(57)【要約】本発明は、藻類から多価不飽和脂肪酸を生成する新規方法に関する。かかる方法には、少なくとも増殖制限ファクターを藻類の培養に適用するステップが含まれ、それによりかかる藻類の培養の分解を停止させ、培養中の藻類によって、多価不飽和脂肪酸を生成させ、蓄える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも増殖制限ファクターを藻類の培養に適用するステップを備え、それにより前記藻類の培養の増殖を停止させ、培養中の藻類により多価不飽和脂肪酸を生成させ、蓄えることを特徴とする、藻類から多価不飽和脂肪酸を生成する方法。
【請求項２】
増殖制限ファクターがケイ酸塩の欠乏であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増殖性制限ファクターが栄養分の欠乏であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２つ以上の増殖制限ファクターを適用することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
藻類が珪藻綱Chaetoceros gracilisであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
藻類が珪藻綱Skeleonema costatumであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項７】
指数増殖期の終期に増殖制限ファクターを適用することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
藻類の培養が少なくとも１０７細胞／ｍｌの濃度に一旦達した後に、増殖制限ファクターを適用することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生成する新規方法に関する。特に、オメガ３を生成する新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細藻類、特にマリカルチャー(mariculture)で培養された微細藻類には、ＰＵＦＡを豊富に含むものが多いが、そのＰＵＦＡの中で最も重要な２種は、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）及びドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である。下記の表１は、標準的に培養された各種の微細藻類のＥＰＡ及びＤＨＡの濃度を示す。
【０００３】
【表１】
2006503556.tif 000002
【０００４】
ＰＵＦＡを生成するための微細藻類のマリカルチャーは、もともと、Crypthecodinium cohnii等の脂肪酸を豊富に含むとして知られる種のみを対象として、始められた。
【０００５】
微細藻類のＰＵＦＡ等の脂質量は、培養条件によって異なる。しかし、藻類の脂肪酸のかかる濃度を得るために最適な条件と、培養における藻類の増殖に必須の条件とを、比較することはできない。したがって、脂肪酸等の脂質を豊富に含む藻類の培養は、低濃度でのみ実施可能である。
【０００６】
したがって、高濃度でＰＵＦＡを生成する方法が提供されることは好都合である。かかる方法によって、同じ産生量のＰＵＦＡを得るための培養量を減らすことができる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的の１つは、ＰＵＦＡを生成する新規方法を提供すること、及び高濃度の脂質を得ることである。
【０００８】
本発明によって、細胞分裂を妨げ、ひいては培養物の増殖を妨げることによって、ＰＵＦＡを生成する方法が提供される。かかる方法によって、脂質の豊富な培養物が得られる。
【０００９】
また、本発明によって、藻類から多価不飽和脂肪酸を生成する方法が提供される。かかる方法には、少なくとも増殖制限ファクターを藻類の培養に適用するステップが含まれ、それにより、かかる藻類の培養の分解を停止させ、培養中の藻類によって、多価不飽和脂肪酸を生成させ、蓄える。
【００１０】
増殖制限ファクターは、例えば、ケイ酸塩の欠乏(silicate deprivation)、他の栄養分の欠乏(other nutrient deprivation)、又は光度等の物理的ファクターであってよい。本発明の一実施態様においては、２つ以上の増殖制限ファクターを同時に適用することもできるし、併用することもできる。本発明の方法を実行するために好ましい藻類は、珪藻綱(diatomaceous) Chaetoceros gracilis 及び珪藻綱Skeleonema costatumである。
【００１１】
本発明の一実施態様においては、指数増殖期の終期に、好ましくは藻類の培養が少なくとも１０７細胞／ｍＬの濃度に達したときに、増殖制限ファクターを適用する。ある一時点で培養中の藻類の細胞分裂（すなわち培養物の増殖）を妨げることにより、ＰＵＦＡ、特にオメガ３脂肪酸を豊富に含む藻類が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
藻類は、その増殖に適合した温度条件、ｐＨ条件及び照明条件で、半連続的方法によって培養される。特に、温度１８〜２０度、ｐＨ７．５〜８．０、及び培養フラスコの一方からのみの照明条件で培養されることが好ましい。Cool-whiteTM及びGrowliteTM蛍光灯によって、６０から２５０μＥｓ−１ｍ−２の様々な強度で光が当てられる。光周期は、明期１６時間とそれに続く暗期８時間とからなる。培養に使用する水を１μｍで濾過し、８０度で低温殺菌する。
【００１３】
予備試験において、７５ｍｌのｆ／２培地を含む１２５ｍｌ三角フラスコに、２〜３ｍｌの最初の藻類の接種源を加えた(Guillard, R., 1975; Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Smith, W. L., Chanley, M.H. (Eds.), Culture of marine invertebrates animals. Plenum Press, New York, pp. 29-60) 。接種から７日後に、かかる三角フラスコの内容物を、３００ｍｌのｆ／２培地を含む５００ｍｌ三角フラスコ容器に移した。５日後に、かかる５００ｍｌ三角フラスコの内容物を、２０リットル培養ビンに移した。１２５ｍｌ三角フラスコ及び５００ｍｌ三角フラスコでの培養中、培養物には特に他の成分や栄養分を加えなかった。
【００１４】
１８リットルの水と共に８ｍｌのｆ／２培地を、２０リットル培養ビンに加えた。２日後に、４ｍｌのケイ酸塩を加え、更に３日後、２０リットル培養ビンの内容物を７フィートの高さの１７０リットル培養管に移した。次に６２ｍｌのｆ／２培地と３１ｍｌのケイ酸塩をかかる培養管に加え、続いてかかる培養管を水で満たした。栄養分及びケイ酸塩、又は栄養分のみを、増殖させる種によって、１日おきに加えた。２０リットル培養ビン及び１７０リットル培養ビン又は培養管に、除菌空気とＣＯ２とを０．２〜０．３Ｌ／分の割合で加える。
【００１５】
１７０リットル培養管で６〜７日培養した後、藻類の培養物は指数増殖期の終期を向かえ、最高濃度が得られた。指数増殖期の終期までの限定した期間、藻類の代謝を改良／又は改変するために、栄養分を欠乏させることによって藻類にストレスを与える。藻類はかかるストレスに反応して、分裂を停止させ、脂質、通常はＰＵＦＡを蓄え始める。藻類に与える栄養ストレス又は環境ストレスの正確な性質は、培養する種によって異なる。栄養分を欠乏させていない同一の藻類の培養物と比較して、ある種では、ＰＵＦＡの濃度は約２倍である。
【００１６】
本発明によって、藻類の培養物にストレスを与えると、藻類は増殖を停止させ、脂質、通常はＰＵＦＡを蓄え始めることが見出された。ストレスを受けている間に細胞培地の栄養を欠乏させる栄養ストレス、ストレスを受けている間にｐＨ条件及び／又は照明条件を改良して藻類に増殖／分裂を停止させる環境ストレス等の、様々な種類のストレスを藻類培地に与えることができる。好ましくは、一旦藻類が指数増殖期を完了した後に、ストレスを藻類に与える。その際、培養中の藻類の濃度は最適なものとなる。できるだけ多くの脂質を得るために、藻類の最高濃度を得ること、言い換えれば、最高濃度の脂質を生成させることが望ましいことは、当業者であれば、容易に理解できるであろう。しかし、本発明においては、栄養分を欠乏させると、又は藻類の培養物にストレスを与えると、藻類が増殖／分裂を停止し、脂質を蓄え始めることが示される。
【００１７】
本発明によって、様々な種類の藻類をテストしたところ、本発明の方法を実際に適用することができ、脂質を豊富に含む藻類の培養物が得られることが示された。しかし、様々な種類の藻類において、代謝方法、すなわち細胞分裂の停止が同様に改良可能であること、それによってＰＵＦＡが同様に著しく増加することは、当業者にはよく理解されるであろう。
【００１８】
以下の実施例を参照することによって、本発明をより容易に理解できるが、かかる実施例は本発明を説明するものであり、本発明の請求の範囲を制限するものではない。
【００１９】
実施例１
珪藻綱Chaetoceros gracilisを、１７０リットルの半連続的システムににおいて、１０７細胞／ｍｌより高濃度で培養した。培養管には、完全栄養を補充したものと、ケイ酸塩を欠乏させたものとを用いた。下記の表２に述べるように、かかる結果は処理による脂肪酸の分布を示している。
【００２０】
【表２】
2006503556.tif 000003
【００２１】
ストレス（ケイ酸塩の欠乏）を与え始めてから７日後に、培養条件の分析を行った。
【００２２】
実施例２
珪藻綱Skeletonema costatumを、１７０リットルの半連続的システムにおいて培養した。培養管には、ケイ酸塩を欠乏させたものと、完全栄養を維持したものとを用いた。下記の表３に示すように、かかる結果は、与えるストレスによる各脂肪酸の分布を示している。
【００２３】
【表３】
2006503556.tif 000004
【００２４】
本実施例においても、ケイ酸塩の欠乏を開始してから７日後に、培養条件の分析を行った。
【００２５】
上記の実施例を用いて本発明を説明したが、かかる実施例は本発明を制限するものではない。ストレスを藻類培地に与えることにより分裂を停止させ、その結果増殖を低下させることに関し、本発明によって、脂質、特にＰＵＦＡ及びオメガ３脂肪酸の産生量の増加が可能であったことを、本明細書で説明している。ストレスによって、微細藻類の単細胞(unicellular cells)では分裂が減少し、脂質の産生量が増加する。
【００２６】
本発明の特定の実施態様に関して本発明を説明してきたが、本発明の属する分野で公知又は慣行の範囲にあり、また前述及び付記の請求の範囲に示す本質的特徴を適用してよいことから、更に変更可能であり、これらの本開示からの逸脱を含め、一般に、本発明の原則に基づく発明のあらゆる変形、使用、適合を、本出願が対象とすることが、理解されるであろう。
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月23日(2004.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
指数増殖期の終期に、少なくとも１つの増殖制限ファクターを珪藻綱 Chaetoceros gracilisの培養に適用するステップを備え、それにより前記藻類の培養の増殖を停止させ、培養中の藻類により多価不飽和脂肪酸を生成させ、蓄えることを特徴とする、珪藻綱Chaetoceros gracilisから多価不飽和脂肪酸を生成する方法。
【請求項２】
指数増殖期の終期に、少なくとも１つの増殖制限ファクターを珪藻綱 Skeleonema costatum の培養に適用するステップを備え、それにより前記藻類の培養の増殖を停止させ、培養中の藻類により多価不飽和脂肪酸を生成させ、蓄えることを特徴とする、珪藻綱Skeleonema costatum から多価不飽和脂肪酸を生成する方法。
【請求項３】
増殖制限ファクターがケイ酸塩の欠乏であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
増殖性制限ファクターが栄養分の欠乏であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
２つ以上の増殖制限ファクターを適用することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
藻類の培養が少なくとも１０７細胞／ｍｌの濃度に一旦達した後に、増殖制限ファクターを適用することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか記載の方法。
【国際調査報告】
2006503556.tif 000005
2006503556.tif 000006
2006503556.tif 000007