(57)【要約】本発明は親水性ポリマーおよび固定化プロテオロドプシンを含む物質、およびそのような物質の光学情報担体としての使用に関する。該物質は、固形に固化する前にプロテオロドプシンと均一相を形成可能な1またはそれ以上の親水性ポリマーを含む。親水性ポリマーは例えば、シリカゾル-ゲル、ゼラチン、ポリビニルアルコール、アガロース、寒天、メチルセルロース、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールまたはそれらの混合物である。固定化プロテオロドプシンを有する固形物は、ガラス、紙、金属、繊維素材、プラスチック素材からなる群より選択される基質上に沈着させ、光学データ記憶物質または詐欺防止用担体として使用する。本発明はさらに、プロテオロドプシンおよび1またはそれ以上の親水性ポリマーを含む安全インキを提供する。
2006515683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定化プロテオロドプシンを有する固形物を含む、光学情報担体。
【請求項２】
ガラス、紙、金属、繊維、プラスチックからなる群より選択され、前記固形物が沈着している基質をさらに含む、請求項１に記載の光学情報担体。
【請求項３】
詐欺防止用データ担体または光学データ記憶物質である、請求項１に記載の光学情報担体。
【請求項４】
前記固形物が、固形に固化する前にプロテオロドプシンと均一相を形成可能な、1またはそれ以上の親水性ポリマーを含む、請求項１に記載の光学情報担体。
【請求項５】
親水性ポリマーが、シリカゾル-ゲル、ゼラチン、ポリビニルアルコール、アガロース、寒天、メチルセルロース、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項４に記載の光学情報担体。
【請求項６】
親水性ポリマーがポリアクリルアミドである、請求項４に記載の光学情報担体。
【請求項７】
親水性ポリマーが、シリカゾル-ゲル、ゼラチンおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される、請求項１に記載の光学情報担体。
【請求項８】
前記固形物の形態がフィルムまたは厚い成型物である、請求項１に記載の光学情報担体。
【請求項９】
消去可能な画像を作成する、請求項１に記載の光学情報担体。
【請求項１０】
固定化プロテオロドプシンの色が、プロテオロドプシンの励起波長光の照明によって変化する、請求項３に記載の詐欺防止用物質。
【請求項１１】
少なくとも2つの固形物を含み、それぞれの固形物が異なる最大吸収波長を持つ固定化プロテオロドプシンを含む、詐欺防止用物質。
【請求項１２】
モノマーまたはオリゴマー型で室温で少なくとも1ヶ月間安定な固定化プロテオロドプシンを有する固形物を含む、光学情報担体。
【請求項１３】
固形物が、固形に固化する前にプロテオロドプシンと均一相を形成可能な、1またはそれ以上の親水性ポリマーを含む、請求項１２に記載の光学情報担体。
【請求項１４】
親水性ポリマーが、シリカゾル-ゲル、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、アガロース、寒天、メチルセルロース、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドンおよびポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項１３に記載の光学情報担体。
【請求項１５】
プロテオロドプシンおよび1またはそれ以上の親水性ポリマーを含み、該プロテオロドプシンおよび親水性ポリマーが均一な液相を形成している安全インキであって、該インキが表面に塗布された後に固化または乾燥することによって、インキを塗布した特定位置にプロテオロドプシンが固定化される安全インキ。
【請求項１６】
親水性ポリマーが、アラビアゴム、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドンである、請求項１５に記載の安全インキ。
【請求項１７】
親水性ポリマーおよび固定化プロテオロドプシンを含む固形物を調製する方法であって、以下の段階を含む方法：
親水性ポリマーまたはその前駆体とプロテオロドプシンを水溶液に混合して均一な溶液を調製する、および、
該溶液を固化し、プロテオロドプシンを親水性ポリマー内に固定化する。
【請求項１８】
固定化プロテオロドプシンを含むポリビニルアルコール物質を調製する方法であって、以下の段階を含む方法：
ポリビニルアルコール、pH3から12の緩衝液およびプロテオロドプシンを混合して溶液を調製する、
該溶液を固形物上に分散させる、および、
該溶液を乾燥させて固定化プロテオロドプシン含有物質を形成する。
【請求項１９】
固定化プロテオロドプシンを含むポリアクリルアミド物質を調製する方法であって、以下の段階を含む方法：
アクリルアミド、ビスアクリルアミド、膜を含まないプロテオロドプシンおよび1またはそれ以上の重合開始剤またはUV誘導性重合剤をpH3から12の緩衝液に混合する、および、
アクリルアミドゲルを重合させる、
該方法により、プロテオロドプシンがポリアクリルアミドゲルマトリックスに固定化される。
【請求項２０】
固定化プロテオロドプシンを含むゾル-ゲルを調製する方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)  シラン前駆体にpH1.5から4の酸性溶液を加えてシラン前駆体を加水分解し、ケイ酸塩ゾルを形成させる、
(b)  ケイ酸塩ゾルに約pH5から9のプロテオロドプシンを含む水溶液を加える、および、
(c)  (b)をインキュベートしてゲル形成させる、
該方法により、プロテオロドプシンがゾル-ゲルマトリックスに固定化される。
【請求項２１】
シラン前駆体が、テトラアルキルオルトケイ酸塩、アルキルトリアルコキシシラン、アリルトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、ジアリルジアルコキシシラン、アルカリ金属ケイ酸塩、ポリオールケイ酸塩、ポリオールシロキサン、ポリ(メチルケイ酸塩)またはアルコール非含有ポリ(ケイ酸)である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
シラン前駆体がテトラメチルオルトケイ酸塩またはテトラエチルオルトケイ酸塩である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
シラン前駆体がポリ(グリセリル)ケイ酸塩である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
固定化プロテオロドプシンを含むゼラチンを調製する方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)  水または緩衝液にゼラチンを加熱溶解させ、均一なゼラチン水溶液を調製する、
(b)  ゼラチン溶液を約39から45℃に冷却する、
(c)  冷却したゼラチン溶液をプロテオロドプシンと混合する、および、
(d)  (c)をインキュベートしてゲル形成させる、
該方法により、プロテオロドプシンがゼラチンゲルマトリックスに固定化される。
【請求項２５】
3次元光学データ記憶物質を作製する方法であって、固定化プロテオロドプシン含有物質をブロックに成型し、厚みのある光学データ記憶物質を作製する方法。
【請求項２６】
固定化プロテオロドプシンを含む物質上に情報を光学的に記憶する方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)  記憶する光学情報を表す第一のスペクトル領域光を、固定化プロテオロドプシン含有物質上に配光する、
(b)  固定化プロテオロドプシン含有物質の選択部分を露出して、プロテオロドプシンを基礎状態からM状態に変換する、および、
(c)  該物質に、記憶した光学情報を表す光学画像を保存する、
ここで、該保存された画像は、吸収スペクトルが第二のスペクトル領域に変化したM状態物質を含む。
【請求項２７】
第二のスペクトル領域光を該物質上に配光してM状態の物質を基礎状態に戻し、光学画像を消去する段階をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
情報を記憶する3次元の光学画像を作成する方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)  記憶する光学情報を表す第一のスペクトル領域光を、固定化プロテオロドプシンを含む3次元の光学情報記憶物質上に配光する、
(b)  光学情報記憶物質の選択位置および層を露出して、プロテオロドプシンを基礎状態からM状態に変換する、および、
(c)  該物質に、記憶した光学情報を表す3次元の光学画像を作成する、ここで、該作成した画像は、吸収スペクトルが第二のスペクトル領域に変化したM状態の物質を含む。
【請求項２９】
光源、および固定化プロテオロドプシンを有する固形物を含む光学データ情報担体を含み、該光源が記録光を出し、プロテオロドプシンを基礎状態からM状態に変換する光学データ記憶装置。
【請求項３０】
M状態から基礎状態に変換する消去光を出す第二の光源をさらに含む、請求項２９に記載の光学データ記憶装置。
【請求項３１】
詐欺防止用物質を調製する方法であって、以下の段階を含む方法：
(a)  プロテオロドプシンおよび1またはそれ以上の親水性ポリマーを含む均一な液状インキを調製する、
(b)  該インキを物質上に分散させる、および、
(c)  該インキを乾燥させる、ここでインキが詐欺防止性能を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性ポリマーおよび固定化プロテオロドプシンを含む物質、およびその物質の光学情報担体としての使用に関する。特に、固定化プロテオロドプシンの光学データ記憶物質または詐欺防止用光学データ担体としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオロドプシン(BR)は、ハロバクテリウム・サリナリウム(Halobacterium salinarium)という塩性沼沢細菌の光合成系に存在するレチナールタンパク質分子である。BR分子は、タンパク質と脂質の二次元配列を形成し一般に紫膜と呼ばれる細胞膜に位置する。光学データを記憶するバクテリオロドプシン(BR)のようなフォトクロミックタンパク質は将来有望であると考えられている。BRを基礎とする光学フィルムが過去二十年に渡って研究されてきたが、それらにはデータ記憶媒体として商業的利用に必要な特性が欠けている。BRを基礎とするフィルムの問題の一つは、BRが0.2から1μmの大きさのタンパク質−脂質のパッチを形成することである。BRをこのパッチから抽出し、モノマータンパク質を形成させると、数日で安定性を失い、失活してしまう。光学フィルムにBRのパッチを用いるにあたっての問題点は、そのパッチが、フィルムに作用させる光の波長とおよそ同じ大きさであることである。これにより、データの読み書きサイクル中に光がかなり散乱してしまい、その結果ノイズが増大し、フィルムの性能が低下する。それに加え、BRのパッチは互いにくっつき合う傾向があるため、フィルム上にBRタンパク質が不均一に分布することになり、BRを基礎とする光学フィルムの性能がさらに低下してしまう。
【０００３】
BRの別の問題点は、大量生産に費用がかかることである。BRに完全な機能性を持たせるには、起源のハロバクテリウム・サリナルム(H. salinarum)から発現させねばならない(Dunn, et al., J Biol Chem, 262: 9246-9254 (1987)、Hohenfeld, et al., FEBS Lett, 442: 198-202 (1999))。ハロバクテリウム・サリナルムは非常にゆっくり成長し、細胞密度も低く、成長培地に大量の塩を必要とする。ハロバクテリウム・サリナルムの生産性が低く、また成長培地の塩濃度の高さに耐え得る発酵・回収装置を特注するのに高額な費用が必要なため、BRの生産費用は高くなる。
【０００４】
プロテオロドプシン(PRs)はバクテリオロドプシンとは遠縁である(配列一致度22から24％)。プロテオロドプシンは膜内在性タンパク質であり、非培養の海生真正細菌から単離され、光駆動プロトンポンプとして機能する。全トランス型レチナール補助因子が光を吸収すると、プロテオロドプシンは多くの中間体を経て光反応サイクルを通過する。プロテオロドプシン分子が光刺激により励起すると、プロテオロドプシン/レチナール複合体は不安定な中間エネルギー状態に励起するとされている。プロテオロドプシンは、様々なエネルギープラトーまたはエネルギー中間体、例えば、「M様状態」または「M状態」、「K様状態」または「K状態」、「N様状態」または「N状態」、または「O様状態」または「O状態」を含む、一連の不安定なエネルギー状態を経て進行する。やがて、プロトン輸送の進行に連れ、複合体はより安定な基礎状態(basal state)に戻る。
【０００５】
プロテオロドプシンとバクテリオロドプシンは、異なるタンパク質ファミリーに属している。両タンパク質はいくつかの性質は同じであるが、明らかに異なる特性も持っている。プロテオロドプシンは発現、生産が容易であるので、いくつかの技術に適用する際にバクテリオロドプシンよりも有利である。プロテオロドプシンは、迅速に大量のタンパク質を発現できる細菌宿主であるE. coliで、機能性を持って発現させることができる。このように、プロテオロドプシンは、バクテリオロドプシンよりも、経済的且つ効率的に生産できる。
【０００６】
Beja, et al. (Science 289:1902-6, 2000)は、海生γ-プロテオバクテリア(すなわち、「SAR86」グループ)の非培養メンバーからプロテオロドプシン遺伝子をクローニングしたことを開示した。プロテオロドプシンはE. coliで機能性を持って発現し、全トランス型レチナールと結合して活性な光駆動プロトンポンプを形成した。
【０００７】
Beja, et al. (Nature 411:786-9, 2001)は、20より多くのプロテオロドプシン遺伝子変異体を様々な起源からクローニングしたことを開示した。これらのプロテオロドプシン変異体は、全世界に渡って分布し、様々な波長に最大吸光を示す広範なプロテオロドプシン変異体ファミリーに属すると思われる。
【０００８】
Dioumaev, et al. (Biochemistry, 42: 6582-6587 (2003))は、プロテオロドプシン含有膜断片をポリアクリルアミドゲルに閉じこめたものを、閃光光分解および可視域内の吸光変化の測定に用いたことを開示した。
【０００９】
光学データ記憶は、記憶容量が非常に多く、データの読み書きも素早く行えるので、コンピュータ工学に大変革をもたらす可能性がある。さらに、光学信号処理を用いると、近年のコンピューティング技術では難しいパターン認識が、かなり忠実な形で行える可能性がある。この方法を実現するには、光の散乱が少ない有効な光学物質を用いる必要がある。
【００１０】
紙幣、小切手、身分証明書などのような紙には、しばしば複製または偽造しにくくするための安全対策がとられている。これらのほとんどは、紙を製造する段階で透かしを入れるなどの対策が施された特別紙を使用するか、複製の難しい非常に細い線模様を印刷するかのどちらかに基づいている。しかし、それらの特徴は絶えず人目にさらされており、セキュリティー要件を満たしていない。
【００１１】
効率的且つ経済的に生産でき、バックグラウンドノイズの少ない光学情報担体が必要である。そのような光学情報担体は、光学データ記憶物質または詐欺防止用光学データ担体として有効である。
【発明の開示】
【００１２】
［発明の概要］
本発明は、固定化プロテオロドプシンを有する固形物を含む光学情報担体を対象とする。その固形物は、固形に固化する前にプロテオロドプシンと均一相を形成可能な1またはそれ以上の親水性ポリマーを含む。その親水性ポリマーは例えば、シリカゾル-ゲル、ゼラチン、ポリビニルアルコール、アガロース、寒天、メチルセルロース、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールまたはそれらの混合物である。
【００１３】
固定化プロテオロドプシンを有する固形物は、ガラス、紙、金属、繊維素材、プラスチックなどの基質上に沈着している。例えば、固定化プロテオロドプシンは、紙、ディスク、カードの上に沈着させるか、または型により成型することが可能であり、光学データ記憶物質または詐欺防止用担体として利用できる。
【００１４】
光学データ記憶物質としては、界面活性剤で可溶化したモノマーまたはオリゴマー型のプロテオロドプシンが好ましい。PRのモノマーまたはオリゴマー型は室温で少なくとも1ヶ月間、または4℃で1年間安定である。界面活性剤で可溶化したプロテオロドプシンを含む光学データ記憶物質は、光の散乱を起こさず、それゆえ良好なノイズ対信号比が得られる点で有利である。
【００１５】
本発明は親水性ポリマーおよび固定化プロテオロドプシンを含む固形物を調製する方法を提供する。その方法には、親水性ポリマーまたはその前駆体とプロテオロドプシンを水溶液に混合して均一な溶液を調製し；そして、その溶液を固化し、プロテオロドプシンを親水性ポリマー内に固定化する段階が含まれる。固化には、重合、冷却、乾燥または硬化過程が含まれる。
【００１６】
本発明はさらに、プロテオロドプシンおよび1またはそれ以上の親水性ポリマーを含み、そのプロテオロドプシンと親水性ポリマーが均一な液相を形成している安全インキであって、該インキが表面に塗布された後に固化または乾燥することによって、インキを塗布した特定位置にプロテオロドプシンが固定化される安全インキを提供する。
【００１７】
一態様において、本発明は光学情報担体に適する物質を提供する。特に、その物質は光学データ記憶物質または詐欺防止用光学データ担体として適している。
【００１８】
一態様において、本発明は光学情報の処理および記憶に適する物質を提供する。
【００１９】
一態様において、本発明は分子情報を記憶および処理するための安定化中間状態(M状態)を提供する。
【００２０】
一態様において、本発明は、光学データの記憶(書き込み)に用いる物質であって、データを非破壊的に検出する(読み取る)間データを保持することができ、データを光学的に消去した後も再利用可能な物質を提供する。
【００２１】
一態様において、本発明は、2次元および3次元様式の両方で光学メモリーシステムに記憶した情報を、非破壊的に読み取る方法を提供する。
【００２２】
一態様において、本発明は偽造者にとって模倣が困難な情報担体物質を提供する。
【００２３】
一態様において、本発明は光に曝すと色が変化する詐欺防止用インキを提供する。
【００２４】
［略語］
CAPS：3-(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸
CHES：2-(N-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸
EDTA：エチレンジアミンテトラアセテート
IPTG：イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド
MES：2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸
TRIS：トリスヒドロキシメチルアミノエタン
PR：プロテオロドプシン
【発明の詳細な説明】
【００２５】
本発明は固定化プロテオロドプシンを有する固形物を含む光学情報担体を提供する。その固形物は、プロテオロドプシン分子が固形物内に均等に分布するように、固形に固化する前にプロテオロドプシンと均一相を形成可能な1またはそれ以上の親水性ポリマーを含む。「均一」なる用語は、プロテオロドプシンおよび親水性ポリマーまたはその前駆体が、混合物内で一様な構造または組成物を形成していることを意味する。
【００２６】
親水性ポリマーは、非-不透明または光学的に透明な固形物を生成するため、効率的な光励起が可能である。
【００２７】
本発明に適する親水性ポリマーには、シリカゾル-ゲル、ゼラチン、ポリアクリルアミド、アラビアゴム、寒天、カラゲナンカルシウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸の他の塩、アルギン、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸、部分的に交差結合したポリアクリル酸、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ペクチンおよびそれらの混合物などがある。
【００２８】
ビニルポリマーおよびその誘導体も本発明に有用である。ポリビニルアルコール(PVA)は同種重合体または共重合体と定義されるものであり、酢酸ビニルが開始モノマー単位であり、そのほとんどまたは全て(70-100％)のアセテート部分が、後にアルコール分子に加水分解される。本発明に有用な他のビニルポリマーには、ポリ酢酸ビニルおよびポリビニルピロリドンが含まれるが、これらに限定されない。PVA-メタクリル酸メチル共重合体などの共重合体も、本発明に用いることができる。広範囲の分子量や粘性の、ポリ酢酸ビニル前駆体から様々な度合いで加水分解されたPVAが、商業的に利用可能である。
【００２９】
本発明に有用な他のポリマーには、カルボポール(Carbopol(登録商標))、酸性カルボキシポリマー、シアナメイ(Cyanamey)-O ポリアクリルアミド、交差結合したインデン-無水マレイン酸ポリマー、ポリオックス(Polyox(登録商標))ポリエチレンオキシドポリマー、デンプングラフト共重合体(starch graft copolymers)、ジエステル交差結合ポリグルカンなどの縮合グルコース単位からなるアクア-キープソ(Aqua-Keepso)アクリル酸ポリマー多糖体などのようなヒドロゲルを形成するポリマーが含まれる。ヒドロゲルを形成する代表的なポリマーは、米国特許第3,865,108号、4,002,173号、4, 207,893号、およびScott、Roff著、オハイオ州、クリーブランドのChemical Rubber Company出版、一般的ポリマーハンドブック(Handbook of Common Polymers)に記載されている。
【００３０】
本発明は、固定化プロテオロドプシンを含有する固形物を含む光学情報担体を提供する。その固形物の厚さは、3次元目よりも2次元の長さの桁が大きい薄い沈着層から、全次元が同程度の桁の長さである厚い成型物に至るまで、様々である。本明細書で用いる「固定化」とは、プロテオロドプシンが移動性でなく、物質中に固定されていることを意味する。プロテオロドプシンとその物質間の相互作用は、共有結合性または非共有結合性であり得る。例えば、プロテオロドプシンをその物質中に物理的に封入することができる。プロテオロドプシンはまた、静電荷、水素結合、疎水性、親水性またはファンデルワールス力の相互作用によってその物質と結合し得る。固定化することにより、プロテオロドプシン分子はその固形物内に固定され、固形物内で拡散しないか、または非常にゆっくりと拡散するようになるため、プロテオロドプシン分子の拡散によって光学信号が失われるようなことはない。
【００３１】
光学情報担体としてプロテオロドプシンを用いる利点の一つは、プロテオロドプシンが、E. coliで機能性を持って発現でき、経済的且つ効率的に大量(グラムまたはキログラム)のタンパク質を生産できることである。プロテオロドプシン発現細胞を溶解させ、膜画分を含むペレットを回収する。界面活性剤で可溶化することにより、プロテオロドプシンタンパク質を膜からさらに抽出することができる。プロテオロドプシンまたは精製したプロテオロドプシンタンパク質を含む膜または膜画分は、親水性ポリマー内に固定化でき、光学データ記憶物質または詐欺防止用データ担体のような光学情報担体として利用できる。
【００３２】
光学データ記憶物質としては、界面活性剤で可溶化され、膜から分離したプロテオロドプシンを固定化して光の散乱を防ぐのが望ましい。界面活性剤で可溶化したプロテオロドプシンは、大抵モノマーであるが、時折オリゴマー(ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマーまたはヘキサマー)の形をとることがある。バクテリオロドプシンとは異なり、プロテオロドプシンタンパク質はモノマーまたはオリゴマーの状態で、室温で少なくとも1ヶ月または4℃で1年間安定である。「安定」なる用語は、プロテオロドプシンのスペクトル特性が有意には変化せず(最大吸収波長の変化は30nmより少ない)、基礎状態からM状態への遷移のような光励起が起こると光反応サイクルが生じることを意味する。比較として、熱変性したPRは480から530nmの範囲内に吸収ピークを持たない。熱変性したPR分子は有効な光反応サイクルを作らず、340から440nm、しばしば350から430nm、より多くは360から420nmに最大吸収波長を持つ。
【００３３】
本明細書に用いられる「基礎状態」または「B状態」または「B様状態」なる用語は、プロテオロドプシン分子の光反応サイクルの光励起していない基礎状態を意味し、基礎状態のプロテオロドプシン変異体の吸収極大は一般的に480nmから530nm、しばしば488から526nmの間にある。「M状態」または「M様状態」は、光反応サイクルにおいて基礎状態に比べて励起したスペクトル状態を意味し、M状態のプロテオロドプシン変異体の吸収極大は一般的に350nmから450nmの間、しばしば約410nmである。M状態は、基礎状態と比較して吸収スペクトルが赤よりにシフト(例えば＞530nm)している他の特定スペクトル状態、K、NおよびO様状態とは区別される。
【００３４】
プロテオロドプシンが励起波長光に曝されると、活性化M状態に励起し、黄色に変化する。その黄色は、時間とともに、もしくは第2光に曝すことにより、基礎状態の色に戻る。例えば、プロテオロドプシン含有物質は黄色光または緑色光で励起し、赤または紫色から黄色に変化するが、自然に、もしくは紫色または青色の光を当てると、その色変化は消去される。顔料または有機色素を基礎とした従来のインキでは、この色変化を模倣することは不可能である。プロテオロドプシン物質はこのような色変化特性を持つため、偽造者による模倣が困難なのである。
【００３５】
プロテオロドプシンモノマーの個々の大きさは約50nmであるが、このように小さいと可視光の散乱は起こらない。プロテオロドプシンがモノマーまたはオリゴマー状態で安定であり、光を散乱するμm規模の粒子が存在しない点が、光学データ記憶物質成分として望ましいところである。さらに、プロテオロドプシンモノマーが小さいため、光学データ記憶物質内でタンパク質を容易に均等分布させることができる。490から550nm波長光に曝すと、プロテオロドプシンのレチナール残基の立体配置に変化が起こる。この配置変化は、熱的および光化学的に可逆性である。
【００３６】
本発明は、親水性ポリマーまたは親水性ポリマーの混合物内に固定化プロテオロドプシンを含有する固形物を調製する方法を提供する。その方法では第一段階として、親水性ポリマーまたはその前駆体とプロテオロドプシンとを水または水性緩衝液内に混合して均一な溶液を調製し、その後ポリマーを固化すると、プロテオロドプシン分子がポリマー内に固定化される。ポリマーの固化は乾燥、冷却、硬化または重合によって行う。本発明はポリビニルアルコール内に固定化プロテオロドプシン含有物質を調製する方法で例示される。その方法には以下の段階が含まれる：(a)ポリビニルアルコール、水またはpHが約3から12の緩衝液、およびプロテオロドプシンを混合して溶液にし、(b)その溶液を固体表面に塗布し、そして(c)溶液を乾燥させ、固定化プロテオロドプシン含有ポリビニルアルコール物質を形成させる。
【００３７】
本発明はまた、固定化プロテオロドプシンを含有するポリアクリルアミド物質を調製する方法で例示される。その方法には以下の段階が含まれる：(a)アクリルアミド、ビスアクリルアミド、膜から分離したプロテオロドプシンおよび1またはそれ以上の重合開始剤を水またはpHが3から12の緩衝液に混合し、(b)アクリルアミドゲルを重合させ、プロテオロドプシンをポリアクリルアミドゲルマトリックス内に固定化する。一般に用いられる重合開始剤には、過硫酸アンモニウムおよびN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)などがある。別法として、以下の段階を含む方法もある：(a)アクリルアミド、ビスアクリルアミド、膜から分離したプロテオロドプシンおよび1またはそれ以上のUV活性化遊離基発生剤を水またはpH3から12の緩衝液に混合し、そして(b)その混合物をUV光に曝してアクリルアミドゲルを重合させる。UV活性化遊離基発生剤には、リボフラビンおよびTEMED(同時に用いる)、2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン(DMPA)、およびスウェーデン特許第96047-3号に記載のものなどがある。
【００３８】
本発明はさらに、固定化プロテオロドプシンを含有するゾル-ゲルを調製する方法で例示される。その方法には以下の段階が含まれる：(a)シラン前駆体にpH1.5から4の酸性溶液を加えてシラン前駆体を加水分解し、ケイ酸塩ゾルを形成させ、(b)ケイ酸塩ゾルにpHが約5から9のプロテオロドプシン含有水溶液を加え、そして(c)(b)をインキュベートしてゲル形成させ、プロテオロドプシンをゾル-ゲルマトリックス内に固定化する。シラン前駆体には、テトラアルキルオルトケイ酸塩、アルキルトリアルコキシシラン、アリルトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、ジアリルジアルコキシシラン、アルカリ金属ケイ酸塩、ポリオールケイ酸塩、ポリオールシロキサン、ポリ(メチルケイ酸塩)およびアルコール非含有ポリ(ケイ酸)などがある。好ましいシラン前駆体は、テトラアルキルオルトケイ酸塩およびポリ(グリセリル)ケイ酸塩である。
【００３９】
加えて本発明は、固定化プロテオロドプシンを含有するゼラチンを調製する方法で例示される。その方法は以下の段階を含む：(a)ゼラチンを水または緩衝液中で加熱溶解して均一なゼラチン水溶液を調製し、(b)ゼラチン溶液を約39から45℃に冷却し、(c)冷却したゼラチン溶液をプロテオロドプシンと混合し、そして(d)(c)をインキュベートしてゲル形成させ、プロテオロドプシンをゼラチンゲルマトリックス内に固定化する。
【００４０】
固定化プロテオロドプシン含有物質は、光学データ記憶物質として用いる書類、ディスクおよびカードの表面に塗布または散布することができる。一態様において、該物質は容積測定データ記憶装置またはホログラフィックデータ記憶装置に用いることができる。容積測定データ記憶装置は3Dデータ記憶装置の一種であり、そこではデータを記録している物質の厚み部分が多数のバーチャルプレーンに分割されており、それぞれが記憶データを保有している。従って、容積測定データ記憶装置は2D記憶装置のスタックに相当する。ホログラフィックデータ記憶装置は別のタイプの3Dデータ記憶装置で、そこではフィルムの厚み部分は搭載データと参照光の3D干渉縞の記録に利用されている。
【００４１】
固定化プロテオロドプシン含有物質は、ガラス、紙、繊維素材、プラスチック素材の表面、金属の表面または鉱物の表面上に塗布、散布、固化、印刷、沈着または乾燥して詐欺防止用データ担体として用いることができる。
【００４２】
固定化プロテオロドプシン含有物質はまた、型で成型して3次元の光学記憶物質または詐欺防止用データ担体にすることができる。
【００４３】
本発明は、固定化プロテオロドプシンを有する固形物およびその固形物がその表面に沈着するガラス、紙、金属、繊維素材、プラスチック素材などの基質を含む光学情報担体を提供する。例えば、その基質はディスク、カードまたは書類である。本発明の一態様において、その固形物は、固形に固化する前にプロテオロドプシンと均一相を形成可能な1またはそれ以上の親水性ポリマーまたはその前駆体を含む。
【００４４】
本発明の光学情報担体は、二次元フィルムとも呼ばれる薄いフィルムまたは膜の形態を取る場合、または3次元の層またはブロックとも呼ばれる厚いフィルムの形態を取る場合がある。そのように生産した光学情報担体は、光に曝すと基礎状態からM状態へ変換するプロテオロドプシン分子を含む。
【００４５】
pH8から12のようなアルカリ性のpHを持つ光学情報担体は、光誘導性M状態の減衰を遅らせ、その結果、M状態が安定化し、室温でも持続性の光学画像をPR含有フィルム上に刷り込むことが可能になる。pHがアルカリ性であると、M状態の寿命を延ばすことができるので、光学データの記憶に効果的である。データの記憶に望ましい時間は適用する目的に依拠し、数秒、数分、数時間、数日、数ヶ月から数年まで多義に渡る可能性がある。詐欺防止に適用する場合は、M状態の寿命が短い(数秒から数分)のが好ましい。
【００４６】
プロテオロドプシン含有物質の特定領域を、多色性の黄色または緑色光(例えば、450nmカットオンフィルターを通したハロゲンランプからの光)、または単色性の緑色光(例えば、波長532nmの半導体励起固体倍頻度(DPSSFD)緑色レーザー光)に短時間曝すことにより、データが本発明の光学情報担体に光学的に書き込まれる。その光に曝した領域が黄色になると、プロテオロドプシンが活性化M中間体に変換されたということである。これが、プロテオロドプシン含有物質にデータを書き込む操作に当たる。フィルムに書き込まれた光学データを読み取る方法に、フィルムの様々な領域の色を(例えばビデオレコーダーを用いて)観察する方法がある。
【００４７】
光に曝さないでいると、プロテオロドプシン含有物質は約1、2分で徐々に基礎色へと戻った。励起(黄色)状態のプロテオロドプシン含有物質を短時間(約1秒以下)紫色の光(例えば456nmカットオフフィルターを通したハロゲンランプからの光)または青色の光(例えば青色発光ダイオード(LED)からの光)に曝すと、プロテオロドプシン含有物質の色は基礎色に戻った。これは、フィルムに刷り込んだ光学信号が素早く消去されたことを現している。このサイクルは繰り返すことができるので、これにより書き込み、読み取り、消去および再書き込みが可能な光学物質を提供することができる。
【００４８】
フィルム上に形成された画像は、あらゆる種類の情報を表すことが可能であり、その情報はフィルム内の個々のPR分子上のデータの点の集合として形作ることができる。フィルム内のPR分子数が多いほど、光学密度(O.D.)は高く、またそこに記憶された画像信号も多くなる。選択された分子群、時としてそれぞれの分子は、ピクセルデータを表すことができる。入射光の位置および波長を調節することにより、個々のピクセルを選択的に光に曝して、情報を書き込んだり、書き込んだ情報または記憶した情報を読み取ったり、またはそれらを消去することができる。それぞれの分子はその分子上に入射した光によってのみ影響を受け、隣接する分子の状態に影響されることはないので、画像またはデータの記憶解像度は高くなる。解像度を制限する因子は、フィルム内の分子密度および分子の大きさに相応する小さな点を指すための光源の性能である。別の因子は、光の散乱によるバックグラウンドノイズである。界面活性剤で可溶化し膜から分離したPRを用いることにより、光の分散は最小限に抑えられ、これにより記憶データのノイズ対信号比が増大する。
【００４９】
本発明は、光源および固定化プロテオロドプシンを含有する固形物を有する光学データ情報担体を含む、光学データ記憶装置を提供する。光源は、プロテオロドプシンを基礎状態からM状態へ変換する書き込み光を放出する。その装置はさらに、M状態を基礎状態に変換する消去光を放出する第二の光源を含む。
【００５０】
本発明は、固定化プロテオロドプシンを有する固形物を含む詐欺防止用データ担体を提供する。その固形物は紙、繊維、プラスチック、金属の表面または鉱物の表面に沈着している。例えば該固形物を、紙幣、書類、IDカード、パスポート、免許証、キーカード、小切手、証券、ステッカー、箔、容器、梱包用製品などの製品に沈着させ、その製品の信頼性を保証する。フォトクロミックタンパク質であるプロテオロドプシンを含有する固形物を用いると、プロテオロドプシンの励起波長光に曝すことで色変化が得られる。この色変化は基礎状態とM状態間で互換性があり、これにより偽造に対する保護が提供できる。物質の特性に目に見える変化を起こさずに、書き込み、読み取り、消去のサイクルを複数回繰り返すことができる。
【００５１】
紙幣、IDカード、パスポート、免許証、キーカード、小切手、証券、ステッカー、箔、容器などの表面の様々な局在領域に、種々のプロテオロドプシン変異体を含有する固形物を沈着させて安全性を加えることができる。実質的に全て同一のスペクトル特性を持つバクテリオロドプシン変異体とは異なり、プロテオロドプシン変異体は、様々なスペクトル特性および色を持つ(表1)。表1には吸収波長に対応する典型的な色を示すが、実際の視覚認知は異なる可能性がある。従って、種々のプロテオロドプシン変異体を用いることにより、単一の詐欺防止用書類上の様々な局在領域に、単一色の代わりに複数色の安全対策を施すことが可能である。複数色の安全対策によって、偽造がより一層難しくなる。
【表１】
2006515683.tif 000003
【００５２】
本発明はさらに、液状に均一相を形成しているプロテオロドプシンと1またはそれ以上の親水性ポリマーを含む安全インキを提供する。該安全インキを表面に塗布した後に固化または乾燥させることにより、プロテオロドプシンは安全対策を施すためにインキを塗布した局在領域に固定化される。一般に安全インキは水性であり、空気中で乾燥または固化し、フィルムを形成する。インキの乾燥または固化は、溶媒の減少、重合または硬化によって起こる。安全インキは、プロテオロドプシンを1またはそれ以上の親水性ポリマーとともに水溶液に混合し、均一な溶液を形成させて調製する。必要に応じて、結合剤、UV吸収剤またはダイなどの助剤を安全インキ内に含ませる。結合剤は、インキを塗布した面へのプロテオロドプシンの結合または接着を増強する。本発明に有用な結合剤には、アラビアゴム、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールなどがある。UV吸収剤は、UVによる障害からプロテオロドプシンを保護し、安全インキのUV耐性を増す。UV吸収剤にはベンゾフェノン、ヒドロキシナフトキノン、フェニルベンゾキサゾール、ケイ皮酸エステル、スルホンアミドおよびアミノ安息香酸エステルなどがある。ダイはインクの外観を変える。安全インキに含んでもよい他の添加剤には、蛍光増白剤、乾燥剤、皮張り防止剤、揺変性促進剤、ワックス、可塑剤、界面活性剤、消泡剤および殺生剤がある。親水性ポリマーは、その中でプロテオロドプシンが一様に分散して均一溶液を形成するならば、どのような親水性ポリマーであってもよい。好ましくは、プロテオロドプシンを含む溶液およびポリマーは、空気中で素早く(1分以内)乾燥してフィルムを形成し、プロテオロドプシンが基礎状態から励起するよう効率的に光を吸収するものがよい。本発明の一態様において、親水性ポリマーは、アラビアゴム、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドンである。
【００５３】
本発明の一態様において、安全インキは紙、箔、ガラス、金属表面またはプラスチック上に印刷できる。
【００５４】
本発明の別の態様において、書類へのスクリーン印刷またはインクジェット印刷に安全インキを用いることができる。普通の周囲条件および通常の室内照明では、安全インキで印刷した範囲には、個々のプロテオロドプシン変異体の基礎状態の色によって紫または赤色が現れる。しかし、光の強度を増すことにより、素早く黄色(M状態)に変化させることができると思われる。それゆえ、安全インキで印刷した書類をデジタルスキャンまたは写真複写して作成した不正コピーは、通常黄色を示すので、正規書類と容易に見分けられる。
【００５５】
本発明はまた、固定化プロテオロドプシン含有物質上に、情報を光学的に記憶する方法を提供する。その方法は以下の段階を含む：(a)記憶する光学情報を表す第一のスペクトル域光を、固定化プロテオロドプシン含有物質上に配光し、(b)プロテオロドプシン物質の選択部位を露出して基礎状態からM状態に変換し、そして(c)記憶した光学情報を表す光学画像をプロテオロドプシン物質に保存する(ここで、記憶画像は吸収スペクトルが第二のスペクトル領域に変化したM状態物質を含んでいる)。記憶した光学画像は、第二のスペクトル領域光を該物質に配光してM状態物質を基礎状態に戻すことで消去できる。
【００５６】
本発明はまた、情報を記憶する3次元の光学画像を作製する方法を提供する。その方法は以下の段階を含む：(a)記憶する光学情報を表す第一のスペクトル域光を、固定化プロテオロドプシンを含有する3次元の光学情報記憶物質上に配光し、(b)プロテオロドプシン物質の選択位置および層を露出してプロテオロドプシンを基礎状態からM状態に変換し、そして(c)記憶した光学情報を表す3次元の光学画像をプロテオロドプシン物質に作成する(ここで、記憶画像は、吸収スペクトルが第二のスペクトル領域に変化したM状態物質を含んでいる。)。
【００５７】
本発明はまた、本発明で調製した光学データ記憶物質のホログラフィック特性を測定する方法を提供する。光学測定装置は緑色レーザー、例えば、波長532nmの半導体励起固体倍頻度(DPSSFD)レーザー、または波長515nmのアルゴンレーザーからなる。レーザーの平行光線は拡張され、ビームスプリッタを通過する。生じた2本の光線を鏡を用いて再び合成すると、正弦干渉縞が生じる。回折像内の線同士の距離は、2本のビーム間の角度を変化させて調節する。プロテオロドプシン含有物質をその回折像に曝すと、光学信号がフィルムに書き込まれる。その信号は、同じレーザーでより低い光強度のもの、またはM状態の黄色タンパク質が吸収する光を用いて読み取る。
【００５８】
回折像の線同士の最短距離とプロテオロドプシン含有フィルムの最大解像度は等しいので、2本の干渉光ビーム間の角度およびそれに伴う回折像内の線同士の距離を変化させて線同士の最短距離を測定することによって、フィルムの最大解像度を測定できる。フィルムを様々な強度の光に曝し、B状態からM状態への変換効率を測定することにより、その物質の感度を測定することができる。フィルムを回折像に短時間曝し、その後の基礎状態への逆戻りを測定することで、物質内での信号の寿命が測定できる。実験装置の例は、Downie and Smithey, Applied Optics, 35, 5780-5789, 1996、Cullin et al., Supramolecular Science, 2, 25032, 1995、およびJuchem and Hampp, Optics Letters, 26, 1702-1704, 2001に記載されている。
【００５９】
本発明を以下の実施例でさらに説明する。以下の実施例は、単に本発明の説明を意図するもので、本発明を制限するものではないと解釈されたい。
【実施例１】
【００６０】
プロテオロドプシンのクローニングと突然変異誘発
様々な天然プロテオロドプシン遺伝子をTaq DNAポリメラーゼ(Roche Applied Science)を用いて説明書に従ってPCR増幅した。全てのプロテオロドプシン変異体の増幅に、プライマーとしてPR-u4およびPR-d2(表2参照)を用い、テンプレートには関連プロテオロドプシンを含有するpCR2.1(Beja, et al., 2000、Beja, et al., 2001)を用いた。PCR産物を、pTrcHis2 TOPO TA発現キット(Invitrogen, カールズバッド, CA)を用い、説明書に従って、pTrcHis2ベクター内にクローニングした。制限酵素で消化したプラスミドを用いてPCR産物が正しい方向に挿入されているクローンを同定した。pTrcHis正方向プライマーおよびpTrcHis逆方向プライマーを用いてプラスミドを配列決定し、PCRおよびクローニング過程で配列変異体が導入されていないことを確かめた。プラスミドには、mycエピトープと6つのヒスチジン残基を含むC末端延長を有するプロテオロドプシン遺伝子を転写する、pTrcプロモーターが含まれている。発現プラスミドのうちの1つのマップを図１に示す。
【表２】
2006515683.tif 000004
【００６１】
正方向pTrcHisおよび逆方向pTrcHisオリゴヌクレオチドはInvitrogenから、他のオリゴヌクレオチドはOperonから入手し、部位特異的突然変異誘発に用いたプライマーはPAGEで精製した。
【００６２】
E108Q Bac31A8プロテオロドプシン変異体は、光反応サイクルにおけるM中間体の存続期間が延長されている(Dioumaev, et al., Biochem. 41:5348-58, 2002)。クイックチェンジ(QuickChange)部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を用い、説明書に従って、突然変異誘発して該タンパク質をコードする発現ベクターを作製し、プラスミドpTrcHis2-Bac31A8 E108Qを得た。pTrcHis2-Bac31A8をテンプレートとして用い、プライマーには31A8-m1Aおよび31A8-m1Bを用いた(表2参照)。
【実施例２】
【００６３】
プロテオロドプシンの発現
前培養：
プロテオロドプシン発現用プラスミド(例えばpTrcHis2-Bac31A8 E108Q)を、コンピテント細胞株BL21-コドンプラス(Codonplus)-RIL(Stratagene)に、説明書に従って移入した。移入細胞を、LA＋0.5％グルコース＋100μg/mlのカルベニシリン＋25μg/mlのクロラムフェニコールを調製したプレート上に蒔き、37℃で一晩インキュベートした。プレートの細胞を、2L三角フラスコに調製したLB500ml＋0.5％グルコース＋100μg/mlのカルベニシリン＋25μg/mlのクロラムフェニコール＋10μMの全トランス型レチナール培地で、約1.0AUでOD550に達するまで37℃で6時間培養し、発酵槽に播種した。
【００６４】
発酵培地：
以下の成分を発酵槽内で同時に滅菌した：KH2PO4 45g、クエン酸12g、MgS04-7H20 12g、イースト抽出物30g、クエン酸第二鉄アンモニウム2.0g、泡止めにマズ(Mazu) DF204 5mL、CaClHO 1.2gおよび硫酸7.3mL。20-28％NH40HでpHを6.8まで上昇させ、以下の成分を加えた：カルベニシリン0.3g、クロラムフェニコール60mg、全トランス型レチナール42mg、微量元素混合溶液60mLおよびグルコース(60重量％溶液から)。加えた後の容積は6.0L、グルコース濃度は10g/Lであった。微量元素混合溶液の内容物(g/L)は以下の通りである：クエン酸一水和物(4.0)、MnSO4・H2O(3.0)、NaCl(1.0)、FeSO4・7H2O(0.10)、CoCl2・6H20(0.10)、ZnS04・7H20(0.10)、CuSO4・5H2O(0.010)、H3BO3(0.010)およびNa2MoO4・2H20(0.010)。
【００６５】
発酵および培養：
15L容量の攪拌発酵槽に上記の培地を調製した。温度は37℃に調整し、アンモニア水(20-28重量％)でpH6.8に保った。溶存酸素(DO)測定値が約140mmol/L/hに達した時にDOの調節が始まるように、通気速度の初期値(最小値は6から12標準リットル毎分に設定)および攪拌速度(最小値は200から690rpmに設定)を設定した。DO調節値は25％に設定した。グルコースは60重量％溶液で0g/Lから10g/Lに維持した。8時間の培養後に全トランス型レチナールをさらに42mg加えた。約60AUでOD550時に、プロテオロドプシン発現を誘導するためにイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)0.167gおよび全トランス型レチナール100mgを加えた。約3時間後、全トランス型レチナールをさらに100mg加えた。3時間後に発酵を止め、遠心分離にかけて培養液から細胞を収穫し、-80℃で保存した。
【実施例３】
【００６６】
プロテオロドプシンの精製
発酵槽から収穫したプロテオロドプシン発現細胞41gを細胞洗浄用緩衝液(50mMトリス-HCl pH7.7、Roche Applied ScienceのEDTA-非含有プロテアーゼインヒビターカクテル錠、コンプリート(Complete))160mLに再懸濁して洗浄し、8000gで10分遠心分離してペレット状にした。
【００６７】
細胞ペレットを溶解緩衝液(50mMトリス-HCl pH7.7、Roche Applied ScienceのEDTA-非含有プロテアーゼインヒビターカクテル錠、コンプリート(Complete))160mLに再懸濁し、その細胞懸濁液を3回凍結および解凍した。細胞をフレンチプレスに2回かけ、50mL容量に溶解させた。
【００６８】
未破壊細胞を除去するために細胞を15000gで1時間遠心分離した。上清を超遠心分離用チューブに移した。それから250,000gで1時間遠心分離して膜ペレットを回収した。
【００６９】
膜画分を含むペレットを懸濁緩衝液(pH7.7の50mMトリス、2％ドデシル-ベータ-D-マルトシド、Roche Applied ScienceのEDTA-非含有プロテアーゼインヒビターカクテル錠、コンプリート(Complete))30mLに再懸濁した。
【００７０】
タロン樹脂(Talon Resin)(Clontech)10mLをカラムに入れ、樹脂洗浄用緩衝液(pH7.7の50mMトリス、0.1％ドデシル-ベータ-D-マルトシド、Roche Applied ScienceのEDTA-非含有プロテアーゼインヒビターカクテル錠、コンプリート(Complete))で平衡化した。膜懸濁液を樹脂カラムに加え、緩やかに上下逆にして混合させながら4℃で約16時間インキュベートした。
【００７１】
(カラム内の)樹脂を40mLの樹脂洗浄用緩衝液で各洗浄毎に樹脂を懸濁させて6回洗浄した。抽出用緩衝液(pH7.7の50mMトリス、pH8.0の250mM EDTA、0.05％ドデシル-ベータ-D-マルトシド、5mM DTT)10mLを加え、プロテオロドプシンを抽出した。抽出は3回繰り返した。
溶出液を貯留し、説明書に従ってミリポア(Millipore)遠心分離フィルターユニットを用いて10倍濃縮を3回連続して行い、交換用緩衝液(pH7.7の20mMトリス、1mM DTT)で希釈してEDTAを除去した。その後プロテオロドプシンサンプルを10倍に濃縮し、4℃で保存した。
【実施例４】
【００７２】
界面活性剤で可溶化した精製プロテオロドプシンの安定性
プロテオロドプシンBac31A8を実施例３に記載の方法で精製した。プロテオロドプシンサンプルを精製した直後および4℃に14ヶ月置いた後に吸収スペクトル測定した。精製プロテオロドプシン5μlを、pH10の100mM CAPS、0.1％ドデシル-ベータ-D-マルトシド溶液500μlに希釈してスペクトルを測定した。キャリー(Cary)3分光光度計(Varian)で、350nmから650nmのスペクトル波長が得られた。図２は、同一プロテオロドプシン調整物を4℃で14ヶ月保存する前(黒線)と14ヶ月の保存した後(破線)のスペクトルを示している。2サンプル間でほぼ同じスペクトル特性が得られた。プロテオロドプシンを変性させると最大波長が約390nmにシフトしてスペクトル特性が変化するので、界面活性剤で可溶化したタンパク質はこれらの条件下で安定であることが容易に判断できた。
【実施例５】
【００７３】
ポリアクリルアミドによるプロテオロドプシンの固定化
プロテオロドプシンをポリアクリルアミドで固定化するために、以下の混合物を調製した：
1.1mL デュラクリル(Duracryl)(80％アクリルアミド、4％ビスアクリルアミド)
0.7mL トリス/アセテート/MES 3成分緩衝液(1/0.5/0.5M、pH9.7)
1.1mL 水
0.5mL プロテオロドプシンBac31A8(17.4 mg/ml)
8.8μl 過硫酸アンモニウム(10％)。
【００７４】
N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミンを2μl加えて素早く攪拌し、ゲルマトリックスの重合を開始した。ゲルを2枚のガラス板の間に流し入れた。重合後ゲルを取り外し、使用および長期間保存するためにアセテートフィルムに挟んで大気湿度まで乾燥させた。
【００７５】
乾燥ゲルをキャリー(Cary)3分光光度計に置き、波長スペクトルを測定した。このスペクトルを、同様に調製し、ゲルを固めたpHのプロテオロドプシンサンプルのスペクトルと比較した(図３)。この2つのスペクトル間の差異は、光の散乱が原因の一つであるが、ゲルを乾燥させる間のpH変化、およびプロテオロドプシン光学スペクトルのpHに対する感受性が原因のようでもあった。室温(20-25℃)で15ヶ月間乾燥保存したプロテオロドプシンのスペクトル(図３の破線)は新たに調製したサンプル(図３の実線)とほとんど同じであった。このことは、乾燥ポリアクリルアミドゲルに固定化したプロテオロドプシンは、室温(20-25℃)で保存した場合、1年より長い間その機能性を保持していることを示している。
【実施例６】
【００７６】
シリカゾル-ゲルによるプロテオロドプシンの固定化
A:  プロテオロドプシンを含有するケイ酸塩ゾルを、テトラエチルオルトケイ酸塩から以下の方法で調製した。
【００７７】
ポリプロピレン製の容器にテトラエチルオルトケイ酸塩(4.5mL、4.2g、20.2mmol)を脱イオン水(1.4mL)および100mM塩酸(100μL)と混合し、1時間超音波洗浄機にかけた。この時点で溶液は均一になっており、使用するまで−20℃で保存した。この方法で調製したケイ酸塩ゾルは−20℃で保存した場合、6ヶ月以上にわたって使用できる。
【００７８】
上記で調製したケイ酸塩ゾルの一定分量(240μL)を、1Mリン酸カリウム緩衝液(19.5μL、pH7)、脱イオン水(331.5μL)およびプロテオロドプシンHot75M1溶液(10mg/mLを39μL)からなる溶液に加えた。その混合物をポリスチレン製のキュベットに移し、混合物がゲル化し(約5分)、連続光学測定に適するフィルムが形成されるまで、密封して横倒しにしておいた。出来上がったゲルをリン酸緩衝液(100mM、pH7)で3回洗浄し、4℃で保存した。
【００７９】
そのゾルをpH9.2の緩衝液に一晩置いて平衡化した後、キャリー(Cary)3分光光度計にかけてスペクトルを測定した。このスペクトルを、同じpHの精製タンパク質と比較した(図４)。
【００８０】
450nm以下に高い吸光度値が現れるのは、ゲル化中にゲル内に生じた粒子が光を散乱するためである。この方法で作製し、乾燥させずに4℃で保存したプロテオロドプシンゾル-ゲルは、12ヶ月より長い間光学的な透明性および色を保持していた。この期間にわたってサンプルの色に顕著な変化が見られなかったことは、本物質内でタンパク質の安定性が保たれていたことを示している。
【００８１】
B:  プロテオロドプシン含有ポリ(グリセリル)ケイ酸塩(PGS)ゾル-ゲルを、以下の方法で作製した。
【００８２】
ポリ(グリセリル)ケイ酸塩(PGS)前駆体は、以下の文献に記載の方法で調製した：Gill. I. and Ballesteros, A. 「ケイ酸塩、シロキサンおよびハイブリッドゾル-ゲルポリマーへの生物学的製剤の封入：効率的且つ一般的方法(Encapsulation of Biologicals within Silicate, Siloxane, and Hybrid Sol-Gel Polymers: An Efficient and generic Approach)」 J. Amer. Chem. Soc. 1998, 120, 8587-8598。PGS前駆体は−20℃で6ヶ月までの間はその性能を損なわずに保存できた。
【００８３】
全ての工程をポリプロピレン製容器中4℃で行った。PGS前駆体(160mg)と脱イオン水(80μL)を均一になるまで混合してPGSゾル調製した。プロテオロドプシンBac31A8(18.2mg/mL)(39μL)を、リン酸緩衝液(1M、pH7.0)(39μL)および脱イオン水(312μL)と混合した。この混合物をPGSゾル(240μL)に手早く加え、素早く上下逆にして混合し、ゲル化させた(約1から5分)。熟成ヒドロゲルを作製するために、容器にリン酸緩衝液(75mM pH7.0)を満たし、4℃で保存した(収縮率は初めのゲル体積に対して約20％であった)。乾燥ゲル(xerogel)を作製するために、生のヒドロゲルを4℃で1週間保存した後、外気に曝して室温で乾燥させた(収縮率は初めのゲル体積に対して50-70％であった)。乾燥ゲルというものは、調製に際してゲル状態を経て、完全に乾燥した開放的構造物である。
【００８４】
湿った状態で4℃で12ヶ月保存したプロテオロドプシン含有ゾル-ゲルを、円筒形ガラスキュベット(Starna cells, Inc.、アタスカデロ、CAの37-PX-5)に入れて蓋をし、その光学スペクトルをキャリー(Cary)3分光光度計で測定した。ゾル-ゲルのスペクトルを新たに精製した可溶性プロテオロドプシン(図５)のスペクトルと比較した。
【００８５】
溶液中のプロテオロドプシンとPGSゾル-ゲルに含まれたプロテオロドプシンのスペクトルが高度に類似していることは、プロテオロドプシンがPGSゾル-ゲル内で機能性を有していたことを表している。これら2つのスペクトルの差異は、光の散乱が原因の一つであるが、ゾル-ゲルが硬化する際のpH変化、およびプロテオロドプシン光学スペクトルのpHに対する感受性が原因のようでもある。この方法で作製し、4℃または室温で保存したプロテオロドプシンゾル-ゲルは、12ヶ月より長い間光学的な透明性および色を保持していた。この期間にわたってサンプルの色に顕著な変化が見られなかったことは、本物質内でタンパク質の安定性が保たれていたことを示している。
【実施例７】
【００８６】
ゼラチンによるプロテオロドプシンの固定化
プロテオロドプシンE108Q Bac31A8をゼラチンフィルムに固定化した。ゼラチン(Knox Company、パーシッパニー、NJ)1.0gを蒸留水10mLに加熱(約90℃)およびマグネチックスターラーで攪拌しながら溶解させ、10％ゼラチン溶液を調製した。そのゼラチン溶液を攪拌しながら約40℃まで冷ました。
【００８７】
プロテオロドプシン含有ゼラチンマトリックスを調製するために、マグネチックスターラーで攪拌しながら以下の成分を混合した：
0.5mL プロテオロドプシンE108Q Bac31A8(19mg/ml)
0.4mL 1M CAPS緩衝液 pH10.0
1.1mL 蒸留水
2.0mL 10％ゼラチン溶液(40℃)。
【００８８】
この混合物を、水を通さない厚さ0.1cmのガスケットで隔離した2枚のガラスプレートに分注し、厚さ約0.1cm×10cm×4cmのゼラチンフィルムを作製した。ゲルを4℃で2時間固めた後、2枚のガラスプレートを切り離し、片方のガラスプレートを取り外してゼラチンフィルムの一表面が露出させた。
【００８９】
ゼラチンフィルムをヒューレットパッカード(Hewlett Packard)8453ダイオードアレイ分光光度計にセットした。フィルムに含まれたプロテオロドプシンE108Q Bac31A8の波長スペクトルを測定した。B状態にあるこのタンパク質のスペクトルを、(強い光源に曝した状態で)M状態にあるタンパク質のスペクトル、およびM状態からB状態への変換過程にあるタンパク質サンプルと比較した(図６)。Oriel Instruments(ストラトフォード、CT)の450nmカットオン色付きガラスフィルター(51284)を付けた、Dolan-Jenner Industries(ロレンス、MA)の150ワット発光体(ファイバーライト(Fiber-Lite)A3200)に、光ファイバーケーブルを接続して光を供給した。手動でシャッターを開け閉めし、光の照射を調節した。
【００９０】
光照射前、照射中および照射後の時間軸に沿って、M状態の最大吸収波長(410nm)とB状態の最大吸収波長(515nm)の吸光度の変化をプロットした(図７)。
【００９１】
連続照射終了後のデータを用いてM状態の半減期(t1/2)(サンプルの半数がM状態からB状態へ戻る時間)を算出すると、このpHおよび水和条件では4.15秒であった。
【実施例８】
【００９２】
ポリビニルアルコールによるプロテオロドプシンの固定化
ポリビニルアルコール(PVA)でプロテオロドプシンを固定化するために、以下の混合物を調製した：
300μl 15％ポリビニルアルコール(平均分子量30,000−70,000)
75μl 1M CHES緩衝液 pH10.3
375μl 精製プロテオロドプシンE108Q Bac31A8(19mg/ml)。
【００９３】
この溶液をカミソリの刃を用いて、紙、プラスチックシートまたはガラスプレート上に塗布し、溶液の薄い層を形成させた。別の方法では、エアブラシを使ってこのプロテオロドプシン含有物質を散布した。これを一晩乾燥させ、プロテオロドプシンを封入したPVAポリマーのフィルムを作製した。
【実施例９】
【００９４】
プロテオロドプシン-PVAフィルムによる光学データの記憶
実施例８に記載したプロテオロドプシン-PVAフィルムを用いて、固定化プロテオロドプシン含有物質への光学データの書き込み、および該物質からの光学データの読み取りが可能なことを示す実験を行った。プロテオロドプシン-PVAフィルムは初期状態では紫色であった。このことは基礎状態(B状態)にある大多数のプロテオロドプシン分子についても同様であった。プロテオロドプシンフィルムの特定領域を多色性の黄色光(450nmカットオンフィルターを通したハロゲンランプからの光)または単色性の緑色光(波長532nmの半導体励起固体倍頻度(DPSSFD)緑色レーザー光)に短時間曝すことにより、データをフィルムに光学的に書き込んだ。その光に曝した領域が黄色になったので、その領域のプロテオロドプシンが活性化M中間体にうまく変換されたことが分かった。この操作でデータがフィルムに書き込まれた。フィルムの様々な領域の色を(例えばビデオレコーダーを用いて)観察して、フィルムに書き込まれた光学データを読み取ることができた。
【００９５】
青色または紫色の光に曝さないでいると、フィルムは1、2分で徐々に初めの紫色に戻った。励起(黄色)状態のプロテオロドプシンフィルムを短時間(一秒未満)紫色の光(456nmの切り口のあるフィルターを通したハロゲンランプからの光)または青色の光(青色発光ダイオード(LED)からの光)に曝すと、フィルムの色は初めの紫色に戻った。これは、フィルムに刷り込んだ光学信号が素早く消去されたことを現している。
【００９６】
目下好ましい態様を示して本発明を説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく種々の改変が可能であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は発現プラスミドpTrcHis2-Hot75m1のマップを示す。
【図２】図２は4℃で14ヶ月保存する前(実線)および保存した後(破線)のプロテオロドプシンBac31A8調製物のスペクトルを示す。
【図３】図３は、(a)pH10の溶液中のプロテオロドプシンBac31A8(点線)、(b)新たに調製したポリアクリルアミド固定化プロテオロドプシンBac31A8(実線)および(c)室温で15ヶ月間乾燥させたポリアクリルアミド固定化プロテオロドプシンBac31A8(破線)のスペクトルを示す。
【図４】図４は溶液中およびテトラエチルオルトケイ酸塩ゾル-ゲル中のプロテオロドプシンHot75m1のスペクトルの比較を示す。
【図５】図５は溶液中およびポリ(グリセリル)ケイ酸塩ゾル-ゲル中のプロテオロドプシンBac31A8のスペクトルの比較を示す。
【図６】図６はB状態、M状態およびM状態からB状態への変換過程にある(ゼラチンに固定化した)プロテオロドプシンE108Q Bac31A8のスペクトルの比較を示す。
【図７】図７は光照射前、照射中および照射後の時間軸に沿って、(ゼラチンに固定化した)プロテオロドプシンE108Q Bac31A8のM状態の最大吸収波長(410nm)およびB状態の最大吸収波長(515nm)の吸光度の変化をプロットしたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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