(57)【要約】活性化プロテインＣおよびプロテインＣチモーゲンを投与することを含む、凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏症のヒトの患者を処置する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に活性化プロテインＣ（ａＰＣ）およびプロテインＣチモーゲン（ＰＣＺ）を投与することを含む、凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏のヒトの患者を処置するための方法。
【請求項２】
前記凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏が、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、大外傷、外科手術中であるまたは外科手術から回復中である、火傷、成人呼吸窮迫症候群、骨髄およびその他臓器の移植、深部静脈血栓、ヘパリン誘導性血小板減少、鎌状赤血球病、サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、不安定狭心症、心筋梗塞、髄膜炎菌血症、類鼻疽、妊娠中の合併症、子癇前症、子癇、羊水塞栓症、胎盤剥離、および化学療法から選択される疾患または状態に伴う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏が敗血症、重症敗血症、および敗血症性ショックから選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
患者に活性化プロテインＣを最初に投与し、次いでプロテインＣチモーゲンを投与する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
患者にプロテインＣチモーゲンを最初に投与し、次いで活性化プロテインＣを投与する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
患者に活性化プロテインＣおよびプロテインＣチモーゲンを同時に投与する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
活性化プロテインＣおよびプロテインＣチモーゲンの投与を活性化プロテインＣとプロテインＣチモーゲンの間で交互に行う、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
活性化プロテインＣを、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量で継続的に点滴することにより投与する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
活性化プロテインＣを、約５μｇ／ｋｇ／時間〜約３０μｇ／ｋｇ／時間の用量で継続的に点滴することにより投与する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
活性化プロテインＣを、約５μｇ／ｋｇ／時間〜約２５μｇ／ｋｇ／時間の用量で継続的に点滴することにより投与する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
活性化プロテインＣおよびプロテインＣチモーゲンを血漿中約２０ｎｇ／ｍＬ〜約１６０ｎｇ／ｍＬの活性化プロテインＣの範囲に達するまで投与する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
血漿中の活性化プロテインＣの範囲が、約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
約１００〜約５００μｇ／ｋｇのボーラス有りまたは無しでのプロテインＣチモーゲンの用量が約６０〜約１２０μｇ／ｋｇ／日である請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
約１００〜約５００μｇ／ｋｇのボーラス有りまたは無しでのＰＣＺの用量が約９０μｇ／ｋｇ／日である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
活性化プロテインＣおよび／またはＰＣＺが組換えにより製造される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１６】
活性化プロテインＣおよび／またはＰＣＺが遺伝子導入により製造される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１７】
活性化プロテインＣおよび／またはＰＣＺが血漿から得られる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１８】
活性化プロテインＣ、プロテインＣチモーゲンおよび医薬用担体を含有する医薬製剤であって、活性化プロテインＣとプロテインＣチモーゲンの重量比が、プロテインＣチモーゲン５重量％：活性化プロテインＣ９５重量％；プロテインＣチモーゲン１０重量％：活性化プロテインＣ９０重量％；プロテインＣチモーゲン１５重量％：活性化プロテインＣ８５重量％；プロテインＣチモーゲン２０重量％：活性化プロテインＣ８０重量％；プロテインＣチモーゲン２５重量％：活性化プロテインＣ７５重量％；プロテインＣチモーゲン３０重量％：活性化プロテインＣ７０重量％；プロテインＣチモーゲン３５重量％：活性化プロテインＣ６５重量％；プロテインＣチモーゲン４０重量％：活性化プロテインＣ６０重量％；プロテインＣチモーゲン４５重量％：活性化プロテインＣ５５重量％；およびプロテインＣチモーゲン５０重量％：活性化プロテインＣ５０重量％；プロテインＣチモーゲン６０重量％：活性化プロテインＣ４０重量％；プロテインＣチモーゲン７０重量％：活性化プロテインＣ３０重量％；プロテインＣチモーゲン８０重量％：活性化プロテインＣ２０重量％；プロテインＣチモーゲン９０重量％：活性化プロテインＣ１０重量％；プロテインＣチモーゲン９５重量％：活性化プロテインＣ５重量％；およびプロテインＣチモーゲン９９重量％：活性化プロテインＣ１重量％から選択される、医薬製剤。
【請求項１９】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン５重量％：活性化プロテインＣ９５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン１０重量％：活性化プロテインＣ９０重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２１】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン１５重量％：活性化プロテインＣ８５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２２】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン２０重量％：活性化プロテインＣ８０重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２３】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン２５重量％：活性化プロテインＣ７５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２４】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン３０重量％：活性化プロテインＣ７０重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２５】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン３５重量％：活性化プロテインＣ６５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２６】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン４０重量％：活性化プロテインＣ６０重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２７】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン４５重量％：活性化プロテインＣ５５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２８】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン５０重量％：活性化プロテインＣ５０重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項２９】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン５５重量％：活性化プロテインＣ４５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３０】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン６０重量％：活性化プロテインＣ４０重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３１】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン６５重量％：活性化プロテインＣ３５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３２】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン７０重量％：活性化プロテインＣ３０重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３３】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン７５重量％：活性化プロテインＣ２５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３４】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン８０重量％：活性化プロテインＣ２０重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３５】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン８５重量％：活性化プロテインＣ１５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３６】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン９０重量％：活性化プロテインＣ１０重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３７】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン９５重量％：活性化プロテインＣ５重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３８】
前記重量比がプロテインＣチモーゲン９９重量％：活性化プロテインＣ１重量％である、請求項１８に記載の製剤。
【請求項３９】
凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏のヒトの患者の処置において使用するための、プロテインＣおよび活性化プロテインＣを含有する医薬製剤。
【請求項４０】
凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏のヒトの患者の処置において使用するための請求項１８に記載の医薬製剤。
【請求項４１】
前記凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏が、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、大外傷、外科手術中であるまたは外科手術から回復中である、火傷、成人呼吸窮迫症候群、骨髄およびその他臓器の移植、深部静脈血栓、ヘパリン誘導性血小板減少、鎌状赤血球病、サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、不安定狭心症、心筋梗塞、髄膜炎菌血症、類鼻疽、妊娠中の合併症、子癇前症、子癇、羊水塞栓症、胎盤剥離、および化学療法から選択される疾患または状態に伴う、請求項３９または４０に記載の製剤。
【請求項４２】
凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏が敗血症、重症敗血症、敗血症性ショックである、請求項４１に記載の製剤。
【請求項４３】
前記製剤が凍結乾燥されている、請求項１８〜４２のいずれかに記載の製剤。
【請求項４４】
さらに、塩、増量剤および緩衝剤を含有する、請求項４３に記載の製剤。
【請求項４５】
再構成によりｐＨ約５．５〜６．５を有する請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
増量剤が、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびスクロース、およびそれらの混合物から選択され；塩が、塩化カリウム、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムから選択され；緩衝系が、トリス−酢酸塩、クエン酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムまたはそれらの混合物から選択される、請求項４５に記載の製剤。
【請求項４７】
活性化プロテインＣ、プロテインＣチモーゲンおよび増量剤を含む溶液を凍結乾燥することを含む、請求項４３に記載の製剤の製造方法。
【請求項４８】
包装材および該包装材内に入れられた活性化プロテインＣを含む製品であって、該包装材が、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、大外傷、外科手術中であるまたは外科手術から回復中である、火傷、成人呼吸窮迫症候群、骨髄およびその他臓器の移植、深部静脈血栓、ヘパリン誘導性血小板減少、鎌状赤血球病、サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、不安定狭心症、心筋梗塞、髄膜炎菌血症、類鼻疽、妊娠中の合併症、子癇前症、子癇、羊水塞栓症、胎盤剥離、および化学療法から選択される疾患または状態の処置のために活性化プロテインＣとプロテインＣチモーゲンを組み合わせて使用することができることを表示したラベルを含む、製品。
【請求項４９】
凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏のヒトの患者の処置のための医薬の製造のためのプロテインＣチモーゲンの使用であって、該医薬が活性化プロテインＣの投与の前にまたは後にあるいは同時に投与するためのものである、使用。
【請求項５０】
凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏のヒトの患者の処置のための医薬の製造における活性化プロテインＣの使用であって、該医薬がプロテインＣチモーゲンの投与の前にまたは後にあるいは同時に投与するためのものである、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、活性化プロテインＣ（ａＰＣまたはＡＰＣ）とプロテインＣチモーゲン（ＰＣＺ）の組合せを投与することを特徴とする、敗血症、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、大外傷、外科手術、火傷、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、移植、深部静脈血栓、ヘパリン誘導性血小板減少、鎌状赤血球病、サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、急性冠症候群（ＡＣＳ；例えば不安定狭心症、心筋梗塞）およびプロテインＣ欠乏症を含む、血管閉塞性疾患および凝固亢進状態を処置するための方法に関する。本発明はさらに、ａＰＣ、ＰＣＺおよび製薬的に許容し得る担体を含有する製剤を包含する。
【０００２】
プロテインＣは、セリンプロテアーゼであり、凝固カスケードにおいてＶａおよびＶＩＩＩａ因子を失活させることにより恒常性の制御において役割を果たす天然の抗凝固薬である。ヒトプロテインＣは、生体内では主として肝臓において４６１アミノ酸の１本鎖ポリペプチドとして生成される。この前駆体分子は、１）４２アミノ酸のシグナル配列を開裂させ、２）１本鎖チモーゲンの１５５位のリジン残基と１５６位のアルギニン残基が蛋白分解により除去され、該分子の２本鎖形（すなわち、１５５アミノ酸残基の軽鎖が、２６２アミノ酸残基のセリンプロテアーゼ含有重鎖とジスルフィド架橋を介して結合）を形成し、３）該軽鎖の最初の４２アミノ酸中のクラスターとなった９個のグルタミン酸残基がビタミンＫ依存性にカルボキシル化して９個のγ−カルボキシグルタミン酸残基を生じ、４）４部位で炭化水素が結合（１つは軽鎖中、３つは重鎖中）することを含む多様な翻訳後修飾を受ける。プロテインＣチモーゲンは、重鎖のＮ末端の１２ペプチドが切断されると血漿中を循環し、酵素活性を有するａＰＣを生ずる。ａＰＣは、血液凝固カスケードにおいてＶａおよびＶＩＩＩａを不活性化することによって止血の調節にとって重要な役割を担っている。
【０００３】
血液凝固は、プロ凝固機構と抗凝固機構との間のバランスによって調節される非常に複雑な過程である。このバランスが、正常な止血の状態か、または発作、心筋梗塞および静脈血栓症などの現象につながる異常な病的な血栓形成の状態かの、いずれかを決定する。フィブリンの生成と、血小板の活性化とその後の凝集という、２つの主要な因子がこのバランスを制御している。両方の過程を制御する決定的な因子は、酵素トロンビンの生成であり、それによって凝固カスケードのそれ以降の活性化が起きる。トロンビンは、血小板を凝集し、循環しているフィブリノーゲンを不溶性のフィブリンに変換するプロ凝固酵素であり、血餅の形成をもたらす。トロンビンはまた、プロテインＣチモーゲンを活性化プロテインＣに活性化し、今度は活性化プロテインＣがトロンビンの生成を阻害するので、強力な抗凝固物質として機能する。したがって、トロンビン生成のフィードバック調節を通じて、ａＰＣは、恐らく血栓症に対する保護をもたらす血液凝固の最も重要な下方調節物質として機能する。
【０００４】
さらに、ａＰＣは、血餅溶解を促進するプロフィブリン溶解特性を示し、腫瘍壊死因子や種々のインターロイキン類等の炎症メディエーターの放出を阻害することにより抗炎症効果を示す。
【０００５】
組換えａＰＣは、重症敗血症の治療について第ＩＩＩ相の臨床試験を終えている。さらに、重症敗血症が被験患者の治療対象である血漿由来のヒトａＰＣのＤＩＣにおける使用に向けられた第ＩＩＩ相試験も日本において終了している。先天性および後天性のプロテインＣ欠乏症を処置するための、および播種性血管内凝固（ＤＩＣ）および高凝固症を処置するためのａＰＣの使用もまた報告されている。Ｗａｄａ， ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ａｍ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ４４： ２１８−２１９； Ｓｕｇｉｍｏｔｏ， ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ７７： １２２３−１２２４； Ｏｈ， ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｂｌｏｏｄ， ９２： ４４０２； Ａｏｋｉ， ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｎｅｗ Ｒｅｍｅｄｉｅｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃｓ ４７： ４４８−４８２）。
【０００６】
動物モデルにおいてａＰＣを使用する有望な前臨床研究もいくつか報告されている。Ｔａｙｌｏｒらのヒヒ敗血症モデルにおける研究［Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７９： ９１８−２５， １９８７］では、血漿由来のａＰＣが用いられた。５匹のうちの５匹とも７日間生存し、その実験プロトコルに対する永続的な生存と考えられた。同じようにして大腸菌を点滴した対照動物では、５匹のうちの５匹ともが２４〜３２時間で死亡した。ヒヒモデルにおける血栓性閉塞あるいは血栓塞栓症を処置するための組換えａＰＣの使用はまた、米国特許第５，０８４，２７４号および欧州特許出願第０３８２０１Ｂ１においてグリフィンらによって開示されている。
【０００７】
ラットのリポ多糖類（ＬＰＳ； 大腸菌）敗血症モデル ［Ｍｕｒａｋａｍｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８７： ６４２−６４７，１９９６］では、ＬＰＳによって引き起こされた肺血管傷害がヒト血漿由来ａＰＣによって阻害された。さらに、ウサギの結紮および穿刺敗血症モデルにおいて、オカモトら［Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０６： Ａ７４７，１９９４］は、血漿由来のヒトａＰＣが凝固異常や臓器不全からその動物を保護するのに有効であることを示した。
【０００８】
血漿由来のＰＣＺは、ヨーロッパと日本において、先天性プロテインＣ欠乏症の処置について承認されている。先天性および後天性プロテインＣ欠乏症を処置するためのヒトＰＣＺの使用もまた報告されている。例えば、Ｄｒｅｙｆｕｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈｅｍｏｓｔ． ２１： ３７１−３８１，１９９５； Ｍｉｎｆｏｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ．， ９３： ２１５−２１６，１９９６； Ｓｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ， ３５０： １５９０−１５９３，１９９７）を参照。さらに、血漿由来ヒトＰＣＺは、細菌性敗血症の電撃性紫斑病の４５人の患者の処置における攻撃的な従来の治療の有効な補助剤として使用されており、４０人が生存した（Ｇｅｒｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ９１： ４１８−４２２， １９９３； Ｓｍｉｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５０： １５９０−１５９３，１９９７； Ｗｈｉｔｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９２： ６７０ａ ＆ｎｕｍ；２７６５， １９９８； Ｅｔｔｉｎｇｓｈａｕｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈｅｍｏｓｔ． ２５： ５３７−５４１，１９９９； Ｂｅｔｒｏｓｉａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２７： ２８４９−２８５０，１９９９； Ｒｉｎｔａｌａ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３４７： １７６７，１９９６； Ｒｉｖａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． １２６： ６４６−６５２， １９９５））。Ｇｅｒｓｏｎら（１９９３年）は、攻撃的な従来の治療に対して反応しなかった、グラム陽性菌血症および電撃性紫斑病を患うことが示された子供の処置について記載している。患者は、血漿由来ヒトＰＣＺで処置され、凝固障害およびＤＩＣがともに治癒され、敗血症性ショック関連電撃性紫斑病の発生の臨床的徴候を阻止した。
【０００９】
Ｒｉｎｔａｌａら（１９９６）は、電撃性紫斑病を呈した髄膜炎菌性敗血症を有する２人の成人の処置を報告している。その患者に４００μｇ／ｋｇの血漿由来ＰＣＺを６時間ごとに８〜１０日間ボーラス投与した。１人が死亡し、１人が生存した。Ｒｉｖａｒｄら（１９９５）は、髄膜炎菌血および電撃性紫斑病を有する４人の患者の治療を報告しており、患者全員がヒトＰＣＺ治療後生存した。Ｓｍｉｔｈら（１９９７）およびＷｈｉｔｅら（１９９８）は、３０人の髄膜炎菌血患者を血漿由来ＰＣＺを約４００μｇ／ｋｇのボーラス、次いで６０μｇ／ｋｇ／時間の点滴により数日間処置した。３０人のうち２７人の患者が生存した。Ｅｔｔｉｎｇｓｈａｕｓｅｎら（１９９９）は、８人の髄膜炎菌血患者を血漿由来ＰＣＺを、約３２０〜４８０μｇ／ｋｇ、次いで約２００μｇ／ｋｇのボーラスを４時間ごとに１回まで投与して処置した。平均治療期間は３日であり、範囲は１〜１６日間である。８人のうち６人の患者が生存した。Ｂｅｔｒｏｓｉａｎら（１９９９）は、１人の髄膜炎菌血患者を、初日は６時間ごとに４００μｇ／ｋｇ、そしてその後は６時間ごとに２４０μｇ／ｋｇの血漿由来ＰＣＺで処置した。患者は生存しなかった。
【００１０】
血漿由来ヒトＰＣＺが、他の凝固障害または後天性プロテインＣ欠乏症状態、例えば骨髄移植の合併症である肝内性肝静脈閉塞症（Ｖｅｌｄｍａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ２１： Ｓ２３８， １９９８）、病因不明の破壊的な凝固障害（Ｆａｖｉｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ４０： ６７−７０，１９９８）およびヘパリン誘導性血小板減少（Ｂｏｓｈｋｏｖ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９４： １０２ｂ， １９９９）をうまく処置することも報告されている。
【００１１】
ＰＣＺとａＰＣは構造が異なり、薬物動態学的および薬物力学的にも異なる。ＰＣＺは、薬学的に不活性なタンパク質であり、ヒトの体内には約４μｇ／ｍＬの濃度で存在している。ＰＣＺは、毛細血管床において内皮膜タンパク質であるトロンボモジュリンとともにトロンビンによってａＰＣに変換される。より大きな血管では、ＰＣＺからａＰＣへのこの変換は、トロンビン−トロンボモジュリンとともにさらにＥＰＣＲによって促進される。したがって、ａＰＣは、処置した患者においてａＰＴＴ凝固時間を長引かせるが、ＰＣＺはそうではない。さらに、ａＰＣは、ヒトの体内を約２ｎｇ／ｍＬというずっと低い濃度で循環している。ヒトにおけるａＰＣの半減期は、約２３〜４５分間であり、ＰＣＺ（約１０時間）よりも１０倍以上も短い。Ｓｈｏｃｋ， Ｖｏｌ． １２， Ｎｏ． ３，２４３−２４４，１９９９。半減期が短い理由は、ａＰＣの血中レベルが、ａＰＣと共有結合により結合して不活性なセルピン／ａＰＣ複合体を形成する、セルピン（セリンプロテアーゼインヒビター）として知られる分子によって調節されているというものである。このセルピン／ａＰＣ複合体は、ａＰＣが結合してセルピンの反応部位のループがタンパク質分解により切断されたときに形成され、この切断により、セルピンがａＰＣを不可逆的に不活性化する立体構造的変化を受ける。さらに、このセルピン／ａＰＣ複合体は、主としてこのセルピン／ａＰＣ複合体に対する肝臓の受容体によって血流から排出される。
【００１２】
様々な研究から得られた主な知見は、敗血症などの凝固亢進状態の処置における早期の介入がによって、よりうまくいくようであるということである。感染の攻撃に対して治療的介入が早いほど、薬物が有益な効果を発揮する傾向にあるということを証拠が示唆している。Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｓｔ， １９９７， １１１： ７４４−５３． Ｔｏｓｈｉａｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｓｕｒｇ， １９９８，１８７： ３２１−３２９． （早期診断は、現在、重症敗血症において非常に重要であると考えられている。敗血症の後の段階で処置を開始した場合の効果は低いので、処置はできるだけ早期に行うべきである）。
【００１３】
早期の治療的介入は好ましいけれども、様々な医学的理由（例えば、潜在的な副作用および薬物の相互作用）から、しばしば、凝固亢進またはプロテインＣ欠乏状態を確認する前に患者を処置することが望ましくない場合がある。さらに、ＰＣＺ単独での処置による不利益も存在する。例えば、ＰＣＺを活性で有用なａＰＣへ変換するのに時間がかかる。さらに、ＰＣＺをａＰＣに変換できない、または変換する能力が低い患者も存在し得る。例えば、凝固亢進状態において循環血液中へ放出されたあるサイトカインが、内皮細胞上のトロンボモジュリンの量を下方調節するかもしれず、プロテインＣ活性化の速度を妨害するかもしれない（Ｍｏｏｒｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７３： １５９−１６５，１９８９）。Ｆａｕｓｔらも、ＰＣＺからａＰＣへの変換に必要な分子機構が敗血症の患者において下方調節されることを報告している。Ｓｈｏｃｋ ２０００： １３ （Ｓｕｐｐｌ．）： ２９（要約　番号１２）。さらに、ａＰＣは、ＰＣＺよりも好中球エラスターゼに対して耐性であり得る（Ｐｈｉｌａｐｉｔｓｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ， ６９： Ａ６６４，１９９３）。敗血症においてエラスターゼは増加している（Ｓｅｔｉｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ４３： ２２−２８，１９８９； Ｊａｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８７： ２３３７−２３４４，１９９６）。したがって、ａＰＣ単独の投与およびＰＣＺ単独での投与は、凝固亢進状態および／またはプロテイン欠乏状態の最適な処置よりも効果が低いかもしれない。
【００１４】
本発明は、凝固亢進状態および／またはプロテインＣ欠乏状態の治療におけるａＰＣとＰＣＺの組合せをはじめて記載する。ａＰＣおよびＰＣＺの組合せは、ａＰＣおよびＰＣＺ両方の用量の低減と、臨床的処置の選択肢と処置される患者の予後の改善を可能にする処置をもたらす。この組み合わせ治療における薬剤の用量の低減は、いずれかの薬剤に伴って起こり得る副作用、特に、ａＰＣをより高い用量で投与することによって引き起こされる出血の可能性、の低減をもたらし得る。この組合せは、特に出血性敗血症の傾向のある、または例えば遺伝性の出血性疾患により出血の危険のある患者、および／または出血性敗血症の危険性が増大し得る薬剤を服用している患者にとって特に好ましい。この組み合わせはさらに、プロテインＣ欠乏状態および／または凝固亢進状態の確認後のａＰＣの投与後の、または患者がＰＣＺから活性な形態のタンパク質であるａＰＣへ変換することができないかもしれないと臨床医が推測したとき、より迅速な処置手段（ＰＣＺ）を可能にする。
【００１５】
ＰＣＺとａＰＣの組み合わせ治療は、必要とする特定の患者または疾患に最も良い組み合わせに従い、任意の順序または組み合わせで投与することができる。本発明は、本明細書において開示した状態を予防または処置するための、ａＰＣおよびＰＣＺを用いるすべての投与レジメを包含することを意図する。特定の患者の必要条件および処置する医師の選択によって、ａＰＣおよびＰＣＺが様々な投与スケジュールで用いられ得る。例えば、ＰＣＺをａＰＣの前に投与してもよい。ａＰＣをＰＣＺの前に投与してもよい。ＰＣＺとａＰＣとを、異なる組合せの比率で同時に投与してもよい。また、ＰＣＺとａＰＣを用量を変えて、２つの薬剤の間で前後に入れ替えて投与してもよい。以下の、可能な用量の選択肢の例は、本発明の範囲の限定を何ら意図するものではない。ＰＣＺおよびａＰＣは、好ましくは、非経口的に、例えば静脈内または皮下経路で投与する。また、ＰＣＺおよびａＰＣをボーラス、負荷量、または継続点滴により投与してもよい。
【００１６】
ａＰＣの前に投与するＰＣＺ：敗血症の発症の危険性のある患者に、例えばＰＣＺを予防的に投与して患者の敗血症または重症敗血症の発症を予防する。イかにより詳細に例示するように、敗血症を発症する危険性のより高い患者には、化学療法を受けている癌患者；他の損傷または外科手術を受けている患者、例えば開腹手術または臓器移植；重症の火傷患者；および妊娠している患者が含まれる。例えば、好中球が減少している患者（強度の化学療法による治療を受けている癌患者）では、敗血症性ショックの臨床的症状序発症の約１２時間前にプロテインＣのレベルが正常値の４０％に減少し得ることが知られている。Ｍｅｓｔｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．， 印刷中）。このグループの患者における低レベルのプロテインＣは、患者の死亡という結果を予兆となるものであった。プロテインＣのこの劇的な減少を示したこのグループの患者はすべて死亡した。プロテインＣのこの減少がなかった患者は生存した。したがって、敗血症を発症する危険性の高い患者を診ている医師は、プロテインＣのレベルを監視することができる。プロテインＣのレベルが正常値よりも減少し始めたらできるだけ早く、その医師は、その患者にＰＣＺを投与することができる。ＰＣＺは、プロテインＣの消費速度に依存して、皮下投与なら（例えば、約２００〜２０００μｇ／ｋｇの用量で）１日に１回〜２、３日に１回、あるいは静脈内投与であれば約２００〜７００μｇ／ｋｇの用量で１日１回投与して、内因的なＰＣＺレベルを正常値の約１００％に維持することができる。ＰＣＺによるこの予防的処置は、敗血症の発症および／または重篤度を低減し得る。後に、敗血症、重症敗血症または敗血症性ショックが発症した時点で、ａＰＣを投与し、患者を処置する。
【００１７】
重症敗血症および敗血症性ショックの急性期におけるａＰＣは、ＰＣＺよりもより良い処置であると考えられる。なぜなら、以前から言われているように、患者におけるＰＣＺからａＰＣへの変換に必要なトロンボモジュリンは、敗血症の間の炎症によって下方調節され得るからである（Ｍｏｏｒｅら、１９８９）。また、ＰＣＺは、ａＰＣよりも好中球エラスターゼによる分解の影響を受けやすい（Ｐｈｉｌａｐｉｔｓｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ， ６９： Ａ６６４，１９９３）。循環好中球エラスターゼは重症敗血症の間、上昇する。
【００１８】
ａＰＣで患者を約１〜１０日間または患者の内因的プロテインＣレベルがほぼ正常値になるまで処置したのち、医師は、凝固障害のすべての徴候がなくなるまで一定期間ＰＣＺを再び投与してもよい（そしてａＰＣを継続または中断してもよい）。ＰＣＺ処置の最終段階を必要とする患者は、重症敗血症／敗血症性ショック段階の間に電撃性紫斑病を発症した患者であってよい。皮膚移植または切断を必要となり得る壊死組織または指があるかもしれない。救済の範囲を超えた虚血性の組織は、適切な処置を行うまで低度の凝固障害を誘発し続け得る。上記の投与レジメの恩恵を受け得るその他の患者には、外傷、火傷を負っている患者または臓器移植を受けているもしくは間近に受ける患者、および肝内性肝静脈閉塞症を発症した患者が含まれる。
【００１９】
ＰＣＺの前に投与されるａＰＣ：凝固亢進状態の明らかな症状を有する病院または医師に罹っている患者、例えば重症敗血症または敗血症性ショックについて、これら患者をすぐにａＰＣにより約１〜１０日間または患者の内因的プロテインＣレベルが正常値の下限よりも高くなるまで処置することができる（本明細書においてさらに詳細に記載するように、正常値の下限は約６０〜８０％である）。このシナリオの一例は、グラム陰性またはグラム陽性菌血症またはウイルスもしくは寄生虫感染のいずれかから電撃性紫斑病を発症している患者である。この患者は、最初にａＰＣで、例えば、約１０μｇ／ｋｇ／時間〜約３６μｇ／ｋｇ／時間の用量で約１〜約１０日間処置し、次いでＰＣＺで、ある用量（２００〜６００μｇ／ｋｇを１日１回）でさらに１〜約７日間から数週間まで処置することができる。更なる例は、急性期の類鼻疽を発症している患者の処置に向けられる。患者は、ａＰＣにより、例えば、約１０μｇ／ｋｇ／時間〜約３６μｇ／ｋｇ／時間の用量で１〜約１０日間（最初のａＰＣボーラス有りまたは無しで）処置する。類鼻疽を引き起こす病原体、即ちＢ． ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、が疾患全体の寛解のため２週間〜６ヶ月の抗感染処置を必要とする場合、Ｂ． ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉは６ヶ月までその患者を感染する活性を有し得る。このことは、ＰＣＺによる処置を６ヶ月まで必要とする継続的または「慢性的」後天性プロテインＣ欠乏症をもたらし得る。ａＰＣおよびＰＣＺの実際の用量は、活性化プロテインＣ血漿レベルが最終的に２ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜９０ｎｇ／ｍＬの範囲に達成するように、変更することができる。別の例は、最初に急性の電撃性紫斑病を示す先天性のプロテインＣ欠乏症と診断された患者、または血栓／凝固亢進の急性の危機にさらされている先天性のプロテインＣ欠乏症の患者の処置に向けられる。この患者は、最初にａＰＣにより、例えば約１０μｇ／ｋｇ／時間〜約３６μｇ／ｋｇ／時間の用量で約１〜約１０日間処置した後、ＰＣＺにより、ある用量（２００〜６００μｇ／ｋｇで１日１回）でさらに１〜約７日の期間、最長数週間まで処置する。１または２日間ＰＣＺ治療に集中したのち、長期の抗凝固治療を開始する一方でＰＣＺ治療を徐々に離脱させることができる。長期の抗凝固治療の例は、経口でのワーファリン治療またはヘパリン治療（静脈内または皮下投与される低分子量ヘパリンまたは未分画ヘパリン）である。これらの患者は、通常、継続的な抗凝固治療を生涯必要とする。ＰＣＺおよびａＰＣは、急性の血栓の危険が存在する間、このグループの患者の命を助けることができるものである。
【００２０】
ＰＣＺおよびａＰＣの監視は、ａＰＣレベルを測定するための酵素補足免疫原法；抗原性と質量分析法の組合せ等、ＰＣＺレベルの測定について開発途上の他の方法；および好ましくは、抗原性または活性の方法論を用いた、商業的および臨床的に承認されたＰＣＺ測定のための診断用キットを含む様々な方法によって行うことができる。
【００２１】
同時投与されるａＰＣおよびＰＣＺ：上記２つのシナリオでは、ＰＣＺの等よからａＰＣの投与への移行またはその逆を見極めるのが困難であるかも知れない。したがって、その移行の間、医師は、ＰＣＺまたはａＰＣ単独の医療へ移行する前にａＰＣとＰＣＺを一緒に用いることができる。さらに、医師は、種々の理由でａＰＣまたはＰＣＺの用量を減らすように決定することができる。患者はａＰＣによる出血およびａＰＣ用量が減少する危険性が増大し得るが、ＰＣＺの継続的な投与は患者の凝固亢進状態および／またはプロテインＣ欠乏症に有益で有り得る。医師は、患者がＰＣＺをａＰＣで変換する能力を有しているかどうかを判断した上で、低用量、例えば、５μｇ／ｋｇ／時間〜約２０μｇ／ｋｇ／時間のａＰＣの投与を、例えば２０〜１００μｇ／ｋｇ／時間のＰＣＺボーラスと同時投与することを望み得る。
【００２２】
本発明の範囲に含まれる、凝固亢進状態の例は、以下のとおりである。
【００２３】
敗血症
臨床上、敗血症は、１またはそれ以上の臓器不全を伴う、感染または擬似感染に対する全身性の応答として定義され、サイトカインネットワーク、白血球、並びに、補体及び凝固／繊溶系を含む多数の宿主防護機構の活性化と関連、及び、活性化により媒介される［Ｍｅｓｔｅｒｓら、Ｂｌｏｏｄ、第８８巻、第８８１〜８８６頁（１９９６年）］。種々の臓器の微小血管系中で繊維素が広範囲にわたって沈着した播種性血管内凝固（ＤＩＣ）は、敗血症／敗血症性ショックの初期の現れである。ＤＩＣは、多臓器不全症候群の進展における重要なメディエーターであり、重症敗血症の患者の不十分な予後の一因である。（Ｆｏｕｒｒｉｅｒら、Ｃｈｅｓｔ、第１０１巻、第８１６〜８２３頁（１９９２年））。
【００２４】
敗血症における臨床試験においてＤＩＣを妨げることが新しい標的として提案されている（例えば、Ｌｅｖｉら、ＪＡＭＡ、第２７０巻、第９７５〜９７９頁（１９９３年））。しかしながら、敗血症における凝固欠陥を単に妨げるのでは十分でないかも知れない。Ｅｓｍｏｎによりレビューされたように（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ＆Ｔｈｒｏｍｂ．、第１２巻、第１３５〜１４５頁（１９９２年））、活性部位がブロックされた第Ｘａ因子（Ｔａｙｌｏｒら、Ｂｌｏｏｄ、第７８巻、第３６４〜３６８頁（１９９１年））、ヒルジン及びＨｉｒｕｌｏｇ（ヒルジン誘導体）（Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ、第１巻、第４６１〜４７８頁（１９９４年））を含む、いくつかの抗血栓剤はヒヒの敗血症モデルにおいて効力を示さなかった。これらの各抗血栓剤は、動物の消費性凝固障害を妨げることができたが、生存を向上させることはできなかった。さらに、日本の研究者ら（特開平７−９７３３５号公報）は、ＤＩＣ様症状を示す可能性のある肝不全に関連した凝固障害を、血漿由来活性化プロテインＣで処置することを提案している。
【００２５】
電撃性紫斑病（溢血性の皮膚病変、発熱、細菌性敗血症に関連する低血圧症、ウイルス、細菌または原虫感染症）および／またはＤＩＣは、リケッチア属（ロッキー山紅斑熱、ダニ熱、発疹チフス等）（Ｇｒａｙｂｉｌｌら、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、第６６巻第４号、第４１０〜４１３頁（１９７３年）；Ｌｏｕｂｓｅｒら、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃｓ、第１３巻、第２７７〜２８０頁（１９９３年））、サルモネラ属（腸チフス、鼡咬症）（Ｋｏｕｌら、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ．、第９３巻、第１３〜１９頁（１９９５年））、肺炎双球菌属（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、第２９巻、第４７９〜４８３頁（１９９７年））、Ｙｅｒｓｉｎａ ｐｅｓｔｉｓ（腺ペスト）（Ｂｕｔｌｅｒら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、第１２９巻、第５７８〜５８４頁（１９７４年））、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ（在郷軍人病）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（脳マラリア）（Ｌｅｒｃａｒｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、第７巻、第９３〜９６頁（１９９２年））、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（類鼻疽）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（類鼻疽）（Ｐｕｔｈｕｃｈｅａｒｙら、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｈｙｇｉｅｎｅ、第８６巻、第６８３〜６８５頁（１９９２年））、連鎖球菌属（歯原性感染）（Ｏｔａ，Ｙ．、Ｊ．Ｊａｐａｎｅｓｅ Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、第６８巻、第１５７〜１６１頁）、帯状疱疹ウイルス（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、第１５３巻、第６４６〜６４９頁（１９９４年））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ （炭疽）（Ｆｒａｎｚら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．、第２７８巻第５号、第３９９〜４１１頁（１９９７年）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（レプトスピラ症）（Ｈｉｌｌら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、第１２巻第１号、第４４〜４９頁（１９９７年））、ブドウ状球菌属（Ｌｅｖｉｎ，Ｍ．、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、第８巻、第２２３〜２２９頁）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ（ブラジル紫斑熱）、ナイセリア属（淋菌血、髄膜炎）、及び、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（粟粒結核）により引き起こされる感染を含むがこれらに限定されない多くの細菌性、ウイルス性または原虫性感染と関連している。
【００２６】
敗血症／敗血症性ショックまたは他の感染における電撃性紫斑病、ＤＩＣまたは後天性プロテインＣ欠乏症症状は先に示したように詳細に文献に記載されているにも拘わらず、本願の治療方法にしたがってこれらの患者を処置することは示唆されていない。
【００２７】
移殖
骨髄移殖（ＢＭＴ）、肝臓、腎臓、または、他の臓器移植に続いて、種々の移殖に伴う血栓塞栓症合併症が起こり得る（Ｈａｉｒｅら、ＪＡＭＡ、第２７４巻、第１２８９〜１２９５頁（１９９５年）；Ｈａｒｐｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ、第９２４〜９２７頁（１９８８年）、及び、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．、第２２６巻、第１０１〜１０５頁（１９８９年）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎ．、第１１巻、第６１〜６５頁（１９９３年））。ＢＭＰ（Ｂａｚａｒｂａｃｈｉら、Ｎｏｕｖ．Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、第３５巻、第１３５〜１４０頁（１９９３年）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓ．、第１１巻、第６１〜６５頁（１９９３年））、腎移植（Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．、第２２６巻、第１０１〜１０５頁（１９８９年））、及び、肝移植（Ｈａｒｐｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ、第９２４〜９２７頁（１９８８年））後における循環性プロテインＣレベルの減少が報告されている。このプロテインＣ欠乏は凝固亢進状態の一因であり、患者が血栓塞栓症合併症を起こす危険に曝す。
【００２８】
例えば、肝臓の肝静脈閉塞疾患（ｈｅｐａｔｉｃ ｖｅｎｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ；ＶＯＤ）は、ＢＭＴの移殖前摂生の用量を制限させる主要な合併症である。ＶＯＤはおそらく、繊維素の血管内沈着による肝内小静脈閉塞の結果である（Ｆａｉｏｎｉら、Ｂｌｏｏｄ、第８１巻、第３４５８〜３４６２頁（１９９３年））。さらに、ＶＯＤはＢＭＴに次いで、かなりの罹患及び死を引き起こすものである（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｔｈｒｏｍ．ａｎｄ Ｈａｅｍｏ．、第７２巻、第２８〜３３頁（１９９４年））。ＶＯＤのピーク発病率と一致したプロテインＣの減少が報告されており（Ｈａｒｐｅｒら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓ．、第５巻、第３９〜４２頁（１９９０年））、この症状の起源に寄与する因子である可能性が高い。
【００２９】
肺、中央神経系、肝臓または腎臓を含む臓器のＢＭＴ後の機能不全は、移植患者において高い確率で起こる合併症である（Ｈａｉｒｅら、ＪＡＭＡ、第２７４巻、第１２８９〜１２９５頁（１９９５年））。ＢＭＴにおける単一の臓器の機能不全は、ＢＭＴ患者における死の主要原因である多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）を強く予期させるものである。凝固系の大規模な活性化、及び、種々の臓器の微小血管系中の繊維素の広範囲にわたる沈着による播種性血管内凝固（ＤＩＣ）は、ＭＯＤＳの進行の主要なメディエーターである（Ｆｏｕｒｒｉｅｒら、Ｃｈｅｓｔ、第１０１巻、第８１６〜８２３頁（１９９２年））。従って、骨髄または他の臓器移植を受けた患者におけるプロテインＣレベルの欠乏は、患者を静脈血栓塞栓症合併症及び臓器の機能不全にかかりやすくする、凝固亢進状態を引き起こす。臓器移殖に伴う凝固亢進状態のヒトを、活性化プロテインＣを用いて処置する方法を確立する、要望が現在存在する。
【００３０】
火傷
重度の火傷の患者が、凝固亢進に関連する合併症を起こすことが昔から、認識されていた（Ｃｕｒｒｅｒｉら、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、第１８１巻、第１６１〜１６３頁（１９７４年））。火傷の患者は、非常に普通のイン・ヴィトロ凝固活性を有し、拡散性出血の突然の始まり、繊維素原、血小板及び第ＶＩＩＩａ因子活性の消費、血管内溶血、二次繊溶、及び、微血栓の生検証拠により特徴付けられるＤＩＣを頻繁に形成する（ＭｃＭａｎｉｓら、Ｊ．ｏｆ Ｔｒａｕｍａ、第１３巻、第４１６〜４２２頁（１９７３年））。最近、重度の火傷患者においてプロテインＣのレベルが劇的に減少すること、及び、この天然抗凝固物質の減少がＤＩＣの危険を増加させ得ることが報告された（Ｌｏら、Ｂｕｒｎｓ、第２０巻、第１８６〜１８７頁（１９９４年））。さらに、Ｕｅｙａｍａらは、火傷障害の初期段階におけるＤＩＣの病因を論じる上で、大量トロンビン産生及び抗凝固物質活性の増加が火傷の度合いに比例して起こるかもしれないと推断している（Ｕｅｙａｍａら、日本外科学会雑誌、第９２巻、第９０７〜９１２頁（１９９１年））。ＤＩＣは、重度の火傷障害を患う患者において一般的な合併症の１つである。
【００３１】
上述のようにプロテインＣ欠乏症が、重度の火傷患者について報告されてきたが、本願において開示された方法にしたがって患者を処置することは何ら示唆されていない。
【００３２】
妊娠
凝固亢進状態となり得る複合的な変化が、妊娠により凝固系において引き起こされることはよく知られている。例えば、妊娠中及び分娩後における静脈血栓症になる危険性は、非妊娠状態に比べて５倍高い。さらに、凝固因子が増加し、凝固の天然阻害因子は減少し、繊溶系で変化が生じ、静脈鬱血が増加するのと同じく、胎盤分離、帝王切開、または感染によるお産での血管の損傷も増加する（Ｂａｒｂｏｕｒら、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、第８６巻、第６２１〜６３３頁（１９９５年））。
【００３３】
何の危険因子も持たない女性が、この凝固亢進状態によって合併症にかかる危険性は小さいが、血栓塞栓症に罹ったことのある女性が妊娠した場合には、再発する危険性が増加する。さらに、最近発見されたａＰＣに対する遺伝的耐性を含む、潜在的に凝固亢進状態である女性もまた、再発する危険性がより高い（Ｄａｈｌｂａｃｋ、Ｂｌｏｏｄ、第８５巻、第６０７〜６１４頁（１９９５年））。
【００３４】
よって、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、または、プロテインＳに欠損を有することが見つけられた、静脈血栓塞栓症に罹ったことのある女性では、血栓症が再発する相当の危険性があるので、予防的抗凝固治療を考慮するべきであることが提案されている（Ｃｏｎｒａｄら、Ｔｈｒｏｍ．Ｈａｅｍｏｓｔ、第６３巻、第３１９〜３２０頁（１９９０年））。繊維素形成の増加、繊溶系の活性化、血小板活性化及び血小板数の減少により示唆されるように、妊婦における子癇前症及び子癇および羊水塞栓症や胎盤剥離等の他の産科学的合併症は、凝固障害の増加状態を示しているようである（Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、第３５巻、第３３８〜３５０頁（１９９２年））。子癇前症は、胎盤の「血管付着」が異形であることによる子宮胎盤虚血の結果と考えられている。子癇前症の結果起こる症状には、高血圧、同様に胎盤、腎臓、肝臓及び脳障害を引き起こすＤＩＣも含まれる（Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．、第８６巻、第１５８〜１６３頁（１９９１年））。そのうえ、血小板減少、溶血、及び、肝臓機能障害の合併した子癇前症として定義されるＨＥＬＬＰ症候群として知られる重篤で、生命を脅かす症状にまで子癇前症は到り得る（Ｒａｔｈｇｅｂｅｒら、Ａｎａｓｔｈ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｔｈｅｒ Ｎｏｔｆａｌｌｍｅｄ．、第２５巻、第２０６〜２１１頁（１９９０年））。さらに、重篤な子癇前症を患う妊婦では、正常な妊婦と比べるとプロテインＣレベルが減少していることが報告されている（Ｄｅ Ｓｔｅｆａｎｏら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、第７４巻、第７９３〜７９４頁（１９９５年））。
【００３５】
従って、妊婦、特に血栓塞栓症を患ったことのある女性が静脈血栓塞栓症の合併症を起こす危険性は、主要な関心事である。子癇前症及びＤＩＣ等の重篤な合併症を起こす可能性は比較的低いものの、活性化凝固系の阻害が始まったと診断されたと同時に、ＤＩＣに対する治療を始めることが必須であると提案されている（Ｒａｔｈｇｅｂｅｒら、Ａｎａｓｔｈ．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｔｈｅｒ Ｎｏｔｆａｌｌｍｅｄ．、第２５巻、第２０６〜２１１頁（１９９０年））。子癇前症またはＤＩＣの合併症は、凝固亢進状態とプロテインＣレベルが減少する点で、敗血症で起こる状況と類似している（Ｌｅｖｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４１： ５８６−５９２， １９９９）。
【００３６】
大手術／外傷
大手術または事故による外傷から回復する患者は、誘導された凝固亢進状態の結果として頻繁に血液凝固合併症になる（Ｗａｔｋｉｎｓら、Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．、第６３巻、第１０１９〜１０２７頁（１９８５年））。凝固亢進状態は、外科手術を受けた患者における静脈血栓塞栓症の原因としてますます認識されている（Ｔｈｏｍａｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１５８巻、第４９１〜４９４頁（１９８９年）；ＬｅＣｌｅｒｃ，Ｊ．Ｒ．、Ｃｌｉｎ．Ａｐｐｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ／Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、第３巻第３号、第１５３〜１５６頁（１９９７年））。そのうえ、この凝固亢進状態は、まれにしか起こらないが、それにもかかわらず、破壊的であり、そして、起こればしばしば致命的であるＤＩＣ様症状を伴う合併症を導く（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１２４巻、第３７５〜３８０頁（１９７７年））。
【００３７】
さらに、冠動脈バイパス移殖（ＣＡＢＧ）（Ｍｅｎｇｅｓら、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒ．Ｖａｓｃ．Ａｎ，、第１０巻、第４８２〜４８９頁（１９９６年））、生命の危険を伴う脊髄手術（Ｍａｙｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．、第２４５巻、第８３〜８９頁（１９８９年））、生命の危険を伴う腹部手術（Ｂｌａｍｅｙら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、第５４巻、第６２２〜６２５頁（１９８５年））、下肢の生命の危険を伴う整形手術若しくは関節形成手術（ＬｅＣｌｅｒｃ（１９９７年））、または、他の型の手術（Ｔｈｏｍａｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１５８巻、第４９１〜４９４頁（１９８９年））を受けた患者は、時折、静脈血栓塞栓症合併症を起こす。さらに、日本の研究者らは、脊髄障害を伴う微小血管血栓症を血漿由来ＰＣＺで、成人で１〜１０ｍｇ／日、若しくは、好ましくは２〜６ｍｇを１〜２回に分けてボーラスまたは静脈点滴によって投与することにより処置することを提案している（特開平８−３２５１６１号公報）。
【００３８】
抗凝固物質による治療が、大手術または外傷を受けた患者において静脈血栓塞栓症を予防するのに重要であることが示唆されてきた（Ｔｈｏｍａｓら（１９８９年）；ＬｅＣｌｅｒｃ（１９９７年））。例えば、肺塞栓症で亡くなる多くの患者は、血栓塞栓症の徴候の臨床的証拠を先立って示さず、診断がされ処置が成される前に亡くなる（ＬｅＣｌｅｒｃ（１９９７年））。例えば、ワルファリン、低分子量ヘパリン等、現在存在する予防的法は、後遺基部血栓症または頻繁に用量調整する必要性がある等の限界を有する。
【００３９】
ＡＲＤＳ
成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、肺浮腫、微血栓、炎症性細胞浸潤、及び、遅延繊維症によって特徴付けられる。これらの多様な細胞性及び炎症性反応の中枢には、結果的に凝固亢進状態になる凝固の活性化がある。一般のＡＲＤＳ−随伴凝固疾患には、血管内凝固及び繊溶の阻害が含まれる。凝固系の活性化及び繊溶の阻害により形成された繊維素は、おそらく急性の肺障害の一因となるであろう。敗血症、外傷及び他の重篤な病気はＡＲＤＳを起こす重要な危険因子である（Ｈａｓｅｇａｗａら、Ｃｈｅｓｔ、第１０５巻第１号、第２６８〜２７７頁（１９９４年））。
【００４０】
ＡＲＤＳは凝固の活性化及び繊溶の阻害に関連している。ＤＩＣで存在する凝固亢進に類似した、肺血管微塞栓が存在することを示す無視できない臨床的事実が存在する。よって、ＡＲＤＳに関連した凝固亢進状態の効果的な治療に対する要望が現在存在する。
【００４１】
本発明は、患者にａＰＣおよびＰＣＺを投与することを含む、凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏のヒトの患者を処置するための方法を提供する。
【００４２】
本発明はさらに、凝固亢進状態またはプロテインＣ欠乏のヒトの患者を処置するための方法であって、有効量のａＰＣおよびＰＣＺを該患者に投与して２ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲の活性化プロテインＣの血漿レベルを達成することを含む、方法を提供する。
【００４３】
本発明の別の態様は、ａＰＣおよびＰＣＺの組合せを投与することを特徴とする、敗血症（重症敗血症および敗血症性ショックを含む）、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、大外傷、大手術、火傷、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、類鼻疽、子癇前症、子癇、羊水塞栓症、胎盤剥離、移植、深部静脈血栓、ヘパリン誘導性血小板減少、鎌状赤血球病、サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、急性冠症候群（ＡＣＳ；例えば不安定狭心症、心筋梗塞）および後天性および先天性プロテインＣ欠乏症を含む血管閉塞性疾患および後天性および先天性の凝固亢進状態を処置するための方法を提供する。
【００４４】
さらに本発明の製剤を提供する。好ましくは、該製剤は、凍結乾燥され、非経口投与に適するようにされ、製薬的担体とともに、活性成分としてａＰＣおよびＰＣＺを任意の比率で含有する。例えばＰＣＺ：ａＰＣの好ましい比率としては、ＰＣＺ５重量％：ａＰＣ９５重量％；ＰＣＺ１０重量％：ａＰＣ９０重量％；ＰＣＺ１５重量％：ａＰＣ８５重量％；ＰＣＺ２０重量％：ａＰＣ８０重量％；ＰＣＺ２５重量％：ａＰＣ７５重量％；ＰＣＺ３０重量％：ａＰＣ７０重量％；ＰＣＺ３５重量％：ａＰＣ６５重量％；ＰＣＺ４０重量％：ａＰＣ６０重量％；ＰＣＺ４５重量％：ａＰＣ５５重量％；およびＰＣＺ５０重量％：ａＰＣ５０重量％；ＰＣＺ６０重量％：ａＰＣ４０重量％；ＰＣＺ７０重量％：ａＰＣ３０重量％；ＰＣＺ８０重量％：ａＰＣ２０重量％；ＰＣＺ９０重量％：ａＰＣ１０重量％；ＰＣＺ９５重量％：ａＰＣ５重量％；およびＰＣＺ９９重量％：ａＰＣ１重量％が挙げられる。好ましくは、該製剤は、さらに塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム）、増量剤（例えば、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、スクロース、または種々の増量剤の）、緩衝剤（例えば、トリス−酢酸、クエン酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウム、または緩衝剤の混合物）、所望により、安定化剤（例えば、アルブミン）を含有する。本明細書に記載の製剤は、許容し得る希釈剤で再構成することにより、以下のような好ましいｐＨ範囲や値を有する：ｐＨ約６．０〜約８．０； ｐＨ ｏｆ 約６．０〜約７．０； ｐＨ ｏｆ 約６．３〜約６．７。本製剤は、本明細書に記載の治療方法において使用するのに好ましく適合させる。本製剤は、ａＰＣ、ＰＣＺおよび増量剤を含む溶液を凍結乾燥することを含む、複数の方法により製造することができる。好ましくは、凍結乾燥する溶液は、さらに塩および／または緩衝剤、および所望により安定化剤を含有してもよい。また、包装材および該包装材内に入れられた活性化プロテインＣを含む製品であって、該包装材が、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、大外傷、外科手術中であるまたは外科手術から回復中である、火傷、成人呼吸窮迫症候群、骨髄およびその他臓器の移植、深部静脈血栓、ヘパリン誘導性血小板減少、鎌状赤血球病、サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、不安定狭心症、心筋梗塞、髄膜炎菌血症、類鼻疽、妊娠中の合併症、子癇前症、子癇、羊水塞栓症、胎盤剥離、および化学療法から選択される疾患または状態の処置のために活性化プロテインＣとプロテインＣチモーゲンを組み合わせて使用することができることを表示したラベルを含む製品も包含する。
【００４５】
本明細書において開示し、特許請求する本発明の目的において、以下の用語は以下に定義される意味である。
【００４６】
ａＰＣまたは活性化プロテインＣは、活性化されたヒトプロテインＣを意味し、血漿由来でも、組換え法もしくは遺伝子導入法より製造されたものでもよい。組換えおよび遺伝子導入活性化プロテインＣには、ヒトプロテインＣが含まれ、また、それであることが好ましいが、他の種またはプロテインＣの完全なタンパク質分解性、アミド分解性、エステル分解性、及び、生物学的（抗凝固若しくは前繊溶）活性を有する誘導体をさらに含み得る。プロテインＣ誘導体の例は、Ｇｅｒｌｉｔｚら（米国特許第５，４５３，３７３号）及びＦｏｓｔｅｒら（米国特許第５，５１６，６５０号）に記載されている。これらの特許の全内容は本明細書の一部を構成する。組換え活性化プロテインＣは、ヒトプロテインＣチモーゲンをイン・ビトロで活性化することにより、または、プロテインＣの活性化形態を直接分泌または産生させることにより製造することができる。プロテインＣは、例えば、ヒト腎臓２９３細胞からの分泌を含む細胞、真核細胞、トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物中でのチモーゲンとしての産生に続いて、当業者に公知の技術により精製及び活性化することができる。
【００４７】
処置−病気、症状または疾患と闘うことを目的とした患者の治療及び介護を表する。処置はまた、病気、症状または疾患の徴候または合併症の始まりを防ぐための予防または予防的投与を包含し得る。
【００４８】
連続点滴−特定の期間にわたって静脈に、実質的に中断されることなく溶液の注入を続けること。
【００４９】
ボーラス注射−規定された量の薬（ボーラスと呼ばれる）の、例えば最大約１２０分の期間にわたる注射。
【００５０】
投与に適する−治療用薬剤として与えるのに適した製剤または溶液。
【００５１】
容器−指定の材料、即ちＰＣＺまたはａＰＣまたはその混合物を受けるのに用いられるバイアルまたはボトル等の容器。
【００５２】
単位投与剤型−ヒトを対象とした単位用量に適する物理的に分離された単位で、各単位は、所望の治療効果を生じるよう計算された、予め決定された量の活性材料を、適当な医薬的賦形剤と共に含む。
【００５３】
凝固亢進状態−拡散性血管内凝固、前血栓症症状、凝固の活性化、またはＰＣＺ等の凝固因子の先天的または後天的欠損に関連した過剰の凝固性。
【００５４】
チモーゲン−本明細書中において使用される、プロテインＣチモーゲンは、分泌された、不活性形態の、一本鎖または二本鎖のプロテインＣを意味する。
【００５５】
子供−新生児、幼児、及び１８歳以下の子供を含むが、それに限られないヒト患者。
【００５６】
有効量−医薬的化合物、具体的にはａＰＣおよび／またはＰＣＺ、の治療的有効量。
【００５７】
電撃性紫斑病−細菌性敗血症、ウイルス性、細菌性または原生動物性感染に関連した斑状出血皮膚障害、熱、低血圧。通常、拡散性血管内凝固が存在する。
【００５８】
敗血症−１またはそれ以上の臓器不全を伴う、感染または感染の疑いに対する全身的な応答をいう。本発明においては、用語「敗血症」は、重症敗血症、（１またはそれ以上の臓器不全の徴候を有する敗血症）を包含する。臓器は、心臓血管、代謝、精神状態／中枢神経系、血液／凝固、腎臓、呼吸器、肝臓、および敗血症性ショック（終末器官に対する低血圧または臓器血流の低下として定義される）であり得る。
【００５９】
プロテインＣ欠乏症は、患者のアベイラビリティーのデータによって主に２つの手段によって決定され定義される。正常な血漿プロテインＣレベルが分かっている患者について、または患者に対して連続的な血漿プロテインＣレベルの測地（例えば、６〜１２時間ごと）を行う場合、後天性プロテインＣ欠乏症は、患者自身の既知の正常なレベルまたは正常な範囲内にあった最新のプロテインＣレベルと比較して１０％またはそれ以上の減少として定義される。患者の正常な血漿プロテインＣレベルが分からないまたは知ることができない（例えば、病院に罹っている患者が既に重症敗血症の症状を示しているまたは実験室での試験が凝固亢進状態を示している）場合、後天性プロテインＣ欠乏症は、一般に、そのプロテインＣ分析を行った実験室で確立されているまたは用いられているプロテインＣの正常な範囲の下限よりも低い場合に定義される。
【００６０】
本発明は、凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症をａＰＣおよびＰＣＺを用いて処置する方法であって、特にその状態または該欠乏症が敗血症、移殖、火傷、妊娠、大手術、外傷、若しくは、ＡＲＤＳに関連する場合の方法に関する。ａＰＣおよびＰＣＺは、真核セルライン、トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物を用いて、当分野における周知の技術により作成し得る。これらに限定されるわけではないが、ＨＥＰＧ−２、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＣＨＯ−Ｋ１、２９３、またはＡＶ１２細胞等、Ｇｒｉｎｎｅｌｌにより米国特許第５，６８１，９３２号（該特許は本明細書の一部を構成する）に記載される例が、適当な宿主真核セルラインに含まれることが当業者には理解される。さらに、トランスジェニックな組換えタンパク質の産生は、Ｄｒｏｈａｎら（米国特許第５，５８９，６０４号）及びＡｒｃｈｉｂａｌｄら（米国特許第５，６５０，５０３号）に記載される。これらの特許は本明細書の一部を構成する。米国特許第５，００９，８８９号（本明細書の一部を構成する）は、血漿からプロテインＣを単離するための様々な方法を記載している。ＰＣＺおよびａＰＣ、ならびにこれらを含有する製剤を調製するための方法の更なる例については、米国特許第５，５８０，９６２号（第３および４欄）；米国特許第５，８３１，０２５号；欧州特許出願０６６２５１３Ａ１；米国特許第５，０９３，１１７号および米国特許第５，０８４，２７３号を参照。
【００６１】
完全に活性であるためには、これらの方法の何れかにより産生されるａＰＣは、９個のγ−カルボキシ−グルタミン酸の側鎖のカルボキシル化（γ−カルボキシ化、即ちＧｌａ含量）、エリスロ−β−ヒドロキシ−Ａｓｐの１個のアスパラギン酸の側鎖のヒドロキシル化（β−ヒドロキシル化）、Ａｓｎ−結合オリゴ糖類への４個のアスパラギン残基の側鎖のグリコシル化（グリコシル化）、リーダー配列（４２アミノ酸残基）の除去、及び、ジペプチドＬｙｓ１５６−Ａｒｇ１５７の除去等の翻訳後修飾を受けなければならない。このような翻訳後修飾がないと、ａＰＣは完全には機能しないか、または、全く機能しない。
【００６２】
以下の方法、製造例および実施例は説明をするものであって、本発明の範囲の限定を意図するものでははない。
【００６３】
患者の血漿サンプル中のプロテインＣレベルの測定方法
プロテインＣレベルは、適当に認可された診断用キットを用い、認証された実験室と訓練された専門家によって、患者のクエン酸添加血漿サンプルにおいて測定することができる。一般に、様々な営利会社から出ているプロテインＣレベルを測定するための診断用キットには３つのタイプがある。１つはＥＬＩＳＡタイプの方法論により、血漿中のプロテインＣの抗原性レベルを測定するものである。他の２つの方法は、プロテインＣ活性のレベルを測定するものである。プロテインＣは、一般にヘビ静脈血から抽出されたプロテアーゼを用いて最初に活性化プロテインＣに変換し、次いでそのアミド活性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（アミド活性キット）またはその抗凝固活性（凝固活性キット）のいずれかを測定することにより測定する。これら診断用キットのいずれかは、患者におけるプロテインＣ欠乏症を決定するために使用することができる。肝機能不全を伴い得る後天性プロテインＣ欠乏症または後天性凝固亢進状態については、患者におけるプロテインＣレベルを測定するための好ましいまたはより臨床的に適切な方法は、凝固活性診断キットである。
【００６４】
プロテインＣレベルは一般に患者のクエン酸添加血漿において測定する。通常、患者の血液サンプルを、３．２％または３．８％クエン酸を含む２．８ｍＬ（小児用サイズ）または４．５ｍＬのバキュテイナーに採取する。血液サンプルを静脈穿刺または中心線により得ることができる。例えば中心線により、血液サンプルを採取する際にヘパリン汚染を回避することができない場合は、そのサンプルにおけるプロテインＣレベルを正確に測定するには、抗原性を利用する方法しか用いることができない。クエン酸添加血液サンプルを約２０００×ｇで約１０〜２０分間遠心する。上清のクエン酸添加血漿を取り、プロテインＣレベルの測定に使用する。
【００６５】
これら３つの種類の診断用キットのいずれか１つを使用する血漿プロテインＣレベルの測定は、手動で、または半自動化もしくは自動化された装置を用いて行うことができる。適正な資格を有する実験室と技術者は、通常、プロテインＣ分析を行うための詳細に標準化された操作手順を持っている。標準化された操作手順には、分析の適正な検証と患者のサンプルを分析する前に使用する装置が含まれる。一般に、分析値および装置を校正および検証するために、プロテインＣのレベルが既知のヒト血漿標準血漿を使用する。これら既知の標準を用いて、分析結果の測定日間および測定日内の変動を１０％ＣＶ未満にする。
【００６６】
ヒト血漿プロテインＣレベルの正常値（１００％）の測定
ヒト血漿プロテインＣレベルの正常値（１００％）は、プールされた正常な血漿サンプルにおけるヒト血漿プロテインＣの量によって定義される。このプールされた正常なヒト血漿サンプルは、確立されたＷＨＯ国際標準（プールされたクエン酸添加血漿１ｍＬ）である。これは、商業的に入手可能なプロテインＣ診断用キットの一部としても提供されている。これは、一般に２０〜１００人以上の健常者のドナーのクエン酸血漿を混合することによって調製されたものである。次いで、このプールされた血漿を少量ずつ分けて、通常は１ｍＬの凍結乾燥されたまたは凍結された液体として、有効期限を記したバイアル中で保存する。
【００６７】
ヒト血漿プロテインＣの正常範囲の測定
ヒト血漿プロテインＣの正常範囲は、通常、臨床スタッフによって、患者の臨床診断を行う目的でヒト血漿プロテインＣレベルを測定するための検証の一部として、各実験室によって測定される。その正常範囲は、プロテインＣ分析を行うために使用した診断用キット／方法および装置によって、実験室の間で若干異なる。標準濃度曲線は、提供された標準および診断用キットおよび装置に添付された手順を用いて決定する。正常範囲は、血液凝固反応に影響を及ぼし得る薬物を服用していない約３０〜１２０人の健常者のドナーから得られたクエン酸添加血漿サンプルにおけるプロテインＣの濃度を測定することによって決定する。正常範囲の下限または上限は、平均（その範囲が正規分布の場合）または中央値（その範囲が正規分布でない場合）からの２つ標準偏差を用いて決定する。成人のヒト（＞１８歳以上）の正常範囲の下限は、通常、プールされた正常な血漿の約６０〜８０％である。成人のヒト（＞１８歳以上）の正常範囲の上限は、通常、約１４０〜１８０％である。正常な新生児は、通常、正常な成人の約３０〜４０％の血漿プロテインＣのレベルである。１歳までに、正常な子供の血漿プロテインＣレベルは、正常な成人のおよそ下限に達する。即ち、子供の正常範囲は成人の正常範囲と異なり、独立に決定する必要がある。
【００６８】
製造例１
ヒトＰＣＺの製造
組換えヒトＰＣＺをヒト腎臓２９３細胞中で、例えばＹａｎにより米国特許第４，９８１，９５２号に述べられるような当業者に周知の技術によって製造した。該特許文献の全内容は本明細書の一部を構成する。ヒトプロテインＣをコードする遺伝子は、Ｂａｎｇらの米国特許第４，７７５，６２４号に開示され、クレームされている。該特許文献の全内容は本明細書の一部を構成する。ヒトプロテインＣを２９３細胞において発現するのに用いたプラスミドは、Ｂａｎｇらの米国特許第４，９９２，３７３号に開示されているプラスミドｐＬＰＣである。該特許文献の全内容は本明細書の一部を構成する。プラスミドｐＬＰＣの構築はまた欧州特許公開第０４４５９３９号、及び、Ｇｒｉｎｎｅｌｌら（１９８７年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第５巻、第１１８９〜１１９２頁にも記載され、これらの全内容も本明細書の一部を構成する。簡単に言うと、該プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトし、その後、安定な形質転換体を同定し、無血清培地において二次培養及び生育させた。培養後、細胞を含有しない培地をミクロフィルター濾過により得た。
【００６９】
ヒトプロテインＣは、Ｙａｎ（米国特許第４，９８１，９５２号、その全内容は本明細書の一部を構成する）の技術を適用することにより培養液より分離した。清澄化した培地は、ＥＤＴＡ中で４ｍＭとした後、陰イオン交換樹脂（Ｆａｓｔ−ＦｌｏｗＱ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に吸着させた。４カラム容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）、及び、２カラム容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、結合した組換えヒトＰＣＺを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ７．４）で溶出した。溶出されたタンパク質の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による溶出後の純度は９５％より大きかった。
【００７０】
さらなるタンパク質の精製は、タンパク質をＮａＣｌ中に３Ｍにした後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ７．４）で平衡化した疎水性相互作用樹脂（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌフェニル６５０Ｍ，ＴｏｓｏＨａａｓ）に吸着させることにより達成された。２カラム容量のＣａＣｌ２を含まない平衡化バッファーで洗浄した後、組換えヒトプロテインＣを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）で溶出した。
【００７１】
溶出したタンパク質から残存カルシウムを除くことにより活性化に備えた。組換えヒトプロテインＣを、カルシウムを除くため金属アフィニティーカラム（Ｃｈｅｌｅｘ−１００，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に通し、再び陰イオン交換体（Ｆａｓｔ ＦｌｏｗＱ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に吸着させた。これら両方のカラムは連続して配置され、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で平衡化した。タンパク質を載せた後、Ｃｈｅｌｅｘ−１００カラムを系から外す前に、１カラム容量の同じバッファーで洗浄した。陰イオン交換カラムを３カラム容量の平衡バッファーで洗浄した後、４００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ６．５）で溶出した。組換えヒトＰＣＺおよび組換えａＰＣ溶液のタンパク質濃度をＵＶ２８０ｎｍ吸光度Ｅ０．１％＝各々１．８５または１．９５で測定した。
【００７２】
製造例２
組換えヒトＰＣＺの活性化
ウシトロンビンを、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）の存在下、４℃で活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合した。結合反応は、前もってカラムに詰められた樹脂に対して、およそ５０００ユニットトロンビン／ｍＬ樹脂を使用して行った。トロンビン溶液をおよそ３時間カラムに循環させた後、ＭＥＡを０．６ｍＬ／ｌの濃度で循環溶液に添加した。樹脂上の未反応アミンの完全なブロックを保証するため、ＭＥＡ含有溶液をさらに１０〜１２時間循環させた。ブロックに続いて、トロンビン結合樹脂を１０カラム容量の１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．５）で、全ての非特異的結合タンパク質を除くため洗浄し、活性化バッファーで平衡化した後、活性化反応において使用した。
【００７３】
精製ＰＣＺをＥＤＴＡ中に５ｍＭとし（残存するカルシウムを全てキレート化するため）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）または２０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ６．５）で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。この材料を、３７℃で５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）または２０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ６．５）の一方で平衡化したトロンビンカラムに通した。流速は、ＰＣＺとトロンビン樹脂の間の接触時間がおよそ２０分となるように設定した。流出物を集め、即座にアミド分解性について分析した。もし材料が、確立された標準ａＰＣに匹敵する特異的活性（アミド分解性）を有していなければ、完全にＰＣＺを活性化するため、それを再度トロンビンカラムに循環させた。これに続いて、次の製造工程に進むまでの間、ａＰＣをより低い濃度に保つため上述のように７．４〜６．０の間のいずれかの値のｐＨを有する（自己消化を防ぐため、低いｐＨの方が好ましい）２０ｍＭバッファーによる材料の１：１溶出を行った。
【００７４】
浸出したトロンビンをａＰＣ材料から除くことは、ａＰＣを１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む活性化バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）または好ましくは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ６．５）のどちらか一方）で平衡化した陰イオン交換樹脂（Ｆａｓｔ−ＦｌｏｗＱ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合することにより達成した。トロンビンはカラムを通過し、２〜６カラム容量の２０ｍＭ平衡化バッファーよりなる洗浄の間に溶出する。結合したａＰＣは、５ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸（ｐＨ６．５）または２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）のどちらか中における、４００ｍＭ ＮａＣｌを用いたステップ勾配で溶出される。より多い容量によるカラムの洗浄によって、より完全なドデカペプチドの除去が促進された。このカラムより溶出された材料を凍結溶液（−２０℃）または凍結乾燥粉末のどちらかにより保存した。
【００７５】
ａＰＣのアミド分解性活性（ＡＵ）は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−７４００ダイオードアレイ分光光度計を用いた、Ｋａｂｉ Ｖｉｔｒｕｍより購入した合成基質Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２３８）からのｐ−ニトロアニリンの解離により測定した。１ユニットのａＰＣは、ｐ−ニトロアニリンの４０５ｎｍにおける吸光係数として９６２０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、２５℃、ｐＨ７．４において１分間で１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを解離するのに必要とされる酵素量として定義した。
【００７６】
ａＰＣの抗凝固活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）凝固分析における凝固時間の延長を測定することにより決定した。プロテインＣ濃度が１２５〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の希釈溶液（１ｍｇ／ｍＬ放射免疫検定グレードＢＳＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３）で標準曲線を作成し、試料をこの濃度範囲のいくつかの希釈度で用意した。各試料を含むキュベットに、５０μｌの冷ウマ血清及び５０μｌの再構成活性化部分トロンボプラスチン時間試薬（ＡＰＴＴ試薬、Ｓｉｇｍａ）を添加し、３７℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、５０μｌの適当な試料またはスタンダートを各キュベットに添加した。基礎凝固時間を決定するため、試料またはスタンダートに代えて希釈バッファーを使用した。ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ（ＣｏＡ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌａｂｏｒ）のタイマーは、各試料またはスタンダートに３７℃で、５０μｌの３０ｍＭ ＣａＣｌ２を添加すると同時にスタートさせた。試料中のａＰＣ濃度は、標準曲線の線形回帰方程式（ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ）より計算した。ここで報告される凝固時間は、標準曲線の試料も含めて、最低３回の実験の平均である。
【００７７】
上記の記述は、当業者に、本明細書に記載された凝固亢進状態または後天性プロテインＣ欠乏症の処置において使用するためのＰＣＺおよびａＰＣの製造を可能にするものである。
【００７８】
実施例１
ａＰＣのヒト血漿レベル
６人のヒト患者に、２４時間以上の期間にわたって１ｍｇ／ｍ２／時間または約０．０２４ｍｇ／ｋｇ／時間でａＰＣの静脈内点滴を与えた。投与されたａＰＣは、１０ｍｇ ａＰＣ、５ｍＭ Ｔｒｉｓ酢酸バッファー及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む、２ｍＬの水で再構成されｐＨ６．５に調整された凍結乾燥製剤であった。
【００７９】
ａＰＣの血清濃度は免疫捕捉−アミド分解分析を用いて測定した。クエン酸抗凝固物質、及び、ａＰＣの可逆的阻害剤であるベンズアミジンの存在下で血液を集めた。酵素は血漿から、マイクロタイタープレートに固定したａＰＣの特異的マウスモノクローナル抗体Ｃ３により捕捉した。洗浄により阻害剤を除去し、アミド分解活性またはａＰＣは、オリゴペプチド色原体基質を用いて測定した。３７℃で１６〜２０時間インキュベーションした後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、加重線状曲線−適合アルゴリズム（Ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔｔｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によりデータを分析した。ａＰＣの濃度は、０〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲の標準曲線から推定した。分析の定量限界は１．０ｎｇ／ｍＬであった。ａＰＣの用量レベル及び血漿濃度は約２４時間の時点で測定した。０．０２４ｍｇ／ｋｇ／時間の用量は２４時間で約５０ｎｇ／ｍＬの血漿濃度を与える。
【００８０】
実施例２
敗血症ヒト患者における２重盲プラシーボコントロール試験、第１期
このプロトコルは、２期にわたる、重度の敗血症ヒト患者における２重盲プラシーボコントロール試験である。第１期では、総数７２人の患者に４８時間にわたって組換えヒトａＰＣを点滴した。
【００８１】
参加基準は、一般に受け入れられている敗血症の基準（心拍数、呼吸運動、体温の上昇／降下、白血球数の増加／減少）のうち３つを含むことであった。患者はまた、冠血栓、尿素排出の減少または低酸素血症のどれかとして定義される臓器不全を示していることが求められた。４つの異なる用量を使用した；１２、１８、２４、３０μｇ／ｋｇ／時間。ａＰＣを４８時間かけて連続点滴法により点滴した。この試験の第１の終了点は；用量及び用量の継続時間の関数としての安全性、及び、用量及び用量の継続時間の関数としての凝固障害を正すａＰＣの能力を示すことであった。
【００８２】
死亡率情報には、全ての用量が、他に特に指定がない限り含まれる。本試験において観察されるプラシーボ死亡率が予想されるプラシーボ死亡率と一致していることは重要である。全てにおいて死亡率が求めれた２８日目が、プラシーボを与えられた患者対ａＰＣを与えられた患者における終了点であった。
【００８３】
全体で観察されたプラシーボ死亡率は３８％（１０／２６）であり、全体で観察されたａＰＣ死亡率は２０％（９／４６）であった。ａＰＣの用量が多い方からの２つのみ（２４及び３０μｇ／ｋｇ／時間）を含むサブグループ対プラシーボ患者では、観察された死亡率は１３％（３／２４）であった。
【００８４】
第２のサブグループ分析には、６０％よりも低い基準プロテインＣ活性として定義される後天性プロテインＣ欠乏症の患者を含んでいた。基準プロテインＣ活性のデータが入手可能であった６４患者のうち６１患者、すなわち９５％は、試験段階に入る時点で後天性プロテインＣ欠乏症を患っていた。プロテインＣ欠乏症患者におけるプラシーボで観察される死亡率は４１％（９／２２）であり、プロテインＣ欠乏症患者におけるａＰＣで観察される死亡率は１８％（７／３９）であった。
【００８５】
ａＰＣによる治療が重度の敗血症患者で有利であることを示唆する明瞭なデータとしては、プラシーボ患者と処置患者が死亡する平均時間がある。プラシーボグループで死亡した１０人の患者における死亡した平均時間は６日間であった。ａＰＣ処置患者では、死亡した平均時間は１４日間であった。さらに、ａＰＣ闘病処置で死亡した９人の患者のうち４人は２１日、あるいはそれよりも長く生き残り、その後、最初の敗血症の症状とは無関係な症状で死亡した。遅れて死亡した４人のうちの２人は、低用量のグループ（１２μｇ／ｋｇ／時間）で起こった。これら両方の患者はＩＣＵに残り、死亡するまでの全試験の間（２７日間）、機械的肺換気を行っていた。遅れて死亡した他の２人は、高用量のグループ（３０μｇ／ｋｇ／時間）に属した。これら両方の患者は最初改善が見られた。２週間内に、両方が機械的肺換気を外されＩＣＵから移された。１人は１週間後、敗血症により誘導された呼吸障害により、受け入れられた「蘇生術を希望せず（ＤＮＲ）」との希望を表明した後、亡くなった。第２の患者は、敗血症の第２の症状に関連した肺不全の症状を患って２８日後に亡くなった。この患者もまたＤＮＲを希望しており、そのため再挿管しなかった。重度の敗血症の第２の症状を示した患者を再度ａＰＣで処置することは２８日間の試験中、治療プロトコル下では認められていなかったことに留意すべきである。
【００８６】
この試験における死亡に関する情報は驚くべきもので、そして予想されないものであった。２８日間にわたる全死亡率のこのような顕著な減少のデータを示した２重盲プラシーボコントロール敗血症試験は他にない。
【００８７】
本治療方法を実施するためのＰＣＺおよびａＰＣの投与は、各々選択された化合物（ＰＣＺおよび／またはａＰＣ）の有効量をその治療を必要とする患者に投与することによって行う。個々の化合物の有効量、適当な投与レジメは、その症例に関わっている医師による最終的な分析において決定されるが、処置される正確な疾患、その疾患の重篤度および患者が患っているその他の疾患または状態、具体的な投与経路、その患者が同時に必要とし得るその他の薬物、そして、勿論医師の判断におけるその他の因子等の因子に依存する。
【００８８】
好ましくは、ａＰＣは、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量で、約２４〜約１４４時間点滴することにより投与される。より好ましくは、ａＰＣの投与量は、約４μｇ／ｋｇ／時間〜約４８μｇ／ｋｇ／時間である。さらにより好ましくは、ａＰＣの投与量は、約６μｇ／ｋｇ／時間〜約４４μｇ／ｋｇ／時間；約８μｇ／ｋｇ／時間〜約４０μｇ／ｋｇ／時間；約１０μｇ／ｋｇ／時間〜約３６μｇ／ｋｇ／時間；約１２μｇ／ｋｇ／時間〜約３４μｇ／ｋｇ／時間；約１４μｇ／ｋｇ／時間〜約３０μｇ／ｋｇ／時間；約１６μｇ／ｋｇ／時間〜約２４μｇ／ｋｇ／時間；約１８μｇ／ｋｇ／時間〜約２０μｇ／ｋｇ／時間；約６μｇ／ｋｇ／時間〜約２２μｇ／ｋｇ／時間；または約１０μｇ／ｋｇ／時間〜約２０μｇ／ｋｇ／時間；または約５μｇ／ｋｇ／時間〜約２５μｇ／ｋｇ／時間；または約５μｇ／ｋｇ／時間〜約３０μｇ／ｋｇ／時間である。好ましいＰＣＺの投与量は、約４μｇ／ｋｇ／時間〜約８００μｇ／ｋｇ／時間；約２０μｇ／ｋｇ／時間〜約６００μｇ／ｋｇ／時間；４０μｇ／ｋｇ／時間〜約４００μｇ／ｋｇ／時間；６０μｇ／ｋｇ／時間〜約１２０μｇ／ｋｇ／時間；８０μｇ／ｋｇ／時間〜約２００μｇ／ｋｇ／時間；または１００μｇ／ｋｇ／時間〜約１５０μｇ／ｋｇ／時間；または約２５μｇ／ｋｇ／時間〜１００μｇ／ｋｇ／時間（点滴のみ）であり、より好ましくは約４０μｇ／ｋｇ／時間〜約８０μｇ／ｋｇ／時間（点滴）であり；および最も好ましくは約９０μｇ／ｋｇ／時間、点滴のみである。あるいは、ボーラスもまた、点滴前または点滴後の種々の間隔で投与してもよい。ボーラスは、好ましくは約２５〜１００μｇ／ｋｇ／時間〜約５００μｇ／ｋｇ／時間（ボーラスの後点滴）；または約２００μｇ／ｋｇ〜２０００μｇ／ｋｇ（１日１回）である。
【００８９】
医師は、好ましいＰＣＺおよび／またはａＰＣ血漿レベルを達成するためにＰＣＺおよびａＰＣを投与することができる。医師が迅速なａＰＣ血漿レベルを望む場合、ａＰＣをボーラスでまたは量を増加させて投与する。ａＰＣはまた、患者がＰＣＺに応答しないと思われる場合には、患者がＰＣＺのａＰＣへの変換することができないことが認識されまたは証明されているであろうから、好ましい。好ましいプロテインＣレベルの範囲の例としては、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１８０ｎｇ／ｍＬ； 約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１６０ｎｇ／ｍＬ； 約２５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ；約３０ｎｇ／ｍＬ〜約１４０ｎｇ／ｍＬ；約４０ｎｇ／ｍＬ〜約１２０ｎｇ／ｍＬ；約４０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ；および約４０〜約８０ｎｇ／ｍＬが挙げられる。さらに、好ましい用量および血漿の範囲を本明細書に記載したが、ＰＣＺおよび／またはａＰＣの種々のボーラスを種々の間隔で、医師の判断で好ましいように使用することができる。
【００９０】
非特許文献および特許文献に記載されたａＰＣおよびＰＣＺの投与レジメの例に関して、表Ｉはヒトまたは非ヒト霊長類における種々の試験の標準化用量レベルを記載する。ヒトの試験は血漿由来ＰＣＺを用いて行い、非ヒト霊長類の試験は組換えヒトａＰＣを用いて行った。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
【表２】
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【００９３】
【表３】
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【００９４】
【表４】
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【００９５】
【表５】
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【００９６】
本発明の別の態様は、有効量のＰＣＺおよびａＰＣを含有する医薬製剤である。ａＰＣおよびＰＣＺは製薬的に有用な組成物を製造するための既知の方法にしたがう製剤において一緒に製剤化することができる。好ましくは、ａＰＣおよびＰＣＺ製剤は、塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウムまたは塩化カリウム；増量剤、好ましくはスクロース、マンニトール、デキストラン、トレハロースまたはラフィノース；および緩衝剤、好ましくはリン酸または塩化ナトリウム緩衝剤、および最も好ましくはトリス−酢酸塩、クエン酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムおよびそれらの組合せから選択される緩衝剤、を含む、から本質的になる、またはからなる。アルブミン等の安定化剤もまた添加してもよい。ＰＣＺおよびａＰＣの自己分解と防止または減少させるために、変性剤の存在下で精製および／または製剤化を行ってもよい。例えば、約３Ｍの濃度の尿素を使用することができる。製剤は、好ましくは凍結乾燥された製剤である。活性成分は任意の比率であってよく、例えば、好ましいＰＣＺ：ａＰＣの比率としては、ＰＣＺ５重量％：ａＰＣ９５重量％；ＰＣＺ１０重量％：ａＰＣ９０重量％；ＰＣＺ１５重量％：ａＰＣ８５重量％；ＰＣＺ２０重量％：ａＰＣ８０重量％；ＰＣＺ２５重量％：ａＰＣ７５重量％；ＰＣＺ３０重量％：ａＰＣ７０重量％；ＰＣＺ３５重量％：ａＰＣ６５重量％；ＰＣＺ４０重量％：ａＰＣ６０重量％；ＰＣＺ４５重量％：ａＰＣ５５重量％；およびＰＣＺ５０重量％：ａＰＣ５０重量％；ＰＣＺ６０重量％：ａＰＣ４０重量％；ＰＣＺ７０重量％：ａＰＣ３０重量％；ＰＣＺ８０重量％：ａＰＣ２０重量％；ＰＣＺ９０重量％：ａＰＣ１０重量％；ＰＣＺ９５重量％：ａＰＣ５重量％；ＰＣＺ９９重量％：ａＰＣ１重量％が挙げられる。
【００９７】
本製剤は、周知および容易に入手できる試薬を用いて、既知の方法により製造する。好ましくは、ＰＣＺおよびａＰＣを非経口的に投与して、有効な形態での血流への送達を確実にする。好ましくは、ａＰＣおよびＰＣＺは、本明細書の開示にしたがって製剤化することができる。ａＰＣ／ＰＣＺ確定混合物は、費用の節約および投与の利便性やコンプライアンスを含む様々な有用性がある。ａＰＣまたはＰＣＺいずれかのバイアルまたはその他容器は、その活性成分の少量を取るために必ずしも口が開いていなくてもよく、したがって、その活性成分の残りは不安定または使用不能になる。この確定混合物はさらに、混合および／または複数回投与を省くことによって時間を節約できる。混合時のミスも減る。
【００９８】
実施例３　ａＰＣ／ＰＣＺの製剤化
ａＰＣの安定な凍結乾燥製剤を、約２．５ｍｇ／ｍＬのａＰＣまたはＰＣＺ、約１５ｍｇ／ｍＬのスクロース、約２０ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、および５．５よりも高く６．５よりも低いｐＨのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む溶液を凍結乾燥することを含む製造方法によって製造した。さらに、ａＰＣおよびＰＣＺの安定な凍結乾燥製剤は、約５ｍｇ／ｍＬのａＰＣおよびＰＣＺ、約３０ｍｇ／ｍＬのスクロース、約３８ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、５．５よりも高くおよび好ましくは６．５よりも低い ｐＨのクエン酸緩衝液を含む溶液を凍結乾燥することを含む。
【００９９】
ａＰＣ：ＰＣＺ：塩：増量剤（ｗ：ｗ：ｗ）の割合は、凍結乾燥製造法に適した製剤化における重要な因子であると考えられている。その割合は、ａＰＣ／ＰＣＺ、塩の選択と濃度、および増量剤の選択と濃度によって変化する。具体的には、約１のａＰＣ／ＰＣＺに対し、塩が約７．６、増量剤が約６の割合が好ましいと考えられる。
【０１００】
非経口投与、好ましくは皮下投与または継続静脈内点滴による投与に適したａＰＣ／ＰＣＺの単位投与製剤は、ａＰＣ、ＰＣＺ、ＮａＣｌ、スクロース、およびクエン酸ナトリウム緩衝液を混合することにより製造する。混合したのち、４ｍＬの溶液を単位投与量の容器に移し、凍結乾燥する。その処置を必要とする患者に約０．０２ｍｇ／ｋｇ／時間〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与量を投与するのに適した、約５ｍｇ〜約２０ｍｇのａＰＣ／ＰＣＺを含む単位投与量容器を密閉し、使用するまで保存する。
【０１０１】
実施例４　ａＰＣ／ＰＣＺ製剤
非経口投与に適したａＰＣおよびＰＣＺの単位投与剤型は、ａＰＣ０．５ｍｇ、ＰＣＺ１．０ｍｇ、ＮａＣｌ９０ｍｇ、マンニトール１００ｍｇ、ヘパリン５０ＵＳＰ、アミノ酢酸２２．５ｍｇ、およびヒト血清アルブミン２５ｍｇを混合することによって製造する。混合した後、この溶液１０ｍＬを単位投与剤型の容器に移し、凍結乾燥する。この単位投与剤型を密閉する。
【０１０２】
実施例５　ａＰＣ／ＰＣＺ製剤
非経口投与または継続点滴に適したａＰＣおよびＰＣＺの単位投与剤型は、ａＰＣ１．０ｍｇ、ＰＣＺ１．０ｍｇ、ＮａＣｌ９０ｍｇ、マンニトール１００ｍｇ、ヘパリン５０ＵＳＰ、アミノ酢酸２２．５ｍｇ、およびヒト血清アルブミン２５ｍｇを混合することによって製造する。混合した後、この溶液１０ｍＬを単位投与剤型の容器に移し、凍結乾燥する。この単位投与剤型を密閉する。ａＰＣ：ＰＣＺの比率がａＰＣ１〜９９重量％〜ＰＣＺ１〜９９重量％で変わる場合、同じ実験操作を反復してよい。
【０１０３】
実施例６　ａＰＣ／ＰＣＺ製剤
ａＰＣ／ＰＣＺの安定な凍結乾燥製剤は、ａＰＣ約０．１２５ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約２．３７５ｍｇ；またはａＰＣ約０．２５ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約２．２５ｍｇ；またはａＰＣ約０．５ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約２．０ｍｇ；またはａＰＣ約０．７５ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約１．７５ｍｇ；またはａＰＣ約１．０ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約１．５ｍｇ；またはａＰＣ約１．２５ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約１．２５ｍｇ；またはａＰＣ約１．５ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約１．０ｍｇ；またはａＰＣ約１．７５ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約０．７５ｍｇ；またはａＰＣ約２．０ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約０．５ｍｇ；またはａＰＣ約２．２５ｍｇ／ｍＬおよびＰＣＺ約０．２５ｍｇ；またはＰＣＺ約２．４７５ｍｇおよびａＰＣ約０．２５ｍｇを含む溶液を凍結乾燥することを含む製造方法により製造することができる。ａＰＣおよびＰＣＺは、スクロース約１５ｍｇ／ｋｇ；ＮａＣｌ約２０ｍｇ／ｍＬ、および ｐＨ５．５〜６．５のクエン酸ナトリウム緩衝液と組み合わせる。さらに、ａＰＣ／ＰＣＺの安定な凍結乾燥製剤は、ａＰＣ約５ｍｇ／ｍＬとＰＣＺ（約９９％ＰＣＺ：約１％ａＰＣ〜１％ＰＣＺ：９９％ａＰＣの間のすべての比率で）、スクロース約３０ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌ約３８ｍｇ／ｍＬ、および ｐＨ５．５〜６．５のクエン酸緩衝液含む溶液を凍結乾燥することを含む。
【０１０４】
凍結乾燥顕微鏡術は凍結乾燥をするために凍結した溶液の崩壊（ｃｏｌｌａｐｓｅ）温度を決定するためには有用な技術である。ＤＳＣは凍結した溶液のガラス転移温度（Ｔｇ’）を決定するために有用な技術である。崩壊温度およびガラス転移温度は凍結乾燥工程の間に安全に使用できる温度の上限を予測するために特に有用である。凍結乾燥顕微鏡術の結果はＤＳＣによって得られるＴｇ’値のガラス転移温度と符合する。−４０℃またはそれより上の崩壊温度は、通常の凍結乾燥機で処理すべき試料について最適である。
【表６】
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【０１０５】
ａＰＣ／ＰＣＺ対スクロース対塩化ナトリウムの比率（１０ｍＭまたは２０ｍＭ−クエン酸塩緩衝液中）は崩壊温度およびガラス転移温度に影響を与える重要な製剤用変数であると考えられている。通常の凍結乾燥機で処理するためには、塩化ナトリウム濃度は凍乾剤製法の凍結工程の間に塩化ナトリウムが晶出を起こすために十分に高い濃度（好ましくは２．５ｍｇ／ｍＬのａＰＣ／ＰＣＺ製剤については３２５ｍＭおよび５ｍｇ／ｍＬのａＰＣ／ＰＣＺ製剤については６５０ｍＭ）でなければならない。ａＰＣ／ＰＣＺの製剤は通常の凍結乾燥機で処理すれば重量比で１部のａＰＣ／ＰＣＺ、６部のスクロースおよび７．６部の塩化ナトリウムから構成される凍結乾燥製品を製造できる。当業者は、ＰＣＺをａＰＣに関して開示した実施例と同様に製剤化することができることをここに理解するであろう。ａＰＣ：ＰＣＺの混合比率は、重量比で、６部のスクロース、７．６部の塩化ナトリウムに対して、好ましくは約１部のａＰＣおよびＰＣＺである。
【０１０６】
実施例７　種々の増量剤を含有する製剤製品におけるａＰＣの安定性
分子安定性に対する様々な増量剤の効果を検討するため、ａＰＣの製剤を調製した。塩を含有しない燐酸緩衝液中のａＰＣに合計６種の添加剤を加えた。これらの増量剤はグリシン、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラフィノース、およびヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）である。燐酸塩中、無塩、無増量剤製剤（「対照」）でのａＰＣの安定性を増量剤添加製剤での安定性と比較した。試料は５０℃、４０℃、および２５℃で様々な長さの時間貯蔵した。これらの試料の分析データを初期値（時間＝０）と比較した。ＡＰＴＴ力価、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛋白質含量検定法を使用して製剤の物理学的および化学的安定性を評価した。
【０１０７】
ａＰＣの製剤はａＰＣを燐酸緩衝液にａＰＣ５ｍｇ／ｍＬまで溶解することによって調製した。増量剤は６：１の比率（増量剤対ａＰＣ）または３０ｍｇ／ｍＬでａＰＣ溶液の一部に添加した。これらの試料を凍結乾燥してａＰＣ５ｍｇ／バイアルとした。
【０１０８】
これらの製剤は５０℃で１４日間および２８日間；４０℃で２８日間、４８日間および６ケ月間；および２５℃で６ケ月間および１２ケ月間；にわたる安定性試験を行った。各時点において、各製剤のバイアル２個を別個の試料として独立に分析し、これらの試料から得たデータを初期値（時間＝０）と比較した。分析には、ａＰＣ力価（ＡＰＴＴ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ａＰＣモノマーの百分率、および蛋白質含量を含めた。
【０１０９】
【表７】
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【０１１０】
【表８】
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【０１１１】
【表９】
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【０１１２】
【表１０】
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【０１１３】
ｐＨ、色、包装特性および物理的外観にはどの試料にも１年の安定性試験期間内に顕著な変化は認められなかった。ＡＴＰＰおよびＳＥ−ＨＰＬＣ操作で分析すると、ＨＥＳ製剤およびグリシン製剤は対照と比較して物理学的安定性（凝集による）および化学的安定性（力価）が低かった。マンニトール製剤は対照と比較すると僅かに良好な物理学的および化学的安定性を示したが、その他の製剤、すなわちスクロース、トレハロースおよびラフィノースの製剤は全て対照と比較してはるかに優れた物理学的および化学的な安定性を示した。それ故、ａＰＣ製剤における増量剤としてのマンニトール、スクロース、トレハロースおよびラフィノースは増量剤不含またはグリシンまたはＨＥＳを有するａＰＣ製剤と比較して化学的および物理学的に優れた安定性を示す。アルブミンまたは同様の周知の医薬用添加剤を添加して、例えば安定性を改善することができる。
【０１１４】
実施例８
組換えヒトａＰＣの安定性
組換えヒトａＰＣの凍結乾燥製剤２ロットを４０℃／相対湿度７５％で１ケ月貯蔵後、分解の可能性について分析した。ａＰＣの安定性は無菌水で再構成し、常温で７２時間まで貯蔵したものについても観察した。バイアル中の凍結乾燥ａＰＣ製品はａＰＣ１０ｍｇ、スクロース６０ｍｇ、塩化ナトリウム７６ｍｇ、およびクエン酸塩１５．１ｍｇを含有していた。この製剤中のａＰＣは乾燥状態では４０℃／相対湿度７５％で短くとも１ケ月間は安定であって、溶液中では常温で貯蔵した時には２４時間安定である。
【０１１５】
両ロットはバイアル当りａＰＣ１０ｍｇ、スクロース６０ｍｇ、塩化ナトリウム７６ｍｇおよびクエン酸塩１５．１ｍｇを含有する同一の単位処方を使用して製造した。ａＰＣの両凍結乾燥ロットは４０℃／相対湿度７５％で１ケ月間貯蔵後にＡＰＴＴ検定、ａＰＣペプチドを定量するためのイオン対形成ＨＰＬＣ、および蛋白質変化体を定量するための質量分析を使用してａＰＣの安定性を観察した。ロットの一つは無菌水を使用してａＰＣ１ｍｇ／ｍＬに再構成し、常温に保持した。溶液中におけるａＰＣの安定性は０時間、１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間の時点でＡＰＴＴおよび質量スペクトル術を使用して観察した。
【０１１６】
乾燥状態では４０℃／相対湿度７５％で１ケ月間の貯蔵後にａＰＣ活性の低下は認められず、また分子構造の分解量は有意でなかった。この製剤中のａＰＣは約１ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬで再構成後、２４時間まで安定である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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