(57)【要約】本発明は、三つの化合物の混合物を不空組成物であって、二つの化合物の混合物を含む組成物であって：（ａ）一つの化合物は、ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体またはその一部であり；（ｂ）一つの化合物は、ｇｐ４１の融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させるものであり；前記混合物中の化合物の相対質量比は約１００：１から約１：１００の範囲にあり；前記組成物は、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染の阻害に有効である組成物を提供する。本発明はまた、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染阻害に効果的な請求項１または２に記載の組成物のある量と接触させることを含み、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二つの化合物の混合物を含む組成物であって、
（ａ）一つの化合物は、ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体またはその一部であり、
（ｂ）一つの化合物は、ｇｐ４１の融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させるものであり、
前記混合物中の化合物の相対質量比は約１００：１から約１：１００の範囲にあり、
前記組成物は、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染の阻害に有効である組成物。
【請求項２】
三つの化合物の混合物を含む組成物であって、
（ａ）一つの化合物は、ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体またはその一部であり、
（ｂ）一つの化合物は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質がＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１がＣＤ４＋細胞に付着するのを遅延させるものであり、
（ｃ）一つの化合物は、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させるものであり、
前記混合物中の化合物のいずれか二つの相対質量比は約１００：１から約１：１００の範囲にあり、
前記組成物は、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染の阻害に有効である組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、前記ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ−１の付着を遅延させる前記化合物は、ＣＤ４に基づいたタンパク質である組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の組成物であって、前記ＣＤ４に基づいたタンパク質は、ＣＤ４−免疫グロブリン融合タンパク質である組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物であって、前記ＣＤ４−免疫グロブリン融合タンパク質はＣＤ４−ＩｇＧ２であり、前記ＣＤ４−ＩｇＧ２は二つの重鎖および軽鎖を具備し、前記重鎖は、ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ受付け番号７５１９３）と称する発現ベクターによってコードされ、前記軽鎖は、ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ受付け番号７５１９４）と称する発現ベクターによってコード化される。
【請求項６】
請求項２に記載の組成物であって、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４に結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１のＣＤ４＋細胞への付着を遅延させる前記化合物はタンパク質であり、そのアミノ酸配列はエンベロープ糖タンパク質としてＨＩＶ−１中に見られる配列を含む組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、前記タンパク質は前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４のエピトープに結合する組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の組成物であって、前記エンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０およびｇｐ１４０からなる群から選択される組成物。
【請求項９】
請求項２に記載の組成物であって、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４に結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１が前記ＣＤ４＋細胞に付着するのを遅延させる前記化合物は、抗体または抗体の一部である組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物であって、前記抗体はモノクローナル抗体である組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、前記モノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である組成物。
【請求項１２】
請求項９に記載の組成物であって、前記抗体の一部は、前記抗体のＦａｂ断片である組成物。
【請求項１３】
請求項９に記載の組成物であって、前記抗体の一部は、前記抗体の可変ドメインを含む組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の組成物であって、前記抗体の一部は、前記抗体のＣＤＲ部を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１０に記載の組成物であって、前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥモノクローナル抗体である組成物。
【請求項１６】
請求項１０に記載の組成物であって、前記モノクローナル抗体がＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質に結合する組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、前記ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質は、前記ｇｐ１２０およびｇｐ１６０からなる群から選択される組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の組成物であって、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質はｇｐ１２０であり、ｇｐ１２０に結合する前記モノクローナル抗体はＩｇＧ１ｂ１２またはＦ１０５である組成物。
【請求項１９】
請求項９に記載の組成物であって、前記抗体は、前記ＣＤ４＋細胞の表面でＣＤ４のエピトープに結合する組成物。
【請求項２０】
請求項２に記載の組成物であって、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４に結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１が前記ＣＤ４＋細胞に結合するのを遅延させる前記化合物は、ペプチドである組成物。
【請求項２１】
請求項２に記載の組成物であって、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４に結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１が前記ＣＤ４＋細胞に結合するのを遅延させる前記化合物は、非ペプチド物質である組成物。
【請求項２２】
請求項１または２に記載の組成物であって、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる前記化合物は抗体である。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、前記抗体はモノクローナル抗体である組成物。
【請求項２４】
請求項１または２に記載の組成物であって、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる前記化合物は、ペプチドである。
【請求項２５】
請求項１または２に記載の組成物であって、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる前記化合物は、Ｔ−２０（配列番号：１）、ＤＰ１０７（配列番号：２）、Ｎ３４（配列番号：３）、Ｃ２８（配列番号：４）、Ｎ３４（Ｌ６）Ｃ２８（配列番号：５）、およびＴ−１２４９（配列番号：６）からなる群から選択されるペプチドを含む融合タンパク質である組成物。
【請求項２６】
請求項２４に記載の組成物であって、前記ペプチドはＴ−２０（配列番号：１）、ＤＰ１０７（配列番号：２）、Ｎ３４（配列番号：３）、Ｃ２８（配列番号：４）、Ｎ３４（Ｌ６）Ｃ２８（配列番号：５）、およびＴ−１２４９（配列番号：６）からなる群から選択される組成物。
【請求項２７】
請求項２４に記載の組成物であって、前記ペプチドはＴ−２０（配列番号：１）である組成物。
【請求項２８】
請求項１または２に記載の組成物であって、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる前記化合物は、非ペプチド物質である組成物。
【請求項２９】
請求項１または２に記載の組成物であって、ＣＣＲ５のレセプターに結合する前記抗体はＰＡ８（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６０５）、ＰＡ１０（ＡＴＣＣ受付け番号１２６０７）、ＰＡ１１（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６０８）、ＰＡ１２（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６０９）、およびＰＡ１４（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６１０）からなる群から選択される組成物。
【請求項３０】
請求項１または２に記載の組成物であって、前記抗体はＰＡ１４（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６１０）である組成物。
【請求項３１】
請求項２９に記載の組成物であって、前記抗体はモノクローナル抗体である組成物。
【請求項３２】
請求項２９に記載の組成物であって、前記モノクローナル抗体はヒトの抗体、ヒト化された抗体、またはキメラ抗体である組成物。
【請求項３３】
請求項１または２に記載の組成物であって、前記抗体のタンパク質は前記抗体のＦａｂ断片である組成物。
【請求項３４】
請求項１または２に記載の組成物であって、前記抗体のタンパク質は前記抗体の様々なドメインを含む組成物。
【請求項３５】
請求項１または２に記載の組成物であって、前記抗体の一部は前記抗体のＣＤＲ部を含む組成物。
【請求項３６】
請求項３１に記載の組成物であって、前記モノクローナル抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥモノクローナル抗体である組成物。
【請求項３７】
請求項１または２に記載の組成物であって、前記混合物中のそのような化合物のそれぞれの相対質量比は、約２５：１から約１：１の範囲にある組成物。
【請求項３８】
請求項３７に記載の組成物であって、前記質量比は約２５：１である組成物。
【請求項３９】
請求項３７に記載の組成物であって、前記質量比は約５：１である組成物。
【請求項４０】
請求項３７に記載の組成物であって、前記質量比は約１：１である組成物。
【請求項４１】
請求項１または２に記載の組成物であって、前記組成物はキャリアに混合される組成物。
【請求項４２】
請求項４１に記載の組成物であって、前記キャリアはエアロゾル、静脈内の、経口のまたは局所的なキャリアである組成物。
【請求項４３】
ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染阻害に効果的な請求項１または２に記載の組成物のある量と接触させることを含み、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記ＣＤ４＋細胞は対象中に存在し、前記接触は前記組成物をその対象に投与することによって成される方法。
【請求項４５】
請求項４３に記載の方法であって、前記効果的な組成物の量は、前記対象の体重量当たり約０．０００００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇであることを含む方法。
【請求項４６】
ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、
（１）ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体のある量、および
（２）ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる化合物のある量、
と接触させることを含み、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法。
【請求項４７】
ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、
（１）ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体のある量、
（２）ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１の前記ＣＤ４＋細胞への付着を遅延させる化合物の、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染阻害に効果的な量、および
（３）ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる化合物のある量
と接触させることを含み、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法。
【請求項４８】
請求項４６または４７に記載の方法であって、前記ＣＤ４＋細胞は対象中に存在し、前記接触は前記組成物をその対象に投与することによって成される方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、前記化合物は前記対象に同時に投与される方法。
【請求項５０】
請求項４８に記載の方法であって、前記化合物は前記対象に異なる時点で投与される方法。
【請求項５１】
請求項４８に記載の方法であって、前記化合物は前記対象に異なる投与経路で投与される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２００１年１月２６日に出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／０２６３３、２００１年２月６日に出願された米国仮出願番号６０／２６６，７３８、２００１年６月２５日に出願された米国出願番号０９／９１２，８２４、および、２０００年９月１５日に出願された米国出願番号０９／６６３，２１９を継続し、その優先権を主張し、その内容を本明細書の一部として援用する。
【０００２】
本願中を通して、種々の刊行物を括弧内に参照する。これらの刊行物の開示は、本発明の属する技術の状態をより完全に記述するために、その全体を本明細書の一部として本願に援用する。これらの参照文献の完全な書誌的引用は、図面の簡単な説明の前に列記されている。
【０００３】
【発明の背景】
ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）による細胞の感染は、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）糖タンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１によって媒介され、これら糖タンパク質は、非共有結合性オリゴマー複合体としてウイルスおよびウイルス感染細胞の表面で発現する。標的細胞に侵入したＨＩＶ−１は、（１）ＨＩＶ−１の最初のレセプターである細胞表面のＣＤ４へ、ウイルス表面の糖タンパク質ｇｐ１２０が結合すること、（２）ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４のような融合コレセプターへ、ｅｎｖが結合すること、（３）ｇｐ４１のコンフォメーションが多様に変化することを含む、カスケード事象を通じて細胞表面において進行する。融合の際に、ｇｐ４１は、最終的に融合を媒介できるコンフォメーションに折り畳まれるプレヘアピン融合中間体を含んだ、一時的なコンフォメーションを採る。ウイルスおよび細胞の膜が融合し、続いてウイルスのゲノムが標的細胞へ導入されることでこれらの事象は完了する。感染した細胞と感染していない細胞の融合を経由する感染の拡散には、同様の分子的事象の連鎖が必要である。ウイルス侵入プロセスのそれぞれの過程が、治療的介入の対象となりうる。
【０００４】
ＨＩＶ−１の結合は、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質と結合する物質によって、また、ヒトＣＤ４に結合する物質によって阻害することが出来る。特に、ＨＩＶ−１の結合は、ｇｐ１２０が結合するヒトＣＤ４のドメインを組み入れた化合物と、それを分子的に擬態した化合物によって阻害することができる［１−７］。このｇｐ１２０とＣＤ４の相互作用はウイルスの感染に不可欠なので、ＣＤ４を基にした分子は、全てではないがほとんどのＨＩＶ−１の株を標的にできる可能性を持つ。加えて、そのような分子に対する耐性を発達させるウイルスの能力は限られている。
【０００５】
ｇｐ１２０の結合を決定する要因は、ＣＤ４上の第１の細胞外ドメイン（Ｄ１）に位置しており、結合に重要なアミノ酸は、３６−４７のアミノ酸を含むループの中央に位置している。有効なＨＩＶ−１の阻害活性は、このループとその周辺の組織を擬態した２７のアミノ酸ペプチドで再現されている［７］。
【０００６】
ＣＤ４を基にした分子の幾つかの組み換え体が開発され、ヒトで臨床活性が試験されている。これらのうちの最初のものは、ＣＤ４の４つの細胞外ドメイン（Ｄ１−Ｄ４）を含んでいたが、膜貫通領域および細胞内領域を欠いていた。この分子は、可溶ＣＤ４（ｓＣＤ４）と称され、１０ｍｇ／ｋｇの投薬範囲でヒトに投与された時に優れた耐性を示した［８，９］。ｓＣＤ４で治療した一定の患者に、感染力を持つＨＩＶ−１のプラスマレベルの一時的な減少が観察された。ヒトの体内においてｓＣＤ４の半減期が短いことが（静脈内投与後４５分）、この物質を長期の治療に使用することの一つの障害であると認識された。
【０００７】
第２世代のＣＤ４を基にしたタンパク質は血清中の半減期を伸ばして開発された。これらのＣＤ４−免疫グロブリン融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ分子のヒンジＣＨ２およびＣＨ３領域に遺伝的に融合した、ＣＤ４のＤ１Ｄ２ドメインを含んでいた。これら二価のタンパク質は、それらのＣＤ４ドメインからはＨＩＶ−１中和能力を、そのＩｇＧ分子からはＦｃエフェクター機能を引き出す。ＣＤ４−ＩｇＧ１融合タンパク質は優れた耐性を有し、フェーズＩの臨床試験において薬物動態が改良されたことが示された［１０］。その抗ウイルス評価は確定されていない。
【０００８】
さらに最近、ヒトＩｇＧ２の軽鎖および重鎖の定常領域に遺伝的に融合したＣＤ４のＤ１Ｄ２ドメインを備えた、第３世代の４価ＣＤ４−ＩｇＧ２融合タンパク質が開発された。この物質はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０にナノモルの親和力［５］で結合し、レセプターを遅延させることによって、また、ｇｐ１２０をビリオン表面から引き離すことによってウイルスの結合を阻害することができ、それによってウイルスを不可逆的に不活性化する。標準的なＰＢＭＣに基づいた中和分析において、ＣＤ４−ＩｇＧ２は、すべての主要なサブタイプおよびアウトライアーグループに由来する一次ＨＩＶ−１分離株を中和した。ウイスルの感染力を９０％減少させるのに必要なＣＤ４−ＩｇＧ２濃度、即ちインビトロＩＣ９０は、おおよそ１５−２０μｇ／ｍｌ［１１］であり、インビボで容易に達成可能な濃度である。ＣＤ４−ＩｇＧ２は、エキソビボ分析で血清陽性であるドナーのプラスマから直接得られたＨＩＶ−１の中和において同様に有効であり、この物質が、臨床で遭遇するさまざまなウイルスの準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）に対して活性であることを示した［１２］。ＣＤ４−ＩｇＧ２はまた、ＨＩＶ−１感染ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいて、初期の分離株による感染を予防した［１３］。最近の分析では、ＣＤ４−ＩｇＧ２が一次ウイルスを中和する能力が、それらがコレセプターを使用することに依存しないことが示されている［１４］。
【０００９】
ＣＤ４に基づいた一価または二価のタンパク質と比較して、ＣＤ４−ＩｇＧ２は一次ＨＩＶ−１分離株の阻害に１００倍大きい有効性を一貫して示している［５，１２，１４，１５］。有効性の増強は、ＣＤ４−ＩｇＧ２の増加された結合価／結合活性を用いてビリオンと結合する能力と、免疫グロブリン分子のそれぞれのＦａｂ様アームにおける二つのｇｐ１２０結合サイトの立体的近位に由来する。
【００１０】
ＣＤ４−ＩｇＧ２のより大きいＦａｂ様アームは、ビリオン上のＨＩＶ−１エンベロープスパイクにまでおよぶ可能性が高い。さまざまな症状発現前のモデルにおいて、ＣＤ４−ＩｇＧ２の抗ＨＩＶ−１活性は、一次ＨＩＶ−１分離株を広く強力に中和する稀有なヒトモノクローナル抗体に都合よく匹敵することが示された［５，１１，１４，１５］。加えて、ＣＤ４−ＩｇＧ２療法は、原理的に、抗ｅｎｖモノクローナル抗体または高度に変異し易いＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を使った治療に比べて、ウイルスの薬物耐性の発達に対する感受性が小さい。これらの特性は、細胞と結合していないウイルスが新しい感染経路を確立する機会を得る前にそれを中和する物質として、ＣＤ４−ＩｇＧ２が治療に有用である可能性を示唆する。治療の他に、ＣＤ４−ＩｇＧ２は職業上の、出産期の、またはその他の理由でＨＩＶ−１に暴露された結果として感染することを予防することに有効性を有する可能性がある。
【００１１】
フェーズＩの臨床試験において、ＣＤ４−ＩｇＧ２の単独投薬は優れた薬理学および耐薬性を示した。加えて、測定可能な抗ウイルス活性が二つの基準のそれぞれで観察された。第１に、１０ｍｇ／ｋｇの単独投薬の後、プラスマＨＩＶ  ＲＮＡの統計的に著しく急激な減少が観察された。加えて、二人の患者の試験のそれぞれで、感染性ＨＩＶのプラスマレベルの持続的な減少が観察された。これらの観察結果を総合すると、ＣＤ４−ＩｇＧ２がヒト中で抗ウイルス活性を有することが示される［１６］。
【００１２】
ＣＤ４を基にしたタンパク質およびその分子的な擬態に加えて、ＨＩＶ−１の結合は抗体および非ペプチジル分子によっても阻害できる。周知の阻害剤は、（１）ＩｇＧ１ｂ１２およびＦ１０５のような抗ｅｎｖ抗体［１７，１８］、（２）ＯＫＴ４Ａ、Ｌｅｕ  ３ａ、およびそれらのヒト化バージョン［１９，２０］、（３）ｇｐ１２０またはＣＤ４のいずれかを標的にする非ペプチド物質［２１］、［２２−２４］、を含む。化合物の後者のグループは、アウリントリカルボン酸、ポリヒドロキシカルボキシレート、スルホン酸ポリマー、および硫酸デキストランを含む。
【００１３】
幾つかの物質は、ｇｐ４１融合中間体を標的にすることにより、ＨＩＶ−１感染を妨げることが確認されている。これらの阻害剤は、融合中間体と相互に作用し、それらが最終融合コンフォメーションに折り畳まれることを防ぐ。最初に同定されたそのような物質は、疎水性のアルファ螺旋を形成すると予測されているｇｐ４１の外部ドメインの一部と一致した、合成あるいは組み換えペプチドを含む。そのような領域の一つは、ｇｐ４１の細胞外部分のアミノセグメントおよびカルボキシセグメントの両方に存在し、最近の結晶学的な証明は、これらの領域がｇｐ４１の推定された融合コンフォメーションと関係していることを示唆している［２５，２６］。ＨＩＶ−１感染は、融合の際に暴露されるＮ−またはＣ−ターミナルｇｐ４１エピトープのいずれかと結合する物質によって阻害することができる。これらの物質は、ｇｐ４１に基づいたペプチドであるＴ−２０（以前はＤＰ１７８として知られていた）、Ｔ−１２４９、ＤＰ１０７、Ｎ３４、Ｃ２８、および様々な融合タンパク質およびそれの類似体を含む［２７−３３］。他の研究では、非天然のＤ−ペプチドおよび非ペプチジル部分を含む阻害剤が確認されている［３４，３５］。Ｔ−２０によって、この分類の阻害剤の臨床的な概念検証が与えられた。Ｔ−２０は、フェーズＩ／ＩＩのヒトの臨床試験において、２対数倍までプラスマＨＩＶ  ＲＮＡレベルを減少した。この抗ウイルス活性の広範さは、多様なＨＩＶ−１株の間でｇｐ４１の配列が高度に保存されていることを、この分類の阻害剤が反映していることを示している。
【００１４】
最近の研究［３７］は、ＨＩＶ−１融合中間体に対して抗体が生じる可能性を示した。この研究は、ＣＤ４と結合するｇｐ１２０／ｇｐ４１と融合コレセプターの相互作用で形成される一時的な融合中間体を補足する「融合成分」ＨＩＶワクチン免疫原を用いる。これらの研究で用いられている免疫原は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現する細胞、およびヒトのＣＤ４およびＣＣＲ５を発現するがＣＸＣＲ４は発現しない細胞、の共生培養体のホルマリン固定物である。そのワクチンによって誘起された抗体は、一次ＨＩＶ−１単離株の阻害において、コレセプターを使用したにも関わらずかつてない幅および強さの有効性を示した。このことは、その抗体が、保存性が高くかつＨＩＶ−１が侵入する間に一過性で暴露されたｇｐ４１の融合中間体のような構造に対して生じたことを示している。このクラスの抗体は、２Ｆ５として知られる、融合前のウイルス粒子に構造的に存在しているエピトープと相互作用する抗ｇｐ４１モノクローナル抗体を含んでいない［３８］。
【００１５】
以前に、ある抗ｅｎｖ抗体を他の抗ｅｎｖ抗体［３９−４４］、抗ＣＤ４抗体［４５］またはＣＤ４を基にしたタンパク質［６］と組み合わせて使用して、ＨＩＶ−１の侵入を阻害する協働作用が示された。同様に、抗ＣＣＲ５抗体を他の抗ＣＣＲ５抗体、ＣＣケモキネシス、またはＣＤ４に基づいたタンパク質［４６］と組み合わせて使用することで、協働作用が観察された。米国出願番号０９／４９３，３４６に記載した我々の以前の研究は、融合阻害剤と付着阻害剤の組み合わせを検討している。２０００年６月に公開されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／３０３４５、ＷＯ  ００／３５４０９に記載した我々の以前の研究は、ＨＩＶ−１付着阻害剤とＣＣＲコレセプター阻害剤の組み合わせを検討している。しかしながら、融合阻害剤とＣＣＲコレセプターの組み合わせ、さらには融合阻害剤とＣＣＲコレセプターおよびＨＩＶ−１付着阻害剤の３つの組み合わせは、いまだ検討されていない。
【００１６】
【発明の概要】
本発明は、二つの化合物の混合物を含む組成物であって：
（ａ）一つの化合物は、ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体またはその一部であり、
（ｂ）一つの化合物は、ｇｐ４１の融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させるものであり；
前記混合物中の化合物の相対質量比は約１００：１から約１：１００の範囲にあり、前記組成物は、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染の阻害に有効である組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、三つの化合物の混合物を含む組成物であって：  （ａ）一つの化合物は、ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体またはその一部であり、（ｂ）一つの化合物は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質がＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１がＣＤ４＋細胞に結合するのを遅延させるものであり、（ｃ）一つの化合物は、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させるものであり；  前記混合物中の化合物のいずれか二つの相対質量比は約１００：１から約１：１００の範囲にあり、前記組成物は、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染の阻害に有効である組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染阻害に効果的な本発明の組成物のある量と接触させ、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害することを含む方法を提供する。
【００１９】
本発明は、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、（１）ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体のある量、および（２）ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる化合物のある量と接触させ、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、（１）ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体のある量、（２）ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１の前記ＣＤ４＋細胞への付着を遅延させる化合物の、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染阻害に効果的な量、および（３）ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる化合物のある量、と接触させることを含む方法を提供する。
【００２１】
【発明の詳細な記述】
プラスミドＣＤ４−ＩｇＧ２−ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶおよびＣＤ４−ＫＬＣ−ｐＲｃＣＭＶは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（「ブダペスト条約」）の要件に従い且つこれを満たして、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、それぞれＡＴＣＣ受付番号７５１９３および７５１９４の下で寄託された。これらのプラスミドは、１９９２年１月３０日にＡＴＣＣに寄託された。ｐＭＡ２４３と命名されたプラスミドも同様に、ブダペスト条約に従って、１９９３年１２月１６日に、受付け番号７５６２６の下でＡＴＣＣに寄託された。
【００２２】
マウスハイブリドーマであるＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、およびＰＡ１４は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（「ブダペスト条約」）の要件に従い且つこれを満たして、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、次のＡＴＣＣ受付番号下で寄託された：ＰＡ８（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６０５）、ＰＡ９（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６０６）、ＰＡ１０（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−１２６０７）、ＰＡ１１（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６０８）、ＰＡ１２（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６０９）、およびＰＡ１４（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６１０）。これらのハイブリドーマは、１９９８年１２月２日に寄託された。
【００２３】
ここで使用する下記の標準略語は、明細書の全体を通して特定のアミノ酸を示すために使用される：
Ａ＝ａｌａ＝アラニン            Ｒ＝ａｒｇ＝アルギニン
Ｎ＝ａｓｎ＝アスパラギン        Ｄ＝ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｃ＝ｃｙｓ＝システイン          Ｑ＝ｇｌｎ＝グルタミン
Ｅ＝ｇｌｕ＝グルタミン酸        Ｇ＝ｇｌｙ＝グリシン
Ｈ＝ｈｉｓ＝ヒスチジン          Ｉ＝ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｌ＝ｌｅｕ＝ロイシン            Ｋ＝ｌｙｓ＝リジン
Ｍ＝ｍｅｔ＝メチオニン          Ｆ＝ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｐ＝ｐｒｏ＝プロリン            Ｓ＝ｓｅｒ＝セリン
Ｔ＝ｔｈｒ＝スレオニン          Ｗ＝ｔｒｐ＝トリプトファン
Ｙ＝ｔｙｒ＝チロシン            Ｖ＝ｖａｌ＝バリン
本発明は、二つの化合物の混合物を含む組成物であって：（ａ）一つの化合物は、ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体またはその一部であり；（ｂ）一つの化合物は、ｇｐ４１の融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させるものであり；前記混合物中の化合物の相対質量比は約１００：１から約１：１００の範囲にあり、前記組成物は、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染の阻害に有効である組成物を提供する。
【００２４】
本発明は、三つの化合物の混合物を含む組成物であって：（ａ）一つの化合物は、ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体またはその一部であり；（ｂ）一つの化合物は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質がＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１がＣＤ４＋細胞に結合するのを遅延させるものであり；（ｃ）一つの化合物は、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させるものであり；前記混合物中の化合物のいずれか二つの相対質量比は約１００：１から約１：１００の範囲にあり、前記組成物は、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染の阻害に有効である組成物を提供する。
【００２５】
本発明は、三つの化合物の混合物を含む組成物であって：一つの化合物は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質がＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１がＣＤ４＋細胞に結合するのを遅延させるものであり；他の化合物は、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させるものであり；前記混合物中の化合物のいずれか二つの相対質量比は約１００：１から約１：１００の範囲にあり、前記組成物は、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染の阻害に有効である組成物を提供する。
【００２６】
ここで使用する「ＨＩＶ−１」は、ヒト免疫不全ウイルス１型を意味する。ＨＩＶ−１は、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−１感染細胞に結合したＨＩＶ−１の形態が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬは、ＡＩＤＳ患者の脳組織から解剖により最初に単離された株である［４７］。このウイルスを、レクチン刺激された正常なヒト抹消血単核細胞と共に共培養した。該ウイルスはクローン化されており、そのエンベロープ糖タンパク質のＤＮＡ配列は既知である（Ｇｅｎｂａｎｋ受付け番号＃Ｕ６３６３２）。ウイルス侵入阻害剤に対する感受性に関して、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬは、ＨＩＶ−１単離株の典型例として知られている。
【００２７】
ここで用いる「ｇｐ４１融合中間体」には、ＨＩＶ−１エンベロープに媒介された膜融合のプロセスの際に、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１上に優先的かつ一時的に提示または露出される構造、コンホメーション、およびオリゴマー状態が含まれる。これらの中間体は、ＨＩＶ−１と細胞レセプターとの相互作用時に形成されるか、または細胞レセプターとの相互作用の前に、ＨＩＶ−１上に部分的にもしくは完全に閉塞された状態で存在する可能性がある。「ｇｐ４１融合中間体」は、治療的介入のための標的を提供できない膜融合性ｇｐ４１のコンホメーションを含まない。
【００２８】
ｇｐ４１融合中間体は、融合の際に一時的に露出され且つ治療的介入の標的を提供できる複数のエピトープを含んでいてもよい。ここで用いる「Ｎ−末端ｇｐ４１エピトープ」は、アミノ酸Ｗ６２８〜Ｌ６６３の配列の全てまたは一部を含むことができる。これらのエピトープは、１位および４位に疎水性アミノ酸を含むヘプタッドリピート（７アミノ酸の配列）によってα螺旋セグメントと相互作用するコイルドコイルを形成する能力を有している。このアミノ酸のナンバリングシステムは、ＨＩＶ−１のＨｘＢ２単離株（Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質受付け番号ＡＡＢ５０２６２）についてのものである。ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の配列の可変性に起因して、このような配列の組成、サイズおよび正確な位置は種々のウイルス単離株について異なる可能性がある。このｇｐ４１融合中間体はまた、ＨＩＶ−１の侵入の際に一時的に発現される他の線形エピトープまたはコンホメーションエピトープにも存在する可能性がある。阻害剤は、ｇｐ４１融合中間体に存在する複数のエピトープをターゲッティングする可能性がある。或いは、別々の阻害剤を組合わせて使用して、ｇｐ４１に存在する一以上のエピトープをターゲッティングしてもよい。
【００２９】
ここで用いる「膜融合性の」は、膜融合を媒介できることを意味する。ここで用いる「ＨＩＶ−１融合コレセプター」は、該レセプターを発現する標的細胞とＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質＋細胞との間の融合を媒介する細胞レセプターを意味する。ＨＩＶ−１融合コレセプターにはＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４および他のケモカインレセプターが含まれるが、これらに限定されない。ここで用いる「融合」は、哺乳類細胞またはＨＩＶ−１のようなウイルス上で見られる脂質二重層膜の結合または一体化を意味する。このプロセスは、標的細胞に対するＨＩＶ−１の付着から区別される。付着は、融合コレセプターではないヒトＣＤ４レセプターに対するＨＩＶ−１外部糖タンパク質の結合によって媒介される。
【００３０】
ここで用いる「遅延する」は、量が低下することを意味する。ここで用いる「付着」は、融合コレセプターではないヒトＣＤ４レセプターに対するＨＩＶ−１糖タンパク質の結合によって媒介されるプロセスを意味する。ここで用いる「ＣＤ４」は、細胞質ドメイン、疎水性のまく貫通ドメイン、およびＨＩＶ−１ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質に結合する細胞外ドメインを含んでなる、成熟した天然の膜結合ＣＤ４タンパク質を意味する。
【００３１】
ここで用いる「エピトープ」は、抗体または他の化合物に結合するための表面を形成する分子の一部を意味する。該エピトープは、隣接もしくは非隣接のアミノ酸、糖鎖、または他の非ペプチド部分、またはオリゴマー特異的な表面を含み得る。
【００３２】
本発明の化合物類は、相乗的効果を示すことが立証されている。ここで用いる「相乗的」は、組合わせて使用したときの化合物類の組合せ効果が、それらを個別に使用したときの効果の合算よりも大きいことを意味する。
【００３３】
本発明の組成物の一つの実施例において、ＣＤ４＋細胞表面上のＣＤ４へのＨＩＶ−１・ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質の結合を遅延させることによりＨＩＶ−１のＣＤ４＋細胞への付着を遅延させる化合物は、ＣＤ４に基づくタンパク質である。
【００３４】
ここで用いる「ＣＤ４に基づくタンパク質」は、ＣＤ４がＨＩＶ−１・ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質との複合体を形成するために必要なＣＤ４の部分に対応したアミノ酸残基の少なくとも一つの配列を含む何れかのタンパク質を意味する。
【００３５】
一つの実施例において、前記ＣＤ４に基づくタンパク質は、ＣＤ４−免疫グロブリン融合タンパク質である。一つの実施例において、このＣＤ４−免疫グロブリン融合タンパク質は二つの重鎖および二つの軽鎖を含んでなるＣＤ４−ＩｇＧ２であり、該重鎖はＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ受付け番号７５１９３）と称する発現ベクターによってコードされ、前記軽鎖はＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ受付け番号７５１９４）と称する発現ベクターによってコード化される。また、ここで用いるＣＤ４−ＩｇＧ２は、ＰＲＯ５４２とも称される。
【００３６】
本発明の組成物の一つの実施例において、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４に結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１のＣＤ４＋細胞への付着を遅延させる前記化合物はタンパク質であり、そのアミノ酸配列はエンベロープ糖タンパク質としてＨＩＶ−１中に存在する配列を含む。一つの実施例において、前記タンパク質は前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４のエピトープに結合する。一つの実施例において、前記エンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０およびｇｐ１４０からなる群から選択される。
【００３７】
本発明の組成物の一つの実施例において、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４に結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１が前記ＣＤ４＋細胞に付着するのを遅延させる前記化合物は、抗体または抗体の一部である。一つの実施例において、前記抗体はモノクローナル抗体である。一つの実施例において、前記モノクローナル抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。一つの実施例において、前記抗体の一部は前記抗体のＦａｂ断片である。一つの実施例において、前記抗体の一部は前記抗体の可変ドメインを含む。一つの実施例において、前記抗体の一部は前記抗体のＣＤＲ部を含む。一つの実施例において、前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥモノクローナル抗体である。
【００３８】
ここで用いる「抗体」は、二つの重鎖および二つの軽鎖を含み、且つ抗原を認識する免疫グロブリン分子を意味する。この免疫グロブリン分子は通常知られている分類の何れから誘導されたものでもよく、ＩｇＡ、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭが含まれるが、これらに限定されない。ＩｇＧサブクラスもまた当業者に周知であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない。それは、例えば天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両者を含む。より詳細に言えば、「抗体」はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、並びにそれらの一価断片および二価断片を含む。更に、「抗体」はキメラ抗体、全合成抗体、単鎖抗体、およびそれらの断片を含む。該抗体は、ヒト抗体または非ヒト抗体であってよい。非ヒト抗体は、人間におけるその抗原性を低下させるために、組換え法によってヒト化してもよい。抗体をヒト化するための方法は、当業者に既知である。
【００３９】
本発明は、上記抗体のヒト化形態を提供する。ここで用いる「ヒト化された」は、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の殆どまたは全部が、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を意味する。ヒト化形態の抗体の一つの実施例においては、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の殆どもしくは全部が、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換されるが、一以上のＣＤＲ領域内の殆どもしくは全部のアミノ酸は変化されない。アミノ酸の小さい付加、欠失、挿入、置換、または改変は、それによって所定の抗原に結合する抗体の能力が排除されない限り許容される。適切なヒト免疫グロブリン分子には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭ分子が含まれる。「ヒト化された」抗体は元の抗体と同じ抗原特異性、即ち、本発明においてはＣＣＲ５に結合する能力を保持するであろう。
【００４０】
当業者は、本発明のヒト化抗体を作製する方法を知っているであろう。種々の刊行物（その幾つかは本明細書の一部として本願に援用される）もまた、ヒト化交代を作製する方法を記載している。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（５８）に記載されている方法は、一つの抗体の可変領域およびもう一つの抗体の定常領域を有するキメラ抗体の製造を含んでいる。
【００４１】
米国特許第５，２２５，５３９号は、ヒト化抗体を製造するためのもう一つのアプローチを記載している。この特許は、ヒト化抗体を製造するための組換えＤＮＡ技術の使用を記載しており、ここでは一つの免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲを、異なる特異性をもった免疫グロブリン由来のＣＤＲで置換して、ヒト化抗体が所望の標的を認識するが、ヒト患者の免疫系によって有意に認識されないようにしている。即ち、部位特異的突然変異誘発を使用して、ＣＤＲをフレームワークにグラフトする。
【００４２】
抗体をヒト化する他のアプローチは、ヒト化された免疫グロブリンを製造する方法を記載した、米国特許第５，５８５，０８９号（６０）および同第５，６９３，７６１号（６１）、並びにＷＯ ９０／０７８６１号に記載されている。これらは、ドナー免疫グロブリン由来の一以上のＣＤＲおよび可能な追加のアミノ酸、並びに受容側のヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域を有している。これらの特許は、所望の抗原に対する抗体の親和性を増大させる方法を記載している。フレームワークにおける幾つかのアミノ酸は、アクセプターではなく、ドナーにおけるこれら位置でのアミノ酸と同じになるように選ばれる。詳細に言えば、これらの特許は、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲをヒト免疫グロブリンのフレームワークおよび定常領域と組合せることによって、レセプターに結合するヒト化抗体を調製すること記載している。ヒトフレームワーク領域は、マウス配列との相同性を最大にするように選択することができる。コンピュータモデルを使用して、ＣＤＲまたは特異的な抗原と相互作用し易いフレームワーク領域のアミノ酸を同定し、次いでこれらの位置にマウスのアミノ酸を使用して、ヒト化抗体を作製することができる。
【００４３】
上記特許５，５８５，０８９号およびＷＯ ９０／０７８６１（６０）もまた、ヒト化抗体の設計に使用し得る四つの可能な基準を提案している。第一の提案は、アクセプターについて、ヒト化すべきドナー免疫グロブリンに対して著しく相同的な、特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用することであった。第二の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が異常で、且つその位置でのドナーアミノ酸がヒト配列について典型的であれば、アクセプターではなくドナーのアミノ酸を選択し得ることであった。第三の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖の３つのＣＤＲに直接隣接した位置において、アクセプターのアミノ酸ではなくドナーのアミノ酸を選択し得ることであった。第四の提案は、アミノ酸が抗体の三次元モデルにおいてＣＤＲの３Å以内に側鎖原子を有すると推定され、且つＣＤＲと相互作用できると推定されるフレームワーク位置において、ドナーアミノ酸残基を使用することであった。上記の方法は、当業者がヒト化抗体を作製するために用い得る幾つかの方法を単に例示するものに過ぎない。
【００４４】
一つの実施例において、当該モノクローナル抗体はＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質に結合する。一つの実施例において、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質は、ｇｐ１２０およびｇｐ１６０から選択される。
【００４５】
一つの実施例において、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質はｇｐ１２０であり、ｇｐ１２０に結合するモノクローナル抗体はＩｇＧ１ｂ１２またはＦ１０５である。ＩｇＧ１ｂ１２は、ＮＩＨ・ＡＩＤＳ研究および参照試薬計画カタログ（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｃａｔａｌｏｇ）の項目＃２６４０に記載されている。Ｆ１０５は、ＮＩＨ・ＡＩＤＳ研究および参照試薬計画カタログの項目＃２６４０に記載されている。
【００４６】
一つの実施例において、当該抗体は、ＣＤ４＋細胞表面上のＣＤ４のエピトープに結合する。
【００４７】
本発明の組成物の一つの実施例において、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、前記ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ−１の付着を遅延させる化合物はペプチドである。本発明の組成物の一つの実施例において、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、前記ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ−１の付着を遅延させる化合物は非ペプチド物質である。ここで用いる「非ペプチド」は、該物質が、その全体が、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の線形配列からなるものでないことを意味する。しかし、非ペプチド物質は、一以上のペプチド結合を含んでいてもよい。
【００４８】
本発明の組成物の一つの実施例において、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させる化合物は、抗体である。一つの実施例において、該抗体はモノクローナル抗体である。一つの実施例において、該抗体はポリクローナル抗体である。
【００４９】
本発明の組成物の一つの実施例において、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することにより、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させる化合物は、ペプチドである。
【００５０】
本発明の組成物の一つの実施例において、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することにより、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる前記化合物は、Ｔ−２０（配列番号：１）、ＤＰ１０７（配列番号：２）、Ｎ３４（配列番号：３）、Ｃ２８（配列番号：４）、およびＮ３４（Ｌ６）Ｃ２８（配列番号：５）からなる群から選択されるペプチドを含む融合タンパク質である。一つの実施例において、該ペプチドは、Ｔ−２０（配列番号：１）、ＤＰ１０７（配列番号：２）、Ｎ３４（配列番号：３）、Ｃ２８（配列番号：４）、Ｎ３４（Ｌ６）Ｃ２８（配列番号：５）、およびＴ−１２４９（配列番号：６）からなる群から選択される。一つの実施例において、該ペプチドはＴ−２０（配列番号：１）である。
【００５１】
ここで用いる「Ｔ−２０」および「ＤＰ１７８」は、次のアミノ酸配列、即ち、記載されている通り［２９、３２］、ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ（配列番号：１）のアミノ酸配列を有するペプチドを指称するために互換的に用いられる。ＤＰ１０７は、下記のアミノ酸配列を有する：ＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫＤＱ（配列番号：２）。Ｎ３４は下記のアミノ酸配列を有する：ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲ（配列番号：３）。Ｃ２８は以下のアミノ酸配列を有する：ＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫ（配列番号：４）。Ｎ３４（Ｌ６）Ｃ２８は、下記のアミノ酸配列を有する：ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＳＧＧＲＧＧＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫ（配列番号：５）。Ｔ−１２４９は、下記のアミノ酸配列を有する：ＷＱＥＷＥＱＫＩＴＡＬＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＥＹＥＬＱＫＬＤＫＷＡＳＬＷＥＷＦ（配列番号：６）。
【００５２】
ここに記載した組成物の一つの実施例において、前記ペプチドは、（１）該ペプチドの５’末端、３’末端または両末端に対する少なくとも一つのグリシン残基が追加されていることを除き、Ｔ−２０（配列番号：１）、ＤＰ１０７（配列番号：２）、Ｎ３４（配列番号：３）、Ｃ２８（配列番号：４）、Ｎ３４（Ｌ６）Ｃ２８（配列番号：５）、およびＴ−１２４９（配列番号：６）からなる群から選択される野生型ペプチドの配列と同一の配列を有するアミノ酸からなり、且つ（２）ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる変異体ペプチドである。
【００５３】
一つの実施例において、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる前記化合物は、Ｔ−２０（配列番号：１）、ＤＰ１０７（配列番号：２）、Ｎ３４（配列番号：３）、Ｃ２８（配列番号：４）、Ｎ３４（Ｌ６）Ｃ２８（配列番号：５）、およびＴ−１２４９（配列番号：６）からなる群から選択されるペプチドを含む融合タンパク質である。
【００５４】
ここに記載する組成物の一つの実施例において、前記ペプチドは、Ｔ−２０（配列番号：１）、ＤＰ１０７（配列番号：２）、Ｎ３４（配列番号：３）、Ｃ２８（配列番号：４）、Ｎ３４（Ｌ６）Ｃ２８（配列番号：５）、およびＴ−１２４９（配列番号：６）からなる群から選択される。
【００５５】
ここに記載する組成物の一つの実施例において、前記ペプチドはＴ−２０（配列番号：１）である。ここに記載する組成物の一つの実施例において、前記ペプチドはＴ−１２４９（配列番号：６）である。
【００５６】
本発明の一つの実施例において、ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる化合物は、非ペプチド物質である。
【００５７】
一つの実施例において、本発明の非ペプチド物質は小分子である。一つの実施例において、前記非ペプチド物質は、５００ダルトン未満の分子量を有する化合物である。
【００５８】
本発明の組成物の一つの実施例において、ＣＣＲ５レセプターに結合する抗体には、ＰＡ８（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６０５）、ＰＡ１０（ＡＴＣＣ受付け番号１２６０７）、ＰＡ１１（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６０８）、ＰＡ１２（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６０９）、およびＰＡ１４（ＡＴＣＣ受付け番号ＨＢ−１２６１０）が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施例において、前記抗体はモノクローナル抗体である。一つの実施例において、該モノクローナル抗体はヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。一つの実施例において、前記抗体の一部は該抗体のＦａｂ断片である。一つの実施例において、前記抗体の一部は、該抗体の可変ドメインを含んでいる。一つの実施例において、前記抗体の一部は該抗体のＣＤＲ部分を含んでいる。一つの実施例において、前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥモノクローナル抗体である。
【００５９】
本発明の組成物の一つの実施例において、前記混合物における各化合物の相対的質量比は、約２５：１〜約１：１で変動する。一つの実施例において、該質量比は約２５：１である。一つの実施例において、該質量比は約５：１である。一つの実施例において、該質量比は約１：１である。
【００６０】
本発明の組成物の一つの実施例において、該組成物はキャリアと混合される。本発明のキャリアには、エアロゾルキャリア、静脈内キャリア、経口キャリアまたは局所キャリアが含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能なキャリアは当業者に周知である。このような薬学的に許容可能なキャリアには、水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれるが、これらに限定されない。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、オイレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性キャリアには、水、アルコール／水溶液、エマルジョンもしくは懸濁液、塩水および緩衝媒体が含まれる。非経腸的担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲル氏ブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム溶液、乳酸添加リンゲル氏液または固定油が含まれる。静脈注射用担体には、液体および栄養補給剤、リンゲル氏ブドウ糖液に基づくもののような電解質補充剤などが含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどのような、保存剤および他の添加剤を存在させてもよい。
【００６１】
本発明は、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染阻害に効果的な本発明の組成物のある量と接触させることを含み、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法を提供する。
【００６２】
一つの実施例において、前記ＣＤ４＋細胞は対象の中に存在し、前記接触は該対象に前記組成物を投与することにより行われる。
【００６３】
ここで用いる「対象」は、ＨＩＶに感染するに至ることができる如何なる動物または人工的に改変された動物をも含む。人工的に改変された動物には、ヒト免疫系を備えたＳＣＩＤマウスが含まれるが、これに限定されない。動物にはマウス、ラット、イヌ、ネコ、モルモット、イタチ、ウサギ、および霊長類が含まれるが、これらに限定されない。一つの好ましい実施例において、この対象はヒトである。
【００６４】
ここで用いる「投与する」は、当業者に既知の如何なる方法を使用して実施または行ってもよく、これには病巣内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、リポソーム媒介送達、経粘膜投与、腸投与、局所投与、鼻内投与、経口投与、肛門内投与、癌内投与、または耳内投与が含まれる。本発明の化合物類は、対象において相乗的な有効量で組合されるように、別々に投与してもよい（例えば、異なる投与経路、注射部位または投与スケジュールによる）。
【００６５】
本発明の組成物の投与量は、対象および特定の投与経路に応じて変化するであろう。投与量は、０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇで変化することができる。組成に基づいて、投与量は、例えば連続ポンプにより連続的に送達してもよく、または周期的な間隔で送達してもよい。例えば、一以上の別々の機会に送達してもよい。特定の組成物を複数回投与する望ましい時間間隔は、当業者によって、過度の実験を伴わずに決定することができる。
【００６６】
ここで用いる「有効投与量」は、対象を治療し、または対象がＨＩＶ−１に感染するに至るのを予防するために十分な量を意味する。当業者は、単純な滴定実験を行って、対象を治療するために如何なる量が必要であるかを決定することができる。
【００６７】
一つの実施例において、該組成物の有効量は、前記対象の体重量当たり約０．０００００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇである。
【００６８】
本発明は、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、（１）ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体のある量、および（２）ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することにより、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採るのを遅延させる化合物のある量と接触させることを含み、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法を提供する。
【００６９】
本発明は、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、（１）ＣＣＲ５のレセプターに結合する抗体のある量、（２）ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１の前記ＣＤ４＋細胞への付着を遅延させる化合物の、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染阻害に効果的な量、および（３）ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる化合物のある量と接触させることを含み、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法を提供する。
【００７０】
本発明は、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法であって、前記ＣＤ４＋細胞を、（１）ＨＩＶ−１のｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質が前記ＣＤ４＋細胞表面のＣＤ４へ結合するのを遅延させることによって、ＨＩＶ−１の前記ＣＤ４＋細胞への付着を遅延させる化合物の、前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染阻害に効果的な量、および（２）ｇｐ４１融合中間体上のエピトープに非共有的に結合することによって、ｇｐ４１がＨＩＶ−１とＣＤ４＋細胞との融合を仲介できるコンフォメーションを採ることを遅延させる化合物のある量と接触させることを含み、それによって前記ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ−１感染を阻害する方法を提供する。
【００７１】
一つの実施例において、前記ＣＤ４＋細胞は対象中に存在し、前記接触は前記組成物を該対象に投与することによって行われる。一つの実施例において、前記複数の化合物は前記対象に同時に投与される。一つの実施例において、前記複数の化合物は前記対象に異なる時点で投与される。一つの実施例において、前記複数の化合物は前記対象に異なる投与経路で投与される。
【００７２】
本発明は種々の応用を有しており、これにはＨＩＶに冒されるに至った対象を治療するような、ＨＩＶ治療が含まれる。ここで用いる「ＨＩＶ−１に冒される」とは、対象がＨＩＶ−１に感染した少なくとも一つの細胞を有することを意味する。ここで用いる「治療する」とは、ＨＩＶ−１障害の進行を遅延させ、停止させ、または反転させることを意味する。一つの実施例において、「治療する」とは、障害を排除する点まで進行を反転させることを意味する。ここで用いる「治療する」とは、ウイルス感染の数の減少、感染性ウイルス粒子の数の減少、ウイルス感染細胞の数の減少、またはＨＩＶ−１に関連した症状の寛解をも意味する。本発明のもう一つの応用は、対象がＨＩＶに罹患するのを防止することである。ここで用いる「罹患する」とは、ＨＩＶ−１に感染するに至り、その遺伝子情報がホスト細胞の中で複製され、および／またはホスト細胞に組み込まれることを意味する。本発明のもう一つの応用は、ＨＩＶ−１に感染するに至った対象を治療することである。ここで用いる「ＨＩＶ−１感染」とは、例えば標的細胞膜とＨＩＶ−１またはＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質＋細胞との融合による、標的細胞へのＨＩＶ−１遺伝子情報の導入を意味する。この標的細胞は、対象の体細胞であってよい。好ましい実施例において、該標的細胞はヒト対象由来の体細胞である。本発明のもう一つの応用は、ＨＩＶ−１感染を阻害することである。ここで用いる「ＨＩＶ−１感染を阻害する」とは、標的細胞ポピュレーションの中に導入されたＨＩＶ−１遺伝子情報の量を、本発明の組成物を投与せずに導入された量と比較して減少させることを意味する。
【００７３】
本発明は、以下の実験の詳細から更に良く理解されるであろう。しかし、当業者は、そこで述べられる特定の方法および結果が、特許請求の範囲により完全に記載された本発明の単なる例示に過ぎないことを容易に理解するであろう。
【００７４】
【実験の詳細】
＜第１シリーズの実験＞
Ａ．材料と方法
１）試薬
精製組み換えＣＤ４−ＩｇＧ２タンパク質は、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ株式会社によって、プラスミドＣＤ４−ＩｇＧ２−ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶおよびＣＤ４−ＫＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（各ＡＴＣＣ受付番号、７５１９３および７５１９４）から、［５］に記載のとおりに製造した。ＨｅＬａ−ｅｎｖ細胞は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０／ｇｐ４１ ｅｎｖ発現プラスミドｐＭＡ２４３を、［５１］の記載のとおりにＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号＃ＣＣＬ−２）に形質転換して調製した。ＰＭ１細胞はアメリカ国立衛生研究所ＡＩＤＳ試薬プログラム（カタログ番号＃３０３８）から入手可能である。Ｔ−２０ペプチドは、標準固相Ｆｏｍｃ化学を使用して合成し、［３１、３２］に記載のとおりに精製し、特性を決定する。
【００７５】
２）ＨＩＶ−１のｅｎｖに媒介される膜融合の阻害
ＨＩＶ−１のエンベロープに媒介された、ＨｅＬａ−ＥｎｖＪＲ−ＦＬとＰＭ１細胞の融合は、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）分析を用いて検出した。フルオレセインオクタデシルエステル（Ｆ１８）でラベルされたエンベロープ発現細胞およびオクタデシルローダミン（Ｒ１８）でラベルされたＰＭ１細胞の同数（２ｘ１０４）を、９６穴プレート中のウシ胎児血清１５％含有リン酸緩衝生理食塩水に蒔き、様々な濃度のＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０またはそれらの組み合わせの存在下で、３７℃で４時間インキュベートした。蛍光ＲＥＴは細胞蛍光プレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定し、％ＲＥＴは以前に記載したとおりに決定した［１９］。
【００７６】
３）薬剤の組み合わせによる相乗効果、相加効果、または拮抗効果の定量解析
ＨＩＶ−１阻害データは、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｙの組合せ指数法［５２，５３］に従って解析した。そのデータは次式で記述できる半有効原理（ｍｅｄｉａｎ−ｅｆｆｅｃｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に従ってモデル化する。
【００７７】
【数１】
2004518624.tif 000002
ここで、ｆは阻害に対する発症の割合、ｃは濃度、Ｋは半有効値を生じるために必要な薬剤の濃度、およびｍは投与量応答曲線の形を表す経験的な係数である。等式（１）は、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎの酵素速度論、ラングミュア吸着等温式、およびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈのイオン化平衡の一般的な形であり、全ての場合でｍ＝１である。本件では、ＫはＩＣ５０値と等しい。Ｋおよびｍは、投与量応答曲線のカーブフィッティングによって決定する。
【００７８】
実験薬剤およびそれらの組み合わせについて、Ｋおよびｍの最適なパラメーターが得られた後、所定のｆについてのｃを計算するために、等式（１）を再編する。得られた値の表（例えば図Ｘ）は、等式
【数２】
2004518624.tif 000003
を用いて組合せ指数（ＣＩ）を計算するために使われる。ここで、
ｃ１は単独で使われた場合の化合物１の濃度
ｃ２は単独で使われた場合の化合物２の濃度
ｃ１ｍは混合で使われた場合の化合物１の濃度
ｃ２ｍは混合で使われた場合の化合物２の濃度
全ての濃度は、所定の程度の阻害を達成するために必要な濃度である。等式（２）は分子が相互に非排他的である場合、即ち異なる活動サイトを有する場合に使用される。これはＨＩＶ−１の結合およびｇｐ４１の融合中間体を阻害するためにあり得るシナリオなので、等式（２）は全ての組合せ指数を計算するために使用した。相互に非排他的な計算は、ｃ１ｍｃ２ｍ／ｃ１ｃ２項が省略される相互に排他的な計算よりも、相乗効果の程度のより保存された評価を提供する。ＣＩ＜１は相乗効果を示し、ＣＩ＝１は純粋に相加的な効果を示し、ＣＩ＞１は拮抗作用を示す。通常、ＣＩ値は、測定可能な臨床上の利益を達成するために必要な高レベルの阻害に最も関連する。
【００７９】
Ｂ．結果と考察
ＨＩＶ−１付着の阻害剤およびｇｐ４１の融合中間体の阻害剤の組み合わせは、最初にＲＥＴ分析において、ＨＩＶ−１のｅｎｖを媒介とした膜融合の阻害能力について試験した。この分析は、ＨＩＶ−１侵入プロセスの高い成功モデルであることが証明されている。この分析は、ｅｎｖ依存性コレセプター使用パターンおよび親ウイルスの細胞屈性を精確に再現する［１９］。実際、この分析は、ＣＣＲ５が必要な融合コレセプターとして機能することと、ウイルス侵入のレベルで作用することを示すのに役立つ［５４］。融合分析および感染性ウイルスは、金属キレート剤、並びにウイルスおよび細胞レセプターの完全な補体をターゲッティングする薬剤による阻害に対して同様に感受性である［１９、４６、５５］。
【００８０】
個別に使用された薬剤および組み合わせて使われた薬剤についての両方の分析から、投与量応答曲線を得た。データは、半有効原理（ｍｅｄｉａｎ−ｅｆｆｅｃｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）を用いて解析した［５２，５３］。単独で使用した薬剤の濃度、または所定の効果を生じるるために要求されるそれらの混合物は、組合せ指数（ＣＩ）として知られる項目で定量的に比較される。ＣＩ＞１は拮抗作用を示し、ＣＩ＝１は純粋に加算効果を示し、ＣＩ＜１は、一つの薬剤の存在がもう一つの薬剤の効果を増強する相乗効果を示す。
【００８１】
ＣＤ４−ＩｇＧ２およびＴ−２０の組み合わせは、ｅｎｖ媒介膜融合の阻害に強力な相乗作用をもたらす。図１は、ＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０、およびその二つの組み合わせの膜融合分析で得られたそれぞれの投与量応答曲線を示す。組み合わせの曲線は、阻害剤濃度が低い方で高く表示され、相乗的な挙動におけるＣＤ４−ＩｇＧ２およびＴ−２０の作用の定量的な証拠を提供している。
【００８２】
観察されたＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０の相乗効果の程度を定量的に計算するために、我々は組合せ指数法［５２，５３］に従って投与量応答曲線を解析した。その解析は、ＣＤ４−ＩｇＧ２：Ｔ−２０の質量比が２５：１、５：１、および１：１のとき得られたデータを含めた。質量比が２５：１のとき、高濃度（０〜２５０μｇ／ｍｌ  ＣＤ４−ＩｇＧ２および０〜１０μｇ／ｍｌ  Ｔ−２０）および低濃度（０〜５０μｇ／ｍｌ  ＣＤ４−ＩｇＧ２および０〜２μｇ／ｍｌ  Ｔ−２０）の両方を評価した。図２に示したとおり、これらの範囲の阻害剤比率および濃度において強力な相乗効果が観察され、ＣＩ値は最適条件下で０．２０と低かった。０．２のＣＩ値は、抗ＨＩＶ−１抗体［４１−４４］、逆転写酵素阻害剤［５６］、またはプロテアーゼ阻害剤［５７］を含んだ組合わせによってはめったに得られないので、この相乗効果の程度は顕著なものである。この観察された相乗効果は、ＨＩＶ−１の結合と、ｇｐ４１融合中間体の形成とが相互依存的なステップであることを示す。一つの可能性として、付着阻害剤は、最適未満の濃度で使われたときには、ｇｐ１２０とＣＤ４の結合を遅延させるが排除はしないかもしれない。この場合、ｇｐ４１融合中間体が形成されて、膜融合に必要とされるよりも下のレベルで長期間ウイスル上で（または感染細胞上で）持続する可能性があり、それゆえ阻害剤のよい標的を提供する。
【００８３】
観察された相乗効果は、阻害に必要なＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０の量を大いに減少する。質量比２５：１で、ＣＤ４−ＩｇＧ２およびＴ−２０を使用したときの減少を図３に示す。この場合、ウイルス侵入を９５％まで阻害するためには、Ｔ−２０単独では０．２１μｇ／ｍｌ、ＣＤ４−ＩｇＧ２単独では１９μｇ／ｍｌ、それらを組み合わせた場合はＴ−２０が０．０４４μｇ／ｍｌおよびＣＤ４−ＩｇＧ２が１．１μｇ／ｍｌで、合計１．１４μｇ／ｍｌが必要である。組み合わせることによって、Ｔ−２０およびＣＤ４−ＩｇＧ２の投与量はそれぞれ５倍および１７倍減少する。より高レベルの阻害剤によって、さらに大きな投与量の減少が得られる。
【００８４】
［第２の実験系］
ＨＩＶ−１の侵入は少なくとも３つの連続するカスケード事象で進行する。即ち、（１）ＨＩＶ−１表面糖タンパク質ｇｐ１２０と、ＨＩＶ−１の主要な細胞レセプターであるＣＤ４の結合；（２）ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４のような膜融合性コレセプターと、ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体との相互作用。（３）ＨＩＶ−１膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１に媒介された膜融合。ＰＲＯ５４２（ＣＤ４−ＩｇＧ２）はｇｐ１２０に結合することにより、ウイルスがＣＤ４を介して宿主細胞に結合することを阻害する抗体様分子である。ＰＲＯ１４０（ＰＡ１４）およびＰＡ１２はＣＣＲ５に対するモノクローナル抗体であり、ＣＣＲ５のＨＩＶ−１コレセプターとしての機能をブロックする。最後に、Ｔ−２０はｇｐ４１の高度に保存されたＣ−末端外部ドメインに由来する３６ｍｅｒのペプチドである。Ｔ−２０は、ｇｐ４１が媒介する膜融合事象をブロックする。従って、ＰＲＯ５４２は、ＨＩＶ−１の侵入の第１の工程をブロックする付着阻害剤である。ＰＲＯ１４０およびＰＡ１２はともに、第２の工程をブロックするＣＣＲ５コレセプター阻害剤である。そして、Ｔ−２０は第３の工程をブロックする融合阻害剤である。付着阻害剤、コレセプター阻害剤および融合阻害剤はすべて、ＨＩＶ−１侵入阻害剤として知られている抗ウイルス物質集団の広義のカテゴリーのメンバーである。ＣＣＲ５コレセプター阻害剤およびＣＸＣＲ４コレセプター阻害剤は、コレセプター阻害剤の二つの異なるサブクラスを構成する。
【００８５】
個別に使用した場合、これらの化合物のそれぞれはＨＩＶ−１のインビトロでの感染を阻害する。ＰＲＯ５４２とＴ−２０は両方とも、ヒト臨床試験で個々に使用された場合でも重大な抗ウイルス活性を示し（１，２）、ＨＩＶ−１侵入の阻害剤の臨床的な概念検証を与えた。
【００８６】
ＨＩＶ−１侵入の多段階的かつ相互依存的な性質は、侵入阻害剤の組み合わせが、抗ウイルス効果を増加する（相乗的）かまたは減少する（拮抗する）非相加的または協同的な方法で作用し得ることを示唆する。ＣＣＲ５コレセプター阻害剤とともに付着阻害剤を使用すること、融合阻害剤とともに付着阻害剤を使用すること、他のＣＣＲ５コレセプター阻害剤とともにＣＣＲ５コレセプター阻害剤を使用すること、融合阻害剤とともにＣＸＣＲ４コレセプター阻害剤を使用することを含む、侵入阻害剤のある２種類の組み合わせによって、顕著な相乗効果が得られた。
【００８７】
しかしながら、阻害剤の任意のクラスのあるメンバーについては相乗効果が得られる一方で、同じクラスの他のメンバーを使用したとき（３）には、純粋に相加的な効果または拮抗的な効果も見られることがあり、これはＨＩＶ−１侵入のプロセスの複雑さと、相乗的な組み合わせを予測する困難性を強調している。ＨＩＶ−１阻害剤の三つのクラスのメンバーに含まれる、ＣＣＲ５コレセプター阻害剤と融合阻害剤の２種の組み合わせ、あるいは３種または４種の組み合わせは、以前の研究では試験されていない。図４Ｄに示したように、我々は、ＣＣＲ５コレセプター阻害剤ＰＲＯ１４０を融合阻害剤Ｔ−２０と合わせて使用し、ＨＩＶ−１の相乗的な阻害が得られることを発見した。加えて、図４Ａ−４Ｃ、および図５に示したように、付着阻害剤（ＰＲＯ５４２）、ＣＣＲ５コレセプター阻害剤（ＰＲＯ１４０またはＰＡ１２のいずれか）および融合阻害剤（Ｔ−２０）を含む３種の組み合わせを使用して、著しい相乗効果が観察された。この３種の組み合わせで観察された相乗効果は驚くほど効能があり、投与減少範囲を２６０倍にする。
【００８８】
＜第１シリーズの実験のための参考文献＞
【００８９】
【参考文献１】
2004518624.tif 000004
2004518624.tif 000005
2004518624.tif 000006
2004518624.tif 000007
2004518624.tif 000008
2004518624.tif 000009
2004518624.tif 000010
2004518624.tif 000011
2004518624.tif 000012
2004518624.tif 000013
2004518624.tif 000014
＜第２シリーズの実験＞
ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）による細胞の感染は、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）糖タンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１によって媒介され、これら糖タンパク質は、非共有結合性のオリゴマー複合体としてウイルスおよびウイルス感染細胞の表面で発現する。標的細胞に侵入したＨＩＶ−１は、（１）ＨＩＶ−１の主要なレセプターである細胞表面のＣＤ４に、ウイルス表面の糖タンパク質ｇｐ１２０が結合すること、（２）ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４のような融合コレセプターにｅｎｖが結合すること、（３）ｇｐ４１のコンフォメーションが多様に変化することを含むカスケード事象を通じて、細胞表面において進行する。融合に際して、ｇｐ４１は、最終的に融合を媒介できるコンフォメーションに折り畳まれるプレヘアピン融合中間体を含む一時的なコンフォメーションを採る。これらの事象は、ウイルスおよび細胞の膜の融合、並びにその後のウイルスゲノムの標的細胞への導入に至る。感染した細胞と感染していない細胞の融合を経由する感染の拡散には、同様の分子的事象の連鎖が必要である。ウイルス侵入プロセスのそれぞれの過程が、治療的介入の対象となりうる。
【００９０】
ＨＩＶ−１の付着は、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質と結合する物質によって、また、ヒトＣＤ４に結合する物質によって阻害することが出来る。特に、ＨＩＶ−１の付着は、ｇｐ１２０が結合するヒトＣＤ４のドメインを組み入れた化合物と、それを分子的に擬態した化合物によって阻害することができる［１−７］。このｇｐ１２０とＣＤ４の相互作用はウイルスの感染に不可欠なので、ＣＤ４を基にした分子は、全てではないがほとんどのＨＩＶ−１の株をターゲッティングできる可能性を有する。加えて、そのような分子に対する耐性を生じるウイルスの能力は限られている。
【００９１】
ｇｐ１２０の結合を決定する要因は、ＣＤ４上の第１の細胞外ドメイン（Ｄ１）に位置しており、結合に重要なアミノ酸は、３６−４７のアミノ酸を含むループの中央に位置している。強力なＨＩＶ−１阻害活性は、このループとその周辺の組織を擬態した２７のアミノ酸ペプチドで再現されている［７］。
【００９２】
ＣＤ４を基にした分子の幾つかの組み換え体が開発され、ヒトで臨床活性が試験されている。これらのうち最初のものは、ＣＤ４の４つの細胞外ドメイン（Ｄ１−Ｄ４）を含んでいたが、膜貫通領域および細胞内領域を欠いていた。この分子は、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）と称され、１０ｍｇ／ｋｇの投薬範囲でヒトに投与された時に優れた耐性を示した［８，９］。ｓＣＤ４で治療した一定の患者に、感染力を持つＨＩＶ−１の血漿レベルの一時的な減少が観察された。ヒトの体内においてｓＣＤ４の半減期が短いことが（静脈内投与後４５分）、この物質を長期の治療に使用することの一つの障害であると認識された。
【００９３】
血清中の半減期を伸ばした、第２世代のＣＤ４に基づくタンパク質が開発された。これらのＣＤ４−免疫グロブリン融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ分子のヒンジＣＨ２およびＣＨ３領域に遺伝的に融合された、ＣＤ４のＤ１Ｄ２ドメインを含んでいた。これら二価のタンパク質は、それらのＣＤ４ドメインからはＨＩＶ−１中和能力を、そのＩｇＧ分子からはＦｃエフェクター機能を引き出す。ＣＤ４−ＩｇＧ１融合タンパク質は優れた耐性を有し、フェーズＩの臨床試験において薬物動態が改良されたことが示された［１０］。その抗ウイルス評価は確定されていない。
【００９４】
さらに最近になって、ヒトＩｇＧ２の軽鎖および重鎖の定常領域に遺伝的に融合された、ＣＤ４のＤ１Ｄ２ドメインを備えた第３世代の４価ＣＤ４−ＩｇＧ２融合タンパク質が開発された。この物質は、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０にナノモルの親和力［５］で結合してレセプターを妨害することによって、また、ｇｐ１２０をビリオン表面から引き離すことによってウイルスの結合を阻害することができ、それによってウイルスを不可逆的に不活性化する。標準的なＰＢＭＣに基づいた中和分析において、ＣＤ４−ＩｇＧ２は、すべての主要なサブタイプおよびアウトライアーグループに由来する一次ＨＩＶ−１分離株を中和した。ウイスルの感染力を９０％減少させるのに必要なＣＤ４−ＩｇＧ２濃度、即ちインビトロＩＣ９０は、おおよそ１５−２０μｇ／ｍｌ［１１］であり、インビボで容易に達成可能な濃度である。ＣＤ４−ＩｇＧ２は、エキソビボ分析で血清陽性であるドナーのプラスマから直接得られたＨＩＶ−１の中和において同様に有効であり、この物質が、臨床で遭遇するさまざまなウイルスの準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）に対して活性であることを示した［１２］。ＣＤ４−ＩｇＧ２はまた、ＨＩＶ−１感染ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいて、初期の分離株による感染を予防した［１３］。最近の分析では、一次ウイルスを中和するＣＤ４−ＩｇＧ２の能力が、それらがコレセプターを使用することに依存しないことが示されている［１４］。
【００９５】
ＣＤ４に基づいた一価または二価のタンパク質と比較して、ＣＤ４−ＩｇＧ２は、一次ＨＩＶ−１分離株の阻害において１００倍大きい有効性を一貫して示している［５，１２，１４，１５］。効能の増強は、ＣＤ４−ＩｇＧ２の増加された結合価／結合活性を用いてビリオンと結合する能力と、免疫グロブリン分子の各Ｆａｂ様アームにおける二つのｇｐ１２０結合サイトとの立体的近位に由来する。ＣＤ４−ＩｇＧ２のより大きいＦａｂ様アームは、ビリオン上のＨＩＶ−１エンベロープスパイクにまでおよぶ可能性が高い。さまざまな症状発現前のモデルにおいて、ＣＤ４−ＩｇＧ２の抗ＨＩＶ−１活性は、一次ＨＩＶ−１分離株を広く強力に中和する稀なヒトモノクローナル抗体に都合よく匹敵することが示された［５，１１，１４，１５］。加えて、ＣＤ４−ＩｇＧ２療法は、原理的に、抗ｅｎｖモノクローナル抗体または高度に変異し易いＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を使った治療に比べて、ウイルスの薬物耐性の発生に対する感受性が小さい。これらの特性は、細胞と結合していないウイルスが新しい感染経路を確立する機会を得る前にそれを中和する物質として、ＣＤ４−ＩｇＧ２が治療に有用である可能性を示唆する。治療の他に、ＣＤ４−ＩｇＧ２は職業上の、出産期の、またはその他の理由でＨＩＶ−１に暴露された結果として感染することを予防することに有効性を有する可能性がある。
【００９６】
フェーズＩの臨床試験において、ＣＤ４−ＩｇＧ２の単独投薬は優れた薬理学および耐薬性を示した。加えて、測定可能な抗ウイルス活性が二つの基準のそれぞれで観察された。第１に、１０ｍｇ／ｋｇの単独投薬の後、血漿ＨＩＶ  ＲＮＡの統計的に著しく急激な減少が観察された。加えて、二人の患者の試験のそれぞれで、感染性ＨＩＶのプラスマレベルの持続的な減少が観察された。これらの観察結果を総合すると、ＣＤ４−ＩｇＧ２がヒトにおいて抗ウイルス活性を有することが示される［１６］。
【００９７】
ＣＤ４に基づくタンパク質およびその分子的な擬態に加えて、ＨＩＶ−１の付着は、抗体および非ペプチド分子によっても阻害することができる。既知の阻害剤には、（１）ＩｇＧ１ｂ１２およびＦ１０５のような抗ｅｎｖ抗体［１７，１８］、（２）ＯＫＴ４Ａ、Ｌｅｕ  ３ａ、およびそれらのヒト化バージョン［１９，２０］、（３）ｇｐ１２０またはＣＤ４のいずれかを標的にする非ペプチド物質［２１］が含まれる［２２−２４］。化合物の後者のグループには、アウリントリカルボン酸、ポリヒドロキシカルボキシレート、スルホン酸ポリマー、および硫酸デキストランが含まれる。
【００９８】
ｇｐ４１融合中間体を標的にすることにより、ＨＩＶ−１感染を妨げる幾つかの物質が確認されている。これらの阻害剤は、融合中間体と相互に作用し、それらが最終的な融合コンフォメーションに折り畳まれることを防ぐ。最初に同定されたそのような物質には、疎水性のアルファ螺旋を形成すると予測されるｇｐ４１の外部ドメインの一部に対応した、合成あるいは組み換えペプチドが含まれる。そのような領域の一つは、ｇｐ４１の細胞外部分のアミノセグメントおよびカルボキシセグメントの両方に存在し、最近の結晶学的な証明は、これらの領域がｇｐ４１の推定された融合コンフォメーションと関係していることを示唆している［２５，２６］。ＨＩＶ−１感染は、融合の際に暴露されるＮ末端またはＣ末端のｇｐ４１エピトープのいずれかと結合する物質によって阻害することができる。これらの物質には、ｇｐ４１に基づいたペプチドであるＴ−２０（以前はＤＰ１７８として知られていた）、Ｔ−１２４９、ＤＰ１０７、Ｎ３４、Ｃ２８、および様々な融合タンパク質およびそれの類似体が含まれる［２７−３３］。他の研究では、非天然のＤ−ペプチドおよび非ペプチド部分を含む阻害剤が確認されている［３４，３５］。Ｔ−２０によって、この分類の阻害剤の臨床的な概念検証が与えられた。Ｔ−２０は、フェーズＩ／ＩＩのヒトの臨床試験において、２対数倍まで血漿ＨＩＶ  ＲＮＡレベルを減少した［３６］。この抗ウイルス活性の広範さは、多様なＨＩＶ−１株の間でｇｐ４１の配列が高度に保存されていることを、この分類の阻害剤が反映していることを示している。
【００９９】
最近の研究［３７］は、ＨＩＶ−１融合中間体に対して抗体が生じる可能性を示した。この研究は、ＣＤ４と結合するｇｐ１２０／ｇｐ４１と融合コレセプターの相互作用の際に形成される一時的な融合中間体を補足する、「融合成分」ＨＩＶワクチン免疫原を用いる。これらの研究で用いられている免疫原は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現する細胞、およびヒトのＣＤ４およびＣＣＲ５を発現するがＣＸＣＲ４は発現しない細胞、の共生培養体のホルマリン固定物である。そのワクチンによって誘起された抗体は、一次ＨＩＶ−１単離株の阻害において、コレセプターを使用したにも関わらずかつてない幅および強さの効力を示した。このことは、その抗体が、保存性が高くかつＨＩＶ−１が侵入する間に一過性で暴露されたｇｐ４１の融合中間体のような構造に対して生じたことを示している。このクラスの抗体は、２Ｆ５として知られる抗ｇｐ４１モノクローナル抗体、即ち、融合前のウイルス粒子に構造的に存在しているエピトープと相互作用するモノクローナル抗体を含んでいない［３８］。
【０１００】
以前に、ある抗ｅｎｖ抗体を、他の抗ｅｎｖ抗体［３９−４４］、抗ＣＤ４抗体［４５］またはＣＤ４に基づくタンパク質［６］と組み合わせて使用して、ＨＩＶ−１の侵入を阻害する協働作用が示された。同様に、抗ＣＣＲ５抗体を他の抗ＣＣＲ５抗体、ＣＣケモキネシス、またはＣＤ４に基づくタンパク質［４６］と組み合わせて使用することで、協働作用が観察された。しかしながらこれまでの研究では、ｇｐ４１融合中間体の阻害剤とＨＩＶ−１侵入の他の段階の阻害剤を組み合わせた相乗効果の可能性は検討されていない。特に、ｇｐ４１融合中間体の阻害剤とＨＩＶ−１付着阻害剤との組み合わせを検討した研究は存在しない。
【０１０１】
Ａ．材料と方法
１）試薬
精製組み換えＣＤ４−ＩｇＧ２タンパク質は、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ株式会社によって、プラスミドＣＤ４−ＩｇＧ２−ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶおよびＣＤ４−ＫＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（各ＡＴＣＣ受付番号、７５１９３および７５１９４）から、［５］に記載のとおりに製造した。ＨｅＬａ−ｅｎｖ細胞は、ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０／ｇｐ４１ ｅｎｖ発現プラスミドｐＭＡ２４３を、［５１］の記載のとおりにＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣカタログ番号＃ＣＣＬ−２）に形質転換して調製した。ＰＭ１細胞はアメリカ国立衛生研究所ＡＩＤＳ試薬プログラム（カタログ番号＃３０３８）から入手可能である。Ｔ−２０ペプチドは、標準固相Ｆｏｍｃ化学を使用して合成し、［３１、３２］に記載のとおりに精製し、特性を決定する。
【０１０２】
２）ＨＩＶ−１のｅｎｖに媒介される膜融合の阻害
ＨＩＶ−１のエンベロープに媒介された、ＨｅＬａ−ＥｎｖＪＲ−ＦＬとＰＭ１細胞の融合は、共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）分析を用いて検出した。フルオレセインオクタデシルエステル（Ｆ１８）でラベルされたエンベロープ発現細胞およびオクタデシルローダミン（Ｒ１８）でラベルされたＰＭ１細胞の同数（２ｘ１０４）を、９６穴プレート中のウシ胎児血清１５％含有リン酸緩衝生理食塩水に蒔き、様々な濃度のＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０またはそれらの組み合わせの存在下で、３７℃で４時間インキュベートした。蛍光ＲＥＴは細胞蛍光プレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定し、％ＲＥＴは以前に記載したとおりに決定した［１９］。
【０１０３】
３）薬剤の組み合わせによる相乗効果、相加効果、または拮抗効果の定量解析
ＨＩＶ−１阻害データは、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｙの組合せ指数法［５２，５３］に従って解析した。そのデータは次式で記述できる半有効原理（ｍｅｄｉａｎ−ｅｆｆｅｃｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に従ってモデル化する。
【０１０４】
【数３】
2004518624.tif 000015
ここで、ｆは阻害に対する発症の割合、ｃは濃度、Ｋは半有効値を生じるために必要な薬剤の濃度、およびｍは投与量応答曲線の形を表す経験的な係数である。等式（１）は、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎの酵素速度論、ラングミュア吸着等温式、およびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｌｃｈのイオン化平衡の一般的な形であり、全ての場合でｍ＝１である。本件では、ＫはＩＣ５０値と等しい。Ｋおよびｍは、投与量応答曲線のカーブフィッティングによって決定する。
【０１０５】
実験薬剤およびそれらの組み合わせについて、Ｋおよびｍの最適なパラメーターが得られた後、所定のｆについてのｃを計算するために、等式（１）を再編する。得られた値の表（例えば図Ｘ）は、等式
【数４】
2004518624.tif 000016
を用いて組合せ指数（ＣＩ）を計算するために使われる。ここで、
ｃ１は単独で使われた場合の化合物１の濃度
ｃ２は単独で使われた場合の化合物２の濃度
ｃ１ｍは混合で使われた場合の化合物１の濃度
ｃ２ｍは混合で使われた場合の化合物２の濃度
全ての濃度は、所定の程度の阻害を達成するために必要な濃度である。等式（２）は分子が相互に非排他的である場合、即ち異なる活動サイトを有する場合に使用される。これはＨＩＶ−１の結合およびｇｐ４１の融合中間体を阻害するためにあり得るシナリオなので、等式（２）は全ての組合せ指数を計算するために使用した。相互に非排他的な計算は、ｃ１ｍｃ２ｍ／ｃ１ｃ２項が省略される相互に排他的な計算よりも、相乗効果の程度のより保存された評価を提供する。ＣＩ＜１は相乗効果を示し、ＣＩ＝１は純粋に相加的な効果を示し、ＣＩ＞１は拮抗作用を示す。通常、ＣＩ値は、測定可能な臨床上の利益を達成するために必要な高レベルの阻害に最も関連する。
【０１０６】
Ｂ．結果と考察
ＨＩＶ−１付着の阻害剤およびｇｐ４１の融合中間体の阻害剤の組み合わせは、最初にＲＥＴ分析において、ＨＩＶ−１のｅｎｖを媒介とした膜融合の阻害能力について試験した。この分析は、ＨＩＶ−１侵入プロセスの高い成功モデルであることが証明されている。この分析は、ｅｎｖ依存性コレセプター使用パターンおよび親ウイルスの細胞屈性を精確に再現する［１９］。実際、この分析は、ＣＣＲ５が必要な融合コレセプターとして機能することと、ウイルス侵入のレベルで作用することを示すのに役立つ［５４］。融合分析および感染性ウイルスは、金属キレート剤、並びにウイルスおよび細胞レセプターの完全な補体をターゲッティングする薬剤による阻害に対して同様に感受性である［１９、４６、５５］。
【０１０７】
個別に使用された薬剤および組み合わせて使われた薬剤についての両方の分析から、投与量応答曲線を得た。データは、半有効原理（ｍｅｄｉａｎ−ｅｆｆｅｃｔ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）を用いて解析した［５２，５３］。単独で使用した薬剤の濃度、または所定の効果を生じるるために要求されるそれらの混合物は、組合せ指数（ＣＩ）として知られる項目で定量的に比較される。ＣＩ＞１は拮抗作用を示し、ＣＩ＝１は純粋に加算効果を示し、ＣＩ＜１は、一つの薬剤の存在がもう一つの薬剤の効果を増強する相乗効果を示す。
【０１０８】
ＣＤ４−ＩｇＧ２およびＴ−２０の組み合わせは、ｅｎｖ媒介膜融合の阻害に強力な相乗作用をもたらす。図６は、ＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０、およびその二つの組み合わせの膜融合分析で得られたそれぞれの投与量応答曲線を示す。組み合わせの曲線は、阻害剤濃度が低い方で高く表示され、相乗的な挙動におけるＣＤ４−ＩｇＧ２およびＴ−２０の作用の定量的な証拠を提供している。
【０１０９】
観察されたＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０の相乗効果の程度を定量的に計算するために、我々は組合せ指数法［５２，５３］に従って投与量応答曲線を解析した。その解析は、ＣＤ４−ＩｇＧ２：Ｔ−２０の質量比が２５：１、５：１、および１：１のとき得られたデータを含めた。質量比が２５：１のとき、高濃度（０〜２５０μｇ／ｍｌ  ＣＤ４−ＩｇＧ２および０〜１０μｇ／ｍｌ  Ｔ−２０）および低濃度（０〜５０μｇ／ｍｌ  ＣＤ４−ＩｇＧ２および０〜２μｇ／ｍｌ  Ｔ−２０）の両方を評価した。図７に示したとおり、これらの範囲の阻害剤比率および濃度において強力な相乗効果が観察され、ＣＩ値は最適条件下で０．２０と低かった。０．２のＣＩ値は、抗ＨＩＶ−１抗体［４１−４４］、逆転写酵素阻害剤［５６］、またはプロテアーゼ阻害剤［５７］を含んだ組合わせによってはめったに得られないので、この相乗効果の程度は顕著なものである。この観察された相乗効果は、ＨＩＶ−１の結合と、ｇｐ４１融合中間体の形成とが相互依存的なステップであることを示す。一つの可能性として、付着阻害剤は、最適未満の濃度で使われたときには、ｇｐ１２０とＣＤ４の結合を遅延させるが排除はしないかもしれない。この場合、ｇｐ４１融合中間体が形成されて、膜融合に必要とされるよりも下のレベルで長期間ウイスル上で（または感染細胞上で）持続する可能性があり、それゆえ阻害剤のよい標的を提供する。
【０１１０】
観察された相乗効果は、阻害に必要なＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０の量を大いに減少する。質量比２５：１で、ＣＤ４−ＩｇＧ２およびＴ−２０を使用したときの減少を図８に示す。この場合、ウイルス侵入を９５％まで阻害するためには、Ｔ−２０単独では０．２１μｇ／ｍｌ、ＣＤ４−ＩｇＧ２単独では１９μｇ／ｍｌ、それらを組み合わせた場合はＴ−２０が０．０４４μｇ／ｍｌおよびＣＤ４−ＩｇＧ２が１．１μｇ／ｍｌで、合計１．１４μｇ／ｍｌが必要である。組み合わせることによって、Ｔ−２０およびＣＤ４−ＩｇＧ２の投与量はそれぞれ５倍および１７倍減少する。より高レベルの阻害剤によって、さらに大きな投与量の減少が得られる。
【０１１１】
＜第二シリーズの実験のための参照文献＞
【０１１２】
【参考文献２】
2004518624.tif 000017
2004518624.tif 000018
2004518624.tif 000019
2004518624.tif 000020
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2004518624.tif 000022
2004518624.tif 000023
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2004518624.tif 000025
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＜第３シリーズの実験＞
ＨＩＶの侵入は一連の現象を通じて進行し、この現象は治療の有望な目標となる。ＰＲＯ５４２は、ＨＩＶ−１がＣＤ４に付着するのを遮断することによってＨＩＶ−１を中和し、Ｔ−２０はｇｐ４１を介した融合を遮断する。両薬物ともに、臨床試験の第Ｉ／ＩＩ相において有望であることが示されている。本実験では、ＨＩＶ−１感染の前臨床モデルにおいて、前記薬物を個別に及び組み合わせて調べ、併用指標法を使用して、協同作用に関し阻害データを分析した。広範な薬物濃度にわたって、様々な表現型のウイルスについて、ウイルス−細胞融合及び細胞−細胞融合の相乗的な阻害が観察され、しばしば、インビトロで１０倍以上の用量低下が生じた。さらに作用機序に関する研究によって、かかる相乗作用の分子的基礎を探った。ＰＲＯ  ５４２：Ｔ−２０の組み合わせに対して顕著な活性の増大が観察されたことは、ＨＩＶ−１の侵入が多段階であるために、侵入阻害剤の組み合わせに対してウイルスが非常に影響を受けやすいことを示している。これらの知見は、これらの薬剤を組み合わせてインビボでの治療に用いることを検討することに関して強固な論拠を与えるものである。
【０１１３】
近年の進歩にもかかわらず、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染に対する現時の治療法には、ＨＩＶ−１を根絶させることができない、多剤耐性変種が発生する、及び顕著な毒性が存在するという限界がある。このため、ＨＩＶ−１複製サイクルのさらなる段階（ウイルスの侵入など）を標的とする新規な治療法が緊急に必要とされている。ＨＩＶ−１の侵入は、治療の標的として有望な３つの段階、すなわち、（１）ＨＩＶ−１表面糖タンパク質ｇｐ１２０のＣＤ４への付着、（２）ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体と補助受容体との相互作用、及び（３）ＨＩＶ−１膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１によって媒介される膜融合から構成される。付着阻害剤、補助受容体阻害剤、及び融合阻害剤は、侵入阻害剤と総称され、現在臨床開発段階にある（１−４）。
【０１１４】
付着阻害剤であるＰＲＯ  ５４２（ＣＤ４−ＩｇＧ２）は、初代ＨＩＶ−１単離株を強力に中和する４価のＣＤ４免疫グロブリン融合タンパク質である（５）。第Ｉ／ＩＩ相試験では、ＰＲＯ  ５４２は優れた許容性と薬理作用を示し、血漿ＨＩＶ  ＲＮＡ、血漿ウイルス血症、及び細胞に付随するウイルスを測定したところによれば、ウイルスの負荷量を減少させた（１、２）。ＰＲＯ  ５４２は、現在、第２相の臨床試験中である。
【０１１５】
融合阻害剤Ｔ−２０は、ｇｐ４１のＣ末端の外部ドメインに由来するペプチドである。Ｔ−２０は、一過的なｇｐ４１融合中間体への作用能によって仲介される広範囲の抗ウイルス活性を有している（６、７）。融合中間体の正確な構造は不明であるが、ｇｐ４１の融合後のコンフォメーションに基づいて、「プレヘアピン」中間体として知られている。Ｔ−２０は、第Ｉ／ＩＩ相試験で単一の薬剤として使用すると、ＨＩＶ  ＲＮＡを１〜２桁減少させ、ＦＤＡによって認可された抗レトロウイルス剤と併用すると長期のウイルス抑制が見られた（３、４）。Ｔ−２０は、第ＩＩＩ相臨床試験に入っている。
【０１１６】
ＨＩＶ−１複製を長期的に抑制させるためには、抗レトロウイルス薬を組み合わせることが必要とされる。ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０は許容度が高く、ＨＩＶ−１侵入の異なる段階を標的とする「ファーストインクラス」薬剤なので、ＰＲＯ  ５４２及びＴ−２０は、併用の候補として魅力的である。さらに、ＨＩＶ−１の侵入は多段階の相互依存的な性質を有するので、これらの薬物は非相加的に作用する可能性があることが示唆される。本研究において、本発明者らは、インビトロでこれらの薬剤を各別に及び組み合わせて評価し、協同的な効果について結果を解析した。ＰＲＯ  ５４２：Ｔ−２０の組み合わせは、広範囲の実験条件にわたって、様々な表現型のＨＩＶ−１単離株の侵入を強力且つ相乗的に阻害した。別の研究では、抗ウイルス活性の増大に関する分子的な基礎に光を当てた。
【０１１７】
＜材料と方法＞
化合物  チャイニーズハムスター卵巣細胞中でＰＲＯ  ５４２を発現させ、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓのカラムクロマトグラフィーによって精製した（５）。固相フルロエニルメトキシカルボニル化学反応によってＴ−２０を合成し、逆相クロマトグラフィーによって精製して、ＰｒｏｇｅｎｉｃｓのＨＰＬＣと質量分析によって純度とサイズを分析した。リン酸緩衝生理食塩水中にＰＲＯ  ５４２とＴ−２０を調合し、−９５℃で保存した。
【０１１８】
ＨＩＶ−１ウイルス−細胞融合アッセイ  ＮＬｌｕｃ＋ｅｎｖ−ウイルスに、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ（Ｒ５）又はＨＩＶ−１ＤＨ１２３（Ｒ５Ｘ４）から得たエンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）をトランスに補完した（８）。薬物の存在下又は不存在下で、ＨｅＬａ−ＣＤ４＋ＣＣＲ５＋細胞を、５０〜１００ｎｇ／ｍｌのｐ２４を含有するキメラのレポーターウイルスに感染させた。細胞を洗浄し、薬物を含有する新鮮な培地を２時間の時点で加え、１２時間の時点で薬物を含有しない培地を加えた。７２時間後に、細胞可溶化液のルシフェラーゼ活性をアッセイした（９）。
【０１１９】
ＨＩＶ−１細胞−細胞融合アッセイ  ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞とＣＤ４＋標的細胞間の融合を測定する蛍光共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）アッセイを用いて、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ及びＨＩＶ−１ＬＡＩのエンベロープ糖タンパク質によって媒介される細胞−細胞融合を測定した（１０）。本研究では、標的細胞としてＴ細胞株ＰＭ１とＳｕｐＴ１を使用した。ＰＭ１は、内在的にＣＣＲ５とＣＸＣＲ４を発現している。融合後に色素が同一の膜に位置するとＲＥＴが起こるように励起スペクトルと発光スペクトルが重複する蛍光色素を用いて細胞の膜を標識する。ＲＥＴシグナルは、膜の融合の程度と直接関連する。
【０１２０】
薬物相互作用の定量的分析  ３つの独立したアッセイから得られる阻害データを平均し、併用指標（ＣＩ、Ｃｐｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）法を用いて協同効果を分析した（１１）。全ての分析で、ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０は非競合的に作用すると仮定したが、これによって相乗効果は控え目に見積もられることになる。０．９未満（又は１．１超）のＣＩ値を意味のある協同効果（又は拮抗作用）を表すものとみなした。薬物を単独で又は組み合わせて使用するときに阻害に必要とされる薬物濃度の比率として、用量の減少を計算した（１１）。
【０１２１】
＜結果＞
ＨＩＶ−１ウイルス−細胞融合の阻害  ＰＲＯ  ５４２、Ｔ−２０、及びこれらを１：２のモル比で組み合わせたものを用いて、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ及びＨＩＶ−１ＤＨ１２３の侵入を阻害した。ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬの場合（図９ａ）、９０％阻害（ＩＣ９０）に必要とされる濃度はＰＲＯ  ５４２で１２ｎＭ、Ｔ−２０で４５ｎＭであり、これらの組み合わせでは４．１ｎＭ（ＰＲＯ  ５４２が１．５ｎＭ、Ｔ−２０が２．６ｎＭ）であった。組み合わせた場合のＩＣ９０が各化合物単独のＩＣ９０に比べて相当低いという事実から、好ましい薬物−薬物相互作用が明白である。
【０１２２】
併用指標分析（図１０）によって、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ及びＨＩＶ−１ＤＨ１２３の両者に強いＰＲＯ  ５４２：Ｔ−２０相乗効果が観察されることが実証された。５０−９５％阻害の範囲では、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬのＣＩ値は０．３９−０．１４の範囲に、ＨＩＶ−１ＤＨ１２３のＣＩ値は１．１−．３６の範囲にあった。ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬの侵入を９０−９５％阻害するために、約１／１０のＰＲＯ５４２と約１／２０のＴ−２０が必要であった。ＨＩＶ−１ＤＨ１２３については、有意な用量減少も観察された（図１０）。
【０１２３】
ＨＩＶ−１  Ｅｎｖを介した細胞−細胞融合の阻害  ＰＲＯ  ５４２、Ｔ−２０、及びこれらを１：１０のモル比で組み合わせたものを用いて、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  Ｅｎｖを介した細胞−細胞融合をＲＥＴアッセイで阻害した（図９ｂ）。ＩＣ９０値は、ＰＲＯ  ５４２で１１ｎＭ、Ｔ−２０で２２ｎＭであり、これらの組み合わせで５．５ｎＭ（０．５５ｎＭ  ＰＲＯ  ５４２及び４．９ｎＭ  Ｔ−２０）であった。５０−９５％阻害の範囲にわたり、ＣＩ値は０．３４−０．２７の範囲にあった（図１０）。１：２及び１：５０のＰＲＯ  ５４２：Ｔ−２０モル比を用いた場合にも強い相乗効果が観察され、５０倍に及ぶ用量の低下がもたらされた（図１０）。
【０１２４】
ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０は、ＨＩＶ−１ＬＡＩ（Ｘ４）  Ｅｎｖを介した融合も相乗的に阻害した。１：１０のＰＲＯ  ５４２：Ｔ−２０の比率では、５０−９５％の阻害でＣＩ値は０．４５−０．２８の範囲にあった。用量の低下は、ＰＲＯ  ５４２で１２倍乃至３０倍、Ｔ−２０で２．５倍乃至５．４倍の範囲にあった。ＰＭ１の代わりにＳｕｐＴ１  Ｔ細胞株を用いたときにも相乗効果が観察された（データは示さず）。
【０１２５】
ＰＲＯ  ５４２：Ｔ−２０相乗効果の機序に関する研究  Ｔ−２０は、融合前のコンフォメーションにあるＥｎｖとは相互作用せず、一過的なｇｐ４１構造を標的にする（７）。これに対して、ＰＲＯ  ５４２は、遊離のウイルスを中和し、侵入に必要とされるＥｎｖのコンフォメーションの変化を誘発する（１２）。ＰＲＯ  ５４２は、おそらく、ｇｐ４１融合中間体の形成を誘発し、Ｔ−２０が遊離のウイルスに作用できるようにし得るのであろう。この仮定を検討するために、洗浄とＰＭ１細胞の添加に先立って、ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０を単独で及び組み合わせて、ＨｅＬａ−Ｅｎｖ細胞とともに、３７℃で１時間プレインキュベートした（図９ｃ）。ＰＲＯ  ５４２の効力は１／６に低下していたが、なお有意な効力を示したのに対して、Ｔ−２０は、この設定条件では実質的に不活性だった。ＰＲＯ  ５４２：Ｔ−２０混合物の効力はＰＲＯ５４２の効力と変わらず、Ｔ−２０が前記混合物中で不活性であることを示すとともに、ＰＲＯ  ５４２がプレヘアピン中間体の形成を誘発しないことを示唆していた。本結果は、ＰＲＯ  ５４２：Ｔ−２０の相乗効果が、両化合物間での直接的な結合を反映しているのではないことも示している。何れの薬物も、洗浄前にＰＭ１細胞とともにプレインキュベートすると活性を示さなかった（データは示さず）。
【０１２６】
さらなる実験によって、プレヘアピン中間体を形成するために必要とされる条件を探った。Ｈｅｌａ−ＥｎｖとＰＭ１細胞を、２５℃（ＨＩＶ−１融合が不能な温度（１３））で２時間、同時にインキュベートした。阻害剤を添加し、細胞を３７℃に加温した。これらの条件下で、ＰＲＯ  ５４２が融合を遮断する効力は明確に低下していたのに対して、Ｔ−２０は完全な活性を示した（図１ｄ）。このように、２５℃では、ＨＩＶ−１の融合は、ｇｐ１２０−ＣＤ４の付着を超えて進行することができるが、プレヘアピン中間体が形成された時点又はその前で停止してしまう。阻害剤を添加する前に、細胞を２５℃で１６時間インキュベートしたときにも同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０１２７】
最後に、洗浄前に、２５℃で２時間、ＨｅＬａ−Ｅｎｖ細胞、ＰＭ１細胞、及び阻害剤（ＰＲＯ  ５４２、Ｔ−２０、又は１：１０の組み合わせ）を同時にインキュベートし、３７℃に加温した。これらの条件下で、ＰＲＯ  ５４２の活性は約１／１２に低下したが、なお有意な活性を示した。Ｔ−２０は実質的に不活性であった（ＩＣ５０が２５０倍を超えて増加した）。ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０の組み合わせは、ＰＲＯ  ５４２成分と同等の活性を保有していた（データは示さず）。総合すると、融合可能な温度でＥｎｖ、ＣＤ４、及び補助受容体が相互作用しなければ、プレヘアピン中間体が形成されないことを、本結果は示している。
【０１２８】
＜考察＞
ＨＩＶ−１の侵入は、新世代の抗レトロウイルス治療の有望な目標であり、ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０は、この極めて協同的なプロセスの異なる段階を遮断する「ファーストインクラス」の治験薬である。侵入阻害剤を組み合わせることが、ＨＩＶ−１治療の新たなパラダイムとして浮上するかもしれないことを認識し、本研究では、２つの前臨床ＨＩＶ−１感染モデルにおいてＰＲＯ  ５４２：Ｔ−２０の組み合わせについて調べた。広い薬物濃度範囲にわたって、様々な表現型のウイルス単離株で、ウイルス−細胞融合及び細胞−細胞融合の両者について強力な相乗効果が観察された。多くの事例で、この相乗効果は、インビトロでＰＲＯ  ５４２とＴ−２０の用量を１０倍以上減少させた。このように、ＨＩＶ−１の侵入が多段階であるために、ＨＩＶ−１ウイルスは、協同的な阻害に対して極めて影響を受けやすい状態にあるものと思われる。本知見は、各化合物の潜在的な治療能力を最大化するように設計された併用臨床試験に対して強固な論拠を与える。
【０１２９】
仮にインビボで確証されれば、これらの知見は臨床において数多くの重要な有益性をもたらすことができるかもしれない。第一に、より強力な治療法は薬剤耐性ウイルスの出現を抑えることにより、患者の治療に対する選択の余地を保持する。さらに、治療に必要とされるＰＲＯ  ５４２とＴ−２０の量を減少させることによって、前記相乗効果は簡略化された投与計画を可能とするであろう。ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０は、これまでの臨床検査で許容度が高かったのでその懸念は少ないかもしれないが、低用量の投薬計画は、一般に毒性も低い。
【０１３０】
ウイルス−細胞融合に関しては、ＰＲＯ  ５４２よりＴ−２０の方が用量の減少が大きかったのに対して、細胞−細胞融合の場合には逆であった。かかる相対的な用量の減少は、この２つの製品の補完的な作用機序（すなわち、ＰＲＯ  ５４２は無細胞ウイルスを中和するが、Ｔ−２０はこれを中和せず、Ｔ−２０は細胞−細胞融合を遮断するのに特に有効である（６−８））を反映している。ＨＩＶ−１の伝染の２つの主要な様式を各薬物がインビトロで強固に遮断する能力を活用することによって、ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０の組み合わせは、インビボで極めて有効であることが明らかとなるかもしれない。
【０１３１】
ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０は、Ｒ５、Ｘ４、及びＲ５Ｘ４ウイルスのエンベロープによって媒介される融合を相乗的に阻害した。初代ウイルスに対するＰＲＯ  ５４２の活性はウイルスによる補助受容体の使用とは無関係である（８）のに対して、Ｔ−２０のウイルス−細胞融合遮断能は、報告によれば、補助受容体の用法に応じて変動する（１４）。ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０の相乗効果が補助受容体の用法によって微妙に影響を受けるのかどうかを決定するためには、多岐にわたるウイルスを用いた研究が別途必要とされる。
【０１３２】
ＰＲＯ  ５４２単独ではｇｐ４１プレヘアピン中間体の形成を誘発することはできず、該中間体はＥｎｖ、ＣＤ４、及び補助受容体が融合可能な温度で相互作用したときにのみ形成された。このため、相乗効果は、複数のｇｐ１２０／ｇｐ４１三量体が集まって融合孔を形成する等のより微弱な現象に由来する可能性がある（１３）。中和量以下の用量で、ＰＲＯ  ５４２は、Ｅｎｖｓの集団の一部が標的細胞と相互作用するのを妨げるが、おそらく残りのＥｎｖｓはプレヘアピン中間体へと進行できるのであろう。かなりの数の遊離Ｅｎｖｓを融合孔の部位へ動員するのに必要とされる十分長い時間にわたって、前記融合中間体はＴ−２０に対して暴露され続け、Ｔ−２０の影響を受ける状態に保たれるのかもしれない。最近の研究では、細胞を混合した最初の１５分以内に加えるとＴ−２０は１００％の阻害を示したが、７５分の時点では、実質的に活性がなかった（１０％未満の阻害）（１５）。現在進行中の研究では、この期間中のＰＲＯ５４２の効果について調べている。
【０１３３】
別の研究では、より多くの付着祖阻害剤、補助受容体阻害剤、及び融合阻害体の組み合わせを探索している。また、本研究では、サブタイプＢウイルスのみを使用した。ＰＲＯ  ５４２及びＴ−２０単独の場合と同様に、前記組み合わせが、遺伝的なサブタイプに依存せずにＨＩＶ−１を阻害するかどうかを決定することが重要であろう。最後に、さらなる研究によって、初代細胞中で複製能を有するウイルスを抑えるウイルスＰＲＯ５４２とＴ−２０の組み合わせが、インビトロ及びＨＩＶ−１感染の動物モデルの両者で探索されるであろう。
【０１３４】
要約すれば、ＰＲＯ  ５４２とＴ−２０は、インビトロでＨＩＶ−１の侵入を阻害するために使用すると、強力な相乗効果を示した。多様な表現型に関して、ウイルス−細胞と細胞−細胞融合の協同阻害が観察され、有意義な用量の低下がもたらされた。これらの知見は、これらの薬剤の組み合わせをインビボで評価するための強固な論拠を与える。
【０１３５】
＜第３シリーズの実験のための参考文献＞
【０１３６】
【参考文献３】
2004518624.tif 000028
2004518624.tif 000029
2004518624.tif 000030
＜第４シリーズの実験＞
ＨＩＶ−１の付着阻害剤、補助受容体阻害剤、及び融合阻害剤間の相乗効果の機序
ＨＩＶ−１の侵入は、ｇｐ１２０−ＣＤ４付着阻害剤ＰＲＯ５４２、ｇｐ１２０−補助受容体阻害剤ＰＲＯ１４０、並びにｇｐ４１融合阻害剤Ｔ−２０及びＴ−１２４９を含む新世代の抗ウイルス治療法の有望な目標となる一連の現象を介して進行する。ＨＩＶ−１の侵入が多段階で生じるために、本プロセスの異なる段階に作用する薬物の組み合わせによる阻害に対して、ウイルスは極めて影響を受けやすくなっている。付着阻害剤、補助受容体阻害剤、及び融合阻害剤を二重及び三重に混ぜ合わせた薬物カクテルによって、インビトロにおける広い範囲の実験条件にわたって、ＨＩＶ−１の侵入が強力且つ相乗的に遮断されることが示されている。
【０１３７】
本研究は、観察された前記相乗的相互作用の分子的基礎を明らかにするために行われた。ＨＩＶ−１膜融合は半自動蛍光アッセイを用いてリアルタイムにモニターし、各薬物及び薬物カクテルの阻害活性は添加時、洗い流し（ｗａｓｈｏｕｔ）、及び段階的温度制御研究において評価した。このデータは、融合孔の部位への多数の融合活性なＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質の動員を協同的に遅延させるように薬物が作用するモデルに合致した。これらの知見は、ＨＩＶ−１侵入阻害剤のインビボでの併用に対して重要な示唆を与え、抗ウイルス治療に対する重要な新しいパラダイムとなる可能性がある。
【０１３８】
図１１に示されているように、ＨＩＶ−１の侵入には、（１）ｇｐ１２０−ＣＤ４付着、（２）ｇｐ１２０−補助受容体相互作用、及び（３）ｇｐ４１を介した融合という治療の目標となる少なくとも３つの段階が関与している。
【０１３９】
ＣＤ４−ＩｇＧ２付着阻害剤（ＰＲＯ  ５４２）は、図１２に示されているように、ＣＤ４に基づいた四価のタンパク質である。該阻害剤は、インビトロ、エクソビボ、及びインビボで広く且つ強力に初代ＨＩＶ単離株を中和し、融合に先立って作用する。ＰＲＯ５４２は、第Ｉ／ＩＩ相の２つの臨床試験を完了しており、（１）優れた安全性と薬物動態学的プロフィール、及び非免疫原性であること、（２）単回投与によって、ウイルスの負荷量が統計学的に有意に減少すること、（３）遊離及び細胞に付随した感染性ウイルスの持続的な減少を示す。ＰＲＯ５４２は、第ＩＩ相の試験中である。
【０１４０】
ＰＲＯ１４０補助受容体阻害剤は、図１３に示されているように、ＣＣＲ５に対するモノクローナル抗体である。該阻害剤は、ＣＣＲ５を用いるウイルスを強力に中和する。該阻害剤は、初代Ｔ細胞とマクロファージを保護し、その阻害は遺伝的サブタイプに依存しない。該阻害剤は、ケモカインによって誘導されるシグナル伝達に影響を与えずにＨＩＶの侵入を選択的に遮断する。インビトロでの３１週の培養を経ても、ＨＩＶ耐性の出現はみられていない。
【０１４１】
Ｔ−２０融合阻害剤は、１４に示されているように、ＨＩＶ−１のｇｐ４１に由来するペプチドである。該阻害剤は、ＨＩＶ−１細胞−細胞融合及び細胞−ウイルス融合をインビトロで広く且つ強力に遮断する。該阻害剤は、第Ｉ／ＩＩ相の臨床試験を完了しており、（１）優れた許容性、（２）薬物動態（ｐＫ）は二日に一度の皮下投与でよいことを裏付け、（３）臨床的に有意な用量依存的ウイルス負荷量の低下を示している。
【０１４２】
侵入阻害剤の併用
ＨＩＶをインビボで抑制するためには、併用療法が必要とされるかもしれない。ＨＩＶ侵入阻害剤は、治療における次なる大きな進歩となるであろう。拮抗的な組み合わせを回避し、相乗的な組み合わせを同定するためには、臨床開発の後期ではなく初期に薬物−薬物相互作用を決定することが重要である。相乗的な組み合わせの臨床的な有益性には、より強力な抗ウイルス効果及びより持続的な抗ウイルス効果が含まれる。
【０１４３】
ＨＩＶ−１ウイルス−細胞融合アッセイは、図１５に記載されている。単サイクルＨＩＶ−１侵入アッセイでは、（１）に記載されているようにＥｎｖ−Ｌｕｃ＋  ＨＩＶレポーターウイルスを調製した。所定のＨＩＶ株のｇｐ１２０／ｇｐ４１が前記ウイルスには補充されているので、ＣＤ４と融合補助受容体を発現する標的細胞と融合することが可能であり、細胞内にウイルス遺伝子が導入されることになる。ウイルスは、ＨＩＶｅｎｖではなくルシフェラーゼレポーター酵素をコードしているので、感染によって、新しいウイルス粒子ではなくルシフェラーゼが産生される。ルシフェラーゼの量は、標準的な方法を用いて感染の７２時間後に測定する。
【０１４４】
図１６及び図１７は、ＰＲＯ５４２とＴ−２０によるウイルス−細胞融合の相乗的な阻害を示している。
【０１４５】
図１８には、ＨＩＶ−１細胞−細胞融合アッセイが記載されている。このようなアッセイは、ＨＩＶ−１膜融合の共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）アッセイである。ｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現する細胞（ＥＮＶ細胞）は蛍光色素オクタデシルフルオレシン（Ｆ１８）で標識されているのに対して、ＣＤ４と融合補助受容体を発現するＴ細胞（ＣＤ４細胞）はオクタデシルローダミン（Ｒ１８）で標識されている。Ｆ１８の発光スペクトルはＲ１８の励起スペクトルと重なっているので、融合後に、前記色素が同一の膜に位置すると、蛍光ＲＥＴを生じせしめる。４５０ｎｍでＦ１８を刺激し、５９０ｎｍでＲ１８の発光を測定することによってＲＥＴを測定する。ＲＥＴシグナルは、ＨＩＶ−１の融合量と直接相関する（２）。
【０１４６】
図１９と図２０は、ＰＲＯ５４２とＴ−２０による細胞−細胞融合の相乗的な阻害を示している。
【０１４７】
図２１と図２２は、ＰＲＯ１４０、ＰＲＯ５４２、及びＴ−２０を三重に組み合わせることによって、ＨＩＶ−１の侵入が相乗的に遮断されることを示している。
【０１４８】
図２３は、補助受容体の不存在下では、ＰＲＯ５４２がＴ−２０の活性を強化しないことを示している。洗浄、ＰＭ１標的細胞の添加、及び融合アッセイの完了前に、３７℃で２時間、ＰＲＯ５４２、Ｔ−２０、又は１：２の混合物をＨｅＬａ−ＥＮＶＪＲ−ＦＬ細胞とともにプレインキュベートした。
【０１４９】
図２４と図２５に示されているように、プレヘアピン中間体の形成には、ＣＤ４、補助受容体、及び３７℃が必要であるのかもしれない。
【０１５０】
図２６と図２７は、ＰＲＯ５４２がＴ−２０の標的の半減期を増加させるという考えられる相乗効果の機序を記載している。
【０１５１】
図２８は、ｅｎｖを介した膜融合（ＲＥＴ）アッセイにおける、ＰＲＯ５４２、Ｔ−１２４９、及び１：１０のモル比での組み合わせを用いたＨＩＶ−１の侵入の相乗的阻害を示している。図２９は、ＰＲＯ５４２とＴ−１２４９を１：１０のモル比で組み合わせたものの併用指標及び用量の減少を示している。
【０１５２】
＜第４シリーズの実験のための参考文献＞
【０１５３】
【参考文献４】
2004518624.tif 000031
［配列表］
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＩＶ−１の侵入の相乗的阻害
ｅｎｖを介した膜融合（ＲＥＴ）アッセイにおいて、ＣＤ４−ＩｇＧ２（−−黒四角−−）、Ｔ−２０（−−黒丸−−）、及びＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０を２５：１で組み合わせたもの（・・・黒三角・・・）のＨＩＶ−１侵入阻害を分析した。それぞれＦ１８とＲ１８で予め標識されたＨｅＬａ−ＥｎｖＪＲ−ＦＬ＋とＰＭ１細胞の混合物に阻害剤を加えた。４時間インキュベートした後に蛍光ＲＥＴを測定し、記載に従って（１９）パーセント阻害を算出した。結果は、３つの独立した実験から得られた平均値である。式（１）に記載されているｍｅｄｉａｎ  ｅｆｆｅｃｔ法に従ってデータを解析した。Ｋ及びｍに対する最適合パラメーターは、ＣＤ４−ＩｇＧ２で０．３１μｇ／ｍｌ及び０．７３、Ｔ−２０で０．０１７μｇ／ｍｌと０．９２、それらの組み合わせで０．１１μｇ／ｍｌと１．０である。これらの曲線をプロットすると、実験と理論が合理的に合致することが示される（それぞれ、ＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０、及びそれらの組み合わせにおいて、ｒ２＝０．９８３、０．９９８、及び０．９９６）。表記のごとく、前記化合物の効力の差を標準化するために、ＣＤ４−ＩｇＧ２並びにＣＤ４−ＩｇＧ２及びＴ−２０の２５：１混合物とＴ−２０とで異なる濃度スケールが使用されている。
【図２】
ＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０を組み合わせることによるＨＩＶ−１侵入の阻害に対する併用指標。ＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０、及びこれらを一定の重量比で組み合わせたものがｅｎｖを介した膜融合を阻害する能力をＲＥＴアッセイで分析した。２５：１（多量）の組み合わせでは、２５０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧ２、１０μｇ／ｍｌのＴ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈１０個を検査した。２５：１（少量）の組み合わせでは、５０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧ２、２μｇ／ｍｌのＴ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈１０個を検査した。５：１の組み合わせでは、５０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧ２、２μｇ／ｍｌのＴ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈１０個を検査した。１：１の組み合わせでは、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧ２、１０μｇ／ｍｌのＴ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈１０個を検査した。分析の前に、３以上の独立のアッセイから得られた阻害データを平均した。様々な阻害剤及び組み合わせの用量反応曲線を式（１）にフィッティングさせた後、所定のパーセント阻害を生じせしめるのに必要とされる阻害剤濃度を計算するために式（１）を再構成した。それらの既知重量比から阻害混合物中の各薬剤の濃度を求めた。次いで、これらの値を用いて、式（２）に従って併用指標（ＣＩ）を求めた。ＣＩ＜１は相乗効果を、ＣＩ＝１は相加的効果を、ＣＩ＞１は拮抗作用を表す。
【図３】
ＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０の相乗的な組み合わせで観察された用量の減少。ＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０、及びこれらを２５：１の一定重量比で組み合わせたものが、ｅｎｖを介した膜融合を阻害する能力をＲＥＴアッセイで調べた。６つの独立したアッセイから得られた阻害データを平均した。Ｋとｍは、用量反応曲線のカーブフィッティングによって決定し、単一の薬剤及びそれらの組み合わせに対する所定のｆに対するｃを計算するために式（１）を再構成した。用量減少とは、阻害剤を単独で使用したときに所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度に対する相乗的な組み合わせで所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度の比率である。
【図４Ａ】
ＣＤ４−ＩｇＧ２、ＰＲＯ  １４０、ＰＡ１２及びＴ−２０の組み合わせで観察された用量の減少。これらの薬剤がＨＩＶ  ｅｎｖを介した膜融合を阻害する能力を、ＲＥＴアッセイにおいて各別に及び組み合わせて調べた。ａ）は、ＣＤ４−ＩｇＧ２、ＰＡ１２、Ｔ−２０、及び概ね１：１：１０の一定モル比でこれらを組み合わせたものであり、用量減少とは、阻害剤を単独で使用したときに所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度に対する相乗的な組み合わせで所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度の比率である。ａ）では、１２５ｎＭ  ＣＤ４−ＩｇＧ２、１６７ｎＭ  ＰＡ１２、１１００ｎＭ  Ｔ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈６〜８個を検査した。所定のパーセント阻害を生じせしめるのに必要とされる阻害剤の濃度を求めた。それらの既知モル比から阻害混合物中の各薬剤の濃度を求めた。次いで、式（２）に従って併用指標（ＣＩ）を算出するために、これらの値を使用した。ＣＩ＜１は相乗効果を、ＣＩ＝１は相加的効果を、ＣＩ＞１は拮抗作用を表す。
【図４Ｂ】
ＣＤ４−ＩｇＧ２、ＰＲＯ  １４０、ＰＡ１２及びＴ−２０の組み合わせで観察された用量の減少。これらの薬剤がＨＩＶ  ｅｎｖを介した膜融合を阻害する能力を、ＲＥＴアッセイにおいて各別に及び組み合わせて調べた。ｂ）は、ＣＤ４−ＩｇＧ２、ＰＲＯ  １４０、Ｔ−２０、及び概ね２：１：２０の一定モル比でこれらを組み合わせたものであり、用量減少とは、阻害剤を単独で使用したときに所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度に対する相乗的な組み合わせで所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度の比率である。ｂ）では、１２５ｎＭ  ＣＤ４−ＩｇＧ２、６７ｎＭ  ＰＲＯ  １４０、１１００ｎＭ  Ｔ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈６〜８個を検査した。所定のパーセント阻害を生じせしめるのに必要とされる阻害剤の濃度を求めた。それらの既知モル比から阻害混合物中の各薬剤の濃度を求めた。次いで、式（２）に従って併用指標（ＣＩ）を算出するために、これらの値を使用した。ＣＩ＜１は相乗効果を、ＣＩ＝１は相加的効果を、ＣＩ＞１は拮抗作用を表す。
【図４Ｃ】
ＣＤ４−ＩｇＧ２、ＰＲＯ  １４０、ＰＡ１２及びＴ−２０の組み合わせで観察された用量の減少。これらの薬剤がＨＩＶ  ｅｎｖを介した膜融合を阻害する能力を、ＲＥＴアッセイにおいて各別に及び組み合わせて調べた。ｃ）はＣＤ４−ＩｇＧ２、ＰＲＯ  １４０、Ｔ−２０、及び概ね４：１：３０の一定モル比でこれらを組み合わせたものであり、用量減少とは、阻害剤を単独で使用したときに所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度に対する相乗的な組み合わせで所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度の比率である。ｃ）では、１２５ｎＭ  ＣＤ４−ＩｇＧ２、３３ｎＭ  ＰＲＯ  １４０、１１００  ｎＭ  Ｔ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈６〜８個を検査した。所定のパーセント阻害を生じせしめるのに必要とされる阻害剤の濃度を求めた。それらの既知モル比から阻害混合物中の各薬剤の濃度を求めた。次いで、式（２）に従って併用指標（ＣＩ）を算出するために、これらの値を使用した。ＣＩ＜１は相乗効果を、ＣＩ＝１は相加的効果を、ＣＩ＞１は拮抗作用を表す。
【図４Ｄ】
ＣＤ４−ＩｇＧ２、ＰＲＯ  １４０、ＰＡ１２及びＴ−２０の組み合わせで観察された用量の減少。これらの薬剤がＨＩＶ  ｅｎｖを介した膜融合を阻害する能力を、ＲＥＴアッセイにおいて各別に及び組み合わせて調べた。ｄ）はＰＲＯ  １４０、Ｔ−２０、及び１：３０の一定モル比でこれらを組み合わせたものであり、用量減少とは、阻害剤を単独で使用したときに所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度に対する相乗的な組み合わせで所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度の比率である。ｄ）では、３６ｎＭ  ＰＲＯ  １４０、１１００ｎＭ  Ｔ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈６〜８個を検査した。所定のパーセント阻害を生じせしめるのに必要とされる阻害剤の濃度を求めた。それらの既知モル比から阻害混合物中の各薬剤の濃度を求めた。次いで、式（２）に従って併用指標（ＣＩ）を算出するために、これらの値を使用した。ＣＩ＜１は相乗効果を、ＣＩ＝１は相加的効果を、ＣＩ＞１は拮抗作用を表す。
【図５】
ＰＲＯ  ５４２、ＰＲＯ  １４０、及びＴ−２０を三重に組み合わせることによって、ＨＩＶ−１の侵入が相乗的に遮断される。ＰＲＯ  ５４２、ＰＲＯ  １４０、及びＴ−２０を単独で、並びに概ね３：１：３０のモル比で組み合わせて使用し、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ  ｅｎｖを介した細胞−細胞融合を阻害した。該アッセイの方法はＬｉｔｗｉｎらに記載されている（６７）。
【図６】
ＨＩＶ−１の侵入の相乗的阻害
ｅｎｖを介した膜融合（ＲＥＴ）アッセイにおいて、ＣＤ４−ＩｇＧ２（−−黒四角−−）、Ｔ−２０（−−黒丸−−）、及びＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０を２５：１で組み合わせたもの（・・・黒三角・・・）のＨＩＶ−１侵入阻害を分析した。それぞれＦ１８とＲ１８で予め標識されたＨｅＬａ−ＥｎｖＪＲ−ＦＬ＋とＰＭ１細胞の混合物に阻害剤を加えた。４時間インキュベートした後に蛍光ＲＥＴを測定し、記載に従って（１９）パーセント阻害を算出した。結果は、３つの独立した実験から得られた平均値である。式（１）に記載されているｍｅｄｉａｎ  ｅｆｆｅｃｔ法に従ってデータを解析した。Ｋ及びｍに対する最適合パラメーターは、ＣＤ４−ＩｇＧ２で０．３１μｇ／ｍｌ及び０．７３、Ｔ−２０で０．０１７μｇ／ｍｌと０．９２、それらの組み合わせで０．１１μｇ／ｍｌと１．０である。これらの曲線をプロットすると、実験と理論が合理的に合致することが示される（それぞれ、ＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０、及びそれらの組み合わせにおいて、ｒ２＝０．９８３、０．９９８、及び０．９９６）。表記のごとく、前記化合物の効力の差を標準化するために、ＣＤ４−ＩｇＧ２並びにＣＤ４−ＩｇＧ２及びＴ−２０の２５：１混合物とＴ−２０とで異なる濃度スケールが使用されている。
【図７】
ＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０の組み合わせによるＨＩＶ−１侵入の阻害に対する併用指標。ＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０、及びこれらを一定の重量比で組み合わせたものが、ｅｎｖを介した膜融合を阻害する能力をＲＥＴアッセイで分析した。２５：１（多量）の組み合わせでは、２５０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧ２、１０μｇ／ｍｌのＴ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈１０個を検査した。２５：１（少量）の組み合わせでは、５０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧ２、２μｇ／ｍｌのＴ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈１０個を検査した。５：１の組み合わせでは、５０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧ２、２μｇ／ｍｌのＴ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈１０個を検査した。１：１の組み合わせでは、１０μｇ／ｍｌのＣＤ４−ＩｇＧ２、１０μｇ／ｍｌのＴ−２０、及びそれらの組み合わせの三倍系列希釈１０個を検査した。分析の前に、３以上の独立のアッセイから得られた阻害データを平均した。様々な阻害剤及び組み合わせの用量反応曲線を式（１）にフィッティングさせた後、所定のパーセント阻害を生じせしめるのに必要とされる阻害剤濃度を計算するために式（１）を再構成した。それらの既知重量比から阻害混合物中の各薬剤の濃度を求めた。次いで、これらの値を用いて、式（２）に従って併用指標（ＣＩ）を求めた。ＣＩ＜１は相乗効果を、ＣＩ＝１は相加的効果を、ＣＩ＞１は拮抗作用を表す。
【図８】
ＣＤ４−ＩｇＧ２とＴ−２０の相乗的な組み合わせで観察された用量の減少。ＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｔ−２０、及びこれらを２５：１の一定重量比で組み合わせたものが、ｅｎｖを介した膜融合を阻害する能力をＲＥＴアッセイで調べた。６つの独立したアッセイから得られた阻害データを平均した。Ｋとｍは、用量反応曲線のカーブフィッティングによって決定し、単一の薬剤及びそれらの組み合わせに対する所定のｆに対するｃを計算するために式（１）を再構成した。用量減少とは、阻害剤を単独で使用したときに所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度に対する相乗的な組み合わせで所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度の比率である。
【図９】
ＰＲＯ  ５４２、Ｔ−２０、及びそれらの組み合わせによるＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬウイルス−細胞融合（Ａ）及び細胞−細胞融合（Ｂ−Ｄ）の阻害。ＰＲＯ５４２：Ｔ−２０のモル比は１：２（ＡとＣ）又は１：１０（Ｂ）であった。用量の減少（Ａ及びＢ）又はその欠如（Ｃ）を表すために、混合物中のＰＲＯ５４２とＴ−２０の濃度がプロットされている。洗い流しアッセイ（Ｃ）では、洗浄、加温、及びＰＭ１細胞の添加の前に、２５℃で２時間、ＨｅＬａ−Ｅｎｖ細胞とともに薬物をプレインキュベートした。細胞−細胞プレインキュベーションアッセイ（Ｄ）では、薬物の添加及び３７℃への加温の前に、ＨｅＬａ−Ｅｎｖ及びＰＭ１細胞を２５℃で２時間同時インキュベートした。値は、三回（Ａ、Ｂ）又は二回（Ｃ、Ｄ）行った独立のアッセイの平均を表している。
【図１０】
ＰＲＯ５４２とＴ−２０の組み合わせによるＨＩＶ−１の侵入阻害に対する併用指標値と用量減少。
【図１１】
ＨＩＶ−１の侵入には、治療の目標となる少なくとも３つの段階、すなわち、ｇｐ１２０−ＣＤ４の付着、ｇｐ１２０−補助受容体相互作用、ｇｐ４１を介した融合が関与する。
【図１２】
ＰＲＯ  ５４２（ＣＤ４−ＩｇＧ２）付着阻害剤。
【図１３】
ＰＲＯ  １４０補助受容体阻害剤。
【図１４】
Ｔ２０融合阻害剤。
【図１５】
ＨＩＶ−１ウイルス細胞融合アッセイ。
【図１６】
ＰＲＯ５４２とＴ−２０によるウイルス−細胞融合の相乗的阻害。ＰＲＯ５４２のみ（・・・黒三角・・・）、Ｔ−２０のみ（−−黒丸−−）、１：２混合物（−−黒四角−−）、（−−−−−−）混合物中のＰＲＯ  ５４２、（｜｜｜｜｜｜）混合物中のＴ−２０。用いたウイルスは、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬであった。
【図１７】
ＰＲＯ５４２及びＴ−２０によるウイルス−細胞融合の相乗的阻害。ＰＲＯ５４２とＴ−２０は１：２のモル比で使用した。
【図１８】
ＨＩＶ−１細胞−細胞融合アッセイ。ＨＩＶ−１膜融合の共鳴エネルギー転移（ＲＥＴ）アッセイ。
【図１９】
ＰＲＯ５４２とＴ−２０による細胞−細胞融合の相乗的阻害。ＰＲＯ５４２のみ（・・・黒三角・・・）、Ｔ−２０のみ（−−黒丸−−）、１：１０混合物（−−黒四角−−）、（−−−−−−）混合物中のＰＲＯ  ５４２、（｜｜｜｜｜｜）混合物中のＴ−２０。用いたウイルスは、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬであった。
【図２０】
１：２、１：１０、及び１：５０の比のＰＲＯ５４２とＴ−２０による細胞−細胞融合の相乗的阻害。
【図２１】
ＰＲＯ１４０、ＰＲＯ５４２、及びＴ−２０を三重に組み合わせることによって、ＨＩＶ−１の侵入が相乗的に遮断される。ＰＲＯ１４０のみ（・・・黒菱形・・・）、ＰＲＯ５４２のみ（・・・黒三角・・・）、Ｔ−２０のみ（−−黒丸−−）、１：３：３０混合物（−−黒四角−−）、（         ）混合物中のＰＲＯ１４０、（｜｜｜｜｜｜）混合物中のＰＲＯ５４２、（−−−−−−）混合物中のＴ−２０。
【図２２】
ＰＲＯ１４０、ＰＲＯ５４２、及びＴ−２０を三重に組み合わせることによって、ＨＩＶ−１の侵入が相乗的に遮断される。ＰＲＯ１４０、ＰＲＯ５４２、及びＴ−２０は１：３：３０のモル比で使用した。
【図２３】
ＰＲＯ５４２は、補助受容体の不存在下では、Ｔ−２０活性を強化しない。ＰＲＯ５４２のみ（・・・黒三角・・・）、Ｔ−２０のみ（−−黒丸−−）、ＰＲＯ５４２：Ｔ−２０カクテル（−−黒四角−−）、（−−−−−−）カクテル中のＰＲＯ５４２。
【図２４】
プレヘアピン中間体の形成には、ＣＤ４、補助受容体、及び３７℃が必要である。（−−黒丸−−）Ｔ−２０標準アッセイ、（−−白丸−−）Ｔ−２０、２５℃プレインキュベーション、（・・・黒三角・・・）ＰＲＯ５４２標準アッセイ、（−−白三角−−）ＰＲＯ５４２、２５℃プレインキュベーション。
【図２５】
プレヘアピン中間体の形成には、ＣＤ４、補助受容体、及び３７℃が必要である。（−−黒丸−−）Ｔ−２０標準アッセイ、（−−白丸−−）Ｔ−２０温度シフト洗い流しアッセイ。
【図２６】
考えられる相乗効果の機序：ＰＲＯ５４２は、Ｔ−２０の標的の半減期を増加させる。
【図２７】
考えられる相乗効果の機序：ＰＲＯ５４２は、Ｔ−２０の標的の半減期を増加させる。
【図２８】
ＨＩＶ−１の侵入の相乗的阻害：ＰＲＯ５４２、Ｔ−１２４９、及びＰＲＯ５４２：Ｔ−１２４９を１：１０のモル比で組み合わせたもの（４：１の重量比での組み合わせ）によるＨＩＶ−１の侵入の阻害を、ｅｎｖを介した膜融合（ＲＥＴ）アッセイで分析した。それぞれＦ１８とＲ１８で予め標識されたＨｅＬａ−ＥｎｖＪＲ−ＦＬ＋とＰＭ１細胞の混合物に阻害剤を加えた。４時間インキュベートした後に蛍光ＲＥＴを測定し、Ｌｉｔｗｉｎらの記載（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：６４３７，１９９６）に従ってパーセント阻害を算出した。カクテル中に存在するＰＲＯ  ５４２とＴ−１２４９の濃度は、データのカーブフィットから得たものであり、用量の減少を表すために示されている。
【図２９】
ＰＲＯ５４２とＴ−１２４９を１：１０のモル比で組み合わせたものについて観察された併用指標と用量減少。図２８に記載されているように化合物を分析した。併用指標の値は、ｍｅｄｉａｎ  ｅｆｆｅｃｔ法に従って求めた。用量減少とは、阻害剤を単独で使用したときに所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度に対する相乗的な組み合わせで所定の阻害度を得るために必要な阻害剤濃度の比率である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004518624.tif 000216
【国際調査報告】
2004518624.tif 000217