(57)【要約】本発明は、細胞内ループ２とのＴＭ３ドメインの接合点に近接して現れるＤＲＹ配列の３アミノ酸が、その側鎖が脂肪親和性でもなく荷電した基も含有しないアミノ酸で置き換えられた修飾タキキニンレセプターを提供する。そのレセプターは、その野生型レセプターに類似するリガンド結合特性を示すが、内因性シグナルを起こすことができないか又はそれを実質的に起こすことができない。従って、そのリガンドは、そのＧタンパク質へのそのレセプターの細胞内共役を示さないか、又はそれを実質的に示さず、それによって、その細胞へのリガンド結合シグナルを実質的に変換しない。本発明は、その修飾ＤＲＹ配列を含有するレセプターの断片、及び、前述された修飾レセプターをコードするポリヌクレオチドをも包含する。そのレセプターのための治療的及び診断的使用が開示されている。
2004531215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異タキキニンレセプターであって、細胞内ループ２とのＴＭ３ドメインの接合点に隣接して存在するＤＲＹ配列の３アミノ酸が、その側鎖が脂質親和性でもなく荷電した基も含有しないアミノ酸で置き換えられており、前記レセプターが、その野生型レセプターに類似するリガンド結合特性を示すが、そのＧタンパク質への該レセプターの細胞内カップリングを実質的に示さないことによって、該細胞へのリガンド結合シグナルの変換が実質的にないレセプター；又は
前記修飾ＤＲＹ配列を含有する前記レセプターの断片；又は
上記配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含有する単離されたタンパク質又はポリペプチド；又は
Ｃ末端又はＮ末端のいずれかからの連続するアミノ酸欠失を有するその変異体；又は
前記修飾ＤＲＹ配列を含有する、その対立変異体、異種特異的同属体又は生物学的に活性なタンパク分解の又は他の断片。
【請求項２】
請求項１記載の非ヒト哺乳類レセプター。
【請求項３】
請求項１記載のラット又はマウスレセプター。
【請求項４】
請求項１記載のヒトレセプター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の突然変異ＮＫ−１レセプター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の突然変異ＮＫ−２レセプター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の突然変異ＮＫ−３レセプター。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のレセプターであって、該置換アミノ酸がＧ及びＡから選択されるレセプター。
【請求項９】
請求項８記載のレセプターであって、ＤＲＹがＧＧＡによって置き換えられたレセプター。
【請求項１０】
配列番号５のタキキニンレセプター、又は配列番号５のレセプターと少なくとも８０％アミノ酸同一性を有しかつサブスタンスＰに結合することができるがそれの内因性シグナルを実質的に開始することができないレセプター、又は前記レセプターの断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されたタキキニンレセプターを組み込んでいる単離された細胞膜。
【請求項１２】
次のいずれかのもの：
（ａ）請求項１〜９のいずれかのタキキニンレセプターをコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子；
（ｂ）上記配列にハイブリダイズすることができる配列を含んでなる単離された核酸分子；
（ｃ）上記配列又は上記配列にハイブリダイズすることができるいずれかの配列を伸ばした結果物である遺伝子；
（ｄ）上記配列又は上記配列を伸ばした遺伝子と機能的に等価である配列又は遺伝子、即ち、言及される配列又は遺伝子と同一ではないが、該言及される配列又は遺伝子と等価なものとして生物学的に機能する、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから作り出された人工的若しくは組み換え配列を包含するあらゆる対立変異体及び異種特異的哺乳類同属体を包含する配列又は遺伝子；
（ｅ）上記遺伝子配列を含んでなる組み換えベクター；及び
（ｆ）該ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
次のいずれかのもの：
（ａ）配列番号６のヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子；
（ｂ）上記配列とハイブリダイズすることができる配列を含んでなる単離された核酸分子；
（ｃ）上記配列又は上記配列にバイブリダイズすることができるいずれかの配列を伸ばした結果物である遺伝子；
（ｄ）上記配列又は上記配列を伸ばした遺伝子と機能的に等価である配列又は遺伝子、即ち、言及される配列又は遺伝子と同一ではないが、該言及される配列又は遺伝子と等価なものとして生物学的に機能する、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから作り出された人工的若しくは組み換え配列を包含するあらゆる対立変異体及び異種特異的哺乳類同属体を包含する配列又は遺伝子；
（ｅ）上記遺伝子配列を含んでなる組み換えベクター；及び
（ｆ）該ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されたアミノ酸配列を有するレセプタータンパク質を産生させるための方法であって、その方法が：
（ａ）前記核酸配列を適切なベクター中に挿入し；
（ｂ）段階（ａ）の組み換えベクターで予め形質転換又は形質移入された宿主細胞を培地中で培養し；
（ｃ）段階（ｂ）から得られた該レセプタータンパク質を含有する細胞を採取し；そして
（ｄ）こうして産生されたレセプタータンパク質を、前記培地又は前記宿主細胞から分離又は精製する
段階を含んでなる方法。
【請求項１５】
有効な量の、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンリガンド又は前記リガンドをコードする核酸配列、及び薬学的及び薬理学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
サブスタンスＰ又は他のタキキニン（ニューロキニン）レセプター結合性リガンドに関連する状態を治療又は予防するための医薬品の調製における、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターの使用。
【請求項１７】
内因性タキキニンリガンドの過剰発現又は不適切な発現に関連する状態を治療又は予防するための方法であって、それを必要とする患者へ非毒性で有効な量の請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されたような修飾タキキニンリガンドを投与することを含んでなる方法。
【請求項１８】
治療的に活性な化合物をスクリーニングするための方法であって：
（ａ）請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターを発現する細胞株を提供し；
（ｂ）標識タキキニンリガンド及び段階（ａ）からの細胞株を含有する溶液へ試験サンプルを加え；
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞株、試験サンプル及び標識リガンドの混合物をインキュベートして、前記リガンド及び試験サンプルが該修飾タキキニンレセプターに結合できるようにし；
（ｄ）場合によって、結合していない標識リガンドを該修飾タキキニンレセプターに結合した標識リガンドから分離し；そして、望まれれば、
（ｅ）該修飾タキキニンレセプターに結合している標識リガンドの量を測定する
段階を含んでなる方法。
【請求項１９】
該野生型タキキニンレセプターに結合する存在物を特定及び／又は評価するためのアッセイにおける、代替物としての請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターの使用。
【請求項２０】
関節炎、痛み、偏頭痛、不安症、精神分裂症、喘息、リューマチ性関節炎を有する患者及び胃腸障害及び胃腸管の疾患の患者における体液中のリガンドの濃度を測定するためのアッセイにおける、代替物としての請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターの使用。
【請求項２１】
アッセイ方法であって：
（ａ）請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターを発現する細胞株を提供し；
（ｂ）該細胞株を標識し；
（ｃ）該試験サンプル及び標識細胞をマトリックス結合性ＳＰ又は他のリガンドへ加え；
（ｄ）該標識細胞、試験サンプル、及びマトリックス結合ＳＰ又は他のリガンドをインキュベートして、ＳＰ又は他のリガンド及び試験サンプルが該発現された修飾タキキニンレセプターへ結合できるようにし；
（ｅ）該標識された結合していない細胞を、該ＳＰ又は他のリガンドが結合した細胞から分離し；そして、望ましければ、
（ｆ）ＳＰ又は他のリガンドに結合した修飾タキキニンレセプターを含有する標識細胞の量を測定する
段階を含んでなるアッセイ方法。
【請求項２２】
過剰又は不適切に産生された内因性リガンドの作用を減少させるタンパク質療法における、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターの使用。
【請求項２３】
治療を必要とする患者を治療するための方法であって、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターを含んでなるエアロゾルの形態の組成物を前記患者へ投与することを含んでなる方法。
【請求項２４】
それを必要とする患者を遺伝子治療するための方法であって、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターをコードする核酸配列、ウイルス又はプラスミドを前記患者へ投与することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タキキニンレセプターをコードする核酸配列、前記配列によってコードされたタキニンレセプター、それを調製するための方法、及び治療及びスクリーニングにおけるそれの使用に関する。特に、本発明は、意外で有用な特性をもたらすタキキニンレセプタータンパク質への修飾に関する。
【背景技術】
【０００２】
タキキニン類は、炎症、痛み、片頭痛、頭痛及びアレルギー誘発喘息を包含する多くの生理学的及び病理学的過程の薬物療法において重要である。それらは、神経伝達において確立した役割を有する進化的に保存されたファミリーのペプチド神経伝達物質に属する。それらは、Ｃ末端配列Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ2（配列番号１２）を共有し、Ｘａａが疎水性残基に相当する。その配列はタキキニンの特徴であるので、ニューロキニンレセプターにおけるそれらの生物学的活性の主な原因であると考えられる。
【０００３】
哺乳類のタキキニンには、サブスタンスＰ（ＳＰ）、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）及びニューロキニンＢ（ＮＫＢ）が含まれ、それらは特異的なレセプターに結合することによってそれらの効果を発揮する。ＳＰは、タキキニン作動系の最も顕著なメンバーであり、知覚神経終末から体のいたるところに放出される。それのアミノ酸配列は：Ｈ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ2（配列番号１）である。
ＮＫＡについてのアミノ酸配列は：Ｈ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ2（配列番号２）である。
ＮＫＢについてのアミノ酸配列は：Ｈ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ2（配列番号３）である。
【０００４】
ＳＰは、多くの疾患の病理に関係している。例えば、血管拡張、平滑筋収縮、気管支収縮、免疫系の活性化及び神経性炎症に関連する状態における痛みの伝達に関与することが示されている。それは、偏頭痛、並びに、不安症及び精神分裂症のような中枢神経系の障害；喘息及びリウマチ性関節炎のような呼吸器性及び炎症性疾患；及び潰瘍性大腸炎及びクローン病のような胃腸（ＧＩ）疾患及び胃腸管の疾患に関係している。
タキキニンレセプターには、ＮＫ−１、ＮＫ−２及びＮＫ−３が含まれ、それはグアニンヌクレオチド結合性タンパク質（Ｇ−タンパク質）カップルドレセプター（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーの膜タンパク質である。それらは、リガンドであるＳＰ、ＮＫＡ及びＮＫＢそれぞれについての優先的な親和性を有する細胞外結合部位を有する。他のＧタンパク質カップルドレセプターのように、それらは、第１、第２及び第３細胞外ループによって及び第１、第２及び第３細胞内若しくは細胞質ループによって連結された細胞外Ｎ末端、細胞内Ｃ末端及び７つの２０〜３０アミノ酸の膜貫通（ＴＭ）α−へリックスを所有する。膜貫通ドメインＴＭ１〜ＴＭ７の膜を跨ぐαへリックスにおいて最も大きいホモロジーが見出される一方で、そのＮ及びＣ末端は、３タイプのニューロキニンレセプター間で大きな多様性を示す。
【０００５】
クローン化されたＮＫ−１レセプターが報告されており、Rana catesbeina, (Simmons et al., Neuroscience, 79: 1219-1229 (1997)), Mus musculus, (Sundelin et al., Eur. J Biochem. 203: 625-631 (1992)), Rattus norvegicus, (Hershey et al, J. Biol. Chem., 266: 4366-4374 (1991) 及び Yokota et al, J. Biol. Chem., 264: 17649-17652 (1989)), Cavia porcellus, (Gorbulev et al., Biochem. Biophys. Acta 1131: 99-102 (1992)), 及び Homo sapiens (ヒト), (Takeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1232-1240 (1991) 及び Fong et al ＵＳ−Ａ−５５２５７１２及び５５８４８８６) についてのものが包含される。クローン化されたラット及びウシニューロキニン２レセプターが報告されている (Y. Sasi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 165: 695 (1989), 及び Y. Masu, et al., Nature 329: 836 (1987))。クローン化されたラットニューロキニン３レセプターも報告されている (R. Shigemoto, et al., J. Biol. Chem., 265:623 (1990))。
【０００６】
これら全ての報告者らは、Ｇタンパクカップルドレセプターのシグナル変換メカニズムを共有している。そのレセプターは、リガンドが存在しない時はＯＦＦ状態にあるが、アゴニストリガンドがそのレセプターに結合するとＯＮ状態に入る。そのＯＮ状態にあるＧタンパク質は、下流のシグナル発信経路若しくはシグナルカスケードの誘発を開始する。そのＧタンパク質は、ＯＦＦ状態では一緒に結合されているα、β及びγユニットを含んでなり、そして、そのαサブユニットはそれに結合したＧＤＰを有する。ＯＮ状態では、ＧＴＰが、αサブユニットに結合したＧＤＰに置き換わる。そのαサブユニットは、β及びγサブユニットから分離するようになり、そして、そのシグナルカスケードを活性化するために利用可能となる。短期間の後、そのＧＴＰはＧＤＰへ加水分解され、そしてそのＧタンパク質は、それの非活性化ＯＦＦ状態に戻る。加水分解が、Ｇタンパク質が短期間だけそれの活性化ＯＮ状態になることを確実にするネガティブフィードバックメカニズムを提供するのである。
【０００７】
異なるＧタンパク質レセプターに関連した種々の検討が、そのタンパク質構造の種々の領域が、Ｇタンパク質へのそのレセプターの細胞内カップリング及びその細胞へのリガンド結合シグナルの必然的変換にどのように影響するかを確認するために行われてきた。Ｇタンパク質レセプターは、第２細胞内ループ中に、そのループが第３膜貫通ドメインとそこで結びつく良く保存された、ＤＲＹ配列として知られる配列を有する。それは、残基：
５’−ＤＲＹＸＸＶ（Ｐ）ＸＸＰＬ−３’（配列番号４）
を有し、ＬはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ又はＰｈｅを表し、そしてＸはあらゆるアミノ酸を表す。ＤＲＹ配列が効率の良い結合とＧタンパク質の活性化に寄与することが示唆されている。Fraser et al., Proc. Natl Acad Sci. USA, 85: 5478-5482 (1988) は、ヒトβアドレナリン作動性レセプターの位置１３０（即ち、ＤＲＹ配列のＤ）におけるＡｓｐのＡｓｎへの変化が、アゴニストの高親和性結合を示す一方でＧタンパク質と有効に相互作用することができないヒトβアドレナリン作動性レセプターをもたらすことを報告している。しかしながら、その同じ研究室からの第２の論文は、上で述べられた結論が基礎としていた、位置１３０において突然変異されたヒトβアドレナリン作動性レセプターにおける以前の非常に高いアゴニスト結合効率が再現されなかったと報告している (Wang et al., Mol Phrmacol 40(2): 168-79 (1991))。総説論文において、Savarese 及び Fraser は、この位置は、全部ではないがいくつかのＧタンパク質とのカップリングに重要であるかもしれないと言った (Biochem J., 283: 1-19 (1992))。Moro et al は、ＤＲＹ配列の５’末端の方に変化を有するＨｍ１ムスカリン様コリン作動性レセプターの突然変異体を作製し、位置１３１におけるＬをＡで置き換えることが、カップリング効率における最強の減少を与えることを見出した (J. Biol. Chem. 268: 22273-22278 (1993))。その後、Shibata et al は、位置１２５〜１２７におけるＤＲＹがＧＧＡによって置き換えられそして位置１３４におけるＭがＡによって置き換えられたアンジオテンシンＩＩレセプタータイプＩの突然変異体を作製し、その突然変異ＡレセプターがＧタンパク質へカップリングしないようにした (Biochem. Biopys. Res. Com. 218: 383-389 (1996))。それら著者らは、その最終的な脂質親和性アミノ酸Ｌを全体として包含するＤＲＹ配列はＧタンパク質カップリングのための一般的部位として役立つと結論付けたが、その配列のＤＲＹ部分に限られた変化によってどのような効果が得られるかを考慮しようとはしなかった。
【０００８】
ヒトＮＫ−１レセプターの二つの既知のイソフォームの結合親和性を比較すると、細胞質内尾部の重要性が分かる。その長いフォーム（４０７アミノ酸）と短いフォーム（３１１アミノ酸）は、Ｃ末端の長さが異なる。長いフォームはラットＮＫ−１レセプターに類似するサブスタンスＰ結合特性を有する一方で、そのレセプターの短いフォームは、ラットＮＫ−１レセプターよりも１０倍低い見かけサブスタンスＰ結合親和性を有する。
更に、これら及び他のレセプターの検討で、突然変異の効果は予測できないものでありかつ一定のファミリーのレセプターに特異的なものであることが分かった。このことから、一つのタンパク質カップリングファミリーにおける変化は、必ずしも別のものに同じ効果を有さない。タンパク質結合とシグナル発信効果を識別する他の試みが、このことを支持している。
【発明の要旨】
【０００９】
本発明は、突然変異タキキニンレセプターであって、細胞内ループ２とのＴＭ３ドメインの接合点に隣接して存在するＤＲＹ配列の３アミノ酸が、その側鎖が脂質親和性でもなく荷電した基も含有しないアミノ酸で置き換えられており、前記レセプターが、その野生型レセプターに類似するリガンド結合特性を示すが、内因性シグナルを開始することができないか又は実質的にできない突然変異タキキニンレセプターを提供する。かくして、そのリガンドは、そのＧタンパク質へのそのレセプターの細胞内カップリングを示さないか又は実質的に示さないことによって、その細胞へのリガンド結合シグナルの変換が実質的にない。タキキニンレセプターが細胞膜に付着する様式、細胞外膜貫通ドメイン及び細胞質ループ、及び上で言及されたＤＲＹ配列が存在する場所は、添付図面の図５を検分することによって明らかとなる。
【００１０】
本発明は、更に次のいずれかを提供する：
前記修飾ＤＲＹ配列を含有する前記突然変異タキキニンレセプターの断片；
上記配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含有する単離されたタンパク質又はポリペプチド；
Ｃ末端又はＮ末端のいずれからの連続するアミノ酸欠失を有するその変異体；及び
前記修飾ＤＲＹ配列を含有する、その対立変異体、異種特異的同属体又は生物学的に活性なタンパク分解物の又は他の断片。
本発明は、前述された修飾タキキニンレセプターが膜タンパク質として組み込まれている単離された細胞膜をも含んでなる。そのような細胞膜材料には、研究のための、特に、以下に説明するように、治療的に有用な化合物のスクリーニングについての有用性が見出される。
【００１１】
本発明は、更に、次のいずれかを提供する：
（ａ）前述された修飾タキキニンレセプターをコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子；
（ｂ）上記配列にハイブリダイズできる配列を含んでなる単離された核酸分子；
（ｃ）上記配列又は上記配列にハイブリダイズできるいずれかの配列を伸ばした結果物である遺伝子；
（ｄ）上記配列又は上記配列を伸ばした遺伝子と機能的に等価である配列又は遺伝子、即ち、言及される配列又は遺伝子と同一ではないが、該言及される配列又は遺伝子と等価なものとして生物学的に機能する、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから作り出された人工的若しくは組み換え配列を包含するあらゆる対立変異体及び異種特異的哺乳類同属体を包含する配列又は遺伝子；
（ｅ）上記遺伝子配列を含んでなる組み換えベクター；及び
（ｆ）該ベクターで形質転換された宿主細胞。
本発明は、本明細書において記載されたアミノ酸配列の一つ、特に、配列番号５によって定義されるレセプタータンパク質を産生させるための方法をも提供し、その方法は：
（ａ）前記核酸配列を適切なベクター中に挿入し；
（ｂ）段階（ａ）の組み換えベクターで予め形質転換又は形質移入された宿主細胞を培地中で培養し；
（ｃ）該レセプタータンパク質を含有する段階（ｂ）から得られた細胞を採取し；そして
（ｄ）このように産生されたレセプタータンパク質を前記培地又は前記宿主細胞から分離又は精製する
段階を含んでなる。上記方法の段階（ｄ）においては、レセプタータンパク質は、培地からでも、及び／又は宿主細胞を溶解することによっても、例えば、超音波処理又は浸透圧ショックによってでも得られ得る。
【００１２】
本発明は、更に、治療的に活性な化合物をスクリーニングするための方法も提供し、前記方法は：
（ａ）前述された修飾タキキニンレセプターを発現する細胞株を提供し；
（ｂ）標識されたＳＰ又は他のタキキニンリガンド及び段階（ａ）からの細胞株を含有する溶液へ試験サンプルを加え；
（ｃ）段階（ｂ）からの該細胞株、試験サンプル及び標識されたＳＰ又は他のリガンドの混合物をインキュベートして、ＳＰ又は他のリガンド及び試験サンプルが、該修飾タキキニンレセプターへ結合できるようにし；
（ｄ）場合によって、結合していない該標識されたＳＰ又は他のリガンドを該修飾タキキニンレセプターに結合した該標識されたＳＰ又は他のリガンドから分離し；そして、望まれれば、
（ｅ）該修飾タキキニンレセプターに結合している標識されたＳＰ又は他のリガンドの量を測定する
段階を含んでなる。
【００１３】
本発明は、更に：
（ａ）サブスタンスＰ又は他のタキキニン（ニューロキニン）レセプター結合性リガンドに関連する状態を治療又は予防するための医薬品の製造における本発明による修飾タキキニンレセプターの使用；
（ｂ）治療におけるそのような修飾タキキニンレセプターの使用；
（ｃ）内因性タキキニンリガンドの過剰発現に関連する状態を治療又は予防するための方法であって、それを必要とする患者へ、無毒で有効な量の上記のような修飾タキキニンリガンドを投与することを含んでなる方法；
（ｄ）上に記載された修飾タキキニンリガンドをそのための薬学的及び薬理学的に許容できる担体と一緒に含んでなる組成物；及び
（ｅ）該修飾タキキニンリガンドが、そのようなリガンドをコードする核酸配列から in vivo で生成される、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つに記載の使用、方法又は組成物を提供する。
本発明は、添付図面に言及しながら更に詳しく説明される。
【好ましい態様の説明】
【００１４】
定義
本明細書において用いられている多くの用語の定義が以下に示される：
“対立遺伝子又は対立配列”は、上で言及されたレセプター遺伝子の別の形態を意味し、その核酸配列中の１又はそれを超える変異から生じ、変化したｍＲＮＡ及びタンパク質又はポリペプチドをもたらすものを意味する。
遺伝子配列又はアミノ酸配列との関係で用いられるときの“機能的に等価”は、言及された配列と同一ではないが、その開示された配列と等価なものとして生物学的又は化学的に機能する配列をカバーする。
本文脈における“内因性シグナルを開始することができない”は、実験誤差の範囲（コントロールの±５％）内で、修飾ＮＫＲが細胞又は組み換え構造中でのＧＴＰのＧＤＰへ転換をもたらさないこと；及び／又は
その中へカルシウムフラックスを喚起しないこと；及び／又は
シグナル変換経路の他の成分を喚起しないこと
を意味する。
【００１５】
ポリヌクレオチド配列との関係で用いられる“単離された”は、それの天然環境から、即ち、それがその中に自然に存在する生物から、及び／又はそれが由来する生物の天然に存在するゲノム中のすぐ近くにある遺伝子（一方が５’末端で他方が３’末端）から取り出された配列を意味する。細胞膜との関係で用いられる“単離された”とは、細胞質材料から実質的に分離した別個の存在物としての膜のことを言う。
“作動できるように連結された”とは、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素の連結のことを言う。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を与えると、そのコーディング配列に作動できるように連結されている。より具体的には、２つのＤＮＡ分子（プロモーター領域及び目的のポリペプチド若しくはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドのようなもの）は、それら２つのポリヌクレオチド間の連結の性質がフレームシフト突然変異の導入をもたらすことも、プロモーターを含有するポリヌクレオチドがコーディングポリヌクレオチドの転写を駆動する能力と干渉することもしなければ、“作動できるように連結された”といわれる。
“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”は、当該技術分野において認められている用語であって、所与の核酸配列について、のこの条件は、その配列がそれの相補的配列にハイブリダイズすることを許容し、かつ実質的に異なる配列へハイブリダイズすることを許容しない条件のことを言う。それは、一般に、それら配列の間に少なくとも９７％の同一性があることを暗示する。
【００１６】
タンパク質配列及び核酸配列
上で述べられた突然変異レセプターにおいては、非極性でありかつ正しい親水性／親油性バランスを有する、ＤＲＹ配列を修飾するためのアミノ酸には、グリシン及びアラニンが含まれ、これらが好ましい。しかしながら、本発明者らは、他の非極性アミノ酸の使用をも予見している。
好ましい側面においては、本発明は、修飾ｈＮＫ−１ｖについてのコンセンサスアミノ酸配列をコードする図２に示された核酸配列（配列番号６）又はそれにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を提供する。
本発明は、図１に示される好ましいｈＮＫ−１ｖレセプター配列（配列番号５）も提供する。
【００１７】
本発明は、更に、配列番号６の核酸配列によってコードされるｈＮＫ−１Ｒｖ１と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、そして最も好ましくは９８％アミノ酸同一性を有するレセプタータンパク質をコードする核酸配列であって、
ＳＰに結合できるが、それの内因性シグナリングを開始することができないタンパク質をコードし、又は
配列（ｄ）に従う、それのペプチド断片をコードし、又は
配列（ｅ）に従う、それに相補的な配列をコードする
上で定義された核酸配列を提供する。
本発明は：
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を有するｈＮＫ−１Ｒｖ１タンパク質と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、そして最も好ましくは９８％アミノ酸同一性を有するタンパク質であって；
（ｂ）ＳＰ若しくはそれのペプチド断片へ結合できるか又はそれに相補的な配列へ結合できるが、Ｇタンパク質へのそれの内因性シグナリングを開始できないタンパク質、
も提供する。
【００１８】
配列番号５で示されたＮＫ−１レセプターのｈＮＫ−１Ｒｖ１変異体は、実施例４及び５において記載されている試験の結果によって証明されるように、その野生型レセプターに類似のリガンド結合特性を有するが、細胞シグナル発信能力が欠けている。いくつかの哺乳類レセプターは、ｈＮＫ−１レセプターとの８０％未満の全体的ホモロジーを示すことができる（例えば、ラットＮＫ−２レセプターはラットＮＫ−１レセプターに約４８％のホモロジーを有する）が、それにも関わらず、ＴＭ３の細胞内ＤＲＹ領域におけるそれらの保存性の観点から本発明の範囲内に包含される。従って、本発明は、ｈＮＫ−１Ｒｖ１と４０％という低さの全体的アミノ酸同一性しか有さないが、ＤＲＹモチーフに近接したｈＮＫ−１Ｒｖ１タンパク質のＴＭ３細胞内ループと少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、そして最も好ましくは９８％アミノ酸同一性を有し、そして、先に特定された特性を有するポリペプチドを提供する。
【００１９】
ＴＭ３細胞内ループのＤＲＹ領域における、他のＮＫレセプターによって証明された高いレベルの保存性、及びヒトと他の種の間でその領域中に観測された高いレベルの保存性からみて、本発明は、修飾ニューロキニンレセプターをコードするヌクレオチド配列であって、その修飾が、ＴＭ３の細胞内ループ内のＤＲＹモチーフの置換、即ち、Ａｓｐ129、Ａｒｇ130及びＴｙｒ131の、それぞれＧｌｙ、Ｇｌｙ及びＡｌａによる置換であるか、又はそれら置換を包含するヌクレオチド配列、例えば、そのレセプターが修飾ＮＫ−２又は修飾ＮＫ−３哺乳類レセプターであるヌクレオチド配列も提供する。
【００２０】
ベクター
本発明は、更に、修飾タキキニンレセプター、特に、本発明のｈＮＫ−１Ｒｖ１レセプター又はあらゆる他の修飾ｈＮＫ−１Ｒをコードする核酸を含んでなるベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）を提供する。
本発明の組み換えベクターは、本修飾ＮＫ−Ｒ、特にｈＮＫ−１Ｒｖ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる発現ベクターを含んでなる。本発明のヒト変異体ＮＫ−１レセプターを発現するための１つの適するベクターは、昆虫細胞及び昆虫細胞株中で増殖され得るバキュロウイルスベクターである。発現は、適切なシグナルがそのベクター中に提供されることを必要とし、前記シグナルは、その宿主細胞中の興味の対象である遺伝子を発現させるウイルス供給源と哺乳類供給源の両方からのエンハンサー／プロモーターのような種々の調節要素を包含する。この発現ベクターの調節配列は、その修飾タキキニンレセプター、特にヒトＮＫ−１変異体レセプターをコードする核酸に作動できるように連結される。一般に、組み換え発現ベクターには、複製の基点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択的マーカー、及び下流構造配列の転写を駆動させるために高度に発現された遺伝子から誘導されたプロモーターが含まれる。その異種構造配列は、翻訳配列、開始配列及び終結配列、そして好ましくは、翻訳されたタンパク質の配列を周辺質スペース若しくは細胞外培地中へ向かわせることができるリーダー配列と一緒に適切なフレーム内で組み立てられる。ベクターが目的の配列を形質移入したり発現するために真核宿主細胞中に適合される場合には、好ましいベクターは、望ましい宿主からの複製の基点、適するプロモーター及びエンハンサー、及びあらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列、及び場合によって５’フランキング非転写配列を含んでなる。
【００２１】
本発明による発現ベクター中で用いられる適するプロモーター領域は、その中で異種核酸が発現されなければならない宿主細胞を考慮に入れて選ばれる。適するプロモーターは、それによって発現が制御される核酸に関して異種であっても、発現されるべきコーディング配列を含有する天然ポリヌクレオチドに内因性であってもよい。更に、そのプロモーターは、一般に、プロモーター／コーディング配列の構造が挿入された組み換えベクター配列に関して異種である。
本発明の組み換えベクターは、修飾ＮＫＲ、特に、適する宿主細胞中に挿入されたｈＮＫ−１Ｒｖ１ポリペプチドをコードする核酸配列から誘導されたポリヌクレオチドを増幅するために使用されることができるので、このポリヌクレオチドは、その組み換えベクターが複製されるたびに増幅される。
ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化部位は、必要とされる非転写遺伝子要素を提供するために用いられ得る。
本発明による発現ベクター中に用いられる適するプロモーター領域は、その異種核酸が発現される宿主細胞を考慮して選ばれる。適するプロモーターは、それがその発現を制御する核酸に関して異種であっても、また、発現されるべきコーディング配列を含有する天然ポリヌクレオチドに対して内因性であってもよい。
【００２２】
更に、そのプロモーターは、一般に、プロモーター／コーディング配列の構造が挿入された組み換えベクター配列に関して異種である。好ましい細菌プロモーターは、ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３又はＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ΛＰＲ、ＰＬ及びｔｒｐプロモーター（ＥＰ００３６７７６）；ポリヘドリンプロモーター；又はバキュロウイルスからのｐ１０タンパク質プロモーター (Kit Novagen; Smith et al., 1983； O’Reilly et al., 1992、バキュロウイルス発現ベクター：A Laboratory Manual. W. H. Freeman and Co., New York) である。
形質転換された宿主細胞を選択するために本発明の発現組み換えベクター中に含有される好ましい選択可能なマーカー遺伝子は、好ましくは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン抵抗性、S. cerevisae についてのＴＲＰ１、大腸菌におけるテトラサイクリン、リファンピシリン若しくはアンピシリン抵抗性、又は mycobacteria についてのレバンサッカラーゼである。この最後ののマーカーは負の選択マーカーである。
【００２３】
本発明の好ましい細菌ベクターが、限定的例ではなくて例示として以下に示される：
ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９ (Qiagen)、ｐＤ１０、ｆｅｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐ．ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ (Stratagene)；ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５ (Pharmacia)；ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ (Stratagene)；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ (Pharmacia)；ｐＱＥ−３０(Qiagen)。
本発明の好ましいバクテリオファージ組み換えベクターは、Sternberg N.L. (1992; 1994) によって記載されたもののようなＰ１バクテリオファージベクターである。
本発明のｈＮＫ−１ｖＲａポリペプチド又はその断片を発現させるための適するベクターは、昆虫細胞及び昆虫細胞株中で増殖され得るバキュロウイルスベクターである。具体的な適する宿主ベクター系は、spodptera frugiperda から誘導されるＳＦ９細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１）を形質移入するために使用されるｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウイルス輸送ベクター (Pharmingen) である。
【００２４】
本発明の組み換え発現ベクターは、Feldman 及び Steg. (1996) 又は Ohno et al. (1994) によって記載されたもののようなアデノウイルスからの誘導され得る。
本発明のこの具体的な態様による別の好ましい組み換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスタイプ２若しくはタイプ５（Ａｄ２若しくはＡｄ５）又は動物起源のアデノウイルス（フランス特許出願第９３０５９５４号）である。
本発明のレトロウイルス性 in vitro 又は in vivo 遺伝子送達ビヒクルを調製又は構築するための特に好ましいレテロウイルスには、ミンク細胞集中誘発ウイルス (Mink-Cell Focus Inducing Virus)、マウス肉腫ウイルス及びＲｏｓｓ肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスが含まれる。他の好ましいレトロウイルスベクターは、Roth et al. (1996)、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／２５２３４、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／０６９２０、及び、やはり Roux et al. (1989)、Julan et al.(1992) 及び Nada et al. (1991) 中に記載されたものである。
本発明によって意図される更に別のウイルスベクター系は、Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989) 及び McLaughlin et al. (1996) によって記載されているもののようなアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）にある。
【００２５】
発現系
修飾ニューロキニンレセプターを発現させるために、本発明は、そのようなベクターで形質転換（原核細胞）又は形質移入（真核細胞）された宿主細胞；及び、そのようなポリペプチドを産生させるために遺伝工学で創り出されたあらゆる細胞又は非ヒト哺乳類を包含する生きている生物であって、本発明の核酸配列を発現的にその中に取り込んでいる細胞又は生物を提供する。
異種発現系は、クローン化ＮＫ−１レセプター、ＮＫ−２レセプター及びＮＫ−３レセプターであって、それらのヒト及び非ヒト哺乳類変異体を包含するレセプターを発現するために使用され得る。発現系の選択は、タンパク質発現の安定性、翻訳後修飾及び必要とされる産出量を包含する多くの要因に依存する。しかしながら、一般的に、その生物が複雑であるほど発現されるレセプターの産出量は低くなるが、そのレセプターがそれの天然コンホメーションをとる見込みは大きくなる。いくつかの発現宿主は、次のように普通は入手可能である。
【００２６】
−  原核宿主細胞、例えば、大腸菌ＤＨ５−α (大腸菌における遺伝子発現への包括的ガイドについての Sambrook et al. を参照のこと)。
−  酵母、例えば、Pichia pastoris。酵母中でＮＫ−１レセプターが発現する可能性が、Arkinstall et at (1995, FEBS 275 183-187) によって証明された。彼らは、その中で、密接に関係したレセプター、即ち、ヒトＮＫ−２をうまく発現させた。酵母中でのヒトＧタンパク質カップリングレセプターの大規模生成は、Sizemann et al (1996, Receptors and Channels, Vol 4, 197-203) によって証明された。簡単に説明すると、機能性のＮＫ−１レセプターを酵母中で発現するためのプロトコールは：（１）そのＮＫ−１ｃＤＮＡを酵母発現ベクター中へスプライシングし；（２）このベクターを酵母中へ形質転換し；そして、（３）そのＮＫ−１ｃＤＮＡ、及びそのＮＫ−１ｃＤＮＡの発現物を含有する酵母を選択することによって表され得る。
【００２７】
−  真核宿主細胞、例えば、昆虫細胞、非哺乳類脊椎動物細胞及び哺乳類細胞。非哺乳類脊椎動物細胞株には、Xenopus（カエル）卵母細胞が含まれる。本発明において意図される他の細胞株には、Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ；番号ＣＣＬ２．１；番号ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０；番号ＣＲＬ１６５１）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ番号第１７１１）、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１８０４）、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６３６１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１）ヒト腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ番号４５５０４；番号ＣＲＬ−１５７３）及びＢＨＫ（ＥＣＡＣＣ番号８４１００５０１；番号８４１１１３０１）；ＰＣ１２（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７２１）、ＮＴ２、ＳＨＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２６６）、ＮＧ１０８（ＥＣＡＣＣ番号８８１１２３０２）及びＦ１１、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−ＨＴＢ−１１）、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２７１）、ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２７）が含まれる。本発明の遺伝子が発現され得る好ましい系は、ＣＯＳ細胞、３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、２９２細胞及びＣＨＯ細胞のような細胞株である。ｈＮＫ−１ｖＲを効率良く発現させるための好ましい系は、ＣＨＯ及びＣＯＳ細胞株の使用を包含する。その遺伝子は、天然ＣＨＯ又はＣＯＳの内因性プロモーターを介しても、外因性プロモーターを介しても発現され得る。適する外因性プロモーターには、ＳＶ４０及びＣＭＶのようなもの、又はテトラサイクリンプロモーターのような真核プロモーターが含まれる。好ましいプロモーターはＣＭＶである。
【００２８】
いくつかの場合において、精製前に例えばヒトＮＫ−１変異レセプターにタグを付けることが必要とされ得る。次いで、殆どの場合、そのタグは、そのポリペプチドを発現することが必要とされるヌクレオチド配列内でコードされる。そのようなタグの例には、Ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、ヒスチジン残基の配列、ヘマグルチニンＡ、Ｖ５、Ｘｐｒｅｓｓ又はＧＳＴをコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。これらタグの殆どは、例えば、ＰＣＲ増幅プライマーの１つの中に適切なコーディング配列を組み込むことにより、ＰＣＲ増殖を介してその配列内に直接取り込まれ得る。しかしながら、そのタグは、ＧＳＴのようなタグ部分をコードする適切な核酸配列を、そのポリペプチド配列をコードする核酸配列の３’又は５’末端と共有結合させることなどにより、他の手段によっても導入され得る。そのＮＫ変異レセプターの精製は、ヒスチジンタグを使用する場合には、ＮｉＮＴＡカラムのようなニッケル又は銅親和性クロマトグラフィーカラム上を通過させることによって行われ得る。このように産生されたポリペプチドは、例えば、そのＮＫ変異レセプターに向けられたポリクローナル又はモノクローナル抗体が予め不動化されている免疫親和性クロマトグラフィーカラム上に結合させることによって、場合により更に特性決定される。
【００２９】
いくつかの目的のためには、修飾ヒト又は非ヒト哺乳類タキキニンレセプター、例えばＮＫ−１ｖレセプターがその中に存在する、哺乳類、例えば、マウス、ラット又はモルモットを提供することは有用であり得る。トランスジェニックラット、マウス及び他の哺乳類細胞は、ターゲッティングベクターを発生させて、そして、培養されるべき細胞を、例えば、遺伝子ターゲッティングサービスの、例えば、DNX Transgenic Sciences を用いることによって形質移入することによって作成され得る。トランスジェニック哺乳類の場合には、幹細胞が形質移入され、芽球細胞まで培養され、そしてメスの哺乳類の子宮内に導入される。それらは、それらの細胞膜内に、ＳＰのような内因性リガンドと結合するがそれらの内因性シグナリングを開始することができないか又は実質的に開始することができないタキキニンレセプターを有するので、これら動物は、これらリガンドの作用の研究及び変換阻害剤の開発において有用である。というのは、特に、それらが、内因性リガンドが存在するが、変換されたシグナル及びアンタゴニストが存在しないという動物の挙動を示し、それ故に真のコントロールを提供することができるからである (Silver, Lee M. 表題： Mouse genetics-concepts and applications、出版社；New York; Oxford University Press 1995；P De-Felipe-C et al；Nature. 1998 Mar 26；392 (6674): 394-7)。
【００３０】
アッセイ
本発明は、更に、ヒトＮＫ−１ｖレセプターのような修飾タキキニンレセプターであって、その野生型タキキニンレセプターに結合する存在物を特定及び評価するためのアッセイにおいて代替物として使用される修飾タキキニンレセプターを提供する。
本発明は、関節炎、痛み、偏頭痛、不安症、精神分裂症、喘息、リューマチ性関節炎を有する患者、及び潰瘍性大腸炎及びクローン病のような胃腸障害及び胃腸管の疾患の患者における体液中のサブスタンスＰの濃度を測定するためのアッセイに代替物として使用されるヒトＮＫ−１ｖレセプターをも包含する。
先に述べたように、３つのタキキニンレセプターは同定され、ＮＫ−１、ＮＫ−２及びＮＫ−３として呼ばれ、そして、それらはそれぞれの内因性リガンドであるＳＰ、ＮＫＡ及びＮＫＢを有する。各々のタキキニンは好ましいリガンドを有するが、各々のレセプターは他のタキキニンリガンドと相互作用する能力を有するので、疾患状態における交差リガンド結合の病理はあまり理解されていない。単独での又は連携してのＮＫ−１、ＮＫ−２又はＮＫ−３レセプター応答が in vitro 又は in vivo で少なくなる系の検討は、疾患状態におけるタキキニンレセプター及びそれらのリガンドの役割を理解するのに有意な助けとなろう。
【００３１】
スクリーニング法
本発明は、治療的に活性な化合物をスクリーニングする方法であって、次の段階：
（ａ）修飾タキキニンレセプター、例えば、ヒトＮＫ−１ｖレセプターを発現する細胞株を提供し；
（ｂ）標識されたＳＰ又は他のリガンド及び段階（ａ）からの細胞株を含有する溶液へ試験サンプルを加え；
（ｃ）段階（ｂ）からの該細胞株、試験サンプル及び標識されたＳＰ又は他のリガンドの混合物をインキュベートして、ＳＰ又は他のリガンド及び試験サンプルが該修飾タキキニンレセプターへ結合できるようにし；
（ｄ）場合によって、該結合していない標識されたＳＰ又は他のリガンドを該修飾タキキニンレセプターに結合した標識されたＳＰ又は他のリガンドから分離し、そして、望まれれば、
（ｅ）該修飾タキキニンレセプターに結合している標識されたＳＰ又は他のリガンドの量を測定する
を含んでなる方法をも提供する。
【００３２】
好ましくは、このアッセイは、ＣＯＳ−７細胞株を包含する。修飾タキキニンレセプター、例えば、ヒトＮＫ−１ｖレセプターを含有する細胞膜が、完全細胞の代わりに使用されてもよい。
ＳＰ又は他のタキキニンリガンド、例えば、ＮＫＡ又はＮＫＢは、スクリーニング技術分野において公知のあらゆる方法、例えば、125Ｉのような放射標識により、又は蛍光標識によって標識され得る。一定の環境（例えば、蛍光分極化 (fluorescence polarization) アッセイ）においては、結合した及び結合していないＳＰ又は他のタキキニンリガンドは、そのレセプターに結合したＳＰ又は他のリガンドの量を定量するために単離されなくてもよい。また、ＳＰ又は他のリガンドはマトリックスに結合することができ、そして、標識された細胞が、ヒトＮＫ−１ｖレセプターのような修飾タキキニンレセプターのそのＳＰへの結合を定量するために使用されてもよい。この場合には、そのアッセイ操作は以下に記載される段階に従う：
（ａ）ヒトＮＫ−１ｖレセプターのような修飾タキキニンレセプターを発現する細胞株が提供され；
（ｂ）該細胞株が標識され；
（ｃ）該試験サンプル及び標識された細胞が、ＳＰ又は他のリガンドが結合しているマトリックスに加えられ；
（ｄ）該標識された細胞、試験サンプル及びマットリックスに結合したＳＰ又は他のリガンドがインキュベートされて、ＳＰ又は他のリガンド及び試験サンプルが、該発現された修飾タキキニンレセプターに結合できるようにされ；
（ｅ）該標識された結合していない細胞が、該ＳＰ又は他のリガンドに結合した細胞から分離され；そして、望まれれば
（ｆ）ＳＰ又は他のリガンドに結合した該ヒトＮＫ−１ｖレセプターのような該修飾タキキニンレセプターを含有する標識された細胞の量が測定される。
【００３３】
アッセイに使用するためのトランスジェニック動物又は細胞株であって、本明細書において記載された配列を含んでなる動物及び／又は細胞株を提供するために、一般的な方法が知られており、そしてしかるべく適合され得る。修飾レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス及びプラスミドＤＮＡを包含する異なるタイプのベクターが、細胞又は組織内へ外来遺伝子材料を導入するためのビヒクルとして提案されている。
【００３４】
タンパク質療法
本発明は、内因性リガンドの作用又は過剰の内因性リガンドを減少させるためのタンパク質療法において使用するための修飾タキキニンレセプター、特に、ヒトＮＫ−１ｖレセプターをも包含する。
タンパク質療法は、肺の間質液におけるＳＰの作用を抑制するために用いられ得る。例えば、ヒトＮＫ−１ｖレセプターのような修飾タキキニンレセプターの精製調製物（例えば、液体又は紛体担体製剤）は、気道へ直接投与され得る。ひとたび気道中に投与されると、そのタキキニン変異レセプターは、例えば、ＳＰ分子に相互作用して結合し得る。これは、内因性ＮＫレセプターにとって利用可能であるＳＰの量を減少させる効果を有する。同様に、ヒトＮＫ−１ｖレセプターのような修飾タキキニンレセプターは、ＳＰが存在する、関節及び間質性肺腔のような体腔ヘ直接導入され得る。本変異レセプターはＳＰに結合する能力を有するので、その野生型レセプターと相互作用するのに利用可能なＳＰの量を減少させて、ＳＰ細胞応答のダウンレギュレーションを起こすことができる。
【００３５】
本発明は、体液、例えば、肺の間質液及び関節の腔の流体中のＳＰを除くか又は抑制する際に使用するための、ヒトＮＫ−１ｖレセプターのような修飾ＮＫレセプターを提供する。ヒトＮＫ−１ｖのような修飾ＮＫレセプターの精製された調製物（例えば、液体担体製剤）は、関節へ直接投与され得る。流体で満たされた関節腔へひとたび投与されると、そのＮＫ変異レセプターはＳＰ分子に相互作用して結合することによって、内因性ＮＫレセプターを活性化するために利用可能なＳＰ分子の量を減少させる。
ヒトＮＫ−１ｖレセプターは、偏頭痛、神経痛、糖尿病、末梢、ＡＩＤＳ関連及び化学療法誘発性神経疾患に付随する痛み、及び多様な起源の神経疾患、つまり；パニック障害、恐怖症及び強迫神経症行動のような不安症及び不安障害；精神分裂症；喘息；リウマチ性関節炎；を有する患者、及び、胃腸障害及び胃腸管の疾患、例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病の患者において過剰に又は不適切に発現したＳＰの作用を減少させることができる。治療、改善又は予防され得る他の状態又は疾患状態には：心身障害及び精神免疫学的障害；注意欠陥障害；月経前（ＰＭＴ若しくはＰＭＳ）又は遅発性黄体期症候群；躁病又は軽躁病；攻撃行動障害；乗り物酔い、偏頭痛誘発嘔吐及び化学療法で生じる嘔吐を包含する嘔吐；帯状疱疹後神経痛；うつ病；炎症；肥満症、過食症及び強迫摂食障害のような摂食障害；痴呆及び健忘障害のような認知障害；ジスキネジ−、無動硬直症候群、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、振せん又はジストニーのような運動障害；精神分裂障害；物質乱用障害；双極性障害；インポテンスを包含する性的機能障害；ストレス症；概日周期性の変化；アルツハイマー病；膀胱障害；高血圧症；アンギナ；虚血症；多発硬化症；慢性閉塞性肺疾患；強皮症；ＣＮＳ障害；及び過剰のＳＰのようなタキキニンペプチドが関連する他の状態が含まれる。更に、本発明者らは、上のＮＫ−１レセプターについて記載されたものと類似のやり方でのＮＫ２レセプター及びＮＫ３レセプターのＤＲＹモチーフへの修飾が、それらの特異的なリガンドを体液から除くために使用され得る修飾タキキニンレセプターの産生を可能にすると考える。
【００３６】
いくつかの因子が、タンパク質療法において考慮に入れられる必要がある。これらには：そのタンパク質の可溶化、活性と安定性の維持、送達及び投与量が含まれる。それら最初の３つの点は密接に関連している。タンパク質は慣用的な薬剤に比較して大きく、それらの生物学的活性は、それらの一次、二次、三次、そして、いくつかの場合においては四次構造が維持されていることに依存している。それらは、しばしば、それらの側鎖中に不安定な結合と多数の化学的反応性基を有する。変性又は凝集によるそれらの構造の崩壊は、活性の喪失又は免疫原性の増大をもたらし得る。生物学的に活性なタンパク質についての効果的な製剤を考案するためのキーとなる問題の１つは、安定でかつ生物学的に活性である製剤を見出すことである。タンパク質の投与ルートも、製剤において重要な役割を果たす。ミクロスフィア製剤は、注射剤のために使用され、そのタンパク質の安定性と活性の維持を助力し、そして徐放性製剤の可能性を提供する。固体の大きな粉末製剤は、エアロゾル及び局所治療における使用に最も適するものである。
【００３７】
Putoney 及び Burke (Nature Biotechnology 1998: 153-157) は、ミクロスフィアを製造するための種々の方法を概説している。１つのそのような方法は、噴霧凍結 (atomization-freezing) 法である。この被包方法においては、微紛にされた固体タンパク質が生物分解性ポリマーのＤＬ−乳酸共グリコール酸（ＰＬＧＡ (polymers of DL-lactic co-glycolic acid)）溶液中に懸濁されて、次いで、それが超音波処理又は空気噴霧を用いて噴霧される。これは小滴を生成し、次いで、それらは液体窒素中で凍結される。タンパク質もＰＬＧＡも両方ともがその中に不溶性であるエタノールを＜−４０℃で加えることで、そのミクロスフィアから有機溶媒を抽出する。この方法は、Ｕ．Ｓ−Ａ−５０１９４００中に更に記載されている。この方法において使用するための別のポリマーは、成長ホルモンを被包するための塩化メチレンポリマーである。Johnson et al, Nature Medicine 2: 795-799 (1996) を参照のこと。次の方法が、精製後のヒトＮＫ−１ｖレセプターのような修飾ＮＫＲをミクロスフィア中に取り込むために用いられ得る：
（ａ）精製された活性なミクロスフィアの、ヒトＮＫ−１ｖレセプターのような修飾ＮＫＲを安定剤の存在下で＞１００ｍｇ／ｍｌに濃縮し；
（ｂ）ＰＬＧＡ又は塩化メチレンポリマー溶液を加えて混ぜ；次いで
（ｃ）その凍結された懸濁物を液体窒素中に噴霧してそのミクロスフィアを固定し、そしてエタノールで抽出する。このように製造されたミクロスフィアは、μＭオーダーの直径を有する筈である。
【００３８】
本発明は、更に、それを必要とする患者を治療するための方法であって、上に記載された修飾タキキニンレセプター、例えば、ｈＮＫ−１Ｒｖレセプターを含んでなるエアロゾルの形態の組成物を前記患者へ投与することを含んでなる方法を提供する。
ＮＫＡ又はＮＫＢのようなＳＰ又は他のリガンドは、上に記載された修飾タキキニンレセプターを使用して生物学的流体から直接除かれ得る。例えば、精製ヒトＮＫ−１ｖレセプターは、適するマトリックスに結合され得る。ＳＰを含有する生物学的流体はそのマトリックス上を通されて、そのＳＰはマトリックスに優先的に結合する一方でその流体の他の成分は結合しないので、ＳＰはその生物学的流体から優先的に除かれることとなる。
【００３９】
核酸療法
本発明は、更に、それを必要とする患者を遺伝子治療する方法であって、上に記載された修飾タキキニンレセプター、例えばｈＮＫ−１Ｒｖレセプターをコードする核酸配列、ウイルス又はプラスミドを前記患者に投与することを含んでなる方法を提供する。修飾レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス及びプラスミドＤＮＡを包含する異なるタイプのベクターが、患者の細胞又は組織中へ外来遺伝子材料を導入するためのビヒクルとして提案されており、そして、主に、上で言及された修飾タキキニンレセプター核酸配列を導入するために使用され得る。その核酸配列を投与するために適切な戦略は、その提案される療法の標的組織、疾患状態及び寿命に依存する。
更に、細胞系でのＳＰの作用のダウンレギュレーションは、天然ＮＫ−１を発現するものとは他の細胞中で、ｈＮＫ−１ｖレセプターを発現させることによって達成され得る。これら細胞（天然ＮＫ−１レセプターを発現する細胞の近位にある細胞）内でのＳＰの発現は、ＳＰを“拭い取って”、その天然レセプターが相互作用するために利用可能であるＳＰを減少させる作用を有している。
【００４０】
ヒトＮＫ−１ｖレセプターのような修飾ＮＫレセプターの、その野生型レセプターを発現する細胞の外膜中への導入（タンパク質の直接導入又はこのタンパク質をコードする発現可能な遺伝子の導入を経由）は、利用可能なＳＰについてその野生型レセプターと変異レセプターの間に競合を引き起こす。その変異レセプターは、利用可能なＳＰとの結合について野生型レセプターと競合し、その野生型レセプターにとって利用可能であるＳＰの量を減少させる。ＮＫ−１ｖレセプターはＳＰ結合でシグナルを変換することができないので、その結果は、その野生型レセプターの作用のダウンレギュレーションをもたらす。
【００４１】
肺組織の治療においては、カリフォルニアのスタンフォード大学医療センターの研究者らは、活性材料が肺にエアロゾルによって送達される、膵嚢胞性繊維症のための遺伝子治療の試みを始めている。その活性材料は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）シェル中に納められた膵嚢胞繊維症経皮的伝導調節遺伝子の変異体からなる。類似のルートが、レセプターリガンドによる天然ｈＮＫ−１レセプターの活性化がダウンレギュレーションされることが必要とされる患者の肺へｈＮＫ−１ｖレセプターを送達するために採用され得る。膵嚢胞性繊維症における遺伝子治療のために提案された戦略に類似している、肺組織におけるＳＰとヒトＮＫ−１ｖレセプターの間の作用をダウンレギュレーションするための戦略が採用され得る。遺伝子をＡＡＶ中に納めて、エアロゾルＡＡＶでその肺組織を感染させる同じ技術が、ｈＮＫ−１ｖを導入するために用いられ得る。Samulski et al (University of North Carolina, Chapel Hill, NC 27599, 米国) は、ヒトＮＫ−１ｖレセプター遺伝子をＡＡＶ中に納めるために使用され得るベクターを市販している。
【００４２】
また、ヒトＮＫ−１ｖレセプター（ｐＣＭＶＮＫ−１ｖ）を含有するプラスミドは、遺伝子治療において直接使用され得る。そのプラスミドは、脂質：ＤＮＡ複合体として調製され、肺へエアロゾルとして投与され得る。Pillai et al., Pharm-Res 15(1l): 1743-7 (1998), McDonald et al., Pharm-Res 1998 15(5): 671-9(1998) を参照のこと。この戦略は、ＮＫ−１レセプタープロモーターと一緒に用いられてもよい。ヒトへの遺伝子治療の使用に予め必要な条件は、十分な薬学的グレードのプラスミドＤＮＡを作る能力である。この問題は、TIBTECH 17: 169-74 (1999) 中の Prazeres et al によって取り扱われている。
【００４３】
ｒＡＶＶと、脂質：ＤＮＡ複合体の両方とも、ネブライザー、例えば、エアジェットネブライザーを介して肺へ投与され得る。投与するための方法は、一般に、McDonald et al, Pharm Res 15(5): 671-9 (1998); Yonemitsu et al, Gene Therapy 4(7): 631-8 (1997); McDonald et al, Human Gene Therapy, 8(4): 411-22 (1997); Bellon et al, Human Gene Therapy 8(1): 15-25 (1997); 及び Niven, Critical Review of Therapeutic Drug Carrier Systems 12(2-3): 151-231 (1995) の教えに従うことができる。
ウイルス治療組成物とプラスミド治療組成物の両方とも、注入及び注射によって、関節及び神経組織のような他の標的部位に送達され得る。
【実施例】
【００４４】
本発明の諸態様が、次の実施例に記載される。
実施例１：修飾ヒトＮＫ−１レセプター（ＮＫ−１ｖ）の調製
使用される出発物質は、ヒトＮＫ−１レセプターをコードするｃＤＮＡクローンを含有しているプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ (Invitrogen Co) であった。そのクローンは４０７アミノ酸をコードし、５’末端（ＡＴＧ開始コドンの辺り）でＮｃｏＩ部位によって側傍され、そして停止コドンに続く３’末端でＸｂａＩ部位によって側傍された。第３膜貫通へリックスの末端のＤＲＹモチーフ（Ａｓｐ129、Ａｒｇ130、Ｔｙｒ131）をＧＧＡに突然変異させたヒトＮＫ−１ｖレセプターが、ＰＣＲをベースとする戦略を使用して上記プラスミドから作られた。
上記プラスミド中のｃＤＮＡクローンの一部が、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ (Stratagne) ；９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で４分間、その後に７２℃で１０分間、５０ｐｍｏｌの各々のプライマー、５０ｎｇのプラスミドＤＮＡ、１００μｌの反応容量を用いる２０サイクルのＰＣＲ；を使用する２つの別々のＰＣＲ反応で増幅された。
【００４５】
第１ＰＣＲ反応は、次のプライマーを使用して４７３ｂｐの予測生成物を生成させた：
５’プライマー，センスＡ：５’−ＡＡＣ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号７）
３’プライマー，アンチセンスＡ：５−ＧＣＣ  ＡＴＡ  ＧＣＧ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＧＴ−３’（配列番号８）。
第２ＰＣＲ反応は、次のプライマーを使用して８８８ｂｐの予測生成物を生成させた：
５’プライマー，センスＢ：５’−ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＧＣＴＡＴＣ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＣＣ−３’（配列番号９）
３’プライマー，アンチセンスＢ：５’−ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＴＡＧ  ＧＴＧ ＡＣＡ−３’（配列番号１０）。
プライマーであるアンチセンスＡ及びセンスＢは、それら２つの産物がアニールしてその完全長突然変異レセプターを形成できるように、１７塩基の重なり合う相補配列を各々の５’末端に含有した。全ての上記プライマーは、Perkin-Elmer によって特注合成された。
それら２つのＰＣＲ産物はゲル精製 (QIAEX, Qiagen) され、５０ｎｇの各々の精製産物が１００μｌＰｆｕＰＣＲ反応に加えられ、そして、それらＰＣＲ産物の２つの重なり合う領域がアニールして伸びるように、３ラウンドのＰＣＲがプライマーなしで行われた。５０ｎｇのそれら側傍 (flanking) プライマー（センスＡ及びアンチセンスＢ）が加えられ、そして２０サイクルの慣用的ＰＣＲが行われた。得られた完全長産物が精製され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ (Stratagene) 中にクローン化され、そして十分に配列解析され、その突然変異がうまく行われたことが確認された。
そのクローンは Clontech Transformer kit を使用する部位特異的突然変異誘発によって修飾されて、やはり Perkin-Elmer からのオリゴヌクレオチドセンスＣを使用して内部ＮｃｏＩ制限部位が除かれた。
センスＣ：５’−ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＴＡＴ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＴ−３’（配列番号１１）
【００４６】
得られたｃＤＮＡは、その親ベクターから切り出され、哺乳類発現ベクターであるｐＣＭＶ３．１ (Invitrogen) 中にスプライシングされた。このｃＤＮＡは、ｈＮＫ−１ｖＲポリペリペプチドの発現を可能にする方向であった。ストックプラスミドが大腸菌中での増幅によって調製され、その後にそのプラスミドＤＮＡは、Qiagen のエンドヌクレア−ゼを含まないＤＮＡ調製キットを使用して精製され、そしてその構造の忠実度がＤＮＡ配列解析によって確認された。そのｃＤＮＡの核酸配列は配列番号６（図２）であり、そしてその翻訳されたタンパク質配列は配列番号５（図１）である。同様に、コントロール（ネガティブコントロール）構造物が調製され、それによって、野生型及び変異ｈＮＫ−１ＲｃＤＮＡが、上に記載されたものとは逆の配置でベクター中にスプライシングされた。更なるコントロール（ポジティブコントロール）は、親野生型ｈＮＫ−１ＲｃＤＮＡを、ｈＮＫ−１Ｒポリペプチドが発現され得るやり方で、そのベクター内へ連結させることによって調製された。
【００４７】
実施例２：ヒトＮＫ−１ｖレセプターを一時的に発現するＣＯＳ−７細胞
ＣＯＳ−７細胞は、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭグルタミンを補充されたＤＭＥＭ培地中で増殖され、そして５％ＣＯ2の雰囲気下で維持された。細胞は、１７５ｃｍ2フラスコ当たりおよそ１０％集密度の濃度に追い播きすることによって、およそ７０％集密度に継代培養した。ＣＯＳ−７細胞が採取され、Equibio エレクトロポレーション緩衝液におけるエレクトロポレーションのために調製された。細胞（５×１０6の細胞）が、Equibio EasyJect とエレクトロポレーターを使用して、室温で、４ｍｍギャップキュベット中で、３０μｇの形質転換用プラスミドＤＮＡを含有する８００μｌの最終容量で、無限抵抗での２５０Ｖ、１５００μＦでエレクトロポレートされた。形質転換されたＣＯＳ−７細胞は、１７５ｃｍ2フラスコ中で２〜３日培養されてからアッセイされた。
また、細胞（およそ５〜５０μｌの形質転細胞）が、２２ｍｍ直径のカバーガラスを含有する６ウェル培養皿中で培養された。細胞でコートされたこれらカバーガラスは、細胞内遊離カルシウムの濃度（[Ｃａ2+]ｉ）の変化を調査するためにデザインされた画像実験のために使用された。カバーガラスは、まず、そのカバーガラスをおよそ７０％のエタノール中に浸漬させて、次いで、すぐにガス炎を通して滅菌することによって調製された。次いで、カバーガラスは培養フード中で空気乾燥されてから、標準的６ウェル培養皿の培養ウェルの底に入れられた。次いで、細胞は上に記載されたように培養された。
【００４８】
実施例３：ヒトＮＫ−１ｖレセプターを含有するＣＯＳ−７細胞膜
実施例２の形質転換されたＣＯＳ−７細胞が、Ｖｅｒｓｅｎｅ (Gibco BRL) で処理することによって採取された。細胞膜タンパク質への実質的な動揺を伴なうことなくフラスコからそれら細胞を脱着できるようにＶｅｒｓｅｎｅが使用され、次いで、アッセイ緩衝液（ｐＨ７．４の５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、３ｍＭＭｎＣｌ2、０．０２％ＢＳＡ、４０μｇ／ｍｌバシトラシン、２μｇ／ｍｌキモスタチン、２μＭホスホラミドン、４μｇ／ｍｌロイペプチン）中で再懸濁することによってその細胞が一回洗浄され、そして１０００ｇで５分間遠心分離された。細胞は５ｍｌのアッセイ緩衝液中に再懸濁され、細胞計数を行ってから、セッティング６で１５秒間 Brinkman ポリトロンを使用して細胞が溶解された。そのホモジネートは、２０００ｇで１０分間遠心分離された。膜ペレットがアッセイ緩衝液中に再懸濁され、使用するまで、０．５〜１ｍｌアリコートとして凍結保存された。
【００４９】
実施例４：細胞膜中のレセプターへのリガンド結合
ＣＯＳ−７細胞が、実施例１の親野生型ヒトＮＫ−１レセプターｃＤＮＡ又はその変異ヒトＮＫ−１レセプターｃＤＮＡのいずれかを含有するｐＣＭＶ３．１ (Invitrogen) で一時的に形質移入され、そして、細胞膜が形質移入後２〜３日間で、実施例３の操作を使用して調製された。放射リガンド結合検討が、ＮＫ−１レセプターを標識するための[125Ｉ]ＢＨサブスタンスＰを使用して行われた。
非特異的結合が、１μＭの最終濃度のＮＫ−１レセプター選択的アゴニスト［Ｓａｒ9，Ｍｅｔ（０2）11］サブスタンスＰ (Bachem) によって特定された。膜懸濁液は必要とされる日に解凍され、アッセイ緩衝液で適切に希釈され、そして変動する濃度の[125Ｉ] Bolton-Hunter サブスタンスＰ（０．０５〜３ｎＭ、Amersham Life Sciences からのもの）と一緒に、２１℃で５０分間インキュベートされた。各々のレセプターについての親和定数及び最大結合能を測定するために、［Ｓａｒ9，Ｍｅｔ（０2）11］サブスタンスＰの存在下及び不存在下で、膜を、増加する濃度の放射リガンドとともにインキュベートすることによって飽和分析が行われた。反応は、０．２％ポリエチレンイミンに予め浸漬されたＧＦＣフィルター上での減圧迅速ろ過によって停止された。
[125Ｉ]ＢＨサブスタンスＰは、野生型及び突然変異レセプターの両方に高い親和性で結合した（それぞれ、２．２１８±１．１０７ｎＭ（ｎ＝３）と１．４４６ｎＭ（ｎ＝２）のＫｄ値）。意外にも、その野生型及び変異ＮＫ−１レセプターの解離定数と最大結合能の間には有意差は無いようであった。このことは、その突然変異はそのＮＫ−１レセプターにおけるアゴニスト結合性に影響しないことを示している。その最大結合能は、表１に示すように直接比較されることができる。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
実施例５：細胞内遊離カルシウム濃度の変化によるＣＯＳ−７細胞内での細胞内レセプターカップリングの分析
細胞を含有するカバーガラスが、上に記載されたように調製されて維持された。培養された細胞は、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｐｅｓ細胞外媒質 (extra-cellular medium) 緩衝液（ＥＭ，ｍＭでの組成：ＮａＣｌ  １１８，ＫＣｌ  ４．７，ＭｇＳＯ4  １．２，ＣａＣｌ2  １．２，ＫＨ2ＰＯ4  １．２，Ｈｅｐｅｓ  １０，グルコース  １１，及びＢＳＡ  ０．１％、２０℃でｐＨ７．２ (Rossant, et al Endocrinology, 140, 1525-1536)）中で２回洗浄され、次いで、Ｆｕｒａ−２−ＡＭ（２μＭ、Molecular Probes）を含有するＥＭと一緒に２０℃で３時間インキュベートすることによってＦｕｒａ−２ (Rossant, et al Endocrinology, 140, 1525-1536) で負荷された。この操作は、ひとたび無傷の細胞内に入るとそのフリーの酸の形態に加水分解されるＦｕｒａ−２−ＡＭでその細胞が負荷されるのを可能にする。負荷の後、カバーガラスが画像化室内に入れられて、ＥＭで灌流されて細胞外Ｆｕｒａ−２−ＡＭが除かれ、そして細胞内Ｆｕｒａ−２−ＡＭの加水分解が起こるようにされた。個々の細胞中の遊離［Ｃａ2+］i の変化の測定が、Spectral Wizard 単色光分光器、冷却積算ＣＣＤカメラ及び特定目的のための一組のソフトウェア (Merlin, Life Sciences Resources, Cambridge, UK) を使用して、蛍光比率（励起３４０ｎｍ／３８０ｎｍ、発光＞５１０ｎｍ）からなされた。データは、比率単位３４０／３８０として表現される。
【００５２】
上に記載された野生型センス、野生型アンチセンス及び変異ＮＫ−１レセプターをコードする遺伝子が、ＣＯＳ−７（サル腎臓）細胞株中に一時的に形質移入された。形質移入２〜３日後、細胞はＦｕｒａ−２−ＡＭ染料（その蛍光は［Ｃａ2+］ｉ依存性）で負荷され、そしてサブスタンスＰで刺激された。［Ｃａ2+］ｉは、３４０ｎｍと３８０ｎｍのいずれの励起光もが逐次的に使用されてその負荷された細胞を照らした時に放出された光（＞５１０ｎｍ）の変化をモニターすることによって追跡され、比率（３４０ｎｍ：３８０ｎｍ）として表現された。ＵＴＰ（非形質移入細胞中で［Ｃａ2+］ｉを増大させる）で刺激された細胞は、機能性ＧタンパクＣａ2+ 関連（linked）経路の存在を示す［Ｃａ2+］ｉ応答を起こした。図３中にプロットされた結果は、野生型ＮＫ−１レセプターを発現している細胞が０．０１〜１０００ｎＭの範囲でサブスタンスＰに応答したことを示している。野生型アンチセンス及び変異ＮＫ−１レセプターを発現している細胞は、１ｎＭのサブスタンスＰ刺激ではＣａ2+応答を引き起こさなかった。
変動する濃度のサブスタンスＰ又はＵＴＰ（３μＭ）での１分間の処理の、野生型か又は修飾ＮＫ−１レセプターのいずれかを発現しているＣＯＳ７培養物の３４０：３８０比率レベルの平均変化への効果（図３、各々の処理グループについてｎ＞５０細胞）、又は測定可能な応答（Ｘｂ）を示しているＣＯＳ細胞のパーセントへの効果を図３に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、図１に示される配列の翻訳物であって、本発明による修飾ヒトＮＫ−１レセプター（ｈＮＫ−１Ｒｖ１）の配列である、タンパク質配列を記載している。
【図２】図２は、本発明による修飾ヒトＮＫ−１レセプターをコードするコンセンサスｃＤＮＡ配列である。
【図３】図３は、ＮＫ−１野生型レセプター及び図１の修飾レセプター（ｈＮＫ−１Ｒｖ１）、及び野生型レセプターアンチセンス形質移入ＣＯＳ細胞でのカルシウム画像実験の棒グラフである。
【図４】図４は、種々の種におけるＮＫ−１と他のＮＫレセプター間での、ＴＭ３中のＤＲＹモチーフの領域における配列アラインメントを示しており、高い保存性を証明している（図中、ＮＫ−１配列１〜４は、配列番号１３を提供し、ＮＫ−１配列５は、配列番号１４を提供し、ＮＫ−２配列１〜２及び４〜７は、配列番号１５を提供し、ＮＫ−２配列３は、配列番号１６を提供し、そしてＮＫ−３配列１〜３は、配列番号１７を提供する）。
【図５】図５は、ｎＮＫ−１Ｒｖ１レセプター、及びそれが組み込まれている細胞膜の部分を示すダイアグラムである（配列番号１８：ＤＲＹ配列に加えて、Ｌ２２３がＩに変わっている；この変化は重要ではないと考えられる）。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月8日(2003.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異タキキニンレセプターであって、細胞内ループ２とのＴＭ３ドメインの接合点に隣接して存在するＤＲＹ配列の３アミノ酸が、その側鎖が脂質親和性でもなく荷電した基も含有しないアミノ酸で置き換えられており、前記レセプターが、その野生型レセプターに類似するリガンド結合特性を示すが、そのＧタンパク質への該レセプターの細胞内カップリングを実質的に示さないことによって、該細胞へのリガンド結合シグナルの変換が実質的にないレセプター；又は
前記修飾ＤＲＹ配列を含有する前記レセプターの断片；又は
前記修飾ＤＲＹ配列を含有しかつ上記配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含有する単離されたタンパク質又はポリペプチド；又は
Ｃ末端又はＮ末端のいずれかからの連続するアミノ酸欠失を有する、前記突然変異タキキニンレセプターの変異体；又は
前記修飾ＤＲＹ配列を含有する、その対立変異体、異種特異的同属体又は生物学的に活性なタンパク分解の又は他の断片。
【請求項２】
請求項１記載の非ヒト哺乳類レセプター。
【請求項３】
請求項１記載のラット又はマウスレセプター。
【請求項４】
請求項１記載のヒトレセプター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の突然変異ＮＫ−１レセプター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の突然変異ＮＫ−２レセプター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の突然変異ＮＫ−３レセプター。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のレセプターであって、該置換アミノ酸がＧ及びＡから選択されるレセプター。
【請求項９】
請求項８記載のレセプターであって、ＤＲＹがＧＧＡによって置き換えられたレセプター。
【請求項１０】
配列番号５のタキキニンレセプター；又は配列番号５のレセプターと少なくとも８０％アミノ酸同一性を有するレセプターであって、細胞内ループ２とのＴＭ３ドメインの接合点に隣接して存在する該ＤＲＹ配列の該３アミノ酸が、その側鎖が脂質親和性でもなく荷電した基も含有しないアミノ酸で置き換えられており、かつサブスタンスＰに結合することができるがそれの内因性シグナルを実質的に開始することができないレセプター；又は前記修飾ＤＲＹ配列を含有する前記レセプターの断片。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されたタキキニンレセプターを組み込んでいる単離された細胞膜。
【請求項１２】
次のいずれかのもの：
（ａ）請求項１〜９のいずれかのタキキニンレセプターをコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子；
（ｂ）上記配列を伸ばした結果物である遺伝子；
（ｃ）上記遺伝子配列を含んでなる組み換えベクター；及び
（ｄ）該ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
次のいずれかのもの：
（ａ）配列番号６のヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子；
（ｂ）上記配列を伸ばした結果物である遺伝子；
（ｃ）上記遺伝子配列を含んでなる組み換えベクター；及び
（ｄ）該ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されたアミノ酸配列を有するレセプタータンパク質を産生させるための方法であって、その方法が：
（ａ）前記核酸配列を適切なベクター中に挿入し；
（ｂ）段階（ａ）の組み換えベクターで予め形質転換又は形質移入された宿主細胞を培地中で培養し；
（ｃ）段階（ｂ）から得られた該レセプタータンパク質を含有する細胞を採取し；そして
（ｄ）こうして産生されたレセプタータンパク質を、前記培地又は前記宿主細胞から分離又は精製する
段階を含んでなる方法。
【請求項１５】
有効な量の、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンリガンド又は前記リガンドをコードする核酸配列、及び薬学的及び薬理学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
サブスタンスＰ又は他のタキキニン（ニューロキニン）レセプター結合性リガンドに関連する状態を治療又は予防するための医薬品の調製における、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターの使用。
【請求項１７】
内因性タキキニンリガンドの過剰発現又は不適切な発現に関連する状態を治療又は予防するための方法であって、それを必要とする患者へ非毒性で有効な量の請求項１〜１０のいずれかにおいて定義されたような修飾タキキニンリガンドを投与することを含んでなる方法。
【請求項１８】
治療的に活性な化合物をスクリーニングするための方法であって：
（ａ）請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターを発現する細胞株を提供し；
（ｂ）標識タキキニンリガンド及び段階（ａ）からの細胞株を含有する溶液へ試験サンプルを加え；
（ｃ）段階（ｂ）からの細胞株、試験サンプル及び標識リガンドの混合物をインキュベートして、前記リガンド及び試験サンプルが該修飾タキキニンレセプターに結合できるようにし；
（ｄ）場合によって、結合していない標識リガンドを該修飾タキキニンレセプターに結合した標識リガンドから分離し；そして、望まれれば、
（ｅ）該修飾タキキニンレセプターに結合している標識リガンドの量を測定する
段階を含んでなる方法。
【請求項１９】
該野生型タキキニンレセプターに結合する存在物を特定及び／又は評価するためのアッセイにおける、代替物としての請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターの使用。
【請求項２０】
関節炎、痛み、偏頭痛、不安症、精神分裂症、喘息、リューマチ性関節炎を有する患者及び胃腸障害及び胃腸管の疾患の患者における体液中のリガンドの濃度を測定するためのアッセイにおける、代替物としての請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターの使用。
【請求項２１】
アッセイ方法であって：
（ａ）請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターを発現する細胞株を提供し；
（ｂ）該細胞株を標識し；
（ｃ）該試験サンプル及び標識細胞をマトリックス結合性ＳＰ又は他のリガンドへ加え；
（ｄ）該標識細胞、試験サンプル、及びマトリックス結合ＳＰ又は他のリガンドをインキュベートして、ＳＰ又は他のリガンド及び試験サンプルが該発現された修飾タキキニンレセプターへ結合できるようにし；
（ｅ）該標識された結合していない細胞を、該ＳＰ又は他のリガンドが結合した細胞から分離し；そして、望ましければ、
（ｆ）ＳＰ又は他のリガンドに結合した修飾タキキニンレセプターを含有する標識細胞の量を測定する
段階を含んでなるアッセイ方法。
【請求項２２】
過剰又は不適切に産生された内因性リガンドの作用を減少させるタンパク質療法における、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターの使用。
【請求項２３】
治療を必要とする患者を治療するための方法であって、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターを含んでなるエアロゾルの形態の組成物を前記患者へ投与することを含んでなる方法。
【請求項２４】
それを必要とする患者を遺伝子治療するための方法であって、請求項１〜１０のいずれかにおいて定義された修飾タキキニンレセプターをコードする核酸配列、ウイルス又はプラスミドを前記患者へ投与することを含んでなる方法。
【国際調査報告】
2004531215.tif 000059
2004531215.tif 000060
2004531215.tif 000061
2004531215.tif 000062