(57)【要約】本発明は、ヘリコバクター感染の治療を監視する方法、および特に、免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）を用いてピロリ菌感染の根絶を監視する方法に関する。本発明はまた、感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法、並びに特に、治療しようとするかまたは治療している被験者において、インターロイキン−４、インターフェロン−γおよびＩｇＧレベルを測定することを含む、根絶に成功する可能性を予測する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染に関して治療する被験者において、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）感染の根絶を監視する方法であって：
ｉ）唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌（Ｈ．　ｐｙｌｏｒｉ）抗体レベルの測定；
ｉｉ）該ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルと、あらかじめ決定した対照ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルとの比較、ここで対照と比較した唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの減少が、ヘリコバクター根絶を示す
を含む、前記方法。
【請求項２】
感染に関して治療する被験者において、ヘリコバクター感染の治療有効性を監視する方法であって：
ｉ）唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの測定；
ｉｉ）該ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルと、あらかじめ決定した対照ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルとの比較、ここで対照と比較した唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの減少が、ヘリコバクターの効果的な治療を示す
を含む、前記方法。
【請求項３】
ヘリコバクターでの感染に関して治療する被験者において、ヘリコバクターの再発または再感染を監視する方法であって：
ｉ）唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの測定；
ｉｉ）該ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルと、あらかじめ決定した対照ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルとの比較、ここで対照と比較した唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの増加が、ヘリコバクターの再発または再感染を示す
を含む、前記方法。
【請求項４】
ヘリコバクター感染の治療への被験者の不反応性を検出する方法であって：
ｉ）唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの測定；
ｉｉ）該ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルと、あらかじめ決定した対照ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルとの比較、ここで対照と比較した唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの変化の欠如が、治療への反応欠如を示す
を含む、前記方法。
【請求項５】
ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体をイムノアッセイによって検出する、請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
アッセイがＥＬＩＳＡである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体の対照レベルを、ピロリ菌に感染していない被験者から得た唾液試料において確立する、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体の対照レベルを、被験者自身の唾液試料中で測定する、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
ヘリコバクター感染の治療を監視するキットであって：
（ｉ）ヘリコバクター抗原
（ｉｉ）ＩｇＧ２サブクラス抗体を測定する試薬
を含む、前記キット。
【請求項１０】
感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法であって：
（ｉ）被験者由来の試料中のＩＬ−４レベルの測定；
（ｉｉ）該ＩＬ−４レベルと、あらかじめ決定した対照または標準ＩＬ−４レベルとの比較、
（ｉｉｉ）被験者由来の試料中のＩＬ−４レベルが対照または標準ＩＬ−４レベルより高いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩＬ−４レベルが対照または標準ＩＬ−４レベルより低いと、根絶に失敗する可能性が予測される
を含む、前記方法。
【請求項１１】
試料が血液試料である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＩＬ−４をイムノアッセイによって検出する、請求項１０または請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
アッセイがＥＬＩＳＡである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＩＬ−４の対照または標準レベルを、ピロリ菌に感染していない被験者および／またはピロリ菌根絶に成功した被験者および／またはピロリ菌に感染した被験者から得た試料の解析から確立する、請求項１０から１３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法であって：
（ｉ）被験者由来の試料中のインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）レベルの測定；
（ｉｉ）該ＩＮＦ−γレベルと、あらかじめ決定した対照または標準ＩＮＦ−γレベルとの比較、
（ｉｉｉ）被験者由来の試料中のＩＮＦ−γレベルが対照または標準ＩＮＦ−γレベルより低いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩＦＮ−γレベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に失敗する可能性が予測される
を含む、前記方法。
【請求項１６】
試料が血液試料である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＩＦＮ−γレベルをイムノアッセイによって検出する、請求項１５または請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
アッセイがＥＬＩＳＡである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＩＦＮ−γの対照または標準レベルを、ピロリ菌に感染していない被験者および／またはピロリ菌根絶に成功した被験者および／またはピロリ菌に感染した被験者から得た試料の解析から確立する、請求項１５から１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法であって：
（ｉ）被験者由来の試料中の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルの測定；
（ｉｉ）該ＩｇＧレベルと、あらかじめ決定した対照または標準ＩｇＧレベルとの比較、
（ｉｉｉ）被験者由来の試料中のＩｇＧレベルが対照または標準レベルより低いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩｇＧレベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に失敗する可能性が予測される
を含む、前記方法。
【請求項２１】
試料が血清試料である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
試料が唾液試料である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
ＩｇＧの対照または標準レベルを、ピロリ菌に感染していない被験者および／またはピロリ菌根絶に成功した被験者および／またはピロリ菌に感染した被験者から得た試料の解析から確立する、請求項２０から２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法であって：
（ｉ）被験者由来の試料中のＩＬ−４および／またはＩＮＦ−γおよび／またはＩｇＧレベルの組み合わせの測定；
（ｉｉ）該ＩＬ−４および／またはＩＮＦ−γおよび／またはＩｇＧレベルと、それぞれ、あらかじめ決定した対照または標準ＩＬ−４および／またはＩＮＦ−γおよび／またはＩｇＧレベルとの比較、
ここで、被験者由来の試料中のＩＬ−４レベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩＬ−４レベルが対照または標準レベルより低いと、根絶に失敗する可能性が予測され、そして
被験者由来の試料中のＩＮＦ−γレベルが対照または標準レベルより低いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩＦＮ−γレベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に失敗する可能性が予測され、そして
被験者由来の試料中のＩｇＧレベルが対照または標準レベルより低いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩｇＧレベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に失敗する可能性が予測される
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）感染の治療を監視する方法、および特に、免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）を用いてピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）感染の根絶を監視する方法に関する。本発明はまた、感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法、特に、治療しようとするかまたは治療している被験者において、インターロイキン−４、インターフェロン−γおよびＩｇＧレベルを測定することを含む、根絶に成功する可能性を予測する方法にも関する。
【０００２】
背景技術
本明細書全体の先行技術のいかなる議論も、決して、こうした先行技術が広く知られているかまたは該分野の通常の一般的な知識の一部を形成することを是認するとみなしてはならない。
【０００３】
ピロリ菌感染は、現在、胃癌が発展する、必須の前提条件と認識されている。集団の約３０％がこの細菌に感染し、そして通常、慢性胃炎と共に存在する。これは、胃または十二指腸潰瘍によって悪化する可能性があるか、あるいは非潰瘍消化不良として存在する可能性がある。キャリアーの相当数は無症候性である。しかし、ピロリ菌を有する患者の少数では、段階（上皮細胞化生および形成異常を含む）を通じて異常が発展し、新形成となる。
【０００４】
ピロリ菌感染の現在の処置慣例
抗生物質を用いた感染根絶は、消化性潰瘍形成の８０−９０％の治癒率を誘導する。広く認められた治療パラダイムは、先に内視鏡診断を伴わない、抗体アッセイを用いた感染検出、これに続く、併用抗生物質療法に基づく。根絶療法前の内視鏡検査は、「危険な」症状（例えば激しい痛み、出血）が生じたか、または胃癌の有意なリスクが存在する場合に、一般的に認められる。しかし、内視鏡検査は、それ自体のリスクと関連する処置であり、そして可能な場合、避けるべきものである。
【０００５】
ピロリ菌は、唾液と共に血清において、ＩｇＧ抗体反応を開始する。血清ＩｇＧ抗体は、非侵襲性診断の基礎である。感染の根絶に続いて、血清抗体レベルの非常に緩慢な低下が生じる。根絶の成功を評価する際、６ヶ月でのＩｇＧ抗体レベルに価値がある可能性があると示唆する研究がなされてきた。しかし、ＩｇＧ抗体の唾液レベルは、根絶後、はるかに迅速に低下し、６週でのレベルは、一様に、抗生物質療法前のものの８０％未満である。
【０００６】
唾液ＩｇＧ抗体レベルが根絶の成功を予測する可能性があるという概念は魅力的であるが、ヘリコバクターの治療進行または根絶を監視するのに実際的な案ではないことが立証された。これは総ＩｇＧ抗体レベルが不安定であり、臨床環境における実行可能な試験が信頼できないことが立証される程度であったためである。現在、ヘリコバクター感染を根絶するよう設計された治療の監視に成功するであろう、非侵襲性の安定な試験は存在しない。
【０００７】
さらに、治療する個体においてピロリ菌の根絶を監視するのに加え、ピロリ菌の根絶に成功する可能性を決定する、治療前に、または治療中に使用可能な試験を有することが望ましいであろう。
【０００８】
先行技術の不都合な点の少なくとも１つを克服するかまたは改良し、あるいは有用な代替法を提供するのが本発明の目的である。
【０００９】
発明の概要
第一の側面にしたがって、感染に関して治療する被験者において、ヘリコバクター感染の根絶を監視する方法であって：
ａ）唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの測定；
ｂ）該ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルと、あらかじめ決定した対照ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルとの比較、ここで対照と比較した唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの減少が、ヘリコバクター根絶を示す
を含む、前記方法を提供する。
【００１０】
第二の側面にしたがって、感染に関して治療する被験者において、ヘリコバクター感染の治療有効性を監視する方法であって：
ａ）唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの測定；
ｂ）該ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルと、あらかじめ決定した対照ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルとの比較、ここで対照と比較した唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの減少が、ヘリコバクターの効果的な治療を示す
を含む、前記方法を提供する。
【００１１】
第三の側面にしたがって、ヘリコバクターでの感染に関して治療する被験者において、ヘリコバクターの再発または再感染を監視する方法であって：
ａ）唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの測定；
ｂ）該ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルと、あらかじめ決定した対照ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルとの比較、ここで対照と比較した唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの増加が、ヘリコバクターの再発または再感染を示す
を含む、前記方法を提供する。
【００１２】
第四の側面にしたがって、ヘリコバクター感染の治療への被験者の不反応性を検出する方法であって：
ａ）唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの測定；
ｂ）該ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルと、あらかじめ決定した対照ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルとの比較、ここで対照と比較した唾液試料中のＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの変化の欠如が、治療への反応欠如を示す
を含む、前記方法を提供する。
【００１３】
第六の側面にしたがって、ヘリコバクター感染の治療を監視するキットであって：
ａ）ヘリコバクター抗原
ｂ）ＩｇＧ２サブクラス抗体を測定する試薬
を含む、前記キットを提供する。
【００１４】
好ましくは、ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体は、近被験者（ｎｅａｒ−ｓｕｂｊｅｃｔ）アッセイによって検出する。しかし、アッセイはまた、実験室に基づく試験であることも可能である。好ましくは、アッセイは抗体アッセイであるが、他の既知の測定法もまた、有効に使用可能であることが理解されるであろう。最も好ましくは、アッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは同様のアッセイ形式などのイムノアッセイである。
【００１５】
ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体の対照レベルは、正常な個体、すなわちピロリ菌感染を確立していない個体から得た唾液試料において確立可能である。しかし、ＩｇＧ２の対照レベルを、感染治療開始前の被験者自身の唾液において測定するか、あるいは再発または再感染を監視する場合、ヘリコバクター根絶成功後の唾液ＩｇＧ２レベルを測定することが好ましい。
【００１６】
第七の側面にしたがって、本発明は、感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法であって：
（ｉ）被験者由来の試料中のＩＬ−４レベルの測定；
（ｉｉ）該ＩＬ−４レベルと、あらかじめ決定した対照または標準ＩＬ−４レベルとの比較、
（ｉｉｉ）被験者由来の試料中のＩＬ−４レベルが対照または標準ＩＬ−４レベルより高いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩＬ−４レベルが対照または標準ＩＬ−４レベルより低いと、根絶に失敗する可能性が予測される
を含む、前記方法を提供する。
【００１７】
好ましくは、試料は血液試料である。
好ましくは、ＩＬ−４はイムノアッセイによって検出し、そしてより好ましくは、ＥＬＩＳＡによって測定する。
【００１８】
当業者は、適切な対照または標準ＩＬ−４レベルを容易に同定可能であろう。例えば、ＩＬ−４の対照または標準レベルは、ピロリ菌に感染していない被験者および／またはピロリ菌根絶に成功した被験者および／またはピロリ菌に感染した被験者から得た試料の解析から確立可能である。
【００１９】
第八の側面にしたがって、本発明は、感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法であって：
（ｉ）被験者由来の試料中のインターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）レベルの測定；
（ｉｉ）該ＩＮＦ−γレベルと、あらかじめ決定した対照または標準ＩＮＦ−γレベルとの比較、
（ｉｉｉ）被験者由来の試料中のＩＮＦ−γレベルが、対照または標準ＩＮＦ−γレベルより低いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩＦＮ−γレベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に失敗する可能性が予測される
を含む、前記方法を提供する。
【００２０】
好ましくは、ＩＮＦ−γレベルは、血液試料中で測定する。
好ましくは、ＩＦＮ−γレベルはイムノアッセイによって検出し、そして好ましくは、アッセイはＥＬＩＳＡである。
【００２１】
当業者は、適切な対照または標準を容易に確立可能であろう。例えば、ＩＦＮ−γの対照または標準レベルは、ピロリ菌に感染していない被験者および／またはピロリ菌根絶に成功した被験者および／またはピロリ菌に感染した被験者から得た試料の解析から確立可能である。
【００２２】
第九の側面にしたがって、本発明は、感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法であって：
（ｉ）被験者由来の試料中の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）レベルの測定；
（ｉｉ）該ＩｇＧレベルと、あらかじめ決定した対照または標準ＩｇＧレベルとの比較、
（ｉｉｉ）被験者由来の試料中のＩｇＧレベルが対照または標準レベルより低いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩｇＧレベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に失敗する可能性が予測される
を含む、前記方法を提供する。
【００２３】
好ましくは、ＩｇＧレベルは血清試料中で測定し、そしてより好ましくは、試料は唾液試料である。
当業者は、適切な対照または標準ＩｇＧレベルを容易に確立可能であろう。例えば、ＩｇＧの対照または標準レベルは、ピロリ菌に感染していない被験者および／またはピロリ菌根絶に成功した被験者および／またはピロリ菌に感染した被験者から得た試料の解析から確立可能である。
【００２４】
第十の側面にしたがって、本発明は、感染に関して治療しようとするかまたは治療している被験者において、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測する方法であって：
（ｉ）被験者由来の試料中のＩＬ−４および／またはＩＮＦ−γおよび／またはＩｇＧレベルの組み合わせの測定；
（ｉｉ）該ＩＬ−４および／またはＩＮＦ−γおよび／またはＩｇＧレベルと、それぞれ、あらかじめ決定した対照または標準ＩＬ−４および／またはＩＮＦ−γおよび／またはＩｇＧレベルとの比較、
ここで、被験者由来の試料中のＩＬ−４レベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩＬ−４レベルが対照または標準レベルより低いと、根絶に失敗する可能性が予測され、そして
被験者由来の試料中のＩＮＦ−γレベルが対照または標準レベルより低いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩＦＮ−γレベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に失敗する可能性が予測され、そして
被験者由来の試料中のＩｇＧレベルが対照または標準レベルより低いと、根絶に成功する可能性が予測され、そしてＩｇＧレベルが対照または標準レベルより高いと、根絶に失敗する可能性が予測される
を含む、前記方法を提供する。
【００２５】
好ましい態様の説明
驚くべきことに、唾液ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体が安定であり、そして治療を受けている被験者において、ピロリ菌感染の治療進行および／または根絶を監視するために開発すべき、信頼しうる試験を可能にすることが見出された。
【００２６】
血液および胃粘膜中のＩｇＧ抗ピロリ菌抗体レベルをピロリ菌状態の指標として使用可能であることが、先に知られていた。同様の目的のために唾液中のＩｇＧ抗ピロリ菌抗体を使用する試みがなされてきたが、こうした試料において該抗体が不安定であることが立証された。以下の例から、ＩｇＧ抗ピロリ菌は、ピロリ菌状態の一般的な指標として使用可能である可能性があるが、開発すべき安定な治療監視試験を可能にするのは、ＩｇＧ２サブクラス抗ピロリ菌抗体の測定であることが理解されるであろう。
【００２７】
さらに驚くべきことに、ピロリ菌根絶成功の予測因子として、ＩＬ−４レベルが使用可能であることが見出された。ＩＬ−４試験は、根絶可能性を予測するため、ピロリ菌感染の治療前、または治療中に、使用可能であることが予見される。
【００２８】
ヒト試料中の抗体およびＩＬ−４の測定技術は、当該技術分野に公知であり、そしてプロトコルおよび試薬は、容易に入手可能である。いくつかの測定がどのように実行可能かの例として、使用する技術のいくつかの例を以下に示す。
【００２９】
別に示さない限り、標準的な教科書および実験室マニュアルから確かめることが可能な標準的な技術が使用可能である。
ここから本発明は、限定しない実施例に関連して、より詳細に記載される。
【００３０】
【実施例】
実施例１　唾液試料中の抗体レベルの測定
試料収集
唾液試料は、アモキシシリン、オメプラゾールおよびクラリスロマイシンで構成される根絶三重療法で７日間治療した、ピロリ菌に感染した４患者から収集した。試料は、治療前および根絶療法１０日後に採取した。
【００３１】
ピロリ菌抗原調製
ピロリ菌ＮＣＴＣ１１６３７株を、Ｇｏｏｄｗｉｎ（＃２０８）に記載される修飾法にしたがったピロリ菌抗原調製に用いた。抽出物中のタンパク質濃度は、ｂｉｏ−ｒａｄキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて測定した。アリコットを−７０℃で保存した。
【００３２】
ＥＬＩＳＡによる抗体検出
唾液抗ピロリ菌抗体検出のため、９６ウェル平底マイクロタイターＰｏｌｙｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）のウェルを、７μｇ／ｍｌのピロリ菌抗原で、４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中の５％脱脂乳（Ｄｉｐｌｏｍａ、オーストラリア）でブロッキングした後、２％ＰＥＧ６０００で１：２希釈した唾液試料を、三つ組で個々のウェルに添加した。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲート化したヒツジ抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＧ２（Ｓｉｌｅｎｕｓ、オーストラリア）１：２０００希釈を、各ウェルに添加した。さらにインキュベーションした後、プレートを洗浄し、そしてその後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｉｇｍａ、米国）を各ウェルに添加した。１モル／ｌ　Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止し、そしてＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ４５０、日本）中、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。結果は、既定の唾液試料の平均ＯＤ４５０を較正試料の平均ＯＤ４５０で割った、ＥＬＩＳＡ指標として表した。陽性および陰性品質管理試料を各実行に含み、アッセイ内およびアッセイ間変動に関して管理した。
【００３３】
ピロリ菌に感染した５人の被験者から、唾液試料を得た。新鮮な試料または１２ヶ月まで保存した後の試料いずれかを、ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＩｇＧ２および総ＩｇＧ抗ピロリ菌抗体に関して試験した。結果は、ＩｇＧ２抗体レベルが、ＩｇＧ抗体レベルより、より安定であったことを示す（図１）。したがって、保存およびアッセイ中に安定であるため、ＩｇＧ２抗体は、感染状態の信頼しうる、そして高感度な指標である。
【００３４】
実施例２　根絶療法を受けている患者由来の唾液中の抗ピロリ菌抗体レベル
抗生物質根絶療法を受けている被験者由来の唾液試料を、実施例１に記載したイムノアッセイ法を用いて、抗ピロリ菌抗体に関して試験した。
【００３５】
ＩｇＧおよびＩｇＧ２抗体を、抗生物質での治療前および治療後に測定した。治療１０日後、ＩｇＧ２抗体レベルは、総ＩｇＧ抗体レベルより、迅速に低下した（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００３６】
別個の研究において、ピロリ菌に感染した被験者由来の唾液は、感染していない被験者（図３Ｂ）に比較した際、ＩｇＧ２レベルが顕著に上昇する（図３Ａ）ことが示された。最終的に感染を根絶するのに失敗した被験者は、ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体レベルの有意な低下を示さなかった。
【００３７】
実施例３−インターロイキン−４／ＩＦＮ−γおよびＩｇＧ研究
被験者
消化不良の検査のため紹介された５２人の被験者、および抗生物質１クール以上の後、持続するピロリ菌感染を持つ１１人の被験者を、この研究に採用した。消化不良の被験者は、研究の３ヶ月以内に、抗生物質を投与されていなかった。研究は、消化性疾患センター倫理委員会（Ｅｔｈｉｃｓ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、オーストラリア・シドニーによって認可された。すべての患者からインフォームドコンセントを得た。組織培養、組織像およびウレアーゼ試験（ＣＬＯ試験、オーストラリア・ウェスタンオーストラリア州デルタウェスト）に用いるため、多数の生検標本を、胃の幽門洞および本体から、上部消化管内視鏡検査中に得た。血液試料は、収集２時間以内に３７℃でインキュベーションした。血清は、ピロリ菌特異的抗体用に−７０℃で保存した。
【００３８】
唾液試料収集
唾液試料は、内視鏡処置前に収集した。試料を１０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離し、そしてアリコットを−７０℃で保存した。
【００３９】
生検培養
胃生検組織の重量測定をし、そして該組織をｍｇ組織（湿重量）あたり、５０μｌ血清不含ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、オーストラリア）の比で、２４時間培養した。培養上清を収集し、そして遠心分離した。アッセイまで、アリコットを−７０℃で保存した。
【００４０】
ピロリ菌抗原調製
ＮＣＴＣ１１６３７株由来のピロリ菌抗原を、Ｇｏｌｄｗｉｎら（Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ　１９８７；１５５：４８８−９４）によって記載される方法にしたがって、酸−グリシン抽出（ＡＧＥ）によって調製した。ピロリ菌ＡＧＥは、細胞培養および特異的抗体測定に用いた。
【００４１】
全血培養中のＩＬ−４に関するＥＬＩＳＡ捕捉アッセイ
全血培養中のサイトカインレベルは、先に記載される方法（Ｒｅｎら，　Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　２０００；５：１３５−４１）にしたがって測定した。簡潔には、１５０μｌのヘパリン処理全血を、マウスポリクローナル抗ヒトＩＬ−４抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ、米国マサチューセッツ州）でプレコーティングした９６ウェルマイクロタイター平底プレートのウェルに三つ組で添加した。０、１または１０μｇ／ｍｌいずれかでピロリ菌ＡＧＥを含有する、等量のＡＩＭ−Ｖ培地もまた、ウェルに装填した。５％ＣＯ２と共に、培養を３７℃で２４時間インキュベーションし、その後、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）アッセイ用に上清を収集した。「捕捉された」ＩＬ−４の量は、以下のようにＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔には、プレートを洗浄した後、ビオチン化マウスモノクローナル抗ヒトＩＬ−４抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ、米国マサチューセッツ州）をウェルに添加し（０．５μｇ／ｍｌ）、そして室温で９０分間インキュベーションした。その後、プレートを洗浄し、そしてストレプトアビジンをコンジュゲート化した西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｅｌｉｎｕｓ、オーストラリア）１：４００希釈と共に、室温でさらに３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄緩衝液で徹底的に洗浄し、そして最後に、３，３’−５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）基質と共に、室温で１０分間インキュベーションした。１モル／ｌ　Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止し、そしてＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ４５０、日本）中、４５０ｎｍの光学密度（ＯＤ４５０ｎｍ）を測定した。各プレートに対して、標準ＩＬ−４（Ｅｎｄｏｇｅｎ、米国マサチューセッツ州）を適用し、プレート間変動を管理した。ＩＬ−４感度限界は９．４ｐｇ／ｍｌであった。試料中のＩＬ−４量は、Ｓｏｆｔｍａｘプログラム（バージョン２．３　ＦＰＵ、米国）を用いて決定した。
【００４２】
ＩＦＮ−γ　ＥＬＩＳＡアッセイ
９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）のウェルを、２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ、米国マサチューセッツ州）で、４℃で一晩コーティングした。洗浄し、そしてブロッキングした後、全血培養由来の上清またはＩＦＮ−γ標準（Ｅｎｄｏｇｅｎ、米国マサチューセッツ州）を、二つ組で添加し、そして９０分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、そしてビオチン化マウスモノクローナル抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ、米国マサチューセッツ州）を添加した（０．２５μｇ／ｍｌ）。９０分間インキュベーションした後、ウェルを洗浄し、そしてストレプトアビジンをコンジュゲート化した西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｅｌｉｎｕｓ、オーストラリア）を１：２０００希釈で適用した。プレートを洗浄し、そしてＴＭＢ色素原（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を各ウェルに添加した。ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ４５０、日本）中、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。ＩＦＮ−γ感度限界は９．４ｐｇ／ｍｌであった。試料中のＩＦＮ−γ量は、Ｓｏｆｔｍａｘプログラム（バージョン２．３　ＦＰＵ、米国）を用いて決定した。
【００４３】
ピロリ菌抗体の検出
９６ウェル平底マイクロタイタープレートのウェルを、５μｇ／ｍｌのピロリ菌ＡＧＥで、４℃で一晩コーティングした。洗浄し、そしてブロッキングした後、１：３０００希釈の血清試料および１：４希釈の唾液試料を、三つ組でウェルに添加した。西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲート化したヒツジ抗ＩｇＧ（Ｓｅｌｉｎｕｓ、オーストラリア）を１：２０００希釈で適用した。発色には、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を用いた。ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ４５０、日本）中、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。結果は、プールした陽性血清の参考標準に対するＥＬＩＳＡ単位として表した。アッセイ内およびアッセイ間変動は、１０％未満であった。
【００４４】
統計解析
データは平均±標準誤差（ＳＥ）として表した。相関Ｚ検定を用いて、粘膜および血液サイトカイン産生間の相関に関して試験した。患者群間の平均の相違は、ＡＮＯＶＡによって解析した。すべての統計解析は、ＳｔａｔＶｉｅｗ４．５ソフトウェアプログラム（Ａｂａｃｕｓ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、米国カリフォルニア州）を用いることによって行った。ｐ値が０．０５未満である場合、有意差とみなした。
【００４５】
結果
ピロリ菌感染状態および抗生物質治療の結果にしたがって、被験者を４つの群に分けた。２３人のピロリ菌陰性被験者；２０人のピロリ菌陽性被験者；根絶療法の６−８週間後、組織像またはＣ１４呼吸試験によって、ピロリ菌根絶に成功したことが確認された、９人の被験者；および抗生物質療法後、ピロリ菌耐性であった１１人の被験者であった。根絶に失敗した被験者の診断および療法措置の詳細を表１に示す。
【００４６】
血液および粘膜ＩＬ−４反応の比較
ピロリ菌感染への血液および粘膜サイトカイン反応間の相関があるかどうか決定するため、ピロリ菌抗原刺激または未刺激全血培養中のＩＬ−４産生レベルを、胃粘膜培養中のレベルと比較した（図１）（抗原刺激した培養からのデータは示していない）。ピロリ菌陽性（ｎ＝６）および陰性被験者（ｎ＝１１）、並びに根絶に失敗した被験者（ｎ＝８）の結果は、全血培養（刺激または未刺激）中のＩＬ−４産生が胃粘膜中のものと相関することを示した（ｒ２＝０．５４９、ｐ＜０．００１）。
【００４７】
全血培養中のＩＬ−４およびＩＦＮ−γ産生
根絶に失敗した被験者由来の、ピロリ菌ＡＧＥ刺激または未刺激全血培養には、ピロリ菌根絶に成功した被験者（ｐ＜０．０５、０および１．０μｇ／ｍｌピロリ菌ＡＧＥ；ｐ＜０．０１、１０μｇ／ｍｌピロリ菌ＡＧＥ）または感染を治療していない被験者（ｐ＜０．０５、１０μｇ／ｍｌピロリ菌ＡＧＥ）に比較して、有意により低いレベルのＩＬ−４が検出された（図２）。ＩＬ−４レベルは、非感染被験者および感染被験者で同様であり、そして根絶に成功した被験者に比較した際、有意に異ならなかった（しかし、根絶後、レベル増加に向かう傾向があった）。異なる群間でＩＦＮ−γレベルの統計的に有意な相違はなかったが、ピロリ菌根絶に成功した被験者では、より低いレベルが検出された（図３）。療法クール数と関わりなく、耐性ピロリ菌に現在感染している被験者の大部分で、低レベルのＩＬ−４分泌が見られた（表２）。
【００４８】
血清および唾液中の抗ピロリ菌ＩｇＧレベル
血清および唾液ＩｇＧ抗体レベルはどちらも、ピロリ菌に関して陽性である被験者におけるより、非感染被験者（ｐ＜０．０５）において、そして根絶療法６−８週間後の被験者（ｐ＜０．０５）において、有意により低かった。唾液および血清抗体両方に関して、感染根絶に失敗した被験者において、抗体がより低いレベルに向かう傾向が見られたが、これは、統計的有意性には足りなかった（図４）。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
【表２】
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【００５１】
【表３】
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【００５２】
当業者は、上記を考慮して、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γおよびＩｇＧを用いて、感染の治療前にまたは治療中に、ヘリコバクター感染の根絶に成功する可能性を予測可能であることを理解するであろう。必然的に、該方法を用いて、ヘリコバクター感染の治療に反応する可能性がない被験者も同定可能であることが明らかであろう。
【００５３】
本発明は、特定の実施例に関連して記載されてきているが、本発明は、本発明の概念の精神または目的から逸脱することなく、多くの他の形で実行可能であることが、当業者には認識されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】唾液ＩｇＧ２抗ピロリ菌抗体の安定性
【図２】ピロリ菌根絶前および後の唾液ＩｇＧ（パネルＡ）およびＩｇＧ２（パネルＢ）抗ピロリ菌抗体
【図３】ピロリ菌に感染した、および感染していない被験者における、唾液ＩｇＧ（パネルＡ）およびＩｇＧ２（パネルＢ）抗ピロリ菌抗体
【図４】全血および胃組織培養におけるＩＬ−４産生間の相関。全血培養または胃幽門洞生検培養を、３７℃で２４時間インキュベーションし、その後、ＩＬ−４レベルをＥＬＩＳＡ捕捉アッセイによって測定した。粘膜および全血ＩＬ−４間の相関を示す結果（ｐ＜０．００１）。
【図５】ピロリ菌ＡＧＥ抗原で刺激した全血培養中のＩＬ−４レベル。ピロリ菌に感染した、または感染していない、あるいは根絶に失敗した被験者から得た末梢血を、示したように段階的な濃度でピロリ菌ＡＧＥ抗原を含有する、等量のＡＩＭ−Ｖ培地に添加した。培養２４時間後、ＩＬ−４レベルをＥＬＩＳＡ捕捉アッセイによって測定した。示した結果は、平均±平均の標準誤差である。＊：ｐ＜０．０５：ピロリ菌根絶被験者と比較；¶：ｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５：それぞれ、ピロリ菌根絶およびピロリ菌陽性の被験者からの値と比較。
【図６】全血における、ピロリ菌、酸−グリシン抽出物刺激に反応したＩＦＮ−γ産生。個々の被験者から末梢血を収集し、そして段階的な濃度のピロリ菌ＡＧＥ抗原の存在下で２４時間培養した。培養上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γに関してアッセイした。示した結果は、平均±平均の標準誤差であった。ＮＳ：有意でない。
【図７】血清および唾液中の特異的ピロリ菌ＩｇＧ抗体レベル。個々の被験者から血清および唾液試料を収集した。特異的ピロリ菌ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。示した結果は、平均±平均の標準誤差であった。＊：ｐ＜０．０５：ピロリ菌陽性群の平均と比較；ＮＳ：有意でない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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