(57)【要約】本発明は、５〜８個の炭素原子、特に５〜７個の炭素原子、さらに好ましくは６個の炭素原子を含む主鎖を有するポリオール担体をコードするＤＮＡの、植物および真菌における、トランスジェニック植物を作成するための使用に関し、該ポリオールは、有利には、マンニトール、ソルビトール、ズルシトール、ガラクシトール、イノシトール、ミオ−イノシトール、リビトールおよびキシリトールの中から選択され、好ましくはマンニトールである、使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物および真菌における直鎖ポリオール、たとえば、主鎖が５〜８個の炭素原子、特に５〜７個の炭素原子、特に６個の炭素原子を有するポリオールの担体をコードしているＤＮＡ配列の、トランスジェニック植物を作成するための使用であって、これらのポリオールが、好都合には、マンニトール、ソルビトール、ズルシトール、ガラクチトール、イノシトール、ミオイノシトール、リビトールおよびキシリトールから選ばれ、特にマンニトールである、使用。
【請求項２】
ＤＮＡ配列が、下記の配列：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０の一つから選ばれる、請求項１記載の使用。
【請求項３】
−配列番号２の配列、あるいは
−配列番号２から、特に一つ以上のアミノ酸の置換、抑制もしくは付加によって誘導され、植物および真菌の直鎖ポリオール、たとえば、主鎖が５〜８個の炭素原子、特に５〜７個の炭素原子、特に６個の炭素原子を含み、これらのポリオールが、好都合にはマンニトール、ソルビトール、ズルシトール、ガラクチトール、イノシトール、リビトールおよびキシリトールから選ばれ、特にマンニトールである、ポリオールを輸送する特性を有する任意の配列、
−配列番号２の相同配列、好ましくは配列配列番号２と少なくとも約５０％の相同性を有し、植物および真菌において、上記に定義されたとおりのポリオールを輸送する特性を有する、任意の相同配列、あるいは
−植物および真菌において、上記に定義されたとおりのポリオールを輸送する特性を有することを条件として、上記に定義された配列の一つの任意のフラグメント、特に配列番号２の配列中の隣接する少なくとも約１０個のアミノ酸で構成される任意のフラグメント
を含むか、またはそれらで構成されることを特徴とする、タンパク質。
【請求項４】
請求項３記載のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列。
【請求項５】
−配列番号１のヌクレオチド配列、あるいは
−配列番号２で表されるタンパク質をコードしている配列番号１の配列から、遺伝暗号の縮重によって誘導される、任意のヌクレオチド配列、あるいは
−請求項３に定義されたとおりの配列番号２から誘導されるタンパク質をコードしている配列番号１の配列から、特に一つ以上のヌクレオチドの置換、抑制もしくは付加によって誘導される任意のヌクレオチド配列、あるいは
−請求項３に定義されたとおりの配列番号２の相同タンパク質をコードしている配列番号１の配列と、好ましくは少なくとも約３５％の相同性を有する配列番号１の任意の相同ヌクレオチド配列、あるいは
−配列番号１のヌクレオチド配列、または上記に定義されたヌクレオチド配列であって、好ましくは、該配列中の隣接する少なくとも約３０個のヌクレオチドで構成される、任意のフラグメント、あるいは
−上記配列またはフラグメントの任意の相補的ヌクレオチド配列、あるいは
−上記配列フラグメントの一つの相補的配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる任意のヌクレオチド配列
を含むか、またはそれらで構成されるＤＮＡ配列。
【請求項６】
請求項４または５のいずれか１項記載のヌクレオチド配列を含む、組換えベクター、特にプラスミド、コスミド、ファージもしくはウイルスＤＮＡ。
【請求項７】
請求項４または５に記載の、該ベクターに挿入された核酸がコードしているポリペプチドを宿主細胞で発現させるのに必要な要素を含む、請求項６記載の組換えベクター。
【請求項８】
特に請求項６または７に記載の組換えベクターを用いて、形質転換される、特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物または哺乳動物の細胞から選ばれる、宿主細胞。
【請求項９】
請求項４もしくは５に記載のヌクレオチド配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスメッセンジャーＲＮＡ誘導体。
【請求項１０】
請求項４または５に記載のヌクレオチド配列をそのゲノムに含む植物細胞。
【請求項１１】
請求項１０記載の細胞を含む、トランスジェニック植物、植物の部分、植物の種子または植物繁殖材料。
【請求項１２】
そのゲノムに請求項４または５に記載のヌクレオチド配列が導入された、その生来の状態では、マンニトール担体の遺伝子を含有または発現しない、請求項１１記載のトランスジェニック植物。
【請求項１３】
そのゲノムに請求項４または５に記載のヌクレオチド配列が導入された、その生来の状態では、マンニトール担体の遺伝子を含有または発現する、請求項１１記載のトランスジェニック植物。
【請求項１４】
問題の少なくとも一つのヌクレオチド配列で遺伝学的に改変された植物のスクリーニング方法であって、下記の工程：
−問題のヌクレオチド配列と、請求項１、２、４および５のいずれか１項に定義されたとおりのポリオール担体をコードしているヌクレオチド配列とを含む、挿入配列を有するベクターで、植物細胞を形質転換する工程と、
−こうして形質転換された細胞を、該ポリオールを唯一の炭素源として含有する培地で培養して、該挿入配列を含むトランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の断片を得る工程と
を含む方法。
【請求項１５】
病原体に耐性であるトランスジェニック植物を得る方法であって、下記の工程：
−請求項１、２、４および５のいずれか１項に定義されたとおりのポリオール担体をコードしているヌクレオチド配列で、植物細胞を形質転換する工程と、
−こうして形質転換された細胞を培養して、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の断片を得る工程と
を含む方法。
【請求項１６】
塩性ストレスに耐性であるトランスジェニック植物の断片を得る方法であって、下記の工程：
−請求項１、２、４および５のいずれか１項に定義されたとおりのポリオール担体をコードしているヌクレオチド配列で、植物細胞を形質転換する工程と、
−こうして形質転換された細胞を培養して、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の断片を得る工程と
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ポリオール担体をコードしているＤＮＡ配列、およびその使用、特にトランスジェニック植物を作成するための使用に関する。
【０００２】
植物は、光合成を通じて、光エネルギーを用いることによって、糖質のような一次化合物を合成することができる。植物の一定の器官、主として成体の葉のみが、糖質を製造し、かつ貯蔵器官、たとえば、ヒトおよび動物の食料に用いられる塊茎、種子および果実へと輸送することができるにすぎない。
【０００３】
大多数の植物では、輸送される主な糖質は、サッカロースであるが、非常に多くの植物は、マンニトールが一例である、ポリオールのようなその他の化合物も輸送する。
【０００４】
ポリオールは、サッカロースと同様に、光合成の一次産物である。さらに、一次炭素の世界的生産の約３０％が、ポリオールの合成に用いられると推計されている。
【０００５】
環状または非環状のポリオールは、植物では非常に広く存在し、低分子量であり、非常に可溶性であり、かつ非還元性の化合物である。被子植物類のうちで最も広く存在する、３種類の非環状ポリオール（アルジトール）は、ガラクチトール、ソルビトールおよびマンニトールである。ソルビトールは、リンゴ、ナシ、モモおよびスモモのような、バラ科のいくつかの種における主な光合成産物である。
【０００６】
マンニトールは、アルジトールのうちで最も広く存在する種であって、１００種を越える高等植物、特にアカネ科（コーヒー）、モクセイ科（イボタノキ、トネリコ、オリーブ）およびセリ科（セロリ、ニンジン、パセリ）に存在する〔Ｌｅｗｉｓ， １９８４〕。それは、葉肉細胞（葉緑素を有する細胞）で産生される。循環するには、師管（葉脈）に再進入しなければならない。しかし、葉肉細胞と師管との間には、連続性がなく、そのためにマンニトール担体が必要である。このようにして、マンニトールは、葉肉細胞を去り、担体を用いて、師管に進入する。
【０００７】
成葉で合成された化合物は、貯蔵器官へと、また特化したタンパク質、すなわち担体を用いて、一定数の膜を横断して輸送される。これらの担体は、植物においては、その成長に不可欠であるため、多大な役割を果たしている。
【０００８】
セロリのような植物中のマンニトール担体の存在は、異なる生化学的実験によって示されている〔Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５〕。この刊行物は、セロリ中にマンニトール担体が存在すること、およびこの担体の発現は、師部の組織内では、非常に多いことを示している。しかし、マンニトール担体の特定については、何も述べられていない。
【０００９】
糖、たとえばサッカロースおよびヘキソースの無数の担体が、最近数年の間にクローニングされているとしても、それらのうち、ポリオールを輸送できるものは皆無である。
【００１０】
現在、生体内で特定されている直鎖ポリオールは、皆無である。細菌では、マンニトールの輸送とリン酸化との双方が可能である多酵素系が記載されている〔Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４〕。しかし、そのような系は、高等生物では記載されたことがない。
【００１１】
本発明の主題は、植物および真菌のポリオールの担体、ならびにそれらのＤＮＡ配列である。
【００１２】
本発明の主題は、ポリオール担体のＤＮＡ配列を、トランスジェニック植物を得るために用いることでもある。
【００１３】
本発明の主題は、ポリオール担体のＤＮＡ配列を、特に病原体に耐性である植物、または塩性ストレスに耐性である植物を得るという範囲内で用いることでもある。
【００１４】
本発明の主題は、ポリオール担体のＤＮＡ配列を、遺伝学的に改変された植物のスクリーニング方法という範囲内で用いることでもある。
【００１５】
本発明は、植物および真菌の直鎖ポリオール担体、たとえば、主鎖が５〜８個、特に５〜７個の炭素原子、特に６個の炭素原子を有するポリオールをコードしているＤＮＡ配列を、トランスジェニック植物を作成するために用いることであって、これらのポリオールが、好都合には、マンニトール、ソルビトール、ズルシトール、ガラクチトール、イノシトール、リビトールおよびキシリトールから選ばれ、特にマンニトールである、使用に関する。
【００１６】
表現「植物および真菌」には、藻類、セン類（コケ植物類）、シダ類（シダ植物類）、高等植物（裸子植物および被子植物）、ならびに真菌が包含される。
【００１７】
定義により、ポリオールは、炭素原子と同じ数のアルコール官能基を有する「ポリアルコール」であることを想起することができる。ポリオール、ポリアルコールおよびアルコール糖という用語は、等価であると規定することもできる。
【００１８】
好都合な実施態様によれば、本発明は、トランスジェニック植物を作成するために、下記の配列：配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０の一つから選ばれるＤＮＡ配列を用いることに関する。
【００１９】
配列番号１は、セロリ（アピウム・グラベオレンスＡｐｉｕｍ ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ Ｌ．）で特定された、新規な核酸配列である。
【００２０】
配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０は、その機能が現在まで未知であるタンパク質をコードしている核酸の配列である。
【００２１】
配列番号３（Ｂｅｅｔ １）および配列番号４（Ｂｅｅｔ ２）は、テンサイ（サトウダイコンＢｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）を起源とする。
【００２２】
配列番号５（Ｐｓｔ １）、配列番号６（Ｐｓｔ ２）、配列番号７（Ｐｓｔ ３）、配列番号８（Ｐｓｔ ４）および配列番号９（Ｐｓｔ ５）は、シロイヌナズナＡｒａｂｉｄｏｐｕｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａを起源とする。
【００２３】
配列番号１０（Ｂｓ）は、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを起源とする。
【００２４】
本発明は、新規なタンパク質であって、
【００２５】
−配列配列番号２、あるいは
【００２６】
−配列番号２から、特に一つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、抑制もしくは付加によって誘導される、植物および真菌の直鎖ポリオール、たとえば、主鎖が５〜８個の炭素原子、特に５〜７個の炭素原子、特に６個の炭素原子を有する、好都合にはマンニトール、ソルビトール、ズルシトール、ガラクチトール、イノシトール、ミオイノシトール、リビトールおよびキシリトールから選ばれ、特にマンニトールである、ポリオールを輸送する特性を有する任意の配列、
【００２７】
−配列番号２の、好ましくは配列配列番号２と少なくとも約５０％の相同性を有し、植物および真菌において、上記に定義されたとおりのポリオールを輸送する特性を有する、任意の相同配列、あるいは
【００２８】
−植物および真菌において、上記に定義されたとポリオールを輸送する特性を有することを条件として、上記に定義された配列の一つの任意のフラグメント、特に配列配列番号２中の隣接する少なくとも約１０個のアミノ酸で構成される任意のフラグメント
も含むか、またはそれらで構成されることを特徴とするタンパク質にも関する。
【００２９】
ポリオール担体が提示する、ポリオールを輸送するという特性は、下記の試験のうち一つによって立証することができる：
−サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）という酵母の使用、または　−師部小胞の精製された原形質膜の使用。
【００３０】
酵母サッカロミセス・セレビシエの使用〔Ｎｏｉｒａｕｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００〕は、試験しようとするヌクレオチド配列による酵母の形質転換を含み、これらの酵母は、該ポリオールで増殖することができる。これらの酵母でポリオールが輸送されることを立証するには、放射能標識化したポリオールを用いることができる。各実験には、ポリオール上で増殖することができず、該ポリオールを輸送しない酵母の菌株を用いて対照を完成する。
【００３１】
師部小胞からの精製された原形質膜を用いる試験は、Ｓａｌｍｏｎら（１９９５）が記載したそれである。
【００３２】
本発明の好都合な実施態様によれば、本発明の、上記に定義されたとおりのタンパク質は、配列配列番号２で構成されることを特徴とする。
【００３３】
本発明は、下記の配列からから選ばれる、上記に定義されたとおりのタンパク質フラグメントにも関する：
【００３４】
−配列配列番号２の位置（２６）のアミノ酸から位置（５０）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００３５】
【表１】
2004502461.tif 000002
【００３６】
−配列配列番号２の位置（６２）のアミノ酸から位置（８２）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００３７】
【表２】
2004502461.tif 000003
【００３８】
−配列配列番号２の位置（９２）のアミノ酸から位置（１１１）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００３９】
【表３】
2004502461.tif 000004
【００４０】
−配列配列番号２の位置（１１６）のアミノ酸から位置（１４０）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００４１】
【表４】
2004502461.tif 000005
【００４２】
−配列配列番号２の位置（１５０）のアミノ酸から位置（１７４）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００４３】
【表５】
2004502461.tif 000006
【００４４】
−配列配列番号２の位置（１８４）のアミノ酸から位置（２０３）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００４５】
【表６】
2004502461.tif 000007
【００４６】
−配列配列番号２の位置（２８１）のアミノ酸から位置（３０２）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００４７】
【表７】
2004502461.tif 000008
【００４８】
−配列配列番号２の位置（３２０）のアミノ酸から位置（３３９）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００４９】
【表８】
2004502461.tif 000009
【００５０】
−配列配列番号２の位置（３４９）のアミノ酸から位置（３７０）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００５１】
【表９】
2004502461.tif 000010
【００５２】
−配列配列番号２の位置（３８２）のアミノ酸から位置（４０７）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００５３】
【表１０】
2004502461.tif 000011
【００５４】
−配列配列番号２の位置（４２１）のアミノ酸から位置（４４１）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００５５】
【表１１】
2004502461.tif 000012
【００５６】
−配列配列番号２の位置（４５１）のアミノ酸から位置（４７０）のアミノ酸までの範囲に限られた
【００５７】
【表１２】
2004502461.tif 000013
【００５８】
本発明は、上記に定義されたとおりのタンパク質をコードしているヌクレオチド配列にも関する。
【００５９】
本発明の好都合なＤＮＡ配列は、
【００６０】
−ヌクレオチド配列である配列番号１、あるいは
【００６１】
−配列番号２で表されるタンパク質をコードしている配列配列番号１の遺伝暗号の縮重によって誘導される、任意のヌクレオチド配列、あるいは
【００６２】
−上記に定義されたとおりの配列番号２から誘導されるタンパク質をコードしている配列配列番号１の、特に一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、抑制もしくは付加によって誘導される任意のヌクレオチド配列、あるいは
【００６３】
−上記に定義されたとおりの配列番号２の相同タンパク質をコードしている配列配列番号１と、好ましくは少なくとも約３５％の相同性を有する配列番号１の任意の相同ヌクレオチド配列、あるいは
【００６４】
−ヌクレオチド配列配列番号１、または上記に定義されたヌクレオチド配列の、好ましくは、該配列中の隣接する少なくとも約３０個のヌクレオチドで構成される、任意のフラグメント、あるいは
【００６５】
−上記配列またはフラグメントの任意の相補的ヌクレオチド配列、あるいは
【００６６】
−上記配列またはフラグメントの一つの相補的配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる任意のヌクレオチド配列
も含むか、またはそれらで構成される。
【００６７】
ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件とは、
−ハイブリダイゼーション温度：６５℃、
−ハイブリダイゼーション媒体：２５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２；６．６％（重量／容量）のＳＤＳ；１ｍＭのＥＤＴＡ；１％（重量／容量）のウシ血清アルブミン、
−洗浄温度：６５℃、
−逐次洗浄媒体：２ｘＳＳＣ（１．７５％ＮａＣｌ；０．８８％クエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、
１ｘＳＳＣ（０．８７５％ＮａＣｌ；０．４４％クエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、
０．５ｘＳＳＣ（０．４４％ＮａＣｌ；０．２２％クエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ
と理解される。
【００６８】
本発明は、下記の配列から選ばれる、上記に定義されたとおりのヌクレオチド配列のフラグメントにも関する：
【００６９】
−配列配列番号１の位置（９２）のヌクレオチドから位置（１６６）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００７０】
【表１３】
2004502461.tif 000014
【００７１】
−配列配列番号１の位置（２００）のヌクレオチドから位置（２６２）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００７２】
【表１４】
2004502461.tif 000015
【００７３】
−配列配列番号１の位置（２９０）のヌクレオチドから位置（３４９）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００７４】
【表１５】
2004502461.tif 000016
【００７５】
−配列配列番号１の位置（３６２）のヌクレオチドから位置（４３６）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００７６】
【表１６】
2004502461.tif 000017
【００７７】
−配列配列番号１の位置（４６４）のヌクレオチドから位置（５３８）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００７８】
【表１７】
2004502461.tif 000018
【００７９】
−配列配列番号１の位置（５６６）のヌクレオチドから位置（６２５）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００８０】
【表１８】
2004502461.tif 000019
【００８１】
−配列配列番号１の位置（８５７）のヌクレオチドから位置（９２２）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００８２】
【表１９】
2004502461.tif 000020
【００８３】
−配列配列番号１の位置（９７４）のヌクレオチドから位置（１，０３３）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００８４】
【表２０】
2004502461.tif 000021
【００８５】
−配列配列番号１の位置（１，０６１）のヌクレオチドから位置（１，１２６）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００８６】
【表２１】
2004502461.tif 000022
【００８７】
−配列配列番号１の位置（１，１６０）のヌクレオチドから位置（１，２３７）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００８８】
【表２２】
2004502461.tif 000023
【００８９】
−配列配列番号１の位置（１，２７７）のヌクレオチドから位置（１，３３９）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００９０】
【表２３】
2004502461.tif 000024
【００９１】
−配列配列番号１の位置（１，３６７）のヌクレオチドから位置（１，４２６）のヌクレオチドまでの範囲に限られた、
【００９２】
【表２４】
2004502461.tif 000025
【００９３】
核酸配列配列番号２３は、タンパク質フラグメント配列番号１１をコードしている。
【００９４】
核酸配列配列番号２４は、タンパク質フラグメント配列番号１２をコードしている。
【００９５】
核酸配列配列番号２５は、タンパク質フラグメント配列番号１３をコードしている。
【００９６】
核酸配列配列番号２６は、タンパク質フラグメント配列番号１４をコードしている。
【００９７】
核酸配列配列番号２７は、タンパク質フラグメント配列番号１５をコードしている。
【００９８】
核酸配列配列番号２８は、タンパク質フラグメント配列番号１６をコードしている。
【００９９】
核酸配列配列番号２９は、タンパク質フラグメント配列番号１７をコードしている。
【０１００】
核酸配列配列番号３０は、タンパク質フラグメント配列番号１８をコードしている。
【０１０１】
核酸配列配列番号３１は、タンパク質フラグメント配列番号１９をコードしている。
【０１０２】
核酸配列配列番号３２は、タンパク質フラグメント配列番号２０をコードしている。
【０１０３】
核酸配列配列番号３３は、タンパク質フラグメント配列番号２１をコードしている。
【０１０４】
核酸配列配列番号３４は、タンパク質フラグメント配列番号２２をコードしている。
【０１０５】
本発明は、上記に定義されたとおりのヌクレオチド配列を含む、組換えベクター、特にプラスミド、コスミド、ファージもしくはウイルスＤＮＡにも関する。
【０１０６】
本発明は、該ベクターに挿入された、上記に定義されたとおりの核酸がコードしているポリペプチドを宿主細胞で発現させるのに必要な要素を含む、上記に定義されたとおりの組換えベクターにも関する。
【０１０７】
本発明の好都合な実施態様によれば、上記に定義されたとおりの組換えベクターは、該宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター、特に誘導できるプロモーターと、場合により、転写または終止配列と、場合により、シグナルおよび／またはアンカー配列とを特に含む。
【０１０８】
本発明のもう一つの好都合な実施態様によれば、たとえば上記に定義された組換えベクターは、上記に定義されたとおりのヌクレオチド配列の、成熟したタンパク質または融合タンパク質としての発現を許す要素を含む。
【０１０９】
本発明は、特に上記に定義されたとおりの組換えベクターを用いて、形質転換された、特に細菌、ウイルス、酵母、真菌、植物または哺乳動物の細胞から選ばれる、宿主細胞にも関する。
【０１１０】
本発明の好都合な実施態様によれば、上記に定義されたとおりの宿主細胞は、上記に定義されたとおりのヌクレオチド配列の発現を許す、調節要素を含む。
【０１１１】
本発明は、上記に定義されたとおりの形質転換された宿主細胞によって発現された、核酸の発現の産物にも関する。
【０１１２】
本発明は、特異的な方式で、本発明のタンパク質に仕向けられることを特徴とする、抗体にも関する。
【０１１３】
本発明は、ポリクローナル抗体に限定されるわけではなく；本発明は、一方では、動物、特に本発明のタンパク質に対して感作しようとする動物、特にマウスまたはラットの脾臓細胞から、他方では、骨髄腫の細胞系の細胞から出発して、標準的方法に従って形成することができて、該動物の免疫感作に予め用いられるタンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するよう、細胞系の能力に応じて選ぶことができる、任意のハイブリドーマが産生する任意のモノクローナル抗体にも関する。
【０１１４】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列のいずれか一つとハイブリダイズすることができる、ヌクレオチドプローブにも関する。
【０１１５】
本発明は、上記に定義されたとおりのヌクレオチド配列から誘導される、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはアンチセンスメッセンジャーＲＮＡにも関する。
【０１１６】
そうして、マンニトール担体の発現の、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた改変によって、マンニトール担体の発現の低下が、塩性ストレスに対する耐性の低下という結果を有するか否かを決定することができる。
【０１１７】
本発明は、上記に定義されたとおりのヌクレオチド配列をそのゲノムに含む、植物細胞にも関する。
【０１１８】
本発明は、上記に定義されたような細胞を含む、トランスジェニック植物、植物の部分、植物の種子または植物繁殖材料にも関する。
【０１１９】
本発明は、特に、そのゲノムに該ヌクレオチド配列が導入された、その生来の状態では、マンニトール担体の遺伝子を含有または発現しないトランスジェニック植物にも関する。
【０１２０】
本発明は、特に、そのゲノムに該ヌクレオチド配列が導入された、その生来の状態では、マンニトール担体の遺伝子を含有または発現するトランスジェニック植物にも関する。
【０１２１】
本発明は、上記に定義されたとおりの組換えタンパク質を調製する方法であって、下記の工程：
【０１２２】
−本発明の核酸を含む適切なベクターによって、予め形質転換しておいた宿主細胞を、適切な培地で培養する工程と、
【０１２３】
−形質転換された上記の宿主細胞が産生したタンパク質を、上記の培地からか、または該宿主細胞から回収する工程と
を含む方法にも関する。
【０１２４】
たとえば、上記に定義されたとおりのトランスジェニックセロリを作成する方法は、下記の工程を含む：
−セロリ組織を接種する工程、
−セロリ切片およびＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細菌を培養する工程、
−Ａ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細菌を排除する工程、ならびに
−形質転換されたセロリの植物体を再生させる工程〔Ｎａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９〕。
【０１２５】
本発明のヌクレオチド配列は、真核細胞における発現のためのプラスミドに導入し、調節要素と組み合わせることができる。これらの調節要素は、一方では転写プロモーターであり、他方では転写ターミネーターである。プラスミドに含まれた本発明のヌクレオチド配列により、この真核細胞は、細胞内でのポリオール担体の合成を可能にする、翻訳できるｍＲＮＡを発現させることを意図してか、または細胞に内在するポリオール担体の合成を阻害する、翻訳できないｍＲＮＡを発現させることを意図して、形質転換することができる。
【０１２６】
双子葉植物および単子葉植物の遺伝学的改変の方法は、既知である〔Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９〕。植物で発現させるには、本発明のヌクレオチド配列を、転写調節要素と結合しなければならない。そのような要素は、プロモーターと呼ばれ、既知である（ＥＰ ３７５０９１）。
【０１２７】
加えて、それによって正しく転写することができる、転写の終止シグナルを有するコーディング領域も与えなければならない。そのような要素も、記載されている〔Ｇｉｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８９〕。転写の開始領域は、天然であるか、および／または宿主植物に対して相同であるばかりでなく、外来性および／もしくは異種であることもできる。望みであれば、終止領域は、互いに変換可能である。転写の開始および終止領域のＤＮＡ配列は、合成によって調製するか、または天然に得るか、あるいは天然もしくは合成ＤＮＡ配列の混合物から得ることができる。外来遺伝子を高等植物に導入するには、大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉのための複製シグナルを包含する多数のクローニングベクター、および形質転換された細胞の選別を許すマーカーが入手可能である。
【０１２８】
本発明のヌクレオチド配列を植物の宿主細胞に導入するには、アグロバクテリアを用いる形質転換に加えて、他の多くの手法が存在する。これらの手法は、プロトプラストの融合、ＤＮＡの微量注入、および電気穿孔はもとより、弾道法およびウイルス感染も包含する。形質転換した植物材料から出発して、選別のための抗生物質または生物致死剤を含有する適切な培地中で、全植物体を再生させることができる。次いで、得られた植物体を、導入されたＤＮＡの存在について試験することができる。注入および電気穿孔に関してはプラスミドに対する必要条件は、特にない。ｐＵＣ誘導体のような、単一のプラスミドを用いることができる。マーカー遺伝子の存在は、そのような形質転換した細胞からの全植物体の再生に必要である。形質転換した細胞は、通常の方式で、植物体内に発生する〔ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８６〕。これらの植物体は、正常に発生し、形質転換した同じ遺伝子、または異なる遺伝子を有する植物と交配することができる。得られる雑種は、対応する表現型の特性を有する。
【０１２９】
本発明のＤＮＡ配列は、原核細胞における発現のためのプラスミドに導入し、調節要素と組み合わせることもできる。
【０１３０】
本発明のＤＮＡ配列は、原核または真核系における、ＤＮＡ配列の組換えによる、突然変異誘発もしくは配列改変を可能とするプラスミドに導入することもできる。
【０１３１】
本発明のトランスジェニック植物は、本発明のポリオールを輸送し、それが抽出された器官内に蓄積させることができる能力の増大を、特に特徴とする。それらは、該担体を援用して、該ポリオールの流れを、僅かな塩を蓄積するにすぎない器官へと仕向けて、こうして抽出を促進するのに用いることができる。
【０１３２】
本発明は、問題の少なくとも一つのヌクレオチド配列で遺伝学的に改変された植物のスクリーニング方法であって、下記の工程：
【０１３３】
−問題のヌクレオチド配列と、上記に定義されたとおりのポリオール担体をコードしているヌクレオチド配列とを含む、挿入配列を有するベクターで、植物細胞を形質転換する工程と、
【０１３４】
−こうして形質転換された細胞を、該ポリオールを唯一の炭素源として含有する培地で培養して、該挿入配列を含むトランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の断片を得る工程と
を含む方法にも関する。
【０１３５】
この方法は、ポリオールを合成しない植物、またはそれを合成する植物にも関する。
【０１３６】
本発明は、より詳しくは、ポリオール担体、特にマンニトールをコードしているヌクレオチド配列による、断片または植物細胞の形質転換に関する。そうして、該ポリオールを唯一の炭素源として含有する培地で、スクリーニングを実施する。こうして、ポリオール担体を発現する植物は、形質転換されなかった植物に優る、成長における利点を有する。この工程では、任意の植物も、該ポリオールを唯一の炭素源として用いることができると仮定することができる。しかし、該ポリオールを分解できるタンパク質をコードしている遺伝子による同時形質転換を実施することが必要であると証明することができる。再生の初期段階でのみの活性プロモーター、または簡単な化合物によって誘導できるプロモーターを用いることは、ポリオール担体の発現を選抜段階に限定することを可能にする。
【０１３７】
したがって、本発明は、選抜が完了したならばそれ以後は不要である、植物遺伝子と、選抜剤としての天然の産物の使用とに基づく簡単な選抜系に関する。この系は、有毒である可能性がある産物、たとえば抗生物質の使用に頼らなければならないことを回避する。
【０１３８】
本発明は、病原体に耐性であるトランスジェニック植物を得る方法であって、下記の工程：
【０１３９】
−上記に定義されたとおりのポリオール担体をコードしているヌクレオチド配列で、植物細胞を形質転換する工程と、
【０１４０】
−こうして形質転換された細胞を培養して、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の断片を得る工程と
を含む方法にも関する。
【０１４１】
この方法は、ポリオールを合成しない植物、またはそれを合成する植物の、ユビキストプロモーター（タイプＣａＭＶ　３５Ｓ）の制御下か、または病原体の攻撃に応答して誘導できるプロモーターの制御下のいずれかのもとに置かれた、ポリオール担体、特にマンニトールのヌクレオチド配列による形質転換に関する。有用性は、病原体が生成した、より多くのポリオールをそれ自体の細胞へと輸送中の植物が、この攻撃に応答して植物が放出した活性化酸素に対して戦うために、病原体によって導入された防衛手段の一つを抑制するということにある。
【０１４２】
方法の有効性を高めるために、ポリオール担体の発現を該ポリオールを分解する酵素と結合することができる。
【０１４３】
本発明は、塩性ストレスに耐性であるトランスジェニック植物の断片を得る方法であって、下記の工程：
【０１４４】
−上記に定義されたとおりのポリオール担体をコードしているヌクレオチド配列で、植物細胞を形質転換する工程と、
【０１４５】
−こうして形質転換された細胞を培養して、トランスジェニック植物、またはトランスジェニック植物の断片を得る工程と
を含む方法に関する。
【０１４６】
この方法は、ポリオールを合成しない植物、または師部特異的プロモーター（もしくはポリオール担体のプロモーター）の制御下に置かれたポリオール担体をコードしているヌクレオチド配列でそれを合成する植物の形質転換に関する。植物が、該ポリオールを合成するならば、該ポリオールの輸送の増大は、塩性ストレスに対する耐性の蓄積へと導く可能性がある。逆の場合には、植物の生長に対する有害な効果を回避するために、該ポリオールの合成を許すが、この合成を葉に限定する遺伝子を導入することも勧奨される。
【０１４７】
材料および方法
植物の材料
セロリの植物体（アピウム・グラベオレンス／Ｌ、ダルス変種、Ｖｅｒｔ ｄ’Ｅｌｎｅ栽培品種）を、Ｄａｖｉｓら（１９８８）が記載した条件に従って、温室内で成長させた。Ｄａｉｅ（１９８７）が記載した技術に従って、成体の葉柄から師部束を単離した。
【０１４８】
細菌株および酵母
本研究では、下記の菌株を用いた：大腸菌株ＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４，ΔｌａｃＵ１６９ （φ８０， ｌａｃＺＭ１５）， ｈｓｄＲ１７， ｒｅｃＡ， ｅｎｄＡ１， ｇｙｒＡ９６， ｔｈｉ−１， ｒｅｌＡ１）（菌株はＣｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手できる）。ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびＳＯＬＲ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、標準的手法〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９〕に従って培養した。サッカロミセス・セレビシエＭａＤＨ４株（ｕｒａ３， ｔｒｐ１， ＬＥＵ２， ｇａｐ１−１， ｐｕｔ４−１， ｕｇａ４−１）（その調製は、以下に示す）は、酵母のマンニトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現し、ＡｇＭａＴ１のｃＤＮＡの機能的特徴付けに用いた。２ａ株は、Δα（ＭＡＴα， ｕｒａ３， ｔｕｒｐ１， ｌｅｕ２）〔Ｍａｒｃｉｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２〕とΣ２２５７４ｄ（ＭＡＴａ， ｕｒａ３−１， ｇａｐ１−１， ｐｕｔ４−１， ｕｇａ４−１）〔Ｊａｕｎｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８７〕株との交配によって得た。
【０１４９】
酵母中の発現ベクター
Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒら（１９９２）が記載したプラスミドＹＩＰ１２８Ａ１を用いた。酵母のマンニトールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＹＥＬ０７０）を、オリゴヌクレオチドＭＤＨＰＳＴ５（５−ＧＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＣＡＧＡＣＧＡＡＡＣＡＡＣ−３）およびＭＤＨＢＧＬ３（５−ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＡＣＴＴＧＧＴＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＣ−３）を用い、サッカロミセス属Δα株のゲノムＤＮＡ上でＰＣＲ（重合連鎖反応）によって増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｐｓｔ１およびＢａｍＨ１で予め消化しておいた、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫベクターにクローニングした。増幅された遺伝子の配列を確認するための配列決定の後、ＰＣＲ産物を、Ｐｓｔ１およびＸｂａ１で消化し、ＹＩＰ１２８Ａ１のＰｓｔ１／Ｘｂａ１部位にクローニングした。ｌｅｕ２遺伝子内のＥｃｏＶ部位によってサッカロミセス・セレビシエのゲノムに、構成を組み込んで、ＭａＤＨ４株を得た。
【０１５０】
５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ＰＣＲによるｃＤＮＡ末端の高速増幅）
Ｋａｙら（１９８７）の方法に従って、セロリ葉の総ＲＮＡを単離した。逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、配列ＬＬＧＦＧＶＧから誘導した縮重プライマー（５’−ＣＣＮＡＣＮＣＣ（Ｇ／Ａ）ＡＡＮＧＧＮＡ（Ｇ／Ａ）ＮＡ（Ｇ／Ａ）−３）で、第一ｃＤＮＡ鎖を総ＲＮＡから逆転写した。ＲＮアーゼＨ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）によってＲＮＡマトリックスを分解した後、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）によって、アンカープライマー（ｄＣ）１６を一本鎖ｃＤＮＡの３’末端に形成した。（ｄＧ）１６およびＬＬＧＦＧＶＧプライマーを用い、下記の条件下：９５℃で２分間、次いで、９５℃で２分間の変性、５５℃で２分間の固定、および７２℃で２分間の伸長を含む３０周期で、ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって分析し、次いで、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。
【０１５１】
セロリ師部のｃＤＮＡバンクの構築およびスクリーニング
Ｋａｙら（１９８７）が記載した方法に従って、師管束の総ＲＮＡを単離した。ポリＡ＋ＲＮＡを、ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔというｍＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。Ｕｎｉ−ＺａｐＸＲというファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に、一方向性ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩバンクを構築した。
【０１５２】
製造者のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従い、プローブとしての５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲの放射能標識化した生成物で、組換えファージ（９００，０００）をふるい分けた。ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎというナイロンフィルター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、標準的条件（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従い、４２℃で終夜ハイブリダイズした。次いで、フィルターを、０．１％ＳＤＳを有する２ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ；０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）中、４２℃で１５分間、次いで同じ培地中、しかし５０℃で１５分間、ならびに１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０℃で３０分間洗浄した。連続する３ターンのスクリーニングの間に陽性のシグナルを生じた、２４クローンに対して、ｉｎ ｖｉｖｏでの切開を実施した。特定されたｃＤＮＡを、部分的に配列決定した。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのサイトで、配列の比較を実施した。Ｔｍｐｒｅｄというプログラム〔Ｈｏｆｍａｎｎ ＆ Ｓｔｏｆｆｅｌ， １９９３〕によって、膜貫通領域を予測した。
【０１５３】
サッカロミセス・セレビシエにおけるＡｇＭａＴ１の発現
ＡｇＭａＴ１のｃＤＮＡを、酵母ベクターＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥ〔Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２〕のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位に結合した。このベクターは、酵母プロモーターＡＤＨ１の制御下で、ｃＤＮＡの発現を可能にする。Ｄｏｈｍｅｎら（１９９１）が記載したプロトコルに従って、ＭａＤＨ４酵母細胞を受容可能にさせ、形質転換させた。
【０１５４】
成長率の決定
２％グルコースまたは２％マンニトールのいずれかを含むＳＣ培地で、酵母培養体を増殖させた。アリコート画分を、培養体から規則的に採取し、その吸光度を６００ｎｍで測定した。
【０１５５】
マンニトールデヒドロゲナーゼ活性の決定
対数増殖期まで細胞を培養し、蒸留水で洗浄し、抽出緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５、１ｍＭＤＴＴ、および０．５％トリトンＸ−１００）中に８０％（重量／体積）として再懸濁させた。ガラスビーズによる渦流によって、細胞を破断した。遠心分離によって、細胞砕片を排除し、未精製抽出物を酵素アッセイに用いた。ＱｕａｉｎおよびＢｏｕｌｔｏｎ（１９８７）に従って、３０℃でマンニトールデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
【０１５６】
放射能標識化したマンニトールの輸送の測定
対数期の開始まで（０．６〜６００ｎｍの吸光度に対応）、細胞を培養し、蒸留水で洗浄し、２５ｍＭＭＥＳでｐＨ４．５に緩衝させたＳＣ培地に、１％（重量／体積）として再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコート画分１００μｌを、５００μＭの〔３Ｈ〕マンニトールを含有する溶液１００μｌ中で、６０、１２０、１８０および３００秒間温置した。４℃の水８ｍｌの添加、およびグラスファイバーフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）越しの濾過によって、反応を停止させた。酵母細胞に取り込まれた放射能を、液体シンチレーション（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いた計数によって決定した。阻害剤または競合剤による実験のためには、放射性マンニトールの前に、製品を３０秒間加えた。
【０１５７】
ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写後ポリメラーゼ連鎖増幅）によるＡｇＭａＴ１の発現の研究
Ｋａｙら（１９８７）の方法に従って、セロリ師部の総ＲＮＡを単離した。逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、オリゴｄＴプライマーによって、ｃＤＮＡの第一鎖を総ＲＮＡから逆転写した。ＲＮアーゼＨ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）によってＲＮＡマトリックスを分解した後、６６１ヌクレオチドのフラグメントの増幅を許す、プライマー５’（ＡＴＴＣＴＧＧＴＧＴＧＴＴＧＣＴＣＧ）および３’（ＣＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＴＧ）を用いて、ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ条件は、下記のとおりであった：９５℃で２分間、次いで、９５℃で３０秒間の変性、４７℃で１分間の固着化、および７２℃で４５秒間の伸長を含む３０周期。アガロースゲル電気泳動によって、ＰＣＲ産物を分析し、得られたシグナルの強さを、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０というソフトウェア（Ａｄｏｂｅ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）を用いて定量した。対照遺伝子としては、伸長因子ｅｌＦ４Ａ（１０）〔Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５〕を用いたが、その発現は、不変であった。
【０１５８】
結果
ＡｇＭａＴ１の分子クローニング
糖または代謝産物を輸送する一定数のタンパク質は、それらの配列に類似性を示す。これらの輸送タンパク質は、６カ所の膜貫通領域を有する祖先タンパク質の倍化から進化したことが示唆されている〔Ｍａｉｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７〕。第６および第１２膜貫通ドメイン、の末端のアミノ酸配列、それぞれＰＥＳＰＲおよびＰＥＴＫＧ〔Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９２〕のような、保存されたいくつかのアミノ酸領域を特定した。異なるグルコース担体（ＭＳＴ１、ＳＴＰ１、ＳＴＰ４、ＨＵＰ１、ＨＵＰ３、ＧＵＬＴ１）、Ｌ．ブレヴィスＬ． ｂｒｅｖｉｓのＤ−キシロース担体、大腸菌のアラビノース担体（ＡＲＡＥ）、大腸菌のガラクトース担体（ＧＡＬＰ）、および酵母のミオイノシトール担体（遺伝子ＩＴＲ１およびＩＴＲ２）の間の比較は、保存領域ＬＬＧＦＧＶＧを示した。この配列を、ＰＣＲ用の縮重５’ＲＡＣＥプライマーを設計するためのマトリックスとして選んだ。
【０１５９】
ｃＤＮＡの第一鎖を、成熟したセロリ葉の総ＲＮＡから、縮重プライマーＬＬＧＦＧＶＧで開始して逆転写した。増幅した後、１ｋｂの帯域を、アガロースゲル上で観察した。このＰＣＲ反応のすべてのフラグメントを、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、いくつかのクローンを得た。
【０１６０】
全クローンを得るために、成熟したセロリの葉柄から単離した、師部束を起源とするｃＤＮＡライブラリーを構築し、このライブラリーを、５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲクローンでふるい分けた。９００，０００の形質転換体をふるい分けた後、２４の陽性のクローンを特定した。約１．８〜２．０ｋｂの挿入断片を有する、陽性の形質転換体を選び、部分的に配列決定した。これらのクローンのうちの一つを、ＡｇＭａＴ１と呼び、詳しい分析のために選んだ。それは、５６ｋＤａと推計される分子量を有する、５１３アミノ酸を含むタンパク質をコードしている、読み取り枠を有する１７７８ｐｂを含んでいた。アミノ酸の推定される配列の水治法的分析は、ＡｇＭａＴ１が、１２の膜貫通ドメイン、および７７アミノ酸残基の長い親水性中央領域を有することを示している。ＡｇＭａＴ１のアミノ酸配列を、データベースのそれと比較し、この配列が、無数の生物の糖担体に関連することが見出された。アミノ酸の同一性の百分率は、約５０％に等しい。しかし、より多い百分率の同一性（６５％）が、サトウダイコンの二つの選択的な糖担体（Ｂｅｅｔ１およびＢｅｅｔ２）で見出された。Ｎ−グリコシル化共通配列の一部である、アスパラギン残基（Ａｓｎ３７２）は、外側に位置し、そのため、グリコシル化されなければならない。加えて、ＭＦＳの糖担体の下位群の共通する特徴である、共通配列が、ＡｇＭａＴ１に存在する。配列ＰＥＳＰＲＸＬおよびＰＥＴＱＧＲＸＸＸＥは、それぞれ、第６および第１２膜貫通ドメインの末端でか、または（Ｒ／Ｋ）ＸＧＲ（Ｒ／Ｋ）というモチーフが、第２と第３と、および第８と第９膜貫通らせんとの間に見出された〔Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９２〕。
【０１６１】
注記
クローニングの際に遭遇する主な困難は、そのような担体の特徴付けが、任意の生存生物中にも全く不在であることであった。事実、唯一のマンニトール担体は、マンニトールの輸送とリン酸化との双方を実施する、細菌のマンニトールホスホトランスフェラーゼである〔Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４〕。この併存系は、無数の基質に向けて細菌中に存在するが、真核生物には存在しない。しかし、最初の大方針に従って、マンニトールホスホトランスフェラーゼの遺伝子の膜貫通フィールドに相当する部分で、ｃＤＮＡバンクの最初のスクリーニングを実施した。このスクリーニングは、結果が得られるのを許さなかったが、それは、ＡｇＭａＴ１とマンニトールホスホトランスフェラーゼとの間の有意な相同性の不在によって、後になって正当化された。
【０１６２】
第二の大方針は、実用的ではないと判明したが、オリゴ糖類の担体を植物で特定するのに用いられたそれ（特許：ＥＰ ０，６４７，２７３）によって示唆された。これは、サッカロミセス・セレビシエの細胞を発現ベクター中のｃＤＮＡバンクで補うことからなる。酵母は、実際には、マンニトールを炭素源として利用できるが、マンニトールに対するかなり長い誘導期間を必要とする。既に指摘されたとおり、酵母で特定されたマンニトール担体は、皆無であった。その理由付けは、酵母が植物マンニトール担体を発現するならば、このことは、増殖の利点をそれに付与することになり、そのため、マンニトールを含有する培地で、より速く増殖したであろうということであった。このようにして、操作を実施したが、得られたｃＤＮＡのどれ一つとして、膜タンパク質の任意の特徴も示さず、実際は、転写因子に似ていた。実際の選別系は、担体ではなく、酵母遺伝子の発現に関与するｃＤＮＡが特定されるのを許した。
【０１６３】
上記の困難に直面して、本発明者らは、ありそうもない先験的な仮説を定式化したが、それによれば、マンニトール担体は、ＭａｒｇｅｒおよびＳａｉｅｒ（１９９３）が記載した糖質担体のスーパーファミリーの一部であると思われた。これを実施するため、マンニトール担体の存在が立証されていた〔Ｓａｌｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５〕一つの種、すなわちセロリを用い、より多く担体が発現される組織（師部）からｃＤＮＡバンクを構築した。第二段階は、得られたｃＤＮＡの、それらが酵母にマンニトールを輸送する可能性を与えられる能力による選別であった。これらの実験では、対照は、空発現プラスミドで形質転換された酵母の菌株であった。このようにして、ＡｇＭａＴ１のｃＤＮＡのマンニトール担体機能が立証された。
【０１６４】
この実験の間に、その他の配列が特定され：合計２４のクローンが得られた。これらのすべてのクローンのうち、担体の水治法像を示す二つを配列決定した。第一は、Ｍ２２（ＡｇＭａＴ１）であって、マンニトールを輸送できる能力を酵母に与えたが、第二のもの、すなわちＭ７は、それを与えなかった。
【０１６５】
細胞内マンニトールを代謝できる酵母の菌株の構築
酵母の、マンニトールを吸収かつ代謝できる能力を特徴付けるために、初期研究を実施した〔Ｑｕａｉｎ ＆ Ｂｏｕｌｔｏｎ， １９８７〕。ふるい分けたサッカロミセス・セレビシエの４０の多倍数体菌株のうち、その半数は、長期の適応後に、５％マンニトールでの充分な増殖を示した〔Ｑｕａｉｎ ＆ Ｂｏｕｌｔｏｎ， １９８７〕。その結果、酵母の異なる菌株について、それらがマンニトールを輸送かつ代謝できる能力について試験し、２菌株を得た。これは、初めに、マンニトールを唯一の炭素源として含有する培地における、増殖特性を分析することによって実施した。Σ２２５７４ｄは、一般に、アミノ酸の総合担体、およびプロリンの担体を欠き、マンニトールを唯一の炭素源として含有する培地では増殖できない。対照的に、Δαは、長期の適応後に、マンニトールで増殖することができた。適応後に、この菌株は、５％マンニトールを含有する固体培地で好成績で維持することができた。しかし、適応したΔα株の、グルコースを含有するにすぎない固体培地での維持は、適応した増殖の全体的欠失へと導いた。マンニトールでのそのような増殖適応は、おそらく、枢要な分解酵素、または輸送透過酵素の誘導によると思われる。以前の観察によれば、Δα酵母では、ＮＡＤ＋依存性Ｄ−マンニトールデヒドロゲナーゼを検出することができた（表１）。
【０１６６】
表１：異なる酵母菌株におけるマンニトールデヒドロゲナーゼの活性
２％グルコースまたは２％マンニトールを含有する液体培地中で、菌株を発育させた。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。ＮＤは、「検出されず」である。
【０１６７】
【表２５】
2004502461.tif 000026
【０１６８】
トリプトファンに対する栄養要求性を知るために、Δα株（Ｔｒｐ−）を、Σ２２５７４ｄ株（Ｔｒｐ＋）と交配した。マンニトールを含有する培地で増殖できない、酵母２ａを、トリプトファンおよびロイシンに対する栄養要求性によって選んだ。細胞２ａでは、マンニトールデヒドロゲナーゼ活性は全く検出されなかった（表１）。限定されたマンニトール加水分解活性を、酵母内部に導入することが必要であった。酵母マンニトールデヒドロゲナーゼの遺伝子のｃＤＮＡを、ＡＤＨ１プロモーターの制御下でＹＩＰ１２８Ａ１にクローニングし、それは、２ａのｌｅｕ２遺伝子に安定的な方式で組み込まれた。いくつかの形質転換体が、マンニトールデヒドロゲナーゼ活性を示した。最も有意な活性を有する菌株を、ＭａＤＨ４と呼び、その後の分析に用いた（表１）。
【０１６９】
ＡｇＭａＴ１タンパク質の異種発現
ＡｇＭａＴ１タンパク質の機能のその後の特徴付けには、酵母細胞のような異種系で、機能的な方式で、担体を発現することが必要であった。ＡｇＭａＴ１のｃＤＮＡを、Ｓ・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ１の遺伝子のプロモーター／ターミネーターボックスを有する、ＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥというシャトルベクターのＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ部位にサブクローニングした〔Ｒｉｅｓｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２〕。この構築で、適格なＭａＤＨ４細胞を形質転換し、ＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥを、対照として用いた。
【０１７０】
初めに、すべての構築を、唯一の炭素源としてのマンニトールで増殖できる能力について試験した。図１に示したとおり、空プラスミドのＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥで形質転換した、ＭａＤＨ４は、マンニトール上で増殖できなかった。ＡｇＭａＴ１を発現する細胞は、このポリオール上で非常に充分に増殖することができた。形質転換した細胞がマンニトールを輸送できる能力を直接試験するため、〔３Ｈ〕マンニトールを含有する培地中で、酵母細胞を数秒ないし数分間温置し、細胞を洗浄し、吸収された放射能を、電気的シンチレーション計数によって測定した。図２は、Ｓ・セレビシエの対照細胞におけるマンニトールの輸送が、無視し得ることを示す。しかし、ＡｇＭａＴ１を発現するＭａＤＨ４という酵母菌株は、マンニトールを含有する培地で増殖させたとき、〔３Ｈ〕マンニトールを高速度で輸送した。同じ結果は、グリセリンで増殖する形質転換酵母の細胞でも得られた（データは示さず）。
【０１７１】
ズルシトール、ソルビトール、キシリトール、ミオイノシトールのような、その他のポリオールは、マンニトールの吸収を半分にまで阻害できるように思われる。マンニトールのオシド形態である、マンノースは、ＡｇＭａＴ１によって認識されるように思われる。
【０１７２】
塩性ストレスの際のＡｇＭａＴ１の発現の変動
塩性ストレスに４週間〔３００ｍＭのＮａＣｌで毎日灌水、Ｎｏｉｒａｕｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００〕付した植物で、ＡｇＭａＴ１の発現を追跡した。これらの植物の師部とともに、対応する対照植物（ＮａＣｌを含まない水で灌水）のそれも取り出して、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施するのに用いた。対照植物の師部でのＡｇＭａＴ１の発現を、１００を基底として考えるならば、ＮａＣｌで処理された植物の師部におけるＡｇＭａＴ１の発現は、５００％であって、非常に有意な刺激を表し、セロリでの塩性ストレスにおけるＡｇＭａＴ１の役割に整合する。
【０１７３】
セロリの葉柄または葉の形質転換プロトコル
胚性細胞から再生させたセロリの植物体（高さ：約１０ｃｍ）を、形質転換用の植物材料として用いた。
【０１７４】
セロリ組織の接種
アグロバクテリアという細菌を、適切な抗生物質を加えたＬＢ培地（液体ブロス：１％トリプシン、０．５％酵母自己分解抽出物、０．５％ＮａＣｌ）中で撹拌しつつ、２８℃で２４時間培養した。
【０１７５】
セロリ植物体の葉柄を、約０．５ｃｍの切片に断片化した。各断片に対して、縦断切片を作成した。セロリの切片を、アグロバクテリア細菌の培養体の２５分の１を含有する、ＭＳ培地〔Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ〕１ｘ（正常な濃度、すなわち希釈なし）の液体中、環境温度で６０分間温置した。
【０１７６】
ＭＳ培地の組成
【０１７７】
【表２６】
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【０１７８】
次いで、過剰な細菌を、吸取り紙上に２〜３分間配置することによって、セロリ切片から除去した。
【０１７９】
セロリ切片およびアグロバクテリア細菌の同時培養
セロリ切片の形成層表面を、ゲロース化した再生培地ＲＭと接触させて放置した。ペトリ皿を、２５℃に空調した室に４８時間入れ、１６時間／８時間の明／暗周期に付した。
【０１８０】
アグロバクテリア細菌の排除
４８時間の同時培養の後、ＲＭ培地の皿からセロリ切片を取り出し、セホタキシムを２５０μｇ／ｍｌの最終濃度で強化した、ＭＳ１ｘ液に移した。６０分間温置した後、セロリ切片を、吸取り紙上で２〜３分間乾燥した。
【０１８１】
形質転換したセロリ植物体の再生
セロリ切片の形成層表面を、ゲロース化したカルス形成開始培地ＣＩＭと接触させて放置した。ＣＩＭのペトリ皿を、２５℃に空調した室に入れ、１６時間／８時間の明／暗周期に付して、カルスを発生させた（２〜３週間）。次いで、セロリ切片を、ゲロース化した器官形成誘導培地ＯＩＭに移した（２〜３週間）。芽が出現した後、これらを取り出し、ゲロース化した根付け培地ＲＭに乗せた（２〜３週間）。若いセロリのシュートの発生には、数週間（３〜４週間）が必要である。
【０１８２】
培地の組成
再生培地ＲＭ
【０１８３】
【表２７】
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【０１８４】
カルス形成開始培地（ＣＩＭ）
【０１８５】
【表２８】
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【０１８６】
器官形成誘導培地（ＯＩＭ）
【０１８７】
【表２９】
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【０１８８】
根付け培地（ＲＭ）
【０１８９】
【表３０】
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【０１９０】
【表３１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
タンパク質の配列ＡｇＭａＴ１を発現する酵母ＭａＤＨ４の増殖試験を示すグラフである。ＡｇＭａＴ１のｃＤＮＡを、プロモーターＡＤＨ１の制御下で、ＭａＤＨ４株の細胞に導入し、形質転換した細胞のマンニトールでの増殖を調べた。形質転換した細胞は、２％グルコース（ＳＣ−ｇｌｕ）または２％マンニトール（ＳＣ−ｍａｎｎ）のいずれかを含有する、トリプトファンなしのＳＣ（合成完全）液体培地で増殖させた。
ＭａＤＨ４−ＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥ：空プラスミドを含むＭａＤＨ４；
ＭａＤＨ４−ＡｇＭａＴ１：ＡｇＭａＴ１の核酸を有するプラスミドを含むＭａＤＨ４；
白い方形は、空プラスミドＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥ（以下で定義される）で形質転換させ、ＳＣ−グルコース培地で増殖させたＭａＤＨ４酵母に相当する。
黒い方形は、空プラスミドＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥ（以下で定義される）で形質転換させ、ＳＣ−マンニトール培地で増殖させたＭａＤＨ４酵母に相当する。
白い円形は、ＡｇＭａＴ１／ＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥ（ＡｇＭａＴ１の核酸を有するプラスミドＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥ）で形質転換させ、ＳＣ−グルコース培地で増殖させたＭａＤＨ４酵母に相当する。
黒い円形は、ＡｇＭａＴ１／ＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥ（ＡｇＭａＴ１の核酸を有するプラスミドＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥ）で形質転換させ、ＳＣ−マンニトール培地で増殖させたＭａＤＨ４酵母に相当する。
曲線は、酵母培養体の（６００ｎｍでの）吸光時間による変化を表す。吸光度のこの上昇は、実際は、培地中の酵母の数の増加に対応し、酵母の増殖率を表している。したがって、グルコース上では、プラスミドＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥおよびＡｇＭａＴ１／ＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥで形質転換した酵母が増殖するが、マンニトール上では、ＡｇＭａＴ１／ＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥプラスミドで形質転換した酵母のみが増殖できるにすぎない。
【図２】
サッカロミセス・セレビシエの細胞内のマンニトールの吸光を示すグラフである。マンニトール３Ｈの外部濃度は、５００μＭであり、ｐＨは、４．５であった。方形は、ＡｇＭａＴ１の核酸で形質転換した細胞における吸光を表すのに対して、円形は、空ＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥプラスミドで形質転換した対照細胞における吸光を表す。ＡｇＭａＴ１／ＹＥＰ１１２Ａ１ＸＥプラスミドで形質転換した細胞のみが、外部培地中に置かれたマンニトール３Ｈを吸収できた。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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