(57)【要約】複素環式誘導体を含む核酸標識化合物が、開示される。化合物を含む複素環式誘導体が、複素環式誘導体と環状基を縮合することにより合成される（例えば、リボフラノース誘導体）。標識化合物は、核酸の内部、または末端のどちらかに対する酵素の結合について適切であり、核酸検出の機構を提供する。標識化合物であるさらなる化合物を提供し、増加する溶解性を有する化合物を提供し、これは、遺伝子発現のモニターについてその化合物をより有用にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）を有する核酸標識化合物であって：
【化１】
2006515863.tif 000027
ここで、Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１またはＣＨＲ２であって、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリルであり；  Ｙは、Ｈ、Ｎ３、Ｆ、ＯＲ９、ＳＲ９またはＮＨＲ９であって、ここで、Ｒ９はＨ、アルキルまたはアリルであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここで、Ｒ１０はＨ、アルキルまたはアリルであり；
Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１またはＣ≡Ｃ−Ｒ１１であって、ここで、Ｒ１１は−Ｏ−、アミノ、チオ、カルボニル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、チオおよびアミノアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；
そしてＭは、結合基であって、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、ここで、Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１であって、ここで、Ｒ１１は、アルキル、アルコキシ、アリール、官能アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、チオおよびアミノアルキルである、化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物であって、ここで、Ｒ１１は、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２であり、Ｒ１２は、結合、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、アルコキシ、チオおよびアミノアルキルである、化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物であって、ここでＡは、ＨまたはＨ４Ｏ９Ｐ３−からなる基から選択され；ＸはＯであり；ＹはＨまたはＯＲ９であって、ここでＲ９は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここでＲ１０は、Ｈ、アルキルもしくはアリールである、化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物であって、ここで、Ｑは、ハプテン、発蛍光団、金属キレーター、インターカレーター、発光部分、金属凝集体、およびタンパク質からなる群から選択される、化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物であって、ここでＱは、ビオチンもしくは蛍光色素からなる群から選択される、化合物。
【請求項７】
Ｑがビオチンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｌが、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
第一のＭおよび第二のＭを有する、請求項１〜８のいずれかに１項に記載の化合物であって、
ここで、第一のＭは、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−であって第二のＭは、−ＣＯ（ＣＨ２）ｐＮＨ−であり；ここで、ｎは、約２〜約１０までの整数であって、ｐは約２〜約１０までの整数であり；およびｍは２である、化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物であって、ここで第一のＭが、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、および第二のＭが、−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−である、化合物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物であって、ここでｍが２であって、以下：
【化２】
2006515863.tif 000028
の構造を有する、化合物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物であって、ここで、ＸはＯであり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨである、化合物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物であって、ここでＱはビオチンであり、以下：
【化３】
2006515863.tif 000029
の構造を有する、化合物。
【請求項１４】
Ａが適切な対イオンを有する三リン酸基である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記対イオンが、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋である、請求項１〜［１６］のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸標識化合物と核酸を連結させることにより産生される、核酸誘導体。
【請求項１７】
相補的なプローブと結合した、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸誘導体を含むハイブリダイゼーション産物。
【請求項１８】
前記プローブがガラスチップに付着される、請求項１７に記載のハイブリダイゼ−ション産物。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸標識化合物の核酸への付着を含む、標識核酸の合成方法。
【請求項２０】
相補的なプローブと、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸誘導体をインキュベートする工程含む、核酸の検出方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記プローブが、ガラスチップに付着される、方法。
【請求項２２】
以下の構造を有する核酸標識化合物であって：
【化４】
2006515863.tif 000030
ここで、Ａは、Ｈ、または該核酸標識化合物を核酸に結合し得る官能基であり；
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１またはＣＨＲ２であって、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；
Ｙは、Ｈ、Ｎ３、Ｆ、ＯＲ９、ＳＲ９またはＮＨＲ９であって、ここで、Ｒ９はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｚは、Ｈ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここで、Ｒ１０はＨ、アルキルまたはアリールであり；
Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１またはＣ≡Ｃ−Ｒ１１であって、ここで、Ｒ１１はヒドロキシル、アミノ、チオ、カルボニル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、チオおよびアミノアルキルであり；
Ｑは、検出可能部分であり；
Ｍは、連結基であって、ここでｍは、０〜約３の範囲の整数である、
核酸標識化合物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の化合物であって、ここでＬは、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１であり、Ｒ１１はアルキル、アルコキシ、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、チオおよびアミノアルキルである、化合物。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の化合物であって、ここで、Ｒ１１は、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２であり、Ｒ１２は、結合、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、アルコキシ、チオおよびアミノアルキルである、化合物。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の化合物であって、ここで、Ａは、ＨまたはＨ４Ｏ９Ｐ３−からなる群から選択され；ＸはＯであり；ＹはＨまたはＯＲ９であって、ここでＲ９は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここでＲ１０は、Ｈ、アルキルもしくはアリールである、化合物。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の化合物であって、ここで、Ｑは、ハプテン、発蛍光団、金属キレーター、インターカレーター、発光部分、金属凝集体、およびタンパク質からなる群から選択される、化合物。
【請求項２７】
請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の化合物であって、ここで、Ｑは、ビオチンもしくは蛍光色素からなる群から選択される、化合物。
【請求項２８】
Ｑがビオチンである、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｌが、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−である、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
第一のＭおよび第二のＭを有する、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の化合物であって、ここで、該第一のＭは、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−であり、第二のＭは、−ＣＯ（ＣＨ２）ｐＮＨ−であり；ここで、ｎは、約２〜約１０までの整数であり；および、ｐは、約２〜約１０までの整数であり；およびｍは２である、化合物。
【請求項３１】
請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の化合物であって、ここで、第一のＭは、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、および第二のＭは、−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−である、化合物。
【請求項３２】
請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の化合物であって、ここでｍは２であり、以下：
【化５】
2006515863.tif 000031
の構造を有する、化合物
【請求項３３】
請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の化合物であって、ここでＸはＯであり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨである、化合物。
【請求項３４】
請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の化合物であって、ここでＱは、ビオチンであり、以下：
【化６】
2006515863.tif 000032
の構造を有する化合物。
【請求項３５】
Ａが適切な対イオンを有する三リン酸基である、請求項２２〜３４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３６】
前記対イオンが、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋である、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３７】
請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の核酸標識化合物と核酸を連結させることにより産生される、核酸誘導体。
【請求項３８】
相補的なプローブと結合した、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の核酸誘導体を含むハイブリダイゼーション産物。
【請求項３９】
前記プローブがガラスチップに付着される、請求項３８に記載のハイブリダイゼ−ション産物。
【請求項４０】
請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の核酸標識化合物を核酸へ付着させる工程を含む、標識核酸を合成する方法。
【請求項４１】
相補的なプローブとともに、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の核酸誘導体をインキュベートする工程を含む、核酸を検出する方法。
【請求項４２】
前記プローブが、ガラスチップに付着されている、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年８月１５日に提出された米国出願第１０／６４１，６７７号の一部継続出願であり、ならびに２００２年１２月５日に提出された同第１０／３１４，０１２号の一部継続出願でありであって、その全ては本明細書中に参考文献として援用される。
【背景技術】
【０００２】
病気の個体および健康な個体における遺伝子の発現は、頻繁に異なり、かつ特徴づけ可能である。そのような場合において遺伝子発現をモニターする能力は、医者に強力な診断ツールを提供する。この診断の形態は、特に、腫瘍学の領域において重要であり、癌遺伝子の過剰発現または腫瘍抑制遺伝子の過剰発現が、腫瘍発生という結果をもたらすと考えられる。Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１，４６，３−８を参照のこと。
【０００３】
例えば、標的遺伝子の転写産物である核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を計測することにより、遺伝子発現を、間接的にモニターし得る。核酸は化学的または生物化学的に検出可能部分を使用して標識され、公知の配列（ときおり本明細書でプローブとして公知）である局在化した核酸にハイブリダイズされ得る。プローブの位置での標識核酸の検出は標的遺伝子が発現していることを示す。例えば、国際出願公開第ＷＯ  ９７／２７３１７号、同第ＷＯ  ９２／１０５８８号、同第ＷＯ  ９７／１０３６５号を参照のこと。
【０００４】
核酸の標識は、代表的に検出可能基を内部位置またはの位置のどちらかに共有結合させることにより実行される。科学者は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに酵素学的に組み込まれている多数の検出可能なヌクレオチドアナログを報告している。例えば、Ｌａｎｇｅｒらは、共有結合的に結合したビオチン部分を含むｄＵＴＰおよびＵＴＰのアナログを開示した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８１，７８，６６３３−６６３７）。下に示すアナログは、一端ではピリミジン環のＣ−５位、およびもう他端にはビオチン部分に結合されるアリルアミンリンカーアームを有する。ｄＵＴＰアナログおよびＵＴＰアナログは、ポリヌクレオチドに組み込まれ、ここで、Ｒは、ＨまたはＯＨである。
【０００５】
【化７】
2006515863.tif 000002
Ｐｅｔｒｉｅらは、ｄＡＴＰアナログ、３−［５［（Ｎ−ビオチニル−６−アミノカプロイル）−アミノ］ペンチル］−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン−５’−三リン酸を開示した（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９１，２，４４１−４４６）。下に示すそのアナログは、ビオチン部分に結合されるリンカーアームを用いて３位で改変される。Ｐｅｔｒｉｅらは、その化合物について報告し、ここで、Ｒは、ニックトランスレーションによってＤＮＡに組み込まれたビオチンである。
【０００６】
【化８】
2006515863.tif 000003
Ｐｒｏｂｅｒらは、それぞれがスクシニルフルオレセイン色素を含む、４つのジデオキシヌクレオチドのセットを開示した（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８７，２３８，３３６−３４１）。ジデオキシヌクレオチド（その一つを下に示す）は、プライマーのテンプレートの特異的伸長（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を介してオリゴヌクレオチドに酵素学的に組み込まれた。化合物を、ゲル移動に基づくＤＮＡ配列決定法のために提供した。
【０００７】
【化９】
2006515863.tif 000004
Ｈｅｒｒｌｅｉｎらは、４つのＤＮＡ塩基の改変ヌクレオシド三リン酸を開示した（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９４，７７，５８６−５９６）。その化合物（その一つを下に示す）は、放射性部分または蛍光部分を含む３’アミノ基を含む。Ｈｅｒｒｌｅｉｎらは、さらに、ＤＮＡ鎖のターミネーターとして、ヌクレオシドアナログの使用について記載した。
【０００８】
【化１０】
2006515863.tif 000005
Ｃｅｃｈらは、３’アミノ官能基化ヌクレオシド三リン酸を開示した（Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６，６１，Ｓ２９７−Ｓ３００）。それらの化合物（その一つを下に示す）は、アミノリンカーを介して３’位に対して結合されるフルオレセイン色素を含む。Ｃｅｃｈらは、記述された官能基化ヌクレオシドは、ＤＮＡ配列決定のためのターミネーターとして有用であると提唱した。
【０００９】
【化１１】
2006515863.tif 000006
核酸に効果的に組み込まれ、容易に検出可能な組成物を提供する新規核酸標識化合物の開発は、遺伝子解析技術に利益をもたらす。例えば、遺伝子の発現モニターならびに変異および多型の検出およびスクリーニングにおいて補助する。そのような化合物は、酵素学的または他の手段のどちらかによって核酸への組み込みに対し適当であるべきである。さらに、標識化合物が結合した核酸は、相補的な核酸といった、プローブに対するその結合能を維持する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
プローブについての連結剤として使用するための核酸標識化合物が利用可能であるが、より有用な標識化合物であるさらなる化合物が続けて必要である。増加する溶解性を有する化合物もまた必要である。これは、遺伝子発現のモニターについてその化合物をより有用にする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、核酸標識化合物に関する。より詳細には、本発明は、検出可能部分を含む複素環式誘導体を提供する。本発明はまた、そのような複素環式誘導体を作製する方法も提供する。さらに、複素環式誘導体を核酸に結合する方法を提供する。
【００１２】
本発明の核酸標識化合物は：
【００１３】
【化１２】
2006515863.tif 000007
の一般式（Ｉ）を有し、ここで、Ｇは、ＮＨまたはＯＨであり（本明細書中で＞Ｃ＝Ｏのように表示される）、ＡはＨまたは核酸標識化合物の核酸への結合を可能にする官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨＲ２であって、ここでＲ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、アルキルまたは酵素学的もしくは例えば、化学的手段のいずれかによる酸であり；Ｙは、Ｈ、Ｎ３、Ｆ、ＯＲ９、ＳＲ９、またはＮＨＲ９であって、ここで、Ｒ９は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここで、Ｒ１０は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１、またはＣ≡Ｃ−Ｒ１１であって、ここでＲ１１は−Ｏ−、アミノ、チオ、カルボニル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、チオおよびアミノアルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり、Ｍは結合基であって、ここで、ｍは０〜約３の範囲の整数である。
【００１４】
さらに、本発明の核酸標識化合物は、酵素学的に核酸に組み込むことが可能である。化合物が結合される核酸は、相補的な核酸配列への結合能を維持する。
【００１５】
本発明の核酸標識化合物は、検出可能部分を有する複素環式誘導体である。本発明はまた、そのような複素環式誘導体の合成方法を提供する。さらに、複素環式化合物の核酸への結合方法を提供する。
【００１６】
本発明は、酵素学的に核酸への組み込みが可能な核酸標識化合物を提供する。化合物が実質的に結合される核酸は、相補的な核酸配列への結合能を維持する。
（発明の詳細な説明）
すぐに開示される発明の一般的な局面は、式（ＩＩ）：
Ａ−Ｏ−ＣＨ２−Ｔ−ＨＣ−Ｌ−（Ｍ）ｍ−Ｑ  （ＩＩ）
の核酸標識化合物を含み、ここで、Ａは、水素または核酸標識化合物の核酸への結合を可能にする官能基であり；Ｔは、テンプレート部分であり；ＨＣはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、およびＵといった塩基を包含するが、これらに限定されない複素環式基であるか；またはＨｃは存在せず；Ｌは、リンカー部分であり；Ｑは検出可能部分であり；そして、Ｍは結合基であって、ここで、ｍは０〜約５の範囲の整数である。従って、結合基は、とりわけＬおよびＱの性質に依存して必要に応じて存在し得ない。
【００１７】
一つの実施形態において、核酸標識化合物は、以下の式（ＩＩＩ）：
【００１８】
【化１３】
2006515863.tif 000008
を有する。
【００１９】
立体異性体もまた、本発明の範囲に含まれ、その二つの例は、以下：
【００２０】
【化１４】
2006515863.tif 000009
で示され、ここで、ＡはＨ、もしくは核酸標識化合物の核酸への結合を酵素学的手段または、例えば化学的手段のどちらかにより可能にする官能基であり；ＸはＯ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨＲ２であって、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；ＹはＨ、Ｎ３、Ｆ、ＯＲ９、ＳＲ９またはＮＨＲ９であって、ここでＲ９はＨ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、またはＯＲ１０であって、ここでＲ１０は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；Ｌは、リンカー基であり；Ｑは、検出可能部分であり；そして、Ｍは結合基であって、ここで、ｍは０〜約３の範囲の整数である。
【００２１】
一つの実施形態において、核酸標識化合物は、以下の式（ＩＶ）：
【００２２】
【化１５】
2006515863.tif 000010
を有する。立体異性体もまた本発明の範囲内に含まれ、その二つの例が以下：
【００２３】
【化１６】
2006515863.tif 000011
で示され、ここで、ＡはＨ、もしくは核酸標識化合物の核酸への結合を酵素学的手段または化学的手段のどちらかにより可能にする官能基であり；ＸはＯ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨＲ２であって、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立してＨ、アルキル、またはアリールであり；ＹはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ９、ＳＲ９またはＮＨＲ９であって、ここでＲ９はＨ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここでＲ１０は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；Ｌは、官能基化アルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；そしてＭは結合基であって、ここで、ｍは０〜約３の整数である。
【００２４】
別の実施形態において、連結において使用される核酸標識化合物は、例えば、下記の構造：
【００２５】
【化１７】
2006515863.tif 000012
を有し、ここでＡはＨ、または核酸標識化合物の核酸への結合を可能にする官能基であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨＲ２であって、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；ＹはＨ、Ｎ３、Ｆ、ＯＲ９、ＳＲ９、またはＮＨＲ９であって、ここで、Ｒ９は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここでＲ１０は、Ｈ、アルキル、またはアリールであって；Ｌはリンカー基であり；Ｑは検出可能部分であり；および、Ｍは結合基であって、ここでｍは０〜約３の範囲の整数である。
【００２６】
この核酸誘導体から形成されたハイブリダイゼーション産物は、相補的なプローブに結合した核酸誘導体を含む。一つの実施形態において、そのプローブはガラスチップに結合される。
【００２７】
別の実施形態において、連結において使用される核酸標識化合物は、例えば、下記の構造：
【００２８】
【化１８】
2006515863.tif 000013
【００２９】
【化１９】
2006515863.tif 000014
を有し、ここで、ＡはＨ、または核酸標識化合物の核酸への結合を可能にする官能基であり；ＸはＯ、Ｓ、ＮＲ１、またはＣＨＲ２であって、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；ＹはＨ、Ｎ３、Ｆ、ＯＲ９、ＳＲ９またはＮＨＲ９であって、ここでＲ９はＨ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここでＲ１０は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；Ｌは、官能基化アルキルであり；Ｑは、検出可能部分であり；およびＭは結合基であって、ここで、ｍは０〜約３の整数である。
【００３０】
本発明の核酸誘導体から形成されたハイブリダイゼーション産物は、相補的なプローブに結合した核酸誘導体を含む。一つの実施形態において、そのプローブはガラスチップに結合される。
【００３１】
本発明の核酸誘導体を使用して核酸を検出する方法は、プローブを有する誘導体のインキュベートを含む。一つの実施形態において、そのプローブは、ガラスチップに結合される。
【００３２】
別の実施形態において、本発明の方法は、以下：
（ａ）支持体に連結する少なくとも一つの核酸を提供する工程；（ｂ）この核酸に対して末端転移酵素を使用して連結可能な標識部分を提供する工程；（ｃ）この末端転移酵素を提供する工程；（ｄ）この標識部分を核酸へ末端転移酵素を使用して連結する工程、を包含する。
【００３３】
さらに別の実施形態において、本発明の方法は、以下の工程：（ａ）支持体に連結した少なくとも二つの核酸を提供する工程；（ｂ）上記において少なくとも二つの核酸で、通常の核酸の末端を形成する上記核酸のモノマーユニットの数を増加する工程；（ｃ）この通常の核酸の末端の認識可能な標識部分を提供する工程；（ｄ）この通常の核酸の尾部末端およびこの標識部分を接触させる工程、を包含する。
【００３４】
さらにまた別の実施形態において、本発明の方法は、以下の工程：（ａ）支持体の結合した少なくとも一つの核酸を提供する工程；（ｂ）リガーゼを使用してこの核酸に連結可能な標識部分を提供する工程；（ｃ）このリガーゼを提供する工程；（ｄ）この標識部分を、核酸にリガーゼを使用して連結する工程、を包含する。
【００３５】
本発明はまた、本明細書中に記載される化合物の式も提供する。
（定義）
「アルキル」は、炭素および水素のみを含む直鎖、分枝または環状の化学基をいう。アルキル基には、これらに限定されないが、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基および２−メチルブチル基が挙げられる。アルキル基は、置換されててないかもしくは、１つ以上の置換基（例えば、ハロゲン、アルコキシ、アミノ）で置換される。
【００３６】
「アリール」は、一価、不飽和の芳香族炭素環基をいう。アリール基には、これらに限定されないが、フェニル基、ナフチル基、アントリル基およびビフェニル基が挙げられる。アリール基は、置換されていないか、もしくは１つ以上の置換基（例えば、ハロゲン、アルコキシ、アミノ）で置換されている。
【００３７】
「アミドアルキル」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４−の構造を有する化学基をいい、ここで、Ｒ３は、水素、アルキルまたはアリールであり、Ｒ４はアルキルまたはアリールである。好ましくは、アミドアルキル基は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ５−の構造であって、ここで、ｎは約２〜約１０の範囲の整数であり、Ｒ５はＯ、ＮＲ６またはＣ（Ｏ）であって、ここで、Ｒ６は水素、、アルキルまたはアリールである。より好ましくは、アミドアルキル基は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｈ）−の構造であって、ここで、ｎは約２〜約６の範囲の整数である。最も好ましくは、アミドアルキル基は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）４Ｎ（Ｈ）−の構造である。
「アルキニルアルキル」は、−Ｃ≡Ｃ−Ｒ４−の構造を有する化学基をいい、ここで、Ｒ４は、アルキルまたはアリールである。好ましくは、アルキニルアルキル基は、−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎＲ５−の構造であって、ここで、ｎは１〜約１０の範囲の整数でありＲ５は、Ｏ、ＮＲ６またはＣ（Ｏ）であって、ここでＲ６は水素、アルキルまたはアリールである。より好ましくは、アルキニルアルキル基は、−Ｃ≡Ｃ−（ＣＨ２）ｎＮ（Ｈ）−の構造であって、ここで、ｎは１〜約４の整数である。もっとも好ましくは、アルキニルアルキルは、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２Ｎ（Ｈ）−の構造である。
【００３８】
「アルケニルアルキル」は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ４−の構造を有する化学基をいい、ここで、Ｒ４はアルキルまたはアリールである。好ましくは、アルケニルアルキル基は、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＲ５−の構造であって、ここで、ｎは１〜約１０の範囲の整数であり、Ｒ５はＯ、ＮＲ６、またはＣ（Ｏ）であって、ここで、Ｒ６は水素、アルキルまたはアリールである。より好ましくは、アルケニルアルキル基は、−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎＮ（Ｈ）−の構造であって、ここで、ｎは１〜約４の範囲の整数である。最も好ましくは、アルケニルアルキル基は、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２Ｎ（Ｈ）−の構造である。
【００３９】
「官能基化アルキル」は、−（ＣＨ２）ｎＲ７−の構造の化学基をいい、ここでｎは１〜約１０の範囲の整数であり、Ｒ７はＯ、Ｓ、ＮＨまたはＣ（Ｏ）である。好ましくは、官能基化アルキル基は、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−の構造であって、ここでｎは１〜約４の範囲の整数である。より好ましくは、官能基化アルキル基は、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−の構造である。
【００４０】
「アルコキシ」は、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ８−の構造の化学基をいい、ここで、ｎは２〜約１０の範囲の整数であり、そしてＲ８は、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＣ（Ｏ）である。好ましくは、アルコキシ基は、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−の構造であって、ここでｎは２〜約４の整数である。より好ましくは、アルコキシ基は、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−の構造である。
【００４１】
「チオ」は、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ８−の構造の化学基をいい、ここで、ｎは２〜約１０の範囲の整数であり、Ｒ８はＯ、Ｓ、ＮＨまたはＣ（Ｏ）である。好ましくは、チオ基は、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−の構造であって、ここで、ｎは２〜約４の範囲の整数である。より好ましくは、チオ基は、−ＳＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−の構造である。
【００４２】
「アミノアルキル」は、アルキル基に結合したアミノ基を有する化学基をいう。好ましくは、アミノアルキルは、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−の構造であって、ここで、ｎは約２〜約１０の範囲の整数である。より好ましくは、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−の構造であって、ここで、ｎは約２〜約４の範囲の整数である。最も好ましくは、アミノアルキル基は、−ＮＨ（ＣＨ２）４ＮＨ−の構造である。
【００４３】
「核酸」は、２個以上のヌクレオチドを含むポリマーをいい、一本鎖、二本鎖および三本鎖のポリマーが挙げられる。「ヌクレオチド」は、天然に存在する化合物と天然に存在しない化合物の両方をいい、複素環式塩基、糖、および結合基、好ましくはリン酸エステルを含む。例えば、構造基が、２’−Ｏ位におけるメチル基またはアリル基、あるいは２’−Ｏ基について置換するフルオロ基のような、ヌクレオチドのリボシル単位またはデオキシリボシル単位に加えられ得る。核酸のホスホジエステルのような結合基は、例えば、メチルホスホネートまたはＯ−メチルホスホネートで置換され得るか、または改変され得る。塩基および糖はまた、当該分野で公知であるように、改変され得る。本開示の目的について「核酸」はまた、天然または改変された核酸塩基がポリアミド骨格に結合される「ペプチド核酸」を含む。
【００４４】
句「支持体への連結」は、共有結合、水素結合、イオン相互作用、疎水相互作用もしくはその他による結合を含む、支持体への直接的な結合、または非直接的な結合を意味する。
【００４５】
「プローブ」は、標的核酸をハイブリダイゼーションによって検出するために使用され得る核酸をいう。好ましくは、プローブは、プローブの全長に沿って標的核酸に対して相補的であるが、プローブと標的との間の１個以上の塩基ミスマッチの存在下で、ハイブリダイゼーションは、起こり得る。
【００４６】
「完全一致プローブ」は、特定の標的配列と完全に相補的な配列を有するプローブをいう。試験プローブは、一般的に、標的配列の一部（部分配列）と完全に相補的である。完全一致（ＰＭ）プローブは、「実験プローブ」、「正規化コントロール」プローブ、発現レベルコントロールプローブであり得る。しかし、完全一致コントロールまたは完全一致プローブは、「ミスマッチコントロール」または「ミスマッチプローブ」とは異なる。発現観測配列の場合において、完全一致プローブは、一般的に標的核酸（例えば、特定の遺伝子）の特定の配列または部分配列に対して相補的であるように前選択（設計）される。対照的に、属差（ｇｅｎｅｒｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）スクリーニングアレイにおいて、特定の標的配列は一般的に未知である。後者の場合において、完全一致プローブは、前選択され得ない。この文脈において、  用語、完全一致プローブとは、そのプローブと、以下に示すような一つ以上の前もって選択された特定のヌクレオチドにおいて完全一致とは異なる対応する「ミスマッチコントロール」とを区別することである。
【００４７】
「ミスマッチコントロール」または「ミスマッチプローブ」は、発現モニタリングアレイにおいて、特定の標的配列に対して完全には相補的でないように故意に選択された配列を有するプローブをいう。高密度アレイにおける各ミスマッチ（ＭＭ）コントロールについて、好ましくは同じ特定の標的配列に対して完全に相補的である、対応する完全一致（ＰＭ）プローブが存在する。「一般的な」アレイにおいて（例えば、無作為の、任意の、偶然の、など）、標的核酸は未知であることから、完全一致プローブおよびミスマッチプローブは、先験的に決定され得ず、設計され得ず、または選択され得ない。この例において、プローブは、好ましくはペアとして提供され、プローブの各ペアは、一つ以上の前もって選択されたヌクレオチドにおいて異なる。従って、このペアにおけるどのプローブが、完全一致であるか先験的にはわからないが、一つのプローブが特定の標的配列に特異的にハイブリダイズする場合、そのペアの別のプローブは、その標的配列についてのミスマッチコントロールとしてふるまうことが分かる。完全一致プローブおよびミスマッチプローブがペアとして提供される必要はないことは理解されているが、特定の前もって選択されたヌクレオチドにおいて、互いに異なるプローブのより大きな収集（例えば３、４、５、またはそれ以上）として提供され得る。ミスマッチは、ミスマッチプローブにおいて任意の場所に存在し得る一方、末端のミスマッチは、標的配列のハイブリダイゼーションをそれほど阻害しないようであるからあまり望ましくない。特定の好ましい実施形態において、ミスマッチは、試験ハイブリダイゼーションの条件下で、そのミスマッチが標的配列との二重鎖を最も不安定化しそうであるようにプローブの中心またはその付近に位置する。特定の好ましい実施形態において、完全一致は、単一の中央に位置するヌクレオチドにおいてミスマッチコントロールと異なる。
【００４８】
「標識部分」は、本明細書中で論じられるか、または当該分野で公知の種々の方法により検出が可能な部分をいう。
【００４９】
基Ａは、水素または核酸標識化合物の核酸への結合を可能にする官能基のどちらかである。そのような基の非限定的な例としては、以下：モノホスフェ−ト；ジホスフェート；トリホスフェート（Ｈ４Ｏ９Ｐ）；ホスホラミダイト（（Ｒ２Ｎ）（Ｒ’Ｏ）Ｐ）、ここで、Ｒは直鎖、分枝鎖または環式アルキルであり、Ｒ’は２−シアノエチルのような保護基である；ならびに、Ｈ−ホスホネート（ＨＰ（Ｏ）Ｏ−ＨＮＲ３）、ここで、Ｒは直鎖、分枝鎖または環式アルキルである、が挙げられる。
【００５０】
複素環式基（ＨＣ）は、炭素およびヘテロ原子を含む環式部分である。本発明によって考慮される複素環式基の非限定的な例は図２に示される：４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン；１，３−ジアゾール（イミダゾール）；１，２，４−トリアジン−３−オン；１，２，４−トリアジン−３，５−ジオン；および、５−アミノ−１，２，４−トリアジン−３−オン。
【００５１】
核酸標識化合物のリンカー部分（Ｌ）が、一つの末端位置でヘテロ環（ＨＣ）に共有結合される。別の末端位置において検出可能基（Ｑ）が、直接的かまたは結合基（Ｍ）を通して結合される。核酸への組み込みに立体的および電位的に適切な構造である。リンカー部分の非限定的な例としては、アミドアルキル基、アルキニルアルキル基、アルケニルアルキル基、官能基化アルキル基、アルコキシ基、チオ基およびアミノアルキル基が挙げられる。
【００５２】
検出可能部分（Ｑ）は、シグナルを提供する化学基である。そのシグナルは、分光学的手段、光化学的手段、生物化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段を含む任意の適切な手段によって検出可能である。特定の場合において、そのシグナルは２つ以上の手段によって検出可能である。
【００５３】
検出可能部分は、直接的または非直接的にシグナルを提供する。直接のシグナルは、標識基が自発的にシグナルを放射する場合、または適切な刺激を導入してシグナルを発生する場合に発生する。３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐといった放射性標識およびＤｙｎａｂｅａｄＴＭといった磁粉は、直接的かつ自発的にシグナルを提供する基の非限定的な例である。刺激が存在する中でシグナルを直接的に提供する標識基には、下記の非限定的な例：緑色光を高能率で散乱する、コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｇｏｌｄ）（直径４０〜８０ｎｍ）；光を吸収し、続いて放出する、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミンおよび緑色蛍光タンパク質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）といった蛍光標識；化学的または生物学的反応の結果として電気的に励起し、続いて光を放出する、ルミノール、ロファイン（ｌｏｐｈｉｎｅ）、アクリジン塩およびルシフェリンといった化学発光標識または生物発光標識；電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法によって検出される、バナジウム、銅、鉄、マンガンおよびニトロキシドフリーラジカルといったスピン標識；光の特定の波形を吸収する、キノリン色素、トリアリールメタン色素およびアクリジン色素といった色素；および、有色のガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズが挙げられる（米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号を参照のこと）。
【００５４】
検出可能部分は、シグナルを自発的に発するか、または適切な刺激の導入によりシグナルを発する第二の化合物と相互作用する非直接的なシグナルを提供する。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジンとの連結を形成することによりシグナルを発生し、それから検出される。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ．  Ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｅｄ．，；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｖｏｌ．２４。ＥＬＩＳＡアッセイにおけるように標識−抗体−抗体において抗体に結合される西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼといった酵素もまた、非直接的なシグナルを発生する。
【００５５】
好ましい検出可能部分は、蛍光基である。一般的に蛍光基は、ノイズに対する高いシグナル比を発生し、それによって、検出手順において増加した解像度および感度を提供する。蛍光基は、好ましくは約３００ｎｍ以上の波長の光、より好ましくは約３５０ｎｍ以上の波長の光、最も好ましくは約４００ｎｍ以上の波長の光を吸収する。蛍光基によって放出される光の波長は、好ましくは約３１０ｎｍ以上の波長、より好ましくは約３６０ｎｍ以上の波長、最も好ましくは４１０ｎｍ以上の波長である。
【００５６】
蛍光検出可能部分は、種々の構造分類から選択され、これらには、以下の非限定的な例が挙げられる：１−アミノナフタレンおよび２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ’ジアミノスチルベン、ピレン、第四級フェナントリジン塩、９−アミノアクリジン、ｐ，ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン、アントラセン、オキサカルボシアニン、マロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビスベンズオキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフェノール（ｓｔｅｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン（ｃｈｒｏｍｅｎ）、インドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチラート、ストロファンチジン、ポルフィリン、トリアリールメタン、フラビン、キサンテン色素（例えば、フルオレセインおよびローダミン色素）；シアニン色素；４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン色素、ならびに蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質）。
【００５７】
多くの蛍光化合物は、本発明に組み入れるのに適している。このような化合物の非限定例としては、以下が挙げられる：ダンシルクロリド；フルオレセイン（例えば、３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロール；ローダミンイソチオシアネート；Ｎ−フェニル−１−アミノ−８−スルホナトナフタレン；Ｎ−フェニル−２−アミノ−６−スルホナトナフタレン；４−アセトアミド−４−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；ピレン−３−スルホン酸；２−トルイジノナフタレン−６−スルホネート；Ｎ−フェニル，Ｎ−メチル２−アミノナフタレン−６−スルホナート；臭化エチジウム；ステブリン（ｓｔｅｂｒｉｎｅ）；オーラミン（ａｕｒｏｍｉｎｅ）−０，２−（９’−アントロイル）パルミタート；ダンシルホスファチジルエタノールアミン；Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン（ｃｙｃａｎｉｎｅ）；Ｎ，Ｎ’−ジヘキシルオキサカルボシアニン；メロシアニン、４−（３’−ピレニル）ブチレート（ｂｕｔｒｙａｔｅ）；ｄ−３−アミノデソキシ−エキレニン；１２−（９’−アントロイル）ステアレート；２−メチルアントラセン；９−ビニルアントラセン；２，２’−（ビニレン−ｐ−フェニレン）ビスベンゾオキサゾール；ｐ−ビス［２−（４−メチル−５−フェニルオキサゾリル）］ベンゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェンジン；レチノール；ビス（３’−アミノピリジニウム）−１，１０−デカンジルジヨージド；ヘリブリエニン（ｈｅｌｌｉｂｒｉｅｎｉｎ）のスルホナフチルヒドラゾン；クロロテトラサイクリン；Ｎ−（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−クロメニル）マレイミド；Ｎ−［ｐ−（２−ベンズイミダゾーリル）フェニル］マレイミド；Ｎ−（４−フルオランチル）マレイミド；ビス（ホモバニリン酸）；レザザリン（ｒｅｓａｚａｒｉｎ）；４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジゾール；メロシアニン５４０；レゾルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）；ローズベンガルならびに２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノン。好ましくは、蛍光検出可能部分は、フルオレセインまたはローダミン色素である。
【００５８】
別の好ましい検出可能部分は、コロイド金である。このコロイド金粒子は、一般的に、直径４０ｎｍ〜８０ｎｍである。このコロイド金は、種々の方法で標識化合物に結合され得る。一つの実施形態において、核酸標識化合物のリンカー部分は、チオール基（−ＳＨ）で終結し、そしてチオール基は、配位結合を介して直接的にコロイド金に結合する。Ｍｉｒｋｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６、３８２、６０７−６０９を参照のこと。別の実施形態において、例えば、抗ビオチンのコロイド金結合体とビオチン化標識化合物との間の相互作用を介して間接的に結合される。金標識化合物の検出は、銀エンハンスメント法（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ）の使用を介して増強され得る。Ｄａｎｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈ  １９９３、１６、２０１−２０７を参照のこと。
【００５９】
結合基（Ｍ）ｍは、リンカー基（Ｌ）を検出可能部分（Ｑ）に共有結合するのに役に立ち得る。各Ｍ基は、同種か、異なり得、ならびに独立して、標識化合物の機能を干渉しない任意の適切な構造であり得る。Ｍ基の限定されない例としては、以下：アミノアルキル、−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯ（Ｏ）−、−ＣＯ（ＮＨ）−、−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−、−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋＮＨ−、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｋＣＨ２ＣＨ２ＮＨ、および−ＣＯ（ＣＨ２）５−が挙げられ；ここで、ｋは、１〜約５の整数であり、好ましくは、ｋは１または２であり；ｍは、０〜約５の範囲の整数であり、好ましくは０〜約３である。
【００６０】
別の実施形態において、Ｌは、塩基のＮに対しその１位で直接的に結合したビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ−）を含む。本発明のこの局面に従って、Ｌがビニルの場合、例えばＲ１１（−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１）のように、さらなる置換基がビニル基の２位に結合する。好ましくは、Ｒ１１は、アルキル、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、アルコキシ、チオおよびアミノアルキルである。もっとも好ましくは、Ｒ１１は、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２であって、ここでＲ１２は、結合、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキルアルコキシ、チオおよびアミノアルキルである。
【００６１】
重要なことに、本発明の一つの局面に従って開示されるように、リンカー基Ｌは、連結官能基を提供するように選択され、単独または適切な結合基（Ｍ）とともにのどちらかで、適切なアッセイがＱ基において実行され得るような長さおよび立体配置においてＨｃ基（ヌクレオチド塩基）からＱ基の空間を適切にあけるが、同時に、適切な酵素（例えば、ターミナルトランスフェラーゼおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ）についての基質として働く核酸標識化合物の能力を実質的に保持する。当業者はまた、選択されたＨｃ−Ｌ−（Ｍ）ｍ−Ｑ基が、相補的な配列とペアのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対形式をおこす基を組み込む核酸ストランドの能力に、悪影響を及ぼすべきではないことを理解する。
【００６２】
本発明の一つの局面に従って、Ｒ１２は、好ましくは結合であり、ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、およびＱはフルオレセインおよびビオチンから成る群より選択され；および第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−、および第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここで、ｍは２である。
【００６３】
特定のＡ基はＨまたはＨ４Ｏ９Ｐ３−である。
【００６４】
特定のＸ基はＯである。
【００６５】
特定のＹ基はＨまたはＯＲ９である。
【００６６】
特定のＺ基はＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０である。
【００６７】
より特定のＹ基は水素またはＯＨである。
【００６８】
より特定のＺ基は水素またはＯＨである。
【００６９】
より特定のＹ基はＯＨである。
【００７０】
より特定のＺ基は水素またはＯＨである。
【００７１】
特定のＲ９基は、Ｈ、アルキルまたはアリールである。
【００７２】
特定のＲ１０基は、Ｈ、アルキルまたはアリールである。
【００７３】
より特定のＲ９基は、水素である。
【００７４】
より特定のＲ１０基は、水素である。
【００７５】
特定のＬ基は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１またはＣ≡Ｃ−Ｒ１１である。
【００７６】
より特定のＬ基は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１である。
【００７７】
より特定のＬ基は、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−である。
【００７８】
特定のＲ１１基は、−Ｏ−、アミノ、チオ、カルボニル、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキルおよびアミノアルキルである。
【００７９】
より特定のＲ１１基は、アルキル、アルコキシ、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、チオおよびアミノアルキルである。
【００８０】
より特定のＲ１１は、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２である。
【００８１】
特定のＲ１２は結合、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、アルコキシ、チオおよびアミノアルキルである。
【００８２】
より特定のＲ１２は結合である。
【００８３】
特定のＱ基はハプテン、発蛍光団、金属キレーター、インターカレーター、発光部分、金属凝集体およびタンパク質である。
【００８４】
より特定のＱ基は、ビオチンまたは蛍光色素である。
【００８５】
より特定のＱ基は、ビオチンである。
【００８６】
特定のビオチンは、以下：
【００８７】
【化２０】
2006515863.tif 000015
の構造を有する。
【００８８】
特定のＭ基は、−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ２）ｐＮＨ−であり；ここで、ｎは約２〜約１０の整数であり；ここでｐは約２〜約１０の整数である。
【００８９】
より特定のＭ基は、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−または−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−である。
【００９０】
特定のｍは、２である。
【００９１】
特定のＡ基は適切な対イオンを有するトリフォスフェートである。
【００９２】
特定の対イオンは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋である。
【００９３】
本発明の特定の化合物は、以下：
【００９４】
【化２１】
2006515863.tif 000016
【００９５】
【化２２】
2006515863.tif 000017
の構造を有する。
【００９６】
別の実施形態において、Ａは、核酸標識化合物の核酸への結合を可能にする官能基であり、好ましくはＡは、適切な対イオンを有するトリホスフェート基である。この対イオンは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋またはＮＨ４＋からなる基より選択され；ＸはＯであり；ＹはＯＨであり；Ｚは、ＯＨであり、Ｌは、−ＣＭ＝ＣＭ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−および−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）からなる群より選択され；Ｍは−（ＣＨ２）５−ＮＨ−であり、およびＱは、下記：
【００９７】
【化２３】
2006515863.tif 000018
の構造を有するビオチンである。
【００９８】
別の実施形態において、ＡはＨまたはＨ４Ｏ９Ｐ３−であり；ＸはＯであり；ＹはＨまたはＯＲ９であって、ここで、Ｒ９はＨ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここで、Ｒ１０はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−および−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−からなる群より選択され；Ｑは、ビオチンまたはフルオレセインであり；および第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−であって、ここで、ｎは約２〜約１０の整数であり、第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）ＰＮＨ−であって、ここで、ｐは約２〜約１０の整数であり、およびｍは２である。
【００９９】
別の実施形態において、Ｙは、ＨまたはＯＨであり；Ｚは、ＨまたはＯＨであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｑはビオチン、またはカルボキシフルオレセインであり；および、第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、および第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここでｍは２である。
【０１００】
別の実施形態において、Ｙは、ＯＨであり；Ｚは、ＯＨであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｑはビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；および、第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、および第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここでｍは２である。
【０１０１】
別の実施形態において、ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｑはビオチンであり；および、第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、および第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここでｍは２である。
【０１０２】
さらに別の実施形態において、Ｌは、その１位が塩基のＮに直接的に結合したビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ−）を含む。本発明のこの局面に従って、ここでＬはビニルであり、例えばＲ１１（−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１）のように、さらなる置換基がビニル基の２位に結合され得る。好ましくは、Ｒ１１はアルキル、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、アルコキシ、チオおよびアミノアルキルである。最も好ましくは、Ｒ１１Ｃ（Ｏ）Ｒ１２であり、ここで、Ｒ１２は、結合、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、アルコキシ、チオ、およびアミノアルキルである。
【０１０３】
重要なことに、本発明の一つの局面に従って開示されるように、リンカー基Ｌが連結基を提供するように選択され、単独、または適切な結合基（Ｍ）とともに、適切なアッセイをＱ基上で実行し得るような長さおよび立体配座で、Ｈｃまたは塩基由来のＱ基の空間を提供するが、同時に、適切な酵素（例えば、ターミナルトランスフェラーゼおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ）についての基質として働く核酸標識化合物の能力を保持する。当業者は、本発明に従って、Ｈｃ−Ｌ−（Ｍ）ｍ−Ｑ基が相補的な配列とワトソンクリック型の塩基対を生ずる基を組み込む核酸ストランドの能力を実質的に阻害するのを避けるように選択されなければならないと理解する。その結果、−Ｌ−（Ｍ）ｍ−Ｑは、核酸の標識および検出を可能にするために機能する何らかの配列または分子もしくは原子の群であり得る。
【０１０４】
本発明の一つの局面に従って、Ｒ１２は、好ましくは結合であり、ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、およびＱはフルオレセインおよびビオチンからなる群より選択され；および第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここでｍは２である。
【０１０５】
別の実施形態において、ＡはＨまたはＨ４Ｏ９Ｐ３ーであり；ＸはＯであり；ＹはＨまたはＯＲ９であって、ここでＲ９は、Ｈ、アルキルまたはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここでＲ１０はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）−であって、ここでｎは約１〜約１０の範囲の整数であり；Ｑはビオチンまたはフルオレセイン；および第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−であって、ここでｎは約２〜約１０の整数であり、第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここでｍは２である。
【０１０６】
別の実施形態において、ＹはＨまたはＯＨであり；ＺはＨまたはＯＨであり；Ｌは−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であって、Ｑはカルボキシフルオレセインであり；および第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、および第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここで、ｍは２である。
【０１０７】
別の実施形態において、ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であって、Ｑはカルボキシフルオレセインであり；および第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、第二のＭは、−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であってここでｍは２である。
【０１０８】
別の実施形態において、ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であって、Ｑはビオチンであり、および第一のＭは、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここで、ｍは２である。
【０１０９】
別の実施形態において、ここでＡは、核酸標識化合物の核酸への結合を可能にする官能基であり；好ましくは、Ａは適切な対イオンを有するトリホスフェート基であり、上記の対イオンはＨ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋およびＮＨ４＋からなる群より選択され；ＸはＯであり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−および−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）からなる群より選択され；Ｍは−（ＣＨ２）５−ＮＨ−であって、およびＱは、以下：
【０１１０】
【化２４】
2006515863.tif 000019
の構造を有する。
【０１１１】
別の実施形態において、ＡはＨまたはＨ４Ｏ９Ｐ３−であり；ＸはＯであり；ＹはＨまたはＯＲ９であって、ここで、Ｒ９は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり；ＺはＨ、Ｎ３、ＦまたはＯＲ１０であって、ここでＲ１０はＨ、アルキルまたはアリールであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｑはビオチンまたはフルオレセインであり；第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ−であって、ここでｎは約２〜約１０の整数であり、第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）ｐＮＨ−であって、ここで、ｐは約２〜約１０の整数であり、ｍは２である。
【０１１２】
別の実施形態において、ＹはＨまたはＯＨであり；ＺはＨまたはＯＨであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−であって、Ｑはビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；および第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、および第二のＭは、−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であり、ｍは２である。
【０１１３】
別の実施形態において、ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−であって、Ｑはビオチンまたはカルボキシフルオレセインであり；および、第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−、および第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここでｍは２である。
【０１１４】
別の実施形態において、Ｙは、ＯＨであり；Ｚは、ＯＨであり；Ｌは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｑは、ビオチンであり；第一のＭは、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、第二のＭは、−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であり、ここで、ｍは、２である。
【０１１５】
別の実施形態において、Ｌは、その１位が塩基のＮに直接的に結合したビニル基（−ＣＨ＝ＣＨ−）を含む。本発明のこの局面に従って、ここでＬはビニルであり、例えばＲ１１（−ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ１１）のように、さらなる置換基がビニル基の２位に結合され得る。好ましくは、Ｒ１１はアルキル、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキルアルコキシ、チオおよびアミノアルキルである。もっとも好ましくはＲ１１は、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２であって、ここでＲ１２は結合、アリール、官能基化アルキル、アミドアルキル、アルケニルアルキル、アルコキシ、チオおよびアミノアルキルである。
【０１１６】
重要なことに、本発明の一つの局面に従って開示されるように、リンカー基Ｌは、リンカー機能を提供するように選択され、単独または適切な結合基（Ｍ）とともに、適切なアッセイをＱ基において実行し得る長さおよび立体配座においてＨｃまたは塩基からＱ基に適切な空間を与えるが、同時に、適切な酵素（例えば、ターミナルトランスフェラーゼおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ）についての基質としてふるまう核酸標識化合物の能力を実質的に保持する。当業者もまた、選択されたＨｃ−Ｌ−（Ｍ）ｍ−Ｑ基が、本発明に従って、相補的な配列とワトソンクリック型の塩基対を生じるそのような基を組み込む核酸ストランドの能力を実質的に阻害するのを避けるために選択されるべきであることを理解する。そのようにして、−Ｌ−（Ｍ）ｍ−Ｑは、核酸への標識および検出を可能にするように機能する任意の配列または分子もしくは原子の群であり得る。
【０１１７】
本発明の一つの局面に従って、Ｒ１２は、好ましくは結合であり；ＹはＯＨであり；ＺはＯＨであり；Ｌは−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、およびＱはフルオレセインおよびビオチンからなる群より選択され；および、第一のＭは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−であり、および第二のＭは−ＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−であって、ここでｍは２である。
【０１１８】
（核酸標識）
核酸は生物学的サンプルから単離され得るか、または例えば、当業者に公知の方法に従って、固体の支持体上または溶液中で合成され得る。本明細書中で使用されるように、標識プロセスにおいて使用される核酸の長さまたは供給源に理論的制限は無い。しかし、長さにおける制限が、ハイブリダイゼーションプロセスによって課され得るかまたは提案され得る。核酸の単離および精製の模範的な方法は、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編；第Ｉ部；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ｎ．Ｙ．，１９９３に記載される。単離の好ましい方法は、酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム抽出に続くオリゴｄＴカラムクロマトグラフィーまたは（ｄＴ）ｎ  磁石ビーズの使用を含む。Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９；１巻−３巻；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編；Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎ．Ｙ．，１９８７。
【０１１９】
特定の場合において、核酸は、増幅を通して量的に増加される。適切な増幅方法は、以下に限定されないが、例：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓら  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０）；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９８９，４，５６０；Ｌａｎｄｇｒｅｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８，２４１，１０７７；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら  Ｇｅｎｅ  １９９０，８９，１１７）；転写増幅（Ｋｗｏｈら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８９，８６，１１７３）；および自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０，８７，１８７４）が挙げられる。これらの参照の各々は、本明細書中で、参考文献として援用される。
【０１２０】
核酸標識化合物は多数の方法を使用して核酸に組み込まれ得る。例えば、それは、元来の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ  ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）または増幅産物へ直接的に結合され得る。標識化合物の核酸への結合方法は、限定されないが、ニックトランスレーション、３末端標識、ライゲーションインビトロ転写（ＩＶＴ）またはランダムプライミングが挙げられる。核酸がＲＮＡの場合、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼといったＲＮＡリガーゼを使用して標識リボオリゴヌクレオチドが結合される。Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ；ＵｈｌｅｎｂｅｃｋおよびＧｒｅｅｎｓｐｏｒｔ編：ＸＶ巻、ｐａｒｔＢ，ｐｐ．３１−５８；および、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ｐｐ．５．６６−５．６９（ここで参考文献として援用される）を参照のこと。例えば、核酸が一本鎖ＤＮＡである場合、ターミナルトランスフェラーゼはデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸、またはリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、またはＮＴＰ）を添加して使用される。
【０１２１】
標識化合物はまた、核酸の内部に組み込まれ得る。例えば、標識化合物の存在中でのＰＣＲは、内部の標識増幅産物を提供する。Ｙｕら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９４、２２、３２２６−３２３２（参考文献として援用される）を参照。同様に、標識化合物の存在中にＩＶＴは内部に標識核酸を提供し得る。
【０１２２】
（プローブハイブリダイゼーション）
標識化合物が結合される核酸は、ハイブリダイゼーション後に核酸プローブを用いて検出され得る。あるいは、プローブは、使用者によって選択された実験スキームに依存して、標識され得る。そのプローブは核酸、もしくは固体の支持体へ結合されるかまたは溶液状態である改変核酸である。それは、ハイブリダイズする標識核酸に対する構造について相補的である。固体の支持体は、ポリスチレンベースのビーズおよびガラスチップを含む、任意の適切な物質である。好ましい実施形態において、プローブまたは標的核酸は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）製品（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）といったガラスチップに結合される。本明細書中で参考文献として援用される、国際出願番号  ＷＯ  ９７／１０３６５号、ＷＯ  ９７／２９２１２号、ＷＯ  ９７／２７３１７号、ＷＯ  ９５／１１９９５号、ＷＯ  ９０／１５０７０号、ならびに米国特許第５，７４４，３０５号、同第５，４４５，９３４号を参照のこと。
【０１２３】
プローブハイブリダイゼーションは、しばしば核酸の検出における工程であることから、核酸標識化合物は、そのプロセスを実質的に妨害しない構造であるべきである。従って、標識化合物の立体的および電気的性質は、相補的な構造に対して、結合された核酸の結合に適応する。
【０１２４】
高密度のＤＮＡプローブアレイは、ハイブリダイゼーションベースの遺伝的解析について役立つ手段であると証明されている。これらのアッセイは、アレイに対するハイブリダイゼーションを検出するために蛍光分子または他の検出可能な分子と、核酸分子の共有結合の標識を必要とする。本発明者らは、種々のアレイベースアッセイについての核酸標的を酵素学的に標識するための新規ヌクレオチドアナログのセットを開発するためのプログラムを探索した。本発明の主要な目的は、二つの特定の標識手順のための新規試薬：（ｉ）末端デオキアシヌクレオチジル転移酵素（ＴｄＴ）を用いるフラグメント化ＰＣＲ産生のＤＮＡ標的の３’末端標識、；および（ｉｉ．）Ｔ７ＲＮＡポリメラ−ゼ（Ｔ７）とインビトロ転写産生ＲＮＡ標的の鋳型指向の内部標的、を提供することである。
【実施例】
【０１２５】
下記の実施例は本発明を説明するのに提供されるが、それに限定されない。
（一般的な実験の詳細）
試薬を、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から利用可能な最も高い純度で購入した。全ての列挙した溶媒は、無水であった。中間体を、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析法によって特定した。
【０１２６】
実行する一般的なアプローチは、素早く定量的なＨＰＬＣベースの反応を使用して、どのアナログが関連のポリメラーゼについての有効な基質であるかを経験的に判定するための種々の塩基置換ヌクレオチドアナログをスクリーニングすることであった。この研究において選択されたアナログを、以下：１−（イミダゾール−４−カルボキサミド）、１−（１，３，６−トラジン−２，４−ジオン）、５−（１，３−ピリミジン−２、４−ジオン）、３−（ピラゾロ−［４，３−ｄ］ピリミジン）、１−（ピラゾロ−［３，４−ｄ］ピリミジン）および単一のカルボキサミド部分、で置換した。次に、有望な候補分子の標識型を設計し、ならびにアレイベースアッセイにおける関連組み込み効率および機能的性能をさらに試験するために合成した。
【０１２７】
ＴｄＴでは、一般的に塩基置換に耐性であり、ならびに２’−デオキシヌクレオチドおよび２’，３’−ジデオキシヌクレオチドと大体同じ効率でリボヌクレオチドを組み込むことを決定した。対照的に、Ｔ７では５−（１，３−ピリミジン−２，４−ジオン）、すなわち、シュードウリジンアナログを除いた複素環式塩基置換に対し比較的不耐性であった。二つの新しい試薬（Ｃ４−標識１−（２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４カルボキサミド５’−トリホスフェート酸およびＮ１標識シュードウリジン５’−トリホスフェート）をＴｄＴおよびＴ７それぞれについての優れた基質として見出した。これらの新規アナログでは一般的な標識試薬を使用して得られるものと等しいアレイアッセイ性能を証明する。
【０１２８】
本明細書で提供される手順を使用して、試薬の合成のための方法、および本発明の実行において有用な標識を組み込む（酵素的またはその他の）方法は、当業者に対し明らかである。例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ３，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ．ら編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｃｈｐｔ．４，Ｇｏｌｄｏｎ，Ｓ．Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ａｎｄ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｚｏｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９４）；Ｇｅｎ  Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ３，Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ．編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照のこと；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ３  Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  Ｌ．Ｂ．編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｃｈｐｔ．４，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ａｎｄ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｚｏｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（１９９４）において記載される類似の方法によって作成され得る；Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｎｏｖａｓ，Ｌ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ２５：１８９−１９２（１９９４）；Ｌｉ，Ｘら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ２０：１７２−１８０（１９９５）；Ｂｏｕｌｔｗｏｏｄ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８：６１ｆｆ．（１９８６）；Ｔｒａｉｎｃａｒｄら、Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４０：３９９−４０５（１９８３）を参照のこと。
（実施例１）
（改変ヌクレオチドの酵素学的取り込みのＨＰＣＬ分析のための手順）
ヌクレオチド。
反応条件
ＴｄＴ。
３μＭ  ｄＴ１６鋳型
１５（３０）μＭ  ＮＴＰ
４０Ｕ  ＴｄＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
１×緩衝液、ｐＨ７．５（Ｐｒｏｍｅｇａ）
手順：３７℃で１時間インキュベートし、次いで７０℃で１０分間、続いて５０μＬ量においてＥＤＴＡ（最終濃度２ｍＭ）の追加。
ＨＰＬＣ分析
材料および試薬
４．６ｍｍ×２５０ｍｍのＮｕｃｌｅｏｐａｃ  ＰＡ−１００イオン交換カラム（Ｄｉｏｎｅｘ）緩衝液Ａ：２０ｍＭ  ＮａＯＨ（または色素標識でないヌクレオチド三リン酸のＴｄＴ組み込みの場合において、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８）緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌ（または色素標識でないヌクレオチド三リン酸のＴｄＴ組み込みの場合、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１Ｍ  ＮａＣｌ）。
一般的な手順
５０μＬの緩衝液Ａを使用して反応物を希釈する。このサンプル５０μＬをＨＰＬＣカラムへ注入し、流速１ｍＬ／分で３０分にわたって５％〜１００％勾配の緩衝液Ｂを使用して分画を得る。色素の２６０ｎｍの吸光および最大吸光（または色素の最大蛍光放射）で同時にピークを検出する。
【０１２９】
組み込み効率は標識されたオリゴヌクレオチドの分画として表現される。この数は、非標識オリゴヌクレオチドおよび標識オリゴヌクレオチドのピーク面積の合計によって標識されたオリゴヌクレオチドの２６０ｎｍの吸収で測定されるピーク面積を除算することにより決定される（フルオレセイン標識ｄＴ１６の保持時間は約２〜３分間であり、非標識ｄＴ１６よりも長い）。このアッセイ型における誤差は、約１０％である。
【０１３０】
（実施例２）
（Ｎ１−標識５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン５’−三リン酸  ４２ａおよび４２ｂの合成（図３））
アセトニトリル（５ｍｌ）における５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン３９（１００ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ、１当量）を、ｐＨ９  １Ｍ  ＴＥＡＢ（５ｍｌ）に添加し、次にメチルアクリレート（５．５ｍｌ、６１ｍｍｏｌ、１５０当量）を添加した。反応を、室温で、一晩攪拌させた。溶媒をエバポレートさせ、残留物を水（３ｘ、５ｍｌ）で、共沸させ、１３５ｍｇのアクリレート４０を得た。アクリレート４０をニートなエチレンジアミン（２ｍｌ過剰）およびＴＥＡ２滴で処理し、、１００℃に加熱した。一時間後、過剰なＥＤＡを蒸発させ、１４６ｍｇのフリーアミンを（定量的に）得た。次いで、粗製残留物をピリジン（３Ｘ、５ｍｌ、不溶性）と共沸し、ピリジンおよびＤＭＦの混合物に再懸濁し、０℃に冷却した。この混合物をＴＦＡ−イミダゾール（７３．８ｍｇ、１．１当量）を添加した。ついで反応を室温まであたため、一晩攪拌した。さらに、その時点でＴＦＡ−イミダゾール１当量を追加し、反応をさらに１５分間攪拌した。次いで、溶媒を乾燥させ、残留物を水（２ｘ、５ｍｌ）と共沸させ、そして水５ｍｌに溶解させた。形成された白い沈殿物を濾過によって取り除いた。ＴＦＡで保護されたヌクレオシド３を含む母液を二等分し、逆層ＨＰＬＣによって精製した。次いで分画を蓄積し、純度４１の収量２０％（３５ｍｇ）に蒸発させ、１ＨＮＭＲによって確認した。標準的な手順（例えば、Ｐｒｏｐｅｒら、ＥＰ０２５２６８３）を使用して、化合物４１を三リン酸に転換し、ついで４２ａおよび４２ｂを提供するようにビオチンおよびフルオレセインと結合させた。
【０１３１】
Ｎ１標識２−アミノ−５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−４（１Ｈ）−ピリミジノン（５５）の合成には、ピラザロ−［４，３−ｄ］ピリミジン（スキーム２）のＮ１のアルキル化についてのＭｕｅｈｌｅｇｇｅｒら（ＷＯ９６／２８６４０）の記載に類似の条件を使用してＮ１アルキル化を含んだ。
【０１３２】
Ｎ１−フルオレセイン−Ｘ−５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン５’−三リン酸  ４２ａのＩＶＴ組み込み効率（１転写物あたりに組み込まれる標識アナログの数）を、１．２４ｋｂ転写物のＩＶＴ増幅におけるＨＰＬＣ（２６０ｎｍおよび４９５ｎｍでのダイオードアレイＵＶ検出）によって計測した。使用される試験方法のさらなる詳細についての米国特許出願ＳＮ０９／１２６，６４５号を参照のこと。チャート１はＵＴＰ／５の異なる比を使用して得られたデータの概要である。１：５の比において、転写産物の組み込みおよび相対収量（ＵＴＰのみを使用して得られた収量に対して計測された）は、最適である。この転写産物をフルオロレセインを使用して標識された転写産物に対するハイブリダイゼーションアッセイにおいて比較した。予備試験の結果は、Ｎ１−フルオレセイン−Ｘ−５（β−Ｄ−リボフラノシル）−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン５’−三リン酸（４２ａ）は、正確な要求（ｃａｌｌ）の数およびハイブリダイゼーション強度における期間においてのハイブリダイゼーションアッセイにおいて同量で実行した（チャート２およびチャート３）。この目的のために使用するハイブリダイゼーションアッセイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＩＶ−ＰＲＴ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  アッセイであって（Ｋｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９６、２：７５３−９を参照のこと）。
【０１３３】
同様に、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素、およびＮ１−フルオレセインおよびビオチン標識５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ピリミジンジオン５’三リン酸を使用したポリチミジル酸オリゴヌクレオチド（Ｔ１６）のＤＮＡ３’末端標識の効率を、ＨＰＬＣによって決定した。この分析において、３’末端標識Ｔ１６−Ｆ１に対するオリゴ−Ｔ１６のパーセント転換は、ＡＸ−ＨＰＬＣによって決定される（詳細な手順について、米国特許出願ＳＮ０９／１２６，６４５号を参照のこと）。そのデータは、チャート４に概説している。ビオチンおよびフルオレセイン三リン酸の組み込みは、ＨＰＬＣによる測定で非常に有効であった。
【０１３４】
【化２５】
2006515863.tif 000020
【０１３５】
【化２６】
2006515863.tif 000021
【０１３６】
【化２７】
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【０１３７】
【化２８】
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【０１３８】
【化２９】
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【０１３９】
【化３０】
2006515863.tif 000025
（ペルアセチル化シュードイソシチジン２）
シュードイソシチジン（１）（２．５ｇ、９ｍｍｏｌ）を４０ｍｌの乾燥ピリジンに溶解した。無水物酢酸（８．５ｍｌ、９０ｍｍｏｌ）を添加し、その混合物を室温で、少なくとも４時間の間アルゴン下で攪拌した。反応はＨＰＬＣによってモニター可能である（Ｃ１８カラム、緩衝液Ａ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ｐＨ７．５；緩衝液Ｂ：アセトニトリル；勾配：２０分間にわたって緩衝液Ｂを５−９５％の勾配）。ピリジンを真空下で取り除き、残留油を５００ｍｌの酢酸エチルに溶解した。その産物が酢酸エチルにおいて制限された溶解性を有することから、酢酸エチルを透明な溶液を得るためにさらに添加した。有機層をブラインで三回洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を取り除いた。白い固体をエチルアセテート／ヘキサンから再結晶化した２を３．２ｇ（８５％）で保存した。
（プロペノン酸メチルエステル３）
化合物２（２．０ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（１．２ｇ、９．７３ｍｍｏｌ）を５０ｍｌ乾燥アセトニトリルと二回共沸し、アルゴン下で４５ｍｌの乾燥アセトニトリルで再溶解した。メチルプロピオレート（０．８２ｇ、０．８６ｍｌ、９．７３ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で２４時間攪拌した。その反応物は、無色から琥珀色の溶液へと変化した。その反応は、これ以上、生産物が産生されなくなるまで、ＨＰＬＣによって追った。溶液をロータリーエバポレーションによって取り除き、残留物を４００ｍｌの酢酸エチルおよび２００ｍｌのブラインに溶解した。水層を二つの２００ｍｌの酢酸エチル部分で抽出した。合わせて有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を取り除いた。残留物を、溶出物として酢酸エチルを使用して、シリカゲル（２００ｍｌ  湿性ゲル）上でフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、白い包状物として８５０ｍｇ（３５％）の３を提供した。
（プロペノン酸４）
化合物３（０．８５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）をクロロホルム（５ｍｌ）に溶解し、濃塩酸（濃１０ｍｌ）を添加した。バラ色の溶液はすぐにレモン色に変化した。反応を、室温でさらに４８時間、または反応がＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、緩衝液Ａ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ｐＨ７．５；Ｂ、アセトニトリル；勾配：９分間にわたって０％Ｂの勾配）によって決定されるように完遂するまで攪拌した。溶媒および水をロータリーエバポレーションによって取り除いた。生産物を、メタノール／アセトにトリルから沈殿物として精製し、真空下で乾燥し、５００ｍｇ（９４％）の４を得た。
（アミノプロペンアミド５）
化合部物４（５００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）および水和エチレンジアミン緩衝溶液（ＭＥＳ緩衝液において２．０Ｍエチレンジアミン８ｍｌ、ｐＨ５．５、ＥＤＡを１６ｍｍｏｌ含有）を混合し、次いで１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２ｇ、１６ｍｍｏｌ）をはげしく攪拌しながら反応物に添加した。１時間後、反応物をＬＣ／ＭＳによって分析し、完全であることを決定した。化合物を分取用ＨＰＬＣ：ＰＲＰ−１，３０×２５０ｍｍ  カラム；流速２５ｍｌ／分；緩衝液：Ａ、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ｐＨ７．５、Ｂ、アセトニトリル；勾配：９分間の間０％、１０分間にわたって０％〜９０％のＢ、によって精製した。塩を、約４分間の保持時間で取り除き、化合物を６分間〜７．５分間まで溶出させた。収集した分画を蓄えて、真空下で溶媒を取り除いた。酢酸トリエチルアンモニウムを含む残留物を水と共に数分間共沸し、最終的に、その産物を、メタノール／アセトニトリルから沈殿させ、２９０ｍｇ（５１％）の５を得た。
（ビオチン−プロペンアミド６）
化合物５（２８０ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解し、次にトリエチルアミン（１６０ｍｇ、２２０μｌ、１．５８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液のｐＨを、必要な場合、さらにトリエチルアミンを追加して７．５に調節した。次いでビオチン−Ｘ−ＮＨＳエステル（３５８ｍｇ、０．７９ｍｍｏｌ）を攪拌しながら混合物に追加した。１．５時間後、溶媒量を真空下で約１ｍｌに減少させた。この化合物は凝集する傾向があり、再溶解が困難なことから、真空で乾燥しないように注意する。化合物を分取用ＨＰＬＣ：ＰＲＰ−１，３０×２５０ｍｍ  カラム；流速２５ｍｌ／分；緩衝液：Ａ、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ｐＨ７．５、Ｂ、アセトニトリル；勾配８分間の間０％、２０分間にわたって０％〜９０％のＢ、によって精製した。分画を、１６〜１７分のピークにわたって収集し、プールした分画の溶液を生産物の存在について分光光度的に定量化した（λ２８９、ε＝８０００と考える）。溶媒を真空下で取り除き、残留物を水（３０ｍｌ）で３回、ならびにメタノール（５０ｍｌ）で２回共沸した。生成物をメタノール／アセトニトリルから沈殿させ３７９ｍｇ（６９％）の６を得た。
（三リン酸）
化合物６（１１０ｍｇ、０．１５８５ｍｍｏｌ）を真空下で二日間の間Ｐ２Ｏ５で乾燥させ、次いで約６０℃まで穏やかに熱しながらリン酸トリメチル（モレキュラーシーブで乾燥、２０ｍｌ）に溶解した。一度その物質を溶解させると、溶液を周囲温度まで冷やし、トラップパック（ＡＢＩ  Ｔｒａｐ−ｐａｋ，Ｐ＃ＧＥＮ  ０８４０３４）を添加し、その混合物を、一晩穏やかに攪拌した。トラップパックを取り除き、アルゴンの存在下、０℃でその溶液にＰＯＣｌ３（７３ｍｇ、４５μｌ、０．４８ｍｍｏｌ）を添加した。反応を、モノリン酸への転換についてＡＸ−ＨＰＬＣによってモニターし、４時間後にさらに２当量のＰＯＣｌ３を添加し、その反応物を２時間以上（または、９０％の転換が達成されるまで）、攪拌した。
【０１４０】
その反応をモニターする間、乾燥ＤＭＦ  ５ｍｌ中で、乾燥テトラ（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェート（２．３５ｍｍｏｌ）の溶液を下記のように調製した：ｎ−ブチルアンモニウムピロホスフェート（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ−８５３３，１．１ｇ，２．３５ｍｍｏｌ）を５ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解した。その溶液にトリ−ｎ−ブチルアミン（２１８ｍｇ、２８０μｌ、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。溶媒を真空下で取り除き、残留物を５ｍｌの乾燥ＤＭＦとともに３回共沸した。５ｍｌ乾燥ＤＭＦ中のアンモニウム塩に対して、さらなるトリ−ｎ−ブチルアミン（１．１２ｍｌ、２．３５ｍｍｏｌ）を添加した。次に、反応物に力強く攪拌しながらピロホスフェート溶液を滴下した。５分後に、重炭酸トリエチルアンモニウム（１．０Ｍ、ｐＨ  ７．５、２０ｍｌ）を添加して反応をクエンチし、次にその混合物をＨＰＬＣによって分析した（７０％  トリホスフェート）。次に、その溶液を水で１００倍に希釈し、ＤＥＡＥイオン交換カラムへ直接ロードし、標準的な手順を使用して精製した。
（実施例４）
【０１４１】
【化３１】
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（プロペン酸メチルエステル２ａ）
化合物１ａ（２．５ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（１．２５ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で１２５ｍｌ乾燥ＤＭＦに溶解した。プロピオン酸メチル（０．９４３ｇ、１．０ｍｌ、１１．２ｍｍｏｌ）を添加し、その溶液を室温で２４時間攪拌した。反応は無色から琥珀色溶液へと変化した。その反応をこれ以上生産物が産生されなくなるまで、ＨＰＬＣによって追った。その溶媒を回転エバポレーションによって取り除き、残留物を１０ｍｌのメタノール−アセトニトリル（１：１の容量比）に溶解した。それを、緩衝液Ａとして水および緩衝液Ｂとしてアセトニトリルを流速２５ｍｌ／分で使用して、分取用のＰＲＰ−１  ３０×２５０ｍｍカラムによって精製した。１５分間で５％から９５％のＢを溶出させた。９分から１０分の分画を収集した。溶媒取り除き１．１ｇ（３３％）を白い固体として得た。
（プロペン酸３ａ）
化合物２（１．１ｇ、３．３５ｍｍｏｌ）を８０ｍｌの１．０Ｎ  ＨＣｌに溶解し、８８時間６０℃に加熱し、このとき、ＬＣ−ＭＳが開始物質が完全に転換されたと示した、。反応混合物をロータリーエバポレーターによってオイリーな残留物に蒸発させ、最低量のメタノールに再溶解した。そのメタノール溶液をアセトニトリルにゆっくりと添加し（少なくとも、２００ｍｌ）、遊離酸を沈殿させた。固体を収集し、真空下で乾燥させて、１．０ｇ（９４％）を白い固体を得た。
（アミノプロペンアミド４ａ）
化合物３ａ（１．０ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）および水中のエチレンジアミンの緩衝溶液（０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液中で１６ｍｌの２．０Ｍエチレンジアミン、ｐＨ５．５、３２ｍｍｏｌのＥＤＡ含有）を混合し、ついで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（４ｇ、３２ｍｍｏｌ）を力強く攪拌しながら、反応物に添加した。１時間後、反応液を、ＬＣ／ＭＳによって分析し、完全であることを決定した。メモ：ＬＣ／ＭＳについてのサンプルを脱塩する。その化合物を分取用ＨＰＬＣによって精製した：ＰＲＰ−１、３０×２５０ｍｍカラム；流速２５ｍｌ／分；緩衝液Ａ、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ｐＨ７．５、Ｂ、アセトニトリル；勾配：９分間の間０％のＢ、１０分の０〜９０％のＢ。塩を約４分間の保持時間で取り除いた。化合物を６分間から７．５分間で溶出させた。分画をプールし、溶媒を真空下で除去した。トリエチルアンモニウムアセテートを含む残留物を、水で数回共沸し、最終的に、メタノール／アセトニトリルから沈殿させ、７００ｍｇ（６２％）の４ａを得た。
（ビオチンプロペンアミド５ａ）
化合物４ａ（１０２ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦで２回（各５ｍｌ）共沸し、次いで乾燥ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶解させ、トリエチルアミン（２９ｍｇ、４０μｌ、０．２８６ｍｍｏｌ）を添加した。必要な場合、溶液のｐＨを、さらにトリエチルアミンを添加することで７．５に調整した。ビオチン−Ｘ−ＮＨＳエステル（０．２８６ｍｍｏｌ、１３０ｍｇ）を攪拌しながらその混合物に添加した。１時間後、反応物をＨＰＬＣによって完全性についてモニターした。その溶媒量を真空下で約１ｍｌに減少させた。注意：この化合物は凝集する傾向があり、再溶解が困難であることから、真空で乾燥させない。残留物を５ｍｌの水および１ｍｌのメタノールに再溶解した。
【０１４２】
化合物を分取用ＨＰＬＣ；ＰＲＰ−１、３０×２５０ｍｍカラム；流速２５ｍｌ／分；緩衝液Ａ、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、ｐＨ７．５、Ｂに水をよって分離し、アセトニトリル；勾配：１１分間の間０％のＢ、１６分間の０〜９５％のＢ、によって精製し、分画を１９〜２１分のピークにわたって集めた。溶液を真空下で取り除き、ついで、その残留物を水（３０ｍｌ）で３回共沸し、メタノール（５０ｍｌ）で２回共沸した。生産物をアセトニトリルから再結晶化し、１３０ｍｇ（６７％）の５ａの収量を得た。
（三リン酸６ａ）
化合物５ａ（１３０ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）をＰ２Ｏ５で真空下で２４時間乾燥させ、次いで約６０℃まで穏やかに熱しながらトリメチルホスフェート（モレキュラーシーブで乾燥、２０ｍｌ）に溶解した。一旦物質が溶解したら、溶液を室温に冷却し、トラップパック（ｔｒａｐ−ｐａｋ）（ＡＢＩ  Ｔｒａｐ−ｐａｋ、Ｐ＃ＧＥＮ  ０８４０３４）を添加し、静かに一晩攪拌させた。その溶液を、氷上で冷却する場合、わずかに濁らせた。そのトラップパックを取り除き、アルゴン下、０℃でＰＯＣｌ３（１１５ｍｇ、７０μｌ、０．７４８ｍｍｏｌ）を添加した。その反応物をモノリン酸への転換についてＡＸ−ＨＰＬＣによってモニターし、４時間後、さらに１当量のＰＯＣｌ３を添加し、その反応溶液を２時間以上（９０％の転換）攪拌させた。その反応物をモニターしながら、乾燥テトラ（トリ−Ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェート（０．１８７×５×３．３＝３．１ｍｍｏｌ）を６ｍｌ乾燥ＤＭＦ溶液で調製した。次いで、力強く攪拌しながらその反応物にピロホスフェート溶液に数滴ずつ添加した。５分後に、重炭酸トリエチルアンモニウムバイカルボネート（１．０Ｍ、ｐＨ７．５、２３ｍｌ）を添加し、その反応をクエンチし、この混合物を氷上で、３０分間攪拌し、一晩、冷蔵庫においた。次いで、その混合物をＨＰＬＣ（７０％トリホスフェート）によって分析し、ＤＥＡＥにおける標準ＴｒｉＬｉｎｋ手順を使用して、精製した。
【０１４３】
最終反応混合物を、１００倍のミリＱ水で希釈し、ＤＥＡＥカラムにロードし得る。その化合物は、塩基性条件下で不安定になり得ることから、ＴＥＡＢをロトバップ（ｒｏｔｏｖａｐ）することは推奨されない。
【０１４４】
テトラ（トリ−Ｎ−ブチルアンモニウム）ピロホスフェートを調製するために、ＴＢＡ−ＰＰｉ（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ−８５３３，１ＰＰｉあたり１．５ＴＢＡ、１．４ｇ、３．１ｍｍｏｌ）を５ｍｌ乾燥ＤＭＦに溶解した（ＴＢＡ２８７ｍｇ、３６４μｌ、１．５５ｍｍｏｌを添加）。少なくとも３回５ｍｌの乾燥ＤＭＦで共沸した。５ｍｌ無水ＤＭＦ中に再溶解させる。ＴＢＡ（１．４６ｍｌ、３．１ｍｍｏｌ）を添加した。Ａｒで満たされたグローブボックス（ｇｌｏｖｅ  ｂｏｘ）においてその物質を処理する。
【０１４５】
（実施例５）
ＩＶＴ組み込みを、ＲＮＡの定量について２６０ｎｍ吸収を使用して分光光度的に、およびＲＬＲ−３ｂ（ビオチン−ΨｉｓｏＣＴＰ、ビニル−架橋）、ＲＬＲ−２ｂ（ビオチン−ΨＵＴＰ、ビニル−架橋）およびＲＬＲ−２ａ（ビオチン−ΨＵＴＰ、エタン（または飽和）−架橋）におけるビオチン定量のためのＨＡＢＡベースの比色分析アッセイで決定した。ビニル架橋アナログは、共に図７に示すように飽和エタンアナログよりもより効率的に組み込んだ。精製され断片化されたＲＮＡを２６０ｎｍでのＵＶ吸光によって定量し、組み込まれたビオチンの量を、ビオチンについての分光光度に基づくアッセイを使用して決定した（Ｓｗａｉｓｇｏｏｄ，Ｈ．Ｅ．ら  １９９６  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５６，１．）。
【０１４６】
明細書において引用される全ての特許、特許出願および文献はその全体において参考文献として援用される。任意の不一致の場合において、本明細書において任意の定義を含む本開示が優先する。
【０１４７】
本発明は、種々の特定の、および好ましい実施形態ならびに技術を参照して記載されている。しかし、多くの変化および改変が、本発明の精神および範囲を維持しながらになされ得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、テンプレート部分の非限定的なセットを示す。
【図２】図２は、複素環式基（４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、１，３−ジアゾール（イミダゾール）、１，２，４−トリアジン−３−オン、１，２，４−トリアジン−３，５−ジオンおよび５−アミノ−１，２，４−トリアジン−３−オン）の非限定的なセットを示す。
【図３】図３は、Ｎ１標識５−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２，４［１Ｈ，３Ｈ］−ピリミジンジオン５’三リン酸の調製のための概略図を示す。
【図４】図４は、アナログ４２ａ（ＲＮＡ標的のＴ７標識）についてのＨＩＶアレイデータを示す。
【図５】図５は、Ｃ−ヌクレオチド４２ａ（Ｔ７  ＲＮＡｐｏｌ、１ｋｂ転写）のＨＰＬＣの転換率を示す。
【図６】図６は不飽和核酸標識化合物に対する飽和核酸標識化合物のＩＶＴの組み込みを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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