(57)【要約】本発明は、活性化Ｔリンパ球から単離、同定された新たに発見されたユビキチン結合酵素相同体（本明細書ではＲＡＴＬ１ｄ６と呼ぶ）およびそのコーディングポリヌクレオチドに関する。本発明の新たに発見されたポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現ベクター、宿主細胞、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンス分子、および活性を伴う抗体、ならびに使用について記載する。ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素ポリペプチドの発現に関連した障害の治療、診断、予防、およびスクリーニング法について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むユビキチン結合酵素相同体をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその断片、
（ｂ）配列番号１を含む単離されたポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するユビキチン結合酵素アミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその断片、
（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７４５の核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号１のヌクレオチド５１７〜１７８２をコードする核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチド（ここで、該ヌクレオチドは出発コドンを除く配列番号２のポリペプチドをコードする）、
（ｆ）配列番号１のヌクレオチド５２０〜１７８２の核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチド（ここで、該ヌクレオチドは出発コドンを含む配列番号２のポリペプチドをコードする）、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドと完全に相補的な単離されたポリヌクレオチドからなる群から選ばれる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含むハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３】
請求項１記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項４】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するユビキチン結合酵素ポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むユビキチン結合酵素ポリペプチド、
（ｃ）アミノ酸配列が配列番号２と保存的置換によってのみ異なる（ａ）のポリペプチド、
（ｄ）アミノ酸配列が配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する（ａ）のポリペプチド、
（ｅ） ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７４５の核酸配列によりコードされる単離されたユビキチン結合酵素ポリペプチド、
（ｆ）配列番号２のアミノ酸２〜４２２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド（ここで、該アミノ酸は出発メチオニンを除く配列番号２のポリペプチドをコードする）、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸１〜４２２のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド（ここで、該アミノ酸配列は出発メチオニンを含む配列番号２のポリペプチドをコードする）、
（ｈ）配列番号１７に記載の貫膜ドメイン領域を有する単離されたポリペプチド、および
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかに記載のユビキチン結合酵素ポリペプチドの実質的に精製された断片からなる群から選ばれる実質的に精製されたユビキチン結合（ＵＢＣ）酵素ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列およびヒト免疫グロブリンタンパク質のＦｃ部分のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む実質的に精製されたユビキチン結合酵素融合タンパク質。
【請求項８】
請求項６記載のポリペプチドまたはその機能的部分、および医薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項７記載の融合タンパク質、および医薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項６記載のポリペプチドまたはその抗原性エピトープと特異的に結合する精製された抗体。
【請求項１１】
（ａ）被検化合物を、請求項６記載の実質的に、もしくは部分的に精製されたポリペプチドと接触させ、
（ｂ）該ポリペプチドと結合し、そして／またはその活性を調節する被検化合物を候補化合物として選択することを含むユビキチン結合酵素と結合し、そして／またはその活性を調節することができる候補化合物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
該候補化合物が小分子、治療薬、生物学的物質、または薬剤である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
癌または腫瘍細胞中の腫瘍抑制遺伝子のユビキチン作用をブロックするのに有効な量の請求項６記載のユビキチン結合酵素ポリペプチドのアンタゴニストまたはインヒビターを投与することを含む癌または腫瘍の治療方法。
【請求項１４】
免疫抑制を生じるのに有効な量の請求項６記載のユビキチン結合酵素ポリペプチドのモジュレーターを投与することを含む該抑制を必要とする対象の免疫応答の抑制方法。
【請求項１５】
免疫または神経障害を治療するのに有効な量の請求項６記載のユビキチン結合酵素ポリペプチドを投与することを含む哺乳動物の免疫または神経障害の治療方法。
【請求項１６】
癌または腫瘍細胞、リンパ系細胞、または神経系細胞中の腫瘍抑制遺伝子のユビキチン化をブロックすることにより疾患または障害を治療するのに有効な量の請求項６記載のユビキチン結合酵素ポリペプチドのアンタゴニストまたはインヒビターを処置または治療を必要とする個体に投与することを含む癌または腫瘍、免疫障害、リンパ増殖性障害、または神経変性障害の治療方法。
【請求項１７】
癌または腫瘍、免疫障害、リンパ増殖性障害、または神経変性障害の治療方法であって、該障害を治療するのに有効な量の請求項６記載のユビキチン結合酵素ポリペプチドのアゴニストを処置または治療を必要とする個体に投与することを含む方法。
【請求項１８】
請求項１記載の単離されたポリヌクレオチドおよび使用指示書を含むハイブリダイゼーション用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、活性化ヒトＴリンパ球（Ｔ細胞）中に発現する、ユビキチン結合酵素（ＵＢＣ）との類似性を有するポリペプチドを定義する新規ポリヌクレオチド配列およびそのコードアミノ酸配列の同定および単離に関する。さらに、本発明は、該ポリヌクレオチドおよび該ポリペプチドの、細胞増殖および細胞周期連鎖の調節、および細胞タンパク質分解の標的化、および新生物疾患、免疫障害、および発育および神経障害および疾患の診断、治療および予防における使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ユビキチン結合系（ＵＣＳ）は、真核細胞およびいくつかの細菌における細胞タンパク質分解の主要経路として働く。ＵＣＳは、異常（ａｂｎｏｒｍａｌ）または異常（ａｂｅｒｒａｎｔ）タンパク質の排除に介在し、細胞プロセス、例えば遺伝子転写や細胞周期連鎖を調節する重要な調節タンパク質の半減期を調節する。ＵＣＳは、有糸分裂周期キナーゼ、腫瘍タンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えばｐ５３）、ウイルスタンパク質、シグナル伝達に関連する細胞表面レセプター、転写調節因子、および突然変異または損傷タンパク質の分解に関与すると考えられている（Ａ． Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、１９９４、Ｃｅｌｌ、７９：１３−２１）。
【０００３】
ユビキチン結合酵素（ＵＢＣ）は、ユビキチン部分の共有結合によりプロテオソーム分解のためのタンパク質を選択的に標的にする。細胞タンパク質のユビキチン化には、ユビキチン結合酵素 （Ｅ２）とユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｅ３）の間の特異的相互作用が介在するらしい（Ｔ． Ｐ． Ｍｏｙｎｉｈａｎら、１９９９、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４ （４３）：３０９６３−８）。ユビキチン介在タンパク質分解は、限定されるものではないがＤＮＡ修復、細胞周期調節、およびｐ５３依存性プロセスを含む真核および哺乳動物細胞における広範な生物学的プロセスを調節する。
【０００４】
ユビキチン化経路は、適切な時に分解する、正常、すなわち短命の細胞内真核性タンパク質を標的とするのみならず、細胞由来の異常な、突然変異体もしくはミスホールドタンパク質の排除にも役立つ（Ｔ． Ｐ． Ｍｏｙｎｉｈａｎら、１９９９、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ、１０：９７７−９８２）。ユビキチン経路においてユビキチンと共有結合するタンパク質は細胞による分解の標的となる。破壊の選択性は一連の酵素反応からなるユビキチン化工程における基質特異性により保証される （Ｆ． Ｙａｍａｏ、１９９９、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （Ｔｏｋｙｏ）、１２５ （２）：２２３−９）。ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）はユビキチン結合酵素 （Ｅ２）とともに、基質の認識に根本的役割を演じると考えられてきた。
【０００５】
ユビキチン結合およびタンパク質分解プロセスには４つの主な工程が含まれる（Ｓ． Ｊｅｎｔｓｃｈ、１９９２、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．、２６：１７９−２０７）。第１工程では、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）が、Ｅ１中の内部システイン残基のチオール基をＵｂのＣ末端と結合するＡＴＰ依存性反応において熱安定性小タンパク質（７６アミノ酸）であるユビキチン（Ｕｂ）を活性化する。次に、活性化Ｕｂは、数種のＵｂ結合酵素（Ｅ２）の１つに伝達される。異なるユビキチン依存性タンパク質分解経路は、特定の分解シグナルを有するタンパク質を指向する認識サブユニットと関連する構造的に同じであるが別のユビキチン結合酵素を用いる。次に、Ｅ２はそのＣ末端グリシンを介してＵｂ分子を標的タンパク質の内部リジン（アクセプターリジン）と連結する。ある場合には、ある種のユビキチンの認識においてユビキチンリガーゼ（Ｅ３）として知られるアクセサリー因子がＥ２と共同して作用する必要がある。さらなるＵｂ分子を加え、最終的にマルチＵｂ鎖構造を形成させてよい。次に、ユビキチン化タンパク質は、大きなマルチサブユニットのタンパク質分解酵素複合体であるプロテオソームにより認識され、分解されてＵｂが放出され、再利用される。
【０００６】
ＵＢＣおよびＵＢＣをコードする遺伝子ファミリーは種々の真核性属、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃａｅｎｏｒａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ （Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｐａｒａｍｅｃｉａ、ならびにマウスおよびヒトで確認されている。ＵＢＣまたはＥ２は互いに関連する大きな遺伝子ファミリーによりコードされている。
【０００７】
Ｅ２ユビキチン結合酵素は、異なるＵＣＳ経路における基質特異性に重要である。すべてのＥ２分子は、すべての他のＥ２と少なくとも３５％同一な、ユビキチン酵素チオエステル形成に必要な中心に位置するシステイン残基を含む、ＵＢＣドメインと呼ばれる約１６ｋＤａの保存ドメインを有する（Ｓ． Ｊｅｎｔｓｃｈ、上記）。高度に保存されたプロリンが豊富なエレメントが活性システイン残基のＮ末端に位置する。この保存ドメイン以上の構造的変動を用いてＥ２酵素を分類する。クラスＩのＥ２（Ｅ２−１）はほとんどもっぱら保存ＵＢＣドメインからなり、酵母Ｅ２−１およびＵＢＣ４、５および７を含む。これらＥ２がその活性を示すにはＥ３が必要と考えられる（Ｓ． Ｊｅｎｔｓｃｈ、上記参照）。ＵＢＣ７は、ユビキチンを基質として認識し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリユビキチン鎖を形成することが示されている（Ｓ． Ｖａｎ Ｎｏｃｋｅｒら、１９９６、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７１：１２１５０−１２１５８）。クラスＩＩのＥ２（Ｅ２−２）は、基質特異性および細胞局在性に寄与する種々の非関連Ｃ末端伸長部を有する。酵母Ｅ２−２酵素、ＵＢＣ２およびＵＢＣ３は、塩基性基質、例えばヒストンとの相互作用を助長する高度に酸性なＣ末端伸長部を有する。酵母ＵＢＣ６は、該タンパク質を小胞体に局在させる疎水性シグナルアンカー配列を有する。
【０００８】
ＵＣＳの正常活性の異常もしくは変化は、多くの疾患および障害と関連している。これには、アルツハイマー病 （Ｌ． Ｇｒｅｇｏｒｉら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．、２０３−１７３１−１７３８）、重篤な損傷後にみられるような筋萎縮障害、および癌やエイズのような病気（Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ、２００１、１０：１１２６）にみられるような悪液質 （Ｍ． Ｌｌｏｖｅｒａら、１９９５、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、６１：１３８−１４１）、腫瘍抑制（サプレッサー）タンパク質 ｐ５３の分解 （Ａ． Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、上記）、神経崩壊と関連するユビキチン依存性のタンパク質分解の増大が含まれる。ユビキチン結合（コンジュゲーション）は抗原提示において律速工程であるから、ユビキチン分解経路は抗原に対する免疫応答に役割を果たすようである（Ｅ． Ｐ． Ｇｒａｎｔら、１９９５、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：３７５０−３７５８）。実際に、本発明のユビキチン結合酵素相同体は活性化Ｔリンパ球から同定および単離されたので、免疫系における役割との関連は本発明により支持される。
【０００９】
新規ユビキチン結合酵素およびこれらタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発見は、当該分野に、癌および腫瘍を含む新生物疾患、免疫障害、発育および神経障害、病状、または疾患の診断、スクリーニング、モニター、治療および予防のための新規組成物、ならびに使用および治療方法を提供する。
【００１０】
発明の要約
本発明は、活性化ヒトＴ細胞から単離したユビキチン結合酵素相同体をコードする新規ポリヌクレオチド（以後、ＲＡＴＬ１ｄ６という、「Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ １ｄ６」）を提供する。ＲＡＴＬ１ｄ６は、ＣＤ３およびＣＤ２８細胞表面抗原に対する抗体によるＪｕｒｋａｔ系Ｔ細胞およびヒト末梢血Ｔリンパ球の刺激を上方制御（アップレギュレート）することがわかった。ＲＡＴＬ１ｄ６核酸は本明細書に記載の活性化ヒトＴリンパ球由来のサブトラクションライブラリー中に確認された。本発明が提供するＲＡＴＬ１ｄ６核酸配列によりコードされるＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドはユビキチン結合酵素との類似性を有する。
【００１１】
本発明の目的は、配列番号１に示す単離されたＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドを提供することである。本発明によれば、単離されたＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むユビキチン結合酵素をコードする。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片または部分も本発明に含まれる。好ましくは、単離されたＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはその断片もしくは部分は実質的に精製されている。
【００１２】
本発明の別の目的は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７４５の核酸配列を有する単離されたＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、配列番号１のポリヌクレオチドによりコードされる、配列番号２のアミノ酸配列を有するユビキチン結合酵素相同体であるＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその機能的または生物学的に活性な部分を提供することである。本明細書に記載のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの貫膜ドメイン領域、およびコーディングポリヌクレオチドも提供する。
【００１４】
本発明の別の目的は、配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％〜９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むユビキチン結合酵素ポリペプチドを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７４５の核酸配列によってコードされる単離され、実質的に精製されたユビキチン結合酵素ポリペプチドを提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、アミノ酸配列が配列番号２と保存的置換でのみ異なるユビキチン結合酵素ポリペプチドを提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、本明細書に記載のＮ末端、Ｃ末端および内部欠失を有するＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを提供することである。これら欠失ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明によれば、そのようなＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドは本明細書に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープを含むことができる。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、開始コドンを欠くＲＡＴＬ１ｄ６（配列番号１）のポリヌクレオチド配列、および得られるコードされたポリペプチドを提供することである。本発明によれば、配列番号１のヌクレオチド５２０〜１７８２に対応するポリヌクレオチドおよび配列番号２のアミノ酸２〜４２２に対応するポリペプチドを提供する。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％〜９５％の配列同一性を有するユビキチン結合酵素ポリペプチドを提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのすべてまたは部分がヘテロローガスなポリペプチドまたはペプチドと結合、カップリング、または連結している実質的に精製されたユビキチン結合酵素融合タンパク質を提供することである。より詳細には、本発明は、配列番号２に記載の配列と少なくとも８０％〜９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、およびヒト免疫グロブリンタンパク質のＦｃ部分のアミノ酸配列を提供する。本発明は、アミノ酸配列が配列番号２と保存的置換によってのみ異なるユビキチン結合酵素融合タンパク質を提供する。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチド配列もしくはその断片、またはコードされたＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその断片もしくは部分を含む組成物を提供することである。本発明は、さらに医薬的または生理学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、少なくとも１種のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその機能的部分を含む医薬組成物も提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の目的は、ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素相同体をコードする、単離され、精製された、好ましくは実質的に精製された新規ポリヌクレオチドを提供することである。詳細な局面において、該ポリヌクレオチドは配列番号１のヌクレオチド配列も提供する。本発明は、配列番号１の相補物またはその変異体を含むポリヌクレオチド配列も提供する。さらに、本発明は、中程度にストリンジェントまたは高ストリンジェンシー条件下で配列番号１のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を特徴とする。さらに本発明は、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）遺伝子コードの冗長性の結果として配列番号１由来の核酸配列分解物、または（ｉｉｉ）それと相補的な核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。より詳細には、（ｉｉｉ）の相補的核酸配列は、中程度または高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の核酸配列を含む変性、二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかの鎖とハイブリダイズすることができる。ここで、中程度ストリンジェント条件の非制限的例には、４２℃の、５０％ホルムアミド、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５ｘＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ、次いで約４２℃〜約５０℃の温度で０．２ｘ ＳＳＰＥまたはＳＳＣおよび０．２％ ＳＤＳで洗浄することを含む。高ストリンジェンシー条件は約６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする核酸配列および該核酸配列のアンチセンス、および該核酸分子またはアンチセンス分子のオリゴヌクレオチド、断片または部分を提供することである。ＲＡＴＬ１ｄ６核酸配列、特にＲＡＴＬ１ｄ６核酸分子のオリゴヌクレオチド、断片または部分は、体液試料中のＲＡＴＬ１ｄ６を検出、診断またはモニターするためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはそのペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその断片もしくは部分を含む発現ベクターおよび宿主細胞も提供する。
【００２４】
また、本発明の目的は、（ａ）ポリヌクレオチドの発現に適した条件下で本発明のＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素相同体をコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも機能的断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、（ｂ）該宿主細胞から該ポリペプチドを回収することを含む配列番号２に示すアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチドの製造方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、治療薬および診断薬として用いるＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはそのエピトープと特異的に結合する抗体およびその結合断片を提供することである。
【００２６】
また、本発明の目的は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと結合し、そして／または調節する物質、例えばアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニング方法、およびモジュレーター、例えばアゴニストおよびアンタゴニスト、特に記載したスクリーニング方法から得られるものを提供することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、配列番号２のポリペプチドの精製、好ましくは実質的に精製されたアンタゴニストを提供することである。これに関して、例として、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。本発明は、さらに、配列番号２のポリペプチドの実質的に精製されたアゴニストを提供する。
【００２８】
本発明のさらに別の目的は、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよびそのコードポリペプチドの発現と関連する障害または疾患の診断および／またはスクリーニングに用いるＲＡＴＬ１ｄ６核酸配列、ポリペプチド、ペプチドおよび抗体を提供することである。
【００２９】
本発明のさらなる目的は、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよびそのコードポリペプチドの発現、および異常または制御されていない細胞発生と関連する障害のスクリーニングおよび診断用キットを提供することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、癌または腫瘍、免疫障害、リンパ増殖性障害、または神経変性障害の治療または予防方法であって、該疾患または障害を治療または予防するのに有効な量のＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素の精製されたアンタゴニストまたはインヒビターを治療または予防を必要とする個体に投与することを含む方法を提供することである。例えば、癌または腫瘍の治療方法において、該ユビキチン結合酵素アンタゴニストは、癌または腫瘍細胞中の腫瘍抑制遺伝子のユビキチン化をブロックするのに有効な量で用いるのが好ましい。
【００３１】
本発明の別の目的は、免疫抑制を生じるのに有効な量の、ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素のアンタゴニストまたはインヒビター、またはＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素のアゴニストまたはアクチベーターを投与することを含む免疫応答の抑制を必要とする対象における免疫応答を抑制する方法を提供することである。そのような方法において、免疫抑制は細胞レセプターのユビキチン化およびそれに続くレセプター活性の下方制御（ダウンレギュレーション）の結果であり得る。
【００３２】
本発明の別の目的は、異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）または異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）細胞増殖、および制御されていない細胞増殖を治療するのに有効な量の、記載したＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその相同体、またはそのアゴニストまたはアンタゴニストを本発明に従って投与することを含む哺乳動物における細胞の制御されない増殖を生じる異常な（ａｂｎｏｒｍａｌ）または異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）細胞増殖の治療方法を提供することである。
【００３３】
本発明のさらに別の目的は、ユビキチン結合酵素の発現または活性に関連する哺乳動物における疾患または疾患に対する感受性の診断方法を提供することである。本方法には、哺乳動物由来の試料をＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド、その相同体、またはその抗原性断片に特異的な抗体と抗原抗体複合体を該抗体と試料中のポリペプチドまたは相同体、またはその抗原性断片との間で形成させることができる条件下で接触させ、形成された抗原抗体複合体を検出することが含まれる。該複合体の検出は、試料中にＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその相同体、または抗原性断片が存在することを示し、被検試料中のポリペプチド、その相同体または断片との間に形成された複合体の量の、正常コントロール試料中の量に比べた増加は、哺乳動物における疾患または病状、または疾患または病状に対する感受性を示す。本発明では、該疾患は免疫障害、神経障害、発育障害、または新生物の増殖であり得る。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、疾患、障害または病状の核酸に基づく診断方法であって、本発明のＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドまたはその断片もしくはオリゴを試料の核酸物質とハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション複合体を形成させ、該ハイブリダイゼーション複合体を検出する方法を提供することである。該方法において、該複合体の存在は、試料中のユビキチン結合酵素をコードするポリヌクレオチドまたはその断片の存在に関連する疾患、障害または状態を診断する。そのような方法はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含むことができる。
【００３５】
本発明のさらに別の目的は、（ａ）配列番号２をコードするポリヌクレオチド配列の相補物を生物試料の核酸物質とハイブリダイズさせてハイブリダイゼーション複合体を形成させ、（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出することを含む、生物試料中のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出方法を提供することである（ここで、該複合体の存在は、生物試料中のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と関連する）。さらに、核酸物質をハイブリダイゼーション前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅してよい。
【００３６】
本発明の別の目的は、試料中のユビキチン結合酵素またはその相同体または抗体反応性断片の検出方法であって、試料をＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその抗原性断片に特異的な抗体と抗原抗体複合体を試料中の該ポリペプチドまたはその抗原性断片と抗体との間に形成させることができる条件下で接触させ、形成された抗原抗体複合体を検出する方法をを提供することである。そのような方法において、該複合体の検出は、試料中のユビキチン結合酵素またはその抗原性断片の存在を示す。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、ポリヌクレオチド配列と特異的に結合する少なくとも１個の分子または化合物を同定するためのポリヌクレオチドを用いて分子または化合物のライブラリーをスクリーニングする方法であって、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドまたはペプチド、またはその結合可能な部分を分子または化合物のライブラリーと特異的結合を可能にする条件下で結合させ、特異的結合を検出することにより、該ポリヌクレオチド配列と特異的に結合する分子または化合物を同定することを含む方法を提供することである。そのような方法において、該ライブラリーはＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、人工的染色体構築物、ＰＮＡ、ペプチドおよびタンパク質を含み得る。
【００３８】
本発明のさらに別の目的は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチド配列を用いて試料中のＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドと特異的に結合する分子または化合物を精製する方法を提供することである。該方法には、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチド、その結合可能な部分またはＲＡＴＬ１ｄ６変異体を、特異的結合を可能にする条件下で結合させ、ポリヌクレオチドと該分子または化合物の間の特異的結合を検出し、結合したポリヌクレオチドを回収し、該ポリヌクレオチドを該分子または化合物から分離し、精製された分子または化合物を得ることが含まれる。
【００３９】
本発明の別の目的は、ユビキチン結合酵素、例えばＲＡＴＬ１ｄ６の活性を調節することができる候補化合物または物質のスクリーニング方法を提供することである。該方法は、被検化合物を実質的または部分的に精製されたＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド、ペプチドまたは断片と接触させ、該ポリペプチドの活性を調節する被験化合物を候補調節化合物として選択することが含まれる。アッセイ方法は、ＲＡＴＬ１ｄ６が細胞または組織中で発現する細胞に基づくアッセイ、または無細胞アッセイであってよい。本発明によれば、本明細書に記載のごとく候補化合物は、ユビキチン結合酵素活性のアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはアゴニストもしくはアクチベーターである。ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン活性化酵素の活性は、リンパ増殖性障害、癌および腫瘍、神経障害、または発育障害と関連するタンパク質分解、または細胞レセプターのユビキチン化であり得る。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素と結合することができる候補化合物のスクリーニングまたは検出方法を提供することである。該方法には、本発明に従って被検化合物を精製されたＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはそのペプチドと接触させ、該ポリペプチドと結合する被検化合物を候補化合物として選択することが含まれる。そのような方法では、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはペプチド、または候補化合物を固体支持体上に固定することができる。また、該方法では、候補化合物の選択は、候補化合物と該ポリペプチドの間に形成された複合体の熱アンホールディング曲線を分析することによる結合親和性測定値に基づくことができる。
【００４１】
本発明が提供するスクリーニング法において、候補化合物は小分子、治療薬、生物学的物質、および／または薬剤であり得る。本発明が提供する本明細書に記載のそのような方法は、高処理能力のスクリーニング技術を介して実施するのに完全に適している。
【００４２】
本発明のさらなる目的、特徴および利点は、発明の詳細な説明と添付の図面からよりよく理解されよう。
【００４３】
図面の簡単な説明
図１Ａおよび１Ｂは、別々にＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素相同体のポリヌクレオチド配列（配列番号１）（図１Ａ）、およびコードされたＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質の推定アミノ酸配列（図１Ｂ）を示す。ＲＡＴＬ１ｄ６のコーディング配列（ＣＤＳ）は配列番号１の５１７〜１７８２である。
図２Ａおよび２Ｂは、ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素相同体のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定コードアミノ酸配列（配列番号２）を示し、その部分は活性化Ｔ細胞サブトラクションライブラリーから単離された。
図３は、ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。配列番号１のヌクレオチドによりコードされたＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの推定分子量はＭＷ＝４６．１Ｋｄである。
図４は、ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素 （ＵＢＣ）とそれぞれ仮定Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）相同分子種Ｆ２Ｈ２．８ （Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ｇｉｌ３８７６３３２、配列番号３）およびＥＧ：２５Ｅ８．２ （Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ｇｉｌ７２９０３０６、配列番号４）、およびＥ２ ＵＢＣ Ｐ５２４８３／マウスＵＢ６Ｂ （Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ｇｉｌ１７１７８５０、配列番号５）、Ｐ２７９２４／ヒトＵＢＣ１／Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ相互作用タンパク質 （ＨＩＰ）、（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ｇｉｌ１４７２７９２２、配列番号６）； ＣＡＡ７２１８４／Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＵＢＣＤ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ｇｉｌ７２９４８９２、配列番号７）、およびＰ１４６８２／酵母ＵＢＣ３／ＣＤＣ３４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ｇｉｌ６３２０２５９、配列番号８）のアラインメントを示す。ＰＦＡＭデータベースの検索により確認されたユビキチン結合ドメインは、ＲＡＴＬ１ｄ６に囲いをつけている。３またはそれ以上の一列に並べた配列で同一である残基を強調表示し、標的タンパク質へのチオールエステル中間体を介するユビキチンの伝達に関与するＵＢＣ中に示す保存Ｃｙｓ残基に「下向きの矢印」をつけている。ＲＡＴＬ１ｄ６とＣ． ｅｌｅｇａｎｓ Ｆ２Ｈ２．８の同一率は完全ペプチド配列に対して４２％、完全ペプチド配列に対してＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＥＧ：２５Ｅ８．２で４７％、および残るタンパク質についてのみＵＢＣドメインに対して約２５％である。
図５Ａおよび５Ｂは、ＲＡＴＬ１ｄ６アミノ酸配列とその推定Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同分子種（図５Ａ、６５％同一）およびＣ． ｅｌｅｇａｎｓ相同分子種（図５Ｂ、６１％同一）との間のＢＬＡＳＴアラインメントを示す。クエリー配列はＲＡＴＬ１ｄ６のそれであり、対象配列は、アミノ酸配列、すなわちＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ （ＥＧ：２５Ｅ８．２）またはＣ． ｅｌｅｇａｎｓ （Ｆ２５Ｈ２．８）である（ＲＡＴＬ１ｄ６配列との同一率を示す）。
図６は実施例１３に記載のＲＡＴＬ１ｄ６のＲＴ−ＰＣＲ発現プロフィールを示す。
【００４４】
発明の説明
本発明は、その発現が非刺激Ｔリンパ球と対比して抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３抗体刺激ヒトＴリンパ球で上方制御される単離された新規ポリヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドを提供する。この新規ポリペプチドを本明細書ではＲＡＴＬ１ｄ６（「Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ １ｄ６」の頭文字）と呼び、さらにユビキチン結合酵素相同体として特徴づける。
【００４５】
本発明の種々の局面をより完全に説明するために以下の定義を規定する。定義は手引きや説明として役立つことを意図し、開示した発明やその態様を限定するものではない。
【００４６】
定義
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド（またはタンパク質）は、あらゆる種、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、ならびに天然、合成、半合成、または組換えを含む種々の供給源由来の実質的に精製されたＲＡＴＬ１ｄ６のアミノ酸配列を表す。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの機能的断片も本発明に含まれる。
【００４７】
アゴニストは、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその機能的断片と結合するとＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの効果の持続時間を増大または延長する分子を表す。アゴニストは、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと結合し、その効果を調節するタンパク質、核酸、炭化水素、または他のあらゆる分子を包含してよい。アンタゴニストは、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその機能的断片と結合すると、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの生物活性および免疫活性の量や持続時間を減少させる分子を表す。アンタゴニストは、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの効果を低下または減少させるタンパク質、核酸、炭化水素、抗体または他のあらゆる分子を包含してよい。
【００４８】
本明細書で用いている「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびその断片または部分、ならびに１本鎖または２本鎖の、センスまたはアンチセンス鎖を表すゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを表す。非限定的例において、断片には、長さ２０−６０ヌクレオチド以上の核酸配列を含み、好ましくは長さが少なくとも７０−１００ヌクレオチド、または少なくとも１０００ヌクレオチド以上の断片を含む。
【００４９】
同様に、本明細書で用いている「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、およびその断片または部分、および天然または合成分子を表す。アミノ酸配列断片は、典型的には長さ約５〜約３０、好ましくは約５〜約１５アミノ酸であり、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの生物活性または機能を保持する。
【００５０】
「アミノ酸配列」が本明細書で天然タンパク質分子のアミノ酸配列を表す場合、「アミノ酸配列」などの用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸配列を、示したタンパク質分子と関連する完全で天然のアミノ酸配列に限定することを意味しない。さらに、本明細書において用語ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドおよびＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質は本発明のＲＡＴＬ１ｄ６核酸配列がコードする生成物を表すのに互換的に用いる。
【００５１】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの変異体は、１またはそれ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列を表す。該変異体は、置換アミノ酸が同様の構造的または化学的特性を有する「保存的」変化、例えばロイシンのイソロイシンによる置換を有してよい。より稀に、変異体は「非保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンによる置換を有してよい。小さな変動はアミノ酸の欠失または挿入、またはその両方を含んでいてもよい。機能的生物活性もしくは免疫活性を失わずにアミノ酸残基が置換、挿入または欠失していることを決定する手引きは、当該分野でよく知られたコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウエアを用いてみいだすことができよう。
【００５２】
アレルまたは対立遺伝子配列はＲＡＴＬ１ｄ６核酸配列の別の形である。アレルは核酸配列中の少なくとも１個の突然変異から生じ、構造や機能が変化してもしなくてもよい変化したｍＲＮＡまたはポリペプチドを生じることができよう。天然または組換えのあらゆる特定の遺伝子は、１または多くの対立遺伝子形を有するか、有していなくてもよい。アレルをを生じる一般的突然変異変化は、一般的にヌクレオチドの天然の欠失、付加または置換による。この種の変化はそれぞれ、単独または他と組み合わせて、特定配列中で１回またはそれ以上生じてよい。
【００５３】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする変化した核酸配列には、同じまたは機能的に等価なＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生じる異なるヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換を含む核酸配列が含まれる。変化した核酸配列は、さらにＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの多形性を含み、そのような多形性は特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出できてもできなくてもよい。コードされたタンパク質は、サイレンス変化、および機能的に等価なＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含んでいてもよい。意図的なアミノ酸置換は、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質の生物活性が保持される限り、残基の極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行ってよい。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸やグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジンやアルギニンが含まれ、同様の親水性値を有する非荷電の極性上部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシンおよびバリン、グリシンおよびアラニン、アスパラギンおよびグルタミン、セリンおよびトレオニン、ならびにフェニルアラニンおよびチロシンが含まれよう。
【００５４】
「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、アミド結合を介して共有結合した修飾核酸塩基対のオリゴマーを表す。ＰＮＡは、多くのアンチセンスおよび抗遺伝子適用の実用性を有する。これらの小分子は、典型的には、転写を阻害することにより作用する（例えば、Ｐ． Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９３、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．、８：５３−６３）。ＰＮＡは相補的１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡと優先的に結合する細胞中での寿命を延長するようにペギレート（ｐｅｇｙｌａｔｅ）させてよい。
【００５５】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、好ましくは、典型的にはＰＣＲ増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイまたはマイクロアレイに用いることができる、長さが少なくとも約６ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８〜１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１２ヌクレオチド、例えば約１５〜３５ヌクレオチドまたは約１５〜２５ヌクレオチド、または約２０〜３５ヌクレオチドの連続したヌクレオチドを含む核酸配列を表す。用語オリゴヌクレオチドは、当該分野で一般に定義されている用語プライマー、プローブ、またはアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）と実質的に同等であると理解されよう。より長いオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ、例えば縮重プローブの混合物を用いて、より長いもしくはより複雑な核酸配列、例えばゲノムＤＮＡを検出することができることも当業者は理解するであろう。そのような場合、該プローブは、少なくとも２０−２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０−１００ヌクレオチド、より好ましくは５０−１００ヌクレオチドを含んでいてよい。
【００５６】
増幅は、核酸配列の更なるコピーを生成することをいい、一般的に当該分野でよく知られ実施されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行われる（Ｄ． Ｗ． ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ． Ｓ． Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、１９９５、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ参照）。
【００５７】
マイクロアレイは、基質、例えば紙、ナイロン、または他のタイプの膜、フィルター、チップ、ガラススライド、または他のあらゆるタイプの適切な固体支持体を用いて合成された別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのアレイ（配列）である。
【００５８】
用語アンチセンスは、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列と相補的なヌクレオチド配列および核酸配列を含む組成物を表す。本明細書で用いている用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖と相補的な核酸鎖に関して使用する。アンチセンス（すなわち、相補的）核酸分子はＰＮＡを含み、合成または転写を含むあらゆる方法により生産してよい。細胞中に導入されると相補的ヌクレオチドは細胞により産生された天然配列と結合し、転写または翻訳をブロックする２本鎖を形成する。用語「ネガティブ」は、アンチセンス鎖について用いることがあり、「ポジティブ」はセンス鎖について用いることがある。
【００５９】
用語コンセンサスは、一連の関連ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質配列間の各位置の塩基またはアミノ酸の最も一般的な選択を反映する配列を表す。特に十分合意されている領域は、保存された機能的ドメインを表すことが多い。
【００６０】
欠失は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化を表し、１またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の欠如を生じる。これに対し、挿入（「付加」ともいう）は、天然分子と比べて１またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加を生じるヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化を表す。置換は、１またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の異なるヌクレオチドまたはアミノ酸による置換を表す。
【００６１】
誘導体核酸分子は、コードされたＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするかまたは相補的な化学修飾を表す。そのような修飾には、例えば、水素の、アルキル、アシル、またはアミノ基による置換が含まれる。核酸誘導体は、天然分子の実質的な生物学的および／または機能的特性を保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、それが誘導されるポリペプチドの生物学的および／または機能的もしくは免疫学的活性を保持するグリコシル化、ペギレーション、またはあらゆる同様のプロセスにより修飾されるものである。
【００６２】
用語「生物学的に活性な」、すなわち、機能的（な）は、天然分子の構造的、調節的、または生化学的機能を有するタンパク質またはポリペプチドまたはその断片を表す。同様に、「免疫学的に活性な」は、適切な動物または細胞に特異的免疫応答を誘導する、例えば抗体を産生し、特異抗体と結合する、天然、組換え、または合成ＲＡＴＬ１ｄ６またはそのあらゆるオリゴペプチドの能力を表す。
【００６３】
用語ハイブリダイゼーションは、核酸鎖が塩基対化により相補鎖と結合するあらゆるプロセスを表す。
【００６４】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的ＧおよびＣ鎖、および相補的ＡおよびＴ塩基の間で水素結合を形成することにより２つの核酸配列の間に形成される複合体を表す。水素結合は、塩基スタッキング相互作用によりさらに安定するかもしれない。２つの相補的核酸配列は水素結合により逆平行に配置される。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えばＣｏｔまたはＲｏｔ分析）、または溶液中に存在する１核酸配列と固体支持体（例えば、膜、フィルター、チップ、ピン、またはガラススライド、または細胞またはその核酸が貼りつく他のあらゆる適切な基質）に固定された別の核酸配列の間に形成することができよう。
【００６５】
用語ストリンジェンシーまたはストリンジェント条件は、核酸組成物、塩、および温度により定義されるハイブリダイゼーション条件を表す。これら条件は当該分野でよく知られており、これを変更して試料中の同じまたは関連ポリヌクレオチド配列を同定および／または検出してよい。低、中程度、または高ストリンジェンシーのいずれかを含む種々の等価な条件は、配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の長さおよび性質、反応環境（溶液中または固体基質上に固定化）、標的核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）の性質、塩濃度、および他の反応成分（例えばホルムアミド、硫酸デキストランおよび／またはポリエチレングリコール）の存在の有無、および反応温度（該プローブの融解温度より約５℃低い〜該融解温度より約２０℃〜２５℃低い温度の範囲内）といった因子に依存する。１またはそれ以上の因子を変更し、前記条件と異なるが等価な低または高ストリンジェンシー条件を生じさせてよい。
【００６６】
当業者が理解するであろうように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは同じまたは関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために変更することができよう。さらに当業者が理解するであろうように、Ｔｍは多くのパラメーター、例えばハイブリッドまたはプローブの長さ（ヌクレオチド数）、またはハイブリダイゼーション緩衝液成分および条件に応じて当該分野で知られた式により概算することができる（例えばＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８２、およびＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｖｏｌ．１，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、１９９４−１９９５、Ｓｕｐｐｌｓ． ２６、２９、３５および４２；２．１０．７−２．１０．１６頁； Ｇ． Ｍ． ＷａｈｌおよびＳ． Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７）； およびＡ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ、１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１参照）。一般的指針として、Ｔｍは配列相同性が１％低下するごとに約１℃〜１．５℃低下する。また、一般的に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の機能である。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は最初低ストリンジェンシー条件下で行い、次いで異なるより高ストリンジェンシーで洗浄する。ハイブリダイゼーションストリンジェンシー、例えば高、中程度、または低ストリンジェンシーに対する言及は典型的にはそのような洗浄条件に関する。
【００６７】
すなわち、非限定的例において、高ストリンジェンシーは、約６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成するそれら核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件を表す（すなわち、ハイブリッドが約６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌで安定でない場合は高ストリンジェンシー条件下で安定でない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば約４２℃の、５０％ホルムアミド、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５ｘＳＳＰＥ （リン酸ナトリウムＥＤＴＡ生理食塩水） （１ｘ ＳＳＰＥ緩衝液は０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）、（または１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ含有１ｘＳＳＣ緩衝液、ｐＨ７．０）、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションし、次いで少なくとも約４２℃、好ましくは約５５℃、より好ましくは約６５℃の温度の１ｘ ＳＳＰＥ （またはクエン酸ナトリウム生理食塩水、ＳＳＣ）および０．１％ＳＤＳで洗浄することにより提供することができる。
【００６８】
中程度ストリンジェンシーは、非限定的例により、４２℃（〜約５０℃）の、５０％ホルムアミド、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５ｘＳＳＰＥ （またはＳＳＣ）、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションさせ、次いで少なくとも約４２℃、好ましくは約５５℃、より好ましくは約６５℃の温度で０．２ｘＳＳＰＥ（またはＳＳＣ）および０．２％ＳＤＳで洗浄する条件を表す。
【００６９】
低ストリンジェンシーは、非限定的例により、４２℃の、１０％ホルムアミド、５ｘ Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、６ｘＳＳＰＥ （またはＳＳＣ）、０．２％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーションさせ、次いで約４５℃、好ましくは約５０℃の温度の１ｘＳＳＰＥ （またはＳＳＣ）および０．２％ＳＤＳで洗浄する条件を表す。
【００７０】
さらなるストリンジェンシー条件については、Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ （１９８２）参照。低、中程度、および高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション／洗浄条件は、当業者によく知られ、実施されている種々の成分、緩衝液、および温度を用いて変更することができよう。
【００７１】
用語相補的（な）または相補性は、塩基対化により許容される塩および温度条件下でポリヌクレオチドが天然に結合することを表す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。２本の１本鎖分子間の相補性は、該核酸のいくらかだけが結合する「部分的」であるか、または１本鎖分子間に完全な相補性が存在するときは完全であってよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に重要な影響をもたらす。これは核酸鎖間の結合に依存する増幅反応、およびＰＮＡ分子の設計および使用において特に重要である。
【００７２】
用語相同性は相補性の程度を表す。部分的相同性または完全な相同性があり、完全な相同性は同一性と等価である。同一の配列が標的核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列は、機能的用語「実質的にホモローガスな」を用いて表される。完全に相補的な配列の標的配列に対するハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（例えばサザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を用いて試験することができよう。
【００７３】
実質的にホモローガスな配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で完全にホモローガスな配列またはプローブと標的配列との結合（すなわちハイブリダイゼーション）と競合し、阻害するであろう。それにも関わらず、低ストリンジェンシー条件は非特異結合を許さず、低ストリンジェンシー条件は２つの配列の互いの一方への結合は特異的（すなわち選択的）相互作用であることを要求する。非特異結合がないことは、部分的な相補性もない（例えば約３０％以下の相同性）第２の標的配列を用いることにより試験することができよう。非特異結合がなければ、プローブは第２の非相補的標的配列とハイブリダイズしないであろう。
【００７４】
当業者は、例えば該分野で知られたＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｊ． Ｄ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２ （２２）：４６７３−４６８０）またはＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇら、１９９０、Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ．、６：２３７−２４５） に基づくようなアルゴリズムを用いて配列間の同一性率を決定する方法を知っているであろう。ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムは典型的にはその計算において配列中に内在する不一致の欠失または付加、すなわちギャップを考慮しないが、これを手動で訂正して同一性％の過剰推定を避けることができる。しかしながら、ＣＬＵＳＴＡＬＷは、その同一性計算値において配列ギャップを考慮する。
【００７５】
特定のポリヌクレオチド配列を含む組成物は、広く特定のポリヌクレオチド配列を含むあらゆる組成物を表す。該組成物は、乾燥製剤または水性溶液剤を含むことができよう。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１）またはその断片を含む組成物をハイブリダイゼーションプローブとして用いてよい。該プローブは凍結乾燥して保存してよく、安定化剤、例えば炭水化物と組み合わせてよい。ハイブリダイゼーションにおいて、該プローブを塩（例えばＮａＣｌ）、洗剤または界面活性剤（例えばＳＤＳ）および他の成分（例えば、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡなど）を含む水性溶液中で用いてよい。
【００７６】
用語「実質的に精製された」は、天然環境から取り出され、単離され、または分離された、それが天然で結合している他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％〜８５％含まない、最も好ましくは９０％またはそれ以上含まない核酸配列またはアミノ酸配列を表す。
【００７７】
用語試料または生物（学的）試料は、その最も広い意味を意味する。ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質をコードする核酸またはその断片、またはＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質自身を含むと思われる生物試料には、体液、細胞または組織抽出物、細胞から単離した染色体（例えば有糸分裂中期染色体スプレッド）、細胞から単離した膜またはオルガネラ、細胞、核酸、例えばゲノムＤＮＡ（溶液中、またはサザン分析用のような固体支持体と結合）、ＲＮＡ（溶液中、またはノーザン分析用のような固体支持体と結合）、ｃＤＮＡ （溶液中または固体支持体と結合）組織、組織プリントなどが含まれよう。
【００７８】
形質転換は、外因性ＤＮＡを導入し、レシピエント細胞を変化させるプロセスを表す。形質転換は当該分野でよく知られた種々の方法を用いる天然または人工的条件下で生じてよい。形質転換は、外来核酸配列を原核性または真核性宿主細胞に挿入するあらゆる知られた方法によってよい。該方法は、形質転換される宿主細胞の種類に基づいて選ばれ、限定されるものではないが、ウイルス感染、エレクトロポーレーション、熱ショック、リポフェクション、および部分衝撃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎ）を含んでよい。そのような「形質転換された」細胞には、挿入されたＤＮＡを自己複製プラスミドまたは宿主染色体の部分として複製することができる安定な形質転換細胞を含む。形質転換細胞には、限定された期間に挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを一時的に発現する細胞も含まれる。
【００７９】
用語「模倣（ｍｉｍｅｔｉｃ）」は、その構造がＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質またはその部分の構造の知識から生じ、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質の作用のいくらかまたはすべてを生じることができるような分子を表す。
【００８０】
タンパク質（「特定タンパク質の部分」として）に関して用語「部分」は、該タンパク質の断片または部分を表す。断片のサイズは、４または５アミノ酸残基〜完全アミノ酸配列の１アミノ酸を欠くものまでの範囲であってよい。すなわち、「配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも部分を含む」タンパク質は完全長ヒトＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその断片を含む。
【００８１】
用語抗体は、完全分子、および抗原決定基や抗原性決定基と結合することができるその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖを表す。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと結合する抗体は、完全ポリペプチド、または目的とする、あるいは免疫抗原として用いるために組換えにより製造した小ペプチドを含む断片を用いて製造することができる。動物を免疫するのに用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの転位から誘導するかまたは化学合成することができ、所望により担体タンパク質と結合させることができる。ペプチドと化学的にカップリングする一般に用いられる担体には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびサイログロブリンが含まれる。次に、カップリングしたペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラット、またはウサギ）を免疫する。
【００８２】
用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体とより厳密に似るように非抗原性結合領域のアミノ酸が置換しているが、依然として最初の結合能力を保持している抗体分子を表す（例えば、Ｃ． Ｌ． Ｑｕｅｅｎらに対する米国特許５，５８５，０８９に記載）。
【００８３】
用語「抗原（性）決定基」は、特定の抗体と接触する分子の部分（すなわちエピトープ（抗原決定基））を表す。タンパク質またはタンパク質の断片を用いて宿主動物を免疫する場合は、該タンパク質の多くの領域が該タンパク質の特定領域または三次元構造と特異的に結合する抗体を誘導することができ、これら領域または構造を抗原性決定基という。抗原性決定基は抗体との結合において完全抗原（すなわち、免疫応答を誘導するのに用いる免疫原）と競合してよい。
【００８４】
用語「特異結合（する）」または「特異的に結合する」は、タンパク質またはペプチドと結合分子、例えばアゴニスト、アンタゴニストまたは抗体の相互作用を表す。該相互作用は結合分子により認識されるタンパク質の特定構造（すなわち、抗原性決定基またはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的であるときは、標識された「Ａ」および抗体を含む反応物中のエピトープＡ（すなわち遊離の非標識Ａ）を含むタンパク質の存在は、抗体と結合した標識Ａの量を減少させるであろう。
【００８５】
用語「ポリヌクレオチドの発現と対応する」は、ノーザン分析による配列番号１と同様なリボ核酸の存在の検出は試料中のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在を示し、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現に対応することを表す。
【００８６】
配列番号１のポリヌクレオチド中の変更には、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出することができる欠失、挿入、および点突然変異を含むＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列におけるあらゆる変更が含まれる。この定義内には、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ配列に対する変更の検出（例えば配列番号１とハイブリダイズすることができる制限断片長多形性のパターンの変更による）、配列番号１の選んだ断片がゲノムＤＮＡ試料にハイブリダイズできないこと （例えばアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用）、および不適切または予期しないハイブリダイゼーション、例えばＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の正常染色体遺伝子座以外の遺伝子座とのハイブリダイゼーション（例えば、有糸分裂中期スプレッドに対する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用）の検出が含まれる。
【００８７】
本発明の詳細な説明
本発明は、Ｊｕｒｋａｔ系Ｔ細胞およびヒト末梢血Ｔリンパ球の刺激が、ＣＤ３およびＣＤ２８細胞表面抗原に対する抗体により上方制御されることがわかった活性化ヒトＴ細胞から単離された新規ポリペプチド（本明細書ではＲＡＴＬ１ｄ６という）の発見に基づく。本発明は、異常または調節されない細胞増殖および／または機能に関連する障害、例えば新生物疾患（例えば癌および腫瘍）、および免疫および神経変性障害および病状をスクリーニング、診断、治療または予防するためのＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む組成物の使用を含む。
【００８８】
また、本発明は異常な免疫応答、例えば自己免疫病状、変性病状、悪液質、筋肉変性などに関連する障害をスクリーニング、診断、治療または予防するためのＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む組成物の使用を含む。
【００８９】
また、本発明は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドおよび本明細書に記載のポリペプチド配列の断片または部分も含む。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの機能的または活性部分が好ましい。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドはユビキチン結合酵素と類似性を有する。
【００９０】
本発明のヒトＲＡＴＬ１ｄ６をコードする核酸はサブトラクションクローニングにより最初に同定された（実施例１）。さらなる核酸が、ＩｎｃｙｔｅデータベースのＢＬＡＳＴ検索によりＩｎｃｙｔｅクローンＮｏ．２３９６４８３ （ＴＨＰ−１、プロモノサイトライブラリー）； ５８１８２４０ （前立腺腫瘍ライブラリー）； ５３９６２７０ （肝臓腫瘍ライブラリー）；および４７４１２０２（胸腺ライブラリー）中に確認された。該配列をアラインメントし、得られたコンフィグを用いて完全長クローンを得るためのオリゴヌクレオチドを設計した。（実施例１および２参照）。
【００９１】
そのある態様において、本発明は図３に示す配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ＲＡＴ１ｄ６ポリペプチドは長さ４２２アミノ酸であり、ユビキチン結合酵素とのアミノ酸配列相同性を有する。すなわち、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質は、活性化Ｔリンパ球から単離されたＵＢＣファミリーの新たに発見されたメンバーとして特徴付けられる。さらに、図４は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド配列とＵＢＣドメインを有するタンパク質のユビキチン結合酵素 （ＵＢＣ）ファミリーを含む種間配列とのアラインメントを提供する。
【００９２】
ＥＧ：２５Ｅ８．２がユビキチン結合酵素であり、Ｒａｔ１ｄ６の相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）らしいとの結論は、該タンパク質間の有意レベルの相同性による。ＲＡＴＬ１ｄ６の機能をよりよく説明するために、ＥＧ：２５Ｅ８．２を用いた試験をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ショウジョウバエ）細胞に基づく免疫モデルを用いて行った（実施例１４参照）。
【００９３】
哺乳動物は固有および適応免疫経路による複雑な免疫応答を有し、これらの経路は同様のクラスの分子を共用する。固有免疫のほとんどの構成要素はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａからヒトに新化論的に保存されるが、より高等な真核生物のみが免疫を獲得した（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｎ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、２００１、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１５：２３２１−２３４２）。
【００９４】
昆虫は広範囲の病原体に対する強力で急速な応答を有する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの真菌および細菌感染は、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）遺伝子の転写活性化をもたらす。各ＡＭＰ遺伝子の誘導は、３つのＲｅｌ／ＮＦ−κＢタンパク質、すなわち、Ｒｅｌｉｓｈ、ＤｏｒｓａｌおよびＤｉｆの組み合せにより発揮されるインプットのバランスにより制御される。ＡＭＰ ＡｔｔａｃｉｎＤ遺伝子はＲｅｌｉｓｈホモダイマー、またはＲｅｌｉｓｈおよびＤｏｒｓａｌのヘテロダイマーの活性化により制御される（Ｈａｎ、Ｚ． Ｓ．およびＩｐ、Ｙ． Ｔ．、１９９９、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４：２１３５５−２１３６１）。Ｒｅｌ／ＮＦ−κＢ経路の活性化は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの固有免疫応答に必須である。例えば、Ｒｅｌｉｓｈ遺伝子中のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの突然変異は、ある種のクラスの抗微生物ペプチドを発現せず、グラム陰性細菌感染に感受性である（Ｈｅｎｄｅｎｇｒｅｎ、Ｍ．ら、１９９９、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．、４ （５）：８２７−８３７）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｒｅｌタンパク質は、哺乳類ＲｅｌｓのようにＩκＢ様インヒビタータンパク質と結合する結果、細胞質中に隔離される。細胞が病原体により活性化される場合、シグナル経路が活性化し、ＩκＢの変性、Ｒｅｌタンパク質の核転座、およびＲｅｌ活性化転写が生じる（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｎ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、２００１、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１５：２３２１−２３４２）。Ｃａｃｔｕｓ（カクタス）はＤｏｒｓａｌおよびＤｉｆを阻害するＩκＢタンパク質である。Ｒｅｌｉｓｈ（レリッシュ）はｐ１０５ ＮＦ−κＢの哺乳類相同体であり、ＮＦ−κ−ＢのようにＲｅｌｉｓｈはＲｅｌドメインとＩκＢ阻害ドメインの両方を含む。ＲｅｌｉｓｈはＩκＢドメインを放出する開裂により活性化される（Ｓｔｏｖｅｎ、Ｓ．ら、２０００、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．、１：３４７−３５２）。
【００９５】
上記試験は、ＥＧ：２５Ｅ８．２タンパク質のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ固有免疫応答の調節機能に関連する。これら試験の中心はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２ （Ｓ２）培養細胞においてＥＧ：２５Ｅ８．２ ｍＲＮＡの２本鎖ＲＮＡ介在干渉（ＲＮＡｉ）による「ノックアウト」表現型を生じることである。ＲＮＡｉ技術は持続的転写後遺伝子サイレンシングを生じるために開発され、Ｓ２細胞中で働くことが報告されてきた （Ｃａｐｌｅｎ、Ｎ． Ｊ．ら、２０００、Ｇｅｎｅ、２５２：９５−１０５、およびＣｌｅｍｅｎｓ、Ｊ． Ｃ．ら、２０００、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９７：６４９９−６５０３）。Ｓ２細胞を細菌細胞壁成分のリポ多糖（ＬＰＳ）により誘導し、Ａｔｔａｃｉｎ（アタシン）を含む抗微生物ペプチドのサブユニットを発現させることができる（Ｈａｎ、Ｚ． Ｓ．およびＩｐ、Ｙ． Ｔ．、１９９９、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４：２１３５５−２１３６１）。実施例１４記載の実験では、Ｓ２細胞を用いるＬＰＳ誘導性ルシフェラーゼレポーター系においてＥＧ：２５Ｅ８．２ ＲＮＡｉを試験した。
【００９６】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド変異体も本発明に含まれる。好ましいＲＡＴＬ１ｄ６変異体は、本明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５〜８０％、より好ましくは少なくとも８５〜９０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的、免疫的、または他の機能的特性または活性を保持する。配列番号２と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する変異体が最も好ましい。
【００９７】
別の態様において、本発明はＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。したがって、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするあらゆる核酸配列を用いてＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質を発現する組換え分子を生成することができる。特定の態様において、本発明は、図１Ａおよび１Ｂに示す配列番号１の核酸配列を含むＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドを含む。より詳細には、本発明は、ブダペスト条約の規定に従って２００１年１０月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託されたＲＡＴＬ１ｄ６クローン（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７４５）を提供する。
【００９８】
当業者が理解するであろうように、遺伝子コードの縮重はＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする多数のヌクレオチド配列の生成を生じる。該配列のあるものは、あらゆる知られた天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性を有する。したがって、本発明は可能なコドン選択に基づく組み合わせを選ぶことにより作製することができるそれぞれすべての可能なヌクレオチド配列の変動を予期する。これらの組み合わせは、天然ＲＡＴＬ１ｄ６のヌクレオチド配列に適用される標準的トリプレット遺伝子コードにしたがって作製され、そのようなすべての変動は具体的に開示されていると考えるべきである。
【００９９】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドおよびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは適切に選ばれたストリンジェンシー条件下で天然ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるが、実質的に異なるコドンを使用しているＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を生成するのが好都合であろう。コドンは、ペプチド／ポリペプチドの発現が特定のコドンが宿主に利用される頻度にしたがって特定の原核および真核宿主に生じる割合を増加させるように選ぶことができよう。コードされたアミノ酸配列を変化させずにＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変化させる他の理由には、より望ましい特性、例えば天然配列から生成される転写物より長い半減期を有するＲＮＡ転写物の生成が含まれる。
【０１００】
また本発明は、もっはら合成化学により、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドおよびその誘導体をコードするＤＮＡ配列またはその部分の生成を含む。生成後、合成配列を当業者が実施するよく知られた試薬を用いるあらゆる多くの利用可能な発現ベクターおよび細胞系に挿入することができよう。さらに、合成化学を用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列またはそのあらゆる断片に突然変異を導入してよい。
【０１０１】
また、種々のストリンジェンシー条件下で配列番号１に示すような本発明のＲＡＴＬ１ｄ６のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列も本発明に含まれる。ハイブリダイゼーション条件は典型的には核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づき（Ｇ． Ｍ． ＷａｈｌおよびＳ． Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ、１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：３９９−４０７、およびＡ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ、１９８７； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５２：５０７−５１１参照）、限定したストリンジェンシーで用いることができよう。例えば、本発明には、中程度のストリンジェント条件下で配列番号１のＲＡＴＬ１ｄ６配列およびＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするものと縮重する他の配列とハイブリダイズすることができる配列が含まれる（例えば、非限定的例として、２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０の前洗浄溶液、および５０℃、５ＸＳＳＣ、一夜のハイブリダイゼーション条件）。
【０１０２】
ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質をコードする核酸配列を部分ヌクレオチド配列を利用し当該分野で知られた種々の方法を用いて伸長させ、プロモーターや制御エレメントのような上流配列を検出することができよう。例えば、用いることができるある方法には普遍的プライマーを利用して既知遺伝子座と隣り合った未知の配列を回収する制限部位ＰＣＲがある（Ｇ． Ｓａｒｋａｒ、１９９３、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．、２：３１８−３２２）。特に、ゲノムＤＮＡは、最初にリンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅される。次に、増幅された配列を同じリンカープライマーおよび最初のものに内在する別の特異的プライマーを用いる２回目のＰＣＲにかける。各回のＰＣＲの生成物を適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写し、逆転写酵素を用いてシーケンスする。
【０１０３】
逆ＰＣＲを用い、既知領域または配列に基づく分岐プライマーを用いて配列を増幅または伸長してもよい （Ｔ． Ｔｒｉｇｌｉａら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：８１８６）。該プライマーは、ＯＬＩＧＯ４．０６プライマー分析ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮ．）または別の適切なプログラムを用い、長さ２２−３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率５０％またはそれ以上、および温度約６８〜７２℃で標的配列とアニールするように設計することができよう。該方法には、遺伝子の既知領域に適切な断片を生じる数種の制限酵素を用いる。次に、該断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として用いる。
【０１０４】
使用できる別の方法には、ヒトおよび酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡの既知配列と隣り合ったＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含むキャプチャーＰＣＲがある（Ｍ． Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、１９９１、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．、１：１１１−１１９）。この方法において、複数の制限酵素消化およびライゲーションを用い、操作した２本鎖配列をＰＣＲを行う前のＤＮＡ分子の未知部分内に置くことができよう。Ｊ． Ｄ． Ｐａｒｋｅｒら（１９９１； Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：３０５５−３０６０）は、未知配列を回収するのに使用できる別の方法を提供する。さらに、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリーを用いてゲノムＤＮＡをワーク（ｗａｌｋ）することができる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部をみいだすのに有用である。
【０１０５】
完全長ｃＤＮＡをスクリーングするときは、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択したライブラリーを用いるのが好ましい。また、遺伝子の５’領域を含む配列をより多く含むであろうことからランダムプライムドライブラリーも好ましい。オリゴ ｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生じない状況ではランダムプライムドライブラリーを使用することも特に好ましいかもしれない。ゲノムライブラリーは、５’および３’非転写制御領域中の配列の伸長、または選択的にスプライスされた転写物におけるエクソンの使用を確認するのに有用かもしれない。
【０１０６】
本発明の態様は、当該分野でよく知られた一般に利用可能なＤＮＡシーケンシング法を用いて実施することができる。該方法には、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ （ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、または組換えポリメラーゼおよびプルーフリーディングエクソヌクレアーゼの組み合わせ、例えばＥＬＯＮＧＡＳＥ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）から市販）といった酵素を用いてよい。好ましくは、該プロセスはＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ （ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）、およびＡＢＩ Ｃａｔａｌｙｓｔおよび３７３および３７７ ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）といった機械を用いて自動化される。
【０１０７】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いてシーケンシングまたはＰＣＲ生成物のサイズを分析し、またはヌクレオチド配列を確認することができよう。特に、キャピラリーシーケンシングには、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザーで活性化する４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに１つ）、および荷電連動装置カメラ（ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ ｃａｍｅｒａ）による放射波長の検出を用いることができよう。アウトプット／光強度を適切なソフトウエア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ ａｎｄ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて電気信号に変換し、全プロセス（試料のローディングからコンピューター分析および電子データ表示まで）をコンピューター制御することができよう。キャピラリー電気泳動は、特定試料中に限られた量だけ存在するかもしれないＤＮＡの小片をシーケンシングするのに特に好ましい。
【０１０８】
本発明の別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはそのペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子に用い、適切な宿主細胞中におけるＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド生成物またはその断片または機能的等価物の発現を導くことができよう。遺伝子コードの固有の縮重のため、実質的に同じかまたは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列を生成し、これら配列を用いてＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質をクローンし、発現させてよい。
【０１０９】
当業者が理解するであろうように、それは非天然コドンを有するＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成するのに好都合かもしれない。例えば、特定の原核性または真核性宿主において好ましいコドンを選び、タンパク質の発現率を増大させ、所望の特性、例えば天然配列から生じる転写物より長い半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。
【０１１０】
本発明のヌクレオチド配列は、限定されるものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列を変更するために当該分野で一般に知られた方法を用いて操作することができる。ランダム断片化によるＤＮＡシャッフリング、および遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いてヌクレオチド配列を操作してよい。例えば、部位指向性（または部位特異的）突然変異誘発を用いて新規制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変更し、コドン選択を変化させ、スプライス変異体を生成し、または突然変異を導入してよい。部位指向性突然変異誘発を行う種々の方法が当該分野で知られ実施されており、例えばＭ． Ｊ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ （ｅｄ）、１９９１、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ； Ｊ． Ｌ． Ｏｗｅｎら、Ａｐｒ．、１９９４、Ｆｏｃｕｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｖｏｌ． １６．２：３９−４４； およびＲ． ＡｎｄａｇおよびＥ． Ｓｃｈｕｔｚ、２００１、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３０ （３）：４８６−４８８）に記載されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位指向性突然変異誘発を行うキットも市販されており、広く使用されている（例えば、Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標） Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ； およびＵｎｉｑｕｅ Ｓｉｔｅ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。
【０１１１】
本発明の別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする天然、修飾、または組換え核酸配列を融合タンパク質をコードするようにヘテロローガスな配列と結合してよい。例えば、ＲＡＴＬ１ｄ６活性のインヒビターのためのペプチドライブラリーをスクリーニングするには、市販の抗体により認識できるキメラＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質をコードすることが有用かもしれない。ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質がヘテロローガスな部分から開裂され、精製されるようにＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質をコードする配列とヘテロローガスなタンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むように融合タンパク質を操作してもよい。
【０１１２】
別の態様において、リガンド結合アッセイはＲＡＴＬ１ｄ６生成物の機能と干渉するインヒビター化合物を同定するのに有用である。そのようなアッセイは、タンパク質の機能が未知であっても有用である。これらアッセイは、被検化合物の特定標的分子、例えばタンパク質またはペプチドへの結合を検出するように設計される。検出には結合の直接測定が含まれてよい。あるいはまた、結合の間接表示には、タンパク質構造の安定化または生物学的機能の破壊が含まれてよい。有用なリガンド結合アッセイの非限定的な例を以下に詳述する。
【０１１３】
結合タンパク質を検出および単離するのに有用な方法の一つには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒが開発し、製造者のプロトコール（ＬＫＢ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に記載のＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ （ＢｌＡｃｏｒｅ）システムがある。ＢＩＡｃｏｒｅシステムではＧＳＴ融合タンパク質をセンサーチップに固定するためにアフィニティー精製抗ＧＳＴ抗体を用いる。センサーは、屈折率の変化を検出する光学的現象である表面プラスモン共鳴を利用する。したがって、目的とするタンパク質、例えば本発明のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその断片はチップ上にコートされ、被検化合物は該チップ上を通過する。屈折率（表面プラスモン共鳴）の変化により結合を検出する。
【０１１４】
別のタイプのリガンド結合アッセイには、米国特許４，５６８，６４９に記載のシンチレーション近似アッセイ（ＳＰＡ）が含まれる。現在開発中のこのアッセイの修飾にはホールドタンパク質とアンホールドタンパク質を区別するためにシャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）を用いる。標的タンパク質をＳＰＡビーズに付着させ、被検化合物を加える。次に、該ビーズを緩やかな変性条件、例えば加熱、ＳＤＳへの暴露などにかけ、精製標識シャペロニンを加える。被検化合物が標的タンパク質に結合していれば、標識シャペロニンは結合せず、反対に被検化合物が結合していなければ該タンパク質はある程度の変性を受け、シャペロニンは結合するであろう。別のタイプのリガンド結合アッセイにおいて、ミトコンドリア標的シグナルを含むタンパク質はｉｎ ｖｉｔｒｏで単離されたミトコンドリア内に取込まれる （Ｈｕｒｔら、１９８５、ＥＭ８０ Ｊ．、４：２０６１−２０６８； ＥｉｌｅｒｓおよびＳｃｈａｔｚ、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：２２８−２３１）。ミトコンドリア取込みアッセイにおいて、特定の標的タンパク質をコードする核酸がミトコンドリア取込みシグナルをコードする特定の下流に挿入されている発現ベクターを構築する。キメラタンパク質を合成し、被検化合物の存在下および非存在下でそれが単離ミトコンドリアに取込まれる能力について試験する。標的タンパク質と結合する被検化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで単離ミトコンドリアへのその取込みを阻害するはずである。
【０１１５】
本発明に従って用いるのに適した別のタイプのリガンド結合アッセイには、酵母２ハイブリッドシステムがある（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４０：２４５−２４６）。酵母２ハイブリッドシステムは、酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４タンパク質の特性を活用する。ＧＡＬ４タンパク質は、ガラクトースの利用を含む酵素をコードする遺伝子の発現に必要な転写アクチベーターである。ＧＡＬ４タンパク質は、２つの分離可能な機能的に不可欠なドメイン、すなわち、特異的ＤＮＡ配列と結合するＮ末端ドメイン（ＵＡＳＧ）、および転写を活性化するのに必要な酸性領域を含むＣ末端ドメインからなる。両ドメインを含む天然ＧＡＬ４タンパク質は、酵母細胞がガラクトース培地上で増殖するときの強力な転写アクチベーターである。Ｎ末端ドメインは配列特異的にＤＮＡと結合するが、転写を活性化することはできない。Ｃ末端ドメインは活性化領域を含むが、ＵＡＳＧに局在することができないので転写を活性化することはできない。ＧＡＬ４の部分を含む２ハイブリッドタンパク質の系である２ハイブリッドシステムにおいて、（１）ＧＡＬ４ ＤＮＡ経合ドメインはタンパク質「Ｘ」と融合し、（２）ＧＡＬ４活性化領域はタンパク質「Ｙ」を融合する。ＸおよびＹがタンパク質−タンパク質複合体を形成し、ＧＡＬ４ドメインの近似物を再構成することができれば、ＵＡＳＧにより制御された遺伝子の転写が起きる。相互作用するタンパク質ＸおよびＹのひとつをそれぞれ含む２ハイブリッドタンパク質の作製により、ＵＡＳＧの活性化領域をその正常作用部位にもたらすことができる。
【０１１６】
固体基質上に合成された多数の明確なポリマーについて被検化合物の結合親和性を試験することを含む、Ｆｏｄｏｒら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７３に記載の結合アッセイも有用であろう。本発明のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその部分と結合する化合物は治療用組成物に用いる物質として潜在的有用性がある。
【０１１７】
別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列は、当該分野でよく知られた化学的方法を用いて全部または部分を合成することができよう（例えば、Ｍ． Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８０、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．、２１５−２２３、およびＴ． Ｈｏｒｎ、Ｔら、１９８０、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．、２２５−２３２参照）。あるいはまた、該タンパク質それ自身をＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその断片もしくは部分のアミノ酸配列を合成する化学的方法を用いて生成することができよう。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実施でき（Ｊ． Ｙ． Ｒｏｂｅｒｇｅら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９：２０２−２０４）、自動合成は、例えばＡＢＩ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成することができよう。新規合成ペプチドは、プレパラティブ高速液体クロマトグラフィー（例えばＴ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ． Ｙ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、または当該分野で知られた他の合成方法により実質的に精製することができる。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシーケンシングにより確認することができよう（例えば、Ｅｄｍａｎ変性法； Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記）。さらに、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはそのあらゆる部分のアミノ酸配列を直接合成時に変更し、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質またはそのあらゆる部分からの配列と結合させることにより変異体ポリペプチドを製造することができよう。
【０１１８】
出発メチオニンを欠くポリペプチド
好ましい態様において、本発明は、得られたＲＡＴＬ１ｄ６のコードポリペプチドに加えて開始出発コドンを欠くポリヌクレオチドを含む。詳細には、本発明は配列番号１のヌクレオチド５２０〜１７８２に対応するポリヌクレオチドと配列番号２のアミノ酸２〜４２２に対応するポリペプチドを含む。本発明には、ＲＡＴＬ１ｄ６をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターおよび該ベクターを含む宿主細胞も含まれる。
【０１１９】
ＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメイン
新規ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのＵＢＣドメインは配列番号２の約Ｇ２４８〜約Ｋ４１１に位置する。ユビキチンのトランスファーに関与する保存システインは、配列番号２のアミノ酸３５１に位置する。
【０１２０】
好ましい態様において、下記ＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメインポリペプチドが本発明に含まれる：
【化１】
2004512836.tif 000002
このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明は、ＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメインポリペプチドを本明細書の別の場所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして使用することも含む。
【０１２１】
さらに好ましい態様において、下記Ｎ末端ＲＡＴＬ１ｄ６ＵＢＣドメイン欠失ポリペプチドが本発明に含まれる：配列番号２の、
【化２】
2004512836.tif 000003
【０１２２】
【化３】
2004512836.tif 000004
これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。本発明は、１またはそれ以上のこれらＮ末端ＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメイン欠失ポリペプチドを本明細書の別の場所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして使用することも含む。
【０１２３】
さらに別の好ましい態様において、下記Ｃ末端ＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメイン欠失ポリペプチドが本発明に含まれる：配列番号２の、
【化４】
2004512836.tif 000005
【０１２４】
【化５】
2004512836.tif 000006
これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。本発明は、１またはそれ以上のこれらＣ末端ＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメイン欠失ポリペプチドを本明細書の別の場所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして使用することも含む。
【０１２５】
さらに好ましい態様において、下記ＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメインアミノ酸置換も本発明に含まれる：配列番号２の、
Ｇ２４８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ２４９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ２５０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ２５１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ａ２５２がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｔ２５３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｄ２５４がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｒ２５５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ２５６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｍ２５７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ２５８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｅ２５９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ２６０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｒ２６１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｄ２６２がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｉ２６３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｙ２６４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷアミノ酸残基で置換される。
Ｒ２６５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ２６６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ２６７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ２６８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｆ２６９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ２７０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ２７１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ２７２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｎ２７３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｙ２７４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷアミノ酸残基で置換される。
Ａ２７５がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ２７６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｅ２７７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ｌ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ２７８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ２７９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｎ２８０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｄ２８１がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ２８２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ２８３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｙ２８４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷアミノ酸残基で置換される。
Ｄ２８５がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｗ２８６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｎ２８７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ２８８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ２８９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ２９０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ２９１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ２９２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ２９３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｄ２９４がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ２９５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｄ２９６がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ２９７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ａ２９８がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ２９９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｈ３００がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｎ３０１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｄ３０２がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３０３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ３０４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｉ３０５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３０６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ３０７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｅ３０８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ３０９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｅ３１０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ３１１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ａ３１２がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｄ３１３がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｆ３１４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｉ３１５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３１６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３１７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｎ３１８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｆ３１９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３２０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｆ３２１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ３２２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｄ３２３がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｎ３２４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｆ３２５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｐ３２６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｆ３２７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｄ３２８がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｐ３２９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｐ３３０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｆ３３１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ３３２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｒ３３３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ３３４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ３３５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３３６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｐ３３７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ３３８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３３９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３４０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ３４１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ３４２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｙ３４３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷアミノ酸残基で置換される。
Ｖ３４４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３４５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ３４６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ３４７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ３４８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ａ３４９がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｉ３５０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｃ３５１がＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｍ３５２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｅ３５３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３５４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３５５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｔ３５６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ３５７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ３５８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ３５９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｗ３６０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３６１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３６２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ａ３６３がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｙ３６４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３６５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｉ３６６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｅ３６７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３６８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ３６９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｉ３７０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｍ３７１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ３７２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｉ３７３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３７４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ａ３７５がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｔ３７６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３７７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ３７８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ３７９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ３８０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ３８１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ａ３８２がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｒ３８３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ３８４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ３８５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｆ３８６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｇ３８７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ａ３８８がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｎ３８９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｋ３９０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３９１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ３９２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｙ３９３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷアミノ酸残基で置換される。
Ｓ３９４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ３９５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｔ３９６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｒ３９７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ａ３９８がＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹで置換される。
Ｑ３９９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ４００がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ４０１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｙ４０２がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶまたはＷアミノ酸残基で置換される。
Ｋ４０３がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｓ４０４がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｌ４０５がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｖ４０６がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｑ４０７がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｉ４０８がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｈ４０９がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
Ｅ４１０がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。
そして／またはＫ４１１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷまたはＹアミノ酸残基で置換される。ならびにそのあらゆる組み合わせ。本発明は、１またはそれ以上のこれらＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメインアミノ酸置換ポリペプチドを本明細書の別の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることも含む。
【０１２６】
別の好ましい態様において、下記ＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメイン保存的アミノ酸置換が本発明に含まれる：配列番号２の、
Ｇ２４８がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ｓ２４９がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｖ２５０がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｑ２５１がＮで置換される。Ａ２５２がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶで置換される。Ｔ２５３がＡ、Ｇ、ＭまたはＳで置換される。Ｄ２５４がＥで置換される。Ｒ２５５がＫまたはＨで置換される。Ｌ２５６がＡ、ＩまたはＶ で置換される。Ｍ２５７がＡ、Ｇ、ＳまたはＴで置換される。Ｋ２５８がＲまたはＨで置換される。Ｅ２５９がＤで置換される。Ｌ２６０がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｒ２６１がＫまたはＨで置換される。Ｄ２６２がＥで置換される。Ｉ２６３がＡ、ＶまたはＬで置換される。Ｙ２６４がＦまたはＷである。Ｒ２６５がＫまたはＨで置換される。Ｓ２６６がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｑ２６７がＮで置換される。Ｓ２６８がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｆ２６９がＷまたはＹで置換される。Ｋ２７０がＲまたはＨで置換される。Ｇ２７１がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ｇ２７２がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ｎ２７３がＱで置換される。Ｙ２７４がＦまたはＷである。Ａ２７５がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶで置換される。Ｖ２７６がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｅ２７７がＤで置換される。Ｌ２７８がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｖ２７９がＡ、ＩまたはＬ で置換される。Ｎ２８０がＱで置換される。Ｄ２８１がＥで置換される。Ｓ２８２がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｌ２８３がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｙ２８４がＦまたはＷである。Ｄ２８５がＥで置換される。Ｗ２８６がＦまたはＹである。Ｎ２８７がＱで置換される。Ｖ２８８がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｋ２８９がＲまたはＨで置換される。Ｌ２９０がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｌ２９１がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｋ２９２がＲまたはＨで置換される。Ｖ２９３がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｄ２９４がＥで置換される。Ｑ２９５がＮで置換される。Ｄ２９６がＥで置換される。Ｓ２９７がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ａ２９８がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶで置換される。Ｌ２９９がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｈ３００がＫまたはＲで置換される。Ｎ３０１がＱで置換される。Ｄ３０２がＥで置換される。Ｌ３０３がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｑ３０４がＮで置換される。Ｉ３０５がＡ、ＶまたはＬで置換される。Ｌ３０６がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｋ３０７がＲまたはＨで置換される。Ｅ３０８がＤで置換される。Ｋ３０９がＲまたはＨで置換される。Ｅ３１０がＤで置換される。Ｇ３１１がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ａ３１２がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶで置換される。Ｄ３１３がＥで置換される。Ｆ３１４がＷまたはＹ で置換される。Ｉ３１５がＡ、ＶまたはＬで置換される。Ｌ３１６がＡ、ＩまたはＶ で置換される。Ｌ３１７がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｎ３１８がＱで置換される。Ｆ３１９がＷまたはＹで置換される。Ｓ３２０がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｆ３２１がＷまたはＹで置換される。Ｋ３２２がＲまたはＨで置換される。Ｄ３２３がＥで置換される。Ｎ３２４がＱで置換される。Ｆ３２５がＷまたはＹで置換される。Ｐ３２６がＰである。Ｆ３２７が��またはＹで置換される。Ｄ３２８がＥで置換される。Ｐ３２９がＰである。Ｐ３３０がＰである。Ｆ３３１がＷまたはＹで置換される。Ｖ３３２がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｒ３３３がＫまたはＨで置換される。Ｖ３３４がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｖ３３５がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｓ３３６がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｐ３３７がＰである。Ｖ３３８がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｌ３３９がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｓ３４０がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｇ３４１がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ｇ３４２がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ｙ３４３がＦまたはＷである。Ｖ３４４がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｌ３４５がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｇ３４６がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ｇ３４７がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ｇ３４８がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ａ３４９がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶで置換される。Ｉ３５０がＡ、ＶまたはＬで置換される。Ｃ３５１がＣである。Ｍ３５２がＡ、Ｇ、ＳまたはＴで置換される。Ｅ３５３がＤで置換される。Ｌ３５４がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｌ３５５がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｔ３５６がＡ、Ｇ、ＭまたはＳで置換される。Ｋ３５７がＲまたはＨで置換される。Ｑ３５８がＮで置換される。Ｇ３５９がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ｗ３６０がＦまたはＹである。Ｓ３６１がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｓ３６２がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ａ３６３がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶ で置換される。Ｙ３６４がＦまたはＷである。Ｓ３６５がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｉ３６６がＡ、ＶまたはＬで置換される。Ｅ３６７がＤで置換される。Ｓ３６８がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｖ３６９がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｉ３７０がＡ、ＶまたはＬで置換される。Ｍ３７１がＡ、Ｇ、ＳまたはＴで置換される。Ｑ３７２がＮで置換される。Ｉ３７３がＡ、ＶまたはＬで置換される。Ｓ３７４がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ａ３７５がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶ で置換される。Ｔ３７６がＡ、Ｇ、ＭまたはＳで置換される。Ｌ３７７がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｖ３７８がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｋ３７９がＲまたはＨで置換される。Ｇ３８０がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ｋ３８１がＲまたはＨで置換される。Ａ３８２がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶで置換される。Ｒ３８３がＫまたはＨで置換される。Ｖ３８４がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｑ３８５がＮで置換される。Ｆ３８６がＷまたはＹで置換される。Ｇ３８７がＡ、Ｍ、ＳまたはＴで置換される。Ａ３８８がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶで置換される。Ｎ３８９がＱで置換される。Ｋ３９０がＲまたはＨで置換される。Ｓ３９１がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｑ３９２がＮで置換される。Ｙ３９３がＦまたはＷである。Ｓ３９４がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｌ３９５がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｔ３９６がＡ、Ｇ、ＭまたはＳで置換される。Ｒ３９７がＫまたはＨで置換される。Ａ３９８がＧ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶで置換される。Ｑ３９９がＮで置換される。Ｑ４００がＮで置換される。Ｓ４０１がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｙ４０２がＦまたはＷである。Ｋ４０３がＲまたはＨで置換される。Ｓ４０４がＡ、Ｇ、ＭまたはＴで置換される。Ｌ４０５がＡ、ＩまたはＶで置換される。Ｖ４０６がＡ、ＩまたはＬで置換される。Ｑ４０７がＮで置換される。Ｉ４０８がＡ、ＶまたはＬで置換される。Ｈ４０９がＫまたはＲで置換される。Ｅ４１０がＤで置換される。そして／またはＫ４１１がＲまたはＨで置換される。ならびにそのあらゆる組み合わせ。ＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメイン内の他の適切な置換が本発明に含まれ、本明細書の他の場所に記載されている。本発明は、１またはそれ以上のこれらＲＡＴＬ１ｄ６ ＵＢＣドメイン保存的アミノ酸置換ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることも含む。
【０１２７】
生物学的に活性なＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはペプチドを発現するには、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたは機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、すなわち挿入コーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入してよい。
【０１２８】
当業者によく知られている方法を用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列および適切な転写および翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築してよい。これら方法にはｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる。そのような技術はＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ． Ｙ．、およびＦ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ． Ｙ．に記載されている。
【０１２９】
種々の発現ベクター／宿主系をＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列を含み、発現させるために利用してよい。そのような発現ベクター／宿主系には、限定されるものではないが、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌、酵母発現ベクターで形質転換した酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバクロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が含まれる。用いる宿主細胞は本発明を限定しない。
【０１３０】
「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を行う宿主細胞タンパク質と相互作用する該ベクターの非翻訳領域、例えばエンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。そのようなエレメントはその強度や特異性が異なってよい。用いるベクター系および宿主に応じて、構成性および誘導性プロモーターを含むあらゆる多くの適切な転写および翻訳エレメントを用いてよい。例えば、細菌系を用いてクローニングするときは、誘導性プロモーター、例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターを用いてよい。バクロウイルスポリヘドリンプロモーターを昆虫細胞に用いてよい。植物細胞のゲノム（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および保存タンパク質遺伝子）または植物ウイルス（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）由来のプロモーターまたはエンハンサーをベクターにクローンしてよい。哺乳動物細胞系において、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ＲＡＴＬ１ｄ６をコードする配列の複数のコピーを含む細胞系を生成する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適切な選択性マーカーと共に用いてよい。
【０１３１】
細菌系において、発現ＲＡＴＬ１ｄ６産物の用途に応じて多くの発現ベクターを選ぶことができよう。例えば、抗体を誘導するために大量の発現タンパク質が必要な場合は、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指示するベクターを用いてよい。そのようなベクターには、限定されるものではないが、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列をβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよび続く７残基に対する多機能性Ｅ． ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター、例えば配列をインフレームでベクターに連結してハイブリッドタンパク質を生成するＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｌＮベクター（Ｇ． Ｖａｎ ＨｅｅｋｅおよびＳ． Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６４：５５０３−５５０９参照）などが含まれる。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用い、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させてもよい。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次いで遊離グルタチオン存在下で溶出させることにより溶解細胞から容易に精製することができる。そのような系で製造するタンパク質は、目的とするクローンされたポリペプチドをＧＳＴ部分から意のままに放出させることができるようにヘパリン、トロンビン、またはＸＡ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計してよい。
【０１３２】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成性または誘導性プロモーターを含む多くのベクターを用いてよい（例えば、Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、およびＧｒａｎｔら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６−５４４参照）。
【０１３３】
植物発現ベクターが望ましくそれを使用する場合は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列の発現をあらゆる多くのプロモーターにより行ってよい。例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターを単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いてよい（Ｎ． Ｔａｋａｍａｔｓｕ、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３０７−３１１）。あるいはまた、植物プロモーター、例えばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターを用いてよい（Ｇ． Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４、ＥＭＢＯ Ｊ．、３：１６７１−１６８０； Ｒ． Ｂｒｏｇｌｉｅら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８−８４３； およびＪ． Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５−１０５）。これら構築物を直接ＤＮＡ形質転換または病原体介在トランスフェクションにより植物細胞に導入することができる。そのような技術は多くの一般に利用可能な総説に記載されている（例えば、Ｓ． ＨｏｂｂｓまたはＬ． Ｅ． Ｍｕｒｒｙ、Ｉｎ ：ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ． Ｙ．； １９１−１９６頁参照）。
【０１３４】
昆虫系を用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを発現させてよい。例えば、あるそのような系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターに用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅ中で外来遺伝子を発現させる。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列をウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子中にクローンし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置いてよい。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの挿入の成功は、ポリヘドリン遺伝子を不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスを生成するであろう。次に、組換えウイルスを用いて例えば、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド産物を発現させることができるＳ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅを感染させてよい（Ｅ． Ｋ． Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、１９９４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、９１：３２２４−３２２７）。
【０１３５】
哺乳類宿主細胞において、多くのウイルスに基づく発現系を用いてよい。アデノウイルスを発現ベクターに用いる場合は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列を後期プロモーターおよびトリプレットリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結してよい。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域中の挿入を用いて、感染宿主細胞中にＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを発現させることができる生存ウイルスを得てよい（Ｊ． ＬｏｇａｎおよびＴ． Ｓｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー、例えばＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーを用いて哺乳類宿主細胞における発現を増大させることができよう。
【０１３６】
特異的開始シグナルを用いて、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成することもできよう。そのようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適切な発現ベクター中に挿入する場合は更なる転写または翻訳制御シグナルを必要としないかもしれない。しかしながら、コーディング配列またはその断片のみが挿入されている場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを与えるべきである。さらに、全挿入物の翻訳を保証するため開始コドンが正しい読み取り枠にあるべきである。外来翻訳エレメントおよび開始コドンは天然および合成の種々の起源のものであってよい。発現効率は、用いる特定の細胞系に適したエンハンサー、例えば文献に記載のものを含めることにより増強することができよう（Ｄ． Ｓｃｈａｒｆら、１９９４、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．、２０：１２５−１６２）。
【０１３７】
さらに、所望の方法で挿入配列の発現を調節し、または発現タンパク質をプロセシングする能力で宿主細胞株を選んでよい。ポリペプチドのそのような修飾には、限定されるものではないがアセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、およびアシル化が含まれる。該タンパク質の「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングを用いて、正しい挿入、ホールディングおよび／または機能を促がすこともできよう。そのような翻訳後活性に関する特異的細胞機構および特徴的メカニズムを有する種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９から利用可能であり、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証するように選ぶことができよう。
【０１３８】
組換えタンパク質を長期間高収率で産生するには安定な発現が好ましい。例えば、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質を安定に発現する細胞株を、同じまたは別のベクター上にウイルス起源の複製および／または内因性発現エレメントおよび選択性マーカーを含む発現ベクターを用いて形質転換することができよう。該ベクターを導入後、細胞を豊富化細胞培養液で１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に切りかえる。選択性マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在により導入配列をうまく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定な形質転換細胞の耐性クローンは該細胞種に適した組織培養技術を用いて増殖させることができよう。
【０１３９】
あらゆる多くの選択系を用いて形質転換細胞株を回収することができよう。これらには、限定されるものではないが、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞中で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ＴＫ）、（Ｍ． Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７、Ｃｅｌｌ、１１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｉ． Ｌｏｗｙら、１９８０、Ｃｅｌｌ、２２：８１７−２３）遺伝子が含まれる。また、抗代謝物、抗生物質、またはヘルビシド（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ）耐性を選択の基準に用いることができる：例えば、メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｍ． Ｗｉｇｌｅｒら、１９８０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、７７：３５６７−７０）、アミノグリコシド ネオマイシンおよびＧ−４１８耐性を付与するｎｐｔ（Ｆ． Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、１９８１、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１５０：１−１４）、およびそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ耐性を付与するａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ、上記）。さらなる選択性（選択可能な）遺伝子が記載されている：例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンのかわりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤ（Ｓ． Ｃ． ＨａｒｔｍａｎおよびＲ． Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８５：８０４７−５１）。最近、形質転換体を同定するだけでなく特定のベクター系による一時的または安定なタンパク質発現量を定量するのに広く用いられるアントシアニン、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンのようなマーカーを含む、可視的マーカーの使用が普及してきた（Ｃ． Ａ． Ｒｈｏｄｅｓら、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５５：１２１−１３１）。
【０１４０】
マーカー遺伝子発現の存在／欠如は、目的遺伝子の存在も示唆するが、所望の目的遺伝子の存在および発現を確認する必要があろう。例えば、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする核酸配列をマーカー遺伝子配列内に挿入すると、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列を含む組換え細胞をマーカー遺伝子機能の欠如により同定することができる。あるいはまた、マーカー遺伝子を１つのプロモーターの制御下でＲＡＴＬ１ｄ７６ポリペプチドをコードする配列と縦一列（タンデム）に置くことができる。誘導または選択に応じたマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の共発現を示す。
【０１４１】
あるいはまた、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド産物を発現する宿主細胞は、当業者に知られた種々の方法により同定することができよう。これら方法には、限定されるものではないが、核酸またはタンパク質を検出および／または定量するための膜、溶液、またはチップに基づく技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、およびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が含まれる。
【０１４２】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分または断片またはプローブを用いる増幅、もしくはＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションにより検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイには、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む形質転換体を検出することが含まれる。
【０１４３】
種々の標識およびコンジュゲーション技術が知られ、当業者に用いられており、種々の核酸およびアミノ酸アッセイに用いることができよう。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブの製造方法には、標識ヌクレオチドを用いるオリゴ−標識、ニックトランスレーション、末端標識またはＰＣＲ増幅が含まれる。あるいはまた、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはそのあらゆる部分または断片をコードする配列をｍＲＮＡプローブを作製するためのベクター中にクローンすることができる。そのようなベクターは当該分野で知られており、市販されており、これを用いて適切なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３またはＳＰ（６）および標識ヌクレオチドを加えてｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成することができよう。これらの方法は種々の市販キットを用いて行うことができよう（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ ａｎｄ Ｕ． Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）。用いてよい適切なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学ルミネッセント物質または色素産生物質、および基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子などが含まれる。
【０１４４】
ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培養から該タンパク質を発現および回収するのに適した条件下で培養してよい。組換え細胞が産生する該タンパク質は、用いる配列および／またはベクターに応じて分泌され、または細胞内に含まれていてよい。当業者が理解するであろうように、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核性または真核性細胞膜を通してＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質を分泌させるシグナル配列を含むように設計することができよう。他の構築物を用いてＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質をコードする核酸配列を可溶性タンパク質の精製を促がすポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列と連結してよい。そのような精製を促がすドメインには、限定されるものではないが、金属キレートペプチド、例えば固定化金属を用いる精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリンを用いる精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製系に用いるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）が含まれる。開裂可能なリンカー配列、例えばＸＡ因子またはエンテロキナーゼに特異的なもの（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を精製ドメインとＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質の間に含めることにより、精製を促がすことができよう。あるそのような発現ベクターは、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６ヒスチジン残基をコードする核酸およびＲＡＴＬ１ｄ６を含む融合タンパク質を発現させるために提供される。ヒスチジン残基は、Ｊ． Ｐｏｒａｔｈら、１９９２、Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆ．、３：２６３−２８１に記載のＩＭＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）を用いる精製を促すが、エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からの精製手段をもたらす。融合タンパク質生成に適したベクターに関する考察についてはＤ． Ｊ． Ｋｒｏｌｌら、１９９３； ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２：４４１−４５３参照。
【０１４５】
組換え生成に加え、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの断片を固相技術を用いる直接ペプチド合成により生成することができよう（Ｊ． Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５４）。タンパク質合成は手動技術または自動操作により行ってよい。自動合成は、例えばＡＢＩ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて達成することができよう。種々のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド断片を別々に化学合成し、次いで化学的方法を用いて結合し、完全長分子を生成することができる。
【０１４６】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いてプラスミドベクター中に含まれ、発現させることができるものより大きなＤＮＡ断片を供給することができよう。ＨＡＣは、１０Ｋ〜１０ＭのＤＮＡ配列を含み、安定な有糸分裂染色体の分離と維持に必要なすべてのエレメントを含んでいてよい直線ミクロ染色体である（Ｊ． Ｊ． Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１５：３４５−３５５参照）。６〜１ＯＭのＨＡＣは、治療目的の常套的送達法（例えば、リポソーム、リポカチオンアミノポリマーまたは小胞）により構築され、送達される。
【０１４７】
該タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの発現を検出および測定するための種々のプロトコールが知られており、当該分野で実施されている。例には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド上の２つの非干渉エピトープと反応するモノクローナル抗体を利用する２部位、モノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを用いてもよい。これらおよび他のアッセイは、Ｒ． Ｈａｍｐｔｏｎら、１９９０； Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｔ Ｐａｕｌ、ＭＮ、およびＤ． Ｅ． Ｍａｄｄｏｘら、１９８３； Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１５８：１２１１−１２１６の刊行物に記載されているように当該分野で知られている。
【０１４８】
貫膜ドメイン領域
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドは、１つが配列番号２の約アミノ酸６９〜約アミノ酸８８に位置し、他方が約アミノ酸３３４〜約アミノ酸３５６に位置する２つの貫膜ドメインを含むことが確定された。これに関連して、用語「約」は、上記貫膜ドメインポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端を１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸越えることを意味すると解釈することができる。ＴＭＰＲＥＤプログラムを貫膜の予測に用いた （Ｋ ＨｏｆｍａｎｎおよびＷ Ｓｔｏｆｆｅｌ、１９９３、Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、３４７：１６６）。
【０１４９】
好ましい態様において、下記貫膜ドメインポリペプチドが本発明に含まれる：
【化６】
2004512836.tif 000007
このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明には、ＲＡＴＬ１ｄ６貫膜ドメインポリペプチドを免疫原性および／または抗原性エピトープ、または本明細書の別の箇所に記載しているようなエピトープの供給源として用いることも含まれる。
【０１５０】
好ましい態様において、下記Ｎ末端ＲＡＴＬ１ｄ６インター貫膜ドメイン欠失ポリペプチドが本発明に含まれる：配列番号２の、
【化７】
2004512836.tif 000008
【０１５１】
【化８】
2004512836.tif 000009
【０１５２】
これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。本発明には、これらＮ末端ＲＡＴＬ１ｄ６インター貫膜ドメイン欠失ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることも含まれる。
【０１５３】
他の好ましい態様において、下記Ｃ末端ＲＡＴＬ１ｄ６インター貫膜ドメイン欠失ポリペプチドが本発明に含まれる：配列番号２の、
【化９】
2004512836.tif 000010
【０１５４】
【化１０】
2004512836.tif 000011
【０１５５】
これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。本発明には、これらＣ末端ＲＡＴＬ１ｄ６インター貫膜ドメイン欠失ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることも含まれる。
【０１５６】
治療薬
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドは、既知のユビキチン結合酵素との相同性を有するので、ＵＢＣタンパク質ファミリーの新しいメンバーとして提供される。ＲＡＴＬ１ｄ６は、活性化Ｔリンパ球中に発現し、それから単離されたので、ＲＡＴＬ１ｄ６生成物は、例えば細胞周期調節および／または細胞シグナリングにおける免疫障害、例えばリンパ増殖性疾患に役割を果たすかもしれない。他のユビキチン結合酵素ファミリーメンバーと同様にして、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質はさらに、さらに以下に記載の細胞周期および細胞シグナリング活性にも関連し得る新生物、発育、および神経障害に関連するかもしれない。特にリンパ増殖性疾患および炎症に関して、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質のインヒビターはリンパ球様細胞が細胞周期に入るのを抑制し、または細胞内シグナリング事象をブロックすることにより免疫抑制剤として役割を果たすかもしれない。さらに、ＲＡＴＬ１ｄ６インヒビターは抗炎症剤として役立つかもしれない。
【０１５７】
腫瘍サプレッサータンパク質、例えばｐ５３のＥ２酵素による分解は、新生物障害の発生に関与するかもしれない。したがって、本発明のある態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのアンタゴニストまたはインヒビターを個体に投与し、新生物障害を予防または治療することができよう。そのような障害には、限定されるものではないが、アデノカルチノーマ、白血病、リンパ肉腫、メラノーマ、肉腫、および奇形癌、特に副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚部、膀胱、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、ペニス、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。上記起源の癌または腫瘍において、ユビキチン化のブロッキングは、半減期、すなわちｐ５３の機能を持続させるかもしれない。関連する局面において、ＲＡＴＬ１ｄ６と特異的に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接に、またはＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを発現する細胞または組織に医薬物質を運ぶ標的化または送達メカニズムとして間接的に用いてよい。
【０１５８】
関連する態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６機能のインヒビターは、ヒト乳癌で高頻度で突然変異することがわかっている腫瘍感受性遺伝子ＴＳＧ１０１と同様にして、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質生成物のようなＵＢＣに負の優性形質（ｄｏｍｉｎａｎｔ）として機能することにより免疫抑制薬として、または特にリンパ増殖性疾患の治療に抗癌薬または剤として有用かもしれない（Ｃ． Ｐ． Ｐｏｎｔｉｎｇら、１９９７、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．、７５：４６７−４６９； Ｌ． Ｌｉら、１９９７、Ｃｅｌｌ、８８ ：１４３−１５４）。ＴＳＧ１０１は、ユビキチン結合酵素と相同性を有するが通常Ｅ２タンパク質に存在し、酵素機能に必要な保存されたシステインを欠く生成物をコードする腫瘍抑制遺伝子とみなされている（Ｃ． Ｐ． Ｐｏｎｔｉｎｇら、上記）。ＴＳＧ１０１は、短命なタンパク質のユビキチン化において優性の負の調節因子として機能することも報告されている （Ｃ． Ｐ． Ｐｏｎｔｉｎｇら、上記、およびＥ． Ｖ． ＫｏｏｎｉｎおよびＲ． Ａ． Ａｂａｇｙａｎ、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：３３０−３３１）。したがって、本発明のＲＡＴＬ１ｄ６のようなある種のＵＢＣのアンタゴニストもＴＳＧ１０１生成物のそれと同様に作用し、Ｔ細胞およびＢ細胞リンパ増殖性障害を含む癌の治療に、および／または有害な免疫系の応答を抑制する物質として有用かもしれない。
【０１５９】
ＲＡＴＬ１ｄ６が固有免疫の鍵となる重要な経路であるＮＦ−κＢ経路に負の役割を果たすことは、この遺伝子産物のアンタゴニストが固有免疫を活性化するかもしれないことを示唆する。固有免疫は細菌、真菌、ウイルスなどを含む微生物病原体に対する防御の最前線である。固有免疫を担う免疫系の細胞は主としてマクロファージ／単球、および範囲が限られるが好中球である。理論に束縛されることを望まないが、ＲＡＴＬ１ｄ６のアンタゴニストは固有の免疫応答を増強し、ヒトに病原体が侵入するのを防御し得ると考えられる。反対に、ＲＡＴＬ１ｄ６のアゴニストは、ＮＦ−κＢ経路を阻害し、炎症反応を弱めると期待される。したがって、ＲＡＴＬ１ｄ６のアゴニストは、リューマチ性関節炎、喘息、多発性硬化症、骨関節症などを含む炎症性疾患の治療に有用かもしれない。
【０１６０】
ＲＡＴＬ１ｄ６はＴ細胞ライブラリー中に同定されたので、このことは該遺伝子産物も適応免疫応答の調節に役割を果たすかもしれないことを示唆する。適応免疫応答は主としてＴ細胞によって取りつがれ、外来抗原および自己免疫疾患の場合は天然抗原のプロセシングおよび表示を必要とする。Ｔ細胞性反応はワクチン接種後の免疫の発現、および腫瘍細胞の排除に重要である。すなわち、ＲＡＴＬ１ｄ６のアンタゴニストはワクチン接種後のヒトの免疫を増強するかもしれないと予測されよう。ＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子または遺伝子産物も腫瘍に対する免疫応答を増強するかもしれない。反対に、この遺伝子のアゴニストはＴ細胞性自己免疫疾患、例えばリューマチ性関節炎、多発性硬化症、乾癬などの治療に有用かもしれない。
【０１６１】
ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質またはその機能的部分は、免疫抑制が必要な患者、好ましくはヒトの免疫応答を抑制する方法に用いることができる。例えば、アンタゴニストまたはアゴニストは、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質またはその部分の活性を調節する有効量を患者に投与することにより免疫抑制効果を生じさせることができる。ＲＡＴＬ１ｄ６活性のアゴニストまたはアクチベーターの場合、細胞レセプター、好ましくはＴ細胞レセプター、またはその成分もしくは相互作用成分のユビキチン化、次いで該レセプター活性の下方調節により免疫抑制を生じさせることができよう。
【０１６２】
ＵＣＳの酵素による神経タンパク質（ＡＰ）のプロセシングの異常は神経障害の原因となるかもしれない。ＵＣＳは神経組織にみいだされるので、ＵＣＳ依存性タンパク質分解に関与するタンパク質ファミリーのメンバーであるらしいＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドは、例えばＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのアンタゴニストにより影響を受けるかもしれない。したがって、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドアンタゴニストを対象に投与して神経障害を予防または治療することができよう。そのような障害には、限定されるものではないが、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、双極性障害、緊張型分裂病、脳新生物、痴呆、鬱病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジア、ジストニー、てんかん、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、パーキンソン病、偏執性精神病、精神分裂病、およびトゥーレット病が含まれよう。
【０１６３】
本発明の好ましい態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのアンタゴニストまたは阻害物質を個体に投与し、免疫障害または免疫関連障害を予防または治療することができよう。そのような障害には、限定されるものではないが、エイズ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレブス病、好酸球増多症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心嚢の炎症、変形性関節症、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、および自己免疫性甲状腺炎；血液透析、体外循環、癌の合併症； ウイルス、細菌、真菌、寄生虫（ｐａｒａｓｉｔｉｃ）、原性動物、および寄生虫（ｈｅｌｍｉｎｔｈｉｃ）感染、および外傷が含まれる。ＲＡＴＬ１ｄ６インヒビターまたはアンタゴニストを用いて例えば充実性臓器または骨髄移植における移植片拒絶を抑制し、または骨髄移植後の移植片対宿主疾患を抑制することができよう。
【０１６４】
本発明の別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのアンタゴニストをそれを必要とする個体に投与して発育障害を予防または治療することができよう。そのような障害には、限定されるものではないが、尿細管性アシドーシス、クッシング諸侯群、骨発育不全性小人症、デュシェーヌおよびベッカー筋ジストロフィー、性器発育異常症、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、遺伝性ニューロパシー、例えばシャルコー・マリー・ツース病、および神経線維腫症、甲状腺機能低下症、水頭症、発作性障害、例えばＳｙｎｄｅｎｈａｍコレラおよび脳性小児麻痺、脊椎披裂、および先天性緑内障、白内障、または感音難聴が含まれる。
【０１６５】
本発明の別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補物を含む発現ベクターを個体に投与し、限定されるものではないが上記タイプの癌および腫瘍を含む新生物障害を治療または予防することができよう。
【０１６６】
本発明の別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補物を含む発現ベクターを個体に投与し、限定されるものではないが上記タイプの障害を含む神経障害を治療または予防することができよう。
【０１６７】
本発明のさらに別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補物を含む発現ベクターを個体に投与し、限定されるものではないが上記タイプの免疫障害を含む免疫障害を治療または予防することができよう。
【０１６８】
本発明のさらなる態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補物を含む発現ベクターを個体に投与し、限定されるものではないが上記タイプの障害を含む発育障害を治療または予防することができよう。
【０１６９】
別の態様において、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的配列またはベクターを他の適切な治療薬と組み合わせて投与することができる。併用療法に用いるのに適した物質の選択は、常套的医薬的原則にしたがって当業者が行うことができよう。治療薬の組み合わせは、上記種々の障害の治療または予防に相乗的に作用するかもしれない。このアプローチを用い、より低用量の各薬剤で、すなわち副作用の潜在性を減少させて治療効果を達成することができよう。
【０１７０】
本発明のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのアンタゴニストまたはインヒビターは、当該分野で一般に知られた方法を用いて製造することができよう。特に、精製ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質またはその断片を用いて抗体を製造し、または例えば当該分野で知られ、実施されている高処理能力のスクリーニング技術により医薬物質のライブラリーをスクリーニングし、ＲＡＴＬ１ｄ６と特異的に結合するものを同定することができる。
【０１７１】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその免疫原性ペプチド断片に特異的な抗体は、当該分野で長く知られ、常套的に実施されている方法を用いて製造することができる。そのような抗体には、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーにより製造される断片が含まれてよい。中和抗体（すなわち、二量体形成を阻害するもの）は治療的使用に特に好ましい。ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗ＲＡＴＬ１ｄ６抗体産生には、完全長ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを免疫原として用いることができるか、または完全長ポリペプチドの部分を用いることができる。好ましくは、免疫原として用いるＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの部分には、該タンパク質のＵＢＣ（例えば残基２４６−４２２）または非ＵＢＣ（例えば残基１−２４５）ドメインのようなドメインが含まれる。
【０１７２】
抗体を製造するには、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、ヒトその他を含む種々の宿主を、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたは免疫原性特性を有するそのあらゆる断片またはオリゴペプチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を増大させることができよう。適切なアジュバントの非限定的例には、フロインド（完全または不完全）、ＲＩＢＩ、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウムまたはシリカ、および表面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ＫＬＨ、およびジニトロフェノールが含まれる。ヒトで通常用いられるアジュバントにはＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍｎが含まれる。
【０１７３】
好ましくは、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドに対する抗体を誘導するのに用いるペプチドｓ、断片またはオリゴペプチド（すなわち免疫原）は、少なくとも５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも７−１０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。免疫原が天然タンパク質のアミノ酸配列の部分と同じであることも好ましく、小天然分子の完全アミノ酸配列を含んでいてもよい。ペプチド、断片またはオリゴペプチドは、単一エピトープまたは抗原性決定基、または複数のエピトープを含んでいてよい。ＲＡＴＬ１ｄ６アミノ酸の短ストレッチを別のタンパク質、例えばＫＬＨのそれと融合または共有結合させてよく、抗体は該キメラ分子に対して産生される。
【０１７４】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその免疫原性断片に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株により抗体分子を産生するためのあらゆる技術を用いて製造することができよう。これらには、限定されるものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれる（Ｇ． Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７； Ｄ． Ｋｏｚｂｏｒら、１９８５、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、８１：３１−４２； Ｒ． Ｊ． Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８０：２０２６−２０３０； およびＳ． Ｐ． Ｃｏｌｅら、１９８４、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、６２：１０９−１２０）。モノクローナル抗体の製造は当該分野でよく知られ、日常的に用いられている。
【０１７５】
さらに、「キメラ抗体」を製造するために開発された技術である適切な抗原特異性と生物活性を有する分子を含ませるためのヒト抗体遺伝子に対するマウス抗体遺伝子のスプライシングも用いることができる（Ｓ． Ｌ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５； Ｍ． Ｓ． Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４−６０８； およびＳ． Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２−４５４）。あるいはまた、１本鎖抗体の製造するために記載された技術を、当該分野で知られた方法を用いて適応させ、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド特異的１本鎖抗体を製造してよい。関連特異性を有するがイデオタイプ組成が異なる抗体を、ランダムコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーのチェーンシャッフリングにより生成してよい（Ｄ． Ｒ． Ｂｕｒｔｏｎ、１９９１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８：１１１２０−３）。リンパ球ポピュレーションを用いるｉｎ ｖｉｖｏ生成を誘導し、または組換え免疫グロブリンライブラリーまたは文献に開示の特異性の高い結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより抗体を製造してもよい（Ｒ． Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６：３８３３−３８３７、およびＧ． Ｗｉｎｔｅｒら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３−２９９）。
【０１７６】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドに対する特異的結合部位を含む抗体断片を生成してもよい。例えば、そのような断片には、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるＦａｂ断片が含まれる。あるいはまた、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片を速やかで容易に同定することができよう（Ｗ． Ｄ． Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４．１２７５−１２８１）。
【０１７７】
種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するスクリーニングに用いることができる。確立された特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いる競合結合または免疫放射アッセイ用の多くのプロトコールが当該分野でよく知られている。そのようなイムノアッセイは、典型的にはＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドとその特異抗体の間の複合体形成を測定することを含む。２つの非干渉ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドエピトープと反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを用いてもよい （Ｍａｄｄｏｘ、上記）。
【０１７８】
本発明のある態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのあらゆる断片または相補物を治療目的に用いることができよう。ある局面において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスを、少なくともある場合にｍＲＮＡの変性によりｍＲＮＡの翻訳をブロックするのが望ましい状況で用いてよい。特に、細胞をＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換してよい。すなわち、相補的分子を用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドおよびポリペプチド活性を調節し、または遺伝子機能の制御を達成することができよう。そのような技術は現在当該分野でよく知られており、センスまたはアンチセンスオリゴマーまたはオリゴヌクレオチド、またはより大きな断片をＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコーディングまたは制御領域に沿った種々の位置から設計することができる。
【０１７９】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルス由来、または種々の細菌プラスミド由来の発現ベクターを用いて、標的器官、組織または細胞ポピュレーションにヌクレオチド配列を送達することができよう。当業者によく知られた方法を用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする核酸配列と相補的な核酸配列を発現する組換えベクターを構築することができる。これら技術はＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、およびＦ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら、上記に記載されている。
【０１８０】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする遺伝子は、細胞または組織を、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルに発現する発現ベクターで形質転換することにより生成することができる。そのような構築物を用いて非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔａｂｌｅ）センスまたはアンチセンス配列を細胞に導入してよい。該ＤＮＡ中への統合がなくても、そのようなベクターは内在性ヌクレアーゼにより不能になるまでＲＮＡ分子を転写し続けることができよう。一時的発現は、非複製ベクターを用いて１月またはそれ以上、また、適切な複製エレメントが該ベクター系の部分に設計されている場合はそれ以上持続することができよう。
【０１８１】
遺伝子発現の修飾は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする遺伝子の制御、５’または調節領域（例えば、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、およびイントロン）に対するアンチセンス分子または相補的核酸配列 （ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計することにより得ることができる。、例えば出発部位から−１０〜＋１０位の転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重ラセン」塩基対化方法論を用いて阻害を達成することができる。三重ラセンペアリングはポリメラーゼ、転写因子または制御分子を結合するために二本鎖が十分開く能力を阻害するので有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療的進歩が記載されている（例えば、Ｊ． Ｅ． Ｇｅｅら、１９９４、Ｂ． Ｅ． ＨｕｂｅｒおよびＢ． Ｉ． Ｃａｒｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ、Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ、ＮＹ、中、参照）。転写物がリボソームに結合するのを抑制し、または転写物の分解を生じることによりｍＲＮＡの翻訳をブロックするように該アンチセンス分子または相補的配列を設計してもよい。
【０１８２】
リボザイム、すなわち酵素的ＲＮＡ分子を用いて、ＲＮＡの特異的開裂を触媒してもよい。リボザイムの作用メカニズムには、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いで内ヌクレオチド結合分解性の開裂が含まれる。適切な例には、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の開裂を特異的および効率的に触媒する操作したハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が含まれる。
【０１８３】
あらゆる潜在的ＲＮＡ標的中の特異的リボザイム開裂部位を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム開裂部位について標的分子を検査することにより最初に同定する。同定したら、該開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短ＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを操作不能にし得る第２の構造的特徴について評価してよい。候補標的の適性を、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いる相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近可能性を試験することにより評価してもよい。
【０１８４】
本発明の相補的リボ核酸分子およびリボザイムは、核酸分子を合成するための当該分野で知られたあらゆる方法により製造することができよう。そのような方法には、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成が含まれる。あるいはまた、ＲＮＡ分子はＲＡＴＬ１ｄ６をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写により生成することができよう。そのようなＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７またはＳＰを含む種々のベクターに組みこむことができよう。あるいはまた、相補的ＲＮＡを構成性または誘導性に合成するｃＤＮＡ構築物を細胞株、細胞、または組織中に導入することができる。
【０１８５】
ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性および半減期を増大させることができよう。可能な修飾には、限定されるものではないが、該分子の５’および／または３’末端にフランキング配列を付加し、または該分子のバックボーン内にホスホジエステラーゼ結合でなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチル結合を用いることが含まれる。この概念はＰＮＡの製造に固有であり、内因性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されない非伝統的塩基、例えばイノシン、クエオシン、およびウィブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、および同様の修飾形を含めることによりこれら分子のすべてに広げることができる。
【０１８６】
細胞または組織中にベクターを導入する多くの方法が利用でき、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏで使用するのに同等に適している。ｅｘ ｖｉｖｏ療法では、ベクターを患者から得た幹細胞に導入し、クローン的に増殖させ、同じ患者に自己移植する。当該分野でよく知られた方法を用い、トランスフェクションおよびリポソーム注射により送達を達成することができよう。
【０１８７】
あらゆる上記治療方法を、例えば、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、乳牛、ウマ、ウサギ、サルを含むそのような療法を必要とするあらゆる個体、最も好ましくはヒトに適用することができよう。
【０１８８】
本発明のさらなる態様には、あらゆる上記治療的使用および治療効果を得るために医薬組成物を医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて投与することが含まれる。そのような医薬組成物は、ＲＡＴＬ１ｄ６核酸、ポリペプチド、またはペプチド、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドに対する抗体、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの模倣物、アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを含んでよい。該組成物は、単独で、または限定されるものではないが生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水を含むあらゆる無菌の生体適合性の医薬的担体を用いて投与することができる少なくとも１つの他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与することができよう。該組成物は、単独で、または他の物質、薬剤、ホルモン、または生物反応修飾物質と組み合わせて投与することができよう。
【０１８９】
本発明に用いる医薬組成物は、限定されるものではないが経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、鞘内（くも膜下）、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、膣内、または直腸法を含むあらゆる多くの経路により投与することができる。
【０１９０】
活性成分（すなわち、ＲＡＴＬ１ｄ６核酸またはポリペプチド、またはその機能的断片）に加え、医薬組成物は、活性化合物を医薬的に用いることができる製剤に加工するのを促進する補助物質を含む適切な医薬的に許容される担体または賦形剤を含んでよい。製剤化と投与に関する技術に関するさらなる詳細はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）に記載されている。
【０１９１】
経口投与用の医薬組成物は、当該分野でよく知られた医薬的に許容される担体を用いて経口投与に適した用量に製剤化することができる。そのような担体は、医薬組成物を患者が摂取するための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、サスペンジョン剤などとして製剤化するのを可能にする。
【０１９２】
経口用途の医薬製剤は、活性化合物と固体賦形剤を混合し、得られた混合物を所望により粉砕し、所望により適切な補助物質を添加した後、顆粒の混合物を加工して錠剤または糖衣錠のコアを得ることにより得ることができる。適切な賦形剤には、炭水化物やタンパク質充填剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニトール、またソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；セルロール、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロース；アラビアおよびトラガカントを含むゴム；およびタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンがある。所望により、崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギニン酸、またはその医薬的に許容される塩、例えばアルギン酸ナトリウムを加えてよい。
【０１９３】
糖衣錠のコアは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい、濃縮糖溶液のような生理学的に適したコーティングと一緒に用いることができよう。製品の種類を確認し、または活性化合物の量、すなわち用量を特徴付けるために、染料または色素を錠剤または糖衣錠コーティングに加えてよい。
【０１９４】
経口的に用いることができる医薬製剤には、ゼラチン製プッシュフィットカプセル、およびゼラチン製軟うろこ状（ｓｃａｌｅｄ）カプセル、およびコーティング、例えばグリセロールまたはソルビトールが含まれる。プッシュフィットカプセルは、充填剤または結合剤、例えば乳糖またはデンプン、潤滑剤、例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および所望により安定化剤と混合した活性成分を含むことができる。軟カプセルにおいて、活性化合物は、安定化剤を含むか含まない、適切な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁してよい。
【０１９５】
非経口投与に適した医薬製剤は、液体溶液、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的緩衝生理食塩水を用いて製剤化してよい。水性注射用サスペンジョンは、サスペンジョンの粘性を増加させる物質、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランを含んでいてよい。さらに、活性化合物のサスペンジョンは適切な油状注射用サスペンジョンとして製造してよい。適切な脂溶性溶媒またはビークルには脂肪油、例えばごま油、合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエート、またはトリグリセリドまたはリポソームが含まれる。所望により、サスペンジョンは、適切な安定化剤または高度に濃縮された溶液の製造を可能にする化合物の可溶性を増大させる物質を含んでいてよい。
【０１９６】
局所または鼻内投与用には、浸透すべき特定のバリアーに適した浸透剤または浸透物質を製剤に用いる。そのような浸透剤は一般に当該分野で知られている。
【０１９７】
本発明の医薬組成物は、当該分野で知られた方法、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣錠化、糊状化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、取込み（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）、または凍結乾燥法により製造することができよう。
【０１９８】
医薬組成物は塩として提供してよく、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などを含む多くの酸を用いて形成することができる。塩は対応する遊離塩基形よりも水性溶媒または他のプロトン性溶媒に対して可溶性であるという傾向がある。他の場合において、好ましい製剤は、以下の、１−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％ショ糖、および２−７％マンニトール（ｐＨ範囲、４．５〜５．５）のすべてまたはあらゆるものを含んでいてよい凍結乾燥粉末（使用前に緩衝液と混合）であってよい。医薬組成物を製造した後、それを適切な容器に入れ、示した病状を治療するためのラベルを貼ることができる。ＲＡＴＬ１ｄ６製品を投与するにはそのようなラベルには、投与量、投与頻度、および投与方法が含まれよう。
【０１９９】
本発明に用いるのに適した医薬組成物には、活性成分が意図する目的を達成するための有効量で含まれる組成物が含まれる。有効用量または有効量の決定は十分当業者の能力の範囲内である。あらゆる化合物について、治療的有効量は、例えば新生物細胞を用いる細胞培養アッセイ、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタを用いて最初に推定することができる。動物モデルを用いて適切な濃度範囲と投与経路を決定することもできよう。次に、そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量と投与経路を決定するために外挿することができる。
【０２００】
治療的有効用量は、有効成分、例えば、症状または病状を改善し、軽減し、または排除するＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその断片、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドに対する抗体、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの該量を表す。治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物を用いる標準的な医薬的方法、例えばＥＤ５０（ポピュレーションの５０％に対して治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（ポピュレーションの５０％に対して致死的な用量）により決定することができよう。毒性に対する治療効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。治療指数の大きな医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを用いてヒトで使用する用量範囲を決定する。医薬組成物に含まれる好ましい用量は、毒性がほとんどまたはまったくないＥＤ５０を含む血中（循環）濃度の範囲内である。用量は、用いる剤形、患者の感受性および投与経路に応じてこの範囲内で変化する。
【０２０１】
正確な用量は、治療を要する個体に関連する因子を考慮して担当医師が決定するであろう。用量および投与は活性成分を十分なレベルとするか、または所望の効果を維持するにように調整される。考慮する因子には、個々の疾患の状態の重症度、患者の一般的健康状態、患者の年齢、体重、および性別、食事、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対するトレランス／反応が含まれる。一般的指針として、長時間作用性（持続性）医薬組成物を、医薬製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて３〜４日毎、１週間毎、または２週間毎に一度投与することができよう。
【０２０２】
正常投与量は、投与経路に応じて０．１〜１００，０００マイクログラム（μｇ）、総用量約１グラム（ｇ）までで変化してよい。特定用量および送達法に関する指針は、文献に示されており、当業者が一般に利用可能である。当業者はヌクレオチド用にタンパク質またはそのインヒビター用とは異なる製剤を用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドやポリペプチドの送達は、特定の細胞、病状、位置などに特異的であろう。
【０２０３】
本発明の別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと特異的に結合する抗体は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現（または過剰発現）を特徴とする病状または疾患の診断、またはＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドもしくはそのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターで治療している患者をモニターするアッセイに用いることができよう。診断目的に有用な抗体は、治療的方法に用いるための上記方法と同様にして製造することができよう。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの診断的アッセイには、ヒトの体液または細胞もしくは組織抽出物中の該タンパク質を検出するために抗体および標識を用いる方法が含まれる。該抗体は修飾するかまたは修飾せずに用いてよく、レポーター分子と共有結合または非共有結合により標識してよい。当該分野で知られている種々のレポーター分子（そのいくつかは先に記載）を用いてよい。
【０２０４】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよびＦＡＣＳを含むいくつかのアッセイプロトコールが当該分野で知られており、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの変化したもしくは異常な発現レベルを診断するための基準を提供する。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド発現の正常値または標準値は、正常哺乳動物対象、好ましくはヒトから得た体液または細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドに対する抗体と混合することにより確立される。標準的複合体形成量は、種々の方法により定量してよいが、光度測定法が好ましい。生検組織由来の対象試料、コントロール試料、および疾患試料に発現したＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値と対象値の偏差が疾患を診断するためのパラメーターとなる。
【０２０５】
本発明の別の態様によれば、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを診断の目的で用いてよい。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、およびＰＮＡが含まれる。該ポリヌクレオチドを用いて、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドの発現（または発現不足もしくは過剰発現）が疾患と関連しているかもしれない生検組織中のＲＡＴＬ１ｄ６をコードする核酸の発現を検出および定量することができよう。例えば、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドおよびその断片を用いて、例えば標識ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをプローブに用い、当該分野で知られ実施されている技術を用いて予後診断、診断、またはモニターの目的で、正常および疾患両組織においてｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施することができよう。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドは、放射性標識、または当該分野で知られた他の手段、例えば酵素、蛍光、化学ルミネッセンス、またはビオチン−アビジン系により標識することができよう。診断的アッセイを用いてＲＡＴＬ１ｄ６の欠如、存在、および過剰発現を区別し、治療的処置または介入時のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドレベルの調節をモニターすることができよう。
【０２０６】
関連する局面において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたは密接に関連した分子をコードするゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブとのハイブリダイゼーションを用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする核酸配列を同定することができよう。高度に特異的な領域、例えば５’制御領域、または特異性の低い領域、例えば特に３’コーディング領域の約８〜１０連続ヌクレオチドから作製されたか否かに関わらず該プローブの特異性、およびハイブリダイゼーションまたは増幅のストリンジェンシー（最大、高、中程度、または低）は、該プローブがＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする天然配列、そのアレル、または関連配列のみを同定するかどうかを決定するであろう。
【０２０７】
プローブは、関連配列を検出するのに用いてよく、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする少なくとも５０％のヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、配列番号１のヌクレオチド配列、または天然ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質のイントロン、プロモーター、およびエンハンサーエレメントを含むゲノム配列由来であってよい。
【０２０８】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするＤＮＡのための特異的ハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはＲＡＴＬ１ｄ６誘導体をコードする核酸配列をｍＲＮＡプローブ作製用のベクター中にクローニングすることが含まれる。そのようなベクターは、当該分野で知られており、市販されており、これを用い、適切なＲＮＡポリメラーゼと適切な標識ヌクレオチドを加えることによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成することができよう。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のディテクター／レポーター基、例えば放射性核種、例えば３２Ｐまたは３５Ｓ、または例えばアルカリホスファターゼをアビジン／ビオチンカップリング系などを介して該プローブとカップリングさせる酵素標識により標識することができよう。
【０２０９】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を用いてＲＡＴＬ１ｄ６の発現と関連する障害を診断することができよう。そのような障害または病状の例は、上記「治療薬」に記載している。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、サザンまたはノーザン分析、ドットブロット、または他の膜ベース技術、ＰＣＲ技術、または例えばＲＡＴＬ１ｄ６のレベルまたは過剰発現の状態を検出し、またはＲＡＴＬ１ｄ６発現の変化を検出するための患者の生検から得た組織または液体を利用するディップスティック、ピン、ＥＬＩＳＡまたはチップアッセイに用いることができよう。そのような定性または定量法は当該分野でよく知られている。
【０２１０】
特定の局面において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、種々の新生物または癌、特に上記のものの活性化または誘導を検出するアッセイに有用かもしれない。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を標準的方法により標識し、ハイブリダイゼーション複合体を形成するのに適した条件下で患者由来の液体または組織試料に加えてよい。適切なインキュベーション時間後、試料を洗浄し、信号を定量し、標準値と比較する。生検または抽出試料中の信号の量が同等のコントロール試料のそれと有意に異なる場合は、該ヌクレオチド配列は試料中に存在するヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、試料中のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のレベル変化の存在は関連疾患の存在を示す。そのようなアッセイを用いて、動物試験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニターにおいて特定の治療的処置法の効果を評価することもできよう。
【０２１１】
ＲＡＴＬ１ｄ６の発現と関連した疾患の診断基準を得るために、正常または標準的発現プロフィールを確立する。これは動物またはヒトの正常対象から得た体液または細胞抽出物を、ハイブリダイゼーションまたは増幅に適した条件下でＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする配列またはその断片と混合することにより達成することができよう。標準的ハイブリダイゼーションは、正常対象から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを用いた実験から得た値と比較することにより定量することができよう。正常試料から得た標準値を疾患の症状がある患者由来の試料から得た値と比較してよい。標準値と対象（患者）の値の間の偏差を用いて疾患の存在を証明する。
【０２１２】
疾患が証明され、治療プロトコールが開始されたら、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に反復し、患者における発現レベルが正常な個体で観察されるものに近づき始めるかを評価することができよう。連続アッセイから得た結果を用いて数日間〜数ヶ月間の範囲の期間にわたり治療効果を示すことができよう。
【０２１３】
癌に関して、個体からの生検組織中の異常な転写量の存在は疾患の発現傾向を示し、または実際の臨床症状の発現前に疾患を検出する手段を提供することができよう。この種のより明確な診断により、医療専門家はより早期に予防的処置や積極的治療を用いることができ、癌の発現またはさらなる進行を予防することができよう。
【０２１４】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする核酸配列から設計したオリゴヌクレオチドのさらなる診断的使用にはＰＣＲの使用が含まれてよい。そのようなオリゴマーは化学的に合成し、酵素的に生成し、または組換え供給源から生成することができよう。オリゴマーは、好ましくは２つのヌクレオチド配列、センス方向 （５’→ ３’）のものとアンチセンス（３’→５’）のものを含み、これを特異的遺伝子または条件を確認するための最適条件下で用いる。同じ２つのオリゴマー、ネスト化オリゴマーセット、またはオリゴマーの縮重プールは、密接に関連したＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出および／または定量するためにより低ストリンジェント条件下で使用することができよう。
【０２１５】
ＲＡＴＬ１ｄ６の発現を定量するのに適した方法には、放射性標識またはビオチン化ヌクレオチド、調節核酸の共増幅、および実験結果を外挿するための標準曲線が含まれる（Ｐ． Ｃ． Ｍｅｌｂｙら、１９９３、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５９：２３５−２４４、およびＣ． Ｄｕｐｌａａら、１９９３、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２９−２３６）。複数試料の定量スピードは、目的とするオリゴマーが種々の希釈で存在し、分光光度法または比色法による反応により急速な定量をもたらすＥＬＩＳＡ形式でアッセイを行うことにより加速することができよう。
【０２１６】
本発明の別の態様において、本明細書に記載のＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片をマイクロアレーにおける標的として用いることができよう。マイクロアレーを用いて、同時に多数の遺伝子の発現レベルをモニターし（転写物の画像を生成）、遺伝的変異体、突然変異体、および多形性を同定することができる。この情報を用いて遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的基盤を理解し、疾患を診断し、そして治療剤を開発し、その活性をモニターすることができよう。特定の局面において、マイクロアレーをＷＯ ９５／１１９９５ （Ｃｈｅｅら）； Ｄ． Ｊ． Ｌｏｃｋｈａｒｔら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：１６７５−１６８０； およびＭ． Ｓｃｈｅｎａら、１９９６、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３：１０６１４−１０６１９）に記載の方法に従って作製し、使用する。マイクロアレーはさらに米国特許６，０１５，７０２（Ｐ． Ｌａｌら）に記載されている。
【０２１７】
本発明の別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする核酸配列を用い、天然ゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することもできよう。該配列を特定の染色体、染色体の特異領域、または人工的染色体構築物（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌ＰＩ構築物、または１本鎖染色体ｃＤＮＡライブラリー（Ｃ． Ｍ． Ｐｒｉｃｅ、１９９３、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．、７：１２７−１３４、およびＢ． Ｊ． Ｔｒａｓｋ、１９９１、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、７：１４９−１５４に概説されている）にマッピングすることができよう。
【０２１８】
蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Ｉ． Ｖｅｒｍａら、１９８８、Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹに記載）を、他の物理的染色体マッピング技術および遺伝子マップデータと関連させることができよう。遺伝子マップデータの例は、多くの科学雑誌やＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ （ＯＭＩＭ）にみることができる。物理的染色体マップ上のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードする遺伝子の位置と特定疾患または特定疾患に対する素因との相関は、該遺伝疾患と関連するＤＮＡの領域の範囲を定めるのに役立つかもしれない。本発明のヌクレオチド配列、特に配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を用いて正常個体、キャリアー個体、または罹患個体間の遺伝子配列の差を検出することができよう。
【０２１９】
染色体調製物のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび物理的マッピング技術、例えば確立された染色体マーカーを用いる連鎖分析を遺伝子マップを延長するのに用いることができよう。しばしばマウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置は、特定のヒト染色体の番号や腕が知られていなくても関連マーカーを示すことができよう。物理的マッピングにより新規配列を染色体腕またはその部分に割り当てることができる。これは位置的クローニングや他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探している研究者に貴重な情報を提供する。疾患や症状が遺伝子的関連により特定ゲノム領域におおよそ限定されたら（例えば、１１ｑ２２−２３に対するＡＴ （Ｒ． Ａ． Ｇａｔｔｉら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：５７７−５８０））、該領域に対するあらゆる配列マッピングはさらに研究するための関連または制御遺伝子を示すことができよう。本発明のヌクレオチド配列を用い、正常個体、キャリアー個体または罹患個体間の転座、転移などによる染色体位置の相違を検出することもできよう。
【０２２０】
本発明の別の態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド、その触媒的または免疫原性断片またはそのオリゴヌクレオチドをあらゆる種々の薬剤スクリーニング技術における化合物ライブラリーのスクリーニングに用いることができる。そのようなスクリーニングに用いる断片は溶液中で遊離し、固体支持体に貼りつき、細胞表面に保持され、または細胞内に局在していてよい。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその部分と被検物質の間の結合複合体形成は、当該分野で通常行われている技術を用いて測定することができよう。
【０２２１】
使用できる他の薬剤スクリーニング技術は、ＷＯ ８４／０３５６４に記載のごとく目的タンパク質に対する適切な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングをもたらすことができよう。この方法において、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質に適用されるように、多数の種々の小被検化合物を固体基質、例えばプラスチックピンまたはいくつかの他の表面上で合成する。被検化合物をＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたはその断片と反応させ、洗浄する。次に、結合したＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを当該分野でよく知られた方法により検出する。精製ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをプレート上に直接コーティングし、前記スクリーニング技術に用いることもできる。あるいはまた、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、固体支持体上にそれを固定化することができる。
【０２２２】
さらに本発明は、ＲＡＴＬ１ｄ６のアゴニストまたはアンタゴニストのための化学物質ライブラリーの高処理能力スクリーニングを含む。そのようなアッセイは、例えば本明細書の実施例６に記載のごとくＵＢＣ酵素活性の測定に基づくか、またはＵＢＣ活性の測定に基づく同様に適合したアッセイである。
【０２２３】
特定タンパク質、すなわちＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質と結合することができる小分子の検出または同定を含む他のスクリーニングおよび小分子（例えば薬物）検出アッセイは本発明に含まれる。高処理能力スクリーニング方法論に適したアッセイが特に好ましい。そのような結合に基づくスクリーニングまたは検出アッセイにおいて、機能的アッセイは通常必要ない。好ましくは実質的に純粋な標的タンパク質、および該タンパク質標的に対する結合をスクリーニングまたはアッセイすべき化合物のライブラリーやパネル（例えばリガンド、薬剤、小分子）だけが必要である。好ましくは標的タンパク質と結合するほとんどの小分子は、いくつかの方法で、該タンパク質上の機能的領域または部位に対する優先的なより高親和性の結合により活性を調節するであろう。
【０２２４】
そのようなアッセイの例には、米国特許６，０２０，１４１および６，０３６，９２０（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏら）に記載の蛍光に基づく熱シフトアッセイ（３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、３ＤＰ、Ｅｘｔｏｎ、ＰＡ）がある（Ｊ． Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、２０００、Ｇｅｎ． Ｅｎｇ． Ｎｅｗｓ、２０ （８）も参照）。該アッセイは、タンパク質薬剤またはリガンド複合体の熱アンホールディング曲線を分析することによる結合親和性測定値に基づき、発現し、好ましくは精製されたＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと結合する小分子（例えば薬剤、リガンド）の検出を可能にする。この技術により確定した薬剤または結合分子を、所望により、該分子が標的タンパク質の機能や活性に影響し、または調節するかを決定するために本明細書に記載したような方法によりさらにアッセイすることができる。
【０２２５】
本発明のさらなる態様において、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと結合することができる中和抗体がＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドとの結合のための被検化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。このようにして、該抗体を用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと１またはそれ以上の抗原決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。
【０２２６】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、限定されるものではないがトリプレット遺伝子コードと特異的塩基対の相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレオチド配列の特性に基づく新規技術であるさらに開発すべきあらゆる分子生物学的技術に用いてよいと理解されよう。
【０２２７】
モチーフおよび説明
モチーフアルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）に基づくいくつかのリン酸化部位を含む本発明のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを決定した。そのような部位のリン酸化は、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの生物活性を調節するかもしれない。例えば、特定部位のリン酸化は、他の分子（例えばタンパク質、リガンド、基質、ＤＮＡなど）と関連または結合する該タンパク質の能力の調節に関与するかもしれない。本願において、リン酸化は、他のポリペプチド、特にＲＡＴＬ１ｄ６の同起源のリガンドと結合するＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの能力、またはある種の細胞シグナル経路を調節するその能力を調節する。
【０２２８】
詳細には、モチーフアルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）を用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドが４つのタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化部位を含むことを予測した。ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＫＣはセリンまたはトレオニン残基のリン酸化に対する選択性を示す。該ＰＫＣリン酸化部位は、以下のコンセンサスパターンを有する：［ＳＴ］−ｘ−［ＲＫ］。ここで、ＳまたはＴはリン酸化部位を表し、「ｘ」は介在アミノ酸残基を表す。ＰＫＣリン酸化部位に関するさらなる情報は、Ｗｏｏｄｇｅｔ、Ｊ． Ｒ．ら、１９８６、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６１：１７７−１８４、およびＫｉｓｈｉｍｏｔｏ Ａ．ら、１９８５、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６０：１２４９２−１２４９９に記載されている（この内容は本明細書の一部を構成する）。
【０２２９】
好ましくは以下のＰＫＣリン酸化部位のポリペプチドは本発明に含まれる：
ＧＳＶＱＡＴＤＲＬＭＫＥＬ （配列番号１８）、ＩＹＲＳＱＳＦＫＧＧＮＹＡ （配列番号１９）、
ＩＬＬＮＦＳＦＫＤＮＦＰＦ （配列番号２０）、および／またはＴＲＡＱＱＳＹＫＳＬＶＱＩ（配列番号２１）。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明には、１またはそれ以上のＲＡＴＬ１ｄ６ＰＫＣリン酸化部位ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることも含まれる。
【０２３０】
モチーフアルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）を用い、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドが６つのカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を含むことを予測した。カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ−２）は、その活性が環状ヌクレオチドとカルシウムに非依存のタンパク質セリン／トレオニンキナーゼである。ＣＫ−２は多くの種々のタンパク質をリン酸化する能力を有する。この酵素の基質特異性は以下のようにまとめることができる：（１）同様の条件下ではＳｅｒがＴｈｒより好ましい。（２）酸性残基（ＡｓｐまたはＧｌｕ）は、リン酸アクセプター部位のＣ末端から３残基存在しなければならない。（３）＋１、＋２、＋４および＋５位のさらなる酸性残基は、リン酸化速度を増大させる。ほとんどの生理学的基質は、これらの位置に少なくとも１つの酸性残基を有する。（４）酸性決定基の供給者としてはＡｓｐがＧｌｕより好ましい。（５）アクセプター部位のＮ末端の塩基性残基はリン酸化速度を低下させ、一方、酸性残基はそれを増大させる。
【０２３１】
典型的カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位のコンセンサスパターンは以下の通りである：［ＳＴ］−ｘ（２）−［ＤＥ］。ここで、「ｘ」はあらゆるアミノ酸を表し、ＳまたはＴはリン酸化部位である。アミノアシル−トランスファーＲＮＡ合成酵素クラスＩＩドメインについてのさらに具体的な情報は以下の刊行物に記載されている：
Ｐｉｎｎａ、Ｌ． Ａ．、１９９０、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１０５４：２６７−２８４（この内容は本明細書の一部を構成する）。
【０２３２】
好ましくは以下のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位ポリペプチドが本発明に含まれる：ＰＡＥＱＣＴＱＥＤＶＳＳＥＤ（配列番号２２）、ＴＱＥＤＶＳＳＥＤＥＤＥＥＭ（配列番号２３）、
ＱＥＤＶＳＳＥＤＥＤＥＥＭＰ（配列番号２４）、ＡＥＧＫＫＳＥＤＤＧＩＧＫＥ（配列番号２５）、
ＥＬＶＮＤＳＬＹＤＷＮＶＫＬ（配列番号２６）および／またはＩＬＬＮＦＳＦＫＤＮＦＰＦＤ（配列番号２７）。これらペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明には、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして使用することも含まれる。
【０２３３】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）に従って４つのグリコシル化部位を含むことが示された。本明細書により具体的に記載したように、タンパク質のグリコシル化は、タンパク質のホールディングの増大、タンパク質凝集の阻害、オルガネラに対する細胞内トラフィッキングの調節、タンパク質分解に対する耐性増加、タンパク質の抗原性の調節、および細胞間付着の仲介を含む種々の機能をもたらすと考えられる。
【０２３４】
アスパラギングリコシル化部位は以下のコンセンサスパターンを有する：
Ｎ−｛Ｐ｝−［ＳＴ］−｛Ｐ｝（ここで、Ｎはグリコシル化部位を表す。）。潜在的Ｎ−グリコシル化部位はコンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに特異的であることがよく知られている。しかしながら、該タンパク質のホールディングはＮグリコシル化の調節に重要な役割を果たすという事実により、コンセンサストリペプチドの存在は、アスパラギン残基がグリコシル化されると結論付けるには十分ではない。ＡｓｎとＳｅｒ／Ｔｈｒの間にプロリンが存在するとＮ−グリコシル化が阻害されることが示され、これはグリコシル化部位の最近の統計分析により確認され、またこの分析はＳｅｒ／ＴｈｒのＣ末端にプロリンを有する部位の約５０％がグリコシル化されないことも示している。アスパラギングリコシル化に関するさらなる情報は以下の刊行物に記載されている（この内容は本明細書の一部を構成する）：
Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｒ． Ｄ．、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４１：６７３−７０２ （１９７２）； Ｐｌｅｓｓ Ｄ． Ｄ．およびＬｅｎｎａｒｚ Ｗ． Ｊ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．、７４：１３４−１３８ （１９７７）； Ｂａｕｓｅ Ｅ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２０９：３３１−３３６ （１９８３）； Ｇａｖｅｌ Ｙ．およびｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、３：４３３−４４２ （１９９０）； およびＭｉｌｅｔｉｃｈ Ｊ． Ｐ．およびＢｒｏｚｅ Ｇ． Ｊ． Ｊｒ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６５：１１３９７−１１４０４ （１９９０）。
【０２３５】
好ましい態様において、以下のアスパラギングリコシル化部位ポリペプチドが本発明に含まれる：
ＶＲＩＨＣＮＩＴＥＳＹＰＡＶ （配列番号２８）、ＡＶＥＬＶＮＤＳＬＹＤＷＮＶ （配列番号２９）、
ＤＦＩＬＬＮＦＳＦＫＤＮＦＰ （配列番号３０）、および／またはＶＱＦＧＡＮＫＳＱＹＳＬＴＲ （配列番号３１）。
これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明には、１またはそれ以上のこれらＲＡＴＬ１ｄ６アスパラギングリコシル化部位ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることも含まれる。
【０２３６】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）を用いて１４個のＮ−ミリスチル化部位を含むと予測された。かなりの数の真核性タンパク質がアミド連鎖を介してそのＮ末端残基にミリステート（Ｃ１４飽和脂肪酸）を共有結合的に付加することによりアシル化される。この修飾を担う酵素、ミリスチルＣｏＡ：タンパク質 Ｎ−ミリスチルトランスフェラーゼ（ＮＭＴ）の配列特異性は、既知のＮミリスチル化タンパク質の配列および合成ペプチドを用いる研究から導かれた。該特異性は以下のようであると思われる：
ｉ） Ｎ末端残基はグリシンでなければならない。ｉｉ）２位には非荷電残基が許される。ｉｉｉ）荷電残基、プロリンおよび大疎水性残基は許されない。ｉｖ）３および４位では、すべてではないがほとんどの残基が許される。ｖ）５位では、小非荷電残基が許される（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、ＡｓｎおよびＧｌｙ）。セリンが好ましい。ｖｉ）６位ではプロリンは許されない。
【０２３７】
Ｎ−ミリスチル化のコンセンサスパターンは以下の通りである：
Ｇ−｛ＥＤＲＫＨＰＦＹＷ｝−ｘ（２）−［ＳＴＡＧＣＮ］−｛Ｐ｝（ここで、「ｘ」はあらゆるアミノ酸を表し、ＧはＮ−ミリスチル化部位である）。Ｎミリスチル化部位に対するさらに具体的な情報は以下に記載されている：Ｔｏｗｌｅｒ Ｄ． Ａ．ら、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７：６９−９９ （１９８８）；およびＧｒａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ａ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２５８：６２５−６３８ （１９８９）（この内容は本明細書の一部を構成する）。
【０２３８】
好ましくは以下のＮ−ミリスチル化部位ポリペプチドが本発明に含まれる：
ＱＱＰＧＰＧＱＱＬＧＧＱＧＡＡＰ （配列番号３２）、ＰＧＱＱＬＧＧＱＧＡＡＰＧＡＧＧ （配列番号３３）、
ＱＬＧＧＱＧＡＡＰＧＡＧＧＧＰＧ （配列番号３４）、ＡＡＰＧＡＧＧＧＰＧＧＧＰＧＰＧ （配列番号３５）、
ＡＰＧＡＧＧＧＰＧＧＧＰＧＰＧＰ （配列番号３６）、ＥＦＬＬＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＰ （配列番号３７）、
ＬＬＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＰＧＰ （配列番号３８）、ＬＡＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＰＧＰＨ （配列番号３９）、
ＨＬＰＰＲＧＳＶＰＧＤＰＶＲＩＨ （配列番号４０）、ＱＤＹＬＮＧＡＶＳＧＳＶＱＡＴＤ （配列番号４１）、
ＮＧＡＶＳＧＳＶＱＡＴＤＲＬＭＫ （配列番号４２）、ＳＱＳＦＫＧＧＮＹＡＶＥＬＶＮＤ （配列番号４３）、
ＧＹＶＬＧＧＧＡＩＣＭＥＬＬＴＫ （配列番号４４）、および／またはＡＲＶＱＦＧＡＮＫＳＱＹＳＬＴＲ （配列番号４５）。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。さらに本発明にはこれらＲＡＴＬ１ｄ６Ｎ−ミリスチル化部位ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることも含まれる。
【０２３９】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドは、モチーフアルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）に従って１つのアミド化部位を含むことが示された。Ｃ末端がアミド化されるホルモンおよび他の活性ペプチドの前駆体には、いつも直接、アミド基を提供するグリシン残基、および最もしばしば一般に活性ペプチド前駆体開裂部位として機能する少なくとも２つのコンセンサス塩基性残基（ＡｒｇまたはＬｙｓ）が続く。すべてのアミノ酸をアミド化することができるが、中性疎水性残基、例えばＶａｌまたはＰｈｅがよい基質であり、荷電残基、例えばＡｓｐまたはＡｒｇははるかに反応性が低い。アミド化部位のコンセンサスパターンは以下の通りである：ｘ−Ｇ−［ＲＫ］−［ＲＫ］（ここで、「ｘ」はアミド化部位を表す）。アミド化に関するさらなる情報は以下の刊行物に記載されている（この内容は本明細書の一部を構成する）：Ｋｒｅｉｌ、Ｇ．、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１０６：２１８−２２３ （１９８４）、およびＢｒａｄｂｕｒｙ、Ａ． Ｆ．およびＳｍｙｔｈ Ｄ． Ｇ．、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｒｅｐ．、７：９０７−９１６ （１９８７）。
【０２４０】
好ましい態様において、以下のアミド化部位ポリペプチドが本発明に含まれる：ＥＥＥＰＡＥＧＫＫＳＥＤＤＧ （配列番号４６）。このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明には、このＲＡＴＬ１ｄ６アミド化部位ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載のごとく免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることも含まれる。
【０２４１】
分子的進化を通した本発明の生物活性／機能的特性の増強方法
知られた最も生物学的に活性なタンパク質の多くは生物におけるその特定機能について有効性が高いが、トランスジェニック、治療的、医薬的および／または産業的適用において望ましくない特性を有する事が多い。これら特徴のうち、生理学的半減期が短いことが最も重要な問題であり、タンパク質レベルやｍＲＮＡレベルでみられる。タンパク質またはペプチドの半減期を延長する能力は、その使用、例えば遺伝子療法、トランスジェニック動物生産、タンパク質のバイオプロセス生産と精製、および該タンパク質の化学モジュレーターとしての使用などにおいて特に重要であろう。したがって、一般の産業的および医薬的適用において応用性があるのに加え、動物起源の疾患を治療するための治療薬としてのその適用を増す特性を有する単離されたタンパク質の新規変異体を確認する必要がある。
【０２４２】
すなわち、本発明のある局面は、指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）分子進化を通して本発明のポリペプチドの特異的な特徴を増強する能力に関する。そのような増強は、非制限的例において、疾患または病気の状態の予防的処置または疾患遺伝子を標的化するためのエフェクターとしてのその後の使用を含む、新たに説明したポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質製品のキット中の必須成分としての有用性、本発明のタンパク質および／またはポリヌクレオチドの物理的特性、例えばその溶解性、構造またはコドン最適化、あらゆる関連酵素活性を含む本発明タンパク質の特異的生物活性、本発明タンパク質の酵素動力学（適用できれば）、本発明タンパク質のＫｉ、Ｋｃａｔ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、Ｋｄ、タンパク質−タンパク質活性、タンパク質−ＤＮＡ結合活性、アンタゴニスト／阻害活性（直接または間接的相互作用を含む）、本発明タンパク質のアゴニスト活性（直接または間接的相互作用を含む）、本発明タンパク質の抗原性（例えば、該タンパク質の抗原的可能性を増大または減少させることが望ましい場合）、本発明タンパク質の免疫原性、本発明タンパク質のそれ自身または他のタンパク質と二量体、三量体または多量体を形成する能力、本発明タンパク質の抗原性効果をもたらすことができよう。
【０２４３】
さらに、タンパク質の特異的特性を増強する能力は、酵素の特徴付けられた活性を、その最初に特徴付けられた活性とはまったく関連のない活性に変化させるのにも応用することができよう。本発明タンパク質の他の望ましい増強は、それぞれ個々のタンパク質に特異的であり、当業者により認識され、本発明により予期されるであろう。
【０２４４】
例えば、操作されたユビキチン結合酵素、例えばＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質はその基質の結合に関して構成性に活性であってよい。あるいはまた、操作されたユビキチン結合酵素は基質結合の非存在下で構成性に活性であってよい。さらに別の例において、操作したユビキチン結合酵素は、通常ユビキチン結合酵素の活性化に必要な制御因子および／または条件（例えば、基質結合、リン酸化、構造変化など）のすべてを必要とせずに活性化されることができよう。そのようなユビキチン結合酵素は、本明細書に記載の他の使用のうちユビキチン結合酵素モジュレーターを同定するためのスクリーニングに有用であろう。あるいはまた、操作したユビキチン結合酵素は基質特異性が変化し、そして／またはユビキチン結合酵素活性が増大していてよい。さらに別の選択肢として、操作したユビキチン結合酵素はユビキチン結合酵素活性が低下していてよい。
【０２４５】
指向性進化はいくつかの工程からなる。第１工程は目的とする遺伝子またはタンパク質のための変異体ライブラリーを確立することを含む。次に、最も重要な工程は、確認すべき活性を有する変異体を選ぶことである。スクリーニングはすべての変異体を排除するほとストリンジェントではないが、有用でない変異体を排除するほどには十分選択的でなければならないので、スクリーニングの設計がきわめて重要である。最後の工程は、先のスクリーニングから得た最良の変異体を用いて上記工程を繰り返すことである。次に、各連続的周期を、必要に応じて例えばスクリーニングのストリンジェンシーを増すことにより調製することができる。
【０２４６】
多年にわたり、高分子に突然変異を導入するために開発された多くの方法がある。これらの方法には、ランダム突然変異誘発、「エラープローン」ＰＣＲ、化学突然変異誘発、部位指向性突然変異誘発、および当該分野でよく知られた他の方法が含まれる（現在の突然変異誘発法の総合的リストについては、Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ （１９８２）参照）。典型的には、そのような方法は、例えばタンパク質のコア機能領域またはタンパク質の特異的ドメインの機能（マルチドメインタンパク質ならば）を確認するための手段として用いられてきた。しかしながら、より最近、そのような方法は特異的または増大した特性を有する高分子変異体の同定に応用されてきた。
【０２４７】
ランダム突然変異誘発は、現在のところ最も広く認識された方法である。典型的には、これは「エラープローン」ＰＣＲ（Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：４５８、（１９９６）に記載）の使用または目的とする特異領域に対応する無作為化合成オリゴヌクレオチド（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ、Ｋ． Ｍ．ら、Ｇｅｎｅ、４６：１４５−１５２、（１９８６）の使用、およびＨｉｌｌ、Ｄ． Ｅ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、５５：５５９−５６８、（１９８７）に記載）の応用により行われてきた。両アプローチでは、得られる突然変異誘発のレベルに限界がある。しかしながら、いずれのアプローチでも研究者は突然変異誘発の速度を効果的に制御することができる。酵素の活性に有用な突然変異誘発はきわめて稀なので、このことは特に重要である。事実、突然変異誘発レベルが高すぎるものを用いると有用な突然変異の所望の利点に対抗または阻害するかもしれない。
【０２４８】
前記方法は共に高分子変異体の無作為化プールを作製するのに有効であるが、「ＤＮＡシャッフリング」またはセクシュアル（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ」（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｗ． Ｐ． Ｃ．、ＰＮＡＳ、９１：１０７４７、（１９９４））と名づけた第三の方法が最近明らかになった。ＤＮＡシャッフリングは、「指向性分子進化」、「エクソンシャッフリング」、「指向性酵素進化」、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化」および「人工進化」とも呼ばれてきた。そのような用語は当該分野で知られており、本発明に含まれる。好ましい新規方法は、得られる結果の肯定的な特徴を広げると同時に否定的な特徴を排除することにより以前の方法の限界を克服するようである。
【０２４９】
ＤＮＡシャッフリングは、「エラープローン」ＰＣＲの方法と同様にｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え原理を組み合わせることによりこの課題を達成する。実質的に、ある遺伝子（すなわち、本発明のＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子）の小ＤＮＡ断片のランダム消化プールをＤＮアーゼＩ消化により作製する。次に、得られる断片を「エラープローン」ＰＣＲアッセンブリー反応に導入する。ＰＣＲ反応時において、任意のサイズのＤＮＡ断片はその同系鎖だけでなく、全ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによっては通常得られない目的のポリヌクレオチドの異なる領域に対応する他のＤＮＡ断片とハイブリダイズする。さらに、ＰＣＲアッセンブリー反応は、「エラープローン」ＰＣＲ反応条件を利用するので、ランダム突然変異が該断片すべてに関するＰＣＲ反応のＤＮＡ合成工程時に導入され、さらに該反応のアニーリング工程時に潜在的ハイブリダイゼーション部位が多様化する。
【０２５０】
種々の反応条件を用いてＤＮＡシャッフリング反応を行うことができる。しかしながら、ＤＮＡシャッフリングの特異的反応条件を以下に手引きとして記載する（ＰＮＡＳ、９１：１０７４７、（１９９４）も参照のこと）。簡単には、ＤＮＡシャッフリング反応にかけるＤＮＡ基質を調製する。調製は該ＤＮＡを夾雑細胞物質、化学物質、緩衝剤、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチド、ＲＮＡなどから単に精製する形でよく、例えばＱｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．やＰｒｏｍｅｇａ、Ｃｏｒｐ．が提供するような市販のＤＮＡ精製キットを利用してよい。
【０２５１】
ＤＮＡ基質を精製したら、それをＤＮアーゼＩ消化にかける。ＤＮＡ基質約２−４μｇを、室温で１０〜２０分間、１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）／１ｍＭ ＭｇＣｌ２中の０．００１５単位／μｌのＤＮアーゼＩ （Ｓｉｇｍａ）で消化する。次に、得られる断片１０−５０ｂｐをアガロースゲル電気泳動（例えば２％低融点アガロースゲル）にかけ、次いでＤＥ８１イオン交換紙（Ｗｈａｔｍａｎ）に移すことにより精製し、該断片は、当該分野で知られた他の方法に加えて、適切な分子量をカットオフするＭｉｃｒｏｃｏｎ濃縮装置 （Ａｍｉｃｏｎ）またはオリゴヌクレオチド精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることにより精製することもできる。ＤＥ８１イオン交換紙を用いる場合は、１０−５０ｂｐ断片を１Ｍ ＮａＣｌを用いて該紙から溶出し、次いでエタノール沈殿する。
【０２５２】
次に、得られる精製断片を２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ ９．０）、および０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（登録商標）を含むＰＣＲ混合物に再懸濁することによりＰＣＲアッセンブリー反応にかける（最終断片濃度は１０−３０ｎｇ／μｌ）。この辞典ではプライマーを加えない。
【０２５３】
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を反応混合物１００μｌあたり２．５単位加える。用いるＰＣＲプログラムは、９４℃６０秒間、９４℃３０秒間、５０−５５℃３０秒間、および７２℃３０秒間で３０−４５サイクルし、次いで７２℃５分間ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ） ＰＴＣ−１５０サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を用いる。アッセンブリー反応が完結した後、得られる無プライマー生成物の１：４０希釈物を各プライマー０．８μｍを含むＰＣＲ混合物（アッセンブリー反応に用いたのと同じ緩衝液混合物を使用）中に導入し、この混合物をＰＣＲ、１５サイクル（９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、および７２℃３０秒間使用）にかける。示したプライマーは、シャッフリング反応に利用したポリヌクレオチドの核酸配列に対応するプライマーである。そのようなプライマーは、当該分野で知られ、本明細書のたの箇所に記載の方法を用いる修飾核酸塩基対を含むことができ、さらなる配列を含むことができる（すなわち、制限部位の付加、特異的塩基対の突然変異などのため）。
【０２５４】
得られる、シャッフル、アッセンブル、および増幅した生成物を当該分野でよく知られた方法（例えばＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット）を用いて精製し、次いで適切な制限酵素を用いてクローンすることができる。
【０２５５】
多くのＤＮＡシャッフリングの変化が現在までに公表されているが、そのような変化は当業者に理解され、実施されており、本発明に含まれる。ＤＮＡシャッフリング法は、Ｚｈａｏら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２５（６）：１３０７−１３０８に記載の方法を用い、所望の突然変異誘発レベルに調整することもできる。
【０２５６】
上記のごとく、ランダム化プールを作製したら、それを特異的スクリーニングにかけて所望の特性を有する変異体を同定することができる。変異体が同定されたら、該変異体に対応するＤＮＡをもう一回ＤＮＡシャッフリングを開始するための基質として用いることができる。このシャッフリング、目的とする最適化変異体の選択、次いで再シャッフリングのサイクルを最終的な変異体が得られるまで繰り返すことができる。ＤＮＡシャッフリング技術を用いて作製した変異体を同定するのに適用されるモデルスクリーニングの例は以下の刊行物に記載されている：
Ｊ． Ｃ． Ｍｏｏｒｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２７２：３３６−３４７、（１９９７）、Ｆ． Ｒ． Ｃｒｏｓｓら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１８：２９２３−２９３１、（１９９８）、およびＡ． Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：４３６−４３８、（１９９７）。
【０２５７】
ＤＮＡシャッフリングはいくつかの利点を有する。第１は、有利な突然変異を利用することである。スクリーニングと組み合わせると、ＤＮＡシャッフリングは最良の突然変異の組み合わせの発見を可能にし、また、該最良の組み合わせがポピュレーション中のすべての突然変異を含むとはみなさない。第２に、組換えは点突然変異誘発と同時に生じる。ＤＮＡポリメラーゼに小断片ＤＮＡプールから完全長遺伝子を合成させる効果がバックグラウンド突然変異誘発率である。ストリンジェント選択方法と組み合わせて、酵素活性は野生型の酵素に比べて１６０００倍まで増加する。本質的に、バックグラウンド突然変異誘発は、組換えが活性の増大をもたらす遺伝子的変動性をもたらした。
【０２５８】
組換えの第３の特徴は、有害な突然変異を除去するのに使用できることである。上記のように、ランダム化工程時に、すべての有益な突然変異について少なくとも１またはそれ以上の中立的または阻害的突然変異があるかもしれない。そのような突然変異は、アッセンブリー反応に、以前の選択から選んだ突然変異体のランダムサイズ断片に加え、過剰の野生型のランダムサイズ断片を含めることにより除去することができる。次の選択時に、ポリヌクレオチド／ポリペプチド／酵素のほとんどの活性変異体のいくつかは阻害的突然変異を失うはずである。
【０２５９】
最後に、組換えはパラレルプロセシングを可能にする。タンパク質をより望ましいものにする複数の特性（例えば可溶性、活性など）があると思われるので、このことは著しい利点である。２つ以上の望ましい特性を一度にスクリーニングするのはますます困難であるから、他の分子進化法は阻害的な傾向がある。しかしながら、組換えを用いて種々の特性のための最良の代表的変異体のランダム化断片を組み合わせ、次いで一度に複数の特性を選択することができる。
【０２６０】
ＤＮＡシャッフリングは、特にポリヌクレオチドおよびポリペプチドを治療的用途で提供する場合、特定宿主における免疫原性を低下させるために本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを適用することもできる。例えば、本発明の特定変異体をＤＮＡシャッフリング技術を用いて作製および単離することができよう。そのような変異体は、その新規な固有の構造により宿主において免疫原性が高いかもしれないが、すべて所望の特性を有するかもしれない。具体的には、所望の特性は、もはや「自己」分子として認識されず、「異種」分子として認識され、新規変異体に対する宿主の免疫応答を活性化する非天然構造を有するポリペプチドをもたらすことができよう。そのような制限は、例えば１またはそれ以上のＤＮＡシャッフリングサイクルにおいて新規変異体遺伝子の遺伝子配列を有する天然タンパク質の生体異物相同分子種の遺伝子配列のコピーを含むことにより克服することができる。したがって、相同分子種と新規変異体ＤＮＡの分子比は変化することがある。理想的には、得られた同定されたハイブリッド変異体は、生体異物タンパク質が宿主免疫系から逃れられるようにするコーディング配列、およびさらに所望の特性をもたらす最初の新規変異体のコーディング配列の少なくともあるものを含むであろう。
【０２６１】
同様に、本発明は、１またはそれ以上のＤＮＡシャッフリングサイクルが、遺伝子鋳型ＤＮＡに加えて、既知の対立遺伝子配列、最適化コドン配列、既知変異体配列、既知ポリヌクレオチド多形性配列、既知相同分子種配列、既知相同体配列、さらなるホモローガスな配列、さらなる非ホモローガスな配列、別の種由来の配列をコードするオリゴヌクレオチド、および上記のあらゆる構成物および組み合わせを含む、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの進化のためのＤＮＡシャッフリング技術の応用を含む。
【０２６２】
上記方法に加えて、ある場合に適用可能な、または望ましい多くの関連方法がある。これらのうちで代表的なものはＰＣＴ出願ＷＯ ９８／３１７００およびＷＯ ９８／３２８４５に記載の方法である（この内容は反応混合物の一部を構成する）。さらに、関連方法を本発明のポリヌクレオチド配列に適用し、ＰＣＴ出願ＷＯ ９８／１３４８５、ＷＯ ９８／１３４８７、ＷＯ ９８／２７２３０、ＷＯ ９８／３１８３７、およびＣｒａｍｅｒｉ、Ａ．ら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：４３６−４３８、（１９９７）に記載の本発明のポリヌクレオチドを含む、遺伝子療法、タンパク質工学、変異体を含む全細胞の進化、または完全な酵素経路の進化に用いるための理想的な変異体を誘導および作製することもできる。
【０２６３】
提案した適用を含む本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対する「ＤＮＡシャッフリング」技術のさらなる適用方法は、米国特許５，６０５，７９３； ＰＣＴ出願ＷＯ ９５／２２６２５； ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／２００７８； ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／３５９６６； およびＰＣＴ出願ＷＯ ９８／４２８３２に記載されている。前記の内容は本明細書の一部を構成する。
【０２６４】
実施例
下記実施例は本発明の例示のために示すものであり、本発明を限定するものではない。
【０２６５】
実施例１
方法
Ａ． Ｔ細胞の調製
【０２６６】
ヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）を用いる標準的ロゼッティングプロトコールによりＴ細胞を製造した。簡単には、それぞれ２頭のドナーから得たヘパリン化血液２２５ ｍｌから末梢血単核細胞 （ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌを用いた遠心により調製した。Ｔ細胞 （Ｅ＋分画）をＳＲＢＣを用いたロゼッティングにより単離した。ＦＡＳＴ−ＴＲＡＣＫ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造業者の指示書に従って半分の非刺激Ｔ細胞（約２．２５ｘ１０８細胞）からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を調製した。残りのＴ細胞を共刺激抗ＣＤ２８ ｍＡｂ ２Ｅ１２ ５μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ／１０％ ＦＢＳで１．２５ ｘ １０６／ｍｌに希釈し、抗ＣＤ３ ｍＡｂ Ｇ１９−４でコーティングした１０ｃｍ組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加えた（２０ｍｌ／プレート）。プレートをＰＢＳで希釈した５μｇ／ｍｌ ｍＡｂ ５ｍｌで３７℃、７時間インキュベーションし、次いでＰＢＳで３回洗浄することによりコーティングした。プレートを正常な細胞培養条件下で１８時間培養した。勢いよくピペッティングし、かきとることにより懸濁および付着Ｔ細胞を得、遠心してペレットとして活性化細胞を回収し、上記のごとくｍＲＮＡ単離用に加工した。
【０２６７】
Ｂ． サブトラクションライブラリーの構築
ｃＤＮＡサブトラクションライブラリーをＣＬＯＮＴＥＣＨ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標） ｃＤＮＡサブトラクションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて作製した。製造業者のプロトコールに従って５００ｎｇの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化末梢血Ｔ細胞ポリＡ＋ＲＮＡ（テスター）および５００ｎｇの非活性化静止末梢血Ｔ細胞ポリＡ＋ＲＮＡ（ドライバー）を調製した。５つの２次ＰＣＲ反応物を混合し、１．２％アガロースゲルに流した。約０．３ｋｂ−１．５ｋｂの範囲の断片をＱＩＡｇｅｎゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製し、ＴＡクローニングベクター、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。ＴＯＰ１０Ｆ’コンピテントＥ． Ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬａｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ （ＬＢ）プレート上に接種した。約６００クローンを単離し、同濃度のアンピシリンを含むＬＢブロスに増殖させた。プラスミドをＱＩＡｇｅｎミニプレップスピン（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて単離し、ＡＢＩサイクルシーケンサー （ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシーケンスした。
【０２６８】
Ｃ． オーバーラッピングＥＳＴクローンのデータベースマイニング
６００クローン以上の挿入物をＢＬＡＳＴ２ （Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて分析した。既知遺伝子のＥＳＴ （Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ（発現配列タグ））を有するクローンをＮＣＢＩにより維持した非冗長ヌクレオチドデータベースを用いて除去した。多くのクローンが新規とわかった。すなわち、そのようなクローンはＮＣＢＩにより公表されていないか、またはデータベース中にみられなかった。ｇｅｎｅｓｅｑヌクレオチド特許データベース（ＢＬＡＳＴ２を通しても利用可能）を用いてさらに検索した。特許配列のＥＳＴを含むクローンを既知配列のサイズ、既知配列情報の質、および／または公に利用可能な配列と関連した有用性の欠如に応じて排除した。
【０２６９】
配列の新規性を分析した後、Ｄ２クラスタードＥＳＴデータベース（ＢＬＡＳＴ２でも利用可能）を用いて実質的なクローニングを実施した。このＤ２クラスタードデータベースはＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ部門が設計した。それはｃｏｎｔｉｇに組み立てられた公開ＥＳＴおよび特許（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）ＥＳＴの両方を含む。ｃｏｎｔｉｇは、より大きな配列断片に組み立てられてたより小さなＥＳＴクローンのコレクションである。サブトラクションクローン配列を用いてこのクラスタードデータベースを照会する。クラスター配列は、配列分析プログラムＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ）を用いてサブトラクションクローン配列を用いて組み立てられた。次に、より大きなｃｏｎｔｉｇ配列を非冗長ヌクレオチド（ＮＲＮ）、ｇｅｎｅｓｉｑヌクレオチド特許（ＧＮＰ）、非冗長タンパク質 （ＮＲＰ）、およびｇｅｎｅｓｉｑペプチド特許（ＧＰＰ） データベースに対して逆検索した。
【０２７０】
Ｄ． Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同分子種の同定
ヒトＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同分子種を検索するため、ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質配列をＢＬＡＳＴソフトウエア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ． Ｆ．ら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２）を用いて公開されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａタンパク質およびＧｅｎＢａｎｋのゲノム配列データベースに対して検索した。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子ＥＧ：２５Ｅ８ （Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＦ４５７６７）は、ヒトＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子と最も高い相同性を有し、該遺伝子の大部分に及ぶアミノ酸レベルで相同性が４８％であることがわかった。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子ＥＧ：２５Ｅ８を用い、公開されたヒトタンパク質およびＧｅｎＢａｎｋのゲノム配列データベースに対して検索した。ヒト遺伝子のすべてのうちＲＡＴＬ１ｄ６は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＥＧ：２５Ｅ８遺伝子とほぼ同様であることがわかった。データベース検索の結果は、ＥＧ：２５Ｅ８がヒトＵＢＣ酵素ＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同分子種であることを示した。
【０２７１】
実施例２
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドのクローニング
【０２７２】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリヌクレオチドを単離および得るための完全長クローニング実験をＧｅｎｅ Ｔｒａｐｐｅｒ技術 （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＤ）を用い、製造業者の指示書にしたがって実施した。簡単には、ＰＣＲプライマー ＰＹ５０８、（５’−ＴＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣ−３’）、（配列番号９）、およびＰＹ５０９、（５’−ＣＴＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＡＴＣＡＣＴＧＡＣ−３’）、（配列番号１０）を用い、骨髄、心臓、肺、脳、腎臓、末梢血白血球、肝臓、脾臓、精巣、および胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを含むヒトｃＤＮＡライブラリーのパネル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をスクリーニングした。強陽性ＰＣＲ生成物がヒト脳および骨髄ｃＤＮＡライブラリー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて確認された。
【０２７３】
二本鎖ｃＤＮＡプラスミドライブラリーをＧｅｎｅ ＩＩおよびＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩを用いて１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に変換した。ビオチン化オリゴヌクレオチド （ＰＹ４９５：５’−ＴＣＣＡＣＴＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＧＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧ−３’）、（配列番号１１）または（ＰＹ４９６：５’−ＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＡＣＴＣＧＴＧＡＡＴＧＡＣＡＧＴＣＴＧＴ−３’）、（配列番号１２）、およびｓｓＤＮＡ間にハイブリッドを形成し、次いで常磁性ビーズ上に捕捉した。（（Ｄ． Ａ． Ｔａｇｌｅら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ、３６１：７５１−７５３）。洗浄後、ｓｓＤＮＡを放出させ、ＤＮＡポリメラーゼによりｄｓＤＮＡに変換した。ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換してプレートに接種後、陽性クローンをＰＣＲ分析により同定した。この技術により、新規 ＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子について陽性クローンを同定した。ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドを調製し、得られたＤＮＡを当該分野で知られた常套的プロトコールを用いてシーケンシングした。
【０２７４】
シーケンシングしたポリヌクレオチドの５’末端の配列分析により、骨髄ｃＤＮＡライブラリーからの３クローンがＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの完全長コーディング領域を含むことが示された。さらにプライマーを合成し、これを用い、常套的シーケンシングプロトコールを用いて完全挿入物をシーケンスした。これらｃＤＮＡ挿入物用のベクターはクローニング部位ＳａＩＩ（５’末端）およびＮｏｔＩ（３’末端）を有するｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２であった。
【０２７５】
実施例３
ハイブリダイゼーションプローブの標識およびその使用
配列番号１から誘導したハイブリダイゼーションプローブを用いてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｍＲＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対を含むオリゴヌクレオチドの標識をこの実施例に記載しているが、実質的に同じ方法をより大きなｃＤＮＡ断片で使用する。オリゴヌクレオチドをステイト・オブ・ザ・アート・ソフトウエア、例えばＯＬＩＧＯ４．０６ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて設計し、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーおよび２５０μＣｉの［γ−３２Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）を混合することにより標識する。標識オリゴヌクレオチドをＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５スーパーファイン樹脂カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド各々１０７カウント／分を含む部分を以下のエンドヌクレアーゼ（例えば、Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇ１ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ １、またはＰｖｕ ＩＩ、ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の一つを用いて消化したヒトゲノムＤＮＡの典型的膜ベースのハイブリダイゼーション分析に使用する。
【０２７６】
各消化物由来のＤＮＡを０．７％アガロースゲルを用いて分画し、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ． Ｈ．）に移す。ハイブリダイゼーションを４０℃で１６時間行う。非特異シグナルを除去するため、ブロットを室温、０．１ｘ生理食塩水クエン酸ナトリウムおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまでの増大するストリンジェント条件下で連続的に洗浄する。ＸＯＭＡＴＡＲフィルム（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）をＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒカセット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）中のブロットに数時間暴露した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。
【０２７７】
実施例４
相補的ポリヌクレオチド
【０２７８】
ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質をコードする配列と相補的な核酸配列もしくはアンチセンス分子、またはそのあらゆる部分を用いて、天然 ＲＡＴＬ１ｄ６の発現を低下させ、または阻害する。約１５〜３５塩基対を含むアンチセンスまたは相補的オリゴヌクレオチドの使用を説明するが、本質的に同じ方法をより小さいまたはより大きい核酸配列断片で使用する。図１Ａ、１Ｂおよび２Ａ、２Ｂに示すようにＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質のコーディング配列に基づくオリゴヌクレオチドを用い、天然ＲＡＴＬ１ｄ６の発現を阻害する。相補的オリゴヌクレオチドを最もユニークな５’配列（図１Ａ、１Ｂおよび２Ａ、２Ｂ）から設計し、これを用いてプロモーターとコーディング配列の結合を阻害することにより転写を阻害するか、またはリボソームがＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質をコードする転写物と結合するのを抑制することにより翻訳を阻害する。配列番号１のシグナルおよび５’配列の適切な部分を用い、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡのあらゆる部分を標的にするあらゆる約１５−３５ヌクレオチドを含み、好ましくは、アンチセンスオリゴは図１Ａ、１Ｂおよび２Ａ、２Ｂに示すポリペプチドのシグナルまたはコーディング配列に翻訳される領域にわたる。適切なオリゴヌクレオチドはＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェアおよびＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質コーディング配列を用いて設計する。
【０２７９】
実施例５
ＲＡＴＬ１ｄ６の発現
【０２８０】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの発現は、コーディングｃＤＮＡを適切なベクターにサブクローンし、該ベクターを宿主細胞に形質転換することにより達成される。この実施例ではクローニングベクターｐＧＥＸを用い、ＤＨ５α宿主細胞中でＲＡＴＬ１ｄ６を発現させる。
Ｅ． ｃｏｌｉを宿主細胞に用いるこの実施例により、クローニングベクターは、クローニング部位の上流のβ−ガラクトシダーゼのためのプロモーター、次いでグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする配列を含む。これら残基の直後には転写に有用なバクテリオファージプロモーターおよび多くのユニークな制限部位を含むリンカーがある。
【０２８１】
標準的方法を用いるＩＰＴＧによる単離された形質転換細菌株の誘導は、β−ガラクトシダーゼの最初の８残基、約５−１５残基のリンカー、ＧＳＴを含む融合タンパク質、次いで完全長ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質を生じる。シグナル残基は、細菌増殖培地へのＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質の分泌を指示し、これを直接アッセイに用いて該タンパク質の活性を測定することができる。
【０２８２】
実施例６
ＲＡＴＬ１ｄ６活性の証明
ＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子産物の活性は、多ユビキチン鎖形成を触媒する遊離ユビキチンおよびＥ２ユビキチン担体タンパク質から多ユビキチンコンジュゲートおよびユビキチン−ＲＡＴＬ１ｄ６チオールエステルリンケージを形成することによりｉｎ ｖｉｔｒｏで証明される（Ｓ． Ｖａｎ ＮｏｃｋｅｒおよびＲ． Ｄ． Ｖｉｅｒｓｔｒａ、１９９１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８：１０２９７−１０３０１）。簡単には、ユビキチンおよびＥ２（２０ｋＤａ）、コントロール、およびＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質間のチオールエステル付加形成をＡ． Ｌ． Ｈａａｓら、１９８２、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５７：２５４３−２５４８に記載のごとくアッセイする。１２５Ｉ標識ユビキチンまたは［Ａｒｇ４８］ユビキチン（１μＭ）を反応混合物中、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中のＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質 （５０−５００ ｎＭ）、Ｅ１（ユビキチン活性化酵素）、（１０ｎＭ）、およびＥ２（２０ｋＤａ）、（５０−５００ｎＭ）、およびおよびＭｇ ＡＴＰ （２ ｍＭ）と３０℃で２分間インキュベーションする。コンジュゲートの形成をアッセイするために、同じ反応混合物を３７℃で種々の時間インキュベーションし続ける。ＲＡＴＬ１ｄ６の活性による多ユビキチンコンジュゲートとチオールエステルの連結はポリアクリルアミドゲル電気泳動により遊離ユビキチンから分離され、オートラジオグラフにより可視化される。
【０２８３】
実施例７
ノーザン分析
ノーザン分析を用いて遺伝子の転写物の存在を検出し、これには標識ヌクレオチド配列の、特定の細胞または組織種由来のＲＮＡが結合している膜とのハイブリダイゼーションが含まれる（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、参照）。ＢＬＡＳＴ （Ｓ． Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．、３６：２９０−３００、およびＳ． Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．、２１５：４０３−４１０）を用いる類似のコンピューター技術を用い、ヌクレオチドデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＬＩＦＥＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）中の同一または関連分子を検索する。この分析法は、多膜ベースのハイブリダイゼーションを実施するよりはるかに急速で労力も少ない。さらに、コンピューター分析の感度を修飾し、あらゆる特定のマッチが正しい（同一）またはホモローガスであると分類されるかどうかを決定することができる。
【０２８４】
検索の基準は、以下のように定義される生成物スコアである：
（％配列同一性 ｘ 最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００。生成物スコアは、２配列間の類似性の程度と配列マッチの長さを考慮する。例えば、生成物スコア４０ではマッチは誤差１−２％以内の正確さであり、７０ではマッチは正確であろう。ホモローガスな分子は、生成物スコアが１５〜４０のものを選ぶことにより通常確認されるが、より低スコアが関連分子を確認するかもしれない。ノーザン分析の結果は、ＲＡＴＬ１ｄ６をコードする転写物が生じるライブラリーのリストとして報告される。存在度および存在度％も報告する。存在度は特定の転写物がｃＤＮＡライブラリー中に存在する回数を反映し、存在度％は存在度をｃＤＮＡライブラリー中の試験配列の総数で割ったものである。
【０２８５】
実施例８
マイクロアレー
マイクロアレー用のオリゴヌクレオチドを作製するため、配列番号１を該ヌクレオチド配列の３’末端で出発するコンピューターアルゴリズムを用いて試験する。該アルゴリズムは、該遺伝子にユニークな、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含量を有し、ハイブリダイゼーションと干渉する予測される２次構造を欠く限定した長さのオリゴマーを同定する。該アルゴリズムは、長さ２０ヌクレオチド、すなわち２０量体の特異的オリゴヌクレオチドを同定する。各配列の中心の１ヌクレオチドが変化したマッチしたオリゴヌクレオチドのセットが生成される。この方法はマイクロアレー中の各遺伝子について反復され、２セットの２０量体を蛍光または放射活性ヌクレオチドの存在下で合成し、基質表面上に配置する。基質がシリコンチップであるときは光指向性の化学的方法を沈着に用いる（ＷＯ ９５／１１９９５、Ｍ． Ｃｈｅｅら）。
【０２８６】
あるいはまた、化学カップリング法およびインクジェット装置を用いて基質表面にオリゴマーを合成する（ＷＯ ９５／２５１１６、Ｊ． Ｄ． Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら）。別の方法として、ドット（またはスロット）ブロットと類似の「グリッド化」アレーを用い、例えば真空システム、または熱、ＵＶ、機械的、または化学的結合技術を用いて基質表面にｃＤＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを配置および結合させる。典型的アレーは、手動で、または利用可能な物質および装置を用いて作製してよく、８ドット、２４ドット、９６ドット、３８４ドット、１５３６ドット、または６１４４ドットのグリッドを含んでいてよい。ハイブリダイゼーション後、該マイクロアレーを洗浄してあらゆるハイブリダイズしていないプローブを除去し、検出装置を用いて放射活性または蛍光のレベルとパターンを検出する。検出装置はＸ線フィルムのように簡単なものでも、光スキャンニング装置のように複雑なものであってもよい。スキャンした蛍光画像を検討して相補性の程度およびマイクロアレー中の各オリゴヌクレオチド配列の相対存在度／発現レベルを決定する。
【０２８７】
実施例９
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドに特異的な抗体の製造
担体、例えばＢＳＡまたはＫＬＨと結合したＲＡＴＬ１ｄ６ペプチドまたは完全長ＲＡＴＬ１ｄ６タンパク質を免疫原に用いて宿主、例えばウサギまたはマウスに抗体を生じさせる。別の方法として、ＲＡＴＬ１ｄ６融合タンパク質、すなわちＧＳＴまたは６ｘＨＩＳと融合したＲＡＴＬ１６を適切な発現系、例えば細菌、昆虫、または哺乳動物細胞で発現させ、得られた融合生成物を標準的方法に従って単離し、これを免疫原に用いて当業者に知られた日常的製造方法およびプロトコールを利用してポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成する。
【０２８８】
別の方法として、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記）、または他の精製技術を用いて実質的に精製されるＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを用い、標準プロトコールを用いてウサギを免疫し、抗体を産生する。配列番号２からのアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）を用いて分析し、高免疫原性領域を決定し、１またはそれ以上の対応するオリゴペプチドを合成し、これを用いて当業者に知られ、用いられる方法により抗体を生じさせる。適切なエピトープ、例えばＣ末端付近または親水性領域中のものの選択はＦ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、その他に記載されている。
【０２８９】
典型的には、該オリゴヌクレオチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ化学を用い、ＡＢＩ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ４３１ Ａ （ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成され、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ； Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら、上記）を用いる反応によりＫＬＨ （Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とカップリングする。ウサギをＦｒｅｕｎｄアジュバント中のオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫する。得られる抗血清の抗ペプチド活性を、例えば該ペプチドをプラスチックに結合させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、放射性ヨウ素化、または酵素標識（例えばホースラディッシュパーオキシダーゼ）ヤギまたはマウス抗ウサギＩｇＧ免疫グロブリンと反応させることにより試験する。
【０２９０】
実施例１０
特異抗体を用いる天然ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの精製
天然または組換えＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドをＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティクロマトグラフィーにより実質的に精製する。イムノアフィニティカラムを抗ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂、例えばＣＮＢｒ活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共有結合的にカップリングさせることにより構築する。カップリング後、樹脂を、製造業者の指示書に従ってブロックし、洗浄する。
【０２９１】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを含む媒質をイムノアフィニティカラムに通し、該カラムをＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドが選択的に吸収される条件下（例えば、界面活性剤存在下の高イオン強度緩衝液）で洗浄する。該カラムを抗体／ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド結合を妨げる条件下（例えばｐＨ ２−３の緩衝剤または高濃度のカオトロープ、例えば尿素またはチオシアネートイオン）で溶出し、ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを回収する。
【０２９２】
実施例１１
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと相互作用する分子の同定
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｂｏｌｔｏｎら、１９７３、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、１３３：５２９）で標識する。マルチウェルプレートのウェルに予め配置した候補分子を標識ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドとインキュベーションし、洗浄し、標識ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド−候補分子複合体を有するあらゆるウェルをアッセイする。種々の濃度のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドを用いて得られるデータを用いてＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと候補分子の結合、親和性、数に関する値を計算する。
【０２９３】
ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドと相互作用するタンパク質、ペプチドまたは他の分子を同定するのに適した別の方法には、リガンド結合アッセイ、例えば上記酵母−２ハイブリッド系が含まれる。
【０２９４】
実施例１２
本発明のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドに対応するＮおよびＣ末端欠失突然変異体の作製
本明細書の他の箇所に記載のごとく、本発明には、本発明のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドに対応するＮおよびＣ末端欠失突然変異体、およびそのＮおよびＣ末端欠失のあらゆる組み合わせの作製が含まれる。そのような突然変異体を作製するには、多くの方法が当業者に利用可能である。そのような方法には、ＰＣＲ増幅と遺伝子クローニング方法論の組み合わせが含まれる。本明細書が提供または記載する、および／または標準法として当該分野で知られた技術の使用を通して分子生物学の当業者は本発明の各欠失突然変異体を容易に作製することができるであろうが、その代表的方法を以下に記載する。
【０２９５】
簡単には、完全長ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド配列またはスプライス変異体配列をコードする単離されたｃＤＮＡクローンを用い、配列番号１の望ましい５’および３’位からの約１５−２５ヌクレオチドの適切なプライマーを設計し、目的とするＮおよび／またはＣ末端欠失突然変異体をＰＣＲ増幅し、次いでクローンすることができよう。そのようなプライマーは、例えば、５’および３’プライマーに対する開始および終止コドンをそれぞれ含むことができる。そのようなプライマーは、増幅後の欠失突然変異体のクローニングを促進する制限部位を含むこともできる。さらに、該プライマーはさらなる配列、例えば、ｆｌａｇ−ｔａｇ配列、ｋｏｚａｃ配列または本明細書に記載および／または引用した他の配列を含むことができる。
【０２９６】
例えば、Ｄ６７〜Ｇ４２２ Ｎ末端欠失突然変異体の場合、表１に示す以下のプライマーを用いてこの欠失突然変異体に対応するｃＤＮＡ断片を増幅することができる。
【０２９７】
表１
2004512836.tif 000012
【０２９８】
さらに、Ｍ１〜Ｑ３５９ Ｃ末端欠失突然変異体の場合、例えば、表２に示す以下のプライマーを用いてこの欠失突然変異体に対応するｃＤＮＡ断片を増幅することができる。
【０２９９】
表２
2004512836.tif 000013
【０３００】
代表的ＰＣＲ増幅条件を以下に示すが、当業者は他の条件が効率的増幅に使用され、そして／または必要であるかもしれないことを認識するであろう。１００μｌ ＰＣＲ反応混合物を１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ （ＲＡＴＬ１ｄ６のｃＤＮＡクローン）、２００μＭ ４ｄＮＴＰ、１μＭプライマー、０．２５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥ）、および標準的Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を用いて調製することができる。典型的なＰＣＲのサイクリング（繰り返し）条件は以下の通りである：
2004512836.tif 000014
【０３０１】
ＰＣＲの最終伸長工程後、５Ｕクレノー断片を加え、３０度で１５分間インキュベーションすることができる。
【０３０２】
ＮｏｔＩおよびＳａｌＩ制限酵素で断片を消化したら、同様に消化した（例えばｐＳｐｏｒｔ１その他）適切な発現および／またはクローニングベクター中に断片をクローンすることができる。当業者は、他のプラスミドを同様に置きかえることができ、ある環境では望ましいかもしれないことを認識するであろう。次に、消化した断片およびベクターをＤＮＡリガーゼを用いて連結し、次いでこれを用い、本明細書に記載の、および／または当該分野で知られた方法を用いてコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換する。
【０３０３】
あらゆるさらなるＮ末端欠失突然変異体を増幅するための５’プライマー配列は以下の式を参照することにより決定することができよう：
（Ｓ＋（Ｘ＊３））〜（（Ｓ＋（Ｘ＊３））＋２５）
［式中、「Ｓ」はＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子（配列番号１）の開始出発コドンのヌクレオチド位に等しく、「Ｘ」は目的とするＮ末端欠失突然変異体の最もＮ末端のアミノ酸に等しい。］。最初の用語は５’プライマーの出発５’ヌクレオチド位を規定し、２番目の用語は、配列番号１のセンス鎖に対応する５’プライマーの末端３’ヌクレオチド位を規定する。該プライマーの対応するヌクレオチド位が決定されたら、最終ヌクレオチド配列を、例えば該配列の５’末端に適用できる制限部位配列を加えることにより作製することができる。本明細書に記載のごとく、ある環境では該５’プライマーに他の配列を加えることが望ましいことがある（例えばｋｏｚａｃ配列など）。
【０３０４】
あらゆるさらなるＮ末端欠失突然変異体を増幅するための３’プライマー配列を以下の式を参照して決定することができる：
（Ｓ＋（Ｘ＊３））〜（（Ｓ＋（Ｘ＊３））−２５）
［式中、「Ｓ」はＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子（配列番号１）の開始出発コドンのヌクレオチド位に等しく、「Ｘ」は目的とするＮ末端欠失突然変異体の最もＣ末端のアミノ酸に等しい。］。最初の用語は３’プライマーの出発５’ヌクレオチド位を規定し、２番目の用語は、配列番号１のアンチセンス鎖に対応する３’プライマーの末端３’ヌクレオチド位を規定する。該プライマーの対応するヌクレオチド位が決定されたら、最終ヌクレオチド配列を、例えば該配列の５’末端に適用できる制限部位配列を加えることにより作製することができる。本明細書に記載のごとく、ある環境では該３’プライマーに他の配列を加えることが望ましいことがある（例えば終止コドン配列など）。当業者は、上記ヌクレオチド位に対する修飾がＰＣＲ増幅を最適化するのに必要なことがあることを認識するであろう。
【０３０５】
上記の同じ一般式を本発明のあらゆるＣ末端欠失突然変異体を増幅するための５’および３’プライマー配列を同定するのに用いることができる。さらに、上記の同じ一般式を本発明のＮ末端およびＣ末端欠失突然変異体のあらゆる組み合わせを増幅するための５’および３’プライマー配列を同定するのに用いてよい。当業者は、上記ヌクレオチド位の修飾がＰＣＲ増幅の最適化に必要なことがあることを認識するであろう。
【０３０６】
好ましくは、配列番号２の以下のＮ末端ＲＡＴＬ１ｄ６欠失ポリペプチドが本発明に含まれる：配列番号２の、
【化１１】
2004512836.tif 000015
【０３０７】
【化１２】
2004512836.tif 000016
【０３０８】
【化１３】
2004512836.tif 000017
【０３０９】
これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。１またはそれ以上のこれらＮ末端ＲＡＴＬ１ｄ６欠失ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることができる。
【０３１０】
また、好ましくは、配列番号２の以下のＣ末端ＲＡＴＬ１ｄ６欠失ポリペプチドが本発明に含まれる：配列番号２の、
【化１４】
2004512836.tif 000018
【０３１１】
【化１５】
2004512836.tif 000019
【０３１２】
【化１６】
2004512836.tif 000020
【０３１３】
これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。１またはそれ以上のこれらＣ末端ＲＡＴＬ１ｄ６欠失ポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載の免疫原性および／または抗原性エピトープとして用いることができる。
【０３１４】
あるいはまた、本発明の好ましいポリペプチド／ペプチドには、例えば配列番号２のＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの内部領域（例えばＮおよびＣ末端ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチド欠失のあらゆる組み合わせ）に対応するポリペプチド／ペプチド配列が含まれる。例えば、内部領域は下記式により定義することができる：
アミノ酸「ＮＸ」〜アミノ酸「ＣＸ」
［式中、「ＮＸ」はＲＡＴＬ１ｄ６（配列番号２）のあらゆるＮ末端欠失ポリペプチドアミノ酸を表し、「ＣＸ」はＲＡＴＬ１ｄ６（配列番号２）のあらゆるＣ末端欠失ポリペプチドアミノ酸を表す。］。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明にはこれらポリペプチドを本明細書の他の箇所に記載のごとく免疫原性および／または抗原性エピトープとして使用することも含まれる。
【０３１５】
実施例１３
ヒトＲＡＴＬ１Ｄ６ポリペプチドの発現プロフィール
以下のＰＣＲプライマー対を用い、定量的ＰＣＲによりＲＡＴＬ１ｄ６ｍＲＮＡの定常レベルを測定する：
2004512836.tif 000021
【０３１６】
簡単には、第１鎖ｃＤＮＡは、市販のｍＲＮＡ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、すなわち、図６の発現プロフィールにおいて分析した１５組織から得られたｍＲＮＡから作製した。各アッセイで使用したｃＤＮＡの相対量は、すべての組織において等量に発現した遺伝子、すなわちシクロフィリンに対するプライマー対を用いる並行実験を行うことにより決定した。シクロフィリンプライマー対は各試料中のｃＤＮＡの量の小さな変動を検出し、これらデータをＲＡＴＬ１ｄ６遺伝子に対するプライマー対を用いて得られたデータの正規化に用いた。
【０３１７】
ＰＣＲデータを、図６に示すように試験した組織間の転写物発生量の差の相対評価に変換した。ユビキチン結合酵素、ＲＡＴＬ１Ｄ６に対応する転写物は多くの組織、主として精巣、脾臓、および脊髄に高レベルに発現し、胸腺、小腸では有意に、前立腺、肺、骨髄、腎臓、脳、肝臓、心臓、リンパ節、下垂体、および膵臓組織ではより少ない程度に発現した。ＲＡＴＬ１ｄ６ポリペプチドの偏在性の発現は、ユビキチン結合酵素としての重要な役割と一致しており、種々の細胞の過程における必須酵素としてのその機能が確認される。
【０３１８】
実施例１４
ＬＰＳ誘導性ルシフェラーゼレポーター系におけるＲＡＴＬ１ｄ６関連Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同分子種ＥＧ：２５Ｅ８．２の機能試験
【０３１９】
安定なＳ２細胞株を、ルシフェラーゼレポーターと融合したＬＰＳ反応性Ａｔｔａｃｉｎ（アタシン）Ｄプロモーターを用いて作製した（Ｔａｕｓｚｉｇ、Ｓ．ら、２０００、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９７：１０５２０−１０５２５から下記のごとく修飾）。Ｓ２細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、２５℃で、１０％加熱不活化ウシ胎児血清（Ｃａｔ． Ｎｏ． １０１００−１４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、元ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ペニシリン−ストレプトマイシンの１００Ｘストック液、Ｃａｔ． Ｎｏ．１５１４０−１４８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、元ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、および２０ｍＭ Ｌ−グルタミン（１００ｘＬ−グルタミン、Ｃａｔ． Ｎｏ．２５０３０−１４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、元ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を含む完全１ ｘ ＳｃｈｎｅｉｄｅｒのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地（Ｃａｔ． Ｎｏ． １１７２０−０３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、元ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中で維持した。
【０３２０】
ＡｔｔａｃｉｎＤ ＡＭＰ遺伝子の１．６Ｋｂプロモーター領域を下記プライマー対を用いるＰＣＲによりＳ２ゲノムＤＮＡから単離した：
５’−ａｔｇａｇｇｃｔｔｇｇａｔｃａｇｃｔｔｔ−３’ （配列番号５０）、（フォワード、ＡＥ００３７１８ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａゲノムプロジェクトの１５７９０４−１５７９２３ｂｐ）および５’−ｃｃｔｇａａｇｃｃｔｇａｃａｔｔｃｃａｔ−３’ （配列番号５１）、（逆、ＡＥ００３７１８の１５９５４７−１５９５６６ｂｐ）。プライマーはＧＩＢＣＯＢＲＬから得た。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９６℃、４分間；９４℃、２分間；５５℃、４５秒間；７２℃２分間；ＰＣＲ３５サイクル。１．６ｋｂ ＡｔｔａｃｉｎＤ ＰＣＲ断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにサブクローンした（ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット、Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｋ４５００−０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＡｔｔａｃｉｎＤ プロモーターはｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターから ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｔｏ ｔｈｅ 制限酵素 ＳａｃＩおよびＸｈｏＩを有するｐＧＬ３−エンハンサールシフェラーゼベクターにサブクローンした（ｐＧＬ３−エンハンサールシフェラーゼレポーターベクター、Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｅ１７７１、Ｐｒｏｍｅｇａ）。同様の領域がレポーターアッセイにおいてＬＰＳ反応性であることが示された（Ｔａｕｓｚｉｇ、Ｓ．ら、２０００、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９７：１０５２０−１０５２５）。
【０３２１】
最終トランスフェクション構築物、ｐＧＬ３−エンハンサー−ＡｔｔａｃｉｎＤを、ヒグロマイシン−Ｂ耐性遺伝子を安定な選択として提供するｐＣｏＨＹＧＲＯプラスミドを用い、既知のリン酸カルシウム法を用いて共トランスフェクションした。この構築物を用いてＳ２細胞をトランスフェクトした（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＤＥＳキット、Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｋ４１２０−０１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
【０３２２】
簡単には、１９μｇのｐＧＬ３−エンハンサー−ＡｔｔａｃｉｎＤ ＤＮＡを１μｇのｐＣｏＨＹＧＲＯ ＤＮＡおよびトランスフェクション緩衝液と混合し、該混合物を用いて６ウェルＦａｌｃｏｎ組織培養プレート中、６−１２ｘ１０６細胞／３ｍｌ／ウェルをトランスフェクションした。安定な細胞を選択し、３００μｇ／ｍｌ ヒグロマイシンＢ （Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ２２０−０５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む完全Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ培地中で維持した。安定な株をＬＰＳに対する応答性について試験した（Ｈａｎ、Ｚ． Ｓ．およびＩｐ、Ｙ． Ｔ．、１９９９、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４：２１３５５−２１３６１）。細胞を２０μｇ／ｍｌ ＬＰＳ （Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｌ−２６５４、Ｓｉｇｍａ）で５時間処理した。ルシフェラーゼ発現をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ系（Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｅ２６２０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイし、ルミネッセンスシグナルを１４５０ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ Ｗａｌｌａｃ Ｊｅｔ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ＆ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により検出した。３回の限界希釈後に２つの安定なＡｔｔＤ−ｌｕｃレポーター細胞株（Ｅ４−１およびＥ４−９）を得、これをさらなる実験に用いた。
【０３２３】
ＲＮＡｉ構築物を以下のごとくＥＧ：２５Ｅ８．２およびコントロール遺伝子について作製した。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子に対する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンをＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。これらにはＲｅｌｉｓｈ （ＥＳＴ ＧＨ０１８８１）、ＩＫＫＢ （ＥＳＴ ＬＤ２１３５４）、Ｃａｃｔｕｓ （ＬＤ１８６２０）、およびＥＧ：２５Ｅ８．２ （ＬＤ０９９９１）由来のｃＤＮＡが含まれた （Ｒｕｂｉｎ、Ｇ． Ｍ．ら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７：２２２２−２２２４）。二本鎖ＲＮＡｉをＨａｍｍｏｎｄ、Ｓ． Ｍ．ら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０４：２９３−０２９６の改良プロトコールに従って作製した。簡単には、ｄｓＲＮＡを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｃａｔ． Ｎｏ． １３３４、Ａｍｂｉｏｎ）を用いＴ７プロモーター配列フランキングｃＤＮＡ挿入物を用いるＰＣＲにより増幅した鋳型から合成した。ＧＨ０８８１およびＬＤ２１３５４をｐＯＴ２ベクター中で用い（フォワードプライマー：５’−ａｃｔｇｃａｇｃｃｇａｔｔｃａｔｔａａｔｇ−３’、（配列番号５２）、（リバースプライマー：５’−ｇａａｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａｔａｔｃａｔａｃａｃａｔａｃｇａｔｔｔａｇ−３’）、（配列番号５３））、ＬＤ１８６２０およびＣＧ２９２４をｐＢＳベクター中で用いた（フォワードプライマー：５’−ｇａａｔｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｇａｃａｔｇａｔｔａｃｇｃｃａａｇｃｔｃｇａａ−３’）、（配列番号５４）； （リバースプライマー：５’−ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｇａａ−３’）、（配列番号５５））。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を１：５に希釈し、変性させ、次いでＥ４−１およびＥ４−９細胞に加えた。
【０３２４】
ｄｓＲＮＡのＳ２細胞へのトランスフェクションは、ｄｓＲＮＡを、無血清培地中のＳ２細胞に直接加えることにより行った（Ｃｌｅｍｅｎｓ、Ｊ． Ｃ．ら、２０００、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９７：６４９９−６５０３）。トランスフェクション前に、細胞をトランスフェクション前約２４時間、完全１ｘＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地中、１ｘ１０６細胞／ｍｌで継代した。トランスフェクション直前に細胞を無血清ＤＥＳ発現培地（Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｑ５００−０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄し、無血清ＤＥＳ培地に７ｘ１０５細胞／ｍｌで再浮遊させた。
【０３２５】
１００μＬの細胞を９６ウェル組織培養プレート （Ｆａｌｃｏｎ）の各ウェルに加えた。次に、５μｌのｄｓＲＮＡ／ウェルを加え、次いで４５分間〜１時間勢いよく振盪させた。最後に、１５０μｌの完全１ｘＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地／ウェルを加えた。９６ウェルプレートをサランラップで覆い、２５℃でインキュベーションした。３日間インキュベーションした後、各ｄｓＲＮＡ処理細胞をルシフェラーゼアッセイ用にデュプリケート、増殖アッセイ用にトリプリケートで接種した。
【０３２６】
総容量１００μｌ中の細胞５−１５μｌをルシフェラーゼアッセイに用い、総容量１００μｌ中の細胞３０−３５μｌを増殖アッセイに用いた。ルシフェラーゼアッセイプレートにＬＰＳ ２０μｇ／ｍｌを加え、次いで５時間インキュベーションした。増殖アッセイプレートを２−３時間インキュベーション後、４９０ｎｍで光学濃度を測定した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｇ３５８０）。
【０３２７】
表３に示す結果は、コントロール試料に対するＥ４−１細胞を用いた１回の実験のデュプリケートでの平均成績を表す。変化は１．００に対するものであり、１．００は、数回の実験を平均した、増殖アッセイで得られた細胞数で正規化した後のコントロール試料の相対ルシフェラーゼ活性を表す。同様の結果が、複数の反復実験で、Ｅ４−９安定細胞株を用いて得られた。表３において、ＮＳは非刺激を表し、ＬＰＳは上記のＬＰＳ処理を表す。
【０３２８】
表３
2004512836.tif 000022
【０３２９】
表３に示すこれらの分析結果は、ＥＧ：２５Ｅ８．２がｃａｃｔｕｓ（カクタス）（ＩκＢ）と同様のプロフィールでＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の不活性免疫モデルにおいて負の調節因子として働くことを示している。このシグナリング経路の正の調節因子のＲＮＡｉ実験から、ＩκＫＢおよびＲｅｌｉｓｈで示されたように低いルシフェラーゼ活性を有することがわかった （Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｎ．ら、２０００、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１４：２４６１−２４７１）。これらの結果は、ＥＧ：２５Ｅ８．２がＬＰＳ反応経路を調節しないことを示す。同様に、ＲＡＴＬ１ｄ６はＥＧ：２５Ｅ８．２との類似性により哺乳動物の免疫経路で同様の役割を有すると予想される。
【０３３０】
実施例１５
部位指向性／部位特異的突然変異誘発
ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位指向性突然変異誘発は、タンパク質の構造と機能の関係および例えば遺伝子発現の研究ならびにベクター修飾のためのきわめて重要な技術である。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を鋳型に用いるアプローチが報告されてきた（例えば、Ｔ． Ａ． Ｋｕｎｋｅｌら、１９８５、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）、８２：４８８−４９２； Ｍ． Ａ． Ｖａｎｄｅｙａｒら、１９８８、Ｇｅｎｅ、６５ （１） ：１２９−１３３； Ｍ． Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９８９、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７９ （２）：３０９−３１１； およびＪ． Ｗ． Ｔａｙｌｏｒら、１９８５、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．、１３ （２４）：８７６５−８７８５）。
【０３３１】
部位指向性突然変異誘発へのＰＣＲの使用は、変性工程を用いて鎖を分離し、相補鎖を分離し、ＰＣＲプライマーの効率的重合を可能にすることにより達成される。すなわち、ＰＣＲ部位指向性突然変異誘発法は、実質的にあらゆる二本鎖プラスミドに組みこむべき部位特異的突然変異を可能にし、Ｍ１３ベースのバクテリオファージベクターへの再サブクローニングまたは１本鎖レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）の必要性を排除する（Ｍ． Ｐ． Ｗｅｉｎｅｒら、１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ、Ａ． Ｍ． ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ． Ｇ． Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、ＵＫ； およびＣ． Ｐａｐｗｏｒｔｈら、１９９６、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、９ （３）：３−４）。
【０３３２】
特にＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位指向性突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ； 米国特許５，７８９，１６６および５，９２３，４１９）を用いる部位指向性突然変異誘発を実施するためのプロトコールは、点突然変異により本発明のＲＡＴＬ１ｄ６アミノ酸配列中のアミノ酸を転換または置換し、１個または複数のアミノ酸を欠失または挿入するために提供される。
【０３３３】
プライマー設計
このプロトコールを用いるプライマー設計では、変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを所望の突然変異に従って個々に設計する。変異原性プライマーの設計にあたって以下ことを考慮すべきである：１）両変異原性プライマーは所望の突然変異を含み、プラスミドの反対側の鎖の同じ配列とアニールしなければならない。２）プライマーは長さが２５および４５塩基であり、プライマーの融解温度（Ｔｍ）は、７８℃と等しいかまたはそれ以上であるべきである。プライマーのＴｍを推定するには通常以下の式を用いる：Ｔ＝８１．５＋０．４１（％ＧＣ）−６７５／Ｎ−％ミスマッチ。Ｔｍの計算において、Ｎはプライマー長（塩基）であり、％ＧＣおよび％ミスマッチの値は整数である。挿入または欠失を導入しようとするプライマーのＴｍを計算するには、上記式を一部変更したものを用いる：Ｔ＝８１．５＋０．４１（％ ＧＣ）−６７５／Ｎ（ここで、Ｎは挿入または欠失される塩基を含まない。３）所望の突然変異（欠失または挿入）は両側に約１０−１５塩基の正しい配列を有するプライマーの中央にあるべきである。４）最適には、プライマーは４０％の最小ＧＣ含量であり、１またはそれ以上のＣまたはＧ塩基で終わるべきである。５）プライマーは５’−リン酸化されている必要はないが、高速ポリヌクレオチド液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製しなければならない。プライマーの精製ができないと突然変異効率の著しい低下を招く。６）プライマー濃度が過剰であることが重要である。プライマー濃度を常に過剰に保ちながら鋳型の量が変化することが示唆される （ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位指向性突然変異誘発キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。
【０３３４】
反応のセットアッププロトコール
上記プライマー設計を用い、非修飾核酸配列と側面を接した所望の突然変異を含む２つの相補的オリゴヌクレオチドを合成する。得られるオリゴヌクレオチドプライマーを精製する。
【０３３５】
コントロール反応を５μｌ １０ｘ反応緩衝液（１００ｍＭ ＫＣｌ； １００ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４； ２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．８； ２０ｍＭ ＭｇＳ０４； １％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００ ； １ｍｇ／ｍｌヌクレアーゼ不含ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）； ２μｌ（１０ｎｇ）のｐＷｈｉｔｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、４．５ｋｂコントロールプラスミド（５ｎｇ／μｌ）； １．２５μｌ（１２５ｎｇ）のオリゴヌクレオチドコントロールプライマー＃１（３４量体、１００ｎｇ／μｌ）； １．２５μｌ（１２５ｎｇ）のオリゴヌクレオチドコントロールプライマー＃２（３４量体、１００ｎｇ／μｌ）； １μｌのｄＮＴＰ混合物； ２回蒸留Ｈ２Ｏ（終量５０μｌ）を用いて調製する。次に、１μｌのＤＮＡポリメラーゼ（ＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、（２．５Ｕ／μｌ）を加える。ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼは、ＴａｑポリメラーゼよりＤＮＡ合成において信頼度が６倍高いと記載されている。温度循環（ｃｙｃｌｉｎｇ）性能を最大にするには、温度循環器（ｃｙｃｌｅｒ）の加熱ブロックとの最適な接触を確実にするため壁の薄い試験管を用いることが示唆される。
【０３３６】
試料反応物を、５μｌの１０ｘ反応緩衝液； ｘμｌ（５−５０ｎｇ）のｄｓＤＮＡ鋳型；ｘμｌ（１２５ｎｇ）のオリゴヌクレオチドプライマー＃１；ｘμｌ（５−５０ｎｇ）のｄｓＤＮＡ鋳型； ｘμｌ（１２５ｎｇ）のオリゴヌクレオチドプライマー＃２； １μｌのｄＮＴＰ混合物； およびｄｄＨ２Ｏ（終量５０μｌ）を混合することにより調製する。次に、１μｌのＤＮＡポリメラーゼ（ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、（２．５Ｕ／μｌ）を加える。
【０３３７】
熱循環器がホットトップアセンブリを持たない場合、各反応物に約３０μｌの鉱油を重層すべきであることが示唆される。
【０３３８】
反応の循環
各反応を以下の循環パラメーターを用いて循環する：
2004512836.tif 000023
【０３３９】
コントロール反応では、１２分間の延長時間を用い、反応を１２サイクル行う。上記循環パラメーターのセグメント２を、所望の突然変異のタイプに従って調整する。例えば、点突然変異では１２サイクルを用い、単アミノ酸変化では１６サイクルを用い、多アミノ酸欠失または挿入には１８サイクルを用いる。温度循環後、反応物を２分間氷上に置き、反応物を＜３７℃に冷却する。
【０３４０】
生成物の消化およびコンピテントＴ細胞の形質転換
１μｌのＤｐｎＩ制限酵素 （１０Ｕ／μｌ）を、先のとがった小ピペットチップを用いて各増殖反応物に直接加える（鉱油重層物の下）。反応混合物を、溶液をピペットで数回上下させて静かに、完全に混合する。次に、反応混合物を微量遠心機を用いて１分間遠心する。直後に、各反応液を３７℃で１時間インキュベーションし、親（すなわち、非突然変異）超らせんｄｓＤＮＡを消化する。
【０３４１】
コンピテントＴ細胞（すなわち、ＸＬ１−Ｂｌｕｅスーパーコンピテント細胞、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を氷上で静かに解凍する。形質転換する各コントロールおよび試料反応物について、５０μｌのスーパーコンピテント細胞を予備冷却した試験管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５９ポリプロピレン）に分注する。次に、１μｌのＤｐｎＩ消化ＤＮＡをコントロールおよび試料反応物から移し、スーパーコンピテント細胞の部分標本を分離する。形質転換反応物を静かに撹拌して混合し、氷上で３０分間インキュベーションする。次に、形質転換反応物を２分間、４２℃で４５秒間パルス加熱する。
【０３４２】
４２℃に予備加熱したＮＺＹ＋ブロス０．５ｍｌを形質転換反応物に加え、次いでこれを２２５−２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で１時間インキュベーションする。各形質転換反応物の部分標本をベクター用の適切な抗生物質を含む寒天プレートに接種する。突然変異誘発および形質転換コントロールのために、細胞を８０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌおよび２０ｍＭ ＭＩＰＴＧを含むＬＢ−アンピシリン寒天プレートに塗布する。形質転換プレートを３７℃で＞１６時間インキュベーションする。
【０３４３】
表４
配列表の説明
2004512836.tif 000024
【０３４４】
2004512836.tif 000025
【０３４５】
2004512836.tif 000026
【０３４６】
本明細書に記載のすべての特許、特許出願、ＰＣＴ出願公開公報、ならびに論文、書籍、参考文献、参考マニュアルおよび抄録の内容は、本発明の関連分野の状況をより完全に説明するために本明細書の一部を構成する。
【０３４７】
本発明の範囲と精神を離れることなく上記内容を種々に変更することができるので、上記明細書に含まれ、添付の請求の範囲に記載されたすべての内容は本発明の説明および例示であると解釈されることを意図するものである。上記開示に照らして本発明の種々の修飾および変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素相同体のポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図１Ｂ】ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素相同体のポリヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２Ａ】ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素相同体のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定コードアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ｂ】ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素相同体のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定コードアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素ポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４】ＲＡＴＬ１ｄ６ユビキチン結合酵素 （ＵＢＣ）とそれぞれ仮定Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓおよびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同分子種Ｆ２Ｈ２．８およびＥＧ：２５Ｅ８．２、およびＥ２ ＵＢＣ Ｐ５２４８３／マウスＵＢ６Ｂ、Ｐ２７９２４／ヒトＵＢＣ１／Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ相互作用タンパク質、ＣＡＡ７２１８４／Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＵＢＣＤ４、およびＰ１４６８２／酵母ＵＢＣ３／ＣＤＣ３４のアラインメントを示す。
【図５Ａ】ＲＡＴＬ１ｄ６アミノ酸配列とその推定Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同分子種との間のＢＬＡＳＴアラインメントを示す。
【図５Ｂ】ＲＡＴＬ１ｄ６アミノ酸配列とその推定Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ相同分子種との間のＢＬＡＳＴアラインメントを示す。
【図６】実施例１３に記載のＲＡＴＬ１ｄ６のＲＴ−ＰＣＲ発現プロフィールを示す。
【図１Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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