(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の分野に属する。特に、本発明は、非常に攻撃的な形態のＡＤをもたらす、アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）に同定された新規な突然変異（Ｔ７１４Ｉ）、ＡＰＰ７１４を提供する。この突然変異は、推定γ４２セクレターゼ切断部位に相当するアミロイドβペプチド（Ａβ）の４３番目のコドンに関与する。この新規な突然変異は、Ａβ４０及びＡβ４２の両方の分泌を変更し、インビトロでＡβ４２／Ａβ４０比を１０倍上昇させる。さらに、これらの患者の脳における主要なアミロイド斑病理学は、主にＮ短縮型Ａβ４２から構成された拡散「プレアミロイド」タイプのものである。密にコア形成した斑は、欠如はしていないが、有意に低減していた。また、Ａβ４０が主に沈着する脳内の通常の部位、例えば脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）又は老人斑コアの血管内は、完全にＡβ４２形態から構成されていた。一緒にすると、これらは、脳内に最も早く沈着するアミロイドのひとつにおけるＮ短縮型Ａβ４２の沈着、すなわち拡散斑は、充分に確立された「アミロイドカスケード」を通じて又は未だ未知のメカニズムによって、充分にＡＤを引き起こすことができることを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質７７０のコドン７１４突然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド配列又はそのアイソフォームもしくはそのフラグメント。
【請求項２】
コドン７１４によってコードされる位置のアミノ酸が、イソロイシンである、請求項１記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
ポリヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、請求項１又は２記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、コドン７１４以外の少なくとも１つの置換を取り込んでいる、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞。
【請求項８】
真核初代細胞、胚性幹細胞系又は不死化細胞系である、請求項７記載のトランスジェニック細胞。
【請求項９】
細菌である、請求項７記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項記載の前記ポリヌクレオチドが、細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項７又は８記載のトランスジェニック細胞。
【請求項１１】
体細胞及び生殖細胞が、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
以下の工程を含む、β−アミロイド４２ペプチドの形成を低減させることができる分子のスクリーニング方法：
−　前記分子を請求項７〜１０のいずれか１項記載の細胞系に投与する工程；
−　形成されたβ−アミロイド４２ペプチドの量を測定する工程；及び
−　前記の量を、前記分子を投与せずに形成されたβ−アミロイド４２の量と比較する工程。
【請求項１３】
以下の工程を含む、アルツハイマー病を治療する分子のスクリーニング方法：
−　前記分子を請求項１１記載のトランスジェニック動物に投与する工程；及び
−　前記動物を、その脳におけるβ−アミロイドの沈着及び／又は神経細胞死及び／又は異常リン酸化タウタンパク質及び／又はグリア細胞数の増加及び／又は低減した行動活性試験に対する前記分子の効果についてモニタリングする工程。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載のスクリーニング方法によって得られる分子。
【請求項１５】
「曇り」拡散斑の形成及び阻害を分析するための、請求項１１記載の非ヒトトランスジェニック動物の使用。
【請求項１６】
以下の工程：
−　前記配列を、プレゼニリン１及びプレゼニリン２陰性細胞系にトランスフェクションする工程；
−　前記細胞系を遺伝子ライブラリーでスーパートランスフェクションする工程；及び
−　β−アミロイド産生の産生をモニタリングする工程
を含む、アミロイドβの代替的プロテアーゼ及び／又はγ−セクレターゼホモログ及び／又はγ−セクレターゼモジュレーターのスクリーニングのためのアッセイを開発するための、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリヌクレオチド配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の分野に関する。特に、本発明は、アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）であるＡＰＰ７１４中に同定され、非常に悪性の形態のＡＤをもたらす新規突然変異（Ｔ７１４Ｉ）を提供する。この突然変異は、推定γ４２−セクレターゼ切断部位に相当するアミロイドβペプチド（Ａβ）の４３番目のコドンに関与する。この新規な突然変異は、Ａβ４０及びＡβ４２分泌の両方を変更し、インビトロでＡβ４２／Ａβ４０比を１０倍上昇させる。さらに、これらの患者の脳における主要アミロイド斑病理は、主にＮ−短縮型Ａβ４２から構成される拡散「プレアミロイド」タイプのものである。密にコアを形成した（ｄｅｎｓｅ−ｃｏｒｅｄ）斑は、存在しないわけではないが、有意に低減している。また、Ａβ４２が優勢に沈着する脳内の通常の部位、例えば脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）又は老人斑コアとしての血管内においては、完全にＡβ４２形態から構成されていた。一緒にすると、これらは、脳内の最も早く沈着するアミロイドのひとつにおけるＮ短縮型Ａβ４２の沈着（拡散斑）が、よく確立された「アミロイドカスケード」を通じて又は未だ未知のメカニズムによって、ＡＤを引き起こすのに充分な能力があることを示す。
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、脳内の細胞内神経原線維濃縮体及び細胞外アミロイド沈着の形成によって組織学的に定義される進行性の神経変性障害である。アミロイドβタンパク（Ａβ）がＡＤの発症において果たす役割に対して、特別の注意が向けられていた。実際、ＡＤの皮質及び脳血管アミロイド沈着の主要タンパク成分は、Ａβである１−３。蓄積する証拠が、アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）１−３からのＡβ産生、原線維へのその凝集及びその沈着がＡＤにおいて鍵となる原因学的事象であることを示唆している４。これらの重要な工程の理解は、治療標的を決定することにおいて重要である。少なくとも５つの別個のＡＰＰアイソフォームが存在し、それぞれ、５６３、６９５、７１４、７５１及び７７０アミノ酸である（Ｗｉｒａｋら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３２３）。これらのＡＰＰのアイソフォームは、ヒト第２１番染色体に位置するＡＰＰ遺伝子の一次転写物の選択的スプライシングによって生成される。
【０００３】
ＡＰＰタンパクは、βセクレターゼ（ＢＡＣＥ）５及び未だ未同定のαセクレターゼによってプロセッシングされ、可溶性ＡＰＰ（ＡＰＰＳα及びＡＰＰＳβ）及び膜結合Ｃ末端フラグメントがもたらされる（α及びβＣＴＦｓ；総説については参考文献を参照のこと６）。β及び１又は多数のγ−セクレターゼ（γ４０及びγ４２）による切断は、４０〜４２アミノ酸のＡβペプチド（Ａβ１−４０及びＡβ１−４２）を放出する一方、主要分泌経路は、Ａβのアミノ酸１６及び１７の間でＡβ配列を切断するαセクレターゼを利用する。γ４０又はγ４２セクレターゼによるαＣＴＦｓのさらなるプロセッシングは、Ｎ末端切断型Ａβ１７−４０又はＡβ１７−４２ペプチド（ｐ３）を放出する。Ａβ１７−Ｘに加えて、βセクレターゼの活性から生じる２つのその他の主要ペプチドがトランスフェクトされた細胞によって分泌され、アミノ酸５（Ａβ５−Ｘ）及び１１（Ａβ１１−Ｘ）から開始して脳内に沈着することが注目される６，７。
【０００４】
さらに、８つのミスセンス突然変異が常染色体優性若年発症型ＡＤを有する家族のＡＰＰにおいて同定された８，９。すべてのこれらの突然変異は、セクレターゼ切断部位のすぐ近くにクラスターを形成しており、２つの異なる方法でＡＰＰ代謝に影響している。βセクレターゼ切断部位の近くに位置するＫ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ突然変異１０は、Ａβ４０及びＡβ４２の両方の産生を増大させる１１−１３。これに対し、γ−セクレターゼ切断部位の近くに位置する突然変異は、Ａβ４２の絶対的又は相対的産生の増大をもたらし、一方、Ａβの総量は、ＡＰＰ　Ｖ７１７Ｉ１２−１４の場合のように影響されないか、又はＡＰＰ　Ｖ７１５Ｍ１５の場合のように低減する。これに対し、常染色体優性若年発症型ＡＤ８，９を引き起こすプレゼニリン遺伝子（ＰＳＥＮ１及び２）内の突然変異は、Ａβ４２の優先的増大をもたらす。これは、インビトロＡβ４２がＡβ４０よりも原線維生成的であり、かつ速く凝集することが明らかにされていたことから、ＡＤ病理にとって重要である１６。
【０００５】
免疫組織化学は、Ａβ４２はＡＤ及びダウン症候群（ＤＳ）患者において拡散斑として最初に沈着するが１７、Ａβ４０は斑のさらなる成長に寄与し、密にコアを形成した老人斑の形成をもたらすことを示した１８。Ａβ４０はまた、血管壁におけるアミロイド沈着の主要構成成分である１９−２２。コンゴフィリック（ｃｏｎｇｏｐｈｉｌｉｃ）な密にコアを形成した斑に沈着するアミロイドは、チオフラビン−Ｔ及びコンゴレッド結合を証明するので、たしかに線維性である。脳内の軸索（ｎｅｕｒｉｔｉｃな）病理学のほとんどは密にコアを形成した斑と関連しているので、このようなコンゴフィリックな沈着は、ＡＤ及びＤＳにおいて病原性であると考えられる２３−２６。しかし、疾患の病因論ならびにＡＤ及びＤＳ患者における認知的低下に対する非原線維性拡散斑の正確な意義は、その非コンゴフィリックな性質により示唆されるように、あまりよくわかっていない。これらの２つの斑形態はまた、それらの正確なＡβ含量に関しても異なっている。全長Ａβが主な構成成分であるコンパクトな斑とは対照的に、拡散斑は、ｐ３又はその他のＮ短縮型Ａβ形態から構成されている１９、２７。ＡβのこれらのＮ短縮型形態の穏和な性質は、マイクログリア活性化及びアポリポタンパクＥ（ＡＰＯＥ）結合に関与するドメインの欠如によっても示唆される２８，２９。これに関して、ＡＰＯＥのアイソフォームは、この対立遺伝子のキャリアの、この疾患の一般的遅発性形態に対する素因となる。
【０００６】
現在、アルツハイマー病のためには、既知の有効な治療法はない。ＡＤ病因論に関与する根底の生化学的事象をさらに定義するために用いることができるＡＤの実験モデルを開発することは重要である。このようなモデルは、ひとつの適用において、ＡＤの進行を阻害、防止又は逆行させる分子をスクリーニングするために用いることができる。
【０００７】
本発明は、コドン７１４の核酸がスレオニン（Ｔ）の代わりにイソロイシン（Ｉ）をコードする、ヒトアミロイド前駆体タンパク７７０をコードする新規な突然変異核酸を提供する。この突然変異（ＡＰＰＴ７１４Ｉ）は、ＡＰＰにおける、これまでのところ記載された最も「劇的な」突然変異である。この突然変異を有するＡＤ患者の脳においては、主要なアミロイド斑病理学はＡβ４０の不在下でＮ短縮型Ａβ４２（ＡβＸ−４２）から主に構成される非コンゴフィリックなプレアミロイド性のものである。これらの観察は、ＡＤ患者における神経毒性及び認知低下における、Ａβ４２及びＡβ４０の原線維全長形態より、又はそれに加えての、拡散プレアミロイドＡβＸ−４２についての鍵となる役割を意味する。Ｔ７１４ＩがＡＤを引き起こす正確な病理学的メカニズムが何であろうと、この異常なＡＰＰ突然変異はＡＤが起こるメカニズムを解明するために役立つであろう可能性が高い。
【０００８】
本発明の目的
本発明は、アルツハイマー病の非常に攻撃的な形態を患う患者において同定されたヒトアミロイド前駆体タンパク７７０のコドン７１４突然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供することを目的とする。具体的には、ＡＰＰ７７０のコドン７１４はロイシンをコードする。本発明は、ＡＰＰ７７０のコドン７１４突然変異体を含むトランスジェニック真核初代細胞、胚性幹細胞株又は不死化細胞株をさらに提供する。本発明は、ＡＰＰのコドン７１４突然変異を発現する非ヒトトランスジェニック動物を提供することをも目的とする。本発明の別の目的は、細胞又は動物における、（Ｎ短縮型）β−アミロイド４２ペプチドの形成を低減することができる分子のスクリーニングのための方法を提供することである。本発明は、さらに、「曇り」拡散斑の形成の分析及び／又は干渉のために非ヒトトランスジェニック動物を用いることをも目的とする。最後に、本発明は、アミロイドβの代替的プロテアーゼ、γ−セクレターゼホモログ及び／又はγ−セクレターゼモジュレーターのスクリーニングのためのアッセイを提供することを目的とする。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、アルツハイマー病のモデル系を提供する。ここで、このモデル系は、ＡＰＰ７７０のアミノ酸残基位置７１４に相当するアミノ酸位置にスレオニン以外のアミノ酸を有するアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）アイソフォーム又はフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む。
【００１０】
あるオーストリアの家系におけるＡＰＰ　Ｔ７１４Ｉ突然変異は、γ４２セクレターゼ切断部位に直接位置するＡβのアミノ酸４３に関与する、現在までに報告された最初のＡＰＰ突然変異である。この突然変異を担持する患者は、だいたい３４〜３５歳の非常に早いＡＤの発病を有し、これはＡＰＰにおける突然変異と関連する常染色体優性ＡＤについてこれまでに報告された最も早い発病年齢である。この早い発病年齢、ならびに疾患の急速な進行及び早期の死亡は、ＰＳＥＮ１における突然変異によって引き起こされるＡＤに匹敵する９。
【００１１】
インビトロでは、Ｔ７１４Ｉ突然変異は、ＡＰＰのγ−セクレターゼ切断に劇的に影響し、有意にＡβ４０を低減させ、Ａβ４２を増大させた。この効果は、全長Ａβに限定されず、Ｎ短縮型Ａβペプチドにも関与した。ＡβＸ−４０及びＡβＸ−４２の分泌を変更することにおける主要な効果に加えて、Ｔ７１４Ｉ突然変異は、残基Ｇ３８（Ａβ３８）及びＶ３９（Ａβ３９）で終わるＡβペプチドへのＡＰＰの有意な選択的プロセッシングをももたらす。２．５倍までの総Ａβ（ＡβＸ−Ｘ）の増大及び不変のＡＰＰＳα及びＡＰＰＳβは、ＣＴＦｓのプロセッシングがＡＰＰプロセッシングにおいて律速段階であり得ることを示す。
【００１２】
多数の用語及び表現が詳細な説明を通じて用いられ、それらの理解を容易にするために、以下の定義が提供される：
【００１３】
ここで用いる場合、「単離されたポリヌクレオチド配列」という用語は、Ｙｏｓｈｉｋａｉら（１９９０） Ｇｅｎｅ ８７：２５７によって詳述されているようなＤＮＡ及びｃＤＮＡ配列を、Ｓａｌｂａｕｍら（１９８８） ＥＭＢＯ Ｊ． ７（９）：２８０７によって記載されているようなプロモーターＤＮＡ配列と一緒に、意味すると解釈することができる。
【００１４】
ここで用いる場合、「アイソフォーム」、「ＡＰＰ」及び「ＡＰＰアイソフォーム」は、ＡＰＰ遺伝子の少なくとも１つのエクソンによってコードされるポリペプチドを指す（Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３１：５３０； ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ及びＯｃｔａｖｅ（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５：６５１； Ｇｏｌｄｅら（１９９０） Ｎｅｕｒｏｎ４：２５３）。ＡＰＰアイソフォームは、ＡＤのある形態と関連する又はＡＤ疾患フェノタイプと関連しないＡＰＰ対立遺伝子（又はそのエクソン）によってコードされていてもよい。
【００１５】
ここで用いる場合、「フラグメント」は、少なくとも約９アミノ酸、典型的には５０〜７５、又はそれ以上のポリペプチドであって、そのポリペプチドがあるアミノ酸コア配列を含むポリペプチドを指す。フラグメントは、短縮形態のＡＰＰアイソフォーム、改変ＡＰＰアイソフォーム（例えばコア配列の外でのアミノ酸置換、欠失、又は付加等による）、又は他の変異ポリペプチド配列であることができるが、ＡＤに罹患しているといないとに関わらず、ヒト個体に存在する天然のＡＰＰアイソフォームではない。望ましい場合、フラグメントは、いずれかの末端で付加的なアミノ酸に融合されていてもよく、それは１〜２０、典型的には５０〜１００の数であってよく、２５０〜５００まで又はそれ以上であることができる。
【００１６】
ここで用いる場合、「ＡＰＰ７７０」は、ヒトＡＰＰ遺伝子によってコードされる７７０アミノ酸残基の長さのポリペプチドを指す。
【００１７】
ここで用いる場合、「コドン７１４」は、ＡＰＰ７７０の７１４番目のアミノ酸位置、又はＡＰＰ７７０の７１４番目に相当するＡＰＰアイソフォームもしくはフラグメント中のアミノ酸位置をコードするコドン（すなわちトリヌクレオチド配列）を指す。例えば、これに限らないが、１００個のＮ末端アミノ酸を除去することによってＡＰＰ７７０を短縮して生成された６７０残基の長さのフラグメントは、コドン７１４に相当する６１４番目のアミノ酸位置を有する。
【００１８】
ここで用いる場合、「ヒトＡＰＰアイソフォーム又はフラグメント」は、ヒト個体に自然に生じるヒトＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１又はＡＰＰ６９５タンパク中の配列と同一の少なくとも９個の連続するアミノ酸の配列を含むＡＰＰアイソフォーム又はフラグメントを指し、ここで、同一の配列は、非ヒト種に自然に生じるＡＰＰタンパク中には存在しない。
【００１９】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、「作動可能に連結されている」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、そのコード配列の転写に影響する場合、その配列と作動可能に連結されている。転写調節配列に関しては、作動可能な連結は、連結されているＤＮＡ配列が、連続しており、２つのタンパクコード領域を結合することが必要な場合には連続しかつリーディングフレーム内にあることを意味する。
【００２０】
ここで用いる場合、「突然変異体」という用語は、ＡＤを発症する遺伝的素因について疾病特徴的なミスセンス突然変異を有するＡＰＰ対立遺伝子を指す。具体的には、ＡＰＰ遺伝子の（ＡＰＰ７７０中のアミノ酸配列によって参照されるように）コドン７１４の突然変異であり、コドン７１４がスレオニンではない１９のアミノ酸（すなわち、バリン、グリシン、メチオニン、アラニン、セリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、ヒスチジン、システイン、チロシン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トリプトファン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、リシン、及びグルタミン）のうちの一つ、好ましくはイソロイシンをコードするようになったものである。したがって、本発明の突然変異ＡＰＰ７７０ポリペプチドは、位置７１４にスレオニンではないアミノ酸残基を有するＡＰＰ７７０ポリペプチドである。他の突然変異ＡＰＰアイソフォームは、コドン７１４に相当する（すなわちコドン７１４によってコードされる）アミノ酸残基位置に非スレオニンアミノ酸を含む。同様に、突然変異ＡＰＰ対立遺伝子又は変異ＡＰＰコドン７１４対立遺伝子は、コドン７１４（「コドン７１４」の定義に記載されているようにヒトＡＰＰ７７０推定翻訳を参照）にスレオニン以外のアミノ酸、好ましくはイソロイシンをコードするＡＰＰ対立遺伝子である。したがって、コドン７１４にスレオニンをコードするＡＰＰ対立遺伝子は、「野生型」ＡＰＰ対立遺伝子である。ＡＰＰＴ７１４Ｉの配列は、配列番号１に示す。
【００２１】
第一の態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０のアミノ酸残基位置７１４に相当するアミノ酸位置にスレオニン以外のアミノ酸を有するＡＰＰアイソフォーム又はフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供し、本発明の１つの具体的な態様においては、このアミノ酸は、イソロイシンである。
別の態様においては、前記突然変異ＡＰＰアイソフォーム又はフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。
【００２２】
別の態様においては、本発明は、ＡＰＰ７７０のアミノ酸残基位置７１４に相当するアミノ酸位置にスレオニン以外のアミノ酸を有する、他のヒトタンパクを含まない、ヒトＡＰＰアイソフォーム又はフラグメントを提供する。発現系の非制限的な例として、バキュロウイルス発現系は真核細胞における異種遺伝子の高レベル発現について有用であり、Ｋｎｏｐｓら（１９９１）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６（１１）： ７２８５は、前記発現系を用いたＡＰＰの発現を記載している。
【００２３】
別の態様においては、本発明は、上記のＡＰＰ７１４突然変異を含む異種ＤＮＡ配列で形質転換又はトランスフェクトされた、又はトランスジェニック非ヒト動物から由来した、組換え細菌及び細胞、典型的には真核細胞、そして好ましくは哺乳類細胞、及びより優先的には神経、グリア、又は星状細胞系統の細胞であって、細胞が、ＡＰＰ７７０のアミノ酸残基位置７１４に相当するアミノ酸位置にスレオニン以外のアミノ酸を有するＡＰＰアイソフォーム又はフラグメントを発現するものを提供する。標準的なプロトコールによれば、培養されたヒト細胞が突然変異体ＡＰＰ７１４ポリペプチドを発現するように、培養されたヒト細胞（初代培養又は不死化細胞株のいずれか）を、突然変異体ＡＰＰ７１４対立遺伝子で一過性又は安定にトランスフェクトすることができる。
【００２４】
ある具体的な態様においては、細胞は、天然から由来することもできる。これについて、例えばエプスタイン−バーウイルスを用いてリンパ芽球腫細胞株へと永久に形質転換され得る必要な細胞を提供するためには、ＡＰＰ７１４突然変異を有すると診断された罹患個体由来の血液試料又は線維芽細胞を入手しなければならない。いったん樹立されると、このような細胞株は、懸濁培養において連続的に生育することができ、突然変異体ＡＰＰ７１４発現及びプロセッシングを研究するための種々のインビトロ実験のために用いることができる。
【００２５】
ＡＰＰ７１４突然変異は優性なので、細胞株を構築する代替的な方法は、突然変異遺伝子又はコドン７１４にわたるその部分を遺伝的に操作し、選択した樹立（安定又は一過性）細胞株にすることである。Ｓｉｓｏｄｉａ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４９２は、トランスフェクションによる哺乳類細胞への正常ＡＰＰ遺伝子の挿入を記載している。Ｏｌｔｅｒｓｄｏｒｆら（１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：４４９２は、不死化真核細胞株へのＡＰＰの挿入を記載している。
【００２６】
別の態様においては、本発明は、その体細胞及び生殖細胞に、ＡＰＰ７７０のアミノ酸残基位置７１４に相当するアミノ酸位置にスレオニン以外のアミノ酸を有するＡＰＰアイソフォーム又はフラグメントをコードするヒトＤＮＡ配列の少なくとも１つの組み込まれたコピーを担持するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００２７】
トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスは、ＡＰＰ７１４突然変異を有するＡＤ患者のヒト脳におけるのと同様にＡβ４２の排他的な沈着が期待されるので、特別の価値を有するであろうことが期待される。マウスにおける突然変異体プレゼニリン１有り又は無しでの突然変異体ＡＰＰの過剰発現は、密にコア形成した斑へのＡβ４０沈着の優性性を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄ＆ｌｉｓｔ ｕｉｄｓ＝１０４４８０５１＆ｄｏｐｔ＝Ａｂｓｔｒａｃｔ）。また、げっ歯類脳においては、Ａβ４２ではなくＡβ４０が、コンゴフィリックアミロイド沈着物として容易に沈着可能であるようであり（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄ＆ｌｉｓｔ ｕｉｄｓ＝９３３４３９４＆ｄｏｐｔ＝Ａｂｓｔｒａｃｔ）、それは、Ａβ４２ではなくＡβ４２が、ＡＤの原因学について中心的であると提案されていることに関して重要である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ＰｕｂＭｅｄ＆ｌｉｓｔ ｕｉｄｓ＝１０１９６５２３＆ｄｏｐｔ＝Ａｂｓｔｒａｃｔ）。本発明においては、突然変異体ＡＰＰ７１４についてニューロン及び非ニューロンの組換え細胞の両方が、Ａβ４２の分泌を増大し、一方、Ａβ４０が低減する。罹患患者の脳においては、ほとんど全くＡβ４０又はＡβ３９の沈着がなく、斑が完全にＡβ４２から構成されている。結論として、この新規なトランスジェニックマウスは、ヒトにおいてはＡβ４２の沈着が常にＡβ４０の沈着に取って代わるので、ＡＤのヒト疾患フェノタイプをよりよく模倣するであろう。
【００２８】
好ましい例においては、突然変異した遺伝子を含むトランスジェニック動物の創出における使用のために突然変異ＡＰＰ７１４遺伝子を切り出すことが可能である可能性がある。別の例においては、ヒトＡＰＰ７１４対立遺伝子全体を、クローニングベクター（例えばコスミド又は酵母又はヒト人工染色体）中に、部分で又は全体として、クローニング及び単離することができる。部分又は全体としてのヒト変異体ＡＰＰ７１４遺伝子は、マウス又はラットのような宿主非ヒト動物に移入することができる。移入の結果として、得られたトランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは１つ又はそれ以上の突然変異体ＡＰＰ７１４ポリペプチドを発現する。最も好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、１つ又はそれ以上の突然変異体ＡＰＰ７１４ポリペプチドを、ニューロン特異的な方式で発現する（Ｗｉｒａｋら（１９９１） ＥＭＢＯ Ｊ． １０：２８９）。これは、最初の主要ＡＰＰ転写開始部位の上流の、それに隣接する４．５キロベース配列を含む、実質的にヒトＡＰＰ遺伝子全体（コドン７１４突然変異体をコードする）を移入することによって達成することができる。
【００２９】
あるいは、変異体ＡＰＰコドン７１４ポリペプチドをコードするミニ遺伝子を設計することができる。このようなミニ遺伝子は、下流のポリアデニル化シグナル配列及び上流のプロモーター（及び好ましくはエンハンサー）に連結された、（好ましくは全長の）変異体ＡＰＰコドン７１４ポリペプチド、ＡＰＰ遺伝子エクソンの組み合わせ、又はそれらの組み合わせをコードするｃＤＮＡ配列を含んでいてもよい。このようなミニ遺伝子構築物は、適切なトランスジェニック宿主（例えばマウス又はラット）に導入された場合、コードされる変異体ＡＰＰコドン７１４ポリペプチド、最も好ましくはＡＰＰ７７０のコドン７１４又はＡＰＰアイソフォームもしくはフラグメントの相当する位置にイソロイシンを含む変異体ＡＰＰコドン７１４ポリペプチドを発現する。
【００３０】
トランスジェニック動物を作製するための別のアプローチは、インビトロでの胚性幹（ＥＳ）細胞株における相同組換え、及びそれに続く宿主胞胚への改変されたＥＳ細胞のマイクロインジェクション及びその後の養母中でのインキュベーションによって所望の遺伝子に突然変異をターゲティングすることである（Ｆｒｏｈｍａｎ及びＭａｒｔｉｎ（１９８９） Ｃｅｌｌ ５６：１４５を参照されたい）。あるいは、一細胞胚への突然変異遺伝子又はその一部分のマイクロインジェクション及びそれに続く養母中でのインキュベーションの技術を用いることができる。トランスジェニック動物、特に野生型ＡＰＰアイソフォーム又はフラグメントを発現するトランスジェニック動物の種々の用途は、Ｗｉｒａｋら（１９９１） ＥＭＢＯ Ｊ． １０（２）：２８９； Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら （１９９１） Ｇｅｎｅ ９８（２）：２２５； Ｑｕｏｎら （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：２３９； Ｗｉｒａｋら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３２３； 及びＫａｗａｂａｔａら（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５４：４７６に開示されている。トランスジェニック動物を作製するための更なる方法は当業界において公知である。
【００３１】
あるいは、部位特異的突然変異誘発及び／又は遺伝子変換を用いて、内在性又はトランスフェクトされた、マウス（又は他の非ヒト）ＡＰＰ対立遺伝子を突然変異させ、突然変異した対立遺伝子がヒトＡＰＰ遺伝子のコドン７１４（ＡＰＰ７７０の）に相当するマウスＡＰＰ遺伝子中のコドン位置にスレオニンをコードしないようにすることができる（このような位置は、ヒトＡＰＰ遺伝子又はＡＰＰ７７０タンパクに対するマウスＡＰＰ遺伝子又はＡＰＰタンパクの相同性マッチングによって容易に同定することができる）。好ましくは、このような突然変異したマウス対立遺伝子は、相当するコドン位置にイソロイシンをコードする。
トランスジェニックラットを作製するための手順は、マウスのものと同様である（Ｈａｍｍｅｒら、Ｃｅｌｌ ６３：１０９９−１１２（１９９０））。３０日齢の雌ラットに、２０ＩＵのＰＭＳＧ（０．１ｃｃ）の皮下注射を与え、４８時間後、各雌を証明された雄と一緒に置く。同時に、４０〜８０日齢の雌を精管切除された雄と一緒にケージ内に置く。これらは、胚移入のための養母を提供することになる。翌朝、雌を膣栓について調べる。精管切除された雄と交配させた雌は、移入時までとっておく。交配したドナー雌を犠牲死させ（ＣＯ２窒息）、それらの卵管を取り出し、０．５％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水）中に置き、胚を集める。胚を囲んでいる丘細胞をヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去する。次に胚を洗浄し、マイクロインジェクションの時まで０．５％ＢＳＡを含有するＥＢＳＳ（Ｅａｒｌｅのバランス塩類溶液）中、３７．５℃インキュベーター内に置く。
【００３２】
いったん胚を注入すると、生きている胚は養母への移入のためにＤＰＢＳに移動する。養母は、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔する。皮膚を通じて腹側中線切開を作製し、卵巣及び卵管を、卵巣を直接覆う筋肉層を通る切開によって露出する。卵嚢を破き、胚を移入ピペット中に拾い上げ、この移入ピペットの先端を漏斗内に挿入する。約１０〜１２個の胚を、漏斗を通じて各ラットの卵管内に移入する。次に切開を縫合で閉じ、養母を単独で巣に入れる。
【００３３】
本発明の別の態様においては、ヒトアミロイド前駆体タンパク７７０のコドン７１４突然変異体をコードするポリヌクレオチド配列又はそのアイソフォームもしくはフラグメントでトランスフェクトしたトランスジェニック細胞株を、分子のスクリーニング及びその分子の有効性のモニタリングのための薬剤スクリーニングアッセイにおいて使用することができる。更に、このようなモデル系は、根底にあるＡＰＰ及びβ−アミロイド代謝の生化学を定義するための道具を提供し、それによって合理的な薬剤設計の基礎を提供する。分子の特異的有効性は、その分子の投与なしでのＡβ４２ペプチド又はＮ短縮型Ａβ４２ペプチドの量と比較して、より低いＡβ４２ペプチド又はＮ短縮型Ａβ４２ペプチドの形成を測定することによってモニタリングすることができる。好適な分子は、小さい分子、生物学的ポリマー、例えばポリペプチド、多糖類、ポリヌクレオチド等である可能性がある。小さい分子（例えば小さい有機分子）及び他の薬剤候補は、例えばコンビナトリアル及び天然生成物ライブラリーから得ることができる。試験化合物は、典型的には約１ｎＭ〜１ｍＭ、通常約１０μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で培地に投与される。
【００３４】
Ａβ４２ペプチド形成及び／又はその短縮型形態のモニタリングは、標準的生化学的技術を用いて測定することができるが、優先的にはＥＬＩＳＡアッセイで行う。これらのアッセイは、スクリーニングの経過中にこれらの目的のために開発された従来の技術を用いて行うことができる。
【００３５】
薬剤スクリーニングアッセイを行うために、アッセイの自動化に適応させることが可能である。組換え細胞及び標的分子の間の相互作用（例えば結合）は、反応物質を含有させるために好適な任意の容器内で達成することができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、及び微量遠心管が挙げられる。
【００３６】
同様にスクリーニングアッセイの範囲内にあるのは、組換え細胞株において特異的ｍＲＮＡ標的の翻訳を阻害するように機能するアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチド配列である。このような標的が、例えばβ−セクレターゼホモログ又は前記β−セクレターゼ（ホモログ）もしくはＮ短縮型Ａβ４２ペプチドのようなＡβ４２ペプチドの短縮形態の生成に関与するプロテアーゼのモジュレーターであろうことは、非常に充分な可能性がある。例えば、アンチセンスＲＮＡ分子は、遺伝子ライブラリーの合成の技術分野において公知の任意の方法によって調製されたライブラリーにおいて生成してもよい。あるいは、前記アンチセンス配列は、誘導可能又は構成的プロモーターの発現下でアンチセンスｃＤＮＡライブラリー中に構築することができる。
【００３７】
別の態様においては、上述のような非ヒトトランスジェニック動物は、「曇り」拡散斑の阻害及び形成について分析することができる。ＡＰＰ７１４中の本発明の突然変異は、主にＮ短縮型Ａβ４２から構成される異常な斑組成を有する重症のＡＤ病理学及び形態学をもたらす。Ａβ４０形態は、ヒト脳におけるアミロイド沈着にはほとんど存在せず、典型的な密にコア形成した斑の形成が遅延することが見出されている。優性なアミロイド沈着は、ジストロフィ的（ｄｉｓｔｒｏｐｈｉｃ）軸索及び反応性グリオーシスと関連する拡散した非コンゴフィリックアミロイド斑である。本発明においては、拡散した非コンゴフィリック（及びそのため非原線維性）Ａβ斑が病原性でありＡＤを引き起こすという新規な病理学的知見が提示される。更に、罹患患者においては、ジストロフィ的軸索及び神経原線維の病理学は、斑非依存性の方法で発症することができることが示される。これは、非原線維性プレアミロイド沈着がニューロン毒性を引き起こす潜在能力を有すること、及び軸策性（ｎｅｕｒｉｔｉｃ）及びアミロイド病理学の発症がＡＤ疾患のある段階で分離され得ることを証明する。更に、本発明は、Ｎ短縮型Ａβ４２がニューロン毒性及びＡＤ患者における認知低下を引き起こすのに必要かつ十分な役割を果たすという証拠を初めて提示する。具体的な態様においては、上述のような非ヒトトランスジェニック動物は、分子のスクリーニング及び脳内でのＡβ沈着に対するその分子の効果についてのその動物のモニタリングに用いることができる。優先的には、細胞性スクリーニングアッセイにおいて同定され、Ｎ短縮型Ａβ４２の形成及びＡβ４２形成に対する効果を有する分子が非ヒトトランスジェニック動物に投与される。トランスジェニック動物のモニタリングは、脳内の斑の量の測定、異常リン酸化タウタンパクの量及び／又はグリア細胞の数の増加の測定を含むがそれらに限定されない病理学的研究によって行うことができる。用いることができる別の手順は、行動活性試験における減少の測定である。学習及び記憶の欠陥を評価するために設計された行動試験が利用される。このような試験の一例は、Ｍｏｒｒｉｓ Ｗａｔｅｒ迷路（Ｍｏｒｒｉｓ， Ｌｅａｒｎ． Ｍｏｔｉｖａｔ． １２：２３９−２６０（１９８１））である。この手順においては、動物を、水の表面のすぐ下に沈めた避難プラットフォームを備えた、水で満たした円形プールに置く。プラットフォーム上には視認できるマーカーを置いて、動物が近位の視覚的な手掛かりに向かって進むことによってそれを見つけることができるようにする。あるいは、プラットフォームの位置をマークする形式的な手掛かりがない、より複雑な形態の試験を動物に与える。この形態においては、動物は、遠位の視覚的な手掛かりに対する相対的なプラットフォームの位置を学習しなければならない。
【００３８】
試験トランスジェニックマウスに適用される手順は、トランスジェニックラットについても同様である。
【００３９】
最後に、最後の態様においては、ＡＰＰ７７０のアミノ酸残基位置７１４に相当するアミノ酸位置にスレオニン以外のアミノ酸（好ましくはイソロイシン）を有するＡＰＰアイソフォーム又はフラグメント（これはγ−セクレターゼの好ましい基質である）をコードするポリヌクレオチド配列は、γ−セクレターゼモジュレーター、及び／又はＡβ４２のＮ短縮型形態及びＣ短縮型形態をもたらす選択的プロセッシング酵素の同定のために用いることができる。最近、γ−セクレターゼの活性がアスパルチルプロテアーゼの新規なクラスであるプレゼニリンによってコードされるという説得力のある証拠が提供された（Ｌｉら （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０５：６８９）。前記の同定は、検出可能なγ−セクレターゼ活性がもはや存在しない二重プレゼニリンノックアウトＥＳ細胞株中で優先的に行うことができる（Ｈｅｒｒｅｍａｎ Ａら （２０００） Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：４６１）。したがって、本発明のＡＰＰ７１４突然変異と一緒での二重プレゼニリン突然変異体ＥＳ細胞株は、γ−セクレターゼホモログ、γ−セクレターゼ活性の遺伝的モジュレーター及びＡＰＰタンパクの代替的プロセッシング酵素を単離及び同定するための優れたコンビナトリアルツールである。単離によって、補充、スクリーニング、又はゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーを用いる選択クローニング法のような標準的分子生物学のツールを用いて細胞をトランスフェクトし、γ−セクレターゼ活性を誘導することが意味される。アデノウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスライブラリーのような組換えウイルスライブラリーもまた使用し得ることは明らかである。先に述べた方法論は単なる例であり、潜在的な候補をもたらし得る他の可能なアプローチを排除するものではない。タンパク分解活性の回復に続いて異なる手段を行うことができ、少数の例を挙げると、ＥＬＩＳＡアッセイ又はアミロイドペプチド産生を測定する他のアッセイ、又はルシフェラーゼレポーター系もしくは他のものを用いるノッチ切断を測定するアッセイがある。このようなアッセイの感度を増大するために、ＡＰＰ７１４突然変異体又は他のタンパク及びこのようなアッセイに有用なレポーターをコードするｃＤＮＡでＥＳ細胞を安定にトランスフェクトすることを考慮することができる。
【００４０】
以下の実施例は、本発明の好ましい特徴をより充分に説明するが、いかなる方法においても本発明を制限することを意図されていない。以下に開示されている出発物質及び試薬のすべては、当業者には公知であり、商業的に入手可能であるか、又は周知の技術を用いて調製することができる。
【００４１】
実施例
ＡＰＰ　Ｔ７１４Ｉ突然変異
家族ＡＤ１５６（図１Ａ）は、早期発症型ＡＤの常染色体優性遺伝と一致するオーストリアの家族であり、ＤＮＡ診断のために調べられた。発端者、その姉妹、及び彼女らの母は、それぞれ３８歳、３８歳及び４４歳の時にＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準にしたがっておそらくＡＤであるとして診断された。しかし、認知障害及び行動障害の兆候は、３人の患者すべてにおいて数年前から明らかであり、この家族における３４歳までの平均発症年齢が示唆された。発端者のゲノムＤＮＡを、ＡＰＰ、ＰＳ１及びＰＳ２中の突然変異について検査した。ＡＰＰのエクソン１７中に（図１Ｂ）、ヘテロ接合性のＣからＴへのトランジション（転置）が位置２２０８に同定され、コドン７１４のＴｈｒ（Ｔ）がＩｌｅ（Ｉ）に置換されていた（Ｔ７１４Ｉ、番号付けはＡＰＰ７７０アイソフォームにしたがう）。この突然変異は、ＴｓｐＲＩ制限部位を失わせており、これは発端者（１５６．１）及びその姉妹（１５６．２）におけるこの突然変異の存在を確認するために用いられた（図１Ｃ）。この突然変異は、その父ならびに５０人の健康なオーストリア人においては欠如していた。他の突然変異は検出されなかった。
このオーストリアＴ７１４Ｉ突然変異は、γ４２−セクレターゼ切断部位に直接位置するＡβのアミノ酸４３に関与する、現在までに報告された最初のＡＰＰ突然変異である。早い発症年齢、ならびに疾患の急速な進行、及び早期の死亡は、ＰＳ１における突然変異によって引き起こされるＡＤに匹敵する（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｌｇｅｎ−ｗｗｗ．ｕｉａ．ａｃ．ｂｅ／ＡＤＭｕｔａｔｉｏｎｓ）。
【００４２】
インビトロで劇的に変更されたＡＰＰプロセッシング
γ４２−セクレターゼの切断特異性に対するＴ７１４Ｉ突然変異の影響を理解するために、非ニューロン及びニューロン細胞におけるＡＰＰのプロセッシングを研究した。ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞を、Ｔ７１４Ｉ　ＡＰＰ　ｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトし、分泌されたＡβ１−４２及びＡβ１−４０レベルをコンディションド培地中で酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した（Ｄｅ Ｊｏｎｇｈｅら、１９９９； Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら、１９９８）。野生型（ＷＴ）及びロンドンＶ７１７Ｉ（Ｇｏａｔｅら、１９９１）ＡＰＰ　ｃＤＮＡを過剰発現する細胞を対照として用いた。Ｔ７１４Ｉ突然変異は、Ａβ４２を増大させ、同時にＡβ４０を低減させて、有意に増大したＡβ１−４２／Ａβ１−４０比（ｐ＜０．００１）をもたらし、これはＷＴ　ＡＰＰにおけるものより４倍高かった。同じ実験において、Ｖ７１７Ｉは、Ａβ１−４２の増大のみによって１．８倍増大したＡβ１−４２／Ａβ１−４０比をもたらし、これらの結果は以前発表されたデータに匹敵する（Ｓｕｚｕｋｉら、１９９４）。本発明者らは、ＥＬＩＳＡによって患者（１５６．２）、その罹患していない父（１５６．３）及び５人の無関係な年齢適合対照の血漿中のＡβ１−４２及びＡβ１−４０もまた測定した。Ａβ１−４２／Ａβ１−４０比は、罹患していない父と比較して２．５倍増大しており、対照と比較して１．７倍であった。Ｔ７１４Ｉ及びＷＴ　ＡＰＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコンディションド培地もまた、レーザーイオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法によって分析した（図２）（Ｈａａｓｓら、１９９２；Ｓｉｓｏｄｉａら、１９９０）。この方法は、全長及びＮ短縮型の両方のＡβを評価することを可能にした。ＷＴと比較して、Ｔ７１４Ｉは、６．４倍（ｐ＜０．００１）のＡβ１−４２の有意な上昇を示したが、同時に、Ａβ１−４０は有意に４３％減少した（ｐ＜０．００１）。これは、ほぼ等しいレベルの分泌Ａβ１−４０及びＡβ１−４２をもたらし、Ａβ１−４２／Ａβ１−４０比を１０．８倍増大した。同様の影響は、ｐ３に対しても見られ、等しいレベルの分泌Ａβ１７−４０及びＡβ１７−４２、及びＷＴに対して１０．７倍増大したＡβ１７−４２／Ａβ１７−４０比を有していた。Ｔ７１４Ｉ突然変異の１つの他の顕著な影響は、Ｎ末端残基に関わらずＶ３９及びＧ３８で終わるＡβペプチドの増大である。同様の影響は、Ｇ３７で終わるｐ３ペプチド及び全長Ａβについても見られた。これらのペプチドは、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２ペプチドが非トランスフェクト細胞の培地に添加された場合には分解しなかったことから、全長Ａβのタンパク分解によって人工的に生成されたのではない（Ｗａｎｇら、１９９６）。Ａβ４０の劇的な増大にもかかわらず、Ｎ又はＣ末端に関係のない総Ａβ（ＡβＸ−Ｘ）は、Ｔ７１４Ｉについて２．５倍増大した。γ４２−セクレターゼ切断部位の近傍に位置する他のＡＰＰ突然変異（Ａｎｃｏｌｉｏら、１９９９； Ｃａｉら、１９９３； Ｇｏａｔｅら、１９９１； Ｓｕｚｕｋｉら、１９９４）と比較して、Ｔ７１４Ｉは、Ａβ４２／Ａβ４０において最高の増大を有する。興味深いことに、Ａβ４０の���ンビトロでの減少もまた、Ｔ７１４Ｉの１アミノ酸下流であるフランスＩ７１５Ｍ突然変異について最近報告された（Ａｎｃｏｌｉｏら、１９９９）。これらの突然変異がＡβ４０及びＡβ４２分泌に影響する又はＡβ３８もしくはＡβ３９への代替的切断をもたらすメカニズムは、未だ解明されていない。別個のγ−セクレターゼ（Ｃｉｔｒｏｎら、１９９６）は、この領域においてα−へリックス構造を有する（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒら、１９９７）これらの突然変異ＣＴＦｓに対して異なる結合親和性／切断効率を有する可能性があり（Ｋｌａｆｋｉら、１９９６）、３又は４位置離れたアミノ酸残基が空間的に近づくことを可能にする。これは、なぜＴ７１４Ｉ及びＶ７１５Ｆが同様にγ４０−セクレターゼ活性にも影響するかを説明する可能性がある。総Ａβの増大がγ−セクレターゼの更なる作用によるＣＴＦｓの増大したプロセッシングによるのか、あるいはα及びβ−セクレターゼが存在する細胞の区画へのＡＰＰの増大した往来によるのか、を分析するために、本発明者らは、ＡＰＰＳα及びＡＰＰＳβを定量した。有意な変化は記録されなかった（図３）。総Ａβ（ＡβＸ−Ｘ）の増大と一緒に考慮すると、ＡＰＰＳα及びＡＰＰＳβの不変のレベルは、ＣＴＦｓのプロセッシングがＡＰＰプロセッシングの律速段階であろうことを示した。次の段階において、本発明者らは、一次ニューロンにおけるＡＰＰのγ−セクレターゼ切断部位の近くの一連の臨床的突然変異の影響を系統的に分析した。この目的のため、本発明者らは、ヒトＷＴ　ＡＰＰ、又はオーストリアＴ７１４Ｉ（Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈ Ｓ （２０００） Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ９：２５８９）、フランスＶ７１５Ｍ（Ａｎｃｏｌｉｏ Ｋ（１９９９） ＰＮＡＳ ９６：４１１９）、ドイツＶ７１５Ａ（Ｖａｎ Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ、未発表データ）フロリダＩ７１６Ｖ（Ｅｃｋｍａｎ Ｃ（１９９７） Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ６：２０８７）、インディアナＶ７１７Ｌ（Ｍｕｒｒｅｌｌ ＪＲ（２０００） Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． ５７：８８５）又はロンドンＶ７１７Ｉ（Ｇｏａｔｅ Ａ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７０９）突然変異のいずれかを含むＡＰＰを、ニューロンの初代培養物中で発現させた。本発明者らは、抗体ＦＣＡ３３４０又は抗体ＦＣＡ３５４２を用いて（Ｂａｒｅｌｌｉ Ｈ（１９９７） Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ３：６９５）、それぞれＡβ４０〜又はＡβ４２を馴化培地から特異的に免疫沈降させた。Ｖ７１５Ｍを除いてすべてのＡＰＰのＣ末端突然変異は、Ａβ１−４２の分泌を増大させた。Ａβ１−４２の増大は、Ｔ７１４Ｉについての１．５４倍からＶ７１７Ｌについての２．７１倍までにわたった。これは、残基４２で終わるＮ短縮型Ａβアイソフォーム（ＡβＸ−４２）の増大が伴っていた。これらのアイソフォームはゲル中を二重のバンドとして泳動し、おそらく、アミノ酸残基１１での代替的β−セクレターゼ活性によって、又はＡβ配列のアミノ酸残基１７でのα−セクレターゼ活性によって、生成されている。一方、Ａβ１−４０は、ほとんどの突然変異について減少する。Ｔ７１４Ｉ、Ｖ７１５Ｍ及びＶ７１５Ａ突然変異は、Ａβ１−４０分泌を、それぞれ野生型レベルの２０％、３０％及び５５％まで最も劇的に減少させる。Ｖ７１７Ｉ及びＶ７１７Ｌ突然変異は、それより少ない程度でＡβ４０分泌に影響し、Ｉ７１６Ｖ突然変異は見かけ上Ａβ４０分泌に影響しない。Ｎ短縮型Ａβ４０アイソフォーム（ＡβＸ−４０）の分泌は、Ａβ１−４０に匹敵する程度で減少した。したがって、Ａβ１−４２／Ａβ１−４０比を各突然変異についてＷＴ　ＡＰＰ（任意に、１に等しいと設定した）と比較する場合、この比は、すべてのＡＰＰ突然変異において増大する。この増大は、Ｖ７１７Ｉについての１．８９倍からＴ７１４Ｉについての８．２０倍までにわたる。更に、Ａβ１−４２／Ａβ１−４０比は、異なる突然変異についての平均発症年齢と逆に相関する（ｒ＝−０．８６）。
【００４３】
異常斑形態学及び構成
発端者（１５６．１）の神経病理学的検査により、拡散グリオーシス、アミロイド斑及び神経原線維濃縮体を伴う広範なニューロン損失が示され、ＡＤの診断が確認された。本発明者らは、３つの選択した脳領域、すなわちエントリナル（ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ）皮質（ＥＲＣ）を含む海馬（ｖｉｚ． ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）、側頭皮質及び前頭皮質由来の連続切片についての組織及び免疫組織化学によって徹底的な分析を行った。全長Ａβ及びｐ３の両方を認識する抗体（ｍＡｂ　４Ｇ８）を用いた免疫染色により、しばしば中心裂孔（ｃｅｎｔｒａｌ ｌａｃｕｎａ）に封入された「雲様」拡散斑として巨大な斑負荷が優勢に顕著に染色された。歯状回の分子層においては、アミロイド斑は、ＰＳ１Δ９患者について記載されたのと同じ非軸索「綿毛（ｃｏｔｔｏｎ ｗｏｏｌ）」斑を有していた（Ｃｒｏｏｋら、１９９８）。本発明者らは、コンゴレッド及びチオフラビン染色によってアミロイド斑の線維性の性質を決定した。密にコア形成した斑は、コンゴフィリックであり、チオフラビンで蛍光性であったが、一方、拡散斑の大部分は非コンゴフィリックであった。チオフラビンについて弱い陽性の少数の拡散斑においては、線維性アミロイドは、免疫組織化学的に認識された総アミロイドのほんの小さい部分のみを占めていた。ＥＲＣの第ＩＩＩ層においては、アミロイド斑はコンゴフィリックであったが、一方、その表面及び深部の層においては、拡散斑はここでも非線維性であった。強い軸索病理は、ＣＡ１、及び海馬及びＥＲＣの鉤状回分野において顕著であった。軸索は、過リン酸化タウ（ＡＴ８）、ユビキチン、及びＡＰＰを、斑病理学にかかわらず蓄積した。アミロイド染色とともに内皮細胞マーカー（ＣＤ３１及びＣＤ３４）を用いると、拡散斑ではなく老人斑コアは、血管と密接に関連していた。この特徴は、終板において最も顕著であり、ここではすべての線維性アミロイド沈着物が血管と関連していた。次に、本発明者らは、インビボでこの突然変異がＡＰＰプロセッシングに対して同様の影響を有するかどうかを検査した。Ｃ末端Ａβ４０特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＪＲＦ／ｃＡｂ４０／１０に対する反応性は、同皮質中の血管壁及びアミロイド斑の両方において完全に欠如していたが、一方、海馬の終板領域においては弱い免疫反応性が時々存在した（各０．７ｍｍ２の１０視野当り２〜３のアミロイド沈着物）。対照的に、Ｃ末端Ａβ４２特異的ｍＡｂであるＪＲＦ／ｃＡｂ４２／１２は、拡散斑、血管壁及び「非頻発性」の密にコア形成した斑を含むすべてのアミロイド沈着物に強い反応性を付与した。４Ｇ８で切片を染色し、画像解析によってＡβ４０及びＡβ４２に対して特異的な抗体についての免疫反応性と比較した。海馬においては、Ａβ４０は、アミロイド沈着物の１〜７％しか構成していなかったが、新皮質においては完全に欠如していた。共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）による多スペクトル分析もまた、Ａβ４０の欠如及び４Ｇ８及びＡβ４２特異的抗体についての完全な組織化学的重複を明らかにした。これらの観察は、他のＡβ４０特異的（ＦＣＡ３３４０； Ｃｌｅｍｅｎｔｓら、１９９３、及びＲ２０９； Ｍｅｈｔａら、２０００）及びＡβ４２特異的抗体（２１Ｆ１２、Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、１９９７； ＦＣＡ３５４２、Ｃｌｅｍｅｎｔｓら、１９９３； Ｒ２２６、Ｍｅｈｔａら、２０００）を用いて確認された。本発明者らは、Ｖａｌ３９（Ａβ３９）及びＴｈｒ４３（Ａβ４３）で終わるＡβの存在についてもチェックしたが、これらのペプチドのいずれもがＡＰＰ７１４脳に有意に沈着していなかった。本発明者らは、これらのアミロイド沈着物におけるＡβのＮ短縮を研究し、拡散斑が何らかのグリア反応を起こすことができるかどうかを確認した。Ｎ末端Ａβに対する抗体のパネル（６Ｅ１０、６Ｆ／３Ｄ及びＪＲＦ／ＡβＮ／１１）についての反応性は、４Ｇ８反応性と比較した場合、拡散斑はＮ短縮型Ａβから構成され、一方、全長Ａβは血管壁、密なアミロイドコア及びＥＲＣ第ＩＩＩ層のアミロイド斑に封入されており、深部皮質層については顕著に陰性であることを示した。豊富なグリア及び炎症性病理が、大グリア細胞（ＧＦＡＰ）、ミクログリア細胞（ＣＤ６８、ＨＬＡ−ＤＲ）及び補体（Ｃ１ｑ）マーカーを用いて拡散斑ならびにコンパクト斑に関連して記録された。強いグリア活性化は白質におけるのと同様に斑病理無しの多くの領域において記録されたが、ミクログリアはコンパクト斑の近傍に存在した。
【００４４】
トランスジェニックマウスの作製
本発明者らは、現在トランスジェニックマウスを作製している。突然変異体ＡＰＰ７１４が血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーターの制御下にある構築物の配列を、配列番号２として示す（配列番号２におけるヌクレオチド番号付けを有する構築物、１１４〜１５７６　ＰＤＧＦプロモーター；１６７６〜１９０５　Ｇｏｒｍａｎの合成イントロン；１６４８〜１９３２　ｐＩＲＥＳ−ＥＹＦＰから由来する、Ｇｏｒｍａｎのイントロンに隣接する配列；１９３８〜４０２２　ＡＰＰコード配列（１９３８−ＡＴＧ、４０２３−ＴＡＧ）；４０２６〜４６７８　ＡＰＰ　３′ＵＴＲ；４６９１〜４８９９　ＳＶ４０　ｐＡ付加；３８５３　ＣからＴへの転置（ＡＰＰ７１４突然変異））。線状化された配列番号２のような構築物を精製し、４種のＦ１雑種株（Ｃ５７／Ｂｌ／６　×　ＣＢＡ，Ｃ５７／Ｂｌ／６　×　ＤＢＡ、Ｃ５７／Ｂｌ／６　×　Ｄ２、Ｃ５７／Ｂｌ／６　×　Ｃ３Ｈ）の過剰排卵させた雌から単離された１．５日齢の前核胚にマイクロインジェクションする。
【００４５】
材料及び方法
ＡＤ診断
家族ＡＤ１５６の患者を、神経学的検査、神経心理学的試験、神経イメージング及び神経病理学に基づいてＡＤと診断した（Ｋｌｅｉｎｅｒｔら、準備中）。その母親は４４歳の時に診断された。彼女は、進行性記憶障害を有し、そのうち分別を失った。ＥＥＧは、中程度であるが一般化された非特異的変化を示したが、一方、ＣＴは脳萎縮を示した。この発端者ならびに彼女の姉妹は、３８歳の時に神経学的検査を受けた。彼女らはともに重症のうつ病を患っていた。ミニメタルステート検査（ＭＭＳＥ）は、痴呆の存在を確認した。ＳＰＥＣＴは明確な活動低下を示し、一方、ＣＴは脳萎縮の存在を確認した。ＭＭＳＥによって繰り返し測定されると、姉妹の両方において痴呆は急速に進行していた。例えば、３９歳の時、発端者は１８／３０の得点を示し、彼女の姉妹は１１／３０であり、４０歳の時、得点は既にそれぞれ１０／３０及び３／３０に低下していた。症状の発症の実際の年齢は、患者らを処置した神経学者によれば数年前であった。母親の発症年齢は、５〜７年前、娘たちでは４〜５年前と見積もられた。したがって、家族ＡＤ１５６における平均発症年齢は、３４歳までと見積もられた。発端者のＡＰＯＥゲノタイプはＥ３Ｅ３、姉妹のそれはＥ２Ｅ３であった。母親のＡＰＯＥゲノタイプ、Ｅ２Ｅ３は、父親及び同胞のそれから推定された。発端者は４１歳で死亡し、脳の剖検を受け、その姉妹は４２歳でまだ生きている。脳の巨視的検査は、ひどい萎縮を示し、１０００ｇまでの重さであった。前脳、中脳及び後脳由来の切片を、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）、Ｎｉｓｓｌ、コンゴレッド、及び改変Ｂｉｅｌｓｈｏｗｓｋｙで染色した。初老性ＡＤの決定的な診断が下された。
【００４６】
遺伝子解析
ＡＰＰのエクソン１６及び１７を、患者１５６．１のゲノムＤＮＡから、発表されたプライマーセット及びＰＣＲ条件を用いて（Ｂａｋｋｅｒら、１９９１）ＰＣＲ増幅し、ＰＣＲフラグメントを、「Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ローダミン　ダイターミネーター　サイクルシークエンシング」キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）を用いて配列決定した。生成物を、ＡＢＩ３１０キャピラリＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。ＡＰＰ　Ｔ７１４Ｉ突然変異は、ＰＣＲ増幅されたＡＰＰエクソン１７のＴｓｐＲＩ消化によって解析された。３５４ｂｐの野生型（ＷＴ）フラグメントは、それぞれ２３２ｂｐと１２２ｂｐとの２つのフラグメントに切断され、一方、Ｔ７１４Ｉ突然変異フラグメントは切断されない（図１）。ＰＳ１及びＰＳ２のすべてのコードエクソンを、発表されたプライマーセット（Ｃｒｕｔｓら、１９９８）を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、記載されたような（Ｃｒｕｔｓら、１９９８）一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析によって突然変異についてスクリーニングした。ＡＰＯＥゲノタイプは、記載されたように決定した（ｖａｎ Ｄｕｉｊｎら、１９９４； Ｗｅｎｈａｎら、１９９１）。
【００４７】
インビトロ突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　部位特異的突然変異誘発」系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いてｐＣＤＮＡ３にクローニングされたＷＴ　ＡＰＰ６９５　ｃＤＮＡについて行った。プライマーａｐｐ７１４ｓ（５′−ＣＧＧＴＧＴＴＧＴＣＡＴＡＧＣＧＡＴＡＧＴＧＡＴＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣ−３′）及びａｐｐ７１４ａｓ（５′−ＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＡＴＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＧ−３′）を用いて、構築物中にＡＰＰ　Ｔ７１４Ｉ突然変異を挿入した。構築物の配列は、「Ｔａｑ　ダイターミネーターシークエナーゼＩＩシークエンシング」キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）を用いて挿入フラグメントの直接ＰＣＲ配列決定によって確認した。生成物を、ＡＢＩ３７３自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。突然変異体ＡＰＰ　Ｖ７１７Ｉは、以前記載されたように構築した（Ｈｅｎｄｒｉｋｓら、１９９５）。
【００４８】
ｃＤＮＡトランスフェクション
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ−２９３Ｔ）細胞を、製造者の手順にしたがってＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、Ｔ７１４Ｉ、Ｖ７１７Ｉ又はＷＴ　ＡＰＰ６９５　ｃＤＮＡ構築物を含むｐＣＤＮＡ３ベクターで一過性にトランスフェクトした。細胞中の構築物の存在は、ウェスタンブロッティングによって確認した。ＡＰＰ発現について正規化するために、細胞を、３００ＩＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ　トリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０，０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ＋完全プロテアーゼ阻害剤）中で溶解した。５μｌアリコートの希釈系列を、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル上で分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜上にブロッティングし、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｔａｒ　化学発光システム（Ｔｒｏｐｉｘ）を用いて抗体１０Ｂ４（Ｓｅｎｅｔｅｋ）で免疫検出を行った。全長ＡＰＰ免疫反応性バンドを、ＮＩＨイメージソフトウェアパッケージを用いて定量した。
【００４９】
Ａβ　ＥＬＩＳＡ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレート中でＷＴ又はＴ７１４Ｉ　ＡＰＰ　ｃＤＮＡで三連でトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、１ｍｌの添加物を含まないＯＰＴＩＭＥＭ培地をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加し、２４時間、馴化した。６回のトランスフェクションから培地を集め、プールした。Ａβ　ＥＬＩＳＡのために１ｍｌアリコートを用いた。Ａβ４２濃度を、Ａβ４２ペプチドを検出するＩＮＮＯＴＥＳＴ　β−アミロイド１−４２　ＨＳ　ＥＬＩＳＡのプロトタイプ版を用いて、ＥＬＩＳＡによって馴化培地中で測定した（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら、１９９８）。記載されたように（Ｄｅ Ｊｏｎｇｈｅら、１９９９； Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら、１９９８）、ウサギ抗血清Ｒ２０９（Ｍｅｈｔａら、２０００）を捕獲抗体とし、ビオチン化３Ｄ６（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｗｏｏｄら、１９９７）を検出抗体として用いて、ＥＬＩＳＡによってＡβ４０を測定した。各実験は三連で行って、結果を平均化した。両側独立ｔ検定を用いて、ＷＴ及び突然変異体トランスフェクタントによって産生されたＡβの平均レベルを比較した。
【００５０】
質量分析Ａβ解析
上記のように集めた上清の第二のアリコートに、プロテアーゼ阻害剤（２ｍＭ　ＥＤＴＡ−Ｎａ、１０μＭ　ロイペプチン、１μＭ　ペプスタチンＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、０．１ｍＭ　ＴＬＣＫ、０．２ｍＭ　ＴＰＣＫ）を添加した。Ａβペプチドを、以前記載されたように（Ｗａｎｇら、１９９６）免疫沈降／質量分析Ａβアッセイ（ＩＰ／ＭＳ）によって解析した。Ａβペプチドを、ｍＡｂ　４Ｇ８（Ｓｅｎｅｔｅｋ， Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＭＯ）及びプロテインＧ　Ｐｌｕｓ／プロテインＡ−アガロースビーズ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｉｎｃ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を用いて１．０ｍｌのコンディションド培地から免疫沈降し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＳＴＲ ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、ＰＥ／ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いて解析した。各質量スペクトルを２５６の測定値から平均し、内部質量較正物質としてウシインシュリンを用いて較正した。コンディションド培地中のペプチドレベルを比較するために、合成Ａβ（１２−２８）ペプチド（１０ｎＭ）を内部標準として用い、相対ピーク強度を用いた。ＥＬＩＳＡ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析の両方を、試料の正体について「目隠しされた」実験者によって行った。
【００５１】
ＡＰＰＳα及びＡＰＰＳβの定量
５μｌの馴化培地を４〜１２％ＮｕＰａｇｅゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜上に転写し、この膜をＰＢＳ＋０．２％Ｉ−ブロック＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中でブロッキングし、一次抗体である１：２０００希釈された６Ｅ１０（ＡＰＰＳαについて）又は１／５００希釈された５３／４（ＡＰＰＳβについて）とともに４℃で一晩インキュベートし、アルカリホスファターゼ標識二次抗体（１／４０００希釈）とともにインキュベートし、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｔａｒ化学発光試薬（Ｔｒｏｐｉｘ）又はＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のいずれかで検出した。
【００５２】
免疫組織化学
それぞれＡβ４０及びＡβ４２のＣ末端に対して特異的なｍＡｂであるＪＲＦ／ｃＡｂ４０／１０及びＪＲＦ／ｃＡｂ４２／１２を、Ａβ残基３６〜４０（ＶＧＧＶＶ）又は残基３３〜４２（ＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ）に相当する合成ペプチドでマウスを免疫することによって作製した（Ｍｅｒｃｋｅｎら、未発表データ）。Ａβ４０及びＡβ４２　ｍＡｂの特異性は、交差反応性を示さないＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングによって確認した。同様に、ＡβのＮ末端に対して特異的なｍＡｂ　ＪＲＦ／ＡβＮ／１１を、Ａβ残基１〜７（ＤＡＥＦＲＨＤ）に対して生じさせ、全長Ａβを認識する。免疫組織化学に加えて、以下のｍＡｂを用いた：ｍＡｂ　６Ｅ１０（Ｓｅｎｅｔｅｋ；Ａβ１〜１７に対して誘起、Ａβ５〜１３を認識、Ｒｏｎｇ　Ｗａｎｇ，私信）、ｍＡｂ　４Ｇ８（Ｓｅｎｅｔｅｋ；Ａβ残基１７〜２４）、６Ｆ３Ｄ（Ｄａｋｏ；Ａβ残基７〜１７に対して誘起）、ｍＡｂ　２１Ｆ１２（Ａβ４２について、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ウサギ抗血清ＦＣＡ３５４２及びＦＣＡ３３４０（Ｂａｒｅｌｌｉら、１９９７）、ウサギＡβ４０抗血清Ｒ２０９（Ｍｅｈｔａら、２０００）及びＡβ４２　Ｒ２２６（Ｍｅｈｔａら、２０００）、ウサギ抗Ａβ１−４０（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）、ウサギ抗Ａβ３９及び抗Ａβ４３（Ｔ．Ｓａｉｄｏ， Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＲＩＫＥＮ Ｂｒａｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｗａｋｏ−ｓｈｉ ３５１−０１９８ Ｊａｐａｎ）、ｍＡｂ　２２Ｃ１１（Ｎ末端ＡＰＰ；Ｒｏｃｈｅ）、ｍＡｂ　ＡＴ８（異常リン酸化タウ；Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、及び抗グリア原線維性酸性タンパク（ＧＦＡＰ；Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ），ＣＤ６８（マクロファージ；Ｄａｋｏ）、ウサギ抗ユビキチン（Ｄａｋｏ）、Ｃ１ｑ補体（Ｄａｋｏ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＨＬＡ−ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ；Ｄａｋｏ）、ＣＤ３１（Ｄａｋｏ）、及びＣＤ３４（ＱＢＥｎｄ；Ｄａｋｏ）。Ａβ免疫組織化学のための抗原取り出しは、９８％ギ酸で１０分間処理した切片について行い、他の抗体については供給者によって推奨されるように行った。単一抗原についての染色は、ストレプトアビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＡＢＣ／ＨＲＰ）又はペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）を用いて、クロモゲンとして３′３′ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を利用して、ほかに記載されたように（Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈら、１９９７）行った。２以上の抗原の検出に関与する免疫組織化学は、ビオチン、ＨＲＰ、アルカリホスファターゼ又はガラクトシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＵＳＡ）に直接コンジュゲート化した種特異的又はＩｇＧサブタイプ特異的二次抗体を用いて行った。これに続いて、以下のクロモゲン（Ｒｏｃｈｅ）のいずれかを用いて発色させた：ＤＡＢ，３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ファストレッド、５−ブロモー４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）又は５−ブロモ−４−クロロ��３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）。Ａβ４０免疫組織化学については、高感度のチラミド増幅系（ＮＥＮ，ＭＡ，ＵＳＡ）を利用した。
【００５３】
濃度計測解析
濃度計測解析は、２１Ｆ１２、ＪＲＦ／ｃＡｂ４２／１２及びＦＣＡ３５４２（Ａβ４２について）、ＪＲＦ／ｃＡｂ４０／１０、Ｒ２０９（Ｍｅｔｈａら、２０００）及びＦＣＡ３３４０（Ａβ４０について）及び４Ｇ８で染色された５μｍ厚の連続切片について行い、Ｖｉｄａｓ画像解析系（Ｋｏｎｔｒｏｎ）を用いて行い、得られた結果を、偶発性ＡＤ症例及びＰＳ１（Ｉ１４３Ｔ）関連家族性ＡＤの患者の同様の脳領域の染色と比較した。免疫組織化学染色を表す画素をカウントし、各斑のサイズを算出した。また、０．７ｍｍ２の面積を認識する最も強度の高い染色を有する海馬又はＥＲＣ由来の５つの視野におけるＡβ染色によって占有された相対面積を、ほかに記載されたように決定した（Ｋｕｍａｒ−Ｓｉｎｇｈら、１９９７）。
【００５４】
蛍光顕微鏡観察
ＣＬＳＭの多標識のために、１０μｍ切片をｍＡｂ　２１Ｆ１２及びＪＲＦ／ｃＡｂ４２／１２とともに一晩インキュベートし、洗浄し、抗マウスＴＲＩＴＣコンジュゲート化及び抗ウサギＦＩＴＣ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｏｒｅｇｏｎ， ＵＳＡ）で標識した。４８８ｎｍラインのアルゴンシングルレーザー又は６３２ｎｍのヘリウム／ネオンダブルレーザーのいずれかを励起のために用いて、Ｚｅｉｓｓ　ＣＬＭ−４１０で画像を得た。１μｍ厚の連続光学スライスを両フルオロクロームについて別個に捕獲し、アミロイド斑中の相対Ａβ４２／Ａβ４０含量及び比を決定した。
【００５５】
組換えＳＦＶウイルスの調製
オーストリアＴ７１４Ｉ、ドイツＶ７１５Ａ，フランスＶ７１５Ｍ，フロリダＩ７１６Ｖ及びインディアナＶ７１７Ｌ突然変異を、適切なオリゴヌクレオチド及びＱｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用いて部位特異的突然変異誘発によってヒトＷＴ　ＡＰＰ　ｃＤＮＡ（６９５アイソフォーム）中に導入した。突然変異体ＡＰＰ　ｃＤＮＡを、続いてｐＳＦＶ−１（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＳｍａＩ部位にクローニングした。組換えセムリキ森林ウイルスを、記載されたように作製した（Ａｎｎａｅｒｔ ＷＧら（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４７、２７７）。
【００５６】
初代ニューロン培養
初代皮質ニューロンを、記載されたように（Ａｎｎａｅｒｔ ＷＧら（１９９９） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４７、２７７）Ｅ１４胚性マウスから単離した。手短に述べると、脳の解剖及びトリプシン処理による細胞の分離の後、細胞をポリリジンでコートした皿に置き、ニューロベーサル培地＋Ｂ２７サプリメント中でインキュベートした。非ニューロン細胞の増殖は、５μＭシトシンアラビノシドを添加することによって防止した。
【００５７】
初代ニューロンの感染
組換えＳＦＶを培地で１：１０に希釈し、３〜５日経過した初代皮質ニューロンに添加した。１時間の吸着の後、ウイルスベクター含有溶液を通常培地で取り替えて、形質導入を２時間継続した。次に培地を１００μＣｉ３５Ｓ−メチオニン（ＩＣＮ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を含む、メチオニン無含有培地に取り替えた。４時間の代謝標識の後、培養上清を集め、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、最後にプロテアーゼ阻害剤（５ｍＭ　ＥＤＴＡ、トラシロール、１μｇ／ｍｌペプスタチン）を含有するＤＩＰ緩衝液（２０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）中で溶解した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
（Ａ）ＡＰＰ　Ｔ７１４Ｉ突然変異を分離するＡＤ１５６の家系。無地の印は罹患した個体を示す。＋：死亡時の年齢；矢印は剖検が行われた発端者を示す。（Ｂ）１５６．１及び１５６．２についての配列分析、ＡＰＰのエクソン１７におけるコドン７１４でのスレオニン（Ｔ）からイソロイシン（Ｉ）へのアミノ酸置換をもたらすｃＤＮＡの位置２２０８でのヘテロ接合性ＣのＴへの転置を示す（番号付けはＡＰＰ７７０アイソフォームにしたがう）。Ｃ．ＰＣＲ増幅ＡＰＰエクソン１７生成物のＴｓｐＲＩ消化後のＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析。
【図２】
可溶性ＡＰＰ（ＡＰＰＳα及びＡＰＰＳβ）の分析。上清を、ＮｕＰＡＧＥゲル上で解像し、ＡＰＰＳαについてはｍＡｂ　６Ｅ１０（Ａ）又はＡＰＰＳβについては５３／４（Ｂ）を用いてイムノブロッティングした。Ｔ７１４Ｉ及びＷＴについてのバンドを、ＮＩＨイメージソフトウェアパッケージを用いて定量した（データは示していない）。
【図３Ａ】
ＡＰＰ　ＷＴ及びＴ７１４Ｉについての代表的なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析スペクトル。Ｔ７１４Ｉ及びＷＴ　ＡＰＰでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコンディションド培地を、ＩＰ／ＭＳによってｍＡｂ　４Ｇ８を用いて研究した。相対ピーク強度を、合成Ａβ（１２−２８）ペプチド（印：ｓｔｄ）を用いて標準化し、観察されたピークの正体を、方法に記載したように解釈した。残基４０で終わるペプチドについての優勢ピークは、Ｔ７１４Ｉについては明確に失われていることに注意されたい。
【図３Ｂ】
異なるＮ及びＣ末端を有する分泌されたＡβに対する効果を、詳細に分析した。これらは、Ａβ４２、Ａβ４０、Ａβ３９、Ａβ３８及びＡβ３７で終わり、Ｅ１（Ａβ１−Ｘ）、Ｒ５（Ａβ５−Ｘ）、Ｅ１１（Ａβ１１−Ｘ）、及びＬ１７（Ａβ１７−Ｘ）で開始するペプチドであった。棒はパネル間の比較を可能にするために等しく目盛をつけてある。ＷＴにおけるいくつかの棒の欠如は、低すぎて測定できないピークのためである。＊：ＷＴに対して少なくとも＜０．００１の統計学的有意。
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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