(57)【要約】レチノイドと少なくとも１つのブースター化合物と化粧品に許容されるビヒクルとから成り、水中油型エマルジョンの油相が１２以下のペルオキシド値を有していることを特徴とする安定な水中油型エマルジョン。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）約０．００１重量％−約１０重量％の少なくとも１種類のブースター化合物と、
（ｂ）約０．００１重量％−約１０重量％のレチノイドと、
（ｃ）化粧品として許容されるビヒクルと、
から成り、水中油型エマルジョンの油相の構成成分の各々が１２以下のペルオキシド値を有していることを特徴とする皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物。
【請求項２】
エマルジョンの油相が６以下のペルオキシド値を有していることを特徴とする請求項１に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物。
【請求項３】
組成物が少なくとも２種類のブースター化合物を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布することから成る、油性皮膚状態を軽減または防止する美容的スキンケア方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布することから成る、皮膚の線維芽細胞によるコラーゲン合成を刺激する美容的スキンケア方法。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布する段階から成る、老化肌、光老化肌、乾燥肌、深いしわまたは小じわのある肌を治療する美容的スキンケア方法。
【請求項７】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布する段階から成る、油性皮膚状態を軽減または防止し、また、老化肌、光老化肌、乾燥肌、深いしわまたは小じわのある肌を治療する美容的スキンケア方法。
【請求項８】
皮膚の線維芽細胞によるコラーゲン合成を刺激する医薬品の製造における請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
皮膚コンディショニング用医薬品の製造における請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
皮膚をコンディショニングするための請求項１から３のいずれか一項に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン。
【請求項１１】
皮膚の線維芽細胞によるコラーゲン合成を刺激するための請求項１から３のいずれか一項に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイドの効果を増強するある種の化合物を含有する安定な皮膚コンディショニング組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然または合成のビタミンＡ誘導体は様々な皮膚障害の治療において皮膚の修復剤または再生剤として広く使用されてきた。レチノイン酸は様々な皮膚状態、例えば、ニキビ、しわ、乾癬、老人斑、変色を治療するために使用されてきた。例えば、Ｖａｈｌｑｕｉｓｔ，Ａ．ら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．９４，Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｃｕｎｌｉｆｆｅ，Ｗ．Ｊ．（１９９０），ｐｐ．４９６−４９８；Ｅｌｌｉｓ，Ｃ．Ｎ．ら，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｋｉｎ，”Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，Ｖｏｌ．３，（１９８９），ｐｐ．２４９−２５２；Ｌｏｗｅ，Ｎ．Ｊ．ら，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｋｉｎ，”Ｖｏｌ．３（１９８９）  ｐｐ．２４０−２４８；及びＰＣＴ特許出願Ｎｏ．ＷＯ９３／１９７４３を参照されたい。
【０００３】
レチノールまたはレチノールの短鎖エステルの使用はレチノイン酸よりも好ましいと考えられている。レチノールは、ヒトの体内で天然に産生する内因性化合物であり上皮細胞の正常な分化に必須である。レチノールの短鎖エステルはｉｎ−ｖｉｖｏで加水分解してレチノールを産生する。レチノール及びレチニルエステルはレチノイン酸よりも安全であると考えられる。しかしながら、レチノール及びレチニルエステルはレチノイン酸よりも不安定である。Ｉｄｓｏｎ，“Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｋｉｎ，”Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  ＆  Ｔｏｉｌｅｔｔｉｅｓ，Ｖｏｌ．１０８，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３，ｐｐ．７９−９４，Ａｌｌｕｒｅｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．（１９９３）；Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．，Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔ  “Ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ−Ｔｈｅ  Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ，”Ｒｏｃｈｅ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ＆  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄａｔａ  “Ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｂｌｅｎｄ．”を参照のこと。特にこれらは水の存在下で急速に分解する。
【０００４】
ある種のレチノイドを配合物中で安定させる幾つかの方法が開示されている。例えば、Ｎｏｇｕｅｉｒａらに付与された米国特許第６，１１３，９２８号（本明細書中で以後“Ｎｏｇｕｅｉｒａ”と記す）は、脂肪相の構成成分が約５以下のペルオキシド値を有しており、脂肪相が１０−１５重量％のカプリン酸／カプリル酸トリグリセリドと０．０２−０．５重量％の抗酸化剤ＢＨＴとを含有する水中油型エマルジョンの形態の１３−トランスレチナールを含有するノンアルコール性の安定な化粧組成物、及び、該組成物の製造方法を開示している。
【０００５】
Ｈａｂｉｆらに付与された米国特許第５，７４４，１４８号（本明細書中で以後“Ｈａｂｉｆ”と記す）は、不安定なレチノイドを油相中に含有している水中油型エマルジョンを開示している。本発明のエマルジョン中では約５０％−約９８％の水相の存在にもかかわらず、可溶化された不安定レチノイドを含有する油滴を形成する特別な油相を使用しかつ油滴に合う特定サイズの結晶の障壁層を形成するように選択された固体成分の組合せを使用することによって、レチノイドが安定化されている。しかしながら、結晶のサイズ調整及び障壁層の形成は実現が難しい。
【０００６】
Ｗｉｌｍｏｔｔらに付与された米国特許第４，８２６，８２８号（本明細書中で以後“Ｗｉｌｍｏｔｔ”と記す）は、レチノールを含有する組成物を調製するために揮発性シリコーンとエタノールとを使用することを開示している。水／油エマルジョンの形成によって塗布前に調製物を希釈し得る。しかしながら、配合物の保存結果は十分でなく、また、水／油エマルジョンは局所塗布適性がよくない。
【０００７】
上記で検討した技術はいずれも、水中油型エマルジョン中のレチノイドをエマルジョン特性値のコントロールによって安定させ同時にレチノイドの作用を増強するという二重の有益な効果を与える効率的な方法を開示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、スキンケア組成物中のレチノールの有効性を増加させながら同時にレチノールの安定性を改善することは永続的な要望である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、
（ａ）約０．００１重量％−約１０重量％のブースター化合物と、
（ｂ）約０．００１重量％−約１０重量％のレチノイドと、
（ｃ）化粧品として許容されるビヒクルと、
から成り、水中油型エマルジョンの油相の構成成分の各々が約１２以下のペルオキシド値を有していることを特徴とする皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物に関する。
【００１０】
操作実施例及び比較実施例に示した数値を除いて、または、別の明確な指定があるときを除いては、材料の量または反応の条件、材料の物理的特性及び／または使用に関して指定された本明細書中のすべての数値は“約”という用語で修飾されることを理解されたい。全部の量は別の明確な指示がない限り、水中油型エマルジョンの重量％である。
【００１１】
本明細書中で使用された“皮膚”という用語は、顔面、首、胸、背中、腕、手、脚及び頭皮の皮膚を包含する。
【００１２】
全部の量は別の明確な指示がない限り、水中油型エマルジョンの重量％である。
【００１３】
本発明は、ある種の化合物がＡＲＡＴ／ＬＲＡＴ、レチナールレダクターゼ、ＣＲＡＢＰＩＩ及びレチノイン酸の酸化（後者はシトクロムＰ４５０系によって触媒される）を阻害し、別のある種の化合物がレチノールデヒドロゲナーゼを増進するという知見にある程度基づく。レチノールエステル及びレチノールは皮膚中でチャート１のメカニズムに従って酵素的にレチノイン酸に変換される。
【００１４】
【表１】
2004527471.tif 000002
本明細書中ではこれらの化合物をまとめて“ブースター”と呼び、チャート１にグループＢ１からＢ５までの記号で示す。ブースターは、単独でまたは互いに組合せて使用されると、レチノイン酸への変換に利用できるレチノールの量を増加させレチノイン酸の分解を阻害することによってレチノイドの作用を増強する。ブースターは、皮膚に内在的に存在するレチノイド（例えば、レチノール、レチニルエステル、レチナール、レチノイン酸）と協同して作用する。本発明の組成物は、最適性能を得るためにブースターと共存するレチノイドをその組成物中に含んでいる。
【００１５】
本発明はその一環として、組成物の約０．０００１重量％−約５０重量％、好ましくは０．００１重量％−１０重量％、最も好ましくは０．００１重量％−５重量％の少なくとも１種類のブースター化合物を含有し、１種または複数の該化合物が合計１０ｍＭの濃度のときｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスグルタミナーゼアッセイにおいてトランスグルタミナーゼを５０％以上阻害することを特徴とする皮膚コンディショニング組成物を包含する。本発明の組成物はまた、１２未満のペルオキシド値（ＰＯＶ）を有する油相と化粧品として許容されるビヒクルとから成る水中油型エマルジョン中のレチノイドを包含する。
【００１６】
本発明の組成物中に含まれているブースターは以下のグループから選択される：
（ａ）双方ともがＢ２；Ｂ３；Ｂ４から成る同じグループから選択された２つのブースター；
（ｂ）Ｂ１／Ｂ２；Ｂ１／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３；Ｂ２／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４；Ｂ３／Ｂ５；Ｂ４／Ｂ５から成るグループから選択された２つのブースターの組合せ；
（ｃ）Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５から成るグループから選択された３つのブースターの組合せ；
（ｄ）Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５から成るグループから選択された４つのブースターの組合せ；
（ｅ）Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５という５つのブースター群の組合せ。
【００１７】
好ましい組成物はグループの１つ（即ち、上記の（ｂ）から（ｅ））から選択された少なくとも１つのブースターを含む。
【００１８】
最初に、表Ａに示した所定の濃度で後出の項２．１−２．７に記載するような特異的酵素に対するｉｎ−ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイに合格する化合物の能力に基づいて、本発明の化合物にブースターとして含ませる化合物を選択する。次に、単独濃度または組合せ濃度１０ｍＭの（単独または別のブースターと組合せた）化合物を、後述するｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスグルタミナーゼアッセイで処理する。このような組合せがトランスグルタミナーゼを５０％以上も阻害するとき、このような組合せは本発明での使用に適している。１つのブースターを個別に試験し、該ブースターがトランスグルタミナーゼアッセイに合格するとき、このブースターをトランスグルタミナーゼアッセイに合格した別のブースターまたは別の組合せと併用してもよい。
【００１９】
本発明の好ましい組成物は、個別濃度１０ｍＭでトランスグルタミナーゼを５０％以上阻害する少なくとも１つのブースターまたはブースターの組合せを含有している。
【００２０】
本明細書中で使用された“コンディショニング”という用語は、乾燥肌、ニキビ、光損傷肌、しわ及び老人斑の出現、老化肌の予防及び治療、角質層の柔軟性の増加、皮膚の美白、皮脂分泌の調節、皮膚の質の全般的な向上を意味する。組成物は、皮膚の落屑及び表皮の分化を改善するために使用し得る。
【００２１】
ブースターは、後出の項２．１−２．７に記載するようなｉｎ−ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイに合格する化合物である。本発明に使用するための適当な化合物は、表Ａに示した濃度で、少なくとも表Ａに示した一般の％まで酵素を阻害または増進する。
【００２２】
【表２】
2004527471.tif 000003
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2004527471.tif 000007
【００２３】
本発明組成物中の化合物の存在適性を判断するために使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイは以下の手順で行う。
【００２４】
１．材料
全−トランス−レチノール、全−トランス−レチノイン酸、パルミトイル−ＣｏＡ、ジラウロイルホスファチジルコリン、ＮＡＤ及びＮＡＤＰＨはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。ミクロソームアッセイ用のレチノイドの予製液はＨＰＬＣグレードのアセトニトリル中で調製した。ＨＰＬＣ分析用のレチノイド標準予製液はいずれもエタノール中で調製し、−７０℃のＮ２雰囲気下で保存し、保存庫から出すと褐色照明下で氷上に維持した。その他の化学薬品及びインヒビターはＡｌｄｒｉｃｈまたはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｌａｖｏｒｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓのような化粧品材料の供給業者または化学会社から市販されていた。
【００２５】
２．方法
２．１  ＲＰＥミクロソームの単離（Ｊ．Ｃ．Ｓａａｒｉ  ＆  Ｄ．Ｌ．Ｂｒｅｄｂｅｒｇ，“ＣｏＡ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−ＣｏＡ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｔｉｎｏｌ  Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ”，Ｊ．Ｂｉｌｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，８０８４−８０９０（１９８８）を修正した方法）
二等分し網膜及び房水を除去したウシの視杯の５０個の凍結標本はＷ．Ｌ．Ｌａｗｓｏｎ  Ｃｏ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡから入手した。眼を一夜解凍し、有色の虹彩膜をピンセットで剥離することによって除去した。視杯の各々を２×０．５ｍＬの低温バッファ（０．１Ｍ  ＰＯ４／１ｍＭ  ＤＴＴ／０．２５Ｍ  スクロース，ｐＨ７）に入れ、暗色に色素沈着した細胞を絵筆またはゴムポリスマンでこすることによって洗浄した。細胞懸濁液を虹彩膜に加え、ビーカー内の懸濁液をテフロン撹拌棒によって数分間撹拌した。懸濁液を荒目フィルター（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ９２５μの網目サイズのポリエチレン網）で濾過して、大きい粒子を除去し、得られた暗色の懸濁液を、モーター駆動Ｔｅｆｌｏｎホモジェナイザーの付いたＧｌａｓ−Ｃｏｌを使用してホモジェナイズした。細胞ホモジェネートを２０，０００ｇで３０分間遠心した（ＳＳ３４ロータの付いたＳｏｒｖａａｌモデルＲＣ−５Ｂ遠心機、２．５×１０ｃｍの管、１４，０００ＲＰＭ）。得られた上清を１５０，０００ｇで更に６０分間遠心した（ＳＷ５０．１ロータの付いたＢｅｃｋｍａｎモデルＬ８０超遠心機、１５×５１ｍｍの管、４０，０００ＲＰＭ）。得られたペレットを、Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．モデルＷ１８５Ｄ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒを使用して〜５ｍＬの０．１ＭのＰＯ４／５ｍＭのＤＴＴ，ｐＨ７バッファに分散させ、得られたミクロソーム分散液を小型管に分注し、−７０℃で保存した。ＢＳＡを標準として用いたＢｉｏＲａｄの色素結合アッセイを使用してミクロソームのタンパク質濃度を測定した。
【００２６】
２．２  ラット肝ミクロソームの単離（Ｍａｒｔｉｎｉ  ＆  Ｍ．Ｍｕｒｒａｙ，“Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ４５０  ３Ａ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ”，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３，５７−６６（１９９３））。
【００２７】
約６グラムの凍結ラット肝（Ａｃｃｕａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．のＨａｒｌａｎスプレーグ・ドーリーネズミから採取）を３倍容の０．１Ｍのトリス／０．１ＭのＫＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡ／０．２５Ｍのスクロース，ｐＨ７．４バッファ中で、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎを使用してホモジェナイズした。得られた組織懸濁液を上述のモーター駆動Ｔｅｆｌｏｎホモジェナイザーで更にホモジェナイズした。得られたホモジェネートを１０，０００ｇで３０分間、２０，０００ｇで３０分間、３０，０００ｇで１５分間で順次に遠心し、得られた上清を１０５，０００ｇで８０分間超遠心した。ペレットを〜５ｍＬの０．１ＭのＰＯ４／０．１ｍＭのＥＤＴＡ／５ｍＭのＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４バッファで上記同様に音波処理し、アリコートに分けて−７０℃で保存した。上述の手順でタンパク質濃度を測定した。
【００２８】
２．３  ＡＲＡＴ及びＬＲＡＴの活性アッセイ（Ｂ１を認定するため）
以下の手順は、Ｊ．Ｃ．Ｓａａｒｉ  ＆  Ｄ．Ｌ．Ｂｒｅｄｂｅｒｇ，“ＡＲＡＴ  ＆  ＬＲＡＴ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｏｍｅ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９０，１５６−１６３（１９９０）に記載された方法の修正方法である。以下のバッファを調製し４℃で保存した：０．１ＭのＰＯ４／５ｍＭのジチオトレイトール，ｐＨ７．０（ＰＯ４／ＤＴＴ）。アッセイ当日にバッファ１ｍＬあたり２ｍｇのＢＳＡを添加してＰＯ４／ＤＴＴ／ＢＳＡから成る処理用バッファ（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を調製した。１ｍＭのレチノール基質をアセトニトリル中で調製し、窒素ガス下、−２０℃で褐色瓶に保存した。（アリコートとして保存した）処理用バッファ中に４ｍＭのパルミトイル−ＣｏＡの溶液とエタノール中に４ｍＭのジラウロイルホスファチジルコリンの溶液とを調製し、−２０℃で保存した。インヒビターは、Ｈ２Ｏ、エタノール、アセトニトリルまたはＤＭＳＯ中の１０ｍＭの予製液として調製した。反応停止溶液は、５０μｇ／ｍＬのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含有する純エタノールを使用して調製し、抽出には５０μｇ／ｍＬのＢＨＴを含有するヘキサン溶液を使用した。
【００２９】
２ドラム容のガラスバイアルに、以下の物質を以下の順序で導入する：合計５００μＬとなるまでのＰＯ４／ＤＴＴ／ＢＳＡバッファ、５μＬのアシル供与体（４ｍＭのパルミトイル−ＣｏＡ及び／またはジラウロイルホスファチジルコリン）、５μＬのインヒビターまたは溶媒ブランク（１０ｍＭの予製液またはより高い希釈度の希釈液）、次いで、約１５μｇのＲＰＥミクロソームタンパク質（約１５μＬの〜１ｍｇ／ｍＬのミクロソームタンパク質アリコート）。３７℃で５分間インキュベートして反応温度を平衡させ、次いで５μＬの１ｍＭレチノールを添加する。バイアルの蓋を締め、５秒間渦流させ、３７℃で３０−９０分間インキュベートする。０．５ｍＬのエタノール／ＢＨＴを加えて反応を停止させる。３ｍＬのヘキサン／ＢＨＴを加えてレチノイドを抽出し、管を数秒間ずつ数回渦流させ、低速で管を５分間遠心して層を速やかに分離する。上部のヘキサン層を清潔なバイアルに取り出し、更に上述のように３ｍＬのヘキサン／ＢＨＴを加えて水相を再び抽出する。ヘキサン層を集めて、加熱アルミニウムブロック上で窒素ガス流下に３７℃で乾燥することによってヘキサンを蒸発させる。乾燥した残渣をＨＰＬＣ分析まで−２０℃で保存する。ＡＲＡＴ及びＬＲＡＴの活性をそれぞれ表すパルミチン酸レチニル及びラウリル酸レチニルの量を後述するようなＨＰＬＣシグナルの積分によって定量する。
【００３０】
インキュベーション溶液が４０μＭのアシル供与体、１００μＭ以下のインヒビター、１０μＭのレチノール、約３０μｇ／ｍＬのミクロソームタンパク質及びほぼ０．１ＭのＰＯ４，ｐＨ７／５ｍＭのＤＴＴ／２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有することに留意されたい。レチノール添加後の全部の段階は暗中または褐色光下で行った。
【００３１】
２．４  レチノールデヒドロゲナーゼ活性のアッセイ（Ｂ２を認定するため）
以下の予製液を調製した：
滅菌濾過した５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４バッファ
ＤＭＳＯ中の１０ｍＭの全トランスレチノール（Ｓｉｇｍａ  Ｒ７６３２）
滅菌水中の２００ｍＭのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸，ナトリウム塩（ＮＡＤＰ）（Ｓｉｇｍａ  Ｎ０５０５）
適当な溶媒（水、バッファ、エタノール、クロロホルムまたはＤＭＳＯ）中の４０ｍＭの被験化合物
５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４バッファ中のラット肝ミクロソームの１：１０希釈物（４μｇ／μｌ）。
【００３２】
ネジ蓋の付いた２ドラム容のガラスバイアルに以下の成分を以下の順序で加える：
４００μｌの最終容量を与えるバッファ
２５μｌの希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照としては煮沸ミクロソームを使用し、被験サンプルとしては標準ミクロソームを使用する
４μｌの２００ｍＭのＮＡＤＰ（最終＝２ｍＭ）
１μｌの４０ｍＭの被験化合物（最終＝１００μＭ）
８μｌの１０ｍＭのレチノール（最終＝２００μＭ）。
【００３３】
バイアルを３７℃の振盪水浴で４５分間インキュベートする。各バイアルに５００μｌの氷冷エタノールを加えて反応を停止させる。氷冷ヘキサン（１回の抽出毎に２．７ｍｌ）でレチノイドを２回抽出する。１回目の抽出中に各サンプル中の抽出効率をモニターする手段として酢酸レチニル（９００μＭの予製液を５μｌ）を各バイアルに添加する。サンプルを１０秒間渦流させた後、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心機に入れ、５℃、１，０００ｒｐｍで５分間ゆるやかに遠心する。各抽出後の水相からレチノイドを含有する頂上のヘキサン層を清潔な２ドラム容のバイアルに取り出す。ゆるやかな窒素ガス流下でヘキサンを留去する。乾燥した残渣をＨＰＬＣ分析まで−２０℃で保存する。
【００３４】
２．５  レチナールレダクターゼ活性のアッセイ（Ｂ３を認定するため）
成分を以下のように代替して全予製液を上記同様に調製した：
レチノールに代えてＤＭＳＯ中の１０ｍＭの全トランスレチンアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ｒ２５００）
ＮＡＤＰに代えて滅菌水中の２００ｍＭのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸，還元形，四ナトリウム塩（ＮＡＤＰＨ）（Ｓｉｇｍａ  Ｎ７５０５）。
【００３５】
ネジ蓋の付いた２ドラム容のガラスバイアルに以下の成分を以下の順序で加える：
４００μｌの最終容量を与えるバッファ
２５μｌの希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照としては煮沸ミクロソームを使用し、被験サンプルとしては標準ミクロソームを使用する
４μｌの２００ｍＭのＮＡＤＰＨ（最終＝２ｍＭ）
１μｌの４０ｍＭの被験化合物（最終＝１００μＭ）
３μｌの１０ｍＭのレチンアルデヒド（最終＝７５μＭ）。
【００３６】
インキュベーション及び抽出の手順は上記に詳述した手順と同じである。
【００３７】
２．６  ＣＲＡＢＰＩＩアンタゴニストのアッセイ（Ｂ４を認定するため）
２．６．１．ＣＲＡＢＰＩＩの合成
ａ．発現系
ＣＲＡＢＰＩＩ遺伝子をｐＥＴ  ２９ａ−ｃ（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でクローニングした。クローン化した遺伝子はバクテリオファージＴ７の強力な転写及び翻訳シグナルのコントロール下にあった。Ｔ７ポリメラーゼのソースは宿主細胞である大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）によって提供された。この大腸菌はＩＰＴＧの存在によって誘発されるｌａｃＵＶ５コントロール下のＴ７ポリメラーゼの染色体コピーを有している。製造業者のプロトコル（Ｎｏｖａｇｅｎ）に従う形質転換によって大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞をプラスミドで形質転換した。
【００３８】
ｂ．誘発
形質転換細胞の一夜培養物を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンと２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールとを含有する２×ＹＴで１：１００に希釈した。３７℃で振盪しながら６００ｎｍのＯＤが０．６−０．８に達するまで細胞を増殖させた。次にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加し、培養物を更に２時間インキュベートした。室温、５，０００ｇで１０分間遠心することによって細胞を採取した。ペレットを−２０℃で保存した。
【００３９】
２．６．２．精製
精製はＮｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉ，１９９７に記載された方法に従って行った。
【００４０】
ａ．溶菌
凍結したペレットを室温で解凍し、１−２ペレット容量の新しく調製した溶菌バッファ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）のナトリウムアジド、０．５ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、２．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、２．５ｍＭのベンズアミジン、６μｇ／ｍＬのＤＮアーゼ）に再懸濁させた。溶菌液を室温で３０分間インキュベートした。音波処理（氷上で６回の１０，０００ｐｓｉの３０秒照射と５回の３０秒遅発照射とを交互に与える）によって更に完全に溶菌した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１時間遠心することによって溶菌液の不溶画分を除去し、上清を−２０℃で保存する。
【００４１】
ｂ．Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００上のゲル濾過
段階ａ．で得られた上清を２．５×１００ｃｍのｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に室温で充填した。溶出バッファは２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．０５％のナトリウムアジド（バッファＡ）であった。流速は２ｍＬ／分とした。集めた２−ｍＬの画分について２８０ｎｍにおける紫外線吸光度をチェックした。ピークを表す画分についてＣＲＡＢＰＩＩの存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検査した。
【００４２】
ｃ．アニオン−交換クロマトグラフィー
ＣＲＡＢＰＩＩを含有する２ｍＬのゲル濾過画分を第四級アミンアニオン−交換カラムＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）型ｍｏｎｏＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。１００％バッファＡから３０％バッファＢ（１００％バッファＢ＝バッファＡ＋２５０ｍＭのＮａＣｌ）までの勾配バッファを使用し室温で２０分間処理してＣＲＡＢＰＩＩを溶出させた。毎分１ｍＬの画分を採取した。ＳＤＳｐａｇｅによってＣＲＡＢＰＩＩの存在を再度チェックした。凍結乾燥前のＣＲＡＢＰＩＩは、バイアル台アタッチメントの付いたＭｉｃｒｏｍｏｄｕｌｙｏ  １．５Ｋ（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｈｉｇｈ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して４℃で保存した。乾燥したサンプルは結合アッセイに使用するまで室温で保存した。
【００４３】
ｄ．ＣＲＡＢＰＩＩの存在の検出
７−１５％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏｒａｄ）上の変性用ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を使用してＣＲＡＢＰＩＩの発現及び精製を検証した。１０μＬのサンプルを１０μＬの２×充填用バッファ（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、０．２％のＢＰＢ、２０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）と混合し、加熱（８０℃で２分間）によって変性した。サンプルをゲルに充填し、ゲルを１×トリス−グリシンバッファ（Ｂｉｏｒａｄ）に浸漬させ、定電流（２５ｍＡ）を室温で１時間印加した。クーマシー・ブルーで染色後、標線を予染色したタンパク質段階基準（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に基づいて決定した分子量に従ってタンパク質を同定した。
【００４４】
ウェスタンブロット法を使用してＣＲＡＢＰＩＩの存在を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質をＢｉｏｒａｄカセットを使用してＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。転移は１×トリス−グリシンバッファ（Ｂｉｏｒａｄ）＋１０％メタノール中で生じた。タンパク質が膜を貫通して泳動できるように電流（６０ｍＡ）を３時間印加した。その後、１×ＴＢＳ中の５％のドライミルクによって膜を室温で１時間ブロックし、同じバッファ中でＣＲＡＢＰＩＩに対する第一抗体（１／１０００に希釈したマウスのアンチクローナル５−ＣＲＡ−Ｂ３）によって４℃で一夜プローブした。翌日、膜をＰＢＳで洗浄し（３×５分間）、次いで１：２０００に希釈した第二抗体、即ち、ペルオキシダーゼコンジュゲートした抗マウス抗体（ＥＣＬＴＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に室温で１時間インキュベートした。膜を１×ＰＢＳで洗浄し（３×５分間）、ＥＣＬ検出キットを製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の指示通りに使用してタンパク質を検出した。
【００４５】
精製したＣＲＡＢＰＩＩの濃度はＢＳＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して測定した。
【００４６】
２．６．３．放射能結合アッセイ
２２０ｐｍｏｌのＣＲＡＢＰＩＩを２０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファ，ｐＨ７．４中で１５ｐｍｏｌの放射性全トランスレチノイン酸（ＮＥＮ）と共に総量７０μＬでインキュベートした。競合アッセイのためには、過剰量の別のリガンド（６６７０：１、６７０：１または７０：１）を混合物に添加した。暗中、室温で１時間反応させた。結合した全トランスレチノイン酸から未結合の全トランスレチノイン酸を分離するために、カットオフ値６ｋＤのミニクロマトグラフィー（Ｂｉｏｒａｄ）を使用した。Ｍｉｃｒｏｐｌｅｘマニホルドを製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の指示通りに使用して保存用バッファを廃棄した。サンプルをカラムに充填し、重力による分離を３０分間行った。ＣＲＡＢＰＩＩに結合したレチノイン酸（“ＲＡ”）は濾液中に出現し、遊離ＲＡはカラム中に残留した。濾液の放射能をシンチレーションカウンターによって測定した。
【００４７】
２．７  ＮＡＤＰＨ依存性レチノイン酸酸化のアッセイ（Ｂ５を認定するため）
以下の手順はＭａｒｔｉｎｉ  ＆  Ｍｕｒｒａｙ，“Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ４５０  ３Ａ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  ４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ”，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３，５７−６６（１９９３）に記載された方法の修正方法である。以下のアッセイバッファを調製し、４℃で保存する：０．１ＭのＰＯ４／０．１ｍＭのＥＤＴＡ／５ｍＭのＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４。アッセイ当日にバッファ中の６０ｍＭのＮＡＤＰＨ溶液を調製する。インヒビター予製液、酸性化エタノール／ＢＨＴから成る反応停止溶液及びヘキサン／ＢＨＴを上述のように調製する。１５ｍＭの予製液（ＤＭＳＯ中）をエタノールで希釈することによって処理用の１ｍＭのレチノイン酸溶液を調製した。
【００４８】
２ドラム容のバイアルに以下の成分を記載の順序で加える：最終容量を５００μＬにする量のアッセイ用バッファ、２０μＬの６０ｍＭのＮＡＤＰＨ、５μＬのインヒビターまたは溶媒ブランク、次いで約２ｍｇのラット肝ミクロソームタンパク質。３７℃で５分間インキュベートし、次いで５μＬの処理用１ｍＭレチノイン酸溶液を添加する。酸化プロセスにはＮＡＤＰＨに加えて分子Ｏ２が必要なのでバイアルの蓋を閉めないで３７℃で６０分間のインキュベーションを継続する。酸性化エタノール／ＢＨＴで反応停止させ、上述のようにヘキサン／ＢＨＴで抽出する。早期に溶出する極性レチノイン酸代謝産物（４−オキソレチノイン酸であると推定される）を後述するようにＨＰＬＣシグナルの積分によって定量する。
【００４９】
レチノイン酸添加後の段階はすべて暗中または褐色光下で行ったことに留意されたい。最終インキュベーション溶液は、２．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１００μＭ以下のインヒビター、１０μＭのレチノイン酸、約４ｍｇ／ｍＬのラット肝ミクロソームタンパク質及びほぼ０．１ＭのＰＯ４／０．１ｍＭのＥＤＴＡ／５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有している。
【００５０】
個々のレチノイドのＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣによるレチノイド定量に用いるサンプルは、各バイアル中の残渣を１００μＬのメタノールに溶解することによって調製した。溶液を１ｍＬの外被バイアルに入れた１５０μＬのガラス円錐管に移し、蓋をぴったりと締め、Ｗａｔｅｒｓ  ７１５  Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒの内部に配置した。６０μＬのアリコートを直ちに注入し、レチノイド含量を分析した。
【００５１】
クロマトグラフィー器具はＷａｔｅｒｓ  ６００勾配コントローラー／ポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ９９６ホトダイオードアレイデテクタ及びＷａｔｅｒｓ  ４７４走査型蛍光デテクタから構成した。レチノイド分析のために２つのＨＰＬＣプロトコルを使用した。ＡＲＡＴ及びＬＲＡＴアッセイのために、Ｗａｔｅｒｓの３．９×３００ｍｍ  Ｃ１８  Ｎｏｖａｐａｋ逆相分析カラム及びＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｎｔｒｙ  ＮｏｖａＰａｋ  Ｃ１８ガードカラムを用い、流量１ｍＬ／分に調製した８０：２０（ｖ／ｖ）メタノール／ＴＨＦアイソクラチック移動相で１０分間処理することによってレチノールとレチノールエステルとを分離した。溶出液について３２５ｎｍの吸光度及び３２５ｅｘ／４８０ｅｍの蛍光をモニターした。Ａ．Ｂ．Ｂａｒｕａ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８９，１３６−１４５（１９９０）に記載された勾配システムの変形を利用するレチノール及びレチノイン酸の酸化アッセイのためには、もっと短いＷａｔｅｒｓ  ３．９×１５０ｍｍ  Ｃ１８  Ｎｏｖａｐａｋ逆相分析用カラム及びＷａｔｅｒｓ  Ｓｅｎｔｒｙ  ＮｏｖａＰａｋ  Ｃ１８ガードカラムを使用して、レチノイン酸とアルコールとを分離した。この系は、１０ｍＭの酢酸アンモニアを含有する６８：３２（ｖ／ｖ）のメタノール／水から４：１（ｖ／ｖ）のメタノール：ジクロロメタンまで２０分間で変化し次いで５分間維持する流速１ｍＬ／分の直線勾配から構成した。カラムの溶出液を３００ｎｍから４００ｎｍまでモニターした。
【００５２】
これらのプロトコルは、各アッセイ毎に該当するレチノイド酸、アルコール、アルデヒド及び／またはエステルを明らかに分解する能力及び相対的分離速度に基づいて選択した。ＨＰＬＣによる個々のレチノイドの同定は、未知のピークの保持時間と入手し得るレチノイド標品との正確な整合、及び、入手し得るレチノイド標品に対する未知ピークのＵＶスペクトル分析（３００−４００ｎｍ）に基づいて行った。
【００５３】
以後のトランスグルタミナーゼアッセイで試験するための適当なブースターの非限定例を以下の表Ｂ１−Ｂ５に示す。
【００５４】
【表３】
2004527471.tif 000008
2004527471.tif 000009
2004527471.tif 000010
【００５５】
【表４】
2004527471.tif 000011
【００５６】
【表５】
2004527471.tif 000012
【００５７】
【表６】
2004527471.tif 000013
【００５８】
【表７】
2004527471.tif 000014
【００５９】
ブースターまたはそれらの組合せは、以下に記載のトランスグルタミナーゼアッセイでトランスグルタミナーゼ（本明細書中で以後“Ｔｇアーゼ”と記す）を１０ｍＭの濃度で少なくとも５０％まで阻害する。
【００６０】
【表８】
2004527471.tif 000015
【００６１】
トランスグルタミナーゼアッセイ及びケラチノサイト分化
表皮の末端分化の進行中に、角質化エンベロープ（ＣＥ）として知られた１５ｎｍ厚みのタンパク質層が細胞周縁の内面に形成される。ＣＥは無数の異なるタンパク質から構成され、これらのタンパク質は表皮中で発現される少なくとも２つの異なるトランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）の作用によって触媒されたＮε−（Ｙ−グルタミル）リシンイソジペプチド結合の形成によって互いに架橋されている。ＴＧアーゼＩは表皮の分化層、特に顆粒層には大量に発現されるが未分化の基底表皮中には存在しない。従って、ＴＧアーゼＩは表皮のケラチノサイト分化を示す有用なマーカーであり、ＴＧアーゼＩの高レベルは、分化が進行した状態を表す指標となる。以下の実施例では培養ケラチノサイトの分化状態を評価するためにＴＧアーゼＩ抗体を用いるＥＬＩＳＡに基づくＴＧアーゼＩアッセイを使用した。
【００６２】
ケラチノサイト（上述のようにして培養）を９６ウェルプレートに２００μｌの培地中でウェルあたり４，０００−５，０００細胞の密度で平板培養した。２−３日間または細胞が〜５０％の単層集密度に達するまでインキュベーションした後、培地を被験化合物含有培地に交換した（試験あたり５つの重複）。細胞を更に９６時間培養し、この期間の経過後、培地を吸引し、プレートを−７０℃で保存した。プレートをフリーザーから取り出し、細胞を２００μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＴＢＳ／５％ＢＳＡ（洗浄用バッファ、ウシ血清アルブミン）と共に室温（Ｒ／Ｔ）で１時間インキュベートした。次にＴＧアーゼ第一抗体：洗浄用バッファで１：２０００に希釈した５０μｌのモノクローナル抗−ＴＧアーゼＩ  Ａｂ  Ｂ．Ｃ．を添加した。第一抗体を３７℃で２時間インキュベートし、次いで洗浄用バッファで６回洗浄した。次に細胞を洗浄用バッファで１：４，０００に希釈した５０μｌの第二抗体（Ｆａｂフラグメント、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ、Ａｍｅｒｓｈａｍから入手）と共に３７℃で２時間インキュベートし、次いで洗浄用バッファで３回洗浄した。洗浄用バッファによる洗浄後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。比色測定用に発色させるために、細胞を１００μｌの基質溶液（１０ｍｌの０．１Ｍのクエン酸バッファ，ｐＨ５．０中の４ｍｇのｏ−フェニレンジアミン及び３．３μｌの３０％のＨ２Ｏ２）と共に暗中（アルミニウム箔で覆う）、室温（Ｒ／Ｔ）で正確に５分間インキュベートした。５０μｌの４ＮのＨ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。９６ウェルプレートＵＶ分光光度計でサンプルの４９２ｎｍの吸光度を読み取った。５つの重複サンプル中、４つのサンプルを両方の抗体で処理し、５番目のサンプルはＴＧアーゼのバックグラウンド対照とした。ＴＧアーゼレベルを測定し、対照に対するパーセンテージで表した。
【００６３】
トランスグルタミナーゼレベルを測定し、前出の表Ｂ１−Ｂ５に、以下の（ｉ）または（ｉｉ）として表した：
（ｉ）％（ブースター＋レチノール阻害／対照阻害）−％（ＲＯＨ阻害／対照阻害）（これは、レチノール単独に比べてブースター＋レチノールが誘発したＴＧアーゼ阻害の追加効果を測定する）；
（ｉｉ）多重ブースター濃度の阻害効果を試験したときのＩＣ５０値（これは、１０−７Ｍという一定のレチノール濃度と組合わせときにＴＧアーゼを５０％だけ阻害するブースター濃度を示す）。
【００６４】
本発明で評価基準として使用するのはＩＣ５０値である。
【００６５】
トランスグルタミナーゼアッセイで試験するために最良のブースターグループを以下に示す。
【００６６】
【表９】
2004527471.tif 000016
2004527471.tif 000017
【００６７】
レチノイド
本発明の製品中の選択された化合物の存在はレチノイドの性能を実質的に改善する。
【００６８】
本発明の組成物は組成物の約０．００１重量％−約１０重量％のレチノイドを含有する。
【００６９】
レチノイドは、レチニルエステル、レチノール、レチンアルデヒド及びレチノイン酸から選択され、好ましくはレチノールまたはレチニルエステルから選択される。“レチノール”という用語は、以下のレチノールの異性体を包含する：全−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、１１−シス−レチノール、９−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１３−シス−レチノール；３，４−ジデヒドロ−１１−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−９−シス−レチノール。好ましい異性体は、全−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、９−シス−レチノールである。商品として入手することが極めて容易であるという理由で全−トランス−レチノールが最も好ましい。
【００７０】
レチニルエステルはレチノールのエステルである。“レチノール”という用語については上記に定義した。本発明に使用するための適当なレチニルエステルは、レチノールのＣ１−Ｃ３０エステル、好ましくはＣ２−Ｃ２０エステルであり、普通以上に入手が容易であるという理由でＣ２、Ｃ３及びＣ１６のエステルが最も好ましい。レチニルエステルの非限定例は、パルミチン酸レチニル、ギ酸レチニル、酢酸レチニル、プロピオン酸レチニル、酪酸レチニル、吉草酸レチニル、イソ吉草酸レチニル、ヘキサン酸レチニル、ヘプタン酸レチニル、オクタン酸レチニル、ノナン酸レチニル、デカン酸レチニル、ウンデカン酸レチニル、ラウリン酸レチニル、トリデカン酸レチニル、ミリスチン酸レチニル、ペンタデカン酸レチニル、ヘプタデコン酸レチニル、ステアリン酸レチニル、イソステアリン酸レチニル、ノナデカン酸レチニル、アラキドン酸レチニル、ベヘン酸レチニル、リノール酸レチニル、オレイン酸レチニルである。
【００７１】
本発明に使用するための好ましいエステルは、商品として最も入手し易く従って最も廉価であるという理由でパルミチン酸レチニル、酢酸レチニル及びプロピオン酸レチニルから選択される。効能の面からはリノール酸レチニル及びオレイン酸レチニルも好ましい。
【００７２】
レチノールまたはレチニルエステルは本発明組成物中に約０．００１％−約１０％の量、好ましくは０．０１％−約１％の量、最も好ましくは約０．０１％−約０．５％の量で使用される。
【００７３】
ペルオキシド値
本明細書中で検討したように、レチノイドは水中油型エマルジョン中で安定でない。レチノイドの化学的安定性は、規定の温度で規定の保存期間の経過後であっても初期の化学的形態を維持しているレチノイドの濃度によって定義される。従って本発明は２つの有益な効果、即ち、皮膚内部でレチノイドの変換を増進する効果と、１２以上、好ましくは６以上のペルオキシド値を有する出発材料を削除することによってレチノイドの安定度を増加する効果とを提供する。
【００７４】
ペルオキシド数（ＰＯＶ）は標準ＡＯＣＳ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｄ  ８−５３を使用して測定されるが、当業者に公知の別の方法も本発明の範囲内である。
【００７５】
本発明の実施例では、ブースターと組合せたレチノール組成物の安定度に対する油のペルオキシド値の効果を測定するために種々のペルオキシド値をもつ油中でレチノールの安定度を試験した。ペルオキシド値は以下の等式１を使用して計算した：
ペルオキシド値（ペルオキシドのミリ等量／サンプル１０００ｇ）＝
｛（Ｓ−Ｂ）×１０００｝／サンプル重量，ｇ                    ［等式１］
式中、Ｂ＝滴定基準液の量，ブランクのｍｌ
Ｓ＝滴定基準液の量，サンプルのｍｌ
Ｎ＝チオ硫酸ナトリウム溶液の規定度
【００７６】
方法
１．ガラス栓の付いた２５０ｍｌ容のフラスコに５ｇのサンプルを計量し、３０ｍｌの３：２酢酸−クロロホルム溶液を添加する。回し振りしてサンプルを溶解する。０．５ｍｌの飽和ＫＩ溶液を加える。
【００７７】
２．ときどき振盪しながら溶液を正確に１分間静置し、次いで３０ｍｌの蒸留水を直ちに加える。
【００７８】
３．定常的に撹拌しながら０．１Ｎのチオ硫酸ナトリウムを徐々に加えることによって滴定する。ヨウ素の黄色がほぼ消えるまで滴定を継続する。０．５ｍｌの１０％ＳＤＳを添加し、次いで約０．５ｍｌのデンプン指示溶液を添加する。特に端点近くで定常的に撹拌しながら滴定を継続してヨウ素を溶媒層から完全に遊離させる。青色がちょうど消えるまでチオ硫酸溶液を滴下する。
【００７９】
４．試薬のブランク定量を毎日行う。ブランク滴定は０．１Ｎのチオ硫酸ナトリウム溶液が０．１ｍｌを超過してはならない。
【実施例１】
【００８０】
【表１０】
2004527471.tif 000018
【実施例２】
【００８１】
ブースター対ＰＯＶのレチノイル安定度（ｔ１／２は２−３週の安定度データに基づいた予測値）
【００８２】
【表１１】
2004527471.tif 000019
【実施例３】
【００８３】
【表１２】
2004527471.tif 000020
【実施例４】
【００８４】
【表１３】
2004527471.tif 000021
【実施例５】
【００８５】
【表１４】
2004527471.tif 000022
【実施例６】
【００８６】
【表１５】
2004527471.tif 000023
【００８７】
化粧品として許容されるビヒクル
本発明の組成物はまた、組成物中の有効成分の希釈剤、分散剤または担体として作用し、組成物を皮膚に塗布したときの有効成分の分布を促進するために化粧品に許容されるビヒクルを含有している。
【００８８】
水に代替または追加されるビヒクルとしては、液体または固体の皮膚緩和剤、溶媒、保湿剤、増粘剤及び粉末がある。特に好ましい非水性担体としてはポリジメチルシロキサン及び／またはポリジメチルフェニルシロキサンがある。本発明のシリコーンは、２５℃で約１０−１０，０００，０００センチストークスの範囲内の任意の粘度をもつシリコーンであればよい。低粘度シリコーンと高粘度シリコーンとの混合物が特に望ましい。これらのシリコーンはＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙから商標Ｖｉｃａｓｉｌ，ＳＥ及びＳＦとして、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙから２００及び５５０シリーズとして入手できる。本発明の組成物中に使用し得るシリコーンの量は、組成物の５−９５重量％、好ましくは２５−９０重量％の範囲内の任意の値である。
【００８９】
任意の皮膚有益物質及び化粧品添加剤
主として使用される乳化剤の平均親水疎水バランス（ＨＬＢ）次第では油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンを形成するために油または油性物質を乳化剤と共に存在させてもよい。
【００９０】
本発明の化粧組成物中には多様な種類の有効成分を存在させ得る。有効成分は、皮膚緩和剤以外、及び、組成物の物理的特性を改善するだけの成分以外の皮膚または髪に有益な物質であると定義される。一般的な例は日光遮断剤、皮膚美白剤、日焼け剤、などであるがこれらの種類に限定はされない。
【００９１】
日光遮断剤は紫外光を遮断するために常用の物質から成る。代表的な化合物はＰＡＢＡ、シンナメート及びサリチレートの誘導体である。例えば、オクチルメトキシシンナメート及び２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られる）を使用し得る。オクチルメトキシシンナメート及び２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンはそれぞれＰａｒｓｏｌ  ＭＣＸ及びベンゾフェノン−３という商標で市販されている。
【００９２】
エマルジョン中に使用される日光遮断剤の正確な量は、日光紫外線の所望の防御度に従って変更し得る。
【００９３】
別の好ましい任意成分は、必須脂肪酸（ＥＦＡ）、即ち、すべての細胞の形質膜形成に必須の脂肪酸から選択される。ケラチノサイト中のＥＦＡ欠乏は細胞を超増殖性にする。ＥＦＡの補給はこれを補正する。ＥＦＡはまた、表皮の脂質生合成を増進し、表皮のバリアー形成用脂質を供給する。必須脂肪酸は好ましくは、リノール酸、Ｙ−リノレン酸、ホモ−Ｙ−リノレン酸、コロンビン酸、エイコサ−（ｎ−６，９，１３）−トリエン酸、アラキドン酸、Ｙ−リノレン酸、チムノドン酸、ヘキサエン酸及びそれらの混合物から選択される。
【００９４】
皮膚緩和剤がしばしば本発明の化粧組成物に添合される。このような皮膚緩和剤のレベルは、全組成物の約０．５重量％−約５０重量％、好ましくは約５重量％−３０重量％の範囲である。皮膚緩和剤はエステル、脂肪酸及びアルコール、ポリオール及び炭化水素のような一般化学物質の種類に分類される。
【００９５】
エステルはモノエステルでもジエステルでもよい。適格な脂肪ジエステルの例は、ジブチルアジペート、ジエチルセバケート、ジイソプロピルジメレート及びジオクチルスクシネートである。適格な分枝状脂肪エステルとしては２−エチル−ヘキシルミリステート、イソプロピルステアレート及びイソステアリルパルミテートがある。適格な三塩基性酸エステルとしてはトリイソプロピルトリリノレエート及びトリラウリルシトレートがある。適格な直鎖状脂肪エステルとしてはラウリルパルミテート、ミリスチルラクテート、オレイルユールケート及びステアリルオレエートがある。好ましいエステルとしてはココ−カプリレート／カプレート（ココ−カプリレートとココ−カプレートとのブレンド）、プロピレングリコールミリスチルエーテルアセテート、ジイソプロピルアジペート及びセチルオクタノエートがある。
【００９６】
適当な脂肪アルコール及び脂肪酸としては１０−２０個の炭素原子をもつ化合物がある。特に好ましい化合物は、セチル、ミリスチル、パルミチル及びステアリルのアルコール及び酸のような化合物である。
【００９７】
皮膚緩和剤として役立つポリオールとしては直鎖状及び分枝鎖状のアルキルポリヒドロキシル化合物がある。例えば、プロピレングリコール、ソルビトール及びグリセリンが好ましい。また、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールのような重合ポリオールも有用である。ブチレン及びプロピレングリコールはまた浸透増進剤としても特に好ましい。
【００９８】
皮膚緩和剤として役立つ代表的な炭化水素は、１２−３０個の範囲内の任意の数の炭素原子を含む炭化水素鎖を有している炭化水素である。特定例は鉱油、石油ゼリー、スクアレン及びイソパラフィンである。
【００９９】
本発明の化粧組成物中の別の種類の機能成分は増粘剤である。増粘剤は通常は、組成物の０．１重量％−２０重量％、好ましくは約０．５重量％−１０重量％の範囲内の任意の量で存在するであろう。代表的な増粘剤は、Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙから商標Ｃａｒｂｏｐｏｌで入手し得る架橋したポリアクリレート材料である。キサンタン、カラゲナン、ゼラチン、カラヤ、ペクチン及びイナゴマメガムのようなガムを使用してもよい。ある種の状況下では、シリコーンまたは皮膚緩和剤として作用する材料が増粘機能も果たし得る。例えば、１０センチストークス以上のシリコーンゴム及びグリセロールステアレートのようなエステルは二重機能を有している。
【０１００】
本発明の化粧組成物に粉末を添合してもよい。これらの粉末としては、チョーク、タルク、フラー土、カオリン、デンプン、スメクタイトクレー、化学的に変性したケイ酸マグネシウムアルミニウム、有機的に変性したモンモリロナイトクレー、水和ケイ酸アルミニウム、ヒュームドシリカ、デンプンオクテニルコハク酸アルミニウム及びそれらの混合物がある。
【０１０１】
また、その他の補助的な少量成分を化粧組成物に添合し得る。これらの成分としては着色料、乳白剤及び香料がある。これらの材料の量は組成物の０．００１重量％−２０重量％までの範囲内の任意の量でよい。
【０１０２】
組成物の使用
本発明の組成物は主としてヒトの皮膚に局所塗布する製品、特に皮膚の状態を調整し皮膚を滑らかにする製品、並びに、しわまたは老化肌の出現を予防または抑制する製品として提供される。
【０１０３】
使用の際には、適当な容器またはアプリケーターから少量、例えば１−５ｍｌの組成物を皮膚の露出領域に塗布し、必要ならば手または指または適当なデバイスを使用して皮膚に展着させるか及び／または擦り込む。
【０１０４】
製品の形態及び包装
本発明の外用皮膚トリートメント組成物はローション、流体クリーム、クリームまたはジェルの形態に配合できる。組成物をその粘度及び消費者の所期の用途に合う適当な容器に包装できる。例えば、ローションまたは流体クリームはびんまたはロールボールアプリケーターまたはカプセルまたは噴射剤推進型エアロゾルデバイスまたは指で操作する適当なポンプを備えた容器に包装できる。組成物がクリームであるときは、非変形性のびんまたはチューブのような絞り出し容器または蓋付きジャーに組成物を収容するだけでよい。
【０１０５】
従って本発明はまた、本明細書中に定義したような化粧品に許容される組成物を収容している閉鎖容器を提供する。
【０１０６】
以下の実施例はレチノールとブースターとの相乗的な組合せを示す。
【実施例７】
【０１０７】
Ｂ１及びＢ５の活性化合物とレチノールとの組合せによってトランスグルタミナーゼ発現の相乗的阻害が生じたことを確認するためには、レチノールの存在下で個々に試験したときの活性化合物の用量応答プロフィル（ＩＣ５０値を含む）を決定することが必須である。レチノールの存在下の活性化合物の混合物の相乗的効果を確認することができるように、このデータを使用して各活性化合物の適正なサブマキシマル阻害濃度を決定した。２つの化合物の相乗作用を証明するためには、最大でＩＣ２０の試験濃度、言い換えると、レチノールによるトランスグルタミナーゼ発現の阻害を２０％だけ増進する個々の化合物の濃度、を選択することが必須である。２つのこのような化合物は合計で４０％の阻害を示すことになる。阻害濃度の決定にこの戦略を使用するとき、更に４０−１００％のトランスグルタミナーゼ阻害の範囲について２つの被験化合物の相乗作用を検出する必要がある。もっと大胆な濃度基準は、単独ではレチノールによるトランスグルタミナーゼ阻害の増進を全く示さなかった化合物の濃度を選択することであろう。しかしながら我々はこの試験でもっと大胆な基準を選択する。我々は、トランスグルタミナーゼを阻害する最小有効濃度の１／１０または１／１００の化合物濃度を選択した。このような極めて低い濃度を使用した相乗的組合せの認定は、最も有効な相乗的組合せが認定されたことを意味するであろう。
【０１０８】
次表のデータは、化合物の最小阻害濃度よりも２ｌｏｇ低い化合物濃度を表す。これらはＢ１／Ｂ５組合せ試験で使用した濃度である。
【０１０９】
【表１６】
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Ｂ１及びＢ５の活性化合物とレチノールとの組合せによるトランスグルタミナーゼ発現の相乗的阻害を研究するために、選択した化合物の組合せを上記の表に示す濃度で試験した。以下のデータが得られた：
【０１１０】
【表１７】
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Ｂ１／Ｂ５組合せの効力は、２つのクラス、即ち、特に有効な組合せ（上記表中の太字で表したもの、即ち、上から１４番目までの組合せまたは列）とあまり有効でない組合せ（太字でないもの、即ち、下から６番目までの組合せまたは列）とに分類される。いくつかのＢ１／Ｂ５の組合せがその他の組合せよりも有効な性能を示すのは予想外であった。あまり有効でなかった組合せは、（ｉ）脂肪酸アミド＋アゾール、（ｉｉ）ヒドロキシ脂肪酸＋アゾールであった。有効な組合せは以下のクラスから選択されたＢ５ブースターと組合せたＢ１ブースターを含んでいた：脂肪ヒドロキシエチルイミダゾリン界面活性剤、脂環式不飽和化合物、多環式トリテルペン、ｎ−置換脂肪酸アミド。
【０１１１】
本明細書中では、本発明をいくつかの好ましい実施態様に基づいてある程度特定的に記載してきたが、記載の実施態様について本発明の範囲内で多くの変更、修正及び置換が可能であることは平均的な当業者に明らかであろう。これらの修正及び変更が本明細書及び特許請求の範囲に記載した本発明の範囲内に包含されること、本発明の範囲が特許請求の範囲によって限定されること、また、このような特許請求の範囲は正当である限りできるだけ広い範囲に解釈されるべきであることは理解されよう。本明細書では多様な刊行物及び文献を引用した。これらの刊行物及び文献の各々について、それらの記載内容全部が参照によって本発明に含まれるものとする。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年2月11日(2003.2.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）約０．００１重量％−約１０重量％の少なくとも１種類のブースター化合物と、
（ｂ）約０．００１重量％−約１０重量％のレチノイドと、
（ｃ）化粧品として許容されるビヒクルと、
から成り、水中油型エマルジョンの油相の構成成分の各々が１２以下のペルオキシド値を有していることを特徴とする皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物。
【請求項２】
エマルジョンの油相が６以下のペルオキシド値を有していることを特徴とする請求項１に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物。
【請求項３】
組成物が少なくとも２種類のブースター化合物を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物。
【請求項４】
ブースター化合物がＢ５ブースターであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物。
【請求項５】
Ｂ５ブースターがクリンバゾールであることを特徴とする請求項４に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物。
【請求項６】
化粧品として許容されるビヒクルがエステル皮膚緩和剤を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン組成物。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布することから成る、油性皮膚状態を軽減または防止する美容的スキンケア方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布することから成る、皮膚の線維芽細胞によるコラーゲン合成を刺激する美容的スキンケア方法。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布する段階から成る、老化肌、光老化肌、乾燥肌、深いしわまたは小じわのある肌を治療する美容的スキンケア方法。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物を皮膚に塗布する段階から成る、油性皮膚状態を軽減または防止し、また、老化肌、光老化肌、乾燥肌、深いしわまたは小じわのある肌を治療する美容的スキンケア方法。
【請求項１１】
皮膚の線維芽細胞によるコラーゲン合成を刺激する医薬品の製造における請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１２】
皮膚コンディショニング用医薬品の製造における請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
皮膚をコンディショニングするための請求項１から６のいずれか一項に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン。
【請求項１４】
皮膚の線維芽細胞によるコラーゲン合成を刺激するための請求項１から６のいずれか一項に記載の皮膚コンディショニング用水中油型エマルジョン。
【国際調査報告】
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