(57)【要約】本発明は被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する方法に関する。本発明の方法は（ａ）上記被験体の尿サンプルを準備し、（ｂ）上記サンプルから総てのタンパク質を単離し、好ましくは分子量が約８Ｋｄａを超えるタンパク質を単離し、（ｃ）所望により、好ましくは、工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行い、工程（ｃ）で得られた混合物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離し、さらに（ｄ）好適な検出技術により、工程（ｃ）で得られたプロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる。また、本発明はさらに被験体においてプリオン疾患を診断する方法、およびプリオン疾患の存在に関して血液サンプルのドナーをスクリーニングする方法に関する。さらに本発明は被験体においてプリオン疾患を診断する診断キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを準備し、
ｂ．上記サンプルからタンパク質を単離し、さらに
ｃ．好適な検出技術により、工程（ｂ）で得られたタンパク質混合物においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行う工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する請求項２に記載の方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを準備し、
ｂ．上記サンプルから分子量が約８Ｋｄａを超える総てのタンパク質を単離し、
ｃ．工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行い、
ｄ．工程（ｃ）で得られた混合物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離し、さらに
ｅ．好適な検出技術により、工程（ｄ）で得られたプロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において上記タンパク質が尿サンプルに対して透析を行い、その透析物からタンパク質を沈降させることにより単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が所望によりタンパク質沈降に先立ち、透析物に担体を添加することをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記透析が約６ＫＤａ〜約８ＫＤａの孔径範囲を有する膜を用いて行われる、請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
透析物を超遠心分離することによりタンパク質を沈降させる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
沈降が４℃、１００，０００ｘｇにて約１時間透析物を超遠心分離することにより行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
好適な方法によってタンパク質を沈降させる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
メタノールおよびＴＣＡのいずれかによりタンパク質を沈降させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
メタノールによりタンパク質を沈降させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｅ）において上記プロテアーゼ耐性画分におけるＰｒＰＳＣプロテアーゼ耐性コアの存在が免疫アッセイによって検出される、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上記免疫アッセイが免疫ブロットＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析によるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
免疫アッセイがＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアに特異的に結合するモノクローナル抗体の使用を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
上記ＰｒＰ抗体が３Ｆ４または６Ｈ４モノクローナル抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
被験体においてプリオン疾患を診断する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを得、さらに
ｂ．請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法により、上記尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出し、それにより上記サンプル中にＰｒＰＳＣタンパク質が存在すれば上記被験体がプリオン疾患を有することを示す工程を含んでなる、方法。
【請求項１８】
上記プリオン疾患がＴＳＥ疾患である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記被験体がヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記被験体がウシである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
上記プリオン疾患がＢＳＥである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記プリオン疾患の診断が臨床徴候の発症の前または後である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
血液サンプルのドナーをそのドナーのプリオン疾患の存在に関してスクリーニングする方法であって、
ａ．上記ドナーから尿サンプルを得、
ｂ．請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法により、上記尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出し、それにより上記サンプル中にＰｒＰＳＣタンパク質が存在すれば上記ドナーがプリオン疾患を有することを示し、さらに
ｃ．工程（ｂ）で行った検出の結果を上記血液サンプルと照合する工程を含んでなる、方法。
【請求項２４】
被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物（この代謝物はヒトプリオン疾患キャリヤーに独特なものである）の存在を検出する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを準備し、
ｂ．上記サンプルから分子量が約８Ｋｄａを超える総てのタンパク質を単離し、さらに
ｃ．好適な検出技術により、工程（ｂ）で得られたタンパク質サンプルにおいて上記ＰｒＰＳＣ代謝物の存在を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）において上記タンパク質が尿サンプルに対して透析を行い、その透析物からタンパク質を沈降させることにより単離される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
透析物を超遠心分離することによりタンパク質を沈降させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
沈降が４℃、１００，０００ｘｇにて約１時間透析物を超遠心分離することにより行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
好適な方法によってタンパク質を沈降させる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
メタノールおよびＴＣＡのいずれかによりタンパク質を沈降させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
メタノールによりタンパク質を沈降させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｃ）において上記タンパク質サンプルにおけるＰｒＰＳＣプロテアーゼ耐性コアの代謝物の存在が免疫アッセイによって検出される、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
免疫アッセイがヒトプリオン疾患キャリヤーの尿に見られるＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアに特異的に結合するモノクローナル抗体の使用を含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記抗体が６Ｈ４または３Ｆ４モノクローナル抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
上記６Ｈ４モノクローナル抗体がヒトプリオン疾患患者に独特な異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物の存在を検出する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記ヒトプリオン疾患がＣＪＤである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
被験体においてヒトプリオン疾患を診断する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを得、さらに
ｂ．請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の方法により、上記尿サンプルにおいてヒトプリオン疾患患者に独特な異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物の存在を検出し、それにより上記サンプル中に上記ＰｒＰＳＣタンパク質代謝物が存在すれば上記被験体がプリオン疾患を有することを示す工程を含んでなる、方法。
【請求項３７】
上記ヒトプリオン疾患がＣＪＤである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
血液サンプルのドナーをそのドナーのヒトプリオン疾患の存在に関してスクリーニングする方法であって、
ａ．上記ドナーの尿サンプルを得、さらに
ｂ．請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の方法により、上記尿サンプルにおいてヒトプリオン疾患患者に独特な異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物の存在を検出し、それにより上記サンプル中に上記ＰｒＰＳＣタンパク質代謝物が存在すれば上記ドナーがヒトプリオン疾患を有することを示し、さらに
ｃ．工程（ｂ）で行った検出の結果を上記血液サンプルと照合する工程を含んでなる、方法。
【請求項３９】
上記ヒトプリオン疾患がＣＪＤである、請求項３８に記載の血液サンプルのドナーをスクリーニングする方法。
【請求項４０】
被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する診断キットであって、
ａ．上記尿サンプルからタンパク質を単離する手段、
ｂ．所望により、尿サンプル中でＰｒＰＳＣを安定化する好適な担体、
ｃ．（ａ）または（ｂ）により得られたタンパク質単離物を消化するプロテアーゼ、
ｄ．（ｃ）による消化物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離する手段、
ｅ．（ｄ）により得られたプロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する手段、および
ｆ．請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に従い、尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの存在の検出を行うための説明書
を含んでなる、キット。
【請求項４１】
タンパク質を単離する上記手段が、分子量が約８Ｋｄａを超えるタンパク質を単離するためのものである、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
上記プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項４０および４１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４３】
ＰｒＰＳＣの存在を検出する上記手段が免疫アッセイによりＰｒＰＳＣを検出する試薬を含んでなる、請求項４０に記載のキット。
【請求項４４】
上記免疫アッセイ試薬がＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアと特異的に反応する抗体を含んでなる、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
被験体の尿サンプルにおいて、ヒトプリオン疾患キャリヤーに独特な異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物の存在を検出する診断キットであって、
ａ．上記尿サンプルから分子量が約８ＫＤａを超える総てのタンパク質を単離する手段、
ｂ．工程（ａ）で得られたタンパク質サンプルにおいて、ヒトプリオン疾患キャリヤーに独特なＰｒＰＳＣ代謝物の存在を検出する手段、および
ｃ．請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に従い、尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの存在の検出を行うための説明書を含んでなる、キット。
【請求項４６】
上記ＰｒＰＳＣ代謝物の存在を検出する上記手段が免疫アッセイにより上記ＰｒＰＳＣ代謝物を検出する試薬を含んでなる、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
上記免疫アッセイ試薬がヒトプリオン疾患キャリヤーに独特なＰｒＰＳＣの代謝物と特異的に反応する抗体を含んでなる、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
上記ヒトプリオン疾患がＣＪＤである、請求項４７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は尿サンプルにおいてＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアおよび／またはそのいくつかの代謝物を検出することによりプリオン疾患を診断する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
プリオン疾患はＴＳＥ（伝染性海綿状脳症）としても知られ、動物およびヒトの致死的な神経変性疾患の一群である。今日、動物疾患で最も流行しているのは「狂牛病」としても知られるＢＳＥ（ウシ海綿状脳症）である。これまでにＢＳＥ感染と診断された罹患体は１００個体に満たないが病気が潜伏している個体数は数百万と考えられる。もう１つの動物プリオン疾患としてヒツジのスクラピーであり、これが齧歯動物への感染を経て主要な実験的プリオン動物モデルを構成している。
【０００３】
ヒトではＣＪＤ（クロイツフェルト・ヤコブ病 ）が最も流行しているプリオン疾患であり、これは散発的に（年間に患者は約１名）、遺伝学的に（プリオンタンパク質ＰｒＰ遺伝子の変異を介して）、またはＢＳＥ感染の場合のように伝染性疾患としてのいずれかで現れうる。ヒトおよび大型動物におけるプリオン疾患の潜伏が１０年間続く可能性があるという研究結果は十分に周知のことである。
【０００４】
プリオン疾患はＰｒＰＳＣ、すなわち異常な折り畳みをもつイソ型ＰｒＰＣ、未知の機能を有するＧＰＩアンカータンパク質が脳に蓄積することが原因と考えられている。プリオン疾患はまだ知られていない機構によってＰｒＰＣ分子がプロテアーゼ耐性で不溶性のＰｒＰＳＣへ変換することにより伝播すると仮定されている。プリオン疾患におけるプロテイナーゼＫ（ＰＫ）耐性ＰｒＰはＭｃＫｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ［Ｃｅｌｌ ３５（１）： ５７−６２（１９８３）］に記載されている。プリオン疾患に感染した脳サンプルをプロテイナーゼＫで消化したものに抗ＰｒＰ抗体を用いて免疫ブロットを行うと、対照または他のいずれの神経疾患を有する患者にも存在しない特徴的なＮ末端切断型ＰｒＰタンパク質（ＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コア、ＰｒＰ２７−３０と称する）が明らかとなる。
【０００５】
今日まで、プリオン疾患の診断は脳生検における特徴的なプロテアーゼ耐性ＰｒＰの存在、ならびに臨床基準に基づくものであった。プリオン疾患を確定するための現行法としては主に患者の脳のホモジネートの死後分析が挙げられる。この疾患の臨床徴候は見誤ることがしばしばありうる。確かに、生存患者から脳組織をサンプリングする場合には痛みや危険を伴う外科的処置が必要であり、さらに脳におけるＰｒＰＳＣ分布が均一でないため、確実な答えは得られない。これまでに用いられている市販の試験は総てプロテアーゼ耐性ＰｒＰの脳における存在に基づくものであり、例えば、脳および脊髄組織におけるプリオンを検出するための免疫学的試験であるＰｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのプリオン検査（同社がＢＳＥ症例のモースト・ヨーロッパ・アクティブ・サーベイオランスを預かっている）がＢＳＥおよびスクラピー診断方法に主として用いられる。プリオン疾患の潜伏期間は非常に長期（数年）であるため、多数の無症候性ヒトおよび動物キャリヤーが存在する可能性がある。そのため、この疾患に対する簡便かつ容易に入手可能な前臨床および臨床診断学的検査を開発する必要がある。１９９６年に変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）の最初の事例が報告されてから［Ｚｅｉｄｌｅｒ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５０（９０８２）， ９０８−１０（１９９７）； Ｂｒｕｃｅ， Ｍ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６５０）， ４９８−５０１（１９９７）； Ｉｒｏｎｓｉｄｅ， Ｊ． Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３７（１）， １−９（２０００）］かかるｉｎ ｖｉｖｏ検査の必要性が高まってきた。ｖＣＪＤはＢＳＥ汚染食肉の消費が原因と考えられている致死的な神経変性疾患であり、感染から臨床徴候までの潜伏期間は数十年とされている［Ｂｒｕｃｅ， Ｍ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ｉｂｉｄ （１９９７）］。畜牛とは違い、潜伏している個体は長年存在するため、血液、一部の例では他の器官が非罹患者集団に提供される。また、かかる検査は食品産業にも重要であり、雌牛およびヒツジなどのウシ亜科の動物のＢＳＥを検出してこれらの動物の感染食肉および乳製品が市場に出ないようにすることが可能である。
【０００６】
よって、本発明の主要な目的はヒトおよび動物においてプリオン疾患の前臨床および臨床診断が可能な、信頼性のある非侵襲的プリオン疾患診断方法を開発することである。
【０００７】
大部分の尿タンパク質が血液を起源とすることから、発明者らは潜伏期間中に脳または周辺器官のいずれかからＰｒＰＳＣが非凝集形態で、低く検知されない濃度ではあるが血清に放出されるものと推測した。ＰｒＰＳＣはそのプロテアーゼ耐性から血中プロテアーゼによって消化されない。しかしながら、ＰｒＰのＭＷが腎細胞のフィルターを通るカットオフサイズ（約４０ｋＤＡ）より小さいため［Ｂｅｒｎｅ， Ｒ． Ｍ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｍ． Ｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄ （１９９８）］、ＰｒＰはその後尿に分泌される。そのため、ＰｒＰは他のタンパク質と同様にその血中濃度の約１２０倍に濃縮されうる［Ｋｏｅｉｓｋｏ， Ｄ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７０（６４８９）， ４７１−４（１９９４）］。腎臓によって濃縮されることから血液を用いるよりも尿におけるＰｒＰＳＣの検出の方が容易に可能となる。
【０００８】
説明を進めるとともに明らかとなるが、こうして、発明者らはプリオンに感染した動物およびヒトの尿において独特のプロテアーゼ耐性イソ型プリオン（ＵＰｒＰＳＣ）を同定した。これは罹患した、または外観上健康であるがプリオンに感染した個体のｉｎ ｖｉｖｏ早期診断に使用しうるものであった。さらに、本発明によって、このプロテアーゼ耐性イソ型ＵＰｒＰＳＣが特別な濃縮手順に従ってスクラピー感染ハムスター、ＢＳＥ感染畜牛およびヒトＣＪＤ患者の尿において検出可能であることがわかる。本発明のこの特別な濃縮手順としては約６ＫＤａ〜約８ＫＤａの孔径範囲を有する膜によるサンプルの透析が挙げられる。また、本発明によって、臨床徴候が発現するずっと以前にプリオンを接種したハムスターの尿にもＵＰｒＰＳＣが見られたことがわかる。これらの発見により前臨床診断への本発明の方法の使用についての将来性も強く示唆される。
【０００９】
尿などの種々の体液におけるプリオン疾患診断についての論理的可能性がいくつかの特許文献に記載されている。例えば、ＥＰ０８５４３６４ではアルツハイマー病およびプリオン疾患などの神経変性障害の診断方法が開示されている。この方法は特定の神経変性疾患と関わりのあるタンパク質（プリオン疾患におけるＰｒＰおよびアルツハイマー病におけるＡＰＰなど）のサンプル（例えば、尿）における濃縮に基づいている。濃縮はサンプルを固体、リン酸カルシウムなどの遊離イオン価を有する非浮遊性粒子材料に接触させることにより行う。しかし、この特許ではアルツハイマー病関連ペプチドＡＰＰの検出しか例示されていない。ＷＯ９３／２３４３２ではＣＳＦ（髄液）および理論的には、尿などの異なる体液におけるプリオン疾患の診断方法が開示されている。ＥＰ０８５４３６４と同様に、この方法は硫酸アンモニウム沈降およびアフィニティークロマトグラフィーによるプリオンタンパク質の濃縮に基づいている。この公報ではサンプルとしてＣＳＦが例示されている。
【００１０】
しかしながら、先行技術の方法に対し、本発明ではプリオン感染動物およびヒトの尿サンプルにおける異常なプロテアーゼ耐性尿イソ型ＵＰｒＰＳＣの検出を明示している。さらに、本発明により示されるように、尿の透析によって検出手順が向上すると考えられる。それゆえ、発明者らはＵＰｒＰＳＣは恐らく比較的高濃度の尿中の変性剤によって半変性形態で存在し、その後、例えば、透析工程により復元されると提案している。従って、本発明による尿サンプルの特別な濃縮によって、非侵襲的処置により異なるプリオン疾患の検出するための新規かつ信頼性のある方法が提供される。
【００１１】
発明の概要
本発明は被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する方法であって、（ａ）上記被験体の尿サンプルを準備し、（ｂ）上記サンプルからタンパク質を単離し、さらに（ｃ）好適な検出技術により、工程（ｂ）で得られたタンパク質混合物においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる方法に関する。
【００１２】
好ましい具体例は、工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行う工程をさらに含んでなる本発明の方法に関する。
【００１３】
特に好ましい具体例では、本発明は被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する方法であって、（ａ）上記被験体の尿サンプルを準備し、（ｂ）上記サンプルから分子量が約８Ｋｄａを超える総てのタンパク質を単離し、（ｃ）工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行い、（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離し、さらに（ｅ）好適な検出技術により、工程（ｂ）で得られたプロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる方法に関する。
【００１４】
本発明の方法の工程（ｂ）において、タンパク質は好ましくは尿サンプルに対して透析を行い、その透析物からタンパク質を沈降させることにより単離される。所望によりタンパク質沈降に先立ち、ＰｒＰＳＣを安定化するために透析物に担体を添加してもよい。好ましくはこの透析は約６ＫＤａ〜約８ＫＤａの孔径範囲を有する膜を用いて行う。
【００１５】
タンパク質は、例えば、４℃、１００，０００ｘｇにて約１時間透析物を超遠心分離することによりその透析物から沈降しうる。また、タンパク質はいずれの好適なタンパク質沈降技術によって沈降させてもよい。好ましい具体例の場合のように、本発明のタンパク質はメタノール、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、または他の沈降法のいずれか１つにより沈降させうる。メタノールによりタンパク質を沈降させるのが好ましいが、例えば、メタノールを加え、約−８０℃で約１時間サンプルを冷凍し、その後、３０００ｘｒｐｍにて約３０分間遠心分離する。
タンパク質消化は、好ましくはサンプルをプロテイナーゼＫで処理することにより行う。例えば、プロテイナーゼＫを４０μｇ／ｍｌまでの濃度に加え、３７℃で約３０分間消化を続ける。
【００１６】
好ましくは、上記未消化画分におけるＰｒＰＳＣプロテアーゼ耐性コアの存在がＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアに特異的に結合するモノクローナル抗体（例えば、３Ｆ４または６Ｈ４モノクローナル抗体）を使用する免疫アッセイ（例えば、免疫ブロットＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析）によって検出される。
【００１７】
本発明はまた被験体においてプリオン疾患を診断する方法であって、（ａ）上記被験体の尿サンプルを得、さらに（ｂ）本発明の方法により、上記尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出し、それにより上記サンプル中にＰｒＰＳＣタンパク質が存在すれば上記被験体がプリオン疾患を有することを示す工程を含んでなる方法に関する。好ましい具体例では、上記プリオン疾患はＴＳＥ疾患である。被験体はヒト、例えば、ＣＪＤ、ｖＣＪＤ、ＧＳＳもしくはＦＦＩキャリヤー、またはＢＳＥ感染個体である。また、被験体はＢＳＥ、スクラピーまたは他のＴＳＥ疾患に感染した動物であってもよい。さらに、本発明の方法により臨床徴候の発症の前または後での異なるプリオン疾患の検出がさらに可能である。
【００１８】
なおさらなる具体例では、本発明は血液サンプルのドナーをそのドナーのプリオン疾患の存在に関してスクリーニングする方法であって、（ａ）上記ドナーから尿サンプルを得、（ｂ）本発明の方法により、上記尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出し、さらに（ｃ）工程（ｂ）で行った検出の結果を上記血液サンプルと照合する工程を含んでなる方法に関する。
【００１９】
なおさらに、本発明は被験体の尿サンプルにおいて病原性イソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）と考えられる異常なイソ型代謝物（この代謝物はヒトプリオン疾患キャリヤーに独特なものである）の存在を検出する方法に関する。好ましい具体例では、かかるヒトプリオン疾患はＣＪＤまたはｖＣＪＤである。この方法は（ａ）上記被験体の尿サンプルを準備し、（ｂ）上記サンプルから分子量が約８Ｋｄａを超える総てのタンパク質を単離し、さらに（ｃ）好適な検出技術により、工程（ｂ）で得られたタンパク質サンプルにおいて上記ＰｒＰＳＣ代謝物の存在を検出する工程を含んでなる。
【００２０】
この具体例では、工程（ｂ）において上記タンパク質が尿サンプルに対して透析を行い、例えば、特に４℃、１００，０００ｘｇにて約１時間透析物を超遠心分離することにより、または他の好適な沈降方法によってその透析物からタンパク質を沈降させることにより単離される。好ましいタンパク質沈降法はメタノールまたはＴＣＡ（トリクロロ酢酸）沈降などの方法である。特に好ましい沈降技術は、特に、メタノールをサンプルに加え、約−８０℃で約１時間冷凍し、その後、３０００ｘｒｐｍ（回転／分）にて約３０分間遠心分離するメタノール沈降である。
【００２１】
上記タンパク質サンプルにおけるＰｒＰＳＣプロテアーゼ耐性コアの代謝物の存在が、好ましくはプリオン疾患キャリヤーの尿に見られるＰｒＰＳＣの特定の代謝物に特異的に結合するモノクローナル抗体（例えば、６Ｈ４モノクローナル抗体）を使用する免疫アッセイ（特にＳＤＳ　ＰＡＧＥ）によって検出される。
【００２２】
さらに、本発明は被験体においてプリオン疾患を診断する方法であって、（ａ）上記被験体の尿サンプルを得、さらに（ｂ）本発明の方法により、上記尿サンプルにおいてヒトプリオン疾患患者に独特な異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物の存在を検出し、それにより上記サンプル中に上記ＰｒＰＳＣタンパク質代謝物が存在すれば上記被験体がプリオン疾患を有することを示す
工程を含んでなる方法に関する。
【００２３】
好ましい具体例によれば、本発明の方法はＣＪＤおよびｖＣＪＤに独特な代謝物の存在を検出することを目的としている。
【００２４】
なおさらに、本発明は血液サンプルのドナーをそのドナーのプリオン疾患の存在に関してスクリーニングする方法に関する。この方法は（ａ）上記ドナーの尿サンプルを得、さらに（ｂ）本発明の方法により、上記尿サンプルにおいてプリオン疾患患者に独特な異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物の存在を検出し、さらに（ｃ）工程（ｂ）で行った検出の結果を上記血液サンプルと照合する工程を含んでなる。
【００２５】
もう１つの具体例では、本発明は被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する診断キットであって、上記尿サンプルから総てのタンパク質を単離する手段、所望により、ＰｒＰＳＣを安定化する担体、未消化画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する手段、および尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの存在の検出を行うための説明書を含んでなる、キットに関する。
【００２６】
もう１つの好ましい具体例では、本発明は被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する診断キットであって、上記尿サンプルから分子量が約８Ｋｄａを超える総てのタンパク質を単離する手段、所望により、透析物中でＰｒＰＳＣを安定化する担体、ＰｒＰＳＣの存在を検出する手段、および尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの存在の検出を行うための説明書を含んでなるキットに関する。
【００２７】
さらにもう１つの特に好ましい具体例では、本発明は被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する診断キットであって、上記尿サンプルから分子量が約８Ｋｄａを超える総てのタンパク質を単離する手段、所望により、透析物中でＰｒＰＳＣを安定化する担体、タンパク質単離物を消化するプロテアーゼ、タンパク質消化物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離する手段、プロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する手段、および尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの存在の検出を行うための説明書を含んでなるキットに関する。
【００２８】
本発明のキットでは、好ましくはプロテアーゼがプロテイナーゼＫであり、ＰｒＰＳＣの存在を検出する上記手段がＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアと特異的に反応する抗体などの免疫アッセイによりＰｒＰＳＣを検出する試薬を含んでなる。
【００２９】
もう１つの具体例では、本発明は被験体の尿サンプルにおいて、ヒトプリオン疾患キャリヤーに独特な異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物の存在を検出する診断キットであって、上記尿サンプルから分子量が約８ＫＤａを超える総てのタンパク質を単離する手段、得られたタンパク質サンプルにおいて、ヒトプリオン疾患キャリヤー、好ましくはＣＪＤおよびｖＣＪＤに独特なＰｒＰＳＣ代謝物の存在を検出する手段を含んでなるキットに関する。上記ＰｒＰＳＣ代謝物の存在を検出する手段は、好ましくは、免疫アッセイにより上記ＰｒＰＳＣ代謝物を検出する試薬、例えば、ヒトプリオン疾患キャリヤーに独特なＰｒＰＳＣの代謝物と特異的に反応する抗体を含んでなる。
【００３０】
好ましい具体例によれば、上記ヒトプリオン疾患がＣＪＤまたはｖＣＪＤである。
後記図面の簡単な説明において、添付の図面によって本発明がさらに詳細に説明されている。
【００３１】
好ましい態様の具体的説明
発明者らは今般驚くべきことにＰｒＰＳＣ、異常なイソ型であり、唯一知られるプリオン疾患のマーカーがスクラピー感染ハムスターの尿、ならびにＣＪＤに罹患したヒトの尿で同定できることを見出した。これが本発明の目的である。さらに、ＰｒＰＳＣの代謝物の中にもＣＪＤ患者の尿において検出できるが正常な個体の尿においては存在しないがものがあった。
【００３２】
よって、第１の態様では、本発明は被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する方法であって、（ａ）上記被験体の尿サンプルを準備し、（ｂ）上記サンプルからタンパク質を単離または濃縮し、さらに（ｃ）好適な検出技術により、工程（ｂ）で得られたタンパク質混合物においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる方法に関する。
【００３３】
好ましい具体例は工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行う工程をさらに含んでなる、本発明の方法に関する。
【００３４】
特に好ましい具体例では、本発明は被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する方法であって、（ａ）上記被験体の尿サンプルを準備し、（ｂ）上記サンプルから分子量が約８Ｋｄａを超える総てのタンパク質を単離または濃縮し、（ｃ）工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行い、（ｄ）工程（ｃ）で得られた混合物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離し、さらに（ｅ）好適な検出技術により、工程（ｂ）で得られたプロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる方法に関する。
【００３５】
１つの好ましい具体例では、これらのタンパク質はサンプルに対して透析を行い、その透析物からタンパク質を沈降させることにより尿サンプルから単離することができる。好ましくはこの透析は約６ＫＤａ〜約８ＫＤａの孔径範囲を有する膜を用いて行う。
【００３６】
透析の後、タンパク質は、例えば、４℃、１００，０００ｘｇにて約１時間超遠心分離することにより、または他の好適なタンパク質沈降技術によって透析物から沈降させうる。例えば、限定されるものではないが、かかるタンパク質沈降技術がメタノールまたはＴＣＡ（トリクロロ酢酸）のいずれか１つによるものであってよい。メタノール沈降が好ましく、例えば、メタノールを加え、約−８０℃で約１時間サンプルを冷凍し、その後、３０００ｘｒｐｍにて約３０分間遠心分離する。
【００３７】
なおもう１つの好ましい具体例では、ＴＣＡを用いてタンパク質を沈降させる。要するに、改変プロトコールに従って、サンプルを１０％ＴＣＡで希釈し、氷上で２時間維持し、その後、４℃、１４０００ｒｐｍにて遠心分離する。上清を廃棄した後、ペレットに対して２回エタノール沈降を行う［改変プロトコールはＴＣＡ沈降プロトコールに基づいている：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ． ｅｄｉｔｏｒｓ： Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ， Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｃ． Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８）］。
【００３８】
所望によりタンパク質沈降に先立ち、透析物に担体を添加してＰｒＰＳＣを安定化してもよい。例えば、かかる担体はＰｒＰ除去したマウスの脳抽出物であってよい。
【００３９】
上記タンパク質を単離した後、それらに対してプロテアーゼ、好ましくはプロテイナーゼＫにより消化を行う。例えば、サンプルに約４０μｇ／ｍｌの濃度のプロテイナーゼＫを加え、３７℃で約３０分間消化を続ける。
【００４０】
好ましくは、上記未消化画分におけるＰｒＰＳＣプロテアーゼ耐性コアの存在がＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアに特異的に結合するモノクローナル抗体（好ましくは、３Ｆ４または６Ｈ４モノクローナル抗体）を使用する免疫アッセイ（例えば、免疫ブロットＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析）によって検出される。このタンパク質の存在はドットブロット免疫アッセイおよび特別に改変したＥＬＩＳＡ試験によっても同定できる。
【００４１】
このように本発明によりプリオン疾患の有効な非侵襲的診断方法が提供される。本発明の方法の基礎となる原理についてはまだ明らかではないが、この疾病の前臨床または臨床病期においてＰｒＰＳＣが脳細胞に分泌され、さらにこのタンパク質がプロテアーゼ耐性であるため、血中で消化される前に尿に排出される可能性があることは理解できよう。
【００４２】
さらなる具体例では、本発明の検出方法が、被験体の尿サンプルを得、さらに本発明の検出方法により、上記尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出し、それにより被験体の尿中にＰｒＰＳＣタンパク質が存在すれば上記被験体がプリオン疾患を有することを示すことにより、ヒトまたは動物被験体においてプリオン疾患を診断するのに用いられる。この異常なイソ型が病原性イソ型プリオンタンパク質であると考えられる。よって、本発明により臨床徴候の発症の前または後での異なるプリオン疾患の検出方法が提供される。
【００４３】
好ましい具体例のプリオン疾患がＴＳＥ疾患である。ＴＳＥ疾患は、限定されるものではないが、例えば、ヒトにおけるＣＪＤ、ＦＦＩ、ＧＳＳのいずれか１つである。非ヒト動物では、ＴＳＥ疾患はＢＳＥ、スクラピー、ラバ、シカおよびヘラジカのＣＷＤ（慢性消耗病）、ならびにＴＭＥ（伝染性ミンク脳症）のいずれか１つである。
【００４４】
本発明の診断方法はＣＪＤキャリヤーを検出する、ＣＪＤ患者の治療をモニターする、および患者の臨床病期および疾患の重篤度を評価するのに特に重要である。ＣＪＤに関する場合、総ての他のＴＳＥのものも含められることにも注意すべきである。病原性プリオン変異の疑いのあるキャリヤーをそれらの保菌状態を確認する変異の存在に関する分子法により試験するが、疾患の発症年齢が３５〜８５歳以上であるため、病症が現れているか否かを早期に確認する試験はない。かかる試験は早期または予防的治療に不可欠でありうる。例えば、遺伝コンサルティングにおいてＣＪＤ疾患を誘導する変異のキャリヤーの検出が利用できる。
【００４５】
ヒトプリオン疾患キャリヤー、好ましくはＣＪＤキャリヤーを検出および診断する本発明の方法はＣＪＤ患者の尿においてすでに同定されているＰｒＰＳＣの独特の代謝物の存在を尿において検出するよう改変することができる。これらの代謝物はヒトプリオン疾患に独特なものであることから、最初に、尿から得られたタンパク質サンプルに対してプロテアーゼ消化を行うことなく、患者の尿において同定できる。この改変では実施例で示されるようにＰｒＰＳＣに特異的な抗体、またはヒトプリオン疾患に独特なものである代謝物に特異的な抗体を使用することが可能である。例えば、６Ｈ４抗体は正常な尿には存在しないＰｒＰ代謝物と結合可能である。そのため、プロテアーゼ消化を省略し、好適な抗体、例えば、一次抗体６Ｈ４を用いて罹患個体にしか見られないＣＪＤ独特のＰｒＰＳＣ代謝物を結合することができる。
【００４６】
さらに、本発明の診断方法はＢＳＥ感染、特にこの疾患に暴露した個体の同定に有用である。ヒトＢＳＥキャリヤーの同定は特に血液サンプルのヒトドナーをそのドナーのプリオン疾患の存在に関してスクリーニングする場合に意味がある。スクリーニングは、例えば、ドナーから尿サンプルを得、本発明の検出方法により、尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出し、さらに、検出の結果を上記血液サンプルと照合することにより行うことができる。かかるスクリーニングによってプリオン感染血の使用が回避され、それにより輸血の危険性が低くなる。
【００４７】
また、本発明の診断方法は、ウシ亜科の動物およびヒツジおよびヤギなどの他の家畜またはＢＳＥもしくは他のプリオン疾患感受性のある他の対象動物に適用すれば、食肉および乳製品などの試験される動物を起源とする食品をスクリーニングする助けとなり、ヒト消費者の感染危険性を引き下げることができる。
【００４８】
本発明の方法のいくつかの工程は、好ましくはウシ亜科の動物に適用するように改変することができる。まず、より多量の尿（約２０〜３０ｍｌ）を試験する。透析後、担体を添加して透析物のタンパク質を安定化することが好ましい。かかる担体は、好ましくはＰｒＰ除去したマウスの脳抽出物であってよい。次に、透析物を超遠心分離することにより、または好ましくは上記のメタノール沈降により沈降させる。ＰＫ消化後、サンプルをＳＤＳ　ＰＡＧＥで分離し、ヒト血清アルブミンを用いてブロットを遮断する。ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）などの他の好適なタンパク質沈降方法を本発明の方法で使用しうることは明らかである。
【００４９】
なおさらなる具体例では、本発明は被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する診断キットであって、上記尿サンプルから分子量が約８Ｋｄａを超える総てのタンパク質を単離する手段、所望により、透析物タンパク質を安定化する担体、タンパク質単離物を消化するプロテアーゼ、消化物から未消化タンパク質を単離する手段、未消化画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する手段、および尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの存在の検出を行うための説明書を含んでなるキットに関する。
【００５０】
特に、本発明のキットに含まれるプロテアーゼがプロテイナーゼＫであり、ＰｒＰＳＣの存在を検出する上記手段が免疫アッセイによりＰｒＰＳＣを検出する試薬、特に、ＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアと特異的に反応する３Ｆ４および６Ｈ４などの抗体を含んでなる。
【００５１】
もう１つの具体例では、本発明のキットからプロテアーゼを外し、ヒトプリオン疾患患者およびキャリヤーの尿において独特に見られるＰｒＰＳＣ代謝物と特異的に結合する抗体を含むように改変しうる。好ましくは、上記ヒトプリオン疾患がＣＪＤまたはｖＣＪＤである。
【００５２】
分子生物学分野の多くの方法については当業者には十分に公知なものであるため、本明細書では詳述していない。かかる方法には、例えば、天然、合成および組換えタンパク質またはペプチドなどの検出および分析が含まれる。かかる方法が記載されているテキストは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ； ＩＳＢＮ： ０８７９６９３０９６， １９８９、Ｆ． Ｍ． ＡｕｓｕｂｅｌによるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＩＳＢＮ： ０４７１５０３３８Ｘ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９８８、およびＦ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）によるＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ； ＩＳＢＮ： ０４７１１３７８１２， １９９５である。これらの刊行物は引用することにより本明細書の一部とされる。さらに、数多くの免疫学的技術については当業者には十分に公知なものであるため、本明細書ではいずれの場合でも詳述していない。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照。
【００５３】
開示、記載された本発明は本明細書に開示される特定の例、処理工程および材料に限定されるものではなく、処理工程および材料自体をある程度変更可能であることがわかるであろう。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびそれと同等なものよってのみ限定され、本明細書で用いられる用語は特定の具体例を例示することを目的として用いるものであって、限定を示すものではないものとする。
【００５４】
以下、本明細書および請求項において「含む」および「含んでなる」などの変形は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、示されている数もしくは工程、または一連の数または工程を含むが、それ以外の数もしくは工程、または一連の数もしくは工程を排除するものではないことを意味するものとする。
【００５５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、とくに断らない限り、単数および複数の対象を含むことにも注意すべきである。
【００５６】
以下の実施例は本発明の態様を行う際に発明者らにより使用された技術の典型例である。これらの技術は本発明の実施を目的とした好ましい典型的な具体例であり、当業者ならば本開示内容を鑑みて意図された本発明の範囲に逸脱することなく多くの改変が可能であるものと分かるであろう。
【００５７】
実施例
試薬
抗体
３Ｆ４−ＰｒＰタンパク質配列の１０８〜１１１アミノ酸残基を検出するモノクローナル抗ＰｒＰ抗体［Ｏｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４０（４）： ７３５−７４６（１９８５）， Ｋａｓｃｓａｋ ＲＪ． Ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１（１２）： ３６８８−９３（１９８７）］。
６Ｈ４−Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入した、ＰｒＰタンパク質の１４４〜１５２アミノ酸残基と結合するモノクローナル抗ＰｒＰ抗体。
【００５８】
バッファー
Ｓａｒｋｏｓｙｌ／ＳＴＥバッファー−１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。
ホモジナイゼーションバッファー−１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ７．５、３００ｍＭ　スクロース。
ＴＢＳＴバッファー−１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０。
【００５９】
試験方法
尿サンプルの分析
尿サンプル（ハムスターでは２ｍｌ、ヒトでは１０ｍｌ、ウシでは１５ｍｌ）を３０００ｒｐｍにて５分間沈降させて時々細胞屑を捨てた。その後、セルロース管状膜（孔径範囲６０００〜８０００ダルトン、ＦＰＩ； Ｔｅｘａｓ， ＵＳＡ）に入れて５リットルの生理食塩水で４℃で一晩透析した（透析中に生理食塩水を２回交換した）。試験目的のために透析工程を省略する場合もあった。続いて、尿サンプルを高速で遠心分離した（１０００００ｇａｖ＊１時間＊４℃）。ペレットを１００μｌの２％Ｓａｒｋｏｓｙｌ／ＳＴＥバッファーに再懸濁した。サンプルを分け、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）の存在または不在下で消化した。消化条件は各々の種に対し最適なものとした。ハムスター尿：４０μｇ／ｍｌ　ＰＫ　３７℃で６０分間：ヒト尿：４０μｇ／ｍｌ　ＰＫ　３７℃で３０分間：ウシ尿：２０μｇ／ｍｌ　ＰＫ　３７℃で３０分間。プロテアーゼ消化後、尿サンプルをＳＤＳサンプルバッファーで煮沸した。
【００６０】
ウエスタンブロット分析
ＳＤＳサンプルバッファーで煮沸したサンプルを１２％ＳＤＳ　ＰＡＧＥに供し、続いてニトロセルロース膜に移した。膜は３％脂肪乳で遮断した（ウシサンプルのみ５％ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン、Ｓｉｇｍａ）で遮断した）。１：３０００抗マウスＩｇＧおよび１：３０００抗ウサギＩｇＧのＴＢＳＴバッファー混合物を用いて第２の遮断工程を行い（３０分間）、二次抗体と尿サンプルによっては存在する場合があるＩｇＧ軽鎖との非特異的結合を防いだ。次いで、膜をＴＢＳＴで１５分間すすぎ、１：５０００のαＰｒＰ　ｍＡｂ　３Ｆ４または６Ｈ４（ハムスター、ヒト）のいずれか、また１：５０００の６Ｈ４（ウシ）を使用して免疫ブロットした。
【００６１】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験
ゴールデンハムスターに正常またはスクラピー罹患ハムスターの尿ＰｒＰを含有するサンプルを接種した。接種に関しては、尿サンプルを上記のように準備し（ＳＤＳ煮沸ではなくＰＫ消化を含む）、必要に応じて１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した。スクラピー感染ハムスターの脳サンプルを対比しうる濃度のＰｒＰＳＣを含有するよう希釈し、さらなるハムスター群に接種した。同じ濃度の脳および尿摂取物プロテアーゼ耐性ＰｒＰを得るために、各動物に、好適な試験群に応じてスクラピーハムスターの尿０．５ｍｌまたは１０％脳ホモジネート１．２５μｌのいずれかを起源とするＰｒＰを含有する５０μｌサンプルを接種した。
【００６２】
ハムスターサンプル
接種後、毎日動物をスクラピー関連症状に関して調べた。時間経過試験では同じ期の潜伏期間にある３匹のハムスター群を週１回、午後３：００〜翌日午前８：００の採尿のために代謝ケージに収容した。朝採尿し、直ちに−８０℃で冷凍した。食物および水は制限なく与えた。スクラピー罹患ハムスターにも同じ方法を用いた。
【００６３】
ヒト尿サンプル
試験したほとんどのＣＪＤ患者（８人のうち６人）はＥ２００Ｋ変異を有している遺伝子患者であった［Ｈｓｉａｏ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２４（１６）， １０９１−７（１９９１）； Ｇａｂｉｚｏｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ ２（１）， ５９−６４（１９９６）； Ｇａｂｉｚｏｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５３（４）， ８２８−３５（１９９３） Ｇｏｌｄｆａｒｂ， Ｌ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３３６（８７１５）， ６３７−８（１９９０）］。患者の１人はこの変異に対して同型接合性の５２歳の被験者であった［Ｓｉｍｏｎ， Ｅ． Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ４７（２）， ２５７−６０（２０００）］。他の遺伝子患者では、４人がコドン１２９においてＭＭであり、１人がＭＶであった。Ｅ２００Ｋ変異はメチオニン１２９対立遺伝子に存在する［Ｇａｂｉｚｏｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９３） ｉｂｉｄ］。ヒト対照（ｎ＝１５）は健康な個体（ｎ＝７）またはアルツハイマー病（ｎ＝３）、多発性硬化症（ｎ＝２）および脳梗塞（ｎ＝３）などの種々の神経変性疾患患者のいずれかであった。
【００６４】
可能である限り、ＣＪＤ患者および対照のヒトサンプルは初尿とした。ＣＪＤおよび脳梗塞後患者の中にはカテーテルを使用している場合があり、これらの場合には尿を蓄尿袋で８時間まで採取した。さらに使用するまで総てのサンプルを冷凍した。
【００６５】
ウシ尿サンプル
総てのＢＳＥおよび大部分の対照ウシ尿サンプルはロンドンのＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｇｅｎｃｙ（ＶＬＡ）から入手した。ＶＬＡサンプルは２４個体の雌牛５１サンプルからなり、総てをブラインドテストのためコード化した。さらに新鮮な冷凍対照サンプルをＨｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｈｏｏｌからも入手した。ＶＬＡレコードに従い、大部分のサンプルを採取後冷凍し、いくつかのものを冷蔵状態においた。サンプル採取日時についての情報はなかった。
【００６６】
組織ホモジネート
総ての脳または腎臓サンプルを１０容量のホモジナイゼーションバッファーでホモジナイズした。遠心分離した後［４℃、２０００ｒｐｍ（回転／分）にて１５分］、上清を冷凍した（−８０℃）。
【００６７】
実施例１
尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの免疫ブロット分析
異なるプリオン疾患を診断する非侵襲的方法を開発するため、異なる哺乳類被験体の尿サンプルにおいてプリオンタンパク質ＵＰｒＰＳＣを検出する可能性を調べた。スクラピー感染ハムスター、ＣＪＤ患者、およびＢＳＥ感染畜牛、ならびにそれらの好適な対照の尿サンプルをＵＰｒＰＳＣの濃縮処理を行った後、本明細書ですでに記載したようにＰｒＰペプチドに関して免疫ブロットした。ヒトおよびハムスター尿サンプルについてはｍＡｂ　３Ｆ４または６Ｈ４のいずれかを使用して免疫ブロットし、ウシサンプルについてはｍＡｂ　６Ｈ４だけを使用してブロットした。比較サンプルではαマウス抗二次血清のみを使用してブロットし、干渉シグナルがないことがわかった。
【００６８】
図１、２、３および４で示されるように、沈降性かつプロテアーゼ耐性型ＰｒＰはプリオン疾患に罹患したヒトおよび動物の透析した尿でのみ検出できた。さらに、好適な対照の尿サンプルでは耐性型ＰｒＰは検出できなかった。ＭＳ（多発性硬化症）患者、脳梗塞患者、ならびに健康な個体のサンプルにおいてＰｒＰＳＣは見られなかった（図２および３）。２患者のバンド強度の差（図２）は患者の臨床病期の違いによって生じると考えられる。他のＣＪＤ同型接合性および異型接合性患者においても同様な結果が得られた（図３および４）。
【００６９】
観察されたシグナルがＰｒＰに独特のものであることを確かめるため、次に遮断試験を行った。図４Ｃで示されるように、尿におけるＰｒＰシグナルは３Ｆ４ペプチドにより遮断できた。このことからこのシグナルがＰｒＰペプチドのものであることが強く明示される。
【００７０】
尿においてＵＰｒＰＳＣを検出する方法を開発するための必須な要素としては、サンプルの遠心分離および消化に先立ち、尿サンプルを透析することによりそれらを濃縮することであった。
【００７１】
図５ではスクラピー感染ハムスター尿サンプルの透析の重要性を例示している。透析したサンプルでしかＰＫ消化後にプロテアーゼ耐性ＵＰｒＰＳＣを検出することはできなかった。
【００７２】
上記の驚くべき研究結果は、ＰｒＰＣでは考えられないことであるが、プロテアーゼ感受性ＰｒＰイソ型が正常尿サンプルの沈降性画分に存在することである。しかしながら、可溶性ＰｒＰＣが結果として得られる膜抽出で行われる超遠心分離の前に尿に界面活性剤を添加しなかったことことにも注意すべきである［Ｍｅｙｅｒ， Ｒ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８３（８）， ２３１０−４（１９８６）； Ｇａｂｉｚｏｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８４（１２）， ４０１７−２１（１９８７）］。総てのＰｒＰ分子は尿素などの種々の変性剤の存在により部分的に変性した状態で尿中に存在している可能性もある。また、正常尿の透析によりＵＰｒＰＳＣとは相反してプロテアーゼ感受性であるＰｒＰＣイソ型の凝集を誘導するかもしれない。ＵＰｒＰＳＣの正確な化学的性質についてはさらに調べるが、その分子量は完全グリコシル化した全長ＰｒＰＣまたはＰｒＰＳＣよりもやや大きいようである。さらに、ＵＰｒＰＳＣの免疫ブロットパターンから、それはグリコシル化の少ない種のものではなく、大部分がＰｒＰの高分子バンドで構成されていることが示唆される。部分的または非グリコシル化ＰｒＰはＵＰｒＰＳＣとして尿に排出される前にＰｒＰＳＣが遭遇する条件に対して耐性が低いことをこれは示している。
【００７３】
少なくともハムスターでは、スクラピー感染ハムスターの腎臓組織でＰｒＰＳＣが確認できなかったことから、ＵＰｒＰＳＣが直接腎臓を起源とするものではないものと考えられる（図４Ｂ、サンプル６）。このことから、ＵＰｒＰＳＣが他の器官を起源とし、血液から尿に到達していることが示される。
【００７４】
実施例２
畜牛の尿サンプルにおけるＢＳＥ診断
イギリスから得た畜牛尿の異なる２４サンプルを二重盲検法によりＰｒＰＳＣの存在について調べた。要するに、畜牛尿２０ｍｌの異なるサンプルを上記のように生理食塩水での透析による処理を行った。ＰｒＰ除去したマウスの脳抽出物１０％ホモジネート１０〜５μｌを異なる濃度に添加して透析したサンプルをさらに安定化した。ＰｒＰ除去したマウスの抽出物を担体として添加すると上記抽出物中の尿ＰｒＰを結合して安定化する分子の存在によりさらに濃縮されたタンパク質沈降物を得る能力が向上した。しかしながら、ＰｒＰ除去したマウス抽出物の担体としての添加は必ずしも必要ではなく、このさらなる工程なしでも試験は実施可能である。次いで、透析したサンプルをメタノール沈降させ（１：４容量比　サンプル／メタノール）、続いて上記のようにＰＫの存在または不在下で消化した。次いで、消化したサンプルに対してウエスタンブロット分析（１２％ＳＤＳ　ＰＡＧＥ）を行い、一次抗体の添加に先立ち、ＴＢＳＴバッファー中５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いてブロットをブロッキングした。表１は得られた結果を同じサンプルの脳組織病理学による臨床診断との比較により示している。表１で示されるように、この試験により得られた結果は極めて有意であった。本発明の方法により総ての陰性サンプルが正確に診断され、臨床的に罹患している動物の大部分がＢＳＥ陽性と診断された（１２サンプルのうち１０サンプル）。４サンプル（４、９、１４および２２番）だけは確定できなかったが、これは保管および輸送状態が適切でなかったためと思われる。サンプル保管および取扱条件のさらなる最適化も本発明の範囲内にある。
【００７５】
【表１】
2004511809.tif 000002
2004511809.tif 000003
【００７６】
実施例３
尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの分析での３Ｆ４と６Ｈ４抗体との比較
３Ｆ４および６Ｈ４モノクローナル抗体を使用してＣＪＤ患者の尿サンプルにおいてＰｒＰＳＣを検出した。サンプルの沈降には超遠心分離の代わりにメタノールを使用した。図６で示されるように、６Ｈ４抗体ではさらなる２つの低バンドが検出できた。これらはＰＫ耐性でありかつＣＪＤ患者にしか存在しないＰｒＰのさらなる２つの代謝物と考えられる。６Ｈ４抗体によって検出されたさらなる代謝物はＰＫでの処理を省略した場合であってもＣＪＤ患者でしか見られなかった［図６］。
【００７７】
試験に先立ち、ＣＪＤ患者にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を投与した場合、尿に排出されるＰｒＰ量にかなりの増加が見られた。図６は１日ＤＭＳＯ投与した（５ｍｌ、１日３回）または投与していないＣＪＤ患者のウエスタンブロット分析の結果を示している。図６の右パネルで示されるように、ＤＭＳＯによって尿へのＰｒＰ排出が増大した。
【００７８】
実施例４
臨床徴候の発症前での尿サンプルにおけるプロテアーゼ耐性ＵＰｒＰＳＣの検出　プリオン疾患の末期では脳変性により一部の血液脳関門が破壊された結果としてＰｒＰＳＣが検出されるものと考えられる［Ｄｅ Ａｒｍｏｎｄ， Ｓ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｇ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ ３１７， ６０１−１８（１９８９）］。しかしながら、潜伏期間初期のプリオン感染尿にＰｒＰＳＣが存在することから、脳または周辺器官いずれかから異常型ＰｒＰが尿へ排出されることによるクリアランス経路が示唆される。この問題に取り組むため、ゴールデンハムスターにハムスタープリオンを大脳内（ｉ．ｃ．）または腹膜内（ｉ．ｐ．）のいずれかで接種した。試験方法で記載したように、潜伏期間中に尿サンプルを週１回採取し、各サンプルを採取後直ちに冷凍した。試験の終わりに同量のこれら尿サンプルを解凍し、上記のようにＰＫ耐性ＵＰｒＰＳＣを濃縮した後、抗ＰｒＰ　ｍＡｂ　３Ｆ４を使用して免疫ブロットした。
【００７９】
図７でわかるように、プリオン独特のプロテアーゼ耐性ＰｒＰが弱いシグナルでｉ．ｃ．接種ハムスターのわずか１７日後の尿サンプルにおいて検出され（図７Ａ）、その後、３５日までにＰｒＰシグナルは消失した。その後、このシグナルは３５日から臨床徴候が現れるまで増強した。ｉ．ｐ．接種ハムスターでも同様の結果が得られた（図７Ｂ）。ＰｒＰシグナルは接種後第１週目に検出され、その後消失し、さらに約６０日に再び現れた。これらの結果はプリオン接種材料の一部が接種後直ちに分泌されたものと推察できる。その後、脳にプリオンタンパク質が蓄積する第１期までＰｒＰシグナルは尿では現れなかった。
【００８０】
スクラピー２６３株をｉ．ｃ．またはｉ．ｐ．接種したハムスターに関して報告されている潜伏期間は各々約７５および１２０日であり、ＰｒＰＳＣはこれらのハムスターの約４０（ｉ．ｃ．）または７０（ｉ．ｐ．）日の濃縮脳サンプルで確認できることにも注意すべきである［Ｃｚｕｂ， Ｍ．， Ｂｒａｉｇ， Ｈ． Ｒ．， ａｎｄ Ｄｉｒｉｎｇｅｒ， Ｈ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６９ （Ｐｔ ７）， １７５３−６（１９８８）； Ｃｚｕｂ， Ｍ．， Ｂｒａｉｇ， Ｈ． Ｒ．， ａｎｄ Ｄｉｒｉｎｇｅｒ， Ｈ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ６７ （Ｐｔ ９）， ２００５−９（１９８６）； Ｔａｒａｂｏｕｌｏｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９， ７６２０−７６２４ （１９９２）］。
【００８１】
これらの結果はＵＰｒＰＳＣが脳への蓄積と同時に尿に排出されることを示している。
【００８２】
これらの結果はプロテアーゼ耐性ＰｒＰの尿試験を使用して疾患末期の動物およびヒトにおいてプリオン疾患が診断でき、さらにこれを使用して感染無症状期でもプリオン疾患を診断できることを明示している。感染後第１週目に検出されたＰｒＰシグナルは、接種材料のクリアランスによるものであることから、ＰｒＰ尿試験は感染の新たな発生の可能性を診断する有力な手段となる。これは将来、新しいプリオン暴露の危険性のある個体の治療に有効な抗プリオン治療法を提供するものとなろう。
【００８３】
実施例５
プリオン疾患はＵＰｒＰＳＣによって伝達可能か
本明細書ですでに示したように、潜伏期間初期および臨床徴候が現れる前の尿においてＵＰｒＰＳＣが検出されることから、プリオン疾患の潜伏期間に罹患した動物の尿を介してプリオン疾患の伝達が起こるという憂慮すべき可能性が高まる。これらの疾患が群をなす動物間で伝達される機構が解明されていないため、ＢＳＥ感染畜牛、ならびにヒツジの天然スクラピーの場合にこの見解は特に懸念される［Ｃｈａｔｅｌａｉｎ， Ｊ．， ａｎｄ Ｄａｕｔｈｅｖｉｌｌｅ Ｇｕｉｂａｌ， Ｃ． Ｅｕｒ Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ ５（１）， １１３−６（１９８９）； Ｂｅｒｎｅ， Ｒ． Ｍ．， ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｍ． Ｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ Ｅｄ． （１９９８）］。よって、尿がこれらの動物の住みかを汚染していると考えられる。
【００８４】
ＴＳＥ感染動物の尿が感染性のものであるか否かを調べるために、２０匹のハムスターに、末期スクラピーのハムスター１０匹の尿をプールし濃縮したＵＰｒＰＳＣを接種した。２０匹のハムスターに、負の対照としての１０匹の正常ハムスターから同様に調製したサンプルを接種した。正の対照としてのさらなるハムスター群に、濃縮したＵＰｒＰＳＣ（０．５ｍｌ尿から）のものと比較できるＰｒＰＳＣ濃度に希釈したスクラピー感染ハムスターの脳サンプル（１．２５μｌの１０％ホモジネート）を接種した（図８Ａ）。毎日、スクラピー感染症状についてハムスターを観察し、ＵＰｒＰＳＣを接種した動物から定期的に採尿した。試験中の異なる時点でＵＰｒＰＳＣを接種したハムスターの一部を犠牲にし、それらの脳におけるＰｒＰＳＣの存在について調べた。
【００８５】
推測されたように、スクラピー感染脳サンプルを接種した動物は接種後（ｄｐｉ）約８０日で致死的な病徴を示すようになる。これに対し、尿サンプル（正常またはスクラピー感染）を接種した動物にはこれまで（２７０ｄｐｉ）プリオン疾患の臨床徴候は現れなかった。１２匹のハムスター（４群各３匹）をＵＰｒＰＳＣの存在について調べ、総てが接種後約６０日で陽性になることがわかった（図８Ｂ、レーン２）。さらに、約１２０日目に犠牲にした３匹の尿感染ハムスターのうち１匹の脳においも低濃度のＵＰｒＰＳＣが確認できた（図８Ｂ、レーン３）。この試験における他の総てのハムスターについてはそれらが致死的なプリオン疾患を後日発症するか否かを調べるためになお観察下においている。これらの結果からＵＰｒＰＳＣ接種により無症状またはキャリヤー状態のプリオン感染を起こしうることが示される。
【００８６】
本発明の特定の具体例を例示を目的に記載してきたが、当業者ならばその精神を逸脱することなく、特許請求の範囲内で多くの改変、変形、および適合を行って本発明を実施しうるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
スクラピーに感染したハムスター（Ｓｃ）または正常対照（Ｎ）の尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの３Ｆ４モノクローナル抗体を使用した免疫ブロット分析。サンプルは各々プロテイナーゼＫ（ＰＫ）で処理（＋）したものと、未処理のもの（−）とした。
【図２】
ヒト同型接合性（ＨＯＺ）または異型接合性（ＨＴＺ）ＣＪＤ、Ｍ．Ｓ（多発性硬化症）、脳梗塞（Ｓｔｒ）患者、および健康な個体（Ｎｏｒｍ）の尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの３Ｆ４モノクローナル抗体を使用した免疫ブロット分析。サンプルは各々プロテイナーゼＫ（ＰＫ）で処理（＋）したものと、未処理のもの（−）とした。
【図３】
同型接合性（ＨＯＺ）ＣＪＤ患者および健康な個体（Ｎｏｒｍ）の尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの３Ｆ４モノクローナル抗体を使用した免疫ブロット分析。ハムスター脳抽出物（Ｈａｍ　ｂｒ）を正の対照として用いた。サンプルは各々プロテイナーゼＫ（ＰＫ）で処理（＋）したものと、未処理のもの（−）とした。青色の予備染色マーカー（Ｎｏｖｅｘ）を分子量マーカー（Ｍ）として用いた。
【図４Ａ】
ＴＳＥに感染したヒトおよび動物の尿または脳サンプルにおけるプロテアーゼ耐性ＰｒＰを示す。
試験方法で記載したように、プロテアーゼ耐性ＰｒＰを濃縮したハムスター、ヒトおよび畜牛の新たに冷凍した尿サンプル。総てのサンプルをプロテイナーゼＫの存在または不在下で消化し（各々＋または−ＰＫ）、抗ＰｒＰ　ｍＡｂ　３Ｆ４（ハムスターおよびヒトサンプル）または６Ｈ４（ウシサンプル）のいずれかを使用して免疫ブロットした。（１）同型接合性Ｅ２００Ｋ　ＣＪＤ患者、（２）異型接合性Ｅ２００Ｋ　ＣＪＤ患者、（３）ヒト対照、（４）スクラピー罹患ハムスター、（５）正常ハムスター、（６）ＢＳＥ罹患畜牛、（７）正常畜牛。
【図４Ｂ】
ＴＳＥに感染したヒトおよび動物の尿または脳サンプルにおけるプロテアーゼ耐性ＰｒＰを示す。
５μｌの１０％脳サンプル（１）同型接合性ＣＪＤ患者、（２）異型接合性ＣＪＤ患者、（３）ヒト対照、（４）スクラピー罹患ハムスター、（５）正常ハムスター、（６）スクラピー罹患ハムスターの腎臓サンプルを使用して行った同分析。
【図４Ｃ】
ＴＳＥに感染したヒトおよび動物の尿または脳サンプルにおけるプロテアーゼ耐性ＰｒＰを示す。
ヒト脳サンプル（ｂ）およびヒト尿サンプル（ｕ）において行ったブロッキング試験。サンプルを３Ｆ４エピトープを含んでなる１０μｇ／ｍｌのペプチドの不在（１）または存在（２）下でｍＡｂ　３Ｆ４を使用して免疫ブロットした。分子量マーカー（上方〜下方）、３６ｋＤａ、３０ｋＤａ。
【図５】
透析工程（Ｄｉａ）を行いまたは行わないでＵＰｒＰＳＣを濃縮したスクラピーハムスター尿サンプル。方法で記載したように、サンプルをプロテイナーゼＫ（ＰＫ）の存在（＋）または不在（−）下で消化した。
【図６】
ＤＭＳＯで１日処理した（＋ＤＭＳＯ（１ｄ））または処理していないＣＪＤ患者および健康な個体（Ｎｏｒｍ）から得たＰｒＰＳＣの６Ｈ４抗体を使用した免疫ブロット分析（３Ｆ４抗体との比較）。ハムスター脳抽出物（Ｈａｍ　ｂｒ）を正の対照として用いた。サンプルはメタノールにより沈降させ、各々プロテイナーゼＫ（ＰＫ）で処理（＋）したものと、未処理のもの（−）とした。青色の予備染色マーカー（Ｎｏｖｅｘ）を分子量マーカー（Ｍ）として用いた。
【図７Ａ】
スクラピー潜伏期間（Ｉｎｃ　Ｔ）（日（ｄ））中に検出可能なプリオン独特のＰｒＰを示す。ｉ．ｃ．（７Ａ）またはｉ．ｐ．（７Ｂ）のいずれかで接種したゴールデンハムスターから尿サンプルを週１回採取した。サンプルをＵＰｒＰ　ｍＡｂ　３Ｆ４を使用して免疫ブロットした。矢印は臨床徴候の発症（Ｃｌｉｎ　ｓｉｇ）を表している。分子量マーカー（上方〜下方）、３６ｋＤａ、３０ｋＤａ。
ハムスター２６３Ｋプリオンをｉ．ｃ．（大脳内）接種し、ＵＰｒＰＳＣを濃縮したゴールデンハムスター。
【図７Ｂ】
スクラピー潜伏期間（Ｉｎｃ　Ｔ）（日（ｄ））中に検出可能なプリオン独特のＰｒＰを示す。ｉ．ｃ．（７Ａ）またはｉ．ｐ．（７Ｂ）のいずれかで接種したゴールデンハムスターから尿サンプルを週１回採取した。サンプルをＵＰｒＰ　ｍＡｂ　３Ｆ４を使用して免疫ブロットした。矢印は臨床徴候の発症（Ｃｌｉｎ　ｓｉｇ）を表している。分子量マーカー（上方〜下方）、３６ｋＤａ、３０ｋＤａ。
ハムスター２６３Ｋプリオンをｉ．ｐ．（腹膜内）接種し、ＵＰｒＰＳＣを濃縮したゴールデンハムスター。
【図８Ａ】
ゴールデンハムスターへのＵＰｒＰＳＣのｉ．ｃ．（大脳内）接種を示す。
ゴールデンハムスターにスクラピー感染ハムスターの脳または尿の同量のＰＫ耐性ＰｒＰを接種した。総てのサンプルを１：５０００　ｍＡｂ　３Ｆ４を使用して免疫ブロットした。
５μｌの１０％ハムスター脳ホモジネート（１）を起源とするＰＫ耐性ＰｒＰＳＣ相当物（２ｍｌスクラピーハムスター尿（２）との比較）。
【図８Ｂ】
ゴールデンハムスターへのＵＰｒＰＳＣのｉ．ｃ．（大脳内）接種を示す。
ゴールデンハムスターにスクラピー感染ハムスターの脳または尿の同量のＰＫ耐性ＰｒＰを接種した。総てのサンプルを１：５０００　ｍＡｂ　３Ｆ４を使用して免疫ブロットした。
スクラピー感染ハムスターの脳サンプル（１）、ＵＰｒＰＳＣを接種したハムスターから採取した尿サンプル（２）、またはＵＰｒＰＳＣを接種したある種の動物の脳サンプル（３）。総てのサンプルをＰＫの存在（＋）または不在（−）下で消化した。分子量マーカー（上方〜下方）、３６ｋＤａ、３０ｋＤａ。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月13日(2003.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
本発明の特定の具体例を例示を目的に記載してきたが、当業者ならば多くの改変、変形、および適合を行って本発明を実施しうるものと考えられる。




【手続補正書】
【提出日】平成15年4月15日(2003.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを準備し、
ｂ．上記サンプルからタンパク質を単離し、さらに
ｃ．好適な検出技術により、工程（ｂ）で得られたタンパク質混合物においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行う工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する請求項２に記載の方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを準備し、
ｂ．上記サンプルから分子量が８ＫＤａを超える総てのタンパク質を単離し、
ｃ．工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行い、
ｄ．工程（ｃ）で得られた混合物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離し、さらに
ｅ．好適な検出技術により、工程（ｄ）で得られたプロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において上記タンパク質が尿サンプルに対して透析を行い、その透析物からタンパク質を沈降させることにより単離される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が所望によりタンパク質沈降に先立ち、透析物に担体を添加することをさらに含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを準備し、
ｂ．上記サンプルから該サンプルの透析により分子量が８ＫＤａを超える総てのタンパク質を単離し、ここで該透析が６ＫＤａ〜８ＫＤａの孔径範囲を有する膜を用いて行なわれ、
ｃ．上記タンパク質を透析物の超遠心分離により沈降させ、
ｄ．工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行い、
ｅ．工程（ｃ）で得られた混合物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離し、さらに
ｆ．好適な検出技術により、工程（ｄ）で得られたプロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項７】
被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを準備し、
ｂ．上記サンプルから該サンプルの透析により分子量が８ＫＤａを超える総てのタンパク質を単離し、ここで該透析が６ＫＤａ〜８ＫＤａの孔径範囲を有する膜を用いて行なわれ、
ｃ．上記蛋白質を４℃、１００，０００ｘｇで１時間の透析物の超遠心分離により沈降させ、
ｄ．工程（ｂ）で得られたタンパク質に対してプロテアーゼ消化を行い、
ｅ．工程（ｃ）で得られた混合物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離し、さらに
ｆ．好適な検出技術により、工程（ｄ）で得られたプロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項８】
メタノールおよびＴＣＡのいずれかによりタンパク質を沈降させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
メタノールによりタンパク質を沈降させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項６および７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｅ）において上記プロテアーゼ耐性画分におけるＰｒＰＳＣプロテアーゼ耐性コアの存在が免疫アッセイによって検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記免疫アッセイが免疫ブロットＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析によるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫アッセイがＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアに特異的に結合するモノクローナル抗体の使用を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
上記ＰｒＰ抗体が３Ｆ４または６Ｈ４モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
被験体においてプリオン疾患を診断する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを得て、さらに
ｂ．請求項６および７のいずれか一項に記載の方法により、上記尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出し、それにより上記サンプル中にＰｒＰＳＣタンパク質が存在すれば上記被験体がプリオン疾患を有することを示す工程を含んでなる、方法。
【請求項１６】
上記プリオン疾患がＴＳＥ疾患である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記被験体がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記被験体がウシである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
上記プリオン疾患がＢＳＥである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記プリオン疾患の診断が臨床徴候の前または後である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物（この代謝物はヒトプリオン疾患キャリヤーに独特なものである）の存在を検出する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを準備し、
ｂ．上記サンプルから分子量が８ＫＤａを超える総てのタンパク質を単離し、さらに
ｃ．ヒトプリオン疾患キャリアーの尿中に見られるＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアに特異的に結合する６Ｈ４モノクローナル抗体の使用を含む免疫アッセイにより、工程（ｂ）で得られたタンパク質サンプルにおいて上記ＰｒＰＳＣ代謝物の存在を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項２２】
工程（ｂ）において上記タンパク質が、６ＫＤａ〜８ＫＤａの孔径範囲を有する膜を用いて尿サンプルに対して透析を行い、その透析物から超遠心分離によりタンパク質を沈降させることにより単離される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
沈降が４℃、１００，０００ｘｇにて１時間透析物を超遠心分離することにより行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
メタノールおよびＴＣＡのいずれかにより単離タンパク質を沈降させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
メタノールによりタンパク質を沈降させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記ヒトプリオン疾患がＣＪＤである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト被験体においてヒトプリオン疾患を診断する方法であって、
ａ．上記被験体の尿サンプルを得て、さらに
ｂ．請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法により、上記尿サンプルにおいてヒトプリオン疾患患者に独特な異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物の存在を検出し、それにより上記サンプル中に上記ＰｒＰＳＣタンパク質代謝物が存在すれば上記被験体がヒトプリオン疾患を有することを示す工程を含んでなる、方法。
【請求項２８】
上記ヒトプリオン疾患がＣＪＤである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
被験体の尿サンプルにおいて異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の存在を検出する診断キットであって、
ａ．上記尿サンプルからタンパク質を単離する手段、
ｂ．所望により、尿サンプル中でＰｒＰＳＣを安定化する好適な担体、
ｃ．（ａ）または（ｂ）により得られたタンパク質単離物を消化するプロテアーゼ、
ｄ．（ｃ）による消化物からプロテアーゼ耐性タンパク質を単離する手段、
ｅ．（ｄ）により得られたプロテアーゼ耐性画分においてＰｒＰＳＣの存在を検出する手段、および
ｆ．請求項６および７のいずれか一項に記載の方法に従い、尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの存在の検出を行うための説明書
を含んでなる、キット。
【請求項３０】
タンパク質を単離する上記手段が、分子量が８ＫＤａを超えるタンパク質を単離するためのものである、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
上記プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
ＰｒＰＳＣの存在を検出する上記手段が免疫アッセイによりＰｒＰＳＣを検出する試薬を含んでなる、請求項２９に記載のキット。
【請求項３３】
上記免疫アッセイ試薬がＰｒＰＳＣのプロテアーゼ耐性コアと特異的に反応する抗体を含んでなる、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
ヒト被験体の尿サンプルにおいて、ヒトプリオン疾患キャリヤーに独特な異常なイソ型プリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の代謝物の存在を検出する診断キットであって、
ａ．上記尿サンプルから分子量が８ＫＤａを超える総てのタンパク質を単離する手段、
ｂ．工程（ａ）で得られたタンパク質サンプルにおいて、ヒトプリオン疾患キャリヤーに独特なＰｒＰＳＣ代謝物と特異的に反応する抗体、好ましくは６Ｈ４を含む免疫アッセイによりヒトプリオン疾患キャリヤーに独特なＰｒＰＳＣ代謝物の存在を検出する試薬、および
ｃ．請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法に従い、尿サンプルにおけるＰｒＰＳＣの存在の検出を行うための説明書を含んでなる、キット。
【請求項３５】
上記ヒトプリオン疾患がＣＪＤである、請求項３３に記載のキット。
【国際調査報告】
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