(57)【要約】試料中の少なくとも1つの、通常複数のDNA結合タンパク質、例えば、転写因子の存在を定性的および定量的に検出する方法が提供されている。本発明の方法において、1つが関心対象のDNA結合タンパク質1つに対応する1つまたはそれ以上のDNAプローブが表面に固定されている基材に、プローブとそれぞれのDNA結合タンパク質の複合体を結合させて生成させるのに十分な条件下で試料を接触させる。試料を1つまたはそれ以上のDNA結合タンパク質に関して精製されていても、または試料は細胞／核抽出物であってもよい。結果として生じる基材の表面の結合複合体を次いで検出し、試料中の関心対象のDNA結合タンパク質-DNA相互作用の存在に関連させる。また、本発明の方法を実施する際に使用する装置およびシステムも提供される。本発明の方法は、種々の異なる用途、例えば、試料中の転写因子の存在の検出、所定の刺激に応答する転写因子プロファイルの検討、治療薬のスクリーニング等における使用を見出している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のDNA結合タンパク質の存在を検出する方法であって、
(a)表面にプローブが特異的に固定されているDNA結合タンパク質によって基材に試料を接触させる段階と、
(b)DNA結合タンパク質に対するプローブの任意の結合複合体を検出してアッセイデータを得る段階と、
(c)試料中のDNA結合タンパク質の存在にアッセイデータを関連させる段階と
を含み、EMSA対照アッセイ法の感度より高感度であることによって特徴づけられる方法。
【請求項２】
DNA結合タンパク質が転写因子である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
試料が精製転写因子試料である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
試料が細胞抽出物である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細胞抽出物が核抽出物である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
DNA結合タンパク質が転写因子であり、表面が少なくとも2つの異なる転写因子に対する少なくとも2つの異なるプローブを含み、少なくとも2つの異なる転写因子の存在を同時に  アッセイする方法である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
基材が、少なくとも5つの異なる転写因子に対する少なくとも5つの異なるプローブを含む、請求項5記載の方法。
【請求項８】
結合複合体が、転写因子に特異的な親和性試薬を含むシグナル生成システムを使用して検出される、請求項2記載の方法。
【請求項９】
親和性試薬が直接検出可能である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
親和性試薬が間接的に検出可能である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
試料中の転写因子の量を定量する、請求項2記載の方法。
【請求項１２】
プローブが、転写因子の共通配列を含む、請求項2記載の方法。
【請求項１３】
表面が少なくとも2つの異なる転写因子に対する少なくとも2つの異なるプローブを含み、少なくとも2つの異なるプローブが流体障壁によって互いに分離されておらず、少なくとも2つの異なる転写因子の存在を同時にアッセイする方法である、請求項2記載の方法。
【請求項１４】
1つのシグナル生成システム流体組成物に存在する少なくとも2つの異なる転写因子の各々に特異的な親和性試薬を含むシグナル生成システムを使用して結合複合体が検出される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
試料中の2つまたはそれ以上の異なる転写因子の量を定量する方法であって、
(a)2つまたはそれ以上の異なる転写因子の各々に対する別個のプローブ組成物が表面に固定されている基材を試料に接触させる段階であって、別個のプローブ組成物の各々が、転写因子共通配列を含む2本鎖核酸分子から作製されている段階と、
(b)プローブと転写因子の任意の結合複合体を検出してアッセイデータを得る段階と、
(c)アッセイデータを試料中の少なくとも2つの転写因子の量に関連させる段階と
を含む方法。
【請求項１６】
試料が細胞抽出物である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
試料が核抽出物である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
流体障壁が、表面の任意の2つの別個のプローブ組成物を分離している、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
基材がマルチウェルプレートであり、別個のプローブ組成物の各々がマルチウェルプレートの別個のウェルに存在する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
流体障壁が、表面の少なくとも2つの別個のプローブ組成物を分離していない、請求項15記載の方法。
【請求項２１】
試料中の少なくとも5つの異なる転写因子を定量する方法である、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
検出する段階が、転写因子に特異的な親和性試薬を含むシグナル生成システムを使用する段階を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
親和性試薬が直接検出可能である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
親和性試薬が間接的に検出可能である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
試料中の少なくとも5つの異なる転写因子を検出するアッセイ装置であって、
少なくとも5つの異なるプローブ組成物が表面に固定されており、少なくとも5つの異なるプローブ組成物の各々が転写因子共通配列を含む2本鎖核酸分子から作製されている基材
を含む装置。
【請求項２６】
装置が少なくとも10の異なるプローブ組成物を含む、請求項25記載のアッセイ装置。
【請求項２７】
少なくとも5つの異なるプローブ組成物の少なくとも2つが流体障壁によって分離されていない、請求項25記載のアッセイ装置。
【請求項２８】
アレイの任意の2つのプローブ組成物が流体障壁によって分離されている、請求項25記載のアッセイ装置。
【請求項２９】
試料中の少なくとも5つの異なる転写因子の存在を定量するキットであって、
(a)少なくとも5つの異なるプローブ組成物が表面に固定されており、少なくとも5つの異なるプローブ組成物の各々が、転写因子共通配列を含む2本鎖核酸分子から作製されている基材と、
(b)少なくとも5つの異なる転写因子の各々に対するシグナル生成システムと
を含むキット。
【請求項３０】
シグナル生成システムが、転写因子に特異的な親和性試薬を含む、請求項29記載のキット。
【請求項３１】
親和性試薬が直接検出可能である、請求項30記載のキット。
【請求項３２】
親和性試薬が間接的に検出可能である、請求項30記載のキット。
【請求項３３】
シグナル生成システムが、間接的に検出可能な親和性試薬に特異的な第2の親和性試薬をさらに含む、請求項32記載のキット。
【請求項３４】
第2の親和性試薬が、基質を発色性生物に変換する酵素部分を含む、請求項33記載のキット。
【請求項３５】
シグナル生成システムが、少なくとも5つの異なる転写因子の各々に対する異なる親和性試薬を含む1つの流体組成物である、請求項30記載のキット。
【請求項３６】
試料中の少なくとも5つの異なる転写因子の存在を定量するシステムであって、
(a)少なくとも5つの異なるプローブ組成物が表面に固定されており、少なくとも5つの異なるプローブ組成物の各々が、転写因子共通配列を含む2本鎖核酸分子から作製されている基材と、
(b)少なくとも5つの異なる転写因子の各々に対するシグナル生成システムと
を含むシステム。
【請求項３７】
シグナル生成システムが、転写因子に特異的な親和性試薬を含む、請求項36記載のシステム。
【請求項３８】
親和性試薬が直接検出可能である、請求項37記載のシステム。
【請求項３９】
親和性試薬が間接的に検出可能である、請求項37記載のシステム。
【請求項４０】
シグナル生成システムが、間接的に検出可能な親和性試薬に特異的な第2の親和性試薬を含む、請求項39記載のシステム。
【請求項４１】
第2の親和性試薬が、基質を発色性生物に変換する酵素部分を含む、請求項40記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法第119(e)節に準じ、本願は、開示内容が参照として本明細書に組み入れられている、2001年3月30日出願の米国特許仮出願第60/280,658号および2001年8月20日出願の米国特許仮出願第60/314,330号の出願日の優先権を主張する。
【０００２】
序文
発明の分野
本発明の分野は、DNA結合タンパク質、特に転写因子である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
DNA結合タンパク質とDNAとの相互作用の検討は、最も急速に成長している分子生物学の分野の1つである。DNA結合タンパク質のサブセットである転写因子は、遺伝子発現、複製および組換えの調節および制御の心臓部にある。DNAに結合する転写因子の阻害および刺激は、重要な役割を持つので、新薬の標的候補を開発する際の関心が大きい。
【０００４】
DNA-タンパク質相互作用を検討するために、DNA-タンパク質光架橋、サウスウェスタンブロット法、インビボリポーティングシステム(in vivo reporting system)および電気泳動移動度シフト解析(EMSA)などのいくつかの異なるプロトコールが開発されている。EMSAは、DNA結合タンパク質とその同種のDNA部位との機能的な関係を検討するための最も強力なツールの1つである。しかし、EMSAには、放射能の使用、試料数の限界および長いアッセイ時間などの本質的な欠点がいくつかある。これらの欠点およびハイスループット形式の必要性により、従来のEMSAを補う酵素結合DNA-タンパク質結合アッセイ法が開発されている。
【０００５】
ELISAプロトコールに基づいたアッセイ法を含むEMSAの別法が開発されている。例えば、Benotmane、Anal. Biochem. (1997) 250: 181〜185は、精製ヒトヘリカーゼ様転写因子の結合活性を検討するELISAに基づいたアッセイ法を開発した。しかし、このアッセイ法は細胞抽出物では試験されなかった。
【０００６】
同様に、McKayら、Anal. Biochem (1998) 1: 28 : 34は、候補物質の存在下において、表面に結合されたDNAプローブに精製転写因子を接触させるELISAに基づいた転写因子阻害剤スクリーニングアッセイ法を報告している。結合された転写因子は発色により検出され、試験化合物の阻害活性を誘導するために使用される。このアッセイ法も、精製転写因子とは異なり細胞抽出物では試験されず、EMSAと比較してこのアッセイ法では感度は提供されない。
【０００７】
別の転写因子ELISA型アッセイ法が、Gublerら、Biotechniques (1995) 18: 1011〜1014に報告されている。このアッセイ法では、先ず、転写因子をビオチン化ds-DNAプローブおよび転写因子に対する抗体と共にインキュベーションする。次いで、得られた混合物を抗IgGコーティングしたマイクロウェルに移し、DNA／転写因子／抗体複合体の存在をAP結合ストレプトアビジンによる呈色反応で検出する。この方法にも、反応は2つ以上の容器で実施されることおよび活性な転写因子対不活性な転写因子の検出に関する特異性の欠如、および感度の低下を含む欠点がある。
【０００８】
さらに別の転写因子アッセイ法は、Renardら、Nucleic Acids Res. (2001年2月15日) 29: E21に報告されており、この論文は、NFκB共通結合配列を含む基質結合オリゴヌクレオチドを使用する呈色アッセイ法を記載しており、この場合には、精製試料および細胞抽出物両方がアッセイされる。この書類に報告されているアッセイ法では、1つの転写因子、NFκBだけがアッセイされる。
【０００９】
転写因子および類似のDNA結合タンパク質の新規ELISA系アッセイ法の開発への関心は途切れることがない。細胞または核抽出物を含む1つの試料中の多数の転写因子を検出するために使用することができると思われ、EMSAより感度が高いこのようなアッセイ法の開発は特に興味深いと思われる。
【００１０】
関連文献
Benotmaneら (1997) Analytical Biochemistry 250: 181〜185、Gublerら、Biotechniques (1995) 18: 1011〜1014、Hibmaら、Nucleic Acids Res. (1994) 22: 3806〜3807、McKayら、Anal. Biochem (1998) 1 : 28 : 34、Mollo、Methods Mol. Biol. (2000) 130: 235〜246、Renardら、Nuc. Acids Res. (2001年2月15日) 29:E21およびRevzin、Biotechniques (1989) 7: 346〜355. (a) 米国特許第4,963,658号、同第4,978,608号、同第5,011,770号、(b) 国際公開公報第95/30026号、国際公開公報第98/08096号、国際公開公報第99/19510号、国際公開公報第01/73115号並びに(c) 欧州特許第0 620 439号および欧州特許第1 136 567号も参照のこと。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
試料中の少なくとも1つの、通常複数のDNA結合タンパク質、例えば、転写因子の存在を定性的および定量的に検出する方法が提供されている。本発明の方法において、1つが関心対象のDNA結合タンパク質1つに対応する1つまたはそれ以上のDNAプローブが表面に固定されている基材に、プローブとそれぞれのDNA結合タンパク質の複合体を結合させて生成させるのに十分な条件下で試料を接触させる。ある態様において、試料は細胞／核抽出物である。結果として生じる基材の表面の結合複合体を次いで検出し、試料中の関心対象のDNA結合タンパク質の存在に関連させる。また、本発明の方法を実施する際に使用する装置およびシステムも提供される。本発明の方法は、種々の異なる用途、例えば、所定の刺激に応答する転写因子プロファイルの検討等における使用を見出している。
【００１２】
詳細な態様の説明
試料中の少なくとも1つの、通常複数のDNA結合タンパク質（例えば、転写因子）の存在を定性的および定量的に検出する方法が提供されている。本発明の方法において、1つが関心対象のDNA結合タンパク質1つに対応する1つまたはそれ以上のDNAプローブが表面に固定されている基材に、プローブとそれぞれの転写因子の複合体を結合させて生成させるのに十分な条件下で試料を接触させる。試料は精製DNA結合タンパク質組成物であっても、または細胞／核抽出物であってもよい。結果として生じる基材の表面の結合複合体を次いで検出し、試料中の関心対象のDNA結合タンパク質（例えば、転写因子）の存在に関連させる。また、本発明の方法を実施する際に使用する装置、キットおよびシステムも提供される。本発明の方法は、種々の異なる用途、例えば、所定の刺激に応答する転写因子プロファイルの検討、治療薬のスクリーニング等における使用を見出している。本発明をさらに記載する上で、本発明が先ず記載され、次いで本発明の方法を実施する際に使用するための代表的な装置、システムおよびキットが概説されている。
【００１３】
本発明をさらに記載する前に、本発明は、当然のことながら変更されてもよく、記載されている特定の態様に限定されないことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書に使用される用語は特定の態様を記載するためであり、限定する意図のものではないことも理解されるべきである。
【００１４】
特に規定しない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本発明を実施または試験する際に、本明細書に記載されているものと同様または等価な任意の方法および材料を使用することもできるが、好ましい方法および材料をここで記載する。
【００１５】
本明細書に記載されている文献は全て、文献が引用している方法および／または材料を開示および記載するために参照として本明細書に組み入れられている。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用されている単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数形も含む。
【００１７】
本明細書に考察されている文献は、本願の出願日以前の開示についてのみ提供されている。本発明は以前の発明によってこのような文献を先行させる資格がないことを認めるものとして考えられるべきものは本明細書にはない。さらに、提供されている文献の日付は、自主的に確認する必要があると思われる実際の公開日とは異なることがある。
【００１８】
方法と装置
上記に要約するように、本発明は、試料中の1つまたはそれ以上のDNA結合タンパク質の存在を検出する方法に関する。試料中の1つまたはそれ以上のDNA結合タンパク質の存在を検出する際には、所定のDNA結合タンパク質を定性的または定量的に検出することができる。関心対象のDNA結合タンパク質を定性的に検出する場合には、典型的には、試料をスクリーニングして、関心対象のDNA結合タンパク質が試料中に存在するかどうかを判定する。定量的な検出の場合には、関心対象のDNA結合タンパク質の濃度または量を測定する。定量的な検出は相対的であっても、絶対的であってもよく、関心対象のDNA結合タンパク質の量は任意の対照値に対して測定されるか、または絶対値、例えば、質量／容積単位で測定される。多数の態様において、関心対象のDNA結合タンパク質の存在は定量的に測定される。
【００１９】
関心対象のDNA結合タンパク質は、DNA分子の所定の規定された、特異的なストレッチ部分（strech）、ドメインまたは領域、例えば、既知の転写因子結合配列、転写因子共通配列等に特異的に結合するタンパク質である。言い換えると、本方法によってアッセイされるDNA結合タンパク質は、DNA分子のヌクレオチド残基の鎖を認識するものであり、すなわち、それらは、DNAの認識または共通配列に特異的に結合する。認識配列は、DNA結合分子に応じて鎖長が異なってもよいが、典型的には鎖長約5〜約25bpであり、通常は鎖長約6〜約18bpであり、さらに通常は鎖長約6〜約12bpである。DNA結合タンパク質は、典型的には、2本鎖DNAに特異的に結合するタンパク質である。関心対象のDNA結合タンパク質には、1)調節タンパク質、例えば、転写因子、アクチベーターおよびコアクチベーター、リプレッサーおよびコリプレッサー、2)基本転写複合体のタンパク質、例えば、ホロ酵素およびそのメディエーター、3)DNAリモデリングに関与するタンパク質、例えば、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼおよびリガーゼ、4)クロマチンの構造および組織化に関与するタンパク質、例えば、ヒストン、ATP-依存的リモデリングシクラーゼ、アセチラーゼ、塩基性ドメイン（bZIP、bHLH、bHLH-ZIP)、ジンクフィンガードメイン（Cys2Cys2、Cys2His2、Cys6クラスター）、ヘリックス-ターン-ヘリックスドメイン（ホメオ、翼状ヘリックス、trp-クラスター、TEA)、副溝接触部を有するβ-足場(REL、MADS、TBP、HMG)等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
多数の態様において、試料が本発明の方法においてスクリーニングされるDNA結合タンパク質は転写因子である。関心対象の転写因子には、1) ジンクフィンガー (CH): EGR1、2および3、SP1、YY1、2) ジンクフィンガー-ジンクツイスト: RXR、HNF-4、ROR、PPARγ、PR、ER、AR、3)ジンクフィンガー CC (G): GATA: 4) ジンクフィンガー CC : YAF2 : 5) ジンクフィンガー C6 (酵母)、6)ホメオドメイン、ホメオボックスタンパク質: pbx-1a、7) POUドメイン: Oct-1、pit、8) BZIP:C/EBP、c-Fos、c-Jun、CREB : 9) ロイシンジッパー : GCF、10) BHLH: Myo D、11) HLH :Id1 、12) bHLH-Zip: c-myc、13) HLH-zip: Vav、14) MADS : MEF2-D 、15) HMG: TCF-4、LEF1 : 16)対ドメイン、対ボックス: Pax-5、17). 対ドメイン、対ボックス+ ホメオドメイン: Pax-7、18)冷ショックドメイン: YB-1、19) Rel : p50、p65、c-rel、NFAT、20) ジンクフィンガー + ホメオドメイン: ATBF1: 21) Tipクラスター: c-myb、IRF1 : 22)フォークヘッドドメイン: FOX03-a、E2F-1、23) TEAドメイン: TEF-1、24) LIMドメイン+ホメオドメイン: Lim-1、25) HTH (非脊椎動物)、26) Homeo、ZIP (非脊椎動物)、27) Limドメイン: Lmo 2、28) Runt相同ドメイン: AML1 : 29)ヒストン折りたたみ: CPIA 、30)GCM:GCMa、31)BHSH: AP-2α、32) AP2 ドメイン(非脊椎動物) 、33) Dof (非脊椎動物)、34) WRKYドメイン(非脊椎動物) 、35)PHDフィンガー(非脊椎動物) 、36) BEDフィンガー(非脊椎動物)、37) T-ボックス: Tbx 5、38)カテゴリーに分類されないもの: STAT、ATF-2、RB、p107、p53およびDP1等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
関心対象の因子には、AAF、abl、ADA2、ADA-NF1、AF-1、AFP1、AhR、AIIN3、ALL-1、α-CBF、α-CP1、α-CP2a、α-CP2b、αHO、αH2-αH3、Alx-4、aMEF-2、AML1、AML1a、AML1b、AML1c、AML1δN、AML2、AML3、AML3a、AML3b、AMY-1L、A-Myb、ANF、AP-1、AP-2αA、AP-2αB、AP-2β、AP-2γ、AP-3(1)、AP-3(2)、AP-4、AP-5、APC、AR、AREB6、Arnt、Arnt (774 AA 型)、ARP-1、ATBF1-A、ATBF1-B、ATF、ATF-1、ATF-2、ATF-3、ATF-3δZIP、ATF-a、ATF-aδ、ATPF1、Barhl1、Barhl2、Barx1、Barx2、Bcl-3、BCL-6、BD73、β-カテニン、Bin1、B-Myb、BP1、BP2、brahma、BRCA1、Brn-3a、Brn-3b、Brn-4、BTEB、BTEB2、B-TFIID、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、CACC結合因子、Cart-1、CBF (4)、CBF (5)、CBP、CCAAT結合因子、CCAAT結合因子、CCF、CCG1、CCK-1a、CCK-1b、CD28RC、cdk2、cdk9、Cdx-1、CDX2、Cdx-4、CFF、Chx10、CLIM1、CLIM2、CNBP、CoS、COUP、CP1、CP1A、CP1C、CP2、CPBP、CPE 結合タンパク質、CREB、CREB-2、CRE-BP1、CRE-BPa、CREMα、CRF、Crx、CSBP-1、CTCF、CTF、CTF-1、CTF-2、CTF-3、CTF-5、CTF-7、CUP、CUTL1、Cx、サイクリン A、サイクリン T1、サイクリン T2、サイクリン T2a、サイクリンT2b、DAP、DAX1、DB1、DBF4、DBP、DbpA、DbpAv、DbpB、DDB、DDB-1、DDB-2、DEF、δCREB、δMax、DF-1、DF-2、DF-3、Dlx-1、Dlx-2、Dlx-3、Dlx-4 (ロングイソ型)、Dlx-4 (ショートイソ型、Dlx-5、Dlx-6、DP-1、DP-2、DSIF、DSIF-p14、DSIF- p160、DTF、DUX1、DUX2、DUX3、DUX4、E、E12、E2F、E2F+E4、E2F+p107、E2F-1、E2F-2、E2F-3、E2F-4、E2F-5、E2F-6、E47、E4BP4、E4F、E4F1、E4TF2、EAR2、EBP-80、EC2、EF1、EF-C、EGR1、EGR2、EGR3、EllaE-A、EllaE-B、EllaE-Cα、EllaE-Cβ、EivF、Elf-1、Elk-1、Emx-1、Emx-2、Emx-2、En-1、En-2、ENH-bind. prot.、ENKTF-1、EPAS1、εF1、ER、Erg-1、Erg-2、ERR1、ERR2、ETF、Ets-1、Ets-1 δVII、Ets-2、Evx-1、F2F、因子2、因子名、FBP、f-EBP、FKBP59、FKHL18、FKHRL1P2、Fli-1、Fos、FOXB1、FOXC1、FOXC2、FOXD1、FOXD2、FOXD3、FOXD4、FOXE1、FOXE3、FOXF1、FOXF2、FOXG1a、FOXG1b、FOXG1c、FOXH1、FOXI1、FOXJ1 a、FOXJ1 b、FOXJ2 (ロングイソ型)、FOXJ2 (ショートイソ型)、FOXJ3、FOXK1a、FOXK1b、FOXK1c、FOXL1、FOXM1a、FOXM1b、FOXM1c、FOXN1、FOXN2、FOXN3、FOX01a、FOX01b、FOX02、FOX03a、FOX03b、FOX04、FOXP1、FOXP3、Fra-1、Fra-2、FTF、FTS、G因子、G6因子、GABP、GABP-α、GABP-β1、GABP-β2、GADD 153、GAF、γCAAT、γCAC1、γCAC2、GATA-1、GATA-2、GATA-3、GATA-4、GATA-5、GATA-6、Gbx-1、Gbx-2、GCF、GCMa、GCN5、GF1、GLI、GLI3、GRα、GRβ、GRF-1、Gsc、Gscl、GT-IC、GT-IIA、GT-IIBα、GT-IIBβ、H1TF1、H1TF2、H2RIIBP、H4TF-1、H4TF-2、HAND1、HAND2、HB9、HDAC1、HDAC2、HDAC3、hDaxx、熱誘導性因子、HEB、HEB1-p67、HEB1-p94、HEF-1B、HEF-1T、HEF-4C、HEN1、HEN2、Hesx1、Hex、HIF-1、HIF-1α、HIF-1β、HiNF-A、HiNF-B、HiNF-C、HiNF-D、HiNF-D3、HiNF-E、HiNF-P、HIP1、HIV-EP2、Hlf、HLTF、HLTF (Met123)、HLX、HMBP、HMG I、HMG l(Y)、HMG Y、HMGI-C、HNF-1A、HNF-1B、HNF-1C、HNF-3、HNF-3α、HNF-3β、HNF-3γ、HNF-4、HNF-4α、HNF-4α1、HNF-4α2、HNF-4α3、HNF-4α4、HNF-4γ、HNF-6α、hnRNP K、HOX11、HOXA1、HOXA10、HOXA10 PL2、HOXA11、HOXA13、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9A、HOXA9B、HOXB1、HOXB13、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB6、HOXA5、HOXB7、HOXB8、HOXB9、HOXC10、HOXC11、HOXC12、HOXC13、HOXC4、HOXC5、HOXC6、HOXC8、HOXC9、HOXD10、HOXD11、HOXD12、HOXD13、HOXD3、HOXD4、HOXD8、HOXD9、Hp55、Hp65、HPX42B、HrpF、HSF、HSF1 (ロング)、HSF1 (ショート)、HSF2、hsp56、Hsp90、IBP-1、ICER-II、ICER-liγ、ICSBP、Id1、Id1H'、Id2、Id3、Id3/Heir-1、IF1、IgPE-1、IgPE-2、IgPE-3、IκB、IκB-α、IκB-β、IκBR、II-1 RF、IL-6 RE-BP、II-6 RF、INSAF、IPF1、IRF-1、IRF-2、irlB、IRX2a、Irx-3、Irx-4、ISGF-1、ISGF-3、ISGF-3α、ISGF-3γ、ISl-1、ITF、ITF-1、ITF-2、JRF、Jun、JunB、JunD、κY因子、KBP-1、KER1、KER-1、Kox1、KRF-1、Ku自己抗原、KUP、LBP-1、LBP-1a、LBX1、LCR-F1、LEF-1、LEF-1B、LF-A1、LHX1、LHX2、LHX3a、LHX3b、LHX5、LHX6.1a、LHX6.1b、LIT-1、Lmo1、Lmo2、LMX1A、LMX1B、L-My1(ロング 型)、L-My1(ショート 型)、L-My2、LSF、LXRα、LyF-1、Lyl-1、M因子、Mad1、MASH-1、Max1、Max2、MAZ、MAZi、MB67、MBF1、MBF2、MBF3、MBP-1 (1)、MBP-1 (2)、MBP-2、MDBP、MEF-2、MEF-2B、MEF-2C (433 AA 型)、MEF-2C (465 AA 型)、MEF-2C (473 AA 型)、MEF-2C/δ32 (441 AA 型)、MEF-2D00、MEF-2DOB、MEF-2DA0、MEF-2DA'0、MEF-2DAB、MEF-2DA'B、Meis-1、Meis-2a、Meis-2b、Meis-2c、Meis-2d、Meis-2e、Meis-3、Meox1、Meox1a、Meox2、MHox (K-2)、Mi、MIF-1、Miz-1、MM-1、MOP3、MR、Msx-1、Msx-2、MTB-Zf、MTF-1、mtTF1、Mxi1、Myb、Myc、Myc 1、Myf-3、Myf-4、Myf-5、Myf-6、MyoD、MZF-1、NC1、NC2、NCX、NELF、NER1、Net、NF III-a、NF III-c、NF III-e、NF-1、NF-1A、NF 1B、NF-1X、NF-4FA、NF-4FB、NF-4FC、NF-A、NF-AB、NFAT-1、NF-AT3、NF-Atc、NF-Atp、NF-Atx、NfβA、NF-CLEOa、NF-CLEOb、NFδE3A、NFδE3B、NFδE3C、NFδE4A、NFδE4B、NFδE4C、Nfe、NF-E、NF-E2、NF-E2 p45、NF-E3、NFE-6、NF-Gma、NF-GMb、NF-IL-2A、NF-IL-2B、NF-jun、NF-κB、NF-κB (様)、NF-κB1、NF-κB1 前躯体、NF-κB2、NFκB2 (p49)、NF-κB2前駆体、NF-κE1、NF-κE2、NF-κE3、NF-MHCIIA、NF-MHCIIB、NF-muE1、NF-muE2、NF-muE3、NF-S、NF-X、NF-X1、NF-X2、NF-X3、NF-Xc、NF-YA、NF-Zc、NF-Zz、NHP-1、NHP-2、NHP3、NHP4、NKX2-5、NKX2B、NKX2C、NKX2G、NKX3A、NKX3A v1、NKX3A v2、NKX3A v3、NKX3A v4、NKX3B、NKX6A、Nmi、N-Myc、N-Oct-2α、N-Oct-2β、N-Oct-3、N-Oct-4、N-Oct-5a、N-Oct-5b、NP-TCII、NR2E3、NR4A2、Nrf1、Nrf-1、Nrf2、NRF-2β1、NRF-2γ1、NRL、NRSF 1型、NRSF 2型、NTF、02、OCA-B、Oct-1、Oct-2、Oct-2.1、Oct-2B、Oct-2C、Oct-4A、Oct-4B、Oct-5、Oct-6、オクタ因子、オクタマー結合因子、oct-B2、oct-B3、Otx1、Otx2、OZF、p107、p130、p28 モジュレーター、p300、p38erg、p45、p49erg、p53、p55、p55erg、p65δ、p67、Pax-1、Pax-2、Pax-3、Pax-3A、Pax-3B、Pax-4、Pax-5、Pax-6、Pax-6/Pd-5a、Pax-7、Pax-8、Pax-8a、Pax-8b、Pax-8c、Pax-8d、Pax-8e、Pax-8f、Pax-9、Pbx-1a、Pbx-1b、Pbx-2、Pbx-3a、Pbx-3b、PC2、PC4、PC5、PEA3、PEBP2α、PEBP2β、Pit-1、PITX1、PITX2、PITX3、PKNOX1、PLZF、Pmx2a、Pmx2b、PO-B、ポンティン（Pontin）52、PPARα、PPARβ、PPARγ1、PPARγ2、PPUR、PR、PR A、pRb、PRDI-BF1、PRDI-BFc、Prop-1、PSE1、P-TEFb、PTF、PTFα、PTFβ、PTFδ、PTFγ、Pu ボックス結合因子、Pu ボックス結合因子 (BJA-B)、PU.1、PuF、Pur因子、R1、R2、RAR-α1、RAR-β、RAR-β2、RAR-γ、RAR-γl、RBP60、RBP-Jκ、Rel、RelA、RelB、RFX、RFX1、RFX2、RFX3、RFX5、RF-Y、RORα1、RORα2、RORα3、RORβ、RORγ、Rox、RPF1、RPGα、RREB-1、RSRFC4、RSRFC9、RVF、RXR-α、RXR-β、SAP-1a、SAP-1b、SF-1、SHOX2a、SHOX2b、SHOXa、SHOXb、SHP、SIII-p110、SIII-p15、SIII-p18、SIM1、Six-1、Six-2、Six-3、Six-4、Six-5、Six-6、SMAD-1、SMAD-2、SMAD-3、SMAD-4、SMAD-5、SOX-11、SOX-12、Sox-4、Sox-5、SOX-9、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Sph因子、Spi-B、SPIN、SRCAP、SREBP-1a、SREBP-1b、SREBP-1c、SREBP-2、SRE-ZBP、SRF、SRY、SRP1、Staf-50、STAT1α、STAT1β、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6、T3R、T3R-α1、T3R-α2、T3R-β、TAF(I)110、TAF(I)48、TAF(I)63、TAF(II)100、TAF(II)125、TAF(II)135、TAF(II)170、TAF(II)18、TAF(II)20、TAF(II)250、TAF(II)250δ、TAF(II)28、TAF(II)30、TAF(II)31、TAF(II)55、TAF(II)70-α、TAF(II)70-β、TAF(II)70-γ、TAF-I、TAF-II、TAF-L、Tal-1、Tal-1β、Tal-2、TAR因子、TBP、TBX1A、TBX1B、TBX2、TBX4、TBX5 (ロングイソ型)、TBX5 (ショートイソ型)、TCF、TCF-1、TCF-1A、TCF-1B、TCF-1C、TCF-1D、TCF-1E、TCF-1F、TCF-1G、TCF-2α、TCF-3、TCF-4、TCF-4(K)、TCF-4B、TCF-4E、TCFβ1、TEF-1、TEF-2、tel、TFE3、TFEB、TFIIA、TFIIA-α/β 前駆体、TFIIA-α/β 前駆体、TFIIA-γ、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIE-α、TFIIE-β、TFIIF、TFIIF-α、TFIIF-β、TFIIH、TFIIH*、TFIIH-CAK、TFIIH-サイクリン H、TFIIH-ERCC2/CAK、TFIIH-MAT1、TFIIH-MO15、TFIIH-p34、TFIIH-p44、TFIIH-p62、TFIIH-p80、TFIIH-p90、TFII-I、Tf-LF1、Tf-LF2、TGIF、TGIF2、TGT3、THRA1、TIF2、TLE1、TLX3、TMF、TR2、TR2-11、TR2-9、TR3、TR4、TRAP、TREB-1、TREB-2、TREB-3、TREF1、TREF2、TRF (2)、TTF-1、TxRE BP、TxREF、UBF、UBP-1、UEF-1、UEF-2、UEF-3、UEF-4、USF1、USF2、USF2b、Vav、Vax-2、VDR、vHNF-1A、vHNF-1B、vHNF-1C、VITF、WSTF、WT1、WT1 I、WT1 I-KTS、WT1 I-del2、WT1-KTS、WT1-del2、X2BP、XBP-1、XW-V、XX、YAF2、YB-1、YEBP、YY1、ZEB、ZF1、ZF2、ZFX、ZHX1、ZIC2、ZID、ZNF174等が挙げられる。
【００２２】
説明を明瞭且つ容易にするために、本発明はここで転写因子検出に関してさらに記載されている。しかし、上記に記載するように、DNA認識配列に特異的に結合する任意の種類のDNA結合タンパク質を本発明の方法によってアッセイすることができるので、本発明によってアッセイされるDNA結合タンパク質の種類は転写因子に限定されない。
【００２３】
本発明の方法を実施する際には、先ずDNA-タンパク質結合条件下で、アッセイ対象の流体試料に、アッセイ対象の異なる転写因子各々に対するプローブ組成物が表面に固定されている基材を接触させる。言い換えると、試料中の検出対象の異なる転写因子各々に特異的なプローブ組成物を基材表面に固定する。例えば、1つの転写因子だけの存在を検出するために基材を使用する予定の場合には、基材は、一般に、表面に1つのプローブ組成物が固定されている。5つの異なる転写因子を検出する際に基材を使用するさらに他の態様において、基材は、表面に5つの異なるプローブ組成物が固定されている。基材表面の異なるまたは別個のプローブ組成物の数は、1つから複数と異なってもよく、複数の異なるプローブ組成物が支持体表面に存在する場合には、その数は少なくとも約2であり、通常少なくとも約5であり、この場合数は約10、15、25、100、200、500、1000またはそれ以上であってもよい。以下に記載するアッセイ条件下で、それらが異なる転写因子に特異的に結合する場合には、任意の2つの所定のプローブ組成物は別個または異なると考えられる。D. G. HigginsおよびP. M. Sharp、「マイクロコンピュータにおける迅速で感度の高い多数の配列アラインメント（Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer）」(1989) CABIOS、5 : 151〜153に記載されている MegAlign、DNAstar (1998) クラスターアルゴリズム（使用したパラメーターはktuple 1、gap penalty 3、window 5およびdiagonals saved 5である)を使用して測定した際に、約95%未満の配列の同一性を有する場合には、任意の2つの所定の転写因子は別個または異なると考えられる。
【００２４】
以下にさらに詳細に記載されているように、1つまたはそれ以上のプローブ組成物を基材の表面に固定する。このように、プローブ組成物は、固相支持体の表面に安定に結合され、この場合支持体は軟性支持体であっても、または硬性支持体であってもよい。「安定に結合される」は、以下にさらに詳細に記載するように、結合および洗浄条件下で、スポットのオリゴヌクレオチドが固相支持体に対する位置を維持する（すなわち、支持体表面に固定されている）ことを意味する。このように、各プローブ組成物を形成するプローブは、当業者に周知の技術に基づいて支持体表面に非共有結合的または共有結合的に安定に結合することができる。非共有結合の例には、非特異的吸着、静電気（例えば、イオン、イオン対相互作用）に基づいた結合、疎水的相互作用、水素結合相互作用、支持体表面に共有結合した特異的な結合対メンバーを介する特異的結合（例えば、ビオチン／ストレプトアビジンまたはニュートラビジン相互作用）等が挙げられる。共有結合の例には、プローブの官能基と硬性支持体の表面に存在する官能基例えば、-OH、-NH2等との間に形成される共有結合が挙げられ、この場合には、官能基は、天然型であっても、または導入される結合基のメンバーとして存在してもよい。
【００２５】
上記のように、アレイのプローブ組成物は、軟性基材または硬性基材の表面に存在する。軟性は、基材が曲げられ、折りたたまれ、または破壊しないで同様に操作できることを意味する。本発明に関して軟性固相支持体である固相材料の例には、膜、および軟性プラスチックフィルム等が挙げられる。硬性は、支持体が固体で、容易に曲がらない、すなわち、支持体が軟性でないことを意味する。このように、本発明のアレイの硬性基材は、特にハイスループット取り扱い条件下でアレイを使用するアッセイ条件下で、存在するポリマー標的に物理的な支持および構造を提供するのに十分である。さらに、本発明の硬性支持体を曲げると、破壊されやすい。
【００２６】
プローブ組成物が提供または提示される固相支持体は、アレイの目的の用途に応じて、単純なものから複雑なものまで種々の構成をとることができる。従って、基材は、長方形またはディスク形状などのオーバーオールスライド（overall slide）またはプレート形状を有してもよい。多数の態様において、基材は、長さ約10mm〜200mm、通常約40〜150mm、さらに通常約75〜125mmおよび幅約10mm〜200mm、通常約20mm〜120mm、さらに通常約25〜80mmおよび厚さ約0.01mm〜5.0mm、通常約0.1mm〜2mm、さらに通常約0.2〜1mmの長方形の断面形状を有する。従って、1つの代表的な態様において、支持体は、寸法約12×85mmのマイクロタイタープレート形式を有してもよい。別の代表的な態様において、支持体は、寸法約25×75mmの標準的な顕微鏡スライドであってもよい。
【００２７】
ある態様において、本発明の装置は、各反応チャンバーが底面にプローブ組成物を含む複数の反応チャンバーを有する基材である。複数は、少なくとも2を意味し、通常少なくとも6を意味し、さらに通常少なくとも24を意味し、最も通常には少なくとも96を意味し、この場合には、装置の異なる反応チャンバーの数は384以上ほどであってもよいが、通常約450を超えず、さらに通常には約400を超えない。装置の全体のサイズおよび形状は、簡単で、手動による取り扱いを提供するものであり、この場合装置はディスク形状、スライド形状等であってもよく、スライド形状（すなわち、顕微鏡スライドまたはクレジットカードに見られるものなどの実質的に長方形の断面形状を有する）が好ましい。装置の長さは、典型的には、50〜150mmであり、通常70〜130mmであり、さらに通常は75〜128mmであり、装置の高さは2〜20mmであり、通常5〜15mmであり、さらに通常は10〜15mmであり、装置の幅は20〜100mmであり、通常20〜90mmであり、さらに通常は25〜87mmである。
【００２８】
ある態様において、装置の各反応チャンバーは、開いた上部と、底面と、容器を形成するのに十分な方法で底部の平面を囲む少なくとも1つの壁を有する容器であり、この場合底面を囲む別個の壁の数は容器の断面形状に依存し、例えば、円形の断面形状の容器では壁は1つであり、四角形の断面形状の容器では壁は4つである。反応チャンバーは、不規則形を含む円形、三角形、長方形、四角形、五角形、六角形等を含む種々の断面形状を有してもよいが、通常長方形または四角形の断面形状を有する。従って、反応チャンバーの底部の平面を囲む別個の壁の数は少なくとも1つであり、断面形状に応じて2、3、4、5、6またはそれ以上であってもよいが、通常4である。さらに他の態様において、望ましい反応チャンバーを形成するために、基材の異なる領域に障壁を配置することによって、例えば、ゴムチャンバーのような別個の反応チャンバーを基材上に形成することができる。
【００２９】
底面の面積は、少なくとも1つのプローブ組成物を提供するのに十分大きく、ある態様において、関心対象の転写因子を含む培地を接触させるとプローブ組成物のプローブを結合に使用させるように2つまたはそれ以上のプローブ組成物を提供するのに十分に大きい。一般に、底面の面積は少なくとも約9mm2であり、通常少なくとも約25mm2であり、さらに通常は少なくとも約30mm2であり、この場合面積は8000mm2またはそれ以上であってもよいが、通常1300 mm2を超えず、さらに通常は350 mm2を超えない。壁の高さは、一般に、均一であり、望ましい量の流体、例えば、反応培地を保持することができる反応チャンバーを形成するのに十分である。このように、反応チャンバーの各ウェルの高さは少なくとも約1mmであり、通常少なくとも約3mmであり、さらに通常は少なくとも約5mmであり、20mmまたはそれ以上の高さであってもよいが、通常約15mmより高くなく、さらに通常は約12mmより高くない。反応チャンバーに入れることができる流体の容積は、一般に、約5μl〜75mlであり、通常約10μl〜3mlであり、さらに通常は約0.05ml〜1.5mlである。好ましくは、壁は長方形または四角形の断面形状を有する。
【００３０】
さらに他の態様において、例えば、疎水性フィルムを存在させるもしくは疎水性材料をコーティングすることによって疎水性にした疎水性ストリップまたは類似の構造物によって分離されている平坦な基材の領域は、上記の反応チャンバーとして作用する。このような態様の例として、開示内容が参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第5,807,522号のカラム11の42行からカラム12の67行を参照のこと。
【００３１】
ある態様において、表面にマルチウェルパターンを形成するために、フォトリトグラフィー方法を使用する。使用するフォトレジストはポジ型フォトレジストおよびネガ型フォトレジストであってもよく、噴霧、浸漬、スピンコーティング、プラズマエッチング、蒸着またはそれらの組み合わせによって適用することができる。表面はガラス、プラスチック、金属、鉱物またはそれらの組み合わせからなってもよい。出願は、数オングストローム〜500μmのウェルサイズのマルチウェルプレートの製造を含む。疎水的レジストはウェルに疎水性液体を捕獲する。このように、ウェルの高さは低くてもよい。基本的に、任意のパターンを製造することができる。本発明の方法は簡単で、高価ではない。解像度は、レジストおよび「イルミネーション」方法によって80nmまで低下することができる。利点には、小規模の試料容量を使用することができることが含まれ、この特徴は小型化およびスループットに関して重要である。表面はストレプトアビジンが事前にコーティングされていてもよい。レジストは、コーティングした表面を変化させない種々の既存の化合物から選択することができる。種々のフォトレジストは多種多様の化学的および熱的抵抗性を示す。しかし、必要であればアッセイ法（例えば、インキュベーション）を実施した後であるが、必要であれば検出の前に、または必要であれば検出の後に、例えば、表面を同じアッセイ法またはその後の反応／インキュベーションに再使用する必要がある場合、レジストは適当な溶媒に容易に溶解して、レジストコーティング表面から洗い流すことができる。前の段階と同じパターン、類似のパターンまたは異なるパターンを形成するように多数の層およびコーティングを適用することができる。フォトレジストパターン形成後の表面に、プラズマエッチングを含む種々の技法を適用して、フォトレジストとは異なる化合物（例えば、ストレプトアビジン）をさらに修飾することも可能である。
【００３２】
本発明のアレイ基材は種々の材料から製造することができる。基材を製造する材料は、以下に記載するように、理想的には、試料と接触している間に非特異的結合レベルが低くなくてはならない。軟性基材では、関心対象の材料には、修飾および未修飾ナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレン等が挙げられ、ナイロン膜およびその誘導体がこの態様において特に興味深い。硬性基材では、関心対象の具体的な材料には、ガラス、プラスチック、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネートおよびそれらのブレンド等、金属、例えば、金、白金等などが挙げられる。ナイロンまたはニトロセルロース等のような膜をコーティングしたガラスまたはプラスチックなどの複合材料も興味深い。
【００３３】
本発明の装置の基材は、1つまたはそれ以上のプローブ組成物が存在する少なくとも1つの表面を含み、表面は滑らかでも、実質的に平坦であってもよく、または陥没部もしくは隆起部などの不規則な形状を有してもよい。プローブ組成物が存在する表面は、望ましい方法で表面の特性を改変する働きをする1つまたはそれ以上の異なる層の化合物で改変されていてもよい。このような改変層は、存在する場合には、一般に単分子の厚さ〜約1mmの厚さであり、通常単分子の厚さ〜約0.1mmの厚さであり、さらに通常は単分子の厚さ〜約0.001mmの厚さである。関心対象の改変層には、金属、金属酸化物、ポリマー、有機小分子等などの無機および有機層が挙げられる。
【００３４】
各プローブ組成物は、組成物に存在する分子に実質的に変更がない実質的に均質である2本鎖DNA分子の収集物である。このように、全ての分子は実質的に同じ長さおよび実質的に同じ配列を有し、長さに関する違いは約1数%(number%)を超えず、通常約0.001数%(number%)を超えず、組成物中の任意の2つのプローブ分子は、（上記のプログラムを使用して測定する場合）少なくとも約90%、通常少なくとも約95%、さらに通常は少なくとも約99%の配列の同一性を有する。種々のプローブ組成物を形成する2本鎖DNAの鎖長は、プローブが結合するように設計されている特異的な転写因子に応じて変わってもよいが、典型的には鎖長は少なくとも約50bpであり、通常鎖長は少なくとも約45bpであり、さらに通常は鎖長は少なくとも約40bpであり、鎖長は50bp以上の長さであってもよいが、一般に約55bpを超えず、通常約60bpを超えない。
【００３５】
プローブ組成物のプローブの配列は関心対象の標的転写因子に特異的に結合するように選択される。種々の転写因子の認識配列または共通配列は当技術分野で周知であり、本発明の装置のプローブとして使用することができる。関心対象の特異的な配列には、1. ジンクフィンガー (CH): EGR1、2および3、SP1、YY1、2. ジンクフィンガー-ジンクツイスト: RXR、HNF-4、ROR、PPARγ、PR、ER、AR、3.ジンクフィンガー CC (G): GATA: 4. ジンクフィンガー CC : YAF2 : 5. ジンクフィンガー C6 (酵母)、7.ホメオドメイン、ホメオボックスタンパク質: pbx-1a、8. POUドメイン: Oct-1、pit、9. BZIP:C/EBP、c-Fos、c-Jun、CREB : 10. ロイシンジッパー : GCF、11. BHLH: Myo D、12. HLH :Id1 、13. bHLH-Zip: c-myc、14. HLH-zip: Vav、15. MADS : MEF2-D 、16. HMG: TCF-4、LEF1、17.対ドメイン、対ボックス: Pax-5、18. 対ドメイン、対ボックス+ ホメオドメイン: Pax-7、18.冷ショックドメイン: YB-1、19. Rel : p50、p65、c-rel、NFAT、20. ジンクフィンガー + ホメオドメイン: ATBF1、 21. Tipクラスター: c-myb、IRF1、22.フォークヘッドドメイン: FOX03-a、E2F-1、23. TEAドメイン: TEF-1、24. LIMドメイン+ホメオドメイン: Lim-1、25. HTH (非脊椎動物)、26. Homeo、ZIP (非脊椎動物)、27. Limドメイン: Lmo 2、28. Runt相同ドメイン: AML1、29.ヒストン折りたたみ: CPIA、30.GCM:GCMa、31.BHSH: AP-2α、32. AP2 ドメイン(非脊椎動物)、33. Dof (非脊椎動物)、34. WRKYドメイン(非脊椎動物)、35.PHDフィンガー(非脊椎動物)、36. BEDフィンガー(非脊椎動物)、37. T-ボックス: Tbx 5、38.カテゴリーに分類されないもの: STAT、ATF-2、RB、p107、p53およびDP1等に特異的に結合するものが含まれる。
【００３６】
関心対象の因子には、AAF、abl、ADA2、ADA-NF1、AF-1、AFP1、AhR、AIIN3、ALL-1、α-CBF、α-CP1、α-CP2a、α-CP2b、αHO、αH2-αH3、Alx-4、aMEF-2、AML1、AML1a、AML1b、AML1c、AML1δN、AML2、AML3、AML3a、AML3b、AMY-1L、A-Myb、ANF、AP-1、AP-2αA、AP-2αB、AP-2β、AP-2γ、AP-3(1)、AP-3(2)、AP-4、AP-5、APC、AR、AREB6、Arnt、Arnt (774 AA 型)、ARP-1、ATBF1-A、ATBF1-B、ATF、ATF-1、ATF-2、ATF-3、ATF-3δZIP、ATF-a、ATF-aδ、ATPF1、Barhl1、Barhl2、Barx1、Barx2、Bcl-3、BCL-6、BD73、β-カテニン、Bin1、B-Myb、BP1、BP2、brahma、BRCA1、Brn-3a、Brn-3b、Brn-4、BTEB、BTEB2、B-TFIID、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、CACC結合因子、Cart-1、CBF (4)、CBF (5)、CBP、CCAAT結合因子、CCAAT結合因子、CCF、CCG1、CCK-1a、CCK-1b、CD28RC、cdk2、cdk9、Cdx-1、CDX2、Cdx-4、CFF、Chx10、CLIM1、CLIM2、CNBP、CoS、COUP、CP1、CP1A、CP1C、CP2、CPBP、CPE 結合タンパク質、CREB、CREB-2、CRE-BP1、CRE-BPa、CREMα、CRF、Crx、CSBP-1、CTCF、CTF、CTF-1、CTF-2、CTF-3、CTF-5、CTF-7、CUP、CUTL1、Cx、サイクリン A、サイクリン T1、サイクリン T2、サイクリン T2a、サイクリンT2b、DAP、DAX1、DB1、DBF4、DBP、DbpA、DbpAv、DbpB、DDB、DDB-1、DDB-2、DEF、δCREB、δMax、DF-1、DF-2、DF-3、Dlx-1、Dlx-2、Dlx-3、Dlx-4 (ロングイソ型)、Dlx-4 (ショートイソ型、Dlx-5、Dlx-6、DP-1、DP-2、DSIF、DSIF-p14、DSIF- p160、DTF、DUX1、DUX2、DUX3、DUX4、E、E12、E2F、E2F+E4、E2F+p107、E2F-1、E2F-2、E2F-3、E2F-4、E2F-5、E2F-6、E47、E4BP4、E4F、E4F1、E4TF2、EAR2、EBP-80、EC2、EF1、EF-C、EGR1、EGR2、EGR3、EllaE-A、EllaE-B、EllaE-Cα、EllaE-Cβ、EivF、Elf-1、Elk-1、Emx-1、Emx-2、Emx-2、En-1、En-2、ENH-bind. prot.、ENKTF-1、EPAS1、εF1、ER、Erg-1、Erg-2、ERR1、ERR2、ETF、Ets-1、Ets-1 δVII、Ets-2、Evx-1、F2F、因子2、因子名、FBP、f-EBP、FKBP59、FKHL18、FKHRL1P2、Fli-1、Fos、FOXB1、FOXC1、FOXC2、FOXD1、FOXD2、FOXD3、FOXD4、FOXE1、FOXE3、FOXF1、FOXF2、FOXG1a、FOXG1b、FOXG1c、FOXH1、FOXI1、FOXJ1 a、FOXJ1 b、FOXJ2 (ロングイソ型)、FOXJ2 (ショートイソ型)、FOXJ3、FOXK1a、FOXK1b、FOXK1c、FOXL1、FOXM1a、FOXM1b、FOXM1c、FOXN1、FOXN2、FOXN3、FOX01a、FOX01b、FOX02、FOX03a、FOX03b、FOX04、FOXP1、FOXP3、Fra-1、Fra-2、FTF、FTS、G因子、G6因子、GABP、GABP-α、GABP-β1、GABP-β2、GADD 153、GAF、γCAAT、γCAC1、γCAC2、GATA-1、GATA-2、GATA-3、GATA-4、GATA-5、GATA-6、Gbx-1、Gbx-2、GCF、GCMa、GCN5、GF1、GLI、GLI3、GRα、GRβ、GRF-1、Gsc、Gscl、GT-IC、GT-IIA、GT-IIBα、GT-IIBβ、H1TF1、H1TF2、H2RIIBP、H4TF-1、H4TF-2、HAND1、HAND2、HB9、HDAC1、HDAC2、HDAC3、hDaxx、熱誘導性因子、HEB、HEB1-p67、HEB1-p94、HEF-1B、HEF-1T、HEF-4C、HEN1、HEN2、Hesx1、Hex、HIF-1、HIF-1α、HIF-1β、HiNF-A、HiNF-B、HiNF-C、HiNF-D、HiNF-D3、HiNF-E、HiNF-P、HIP1、HIV-EP2、Hlf、HLTF、HLTF (Met123)、HLX、HMBP、HMG I、HMG l(Y)、HMG Y、HMGI-C、HNF-1A、HNF-1B、HNF-1C、HNF-3、HNF-3α、HNF-3β、HNF-3γ、HNF-4、HNF-4α、HNF-4α1、HNF-4α2、HNF-4α3、HNF-4α4、HNF-4γ、HNF-6α、hnRNP K、HOX11、HOXA1、HOXA10、HOXA10 PL2、HOXA11、HOXA13、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA6、HOXA7、HOXA9A、HOXA9B、HOXB1、HOXB13、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB6、HOXA5、HOXB7、HOXB8、HOXB9、HOXC10、HOXC11、HOXC12、HOXC13、HOXC4、HOXC5、HOXC6、HOXC8、HOXC9、HOXD10、HOXD11、HOXD12、HOXD13、HOXD3、HOXD4、HOXD8、HOXD9、Hp55、Hp65、HPX42B、HrpF、HSF、HSF1 (ロング)、HSF1 (ショート)、HSF2、hsp56、Hsp90、IBP-1、ICER-II、ICER-liγ、ICSBP、Id1、Id1H'、Id2、Id3、Id3/Heir-1、IF1、IgPE-1、IgPE-2、IgPE-3、IκB、IκB-α、IκB-β、IκBR、II-1 RF、IL-6 RE-BP、II-6 RF、INSAF、IPF1、IRF-1、IRF-2、irlB、IRX2a、Irx-3、Irx-4、ISGF-1、ISGF-3、ISGF-3α、ISGF-3γ、ISl-1、ITF、ITF-1、ITF-2、JRF、Jun、JunB、JunD、κY因子、KBP-1、KER1、KER-1、Kox1、KRF-1、Ku自己抗原、KUP、LBP-1、LBP-1a、LBX1、LCR-F1、LEF-1、LEF-1B、LF-A1、LHX1、LHX2、LHX3a、LHX3b、LHX5、LHX6.1a、LHX6.1b、LIT-1、Lmo1、Lmo2、LMX1A、LMX1B、L-My1(ロング 型)、L-My1(ショート 型)、L-My2、LSF、LXRα、LyF-1、Lyl-1、M因子、Mad1、MASH-1、Max1、Max2、MAZ、MAZi、MB67、MBF1、MBF2、MBF3、MBP-1 (1)、MBP-1 (2)、MBP-2、MDBP、MEF-2、MEF-2B、MEF-2C (433 AA 型)、MEF-2C (465 AA 型)、MEF-2C (473 AA 型)、MEF-2C/δ32 (441 AA 型)、MEF-2D00、MEF-2DOB、MEF-2DA0、MEF-2DA'0、MEF-2DAB、MEF-2DA'B、Meis-1、Meis-2a、Meis-2b、Meis-2c、Meis-2d、Meis-2e、Meis-3、Meox1、Meox1a、Meox2、MHox (K-2)、Mi、MIF-1、Miz-1、MM-1、MOP3、MR、Msx-1、Msx-2、MTB-Zf、MTF-1、mtTF1、Mxi1、Myb、Myc、Myc 1、Myf-3、Myf-4、Myf-5、Myf-6、MyoD、MZF-1、NC1、NC2、NCX、NELF、NER1、Net、NF III-a、NF III-c、NF III-e、NF-1、NF-1A、NF 1B、NF-1X、NF-4FA、NF-4FB、NF-4FC、NF-A、NF-AB、NFAT-1、NF-AT3、NF-Atc、NF-Atp、NF-Atx、NfβA、NF-CLEOa、NF-CLEOb、NFδE3A、NFδE3B、NFδE3C、NFδE4A、NFδE4B、NFδE4C、Nfe、NF-E、NF-E2、NF-E2 p45、NF-E3、NFE-6、NF-Gma、NF-GMb、NF-IL-2A、NF-IL-2B、NF-jun、NF-κB、NF-κB (様)、NF-κB1、NF-κB1 前躯体、NF-κB2、NFκB2 (p49)、NF-κB2前駆体、NF-κE1、NF-κE2、NF-κE3、NF-MHCIIA、NF-MHCIIB、NF-muE1、NF-muE2、NF-muE3、NF-S、NF-X、NF-X1、NF-X2、NF-X3、NF-Xc、NF-YA、NF-Zc、NF-Zz、NHP-1、NHP-2、NHP3、NHP4、NKX2-5、NKX2B、NKX2C、NKX2G、NKX3A、NKX3A v1、NKX3A v2、NKX3A v3、NKX3A v4、NKX3B、NKX6A、Nmi、N-Myc、N-Oct-2α、N-Oct-2β、N-Oct-3、N-Oct-4、N-Oct-5a、N-Oct-5b、NP-TCII、NR2E3、NR4A2、Nrf1、Nrf-1、Nrf2、NRF-2β1、NRF-2γ1、NRL、NRSF 1型、NRSF 2型、NTF、02、OCA-B、Oct-1、Oct-2、Oct-2.1、Oct-2B、Oct-2C、Oct-4A、Oct-4B、Oct-5、Oct-6、オクタ因子、オクタマー結合因子、oct-B2、oct-B3、Otx1、Otx2、OZF、p107、p130、p28 モジュレーター、p300、p38erg、p45、p49erg、p53、p55、p55erg、p65δ、p67、Pax-1、Pax-2、Pax-3、Pax-3A、Pax-3B、Pax-4、Pax-5、Pax-6、Pax-6/Pd-5a、Pax-7、Pax-8、Pax-8a、Pax-8b、Pax-8c、Pax-8d、Pax-8e、Pax-8f、Pax-9、Pbx-1a、Pbx-1b、Pbx-2、Pbx-3a、Pbx-3b、PC2、PC4、PC5、PEA3、PEBP2α、PEBP2β、Pit-1、PITX1、PITX2、PITX3、PKNOX1、PLZF、Pmx2a、Pmx2b、PO-B、ポンティン52、PPARα、PPARβ、PPARγ1、PPARγ2、PPUR、PR、PR A、pRb、PRDI-BF1、PRDI-BFc、Prop-1、PSE1、P-TEFb、PTF、PTFα、PTFβ、PTFδ、PTFγ、Pu ボックス結合因子、Pu ボックス結合因子 (BJA-B)、PU.1、PuF、Pur因子、R1、R2、RAR-α1、RAR-β、RAR-β2、RAR-γ、RAR-γl、RBP60、RBP-Jκ、Rel、RelA、RelB、RFX、RFX1、RFX2、RFX3、RFX5、RF-Y、RORα1、RORα2、RORα3、RORβ、RORγ、Rox、RPF1、RPGα、RREB-1、RSRFC4、RSRFC9、RVF、RXR-α、RXR-β、SAP-1a、SAP-1b、SF-1、SHOX2a、SHOX2b、SHOXa、SHOXb、SHP、SIII-p110、SIII-p15、SIII-p18、SIM1、Six-1、Six-2、Six-3、Six-4、Six-5、Six-6、SMAD-1、SMAD-2、SMAD-3、SMAD-4、SMAD-5、SOX-11、SOX-12、Sox-4、Sox-5、SOX-9、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4、Sph因子、Spi-B、SPIN、SRCAP、SREBP-1a、SREBP-1b、SREBP-1c、SREBP-2、SRE-ZBP、SRF、SRY、SRP1、Staf-50、STAT1α、STAT1β、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6、T3R、T3R-α1、T3R-α2、T3R-β、TAF(I)110、TAF(I)48、TAF(I)63、TAF(II)100、TAF(II)125、TAF(II)135、TAF(II)170、TAF(II)18、TAF(II)20、TAF(II)250、TAF(II)250δ、TAF(II)28、TAF(II)30、TAF(II)31、TAF(II)55、TAF(II)70-α、TAF(II)70-β、TAF(II)70-γ、TAF-I、TAF-II、TAF-L、Tal-1、Tal-1β、Tal-2、TAR因子、TBP、TBX1A、TBX1B、TBX2、TBX4、TBX5 (ロングイソ型)、TBX5 (ショートイソ型)、TCF、TCF-1、TCF-1A、TCF-1B、TCF-1C、TCF-1D、TCF-1E、TCF-1F、TCF-1G、TCF-2α、TCF-3、TCF-4、TCF-4(K)、TCF-4B、TCF-4E、TCFβ1、TEF-1、TEF-2、tel、TFE3、TFEB、TFIIA、TFIIA-α/β 前駆体、TFIIA-α/β 前駆体、TFIIA-γ、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIE-α、TFIIE-β、TFIIF、TFIIF-α、TFIIF-β、TFIIH、TFIIH*、TFIIH-CAK、TFIIH-サイクリン H、TFIIH-ERCC2/CAK、TFIIH-MAT1、TFIIH-MO15、TFIIH-p34、TFIIH-p44、TFIIH-p62、TFIIH-p80、TFIIH-p90、TFII-I、Tf-LF1、Tf-LF2、TGIF、TGIF2、TGT3、THRA1、TIF2、TLE1、TLX3、TMF、TR2、TR2-11、TR2-9、TR3、TR4、TRAP、TREB-1、TREB-2、TREB-3、TREF1、TREF2、TRF (2)、TTF-1、TxRE BP、TxREF、UBF、UBP-1、UEF-1、UEF-2、UEF-3、UEF-4、USF1、USF2、USF2b、Vav、Vax-2、VDR、vHNF-1A、vHNF-1B、vHNF-1C、VITF、WSTF、WT1、WT1 I、WT1 I-KTS、WT1 I-del2、WT1-KTS、WT1-del2、X2BP、XBP-1、XW-V、XX、YAF2、YB-1、YEBP、YY1、ZEB、ZF1、ZF2、ZFX、ZHX1、ZIC2、ZID、ZNF174等が挙げられる。
【００３７】
ある態様において、プローブ配列は、共通配列のDNA-タンパク質結合部位の1つまたはそれ以上、例えば、1つまたは2つのヌクレオチドの点変異が存在する突然変異型オリゴであってもよい。突然変異型オリゴは、特異的DNA-タンパク質結合と非特異的結合を識別するために使用することができる。
【００３８】
プローブ組成物を形成するプローブの量は異なってもよいが、一般に少なくとも約10ngであり、通常少なくとも約50ngであり、さらに通常は少なくとも約100ngであり、この場合量は10μgまたはそれ以上であってもよいが、典型的には約1μgを超えず、通常約0.1μgを超えない。所定のプローブ組成物が覆う基材表面の面積は異なってもよいが、一般に少なくとも約0.1〜1cm2であり、通常約0.1〜0.5 cm2である。
【００３９】
上記のように、2つまたはそれ以上の異なるプローブ組成物がアレイに存在する場合には、各々が反応チャンバーに存在することができ、流体障壁がアレイ上の任意の2つのプローブ組成物を分離し、各プローブ組成物はアレイ上の任意の他のプローブ組成物から流体的に分離されている。さらに他の態様において、アレイの2つまたはそれ以上のプローブ組成物は流体障壁によって分離されていない。例えば、全てのプローブ組成物は、表面の任意の2つの組成物の間に障壁がない平坦な基材表面、例えば、ガラス表面に存在することができる。または、組成物群は互い分離されていてもよい。複数の異なる反応チャンバーがアレイに存在し、各反応チャンバーが異なる転写因子に対する2つまたはそれ以上の異なるオリゴプローブを含むある態様では、同一反応チャンバーの他のプローブの転写因子と交差反応しないプローブが選択され、任意の所定の反応チャンバーに一体として配置される。
【００４０】
上記の装置は、任意の便利なプロトコールを使用して製造することができる。1つの便利なプロトコールは以下の実験例の節に提供されている。しかし、他のプロトコールも可能であり、第一の考慮点は簡便性である。
【００４１】
基材表面を接触させる試料は、実施するアッセイ法の種類に応じて大きく異なってもよい。一般に、試料は水溶性流体試料である。流体試料の量も装置の特徴、試料の性質等に関して変わる。多数の態様において、基材表面を接触させる試料の量は、約2.5μg〜100μgであり、通常約5μg〜50μgであり、さらに通常は約5μg〜30μgである。
【００４２】
多数の態様において、流体試料は天然に存在する試料であり、この場合試料は基材に接触させる前に改変されても、改変されなくてもよい。多数の態様において、流体試料は生理学的供給源から得られ、この場合生理学的供給源は、典型的には、真核細胞であり、関心対象の生理学的供給源は酵母などの単細胞生物、並びに植物および動物、特に哺乳類を含む多細胞生物から得られ、多細胞生物由来の生理学的供給源は多細胞生物の特定の器官もしくは組織から得られても、またはそれら由来の単離細胞もしくは細胞区画、例えば、核、細胞質等由来であってもよい。流体試料を入手する際には、最初の生理学的供給源（例えば、組織）を数多くの異なる処理段階に付してもよく、このような処理段階は組織ホモジネート、核酸抽出等を含んでもよく、このような処理段階は当業者に周知である。流体試料として細胞抽出物および核抽出物を使用することは多数の態様において特に興味深い。細胞抽出物および核抽出物を調製する代表的な方法は以下の実験例の節に提供されている。
【００４３】
本発明の方法は感度が高く、非常に少量の標的転写因子を検出することができるが、試料中の標的転写因子の濃度は、一般に、少なくとも約0.3μMであり、通常少なくとも約0.5μMであり、さらに通常少なくとも約1μMであり、この場合濃度は5μM以上であってもよいが、一般に約10μMを超えず、通常は約30μMを超えない。
【００４４】
ある態様において、試料は、天然型供給源から単離されても、または組換えにより作製されてもよい1つまたはそれ以上の精製転写因子の水溶性流体試料である。精製転写因子タンパク質のこのような流体試料は、例えば、関心対象の転写因子の作用物質または拮抗物質などの認識配列への転写因子の結合を調節する物質を同定するスクリーニングアッセイ法のような用途を種々の用途に見出す。精製転写因子の流体試料は1つの転写因子を有しても、または複数の異なる転写因子を有してもよく、複数が存在する場合には、数は少なくとも約2個であり、通常少なくとも約5個であり、10個以上、例えば、15個、25個、50個、75個、100個以上であってもよい。このような試料では、転写因子の同定および多くの場合、その量並びに試料に存在する他の成分は典型的には既知である。試料中の各転写因子の量は、典型的には約0.75ng〜100ngであり、通常約2ng〜40ngであり、さらに通常約2ng〜20ngである。この態様における試料は、水および転写因子以外に、数多くの追加の成分、例えば、緩衝液、イオン、キレート剤等も含む。代表的な結合緩衝液は以下の実験例の節に開示されている。
【００４５】
上記の細胞／核抽出物または精製転写因子試料の場合には、試料は、非特異的結合相互作用を低下するためにブロッキング剤を含んでもよい。関心対象のブロッキング剤には、当技術分野で周知の脱脂乳、BSA、ゼラチン、免疫前血清等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
上記に要約するように、本発明の第1の段階は、試料中に存在する任意の転写因子と基材表面に提示されている認識されたDNA配列との間に特異的な結合を生じさせるのに十分な条件下で、1つまたはそれ以上のプローブ組成物を提示する基材表面に流体試料を接触させることである。接触は、任意の便利なプロトコールを使用して生じさせてもよい。このように、試料を基材表面に適用しても、基材表面の反応チャンバー内に配置しても、基材表面に流しても、または基材表面を流体試料に浸漬する等でもよい。
【００４７】
接触後、試料中の転写因子と基材表面上の認識されたプローブとの間に結合を生じさせるのに十分な時間、表面と流体試料との接触を維持する。このように、プローブと試料中の対応する転写因子との結合を生じさせるのに十分な時間および条件下で、基材表面と試料をインキュベーションする。試料と基材は、典型的には、約5分〜2時間インキュベーションし、通常約15分〜2時間インキュベーションし、さらに通常は約30分〜1時間インキュベーションする。このインキュベーション時の温度は、一般に、約0〜約37℃であり、通常約15〜30℃であり、さらに通常は約18〜25℃である。望ましい場合には、基材と試料は、インキュベーション中、例えば、振とう、撹拌等によって撹拌してもよい。
【００４８】
インキュベーション後、基材の表面に存在する転写因子／プローブ複合体を検出する。多数の態様では、使用する標識スキームに応じて、検出前に未結合転写因子を基材表面から除去する。表面結合複合体の検出前に、未結合転写因子を除去する場合には、未結合転写因子は、洗浄または他の好適なプロトコールによって便利に除去することができる。洗浄は、典型的には、表面に洗浄液を接触させ、次に例えば、表面に洗浄液を流すことによって表面から流体を除去することを含む。アレイ用途への使用に好適である数多くの異なる洗浄液／洗浄プロトコールが当技術分野で周知であり、これは本発明に使用することができる。
【００４９】
表面結合複合体の存在および多くの場合、その量を検出するために、任意の便利な検出プロトコールを使用することができる。多数の態様において、表面結合複合体の存在を検出するためにシグナル生成システムを使用する。シグナル生成システムは、表面結合複合体の存在に関連させることができる検出可能なシグナルを提供する作用をする1つまたはそれ以上の試薬のシステムを意味する。多数の態様において、表面結合複合体の存在は、検出対象の表面結合複合体の転写因子部分に特異的である標識親和性試薬、例えば、抗体またはそれらの結合断片もしくは模倣物、例えば、Fv、F (ab') 2、scFvおよびFab等を使用することによって検出される。このように、多数の態様において、使用されるシグナル生成システムは、抗体を用いたまたは親和性試薬を用いたシグナル生成システムである。
【００５０】
検出は、各々がシグナル生成システムの1つまたはそれ以上の試薬メンバーを含む、1つまたはそれ以上の異なるシグナル生成システム流体組成物を使用して行うことができる。例えば、各プローブ組成物が流体的に分離された領域、例えば、マイクロタイタープレートのウェルの基材に存在する場合には、各プローブ組成物に対して異なる流体組成物を使用することができ、この場合異なる流体組成物は、シグナル生成システムの特異性に関して、例えば、標識親和性試薬特異性に関して互いに異なり、使用する各流体組成物は1つの種類の親和性試薬だけを含む。別の態様では、例えば、2つまたはそれ以上の異なるプローブ組成物が互いに流体的に分離されていないような状況では、複数の異なる標識親和性試薬を含む流体組成物を使用することができる。例えば、5つの異なるプローブ組成物が平坦な表面に存在し、互いに分離されていない態様では、検出は、1つが異なる組成物の各々に対する5つの異なる検出抗体の流体組成物（例えば、抗体カクテル）を使用することによって実施することができる。
【００５１】
表面結合複合体を検出する際に用途が見出されている抗体／それらの断片は、関心対象の転写因子に特異的に結合し、転写因子が対応するプローブに結合する場合に使用される位置、例えば、転写因子がプローブに結合した後でも接近可能なエピトープにさらに特異的に結合するものである。抗体またはそれらの結合断片は、市販品を入手しても、当業者に周知の抗体作製プロトコール、例えば、モノクローナル抗体作製技術、ポリクローナル抗体作製技術、ファージ提示等を使用して新規作製してもよい。
【００５２】
上記のように、抗体またはその断片は、結合する表面複合体を検出するために標識される。種々のタンパク質標識スキームが当技術分野で周知であり、使用することができ、選択される特定のスキームおよび標識は、実施される特定のアッセイプロトコールにとって最も便利なものである。このように、標識は直接検出可能な標識であっても、または間接的に検出可能な標識であってもよい。種々の異なる標識を使用することができ、この場合このような標識には、蛍光標識、同位体標識、酵素標識、粒状標識等が挙げられる。例えば、直接検出を提供する好適な標識には、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、シアニン色素、例えば、Cy5、Cy3、ボディピー（BODIPY）色素、例えば、ボディピー630/650、アレキサ（Alexa）542等が挙げられる。好適な同位体標識には、放射性標識、例えば、32P、33P、35S、3Hが挙げられる。他の好適な標識には、光散乱、蛍光特性を有するか、または捕獲した多数の蛍光色素を有するサイズ粒子が挙げられる。抗体の存在の間接的な測定を可能にする標識の例には、基質が着色または蛍光産物を提供することができる酵素が挙げられる。例えば、好適な基質を添加することにより検出可能な産物のシグナルを提供することができる共有結合酵素で抗体を標識することができる。抗体に酵素を共有結合しないで、酵素に結合される特異的な結合対の第2のメンバーに特異的に結合する特異的な結合対の第1のメンバーを含むように抗体を修飾してもよく、例えば、抗体はビオチンに共有結合することができ、酵素はストレプトアビジンに結合する。
【００５３】
抗体を用いたシグナル生成システムでは、1つの抗体を使用しても、または共同して働く2つまたはそれ以上の異なる抗体を使用してもよい。例えば、転写因子特異的結合領域および直接的または間接的に検出可能な標識の両方を含む1つの抗体を使用してもよい。または、第1および第2の抗体を使用してもよく、この場合第1の抗体は転写因子に特異的であり、第2の抗体は直接的または間接的に検出可能であり、第1の抗体に結合し、例えば、第2の抗体は標識抗IgGである。さらに他の態様において、上記の2抗体システムと類似した方法で共同して働く3つまたはそれ以上の抗体を使用する。
【００５４】
多数の態様において、表面結合複合体の存在を検出するために、ELISAシグナル生成システムを使用する。ELISAシグナル生成システムはイムノアッセイ分野の当業者に周知である。例えば、Voller、「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)」、Diagnostic Horizons 2: 1〜7、1978、マイクロバイロジカル  アソシエーツ  クォーターリ  パブリケーション(Microbiological Associates Quarterly Publication)、メリーランド州ウォーカースビル、Vollerら、J.Clin. Pathol. 31: 507〜520 (1978)、Butler、Meth. Enzymol. 73: 482〜523 (1981)、Maggio (編) Enzyme Immunoassay、シーアールシープレス(CRC Press)、Boca Raton、Fla.、1980およびIshikawaら、(編) Enzyme Immunoassay、Kgaku Shoin、東京 1981年参照のこと。
【００５５】
このようなアッセイ法において、先ず、好適な酵素、例えば、1つの抗体複合体または共同して働き、最終的に表面複合体を酵素で標識する2つまたはそれ以上の抗体で表面結合複合体を標識する。用途が見出されている酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α-グリセロリン酸、脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
酵素で標識した後で、典型的には上記の1回以上の洗浄段階の後で、例えば、分光学的、蛍光または視覚的な手段によって検出できる化学的部分を生成するような方法で、酵素に適当な基質、好ましくは発色基質を反応させる。検出は、酵素に対する発色基質を使用する発色方法によって実施することができ、この場合好適な基質には、o-フェニレンジアミン(OPD)、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)、3,3'-ジアミノベンジドテトラヒドロクロライド(DAB)等が挙げられるが、これらに限定されない。この段階において、基質の流体組成物、例えば、基質の調製水溶液を、典型的には、基材表面と共に、検出可能な産物が生成されるのに十分な時間インキュベーションする。インキュベーションは、典型的には、約0〜37℃、通常約15〜30℃、さらに通常は約18〜25℃の温度範囲において、約10秒〜2時間、通常約30秒〜1時間、さらに通常は約5分〜15分間継続する。
【００５７】
さらに他の2部システムにおいて、上記のように、第2の抗体を直接検出可能な標識、例えば、蛍光または同位体標識で標識する。
【００５８】
インキュベーション時間の終了時に、産物を検出し、基材表面の複合体の存在に関連させる。検出は、基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準品と視覚的に比較することによって実施してもよい。検出は、分光学的、蛍光的または視覚的手段を含むが、これらに限定されない任意の便利なプロトコールおよび装置を使用することによって実施することができる。
【００５９】
最終段階は、検出可能であるように標識した表面結合複合体から形成される検出シグナルを、アッセイした流体試料中の対応する転写因子の存在に関連させることである。検出したシグナルは、関心対象の転写因子がアッセイした試料中に存在するかどうかを定性的に判定するために使用することができる。または、検出したシグナルは、アッセイした試料中の関心対象の転写因子の量を定量的に測定するために使用することができる。定量的な測定は、一般に、検出したシグナルのパラメーター、例えば、強度を基準値（既知量の標識から形成されるシグナル強度など）と比較することによって行われる。
【００６０】
このように、上記の方法は、流体試料中の1つまたはそれ以上の転写因子の存在を定量的または定性的に検出するために使用することができる。
【００６１】
本発明の特徴は、本発明の方法がEMSAより感度が高いということである。特に、本発明は、以下の実験例の節に開示されているように、対応するEMSA対照より感度が高い。感度の増加は少なくとも約5倍であり、通常少なくとも約10倍である。
【００６２】
利用性
上記の方法および装置は、流体試料中の1つまたはそれ以上の転写因子の存在を検出することが望まれる種々の異なる用途に用途が見出されている。本発明の方法および装置は、その性質故に、複数の異なる転写因子を同時にアッセイする用途に使用するのに特に好適であり、例えば、少なくとも5個、10個、15個、25個以上の転写因子を同時に検出することが望まれる用途などの、2個またはそれ以上の転写因子の存在を同時に検出することが望まれるハイスループット用途に使用するのに特に好適である。
【００６３】
1つの特定の用途では、本発明により、組織、細胞または細胞下位置の転写因子集団をプロファイリングする際、すなわち、組織、細胞または細胞の一部（細胞下位置）の転写因子プロファイリングする際に用途を見出される。「転写因子プロファイリング」は、存在して、細胞またはその区画に影響を与える種々の転写因子の性質に関する情報を入手するために、細胞またはその区画、例えば、核における1つまたはそれ以上、通常複数の、例えば、2個、5個、10個、15個、25個またはそれ以上の異なる転写因子の量を測定することを意味する。アッセイしている細胞の性質に関する比較データを得るために、転写因子プロファイルを入手し、1個またはそれ以上の異なる種類の細胞の転写因子プロファイルと比較することができる。または、細胞が所定の刺激にどのように応答するかに関する情報を同定するために、細胞を所定の刺激に付する前後に転写プロファイルを検出することができる。さらに他の態様において、発生が細胞をどのように変化させるかを解明するために、細胞の転写プロファイルの変化を経時的にモニターすることができる。このように、本発明は、転写因子ファミリー、シグナル伝達経路のプロファイリング、新規転写因子の検出等に用途を見出している。
【００６４】
本発明はまた、EMSAが現在用途を見出している全てのタンパク質／DNA相互作用アッセイ法を含むが、これらに限定されない、EMSAが使用される全ての用途に用途を見出している。
【００６５】
本発明が用途を見出しているさらに別の用途は、認識されたDNA配列への転写因子の結合活性を調節する物質のハイスループットスクリーニング、例えば、転写因子作用物質および拮抗物質のハイスループット方法によるスクリーニングにおいてである。このようなアッセイ法では、例えば、上記のように2つまたはそれ以上の精製転写因子の試料などの、調節剤の同定が望まれる複数の転写因子の試料に、候補物質の存在下において上記の装置を接触させ、オリゴヌクレオチドプローブに対する転写因子の結合に与える候補物質の影響を、例えば、対照を比較参照することによって判定する。次いで、観察された影響または影響がないことを、候補化合物の調節能力に関連させる。この方法では、所定の物質は、2つ以上の転写因子に関する調節作用について同時にスクリーニングすることができる。例えば、候補物質の存在下において関心対象の転写因子を含有する試料に、関心対象の各転写因子に対するプローブを有する装置を接触させ、それぞれのプローブに対する関心対象の転写因子各々の結合に与える候補物質の影響を観察することによって、候補と思われる阻害剤を複数の異なる転写因子に対して同時にスクリーニングすることができる。
【００６６】
キットとシステム
上記に要約するように、本発明の方法を実施する際に使用するキットおよびシステムも提供される。上記のように、本発明のキットおよびシステムは少なくとも、本発明のハイスループット装置を含む。本発明のキットおよびシステムはまた、本発明の方法において用途を見出す数多くの選択的な成分も含んでもよい。関心対象の選択的な成分には、シグナル生成システムまたはその成分、例えば、関心対象の転写因子に特異的な抗体、抗体酵素複合体、発色基質等を含むが、これらに限定されない抗体を用いたシグナル生成システムまたはその成分が挙げられる。シグナル生成システムは1つまたはそれ以上の別個のシグナル生成システム流動組成物の形態であってもよく、この場合各流体組成物は、複数を含む1つまたはそれ以上の異なる親和性試薬、例えば、標識抗体を含んでもよく、流体組成物は1つの抗体を含有しても、または抗体カクテルであってもよい。最後に、本発明のキットの多数の態様において、キットは本発明を実施するための取扱説明書またはこれを入手するために手段（例えば、ウェブサイトURLにより、使用者は取扱説明書が提供されているウェブページ見ることができる）をさらに含み、この場合これらの取り扱い説明書は、典型的には基板に印刷されており、基板は、添付資料、包装材料、および試薬容器等の1つまたはそれ以上であってもよい。本発明のキットにおいて、便利または望ましいように、1つまたはそれ以上の成分が同じまたは異なる容器に存在する。
【００６７】
以下の実施例は例示のために提供されており、限定するために提供されているものではない。
【００６８】
実験例
I.
A. 材料と方法
1. オリゴヌクレオチド
野生型および突然変異型転写因子共通配列（図1）に相当する親オリゴヌクレオチドおよび相補的な1本鎖オリゴヌクレオチドはオペロン（OPERON）社（カナダ、アラメダ）から購入した。各オリゴヌクレオチドはHPLCで精製し、親鎖はオペロン（OPERON）社により5'側末端がビオチン化されていた。使用前に、両鎖を100℃においてTE緩衝液中で5分間加熱し、徐々に室温に冷却してアニーリングした。
【００６９】
2.  核抽出物および精製タンパク質
トランスファクター抽出キット（TransFactor Ectraction Kit）(クロンテック（Clontech）社、カリフォルニア州パロアルト、CA#K2064-1)を使用して核抽出物を作製した。細胞は80〜90%集密化するまで増殖させ、非誘導のHeLaおよびジャーカット、または誘導したHeLaであった。誘導するためには、HeLa細胞を0.1μg／mlのTNF-α（クロンテック（Clontech）社、8157-1)と共に30分間インキュベーションするか、または2μg／mlのPMA（シグマ(Sigma)社、ミズーリ州セントルイス）と共に2時間インキュベーションした。細胞を回収し、洗浄し、ペレット化した。ペレット化した細胞の容積に応じて、細胞を5容量の低張細胞溶解緩衝液に再懸濁させ、氷上で15分間インキュベーションした。次いで、細胞を遠心分離し、元のペレット化した細胞の容積に対して2容量の低張細胞溶解緩衝液に懸濁させ、シリンジで破壊した。破壊した細胞を遠心分離して、細胞質画分を単離して、取り出し、-70℃で保存した。核を含有するペレットを抽出緩衝液に懸濁させ、シリンジで破壊し、4℃において30分間ゆっくり振とうした。最後に、材料を高速で5分間遠心分離し、核抽出物に相当する上清を取り、-70℃で保存した。精製ヒト組換えNFκB p50はプロメガ(Promega)社（ウィスコンシン州マディソン）から購入した。
【００７０】
3.  転写因子酵素結合イムノアッセイ法(TF-EIA)
ニュートラビジンをコーティングした96ウェルストリッププレート（ピアス(Pierce)社、イリノイ州ロックフォード）を、関連する野生型および突然変異型共通配列に相当する、ウェルあたり100μlの33 nMのビオチン化2本鎖DNA（dsDNA）と共に室温において1時間インキュベーションした。各段階後3回洗浄を実施した。次いで、各ウェルをトランスファクター緩衝液中で3%脱脂粉乳で1時間ブロッキングした。トランスファクター緩衝液プラス3%脱脂粉乳で希釈した核抽出物または精製転写因子をウェルあたり50μlの容量を添加し、室温において1時間インキュベーションした。次いで、トランスファクター緩衝液プラス3%脱脂粉乳で希釈（1：1000）した一次抗体（表1）をウェルあたり100μl添加し、室温において1時間インキュベーションした。洗浄後、トランスファクター緩衝液プラス3%脱脂粉乳で希釈したウェルあたり100μlの二次抗体を添加し、室温において30分間インキュベーションした。最後に、ウェルあたり100μlのTMB(3,3,5,5-テトラメチルベンジジン）を添加してから、基質（バイオラッド(Bio-Rad)社、カリフォルニア州ヘルキュルス）の発色を、バイオラッド(Bio-Rad)モデル550マイクロプレートリーダーで655nmで検出した。
【００７１】
4.  抗体
使用した一次抗体には、抗NFkB p50 (アップステートバイオテック(Upstate Biotech)社、マサチューセッツ州ウァルサム、 pAb #06886)、抗NFkB p65 (アップステートバイオテック(Upstate Biotech)社、カリフォルニア州サンタクルーズ、pAb #06418)、抗c-Rel (サンタクルーズバイオテック(Santa Cruz Biotech)社、pAb #SC-71)、抗c-Fos (サンタクルーズバイオテック(Santa Cruz Biotech)社、pAb #SC 7201)、抗CREB-1 (サンタクルーズバイオテック(Santa Cruz Biotech)社、pAb #SC186)および抗ATF-2 (サンタクルーズバイオテック(Santa Cruz Biotech)社、pAb #SC187)が挙げられる。使用した二次抗体は抗ウサギIgG-HRP (ビーディー-トランスダクションラボズ(BD-Transduction Labs)、#R14745)であった。。
【００７２】
5.  オリゴヌクレオチド競合アッセイ法
トランスファクター緩衝液中でウェルを野生型dsDNAオリゴヌクレオチドと共に室温において1時間インキュベーションした。トランスファクター緩衝液プラス3%ミルクの総容量50μlに30μgの核抽出物を加えたものに、野生型または突然変異型競合オリゴヌクレオチドの濃度を増加させて（25ng〜200ng)を添加した。ブロッキング後、野生型dsDNAで1時間コーティングした各ウェルにこの混合物を添加した。以前に記載されているように、TF-EIAの残りの段階を実施した。
【００７３】
6.  電気泳動移動度シフト解析(EMSA)
3'末端標識キット（アマシャムファルマシアバイオテック(Amersham Pharmacia Biotech)社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して、2本鎖DNAオリゴヌクレオチド（野生型）を32Pで標識した。核抽出物または精製転写因子を、20 mMのHEPES、pH 7.9、40 mMのKCI、1 mMのMgC12、100μMの EDTA、500 μMのジチオスレイトール、6%のグリセロールおよび0.1 mg/mlのポリ (dl- dC)中で2.5μlの32P-オリゴヌクレオチドプローブと共に20分間インキュベーションした。次いで、試料を0.5×TBE(100 mMのTrisホウ酸、pH8、2mMのEDTA）、5%アクリルアミドゲル上で分画した。スーパーシフト解析では、0.5μlのポリクローナル抗体または1μlの(1mg/ml)のモノクローナル抗体を32P標識DNA-転写因子複合体と共にインキュベーションした。
【００７４】
B.  結果と考察
1.  転写因子酵素結合イムノアッセイ法(TF-EIA)の原理
各転写因子の野生型および突然変異型dsDNA共通配列をニュートラビジンコーティングした96ウェルプレートに固定した。次いで、DNAコーティングしたウェルを、精製タンパク質、哺乳類核抽出物または哺乳類細胞抽出物と共にインキュベーションした。標的転写因子に特異的な一次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体でDNA-転写因子複合体を検出した。最後に、TMB基質をウェルに添加して、マイクロプレートリーダーで発色を測定した（図2）。
【００７５】
2.  EMSAと比較したTF-EIAの高い感度
精製組換えヒトNFκB p50タンパク質を使用して、DNA-タンパク質結合活性を検出するためのTF-EIAおよびEMSAの感度を比較した。ニュートラビジンをコーティングしたウェルを、33nMの飽和濃度の野生型NFκB p50dsDNA（図1）と共にインキュベーションした。次いで、dsDNAを、0μM〜25.6μMの濃度の精製NFκB p50タンパク質に曝露した。抗NFκB p50抗体は、dsDNAに結合したNFκB p50タンパク質を検出した。結果はシグモイド曲線で、6μMから飽和プラトーが見られた(図3a)。本発明者らは、最低検出点を、バックグラウンド吸光度の2倍に相当する濃度、0.3Mの精製NFκB p50タンパク質と規定した。
【００７６】
32P末端標識NFκB p50野生型dsDNAを、0μMから102.4μMまで量を増加させた精製NFκB p50タンパク質と共にインキュベーションした。遊離dsDNAおよびタンパク質結合dsDNAをゲル電気泳動で分離し、ホスホールイメージャーでバンドの光学密度を測定した（図3b)。吸光度をバンドの光学密度と置き換えると、バックグラウンドの2倍に基づいた最低検出濃度は約3μMであった。バンド強度は、この点から、約100μMの飽和点に到達するまで徐々に増加した。高濃度の精製タンパク質では、多量体形成量の増加が見られた。これらのバンドは、単量体またはオリゴマーなどのタンパク質-DNA結合型を識別する方法がないTF-EIAと比較するために、光学密度を測定する際の低いバンドに含まれていた。
【００７７】
図3aからわかるように、標準化後、TF-EIAおよびEMSAは共に同様のシグモイド曲線を示した。しかし、両アッセイ法の最低検出タンパク質濃度に基づくと、TF-EIA(0.3μM）はEMSA(3μM）より10倍高い感度を示した。
【００７８】
3.  哺乳類核抽出物中の転写因子-DNA結合活性の分析
多くの場合において、精製タンパク質は入手できないか、または精製が困難であるので、本発明者らは、哺乳類細胞の核抽出物を使用して、TF-EIAが特異的な転写因子-DNA結合を検出する能力を試験した。NFκB p50野生型および突然変異型dsDNA共通配列（図1）を、TNF-αで誘導したHeLa細胞の核抽出物の量を増加したもの（0〜30μg）と共にインキュベーションした。野生型dsDNAに対するタンパク質の結合は、適用した核抽出物の量に比例して増加した。一方、突然変異型dsDNAをコーティングしたウェルでは結合の増加は観察されなかった。
【００７９】
典型的には、結合特異性を評価し、タンパク質結合DNA共通配列の主要な塩基を判定するために、オリゴ競合アッセイ法をEMSAで実施する。同じ競合アッセイ法をTF-EIAで実施した。野生型または突然変異型NFκB p50共通配列に相当する非ビオチン化オリゴに、TNF-αで誘導したHeLaの30μgの核抽出物（最高用量）を混合し、次いでこれをビオチン化した野生型NFκB p50dsDNAをコーティングしたウェルに添加した（図4a)。野生型競合物質のオリゴの量を増加させて添加すると、DNA-タンパク質結合活性が徐々に低下するのが観察されたが、突然変異型オリゴの量を増加させて添加した場合には対応する低下は見られなかった。
【００８０】
本発明者らは、ジャーカット核抽出物およびPMA核抽出物で誘導したHeLaを使用して、2つの他の転写因子ファミリー、ATF-2(図4b)およびc-Fos(図4c)のメンバーを用いた用量および競合アッセイ法を実施した。本発明者らが試験した3つの転写因子は全て同様の用量応答を示し、DNA-タンパク質結合は特異的な野生型オリゴを添加することにより競合された。各場合において、DNA-タンパク質結合は最低量の5μgの核抽出物で検出され、検出可能な結合は、40倍の競合物質のオリゴを添加するとほとんど完全に消失された。核抽出物に存在する転写因子の量を定量するために、精製タンパク質を使用して、標準曲線を作成してもよい。各転写因子について、検出感度がわずかに異なることが観察された。このような差は以下によって生じることがある。各核抽出物は異なる濃度の各転写因子を含有する場合がある。または共通配列に対する転写因子の結合親和性およびタンパク質に対する抗体の結合親和性が異なるか場合がある。
【００８１】
4.  抗体-転写因子結合の特異性
各抗体が、特異的な転写因子に結合することを証明するために、特異的および非特異的抗体を使用してTF-EIAを実施した。NFκB p50野生型dsDNAをコーティングしたウェルを、TNF-α核抽出物で誘導した30μgのHeLaおよび3つの抗体：抗NFκB p50、抗ATF-2および抗c-Fosの1つと共にインキュベーションした（図5)。NFκB p50タンパク質-DNA複合体は、抗NFκB p50で検出されたが、抗ATF-2または抗c-Fosでは検出されなかった。同様に、それぞれ、ジャーカット核抽出物およびPMA核抽出物で誘導したHeLaを使用した場合、特異的な抗体だけがATF-2タンパク質-DNA複合体およびc-Fosタンパク質-DNA複合体を検出した。このアッセイ法では抗体の交差反応は観察されず、これは正のシグナルは、通常、特異的なdsDNA-タンパク質抗体複合体に対応することを示している。しかし、NFκB p50およびNFκB p65ヘテロ二量体などの、転写因子間のタンパク質-タンパク質相互作用が通常生じる。このアッセイ法では、本発明者らは、NFκB p50野生型dsDNAだけをコーティングしたプレートにそれぞれの抗体を使用して、NFκB p65およびNFκB p50の両方を別個に検出することができた。
【００８２】
5.  異なる核抽出物における多数の転写因子のDNA結合活性のプロファイリング
誘導細胞および非誘導細胞において転写因子活性化を比較することは興味深いことが多い。免疫疾患に関与する6つの転写因子の活性化レベルを、3つの異なるHeLa核抽出物中で同時にプロファイリングした。HeLa、TNF-αで誘導したHeLaおよびPMAで誘導したHeLaの核抽出物を、NFκB p50、NFκB p65、c-Rel、c-Fos、CREB-1およびATF-2に相当する野生型または突然変異型dsDNAを含有するウェルに添加した（図1）。全ての場合において、突然変異型dsDNAをコーティングしたウェルはほとんどまたは全くシグナルを示さなかった（データは示していない）。
【００８３】
転写因子NFκB は、通常、IkBと結合することにより細胞質ゾル内に隔離されている。刺激を受けると、この結合は解離し、NFκB は核に転位する。非誘導HeLa核抽出物と比較した場合、高いレベルのNFκBp50およびNFκBp65が誘導HeLa核抽出物中に検出された（図6)。
【００８４】
PMAによりプロテインキナーゼCシグナル伝達経路が活性化されると、c-Fosは核に転位される。非誘導HeLa核抽出物と比較した場合、PMA核抽出物で誘導したHeLaにおけるc-Fos結合活性の有意な増加が観察された（図6)。
【００８５】
このプロファイリング実験において、炎症に関与する転写因子に焦点を絞るために、本発明者らは異なる条件で刺激した特異的な種類の核抽出物を検討した。C-RelおよびCREB-1はこれらの核抽出物中では活性化されなかったが（図6)、非誘導Raji核抽出物では高いレベルの内因性c-Relが見られ、非誘導PC-12核抽出物では高いレベルのCREB-1が見られた（データは示していない）。ATF-2タンパク質は普遍的で、継続的に発現されるので、ATF-2は、非誘導Raji、PC-12およびジャーカット核抽出物（データは示していない）と共に、全てのHeLa核抽出物において高い内因性レベルを示す（図6）。
【００８６】
本発明者らは、ELISAプラットフォームに基づいてEMSAの別法を開発した。EMSAと比較すると、TF-EIAはEMSAより10倍感度が高く、実験時間が短く、放射能を使用しない。TF-EIAは、その感度により、核抽出物、細胞抽出物全体におけるDNA-タンパク質結合現象を検討するために使用することができ、組織抽出物でも効果的となりうる。また、精製タンパク質を標準として使用して、定量的検討を実施することもできる。EMSAと同様に、TF-EIAは競合検討に使用することができ、また新規転写因子を検出するために使用することができる。TF-EIAの場合に、抗体が入手できない場合には、転写因子と推定されるものに標識した発現ベクターを融合させ、タグ特異的抗体で検出することができる（データは示していない）。
【００８７】
TF-EIAは、ハイスループット形式においてDNA結合タンパク質活性の活性化または阻害をスクリーニングするために本質的な柔軟性を有し、384ウェルに容易に拡大可能である。これは、薬剤の発見および癌の研究において特に有用であると思われる。また、ヒトゲノムプロジェクトの完成に伴い、多くの転写因子が同定されるほど、プラットフォームの高い収容能力が必要とされる。dsDNAをガラスに固定し、抗体カクテルを使用することによって、TF-EIAをアレイ形式に適用することができる。マイクロアレイによって生じる小型化により、使用される試料および抗体は少なくてすみ、多くの転写因子-DNA結合現象を同時に分析する能力が促進される。
【００８８】
II.  ガラスアレイ上でのELISAを用いたタンパク質-DNA結合アッセイ法
A.  第1のアッセイ法
数多くの異なる転写因子に相当する野生型または突然変異型共通配列に対する6μMのDNAオリゴをビオチン標識して、ストレプトアビジンをコーティングしたスライドにプリントした。スライドをブロッキング溶液（20 mMのHepes、pH 7.6、50 mMのKCI、10 mMの(NH4)2S04、1 mMのDTTおよびEDTA、0.2% Tween-20、3% の粉乳）中で1時間インキュベーションし、次いで1nM、10nMの精製NF-κBまたはPMA(2μg／ml）処理したHela細胞の3μg、30μg核抽出物と共にインキュベーションした。精製タンパク質または核抽出物のインキュベーションはブロッキング溶液中で1時間実施し、次にブロッキング溶液で3回洗浄した。次いで、アレイ上に存在する全ての転写因子に対する抗体を含む一次抗体カクテル中でスライドを1時間インキュベーションした。ブロッキング溶液による洗浄を3回適用し、次にCy3結合二次抗体（アマシャムファルマシアバイオテック(Amersham Pharmacia Biotech)社抗マウス1:200希釈、抗ウサギ1:500希釈）カクテルと共に1時間半インキュベーションした。次いで、洗浄緩衝液（粉乳を含有しないブロッキング溶液）でスライドを4回洗浄し、蛍光スライドリーダーで検討した。手法は全て室温において実施した。
【００８９】
野生型NF-κB p50およびNF-κB p65オリゴは同じ共通配列を共有するので、精製NF-κB p50はそれらに特異的に結合する。いくつかの非特異的結合も検出された。1nMの精製タンパク質が実験に使用される場合と比較した場合、10nMのNF-κB p50では高いレベルの非特異的結合が観察された。PMA核抽出物で処理した3μgのHela細胞は任意の結合シグナルを生じなかったが、30μgの核抽出物を実験に使用した場合、野生型NF-κB p50、NF-κB p65およびc-Jun共通配列に対して特異的なタンパク質DNA結合が検出された。いくつかの非特異的結合も検出された。
【００９０】
B.  ガラスアレイ上でのELISAを用いたタンパク質-DNA結合アッセイ法
24個または48個の異なる転写因子に相当する野生型または突然変異型共通配列に対する6μMのDNAオリゴをビオチン標識し、記載されているように、8つの異なるチャンバーのストレプトアビジンをコーティングしたスライドにプリントした。スライドをブロッキング溶液（20 mMのHepes、pH 7.6、50 mMのKCI、10 mMの(NH4)2S04、1 mMのDTTおよびEDTA、0.2% Tween-20、3% の粉乳）中で1時間インキュベーションし、次いで1μMの精製タンパク質（c-Jun、NF-κBP50）または処理細胞もしくは未処理細胞由来の0.12μg／μlの核抽出物と共にインキュベーションした。精製タンパク質または核抽出物のインキュベーションはブロッキング溶液中で1時間実施し、次に3回洗浄した。次いで、各チャンバーに存在するすべての転写因子に対する抗体、またはブロッキング溶液でチャンバーに存在する1つの転写因子に対する抗体を含む1つの一次抗体を含む一次抗体カクテル中でスライドを1時間インキュベーションした。ブロッキング溶液による洗浄を3回適用し、次にCy3結合二次抗体（アマシャムファルマシアバイオテック(Amersham Pharmacia Biotech)社抗マウス1:200希釈、抗ウサギ1:500希釈）カクテルと共に半時間インキュベーションした。次いで、洗浄緩衝液（粉乳を含有しないブロッキング溶液）でスライドを4回洗浄し、蛍光スライドリーダーで検討した。手法は全て室温において実施した。
【００９１】
活性化した転写因子による核抽出物をインキュベーションに使用した場合、野生型オリゴに対して特異的なタンパク質DNA結合が検出された。突然変異型オリゴでは結合は検出されなかった。添加した1つの一次抗体または一次抗体のカクテルおよび特異的な核抽出物中で活性化された転写因子に応じて、1つまたはそれ以上の転写因子に対する結合が示された。結合の特異性を比較するために、1つの一次抗体または各チャンバーの全ての転写因子を含む抗体カクテルを使用した並列比較を実施した。結果（表10)は、同じ核抽出物を実験に使用すると、1つの一次抗体または一次抗体のカクテルのどちらかを実験に使用する場合、特異的な野生型オリゴに対するタンパク質の結合の有意な差はないことを示した。さらに、抗体カクテルをチャンバーに添加すると、Raji核抽出物におけるように、2つ以上の転写因子-DNA結合が見られ、c-RelおよびMaxが正のシグナルを示した（図10Cおよび10D)。
【００９２】
本発明は、EMSAなどの、DNA／タンパク質結合相互作用をアッセイするために現在使用されているアッセイ法に多数の改良を提供していることは上記の結果および考察から明らかである。本発明の利点には、高い感度、細胞または核抽出物のような不純な試料を用いて研究できること、ハイスループット形式に適合させられること等が挙げられる。このように、本発明は、当技術分野に大きな貢献をしている。
【００９３】
本明細書に引用されている全ての文献および特許出願は、個々の文献または特許出願各々が参照として組み入れられていることが具体的に、個別に示されているかのように、参照として本明細書に組み入れられている。任意の文献の引用は、出願日前の開示に関してであり、本発明が以前の発明に関してこのような文献を先行させる資格がないことを認めるものと考えるべきではない。
【００９４】
上記の発明は、理解を明らかにするために例示および例として幾分詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、ある種の変更および改良を加えることができることは、本発明の開示内容に鑑みて、当技術分野の当業者に容易に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明による転写因子アッセイ法に使用する種々の共通配列の表を提供する。
【図２】本発明による代表的なアッセイ法の略図を提供する。96ウェルプレートに固定された2本鎖DNAは、核抽出物の転写因子を捕獲する。転写因子特異的抗体はDNA結合転写因子を検出する。次いで、HRP結合抗体およびその基質の組み合わせによってこの複合体を定量する。
【図３】TF-EIAおよびEMSAの感度比較である。(a)TF-EIA:0〜25.6μMまで濃度を増加（2倍）させた精製NFκB p50をNFκB p50野生型dsDNAと共にインキュベーションした。EMSA:0〜102.4μMまで濃度を増加（2倍）させた精製NFκB p50タンパク質を32P末端標識NFκB p50野生型dsDNAと共にインキュベーションした。(b)EMSAシグモイド曲線のゲル可視化である。レーン13は、32P末端標識NFκB p50野生型dsDNAおよびレーン9に使用した濃度に相当する12.8μMのNFκB p50精製タンパク質と共にインキュベーションした抗NFκB p50ポリクローナル抗体を使用したスーパーシフトである。
【図４】NFκB p50、ATF-2およびc-Fosの用量応答および競合アッセイ法である。野生型または突然変異型dsDNAをコーティングした各転写因子に特異的なウェルに核抽出物の量を増加させて（0〜30μg)適用することによって、用量応答アッセイ法を実施した。一方、競合アッセイ法では、各転写因子に特異的な野生型オリゴまたは突然変異型オリゴの濃度を増加させたもの(25〜200ng)を30μgの核抽出物と共にインキュベーションし、野生型dsDNAをコーティングしたウェルにこの混合物を添加した。(a)TNFα核抽出物で刺激したHeLaにおいて抗NFκB p50によってNFκB p50を検出した。(b)ジャーカット核抽出物において抗ATF-2によってATF-2を検出した。(c)PMA核抽出物で刺激したHeLaにおいて抗c-Fosによってc-Fosを検出した。データは3つの値の平均±SDを示す。
【図５】NFκB p50、ATF-2およびc-FosのTF-EIAの抗体特異性である。TNFα核抽出物で刺激した30μgのHeLaを、NFκB p50野生型dsDNAをコーティングしたウェルに添加し、抗NFκB p50、抗ATF-2および抗c-Fosと共にインキュベーションした。30μgのジャーカット核抽出物を、ATF-2野生型dsDNAをコーティングしたウェルに添加し、同じ3つの抗体と共にインキュベーションした。PMA核抽出物で刺激した30μgのHeLaを、c-Fos dsDNAをコーティングしたウェルに添加し、同じ3つの抗体と共にインキュベーションした。データは、3つの値の平均±SDを示す。
【図６】異なるHeLa核抽出物における多数の転写因子プロファイルである。3つの別個のHeLa核抽出物、非誘導、TNFαで誘導およびPMAで誘導したものを、NFκB p50、NFκB p65、c-Rel、c-Fos、CREB-1およびATF-2に相当する野生型dsDNAをコーティングしたウェルに適用した。次いで、対応する一次抗体で検出した。データは2つの値の平均±SDを示す。
【図７】RajiおよびNIH-3T3細胞による多数の転写因子プロファイルである。Raji細胞およびNIH-3T3細胞から30μgの核抽出物を調製し、ウェルに添加した。次いで、記載するようにアッセイ法を進めた。突然変異型オリゴは、任意の結合現象を示さなかった（データは示していない）。
【図８】RajiおよびU937細胞による多数の転写因子プロファイルである。RajiおよびU937細胞由来の30μgの核抽出物を各結合アッセイ法に使用した。実験は三回通りで実施した。
【図９】実験例の節に使用する48 DBPトランス因子ガラスアレイ（48 DBP TransFactor Glass Array)(フォーマット3.0）の略図を提供する。
【図１０】単一抗体対混合抗体の比較である。3つの異なる転写因子に対するビオチン化野生型オリゴおよび突然変異型オリゴを8チャンバースライドの各チャンバーにプリントした。Hela+TNFa(A)、K562+PMA(B)、Raji(C&D)、U937(E)またはジャーカット(F)の核抽出物をそれぞれのチャンバーでインキュベーションした。比較のために、二回通りでアッセイするチャンバーを、単一一次抗体NF-κB p50もしくはNF-κB p50、Oct-1、HSF-1の混合抗体(A)、単一抗EGRもしくは混合抗EGR、NF-κB p50、Oct-2(B)、単一抗c-Rel(C)、抗Max(D)もしくは混合抗c-Rel、Max、p53(C&D)、単一抗SRF-1もしくは混合抗SRF-1、ATF2、pRb(E)または単一抗ATF2もしくは混合抗SRF-1、ATF2、pRb(F)と共にインキュベーションした。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004537039.tif 000076
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