(57)【要約】ニトロキシル化合物を酸化可能である酵素化合物の存在下で酸化することにより得られる、触媒量のニトロソニウム化合物を用いて、１級アルコール、特に炭水化物が酸化されるアルデヒド、及び／またはカルボン酸を製造する方法が記述されている。更に記述されているのは、２５個のモノサッカライド単位当たり及び分子当たり１個のカルボアルデヒド基を持つ少なくとも１個の環状モノサッカライド鎖基を含む、酸化された炭水化物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロキシル化合物が酸化可能である酵素の存在下で及び／または金属錯体の存在下で酸化されることを特徴とする、ニトロキシル化合物を酸化剤で酸化することによりニトロソニウムイオンを製造する方法
【請求項２】
該ニトロキシル化合物がジ−ｔ−ニトロキシル化合物、特に２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該酸化可能である酵素が酸化還元酵素である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該酵素がペルオキシダーゼ、特にホースラデッシュペルオキシダーゼ、大豆ペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼまたは骨髄−あるいはラクト−ペルオキシダーゼであり、該酸化剤が過酸化水素である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該酵素がポリフェノールペルオキシダーゼまたはラッカーゼであり、該酸化剤が酸素である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該酵素が金属化合物の存在下でヒドロラーゼ、特にフィターゼまたはリパーゼである請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ニトロソニウムイオンが請求項１−６のいずれか一つの方法により製造されることを特徴とする、触媒としてニトロソニウムイオンにより１級アルコールを酸化する方法。
【請求項８】
該１級アルコールが炭水化物、特にα−グルカンまたはフルクタンまたはこれらの誘導体に含まれる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
２５個のモノサッカライド単位当たりそして平均分子当たり１個のカルボアルデヒド基を持つ少なくとも１個の環状モノサッカライド鎖基を含むカルボニル基含有炭水化物が製造される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該炭水化物がヒドロキシアルキル化された炭水化物またはグリコシドまたはグリコン酸である請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
該１級アルコールがステロイド化合物に含まれる請求項１−７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
木綿繊維が請求項１−６のいずれか一つの方法により製造されるニトロソニウムイオンにより処理されることを特徴とする、テキスタイル繊維を処理して、アルデヒド基を導入する方法。
【請求項１３】
酸化された炭水化物であって、該炭水化物が２５個のモノサッカライド単位当たりそして平均分子当たり１個のカルボアルデヒド基を持つ少なくとも１個の環状モノサッカライド鎖基またはこれらの化学的誘導体を含む、グルカン、マンナン、ガラクタン、フルクタン、及びキチンタイプのジサッカライド、オリゴサッカライド及びポリサッカライド、及び炭水化物グリコシドから選ばれるもの。
【請求項１４】
平均分子当たり少なくとも５個のモノサッカライド単位を含む請求項１３に記載の酸化された炭水化物。
【請求項１５】
５０個のモノサッカライド単位当たりそして平均分子当たり１個のカルボアルデヒド基を持つ少なくとも１から５０個の環状モノサッカライド鎖基を含む請求項１３または１４に記載の酸化された炭水化物。
【請求項１６】
該誘導体において、少なくとも一部のカルボアルデヒド基が式−ＣＨ＝Ｎ−Ｒまたは−ＣＨ２−ＮＨＲの基（式中、Ｒは水素、ヒドロキシル、アミノ、または基Ｒ１、ＯＲ１またはＮＨＲ１（ここで、Ｒ１はＣ１−Ｃ２０アルキル、Ｃ１−Ｃ２０アシル、炭水化物残基、また炭水化物残基と結合した、あるいは結合可能である基である）に変換された請求項１３−１５のいずれか一つに記載の炭水化物誘導体。
【請求項１７】
誘導体において、少なくとも一部のカルボアルデヒド基が式−ＣＨ（ＯＲ３）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＲ２または−ＣＨ（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯＯＲ２）２の基（式中、Ｒ２は水素、金属カチオンまたは場合によっては置換アンモニウム基であり、そしてＲ３は水素または炭水化物の脱水素化されたヒドロキシル基の酸素原子への直接結合である）
に変換された請求項１３−１５のいずれか一つに記載の炭水化物誘導体。
【請求項１８】
カルボキシル及び／またはカルボキシメチル基を更に含む請求項１３−１７のいずれか一つに記載の炭水化物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ニトロキシルラジカル、特に２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−ｌ−オキシル（ＴＥＭＰＯ）の酸化によるニトロソニウムイオン（オキソアンモニウムイオン）の生成に関する。このニトロソニウムイオンは、１級アルコールをアルデヒドに選択的酸化するための触媒的酸化剤として使用され得る。
【０００２】
化学的手段によりＴＥＭＰＯを再酸化するこのような方法は、ＤｅＮｏｏｙ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９６、１１５３−１１７４によるレビュー及びＷＯ９５／０７３０３から知られる。
【０００３】
塩素ベースの酸化剤を使用せずに、そして最終酸化剤として過酸化水素または酸素を使用して、アルコール官能基、特に１級アルコール官能基の酸化を行うことができることが本発明により見出された。本発明による酸化は、酵素及び／または金属錯体を用いて行われる。驚くべきことには、１級アルコールについて行われる場合には、この酸化は、結果として、所望ならば適切な条件を用いてカルボキシル基への実質的に更なる酸化なしでアルデヒドを生成せしめる。このアルデヒドは、（ヘミ）アセタール形及び関連する構造で存在してよい。本発明の酸化方法の適用を使用して、２級アルコール、特に炭水化物をケト誘導体に酸化することができる。本発明の方法は、添付のクレームの特徴を記述する要点により更に規定される。
【０００４】
非事前公開の国際特許出願ＷＯ９９／２３１１７及びＷＯ９９／２３２４０は、ラッカーゼ等の酸化性酵素を酸素及びＴＥＭＰＯの媒介と共に使用して、それぞれセルロースまたは澱粉を酸化することを記述している。セルロースのラッカーゼ／ＴＥＭＰＯ酸化は、結果として低レベルの未特定カルボキシル及びカルボニル基の存在を生じせしめ、一方、澱粉のラッカーゼ／ＴＥＭＰＯ酸化は、１００個のグルコース単位当たり１個のカルボキシル基と３個のアルデヒド基を持つ生成物を生じると報告されている。アルデヒド含量を定量する方法は示されていない。
【０００５】
次の説明においては、簡便のために、ＴＥＭＰＯのみを引用するが、他の好適なニトロキシル、すなわち２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−Ｎ−オキシル（ＰＲＯＸＹＬ）、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ、４−アセトアミド−ＴＥＭＰＯ及びこれらの誘導体等のα−水素原子を欠く有機ニトロキシル化合物とＷＯ９５／０７３０３に記述されているものをＴＥＭＰＯに置き換えることができると理解されるべきである。これらのジ−ｔ−アルキルニトロキシルは、特に酸化対象でない２級アルコール官能基の存在下で１級アルコールをアルデヒド官能基に選択的に酸化するのに特に好適である。４，４−ジメチルオキサゾリジン−Ｎ−オキシル（ＤＯＸＹＬ）等の立体障害の少ないニトロキシルは、例えば核のセルロースまたはケト澱粉の製造において２級アルコールをケト官能基に優先的に酸化するのに好適である。活性な酸化性種は、対応するヒドロキシルアミンとニトロキシルラジカルの酸化により系内で生成するニトロソニウムイオン（オキソアンモニウムイオン＞Ｎ＋＝Ｏ）である。所望する場合には、ニトロソニウムイオンの生成を第１に、そしてアルコール官能基の酸化を第２というように、この反応を２ステップで行うことができる。
【０００６】
触媒量のニトロキシルは、好ましくは１級アルコール基準で０．１−２５重量％、あるいは１級アルコールに対して０．１−２５モル％である。このニトロキシルは、また、例えば４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯのヒドロキシル基を好適なキャリアに結合することにより、あるいは−［（ＣＨ３）２Ｃ−ＮＯ−Ｃ（ＣＨ３）２−Ａ］ｎ−（式中、Ａはアルキレン基及び／またはヘテロ原子であってよく、ｎは例えば１０から数１００迄の数である）等のポリマーニトロキシルの形で固定化されてもよい。
【０００７】
本発明の方法は、最初に、１級アルコールの対応するアルデヒドへの酸化に使用され得る。必要ならば、次亜塩素酸塩、塩素酸塩、過酸化水素等の既知の酸化剤を使用することにより、あるいは上昇した温度、例えば４０−８０℃等の更に苛酷な条件下で、あるいは反応条件への長期曝露の間にＴＥＭＰＯ−媒介の酸化を使用することにより、この１級の生成物を対応するカルボン酸に更に酸化することができる。あるいは、比較的低いｐＨ（例えば、ｐＨ３−７）を使用することにより、酸化剤をコントロールして添加することにより、酸素濃度を低下することにより、あるいは最初にニトロソニウムイオン溶液を製造する（２ステッププロセス）ことにより、アルデヒド／カルボン酸比を増加することができる。
【０００８】
本方法は、１，６−オクタンジオール、１，９−オクタデカンジオール、ステロイドホルモン、シュガーアルコール、グリコシド（風味前駆体）等の、１級アルコールに加えて２級アルコール官能基を持つアルコール、特に１級アルコール官能基を持つ炭水化物における１級ヒドロキシル基の選択的酸化に特に有利である。この炭水化物は、グルコース、フルクトース等のモノサッカライド、スクロース、マルトース、ラクトース等のジサッカライド、オリゴサッカライド、及びポリサッカライドであってよい。このオリゴ−及びポリサッカライドは、いかなるタイプであってもよく、例えば、澱粉、澱粉成分（すなわち、アミロース、アミロペクチン、デキストリン）等のグルカン、プルラン（α−１，４−α−１，４−α−１，６−グルカン）、セルロース（特に非−木材）、キチン、リケニンなど、イヌリン及びレバン等のフルノフルクタン、ガラクタン、アラビノガラクタン、フラノイドペントサン（キシラン）、（ガラクト）マンナン（グアー、イナゴマメガム）、細菌型エクソポリサッカライド（ＥＰＳ）など及び加水分解物等のこのような炭水化物の誘導体である。これらのオリゴ−及びポリサッカライドは、ヘテロサッカライド、すなわち、例えば、キサンタン及び藻から誘導される炭水化物におけるように、これらの異なる単位自身がウロン酸単位等の１級ヒドロキシル基を持たないとしても、異なる構造単位を持つものを含む。本発明により酸化を受ける炭水化物は、グリコシドと他の保護された炭水化物を含む。更なる例は、デルタ−ラクトン等のグリコン酸であり、これは、グリカル酸などに酸化され得る。
【０００９】
本方法による酸化に好適な化合物の明確な群は、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチル澱粉またはヒドロキシエチルイヌリン等のヒドロキシアルキル化炭水化物からなり、これらは、結果としてホルミルアルキル炭水化物を製造する代替法を与える。少なくとも一部の（６−）ヒドロキシメチル基が損なわれないままの他の好適な炭水化物基質は、例えば（２−及び３−）カルボキシメチル炭水化物を含む。
【００１０】
１級ヒドロキシル基を含む炭水化物の酸化は、結果としてアルデヒドを含む対応する炭水化物を生じ、所望ならば、損なわれないままの環系カルボン酸に至る。例は、α−１，４−グルカン−６−アルデヒド、β−ｌ，４−グルカン−６−アルデヒド、β−２，１−フルクタン６−アルデヒド及びβ−２，６−フルクタン−１−アルデヒドを含む。これらの生成物は、アルデヒド基が例えば、アミン化合物などと更に反応する、官能基を含む炭水化物の有用な中間体である。これらは、また、架橋された炭水化物の有用な中間体でもあり、アルデヒド基が例えばジアミン試剤と反応する。
【００１１】
本発明により使用される触媒は、好適な酸化還元系の存在下で酸化可能である、酸化還元酵素または他の酵素である。本発明の方法で使用される酸化還元酵素、すなわち更なる酸化還元系の存在なしで酸化可能である酵素は、ペルオキシダーゼとオキシダーゼ、特にポリフェノールオキシダーゼとラッカーゼを含む。金属錯体、例えばバナジウム酸塩等の更なる酸化還元系が存在する場合には、フィターゼ及びリパーゼ等のしかるべきヒドロラーゼを使用することができる。例えば、リパーゼは、有機の、特にＣ１−Ｃ６カルボン酸（例えば、酢酸）の存在下でＴＥＭＰＯ／過酸化水素／銅により１級アルコール官能基を選択的酸化するのに有効な触媒であることが判明する。完全な酵素の代りに、いわゆる「合成酵素」、すなわち酵素を模倣する遷移金属錯体を使用することができる。このような錯体は、例えばバナジウム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケルまたは銅を、錯化剤、特に２，２’−ビピリジル、フェナントロリン、テトラメチルエチレンジアミン、ペンタメチルジエチレントリアミン及び１，４，７−トリメチル−１，４，７−トリアゾナン、及びヒスチジンとそのオリゴマー等のこれらの環状相当品等のポリアミンと共に含んでなる。この金属活性化酵素は、最終の電子受容体として過酸化水素、アルキル及びアリール（アルキル）ハイドロパーオキサイド（ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド等の）または塩素酸塩を必要とする。
【００１２】
本発明により使用することができるペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．１−１．１１．１．１１）は、補助因子に無関係なペルオキシダーゼ、特に古典的なペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）を含む。ペルオキシダーゼは、植物、バクテリア、線維状及び他の菌類及びイーストを含むいかなる起源からの由来であることができる。例は、ホースラデッシュペルオキシダーゼ、大豆皮ペルオキシダーゼ、骨髄ペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ａｎｄ Ｃｏｐｒｉｍｕｓペルオキシダーゼである。いくつかのペルオキシダーゼは市販されている。このペルオキシダーゼは、電子受容体として過酸化水素を必要とする。
【００１３】
ポリフェノールオキシダーゼ（ＥＣ１．１０．３．１）は、チロシナーゼ及びリグニンペルオキシダーゼ等のカテコールオキシダーゼを含む。好適なポリフェノールオキシダーゼは、菌類、植物または動物から得られてよい。ポリフェノールオキシダーゼは、電子受容体として酸素を必要とする。ラッカーゼ（ＥＣ１．１０．３．２）は、時にはポリフェノールオキシダーゼの下に置かれるが、これらは、また、時には明確な群として分類され得、ｐ−ジフェノールオキシダーゼと呼ばれる。ラッカーゼは、植物起源または微生物の、特に菌類の起源、例えばＴｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒの種由来であることができる。組み換えラッカーゼの使用が有利であることが可能である。また、このラッカーゼは、電子受容体として酸素を必要とする。
【００１４】
比較的温和な条件下で、例えば２と１０の間のｐＨ、また１５と６０℃の間の温度（双方とも個別の酵素または金属錯体に依って）で、本発明の方法を行うことができる。この反応媒体は、水性媒体、または均一な混合媒体、例えばアルコール／水またはエーテル／水混合物、または不均一な媒体、例えば水と疎水性エーテル、炭水化物またはハロゲン化炭水化物等の水−非混和性有機溶媒との混合物であることができる。後者の場合には、酵素及び／またはニトロキシル及び酸化剤が水性相に存在し、アルコール基質とアルデヒドまたはケトン生成物が有機相に存在してよい。必要ならば、相間移動触媒を使用してよい。このタイプの反応は、例えば１９−ヒドロキシステロイドの選択的酸化等のステロイドの酸化及びアルデヒド及び／またはカルボキシル基の芳香化合物等の影響を受け易い他の化合物への導入に好適である。また、この反応媒体は、特にこのニトロキシルの酵素を固体キャリア上に固定化する場合には、固体／液体混合物であることもできる。基質または生成物が比較的影響を受け易い場合、あるいは生成物の他の試剤からの分離が困難である場合不均一な反応媒体は有利であることもある。
【００１５】
本発明は、また、本発明の方法により得られる新規な炭水化物酸化生成物及びこれらの誘導体にも関する。これらは、１００個、特に５０個、更には２５個のモノサッカライド単位当たり少なくとも１個のヒドロキシメチルがヘミアセタールまたは類似の形であってもなくとも、カルボアルデヒド基に変換された、ポリサッカライドを含む。但し、平均として、各分子がオリゴ−あるいはポリサッカライドの還元性末端であり得る（ヘミアセタール化された）アルデヒド基以外の少なくとも１個のカルボアルデヒド基を含有するものとする。この炭水化物が澱粉である場合には、酸化度は、２５個のアンヒドログルコース単位当たり少なくとも１個のカルボアルデヒド基である。このカルボアルデヒド基は、好ましくは分枝単位によりも鎖（骨格）単位に存在する。１００（５０，２５）個単位当たりのこの少なくともカルボアルデヒド基には、ガラクトースオキシダーゼによる酸化により得ることができる、末端ガラクトース単位から誘導されるカルボアルデヒド基は含まれない。この新規な生成物は、グリコシド誘導体、すなわちアセタール化された末端基に加えて、非−ガラクトースヒドロキシメチレン基の酸化により得ることができる、少なくとも一つのカルボアルデヒド基を持つ生成物を含む。
【００１６】
本発明の製品においては、カルボアルデヒド基を含むモノサッカライド環は、大部分損なわれないままであり、アルデヒド基の数はカルボキシル基の数よりも多く、特に２倍以上多い（導入されたカルボキシアルキル基以外）。カルボキシル基迄の少なくとも部分的な更なる酸化を常に起こす従来技術の酸化方法によっては、このような製品は容易に製造されない。主含量のアルデヒド基を持つ唯一の普通の炭水化物誘導体は、澱粉、セルロースなどの過ヨウ素酸塩−タイプの酸化製品であり、ここではアルデヒド基を含む環が破壊されている。本発明により網羅されているアルデヒド炭水化物は、特に非セルロースタイプである。本発明により得ることができる製品は、アルデヒド基に加えて、他の官能基、更なる酸化により、あるいはカルボキシアルキル化（例えばクロロ酢酸との反応）により特にカルボキシル基を含んでよい。
【００１７】
本発明の新規な誘導体は、エマルションなどの濃化剤、増粘剤、安定剤として、そして特にアルコール、アミン、及びアルデヒド官能基との結合が可能である他の試剤と共に更なる官能基化のための出発材料として極めて好適である。このような試剤は、炭水化物を架橋するのに、あるいはこれらをアミノ酸、タンパク質、活性基などに結合するのに使用することができる、架橋剤（ジアミン、ジオールなど）を含む。
【００１８】
また、澱粉または木綿セルロース等のバイオポリマーを変成して、誘導体化（例えば、テキスタイルの染色、テキスタイル繊維の強化及びピリング防止）を可能にするのに、あるいは粘度及び他の物理的あるいは化学的性質を適合させるのに、例えばフルクタン、マンナン、セルロースを含む食物繊維を変成するのに、本発明の方法を使用するのも有利である。
【００１９】
本発明は、また、例えばアミンと上記に述べたアルデヒド炭水化物とを結合して、添付のクレームに定義されているような炭水化物のイミノあるいはアミノ誘導体を特に還元アミノ化により製造することによって得られる誘導体にも関する。また、更に誘導体化するために、このアルデヒド炭水化物をヒドロキシ−官能基化された化合物、例えばグリコール酸により、反応し、アセタール化することができる。
実施例：全般
Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７３）５４，４８４）を用い、濃硫酸中のホウ酸（０．０１２５Ｍ）を用い、３−ヒドロキシビフェニルを添加し、そして吸光度を５２０ｎｍで測定して、ウロン酸（ヘキソピラノース単位の６−ＣＯＯＨ）含量を求めた。
【００２０】
差し引き法（アルデヒドの塩素酸塩と過酸化水素による酸化の前後でウロン酸含量を定量）により、あるいはヒドロキシラミン塩酸塩を添加して、オキシムを生成し、そして遊離される塩酸を逆滴定することにより、あるいは
１３Ｃ ＮＭＲスペクトル（アンヒドログルコース単位のＣ１に対するアルデヒドのＣ６シグナルの強度あるいはこのオキシム中のＣ６（Ｃ＝Ｎ）の強度）により、アルデヒド含量を求めた。
実施例１：ホースラデシュペルオキシダーゼを用いる６−アルデヒド澱粉の製造
２グラムの澱粉を１００ｍｌの水中１００℃でゼラチン化した。得られた溶液を２２℃迄冷却した。この溶液に２５ｍｇのＴＥＭＰＯ（０．１３ミリモル）と４０ｍｇのペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を添加した。ｐＨを酢酸（０．１Ｍ）により５に調節した。過酸化水素溶液（５０ｍｌ中の１．５ｍｌの３０％）を滴加した（時間当たり２ｍｌ）。ｐＨ調節は不必要であった。２５時間後、ヒドロキシルアンモニウムクロライドの添加により試料を分析した。この間接分析により、３０％のＣ６−アルデヒド澱粉が生成し、１３Ｃ ＮＭＲにより確認された。
実施例２：ラッカーゼによるプルランの酸化
１００ｍｌ水中の１．８４ｇのプルラン（１１．５ミリモルアンヒドログルコース単位）、１７ｍｇのＴｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒラッカーゼＶＩＩＩｂ（組み換え大腸菌中で発現，ＷａｃｋｅｒＣｈｅｍｉｅ）及び２５ｍｇのＴＥＭＰＯの溶液に、酸素ガスをバブリングした。この溶液（６．１）のｐＨは、２４時間後に４．５迄徐々に減少した。ヒドロキシルアミン塩酸塩との反応により求めたこの溶液のアルデヒド含量は、１．１ミリモルであった。このウロン酸含量は２４％であった。このアルデヒド基をカルボン酸基に酸化するために、この溶液を塩素酸ナトリウムと過酸化水素により処理した。処理後、ウロン酸は３２％迄増加した。酸化性基基準で、収率はそれぞれ３６と４８％であった。この溶液をエタノール中に注いだ。白色沈殿が生成し、１日後にこれを濾過により集め、真空中で乾燥した。この材料のウロン酸含量は２５％であった。
実施例３：ラッカーゼによるプルランの酸化
１．８４ｇのプルラン（１１．５ミリモル）、１００ｍｇの４−アセタミド−ＴＥＭＰＯ、及び１８ｍｇのラッカーゼ（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）の溶液を作製した。この混合物を酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液（０．０５Ｍ）により緩衝した。この溶液の初期のｐＨは６．１であった。この混合物を密閉系中で酸素ガスに曝露した。１日の反応後、２４ｍｌの酸素が消費された。ｐＨを元の値に戻すために、２ｍｌの０．５ＭＮａＯＨを添加した。この反応を更に１日続け、その結果２０ｍｌの酸素ガスが消費された。最終ｐＨは５．１であった。１．２ｍｌのＮａＯＨ（０．５Ｍ）の添加により、このｐＨを再度調節した。１５ｍｇラッカーゼを添加し、反応を２日間進行させた。この期間の後、ｐＨは４．５であり、３０ｍｌの酸素ガスが消費された。ｐＨを６とするために、３ｍｌの０．５ＮａＯＨを添加する必要があった。この溶液に０．２ｍｌの過酸化水素（３０％ｗ／ｗ）と２５０ｍｇの塩素酸ナトリウムを添加した。１日の反応後、ウロン酸含量を測定した。塩素酸ナトリウムによる酸化前のウロン酸の収率は、５５０ｍｇ（２６％）であり、後では６９５ｍｇ（３３％）であった。
実施例４：ラッカーゼを用いるＴＥＭＰＯのニトロソニウム塩の製造
ＴＥＭＰＯニトロソニウムイオンの溶液をラッカーゼにより次のように作製した。６．９ｇのＴＥＭＰＯを１ｌの脱塩水に溶解した。Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｗａｃｋｅｒ）からの２００ｍｇのラッカーゼＶＩＩＩｂを２０ｍｌの脱塩水に懸濁した。この酵素溶液を１０分間撹拌した後、Ｐ６カラムを用いて遠心分離（５分 １５００ｘｇ）後の上澄み液を脱塩した。この脱塩した材料をＴＥＭＰＯ溶液に添加した。ほぼ１５０分間でｐＨ５のｐＨ一定の条件下、周囲温度で、空気噴霧のエアレーションにより、１００．８ｍｌのＨＣｌ（０．４Ｎ）の消費と黄色から更に橙色へのシフト（比Ｅ４８０／Ｅ４３０はほぼ０．３から１に増加する）により定量して、９１％のＴＥＭＰＯをニトロソニウムに変換した。
実施例５：ニトロソニウム塩とＵＦ膜システムを用いる澱粉の酸化
実施例４により得られるニトロソニウム溶液を０．２Ｍ酢酸塩によりｐＨ４．５で緩衝した。２ｇの土産のジャガイモ澱粉を１００ｍｌの水中でゼラチン化し、１００ｍｌの緩衝したニトロソニウム溶液と混合した。この混合物を２００ｍｌの撹拌したＵＦ容器中に注いだ（カットオフ５ｋＤ）。ほぼ８００ｍｌのニトロソニウム溶液を０．５ｍｌ／分の速度で室温２０℃で容器中にポンプ注入した。この透過液は、５０％のニトロソニウムイオンのＴＥＭＰＯへの変換（Ｅ４８０／Ｅ４３０比基準で）を示した。この処理の後、この澱粉のウロン酸含量は３８％であることが判明した。
実施例６：酸素／ラッカーゼ／ＴＥＭＰＯサイクルを用いる澱粉の変換
リントナーじゃがいも澱粉（Ｓｉｇｍａ５−２６３０）を水中にゼラチン化することにより、澱粉溶液を製造した。０．２Ｍコハク酸／コハク酸塩緩衝液の添加により、ｐＨを調節した。ＴＥＭＰＯまたは４−アセトアミドＴＥＭＰＯ（４ａｃｍＴ）を添加した。（ＴＥＭＰＯは、ある条件において、加工時に溶解する沈殿を澱粉と共に形成する）。大腸菌中で発現されたＴｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒからのラッカーゼＶＩｌＩｂ（ＷａｃｋｅｒＣｈｅｍｉｅ製）を１０ｍｇ／ｍｌ０．２Ｍコハク酸塩緩衝液ｐＨ６で懸濁した。１０ｍｇのラッカーゼについて遠心分離（５分 １５００ｇ）した後、１ｍｌの上澄み液を添加した。撹拌した加圧容器ＡとＢ中でこの溶液への酸素移動を増進させた。双方の容器にはほぼ１００ｍｌが入っていた。ガス相との接触面積は、容器Ａについては７０ｃｍ２であり、容器Ｂについては３２ｃｍ２であった。Ｃ６−酸化（アルデヒドまたはカルボン酸）に関する実験条件と結果を表１及び２に要約する。反応条件についての重要なパラメーターは、この溶液への酸素移動、ｐＨ、温度、ＴＥＭＰＯ、酵素及び澱粉の濃度である。ウロン酸の生成をＢｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚによりモニターした。次の条件下でウロン酸に酸化した後、アルデヒドの生成をモニターした。５ｍｌの試料（２０ｇ／ｌ澱粉）に０．０９５ｍｌの３％Ｈ２Ｏ２と０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌ塩素酸ナトリウムを添加した。このウロン酸含量を１６時間後室温で測定した。
【００２１】
【表１】
2004512805.tif 000002
【００２２】
【表２】
2004512805.tif 000003
【００２３】
実施例７：ＴＥＭＰＯ／Ｍｎ／Ｈ２Ｏ２によるプルランの酸化
２５ｍｌの水中に２５０ｍｇのプルランと２０ｍｇのＴＥＭＰＯを溶解した。この溶液に２５ｍｇの硝酸マンガンを、続いて１００μｌの過酸化水素（３％溶液，ｗ／ｗ）とビピリジン溶液（５ｍｌ ０．０５Ｍ）を添加した。この反応をｐＨ６．５で行った。１日目に、６０ｍｇ（１．８ミリモル）の過酸化水素を添加し、１日後に２５ｍｇのウロン酸が生成した。２日目に、３０ｍｇの過酸化水素を添加し、ウロン酸の量は５０ｍｇに増加した。このアルデヒド基を過酸化水素／塩素酸ナトリウムによりカルボン酸基に変換し、この含量は９０ｍｇ（Ｄ．Ｏ．６０％）に上昇した。
【国際公開パンフレット】
2004512805.tif 000004
2004512805.tif 000005
2004512805.tif 000006
2004512805.tif 000007
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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