または非自己）であると認識される必要がある。この認識の誤りが、未熟ＤＣによるアポトーシス細胞集団の除去において起こる。
【００１３】
細胞内自己抗原はアポトーシスにおいて修飾され、アポトーシスストレスによって活性化したキナーゼによるタンパク質のエステル化が、新しいコンホメーションのエピトープをもたらす（１９９８ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７：５４７−５６０）。
【００１４】
細胞死と核崩壊の後に、特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）による自己抗原破壊（１９９６ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８４：７６５−７７０； １９９６ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３：１９５７−１９６４）、および、全身性自己免疫疾患の原型である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）における主要な抗原である、ヌクレオソームの生成が起こる（１９９３ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １７７：１３６７−１３８１； １９９９； １９９９ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ４２：８３３−８４３）。
【００１５】
自己抗原の中には通常小胞体および細胞骨格の原形質膜に結合しているものもある；これらの抗原はアポトーシスの初期段階において分離する。
【００１６】
核自己抗原はアポトーシスの後期に生じるアポトーシス集団とともに分離し、アポトーシス細胞から放出される（１９９４ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１３１７−１３３０； １９９７ Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２３４：５１２−５２０）。
【００１７】
逆に内部に取り込まれた瀕死（アポトーシス）細胞のプロセシングによりＴ細胞エピトープが生じる（１９９７ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：５３９１−５３９９）。
【００１８】
免疫応答を引き起こす能力を欠く、特異的または半特異的なスカベンジャー食細胞は、生体内でほとんどの瀕死細胞の除去を行う（１９９８ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆ． ５：５６３−５６８）。しかし、もっとも強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）はＤＣであり（１９９７ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：１０−１６； １９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２）、これらの細胞は瀕死細胞を内部に取り込んでプロセシングから生ずるエピトープを、ＭＨＣクラスＩ−およびクラスＩＩ−拘束Ｔリンパ球に提示する（１９９８ Ｎａｔｕｒｅ ３９２：８６−８９； １９９８ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：５３９１−５３９９； １９９８ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：２１６３−２１７３： １９９９ Ｎａｔ Ｍｅｄ ５：１２４９−１２５５； １９９９ Ｎａｔ Ｍｅｄ ５：１２３２−１２３３）。
【００１９】
ＤＣは骨髄のＣＤ３４＋前駆細胞から生ずる（１９９２ Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２５８−２６１）。
【００２０】
ＤＣ前駆細胞は血中に入り周囲の器官に達し、そこで発達して未熟ＤＣになる。
【００２１】
未熟ＤＣは可溶性の抗原をマクロピノサイトーシスによって捕捉し（１９９４ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１１０９−１１１８）、ファゴサイトーシスによって粒状化する（１９９３ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：４７９−４８８）。
【００２２】
ＩＬ−１βやＴＮＦ−αなどの一次炎症誘発性シグナルは、ＤＣの生理的成熟および抗原提示機能を促進する（１９９９ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：３０８−３１３）。
【００２３】
瀕死細胞抗原のＤＣからの提示は、細胞（当然に「自己」抗原の貯蔵所である）が成長および正常な組織のターンオーバーにおいて絶え間なく死んでいくために、厳密に調節されている。
【００２４】
アポトーシスによる正常な細胞死は、ＤＣ成熟を引き起こす炎症シグナルの不在下において起こる。
【００２５】
それゆえ瀕死細胞と成熟中のＤＣは、周囲の抗原に対するトレランスをおびやかしながら共存する（１９９９ Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：１２３２−１２３３）。しかし自己免疫は通常は炎症をともなうものではない。
【００２６】
生理条件においては未熟ＤＣ細胞によって貪食されるアポトーシス細胞は数少ない。
【００２７】
炎症シグナル自体にさらされているであろう環境における因子は、未熟ＤＣによる瀕死細胞のファゴサイトーシスを阻止しなければならない。
【００２８】
細胞死の増加を伴う、過剰かつ制御を失った炎症においてのみ、異常な食細胞のファゴサイトーシス活性が上昇し、このファゴサイトーシスの上昇によって、自己抗原が生物体によって非自己であると認識される可能性が増すのである。
【００２９】
免疫担当細胞が有する、自己抗原を生物体にとって有害または外来性であると認識するこれらのメカニズムが多くの自己免疫疾患の発症の基礎となっている。自己免疫疾患には例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節炎、糖尿病、甲状腺炎、溶血性貧血症、萎縮性睾丸炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、慢性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、ライター症候群、筋肉炎 （ｍｉｏｓｉｔｉｓ）、全身性硬化症および多発性関節炎などがある。
【００３０】
全身性エリテマトーデスは、高い親和性を有する、Ｔ細胞からの自己免疫抗体の産生によって特徴付けられる炎症性全身性自己免疫疾患である。
【００３１】
疾患の活動期のＳＬＥ患者はＣ−反応性タンパク質ＣＲＰの血漿レベルが低いという特徴を示す。
【００３２】
ＳＬＥを患う患者において、ＰＴＸ３によって認識される因子である補体因子Ｃ１ｑ（１９９８ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：５６−５９； １９９８ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９：３−４）が先天的に欠乏することが見出された（１９９７ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：３２８１７−３２８２３）。
【００３３】
さらにＰＴＸ３は、ヒストンその他のＳＬＥによく特徴られた自己抗原のいくつかに結合する（１９９０ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２：１３−１８； １９９７ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：３２８１７−３２８２３）。
【００３４】
すでに、ＰＴＸ３の利用が知られている。例えば、本出願人によって出願された、ＷＯ９９／３２５１６号には、腫瘍性、炎症性および感染性疾患の治療のための長いペントラキシンＰＴＸ３の使用が記載されている。
【００３５】
米国特許第５７６７２５２号にはペントラキシンファミリーに属する神経細胞のための成長因子が記載されている（引用公報を参照されたい）。この特許は、神経生物学分野に関するものである。
【００３６】
今日までほとんどの自己免疫疾患のための十分な治療法は知られていない。自己抗原を外来性であると認識することを阻害することができ、かつ、副作用を引き起こさずにこれらの疾患の症状を緩和することのできる新規な薬剤に対する強い要求はいまだ存在する。
【００３７】
このタイプの阻害は上述の症状の基礎をなす自己免疫疾患の発症を阻止する。
【００３８】
今回、驚くべきことに、長いペントラキシンＰＴＸ３が自己免疫疾患の症状の予防および軽減に有用であることが見出された。
【００３９】
実際、長いペントラキシンＰＴＸ３はアポトーシス細胞に結合することができ（しかし生細胞には結合できない）、過剰で無秩序なアポトーシスにおいて、これら細胞が未熟ＤＣによって貪食されるのを阻害することができる。
【００４０】
上述のように、炎症および細胞死の増加において、大量の死細胞が、そのような細胞を生物体が除去する能力を阻害し、これら細胞が組織に蓄積して未熟ＤＣ細胞などの異常な食細胞によるファゴサイトーシスに供し、自己免疫プロセスが開始する可能性が増加する。
【００４１】
アポトーシス細胞とＰＴＸ３との結合によりマクロファージによるアポトーシス細胞の除去が促され、自己免疫疾患を促進する、未熟ＤＣ細胞によるアポトーシス細胞の貪食が妨げられる。
【００４２】
本発明によって治療され得る自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節炎、糖尿病、甲状腺炎、溶血性貧血症、萎縮性睾丸炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少症、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、皮膚炎、慢性糸球体腎炎、シェーグレン症候群、ライター症候群、筋肉炎　（ｍｉｏｓｉｔｉｓ）、全身性硬化症および多発性関節炎からなる群から選択される。
【００４３】
「長いペントラキシンＰＴＸ３」とは、その起源（ヒトであるか動物であるか）や合成のもであるかに関わらず、あらゆる長いペントラキシンＰＴＸ３またはその機能性アナログを意味する。
【００４４】
好ましい長いペントラキシンは、その配列がＷＯ９９／３２５１６に記載されているヒトＰＴＸ３である。
【００４５】
以下に本発明を例示する実施例を報告する。
【００４６】
実施例１
ＰＴＸ３の、アポトーシスヒト細胞へ結合する能力およびその除去を制御する能力
細胞タイプ
１．白血病細胞
ヒト白血病ジャーカットＴ細胞をＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から購入し、以下を含有するＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇｌａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）中で培養した。１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ−グルタミンおよび１０％　ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）（組織培養培地（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＴＣＭ）または１％ニュートリドーマ（Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ）−ＳＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＴＣＭ−ｎｕｔ）。
【００４７】
２．樹状細胞
循環している単球由来の未熟ヒトＤＣを組換えＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で培養し（（１９９９） Ｊ． Ｌｅｕｋ． Ｂｉｏｌ．， ６６：３４５−３４９； （１９９７） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５：３１７−３２８）、この処理によって均一な未熟ＤＣ細胞の集団を得た。
【００４８】
アポトーシスの誘導
ジャーカット細胞を性質不明な血清補因子による干渉を避けるためにＴＣＭ−ｎｕｔ中で培養し、ＴＣＭ−ｎｕｔ中で３７℃で抗−ＣＤ９５　ｍｏＡｂ（ＣＨ−１１、１００ｎｇ／１０６細胞）によって、またはＵ．Ｖ．源下で２０秒間照射することによってアポトーシスさせた。アポトーシスはフローサイトメトリーまたは形態学的特徴によって文献の記載（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． １９９８； ４１：２０５−２１４）にしたがって確認した。両処理の後、ほとんどのジャーカットＴ細胞（＞９５％）がアポトーシスした。
【００４９】
ＭｇＣｌ２　０．１ｍＭおよびＣａＣｌ２　０．１ｍＭを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ＋＋）中でＦＩＴＣ−標識化アネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ， Ｐｒｏｄｏｔｔｉ Ｇｉａｎｎｉ， Ｍｉｌａｎｏ， Ｉｔａｌｙ）（０．５μｇ／ｍｌ）で室温で１０分間染色した後、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の露出をフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡法（以下を参照）によって評価した。
【００５０】
ＤＮＡ含量をフローサイトメトリーによって検出した。
【００５１】
いくつかの実験においては細胞を異なる薬品処理（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ　５μＭ、シクロヘキシミド１０μｇ／ｍｌ、スタウロスポリン２０μＭ、ピロリジンジチオカーバメートＰＤＴＣ１００μＭおよび５０ｍＭ、デキサメタゾン１００ｎＭ）によってアポトーシスさせた。
【００５２】
細胞の熱処理（９５℃で５分）、細胞の凍結解凍または高浸透圧ショック（ＮａＰ　１５０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＮａＣｌ　１．４Ｍバッファー中で１０分）のいずれかによってネクローシスさせた。
【００５３】
タンパク質
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７； ２７２：３２８１７−３２８２３に記載されているように、ヒトＰＴＸ３を、該タンパク質を安定かつ恒常的に発現しているＣＨＯ細胞から精製した。ＰＴＸ３のビオチン標識を、ＥＭＢＯ Ｊ． １９９２； １１：８１３−８９に記載されているように行い、ビオチン標識されたＰＴＸ３を次にＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７； ２７２：３２８１７−３２８２３に記載されているように、５−１０％グラジエントＰＡＧＥにおいて未変性（ネイティブ）状態で分析した。
【００５４】
精製ヒトＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ要素（ＳＡＰ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ）から購入した。
【００５５】
ＰＴＸ３のアポトーシス細胞への結合
細胞を３０分間室温でビオチン標識ＰＴＸ３（試験範囲０．１−５００μｇ／ｍｌ）による攻撃にさらした。
【００５６】
ＦＩＴＣ−結合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）の添加後、細胞に結合した補因子をフローサイトメトリーによって明らかにした。蛍光バックグラウンドはＦＩＴＣ−結合ストレプトアビジンのみの存在下で計算した。
【００５７】
用いるビオチン標識ＰＴＸ３の濃度を上げると、それに比例して結合の増加が観察され、およそ１００μｇ／ｍｌで定常状態に達した。
【００５８】
ビオチン標識ＰＴＸ３（１０μｇ／ｍｌ）、ＦＩＴＣストレプトアビジンの添加そしてＦＡＣＳ分析の前に、アポトーシス細胞をＰＴＸ３、ＳＡＰ、ＣＲＰおよびＢＳＡ（５００μｇ／ｍｌ）とプレインキュベートすることによって結合の特異性を確認した。
【００５９】
瀕死細胞へのＰＴＸ３の結合は共焦点画像法によっても特徴付けられた：この場合、染色された細胞を室温で２０分間ポリリジンコーティングしたカバーグラスに播き、４％（重量／体積）パラホルムアルデヒド中で室温で１５分間固定し、そしてＭｏｗｉｏｌ培地中に置いた。
【００６０】
レーザーアルゴン／クリプトン、７５ｍＷマルチライン（ｍｕｌｔｉｌｉｎｅ）を備えたライカ（Ｌｅｉｃａ）ＴＣＳ−ＮＴ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）共焦点レーザースキャニング顕微鏡を用いて共焦点レーザースキャニング顕微鏡観察を行った。
【００６１】
ＣＤ９５（ＦＡＳ）−刺激アポトーシスに瀕しているジャーカット細胞は、クロマチン辺縁化（ｍａｒｇｉｎａｔｉｏｎ）、凝縮および断片化などの核の特性に基づいて容易に同定された。
【００６２】
ファゴサイトーシス
対数増殖期にあるジャーカット細胞をＵ．Ｖ．照射によってアポトーシスさせ、緑色蛍光脂肪性色素ＰＫＨ２−ＧＬ（Ｓｉｇｍａ）で標識した。
【００６３】
洗浄した後、細胞の一部はＰＴＸ３とともにインキュベートし（１００μｇ／ｍｌ、室温で３０分間）、一部はそのようなインキュベートをせず、そして、それら細胞をＤＣと９０分間、３７℃または４℃で共インキュベートした。
【００６４】
未熟ＤＣと、ＴＮＦ−αでの処理後の成熟ＤＣ（１９９７ Ｊ． Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １８５：３１７−３２８）との両方を用いた。コントロールとして、ＦＩＴＣ−標識卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ）または緑色蛍光ラテックスビーズ（直径２μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＰＡ）の未熟ＤＣおよび成熟ＤＣによるインターナライゼーションを、ＰＴＸ３の存在下または不在下で評価した。ファゴサイトーシスの後、ＤＣをＥＤＴＡとトリプシンを含有するＰＢＳ中で１５分間３７℃でインキュベートし、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｓｃａｎ， Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ Ｊｐｓｅ， ＣＡ）によって分析した。
【００６５】
アポトーシス細胞に結合したか、あるいはアポトーシス細胞を内部に取り込んだ細胞のパーセンテージを個々の試料において比較した。
【００６６】
実施例１／１
上述のように、ジャーカット細胞をビオチン標識ＰＴＸ３およびＦＩＴＣ−ストレプトアビジンでの攻撃にさらし、次に結合をフローサイトメトリーで評価した。
【００６７】
下記の表１に報告する結果（４つの独立した実験の代表）は、相対蛍光強度（ＲＦＩ）として表す。これは、ＰＴＸ３とＦＩＴＣ−ストレプトアビジンの存在下での平均蛍光強度を、ＦＩＴＣ−ストレプトアビジンのみの存在下でのもので割った値である。
【００６８】
【表１】
2004512372.tif 000002
＊＝ジャーカット細胞；＊＊＝相対蛍光強度
【００６９】
これらの結果は、ＰＴＸ３が後期アポトーシスにある細胞に結合する能力を獲得していること、およびＰＴＸ３による認識はアポトーシスを引き起こすのに用いられた開始刺激に依存しないということを示すものであった。さらにＰＴＸ３はアポトーシス後の時期へと進んでいる細胞に結合する能力を失っていた。
【００７０】
表１において報告した結果は、アポトーシス細胞のみがビオチン標識ＰＴＸ３に結合することができることを示しており、これはＰＴＸ３結合の特異性を証明するものである。
【００７１】
実施例１／２
上述のＰＴＸ３が結合したアポトーシス細胞は未熟ＤＣによるインターナリゼーションから逃れる。
【００７２】
この実験において、未熟ＤＣまたはＴＮＦ−α処理後の成熟ＤＣのいずれかを用いた。
【００７３】
コントロールとして、未熟ＤＣおよび成熟ＤＣによる、ＦＩＴＣ−標識卵白アルブミンまたは緑色蛍光ラテックスビーズのインターナリゼーションを、ＰＴＸ３の存在下または不在下で評価した。
【００７４】
【表２】
2004512372.tif 000003
【００７５】
表２において報告された結果（３つの別々の実験の平均）は、ＰＴＸ３は未熟ＤＣによる不活性基質のファゴサイトーシスには影響を及ぼさないことを示すものであった。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004512372.tif 000021
【国際調査報告】
2004512372.tif 000022
2004512372.tif 000023
2004512372.tif 000024
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