(57)【要約】細菌感染症一般、特に乳腺炎を予防又は治療するための、ＣＡＭＰ因子と組み合わせたストレプトコッカス ディスガラクティエ（S.dysgalactiae）、ストレプトコッカス アガラクティエ（S.agalactiae）、ストレプトコッカス ウベリス（S.uberis）、ストレプトコッカス パラウベリス（S.parauberis）及びストレプトコッカス イニエ（S.iniae）からのＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の使用が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）薬剤として許容されるビヒクルと、（ｂ）図２９の２７〜３１４位置で表した連続アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいるキメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドと、（ｃ）ＧａｐＣタンパク質とを含み、前記ＧａｐＣタンパク質が、
（ｉ）図１Ａ〜１Ｂ（配列番号４）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ii）図２Ａ〜２Ｂ（配列番号６）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（iii）図３Ａ〜３Ｂ（配列番号８）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（iv）図４Ａ〜４Ｂ（配列番号１０）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｖ）図５Ａ〜５Ｂ（配列番号１２）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、並びに、
（vi）（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）及び（vi）の免疫原性断片であって、少なくとも約５つのアミノ酸を含む断片
からなる群から選択されるワクチン組成物。
【請求項２】
前記キメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドが図２９の２７〜３１４の位置で表した連続アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ＧａｐＣタンパク質が、図１Ａ〜１Ｂ（配列番号４）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス ディスガラクティエのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片が少なくとも約５つのアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記ＧａｐＣタンパク質が図１Ａ〜１Ｂ（配列番号４）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記ＧａｐＣタンパク質が、図２Ａ〜２Ｂ（配列番号６）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス アガラクティエのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片が少なくとも約５つのアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記ＧａｐＣタンパク質が図２Ａ〜２Ｂ（配列番号６）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ＧａｐＣタンパク質が、図３Ａ〜３Ｂ（配列番号８）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス ウベリスのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片が少なくとも約５つのアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記ＧａｐＣタンパク質が図３Ａ〜３Ｂ（配列番号８）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記ＧａｐＣタンパク質が、図４Ａ〜４Ｂ（配列番号１０）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス パラウベリスのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片が少なくとも約５つのアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記ＧａｐＣタンパク質が図４Ａ〜４Ｂ（配列番号１０）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記ＧａｐＣタンパク質が、図５Ａ〜５Ｂ（配列番号１２）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス イニエのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片が少なくとも約５つのアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記ＧａｐＣタンパク質が図５Ａ〜５Ｂ（配列番号１２）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
アジュバントをさらに含む、請求項１又は２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
ワクチン組成物を製造する方法であって、
（ａ）図２９の２７〜３１４の位置で表した連続アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでいるキメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドと、
（ｂ）ＧａｐＣタンパク質であって、前記ＧａｐＣタンパク質が、
（ｉ）図１Ａ〜１Ｂ（配列番号４）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ii）図２Ａ〜２Ｂ（配列番号６）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（iii）図３Ａ〜３Ｂ（配列番号８）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（iv）図４Ａ〜４Ｂ（配列番号１０）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｖ）図５Ａ〜５Ｂ（配列番号１２）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、並びに、
（vi）（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）及び（vi）の免疫原性断片であって、少なくとも約５つのアミノ酸を含む断片
からなる群から選択されるＧａｐＣタンパク質と、
（ｃ）薬剤として許容されるビヒクルとを組み合わせることを含む、ワクチン組成物の製造方法。
【請求項１５】
脊椎動物対象の細菌感染症の治療又は予防の方法であって、前記対象に請求項１から１４のいずれかに記載のワクチン組成物の治療的有効量を投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記細菌感染症が連鎖球菌感染症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌感染症が乳房炎を起こす、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
脊椎動物対象の細菌感染症の治療又は予防のためのキメラＣＡＭＰ因子ポリペプチド及びＧａｐＣタンパク質の使用であって、前記キメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドが図２９の２７〜３１４の位置で表した連続アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＧａｐＣタンパク質が、
（ａ）図１Ａ〜１Ｂ（配列番号４）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｂ）図２Ａ〜２Ｂ（配列番号６）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｃ）図３Ａ〜３Ｂ（配列番号８）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｄ）図４Ａ〜４Ｂ（配列番号１０）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｅ）図５Ａ〜５Ｂ（配列番号１２）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、並びに、
（ｆ）（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）及び（vi）の免疫原性断片であって、少なくとも約５つのアミノ酸を含む断片
からなる群から選択される使用。
【請求項１９】
前記細菌感染症が連鎖球菌感染症である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記細菌感染症が乳房炎を起こす、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
脊椎動物対象の細菌感染症を治療又は予防する薬剤の製造におけるキメラＣＡＭＰ因子ポリペプチド及びＧａｐＣタンパク質の使用であって、前記キメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドが図２９の２７〜３１４の位置で表した連続アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＧａｐＣタンパク質が、
（ａ）図１Ａ〜１Ｂ（配列番号４）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｂ）図２Ａ〜２Ｂ（配列番号６）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｃ）図３Ａ〜３Ｂ（配列番号８）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｄ）図４Ａ〜４Ｂ（配列番号１０）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ｅ）図５Ａ〜５Ｂ（配列番号１２）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、並びに、
（ｆ）（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）及び（vi）の免疫原性断片であって、少なくとも約５つのアミノ酸を含む断片
からなる群から選択される使用。
【請求項２２】
前記細菌感染症が連鎖球菌感染症である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記細菌感染症が乳房炎を起こす、請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌感染症を治療するか予防するための複合ワクチンに関する。より詳しくは、本発明は、ワクチン組成物においてＣＡＭＰ因子と組み合わせた、ストレプトコッカス ディスガラクティエ（Streptococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス ウベリス（Streptococcus uberis）、ストレプトコッカス パラウベリス（Streptococcus parauberis）及びストレプトコッカス  イニエ（Streptococcus iniae）に由来するＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳腺炎は、通常細菌又は真菌に起因する乳腺の感染症である。感染の後の炎症性反応は、乳汁収率並びに品質の低下を起こし、酪農業に年間で大きな経済的損失を引き起こす。
【０００３】
最も一般的に乳腺炎と関連する細菌種の中には、ストレプトコッカス アウレウス（Streptococcus aureus）、ストレプトコッカス ウベリス（型別不能）、ストレプトコッカス  アガラクティエ（ランスフィールドＢ群）、ストレプトコッカス  ディスガラクティエ（ランスフィールドＣ群）、Streptococcus zooepidemicus並びにランスフィールド群Ｄ、Ｇ、Ｌ及びＮの連鎖球菌などのStreptococcus属の様々な種が含まれる。これらの種の一部（例えばS.agalactiae）は感染性病原菌であり、一部（例えばS.dysgalactiaeとS.uberis）は環境病原菌と考えられる。
【０００４】
環境病原菌S.uberisは、乳腺炎のすべての臨床症例の約２０％を起こしている（Bramley, A. J. and Dodd, F. H. (1984) J. Dairy Res. 51:481〜512; Bramley, A. J. (1987) Animal Health Nutrition 42:12〜16; Watts, J. L. (1988) J. Dairy Sci. 71: 1616〜1624）。この病原菌は非授乳期間に乳腺から分離される主要な種である（Bramley, A. J. (1984) Br. Vet. J. 140: 328〜335; Bramley and Dodd (1984) J. Dairy Res. 51:481〜512; Oliver, S. P. (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1789〜1793）。
【０００５】
S.uberis感染に起因する乳腺炎は一般に無症状であり、見かけ上、乳汁は正常であるが白血球の流入のために体細胞数が増加する。乳汁の化学組成は、血液から乳汁への塩化ナトリウムと重炭酸塩の移動に伴う分泌の抑制のために変化し、よりアルカリ性に傾く。Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ乳腺炎は急性の臨床状態を示すこともあり、その場合、乳汁の凝固又は変色及び乳腺の腫脹又は硬化などの明らかな病変徴候が見られる。一部の症例では臨床病変が激しくなり、発熱を伴うこともある。S.uberis乳腺炎の臨床症状のレビューに関しては、C. Burvenich, G. Vandeputte-van Messom and A. W. Hill（監修）、New insights into the pathogenesis of mastitis, Rijksuniversiteit Gent、 ベルギー、中のBramley (1991) Mastitis: physiology or pathology, p.3〜9、及びBovine Mastitis. Lee & Febiger、フィラデルフィア、中のSchalm et al. (1971) The mastitis complex-A brief summary, p.1〜3を参照。
【０００６】
乳首浸漬と抗生物質療法のような従来の抗菌剤による制御方法は多くの種類の伝染性乳腺炎の管理に効果的であるが、すべての乳牛畜舎で典型的に見つかる環境微生物はそのような手段に対してしばしば耐性である。従って、ワクチン接種は乳腺感染症を予防する魅力的な方策であり、一部の伝染性乳房炎病源菌の場合に有益であることが示された。
【０００７】
S.dysgalactiaeとS.uberisに対するワクチン接種の研究に関する文献は限られており、様々な結果が観察されている。場合によっては、免疫化により特定の種に対する感受性が高くなり、また他の場合には菌株特異的な保護が得られた。
【０００８】
例えば、以前の研究により、S.uberisによる一次感染が同じ菌株による第２の感染の後の感染率をかなり減らせることが分かった（Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sci. 44:386〜387）。死菌化S.uberisによる局所のワクチン接種は、ウシの乳腺を相同的菌株による乳房内感染から保護する（Finch et al.(1994) Infect. Immun. 62:3599〜3603）。同様に、生菌S.uberisによる皮下接種は、同じ株による乳腺炎の発生病理を劇的に修飾することが分かった（Hill et al. (1994) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 8:109〜118）。このようにワクチン接種をされた動物がその乳汁に排出する細菌は少なく、多くの乳房区は感染を逃れる。
【０００９】
それでもなお、生菌又は弱毒化細菌によるワクチン接種は、被接種個体に危険をもたらす可能性がある。さらに、一般的に従来の死菌ワクチンが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した細胞上の感染防御抗原の欠如、又は分子相同性によるこれらの抗原のマスキングのために、大体においてS.uberisとS.agalactiaeに対して効果がないことは明らかである。
【００１０】
S.agalactiae又は伝染性の連鎖球菌株に対する乳腺炎ワクチンが現在ないのは、少なくとも１つには病原性決定因子、及び乳腺の侵襲と保護に関係している微生物が生産する感染防御抗原に関する知識が不足しているからである（Collins et al. (1988) J. Dairy Res. 55:25〜32；Leigh et al. (1990) Res. Vet. Sci. 49:85〜87; Marshall et al.(1986)J.Dairy Res.53:507〜514)。
【００１１】
S.dysgalactiaeは、細胞外の血漿に由来するいくつかのタンパク質、例えばフィブロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、α−ＩＩ−マクログロブリン、免疫グロブリンＧ、アルブミンその他の化合物と結合することが周知である。この微生物はヒアルロニダーゼとフィブリノリシンも生成し、ウシの乳房の上皮細胞に付着して侵入することができる。しかし、これら発生病理の表現型を起こす細菌成分の正確な役割は知られていない。
【００１２】
同様に、S.uberis感染症の発生病理は十分に理解されていない。さらに、宿主防御機構と乳腺生理学に対するS.uberisの病原性因子の影響は明らかにされていない。S.uberisと関連する公知の病原性因子には、ヒアルロン酸カプセル（Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sci. 45:400〜404）、ヒアルロニダーゼ（Schaufuss et al. (1989) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A271:46〜53）、Ｒ様タンパク質（Groschup, M. H. and Timoney, J. F. (1993) Res. Vet. Sci. 54:124〜126）、ＵＢＥＲＩＳ因子としても知られるＣＡＭＰ因子であるコヘモリシン（cohemolysin）（Skalka, B. and Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A249:190〜194）、Ｒ様タンパク質、プラスミノーゲンアクティベーター及びＣＡＭＰ因子がある。しかし、病原性におけるそれらの役割はほとんど知られていない。
【００１３】
連鎖球菌に由来する病原性決定因子の免疫原性剤としての使用が提案されている。例えば、S.uberisのＣＡＭＰ因子は、その微生物による感染から脊椎動物対象を保護することが示された（Jiang、米国特許第５８６３５４３号）。
【００１４】
Ｂ群Streptococci  Ａ９０９株（ＡＴＣＣ番号２７５９１）のγ抗原はＣタンパク質マーカー複合体の１成分であり、この複合体には他にα及びβサブユニットが含まれる（Ｂｏｙｌｅ、米国特許第５７２１３３９号）。Ｂ群連鎖球菌の血清型Ｉａ、ＩＩ及びＩｂの実質的にすべての血清型の細胞のサブセットは、Ｃタンパク質の成分を発現すると報告されている。ランスフィールドＢ群の連鎖球菌感染による感染症に対する免疫原性剤としてのγサブユニットの使用が提案されている。しかし、動物の細菌感染症、例えばウシ乳腺炎の予防又は治療のための使用は調査されていない。
【００１５】
Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質は、ヒトの食細胞による攻撃を妨害する能力のために、この微生物の主要な病原性因子の１つであると考えられている（Lancefield, R. C. (1962) J. Immunol. 89:307〜313）。この細菌は、Ｍ分子に対して抗体が生成されるまで感染させた組織に留まる。Ｍタンパク質に対する型特異抗体はその分子の食作用阻止効果を無効にして、侵入微生物の効率的な一掃を可能にする。
【００１６】
Ｍタンパク質は、食作用耐性の媒介に関わる（Kehoe, M. A. (1991) Vaccine 9:797〜806）こと、またそのスーパー抗原性とその宿主交差反応性抗体応答を誘起する能力を通して潜在的に有害な宿主免疫応答を誘発する能力（Bisno, A. L. (1991) New Engl. J. Med. 325:783〜793; Froude et al.(1989) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 145:5〜26; Stollerman, G. H. (1991) Clin. Immunol. Immunopathol.61: 131〜142）のために、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes)の主要な病原性因子の１つである。
【００１７】
しかし、手つかずのＭタンパク質をワクチンとして使うことには障害が存在する。前記タンパク質のオプソニン性エピトープは極めて型特異的であり、範囲の狭い、型特異的保護となる。さらに、一部のＭタンパク質は免疫化対象の組織と交差反応するエピトープを含有して有害な自己免疫応答を引き起こすようである（例えば、Dale, J. L. and Beached, G. H. (1982) J. Exp. Med 156:1165〜1176; Dale, J. L. and Beached, G. H. (1985) J. Exp. Med. 161:113〜122; Baird, R. W.、 Bronze, M. S.、 Drabs, W., Hill, H. R., Veasey, L. G. and Dale, J. L. (1991) J. Immun. 146:3132〜3137; Bronze, M. S. and Dale, J. L. (1993) J. Immun 151:2820〜2828; Cunningham, M. W. and Russell, S. M. (1983) Infect. Immun. 42:531〜538）。
【００１８】
S.dysgalactiaeとStaphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）のフィブロネクチン結合タンパク質に由来する３つの異なるフィブロネクチン結合領域（ＦＮＢＤｓ）を含有しているキメラタンパク質が、Staph.carnosus細胞の表面で発現された。これらのタンパク質の１つの場合、その表面でキメラタンパク質を発現している組換えStaph.carnosus生菌細胞による鼻腔内の免疫化により、キメラ表面タンパク質内に存在するモデル免疫原に対する抗体応答が改善された。
【００１９】
Ａ群連鎖球菌株からのＧａｐＣプラスミン結合タンパク質は以前に同定されて特性が明らかにされており、血栓溶解療法におけるその使用が記載されている（Boyle et al.、米国特許第５２３７０５０号；Boyle et al.、米国特許第５３２８９９６号）。
【００２０】
しかし、これまで、キメラＣＡＭＰ因子と組み合わせたＧａｐＣの保護的能力は研究されていない。
【特許文献１】米国特許第５８６３５４３号
【特許文献２】米国特許第５７２１３３９号
【特許文献３】米国特許第５２３７０５０号
【特許文献４】米国特許第５３２８９９６号
【特許文献５】国際出願第９１／０４２８２号
【特許文献６】米国特許第４７０８８７１号
【特許文献７】米国特許第４４３１７３９号
【特許文献８】米国特許第４４２５４３７号
【特許文献９】米国特許第４３３８３９７号
【特許文献１０】米国特許第４３４１７６１号
【特許文献１１】米国特許第４３９９１２１号
【特許文献１２】米国特許第４４２７７８３号
【特許文献１３】米国特許第４４４４８８７号
【特許文献１４】米国特許第４４５２５７０号
【特許文献１５】米国特許第４４６６９１７号
【特許文献１６】米国特許第４４７２５００号
【特許文献１７】米国特許第４４９１６３２号
【特許文献１８】米国特許第４４９３８９０号
【特許文献１９】米国特許第５０７１６５１号
【特許文献２０】米国特許第４７２２８４０号
【特許文献２１】国際出願第ＷＯ／９０／１１０９２号
【特許文献２２】Mullis et al.、米国特許第４６８３１９５号
【特許文献２３】Mullis、米国特許第４６８３２０２号
【非特許文献１】Bramley, A. J. and Dodd, F. H. (1984) J. Dairy Res. 51:481〜512
【非特許文献２】Bramley, A. J. (1987) Animal Health Nutrition 42:12〜16
【非特許文献３】Watts, J. L. (1988) J. Dairy Sci. 71:1616〜1624)
【非特許文献４】Bramley,A.J. (1984) Br. Vet. J. 140:328〜335
【非特許文献５】Oliver, S. P. (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1789〜1793
【非特許文献６】C. Burvenich, G. Vandeputte-van Messom and A.W.Hill（監修）、New insights into the pathogenesis of mastitis、Rijksuniversiteit Gent、ベルギー、中のBramley (1991) Mastitis: physiology or pathology, p.3〜9
【非特許文献７】Bovine Mastitis.Lee & Febiger、フィラデルフィア、中のSchalmet al. (1971), The mastitis complex-A brief summary, p.1〜3
【非特許文献８】Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sci. 44:386〜387
【非特許文献９】Finch et al. (1994) Infect. Immun. 62:3599〜3603
【非特許文献１０】Hill et al.(1994) FEMS Immunol. Med. Microbiol. 8:109〜118
【非特許文献１１】Collins et al. (1988) J. Dairy Res. 55:25〜32
【非特許文献１２】Leigh et al.(1990) Res. Vet. Sci. 49:85〜87
【非特許文献１３】Marshall et al. (1986) J. Dairy Res. 53:507〜514
【非特許文献１４】Hill, A. W. (1988) Res. Vet. Sci. 45:400〜404
【非特許文献１５】Schaufuss et al. (1989) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A271:46〜53
【非特許文献１６】Groschup, M. H. and Timoney, J. F. (1993) Res. Vet. Sci. 54:124〜126
【非特許文献１７】Skalka, B. and Smola, J. (1981) Zentralbl. Bakteriol. Ser. A249:190〜194
【非特許文献１８】Lancefield, R. C. (1962) J. Immunol. 89:307〜313
【非特許文献１９】Kehoe, M. A. (1991) Vaccine 9:797〜806
【非特許文献２０】Bisno, A. L. (1991) New Engl. J. Med. 325:783〜793
【非特許文献２１】Froude et al. (1989) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 145:5〜26
【非特許文献２２】Stollerman, G. H. (1991) Clin. Immunol. Immunopathol. 61:131〜142
【非特許文献２３】Dale,J.L. and Beached, G. H. (1982) J. Exp. Med. 156:1165〜1176
【非特許文献２４】Dale, J. L. and Beached, G. H. (1985) J. Exp. Med. 161:113〜122
【非特許文献２５】Baird, R. W., Bronze, M. S., Drabs, W., Hill, H. R., Veasey, L. G. and DALE, J. L. (1991) J. IMMUN. 146:3132〜3137
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【非特許文献２７】Cunningham, M. W. and Russell, S. M. (1983) Infect. Immun. 42:531〜538
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【非特許文献７９】Finch et al. (1997) Vaccine 15:1138〜1143
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
従って、本発明は、キメラＣＡＭＰ因子と連鎖球菌ＧａｐＣワクチンの新規組成物及びそれを使う方法を提供する。一実施形態では、本発明はワクチン組成物に向けられ、この組成物は（ａ）薬剤として許容されるビヒクル、（ｂ）図２９の２７〜３１４位置で表した連続アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性（sequence identity）を有するアミノ酸を含んでいるキメラＣＡＭＰ因子ポリペプチド、並びに（ｃ）ＧａｐＣタンパク質を含み、前記ＧａｐＣタンパク質は、
（ｉ）図１Ａ〜１Ｂ（配列番号４）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（ii）図２Ａ〜２Ｂ（配列番号６）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（iii）図３Ａ〜３Ｂ（配列番号８）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（iv）図４Ａ〜４Ｂ（配列番号１０）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、
（v）図５Ａ〜５Ｂ（配列番号１２）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧａｐＣタンパク質、並びに、
（vi）（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（v）及び（vi）の免疫原性断片であって、少なくとも約５つのアミノ酸を含む断片
からなる群から選択される。
【００２２】
別の実施形態では、ＧａｐＣタンパク質は、図１Ａ〜１Ｂ（配列番号４）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス  ディスガラクティエのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片は少なくとも約５つのアミノ酸を含む。
【００２３】
別の実施形態では、ＧａｐＣタンパク質は、図２Ａ〜２Ｂ（配列番号６）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス  アガラクティエのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片は少なくとも約５つのアミノ酸を含む。
【００２４】
別の実施形態では、ＧａｐＣタンパク質は、図３Ａ〜３Ｂ（配列番号８）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス  ウベリスのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片は少なくとも約５つのアミノ酸を含む。
【００２５】
別の実施形態では、ＧａｐＣタンパク質は、図４Ａ〜４Ｂ（配列番号１０）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス  パラウベリスのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片は少なくとも約５つのアミノ酸を含む。
【００２６】
別の実施形態では、ＧａｐＣタンパク質は、図５Ａ〜５Ｂ（配列番号１２）の１から３３６までのアミノ酸位置に示されたストレプトコッカス  イニエのＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列、又はその免疫原性断片を含み、前記断片は少なくとも約５つのアミノ酸を含む。
【００２７】
ある実施形態では、前記組成物はさらにアジュバントを含む。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は脊椎動物対象の細菌感染症の予防又は治療方法に向けられ、この方法には前記対象に前記ワクチン組成物の治療的有効量を投与することが含まれる。ある実施形態では、この細菌感染症は連鎖球菌感染症（streptococcus infection）である。別の実施形態では、この細菌感染症は乳腺炎を引き起こす。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は脊椎動物対象の細菌感染症を治療又は予防するためのキメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドとＧａｐＣタンパク質の使用に向けられ、前記キメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドと前記ＧａｐＣタンパク質は上に記載した通りである。ある実施形態では、この細菌感染症は連鎖球菌感染症である。別の実施形態では、この細菌感染症は乳腺炎を引き起こす。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は脊椎動物対象の細菌感染症を治療又は予防するための薬剤の製造におけるキメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドとＧａｐＣタンパク質の使用に向けられ、前記キメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドと前記ＧａｐＣタンパク質は上に記載した通りである。ある実施形態では、この細菌感染症は連鎖球菌感染症である。別の実施形態では、この細菌感染症は乳腺炎を引き起こす。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は前記したキメラＣＡＭＰ因子ポリペプチドとＧａｐＣタンパク質、及び薬剤として許容されるビヒクルを組み合わせることを含むワクチン組成物の製造方法に向けられる。
【００３２】
本発明のこれらを含む実施形態は、本明細書で開示されたものに照らし、当業者には容易に思い付くことである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の実施には、特に明記しない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術及び免疫学の従来の手法を使用するが、これらは当分野の技術の範囲内である。そのような手法は、文献に詳しく説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II ans III, Second Edition (1989); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); シリーズのMethods In Enzymology( S. Colowick and N.Kaplan編, Academic Press,Inc.);及びHandbook of Experimental Immunology, Vols. I〜IV(D. M. Weir and C.C. Blackwell編, 1986, Blackwell Scientific Publications）を参照。
【００３４】
上であれ以下であれ、本明細書で引用したすべての刊行物、特許及び特許出願はそのまま参照により本明細書に取り込まれている。
【００３５】
以下のアミノ酸略記号が本文を通して使われる。
アラニン：Ａｌａ（Ａ）        アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）    アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）      グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）    グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）      イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）        リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）      フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）        セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
トレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）      トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）        バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００３６】
１．定義
本発明を記載する際に以下の用語が使用され、これらは以下で示すように定義される。
【００３７】
本明細書と添付の請求項で使われているように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、明らかに別の指示がない限り複数体を含むことに注意する必要がある。従って、例えば、「連鎖球菌ＧａｐＣタンパク質」への言及は、２個以上のそのようなタンパク質の混合物を含む、などである。
【００３８】
用語「ＧａｐＣタンパク質」と「ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質」（本明細書では同じ意味で使用される）、又はこれをエンコードするヌクレオチド配列は、それには限定されないがＡ群連鎖球菌のある株を含めて様々な連鎖球菌種に存在するＧａｐＣ遺伝子に由来するタンパク質若しくはヌクレオチドの配列をそれぞれ意味する（Lottenbery, R. et al. (1987) Infect. Immun. 55:1914〜1918）。代表的連鎖球菌ｇａｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列とこれらの遺伝子によってエンコードされるＧａｐＣタンパク質の対応するアミノ酸配列は、図の中で表されている。特に、図１から５は、以下に示す単離されたヌクレオチド配列及び単離されたアミノ酸配列を示す。S.dysgalactiae（それぞれ配列番号３及び配列番号４）、S.agalactiae（それぞれ配列番号５及び配列番号６）、S.uberis（それぞれ配列番号７及び配列番号８）、S.parauberis（それぞれ配列番号９及び配列番号１０）並びにS.iniae（それぞれ配列番号１１及び配列番号１２）。S.uberisとS.agalactiaeのｇａｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれアクセッション番号ＡＦ４２１８９９及びＡＦ４２１９００の下でＧｅｎＢａｎｋに提出された。
【００３９】
しかし、これらの連鎖球菌種の各々にはサブタイプが知られ、ＧａｐＣタンパク質の変異がそれらの間に発生するので、本明細書で定義されたＧａｐＣタンパク質は示された配列に限定されない。
【００４０】
S.dysgalactiae、S.agalactiae、S.uberis及びS.parauberisに由来する代表的ｇａｐＣ遺伝子は、それぞれプラスミドｐＥＴ１５ｂｇａｐＣ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７６）、ｐＭＦ５２１ｃ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７５）、ｐＭＦ５２１ａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７３）、ｐＭＦ５２１ｄ及びｐＭＦ５２１ｅ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７２）に存在する。
【００４１】
さらに、導かれたタンパク質又はヌクレオチド配列は、前記遺伝子から物理的に導かれる必要はなく、本明細書で提供される情報に基づきどんな方法、例えば、化学合成、単離（例えば、S.dysgalactiaeから）又は、組換え生成などの方法で作成されてもよい。
【００４２】
この用語には、そのようなものが存在すればシグナル配列を所有するか欠いているタンパク質、並びに調製様式により中性の形態、又は塩基若しくは酸添加塩の形態のタンパク質も含まれる。そのような酸添加塩は遊離のアミノ基を含むこともでき、塩基性塩が遊離のカルボキシル基で形成されるかもしれない。薬剤として許容される塩基及び酸の添加塩は、さらに下で議論される。さらに、前記タンパク質は、脂質（その分子を有する天然の資質又は免疫学的な活性を破壊しない他の脂質）及びサッカライドのような他の生体物質と組み合わせることにより、或いは側鎖修飾、例えばアミノ基のアセチル化、ヒドロキシ側鎖のリン酸化、スルフヒドリル基の酸化、アミノ酸残基のグリコシル化、並びにエンコードされた一次配列の他の修飾によって修飾できる。
【００４３】
用語「連鎖球菌ＧａｐＣタンパク質」は、上で定義されたように、それを生成する連鎖球菌種、例えばそれには限定されないがS.dysgalactiae、S.agalactiae、S.uberis、S.parauberis及びS.iniaeに由来するＧａｐＣプラスミン結合タンパク質を意味する。例えば、「S.dysgalactiaeのＧａｐＣタンパク質」は、上で定義されたように、S.dysgalactiaeに由来するＧａｐＣプラスミン結合タンパク質である。同様に、「S.agalactiaeのＧａｐＣタンパク質」は、S.agalactiaeに由来するＧａｐＣ結合タンパク質である。
【００４４】
ＧａｐＣタンパク質に関する用語「変異体」と「突然変異蛋白質」は、上で定義したようにＧａｐＣタンパク質の生物学的に活性な誘導体、又は免疫学的及び／又はプラスミン結合活性を保持するその誘導体の断片を指す。用語「突然変異蛋白質」は、１つ以上のペプチド擬態（「ペプトイド」）を有するペプチドを意味し、これらは例えば、国際出願第９１／０４２８２号に記載されている。好ましくは、変異体又は突然変異蛋白質は少なくとも未変性の分子と同じ活性を有す。ポリペプチド変異体と突然変異蛋白質の作製方法は当技術分野で周知であり、さらに下で記載される。
【００４５】
一般に、用語「変異体」は、その修飾が活性を破壊しない限り、元の分子に１つ以上のアミノ酸添加、置換（通常、自然界では保存的）及び／又は欠失を有するポリペプチド配列を有する化合物を意味する。このように、ＧａｐＣタンパク質の「変異体」には、前記免疫学的及び／又はプラスミン結合活性を示すＧａｐＣ遺伝子によってエンコードされる連続するアミノ酸配列と実質上相同的（下で定義される）なアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。特に好ましい置換は、一般的に自然界では保存的なものであり、つまりアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。例えば、アミノ酸は通常、４つのファミリーに分けられる。（１）酸性−アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩、（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることもある。例えば、イソロイシン若しくはバリンによるロイシンの独立した置換又はその逆の置換、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩の独立した置換又はその逆の置換、セリンによるトレオニンの独立した置換又はその逆の置換、或いは構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の同様な保存的な置換は、生物学的活性に大きく影響しないことは当然予想できる。実質上同じアミノ酸配列を参照分子として有するが前記タンパク質の免疫原性及び／又はプラスミン結合能に実質的に影響を及ぼさない些細なアミノ酸置換を有するタンパク質は、従って前記参照ポリペプチドの定義の範囲内である。
【００４６】
他の置換には、天然のアミノ酸のアミノ酸類似体による置換が含まれる。そのようなアミノ酸類似体は公知であり、それには限定されないが以下の化合物が含まれる。２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、ピペリジン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、及びオルニチン。
【００４７】
例えば、関心のポリペプチドは最高約５〜１０の保存的若しくは非保存的アミノ酸置換を含んでもよく、又は約１５〜２５若しくは２０〜５０の保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換を含んでもよく、又は前記分子の望ましい機能がそのまま保持される限りこれらの値の間のいかなる整数の置換を含んでもよい。
【００４８】
この点に関し、連鎖球菌から単離されるＧａｐＣタンパク質はそのアミノ酸配列にいくつかの可変領域を示し、これらは図１〜５に示したアミノ酸配列と比較して、アミノ酸位置６２〜８１、１０２〜１１２、１６５〜１７２、２４８〜２７１及び２８６〜３０５に存在する。これらの領域はS.dysgalactiae、S.agalactiae、S.uberis、S.parauberis及びS.iniaeにおいて１〜９個のアミノ酸置換を示すが、実質的に免疫原性や酵素機能が影響されずに変異を受けることが予想される。
【００４９】
同様に、もし存在するならば膜貫通結合領域やシグナル配列で起こる置換は、通常、免疫原性に影響を及ぼさない。当分野の技術を有する者ならば、本明細書図８〜１７に示されるタンパク質構造データを参考にして、変異に寛容な関心分子の他の領域を容易に確定できるかもしれない。
【００５０】
用語「断片」は、参照遺伝子の未変性のポリペプチド配列と構造又はヌクレオチド配列と構造の一部のみからなるポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチド断片は、未変性のポリペプチドのＣ末端の欠失及び／又はＮ末端の欠失を含むことができ、或いは分子の内部に由来してもよい。同様に、ポリヌクレオチド断片は、未変性のポリヌクレオチドの３’及び／又は５’の欠失を含むことができ、或いは分子の内部に由来してもよい。ＧａｐＣタンパク質のポリペプチド「断片」は、通常、少なくとも約５つの連続するアミノ酸残基、好ましくは完全長分子の少なくとも約１０の連続するアミノ酸残基、好ましくは完全長分子の少なくとも約１５〜２５の連続するアミノ酸残基、最も好ましくは完全長分子の少なくとも約２０〜５０以上の連続するアミノ酸残基を含むが、前記したように当の断片がＧａｐＣ活性を保持するならばアミノ酸５個と完全長配列の間のいかなる整数のアミノ酸でもよい。
【００５１】
関心遺伝子のヌクレオチド断片は、通常、前記遺伝子の少なくとも約８つの連続する塩基対、より好ましくは少なくとも約１０〜２０の連続する塩基対、最も好ましくは少なくとも約２５〜５０以上の連続する塩基対を含むが、これらの値の間のいかなる整数でもよい。このような断片はプローブとして、また診断法で役立つが、以下でより詳しく議論される。
【００５２】
さらに、ポリペプチド断片には、参照タンパク質に存在するならば膜アンカー領域が欠失したＧａｐＣタンパク質の形態、及びそのような欠失を有するタンパク質をエンコードする核酸配列が含まれる。そのような欠失は、前記タンパク質の分泌をしない系で望ましいかもしれない。
【００５３】
さらに、前記タンパク質のプラスミン結合領域は存在してもよく存在しなくてもよい。このように、例えば、ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質がプラスミンを精製するために用いられるならば、前記プラスミン結合領域は通常保持される。前記タンパク質がワクチン組成物で使われる予定ならば、プラスミン結合領域を含むか又は含まない免疫原性エピトープが存在する。
【００５４】
「単離された」タンパク質又はポリペプチドとは、自然界でその分子が存在する生物全体から分離され引き離されたタンパク質又はポリペプチド分子、或いは自然界では通常それと会合する配列の全体若しくは一部が欠けたタンパク質又はポリペプチド、或いは自然界に存在するような配列であるがそれと会合して異種配列（下で定義される）を有する配列である。
【００５５】
用語「機能的に等価」は、ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質又はＣＡＭＰ−３ポリペプチドのアミノ酸配列が、そのタンパク質がワクチンで使われる予定ならば本明細書で定義されたように実質的に等価若しくは強化された免疫応答を引き出すアミノ酸配列、或いは参照ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質若しくはその免疫原性部分、若しくは図２９に示すＣＡＭＰ−３ポリペプチド若しくはその免疫原性部分と同一性を有するＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の活性と比較してイムノアッセイで等価若しくは高い活性を示すアミノ酸配列を意味する。
【００５６】
用語「エピトープ」は、特定のＢ細胞及び／又はＴ細胞が反応する抗原又はハプテン上の部位を指す。この用語は、「抗原決定基」又は「抗原決定基部位」と同義でも使用される。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体による他の抗体の標的抗原との結合を阻止する能力を示す簡単なイムノアッセイで同定できる。
【００５７】
用語「免疫原性」タンパク質又はポリペプチドは、本明細書で記載されているように、免疫応答を引き出すアミノ酸配列を指す。本明細書で使われるように、「免疫原性」タンパク質又はポリペプチドは、当のＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の完全長配列、或いはシグナル配列、膜アンカー領域及び／又はプラスミン結合領域、その類似体、若しくはその免疫原性断片の有無にかかわらずＣＡＭＰ−３の完全長配列を含む。「免疫原性断片」は、１つ以上のエピトープを含み、本明細書で記載された免疫応答を引き出すＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の断片を意味する。そのような断片は、当技術分野で公知のエピトープマッピング手法を適宜使って同定できる。例えば、Methods in Molecular Biology, Vol.66（Glenn E. Morris編, 1996）、Humana Press、Totowa、New Jersey、中のEpitope Mapping Protocolsを参照。例えば、線形のエピトープは、例えば、タンパク質分子の部分に対応するペプチドを多数固体の支持体上で同時に合成し、前記ペプチドが支持体に固着している間に前記ペプチドを抗体と反応させることにより確定できる。そのような手法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第４７０８８７１号；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998〜4002；Geysen et al.(1986) Molec. Immunol. 23:709〜715に記載されており、すべて完全に参照により本明細書に組み込まれている。同様に、立体配座エピトープは、アミノ酸の空間配座を、例えばＸ線結晶学と２次元核磁気共鳴によリ決定して容易に同定できる。例えば、上と同様Epitope Mapping Protocolsを参照。タンパク質の抗原性領域は、標準の抗原性及びハイドロパシープロット、例えばOxford Molecular Groupから入手できるソフトウェアOmiga Ver.1.0を用いて計算されたものなどを使用しても同定できる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにホップ／ウッズ方法、Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78:3824〜3828、またハイドロパシープロットのためにはＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ手法、Ｋｙｔｅ他、J. Mol. Biol. (1982) 157:105〜132を用いる。本明細書図８〜１２は、本発明に含まれる代表的タンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロフィールを表す。
【００５８】
本発明では、免疫原性断片は通常、親のＧａｐＣプラスミン結合、結合タンパク質分子の最低約３つのアミノ酸、好ましくは最低約５つのアミノ酸、より好ましくは最低約１０〜１５のアミノ酸、最も好ましくは２５以上のアミノ酸を含む。断片長には臨界上限がなく、前記タンパク質配列のほぼ完全長、又はＧａｐＣの２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質でさえ含むことができる。
【００５９】
「免疫原性組成物」は、組成物の対象への投与により、前記対象で関心の抗原性分子に対する液性及び／又は細胞性の免疫反応が発達するような抗原性の分子を含む組成物である。
【００６０】
「サブユニットワクチン組成物」は、関心の病原体の抗原に由来するかそれと相同的な、すべてではなく最低１つの免疫原性ポリペプチドを含有する組成物を意味する。そのような組成物は、実質的に未変性の病原体細胞や粒子、及びそのような細胞や粒子の溶解物を含まない。従って、「サブユニットワクチン組成物」は、病原体の少なくとも部分的に精製された（好ましくはかなり精製された）免疫原性ポリペプチド、又はその組換え類似体から調製される。サブユニットワクチン組成物は、病原体に由来する他の抗原やポリペプチドを実質上含まないサブユニット抗原又は関心の抗原を含むことができる。
【００６１】
「薬剤として許容される」又は「薬理学的に許容できる」は、生物学上又はその他の観点から望ましくなくはない物質を意味し、即ち、その物質が個体に対してある製剤若しくは組成で投与されたときに、いかなる望ましくない生体影響も引き起こさず、またそれが含有される組成物のいかなる成分とも有害な相互作用を起こさない。
【００６２】
組成物又はワクチンへの「免疫応答」は、宿主における関心の組成物又はワクチンに対する細胞性及び／又は抗体媒介性免疫応答の発達である。通常、「免疫応答」は以下の効果の１つ以上を含むが、これに限定されるものではない。関心の組成物又はワクチンに含まれる１つ若しくは複数の抗原に特異的な、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞及び／又は細胞障害性Ｔ細胞及び／又はγδＴ細胞の生産。好ましくは、新規感染症に対する乳腺の抵抗性が強化され、かつ／又は前記疾患の臨床重症度が軽減されるように宿主が治療的若しくは予防的免疫応答を示すのがよい。このような保護は、感染宿主が通常示す症状の軽減若しくは欠如、及び／又はより早い回復時間によって証明される。
【００６３】
「核酸免疫化」は、１つか複数の抗原、又は１つか複数のエピトープのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現のために、宿主細胞へ選択された１つ以上の抗原をエンコードしている核酸分子を導入することを意味する。核酸分子は、例えば注射、吸入、経口、鼻腔内及び粘膜投与、又は類似の方法で直接対象に導入でき、或いは、宿主から取り出された細胞に生体外で導入することができる。後者の場合、形質転換細胞は対象に再び導入され、そこではエンコードされた抗原に対する免疫応答が前記核酸分子によって開始される。
【００６４】
本明細書で使用される用語「治療」は、（１）感染若しくは再感染の防止（予防）、又は（２）関心疾患の症状の軽減若しくは除去（治療）を指す。
【００６５】
「乳腺炎」は、ウシ、雌ヒツジ、ヤギ、雌ブタ、雌馬、などを含む哺乳類のＳ．ｕｂｅｒｉｓに起因する乳腺の炎症を意味する。この感染症は、腺内の食細胞の浸潤として現れる。通常、乳腺炎では４つの臨床型が認められている。（１）過急性、腫脹と関連する、腺の熱、痛覚、及び異常な分泌、発熱と全身の撹乱の徴候、例えば著しい欝状態、急速な虚脈、窪んだ眼、衰弱及び完全な食欲低下などが伴う。（２）急性、上と同じような腺の変化を伴うが、発熱、食欲低下及び欝状態がわずかから中等度である。（３）亜急性、全身の変化は見られなく、腺とその分泌の変化の程度はより低い。（４）無症状、炎症反応は乳腺炎の標準検査だけによって検出可能。
【００６６】
乳腺炎の検出のための標準検査には、それに限定されないが、カリフォルニア乳腺炎検査、ウィスコンシン乳腺炎検査、ナガセ検査、及び乳汁内の持続的に高い白血球含量を検出する電子細胞計測及び体細胞数計測が含まれる。一般的に、乳汁１ｍｌにつき約３００，０００〜５００，０００の体細胞数は、感染症の存在を示す。このように、例えば、乳汁中の体細胞数計測が１ｍｌにつき約５００，０００以下に維持されているときは、ワクチンは乳腺炎の治療及び／又は予防に効果的であると思われる。乳腺炎とその診断の考察に関しては、例えばThe Merck Veterinary Manual: A Handbook of Diagnosis, Therapy, and Disease Prevention and Control for the Veterinarian, Merck and Co., Rahway, New Jersey, 1991を参照。
【００６７】
用語「脊椎動物」、「対象」及び「脊椎動物対象」は、脊索動物亜門のいかなる種を意味し、これには、それには限定されないが、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、ヒトなどの哺乳類、例えばイヌ、ネコなどの家畜、ニワトリ、シチメンチョウ及び他の家禽類を含む雄鶏と雌鶏のような飼い鳥、野鳥及び狩猟鳥などの鳥類、並びに魚類が含まれる。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成体及び生まれたばかりの動物、並びに胎仔が含まれる。
【００６８】
「核酸」分子には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列でさえ含まれるが、これに限定されるものではない。この用語には、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列も含まれる。
【００６９】
「単離された」核酸分子とは、自然界でその分子が存在する生物全体から分離され引き離された核酸分子、或いは自然界では通常それと会合している配列の全体若しくは一部が欠けた核酸分子、或いは自然界に存在するような配列であるがそれと会合して異種配列（下で定義される）を有する配列である。ポリヌクレオチドに関連して用いられる用語「単離された」は、前記ポリヌクレオチドがそれが通常会合している染色体から分離され、またそれが通常存在する完全なゲノム配列から分離されることを意味する。
【００７０】
「精製ポリヌクレオチド」は、前記ポリヌクレオチドが自然に会合しているタンパク質を実質的に含まない、例えば、それを約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満含有する関心のポリヌクレオチド又はその断片を指す。関心のポリヌクレオチドを精製する手法は当技術分野で公知であり、例えば、ポリヌクレオチドを含有する細胞のカオトロピック剤による破壊、並びにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度による沈降によるポリヌクレオチドとタンパク質との分離が含まれる。
【００７１】
「コード配列」又は特定のタンパク質を「エンコードするヌクレオチド配列」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで適当な調節要素による制御下で転写されポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンで決まる。コード配列には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列でさえ含まれるが、これに限定されるものではない。転写終止配列は、通常、コード配列の３’側に位置する。「相補的」配列は、与えられたヌクレオチド位置の窒素性塩基が参照配列の同じ位置に出現する窒素性塩基の相補体である配列である。実例を示すと、アデノシンの相補体はチロシンでありその逆もそうである。同様に、シトシンはグアニンと相補的でその逆もそうである。従って、参照配列５’−ＡＴＧＣＴＧＡ−３’の相補体は５’−ＴＡＣＧＡＣＴ−３’である。
【００７２】
本明細書で使われる「野生型」又は「未変性の」配列は、実質的に自然界で見られるような配列をエンコードするポリペプチドを指し、図１Ａ〜１Ｂ（配列番号４）で表されたＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅのＧａｐＣタンパク質をエンコードしている配列がその例である。
【００７３】
本明細書で核酸分子の記載に用いられる「組換え」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成若しくは合成のポリヌクレオチドを意味し、これらは、その起源若しくは操作のために、（１）自然界でそれと会合しているポリヌクレオチドのすべて若しくは一部と会合していなく、かつ／又は（２）自然界でそれと結合しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドと結合している。タンパク質又はポリペプチドに関して用いられる用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養」及び原核微生物若しくは単細胞体として培養された真核細胞系を示す他の用語は同じ意味で使われ、組換えベクター若しくは他の転移ＤＮＡの受容体として使用できる若しくは使用されてきた細胞を指し、トランスフェクションした原細胞の後代を含む。１個の親細胞の後代は、偶発性若しくは意図的突然変異の結果、必ずしもその親と形態又はゲノム若しくは総ＤＮＡ相補体が完全に一致しないかもしれないと理解されている。関連した特性、例えば所望のペプチドをエンコードしているヌクレオチド配列の存在などによって特徴づけられる、親細胞と十分に類似している後代が、この定義が意味する後代に含まれ、上記の用語も適用される。
【００７４】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド部分の類似度を指す。２つのＤＮＡ又は２つのポリペプチド配列が互いに「実質上相同的である」のは、その配列が少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは最低約９０％、最も好ましくは最低約９５％〜９８％の配列類似度若しくは同一性を規定された長さの分子上で示すときである。本明細書で使われるように、実質的に相同は、特定されたＤＮＡ又はポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列も意味する。
【００７５】
一般に、「同一性」は、ヌクレオチド間又はアミノ酸間のそれぞれ２つのポリヌクレオチド配列若しくは２つのポリペプチド配列の正確な一致を意味する。同一度は、２つの分子間の配列情報の直接比較で測定でき、この方法では前記配列を一列に並べ、２つの整列させた配列間の正確なマッチ数を数え、短い配列の長さで割り、その結果に１００を掛ける。この解析を支援するコンピュータプログラムが容易に入手でき、例えば、ALIGN, Dayhoff, M. O., Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoff編、５付録３：３５３〜３５８、National biomedical Research Foundation, Washington, DCは、Smith and Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482〜489、のペプチド解析用の局所相同性アルゴリズムを応用している。ヌクレオチド配列の同一性を測定するためのプログラムは、Wisconsin Sequence Analysis Package Ver.8（Genetics Computer Group、Madison、WT、から入手可能）にあり、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＧＡＰプログラムが利用でき、これらもＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する。これらのプログラムは、メーカーによるデフォルトパラメータを使用して容易に利用でき、また前記Wisconsin Sequence Analysis Packageに記載されている。例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列への同一度は、Smith and Watermanの同一性アルゴリズムを利用し、またデフォルトのスコアリング表及び６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティーを使用して測定できる。
【００７６】
本発明との関連で同一度を確立する別の方法は、エジンバラ大学が著作権を有するプログラムパッケージＭＰＳＲＣＨを使用する方法で、このプログラムはJohn F.Collins及びShane S. Sturrokによって開発され、IntelliGenetics,Inc.(Mountain View、CA)によって配布されている。このパッケージセットからSmith-Watermanアルゴリズムを使用でき、そのスコアリング表ではデフォルトパラメータが使用される（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップエクステンションペナルティー及び６のギャップ）。発生するデータから、「マッチ」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一度又は類似性を計算するための他の適当なプログラムは一般的に当技術分野で公知であり、例えば、ＢＬＡＳＴはもう１つの配列プログラムでありデフォルトパラメータで使われる。例えば、ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＰは以下のデフォルトパラメータを使って利用できる：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；分類基準＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は以下のインターネットサイトで掲載されている：http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
【００７７】
別法では、相同性は、相同的領域の間で安定した二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、それに続く１本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化及び消化断片の大きさの測定により決定できる。実質的に相同的なＤＮＡ配列は、例えばその特定の系のために規定されたストリンジェントな条件下で行うサザンハイブリダイゼーション実験で同定できる。適切なハイブリダイゼーション条件を定めることは当技術分野の範囲内である。例えば、Sambrook他、同上；DNA Cloning、同上；Nucleic Acid Hybridization、同上を参照。
【００７８】
用語「変性変異体」は、その変性変異体が由来するポリヌクレオチドがエンコードするポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードし、その核酸配列に変化を含んでいるポリヌクレオチドを意味する。
【００７９】
アミノ酸配列の「類似性」を決定するための手法は、当技術分野で公知である。一般に、「類似性」は２つ以上のポリペプチドの適当な部位のアミノ酸同士の正確な比較を意味し、そこではアミノ酸は同一であるか、或いは類似した電荷若しくは疎水性などの化学的及び／又は物理的性質を有する。いわゆる「類似度」は、この比較されたポリペプチド配列間で測定することができる。核酸及びアミノ酸配列の同一性を決定するための手法も当技術分野で公知で、これらの手法では前記遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定（通常ｃＤＮＡ中間体を通して）し、それによりエンコードされるアミノ酸配列を決定し、これを第２のアミノ酸配列と比較する。一般に、「同一性」は、ヌクレオチド間又はアミノ酸間のそれぞれ２つのポリヌクレオチド配列若しくは２つのポリペプチド配列の正確な一致を意味する。
【００８０】
ＤＮＡ構築物の「非相同的」領域とは、自然界では他の分子と会合していない別のＤＮＡ分子の内部にあるか又はそれに付着している識別可能なＤＮＡセグメントである。従って、非相同的領域がある細菌遺伝子をエンコードしているとき、前記遺伝子は通常、原細菌のゲノムの前記細菌遺伝子に隣接していないＤＮＡに隣接する。非相同的コード配列の別の１例は、コード配列自体が自然界には存在しない構築物である（例えば、原遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子の変異及び自然の突然変異は、本明細書で使われるようなＤＮＡの非相同的領域を生成しない。
【００８１】
「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントをそのセグメントが複製されるように付着させた、プラスミド、ファージ又はコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、遺伝子配列を標的細胞へ移すことができる（例えば細菌プラスミドベクター、ウイルスのベクター、非ウイルスベクター、粒状キャリヤー、及びリポソーム）。
【００８２】
一般的に、用語「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「遺伝子発現ベクター」、「遺伝子送達ベクター」、「遺伝子転移ベクター」、及び「発現カセット」は、すべて、関心の配列又は遺伝子の発現を指示することができる集合体を指す。従って、この用語はクローニング媒体及び発現媒体、並びにウイルスのベクターを含む。
【００８３】
これらの集合体は、関心の配列又は遺伝子に作動可能的に結合したプロモーターを含む。他の調節要素も同様に存在してもよい。本明細書で記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれてもよい。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物は、細菌の複製開始点、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物を一重鎖ＤＮＡになるようにするシグナル（例えば、Ｍ１３複製開始点）、複数のクローニング部位、及び「哺乳類の」複製開始点（例えば、ＳＶ４０又はアデノウイルス複製開始点）も含むことができる。
【００８４】
ＤＮＡ「調節要素」は、総称して転写プロモーター、転写エンハンサー要素、転写終止配列、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’側に位置する）、翻訳開始最適化配列（コード配列の５’側に位置する）、翻訳終止配列、上流調節領域、及びリボソーム結合部位などを指し、これらはすべて宿主細胞におけるコード配列の転写と翻訳をほう助する。例えば、McCaughan et al. (1995) PNAS USA 92:5431〜5435；Kochetov et al. (1998) FEBS Letts. 440:351〜355を参照。所望の遺伝子が転写され翻訳される限り、これらの調節配列のすべてが組換えベクターに常に存在する必要はない。
【００８５】
「作動可能的に結合した」は、そのように記載された要素がその通常の機能を発揮するように構成されている要素の配列を指す。従って、作動可能的にコード配列に結合した調節要素は、そのコード配列の発現をもたらすことができる。調節要素は、それらが機能してその発現を指示する限り、コード配列に隣接する必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されていないが転写された配列がプロモーターとコード配列との間に存在することもあり、その場合でもそのプロモーターは前記コード配列に「作動可能的に結合した」とみなすことができる。同様に、「対象での発現と両立する調節要素」とは、その対象でコード配列の発現をもたらすことができるもののことである。
【００８６】
調節要素、例えばプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合してコード配列をｍＲＮＡに転写し、これが前記コード配列によってエンコードされるポリペプチドに翻訳されるときに、細胞内でコード配列の「転写を指示する」。
【００８７】
「宿主細胞」は、外因性核酸分子によって形質転換された細胞、又は形質転換ができる細胞である。
【００８８】
ある細胞が外来性ＤＮＡによって「形質転換」されるのは、そのような外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたときである。外来性ＤＮＡは、前記細胞のゲノムを形成している染色体ＤＮＡに取り込まれても（共有結合により）取り込まれなくてもよい。例えば原核生物や酵母では、外来性ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム要素上で保持されているかもしれない。真核細胞に関しては、安定的に形質転換された細胞とは、外来性ＤＮＡが染色体に取り込まれ、染色体複製を通して娘細胞に受け継がれる細胞のことである。この安定性は、前記外来性ＤＮＡを保有する娘細胞の群から成る細胞系又はクローンを樹立する真核細胞の能力によって示される。
【００８９】
２．発明を実施するための形態
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定の製剤又はプロセスパラメータに限られないこと、それはこれらが当然ながら変わるかもしれないからであることを理解されたい。本明細書で使われる専門用語は本発明の特定の実施形態を記載することだけが目的であり、限定するものではないことも理解されたい。
【００９０】
本発明の実施において、本明細書で記載されているものと類似若しくは同等の多くの方法及び物質を使用できるが、本明細書では好ましい物質及び方法が記載される。
【００９１】
本発明にとって重要なことは、ＧａｐＣタンパク質がＣＡＭＰキメラタンパク質と組み合わさって脊椎動物対象で免疫応答を引き出すことができるという発見である。特に、S.dysgalactiae、S.agalactiae、S.uberis、S.parauberis及びS.iniaeのＧａｐＣタンパク質の遺伝子が単離され、配列決定され、特徴が解明され、またそれらの遺伝子のタンパク質配列がそこから導かれた。それらの遺伝子の完全なＤＮＡ配列と対応するアミノ酸配列を図１〜５に示す。
【００９２】
実施例で記載されているように、図１Ａ〜１Ｂのヌクレオチド位置１〜１０１１で表される完全長S.dysgalactiaeのｇａｐＣ遺伝子は、同じ図のアミノ酸１〜３３６で示されるアミノ酸３３６個の完全長S.dysgalactiaeのＧａｐＣタンパク質をエンコードする。S.dysgalactiaeのＧａｐＣは、予測分子量が約３６ｋＤａである（Canadian Bioinformatics ResourceのＳｅｑＷｅｂ配列解析パッケージＶｅｒ．１．１によって提供されるＧＣＧウィスコンシンパッケージＶｅｒ．１０のＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｏｒｔプログラムを使用して計算された）。同様に、S.agalactiae、S.uberis、S.parauberis及びS.iniaeから単離されたｇａｐＣ遺伝子を図２〜５に表す。それぞれ同じく３３６個のアミノ酸の完全長ＧａｐＣタンパク質をエンコードし、それぞれ同じく約３６ｋＤａの予測分子量を持つ。完全長配列のいずれもシグナルペプチド及び膜アンカー領域を含まないようである。
【００９３】
図６及び７は、それぞれＤＮＡ配列とアミノ酸配列を示し、各種連鎖球菌株からのＧａｐＣタンパク質の間に存在する相同領域及び変異領域を表している。特に、いくつかの可変領域は、アミノ酸位置６２〜８１、１０２〜１１２、１６５〜１７２、２４８〜２７１及び２８６〜３０５に存在する。そのような可変領域は一般的に変化により寛容である。それ故に、これらの領域におけるアミノ酸変化、例えば置換、付加及び欠失などは寛容される可能性が高い。
【００９４】
図８〜１２は、本発明の各ＧａｐＣタンパク質に関する以下のプロットを示す：７のウィンドウで平均されたＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー；Ｅｍｉｎｉによる表面確率；Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚによる鎖屈曲性；Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆによる抗原性指数；Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎによる二次構造；Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎによる二次構造；及び予測されたグリコシル化部位。図１３〜１７は、本発明の各ＧａｐＣタンパク質のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎによる二次構造プロットを表す。当業者は、図８〜１７に示された情報を使い、ワクチン組成物で使用するための前記タンパク質の免疫原性領域を容易に決定することができる。
【００９５】
本明細書で「ＣＡＭＰ−３」と称されるキメラＣＡＭＰタンパク質は、図２９の２７〜３１４位置に示される。図２９のアミノ酸１〜２６は、大腸菌ＬｉｐｏＦシグナル配列を表わす。図２９のアミノ酸２７〜８６は、成熟した原S.uberisのＣＡＭＰのアミノ酸１〜６０と一致する。アミノ酸８７はリンカーアミノ酸である。図２９のアミノ酸８８〜１４４は、成熟した原S. agalactiaeのＣＡＭＰ因子配列のアミノ酸２〜５８と一致する。図２９のアミノ酸１４５と１４６はスペーサーアミノ酸である。図２９のアミノ酸１４７〜３１４は、成熟した原S.uberisのＣＡＭＰ因子配列のアミノ酸６３〜２３０と一致する。従って、図２９で示されるキメラは、S.agalactiaeからのＣＡＭＰ因子のＮ末端配列からのエピトープが挿入された、完全長のS.uberis骨格を含む。
【００９６】
各種ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質、その変異体若しくは突然変異タンパク質、その免疫原性断片、又はそれを含むキメラタンパク質が、ＣＡＭＰ−３又はＣＡＭＰ−３と実質的に相同で機能的に同等（上で定義されている）な免疫原性ポリペプチドと組み合わされてサブユニットワクチン組成物として提供される。さらに、それに対するタンパク質又は抗体は、脊椎動物の対象で感染症の存在を検出するための診断試薬として用いることができる。同様に、前記タンパク質をエンコードする遺伝子をクローニングし、他の細菌株で相同遺伝子を検出・単離するためのプローブを設計するために利用できる。例えば、最低約８つのヌクレオチド、好ましくは１５〜２０のヌクレオチド、より好ましくは最低約２０〜５０のヌクレオチド、最も好ましくは約６０〜１００のヌクレオチド、又はこれらの値の中間のいかなる整数でも含む断片は、これらの実施形態の使用で使える。
【００９７】
本発明のワクチン組成物を用いて、脊椎動物対象の多種多様な細菌感染症を治療又は予防できる。例えば、Ｓ.dysgalactiae、S.uberis、S.parauberis、S.iniae及び／又はＢ群連鎖球菌（ＧＢＳ）、例えばS.agalactiaeからのＣＡＭＰ−３ポリペプチド及びＧａｐＣプラスミン結合タンパク質を含むワクチン組成物を用いて、これらの細菌やその他の細菌に起因する脊椎動物対象の連鎖球菌感染症を治療できる。特に、S.uberis及びS.agalactiaeは、ウシ、ウマ、ヒツジ及びヤギの乳腺炎と通常関連する細菌病原体である。さらに、Ｂ群連鎖球菌、例えばS.agalactiaeは、脊椎動物でその他多数の感染症を起こすことが知られており、これには敗血症、髄膜炎、菌血症、膿痂疹、関節炎、尿路感染症、膿瘍、自然流産、その他が含まれる。それ故に、連鎖球菌ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質を含むワクチン組成物は、多種多様な連鎖球菌感染症の治療及び／又は予防に使用できるようになる。
【００９８】
同様に、他の細菌属、例えばスタフィロコッカス、マイコバクテリア、大腸菌、シュードモナス、ノカルジア、パスツレラ、クロストリジウム及びマイコプラズマに由来するＧａｐＣプラスミン結合タンパク質は、ＣＡＭＰ−３ポリペプチドと併用してこれらの属の種に起因する細菌感染症を治療するために使用できるようになる。従って、ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質をＣＡＭＰ−３と併用して、多くの種で多種多様な細菌感染症を治療かつ／又は予防できることは、直ちに明らかとなる。
【００９９】
連鎖球菌ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質とＣＡＭＰ−３ポリペプチドは、単独又は他の細菌、糸状菌、ウイルス若しくは原虫に由来する抗原と併用して、ワクチン組成物として利用できる。これらの抗原は、独立して、又はこれらの抗原の１つ以上と融合したＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の１つ以上のエピトープを含む融合タンパク質としてさえ提供される。例えば、S.uberisの他の免疫原性タンパク質、例えばＣＡＭＰ因子、ヒアルロン酸カプセル、ヒアルロニダーゼ、Ｒ様タンパク質及びプラスミノーゲンアクティベーターは、ＧａｐＣタンパク質やＣＡＭＰ−３ポリペプチドと共に投与できる。さらに、スタフィロコッカス、コリネバクテリウム、シュードモナス、ノカルジア、クロストリジウム、マイコバクテリア、マイコプラズマ、パスツレラ、プロトセカ、他の連鎖球菌、大腸菌の各属、並びに酵母など、乳腺炎に関係する他の微生物からの免疫原性タンパク質は、本明細書で記載されるＣＡＭＰ−３ポリペプチド及びＧａｐＣプラスミン結合タンパク質と共に投与し、広い範囲の保護を提供することができる。このように、例えば、Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）、Str.agalactiae、Str.dysgalactiae、Str.zooepidemicus、Corynebacterium pyogenes、Pseudomonas aeruginosa、Nocardia asteroides、Clostridium perfringens（ウェルシュ菌）、E.coli（大腸菌）、Enterobacter aerogenes（アエロゲネス菌）及びKlebsiella spp.からの免疫原性タンパク質は、本発明のＣＡＭＰ−３及びＧａｐＣプラスミン結合タンパク質と共に提供することができる。
【０１００】
その上、異なる連鎖球菌種からのＧａｐＣタンパク質を本発明のワクチン組成物中で一緒に使うこともできる。この実施形態では、複数のＧａｐＣタンパク質が融合タンパク質、又は同じ若しくは異なるワクチン組成物中の別々の抗原として提供されてもよい。
【０１０１】
ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の生産
上記のプラスミン結合タンパク質とそれに由来する活性断片、類似体及びキメラタンパク質は、各種方法で生産できる。具体的には、ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質は、それを発現する細菌から直接単離できる。これを達成するためには、通常、先ず細胞成分といくつかの外来性タンパク質が含まれない粗抽出物を調製する。所望のタンパク質は、それからカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、免疫吸着剤法その他の当技術分野で公知の従来法によって、細胞溶解物画分からさらに精製できる。
【０１０２】
より詳しくは、ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質を単離する手法が記載されている。例えば、S.pyogenesのＧａｐＣタンパク質は、硫酸アンモニウムによる沈降、その後Ｍｏｎｏ  ＦＰＬＣカラムによるクロマトグラフィーを２回、ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＦＰＬＣカラム及びＴＳＫ−フェノールＨＰＬＣカラムによるクロマトグラフィーを１回ずつ行って粗細胞抽出物から精製された（Pancholi,V.And Fischetti, VA (1992) J Exptl. Med 76:415〜426）。別の手法では、ＮＡＤ＋−アガロースアフィニティーカラムを使用し、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの６４／１４株の溶解プロトプラストからＧａｐＣを精製した（Winram, SB and Lottenberg, R (1996) Microbiol. 142:2311〜2320）。
【０１０３】
或いは、本明細書で記載されているように、前記タンパク質は組換えで生成できる。上で説明されるように、これらの組換え産物は不完全なタンパク質配列、完全長配列、シグナル配列を含む前駆体形態、シグナルのない成熟した形態、又は融合タンパク質（例えば、組換え宿主のための適当なリーダーを有するもの、又は連鎖球菌若しくは他の病原体の別のサブユニット抗原配列を有するもの）の形態さえとることができる。
【０１０４】
本発明の一実施例では、ＧａｐＣタンパク質は組換え手法で生成したヒスチジン標識と融合され、次にアフィニティークロマトグラフィーを使って細胞溶解物画分から精製される。実施例を参照。
【０１０５】
本発明のＧａｐＣプラスミン結合タンパク質は、下記のように前記タンパク質産物のプラスミンを結合する能力に基づき、プラスミン結合アッセイを用いて単離できる。例えば、実施例に記載の方法を参照。こうして、遺伝子ライブラリーが構築され、結果として生じるクローンは適当な宿主細胞の形質転換のために用いることができる。コロニーをプールし、プラスミン結合活性を有するクローンを選抜できる。コロニーは、ポリクローナル血清又はプラスミン結合タンパク質に対するモノクローナル抗体を使ってもスクリーニングできる。
【０１０６】
別法では、一旦アミノ酸配列が決定されたならば、前記決定されたアミノ酸配列の一部のコドンを含むオリゴヌクレオチドプローブを調製し、それを問題のタンパク質をエンコードしている遺伝子に関してゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。オリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡライブラリーを調製するための基本的な方策、並びにそれらの核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニングは、当業者には公知である。例えば、DNA Cloning:Vol.II、上記；Nucleic Acid Hybridization、上記；Oligonucleotide Synthesis、上記；Sambrook他、上記を参照。スクリーニングされたライブラリーからのクローンが一旦ポジティブハイブリダイゼーションによって同定されると、特定のライブラリーインサートがＧａｐＣプラスミン結合タンパク質遺伝子又はその相同体を含むことが、制限酵素分析とＤＮＡ塩基配列決定によって確認できる。遺伝子はその後標準の手法を使ってさらに単離され、必要に応じてＰＣＲ手法又は制限酵素を使用して完全長配列の一部が削除される。
【０１０７】
同様に、遺伝子を公知の手法、例えばフェノール抽出を使って細菌から直接単離し、配列をさらに操作していかなる所望の変化を起こすことができる。ＤＮＡを取得して単離する手法の記載に関しては、例えばSambrook他、同上を参照。
【０１０８】
或いは、関心のタンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列は、クローニングではなく合成で調製することができる。ＤＮＡの塩基配列は、特定のアミノ酸配列のための適当なコドンで設計できる。一般に、配列が形質発現のために使われるならば、意図された宿主に好ましいコドンが選択されるようになる。完全な配列は、標準法によって調製された重複しているオリゴヌクレオチドから形成され、完全なコード配列に組み立てられる。例えば、Edge (1981) Nature 292:756；Nambair et al. (1984) Science 223:1299；Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311を参照。
【０１０９】
一旦所望のタンパク質のコード配列が調製されるか単離されると、それらはいかなる適当なベクター又はレプリコンにもクローニングできる。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、適当なクローニングベクターの選抜は選択の問題である。クローニングのための組換えＤＮＡベクターとそれらが形質転換できる宿主細胞の例としては、バクテリオファージλ（大腸菌）、ｐＢＲ３２２（大腸菌）、ｐＡＣＹＣ１７７（大腸菌）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（大腸菌以外のグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４（大腸菌と枯草菌）、ｐＢＤ９（バシラス）、ｐＩＪ６１（ストレプトマイセス）、ｐＵＣ６（ストレプトマイセス）、ＹＩｐ５（サッカロミセス）、ＹＣｐ１９（サッカロミセス）及びウシパピローマウイルス（哺乳類の細胞）が含まれる。例えば、Sambrook他、同上；DNA Cloning、同上；B. Perbal、同上を参照。
【０１１０】
遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現のために）、及び、任意に、オペレーター（本明細書では総称して「調節」要素と称す）の管理下に置き、所望のタンパク質をエンコードしているＤＮＡ配列が、この発現構築物を含むベクターで形質転換された宿主細胞内でＲＮＡに転写されるようにできる。コード配列は、シグナルペプチド又はリーダー配列を含んでもよいし含まなくてもよい。シグナル配列が含まれるならば、それは原配列、相同配列又は異種配列のいずれかでよい。リーダー配列は、翻訳後プロセシングで宿主によって取り除かれてもよい。例えば、米国特許第４４３１７３９号、第４４２５４３７号、第４３３８３９７号を参照。
【０１１１】
宿主細胞の増殖と比較してタンパク質配列の発現の調節を可能にする他の調節配列も望ましいかもしれない。調節配列は当業者に公知であり、その例としては、調節化合物の存在を含む化学的若しくは物理的な刺激に応じて遺伝子の発現を有効又は無効にする配列が含まれる。他の種類の調節要素、例えばエンハンサー配列もベクターに存在してもよい。
【０１１２】
制御配列と他の調節配列は、例えば上述のクローニングベクターなどのベクターに挿入する前にコード配列に連結してもよい。或いは、コード配列は、既に制御配列と適切な制限部位を有する発現ベクターに直接クローニングできる。
【０１１３】
場合によっては、コード配列を修正し、それが適切な向きで制御配列に付着するように、即ち適切な読み枠を維持できるようにする必要があるかもしれない。また、ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の変異体又は類似体を作成することも望ましいかもしれない。変異体又は類似体は、前記タンパク質をエンコードしている配列の一部の欠失により、配列の挿入により、及び／又は配列内の１つ以上のヌクレオチドの置換により調製できる。部位指定突然変異誘発などのヌクレオチド配列を修飾する手法は、例えば、Sambrook他、同上；DNA Cloning、同上；Nucleic Acid Hybridization、同上に記載されている。
【０１１４】
次に、発現ベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換する。多くの哺乳類の細胞系が当技術分野では公知で、アメリカ基準種保存機構（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞系などがあるが、これには、それには限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞腫細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、その他が含まれる。同様に、細菌の宿主、例えば大腸菌、枯草菌、及び連鎖球菌も本発現構築物と使用できるようになる。本発明に有用な酵母宿主には、中でも、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans、Candida maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis、Kluyveromyces lactis、Pichia guillerimondii、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe及びYarrowia lipolyticaが含まれる。バキュロウイルス発現ベクターと使用できる昆虫細胞としては、とりわけ、Aedes aegypti、Autographa californica、Bombyx mori（カイコ）、Drosophila melanogaster（キイロショウジョウバエ）、Spodoptera frugiperda及びTrichoplusia ni（キンウワバ）が含まれる。
【０１１５】
選択される発現系と宿主に従い、本発明のタンパク質は、上述の発現ベクターによって関心のタンパク質が発現する条件下で形質転換された宿主細胞を培養することによって生産される。前記タンパク質は、次に宿主細胞から単離されて精製される。発現系が培地に前記タンパク質を分泌するならば、前記タンパク質は培地から直接精製できる。前記タンパク質が分泌されないならば、それは細胞溶解物から単離される。適当な増殖条件と回収方法の選択は、前記技術の範囲内である。
【０１１６】
本発明のタンパク質は、公知のアミノ酸配列又は関心の遺伝子のＤＮＡ配列に由来するアミノ酸配列を用いて、固相ペプチド合成のような化学合成によっても生産できる。このような方法は当業者には既知である。固相ペプチド合成手法に関しては、例えば、J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)、G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides :Analysis, Synthesis, Biology、E.Gross and J. Meienhofer編、Vol.2, Academic Press, New York(1980), pp.3〜254を参照、古典的な溶液合成に関しては、M. Bodansky、 Principles of Peptide Synthesis、Springer-Verlag、 Berlin(1984)及びE. gross and J. Meienhofer編, The Peptides :Analysis, Synthesis, Biology, 同上, Vol.1を参照。問題の抗原の小断片が関心の対象で免疫応答を起こせる場合は、ペプチドの化学合成が好ましいかもしれない。
【０１１７】
本発明のＧａｐＣプラスミン結合タンパク質、又はその変異体若しくは断片は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を生産するために使用できる。ポリクローナル抗体が望まれるならば、選択された哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、その他）を本発明の抗原、又はその断片、又は突然変異抗原で免疫化する。免疫化された動物から血清を採取し、公知の方法で処理される。例えば、Jurgens et al.(1985) J.Chrom.348:363〜370を参照。ポリクローナル抗体を含む血清が使われるならば、前記ポリクローナル抗体は公知の方法を用いて免疫アフィニティークロマトグラフィーで精製できる。
【０１１８】
ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質及びその断片に対するモノクローナル抗体も、当業者によって容易に生産できる。ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作成する一般的方法は公知である。不死の抗体産生細胞系は、細胞融合、また他の手法、例えば腫瘍形成性ＤＮＡを有するＢリンパ球の直接的形質転換、又はＥＢウイルスによるトランスフェクションによっても作成できる。例えば、M. Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980)；Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981)；Kennett et al., Monoclonal Antibodies(1980)；また、米国特許第４３４１７６１号、４３９９１２１号、４４２７７８３号、４４４４８８７号、４４５２５７０号、４４６６９１７号、４４７２５００号、４４９１６３２号、４４９３８９０号を参照。ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質又はその断片に対するモノクローナル抗体のパネルは、各種特性、即ちアイソタイプ、エピトープ、親和性、その他につきスクリーニングできる。モノクローナル抗体は、それらと特異的な個々の抗原を免疫親和性手法を用いて精製するときに役立つ。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、共に受動免疫化のために使用でき、又はサブユニットワクチン製剤と併用して免疫応答を強化することができる。ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、診断目的にも役立つ。
【０１１９】
ＣＡＭＰ因子キメラの生産
ＣＡＭＰ−３ポリペプチドは、前記したようにまた実施例のように、標準の組換え手法を使って都合よく生産できる。ＣＡＭＰ因子キメラは、いくつかの標準試験のいずれを用いてもＣＡＭＰ活性を試験できる。例えば、ＣＡＭＰ因子は、ウシ及びヒツジの赤血球などの各種標的細胞に対して、溶解作用を示すことが知られている。このように、ＣＡＭＰ因子活性を試験する便利な方法では、ヒツジ又はウシの赤血球を用いた標準の溶血反応を利用する。例えば、Christie et al.(1944)Aus.J.Exp.Biol.Med.Sci.22:197〜200；Brown et al. (1974) Infect.Immun. 9:377〜383；Darling, C. L. (1975) J. Clin. Microbiol.1:171；Wilkinsin, H. W. (1977) J. Clin. Microbiol. 6: 42；Bernheimer et al. (1979) Infect. Immun. 23:838〜844; Skalka, B. and Smola, J. (1981) Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A249: 190〜194; Huser et al.(1983)J. Gen. Microbiol. 129:1295を参照。
【０１２０】
活性は、ＣＡＭＰ因子による破壊に感受性の物質から作られたリポソームからの、エントラップされたマーカー分子の放出をモニターすることによっても試験できる。例えば、ＣＡＭＰ活性は、スフィンゴミエリン、コレステロール及びリン酸ジセチルなどから調製される［１４Ｃ］グルコースを含有するリポソームを使って、ＣＡＭＰ因子によるリポソームの破壊のために放出されるトラップされた［１４Ｃ］グルコースを測定してモニターできる。例えば、Bernheimer et al. (1979)Infect.Immun.23:838〜844を参照。同様に、Ａｌｏｕｆ他編、Bacterial protein toxins, London: Academic Press Inc., 1984:195〜196中のSterzik et al. (1984)「Interaction of the CAMP factor from S.agalactiae with artificial membranes」、及びSterzik et al. (1985) Zentralbl. Bacteriol. Microbiol. Hyg. Abt. 1 Suppl. 15:101〜108に記載されているように、ＣＡＭＰ因子存在下でリポソームからのＡＴＰ放出をモニターできる。Alouf et al.編、Bacterial protein toxins, London:Academic Press Inc., 1984:317〜324中のFehrenbach et al. (1984)「Interaction of amphiphilic bacterial polypeptides with artificial membranes」も参照。
【０１２１】
ワクチン製剤と投与
ＣＡＭＰ−３ポリペプチド並びにＧａｐＣプラスミン結合タンパク質、その変異体及び断片は、下記のように対象を免疫にするために、免疫原性組成物、例えばワクチン組成物に、単独で又は他の抗原と組み合わせて製剤できる。そのような製剤を調製する方法は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18 Edition, 1990に記載されている。一般的に、本発明のワクチンは、液溶体又は懸濁液の注射剤として調製される。注射に先立ち液体ビヒクルで溶液又は懸濁液にするのに適した固体の剤型も調製できる。製剤は乳剤にしてもよく、又は活性成分をリポソームビヒクルでカプセル化してもよい。活性免疫原性成分は、通常、親和性のある医薬ビヒクル、例えば、水、塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール、その他、及びその混合物と混合されており、さらに、必要に応じて前記ビヒクルは少量の湿潤剤若しくは乳化剤のような補助剤とｐＨ緩衝剤を含有してもよい。
【０１２２】
ワクチンの効果を強化するアジュバントも製剤に加えてよい。アジュバントとしては、例えば、ムラミルジペプチド、アビジン、水酸化アルミニウム、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（ＤＤＡ）、油、水中油乳濁液、サポニン、サイトカイン、及びその他当技術分野で公知の物質が含まれる。
【０１２３】
タンパク質はその免疫原性を増強するためにキャリヤーと結合してもよい。適当なキャリヤーには大きくて新陳代謝が遅い巨大分子が含まれ、例えば、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、及び当業者に周知の他のタンパク質などのタンパク質；セファロース、アガロース、繊維素、繊維素ビーズなどの多糖類；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのポリマーアミノ酸；アミノ酸コポリマー；並びに、不活化ウイルス粒子が含まれる。
【０１２４】
前記タンパク質はその未変性の形態で使用でき、又はその官能基の内容は、例えば、リジン残基のスクシニル化若しくはＣｙｓ−チオラクトンとの反応により修飾されてもよい。スルフヒドリル基も、例えばアミノ官能基の２−イミノチオラン又は３−（４−ジチオピリジルプロピオン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応により、キャリヤー（又は抗原）に取り込むことができる。適当なキャリヤーは、ペプチドの付着のためにスペーサアーム（例えば、ヘキサメチレンジアミン又は類似した大きさの他の二官能分子）を取り込むために修飾することもできる。
【０１２５】
本発明のタンパク質に適した他のキャリヤーとしては、本明細書で参照により組み込んだ米国特許第５０７１６５１号で開示されているように、ロタウイルス又はその機能的断片のＶＰ６ポリペプチドが含まれる。ウイルスタンパク質の融合生成物も有用であり、前記免疫原は米国特許第４７２２８４０号で開示されている方法で作られる。別の適当なキャリヤーとしてはリンパ球などの細胞が含まれるが、それは、この形態での提示が対象において免疫状態を引き起こす自然な提示様式を模倣しているからである。或いは、本発明のタンパク質は赤血球、好ましくは対象自身の赤血球に結合できる。ペプチドをタンパク質又は細胞に結合する方法は、当業者に周知である。
【０１２６】
さらに、前記タンパク質（又はその複合体）はワクチン組成物又は診断薬などの免疫原性組成物に、中性又は塩の剤型で製剤できる。薬剤として許容される塩としては、酸添加塩（活性ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）が含まれ、これらは、無機酸、例えば塩酸若しくはリン酸、又は有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの酸で形成される。遊離のカルボキシル基から作られる塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることもできる。
【０１２７】
ワクチン製剤は「治療的有効量」の活性成分、つまり、組成物が投与される対象で免疫応答を引き出すことのできる量を含有する。乳腺炎の治療と予防では、例えば、「治療的有効量」は好ましくは新しい感染症に対する乳腺の抵抗性を強化し、かつ／又は病気の臨床上の重症度を低くする量である。このような保護は、感染宿主が通常示す症状の軽減若しくは欠如、より早い回復時間、及び／又は感染乳房区の乳汁中の体細胞数の減少によって証明される。例えば、乳汁中体細胞数（ＳＣＣ）を約５００，０００／ｍｌ、つまりInternational Dairy Federationが設定した、動物が臨床上乳腺炎であると考えられる閾値以下に保持若しくは下げる組成物の能力は、治療効果の指標となるであろう。
【０１２８】
正確な量は、標準試験を用いて当業者により容易に測定される。ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質濃度は、一般的に組成物の約１％から約９５％（ｗ／ｗ）の間になり、又は適当であればこれより高いか、より低い。本ワクチン製剤では、１動物につき１〜３ｍｌの用量が投与されるとき、注射された溶液１ｍｌにつき５〜５００μｇの活性成分が、免疫応答を引き出すのに十分となるはずである。
【０１２９】
対象を免疫化するために、ワクチンは一般的に非経口的に投与されるが、通常、筋肉内注射によリ投与される。しかし、他の方式の投与、例えば、皮下、腹腔内及び静脈内注射も許容される。投与される量は、治療する動物、動物免疫系の抗体を合成する能力、及び所望の保護度に依存する。有効投薬量は、用量反応曲線を確立するルーチン試験を通して、当業者により容易に設定される。対象の免疫化は、ワクチンの最低１回分の用量、好ましくは２回分の用量の投与によって行う。さらに、感染に対する免疫状態を維持するために必要な回数分の用量を動物に投与してもよい。
【０１３０】
他の投与方式に適当な別のワクチン製剤として、座薬、及び場合によってはエアゾール、経鼻及び経口製剤、並びに徐放製剤が含まれる。坐薬に関しては、ビヒクル組成物としては、伝統的な結合剤とキャリヤー、例えばポリアルカリグリコール又はトリグリセリドが含まれる。そのような坐薬は、活性成分を約０．５％から約１０％（ｗ／ｗ）、好ましくは約１％から約２％含有する混合物から形成されてもよい。経口用のビヒクルとしては、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウム、ステアラート、ナトリウムサッカリン繊維素、炭酸マグネシウム、などの通常使用されるビヒクルが含まれる。これらの経口ワクチン組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は散剤の形で投与でき、活性成分を約１０％から約９５％、好ましくは約２５％から約７０％含有することができる。
【０１３１】
鼻腔内投与製剤は、通常、鼻粘膜に刺激を引き起こさず線毛機能を著しく妨げもしないビヒクルを含む。水、食塩水、又は他の公知の物質のような希釈液は、当発明で使用できる。鼻用製剤には、それに限定されないがクロロブタノール及び塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤が含まれてもよい。鼻粘膜による当タンパク質の吸収を強化するために、界面活性剤が含まれてもよい。
【０１３２】
制御放出性の又は徐放性製剤は、タンパク質をキャリヤー又はビヒクル、例えばリポソーム、エチレン酢酸ビニル共重合体及びＨｙｔｒｅｌ（登録商標）共重合体のような非再吸収性、不浸透性のポリマー、ヒドロゲルのような膨潤性ポリマー、又はコラーゲン、ある種のポリ酸、若しくは再吸収性縫合糸に使われるようなポリエステルなどの再吸収性ポリマーに取り込むことにより作成される。ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質は、当技術分野で公知の植込み型ミニポンプを使っても送達できる。
【０１３３】
本発明のタンパク質は、それを発現するキャリヤーウイルスを通じても投与できる。本発明で利用できるキャリヤーウイルスとしては、それに限定されないが、ワクシニアウイルスと他のポックスウイルス、アデノウイルス及びヘルペスウイルスが含まれる。例として、新規タンパク質を発現する組換ワクシニアウイルスは、次のように構築できる。特定のタンパク質をエンコードしているＤＮＡを先ず適当なベクターに挿入し、それをワクシニアプロモーター及び隣接するワクシニアＤＮＡ配列、例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ）をエンコードする配列に隣接させる。次にこのベクターを用いて、ワクシニアに感染させるのと同時に細胞をトランスフェクションする。相同組み換えは、ウイルスゲノムにワクシニアプロモーターと当のタンパク質をエンコードしている遺伝子を挿入するのに役立つ。結果として生じるＴＫ組換体を選抜するには、５−ブロムデオキシウリジン存在下で細胞を培養して、それに耐性のウイルスプラークを拾う。
【０１３４】
別の投与経路には、遺伝子治療又は核酸免疫化が含まれる。このように、対象のタンパク質をエンコードしているヌクレオチド配列（と付属する調節要素）は、そのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳のために直接対象に投与できる。或いは、遺伝子導入は、生体外で対象の細胞又は組織をトランスフェクションして、宿主に形質転換体を再導入することによリ達成できる。ＤＮＡは直接、つまり注射により、宿主生物に導入できる（国際出願第ＷＯ／９０／１１０９２号、及びWolff et al. (1990) Science 247:1465〜1468を参照）。リポソームを介した遺伝子導入は、公知の方法を使用してもできる。例えば、Hazinski et al.(1991) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 4:206〜209；Brigham et al.(1989) Am. J. Med. Sci. 298:278〜281; Canonico et al.(1991)Clin.Res.39:219A；及びNabel et al.(1990)Science 249:1285〜1288を参照。ターゲッティング剤、例えば、特異的な細胞型上で発現する表面抗原を標的にした抗体はリポソームの表面へ共有結合で結合でき、それにより核酸を感染に感受性の特異的な組織及び細胞に送達できる。
【０１３５】
本発明の実施に有用な株の保存
以下の株の生物学的に純粋な培養体が、ブダペスト条約の規定により、アメリカ基準株保存機構（ＡＴＣＣ）、10801 University Boulevard、Manassas、Virginiaにより保存された。示されたアクセッション番号は、生存力検査を通過し、必要な料金が支払われた後に割り当てられた。指定の保存株は、保存開始から３０年間、又は最終保存要請から５年間のいずれか長い期間維持される。培養物が生育不能になった場合、又は不注意に破壊された場合、或いはプラスミド含有株の場合、そのプラスミドが消失した場合は、その培養物は同じ分類学基準に適合する生育可能な培養物と交換される。
【０１３６】
本出願で提示された配列と保存プラスミドにおける関心遺伝子の配列との間で、ルーチンの配列決定の誤りのために相違が生じた場合、保存プラスミドの配列が優先する。
細菌株                プラスミド    遺伝子          保存日          ATCC番号
E.coli (大腸菌) BL21  pET15bgapC    gapC           2000年5月31日    PAT-1976
DE3                (S. dysgalactiae)
E.coli (大腸菌) BL21  pMF521c      gapC            2000年5月31日    PAT-1975
DE3                                (S. agalactiae)
E.coli (大腸菌) BL21  pMF521a      gapC            2000年5月31日    PAT-1973
DE3                                (S. uberis)
E.coli (大腸菌) BL21  pMF521e      gapC            2000年5月31日    PAT-1972
DE3                                (S. iniae)
【０１３７】
３．実験
下記は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。実施例は例示目的のためだけに示されており、いかなる方法であれ本発明の範囲を限定するものではない。
【０１３８】
用いた数字（例えば、量、温度、その他）に関しては正確を期したが、当然ながら若干の実験誤差と偏差は考慮に入れられなければならない。
【０１３９】
材料と方法
酵素は一般市場から購入し、製造業者の指示に従って使用した。
【０１４０】
ＤＮＡ断片の単離では、記載された場合を除き、すべてのＤＮＡ操作を標準手法によって行った。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、同上を参照。制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、クレノーフラグメント、及び他の生物学的試薬は一般市場から購入でき、メーカーの指示に従って使用できる。二重鎖ＤＮＡ断片は、アガロースゲルで分離した。
【０１４１】
化学試薬の供給先としては、通常、Sigma Chemical Company、St.Louis、MO;Alrich、Milwaukee、WI;Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、INが含まれる。
【実施例１】
【０１４２】
S.dysgalactiaeのＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の調製、増幅、配列決定、発現、精製及び特性検査
Ａ．S.dysgalactiae染色体ＤＮＡの調製
ウシ乳房炎臨床症例からのS.dysgalactiae分離株（ＡＴＣＣアクセッション番号ＡＴＣＣ４３０７８）を、アメリカ基準株保存機構（10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110-2209）から得、ＤＮＡ源として使用した。この微生物は、通常、ＴＳＡ羊血寒天培地（ＰＭＬ  Microbiologicals、Mississauga、Ontario）を用いて３７℃で１８時間、又は０．３％の酵母エキス（ＴＨＢ−ＹＥ）を添加したトッド−ヒューウィット培地（Oxoid Ltd.、Hampshire、England）を用いて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【０１４３】
染色体ＤＮＡは、Ａ６００が０．８〜１．０になるまで、２０ｍＭのグリシンを添加した１００ｍｌのＴＨＢ−ＹＥで約６時間培養したS.dysgalactiaeから調製された。細胞を収穫し、５０ｍＭのＥＤＴＡ，５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）（Sigma、St.Louis、MO）で再懸濁し、ＲＮアーゼＡ（２００ｍｇ／ｍｌ）、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）、リゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌ）及びムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）（１００ｍｇ／ｍｌ）（ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した。激しく振盪しながら３７℃で３０分間細菌溶解をした後、塩酸グアニジンとｐＨ５．５のＴｗｅｅｎ２（登録商標）を溶解物を混合して、それぞれ０．８Ｍと５％の最終濃度を得た。この混合液を５０℃で３０分間インキュベートした。次に、染色体のＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ  １００ｇ（Qiagen、Santa Clarita、CA）を使って精製し、０．７容量のイソプロパノールを使って沈殿した。結果として生じるペレットは７０％エタノールで洗浄し、０．５ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）で再懸濁した。
【０１４４】
Ｂ．S.dysgalactiae  ｇａｐＣ遺伝子の増幅とクローニング
ｇａｐＣ遺伝子はＰＣＲによって増幅された（Mullis他、米国特許第４６８３１９５号、Mullis、米国特許第４６８３２０２号を参照）。順方向プライマー、ｇａｐＣ１にはＮｄｅ１制限部位（配列番号１、表１で示される）が、逆方向プライマー、ｇａｐＣ１ｒにはＢａｍＨＩ部位（配列番号２、表１で示される）が含まれていた。表１に示す以前のプライマーでは、下線は原配列に加えられたヌクレオチドを、太字は制限酵素認識部位の位置を示す。
【０１４５】
ＰＣＲは、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs、Mississauga、ON、カナダ）を使って行った。S.dysgalactiae染色体ＤＮＡ０．７μｇを、以前のプライマーを各々１μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰを各２００μＭ、３ｍＭの硫酸マグネシウム、１倍濃度のＴｈｅｒｍｏｐｏｌ緩衝液（New England Biolabs、Mississauga、ON、カナダ）、並びに２単位のＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれた反応混合物中でインキュベートした。この混合液は、９４℃で１分、５０℃で３分、及び７２℃で１分１０秒の３つの増幅周期でインキュベートし、次に、９５℃で１５秒、５５℃で３０秒、及び７２℃で１分の増幅周期でのインキュベートを２７回行い、最後に７２℃で５分の周期で１回インキュベートした。
【０１４６】
【表１】
2006503803.tif 000002
【０１４７】
ｇａｐＣＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨＩとＮｄｅＩで消化された発現ベクターｐＥＴ１５Ｂ（Novagen、Madison、WI）にクローニングされた。この部位へのＰＣＲ生成物のクローニングにより、ｇａｐＣコード配列に対してヘキサヒスチジル（６×Ｈｉｓ）標識のフレーム内コード配列が付加された。以降の発現により、ヒスチジン標識が付属した完全長タンパク質が生成され、その標識は金属キレートクロマトグラフィーを使った非変性条件下での前記タンパク質の精製を可能にする。
【０１４８】
この構築物を使用して、大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３（Life Technologies、Gaithersburg、MD）を形質転換した。本形質転換株は、ＢＬ２１  ＤＥ３と名付けられた（ｐＥＴ１５ｂｇａｐＣ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７６）。
【０１４９】
Ｃ．S.agalactiae、S.uberis、S.parauberis及びS.iniaeからの染色体ＤＮＡの単離並びにｇａｐＣ遺伝子の増幅とクローニング
ｇａｐＣ遺伝子は、基本的に前記したように他の分離株から調製された。
【０１５０】
S.agalactiae、S.uberis及びS.parauberisの染色体ＤＮＡは、アメリカ基準株保存機構から得た株（10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110-2209；ＡＴＣＣ番号２７５４１、９９２７及び１３３８６）から分離された。S.iniaeの染色体ＤＮＡは、Mount Sinai Hospital、University of Torontoから得た９１１７と名付けられた株から分離された。
【０１５１】
上記連鎖球菌株からのｇａｐＣ遺伝子の増幅に使用されたプライマーは、S.dysgalactiaeで使用されたものと同じで、即ち、プライマーｇａｐＣ１（配列番号１）とプライマーｇａｐＣ１ｒ（配列番号２）である。
【０１５２】
増幅の後、各ケースのＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐクローニングキット（Stratagene、La Jolla、CA）に記載のクローニングプロトコルを用いてｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔにクローニングし、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（Stratagene、La Jolla、CA）を形質転換するために用いた。ＰＣＲ生成物インサートは、次にＮｄｅＩとＢａｍＨＩを使って切り取り、ｐＥ１５ｂのそれらの部位に従来のクローニングプロトコル（例えば、Sambrook他、前記を参照）を用いて再クローニングし、大腸菌ＤＨ５αＦ’ｌａｃ１ｑを形質転換するために使用した。この結果生じたS.agalactiaｅ、S.uberis、S.parauberis及びS.iniaeを含むプラスミドは、それぞれｐＭＦ５２１ｃ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７５）、ｐＭＦ５２１ａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７３）、ｐＭＦ５２１ｄ及びｐＭＦ５２１ｅ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７２）と称された。（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣタンパク質の発現のために、前記したように構築物を使用して大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３を形質転換した。
【０１５３】
Ｄ．ｇａｐＣ遺伝子のヌクレオチド配列及び導かれたアミノ酸配列
S.equisimilis相同体のｇａｐＣと相同な配列（Gase et al.(1996)European J.of Biochem.239:42〜51）は、当初、S. dysgalactiae中の連結しているが無関係な遺伝子の配列決定中に同定された。S. dysgalactiaeのｇａｐＣ遺伝子の完全な配列を得るために、上述のプライマー、即ちプライマーｇａｐＣ１及びプライマーｇａｐＣ１ｒを使ってＰＣＲを行った。
【０１５４】
配列の決定は、Plant Biotechnology Institute（PBI、Saskatoon、カナダ）において、ＡＢＩ  ３７３  ＤＮＡ自動シーケンサー（Applied Biosystems、Emeryville、CA)の蛍光標識ターミネーターを使って行った。
【０１５５】
図１Ａ〜１Ｂは、S. dysgalactiaeからのｇａｐＣ遺伝子のコード配列（ＤｙｓＧａｐＣ）（配列番号３）と導かれたアミノ酸配列（配列番号４）を表す。
【０１５６】
S.agalactiae、S.uberis、S.parauberis及びS.iniaeから単離されたＧａｐＣタンパク質の配列は、同じ方法で決定された。
【０１５７】
図２から５は、S.dysgalactiaeのＧａｐＣタンパク質（DysgalGapC）のヌクレオチド配列と予測されたアミノ酸配列（配列番号３及び配列番号４）、並びにS.agalactiaeのＧａｐＣタンパク質（ＡｇａｌＧａｐＣ）（配列番号５及び配列番号６）、S.uberis（ＵｂｅｒＧａｐＣ）（配列番号７及び配列番号８）、S.parauberis（ＰＵｂｅｒＧａｐＣ）（配列番号９及び配列番号１０）、並びにS.iniae（ＩｎｉａｅＧａｐＣ）（配列番号１１及び配列番号１２）のヌクレオチド配列と予測されたアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【０１５８】
図１Ａ〜１Ｂに示したS.dysgalactiaeのＧａｐＣタンパク質遺伝子は、シグナル配列と膜アンカー領域のいずれも含むようには見えない３３６個のアミノ酸タンパク質をコードする。ＢＬＡＳＴＸプログラムを使用したＧｅｎＢａｎｋデータベースの検索で、オープンリーディングフレームはS.equisimilisのＧａｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９７７８８）と９５．５％相同で、S.pyogenesのＧａｐＣ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ９５５６９）と９９．４％相同であることが分かった。ＧａｐＣタンパク質の予測されたアミノ酸配列も、ウシのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８５０４２）に対して４３％のアミノ酸同一性を示した。
【０１５９】
同様に、S.agalactiae、S.uberis、Ｓ.parauberis及びS.iniaeのＧａｐＣタンパク質配列に関しても、シグナル配列や膜アンカー領域が存在しているようには見えない。
【０１６０】
配列同一性を表２に示す。
【０１６１】
【表２】
2006503803.tif 000003
【０１６２】
Ｅ．組換えS.dysgalactiae  ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質の発現と精製
ヘキサヒスチジル標識ＧａｐＣタンパク質は、メーカーの指示により、金属キレート（Ｎｉ−ＮＴＡ）アガロース（Qiagen、Santa Clarita、CA）アフィニティークロマトグラフィーを非変性条件下で用いて発現、精製した。
【０１６３】
組換えプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３は、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含まれたルーリア培地で、Ａ６００が約０．５になるまで培養した。次に、１ｍＭのイソプロピル−β，Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加してＧａｐＣタンパク質の発現を誘発した。３７℃で３時間のインキュベーションの後、細胞を収穫し、カラム緩衝（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、０．３ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）で洗浄して、音波処理により溶解した。
【０１６４】
組換えタンパク質の約４０％は超音波処理細胞の可溶性画分で、培養物容積１リットルあたり組換えタンパク質が約５０ｍｇの収率であることが、標準としてウシ血清アルブミン（Pierce、Rockford、IL）を用いたＤＣプロテインアッセイキット（Bio-Rad Laboratories、Mississauga、ON、カナダ）を使用して決定された。
【０１６５】
溶解物は遠心によって清澄化し、可溶画分はＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に入れ、次に、このカラムをカラム１０倍量のカラム緩衝（２０ｍＭのイミダゾールを含有することを除いて上と同様）で洗浄した。カラム緩衝（２５０ｍＭのイミダゾールを含有することを除いて上と同様）を用いてヘキサヒスチジル標識ＧａｐＣを溶出し、ＧａｐＣ濃度が１０〜１５ｍｇ／ｍｌの同質のタンパク分画が得られた。その画分は、２０００容のＰＢＳＡ（１３６ｍＭ塩化ナトリウム、２．６ｍＭ塩化カリウム、８．１ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム、１．４６ｍＭ一塩基性リン酸カリウム）で透析した。
【０１６６】
Ｆ．S.agalactiae、S.uberis、S.parauberis及びS.iniaeからの組換えＧａｐＣタンパク質の発現と精製
これらの連鎖球菌からの組換えタンパク質の発現及び精製は、前記実施例１Ｅで記載の同じ方法で達成できる。S.agalactiae、S.uberis、S.parauberis及びS.iniaeの組換えＧａｐＣタンパク質の発現のために使用された形質転換された細菌株は、それぞれ、ＢＬ２１  ＤＥ３（ｐＭＦ５２１ｃ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７５）、ＢＬ２１  ＤＥ３（ｐＭＦ５２１ａ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７３）、ＢＬ２１  ＤＥ３（ｐＭＦ５２１ｄ）及びＢＬ２１  ＤＥ３（ｐＭＦ５２１ｅ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−１９７２）と称された。
【０１６７】
Ｇ．組換えS.dysgalactiae ＧａｐＣタンパク質の特性解析
１．ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析
溶出タンパク質試料のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析は、Laemli（Laemli、英国、(1970) Nature 227:680〜685）が記載した方法を使用した。結果を図１８に示す。図中、レーン１：分子量マーカー（20.5〜103kDa;BioRad Laboratories、Emeryville、CA）；レーン２：Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたS.dysgalactiaeの可溶性組換えＧａｐＣタンパク質）。
【０１６８】
これらの結果は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる精製により、相同のタンパク分画が得られることを実証している。
【０１６９】
２．組換えＧａｐＣ及びS.dysgalactiae完全細胞のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）活性
ＧＡＰＤＨは、ＮＡＤ＋及び無機リン酸塩存在下で、Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸の１，３−ジホスホグリセリン酸への酸化的リン酸化を触媒する。ＧａｐＣと連鎖球菌のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素との高い相同性は、ＧａｐＣが本酵素活性を示す可能性を示唆した。
【０１７０】
S.dysgalactiae完全細胞（１０１０ＣＦＵ）と組換えＧａｐＣタンパク質のＧＡＰＤＨ活性は、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元の測定により定量した。アッセイ緩衝液は、４０ｍＭトリエタノールアミン、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４及び５ｍＭのＥＤＴＡから成り、ｐＨは６．８であった。S.dysgalactiae細胞又は精製された組換えタンパク質の５ｍｇを、７ｍｌのグリセルアルデヒド−３−リン酸（４９ｍｇ／ｍｌ；Sigma Chemical Company）、最終容積１ｍｌ中７５μｌのＮＡＤ＋（１５ｍＭ；Sigma Chemical Company）を含有しているアッセイ緩衝液でインキュベートした。ネガティブコントロールは、グリセルアルデヒド−３−リン酸塩及び組換えＧａｐＣ分子／S.dysgalactiae細胞を含有していないサンプルから成った。ＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの還元は、３４０ｎｍの吸光度を分光測光法でモニターした。
【０１７１】
結果は、組換えタンパク質並びに未変性のS.dysgalactiae野生株細胞は酵素活性を有することを示した（表示せず）。さらに、S.dysgalactiae細胞をトリプシンで処理して表面タンパク質を消化すると、ＧＡＰＤＨ活性は消失した。このように、未変性の野生型細胞で観察された酵素活性は、細胞内のＧＡＰＤＨによるものではなかった。
【０１７２】
このデータは、ＧａｐＣタンパク質は、ヌクレオチド又はアミノ酸におけるシグナル配列又は膜アンカー領域の明らかな欠如にもかかわらず、細胞表面上に限局されることを示唆している。
【０１７３】
３．S.dysgalactiae組換えＧａｐＣプラスミン結合タンパク質及びＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ完全細胞のプラスミン結合活性
マイクロプレートアッセイを用いて、組換えＧａｐＣタンパク質がウシのプラスミンを結合できるか、もしできるとすれば、結合したプラスミンは酵素活性型であるかどうかを確定した。
【０１７４】
９６穴マイクロタイタープレートを５ｍｇの精製された組換えＧａｐＣタンパク質でコーティングし、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０が含まれた０．１％のゼラチン−ＰＢＳＡ（ＰＢＳＧＴ）で３回洗浄した。穴は同じ緩衝液中で３７℃で１時間ブロックし、洗浄後、２００ｍｌのウシのプラスミン（０．２５ｍｇ／ｍｌ；Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN）と３７℃で１時間インキュベートした。穴は、その後８回、ＰＢＳＧＴで洗浄した。合成基質クロマジン−ＰＬ（Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−４−ＮＡ、０．３ｍｇ／ｍｌ）２００ｍｌを穴に加え、３７℃で１時間インキュベートした。関連したプラスミン活性の存在は、上清に放出され４０５ｎｍの吸光度に基づき検出されるパラニトロアナリド（paranitroanalide）（４−ニトラニリン）の濃度を測定して確定した。類似の方法を用いてS.dysgalactiae完全細胞のプラスミン結合活性を測定したが、ここでは１０１０個の細胞をＰＢＳＧＴで洗浄し、４００μｌのクロマジン−ＰＬ（０．３ｍｇ／ｍｌ）で再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。
【０１７５】
図１９に示した結果は、精製された組換えタンパク質は酵素活性のあるウシプラスミンと結合することを証明している。同様に、S.dysgalactiae完全細胞を用いた場合、類似した結果が得られた。図では、データは個々の３つのアッセイの平均を表す。
【０１７６】
このように、プラスミン受容体はS.dysgalactiaeの表面に位置し、前記精製されたタンパク質は生物学的活性を保持する。
【実施例２】
【０１７７】
S.dysgalactiaeのＧａｐＣによる免疫化及びウシの試験的感染
ワクチンは、それらがオイルベースのアジュバントＶＳＡ３（VIDO、Saskatoon、Saskatchewan、カナダ；van Drunen Littel-van den Hurk et al.(1993)Vaccine 11:25〜35）に５０ｍｇ／ｍｌの親和性精製組換えＧａｐＣを含むように製剤された。ＶＳＡ３は、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ  Ｐｌｕｓ（商標）（MVP Laboratories、Ralston、Nebraska）とジメチルジオクタデシル臭化アンモニウム（Kodak、Rochester、New York）とを組み合わせたものである。ワクチン製剤のために使われるアフィニティー精製組換えＧａｐＣタンパク質を図１８に示す。
【０１７８】
S.dysgalactiae感染の病歴のない２４頭の非授乳ホルスタインが、カナダのサスカチュワン州の様々な農場から得られた。ワクチン接種の１週間前に、すべての動物をＣｅｐｈａ−ｄｒｙ（商標）（Ayerst Laboratories、Montreal、カナダ）で処置（１乳房区につき３００ｍｇ）し、ワクチン接種の段階の前に乳房のいかなる感染も取り除いた。
【０１７９】
８動物からなる群を、S.dysgalactiaeのＧａｐＣ、Ｍｉｇ（S.dysgalactiaeから分離されたＦＣ受容体タンパク質で同時に評価された）、又はプラセボを含有するワクチンを、３週間の接種間隔で２用量を皮下経路で投与して免疫化した。２回目の接種から２週間後、動物の３つの乳房区は乳房注入カニューレで６５０ｃｆｕのＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅに曝された。各動物の第４の乳房区は、非感染コントロールとして用いられた。
【０１８０】
すべての動物は、毎日、病気の臨床徴候がないか調べられ、また、すべての乳房区からのサンプルを毎日採取した。サンプルは粘稠度と体細胞数、並びに細菌数が観察された。
【実施例３】
【０１８１】
ＧａｐＣ特異抗体の測定
ウシ血清中のＧａｐＣ特異抗体は、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使って測定された。手短に言うと、マイクロタイタープレート（NUNC、Naperville、Illinois）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝（ｐＨ９．６）中の精製組換え抗原を１穴あたり１マイクログラムを加えることによってコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。液を取り除き、穴を３７℃で１時間、３％のウシ血清アルブミンでブロックした。次に、ウシ血清の連続希釈液（１対４から１対６，４００まで）を穴に加え、室温で２時間インキュベートした。穴を吸引、洗浄し、１００ｍｌのアルカリホスファターゼ抱合ヤギ抗ウシＩｇＧ（Kirkgaard & Perry Laboratories Inc.、Gaithersburg、MD）と室温で１時間インキュベートした。穴を再び洗浄し、１００μｌのｐ−ニトロフェノールリン酸塩（SIGMA、St.Louis、MO）を、アルカリホスファターゼ活性を見つけるための基質として加えた。基質と室温で１時間インキュベーション後に、４０５ｎｍにおける吸光度を記録した。
【０１８２】
図で参照されている場合、比抗体価はバックグラウンドレベルより上の活性を示す希釈倍率の逆数で表されている。
【実施例４】
【０１８３】
細菌の定着
細菌は、ＴＳＡ羊血寒天プレートの上に系列希釈（１００から１０−３）を直接塗抹し、一晩３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションして計数した。定着は、感染生物の回収が＞５００ｃｆｕ／ｍｌと定義される。
【０１８４】
泌乳から回収される細菌がS.dysgalactiaeであることを確認するために、各動物から回収され選抜されたコロニーを、ＡＰＩ  ｓｔｒｅｐ−２０検査（bioMerieux SA、Hazelwood、Missouri）をメーカーの指示通りに使って検査した。本試験は、酵素活性と糖の発酵の測定のための２０の生化学検査を組み合わせた標準方法である。反応は読取り表に従って読み取り、分析プロフィール指数を参照して、又は確認ソフトウェアを使用して確認される。
【０１８５】
感染の後、すべての群の動物はS.dysgalactiaeが定着していることが示された（図２０）。ＧａｐＣで免疫化したウシだけは、感染させた乳房区の数と乳房区あたりの分離細菌総数において統計学的に有意な減少を示した。従って、ＧａｐＣによる免疫化は、S.dysgalactiaeによる感染後の細菌の定着を減らした。
【０１８６】
抗ＧａｐＣ抗体価と細菌定着の間の関係を図２１と２２に示す。抗ＧａｐＣ血清抗体レベルと、いずれの乳房区における最大細菌数（ＣＦＵ（ｌｏｇ１０／乳汁１ｍｌで表示）（ｒ＝０．７４）（図２１）との間、並びに感染乳房区総数（ｒ２＝０．７４）（図２２）との間に強い相関が見られた。相関は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖｅｒ．２．０１（GraphPad Software Inc.、San Diego、カリフォルニア）を使用して計算した。
【０１８７】
この相関は図２３及び図２４にも例示されており、そこではＧａｐＣ免疫化群は高力価応答体と低力価応答体にさらに分割されている。これらの図では、「低力価応答体」はＧａｐＣに対して最も弱い応答を示した４動物を指し、「高力価応答体」は前記群の残りの動物を指す。高力価群では定着は起こらなかったが、低力価群でさえ３日後には回収細菌数の減少が見られた。
【実施例５】
【０１８８】
炎症性反応の測定
炎症性反応は、体細胞数（即ち、リンパ球、好中球及び単球）の関数として測定された。体細胞数は、Agriculture and Agri-Food Canada Pamphlet IDF50B(1985)Milk and Milk products-Methods of Samplingの推奨に従って、標準の手法を使ってコールターカウンターで測定した。サンプルは、感染後１〜７日に、常に採取及び固定から４８時間以内に判読された。
【０１８９】
腺に存在する体細胞数は、感染後の毎日測定された。感染させなかった乳房区からの数は試験期間を通して一定であったが、１日後のＧａｐＣ群ではプラセボ接種群より低かった（図２５）。ＧａｐＣ群とプラセボ群の間の相違は、統計学的に有意であった。１日後の個々のデータを図２６に示す；感染後７日間におけるＧａｐＣ処置動物のデータを図２７に示す。ＧａｐＣ接種動物の乳房区からのサンプルは、感染させなかった乳房区と見分けがつかなかった。
【０１９０】
従って、ＧａｐＣによる免疫化は、S.dysgalactiaeによる感染後の炎症性反応を減らした。
【実施例６】
【０１９１】
泌乳牛の免疫化と感染
S.uberis及びS.dysgalactiaeを含むワクチンの泌乳牛における効果を試験するための同様の実験を下記のように行った。合計９９頭の泌乳ホルスタイン牛を、S.uberis完全細胞、ＧａｐＣとＣＡＭＰ、別の連鎖球菌抗原に対する血清ＩｇＧが存在するかスクリーニングした。８動物からなる４群を、プラセボ、S.uberisの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ、S.dysgalactiaeの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ、及びＣＡＭＰ−３によるワクチン接種のために選抜した。各ワクチン用量（２ｍｌ）には、１００μｇ／ｍｌの精製された（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ、ＣＡＭＰ−３又は抗原が含まれないプラセボ（０．８５％（ｗ／ｖ）食塩水）、及び３０％のＶＳＡ３（VIDO、Saskatoon、Saskatchewan、カナダ；van Drunen Littel-van den Hurk et al. (1993) Vaccine 11:25〜35）が含まれた。ウシは、感染の３６日前（ｄａｙ  ０）と１５日前に、皮下注射を首に２回受けた。感染の８日前に、各乳房区からの乳サンプルの細菌の存在を分析し、感染していた動物は試験から排除された。その後、各群の６頭のウシを感染させた。感染の３時間前に、乳首を清潔な暖かい水で洗浄し、乾燥して、アルコールで拭いた。乳サンプルは体細胞数計測（ＳＣＣ）と細菌学的検査のために採取した。左の乳房区は、コントロールとして感染させなかった。０．８５％（ｗ／ｖ）食塩水に懸濁したS.uberis  ＳＵ２１（Animal Health Laboratory、Alberta、カナダから得られた臨床分離株）の対数増殖期培養物の３．０×１０７ｃｆｕ／ｍｌを含有した接種菌の３ｍｌを、乳房内注入により各動物の右の乳房区に投与した。乳サンプルは、感染後７日間毎日すべての乳房区から集め、ＳＳＣの測定と細菌学的検査を行った。すべてのサンプルは氷の上で保存し、採取から４８時間以内に分析された。動物の臨床評価には、直腸温と乳房腫脹（目視検査及び触診による）の計測が含まれた。１（正常）から３．５（重症乳腺炎）までの数値スコアを各動物に割り当て、ワクチン群間での乳腺炎の重症度の比較手段として用いた。乳汁品質はクロットの存在により評価した。
【０１９２】
血清ＩｇＧ力価は、第１回目及び２回目のワクチン接種時、感染８日前（ｄａｙ  ２８）、及び感染１１日後（ｄａｙ  ４７）に測定した。同様に、乳汁ＩｇＧ力価をｄａｙ  ２１とｄａｙ  ４３に測定した。血清ＩｇＡ力価をｄａｙ  ２１及びｄａｙ  ４７に、乳汁ＩｇＡ力価をｄａｙ  ２１とｄａｙ  ４３に測定した。丸底９６穴マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）をＣＡＭＰ−３及びS.uberis及びS.dysgalactiaeの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ（１００ｎｇ／穴、１００μｌの炭酸塩緩衝溶液、ｐＨ９．６）を用いて４℃で一晩コーティングし、２００μｌのＰＢＳＴｇを用いて３７℃で１時間ブロックした。試験サンプルを１穴あたり１００μｌ加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ抱合型ヤギ抗ウシＩｇＧ（H&L;Kirkegaard and Perry Labs.Inc.、Gaithersburg、MD）を加え（１００μｌ／穴）、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．８）と０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２に溶かしたｐ−ニトロフェニルリン酸塩と室温で１．５時間インキュベーションした後に、４０５ｎｍでアルカリホスファターゼ活性を検出した。
【０１９３】
乳汁ＩｇＧとＩｇＡの測定は、乳汁を市販のレンニン溶液で処理した後に以下のように行った。Ｒｅｎｎｅｔ（ＣＨＲＨＡＮＳＥＮ）１錠を４０ｍｌの水に溶かし、この溶液の０．１ｍｌを２ｍｌの乳汁に加えて、室温で４時間インキュベートした。凝固したカゼインを３，０００×ｇで２０分間の遠心にかけてペレット化し、中間層を取り出し（上層は脂肪を含む）、血清サンプルとして分析した。血清と乳汁の力価の測定は、ＯＤ４０５対希釈対数の最小二乗回帰と血清を含有していない穴から得られたＯＤ４０５との交差により測定された。
【０１９４】
乳サンプルからのＳＣＣの測定は、Pacific Milk Analysis Laboratory（Chilliwak、British Columbia)で実施された。サンプルは防腐剤入りの１４ｍｌのポリスチレン製の丸底管（Ｆａｌｃｏｎ）で採取された。ＳＣＣは、０．５ｍｌの乳サンプルを１０μｌの固定液（０．２ｍｇ／ｍｌのエオシン、３．３％ホルムアルデヒド溶液）と３０℃で１８時間混合して固定した。サンプルは乳化電解溶液（１２％のエタノール、０．０２％トリトンＸ−１００，０．１ＭのＮａＣｌ）で１００倍に希釈し、８０℃で１０分間インキュベートした。室温まで冷却後、ＳＣＣをコールターカウンターで測定した。処理間、及び経時的なＳＣＣ反復測定値の分散分析は、ＳＹＳＴＡＴ  １０ソフトウェアパッケージ（ＳＰＳＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、シカゴ、米国）を使って行った。
【０１９５】
表３は、感染前及び後の力価を示すが、これらは各投与群のすべての動物から得られた血清力価の自然対数変換値の算術平均として示されている（括弧内は標準偏差を示す）。ワクチン接種の前には、いかなる程度であれ（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣに対して検出可能な血清ＩｇＧ力価を示した動物は４個体だけであった。ワクチン接種の後、（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣによるワクチン接種をしたすべての動物は血清及び乳汁の抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ−ＩｇＧ力価における有意な上昇を示し、それらは一貫して対照動物より最低１０倍高いレベルを維持したが、ＣＡＭＰ−３によるワクチン接種をした動物の抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ−ＩｇＧ力価は対照群のそれと類似していた。乳汁中の抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ−ＩｇＧ力価は、血清中の対応する値より一貫して低かった。しかしなから、感染の直前には、対照動物及びＣＡＭＰ−３接種動物と比較して、（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ接種動物における血清及び乳汁のＩｇＧ力価の上昇が明らかであった。血清抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ−ＩｇＡレベルは、感染前にはすべての群で検出できたが、感染後には著しく上昇した。ＣＡＭＰ−３でワクチン接種された群でさえ血清抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ−ＩｇＡ力価の上昇を示し、これは恐らく、S.uberis感染細菌の細胞表面関連のＧａｐＣに曝露されたことが原因と考えられる。ＣＡＭＰ−３ワクチン接種を受けた動物では、抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ乳ＩｇＧ力価における感染後の増加も観察されたが、対応する増加は血清ＩｇＧ力価では観察されなかった。血清と対照的に、乳汁抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ−ＩｇＡは、感染の前でも後でも、実質的にすべての群で検知されなかった。
【０１９６】
ＣＡＭＰ−３によるウシのワクチン接種の後に、対照及び（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ接種動物のそれらと比較して、血清及び乳汁の抗ＣＡＭＰ−ＩｇＧ力価の著しい増加があった。さらに、抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ−ＩｇＧ力価と対照的に、抗ＣＡＭＰ−３力価は感染後に上昇し、一方、（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣのそれはわずかに減少した。原因は不明であるが、この観察はすべてのワクチン接種群を通して一貫していた。感染後の血清抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ−ＩｇＧ力価は減少することが分かったが、対応する乳汁の力価は増加した（S.dysgalactiaeの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ接種群は除く）。感染前の血清抗ＣＡＭＰ−３−ＩｇＡ力価は、同時（ｄａｙ  ２１）に測定された対応する血清抗（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ力価よりも高く、感染後の血清サンプル採取時には、抗ＣＡＭＰ−３−ＩｇＡレベルはすべての群で上昇しており、最も著しかったのはＣＡＭＰ−３接種群であった。これに対して、感染の前でも後でも、乳汁抗ＣＡＭＰ−３−ＩｇＡ力価は実質的に検出されなかった。
【０１９７】
S.uberis  ＳＵ２１による感染の後には、ワクチン接種されたかそうではない動物から、細菌はどの時点でも回収されなかった。このことは前の研究（Finch et al. (1994)Infect.Immun.62:3599〜3603）の結果と一致しているが、その研究では加熱殺菌S.uberisでワクチン接種された乳牛からは感染後に細菌が分離されなかったが、ワクチン接種されなかった対照動物からは細菌が分離された。この研究においては、投与された接種菌密度が、ワクチン接種されない動物においてさえ、持続的な感染を起こさずに乳腺炎を起こす程度に十分に低かった可能性がある。しかし、細菌が回収されなかったにもかかわらず、動物は病気の臨床徴候を示し、ＳＣＣは炎症の存在を示していた。従って、感染は成功したと考えられた。ワクチン群の間では、直腸温に有意差は観察されなく、また、臨床スコアは感染程度に有意差がないことを示していた。乳汁収率の差はどの動物においても観察されなかったけれども、乳汁の品質は以下で記すようにすべての群でわずかに影響を受けた。
【０１９８】
ウシの乳房は連結していない乳房区から成るが、S.uberisにより２つの乳房区のみを感染させることによって、各動物では内部防御が備わる。図２８は試験期間中の各特定ワクチン群のＳＣＣを示す。初期解析の結果、対照群で報告されたＳＣＣはいくらか変化しているようである。しかし、全体的には時間と共にＳＣＣは増加し、二次関係（ｐ＝０．０２）で説明された。ｄａｙ  ２の後、対照群のＳＣＣは著しく増加し、感染後４日にはその最高レベルに達した。その後ＳＣＣはわずかに減少し、感染後７日までには再び著しく上昇した。この幾分不安定な傾向は、別の論文（Finch et al.(1997)Vaccine 15:1138〜1143；Finch et al.(1994)Infect.Immun.62:3599〜3603）で報告されている、泌乳牛をS.uberisで感染させた場合のＳＣＣ値と一致している。S.dysgalactiae（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣで接種した動物のＳＣＣは感染直後に鋭く上昇し、ｄａｙ  ３には最大に到達したが、その後試験の残りの期間は不安定に減少した。しかしながら、感染後４日以降の見かけの相違にかかわらず、ＳＣＣの減少はどの時点でも対照群のそれと統計学的に有意に異なることはなかった。この結果は、S.dysgalactiaeの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣはS.uberisのそれほど保護的でないことが原因かもしれない。
【０１９９】
S.uberis（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣによるワクチン接種は、対照群と比較してＳＣＣの有意な減少をもたらした。ｄａｙ  ３以降、この群のＳＣＣは対照群のそれよりも統計学的に有意に低かった（ｐ値は、感染後３日は０．０２３、４日は０．００１、５日は０．０１１、６日は０．００６、７日は０．０００）。ＣＡＭＰ−３抗原でワクチン接種をしたウシのＳＣＣはＳ．ｕｂｅｒｉｓの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ接種動物のそれよりもわずかに高かったが、それでもまだ対照群のそれよりも明らかに低かった。対照群とＣＡＭＰ−３ワクチン接種群のＳＣＣの比較で、感染後３日（ｐ＝０．０３３）、６日及び７日（それぞれ、ｐ＝０．０３２及びｐ＝０．０４６）に統計学的に有意な差が明らかになったが、４日後及び５日後は、これらの日にはＳＣＣがＣＡＭＰ−３接種群で明らかに低かったけれどもそのようなことはなかった。
【０２００】
ＳＵ２１による感染の後、乳汁品質への影響が残っていた時間は、ワクチン群間で変動した。対照群、S.dysgalactiae（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ、ＣＡＭＰ−３，及びS.uberis（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ接種群における感染後の乳汁品質は、それぞれ計２１日、２４日、１１日及び９日間低下した。このデータによると、S.dysgalactiae（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ接種群における乳腺炎は、対照群のそれよりも悪くはないにしてもより軽いものではなかった。反対に、S.uberis（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣによるワクチン接種では乳汁品質の劣化を完全に予防できなかったが、乳汁品質が影響を受けた延べ時間をかなり減らした。ＣＡＭＰ−３によるワクチン接種も乳汁品質が低下した延べ時間を短縮したようであるが、S.uberis（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣ群ほどではなく、これはＳＣＣの結果と一致する。
【０２０１】
このように、S.uberis（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣによるワクチン接種は、異種感染に対して著しい保護をもたらし、S.uberisのＧａｐＣは従ってS.uberis乳腺炎並びに異種株による乳腺炎に対してもワクチン抗原としての利用に適当である。
【０２０２】
【表３】
2006503803.tif 000004
【０２０３】
このように、各種ＧａｐＣプラスミン結合タンパク質のクローニング、発現、及び特性解明がその利用方法と並んで開示されている。本発明の好ましい実施形態がある程度詳細に記載されたが、添付の請求項に定義されているような本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、明らかな変更を加えることができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１Ａ】S.dysgalactiaeのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号３及び配列番号４）。
【図１Ｂ】S.dysgalactiaeのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号３及び配列番号４）。
【図２Ａ】S.agalactiaeのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号５及び配列番号６）。
【図２Ｂ】S.agalactiaeのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号５及び配列番号６）。
【図３Ａ】S.uberisのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号７及び配列番号８）。
【図３Ｂ】S.uberisのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号７及び配列番号８）。
【図４Ａ】S.parauberisのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号９及び配列番号１０）。
【図４Ｂ】S.parauberisのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号９及び配列番号１０）。
【図５Ａ】S.iniaeのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号１１及び配列番号１２）。
【図５Ｂ】S.iniaeのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列及び導いたアミノ酸配列を表す図である（配列番号１１及び配列番号１２）。
【図６Ａ】ＰｉｌｅＵｐによって作成されＰｒｅｔｔｙソフトウェア（Canadian Bioinformatics ResourcｅのＳｅｑＷｅｂ配列解析パッケージＶｅｒ．１．１によって提供されるＧＣＧウィスコンシンパッケージＶｅｒ．１０の構成体）で表示されたＤＮＡ配列を示す図である。  図は、S.dysgalactiae（DysGapC、Check 9344）、S.agalactiae（AgalGapC、 Check 2895）、S.uberis（UberGapC、Check 5966)、S.parauberis（ParaUbGapC、Check 9672)及びS.iniae（SiniGapC、Check 990)からのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列を表す。S.equisimilis（SeqGapC、Check 5841）、化膿連鎖球菌（SpyGapC、Check 4037）及びウシのＧＡＰＤＨタンパク質（BovGapC、check 5059）の既知の配列も含まれる。長さと重量パラメータは、すべての配列で同一であった（それぞれ１０１８及び１．００）。ＤＮＡの塩基配列比較において使われるパラメータは、次の通りであった：Plurality-2.00;Threshold-1;Aveweight-1.00;AveMatch-1.00;AveMisMatch-0.00;Symbol comparison table-pileupdna.cmp;CompCheck-6876;GapWeight-5;GapLengthWeight-1;PileUp MSF-1018;Type-N;Check-3804。同図において、ダッシュは同一のヌクレオチドを意味し、点は配列表を作成するためにソフトウェアによって導入されるギャップを表し、波形符号は遺伝子配列の長さの相違のために配列全体に含まれない領域を表す。
【図６Ｂ】ＰｉｌｅＵｐによって作成されＰｒｅｔｔｙソフトウェア（Canadian Bioinformatics ResourcｅのＳｅｑＷｅｂ配列解析パッケージＶｅｒ．１．１によって提供されるＧＣＧウィスコンシンパッケージＶｅｒ．１０の構成体）で表示されたＤＮＡ配列を示す図である。  図は、S.dysgalactiae（DysGapC、Check 9344）、S.agalactiae（AgalGapC、 Check 2895）、S.uberis（UberGapC、Check 5966)、S.parauberis（ParaUbGapC、Check 9672)及びS.iniae（SiniGapC、Check 990)からのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列を表す。S.equisimilis（SeqGapC、Check 5841）、化膿連鎖球菌（SpyGapC、Check 4037）及びウシのＧＡＰＤＨタンパク質（BovGapC、check 5059）の既知の配列も含まれる。長さと重量パラメータは、すべての配列で同一であった（それぞれ１０１８及び１．００）。ＤＮＡの塩基配列比較において使われるパラメータは、次の通りであった：Plurality-2.00;Threshold-1;Aveweight-1.00;AveMatch-1.00;AveMisMatch-0.00;Symbol comparison table-pileupdna.cmp;CompCheck-6876;GapWeight-5;GapLengthWeight-1;PileUp MSF-1018;Type-N;Check-3804。同図において、ダッシュは同一のヌクレオチドを意味し、点は配列表を作成するためにソフトウェアによって導入されるギャップを表し、波形符号は遺伝子配列の長さの相違のために配列全体に含まれない領域を表す。
【図６Ｃ】ＰｉｌｅＵｐによって作成されＰｒｅｔｔｙソフトウェア（Canadian Bioinformatics ResourcｅのＳｅｑＷｅｂ配列解析パッケージＶｅｒ．１．１によって提供されるＧＣＧウィスコンシンパッケージＶｅｒ．１０の構成体）で表示されたＤＮＡ配列を示す図である。  図は、S.dysgalactiae（DysGapC、Check 9344）、S.agalactiae（AgalGapC、 Check 2895）、S.uberis（UberGapC、Check 5966)、S.parauberis（ParaUbGapC、Check 9672)及びS.iniae（SiniGapC、Check 990)からのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列を表す。S.equisimilis（SeqGapC、Check 5841）、化膿連鎖球菌（SpyGapC、Check 4037）及びウシのＧＡＰＤＨタンパク質（BovGapC、check 5059）の既知の配列も含まれる。長さと重量パラメータは、すべての配列で同一であった（それぞれ１０１８及び１．００）。ＤＮＡの塩基配列比較において使われるパラメータは、次の通りであった：Plurality-2.00;Threshold-1;Aveweight-1.00;AveMatch-1.00;AveMisMatch-0.00;Symbol comparison table-pileupdna.cmp;CompCheck-6876;GapWeight-5;GapLengthWeight-1;PileUp MSF-1018;Type-N;Check-3804。同図において、ダッシュは同一のヌクレオチドを意味し、点は配列表を作成するためにソフトウェアによって導入されるギャップを表し、波形符号は遺伝子配列の長さの相違のために配列全体に含まれない領域を表す。
【図６Ｄ】ＰｉｌｅＵｐによって作成されＰｒｅｔｔｙソフトウェア（Canadian Bioinformatics ResourcｅのＳｅｑＷｅｂ配列解析パッケージＶｅｒ．１．１によって提供されるＧＣＧウィスコンシンパッケージＶｅｒ．１０の構成体）で表示されたＤＮＡ配列を示す図である。  図は、S.dysgalactiae（DysGapC、Check 9344）、S.agalactiae（AgalGapC、 Check 2895）、S.uberis（UberGapC、Check 5966)、S.parauberis（ParaUbGapC、Check 9672)及びS.iniae（SiniGapC、Check 990)からのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列を表す。S.equisimilis（SeqGapC、Check 5841）、化膿連鎖球菌（SpyGapC、Check 4037）及びウシのＧＡＰＤＨタンパク質（BovGapC、check 5059）の既知の配列も含まれる。長さと重量パラメータは、すべての配列で同一であった（それぞれ１０１８及び１．００）。ＤＮＡの塩基配列比較において使われるパラメータは、次の通りであった：Plurality-2.00;Threshold-1;Aveweight-1.00;AveMatch-1.00;AveMisMatch-0.00;Symbol comparison table-pileupdna.cmp;CompCheck-6876;GapWeight-5;GapLengthWeight-1;PileUp MSF-1018;Type-N;Check-3804。同図において、ダッシュは同一のヌクレオチドを意味し、点は配列表を作成するためにソフトウェアによって導入されるギャップを表し、波形符号は遺伝子配列の長さの相違のために配列全体に含まれない領域を表す。
【図６Ｅ】ＰｉｌｅＵｐによって作成されＰｒｅｔｔｙソフトウェア（Canadian Bioinformatics ResourcｅのＳｅｑＷｅｂ配列解析パッケージＶｅｒ．１．１によって提供されるＧＣＧウィスコンシンパッケージＶｅｒ．１０の構成体）で表示されたＤＮＡ配列を示す図である。  図は、S.dysgalactiae（DysGapC、Check 9344）、S.agalactiae（AgalGapC、 Check 2895）、S.uberis（UberGapC、Check 5966)、S.parauberis（ParaUbGapC、Check 9672)及びS.iniae（SiniGapC、Check 990)からのｇａｐＣ遺伝子の単離されたヌクレオチド配列を表す。S.equisimilis（SeqGapC、Check 5841）、化膿連鎖球菌（SpyGapC、Check 4037）及びウシのＧＡＰＤＨタンパク質（BovGapC、check 5059）の既知の配列も含まれる。長さと重量パラメータは、すべての配列で同一であった（それぞれ１０１８及び１．００）。ＤＮＡの塩基配列比較において使われるパラメータは、次の通りであった：Plurality-2.00;Threshold-1;Aveweight-1.00;AveMatch-1.00;AveMisMatch-0.00;Symbol comparison table-pileupdna.cmp;CompCheck-6876;GapWeight-5;GapLengthWeight-1;PileUp MSF-1018;Type-N;Check-3804。同図において、ダッシュは同一のヌクレオチドを意味し、点は配列表を作成するためにソフトウェアによって導入されるギャップを表し、波形符号は遺伝子配列の長さの相違のために配列全体に含まれない領域を表す。
【図７Ａ】ＰｉｌｅＵｐによって作成されＰｒｅｔｔｙ（同上）で表示されたアミノ酸配列順序を示す図である。この配列はS.dysgalactiae(DysGapC、Check 6731)、S.agalactiae(AgalGapC、 Check 1229)、S.uberis(UberGapC、Check 8229)、S.parauberis(PUberGapC、Check 8889)及びS.iniae(IniaeGapC、Check 8785)から導かれたＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列を表す。S.equisimilis(SeqGapC、Check 8252)、化膿連鎖球菌(SpyGapC、Check 6626)及びウシのＧＡＰＤＨタンパク質(BovGapC、Check 8479)の既知の配列も含まれる。同図において、ダッシュは同一のアミノ酸残基を意味し、点はＰｉｌｅＵｐソフトウェアによって導入されるギャップを表し、波形符号は遺伝子配列の長さの相違のために配列全体に含まれない領域を表す。
【図７Ｂ】ＰｉｌｅＵｐによって作成されＰｒｅｔｔｙ（同上）で表示されたアミノ酸配列順序を示す図である。この配列はS.dysgalactiae(DysGapC、Check 6731)、S.agalactiae(AgalGapC、 Check 1229)、S.uberis(UberGapC、Check 8229)、S.parauberis(PUberGapC、Check 8889)及びS.iniae(IniaeGapC、Check 8785)から導かれたＧａｐＣタンパク質のアミノ酸配列を表す。S.equisimilis(SeqGapC、Check 8252)、化膿連鎖球菌(SpyGapC、Check 6626)及びウシのＧＡＰＤＨタンパク質(BovGapC、Check 8479)の既知の配列も含まれる。同図において、ダッシュは同一のアミノ酸残基を意味し、点はＰｉｌｅＵｐソフトウェアによって導入されるギャップを表し、波形符号は遺伝子配列の長さの相違のために配列全体に含まれない領域を表す。
【図８】S.dysgalactiaeから単離されたＧａｐＣタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシープロット（７のウィンドウで平均）、Ｅｍｉｎｉ表面確率プロット、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ鎖屈折プロット、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数プロット並びにＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎの両方の二次構造プロットを示す図である。
【図９】S.agalactiaeから単離されたＧａｐＣタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシープロット（７のウィンドウで平均）、Ｅｍｉｎｉ表面確率プロット、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ鎖屈折プロット、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数プロット並びにＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎの両方の二次構造プロットを示す図である。
【図１０】S.uberisから単離されたＧａｐＣタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシープロット（７のウィンドウで平均）、Ｅｍｉｎｉ表面確率プロット、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ鎖屈折プロット、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数プロット並びにＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎの両方の二次構造プロットを示す図である。
【図１１】S.parauberisから単離されたＧａｐＣタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシープロット（７のウィンドウで平均）、Ｅｍｉｎｉ表面確率プロット、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ鎖屈折プロット、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数プロット並びにＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎの両方の二次構造プロットを示す図である。
【図１２】S.iniaeから単離されたＧａｐＣタンパク質のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシープロット（７のウィンドウで平均）、Ｅｍｉｎｉ表面確率プロット、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ鎖屈折プロット、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数プロット並びにＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎの両方の二次構造プロットを示す図である。
【図１３】S.dysgalから単離されたＧａｐＣタンパク質のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ二次構造プロットを図示した図である。
【図１４】S.agalactiaeから単離されたＧａｐＣタンパク質のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ二次構造プロットを図示した図である。
【図１５】S.uberisから単離されたＧａｐＣタンパク質のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ二次構造プロットを図示した図である。
【図１６】S.parauberisから単離されたＧａｐＣタンパク質のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ二次構造プロットを図示した図である。
【図１７】S.iniaeから単離されたＧａｐＣタンパク質のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ二次構造プロットを図示した図である。
【図１８】大腸菌ＤＥ３で生成された組換えS.dysgalactiaeのＧａｐＣのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。レーン１、分子量マーカー（２０．５〜１０３ｋＤａ；ＢｉｏＲａｄ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）；レーン２、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製された組換えS.dysgalactiaeの可溶性ＧａｐＣ。図の左の数字は分子量マーカーの位置を示す（単位：ｋＤａ）。
【図１９】手つかずのS.dysgalactiae細胞と結合したウシのプラスミン、組換えS.dysgalactiaeのアフィニティー精製ＧａｐＣタンパク質と結合したウシのプラスミン、手つかずのS.dysgalactiae細胞単独、組換えS.dysgalactiaeのアフィニティー精製ＧａｐＣタンパク質単独、及びウシのプラスミン単独の酵素活性を比較した柱状グラフである。活性は、合成基質ｃｈｒｏｍｏｚｉｎｅ−ＰＬ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｌａｖａｌ、ケベック、カナダ）からのparanitroanalideの放出後の４０５ｎｍにおける吸光度の上昇で測定された。データは、個々の３つのアッセイの平均を表す。
【図２０】以下の３実験群における、７日間にＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅに感染させた乳房区の割合の変化を比較した図である。（１）ワクチン接種をしない対照動物群。（２）Ｍｉｇ  Ｆｃ結合タンパク質でワクチン接種された動物群。（３）ＧａｐＣでワクチン接種された動物。感染は、泌乳１ｍｌにつきS.dysgalactiaeが＞５００ｃｆｕ回収されるときと定義された。
【図２１】いかなる乳房区におけるＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅの最大数を血清抗ＧａｐＣ抗体価（バックグラウンドレベルより上の活性を示す希釈倍率の逆数で表されている）に対してプロットした図である。血清抗ＧａｐＣタイターは、GraphPad Software、Inc、サンディエゴ、ＣＡ、のGraphPad PrismソフトウェアＶｅｒ．２．０１を使用して解析されたように、乳腺から回収された最大ｃｆｕ／ｍｌ値と相関する（Ｒ＝０．７４）ことが示された。
【図２２】感染させた乳房区の累積数を血清抗体価（バックグラウンドレベルより上の活性を示す希釈倍率の逆数で表されている）に対してプロットした図である。抗ＧａｐＣ抗体血清抗体レベルと感染させた乳房区の合計数との間に高い相関が観察された。
【図２３】ＧａｐＣで免疫化した動物からの細菌回収を例示した図である。データポイントは、平均細菌回収数／乳汁１ｍｌ対時間（感染後日数）でプロットされている。同図において、ダイヤモンド（−◆−）は非ワクチン接種動物を表し、正方形（−■−）は低タイターの動物（即ち、ＧａｐＣに対して抗体価に関して低い応答を示す動物）を表し、三角形（−△−）は高タイター動物（即ち、残りの動物）を表す。
【図２４】ＧａｐＣで免疫化した動物からのＳ.dysgalactiaeの回収を示した図で、乳房区感染率対感染後日数で表される時間でプロットされている。同図において、点バーは非ワクチン接種動物を表し、クロスハッチバーは低タイターの動物（即ち、ＧａｐＣに対して抗体価に関して低い応答を示す動物）を表し、ブランクバーは高タイター動物（即ち、残りの動物）を表す。
【図２５】観察されたS.dysgalactiaｅ感染に対する炎症性反応を表す図で、各実験群における平均体細胞数（ＳＣＣ）対感染後日数でプロットされている。同図において、ダイヤモンド（−◆−）は感染させない、非ワクチン接種動物を表し、正方形（−■−）は感染させた、非ワクチン接種動物を表し、三角形（−△−）は感染させた、Ｍｉｇワクチン接種動物を表し、ｘ（−ｘ−）は感染させたＧａｐＣワクチン接種動物を表す。
【図２６】感染後１日目の１乳房区あたりの体細胞数を例示する図である。同図において、バーは各群の平均を表す。正方形（−■−）は非ワクチン接種動物を表し、三角形（−▲−）はＧａｐＣワクチン接種動物を表し、逆三角形（−▼−）はＭｉｇワクチン接種動物を表す。
【図２７】感染後７日間の非ワクチン接種、非感染、及びＧａｐＣ免疫化高タイター動物（即ち、特定群の８動物中最も高い抗体価を示す４動物）の体細胞数を表す図で、平均体細胞数のｌｏｇ１０／１ｍｌ乳汁対感染後日数でプロットされている。ダイヤモンド（−◆−）は感染させない、非ワクチン接種動物を表し、正方形（−■−）は感染させた、非ワクチン接種動物を表し、三角形（−△−）は感染させたＧａｐＣワクチン接種動物を表す。
【図２８】実施例６で記載された牛群におけるS.uberis感染させた乳房区における感染後７日間の幾何平均ＳＣＣ（プラス１標準偏差）を示す図である。データセットは、０日後（左端のバー）、１日後（左から２番目のバー）、２日後（左から３番目のバー）、３日後（左からの４番目のバー）、４日後（左から５番目のバー）、５日後（左から６番目のバー）、６日後（左から７番目のバー）及び７日後（左から８番目のバー）に対応する。図の外観にもかかわらず、S.dysgalactiaeの（６×Ｈｉｓ）ＧａｐＣでワクチン接種した動物の７日後及び８日後のＳＣＣ、並びにＣＡＭＰ−３ワクチン接種動物の感染後４日後及び５日後のＳＣＣは、対照群のそれらと統計学的に有意に異ならなかった。
【図２９】ＬｉｐｏＦ：ＣＡＭＰ３キメラのヌクレオチド及びアミノ酸の配列を表す図である（配列番号１３及び１４）。ＬｉｐｏＦシグナル配列と融合したＣＡＭＰ−３キメラのヌクレオチド及びタンパク質の配列が示されている。ヌクレオチド番号は図の左の数字で示され、アミノ酸残基の番号は右に示されている。下線を引いた配列は、ＬｉｐｏＦシグナル配列を表す。スペーサーアミノ酸は、８７、１４５及び１４６の位置に見られる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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