(57)【要約】本発明は、一般に、代謝経路の発現のための方法および技術、多機能酵素ドメインをコードする新規遺伝子融合構築物、ならびに関連ハイブリッドタンパク質に関する。改変遺伝子融合構築物を生成する方法であって、該方法は、２つ以上の異種核酸配列を共連結して、それにより該改変遺伝子融合構築物を生成する工程であって、ここで、各異種核酸配列は、１つ以上の酵素ドメインをコードし、該２つ以上の異種核酸配列の少なくとも１つは改変される、工程、を包含する。前記２つ以上の核酸配列の少なくとも１つは、該２つ以上の核酸配列を共連結する前に改変される、方法。
2004527215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変遺伝子融合構築物を生成する方法であって、該方法は、２つ以上の異種核酸配列を共連結して、それにより該改変遺伝子融合構築物を生成する工程であって、ここで、各異種核酸配列は、１つ以上の酵素ドメインをコードし、該２つ以上の異種核酸配列の少なくとも１つは改変される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記２つ以上の核酸配列の少なくとも１つは、該２つ以上の核酸配列を共連結する前に改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２つ以上の核酸配列の少なくとも１つは、該２つ以上の核酸配列を共連結した後に改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の酵素ドメインは、同じ代謝経路に関与する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記２つ以上の核酸配列の少なくとも１つは、少なくとも１つの核酸配列をシャッフリングする工程により改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの核酸配列をシャッフリングする工程は、再帰配列組換えを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記２つ以上の核酸配列は、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ｚ−カロチンデサチュラーゼ、およびβ−シクラーゼからなる群から選択される酵素ドメインをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記２つ以上の核酸配列は、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼからなる群から選択される酵素ドメインをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記２つ以上の核酸配列は、β−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼからなる群から選択される酵素ドメインをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記２つ以上の核酸配列は、ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼからなる群から選択される酵素ドメインをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記２つ以上の核酸配列を共連結する工程は、該２つ以上の核酸配列を互いに直接連結することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記２つ以上の核酸配列を共連結する工程は、該２つ以上の核酸配列を、１つ以上のヌクレオチドリンカー配列で連結することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上のヌクレオチドリンカー配列は独立して、約３〜約３００ヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上のヌクレオチドリンカー配列は独立して、約１２〜約９０ヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のヌクレオチドリンカー配列の少なくとも１つは、１つ以上のイントロン配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上のヌクレオチドリンカー配列の少なくとも１つは、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチドリンカーは、切断可能なペプチド配列またはインテイン配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドリンカー中のアミノ酸残基の少なくとも約８０％は、アラニン残基およびグリシン残基からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記改変遺伝子融合構築物は、１つ以上の転写調節配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の転写調節配列は、１つ以上の植物転写調節配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記改変遺伝子融合構築物を、真核生物系に導入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記真核生物系は、植物系である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物系は、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｍａｌｕｓ、Ａｐｉｕｍ、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ、ＤｏｃｕｓおよびＤａｔｕｒａから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法により調製される、トランスジェニック植物。
【請求項２５】
２つ以上の共連結異種核酸配列を含む改変遺伝子融合構築物であって、各核酸配列は、１つ以上の酵素ドメインをコードし、該２つ以上の異種核酸配列の少なくとも１つは改変される、改変遺伝子融合構築物。
【請求項２６】
前記２つ以上の核酸配列の少なくとも１つはシャッフリングされる、請求項２５に記載の改変遺伝子構築物。
【請求項２７】
前記２つ以上の核酸配列は、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ｚ−カロチンデサチュラーゼ、およびβ−シクラーゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、請求項２５に記載の改変遺伝子融合構築物。
【請求項２８】
前記２つ以上の核酸配列は、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、請求項２５に記載の改変遺伝子融合構築物。
【請求項２９】
前記２つ以上の核酸配列は、β−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、請求項２５に記載の改変遺伝子融合構築物。
【請求項３０】
前記２つ以上の核酸配列は、ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、請求項２５に記載の改変遺伝子融合構築物。
【請求項３１】
請求項２５に記載の改変遺伝子融合構築物およびプロモーターを含む、ベクター。
【請求項３２】
遺伝子融合構築物を生成する方法であって、該方法は、同じ代謝経路に関与する２つ以上の異種核酸配列を共連結する工程であって、該共連結核酸配列の１つは真核生物に由来し、別の共連結核酸配列は異なる種の真核生物または原核生物のいずれかに由来する、工程、を包含する、方法。
【請求項３３】
前記共連結核酸配列の少なくとも１つは、植物に由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記共連結核酸配列の少なくとも１つは、原核生物に由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記共連結核酸配列の少なくとも１つは、植物に由来する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記共連結核酸配列の少なくとも２つは、異なる植物種に由来する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
同じ代謝経路に関与する３つ以上の異種核酸配列を共連結する工程を包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記異種核酸配列の少なくとも１つは改変される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記異種核酸配列の少なくとも１つはシャッフリングされる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記２つ以上の核酸配列は、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ｚ−カロチンデサチュラーゼ、およびβ−シクラーゼからなる群から選択される酵素ドメインをコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記２つ以上の核酸配列は、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼからなる群から選択される酵素ドメインをコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記２つ以上の核酸配列は、β−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼからなる群から選択される酵素ドメインをコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記２つ以上の核酸配列は、ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼからなる群から選択される酵素ドメインをコードする、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
前記共連結核酸配列は、互いに直接連結される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記共連結配列は、１つ以上のヌクレオチドリンカー配列と互いに連結される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
前記改変遺伝子融合構築物は、１つ以上の転写調節配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記１つ以上の転写調節配列は、１つ以上の植物転写調節配列を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記改変遺伝子融合構築物を、真核生物系に導入する工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４９】
前記真核生物系は、植物系である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記植物系は、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｍａｌｕｓ、Ａｐｉｕｍ、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ、ＤｏｃｕｓおよびＤａｔｕｒａから選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４９に記載の方法により調製される、トランスジェニック植物。
【請求項５２】
同じ代謝経路に関与する２つ以上の共連結異種核酸配列を含む遺伝子融合構築物であって、該共連結核酸配列の少なくとも１つは真核生物に由来し、別の共連結核酸配列は異なる種の真核生物または原核生物のいずれかに由来する、遺伝子融合構築物。
【請求項５３】
前記核酸配列の少なくとも１つは改変される、請求項５２に記載の遺伝子構築物。
【請求項５４】
前記核酸配列の少なくとも１つはシャッフリングされる、請求項５３に記載の遺伝子構築物。
【請求項５５】
前記２つ以上の異種核酸配列は、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ｚ−カロチンデサチュラーゼ、およびβ−シクラーゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、請求項５２に記載の遺伝子融合構築物。
【請求項５６】
前記２つ以上の核酸配列は、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、請求項５２に記載の遺伝子融合構築物。
【請求項５７】
前記２つ以上の核酸配列は、β−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、請求項５２に記載の遺伝子融合構築物。
【請求項５８】
前記２つ以上の核酸配列は、ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、請求項５２に記載の遺伝子融合構築物。
【請求項５９】
請求項５２に記載の改変遺伝子融合構築物およびプロモーターを含む、ベクター。
【請求項６０】
２つ以上の共連結異種核酸配列を含む遺伝子融合構築物であって、該２つ以上の核酸配列は、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、遺伝子融合構築物。
【請求項６１】
前記少なくとも２つの共連結核酸配列の少なくとも１つは改変される、請求項６０に記載の組換え核酸配列。
【請求項６２】
前記少なくとも２つの共連結核酸配列の少なくとも１つはシャッフリングされる、請求項６１に記載の組換え核酸配列。
【請求項６３】
３つ以上の共連結異種核酸配列を含む遺伝子融合構築物であって、該３つ以上の核酸配列は、β−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼからなる群から選択される少なくとも３つの酵素ドメインをコードする、遺伝子融合構築物。
【請求項６４】
前記少なくとも３つの共連結核酸配列の少なくとも１つは改変される、請求項６３に記載の組換え核酸配列。
【請求項６５】
前記少なくとも３つの共連結核酸配列の少なくとも１つはシャッフリングされる、請求項６４に記載の組換え核酸配列。
【請求項６６】
２つ以上の共連結異種核酸配列を含む遺伝子融合構築物であって、該２つ以上の核酸配列は、ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、遺伝子融合構築物。
【請求項６７】
前記少なくとも２つの共連結核酸配列の少なくとも１つは改変される、請求項６６に記載の組換え核酸配列。
【請求項６８】
前記少なくとも２つの共連結核酸配列の少なくとも１つはシャッフリングされる、請求項６７に記載の組換え核酸配列。
【請求項６９】
２つ以上の共連結異種核酸配列を含む遺伝子融合構築物であって、該２つ以上の核酸配列は、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ｚ−カロチンデサチュラーゼ、およびβ−シクラーゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、遺伝子融合構築物。
【請求項７０】
前記少なくとも２つの共連結核酸配列の少なくとも１つは改変される、請求項６９に記載の組換え核酸配列。
【請求項７１】
前記少なくとも２つの共連結核酸配列の少なくとも１つはシャッフリングされる、請求項７０に記載の組換え核酸配列。
【請求項７２】
同じ代謝経路に関与する２つ以上の異種酵素ドメインを含むハイブリッドタンパク質であって、該２つ以上の酵素ドメインの少なくとも１つは、改変された核酸配列にコードされる、ハイブリッドタンパク質。
【請求項７３】
前記２つ以上の酵素ドメインの少なくとも１つは、シャッフリングされた核酸配列にコードされる、請求項７２に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項７４】
前記２つ以上の酵素ドメインは、１つ以上のペプチドリンカー配列に連結される、請求項７２に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項７５】
前記１つ以上のペプチドリンカー配列の少なくとも１つは、切断可能なペプチド配列またはインテイン配列を含む、請求項７４に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項７６】
前記同じ代謝経路に関与する酵素ドメインは、１つ以上のフィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ｚ−カロチンデサチュラーゼ、またはβ−シクラーゼを含む、請求項７２に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項７７】
前記同じ代謝経路に関与する酵素ドメインは、１つ以上のジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、またはエクトインシンターゼを含む、請求項７２に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項７８】
前記同じ代謝経路に関与する酵素ドメインは、１つ以上のβ−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、またはポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼを含む、請求項７２に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項７９】
前記同じ代謝経路に関与する酵素ドメインは、１つ以上のケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、またはシクラーゼを含む、請求項７２に記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項８０】
遺伝子融合構築物を生成する方法であって、該方法は、少なくとも２つの酵素ドメインをコードする２つ以上の核酸配列を共連結し、それにより遺伝子融合構築物を生成する工程であって、ここで、該核酸の少なくとも１つは植物に由来する、工程、を包含する、方法。
【請求項８１】
前記植物酵素は、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ｚ−カロチンデサチュラーゼ、およびβ−シクラーゼからなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記１つ以上の酵素ドメインは、同じ代謝経路に関与する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記２つ以上の核酸配列の少なくとも１つは改変される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記２つ以上の核酸配列の少なくとも１つは、シャッフリングする工程により改変される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記少なくとも１つの核酸配列をシャッフリングする工程は、再帰配列組換えを包含する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記２つ以上の核酸配列を共連結する工程は、該２つ以上の核酸配列を互いに直接連結する工程を包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
前記２つ以上の核酸配列を共連結することは、該２つ以上の核酸配列を、１つ以上のヌクレオチドリンカー配列で連結することを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８８】
前記１つ以上のヌクレオチドリンカー配列は独立して、約３〜約３００ヌクレオチドを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記１つ以上のヌクレオチドリンカー配列は独立して、約１２〜約９０ヌクレオチドを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記１つ以上のヌクレオチドリンカー配列の少なくとも１つは、１つ以上のイントロン配列を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記１つ以上のヌクレオチドリンカー配列の少なくとも１つは、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記ペプチドリンカーは、切断可能なペプチド配列またはインテイン配列を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記ペプチドリンカー中のアミノ酸残基の少なくとも約８０％は、アラニン残基およびグリシン残基からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記改変遺伝子融合構築物は、１つ以上の転写調節配列を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項９５】
前記１つ以上の転写調節配列は、１つ以上の植物転写調節配列を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記改変遺伝子融合構築物を、真核生物系に導入する工程をさらに包含する、請求項８０に記載の方法。
【請求項９７】
前記真核生物系は、植物系である、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記植物系は、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｍａｌｕｓ、Ａｐｉｕｍ、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ、ＤｏｃｕｓおよびＤａｔｕｒａから選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
請求項９７に記載の方法により調製される、トランスジェニック植物。
【請求項１００】
２つ以上の共連結異種核酸配列を含む遺伝子融合構築物であって、各核酸配列は、１つ以上の酵素ドメインをコードし、該２つ以上の核酸配列の少なくとも１つは植物に由来する、遺伝子融合構築物。
【請求項１０１】
前記２つ以上の異種核酸配列の少なくとも１つは改変される、請求項１００に記載の遺伝子融合構築物。
【請求項１０２】
前記２つ以上の異種核酸配列の少なくとも１つはシャッフリングされる、請求項１０１に記載の遺伝子融合構築物。
【請求項１０３】
前記２つ以上の異種核酸配列は、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、ｚ−カロチンデサチュラーゼ、およびβ−シクラーゼからなる群から選択される少なくとも２つの酵素ドメインをコードする、請求項１００に記載の改変遺伝子融合構築物。
【請求項１０４】
請求項１００に記載の遺伝子融合構築物およびプロモーターを含む、ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年８月２４日に提出された米国仮出願第６０／２２７，７１９号に対する優先権と利益を主張する。
【０００２】
（著作権情報）
３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．７１（ｅ）に従って、出願人等は、この開示の一部が、著作権保護対象の要素を含むことを注記する。著作権者は、米国特許商標庁の特許ファイルまたは記録で公表されているため、あらゆる人々による特許文書または特許開示の複製を拒否しないが、さもなくとも著作権全てを確保する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学の分野、より詳細には、２以上の融合酵素ドメインをコードする遺伝子融合構築物を作製する方法に関する。
【０００４】
（発明の背景）
代謝経路は、本質的に、特定の順序で実施される場合に、出発物質を所望の最終生成物へと導く、酵素活性の集合である。ある状況では、代謝経路は、合成手順であり、ある場合では、代謝経路は、分解プロセスである。代謝経路の酵素成分の合成および協調は、原核生物細胞のほとんど区画化されていない細胞環境下では比較的単純である。原核生物での転写および翻訳は、空間的および時間的の両方で連結している。原核細胞は膜に囲まれた核を有さないので、転写および翻訳は、真核生物のように区画化されておらず、これらのプロセスは、同じ細胞位置（細胞質）で行われる。しかし、真核生物は、それらの細胞構造においてより区画化されている。例えば、植物のような真核生物系の所望の区画において新規代謝経路を確立および実施することは、例えば、複数タンパク質に関する転写および翻訳事象の協調のさらなる障害、細胞内区画化の問題、ならびに複数のプロモーター、開始系および終結系の使用に起因して、原核細胞系における匹敵する代謝経路を確立することよりも困難である。従って、生物体（特に、真核生物）における代謝経路操作を容易にする、新規方法が所望される。
【０００５】
本発明は、例えば、植物系のような真核生物における代謝経路および経路成分の発現のための方法および組成物を提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
代謝経路操作は、新規代謝産物の産生のため、ならびに既存の代謝産物の産生のための現在のプロトコルの増強または拡大のための、両方に使用され得る。種間の代謝経路の移入もまた、特定の宿主において所望の代謝産物を産生する、新規方法を提供する。例えば、化学化合物の産生に関する細菌代謝経路を植物系に移入することにより、従来の化学合成または細菌発酵と比較して、代替的かつ潜在的に経済的に競合する様式で、この化合物を産生することが可能となる。あるいは、代謝経路成分の移入および発現、および生じた代謝産物（単数または複数）は、レシピエント系に所望の形質を付与し得る。
【０００７】
従って、本発明は、２以上の酵素ドメインをコードする２以上（しばしば、３以上）の核酸配列を共連結（ｃｏｊｏｉｎ）することを含む、改変された遺伝子融合構築物を産生する方法を提供し、ここで、それらの核酸配列の少なくとも１つは、元々決定されている（すなわち、未改変）配列と比較して、改変されている（例えば、変異、シャッフリング、さもなければ、変更されている）。この改変された核酸配列は、その配列を第２のヌクレオチド配列に共連結する前に改変され得るか、または、その配列が共連結された後に改変され得る。必要に応じて、改変された核酸配列は、繰り返しの（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）組換えを経て、その配列中に改変を生じる。核酸配列は、様々な形態のデオキシリボ核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、組換えＤＮＡ、シャッフリングされたＤＮＡ、改変ＤＮＡ、またはＤＮＡアナログ）であり得る。あるいは、核酸配列は、リボ核酸（ゲノムＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、組換えＲＮＡ、シャッフリングされたＲＮＡ、改変ＲＮＡ、またはＲＮＡアナログが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。核酸配列は、直接的に一緒に連結され得るか、または、１以上のヌクレオチドリンカー配列によって分離され得る。本発明のヌクレオチドリンカー配列は、代表的に、約３〜約３００ヌクレオチド長範囲であるが、場合によっては、より長くあり得る。必要に応じて、このヌクレオチドリンカー配列としては、イントロン、制限酵素部位、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）コード配列、および／または切断可能なペプチド領域をコードする配列が挙げられる。酵素ドメインをコードするヌクレオチド配列と同様に、ヌクレオチドリンカー配列は、例えば、変異、シャッフリング、または他の変更によって改変され得る。さらに、１以上の転写調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）が、その改変された遺伝子融合構築物に組み込まれ得る。この改変された遺伝子融合タンパク質は、真核生物系（例えば、植物系のような）にさらに導入され得る。
【０００８】
本発明の改変された遺伝子融合構築物に組み込まれる核酸は、単一の代謝経路に由来し得るか、または、（例えば、新規代謝経路を産生するために）２以上の別個の代謝経路に由来し得る。さらに、その遺伝子融合構築物に組み込まれる核酸は、単一の供給源または種に由来し得るか、または、複数の供給源または種を起源とし得る。本発明の一実施形態では、２以上の核酸配列にコードされる酵素ドメインは、酵素フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、および／またはβ−シクラーゼに由来する。本発明の代替的な実施形態では、２以上の核酸配列にコードされる酵素ドメインは、酵素ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼに由来する。本発明の別の実施形態では、２以上の核酸配列にコードされる酵素ドメインは、酵素β−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼに由来する。本発明のさらなる実施形態では、２以上の核酸配列にコードされる酵素ドメインは、以下のクラスの酵素に由来する：ケトシンターゼアシルトランスフェラーゼ、鎖長因子（ｃｈａｉｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼ。さらに、本発明は、改変された融合構築物、改変された遺伝子構築物を含むベクター、ハイブリッドタンパク質、およびトランスジェニック系（例えば、トランスジェニック植物系のような）を提供する。
【０００９】
本発明はまた、同じ代謝経路に関与する２以上の異種核酸配列を共連結することによって遺伝子融合構築物を産生する方法を提供し、ここで、共連結される核酸配列の少なくとも１つは、真核生物に由来し、共連結される別の核酸配列は、異なる種の真核生物または原核生物に由来する。改変された融合構築物を産生するための先に記載された方法における目的の核酸配列は、２以上の真核生物、または少なくとも１つの原核生物および少なくとも１つの真核生物に由来する、２以上の異種核酸配列を用いる方法において使用され得る。さらに、同様のヌクレオチドリンカー配列および転写調節エレメントが、使用され得る。これらの方法は、その改変された遺伝子融合構築物を、原核生物系または真核生物系（例えば、植物系）に導入する工程をさらに包含し得る。さらに、本発明は、遺伝子融合構築物、遺伝子融合構築物を含むベクター、ハイブリッドタンパク質、およびトランスジェニック系（例えば、トランスジェニック植物系）を提供する。
【００１０】
本発明はまた、異種酵素ドメインをコードする２以上の核酸配列を共連結することによって、遺伝子融合構築物を産生する方法を提供し、ここで、酵素ドメインの少なくとも１つが、植物に由来する。この植物酵素ドメインは、例えば、カロテノイドの生合成に関与する酵素に由来し得る。核酸配列は、改変された遺伝子融合構築物を産生する方法に関して記載されたように、様々な形態のデオキシリボ核酸またはリボ核酸であり得る。さらに、同様のヌクレオチドリンカー配列および転写調節エレメントが、必要に応じて使用され得る。これらの方法は、上記遺伝子融合構築物を、生物学的系（例えば、原核生物系または真核生物系）に導入する工程をさらに包含し得る。さらに、本発明は、遺伝子融合構築物、遺伝子融合構築物を含むベクター、ハイブリッドタンパク質、およびトランスジェニック生物学的系（例えば、トランスジェニック細菌、真菌、または植物系）を提供する。
【００１１】
本発明はまた、生物学的系（例えば、原核生物系または真核生物系）において、複数の酵素活性を発現させる方法を提供する。これらの方法は、上述の遺伝子構築物の１以上を、生物学的系に導入する工程を包含する。核酸配列は、一般的に、代謝経路に関与し得るタンパク質をコードし、ここで、この経路は、天然に存在し得るが、必ずしもそうではない（例えば、天然では同じ経路で通常機能しない酵素ドメインを組み合わせることによって新規代謝経路を作製する場合）。本発明の一実施形態では、核酸配列によりコードされる酵素ドメインは、酵素フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、および／またはβ−シクラーゼに由来する。本発明の代替的実施形態では、核酸配列にコードされる酵素ドメインは、酵素ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼに由来する。本発明の別の実施形態では、核酸配列にコードされる酵素ドメインは、酵素β−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼに由来する。本発明のさらなる実施形態では、核酸配列は、以下のクラスの酵素に由来する：ケトシンターゼアシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼ。本発明の方法で用いられる核酸配列は、様々な形態のデオキシリボ核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、組換えＤＮＡ、シャッフリングされたＤＮＡ、改変されたＤＮＡ、またはＤＮＡアナログ）であり得る。あるいは、リボ核酸（ゲノムＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、組換えＲＮＡ、シャッフリングされたＲＮＡ、改変されＲＮＡ、またはＲＮＡアナログが挙げられるが、これらに限定されない）を、使用し得る。個々の核酸配列、または核酸配列のライブラリーが、遺伝子融合構築物の合成にて使用され得る。酵素ドメインをコードする核酸配列は、互いに直接連結され得るか、またはそれらは、約３〜約３００ヌクレオチド長範囲の１以上のヌクレオチドリンカーを介して連結され得る。必要に応じて、これらの核酸配列の１以上および／またはリンカー配列の１以上は、（配列の連結の前または後のいずれかに）変異、シャッフリングまたは変更され得る。
【００１２】
上記の遺伝子融合構築物および改変された遺伝子融合構築物のように、本方法の遺伝子融合構築物に組み込まれる核酸は、単一の代謝経路に由来し得るか、または、（例えば、新規代謝経路を産生するために）２以上の別個の代謝経路に由来し得る。さらに、遺伝子融合構築物に組み込まれる核酸は、単一の供給源または種に由来し得るか、またはそれらは、複数の供給源または種を起源とし得る。遺伝子融合構築物および改変された遺伝子融合構築物は、構築物のライブラリー（例えば、組換え遺伝子融合構築物）を含み得、これは、必要に応じて、その遺伝子融合構築物または改変された遺伝子融合構築物を生物学的系に導入する前にスクリーニングされ得る。さらに、１以上の転写調節配列が、遺伝子融合構築物に組み込まれ得る。生物学的系は、原核生物系（例えば、細菌または古細菌細胞）であり得る。あるいは、生物学的系は、真核生物系（例えば、真核細胞、植物細胞、動物細胞、真菌、酵母、プロトプラスト、組織培養物、生物体など）であり得る。遺伝子融合構築物のこれらの系のいずれかへの導入は、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ポリエチレングリコール媒介性形質転換、またはアグロバクテリウム媒介性形質転換のような、当業者に公知の技術によって達成され得る。本発明の方法は、真核生物系において遺伝子融合構築物を発現させる工程をさらに包含し得る。さらに、本発明は、本発明の方法により調製されるような、遺伝子融合構築物、遺伝子融合構築物を含むベクター、ハイブリッドタンパク質、およびトランスジェニック系（例えば、トランスジェニック植物系）を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、本明細書中に記載の方法により調製される組換え核酸配列を提供する。いくつかの実施形態では、組換え核酸配列は、異なる真核生物種または真核生物および原核生物に由来する、少なくとも２つの共連結された酵素ドメインをコードする配列を含む。代替的な実施形態では、組換え核酸配列は、植物遺伝子に由来する、少なくとも２つの共連結された酵素ドメインをコードする配列を含む。必要に応じて、この組換え核酸配列は、例えば、変異、シャッフリング、繰り返しの組換えなどによって改変される。いくつかの実施形態では、組換え核酸配列は、少なくとも２つの共連結された酵素ドメインをコードする配列を含み、ここで、１以上の酵素ドメインをコードする配列は、本明細書に記載するように改変されている。組換え核酸配列にコードされる酵素ドメインは、同一代謝経路に関与するタンパク質に由来し得るか、または、（例えば、新規代謝経路を産生するために）２以上の別個の代謝経路に由来し得る。酵素ドメインが由来し得る代謝経路の例としては、カロチン合成経路（フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、およびβ−シクラーゼを含む）、エクトイン合成経路（ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼを含む）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）合成経路（β−ケトチオラーゼ、レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼを含む）、および最小ポリケチド合成経路（ケトシンターゼアシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼを含む）が挙げられる。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、特定の組成物または生物学的系に限定されず、これらの組成物および生物学的系が、当然、多種多様であり得ることが、理解される。また、本明細書中で使用する専門用語は、特定の実施形態のみについて記載する目的のためのものであり、限定するものと解釈されないことも理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに単数でないことを指示しない限り、複数対象を包含する。従って、例えば、「装置（ａ  ｄｅｖｉｃｅ）」に対する言及は、２以上のかかる装置の組み合わせを包含し、また「遺伝子融合構築物（ａ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」に対する言及は、構築物の混合物を包含する、など。
【００１５】
他に規定されない限り、本明細書中で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が関連する当該技術分野の当業者により一般に理解されているのと同義である。本明細書中に記載するものと類似または等価の任意の方法および材料が本発明の試験の実施に使用され得、好ましい材料および方法が、本明細書に記載される。
【００１６】
本発明を説明および特許請求する際に、以下の専門用語が、以下に記載する定義に従って使用される。
【００１７】
「改変（された）核酸配列」という用語は、例えば、親核酸と比較して改変された核酸における１以上のヌクレオチド残基を改変、欠失、再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｉｎｇ）または置換することによって、１以上の親核酸（例えば、１以上の天然に存在する核酸のような）に比較して変更されている核酸配列をいう。核酸配列改変の好ましい様式としては、シャッフリングおよび変異が挙げられる。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、核酸配列に対する改変は、核酸配列にコードされるアミノ酸配列の内部領域での置換、欠失および／または挿入を生じ、より好ましくは、複数の内部改変（すなわち、２個、３個またはそれ以上）が、そのコードされるポリペプチドに導入される。この型の内部改変は、例えば、タンパク質の一方の末端の切断と区別されるべきである。従って、酵素ドメインに対する内部改変の部位は、その酵素ドメインのアミノ末端とカルボキシ末端とに隣接する。
【００１８】
「改変（された）タンパク質」、「改変（された）酵素」、および「改変（された）酵素ドメイン」という用語は、対応する改変された核酸配列にコードされる翻訳産物をいう。
【００１９】
「多様化」および「多様性」という用語は、核酸配列に適用する場合、複数の改変形態の親核酸、または複数の親核酸の生成をいう。この核酸配列が遺伝子産物をコードする場合、その核酸配列の多様性は、対応する遺伝子産物の多様性を生じ得る（例えば、複数の改変されたタンパク質をコードする核酸配列の多様なプール）。本発明のいくつかの実施形態では、この配列多様性は、所望の機能特性を保有する改変された核酸／タンパク質についてスクリーニング／選択することによって利用される。
【００２０】
「コード（する）」という用語は、１以上のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、開始コドンまたは終止コドンを必要としない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列により提供される６つの異なる読み枠のいずれか１つにコードされ得る。
【００２１】
「植物」という用語は、植物全体、苗条栄養器官／構造（例えば、葉、茎および塊茎）、根、花および花器官／構造（例えば、苞葉、萼片、花弁、雄蕊、心皮、葯および胚珠）、種子（胚、内胚乳、および種皮を含む）および果実（成熟した子房）、植物組織（例えば、維管束組織、基本組織など）および細胞（例えば、孔辺細胞、卵細胞、突起様構造など）、ならびにそれらの子孫を包含する。本発明の方法で使用され得る植物のクラスは、一般に、被子植物（単子葉植物および双子葉植物）、裸子植物、シダ類、および多細胞藻類を含む、形質転換技法になじみやすい高等植物ならびに下等植物の種類と広範である。植物という用語は、様々な倍数性レベル（異数体、倍数体、二倍体、半数体、およびヘミ接合体を含む）の植物を包含する。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「遺伝子融合構築物」という用語は、少なくとも２つの異なる親核酸に由来する共連結された配列を含む、組換え核酸配列をいう。「改変された遺伝子融合構築物」は、構築物中の少なくとも１つのヌクレオチド（必要に応じて、コード領域中またはリンカー領域中）が、その構築物の一部が由来する親配列または野生型配列と比較した場合に、改変または変化されている、遺伝子融合構築物のサブセットを含む。
【００２３】
「酵素ドメイン」という用語は、酵素の活性部位を包含するポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の部分をいう。「酵素の活性部位」という用語は、一般に、タンパク質のある種の機能的活性を達成することが可能な酵素の領域をいい、例えば、化学反応を触媒し、リガンドまたは基質に結合し、あるいは小分子、生体高分子、核酸または他のタンパク質もしくはペプチドのような、別の分子と特異的に相互作用する。タンパク質の活性は、天然に存在する形態のタンパク質に対して内因性の活性であり得るか、またはそのタンパク質が由来とする親核酸の改変によりタンパク質に導入された活性であり得る。
【００２４】
酵素ドメインは、それが、特定の酵素のアミノ酸配列のいくつかの部分に、または場合によっては、特定の酵素の実質的に全てのアミノ酸配列に対応する場合、その特定の酵素「に由来」する。酵素ドメインは、特定の酵素をコードする核酸配列の改変の結果として、それが実質的に異なる配列および／または機能を有する場合でさえも、その特定の酵素に由来するとみなされる。
【００２５】
核酸配列は、その配列が元々植物から単離された場合、その配列が本明細書中に記載するようにその後に改変されるか否かに関係なく、植物「に由来」する。
【００２６】
「ペプチドリンカー」および「ペプチドリンカー配列」という用語は、他のペプチド配列（例えば、酵素ドメイン）との間に位置して、これらの配列を一緒に連結するアミノ酸配列をいう。ペプチドリンカーは、例えば、最終伸長構築物においてスペーサーユニットとして作用し得る。あるいは、ペプチドリンカーは、連結された配列を分離し得る機構によって（例えば、タンパク質分解性切断部位またはインテイン配列を提供することによって）提供することができる。
【００２７】
「遺伝子融合構築物」という用語は、２以上の共連結された異種核酸配列を含む構築物をいう。本発明の好ましい実施形態では、共連結された配列は、異種酵素ドメインをコードし、その構築物の発現により、直接的にかまたはペプチドリンカーによって一緒に融合された異種酵素ドメインを含む、ハイブリッドタンパク質を生じる。遺伝子融合構築物の調製は、代表的に、融合コード領域における正確な読み枠の維持および任意の内部終止コドンの除去を包含する。あるいは、内部終止コドンは、特定の生物学的系で抑制され得る。
【００２８】
本明細書中で使用する場合、「異種」という用語は、２以上の成分が通常天然では互いに近接して見出されないことを示す、それらの成分間の関係を表す。従って、「異種酵素ドメイン」という用語は、天然で単一のポリペプチド中に見出されない酵素ドメインをいう（例えば、異種ドメインが、２つの異なる酵素または異なる種の酵素に由来する場合、など）。異種のアイテム（すなわち、酵素ドメイン、ポリペプチド、核酸配列など）は、同じ種に由来し得るか（例えば、その種における２つの異なるタンパク質）、または異なる種に由来し得る。
【００２９】
ポリヌクレオチド配列は、それが外来種を起源とする場合に、または同種に由来し、その本来の形態から改変されている場合、生物または第２のポリヌクレオチド配列「に対して異種」である。例えば、異種コード配列に作動可能に連結されているプロモーターは、そのプロモーターが由来する種と異なる種由来のコード配列をいうか、または同種に由来する場合、そのプロモーターと天然では関連しないコード配列（例えば、遺伝子操作されたコード配列または異なる生態型または変種由来の対立遺伝子）をいう。
【００３０】
「代謝経路」という用語は、生成物への基質の化学的変換をもたらす、代表的には、酵素に媒介される、触媒活性の任意の組合せをいう。代謝経路は、異化作用性または同化作用性であり得る。代謝経路は、通常、生物学的系中で見出されるものであり得るか、または天然では見出されない新規代謝経路であり得る。２以上の酵素（または酵素ドメイン）群は、各酵素の基質および／または生成物が、その群の別のメンバーの基質または生成物である場合に、共通の代謝経路のメンバーであり、それらの酵素の協調された活性は、適切な条件下で、中間体（または一連の中間体）を介した生成物（単数または複数）への基質（単数または複数）の変換をもたらす。代表的な例では、基質は、その群の第１のメンバーによって第１の中間体に変換され、第１の中間体は、その群の第２のメンバーによって第２の中間体に変換され、第２の中間体は、その群の第３のメンバーによって代謝経路の最終生成物に変換される。代謝経路中の中間体数は、経路によって様々であり、例えば、その経路が１つの中間体しか有さない場合もあれば、多くの中間体を有する場合もある。場合によっては、代謝経路は、分岐し得、その結果、１以上の中間体が、代替的な生成物に変換され得る。代謝経路に応じて、基質、生成物および中間体の数は、１つから多数まで変化することができる。
【００３１】
「生物学的系」という用語は、その後の複製、組換えおよび／または発現のために核酸配列が導入され得る任意の系（細菌、古細菌、原生動物、真菌、植物、動物、ウイルス、単細胞、多細胞生物、リポソームのような人工構造、インビトロ発現系などが挙げられるが、これらに限定されない）を指す。
（真核生物における代謝経路操作および発現）
植物のような真核生物の所望の区画に複数の単一酵素を有する新たな（または改変された）代謝経路を確立することは、原核生物系の比較的区画化されていない環境でこれを達成するよりも困難である。その困難性は、各酵素の転写がそれ自身のプロモーターおよび終結配列により支配されているという事実に、一部は存在する。例として、４つの酵素から構成される代謝経路は、代表的には、完全な発現のために４つのプロモーター配列および４つの終結配列を必要とする。複数の転写物の別個の合成および翻訳後に、翻訳されたペプチド配列を、形質転換宿主中の同じ区画に共存させることに困難が生じ得る。別の考慮事項は、真核生物中へ操作されるべき酵素の供給源である。酵素が同じ代謝経路に関与し得る一方で、代謝経路の各工程に関する酵素の最適な選択は異なる種に由来してもよく、したがって、様々なｐＨ最適条件、温度要件、代謝回転速度、および他の環境要件または効果を有する。
【００３２】
複数の代謝酵素の同時発現の問題を解決するための１つの現在のアプローチとしては、酵素それぞれをコードする核酸配列を別個のプラスミドにクローニングすることが挙げられる。次に、そのプラスミドは、所望の真核生物系に、当該系に適切な形質転換方法論（細菌媒介性形質転換、プロトプラスト融合技法、粒子ボンバードメントなど）によりトランスフェクトされる。あるいは、酵素をコードする核酸配列が、発現カセットに集められて、複数のエレメントとしてではなく単一ベクターとして、宿主細胞にトランスフェクトされ得る。このような方法論は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌら編（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の共同事業（２０００年に増補））。
【００３３】
しかしながら、これらのアプローチは、かなりの欠点に苦しむ。核酸配列が宿主ゲノムに組み込まれる場合、位置的な効果に起因する発現問題が存在し得る（例えば、関連核酸配列が、きつく凝縮されたクロマチンセクションに挿入され得る）。ゲノムが複製されて、宿主細胞が分裂する場合の分離効果もまた、１つ以上の関連配列の損失を引き起こし得る。さらに、タンデムクローニングアプローチの場合では、同じプロモーター系の繰り返しの使用に関連した安定性の問題が存在する。これらの問題は、真核生物系における多酵素代謝経路の実用性および実施を激しく損なう。
【００３４】
本発明は、複数の酵素活性を発現する方法、および改変遺伝子構築物を生産する方法を提供し、ここで所望の代謝酵素は、長い単一多機能ハイブリッドタンパク質として生産される。共連結された一連の核酸配列から翻訳される単一ペプチドとして所望の酵素ドメインを合成することにより、代謝経路中の複数酵素の同時発現および共存を取り巻く問題は、克服される。本発明の遺伝子融合構築物に組み込まれた核酸配列は、互いに直接連結され得、あるいはその配列は、ヌクレオチドリンカー配列により隔てられ得る。本発明のいくつかの実施形態では、生じるハイブリッドタンパク質に組み込まれた酵素活性は、共連結された形態またはつながった形態で活性である。別の実施形態では、例えば酵素活性を改変するために、転写または翻訳後に酵素ドメインを切断または分離することが、望ましい場合があり得る。構成する酵素活性の分離は、例えばタンパク質分解性切断または加水分解に感受性であるペプチドリンカーの使用により、あるいはリンカー配列にインテインまたはイントロン配列を組み込むことにより、達成され得る。これらの方法、ならびにこれらの方法にて使用されるかまたはこれらの方法により生産される遺伝子融合構築物、改変遺伝子融合構築物、およびハイブリッドタンパク質について、以下でさらに詳述する。
（遺伝子融合構築物）
本発明は、遺伝子融合構築物の使用により複数の酵素活性を発現する方法、および改変遺伝子構築物を生成する方法を提供する。さらに、本発明は、これらの方法で使用するための遺伝子融合構築物、およびこれらの方法により調製される改変遺伝子融合構築物を提供する。最も簡単な形態の遺伝子融合構築物は、酵素ドメインをコードする核酸配列の組合せである（図１〜３）。この構築物は、転写エレメント、プロモーター、終結配列、イントロンなどのような、コードされるハイブリッドタンパク質の発現に関与する核酸配列をさらに含み得る。さらに、この構築物は、以下に記載するようなヌクレオチドリンカー配列を含み得る。
【００３５】
本発明の遺伝子融合構築物および改変遺伝子融合構築物を形成するために共連結される核酸配列は、様々な形態のデオキシリボ核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、組換えＤＮＡ、シャッフリングされたＤＮＡ、改変ＤＮＡ、またはＤＮＡアナログ）であり得る。あるいは、この核酸配列は、リボ核酸（ゲノムＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、組換えＲＮＡ、シャッフリングされたＲＮＡ、改変ＲＮＡ、またはＲＮＡアナログが挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。本発明の融合構築物に組み込まれる核酸配列はまた、１つ以上の核酸配列ライブラリーに由来し得る。
【００３６】
本発明の遺伝子融合構築物および改変遺伝子構築物は、分子クローニング技法のような、当該技術分野で公知の多数の技法により調製され得る。発現ベクターのような、組換え核酸の構築に適した多種多様なクローニング方法およびインビトロ増幅方法が、当業者に周知である。変異誘発を含む、本明細書にて有用な分子生物学的技法を記載している一般的なテキストとしては、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  １５２、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（「Ｂｅｒｇｅｒ」）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版），ｖｏｌｕｍｅｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）；ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の共同事業）（２０００年に増補）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性技法（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む、インビトロ増幅方法を介して当業者を指向するために十分な技法の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓら、（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；ＡｒｎｈｅｉｍおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；Ｋｗｏｈら、（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ  ４：５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８９：１１７；ならびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４に見出される。インビトロ増幅核酸をクローニングする改良方法は、Ｗａｌｌｅｎｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。ＰＣＲにより大きな核酸を増幅する改良方法は、Ｃｈｅｎｇら��１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５およびその中の参照文献に要約されており、そこでは最大４０ｋｂのＰＣＲアンプリコンが生成される。当業者は、本質的に任意のＲＮＡが、逆転写酵素およびポリメラーゼを用いて、制限消化、ＰＣＲ増大および配列決定に適した二重鎖ＤＮＡに変換され得ることを理解する。Ａｕｓｂｅｌ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（全て上述）を参照されたい。
【００３７】
遺伝子融合構築物に含まれるための核酸配列の単離は、当該技術分野で公知の多数の技法により達成され得る。例えば、既知の配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブが用いられて、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の遺伝子が同定され得る。プローブが用いられて、同種または異なる種中の相同遺伝子を単離するためにゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズされ得る。あるいは、酵素に対して誘起される抗体を用いて、対応するコード配列に関して、ｍＲＮＡ発現ライブラリーがスクリーニングされ得る。
【００３８】
あるいは、目的の核酸は、増幅技法を用いて核酸サンプルから増幅され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が用いられて、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリー、またはｃＤＮＡライブラリーから直接、所望の遺伝子配列が増幅され得る。ＰＣＲおよび他のインビトロ増幅方法はまた、例えば発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするために、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用する核酸を作製するために、核酸配列決定のために、または他の目的のために、有用であり得る。ＰＣＲの総説に関しては、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．、Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．、Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．およびＷｈｉｔｅ，Ｔ．編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０）を参照されたい。
【００３９】
ポリヌクレオチドまた、技術文献中に記載されているような周知の技法により合成され得る。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８（１９８２）、およびＡｄａｍｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１（１９８３）を参照されたい。続いて、二本鎖ＤＮＡフラグメントは、相補鎖を合成することかつ適切な条件下でその鎖を一緒にアニーリングすること、あるいは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖に適切なプライマー配列を付加することのいずれかによって、得られ得る。
（例えばインビトロ増幅方法で、遺伝子プローブとして使用するための）プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチド、またはシャッフリング標的使用するためのオリゴヌクレオチド（例えば合成遺伝子また遺伝子セグメント）は、代表的には、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２に記載される固相ホスホロアミダイトトリエステル方法に従って、例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８に記載されるようなに自動合成機を用いて、化学的に合成される。本発明の核酸構築物に使用するためのオリゴヌクレオチドはまた、当業者に公知の種々の商業的供給源に、特注および注文され得る。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子融合構築物は、共連結核酸配列の他に、プロモーター、エンハンサーエレメント、およびシグナル伝達配列のような、エレメントを含む。例示的プロモーターとしては、ＣａＭＶプロモーター、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ小サブユニット遺伝子由来のプロモーター、ユビキチンプロモーター、およびｒｏｌＤプロモーターが挙げられる。例示的エンハンサーエレメントとしては、が挙げられるが、これらに限定されない。例示的シグナル伝達配列としては、組織特異的輸送ペプチド（例えば、葉緑体輸送ペプチド）をコードする核酸配列が挙げられるが、これに限定されない。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態では、植物細胞の形質転換に適切な遺伝子融合構築物および／または改変遺伝子融合構築物が調製される。所望の核酸をコードするＤＮＡ配列（例えば酵素ドメインをコードするｃＤＮＡ配列またはゲノム配列）が、所望の植物に導入され得る組換え発現カセットを構築するために、便利よく使用される。発現カセットは、代表的には、形質転換植物の対象組織（例えば、植物全体、葉、種子）中の遺伝子から配列の転写を指向する、プロモーターならびに他の転写開始調節配列および翻訳開始調節配列に作動可能に連結された、選択核酸配列（構築物に依存して改変または未改変）を含む。
【００４２】
例えば、植物の組織全部において本明細書中に記載する遺伝子融合構築物または改変遺伝子融合構築物中のコード配列の発現を指向する、強く構成的な植物プロモーターまたは弱く構成的な植物プロモーターが、使用され得る。このようなプロモーターは、ほとんどの環境条件および発達また細胞分化の状態下で活性である。構成的プロモーターの例としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡに由来する１’−プロモーターまたは２’−プロモーター、および当業者に公知の様々な植物遺伝子からの他の転写開始領域が、挙げられる。遺伝子融合構築物からの遺伝子の過剰発現が植物にとって有害である状況では、当業者は、本開示を吟味して、低レベルの発現のために弱い構成的プロモーターが使用され得ることを、理解する。高レベルの発現が植物にとって有害でない場合では、強力なプロモーター（例えば、ｔ−ＲＮＡプロモーターまたは他のｐｏｌＩＩＩプロモーター）、または強力なｐｏｌＩＩプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター）が、使用され得る。
【００４３】
あるいは、植物プロモーターは、環境制御下にあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では「指向性」プロモーターと称する。指向性プロモーターによる転写を達成し得る環境条件の例としては、病原体攻撃、嫌気性条件、または光の存在が挙げられる。
【００４４】
本発明の遺伝子融合構築物および／または改変遺伝子融合構築物に組み込まれるプロモーターは、「組織特異的」であり得、したがって所望の遺伝子が、葉および種子のような特定の組織のみで発現されるという点で発達制御下にあり得る。植物系にとって内因性の１つ以上の核酸配列が構築物に組み込まれる実施形態では、これらの遺伝子由来の内因性プロモーター（またはその改変体）が、トランスフェクトされた植物中の遺伝子発現を指向するために使用され得る。組織特異的プロモーターはまた、本明細書中に記載するような改変核酸を含む異種構造遺伝子の発現を指向するために使用され得る。
【００４５】
一般に、植物中の発現カセットで使用される特定のプロモーターは、対象とされる用途に依存する。植物細胞での転写を指向する多数のプロモーターのいずれかが適切である。このプロモーターは、構成的または指向性のいずれかであり得る。上述のプロモーターに加えて、植物中で作動する細菌起源のプロモーターとしては、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびネイティブＴｉプラスミドに由来する他のプロモーターが挙げられる（例えば、Ｈｅｒｒａｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３）。ウイルスプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターが挙げられる（Ｏｄｅｌｌら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）。他の植物プロモーターとしては、リブロース−１，３−二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットプロモーター、およびファゼオリンプロモーターが挙げられる。Ｅ８遺伝子および他の遺伝子由来のプロモーター配列が、使用され得る。Ｅ８プロモーターの単離および配列は、ＤｅｉｋｍａｎおよびＦｉｓｃｈｅｒ（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３３１５−３３２７に詳述されている。
【００４６】
候補プロモーターを同定するために、ゲノムクローンの５’部位が、プロモーター配列に特徴的な配列に関して分析される。例えば、プロモーター配列エレメントは、ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）を含み、これは通常、転写開始部位の２０〜３０塩基上流にある。植物では、Ｍｅｓｓｉｎｇら（１９８３）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｋｏｓａｇｅら（編），ｐｐ．２２１−２２７に記載されるように、ＴＡＴＡボックスからさらに上流に、−８０位〜−１００位に、トリヌクレオチドＧ（またはＴ）の周囲にある一連のアデニンを有するプロモーターエレメントが、代表的には、存在する。
【００４７】
本発明の遺伝子融合構築物または改変遺伝子融合構築物を調製する際に、プロモーターおよび共連結核酸配列以外の配列もまた、使用され得る。正常なポリペプチド発現が望ましい場合、シャッフリングされたコード領域の３’末端にあるポリアデニル化領域を含まれ得る。ポリアデニル化領域は、天然遺伝子、様々な他の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡに由来し得る。
【００４８】
この遺伝子融合構築物および／または改変遺伝子融合構築物はまた、選択可能な表現型を植物細胞に付与するマーカー遺伝子を含み得る。例えば、このマーカーは、殺生剤耐性、特に抗生物質耐性（例えば、カナマイシンに対する耐性、Ｇ４１８に対する耐性、ブレオマイシンに対する耐性、ハイグロマイシンに対する耐性）、または除草剤耐性（クロロスルフォロン（ｃｈｌｏｒｏｓｌｕｆｏｒｏｎ）に対する耐性またはホスフィノスリシン（除草剤ビアラホスおよびＢａｓｔａにおける活性成分）に対する耐性）をコードし得る。
【００４９】
この遺伝子融合構築物はまた、例えばコードされたポリペプチドの精製を容易とするマーカー配列にインフレームで融合された、コード配列またはそのフラグメントを含み得る。このような精製を容易とするドメインとしては、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、グルタチオンを結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティ精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で利用されるＦＬＡＧエピトープなどが挙げられるが、これらに限定されない。精製ドメインと酵素ドメインとの間に、プロテアーゼで切断可能なポリペプチドリンカーを含むことは、精製を容易にするために有用である。
【００５０】
例えば、本明細書中に記載する組成物および方法で使用することが可能である発現ベクターの１つは、エンテロキナーゼ切断部位により分離されたポリヒスチジン領域に融合された本発明のポリペプチドを含む、融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（Ｐｏｒａｔｈら（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３：２６３−２８１に記載されるような、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ）での精製を容易にすると同時に、エンテロキナーゼ切断部位は、発現産物の残部からポリヒスチジン領域を分離する方法を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために、必要に応じて使用される。例えばＰｉｃｈｉａでの発現を可能にするｐＰＩＣｚベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような、他の発現系もまた、必要に応じて使用される。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、リガンド−アガロースビーズ（ＧＳＴ融合物の場合、グルタチオン−アガロース）への吸着、続く遊離リガンドの存在下での溶出により、溶解した細胞から容易に精製され得る。
【００５１】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニア沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィまたはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（例えば、本明細書中に記載するタグ付け系のいずれかを用いて）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、およびレクチンクロマトグラフィを含む、当該技術分野で周知の多数の方法のいずれかにより、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。いくつかの場合、タンパク質は、機能的生成物を回収するためにリフォールディングさせる必要がある。上述の参照文献に加えて、例えばＳａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；ならびにＢｏｌｌａｇら（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；ならびにＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪに記載されるものを含む様々な精製方法が、当該技術分野で既知である。
【００５２】
無細胞転写／翻訳系もまた、本発明の遺伝子融合構築物を発現するために使用され得る。いくつかのこのような系が市販されている。インビトロ転写および翻訳プロトコルに関する一般的な手引きは、Ｔｙｍｍｓ（１９９５）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  ３７，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹに見出される。
【００５３】
本発明はまた、本発明の２つ以上の核酸を（例えば、組換え用基質として）含む、組成物を包含する。この組成物は、組換え核酸ライブラリーを含むことができ、ここでライブラリーは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、もしくは少なくとも５０個またはそれ以上の核酸を含む。この核酸は、必要に応じて発現ベクター中にクローニングされて、発現ライブラリーを提供する。
【００５４】
本発明はまた、（例えば、上述の組換え方式のいくつかで実施されるように）制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡ分解酵素、またはＤＮＡ分解酵素で、本発明の１つ以上の核酸を消化することにより生成される組成物、および機械的手段（例えば、超音波処理、ボルテックスなど）により本発明の１つ以上のポリヌクレオチドをフラグメント化あるいはせん断することにより生成される組成物を包含し、これらの組成物は、上述の方法で組換え用の基質を提供するために使用され得る。同様に、１つより多くの本発明の核酸に対応するオリゴヌクレオチドのセットを含む組成物は、組換え基質として有用であり、本発明の特徴である。便宜上、これらのフラグメント化混合物、せん断混合物、オリゴヌクレオチド合成混合物を、フラグメント化核酸セットと呼ぶ。
【００５５】
また、リボヌクレオチド三リン酸またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸と核酸ポリメラーゼとの存在下でフラグメント化核酸セットの１つ以上をインキュベートすることにより生成される組成物もまた、本発明に包含される。この生じた生成物は、上述の組換え方式の多数用の組換え混合物を形成する。核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、「逆転写酵素」）であってもよい。このポリメラーゼは、例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＶＥＮＴ、ＴＡＱなど）であり得る。
【００５６】
本発明の融合タンパク質を生産および単離するための組換え方法は、上述している。組換え生産に加えて、このポリペプチドは、固相技法を用いた直接ペプチド合成により生産され得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら（１９６９）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４を参照のこと）。ペプチド合成は、手動技法を用いて、または自動化により、実施され得る。自動合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて、製造業者により供給される説明書に従って達成され得る。例えば、部分配列が、別個に化学的に合成され、化学的方法を用いて組み合わされ、完全長融合タンパク質が提供され得る。あるいは、このような配列は、ポリペプチドの生産を専門とする多数の会社に注文され得る。本発明の最も一般的な融合タンパク質は、例えば上述のように、コード核酸を発現させて、ポリペプチドを回収することにより生成される。
（核酸配列の改変による改変遺伝子融合構築物の形成）
本発明のいくつかの実施形態において、改変遺伝子融合構築物が用いられる。遺伝子融合構築物における１つ以上の核酸配列の改変プロセスは、そのタンパク質または酵素ドメインの、最初に同定された（すなわち「親」）配列と比較して、配列を変更することを包含する。配列の変更プロセスは、例えば、核酸配列の単一ヌクレオチド置換、複数ヌクレオチド置換、および領域の挿入または欠失をもたらし得る。
【００５７】
様々な多様性生成プロトコルが、当該技術分野で利用可能でありそして記載されている。その手順は、核酸または核酸のセットの１つ以上の改変体、ならびにコードタンパク質の改変体を生成するために、別々に、かつ／または組み合わせて使用され得る。個別かつ集合的に、それらの手順は、例えば、新規の特徴および／または改善された特徴を持つ、核酸、タンパク質、経路、細胞、および／または生物の、変更、操作、または急速な進化に有用な、多様化された核酸および核酸のセット（例えば、核酸ライブラリーを含む）を生成する、強固で広範囲に応用可能な方法を提供する。
【００５８】
明確にするために、続く議論において区別および分類がなされるが、これらの技術がしばしば相互に排他的ではないことが、理解される。実際、様々な方法が、多様な配列改変体を利用するために、単独にか、あるいは、並行してかまたは順次に組み合わせて、使用され得る。
【００５９】
本明細書中に記載されるいずれの多様性生成手順の結果も、１つ以上の核酸の生成であり得、これらの核酸は、所望の特性を持つかまたは与えるタンパク質をコードする核酸について、選択またはスクリーニングされ得る。本明細書中の方法または当業者に利用可能な方法の１つ以上による多様化の後、生成される任意の核酸が、所望の活性または特性（例えば、１つ以上の代謝経路に由来する複数の酵素ドメインのコード）について選択され得る。これは、例えば自動化方式または自動化可能な方式で、当該技術分野の任意のアッセイにより検出され得る任意の活性または活性のセットを同定することを、含み得る。例えば、カロテノイド化合物、エクトイン、種々のポリヒドロキシアルカノエート、多数の芳香族ポリケチド、または他の代謝経路生成物もしくは副生成物の生合成が、さらに以下で記載されるように、決定され得る。あるいは、個々の酵素活性は、当該技術分野で公知の多数のアッセイのいずれかにより、アッセイされ得る。さらに，様々な関連した（またはさらに未関連の）特性が、順次にかまたは並行して、実施者の判断により、評価され得る。
【００６０】
複数の酵素ドメインをコードする改変核酸配列を生成するための様々な多様性生成手順の記載は、以下の文献およびその中に引用される参考文献に見られる：
Ｓｏｏｎｇ，Ｎ．ら（２０００）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ」Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５（４）：４３６−３９；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」Ｔｕｍｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ４：１−４；Ｎｅｓｓら（１９９９）「ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６；Ｃｈａｎｇら（１９９９）「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：７９３−７９７；ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９９）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら（１９９９）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ＡＺＴ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｓｅｎａｔｅ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら（１９９７）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４５０４−４５０９；Ｐａｔｔｅｎら（１９９７）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：７２４−７３３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：１００−１０３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３１５−３１９；Ｇａｔｅｓら（１９９６）「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｓｏｌａ���ｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｎ  ａ  ｌａｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｈｅａｄｐｉｅｃｅ  ｄｉｍｅｒ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５５：３７３−３８６；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９６）「Ｓｅｘｕａｌ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ」Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐｐ．４４７−４５７；ＣｒａｍｅｒｉおよびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａｌｌ  ｔｈｅ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ｗｉｌｄｔｙｐｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：１９４−１９５；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５）「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｏｒｍ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｇｅｎｅ，１６４：４９−５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｔｈｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１５１０；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｐａｃｅ」Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５４９−５５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１；およびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１。
【００６１】
多様性を生成する突然変異性法として、例えば、部位特異的突然変異誘発（Ｌｉｎｇら（１９９７）「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８；Ｄａｌｅら（１９９６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ（１９８５）「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ（１９８６）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；およびＫｕｎｋｅｌ（１９８７）「Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｓｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ））；ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）「Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２；およびＢａｓｓら（１９８８）「Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５）；オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（１９８２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（１９８３）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５��０；およびＺｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（１９８７）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０）；ホスホロチオエートで改変ＤＮＡの突然変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）  「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）「Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８６）「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８；Ｓａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｙ−Ｔ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２；およびＳａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４）；ギャップ化二本鎖ＤＮＡを使用する突然変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ」１５４：３５０−３６７；Ｋｒａｍｅｒら（１９８８）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍ��ｔａｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７；およびＦｒｉｔｚら（１９８８）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９）が挙げられる。
【００６２】
さらなる適した方法として、点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ」Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７）、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら（１９８５）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；およびＣａｒｔｅｒ（１９８７）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３）、欠失突然変異誘発（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８６）「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５）、制限−選択および制限−選択および制限−精製（Ｗｅｌｌｓら（１９８６）「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４１５−４２３）、全遺伝子合成による突然変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら（１９８４）「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１；ＳａｋａｍａｒおよびＫｈｏｒａｎａ（１９８８）「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ）」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２；Ｗｅｌｌｓら（１９８５）「Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ」Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３；およびＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍら（１９８５）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ’ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６）、二本鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５．「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇ��ｎｅｓｉｓ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：７１７７−７１８１）が挙げられる。上記方法の多くのさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５４（種々の突然変異誘発法での問題を解決するための有用なコントロールもまた記載する）に見いだされ得る。
【００６３】
種々の多様性生成法に関するさらなる詳細は、以下の米国特許、ＰＣＴ公開広報、およびＥＰＯ公開広報に見いだされ得る：Ｓｔｅｍｍｅｒに対する米国特許第５，６０５，７９３号（１９９７年２月２５日）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８１１，２３８号（１９９８年９月２２日）「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３０，７２１号（１９９８年１１月３日）、ＤＮＡ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３４，２５２号（１９９８年１１月１０日）「Ｅｎｄ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」；Ｍｉｎｓｈｕｌｌらに対する米国特許第５，８３７，４５８号（１９９８年１１月１７日）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＷＯ９５／２２６２５、ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉ、「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；ＳｔｅｍｍｅｒおよびＬｉｐｓｃｈｕｔｚによるＷＯ９６／３３２０７「Ｅｎｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」；ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＷＯ９７／２００７８「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ９７／３５９６６、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ９９／４１４０２「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ９９／４１３８３「Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ９９／４１３６９「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＰｕｎｎｏｎｅｎらによるＷＯ９９／４１３６８「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉによるＥＰ７５２００８、「ＤＮＡ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ」；ＳｔｅｍｍｅｒによるＥＰ０９３２６７０、「Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ  Ｕｐｔａｋｅ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍ���ｉｎａｔｉｏｎ」；ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ９９／２３１０７、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  Ｒａｎｇｅ  ｂｙ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；ＡｐｔらによるＷＯ９９／２１９７９、「Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」；ｄｅｌ  ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ９８／３１８３７、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＰａｔｔｅｎおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ９８／２７２３０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」；ＳｔｅｍｍｅｒらによるＷＯ９８／１３４８７、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、ＷＯ００／００６３２、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ００／０９６７９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｎｋｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ９８／４２８３２、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｎｄｏｍ  ｏｒ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒｓ」、ＡｒｎｏｌｄらによるＷＯ９９／２９９０２、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｒｅａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＶｉｎｄによるＷＯ９８／４１６５３、「Ａｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ」、ＢｏｒｃｈｅｒｔらによるＷＯ９８／４１６２２、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、およびＰａｔｉおよびＺａｒｌｉｎｇによるＷＯ９８／４２７２７、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」、ＰａｔｔｅｎらによるＷＯ００／１８９０６、「Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ−Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｇｅｎｅｓ」；ｄｅｌ  ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ００／０４１９０、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＣｒａｍｅｒｉらによるＷＯ００／４２５６１、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ００／４２５５９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ００／４２５６０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」；ＷｅｌｃｈらによるＷＯ０１／２３４０１、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；およびＡｆｆｈｏｌｔｅｒによるＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」。
【００６４】
特定の米国特許出願が、種々の多様性生成法に関するさらなる詳細を提供し、これには以下が挙げられる：Ｐａｔｔｅｎらによる「ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ  ＯＦ  ＣＯＤＯＮ  ＡＬＴＥＲＥＤ  ＧＥＮＥＳ」、１９９９年９月２８日出願（ＵＳＳＮ０９／４０７，８００）；ｄｅｌ  Ｃａｒｄａｙｒｅらによる「ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＷＨＯＬＥ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＯＲＧＡＮＩＳＭＳ  ＢＹ  ＲＥＣＵＲＳＩＶＥ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」、１９９８年７月１５日出願（ＵＳＳＮ０９／１６６，１８８）、および１９９９年７月１５日出願（ＵＳＳＮ０９／３５４，９２２）；Ｃｒａｍｅｒｉらによる「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」、１９９９年９月２８日出願（ＵＳＳＮ０９／４０８，３９２）、およびＣｒａｍｅｒｉら「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」、２０００年１月１８日出願（ＰＣＴ／ＵＳ００／０１２０３）；Ｗｅｌｃｈらによる「ＵＳＥ  ＯＦ  ＣＯＤＯＮ−ＢＡＳＥＤ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＦＯＲ  ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」、１９９９年９月２８日出願（ＵＳＳＮ０９／４０８，３９３）；Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖらによる「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＡＫＩＮＧ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ  ＳＴＲＩＮＧＳ，  ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＆  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＥＳＩＲＥＤ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」、２０００年１月１８日出願（ＰＣＴ／ＵＳ００／０１２０２）、およびＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによる「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＭＡＫＩＮＧ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ  ＳＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＆  ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＥＳＩＲＥＤ  ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」、２０００年７月１８日出願（ＵＳＳＮ０９／６１８，５７９）；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによる「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＰＯＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＤＡＴＡ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ  ＦＯＲ  ＵＳＥ  ＩＮ  ＥＶＯＬＵＴＩＯＮＡＲＹ  ＳＩＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」（ＰＣＴ／ＵＳ００／０１１３８）、２０００年１月１８日出願；およびＡｆｆｈｏｌｔｅｒによる「ＳＩＮＧＬＥ−ＳＴＲＡＮＤＥＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＴＥＭＰＬＡＴＥ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＦＲＡＧＭＥＮＴ  ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ」（ＵＳＳＮ６０／１８６，４８２、２０００年３月２日出願）。
【００６５】
簡単には、いくつかの異なる一般的なクラスの配列改変法（例えば、突然変異、組換えなど）が本発明に適用可能であり、例えば上記の参考文献中に示される。すなわち、成分核酸配列を変更して改変遺伝子融合構築物を生成することは、配列の共連結（ｃｏｊｏｉｎｉｎｇ）の前かまたは共連結工程後のいずれかに、任意の数の記載されるプロトコルにより行われ得る。以下は、本発明の文脈における多様性生成のための好適な方式（例えば、特定の組換えに基づく多様性生成方式を含む）の異なる型のいくつかを例示する。
【００６６】
核酸は、上記の参考文献に考察される種々の技術（例えば、組換えられる核酸のＤＮＡａｓｅ消化、続く核酸のライゲーションおよび／またはＰＣＲ再アセンブリが挙げられる）のいずれかによりインビトロで組換えられ得る。例えば、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発は、ＤＮＡ分子の無作為（または擬似無作為、またはさらに非無作為の）フラグメント化に続いて、インビトロで、異なるが関連したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子間の配列類似性に基づく組換え、続くポリメラーゼ連鎖反応法における伸長による交差の固定化において、使用され得る。このプロセスおよび多くのプロセス改変型が、上記の参考文献のいくつか、例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１０７４７−１０７５１に記載される。
【００６７】
同様に、核酸は、例えば細胞中の核酸間で組換えを生じさせることにより、インビボで再帰に組換えられ得る。多くのそのようなインビボ組換え方式は、上記の参考文献中に記述される。そのような方式は、他の方式と同様に、必要に応じて、目的の核酸間の直接組換えを提供するか、または目的の核酸を含むベクター、ウイルス、プラスミドなどの間の組換えを提供する。そのような手順に関する詳細は、上記される参考文献中に見いだされる。
【００６８】
全ゲノム組換え法もまた、細胞または他の生物の全ゲノムの組換えにおいて使用することができ、必要に応じて、所望のライブラリー成分（例えば、本発明の経路に対応する遺伝子）を持つゲノム組換え混合物のスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）を含む。これらの方法は、標的遺伝子の正体が未知であるものを含む、多くの適用を有する。そのような方法の詳細は、例えば、ｄｅｌ  ＣａｒｄａｙｒｅらによるＷＯ９８／３１８３７、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」に、そして、例えば、ｄｅｌ  ＣａｒｄａｙｒｅらによるＰＣＴ／ＵＳ９９／１５９７２、表題「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」にも見いだされる。したがって、組換え、再帰組換え、および全ゲノム組換えのためのこれらのプロセスおよび技術のいずれかが、単独または組み合わせて、本発明の改変核酸配列および／または改変遺伝子融合構築物を生成するために使用され得る。
【００６９】
目的の標的に対応するオリゴヌクレオチドが、１つ以上の親核酸に対応するオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲまたはライゲーション反応物中で合成および再アセンブリされる合成的組換え法もまた、使用することができ、それにより新規組換え核酸を生成する。オリゴヌクレオチドは、標準ヌクレオチド付加法により作成され得るか、または、例えばトリヌクレオチド合成アプローチにより作成され得る。そのようなアプローチに関する詳細は、上記の参考文献中に見いだされ、例えば、ＣｒａｍｅｒｉらによるＷＯ００／４２５６１、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；ＷｅｌｃｈらによるＷＯ０１／２３４０１、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ−Ｖａｒｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」；ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ００／４２５６０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」；ならびにＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ００／４２５５９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」が挙げられる。
【００７０】
相同（またはさらに非相同）核酸に対応する配列文字列を組み換えるために、コンピュータ内で遺伝的アルゴリズムが使用されるインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）組換え法がもたらされ得る。得られた組換え配列文字列は、例えば、オリゴヌクレオチド合成／遺伝子再アセンブリ技術と協調して、必要に応じて、組換え配列に対応する核酸の合成により、核酸へ変換される。このアプローチは、無作為、部分的無作為、または設計された改変体を生成し得る。対応する核酸（および／またはタンパク質）ならびに設計された核酸および／またはタンパク質の組合せ（例えば、交差部位選択に基づく）の生成と組み合わせた、コンピュータシステムにおける遺伝的アルゴリズム、遺伝的オペレータなどの使用を含む、インシリコ組換え、ならびに設計された擬似無作為または無作為組換え法に関する多くの詳細は、ＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによるＷＯ００／４２５６０、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｄｅｓｉｒｅｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ」ならびにＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによるＷＯ００／４２５５９、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ」に記載される。インシリコ組換え法に関する広範な詳細がこれらの出願に見いだされる。この方法論は、一般に、種々の代謝経路（例えば、カロテノイド生合成経路、エクトイン生合成経路、ポリヒドロキシアルカノエート生合成経路、芳香族ポリケチド生合成経路など）に含まれるタンパク質をコードする核酸配列および／または遺伝子融合構築物のインシリコ組換え、および／または対応する核酸またはタンパク質の生成を提供する際に、本発明に適用可能である。
【００７１】
例えば、多様な核酸または核酸フラグメントの一本鎖鋳型へのハイブリダイゼーション、続く重合および／またはライゲーションでの完全長配列の再生成、必要に応じてそれに続く鋳型の分解および得られた改変核酸の回収による、自然の多様性を利用する多くの方法が、同様に使用され得る。一本鎖鋳型を用いる１つの方法において、ゲノムライブラリー由来のフラグメント集団は、反対側の鎖に対応するｓｓＤＮＡまたはＲＮＡの一部またはしばしばほぼ全長とアニーリングされる。次いで、この集団由来の複合キメラ遺伝子のアセンブリが、ハイブリッドしていないフラグメント末端のヌクレアーゼベースの除去、そのようなフラグメント間のギャップを埋めるための重合化、および続く一本鎖ライゲーションにより媒介される。親ポリヌクレオチド鎖は、消化（例えば、ＲＮＡまたはウラシル含有の場合）、変性条件下での磁選（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）（そのような分離を助長する様式で標識されている場合）および他の利用可能な分離／精製法により除去され得る。あるいは、親鎖は、必要に応じて、キメラ鎖と同時精製（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）され、続くスクリーニングおよびプロセシング工程の間に除去される。このアプローチに関するさらなる詳細は、例えば、Ａｆｆｈｏｌｔｅｒによる「Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ」、ＰＣＴ／ＵＳ０１／０６７７５に見いだされる。
【００７２】
別のアプローチにおいて、一本鎖分子は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換され、そしてこのｄｓＤＮＡ分子がリガンド媒介結合により固体支持体に結合される。未結合ＤＮＡの分離後、選択されたＤＮＡ分子は支持体から放出され、適切な宿主細胞中に導入されて、プローブとハイブリダイズする配列が豊富なライブラリーを生成する。この様式で生成されたライブラリーは、本明細書中に記載される手順のいずれかを使用して、さらなる多様化のために望ましい基質を提供する。
【００７３】
任意の前述の一般的組換え方式が、組換え核酸のより多様なセットを生成するために、反復様式（例えば、突然変異／組換えまたは他の多様性生成法の１回以上のサイクル、必要に応じて、続く１以上の選択法）で実行され得る。
【００７４】
ポリヌクレオチド鎖終結法を用いる突然変異誘発もまた提案されており（例えば、Ｓｈｏｒｔに対する米国特許第５，９６５，４０８号、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」および上記の参考文献を参照）、そして本発明に適用され得る。このアプローチにおいて、配列類似性の領域を共有する１以上の遺伝子に対応する二本鎖ＤＮＡが、遺伝子特異的プライマーの存在下または不在下で、組み合わされそして変性される。次いで、一本鎖ポリヌクレオチドがアニーリングされ、そしてポリメラーゼおよび鎖終結試薬（例えば、紫外線、ガンマ線、またはＸ線照射；臭化エチジウムまたは他のインターカレーター；一本鎖  結合タンパク質、転写活性化因子、またはヒストンのようなＤＮＡ結合タンパク質；多環式芳香族炭化水素；三価クロムまたは三価クロム塩；あるいは、急速熱サイクル（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）により媒介される省略された重合化など）の存在下インキュベートされて、部分的二重分子の生成をもたらす。例えば部分的に伸長した鎖を含有する部分的二重分子は、次いで、続く複数回の複製または部分的複製で、変性および再アニーリングされて、様々な程度の配列類似性を共有し、かつＤＮＡ分子の出発集団に関して多様化されたポリヌクレオチドをもたらす。必要に応じて、産物、または産物の部分的プールが、プロセスの１以上の段階で増幅され得る。上記のような鎖終結法により生成されるポリヌクレオチドは、任意の他の記載される組換え方式に適した基質である。
【００７５】
多様性はまた、Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）「Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ」  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５に記載される「ハイブリッド酵素作成のための漸増性切断」（「ＩＴＣＨＹ」）と呼ばれる組換え手順を使用して、核酸または核酸の集団において生成され得る。このアプローチは、改変体の開始ライブラリーを生成するために使用され得、これは、必要に応じて、１以上のインビトロ組換え法またはインビボ組換え法のための基質として役立ち得る。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）「Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４、もまた参照のこと。
【００７６】
個々のヌクレオチドまたは連続性もしくは非連続性のヌクレオチドの群の変更を生じる変異方法は、本発明の核酸配列および／または遺伝子融合構築物中にヌクレオチド多様性を導入するために好ましく使用され得る。多くの変異誘発法が、上記の参考文献中に見出され得る；変異誘発法に関するさらなる詳細は、以下に見出され得、これらもまた、本発明に適用され得る。
【００７７】
例えば、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲが、核酸改変体を生成するために使用され得る。この方法を使用して、ＤＮＡポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下でＰＣＲを行い、その結果、ＰＣＲ産物の全長に沿って、高い割合の点変異が得られる。そのような技術の例は、上記の参考文献に、および例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５およびＣａｌｄｗｅｌｌら（１９９２）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３に見出される。同様に、アセンブリＰＣＲが使用され、このプロセスは、小さいＤＮＡフラグメントの混合物からのＰＣＲ産物のアセンブリ（組み立て）を包含する。１つの反応の産物が別の反応の産物をプライム（ｐｒｉｍｉｎｇ）しながら、多くの異なるＰＣＲ反応が、同じ反応混合物中で平行して生じ得る。
【００７８】
オリゴヌクレオチド指向性変異誘発は、目的の核酸配列に部位特異的変異を導入するために使用され得る。そのような技術の例は、上記の参考文献に、および例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：５３−５７に見出される。同様に、カセット変異誘発が使用され、このプロセスは、二本鎖ＤＮＡ分子の小さい領域を、ネイティブ配列とは異なる合成オリゴヌクレオチドカセットで置き換える。このオリゴヌクレオチドは、例えば、完全および／または部分的に無作為化されたネイティブ配列（単数または複数）を含み得る。
【００７９】
反復アンサンブル（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）変異誘発は、タンパク質変異誘発のためのアルゴリズムを使用して、表現型的に関連した変異体の多様な集団（そのメンバーはアミノ酸配列において異なる）を生成されるプロセスである。この方法は、連続的な複数回のコンビナトリアル（組み合わせ）カセット変異誘発をモニターするために、フィードバック機構を使用する。このアプローチの例は、Ａｒｋｉｎ  ＆  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５に見出される。
【００８０】
指数関数的アンサンブル変異誘発は、高い割合の独特かつ機能的な変異体を有するコンビナトリアルライブラリーを生成するために使用され得る。目的の配列中の残基の小さい群が、平行して無作為化され、各々の変更された位置で、機能的なタンパク質を導くアミノ酸を同定する。そのような手順の例は、Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ  ＆  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５４８−１５５２に見出される。
【００８１】
インビボ変異誘発は、例えば、１以上のＤＮＡ修復経路に変異を有するＥ．ｃｏｌｉ株において、任意の目的のクローニングされたＤＮＡを増幅させることによって、そのＤＮＡにおいてランダム変異を生成するために使用され得る。これらの「変異誘発」株は、野生型親株よりも高いランダム変異率を有する。これらの株の１つにそのＤＮＡを増幅させる工程は、最終的にそのＤＮＡにおいてランダム変異を生成する。そのような手順は、上記の参考文献に記載される。
【００８２】
ゲノム（例えば、細菌、真菌、動物、または植物ゲノム）中に多様性を導入するための他の手順が、上記および／または参照される方法と組み合わせて使用され得る。例えば、上記の方法と組み合わせて、様々な種への形質転換に適切な核酸マルチマーを生成する方法が提案されている（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  米国特許第５，７５６，３１６号および上記の参考文献を参照のこと）。互いに異なる遺伝子からなるこのようなマルチマー（例えば、天然の多様性に由来するか、または部位特異的変異誘発、誤りがちなＰＣＲ、変異原性細菌株を通じる継代などの適用を介する）での適切な宿主の形質転換は、例えば、上記のようなインビボ組換えプロセスによるＤＮＡ多様化のための、核酸多様性の供給源を提供する。
【００８３】
あるいは、部分的な配列類似性の領域を共有する多くのモノマーポリヌクレオチドが、宿主種に形質転換され、その宿主細胞によってインビボで組換えられ得る。その後の複数回の細胞分裂が、ライブラリーを生成するために使用され得、そのメンバーは、モノマーポリヌクレオチドの単一の均一な集団またはプールを含む。あるいは、モノマー核酸は、標準的な技術（例えば、ＰＣＲおよび／またはクローニング）により回収され得、そして上記の任意の組換え形式（反復組換え形式を含む）で組換えられ得る。
【００８４】
多種（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｅｓ）発現ライブラリーを生成するための方法が記載され（上記の参考文献に加えて、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら（１９９８）  米国特許第５，７８３，４３１号「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＡＮＤ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＮＯＶＥＬ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＰＡＴＨＷＡＹＳ」、およびＴｈｏｍｐｓｏｎら（１９９８）米国特許第５，８２４，４８５号「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ  ＡＮＤ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＮＯＶＥＬ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＰＡＴＨＷＡＹＳ」を参照）、そして目的のタンパク質活性を同定するためのそれらの使用が提案されている（上記の参考文献に加えて、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）の米国特許第５，９５８，６７２号「ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＣＴＩＶＩＴＹ  ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ  ＯＦ  ＣＬＯＮＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＮＡ  ＦＲＯＭ  ＵＮＣＵＬＴＩＶＡＴＥＤ  ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳＭＳ」を参照）。多種発現ライブラリーは、一般に、発現カセット中に、適切な調節配列に作動可能に連結された、複数の種または株由来のｃＤＮＡまたはゲノム配列を含む、ライブラリーを含む。ｃＤＮＡおよび／またはゲノム配列は、必要に応じて、ランダムに連結されて、多様性がさらに増強される。ベクターは、２より多い宿主生物種（例えば、細菌種、真核生物細胞）における形質転換および発現に適切な、シャトルベクターであり得る。いくつかの場合において、ライブラリーは、目的のタンパク質をコードする配列または目的の核酸とハイブリダイズする配列を予め選択することによって、偏りを有する。任意のそのようなライブラリーが、本明細書中に記載される方法のいずれかのための基質として提供され得る。
【００８５】
上述の手順は、主に核酸および／またはコードされたタンパク質の多様性を増加することを指向してきた。しかしながら、多くの場合において、全ての多様性が有用（例えば、機能的）であるわけではなく、数少ない好ましい改変体を同定するためにスクリーニングまたは選択されなければならない改変体のバックグラウンドを増加させるのに寄与するに過ぎない。いくつかの応用において、多様化の前に、例えば、組換えベースの変異誘発手順により、ライブラリー（例えば、増幅されたライブラリー、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、規格化ライブラリーなど）または他の基質核酸を事前選択または事前スクリーニングすることか、あるいはそうでなければ機能性生成物をコードする核酸に対して基質を偏らせることが望ましい。例えば、抗体操作の場合、任意の記載される方法による操作の前にインビボ組換え事象を利用することにより、機能性抗原結合部位を有する抗体に対して多様性生成プロセスを偏らせることが可能である。例えば、Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリー由来の組換えＣＤＲは、増幅されて、そして本明細書中に記載される方法のいずれかに従って多様化される前に、フレームワーク領域中に組み込まれ得る（例えば、Ｊｉｒｈｏｌｔら（１９９８）Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｐａｃｅ：ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｏｒｍｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｍａｓｔｅｒ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ」Ｇｅｎｅ  ２１５：４７１）。
【００８６】
ライブラリーは、所望の酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸に対して偏り得る。例えば、特定の活性を示すクローンをライブラリーから同定した後、そのクローンは、ＤＮＡ変更を導入するための任意の公知の方法を使用して変異誘発され得る。変異誘発された相同体を含むライブラリーは、次いで、所望の活性（これは最初に特定した活性と同じであっても異なってもよい）についてスクリーニングされる。そのような手順の例は、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）の米国特許第５，９３９，２５０号「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＥＮＺＹＭＥＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＤＥＳＩＲＥＤ  ＡＣＴＩＶＩＴＩＥＳ  ＢＹ  ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ」に提案されている。所望の活性は、当該技術分野で公知の任意の方法により同定され得る。例えば、ＷＯ９９／１０５３９は、遺伝子ライブラリーからの抽出物を代謝的にリッチな細胞から得られる成分と組み合わせて、そして所望の活性を示す組合せを同定することにより、遺伝子ライブラリーがスクリーニングされ得ることを提案している。生理活性基質をライブラリーの試料中に挿入して、所望の活性の生成物に対応する生理活性蛍光を蛍光分析器（例えば、フローサイトメトリ装置、ＣＣＤ、蛍光光度計、または分光光度計）を使用して検出することにより、所望の活性を有するクローンが同定され得るということもまた提案されている（例えば、ＷＯ９８／５８０８５）。
【００８７】
ライブラリーはまた、例えば選択された核酸プローブに対するハイブリダイゼーションなど、特定の特徴を有する核酸に対して偏り得る。例えば、出願ＷＯ９９／１０５３９は、所望の活性（例えば、酵素活性、例えば：リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、加水分解酵素、ヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダーゼ、またはアシラーゼ）をコードするポリヌクレオチドが以下の様式でゲノムＤＮＡ配列の中から同定され得ると提案する。ゲノムＤＮＡ集団からの一本鎖ＤＮＡ分子が、リガンド結合プローブとハイブリダイズする。ゲノムＤＮＡは、培養されたかまたは培養されていない微生物のいずれかに由来し得るか、または環境試料由来であり得る。あるいは、ゲノムＤＮＡは、多細胞生物由来、またはそれら由来の組織由来であり得る。第二鎖合成は、捕捉培地からの前放出を伴ってかまたは伴わずに、あるいは当該技術分野で公知の広範な種々の他の戦略により、捕捉に使用されるハイブリダイゼーションプローブから直接実施され得る。あるいは、単離された一本鎖ゲノムＤＮＡ集団は、さらなるクローニングなしに断片化され得、直接、例えば上記のような一本鎖鋳型を用いる組換えベースアプローチに使用され得る。
【００８８】
核酸およびポリペプチドを生成する「非確率的」方法が、Ｓｈｏｒｔの「Ｎｏｎ−Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＷＯ００／４６３４４に主張されている。提案された非確率的ポリヌクレオチドの再アセンブリおよび部位飽和変異誘発法を含むこれらの方法も、同様に本発明に応用される。ドープ処理オリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドを使用する無作為または半無作為（ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ）変異誘発もまた、例えば、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ  （１９９２）「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００；Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）「Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６；ＬｉｍおよびＳａｕｅｒ（１９９１）「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐａｃｋｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３５９−７６；  ＢｒｅｙｅｒおよびＳａｕｅｒ  （１９８９）「Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ５１Ｆ  ｔｏ  ｌａｍｂｄａ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３３５５−６０）；および「Ｗａｌｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」（Ｃｒｅａ，Ｒ；米国特許第５，８３０，６５０号および第５，７９８，２０８号、ならびに欧州特許第０５２７８０９Ｂ１号に記載される。
【００８９】
多様化の前にライブラリーを富化するのに適した上記の技術のいずれも、多様性生成法により生成された生成物、または生成物のライブラリーをスクリーニングするためにも使用され得ることが容易に理解される。
【００９０】
変異誘発のためのキット、ライブラリー構築物、および他の多様性生成法はまた、市販されている。例えば、キットは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  （例えば、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的変異誘発キット；およびＣｈａｍｅｌｅｏｎＴＭ二本鎖部位特異的変異誘発キット）、Ｂｉｏ／Ｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  （例えば、上記のＫｕｎｋｅｌ法を使用する）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、５プライム３プライムキット）；Ｇｅｎｐａｋ  Ｉｎｃ、Ｌｅｍａｒｇｏ  Ｉｎｃ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ  （例えば、上記のＥｃｋｓｔｅｉｎ法を使用する）、およびＡｎｇｌｉａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ（例えば、上記のＣａｒｔｅｒ／Ｗｉｎｔｅｒ法を使用する）から利用可能である。
上記の参照は、組換え、再帰的組換え、再帰的変異、および変異誘発の他の型との組合せまたは組換えを含む多数の変異的方式、ならびにこれらの方式の多くの変形を提供する。使用される多様性生成方式に関係なく、本発明の核酸は再結合（互いに、または関連した（もしくは関連すらしていない）配列と）されて、本発明の遺伝子融合構築物および改変遺伝子融合構築物に使用するための組換え核酸の多様なセット（例えば、相同性の核酸、ならびに対応するポリペプチドのセットを含む）を生成し得る。
【００９１】
改変核酸配列を生成するための多くの上述される方法論は、親配列（単数または複数）の多数の多様な改変体を生成する。本発明のいくつかの好適な実施形態において、改変方法（例えば、シャッフリングのいくつかの形態）は、改変体ライブラリーを生成するために使用され、次いでこのライブラリーは、いくつかの所望の機能属性をコードする改変核酸または改変核酸のプールについてスクリーニングされる。この所望の機能属性は、好ましくは、親配列によりコードされる酵素活性よりも何らかの点で優れている酵素活性である。スクリーニングされ得る酵素活性の例として、触媒速度（ｋｃａｔおよびＫＭのような速度定数という形で慣習的に特性決定される）、基質特異性、および基質、生成物、または他の分子（例えばインヒビターまたは活性化因子）による活性化または阻害に対する感受性、が挙げられる。
【００９２】
本発明の好適な実施形態のいくつかにおいて、改変核酸は、改変核酸の発現生成物が関与すると期待される代謝経路の機能をアッセイすることにより、スクリーニングおよび／または選択される。所定の核酸の特定の改変が遺伝子生成物の機能変更をもたらす場合、これはしばしば経路の出力に検出可能な変更をもたらす。例えば、代謝経路の律速または部分的律速工程を触媒する酵素ドメインの活性を増強する改変は、改変核酸を発現する細胞において生成物形成の速度を増加させる可能性が高い。したがって、増強された酵素活性をコードする改変核酸は、代謝経路の生成物を比較的高いレベルで生成する宿主細胞についてスクリーニングすることにより同定され得る。１つの非制限的な例は、宿主細胞をカロテノイド生成の増加についてアッセイすることによる、カロテノイド合成経路における酵素活性の増強についてのスクリーニングである。この例において、スクリーニングプロセスは、カロテノイドの発色特性（カロテノイドに伴う可視色の強度増加をアッセイすることにより、改善された改変核酸の検出を可能にする）により促進される。
【００９３】
所望の酵素活性の選択の１つの例は、目的の酵素活性および／または代謝経路を十分に発現しない細胞の成長および／または生存を阻害する条件下で、宿主細胞を成長させることを必要とする。そのような選択を使用して、プロセスは所望の酵素活性をコードするものを除く全ての改変核酸を、考慮から排除し得る。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、宿主細胞は目的の酵素および／または代謝経路の生産の十分なレベルを欠いている細胞の生存を阻害する条件下に維持される。それらの条件下では、十分なレベルの生成物の生成を触媒し得る酵素活性（単数または複数）をコードする改変核酸を保有する宿主細胞のみが生存し成長する。例えば、増強されたエクトイン合成活性についてのスクリーニングは、以下の実施例１に記載されるように高塩条件下で宿主を成長させることによりスクリーニングされ得る。
【００９４】
利便性および高い処理能力のため、微生物、例えばＥ．ｃｏｌｉのような細菌における所望の改変核酸についてスクリーニング／選択することがしばしば望ましい。一方で、植物細胞または植物におけるスクリーニングは、いくつかの場合において、最終的な目標が植物系における発現のための改変核酸を生成することである場合に好適であり得る。
【００９５】
本発明のいくつかの好適な実施形態において、単独または遺伝子融合構築物の一部としてのいずれかで、異なる改変核酸を発現する宿主細胞のプールをスクリーニングすることにより、処理能力が増加する。顕著な活性を示す任意のプールが、望ましい活性を発現する単一のクローンを同定するために、逆重畳され（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）得る。
【００９６】
当業者は、関連するアッセイ、スクリーニング、または選択法が、特定の酵素または代謝経路に依存して変化することを理解する。高処理能力方式で実行され得るアッセイを採用することが通常有利である。
【００９７】
高処理能力アッセイにおいて、一日の間に数千もの異なる改変体をスクリーニングすることが可能である。例えば、マイクロタイタープレートの各ウェルが、別個のアッセイを実行するために使用され得るか、または濃度もしくはインキュベーション時間の効果を観察する場合、５〜１０ウェルごとに単一の改変体を試験し得る。
【００９８】
流体アプローチに加えて、上記のように、単純に、所望の酵素または代謝機能を選択する培地プレート上に細胞を成長させることが可能である。このアプローチは、簡潔かつ高処理能力のスクリーニング法を提供する。
【００９９】
多数の周知のロボットシステムもまた、アッセイ系において有用な液相化学のために開発されてきた。これらのシステムは、Ｔａｋｅｄａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＬＴＤ（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）により開発された自動合成装置のような自動ワークステーション、および科学者により行われる手動合成操作をまねするロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ，  Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，  ＭＡ．；  Ｏｒｃａ，  Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を含む。上記装置のいずれも本発明への適用に適している。集積システムに関してこれらの装置が本明細書中に考察されるように作動できるようにするための、それらの装置に対する変更の性質およびインプリメンテーションは（もしあれば）、関連分野の当業者に明らかである。
【０１００】
ハイスループットスクリーニングシステムは、市販されている（例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．，  Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，  ＭＡ；  Ａｉｒ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｍｅｎｔｏｒ，  ＯＨ；  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ；  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡ、などを参照）。これらのシステムは、典型的には、全試料および試薬のピペット採取（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）、液体分配、インキュベーションの時間調節、およびアッセイに適切な検出器（複数可）におけるマイクロプレートの最終読み込みを含む全手順を自動化する。これらの構造化可能なシステムは、高処理能力および急速な始動、ならびに高度の可撓性およびカスタマイゼーションを提供する。
【０１０１】
そのようなシステムの製造業者は、種々の高処理能力装置についての詳細なプロトコルを提供する。したがって、例えば、Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐ．は、遺伝子転写、リガンド結合などの調節を検出するためのスクリーニングシステムを記述する技術告示を提供する。試薬操作に対する微流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）アプローチもまた、例えばＣａｌｉｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により開発されている。
【０１０２】
カメラまたは他の記録装置（例えば、フォトダイオードおよびデータ記憶装置）により見られる（および、任意に記録される）光学画像は、必要に応じて、例えばコンピュータ上で画像をデジタル化し、かつ／または画像を記憶および解析することにより、本明細書中の任意の実施形態においてさらに処理される。様々な市販の周辺機器およびソフトウェアが、例えば、ＰＣ（インテルｘ８６またはペンティアム（登録商標）チップ互換ＤＯＳＴＭ、ＯＳＴＭ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＴＭ、ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ＮＴＴＭまたはＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）  ９５ＴＭベースの機種）、ＭＡＣＩＮＴＯＳＨＴＭ、またはＵＮＩＸ（登録商標）ベース（例えば、ＳＵＮＴＭワークステーション）のコンピュータを使用して、デジタル化、記憶、およびデジタル化ビデオまたはデジタル化光学画像の解析のために利用可能である。
【０１０３】
１つの従来のシステムは、アッセイ装置からの光を、冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（当該技術分野で一般に使用される）に運ぶ。ＣＣＤカメラは、画像素子（ピクセル）のアレイを含む。試料からの光は、ＣＣＤで画像化される。標本（例えば、生物学的重合体のアレイ上の個々のハイブリダイゼーション部位）の領域に対応する特定のピクセルが、各位置についての光度数値を得るために採取される。複数のピクセルが、速度を増加させるために並行して処理される。本発明の装置および方法は、例えば蛍光または暗視野顕微鏡法により、任意の試料を観察するために容易に使用される。
【０１０４】
（酵素ドメインの標的活性化非機能融合）
本発明の方法において用いられる未改変核酸配列および改変核酸配列は、多数の様式で共連結し得る。例えば、配列は、いかなる介入配列もなく、互いに直接連結し得る（図１）。必要に応じて、第１の核酸配列の停止コドンが、インフレームで第２の核酸配列への付着前に除去される。そのような共連結した配列に基づいて合成されたペプチド配列は、互いに直接付着したタンパク質配列（またはその一部分）を含む（すなわち、第１の酵素ドメインのＣ末端アミノ酸が、続く酵素ドメインのＮ末端に接続していき、以下同様）。あるいは、核酸配列は、１つまたはそれより多いヌクレオチドリンカー配列を介して共連結し得る（図２）。
【０１０５】
必要に応じて存在するヌクレオチドリンカー配列は、好ましくは約３ヌクレオチド（すなわち、単一のアミノ酸リンカーをコードする）〜約３００ヌクレオチド（すなわち、ほぼ１００アミノ酸リンカーペプチドをコードする）の長範囲であるが、さらに長くあり得る。必要に応じて、ヌクレオチドリンカー配列は、約１２個〜約１５０個のヌクレオチド、約１２個〜約１２０個のヌクレオチド、または約１２個〜約９０個のヌクレオチドを含む。あるいは、ヌクレオチドリンカー配列は、約３個〜約１５０個のヌクレオチド、または約３個〜約３０個のヌクレオチドを含む。ヌクレオチドリンカー配列は、翻訳前にハイブリッドタンパク質転写物から除去される、イントロン配列であり得る。あるいは、ヌクレオチドリンカー配列は、ハイブリッドタンパク質の一部として、酵素ドメインで翻訳されるペプチドをコードし得る。ヌクレオチドリンカー配列によりコードされたペプチドは、任意の所望の組成物の無作為アミノ酸配列であり得る。組成物の１つの例は、主にグリシンおよび／またはアラニンを含むペプチドリンカーである。別の組成物の選択肢は、ペプチドリンカーが翻訳中または翻訳後にハイブリッドタンパク質配列から自体を遊離させ得るような、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）構造を有するペプチドリンカーである。好ましくは、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチドリンカー配列がハイブリッドタンパク質の一部として翻訳される場合、リンカー配列の長さは、ヌクレオチドリンカー配列の後にコードされる酵素ドメインの翻訳がリーディングフレーム外へシフトしないように、３ヌクレオチドずつ増加する。
【０１０６】
リンカー配列はまた、切断可能部位（例えばヌクレオチドリンカー配列における制限部位、または例えばペプチドリンカーのアミノ酸配列におけるプロテアーゼ感受性部位など）を含むように操作され得る。
【０１０７】
本発明の遺伝子融合構築物中への１つまたはそれ以上のヌクレオチドリンカー配列の組み込みは、遺伝子融合構築物および得られるハイブリッドタンパク質生成物のさらなる操作および制御を提供する。例えば、ヌクレオチドリンカー配列は、ハイブリッドタンパク質の標的化活性化を提供するように選択され得る。そのような標的活性化ハイブリッドタンパク質の例において、１つまたはそれ以上の酵素ドメインは、ペプチドリンカー領域が改変される（例えば、切断または除去される）まで、活性化されない。代替的な例において、ヌクレオチドリンカー配列は、例えば触媒性ＲＮＡ分子を介しての切断により、ヌクレオチドリンカー配列が変更されない限り、遺伝子融合構築物の転写または翻訳に影響を与え得るかまたは阻害し得る。
【０１０８】
（改変遺伝子融合構築物を生産する方法）
本発明は、改変遺伝子融合構築物を生産する方法を提供する。これらの方法は、２つまたはそれ以上の酵素ドメインをコードする２つまたはそれ以上の核酸配列を共連結させる工程を含み、ここで少なくとも１つの核酸配列が、最初に決定された配列と比較して改変されている（図１）。核酸配列は、任意の下流コード配列のリーディングフレームが維持されるような様式で、共連結されるべきである。さらに、設計は、コード転写物の翻訳が停止コドンにより未熟状態で分断されないようにするべきである。これは、構築物のコード配列からすべての内部停止コドンを除去することにより簡便に達成される。
【０１０９】
核酸配列は、上記のように、種々の形態のデオキシリボ核酸またはリボ核酸であり得る。さらに、核酸配列は、必要に応じて、個々の核酸配列、または配列のライブラリーを含み得る。少なくとも１つの核酸配列に対する改変は、２つまたはそれ以上の配列を一緒に共連結させる前に行われ得るか、または配列が共連結した後に達成され得る。そのような改変としては、核酸配列の一部分の変異またはシャッフリングが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１０】
本発明の遺伝子融合構築物は、必要に応じて、分泌／局在化配列（例えば、シグナル配列、細胞小器官標的化配列、膜局在化配列など）および／または精製を促進する配列（例えば、エピトープタグ（ＦＬＡＧエピトープ）、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合物）をコードするように操作され得る。発現生成物は、必要に応じて、１つまたはそれ以上の修飾アミノ酸（例えば、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、カルボキシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸など）を含む。
【０１１１】
改変遺伝子構築物を生産するための方法はさらに、改変遺伝子融合構築物を真核生物系中に導入する工程を含み得る。真核生物系は、哺乳動物系（例えば、マウス、齧歯類、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、霊長類、またはヒト系）を含む多数の生態系のいずれかであり得る。あるいは、真核生物系は、鳥類、両生類、爬虫類、または魚類系であり得る。好ましくは、真核生物系は植物系である。遺伝子発現方法論のさらなる記載は、「遺伝子融合構築物の発現」と題される節において、以下に提供される。
【０１１２】
真核生物系が植物系である本発明の実施形態において、改変遺伝子構築物は、植物由来である核酸配列、または植物由来ではない核酸配列（例えば、細菌由来）、または植物および非植物由来配列のいくつかの組合せを含み得る。例えば、本発明のいくつかの好適な実施形態は、細菌または古細菌のような非植物微生物由来である１つまたはそれ以上の核酸配列を含む改変遺伝子構築物の導入を含む。このアプローチの潜在的に強力な適用は、植物に通常存在しない代謝経路の植物中への導入を含む。以下により詳細に記載される例は、得られる植物のストレス耐性を増加させるための、好塩細菌から植物へのエクトイン合成経路導入である。
【０１１３】
本発明の改変遺伝子構築物は、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の酵素ドメインを含み得、ここで１つまたはそれ以上の酵素ドメインが本明細書中に記載されるように改変される。
【０１１４】
本発明の好適な実施形態において、改変遺伝子構築物の核酸要素の改変は、相同な親配列（オルソログまたはパラログ）のシャッフリングにより達成される。親配列は、植物または非植物由来であり得る。本発明は、植物および非植物由来配列のシャッフリング（例えば、植物および細菌からの相同配列のシャッフリング）に由来する改変核酸を含む。本発明のいくつかの局面において、相同性の低い配列、または識別可能な相同性のない配列さえも、改変遺伝子構築物の調製に有用な核酸に到着するためにシャッフリングされ得る。
【０１１５】
目的の任意の数の代謝経路から酵素ドメインをコードする核酸配列が、本発明の方法により生産される改変遺伝子融合構築物中に組み込まれ得る。さらに、新規代謝経路が、酵素ドメインの融合により作製され得、これは、段階的な様式で、所望の最終生成物を生成するための一連の関連した基質／中間体を使用し得る。
【０１１６】
改変遺伝子融合構築物を生産するための方法の１つの実施形態において、２つまたはそれ以上の核酸配列によりコードされた酵素ドメインは、酵素、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、および／またはβ−シクラーゼに由来する。本発明の代替的な実施形態において、２つまたはそれ以上の核酸配列によりコードされる酵素ドメインは、酵素、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼに由来する。本発明の別の実施形態において、２つまたはそれ以上の核酸配列によりコードされる酵素ドメインは、酵素、β−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼに由来する。本発明のさらなる実施形態において、２つまたはそれ以上の核酸配列は、以下のクラスの酵素に由来する：ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼ。
【０１１７】
（遺伝子融合構築物を生産する方法）
本発明はまた、共通の代謝経路に関与する少なくとも２つの酵素ドメインをコードする２つまたはそれ以上の核酸配列を共連結することにより、遺伝子融合構築物を生産する方法を提供する。本発明のいくつかの好適な実施形態において、少なくとも２つの酵素ドメインをコードする３つまたはそれ以上の核酸配列が共連結されて、遺伝子融合構築物を生産する。本発明における使用が意図される特定の代謝経路としては、カロテノイド生合成、エクトイン生合成、ポリヒドロキシアルカノエート生合成、および芳香族ポリケチド生合成が挙げられる。これらの経路およびそれらの構成要素酵素ドメインは、以下により詳細に記述される。すでに記載された方法における目的の核酸配列が採用され得るが、本発明のこの実施形態において、遺伝子融合構築物中に組み込まれる任意の核酸配列の改変は任意である。（図３）。さらに、類似したヌクレオチドリンカー配列および転写調節要素が使用され得る。遺伝子融合構築物を生産するための方法はさらに、上記のような真核生物系、例えば植物系中に、改変遺伝子融合構築物を導入する工程を含み得る。
【０１１８】
さらに、本発明は、それぞれが少なくとも１つの酵素ドメインをコードする２つまたはそれ以上の核酸配列を共連結することによる遺伝子融合構築物の生産方法を提供し、ここで１つまたはそれ以上の酵素ドメインは植物酵素または植物系由来である。植物系に由来する例示的生合成経路は、カロテノイド生合成に関与する酵素を含むが、それに限定されない。植物由来の酵素ドメインをコードする核酸配列は、直接共連結し得るか、またはそれらはヌクレオチドリンカー配列を介して連結し得、そしてまた、上記に記載されるように、調節配列を含み得る。さらに、核酸配列、ヌクレオチドリンカー配列、または両方が、すでに記載されているように、必要に応じて改変され、このようにして、改変遺伝子融合構築物を形成する。この方法は、必要に応じてさらに、生物、例えば原核生物系または真核生物系中に、遺伝子融合構築物（または改変遺伝子融合構築物）を導入する工程を含む。原核生物系および真核生物系の例は、「遺伝子融合構築物の発現」と題される節に記載される。
【０１１９】
本発明はさらに、それぞれが少なくとも１つの酵素ドメインをコードする２つまたはそれ以上の核酸配列を含む遺伝子融合構築物の生産を提供し、ここで少なくとも１つの酵素ドメインが非植物種に由来し、そしてこの構築物を植物中に導入する。これは、異種代謝経路、例えば通常微生物に見いだされる経路を、植物中に導入するために有用であり得る。あるいは、本発明のこの局面は、対応する内因性経路と異なって機能する経路を導入するために使用され得、例えば好熱性生物からの酵素活性を植物中へ導入することにより、高温で活性化される代謝経路を生産することが可能になる。いくつかの場合において、非植物核酸配列によりコードされる酵素ドメインが植物環境中の活性化により良く適するように、非植物核酸配列を改変することが望ましい。非制限的な例は、植物系における最適な活性のために細菌酵素活性のｐＨ依存性を改変することである。
【０１２０】
（複数の酵素活性を発現する方法）
本発明はまた、生体系、例えば真核生物または原核生物において複数の酵素活性を発現するための方法を提供する。この方法は、少なくとも３つの酵素ドメインを有する単一のポリペプチドをコードする遺伝子融合構築物を提供する工程、および遺伝子融合構築物を生体系中へ導入する工程を含む。遺伝子融合構築物は、少なくとも３つの酵素ドメインをコードする少なくとも３つの核酸配列を有する共連結した核酸配列を含む。あるいは、遺伝子融合構築物は植物由来の酵素ドメインをコードする２つまたはそれ以上の核酸配列を含む。
【０１２１】
任意の数の目的の代謝経路からの酵素ドメインをコードする核酸配列は、本発明の方法により生産される遺伝子融合構築物中に組み込まれ得る。さらに、新規代謝経路が、酵素ドメインの融合により作成され得、これは、段階的な様式で、所望の最終生成物を生成するために一連の関連した基質／中間体を使用し得る。酵素ドメインは、様々な供給源、および生化学または代謝経路の範囲からの由来であり得る。任意に、核酸配列は同じ代謝経路に関与するタンパク質をコードする。本発明の１つの実施形態において、３つまたはそれ以上の核酸配列によりコードされる酵素ドメインは、酵素、フィトエンシンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ、および／またはβ−シクラーゼに由来する。本発明の代替的な実施形態において、３つまたはそれ以上の核酸配列によりコードされる酵素ドメインは、酵素、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼに由来する。本発明の別の実施形態において、３つまたはそれ以上の核酸配列によりコードされる酵素ドメインは、酵素、β−ケトチオラーゼ、Ｄ−レダクターゼ、およびポリ（ヒドロキシアルカノエート）シンターゼに由来する。本発明のさらなる実施形態において、３つまたはそれ以上の核酸配列は、以下のクラスの酵素に由来する：ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、アシルキャリアタンパク質、およびシクラーゼ。
【０１２２】
上記のように、本発明の方法に用いられる核酸配列は、種々の形態のデオキシリボ核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、組換えＤＮＡ、シャッフリングしたＤＮＡ、改変ＤＮＡ、またはＤＮＡアナログ）またはリボ核酸（ゲノムＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、センス鎖配列、アンチセンス鎖配列、組換えＲＮＡ、シャッフリングしたＲＮＡ、改変ＲＮＡ、またはＲＮＡアナログを含むが、これらに限定されない）であり得る。酵素ドメインをコードする核酸配列は、互いに直接連結することができるか、またはそれらは、１つまたはそれ以上の、約３〜約３００ヌクレオチド長の範囲のヌクレオチドリンカー配列を介して連結することができる。ヌクレオチドリンカー配列が、翻訳前に核酸転写物から切除されない場合、リンカー領域を過ぎて転写される酵素ドメインの翻訳が、リーディングフレーム外へシフトしないように、リンカーを構成するヌクレオチドの数は３つずつの集合または増加単位で表されることが好ましい。任意に、１つまたはそれ以上の核酸配列および／または１つまたはそれ以上のリンカー配列が、突然変異またはシャッフリングされ得る（配列の共連結の前または後のいずれかで）。
【０１２３】
本発明の方法はさらに、以下に記載されるように、生体系において遺伝子融合構築物を発現する工程を含み得る。さらに、本発明は、本発明の方法により調製されるように、遺伝子融合構築物、およびトランスジェニック植物系のようなトランスジェニック系を提供する。
【０１２４】
（遺伝子融合構築物の発現）
本発明の方法の実行は、上記の遺伝子融合構築物の構築、およびいくつかの態様において、トランスフェクトされた宿主細胞における組換え核酸の発現を含む。
【０１２５】
宿主細胞は、真核生物系、例えば、真核生物細胞、植物細胞、動物細胞、プロトプラスト、または組織培養物を包含し得る。宿主細胞は、任意に、複数の細胞、例えば生物体を包含する。あるいは、宿主細胞は、原核生物系を包含し得、細菌（すなわち、グラム陽性菌、紅色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、シアノバクテリア、スピロヘータ、サーマトガレ（ｔｈｅｒｍａｔｏｇａｌｅｓ）、フラボバクテリア、およびバクテロイド）および古細菌（すなわち、コル古細菌門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、テルモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）、ピロディクティウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）、テルモコックス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、メタン生成古細菌、アルカエグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、および高度好塩菌）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、原核生物は、１つまたはそれ以上の農業、環境、工業、薬学、または臨床目的の細菌種を包含し、これらは、大腸菌、種々のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、および種々のバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を含むがこれらに限定されない。
【０１２６】
所望の系中への遺伝子融合構築物の導入は、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ポリエチレングリコール媒介形質転換、またはアグロバクテリウム属媒介形質転換のような技法により達成され得る。遺伝子融合構築物（または改変遺伝子融合構築物）は、任意に、所望の系中へ遺伝子融合構築物を導入する前にスクリーニングされ得る。融合構築物のライブラリーを採用する実施形態において、構築物は、任意に、所望の系中へ構築物のライブラリーを導入する前にスクリーニングされ得る。
【０１２７】
本発明の方法の特定の実施形態において、上記の遺伝子融合構築物および／または改変遺伝子融合構築物は、植物系中に導入され、それによりトランスジェニック植物を提供する。植物細胞に核酸を形質導入する方法が、一般に利用可能である。Ｂｅｒｇｅｒ，ＡｕｓｕｂｅｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋに加えて、植物細胞クローニング、培養、および再生のための有用な一般的参照として、Ｐａｙｎｅら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）およびＧａｍｂｏｒｇおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ編（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）が挙げられる。細胞培地は、例えば、ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ編（１９９３）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）に記載される。さらなる情報が、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．の「生命科学研究細胞培養（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）」カタログ（１９９８）（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，「Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ」）、および例えば、同じくＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの「植物培養カタログ（Ｐｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）」（「Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ」）および付録（１９９７）のような商業用文献に見られる。
【０１２８】
本発明の遺伝子融合構築物および改変遺伝子融合構築物は、様々な従来技法により、所望の植物宿主のゲノム中へ導入され得る。広範な高等植物種を形質転換するための方法は、周知であり、技術書および科学書に記載される。例えば、Ｐａｙｎｅ，Ｇａｍｂｏｒｇ，Ａｔｌａｓ，Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣおよびＳｉｇｍａ−ＰＣＣＳ（全て上述）、ならびに例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇら、（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７を参照。
【０１２９】
例えば、核酸は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような技術を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡ中へ直接導入され得るか、または遺伝子融合構築物は、ＤＮＡ微粒子銃のような弾道的方法を使用して、植物組織に導入され得る。あるいは、遺伝子融合構築物は、適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と合わせられて、従来のアグロバクテリウム  チュメファシエンス宿主ベクター中に導入され得る。アグロバクテリウム宿主の病原性機能は、細胞が細菌により感染したときに、構築物および隣接するマーカーの植物細胞ＤＮＡ中への挿入を指向する。
【０１３０】
マイクロインジェクション法は、当該技術分野で既知であり、科学書および特許文献で十分に記載されている。ポリエチレングリコール沈殿を使用するＤＮＡ構築物の導入は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７−２７２２に記載される。エレクトロポレーション技術は、Ｆｒｏｍｍら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５８２４に記載される。弾道的形質転換法は、Ｋｌｅｉｎら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３；およびＷｅｅｋｓら、（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１０７７−１０８４に記載される。
【０１３１】
１つの実施形態において、アグロバクテリウム媒介形質転換法は、シャッフリングされたコード配列をトランスジェニック植物へ転移させるために使用される。アグロバクテリウム媒介形質転換は、主として双子葉類において有用であるが、特定の単子葉類が、アグロバクテリウムにより形質転換され得る。例えば、コメのアグロバクテリウム形質転換が、Ｈｉｅｉら、（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６：２７１−２８２；米国特許第５，１８７，０７３号；米国特許第５，５９１，６１６号；Ｌｉら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ  ３４：５４；およびＲａｉｎｅｒｉら、（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３３に記載される。さらに、Ｘｕら、（１９９０）Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ．Ｂｏｔ．２：８１は、アグロバクテリウム感染により、トウモロコシ、オオムギ、ライコムギ、およびアスパラガスを形質転換した。
【０１３２】
この技法において、Ａ．チュメファシエンスの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドの植物細胞ゲノム中に組み込む能力が、目的の核酸を本発明の組換え植物細胞中へ同時移入させるために有利に使用される。典型的には、発現ベクターが生成され、ここで目的の遺伝子融合構築物（または改変遺伝子融合構築物）が自己複製プラスミド（これもまたＴ−ＤＮＡ配列を含む）中に連結される。Ｔ−ＤＮＡ配列は、典型的には、遺伝子融合構築物に隣接し、プラスミドの組み込み配列を含む。遺伝子融合構築物に加えて、Ｔ−ＤＮＡはまた、典型的には、マーカー配列、例えば、抗生物質耐性遺伝子も含む。次いで、Ｔ−ＤＮＡを持つプラスミドおよび遺伝子融合構築物は、アグロバクテリウム  チュメファシエンス中にトランスフェクトされる。植物細胞の効果的な形質転換のため、Ａ．チュメファシエンス細菌はまた、自然のＴｉプラスミドに必須ｖｉｒ領域も含む。
【０１３３】
代替的な形質転換法において、Ｔ−ＤＮＡ配列ならびにｖｉｒ配列の両方が同じプラスミド上にある。Ａ．チュメファシエンス遺伝子形質転換の論考について、例えば、Ｆｉｒｏｏｚａｂａｄｙ  ＆  Ｋｕｅｈｎｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  １９９５  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ，ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ（上記）を参照。
【０１３４】
様々な植物型からの形質転換可能なプロトプラストの確立および続く培養プロトプラストの形質転換についての多数のプロトコルが当該技術分野で利用可能であり、本明細書中に参照により援用される。例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ９３：８５７；ＦｏｗｋｅおよびＣｏｎｓｔａｂｅｌ（編）（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ；Ｓａｕｎｄｅｒｓら、（１９９３）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，ＵＰＭ  １６−１８；およびＬｙｚｎｉｋら、（１９９１）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０：２９５を参照（これらのそれぞれが本明細書中に参考により援用される）。
【０１３５】
本発明の１つの実施形態において、植物宿主の形質転換は、所望の植物の組織、例えば葉から調製した外植片を使用して達成される。外植片は、約０．８×１０９〜約１．０×１０９細胞／ｍＬのＡ．チュメファシエンス溶液中、適した時間の間、通常は数秒間インキュベートされる。次いで、外植片は適した培地上でほぼ２〜３日間培養される。
【０１３６】
上記の形質転換法のいずれかにより得られた形質転換された植物細胞は、培養され、形質転換された遺伝子型、したがって所望の表現型を保有する植物全体を再生させ得る。そのような再生技術は、典型的には所望のヌクレオチド配列とともに導入された殺生剤および／または除草剤マーカーに依存して、組織培養成長培地中で、特定の植物ホルモンの操作を介して行われる。培養プロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓら、（１９８３）Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．１２４−１７６（Ｍａｃｍｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＢｉｎｄｉｎｇ（１９８５）Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｐｐ．２１−７３（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）に記載される。再生はまた、植物カルス、外植片、器官、またはそれらの一部から得られ、かつ／またはそれらを使用して行われ得る。そのような再生技術は、一般に、Ｋｌｅｅら、（１９８７）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．３８：４６７−４８６に記載される。Ｐａｙｎｅ，Ｇａｍｂｏｒｇ，Ａｔｌａｓ，Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ  ａｎｄ  Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳもまた参照（全て上述）。
【０１３７】
アグロバクテリウムでの形質転換後、外植片は選択培地へ移される。当業者は、選択培地の選択が、どの選択マーカーが外植片中に同時トランスフェクトされたかに依存することを理解するだろう。適切な長さの時間後、形質転換体はシュートを形成し始める。シュートが約１〜２ｃｍの長さになった後、シュートは適した根およびシュート培地へ移され得る。いったん根およびシュート培地中に置かれると、淘汰圧は維持されなければならない。
【０１３８】
形質転換体は、１〜約２週間で根を発達させ、小植物を形成する。小植物が約３〜約５ｃｍの高さになった後、それらは繊維ポット中の無菌土壌に置かれ得る。当業者は、異なる種の形質転換植物を得るために異なる順化手順が使用されなければならないことを理解するだろう。好適な実施形態において、切断物、ならびに形質転換植物の不定胚が、根およびシュートの発達後、小植物確立のための培地へ移される。形質転換植物の選択および再生の記載について、Ｄｏｄｄｓ  ＆  Ｒｏｂｅｒｔｓ（１９９５）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，第３版（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を参照。
【０１３９】
葉緑体は多くの活性の作用部位であり、いくつかの場合において、遺伝子融合構築物は、葉緑体輸送配列ペプチドと融合して遺伝子生成物の葉緑体中への転位を促進し得る。これらの場合において、遺伝子融合構築物を植物宿主細胞の葉緑体中へ形質転換することが有利であり得る。葉緑体形質転換および発現を達成するために、多数の方法が当該技術分野で利用可能である（例えば、Ｄａｎｉｅｌｌら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：３４６；Ｏ’Ｎｅｉｌｌら、（１９９３）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：７２９；Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１を参照）。発現構築物は、通常、遺伝子融合構築物に操作可能に連結した植物中の機能的な転写調節配列を含む。葉緑体で機能するように設計されている発現カセットは、葉緑体における発現を保証するために必要な配列を含む。典型的には、コード配列は、葉緑体ゲノムでの相同組換えに影響を与えるために、葉緑体ゲノムと相同の２つの領域により隣接される；しばしば、選択可能なマーカー遺伝子もまた、隣接する色素体ＤＮＡ配列内に存在して、得られるトランスプラストニック（ｔｒａｎｓｐｌａｓｔｏｎｉｃ）植物細胞において遺伝的に安定な形質転換葉緑体の選択を促進させる（例えば、Ｍａｌｉｇａ（１９９３）およびＤａｎｉｅｌｌ（１９９８）、および本明細書中に記載される参照を参照）。
【０１４０】
本発明のトランスジェニック植物は、遺伝子型的または表現型的のいずれかで特徴づけられて、シャッフリングされた遺伝子の存在を決定し得る。遺伝子型分析は、特定の遺伝物質の存在または不在の決定である。表現型分析は、表現型形質の存在または不在の決定である。表現型形質は、環境因子に呼応して植物の遺伝物質により決定される、植物の物理的特徴である。遺伝子融合構築物（または、改変遺伝子融合構築物）の存在は、例えば、トランスジェニック植物のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅およびゲノムＤＮＡの特定標識プローブとのハイブリダイゼーションにより、最適化シャッフリングされた核酸の同定に関する先のセクションに記載されたように検出され得る。遺伝子融合構築物によりコードされる生成物が選択ストレスに対抗するのを助けるような選択プロセスへの曝露における植物の生存もまた、遺伝子融合構築物の植物中への組み込みをモニタリングするために使用され得る。
【０１４１】
本質的に、任意の植物が本発明の遺伝子融合構築物で形質転換され得る。本発明の新規核酸の形質転換および発現に適した植物として、農業経済学的（ａｇｒｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ）および園芸学的（ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌｌｙ）に重要な種が挙げられる。そのような種として、イネ科（コーン、ライムギ、ライコムギ、オオムギ、ミレット、コメ、コムギ、カラスムギなどを含む）；マメ科（エンドウマメ、マメ、レンズマメ、ピーナッツ、クズイモ、ササゲ、ハッショウマメ、ダイズ、クローバー、アルファルファ、ルピナス、ベッチ、ミヤコグサ、スイートクローバー、フジ、およびスイートピーを含む）；キク科（少なくとも１，０００属を含む維管束植物の最大の科で、ヒマワリのような重要な商品作物を含む）およびバラ科（Ｒｏｓａｃｉａｅ）（ラズベリー、アンズ、アーモンド、モモ、バラなどを含む）、ならびにナッツ植物（クルミ、ペカン、ヘーゼルナッツなどを含む）、および森林樹（マツ属，カシ属，トガサワラ属，セコイア属，ヤマナラシ属などを含む）が挙げられるが、これらの科の成員に制限されない。
【０１４２】
さらに、本発明の核酸、ならびに上記のものによる改変の好適な標的として、以下の属の植物が挙げられる：コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、キンギョソウ属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、アピウム属（Ａｐｉｕｍ）、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）、アスパラガス属（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、アトロパ属（Ａｔｒｏｐａ）、カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）（例えばカラスムギ）、ホウライチク属（Ｂａｍｂｕｓａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ブロムス属（Ｂｒｏｍｕｓ）、ブロウワリア属（Ｂｒｏｗａａｌｉａ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ヒヨコマメ属（Ｃｉｃｅｒ）、アカザ属（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、チコリウム属（Ｃｈｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、ジュズダマ属（Ｃｏｉｘ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｒｃｕｂｉｔａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、カモガヤ属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、ダウクス属（Ｄａｕｃｕｓ）、キツネノテブクロ属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、オヒシバ属（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、フウロソウ属（Ｇｅｒａｎｉｕｍ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、キスゲ属（Ｈｅｔｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、パラゴム属（Ｈｅｖｅａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）（例えばオオムギ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、サツマイモ属（Ｉｐｏｍｏｅａ）、ラクツカ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、レンズ属（Ｌｅｎｓ）、ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ハナハッカ属（Ｍａｊｏｒａｎａ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、マンゴー属（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、ネメシア属（Ｎｅｍｅｓｉａ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オノブリキス属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）（例えばコメ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）（例えばミレット）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ）、インゲン属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、イチゴツナギ属（Ｐｏａ）、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）、キンポウゲ属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、スグリ属（Ｒｉｂｅｓ）、ヒマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、サルメンバナ属（Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）（例えばライムギ）、セネシオ属（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、エノコログサ属（Ｓｅｔａｒｉａ）、シナピス属（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、イヌシバ属（Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、シャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、トリゴネラ属（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（例えばコムギ）、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）、ササゲ属（Ｖｉｇｎａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）（例えばコーン）、ならびにオリレアエ（Ｏｌｙｒｅａｅ）、ファロイデアエ（Ｐｈａｒｏｉｄｅａｅ）およびその他多数。記述されるように、イネ科の植物が、本発明の方法にとって特に好適な標的植物である。
【０１４３】
本発明の標的である一般的な作物として、コーン、コメ、ライコムギ、ライムギ、ワタ、ダイズ、モロコシ、コムギ、カラスムギ、オオムギ、ミレット、ヒマワリ、アブラナ、エンドウマメ、マメ、レンズマメ、ピーナッツ、クズイモ、ササゲ、ハッショウマメ、クローバー、アルファルファ、ルピナス、ベッチ、ミヤコグサ、スイートクローバー、フジ、スイートピー、トマト、バナナ、およびナッツ植物（例えばクルミ、ペカンなど）が挙げられる。
【０１４４】
植物に加えて、他の真核生物（真菌、鞭毛虫および繊毛虫（ｃｉｌｌｉａｔｅｓ）、微胞子虫、ならびに動物さえも（すなわち、種々の魚類、鳥類、爬虫類、およびほ乳類）など）が、本発明の遺伝子融合構築物および／または改変遺伝子融合構築物で形質転換され得る。全体に記述される参照に加えて、当業者は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびその中に記述される参考文献に、動物細胞培養に対するようなガイダンスを見いだし得る。Ｋｕｃｈｌｅｒら、（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＩｎａｂａら、（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１６９３−１７０２もまた参照。細胞培養に関するさらなる情報は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（上述）に見いだされる。細胞培地は、ＡｔｌａｓおよびＰａｒｋｓ（同じく上述）に記載される。一般に、当業者は、利用可能な技法を使用して、動物、植物、真菌、細菌からの細胞、および他の細胞に形質導入することが十分に可能である。さらに、当業者は、利用可能な技法を使用して、生物全体に遺伝子構築物を形質導入し得る。
【０１４５】
あるいは、原核生物系は本発明の遺伝子融合構築物および／または改変遺伝子融合構築物で形質転換され得る。任意に、原核生物系は少なくとも１つの植物由来の核酸配列を含む構築物で形質転換される。本発明の方法に採用され得る系の例として、細菌系（酢酸菌属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アセトモナス属（Ａｃｅｔｏｍｏｎａｓ）、放線菌属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテリウム属（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ボゴリエラ属（Ｂｏｇｏｒｉｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クリオバクテリウム属（Ｃｒｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ディプロコッカス（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ユウバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ハロバシラス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバクテロイデス属（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、ヘリオバシラス属（Ｈｅｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘリオバクテリウム属（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ロイコバクター属（Ｌｅｕｃｏｂａｃｔｅｒ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、リストネラ属（Ｌｉｓｔｏｎｅｌｌａ）、メタノモナス属（Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ）、ミクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラナ属（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ペプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾバクター属（Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒ）、リゾモナス属（Ｒｈｉｚｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、スピロヘータ属（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ）、スピロソーマ属（Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトバシラス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトバクテリウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）などの属にあるようなもの）および古細菌系（例えば、コル古細菌門（Ｋｏｒａｒｃｈａｅｏｔａ）、テルモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）、ピロディクティウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）、テルモコックス目（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｌｅｓ）、アルカエグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、メタン生成古細菌、および高度好塩菌など）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、原核生物は、１つまたはそれより多い農業、環境、工業、薬学、または臨床目的の細菌種を包含し、大腸菌、種々のストレプトマイセス属種、および種々のバシラス属種を含むがこれらに限定されない。
【０１４６】
（代謝経路および系）
（カロテノイド生合成）
真核生物系において発現させるのに有利な代謝系の１つの例は、カロテノイドの代謝である（図４）。カロテノイドは、一般に、着色したイソプレノイドベース分子であり、これは様々な植物、カビ、酵母、およびいくつかの細菌により合成される。ヒトの場合、β−カロチンはビタミンＡの合成における前駆体として機能し、β−カロチンまたはビタミンＡの栄養上の欠乏は、感染にかかりやすいこと、夜盲症、眼球乾燥症（ドライアイ）、および角膜軟化症（過剰なケラチン形成）を導き得る。プロビタミンＡに加えて、リコペン、β−カロチンなどのような種々のカロテノイドは効果的な抗酸化剤である。その上さらに、証拠は、カロテノイドが心血管疾患および癌の予防に重要な役割を果たしていることを示唆する（例えば、Ｓｉｎｇｈ．＆  Ｌｉｐｐｍａｎ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ  １：Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｌａｓｓｉｃ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ＮＹ，１２，１６４３−１６５３を参照）。カロテノイドのさらなる工業的応用として、食用色素、および動物飼料におけるものが挙げられる。植物、藻類、真菌、および細菌において、カロチンは頻繁に光合成的役割において機能する。
【０１４７】
カロテノイドの生合成は、一連の代謝酵素を含む多段階プロセスである。細胞の出発物質は、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）という２０個の炭素のイソプレノイド分子である。２分子のＧＧＰＰは酵素フィトエンシンターゼにより触媒される縮合反応を起こして、４０−炭素中間体フィトエンを形成する。カロテノゲン（ｃａｒｏｔｅｎｏｇｅｎｉｃ）微生物において、細菌フィトエン不飽和化酵素（フィトエン脱水素酵素とも呼ばれる）の作用を介して、フィトエン分子のＣ７、Ｃ７’、Ｃ１１、およびＣ１１’位で４つの二重結合を対称に導入することは、生合成経路に次の中間体、リコペンを導く。しかしながら、高等植物において、リコペンの形成は２種の別個の酵素、植物フィトエン不飽和化酵素およびｚ−カロチン不飽和化酵素を使用して達成される。最後に、酵素β−シクラーゼ（リコペンシクラーゼとも呼ばれる）が、リコペン分子の各末端で環を閉じて、β−カロチンを形成する。異なるシクラーゼもまた生合成経路に組み込まれ得て、異なる環化パターンを導く。カロテノイド構造のさらなる誘導は、種々の生物に存在または現れる下流改変酵素により達成され得る。
【０１４８】
単一の核酸転写物としてβ−カロチン生合成酵素（フィトエンシンターゼ、フィトエン不飽和化酵素、ｚ−カロチン不飽和化酵素、およびリコペンシクラーゼを含む）をコードする遺伝子融合構築物および改変遺伝子融合構築物は、植物系のような真核生物系の形質転換に有用である。カロテノイド代謝経路をすでに包含している植物系におけるβ−カロチンの生成が増強される。さらに、天然にはβ−カロチンを合成しないコメおよびグレインのような植物系が、この代謝経路の発現により栄養的に濃縮され得る。これらおよび他のカロテノイド生合成酵素の核酸配列は、アクセッション番号Ｍ８４７４４（リコペルシコン  エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、ＡＦ２２０２１８（シトラス  ウンシュウ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ））、Ｚ３７５４３（メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ））、Ｘ７８８１４（ナルキッスス  シュードナルキッスス（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ））、Ｘ６８０１７（カプシカム  アンニューム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ））、ＡＢ０３２７９７（ドクス  カロタ（Ｄｏｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ））、Ｕ３２６３６（トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ））、および植物フィトエンシンターゼについてさらなる関連した配列；アクセッション番号ＡＦ１９５５０７（リコペルシコン  エスクレンタム）、ＡＪ２２４６８３（ナルキッスス  シュードナルキッスス）、Ｘ８９８９７（カプシカム  アンニューム）、ＡＦ０４７４９０（トウモロコシ）、および植物ｚ−カロチン不飽和化酵素についてさらなる関連した配列；アクセッション番号Ｍ８８６８３（リコペルシコン  エスクレンタム）、Ｘ７８８１５（ナルキッスス  シュードナルキッスス）、Ｘ６８０５８（カプシカム  アンニューム）、Ｕ３７２８５（トウモロコシ）、および植物フィトエン不飽和化酵素についてさらなる関連した配列；およびアクセッション番号Ｘ８６４５２（リコペルシコン  エスクレンタム）、Ｘ８６２２１（カプシカム  アンニューム）、Ｕ５０７３９（アラビドプシス  タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））、ＡＦ１５２２４６（シトラス  ｘ  パラジシ（Ｃｉｔｒｕｓ  ｘ  ｐａｒａｄｉｓｉ））およびＸ８１７８７（ニコチアナ  タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、および植物リコペンシクラーゼについてさらなる関連した配列（ＷＯ９９／０７８６７およびその中に記述される参照）のようにＧｅｎＢａｎｋから得ることができる。
【０１４９】
さらに、カロテノゲン微生物由来のカロテノイド生合成酵素クラスターの核酸配列が、アクセッション番号Ｍ８７２８０（エルウィニア  ハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）Ｅｈｏ１０）、Ｄ９００８７（エルウィニア  ウレドボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｕｒｅｄｏｖｏｒａ））、Ｕ６２８０８（フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、Ｄ５８４２０（アグロバクテリウム  オーランチアクム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ））およびＭ９０６９８（エルウィニア  ハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  Ｅｈｏ１３））（および関連する配列）のように、ＧｅｎＢａｎｋから得られ得る。
【０１５０】
大部分のカロテノイドが着色していることから、所望のカロテノイド生成物は、視覚化されてそれらの特徴的なスペクトルおよび他の分析法により決定され得る。
【０１５１】
使用され得るさらなる分析技法として、質量分析、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、およびＮＭＲ分光法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
（エクトイン生合成）
真核生物系、特に植物系に生成するのに有利である別の代謝系は、エクトイン（１，４，５，６−テトラヒドロ−２−メチル−４−ピリミジンカルボン酸）の生合成である。エクトインは非毒性の環状アミノ酸で、その存在は、インビボで増加した塩耐性を細胞に与えるような浸透圧保護（ｏｓｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）特性を有する。さらに、エクトインはストレス条件下におかれた種々のタンパク質および酵素のインビトロ活性の損失を保護するように見える。従って、エクトイン生合成機構での植物系の形質転換は、ストレスの多い環境（例えば、高塩、高温または低温、干ばつなど）に対する植物の耐性を改善するであろう。これらの非理想的条件に対する耐性の改善は、作物生産性の増加をもたらし得る。さらに、エクトインはタンパク質／酵素安定剤、またはいわゆる化学的シャペロンとして使用され得る。酵素とこのシャペロン分子との会合は、凍結／融解サイクル、熱処理、および／または乾燥の繰り返し後も酵素活性を保持するのを助ける。従って、エクトインはまた、薬学的、化粧品用、および栄養組成物に使用するための安定剤としての可能性がある。
【０１５３】
エクトインの生合成は、３つの酵素、すなわち、ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼとも呼ばれる）、ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ、およびエクトインシンターゼを含む（図５）。合成経路の最初の反応において、アミノトランスフェラーゼは、アスパラギン酸−セミアルデヒドおよびＬ−グルタミンをジアミノ酪酸へ変換する。次に、アセチルトランスフェラーゼが、ジアミノ酪酸のアセチル化を触媒して、Ｎ−アセチルジアミノ酪酸を形成する。最後の反応において、Ｎ−アセチルジアミノ酪酸は、エクトインシンターゼの作用を介して環化されてエクトインを生成する。
【０１５４】
エクトイン生合成経路の３つの遺伝子（それぞれ、ｅｔｃＢ、ｅｃｔＡ、およびｅｃｔＣ）が、好塩細菌から単離されている。これらの酵素の配列は、例えば、アクセッション番号Ｕ６６６１４（マリノコッカス  ハロファイルス（Ｍａｒｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ））およびＡＪ０１１１０３（ハロモナス  エロンガタ（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｎｇａｔａ））などのように、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。これらの酵素の最適ｐＨ範囲は８．２〜９．０であり、植物系のような真核生物系における発現の前にペプチド一次配列へのある改変をすることが望ましいことを示唆している。これは、上記のように、例えば、これらの酵素ドメインをコードする核酸配列に再帰組換えを行うこと、および改変配列を改変遺伝子融合構築物中へ組み込むことにより達成され得る。
【０１５５】
エクトイン生合成の酵素をコードする遺伝子融合構築物および／または改変遺伝子融合構築物の選択は、例えば、高塩濃度のような環境ストレスに対する耐性の増加を示す形質転換宿主を選択することにより、達成され得る。例えば、野生型大腸菌は、３％（０．５２Ｍ）のＮａＣｌ濃度まで成長可能であるが、一方エクトイン生合成経路をコードする遺伝子で形質転換された大腸菌株（インビボでエクトインの合成を導く）は、より高いＮａＣｌ濃度、例えば５％ＮａＣｌ（０．８６Ｍ）でも生存可能でありかつ成長し得る。遺伝子融合またはシャッフリングからのライブラリーＤＮＡで形質転換した大腸菌を成長させることにより、最初の機能性クローンが選択され得る。
【０１５６】
選択手順の別の例として、所望の特性を有する遺伝子融合構築物および／または改変遺伝子融合構築物を選択するために、酵母が使用され得る。酵母は、広範囲のｐＨ（下は約ｐＨ３まで）および塩濃度（上は約１Ｍまで）にわたり生存可能であるが、しかしｇｐｄ（グリセロールリン酸脱水素酵素）ノックアウト酵母株は塩感受性である。ｇｐｄノックアウト酵母における、エクトイン生合成経路の発現およびエクトインの合成は、この生物の塩耐性を回復（または部分的に回復）させる。しかしながら、野生型エクトイン生合成経路酵素を低い発現レベルで保有するｇｐｄ欠失株は、増殖培地のｐＨが野生型酵素に最適ではない場合、高塩ではなお増殖できないかもしれない。変更された最適ｐＨを有するエクトイン生合成経路酵素のみが、必要量のエクトイン産物を生成して、塩感受性株の増殖を回復させ得る。それ故に、塩感受性の酵母株は、変更された最適ｐＨを有するクローンの最初の選択のための宿主として使用され得る。
【０１５７】
（ポリヒドロキシアルカノエート生合成）
本発明の遺伝子融合構築物および改変遺伝子融合構築物中に組み込まれ得るさらに別の代謝経路は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生じる生合成経路である。ポリ−３−ヒドロキシ酪酸などのＰＨＡは、炭素およびエネルギー貯蔵として、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＲａｌｓｔｏｎｉａおよびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍなどの微生物により生成される生分解性重合体である。種々の単量体単位から形成され得るこれらの生体高分子は、熱可塑性および薬物送達マトリックスの生成を含む、複数の工業的適用および医学的適用を有する。このクラスの重合体の物理的性質および化学的性質は、側鎖の長さにより一部決定される；より短い側鎖を有する重合体は、半結晶性である傾向があり、かつかなり熱可塑性であるが、一方、より長い側鎖を有する重合体は、より弾性的である。
【０１５８】
短い側鎖のＰＨＡの生合成は、３つの酵素および出発物質としてアセチルＣｏＡを含む（図６）。第一の酵素、ケトチオラーゼは、アセチルＣｏＡ分子のような２つの構築ブロック分子を縮合させて、中間体基質（アセトアセチルＣｏＡ）を形成する。次に、中間体基質は、ＮＡＤＨ依存性機構またはＮＡＤＰＨ依存性機構を介して、レダクターゼ酵素により還元されて、ヒドロキシアルカノエートＣｏＡ分子を形成する。最後に、ヒドロキシアルカノエートＣｏＡは、ＰＨＡシンターゼにより重合されて、ＰＨＡ重合体を形成する。１０３〜１０８ダルトンの範囲の大きさであり得るＰＨＡは、一般に、細胞中の顆粒または「封入体」に貯蔵される。異なる長さおよび／または組成の構築ブロックで出発することにより、他の型の重合体が生成され得る。得られる重合体の物理的特性は、一部、最終産物中に組み込まれた側鎖の長さにより影響される。
【０１５９】
これらの酵素の配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、登録番号ＡＦ１５３０８６（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ種ＤＳＭＺ９２４２）、Ｕ４７０２６（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）、ＡＦ１０９９０９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ＡＢ００９２７３（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）および関連配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
細胞ベースの系におけるＰＨＡの生成は、特定の化学物質を用いた蛍光抗体法により視覚化され得る。なぜなら、ＰＨＡは通常は顆粒として蓄積されるからである。ＮＭＲ分光法（ＬＣ／ＮＭＲを含む）、質量分析（電子イオン化法、高速原子／イオン照射法、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化法、タンデム型ＭＳ、ＧＣ／ＭＳなどのような技術および／または装置を含む）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびキャピラリー電気泳動（ＣＥ）のような他の分析法が、重合体組成の決定のために使用され得る。
【０１６１】
（芳香族ポリケチドの生合成）
本発明の遺伝子融合構築物または改変遺伝子融合構築物によりコードされ得るさらなる代謝経路は、最小芳香族ポリケチドシンターゼを含み、これは、抗生物質、抗真菌剤、抗腫瘍薬剤、心血管薬剤、およびエストロゲンレセプターアンタゴニストを含む広範な産物のための前駆体を合成する多酵素系である。芳香族ポリケチドの例として、アントラキノン、ドキソルビシン、エンジエン（ｅｎｅｄｉｙｅｎｅｓ）、エリスロマイシンおよびリファマイシンのようなマクロライドポリケチド、アントラサイクリン、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、アクラビノン（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ）、および他のアクラシノマイシン；ミスラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）および他のオーレオリック酸（ａｕｒｅｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）ベースの抗生物質が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６２】
最小ポリケチドシンターゼ系は、ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼ、鎖長因子、およびアシルキャリアタンパク質を含む。この系の補助的成分として、様々なケトレダクターゼ、アロマターゼ、およびシクラーゼ（例えば、Ｃａｒｒｅｒａｓら（１９９７）Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８８：８５−１２６およびその中に引用される参考文献を参照）が挙げられる。ポリケチド合成機構は、細菌、真菌、および植物を含む種々の供給源から単離されている。関与する酵素の数および酵素ドメインの配列は、供給源に依存して異なり得るものの、これらの重合体の合成に含まれる化学反応は、以下のように記載され得る。例示的なポリケチドシンターゼ酵素の配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能であり、登録番号Ｘ６３４４９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、Ｘ７７８６５（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ＡＦ１２６４２９（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、ＡＦ０９８９６５（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｒｅｎａｅ）および関連する配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
ポリケチド代謝経路（図７）は、酢酸またはプロピオン酸のような短鎖カルボン酸「開始単位」で開始する。開始単位の補酵素Ａ−チオエステルは、ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼの作用を介して、マロン酸またはメチルマロン酸のようなジカルボン酸「伸長基」の補酵素Ａ−チオエステルと縮合する。新生ポリケチド鎖は、ケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼにより保持されるが、一方、各回の縮合／鎖伸長で、アシルキャリアタンパク質は、成長するポリケチド鎖上に付加するためのさらなるＣｏＡ連結伸長基を提供する。鎖長因子は、ポリケチドが伸長される長さを指示する。最終産物の、鎖長、ケト還元（ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）の程度（もしあれば）、および環化の位置特異性は、生合成に含まれる代謝酵素により全て決定される。
【０１６４】
成長するポリケチド鎖に対するさらなる改変は、酵素ベースの触媒作用と独立して起こり得る。最小芳香族ポリケチドシンターゼにより生成された直鎖ポリケチド前駆体は、特異的シクラーゼの存在なしに、自動環化して異なる型の芳香族ポリケチドを形成し得る（例えば、Ｙｕｅｍａｏ  Ｓｈｅｎら（１９９９）「Ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｗｈｉＥ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｉｚｅｓ  ａｎｄ  ｓｈａｐｅｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：３６２２−３６２７を参照）。
【０１６５】
種々のケトシンターゼ−アシルトランスフェラーゼおよび鎖長因子をコードする核酸配列は、多数の異なる種にまたがって配列が類似している。これらの配列のシャッフリングは、本発明の改変遺伝子融合構築物に使用するための改変核酸配列を提供する。詳細には、鎖長因子のシャッフリングは、新規ポリケチド、例えば様々な鎖長を持つ直鎖芳香族ポリケチド前駆体を合成し得る酵素を生成するために使用され得る。バリエーションのさらなる供給源として、これらの酵素ドメインは、配列が、脂肪酸シンターゼ（上記のように、これもまた、ヌクレオチド配列改変の生成に使用され得る）に類似している。
【０１６６】
ポリケチド生合成機構をコードする遺伝子融合構築物および／または改変遺伝子融合構築物の発現により生成される代謝物および／または産物は、質量分光法、ＮＭＲ分光法などのような従来の分析法および技術により検出および分析され得る。あるいは、代謝物、またはこれらが合成される宿主細胞が、目的とする標的に対する生物学的活性についてスクリーニングされ得る。例えば、抗生物質活性または他の殺生物性関連活性を有する芳香族ポリケチドは、病原微生物、疾患関連の細胞型、または全動物のような標的に対してスクリーニングされ得る。
【０１６７】
（本発明の方法および組成物の使用）
上記のように、特許請求される本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本方法および材料に改変がなされ得、そして本発明は、以下を含む多数の異なる使用を指向し得る：
本明細書中の任意の組成物またはトランスジェニック生物を生成するための、本明細書中の任意の方法の使用。
【０１６８】
トランスジェニック生物、例えば、トランスジェニック原核生物、トランスジェニック真核生物、トランスジェニック植物などを生成するための、方法または組み込まれた系の使用。
【０１６９】
遺伝子融合構築物または改変遺伝子融合構築物を生成するための、方法または組み込まれた系の使用。
【０１７０】
複数の酵素活性を原核生物系または真核生物系において発現するための、方法または組み込まれた系の使用。
【０１７１】
本明細書中に記載される方法ならびに当該技術分野で既知の方法に従って、１つ以上の本発明の遺伝子融合構築物または改変遺伝子融合構築物で形質転換された、トランスジェニック生物の使用。
【０１７２】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中の方法および組成物を具体化し、そして、任意の１つ以上の、本明細書中の先に記載された選択戦略、材料、成分、方法、または基質の使用を利用するキットを提供する。本発明のキットは、必要に応じて、１つ以上の、以下：（１）本明細書中に記載されるような遺伝子融合構築物または改変遺伝子融合構築物；（２）本明細書中に記載される方法を実施するための、および／または本明細書中の選択手順を実行するための指示書；（３）１つ以上のアッセイ成分（１つ以上の緩衝液、酵素、補助因子、基質、インヒビター、触媒などを含むが、これらに限定されない）；（４）核酸、植物、細胞などを保持するための容器、および必要に応じて（５）包装材料を含む。
【０１７３】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中の任意の成分またはキットの使用、本明細書中の任意の方法またはアッセイの実行、および／または本明細書中の任意のアッセイまたは方法を実行するための任意の装置またはキットの使用を提供する。
【０１７４】
（実施例）
以下の実施例は、特許請求される本発明を制限するためにではなく例示するために提供される。
【０１７５】
（実施例１：３つの酵素ドメイン−エクトインシンターゼをコードする遺伝子融合構築物の調製および機能評価）
（野生型エクトインシンターゼオペロンのクローニング）
目的のエクトインシンターゼオペロンを含むＭａｒｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ（ＡＴＣＣ２７９６４）を、ＡＴＣＣから得た。ｅｃｔＡ（ジアミノ酪酸アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｅｃｔＢ（ジアミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ）遺伝子およびｅｃｔＣ（エクトインシンターゼ）遺伝子を含むオペロンが特徴付けられており、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能である（登録番号Ｕ６６６１４）。ｅｃｔＡ開始コドンの０．７ｋｂ上流からｅｃｔＣ終止コドンの０．１５ｋｂ下流まで延びる３．２６ｋｂのオペロンが、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ増強ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（図８）を使用してゲノムＤＮＡから増幅し、そして、以下のプライマー対：ｅｃｔＰ−５’（５’−ＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＧＴＡＧＴＡＣＡＣＧＣＡＡＧＧＡＴＧＧＧ−３’（配列番号１；ＥｃｏＲＩ部位は下線が引かれている））およびｅｃｔ−３’（５’−ＣＧＴＴＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＴＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧ−３’（配列番号２；ＮｃｏＩ部位は下線が引かれている））を、ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩ部位の導入を有する０．７ｋｂフラグメントのＰＣＲアウトのために使用した；ｅｃｔ−５’（５’−ＡＧＧＴＧＧＴＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＡＡＣＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＧＡＡＣＧ−３’（配列番号３；ＮｃｏＩ部位は下線が引かれている））およびＩｎ−３’（５’−ＡＧＧＡＧＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧ−３’（配列番号４；ＸｈｏＩ部位は下線が引かれている））を、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位の導入を有する２．５６ｋｂフラグメントのＰＣＲアウトのために使用した。
【０１７６】
Ｅ．ｃｏｌｉベクターｐＢＲ３２２を、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（ＸｈｏＩと適合性の末端）制限酵素により消化して、上記で得られたＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ（０．７ｋｂ）フラグメントおよびＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ（２．５６ｋｂ）フラグメントのためのクローニングベクターを作成した。３回のフラグメントライゲーション後、これをＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞中へ形質転換して、ｐＢＲ３２２−ｗｔ構築物を形成した。
【０１７７】
（エクトインシンターゼ遺伝子融合構築物の調製）
ｅｃｔＡ遺伝子、ｅｃｔＢ遺伝子、およびｅｃｔＣ遺伝子を組み合わせて、遺伝子融合構築物を形成した（図９）。このプロセスは、ｅｃｔＡおよびｅｃｔＢの終止コドン、遺伝子間（ｉｎｔｅｒ−ｇｅｎｅ）空間、ならびにｅｃｔＢおよびｅｃｔＣの開始コドンの除去、ならびにｅｃｔＡ、ｅｃｔＢ、およびｅｃｔＣの、４つのグリシンリンカー配列とのインフレームの融合を必要とした。構築を、以下のＰＣＲ操作を使用して達成した：プライマー対ｅｃｔ−５’（配列番号３）および０３１−２５（５’−ＣＧＣＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＣＴＴＴＧＴＡＡＡＴＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＧＡＡＡＴＧＴＣ−３’（配列番号５；４−グリシンリンカーをコードする部位は下線が引かれている））を使用してｅｃｔＡフラグメントを生成した；プライマー対０３１−２４（５’−ＣＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＴＡＣＧ−３’（配列番号６；４−グリシンリンカーをコードする部位は下線が引かれている））および０３１−２７（５’−ＧＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＴＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＴＴＴＧＧＣＴＡＣＧＡＧＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＧＣＧ｀ＧＴＡＡＣ−３’（配列番号７；４−グリシンリンカーをコードする部位は下線が引かれている））を使用してｅｃｔＢフラグメントを生成した；そしてプライマー対０３１−２６（５’−ＣＣＴＣＧＴＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＡＡＡＣＴＣＧＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＧＧＣ−３’（配列番号８；４−グリシンリンカーをコードする部位は下線が引かれている））およびＩｎ−３’（配列番号４）を使用してｅｃｔＣフラグメントを生成した。
【０１７８】
３つの重なり合うＰＣＲフラグメントを、９５℃の溶融温度で３０秒間、６０℃のアニーリング温度で３０秒間、および７２℃の伸長温度で１分間の条件で、プライマー無しで５〜１０回のＰＣＲサイクルによりアセンブリした。次いで、アセンブリされた産物を、５５℃のアニーリング温度でｅｃｔ−５’およびＩｎ−３’のプライマーで増幅した。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ増強ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、アセンブリおよび続くＰＣＲ増幅の両方のために使用した。得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｄｅＩ制限酵素で消化し、そして、ＮｃｏＩ／ＮｄｅＩ消化ｐＢＲ３２２中にクローニングした。構築物のリンカー領域を、配列決定分析により確定した。得られるプラスミドを、Ｔｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細胞中へ形質転換した。
【０１７９】
（エクトインシンターゼ遺伝子融合構築物で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの塩耐能力の評価）
野生型エクトインオペロンおよびエクトインシンターゼ融合構築物で形質転換したＴｏｐ１０’細胞を、種々の塩濃度で増殖する能力について試験した。試験は、以下の培地：ＭＭ６３（１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、７５ｍＭのＫＯＨ、１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、３．９μＭのＦｅＳＯ４、２２ｍＭのグルコース、１．５ｍｌ／ｌのビタミン溶液、ｐＨ７．４（ビタミン溶液：１００ｍｌのＨ２Ｏ中、１０ｍｇのビオチン、３５ｍｇのニコチンアミド、３０ｍｇの二塩化チアミンジクロリド、２０ｍｇのｐ−アミノ安息香酸、１０ｍｇの塩化ピロドキサール、１０ｍｇのＣａパントテン酸塩、５ｍｇのビタミンＢ１２））＋１０％ＬＢおよび種々の量の塩（０〜５％ＮａＣｌ）中、３７℃で３６時間細胞を増殖させる工程を含んだ。培養物の細胞密度を、分光器により６００ｎｍで測定した。
【０１８０】
結果（図１０）は、３つの遺伝子融合構築物が、Ｅ．ｃｏｌｉに野生型エクトインオペロンに匹敵する塩耐能力を与えることを示す。
【０１８１】
上記の発明は、明瞭性および理解の目的である程度詳細に記載されてきたが、形態および詳細における種々の変更が、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得るということが、本開示を読むことにより当業者に明らかである。例えば、上記で記載される全ての技術および組成物が、種々の組合せで使用され得る。願において引用される全ての発行物、特許文書（例えば、出願、特許など）または他の参考文献は、各個々の発行物または特許文書が個別に示されるのと同じ範囲で、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１：リンカー配列を含まない、２つの核酸配列を有する改変された遺伝子構築物の概略図。遺伝子１の終止コドンを除去し、次いで、遺伝子２のコード配列にインフレームで融合させる。
【図２】
図２：リンカー配列を有する、２つの核酸配列を有する改変された遺伝子融合構築物の概略図。遺伝子１の終止コドンを除去し、次いで、遺伝子２のコード配列にインフレームで融合させたリンカー配列に融合させる。
【図３】
図３：リンカー配列を含むおよび含まない、３つの核酸配列を有する遺伝子融合構築物の概略図。リンカー配列の存在は任意である。遺伝子１および２の終止コドンを除去した後に、遺伝子３にインフレーム融合させる。
【図４】
図４：カロテノイド生合成経路、および本発明の遺伝子融合産物の可能性のある実施形態。
【図５】
図５：エクトイン生合成経路（ＡＳＡ：アスパラギン酸β−セミアルデヒド、ＤＡＢＡ：２，４−ジアミノ酪酸、ＡＤＡＢＡ：γ−Ｎ−アセチル−α，γ−ジアミノ酪酸）。
【図６】
図６：ＰＨＡ生合成経路（Ｒ＝アセチル、プロピオニル、および他の長鎖基、ｉおよびｊ＝繰り返し単位数、最終的なポリマーのバリエーションは、開始構成単位由来のＲ基によって決定される）。
【図７】
図７：最小ポリケチド合成経路。
【図８】
図８：野生型エクトインシンターゼオペロンの機能的単離のためのクローニングストラテジー。
【図９】
図９：３つのエクトイン生合成酵素の融合構築物を作製するためのストラテジー。
【図１０】
図１０：様々な塩濃度で、ｐＢＲ３２２（コントロール）、ならびにＷＴ  ｅｃｔオペロンを含有するプラスミド（ｅｃｔオペロン１およびｅｃｔオペロン２は、２つの別個の形質転換Ｅ．ｃｏｌｉコロニーである）、および融合ｅｃｔ遺伝子を含有するプラスミド（融合ｅｃｔ１および融合ｅｃｔ２は、２つの別個の形質転換Ｅ．ｃｏｌｉコロニーである）で形質転換された、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004527215.tif 000106
【国際調査報告】
2004527215.tif 000107
2004527215.tif 000108
2004527215.tif 000109