(57)【要約】個体の疾病状態の処置において、Ａ３アデノシンレセプター（Ａ３ＡＲ）と相互作用する投与薬剤の有効性をモニタするための方法を提供する。生物学的マーカーの少なくとも１つのパラメータのレベルを測定し、処置前の個体におけるパラメータのレベル、または疾病状態を有する未処置の対照被験者におけるパラメータのレベルのいずれかとして測定される、処置を伴わないパラメータのレベルである対照レベルと比較した。対照に対するこれらのパラメータにおける変化のモニタは、Ａ３ＡＲと相互作用する、疾病状態の処置に使用され得るような、スクリーニング薬剤として使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における疾病状態の処置において、Ａ３アデノシンレセプター（Ａ３ＡＲ）と相互作用する投与薬剤の有効性をモニタする方法であって、前記方法は、
（ｉ）薬剤が、疾病状態に関連する個体における細胞に到達し、且つ作用することを可能にするように選択された、個体への薬剤の投与後の、定められた時点において、から前記、または前記細胞を含む組織のサンプルを取り出すこと、
（ｉｉ）前記細胞における、Ａ３ＡＲ、またはＡ３ＡＲシグナル伝達経路に関連し、Ａ３ＡＲの下流にある要素であるところの少なくとも１つの生物学的マーカーの少なくとも１つの生理学的パラメータのレベルを検出すること、及び
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのパラメータのレベルを、前記薬剤の投与前の同一の個体に由来する細胞または組織におけるレベルであるか、または未処置の疾病状態を示す前記マーカーに対する標準対照であるところの対照レベルを比較すること
を包含し、対照との生理学的パラメータのレベルの差異は、これらの状態に対する前記処置の有効性を示すものである方法。
【請求項２】
前記Ａ３ＡＲと相互作用する前記薬剤が、Ａ３ＡＲアゴニストである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ａ３ＡＲシグナル伝達経路が、Ｗｎｔ経路である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記要素が、ＰＫＡ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＧＳＫ−３β、β−カテニン、サイクリンＤ１、ｃ−ｍｙｃから選択される少なくとも１つの要素である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ａ３ＡＲシグナル伝達経路が、ＮＦ−κＢ経路である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記要素が、ＮＦ−κＢ、ＰＩ３Ｋ、ＩＫＫ、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１から選択される少なくとも１つの要素である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生理学的パラメータが、ｍＲＮＡまたはタンパク発現のレベル、リン酸化のレベル及び細胞局在である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記疾病状態が、増殖関連疾病である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記疾病が、ガンである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ガンが、黒色腫、結腸ガン、または前立腺ガンである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾病が、炎症性疾病である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）Ａ３ＡＲ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＰＫＡ、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、及びＮＦ−κＢ、ＴＮＦ−αのうちの少なくとも１つのタンパクレベル若しくはそれらをコードしているｍＲＮＡレベルの低下、またはＧＳＫ−３βのタンパクレベルもしくはそれをコードしているｍＲＮＡの上昇、
（ｂ）ＧＳＫ−３βのリン酸化レベルの低下、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＰＫＡ、またはベータ−カテニンのリン酸化レベルの上昇から選択されるリン酸化レベルにおける少なくとも１つの変化、
（ｃ）対照と比較して細胞膜におけるＡ３ＡＲレセプターの局在の低下、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニンまたはＮＦ−カッパＢの局在の低下から選択される細胞局在における少なくとも１つの変化
から選択される生物学的マーカーの生理学的パラメータの変化により、前記疾病に対する有効な処置が示される請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾病状態が、高められた増殖により有益な治療学的効果が明らかである疾病または状態である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾病状態が、化学療法または放射線治療の結果としての白血球のカウント、特に好中球の減少である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）Ａ３ＡＲ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＰＫＡ、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ＮＦ−κＢのうちの少なくとも１つのタンパクレベル若しくはそれらをコードしているｍＲＮのレベルの上昇、またはＧＳＫ−３βのタンパクレベル若しくはｍＲＮＡレベルの低下、
（ｂ）ＧＳＫ−３βのリン酸化レベルの上昇、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＰＫＡのリン酸化レベルまたはベータ−カテニンのリン酸化レベルの低下から選択されるリン酸化レベルにおける少なくとも１つの変化、
（ｃ）対照と比較して細胞膜におけるＡ３ＡＲレセプターの局在の上昇、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニンの局在の上昇から選択される細胞局在における少なくとも１つの変化
から選択される生物学的マーカーの生理学的パラメータの変化により、前記疾病に対する有効な処置が示される請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの生物学的マーカーの前記少なくとも１つの生理学的パラメータのレベルが、処置された被験者における前記パラメータのレベルと未処置の対照における前記パラメータのレベル間での差異が最も顕著であると予測される、薬剤の投与後の時点で測定される請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ａ３ＡＲアゴニストが、１−デオキシ−１−［６［［（３−ヨードフェニル）メチル］アミノ］−９Ｈ−プリン−９−イル］−Ｎ−メチル−β−Ｄ−リボフラ−ニューロンアミンド（nuronaminde）（ＩＢ−ＭＥＣＡ）である請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
薬候補が、疾病細胞中で示される疾病状態の処置に有用なＡ３ＡＲアゴニストであるか否かを決定する方法であって、前記方法は、
（ｉ）前記疾病細胞または前記細胞を含む組織のサンプルを得ること、
（ｉｉ）前記サンプルを前記薬候補に接触させること、
（ｉｉｉ）前記細胞における、Ａ３ＡＲ、またはＡ３ＡＲの下流にある、Ａ３ＡＲシグナル伝達経路に関連する要素であるところの少なくとも１つの生物学的マーカーの少なくとも１つの生理学的パラメータのレベルを検出すること、及び
（ｉｖ）前記少なくとも１つのパラメータのレベルと、前記薬候補と接触させていない未処置のサンプルにおけるそのレベルを比較すること
を包含し、処置されたサンプルと未処置のサンプル間の、生理学的パラメータのレベルの差異が、薬候補がＡ３ＡＲのアゴニストであることを示す方法。
【請求項１９】
薬候補が、疾病細胞中で示される疾病状態の処置に有用なＡ３ＡＲアゴニストであるか否かを決定する方法であって、前記方法は、
（ｉ）前記薬候補を、前記疾病状態を有する被験者に投与すること、
（ｉｉ）投与に続く、１以上の定められた時点において、前記被験者から前記疾病細胞または前記細胞を含む組織のサンプルを取り出すこと、
（ｉｉｉ）前記細胞における、Ａ３ＡＲ、またはＡ３ＡＲの下流にある、Ａ３ＡＲシグナル伝達経路に関連する要素であるところの少なくとも１つの生物学的マーカーの少なくとも１つの生理学的パラメータのレベルを検出すること、及び
（ｉｖ）前記少なくとも１つのパラメータのレベルを、前記薬候補を投与されていない被験者から取り出された疾病細胞におけるレベルと比較すること
を包含し、処理されたサンプルと未処理のサンプル間の前記生理学的パラメータのレベルの差異が、前記薬候補がＡ３ＡＲのアゴニストであることを示す方法。
【請求項２０】
前記Ａ３ＡＲシグナル伝達経路が、Ｗｎｔ経路である請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記要素が、ＰＫＡ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＧＳＫ−３β、β−カテニン、サイクリンＤ１、ｃ−ｍｙｃから選択される少なくとも１つの要素である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ａ３ＡＲシグナル伝達経路が、ＮＦ−κＢ経路である請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記要素が、ＮＦ−κＢ、ＰＩ３Ｋ、ＩＫＫ、ＴＮＦ−α、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１から選択される少なくとも１つの要素である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生理学的パラメータが、ｍＲＮＡまたはタンパク発現のレベル、リン酸化のレベル及び細胞局在から選択される請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾病状態が、増殖関連疾病である請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、診断の分野、特に疾病状態に関連し、及び治療学的処置に関連する生物学的マーカーに関する。
【０００２】
先行技術
以下は、本発明の分野における技術の情勢の記載に関係すると考えられる先行技術のリストである。本明細書中でのこれらの文献の確認は、下のリストの括弧内の数字を示すことにより成される。
【０００３】
（１）Olah M.E. 及び Stiles G.L.  The role of receptor structure in determining adenosine receptor activity, Pharmacol.There., 85:55-75(2000)；
（２）Poulsen S.A. 及び Quinn R.J., Adenosine receptors : new opportunities for future drugs. Bioorg. Med. Chem., 6:619-641(1998)；
（３）Frang X 等 Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3 by protein kinase A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:11960-11965(2000)；
（４）Fishman, P.,等 Involvement of Wnt Signaling Pathway in IB-MECA Mediated Suppression of Melanoma Cells, Oncogene 21:4060-4064(2002)；
（５）Ferkey, D.M.,及び Kimelman. D. GSK-3: New Thoughts on an Old Enzyme, Dev. Biol.,225:471-479(2000)；
（６）Bonvini, P.,等 Nuclear beta-catenin displays GSK-3beta- and APC-independent proteasome sensitivity in melanoma cells, Biochim. Biophys. Acta., 1495:308-318(2000)；
（７）Olah, M.E. 及び Stiles, G.L, The role of receptor structure in determining adenosine receptor activity, Pharmacol. Ther., 85:55-75(2000)。
【０００４】
発明の背景
Ａ３アデノシンレセプターは、Ｇｉタンパク関連細胞表面レセプターのファミリーに属する。レセプターの活性化は、その内部移行と、続くアデニル酸シクラーゼ活性、ｃＡＭＰ形成、及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）発現の阻害をもたらし、種々のシグナル伝達経路の開始をもたらす（１、２）。ＰＫＡは、ｃＡＭＰを用いる活性化により親分子から解離する触媒サブユニットＰＫＡｃを含有する。近年の研究は、ＰＫＡｃはＧＳＫ−３βをリン酸化し、且つ不活化することを証明している（３）。
【０００５】
近年、Ａ３ＡＲに対する安定アゴニストである１−デオキシ−［６［［（３−ヨードフェニル）メチル］アミノ］−９Ｈ−プリン−９−イル］−Ｎ−メチル−β−Ｄ−リボフラ−ニューロンアミンド（nuronaminde）（ＩＢ−ＭＥＣＡ）が、Ｗｎｔシグナル伝達経路の鍵成分であるＧＳＫ−３β及びβ−カテニンの発現を変化させることが示されている。結果的に、それは細胞周期進行遺伝子であるｃ−ｍｙｃ及びサイクリンＤ１の発現の抑制をもたらす（４）（Ａ１０における本発明者の補正を参照されたい）。
【０００６】
発明の概要
本発明は、Ａ３アデノシンレセプター（Ａ３ＡＲ）のアゴニストが、細胞マーカーの、その発現レベル、リン酸化、及びその細胞局在を含む種々の特性を変化させるという発見に基づく。従って、多くの生物学的マーカーの発現、リン酸化、または局在の変化をモニタすることにより、Ａ３ＡＲモジュレータによる治療学的処置の成功を評価、またはモニタすることが可能である。
【０００７】
すなわち、本発明は、処置前の個体におけるパラメータのレベルか、疾病状態を有する未処置の対照被験者のパラメータのレベルのいずれかとして決定される、処置を伴わないパラメータのレベルである対照レベルと比較した、生物学的マーカーの少なくとも１つのパラメータのレベルを連続的に、または１以上の予め定めた時点でモニタすることにより、個体の疾病状態の処置におけるＡ３ＡＲと相互作用する投与薬剤の有効性をモニタする方法に関する。本処置は、個体への、Ａ３ＡＲと相互作用する薬剤の投与から成る。本方法は、
（ｉ）個体への薬剤の投与後に、個体から、疾病状態に関連する細胞または上記細胞を含有する組織のサンプルを、薬剤が上記細胞に到達し、及び作用することを可能にするように選択される時点である予め定めた時点において取り出すこと；
（ｉｉ）上記細胞における、Ａ３ＡＲ、またはＡ３ＡＲシグナル伝達経路と関連しＡ３ＡＲの下流にある要素であるところの少なくとも１つの生物学的マーカーの少なくとも１つの生理学的パラメータのレベルを検出すること；
（ｉｉｉ）上記少なくとも１つのパラメータのレベルと、上記薬剤の投与前の同一の個体に由来する細胞または組織における上記レベルであるか、または未処置の疾病状態を示す上記マーカーに対する標準対象であるところの対照レベルとを比較すること
を含み、ここで、処置された細胞と対照間の生理学的パラメータのレベルにおける差異は、疾病状態の上記処置の有効性を示すものである。
【０００８】
薬剤は、Ａ３ＡＲに対しアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果を及ぼす１以上の薬であり得る。ＩＢ−ＭＥＣＡ、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ等のようなＡ３ＡＲアゴニストである薬剤が、本発明の好ましい態様である。薬剤は、典型的に、Ａ３ＡＲに対するアゴニスト効果、またはアンタゴニスト効果を有する単一の薬であるが、時として、例えば、アゴニストとモジュレータのように、組み合わせて投与される２以上の薬から成り得る。
【０００９】
本発明によれば、「生物学的マーカー」または簡潔に「マーカー」という語は、その最も広い意味で、限られないが、アミノ酸含有化合物（例えば、タンパク、ポリペプチド、またはペプチド）、核酸化合物（例えば、ｍＲＮＡ）、細胞から出されるまたは分泌される、疾病細胞の表面に存在する（例えば、細胞表面レセプター、細胞表面糖タンパク等）か、または細胞内に存在する（例えば、キナーゼ）細胞代謝物質を含む、いずれもの内在性の細胞関連物質を指すと解釈されるべきである。特に、生物学的マーカーは、Ａ３ＡＲのシグナル伝達経路と関連するマーカー、すなわち、Ａ３ＡＲにより媒介されるシグナル伝達と関連することが知られた、または実験的に見出された要素である。例は、ＰＫＡ、ＰＫＢ、ＧＳＫ−３β、β−カテニン、サイクリンＤ１、及びｃ−ｍｙｃを含むＷｎｔシグナル伝達経路の要素、並びにＰＩ３Ｋ、ＩＫＫ、ＩＫＢ、ＮＦ−κＢ、及びＴＮＦ−α等のＮＦ−κＢシグナル伝達経路の要素である。
【００１０】
「生理学的パラメータのレベル」という語は、以下のうちの１つを指す。
【００１１】
（１）生物学的マーカーのタンパク、またはタンパクフラグメントの量により決定される、または生物学的マーカーのｍＲＮＡの量により決定される生物学的マーカーの発現のレベル。このパラメータは、全てのマーカー、すなわち、Ａ３ＡＲ、ＰＫＡ、ＰＫＢ、ＧＳＫ−３β、ＮＦ−κＢ、ＩＫＫ、ＰＩ３Ｋ、ＩＫＫ、サイクリンＤ１、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ、ＴＮＦ−α等のような、Ｗｎｔ及び／またはＮＦ−κＢ経路に関するマーカーに関連する。
【００１２】
（２）生物学的マーカーのリン酸化レベル。このパラメータは、ＰＫＢ、ＰＫＡに、並びに特にＧＳＫ−３β及びβ−カテニンに関連する。
【００１３】
（３）生物学的マーカーの細胞局在、例えば、細胞膜対細胞質ゾル（Ａ３ＡＲについて）、細胞質ゾル対核（β−カテニン、ＮＦ−κＢ）における局在。
【００１４】
生物学的マーカーの発現のレベルの検出は、細胞質ゾル若しくは膜のいずれかでの細胞内のタンパク、またはタンパクのフラグメントの存在を検出するための、従来技術において知られている任意の手法により、及び細胞質ゾル若しくは膜のいずれかでの細胞内の、または細胞の任意の細胞間成分におけるタンパク、またはタンパクのフラグメントの存在を検出するための、従来技術において知られている任意の手法を用いるｍＲＮＡの検出のための手法により、及び細胞の任意の成分におけるｍＲＮＡレベルの検出のための手法により行われる。
【００１５】
タンパクのレベルを検出するための方法は、例えば通常技術の溶解、消化、分離、分取、及び精製手法を用いることによる、細胞のタンパク内容物の抽出、または細胞の膜からの、若しくは細胞質ゾルからのタンパクのフラグメントの抽出、並びにウエスタンブロット上での細胞のタンパク内容物（未精製内容物または精製された内容物のいずれか）の分離、その後の、従来技術において知られている種々の同定手法によるタンパクまたはタンパクフラグメントの検出を包含し得る。例えば、ゲル上に分離された内容物は、タンパク同定手法と共に適切な分子量マーカーを用いることにより、または適切な検出部位（標識された抗体、標識されたラクチン、標識された結合剤（アゴニスト、アンタゴニスト、基質、補助因子、ＡＴＰ等）を用いることにより同定され得る。検出は、インサイチュ、すなわち、全組織サンプル中で、損傷を受けていない細胞内または組織内に存在する生物学的マーカーに、特異的な認識剤を結合させることによるものであり得る（本発明に関しては、特にＡ３ＡＲのレベルの測定に関して適切である）。このような特異的な認識剤は、標識されたＩＢ−ＭＥＣＡのような標識されたＡ３ＡＲアゴニスト、標識されたＭＲＳ１５２３のような標識されたＡ３ＡＲアンタゴニスト、Ａ３ＡＲに対する抗体であり得る。標識された認識部位の存在は、ラベルの性質に適した手法を用いて検出され得る。認識剤が、蛍光標識されている場合、検出は、共焦点顕微鏡を用いて（膜に）結合したラベルのレベルを直接的に見ることにより行われ得る。認識剤が標識されている、例えば、放射標識されている場合、レベルは、細胞内の放射標識レベルの決定により測定され得る。
【００１６】
発現レベルの測定は、ｍＲＮＡレベルの測定でもあり得、例えば、検出は、検出可能なプローブ、例えば検出可能な部位（蛍光、放射性、色素胞部位等）を含む相補的な配列とのインサイチュハイブリッド形成を用いることによる等の、細胞含有サンプルにおけるＲＮＡ検出のための従来技術において用いられる任意の方法であり得る。インサイチュハイブリッド形成のような場合において、細胞からＲＮＡを抽出する必要は全くなく、必要とされることは、細胞を多孔性にする処置のみである。しかしながら、微量のＲＮＡを検出するに十分感度の高い種々の増幅方法も好ましい。このような方法は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュＰＣＲ、インサイチュＲＴ−ＰＣＲ（上記の全ては、「ネステッド」ＰＣＲ、及びネステッドＲＴ−ＰＣＲをも指す）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、及び３ＳＲ（自立性配列複製）を含む。好ましい態様によれば、ＲＴ−ＰＣＲ及びネステッドＲＴ−ＰＣＲが用いられる。増幅生成物は、ゲル上で分離し、適した標識されたプローブを用いる検出による等の、従来技術において用いられる方法により確認される。
【００１７】
サンプルは、例えば生検により得られた組織サンプルの膜、組織サンプルから分離された無傷の細胞、または血液、若しくは任意の他の体液中のような循環中に存在する無傷の細胞、パラフィン包埋された組織サンプルを含む被験者から得られた細胞若しくは組織サンプル、細胞質ゾル、細胞膜、核、若しくは任意の他の細胞成分から得られた、抽出されたタンパク、または核若しくは細胞質ゾルから得られたｍＲＮＡであり得る。
【００１８】
生理学的パラメータが、例えば、マーカーのリン酸化レベルである場合、これは、標識された抗チロシン抗体のような、リン酸化された物質に対する標識された抗体、またはリン酸化されたＧＳＫ−３βと結合する能力がある抗体を用いることにより決定され得る。
【００１９】
試験されるパラメータのレベルが、種々の細胞成分における局在である場合、各区画におけるマーカーの量、または種々の成分における量の比率が測定され得る。これは、細胞成分を分離すること（例えば、細胞を溶解し、且つ膜と細胞質ゾルとを別々に得ること）、または細胞質ゾルと核とを別々に得ること、及び上記した方法のいずれか１つ、若しくはタンパク含有量を測定するに用いられる他の方法を用いることにより、各々分離された細胞成分における関連する生物学的マーカーのタンパク含有量を測定することにより行われ得る。
【００２０】
あるいは、Ａ３ＡＲ局在を測定するために、標識されたＡ３ＡＲ結合剤（抗体、アゴニスト、アンタゴニスト）、特に蛍光標識された結合剤を用い、例えば共焦点顕微鏡を用いて、細胞の表面上のＡ３ＡＲの局在をモニタすることが可能である。
【００２１】
一般的に、生理学的パラメータは、対照と比較すると２つの様式のうちの１において変化しうる。すなわち、薬（好ましくはＡ３ＡＲモジュレータ、最も好ましくはＡ３ＡＲアゴニスト）の投与等の処置の結果として、高められた増殖を示す変化（本明細書中では以後「プロ−増殖」とする）、または薬の投与等の処置の結果として、低下した増殖を示す変化（本明細書中では以後「アンチ−増殖」とする）である。
【００２２】
処置のアンチ−増殖効果を示す変化の例：
（１）発現レベルにおいて：Ａ３ＡＲ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＰＫＡ、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ＮＦ−κＢ、若しくはＴＮＦ−αのタンパク若しくはｍＲＮＡ発現の低下、またはＧＳＫ−３βのタンパク若しくはｍＲＮＡレベルの上昇、
（２）リン酸化レベルにおいて：ＧＳＫ−３βのリン酸化レベルの低下、ＰＫＢ／Ａｋｔ及びＰＫＡのリン酸化レベル並びにβ−カテニンのリン酸化レベルの上昇、
（３）局在において：対照と比較して細胞膜におけるＡ３ＡＲレセプターの局在の低下、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニンの局在の低下。細胞質ゲルと比較して核内のＮＦ−κＢの局在の低下。
【００２３】
処置のプロ−増殖効果を示す変化は、
（１）発現レベルにおいて：Ａ３ＡＲ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＰＫＡ、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、及びＮＦ−κＢのタンパクまたはｍＲＮＡ発現の上昇、またはＧＳＫ−３βのタンパクまたはｍＲＮＡ発現レベルの低下、
（２）リン酸化において：ＧＳＫ−３βのリン酸化レベルの上昇、ＰＫＢ／Ａｋｔ及びＰＫＡのリン酸化レベル、並びにβ−カテニンのリン酸化レベルの低下、
（３）局在において：対照と比較して細胞膜内のＡ３ＡＲレセプターの局在の上昇、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニン及びＮＦ−κＢの量の増加
を含む。
【００２４】
低下した増殖を示す変化は、増殖の低下または抑制により治療上有益な効果が明らかであり得る疾病状態の処置のために投与されるＡ３ＡＲモジュレータ、好ましくはＡ３ＡＲアゴニストの有効性を示す。過剰の増殖により典型的に特徴づけられるこのような疾病の例は、限られないが、全てのタイプのガン；特に全てのタイプの固形腫瘍；皮膚増殖性疾病（例えば乾癬）；種々の良性の増殖性疾患；炎症性疾病等を含む。
【００２５】
「固形腫瘍」という語は、ガン、肉腫、腺腫、及び神経細胞の起始部のガン、並びに実際は、造血細胞から生じるものでない全てのタイプのガンを指し、特に、ガン、肉腫、腺腫、肝細胞ガン、肝細胞ガン、胚芽腫、横紋筋肉腫、食道ガン、甲状腺ガン、神経節芽腫、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、ラブドテリオ肉腫（rhabdotheliosarcoma）、結腸ガン、膵臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮ガン、基底細胞ガン、腺ガン、腎細胞ガン、血腫、胆管ガン、黒色腫、絨毛ガン、精上皮腫、胎生期ガン、ウィルムス腫、子宮頚ガン、睾丸腫瘍、胚ガン、小型肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽腫、多発性骨髄腫、直腸ガン、甲状腺ガン、頭頸部ガン、脳腫瘍、末梢神経系ガン、中枢神経系ガン、神経芽腫、子宮内膜ガン、及び上記の転移に関する。本発明に従えば、Ａ３ＡＲの上昇した発現は、原発腫瘍部位のみならず、それらの転移において見受けることができることが明らかにされている。
【００２６】
良性の増殖性疾病は、限定されないが、良性の前立腺過形成（ＢＰＨ）、消化管、子宮等における非腫瘍性ポリープを含む。
【００２７】
炎症性疾病は、限られないが、慢性関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症等を含む。本発明に従えば、その場所にある炎症性細胞は、炎症性細胞の様相を呈し、時として、リンパ節の排出時の炎症性細胞の様相を呈すること、並びにＡ３ＡＲ発現の増加、従って生理学的パラメータの特徴的な変化が、そのような細胞内で見出されることが見出された。
【００２８】
疾病がガンである場合、被験者から得られた細胞は、ガン化されたと疑われる細胞、及び好中球のような特に血球である他の細胞であり得る。ガン化されたと疑われる細胞を、生検、針生検、細針吸引等によるような「疑わしい」細胞を得るための既知の方法により得ることができ、疾病状態であるということの疑いは、種々の画像化（ＮＭＲ、ＭＲ、スキャニング、超音波、メモグラフィック（memographic））、または病理学的な技術によって招かれ得る。血球は、血を抜くことにより単純に得られ得る。
【００２９】
高められた増殖性を示す変化は、治療上有益な効果が、高められた増殖により明らかであり得る疾病または状態の処置のために投与される薬（好ましくは、Ａ３ＡＲモジュレータ、最も好ましくはＡ３ＡＲアゴニスト）の有効性を示す。これらの状態は、典型的に、損傷（傷害、虚血、低酸素）の結果としての通常の細胞死、または有害物質の投与の結果としての通常の細胞死、または化学療法もしくは放射線治療の過程中で施された物質若しくは放射線のような、有毒な処置の結果としての通常の細胞死の状態である。特にこの語は、骨髄保護療法の効果、すなわち化学療法または放射線治療に続く、好中球、及び他の白血球の数の減少の防止に関する。
【００３０】
Ａ３ＡＲと相互作用する薬剤は、Ａ３ＡＲアゴニストまたはＡ３ＡＲアンタゴニストであり、好ましい態様に従えば、Ａ３ＡＲアゴニストである。
【００３１】
「Ａ３ＡＲ関連シグナル伝達経路」という語は、Ａ３ＡＲレセプターによる活性化により開始され、その末端エフェクターの効果により継続する任意の経路に関する。これらのエフェクターは、Ｗｎｔ経路及びＮＦ−κＢ経路の要素を含んでいると今日知られているが、さらなる要素がしばしば発見されており、この語はこのような新しく発見された要素と、新しく発見されたＡ３ＡＲ活性化に関する経路をも包含する。
【００３２】
本発明に従って試験されたサンプルは、処置された被験者から得た細胞サンプル、組織サンプル、または細胞構成成分（例えば、細胞膜または細胞性成分）を指す。１つの態様によると、サンプルは、疾病を示すと知られている細胞であって、例えば、疾病はタイプＸのガンであり、細胞はガン（乳房、結腸、皮膚、肝臓、肺、細胞等）、または上記の転移の組織の細胞である。他の態様によると、サンプルは、例えば好中球である、血液から得られる細胞のような無病の細胞であり得る。
【００３３】
低下した増殖により有効性が示される「疾病状態」は、腫瘍、特に固形腫瘍を含み、固形腫瘍の例は、黒色腫、結腸ガン、前立腺ガン、肝ガン、乳ガン、膵臓ガン、及び乾癬のような皮膚増殖性疾病である。
【００３４】
高められた増殖により有効性が示される疾病状態は、特に、化学療法または放射線治療の結果として、好中球のような白血球の血球カウントが増加する疾病である。
【００３５】
上記の方法の１つの利用に従って、細胞における生物学的マーカーの少なくとも１の生理学的パラメータのレベルのモニタは、疾病状態の治療のための候補者を、Ａ３ＡＲとの相互作用を通してスクリーニングすることにも役立ち得る。特定の例は、ガンまたは炎症性疾病の治療のためのＡ３ＡＲアゴニストである。
【００３６】
例えば、疾病状態、例えば、治療のための目的とする標的であるガンのタイプに由来するガン細胞の特定の系の細胞培養を用いることが可能である。上記生理学的パラメータの１以上の変化の測定は、ガンの処置における薬候補の考えられる使用の指標として役立ち得る。
【００３７】
本発明に従えば、薬投与、及びそれに細胞を曝露することに続いて起こる、Ａ３ＡＲモジュレータ、及び特にＡ３ＡＲアゴニストの投与後の、種々の生物学的マーカーの発現レベルにおける、または細胞局在における、薬が誘発する変動があることが見出された。これは、例えばＡ３ＡＲ−モジュレータ投与の結果として、特定のマーカーのタンパク量が減少した場合、この減少は、Ａ３ＡＲモジュレータ投与後Ｘ分で最も顕著になり得、一方２Ｘ分後には、減少は、顕著さが低下し得、及び３Ｘ分後には減少が再び顕著に成り得る。この変動的な挙動（典型的に洞様毛細血管様のパターン）は、殆どの生物学的マーカーのタンパクレベル、及びＡ３ＡＲレセプターそれ自身の細胞膜上での局在を特徴づける。パラメータのレベルの変化が、対照と比較して最も顕著である投与後のある時間において、本発明の方法を行うことが最も好ましいことは明らかである。
【００３８】
従って、本発明の方法を行う前に、生理学的パラメータの変化が対照と比較して最も顕著である、薬の投与後の最適な時間を確立するために、予備的な測定を行うことが重要であり得る。これは、薬を投与すること、及び生理学的パラメータ（インビトロ、インビボ、最も好ましくは投与後の多数の異なる時間においてサンプルが得られる多くの被験者  における変動をモニターすること、及び処置されたサンプル（細胞、組織等）におけるパラメータ間の差異が、未処置の対照と比較して最も大きい期間を測定のための時間として選ぶことにより達成され得る。
【００３９】
本発明を理解し、及びどのように実際に行われたのかを確認するために、好ましい態様を、限定されない例としてのみ、添付の図面と参照しながらここに記載する。
【００４０】
発明の詳細な記述
本発明は、Ａ３ＡＲとＷｎｔシグナル伝達経路及びＮＦ−κＢシグナル伝達経路間のクロストークが存在するという発見に基づく。Ａ３ＡＲ活性化は、ＰＫＡ及びＰＫＢ／ａｋｔを抑制し、それによりＧＳＫ−３βをその活性非リン酸化型に保つことが、細胞内で見出された（４）。活性（非リン酸化）ＧＳＫ−３βは、β−カテニンをリン酸化及び不活化し、核へのその移動を排除し、結果としてｃ−ｍｙｃ及びサイクリンＤ１のダウンレギュレーションを誘発し（５）、細胞の低下した増殖をもたらすことが示された。
【００４１】
ＮＦ−κＢ経路において、ＰＫＢ／ＡＫＴレベルの低下は、ＩＫＫ及びＮＦ−κＢのダウンレギュレーション、これは後者の、そのＩＫＢとの錯体からの放出及びその核への移行を妨げるが、をもたらし、従って、核へのＮＦ−κＢのトランスロケーションを防止し、サイクリンＤ１およびｃ−ｍｙｃの転写の低下した誘発を招き、増殖の低下をもたらす。ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ−αの転写因子でもあり、従って、ＮＦ−κＢのダウンレギュレーションは、このサイトカインのダウンレギュレーションをももたらす。
【００４２】
例えば黒色腫、結腸ガン、前立腺ガンを含む腫瘍、及び他の腫瘍細胞におけるような増殖性の疾病において、未処置の事のなりゆきは、リン酸化されたＧＳＫ−３βが、β−カテニンをリン酸化できずに、従ってこれは細胞質ゾル中に蓄積することを含むプロ−増殖方向における生物学的マーカーの生理学的パラメータにおける変化により明らかにされる。その後、核に転移し、サイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃの転写を誘発し、細胞周期進行をもたらす（６〜７）。生物学的マーカーの生理学的パラメータのレベルの以下の変化の測定によりモニタされる、好結果のアンチ−増殖処置は、アンチ−増殖方向への生物学的マーカーの生理学的パラメータの変化である。
【００４３】
いくつかの自己免疫炎症性疾患において、レセプターに対するアゴニストを用いたＡ３ＡＲの活性化は、ＰＩ３Ｋ及びＰＫＢ／Ａｋｔの抑制を誘発し、アポトーシス、及びＴＮＦ−αの生成の阻害をもたらす。従って、これら３つのタンパクのレベルをモニタすることは、Ａ３ＡＲアゴニストの抗炎症性効果を判断する手段を提供し得る。
【００４４】
以下は、ガンのように、低下した増殖により有益な効果が明らかである、疾病の好結果な処置を示す生理学的パラメータの変化である。すなわち、
（１）発現レベルにおいて：Ａ３ＡＲ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＰＫＡ、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、ＰＩ３Ｋ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢ、若しくはＴＮＦ−αのタンパクまたはｍＲＮＡ発現の低下、またはＧＳＫ−３βのタンパク若しくはｍＲＮＡレベルの上昇、
（２）リン酸化レベルにおいて：ＧＳＫ−３βのリン酸化レベルの低下、ＰＫＢ／Ａｋｔ及びＰＫＡ及びベータ−カテニンのリン酸化レベルの上昇、
（３）局在において：対照と比較して、細胞膜におけるＡ３ＡＲレセプターの局在の低下、細胞質ゾルと比較して、核内におけるβ−カテニン及びＮＦ−カッパＢの局在の低下。
【００４５】
以下は、化学療法または放射線治療に続く白血球の増殖の上昇のように、増殖の上昇により治療上の有益な効果が明らかであり得る、疾病及び状態の好結果な処置の指標である生物学的マーカーの生理学的パラメータの変化である。すなわち、
（１）発現レベルにおいて：Ａ３ＡＲ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＰＫＡ、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、及びＮＦ−κＢのタンパク若しくはｍＲＮＡ発現の上昇、またはＧＳＫ−３βのタンパク若しくはｍＲＮＡ発現レベルの低下、
（２）リン酸化において：ＧＳＫ−３βのリン酸化レベルの上昇、ＰＫＢ／Ａｋｔ及びＰＫＡ及びベータ−カテニンのリン酸化レベルの低下、
（３）局在において：対照と比較して細胞膜におけるＡ３ＡＲレセプターの局在の上昇、細胞質ゾルと比較して核内のβ−カテニン及びＮＦ−カッパＢの量の増加。
【００４６】
具体例
Ａ．材料と方法
マウス、及びヒトＡ３ＡＲ、ＰＫＡｃ、ｃ−ｍｙｃ、及びＧＳＫ−３βに対するウサギ多クローン性抗体を、米国、カリフォルニアのSanta Cruz Biotechnology社から購入した。
【００４７】
マウス及びヒトサイクリンＤ１に対するウサギ多クローン性抗体（ニューヨーク州北部）、Ａ２Ｂアデノシンレセプター、Ｃｙ３結合抗ヤギＩｇＧ、及びフルオレセイン結合抗ウサギＩｇＧを、カリフォルニアのChemicon社から購入した。
【００４８】
シクロヘキシミド及びフォルスコリンをセントルイスのSigma社から入手し、８−Ｂｒ  ｃＡＭＰ及びＭＧ１３２をカリフォルニアのCalbiochem社から入手した。
【００４９】
２ヶ月で、平均２５ｇの重さがあるオスＩＣＲマウス、及びＮｕｄｅ／ＢａｌｂＣオス１０週マウス（Harlan Laboratories社、エルサレム、イスラエル）、並びにウサギ（Harlan Laboratories社、エルサレム、イスラエル）を、以下の実験において用いた。標準ペレット飼料及び水道水を与えた。
【００５０】
実験を、イスラエル、ペターティクヴァのRabin Medical Centerにおける、Institutional Animal Care and Use Committeeにより確立されたガイドラインに従って行った。
【００５１】
Ｂ．免疫染色及び共焦点顕微鏡検査
Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を、Ｐｌｏｙ−Ｌ−リシン（５００μｇ／ｍｌ）でコーティングされたカバーガラス上で２４時間増殖した。細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒド中に、１時間（ｈ）、室温で固定した。固定した細胞を、ＰＢＳを用いて１分間、３回すすいだ。抗体の非特異的な相互作用を防ぐために、細胞を、ＰＢＳ（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％トリトンＸ−１００）中の４％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）中で３０分間インキュベートした。シングルラベリング実験のために、細胞を、ＰＢＳ（１％ＢＳＡ、１％ＮＧＳ、０．１％トリトンＸ−１００）中での１：１０００希釈におけるＡ３ＡＲに対する１次抗体を用いて、２４時間、４℃でインキュベートした。ダブルラベリング実験のために、Ａ２Ｂアデノシンレセプター（Ａ２ＢＲ）に対する抗体を、１：１０００の希釈で、反応混合物に加えた。ＰＢＳを用いて３分間、３回洗浄した後、細胞を、シングルラベリング実験についてはＣｙ３結合抗ヤギＩｇＧを用いてインキュベートし、及びダブルラベリングについてはフルオレセイン結合抗ウサギＩｇＧの両者を用いてインキュベートした。両抗体をＰＢＳ中で１：２５０に希釈し、暗所で２時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳを用いてさらに３回すすぎ、ＡＭ１００（Chemicon社、カリフォルニア）で封入した。染色した細胞は、共焦点顕微鏡（Zeiss社、Axiovert 100M、Ｃｙ３については５５３で励起及び５６０〜６１５ｎｍで発光、並びにフルオレセインについては、それぞれ４９２で励起及び５２０ｎｍで発光）により可視化された。
【００５２】
Ｃ．ウエスタンブロット分析
Ａ３ＡＲタンパクの発現のレベルを検出するために、ウエスタンブロット分析を行った。細胞を、ＩＢ−ＭＥＣＡ（１０ｎＭ）、ＭＲＳ１５２３（１０ｎＭ）、フォルスコリン（５０ｎＭ）、８  Ｂｒ  ｃＡＭＰ（１００μＭ）、シクロヘキシミド２０μｇ／ｍｌ、またはＭＧ１３２（２０ｎＭ）の存在下及び非存在下で、異なる時間、３７℃でインキュベートした。その後、細胞を氷冷ＰＢＳを用いてすすぎ、氷冷溶解緩衝液（ＴＮＮ緩衝液、５０ｍＭトリス緩衝液  ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＮＰ４０）に移した。Ａ３ＡＲ発現に対するトリプシンの効果を検討する実験において、細胞を、０．５ｍｌの０．２５％トリプシンを用いて、５分間インキュベートした。トリプシン処理された細胞を、氷冷ＰＢＳを用いて再び洗浄し、遠心分離により収集し、及びＴＮＮ緩衝液中での溶解に供した。細胞片を、１０分間、７５００ｘｇでの遠心分離により取り除いた。上澄みをウエスタンブロット分析に用いた。タンパク濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパクアッセイ染色試薬を用いて測定した。サンプルの同量（５０μｇ）を、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、分離したタンパクを、ニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell社、キーン、ニューハンプシャー、米国）上でエレクトロブロットした。膜を、１％ウシ血清アルブミンを用いてブロックし、所望される１次抗体（１：１０００希釈）を用いて、２４時間、４℃でインキュベートした。その後、ブロットを洗浄し、２次抗体を用いて１時間、室温でインキュベートした。バンドを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ色発生キット（Promega社、マディソン、ウィスコンシン、米国）を用いて記録した。異なる形で示されるデータは、少なくとも３つの実験を代表している。
【００５３】
Ｄ．ノザンブロット分析
全ＲＮＡを、Ｔｒｉ−試薬（Sigma社、セントルイス）を用いて、ＩＢ−ＭＥＣＡで処理されたＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞から単離した。その後、サンプルをフェノール：クロロホルム抽出に二度供し、クロロホルムで洗浄した。ＲＮＡをエタノールを用いた洗浄に続き、酢酸ナトリウム／エタノールで沈殿させ、その後変性させ、１．１％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で展開し（レーンにつき２５μｇ）、及びＨｙｂｏｎｄ−Ｎ膜に転写した。Ｋａｔｈｉａ  Ｒａｖｉｄ博士から供給していただいた、マウス（ＴＡＡ３Ｉ．Ｓ）のＡ３ＡＲ  ｃＤＮＡクローン由来の３９０  ｂｐ  ＥｃｏＲＩフラグメントを、ランダムプライム合成により調製した。プローブを、４２℃のハイブリッド形成温度において、５０％のホルムアミドの存在下で、ＲＮＡブロット分析に用いた。
【００５４】
Ｅ．ホルマリン固定した、パラフィン包埋された組織における、無傷のＲＮＡの検出のためのＲＴ−ＰＣＲ
Ｈ＆Ｅにより染色された、スライドガラス上の組織切片（５μｍ厚）を、病理学者により観察した。腫瘍性部位と正常部位を検出し、それぞれを別々に標識した。腫瘍性組織と正常組織を、異なるマイクロ遠心分離チューブに収集した。サンプルを、プロテイナーゼＫを用いて、０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で処理し、ＤＮＡ消化を考慮して３７ＯＣで１時間インキュベートした。細胞溶解物を、デオキシリボヌクレアーゼとプロテイナーゼＫを不活化するために、９５℃に、１５分間加熱した。１４，０００ＲＰＭでの５分間の遠心分離に続き、１７μｌの上澄みをセパレートチューブに移し、４μｌのＲＴ混合物（５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２．５μＭ  ランダム六量体、５Ｕ  ＲＮａｓｉｎ、プラチナＴａｑ（Invitrogene社）を用いた１００Ｕ  スーパースクリプトワンステップＲＴ−ＰＣＲ  を加えた。
【００５５】
ＲＴ反応を、４５℃で４５分間行った。ＰＣＲ反応を、セットＮｏＩについては、増幅のために用いられるプライマーに依存して変化させた。ＲＴは、９９℃まで５分間加熱することを伴い、３０秒間９４℃、４５秒間５９℃、及び４５秒間７３℃の５０サイクルを行った。セットＮｏＩＩについては、アニーリングを５５℃で行った。生成物を、２％アガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウムを用いて染色し、及びＵＶ照明を用いて可視化した。ＲＴ−ＰＣＲ反応の特異性を、標準手法を用いて抽出されたＲＮＡ由来の正の制御と比較するアガロースゲル上のサイズ測定により、及びＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定し、その配列と既知の配列（ＡＤＯＲＡ３−Ｌ７７７２９，Ｌ７７７３０）を比較することにより確認した。
【表１】
2006503564.tif 000002
【００５６】
Ｆ．インビボ実験
マウスを標準ペレット飼料で飼育し、水道水を与えた。実験を、イスラエル、ペターティクヴァの、Rabin Medical CenterにおけるInstitutional Animal Care and Use Committeeにより確立されたガイドラインに従って行った。
【００５７】
黒色腫：２ヶ月で、平均２５ｇの重さのある、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのオスのマウス（Harlan Laboratories、エルサレム、イスラエル）を用いた。Ｂ１６−Ｆ１０（２．５×１０５）黒色腫細胞を、マウスの側腹部に、皮下（ｓ．ｃ．）注入した。１００μｇ／ｋｇ体重の投与量におけるＩＢ−ＭＥＣＡを、毎日１度経口的に投与し、これは腫瘍細胞摂取後２４時間から開始した。対照プローブを、賦形剤のみを用いて、毎日、経口的に処置した。マウスを、１５日後に屠殺し、腫瘍病変部を切除し、タンパクを上記した測定のために抽出した。腫瘍サイズ（幅（Ｗ）及び長さ（Ｌ））を直径で測定し、以下の式に従って計算した。すなわち、腫瘍サイズ＝（Ｗ）２×Ｌ／２である。１５マウスを含むそれぞれのグループ及び実験を３回繰り返した。
【００５８】
結腸ガン：１０週のＮｕｄｅ／ＢａｌｂＣオスのマウスを使用した。ＨＣＴ−１１６ヒト結腸ガン細胞（１００μＬ  ＰＢＳ中１．２×１０６細胞）を、マウスの側腹部に、皮下接種した。腫瘍が、〜１５０ｍｍ３のサイズに到達してから処置を開始した。それぞれのグループは１０マウスを含み、対象グループは、賦形剤のみで処理され、一方で、テストグループには、ＩＢ−ＭＥＣＡ（１０μｇ／ｋｇ）を毎日経口的に投与した。
【００５９】
３２日後、マウスを屠殺し、腫瘍病変部を切除し、タンパクを上述した測定のために抽出した。腫瘍サイズを、直径の幅（Ｗ）及び長さ（Ｌ）を測定することにより求め、上式に従って計算した。
【００６０】
ラットにおけるＡＩＡ：Harlan Laboratories（エルサレム、イスラエル）から入手した、８〜１２週のメスルイスラットに、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と１０ｍｇ／ｍｌの熱死滅させたヒト結核菌（Ｍｔ）Ｈ３７Ｒａ（Difco社、デトロイト、米国）で構成された１００μｌの懸濁液を、尾の付け根に皮下（ＳＣ）注射した。臨床的疾患活動性評価を評価するために、動物を、臨床的関節炎について、一日おきに検査した。評価方法は、各肢０〜４に渡る。すなわち、０−関節炎なし；１−１つの足指／指の関節の赤さ、または腫れ；２−１つを超える足指／指の関節の赤さ、または腫れ、３−足首、及び足根骨−中足骨関節関与。４−全体の足の赤さ、または腫れである。関節炎評価を、１６の最大値にまで、４つの個々の足評価を加えることにより計算した。組織学的評価のために、動物を屠殺し、足を膝レベルにまで取り外し、１０％ホルムアルデヒド中に固定し、脱灰し、脱水し、パラフィン包埋し、４μｍ切片に切断し、ヘマトキシリン−エオシンにより染色した。全ての病理学的発見の評価を、ブラインドで（Ｌ．Ｒ−Ｗ及びＭ．Ｈによる）、以下のパラメータについての０〜４の半定量評価基準を用いて行った。すなわち、ａ）関節組織に対する炎症性細胞湿潤の程度、ｂ）滑膜表層細胞過形成、ｃ）パンヌス形成、ｄ）関節軟骨層破壊、ｅ）０〜５で評価される骨損傷及び侵食評価、すなわち、０−正常；１−いくつかの部位における皮質骨の最小の損失；２−皮質海綿骨（cortical trabecular bone）の軽度の損失；３−多くの部位における骨の中程度の損失；４−多くの部位における骨の顕著な損失；５−炎症性工程での断片化、及び全層穿通または皮質骨におけるパンヌス（１７、１８）を伴う、多くの部位における骨の顕著な喪失である。全ての組織学的パラメータ評価の平均を「組織学評価」と名付けた。ＴＮＦ−αを、対照及びＣＦ１０１処理ラットから得られた滑膜、ＤＬＮ、及び脾臓組織において測定した。ＴＮＦ−αの発現のレベルを検出するために、ＷＢ分析を行った。脾臓及びＤＬＮ単核細胞及び滑膜組織を氷冷ＰＢＳを用いてすすぎ、氷冷溶解緩衝液（ＴＮＮ緩衝液、５０ｍＭ  トリス緩衝液  ｐＨ＝７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＮＰ  ４０  ０．５％、２０分間）に移した。細胞片を１０分間、７５００ｇで遠心分離により除去した。上澄みをＷＢ分析に用いた。タンパク濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパクアッセイ染色試薬を用いて測定した。同量のサンプル（５０μｇ）を、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、分離したタンパクを、ニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell 社、キーン、ニューハンプシャー、米国）上で、エレクトロブロットした。膜を１％ウシ血清アルブミンを用いてブロックし、多クローン性ヤギ抗ラットＴＮＦ−α抗体（１：１０００希釈）（Santa Cruz Biotechnology 社、カルフォルニア、米国）を用いて、２４時間、４０℃でインキュベートした。その後、ブロットを洗浄し、ウサギ抗ヤギ多クローン性抗体を用いて、１時間、室温でインキュベートした。バンドをＢＣＩＰ／ＮＢＴ色発生キット（Promega社、マディソン、ウィスコンシン、米国）を用いて記録した。タンパク発現のデンシトメトリーを、β−アクチンに対し���規準化し、対照の％として表した。
【００６１】
Ｇ．統計分析
結果を、ｐ＜０．０５の統計的有意性で、スチューデントｔ検定を用いて評価した。異なる実験の平均値間の比較を行った。
【００６２】
例１：黒色腫細胞における生物学的マーカー局在の変化のモニタ
レセプター局在を調べるために、共焦点レーザー顕微鏡検査を利用した。未処置の細胞（対照）は、蛍光強度レベル（図１ａ）から確認されるように、細胞表面上でＡ３ＡＲを高く示した。蛍光レベルにおける顕著な低下が、ＩＢ−ＭＥＣＡ処置細胞において、５分後に認められた（図１ｂ）。ＩＢ−ＭＥＣＡの存在下で、黒色腫細胞をＡ３ＡＲアンタゴニストＭＲＳ１５２３に曝露すると、細胞表面の蛍光強度が、対象のそれと類似する結果となった（図１ｃ）。これらのデータは、速いレセプターの内部移行が、ＩＢ−ＭＥＣＡ処置により起こることを示唆する。
【００６３】
Ａ３ＡＲ内部移行の動力学的な時間経過をさらに調査するために、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を、異なる時間、ＩＢ−ＭＥＣＡに曝露し、共焦点顕微鏡検査分析を行った。図２は、数分以内で起こり、６分後に蛍光の消失に至るゆるやかな内部移行速度を示す。黒色腫細胞のＩＢ−ＭＥＣＡへの長い曝露（１５分）は、細胞表面へのレセプター内部移行を生じた。これは、より長いインキュベーション時間（３０及び６０分）後に、内部移行／外部移行を伴う。蛍光レベルが内部移行の結果低下したという観察を確認するために、細胞の光学的区分けを行った（データは示さない）。未処置の細胞（対照）において、レセプターは細胞表面上に示され、ＩＢ−ＭＥＣＡに曝露すると（５分間）細胞質ゾル中に示され、Ａ３ＡＲが膜から細胞質ゾルに転位置するという見解を支持した。１５分、及び６０分の曝露後、レセプターは、細胞質ゾル中及び細胞表面上の双方に見受けられた。６０分のサンプルにおいて、１５分と比較すると、より多くの蛍光が細胞質ゾル中で見受けられた。Ａ３ＡＲ局在の特異性を明らかにするために、Ａ２Ｂアデノシンレセプターのものと比較した。興味深いことに、未処置の細胞において、Ａ３ＡＲが細胞表面上に主に局在した一方で、Ａ２ＢＲは細胞質ゾル中に見受けられた。細胞をＩＢ−ＭＥＣＡに曝露すると、Ａ２ＢＲは、細胞質ゾル中でＡ３ＡＲによりマスクされた。
【００６４】
例２：ＩＢ−ＭＥＣＡ投与黒色腫細胞におけるＡ３ＡＲのＲＮＡ及びタンパク発現レベルにおける変化のモニタ
細胞表面レセプターを取り除くトリプシンを用いて、黒色腫細胞を処置することによるレセプターの内部移行を検討した。未処置の黒色腫細胞は、高いレベルのＡ３ＡＲタンパクを発現し、これはＩＢ−ＭＥＣＡまたはトリプシン処理（図３  レーン１、２、及び３）後にダウンレギュレートした。これは、対照の未処置の腫瘍細胞において、大部分のＡ３ＡＲが細胞表面上に示され、トリプシンによる消化に供されるということを示す。ＩＢ−ＭＥＣＡ＋トリプシン処理細胞（５分間）において、無視できる差異が、トリプシン処理細胞及びトリプシン未処理細胞間で観測され、Ａ３ＡＲアゴニストＩＭ−ＭＥＣＡを用いた処理のために、大部分のＡ３ＡＲが既に内部に取り入れられ（局在変化）、よって消化から保護されたことを証明した（図３、レーン３及び４）。
【００６５】
黒色腫細胞におけるＡ３ＡＲの時間依存的な発現を、ウエスタンブロット分析により検討した。ＩＢ−ＭＥＣＡが誘発する正弦波状パターンのＡ３ＡＲ発現の変化、すなわち、ダンレギュレーション及びアップレギュレーションが、異なる時点で起こった（図４ａ）。本発明の方法を行うための最適の時間を表すこのパターンは、実験的に決定された。
【００６６】
タンパク発現が、分解及び再合成のために変化するか否かを試験するために、細胞をＭＧ１３２（タンパク分解阻害剤）及びシクロヘキシミド（タンパク合成阻害剤）の存在下で、１８０分間、ＩＢ−ＭＥＣＡに曝露した。実際に、ＭＧ１３２は、Ａ３ＡＲのダウンレギュレーションを防止し、シクロヘキシミドは、レセプターの増加を阻害し、内部移行に続き、レセプター分解及び再合成が起こったことを明らかにした（図４ｂ）。さらに、ｍＲＮＡ発現レベルの上昇が観測され、Ａ３ＡＲのデノボ合成が起こったことを示唆した。この反応の特異性は、ｍＲＮＡ発現の増加を逆転させるＭＲＳ１５２３により説明された。
【００６７】
例３：ＩＢ−ＭＥＣＡを用いて処理された、黒色腫接種マウスにおける生物学的マーカーの発現レベルのモニタ
ＩＢ−ＭＥＣＡは、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫腫瘍成長の発達を顕著に抑制した（７６％阻害、ｐ＜０．０００１、図５ａ）。これらマウスから切除された腫瘍病変部において、ウエスタンブロット分析（図５ｂ）は、ＰＫＡ及びＰＫＢ／Ａｋｔの双方のレベルが低下するということを明らかにした。従って、総ＧＳＫ−３βレベルの上昇は、特筆すべきであり、それによって、β−カテニンのレベルの減少へと導かれた。細胞核へのβ−カテニン／Ｌｅｆｌのトランスロケーションに続いて、転写されることが知られているサイクリンＤ１及びｃ−ｍｙｃは、ＩＢ−ＭＥＣＡ処理された黒色腫細胞においてダウンレギュレートされたことが双方とも見出された。
【００６８】
加えて、その活性化が、腫瘍発育において重要な役割を演じる転写因子ＮＦ−κＢのレベルもまた、ダウンレギュレートされた。ハウスキーピングタンパクβ−アクチンのレベルは、変化しなかった（示さない）。
【００６９】
例４：ＩＢ−ＭＥＣＡ処置によるマウスの結腸ガン発育の阻害中での生物学的マーカーの発現レベルのモニタ
ＩＢ−ＭＥＣＡは、ＨＣＴ−１１６ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスの結腸ガン細胞の発育を顕著に抑制した（図５ａ）。ＨＣＴ−１１６ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスから切除した腫瘍病変部において、ウエスタンブロット分析は、Ａ３ＡＲのダウンレギュレーション、ＧＳＫ−３β発現レベルのアップレギュレーション、続くｃ−ｍｙｃ及びサイクリンＤ１のレベルの低下を明らかにした（図５ｂ）。ハウスキーピングタンパクβ−アクチンのレベルは、変化しなかった。
【００７０】
例５：前立腺ガン（ＰＣ−３）における生物学的マーカーの発現の変化のモニタ
ＩＢ−ＭＥＣＡの、前立腺ガン細胞におけるＡ３ＡＲ活性化に対して末端の鍵タンパクに対する効果を、黒色腫細胞を用いて行ったものと同様の方法で検討した（上記参照のこと）。図６は、前立腺ガン細胞から抽出されたタンパクの免疫ブロット分析を示し、Ａ３ＡＲ、ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｃ、及びサイクリンＤ１のダウンレギュレーションが示される。
【００７１】
例６：ＩＭ−ＭＥＣＡ投与の結果としての、結腸ガンにおける生物学的マーカーの発現レベルの変化のモニタ
ＨＣＴ−１１６ヒト結腸ガン細胞におけるＡ３ＡＲ活性化に対して末端の鍵タンパクに対するＩＢ−ＭＥＣＡの効果は、黒色腫細胞を用いて行ったものと同様の方法で検討した（上記参照のこと）。図７は、結腸ガン細胞から得られたタンパク抽出物の免疫ブロット分析を示し、ＩＢ−ＭＥＣＡを用いた処理（右のレーン）は、対照（左のレーン）と比較して、ＰＫＡｃ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ、及びサイクリンＤ１、及びＮＦ−κＢのダウンレギュレーション、並びにＧＳＫ−３β発現レベルのアップレギュレーションを引き起した。これらの結果は、黒色腫及び前立腺ガン細胞により得られ、且つ上に示した結果と一致し、これら制御要素の発現レベルの測定が、疾病状態の生物学的マーカーとして機能し得るという見解を支持する。
【００７２】
その活性化が、腫瘍発育において重要な役割を演じる転写因子ＮＦ−κＢのレベルもまた、ダウンレギュレートされたことは特筆すべきである。
【００７３】
例７：黒色腫細胞におけるＩＢ−ＭＥＣＡ処置によるＡ３ＡＲ活性化に対して末端の鍵タンパクの発現のモニタ
レセプター機能性を試験するために、Ａ３ＡＲ活性化に対して末端で変化されるＰＫＡ及びＧＳＫ−３βのタンパク発現レベルを検討した。ＩＢ−ＭＥＣＡによる機能的レセプター感作が、１５分及び６０分後に観察され、低下したＰＫＡレベル及び上昇したＧＳＫ−３βレベルにより明らかにされた。しかしながら、３０分において、ＰＫＡレベルは安定化し、ＧＳＫ−３βのみがわずかに増加し、レセプターの脱感作／再感作が、アゴニストへの慢性的な曝露により起こったことを示した。この反応の特異性は、Ａ３ＡＲ活性化を相殺することが全て知られている、ＭＲＳ１５２３、フォルスコリン、及び８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを導入することにより示された。実際に、ＰＫＡ及びＧＳＫ−３βに対するＩＢ−ＭＥＣＡの調節効果が、上記した薬剤の存在下では逆転された（図８ａ、８ｂ、及び８ｃ）。
【００７４】
例８：ＩＢ−ＭＥＣＡのマウスにおける結腸ガン発育の阻害、及び生物学的マーカーの発現のダウンレギュレート
ＩＢ−ＭＥＣＡは、ＨＣＴ−１１６ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスにおいて、結腸ガン細胞の発育を顕著に阻害した（図９ａ）。ＨＣＴ−１１６ヒト結腸ガン細胞を接種されたマウスから切除された腫瘍病変部において、ウエスタンブロット分析は、Ａ３ＡＲのダウンレギュレーション、ＧＳＫ−３β発現レベルのアップレギュレーション、続くｃ−ｍｙｃ及びサイクリンＤ１のレベルの低下を明らかにした（図９ｂ）。ハウスキーピングタンパクβ−アクチンのレベルは、変化しなかった（データは示さない）。
【００７５】
例９：臨床的処置における生物学的マーカーの発現レベルのモニタ
以下の検討の目的は、異なる投与量での、ＩＢ−ＭＥＣＡの、新たに診断された結腸直腸ガンを有する個体における、関連する生物学的マーカーの発現プロフィールを変化させる能力を測定することである。被験者は、診断生検において得られた組織に対してＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、治療前に、以下のマーカーのｍＲＮＡのレベルについて試験され得る。
【００７６】
少なくとも１つの、好ましくはいくつかの以下の腫瘍マーカーを測定する。すなわち、Ａ３ＡＲレセプター、ＰＫＡ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＧＳＫ−３β、β−カテニン、サイクリンＤ１、ｃ−ｍｙｃ、ＮＦ−κＢである。
【００７７】
診断された被験者は、悪性である高い可能性を有すると感じられる結腸直腸病変部を有する患者で、ほぼ確実に生検を受け、続いて最終的な手術を受け得る患者を含む。
【００７８】
生検検体は、（結腸鏡検査を通して）被験者から取り出され、上記の生物学的マーカーの試験のために、処置前に、ノザン分離またはＲＴ−ＰＣＲ増幅を受ける。
【００７９】
処置方法：５〜１０人の患者のコホートを、段階的に増やしていくＩＢ−ＭＥＣＡの投与量で、毎日または１日に２回処置する。ＩＢ−ＭＥＣＡを用いる処置を、最終的な手術の前に始める。
【００８０】
ＩＢ−ＭＥＣＡを用いる処置の所定の時間（処置と対照間で最大の差異を示すように予め定められた時間）後、腫瘍病変部を手術において取り除き、末端シグナル、ＰＫＡ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、ＧＳＫ−３β、β−カテニン、サイクリンＤ１、ｃ−ｍｙｃ、ＰＩ３Ｋ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢと共に、Ａ３レセプターｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲを用いて測定する。異なるタンパクの発現のレベルを、処置前の生検検体から測定したものと比較することができる。
【００８１】
同様の方法で、ＩＢ−ＭＥＣＡを用いる処置の効果を、調節マーカーのレベルの測定を経て、乳ガン、前立腺ガン、黒色腫等の場合に測定する。類似の方法で、必要な変更を加えて、自己免疫炎症性疾病における治療の効果を判定することができる。
【００８２】
例１０：ヒト好中球に対するＡ３ＡＲレセプターの検出
２０ｍｌのヒト血液から単離された１０×１０６好中球細胞を、１５分間、０．０１ｍＭまたは１０ｍＭのＣＦ１０１を用いて、３７℃でインキュベートした。細胞を遠心分離により収集し、ＰＢＳを用いて洗浄した。ＲＮＡをＴＲＩ−試薬（Sigma社）を用いることにより細胞から抽出した。ＲＮＡレベルを分光光度計を用いて定量化し、各サンプルから１ｍｇを、セクションＥにおいて上記した通り、３６１ｂｐフラグメントの増幅のためのプライマ−として、セットＮｏＩＩを用いることによる、プラチナＴａｑ（Invitrogene社）を用いるスーパースクリプトワンステップＲＴ−ＰＣＲを使用するＲＴ−ＰＣＲに供した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物を電気泳動により検出し、サイズを既知のＲＮＡと比較することにより検証した。
【００８３】
結果を図１０に示す。見受けることができるように、Ａ３ＡＲアゴニストＩＢ−ＭＥＣＡは、好中球においてＡＲＡＲの発現を高めることができる。これは、初期増殖様式において、好中球が治療処置に反応したということを示す。従って、Ａ３ＡＲのレベルの検出変化は、増加する好中球の総数についての処置（Ａ３ＡＲアゴニストによる）の有効性、例えば、化学療法の効果を相殺することを示す。
【００８４】
例１１：ＩＢ−ＭＥＣＡによる、炎症性反応、及びＡ３ＡＲ発現、及びいくつかの末端タンパクの変化
アジュバント誘発性関節炎（ＡＩＡ）を、上記したようにラットに誘発した。ラットを、（ｉ）賦形剤（これらのラットは対照となる）、（ｉｉ）１０μｇ／ＫｇのＩＢ−ＭＥＣＡ、または（ｉｉｉ）特異的Ａ３ＡＲアゴニストＭＲＳ１２２０、続く３０分後にＩＢ−ＭＥＣＡ、のいずれかを用いて経口的に毎日２度の処置をした。マウスを組織学的評価、並びにシグナル伝達タンパク及びＴＮＦ−αの測定のために、２８日で屠殺した。
【００８５】
図１０ａに見受けることができるように、ＩＢ−ＭＥＣＡは、Ａ３ＡＲアンタゴニストＭＲＳ１２２０により帳消しにされるように、特異的である抗炎症性反応を誘発した。ＩＢ−ＭＥＣＡの抗炎症性活性を、組織学的評価においても、同様に見受けることができる（図１０ｂ）。
【００８６】
図１１に見受けることができるように、ＩＢ−ＭＥＣＡの抗炎症性活性は、Ａ３ＡＲのレベルのダウンレギュレーションと関連があり、一方でＡ２アデノシンレセプターの効果を有さなかった。ＭＲＳ１２２０は、特異的であり、Ａ３ＡＲを通して媒介されることを示すこの変化をブロックした。同様のダウンレギュレーションを、末端のシグナル伝達タンパクＰＩ３Ｋ（図１０）、ＰＫＢ／Ａｋｔ（図１１ａ、及び１１ｂ）、ＩＫＫα／β、ＮＦ−κＢ、及びＴＮＦ−α（ＤＬＮ及び滑膜組織について、それぞれ、図１２及び１３）においても同様に見受けることができる。アップレギュレーションが、ＧＳＫ−３β及びカスパーゼ−３を含む、末端のシグナル伝達タンパクにおいて見受けられる。
【００８７】
これらシグナル伝達タンパクのレベルをモニタすることにより、発現に関する、及びその活性に関する双方で、自己免疫炎症性疾病の処置におけるＡ３ＡＲアゴニストの効果を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１ａ】Ａ３ＡＲに対する１次及び２次抗体、並びにＣｙ３結合抗ヤギＩｇＧをそれぞれ用いて標識された、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞の共焦点レーザー顕微鏡分析を示す画像であって、未処置の黒色腫細胞におけるＡ３ＡＲの画像。画像はＸ−Ｙ平面の中央部を表す。
【図１ｂ】Ａ３ＡＲに対する１次及び２次抗体、並びにＣｙ３結合抗ヤギＩｇＧをそれぞれ用いて標識された、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞の共焦点レーザー顕微鏡分析を示す画像であって、ＩＢ−ＭＥＣＡ処理された細胞を示す画像。画像はＸ−Ｙ平面の中央部を表す。
【図１ｃ】Ａ３ＡＲに対する１次及び２次抗体、並びにＣｙ３結合抗ヤギＩｇＧをそれぞれ用いて標識された、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞の共焦点レーザー顕微鏡分析を示す画像であって、ＩＢ−ＭＥＣＡ及びＭＲＳ  Ａ３ＡＲアンタゴニストを用いる、組み合わされた処理を示す画像。画像はＸ−Ｙ平面の中央部を表す。
【図２】Ａ３ＡＲに対する１次抗体、及び２次抗体であるＣｙ３結合抗ヤギＩｇＧを用いてそれぞれ用いて標識された、異なる時間ＩＢ−ＭＥＣＡに曝露されたＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞の共焦点レーザー顕微鏡分析を示す画像。画像はＸ−Ｙ平面の中央部を表す。
【図３】未処置の黒色腫細胞（対照）における、またはトリプシン処理、ＩＢ−ＭＥＣＡ処理、若しくはＩＢ−ＭＥＣＡ及びトリプシンを用いる組み合された処理に対する、Ａ３ＡＲ内部移行のウエスタンブロット分析を示す画像。ハウスキーピングタンパクβ−アクチンのレベルは変化しなかった。
【図４ａ】Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞におけるＡ３ＡＲのウエスタンブロット分析を示す画像であって、ＩＢ−ＭＥＣＡを用いる、異なる時間の間の、細胞の処置に対する結果を示す画像。
【図４ｂ】Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞におけるＡ３ＡＲのウエスタンブロット分析を示す画像であって、未処置の細胞（対照  と比較した、ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＩＢ−ＭＥＣＡとシクロヘキシミド（タンパク合成阻害剤）の組み合わせ、またはＩＢ−ＭＥＣＡとＭＧ１３２（タンパク分解阻害剤）の組み合わせを用いる処置に対する結果を示す画像。
【図５ａ】結腸ガン細胞における、腫瘍サイズと調節要素のレベルとの間の相関を示すグラフであって、Ｂ１６黒色腫細胞を接種されたマウスの、ＩＢ−ＭＥＣＡを用いた毎日の治療の１５日後の腫瘍サイズを示すグラフ。
【図５ｂ】結腸ガン細胞における、腫瘍サイズと調節要素のレベルとの間の相関を示す図であって、図５ａに記載した病変における、細胞増殖調節タンパク（ＰＫＡｃ、ＰＫＢ／ａｋｔ、ＧＳＫ−３β、β−カテニン、サイクリンＤ１、ｃ−ｍｙｃ、及びＮＦ−κＢ）の変化を示す図（左がＡ３ＡＲアゴニストを用いる処置前、右が、Ａ３ＡＲを用いる処置後）。
【図６】ＩＢ−ＭＥＣＡの存在下（右レーン）、及び非存在下（左レーン）での、ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｃ、及びサイクリンＤ１である、前立腺ガン細胞から抽出されたタンパクの免疫ブロット分析を示す画像。
【図７】ＩＢ−ＭＥＣＡの存在下（右レーン）、及び非存在下（左レーン）での、ＫＰＡｃ、ＰＫＢ／Ａｋｔ、β−カテニン、ｃ−ｍｙｃ、及びサイクリンＤ１  ＮＦ−κＢ、及びＧＳＫ−３βである、結腸ガン細胞から得られたタンパク抽出物の免疫ブロット分析を示す画像。
【図８ａ】ＰＫＡ及びＧＳＫ−３βのレベルをモニタすることにより測定される、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞におけるレセプター機能性のウエスタンブロット分析を示す画像であって、異なる時点での、黒色腫細胞における、ＰＫＡ及びＧＳＫ−３βレベルに対するＩＢ−ＭＥＣＡの効果を示す画像。
【図８ｂ】ＰＫＡ及びＧＳＫ−３βのレベルをモニタすることにより測定される、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞におけるレセプター機能性のウエスタンブロット分析を示す画像であって、同時にＩＢ−ＭＥＣＡ＋ＭＲＳ１５２３を用いて処置された細胞に対する効果を示す画像。
【図８ｃ】ＰＫＡ及びＧＳＫ−３βのレベルをモニタすることにより測定される、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞におけるレセプター機能性のウエスタンブロット分析を示す画像であって、フォルスコリンまたは８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを用いて処置された細胞に対する効果を示す画像。
【図９ａ】結腸ガン細胞における、腫瘍サイズと調節要素のレベルとの間の相関を示すグラフであって、時間の関数としての、ＨＣＴ−１１６ヒト結腸ガンを接種されたマウスのＩＢ−ＭＥＣＡを用いた毎日の治療の１５日後の腫瘍サイズを示すグラフ。
【図９ｂ】結腸ガン細胞における、腫瘍サイズと調節要素のレベルとの間の相関を示す画像であって、図９ａに記載した腫瘍病変における、細胞増殖調節タンパク（Ａ３ＡＲ、ＧＳＫ−３β、サイクリンＤ１、及びｃ−ｍｙｃ）の変化を示す画像。
【図１０】ヒト好中球に対するＡ３ＡＲレセプターの検出を示す画像。
【図１０ａ】ＩＢ−ＭＥＣＡの抗炎症性反応を示すグラフ。賦形剤処置対照（黒三角印）、及びＩＢ−ＭＥＣＡ投与の３０分前に投与された、特異的なＡ３レセプターアンタゴニストＭＲＳ１２２０による抗炎症性反応の無効化（黒ダイヤ印）と比較した、ＩＢ−ＭＥＣＡの１０μｇ／Ｋｇの臨床スコア（黒四角印）を示すグラフ。
【図１０ｂ】ＩＢ−ＭＥＣＡの抗炎症性反応を示すグラフ。対照と比較して、２８日における、ＩＢ−ＭＥＣＡ処置された図１０ａのラットの組織学的スコアを示すグラフ。
【図１１】アジュバント誘発性関節炎（ＡＩＡ）ラットモデルにおける、排出リンパ節（drain lymph nodes）（ＤＬＮ）中のＡ３ＡＲ、及び末端シグナル伝達エフェクターＰＩ３Ｋの変化を示すウエスタンブロットの画像。Ａ３ＡＲのブロット、Ａ３ＡＲの変化の特異性を示す負の制御として役立つＡ２アデノシンレセプターのブロット、及びＰＩ３Ｋのブロットを示す。左側のブロットは、対照である、賦形剤処理された動物に由来し、中央は、ＩＢ−ＭＥＣＡ処置動物に由来し、並びに右側のブロットは、ＩＢ−ＭＥＣＡ、及び特異的なＡ３ＡＲアンタゴニストであるＭＲＳ１２２０の双方を用いて処理された動物に由来する。
【図１２ａ】タンパク発現に関して示される、ＡＩＡラットモデルにおけるＤＬＮ中のＰＫＢ／ＡｋｔのレベルのＩＢ−ＭＥＣＡ誘発変化を示す画像。リン酸化されたＰＫＢ／Ａｋｔのウエスタンブロットである。左側のブロットは、対照である、賦形剤処置された動物に由来するものであり、中央は、ＩＢ−ＭＥＣＡ処置された動物に由来するものであり、及び右側のブロットは、ＩＢ−ＭＥＣＡとＭＲＳ１２２０の双方を用いて処置された動物に由来する。β−アクチンブロットは、反応の特異性を示すための対照として挙げられる。
【図１２ｂ】基質としてＧＳＫ−３βを利用する活性化に関して示される、ＡＩＡラットモデルにおけるＤＬＮ中のＰＫＢ／ＡｋｔのレベルのＩＢ−ＭＥＣＡ誘発変化を示す画像。左側のブロットは、対照である、賦形剤処置された動物に由来するものであり、中央は、ＩＢ−ＭＥＣＡ処置された動物に由来するものであり、及び右側のブロットは、ＩＢ−ＭＥＣＡとＭＲＳ１２２０の双方を用いて処置された動物に由来する。
【図１３】ＡＩＡラットモデルのＤＬＮ中のＩＫＫα／β、ＮＦ−κＢ、及びＴＮＦ−αのＩＢ−ＭＥＣＡ誘発変化を示すウエスタンブロットの画像。ＮＦ−κＢレベルは、ＤＮＡ結合アッセイにより示される。
【図１４】ＡＩＡラットモデルからの滑膜組織における、ＩＫＫα／β、ＮＦ−κＢ、及びＴＮＦ−αのＩＢ−ＭＥＣＡ誘発変化を示すウエスタンブロットの画像。
【図１５】ＡＩＡラットモデルのＤＬＮ中のＧＳＫ−３βとカスパーゼ−３のＩＢ−ＭＥＣＡ誘発アップレギュレーションを示す画像。
【図１ａ】
2006503564.tif 000003
【図１ｂ】
2006503564.tif 000004
【図１ｃ】
2006503564.tif 000005
【図２】
2006503564.tif 000006
【図３】
2006503564.tif 000007
【図４ａ】
2006503564.tif 000008
【図４ｂ】
2006503564.tif 000009
【図５ａ】
2006503564.tif 000010
【図５ｂ】
2006503564.tif 000011
【図６】
2006503564.tif 000012
【図７】
2006503564.tif 000013
【図８ａ】
2006503564.tif 000014
【図８ｂ】
2006503564.tif 000015
【図８ｃ】
2006503564.tif 000016
【図９ａ】
2006503564.tif 000017
【図９ｂ】
2006503564.tif 000018
【図１０】
2006503564.tif 000019
【図１０ａ】
2006503564.tif 000020
【図１０ｂ】
2006503564.tif 000021
【図１１】
2006503564.tif 000022
【図１２ａ】
2006503564.tif 000023
【図１２ｂ】
2006503564.tif 000024
【図１３】
2006503564.tif 000025
【図１４】
2006503564.tif 000026
【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月26日(2005.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における疾病状態の処置において、Ａ３アデノシンレセプター（Ａ３ＡＲ）と相互作用する投与薬剤の有効性をモニタするためのデータを得る方法であって、
（ｉ）前記個体から取り出された細胞、または前記細胞を含む組織のサンプル中に含まれる、細胞内の少なくとも１つの生物学的マーカーの少なくとも１つの生理学的パラメータのレベルを検出することであって、前記サンプルは、前記個体への前記薬剤の投与後の定められた時点において取り出され、前記時点は、前記薬剤が、前記疾病状態に関連する前記個体中の細胞に到達し、且つ作用することを可能にするように選択され、前記マーカーは、Ａ３ＡＲ、またＡ３ＡＲシグナル伝達経路末端に関連し、Ａ３ＡＲの下流にある要素であり、及び
（ｉｉ）前記少なくとも１つのパラメータのレベルと対照レベルを比較することであって、対照レベルは、前記薬剤の投与前の、前記同一の個体に由来する細胞または組織におけるレベル、または未処置の疾病状態を示す前記マーカーに対する標準対象である
を包含し、対照との前記生理学的パラメータのレベルの差異は、前記疾病状態に対する前記処置の有効性を示す方法。
【請求項２】
前記Ａ３ＡＲと相互作用する前記薬剤が、Ａ３ＡＲアゴニストである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬候補が、疾病細胞中で示される疾病状態の処置に有用なＡ３ＡＲアゴニストであるか否かを決定する方法であって、前記方法は、
（ｉ）前記疾病細胞、または前記細胞を含む組織のサンプルと、前記薬候補を接触させること、
（ｉｉ）前記細胞における少なくとも１つの生物学的マーカーの少なくとも１つの生理学的パラメータのレベルを検出することであって、前記マーカーは、Ａ３ＡＲ、またはＡ３ＡＲシグナル伝達経路に関連し、Ａ３ＡＲの下流にある要素である、
（ｉｉｉ）前記薬候補と接触させていない未処置のサンプルにおけるそれらのレベルと、前記少なくとも１つのパラメータのレベルを比較すること
を包含し、前記処置サンプルと前記未処置サンプルとの間の前記生理学的パラメータのレベルの差異が、前記薬候補がＡ３ＡＲのアゴニストであることを示す方法。
【請求項４】
薬候補が、疾病細胞中で示される疾病状態の処置に有用なＡ３ＡＲアゴニストであるか否かを決定する方法であって、前記方法は、
（ｉ）前記疾病状態を有する被験者から取り出したサンプル中に含まれている、前記疾病細胞または前記細胞を含む組織の、少なくとも１つの生物学的マーカーの少なくとも１つの生理学的パラメータのレベルを、前記被験者への前記薬候補の投与後の１以上の定められた時点において検出することであって、前記マーカーは、Ａ３ＡＲ、またはＡ３ＡＲシグナル伝達経路に関連し、Ａ３ＡＲの下流にある要素である、
（ｉｉ）前記薬候補を投与されない被験者から取り出された疾病細胞におけるレベルと、前記少なくとも１つのパラメータのレベルを比較すること
を包含し、前記処置サンプルと前記未処置サンプルとの間の前記生理学的パラメータのレベルの差異が、前記薬候補がＡ３ＡＲのアゴニストであることを示す方法。
【請求項５】
前記生理学的パラメータが、ｍＲＮＡまたはタンパク発現のレベル、リン酸化レベル、及び細胞局在から選択される請求項３または４に記載の方法。
【国際調査報告】
2006503564.tif 000028
2006503564.tif 000029
2006503564.tif 000030
2006503564.tif 000031
2006503564.tif 000032
2006503564.tif 000033